Способы и средства для диагностики гриппа
METHODS AND KITS FOR DIAGNOSIS OF INFLUENZA

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет, заявленный в предварительной заявке на патент США №61/807,185, поданной 1 апреля 2013 года, под названием «Point Of Care (РОС) Influenza Antiviral Susceptibility Test», содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Некоторые приведенные варианты осуществления изобретения представляют собой способы, композиции, устройства и системы для диагностики гриппа в месте наблюдения за пациентом. Некоторые варианты осуществления изобретения представляют собой комбинированные методы анализа. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ для идентификации вируса гриппа типа «А» или типа «В» сочетают с анализом на чувствительность нейраминидазы вируса гриппа к противовирусному препарату.
ИЗВЕСТНЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Грипп является постоянной серьезной угрозой для здоровья населения. Каждый год в Соединенных Штатах сопутствующие гриппу заболевания приводят к 200000 случаев госпитализации и 36000 смертей. С точки зрения последствий на национальном уровне, общие экономические издержки в 2010 году, связанные со вспышками гриппа, составили $29 млрд. Противовирусная терапия гриппа эффективна для лечения или профилактики заболевания только в случае своевременного начала. Ряд исследований позволяет заключить, что препараты против нейраминидазы сокращают продолжительность симптомов. Эффективность препаратов «Тамифлю» (Tamiflu) и «Реленза» (Relenza) при профилактике сезонного гриппа составляет 80%. При лечении больных гриппом рекомендуется начать терапию как можно раньше, в течение 48 часов с момента проявления симптомов. Оперативная диагностика и начало противовирусной терапии приводит к наилучшему исходу для пациента.
[0004] На основании распространенной устойчивости к блокаторам М2-каналов разумно предположить, что широкое использование ингибиторов нейраминидазы в конечном итоге может привести к появлению устойчивости к ним у вируса сезонного или пандемического гриппа. В ходе клинических исследований был выявлен ряд мутантов, устойчивых к ингибиторам нейраминидазы. За три года наблюдение было выделено восемь вариантов вируса с более чем десятикратной сниженной восприимчивостью к Осельтамивиру (oseltamivir). Эти выводы должны притормозить массовое распространение препаратов на основе ингибиторов нейраминидазы для лечения сезонного гриппа. В 2010 году Всемирная Организация Здравоохранения ВОЗ (WHO) впервые провела глобальную консультацию по противовирусной резистентности в Гон Конге после появления резистентного к осельтамивиру вируса гриппа в течение зимнего периода 2007-2008 и обнаружения резистентности к осельтамивиру HSN1 и пандемического гриппа H1N1 (2009). Одним из ключевых результатов этой консультации стало требование составления официальной государственной отчетности по противовирусной резистентности гриппа, как в клинических условиях, так и в рамках национального эпидемоилогического надзора. Кроме того, некоторые противовирусные препараты наподобие осельтамивира имеют побочные эффекты, поэтому их назначают только в случае необходимости. Спектр действия различных противовирусных препаратов может варьироваться в зависимости от поставщика и имеет различную стоимость для пациента. Врач обязан прописывать только то, что необходимо. Несмотря на то, что эффективность препарата важнее его стоимости, врач обязан проинформировать пациента о вариантах в случае, если есть возможность обойтись менее дорогим препаратом. В соответствии с вышеизложенным, на сегодняшний день требуется диагностика в месте наблюдения за пациентом, которая сможет обеспечить точный диагноз с целью избежание побочных эффектов, замедления развития лекарственной устойчивости и экономии финансовых средств пациента и системы здравоохранения США.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] Некоторые приведенные варианты осуществления способов, средств, систем и композиций включают способ обнаружения вируса гриппа, включающий: (а) контакт образца с иммунологическим буфером, предназначенным для иммуноанализа с целью обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», для получения образца для иммунологического исследования; (б) контакт первой порции образца для иммунологического исследования с тест-системой, включающий иммуноанализ для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», посредством которого происходит определение наличия или отсутствия в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В»; (в) контакт второй порции образца для иммунологического исследования с матрицей, включающий буфер для анализа активности нейраминидазы; включающей образец нейраминидазы; и (г) контакт исследуемого образца нейраминидазы с тест-системой для определения активности нейраминидазы, посредством чего определяют наличие в образце нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический буфер не подходит для анализа активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический буфер подавляет активность нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадии (в) и (г) проводятся в одном резервуаре.
[0006] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают способ обнаружения вируса гриппа, включающий: (а) контакт образца с буфером для анализа активности нейраминидазы, посредством которого получают исследуемый образец нейраминидазы; (б) контакт первой порции исследуемого образца нейраминидазы с тест-системой, включающей иммуноанализ для определения вируса гриппа типа «А» или типа «В», причем исследуемый образец нейраминидазы контактирует с матрицей, включающей иммунологический буфер, посредством чего получают образец для иммунологического исследования и определяют наличие или отсутствие в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В»; и (в) контакт второй порции исследуемого образца нейраминидазы с тест-системой для определения активности нейраминидазы, посредством которого определяют наличие в образце нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер для анализа активности нейраминидазы не подходит для иммуноанализа для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер для анализа активности нейраминидазы подавляет специфическое связывание антитела с антигеном, выбранным из следующей группы: вирус гриппа типа «А» и вирус гриппа типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица включает лиофилизированный или полностью высушенный буфер. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия (в) проводится в резервуаре, включающем несколько отсеков.
[0007] В некоторых вариантах осуществления способов определения вируса гриппа резервуар включает несколько отсеков. В некоторых вариантах осуществления изобретения резервуар включает отсек с матрицей и отсек с реагентами для анализа активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица содержит поперечно сшитый полисахарид. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрицу выбирают из следующей группы: сефадекс и сефароза.
[0008] В некоторых вариантах осуществления изобретения образец для иммунологического исследования и исследуемый образец нейраминидазы перемещаются внутри резервуара посредством одной или нескольких указанных сил: гравитация, капиллярный эффект и диффузия.
[0009] В некоторых вариантах осуществления изобретения резервуар включает картридж. В некоторых вариантах осуществления изобретения резервуар включает мультилуночный картридж, адаптированный для чтения фотоумнжителем. В некоторых вариантах осуществления изобретения фотоумножитель выбирают из следующей группы: фотоумножительная трубка и микро-фотоумножительная трубка. В некоторых вариантах осуществления изобретения фотоумножитель является портативным. В некоторых вариантах осуществления изобретения фотоумножитель находится в портативном считывающем устройстве, подходящем для работы в кабинете лечащего врача. В некоторых вариантах осуществления изобретения фотоумножительная трубка имеет круглую поверхность и диаметр от 6 мм до 9 мм, или микро-фотоумножительная трубка имеет прямоугольную поверхность и размеры от 1 мм до 3 мм.
[0010] В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает определение чувствительности нейраминидазы к исследуемому соединению. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает: (а) получение соотношения величин ингибирования, причем соотношение включает уровень активности нейраминидазы в присутствии исследуемого соединения, отнесенный к уровню активности нейраминидазы в отсутствие исследуемого соединения; и (б) сравнение соотношения величин ингибирования с порогом ингибирования, посредством чего происходит определение чувствительности активности нейраминидазы к исследуемому соединению. В некоторых вариантах осуществления изобретения порог ингибирования устанавливают посредством обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения первый порог ингибирования применяют в случае обнаружения вируса типа «А», а второй порог ингибирования применяют в случае обнаружения вируса типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения первый порог ниже, чем второй. В некоторых вариантах осуществления изобретения порог ингибирования определятся исследуемым соединением.
[0011] Некоторые варианты осуществления изобретения также включают выбор исследуемого соединения для лечения гриппа.
[0012] В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает двойной иммуноферментный анализ, включающий сигнальный фермент. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом проявления активности нейраминидазы является образование субстрата для сигнального фермента. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с люциферином или его производным. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом проявления активности нейраминидазы является образование ингибитора сигнального фермента. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с трифторметилкетоном или его производным. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальный фермент включает люциферазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер для иммунологического анализа подавляет активность люциферазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень активности нейраминидазы измеряют с помощью фотоумножительной трубки.
[0013] В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуемое соединение представляет собой противовирусный препарат. В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуемое соединение представляет собой противовирусный препарат, выбранный из указанной группы: Осельтамивир (Oseltamivir), Занамивир (Zanamivir), Ланамивир (Lanamivir) и Перамивир (Peramivir).
[0014] В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ включает «сэндвич»-метод.
[0015] В некоторых вариантах осуществления изобретения образец получают от субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект предположительно болен гриппом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.
[0016] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают способ выбора лечения вируса гриппа, включающий: (а) контакт образца с иммунологическим буфером, предназначенным для иммуноанализа для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», посредством чего получают образец для иммунологического исследования; (б) контакт первой порции образца для иммунологического исследования с тест-системой, включающий иммуноанализ для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», посредством чего определяют наличие или отсутствие в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В»; (в) контакт второй порции образца для иммунологического исследования с матрицей, включающей буфер для анализа активности нейраминидазы, посредством чего получают исследуемый образец нейраминидазы; (г) контакт исследуемого образца нейраминидазы с тест-системой для анализа активности нейраминидазы, посредством чего определяют чувствительность нейраминидазы в исследуемом образце нейраминидазы к исследуемому соединению, определение включает: (1) получение соотношения величин ингибирования, причем соотношение включает уровень активности нейраминидазы в присутствии одного или нескольких исследуемых соединений, отнесенный к уровню активности нейраминидазы в отсутствии одного или нескольких исследуемых соединений, и (2) сравнение соотношения величин ингибирования с порогом ингибирования, посредством чего определяют чувствительность активности нейраминидазы к исследуемому соединению; и (д) выбор исследуемого соединения из одного или нескольких исследуемых соединений, подавляющих активность нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический буфер не подходит для анализа активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический буфер подавляет активность нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадии (в) и (г) проводят в одном резервуаре.
[0017] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают способ выбора лечения вируса гриппа, включающий: (а) контакт образца с буфером для анализа активности нейраминидазы, предназначенного для анализа нейраминидазы, посредством чего получают исследуемый образец нейраминидазы; (б) контакт первой порции исследуемого образца нейраминидазы с тест-системой, включающий иммуноанализ для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», причем исследуемый образец нейраминидазы контактирует с матрицей, включающей иммунологический буфер, посредством чего получают образец для иммунологического исследования и определяют наличие или отсутствие в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В»;
и (в) контакт второй порции исследуемого образца нейраминидазы с тест-системой для определения активности нейраминидазы, посредством чего определяют чувствительность нейраминидазы в исследуемом образце нейраминидазы к исследуемому соединению, определение включает: (1) получение соотношения величин ингибирования, причем соотношение включает уровень активности нейраминидазы в присутствии одного или нескольких исследуемых соединений, отнесенный к уровню активности нейраминидазы в отсутствии одного или нескольких исследуемых соединений, и (2) сравнение соотношения величин ингибирования с порогом ингибирования, посредством чего определяют чувствительность активности нейраминидазы к исследуемому соединению; и (г) выбор исследуемого соединения из одного или нескольких исследуемых соединений, подавляющих активность нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица содержит лиофилизированный или иными словами полностью высушенный иммунологический буфер. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадию (в) проводят в том же самом резервуаре. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадию (в) проводят в резервуаре, включающем несколько отсеков.
[0018] В некоторых вариантах осуществления способов выбора лечения вируса гриппа порог ингибирования определяют посредством обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения первый порог ингибирования применяют в случае обнаружения вируса типа «А», а второй порог ингибирования применяют в случае обнаружения вируса типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения первый порог ниже, чем второй.
[0019] В некоторых вариантах осуществления изобретения резервуар включает многолуночную тест-полоску или картридж, приспособленные для считывания при помощи фотоумножительной трубки или микро-фотоумножительной трубки. В некоторых вариантах осуществления изобретения фотоумножительная трубка и микро-фотоумножительная трубка являются портативными. В некоторых вариантах осуществления изобретения фотоумножительная трубка находится в портативном считывающем устройстве, подходящем для работы в кабинете лечащего врача. В некоторых вариантах осуществления изобретения фотоумножительная трубка имеет круглую поверхность и диаметр от 6 мм до 9 мм, или микро-фотоумножительная трубка имеет прямоугольную поверхность и размеры от 1 мм до 3 мм.
[0020] Некоторые варианты осуществления изобретения включают выбор исследуемого соединения для лечения гриппа.
[0021] В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает сигнальный фермент. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом проявления активности нейраминидазы является образование субстрата для сигнального фермента. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с люциферином или его производным. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом проявления активности нейраминидазы является образование ингибитора сигнального фермента. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с трифторметилкетоном или его производным. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальный фермент включает люциферазу.
[0022] В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень активности нейраминидазы измеряют с помощью фотоумножительной трубки.
[0023] В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуемое соединение представляет собой противовирусный препарат. В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуемое соединение представляет собой противовирусный препарат, выбранный из указанной группы: Осельтамивир (Oseltamivir), Занамивир (Zanamivir), Ланамивир (Lanamivir) и Перамивир (Peramivir).
[0024] В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ включает «сэндвич»-метод.
