СПОСОБ ОЦЕНКИ ВИРУСНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ ВОЗДУХА
METHOD FOR EVALUATING VIRAL CONTAMINATION OF AIR

Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, вирусологии, и может быть использовано для оценки вирусной обсемененности воздуха в помещениях предприятий и организаций различного профиля РНК-содержащими вирусами, возбудителями острых респираторных вирусных инфекций с целью их профилактики.
По частоте и количеству заболеваний острые респираторные заболевания (ОРЗ) занимают первое место в мире, составляя 95% всех инфекционных заболеваний. Смертность от ОРЗ на сегодняшний день остается стабильно высокой. Так, от гриппа ежегодно в мире умирают 2 миллиона человек. В Российской Федерации, по данным «Доклада о состоянии здоровья населения и организации здравоохранения по итогам деятельности органов исполнительной власти субъектов Российской Федерации за 2014 год» ежегодно на 100 тысяч населения приходится 4573,9 случаев инфекционных и паразитарных заболеваний (темп прироста 0,2%). В структуре инфекционной заболеваемости важное место отведено инфекционным заболеваниям органов дыхания.
Острые респираторные заболевания - группа заболеваний, чаще вызываемых вирусами (гриппа, парагриппа, представителями семейства Paramixoviridae, аденовирусами, коронавирусами, риновирусами и др.) и характеризующихся чрезвычайно быстрым распространением в виде эпидемий и пандемий. Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) - инфекционные заболевания, характеризующиеся поражением верхних и нижних дыхательных путей и др. [Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция: клиника, диагностика, лечение / Чешик С.Г., Вартанян Р.В. Методические рекомендации Роспотребнадзора (проект) «лабораторная диагностика гриппа и других орви методом полимеразной цепной реакции» / Справочник заведующего КДЛ. 2014. №7. С. 50-69].
Вирусы, вызывающие ОРЗ и ОРВИ, передаются воздушно-капельным путем от больных людей и здоровых вирусоносителей [Рациональная терапия острых респираторных инфекций и гриппа / Овсянникова Е.М., Коровина Н.А., Моргунова С.Л., Стойко Т.Ю., Бодаревская О.П. Медицинский совет. 2015. №1; Роль респираторных вирусов в развитии аллергии / Гервазиева В.Б., Сверановская В.В., Штерншис Ю.А., Семенов Б.Ф. / Цитокины и воспаление. 2003. Т. 2. №3. С. 1-8; Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция (РС-инфекция)]. Человек, как источник передачи респираторных вирусных инфекций, выделяет вирусы во внешнюю среду с кашлем, чиханьем, слюной, слизью и т.д. Так, человек, зараженный вирусом гриппа, заразен с первых часов заболевания до 5-7-го дня болезни; зараженный парамиксовирусами (в т.ч. парагриппом) и коронавирусами - заразен от первых двух-трех суток (максимальная опасность заражения) до десяти дней заболевания (вероятность заболевания снижается); зараженный аденовирусами опасен до 3-4 недель болезни [Инфекционная иммунология/журнал медицинская иммунология 2005. Т. 7. №2-3. С. 287-335; Актуальные вопросы симптоматического и патогенетического лечения острых респираторных вирусных инфекций / Селькова Е.П. Справочник поликлинического врача. 2013. №1. С. 9-13; Острые респираторные вирусные инфекции / Лиознов Д.А., Лапотников В.А., Петров В.Н. / Медицинская сестра. 2011. №4. С. 3-9; Современное лабораторное обеспечение эпидемиологических исследований и профилактических мероприятий / Инфекция и иммунитет. 2012. Т. 2. №1-2. С. 234-349].
