Передача гена устойчивости к имидазолиноновым гербицидам в селекционный материал подсолнечника во ВНИИМК

Я. Н. Демурин,

доктор биологичкских наук

А. А. Перстенёва,

научный сотрудник ГНУ ВНИИ масличных культур

ПЕРЕДАЧА ГЕНА УСТОЙЧИВОСТИ К ИМИДАЗОЛИНОНОВЫМ ГЕРБИЦИДАМ В СЕЛЕКЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ ПОДСОЛНЕЧНИКА ВО ВНИИМК

УДК 633.854.78:575

В последние годы большой интерес в борьбе с сорной растительностью в фитоагроценозах представляет новая группа послевсходовых системных гербицидов - имидазолинонов. Эти гербициды поглощаются корнями и листьями растений, прекращая их рост уже через несколько часов, что приводит к гибели организма в течение 2-4 недель в зависимости от вида сорняка и его размеров [1]. Одновременно с созданием новых экологически приемлемых гербицидов, ведущие селекционные компании мира работают над повышением устойчивости культурных растений к гербицидам.

В 2002 г. фирмой BASF запатентованы способ получения устойчивых к имидазолинонам растений и новая устойчивая линия пшеницы. Эти результаты получены с помощью метода генной инженерии. Было доказано, что устойчивость к действию гербицида достигается точковой мутацией в одном кодоне, вследствие чего в белковой молекуле фермента аце-толактатсинтазы аминокислота аспарагин меняется на серин, например, для кукурузы в позиции 621 [5]. Следует отметить, что фермент ацетогидроксикислая синтаза (AHAS) или ацетолактатсинтаза (ALS) присутствует у многих организмов и катализирует биосинтез аминокислот с разветвленной боковой цепью - валина, лейцина и изолейцина. Имидазолиноновые гербициды, воздействуя на ALS неустойчивого растения, ингибируют биосинтез этих аминокислот на начальных стадиях, что вызывает гибель организма.

До настоящего времени подсолнечник, устойчивый к имидазолинонам, методом трансгеноза не получен.

В 1996 г. в штате Канзас, США, на поле, обрабатываемом в течение семи лет имазетапиром, в популяции дикорастущего подсолнечника Helianthus annuus L. были впервые обнаружены устойчивые к имидазолинонам растения. В 1997 г. исследовали образцы дикорастущего подсолнечника, собранные с 14 полей сои, одного поля кукурузы и 11 популяций вдоль автомобильных дорог в радиусе 20 км от исходного поля. Двадцать популяций из 26 содержали около 1 % устойчивых растений [3].

Частота встречаемости полностью резистентных к имазетапиру растений в исходной популяции дикорастущего H. annuus L. составила 9 % при обработке гербицидом в дозе 15Х [4] и, по другим данным, 27 % при дозе 2Х [2]. Данная популяция в дальней-

шем использовалась в качестве источника устойчивости к имидазолиноновым гербицидам. Этот признак был перенесён путём скрещивания устойчивых растений дикорастущего подсолнечника c культурными формами в гербицидоустойчивые линии НА425 и RHA426.

Bruniard J.M. и J.F. Miller в 2001 г. изучили наследование устойчивости к гербициду имазетапир у подсолнечника. Оценка F2 и анализирующего скрещивания показала, что устойчивость контролируется двумя генами, один из которых имеет полудоминантный тип наследования (Imr¡), а другой является геном-модификатором (Imr2). Полная устойчивость подсолнечника, по мнению американских учёных, может быть достигнута только в доминантной гомозиготе (Imr¡Imr¡ Imr2Imr2) по двум генам устойчивости в инбредных линиях или гибридах.

Молекулярно-генетическое изучение гербицидо-устойчивости у подсолнечника показало наличие замены C на T в кодоне 205 гена AHAS1. Эта Ala205Val мутация приводит к устойчивости ALS фермента по отношению к имидазолинонам [7].

