СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR TICK-BORNE BORRELIOSIS

Изобретение относится к области медицины, к инфекционной иммунологии и касается способов диагностики иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ).
Иксодовый клещевой боррелиоз - природно-очаговое трансмиссивное инфекционное заболевание, передаваемое иксодовыми клещами. В настоящее время выросло количество больных с острым ИКБ с преобладанием безэритемных форм, своевременная диагностика которых бывает затруднена.
Диагностику ИКБ осуществляют на основании положительного эпиданамнеза (проживание в лесных зонах, работа на пригородном дачном участке, поездки за город, прогулки в лес в теплое время года, присасывание клеща, насекомых, особенно в пределах последних 2 недель, сезон - теплое время года); наличия характерной клинической картины: мигрирующая эритема (МЭ), сопутствующие симптомы - гриппоподобное состояние, скованность в области шеи, боли в суставах, головные боли, лихорадка (1). Однако диагностика не может быть основана только на этих данных, так как иксодовые клещи являются резервуарами множества трансмиссивных инфекций (например, клещевой энцефалит, моноцитарный эрлихиоз и др.), имеющих схожие клинические проявления. Отсутствие МЭ, особенно в сочетании с отрицательным эпиданамнезом, нередко приводит к сложностям диагностики безэритемной формы ИКБ (2). Основное значение в диагностике ИКБ имеют серологические способы диагностики, основанные на выявлении специфических антител к антигенам боррелий. Известен серологический способ диагностики ИКБ - реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), в которой определяют титр специфических антител к боррелиям в сыворотке крови и при значении показателя 1:40 и выше диагностируют иксодовый клещевой боррелиоз (3).
Недостатками известного способа является достаточно низкая информативность на ранних этапах заболевания: в первые 2-3 недели от момента инфицирования специфические антитела выявляются только в 12% случаев; способ недостаточно специфичен из-за наличия перекрестных реакций с другими микроорганизмами, в частности с Treponema pallidum.
Наиболее близким к предлагаемому является серологический способ диагностики иксодового клещевого боррелиоза, при котором используют иммуноферментный анализ (ИФА) (3). По известному способу определяют титры антигенспецифических антител к боррелиям в сыворотке крови и при их наличии диагностируют ИКБ. По различным данным известный способ обладает большей специфичностью и дает меньше ложноположительных результатов по сравнению с другими способами серологической диагностики (например, РНИФ) (2).
Недостатком известного способа диагностики ИКБ является его низкая информативность на ранних стадиях заболевания - до появления регистрируемых уровней специфических антител в связи с запаздыванием гуморального иммунного ответа, и при серонегативной форме ИКБ.
Новая техническая задача - повышение точности и информативности диагностики ИКБ как на ранних стадиях заболевания, так и в сомнительных случаях для верификации диагноза.
Для решения поставленной задачи в способе диагностики иксодового клещевого боррелиоза путем определения показателей крови определяют процент бластных клеток в реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ), стимулированной антигеном боррелий, процент бластных клеток в реакции бластной трансформации лимфоцитов, стимулированной фитогемагглютинином, рассчитывают коэффициент антигенспецифической стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов - К по формуле:
и при значениях К>53 диагностируют иксодовый клещевой боррелиоз.
Новым в способе является то, что определяют процент бластных клеток в реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ), стимулированной антигеном боррелий, процент бластных клеток в реакции бластной трансформации лимфоцитов, стимулированной фитогемагглютинином, рассчитывают коэффициент антигенспецифической стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов - К по формуле:
и при значениях К>53 диагностируют иксодовый клещевой боррелиоз.
Предлагаемое решение является новым, так как в проанализированной авторами патентной и научно-медицинской литературе не найдено аналогичных способов диагностики данного заболевания.
Предлагаемый способ соответствует критерию изобретения «изобретательный уровень», так как данная совокупность отличительных признаков не вытекает явным образом для специалистов из уровня техники.
Предлагаемый способ диагностики иксодового клещевого боррелиоза соответствует критерию изобретения «промышленно применимо», так как он апробирован на кафедре иммунологии и аллергологии СибГМУ.