Вирусы, вызывающие респираторные инфекции и являющиеся в основном РНК-содержащими (за исключением ДНК-содержащего аденовируса), характеризуются различным строением, небольшими размерами (до 250 нм) [Масс-спектрометрические подходы в изучении оболочечных вирусов: новые возможности для структурной биологии и профилактической медицины обзор / Кордюкова Л.В., Серебрякова М.В. Журнал биохимия. №8. С. 1002-1016. 2012 г.; Молекулярные и клеточные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции (экспериментальные модели) / Медицинская иммунология. 2006. Т. 8. №2-3. С. 113-194; Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция: современный взгляд на проблему / Бевза С.Л., Харламова Ф.С / Детские инфекции. 2008. т. 7. №1. С. 43-51; Идентификация аденовирусов респираторной группы методом ПЦР / Штыров А.А., Орлова С.В. / Журнал Молодежный сборник научных статей «Научные стремления» №2 / 2012 / - С. 63; Современное лабораторное обеспечение эпидемиологических исследований и профилактических мероприятий / Инфекция и иммунитет. 2012. Т. 2. №1-2. С. 234-349; Острые респираторные вирусные инфекции / Аверьянов А.В. / Журнал Практическая пульмонология №4 / 2003 - С. 33; Современные аспекты терапии и профилактики гриппа / Попов С.Ф., Левшин В.К. / Иванова Г.Ф. / Кувшинова Т.Д. 2010 г. Журнал лекарственный вестник. №6(38). С. 17-22; Конструирование Дезоксирибозимов Для Ингибирования Репродукции Вируса Гриппа А / Евдокимов А.А., Мазуркова Н.А., Малыгин Э.Г., Зарытова В.Ф., Левина А.С., Репкова М.Н., Загребельный С.Н., Нетесова; Молекулярные и клеточные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции (Эксперименталь); SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome), или ТОРС (тяжелый острый респираторный синдром) / Н.В. Астафьева, Е.Г. Белова / Медицинский научно-практический журнал. Лечащий врач. №9. 2003 г.; Способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной пцр с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления / Файзулоев Е.Б., Никонова А.А., Океании А.С., Лободанов С.А., Малахо С.Г., Зверев В.В. / Патент на изобретение RUS 2460803, 27.10.2010] и различной степенью устойчивости во внешней среде, а некоторые из них могут сохраняться в жизнеспособном состоянии в течение длительного периода времени. Так, вирусы парагриппа при комнатной температуре сохраняются в воздухе 4 часа; коронавирусы - на пластиковой поверхности сохраняются до 2 суток, в канализационных водах до 4 суток, респираторно-синтициальные вирусы сохраняются в жизнеспособном состоянии на предметах окружающей среды от 20 минут до 5-6 часов; аденовирусов - до 14 суток [Методические Рекомендации Роспотребнадзора (Проект) «Лабораторная Диагностика Гриппа и Других Орви Методом Полимеразной Цепной Реакции» / Справочник заведующего КДЛ. 2014. №7. С. 50-69; Современное лабораторное обеспечение эпидемиологических исследований и профилактических мероприятий / Инфекция и иммунитет.2012. Т. 2. №1-2. С. 234-349; Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция (РС-инфекция); Инфекционная иммунология/журнал медицинская иммунология 2005. Т. 7. №2-3. С. 287-335].
Известен ряд методов отбора проб, проведения исследований, учета результатов, описанных в различных нормативных документах, для оценки бактериальной и микологической обсемененности воздуха в помещениях организаций и предприятий различного профиля [Приказ Министерства здравоохранения СССР от 30.09.91 г. №254 «О развитии дезинфекционного дела»; МУК 4.2.1089-02 Использование установки обеззараживания воздуха УОВ "ПОТОК 150-М-01" и контроль микробной обсемененности воздуха при ее работе; МУ 28-6/15-86 «Методические указания по организации и проведению комплекса санитарно-противоэпидемических мероприятий в асептических отделениях (блоках) и палатах»; МУК 4.2.2942-11. «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы санитарно-бактериологических исследований объектов окружающей среды, воздуха и контроля стерильности в лечебных организациях. Методические указания"; Приказ МЗ СССР №720 от 31 июля 1978 г. «Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничной инфекцией»; МУ 42-51-4-93 «Контроль микробной контаминации воздуха производственных помещений»; МУ 3182-84 «Методические указания по микробиологическому контролю в аптеках»; Приложение Приказ Минздрава СССР от 28.12.89 N 691 «Инструкция по организации и проведению комплекса санитарно-противоэпидемических мероприятий в акушерских стационарах»; МУ-44-116 (утв. департаментом Госсанэпиднадзора Минздрава РФ 19.05.1997) «Медицинские иммунобиологические препараты. Асептическое производство медицинских иммунобиологических препаратов; МУ 64-02-005-2002 «Методические указания классификация и организация помещений для производства нестерильных лекарственных средств»; СанПиН 2.1.3.2630-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность»; МУ 2657-82. Методические указания по санитарно-бактериологическому контролю на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами. Однако ни один из указанных документов не отражает метода оценки вирусной обсемененности воздуха.
