ОБОЛОЧЕЧНЫЙ ВИРУС, РЕЗИСТЕНТНЫЙ К ИНАКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТОМ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
ENVELOPED VIRUS RESISTANT TO INACTIVATION WITH COMPLEMENT FOR TREATMENT OF MALIGNANT NEOPLASMS

ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Список последовательностей, поданный в электронном виде в форме текстового файла Annex C/ST.25 и имеющий регистрационный номер 21003-PCT, является частью описания.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Проводят тестирования онколитических вирусов в качестве средств для лечения злокачественных новообразований, инфицирующих и разрушающих опухолевые клетки. Эти онколитические вирусы включают вирус болезни Ньюкасл, аденовирус, вирус Синдбис, вирус осповакцины, вирус герпеса и т.д. Вирус болезни Ньюкасл (NDV) обладает большим потенциалом в отношении уменьшения опухоли у пациентов со злокачественными новообразованиями благодаря его уникальному свойству преференциальной репликации в опухолевых клетках и их лизиса, вероятно, вследствие того, что большинство опухолевых клеток имеют дефектный интерфероновый путь (Pecora et al., 2002; Laurie et al., 2006; Lorence et al., 2007). Несмотря на многообещающие предварительные клинические результаты, NDV в качестве противоопухолевого терапевтического средства имеет недостаток: большинство частиц NDV неизбежно будут разрушаться под действием врожденной иммунной системы пациента, альтернативного пути комплемента, после проникновения вирусов в организм пациента.
The Human Complement System in Health and Disease
Система комплемента является частью врожденной и адаптивной иммунной системы (см. обзор Volanakis, J.E., 1998. Chapter 2 в под редакцией J. E. Volanakis и M.M. Frank. Marcel Dekker, Inc., New York pp 9-32). Комплемент играет важную роль в уничтожении микроорганизмов и транспорте и выведении иммунных комплексов. Многие из продуктов активации системы комплемента также связаны с провоспалительными или иммунорегуляторными функциями. Система комплемента состоит из белков плазмы и мембрано-ассоциированных белков, объединенных в три каскада ферментативной активации: классический, лектиновый и альтернативный пути. Все три пути могут приводить к образованию терминального комплекса комплемента/мембраноатакующего комплекса (TCC/MAC) и ряда биологически активных продуктов.
Клетки и органы человека содержат семейство мембраносвязанных регуляторных белков комплемента для их защиты от гомологичного комплемент-опосредованного лизиса. Эти регуляторные белки комплемента включают CD55 (комплементзамисимый стимулятор гемолиза, DAF), CD46 (мембранный кофакторный белок, MCP), CD35 (рецептор комплемента 1, CR1), и CD59 (мембранный ингибитор реактивного лизиса) (Carroll et al., 1988; Rey-Campos et al., 1988; Lublin et al., 1989; Morgan et al., 1994; Kim and Song, 2006).
CD55 является гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-заякоренным белком и прикрепляется к плазматической мембране через гликолипидный остаток (GPI-якорь) на его C-конце. GPI-заякоренные белки, такие как CD55, могут подвергаться эндоцитозу и деградировать или расщепляться и высвобождаться из плазматической мембраны клетки (Censullo and Davitz, 1994a, 1994b; Turner 1994). Например, GPI-заякоренные белки, включая CD55, могут высвобождаться с поверхности клетки под действием GPI-специфических фосфолипаз C и D (Turner 1994). Эта ферментативная активность, вероятно, контролирует катаболизм GPI-заякоренных белков и регулирует экспрессию белков на поверхности клетки (Censullo and Davitz, 1994b).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к рекомбинантному слитому белку, содержащему: (a) последовательность пептида CD55, (b) линкерную последовательность, C-концевую относительно последовательности CD55, (c) трансмембранный домен, C-концевой относительно линкерной последовательности, и (d) внутриклеточный домен, C-концевой относительно трансмембранного домена, где слитый белок не содержит GPI-якорь. Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам и экспрессирующим векторам, кодирующим белок, клеткам, экспрессирующим белок, оболочечным вирусам, включающим белок на вирусной мембране, фармацевтическим композициям, содержащим вирус, включающий белок, по настоящему изобретению, а также способам лечения и применению вируса.
Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того, что вирус, экспрессирующий слитый белок по настоящему изобретению, являлся резистентным к инактивации нормальной сывороткой человека, о чем свидетельствует более высокий коэффициент выделения по сравнению с вирусом, не экспрессирующим слитый белок. Онколитический оболочечный вирус, продуцируемый сконструированными клетками по изобретению, включающий ингибитор комплемента в форме рекомбинантного слитого белка на вирусной мембране, является улучшенным противоопухолевым терапевтическим средством и обеспечивает лучшие клинические исходы у пациентов со злокачественными новообразованиями по сравнению с соответствующим вирусом, в котором отсутствует ингибитор комплемента на вирусной мембране, благодаря способности к выживанию в сыворотке человека до достижения очага опухоли. Преимущество является трехкратным: 1) онколитический вирус можно получать в системе культивирования клеток в биореакторе; 2) необходимо меньше вирусных частиц для достижения той же терапевтической эффективности по сравнению с родительским онколитическим вирусом, получаемым с помощью куриных яиц; 3) С помощью инфузии меньшего количества вирусных частиц пациенту со злокачественным новообразованием можно снижать побочные эффекты, ассоциированные с большими количествами вирусных частиц, такие как цитокиновая буря или эффекты, связанные с примесями.
В других исследованиях эффектов регуляторного белка комплемента CD55 в отношении защиты вируса болезни Ньюкасл (NDV) (Biswas et al., 2012; Rangaswamy et al., 2016) использовали нативный немодифицированный CD55, включающий гликозилфосфатидил-инозитоловый (GPI) якорь. В отличие от этого, слитый белок по настоящему изобретению не включает GPI-якорь. Не желая быть связанными какой-либо теорией, полагают, что невключение GPI-якоря изменяло динамику катаболизма CD55 на поверхности клетки. Слитый белок по настоящему изобретению был способен противостоять инактивирующим условиям сильнее, чем белки, используемые Biswas и Rangaswamy. Biswas использовал в анализах активации 5-10% нормальной сыворотки человека, а Rangaswamy использовал 0,3-5% нормальной сыворотки человека. В приведенном ниже примере использовали 40% нормальной сыворотки человека для осуществления анализа инактивации NDV, включающего рекомбинантный слитый белок.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1. Клетка млекопитающего, экспрессирующая последовательность конструкции, кодирующей рекомбинантный комплемент-ингибирующий слитый белок, состоящий из секреторного сигнального пептида, четырех коротких консенсусных повторов (SCR) CD55, гибкого линкера, трансмембранного домена CD8 и укороченного внутриклеточного домена CD8 с последующим селективным маркером IRES-neo и синтетическим сигналом полиаденилирования (поли-A).
Фигура 2. Диаграмма, на которой представлена ориентация зрелого комплемент-ингибирующего слитого белка на мембране сконструированной клетки DF1 или модифицированной мембране NDV.
Фигура 3. Экспрессия рекомбинантного комплемент-ингибирующего слитого белка на поверхности клетки. Анализ экспрессии слитого белка посредством проточной цитометрии с использованием CD55-специфического антитела. На гистограмме слева представлены наивные клетки DF1 в качестве отрицательного контроля. На гистограмме справа представлены клетки DF1, стабильно экспрессирующие SEQ ID NO: 2 (клон клетки № 8).
Фигура 4. Анализ цитотоксичности NDV, продуцируемого сконструированными клетками DF1 (клон № 8), включающего комплемент-ингибирующий слитый белок, в линиях опухолевых клеток.
Фигура 5. Аминокислотная последовательность рекомбинантного комплемент-ингибирующего слитого белка, состоящего из секреторного сигнального пептида, четырех коротких консенсусных повторов (SCR) CD55, гибкого линкера, трансмембранного домена CD8 и укороченного внутриклеточного домена CD8 (SEQ ID NO: 2).
Двойным подчеркиванием указан
секреторный сигнальный пептид
Нормальным шрифтом указаны SCR CD55
Подчеркиванием указан
линкер (G4S1)3
Полужирным шрифтом
указан трансмембранный домен CD8
Курсивом
указан укороченный внутриклеточный домен CD8
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Что касается слитого белка по настоящему изобретению, можно использовать любую последовательность пептида CD55 для последовательности (a). В варианте осуществления последовательность пептида CD55 является последовательностью пептида CD55 человека. Последовательность пептида CD55, предпочтительно, содержит четыре коротких консенсусных повтора (SCR) CD55. Для последовательности (b) можно использовать любой гибкий линкер, например, общепринятый гибкий линкер, известный в этой области. В одном из вариантов осуществления используют линкер G4S1, предпочтительно, линкер (G4S1)3. Для последовательности (c) можно использовать любой трансмембранный домен, например, общепринятый трансмембранный домен, известный в этой области. В одном из вариантов осуществления трансмембранный домен является трансмембранным доменом CD8. Для последовательности (d) можно использовать любой внутриклеточный домен, например, общепринятый внутриклеточный домен. В одном из вариантов осуществления трансмембранный домен является трансмембранным доменом CD8, предпочтительно, укороченным трансмембранным доменом CD8.
