КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И НАБОРЫ ДЛЯ СИНТЕЗА И ОБНАРУЖЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
COMPOSITIONS, METHODS AND SETS FOR SYNTHESIZING AND DETECTING NUCLEIC ACIDS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Согласно 35 U.S.C. §119 (е), настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/319151, поданной 6 апреля 2016 года, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и генетического анализа. Настоящее изобретение относится к композициям, способам и наборам, подходящим для синтеза нуклеиновых кислот. Конкретнее, предложены композиции, способы и наборы для амплификации, обнаружения и/или количественного определения молекул нуклеиновых кислот, особенно характеризующихся низким количеством копий и/или присутствием ингибиторов, например, в необработанном лизате.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
9
[0003] В своей простейшей форме полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой способ ферментативного синтеза специфических последовательностей ДНК in vitro с использованием двух олигонуклеотидных праймеров, которые гибридизуются с противоположными цепями и фланкируют нужную область ДНК-мишени. Повторяющаяся серия поэтапных реакций, включающая денатурацию матрицы, отжиг праймеров и удлинение отожженных праймеров ДНК-полимеразой, приводит к экспоненциальному накоплению специфического фрагмента, концы которого определяются 5'-концами праймеров. ПЦР может выполнять селективное обогащение определенной последовательности ДНК с коэффициентом 10. См., например, патенты США №4683202, 4683195, 4800159 и 4965188 и статью Saiki et al., 1985, Science 230:1350.
2
[0004] Доступные для приобретения мастер-миксы для ПЦР повышают эффективность и снижают вероятность ошибок, связанных с компоновкой большого количества ПЦР-реакций, необходимого для высокопроизводительного анализа. Эти мастер-миксы содержат комбинацию реагентов, общих для всех ПЦР-реакций. Например, мастер-микс может содержать буфер, соль, например, MgCl, дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ) и термостабильную ДНК-полимеразу. Как правило, мастер-миксы изготавливают и распространяют в виде концентрированных растворов или лиофилизированных порошков, которые затем разбавляют или растворяют при компоновке окончательных реакций.
[0005] Для точного анализа нуклеиновых кислот мастер-миксы для ПЦР должны обеспечивать получение достоверных, надежных и воспроизводимых результатов ПЦР. Кроме того, мастер-миксы для ПЦР должны обеспечивать обнаружение нуклеиновых кислот-мишеней с небольшим количеством копий. Например, многие медицинские, диагностические и судебные варианты применения зависят от амплификации определенной последовательности ДНК в образце, в котором эта последовательность присутствует в очень малых количествах. Кроме того, многие из таких вариантов применения основаны на амплификации нуклеотидной последовательности из необработанного или неочищенного образца, например, необработанного лизата клеток или тканей.
[0006] Соответственно, существует потребность в композициях для ПЦР, которые надежно работают со всеми видами образцов нуклеиновых кислот, включая необработанные препараты образцов и/или образцы с небольшим количеством мишеней.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] В настоящем документе предложены композиции, наборы и способы для синтеза, обнаружения и/или количественного определения нуклеиновых кислот путем полимеразно-зависимого синтеза нуклеиновых кислот, включая, например, использование полимеразной цепной реакции (ПЦР). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены композиции, содержащие ДНК-полимеразу, соль, пеногаситель и комбинацию дНТФ и производного дНТФ.
[0008] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая термостабильную ДНК-полимеразу. В некоторых вариантах реализации термостабильную ДНК-полимеразу выбирают из ДНК-полимеразы Taq; ДНК-полимеразы Tne; ДНК-полимеразы Tma; ДНК-полимеразы Pfu; ДНК-полимеразы KOD; ДНК-полимеразы ТА; ДНК-полимеразы Tth; фрагмента Штоффеля ДНК-полимеразы; ДНК-полимеразы VENT™; ДНК-полимеразы DEEPVENT™; и их мутантов, вариантов или производных. В некоторых вариантах реализации термостабильная ДНК-полимераза представляет собой ДНК-полимеразу, происходящую от Taq-полимеразы.
[0009] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая соль калия, соль магния и/или соль натрия. В некоторых вариантах реализации концентрация соли составляет от приблизительно 5 мМ до приблизительно 200 мМ.
[0010] В некоторых вариантах реализации композиция содержит пеногаситель на основе силикона. В некоторых вариантах реализации пеногаситель на основе силикона выбирают из XIAMETER AFE-1010, AFE-1430, AFE-1510, AFE-1520, AFE-2210, пеногасителя Antifoam А, пеногасителя Antifoam В, пеногасителя Antifoam С, пеногасителя Antifoam Н-10, пеногасителя Antifoam SE-15, пеногасителя Antifoam SE-35, пеногасителя Antifoam SO-25, пеногасителя Antifoam Y-30 и пеногасителя Antifoam 289. В некоторых вариантах реализации композиция содержит пеногаситель, не содержащий силикона. В некоторых вариантах реализации пеногаситель, не содержащий силикона, выбирают из органических сульфонатов, полиэфиров, органических фосфатов, ацетиленовых гликолей, фторуглеводородов, полиалкенполиаминов и полиалкилениминовых соединений, в том числе, без ограничения, пеногасителя 204 и пеногасителя О-30. В некоторых вариантах реализации концентрация пеногасителя составляет приблизительно от 0,001% до 0,1%.
[0011] В некоторых вариантах реализации дНТФ выбирают из дГТФ, дЦТФ, дАТФ и дТТФ. В некоторых вариантах реализации дНТФ представляет собой дГТФ. В некоторых вариантах реализации концентрация дГТФ составляет от 0,05 мМ до 1,0 мМ
[0012] В некоторых вариантах реализации производное дНТФ выбирают из 7-дезаза-2-дезокси-ГТФ, 7-дезаза-дАТФ, альфа-тио-дАТФ, альфа-тио-дТТФ, альфа-тио-дГТФ и альфа-тио-дЦТФ. В некоторых вариантах реализации производное дНТФ представляет собой 7-деаза-2-дезокси-ГТФ. В некоторых вариантах реализации производное дНТФ представляет собой 7-деаза-2-дезокси-дГТФ. В некоторых вариантах реализации концентрация 7-дезаза-2-дезокси-дГТФ составляет от 0,05 мМ до 1,0 мМ.
[0013] В некоторых вариантах реализации композиция содержит дГТФ и 7-дезаза-2-дезокси-дГТФ в соотношении от приблизительно 1:2 до приблизительно 2:1. В некоторых вариантах реализации композиция содержит дГТФ и 7-дезаза-2-дезокси-дГТФ в соотношении от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:10. В некоторых вариантах реализации композиция содержит дГТФ и 7-дезаза-2-дезокси-дГТФ в соотношении от приблизительно 2:1 до приблизительно 10:1. В некоторых вариантах реализации композиция содержит дГТФ и 7-дезаза-2-дезокси-дГТФ в соотношении приблизительно 1:1.
[0014] В некоторых вариантах реализации предлагаемая композиция дополнительно содержит блокатор ингибитора ПЦР. В некоторых вариантах реализации блокатор ингибитора ПЦР представляет собой белок. В некоторых вариантах реализации белок, блокирующий ингибитор ПЦР, выбирают из альбумина, желатина и их комбинации. В некоторых вариантах реализации композиция содержит желатин и сывороточный альбумин. В некоторых вариантах реализации желатин выбирают из желатина КРС, рыбьего желатина и их комбинации. В некоторых вариантах реализации концентрация желатина КРС составляет от 0,01% до 1,0%, и/или концентрация указанного рыбьего желатина составляет от 0,01% до 1,0%. В некоторых вариантах реализации сывороточный альбумин является бычьим сывороточным альбумином. В некоторых вариантах реализации концентрация бычьего сывороточного альбумина составляет от 0,05 мг/мл до 5 мг/мл.
[0015] В некоторых вариантах реализации предлагаемая композиция дополнительно содержит детергент. В некотором варианте детергент является неионным детергентом. В некоторых вариантах реализации неионный детергент выбирают из группы, состоящей из тритона Х-100, Nonidet Р-40, твин-80, Brij 30, Brij 35 и Brij 58. В некоторых вариантах реализации неионный детергент представляет собой детергент, отличающийся от твин-20. В некоторых вариантах реализации неионный детергент присутствует в композиции в концентрации от 0,005% до 0,1%. В некоторых вариантах реализации предлагаемая композиция дополнительно содержит пассивный эталонный контрольный краситель. В некоторых вариантах реализации пассивный эталонный контрольный краситель представляет собой флуоресцентный краситель. В некоторых вариантах реализации пассивный флуоресцентный пассивный эталонный краситель представляет собой краситель ROX или краситель MUSTANG PURPLE. В некоторых вариантах реализации концентрация пассивного эталонного красителя составляет от приблизительно 25 нМ до приблизительно 500 нМ.
[0016] В конкретном варианте реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая термостабильную ДНК-полимеразу, хлорид калия, силиконсодержащий пеногаситель, дГТФ и 7-дезаза-2-дезокси-дГТФ, причем концентрация 7-дезаза-2-дезокси-дГТФ составляет от приблизительно 0,05 мМ до 1,0 мМ, неионный детергент, отличающийся от Твин-20, желатин КРС в концентрации от 0,01% до 1,0%, рыбий желатин в концентрации от 0,01% до 1,0% и бычий сывороточный альбумин в концентрации от 0,05 мг/мл до 5,0 мг/мл.
[0017] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы осуществления синтеза нуклеиновых кислот, включающие контакт композиции, предложенной в настоящем документе, с биологическим образцом, содержащим полинуклеотид-мишень с праймером, специфическим по отношению к мишени, в любом порядке или комбинации компонентов, с целью формирования реакционной смеси и выполнения реакции синтеза нуклеиновых кислот в реакционной смеси с образованием продукта амплификации. В некоторых вариантах реализации реакция синтеза нуклеиновых кислот представляет собой полимеразную цепную реакцию (ПЦР). В некоторых вариантах реализации реакция синтеза нуклеиновых кислот представляет собой реакцию амплификации. В некоторых вариантах реализации реакция синтеза нуклеиновых кислот представляет собой реакцию удлинения праймера.
[0018] В некоторых вариантах реализации предложенные способы дополнительно включают определение генотипа полинуклеотида-мишени с использованием продукта амплификации. В некоторых вариантах реализации предлагаемые способы дополнительно включают определение количества копий полинуклеотида-мишени с использованием продукта амплификации.
[0019] В некоторых вариантах реализации предложенных способов время выполнения ПЦР с использованием композиций или реакционных смесей, описанных в настоящем документе, снижается по сравнению с эквивалентной ПЦР, выполненной с использованием стандартной реакционной смеси для ПЦР. В некоторых вариантах реализации ПЦР, выполненная с использованием композиций или реакционных смесей, описанных в настоящем документе, позволяет получить продукт амплификации за более короткое время по сравнению с эквивалентной ПЦР, выполненной с использованием стандартной реакционной смеси для ПЦР.
[0020] В некоторых вариантах реализации ПЦР является симплексной ПЦР. В некоторых вариантах реализации ПЦР представляет собой мультиплексную ПЦР. Термин «симплексный» или «симплексная ПЦР» в настоящем документе относится к анализу, который предусматривает амплификацию единственного продукта в реакционном сосуде. Для получения продукта используют отдельную пару праймеров. Симплексная реакция может дополнительно включать меченый зонд, специфичный по отношению к амплифицированному продукту, причем указанный зонд мечен обнаружимым фрагментом, например, флуоресцентным красителем. Термин «мультиплексный» или «мультиплексная ПЦР» в настоящем документе относится к анализу, который предусматривает одновременную амплификацию двух или более продуктов в одном и том же реакционном сосуде. Для получения каждого продукта используют отдельную пару праймеров. Мультиплексная реакция может дополнительно включать меченые зонды, специфичные по отношению к каждому продукту, причем указанные зонды мечены различными обнаружимыми фрагментами. В некоторых вариантах реализации мультиплексная ПЦР включает реакции, в которых: (i) множество мишеней амплифицируют в одном образце; одновременно амплифицируют две или более мишеней в одном образце или (ii) множестве образцов; амплифицируют две мишени в двух разных образцах в ходе одной реакции практически в одно и то же время.
[0021] В некоторых вариантах реализации предложенных способов биологический образец представляет собой лизат, например, лизат крови или лизат, содержащий клетки, полученные из полости рта. В некоторых вариантах реализации биологический образец получен из слюны, мочи или сыворотки. В некоторых вариантах реализации лизат представляет собой необработанный лизат. В некоторых вариантах реализации биологические образцы содержат один или более из ингибиторов ПЦР, в том числе IgG, гематин, гепарин, ЭДТА, цитрат натрия или любую их комбинацию, но не ограничиваясь ими.
[0022] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены наборы, содержащие композиции, предложенные в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации указанные наборы дополнительно содержат пару праймеров и/или меченый зонд, специфичный по отношению к продукту синтеза нуклеиновой кислоты (например, ПЦР-амплификации) и/или обнаружению ДНК-мишени.
[0023] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены наборы, содержащие композиции, предложенные в настоящем документе, контрольный образец нуклеиновой кислоты и пару праймеров и/или меченый зонд, специфичный по отношению к продукту синтеза нуклеиновой кислоты (например, ПЦР-амплификации) и/или обнаружению ДНК-мишени в контрольном образце нуклеиновой кислоты.
[0024] Описанные выше и другие признаки проиллюстрированы следующими фигурами и подробным описанием.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0025] На ФИГ. 1А - ФИГ. 1G показаны графики Δ Rn в зависимости от цикла ПЦР для образца необработанного лизата слизистой оболочки полости рта объемом два микролитра, амплифицированного в двух повторных запусках анализа количества копий на основе РНКазы Р и зондов TaqMan™ с использованием варианта реализации композиций, описанных в настоящем документе (левая верхняя панель) и доступного для приобретения мастер-микса для ПЦР (правая верхняя панель). На нижней панели показаны отдельные графики для результатов, полученных с использованием обоих мастер-миксов для каждого объема добавленного лизированного раствора.
[0026] На ФИГ. 2А - ФИГ. 2G показаны графики Δ Rn в зависимости от цикла ПЦР для различных количеств образца необработанной слюны, амплифицированного в двух повторных запусках анализа количества копий на основе РНКазы Р и зондов TaqMan™ с использованием варианта реализации композиций, описанных в настоящем документе (левая верхняя панель) и доступного для приобретения мастер-микса для ПЦР (правая верхняя панель). На нижней панели показаны отдельные графики для результатов, полученных с использованием обоих мастер-миксов для каждого объема необработанной слюны.
[0027] На ФИГ. 3 показан график генотипирования на основе анализов, выполненных для необработанных лизатов крови с использованием варианта реализации композиций, описанных в настоящем документе.
[0028] ФИГ. 4А - ФИГ. 4В представляют собой графики результатов анализа изменчивости количества копий, выполненного с использованием необработанного лизата крови (левые столбики) и с соответствующими образцами очищенной ДНК (правые столбики). Анализы выполнили с использованием варианта реализации композиций, описанных в настоящем документе.
[0029] На ФИГ. 5А - ФИГ. 5D показаны графики сигнала флуоресценции SYBR Green в зависимости от цикла ПЦР для реакционных смесей, содержащих различные количества пеногасителя Antifoam 204 в концентрациях от 0% до 0,1%. Реакции (в объеме 10 мкл) выполняли в 96 повторностях в 384-луночном титрационном микропланшете с использованием системы ПЦР в режиме реального времени ViiA 7.
[0030] На ФИГ. 6А - ФИГ. 6D показаны графики сигнала флуоресценции SYBR Green в зависимости от цикла ПЦР для реакционных смесей, содержащих различные количества пеногасителя SE-15 в концентрациях от 0% до 0,1%. Реакции (в объеме 10 мкл) выполняли в 96 повторностях в 384-луночном титрационном микропланшете с использованием системы ПЦР в режиме реального времени ViiA 7.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0031] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены композиции, способы и наборы для синтеза, обнаружения и/или количественного определения нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены композиции, способы и наборы для синтеза, обнаружения и/или количественного определения нуклеиновых кислот посредством синтеза нуклеиновых кислот, опосредованного полимеразами, включая удлинение праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР), но не ограничиваясь им. В некоторых вариантах реализации композиции, предложенные в настоящем документе, являются особенно эффективными и демонстрируют превосходные характеристики при анализе необработанных или неочищенных образцов нуклеиновых кислот, например, необработанных лизатов или необработанных экстрактов.
[0032] В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, можно применять при широком диапазоне анализов, включая обнаружение, количественное определение и/или исследование характеристик нуклеиновых кислот-мишеней. Например, указанные композиции можно применять при анализах для генотипирования, в том числе, без ограничения, однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), микросателлитного анализа и генотипирования других мутаций, для определения количества копий и анализа изменчивости, для обнаружения экспрессии генов и для обнаружения экспрессии малых РНК (например, экспрессии микроРНК).
[0033] Кроме того, описаны наборы, содержащие указанные композиции, а также способы применения указанных композиций и наборов.
[0034] В одном аспекте настоящего изобретения предложены скомпонованные композиции мастер-микса для ПЦР, демонстрирующие превосходную чувствительность, точность и специфичность по сравнению со стандартными реакционными смесями для ПЦР при работе на стандартной аппаратуре для ПЦР. В некоторых вариантах реализации применение скомпонованных мастер-миксов для ПЦР, предложенных в настоящем документе, приводит к превосходной амплификации, обнаружению и/или количественному определению молекул нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующих в необработанных или неочищенных препаратах образцов, по сравнению с применением стандартных композиций для ПЦР. В некоторых вариантах реализации применение скомпонованных мастер-миксов для ПЦР, предложенных в настоящем документе, приводит к превосходной амплификации, обнаружению и/или количественному определению молекул нуклеиновой кислоты-мишени, присутствующих в небольшом количестве копий в препарате образца, по сравнению с применением стандартных композиций мастер-миксов для ПЦР.
[0035] В некоторых вариантах реализации применение скомпонованных композиций для ПЦР, предложенных в настоящем документе для генотипирования, приводит к улучшенной чувствительности и специфичности по сравнению с применением стандартных композиций для ПЦР. В некоторых вариантах реализации применение скомпонованных композиций для ПЦР, предложенных в настоящем документе для анализа экспрессии генов, приводит к улучшенным значениям чувствительности по сравнению с применением стандартных композиций для ПЦР. В некоторых вариантах реализации такие скомпонованные композиции для ПЦР для генотипирования или анализа экспрессии генов с использованием необработанных лизатов или образцов неочищенных нуклеиновых кислот дают результаты, сопоставимые с результатами, полученными с использованием соответствующих образцов очищенных нуклеиновых кислот.
