Мутации TP53 без делеции 17p могут быть связаны с рефрактерностью к терапии

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3

выполнено 7 больным. И уже через 1-5 дней (медиана 3 дня) после аборта всем им было начато проведение индукционной химиотерапии в полных дозах. Вопрос о родоразрешении до начала курса ХТ встает лишь на поздних сроках (35-40 нед). До начала ХТ родоразрешение было выполнено 7 больным (ОМЛ - 4, ОПЛ - 2, ОЛЛ - 1) на сроке 36-39 нед (медиана 38 нед). Всем им через 1-35 дней (медиана 7 дней) было начато проведение индукционной ПХТ в полных дозах. Если срок беременности составляет 12-34 нед, необходимо проводить ХТ, которая должна осуществляться по стандартным программам лечения ОМЛ, ОПЛ и ОЛЛ взрослых без снижения доз цитостатических препаратов. Лечение ОЛ (1-4 курса ХТ (медиана 1 ) на фоне беременности на сроках 14-34 нед (медиана 24 нед) выполнено 24 больным (у 13 - ОМЛ, у 3 - ОПЛ, у 8 - ОЛЛ). У 11 (45,8%) из 24 при проведении индукционного курса ХТ в полных дозах к моменту родоразрешения была достигнута полная ремиссия ОЛ. У 13 (54,2%) из 24 пациенток родоразрешение выполнялось вне ремиссии - либо по срочным показаниям на фоне продолжающего индукционного курса ХТ или при резистентности лейкемии. У 2 больных на фоне ХТ была констатирована антенатальная гибель плода на сроке беременности 30 и 32 нед. У 12 больных - на сроке беременности 30-39 нед (медиана 36 нед) произошли

самостоятельные роды и 17 - было выполнено кесарево сечение. Один ребенок умер на фоне пневмонии в течение первой недели жизни, остальные дети живы (2 нед - 22 года) и здоровы. Нами замечен курьезный феномен, что у больных, страдающих ОМЛ чаще (83%) рождаются мальчики, а ОЛЛ -девочки (63%), причем эти различия статистически значимы (p = 0,01). При проведении ХТ в полных дозах результаты лечения беременных с ОЛ не отличаются от таковых показателей в данной возрастной группе - по данным ГНЦ частота достижения ремиссии у этой категории больных составляет 72%. В целом, частота достижения ремиссии выше при ОМЛ и ОПЛ - 81,3% и 80%, с ранней летальностью - 6,2% и 20% и резистентностью - 2% и 0%, соответственно, чем при ОЛЛ -60%, 20% и 20% соответственно. В настоящее время живы 14 (36,8%) из 38 наших больных; период наблюдения от 4 нед до 13 лет.

Заключение. Наши данные демонстрируют, что основной целью лечения ОЛ на фоне беременности является спасение двух жизней. ХТ беременным женщинам с целью достижения ремиссии ОЛ после 1-го курса должна проводиться по стандартным программам в полных дозах. Долгосрочные результаты лечения этих больных сопоставимы с общими результатами лечения ОЛ.

Оптимизация условий культивирования В-клеток хронического лимфолейкоза

Р.А. Сарибекян, И.А. Воробьев

ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России, Москва

Введение. При культивировании В-клеток хронического лимфолейкоза (В-ХЛЛ) in vitro, в большинстве работ наблюдается высокий уровень спонтанного апоптоза, что сильно затрудняет исследования данного заболевания в моделях ex vivo. Целью настоящей работы являлся поиск оптимальной среды для культивирования В-ХЛЛ.