Слитый белок по настоящему изобретению может дополнительно содержать секреторный сигнальный пептид, N-концевой относительно последовательности (a). Что касается предпочтительного способа по настоящему изобретению, слитый белок сначала экспрессируется с сигнальным пептидом. Сигнальный пептид направляет новый синтезированный слитый белок в эндоплазматический ретикулум (ER), где сигнальный пептид отщепляется сигнальной пептидазой. SEQ ID NO: 2 является примером слитого белка по настоящему изобретению, содержащим N-концевой сигнальный пептид. SEQ ID NO: 3 является примером слитого белка по настоящему изобретению, не содержащего N-концевой сигнальный пептид.
Что касается слитого белка по настоящему изобретению, необязательно, можно включать спейсер из одной или более аминокислот между N-концевым сигнальным пептидом и последовательностью (a), между последовательностью (a) и последовательностью (b), между последовательностью (b) и последовательностью (c), между последовательностью (c) и последовательностью (d), между любыми двумя из них, между любыми тремя из них или между всеми четырьмя. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсер между N-концевым сигнальным пептидом и последовательностью (a) отсутствует, или, другими словами, N-концевой сигнальный пептид ковалентно связан с последовательностью (a) одной пептидной связью. В другом варианте осуществления спейсер находится между N-концевым сигнальным пептидом и последовательностью (a).
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсер между последовательностью (a) и последовательностью (b) отсутствует, или, другими словами, последовательность (a) ковалентно связана с последовательностью (b) одной пептидной связью. В другом варианте осуществления спейсер находится между последовательностью (a) и последовательностью (b). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсер между последовательностью (b) и последовательностью (c) отсутствует, или, другими словами, последовательность (b) ковалентно связана с последовательностью (c) одной пептидной связью. В другом варианте осуществления спейсер находится между последовательностью (b) и последовательностью (c). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения спейсер между последовательностью (c) и последовательностью (d) отсутствует, или, другими словами, последовательность (c) ковалентно связана с последовательностью (d) одной пептидной связью. В другом варианте осуществления спейсер находится между последовательностью (c) и последовательностью (d). В принципе, нет ограничения размера спейсеров.
CD55 содержит четыре внеклеточных коротких консенсусных повтора (SCR), Ser/Thr/Pro (STP)-богатую область и GPI-заякоренный домен. Что касается слитого белка по настоящему изобретению, GPI-заякоренный домен отсутствует. STP-богатая область может присутствовать или отсутствовать. Один из вариантов осуществления кодирующей последовательности слитого белка по настоящему изобретению дополнительно содержит сигнал полиаденилирования, C-концевой относительно третьей кодирующей последовательности пептида. Сигнал полиаденилирования (поли-A) может являться любым поли-A.
Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, описанный выше. В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота является ДНК. Она, необязательно, может содержать один или более интронов между последовательностями, кодирующими сигнальный пептид и последовательность (a), между последовательностью (a) и последовательностью (b), между последовательностью (b) и последовательностью (c), между последовательностью (c) и последовательностью (d) или где-либо еще. В варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 1 является одним из примеров нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2. Т.к. разные кодоны нуклеиновой кислоты кодируют одну и ту же аминокислоту благодаря взаимосвязи, известной как вырожденность генетического кода, можно представить себе и включить в изобретение многие другие последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2.
Вариант осуществления настоящего изобретения является экспрессирующим вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, описанную выше, функционально связанную с контрольной последовательностью, например, промотором. Промотор, регулирующий слитый белок, может являться любым промотором и не ограничен промотором CMV. Если между промотором и кодирующей последовательностью слитого белка находится интрон, можно использовать любой подходящий и общепринятый интрон. Например, подходящим является интрон β-глобина.
Настоящее изобретение относится к линии клеток, стабильно экспрессирующей слитый белок по настоящему изобретению на своей поверхности. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любую общепринятую линию клеток для экспрессии белка. В одном из вариантов осуществления линия клеток является линией клеток млекопитающего. В другом варианте осуществления линия клеток является линией клеток, не принадлежащих млекопитающему, например, линией эмбриональных фибробластов курицы DF-1.
Настоящее изобретение относится к оболочечному вирусу, включающему слитый белок, описанный выше на мембране вируса. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой оболочечный вирус. В варианте осуществления вирус является онколитическим вирусом, например, парамиксовирусом, таким как вирус болезни Ньюкасл (NDV). В примерах ингибитор комплемента в форме рекомбинантного слитого белка находился на оболочке частицы NDV. Рекомбинантный слитый белок по настоящему изобретению можно использовать для иных онколитических вирусов, чем NDV, что приводит к получению онколитических вирусных частиц, более резистентных к инактивации комплементом организма-хозяина. Новый рекомбинантный ингибитор комплемента в форме слитого белка можно использовать для модификации любых других клеток млекопитающих, таких как клетки HeLa, для продукции онколитических вирусов. Онколитические вирусы описывают в международной патентной публикации № WO 2000/062735, содержание которое включено в настоящее описание в качестве ссылки. В экспериментах, результаты которых представлены ниже, используемым NDV являлся PPMK107, описанный в WO 2000/062735.
