СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА А У ДЕТЕЙ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR ACUTE VIRAL HEPATITIS A IN CHILDREN

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике острого вирусного гепатита А у детей, и может быть использовано в медицинской практике.
Острый вирусный гепатит А (ВГА) и в настоящее время остается актуальной проблемой здравоохранения многих стран мира, в 2009г, по данным ВОЗ, в мире зарегистрировано 1 млн 400 тыс. случаев. В последние годы значительно повысилась заболеваемость ВГ А в Скандинавских странах, Швейцарии, где эти показатели ранее составляли менее 5 на 100000 населения. В России также периодически регистрировались крупные вспышки заболевания ВГ А (г.Нижний Новгород - более 3000 заболевших ВГА, г.Москва - более 700, г.Ржев - более 600 и др.).
Снижение активной циркуляции вируса ВГ А на территории РФ привело, во-первых, к изменению коллективного иммунитета населения и уменьшению числа носителей защитных титров анти-ВГА, а, во-вторых, к вовлечению в эпидемический процесс наименее защищенных возрастных групп (детей дошкольного и младшего школьного возраста). Существенное влияние на заболеваемость ВГ А оказывает высокая интенсивность миграционных процессов в стране, а также резкое увеличение числа лиц, путешествующих в страны с низким санитарно-коммунальным благоустройством и эндемичные по ВГ А. Таким образом, ВГ А, продолжая оставаться лидером среди ВГ, наносит значительный экономический ущерб нашей стране и городу, который может возрасти во много раз. Это свидетельствует о необходимости использования быстрой и качественной диагностики для раннего выявления больных и успешной локализации очагов этой инфекции. Поэтому разработка низкозатратных экспресс-методов диагностики для своевременного установления диагноза ВГ А у детей и взрослых является весьма актуальным. Данный метод может быть применен в очагах инфекции для выявления ранних и атипичных форм заболевания, которые могли и могут стать источниками новых случаев болезни. Использование быстрой и качественной диагностики позволит успешно бороться с локализацией очагов этой инфекции.
В настоящее время известны различные способы диагностики острого ВГ А, одним из них является диагностика по выявлению антигена ВГ А в фекалиях методом ИФА (Блюгер А.Ф. Основы гепатологии. Рига: Звайгзне, 1975. - 470 с.). Антиген вируса ГА (ВГА-Ag) обнаруживается в фекалиях больных за 7 до проявления клинических симптомов и в первые дни заболевания. У взрослых выделение вируса с фекалиями продолжается обычно менее одной недели, а у детей в течение 2-3 дней после появления желтухи. Метод обладает специфичностью и чувствительностью у взрослых, однако для определения антигена вируса необходим отличный от сыворотки «неудобный» субстрат (фекалии), а так же из-за короткого времени виремии при ВГ А у детей этот метод может давать ложноотрицательные результаты. Указанные недостатки существенно ограничивают возможность точной диагностики ВГ А у детей, что не позволяет использовать данный метод в практической медицине и проводить раннюю и адекватную терапию и санитарно-эпидемиологические мероприятия у детей.