Способ осуществляют следующим образом:
1. Кровь из локтевой вены в количестве 4-5 мл забирают натощак и смешивают в стерильной пробирке с 0,5 мл гепарина в концентрации 50 ЕД/мл.
2. Состав среды для культивирования клеток крови: среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки - ЭТС («ICN biomedical», США). инактивированной в течение 30 минут при температуре 56°, гентамицин в концентрации 100 мкг/мл.
3. Антиген боррелий используют в дозе 1,25×106 микробных клеток/мл. Ультразвуковой лизат В.garinii, выделенный из клещей, собранных на территории Томской области, предоставлен ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ НПО «Вирион». ФГА («Sigma», США) используют в концентрации 10 мкг/мл.
4. Постановка РБТЛ (4). В стерильные флаконы наливают по 2 мл среды для культивирования клеток. В культуральную среду (2 флакона на каждого пациента) вносят 0,2 мл гепаринизированной крови. В один флакон добавляют 0,2 мл ФГА, в другой - 0,2 мл антигена боррелий. Флаконы инкубируют при 37°С в течение 3 суток.
Учет результатов РБТЛ. Содержимое флаконов встряхивают, центрифугируют, из осадка готовят по 2 мазка на каждый флакон. Мазки фиксируют в этиловом спирте (10 минут), окрашивают азуром-зозином по методу Романовского-Гимза. Мазки микроскопируют под иммерсионным объективом 90×10. Ведут учет процента бласттрансформированных лимфоцитов: на 100-200 клеток. Рассчитывают коэффициент антигенспецифической стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов (К), как отношение процента бластных клеток в РБТЛ, стимулированной антигеном боррелий, к проценту бластных клеток в РБТЛ, стимулированной фитогемагглютинином:
и при К>53 диагностируют иксодовый клещевой боррелиоз.
Обоснование.
1. Кровь из локтевой вены в количестве 4-5 мл забирают натощак и смешивают в стерильной пробирке с 0,5 мл гепарина в концентрации 50 ЕД/мл.
2. Состав среды для культивирования клеток крови: среда RPMI-1640, содержащая 10% эмбриональной телячьей сыворотки - ЭТС («ICN biomedical», США), инактивированной в течение 30 минут при температуре 56°, гентамицин в концентрации 100 мкг/мл.
3. Антиген боррелий используют в дозе 1,25×106 микробных клеток/мл. Ультразвуковой лизат В.garinii, выделенный из клещей, собранных на территории Томской области, предоставлен ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ НПО «Вирион». ФГА («Sigma», США) используют в концентрации 10 мкг/мл.
4. Постановка РБТЛ (4). В стерильные флаконы наливают по 2 мл среды для культивирования клеток. В культуральную среду (2 флакона на каждого пациента) вносят 0,2 мл гепаринизированной крови. В один флакон добавляют 0,2 мл ФГА, в другой - 0,2 мл антигена боррелий. Флаконы инкубируют при 37°С в течение 3 суток.
Учет результатов РБТЛ. Содержимое флаконов встряхивают, центрифугируют, из осадка готовят по 2 мазка на каждый флакон. Мазки фиксируют в этиловом спирте (10 минут), окрашивают азуром-зозином по методу Романовского-Гимза. Мазки микроскопируют под иммерсионным объективом 90×10. Ведут учет процента бласттрансформированных лимфоцитов: на 100-200 клеток. Рассчитывают коэффициент антигенспецифической стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов (К) как отношение процента бластных клеток в РБТЛ, стимулированной антигеном боррелий, к проценту бластных клеток в РБТЛ, стимулированной фитогемагглютинином:
и при К>53 диагностируют иксодовый клещевой боррелиоз.
Обоснование.
Известно, что Т-лимфоциты высоко чувствительны к воздействию боррелиозных антигенов, и их специфическая сенсибилизация выявляется раньше, чем измеримые уровни специфических антител (5, 6, 7).