7
12
7
13
2
Вирус можно включать в фармацевтическую композицию, содержащую вирус и фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение относится к способу лечения неопластического заболевания млекопитающего, включающему введение индивидууму количества описанного выше вируса, эффективного для лечения неопластического заболевания. В случае лечения злокачественных новообразований вирус можно вводить пациентам любым общепринятым путем, например, посредством одной или более внутриопухолевых или внутривенных инъекций. В случае внутриопухолевого введения диапазон доз может составлять от 1×10 до 5×10БОЕ/опухоль. В случае внутривенного введения диапазон доз может составлять от 1×10 до 1×10БОЕ/м ("БОЕ" является сокращением для "бляшкообразующей единицы").
Онколитический вирус по настоящему изобретению также можно конструировать так, чтобы он включал другие молекулы, такие как ГМ-КСФ, для повышения эффективности онколитического вируса. Кроме того, онколитический вирус может являться частью комбинированной противоопухолевой терапии с использованием ингибитора контрольных точек, такого как молекула против PD1 или против PDL1. Кроме того, онколитический вирус может являться частью комбинированной противоопухолевой терапии с использованием других химиотерапевтических средств. Химиотерапевтические средства могут являться, в качестве неограничивающих примеров, камптотециновыми соединениями, например, иринотеканом или топотеканом.
Все публикации, патенты и патентные заявки, упомянутые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме до той степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная в настоящее описание в качестве ссылки. Также в качестве ссылки включена любая дополнительная информация, опубликованная вместе с любой из указанных выше публикаций, патентов и патентных заявок. Например, некоторые статьи в журналах опубликованы с дополнительной информацией, как правило, доступной он-лайн.
Изобретение будет более понятным с учетом следующих примеров, иллюстрирующих, но не ограничивающих изобретение, представленное в настоящем описании.
ПРИМЕРЫ
Пример 1:
Получали модифицированную версию рекомбинантного CD55 с четырьмя короткими консенсусными повторами (SCR) CD55 ниже секреторного сигнального пептида с последующим гибким линкером (3xG4S1) и трансмембранным доменом CD8 и укороченным внутриклеточным доменом CD8 (фигура 1). Кодирующую последовательность клонировали в экспрессирующую конструкцию млекопитающего, содержащую промотор CMV, синтетический интрон, регулирующий экспрессию рекомбинантного белка. Экспрессирующая кассета также содержала селективный маркер лекарственного средства, неомицинфосфотрансферазу, ниже IRES. Экспрессирующая кассета заканчивалась синтетическим сигналом полиаденилирования. SEQ ID NO: 1 является нуклеотидной последовательностью экспрессирующей конструкции клетки млекопитающего. SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность экспрессируемого белка. При экспрессии на поверхности эмбриональных фибробластов курицы DF1 или на мембране вируса сигнальный пептид отщепляется, что приводит к получению зрелого рекомбинантного слитого белка (SEQ ID NO: 3), имеющего такую конфигурацию/ориентацию, что CD55 SCR находится вне клетки или вирусной мембраны, гибкий линкер, смежный с клеткой или вирусной мембраной, должен обеспечивать максимальную гибкость для SCR CD55 для выполнения его биологической функции, т.е. блокировать C3-конвертазу, являющуюся центральным регулятором пути комплемента. После гибкого линкера следует трансмембранный домен CD8 и укороченный внутриклеточный домен CD8.
Пример 2:
Используя экспрессирующую конструкцию млекопитающего, с помощью PEI25K-опосредованной трансфекции (полиэтиленимина, линейного, 25 кДа, Polysciences, кат. № 23966) трансфицировали эмбриональные фибробласты курицы DF1. Через семьдесят два часа после трансфекции трансфицированные клетки подвергали селекции с использованием 300 мкг/мл G418 (Geneticin, аминогликозидного антибиотика) для получения стабильной линии клеток, конститутивно экспрессирующей SEQ ID NO: 2. Стабильная линия клеток конститутивно экспрессировала SEQ ID NO: 3 на поверхности клеток, что определяли с помощью моноклонального антитела (R&D Systems, кат. № MAB20091), специфического в отношении зрелого CD55 человека. Как показано на фигуре 3, рекомбинантный слитый белок экспрессировался на клетках DF1, стабильно трансфицированных с использованием конструкции, кодирующей рекомбинантный слитый белок, что определяли посредством проточной цитометрии (фигура 3, гистограмма справа). Наивные клетки DF1 служили в качестве отрицательного контроля (фигура 3, гистограмма слева).
