Адаптивный ответ эритроцитов на холодовые воздействия и окислительный стресс

Экспериментальная

медицина

IVh

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ

УДК 615.015.45:615.832.9:612.015.11

АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ ЭРИТРОЦИТОВ НА ХОЛОДОВЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС

И.П. Горячая, И.А. Буряк, В.Д. Зинченко,

«Институт проблем криобиологии и криомедииины Национальной академии наук Украины», г. Харьков

Зинченко Василий Демидович - e-mail: vd_zin@mail.ru

Цель работ: использование адаптивной реакции эритроцитов на окислительный стресс как

способа повышения их устойчивости к факторам криоконсервирования. Окислительный стресс эритроцитов вызывали озоном, который вводили в суспензию эритроцитов в виде озонированного физиологического раствора. Озон получали при помощи изготовленного нами озонатора барьерного типа. Концентрацию растворенного озона в озонированном физиологическом растворе (ОФР) определяли спектрофотометрическим методом на приборе Specord UV VIS по значению экстинкции на полосе Хартли. Осмотическую хрупкость эритроцитов оценивали по выходу гемоглобина из клеток в гипотонических растворах хлорида натрия. Полученные результаты дают основание для разработки нового подхода к повышению эффективности криоконсервирования эритроцитов и, возможно, других клеток на базе озоновых технологий. Этот подход мы условно назвали «некриопротекторным» методом повышения эффективности криоконсервирования. Он состоит в мобилизации естественных защитных ресурсов живой системы при адаптивной реакции на окислительный стресс и может применяться в дополнение к существующим методам защиты клеток при их криоконсервировании.

Ключевые слова: эритроциты, криоконсервирование, озон, осмотическая хрупкость.

The purpose of this paper is to use the adaptive response of erythrocytes to oxidative stress as a method for the enhancement of their stability to cryoconservation factors. The oxidative stress of erythrocytes was induced by ozone introduced in erythrocyte suspension as ozonated saline solution. Ozone was produced with a barrier-type ozonator of our design. The concentration of dissolved ozone in ozonated saline solution (OSS) was measured by spectrophotometric method with device Specord UV VIS according to extinction value on Hartley band. The osmotic erythrocyte brittleness was assessed by hemo-globulin liberation from cells in hypotonic sodium chloride solutions. The obtained results give grounds for the development of a new approach to the enhancement of erythrocyte cryoconservation efficiency and possibly other cells based on ozone technologies. The said approach was conditionally named by us the so-called non-cryoprotective method of cryoconservation efficiency enhancement. It consists in the living system natural resource mobilization under adaptive response to oxidative stress and may be used in addition to available cell protective methods during their cryoconservation.

Key words: erythrocytes, cryoconservation, ozone, osmotic brittleness.

Эритроциты относятся к числу биологических объектов, низкотемпературное консервирование которых достаточно хорошо разработано. Однако проблема повышения эффективности криоконсервирования этих клеток и их сохранности после деконсервации не теряет своей актуальности.

Цель исследования: использование адаптивной реакции эритроцитов на окислительный стресс как способа повышения их устойчивости к факторам криоконсервирования.

Согласно существующим представлениям, криоповреждения биологических систем, в первую очередь, обуслов-

лены действием холода на мембранные структуры, и восстановление биологических объектов после криоконсервирования во многом определяется восстановлением свойств мембран. В настоящей работе в качестве характеристики состояния мембран эритроцитов при их восстановлении после криоконсервирования использовали осмотическую резистентность (осмотическую хрупкость) их мембран. Осмотическая хрупкость характеризует способность эритроцитов выдерживать повышение осмотического давления внутри клетки, возникающее в условиях гипотонии. Численной величиной осмотической хрупкости является концентрация раствора хлористого натрия или

Экспериментальная

медицина

осмоляльность, при которой лизирует 50% клеток [1]. Чем ниже эта концентрация, тем более устойчивыми считаются клетки.

