Биологическая активность воды с измененным соотношением h/d: является ли дейтерий компонентом минерального питания?

БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ВОДЫ С ИЗМЕНЕННЫМ СООТНОШЕНИЕМ НЯ>: ЯВЛЯЕТСЯ ЛИ ДЕЙТЕРИЙ КОМПОНЕНТОМ МИНЕРАЛЬНОГО ПИТАНИЯ?

A.B. Балышев *, A.A. Тимаков2, М.М. Гаврилова 3, А.Н. Смирнов 3, И.С. Матвеева3, И.М. Лебедев3, В.Б. Лапшин4, A.B. Сыроешкин 1,3

1 Кафедра фармацевтической и токсикологической химии, медицинский факультет, РУДН, ул. Миклухо-Маклая 8, 117198,Москва, Россия 2НМТК «Айсберг», Сретенский бул. д. 6/1, Москва, Россия 3Государственный океанографический институт, лаборатория прикладной гидрохимии и аналитической химии, Кропоткинский пер. 6, 119034, Москва, Россия 4Российский фонд фундаментальных исследований, Ленинский пр. 32а,

117311, Москва, Россия

В настоящее время в практику противораковых исследований активно внедряется особый вид воды, обедненный по содержанию дейтерия [Тимаков A.A., 2003]. Нами показано альтерирование биологической активности противотуберкулезного препарата при введении в его состав тяжелой воды [Сыроешкин A.B. и др., 2004]. В настоящей работе обнаружено, что повышенное содержание дейтерия вызывает субпопуляционные переходы у бактерий и интенсифицирует метаболизм металлов. Для эукариотической клетки получена зависимость «концентрация дейтерия - время жизни» (диаграмма «Доза-Ответ»), имеющая колоколообразную форму с максимумом при природных концентрациях дейтерия, что указывает на участие дейтерия в минеральном обмене.

Вода и органические соединения с измененным соотношением про-тий/дейтерий широко применяется в настоящее время в фармации. D2O широко используется в бор-нейтрон-захватной терапии раковых опухолей [1]. D2O в высоких концентрациях предотвращает солевую и этанольную гипертензию, снижает мутагенность лекарственного препарата, усиливает действия антибиотических реагентов и инсектицидов [2]. Вода, обедненная по содержанию дейтерия («легкая» вода, deuterium depleted water), демонстрирует целую гамму лечебных эффектов: от противораковых до иммуномодулирующих [3, 4]. Действие избытка дейтерия в воде зависит от вида живого организма и стадии развития. У эукариот отмечены разнообразные БгО-индуцируемые хромосомные мутации и нарушения клеточного цикла [5, 6]. Для млекопитающих и человека D2O малотоксична, её действие проявляется, если она составляет более 20% от всей воды в организме [7]. Для простейших D2O токсична в концентрациях от 70% и выше, тогда как сине-зеленые водоросли и бактерии способны существовать и поддерживать свою жизнедеятельность и в 100% D2O [2, 8].

Если рассматривать дейтерий как микроэлемент, входящий в состав не только воды, но важнейших органических соединений, то окажется, что среди других элементов в организме человека D оказывается сразу за натрием (содержание дейтерия в организме человека может варьировать в диапазоне от 9 до 16 мМ) [4]. Является ли изотоп в такой концентрации

примесным элементом или участником минерального обмена? В настоящей работе представленные результаты по БгО-индуцируемой интенсификации метаболизма d-элементов у прокариот и вид кривой «Доза-Ответ» («Концентрация D в воде» - «Время жизни») у эукариот обсуждаются согласно гипотезе об адаптационном включении дейтерия в минеральный обмен.

МЕТОДЫ

Культуру клеток E. coli (штамм ТОРЮ) растили в среде на обычной бидистиллированной воде или на тяжелой воде как описано в работе [9].

Измерение численного и объемного распределения клеток. Распределение клеток по размерам и форме регистрировали с помощью дифракции лазерного света на лазерном дифракционном определителе размером частиц («particle sizer») «Malvern 3600 Ес» как описано в работе [10].

Пробоподготовку образцов для элементного анализа проводили с помощью кислотного озоления в СВЧ-минерализаторе как описано в работе [11].

Определение содержания металлов методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией фона проводили как описано в работах [11, 12].

Диаграмму «Доза-Ответ» («Концентрация D в воде» - «Время жизни») получали с использованием клеточного биосенсора Spirostomum ambigua как описано в работе [13]. Использовали препараты воды разной степени обеднения по содержанию дейтерия, любезно предоставленные НМТК «Айсберг». Избыточное содержание дейтерия создавали путем смешения бидистиллированной и тяжелой воды. 99,9% тяжелая вода соответствовала ТУ 95-1893-89.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Как хорошо известно, среди всех элементов наиболее сильные изотопные эффекты проявляются у водорода при замене протия на дейтерий. С нашей точки зрения, такая замена повлечет в первую очередь изменение скоростей трансмембранного транспорта веществ в клетке, обеспечиваемого существованием межфазного электрохимического потенциала. Действительно, при росте E. coli в среде, приготовленной с использованием тяжелой воды, в культуре накапливается марганец, кадмий, мышьяк, железо (табл. 1) при отсутствии такой динамики в среде, приготовленной на обычной бидистиллированной воде (около 160 ppm дейтерия).