Известен способ дифференциальной диагностики респираторных вирусных инфекций методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени и перечень последовательностей для его осуществления [патент RU №2460803], предусматривающий анализ каждого исследуемого образца на наличие нуклеиновых кислот 11 респираторных вирусов в 3-х реакционных смесях. Способ позволяет дифференциально выявлять в биологических образцах нуклеиновые кислоты основных возбудителей ОРВИ - вирусов гриппа А и В, коронавирусов, вирусов парагриппа 1, 2, 3, 4 типов, аденовирусов, респираторно-синцитиального вируса, риновирусов и энтеровирусов. Наличие в изучаемой пробе нуклеиновых кислот того или иного респираторного вируса определяется ростом сигнала флуоресценции определенного красителя в одной из реакционных смесей. Недостатком данного способа является то, что метод не предусматривает отбор проб воздуха с адсорбцией вирусных нуклеиновых кислот, а также его сложность и большая продолжительность (до двух суток) определения общей микробной обсемененности воздушной среды, что не позволяет проводить исследование в режиме реального времени (в виде экспресс-прогноза).
0,5
1,0
0,3
0,5
0,5
1,0
0,3
0,5
1,0
Известен способ экспресс-прогноза общей микробной обсемененности воздушной среды [Патент RU 2491349, 2013 г.], включающий определение количества аэрозольных частиц с диаметром 0,3 мкм, 0,5 мкм и 1,0 мкм в единице объема воздуха с использованием счетчика аэрозольных частиц, расчет прогнозируемой общей микробной обсемененности воздушной среды по формуле: Y=0,0003(n+n)-1,2, по меньшей мере, при одном из условий n≤2,95n и/или n≤3,99n, где: Y - прогнозируемая общая микробная обсемененность воздушной среды, КОЕ на единицу объема воздуха; n - количество аэрозольных частиц диаметром 0,3 мкм в единице объема воздуха; n - количество аэрозольных частиц диаметром 0,5 мкм в единице объема воздуха; n - количество аэрозольных частиц диаметром 1,0 мкм в единице объема воздуха; 0,0003; 2,95 и 3,99 - коэффициенты; 1,2 - корректирующая безразмерная величина. Однако данный способ является расчетным, кроме этого он не улавливает и не идентифицирует вирусы.
Прототипом изобретения является способ оценки бактериальной контаминации воздуха [Методические указания МУК 4.2.734-99 «Микробиологический мониторинг производственной среды». Москва 1999, Минздрав России], включающий отбор проб воздуха с помощью пробоотборника «Флора - 100» на питательные среды, с последующей инкубацией и идентификацией выделенных бактерий. Недостатком способа является то, что он улавливает и идентифицирует только бактерии без выделения и идентификации вирусов, способ применим лишь для производителей медицинских иммунобиологических препаратов.
Задачей изобретения является разработка способа, позволяющего с высокой достоверностью оценить вирусную обсемененность воздуха РНК-содержащими вирусами, возбудителями острых респираторных вирусных инфекций в помещениях предприятий и организаций различного профиля, с целью профилактики острых респираторных вирусных инфекций.
3
Технический результат при использовании изобретения - повышение точности оценки за счет определения вирусной обсемененности воздуха РНК-содержащими вирусами, возбудителями острых респираторных вирусных инфекций в помещениях в 1 м воздуха.
Изобретение иллюстрируется фигурами 1-2, на которых изображены точки, в которых проводят отбор проб воздуха.
