ПЕРСПЕКТИВА СОЗДАНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОТИВОГРИППОЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК

ОБЗОРЫ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020

Перспектива создания специфических противогриппозных препаратов на основе синтетических малых интерферирующих РНК

Пашков Е.А.1, 2, Файзулоев Е.Б.2, Свитич О.АЛ 2, Сергеев О.В.1 3, Зверев В.В.1 2

1 ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), 119991, Москва, Россия;

2 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» Минздрава России, 105064, Москва, Россия;

3 ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, 123098, Москва, Россия

Грипп является одной из самых актуальных проблем здравоохранения во всём мире. Ежегодно гриппом болеют до 15% населения земли, из них около 500 тыс. человек умирают. Особую клиническую значимость представляют вирусы гриппа А и В, имеющие высокий эпидемический и пандемический потенциал. Помимо поражения дыхательных путей, грипп способен вызвать осложнения со стороны сердечно-сосудистой и центральной нервной системы. Несмотря на широкий спектр специфически направленных на различные стадии вирусной репродукции противогриппозных препаратов, наиболее остро стоит проблема формирования вирусной резистентности к традиционным лекарственным препаратам, что требует поиска новых технологий для её преодоления. Перспективным представляется создание лекарственных препаратов, действие которых основано на ингибировании активности вирусных или клеточных генов под влиянием механизмов РНК-интерференции. РНК-интерференция - это каскад регуляторных реакций в эукариотических клетках, вызванный чужеродной экзогенной двухцепочечной РНК, в результате чего происходит расщепление целевой матричной РНК. В настоящем обзоре рассматриваются использование механизма РНК-интерференции при разработке специфически направленных противогриппозных средств, а также перспективы, преимущества и недостатки данного подхода. Необходимо учитывать, что важным фактором, снижающим эффективность РНК-интерференции, является формирование резистентности вирусов к действию малых интерферирующих РНК, направленных к вирусным генам. Ввиду этого для преодоления лекарственной устойчивости вируса гриппа наиболее пристального внимания заслуживает исследование применения малых интерферирующих РНК, направленных непосредственно к факторам клетки-хозяина, которые необходимы для репродукции вируса гриппа.

Ключевые слова: грипп; РНК-интерференция; малые интерферирующие РНК; лекарственная резистентность; вирусы гриппа А и В; нокдаун гена.

Для цитирования: Пашков Е.А., Файзулоев Е.Б., Свитич О.А., Сергеев О.В., Зверев В.В. Перспектива создания специфических противогриппозных препаратов на основе синтетических малых интерферирующих РНК. Вопросы вирусологии. 2020; 65(4): 182-190. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-4-182-190 Для корреспонденции: Пашков Евгений Алексеевич, мл. науч. сотр. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», 105064, Москва, Россия. E-mail: pashckov.j@yandex.ru

Участие авторов: Пашков Е.А., Файзулоев Е.Б. - сбор и обработка материалов ; Зверев В.В., Сергеев О.В, Свитич О.А. - написание текста, заключение; Сергеев О.В., Свитич О.А. - научное редактирование; Зверев В.В. -резюме, общая редакция.

Финансирование. Авторы благодарят «Сеченовский Университет» за финансирование в рамках проекта «Университетский грант - 2020».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Поступила 29.07.2020 Принята в печать 04.08.2020

REVIEWS

The potential of synthetic small interfering RNA-based antiviral drugs for influenza treatment

Evgeny A. Pashkov1, 2, Evgeny B. Faizuloev 2 , Oxana A. Svitich1, 2, Oleg V. Sergeev 1 3, Vitaliy V. Zverev 1 2

1 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, 119991, Russia;

2 I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera, Moscow, 105064, Russia;

3 National Research Centre for Epidemiology and Microbiology named after the honorary academician N.F. Gamaleya, Moscow, 123098, Russia

Influenza is a worldwide public health problem. Annually, this infection affects up to 15% of the world population; and about half a million people die from this disease every year. Moreover, influenza A and B viruses tend to garner most of the attention, as these types are a major cause of the epidemics and pandemics. Although the influenza virus primarily affects the respiratory tract, it may also affect the cardiovascular and central nervous systems. Several antiviral drugs, that target various stages of viral reproduction, have been considered effective for the treatment and prevention of influenza, but some virus strains become resistant to these medications. Thus, new strategies and techniques should be developed to overcome the antiviral drug resistance. Recent studies suggest that new drugs based on RNA interference (RNAi) appear to be a promising therapeutic approach that regulates the activity of viral or cellular genes. As it is known, the RNAi is a eukaryotic gene regulatory mechanism that can be triggered by a foreign double-stranded RNA (dsRNA) and results in the cleavage of the target messenger RNA (mRNA). This review discusses the prospects, advantages, and disadvantages of using RNAi in carrying out a specific treatment for influenza infection. However, some viruses confer resistance to small interfering RNAs (siRNA) targeting viral genes. This problem can significantly reduce the effectiveness of RNAi. Therefore, applying siRNAs targeting host cell factors required for influenza virus reproduction can be a way to overcome the antiviral drug resistance.

Keywords: influenza; RNA-interference; small interfering RNA; drug resistance; influenza virus А and В; gene knockdown.

For citation: Pashkov E.A., Faizuloev E.B., Svitich O.A., Sergeev O.V., Zverev V.V. The potential of synthetic small interfering RNA-based antiviral drugs for influenza treatment. Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2020; 65(4): 182-190. (In Russ.).

DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-2020-65-4-182-190

For correspondence: Evgeniy A. Pashkov, junior researcher of I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines

and Sera, Moscow, 105064, Russia. E-mail: pashckov.j@yandex.ru

Information about the authors:

Pashkov E.A., https://orcid.org/0000-0002-5682-4581

Faizuloev E. B., https://orcid.org/0000-0001-7385-5083

Svitich O.A., https://orcid.org/0000-0003-1757-8389

Zverev V.V., https://orcid.org/0000-0002-0017-1892

Sergeev O.V., https://orcid.org/0000-0003-3407-2224

Contribution: Pashkov E.A., Fayzuloev E.B. - collection and processing of materials; Zverev V.V., Sergeev O.V. -writing a text, conclusion; Fayzuloev E.B., Svitich O.A. - scientific editing; Zverev V.V. - resume, general edition. Acknowledgments. The authors are grateful to I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University) for financing within the framework of the University Grant 2020 project.

Conflict of interests. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Received 27 July 2020 Accepted 04 August 2020

Грипп является одной из самых актуальных проблем мирового здравоохранения. Ежегодно гриппом болеют до 15% населения земли, из них около 500 тыс. человек умирают [1]. Вирус гриппа поражает дыхательные пути человека, но осложнения гриппа могут затронуть не только респираторную, но и сердечно-сосудистую, и центральную нервную систему [2-4]. Особую клиническую значимость представляют вирусы рода Alphainfluenzavirus (Influenza A virus, вирус гриппа А, ВГА) и Betainfluenzavirus (Influenza B virus, вирус гриппа В, ВГВ), принадлежащие к семейству Orthomyxoviridae (https://talk.ictvonline.org/ taxonomy/), поскольку они являются причиной тяжёлых заболеваний и имеют высокий эпидемический и пандемический потенциал [5].

Терапия гриппа проблематична, поскольку вирус, в силу присущей ему высокой изменчивости, способен быстро вырабатывать резистентность к специфическим противогриппозным препаратам. Альтернативным перспективным подходом к созданию противогриппозных препаратов является использование специфических малых интерферирующих РНК (миРНК), которые могут быть нацелены на вирусные гены, либо на мРНК клеточных генов, важных для репродукции вирусов гриппа.

