Исследование популяции тучных клеток тимуса при длительном воздействии кремния и кальция

УДК 612.438

ИССЛЕДОВАНИЕ ПОПУЛЯЦИИ ТУЧНЫХ КЛЕТОК ТИМУСА ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ВОЗДЕЙСТВИИ КРЕМНИЯ И КАЛЬЦИЯ

THE INVESTIGATION OF POPULATION OF MAST CELLS THYMUS UNDER LONG INFLUENCE OF SILICON AND CALCIUM

И. М. Дьячкова, В. Е. Сергеева, С. П. Сапожников I. M. Dyachkova, V. E. Sergeeva, S. P. Sapozhnikov

ФГОУ ВПО «Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова», г. Чебоксары

Аннотация. Изучено длительное влияние кремния и кальция на вилочковую железу, а именно на количественный и качественный состав тучных клеток в структурах тимуса.

Abstract. Long influence of silicon and calcium on thymus gland, namely, quantitative and qualitative structure of mast cells in thymus structures is investigated.

Ключевые слова: тимус, кремний, кальций, тучные клетки.

Keywords: thymus, silicon, calcium, mast cells.

Актуальность исследуемой проблемы. Изучение влияния микро- и макроэлементов на структуры органов иммунной системы является актуальной медико-биологической проблемой, имеющей большую научно-практическую ценность.

Тимус - центральный орган иммунной системы. В тимусе характерными клетками являются тучные клетки (мастоциты, тимусные базофилы), расположенные в основном в периферической части долек железы по ходу кровеносных сосудов. Тучные клетки (ТК), наряду с адренергическими нервами и люминесцирующими макрофагами, являются огромным по емкости депо гистамина, серотонина и катехоламинов [2], [11]. В гранулах тучных клеток центр занимает липопротеид, с ним связываются биогенные амины, которые затем покрываются гепарином, тем самым нейромедиаторные биоамины инактивируются [5]. Выделяя или поглощая медиаторы для сосудистой проницаемости, тучные клетки облегчают контакт и миграцию образовавшихся тимо-цитов [4], [9].

В некоторых исследованиях подробно изучены биоаминсодержащие тучные клетки тимуса, описаны изменения функциональной активности тучных клеток в зависимости от сезона года и при различных воздействиях на целостный организм медиаторами, гормонами и антигенами [8], [9], [10], [11]. Так, установлено, что введение соматотроп-ного гормона в течение 14 суток увеличивает количество тучных клеток в 1,6 раза, одновременно происходит изменение их тинкториальных свойств. Тестэктомия ведет к появлению популяции молодых развивающихся форм тучных клеток без признаков

дегрануляции, содержащих малосульфатированный незрелый гепарин. Отмечено повышение количества тучных клеток и индекса их дегрануляций в тимусе потомства крыс с D-галактозоаминовым поражением печени [3].

Как известно, для нормального протекания жизненных процессов в клетках и тканях необходимы микро- и макроэлементы [7]. Кальций принимает активное участие в процессах высвобождения катехоламинов из надпочечников, в выделении нейроме-диаторов пресинаптическими нервными окончаниями. Соединения кремния стимулируют функцию макрофагов, продуцирование этими клетками ИЛ-1, ФНО-а, лейкотрие-нинов и простагландина Е [12]. Анализ литературы показывает, что действие кремния и кальция на тучные клетки тимуса не изучено.

В связи с вышеизложенным становится актуальным изучение тучноклеточной популяции тимуса при воздействии микро- и макроэлементов, таких как кремний и кальций.

Материал и методика исследований. Объектом исследования служила вилочко-вая железа 45 самцов белых беспородных крыс (15 контрольных, 30 опытных).

Исследования проводились осенью.

Опытные животные были разделены на две группы: первая опытная группа получала питьевую воду с кальцием (200 мг/л), вторая опытная группа - питьевую воду с кремнием (10 мг/л).

Эксперимент проводился в течение 60 дней. Все действия, предусматривавшие контакт с экспериментальными животными, осуществлялись согласно правилам проведения работ с использованием лабораторных животных. Из ткани тимуса готовились парафиновые срезы толщиной 10-20 мкм, окрашивались гематоксилином и эозином для проведения общегистологической оценки структур тимуса и морфометрического анализа с использованием программы SigmaScanPro, а также по методу Гимза (01еш8а) для контроля состояния тканевых мукополисахаридов и гепарина в тучных клетках.