[0025] В некоторых вариантах осуществления изобретения образец получают от субъекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект предположительно болен гриппом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком. В некоторых вариантах осуществления изобретения образец получали от субъекта и рекомендовали субъекту принимать выбранное исследуемое соединение для лечения гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения образец получали от субъекта и обеспечивали субъекта выбранным исследуемым соединением для лечения гриппа.
[0026] Некоторые варианты осуществления изобретения включают диагностическую тест-систему для обнаружения вируса гриппа, включающую: картридж для определения активности нейраминидазы в образце, причем картридж приспособлен для обработки образца, включающего несовместимый буфер для определения, и образца, включающего совместимый буфер для определения; тест-систему для обнаружения в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В», причем тест-система приспособлена для обработки образца, включающего несовместимый буфер для обнаружения, и образца, включающего совместимый буфер для обнаружения; первый детектор для измерения сигнала от картриджа (тест-системы); и второй детектор выполнен с возможностью измерения сигнала из картриджа.
[0027] В некоторых вариантах осуществления изобретения картридж включает отсек для матрицы, содержащий матрицу, содержащую совместимый буфер для определения, и отсек для реагентов, содержащий реагенты для определения активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица в картридже содержит поперечно сшитый полисахарид. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрицу в картридже выбирают из указанной группы: сефадекс и сефароза.
[0028] В некоторых вариантах осуществления изобретения отсек для матрицы и отсек для картриджа гидравлически сообщаются таким образом, что нанесенный на матрицу образец перетекает из отсека для матрицы в отсек для реагентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения образец перемещается в картридже посредством одной или нескольких указанных сил: гравитация, капиллярный эффект, диффузия.
[0029] В некоторых вариантах осуществления изобретения картридж включает многолуночный картридж, приспособленный для считывания посредством фотоумножительной трубки или микро-фотоумножительной трубки.
[0030] В некоторых вариантах осуществления изобретения тест-система включает иммуноанализ. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ представляет собой «сэндвич»-метод. В некоторых вариантах осуществления изобретения тест-система включает матрицу, включающую совместимый буфер для обнаружения. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица содержит нитроцеллюлозу. В некоторых примерах осуществления изобретения совместимый буфер для обнаружения лиофилизирован или полностью высушен.
[0031] В некоторых вариантах осуществления изобретения первый детектор включает люминометр. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый детектор включает считывающее устройство, работающее в режиме отражения. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй детектор включает фотоумножительную трубку или микро-фотоумножительную трубку. В некоторых вариантах осуществления изобретения прибор включает первый и второй детекторы. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй детекторы есть одно и то же.
[0032] В некоторых вариантах осуществления изобретения прибор является портативным. В некоторых вариантах осуществления изобретения прибор является карманным.
[0033] Некоторые варианты осуществления изобретения включают средство для обнаружения вируса, включающее: картридж для определения активности нейраминидазы в образце, причем картридж предназначен для обработки образца, включающего несовместимый буфер для определения, и образца, включающего совместимый буфер для определения, и тест-систему для обнаружения в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В», причем тест-система предназначена для обработки образца, включающего несовместимый буфер для обнаружения, и образца, включающего совместимый буфер для обнаружения. Некоторые варианты осуществления изобретения включают первый детектор, предназначенный для измерения сигнала от образца; и второй детектор, предназначенный измерения сигнала от картриджа. Некоторые варианты осуществления изобретения включают реагенты для анализа активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения реагенты для анализа активности нейраминидазы выбирают из указанной группы: люцифераза, конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с люциферином или его производным, конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с трифторметилкетоном или его производным и противовирусный препарат. В некоторых вариантах осуществления изобретения противовирусный препарат выбирают из указанной группы: Осельтамивир (oseltamivir), Занамивир (zanamivir), Ланамивир (lanamivir) и Перамивир (peramivir). Некоторые варианты осуществления изобретения включают реагенты для иммуноанализа. В некоторых вариантах осуществления изобретения реагенты для иммуноанализа выбирают из указанной группы: антитело, специфичное к антигену вируса гриппа типа «А», и антилело, специфичное к антигену вируса гриппа типа «В»
[0034] Некоторые варианты осуществления изобретения включают маскированный ингибитор, предназначенный для двойного иммуноферментного анализа чувствительности нейраминидазы вируса гриппа со структурой согласно формуле (I):
1
2
3
4
5
5
m
3
2
z
3
причем R, R и R независимо представляют собой водород или (С1-5)алкил; n равно 0, 1, 2 или 3; R представляет собой -(CH2)C(=0) CF; m равно 0 или 1; X представляет собой -S(0)- или -CH(R)-; R представляет собой -(0)СН; и z равно 0, 1 или 2.
[0035] В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (I) выбирают из указанной группы:
и
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
[0036] На Фиг. 1 представлен вариант осуществления тест-полоски для иммуноанализа и считывающего устройства для системы Veritor System (Becton Dickinson.).
[0037] На Фиг. 2 представлен вариант схемы работы, комбинирующей иммунохроматографический анализ и анализ лекарственной чувствительности.
[0038] На Фиг. 3 представлен вариант осуществления изобретения для определения соотношения сигналов при анализе лекарственной чувствительности.
[0039] На Фиг. 4 представлен вариант синтеза маскированного ингибитора.
[0040] На Фиг. 5 представлен вариант картриджа для кинетического иммуноферментного анализа нейраминидазы.
[0041] На Фиг. 6 представлена графическая зависимость между интенсивностью сигнала, выраженной в относительных световых единицах, и концентрацией флуоресцентного контроля, измеренной при помощи портативного считывающего устройства.
[0042] На Фиг. 7 представлена графическая зависимость между интенсивностью сигнала, выраженной в относительных световых единицах, и разведением вируса при анализе активности нейраминидазы, демонстрирующая применимость двойного иммуноферментного анализа для выбора наилучшего противовирусного препарата, механизм действия которого основан на угнетении активности нейраминидазы. В данном примере Реленза превосходит Тамифлю.
[0043] На Фиг. 8 представлена графическая зависимость величин ингибирования для ряда разведений различных вирусов гриппа типа «А», демонстрирующая наличие отдельной величины ингибирования, которая позволяет отличить резистентный к лекарственным препаратам штамм вируса гриппа типа «А» от нерезистентного и не совпадает с аналогичной величиной ингибирования для штаммов гриппа типа «В», и BD (Beckton Dickinson) позволяет установить непосредственно в месте наблюдения за пациентом РОС (МНП), когда тест на чувствительность к противовирусным препаратам AST (ЧПП) последует за обычным тестом на идентификацию вируса гриппа Flu ID (ИВГ), обеспечивающим А/В типирование.
[0044] На Фиг. 9 представлена графическая зависимость величин ингибирования для ряда разведений различных вирусов гриппа типа «В», демонстрирующая наличие отдельной величины ингибирования, которая позволяет отличить резистентный к лекарственным препаратам штамм гриппа типа «В» от нерезистентного и не совпадает с аналогичной величиной ингибирования для штаммов гриппа типа «А»; и BD позволяет установить в МНП условиях, когда тест на ЧПП последует за обычным тестом на ИВГ, обеспечивающим А/В типирование.
[0045] На Фиг. 10 представлена графическая зависимость величин ингибирования для различных разведений смесей вирусов, демонстрирующая способность описанной технологии отметить присутствие резистентных к лекарственным препаратам штаммов, существующих в смешанной клеточной культуре. Даже более значимой является продемонстрированная способность отмечать высокорезистентные штаммы гриппа, активность нейраминидазы которых чувствительна к рН.
[0046] На Фиг. 11 представлена химическая структура варианта субстрата для нейраминидазы, NANA-CF3 (маскированный ингибитор), и трифторкетона (свободный ингибитор), использующихся в варианте осуществления каскада реакций при двойном иммуноферментном анализе для теста на чувствительность к противовирусным препаратам.
[0047] На Фиг. 12 представлен вариант осуществления полного каскада реакций при двойном иммуноферментном анализе при участии маскированного и свободного ингибиторов.
[0048] На Фиг. 13 представлены графики, построенные по результатам двух различных двойных иммуноферментных анализов, и демонстрирующие диапазон чувствительности, который можно достичь при помощи двойной иммуноферментной аналитической технологии.
[0049] На Фиг. 14 представлен вариант осуществления тест-полоски для иммуноферментного анализа, содержащей предварительно нанесенные реагенты для выделения нуклекапсида.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0050] Некоторые приведенные варианты осуществления способов, композиций, средств, устройств и систем включают комбинированную диагностику в месте наблюдения за пациентом (МНП) и направляющую противовирусную терапию. В некоторых вариантах осуществления изобретения портативную платформу можно использовать медицинским персоналом с ограниченными лабораторными навыками. Некоторые варианты осуществления изобретения включают технологию иммунохроматографического анализа на тест-полосках для обнаружения гриппа, включающую анализ для обнаружения резистентных к противовирусным препаратам штаммов непосредственно в донорских штаммах без какого-либо культивирования на клеточных культурах.
[0051] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций включают комбинированный анализ, при котором образец анализируют на (1) наличие вируса гриппа типа «А» или типа «В»; и (2) чувствительность нейраминидазы вируса гриппа к одному или нескольким антивирусным препаратам. Как правило, образец, приготовленный для иммуноанализа на наличие вируса гриппа типа «А» или типа «В», не подходит для анализа активности вирусной нейраминидазы. Например, лизирующий буфер для иммуноанализа может угнетать активность вирусной нейраминидазы. Некоторые приведенные варианты осуществления способов и композиций включают способы проведения иммуноанализа и анализа активности нейраминидазы в одном и том же образце, содержащем исходный буфер, совместимый с одним из анализов. Некоторые из этих вариантов представляют собой экспресс-анализ типа вируса гриппа и помогают при выборе противовирусного препарата для лечения.
[0052] Кроме того, некоторые приведенные варианты осуществления изобретения значительно повышают чувствительность подобного анализа. В некоторых вариантах осуществления изобретения идентификация типа вируса гриппа в образце предоставляет дополнительные данные для анализа результатов определения резистентности или чувствительности нейраминидазы вируса гриппа к противовирусному препарату. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно выбрать пороговую величину ингибирования для вируса гриппа типа «А» или типа «В», соответствующую конкретному противовирусному препарату, и использовать ее для определения чувствительности или резистентности нейраминидазы вируса к данному противовирусному препарату.
[0053] Некоторые приведенные варианты осуществления изобретения включают интеграцию двух аналитических методов с целью усиления лечебного эффекта для пациента. Приведенные варианты осуществления изобретения значительно улучшают чувствительность аналитических методов обнаружения вируса гриппа. Кроме того, оба аналитических метода позволяют работать с одним и тем же объемом образца. В некоторых вариантах осуществления изобретения первоначальный иммуноанализ и подходящий для него экстрагирующий буфер остаются неизменными, что позволяет не подвергать уже коммерциализированный анализ новым клиническим исследованиям. В некоторых вариантах осуществления изобретения образец в буфере, подходящем для определения типа вируса гриппа, можно преобразовать в образец в буфере, подходящий для определения чувствительности нейраминидазы к лекарственному препарату. В некоторых вариантах осуществления изобретения образец в буфере, подходящем для определения чувствительности нейраминидазы к лекарственному препарату, можно преобразовать в образец в буфере, подходящем для определения типа вируса гриппа. В некоторых вышеизложенных вариантах осуществления изобретения преобразование может происходить в течение периода времени, подходящего для диагностики в месте наблюдения за пациентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения период времени, подходящий для диагностики в месте наблюдения за пациентом, может составлять менее одного дня, менее 12 часов, менее 6 часов, менее 3 часов, менее 1 часа, менее 30 минут, менее 10 минут, менее 5 минут, менее 1 минуты и находиться между любым из указанных интервалов.
[0054] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций могут предоставить величины ингибирования для конкретных лекарственных препаратов посредством определения чувствительности нейраминидазы к лекарственному препарату, причем данные величины значительно ниже аналогичных, полученных в результате других предварительных анализов. Такие величины ингибирования позволяют установить резистентность или чувствительность варианта вируса гриппа к конкретному лекарственному препарату. Улучшенная чувствительность приводит к уменьшению количества ошибочных результатов, указывающих на резистентность вируса к лекарственному препарату, в то время как это не соответствует истине.
[0055] Некоторые варианты осуществления изобретения включают компонент для идентификации гриппа, включающий иммунохроматографический анализ на тест-полосках, подразумевающий использование наночастиц для детекции, фокусирующийся на присутствии нуклеокапсида вируса гриппа и использующий считывающее устройство с функцией передачи данных по типированию вируса гриппа (тип «А» или тип «В») в считывающий модуль, таким образом получая наиболее подходящую величину ингибирования для конкретного лекарственного препарата, которую можно использовать в дальнейших исследованиях на предмет определения чувствительности или резистентности вируса. В некоторых вариантах осуществления изобретения компонент для идентификации гриппа предоставляет информацию о типе вируса гриппа компоненту для определения лекарственной чувствительности без дальнейшего вмешательства человека.
[0056] Некоторые варианты осуществления изобретения включают двойной иммуноферментный анализ для определения лекарственной чувствительности, способствующий увеличению активности нейраминидазы вируса гриппа. Таким образом, первый фермент (нейраминидаза) расщепляет первый субстрат с высвобождением второго субстрата, с которым взаимодействует второй фермент, участвующий в генерировании сигнала.
