УНИВЕРСАЛЬНАЯ РАЗБОРНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ЯЧЕЙКА ДЛЯ МИКРОГРАВИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА СУСПЕНЗИЙ АНТИГЕНОВ И РАСТВОРОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ. ВАРИАНТЫ

Полезная модель относится к биомедицинским техническим устройствам для инструментального анализа жидкостей и диагностики возбудителей особо опасных инфекционных (ООИ) болезней, находящихся в жидкой среде. Устройство может быть использовано в медицинской микробиологии, микробиологической, химической и пищевой промышленности, а также на предприятиях агропромышленного комплекса. Конструкция устройства позволяет получать максимальные преимущества в эффективности исследования проб за счет инженерных решений, принятых с учетом описаний производственного источника (В.В. Малов. Пьезорезонансные датчики. Энергоатомиздат. Москва, 1989 - 272 с). Расширение функциональных возможностей устройства, представленных в виде базового и двух модифицированных вариантов жидкостной ячейки (ЖЯ) способствуют более равномерному распределению анализируемого образца в жидкой фазе по функциональной поверхности кварцевой пластины, Кроме того, модифицированный вариант ЖЯ с дополнительным электродом позволяет в процессе проведения микрогравиметрического анализа образца прикладывать энергию постоянного электрического поля к электродам, образующим контрольную камеру.
Известно устройство пьезокварцевого иммуносенсора с примененим кремнийорганического модификатора (Фадеев А.Ю., Ельцов Α.Α., Алешин Ю.К., Малышенко С.И., Лисичкин Г.В. Жидкостной химически модифицированный кварцевый резонатор как иммуносенсор // Журнал физической химии. - 1994. - Т. 68, №11. - С. 2071-2075.). При конструировании ячейки авторы постарались предотвратить все радиотехнические наводки и другие факторы, действующие на тонкую пластинку пьезокварца, погруженную в жидкость. Плоскость резонатора располагали под некоторым углом к уровню жидкости для удаления воздушных пузырьков, скапливающихся у поверхности пьезосенсора. Для предотвращения электролиза только одна сторона пьезосенсора была погружена в жидкость, также эмпирически была выбрана глубина погружения пьезоиммуносенсора.
Недостатком устройства является необходимость соблюдения условий работы при проведении исследования с пьезосенсором, который должен быть расположен под некоторым углом к поверхности жидкости, что в свою очередь требует выбора глубины погружения пьезоиммуносенсора. В целом, это усложняет изготовление и практическое применение пьезокварцевого резонатора.
Известно устройство проточной ячейки детектирования с объемом контрольной камеры 15-20 мкл для пьезокварцевых пластин диаметром 8 мм с собственной частотой 8-10 МГц в составе установки для проточно-инжекционного анализа (ПИА) пьезокварцевого иммуносенсора (Калмыкова Е.Н., Ермолаева Т.Н.,. Еремин С.А. Разработка пьезокварцевых иммуносенсоров для проточно-инжекционного анализа высоко- и низкомолекулярных соединений // Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. - 2002. - Т. 43, №6. - С. 399-403).
Недостатками данного устройства проточной ячейки являются: с одной стороны, ее микроразмерная конструкция и сложность изготовления из-за того, что сенсор должен контактировать с жидкостью только одной стороной; с другой, авторы в описании показали только принципиальную схему конструкции устройства. Вследствие чего, использование коммерческих вариантов кварцевых резонаторов в их традиционном исполнении (с боковыми токоотводами), усложняет изготовление герметичной контрольной камеры устройства из-за боковых креплений токоотводов к пластине. Кроме того, соединяющие каналы из силиконовых трубок, с указанным диаметром 0,16 мм (без уточнения внутренний это или наружный диаметр) и параметрами расхода жидкости 30 мкл/мин, что равно 0,5 мкл/сек и соответствует скорости потока жидкости в трубке, равной 25 мм/сек. То есть, для обеспечения приведенных авторами параметров расхода жидкости, требуется создание достаточного динамического давления перистальтическим насосом.
Известно устройство пьезокварцевого сенсора в металлическом корпусе, включающее сменную насадку с полимерными мембранами и кварцевым резонатором с двумя электродами и боковыми токоотводами, закрепленными в держателе, при наличии системы питания и передачи сигнала сенсора обеспечивается его функция (Пат. РФ №2366036 РФ / Устройство пьезорезонансного сенсора / В. Калач, О.С. Корнеева, А.И. Ситников, О.Л. Мещерякова. Опубл. 27.08.2009, Бюл. №24).
