Роль нарушений системы цитокинов в патогенезе Helicobacter pylori-ассоциированной патологии

Роль нарушений системы цитокинов в патогенезе Helicobacter pylon-ассоциированной патологии

1 1 "2 Ч

Агеева Е.С. , Штыгашева О.В. , Иптышев В.М. , Рязанцева Н.В.

The role disorders at system of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pilory-associated pathology

Ageyeva Ye.S., Shtygasheva O.V., Iptyshev V.M., Ryazantseva N. V.

1 Хакасский государственный университет им. Н.Ф. Катанова, г. Абакан

2 Хакасская республиканская больница им. Г.Я. Ремишевской, г. Абакан

3 Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

© Агеева Е.С., Штыгашева О.В., Иптышев В.М., Рязанцева Н.В.

Обследовано 55 хакасов с Helicobacter pylori-ассоциированными язвенной болезнью и хроническим гастритом. Целью работы являлось оценить продукцию интерлейкинов IL-2, IL-4, IL-10 у пациентов с хронической персистенцией Helicobacter pylori. Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови определяли методом проточной цитофлюоримет-рии. Апоптоз оценивали методом световой микроскопии. Продукцию IL-2, IL-4, IL-10 в супернатантах определяли твердофазным иммуноферментным методом. Изменения, выявленные в крови у больных, инфицированных Helicobacter pylori, характеризовались увеличением количества и субпопуляционным дисбалансом лимфоцитов, модификацией апоптоза, истощением функциональной активности лимфоцитов.

Ключевые слова: Helicobacter pylori, язвенная болезнь, хакасы, апоптоз, иммунный ответ, лимфоциты.

Fifty five Khakas people with Helicobacter pylori-associated ulcer disease and chronic gastritis were examined in order to estimate the production of IL-2, IL-4, and IL-10 interleukins in patients with chronic Helicobacter pylori persistence. The subpopulation composition of lymphocytes of peripheral blood was determined by the method of flow-through cytofluorometry. Apoptosis was estimated by the method of optical microscopy. The IL-2, IL-4, IL-10 production in supernatants was determined by the solidphase immunoenzymometric method. Changes revealed in the blood of patients infected with Helicobacter pylori were characterized by the increased amount and subpopulation disbalance of lymphocytes, apoptosis modification, and depletion of lymphocyte functional activity.

Key words: Helicobacter pylori, ulcerative disease, Khakasses, apoptosis, immune response, lymphocytes.

УДК 616-092.19:579.835.12

Введение

Инфекция Helicobacter pylori (H. pylori) и ассоциированные с ней заболевания относятся к актуальным проблемам современной медицинской науки. Многочисленные исследования в области иммунологии и патофизиологии этого инфекционного процесса внесли существенный вклад в понимание механизмов персистенции H. pylori в организме [4, 9, 11, 15]. Установлено, что персистенция H. pylori связана со способностью возбудителя к взаимодействию с иммунной системой человека и адаптацией к ее изменениям [8]. Известно, что дисрегуляция TЫ/Th2-системы является важным звеном патогенеза H. pylori персистентной инфекции, определяя клинический полиморфизм и исход заболеваний [3, 7].

Известно, что лимфоциты дифференцируются на две основные субпопуляции Т-хелперов (ТЫ и Th2), различающихся набором секретируемых цитокинов. Активация Т-лимфоцитов заключается в индукции экспрессии генов ростовых факторов, в частности ГЬ-2, который готовит клетку к пролиферации и дифферен-цировке по ТЫ-пути [2]. Дифференцировка лимфоцитов по Th2-пути иммунного ответа контролируется преимущественно ГЬ-4 [1], который, являясь антагонистом ГЬ-2, смещает направленность иммунного ответа в сторону Th2-пути. Эффекты ГЬ-4 связаны с ингибицией продукции цитокинов и хемокинов ТЫ-пути (фактор некроза опухолей а, интерлейкины ГЬ-1, ГЬ-12), а также с подавлением продукции макрофагами супероксидных и нитроксидных радикалов. ГЬ-10, как и ГЬ-4, участвует

Агеева Е.С., Штыгашева О.В., Иптышев В.М., Рязанцева Н.В. Роль нарушений системы цитокинов в патогенезе.

