Лекарственная форма ДНК-аптамера
DOSAGE FORM OF DNA-APTAMER

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а конкретно фармацевтическому препарату, представляющему собой раствор, содержащий антитромбиновый ДНК аптамер. Изобретение также относится к способу получения лекарственной формы пэгилированного ДНК-аптамера, кроме того описан способ масштабирования и оптимизации технологии для получения значительных объемов ДНК-аптамера. Изобретение обеспечивает реализацию указанного назначения.
Уровень техники
В последние десятилетия был разработан новый тип ингибиторов тромбина - ДНК-аптамеры. Аптамерами называют небольшие молекулы нуклеиновых кислот, которые могут выполнять функции высокоспецифичных рецепторов любых мишеней - от целых клеток до низкомолекулярных органических соединений. Олигонуклеотидные аптамеры с требуемыми свойствами выделяют из библиотек случайных последовательностей методами селекции in vitro (SELEX), используя их способность специфически взаимодействовать с соответствующими иммобилизованными мишенями/лигандами.
Так, одним из первых ДНК-аптамеров, ингибирующих тромбин, был найден Schultze Р et al. "Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG)", J. Mol. Biol. 1994 Feb 4; 235(5): 1532-47. ДНК-олигонуклеотид dGGTTGGTGTGGTTGG, тромбинсвязывающий аптамер, специфически связывается с тромбином и подавляет активность фермента в цепи реакций, приводящих к свертыванию крови. В публикации Nagatoishi (Nagatoishi S. et al., "Circular dichroism spectra demonstrate formation of the thrombin-binding DNA aptamer G-quadruplex under stabilizing-cation-deficient conditions", Biochem Biophys Res Commun. 2007 Jan 19; 352(3):812-7. Epub 2006 Nov 27) описан антитромбиновый аптамер, имеющий G-квадруплексную структуру.
Gatto В. (Gatto В. et al., "Nucleic acid aptamers based on the G-quadruplex structure: therapeutic and diagnostic potential", Curr Med Chem. 2009; 16(10): 1248-65) описывает G-квадруплексный антитромбиновый аптамер, а также проводит обзор современных знаний об аптамерах на основе G-квадруплексных структур, а также оценку их диагностического и лечебного потенциала (как биотехнологических препаратов) для обнаружения и лечения тяжелых патологий, в том числе сосудистых, раковых и вирусных заболеваний.
Кроме того, для тромбина получены аптамерные ДНК, биомедицинские свойства которых описаны, например, в ряде публикаций:
1. IE 920561 A1 (GILEAD SCIENCES) от 26.08.1992 года, в котором описан аптамерный олигонуклеотид, который специфически связывается с тромбином, и имеющий последовательность нуклеотидов GGXTGG, где X - это Т, A, U, dU или G, в частности содержит нуклеотидную последовательность GGTTGGTGTGGTTGG.
2. US 2005176940 A1 (UNISEARH LTD) от 11.09.2005 года, в котором описан аптамерный олигонуклеотид, который специфически связывается с тромбином, и имеющий последовательность нуклеотидов GGTMGGXGGTTGG, где М - это А или Т, а X представляет собой последовательность от 2 до 5 любых нуклеотидов или их модификаций.
3. Griffin L.C. et al., "In vivo anticoagulant properties of a novel nucleotide-based thrombin inhibitor and demonstration of regional anticoagulation in extracorporeal circuits", Blood. 1993 Jun 15; 81(12):3271-6, описывает аптамерный олигонуклеотид, имеющий последовательность GGTTGGTGTGGTTGG.
Несмотря на то, что многочисленные примеры олигонуклеотидов первого поколения ДНК-аптамеров к тромбину известны уже около 20 лет, их практическое продвижение в медицинскую сферу сдерживается рядом факторов. В настоящее время в клинической практике пока не применяются препараты на основе ДНК-аптамеров к тромбину. Так, например, аптамеры первого поколения ARC 183 и ACR2172 успешно прошли стадии доклинических испытаний в США, но были остановлены на стадии клинических испытаний. Исходя из экспериментальных данных, собранных во время работы с изобретением можно предположить, что основной причиной приостановки продвижения этих аптамеров была проблема правильной сборки G-квадруплексного фармакофора с дополнительными дуплексными модулями. Аналогичной дополнительной дуплексной структурой обладают существующие российские аналоги ДНК-аптамеров к тромбину, в том числе запатентованные ранее RE31 и ST43. Соответственно, задача по разработке лекарственной формы, способной к применению в клинической практике, на сегодняшний день является актуальной. Таким образом, целью заявителя является разработка лекарственного средства на основе антикоагулянта прямого действия на основе ДНК-аптамера, селективно ингибирующего активность тромбина. В процессе экспериментальной работы был выработан и способ получения лекарственной формы.
Описание чертежей
Анализ тромбинового времени при использовании RA-361 и контроля Ангиокс на плазме человека и животных.
Фигура 1. Тромбиновое время. Плазма человека.
Фигура 2. Тромбиновое время. Плазма крысы. Анализ тромбинового времени при использовании RA-361 и контроля Ангиокс на плазме человека и животных.
Фигура 3. Тромбиновое время. Плазма кролика.
Фигура 4. Тромбиновое время. Плазма собаки. Анализ протромбинового времени при использовании RA-361 и контроля Ангиокс на плазме человека и животных.
Фигура 5. Про тромбиновое время, с. Плазма человека.
Фигура 6. Протромбиновое время, с. Плазма крысы. Анализ протромбинового времени при использовании RA-361 и контроля Ангиокс на плазме человека и животных.
Фигура 7. Протромбиновое время, с. Плазма кролика.
Фигура 8. Протромбиновое время, с. Плазма собаки. Анализ АЧТВ при использовании RA-361 и контроля Ангиокс на плазме человека и животных.
Фигура 9. АЧТВ, с. Плазма человека.
Фигура 10. АЧТВ, с. Плазма крысы. Анализ АЧТВ при использовании RA-361 и контроля Ангиокс на плазме человека и животных.
Фигура 11. АЧТВ, с. Плазма кролика.
Фигура 12. АЧТВ, с. Плазма собаки.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении описаны специально разработанные технологии, позволяющие нарабатывать значимые и достаточные количества аптамера для проведения исследований различных уровней, а также такого количества, которого будет хватать для промышленного производства лекарственной формы. В первую очередь, была разработана принципиально новая конструкция бивалентного ДНК-аптамер, которая является примером аптамеров нового поколения. Разработанный аптамер RA-361, имеет вместо дуплекса второй G-квадруплексный фармакофор. Значимым преимуществом данной конструкции является быстрая, самопроизвольная сборка, которая определяется его уникальной структурой. Разработанная лекарственная форма на основе RA-361, тромбинового ДНК-аптамера нового поколения создан на основе детального авторского изучения свойств фармакофорного мотива, входящего в состав многочисленных ДНК-аптамеров первого поколения. В предварительных лабораторных экспериментах in vitro и in vivo показана высокая специфическая активность RA-361 по отношению тромбину человека и низкая токсичность, что делает возможным использование препарата в форме раствора для инъекций и инфузий для применения в качестве антикоагулянта в высокотехнологичных хирургических операциях. Лекарственное средство на основе ДНК-аптамера к тромбину может быть использовано для профилактики тромбозов, в том числе и в период хирургических вмешательств.