Результаты исследований и их обсуждение. При микроскопировании препаратов тимуса всех опытных групп, окрашенных гематоксилином и эозином, хорошо видны дольки, разделенные септами, являющимися продолжением соединительнотканной капсулы. В четко контурированных дольках овально-полигональной формы хорошо определяются корковое и мозговое вещество. Корковое вещество долек за счет более плотного расположения тимоцитов в нем выглядит сравнительно темнее, чем мозговое. Эпителиальная основа органа лучше просматривается в мозговом веществе в связи с меньшим количеством тимоцитов, здесь же иногда встречаются слоистые тельца Гассаля, образованные концентрически наслоенными эпителиальными клетками. У животных, употреблявших с питьевой водой кальций, мозговое вещество, как и у контрольных животных, имеет овальную форму, но в некоторых срезах наблюдаются врастания его в корковое вещество в виде небольших наплывов. У животных, употреблявших кремний, в гистологическом строении тимуса выявлена особенность, связанная с расположением мозгового вещества в тимусных дольках. Обнаружено, что мозговое вещество, помимо стандартного своего размещения в центре дольки, небольшими островками размещается и в корковом веществе, между субкапсулярной и кортикомедул-лярной зонами.

Оценка морфометрических показателей долек тимуса позволила выявить существенные различия между контрольными и опытными животными (табл. 1).

Таблица 1

Морфометрическая характеристика долек тимуса экспериментальных животных

' Параметр Группа ^^^ Площадь дольки Площадь мозгового вещества дольки Площадь коркового вещества дольки

Контрольная 1,13±0,14 0,25±0,04 0,88±0,11

С кальцием 1,88±0,20* 0,37±0,07 1,51±0,16*

С кремнием 1,36±0,20 0,28±0,10 1,07±0,14

* - различия достоверны с контрольной группой

Поставленная реакция по методу Гимза позволила нам оценить степень созревания гепарина и дегрануляции тучных клеток.

У контрольных животных в паренхиме и в междольковых септах тимуса выявляются самые разнообразные тучные клетки. По состоянию мукополисахаридов различаются: ортохромные виды тучных клеток с голубой окраской цитоплазмы и несульфати-рованным незрелым гепарином; Р1 - метахроматичные тучные клетки с фиолетовым окрашиванием гранул в цитоплазме и с более сульфатированным незрелым гепарином; р2 - метахроматичные клетки, имеющие фиолетовую цитоплазму с красноватым оттенком гранул за счет созревания сульфатированного гепарина. По степени дегрануляции определяются следующие формы тучных клеток: Т0-формы - гранулы плотно расположены в цитоплазме, ядро визуально не определяется (рис. 1); Т1-формы - ядро хорошо просматривается, гранулы располагаются внутри клетки, за пределы цитоплазмы не выходят; Т2-формы - гранулы частично выходят за пределы неповрежденной цитоплазмы; Т3-формы - полностью дегранулированные виды.

9 I

*

Рис. 1. Долька тимуса контрольных животных. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 60. Ок.10.

1) корковое вещество; 2) ортохромные Т0-формы тучные клетки в паренхиме тимуса

В группе животных, употреблявших кальций, значительно увеличилась площадь долек тимуса преимущественно за счет разрастания коркового вещества (с 1,13±0,14 мм2 до 1,88±0,20 мм2) (табл. 1). Также увеличились площадь и количество тучных клеток. Количество клеток с незрелым и созревающим гепарином (Р1- и р2-клетки) в междольковых

септах составило 37,6 % и 49,6 % соответственно и 50,0 % и 30,6 % - в паренхиме, что существенно отличалось от контрольной группы, в которой данные клетки составили 48,4 % и 48,4 % в септе долек, 49,2 % и 39,3 % - в паренхиме железы соответственно. Увеличилось число ортохромных тучных клеток и появились р3-формы (табл. 2). Но в то же время произошло увеличение процента клеток с выходом гранул за пределы цитоплазмы до 26,5 % в септе. В контрольной группе такие клетки составили 10,9 % (табл. 3).