в реализации негативной регуляции провоспалительных функций иммунокомпетенных клеток, усиливает Th2-опосредованные реакции. В то же время увеличение продукции IL-10 ведет к снижению противоинфекци-онной защиты, развитию хронического персистирую-щего воспаления [13].

Учитывая важную роль дисрегуляции Th1/Th2-системы в патогенезе хронического инфекционного процесса, целью настоящего исследования явилась оценка продукции IL-2, IL-4 и IL-10 лимфоцитами крови у пациентов с H. pylori-ассоциированной патологией.

Материал и методы

Обследовано 55 пациентов — носителей H. pylori, в родословных которых не было смешанных браков. Все участники исследования являлись коренными жителями Республики Хакасия. У всех обследованных выявлялись специфические иммуноглобулины G к H. pylori с использованием метода твердофазного иммунофермент-ного анализа (ИФА) (тест-система «ИмДи-спектр», г. Новосибирск). Обследованные пациенты страдали хронической патологией желудочно-кишечного тракта (язвенная болезнь (ЯБ) диагностирована у 21 пациента, хронический гастрит (ХГ) — у 34 пациентов). Контрольная группа была сформирована из 35 здоровых доноров — коренных жителей Хакасии.

Материалом для исследования являлась венозная кровь. Кровь забирали утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл в пробирку, содержащую 2,5%-й раствор ЭДТА.

Иммунофенотипические особенности лимфоцитов в крови (CD3+, CD4+ и CD8+) оценивали методом проточной цитофлюориметрии (Beckman Coulter EPICS XL, Швейцария) с применением моноклональных антител (R&D Systems, США). Результаты выражали в относительных (%) и абсолютных (тыс./мкл) значениях.

Для исследования цитокинпродуцирующей способности лимфоцитов выделенные клетки ресуспен-дировали в полной питательной среде (90%-я RPMI-1640 (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск), 10%-я инак-тивированная эмбриональная телячья сыворотка (ООО «Биолот», г. Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина). Для определения спонтанной продукции цитокинов клетки культивировали без митогена, для стимуляции секреторной функции в пробы вносили 10 мкл/мл фито-гемагглютинина (ФГА) (Difco, Германия), культивировали в течение 24 ч при температуре 37 °С и 5%

СО2. Концентрацию IL-2, IL-4 и IL-10 определяли в супернатантах с помощью ИФА (тест-система ProCon, г. Санкт-Петербург) на микропланшетном фотометре Immunochem 2100 (High Technology, США) (при длине волны 450 нм).

Для оценки апоптотической гибели клетки концентрировали в градиенте плотности фиколл-верографина. Апоптотическую гибель лимфоцитов оценивали через 24 ч культивирования с использованием микроскопа Micros (Австрия) при увеличении объектив 100 х окуляр 10 (окрашивание гематоксилином и эозином). Подсчитывали не менее 200 клеток. Критериями, характеризующими апоптоз in vitro, являлись кариопатологиче-ские и цитопатологические изменения (конденсация и маргинация хроматина, уменьшение объема клетки, пузырчатость и фрагментация клеточного ядра). При некротической гибели преобладали процессы набухания, кариорексиса и кариолизиса с последующей ферментативной деградацией всей клетки [10]. Результаты выражали в процентах, характеризующих количество клеток с апоптотической морфологией ко всем остальным клеткам.