Материалы и методы. Исследовали опухолевые клетки, выделенные у больных В-ХЛЛ. У 39 из них, клетки выделяли из образцов периферической крови, у 12 - из биоптатов селезенки или лимфатических узлов. Для получения культуры стромальных клеток использовали клетки выделенные из пун-ктатов костного мозга у 19 больных В-ХЛЛ. Периферические мононуклеары крови (ПМК) и стромальные клетки костного мозга выделяли в градиенте фиколла ("Sigma-Aldrich") и культивировали в термостате при 5% CO2 и температуре 37оС. При культивировании стромальных клеток в качестве фидерного слоя использовали среду RPMI-1640 ("Панэко") с добавлением 10% сыворотки новорожденных телят (NBCS, "Панэко"). При этом по прошествии 24 ч все не прикрепившиеся к пластику клетки удаляли. Полученную культуру стромальных клеток выращивали в течение 2-3 нед, и затем использовали в качестве подложки. Для культивирования клеток В-ХЛЛ использовали среду Hybridoma SFM ("Invitrogen") без добавления сыворотки, и среду RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки NBCS. Уровень апоптоза определяли методом проточной цитофлюориметрии (прибор FACS Calibur, "BD Bioscience", США). Для маркирования апоптотических В-клеток использовали Annexin V ("BD Pharmingen") и моноклональные антитела к CD19 ("Dako Cytomation"). Анализ полученной информации производили с помощью программы CellQuest.

Результаты и обсуждение. При культивировании ПМК от больных В-ХЛЛ в среде Hybridoma SFM

частота апоптоза составила 32 ± 6,3% на 1-е сутки, 32,3 ± 8,4% на 2-е сутки, 27,5 ± 6,1% на 3-и сутки и 39,1 ± 14% 6-е сутки (n = 20). При культивировании ПМК В-ХЛЛ в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки частота апоптоза составила 20 ± 5,2% на 1-е, 21,7 ± 6,7% на 2-е, 25,7 ± 8,2% на 3-и, и 40,1 ± 10,9% на 6-е сутки (n = 19). При добавлении в среду Hybridoma SFM альбумина (25 мг/мл) частота апоптоза уменьшилась и составляла 15,4 ± 5,1% на 1-е сутки, 20,2 ± 9,5% на 2-е сутки, 21 ± 10,8% на 3-и сутки (n = 20). Добавление IL-6 в среду Hybridoma SFM не имело существенного влияния на уровень апоптоза - доля апопто-тических клеток составляла 33,7 ± 5,7% после 24 ч культивирования, 31,2 ± 7,6% после 48 ч и 31 ± 14,6% после 72 ч (n = 20). При культивировании суспензий лимфатических органов, которые содержали как клетки В-ХЛЛ, так и стромальные клетки, в среде Hybridoma SFM уровень апоптоза составил 10,8 ± 4,8% на 1-е сутки, 10,1 ± 5,1% на 2-е сутки,

11,1 ± 5,5% на 3-и сутки (n = 12). При кокультивировании ПМК от больных В-ХЛЛ с заранее подготовленной подложкой из стромальных клеток неродственного костного мозга в среде RPMI-1640 с 10% сыворотки уровень апоптоза составлял 10,5 ± 3,9% на 1-е; 10,9 ± 4,8% на 2-е; 11,5 ± 5,3% на 3-и и 10,1 ± 3,1% на 6-е сутки (n = 19).

Заключение. При кокультивировании со стромальными клетками уровень спонтанного апоптоза в клетках В-ХЛЛ был в 2-3 раза ниже, чем при использовании как стандартной среды RPMI-1640 с добавлением сыворотки, так и среды Hybridoma SFM. Мы полагаем, что методикой культивирования клеток В-ХЛЛ, обеспечивающей минимальный уровень спонтанного апоптоза, является их кокультивирование с клетками стромы, получаемыми из костного мозга, в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки NBCS.

Мутации TP53 без делеции 17p могут быть связаны с рефрактерностью к терапии

Н.А. Северина, Б.В. Бидерман, Т.Н. Обухова, Е.А. Никитин, А.Б. Судариков ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России, Москва.

Введение. В настоящее время стандартом в лечении соматически сохранных больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) является режим FCR (флударабин, циклофосфан, ри-туксимаб). Эффективность и хорошая переносимость этого режима продемонстрирована в нескольких клинических испытаниях. Несмотря на высокую эффективность режима, существует категория больных, у которых это лечение не эффективно. В этой группе больных прогноз крайне неблаго-

приятен. Данная работа посвящена изучению молекулярных маркеров рефрактерности к режимам химиотерапии с использованием флударабина.