Цель данного обзора - оценка перспектив применения метода РНК-интерференции при разработке специфических противогриппозных препаратов.

Для лечения гриппа применяется широкий спектр этиотропных, патогенетических, симптоматических

и специфических препаратов. Особый интерес представляют специфические препараты, направленные на подавление репродукции вируса гриппа и разрешённые для клинического применения.

Производные адамантана (амантадин и ремантадин). В результате действия препаратов этого ряда эндосома, содержащая вирус гриппа, не сливается с оболочкой вируса и выход вирусного рибонуклеопро-теина из неё вследствие блокировки ионного канала, сформированного белком М2, не происходит. Однако ионный канал, формируемый белком М2, у вируса гриппа В выстлан полярными аминокислотами, соответственно применение препаратов адамантано-вого ряда в отношении ВГВ неоправданно, поскольку присутствие полярных (гидрофильных) остатков аминокислот уменьшает эффект гидрофобного препарата - адамантана [6]. Недостатком этих препаратов является то, что практически все циркулирующие в настоящее время штаммы вирусов гриппа приобрели устойчивость к ним. Если у циркулировавших до 2004 г. ВГА наблюдалась резистентность менее 1%, то с 2004 по 2016 г. в Австралии, Азии, Европе и США у таких штаммов, как A/California/07/2009 (H1N1), A/Texas/04/2009 (H1N1), A/Denmark/524/2009 (H1N1), A/Denmark/528/2009 (H1N1) и A/WSN/33 (H1N1) была выявлена более чем 95%-ная устойчивость к производным адамантана, в результате появления у них мутации S31N в гене M2 [7].

Ингибиторы нейраминидазы (озельтамивир, зана-мивир, перамивир). Препараты этого ряда подавляют проникновение вирусов в клетку путём отщепления остатков сиаловой кислоты с поверхности клеточной стенки. В разные эпидемические сезоны чувствительность штаммов ВГА и ВГВ по отношению к ним сильно различалась. Так, в сезон 2008-2009 гг. почти все циркулирующие вирусы гриппа A (H1N1) были устойчивы к озельтамивиру [8, 9]. С 2017 по 2018 г. циркулирующие вирусы гриппа A (H1N1) были восприимчивы к озельтамивиру и перамивиру на 99%, а к занамивиру - на 100% [10].

Ингибитор слияния умифеновир (Арбидол). Данный препарат блокирует слияние липидной оболочки вируса с мембранами эндосомы, что предотвращает выход вРНК из эндосомы [11]. Известно, что некоторые циркулирующие штаммы резистентны к данному препарату. Так, у реассортантов, образованных от штаммов A/Singapore/1/57 и A/chicken/Germany/27/ Weybridge, лишь на 50% снижалась репродукция при дозировке арбидола 10 мкг/мл [12].

Ингибиторы вирусных полимераз (фавипиравир и пр.). Они эффективны в отношении штаммов вируса гриппа, резистентных к препаратам адамантанового ряда и ингибиторам нейраминидазы [13]. Механизм действия фавипиравира заключается в том, что в клетке под воздействием протеаз он фосфорилируется в свою активную форму - фавипиравир-рибофурано-зил-5'-трифосфат (F-RTP), что приводит к ингибиро-ванию РНК-зависимой РНК-полимеразы, в результате чего тормозится репродукция вируса гриппа [14]. Установлено, что замена Lys229 на Arg в белке PB1 приво-

дит к формированию устойчивости в отношении фави-пиравира, что было продемонстрированно на штамме вируса гриппа A/England/195/2009 (H1N1) [15].

Таким образом, несмотря на широкий спектр специфических противогриппозных препаратов, остро стоит проблема формирования вирусной резистентности к ним [16]. Для её преодоления необходимы принципиально новые антивирусные препараты. Одна из перспективных технологий создания специфических противовирусных препаратов основана на механизме РНК-интерференции.

РНК-интерференция - это регуляторный путь эука-риотических клеток, индуцированный двухцепочеч-ной молекулой РНК [17]. Явление РНК-интерференции было открыто Э. Файром и К. Мелло в 1998 г. у нематоды Caenorhabditis elegans. Этими исследователями также были описаны основные особенности РНК-интерференции, которые доказывают, что при ней расщепляется матричная РНК (мРНК); двухце-почечная РНК (дцРНК), определяющие узнавание комплементарного участка мРНК-мишени, эффективнее, чем одноцепочечная РНК (оцРНК); для подавления экспрессии гена необходим короткий фрагмент дцРНК [18]. В 2006 г. Э. Файр и К. Мелло получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине за открытие явления РНК-интерференции - механизма сайленсинга генов при участии дцРНК.

Сущность РНК-интерференции заключается в подавлении экспрессии гена-мишени под влиянием миРНК (siRNA) [19-21]. Механизм РНК-интерференции состоит в том, что эндонуклеаза Dicer расщепляет экзогенную чужеродную дцРНК на отдельные двухцепочечные последовательности длиной от 21 до 25 пар нуклеотидов, которые и есть миРНК. Далее миРНК связывается с белковым комплексом RISC (RNA-induced silencing complex), в состав которого входит белок Ago2 из семейства Argonaute, белок PACT и белок TRBP, который распознает и расщепляет мРНК-мишень [22, 23].

Создание лекарственных препаратов, действие которых основано на ингибировании активности целевых генов путём РНК-интерференции, представляется перспективным направлением, эффективность которого исследуется в отношении широкого спектра заболеваний различной этиологии, в том числе инфекционных. На данный момент разработаны и проходят стадии клинических испытаний такие препараты, как Miravirsen (против гепатита С), ARC-520 и ARC-521 (против гепатита В), ALN-RSV01 (против респиратор-но-синцитиальной вирусной инфекции), pHIV7-shI-TAR-CCR5RZ (против ВИЧ-инфекции) [22, 24-26].

Традиционный подход к разработке противовирусных препаратов - дизайн миРНК, мишенью которых является вирусный геном. Метод РНК-интерференции был успешно испытан в одной из ранних работ Q. Ge и соавт. на двух модельных штаммах вируса гриппа: A/PR/8/34 (PR8) и A/WSN/33 (WSN) на разных клеточных культурах (Vero и MDCK). Были подобраны и исследованы около 20 миРНК, но наибольший эффект показали те, которые были направлены к мРНК вирусных

REVIEWS

белков NP и PA. При наличии в клетке миРНК, специфичных к последовательностям мРНК белков NP и PA, приостанавливался синтез этих белков, что приводило к подавлению репродукции вируса, так как прекращались репликация и транскрипция вирусного генома [27].

В дальнейшем эти авторы исследовали эффективность данного подхода на модели in vivo. Исследование проводили с использованием штамма вируса гриппа A/PR/8/34 (H1N1) на мышах. Вводили смесь, содержащую миРНК, путём эндотрахеального аэрозольного распыления. Были выбраны миРНК к генам NP, PA и PB1. В работе было показано, что использование миРНК как в терапевтических, так и в профилактических целях способно снижать репродукцию ВГА у мышей в эпителиальных клетках дыхательных путей. Доказан дозозависимый эффект препарата миРНК: при введении мышам 60 мкг миРНК к мРНК последовательности вирусного белка NP титр вируса в лёгких снижался на один порядок, тогда как при введении 120 мкг той же миРНК - в 1000 раз [28].