Пример 3:
Стабильную линию клеток, экспрессирующую SEQ ID NO: 3 на поверхности клеток, инфицировали NDV дикого типа, полученным из оплодотворенных куриных яиц. Затем вирус титровали с использованием линии опухолевых клеток человека HT1080. Равное количество вируса (определяемое по БОЕ) инкубировали с 40% нормальной сыворотки человека (NHS) и 40% термически инактивированной нормальной сыворотки человека (iNHS), соответственно. Затем подсчитывали вирус, остающийся живым после инкубации с сывороткой человека, на клетках HT1080 с помощью анализа бляшкообразования. Вычисляли соотношение вируса, выделенного после инкубации с NHS и iNHS. Как представлено в таблице 1, коэффициент выделения для вируса, полученного с помощью оплодотворенных куриных яиц, составлял 0,5%, что позволяет предполагать, что подавляющее большинство частиц NDV, полученных с помощью куриных яиц, инактивировалось, наиболее вероятно, под действием альтернативного пути комплемента человека. Аналогично, коэффициент выделения вируса, полученного с помощью родительских эмбриональных фибробластов курицы DF1, составлял 0,5%. Неожиданно, коэффициент выделения вируса, полученного из объединенных неклональных клеток DF1, стабильно экспрессирующих SEQ ID NO: 3 на своей поверхности, составлял 5,8%, более чем в 10 раз больше вируса дикого типа. При исследовании всего 11 клональных популяций клеток DF1, экспрессирующих SEQ ID NO: 3, коэффициент выделения находился в диапазоне от 0,8 до 20%, при этом у пяти клонов наблюдали более низкий коэффициент выделения, а у шести клонов - более высокий коэффициент выделения, чем у объединенной неклональной линии клеток (таблица 1). Вирус, полученный с помощью клона № 8, имел коэффициент выделения 10%, что было в 20 раз больше, чем в случае вируса, полученного с помощью оплодотворенных куриных яиц или родительских клеток DF1. Вирус, полученный с помощью клона № 40, имел коэффициент выделения 20%, что было в 40 больше, чем в случае вируса, полученного с помощью оплодотворенных куриных яиц или родительских клеток DF1. Эти данные позволяют предполагать, что активность комплемента, присутствующего в нормальной сыворотке человека, приводила к быстрому разрушению частиц NDV, полученных с помощью оплодотворенных куриных яиц или родительских эмбриональных фибробластов курицы DF1. Однако, новые частицы NDV, продуцируемые клетками DF-1, стабильно экспрессирующими рекомбинантный ингибитор комплемента на своей поверхности, демонстрировали значительное повышение коэффициента выделения до 40 раз по сравнению с вирусом, полученным с помощью куриных яиц или родительских клеток DF1 после инкубацией с 40% нормальной сывороткой человека в идентичных экспериментальных условиях.
Таблица 1. Коэффициент выделения вируса, измеряемый по соотношению вируса, выделенного после инкубации с 40% нормальной сывороткой человека (NHS) или 40% термически инактивированной сывороткой человека (iNHS)
Онколитический NDV, полученный с помощью
% коэффициент выделения после инкубации с сывороткой человека
Оплодотворенные куриные яйца
0,5
Родительские клетки DF1
0,5
Неклональные клетки DF1, экспрессирующие SEQ ID NO: 3
5,8
Клон #1 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
4,3
Клон #2 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
5,2
Клон #3 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
0,8
Клон #4 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
6,8
Клон #5 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
3,6
Клон #6 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
1,5
Клон #7 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
7,1
Клон #8 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
10,0
Клон #10 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
6,1
Клон #11 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
6,0
Клон #40 DF1, экспрессирующий SEQ ID NO: 3
20,0
Пример 4:
2
50
50
Широкий спектр онколитической активности NDV, полученного с помощью DF1 клеток, стабильно экспрессирующих комплемент-ингибирующий слитый белок на своей поверхности (клон № 8), оценивали с использованием раствора CellTiter96 AQueous One Solution. Этот раствор действует аналогично анализу MTT (т.е. 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида), в котором метаболически активные клетки способны биовосстанавливать реагент MTS тетразолий (т.е. 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий) в растворимый хромогенный формазан. В кратком изложении, три разные линии опухолевых клеток HT1080 (фибросаркомы), PANC-1 (эпителиальной карциномы поджелудочной железы) и OV-CAR3 (аденокарциномы яичника) выращивали в отдельных 96-луночных планшетах. На следующий день в соответствующие лунки добавляли серийные разведения вируса NDV и инкубировали планшет в течение 6 дней при 37°C в инкубаторе с 5% CO. В день 6 измеряли поглощение во всех лунках каждого планшета при 490 нм с использованием спектрофотометра. IC вычисляли с использованием 4-параметрического анализа логистической нелинейной регрессии для каждой линии клеток. Получали конечные значения IC255, 120 и 47 БОЕ/лунку для линий клеток HT1080, OV-CAR-3 и PANC-1, соответственно (фигура 4). Эти результаты свидетельствуют о том, что частицы NDV, полученные с помощью клеток DF-1, стабильно экспрессирующих рекомбинантный ингибитор комплемента на своей поверхности, сохраняли способность лизировать различные линии опухолевых клеток дозо-зависимым образом.