При проникновении патогена в макроорганизм в процессе формирования иммунного ответа происходит его распознавание Т-лимфоцитами, активация лимфоцитов, трансформация их в бласты с формированием антигенспецифического клона с последующим выходом клеток в кровоток. При повторном контакте с антигеном сенсибилизированные лимфоциты вновь активируются и претерпевают трансформацию в бласты, которая может быть зафиксирована в РБТЛ с соответствующим антигеном. Фитогемагглютинин (ФГА) относится к так называемым поликлональным активаторам Т-клеток и позволяет, таким образом, определить потенциальную способность лимфоцитов к активации и трансформации в бласты. Циркулирующие антигенспецифические Т-клетки появляются в крови при ИКБ уже на ранних сроках заболеваниях в отличие от специфических антител, используемых в настоящее время для диагностики, которые обычно начинают определяться у пациентов на 3-6-й неделе после начала инфекции (3, 7).
Было проведено обследование 56 пациентов с различными вариантами течения ИКБ (33 пациента с острым течением ИКБ, 23 пациента с хроническим течением ИКБ и 13 пациентов с серонегативным вариантом ИКБ из общего числа пациентов с острым и хроническим течениями ИКБ).
В 100% случаев регистрировалась безэритемная форма ИКБ. 23% пациентов с различными сроками заболевания (13 человек) имели отрицательные или сомнительные результаты при определении специфических антител в ИФА при наличии клинических проявлений ИКБ (головные боли, головокружение, тошнота, повышение температуры, боли в суставах) и в части случаев положительного эпиданамнеза (присасывание клеща, пребывание в лесу). В качестве контрольной группы были обследованы 25 здоровых добровольцев, отрицавших присасывание клеща в анамнезе в течение всей жизни.
В Таблице представлены результаты обследования пациентов (РБТЛ ФГА,% бластных клеток - процент бластных клеток в РБТЛ стимулированной фитогемагглютинином; РБТЛ Аг, % бластных клеток - процент бластных клеток в РБТЛ стимулированной антигеном боррелей).
По результатам проведения РБТЛ выявлено, что уровень антигенстимулированной пролиферации лимфоцитов (РБТЛ Аг, % бластных клеток) в группе пациентов с серонегативным вариантом ИКБ вдвое, а значение К в 3 раза превышает аналогичный показатель в группе здоровых доноров, что является подтверждением эффективности предлагаемого способа ранней диагностики ИКБ при отсутствии специфических антител.
Примеры конкретного выполнения способа.
Пример 1.
Пациентка Г., 19 лет. Страховой полис Медика-Томск, серия 07777 №633605.
Диагноз: ИКБ, острое течение, безэритемная форма, цереброастенический, артралгический синдром.
Диагноз подтверждался наличием характерных симптомов - головные боли, головокружения, слабость, субфибрилитет, боли в суставах (коленные, локтевые).
Из анамнеза известно - присасывания клеща не замечала, эпиданамнез отрицательный.
Дата заболевания - 27.06.07.
Появились выраженные головные боли, головокружение, слабость, боли в крупных суставах. С учетом эпидсезона направлена на ИФА-диагностику клещевых инфекций.
8.07.07 - ИФА-скрининг на антитела к боррелиям - результат сомнительный, IgM - сомнительный, IgG - отр.
13.07.07 - Антитела к вирусу клещевого энцефалита - отр.
Госпитализирована 11.07.07.
Из анамнеза жизни - хронических заболеваний нет.
По предлагаемому способу на следующий день после госпитализации был определен коэффициент антигенспецифической стимуляции пролиферативной активности лимфоцитов К как отношение процента бластных клеток в РБТЛ, стимулированной антигеном боррелий, к проценту бластных клеток в РБТЛ, стимулированной фитогемагглютинином.
Получены результаты: процент бластных клеток в РБТЛ, стимулированной ФГА - 56,5, процент бластных клеток в РБТЛ, стимулированной антигеном боррелий - 67, К=119, что подтвердило клинический диагноз ИКБ до появления в сыворотке крови специфических антител при наличии сомнительного результата по ИФА-диагностике (по способу-прототипу).
Пример 2.
Пациентка У. 38 лет, Страховой полис Коместра-Мед, серия 002229 №00000499.
Диагноз: ИКБ, хроническое течение, цереброастенический, артралгический синдром.
Диагноз установлен на основании положительного эпиданамнеза, характерной клинической картины - головные боли, выраженная слабость, боли в коленных суставах, с периодическими эпизодами обострений длительностью более 6 месяцев, сопровождающиеся повышением титра специфических иммуноглобулинов (IgG) по результатам ИФА.