Успешное использование миРНК, направленных к вирусному геному, было показано в работе W. Zhiqiang и соавт. [29]. Авторы провели выравнивание последовательностей 8 сегментов РНК вируса гриппа A/Beijing/01/2009 (H1N1) и выбрали для конструирования миРНК наиболее консервативные области генов. Эффективность синтезированных миРНК оценивали по экспрессии вирусных генов при полиме-разной цепной реакции (ПЦР) и с помощью титрования по цитопатическому действию. За 6 ч до инфицирования клеток А549 вирусом гриппа с множественностью заражения (MOI), равной 0,001, авторы проводили на них трансфекцию выбранными миРНК. Из 35 созданных миРНК было отобрано 10, которые снижали экспрессию целевых генов ВГА на 70% и более: PB2-912, PB1-851, PB1-1067, PB1-1789, PA-1274, NP-574, NP-571, NP-1494, M-969, M-559. Через 1 сут определяли содержание вирусной РНК (вРНК) и вирусных белков с помощью ПЦР-РВ и вестерн-блоттинга.

В работе H.Y. Sui и соавт. [30] была определена консервативная последовательность вирусного гена белка М2, подобраны миРНК и продемонстрировано пролонгированное ингибирование репродукции ВГА в культуре клеток MDCK. В исследовании использовали 2 миРНК, направленные к белку М2 и 2 миРНК, направленные к гену NP [27], в качестве положительного контроля. Клетки MDCK были трансфицированы синтетическими миРНК и через 8 ч заражены штаммом вируса гриппа A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) при MOI = 0,005. Вируссодержащую жидкость собирали через 48 ч и оценивали концентрацию вРНК методом количественной ОТ-ПЦР-РВ. Наибольший противовирусный эффект обеспечивала миРНК М-950, снижая репродукцию вируса гриппа на 80% относительно отрицательного контроля (миРНК к GFP). Кроме того, миРНК, направленные к гену белка М2, ин-гибировали репродукцию высоковирулентного A/Hong Kong/486/97 (H5N1) при MOI = 0,5 и 0,05 в 3 раза, при MOI = 0,005 - в 7 раз.

J. Piasecka и соавт. подобрали 9 миРНК (183, 412, 471, 613, 682, 901, 1008, 1090, 1312), нацеленных на различные участки последовательности мРНК 5-го сегмента вируса гриппа, которая кодирует белок NP. В работе использовали штаммы вируса гриппа A/Califomia/04/2009 (H1N1), A/PR/8/34 (H1N1) и культуры клеток MDCK. В качестве положительного контроля применяли миРНК-1496, направленную к аналогичной последовательности мРНК гена NP [27-29]. Из девяти предложенных авторами последовательностей самый высокий ин-гибирующий эффект оказали миРНК 613 и 682, при использовании которых концентрация вирусной РНК снижалась от 78 до 85% в зависимости от штамма вируса по сравнению с отрицательным контролем [31].

В табл. 1 представлены наиболее эффективные вирусные гены-мишени, подавление которых с последующим эффективным снижением репродукции вируса гриппа было подтверждено в независимых исследованиях.

Следует отметить, что метод РНК-интерференции имеет ограничения. Помимо необходимости создания эффективного и безопасного средства доставки специфической миРНК в клетки лёгких, существует риск возникновения устойчивых к действию миРНК вирусов. В процессе репродукции популяции вирусов в заражённых клетках образуются квазивиды вирусов, среди которых под селективным влиянием миРНК будут получать преимущества вируса, имеющие ну-клеотидные замены в сайте связывания с миРНК. Образование единичной мутации в последовательности РНК-мишени приводит к полной утрате эффекта РНК-интерференции [32]. Способность РНК-содер-жащих вирусов ускользать от воздействия РНК-интерференции экспериментально доказана на клеточной модели инфекции ВИЧ-1, который способен уходить от миРНК в результате появления нуклеотидных замен в генах tat, nef, int и att [33]. Кроме того, остро стоит проблема точной, безопасной и действенной доставки миРНК в клетки-мишени для вируса, поскольку миРНК - неустойчивое соединение и часто подвержена воздействию нуклеаз [34].

Альтернативным подходом к созданию противогриппозных препаратов является использование специфических миРНК, направленных к мРНК клеточных генов, важных для репродукции вирусов гриппа. Вирус гриппа способен к высокой изменчивости посредством не только мутаций и реассортаций, но и путём эпистаза, то есть благодаря парным мутациям, когда появление одной мутации ведёт к возникновению другой [35]. По мнению M. Lesch и соавт. [36], целесообразно влиять непосредственно на внутриклеточные структуры клетки-хозяина, способствующие репродукции вируса гриппа в клетке, поскольку вероятность появления альтернативного пути вирусной репродукции очень низка.

Эффективность использования миРНК, направленных на подавление клеточных факторов, была исследована в работах по полногеномному миРНК-скри-нингу с целью выявления перспективных мишеней для РНК-интерференции. В одной из первых работ

ОБЗОРЫ

R. Konig и соавт. с использованием этого подхода обнаружили 295 клеточных факторов, необходимых для ранних стадий репродукции вируса гриппа. Из них авторами было выделено 23 наиболее эффективных гена-мишени, нокдаун которых не приводил к индукции значительной цитотоксичности. Исследование проведено на клеточных линиях А549 (аденокарци-нома лёгкого человека) и штамме вируса гриппа А/ WSN/33 [37].

В другой работе А. Каг^ и соавт. [38] использовали двухэтапный подход для проведения полногеномного миРНК-скрининга. Первым шагом была транс-фекция миРНК культуры клеток А549, через 48 ч их инфицировали штаммом вируса гриппа А/WSN/33, а после окрашивали специфическими антителами к ВГА. Вторым шагом был перенос вируссодержаще-го супернатанта с А549 на репортерную культуру клеток почки эмбриона человека 293Т, стабильно транс-фицированную геном люциферазы, в которой после заражения вирусом гриппа запускается экспрессия транскриптов светляковой люциферазы, фланкированных нетранслируемым участком сегмента нуклео-протеина (ОТ) вируса гриппа A/WSN/33. Надёжность этого подхода подтвердили с помощью миРНК, направленной к мРНК вирусного белка NP, в результате чего блокировалась репродукция вируса гриппа.

В 2018 г. А. Каг^ и соавт. провели масштабный миРНК-скрининг на клеточной модели инфек-

ции ВГА и ВГВ, в том числе A/WSN/1933(H1N1), A/Panama/2007/1999 (H3N2), ВГА птиц (А/ Vietnam/1203/2004(H5N1)) и B/Thuringia/02/2006xB/ Vienna/33/2006 для определения факторов клетки-хозяина, необходимых для репродукции вирусов гриппа. На основании скрининга установлено, что нокдаун таких генов, как Nup98, Nup205, FLT4, COPA, ARCN1, COPG, NXF1, EIF3A, ATP6V0C, EIF4A3, COPB1, NME3, AP2M1, MAGI2, EIF3C, ROR2 приводит к достоверному подавлению репродукции ВГА и ВГВ. Затем в базе www.ingenuity.com искали лекарственные препараты, нацеленные на выявленные гены, необходимые для репродукции всех четырёх штаммов. В результате найдены два препарата, регорафениб и сорафениб, нацеленные на FLT4, с высокой противовирусной активностью при нетоксичных концентрациях в клетках А549. Эти препараты являются ингибиторами киназ и представляют особый интерес, поскольку ген FLT4 кодирует белок-рецептор эпидермального фактора роста (EGF), а именно рецептор тирозинкиназы. Известно, что EGF принимает активное участие в проникновении вируса гриппа в клетку [39]. Авторами было установлено, что при применении регорафениба и сорафениба внутриклеточный уровень EGF оставался неизменным из-за нарушения закисления эндосом. Далее авторы описали влияние регорафениба и сорафениба на слияние вируса гриппа с мембраной эндосомы. Они пометили вирусные частицы двумя липофильными красителя-