Известен также способ диагностики вирусного, гепатита А, в котором используется определение РНК вируса гепатита А методом ПЦР (Быстрова Т.Н., Попкова М.И., Блохин К.В. // Патент №2307168 от 27.09.2007 г.). Данный способ заключается в том, что исследуемые субстраты подвергают предварительной обработке с последующей детекцией РНК вируса. Этот метод определения ВГ А обладает чувствительностью, однако он также мало применим при позднем обращении больного из-за короткого времени виремии при ВГ А и требует высокой квалификации персонала, специальных помещений и дорогостоящего оборудования. Таким образом, способ не обладает достаточной точностью.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики ВГ А по выявлению в сыворотке специфических антител класса IgM к антигену вируса (анти-ВГА IgM) методом ИФА (Михайлов М.И., Шахгильдян И.В., Онищенко Г.Г. Энтеральные вирусные гепатиты. Этиология, эпидемиология, диагностика, профилактика. М.: ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава», 2007. - 352 с.). Этот способ диагностики основан на «узнавании» анализируемого соединения специфическим к нему антителом. К иммобилизированному АГ добавляют исследуемую сыворотку и, после инкубации и удаления несвязавшихся компонентов, выявление специфических иммунохимических комплексов проводят с помощью меченных ферментом антивидовых AT. Измеряемое на носителе содержание ферментной метки пропорционально концентрации специфических AT в сыворотке. Этот способ диагностики, используемый в настоящее время в практической медицине, но он мало применим у детей, так как у них происходит быстрая смена синтеза AT класса IgM на IgG, а также обычно поздняя обращаемость пациентов к врачу, ограничивает возможность диагностики ВГ А, что в конечном счете не обеспечивает точности диагностики.
С целью устранения вышеизложенных недостатков диагностики ВГ А у детей, авторами впервые предложен принципиально новый способ диагностики острого вирусного гепатита А у детей.
Технический результат изобретения заключается в повышении точности диагностики острого ВГ А у детей за счет выявления индекса авидности при определении IgG к ВГ А особенно на поздних сроках болезни, что крайне важно для назначения терапии и проведения противоэпидемических мероприятий в детских коллективах и семьях.
Это достигается тем, что в известном способе, включающем определение антител в иммуноферментном тесте, согласно изобретению сыворотку больных, разведенную в 100 раз, вносят в два ряда параллельных лунок, один ряд обрабатывают раствором 6М мочевины в течение 5 минут, показатели сравнивают, определяют авидность комплекса антиген-антитело класса Ig G к вирусу гепатита А и при уровне индекса авидности ≤50% диагностируют острый вирусный гепатит А.
При острой форме заболевания антитела находятся в составе специфического иммунного комплекса, отмывание 6М мочевиной приводит к разрыву комплекса из-за низкой авидности этих антител и вторичной сорбции их на подложке. Это позволяет нам дифференцировать острую фазу заболевания от протективного иммунитета, при котором антитела обладают высокой авидностью и не включаются в состав комплексов вирус-антитело по причине отсутствия или малого количества вирусных частиц. Как показали авторы, антитела в составе низкоавидного иммунного комплекса легко отщепляются от него, давая увеличение экстинции при отмывании мочевиной по сравнению с буферным раствором.
Мы показали, что при отмывании 6М мочевиной увеличение показателя ОП в ИФА объясняется разрушением комплекса антител к.. с этим белком, так как молекулярная масса белка меньше, чем суммарная масса того же белка в составе иммуносорбента. Это происходит в случае, если авидность таких антител низкая.
Авторы внесли существенные признаки, уменьшив число промываний лунок планшета и впервые предложив однократную обработку одного ряда лунок раствором 6М мочевины в течение 5 минут. Время выбрано экспериментальным путем при исследовании одних и тех же сывороток.
Авидность антител характеризует суммарную величину прочности связывания всех молекул антител с целевыми антигенными детерминантами, определяется путем разрушения комплексов антиген-антитело каким-либо денатурирующим химическим реагентом с последующим измерением оставшихся связанными после обработки антител. В качестве денатурирующего реагента наиболее часто используется мочевина в различных концентрациях. Сравнительный анализ, проводимый авторами, результатов исследований одних и тех же сывороток с применением промывающих буферных растворов, содержащих 3М, 6М и 9М мочевины, показал, что наиболее адекватные данные могут быть получены при обработке образцов 6М мочевиной. Применение сравнительно низких (3М) и высоких (9М) концентраций мочевины приводило к значительному расхождению результатов при измерении авидности антител 90,0±1,4% и 70,0±3,7% соответственно для 3М и 9М растворов мочевины. В то же время, средний индекс авидности антител при применении 6М раствора мочевины составлял 80,1±2,3% и не отличался статистически от средних показателей при применении 3М и 9М мочевины.