Абсолютных аналогов настоящего лекарственного средства нет, однако для сравнительного анализа фармацевтической композиции в качестве аналога был взят препарат Бивалирудин (торговое название АНГИОКС). В следующих патентных документах описаны фармацевтические составы и способы их получения, относящиеся к пептидному ингибитору тромбина Бивалирудину (торговое название АНГИОКС): US 7582727, US 7598343, WO 2015175668, CN 104888207.
Лекарственное средство на основе аптамера RA-361 (описан в RU 2631829) относится к новому поколению антитромботических препаратов пролонгированного действия на основе модульного бивалентного ДНК-аптамера, селективного к тромбину.
Основным действующим веществом исследуемого лекарственного средства является 31-звенный ДНК-олигонуклеотид, обладающий пространственной структурой типа антипараллельного G квадруплекса, стабилизированного катионами калия. Так как олигонуклеотиды не устойчивы в кровотоке, то для преодоления этой проблемы олигонуклеотид был ковалентно модифицирован полиэтиленгликолем массой 20000. Основной ДНК-олигонуклеотид имеет следующую последовательность нуклеотидов: 5'-GG-TT-GG-TGT-GG-TT-GG-T-GG-TT-GG-TGT-GG-TT-GG-3'
Эта последовательность была получена на основе рационального дизайна и оптимизации структуры молекулы-прототипа с привлечением методов молекулярного моделирования. Прототипом являлся 15-звенный ДНК-олигонуклеотид с последовательностью [1]:
5'-GG-TT-GG-TGT-GG-TT-GG-3'
Молекула-прототип способна образовывать антипараллельный G квадруплекс, состоящий из двух планарных G-квартетов, соединенных тремя латеральными петлями. Трехмерная структура молекулы-прототипа была определена ранее методами ядерного магнитного резонанса и рентгеноструктурного анализа [2], [3], [4], [5]. Как и в случае молекулы-прототипа, предложенный нами аптамер содержит антипараллельный G-квадруплекс, для стабилизации которого ключевую роль играют катионы металлов, в частности, катионы калия [6]. Катион калия координируется 31 гуанинами G-квадруплекса, добавляя энтальпийную составляющую в энергию структуры. [3][4]. Предложенный олигонуклеотид имеет ингибирующую активность в отношении тромбина в 2 раза большую, чем молекула- прототип: кажущиеся константы ингибирования 7,3 нМ и 14,7 нМ, соответственно [7]. Обе G квадруплексных части важны для ингибирующей активности и термической стабильности ДНК-аптамера, нарушение структуры любого из них приводит к повышению кажущихся констант ингибирования [7] и снижению температуры плавления квадруплексной структуры по данным кругового дихроизма [6]
1. Наработка опытных образцов лекарственного средства
Для получения исходного аминомодифицированного олигонуклеотида RA-36 было проведено 4 синтеза аминопроизводного олигонуклеотида методом масштабированного твердофазного синтеза. После синтеза и проведения процедуры отщепления от носителя в аммиачном растворе и депротекции получено порядка 152 копт, ед (kOD) при масштабе синтеза 260-270 мкмоль со средним выходом 130-135 опт. ед./мкмоль.
Во время проведения всех этапов получения препарата содержание олигонуклеотидного компонента осуществлялась спектрофотометрически путем прямого измерения значений поглощения растворов при длине волны 260 нм.
Эффективность проведения суммарного синтеза конъюгата в значительной степени определяется качеством проведения синтеза исходного аминопроизводного. Для проведения конъюгации отбирали фракции очищенного аминопроизводного олигонуклеотида RA-36 с содержанием целевого компонента свыше 80%.
После 3 циклов хроматографической очистки проводили один цикл тангенциальной фильтрации и концентрирования методом тангенциальной фильтрации. Потери на тангенциальную фильтрацию аминопроизводного составляют порядка 8%, в результате чего получают 3,4 гр олигонуклеотида с содержанием основного компонента не менее 85%.
1.1 Коньюгация исходного аминомодифицированного производного олигонуклеотида RA-36 и N-сукцинимидного производного ПЭГ.
Наработанные продукты исходного аминопроизводного олигонуклеотида RA-36 были использованы для проведения реакций конъюгации с N-сукцинимидным производным полиэтиленгликоля молекулярной массой 20 кДа. Приведены хроматограммы реакционной смеси аминопроизводного олигонуклеотида RA-36 с N-сукцинимидным производным полиэтиленгликоля молекулярной массой 20 кДа (табл. 1).
Очистку полученного конъюгата от непрореагировавших аминопроизводного олигонуклеотида и полиэтиленгликоля осуществляли с помощью анионообменной хроматографии аналогично хроматографической очистке аминомодифицированного олигонуклеотида.
1.2 Приготовление образцов лекарственного средства
В следующем примере описан предпочтительный способ получения лекарственного средства.
Пример 1
После хроматографической очистки активного вещества и синтеза проводили цикл концентрирования методом тангенциальной фильтрации против 10 мМ раствора хлорида калия до концентрации 120-150 мг/мл активного вещества, где предпочтительной является концентрация 120 мг/мл.
Очищенные образцы активного вещества подвергались отжигу (annealing). Причем под отжигом подразумевается нагрев образца до температуры 95 С и охлаждение до комнатной температуры с скоростью 5С в минуту. Термин отжиг часто относиться к процессу гибридизации праймеров в ПЦР реакции. Тем не менее существует такое же название процесса формирования структуры нуклеиновой кислоты при постепенном остужении раствора, так же это процесс может называться ренатурацией, т.е. образование нативной структуры. В случае аптамера понятие нативной структуры не применимо, поэтому применяется термин отжиг.Время нахождения образцов при концентрации олигонуклеотида RA-361 120-150 мг/мл, где предпочтительной является концентрация 120 мг/мл, при 95С составляло 5 минут, затем образцы охлаждали до комнатной температуры в термостате Biosan в течении 15 минут.