Alonso L. C. с сотрудниками в 1998 г. обнаружили факт гибели заразихи на корнях гербицидоустойчи-вого подсолнечника после обработки гербицидом растений на стадии 3-х пар листьев в вегетационном опыте при искусственном внесении семян заразихи в почву. Этот факт объясняется тем, что имидазолино-ны (имазетапир и имазамокс), являясь гербицидами системного действия, проникают через поверхность листьев по флоэме к корням растения-хозяина и уничтожают заразиху. При этом растение-хозяин -гербицидоустойчивый подсолнечник, не страдает от воздействия имидазолинона. Ценность этого химического метода может заключаться в борьбе с новыми агрессивными расами заразихи [2].

В сильно инфицированных заразихой расы F районах Испании было проведено полевое испытание четырех гербицидоустойчивых гибридов подсолнечника. В результате наблюдали снижение поражаемо-сти растений заразихой при их обработке имазамоксом на стадии 3-х и 9-ти пар листьев. При этом урожай семян увеличился на 15 % по отношению к пораженным участкам [6].

Один из первых межлинейных ИМИ-устойчивых гибридов подсолнечника Rimisol был создан в 2002 г. в Институте полевых и овощных культур,

г. Нови Сад, Сербия. Разрабатываемая в настоящее время фирмой BASF агротехнология выращивания подсолнечника CLEARFIELD включает два компонента: ИМИ-устойчивый гибрид и имидазолиноно-вый гербицид EuroLightning (имазапир + имазамокс).

Таким образом, спонтанная устойчивость к ими-дазолиноновым гербицидам, найденная в популяции дикорастущего подсолнечника, открывает новую возможность борьбы селекционно-генетическими методами с распространением таких опасных сорняков, как заразиха, амброзия и осот. В связи с этим, перед нами возникла цель введения гена (генов), контролирующего гербицидоустойчивость, в селекционный материал подсолнечника ВНИИМК. В задачи исследования были включены: оценка гербицидоустойчивости как подсолнечника, так и заразихи; гибридизация и изучение наследования этого признака; создание константных ИМИ-устойчивых линий при самоопылении и отборе.

Материал и методы. Исследования проводились на ЦЭБ ВНИИМК, г. Краснодар в 2003-2007 гг. В работе использовались сорт, линии и образцы подсолнечника различного происхождения. Гербицидо-устойчивые линии подсолнечника HA425 и RHA426 получены из коллекции Департамента сельского хозяйства, г. Фарго, США. Использованы также сорт Юбилейный 60, селекционные линии ВНИИМК (ВК276, ВК464, ВК508, ВК541, ВК585, ВК653, ВК876, ВА2, ВА93, ВА317, ВА325), линии генетической коллекции ВНИИМК (ЛГ26, ЛГ27, ЛГ28), линии ВИР (ВИР721, К235, К824, К1787, К3353), линия из Франции (RIL100), линии из США (HA413, RHA416), образцы из Сербии (SURES-B, SURES-R). Кроме того, изучены образцы семян, собранных с четырех сорных растений подсолнечника на соевом поле в 2005 г. при его обработке пульсаром в дозе 1 л/га (корзинки от свободного цветения). Всего изучен 31 образец.

В опытах 2003-2004 гг. использовались водные растворы гербицида пивот (д.в. имазетапир), а в 2005-2007 гг. - гербицида пульсар (д.в. имазамокс) в дозе 6 мл/л или 2Х, что соответствует около 1 л/га. Растения опрыскивали ручным пульверизатором в фазе 3-х пар настоящих листьев (V6).

Опыт по оценке влияния имидазолинонов на поражение заразихи на растениях подсолнечника проводился в камере фитотрона с 16 марта по 20 апреля 2006 г. Использовались светильники Фотос.4 с лампами ДРИ-2000-6, обеспечивающие освещенность 25 килолюкс при 16-часовом световом дне и дневной температуре воздуха около 27-30 оС. В короб с поч-венно-песчаной смесью (2:1) высевались семена неустойчивых к заразихе линий - селекционной ВК508 и гербицидоустойчивой RHA426. Почва в коробе была искусственно инфицирована смесью семян заразихи (сбор в Краснодарском и Ставропольском краях, Ростовской области в 2004 г.), любезно предоставленных отделом селекции сортов подсолнечника, из расчёта 5 г семян заразихи на 10 кг почвы.