[0057] Несколько версий двойного иммуноферментного анализа совместимы с вариантами осуществления изобретения, раскрытыми в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом первой реакции «фермент-субстрат» может быть субстрат, взаимодействующий со вторым ферментом, при этом сигнал усиливается с увеличением количества антигена вируса гриппа и ослабевает в присутствии противовирусного препарата. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом первой реакции «фермент-субстрат» может быть соединение, действующее как ингибитор второй реакции «фермент-субстрат». В некоторых вариантах осуществления изобретения первый субстрат представляет собой маскированный ингибитор, то есть прекурсор ингибитора. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнал ослабляется при увеличении количества антигена вируса гриппа и усиливается в присутствии эффективного противовирусного препарата. Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций включают двойной иммуноферментный анализ, крайне чувствительный к нейраминидазе вируса гриппа вплоть до ее концентраций в диапазоне от 10 пкмоль до 100 фентамоль.
[0058] В настоящее время наиболее эффективные противовирусные препараты для лечения гриппа нацелены на нейраминидазу. Двумя основными препаратам группы ингибиторов нейраминидазы являются Занамивир (RELENZA™) и Осельтамивир (TAMIFLU™). На первичном приеме у пациента могут не обнаружить штаммы вируса гриппа, резистентные к данным препаратам, что в дальнейшем приведет к дополнительному стрессу, которого можно избежать посредством МНП анализа резистентности вируса к лекарственным препаратам. В США и других промышленно развитых странах тест на чувствительность к противовирусным препаратам проводится главным образом в государственных лабораториях как компонент эпидемиологического надзора, вдали от пациентов и спустя долгое время после посещения ими лечащего врача. До недавнего времени сложно было представить, что подобные тесты можно проводить в лаборатории при врачебном кабинете. Кроме того, реагенты для данного теста не обладали чувствительностью, достаточной для проведения прямого тестирования на образце, не контактировавшем с клеточными культурами. Требовался более чувствительный химический метод, направленный на независимый антиген, а также портативное считывающее устройство, способное считывать несколько выходных сигналов в режимах отражения, флуоресценции и люминесценции. Соответственно, существует потребность в чувствительном и быстром тесте на лекарственную устойчивость вируса гриппа, который будет способствовать более рациональному использованию противовирусных препаратов.
[0059] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают МНП тест на наличие вируса гриппа типа А+В, нацеленный на конкретный набор вирусных эпитопов посредством иммунологического анализа, и оценку лекарственной устойчивости вируса гриппа посредством таргетирования отдельного вирусного антигена, нейраминидазы. Сочетание этих антигенов в целом приводит к более эффективному обнаружению вируса гриппа, одновременно задавая вектор последующей терапии.
[0060] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают чувствительный иммуноанализ нуклеокапсида и кинетический иммунолоанализ для измерения активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения кинетический иммуноанализ может включать двойной кинетический иммуноферментный анализ. Двойной кинетический иммуноферментный анализ для измерения активности нейраминидазы совместно с иммуноанализом нуклеокапсида могут включать люциферазу в качестве второго фермента и конъюгаты на основе люциферазы в качестве субстрата. Вирус гриппа типа «А» и типа «В» имеет на своей поверхности гликопротеины и нейраминидазу, способную гидролизовать субстраты, содержащие связанную альфа-кетозидной связью N-ацетилнейраминовую кислоту. В некоторых вариантах осуществления изобретения тесты на чувствительность к противовирусным препаратам-ингибиторам нейраминидазы предполагают использование субстратов, являющихся гибридными молекулами (конъюгатами), включающими N-ацетинейраминовую кислоту и люциферин. Окисление люциферина в присутствии люциферазы приводит к высвобождению энергии в виде света, количественно прямо пропорциональной остаточной активности нейраминидазы в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут использовать конъюгаты N-ацетинейраминовой кислоты и люциферина светлячков из набора QFlu™ Combo kit производства компании Cellex.
[0061] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают считывающее устройство. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут использовать считывающее устройство системы Veritor™ System (Beckton Dickinson) с функцией люминометрии. Люминометр могут использовать совместно с различными расходными материалами для иммунохроматографического анализа на тест-полосках, включающими иммунохроматографический картридж и тест-полоски с микролунками. Дополнительная чувствительность и гибкость за счет использования одноразовых расходных материалов могут способствовать повторному тестированию образца, на сегодняшний день использующегося только для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В».
50
[0062] В случае вспышки гриппа забор образца и тест на обнаружение вируса гриппа типа «А» или типа «В» проводит врач-терапевт. Остатки образцов отправляют в государственную лабораторию для проведения теста на лекарственную чувствительность, а результаты публикуются на сайте правительства для ознакомления. Несмотря на то, что целью некоторых из приведенных в данном документе способов и композиций является помощь лечащему врачу в поиске наилучшего противовирусного препарата-ингибитора нейраминидазы ИНА (ΝΑΙ), они также позволяют в дальнейшем улучшить чувствительности базовых вирусных тестов, проводимых в лаборатории при врачебном кабинете, так как нейраминидазу и нуклеокапсид можно протестировать на одном и том же образце. Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций также предоставляют возможность собрать более точные данные по резистентности к антивирусным препаратам для эпидемиологического надзора, так как многие ведущие в этом вопросе авторитеты считают, что истинный фенотип нейраминидазы может меняться в случае выделения вируса на культуре клеток почки коккер-спаниэля (MDCK), являющегося обязательным этапом трудоемкого традиционного анализа на чувствительность к лекарственным препаратам с расчетом IC.
50
[0063] Измерения активности нейраминидазы в присутствии и отсутствии лекарственного препарата регулярно проводят в лабораториях по всему миру как компонент эпидемиологического надзора за вирусом гриппа. Хотя измерение активности нейраминидазы на основе использования клеточных культур может только выиграть от дополнительной стандартизации, оно, тем не менее, является надежным средством определения лекарственной резистентности в клинических образцах после того, как клеточная культура произвела достаточное количество вируса. Для измерения активности нейраминидазы вируса гриппа обычно используют хемилюминесцентные субстраты, такие как NA-Star™ (Applied Biosystems). В противоположность этому, некоторые приведенные в данном документе способы и композиции добавляют в коктейль реагентов еще один фермент, действующий на субстрате, созданном реакцией нейраминидазы. Некоторые приведенные в данном документе способы и композиции таким образом усиливают сигнал от собственного фермента вируса гриппа. Второй фермент, в свою очередь, служит для замены этапа выделения вируса на культуре клеток, входящего в состав более традиционной лабораторной процедуры надзора. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнал от системы Veritor™ System может подтвердить наличие достаточного количества вирусного антигена для анализа активности нейраминидазы, тем самым заменяя лабораторное титрование вируса, часто применяемое при расчете IC. При достижении сигналом конкретной интенсивности в процессе проведения иммуноанализа, соотношение сигналов люминесценции (активность фермента в отсутствии лекарственного препарата: активность фермента в присутствии лекарственного препарата) является допустимым.
[0064] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций включают быструю, простую в использовании и недорогую платформу. Некоторые варианты осуществления изобретения могут быть нацелены на осуществление нескольких сценариев тестирования, обеспечивая МНП лаборатории при врачебном кабинете высокопроизводительным инструментом исследований. Эти же качества полезны в условиях ограниченности ресурсов и во время пандемий.
[0065] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций включают Veritor™ System, портативную или карманную систему с улучшенной главным образом за счет новейших патентованных индикаторных частиц чувствительностью. См. фиг. 1, на которой представлен вариант осуществления тест-полоски для иммуноанализа и считывающего устройства для системы Veritor System (Becton Dickinson.), т.e. оснащены оборудованием, считывающим создаваемый потенциал, что предполагает определение антимикробной чувствительности.
[0066] Некоторые полезные свойства, делающие Veritor™ System подходящей для широкого применения: 1) Простота в использовании, позволяющая даже относительно неквалифицированным медицинскому персоналу работать с системой, и портативность, делающая возможным перемещение системы в различные места проведения тестов (врачебные кабинеты, аптеки, реабилитационные центры и другие места потенциального использования). 2) Максимально широкий круг пациентов за счет уникальной возможности проведения теста на чувствительность к противовирусным препаратам непосредственно в месте наблюдения за пациентом (МНП). 3) Использование в биологических средах. 4) Низкая стоимость внедрения. 5) Комбинированная система, позволяющая определять вирус гриппа типа «А» или типа «В» в мазках из носа, смывах из носоглотки или аспиратах с возможностью пометить штаммы, устойчивые к лекарственным препаратам. В конечном итоге значительно улучшается диагностика, лечение и надзор. 6) Батарейное питание. 7) Легкое считывающее устройство небольших размеров - 15 см (Ш) × 15 см (В) × 15 см (Д).
[0067] Приведенные на Фиг. 1 схема иммунохроматографического анализа на тест-полосках и мембраны демонстрируют возможность интегрирования двух и более анализов различной химической природы. Субстраты для иммунохроматографического анализа на тест-полосках позволяют проводить химические реакции с участием двух различных ферментов в правильной последовательности, при которых буферы можно заменять, другие реагенты можно наносить заранее и различные виды сигнала можно считывать в различных регионах субстрата.
[0068] В некоторых вариантах осуществления изобретения находящиеся в реакционной зоне твердые носители (например, целлюлоза) и индикаторные частицы являются стандартными компонентами устройств для иммунохроматографического анализа на тест-полосках. См., напр., US 5,998,221 и US 6,194,220, относящиеся к количественному иммунохроматографическому анализу на тест-полосках и включенные в данный документ во всей полноте посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения проведение количественного иммунохроматографического анализа на тест-полосках является полезным при проверке адекватности количества вирусного антигена для теста на резистентность к противовирусным препаратам. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунохроматографические тест-полоски для иммунохроматографического анализа могут содержать отдельные мембраны для зоны образца и зоны конъюгата. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунохроматографическая тест-полоска может включать несколько мембран. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунохроматографическая тест-полоска может включать четыре мембраны. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунохроматографическая тест-полоска может включать четыре мембраны в иммунохроматографической кассете для иммунохроматографического анализа на тест-полосках. В других вариантах осуществления изобретения одна мембрана используется для размещения как образца, так и полностью высушенного конъюгата.
[0069] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций включают двойную иммуноферментную систему. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут использовать компоненты реагентной системы «субстрат-фермент» производства компании Cellex. С подробным описанием химических свойств и реакций эстеразы при двойном иммуноферментном анализе можно ознакомиться в следующих публикациях: Mize et al., Dual Enzyme Cascade, Analytical Chemistry, 179, (1989) p229-235; U.S. Patent 4,904,583; и U.S. Patent 4,835,099, включенные в данный документ во всей полноте посредством ссылки.
[0070] Некоторые приведенные в данном документе способы и композиции включают модификации фермента люцифераза и субстраты для данных модификаций, включающие конъюгаты нейраминовой кислоты и люциферина. В некоторых вариантах осуществления изобретения амплификацию можно провести при помощи введения другого второго фермента (эстераза) и блокированного (маскированного) ингибитора на основе фторкетона. На Фиг. 4 представлен синтез варианта маскированного ингибитора эстеразы. На Фиг. 4 представлен вариант субстрата для нейраминидазы, включающего карбаминовые или карбонатные связи.
[0071] Некоторые приведенные в данном документе способы и композиции включают широкий спектр возможных конфигураций формата. В некоторых вариантах осуществления изобретения полное проведение иммунологического и двойного иммуноферментного анализа может включать формат иммунохроматографического анализа на тест-полосках. В некоторых подобных вариантах осуществления изобретения образец, обрабатываемый одним и тем же эсктрагирующим реагентом, можно поместить в зону для образца и через несколько секунд считать результаты теста на наличие вируса гриппа с наконечника иммунохроматографической кассеты, а также сформулировать рекомендации по терапии. В некоторых вариантах осуществления изобретения изменение цвета можно измерить при помощи считывающего устройства в режиме отражения. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие измерения, как измерение в режиме отражения, можно проводить на мембране с целью обнаружения вируса гриппа, а такие измерения, как измерения в режиме хемилюминесценции, флуоресценции или измерения хромофор, можно проводить с целью тестирования лекарственной чувствительности. В некоторых вариантах осуществления изобретения измерения проводят при помощи считывающего устройства, относящегося к прибору для обнаружения и/или количественного анализа данных, такому как тест-полоски. Такие считывающие устройства раскрыты и описаны в U.S. Pat. №№6,267,722, 6,394,952 и 6,867,051, включенных в данный документ во всей полноте посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения считывающее устройство в режиме отражения относится к прибору, приспособленному для считывания тест-полосок с использованием отраженного света, включающая флуоресценцию или электромагнитное излучение любой длины волны. Отраженный свет можно обнаружить при помощи фотоприемника или другого детектора, такого как детектор с зарядовой связью ПЗС (CCD).
[0072] Сигналы при иммуноанализе и анализе на лекарственную чувствительность можно фиксировать при помощи стандартного детектора, такого как ПЗС камера. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический анализ и анализ на чувствительность к лекарственным препаратам можно проводить при помощи различных детекторов, таких как ПЗС и фотоумножительная трубка. В некоторых вариантах осуществления изобретения используют портативные ПЗС камеры с охлаждением для количественных измерений хемилюминесценции «на местах». В некоторых вариантах осуществления изобретения хемилюминесцентный анализ на чувствительность к противовирусным препаратам можно также проводить при помощи PIN-диода с усилителем с низким уровнем шума.