[0036] В некоторых вариантах реализации применение скомпонованных композиций ПЦР, предложенных в настоящем документе для определения количества копий и/или анализа вариации количества копий, приводит к повышению чувствительности, точности и специфичности по сравнению с применением стандартных композиций для ПЦР. В некоторых вариантах реализации применение скомпонованных композиций ПЦР, предложенных в настоящем документе для определения количества копий и/или анализа вариации количества копий, приводит к повышению частоты обнаружения и согласованности количества копий по сравнению с применением стандартных композиций для ПЦР. В некоторых вариантах реализации применение скомпонованных композиций ПЦР, предложенных в настоящем документе для определения и/или анализа количества копий, улучшает диапазон более низкого количества копий (от максимального к минимальному) и нулевые значения по сравнению с применением стандартных композиций для ПЦР. Такие улучшения анализа вариации числа копий обнаруживаются при использовании необработанных образцов нуклеиновой кислоты, например, необработанных лизатов, или образцов очищенных нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации применение скомпонованных композиций для ПЦР, предложенных в настоящем документе для анализа вариации количества копий с использованием необработанных лизатов в качестве образцов нуклеиновых кислот дает результаты, сопоставимые с результатами, полученными с использованием соответствующих образцов очищенных нуклеиновых кислот.
[0037] В некоторых вариантах реализации превосходная чувствительность ПЦР, скомпонованных с использованием композиций, описанных в настоящем документе, позволяет сократить время ПЦР на FAST или стандартном оборудовании для ПЦР. В некоторых вариантах реализации композиции для ПЦР предназначены для применения в симплексной ПЦР и реакциях обнаружения. В некоторых вариантах реализации композиции для ПЦР предназначены для применения в мультиплексной ПЦР и реакциях обнаружения. Как правило, мультиплексная ПЦР снижает стоимость анализа и использование образцов за счет одновременного обнаружения нескольких локусов-мишеней в одной реакции.
[0038] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены скомпонованные композиции, содержащие термостабильную ДНК-полимеразу, соль, пеногаситель и дНТФ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены скомпонованные композиции, содержащие термостабильную ДНК-полимеразу, соль, пеногаситель и комбинацию по меньшей мере одного дНТФ и по меньшей мере одного производного дНТФ.
[0039] В некоторых аспектах композиции согласно настоящему изобретению содержат одну или более полимераз. Такими полимеразами могут являться любые ферменты, способные реплицировать молекулу ДНК. В некоторых вариантах реализации указанные композиции могут содержать ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, фермент для обратной транскрипции (РНК-зависимую ДНК-полимеразу) и/или комбинацию обоих типов ферментов. В некоторых вариантах реализации в композициях, описанных в настоящем документе, может присутствовать комбинация ДНК-зависимых ДНК-полимераз и/или комбинация РНК-зависимой ДНК-полимеразы.
[0040] В некоторых вариантах реализации полимеразы, применяемые в настоящем изобретении, представляют собой термостабильные ДНК-полимеразы. В некоторых вариантах реализации, термостабильные ДНК-полимеразы, применяемые в настоящем изобретении, не характеризуются необратимой инактивацией при воздействии повышенных температур в течение времени, необходимого для дестабилизации одноцепочечных нуклеиновых кислот или денатурации двуцепочечных нуклеиновых кислот в процессе синтеза нуклеиновой кислоты или ПЦР-амплификации. Необратимая денатурация фермента относится к значительной потере активности фермента. Предпочтительно, термостабильная ДНК-полимераза не должна необратимо денатурироваться при температуре приблизительно 90-100°С в условиях, которые обычно требуются для ПЦР-амплификации.
[0041] ДНК-полимеразы в соответствии с настоящим изобретением можно выделить из природных или рекомбинантных источников с помощью методик, хорошо известных в данной области техники (см., например, публикации РСТ №WO 92/06200, WO 96/10640; патентах США №5455170; 5912155; и 5466591, описание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылок), из множества термофильных бактерий, которые доступны для приобретения (например, в Американской коллекции типовых культур, Роквилл, штат Мэриленд, США), или получить с использованием технологии рекомбинантных ДНК (см., например, публикацию РСТ №WO 96/10640 и патент США №5912155). В качестве источников термостабильных полимераз или их генов для экспрессии в рекомбинантных системах подходят, например, термофильные бактерии Thermus thermophilus, Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woosii и другие виды рода Pyrococcus, Bacillus sterothermophilus, Sulfolobus acidocaldarius, Thermoplasma acidophilum, Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus brockianus, Thermotoga neapolitana, Thermotoga maritima и другие виды рода Thermotoga и Methanobacterium thermoautotrophicum и их мутанты, варианты или производные. В некоторых вариантах реализации композиции, способы и наборы, предложенные в настоящем документе, содержат термостабильные ДНК-полимеразы, выбранные из группы, состоящей из ДНК-полимеразы Taq, ДНК-полимеразы Tne, ДНК-полимеразы Tma, ДНК-полимеразы Tfi, ДНК-полимеразы Pfu, ДНК-полимеразы Pwo, ДНК-полимеразы VENT™, ДНК-полимеразы DEEPVENT™, их мутантов или производных, обладающих ДНК-полимеразной активностью, а также любой комбинации вышеперечисленного. ДНК-полимераза Taq и ее мутантные формы доступны для приобретения, например, в Life Technologies (Карлсбад, штат Калифорния, США) или могут быть выделены из природного источника (например, из термофильной бактерии Thermus aquaticus для Taq-полимеразы), как описано ранее (см., например, патенты США №4889818 и 4965188, описание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылок). ДНК-полимеразу Tne можно выделить из природного источника - термофильной бактерии Thermotoga neapolitana (см., например, публикацию РСТ №WO 96/10640 и патент США №5912155), а ДНК-полимеразу Tma можно выделить из природного источника - термофильной бактерии Thermotoga maritima (см., например, патент США №5374553, описание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки). Типичные термостабильные полимеразы включают ДНК-полимеразу AmpliTaq и ДНК-полимеразу AmpliTaq Gold (Thermo Fisher Scientific), но не ограничиваются ими.
[0042] В то же время следует понимать, что в настоящем изобретении также можно применять ДНК-полимеразы других организмов, не отступая от сущности изобретения или предпочтительных вариантов его реализации. В качестве альтернативы выделению, ДНК-полимеразы доступны для приобретения, например, в Life Technologies (Карсбад, штат Калифорния, США), New England BioLabs (Беверли, штат Массачусетс, США), Finnzymes Оу (Эспо, Финляндия), Stratagene (Ла-Хойя, штат Калифорния, США), Boehringer Mannheim Biochemicals (Индианаполис, штат Индиана, США) и Perkin Elmer Cetus (Норуолк, штат Коннектикут, США). Следует понимать, что в композициях, способах и комплектах согласно настоящему изобретению можно применять различные ДНК-полимеразы, в том числе полимеразы, не описанные в настоящем документе явным образом, без отступления от сущности изобретения или предпочтительных вариантов его реализации.
[0043] В некоторых вариантах реализации концентрация термостабильной ДНК-полимеразы в описываемых в настоящем документе композициях и реакционных смесях составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 500 единиц на микролитр, от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 единиц на микролитр, от приблизительно 0,01 до приблизительно 25 единиц на микролитр, от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 единиц на микролитр, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 единиц на микролитр, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2 единиц на микролитр, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 единицы на микролитр или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 единиц на микролитр (единицы на микролитр = ед/мкл), включая все концентрации и диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов.
[0044] В некоторых вариантах реализации композиции, представленные в настоящем документе, содержат пеногаситель. Пеногаситель в настоящем документе, представляет собой поверхностно-активное химическое вещество, которое облегчает высвобождение газа и противодействует вспениванию, вызванному, например, смешиванием реакционной смеси. Пеногасители могут предотвращать, устранять и/или снижать образование пены. Пеногасители могут дополнительно придавать смеси положительные вспомогательные поверхностные свойства, например, смачивания, дисперсии, эмульгирования и солюбилизации. В некоторых вариантах реализации пеногаситель предложенной композиции не является детергентом. В некоторых вариантах реализации в композициях, описанных в настоящем документе, может присутствовать комбинация различных пеногасителей. В некоторых вариантах реализации пеногаситель или пеногасители находятся/присутствуют в количестве, эффективном для повышения чувствительности реакции ПЦР.

[0045] В качестве пеногасителей можно применять многие химические соединения, включая, без ограничения, алкилполиоксиалкиленгликолевые простые эфиры; сложные эфиры; спирты; силоксаны; силиконы; сульфиты; сульфонаты; жирные кислоты и их производные. Ряд таких агентов известен и доступен для приобретения в различных источниках, включая J.Т. Baker, Spectrum Chemicals, Dow Corning Corporation и Sigma-Aldrich Company. Композиции пеногасителей могут содержать один компонент или несколько компонентов, которые можно объединить путем простого смешивания. В некоторых вариантах реализации пеногасители для применения в предложенных композициях включают, без ограничения, силоксановые полимеры, полиэфирные дисперсии на основе смесей органического несиликонового полипропилена, силиконовые эмульсии, неионные симетиконовые эмульсии, пеногасители на основе сложных эфиров органических жирных кислот. Например, известный класс пеногасителей на основе силикона - органосилоксаны - включает чистые силиконовые масла, например, диметилполисилоксаны, а также блоксополимеры полисилоксана/полиоксиалкилена, например, диметилполисилоксаны. В некоторых вариантах реализации пеногаситель представляет собой пеногаситель на основе силикона, и его выбирают из XIAMETER AFE-1010, AFE-1430, AFE-1510, AFE-1520, AFE-2210, пеногасителя Antifoam А, пеногасителя Antifoam В, пеногасителя Antifoam С, пеногасителя Antifoam Н-10, пеногасителя Antifoam SE-15, пеногасителя Antifoam SE-35, пеногасителя Antifoam SO-25, пеногасителя Antifoam Y-30 и пеногасителя Antifoam 289.
[0046] В некоторых вариантах реализации пеногаситель представляет собой пеногаситель на основе силикона. Примеры пеногасителей, не содержащих силикона, включают, без ограничения, органические сульфонаты, полиэфиры, органические фосфаты, ацетиленовые гликоли, фторуглеводороды, полиалкенполиамины и полиалкилениминовые соединения, в том числе, без ограничения, пеногаситель 204 и пеногаситель О-30.
[0047] В некоторых вариантах реализации пеногаситель или пеногасители присутствуют в композициях или реакционных смесях, описанных в настоящем документе, в концентрации от приблизительно 0,0005 до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,1%, от 0,002% до приблизительно 0,05% или от 0,005% до приблизительно 0,02% или от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,05%, включая все концентрации и диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов.
3
14
32
35
[0048] В некоторых вариантах реализации композиции, предложенные в настоящем документе, содержат по меньшей мере один дезоксинуклеозидтрифосфат (дНТФ). В некоторых вариантах реализации композиция может дополнительно содержать комбинацию одного или более дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ) и одного или более производных дНТФ. В некоторых вариантах реализации композиция содержит от двух до восьми различных дНТФ и/или производных дНТФ. В некоторых вариантах реализации композиция содержит два, три, четыре, пять или шесть различных дНТФ и/или производных дНТФ. Примеры дНТФ, которые можно включать в композиции, реакционные смеси или наборы, предложенные в настоящем документе, включают дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ, дУТФ и/или дИТФ, но не ограничиваются ими. Примеры возможных производных дНТФ включают 7-дезаза-дГТФ (например, 7-дезаза-2-дезокси-дГТФ), 7-дезаза-дАТФ, альфа-тио-дАТФ, альфа-тио-дТТФ, альфа-тио-дГТФ и/или альфа-тио-дЦТФ, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации композиция может дополнительно содержать комбинацию одного или более дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ) и одного или более производных дНТФ. В некоторых вариантах реализации композиция может дополнительно содержать один или более дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ддНТФ) и/или одно или более из производных ддНТФ. дНТФ, ддНТФ и производные каждого из них доступны для приобретения в различных источниках, в том числе Thermo Fisher Scientific, New England Biolabs и Sigma-Aldrich Company. Такие дНТФ, ддНТФ и производные каждого из них могут быть немечеными или мечеными посредством способов присоединения, известных в данной области, радиоактивными изотопами (например, Н, С, Р или S), витаминами (например, биотином), флуоресцентными соединениями (например, флуоресцеином, родамином, Texas Red или фикоэритрином), хемилюминесцентными метками, дигоксигенином (DIG) и т.п. Меченые дНТФ, ддНТФ и производные каждого из них также можно приобрести, например, в Life Technologies (Карлсбад, штат Калифорния, США) или Sigma Chemical Company (Сент-Луис, штат Миссури, США).
[0049] Концентрация отдельных дНТФ, ддНТФ и/или производных каждого из них в композиции не обязательно должна быть одинаковой. В некоторых вариантах реализации композиций согласно настоящему изобретению можно добавлять дНТФ и/или ддНТФ, получая концентрацию каждого дНТФ и/или ддНТФ, равную от приблизительно 0,001 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 1 мМ или, предпочтительно, от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 0,8 мМ, включая любые концентрации или диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов. В некоторых вариантах реализации концентрации каждого дНТФ и/или ддНТФ в композиции таковы, что их конечная концентрация в скомпонованной смеси для ПЦР составляет от приблизительно 0,015 мМ до приблизительно 5 мМ, от приблизительно 0,05 до приблизительно 2 мМ, от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 0,5 мМ, от приблизительно 0,15 мМ до приблизительно 0,65 мМ, от приблизительно 0,15 мМ до приблизительно 0,35 мМ или от приблизительно 0,35 мМ до приблизительно 0,65 мМ, включая любые концентрации или диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов. В некоторых вариантах реализации композиций согласно настоящему изобретению можно добавлять производные дНТФ и/или производные ддНТФ, получая концентрацию каждого производного дНТФ и/или производного ддНТФ, равную от приблизительно 0,001 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 1 мМ или, предпочтительно, от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 0,8 мМ, включая любые концентрации или диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов. В некоторых вариантах реализации концентрации каждого дНТФ и/или ддНТФ в композиции таковы, что их конечная концентрация в скомпонованной смеси для ПЦР составляет от приблизительно 0,015 мМ до приблизительно 5 мМ, от приблизительно 0,05 до приблизительно 2 мМ, от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 0,5 мМ, от приблизительно 0,15 мМ до приблизительно 0,65 мМ, от приблизительно 0,15 мМ до приблизительно 0,35 мМ или от приблизительно 0,35 мМ до приблизительно 0,65 мМ, включая любые концентрации или диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов.
[0050] В некоторых вариантах реализации композиция содержит комбинацию дНТФ и соответствующего производного того же самого нуклеотида, например, комбинацию дНТФ и соответствующего производного альфа-тио-дНТФ того же нуклеотида или комбинацию дНТФ и соответствующего производного дезаза-дНТФ того же нуклеотида. Например, в одном варианте реализации предложенная композиция содержит как дГТФ, так и альфа-тио-дГТФ. В еще одном варианте реализации предложенная композиция содержит как дГТФ, так и 7-дезаза-дГТФ. В еще одном варианте реализации композиция содержит комбинацию дАТФ и 7-дезаза-дАТФ.
[0051] Если в композиции присутствуют как дНТФ, так и его производное, относительная концентрация или отношение концентраций дНТФ и его производного может варьироваться. Например, в некоторых вариантах реализации относительная концентрация дНТФ:производного дНТФ составляет 1:1. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дНТФ:концентрация производного дНТФ» составляет от приблизительно 100:1 до приблизительно 1:1, от приблизительно 50:1 до приблизительно 1,2:1, от приблизительно 25:1 до приблизительно 1,5:1, от приблизительно 10:1 до приблизительно 2:1. В других вариантах реализации отношение «концентрация дНТФ:концентрация производного дНТФ» составляет от приблизительно 1:1 до приблизительно 1:100, от приблизительно 1:1,2 до приблизительно 1:50, от приблизительно 1:25 до приблизительно 1:1,5, от приблизительно 1:110 до приблизительно 1:2. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дНТФ:концентрация производного дНТФ» составляет от приблизительно 2:1 до приблизительно 1:2. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дНТФ:концентрация производного дНТФ» составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 2:1. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дНТФ:концентрация производного дНТФ» составляет от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:10. Например, в некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация альфа-тио-дГТФ» составляет от приблизительно 100:1 до приблизительно 1,5:1 или от приблизительно 50:1 до приблизительно 12:1. В других вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация альфа-тио-дГТФ» составляет от приблизительно 1:1,5 до приблизительно 1:100 или от приблизительно 1:12 до приблизительно 1:50. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация альфа-тио-дГТФ» составляет от приблизительно 2:1 до приблизительно 1:2. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация альфа-тио-дГТФ» составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 2:1. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация альфа-тио-дГТФ» составляет от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:10. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация дезаза-дГТФ» составляет от приблизительно 100:1 до приблизительно 1,5:1 или от приблизительно 50:1 до приблизительно 12:1. В других вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация дезаза-дГТФ» составляет от приблизительно 1:1,5 до приблизительно 1:100 или от приблизительно 1:12 до приблизительно 1:50. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация дезаза-дГТФ» составляет от приблизительно 2:1 до приблизительно 1:2. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация дезаза-дГТФ» составляет от приблизительно 10:1 до приблизительно 2:1. В некоторых вариантах реализации отношение «концентрация дГТФ:концентрация дезаза-дГТФ» составляет от приблизительно 1:2 до приблизительно 1:10.