ССЫЛКИ
Carroll, M. C., E. M. Alicot, P. J. Katzman, L. B. Klickstein, J. A. Smith, and D. T. Fearon. 1988. Organization of the genes encoding complement receptors type 1 and 2, decay-accelerating factor, and C4-binding protein in the RCA locus on human chromosome 1. J. Exp. Med. 167:1271.
Rey-Campos, J., P. Rubinstein, and S. Rodriguez de Cordoba. 1988. A physical map of the human regulator of complement activation gene cluster linking the complement genes CR1, CR2, DAF, and C4BP. J. Exp. Med. 167:664.
Lublin, D. M., and J. P. Atkinson. 1989. Decay-accelerating factor: biochemistry, molecular biology, and function. Annu. Rev. Immunol. 7:35. 5. Nakano, Y., K. Sumida, N. Kikuta, N. H. Miura, T. Tobe, and M. Tomita. 1992. Complete determination of disulfide bonds localized within the short consensus repeat units of decay accelerating factor (CD55 antigen). Biochim.Biophys.Acta 1116:235.
Censullo, P., and M.A. Davitz. 1994a. How GPI-anchored proteins turnover: or where do they go after arrival at the plasma membrane. SeminImmunol. 6:81.
Censullo, P., and M.A. Davitz. 1994b. The fate of GPI-anchored molecules. Braz J. Med. Biol. Res. 27:289
Morgan, B. P., and S. Meri. 1994. Membrane proteins that protect against complement lysis. Springer Semin.Immunopathol.15:369.
Turner A.J. 1994. PIG-tailed membrane proteins.Essays Biochem.28:113.
Kim D.D., and W.C. Song. 2006. Membrane complement regulatory proteins. Clin.Immunol.118:127.
Pecora, A.L., Rizvi, N., Cohen, G.I., Meropol, N.J., Sterman, D., Marshall, J.L., Goldberg, S., Gross, P., O'Neil, J.D., Groene, W.S., Roberts, M.S., Rabin, H., Bamat, M.K., and R.M. Lorence. 2002. Phase I trial of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, in patients with advanced solid cancers. J. Clin. Oncol.20:2251.
Laurie, S.A., Bell, J.C., Atkins, H.L., Roach, J., Bamat, M.K., O'Neil, J.D., Roberts, M.S., Groene, W.S., and R.M. Lorence. 2006. A phase 1 clinical study of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus, using two-step desensitization. Clin. Cancer Res. 12:2555.
Lorence, R.M., Roberts, M.S., O'Neil, J.D., Groene, W.S., Miller, J.A., Mueller, S.N., and M.K. Bamat. 2007. Phase 1 clinical experience using intravenous administration of PV701, an oncolytic Newcastle disease virus. 7:157.
Biswas, M., Johnson, J.B., Kumar, S.R.P. Parks, G.D., and E. Subbiah. 2012. Incorporation of host complement regulatory proteins into Newcastle disease virus enhances complement evasion. J. Virol. 86:12708.