Таблица 2

Распределение тучных клеток в септе

Группа Ортохромные 01 02 03

С П С П С П С П

Контрольная 3,2 11,5 48,4 49,2 48,4 39,3 - -

С кальцием 9,4 19,4 37,6 50,0 49,6 30,6 3,4 -

С кремнием 16,5 10,0 46,6 35,0 36,9 55,0 - -

Таблица 3

Распределение тучных клеток в септе

Группа Тс Т1 Т2 Т3

С П С П С П С П

Контрольная 79,7 75,4 6,3 9,8 3,1 6,6 10,9 8,2

С кальцием 47,9 51,6 23,9 25,8 1,7 17,7 26,5 4,9

С кремнием 41,7 72,5 35,9 27,5 18,4 - 3,9 -

У животных, употреблявших с питьевой водой кремний, наметилась лишь тенденция к увеличению средней площади долек тимуса, вместе с тем также произошло увеличение площади и количества тучных клеток. Количество клеток с созревающим гепарином (р2) в септе было ниже, чем в контроле, в 1,31 раза, а в паренхиме - в 1,39 раза выше. Процент клеток с неповрежденной цитоплазматической мембраной и частичным выходом гранул за ее пределы повысился в 5,93 раза в септе и совсем отсутствовал в паренхиме тимуса.

Таким образом, в первой экспериментальной группе было выявлено повышение процента ортохроматичных тучных клеток в 2,94 раза и в 2,43 раза, находящихся в Т3-форме в септе, а во второй - выявлено увеличение в 5,16 раза ортохроматичных клеток и в 5,93 раза - клеток, теряющих гранулы без разрушения цитоплазматической мембраны (Т2-форма). Т. е. в междольковых септах тимуса опытных животных усиливается образование молодых тучных клеток, и при длительном приеме кремния этот процесс идет интенсивнее, но с замедлением созревания гепарина. При употреблении кальция созревание гепарина в мастоцитах ускоряется. В то же время дегрануляция тучных клеток протекает интенсивнее, чем в контроле, и при приеме кремния.

В паренхиме тимуса животных первой опытной группы наблюдалось увеличение процента ортохроматичных клеток (1,69 раза), снижение скорости созревания гепарина и повышение Т2-форм. Во второй опытной группе выявлено ускорение созревания гепарина, в то же время замечено отсутствие тучных клеток с потерей гранул.

Кальций является мобилизующим сигналом для дегрануляции тучных клеток. Процесс дегрануляции тучных клеток предуготован и осуществляется тотчас же при поступлении кальция (Ca2) внутрь клетки, что и подтверждается в нашем опыте. Известно, что на метахромазию, т. е. степень связывания красителя с кислыми окончаниями гликозамингликана (-COO или -SO3H группами), влияют количество самих свободных кислых радикалов, количество сульфатных радикалов, сила связи комплекса мукополисахарид - белок (в данном случае, гепарин - белок) [6], степень деполимеризации кислых мукополисахаридов и блокада реакционных центров кальцием [1].

Оценивая полученные результаты, а именно усиление метахромазии в тучных клетках паренхимы тимуса животных, употреблявших кремний, можно предположить, что кремний, являясь структурным компонентом гепарина и гепаринсульфата, выполняя роль подвижной поперечной эфирной связи (Si - O - C-полимер) как между полисахаридами, так и между протеином и полисахаридом, мог ускорить данный процесс [13]. Кроме того, имеются данные, что кремний влияет на ферментные системы, участвующие в синтезе гликозамингликанов [14]. Низкий процент тучных клеток с вышедшими за пределы цитоплазмы гранулами паренхимы (отсутствие Т2- и Т3-форм) тимуса животных данной группы, возможно, связан с тем, что кремний повышает обмен комплексов «биогенный амин - гепарин - белок» не в составе гранул, а в растворенном виде [15].

Выводы:

1) при водном поступлении кремния и кальция изменяются морфология тимуса, скорость созревания гепарина и степень дегрануляции тучных клеток;

2) кальций усиливает процесс дегрануляции тучных клеток тимуса и одновременно увеличивает процент ортохромных клеток в септе и в паренхиме;

3) кремний стимулирует пролиферацию и дальнейшее развитие тучных клеток тимуса, что проявляется в увеличении их количества и доли ортохромных тучных клеток в септе.