[0052] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложена скомпонованная композиция для ПЦР, содержащая термостабильную ДНК-полимеразу, соль магния, пеногаситель и комбинацию дАТФ, дЦТФ, дУТФ и 7-дезаза-дГТФ. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложена скомпонованная композиция для ПЦР, содержащая термостабильную ДНК-полимеразу, соль магния, пеногаситель и комбинацию дЦТФ, дГТФ, дУТФ и 7-дезаза-дАТФ. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложена скомпонованная композиция для ПЦР, содержащая термостабильную ДНК-полимеразу, соль калия, пеногаситель и комбинацию дГТФ и 7-дезаза-дГТФ. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложена скомпонованная композиция для ПЦР, содержащая термостабильную ДНК-полимеразу, соль калия, пеногаситель и комбинацию дАТФ и 7-дезаза-дАТФ. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложена скомпонованная композиция для ПЦР, содержащая термостабильную ДНК-полимеразу, соль магния, пеногаситель и комбинацию дГТФ и 7-дезаза-дГТФ. В одном варианте реализации настоящего изобретения предложена скомпонованная композиция для ПЦР, содержащая термостабильную ДНК-полимеразу, соль магния, пеногаситель и комбинацию дАТФ и 7-дезаза-дАТФ. В некоторых вариантах реализации пеногаситель представляет собой пеногаситель на основе силикона. В одном варианте реализации пеногаситель на основе силикона выбирают из XIAMETER AFE-1010, AFE-1430, AFE-1510, AFE-1520, AFE-2210, пеногасителя Antifoam А, пеногасителя Antifoam В, пеногасителя Antifoam С, пеногасителя Antifoam Н-10, пеногасителя Antifoam SE-15, пеногасителя Antifoam SE-35, пеногасителя Antifoam SO-25, пеногасителя Antifoam Y-30 и пеногасителя Antifoam 289. В других вариантах реализации пеногаситель представляет собой пеногаситель, не содержащий силикона. В одном варианте реализации пеногаситель, не содержащий силикона, выбирают из органических сульфонатов, полиэфиров, органических фосфатов, ацетиленовых гликолей, фторуглеводородов, полиалкенполиаминов и полиалкилениминовых соединений, в том числе, без ограничения, пеногасителя 204 и пеногасителя О-30.
[0053] Предложенные композиции также могут содержать один или более блокаторов ингибиторов ПЦР. Такие блокаторы ингибиторов ПЦР можно добавлять к композициям или реакционным смесям, описанным в настоящем документе, с целью противодействия ингибированию ПЦР-реакций различными соединениями, часто встречающимися в биологических образцах, используемых для получения, выделения или очистки нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации блокатор(ы) ингибиторов ПЦР может количественно снижать ингибирование ПЦР ингибитором или ингибиторами ПЦР с некоторого процентного значения, превышающего нуль, до 100% по сравнению с уровнем ингибирования, наблюдаемым в отсутствие таких блокаторов ингибиторов ПЦР. Например, ингибирование можно снизить по меньшей мере на приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 50%, приблизительно 75%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или приблизительно 100% или любое процентное значение между этими величинами.
[0054] В некоторых вариантах реализации блокатор ингибитора ПЦР, описанный в настоящем документе, представляет собой белок. В некоторых вариантах реализации такие белки могут включать альбумины, желатины и ДНК-связывающие белки или их пептидные или полипептидные варианты, фрагменты или производные, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах реализации другие небелковые блокаторы ингибиторов ПЦР для применения в настоящем изобретении могут включать, например, мезилат дефероксамина. В некоторых вариантах реализации указанные композиции могут содержать комбинацию блокаторов ингибиторов ПЦР и/или белков. Например, в некоторых вариантах реализации композиции включают альбумин, желатин или комбинацию альбумина и желатина. В некоторых вариантах реализации альбумин или желатин можно выбрать из сывороточного альбумина, рыбьего желатина или комбинации сывороточного альбумина и рыбьего желатина. Сывороточный альбумин может представлять собой альбумин любого вида животных, например, бычий сывороточный альбумин (БСА), человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). В некоторых вариантах реализации альбумин получают из организмов других видов животных, хорошо известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации альбумин представляет собой рекомбинантный альбумин, например, рекомбинантный БСА (rBSA). Желатин может быть получен из организма любого вида животных, например, представлять собой рыбий желатин, желатин крупного рогатого скота. В некоторых вариантах реализации желатин получают из других видов животных, хорошо известных специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах реализации желатин представляет собой рекомбинантный желатин, например, рекомбинантный желатин человека. В некоторых вариантах реализации ДНК-связывающие белки могут включать белок 32 гена Т4 (Т4 gp32), но не ограничиваются ими.
[0055] В композиции согласно настоящему изобретению можно добавлять некоторые блокаторы ингибиторов ПЦР, получая их концентрацию в композиции от приблизительно 0,0001 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, от приблизительно 0,001 мг/мл до приблизительно 8 мг/мл, от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 6 мг/мл, от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 3 мг/мл или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 2 мг/мл, включая любые концентрации или диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов. Некоторые блокаторы ингибиторов ПЦР также можно добавлять в некоторой процентной концентрации от их конечной концентрации в композиции, например, от приблизительно 0,001 до приблизительно 15%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 10%, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% или от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, включая любые концентрации или диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов. В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, содержат блокатор ингибитора ПЦР, например, альбумин, в такой концентрации, что его концентрация в скомпонованной смеси для ПЦР составляет от приблизительно 0,001 мг/мл до приблизительно 10,0 мг/мл, 0,005 мг/мл до приблизительно 5,0 мг/мл, от приблизительно 0,01 до приблизительно 4,0 мг/мл, от приблизительно 0,05 до приблизительно 3,0 мг/мл или от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 2,0 мг/мл, включая любые концентрации или диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов. В еще одном варианте реализации композиции, описанные в настоящем документе, содержат блокатор ингибитора ПЦР, например, желатин, в такой концентрации, что его концентрация в скомпонованной смеси для ПЦР составляет от приблизительно 0,005% (масс/об) до приблизительно 2% (масс/об), от приблизительно 0,01% (масс/об) до приблизительно 1,0% (масс/об), и, конкретнее, от приблизительно 0,05% (масс/об) до приблизительно 0,5% (масс/об), включая любые концентрации или диапазоны концентраций в пределах любого из вышеуказанных диапазонов. В еще одном варианте реализации композиции, описанные в настоящем документе, содержат комбинацию альбумина и желатина в любой из вышеуказанных концентраций. В некоторых предпочтительных вариантах реализации концентрация альбумина составляет от приблизительно 0,05 мг/мл до 5 мг/мл, а концентрация желатина - от приблизительно 0,01% (масс/об) до приблизительно 1%. В некоторых вариантах реализации альбумин представляет собой бычий сывороточный альбумин (БСА), а желатин представляет собой рыбий желатин и/или желатин крупного рогатого скота.
[0056] В некоторых вариантах реализации композиция может содержать один, два, три, четыре, пять или более различных белков и/или агентов-блокаторов ингибиторов ПЦР. Например, в некоторых вариантах реализации композиция включает альбумин, рыбий желатин и желатин крупного рогатого скота. В некоторых вариантах реализации концентрация каждого белка и/или агента-блокатора ингибитора ПЦР является одинаковой. В некоторых вариантах реализации концентрация каждого белка и/или агента-блокатора ингибитора ПЦР различается. В некоторых вариантах реализации в композиции или реакционные смеси добавляют один или более блокаторов ингибиторов ПЦР с целью противодействия ингибированию ПЦР различными ингибиторами, часто встречающимися в биологических образцах. Такие ингибиторы включают, например, гепарин (кровь); гематин (кровь); ЭДТА (кровь); цитрат (кровь); иммуноглобин G (кровь, сыворотка); гуминовую кислоту (почва, фекалии); лактоферрин (молоко, слюна, другие секреторные жидкости); мочевину (моча); растительные полисахариды (растения); меланин (кожа, волосы); миоглобин (ткань); и краситель индиго (текстильные изделия). Добавление блокаторов ингибиторов ПЦР, как по отдельности, так и в комбинации, может повысить устойчивость к таким примесям ингибиторов ПЦР. Таким образом, композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать агенты, действующие по отдельности или в комбинации, повышая устойчивость к различным ингибиторам ПЦР, включая, например, гуминовую кислоту, гематин и гепарин. В некоторых вариантах реализации каждый белок или агент-блокатор ингибитора ПЦР в композиции или реакционной смеси может блокировать свой ингибитор или группу ингибиторов по сравнению с другим агентом или белком-блокатором ингибитора ПЦР в композиции или реакционной смеси. В некоторых вариантах реализации различные агенты или белки-блокаторы ингибиторов ПЦР в композиции или реакционной смеси могут блокировать один и тот же ингибитор или группу ингибиторов. В некоторых вариантах реализации различные агенты или белки-блокаторы ингибиторов ПЦР в композиции или реакционной смеси могут блокировать перекрывающееся количество ингибиторов в группе ингибиторов. Например, в некоторых вариантах реализации желатин эффективно ослабляет ингибирование ПЦР по меньшей мере гуминовой кислотой и гепарином, а альбумин эффективно ослабляет ингибирование ПЦР по меньшей мере гуминовой кислотой и гематином.
[0057] В соответствии с настоящим изобретением, композиции, предложенные в настоящем документе, могут содержать один или более праймеров, облегчающих синтез молекулы ДНК (например, одноцепочечной молекулы кДНК или двуцепочечной молекулы кДНК), полностью или частично комплементарной матричной нуклеиновой кислоте (РНК или ДНК). Кроме того, эти праймеры можно применять для амплификации молекул нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением. Олигонуклеотидные праймеры могут представлять собой любой олигонуклеотид длиной два или более (например, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20, 25 и т.д.) нуклеотидов. Такие праймеры включают праймеры, специфические по отношению к мишени (которые предпочтительно представляют собой ген-специфические праймеры), олиго(dT) праймеры, случайные праймеры или произвольные праймеры, но не ограничиваются ими. Дополнительные праймеры, которые можно применять для амплификации молекул ДНК в соответствии с описанными в настоящем документе способами, очевидны для специалиста в данной области техники. Следует понимать, что в композициях, способах и наборах согласно настоящему изобретению, в том числе не описанных в настоящем документе явным образом, можно применять огромное количество праймеров, не отступая от сущности изобретения или предпочтительных вариантов его реализации.
[0079] В некоторых вариантах реализации конечная концентрация праймеров может находиться в диапазоне от приблизительно 25 нМ до приблизительно 2000 нМ, например, от приблизительно 50 нМ до приблизительно 1700 нМ, от приблизительно 75 нМ до приблизительно 1500 нМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1200 нМ, от приблизительно 200 нМ до приблизительно 1000 нМ, или в любом диапазоне между ними. В некоторых типичных вариантах реализации концентрация каждого праймера составляет от приблизительно 400 нМ до приблизительно 900 нМ, включая все количества или интервалы между ними.
[0058] В соответствии с настоящим изобретением, указанные композиции могут дополнительно содержать зонды для обнаружения нуклеиновых кислот-мишеней. В данной области техники известны различные зонды, например, зонды TaqMan™ (см., например, патент США №5538848), различные молекулярные маяки со структурой типа «петля на стебле» (см., например, патенты США №6103476 и 5925517 и статье Tyagi and Kramer, 1996, Nature Biotechnology 14:303-308), бесстебельные или линейные маяки (см., например, WO 99/21881), молекулярные ПНК-маяки PNA Molecular Beacons™ (см., например, патенты США №6355421 и 6593091), линейные ПНК-маяки (см., например, статью Kubista et al., 2001, SPIE 4264:53-58), зонды, не использующие FRET (см., например, патент США №6150097), зонды Sunrise™/Amplifluor™ (патент США №6548250), зонды Scorpion™ со структурой типа «петля на стебле» и дуплексные зонды Scorpion™ (см., например, статью Solinas et al., 2001, Nucleic Acids Research 29:E96 и патент США №6589743), зонды с одноцепочечной петлей (см., например, патент США №6590091), зонды с псевдоузлом (см., например, №6589250), цикликоны (см., например, патент США №6383752), зонд MGB Eclipse™ (Epoch Biosciences), шпилечные зонды (см., например, патент США №6596490), светящиеся зонды на основе пептидных нуклеиновых кислот (ПНК), зонды на основе самособирающихся наночастиц и зонды, модифицированные ферроценом, описанные, например, в патенте США No. 6485901; Mhlanga et al., 2001, Methods 25:463-471; Whitcombe et al., 1999, Nature Biotechnology. 17:804-807; Isacsson et al., 2000, Molecular Cell Probes. 14:321-328; Svanvik et al., 2000, Anal Biochem. 281:26-35; Wolffs et al., 2001, Biotechniques 766:769-771; Tsourkas et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30:4208-4215; Riccelli et al., 2002, Nucleic Acids Res. 30:4088-4093; Zhang et al., 2002 Shanghai. 34:329-332; Maxwell et al., 2002, J. Am. Chem. Soc. 124:9606-9612; Broude et al., 2002, Trends Biotechnol. 20:249-56; Huang et al., 2002, ChemRes. Toxicol. 15:118-126; и Yu et al., 2001,1 Am. Chem. Soc 14:11155-11161. Зонды могут содержать репортерные красители, например, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM) или тетрахлорфлуоресцеин (ТЕТ). Детекторные зонды могут также содержать группы гасителей, например, тетраметилборамин (TAMRA), гасители Black Hole Quencher (Biosearch), Iowa Black(IDT), гаситель QSY (Thermo Fisher Scientific) и сульфонатно/карбоксилатные гасители Dabsyl и Dabcel (Epoch). Зонды могут также содержать два зонда, причем, например, флуорофор находится на одном зонде, а гаситель - на другом, причем совместная гибридизация этих двух зондов на мишени гасит сигнал, или гибридизация на мишени изменяет сигнатуру сигнала посредством изменения флуоресценции.

[0081] Типичные обнаружимые метки включают, например, флуоресцентный краситель или флуорофор (например, химическую группу, которая может возбуждаться светом с излучением флуоресценции или фосфоресценции), «акцепторные красители», способные гасить флуоресцентный сигнал флуоресцентного донорного красителя и т.п. Подходящие обнаружимые метки могут включать, например, флуоресцеины (например, 5-карбокси-2,7-дихлорфлуоресцеин, 5-карбоксифлуоресцеин (5-FAM), 5-НАТ (гидрокситриптамин), 6-НАТ, 6-JOE, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM), FITC); флуорофоры Alexa (например, 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); флуорофоры BODIPY (например, 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650- X, 650/665-Х, 665/676, FL, FL-АТФ, FI-церамид, R6G SE, TMR, конъюгат TMR-X, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE), кумарины (например, 7-амино-4-метилкумарин, АМС, АМСА, AMCA-S, АМСА-Х, ABQ, СРМ, метилкумарин, кумарин-фаллоидин, гидроксикумарин, CMFDA, метоксикумарин), кальцеин, кальцеин AM, кальцеиновый синий, кальциевые красители (например, Calcium Crimson, Calcium Green, Calcium Orange, Calcofluor White), Cascade Blue, Cascade Yellow; красители Су™ (например, 3, 3.18, 3.5, 5, 5.18, 5.5, 7), голубой GFP, цАМФ-чувствительный флуоресцентный индикатор (FiCRhR), флуоресцентные белки (например, зеленый флуоресцентный белок (например, GFP. EGFP), синий флуоресцентный белок (например, BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal), голубой флуоресцентный белок (например, ECFP, Cerulean, CyPet), желтый флуоресцентный белок (например, YFP, Citrine, Venus, YPet), пары донор/акцептор FRET (например, флуоресцеин/тетраметилродамин, IAEDANS/флуоресцеин, EDANS/Dabcyl, флуоресцеин/флуоресцеин, BODIPY FL/BODIPY FL, флуоресцеин/QSY7 и QSY9), LysoTracker и LysoSensor (например, Lysotracker Blue DND-22, LysoTracker Blue-White DPX, LysoTracker Yellow HCK-123, LysoTracker Green DND-26, LysoTracker Red DND-99, LysoSensor Blue DND-167, LysoSensor Green DND-189, LysoSensor Green DND-153, LysoSensor Yellow/Blue DND-160, LysoSensor Yellow/Blue-декстран с молекулярной массой 10000 Да), Oregon Green (например, 488, 488-Х, 500, 514); родамины (например, 110, 123, В, В 200, ВВ, BG, В-экстра, 5-карбокситетраметилродамин (5-TAMRA), 5 GLD, 6-карбоксиродамин 6G, лиссамин, лиссамин-родамин В, фаллицидин, фаллоидин, Red, Rhod-2, 5-ROX (карбокси-Х-родамин), сульфородамин В и С, сульфородамин G-экстра, тетраметилродамин (TRITC), WT), Texas Red, Texas Red-X, VIC и другие метки, описанные, например, в публикации US №2009/0197254), в числе прочих, известных специалистам в данной области техники.

[0059] В некоторых вариантах реализации зонды сконструированы в соответствии со способами и принципами, описанными, например, в патенте США №6727356 (описание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки). Некоторые зонды могут быть основаны на последовательности, например, 5'-нуклеазные зонды, а некоторые, например, SYBR Green, могут быть неспецифическими по отношению к последовательности ДНК-связывающими красителями. В некоторых предпочтительных вариантах реализации зонд для обнаружения представляет собой зонд TaqMan™ (Applied Biosystems, Фостер-Сити, штат Калифорния, США). Следует понимать, что в данной области техники известно большое количество зондов, которые можно применять в композициях, способах и наборах согласно настоящему изобретению, в том числе не описанных в настоящем документе явным образом.
[0060] В некоторых вариантах реализации концентрация зонда в рабочем растворе может составлять от приблизительно 5 нМ до приблизительно 750 нМ, например, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 600 нМ, от приблизительно 25 нМ до приблизительно 500 нМ, от приблизительно 50 нМ до приблизительно 400 нМ, от приблизительно 75 нМ до приблизительно 300 нМ, или любое значение между ними. В некоторых типичных вариантах реализации концентрация каждого зонда составляет от приблизительно 100 нМ до приблизительно 250 нМ, включая все значения или диапазоны между ними.
3
[0061] В соответствии с настоящим изобретением, в композиции, способы и наборы согласно настоящему изобретению можно включить один или более из дополнительных компонентов и/или добавок для оптимизации синтеза нуклеиновых кислот из матричной нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации композиция может содержать дополнительные компоненты и/или добавки, которые способны облегчать или усиливать реакции синтеза нуклеиновых кислот (например, реагенты для облегчения или усиления ПЦР). Компоненты и/или добавки, которые усиливают синтез нуклеиновых кислот, могут являться органическими или неорганическими соединениями. Некоторые компоненты и/или добавки, которые можно применять в композициях, способах и наборах согласно настоящему изобретению, содержат полипептиды, а также неполипептидные компоненты. Такие компоненты и/или добавки могут включать, например, в числе прочего, белки, связывающие одноцепочечную ДНК (SSB), серусодержащие соединения, ацетат-содержащие соединение, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин, формамид, бетаин, тетраметиламмонийхлорид (ТМАС), эктоин, азид натрия, катон, полиолы, NaN, буферы, поверхностно-активные вещества, детергенты (например, твин-20, NP-40, тритон Х-100 и CHAPS), компонент или соединение, используемое для ПЦР с «горячим стартом», пассивный эталонный контроль для минимизации изменчивости между образцами и/или лунками в количественных анализах обнаружения ДНК в реальном времени и/или урацил-ДНК-гликозилазу, но не ограничиваются ими. Композиция может дополнительно содержать загустители, например, фиколл-70, гликоген и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Специалисты в данной области техники смогут установить дополнительные реагенты и/или добавки для применения в соответствии с композициями, способами и наборами согласно настоящему изобретению.
