СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПОЗИЦИЙ, СПОСОБНЫХ СТИМУЛИРОВАТЬ ОБРАЗОВАНИЕ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В КОЖЕ
METHOD OF DETERMINING COMPOSITIONS STIMULATING SKIN STEM CELL FORMATION

Область техники
[0001] Данное изобретение относится к препаратам, предназначенным для стимуляции выработки стволовых клеток в коже, и способу их идентификации.
Уровень техники
[0002] Стволовая клетка - это клетка, которая обладает двумя свойствами: (1) сохраняет способность к самовосстановлению посредством деления митотических клеток при поддержании недифференцированного состояния и (2) обладает активностью для дифференциации в любой тип специализированных клеток. Стволовые клетки можно опознать по специфическим маркерам стволовых клеток. Такие маркеры хорошо известны из уровня техники (Rao R et al., Biology of Reproduction, 71: 1772-1778, 2004 г.). Обычно маркеры стволовых клеток представляют собой генные продукты, которые функционально связаны с поддержанием недифференцированного состояния стволовых клеток, поддержанием полипотентности, мультипотентности или иногда унипотентности. Примером надежного маркера стволовой клетки является ОСТ4, который часто называют ОСТ3/4 или Pou5f1. Именно фактор транскрипции семейства POU очень важен для обеспечения недифференцированного состояния стволовой клетки и полипотентности (Watson CM et al., Cell Struct. Func 90, 26: 123-129, 2001; Pesce M et al.. Stem Cells, 19: 271-278, 2001).
[0003] В зрелой коже выявляются как минимум три популяции эндогенных стволовых клеток. Популяция стволовых клеток обнаруживается в выпуклой части волосяного фолликула (Potten CS et al. Experientia 39, 1125-1129, 1983 г.; Watt FM. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B.Biol. Sci. 353, 831-837, 1998 г.; Lavker RM et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13473-13475, 2000 г.). Известно, что другая популяция стволовых клеток расположена в межфолликулярном базальном слое эпидермиса (Tumbar Т et al. Science 303, 359-363, 2004 г.; Taylor G et al. Cell 102, 451-461, 2000 г.). Еще одна популяция стволовых клеток находится в мезенхимальной ячейке. Эта популяция способна формировать множество типов клеток в лабораторных условиях и даже способна генерировать слой эпидермиса, состоящий из клеток различных видов в 3-мерной модели кожи (Crigler L et al.. FASEB Journal. 2007 г. 21: 2050-2063). Из-за способности эндогенных стволовых клеток к регенерации кожи существует потребность в веществах, которые могут стимулировать выработку стволовых клеток в коже, чтобы активизировать регенерацию кожи и процесс обновления при неблагоприятных обстоятельствах, таких как травма, болезнь или старение. Однако надежная идентификация таких веществ ограничена отсутствием подходящих способов.
[0004] Целью данного изобретения является создание препарата, предназначенного для стимуляции выработки стволовых клеток в коже, и способа их идентификации.
Подробное описание изобретения
[0005] Данное изобретение предусматривает способ идентификации препарата-кандидата, предназначенного для стимуляции выработки стволовых клеток в коже, включающий в себя: (а) нанесение тестового препарата на кожу животного; и (b) определение того, повышает ли тестовый препарат уровень маркеров стволовых клеток в коже животного, идентифицируя таким образом тестовый препарат как предназначенный для стимуляции выработки стволовых клеток в коже, если тестовый препарат увеличивает уровень маркеров стволовых клеток в коже.
[0006] Кроме того, данное изобретение предусматривает препарат, предназначенный для стимуляции выработки стволовых клеток в коже, при этом указанный препарат идентифицируется способом, включающим в себя: (а) нанесение тестового препарата на кожу животного; и (b) определение того, повышает ли тестовый препарат уровень маркеров стволовых клеток в коже животного, идентифицируя таким образом тестовый препарат как препарат, предназначенный для стимуляции выработки стволовых клеток в коже, если тестовый препарат увеличивает уровень маркеров стволовых клеток в коже.
