Экспрессия онкомаркерного белка В23/нуклеофозмина в различных опухолевых клетках

references

1. Vicentini F.T., He T., Shao Y. et al. Quercetin inhibits UV irradiation-induced inflammatory cytokine production in primary human keratinocytes by supressing NF-kB pathway. J. Dermatol. Sci. 2011; 61(3): 162-8.

2. Dagne A., Melkamu T., Schutten M.M. et al. Enhanced inhibition of lung ad-enocarcinoma by combinatorial treatment with indole-3-carbinol and silibinin in A/J mice. Carcinogenesis. 2011; 32(4): 561-7.

3. Akiyama T., Ishida J., Nakawaga S. et al. Genistein, a specific inhibitir of tyrosine-specific protein kinases. J. Biol. Chem. 1987; 262: 5592-5.

4. Albegova D. Z., Pavlova S. I., Negrebetskiy et al. Modified bioflu-monoid suppresses the reaction of contact hypersensitivity in mice.

Rossiyskiy immunologicheskiy zhurnal. 2014; 8, №2

5. Kim T.Y., Kripke M.L., Ullrich S.E. Immunosuppression by factors released from UV-irradiated epidermal cells: selective effects on the generation of contact and delayed hypersensitivity after exposure to UVA or UVB radiation. J. Invest. Dermatol. 1990; 94: 26-32.

6. Gober M.D., Gaspari A.A. Allergic contact dermatitis. Curr. Dir. Autoimmun. 2008; 10: 1-26.

7. Kehren J., Desvignes C., Krasteva M. et al. Cytotoxicity is mandatory for CD8(+) T cell-mediated contact hypersensitivity. J. Exp. Med. 1999; 189 (5): 779-86.

Received 30.09.14

ИММУНООНКОЛОГИЯ

© коллектив авторов, 2015 удк 616-006.04-078.33-076.5-074

Дейнеко Н.Л.1, Булычева Т.И.1, Григорьев А.А.1, Вольпина О.М.2, Владимирова Н.М.2

экспрессия ОнКОМАРКЕРнОГО белка B23/HУКЛE0Ф03МИHА Б РАзлИЧнЫХ опухолевых клетках

1ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 125167, г Москва; 2Учреждение РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, г. Москва

Методом иммуноцитохимического окрашивания в реакции непрямой иммунофлюоресценции проведено исследование опухолевых клеток различной этиологии на ограниченном контингенте больных с использованием аффинно-очищенных противопептидных антител (АТ), специфичных к мономерным (АТ 19-36) формам белка В23, и АТ к олигомерным (АТ 283-294) формам, избирательно выявляющих изоформу В23.1, в сравнении с коммерческими моноклональными АТ к белку В23 с целью определения их диагностической и прогностической значимости. В результате исследований подтверждено, что белок В23, исследованный ранее в основном в качестве аргирофиль-ного белка иммуногистохимическим методом, может использоваться в качестве маркера злокачественности опухолей также при проведении иммуноцитохимического метода, который более доступен в лабораторной практике. Установлено, что не вся молекула белка В23 отвечает за информативность метода, а только олигомерная форма, маркирующая белок в ядрышках опухолевых клеток в виде многочисленных фокусов свечения высокой интенсивности, в отличие от мономерной формы, локализованной в цито- и нуклеоплазме клеток при отсутствии свечения в ядрышках. Показано, что степень экспрессии изоформы белка В23.1, выявляемая противопептидными АТ 283-294, может стать новым маркером злокачественных опухолей по количеству, форме и интенсивности окрашивания ядрышек в опухолевых клетках.

Ключевые слова: опухолевые маркеры; мономерная и олигомерная форма белка В23/нуклеофозмина; противо-пептидные антитела; иммуноцитохимический метод.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(2): 153-158. Deineko N.L.1, Bylycheva T.I.',Grigoryev A.A.1, Volpina O.V.2, Vladimirova N.M.2

EXPRESSION OF THE ONCOLOGICAL MARKER POTEIN B23/NUCLEOPHOSMIN VARIOS TUMOR CELLS National Center for Hematology, 125167, Moscow; 2Institute of Bioorganic Chemistry, 117997, Moscow Using the method of immunocytochemical staining in the reaction of indirect immunofluorescence we conducted a study of tumor cell of different etiologies on a limited number of patients using affinity purified antipeptide antibodies against monomeric (AT 19-36) forms of the protein B23 and antibodies against oligomeric forms (AT 283-294) that selectively stains isoform B23.1 compared to the commercial antibody against the protein B23 to determine their diagnostic and prognostic significance. As a result it was confirmed that the protein B23 known as an argyrophillic protein could also be used as a marker of malignancy of tumors when applying not only the immunohistochemical but also immunocytochemical method that is more accessible in the laboratory practice. It was established that not all molecule of the protein B23 is responsible for the informative value of the method but only the oligomeric form that marks the protein in the nucleoli of the tumor cells as multiple shining foci of high intensity as opposed to the monomeric form that is located in the cytoplasm and nucleoplasm with no luminescence present in the nucleoli.