Недостатками вышеприведенного пьезокварцевого сенсора является ограниченная возможность сменной насадки для исследования отдельных образцов в жидкой фазе, содержащих корпускулярные антигены или иммуноглобулины и невозможность динамического исследования жидких проб, в виду отсутствия каналов для их подачи. Кроме того, авторы в описании показали только принципиальную схему конструкции пьезокварцевого устройства, а в описании не раскрыли приемы герметизации кварцевой пластины.
Наиболее близкой к заявляемой полезной модели является жидкостная ячейка QFM 401 (quartz flow manual) шведской фирмы «Q-Sense» (Stockholm, Sweden, http://www.q-sense.com/products/q-sense-e4), которая представляет собой компактное, разборное электротехническое устройство в титановом корпусе в виде параллелепипеда, обеспечивающего проточно-инжекционный метод анализа жидких образцов. В качестве основного функционального элемента в жидкостной ячейке QFM 401 использована круглая кварцевая пластина диаметром 14 мм с золотыми электродами, работающая в диапазоне 5,0 МГц.
Несмотря на отдельные преимущества рассматриваемого устройства - изготовление ячейки из химически инертного материала фторопласта (поливини-лиденфторид, ПВДФ), уплотнительных колец из фторуглеродистого каучука (viton), возможность термостабилизации пробы (образца) в контрольной камере объемом около 100 мкл, соединение с анализатором токоотводами минимальной длины, а также возможность быстро и без рисков замены пьезодатчика, есть все основания отметить недостатки жидкостной ячейки QFM 401 шведской фирмы «Q-Sense».
Основными недостатками прототипа являются: отсутствие возможности приложения энергии постоянного и/или пульсирующего электрического тока для принудительного перемещения искомых клеток возбудителей к функциональному рецепторному слою на поверхности пластины кварцевого резонатора; отсутствие возможности подачи исследуемой пробы под действием ускорения силы тяжести (гравитационного поля); необходимость подачи пробы через входящий капиллярный канал небольшого диаметра (0,47 мм) и отвода через канал не намного большего диаметра (0,62 мм), а также значительный объем исследуемой пробы в силиконовых капиллярах; незначительное отличие диаметров подающего и аспирирующего каналов, что затрудняет равномерное распределение аналита по функциональной поверхности кварцевой пластины и не гарантирует формирование ламинарного потока в контрольной камере; относительной большой объем (100 мкл) контрольной камеры (полости) и, кроме того, выполнение отдельных конструктивных элементов ячейки из мало технологичного титана и использование в качестве резонатора кварцевой пластины 5,0 МГц.
Предлагаемая полезная модель «Универсальная разборная жидкостная ячейка для микрогравиметрического анализа суспензий антигенов и растворов иммуноглобулинов. Варианты.» (далее, устройство) предназначено для анализа проб образцов в жидкой фазе с использование в качестве детектора кварцевого (Ат-срез) иммуносенсора для измерения изменений нагрузки массы на сенсорном слое за счет антигена или иммуноглобулинов, оцениваемой по сдвигу частоты с помощью частотомера или аналогичного анализатора. Устройство может быть использовано для индикации бактериальных антигенов в специализированных противоэпидемических бригадах в условиях чрезвычайных ситуаций, а также в научно-исследовательской работе.
Целью предлагаемой полезной модели является обеспечением максимальной эффективности детекции бактериальных антигенов или иммуноглобулинов, находящихся в жидкой фазе, с помощью микрогравиметрического анализа за счет оптимизации условий подачи исследуемого образца.
Сущность технического результата заявляемой полезной модели заключается в конструктивных модификациях устройства в виде вариантов жидкостной ячейки с подачей и отведением жидкого образца через капиллярные каналы крышки, изготовлении на крышке цилиндрической емкости объемом 1,2 мл и установке дополнительного электрод из химически неактивного металла над функциональной поверхностью кварца.
Базовый вариант ЖЯ состоит из корпуса, с размещенной в нем пластиной кварцевого резонатора (кристалл), прижимаемой винтовой гайкой через крышку с тремя каналами, продолжающимися в виде металлических капилляров с внутренним диаметром 1,2 мм. С противоположной стороны кварцевой пластины установлены подпружинивающие контакты с токоотводами. Контрольная камера, образуемая функциональной поверхностью пластины и крышкой, с открывающимися в ней каналами, герметизирована за счет установки уплотнительных из фторуглеродистого каучука (viton), а корпус, крышка и основание изготовлены из диэлектрической пластмассы -фторопласта (поливинилиденфторид, ПВДФ).