[0006] Кроме того, данное изобретение предусматривает композицию для стимуляции выработки стволовых клеток в коже, содержащую препарат, предназначенный для стимуляции выработки стволовых клеток в коже, при этом указанный препарат идентифицируется способом, включающим в себя: (а) нанесение тестового препарата на кожу животного; и (b) определение того, повышает ли тестовый препарат уровень маркеров стволовых клеток в коже животного, идентифицируя таким образом тестовый препарат как препарат, предназначенный для стимуляции выработки стволовых клеток в коже, если тестовый препарат увеличивает уровень маркеров стволовых клеток в коже; и приемлемого для косметических целей разбавителя или носителя.
[0008] Предпочтительно, чтобы животное по настоящему изобретению было млекопитающим. Более предпочтительно, чтобы млекопитающее было мышью.
[0009] Термин «стволовая клетка» относится к клетке, которая обладает двумя свойствами: (1) самовосстановление и (2) активность, где термин самовосстановление означает способность клетки проходить многочисленные циклы деления клетки при поддержании недифференцированного состояния и где термин активность означает способность клетки к дифференциации в любой тип специализированных клеток.
[0008] Предпочтительно, чтобы стволовые клетки по данному изобретению были полипотентными, мультипотентными или унипотентными стволовыми клетками. Более предпочтительно, чтобы стволовые клетки по данному изобретению были полипотентными стволовыми клетками. Термин полипотентная относится к стволовой клетке, которая может дифференцировать в клетки, происходящие из любого из трех слоев кожи, а именно мезодермы, эндодермы и эктодермы, из которых возникают все клетки тела. Термин "мультипотентная" относится к стволовой клетке, из которой могут возникать только клетки близкородственного семейства клеток. Термин "унипотентная" относится к стволовой клетке, которая может дифференцировать только в клетки одного типа.
[0010] Термин "маркер стволовой клетки" относится к любому маркеру, распознающему полипотентные, мультипотентные или унипотентные клетки в коже. Данное изобретение не ограничивается так или иначе конкретным маркером стволовой клетки, но применимо ко всем таким маркерам, известным в настоящее время или открытым или разработанным впоследствии. Специалист в данной области техники знает, как выявить конкретный подходящий маркер стволовой клетки для использования в методе по данному изобретению. Однако предпочтительный маркер стволовой клетки по данному изобретению выбирается из группы маркеров экспрессии генов, состоящей из
Более предпочтительно, чтобы маркер стволовой клетки по данному изобретению был ОСТ4. При практическом применении данного изобретения маркер стволовой клетки может быть выявлен способом, известным из уровня техники. Такие способы включают в себя, помимо прочего, нозерн-блоттинг, вестерн-блоттинг, иммуногистохимию, проточную цитометрию, иммуносорбентный анализ с ферментной меткой и иммуноэлектронную спектроскопию.
[0011] Термин «дерматологически приемлемый разбавитель или носитель» относится к одному или более совместимым твердым или жидким разбавителям или носителям клеток-филлеров, которые подходят для введения в любую часть кожи человека и совместимы с препаратом, пригодным для стимуляции выработки стволовых клеток. Примерами таких носителей являются, помимо прочего, дистиллированная или деионизированная вода, пропилен гликоль, глицерин и масло.
[0012] Предпочтительно, чтобы препарат, пригодный для стимуляции выработки стволовых клеток, который можно идентифицировать способом по данному изобретению, был выбран из группы, состоящей из интерлейкинов и факторов роста.
[0013] Более предпочтительно, чтобы интерлейкин по данному изобретению был выбран из группы, включающей в себя интерлейкин 1 альфа, интерлейкин 1 член семейства 5 (дельта), интерлейкин 1 член семейства 6 (эпсилон), интерлейкин 1 член семейства 7 (дзета), интерлейкин 1 член семейства 8 (эта), интерлейкин 1 член семейства 9, интерлейкин 1 член семейства 10 (тета), интерлейкин 2, интерлейкин 3, интерлейкин 4, интерлейкин 6, интерлейкин 8 и интерлейкин 18.