Материалы и методы. В исследование включены 39 первичных больных ХЛЛ

76

Приложение

Больные В-ХЛЛ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 28 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39

Делеция 17p + + + + + + + + +

Мутации TP 53 + + + + + + + - - + + + + +

Ответ на лечение ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±

больных был ХЛЛ в стадии А с прогрессией, у 29 (74%) - стадии B и у 6 (16%) - стадии С. Больные получали терапию по программам FCR, FCR-Lite и LR. Ответ в рамках данной работы оценивали по критериям IWCLL. Для анализа мутационного статуса гена TP53 использовали метод FASAY (R. Iggo et al., 1993). Принцип метода заключается в экспрессии мРНК опухолевого TP53 в специальном штамме S. cerevisiae, имеющем ген биосинтеза аденина под контролем TP53-зависимого промотора. Для анализа берут опухолевые клетки, выделяют мРНК, синтезируют кДНК, амплифицируют кодирующую последовательность TP53 и трансфецируют в штамм yIG398. В результате гомологичной рекомбинации кодирующая последовательность попадает в экспрессирующую конструкцию pSS16 и происходит синтез белка p53. Если в результате синтезируется функционально-активный белок p53, то соответствующие дрожжевые колонии бесцветны. Экспрессия мутантного p53 приводит к окрашиванию колоний в красный цвет. Соотношение бесцветных и красных колоний позволяет оценить долю мутантных мРНК гена TP53 в образце опухолевых клеток. За границу, дискриминирующую случаи В-ХЛЛ с мутациями от таковых без мутаций, в соответствии с данными литературы, было принято 30% красных колоний.

Результаты и обсуждение. Делеция 17p более чем в 10% ядер была выявлена у 9 больных. У 2 из них, число ядер с делецией составило 10 и 13,5% соответственно; у 1 - 23%, у 6 - более 80%. Медиана красных колоний у больных без

мутаций TP53 составила 9% (разброс 2-29%); у больных с мутациями - 70% (33-96%). С использованием границы в 30% мутации TP53 идентифицированы у 12 больных. В группе больных с делецией 17p (n = 9) мутации были выявлены у 7 больных. У 5 больных с мутациями TP53 делеции 17p не было. Из других хромосомных нарушений в этой группе у 2 больных имелась делецию 13q, у 1 - трисомия 12 и у 1 -делеция 11q (см. таблицу).

У 10 (26%) больных из 39 ответ на лечение расценивался как неблагоприятный за счет прогрессии на фоне терапии, у 29 - частичная ремиссия. В группе больных с нарушениями TP53 (п = 14) лечение было неэффективным у 8 (57%) больных. Рефрактерность наблюдалась у 5 из 9 больных с деле-цией 17p, у 3 из 5 больных с мутациями TP53 без делеции. В группе больных без мутаций и делеции терапия была неэффективна у 2 (8%) из 25 больных.

Заключение. Наше исследование показывает, что мутации TP53 выявляются у больных ХЛЛ чаще, чем делеция 17p. Мутации ассоциируются с делецией 17p, но могут наблюдаться в отсутствие делеции. Наличие только мутаций TP53 может быть связано с развитием рефрактерности к терапии c использованием флударабина. При подтверждении полученных закономерностей на большей выборке больных оценка мутаций TP53 методом FASAY может быть рекомендована в качестве скринингового метода, позволяющего предсказывать рефрактерность к терапии.