На стадии 3 -х пар настоящих листьев гербицидом

пульсар было обработано по 20 растений линии ВК508 и линии RHA426. Кроме того, 20 растений последней линии не обрабатывались (контроль). Концентрация гербицида составила 3 мл/л, т. е. IX дозировка. Через 10 дней была произведена оценка влияния гербицида на растения, после чего растения были выкопаны для подсчёта клубеньков заразихи на корнях, а также оценки размера клубеньков и их морфологического состояния после воздействия гербицида.

Клубеньки на корнях растений были классифицированы как жёлтые (жк) - жизнеспособные клубеньки; потемневшие (пк) - клубеньки заразихи, остановившиеся в развитии, с начальными стадиями некроза тканей; некротические клубеньки (нк) - погибшие клубеньки тёмного цвета.

Результаты и обсуждение. Все растения 29 изученных генотипов, в среднем, по 20 растений на образец, погибли после обработки имидазолинонами в полевых условиях. Линии HA425 и RHA426 подтвердили уникальный гербицидоустойчивый фенотип, известный из литературных источников.

Отсутствие гербицидоустойчивых растений подсолнечника в потомстве особей, выживших после использования пульсара на соевом поле, объясняется, вероятно, отсутствием их контакта с гербицидом из-за прикрытия листьями сои в момент обработки относительно позже взошедшей «падалицы» подсолнечника.

Семена Fl получены летом 2003 г. в следующих комбинациях скрещиваний: НА425 устойчи-

вость) х ВК876 (01, рИ1, рН2) и RHA426 (шь устойчивость) х ВК508 (01). В камере фитотрона зимой 2003-2004 гг. получены семена F2.

Летом 2004 г. в поле были одновременно выращены и обработаны гербицидом растения P, F1 и F2. Изучение наследования гербицидоустойчивости показало неполное доминирование этого признака у гибридов первого поколения, выражающееся в уменьшении высоты гетерозиготных растений на 62 и 40 см по двум комбинациям скрещивания соответственно (табл. 1). При этом уменьшения числа листьев не наблюдалось.

Таблица 1 - Высота растений родительских линий и гибридов Г2 при обработке гербицидом пивот

ЦЭБ ВНИИМК, 2004 г.

Генотип Высота растений, см Число листьев, шт.

обработка контроль обработка контроль

НА425 102 98 - -

НСР05=11

RHA426 136 | 136 - -

НСР05=18

HA425 х ВК876 114 176 34 33

НСР05=7 НСР05=4

RHA426 х ВК508 164 204 29 30

НСР05=11 НСР05=2

В популяции гибридов второго поколения в обоих случаях обнаружено расщепление по моногенной

схеме - 3 устойчивых : 1 погибший. Для скрещивания ИЛ425 х ВК876 фактическое отношение составило 98:32 (х2з1= 0,01) и для ИИЛ426 х ВК508 -54:18 (х2 3:1= 0). Появление в популяции Б2 в пределах фенотипического класса «устойчивый» угнетенных в различной степени растений, возможно, указывает, наряду с неполным доминированием, на наличие генов-модификаторов (рис. 1). Для дальнейшей работы получено (11Р2).

С

Рисунок 1 - Фенотипические классы по гербицидо-устойчивости через 10 дней после обработки пиво-том

(А - полностью устойчивый; В - промежуточный;

С - восприимчивый)

Пять популяций гибридов F3 скрещивания ИЛ425 х ВК876 состояли только из устойчивых растений, 20

тогда как в семи популяциях F3 наблюдалось расщепление 3:1, что также согласуется с моногенной схемой наследования (табл. 2).

Таблица 2 - Наследование гербицидоустойчивости в скрещивании НА425 х ВК876

ЦЭБ ВНИИМК, 2005 г.