[0073] В некоторых вариантах осуществления изобретения в случае несовместимости первой реакции фермента при двойном иммуноферментном анализе с реагентами для иммуноанализа, устройство предварительной обработки двойного иммуноферментного анализа работает автономно, и частично обработанный образец с расщепленным субстратом загружают в зону для образца, которая может перемещаться по тест-полоске за счет капиллярного эффекта по направлению к твердой подложке, содержащей люциферазу и другие реагенты, необходимые для генерирования люминесцентного сигнала. В данной конфигурации сигналы при иммуноанализе и анализе на чувствительность к лекарственным препаратам можно считывать при помощи стандартного детектора, такого как ПЗС камера. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический анализ и анализ на чувствительность к лекарственным препаратам можно проводить при помощи различных детекторов, таких как ПЗС и фотоумножительная трубка.
[0074] В некоторых вариантах осуществления изобретения двойной иммунохроматографический анализ на тест-полосках можно проводить путем погружения отсека иммунохроматографической кассеты с расщепленным люциферином в лунку с люциферазой и другими реагентами, необходимыми для генерирования люминесцентного сигнала. Затем свет, образующийся в процессе проведения двойного иммуноферментного анализа, измеряют при помощи системы Luminoskan TL Pus или аналогичного люминометра.
[0075] В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ проводят на иммунохроматографической кассете, а двойной иммуноферментный анализ проводят на луночной тест-полоске. Хотя для этих двух анализов берут один и тот же экстрагированный образец, их проводят в различном формате, затем считывают данные при помощи одного устройства, приспособленного для работы в режимах отражения и хемилюминесценции (или флуоресценции или другого оптического сигнала). При проведении иммунологического анализа и анализа на чувствительность к лекарственным препаратам сигнал можно регистрировать при помощи одного детектора, например, ПЗС камеры, или разных детекторов, например, ПЗС и фотоумножительной трубки.
[0076]
Общий подход к определению варианта осуществления изобретения:
[0077] Как показано на Фиг. 2, заявитель исследовал несколько вариантов проведения типирования вируса гриппа и теста на чувствительность к противовирусным препаратам на одном и том же образце. В одном варианте осуществления изобретения образец был разделен и обработан двумя различными экстрагирующими буферами, при этом каждая порция образца использовалась для проведения только одного анализа. Ограничение этого подхода заключается в том, что в некоторых ситуациях объем образца бывает недостаточным для проведения обоих ЧИП и ИВГ тестов. В одном варианте осуществления изобретения протестировали общий экстрагирующий реагент и буфер, подходящий для проведения обоих анализов. Ограничение этого подхода заключается в том, что условия проведения кинетического и иммуноанализа имеют различия, делающие использование общего буфера не особенно оправданным. В другом варианте осуществления изобретения использовали один экстрагирующий буфер, подходящий для проведения как ИВГ, так и ЧИП теста, с преобразованием буфера в противоположный анализ в режиме реального времени. Этот вариант осуществления изобретения обеспечил достаточный объем образца и уровень чувствительности обоих анализов. На Фиг. 2 представлены несколько вариантов разработанных форматов проведения ИВГ и ЧПП теста. Используются соответствующие считывающие устройства и расходные материалы для сочетания иммунохроматографического анализа на тест полосках и двойного иммуноферментного анализа (например, если для ЧИП теста используется луночная тест-полоска, то для считывания данных может использоваться отдельное считывающее устройство для лучночных тест-полосок, тогда как в случае использования иммунохроматографической тест-полоски при проведении обоих анализов может использоваться одно и то же считывающее устройство для иммунохроматографического анализа).
[0078] В некоторых вариантах осуществления изобретения используют общий экстрагирующий реагент для проведения иммунохроматографического и двойного иммуноферментного анализов.
[0079] В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунохроматографический формат используется как для иммунохроматографического анализа, так и для двойного иммуноферментнного анализа, при котором измерение резистентности к противовирусным препаратам основано на перемещении нейраминидазы по нитроцеллюлозной зоне. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ проводят на образце ~150 мкл, часто остающемся после загрузки иммунохроматографического картриджа. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или оба объема образца можно измерить на луночной тест-полоске в качестве одинакового анализа).
[0080] В некоторых вариантах осуществления изобретения система включает люминометр, например, Tropix или Bethold, портативный люминометр, например, HG-2 производства компании Shanghi Huguo Science Instrument Company.
[0081] В некоторых вариантах осуществления изобретения источник вируса может включать замороженный, позитивный на грипп клинический образец с целью проверки функциональности кинетического и иммуноанализа в присутствии человеческих назальных выделений.
Двойной иммуноферментный анализ для определения чувствительности к противовирусным препаратам
[0082] Как показано на Фиг. 3, некоторые варианты осуществления кинетического двойного иммуноферемнтного анализа для определения активности нейраминидазы может включать люциферазу в качестве второго фермента и конъюгат на основе люциферазы в качестве субстрата. Иолкен сообщил о флуоресцентных субстратах для нейраминидазы в 1980 году. Бакстон сообщил о хемилюминесцентных субстратах для нейраминидазы в 2000 году, Гамильтон выполнил в 2004 году параллельное сравнение теста ZestatFlu-II, одобренного Управлением по контролю продуктов питания и лекарственных средств США (FDA), который использует в качестве хемилюминесцентного субстрата для нейраминидазы при идентификации вируса гриппа. До сих пор ни одна система «один фермент-один субстрат» не превратилась в надежный тест на лекарственную чувствительность, подходящий для проведения в лаборатории при врачебном кабинете. Причиной этому может быть чувствительность, которая может быть достигнута только системой с более мощным усилением сигнала. Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают двойную ферментную систему, включающую конъюгат люциферина. После взаимодействия с нейраминидазой вируса гриппа конъюгат продуцирует свободный люциферин, который, в свою очередь, взаимодействует с люциферазой. Раскрытые в данном документе варианты осуществления изобретения, такие как двойные ферментные хемилюминесцентные системы, могут обеспечить достаточное усиление сигнала для МНП диагностики чувствительности вируса гриппа к противовирусным препаратам. Примеры реагентов, подходящих для приведенных в данном документе способов и композиций, включают реагенты из набора QFlu™ Combo Test производства компании Cellex.
Демонстрация выполнения иммунологического анализа гриппа А/В и теста на лекарственную чувствительность на одном и том же экстрагированном образце.
[0083] Некоторые варианты осуществления изобретения включают демонстрацию совместимости конкретных реакционных стадий / реагентов, применяемых в одно и то же время и в непосредственной близости друг от друга или даже в одном и тот же пространстве. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический анализ нуклеокапсида и двойной иммуноферментный анализ активности нейраминидазы можно контролировать на предмет ухудшения чувствительности, специфичности, диапазона результатов количественного анализа, разрешения и скорости выхода на результат. Для получения успешного результата полная совместимость всех стадий этих двух анализов не обязательна. В некоторых вариантах осуществления изобретения реагенты для иммуноанализа Veritor™ и реагенты для двойного иммуноферментного анализа, использующиеся в анализе QFlu™ производства компании Cellex (в настоящее время применяются для целей надзора) используются в раскрытых способах, композициях, средствах, устройствах и системах. Одним из исследуемых реагентов был лизирующий реагент, использующийся в обоих анализах. В некоторых вариантах осуществления изобретения лизирующий реагент для анализа Veritor™ используют для подготовки образца для проведения теста на определение вируса гриппа типа «А»/«В» и теста на чувствительность к противовирусным препаратам. В других вариантах осуществления изобретения лизирующий реагент для анализа QFlu™ производства компании Cellex используют для подготовки образца для проведения теста на определение вируса гриппа типа «А»/«В» и теста на чувствительность к противовирусным препаратам.
Скрининг интерференции теста на чувствительность/резистентность к противовирусным препаратам
50
[0084] Вирус гриппа типа «А» и типа «В» имеет на своей поверхности гликопротеины и нейраминидазу, способную гидролизовать субстраты, содержащие N-ацетилнейраминовую кислоту с альфа-кетозидными связями, иногда обозначаемую Neu5Ac. Субстраты, исследуемые на предмет применения для теста на чувствительность к противовирусным препаратам на основе определения активности нейраминидазы, включали гибридные молекулы (конъюгаты), включавшие N-ацетилнейраминовую кислоту и люциферин. Окисление люциферина в присутствии люциферазы приводит к высвобождению энергии в виде света, количественно прямо пропорциональной остаточной активности нейраминидазы в образце. В одном варианте осуществления изобретения был исследован конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты и люциферина светлячков из набора QFlu™ Combo kit производства компании Cellex, в настоящее время использующегося для осуществления эпидемиологического надзора. В некоторых вариантах осуществления изобретения сопоставительные эксперименты проводят на культивированных стоках вируса, при этом две отдельные реакции проводятся для каждого условия теста, например, одна реакция включает противовирусный препарат (пример: осельтамивир), а другое измерение активности нейраминидазы выполнено без противовирусного ингибитора. Контрольный образец можно проанализировать при помощи разрабатываемого экспресс-метода и одного из рекомендованных ВОЗ методов, включающих расчет IС. В некоторых вариантах осуществления изобретения скрининг реагентов для теста на чувствительность к противовирусным препаратам может проводиться в микролунке, пробирке, кювете или плашке, а данные считываются в режиме хемилюминесценции или флуоресценции. Скрининг может проводиться на резистентных и чувствительных к противовирусным препаратам штаммах вируса гриппа. В случае срочной необходимости, чистую нейраминидазу можно прикрепить к образцу и использовать для скрининга интерференции. Замороженные, позитивные на грипп клинические образцы можно регулярно проверять на наличие других компонентов назального секрета, которые могут помешать проведению двойного иммуноферментного анализа.
Скрининг интерференции иммунологического анализа
[0085] В некоторых вариантах осуществления изобретения скрининг реагентов для обнаружения вируса гриппа можно проводить в хроматографическом формате и получать данные в режиме отражения, что в настоящее время позволяет осуществить тест-система Veritor™, имеющая сертификат ограниченных возможностей CLIA и одобренная FDA. Иммунологический анализ BD Veritor™ использует два моноклональные антитела, направленных на нуклеокапсид вируса гриппа. Одно антитело иммобилизовано на поверхности патентованных золотых наночастиц, другое - на нитроцеллюлозе в иммунохроматографической кассете. Интенсивность сигнала от реакции, происходящей в зоне нитроцеллюлозы на тест-полоске, пропорциональна количеству вируса гриппа в образце. Тестирование реагентов для двойного иммуноферментного анализа на возможную интерференцию с тест-системой Veritor™ можно проводить в присутствии образцов, позитивных на вирус гриппа типа «А» (грипп A/PR/8/34) и типа «В» (грипп B/Lee/40) и подготовленных с получением конечной концентрации, соответствующей умеренно положительной (~5 раз уровень обнаружения). Интерференция может проявляться как ложный положительный результат в образцах, не содержащих вирус гриппа типа «А» или «В», или как ложный отрицательный результат в образцах, содержащих вирус гриппа типа «А» или «В». Использованию подлежат только те реагенты для двойного иммуноферментного анализа, которые не проявляют интерференцию. В случае срочной необходимости, чистый нуклеокапсид можно прикрепить к образцу и использовать для дальнейшего скрининга.
Другие химические особенности двойного иммуноферментного анализа
[0086] Другие тест-системы для двойного иммуноферментного анализа включают субстраты, похожие на используемые в тест-системе производства компании Cellex и включающие конъюгаты N-ацетилнейраминовой кислоты и люциферина, однако с другим связующим агентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут использоваться другие ферменты люциферазы.
Определение формата/расходных материалов для анализа на лекарственную чувствительность
[0087] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций включают выбор подходящего формата комбинированного анализа. В некоторых вариантах осуществления изобретения в случае установленной совместимости иммуноанализ и двойной иммуноферментный анализ лучше всего проводить в хроматографическом формате. При использовании хроматографического формата для обоих анализов образец, обрабатываемый экстрагирующим реагентом, загружают в зону для образца и несколько секунд спустя считывают данные по наличию вируса гриппа типа «А»/«В» с наконечника иммунохроматографической кассеты, после чего формулируют рекомендации по терапии, основываясь на данных по лекарственной чувствительности. Измерения в режиме отражения для определения вируса гриппа и измерения в режиме хемилюминесценции для теста на лекарственную чувствительность могут производиться непосредственно на иммунохроматографической мембране. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут использоваться портативные охлаждаемые ПЗС камеры для количественных измерений хемилюминесценции «на местах».
[0088] В некоторых вариантах осуществления изобретения в случае несовместимости реакции первого фермента с другими реагентами при проведении двойного иммуноферментного анализа, устройство предварительной обработки двойного иммуноферментного анализа работает автономно и частично обработанный образец с расщепленным субстратом загружают в хроматографическую зону для образца, которая может перемещаться по тест-полоске за счет капиллярного эффекта по направлению к твердой подложке, содержащей люциферазу и другие реагенты, необходимые для генерирования люминесцентного сигнала.
[0089] В некоторых вариантах осуществления изобретения двойной иммуноферментный анализ в хроматографическом формате могут проводить путем погружения отделения иммунохроматографической кассеты с расщепляемым люциферином в лунку с люциферазой и другими реагентами, необходимыми для генерирования люминесцентного сигнала. Затем свет, производимый в процессе проведения двойного иммуноферментного анализа, измеряют при помощи системы Luminoskan TL Pus или аналогичного люминометра.