После проведения процедуры 'отжига' образцы стерилизовались с помощью фильтровальных насадок Millex (материал фильтра - дюрапор с диаметром пор 0,22 мкм). В результате указанных процедур была получена стерильная фармацевтическая субстанция, в которой концентрация активного вещества составляла 120-150 мг/мл в 10-20 мМ раствора хлорида калия в воде в зависимости от концентрации активного вещества, где предпочтительной является концентрация 120 мг/мл. Образцы лекарственного средства приготовлялись из фармацевтической субстанции четырехкратным растворением в стерильном физиологическом растворе, где используется вода, приготовленная по стандарту ISO 3696, и фасовались в стеклянные флаконы в ламинарном шкафу, после чего укупоривались. Потери на стадии 'преформирования' и стерильного фильтрования составляют до 2% целевого компонента. На выходе получают субстанцию объемом 10 мл, концентрация 30-37,5 мг/мл олигонуклеотида RA-361, где предпочтительной является концентрация 30 мг/мл. RA-361 это 31-звенный олигонуклеотид с модификацией 20 кДа этиленгликолем в 16 положении.
Таким образом получено лекарственное средство содержащие олигонуклеотид RA-361 в концентрации 30 мг/мл, с допустимым пределом до 37,5 мг/мл, хлорид калия с концентрацией 10 мМ или выше, где концентрация хлорида калия не превышает 20 мМ, стерильный физиологический раствор и вода, приготовленная по стандарту ISO 3696 (или мили-Q качества). При использовании воды, приготовленной по стандарту ISO 3696 рН раствора, составит около 7.4 при допустимой норме в диапазоне между 7 и 7,5. Нуклеиновая кислота при данных концентрациях оказывает эффект «буффера» с помощью фосфатных групп из сахарофосфатного остова ДНК. Лекарственная форма на выходе представляет собой прозрачный раствор.
Таким образом, по новой, экспериментально наработанной, методике проведен синетез исходного аминопроизводного RA-36, продукт синтеза очищен анионо-обменной хроматографией Для очищенного исходного аминопроизводного RA-36 проведена реакция конъюгации с активированным производным ПЭГ. Выход реакции конъюгации достигал 77%. Полученный пэгилированный олигонуклеотид RA-361 также был подвергнут очистке аналогично исходному аминопроизводному RA-36. В результате проведенных работ было наработано суммарно 200 ммоль пэгилированного олигонуклеотида RA-361. Полученный олигонуклеотид был использован для приготовления лекарственного средства пэгилированного олигонуклеотида RA-361, для которого далее проводились исследования специфической активности и механизмов действия.
2 Выбор животных моделей для испытаний специфической активности.
Наибольшей эффективностью аптамер RA-361 обладает при использовании модели человека, который, однако, не может быть использован для доклинических исследований, следующей по эффективности была плазма крысы, что позволило рекомендовать ее для дальнейших исследований in vivo, далее по эффективности следовала плазма собаки, однако, данную модель весьма сложно использовать в связи с отсутствием набора однотипных животных в вивариях России, последней по эффективности была плазма кроликов. Следует обратить внимание, что кролики (не грызуны) это - одна из требуемых животных моделей, согласно «Руководству по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». (Хабриев Р.У.). Таким образом, несмотря на низкую эффективность на плазме кролика, было предложено рекомендовать кролика второй моделью для доклинических исследований эффективности аптамера RA-361 in vivo.
3. Определение эффективности препарата in vitro на плазме крови животных и человека.
Антикоагулянтное действие исследуемого препарата и препарата сравнения обусловлено ингибированием фактора IIa (тромбина), важнейшего компонента системы свертывания крови. В ходе данного эксперимента, для исследования антикоагулянтной активности ДНК-апатмера RA-361 и препарата сравнения была проведена оценка их влияния на такие лабораторные показатели гемостаза как:
- тромбиновое время (ТВ);
- протромбиновое время (ПВ);
- активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ).
Данные показатели определяли в цитратной плазме крови лабораторных животных, которым были введены исследуемый препарат, либо препарат сравнения, либо физиологический раствор (контрольная группа). Оценку проводили на полуавтоматическом коагулометре, оснащенном программным обеспечением для определения обсуждаемых показателей, и с использованием соответствующих наборов реактивов.
Проведение теста тромбинового времени: Отбирали 50 мкл исследуемого образца цитратной плазмы в пластиковую кювету коагулометра, выдерживали 60 секунд при 37°С, прибавляли 100 мкл рабочего раствора реактива для проведения теста тромбинового времени, прогретого при 37°С. Измеряли время свертывания исследуемого образца плазмы на коагулометре.
Проведение теста протромбинового времени: Отбирали 50 мкл исследуемого образца цитратной плазмы в пластиковую кювету коагулометра, выдерживали 60 секунд при 37°С, прибавляли 100 мкл рабочего раствора реактива для проведения теста протромбинового времени, прогретого при 37°С. Измеряли время свертывания исследуемого образца плазмы на коагулометре.
Проведение теста активированного частичного тромбопластинового времени: Отбирали 50 мкл исследуемого образца цитратной плазмы в пластиковую кювету коагулометра, выдерживали 60 секунд при 37°С, прибавляли 50 мкл рабочего раствора реактива для проведения теста активированного частичного тромбопластинового времени, прогретого при 37°С, выдерживали при 37°С 180 секунд. Прибавляли 50 мкл раствора кальция хлорида, прогретого при 37°С. Измеряли время свертывания исследуемого образца плазмы на коагулометре. Сравнительные примеры эффективности представлены на фиг. 1-12.
RA-361 требуется в 30 раз больше для достижения в тесте на тромбиновое время (с плазмой человека) равного эффекта с наиболее близким по антикоагулянтному механизму действия Ангиоксом (прямой ингибитор тромбина, блокирует активный центр тромбина); в тесте протромбинового времени - в 2,2 раза больше; в тесте АЧТВ - в 6,8 раз больше.
Наиболее чувствительным к аптамеру RA-361 оказался тест тромбинового времени, так как величины эффективных концентраций антикоагулянта наименьшие: 0,9 мкМ. По данным Hirch J. и соавт. необходимой степени антикоагуляции можно добиться при концентрации в плазме человека Ангиокса 1 мкг/мл (по тесту АЧТВ- 0,67±0,1 мкг/мл) [17, 18]. Если рассчитать концентрацию Ангиокса в плазме (исходя из того, что количество крови в организме взрослого человека составляет 6-8% массы тела [19], то есть 4,5-6 л, а количество плазмы в 1,8 раз меньше, так как гематокрит у людей 41-46%) при внутривенном болюсном введении в дозе 0,4 мг/кг [17], то она может составить около 10 мкг/мл.
Диапазон эффективных плазменных концентраций Ангиокса у человека составляет 0,14-9,36 мкг/мл, а диапазон плазменной концентрации аптамера RA-361 в чувствительных тестах достигает 27-48 1700 мкг/мл (рассчитанный на основании плазменных концентраций аптамера диапазон доз может быть от 2 до 100 мг/кг), а по тестам тромбинового времени, АЧТВ и протромбинового времени: не менее 27, 60, 80 мкг/мл плазмы, соответственно.
Суммируя данные можно вывести диапазон доз: 2-100 мг/кг.