Резюме. В эксперименте на белых беспородных крысах с введением кремния и кальция исследовались популяции тучных клеток на разных этапах развития. Выявлено, что в септах опытных групп усиливается образование молодых тучных клеток, и в группе животных, употреблявших кремний, этот процесс идет интенсивнее, но с замедлением созревания гепарина. В группе животных, употреблявших кальций, созревание гепарина идет быстрее. В то же время, в группе с кальцием дегрануляция тучных клеток протекает интенсивнее, чем в контрольной и второй опытной группах.

В паренхиме тимуса животных первой опытной группы наблюдались увеличение процента ортохроматичных клеток, снижение скорости созревания гепарина и повышение количества тучных клеток с неповрежденной цитоплазматической мембраной с частичным выходом гранул. Во второй опытной группе выявлено ускорение созревания гепарина при отсутствии клеток с потерей гранул. Полученные результаты имеют непосредственное отношение к проблемам иммунофармакологии микро- и макроэлементов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Авцын, А. П. Принципы и методы гисто-цитохимического анализа в патологии / А. П. Авцын, А. И. Струкова, Б. Б. Фукса. - Л. : Медицина, 1971. - 368 с.

2. Бережная, Н. М. Тучные клетки и гистамин / Н. М. Бережная, Р. И. Сепиашвили // Аллергология и иммунология. - 2003. - Т. 4. - № 3. - С. 64-70.

3. Бирюкова, Т. И. Морфофункциональная характеристика тучных клеток тимуса потомства крыс с экспериментальным заражением D-галактозоаминовым поражением печени / Т. И. Бирюкова, Г. В. Брюхин, А. А. Федосов // Морфология. - 2008. - Т. 133. - № 2. - С. 19.

4. Быков, В. И. Развитие и гетерогенность тучных клеток / В. И. Быков // Морфология. - 2000. -Т. 117. - № 2. - С. 86-89.

5. Гордон, Б. М. Цитобиоаминная система тимуса и адаптация / Б. М. Гордон. - Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 2000. - 242 с.

6. Пирс, Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная / Э. Пирс. - М. : Изд-во иностр. литер., 1962. -С. 225-236.

7. Сапожников, С. П. Влияние эколого-биогеохимических факторов среды обитания на функциональное состояние и здоровье населения Чувашии : автореф. дис. ... д-ра мед. наук : 03.00.13, 14.00.07 / С. П. Сапожников. - М., 2001. - 32 с.

8. Сарилова, И. Л. Морфофункциональная характеристика структур тимуса при экспериментальной тестоктемии : автореф. дис. ... канд. мед. наук : 03.00.25 / И. Л. Сарилова. - Саранск, 2009. - 26 с.

9. Сергеева, В. Е. Люминесцентно-гистохимическая характеристика ранней реакции моноаминсодер-жащих структур тимуса на антигенные воздействия / В. Е. Сергеева, Д. С. Гордон. - Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 1992. - 351 с.

10. Спирин, И. В. Морфофункциональная характеристика биоаминсодержащих структур тимуса при введении соматотропного гормона : автореф. дис. ... канд. мед. наук : 03.00.25 / И. В. Спирин. - Саранск, 2007. - 27 с.

11. Ястребова, С. А. Механизмы гидрокортизонной иммуномодуляции биоаминной клеточной системы тимуса / С. А. Ястребова, В. Е. Сергеева. - Чебоксары : Изд-во Чуваш. ун-та, 2000. - 83 с.

12. Activation of murine macrophages by silica particles in vitro is a process independent of silica induced cell death / E. Claudio et al. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 1995. - Vol. 13. - № 5. - P. 547-554.

13. Birshall, J. D. New trends in bio-inorganic chemistry / J. D. Birshall. - London, 1978. - P. 209-252.

14. Carlisla, E. M. A metabolic role for silicon in cartiage growth / E. M. Carlisla // Trace Elem. Man and Anim. - London, 1985. - P. 128-132.

15. Dvozak, A. M. Ultrastructural analysis of human mast cell and basophils / A. M. Dvozak // Chem. Jmmu-nol. - 1995. - Vol. 61. - P. 1-33.