[0090] В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ проводят на иммунохроматографической кассете, а оптимизированный анализ Qflu™ Combo assay производства компании Cellex проводят на луночной тест-полоске. Эти два анализа проводятся на одном экстрагированном образце, хотя имеют различные форматы; считывание данных происходит при помощи одного прибора, работающего в режиме отражения (иммунохроматографическая кассета) и хемилюминесценции (луночная тест-полоска). В некоторых вариантах осуществления изобретения используются два разных прибора. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или несколько приборов являются портативными, имеют небольшие размеры, батарейное питание и могут быть размещены в кабинете врача, например, на столе или портатвином медицинском стенде.
Валидация тест-системы
[0091] Тестовый набор из 20 штаммов вируса гриппа можно
культивировать и пронумеровать с целью проведения анализа финальной комбинированной платформы (интегрированные расходные материалы, считывающее устройство и реагенты) на чувствительность вплоть до концентрации вирусных частиц 10Е3 (выражается в единицах ТСID50/мл или СЕID50/мл). Тестовый набор из 20 штаммов может включать равное количество штаммов гриппа типа «А» и типа «В». Штаммы вируса гриппа типа «А» могут представлять собой смесь вирусов HIN1 и H3N2. Тестовый набор может включать резистентные и чувствительные штаммы TamiFlu™. Тестовый набор может также включать штаммы, резистентные и чувствительные ко второму препарату ИНА. Для прогресса бенчмаркинга финальной интегрированной системы можно использовать около 100 замороженных позитивных на вирус гриппа клинических образцов.
Противовирусные препараты для разработки и валидации
[0092] В ТАБЛИЦЕ 1 представлены примеры противовирусных
препаратов ИНА (ингибитор нейраминидазы), подходящих для использования совместно с приведенными в данном документе способами и композициями. Поскольку население не должно полагаться на обязательную чувствительность недавно циркулирующих штаммов гриппа к осельтамивиру и занамивиру, желательно генерировать данные по диагностике чувствительности вируса к противовирусным препаратам в МНП условиях.
Штаммы вируса гриппа, изоляты и контрольные коллекции
[0093] ТАБЛИЦА 2 содержит примеры конкретных фенотипов игенотипов, использующихся совместно с некоторыми приведенными в данном документе вариантами осуществления способов и композиций. Можно получить как резистентные, так и чувствительные к препаратам-ингибиторам нейраминидазы штаммы вируса гриппа типа «А» и «В» (BSL-2) для дальнейшего исследования. В некоторых вариантах осуществления изобретения, приведенные в данном документе способы и композиции включают по большей части нейраминидазу вируса гриппа типа «А» и нейраминидазу вируса гриппа типа «В».
Бенчмаркинг
50
[0094] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают расчет IC для одноточечного анализа QFlu™ Combo and Immunoassays. Системы Veritor™ и QFlu™ можно использовать согласно инструкции на вкладыше. Существует множество вариантов готовых наборов для расчета IC50, например, NA-Star™ Kit производства компании Applied Biosystems / Life Technologies. В ТАБЛИЦЕ 3 приведены примеры источников и каталожных номеров расходных материалов, используемых для тестирования противовирусных препаратов.
50
Методы расчета IC
[0095] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления методов и композиций можно сравнить с хемилюминесцентным анализом ИНА, проводимым при помощи коммерчески доступного набора NA-Star Kit (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния), включающим буфер NA-Star (26 мкмоль MES, 4 мкмоль СаСl2, рН 6.0), субстрат NA-Star, акцелератор NA-Star и 96-луночные белые матовые планшеты. Кат. номер 4374348 и 4374349. Более подробная информация о способах расчета IC50, подготовке и анализе можно найти в публикации ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY, Sept. 2008, p.3284-3292 Vol.52, No. 9, полностью включенной в данный документ посредством ссылки.
Выбор образца (мазок, смыв, аспират) и его влияние на чувствительность анализа
[0096] Некоторые варианты осуществления изобретения включают три варианта образца (прямое тестирование мазков, тестирование носоглоточных смывов или аспиратов). Некоторые варианты осуществления изобретения включают тестирование замороженного образца и культуры, а также возможность проведения иммуноанализа нуклеокапсида и анализа активности нейраминидазы от одного сбора.
Прямое тестирование мазков
[0097] Некоторые приведенные в данном документе вариант осуществления способов и композиций включают использование мазков для сбора образцов. Первый иммуноанализ Veritor™ основан на сборе мазков сухим тампоном, при этом весь образец намеренно помещают в «Обрабатывающий Реагент» (объем 400 мкл) и согласно инструкции на вкладыше наносят на иммунохроматографическую тест-полоску в течение часа. Обычно после загрузки ~80 мкл объема в иммунохроматографическую кассету остается несколько сотен микролитров, то есть большое количество неиспользуемых обработанных антигенов, которые можно направить на тестирование чувствительности к противовирусным препаратам. Путь обработки образца не подразумевает распределения по вирусным культурам, в некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ и кинетический анализ могут выполнять на или вблизи их пикового уровня обнаружения с некоторыми оставшимися образцами, которые могут быть дополнены стабилизатором нуклеиновой кислоты для последующего обнаружения ПЦР.
Тестирование носоглоточных смывов / аспиратов
2
4
[0098] Платформа Veritor™ включает в себя способ, при котором концентрированный муколитический реагент добавляют к собранному образцу в пропорции 3:1 перед загрузкой в иммунохроматографическую кассету. Триста микролитров суспензии каждого организма добавляют в трубку, содержащую RV Reagent С or RV Reagent D как предлагает BD (например, набор для системы Veritor™ для экспресс-диагностики гриппа А/В (Продукт №256045). Более 10 сред для хранения и транспортировки были успешно протестированы с данными образцами носоглоточных смывов/ аспиратов. Примеры сред для хранения и транспортировки включают: M4RT, М4, М5, UTM, среда Эймса (жидкая), среда Bartel Vira Trans™, сбалансированный солевой раствор Хенкса, изотонический раствор, физиологический раствор с фосфатным буфером. Среда M4RT имеет рН 7.3 при 25°С и содержит сбалансированный солевой раствор Хенкса: СаСl2, MgCl2-6H20, MgS04-7H20, КСl, КНР0, NaCl, Na2HP04-7H20, глюкоза. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения образец для изучения распространения вируса можно получить из носоглоточного смыва/аспирата до добавления муколитического агента. При использовании носоглоточного смыва/аспирата можно принять во внимание возможную роль разведения антигена. Анализ Veritor™ обладает большей чувствительностью, чем любой другой экспресс-анализ на рынке.
Хемилюминесценые методы и параметры для обеспечения чувствительности
3
50
[0099] Хемилюминесценция методы, подходящие для совместного использования со способами и композициями, приведенными в данном документе, включают раскрытые в патентах США №№8,221,976; 8,163,237; 7,947,820; 7,642,060; 7,291,488; 5,736,365; 5,639,428; 5,561,044; 5,518,884; 5,470,723; 5,457,027; 5,314,801; 5,017,473; и 4,810,631, каждый из которых включен в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения параметры двойного иммуноферментного теста в значительной мере похожи на параметры (например, уровень обнаружения вириона гриппа), полученные при помощи иммуноанализа Veritor™. В некоторых вариантах осуществления изобретения химические механизмы обнаружения присутствия нейраминидазы могут обеспечить достаточный сигнал при 10 TCID, а также устойчивое соотношение 5:1 между реакциями с/без участия лекарственного препарата. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно достичь как чувствительности, так и длинного линейного диапазона. В некоторых вариантах осуществления изобретения может использоваться Cellex.
Некоторые химические механизмы
[00100] На Фиг. 12 представлены химические механизмы на основе эстеразы, которые можно использовать совместно с приведенными в данном документе композициями и способами для анализа активности нейраминидазы. Методы, подходящие для совместного использования с приведенными в данном документе вариантами осуществления способов и композиций, включают раскрытые в следующих документах: Mize et al., Dual Enzyme Cascade, Analytical Chemistry, 179, (1989) с 229-235; патент США 4,904,583; патент США 4,835,099, каждый из которых включен в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки. Некоторые варианты осуществления изобретения включают модифицированные люциферазы и их субстраты, такие как модифицированные конъюгаты нейраминовой кислоты и люциферина. Для использования также подходят другие ингибиторы, включающие:
Некоторые возможные бета-тио- варианты ингибиторов/маскированных ингибиторов
[0100] Соединение на Фиг. 12 имеет трифторкетон в пара-положении. Другие ингибиторы эстеразы включают 1,1,1-трифтор-4-(4-гидроксифенил)бутан-2-он (пара); 1,1,1- трифтор-4-(3-гидроксифенил)бутан-2-он (мета); и 1,1,1-трифтор-4-(2-гидроксифенил)бутан-2-он (орто).
[0101] Альтернативные маскированные ингибиторы для использования с раскрытыми в настоящем документе вариантами осуществления изобретения включают варианты с трифторкетоном в мета- и орто-положениях, как показано ниже:
[0102] В другом варианте осуществления изобретения 4,7-метилированная ацетилнейраминовая кислота (NАNА)-трифторкетон может использоваться при двойном иммуноферментном анализе с маскированным ингибитором, с большей специфичностью по отношению к нейраминидазе вируса гриппа.
[0103] Некоторые варианты осуществления изобретения включают
маскированное соединение-ингибитор для использования в двойном иммуноферментном анализе для определения чувствительности нейраминидазы со структурой Формулы (I):
1
2
3
4
5
5
1-5
2
m
3
z
z
3
Причем R, R и R независимо представляют собой водород или С алкил; n равно 0, 1, 2 или 3; R представляет собой -(CH)C(=0)CF; m равно 0 или 1; X представляет собой -S(0)- или -CH(R)-; R представляет собой -S(0)CH; и z равно 0, 1 или 2.
[0104] В некоторых вариантах осуществления изобретения соединение формулы (I) выбирают из следующей группы:
и
Секвенирование ДНК
[0105] В некоторых вариантах осуществления изобретения данные по генотипу получают из образца вириона гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения определенный вирусный изолят может продемонстрировать различные профили лекарственной чувствительности при расчете IC50 в тканевой культуре и МНП экспресс-тестировании. Различие профилей может быть вызвано мутациями в остатках внутри активного центра нейраминидазы, которые сообщают резистентность отдельным подтипам вируса гриппа, или заменам в структуре НА. Способы секвенирования нуклеиновых кислот из образцов хорошо известны в данной области.
Интерференция других патогенов
[0106] В некоторых вариантах осуществления изобретения предполагается, что некоторые образцы, полученные от пациентов с подозрением на грипп, могут содержать другие патогены, производящие нейраминидазу. В ТАБЛИЦЕ 4 приведены примеры патогенов, наиболее часто встречающихся в клинических образцах, положительных на вирус гриппа.
[0107] В таблице 5 приводятся примеры патогенов, которые можно протестировать на интерференцию в образце. Такие патогены можно протестировать на предмет любого влияния на приведенные в данном документе способы и композиции. Тесты на интерференцию со всем вирусом или очищенной нейраминидазой. Эти патогены можно проанализировать при концентрациях, близких к концентрациям в клинических коллекциях.
[0108] В некоторых вариантах осуществления изобретения образцы могут включать носоглоточные смывы, аспираты и мазки.
Обнаружение вируса гриппа типа А или типа В
[0109] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают определение присутствия вируса гриппа типа «А» или типа «В» в образце. Некоторые варианты осуществления изобретения включают использование иммуноанализа для идентификации вирусных антигенов, который способен различить типы вируса, такие как А/В. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген является нуклеокапсидом. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ включает «сэндвич»-анализ. В некоторых вариантах осуществления изобретения первое антитело специфически привязывается к целевому антигену, а затем ко второму антителу, которое продуцирует сигнал. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнал является колориметрическим, флуоресцентным, хемилюминесценым и радиоактивным. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ может включать иммунохроматографическую систему. В некоторых вариантах осуществления изобретения тест-полоска включает иммуноанализ. Системы и композиции, подходящие для использования совместно с приведенными в данном документе способами и композициями, включают систему Veritor™ для экспресс-обнаружения вируса гриппа А+В (Becton Dickinson). В некоторых случаях выходной сигнал тест-полоски будет в режиме отражения. В некоторых вариантах осуществления изобретения выходной сигнал тест-полоски представляет собой изменение цвета, которое можно измерить при помощи считывающего устройства в режиме отражения. В дополнение к иммунохроматографическому формату анализа, варианты осуществления изобретения для определения вируса гриппа типа «А» или типа «В» могут включать молекулярное и иммунообнаружение в жидкой фазе, на субстратах, таких как мембраны, поверхности и частицы. В некоторых вариантах осуществления изобретения микролуночные ИФА, анализы на основе разделения в магнитном поле осуществляются при помощи нанотагов и агглютинации частиц. Пример молекулярного обнаружения включает систему Xpert Flu (Cephied, Саннивейл, Калифорния). Варианты осуществления изобретения, включающие нанотаги, включают нанотаги для спектроскопии комбинационного рассеяния, усиленного поверхностью. См., например, публикацию ACS Nano, 2009, 3 (10), стр. 2859-2869, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки. Варианты осуществления изобретения, включающие агглютинацию частиц хорошо известны и включают контакт антигена в жидкости с антиген-связывающими элементами, такими как антитела, прикрепленные к поверхности наночастиц. См., например, патент США 4,590,169, полностью включенный в данный документ посредством ссылки.