Предлагаемый способ оценки вирусной обсемененности воздуха осуществляют следующим образом: отбирают пробы воздуха с использованием импактора микробиологического «Флора-100», заливают средой-РНК, определяют вирусную обсемененность воздуха методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
2
2
Пробоотборник - импактор воздуха микробиологический «Флора-100» - размещают на высоте не менее 50 см от пола и на расстоянии не менее 30 см от стены или каких-либо предметов, препятствующих свободному проходу воздуха. Отбор проб воздуха в помещении площадью до 15 м отбирают в одной точке в центре комнаты; в помещениях площадью более 15 м - пробы отбирают в пяти точках по «принципу конверта» (фиг. 1); в узких длинных помещениях (с отношением ширины к длине >1:5) пробы в точках на расстоянии не более 5 м друг от друга
(фиг. 2). Указанный способ отбора воздуха используют для полного охвата всего объема воздуха в помещении.
В пробоотборник устанавливают пустую стерильную чашку Петри с мембранным фильтром «Владипор» типа МФАС-ОС-1 (диаметр пор 0,22 мкм, диаметр диска 47 мм) в держатель пробоотборника - импактора воздуха микробиологического «Флора-100».
Нажимают кнопку, имеющую маркировку требуемого объема отбираемого воздуха 1000 л, при этом над кнопкой загорается красный световой индикатор. Производят отбор пробы воздуха аспирационным методом, нажатием кнопки [СЕТЬ], расположенной на левой стенке пробоотборника. После отбора заданного объема воздуха индикаторная лампа гаснет.
В чашку с отобранной пробой помещают 10 мл среды-РНК для сохранения и стабилизации РНК вирусов (среда производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, каталожный номер 981, поставлена ООО «Интерлабсервис»). Среда предназначена для сохранения и транспортировки с одновременной стабилизацией внутриклеточной мРНК для последующего выделения тотальной РНК. Транспортная среда содержит компонент, который стабилизирует профиль экспрессии [http://www.opt-union.ru/i_store/item_1000380764/sreda-rnk.html].
Содержимое чашки перемешивают.
Определяют содержание нуклеиновых кислот вирусов методом мультиплексной ПНР с детекцией в режиме реального времени, метод включает следующие этапы:
1) подготовка смесей праймеров, зондов для проведения ОТ и ПЦР-РВ и контрольных образцов (внутренний положительный контроль, положительный контроль 1, положительный контроль 2, положительный контроль 3, отрицательный контроль);
2) выделение нуклеиновых кислот респираторных вирусов из исследуемых проб;
3) проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР в реальном времени (каждый образец анализируется в трех пробирках);
4) учет и интерпретация результатов анализа.
Этап 2 (проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР-РВ) выявления и идентификации специфических фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ): РНК респираторно-синцитиального вируса (human Respiratory Syncytial virus - hRSv), метапневмовируса (human Metapneumovirus - hMpv), вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов (human Parainfluenza virus-1-4 - hPiv), коронавирусов видов OC43, E229, NL63, HKUI (human Coronavirus - hCov), риновирусов (human Rhino virus - hRv), ДНК аденовирусов групп В, С и E (human Adenovirus - hAdv) и бокавируса (human Bocavirus - hBov) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации согласно инструкции к набору реагентов для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) (ООО «Интерлабсервис», каталожный номер R-V57).
- Для проведения количественного анализа строится калибровочный график зависимости значений порогового цикла Ct от десятичного логарифма концентрации ДНК. По значению порогового цикла трех калибраторов с известной концентрацией, с помощью компьютерной программы, проводится расчет концентрации РНК исследуемых вирусов, согласно руководству к прибору.
- Рассчитывают концентрацию вируса в воздухе по формуле:
3
К=М/2 (копий/м),
где М - концентрация вируса в растворе транспортной РНК-среды, которая была определена в предыдущем пункте. Полученное число копий умножают на 10 (в пересчете на 10 мл среды).
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.