[0014] Более предпочтительно, чтобы фактор роста по данному изобретению был выбран из группы, включающей в себя CSF, GM-CSF, VEGF, EGF, FGF, IGF и PDGF.
[0015] Композиции по данному изобретению пригодны для регуляции состоянии кожи, видимых или и/или осязаемых неоднородностей кожи (особенно на поверхности кожи; такие неоднородности обычно нежелательны). Такие неоднородности могут быть индуцированы или вызваны внутренними и/или внешними факторами и включают в себя признаки старения кожи, описанные в настоящей заявке. Термин "регуляция состояния кожи" включает в себя профилактическую регуляцию и/или терапевтическую регуляцию состояния кожи, включая видимые или и/или осязаемые неоднородности в коже. В контексте данной заявки профилактическая регуляция состояния кожи включает в себя задержку, сведение к минимуму и/или предупреждение видимых или и/или осязаемых неоднородностей в коже. В контексте данной заявки терапевтическая регуляция состояния кожи включает в себя уменьшение интенсивности симптомов, т.е. уменьшение, сведение к минимуму и/или удаление неоднородностей в коже. Регуляция состояния кожи включает в себя улучшение внешнего вида кожи и/или тактильных ощущений. Кроме того, композиции по данному изобретению особенно полезны при лечении угревой сыпи или других воспалений кожи.
[0016] Композиции по данному изобретению особенно полезны для регуляции признаков старения кожи, главным образом особо видимых или и/или осязаемых неоднородностей в текстуре коже, связанных со старением. "Регуляция признаков старения кожи" включает в себя профилактическую регуляцию и/или терапевтическую регуляцию одного или более таких признаков (аналогично, регуляция данного признака старения кожи, т.е. складок, морщин или пор, включает в себя профилактическую регуляцию и/или терапевтическую регуляцию такого признака). В контексте данной заявки профилактическая регуляция такого признака включает в себя задержку, сведение к минимуму и/или предупреждение признаков старения. В контексте данной заявки терапевтическая регуляция таких признаков включает в себя уменьшение интенсивности симптомов, т.е. уменьшение, сведение к минимуму и/или удаление признаков старения.
[0017] "Признаки старения кожи" включают, помимо прочего, все внешние проявления, видимые глазу или определяемые наощупь, а также все прочие макро- или микроэффекты, вызванные старением кожи. Такие признаки могут быть индуцированы или вызваны внутренними факторами или внешними факторами, т.е. возрастному старению и/или влиянием условий окружающей среды. Эти признаки могут стать результатом процессов, которые включают, помимо прочего, развитие неоднородностей текстуры, таких как морщины, включая как мелкие поверхностные морщины, так и крупные глубокие морщины, кожные складки, трещины, наросты, крупные поры (т.е. связанные с придаточными структурами, такими как протоки потовой железы, сальные железы или волосяные фолликулы), шелушение и перхоть и/или прочие формы неровности или шероховатости, потерю эластичности кожи (утрату и/или инактивацию функционального эластина в коже), обвисание (включая припухлости в области глаз и щек), потерю плотности кожи, потерю натянутости кожи, потерю кожного возврата после деформации, обесцвечивание (включая круги под глазами), пятнистость, желтизну, участки кожи с гиперпигментацией, такие как старческие пятна и веснушки, роговые наросты, патологическую дифференциацию, гиперкератинизацию, эластоз, разрушение коллагена и прочие гистологические изменения в роговом слое, дерме, эпидермисе, сосудистой системе кожи (т.е. телеангиоэктазия или сосудистые звездочки), и нижележащих тканях, особенно расположенных близко к коже.
[0018] Процентное содержание препарата по данному изобретению составляет от 0,0000001 до 10%, предпочтительно от 0,000001 до 0,00001% от веса композиции.