Модифицированная программа NHL-BFM-90 в лечении взрослых больных первичными лимфомами кишки

А.А. Сидорова1, Е.Е. Звонков2, А.К. Морозова2, С.К. Кравченко2, А.У. Магомедова2, Е.А. Барях 2, Т.Н. Обухова2,

Э. Г. Гемджян 2, В.И. Воробьев2, А.М. Кременецкая2, А.И. Воробьев2

1ФГБУ Больница красноярского научного центра СО РАН; 2 ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития России, Москва

Введение. Первичная лимфома кишки (ПЛК) - редкая и гетерогенная группа экстранодальных лимфатических опухолей. Чаще всего встречается диффузная В-крупноклеточная лимфома кишки (B-ККЛК) и лимфома Беркитта кишки (ЛБК), значительно реже целиакияассоци-ированная Т-крупноклеточная лимфома кишки (Т-ККЛК). Выбор терапии определяется нозологической формой и наличием факторов неблагоприятного прогноза. При стандартном режиме терапии диффузной B-ККЛК по схеме СНОР/RCHOP общая и безрецидивная 5-летняя выживаемость составляет от 40 до 60%. Работы по интенсификации полихимиотерапии (ПХТ) у этой группы больных не многочисленны и противоречивы. Эффективность ПХТ у взрослых больных ЛБК и целиакияассоциированной Т-ККЛК оценить сложно из-за малого числа наблюдений описанных в литературе. Целью исследования явилась оценка эффективности и токсичности модифицированной программы mNHL-BFM-90 у взрослых больных ПЛК.

Материалы и методы. С августа 2004 г по февраль 2012 г. на лечение по программе mNHL-BFM-90 было принято 28 больных ПЛК в возрасте от 15 до 59 лет (средний возраст 34 года). У 18 (64%) больных выявлена диффузная B-ККЛК, у 9 (32%) - ЛБК, у 1 (4%) - целиакияассоциированная Т-ККЛК. У 15 (54%) больных выявлено вовлечение толстой кишки, у 7 (25%) - илеоцекального угла, у 6 (21%) - тонкой кишки. Факторы неблагоприятного прогноза (1 фактор и более) выявлены у всех больных. Согласно классификации Lugano, стадия

IE установлена у 3 (11%) больных, стадия IIE - у 20 (71%), стадия IIIE - у 3 (11%), стадия IVE (сочетанное поражение кишки и миндалины - 1, кишки и оболочек мозга - 1) - у 2 (7%) больных. Повышение концентрации ЛДГ отмечено у 11 (39%), В-симптомы - у 13(46%) больных. Размер опухоли превышал 10 см у 16 (57%) больных. Резекция пораженной кишки до поступления в клинику проведена 22 (79%) больным. Всем больным проведено от 4 до 6 курсов ПХТ по программе mNHL-BFM-90. Больному целиакияассоциированной Т-ККЛК после 6 курсов mNHL-BFM-90 выполнена высоко-дозная химиотерапия по схеме BEAM с трансплантацией аутологичных стволовых клеток крови.

Результаты и обсуждение. Из 18 больных диффузной B-ККЛК у 15(83%) больных достигнута полная ремиссия, у 2 больных опухоль прогрессировала сразу после окончания лечения, что послужило причиной смерти больных; 1 больной умер от септических осложнений после 2-го курса ПХТ. При среднем сроке наблюдения 38 мес (2-108 мес) общая и безрецидивная выживаемость составила 83% и 100%. Из 9 больных ЛБК полная ремиссия достигнута у 9 (100%) больных. Общая и безрецидивная выживаемость составила 100% при среднем сроке наблюдения 65 мес (9-108 мес). У больного целиакияассоциированной Т -ККЛК сохраняется ремиссия заболевания в течение 4 мес.

Заключение. ПХТ по программе mNHL-BFM-90 показала универсально высокую эффективность в гетерогенной группе больных ПЛК.

Показатели состояния эндотелия и гемостаза после многократного и однократного введения

L-аспарагиназы

О.Ю. Скольская, С.Г. Владимирова, Л.Н. Тарасова, В.В. Черепанова ФГБУН Кировский НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России

Введение. Целью работы явилось сравнение показате- ных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) при терапии

лей состояния эндотелия и плазменного гемостаза у боль- L-аспарагиназой.

77