2
Пример 1. Помещение площадью 14,35 м. Отбирают воздух в центре комнаты в одной точке, пробоотборник - импактор воздуха микробиологический «Флора-100» - размещают на высоте 50 см от пола на табурете, в пробоотборник устанавливают пустую стерильную чашку Петри с мембранным фильтром «Владипор» типа МФАС-ОС-1 (диаметр пор 0,22 мкм, диаметр диска 47 мм) в держатель пробоотборника - импактора воздуха микробиологического «Флора-100». Нажимают кнопку, имеющую маркировку требуемого объема отбираемого воздуха 1000 л, при этом над кнопкой загорается красный световой индикатор. Производят отбор пробы воздуха аспирационным методом, нажатием кнопки [СЕТЬ], расположенной на левой стенке пробоотборника. После отбора заданного объема воздуха индикаторная лампа гаснет. В чашку с отобранной пробой помещают 10 мл среды-РНК для сохранения и стабилизации РНК вирусов. Содержимое чашки перемешивают.
Определяют содержание нуклеиновых кислот вирусов методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
1) подготавливают смесь праймеров, зондов для проведения ОТ и ПЦР-РВ и контрольных образцов (внутренний положительный контроль, положительный контроль 1, положительный контроль 2, положительный контроль 3, отрицательный контроль);
2) выделяют нуклеиновые кислоты респираторных вирусов из исследуемых проб;
3) проводят мультиплексную реакцию обратной транскрипции и мультиплексную ПЦР в реальном времени (каждый образец анализируется в трех пробирках);
4) учитывают и интерпретируют результаты анализа.
Этап 2 (проведение мультиплексной реакций обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР-РВ) выявления и идентификации специфических фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ): РНК респираторно-синцитиального вируса (human Respiratory Syncytial virus - hRSv), метапневмовируса (human Metapneumovirus - hMpv), вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов (human Parainfluenza virus-1-4 - hPiv), коронавирусов видов OC43, E229, NL63, HKUI (human Coronavirus - hCov), риновирусов (human Rhino virus - hRv), ДНК аденовирусов групп В, С и E (human Adenovirus - hAdv) и бокавируса (human Bocavirus - hBov) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации согласно инструкции к набору реагентов для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) (ООО «Интерлабсервис», каталожный номер R-V57).
- Для проведения количественного анализа строится калибровочный график зависимости значений порогового цикла Ct от десятичного логарифма концентрации ДНК. По значению порогового цикла трех калибраторов с известной концентрацией, с помощью компьютерной программы, проводится расчет концентрации РНК исследуемых вирусов, согласно руководству к прибору.
- Рассчитывают концентрацию вируса в воздухе по формуле:
3
К=М/2 (копий/м),
где М - концентрация вируса в растворе транспортной РНК-среды, которая была определена в предыдущем пункте.
3
К=2/2=1. Умножают на 10. 10 копий/м вируса возбудителя респираторных заболеваний.
2
Пример 2. Помещение площадью 22,31 м (квадратная комната). Отбирают воздух в пяти точках по принципу конверта, пробоотборник - импактор воздуха микробиологический «Флора-100» - размещают на высоте 50 см от пола на табурете, в пробоотборник устанавливают пустую стерильную чашку Петри с мембранным фильтром «Владипор» типа МФАС-ОС-1 (диаметр пор 0,22 мкм, диаметр диска 47 мм) в держатель пробоотборника - импактора воздуха микробиологического «Флора-100». Нажимают кнопку, имеющую маркировку требуемого объема отбираемого воздуха 1000 л, при этом над кнопкой загорается красный световой индикатор. Производят отбор пробы воздуха аспирационным методом, нажатием кнопки [СЕТЬ], расположенной на левой стенке пробоотборника. После отбора заданного объема воздуха индикаторная лампа гаснет. Во все чашки с отобранной пробой помещают 10 мл среды-РНК для сохранения и стабилизации РНК вирусов. Содержимое чашки перемешивают.