[0019] Композиции по данному изобретению обычно составляются таким образом, чтобы pH был приблизительно от 4,5 и приблизительно до 9,5, при этом более предпочтительно, чтобы он был приблизительно от 5 и приблизительно до 7,5.
[0020] Для доказательства изобретения даны следующие примеры. Примеры даны только для пояснения и никаким образом не ограничивают объем изобретения.
Пример 1
[0021] Этот пример доказывает способы идентификации препарата, пригодного для стимуляции выработки стволовых клеток в коже.
2
Самцы белой мыши BALB/C в возрасте 5 дней случайным образом разделены на экспериментальные группы (численность группы n=10) и контрольную группу (n=10). Все эксперименты проводились в соответствии с "Принципами наблюдений за лабораторными животными", сформулированными NIH. Крем, содержащий тестовый препарат, наносится на кожу мышей из экспериментальной группы один раз в день в течение 5 недель. Мыши из контрольной группы получали лекарственную среду. В конце эксперимента пробы кожи, контактировавшей с препаратом, были получены с мышей под анестезией. Был сделан иммуногистохимический анализ проб кожи на маркер стволовых клеток уровней ОСТ4 при помощи козьих поликлональных антител ОСТ4 (лаборатория Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния в растворе 1:8000). Коротко говоря, пробы кожи были зафиксированы в 10% растворе формалина и затем парафинированы по стандартной процедуре. Парафинированные срезы были нарезаны по 4 мкм и депарафинированы. Эндогенные пероксидазы были блокированы 3% перекисью водорода. Затем срезы нагревали в течение 5 мин в 10 мМ цитратном буфере, чтобы разрушить нуклеомембраны, обрабатывали 1% BSA при комнатной температуре в течение 40 мин и помещали в термостат на ночь при температуре 4°C с первичными антителами ОСТ4. На следующий день срезы инкубировали (шаг 1) с биотинилированным анти-козьим иммуноглобулином В (лаборатория Santa Cruz Biotechnology, Санта Круз, Калифорния), используемым в растворе 1:200 и (шаг 2) авидин-биотиновым комплексом, конъюгированным с пероксидазой из хрена. Было выполнено окрашивание с 3-амино-этил-карбазолом и перекисью водорода. И в конце концов выполнено контрастное окрашивание с гематоксилином Майера. Окрашенные иммуногистохимическим образом срезы кожи исследовали под оптическим микроскопом. Подсчитали количество ОСТ4-положительных клеток на мм. Результаты выразили в среднекратном увеличении плотности ОСТ4-положительных клеток по сравнению с контрольной группой. Разница между группами считается значительной при p<0.05 (однонаправленный ANOVA).
Идентификация препарата-кандидата. Целью тестирования была идентификация препарата-кандидата, пригодного для стимуляции выработки стволовых клеток в коже. Использовались пять препаратов-кандидатов. Крем, содержащий тестовый препарат или среду, был изготовлен обычными способами. Крем наносили на кожу мыши, как описано в способе. Плотность стволовых клеток в коже была оценена иммуногистохимическим способом, как описано выше. При обработке четырьмя тестовыми препаратами никакого эффекта на выработку стволовых клеток не было обнаружено. Один тестовый препарат, интерлейкин 1 альфа, показал значительное 1,9-кратное (p<0.05) увеличение уровня стволовых клеток в коже по сравнению с контрольной группой. Таким образом, интерлейкин 1 альфа был идентифицирован как препарат-кандидат, пригодный для стимуляции выработки стволовых клеток в коже.
Пример 2
[0022] Этот пример отображает композицию для стимуляции выработки стволовых клеток в коже
Процентное содержание ингредиентов, % от веса
Интерлейкин 1 альфа 0,000001, Цитратный буфер - сколько нужно до получения pH 5.5, дистиллированная вода до 100
Изготовление раствора: ингредиенты смешивают обычным образом для изготовления композиции. Способ стимуляции выработки стволовых клеток в коже: 1 мл композиции локально наносится на кожу черепа, предпочтительно оставлять ее на коже на период времени не менее приблизительно 15 минут.