RA-361 требуется в 24 раз больше для достижения в тесте тромбинового времени (с плазмой кроликов) равного эффекта с Ангиоксом; в тесте АЧТВ - в 1,1 раза больше; в тесте протромбинового времени - 1,2. Эффективные концентрации RA-361 в тестах тромбинового времени, АЧТВ и протромбинового времени составляют 12, 106 и 160 мкМ, соответственно. Диапазон доз рассчитанный по соотношению с активностью на плазме человека составляет 21 - 8000 мг/кг, вычисления проведены по плазменным концентрациям (исходя из того, что в среднем количество крови у кроликов составляет 4,5-6,7% от веса (3,5-4,5 кг) [20], а это в среднем 220 мл, а плазмы - 130 мл, так как гематокрит у кроликов 34-44%). Диапазон доз аптамера, рассчитанный по эффективным концентрациям в плазме крыс в тестах ТВ, АЧТВ, ПВ (количество крови у крыс весом 200-250 г составляет 15-17 мл веса, в среднем плазмы - 8,8 мл; гематокрит у крыс 40-50%) достигает 3-700 мг/кг.
Синтетический ДНК-аптамер RA-361 в диапазоне плазменных концентраций 1,63-575 мкг/мл, так же как и препарат сравнения (Ангиокс) удлиняет время свертывания плазмы человека, кроликов, крыс, собаки в тесте ТВ. Ангиокс и синтетический аптамер RA-361 в диапазоне плазменных концентраций 2,2-217 мкг/мл удлиняют время свертывания плазмы человека в тесте ПВ.
Концентрации Ангиокс и аптамера, при которых время свертывания плазмы увеличивается в 2 раза (2ПВ), в сравнении с контролем (вместо АК добавляли буфер), составили 0,9 и 2,0 мкг/мл, соответственно. Концентрации Ангиокс и аптамера RA-361, при которых время свертывания плазмы человека увеличивается в 2 раза (2ПВ), в сравнении с контролем (вместо АК добавляли буфер), составили 0,9 и 2,0 мкМ, соответственно;
- 2 ПВ концентрации Ангиокс и аптамера RA-361 в плазме кроликов 130 и 160 мкМ, соответственно;
- 2 ПВ концентрации Ангиокс и аптамера RA-361 в плазме крыс 0,3 и 7 мкМ, соответственно;
- 2 ПВ концентрации Ангиокс и аптамера RA-361 в плазме собаки 1,9 и 11 мкМ, соответственно.
Эффективные концентрации Ангиокса и аптамера составили 0,9 и 2,0 мкг/ мл, соответственно.
Влияние АК на свертывание плазмы человека, кроликов, собаки или крыс при активации фактора XII эллаговой кислотой в присутствии фосфолипидов сои исследовали в тесте АЧТВ. Синтетический аптамер RA-361 в диапазоне плазменных концентраций 1,96 - 195,6 мкг/мл, так же как и Ангиокс удлиняет время свертывания плазмы человека, кроликов, крыс и собаки. Концентрации Ангиокс и аптамера RA-361, при которых время свертывания плазмы человека увеличивается в 2 раза (2АЧТВ), в сравнении с контролем (вместо АК добавляли буфер), составили 0,4 и 2,7 мкМ, соответственно;
- 2 АЧТВ концентрации Ангиокс и аптамера RA-361 в плазме кроликов 96 и 106 мкМ, соответственно;
- 2 АЧТВ концентрации Ангиокс и аптамера в плазме крыс 0,6 и 5 мкМ, соответственно;
- 2 АЧТВ концентрации Ангиокс и аптамера RA-361 в плазме собаки 4,7 и 28 мкМ, соответственно.
Диапазон доз аптамера, рассчитанный по эффективным концентрациям в плазме крыс в тестах ТВ, АЧТВ, ПВ (количество крови у крыс весом 200-250 г составляет 15-17 мл веса, в среднем плазмы - 8,8 мл; гематокрит у крыс 40-50%) достигает 3-700 мг/кг.
Таким образом, аптамер RA-361 проявляет свойства антикоагулянта прямого действия, ингибируя тромбин. С увеличением концентрации синтетического аптамера RA-361 в плазме человека время появления фибринового сгустка в тестах тромбинового времени, АЧТВ и протромбинового времени возрастает.
4. Определение эффективности препарата при однократном болюсном внутривенном введении в сравнении с ближайшим аналогом - пептидным ингибитором тромбина бивалирудином
В качестве контрольного вещества был использован физиологический раствор хлорида натрия (натрия хлорид раствор для инфузий 0,9%, ООО «МОСФАРМ», Россия).
Введение препарата крысам
Крыс вводили в состояние наркоза при помощи раствора хлоралгидрата 100 мг/мл из расчета 400 мг на кг веса животного. Вскрывали яремную вену и с помощью шприца инсулинового (1 мл 0,33 мм (29 G) × 12,7 мм, шаг 2 ЕД BD Микро- Файн Плюс Инсулиновый U-40) вводили количество исследуемого препарата, препарата сравнения или физиологического раствора, указанных в таблице 3.
Контрольным группам животных, как крысам, так и кроликам вводили 200 мкл физиологического раствора.
Крысам исследуемый препарат вводили однократно в виде инъекционного раствора в объеме 200 мкл в дозах 21, 10,5, 42 мг/кг. Препарат сравнения вводили однократно в виде инъекционного раствора в объеме 200 мкл в дозах: 0,38 мг/кг, 0,75 мг/кг, 1,5 мг/кг. Количество препарата для введения конкретному животному рассчитывалось исходя из массы животного. Необходимое разведение получали при помощи физиологического раствора в пластиковых пробирках.
Введение препарата кроликам
Кроликам препараты вводили в краевую вену уха без предварительной наркотизации. При введении препаратов фиксировалось время введения препарата с точностью до минуты.
Дозы и подготовка препарата для введения
Контрольным группам животных вводили 200 мкл физиологического раствора. Крысам препарат сравнения и исследуемый препарат вводили как однократно, так и многократно. Кроликам - однократно. При однократном введении исследуемый препарат крысам вводили в виде инъекционного раствора в объеме 200 мкл в дозах 10,5, 21 и 42 мг/кг.
Препарат сравнения при однократном введении использовали в следующих концентрациях: 0,38, 0,75 и 1,5 мг/кг.
Было применено внутривенное введение, поскольку это планируемый способ введения человеку. Вводимый препарат приготовлен в виде раствора фармацевтической субстанции RA-361.
Процедура введения.
Вещество вводилось однократно внутривенно в диапазоне выбранных доз и в объемах, допустимых для внутривенного введения. Дозы для введения были рассчитаны индивидуально для каждого животного на основании последних данных массы тела животных.
Процедура отбора крови.