Изготовление на крышке контрольной камеры цилиндрической емкости объемом 1,2 мл с семью каналами, шесть из которых диаметром 1,5 мм равномерно расположены по окружности крышки, способствуют равномерному поступление пробы образца в жидкой фазе к функциональной поверхности кварцевой пластины. Центральный канал в виде металлического капилляра является аспирирующим.
Установка дополнительного электрода из химически неактивного металла над поверхностью функционального электрода кварцевой пластины позволяет использовать энергию постоянного и/или пульсирующего электрического поля для увеличения эффективности сорбции антигенов или иммуноглобулинов за счет иммуноэлектроиммобилизации при использовании центрального аспирирующего канала в качестве токовода.
Таким образом, предлагаемые варианты конструкций полезной модели позволяют при необходимости полностью разбирать устройство, наряду с подачей проб образцов через два латеральных канала, обеспечивается возможность подачи исследуемого материала, поступающего в контрольную камеру за счет ускорения силы тяжести, а также возможности использования энергии постоянного и/или пульсирующего электрического в режиме их сочетания поля для ускорения перемещения антител, иммуноглобулинов или антигенов.
Отличительными признаками вариантов устройства - заявляемой полезной модели являются:
- возможность быстрой разборки устройства для его обработки;
- использование в качестве резонатора полированной кварцевой пластины ДМ-7 с золотыми электродами для 10,0 МГц;
- обеспечение ламинарного потока образца за счет двух или шести подающих каналов, что в разы снижает скорость потока на функциональной поверхности кварцевой пластины;
- наличие цилиндрической емкости объемом 1,2 мл на крышке контрольной камеры;
- возможность внесения проб образцов в объеме 1,0 мл непосредственно в цилиндрическую емкость на крышке контрольной камеры;
- наличие дополнительного электрода из химически неактивного металла над функциональной поверхностью кварцевой пластины
- возможность приложения энергии постоянного электрического поля к электроду функциональной поверхности пластины и дополнительному электроду;
- возможность приложения энергии пульсирующего электрического поля к электроду функциональной поверхности пластины и дополнительному электроду;
- возможность приложения энергии постоянного и пульсирующего электрического поля в режиме их сочетания к электроду функциональной поверхности пластины и дополнительному электроду;
На фото 1, 2 и фиг. 1-7, соответственно, показано изображение базового варианта жидкостной ячейки, модифицированной жидкостной ячейки и схемы вариантов жидкостной ячейки и их основных деталей.
На фиг. 1 (вид сбоку) представлена схема базового варианта жидкостной ячейки с тремя каналами, где: 1 - корпус, 2 - пластина кварцевого резонатора (кристалл), 3 - гайка, 4 - крышка, 5 - каналы (3 шт. ), 6 - металлические капилляры, 7 - токоотводы, 8 - контакты, 9 - уплотнительные кольца из фторуглеродистого каучука (viton), 10 - основание, 11 - контрольная камера.
На фиг. 2 (вид сверху) показана схема крышки базового варианта жидкостной ячейки, где 5 - каналы для металлических капилляров.
На фиг. 3. (вид сбоку) представлена схема модифицированной жидкостной ячейки с семью каналами в крышке и цилиндрической емкостью на ней, где: 1 - корпус, 2 - пластина кварцевого резонатора (кристалл), 3 - гайка, 4 - крышка, 5 - каналы (6 шт. ), 6 - цилиндрическая емкость (пробоприемник), 7 - аспирирующий канал с металлическим капилляром, 8 - токоотводы, 9 - контакты, 10 - уплотнительные кольца из фторуглеродистого каучука (viton), 11 - основание, 12 - контрольная камера.
На фиг. 4 (вид сверху) показана схема крышки модифицированной жидкостной ячейки с семью каналами и цилидрической емкостью на ней, где 5 - каналы (6 шт. ), 6 - цилиндрическая емкость (пробоприемник), 7 - металлический аспирирующий капилляр.