Таблица 1. Вирусные гены, нокдаун которых эффективно подавляет репродукцию вируса гриппа* Table 1. The inhibition of influenza virus reproduction using knockdown of virus genes*

Ген вируса гриппа А Функция гена Ссылка

Gene of influenza A virus Gene function References

NP Инкапсидация вирусного генома для осуществления транс- [27]A

крипции, репликации и упаковки вирусной РНК [27]A

Viral genome encapsidation required for subsequent replication, [28]**B

transcription, and packaging of the viral RNA [28]**B

[29]C

[29]C

[31]D

[31]D

PA Участие в процессе вирусной транскрипции [27]A

Participation in the process of viral transcription [27] A

PB1 Содержит SDD-последовательность, характерную [28]**B

для вирусных полимераз [28]**B

Contains SDD sequence characteristic of viral polymerases [29]C

[29]C

PB2 Распознавание «сар» на клеточных мРНК [27]A

Recognition of «cap» on cellular mRNA [27] A

[29]C

[29]C

М2 Стабилизация вирусной оболочки, формирование ионных [27]A

каналов [27]A

Viral envelope stabilization [30]E

formation of ion channels [30]E

Примечание. * Приведены вирусные гены-мишени для миРНК, нокдаун которых приводил к достоверному снижению вирусной репродукции в независимых исследованиях; ** в исследовании была использована модель животных; штаммы, использованные при проведении исследования: A - A/PR/8/34 (PR8), A/WSN/33 (WSN) subtypes H1N1; B - A/PR/8/34 (PR8) - в работе использовали животную модель; C - A/Bei-jing/01/2009 (H1N1); D - A/California/04/2009 (H1N1), A/PR/8/34 (H1N1); E - A/New Caledonia/ 20/1999 (H1N1), A/Hong Kong/486/97 (H5N1).

Note. * Findings from independent studies revealed that specific knockdown of miRNA-targeted virus genes resulted in the inhibition of viral reproduction; ** an animal model was used in the research. Virus strains used in the study: A - A/PR/8/34 (PR8), A/WSN/33 (WSN) subtypes H1N1; B - A/PR/8/34 (PR8); C - A/Beijing/01/2009 (H1N1); D - A/California/04/2009 (H1N1), A/PR/8/34 (H1N1); E - A/New Caledonia/ 20/1999 (H1N1), A/Hong Kong/486/97 (H5N1).

REVIEWS

ми, красным Dil и зелёным DiOC18, которые генерировали между собой Фёрстеровский перенос энергии. Интактные меченые вирионы становились красными, когда происходил перенос энергии от DiOC18 к Dil, в то время как сдвиг в сторону зелёного DiOC18 свидетельствовал о том, что мембраны вируса и эндосомы сливаются и происходит рассеивание хромофоров, что уменьшает Фёрстеровский перенос энергии. Таким образом, авторами было доказано, что нарушаются процессы, необходимые для слияния. A. Karlas и соавт. также сравнили профилактическую (за 2 ч до заражения) и терапевтическую (через 4 ч после заражения) эффективность обоих препаратов. При профилактическом подходе эти препараты никак не влияли на репродукцию вируса гриппа. При терапевтическом применении сорафениба вирусная нагрузка снижалась в 109 раз. В супернатанте клеток, обработанных рего-рафенибом, вирус не обнаруживался. Данная работа показывает, что внутриклеточный процесс, строго необходимый для репродукции всех штаммов вирусов гриппа, - это нуклеоцитоплазматический транспорт. Следовательно, агенты, блокирующие нуклеоцито-плазматический транспорт, представляют собой пер-

спективных кандидатов для терапии гриппа, направленной на факторы хозяина. Авторами также изучена возможная эффективность подхода для вирусов других штаммов ВГА и ВГВ. Были протестированы шесть человеческих штаммов ВГА (A/WSN/33 (H1N1), А/ Puerto Rico (H1N1), A/Hamburg/04/2009 (H1N1), A/Victoria/3/1975 (H3N2), A/Panama/2007/1999 (H3N2), A/England/691/2010/ (H3N2)), три птичьих штамма (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1), A/FPV/Bratislava/1979 (H7N7), A/Mallard/Germany/439/2004 (H3N2)) и два штамма ВГВ (B/Thuringia/02/2006xB/Vienna/33/2006, B/Brisbane/60/2008). Сорафениб был активен в отношении всех штаммов, в то время как регорафениб не показал значительного влияния на репродукцию птичьих штаммов. По мнению авторов, данный результат связан с различием в кислотной стабильности гемагглютинина птичьих и человеческих штаммов. При меньшей стабильности гемагглютинина нужны более высокие значения pH для слияния и образования эндосомы. Особый интерес представляет тот факт, что регорафениб и сорафениб влияют ещё и на вирусы, которые находятся в отдалённых друг от друга филогенетических группах, такие как хантавирусы, вирусы

Таблица 2. Клеточные гены, нокдаун которых эффективно подавляет репродукцию вируса гриппа в культуре клеток* Table 2. The inhibition of influenza virus reproduction in cell culture using knockdown of cellular genes*

Клеточные гены (группы генов) Функция гена Стадия репродукции вируса гриппа Ссылка

Cellular gene (group of genes) Gene function Stage of influenza virus reproduction References

ATP6AP1 Участие в работе клеточных АТФаз Закисление эндосомы для последу- [40]A

Regulation of cellular ATPase activity ющего выхода вирусной РНК [40]A

Endosome acidification and subse- [37]B

quent release of viral RNA [37]B

COPA ARCNI Транспорт белка от эндоплазматической Участие в процессе эндоцитоза [38]C

сети к аппарату Гольджи, раннее созревание Regulation of endocytosis [38]C

эндосомы [40]A

Protein translocation from the endoplasmic [40]A

reticulum to the Golgi apparatus.

Early endosome maturation

Nup98 Участие в работе ядерно-порового комплекса Импорт и экспорт в РНК из нукле- [36]D

Control of the nuclear pore complex functions оплазмы [36]D

Import and export of viral RNA [38]C

through the nucleoplasm [38]C

[40]A

[40]A

NXF1 Участие в работе ядерно-порового комплекса, Импорт и экспорт вРНК из нукле- [36]D

регуляция сигналов ядерного экспорта оплазмы [36]D

Control of the nuclear pore complex functions Import and export of viral RNA [40]A

regulation of nuclear export signals through the nucleoplasm [40]A

ATP6V0D Участие в работе клеточных АТФаз и в закис- Закисление эндосомы для последу-

лении внутренней среды эндосомы ющего выхода вРНК

Regulation of cellular ATPase activity Endosome acidification and subse-

the decrease in internal pH of endosomes quent release of viral RNA

Примечание. * Приведены клеточные гены-мишени для миРНК, нокдаун которых приводил к достоверному снижению вирусной репродукции в независимых исследованиях.