Авторами установлено оптимальное разведение сыворотки для измерения авидности антител не более чем в 100 раз. В исследуемых образцах сыворотки крови может содержаться различная концентрация антител к тестируемым вирусным белкам. В связи с этим, важно было определить стандартную кратность разведения образца, позволяющую измерять авидность антител. В специальных экспериментах с панелью высокотитражных и низкотитражных сывороток было продемонстрировано, что оптимально разводить сыворотки для измерения авидности антител не более чем в 100 раз. Увеличение кратности разведения исследуемых образцов с низким содержанием антител приводит к снижению концентрации AT и большей доступности комплексов АГ-АТ воздействию детергента и, как следствие, к полному их разрушению и не возможность измерить авидность AT.
Таким образом, наиболее оптимальными условиями при проведении измерения авидности антител IgG к ВГ А в ИФА являлись обработка комплексов антиген-антитело, образующихся при исследовании сывороток, разведенных в 100 раз, 6М раствором мочевины.
Диагностика острого вирусного гепатита А у детей может основываться на определении авидности антител класса Ig G к вирусу гепатита А в сыворотке больных, разведенной в 100 раз, которая не должна превышать 50%.
Авторы показали, что определение авидности антител заключается в разрушении слабых связей после обработки комплексов антиген-антитело между недавно синтезированными антителами (низкоавидные антитела, возникающие на ранних стадиях заболевания), связи с высокоавидными антителами сохраняются. Реакцию необходимо проводить в 2-х параллельных лунках микропланшетов с адсорбированным целевым антигеном (ВГ А) для оценки результатов и выявления авидности антител.
Принципиальным новым и существенным в предлагаемом способе диагностики ВГ А у детей является диагностика ВГ А по уровню IgG к ВГ А и индекса авидности этих AT, что отличает предлагаемый способ диагностики ВГ А от прототипного способа. Анти-ВГА класса IgG по нашим наблюдениям у детей появляются рано в начале заболевания (с 3-4 недели), сохраняются на протяжении всей жизни и обеспечивают пожизненную защиту от этого заболевания.
Авторы впервые используют Ig класса G, так как авидность характеризуется только антителами класса G. Антитела класса М имеют множество сайтов связывания и поэтому при обработке комплекса антиген-антитело класса М мочевиной их разрушения не происходит. Антитела класса М имеют множество сайтов связывания и поэтому при обработке комплекса антиген-антитело класса М мочевиной их разрушения не происходит. Интенсивность ИФА реакции с анти-ВГА IgM без обработки и с обработкой мочевиной вообще не изменяется, поэтому в основу данного способа диагностики был взят метод ИФА по определению IgG к ВГ А.
Способ осуществляется следующим образом.
При поступлении ребенка в стационар с подозрением на ВГ А при проведении диагностического теста по определению IgG ВГ А устанавливают уровень авидности этих AT к ВГ А путем обработки комплекса антиген-антитело, внося в два ряда параллельных лунок разведенную в 100 раз сыворотку больных. После инкубации в термостате при t 37°C в течение 30 минут промывают стрипы ФСБ-Т (фосфатно-солевой раствор с твином-20) 4 раза, затем в лунки нечетных стрипов вносят по 100 мкл раствора сравнения, а в лунки четных стрипов -денатурирующим раствором 6М мочевины и выдерживают 5 минут при температуре от 18 до 24°С. Содержимое лунок удаляют, затем два ряда промывают 4 раза ФСБ-Т, после внесения конъюгата инкубируют микропланшет в термостате при t 37°С в течение 30 минут, после очередной промывки ФСБ-Т 5 раз содержимое лунок удаляют и вносят раствор хромогена (тетраметилбензидин) и выдерживают микропланшет в течение 30 минут в защищенном от света месте при температуре от 18 до 24°С, после остановки реакции стоп-реагентом (серная кислота, раствор 0,75 моль/л) и проводят учет результатов.
Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра любой фирмы при длине волны 450 нм и сравнивают показатели оптической плотности (ОП) растворов в лунках 2-х параллельных рядов, отмытых 6М мочевиной и ФСБ-Т соответственно. При увеличении показателя ОП в лунках, промытых 6М мочевиной, по сравнению с ОП в лунках, промытых только ФСБ-Т, до 50% результат считают положительным в отношении наличия в крови слабоавидных антител класса IgG к антигену вируса гепатита А и констатации острого вирусного гепатита А. При показателе в пределах 50% и выше - наличие высокой авидности антител IgG вируса гепатита А и отсутствия острой инфекции.
Индекс авидности можно вычислить по формуле:
При отсутствии IgG ВГ А у ребенка при обследовании диагностика может быть повторена через 7-10 дней.
В таблице 1 представлены показатели антителообразования.
Таблица 1
Показатели антителообразования при остром вирусном гепатите А и пастинфекции
Окончательный диагноз
Всего обследовано больных
Положительный результат выявления антител в ИФА-тест
Результат определения авидности антител
Ig M HAV
Ig G HAV
Низкоавидных
Высокоавидных
Острый вирусный гепатит А
84 чел.
68 чел. (55,3%)
84 чел. (68,3%)
84 чел. * (68,3%)
0*
Пастинфекция
39 чел.
0
39 чел. (31,7%)
0*
39 чел.* (31,7%)
Способ можно проиллюстрировать конкретными примерами.
Пример 1.
Больной Николай Д., 6 лет. Из анамнеза заболевания известно, что ребенок 2 недели назад приехал из Средней Азии, где был во многих городах, питался в столовых, ел много фруктов, несколько дней назад у старшего брата установлен диагноз вирусного гепатита А, при обследовании по контакту АлАТ 0,3 ммоль/л. Через два дня после обследования ребенок заболел, температура до 38,6°С, озноб, головная боль, насморк, получал жаропонижающие средства, однако температура не снижалась. Ночью дважды повторялась рвота, отсутствовал аппетит, отмечалась тошнота, расстройство стула. При обследовании АлАТ-6,0 ммоль/л. Госпитализирован в стационар на 5-6 день болезни. При госпитализации:
состояние средней тяжести, небольшой насморк, гиперемия слизистой ротоглотки. Кожа чистая, субъиктеричная. Лимфоузлы не увеличены. В легких дыхание жесткое, хрипов нет. Пульс 88 уд./мин. АД 120/60. Тоны сердца звучные. Язык обложен белым налетом. Живот мягкий, доступен пальпации во всех отделах, печень средней плотности до 3,0 см, селезенка не увеличена. Стул кашецеобразный. Моча пигментирована. При обследовании в стационаре: билирубин общ. - 14,4; АлАТ-2,82; АсАТ-1,12; тимол. пр. - 9,2; общ. белок - 80 г/л; мочевина - 7,1; креатинин - 27 мкм/л; сахар - 6,9; HAV IgM (+); HAV Ig G (+); HbsAg отриц., анти HCV отриц., авидность HAV Ig G 12%. Таким образом диагноз вирусного гепатита А был установлен заявляемым способом по выявлению антител класса HAV Ig G (+) и определения их авидности и подтвержден на основании типичной клинической картины и выявлению антител HAV IgM (+).
Пример 2.