Таблица 1

Коэффициент изменения содержания элементов в биомассе E.coli в при росте

вода V Al Mn Ni Cu Cd As Fe

н2о 0.42 2.4 0.4 1.2 1.0 1.0 ' Ниже n.o. 0.7

D20 0.09 2.6 2.8 1.2 1.7 6.8 3.16 13.5

Полученный результат позволяет предположить, что токсичность тяжелой воды может быть связана не только с изотопными эффектами, но и с дейтерий-индуцируемой интенсификацией накопления тяжелых металлов и мышьяка. У бактерий и сине-зеленых водорослей устойчивость к тяжелым металлам выше, что и объясняет возможность их роста на тяжелой воде. Используемый в настоящей работе штамм E. coli проверили на наличие адаптационного ответа по пути образования псевдомногоклеточ-ных ассоциатов. Рост на среде с тяжелой водой в три раза снижает биомассу и приводит к формированию «защитных» ассоциатов, подобно реакции на токсические соединения или антибиотики [9].

мкм

мкм

Рис.1 Размерные спектры культуры E.coli, штамм ТОРЮ, выращенной в течение 12 часов на среде с обычной («Н20») и тяжелой водой

Так, с помощью изменения соотношения H/D возможно управление субпопуляционным составом полиморфной бактериальной культуры, аналогично ранее применяемому подходу с использованием комплексов d-элементов [12].

Как следует из табл. 1 возможно существование потенциальной роли дейтерия в составе воды как активатора минерального метаболизма. В таком случае диаграмма «Доза (дейтерия)- Ответ» должна иметь вид кривой с максимумом, т.е. при недостатке дейтерия может наблюдаться, например, угнетение жизнедеятельности. Для решение этой проблемы мы использовали клеточный биосенсор S. ambigua, введенный нами в практику доклинического исследования компонентов фармацевтических препаратов [13]. Оказалось, что зависимость времени жизни клеточного биосенсора от содержания дейтерия в воде (в интервалах от 10 ppm до 99%) имеет колоколообразную форму с явно выраженными зонами угнетения жизнедеятельности при избытке и недостатке последнего (рис. 2).

Кажущаяся энергия активации кинетики гибели на участке недостаточности и на участке избытка дейтерия сильно различается и составляет 110 и 220 кДж/моль, соответственно, что указывает на

110 и 220 кДж/моль, соответственно, что указывает на различный механизм угнетения жизнедеятельности эукариотической клетки при избытке и недостатке О. Согласно колоколообразной кривой на рис. 2, дейтерий является компонентом минерального питания. «Легкая» вода как фармацевтический препарат является в этом смысле вариантом диеты по дейтерию.

D, ррт

Рис. 2. Диаграмма «Концентрация D в воде» - «Время жизни S. ambigua». 100% соответствует 55 ±5 минутам

В настоящее время неизвестно, может ли существовать клетка без активатора минерального метаболизма - D. Кривая «Доза-Ответ» на рис. 2 относится к временам существования клеточного биосенсора, тандемно независящих от событий жизненного цикла (много меньше времени от деления до деления клетки). Если недостающий параметр времени отправить к значениям много большим длительности цикла деления, не исключено, что возможно адаптивное приспособление к жизни без дейтерия, но с участием иных активаторов межфазных неравновесных электрохимических процессов, как, например, тепловых нейтронов [14].

Следует также отметить, что клеточный биосенсор «целиком» погружен в исследуемую воду, в отличие от перрорального приема при испытании на млекопитающих. Полное погружение клетки приведет к резкой зависимости ее жизнедеятельности от струтуры воды: зависимость устой-

чивости супранадмолекулярных комплексов воды [15] от концентрации

дейтерия недавно показана в нашей лаборатории.

БЛАГОДАРНОСТИ

Авторы благодарят к.б.н. Гребенникову Т.В. и к.х.н. Пака Ю.С. за методологическую помощь и обсуждение результатов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kushner D.J., Baker A., Dunstall T.G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and denatured compounds// Can. J. Physiol. Pharmacol. - 1999. - V. 77(2). - P. 79-78

2. Kushner D.J., Baker A., Dunstall T.G. Pharmacological uses and perspectives of heavy water and denatured compounds// Can. J. Physiol. Pharmacol. - 1999. - V. 77(2). - P. 79-78

3. Somlyai G., Jancso G. et al. Naturally occurring deuterium is essential for the normal growth rate of cells// FEBS Lett. - 1993. - V. 317. - P. 1-4.