Штаммы, использованные в исследовании: A - A/WSN/1933 (H1N1), A/New-Jersey/8/1976/ (H1N1), A/Netherlands/2629/2009 (H1N1), A/ Hong Kong/8/68 (H3N2), A/Nanchang/933/1995 (H3N2), A/Brisbane/10/2007 (H3N2), A/WSN/15/2009 (H3N2), A/NWS/34(HA), A/RI/5/57(-NA) (H1N1), A/harbour seal/New Hampshire/2011 (H3N8), A/mallard/interior Alaska/6MP0758/2006 (H10N8), A/mallard/Interior Alaska/10B-M05347R0/2010 (H7N3), Alaska/10BM02980R0/2010 (H9N2); B - A/Netherlands/602/2009 (H1N1), A/WSN/33 (H1N1); C - A/H1N1 (WSN), A/ Panama/2007/1999 (H3N2), A/Vietnam/ 1203/2004 (H5N1), B/Thuringia/02/2006; D - A/H1N1 (A/WSN/33).

Note. * Findings from independent studies revealed that specific knockdown of cellular miRNA-targeted genes resulted in the inhibition of viral reproduction.

Virus strains used in the study: A - A/WSN/1933 (H1N1), A/New-Jersey/8/1976/ (H1N1), A/Netherlands/2629/2009(pH1N1), A/Hong Kong/8/68(H3N2), A/Nanchang/933/1995(H3N2), A/Brisbane/10/2007(H3N2), A/WSN/15/2009(H3N2), A/NWS/34(HA), A/RI/5/57(NA)(H1N1), A/ harbour seal/New Hampshire/2011(H3N8),A/mallard/ interiorAlaska/6MP0758/2006(H10N8),A/mallard/InteriorAlaska/10BM05347R0/2010 (H7N3), Alaska/10BM02980R0/2010(H9N2); B - A/Netherlands/602/2009 (H1N1), A/WSN/33 (H1N1); C - A H1N1 (WSN), A/Panama/2007/1999(H3N2), A/ Vietnam/ 1203/2004(H5N1), B/Thuringia/02/2006; D - A H1N1 (A/WSN/33).

везикулярного стоматита и простого герпеса 1 [36].

Перспективность подхода, основанного на подавлении активности клеточных генов, необходимых для репродукции вируса гриппа, показана в исследовании М. Estrin и соавт. [40]. Авторы отобрали группу генов, для которых ранее была определена важная роль в цикле репродукции вируса гриппа, и оценили эффективность профилактического и терапевтического применения миРНК, направленных к этим генам как раздельно, так и в виде комбинаций из нескольких миРНК на клетках А549. В работе использовали 12 штаммов ВГА, включая серотипы H1N1, H3N2, H1N2, H3N8, H10N8, H7N3, H9N2 и миРНК, направленные к генам ATP6AP1, COPA, ARCN1, NUP98, RPS14, PGD. миРНК к мРНК вирусного белка NP использовали в качестве положительного контроля. 1-я -4-я комбинации миРНК ингибировали репродукцию вируса более чем на 70%. Для учёта полученных данных авторы использовали метод бляшкообразования.

В исследовании J. Rupp и соавт. было продемонстрировано, что миРНК, направленные к генам, влияющим на гомеостаз меди, снижают репродукцию вируса гриппа. Чтобы оценить противовирусный эффект, в клеточной линии А549 была проведена трансфекция миРНК к гену CTR1, который является высокоаффинным транспортёром меди, в заражённых клетках. Нокдаун CTR1 привёл к снижению репродукции в 7,3 раза (через 24 ч, p = 0,04). Авторы считают, что влияние на внутриклеточный метаболизм меди с помощью миРНК можно использовать для профилактики и лечения гриппа [41].

Известно, что вирус гриппа блокирует процессы аутофагии, что, в свою очередь, приводит к накоплению аутофагосом из-за нарушения их слияния с лизо-сомами и способствует его репродукции внутри клетки [42]. Одну из ключевых ролей в аутофагии играют гены ATG5 и BECN1 [43, 44]. R. Wang и соавт. показали, что подавление образования аутофагосом с помощью миРНК, нацеленных на ATG5 и BECN1, снижает репродукцию вируса гриппа. В клетках А549, инфицированных штаммом вируса гриппа (A/duck/Hubei/ Hangmei01/2006 (H5N1)), была снижена экспрессия вирусных генов PB1, PB2, PA, NP и М2. По результатам вестерн-блоттинга, их экспрессия при использовании миРНК к ATG5 снизилась в 4 раза относительно контрольной GAPDH, тогда как при использовании миРНК к BECN1, - в 2 раза [45].

В табл. 2 представлены наиболее эффективные клеточные гены-мишени, эффективность которых была подтверждена в независимых исследованиях.

Анализ научной литературы свидетельствует о большом потенциале механизмов РНК-интерференции для создания специфических противогриппозных препаратов. Учитывая, что на данный момент ни один лекарственный или профилактический препарат не обеспечивает полной защиты от гриппа, метод РНК-интерференции продолжает привлекать внимание исследователей. Однако следует понимать, что важным фактором, снижающим эффективность РНК-интерференции, является формирование рези-

стентности вирусов к действию миРНК, направленных к вирусным генам. С точки зрения преодоления лекарственной устойчивости вируса гриппа большого внимания заслуживает применение миРНК, направленных к факторам клетки-хозяина, которые необходимы для репродукции вируса.

ЛИТЕРАТУРА

1. Peteranderl C., Herold S., Schmoldt C. Human influenza virus infections. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2016; 37(4): 487-500. DOI: http://doi.org/10.1055/s-0036-1584801

2. Cheng A.C., Holmes M., Dwyer D.E., Senanayake S., Cooley L., Irving L.B., et al. Influenza epidemiology in patients admitted to sentinel Australian hospitals in 2018: the Influenza Complications Alert Network (FluCAN). Commun. Dis. Intell. (2018). 2019; 43. DOI: http://doi/10.33321/cdi.2019.43.48

3. Chekkoth S.M., Supreeth R.N., Valsala N., Kumar P., Raja R.S. Spontaneous pneumomediastinum in H1N1 infection: uncommon complication of a common infection. J. R. Coll Physicians. Edinb. 2019; 49(4): 298-300.

DOI: http://doi.org/10.4997/JRCPE.2019.409.

4. Mastrolia M.V., Rubino C., Resti M., Trapani S., Galli L. Characteristics and outcome of influenza-associated encephalopathy/ encephalitis among children in a tertiary pediatric hospital in Italy, 2017-2019. BMC Infect. Dis. 2019; 19(1): 1012.

DOI: http://doi.org/10.1186/s12879-019-4636-5

5. Taubenberger J.K., Kash J.C. Influenza virus evolution, host adaptation, and pandemic form. Cell Host Microbe. 2010; 7(6): 440-51. DOI: http://doi.org/10.1016/j.chom.2010.05.009

6. Pinto L.H., Lamb R.A. The M2 proton channels of influenza A and B viruses. J. Biol. Chem. 2006; 281(14): 8997-9000.

DOI: http://doi.org/10.1074/jbc.R500020200

7. Wang J., Wu Y., Ma C., Fiorin G., Wang J., Pinto L.H., et al. Structure and inhibition of the drug-resistant S31N mutant of the M2 ion channel of influenza A virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013; 110(4): 1315-20.

DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.1216526110

8. Hurt A.C., Ernest J., Deng Y.M., Iannello P., Besselaar T.G., Birch C., et al. The emergence and spread of resistant influenza A (H1N1) viruses in Oceania, Southeast Asia and South Asia. Antiviral Res. 2009; (1): 90-3.

DOI: http://doi.org/10.1016/j.antiviral.2009.03.003

9. Hurt A.C. The epidemiology and spread of drug resistant human influenza viruses. Curr. Opin. Virol. 2014; (8): 22-9.

DOI: http://doi.org/10.1016/j.coviro.2014.04.009

10. Lampejo T. Influenza and antiviral resistance: an overview. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2020; 39(7): 1201-8.

DOI: http://doi.org/10.1007/s10096-020-03840-9

11. Киселев О.И., Малеев В.В., Деева Э.Г., Ленева И.А., Селькова Е.П., Осипова Е.А. и др. Клиническая эффективность препарата Арбидол (умифеновир) в терапии гриппа у взрослых: промежуточные результаты многоцентрового двойного слепого рандомизированного плацебо-контролируемого исследования АРБИТР. Терапевтический архив. 2015; 87(1): 88-96.

DOI: http://doi.org/10.17116/terarkh201587188-96

12. Leneva I.A., Russell R.J., Boriskin Y.S., Hay A.J. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: Implications for the mechanism of anti-influenza action of arbidol. Antiviral Res. 2009; 81(2): 132-40.

DOI: http://doi.org/10.1016/j.antiviral.2008.10.009

13. Furuta Y., Takahashi K., Kuno-Maekawa M., Sangawa H., Uehara S., Kozaki K., et al. Mechanism of action of T-705 against influenza virus. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49(3): 981-6.

DOI: http://doi.org/10.1128/AAC.49.3.981-986.2005

14. Sleeman K., Mishin V.P., Deyde V.M., Furuta Y., Klimov A.I., Gu-bareva L.V. In vitro antiviral activity of favipiravir (T-705) against drug-resistant influenza and 2009 A (H1N1) viruses. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54(6): 2517-24.

DOI: http://doi.org/10.1128/AAC.01739-0954

15. Goldhill D.H., Te Velthuis A.J.W., Fletcher R.A., Langat P., Zambon M., Lackenby A., et al. Barclayb. The mechanism of resistance to favipiravir in influenza. Proc. Natl. Acad. Sci. 2018; 115(45): 11613-8. DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.1811345215

16. Han J., Perez J., Schafer A., Cheng H., Peet N., Rong L., et al. Influenza virus: small molecule therapeutics and mechanisms of antiviral resistance. Curr. Med. Chem. 2018; 25(38): 5115-27. DOI: http://doi.org/10.2174/0929867324666170920165926

REVIEWS

17. Fire A.Z. Gene silencing by double-stranded RNA. Cell Death Differ. 2007; 14(12): 1998-2012.

DOI: http://doi.org/10.1038/sj.sdd.4402253

18. Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391(6669): 806-11. DOI: http://doi.org/10.1002/hep.30594

19. Park S., Park J., Kim E., Lee Y. The Capicua-ETV 5 axis regulates liver-resident memory CD 8+ T cell development and the pathogenesis of liver injury. Hepatology. 2019; 70(1): 358-71.

DOI: http://doi.org/10.1002/hep.30594

20. Vaucheret Х., Béclin С., Fagard М. Post-transcriptional gene silencing in plants. J. Cell Sci. 2001; 114(Pt. 17): 3083-91.

21. Sharp P.A. RNA-interference - 2001. GenesDev. 2001; 15(5): 485-90. DOI: http://doi.org/10.1101/gad.880001

22. Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Зверев В.В. Перспективы создания противовирусных препаратов на основе малых интерферирующих РНК. Вопросы вирусологии. 2013; (Спец. 1): 159-69.

23. Haiyong H. RNA interference to knock down gene expression. Methods Mol. Biol. 2018; 1706: 293-302.

DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7471-9_16

24. van der Ree M.H., van der Meer A.J., van Nuenen A.C., de Bruijne J., Ottosen S., Janssen H.L., et al. Miravirsen dosing in chronic hepatitis C patients results in decreased microRNA-122 levels without affecting other microRNAs in plasma. Aliment. Pharmacol. Ther. 2016; 43(1): 102-13.

DOI: http://doi.org/10.1111/apt.13432

25. Soriano V., Barreiro P., Benitez L., Peña J.M., de Mendoza C. New antivirals for the treatment of chronic hepatitis B. Expert Opin. In-vestig. Drugs. 2017; 26(7): 843-51.

DOI: http://doi.org/101080/13543784.2017.1333105

26. Qureshi A., Tantray V.G., Kirmani A.R., Ahangar A.G. A review on current status of antiviral siRNA. Rev. Med Virology. 2018; 28(4): 1976. DOI: http://doi.org/10.1002/rmv. 1976

27. Ge Q., McManus M.T., Nguyen T., Shen C.H., Sharp P.A., Eisen H.N., et al. RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003; 100(5): 2718-23. DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.0437841100

28. Ge Q., Filip L., Bai A., Nguyen T., Eisen H.N., Chen J. Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci. 2004; 101(23): 8676-81.

DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.0402486101

29. Zhiqiang W., Yaowu Y., Fan Y., Jian Y., Yongfeng H., Lina Z., et al. Effective siRNAs inhibit the replication of novel influenza A (H1N1) virus. Antiviral Res. 2010; 85(3): 559-61.

DOI: http://doi.org/10.1016/j.antiviral.2009.12.010

30. Sui H.Y., Zhao G.Y., Huang J.D., Jin D.Y., Yuen K.Y., Zheng B.J. Small interfering RNA targeting M2 gene induces effective and long-term inhibition of influenza A virus replication. PLoS One. 2009; 4(5): 5671.

DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0005671

31. Piasecka J., Lenartowicz E., Soszynska-Jozwiak M., Szutkowska B., Kierzek R., Kierzek E. RNA Secondary structure motifs of the influenza A virus as targets for siRNA-mediated RNA interference. Mol. Ther. Nucleic. Acids. 2020; 19: 627-42.

DOI: http://doi.org/10.1016/j/omtn.2019.12.018

32. Presloid J.B., Novella I.S. RNA viruses and RNAi: quasispecies implications for viral escape. Viruses. 2015; 7(6): 3226-40.

DOI: http://doi.org/10.3390/v7062768

33. Das A.T., Brummelkamp T.R., Westerhout E.M., Vink M., Madire-djo M., Bernards R., et al. Human immunodeficiency virus type 1 escapes from RNA interference-mediated inhibition. J. Virol. 2004; 78(5): 2601-5.

DOI: http://doi.org/10.1128/jvi.78.5.2601-2605.2004

34. Nikam R.R., Gore K.R. Journey of siRNA: clinical developments and targeted delivery. Nucleic. Acid Ther. 2018; 28(4): 209-24. DOI: http://doi.org/10.1089/nat.2017.0715

35. Lyons D.M., Lauring A.S. Mutation and epistasis in influenza virus evolution. Viruses. 2018; 10(8): 407.

DOI: http://doi.org/10.3390/v10080407

36. Lesch M., Luckner M., Meyer M., Weege F., Gravenstein I., Raf-tery M., et al. RNAi-based small molecule repositioning reveals clinically approved urea-based kinase inhibitors as broadly active antivirals. PLoS Pathog. 2019; 15(3): e1007601.

DOI: http://doi.org/101371/journal.ppat.1007601

37. Konig R., Stertz S., Zhou Y., Inoue A., Hoffmann H.H., Bhattacha-ryya S., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 2010; 46(7282): 813-7.