Rangaswamy, U.S., Cotter, C.R., Chang, X., Jin, H., and Z. Chen. 2016. CD55 is a key complement regulatory protein that counteracts complement-mediated inactivation of Newcastle disease virus. J. Gen. Virol. 97:1765
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Wellstat ImmunoTherapeutics Corporation
<120>  ОБОЛОЧЕЧНЫЙ ВИРУС, РЕЗИСТЕНТНЫЙ К ИНАКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТОМ, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
<130>  21003-PCT
<150>  US 62/504,120
<151>  2017-05-10
<160>  3
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  6606
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Экспрессирующая конструкция клетки млекопитающего
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1064)..(1165)
<223>  Кодирующая последовательность секреторного сигнального пептида
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (1166)..(2119)
<223>  Кодирующая последовательность SCR CD55
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2120)..(2164)
<223>  Кодирующая последовательность линкера (G4S1)3
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2165)..(2227)
<223>  Кодирующая последовательность трансмебранного домена CD8
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (2228)..(2260)
<223>  Кодирующая последовательность укороченного внутриклеточного домена CD8
<400>  1
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta       60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc      120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg      180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc      240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat      300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc      360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga      420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg      480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac      540
caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt      600
caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc      660
cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc      720
tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat      780
tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc      840
gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa      900
actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac      960
tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta     1020
aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcgcc accatgacag tggccagacc     1080
ttctgtgcct gccgccctgc ctctgctggg agaactgcct agactgctgc tgctggtgct     1140
gctgtgtctg cctgccgtgt ggggcgattg tggcctgcct cccgatgtgc ctaatgccca     1200
gcctgccctg gaaggcagaa ccagcttccc cgaggacacc gtgatcacct acaagtgcga     1260
ggaatccttc gtgaagatcc ccggcgagaa ggatagcgtg atctgcctga agggcagcca     1320
gtggagcgac atcgaagagt tctgcaacag atcctgcgag gtgcccaccc ggctgaatag     1380
cgcctctctg aagcagccct acatcaccca gaactacttc cctgtgggca ccgtggtgga     1440
atacgagtgc agacccggct acagaagaga gccctccctg agccctaagc tgacctgcct     1500
gcagaacctg aagtggtcca ccgccgtgga gttctgtaaa aagaagtcct gccccaaccc     1560
tggcgagatc cggaacggcc agattgatgt gcctggcggc atcctgttcg gcgccacaat     1620
cagcttcagc tgcaacaccg gctacaagct gttcggcagc acctccagct tttgcctgat     1680
cagcggcagc agcgtgcagt ggagtgaccc tctgcctgag tgcagagaga tctactgccc     1740
tgccccccct cagatcgaca acggcatcat tcagggcgag cgggaccact acggctacag     1800
gcagagcgtg acctacgcct gcaacaaggg cttcaccatg atcggcgagc acagcatcta     1860
ctgcaccgtg aacaacgacg agggcgagtg gagcggccca ccccctgagt gtagaggcaa     1920
gagcctgacc agcaaggtgc cccccaccgt gcagaaaccc accaccgtga atgtgcctac     1980
caccgaggtg tccccaacca gccagaaaac aaccaccaag accaccaccc ccaacgccca     2040
ggccaccaga tctacccctg tgtccaggac caccaagcac ttccacgaga caacccctaa     2100
caagggcagc ggcacaaccg gtggcggagg atctggcggc ggaggaagcg gagggggagg     2160
atccatctat atctgggccc ctctggccgg cacctgtggc gtgctgctgc tgtctctcgt     2220
gatcaccctg tactgcaacc accggaaccg gcggagagtg tgatgagaat tcacgcgtgg     2280
tacctctaga gtcgaccctc tagggcggcc aattccgccc ctctccctcc ccccccccta     2340
acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt     2400
ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga     2460
cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg     2520
tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt     2580
gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat     2640
aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg     2700
aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg     2760
taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt     2820
cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa     2880
cacgatgata agcttgccac aacccgggat aattcctgca gccaatatgg gatcggccat     2940
tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta     3000
tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca     3060
ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga     3120
cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga     3180
cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct     3240
cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg     3300
gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga     3360
gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca     3420
tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga     3480
tgatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg     3540
cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc     3600
gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt     3660
gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga     3720
gttcttctga ggggatcaat tctgggcggc ctcgagaata aacaatcatt attttcattg     3780
gatctgtgtg ttggtttttt gtgtgggctt gggggagggg gaggccagaa tgactccaag     3840
agctacagga aggcaggtca gagaccccac tggacaaaca gtggctggac tctgcaccat     3900
aacacacaat caacagggga gtgagctgga tcgagctgct cgagatccgg gctggcgtaa     3960
tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg     4020
gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc     4080
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc     4140
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt     4200
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg     4260
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt     4320
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta     4380
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt     4440
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttcct gatgcggtat tttctcctta     4500
cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg     4560
ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt     4620
gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc     4680
agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat     4740
ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg     4800
gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc     4860
tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta     4920
ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg     4980
ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg     5040
gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac     5100
gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg     5160
acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt     5220
actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg     5280
ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac     5340
cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt     5400
gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag     5460
caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc     5520
aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc     5580
ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta     5640
tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg     5700
ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga     5760
ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac     5820
ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa     5880
tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat     5940
cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc     6000
taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg     6060
gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc     6120
acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg     6180
ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg     6240
ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa     6300
cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg     6360
aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga     6420
gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct     6480
gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca     6540
gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atggctcgac     6600
agatct                                                                6606
<210>  2
<211>  399
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Слитый белок
<220>
<221>  СИГНАЛ
<222>  (1)..(34)
<223>  Секреторный сигнальный пептид
<220>
<221>  ПЕПТИД
<222>  (35)..(352)
<223>  SCR CD55
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (353)..(367)
<223>  Линкер (G4S1)3
<220>
<221>  TRANSMEM
<222>  (368)..(388)
<223>  Трансмембранный домен CD8
<220>
<221>  DOMAIN
<222>  (389)..(399)
<223>  Укороченный внутриклеточный домен CD8
<400>  2
Met Thr Val Ala Arg Pro Ser Val Pro Ala Ala Leu Pro Leu Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Leu Pro Arg Leu Leu Leu Leu Val Leu Leu Cys Leu Pro Ala Val
20                  25                  30
Trp Gly Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala
35                  40                  45
Leu Glu Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys
50                  55                  60
Cys Glu Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile
65                  70                  75                  80
Cys Leu Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg
85                  90                  95
Ser Cys Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro
100                 105                 110
Tyr Ile Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu
115                 120                 125
Cys Arg Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr
130                 135                 140
Cys Leu Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys
145                 150                 155                 160
Lys Ser Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val
165                 170                 175
Pro Gly Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr
180                 185                 190
Gly Tyr Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly
195                 200                 205
Ser Ser Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr
210                 215                 220
Cys Pro Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg
225                 230                 235                 240
Asp His Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly
245                 250                 255
Phe Thr Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp
260                 265                 270
Glu Gly Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu
275                 280                 285
Thr Ser Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val
290                 295                 300
Pro Thr Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr
305                 310                 315                 320
Thr Thr Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr
325                 330                 335
Thr Lys His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr
340                 345                 350
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile
355                 360                 365
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
370                 375                 380
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val
385                 390                 395
<210>  3
<211>  365
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Зрелый слитый белок (a после отщепления сигнального пептида).
<220>
<221>  PEPTIDE
<222>  (1)..(318)
<223>  SCR CD55
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (319)..(333)
<223>  Линкер (G4S1)3
<220>
<221>  TRANSMEM
<222>  (334)..(354)
<223>  Трансмембранный домен CD8
<220>
<221>  DOMAIN
<222>  (355)..(365)
<223>  Укороченный внутриклеточный домен CD8
<400>  3
Asp Cys Gly Leu Pro Pro Asp Val Pro Asn Ala Gln Pro Ala Leu Glu
1               5                   10                  15
Gly Arg Thr Ser Phe Pro Glu Asp Thr Val Ile Thr Tyr Lys Cys Glu
20                  25                  30
Glu Ser Phe Val Lys Ile Pro Gly Glu Lys Asp Ser Val Ile Cys Leu
35                  40                  45
Lys Gly Ser Gln Trp Ser Asp Ile Glu Glu Phe Cys Asn Arg Ser Cys
50                  55                  60
Glu Val Pro Thr Arg Leu Asn Ser Ala Ser Leu Lys Gln Pro Tyr Ile
65                  70                  75                  80
Thr Gln Asn Tyr Phe Pro Val Gly Thr Val Val Glu Tyr Glu Cys Arg
85                  90                  95
Pro Gly Tyr Arg Arg Glu Pro Ser Leu Ser Pro Lys Leu Thr Cys Leu
100                 105                 110
Gln Asn Leu Lys Trp Ser Thr Ala Val Glu Phe Cys Lys Lys Lys Ser
115                 120                 125
Cys Pro Asn Pro Gly Glu Ile Arg Asn Gly Gln Ile Asp Val Pro Gly
130                 135                 140
Gly Ile Leu Phe Gly Ala Thr Ile Ser Phe Ser Cys Asn Thr Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Lys Leu Phe Gly Ser Thr Ser Ser Phe Cys Leu Ile Ser Gly Ser Ser
165                 170                 175
Val Gln Trp Ser Asp Pro Leu Pro Glu Cys Arg Glu Ile Tyr Cys Pro
180                 185                 190
Ala Pro Pro Gln Ile Asp Asn Gly Ile Ile Gln Gly Glu Arg Asp His
195                 200                 205
Tyr Gly Tyr Arg Gln Ser Val Thr Tyr Ala Cys Asn Lys Gly Phe Thr
210                 215                 220
Met Ile Gly Glu His Ser Ile Tyr Cys Thr Val Asn Asn Asp Glu Gly
225                 230                 235                 240
Glu Trp Ser Gly Pro Pro Pro Glu Cys Arg Gly Lys Ser Leu Thr Ser
245                 250                 255
Lys Val Pro Pro Thr Val Gln Lys Pro Thr Thr Val Asn Val Pro Thr
260                 265                 270
Thr Glu Val Ser Pro Thr Ser Gln Lys Thr Thr Thr Lys Thr Thr Thr
275                 280                 285
Pro Asn Ala Gln Ala Thr Arg Ser Thr Pro Val Ser Arg Thr Thr Lys
290                 295                 300
His Phe His Glu Thr Thr Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Gly Gly
305                 310                 315                 320
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Tyr Ile
325                 330                 335
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
340                 345                 350
Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Arg Arg Val
355                 360                 365
<---