It was shown that the degree of expression of the isoform B23.1 that is revealed with the antipeptide antibodies AT 283-294 could serve as a new marker of the malignant tumors based on the quantity , form and intensity of staining of the nucleoli in the tumor cells.

Key words: tumor marker; monomeric and oligomeric forms of the protein B23/nucleofosmin; antipeptide antibodies; immunocytochemical method.

citation: Immunologiya. 2015; 36

Для корреспонденции: Булычева Татьяна Ивановна, tb@blood.ru For correspondence: Bulycheva Nat'yana Ivanovna, tb@blood.ru

Введение. В исследованиях последних лет много внимания уделяют изучению ядрышкового полифункционального белка В23/нуклеофозмина (В23), который может быть представлен в клетках различными структурными формами. Работы по изучению нуклеофозмина показали его важную роль в пролиферации, малигнизации и апоптозе клеток [1-6]. Это привело к тому, что большинство исследователей рассматривают В23 в качестве онкомаркерного белка, функционирующего в виде олигомерной и мономерной форм, выявляемых на иммуноблоттах [7].

В наших ранних исследованиях показано, что белок В23 является более ранним маркером активации клеток к пролиферации лимфоцитов, чем общепринятый маркер пролиферации белок Ю-67, что оказалось важным для ранней диагностики онкогематологических заболеваний [8-11].

В последние годы онкологи придают большое значение изучению уровня экспрессии белка В23 как одного из основных аргирофильных белков областей ядрышковых организаторов (Аg-ОЯОР-белки), представляющих собой группу протеинов ядрышка, для которых характерны специфичное окрашивание серебром и высокий уровень экспрессии в пролиферирующих клетках [12]. В иммуногистохимиче-ских исследованиях показано, что в клетках больных с ней-роэндокринными опухолями легкого при высоком уровне экспрессии нуклеофозмина происходят неконтролируемый клеточный рост и злокачественная трансформация [13-16]. Имеются данные о том, что при диагностике опухолей надпочечников (различия в доброкачественном и злокачественном росте, определение степени злокачественности опухолей, прогноза, выживаемость больных и пр.) изучения количества Ю-67-позитивных клеток оказывалось недостаточно и требовалось исследование уровня экспрессии белка В23 в имму-ногистохимическом методе [17]. Сходные данные получены при изучении клеток у пациентов с раком почки и опухолями другой этиологии [18-21].

Несмотря на наличие информации о существовании нескольких структурных форм нуклеофозмина, данные о том, какая из форм белка (мономерная или олигомерная) и какая из изоформ белка (В23.1 или В23.2) отражает состояние про-лиферативной активности клеток, до недавнего времени отсутствовали.

После получения нами аффинно-очищенных противо-пептидных антител (АТ), направленных к синтезированному №концевому участку аминокислотной последовательности нуклеофозмина (АТ 19-36) [22], содержащемуся во всех известных формах белка и вовлеченному в межмолекулярный контакт в олигомерах, а также АТ к синтезированному С-концевому участку аминокислотной последовательности АТ 283-294 [23], который выявляет олигомеры и содержится только в изоформе В23.1, установлено, что в иммуноцитохимических реакциях на моделях ФГА-стимулированных лимфоцитов олигомерная форма в отличие от мономерной локализована в ядрышке, и именно она связана с возрастанием пролиферативной активности клеток, что выражается в увеличении количества маркируемых ядрышек и интенсивности их окрашивания [24, 25].

Принимая во внимание то, что определение проли-феративной активности клеток имеет важное значение в дифференциальной диагностике и прогнозировании онко-гематологических заболеваний, мы провели анализ мономер-олигомерного состояния В23 в клетках у больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями (ЛПЗ) и заболеваниями неопухолевой природы [26].

В результате этих исследований выявили, что о проли-феративной активности клеток можно судить по количеству окрашиваемых в каждой клетке ядрышек в иммуноцитохи-мическом методе при использовании АТ 283-294 в отличие от АТ 19-36 и общепринятого маркера пролиферации Ю-67. При этом количество ядрышек прямо коррелировало со степенью злокачественности заболевания. Полученные результаты еще раз подтвердили, что за состояние пролиферации отвечает не весь пул белка В23, а только изоформа В23.1, образующая олигомеры, локализованные в ядрышках и изменяющиеся в

процессе пролиферации. В то же время мономерная форма белка В23 является более инертной, практически не изменяясь на всем протяжении пролиферативного процесса. Однако при наиболее злокачественных формах ЛПЗ с максимальным количеством Ki-67-положительных клеток наблюдали миграцию в ядрышки и мономерной формы белка В23.

С учетом возрастающего интереса к использованию белка В23 в качестве одного из основных маркеров опухолей целью данной работы стало предварительное исследование мономер-олигомерного состояния В23 в иммуноцитохимическом методе с помощью полученных противопептидных АТ в клетках ограниченного контингента больных с опухолями различной этиологии и доброкачественными новообразованиями.