Для проверки нормальности распределения показателей использовали критерий Колмогорова—Смирнова. Оценку достоверности различий выборок проводили при помощи критериев Вилкоксона и Манна—Уитни. Рассчитывали медиану Me и интерквартильный размах в виде 25-го и 75-го перцентилей (Q25—Q75). Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Установлено, что у пациентов с хронической инфекцией H. pylori отмечалось повышение абсолютного и относительного количества лимфоцитов крови по сравнению с аналогичными показателями в контрольной группе (р < 0,05). При этом у больных язвенной болезнью увеличение числа лимфоцитов происходило в большей степени (52,3 (46,0—59,2)% и 3,4 (2,9— 3,7) • 109/л), чем при хроническом гастрите (46,1 (39,5—53,4)% и 2,6 (2,3—2,8) • 109/л), р < 0,05. В обеих группах обследования число лимфоцитов было достоверно выше, чем в контроле (25,5 (21,0—28,8)% и 2,1 (1,7—2,3) • 109/л соответственно), р < 0,05.

Кроме того, у больных с хроническим носительст-вом H. pylori установлено снижение абсолютного и относительного количества CD3+-, CD4+- и CD8+-лимфо-цитов по сравнению с контрольными значениями

(табл. 1). Наибольшее снижение числа СБ3+- и СБ8+-лимфоцитов отмечалось у пациентов с ЯБ. При этом в данной группе больных на фоне снижения числа всех субпопуляций лимфоцитов увеличивался иммуноре-гуляторный индекс (ИРИ) СБ4+/СБ8+ (табл. 1).

Таблица 1

Иммунофенотип лимфоцитов крови у пациентов с Helicobacter pyfori-ассоциированой патологией

Доля клеток Здоровые доноры

% тыс./мкл 89,68 54,71 62,74

CD3+ (62,85-97,00) 1,99 (36,52-59,201)* 1,51 (51,64-78,65) 1,60

% 58,83 31,97 33,65

CD4+

тыс./мкл 1,20 0,92 0,87

% 33,64 17,51 23,32

CD8+

тыс./мкл 0,66 0,54 0,66

CD4+/CD8+ 1,63 1,73 1,53

Примечание. п — число обследованных, * — р < 0,05 достоверность различий по сравнению с показателями у здоровых доноров.

Полученные результаты свидетельствуют о снижении содержания субпопуляций лимфоцитов Т-клеточ-ного звена у больных хроническим гастритом и язвенной болезнью, ассоциированных с H. pylori, что можно рассматривать как проявление Т-клеточного иммунодефицита. Такое перераспределение субпопуляций лимфоцитов может быть связано с миграцией клеток в слизистую оболочку, а также с элиминацией иммунокомпе-тентных клеток за счет индукции апоптоза. Фактические доказательства этого предположения получены при оценке доли апоптотических лимфоцитов. Исследование показало, что в группе пациентов с ЯБ их было достоверно больше, чем в контрольной группе (18,5 (16,8—19,8)% и 15,7 (13,9—16,4)% соответственно, р < 0,05). Уровень апоптотической гибели лимфоцитов у пациентов с ХГ составил 14,8 (11,2—21,0)% и был ниже относительно контрольных значений.

Известно, что апоптоз иммунокомпетентных клеток может быть инициирован как самим возбудителем, так и нарушениями метаболических процессов макроорганизма. При этом в ряде случаев Thl-лимфоциты более чувствительны к апоптозу, чем ThZ-клетки, что следует

рассматривать как дополнительный механизм ограничения Thl-опосредованного иммунного ответа [14].

Одной из важных причин снижения количества лимфоцитов и (или) их субпопуляций может служить угнетение процессов лимфопролиферации. Существует несколько причин низкого пролиферативного ответа лимфоцитов. В качестве возможных рассматривают недостаточность активирующего сигнала, связанную с низким уровнем продукции активирующих цитокинов либо с гиперпродукцией ингибирующих цитокинов.