[0110] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают обнаружение присутствия вируса гриппа типа «А» или типа «В» в образце, включающее неиммунологические способы. В некоторых вариантах осуществления изобретения присутствие вируса гриппа типа «А» или типа «В» можно обнаружить при помощи методов на основе нуклеиновых кислот, таких как ПНР, гибридизация нуклеиновой кислоты и секвенирование нуклеиновой кислоты.
Измерение активности нейраминидазы
[0111] Некоторые приведенные в данном документе варианты
осуществления изобретения включают обнаружение и/или измерение активности нейраминидазы в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения нейраминидаза является вирусной нейраминидазой, такой как нейраминидаза вируса гриппа типа «А» или типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения фермент, который требуется обнаружить, является сиалидазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения активность нейраминидазы можно измерить при помощи двойного иммуноферментного анализа. Реагенты, подходящие для использования с некоторыми приведенными в данном документе вариантами осуществления способов и композиций, включают реагенты, входящие в анализы QFlu™ N1 Assay (Cellex, Inc., Мэриленд) и QFluTM Combo Assay.
[0112] В некоторых вариантах осуществления изобретения субстрат для нейраминидазы преобразуется в субстрат для второго фермента, такого как эстераза или люцифераза. В некоторых вариантах осуществления изобретения субстрат для нейраминидазы включает конъюгаты производных N-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловая кислота) и производные люциферина. В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгаты N-ацетилнейраминовой кислоты и ее производных с люциферином связаны между собой гликозидной связи через - ОН группы в сахарном кольце N-ацетилнейраминовой кислоты. В некоторых вариантах осуществления изобретения сахарное кольцо находится в 2' положении, так как это гликозидная связь является предпочтительной для нейраминидазы вируса гриппа. Примеры производных сиаловой кислоты включают 4-алкил, 7-алкил или 4,7 алкил N-ацетилнейраминовые кислоты (например описанные в патенте США №6,303,764 и патентах США №6,420,552, 6,680,054, которые полностью включены в данный документ посредством ссылки). Один из примеров является конъюгат 4,7 метилированной N-ацетилнейраминовой кислоты с люциферином светлячков. Варианты осуществления таких конъюгатов представлены в патенте США №7,893,272, который полностью включен в данный документ посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгаты, используемые в качестве субстрата для нейраминидазы, можно представить следующей формулой, показанной для соли Na:
1
2
3
[0113] В некоторых вариантах осуществления изобретения R, R, Rнезависимо представляют водород или алкил с 1-5 атомами углерода.
[0114] В некоторых вариантах осуществления изобретения субстрат для нейраминидазы преобразуется в ингибитор для второго фермента, такого как эстераза или люцифераза. В некоторых вариантах осуществления изобретения субстрат для нейраминидазы включает конъюгаты производных N-ацетилнейраминовой кислоты (сиаловая кислота) и производных трифторметилкетона (CF3). Производные N-ацетилнейраминовой кислоты описаны выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения субстрат для нейраминидазы является:
[0115] В некоторых вариантах осуществления изобретения ингибитортрифторметилкетона включает:
[0116] В некоторых вариантах осуществления изобретения, где субстрат для нейраминидазы преобразуется в ингибитор второго фермента, например, такой субстрат также является маскированным ингибитором. В данном документе раскрыты примеры маскированных ингибиторов, подходящих для использования совместно с приведенными в данном документе способами.
[0117] Пример синтеза представлен на Фиг. 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения образец может содержать нейраминидазу из источника, отличного от вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения нежелательная нейраминидаза угнетается при помощи специфических антител и ингибиторов. Активность нежелательной нейраминидазы угнетается при помощи специфических поликлональных или моноклональных антител. Например, при определении нейраминидазы вируса гриппа активность в образце неспецифической нейраминидазы организмов-загрязнителей, таких как бактерия Streptococcus pneumoniae и Actinomyces viscosus, угнетается при помощи антител, специфичных к нейраминидазе этих организмов. Такой подход возможен благодаря тому, что нейраминидазы различных организмов имеют различные аминокислотные последовательности, позволяющие создание видо- или подвидоспецифичных антител. Например, специфичные антитела обычно используются для различения подвидов нейраминидазы вируса гриппа в анализах нейтрализации нейраминидазы.
Комбинированные анализы
[0118] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают комбинированные анализы, при которых образец исследуют на (1) наличие вируса гриппа типа «А» или типа «В» в образце; и (2) чувствительность нейраминидазы вируса гриппа к определенным противовирусным препаратам. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В» в образце проводят в буфере, отличном от буфера для измерения чувствительности нейраминидазы вируса гриппа к определенным противовирусным препаратам.
[0119] В некоторых вариантах осуществления изобретения получают образец. В некоторых вариантах осуществления изобретения образцы могут включать носоглоточные смывы, аспираты и мазки. В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть недостаточно материала для приготовления нескольких исходных образцов в различных буферах. В некоторых вариантах осуществления изобретения образец помещают в первый буфер с целью получения первого исследуемого образца для первого анализа. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый исследуемый образец включает буфер, несовместимый со вторым анализом. Например, первый буфер может угнетать второй анализ. В некоторых подобных вариантах осуществления изобретения первый исследуемый образец преобразуется во второй исследуемый образец, включающий второй буфер, совместимый со вторым анализом. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый или второй анализ включает иммуноанализ для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В» в образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый или второй анализ представляет анализ для определения чувствительности нейраминидазы вируса гриппа к определенному противовирусному препарату.
[0120] В некоторых вариантах осуществления изобретения образец добавляют к первому буферу, совместимому с иммуноанализом для определения вируса гриппа типа «А» или типа «В» с целью подготовки образца для иммунологического исследования. Первую порцию образца для иммунологического исследования можно использовать для проведения иммуноанализа для определения вируса гриппа типа «А» или типа «В». Вторую порцию образца можно преобразовать в исследуемый образец нейраминидаза посредством контакта образца для иммунологического исследования с обменной матрицей, уравновешенной вторым буфером, совместимым с анализом для определения активности нейраминидазы. Примеры матриц включают поперечно-сшитые полисахариды, такие как сефадекс и сефароза. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает картридж, включающий отсек, включающий матрицу. Сефадекс может быть представлен разновидностями G25 medium, G25 coarse, G25 fine. Высота подложки может варьироваться от одного до 15 см. В некоторых вариантах осуществления изобретения смола может быть предварительно очищена и помещена в предварительно уравновешенный буфер, который способствует высвобождению нейраминидазы вируса гриппа для последующих измерений ее активности. Такие реагенты аналогичны тем, что входят в состав наборов NA-STARTM и NA-FLUORTM, а также продукта ZstatFluTM. Эти буферы обычно имеют низкое содержание хлорида натрия, менее 100 мМ или часто менее 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержание хлорида натрия составляет 100 мМ и 0.1 мМ, 100 мМ и 1 мМ, 10 мМ и 0.1 мМ, и 10 мМ и 1 мМ. Эти буферы, как правило, содержат ионы кальция и/или магния в диапазоне концентраций от 0.1 мМ до 50 мМ, от 1 мМ до 20 мМ, или от 4 мМ до 10 мМ для получения наиболее оптимального измерения активности нейраминидазы. Буферы, используемые для уравновешивания смол, имеют рН между 5 и 8, чтобы последующий анализ для определения активности нейраминидазы работал на редких штаммах, содержащий чувствительную к рН нейраминидазу, например, летальный вирус гриппа H7N9. Образец вируса гриппа, проходящий через картридж со смолой, может содержать небольшое количество детергента, похожего на детергент для высвобождения нуклеокапсида при проведении иммуноанализа для обнаружения вируса гриппа. Детергенты могут включать NP-40, соли желчных кислот, Бридж-35 и Тритоны. Примером Тритона является Тритон Х-100. Примером соли желчных кислот дезоксихолат натрия. Эти агенты для лизирования тканей и вирусов могут существовать в жидкой или твердой форме. Присутствие Тритонов и NP-40 в образце, проходящем через картридж со смолой, может составлять от 0.01% до 10% v/v или от 0.5% до 3% V/V. Твердые детергенты могут присутствовать в концентрациях от 0.1% до 10% W/V или от 0.5% до 2% W/V.
[0121] В некоторых вариантах осуществления изобретения образец добавляют к первому буферу, совместимому с анализом для определения активности нейраминидазы, с целью приготовить исследуемый образец нейраминидазы. Первую порцию исследуемого образца нейраминидазы можно использовать для определения активности нейраминидазы. Вторую порцию можно преобразовать в образец для иммунологического исследования посредством контакта исследуемого образца нейраминидазы с обменной матрицей, уравновешенной вторым буфером, совместимым с иммуноанализом для определения вируса гриппа типа «А» или типа «В». Примеры таких матриц включают поперечно-сшитые полисахариды, такие как сефадекс, сефароза и нитроцеллюлоза. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ включает тест-полоску, и матрица включает нитроцеллюлозу. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй буфер лиофилизирован или иначе полностью высушен в матрице. Экстрагирующий буфер для высвобождения нуклекапсида для проведения иммуноанализа помещают в зону для образца, или зону для конъюгата, или в обе зоны сразу. Подходящие примеры данных зон (мембран) включают стекловолокно Millipore G041, Millipore GFDX и целлюлозный полимер Millipore С083, Millipore С048, Millipore С068, Millipore C083, Millipore C248. Семейство подходящих зон Millipore присутствует в продуктовой линейке SureWick. Другими подходящими примерами являются хлопковые линтеры GE Healthcare CF1, CF3, CF4, Whatman Fusion 5, Std 14 и Std 15, а также полиэфирные зоны для образца/конъюгата и другие примеры. На РИС. 14 приведен вариант осуществления размещения на иммунохроматографической тест-полоске реагентов для экстрагирования нуклеокапсида.
Измерение чувствительности нейраминидазы к исследуемому соединению.
[0122] Некоторые приведенные в данном документе вариант осуществления изобретения включают измерение чувствительности нейраминидазы к исследуемому соединению. Исследуемое соединение включает противовирусный препарат, такой как препарат против вируса гриппа. В вариантах осуществления изобретения активность нейраминидазы измеряют в присутствии или отсутствии исследуемого соединения. Соотношение активности могут использовать для определения величины ингибирования, и величину ингибирования могут сравнить с выбранным порогом ингибирования с целью определения чувствительности или резистентности нейраминидазы к исследуемому соединению.
[0123] В некоторых вариантах осуществления изобретения значение порога ингибирования можно определить посредством определения величин ингибирования группы различных вирусов с известной чувствительностью или резистентностью к конкретному исследуемому соединению. Величины ингибирования каждого вируса можно нанести на график, и нужный порог ингибирования будет лежать между величинами ингибирования вирусов, чувствительных к исследуемому соединению, и величинами ингибирования вирусов, резистентных к исследуемому соединению. Заявители обнаружили, что пороги ингибирования для гриппа типа «А» и типа «В» неожиданно различаются. В некоторых вариантах осуществления изобретения для конкретного исследуемого соединения вирус типа «А» имеет более низкий порог ингибирования, чем вирус типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения, если известен тип вируса гриппа в образце (т.е. «А» или «В»), соответствующий порог ингибирования можно использовать для исследуемого соединения, что может существенно повысить чувствительность анализа и позволит отличать штаммы гриппа с низким уровнем лекарственной устойчивости от штаммов, вообще не обладающих лекарственной устойчивостью.
Тест-картриджи для исследования нейраминидазы
[0124] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций включают тест-картриджи для анализа нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы с целью определения чувствительности к исследуемому соединению, такому как исследуемый препарат и/или противовирусный препарат, могут проводить в картридже, включающем отсек для матрицы и отсек для реагентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения картридж может включать один или несколько тест-отсеков. Тест-отсеки могут включать еще один отсек, содержащий: образец + реагенты для анализа без исследуемого соединения; реагенты для анализа без образца или исследуемого соединения; образец + реагенты для анализа + исследуемое соединение; и реагенты для анализа + исследуемое соединение без образца. В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуют несколько исследуемых соединений, и для этих целей присутствуют дополнительные тест-отсеки для образца + реагенты для анализа + исследуемое соединение, и реагенты для анализа + исследуемое соединение без образца для каждого дополнительного исследуемого соединения (т.е. первое, второе, третье, четвертое, и т.д. исследуемое соединение). Контрольный тест-отсек для образца + реагенты для анализа и/или реагенты для анализа), можно использовать для всех исследуемых соединений, тестируемых на картридже. В некоторых вариантах осуществления изобретения отсек для матрицы гидравлически сообщается с одним или несколькими другими отсеками, такими как отсеки, выбранные для размещения образца. В некоторых вариантах осуществления изобретения тест-отсеки включают: (1) Тест с лекарственным препаратом, включающий образец, реакционную смесь и исследуемый лекарственный препарат; (2) Тест без лекарственного препарата, включающий образец и реакционную смесь; (3) Контроль для реакционной смеси, включающий реакционную смесь; и (4) Контроль для исследуемого лекарственного препарата, включающий реакционную смесь и лекарственный препарат. В некоторых вариантах осуществления изобретения могут присутствовать другие контроли.