DOI: http://doi.org/10.1038/nature08699

38. Karlas A., Machuy N., Shin Y., Pleissner K.P., Artarini A., Heuer D., et al. Genome-wide RNAi screen identifies human host factors crucial for influenza virus replication. Nature. 2010; 463(7282): 818-22. DOI: http://doi.org/10.1038/nature08760

39. Eierhoff T., Hrincius E.R., Rescher U., Ludwig S., Ehrhardt C. The Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) promotes uptake of influenza A viruses (IAV) into host cells. PLoS Pathog. 2010; 6(9): e1001099.

DOI: http://doi.org/101371/journal.ppat1001099

40. Estrin M.A., Hussein I.T.M., Puryear W.B., Kuan A.C., Artim S.C., Runstadler J.A. Host-directed combinatorial RNAi improves inhibition of diverse strains of influenza A virus in human respiratory epithelial cells. PLoS One. 2018; 13(5): e0197246.

DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0197246

41. Rupp J.C., Locatelli M., Grieser A., Ramos A., Campbell P.J., Yi H., et al. Host cell copper transporters CTR1 and ATP7A are important for Influenza A virus replication. Virol J. 2017; 14(1): 11.

DOI: http://doi.org/10.1186/s12985-016-0671-7

42. Feizi N., Mehrbod P., Romani B., Soleimanjahi H., Bamdad T., Feizi A., et al. Autophagy induction regulates influenza virus replication in a time-dependent manner. J. Med. Microbiol. 2017; 66(4): 536-41. DOI: http://doi.org/10.1099/jmm.0.000455

43. Rossman J.S., Lamb R.A. Autophagy, apoptosis, and the influenza virus M2 protein. Cell Host Microbe. 2009; 6(4): 299-300.

DOI: http://doi.org/10.1016/jxhom.2009.09.009

44. Romanov J., Walczak M., Ibiricu I., Schuchner S., Ogris E., Kraft C., et al. Mechanism and functions of membrane binding by the Atg5-Atg12/Atg16 complex during autophagosome formation. EMBO J. 2012; 31(22): 4304-17.

DOI: http://doi.org/10.1038/emboj.2012.278

45. Wang R., Zhu Y., Zhao J., Ren C., Li P., Chen H., et al. Autophagy Promotes Replication of Influenza A Virus In Vitro. J. Virol. 2019; 93(4): e01984-18.

DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.01984-18

REFERENCES

1. Peteranderl C., Herold S., Schmoldt C. Human influenza virus infections. Semin. Respir. Crit. Care Med. 2016; 37(4): 487-500. DOI: http://doi.org/10.1055/s-0036-1584801

2. Cheng A.C., Holmes M., Dwyer D.E., Senanayake S., Cooley L., Irving L.B., et al. Influenza epidemiology in patients admitted to sentinel Australian hospitals in 2018: the Influenza Complications Alert Network (FluCAN). Commun. Dis. Intell. (2018). 2019; 43.

DOI: http://doi/10.33321/cdi.2019.43.48

3. Chekkoth S.M., Supreeth R.N., Valsala N., Kumar P., Raja R.S. Spontaneous pneumomediastinum in H1N1 infection: uncommon complication of a common infection. J. R. Coll Physicians. Edinb. 2019; 49(4): 298-300.

DOI: http://doi.org/10.4997/JRCPE.2019.409.

4. Mastrolia M.V., Rubino C., Resti M., Trapani S., Galli L. Characteristics and outcome of influenza-associated encephalopathy/en-cephalitis among children in a tertiary pediatric hospital in Italy, 2017-2019. BMC Infect. Dis. 2019; 19(1): 1012.

DOI: http://doi.org/10.1186/s12879-019-4636-5

5. Taubenberger J.K., Kash J.C. Influenza virus evolution, host adaptation, and pandemic form. Cell Host Microbe. 2010; 7(6): 440-51. DOI: http://doi.org/10.1016Zj.chom.2010.05.009

6. Pinto L.H., Lamb R.A. The M2 proton channels of influenza A and B viruses. J. Biol. Chem. 2006; 281(14): 8997-9000.

DOI: http://doi.org/10.1074/jbc.R500020200

7. Wang J., Wu Y., Ma C., Fiorin G., Wang J., Pinto L.H., et al. Structure and inhibition of the drug-resistant S31N mutant of the M2 ion channel of influenza A virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013; 110(4): 1315-20.

DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.1216526110

8. Hurt A.C., Ernest J., Deng Y.M., Iannello P., Besselaar T.G., Birch C., et al. The emergence and spread of resistant influenza A (H1N1) viruses in Oceania, Southeast Asia and South Asia. Antiviral Res. 2009; (1): 90-3.

DOI: http://doi.org/10.1016/j.antiviral.2009.03.003

9. Hurt A.C. The epidemiology and spread of drug resistant human influenza viruses. Curr. Opin. Virol. 2014; (8): 22-9.

DOI: http://doi.org/10.1016/j.coviro.2014.04.009

10. Lampejo T. Influenza and antiviral resistance: an overview. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2020; 39(7): 1201-8.

DOI: http://doi.org/10.1007/s10096-020-03840-9

11. Kiselev O.I., Maleev V.V., Deeva E.G., Leneva I.A., Sel'kova E.P., Osipova E.A., et al. Clinical efficacy of arbidol (umifenovir) in the therapy of influenza in adults: preliminary results of the multicenter double-blind randomized placebo-controlled study ARBITR. Tera-pevticheskiy arkhiv. 2015; 87(1): 88-96.

DOI: http://doi.org/10.17116/terarkh201587188-96

12. Leneva I.A., Russell R.J., Boriskin Y.S., Hay A.J. Characteristics of arbidol-resistant mutants of influenza virus: Implications for the mechanism of anti-influenza action of arbidol. Antiviral Res. 2009; 81(2): 132-40.

DOI: http://doi.org/10.1016/j.antiviral.2008.10.009

13. Furuta Y., Takahashi K., Kuno-Maekawa M., Sangawa H., Uehara S., Kozaki K., et al. Mechanism of action of T-705 against influenza virus. Antimicrob. Agents Chemother. 2005; 49(3): 981-6.

DOI: http://doi.org/10.1128/AAC.493.981-986.2005

14. Sleeman K., Mishin V.P., Deyde V.M., Furuta Y., Klimov A.I., Gu-bareva L.V. In vitro antiviral activity of favipiravir (T-705) against drug-resistant influenza and 2009 A (H1N1) viruses. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54(6): 2517-24.

DOI: http://doi.org/10.1128/AAC.01739-0954

15. Goldhill D.H., Te Velthuis A.J.W., Fletcher R.A., Langat P., Zambon M., Lackenby A., et al. Barclayb. The mechanism of resistance to favipiravir in influenza. Proc. Natl. Acad. Sci. 2018; 115(45): 11613-8. DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.1811345215

16. Han J., Perez J., Schafer A., Cheng H., Peet N., Rong L., et al. Influenza virus: small molecule therapeutics and mechanisms of antiviral resistance. Curr. Med Chem. 2018; 25(38): 5115-27.