Материалы и методы. Материалом исследования служили отпечатки биопсированной ткани новообразований, сделанные на 8-луночных стеклах (MP Biomedicals, Германия). После высушивания клетки на отпечатках фиксировали 2% параформальдегидом на PBS при комнатной температуре в течение 20 мин с последующей обработкой 0,5% раствором тритона Х-100 на PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. После фиксации иммуноцитохимическое выявление проводили по описанной нами ранее методике [24].

Первичными тест-АТ служили аффинно-очищенные по-ликлональные (кроличьи) противопептидные АТ (ИБХ РАН) в разведении 1:50:

• АТ 19-36, выявляющие на иммуноблоттах пул белка В23 в виде мономеров;

• АТ 283-294, выявляющие на иммуноблоттах пул белка В23 в виде SDS-устойчивых олигомеров.

В качестве контрольных первичных АТ использовали моноклональные АТ (МКА) - анти-В23 к белку B23 (кат. № М724001; Sigma, США) в разведении 1:100. Для люминесцентного окрашивания в качестве вторичных АТ использовали для МКА анти-В23 козью сыворотку против иммуноглобулинов мыши, меченную ФИТЦ («Сорбент», Россия) в разведении 1:80. Для противопептидных кроличьих АТ 19-36 и АТ 283-294 использовали АТ к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с ФИТЦ («Медгамал», Россия).

В качестве обязательного отрицательного контроля для исключения неспецифического связывания с ФИТЦ-меченными вторичными АТ использовали клетки без внесения специфических первичных АТ.

Полученные препараты изучали с помощью люминесцентного микроскопа «Axiophot» (Carl Zeiss, Германия), используя объективы х100/1,3 и окуляры х10. Захват изображения проводили с помощью цифровой камеры Delta Pix.

Результаты и обсуждение

Исследования в иммуноцитохимическом методе провели на отпечатках новообразований различной этиологии и локализации у 26 больных (см. таблицу). В связи с тем, что наши исследования проводились до установления окончательного диагноза, группы больных были не однородными по количеству обследованных.

В качестве условного контроля использовали отпечатки ткани различных доброкачественных новообразований щитовидной железы с нулевым пролиферативным индексом по Ki-67 (1-я группа). Как видно из таблицы, в этой группе АТ к В23 маркировали в среднем 40% клеток, окрашивая не более 1-2 ядрышек (рис. 1, а). В то же время АТ 19-36 давали свечение, локализованное в цитоплазме и нуклеоплазме в виде многочисленных фокусов слабой интенсивности в большинстве (в среднем 70%) клеток, причем свечения в ядрышках не выявили ни в одном случае (рис. 1, б). При этом АТ 283-294 выявляли свечение пула белка, локализованного не только в цитоплазме (25%), но и в ядрышке в виде 1-2 фокусов средней интенсивности приблизительно в 25% клеток (рис. 1, в), что было сходно с локализацией белка В23, выявляемого в контрольной группе общепринятыми МКА к цельному белку В23. Эти данные оказались сходными и с нашими предыдущими исследованиями по сравнению содержания АТ, выявляющих цельную молекулу В23 или его различные формы в лимфоци-

Иммуноцитохимическое окрашивание ядрышкового белка В23/нуклеофозмина, выявляемого МКА анти-В23 (а), его мономерной формы, выявляемой противопептидными антителами АТ 19-36 (б), и олигомерной формы, выявляемой противопептидными антителами АТ 283-294 (в) в различных опухолевых клетках. Ув. 40.

1 - доброкачественное новообразование щитовидной железы (узловой зоб, контроль), 2 - рак щитовидной железы, 3 - рак поджелудочной железы.

тах у больных с нелимфопролиферативными заболеваниями, имеющими нулевой пролиферативный индекс [26].

При исследовании отпечатков опухолевой ткани у больных с различными формами рака щитовидной железы (2-я группа) общий процент позитивных клеток с окрашиванием как анти-В23 (рис. 2, а), так и обоими противопептидными АТ был существенно выше, достигая у некоторых больных 100%. При этом АТ 19-36 выявляли свечение, локализованное только в области цитоплазмы и нуклеоплазмы в виде многочисленных фокусов высокой интенсивности (рис. 2, б) в подавляющем большинстве клеток (от 48 до 100%) с увеличением интенсивности свечения (с + до +++) по сравнению с клетками у больных контрольной группы. У большинства больных этой группы при использовании АТ 283-294 наблюдали сходные показатели с контрольными АТ к В23 по количеству позитивных клеток, интенсивности свечения и количеству маркируемых ядрышек (у 4 из 8 больных окрашивалось три ядрышка и более в большинстве клеток). От-

личие же состояло в том, что у большинства больных при использовании АТ 283-294 в клетках выявляли видоизмененные, с размытыми очертаниями, увеличенные в размере ядрышки (рис. 2, в), в то время как ядрышки, выявляемые контрольными АТ анти-В23, были обычного размера и имели очень четкие очертания.