При оценке уровня секреции цитокинов лимфоцитами у больных ХГ и ЯБ отмечалось значительное уменьшение как спонтанной, так и ФГА-стимулирован-ной продукции IL-2 по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы (табл. 2). В то же время базальный и резервный уровни цитокинов IL-4 и IL-10 in vitro у пациентов с хроническим гастритом и язвенной болезнью были выше, чем аналогичные показатели в группе контроля (табл. 2). Полученные результаты свидетельствуют об угнетении Thl-пути иммунного ответа у пациентов с H. py/ori-ассоциированными хроническим гастритом и язвенной болезнью и активации Т112-пути.

Таблица 2

Базальная и ФГА-стимулированная продукция IL-2, IL-4, IL-10 мононуклеарными клетками у пациентов с Helicobacter pylori-ассоциированной патологией (Me (Q1—Q3)), пг/мл

Продукция Здоровые доноры Больные ЯБ Больные ХГ

IL-2 Cпонтанная ФГА-стимули-рованная 141,7 45,0 89,0 (39,0-220,0) (30,0-112,0) (75,1-93,0) 190,0 119,0 139,0 (70,0-279,0) (90,0-205,9) (112,0-164,9)"

IL-4 Cпонтанная ФГА-стимули-рованная 35,0 98,0 101,0 (16,0-44,3) (84,0-131,6)* (89,0-109,5) * 123,3 197,0 189,0 (69,0-147,6)" (176,0-342,7)*,# (167,0-262,0)*,#

IL-10 ^о^анная ФГА-стимули-рованная 57,3 342,9 309,0 (32,0-78,2) (289,0-402,0)* (239,0-369,8)* 128,0 509,0 443,5 (90,0-134,0)" (470,0-549,0)*# (397,0-535,0)*,#

* — р < 0,05 - по сравнению с показателями у здоровых доноров.

# - р < 0,05 - достоверность различий при сравнении спонтанной и ФГА-стимулированной продукции цитокина.

Известно, что Thl-ответ препятствует колонизации H. pylori в слизистой оболочке. Однако при длительном воспалительном процессе происходит гибель собственных клеток [5, 6, 12]. Детерминация ТК2-пути протекает без выраженного повреждения слизистой

Агеева Е.С., Штыгашева О.В., Иптышев В.М., Рязанцева Н.В.

оболочки и также может рассматриваться как протек-тивная форма антихеликобактерной защиты [2, 4]. Наряду с этим H. pylori является длительно персистирующей инфекцией, в результате которой развивается гиперактивация иммунной системы с последующей декомпенсацией по количественным и качественным признакам и, соответственно, снижением эффективности иммунного ответа. В связи с этим увеличение продукции мононуклеарными лейкоцитами крови IL-4 и IL-10, вероятно, можно рассматривать как фактор, способствующий хронизации заболеваний, связанных с H. pylori-инфекцией.

Заключение

Проведенное исследование позволило выявить изменение иммунологических показателей у больных с H. pylori-ассоциированными заболеваниями. Данные изменения касались нарушения продукции цитокинов и характеризовались угнетением Thl-пути и активацией ТЬ2-пути иммунного ответа при хроническом гастрите и язвенной болезни. Дальнейшее изучение молекулярных механизмов функционирования иммунной системы при инфекции H. pylori позволит идентифицировать новые подходы в предупреждении и коррекции иммунопатологических расстройств данных социально значимых заболеваний.

Работа выполнена при поддержке гранта «Разработка технологической платформы молекулярной диагностики и лечения социально значимых заболеваний и подготовка на ее основе научно-исследовательских кадров для молекулярной медицины» (ГК № 02.740.11.0311 (2009—2011 гг.)).

Литература

1. Ивашкин В.Т. Основные понятия и положения фундаментальной иммунологии // Рос. журн. гастроэнтерологии, ге-патологии и колопроктологии. 2008. № 4. С. 4—13.

2. Козлова Н.Н., Прокопенко В.Д. Иммунный ответ организма на инфекцию Helicobacter pylori // Иммунопатология, ал-

Роль нарушений системы цитокинов в патогенезе...

