КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ ЛИГАНД CD40L, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Применение IL-2 и/или IL-21 для совместного культивирования кроличьих B-клеток с фидерными клетками.
2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что фидерные клетки представляют собой клетки млекопитающих, экспрессирующие CD40L кролика.
3. Cпособ культивирования антитело-секретирующих кроличьих B-клеток, включающий в следующем порядке:
i) первое совместное культивирование кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии стимулятора митоза, и
ii) последующее второе совместное культивирование кроличьих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L кролика, в присутствии стимулятора продукции антитела.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что стимулятор митоза выбран из группы, включающей соединения, взаимодействующие с CD40 и CD40L, соединения, взаимодействующие с индуцибельным костимулятором T-клеток (ICOS) и лигандом ICOS (ICOS-L), индуцирующий пролиферацию лиганд (APRIL), активирующий B-клетки фактор (BAFF), рецептор комплемента 2 типа (CR2), хемокиновый лиганд с мотивом CXC (CXCL9), CXCL12 (фактор стромальных клеток 1 типа (SDF-1)), CXCL13, CXCL16, лиганд Fms-подобной тирозинкиназы (Flt-3L), интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-7, интерлейкин-10, интерлейкин-14, интерлейкин-21, белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов SLAM (SAP), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR), такие как липополисахарид (LPS), различные олигодезоксинуклеотиды на основе цитозинфосфатгуанина CpG или резиквимод (R-848), лимфопоэтин из стромы тимуса (TSLP), фактор некроза опухоли (TNF) альфа, интерфероны I типа (например, IFN α/β), интерфероны II типа (например, IFNγ).
5. Способ по любому из пп. 3 или 4, отличающийся тем, что стимулятор продукции антитела выбран из группы, включающей соединения, взаимодействующие с CD40 и CD40L, соединения, взаимодействующие с ICOS и ICOS-L, APRIL, BAFF, CR2, CXCL9, CXCL12 (SDF-1), CXCL13, CXCL16, Flt-3L, интерлейкин-1 (α/β), интерлейкин-2, интерлейкин-3, интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-9, интерлейкин-10, интерлейкин-13, интерлейкин-21, интерлейкин-33, SAP (белок, ассоциированный с сигнальной молекулой активации лимфоцитов), частицы золотистого стафилококка штамма Cowan 1 (SAC, убитые нагреванием, фиксированные формалином), лиганды TLR, такие как LPS, различные олигодезоксинуклеотиды на основе CpG или резиквимод (R-848), TSLP, фактор некроза опухоли (TNF) альфа, интерфероны I типа (например, IFN α/β), интерфероны II типа (например, IFNγ).
6. Применение SAC для совместного культивирования антитело-секретирующих B-клеток, возможно с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L и/или IL-2, и/или IL-21, и/или IL-6.
7. Способ получения антитела, включающий этап совместного культивирования человеческих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, в присутствии IL-2 или IL-21, или IL-6 или их комбинации.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что B-клетки представляют собой незрелые B-клетки.
9. Способ по любому из пп. 7-8, отличающийся тем, что совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2, или IL-2 и IL-21, или IL-2 и IL-21 и IL-6.
10. Способ по любому из пп. 7-9, отличающийся тем, что B-клетка представляет собой одиночную осажденную B-клетку.
+
11. Способ по любому из пп. 7-10, отличающийся тем, что B-клетки представляют собой IgG-положительные B-клетки (IgG B-клетки).
12. Применение IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 для совместного культивирования человеческих B-клеток с фидерными клетками.
13. Применение по п. 12, отличающееся тем, что фидерная клетка представляет собой клетку млекопитающих, экспрессирующую CD40L человека.
14. Применение по любому из пп. 12-13, отличающееся тем, что применяют IL-2, или IL-2 и IL-21, или IL-2 и IL-21, и IL-6.
15. Способ культивирования человеческих B-клеток, секретирующих антитело, которое специфически связывается с поверхностным антигеном T-клеток и опосредует передачу ингибирующего сигнала в T-клетки, включающий совместное культивирование человеческих B-клеток и клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, в присутствии IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6.
16. Способ получения антитела, которое специфически связывается с антигеном, включающий следующие этапы:
a) совместное культивирование пула антитело-секретирующих человеческих B-клеток или одиночных антитело-секретирующих человеческих B-клеток с клетками млекопитающих, экспрессирующими CD40L человека, в присутствии IL-2 и/или IL-21, и/или IL-6,
b) культивирование клеток, содержащих в составе одной или нескольких экспрессионных кассет нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельные участки антитела, секретируемого человеческими B-клетками, культивируемыми совместно на этапе (a), или ее вариант,
c) выделение антитела из клеток или культуральной среды и таким образом получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что способ включает следующие этапы:
a) обеспечение популяции антитело-секретирующих (зрелых) человеческих B-клеток,
b) окрашивание клеток, входящих в популяцию человеческих B-клеток, по меньшей мере одним флуоресцентным красителем (в одном воплощении с использованием от одного до трех, или от двух до трех флуоресцентных красителей),
c) осаждение одиночных клеток из популяции окрашенных B-клеток в отдельные контейнеры (в одном воплощении контейнер представляет собой лунку многолуночного планшета),
d) культивирование осажденных отдельных человеческих B-клеток в присутствии клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, а также IL-2 и/или IL21 и/или IL-6,
e) определение специфичности связывания антител, секретируемых в культуральную среду отдельными человеческими B-клетками,
f) определение аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей специфически связывающихся антител, и получение таким образом при помощи ПЦР с обратной транскрипцией и секвенирования нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела,
g) включение нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельные домены легкой и тяжелой цепей моноклонального антитела, в экспрессионную кассету для экспрессии антитела,
h) введение нуклеиновой кислоты в клетку,
i) культивирование клетки и выделение антитела из клетки или культуральной надосадочной жидкости и, таким образом, получение антитела, которое специфически связывается с антигеном.
18. Способ по любому из пп. 16-17, отличающийся тем, что совместное культивирование осуществляют в присутствии IL-2, или IL-2 и IL-21, или IL-2 и IL-21 и IL-6.
19. Применение клеток млекопитающих, экспрессирующих CD40L человека, IL-2 и/или IL-21 и/или IL-6 для совместного культивирования антитело-секретирующих человеческих B-клеток.
20. Применение по п. 19, отличающееся тем, что применяют IL-2, или IL-2 и IL-21, или IL-2 и IL-21 и IL-6.