В 3-ю группу вошли 5 больных раком молочной железы на разных стадиях болезни. В данной группе при использовании контрольных АТ к белку В23 наблюдали свечение белка в области ядрышек в среднем в 67% клеток (от 56 до 85%), причем в основном по 1 ядрышку, только у 2 больных маркировалось 2 ядрышка. При исследовании этих же отпечатков с АТ 283-294 количество позитивных клеток было несколько выше - в среднем 86% (от 65 до 100%) с увеличением количества многоядрышковых клеток с видоизмененными ядрышками (до 69%). Следует отметить, что при наличии в клетках более 3 ядрышек помимо общего увеличения их количества (до 5) и усиления интенсивности свечения наблюдали увели-

чение размера ядрышек и потерю ими четких очертаний. При исследовании этих же клеток с АТ 19-36 количество позитивных клеток в среднем составило около 78% (также от 65 до 100%), однако свечение при этом локализовалось только в области нуклеоплазмы и цитоплазмы в виде многочисленных фокусов средней интенсивности при отсутствии высвечивания ядрышек.

В 4-й группе представлены результаты иммуноцитохи-мического окрашивания отпечатков опухолей желудочно-кишечного тракта (рак желудка, поджелудочной железы, толстой кишки). Данная группа характеризовалась довольно высоким уровнем экспрессии белка В23 (рис. 3, а), выявляемого контрольными АТ анти-В23 (в среднем 84%), однако уровень экспрессии белка, обнаруженного обоими противо-пептидными АТ, был существенно выше, достигая 100% при очень высокой интенсивности свечения. При сравнении контрольных АТ и АТ 283-294 установили, что даже при максимально высоком проценте положительных клеток количество многоядрышковых клеток с анти-В23 существенно ниже (28% против 90%) с отсутствием видоизмененных ядрышек в отличие от ядрышек, окрашенных АТ 283-294 (рис. 3, б). Количество позитивных клеток при использовании АТ 19-36 было также очень высоким, составив в среднем 97%, но свечение при этом локализовалось лишь в области нуклеоплаз-мы и цитоплазмы в виде многочисленных фокусов свечения высокой интенсивности (рис. 3, в).

При исследовании отпечатков опухолевой ткани у больных с диагнозом рака средостения (5-я группа) экспрессия белка, выявляемого и контрольными АТ, и исследуемыми противо-пептидными АТ, была очень высокой, достигая 100%. При этом количество клеток, маркируемых контрольными АТ анти-В23, все же было существенно ниже, чем количество положительных клеток при использовании АТ 283-294, которое у больных составило от 85 до 100%. Причем видоизмененные ядрышки в многоядрышковых клетках выявляли только при иммуноокрашивании АТ 283-294. При этом АТ 19-36 выявляли свечение, локализованное только в области цитоплазмы и нуклеоплазмы, в виде многочисленных фокусов высокой интенсивности свечения, не затрагивая ядрышки.

Заключение. Таким образом, в наших исследованиях мы действительно подтвердили, что белок В23, изученный ранее в основном в качестве аргирофильного белка в иммуногисто-химическом методе [13-21], может являться маркером злокачественных опухолей и при использовании иммуноцитохи-мического метода, который более доступен в лабораторной практике. Однако не вся молекула белка В23 отвечает за информативность метода, что следует из сравнения результатов с противопептидными АТ, выявляющими раздельно его мономерную (АТ 19-36) или олигомерную (АТ 283-294) форму. При этом хотелось бы отметить, что АТ (19-36) давали достаточно сходные результаты при всех видах опухолей, локализуясь только в цитоплазме и нуклеоплазме, не маркируя ядрышки, даже несмотря на очень высокий уровень экспрессии белка, выявляемого АТ 19-36 у некоторых больных во всех группах. Это отличает их от феномена, описанного нами у больных с ЛПЗ при высокой степени злокачественности, где у некоторых из них мономерная форма белка, выявляемая АТ 19-36, мигрирует в ядрышки [26]. В отличие от АТ 19-36 противопептидные АТ 283-294, выявляющие пул белка В23 изоформы В23.1, маркировали, не окрашивая цитоплазмы, исключительно ядрышки клеток, выявляя не только их повышенное количество, но и изменение формы, очертаний и интенсивности свечения у больных со злокачественными опухолями, что безусловно свидетельствует об их диагностической значимости. Мы считаем перспективным их использование в диагностике и прогнозировании течения рака молочной железы, так как, несмотря на большое количество попыток, не найдено однозначно достоверных данных, которые позволили бы при этой форме опухоли рекомендовать общепринятый маркер пролиферации Ю-67 в клинической практике [27] в отличие от его использования при других форм рака (например, при раке легкого) [14-16]. Это делает особенно актуальным появление нового

диагностического и прогностического маркера как для рака молочной железы, так и для других опухолей, которым может явиться изоформа В23.1, выявляемая АТ 283-294 по наличию, количеству, форме и интенсивности окрашивания ядрышек в опухолевых клетках.