На фиг. 5 (вид сбоку) представлена схема модифицированной жидкостной ячейки с семью каналами, цилиндрической емкостью на крышке и дополнительным электродом, где: 1 - корпус, 2 - пластина кварцевого резонатора (кристалл), 3 - гайка, 4 - крышка, 5 - каналы (6 шт. ), 6 - цилиндрическая емкость (пробоприемник), 7 - аспирирующий канал, 8 - токоотводы, 9 - контакты, 10 - уплотнительные кольца из фторуглеродистого каучука (viton), 11 - дополнительный электрод, 12 - основание, 13 - контрольная камера.
На фиг. 6. (вид сверху) показана схема крышки модифицированной жидкостной ячейки с семью каналами, цилидрической емкостью на ней и дополнительным электродом, где: 5 - каналы (6 шт. ), 6 - цилиндрическая емкость (пробоприемник), 7 - металлический аспирирующий капилляр.
На фиг. 7. (общий вид) представлена схема дополнительного электрода, где 5 - каналы (6 шт. ), 7 - металлический аспирирующий капилляр.
Возможность применения вариантов универсального разборного устройства подтверждена конкретными примерами их использования.
Пример 1. Полированный кварцевый резонатор ДМ-7 с золотыми электродами и паянными токоотводами с предварительно активированной функциональной поверхностью в плазме бензальдегида и иммобилизированными специфическими антибруцеллезными иммуноглобулинами, то есть иммуносенсор, помещали в контрольную камеру базового вариант ЖЯ. Затем при аспирирующей подаче перистальтическим насосом потока физиологического раствора через контрольную камеру в течение 2-х мин. со скоростью расхода жидкости, равной 2 мкл/сек, с помощью векторного анализатора CPNA-330 с одновременной электронной фиксацией и обработкой динамических результатов измерений частоты и сопротивления с помощью компьютерной программы определяли частоту иммуносенсора, которая составила 9986347 Гц. При этом отводимый физиологический раствор поступал в чашку Петри.
Образец исследуемой пробы в объеме 500 мкл с плотностью суспензии 105 микробных клеток/мл (м.к./мл) вносили в пробирку эппендорф и подавали в контрольную камеру по силиконовым капиллярным каналам с такой же скоростью расхода жидкости и ее отведением в чашку Петри с одновременной электронной фиксацией и обработкой динамических результатов измерений частоты и сопротивления с помощью компьютерной программы. Сдвиг частоты составил 307 Гц.
Пример 2. Отличается от примера 1 тем, что иммуносенсор помещали в контрольную камеру модифицированного варианта жидкостной ячейки с семью каналами. Исходная частота иммуносенсора в физиологическом растворе составляла 9988532 Гц, а образец исследуемой пробы в объеме 500 мкл с плотностью суспензии 105 м.к./мл вносили в цилиндрическую емкость и из контрольной камеры по центральному металлическому капилляру и силиконовому капиллярному отводили в чашку Петри. Сдвиг частоты после компьютерной обработки результатов составил 443 Гц.
Пример 3. Отличается от примера 1 тем, что иммуносенсор помещали в контрольную камеру модифицированного варианта жидкостной ячейки с семью каналами и дополнительным электродом. Исходная частота иммуносенсора в физиологическом растворе составляла 9987734 Гц.
Образец исследуемой пробы в объеме 500 мкл с плотностью суспензии 105 м.к./мл вносили в цилиндрическую емкость, к дополнительному электроду и электроду функциональной поверхности кварцевой пластины прикладывали постоянный электрический ток в течение периода измерения. Из контрольной камеры по центральному металлическому капилляру и силиконовому капиллярному образец пробы отводили в чашку Петри. Сдвиг частоты после компьютерной обработки результатов составил 578 Гц.
Пример 4. Отличается от примера 1 тем, что иммуносенсор помещали в контрольную камеру модифицированного варианта жидкостной ячейки с семью каналами и дополнительным электродом. Исходная частота иммуносенсора в физиологическом растворе составляла 9994236 Гц.
Образец исследуемой пробы в объеме 500 мкл с плотностью суспензии 105 м.к./мл вносили в цилиндрическую емкость, к дополнительному электроду и электроду функциональной поверхности кварцевой пластины прикладывали постоянный электрический ток и равномерные импульсы постоянного тока от источника (аккумулятора) параллельно включенного в цепь постоянного электрического тока в течение периода измерения. Из контрольной камеры по центральному металлическому капилляру и силиконовому капиллярному образец пробы отводили в чашку Петри. Сдвиг частоты после компьютерной обработки результатов составил 623 Гц.