[0125] В некоторых вариантах осуществления изобретения жидкий образец добавляют в отсек для матрицы. Жидкий образец перетекает из отсека для матрицы в отсек, выбранный для размещения образца посредством одной или нескольких указанных сил: гравитация, капиллярный эффект и диффузия. Сигнал от происходящей в отсеке реакции можно измерить при помощи фотоумножительной трубки, пример картриджа показан на Фиг. 5.
Способы обнаружения вируса гриппа
[0126] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают обнаружение вируса гриппа, включающее контакт образца с иммунологическим буфером, предназначенным для иммуноанализа с целью обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», для получения образца для иммунологического исследования; контакт первой порции образца для иммунологического исследования с тест-полоской, включающей иммуноанализ для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», посредством которого происходит определение наличия или отсутствия в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В»; контакт второй порции образца для иммунологического исследования с матрицей, включающей буфер для анализа активности нейраминидазы, посредством чего получают исследуемый образец нейраминидазы; и контакт исследуемого образца нейраминидазы с тест-системой для определения активности нейраминидазы, посредством чего определяют наличие в образце нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический буфер не подходит для анализа активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический буфер угнетает активность нейраминидазы.
[0127] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций включают способы обнаружения вируса гриппа, включающие: контакт образца с буфером для анализа активности нейраминидазы, посредством которого получают исследуемый образец нейраминидазы; контакт первой порции исследуемого образца нейраминидазы с тест-полоской, включающей иммуноанализ для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», причем исследуемый образец нейраминидазы контактирует с матрицей, включающей иммунологический буфер, посредством чего получают образец для иммунологического исследования и определяют наличие или отсутствие в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В»; и контакт второй порции исследуемого образца нейраминидазы с тест-системой для определения активности нейраминидазы, посредством которого определяют наличие в образце нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер для анализа активности нейраминидазы несовместим с иммуноанализом для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер для анализа активности нейраминидазы подавляет специфическое связывание антитела с антигеном, выбранным из следующей группы: вирус гриппа типа «А» и вирус гриппа типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица включает лиофилизированный или полностью высушенный буфер.
[0128] В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица, включающая буфер для анализа активности нейраминидазы, и реагенты для анализа активности нейраминидазы находятся в одном резервуаре, таком как картридж. В некоторых вариантах осуществления изобретения резервуар включает несколько отсеков, таких как отсек, включающий матрицу, и отсек, включающий реагенты для анализа активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица включает поперчено-сшитый полисахарид, такой как сефадекс и сефароза. В некоторых вариантах осуществления изобретения резервуар включает многолуночный картридж, адаптированные для чтения фотоумножительной трубкой, такой как портативная фотоумножительная трубка В некоторых вариантах осуществления изобретения образец для иммунологического исследования и исследуемый образец нейраминидазы перемещаются внутри резервуара посредством одной или нескольких указанных сил: гравитация, капиллярный эффект и диффузия.
[0129] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления способов и композиций включают определение чувствительности нейраминидазы к исследуемому соединению, включающее: (а) получение соотношения величин ингибирования, причем соотношение включает уровень активности нейраминидазы в присутствии исследуемого соединения, отнесенный к уровню активности нейраминидазы в отсутствие исследуемого соединения; и (б) сравнение соотношения величин ингибирования с порогом ингибирования, посредством чего происходит определение чувствительности нейраминидазы к исследуемому соединению. Соотношение величин ингибирования выше порога ингибирования указывает на чувствительность активности нейраминидазы к исследуемому соединению, и, таким образом, штамм вируса гриппа также чувствителен к исследуемому соединению. Соотношение величин ингибирования ниже порога ингибирования указывает на отсутствие чувствительности активности нейраминидазы к исследуемому соединению, и, таким образом, штамм вируса гриппа резистентен к исследуемому соединению. В некоторых вариантах осуществления изобретения порог ингибирования определятся обнаружением вируса гриппа типа «А» или типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения порог ингибирования определятся исследуемым соединением. В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуемое соединение для лечения вируса гриппа могут выбирать согласно чувствительности его нейраминидазы к исследуемому соединению. В некоторых вариантах осуществления изобретения страдающему гриппом пациенту могут посоветовать принимать исследуемое соединение или обеспечить его исследуемым соединением, или исследуемое соединение могут предоставить пациенту в случае чувствительности нейраминидазы к данному исследуемому соединению.
[0130] В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает двойной иммуноферментный анализ, включающий сигнальный фермент. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом проявления активности нейраминидазы является образование субстрата для сигнального фермента. В некоторых варианты осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с люциферином или его производным. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом проявления активности нейраминидазы является образование ингибитора сигнального фермента. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с трифторметилкетоном или его производным. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальный фермент включает люциферазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения буфер для иммунологического анализа подавляет активность люциферазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень активности нейраминидазы измеряют с помощью фотоумножительной трубки.
[0131] В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуемое соединение представляет собой противовирусный препарат. В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуемое соединение представляет собой противовирусный препарат, выбранный из указанной группы: Осельтамивир, Занамивир, Ланамивир и Перамивир.
[0132] В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ включает «сэндвич»-анализ.
[0133] В некоторых вариантах осуществления изобретения образец получают от субъекта, такого как человек с подозрением на вирус гриппа.
[0134] В некоторых вариантах осуществления изобретения описанный в данном документе комбинированный анализ ограничен минимальными дозами 2000 ТСID50/мл, 1000 ТСID50/мл, 500 ТСID50/мл, 200 ТСID50/мл, 100 ТСID50/мл или диапазоном, определяемый любыми двумя указанными величинами. В мольном выражении раскрытый комбинированный тест способен обнаружить нейраминидазу с минимальной концентрацией 1000 фМ, 500 фМ, 100 фМ, 10 фМ или в диапазоне, определяемом любыми двумя указанными величинами.
Способы выбора лечения
[0135] Некоторые варианты осуществления приведенных в данном документе способов и композиций включают способы выбора лечения вируса гриппа, включающие: (а) контакт образца с иммунологическим буфером, предназначенным для иммуноанализа для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», посредством чего получают образец для иммунологического исследования; (б) контакт первой порции образца для иммунологического исследования с иммунохроматографической тест-полоской, включающий иммуноанализ для обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», посредством чего определяют наличие или отсутствие в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В»; (в) контакт второй порции образца для иммунологического исследования с матрицей, включающей буфер для анализа активности нейраминидазы, посредством чего получают исследуемый образец нейраминидазы; (г) контакт исследуемого образца нейраминидазы с тест-системой для анализа активности нейраминидазы, посредством чего определяют чувствительность нейраминидазы в исследуемом образце нейраминидазы к исследуемому соединению (т.е. противовирусному препарату), определение включает: (1) получение соотношения величин ингибирования, причем соотношение включает уровень активности нейраминидазы в присутствии исследуемого соединения, отнесенный к уровню активности нейраминидазы в отсутствии исследуемого соединения, и (2) сравнение соотношения величин ингибирования с порогом ингибирования, посредством чего определяют чувствительность активности нейраминидазы к исследуемому соединению; и (д) выбор или идентификация исследуемого соединения, подавляющих активность нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения порог ингибирования определяют посредством обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический буфер не подходит для анализа активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммунологический буфер угнетает активность нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадии (в) и (г) проводятся в одном резервуаре. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект предположительно болен гриппом. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект является человеком.
[0136] Некоторые варианты осуществления приведенных в данном документе способов и композиций включают способы выбора лечения вируса гриппа, включающие: (а) контакт образца с буфером для анализа активности нейраминидазы, посредством которого получают исследуемый образец нейраминидазы; (б) контакт первой порции исследуемого образца нейраминидазы с тест-полоской, включающей иммуноанализ для определения вируса гриппа типа «А» или типа «В», причем исследуемый образец нейраминидазы контактирует с матрицей, включающей иммунологический буфер, посредством чего получают образец для иммунологического исследования и определяют наличие или отсутствие в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В»; и (в) контакт второй порции исследуемого образца нейраминидазы с анализом для определения активности нейраминидазы, посредством которого определяют чувствительность нейраминидазы в исследуемом образце нейраминидазы к исследуемому соединению, определения включает: (1) получение соотношения величин ингибирования, причем соотношение включает уровень активности нейраминидазы в присутствии исследуемого соединения, отнесенный к уровню активности нейраминидазы в отсутствии исследуемого соединения, и (2) сравнение соотношения величин ингибирования с порогом ингибирования, посредством чего определяют чувствительность активности нейраминидазы к исследуемому соединению; и (г) выбор исследуемого соединения, подавляющего активность нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения порог ингибирования определяют посредством обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица включает лиофилизированный буфер. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия (в) проводится в том же самом резервуаре.
[0137] В некоторых вариантах осуществления изобретения порог ингибирования определяют посредством обнаружения вируса гриппа типа «А» или типа «В», причем первый порог ингибирования применяют в случае обнаружения вируса типа «А», а второй порог ингибирования применяют в случае обнаружения вируса типа «В». В некоторых вариантах осуществления изобретения порог ингибирования в случае вируса гриппа типа «А» ниже, чем в случае вируса гриппа типа «В».
[0138] В некоторых вариантах осуществления изобретения резервуар включает несколько отсеков, таких как отсек, включающий матрицу, и отсек, включающий реагенты для анализа активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица включает поперчено-сшитый полисахарид, такой как сефадекс и сефароза.
[0139] В некоторых вариантах осуществления изобретения резервуар включает картридж, такой как многолуночный картридж, адаптированный для чтения фотоумножительной трубкой. В некоторых вариантах осуществления изобретения фотоумножительная трубка является портативной.
[0140] В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает двойной иммуноферментный анализ, включающий сигнальный фермент. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом проявления активности нейраминидазы является образование субстрата для сигнального фермента. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с люциферином или его производным. В некоторых вариантах осуществления изобретения результатом проявления активности нейраминидазы является образование ингибитора сигнального фермента. В некоторых вариантах осуществления изобретения анализ активности нейраминидазы включает конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с трифторметилкетоном или его производным. В некоторых вариантах осуществления изобретения сигнальный фермент включает люциферазу. В некоторых вариантах осуществления изобретения уровень активности нейраминидазы измеряют с помощью фотоумножительной трубки.
[0141] В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуемое соединение представляет собой противовирусный препарат. В некоторых вариантах осуществления изобретения исследуемое соединение представляет собой противовирусный препарат, выбранный из указанной группы: Осельтамивир, Занамивир, Ланамивир и Перамивир.
[0142] В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ включает «сэндвич»-анализ.
[0143] В некоторых вариантах осуществления изобретения образец получают от субъекта.
Системы и наборы
[0144] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают диагностические системы для обнаружения вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие системы включают картридж для определения активности нейраминидазы в образце, причем картридж приспособлен для обработки образца, включающего несовместимый буфер для определения, и образца, включающего совместимый буфер для определения; и тест-полоску для обнаружения в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В», причем тест-полоска, например, иммунохроматограическая тест-полоска, приспособлена для обработки образца, включающего несовместимый буфер для обнаружения, и образца, включающего совместимый буфер для обнаружения. В некоторых вариантах осуществления изобретения система также включает первый детектор, предназначенный для измерения сигнала от картриджа; и второй детектор, предназначенный измерения сигнала от тест-полоски.
[0145] В некоторых вариантах осуществления изобретения картридж включает отсек для матрицы, включающий матрицу, содержащую совместимый буфер для определения, и отсек для реагентов, содержащий реагенты для определения активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица в картридже содержит поперечно сшитый полисахарид. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрицу в картридже выбирают из указанной группы: сефадекс и сефароза. В некоторых вариантах осуществления изобретения отсек для матрицы и отсек для картриджа гидравлически сообщаются таким образом, что нанесенный на матрицу образец перетекает из отсека для матрицы в отсек для реагентов. В некоторых вариантах осуществления изобретения образец перемещается в картридже посредством одной или нескольких указанных сил: гравитация, капиллярный эффект, диффузия. В некоторых вариантах осуществления изобретения картридж включает многолуночный картридж, приспособленный для считывания посредством фотоумножительной трубки.
[0146] В некоторых вариантах осуществления изобретения тест- полоска включает иммуноанализ. В некоторых вариантах осуществления изобретения иммуноанализ представляет собой «сэндвич»-анализ. В некоторых вариантах осуществления изобретения тест-система включает матрицу, включающую совместимый буфер для обнаружения. В некоторых вариантах осуществления изобретения матрица содержит нитроцеллюлозу. В некоторых примерах осуществления изобретения совместимый буфер для обнаружения лиофилизирован.
[0147] В некоторых вариантах осуществления изобретения первый детектор включает люминометр. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый детектор включает считывающее устройство, работающее в режиме отражения. В некоторых вариантах осуществления изобретения второй детектор включает фотоумножительную трубку. В некоторых вариантах осуществления изобретения прибор включает первый и второй детекторы. В некоторых вариантах осуществления изобретения первый и второй детекторы есть одно и то же. В некоторых вариантах осуществления изобретения прибор является портативным. В некоторых вариантах осуществления изобретения прибор является карманным. В некоторых вариантах осуществления изобретения данные с иммунохроматографической тест-полоски и многолуночного strip/ resin картридж а считываются при помощи общей платформы с двумя отдельными режимами детекции, но с общим источником энергии и дисплеем для отображения результатов ИВГ и ЧПП.