- При однократном введении физиологического раствора пробы крови отбирали: за 5 минут до введения препарата и после на 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 минуте;
- При однократном введении исследуемого препарата пробы крови отбирали: за 5 минут до введения препарата и после на 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 минуте;
- При однократном введении препарата сравнения пробы крови отбирали: за 5 минут до введения препарата и после на 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 минуте.
Отбор проб крови производили из яремной вены у крыс до и после введения исследуемого препарата, с помощью шприца инсулинового (1 мл 0,33 мм (29 G) × 12,7 мм, шаг 2 ЕД BD Микро-Файн Плюс Инсулиновый U-40), в котором находился 3,8% раствор цитрата натрия (соотношение кровь: 3,8% раствор цитрат натрия составляло 9:1). После отбора пробы крови центрифугировались в течение 15 минут при 1400 об/мин., плазма переносилась в пластиковые пробирки. Объем взятых проб составлял около 300 мкл, объем полученной цитратной плазмы крови - не менее 150 мкл. Статистическая обработка результатов исследования. Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью стандартных методов вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента.
Исследования эффективности фармакологических средств на животных обладают прогностическим характером в отношении ряда параметров их применения у человека, в том числе дозы фармакологического средства. В настоящем исследовании была сформирована подборка доз исследуемого препарата для изучения его влияния на параметры свертываемости плазмы крови (ТВ, ПВ, АЧТВ), с целью обнаружения однократной дозы препарата. Поиск такой дозы основывался на суждении о том, что применение однократной дозы препарата RA-361 должно вызывать увеличение обсуждаемых показателей в 2-3 раза относительно исходных значений. Данные целевые показатели соответствуют таковым при выборе режима дозирования гепарина, золотого стандарта среди прямых антикоагулянтов. Было изучено влияние трех доз исследуемого препарата: 10,5; 21; 42 мг на кг массы тела лабораторного животного, на ТВ, ПВ, АЧТВ. Дозировки препарата RA-361 исследовались на группах экспериментальных животных по 6 крыс в каждой. В таблице 4 представлены результаты исследования влияния каждой дозы RA-361 на ТВ, ПВ, АЧТВ.
Таким образом, на этапе доклинических исследований за однократную дозу препарата RA-361 была принята доза 21 мг/кг. На следующем этапе исследования сравнивалась антикоагулянтная активность однократной дозы препарата RA-361 с однократной дозой препарата сравнения - Ангиокса, который обладает схожим механизмом действия, способом введения и зарегистрирован на территории Российской Федерации. Антикоагулянтную активность Ангиокса оценивали также, по параметрам свертываемости плазмы крови лабораторных животных. Однократная доза Ангиокса, а именно 0,75 мг на кг массы лабораторного животного, исследовалась на группе экспериментальных животных, в которую входило 6 крыс.
Было изучено влияние препаратов RA-361 и Ангиокс на показатели свертываемости плазмы крови и клиническое состояние биологической модели - кролик шиншилла. Значимых изменений в состоянии животных во время проведения экспериментов не было обнаружено. Увеличения длительности постинъекционных кровотечений при введении различных дозировок исследуемого препарата и препарата сравнения и последующем заборе крови через установленные временные промежутки не наблюдалось. Случаев тромбирования сосудов зафиксировано не было. Следует обратить внимание, что, не смотря на то, что незначительные закономерности в увеличение концентраций аптамера и изменение ТВ и АЧТВ наблюдаются, также наблюдается чрезвычайно сильный разброс в результатах, что говорит о неспецифичности аптамера RA-361 к плазме кролика.
Из данных, представленных в таблицах следует, что препарат RA-361 в дозе 21 мг/кг, в отличие от препарата Ангиокс в однократной дозе 0,75 мг/кг, укладывается в рамки сформулированных выше целевых показателей значений ТВ, ПВ, АЧТВ. Исходя из представленных выше данных, RA-361 и Ангиокс обладают несколько отличающимся профилем антикоагулянтной активности. Препарат сравнения, Ангиокс, оказывает наиболее выраженный антикоагулянтный эффект по тестам ПВ и ТВ. Исследуемый препарат, RA-361, оказывает наиболее выраженный антикоагулянтный эффект на тесты ТВ и АЧТВ.
5. Определение эффективности препарата при многократном внутривенном введении животным в сравнении с ближайшим аналогом - пептидным ингибитором тромбина бивалирудином
Вещество вводилось однократно внутривенно в диапазоне доз от 1,0 до 15,0 мг/кг в объемах, допустимых для внутривенного введения. Дозы для введения были рассчитаны индивидуально для каждого животного на основании последних данных массы тела животных.
Проведение анализа Анализ активности антикоагулянтов прямого действия in vitro включает оценку влияния на свертывание плазмы человека в коагулологических (фибриногенолитических) тестах или на амидолитическую активность факторов свертывания [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Анализ проводили в пластиковых пробирках при 37°С.
Контрольной группе крыс многократно вводили 200 мкл физиологического раствора (натрия хлорид раствор для инфузий 0,9%, ООО «МОСФАРМ», Россия). Физиологический раствор вводили на 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 минуте.
Исследуемый препарат вводили многократно крысам в виде инъекционных растворов в объеме 200 мкл в дозах: 7 мг/кг, 21 мг/кг, 42 мг/кг. Исследуемый препарат вводили на 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 минуте.
Препарат сравнения вводили многократно крысам в виде инъекционных растворов в объеме 200 мкл в дозах: 0,19 мг/кг, 0,38 мг/кг, 0,75 мг/кг. 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 минуте.
Количество препарата для введения конкретному животному рассчитывалось исходя из массы животного.
Процедура отбора крови
При многократном введении физиологического раствора пробы крови отбирали: за 5 минут до введения препарата и после на 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 минуте.
При многократном введении исследуемого препарата пробы крови отбирали: за 5 минут до введения препарата и после на 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 минуте.
При многократном введении препарата сравнения пробы крови отбирали: за 5 минут до введения препарата и после на 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150, 180 минуте.
Отбор проб крови производили из яремной вены у крыс до и после введения исследуемого препарата, с помощью шприца инсулинового (1 мл 0,33 мм (29 G) × 12,7 мм, шаг 2 ЕД BD Микро-Файн Плюс Инсулиновый U-40), в котором находился 3,8% раствор цитрата натрия (соотношение кровь: 3,8% раствор цитрат натрия составляло 9:1). После отбора пробы крови центрифугировались в течение 15 минут при 1400 об/мин., плазма переносилась в пластиковые пробирки. Объем взятых проб составлял около 300 мкл, объем полученной цитратной плазмы крови - не менее 150 мкл.
С целью оценить способность исследуемого препарата и препарата сравнения сохранять показатели свертываемости плазмы крови в рамках целевых показателей была изучена их антикоагулянтная активность при последовательном многократном внутривенном введении. Изменение параметров свертываемости плазмы крови во времени при использовании RA-361 представлены в на таблице 7. Данные в таблице приведены для многократных инфузионных внутривенных терапевтических доз препарата RA-361: болюсное введение 7 мг/кг со следующим введением 7 мг/кг/час; болюсное введение 14 мг/кг со следующим введением 14 мг/кг/час; болюсное введение 21 мг/кг со следующим введением 21 мг/кг/час.Анализ проводился по трем целевым показателям ТВ, ПВ, АЧТВ.