лергология, инфектология. 2007. № 4. C. 58—62.

3. Кондрашина ЭА, Калинина Н.М., Давыдова Н.И. и др. Особенности цитокинового профиля у пациентов с хроническим H. pyloи-ассоциированным гастритом и язвенной болезнью // Цитокины и воспаление. 2002. Т. 1, № 4. С. 3— 11.

4. Кононов А.В. Генетическая регуляция и фенотип воспаления при Helicobacter pylori-инфекции // Архив патологии. 2009. Т. 71, № 5. С. 57—63.

5. Кононов А.В. Молекулярная генетика и фенотип воспаления, вызванного Helicobacter pylori // Омск. науч. вестн. 2007. № 3 (61). С. 17—23.

6.Маев И.В., Кучерявый Ю.А., Оганесян Т.С. Аллельный полиморфизм интерлейкина-1 при геликобактериозе // Иммунология. 2008. № 5. С. 4—11.

7. Останин А.А., Пальцев А.И., Лебедев А.Г. и др. Характеристика апоптотической и функциональной активности лимфоцитов у больных язвенной болезнью // Бюл. СО РАМН. 2004. № 1 (111). С. 129—134.

8. Ющук Н.Д., Маев И.В. Что скрывается за нелеченой инфекцией Helicobacter pylori // Терапевт. архив. 2008. № 11. С. 72—77.

9. Ющук Н.Д., Маев И.В., Гуревич К.Г. Иммунный ответ при инфекции, вызванной Helicobacter pylori // Журн. микробиологии. 2003. № 6. С. 86—91.

10.Allen R.T. Hunter W.J., AgrawalD.K. Morfological and biochemical characterization and analyis of apoptosis // J. of Pharmacol. and Toxicol. Methods. 1997. V. 37, № 4. P. 215—228.

11. D'Ellios M.M., Anderson L.P. Helicobacter pylori Inflammation, immunity, and vaccines // Helicobacter. 2007. V. 12 (1). P. 15—19.

12. Goll R., Husebekk A., Isaksen V. et al. Increased frequency of antral CD4+ T and CD19+ B cells in patients with Helicobacter pylori-related peptic ulcer disease // Scand. J. Immunol. 2005. V. 61. P. 92—97.

13. JungM., SabatR., Kratzschmar J. et al. Expression profiling of IL-10-regulated genes in human monocytes and peripheral blood mononuclear cells from psoriatic patients during IL-10 therapy // Eur. J. Immunol. 2004. V. 34. P. 481—493.

14.Morris S.C., Stephani M.H., DeBroski R.H. et al. Endogenously produced IL-4 nonredundantly stimulates CD8+ T cell proliferation // J. Immunol. 2009. V. 182. P. 1429—1438.

15. Suares G., Reyes V.E., Beswick E.J. Immune response to H. pylori // World J. Gastroenterology. 2006. V. 12 (35). P. 5593—5598.

Поступила в редакцию 11.05.2011 г. Утверждена к печати 20.09.2011 г.

Сведения об авторах

Е.С. Агеева — канд. мед. наук, зав. кафедрой фундаментальной медицины и гигиены ХГУ им. Н.Ф. Катанова (г. Абакан). О.В. Штыгашева — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой внутренних болезней ХГУ им. Н.Ф. Катанова (г. Абакан).

В.М. Иптышев — зав. клинико-диагностической лабораторией ХРБ им. Г.Я. Ремишевской, гл. внештатный специалист Министерства здравоохранения Республики Хакасия по клинической лабораторной диагностике (г. Абакан).

Н.В. Рязанцева — д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой фундаментальных основ клинической медицины СибГМУ (г. Томск).

Для корреспонденции

Агеева Елизавета Сергеевна, тел. 8 (39-02) 34-27-20; e-mail: Ageevaeliz@rambler.ru