[0148] Некоторые приведенные в данном документе варианты осуществления изобретения включают диагностические наборы для обнаружения вируса гриппа. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие наборы включают картридж для определения активности нейраминидазы в образце, причем картридж приспособлен для обработки образца, включающего несовместимый буфер для определения, и образца, включающего совместимый буфер для определения; и тест-полоску для обнаружения в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В», причем тест-полоска приспособлена для обработки образца, включающего несовместимый буфер для обнаружения, и образца, включающего совместимый буфер для обнаружения.
[0149] Некоторые варианты осуществления изобретения также включают первый детектор, предназначенный для измерения сигнала от картриджа; и второй детектор, предназначенный для измерения сигнала от тест-полоски.
[0150] Некоторые варианты осуществления изобретения также включают реагенты для анализа активности нейраминидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения реагенты для анализа активности нейраминидазы выбирают из указанной группы: люцифераза, конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с люциферином или его производным, конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты с трифторметилкетоном или его производным и противовирусный препарат. В некоторых вариантах осуществления изобретения противовирусный препарат выбирают из указанной группы: Осельтамивир, Занамивир, Ланамивир и Перамивир.
[0151] Некоторые варианты осуществления изобретения также включают реагенты для иммуноанализа. В некоторых вариантах осуществления изобретения реагенты для иммуноанализа выбирают из указанной группы: антитело, специфичное к антигену вируса гриппа типа «А», и антилело, специфичное к антигену вируса гриппа типа «В».
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - Комбинированный анализ
[0152] Приводится пример рабочего процесса с участием теста на
определение вируса гриппа типа "А" или типа "В" и теста на лекарственную устойчивость нейраминидазы. Набор, включающий пробирку с аппликатором, содержащую экстрагирующий буфер для иммуноанализа и крышку с отверстием; первое устройство для тестирования, включающий иммунохроматографический анализ для определения вируса гриппа типа «А» или типа «В»; и второе устройство для тестирования, включающий кинетический анализ для определения лекарственной устойчивости нейраминидазы, извлекают из упаковки и наносят на каждый компонент информацию о пациенте. Образец собирают из носа пациента при помощи тампона. Тампон помещают в экстрагирующий буфер и трижды проворачивают. Тампон удаляют из экстрагирующего буфера, сжимая стенки пробирки, и затем выбрасывают. Крышка аппликатора прикреплена к пробирке.
[0153] Пробирку с аппликатором переворачивают и выдавливают через крышку три капли экстрагирующего буфера (~85 мкл) в первое устройство для тестирования. Первое устройство для тестирования включает зону для образца, не соприкасающуюся с реагентами для детекции и содержащую первый буфер для первого теста. Образец диффундирует сквозь первый буфер в пространство для проведения теста первого устройства. Первое устройство инкубируют в течение 10 минут, и результаты первого теста измерят при помощи считывающего устройства. Считывающее устройство определяет наличие в образце вируса гриппа типа «А» или типа «В».
[0154] Пробирку с аппликатором переворачивают и выдавливают через крышку оставшийся экстрагирующий буфер во второе устройство. В этом тесте увеличение количества нейраминидазы приводит к усилению сигнала люциферазы. Второе устройство включает обменный отсек для буфера (т.н. отсек для матрицы) и отсеки для реагентов. Образец диффундирует сквозь обменный отсек для буфера в отсеки для реагентов для проведения анализа на лекарственную устойчивость нейраминидазы. Величина ингибирования представляет собой соотношение сигналов в присутствии и отсутствии исследуемого лекарственного препарата с учетом фоновых сигналов, производимых реакционной смесью и исследуемым лекарственным препаратом. Реакционные отсеки приведены в ТАБЛИЦЕ 5А.
[0155] Второе устройство инкубируют и сигнал от каждого отсека измеряют при помощи фотоумножительной трубки. Величину ингибирования определяют при помощи следующей формулы по сигналам от каждого реакционного отсека:
[0156] Порог лекарственной чувствительности для каждого исследуемого противовирусного препарата выбираются в зависимости от типа вируса гриппа, определяемого в первом тесте и в тесте на противовирусный препарат. Если величина ингибирования находится ниже порога ингибирования, нейраминидаза является чувствительной к противовирусному препарату.
Пример 2 - Чувствительность фотоумножительной трубки
[0157] Этот пример демонстрирует чувствительность портативной карманной фотоумножительной трубки Hamamatsu ТО-Can и ее способность к чтению с низким шумом темнового тока. При помощи фотоумножительной трубки Hamamatsu ТО-Can были получены относительные световые единицы (RLU) для различных концентраций контрольного реагента (Cell Titer Glo), производящего положительный хемилюминесцентный сигнал. Контроль включал контроль фона и темновой скорости счета. Результаты представлена на Фиг. 6.
Пример 3 - Двойной иммуноферментный анализ
[0158] Этот пример демонстрирует применение двойного иммуноферментного анализа для тестирования штамма А/Миссисипи/03/2001 A(H1N1) H275Y, включающего нейраминидазу, устойчивую к Осельтамивиру и чувствительную к Занамивиру. Образец, включающий исследуемый штамм, разбавили 1/3000 или 1/9000 и поместили в устройство для кинетического анализа. Отсек для тестирования и кинетический анализ включали (ТАБЛИЦА 5А): (1) реакционную смесь + образец; (2) реакционную смесь + исследуемый противовирусный препарат; (3) контроль: реакционная смесь; и (4) контроль: реакционная смесь + исследуемый противовирусный препарат. Сигнала от каждого отсека измерили с помощью фотоумножительной трубки. Результаты представлена на РИС. 7. Анализ показал, что исследуемый штамм более чувствителен к Занамивиру, чем к Осельтамивиру.
Пример 4 - чувствительность различных штаммов гриппа типа «А»
[0159] Этот пример демонстрирует определение порога ингибирования для группы вирусов гриппа типа «А» с известной чувствительностью или устойчивостью к Осельтамивиру. Приготовили образцы различных разведений штаммов вируса гриппа типа «А» и поместили в устройство для кинетического анализа с Осельтамивиром. Отсек для тестирования и кинетический анализ включали (ТАБЛИЦА 5А): (1) реакционную смесь + образец; (2) реакционную смесь + исследуемый противовирусный препарат; (3) контроль: реакционная смесь; и (4) контроль: реакционная смесь + исследуемый противовирусный препарат. Сигнала от каждого отсека измерили с помощью фотоумножительной трубки. Величину ингибирования каждого штамма определяли согласно Примеру 1. Величины ингибирования каждого штамма нанесли на график, посредством которого определили пороговую величину ингибирования. Пороговая, или предельная, величина ингибирования для определения лекарственной чувствительности или резистентности составила около 0.6. Предельная величина ингибирования отражает величину, при которой строки ошибки от чувствительных к лекарственному препарату штаммов не перекрываются со строками резистентных штаммов. См. Фиг. 8.
Пример 5 - Чувствительность различных штаммов гриппа «В»
[0160] Этот пример демонстрирует определение порога ингибирования для группы вирусов гриппа типа «В» с известной чувствительностью или устойчивостью к Осельтамивиру. Образцы приготовили и исследовали согласно Примеру 4. Определили величину ингибирования каждого штамма. Величины ингибирования каждого штамма нанесли на график, посредством которого определили пороговую величину ингибирования. Пороговая, или предельная, величина ингибирования для определения лекарственной чувствительности или резистентности составила около 1.55. См. Фиг. 9.
Пример 6 - влияние обмена буфера на иммунохроматографический анализ
[0161] Этот пример демонстрирует чувствительность иммунохроматографического анализа для определения гриппа типа «А» или введите «В» в образце, после замены буфера на буфер для кинетического анализа активности нейраминидазы. Образцы различных разведений вируса гриппа: A/PR/8/34, В/Флорида/4/2006, и А/Техас/12/2007 исследовали при помощи (1) иммунохроматографического анализа Veritor™ согласно инструкции на вкладыше, или (2) иммунохроматографического анализа Veritor™ с заменой экстрагирующего буфера для кинетического анализа на экстрагирующий буфер для иммуноанализа в иммунохроматографической зоне. Сигналы измерили при помощи считывающего устройства, определившего присутствие или отсутствие в каждом образце вируса гриппа типа «А» и/или типа «В». В ТАБЛИЦЕ 6 приведены результаты. Примечательно, что вирус гриппа типа «А» или типа «В» чаще обнаруживали в разведенных образцах с использованием протокола Veritor™ с заменой буфера, чем с протоколом Veritor™ согласно инструкции на вкладыше.
Пример 7 - Чувствительность иммуноанализа и двойного иммуноферментного ДИ (DE) анализа.
[0162] Иммуноанализ Veritor и кинетический двойной иммуноферментный анализ активности нейраминидазы с Осельтамивиром провели на различных разведениях вируса гриппа: A/Perth/211/2001 WT. В ТАБЛИЦЕ 7 приведены результаты двух экспериментов. Эти результаты показывают, что внесение образца в экстрагирующем буфере для иммуноанализа в сефадекс G25M, предварительно стабилизированный буфером для анализа активности нейраминидазы, не оказало негативного эффекта на чувствительность стандартного Стд (Std) ДИ анализа. Стд ДИ анализ обеспечил результат по лекарственной чувствительности при клинически значимых концентрациях образца.
Пример 8 - Выявление лекарственной устойчивости в смешанных образцах вируса гриппа
[0163] Различные разведения образцов были подвергнуты кинетическому иммуноанализу с противовирусным препаратом Оселтамивир. Образцы включали A\Bethesda (H3N2 R); AVFukui (H3N2 S); и смесь A\Bethesda (V) + AFukui (WT). С помощью фотоумножительной трубки были измерены сигналы, и затем определены величины ингибирования. Результаты обобщены на Фиг. 10. Данные результаты показывают, что химические механизмы стандартного двойного иммуноферментного ЧИП позволяют обнаружить резистентные к лекарственному препарату штаммы в присутствии штаммов, чувствительных к этому препарату.
Пример 9 - Сравнение двойных иммуноферментных анализов
[0164] В этом примере сравнивается чувствительность двух типов двойного иммуноферментного анализа. Различные разведения очищенной нейраминидазы вируса гриппа H3N2 были подвергнуты двойному иммуноферментному анализу, включавшему (1) нейраминидазный субстрат, являющийся проингибитором люциферазы (NANA-CF3; см. Фиг. 11); или (2) нейраминидазный субстрат, являющийся просубстратом люциферазы (конъюгат N-ацетилнейраминовой кислоты и люциферина). Нейраминидаза расщепляет NANA-CF3 до ингибитора эстеразы, CFC. В анализе, где эстераза включает люциферазу, активность нейраминидазы приводит к появлению ингибитора CFC, угнетающего активность люциферазы, что приводит к уменьшению перехода субстрата люциферазы в люминесцентный продукт. См. Фиг. 12. Результаты анализов представлены на Фиг. 13. Уровень детекции УД (LOD) для анализа (1, двойной иммуноферментный анализ с маскированным ингибитором) составил около 10 пкмоль. В противополжность этому, уровень детекции анализа (2, стандартный двойной иммуноферментный анализ) оказался менее 0.1 пкмоль.
Пример 10 - Эффект контроля фоновых сигналов.
[0165] Этот пример демонстрирует эффект вычитания фоновых уровней, как описано в формуле расчета величины ингибирования активности нейраминидазы в пФигутствии противовирусного препарата в римере 1. Величины ингибирования определяли для различных концентраций конкретного штамма вируса с конкретным противовирусным препаратом согласно Примеру 1. Величину ингибирования без вычитания фона определяли при помощи следующей формулы для сигнала из отсека, содержащего реакционную смесь + образец + тестируемый противовирусный препарат (тест с препаратом), и реакционную смесь + образец (тест без препарата):
[0166] Результаты представлены в ТАБЛИЦЕ 8. В столбцах слева направо понижается концентрация вируса. Вычитание фона как в примере 1 при расчете величин ингибирования повышает чувствительность анализа.
[0167] Термин «включающий» используется в данном документе в качестве синонима терминов «содержащий», и «характеризуемый», является охватывающим и неограничивающим и не исключает дополнительных нецитированных элементов или стадий способов.
[0168] Приведенное выше описание раскрывает несколько способов и материалов настоящего изобретения. Данное изобретение подвержено модификациям способов и материалов, а также изменениям способов изготовления и оборудования. Такие модификации могут стать очевидными для специалистов после рассмотрения данного раскрытия или практического применения раскрытого в данном документе изобретения. Следовательно, не предполагается, что изобретение ограничено конкретными вариантами осуществления, раскрытыми в данном документе, но, что оно охватывает все модификации и альтернативы, входящие в истинный объем и сущность изобретения.
[0169] Все ссылки, упомянутые в настоящем документе, включая, но не ограничиваясь опубликованными и неопубликованными заявками, патентами и литературными источниками, включены здесь путем ссылки во всей их полноте и настоящим являются неотъемлемой частью данной спецификации. По мере публикации и патентов или патентных заявок, включенных посредством ссылки и противоречащим раскрытию, содержащемуся в спецификации, спецификации призвана заменить и/или иметь приоритет над любым таким противоречивым материалом.