[0062] В некоторых аспектах композиции или наборы, предложенные в настоящем документе, могут содержать глицерин. В некоторых вариантах реализации глицерин присутствует в композиции в концентрации от приблизительно 5 до приблизительно 50% (масс/об) или от приблизительно 10% (масс/об) до приблизительно 30% (масс/об), включая все концентрации или диапазоны концентраций между любыми из вышеперечисленных значений.
3
3
[0063] В некоторых аспектах композиции или наборы, предложенные в настоящем документе, могут содержать NaN. В некоторых вариантах реализации NaN присутствует в композиции в концентрации от приблизительно 0,005% (масс/об) до приблизительно 0,05% (масс/об) или от приблизительно 0,01% (масс/об) до приблизительно 0,1% (масс/об).
[0064] В некоторых аспектах композиции или наборы, предложенные в настоящем документе, могут содержать детергент или комбинацию детергентов. В некоторых вариантах реализации детергент(ы) присутствует(ют) в количестве, эффективно повышающем чувствительности реакции ПЦР. Детергент(ы) может представлять собой анионный детергент, катионный детергент, цвиттерионный детергент и/или неионный детергент.В некоторых вариантах неионный(е) детергент(ы) могут представлять собой, без ограничения, тритон Х-100, Nonidet Р-40 (NP-40), твин-20, твин-80, Brij 30, Brij 35 и/или Brij 58. В некоторых вариантах реализации композиция содержит любой неионный детергент, например, твин-20. В некоторых вариантах реализации композиция содержит неионный детергент, отличающийся от твин-20. В некоторых вариантах реализации композиция не содержит обнаружимых количеств твин-20. В некоторых вариантах реализации предлагаемая в настоящем документе композиция содержит неионный детергент, отличающийся от твин-20, присутствующий в количестве, эффективно повышающем чувствительность реакции ПЦР. В некоторых вариантах реализации композиция содержит тритон Х-100. В некоторых вариантах реализации композиция содержит NP-40. В некоторых вариантах реализации композиция содержит Brij 30, Brij 35 или Brij 58. В некоторых вариантах реализации композиция содержит любую комбинацию вышеупомянутых детергентов. Детергент может присутствовать в композиции при концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,50% (масс/об), от приблизительно 0,005 до приблизительно 0,1% (масс/об) или от приблизительно 0,01% (масс/об) до приблизительно 0,05% (масс/об), включая все концентрации или диапазоны концентраций между любыми из вышеперечисленных значений.
[0065] В некоторых аспектах композиции, реакционные смеси или наборы, представленные в настоящем документе, могут содержать буферный компонент, например, солевой буферный раствор. В некоторых вариантах реализации буферный агент обеспечивает соответствующие значения рН для поддержания стабильности фермента ДНК-полимеразы. Термины «стабильный» и «стабильность» в настоящем документе обычно означают сохранение композицией, например, ферментативной композицией, по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% исходной ферментативной активности (в единицах) после хранения фермента или композиции, содержащей фермент, в течение приблизительно 3 дней при приблизительно комнатной температуре (например, от приблизительно 20°С до приблизительно 25°С), от приблизительно одной до восьми недель при температуре приблизительно 4°С, от приблизительно двух до шести месяцев при температуре приблизительно -20°С и в течение приблизительно шести месяцев или дольше при температуре приблизительно -80°С. Примеры таких буферных агентов могут включать, например, трис, трицин, бис-трицин, HEPES, MOPS, TES, TAPS, PIPES и CAPS. В некоторых вариантах реализации концентрация буфера в композициях и/или реакционных смесях, описанных в настоящем документе, составляет от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ, между приблизительно 5 мМ и приблизительно 250 мМ, между приблизительно 10 мМ и приблизительно 200 мМ, между приблизительно 25 мМ и приблизительно 150 мМ, а также между приблизительно 50 мМ и приблизительно 100 мМ, включая любую концентрацию или диапазон, попадающие в вышеуказанные значения. Следует понимать, что в данной области техники известно большое количество буферов (или буферных солей), в том числе не описанных в настоящем документе явным образом, которые можно применять в соответствии с композициями, способами и наборами согласно настоящему изобретению.
[0066] Примеры солей, подходящих для включения в композиции, предложенные в настоящем изобретении, включают, без ограничения, хлорид калия, ацетат калия, сульфат калия, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, хлорид магния, ацетат магния, сульфат магния, хлорид марганца, ацетат марганца, сульфат марганца, хлорид натрия, ацетат натрия, хлорид лития и ацетат лития. В некоторых вариантах реализации композиция содержит более одного (например, двух, трех, четырех, пяти, шести и т.д.) солевого компонента. Например, описанные в настоящем документе композиции могут содержать две различные соли. В других вариантах реализации композиции содержат три различные соли. В других вариантах реализации композиции содержат четыре различные соли. В одном варианте реализации композиция содержит конкретную соль в концентрации от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 1000 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 500 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 250 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 5 мМ до приблизительно 50 мМ и от приблизительно 2 мМ до приблизительно 10 мМ, включая любую концентрацию или диапазон, попадающие в вышеуказанные диапазона. Без ограничений, в некоторых вариантах реализации, где композиция содержит соль, например, хлорид калия, ацетат калия, сульфат калия, сульфат аммония, хлорид аммония и/или ацетат аммония, композиция содержит соль в такой концентрации, что концентрация соли в скомпонованной реакционной смеси для ПЦР составляет от приблизительно 5 мМ до приблизительно 250 мМ, от 5 мМ до приблизительно 150 мМ, от приблизительно 10 мМ до приблизительно 120 мМ, от приблизительно 20 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мМ до приблизительно 90 мМ или от приблизительно 40 до приблизительно 80 мМ, включая любую концентрацию, попадающую в вышеуказанные диапазоны. Без ограничений, в некоторых вариантах реализации, где композиция содержит соль, например, ацетат магния, сульфат магния, хлорид марганца, ацетат марганца или сульфат марганца, композиция содержит соль в такой концентрации, что концентрация соли в скомпонованной реакционной смеси для ПЦР составляет от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 75 мМ, от приблизительно 1,5 мМ до приблизительно 50 мМ, от приблизительно 2 мМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 3 мМ до приблизительно 15 мМ, от приблизительно 4 мМ до приблизительно 10 мМ или от приблизительно 1 мМ до приблизительно 5 мМ, включая любую концентрацию, попадающую в вышеуказанные диапазоны. Следует понимать, что в данной области техники известны разнообразные соли или растворы солей, в том числе не описанные в настоящем документе явным образом, которые можно применять в соответствии с композициями, способами и комплектами согласно настоящему изобретению.
[0067] В некоторых аспектах композиции или наборы, предложенные в настоящем документе, могут содержать пассивный эталонный контрольный компонент. В некоторых вариантах реализации пассивный эталонный контроль минимизирует изменчивость между образцами и/или лунками в количественных анализах обнаружения нуклеиновых кислот в реальном времени и/или может содержаться в концентрации, позволяющей использовать его в качестве обнаруживаемого контроля. В одном варианте реализации в качестве пассивного эталонного контроля включают эталонный хромофор, в частности, флуорофор. В одном варианте эталонный хромофор представляет собой флуоресцентный краситель. В некоторых вариантах реализации флуоресцентный краситель представляет собой краситель ROX (Thermo Fisher Scientific). В некоторых вариантах реализации флуоресцентный краситель представляет собой краситель MUSTANG PURPLE (Thermo Fisher Scientific). Пассивный эталон содержаться в композиции в такой концентрации, что его концентрация в скомпонованный смеси для ПЦР составляет от приблизительно 10 до приблизительно 750 нМ или от приблизительно 20 нМ до приблизительно 500 нМ или от приблизительно 50 нМ до приблизительно 200 нМ, включая любую концентрацию, попадающую в вышеуказанные диапазоны.
[0068] В некоторых аспектах в композиции или наборы, предложенные в настоящем документе, можно включать урацил-ДНК-гликозилазу (UNG или UDG). Данный фермент доступен для приобретения в ряде коммерческих источников, например, Thermo Fisher Scientific, Enzymatics, New England Biolabs, Genscript или USB. В некоторых вариантах реализации UNG является термолабильной. В других вариантах реализации UNG является термостабильной. Термолабильные или термостабильные UNG могут содержаться в композиции в такой концентрации, что их концентрация в конечной скомпонованной смеси для ПЦР составляет от приблизительно 0,0001 ед/мкл до приблизительно 50 ед/мкл, от приблизительно 0,0005 ед/мкл до приблизительно 10 ед/мкл, приблизительно 0,001 ед/мкл до 5 ед/мкл, от 0,005 ед/мкл до 1,0 ед/мкл или от 0,01 ед/мкл до приблизительно 0,5 ед/мкл (ед/мкл = единицы на микролитр), включая любую концентрацию или диапазон, попадающие в вышеуказанные диапазоны.
[0069] Нежелательные реакции амплификации, которые могут возникать в ходе ПЦР, обычно начинаются во время компоновки реакционных смесей или в процессе прогревания термоциклера до температуры начальной денатурации. Эти побочные реакции можно минимизировать за счет выполнения амплификации с «горячим стартом». В целом методики «горячего старта» ограничивают доступность основного компонента реакции до достижения повышенной температуры, часто >60°С.
[0070] Композиции, наборы и способы в соответствии с настоящим изобретением могут включать механизмы, компоненты или стадии «горячего старта» в качестве средства для предотвращения, ослабления или устранения неспецифического синтеза нуклеиновых кислот. Существует несколько способов выполнения реакций «горячего старта», включая ручные методики, барьеры, обратимую инактивацию полимеразы и специально разработанные шпилечные праймеры. В некоторых вариантах реализации компоненты или соединения, используемые для реакций «горячего старта», например, в ПЦР, могут представлять собой любые компоненты или соединения, предотвращающие неспецифическую амплификацию ДНК за счет инактивации полимеразной активности при пониженной температуре, например, во время фазы отжига, обеспечивая реактивацию или активацию полимеразной активности при более высокой температуре, например, во время фазы удлинения. Такие примеры компонентов «горячего старта» могут включать, например, антитело, химическую модификацию (например, полимеразы), олигонуклеотид, аптамер, специально разработанный праймер, связывающий белок и/или парафин для секвестрации, но не ограничиваются ими. Парафиновые гранулы для ПЦР с «горячим стартом» доступны для приобретения, например, в виде реакционных пробирок HotStart™ Storage (Thermo Fisher Scientific). Выбор подходящего аптамера для «горячего старта» можно выполнить способом, известным в данной области техники, или можно использовать доступный для приобретения аптамер для «горячего старта». Аналогичным образом, выбор подходящего шпилечного праймера для «горячего старта» можно осуществить способом, известным в данной области техники, или можно использовать доступный для приобретения праймер для «горячего старта». Антитела для ПЦР с «горячим стартом» можно получить или выбрать различными способами, известными в данной области техники. В качестве альтернативы, можно использовать антитело, доступное для приобретения, например, TaqStart Antibody (Clontech), эффективное при применении с любой ДНК-полимеразой, производной от Taq, включая нативные, рекомбинантные и N-концевые делеционные мутанты. В некоторых случаях подходящий праймер для «горячего старта» может представлять собой праймер со специально спроектированной вторичной структурой (например, шпилечный праймер), которая предотвращает отжиг праймера, пока циклическое изменение температуры не приведет к денатурации и разворачиванию структуры. Соответствующую концентрацию соединения или реагента для ПЦР с «горячим стартом» в скомпонованных реакционных смесях можно определить с помощью ряда способов, известных в данной области, или, в случае коммерческого продукта, ее указывает производитель. Некоторые из механизмов, компонентов или этапов «горячего старта» подробнее описаны ниже.
[0071] В целом, ручные способы выполнения «горячего старта» обычно (хотя и не всегда) требуют от исследователя изъять критический компонент, обычно магний или полимеразу, до прогрева реакционной смеси. Затем изъятый компонент добавляют для инициирования реакции. При втором способе используют физический барьер (например, воскоподобные вещества) для отделения критического компонента от матрицы и праймеров. В патенте США №5565339 описано использование барьера из воскоподобных веществ для отделения различных реагентов ПЦР друг от друга в пробирке. В патенте США №5113924 описано использование парафиновых гранул для секвестрации ДНК-полимеразы.
[0072] Альтернативным способом амплификации с «горячим стартом» является обратимая инактивация полимеразы. Полимеразу подвергают взаимодействию с антителом или олигонуклеотидным аптамером, который связывается с нуклеотид-связывающим доменом полимеразы, инактивируя полимеразу. Например, в реакционную смесь вводят моноклональное антитело к Taq-полимеразе, например, антитело против ДНК-полимеразы Taq, доступное в Sigma. При нагревании указанное соединение диссоциирует с полимеразы, за счет чего активность фермента восстанавливается. В другом примере, в патенте США №5677152 описан способ, при котором ДНК-полимеразу химически модифицируют, что обеспечивает ее активацию только при повышенных температурах.
[0073] Другим подходом для достижения амплификации с «горячим стартом» является разработка праймеров, которые должны подвергаться самоотжигу с образованием специфических шпилечных структур. Шпилечные праймеры не должны отжигаться с нуклеиновой кислотой-мишенью, находясь в шпилечной конформации. Шпилечные праймеры должны сохранять шпилечную конформацию до нагревания до температуры денатурации. В то же время, если шпилечная структура включает удлинение одной цепи, то сама структура шпильки напоминает праймер, отожженный с матрицей, и может привести к удлинению цепи.
[0074] Кроме того, специалистам в данной области техники хорошо известны различные другие компоненты или механизмы «горячего старта», в дополнение к описанным выше, и они смогут выбрать такие компоненты на основе их способности работать в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах реализации предложены композиции, реакционные смеси, наборы и способы, которые содержат по меньшей мере два разных механизма, компонента или стадии «горячего старта», применяемые для ингибирования или практического ингибирования активности полимеразы нуклеиновой кислоты при первом условии (например, при более низкой температуре) и обеспечивают активацию полимеразы при втором условии (например, при более высокой температуре). Такие механизмы «горячего старта» включают вышеперечисленные механизмы, включая антитела или комбинации антител, блокирующие активность ДНК-полимеразы при пониженных температурах, олигонуклеотиды, блокирующие активность ДНК-полимеразы при пониженных температурах, обратимые химические модификации ДНК-полимеразы, диссоциирующие при повышенных температурах, аминокислотные модификации ДНК-полимеразы, обеспечивающие пониженную активность при низких температурах, гибридные белки, содержащие гиперстабильные ДНК-связывающие домены и топоизомеразу, температурно-зависимые лиганды, ингибирующие ДНК-полимеразу, белки, связывающие одноцепочечные структуры, которые выполняют секвестрацию праймеров при пониженных температурах, модифицированные праймеры или модифицированные дНТФ, но не ограничиваются ими.
[0075] В некоторых вариантах реализации композиции содержат термостабильную ДНК-полимеразу, соль, пеногаситель, дНТФ, комбинацию блокаторов ингибиторов ПЦР, буфер, компонент «горячего старта», глицерин, неионный детергент и пассивный эталонный краситель. В других вариантах реализации композиция содержит термостабильную ДНК-полимеразу, соль калия, соль магния, пеногаситель на основе силикона, дНТФ, включая комбинацию производных дНТФ/дНТФ, альбумин, рыбий желатин, буфер, компонент «горячего старта», глицерин, неионный детергент, отличающийся от твин-20, и пассивный контрольный краситель. Компоненты можно заменять или модифицировать на усмотрение специалистов в данной области техники. Следует понимать, что в данной области техники известно большое количество дополнительных компонентов, которые можно применять в композициях, способах и наборах согласно настоящему изобретению, в том числе не описанных в настоящем документе явным образом. Специалисты в данной области техники также должны знать способы, необходимые для определения конкретных условий или концентраций для оптимального использования каждого компонента в соответствии с настоящим изобретением.
[0076] В одном аспекте можно предложить композиции в виде концентрированного исходного раствора или смеси. Термин «концентрированный исходный раствор» в настоящем документе означает концентрацию, требующую дальнейшего разбавления для достижения оптимальной концентрации для использования в растворе для выполнения определенной функции (например, ПЦР-амплификации). Например, композиции могут представлять собой исходные растворы, содержащие приблизительно 2Х, приблизительно 3Х, приблизительно 4Х, приблизительно 5Х, приблизительно 6Х, приблизительно 10Х концентрацию и т.д., включая любые значения между любыми из вышеперечисленных значений. В некоторых вариантах реализации композиции могут требовать более чем 2Х, более чем 3Х, более чем 4Х, более чем 5Х, более чем 6Х, более чем 10Х и т.д. разбавления, включая любые значения между любыми из вышеперечисленных значений, которое требуется для получения рабочей или оптимальной концентрации для использования, например, в способах синтеза или амплификации нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации также можно предложить описанные в настоящем документе композиции в рабочей концентрации или в виде «рабочего раствора или смеси». Термин «рабочая концентрация» или «рабочий раствор или смесь» в настоящем документе используется для обозначения раствора или смеси, находящегося в оптимальной или близкой к оптимальной концентрации, используемой для выполнения определенной функции или реакции (например, амплификации или ПЦР). В некоторых вариантах реализации композиция, которая находится в рабочей концентрации, не нуждается в минимальном разбавлении или не нуждается в разбавлении перед использованием. Например, в некоторых вариантах реализации композиции, которые находятся в рабочей концентрации, находятся в приблизительно 1X, приблизительно 1,25Х, приблизительно 1,5Х, приблизительно 1,8Х, приблизительно 2Х или приблизительно 2,2Х концентрации от конечной концентрации в скомпонованной реакционной смеси.