Материалы и методы

Окислительный стресс эритроцитов вызывали озоном, который вводили в суспензию эритроцитов в виде озонированного физиологического раствора. Озон получали при помощи изготовленного нами озонатора барьерного типа [2]. Концентрацию растворенного озона в озонированном физиологическом растворе (ОФР) определяли спектрофотометрическим методом на приборе Specord UV VIS по значению экстинции на полосе Хартли.

Эритроциты выделяли из донорской крови человека, взятой в Харьковской областной станции переливания крови. Для этого их трижды отмывали от плазмы физиологическим раствором, центрифугируя при 800 g в течение 5 мин. и отбирая надосадочную жидкость. Для криоконсервирования к эритромассе в объемном соотношении 1:1 приливали водный криозащитный раствор следующего состава: декстран (М.м.=10000) - 10%, ДМСО - 5%, глюкоза - 2%, сахароза - 7%, NaCl - 0,3%. Замораживание проводили в контейнерах объемом 1 мл путем погружения в жидкий азот. Оттаивание образцов осуществляли на водяной бане при 40°С, после чего медленно, при постоянном помешивании, 1 мл смеси эритроцитов с криоконсервантом разводили в 10 раз физиологическим раствором, находившимся при t 37°С. Затем суспензию отмывали от криоконсерванта, центрифугируя при 800 g в течение 5 мин. и отбирая надосадочную жидкость. Данную процедуру проводили три раза, последний раз отмывание проводили с ОФР. Для сравнения такую же процедуру отмывания проводили с эритроцитами после смешивания их с криозащитным раствором, но без замораживания. Осмотическую хрупкость эритроцитов оценивали по выходу гемоглобина из клеток в гипотонических растворах хлорида натрия [1]. Статистическую обработку полученных результатов проводили в программе Statgraphics plus for Windows с использованием непараметрического метода Манна-Уитни. Достоверными считали различия при уровне значимости p<0,05.

Результаты и их обсуждение

На рисунке представлены результаты исследования влияния отмывки ОФР с разными концентрациями озона на осмотическую хрупкость эритроцитов без замораживания и после замораживания-оттаивания.

1 2

РИС.

Коэффициенты осмотической хрупкости эритроцитов (мосм/л), обработанных озоном в различных концентрациях после: 1 - инкубации в криозащитном растворе, содержащем 10% декстрана, без замораживания; 2 - после замораживания-оттаивания в том же растворе.

Примечание: концентрации растворенного озона в мг/л указаны на рисунке; * - достоверно по отношению к контролю, p<0,05 (n=5).

При отмывании эритроцитов озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона 0,2 мгОз/л наблюдается тенденция к снижению коэффициента осмотической хрупкости эритроцитов как после инкубирования в криозащитных средах, так и после замораживания-оттаивания, что свидетельствует о повышении осмотической устойчивости клеток.

Выводы

Полученные результаты дают основание для разработки нового подхода к повышению эффективности криоконсервирования эритроцитов и, возможно, других клеток на базе озоновых технологий. Этот подход мы условно назвали «некриопротекторным» методом повышения эффективности криоконсервирования. Он состоит в мобилизации естественных защитных ресурсов живой системы при адаптивной реакции на окислительный стресс и может применяться в дополнение к существующим методам защиты клеток при их криоконсервировании.

ЛИТЕРАТУРА

1. Wagner С.Т., Burnett М.В., Livesey S.A., Connor J. Red blood cell stabilization reduces the effect of cell density on recovery following cryopreservation. Cryobiology. 2000. Vol. 41. № 3. P. 178-194.

2. Зинченко В.Д., Голота В.И., Сухомлин Е.А. и др. Лабораторное оборудование для применения озоновых технологий в биологии и медицине. Проблемы криобиологии. 2006. Т. 16. № 2. С. 68-72.

М\

МЕДИЦИНСКИЙ

АЛЬМАНАХ