Поколение, Число растений, шт. X2 3:1

популяция устойчивых погибших

ИЛ425 ? 20 0 -

ВК876 3 0 14 -

19 0 -

^2 98 32 0,01

Б3, №1 24 0 -

2 16 6 0,06

3 23 0 -

4 27 0 -

5 19 4 0,40

6 22 0 -

7 20 3 1,75

8 12 3 0,20

9 19 6 0,01

10 20 5 0,33

11 21 5 0,46

12 20 0 -

Дальнейшее самоопыление и отбор устойчивых растений позволили создать 44 константные по гер-бицидоустойчивости линии Б5: 22 закрепителей стерильности и 22 - восстановителей фертильности (табл. 3 и 4). Важно, что эти линии после обработки растений гербицидом показывают при самоопылении высокий уровень фертильности.

Таблица 3 - Гербицидоустойчивые константные

В-линии подсолнечника (Г5 НА425 х ВК876) после обработки пульсаром

ЦЭБ ВНИИМК, 2007 г.

Линия Период всходы-цветение, дни Высота растения, см Число семянок в самоопыленной корзинке, шт.

Ими-В1 54 58 37

Ими-В2 53 71 135

Ими-В3 56 70 112

Ими-В4 52 66 134

Ими-В5 52 87 346

Ими-В6 52 70 274

Ими-В7 56 62 84

Ими-В8 52 62 56

Ими-В9 52 57 183

Ими-В10 56 56 137

Ими-В 11 56 81 307

Ими-В12 56 81 692

Ими-В13 64 88 259

Ими-В14 63 98 405

Ими-В15 50 88 351

Ими-В16 69 71 479

Ими-В17 56 85 271

Ими-В18 64 99 646

Ими-В19 56 58 270

Ими-В20 56 87 60

Ими-В21 56 84 42

Ими-В22 69 120 470

Среднее 57 77 261

Таблица 4 - Гербицидоустойчивые константные Я-линии подсолнечника (Г5 ЯИЛ426 х ВК508) после обработки пульсаром

ЦЭБ ВНИИМК, 2007 г.

Линия Период всходы-цветение, дни Высота растения, см Число семянок в самоопыленной корзинке, шт.

Ими-Ш 62 103 239

Ими-Я2 64 120 35

Ими-ИЗ 57 126 326

Ими-Я4 58 131 521

Ими-И5 59 112 169

Ими-Иб 56 110 184

Ими-Я7 52 84 107

Ими-Я8 56 117 323

Ими-Я9 57 134 401

Ими-Я10 57 120 335

Ими-Я11 65 111 136

Ими-Я12 56 118 238

Ими-Я13 59 125 362

Ими-Я14 62 109 198

Ими-Я15 60 116 291

Ими-Шб 56 107 172

Ими-Я17 57 102 226

Ими-Я18 56 116 186

Ими-Я19 60 124 311

Ими-Я20 57 132 349

Ими-Я21 58 126 399

Ими-Я22 56 103 132

Среднее 59 116 256

Измерение высоты растений в опыте по изучению влияния гербицида на заразиху показало, что обработанная линия ВК508 (погибшие растения) в среднем была на 6,9 см ниже, чем линия RHA426. Это объясняется влиянием гербицида на восприимчивую линию ВК508, рост которой остановился после обработки растений пульсаром на 3-й паре листьев. Растения гербицидоустойчивой линии RHA426, напротив, продолжили рост (табл. 5).

Таблица 5 - Влияние гербицида пульсар на поражение заразихой подсолнечника

ЦЭБ ВНИИМК, 2006 г.

Линия Высота растения, см Количество клубеньков заразихи, шт./растение

общее жк пк нк

ВК 508 обработанная 10,2 4,0 0,3 1,1 2,6

ЯНА 426 обработанная 17,1 11,0 4,0 6,3 0,7

ЯНА 426 не обработанная 17,1 13,0 12,7 0,3 0,0

Примечание: жк - жёлтые клубеньки, пк - потемневшие клубеньки, нк - некротические клубеньки.

Наибольшее число клубеньков заразихи на корнях имела необработанная линия RHA426, в среднем, 13 штук на растение. Наличие клубеньков на погибших от гербицида растениях линии ВК508, по-видимому, связано с внедрением заразихи на более ранних стадиях развития растения, т. е. до обработки пульсаром.