литература

1. Chan P.K., Chan F.Y. Nucleophosmin/B23 (NPM) oligomer is a major and stable entity in HeLa cells. Biochim. Biophys. Acta. 1995; 1262: 37-42.

2. Lim M.J., Wang X. Nucleophosmin and human cancer. Cancer Detect. Prev. 2003; 30: 481-90.

3. Grisendy S., Meccuci C., Falini B., Pandolfi P. Nucleophosmin and cancer. Nat. Rev. 2006; 6: 493-505.

4. Falini B., Nicoletti I., Bolli N., Martelli M.P., Liso A., Gorello P. et al. Translocations and mutations involving the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and leukemias. Haematol. 2007; 92: 519-32.

5. Сауткина Е.Н., Потапенко Н.А., Булычева Т.И., Владимирова Н.М. Выделение белка В23/нуклеофозмина из ядер клеток HeLa. Прикладная биохимия и микробиология. 2008; 44 (3): 287-95.

6. Grummit C.G., Townsley F.M., Johnson C.M., Warren A.J., By-croft M. Sructural TOnsequences of тucleophosmin Hutations in аcute мyeloid leukemia. J. Biol. Chem. 2008; 283: 23326-32.

7. Владимирова Н.М., Сауткина Е.Н., Табданов Е.Б. Идентификация и характеристика мономерных и олигомерных изо-форм ядрышкового белка 23/нуклеофозмина в клетках HeLa. Биологические мембраны. 2004; 21: 94-101.

8. Булычева Т.И., Артеменко Е.Г., Дергунова Н.Н., Дудник О.А., Шпакова А.П., Малашенко О.С., Зацепина О.В. Анализ пролиферативной активности клеток с помощью новых моноклональных антител к ядрышковому белку B23/нуклео-фозмину. Цитология. 2000; 42 (10): 944-54.

9. Dergunova N.N., Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Shpakova A.P., Pegova A.N., Gemijan E.G. еt al. A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes. Immunol. Lett. 2002; 83: 67-72.

10. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Артеменко Е.Г., Самойлова Р.С., Зацепина О.В. Диагностическое значение ядрышкового белка В23/нуклеофозмина при хронических лимфопролифе-ративных заболеваниях. Terra Medica. Лабораторная диагностика. 2006; 2 (10): 16-21.

11. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Артеменко Е.Г., Самойлова Р.С., Зацепина О.В. Способ прогнозирования прогрессирова-ния хронического лимфолейкоза по количественному содержанию ядрышкового белка В23/нуклеофозмина в лизатах лимфоидных клеток. Патент РФ № 2310201 от 10.11.2007.

12. Зенит-Журавлева Е.Г., Полковниченко Е.М., Лушникова А.А., Трещалина Е.М., Букаева И.А., Райхлин Н.Т.. Нуклео-фозмин и нуклеолин: кодирующие гены и экспрессия в различных тканях животных и человека: обзор. Молекулярная медицина. 2012, 4: 24-31.

13. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Смирнова Е.А., Гуревич Л.Е., Делекторская В.В., Полоцкий Б.Е. и соавт. Значение экспрессии ядрышковых аргирофильных белков и антигена Ki-67 в определении пролиферативной активности клеток и прогноза малого (Т1) рака легкого. Архив патологии. 2008, 3: 15-8.

14. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Смирнова Е.А., Пономарева М.В., Чекини А.К., Павловская А.И., Шабанов М.А. Про-лиферативная активность, степень злокачественности и прогноз при карциноидных опухолях легкого. Вестник РОНЦ им. Н.Н. БлохинаРАМН. 2012, 4: 17-23.

15. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Лазарев А.Ф. и др. Взаимосвязь между арги-рофильными белками районов ядрышковых организаторов и стадией плоскоклеточного рака легкого. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013; 156 (7): 93-7.

16. Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П., Бычкова Е.Ю., Круглова Н.М. и др. Аргирофильные белки ядрышковых организатов и пролиферативная активность клеток при плококлеточном раке легкого. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2014, 2: 97-103.

17. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Филиманюк А.В., Смирнова Е.А., Пробатова Е.А., Павловская А.И. и др. Значение оценки про-лиферативного потенциала (соотношение количества проли-

ферирующих клеток и длительность митотического цикла) в определении степени злокачественности и прогноза при адре-нокортикальном раке. Архив патологии. 2011; 73(5): 43-7.

18. Бобров И.П., Черданцева Т.М., Климачев В.В., Брюханов В.М., Лазарев А.Ф., Авдалян А.М. и др. Морфофункциональ-ная активность ядрышковых организаторов при раке почки, взаимосвязь с гистологическим строением перитуморозной зоны. Фундаментальные исследования. 2011; 11: 485-90.