Из данных, представленных в таблице 7, следует, что при выбранном режиме дозирования RA-361 способен удерживать значения ТВ, ПВ, АЧТВ в рамках целевых показателей не менее 3 часов, что указывает на перспективность его применения при продолжительном инфузионном введении при помощи капельницы. При использовании однократного болюсного и инфуционного введения RA-361 возможно снижение концентрации препарата до 14 мг/кг и поддержание необходимой концентрации в крови в течение 3-часовой операции. Анализ результатов, проведенного доклинического исследования, позволяет сделать следующий вывод:
- Исследование способности препарата RA-361 сохранять показатели свертываемости крови при использовании животной модели «крыса», при последовательном многократном введении выбранной однократной дозы препарата, в рамках увеличения показателей в 2-3 раза показало, что RA361 способен удерживать 95 значения ТВ, ПВ, АЧТВ в рамках целевых показателей не менее 3 часов, что указывает на перспективность его применения при продолжительном инфузионном введении.
6. Оптимизация технологии получения лекарственного средства
Для оптимизации и масштабирования технологии получения препарата RA-361 необходимо наладить процесс синтеза аминопроизводного олигонуклеотида. С помощью технологии, экспериментально разработанной в процессе исследования препарата, такая цель была осуществлена при использовании высокопроизводительного синтезатора АКТА oligopilot plus 100 и проточного колоночного картриджа с фиксированным объемом 6,3 мл (Column Reactor 6.3 ml, prod code 18-1101-13) с последующей депротекцией, очисткой полученного аминопроизводного препаративной хроматографией, получением и очисткой конъюгата.
Основным этапом масштабирования на текущей стадии производства аптамера является процесс твердофазного синтеза. Синтезируемая нуклеотидная последовательность аминопроизводного на 58% является G-богатой, оставшуюся часть последовательности составляют dT-нуклеотиды. Данная последовательность может в ряде случаев усложнять процесс синтеза из-за низкой эффективности конденсации dG-нуклеотида, а также чувствительность dT-богатых последовательностей к модификации во время процедуры депротекции, вызванной реакцией акрилонитрила с N3-позицией dT-остатков. Снижение эффективности конденсации dG-мономера в частности связано с тем, что связанные с носителем и защищенные dG- богатые олигомеры предрасположены к агрегированию, а также к снижению растворимости олигонуклеотида в ацетонитриле после достижения определенной длины и/или соотношения типа оснований в последовательности, вызывающих сложность к доступу 5'-ОН- гидроксильной группы [21]. Эти особенности в общем случае вызывают снижение выхода целевого продукта и увеличение содержания примесей олигонуклеотидной природы, в том числе и продуктов модификации основной последовательности.
Выбор подходящих составов рабочих реагентов и оптимизация параметров процесса синтеза позволяет значительно снизить влияние негативных факторов на качество получаемого продукта.
Для синтеза аминомодифицированного олигонуклеотида использовались коммерческий полимерный носитель Primer Support 200 dG-iBu Synth (200±10 μmol/g, cat no. 17-5290-02, далее в тексте PS 200 dG) компании GE Healthcare. Использование PS 200 dG при синтезе олигонуклеотидов, чья длина превышает 30 нуклеотидов, требует увеличения количества растворителей и реагентов на этапах промывки проточного реактора и детритилирования, в особенности на последних этапах синтеза для инициирования полного протекания реакции детритилирования. После этапа конъюгации аминомодифицированного dT-цианоэтил-фосфорамидита следует свести до минимума (или полностью исключить) этап кэппирования для снижения риска ацилирования первичной аминогруппы аминолинкера. Так как данная нуклеотидная вставка с аминолинкером расположена в 16-ой позиции последовательности, во второй половине синтеза этап кэппирования пропускается (15 циклов конденсации мономеров), что приводит к снижению выхода целевой нуклеотидной последовательности и увеличения в пределах допустимого количества примесей «недосинтеза» при тщательной оптимизации этапов депротекции и конденсации. Для предотвращения миграции ацильной группы с экзоциклической аминогруппы (dG-iBu на полимерном носителе) на аминогруппу линкерного нуклеотида, также после синтеза необходимо обрабатывать синтезированную последовательность перед депротекцией и отщепления от PS-носителя 20% раствором N,N-диалкиламином (например, диэтиламином в ацетонитриле), что увеличивает стабильность при хранении синтезированного олигонуклеотида на PS-носителе.
Подобная обработка также удаляет цианоэтильную защитную группу, которая может приводить к пришивке молекул акрилонитрила к N3-атому тимидина при депротекции данного основания, и опционально включена в процесс синтеза на синтезаторе АКТА Oligopilot plus 100. Находящаяся на аминолинкере TFA-защитная группа (TFA-трифторацетильная, лабильная в основных условиях, т.о. удаляющая в процессе депротекции результирующей последовательности) сокращает стабильность материала во время хранения на носителе после синтеза, а также является относительно восприимчивой к побочным реакциям по механизму трансацилирования во время синтеза.
Процесс синтеза рабочей нуклеотидной последовательности аминомодифицированного производного [5'-GGTTGGTGTGGTTGG 16-pos/iAmMC6T/GGTTGGTGTGGTTGG-3'] подобен синтезу на автоматизированном синтезаторе MerMade 48 компании BioAutomation (далее ММ48).
Последовательность присоединения нуклеотидного звена также состоит из следующих реакций:
Первая реакция, удаление 5'-диметокситритильной защитной группы от связанного с носителем нуклеозида. Реакция должна проводиться в максимально безводной среде (<3 ррт) в атмосфере аргона (ОСЧ качества). Отщепление защитной группы генерирует раствор ярко-оранжевой окраски, относительные количества которого могут мониторироваться по УФ-поглощению (контроль UV-Vis). На основании этих данных можно производить оценку эффективности реакций конденсации во время всего процесса синтеза (т.н. PAT, Process Analytical Technology - технология аналитического контроля процесса в режиме реального времени). Измеренное количество диметокситритильного иона интегрируется в режиме реального времени контролирующим синтезатор ПО. По количеству элюируемого диметокситритильного иона на текущем этапе синтеза можно судить о состоянии синтезируемой последовательности и характере конденсации следующего звена, что можно использовать для количественного анализа продолжающегося синтеза. Эта информация может быть использована для остановки текущего синтеза, если площадь и интенсивность интегрируемого пика станет ниже предустановленного предела, тем самым сократив расход дорогостоящих реагентов и потерю времени на получение олигонуклеотидной последовательности, не отвечающей заданным критериям качества.