Маша М, 3 г. 8 месяцев. Девочка обследована по контакту с дядей, больным вирусным гепатитом А. При обследовании по месту жительства АлАТ-4,8 ммоль/л. Госпитализирована. Из анамнеза заболевания было выяснено, что у девочки 4 недели назад среди полного здоровья отмечались повторные рвоты, поноса не было, температура повышалась до 37,5°С, отмечались умеренные катаральные явления, боли в животе. Состояние при поступлении средней тяжести, кожа чистая, обычной окраски. Зев не гиперемирован. Тоны сердца звучные. В легких жесткое дыхание, без хрипов. Живот мягкий, умеренно болезненный в эпигастрии, печень пальпируется средней плотности на 2,0 см, ниже реберной дуги, селезенка не пальпируется. При поступлении в стационар: АлАТ-3,0 ммоль/л, билирубин общ.-14,4; АлАТ-2,82; АсАТ-1,12; тимол. пр. - 9,2; общ. белок - 80 г/л; мочевина - 7,1; креатинин - 27 мкм/л; сахар - 3,9; aHAV IgM (-); HbsAg, aHCVG (-), HAV Ig G (+); авидность HAV Ig G 22%. Таким образом, диагноз вирусного гепатита А у этого ребенка нельзя было подтвердить классическим способ, так как девочка поступила на поздних сроках заболевания и ранние антитела к вирусу гепатита А уже прекратили вырабатываться, РНК HAV методом ПЦР не выявлялся, однако, учитывая типичную клиническую картину у данного ребенка подозревали ВГ А, чтобы подтвердить данный диагноз ребенок был обследован по данному способу диагностики: HAV Ig G (+), уровень авидности этих антител 22%. Благодаря новому способу диагностики ВГ А удалось установить диагноз ребенку, назначить адекватную терапию. В детском саду, который посещал ребенок были проведены санитарно-эпидемиологические мероприятия, выявлен один ребенок со стертой формой ВГ А, остальные контактные были вакцинированы от ВГ А, что привело к локализации вспышки ВГ А в детском саду.
Пример 3.
Егор Т., 5 лет. Ребенок обследован амбулаторно в НИИ детских инфекций: заболел остро, температура до 37,8°С, выраженные катаральные явления, слизистые выделения из носа, непродуктивный кашель, на второй день болезни присоединились повторные рвоты, отказывался от еды, практически не пил, на 4-й день болезни появился жидкий стул. В результате симптоматической терапии: регидрон, энтерол, смекта, рвота прекратилась на 8-9 день болезни, стул нормализовался на 10-12 день болезни, при выписке ребенка в детский сад в поликлинике выявлена гиперферментемия АлАТ 280 Ед/л. Ребенок обследован в НИИ детских инфекций: при поступлении состояние ср. ст. тяжести за счет умеренных симптомов интоксикации. Кожа чистая, обычной окраски. Зев не гиперемирован. Тоны сердца звучные. В легких жесткое дыхание, без хрипов. Живот мягкий, умеренно болезненный в эпигастрии, печень пальпируется средней плотности на 1,0 см, ниже реберной дуги, селезенка не пальпируется. При обследовании АлАТ 170Ед/л, анти-HAV IgM (-); HbsAg(-), анти HCV Ig G (-), HAV Ig G (+); авидность HAV Ig G 84%. Таким образом, у данного ребенка нельзя подтвердить диагноз вирусного гепатита А, так как клинические проявления не характерны для ВГ А, а вирусологические показатели подтверждали эти предположения: диагноз ВГ А не подтвердился ни классическим способом, ни новым методом диагностики ВГ А.
Разработанный авторами способ диагностики ВГ А применен у 123 детей в возрасте от 1 до 18 лет с подозрением на ВГ А, у 16 человек диагноз был подтвержден только данным способом диагностики. Срок от начала заболевания до исследования составил от 7 до 30 дней.
Благодаря применению предложенного способа возрастет точность диагностики ВГ А у детей, что позволит проводить своевременную адекватную терапию, сократить число осложнений данного заболевания у детей и своевременно проводить санитарно-эпидемиологические мероприятия в очагах инфекции, прерывая эпидемический процесс. Данный способ может найти широкое применение в клинической практике, в инфекционных, педиатрических и гастроэнтерологических стационарах для диагностики ВГ А у детей.