19. Райхлин Н.Т., Букаева И.А., Смирнова Е.А., Павловская А.И., Бржезовский В.Ж., Богатырев В.Н., Пономарева М.В. Прогностическое значение исследования степени экспрессии аргирофильных белков областей ядрышковых организатов на примере папиллярного рака щитовидной железы. Архив патологии. 2010; 4: 49-52.

20. Бобров И.П., Авдалян А.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я., Долгатов А.Ю. и др. Аргирофильные белки районов ядрышковых организаторов в аденомах с различной степенью дисплазии и аденокарциноме толстой кишки. Архив патологии. 2010; 4: 16-23.

21. Бобров И.П., Авдалян А.М., Лазарев А.Ф., Климачев В.В., Климачева Т.Б., Мищенко Е.В. Морфофункциональная характеристика белков областей ядрышковых организаторов при гладкомышечных опухолях матки. Архив патологии. 2008; 3: 18-23.

22. Короев Д.О., Шалгунов B.C., Владимирова Н.М., Лобанова Н.В., Волкова Т.Д., Вольпина О.М. Пептид, стимулирующий образование специфических антител против мономерной формы нуклеофозмина в опухолевых клетках. Патент РФ № 2401274 от 06.04.2009.

23. Короев Д.О., Шалгунов B.C., Владимирова Н.М., Лобанова Н.В., Волкова Т.Д., Вольпина О.М. Пептид, стимулирующий образование специфических антител против олигомерной формы нуклеофозмина в опухолевых клетках. Патент РФ № 2401275 от 06.04.2009.

24. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л., Вольпина О.М., Владимирова Н.М. Иммуноцитохимическая визуализация мономерных и олигомерных форм ядрыщшкового белка В23/нуклеофозми-на в лимфоцитах человека в процессе пролиферации. Иммунология. 2011; 5: 231-6.

25. Булычева Т.И., Дейнеко Н.Л. Способ иммуноцитохимиче-ской оценки пролиферативного состояния лимфоцитов по характеру экспрессии c-концевого фрагмента белка В23/ нуклеофозмина в реакции непрямой иммунофлюоресценции. Патент РФ № 2438135 от 27 декабря 2011.

26. Дейнеко Н.Л., Булычева Т.И., Григорьев А.А., Ковригина А.М., Вольпина О.М., Владимирова Н.М. Иммуноцитохи-мическая идентификация мономерных и олигомерных форм белка В23/нуклеофозмина в лимфоцитах человека у больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Иммунология. 2014; 2: 68-73.

27. Yerushalmi R., Woods R., Ravdin P.M. Ki-67 in breast cancer prognostic and predictive potential. Lancet Oncol. 2011; 11 (2): 174-83.

Поступила 01.10.14

references

1. Chan P.K., Chan F.Y. Nucleophosmin/B23 (NPM) oligomer is a major and stable entity in HeLa cells. Biochim. Biophys. Acta. 1995; 1262: 37-42.

2. Lim M.J., Wang X. Nucleophosmin and human cancer. Cancer Detect. Prev. 2003; 30: 481-90.

3. Grisendy S., Meccuci C., Falini B., Pandolfi P. Nucleophosmin and cancer. Nat. Rev. 2006; 6: 493-505.

4. Falini B., Nicoletti I., Bolli N., Martelli M.P., Liso A., Gorello P. et al. Translocations and mutations involving the nucleophosmin (NPM1) gene in lymphomas and leukemias. Haematologica. 2007; 92: 519-32.

5. Sautkina E.N., Potapenko N.A., Bulycheva T.I., Vladimirova N.M. Isolation of the protein B23/nucleophosmin from the nuclei of the cells HeLa. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2008; 44

6. Grummit C.G., Townsley F.M., Johnson C.M., Warren A.J., By-croft M. Sructural TOnsequences of тucleophosmin Hutations in аcute мyeloid leukemia. J. Biol. Chem. 2008; 283: 23326-32.

7. Vladimirova N.M., Sautkina E.N., Tabdanov E.B. Identification and characterization of monomelic and oligomeric isoforms of

the nucleolar protein B23/nucleophosmin in cells HeLa. Biolog-icheskie membraney. 2004; 21: 94-101.

8. Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Dergunova N.N., Dudnik O.A., Shpakova A.P., Malashenko O.S., Zatsepina O.V. Analysis of proliferative activity of cells using new monoclonal antibodies against the nucleolar protein B23/nucleophosmin. Tsitologiya. 2000; 42

9. Dergunova N.N., Bulycheva T.I., Artemenko E.G., Shpakova A.P., Pegova A.N., Gemijan E.G. et al. A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes. Immunol. Lett. 2002; 83: 67-72.

10. Bulycheva T.I., Deineko N.L., Artemenko E.G., Samoilova R.S., Zatsepina O.V. Diagnostic significance of the nucleolar protein B23/nucleophosmin during chronic lymphoproliferative diseases. Terra Medica. Laboratornaya diagnostika. 2006; 2

11. Bulycheva T.I., Deineko N.L., Artemenko E.G., Samoilova R.S., Zatsepina O.V. A Method of Forecasting of the Development of Chronic Lympholeukosis According to the Levels of the Nucleolar Protein B23/Nucleophosmin in Lysates of Lymphoid Cells. Patent RF, № 2310201, 2007.