Композиция рабочего раствора для проведения реакции детритилирования на синтезаторе АКТА Oligopilot 100 отличается от аналогичного раствора для синтеза на синтезаторе ММ48. Вместо сильной трихлоруксусной кислоты (ТХУ, pKa 0,7) используется более слабая дихлоруксусная кислота (ДХУ, pKa 1,5, рабочая концентрация в растворе 5% (w/v)), что приводит к снижению вероятности отщепления нуклеотидных оснований (депуринизация) во время детритилирования. Использование диметилформамидной защиты на гуанозиовом (dG-dmf) основании также снижает вероятность депуринизации. В качестве растворителя для масштабируемого синтеза используется толуол, использование которого, в отличие от дихлорметана, не вызывает дегазирования раствора и возникновения зон неравномерного распределения компонентов раствора в реакторе и насосе. Кроме того, использование раствора для детритилирования на основе толуола, не вызывает генерирования большого количества потенциально опасных хлорсодержащих отходов, утилизация которых требует особых подходов [22].
Мониторинг реакции детритилирования осуществляется при длинах волн 350 и 280 нм.
После детритилирования реактор промывается безводным ацетонитрилом для удаления оставшейся ДХУ и тритильного атиона, которые могут в процессе присоединения следующего нуклеотида генерировать N+1 примеси и снижать конечное содержание целевого олигонуклеотида;
Вторая реакция включает в себя конденсацию соответствующего фосфорамидитного мономера (dG-dmf-CE, dTCE или TFA-AmC6dT-CE фосфорамидита в концентрации 0,2 М, 2,2 эквивалента), смешанного с активатором (0,25 М 5-этил- 1Н-тиотетразол, ЕТТ, в безводном ацетонитриле, 60% (v/v)). Во время этой реакции формируется с высоким выходом (более 98%) фосфотриэфирная межнуклеотидная связь.
Для синтеза ДНК конденсация проводится путем рециркуляции раствора активатора и фосфорамидита через реактор в течение 3 минут, для конденсации амидита с аминолинкером используется более длительное время - 5 минут. После этапа конденсации выполняется промывка носителя безводным ацетонитрилом для удаления избытка реагентов и снижения возможного образования N+1 примесей.
Образованная при конденсации фосфотриэфирная межнуклеотидная связь в процессе окисления раствором йода с органическим основанием (обычно, пиридин или лутидин) переводится в фосфодиэфирную. После окисления носитель промывается безводным ацетонитрилом. Для проведения реакции используется проточная обработка носителя в реакторе раствором 0,05 М йода в смеси гетероциклического основания (обычно, пиридин, лутидин, коллидин) с водой в соотношении 90:10. Вода действует как донор кислорода, а йод образует аддукт с фосфорной связью, который разлагается водой, оставляя стабильную фосфодиэфирную связь [21, 22].
Последней реакцией в цикле присоединения мономерного звена является кэппирование непрореагировавшей 5'-гидроксильной группы с последующей промывкой носителя безводным ацетонитрилом. В стандартных условиях синтеза используется раствор уксусного ангидрида в ацетонитриле. При масштабировании синтеза G-богатых последовательностей изобутирильная защита аминогруппы у С2-позиции dG-основания фосфорамидитов может замещаться ацетильной группой в результате протекания реакции по механизму транс-амидирования на этапе кэппирования; подобную примесь нельзя устранить в стандартных условиях депротекции. Использование N-диметил-формамидной защиты и изобутирильного ангидрида устраняет данную проблему, блокируя свободную 5'-ОН-группу без возможности побочной реакции транс-амидирования [23]. - В конце синтеза включен единичный цикл обработки 20% раствором диэтиламина в ацетонитриле. При расщеплении линкероной связи между новосинтезированным олигонуклеотидом и носителем для защиты фосфатной группы используется -цианоэтильная группа. При депротекции данная группа отщепляется и в форме акрилонитрила взаимодействует с N3-позицией тимина с образованием цианоэтильного аддукта по механизму присоединения по Михаэлю, который невозможно удалить при хроматографической очистке смеси после синтеза. Этот эффект минимизируется обработкой носителя после синтеза алкиламинами (диэтиламин, трет-бутиламин) по механизму -элиминирования, результирующий продукт удаляется при обработке раствором депротекции. Этапы синтеза повторяются 30 раз для синтеза заданной последовательности.
Синтезированный олигонуклеотид подвергается процедуре отщепления и депротекции согласно инструкциям к твердофазному носителю PS 200 dG (Instruction 03-0015-79 AD, GE Healthcare). После синтеза носитель на реакторе сушиться в течение часа под вакуумом для количественной оценки изменения массы носителя после синтеза (взвешивания). Далее носитель еще раз разводится минимум в 1 объеме колонки (6,3 мл), переносится в емкость для работы с растворами под давлением с плотной крышкой, который затем заполняется охлажденным водным раствором концентрированного аммиака (35%) в соотношении 10 мл на 1 грамм носителя. Смесь инкубируется при мягком перемешивании при 55°С в течение 16 часов. После инкубации смесь охлаждается в течение 30 минут при -34°С и фильтруется на стеклянном фильтре с пористостью 3 (16-40 мкм). Фильтр промывается пятикратно водным раствором этанола (1:1) в объеме, равным объему использованного аммиачного раствора. Методом спектрофотомерии по прямому поглощению раствора при длине волны 260 нм определяется концентрация олигонуклеотида (выход с синтеза составляет 130-135 OD260/мкмоль).
Методом анионообменной ВЭЖХ определяется состав смеси и процентного содержание основного компонента. Сконцентрированный водный раствор олигонуклеотида разбавляется в перхлоратном буфере для хроматографической очистки. Примеси синтеза и остаточные низкомолекулярные компоненты реагентов удаляется методом препаративной анионообменной хроматографии на 150 мл колонне с АО-носителем Source 15Q (GE Healthcare).
Процесс пэгилирования аминопроизводного олигонуклеотида линейно масштабируется. Для удаления непрореагировавшего с ПЭГ 20 кДа олигонуклеотида и не удаленных на препаративной хроматографии олигонуклеотидных примесей удобно использовать процедуру переосаждения конъюгата по следующей методике.