2
[0077] В некоторых вариантах реализации композиции согласно настоящему изобретению можно составить в виде мастер-микса. Мастер-миксы могут повышать эффективность и снижать вероятность ошибок, связанных с компоновкой большого количества реакций, необходимого для высокопроизводительного анализа. В некоторых вариантах реализации мастер-миксы могут содержать комбинацию реагентов, общих для всех реакций. Например, в некоторых вариантах реализации мастер-микс может содержать буфер, соль, например, MgCl, дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ), термостабильную ДНК-полимеразу, детергент и блокатор ингибитора ПЦР. Для использования в определенных анализах каждая реакционная смесь должна содержать аликвоту общего мастер-микса, специфическую матрицу нуклеиновой кислоты-мишени и по меньшей мере один праймер. В некоторых вариантах реализации мастер-миксы можно изготавливать и распространять в виде концентрированного исходного раствора или смеси. Затем мастер-микс можно разбавлять при компоновке готовых реакционных смесей. В других вариантах реализации мастер-микс можно изготавливать и распространять в виде рабочего раствора или смеси.

[0078] В некоторых аспектах настоящее изобретение также относится к композициям, которые представляют собой реакционные смеси. Термин «реакционная смесь» в настоящем документе относится к смеси двух или более веществ, которые совместно могут вызывать реакцию; или случаям, когда смесь двух или более веществ может вызывать химическую трансформацию или изменение. В некоторых вариантах реализации реакционные смеси содержат: (а) по меньшей мере одну полимеразу; (b) по меньшей мере один блокатор ингибитора ПЦР; (с) по меньшей мере один детергент; (d) по меньшей мере один пеногаситель; (е) по меньшей мере одну соль; (f) буфер; (g) по меньшей мере один дНТФ и/или производное дНТФ; (h) по меньшей мере один праймер; (i) и образец нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации реакционная смесь может дополнительно содержать меченый зонд (например, зонд TaqMan™). В некоторых вариантах реализации полимераза реакционной смеси представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу. В некоторых вариантах реализации термостабильная ДНК-полимераза реакционной смеси представляет собой ДНК-полимеразу Taq. В некоторых вариантах реализации блокатор ингибитора ПЦР реакционной смеси представляет собой белок. В некоторых вариантах реализации белок-блокатор ингибитора ПЦР реакционной смеси выбирают из альбумина, желатина или комбинации альбумина и желатина. В некоторых вариантах реализации детергент реакционной смеси является неионным детергентом. В некоторых вариантах реализации неионный детергент реакционной смеси представляет собой неионный детергент, отличающийся от твин-20. В некоторых вариантах реализации пеногаситель реакционной смеси представляет собой агент на основе силикона. В некоторых вариантах реализации реакционной смеси агент на основе силикона выбирают из XIAMETER AFE-1010, AFE-1430, AFE-1510, AFE-1520, AFE-2210, пеногасителя Antifoam А, пеногасителя Antifoam В, пеногасителя Antifoam С, пеногасителя Antifoam Н-10, пеногасителя Antifoam SE-15, пеногасителя Antifoam SE-35, пеногасителя Antifoam SO-25, пеногасителя Antifoam Y-30 и пеногасителя Antifoam 289. В некоторых других вариантах реализации пеногаситель реакционной смеси представляет собой агент, не содержащий силикона. В некоторых вариантах реализации реакционной смеси агент, не содержащий силикона, выбирают из органических сульфонатов, полиэфиров, органических фосфатов, ацетиленовых гликолей, фторуглеводородов, полиалкеновых полиаминов и полиалкилениминовых соединений, включая, без ограничения, пеногаситель 204 и пеногаситель О-30.
[0079] В некоторых вариантах реализации дНТФ реакционной смеси выбирают из дГТФ, дЦТФ, дАТФ и дТТФ. В некоторых вариантах реализации производное дНТФ реакционной смеси выбирают из 7-дезаза-дГТФ (например, 7-дезаза-2-дезокси-дГТФ), 7-дезаза-дАТФ, альфа-тио-дАТФ, альфа-тио-дТТФ, альфа-тио-дГТФ и альфа-тио-дЦТФ. В некоторых вариантах реализации реакционная смесь содержит смесь дНТФ/производных дНТФ, содержащую некоторую комбинацию вышеупомянутых дНТФ и производных дНТФ. В некоторых вариантах реализации матричная нуклеиновая кислота реакционной смеси представляет собой ДНК. В некоторых вариантах ДНК в реакционной смеси представляет собой геномную ДНК (гДНК) или комплементарную ДНК (кДНК).
[0080] В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, можно упаковать в подходящий контейнер, способный удерживать композицию и не взаимодействующий с компонентами композиции в значительной степени. Контейнер можно сконструировать таким образом, чтобы обеспечить возможность свободного получения разовой дозы физическим лицом или инструментом для работы с жидкостями. Контейнеры композиции можно дополнительно упаковать в многокомпонентные блоки. В некоторых вариантах реализации многокомпонентные блоки могут дополнительно содержать дополнительные контейнеры, содержащие добавки или другие реагенты, которые следует добавлять в композицию перед использованием в реакционной смеси, например, при ПЦР.
[0081] В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, могут находиться в жидкой форме, например, в гидратированном растворе. В других вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, могут находиться в форме геля. Термин «гель» в настоящем документе представляет собой композицию, которая не является твердой или замороженной при -20°С. В других вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, могут находиться в обезвоженной или высушенной форме, например, в виде лиофилизированной композиции.
[0082] Кроме того, в настоящем документе описаны наборы, содержащие композиции или упакованные контейнеры, содержащие композиции. В некоторых вариантах реализации композиции можно собрать в наборы для применения в реакциях синтеза или амплификации нуклеиновых кислот. Наборы могут дополнительно содержать дополнительные реагенты, используемые в одном или нескольких анализах, применяемых для синтеза, обнаружения или количественного определения нуклеиновых кислот. В одном варианте реализации композиция может присутствовать в наборе для применения при амплификации молекулы нуклеиновой кислоты, например, ПЦР.
[0083] В некоторых вариантах реализации наборы содержат носитель, например, коробку, картонную упаковку, тубу и т.п., внутри которого плотно размещен контейнер, например, флакон, пробирка, ампула, планшет, бутыль и т.п. Если набор содержит более одного фермента (например, ДНК-полимеразу и обратную транскриптазу или ДНК-полимеразу и UNG), ферменты могут находиться в одном контейнере в виде смесей двух или более ферментов (например, 2, 3, 4, 5 и т.д.) или в отдельных контейнерах. Наборы согласно настоящему изобретению могут также содержать (в тех же или отдельных контейнерах) раствор соли, пеногаситель, подходящий буфер, смесь дНТФ и/или производных дНТФ, зонд и/или праймер. В некоторых вариантах реализации ДНК-полимеразу, соль, пеногаситель, смеси дНТФ и/или производных дНТФ и буфер объединяют в одной пробирке или контейнере.
[0084] В еще одном аспекте наборы могут содержать композиции мастер-микса для применения в реакциях синтеза или амплификации нуклеиновых кислот. Такие композиции можно составить в виде концентрированного исходного раствора (например, 2Х, 3Х, 4Х, 5Х, 6Х и т.д.). В некоторых вариантах реализации композиции можно составить в виде концентрированного исходного раствора в одной пробирке или контейнере, содержащей ДНК-полимеразу, соль, пеногаситель и дНТФ. В некоторых вариантах реализации такие композиции в виде концентрированного исходного раствора могут дополнительно содержать комбинацию блокаторов ингибиторов ПЦР, неионного детергента, отличающегося от твин-20, компонента «горячего старта» и/или пассивного эталонного красителя в буферном растворе. В некоторых дополнительных вариантах реализации такие буферные растворы могут содержать глицерин, ДМСО и/или вторую соль.
[0085] В одном варианте реализации набор может дополнительно содержать, помимо композиции или мастер-микса, по меньшей мере одну пару праймеров, специфичных по отношению к ПЦР-амплификации нуклеиновой кислоты, и/или по меньшей мере один зонд, специфичный по отношению к амплифицированной нуклеиновой кислоте. Например, зонд может представлять собой зонд TaqMan™, зонд HydrolEasy™, зонд, связывающийся с малой бороздкой (MGB), зонд с закрытой нуклеиновой кислотой (LNA), зонд SYBR Green или SYBR GreenER™ или зонд для технологии циклического использования зонда (СРТ).
[0086] В другом варианте реализации набор может дополнительно содержать контрольный образец нуклеиновой кислоты и по меньшей мере одну пару праймеров, специфичных по отношению к ПЦР-амплификации нуклеиновой кислоты-мишени в образце контрольной нуклеиновой кислоты, и/или по меньшей мере один зонд, специфичный по отношению к амплифицированной нуклеиновой кислоте-мишени в контрольном образце нуклеиновой кислоты. Набор также может содержать зонд для обнаружения амплификации.
[0087] Компоненты набора, отличающиеся от композиции, при необходимости могут быть представлены в отдельных контейнерах или в одном контейнере. В некоторых вариантах реализации могут быть представлены инструкции, руководства и/или протоколы для применения набора. Специалист в данной области техники должен понимать, что при синтезе нуклеиновых кислот-мишеней с использованием описанных композиций и реакционных смесей можно применять различные анализы, которые рассматриваются в настоящем документе.
[0088] Кроме того, в настоящем документе описаны способы применения описанных композиций и наборов. Композиции, реакционные смеси и наборы, предложенные в настоящем документе, можно применять во множестве анализов на основе синтеза нуклеиновых кислот для обнаружения, количественной оценки и/или исследования характеристик нуклеиновой кислоты-мишени или нуклеиновых кислот-мишеней. В некоторых вариантах реализации такие анализы включают смешивание любой из композиций, предложенных в настоящем документе, с образцом нуклеиновой кислоты и одним или более праймерами и выполнение указанного анализа. В некоторых вариантах реализации указанные способы включают амплификацию нуклеиновой кислоты, например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
[0089] В некоторых аспектах в способах, предлагаемых в настоящем документе, также можно применять гидролизуемый зонд для обнаружения нуклеиновых кислот. Гидролизуемые зонды используют 5'-экзонуклеазную активность некоторых полимераз. Во время фазы удлинения при ПЦР полимераза, например, Taq-полимераза, использует «верхний» праймер в качестве сайта связывания и затем выполняет удлинение ДНК. Затем гидролизуемый зонд расщепляется во время полимеразного удлинения по 5'-концу за счет 5'-экзонуклеазной активности полимеразы.
[0090] Термины «выше» и «ниже» используются в настоящем документе по отношению к синтезу образующейся цепи с использованием праймера, специфичного по отношению к мишени. Так, например, специфичный по отношению к мишени зонд гибридизуется с областью нуклеиновой кислоты-мишени, которая находится «ниже» области нуклеиновой кислоты-мишени, с которой гибридизуется праймер, и расположена в 3'-направлении от праймера и на пути полимеразы, выполняющей удлинение ДНК от праймера в направлении от 5' к 3'.
[0091] Анализ TaqMan (см., например, патент США 5210015, полностью включенный в настоящий документ посредством ссылки) является примером анализа на основе гидролизуемого зонда. В анализе TaqMan гидролизуемые зонды обычно метят репортером по 5'-концу и гасителем по 3'-концу. При присоединении репортера и гасителя к одному и тому же зонду они вынужденно находятся в непосредственной близости друг от друга. Эта близость эффективно гасит сигнал репортера даже при гибридизации зонда с последовательностью-мишенью. Гидролизуемые зонды расщепляются во время продвижения полимеразы по 5'-концу за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq. При этом репортерный флуорофор отделяется от зонда и, следовательно, больше не находится в непосредственной близости от гасителя. Это приводит к постоянному увеличению репортерного сигнала с каждой фазой удлинения, поскольку реакция ПЦР циклически продолжается. Для достижения максимального сигнала с каждым циклом Tm разрабатываемых гидролизуемых зондов часто приблизительно на 10°С превышает соответствующую температуру для праймеров в реакционной смеси. Использование реакции в реальном времени с гидролизуемым зондом также описано в патентах США №5538848, 6653473, 7485442 и 7205105, описание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылок. В некоторых вариантах реализации способы, описанные в настоящем документе, включают применение анализа TaqMan для анализа и/или обнаружения нуклеиновой кислоты. Например, композиции согласно настоящему изобретению можно применять в способах и/или анализах с использованием зондов TaqMan. Такие анализы могут включать анализы экспрессии генов (например, анализы экспрессии генов TaqMan™), анализы вариации количества копий (например, анализы количества копий TaqMan™), анализы генотипирования (например, анализы генотипирования метаболизма лекарственных средств TaqMan™ или анализы генотипирования ОНП TaqMan™), анализы миРНК (например, анализы микроРНК TaqMan™) или анализы количественного анализа РНК (например, двухэтапные анализы на основе полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) и анализы ч использованием чипов низкой плотности TaqMan™, но не ограничиваются ими.
[0092] Термин «реакционный сосуд» в настоящем документе обычно относится к любому контейнеру, в котором может протекать реакция в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах реализации реакционный сосуд может представлять собой микропробирку, например, реакционную пробирку объемом 0,2 мл или 0,5 мл, например, пробирку MicroAmp™ Optical (Applied Biosystems™, Thermo Fisher Scientific) или микроцентрифужную пробирку или другие контейнеры подобного типа, обычно используемые в молекулярно-биологических лабораториях, но не ограничивается ими. В некоторых вариантах реализации реакционный сосуд может представлять собой лунку в титрационном микропланшете (например, 96-луночном планшете, 384-луночном планшете), например, планшете TaqMan™ Array (Applied Biosystems™, Thermo Fisher Scientific), область на предметном стекле, лунку в карте-чипе или планшете Applied Biosystems™ TaqMan™ (Thermo Fisher Scientific) или сквозное отверстие планшета Applied Biosystems™ TaqMan™ OpenArray™ (Thermo Fisher Scientific). Например, множество реакционных сосудов могут находиться на одной и той же подложке. В некоторых вариантах реализации реакционные сосуды могут находиться в устройствах типа "лаборатория на чипе", доступных, например, в Caliper and Fluidigm. В некоторых вариантах реализации можно применять различные микрожидкостные подходы. Следует понимать, что в данной области техники доступны различные реакционные сосуды, которые подпадают под действие настоящего изобретения.
[0093] Термины «ампликон» и «продукт амплификации» или «амплифицированный продукт» в настоящем документе обычно относятся к продукту реакции амплификации. Ампликон может быть двуцепочечным или одноцепочечным и может содержать разделенные цепи компонентов, полученные денатурацией двуцепочечного продукта амплификации. В некоторых вариантах реализации ампликон одного цикла амплификации может использоваться в качестве матрицы в следующем цикле амплификации.
[0094] Термин «амплификация» в настоящем документе относится к любым средствам, с помощью которых по меньшей мере часть полинуклеотида-мишени, суррогатного полинуклеотида-мишени или их комбинации воспроизводится, как правило, в зависимости от матрицы, включая, без ограничения, широкий спектр способов как линейной, так и экспоненциальной амплификации нуклеотидных последовательностей. Для амплификации полинуклеотида-мишени можно использовать любой из нескольких способов. Для множественного воспроизведения копий нуклеотидной последовательности-мишени можно использовать любые средства in vitro. К ним относятся способы линейной, логарифмической или любой другой амплификации. Типичные способы включают, в числе прочего, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), частичное разрушение молекул праймера (см., например, публикацию заявки РСТ WO 2006/087574), лигазную цепную реакцию (см., например, Wu, et al. Genomics 4:560-569 (1990) и Barany, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193 (1991), системы на основе РНК-репликазы Qβ (см., например, WO 1994/016108), системы на основе транскрипции РНК (например, TAS, 3SR), амплификация по типу катящегося кольца (RCA) (см., например, патент США №5854033; Lizardi, et al. Nat. Genet. 19:225-232 (1998); и , et al. Nucleic Acid Res. 26: 5073-5078 (1998)) и амплификацию с вытеснением цепи (SDA) (Little, et al. Clin. Chem. 45:777-784 (1999)). Для применения при амплификации нуклеиновых кислот-мишеней подходящими являются многие системы, которые рассматриваются в настоящем документе, как должен понимать специалист в данной области техники. В некоторых вариантах реализации способов согласно настоящему изобретению реакцию амплификации нуклеиновой кислоты можно выполнить посредством ПЦР. В некоторых вариантах реализации ПЦР может являться количественной ПЦР (qPCR). В некоторых вариантах реализации qPCR можно выполнить посредством ПЦР в реальном времени. В других вариантах реализации ПЦР может представлять собой ПЦР с анализом по конечной точке. В других вариантах реализации ПЦР может являться цифровой ПЦР. В других вариантах реализации ПЦР может включать термоциклирование. В некоторых вариантах реализации термоциклирование можно оптимизировать для быстрого термоциклирования.
[0095] В некоторых вариантах реализации способы амплификации нуклеиновых кислот с помощью ПЦР включают добавление композиции, предложенной в настоящем документе, содержащей термостабильную ДНК-полимеразу, соль, пеногаситель и дНТФ и/или производные дНТФ, в реакционный сосуд; добавление образца нуклеиновой кислоты и праймера в реакционный сосуд с образованием реакционной смеси; и выполнение ПЦР на образце нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации ПЦР продолжается до 72 часов (например, до 4 часов, 8 часов, 12 часов, 24 часов, 36 часов, 48 часов, 60 часов или 72 часов) после добавления композиции, образца нуклеиновой кислоты и праймера в реакционный сосуд.