DOI: http://doi.org/10.2174/0929867324666170920165926

17. Fire A.Z. Gene silencing by double-stranded RNA. Cell Death Differ. 2007; 14(12): 1998-2012.

DOI: http://doi.org/10.1038/sj.sdd.4402253

18. Fire A., Xu S.Q., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391(6669): 806-11.

DOI: http://doi.org/10.1002/hep.30594

19. Park S., Park J., Kim E., Lee Y. The Capicua-ETV 5 axis regulates liver-resident memory CD 8+ T cell development and the pathogenesis of liver injury. Hepatology. 2019; 70(1): 358-71.

DOI: http://doi.org/10.1002/hep.30594

20. Vaucheret X., Béclin C., Fagard M. Post-transcriptional gene silencing in plants. J. Cell Sci. 2001; 114(Pt. 17): 3083-91.

21. Sharp P.A. RNA-interference - 2001. Genes Dev. 2001; 15(5): 485-90. DOI: http://doi.org/10.1101/gad.880001

22. Fayzuloev E.B., Nikonova A.A., Zverev V.V. Prospects for the development of antiviral drugs based on small interfering RNA. Vo-prosy virusologii. 2013;

23. Haiyong H. RNA interference to knock down gene expression. Methods Mol. Biol. 2018; 1706: 293-302.

DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7471-9_16

24. van der Ree M.H., van der Meer A.J., van Nuenen A.C., de Bruijne J., Ottosen S., Janssen H.L., et al. Miravirsen dosing in chronic hepatitis C patients results in decreased microRNA-122 levels without affecting other microRNAs in plasma. Aliment. Pharmacol. Ther. 2016; 43(1): 102-13.

DOI: http://doi.org/10.1111/apt.13432

25. Soriano V., Barreiro P., Benitez L., Peña J.M., de Mendoza C. New antivirals for the treatment of chronic hepatitis B. Expert Opin. In-vestig. Drugs. 2017; 26(7): 843-51.

DOI: http://doi.org/101080/13543784.2017.1333105

26. Qureshi A., Tantray V.G., Kirmani A.R., Ahangar A.G. A review on current status of antiviral siRNA. Rev. Med Virology. 2018; 28(4): 1976. DOI: http://doi.org/10.1002/rmv.1976

27. Ge Q., McManus M.T., Nguyen T., Shen C.H., Sharp P.A., Eisen H.N., et al. RNA interference of influenza virus production by directly targeting mRNA for degradation and indirectly inhibiting all viral RNA transcription. Proc. Natl. Acad. Sci. 2003; 100(5): 2718-23. DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.0437841100

28. Ge Q., Filip L., Bai A., Nguyen T., Eisen H.N., Chen J. Inhibition of influenza virus production in virus-infected mice by RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci. 2004; 101(23): 8676-81.

DOI: http://doi.org/10.1073/pnas.0402486101

29. Zhiqiang W., Yaowu Y., Fan Y., Jian Y., Yongfeng H., Lina Z., et al. Effective siRNAs inhibit the replication of novel influenza A (H1N1) virus. Antiviral Res. 2010; 85(3): 559-61.

DOI: http://doi.org/10.1016Zj.antiviral.2009.12.010

30. Sui H.Y., Zhao G.Y., Huang J.D., Jin D.Y., Yuen K.Y., Zheng B.J. Small interfering RNA targeting M2 gene induces effective and long-term inhibition of influenza A virus replication. PLoS One. 2009; 4(5): 5671.

DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0005671

31. Piasecka J., Lenartowicz E., Soszynska-Jozwiak M., Szutkowska

B., Kierzek R., Kierzek E. RNA Secondary structure motifs of the influenza A virus as targets for siRNA-mediated RNA interference. Mol. Ther. Nucleic. Acids. 2020; 19: 627-42.

DOI: http://doi.org/10.1016/j/omtn.2019.12.018

32. Presloid J.B., Novella I.S. RNA viruses and RNAi: quasispecies implications for viral escape. Viruses. 2015; 7(6): 3226-40.

DOI: http://doi.org/10.3390/v7062768

33. Das A.T., Brummelkamp T.R., Westerhout E.M., Vink M., Madired-jo M., Bernards R., et al. Human immunodeficiency virus type 1 escapes from RNA interference-mediated inhibition. J. Virol. 2004; 78(5): 2601-5.

DOI: http://doi.org/10.1128/jvi.78.5.2601-2605.2004

34. Nikam R.R., Gore K.R. Journey of siRNA: clinical developments and targeted delivery. Nucleic. Acid Ther. 2018; 28(4): 209-24. DOI: http://doi.org/10.1089/nat.2017.0715

35. Lyons D.M., Lauring A.S. Mutation and epistasis in influenza virus evolution. Viruses. 2018; 10(8): 407.

DOI: http://doi.org/10.3390/v10080407

36. Lesch M., Luckner M., Meyer M., Weege F., Gravenstein I., Raf-tery M., et al. RNAi-based small molecule repositioning reveals clinically approved urea-based kinase inhibitors as broadly active antivirals. PLoSPathog. 2019; 15(3): e1007601.

DOI: http://doi.org/101371/journal.ppat.1007601

37. Konig R., Stertz S., Zhou Y., Inoue A., Hoffmann H.H., Bhattacha-ryya S., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 2010; 46(7282): 813-7.

DOI: http://doi.org/10.1038/nature08699

38. Karlas A., Machuy N., Shin Y., Pleissner K.P., Artarini A., Heuer D., et al. Genome-wide RNAi screen identifies human host factors crucial for influenza virus replication. Nature. 2010; 463(7282): 818-22. DOI: http://doi.org/10.1038/nature08760

39. Eierhoff T., Hrincius E.R., Rescher U., Ludwig S., Ehrhardt C. The Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) promotes uptake of influenza A viruses (IAV) into host cells. PLoS Pathog. 2010; 6(9): e1001099.

DOI: http://doi.org/101371/journal.ppat1001099

40. Estrin M.A., Hussein I.T.M., Puryear W.B., Kuan A.C., Artim S.C., Runstadler J.A. Host-directed combinatorial RNAi improves inhibition of diverse strains of influenza A virus in human respiratory epithelial cells. PLoS One. 2018; 13(5): e0197246.

DOI: http://doi.org/10.1371/journal.pone.0197246

41. Rupp J.C., Locatelli M., Grieser A., Ramos A., Campbell P.J., Yi H., et al. Host cell copper transporters CTR1 and ATP7A are important for Influenza A virus replication. Virol J. 2017; 14(1): 11.

DOI: http://doi.org/10.1186/s12985-016-0671-7

42. Feizi N., Mehrbod P., Romani B., Soleimanjahi H., Bamdad T., Feizi A., et al. Autophagy induction regulates influenza virus replication in a time-dependent manner. J. Med. Microbiol. 2017; 66(4): 536-41.

DOI: http://doi.org/10.1099/jmm.0.000455

43. Rossman J.S., Lamb R.A. Autophagy, apoptosis, and the influenza virus M2 protein. Cell Host Microbe. 2009; 6(4): 299-300.

DOI: http://doi.org/10.1016/jxhom.2009.09.009

44. Romanov J., Walczak M., Ibiricu I., Schuchner S., Ogris E., Kraft

C., et al. Mechanism and functions of membrane binding by the Atg5-Atg12/Atg16 complex during autophagosome formation. EMBO J. 2012; 31(22): 4304-17.

DOI: http://doi.org/10.1038/emboj.2012.278

45. Wang R., Zhu Y., Zhao J., Ren C., Li P., Chen H., et al. Autophagy Promotes Replication of Influenza A Virus In Vitro. J. Virol. 2019; 93(4): e01984-18.

DOI: http://doi.org/10.1128/JVI.01984-18