Определяют содержание нуклеиновых кислот вирусов во всех чашках методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
1) подготавливают смесь праймеров, зондов для проведения ОТ и ПЦР-РВ и контрольных образцов (внутренний положительный контроль, положительный контроль 1, положительный контроль 2, положительный контроль 3, отрицательный контроль);
2) выделяют нуклеиновые кислоты респираторных вирусов из исследуемых проб;
3) проводят мультиплексную реакцию обратной транскрипции и мультиплексную ПЦР в реальном времени (каждый образец анализируется в трех пробирках);
4) учитывают и интерпретируют результаты анализа.
Этап 2 (проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР-РВ) выявления и идентификации специфических фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ): РНК респираторно-синцитиального вируса (human Respiratory Syncytial virus - hRSv), метапневмовируса (human Metapneumovirus - hMpv), вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов (human Parainfluenza virus-1-4 - hPiv), коронавирусов видов OC43, E229, NL63, HKUI (human Coronavirus - hCov), риновирусов (human Rhinovirus - hRv), ДНК аденовирусов групп В, С и E (human Adenovirus - hAdv) и бокавируса (human Bocavirus - hBov) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации согласно инструкции к набору реагентов для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) (ООО «Интерлабсервис», каталожный номер R-V57).
- Для проведения количественного анализа строится калибровочный график зависимости значений порогового цикла Ct от десятичного логарифма концентрации ДНК. По значению порогового цикла трех калибраторов с известной концентрацией, с помощью компьютерной программы, проводится расчет концентрации РНК исследуемых вирусов, согласно руководству к прибору.
- Рассчитывают концентрацию вируса в воздухе в каждой чашке по формуле:
3
К=М/2 (копий/м),
где М - концентрация вируса в растворе транспортной РНК-среды, которая была определена в предыдущем пункте.
1
2
3
4
5
К=0/2=0, К=1/2=0,5, К=2/2=1, К=0/2=0, К=0/2=0.
3
3
Рассчитывают сумму копий на всех чашках К=1,5 копия/м. Умножают на 10. Получают 15 копий/м вируса возбудителя респираторных заболеваний.
2
Пример 3. Помещение площадью 20,0 м (коридор). Отбирают воздух в двух точках, на расстоянии 5 метров друг от друга. Пробоотборник - импактор воздуха микробиологический «Флора-100» - размещают на высоте 50 см от пола на табурете, в пробоотборник устанавливают пустую стерильную чашку Петри с мембранным фильтром «Владипор» типа МФАС-ОС-1 (диаметр пор 0,22 мкм, диаметр диска 47 мм) в держатель пробоотборника - импактора воздуха микробиологического «Флора-100». Нажимают кнопку, имеющую маркировку требуемого объема отбираемого воздуха 1000 л, при этом над кнопкой загорается красный световой индикатор. Производят отбор пробы воздуха аспирационным методом, нажатием кнопки [СЕТЬ], расположенной на левой стенке пробоотборника. После отбора заданного объема воздуха индикаторная лампа гаснет. Во все чашки с отобранной пробой помещают 10 мл среды-РНК для сохранения и стабилизации РНК вирусов. Содержимое чашки перемешивают.
Определяют содержание нуклеиновых кислот вирусов во всех чашках методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
1) подготавливают смесь праймеров, зондов для проведения ОТ и ПЦР-РВ и контрольных образцов (внутренний положительный контроль, положительный контроль 1, положительный контроль 2, положительный контроль 3, отрицательный контроль);
2) выделяют нуклеиновые кислоты респираторных вирусов из исследуемых проб;
3) проводят мультиплексную реакцию обратной транскрипции и мультиплексную ПЦР в реальном времени (каждый образец анализируется в трех пробирках);
4) учитывают и интерпретируют результаты анализа.
Этап 2 (проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР-РВ) выявления и идентификации специфических фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ): РНК респираторно-синцитиального вируса (human Respiratory Syncytial virus - hRSv), метапневмовируса (human Metapneumovirus - hMpv), вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов (human Parainfluenza virus-1-4 - hPiv), коронавирусов видов OC43, E229, NL63, HKUI (human Coronavirus - hCov), риновирусов (human Rhino virus - hRv), ДНК аденовирусов групп В, С и E (human Adenovirus - hAdv) и бокавируса (human Bocavirus - hBov) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации согласно инструкции к набору реагентов для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) (ООО «Интерлабсервис», каталожный номер R-V57).