12. Zenit-Zhuravleva E.G., Polkovnichenko E.M., Lushnikova A.A., Treshchalina E.M., Bukaeva I.A., Raikhlin N.T. Nucleophosmin and nucleoloin: coding genes and expression in various human and animal tissues, review. Molekulyarnaya meditsina. 2012; 4: 24-31.

13. Raikhlin N.T., Bukaeva I.A., Smirnova E.A., Gurevich L.E., Delek-torskaya V.V., Polotskiy B.E. et al. The significance of expression of the nucleolar argyrophilic proteins and the antigen Ki-67 in determination of the proliferative activity of cells and prognosis of small lung cancer. Arkhiv patologii. 2008; 3: 15-8.

14. Raihlin N.T., Bukaeva I.A., Smirnova E.A., Ponomareva M.V., Chekini A.K., Pavlovskaya A.I., Shabanov M.A. Proliferative activity, the degree of malignancy and prognosis during carcinoid lung tumors. VestnikRONTS im. N.N. Blokhina. 2012; 4: 17-23.

15. Kobyakov D.S., Klimachev V.V., Avdalyan A.M., Bobrov I.P., Bychkova E.Yu., Lazarev A.F. et al. A relationship between argyrophilic proteins from nucleolar organizer regions and the stage of squamous cell carcinoma of lung. Byulleten' eksperimental'noy biologii i meditsiny. 2013; 156

16. Kobyakov D.S., Klimachev V.V., Avdalyan A.M., Bobrov I.P., Bychkova E.YU., Kruglova N.M. et al. Argyrophilic proteins of the nucleolar organizer during squamous cell carcinoma of the lung. Kletochnye tekhnologii v biologii i meditsine. 2014; 2: 97-103.

17. Raikhlin N.T., Bukaeva I.A., Filimanyuk A.V., Smirnova E.A., Probatova E.A., Pavlovskaya A.I. et al. The significance of the estimation of proliferative potential in estimation of the degree of malignancy and prognosis during adrenocortical cancer. Arkhiv patologii. 2011; 73

18. Bobrov I.P., Cherdantseva T.M., Klimachev V.V., Bryukhanov V.M., Lazarev A.F., Avdalyan A.M. et al. Morfofunctional activity of the nucleolar organizers during renal cancer, the connection with the histological compostion of peritumor zone. Fundamental'nye issledovaniya. 2011; 11: 485-90.

19. Raikhlin N.T., Bukaeva I.A., Smirnova E.A., Pavlovskaya A.I., Brezhesovskiy V.Zh., Bogatyrev V.N., Ponomareva M.V. Prognostic significance of studying the degree of expression of argirophyl-lic proteins from the nucleolar organizer regions using papillary thyroid cancer. Arkhiv patologii. 2010; 4: 49-52.

20. Bobrov I.P., Avdalyan A.M., Klimachev V.V., Lazarev A.F., Gerval'd V.Ya., Dolgatov A.Yu. et al. Argyrophylic proteins from the nucleolar organizer regions in adenomas with various degrees of dysplasia and adenocarcinoma of colon. Arkhiv patologii. 2010; 4: 16-23.

21. Bobrov I.P., Avdalyan A.M., Lazarev A.F., Klimachev VV., Kli-macheva T.B., Mishchenko E.V. Morfofunctinal characteristic of the proteins from the nucleolar organizer regions during smooth muscle tumors of the uterus. Arkhiv patologii. 2008; 3: 18-23.

22. Koroev D.O., Shalgunov V.S., Vladimirova N.M., Lobanova N.V., Volkova T.D., Volpina O.M. A Peptide that Stimulates Formation of Specific Antibodies Against a Monomeric Form of Nucleophosmin in Tumor Cells. Patent RF N 2401274, 2009.

23. Koroev D.O., Shalgunov V.S., Vladimirova N.M., Lobanova N.V., Volkova T.D., Vol'pina O.M. A Peptide that Stimulates Formation

of Specific Antibodies Against an Oligomeric Form ofNucleophos-min in Tumor Cells. Patent RF N 2401275, 2009.

24. Bulycheva T.I., Deinkeo N.L., Volpina O.M., Vladimirova N.M. Im-munocytochemic visualization of monomelic and oligomeric forms of the nucleolar protein B23/nucleophosmin in human lymphocytes during proliferation. Immunologiya. 2011; 5: 231-6.

25. Bulycheva T.I., Deinkeo N.L. A Method of Immunocytochemic Evaluation of the Proliferative State of Lymphocytes Based on the Patterns of Expression of the C Terminus Fragment of the Protein B23/Nucleophosmin in the Reaction of Indirect Immunofluorescence. Patent RF № 2438135, 2011.