[0096] В некоторых вариантах реализации способы амплификации нуклеиновой кислоты-мишени могут представлять собой мультиплексную ПЦР-амплификацию, при которой происходит одновременная амплификация множественных мишеней. Количество амплифицируемых мишеней может составлять до 2 мишеней, 5 мишеней, 10 мишеней, 25 мишеней, 50 мишеней, 100 мишеней, 1000 мишеней, 5000 мишеней и т.д., включая все численные значения между ними. В некоторых вариантах реализации одна из множественных мишеней является эндогенным или экзогенным внутренним положительным контролем для амплификации. В некоторых вариантах реализации способы обнаружения нуклеиновой кислоты-мишени могут представлять собой мультиплексную ПЦР и/или анализы обнаружения, при которых происходит одновременное обнаружение множественных мишеней. В некоторых вариантах реализации количество амплифицируемых и/или обнаруживаемых мишеней может составлять до 25 мишеней, 10 мишеней, 8 мишеней, 6 мишеней, 5 мишеней, 4 мишени, 3 мишени или 2 мишени. В одном варианте реализации одна из множественных мишеней является эндогенным или экзогенным внутренним положительным контролем для амплификации и/или обнаружения. В некоторых вариантах реализации происходит одновременная амплификация и обнаружение множества мишеней. В некоторых вариантах реализации происходит одновременная амплификация и обнаружение множества мишеней в одном и том же реакционном сосуде. В некоторых вариантах реализации для мультиплексной ПЦР можно комбинировать различные варианты репортерных красителей для зондов TaqMan™ и пассивных красителей. Например, зонды TaqMan™ с репортерными красителями FAM™, VIC™ и ABY™ в комбинации с композицией для ПЦР, содержащей пассивный эталонный краситель ROX, можно применять для 3-локусной ПЦР-амплификации и анализа обнаружения. В качестве еще одного примера, можно использовать зонды TaqMan™ с репортерными красителями FAM™, VIC™, ABY™ и JUN™ в комбинации с композицией для ПЦР, содержащей пассивный эталонный краситель MUSTANG PURPLE™, для 4-локусной ПЦР-амплификации и анализа обнаружения. В некоторых вариантах реализации может происходить одновременный синтез нуклеиновой кислоты (например, реакция амплификации нуклеиновых кислот или ПЦР) и обнаружение нуклеиновой кислоты (например, ампликона). Соответственно, в некоторых вариантах реализации синтез нуклеиновой кислоты и определение нуклеиновой кислоты происходят в одном и том же реакционном сосуде.
[0097] В общем случае термоциклирование при ПЦР включает начальную стадию денатурации при высокой температуре с последующей повторяющейся серией температурных циклов, предназначенных для денатурации матрицы, отжига праймера и удлинения отжигаемых праймеров полимеразой. Обычно образцы сначала нагревают в течение приблизительно 2-10 минут при температуре приблизительно 95°С для денатурации двуцепочечной ДНК образца. Затем в начале каждого цикла, образцы денатурируют в течение приблизительно 10-60 секунд, в зависимости от образцов и типа используемого прибора. После денатурации допускают отжиг праймеров с ДНК-мишенью при более низкой температуре, обычно от приблизительно 40°С до приблизительно 60°С в течение приблизительно от 20 до 60 секунд. Удлинение праймеров полимеразой часто выполняют в интервале температур от приблизительно 60°С до приблизительно 72°С. Время, используемое для удлинения, зависит от размера ампликона и типа ферментов, используемых для амплификации, и легко определяется обычным экспериментом. Кроме того, этап отжига можно объединить с этапом удлинения, что приводит к двухэтапному циклированию. Термоциклирование может также включать дополнительные температурные сдвиги при ПЦР-анализе. Количество циклов, используемых в анализе, зависит от многих факторов, включая используемые праймеры, количество присутствующей в образце ДНК и условий термоциклирования. Количество циклов, которое следует использовать в каком-либо анализе, может определить специалист в данной области техники с использованием обычных экспериментов. После завершения термоциклирования можно необязательно добавить окончательный этап удлинения для синтеза всех продуктов амплификации.
[0098] В одном варианте реализации типичные условия термоциклирования для ПЦР-амплификации с использованием композиций и реакционных смесей, описанных в настоящем документе, представляют собой:
Этап UNG (необязательно): 50°С, 2 мин (например, для предотвращения контаминации ампликоном/переносимым материалом от предыдущих ПЦР)
Активация: 95°С, 20 с
Денатурация: 95-97°С/1-3 с
Удлинение: 60-62°С/20 - 30 с (х 40 циклов)
[0099] В одном варианте реализации, где описанную в настоящем документе композиция применяют для платформы TaqMan на основе чипа низкой плотности (TLDA), рекомендуется активация при 92°С в течение 10 минут.
[00100] Предложенные композиции и реакционные смеси также можно применять для реакций амплификации с ограниченным количеством циклов (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14 или 15 циклов амплификации, но не ограничиваясь ими), например, в реакциях предварительной амплификации. В некоторых вариантах реализации выполняют этап предварительной амплификации с использованием предложенных композиций и реакционных смесей (см., например, патент США №9206475, описание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки). В некоторых вариантах реализации предварительную амплификацию выполняют с помощью пары универсальных прямых и обратных праймеров. В некоторых вариантах реализации предварительную амплификацию выполняют в течение менее 20 циклов, например, 2-18 циклов. В некоторых вариантах реализации этап предварительной амплификации укорачивают перед достижением плато реакции амплификации. В некоторых вариантах реализации способы, описанные в настоящем документе, могут включать этап предварительной амплификации, выполняемый до амплификации с использованием композиций и реакционных смесей, предложенных в настоящем документе.
[00101] ПЦР с использованием описанной композиции можно выполнять на «стандартной» ПЦР-аппаратуре, например, в стандартных системах для ПЦР Applied Biosystems™ 7900НТ, 7500 и 7300 или на аппаратуре для «быстрой» ПЦР, например, на системах для «быстрой» ПЦР в реальном времени Applied Biosystems™ StepOne, StepOne Plus, 7500 и 7900HT. В некоторых вариантах реализации ПЦР с использованием описанных композиций включает термоциклирование с использованием такого прибора, как, без ограничения, термоциклер GeneAmp PCR System 9700, 9600, 2700 или 2400, система для ПЦР в реальном времени Applied Biosystems ViiA™ 7, система для ПЦР в реальном времени QuantStudio™ 12К Flex, система для ПЦР в реальном времени QuantVudio™ Dx, система для ПЦР в реальном времени QuantVudio™ 6 Flex, система для ПЦР в реальном времени QuantVudio™ 7 Flex, система для ПЦР в реальном времени QuantVudio™ 3, система для ПЦР в реальном времени QuantVudio™ 5 и т.п. (все указанные приборы производства Thermo Fisher Scientific). Другие примеры спектрофотометрических термоциклеров для применения в этих способах включают Bio-Rad ICycler IQ™, Cepheid SmartCycler™ II, Corbett Research Rotor-Gene 3000, Idaho Technologies RAPID™, MJ Research Chromo 4™, Roche Applied Science LightCycler™, Roche Applied Science LightCycler2.0, Stratagene Мх3000Р™ и Stratagene Mx4000™, но не ограничиваются ими.
[00102] В некоторых аспектах композиции, наборы и способы, предложенные в настоящем документе, обладают преимуществами перед стандартными или традиционными композициями, наборами и способами (например, другими доступными для приобретения мастер-миксами или наборами), применяемыми для синтеза и/или обнаружения нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах реализации такие преимущества включают любые из следующих преимуществ, но не ограничиваются ими:
а) возможность применения для амплификации нуклеиновых кислот (например, qPCR в реальном времени) непосредственно в необработанных образцах (например, возможность амплификации мишени непосредственно из слюны и цельной крови)
б) улучшенную точность результатов анализа вариации количества копий;
с) повышенную устойчивость к различным ингибиторам ПЦР;
e) повышенную специфичность и чувствительность;
f) возможность применения с протоколами быстрого термоциклирования для ускоренного считывания; и/или
g) возможность использования при мультиплексной ПЦР (например, (i) возможность амплификации множества мишеней с использованием одного образца; двух или более мишеней в одном образце или (ii) возможность амплификации множества образцов; двух мишеней в двух различных образцах) в одной реакции практически в одно и то же время.
[00103] В некоторых вариантах реализации точность анализа вариации количества копий при ПЦР улучшается по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 25% при использовании композиций, наборов и способов, предложенных в настоящем документе, по сравнению с анализом вариации количества копий, наблюдаемой при ПЦР с использованием стандартных или традиционных композиций, наборов и способа. В некоторых вариантах реализации чувствительность обнаружения исходного материала при ПЦР увеличивается по меньшей мере в 10 раз, в 50 раз, в 100 раз, в 500 раз или в 1000 раз при использовании композиций, наборов и способов, предложенных в настоящем документе, по сравнению с чувствительностью обнаружения исходного материала, наблюдаемой при ПЦР с использованием стандартных или традиционных композиций, наборов и способа. В некоторых вариантах реализации специфичность и чувствительность при ПЦР обеспечивают по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% точность для генотипирования при использовании композиций, наборов и способов, предложенных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации любое из вышеперечисленных преимуществ (а) - (g) по меньшей мере сопоставимо с возможностями, наблюдаемыми при применении стандартных или традиционных композиций, наборов и способов синтеза и/или обнаружения нуклеиновых кислот.
3
14
32
35
[00104] Термин «нуклеотид» в настоящем документе относится к комбинации "основание-углевод-фосфат". «Нуклеозид» относится к комбинации "основание-углевод". Нуклеотиды являются мономерными единицами нуклеотидной последовательности (например, ДНК и РНК). Термин "нуклеотид" включает моно-, ди- и трифосфатные формы дезоксирибонуклеозидов и рибонуклеозидов и их производные. дНТФ могут являться немечеными или обнаружимо мечеными посредством присоединения способами, известными в данной области техники, радиоактивных изотопов (например, Н, С, Р или S), витаминов (например, биотина), флуоресцентных соединений (например, флуоресцеина, родамина, Texas Red или фикоэритрина), хемилюминесцентных меток, дигоксигенина и т.п. Меченые дНТФ можно получить коммерческим путем, например, в компании Thermo Fisher Scientific или компании Sigma-Aldrich.
[00105] Термины «полинуклеотид» и «олигонуклеотид» в настоящем документе относятся к синтетической или биологически продуцируемой молекуле, содержащей последовательность ковалентно связанных нуклеотидов, которые могут быть соединены фосфодиэфирными связями между 3'-положением пентозы одного нуклеотида и 5'-положением пентозы соседнего нуклеотида. Кроме того, полинуклеотид или олигонуклеотид могут содержать модифицированные или неприродные углеводные остатки (например, арабинозу) и/или модифицированные остатки оснований. Полинуклеотид или олигонуклеотид могут также содержать блокирующие группы, препятствующие взаимодействию молекулы с конкретными белками, ферментами или субстратами.
[00106] Термин «нуклеиновая кислота» в настоящем документе включает соединения, содержащие множество природных нуклеотидов и/или неприродных (или «производных») нуклеотидных единиц. «Нуклеиновая кислота» может дополнительно содержать ненуклеотидные единицы, например, пептиды. Таким образом, термин "нуклеиновая кислота" охватывает такие соединения, как ДНК, РНК, пептидные нуклеиновые кислоты, нуклеиновые кислоты, содержащие фосфотиоаты, нуклеиновые кислоты, содержащие фосфонаты, и т.п. Конкретное предельное количество единиц в нуклеиновой кислоте отсутствует при условии, что нуклеиновая кислота содержит более 2 (в частности, 5, 10, 15, 25, 50, 100 и более) нуклеотидов, производных нуклеотидов или их комбинаций. Нуклеиновые кислоты могут включать как одно-, так и двуцепочечные формы, а также полностью или частично двуцепочечные гибриды (например, РНК-ДНК, РНК-ПНК или ДНК-ПНК).
[00107] Термин «праймер» в настоящем документе может относиться к более чем одному праймеру и относится к олигонуклеотиду, независимо от того, является ли он природным, как в очищенном рестрикционном гидролизате, или получен синтетическим путем, который способен действовать в качестве сайта инициации синтеза вдоль комплементарной цепи в условиях, при которых происходит катализ синтеза продукта удлинения праймера, комплементарного цепи нуклеиновой кислоты. Такие условия включают присутствие четырех различных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и агента, индуцирующего полимеризацию, например, ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы, в подходящем буфере («буфер» включает заместители, которые являются кофакторами или влияют на рН, ионную силу и т.д.) и при подходящей температуре. Праймер предпочтительно является одноцепочечным, что обеспечивает максимальную эффективность при амплификации. Длина праймера обычно составляет 11 оснований или более; конкретнее, длина праймера составляет 17 оснований или более, хотя в зависимости от потребности можно применять более короткие или более длинные праймеры. Как должны принимать во внимание специалисты в данной области техники, олигонуклеотиды можно применять в качестве одного или более праймеров в различных реакциях удлинения, синтеза или амплификации.
[00108] Последовательность, комплементарная нуклеотидной последовательности, в настоящем документе относится к олигонуклеотиду или полинуклеотиду, который выравнивается с указанной нуклеотидной последовательностью нуклеиновой кислоты таким образом, что 5-конец одной последовательности спаривается с 3'-концом другой последовательности, находящейся в "антипараллельной ассоциации". Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут содержать некоторые основания, обычно не встречающиеся в природных нуклеиновых кислотах, и включают, например, инозин и 7-дезазагуанин. Комплементарность не должна быть полной; устойчивые двуцепочечные структуры могут содержать несовпадающие пары оснований или основания, не имеющие пары. Специалисты в области технологии нуклеиновых кислот могут эмпирически определять стабильность двуцепочечной структуры с учетом ряда переменных, включая, например, длину олигонуклеотида, состав оснований и последовательность олигонуклеотида, ионную силу и частоту несовпадения пар оснований.
[00109] Стабильность двуцепочечной нуклеиновой кислоты измеряется температурой плавления («Tm»). Tm конкретной двуцепочечной нуклеиновой кислоты при определенных условиях представляет собой температуру, при которой происходит диссоциация половины пар оснований.
[00110] По отношению к термостабильной ДНК-полимеразе одной единицей активности является количество фермента, которое включает 10 наномолей дНТФ в нерастворимый в кислоте материал (т.е. ДНК или РНК) в течение 30 минут при стандартных условиях синтеза ДНК с использованием праймеров.
[00111] Термин «мишень», «последовательность-мишень», «матрица-мишень» или «нуклеотидная последовательность-мишень» в настоящем документе относится к нуклеотидной последовательности или области нуклеиновой кислоты, подлежащей амплификации и/или обнаружению. Обычно при ПЦР последовательность-мишень находится между двумя последовательностями праймеров, используемыми для амплификации.
[00112] Термин «или их комбинации» в настоящем документе относится ко всем перестановкам и комбинациям перечисленных терминов, предшествующих указанному термину. Например, подразумевается, что фраза «А, В, С или их комбинации» включает по меньшей мере одно из: А, В, С, АВ, АС, ВС или ABC, и, если в определенном контексте важен порядок, также ВА, СА, СВ, АСВ, СВА, ВСА, ВАС или CAB. Продолжая этот пример, можно сказать, что он явным образом включает комбинации, которые содержат повторы одного или нескольких элементов или терминов, например, ВВ, AAA, ААВ, ВВС, АААВСССС, СВВААА, САВАВВ и т.д. Специалист в данной области техники должен понимать, что, как правило, ограничения на количество элементов или терминов в любой комбинации отсутствуют, если иное не очевидно из контекста.
[00113] Типичные образцы нуклеиновых кислот включают ДНК и/или РНК. В одном варианте реализации нуклеиновая кислота представляет собой выделенную и/или очищенную нуклеиновую кислоту. Выделенная или очищенная нуклеиновая кислота практически не содержит других компонентов, например, белков, полисахаридов или других клеточных, бактериальных или вирусных компонентов. В еще одном варианте реализации нуклеиновая кислота не является выделенной или очищенной. В некоторых вариантах реализации образец нуклеиновой кислоты находится в биологическом образце. Например, нуклеиновая кислота может присутствовать в сложной смеси, например, необработанном лизате или экстракте цельных клеток. В еще одном варианте реализации нуклеиновая кислота может находиться in situ и в пределах своего обычного клеточного, бактериального или вирусного окружения.
[00114] Нуклеиновую кислоту-мишень можно получить из любого источника, и она может содержать любое количество различных компонентов композиции. Например, мишень может представлять собой нуклеиновую кислоту (например, ДНК или РНК), матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК), микроРНК (miRNA) или другую зрелую небольшую РНК и может включать аналоги нуклеиновых кислот или другие соединения, имитирующие нуклеиновые кислоты. Мишень может быть метилирована и/или неметилирована. Мишень можно обработать бисульфитом и преобразовать неметилированные остатки цитозина в урацил. Кроме того, следует понимать, что «нуклеиновая кислота-мишень» может относиться к самой нуклеиновой кислоте-мишени, а также к ее суррогатам, например, к продуктам амплификации и нативным последовательностям.
[00115] Образцы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению можно получить из любого количества биологических источников, включая, без ограничения, вирусы, архей, простейших, прокариот и эукариот, например, из биологического образца, полученного из эукариотического организма, наиболее предпочтительно, млекопитающего, например, примата, например, шимпанзе или человека; коровы; собаки; кошки; грызуна, например, морской свинки, крысы, мыши; кролика; или птицы; рептилии; или рыбы. Нуклеиновую кислоту можно получить из клеток, тканей, органов или организмов на разных стадиях развития. Образцы нуклеиновой кислоты также можно получить из раковых клеток и предраковых клеток, полученных от животных, в том числе людей. Нуклеиновую кислоту можно также получить из линий клеточной культуры, включая трансформированные и не трансформированные линии клеточной культуры. Образцы нуклеиновой кислоты можно выделить из различных источников. Они включают, например, одежду, почву, бумагу, металлические поверхности, воздух, воду, части растений, а также кожу, волосы, кровь, сыворотку, фекалии, молоко, слюну, мочу и/или другие секреторные жидкости человека и/или животных, но не ограничиваются ими.
[00116] Следует принимать во внимание, что образцы нуклеиновых кислот и нуклеиновые кислоты-мишени можно выделить из биологических и других образцов с использованием любой из множества процедур, известных в данной области техники, например, набора для выделения ДНК DNA Extract All Reagents Kit (Applied Biosystems™, Thermo Fisher Scientific), системы пробоподготовки MagMax™ Sample Preparation Systems (Thermo Fisher Scientific), набора для пробоподготовки TargetPrep RNA FFPE Sample Preparation Kit (Abbott Laboratories), набора для выделения общих нуклеиновых кислот RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit для набора для выделения РНК FFPE and PureLink™ FFPE RNA Isolation Kit (Ambion™, Thermo Fisher Scientific), станции выделения нуклеиновых кислот ABI Prism 6100 Nucleic Acid PrepStation и автоматизированной рабочей станции для выделения нуклеиновых кислот ABI Prism 6700 Automated Nucleic Acid Workstation (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific) и т.п.
[00117] «Биологический образец» включает срезы тканей, например, биоптаты и образцы, полученные при вскрытии, и замороженные срезы, взятые для гистологических целей. Такие образцы включают кровь и фракции или продукты крови (например, сыворотку, тромбоциты, эритроциты и т.п.), лимфу, костный мозг, мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, амниотическую жидкость, волосы, кожу, культивируемые клетки, например, первичные культуры, экспланты и трансформированные клетки, кал, мочу и т.д. Перед получением нуклеиновой кислоты-мишени биологические образцы могут представлять собой свежую, замороженную или фиксированную формалином или параформалином и включенную в парафин ткань (FFPE).