Наибольшее количество жёлтых жизнеспособных клубеньков наблюдалось на необработанной линии

RHA426, причём полностью отсутствовали погибшие клубеньки. Наибольшее количество потемневших и некротических клубеньков отмечено у обработанной гербицидом линии RHA426 (рис. 2).

Рисунок 2 - Влияние гербицида пульсар на заразиху у линии RHA426

Измерение величины клубеньков показало, что наибольший размер (до 9 мм) имели жизнеспособные клубеньки на корнях необработанной линии ИИЛ426 (табл. 6). Некротические клубеньки на обработанной линии КИЛ426 были меньшего размера (до 4 мм).

Таблица 6 - Размер и общее число клубеньков заразихи на корнях растений линий подсолнечника

_ЦЭБ ВНИИМК, 2007 г.

Линия, обработка Средняя величина клубеньков, мм Общее число клубеньков, шт.

жк пк нк жк пк нк

ВК 580 обработанная 0,8 0,9 0,7 7 22 53

RHA 426 обработанная 0,6 1,2 1,7 80 127 14

RHA 426 не обработанная 1,9 1,0 0,0 254 6 0

Примечание: жк - жёлтые клубеньки, пк - потемневшие клубеньки, нк - некротические клубеньки.

Заключение. В генофонде 29 образцов культурного подсолнечника не обнаружено признака устойчивости к имидазолиноновым гербицидам. Американские линии ИЛ425 и ИИЛ426 подтвердили гер-бицидоустойчивый фенотип, который контролировался одним геном с неполным доминированием. На основе соответствующего скрещивания этих доноров с селекционными линиями ВНИИМК ВК876 и ВК508 с последующим самоопылением и отбором устойчивых растений создан новый селекционный материал в виде 44 константных линий Б5. В лабораторных условиях установлен факт гибели заразихи при обработке гербицидом пульсар генетически восприимчивых к заразихе гербицидоустойчивых растений подсолнечника линии КИЛ426. Этот факт позволит использовать химический метод борьбы с новыми расами цветкового паразита на время, необ-

ходимое для селекционного создания устойчивых сортов и гибридов подсолнечника.

Благодарности. Авторы выражают признательность Дж. Миллеру из Департамента сельского хозяйства США, г. Фарго за семена линий подсолнечника HA425 и RHA426, а также С. Г. Бородину, заведующему отделом селекции сортов подсолнечника ВНИИМК, за семена заразихи.

Литература

1. Захаренко В. А. Гербициды. - М.: ВО "Агро-промиздат", 1990. - 415 с.

2. Alonso L. C., Rodrigues-Ojeda M. I., Fernandez-Escobar. Chemical control of broomrape in sunflower resistant to imazethapyr herbicide // Helia. - 1998. - V. 21. - P. 45-54.

3. Baumgartner J. R., Al-Khatib K., Currie R.S. Survey of Common Sunflower (Helianthus annuus) Resistanse to Imazethapyr and Chlorimuron in Northeast Kansas // Weed Technology. - 1999. - V.13. - P. 510514.

4. Bruniard J. M., Miller J. F. Inharitance of imida-zolinone-herbicide resistance in sunflower // Helia. -2001. - V. 24. - P. 11-16.

5. US 6,444,875 B1. (G.E. Dietrich, R. Hill). Imida-zolinone resistant AHAS mutants. - 2002.

6. Dominguez J., Alvarado J., Espinosa J. L., Falcon M., Mateos A., Navarro F. Use of sunflower cultivars with resistance to imidazolinone herbicides to control broomrape (Orobanche cumana) infection // Proc. 16th International Sunflower Conference. - 2004. - V.1. -P.181-186.

7. Kolkman J. V., Slabaugh M. B., Bruniard J. M., Berry S., Bushman B. S., Olungu C., Maes N., Abratti G., Zambelli A., Miller J.F., Leon A., Knapp S. J. Aceto-hydroxyacid synthase mutations conferring resistance to imidazolinone or sulfonylurea herbicides in sunflower // Theor. Appl. Genet. - 2004. - V.109. - P.1147-1159.