26. Deineko N.L., Bulycheva T.I., Grigor'ev A.A., Kovrigina A.M., Vol'pina O.M., Vladimirova N.M. Immunocytochemical identification of monomomeric and oligomeric forms of the protein B23/ nucleofosmin in human lymphocytes from patients with various lymphoproliferative diseases. Immunologiya. 2014; 2: 68-73.

27. Yerushalmi R., Woods R., Ravdin P.M. Ki-67 in breast cancer prognostic and predictive potential. Lancet Oncol. 2011; 11 (2): 174-83.

Received 01.10.14

© богданова и.м., пономаренко е.а., 2015 удк 615.277.3.015.44.076.9

Богданова И.М., Пономаренко Е.А.

стимуляция опухолеспецифического иммунного ответа цитостатическими химиопрепаратами в популяции клеток селезенки мышей in vitro

ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН, г Москва

Исследовали влияние противоопухолевых химиопрепаратов доксорубицина, цисплатина и топотекана на клетки опухолевых линий различного генеза in vitro. Культивирование опухолевых клеток с клетками селезенки интактных мышей приводит к опухолеспецифической активации иммунитета, регистрируемой по выработке провоспалитель-ных цитокинов фактора некроза опухоли а и интерферона-Y. При оценке прямого цитотоксического действия химиопрепаратов на клетки опухолевых линий выявлены чувствительные и резистентные линии. Предварительная обработка опухолевых клеток цитостатиками с последующей отмывкой приводит к повышению уровня цитокинов в надосадочной жидкости 24-часовых культур опухолевых клеток и клеток селезенки. Это, очевидно, связано с усилением экспрессии иммуногенных детерминант в опухолевых клетках, претерпевающих начальную стадию апоптоза. Взаимосвязь между повышением иммуногенного потенциала опухолевых клеток, обработанных цитостатиками, и их чувствительностью к действию химиопрепаратов выявлена только при использовании опухолевых линий одного тканевого происхождения, глиобластом 101.8 и С6. В случае с клетками L929 (фибробластоподобная опухолевая клеточная линия), резистентными к цитотоксическому действию цитостатиков, выявлена обратная зависимость между резистентностью опухоли к цитостатикам и индукцией иммуногенного потенциала. Возможно, экспрессия иммуно-генных детерминант на опухолевых клетках и их гибель, индуцированная действием препаратов, значительно разобщены во времени. Необходимы дополнительные эксперименты для ответа на поставленные вопросы.

Ключевые слова: опухолевые клеточные линии; клетки селезенки; иммуногенность; противоопухолевые хи-миопрепараты.

Для цитирования: Иммунология. 2015; 36(3): 158-161.

Bogdanova I.M., Ponomarenko E.A.

STIMULATION OF TUMOR-SPECIFIC IMMUNE RESPONSE BY CYTOSTATIC CHEMOTHERAPEUTIC DRUGS IN POPULATION MICE SPLEEN CELLS IN VITRO

The influence of anticancer chemotherapeutic drugs (doxorubicin, cisplatin, topotekan) on the different tumor cell lines was investigated in vitro. The cultivation of tumor cells with splenic ones from intact mice resulted in the activation of tumor-specific immune response, detected by the proinflammatory cytokines production - TNF-а and IFN-y. When estimating a direct cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs, sensitive and resistant cell lines were detected. Pretreatment of tumor cells by cytostatics and subsequent washing leaded to increase of cytokines production in the supernatant of 24 hours tumor and splenic cells culture. Obviously, that connected with the enhancement of immunogenic determinants in tumor cells, undergoing the initial stage of apoptosis. The enhancement of immunogenic determinants in tumor cells, treated by cytostatics, correlated with their susceptibility to chemotherapeutic drugs action in cases of 101.8 and C6 glioblastomas only. L929 cells (fibroblast-like tumor cell line) were resistant to cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs and had inverse relationship between tumor resistance to cytostatics and the induction of immune potential. Probably, the expression of immunogenic determinants on tumor cells and their death, induced by drugs, are significantly disconnected in a time. Additional experiments are clearly needed to clarify this point.

Keyword: tumor cell lines; spleen cells;immunogenicity; chemotherapeutic drugs.

citation: Immunologiya. 2015; 36

Иммунная система может идентифицировать и разрушать вновь образуемые опухолевые клетки, т.е. осуществлять противоопухолевый иммунный надзор. В процессе онкогенеза

Для корреспонденции: Богданова Ирина Михайловна, mor-folhum@mail.ru

For correspondence: Bogdanova Irina Mikhaylovna, morfolhum@mail.ru

в результате многочисленных мутаций опухолевые клетки начинают экспрессировать измененные антигенные пептиды, которые могут быть распознаны иммунной системой как измененное «свое» [1]. К настоящему времени в многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях получены неоспоримые доказательства участия клеток врожденного и адаптивного иммунитета в противоопухолевом иммунном надзоре [2, 3]. Взаимосвязь между врожденным и