[00118] Предложенные композиции для ПЦР совместимы со способами выделения неочищенных нуклеиновых кислот и могут быть устойчивы к ингибиторам ПЦР, перенесенным из препарата образца. Композиции для ПЦР совместимы с необработанными клеточными или тканевыми лизатами, например, полученными из, например, цельной крови в жидкой форме, цельной крови, высушенной на бумаге, буккальных соскобов (например, слизистой полости рта), необработанной слюны, мочи, сыворотки, волосяных фолликулов, растительных листьев и FFPE.
[00119] Термин «необработанный образец» в настоящем документе относится к образцу биологического происхождения, предположительно содержащему нуклеиновые кислоты, не подвергавшемуся процедурам выделения или очистки этих нуклеиновых кислот. Например, образец крови или мочи является необработанным образцом. Кроме того, образец крови, нанесенный на бумагу, содержащую лизирующий реагент, например, бумагу FTA (доступную для приобретения в Whatman), также считается необработанным образцом. Буккальный мазок из клеток слизистой щеки является еще одним примером необработанного образца. Необработанные образцы включают кровь, разбавленную кровь, кровь на бумаге, буккальные мазки и буккальные мазки на подложке для хранения образцов, например, бумаге FTA, но не ограничиваются ими. Клетки в необработанном образце можно необязательно лизировать с получением «необработанного лизата». Специалист в данной области техники должен различать огромное количество других необработанных образцов или необработанных лизатов, анализ которых облегчает настоящее изобретение.
[00120] После амплификации или синтеза амплифицированные или синтезированные фрагменты нуклеиновой кислоты можно выделить для дальнейшего использования или исследования характеристик. Этот этап обычно осуществляют путем разделения амплифицированных или синтезированных фрагментов нуклеиновой кислоты по размеру или любыми физическими или биохимическими средствами, включая гель-электрофорез, капиллярный электрофорез, хроматографию (включая эксклюзионную, аффинную и иммунохроматографию), центрифугирование в градиенте плотности и иммуноадсорбцию. Типичный способ представляет собой разделение фрагментов нуклеиновых кислот с помощью гель-электрофореза, который представляет собой быстрое и хорошо воспроизводимое средство эффективного разделения множества фрагментов нуклеиновых кислот и позволяет выполнять непосредственное одновременное сравнение фрагментов в нескольких образцах нуклеиновых кислот.
[00121] В одном варианте реализации один или несколько амплифицированных или синтезированных фрагментов нуклеиновой кислоты удаляют из геля, использованного для идентификации (см. выше), в соответствии со стандартными методиками, например, химической экстракции, электроэлюирования или физического вырезания. Выделенные уникальные фрагменты нуклеиновой кислоты затем можно вставить в стандартные векторы, в том числе экспрессирующие векторы, подходящие для трансфекции или трансформации различных прокариотических (бактериальных) или эукариотических (дрожжей, растений или животных, включая человека и других млекопитающих) клеток. В качестве альтернативы, нуклеиновые кислоты, полученные указанными способами, можно дополнительно исследовать, например, путем секвенирования (т.е. определения нуклеотидной последовательности фрагментов нуклеиновой кислоты), способами, описанными ниже, и другими стандартными способами в данной области техники (см., например, патенты США №4962022 и 5498523, относящиеся к способам секвенирования ДНК). Кроме того, можно использовать способы классического секвенирования, например, способ обрыва цепи по Сэнгеру (Sanger, F., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 (1977)) и способ химического расщепления по Максаму и Гилберту (Maxam, А. М. and Gilbert, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560-564 (1977)).
[00122] В одном варианте реализации нуклеиновые кислоты, полученные указанными способами, можно дополнительно исследовать посредством секвенирования следующего поколения. Термин «секвенирование следующего поколения» или «NGS» в настоящем документе в общем случае относится к технологиям высокопроизводительного секвенирования, включая массивно-параллельное опознавательное секвенирование, высокопроизводительное секвенирование, секвенирование путем лигирования (например, секвенирование SOLiD), секвенирование с обнаружением протонов полупроводниковыми датчиками, секвенирования с использованием наногранул ДНК, секвенирование одиночной молекулы и секвенирование с использованием нанопор, но не ограничиваясь этим.
[00123] Подходящие ДНК-полимеразы для амплификации и/или секвенирования могут включать любые полимеразы, ранее описанные в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации такая полимераза включает ДНК-полимеразу Thermus thermophilus (Tth), ДНК-полимеразу Thermus aquaticus (Taq), ДНК-полимеразу Thermotoga neopolitana (Tne), ДНК-полимеразу Thermotoga maritima (Tma), ДНК-полимеразу Thermococcus litoralis (Tli или VENT™), ДНК-полимеразу Pyrococcus furiosus (Pfu), ДНК-полимеразу DEEPVENT™, ДНК-полимеразу Pyrococcus woosii (Pwo), ДНК-полимеразу Pyrococcus sp KOD2 (KOD), ДНК-полимеразу Bacillus sterothermophilus (Bst), ДНК-полимеразу Bacillus caldophilus (Вса), ДНК-полимеразу Sulfolobus acidocaldarius (Sac), ДНК-полимеразу Thermoplasma acidophilum (Tac), ДНК-полимеразу Thermus flavus (Tfl/Tub), ДНК-полимеразу Thermus ruber (Tru), ДНК-полимеразу Thermus brockianus (DYNAZYME™), ДНК-полимеразу Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth), ДНК-полимеразу Mycobacterium (Mtb, Mlep), ДНК-полимеразу E.coli pol I, фрагмент Кленова, ДНК-полимеразу T5, ДНК-полимеразу Т7 и ДНК-полимеразы типа Pol I в общем смысле; их мутанты, варианты и производные и комбинации вышеизложенного, но не ограничивается ими.
[00124] Подходящие полимеразы нуклеиновых кислот могут являться мезофильными или термофильными и предпочтительно являются термофильными и термостабильными. Термин «термостабильная полимераза нуклеиновых кислот» в настоящем документе относится к ферменту, относительно устойчивому к нагреванию по сравнению, например, с нуклеотидными полимеразами E.coli и катализирующему полимеризацию нуклеозидтрифосфатов. Как правило, указанный фермент должен инициировать синтез на 3'-конце праймера, отожженного с последовательностью-мишенью, и продолжать его в 5'-направлении вдоль матрицы и, при наличии у него 5'-3'-нуклеазной активности, гидролизовать отожженный между праймерами зонд с высвобождением как меченых, так и немеченых фрагментов зонда, вплоть до прекращения синтеза. Типичный термостабильный фермент, выделенный из Thermus aquaticus (Taq), описан в патенте США №4889818, а способ его использования при обычной ПЦР описан в статье Saiki et al., 1988, Science 239:487.
[00125] Подходящие мезофильные ДНК-полимеразы включают семейство ДНК-полимераз Pol I (и их соответствующие фрагменты Кленова), любую из которых можно выделить из такого организма, как Е. coli, Н. influenzae, D. radiodurans, Н. pylori, С. aurantiacus, R prowazekii, Т pallidum, Synechocystis sp., В. subtilis, L. lactis, S. pneumoniae, M. tuberculosis, M. leprae, M. smegmatis, бактериофагов L5, phi-C31, T7, Т3, T5, SP01, SP02, митохондрий S. cerevisiae MIP-1 и эукариот С. elegans и D. melanogaster (Astatke, M. et al., 1998, J Mol. Biol. 278, 147-165), ДНК-полимеразу типа pol III, выделенную из любых источников, и их мутанты, производные или варианты и т.п.
[00126] В некоторых вариантах реализации полимераза нуклеиновых кислот облядает 5'→3'-экзонуклеазной активностью. Термин «5'→3'-нуклеазная активность» или «5'-3'-нуклеазная активность» в настоящем документе относится к указанной активности матрично-специфичной полимеразы нуклеиновых кислот, включающей 5'-3'-экзонуклеазную активность, традиционно ассоциированную с некоторыми ДНК-полимеразами, посредством которой происходит удаление нуклеотидов с 5'-конца олигонуклеотида последовательным образом (т.е. ДНК-полимераза I E.coli обладает этой активностью, тогда как фрагмент Кленова - нет), и/или 5'-3'-эндонуклеазную активность, посредством которой происходит расщепление более чем одной фосфодиэфирной связи (нуклеотида) с 5'-конца. ДНК-полимераза Taq обладает зависимой от синтеза ДНК 5'-3'-экзонуклеазной активностью, обеспечивающую вытеснение цепи (см. Gelfand, "Taq DNA Polymerase" in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, Erlich, Ed., Stockton Press, N.Y. (1989), Chapter 2). В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения рассматриваются способы, включающие полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В таких способах композиции и реакционные смеси, предложенные в настоящем документе, могут дополнительно содержать фермент с активностью обратной транскриптазы. Подходящими ферментами, обладающими активностью обратной транскриптазы, могут являться, например, ретровирусные обратные транскриптазы, например, обратная транскриптаза вируса лейкоза мышей Молони (M-MLV), обратная транскриптаза вируса саркомы Рауса (RSV), обратная транскриптаза вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), обратная транскриптаза AMV, обратная транскриптаза RAV, обратная транскриптаза MAV, обратная транскриптаза ASLV, а также лентивирусные обратные транскриптазы или их соответствующие мутанты, варианты или производные с активностью обратной транскриптазы. Фраза «мутанты, варианты или производные» в настоящем документе относится ко всем вариантам преобразованиям химического соединения, которые могут существовать или быть выполнены, позволяющим сохранять определенную химическую активность этих химических соединений. Некоторые предпочтительные ферменты для применения в настоящем изобретении включают РНКазы Н+, например, обратные транскриптазы РНКазу Н+ M-MLV или РНКазу Н+ АМВ. В качестве альтернативы, обратные транскриптазы могут обладать ослабленной, существенно ослабленной или устраненной активностью РНКазы Н (см., например, патент США №7078208, описание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки). РНКаза Н представляет собой процессивную 5'- и 3'-рибонуклеазу, специфичную по отношению к цепи РНК в гибридах РНК-ДНК (Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, New York: Wiley & Sons (1984)). Активность РНКазы H можно определить с помощью различных анализов, например, описанных в патенте США №5449797, в статьях Kotewicz, М.L., et al., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988) и Gerard, G.F., et al., FOCUS 14(5):91 (1992).
[00127] Обратная транскриптаза может содержать мутацию по сравнению с природной обратной транскриптазой. Например, обратную транскриптазу можно модифицировать, внеся в нее мутацию, обеспечивающую повышенную стабильность и/или функциональность обратной транскриптазы. Подходящие ферменты могут также включать ферменты со сниженной, существенно сниженной или устраненной активностью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT). Обратные транскриптазы, проявляющие такую повышенную или пониженную функциональность, описаны, например, в патентах США №7056716 и 7078208.
[00128] Предложенные в настоящем документе скомпонованные композиции для ПЦР эффективны с точки зрения уменьшения времени выполнения ПЦР по сравнению с эквивалентной ПЦР с доступным для приобретения мастер-миксом. Это было особенно характерно для случая, когда образец нуклеиновой кислоты, добавленный при ПЦР, представлял собой необработанный лизат и/или последовательность-мишень присутствовала в небольшом количестве копий. В некоторых вариантах реализации это снижение времени выполнения ПЦР демонстрируют за счет более низких значений Ct. В некоторых вариантах реализации значение Ct по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 500 раз, или по меньшей мере в 1000 раз ниже при применении скомпонованных композиций для ПЦР, предложенных в настоящем документе, по сравнению с эквивалентной ПЦР с доступной для приобретения композицией или мастер-миксом.
+
-
+
-
[00129] Термин «Ct» или «значение Ct» в настоящем документе относится к пороговому циклу и обозначает цикл анализа на основе ПЦР-амплификации, в котором сигнал репортера, указывающий на генерацию ампликона (например, флуоресценция), впервые становится обнаружимым выше фонового уровня. В некоторых вариантах реализации пороговый цикл или «Ct» представляет собой номер цикла, при котором ПЦР-амплификация становится экспоненциальной. В одном варианте реализации сигнал репортера, например, флуоресценция, описывается как дельта Rn. Термин «dRn» или «дельта Rn» в настоящем документе относится к разности нормированного сигнала репортера (Rn), вычитаемого из фонового (исходного) сигнала, которую затем нормируют по сигналу пассивного эталона. Дельта Rn можно определить по формуле Rn- Rn, где Rn представляет собой значение Rn для реакции с участием всех компонентов, включая матрицу, a Rn - значение для непрореагировавшего образца.
[00130] В соответствии с различными вариантами реализации значение Ct можно определить с использованием производной кривой ПЦР. Например, для определения значения Ct можно выполнить способ с получением производной кривой ПЦР первого, второго или n-го порядка. В различных вариантах реализации характеристику производной можно применять при определении значения Ct. Такие характеристики могут включать положительный перегиб второй производной, отрицательный перегиб второй производной, пересечение нуля второй производной или положительный перегиб первой производной, но не ограничиваются ими. В различных вариантах реализации значение Ct можно определить с использованием способа порогового и исходного значений. Например, верхнюю границу экспоненциальной фазы кривой ПЦР можно установить с использованием способа производной, тогда как для установления нижней границы экспоненциальной фазы кривой ПЦР можно определить исходное значение для кривой ПЦР. На основании верхней и нижней границы кривой ПЦР можно установить пороговое значение, из которого определяют значение Ct. В данной области техники известны и другие способы определения значения Ct, например, различные варианты реализации способа точечной аппроксимации и различные варианты реализации сигмоидального способа, но не ограничиваясь ими (см., например, патенты США №6303305; 6503720; 6783934, 7228237 и заявку на патент США №2004/0096819, описание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылок).
[00131] Термины «отжиг» и «гибридизация» в настоящем документе используются на равных основаниях и означают комплементарное взаимодействие пар оснований одной нуклеиновой кислоты с другой нуклеиновой кислотой, что приводит к образованию двуцепочечной, трехцепочечной или другой высокоупорядоченной структуры. В некоторых вариантах реализации первичное взаимодействие является специфичным по отношению к основаниям, например, А/Т и G/C, и осуществляется путем образования водородных связей по Уотсону-Крику и Хугстину. В некоторых вариантах реализации стабильности двуцепочечной структуры также могут способствовать стэкинг-взаимодействие и гидрофобные взаимодействия. Условия гибридизации зондов и праймеров нуклеиновых кислот с комплементарными и практически комплементарными последовательностями-мишенями хорошо известны, например, описаны в Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, В. Hames and S. Higgins, eds., IRL Press, Washington, D.C. (1985) и J. Wetmur and N. Davidson, Mol. Biol. 31:349 et seq. (1968). В целом, на возможность такого отжига влияет, в числе прочего, длина зондов и комплементарных последовательностей мишеней, рН, температура, присутствие одно- и двухвалентных катионов, доля нуклеотидов G и С в области гибридизации, вязкость среды и присутствие денатурирующих агентов. Такие переменные влияют на время, необходимое для гибридизации. Таким образом, предпочтительные условия отжига зависят от конкретного варианта применения. В то же время такие условия может определить специалист в данной области техники в рабочем порядке без неоправданных экспериментов. Кроме того, в общем случае, зонды и праймеры согласно настоящему изобретению сконструированы с учетом их комплементарности последовательности-мишени, что обеспечивает гибридизацию мишени и зондов или праймеров. В то же время следует принимать во внимание, что эта комплементарность не обязательно должна быть полной; возможно наличие любого количества несоответствий пар оснований, мешающих гибридизации последовательности-мишени и одноцепочечных нуклеиновых кислот в соответствии с настоящим изобретением. Однако если количество несоответствий пар оснований настолько велико, что гибридизация невозможна даже при наименее строгих условиях гибридизации, данная последовательность не является комплементарной последовательности-мишени. Таким образом, под термином «практически комплементарный» подразумевается, что зонды или праймеры достаточно комплементарны последовательности-мишени для гибридизации при выбранных условиях реакции.
[00132] Термин «метка» в настоящем документе относится к любому атому или молекуле, которые можно применять для получения обнаружимого сигнала и которые можно присоединить к нуклеиновой кислоте или белку. Метки могут обеспечивать получение сигналов, обнаружимых по флуоресценции, радиоактивности, путем колориметрии, гравиметрии, по дифракции или поглощению рентгеновских лучей, магнитным свойствам, ферментативной активности и т.п. В некоторых вариантах реализации обнаружимый сигнал является измеряемым сигналом.
[00133] Например, метка может представлять собой любую группу, которая: (i) обеспечивает получение обнаружимого сигнала; (ii) взаимодействует со второй меткой, модифицируя обнаружимый сигнал, обеспечиваемый первой или второй меткой; или (iii) обеспечивает функцию захвата, например, гидрофобное сродство, взаимодействие антитело/антиген, ионное комплексообразование. Специалист в данной области техники должен принимать во внимание, что в настоящем изобретении можно применять различные виды репортерных меток по отдельности или в комбинации с одной или более другими метками. Типичные метки включают флуорофоры, радиоактивные изотопы, квантовые точки, хромогены, ферменты, антигены, включая эпитопные метки,, но не ограничиваясь ими, тяжелые металлы, красители, фосфоресцирующие группы, хемилюминесцентные группы, группы, обеспечивающие электрохимическое обнаружение, аффинные метки, связывающие белки, люминофорами, хелаты редкоземельных элементов и красители для ближнего инфракрасного диапазона, но не ограничиваются ими.