Пример 5. Полированный кварцевый резонатор ДМ-7 с золотыми электродами и паянными токоотводами с предварительно активированной функциональной поверхностью в плазме бензальдегида и иммобилизированной фракицей F I чумного микроба, то есть иммуносенсор, помещали в контрольную камеру базового вариант ЖЯ, Затем при аспирирующей подаче перистальтическим насосом потока физиологического раствора через контрольную камеру в течение 2-х мин. со скоростью расхода жидкости, равной 2 мкл/сек, с помощью векторного анализатора CPNA-330 с одновременной электронной регистрацией и обработкой динамических результатов измерений частоты и сопротивления с помощью компьютерной программы определяли частоту иммуносенсора, которая составила 9996564 Гц. При этом отводимый физиологический раствор поступал в чашку Петри.
Образец исследуемой пробы в объеме 500 мкл с концентрацией иммуноглобулинов против чумного микроба суспензии 0,125 мг/мл вносили в пробирку эппендорф и подавали в контрольную камеру по силиконовым капиллярным каналам с такой же скоростью расхода жидкости и ее отведением в чашку Петри с одновременной электронной регистрацией и обработкой динамических результатов измерений частоты и сопротивления с помощью компьютерной программы. Сдвиг частоты составил 227 Гц.
Пример 6. Отличается от примера 1 тем, что иммуносенсор помещали в контрольную камеру модифицированного варианта жидкостной ячейки с семью каналами. Исходная частота иммуносенсора в физиологическом растворе составляла 99964353 Гц, а образец исследуемой пробы в объеме 500 мкл с концентрацией иммуноглобулинов против чумного микроба суспензии 0,125 мг/мл вносили в цилиндрическую емкость и из контрольной камеры по центральному металлическому капилляру и силиконовому капиллярному отводили в чашку Петри. Сдвиг частоты после компьютерной обработки результатов составил 314 Гц.
Пример 7. Отличается от примера 1 тем, что иммуносенсор помещали в контрольную камеру модифицированного варианта жидкостной ячейки с семью каналами и дополнительным электродом. Исходная частота иммуносенсора в физиологическом растворе составляла 99964384 Гц.
Образец исследуемой пробы в объеме 500 мкл с концентрацией иммуноглобулинов против чумного микроба суспензии 0,125 мг/мл вносили в цилиндрическую емкость, к дополнительному электроду и электроду функциональной поверхности кварцевой пластины прикладывали постоянный электрический ток в течение периода измерения. Из контрольной камеры по центральному металлическому капилляру и силиконовому капиллярному образец пробы отводили в чашку Петри. Сдвиг частоты после компьютерной обработки результатов составил 427 Гц.
Пример 8. Отличается от примера 1 тем, что иммуносенсор помещали в контрольную камеру модифицированного варианта жидкостной ячейки с семью каналами и дополнительным электродом. Исходная частота иммуносенсора в физиологическом растворе составляла 9996325 Гц.
Образец исследуемой пробы в объеме 500 мкл с концентрацией иммуноглобулинов против чумного микроба суспензии 0,125 мг/мл вносили в цилиндрическую емкость, к дополнительному электроду и электроду функциональной поверхности кварцевой пластины прикладывали постоянный электрический ток и равномерные импульсы постоянного тока от источника (аккумулятора) параллельно включенного в цепь постоянного электрического тока в течение периода измерения. Из контрольной камеры по центральному металлическому капилляру и силиконовому капиллярному образец пробы отводили в чашку Петри. Сдвиг частоты после компьютерной обработки результатов составил 492 Гц.
Таким образом, заявляемое в качестве полезной модели техническое устройство, выполненное в виде практически осуществимо. Полученные в экспериментах результаты свидетельствуют о увеличении эффективности детекци бактериального антигена на модели суспензии бруцеллезного микроба за счет оптимизации условий подачи проб образцов к функциональной поверхности кварцевой пластины, особенно, при дополнительном воздействии на компоненты пробы энергией электрического поля, в том числе постоянного и пульсирующего электрического поля. Использование предлагаемой полезной модели позволяет в различных условиях и для различных целей оперативно исследовать микрогравиметрическим методом материал/проб объектов с повышением чувствительности, скорости и эффективности обнаружения клеток возбудителей инфекционных заболеваний.