На 30 мл реакционной смеси внести 3 мл 5 М водного раствора перхлората натрия, после чего добавить 100 мл ацетона (ХЧ), расфасовать в 50 мл пробирки типа фалькон и открутить раствор на центрифуге (15 мин, 3000 rpm). После центрифугирования отдекантировать полученный раствор от осадка. В осадке содержатся непрореагировавший олигонуклеотид и примеси сходной природы. Пэгилированный аптамер содержится в растворе, из которого после декантирования при слабом нагревании под вакуумом удаляется ацетон. Избыток непрореагировавшего ПЭГ удаляется препаративной анионообменной хроматографией; в качестве подвижной фазы используется 10 mM Tris, 50 mM NaCl, в качестве элюента - 10 mM Tris, 700 mM NaCl. Непрореагировавший ПЭГ элюируется практически сразу после инжекции, для его детекции первые фракции после очистки анализируются по поглощению при длине волны 280 нм (т.к. в хроматографе АКТА purifier 100 отсутствует функция мониторирования данной области поглощения в режиме он-лайн в процессе очистки). Единичный пик поглощения (пэгилированный олигонуклеотид) с хроматографической очистки обессаливается и концентрируется методом тангенциальной фильтрации. Полученный раствор сушится в течение 1,5 суток лиофилизацией, после чего передается на преформирование.
Приведенные выше данные позволяют заключить, что разработанная технология оптимизирована по сравнению с ранее описанными в литературе за счет выбора подходящих составов рабочих реагентов и оптимизации параметров процесса синтеза, таких как пропуск этапа кэппирования во второй половине синтеза, обработка синтезированной последовательности перед депротекцией и отщепления от PS-носителя 20% раствором N,N-диалкиламина, использование дихлоруксусной кислоты на этапе детритилирования и другие.
Список использованных источников
1. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin / Louis С Bock, Linda С Griffin, John A Latham et al. - 1992.
2. Marathias, Vasilios M. Structures of the potassium-saturated, 2: 1, and intermediate, 1: 1, forms of a quadruplex DNA / Vasilios M Marathias, Philip H Bolton // Nucleic acids research. - 2000. - Vol. 28, no. 9. - Pp. 1969-1977.
3. Schultze, Peter. Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer d (GGTTGGTGTGGTTGG) / Peter Schultze,  F Macaya, Juli Feigon // Journal of molecular biology. - 1994. - Vol. 235, no. 5. - Pp. 1532-1547.
4. High-resolution structures of two complexes between thrombin and thrombin-binding aptamer shed light on the role of cations in the aptamer inhibitory activity / Irene Russo Krauss, Antonello Merlino, AntonioRandazzo et al. // Nucleic acids research. - 2012. - P. gks512.
5. Golovin, A.V. Антитромбиновые аптамеры и способ стабилизации их структуры. - 2011. - WO Patent Арр. PCT/RU2010/000,750. http://www.google.com/patents/ WO 2011075004A1?cl=ru.
6. Юминова A.B. Смирнова И.Г., Арутюнян A.M. Копылов A.M. Головин А.В. Павлова Г.В. Структура G-квадруплексного ДНК- аптамера к тромбину RA36. / Арутюнян A.M. Копылов A.M. Головин А.В. Павлова Г.В. Юминова А.В., Смирнова И.Г. - Харьков, 2015. - Т. 56. - С. 51-55.
7. Module-activity relationship of G-quadruplex based DNA aptamers for human thrombin / E Zavyalova, A Golovin, G Pavlova, A Kopylov // Current medicinal chemistry. - 2013. - Vol. 20, no. 38. - Pp. 4836-4843.
8. Баркаган, З С. Диагностикая и контролируемая терапия нарушений гемостаза / З С Баркаган, А П Момот. - Ньюдиамед, 2001. 123
9. Гемокоагуляционная характеристика яда щитомордника agkistrodon halys halys и его тромбиноподобной фракции / ИБ Калмыкова, ОБ Зайченко, ЭС Садыков et al. // Вопросы медицинской химии. - 1990. - Vol. 36, no. 2. - Pp. 12-14.
10. Teien, Arne N. Heparin assay in plasma: A comparison of five clotting methods / Arne N Teien, Mette Lie // Thrombosis research. - 1975. - Vol.7, no. 5. - Pp. 777-788.
11. Rezaie, Alireza R. Determinants of specificity of factor xa interaction with its physiological inhibitors / Alireza R Rezaie // Mini reviews in medicinal chemistry. - 2006. - Vol. 6, no. 8. - Pp. 859-865.
12. Ingram, GI. Reference method for the one-stage prothrombin time test on hlman blood. International committee for standardization in hematology. / GI Ingram, M Hills // Thrombosis and haemostasis. - 1976. - Vol. 36, no. 1. - P. 237.
13. Stuart, RK. Monitoring heparin therapy with the activated partial thromboplastin time / RK Stuart, A Michel // Canadian Medical Association Journal. - 1971. - Vol. 104, no. 5. - P. 385.
14. Teien, Ame N. Assay of heparin in plasma using a chromogenic substrate for activated factor X / Arne N Teien, Mette Lie, Ulrich Abildgaard // Thrombosis research. - 1976. - Vol. 8, no. 3. - Pp. 413-416.
15. Teien, Arne N. Evaluation of an amidolytic heparin assay method: increased sensitivity by adding purified antithrombin III / Arne N Teien, Mette Lie // Thrombosis research. - 1977. - Vol. 10, no. 3. - Pp. 399-410.
16. Yin, E Thye. Plasma heparin: a unique, practical, submicrogramsensitive assay / E Thye Yin, Stanford Wessler, Janet V Butler // Translational Research. - 1973. - Vol. 81, no. 2. - Pp. 298-310.
17. Parenteral anticoagulants: American College of Chest Physicians evidence-based clinical practice guidelines / Jack Hirsh, Kenneth A Bauer, Maria В Donati et al. // Chest Journal. - 2008. - Vol. 133, no. 6_suppl. - Pp. 141S-159S.
18. Fenyvesi, Tivadar. Monitoring of anticoagulant effects of direct thrombin inhibitors / Tivadar Fenyvesi, Ingrid Jorg, Job Harenberg // Seminars in thrombosis and hemostasis / New York: Stratton Intercontinental Medical Book Corporation, C1974-. - Vol. 28. - 2002. - Pp. 361-368.
19. Физиология человека/Под ред. чл.-кор. АМН СССР НА Агаджаняна / НА Агаджанян, ЛЗ Тель, ВИ Циркин, С А Чеснокова // 124 Алма-Ата: Казахстан. - 1992.
20. Александров, Станислав. Кролики: разведение, выращивание, кормление / Станислав Александров, Татьяна Косова. - Litres, 2014.
21. Sproat, Brian Stephen. Oligonucleotides containing high concentrations of guanine monomers. - 2013. - US Patent 8,586,728.
22. Manufacture of therapeutic oligonucleotides: Development of new reagents and processes / Nanda D Sinha, Satya N Kuchimanchi, Greg Miranda, Saied Shaikh // Indian Journal of Chemistry Section B. - 2006. - Vol. 45, no. 10. - P. 2297.
23. Formation of the N 2-acetyl-2, 6-diaminopurine oligonucleotide impurity caused by acetyl capping / Andrew A Rodriguez, Isaiah Cedillo, Brendan P Mowery et al. // Bioorganic & medicinal chemistry letters. - 2014. - Vol. 24, no. 15. - Pp. 3243-3246.