[00134] Подходящие обнаружимые метки могут включать, например, флуоресцеины (например, 5-карбокси-2,7-дихлорфлуоресцеин, 5-карбоксифлуоресцеин (5-FAM), 5-НАТ (гидрокситриптамин), 6-НАТ, 6-JOE, 6-карбоксифлуоресцеин (6-FAM), FITC); флуорофоры Alexa (например, 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); флуорофоры BODIPY (например, 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650- X, 650/665-Х, 665/676, FL, FL-АТФ, FI-церамид, R6G SE, TMR, конъюгат TMR-X, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE), кумарины (например, 7-амино-4-метилкумарин, АМС, АМСА, AMCA-S, АМСА-Х, ABQ, СРМ, метилкумарин, кумарин-фаллоидин, гидроксикумарин, CMFDA, метоксикумарин), кальцеин, кальцеин AM, кальцеиновый синий, кальциевые красители (например, Calcium Crimson, Calcium Green, Calcium Orange, Calcofluor White), Cascade Blue, Cascade Yellow; красители Су™ (например, 3, 3.18, 3.5, 5, 5.18, 5.5, 7), голубой GFP, цАМФ-чувствительный флуоресцентный индикатор (FiCRhR), флуоресцентные белки (например, зеленый флуоресцентный белок (например, GFP, EGFP), синий флуоресцентный белок (например, BFP, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal), голубой флуоресцентный белок (например, ECFP, Cerulean, CyPet), желтый флуоресцентный белок (например, YFP, Citrine, Venus, YPet), пары донор/акцептор FRET (например, флуоресцеин/тетраметилродамин, IAEDANS/флуоресцеин, EDANS/Dabcyl, флуоресцеин/флуоресцеин, BODIPY™ FL/BODIPY™ FL, флуоресцеин/QSY7 и QSY9), LysoTracker™ и LysoSensor™ (например, LysoTracker™ Blue DND-22, LysoTracker™ Blue-White DPX, LysoTracker™ Yellow HCK-123, LysoTracker™ Green DND-26, LysoTracker™ Red DND-99, LysoSensor™ Blue DND-167, LysoSensor™ Green DND-189, LysoSensor™ Green DND-153, LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160, LysoSensor Yellow/Blue-декстран с молекулярной массой 10.000 Да), Oregon Green (например, 488, 488-Х, 500, 514); родамины (например, 110, 123, В, В 200, ВВ, BG, В-экстра, 5-карбокситетраметилродамин (5-TAMRA), 5 GLD, 6-карбоксиродамин 6G, лиссамин, лиссамин-родамин В, фаллицидин, фаллоидин, Red, Rhod-2, 5-ROX (карбокси-Х-родамин), сульфородамин В и С, сульфородамин G-экстра, тетраметилродамин (TRITC), WT), Texas Red, Texas Red-X, VIC и другие метки, описанные, например, в публикации US №2009/0197254), в числе прочих, известных специалистам в данной области техники. Кроме того, можно применять другие обнаружимые метки (см., например, публикацию заявки на патент США №2009/0197254), известные специалистам в данной области техники.
[00135] Пары "флуоресцентная репортерная молекула - молекула гасителя" встраивают в олигонуклеотидные зонды для мониторинга биологических явлений на основании разделения или сближения флуоресцентной репортерной молекулы и молекулы гасителя на минимальное расстояние гашения друг от друга. Например, разработаны зонды, в которых интенсивность флуоресценции репортерной молекулы возрастает из-за отделения репортерной молекулы от молекулы гасителя. Кроме того, разработаны зонды, теряющие флуоресценцию из-за сближения молекулы гасителя с репортерной молекулой. Эти зонды с парой "репортер-гаситель" применяют для мониторинга анализов гибридизации и реакций амплификации нуклеиновых кислот, особенно полимеразной цепной реакции (ПЦР), путем мониторинга появления или исчезновения сигнала флуоресценции, генерируемого репортерной молекулой. (Например, см. патент США №6030787)
[00136] Типичные пары "репортер-гаситель" можно выбрать из ксантеновых красителей, в том числе флуоресцеинов, и родаминовых красителей. Многие подходящие формы этих соединений широко доступны для приобретения с заместителями на их фенильных группах, которые можно применять в качестве сайта связывания или в качестве связывающей функциональной группы для присоединения к олигонуклеотиду. Другой группой флуоресцентных соединений являются нафтиламины, содержащие аминогруппу в альфа- или бета-положении. К таким нафтиламиносоединениям, в частности, относятся 1-диметиламинонафтил-5-сульфонат, 1-анилин-8-нафталинсульфонат и 2-п-толуидинил-6-нафталинсульфонат. Другие красители включают 3-фенил-7-изоцианаткумарин, акридины, например, 9-изотиоцианатакридин и акридиновый оранжевый; N-(п-(2-бензоксазолил)фенил)малеимид; бензоксадиазолы, стилбены, пирены и т.п.
[00137] Молекулы репортера и гасителя предпочтительно выбирают из флуоресцеиновых и родаминовых красителей. Эти красители и соответствующие методологии присоединения к олигонуклеотидам описаны во многих источниках, например, Marshall, Histochemical J., 7: 299-303 (1975); Menchen et al., патент США №5189934; Menchen et al., заявка на европейский патент 87310256.0; и Bergot et al., международная заявка PCT/US90/05565.
[00138] Использованные в данном документе заголовки разделов предназначены лишь для организационных целей и не должны каким-либо образом ограничивать сущность описанного изобретения. Вся литература, указанная в настоящем документе, включая патенты, патентные заявки, статьи, книги и трактаты, но не ограничиваясь ими, явным образом полностью включена в настоящий документ посредством ссылок для любых целей. Если какой-либо из литературных источников противоречит любому термину, заданному в настоящем документе, преимущественную силу имеет настоящий документ.
[00139] Хотя настоящее изобретение описано с помощью указанных типичных вариантов реализации, специалист в данной области должен понимать без выполнения ненужных экспериментов, что возможны многочисленные варианты и модификации этих типичных вариантов реализации. Все подобные изменения и модификации входят в рамки настоящего изобретения. Аспекты настоящего изобретения можно дополнительно рассматривать в свете следующих примеров, которые не следует истолковывать как ограничивающие рамки настоящего изобретения каким-либо образом.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Типичная композиция
[00140] Типичную композицию составляли в виде концентрированного вдвое исходного раствора, содержащего термостабильную ДНК-полимеразу, соль калия, соль магния, пеногаситель на основе силикона, дНТФ, в том числе комбинацию дГТФ и 7-деаза-дГТФ, БСА, рыбий желатин, буферный раствор, компонент "горячего старта", глицерин, неионный детергент, отличающийся от твин-20, и пассивный эталонный краситель. Типичную композицию ПЦР тестировали в ряде анализов, описанных ниже в примерах.
Пример 2. Превосходная чувствительность ПЦР неочищенных образцов при использовании типичной композиции
[00141] Производительность композиции для ПЦР согласно примеру 1 в анализе количества копий TaqMan™ сравнивали с производительностью доступной для приобретения композиции TaqMan™ Fast Advanced Master Mix («ММ», Applied Biosystems™, номер в каталоге 4444557) с использованием двух различных образцов нуклеиновых кислот. Анализы выполняли в соответствии с протоколами изготовителя для анализа и ММ, заменяя ММ на типичную композицию в одном наборе анализов.
[00142] Необработанный образец нуклеиновой кислоты получали из слизистой оболочки полости рта, собранной с использованием буккального тампон-зонда и набора для выделения ДНК DNA Extract АН Reagents Kit согласно протоколу производителя (Applied Biosystems™, номер в каталоге 4402599). Вкратце, образец слизистой полости рта получали путем протирания внутренней поверхности щеки с каждой стороны рта участника тампон-зондом 4N6FLOQSwab. Мазок добавляли к 200 мкл лизирующего реагента и инкубировали при 95°С в течение 3 минут. После охлаждения образца до комнатной температуры к каждому образцу лизирующего раствора добавляли 200 мкл стабилизирующего реагента с образованием необработанного лизата слизистой полости рта.
[00143] Анализ количества копий TaqMan™ RNase Р Copy Number Assay выполняли с использованием 2 мкл необработанного лизата и дополнительного количества лизирующего раствора. Реакции выполняли в двух повторностях.
[00144] Одна скомпонованная смесь для ПЦР объемом 20 мкл содержит следующие компоненты:
1 мкл реагентов для анализа на основе РНКазы Р (20Х, прямой и обратный ПЦР-праймер и зонд TaqMan™)
2 мкл необработанного лизата
1, 2, 3, 4 или 7 мкл лизирующего раствора
10 мкл мастер-микса TaqMan™ Fast Advanced Master Mix или композиции согласно примеру 1
Воду, не содержащую РНКазу, до общего объема смеси для ПЦР (20 мкл)
[00145] ПЦР выполняли с использованием системы для ПЦР в реальном времени Applied Biosystems ViiA™ 7 со следующими параметрами термоциклирования:
Этап UNG (необязательно): 50°С, 2 минуты
Активация: 95°С, 20 секунд
(Денатурация: 95°С/1 секунда;
Удлинение: 60°С/20 секунд)×40 циклов
[00146] Значения порогового цикла (Ct), определенные для каждого анализа с использованием композиции согласно примеру 1 или коммерческого ММ, показаны на фиг. 1А - фиг. 1G. Композиция согласно примеру 1 позволяла выполнять амплификацию и обнаружение единственной копии РНКазы Р в 2 микролитрах необработанного лизата буккального мазка, в то время как при использовании доступного для приобретения мастер-микса для ПЦР сигнал отсутствовал. При использовании композиции согласно примеру 1 сигнал РНКазы Р обнаруживали даже в присутствии дополнительных 1, 2, 3 или 4 мкл лизирующего раствора. Это обнаружение сигнала в необработанном лизате с добавлением дополнительного количества лизирующего раствора указывает на то, что условия реакции в данном анализе могли бы позволять использовать дополнительный лизат образца. Соответственно, типичная композиция, предложенная в настоящем документе, обеспечивала более надежную амплификацию в образце необработанного лизата и была более устойчива к ингибиторам ПЦР, перенесенным из необработанного экстракта, чем доступный для приобретения мастер-микс.
[00147] Свежий образец необработанной слюны использовали в качестве источника ДНК для сравнения типичной композиции с доступным для приобретения мастер-миксом для ПЦР в анализе количества копий. Образец слюны не подвергали предварительной обработке лизирующим раствором и не обрабатывали. Анализ количества копий TaqMan™ RNase Р Copy Number Assay выполняли с использованием 1-9 мкл необработанной слюны. Реакции выполняли в двух повторностях.
[00148] Одна скомпонованная смесь для ПЦР объемом 20 мкл содержит следующие компоненты:
1 мкл реагентов для анализа на основе РНКазы Р (20Х, прямой и обратный ПЦР-праймер и зонд TaqMan™)
10 мкл мастер-микса TaqMan™ Fast Advanced Master Mix или композиции согласно примеру 1
1-9 мкл сырой слюны
Воду, не содержащую РНКазу, до общего объема смеси для ПЦР (20 мкл)
[00149] ПЦР выполняли с использованием системы для ПЦР в реальном времени ViiA™ 7 со вышеуказанными параметрами термоциклирования. Значения порогового цикла (Ct), определенные для каждого анализа с использованием композиции согласно примеру 1 или коммерческого ММ, показаны на фиг. 2А - фиг. 2G для различных объемов необработанной слюны. Композиция согласно примеру 1 позволяла выполнять амплификацию и обнаружение единственной копии РНКазы Р во всех протестированных образцах слюны, в то время как при использовании доступного для приобретения мастер-микса для ПЦР сигнал удалось получить лишь для образца слюны объемом 1 мкл. Каждый из 1, 2, 3, 4 и 9 мкл образцов необработанной слюны позволял получить четкий обнаружимый ответ при использовании типичной композиции для ПЦР (фиг. 2А - фиг. 2в, верхняя панель, левый график). Доступный для приобретения мастер-микс для ПЦР был совместим с объемом слюны, составлявшим не более 5% объема реакционной смеси. При использовании доступного для приобретения мастер-микса для ПЦР сигнал для образцов необработанного лизата слюны объемом 2, 3, 4 или 9 мкл получить не удалось (фиг. 2А - фиг. 20, верхняя панель, правый график). Соответственно, типичная композиция, предложенная в настоящем документе, обеспечивала более надежную амплификацию в образце необработанной слюны и была более устойчива к ингибиторам ПЦР, перенесенным из необработанной слюны, чем доступный для приобретения мастер-микс.
Пример 3. Генотипирование образца необработанного лизата с использованием типичной композиции
[00150] Необработанный образец нуклеиновой кислоты получали из цельной крови с использованием набора для выделения ДНК DNA Extract All Reagents Kit согласно протоколу производителя. Вкратце, образцы цельной крови инкубировали с лизирующим раствором при 95°С в течение 3 минут с последующим добавлением стабилизирующего раствора для получения необработанных лизатов крови.
[00151] Анализ для генотипирования CYP2C19*.g.-806C>T TaqMan™ (анализ для генотипирования ОНП Applied Biosystems TaqMan™, идентификатор С_469857_10) выполняли с использованием 2 мкл необработанного лизата крови и 2 мкл типичной композиции для ПЦР согласно примеру 1. Анализ генотипирования выполняли в соответствии с протоколом производителя. Для анализа выполняли пятьдесят циклов ПЦР.
[00152] График генотипирования, полученный в результате анализа необработанных лизатов крови, показан на фиг. 3. Зонд TaqMan™ MGB, меченый VIC, обнаруживал аллель 1 (минорную аллель), а зонд TaqMan™, меченый FAM, обнаруживал аллель 2. На графике фиг. 3 линии обозначают интенсивность сигнала в каждом цикле ПЦР, а кластеры показывают интенсивность на 40-м цикле. Эти результаты показывают, что типичная композиция, предложенная в настоящем документе, позволяла получать точные результаты генотипирования в необработанных образцах нуклеиновой кислоты. ПЦР и анализ генотипирования при использовании типичной композиции были устойчивы к ингибиторам ПЦР, присутствующим в необработанных образцах нуклеиновой кислоты.
Пример 4. Сравнение необработанного лизата и образцов очищенной ДНК при использовании типичной композиции
[00153] Выполнено сравнение необработанного лизата и образцов очищенной ДНК при анализе вариации количества копий. Необработанный лизат получали из цельной крови с использованием набора для выделения ДНК Applied Biosystems™ DNA Extract All Reagents Kit согласно протоколу производителя. Образец очищенной ДНК получили с использованием системы пробоподготовки MagMax™ согласно протоколу производителя (Thermo Fisher Scientific). Очищенную ДНК подвергали количественному анализу и нормировали до концентрации 5 нг/мкл.
[00154] Анализ вариации количества копий TaqMan™ Copy Number Variation Assay выполняли с использованием необработанных лизатов и очищенной ДНК из 18 образцов цельной крови. Анализ вариации количества копий Hs00010003_cn, идентификаторы 48DGV, выполняли с использованием типичной композиции для ПЦР согласно примеру 1 в объеме ПЦР 10 мкл с добавлением 2 мкл необработанного лизата или 10 нг очищенной ДНК. Количество копий рассчитывали по способу ΔΔCt, используя ген РНКазы Р в качестве нормирующего гена; для расчета количества копий использовали приложение Applied Biosystems™ CopyCaller™ Software версии 2.1. На фиг. 4А - фиг. 4В показаны результаты анализа, причем столбики слева обозначают количество копий в необработанном лизате, а столбики справа - количество копий в соответствующих образцах очищенной ДНК. Результат анализа вариации количества копий был сопоставим между необработанными лизатами и образцами очищенной ДНК из-за высокой устойчивости типичной композиции для ПЦР, предложенной в настоящем документе, к ингибиторам. Соответственно, типичная композиция, предложенная в настоящем документе, обладает хорошими эксплуатационными характеристиками при анализах вариации количества копий с использованием образцов необработанного лизата. Эти результаты показывают, что типичная композиция, предложенная в настоящем документе, позволяла получать точные результаты количества копий при использовании необработанных образцов нуклеиновой кислоты. ПЦР и анализ количества копий при использовании типичной композиции были устойчивы к ингибиторам ПЦР, присутствующим в необработанных образцах нуклеиновой кислоты.
Пример 5: Сравнение меняющихся концентраций различных пеногасителей
[00155] Мастер-микс Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) приобрели и использовали в соответствии с инструкциями производителя в концентрации 1X с добавлением дополнительных компонентов, описанных ниже. В мастер-микс добавляли 10 мкг/мкл матричной кДНК (полученной с использованием универсальной эталонной РНК человека производства Agilent и набора для обратной транскрипции Applied Biosystem's High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit в соответствии с инструкциями производителя) и 200 нМ прямого и обратного праймера гена-мишени 18s. Различные концентрации (0%, 0,01%, 0,05% и 0,1%) пеногасителя Antifoam 204 (Sigma) (фиг. 5А - фиг. 5D) или пеногасителя Antifoam SE-15 (Sigma) (фиг. 6А - фиг. 6D) добавляли в мастер-микс до распределения 10-мкл реакционной смеси/лунку в 384-луночном титрационном микропланшете (каждую из четырех различных концентраций пеногасителя тестировали в 96-луночных повторностях). Образование пузырьков в каждой реакционной лунке визуально проверяли перед амплификацией, но после внесения в планшет и центрифугирования при 1000 об/мин в течение 60 секунд. Затем выполняли амплификацию в условиях быстрого термоциклирования по умолчанию для системы ПЦР в реальном времени ViiA 7 (Applied Biosystems) в соответствии с инструкциями производителя. Горизонтальные и красные кривые на графиках фиг. 5А - фиг. 5D и фиг. 6А - фиг. 6D представляют собой сигнал флуоресценции пассивного эталонного красителя ROX, в то время как зеленые кривые представляют собой график флуоресценции красителя SYBR Green для мишени ПЦР во время термоциклирования.
[00156] Как показано на верхнем левом графике фиг. 5А - фиг. 5D, без добавления пеногасителя Antifoam 204 перед термоциклированием наблюдалось 87 пузырьков, и эти пузырьки исчезали в некоторый момент между 0 и 36 циклами (согласно увеличению флуоресценции ROX). При добавлении 0,01% пеногасителя Antifoam 204 до ПЦР насчитывали 60 пузырьков, которые, по-видимому, исчезали до первого цикла реакции. При добавлении 0,05% и 0,1% пеногасителя Antifoam 204 пузырьки не наблюдались после центрифугирования планшета и не влияли на пассивный сигнал ROX.
[00157] Как показано на верхнем левом графике фиг. 6А - фиг. 6D, без добавления пеногасителя Antifoam SE-15 перед термоциклированием наблюдалось 92 пузырька, и эти пузырьки исчезали в некоторый момент между 0 и 40 циклами (согласно увеличению флуоресценции ROX). При добавлении 0,01% пеногасителя Antifoam SE-15 до ПЦР насчитывали 10 пузырьков, которые, по-видимому, исчезали до второго цикла реакции. При добавлении 0,05% и 0,1% пеногасителя Antifoam SE-15 пузырьки не наблюдались после центрифугирования планшета и не влияли на пассивный сигнал ROX.