- Для проведения количественного анализа строится калибровочный график зависимости значений порогового цикла Ct от десятичного логарифма концентрации ДНК. По значению порогового цикла трех калибраторов с известной концентрацией, с помощью компьютерной программы, проводится расчет концентрации РНК исследуемых вирусов, согласно руководству к прибору.
- Рассчитывают концентрацию вируса в воздухе в каждой чашке по формуле:
3
К=М/2 (копий/м),
где М - концентрация вируса в растворе транспортной РНК-среды, которая была определена в предыдущем пункте.
2
К,=0/2=0, К=1/2=0,5
Рассчитывают сумму копий на всех чашках К=0,5.
3
Умножают на 10. 5 копий/м вируса возбудителя респираторных заболеваний.
2
Пример 4. Помещение площадью 20,0 м (коридор). Отбирают воздух в двух точках, на расстоянии 5 м друг от друга. Пробоотборник - импактор воздуха микробиологический «Флора-100» - размещают на полу, в пробоотборник устанавливают пустую стерильную чашку Петри с мембранным фильтром «Владипор» типа МФАС-ОС-1 (диаметр пор 0,22 мкм, диаметр диска 47 мм) в держатель пробоотборника - импактора воздуха микробиологического «Флора-100». Нажимают кнопку, имеющую маркировку требуемого объема отбираемого воздуха 1000 л, при этом над кнопкой загорается красный световой индикатор. Производят отбор пробы воздуха аспирационным методом, нажатием кнопки [СЕТЬ], расположенной на левой стенке пробоотборника. После отбора заданного объема воздуха индикаторная лампа гаснет. Во все чашки с отобранной пробой помещают 10 мл среды-РНК для сохранения и стабилизации РНК вирусов.
Определяют содержание нуклеиновых кислот вирусов во всех чашках методом мультиплексной ПЦР с детекцией в режиме реального времени.
1) подготавливают смесь праймеров, зондов для проведения ОТ и ПЦР-РВ и контрольных образцов (внутренний положительный контроль, положительный контроль 1, положительный контроль 2, положительный контроль 3, отрицательный контроль);
2) выделяют нуклеиновые кислоты респираторных вирусов из исследуемых проб;
3) проводят мультиплексную реакцию обратной транскрипции и мультиплексную ПЦР в реальном времени (каждый образец анализируется в трех пробирках);
4) учитывают и интерпретируют результаты анализа.
Этап 2 (проведение мультиплексной реакции обратной транскрипции и мультиплексной ПЦР-РВ) выявления идентификации специфических
фрагментов нуклеиновых кислот возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ): РНК респираторно-синцитиального вируса (human Respiratory Syncytial virus - hRSv), метапневмовируса (human Metapneumovirus - hMpv), вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов (human Parainfluenza virus-1-4 - hPiv), коронавирусов видов OC43, E229, NL63, HKUI (human Coronaviras - hCov), риновирусов (human Rhinovirus - hRv), ДНК аденовирусов групп В, С и E (human Adenovirus - hAdv) и бокавируса (human Bocavirus - hBov) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации согласно инструкции к набору реагентов для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) (000 «Интерлабсервис», каталожный номер R-V57).
- Для проведения количественного анализа строится калибровочный график зависимости значений порогового цикла Ct от десятичного логарифма концентрации ДНК. По значению порогового цикла трех калибраторов с известной концентрацией, с помощью компьютерной программы, проводится расчет концентрации РНК исследуемых вирусов, согласно руководству к прибору.
- Рассчитывают концентрацию вируса в воздухе в каждой чашке по формуле:
3
К=М/2 (копий/м),
где М - концентрация вируса в растворе транспортной РНК-среды, которая была определена в предыдущем пункте.
1
2
К=0/2=0, К=1/2=0
Рассчитывают сумму копий на всех чашках К=0
Умножают на 10.
3
0 копий/м.