4. Тгшаков A.A. Основные эффекты легкой воды// 8-я Всероссийская (международная) научная конференция «Физико - химические процессы при селекции атомов и молекул» 6-10 ноября 2003. Москва, http://www.langvey.ru

5. Tatevaki R., Furuse F., Tanaka О., Hatta T. Relationship of abnormal development and the chromosomal anomalies of embryos from D20-Treated mice// Anat. Rec. - 1993. - V. 237 (Suppl. 1). P. 112-117.

6. Lamprecht J., Schroeter D., Paveletz N. Disorganization of mitosis in HeLa cells by deuterium oxide// Eur. J. Cell Biol.. - 1989. - V. 50(2). - P. 360-369.

7. Foerstel H. Estimation of the Risk of Heavy Water Incorporation in the Human Organism. // Govt Reports Announcements & Index (GRA&I), Issue 13, 1980.

8. Papadimitriou C., Wenzel M.Z. Protective effect of D20 in bacteria (E. coli)// Naturforsch (C).- 1989.-V. 44.- P. 11-12.

9. Сыроешкин А.В., Гребенникова Т.В., Березинская Т.Л., Плетпенева Т.В., Глущенко

Н.Н., Аветисян А., Бикетов С.Ф. Колонеобразование у прокариот как проблема инфекционной патологии// Вестник РУДН. - 2001, № 3, 17-24

http://med.pfu.edu.ru/_new/russian/win/library/vestnik/v013/03_2001.html

10. Сыроешкин А.В., Гребенникова Т.В., Байкова В.Н., Ковалева А.А., Лебедев И.М., Бикетов С.Ф., Плетенева Т.В., Фролов В.А.. Новый подход к исследованию патофизиологии клетки: изучение распределения клеток по размерам и форме как метод диагностики и мониторинга заболеваний.(2002) Клиническая лабораторная диагностика, №5, 35-40.

11. Матвеева И.С., Плетенева Т.В., Березинская Т.Л., Аветисян А., Шлеева М.О, Ка-прильянц А.С., Лебедев И.М, Колесников МН., Бикетов С.Ф., Сыроешкин А.В. Элементные профили металлов как векторная характеристика вида и физиологического состояния (2003) Микроэлементы в медицине, 4, 15-21. http://mars.udsu.ru/cgi-bin/cls/joumal_content?7202

12. Балышев А.В., Плетенева Т.В., Гребенникова Т.В., Каприльянц А.С., Сыроешкин А.В. К вопросу о разработке нового противотуберкулезного Zn^-содержащего препарата вод (2004) Вестник ОГУ.(«Приложение «Биоэлементология») №4 (29). 13-14.

13. Быканова С.Н., Суздалева О С., Серегина О.Б., Ковалева А.А., Комиссарова И.А., Плетенева Т.В., Сыроешкин А.В. Использование клеточного биосенсора Spirostomum ambigua для характеристики биологической активности компонентов фармацевтических препаратов. Электронный журнал «Исследовано в России», 98, 1114-1129,2003, http://zhurnal.ape.relam.ru/articles/2003/098.pdf

14. Матвеева КС., Смирнов А.Н., Воденников Б.Д., Попов И.М., Семенов Д.С., Колесников М.В., Сыроешкин А.В. Облучение потоком нейтронов как тест на выживаемость спор Artemia salina. (2004) Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. т.138, №11

15. Смирнов А.Н., Лапшин В.Б., Балышев А.В., Лебедев И.М., Сыроешкин А.В. «Супра-надмолекулярные комплексы воды» Электронный журнал «Исследовано в России», 38, стр. 413-421, 2004 г. http://zhumal.ape.relam.ru/articles/2004/038.pdf

BIOLOGICAL ACTIVITY OF WATER WITH CHANGED RATIO H/D: IF DEUTERIUM IS COMPONENT OF MINERAL NUTRITION?

A.V. Balyshev *, A.A. Tymakov 2, M.M. Gavrilova 3, A.An. Smirnov 3,1.S. Matveeva3,1.M. Lebedev3, V.B. Lapshin4, A.V. Syroeshkin 1,3

department ofpharmaceutical and toxicological chemistry, medical faculty, RPFU, Miklukho-Maklaya, 8, 117198, Moscow, Russia 2R&D Complex “Iceberg”

3 Laboratory of Applied Hydrochemistry and Analytical Chemistry, State

Oceanographic Institute 4Russian Foundation for Basic Research

In the present time for antitumor therapy there is the active development the new type of water - deuterium depleted water. [Tymakov A.A., 2003, 2004]. We also have showed the added deuterium oxide changed the bioactivity of antituberculosis pharmaceutical [Syroeshkin et al., 2004]. It is shown in the paper the higher concentration of deuterium cause the bacterial subpopulation’s transitions and intensify the metals’ metabolism. For eukaryotic cell the dependence “Concentration of D - Time of life” was obtained as curve with maximum (“bell curve”) at the natural concentration of deuterium thus indicates on its participation in mineral metabolism.