Из анамнеза - впервые присасывание клеща отметила в 2006 году, перенесла острый ИКБ, эритемную форму. Проведен курс антибиотикотерапии, с хорошим эффектом. Затем в течение года чувствовала себя хорошо, специфические антитела не определялись, по заключению инфекциониста случай закончился выздоровлением.
В 2007 году - повторное присасывания клеща, после которого появились жалобы на головные боли, выраженную слабость, головокружения, боли в коленных суставах.
Диагностирован ИКБ, безэритемная форма. Проведен повторный курс лечения, с улучшением. В дальнейшем отмечены неоднократные эпизоды ухудшения самочувствия с одновременным повышением содержания специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови. Продолжительность клинических проявлений и наличия высоких титров специфических антител после повторного инфицирования составила более 6 месяцев, в результате был диагностирован хронический ИКБ.
Анамнез жизни не отягощен.
На момент обследования вышеуказанные жалобы сохранялись.
8.10.07 - ИФА-скрининг на антитела к боррелиям - результат сомнительный, IgM - сомнительный, IgG - 1/1600.
По предлагаемому способу в течение первой недели с момента госпитализации был определен коэффициент антигенспецифической стимуляции пролиферативной активности и лимфоцитов К как отношение процента бластных клеток в РБТЛ, стимулированной антигеном боррелий, к проценту бластных клеток в РБТЛ, стимулированной фитогемагглютинином.
Получены результаты: процент бластных клеток в РБТЛ, стимулированной ФГА - 50, процент бластных клеток в РБТЛ, стимулированной антигеном боррелий - 41, К=82, подтверждающие диагноз ИКБ одновременно с наличием выше перечисленных клинических и серологических критериев диагностики.
Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой информативностью, особенно в период отсутствия определяемых уровней специфических антител. Чувствительность метода составляет 78%, специфичность - 100%. Кроме того, метод достаточно прост и применим в условиях клинико-диагностической лаборатории, так как для его постановки не требуется дорогостоящих реактивов и оборудования.
Практическое применение метода возможно в комплексной диагностике ИКБ как на этапе ранней диагностики до появления специфических антител в ИФА и НРИФ, так и в сомнительных случаях для верификации диагноза.
Литература
1. Ананьева Л.П. Иксодовые клещевые боррелиозы (Лаймская болезнь). Экология, клиническая картина и этиология. / Ананьева, Л.П. / Терапевтический архив. - 2000. - №5. - С.72-78.
2. Матущенко Е.В. Совершенствование лабораторной верификации клещевых инфекций в условиях сочетанности природных очагов: Автореф. дисс. … канд. мед. наук / Е.В.Матущенко - Омск - 2006.
3. Манзенюк И.Н. Клещевые боррелиозы (болезнь Лайма). / И.Н.Манзенюк, О.Ю.Манзенюк, - Кольцово, 2005., стр.42-43 (прототип).
4. Иммунологические методы (под ред. Г.Фримеля). М.: Медицина, 1987 г., 479 с.
5. Федоров Е.С. Механизмы регуляции воспаления и иммунитета в патогенезе болезни Лайма. / Е.С.Федоров, В.Г.Барскова, Л.П.Ананьева, А.В.Шайков, Е.Л.Насонова // Клиническая медицина - 1999. - №6. С.14-18.
6. Ausubel L.J. Characterization of in vivo expanded OspA-specific human T-cell clones. / L.J.Ausubel, K.C.O′Connor, C.Baecher-Allen, C.Trollmo, B.Kessler. B.Hekking, D.Merritt, A.L.Meyer, B.Kwok, H.Ploegh, B.T.Huber, D.A.Hafler//Clin. Immunol. - 2005. - Vol.115, №3. - P.313 - 22.
7. Vaz A. Cellular and humoral immune responses to Borrelia burgdorferi antigens in patients with culture-positive early Lyme disease. / A.Vaz, L.Glickstein, J.A.Field, G.McHugh, V.K.Sikand, N.Damie and A.C.Steere // Infectology and Immunology, - 2001. - Vol.69, №12. - P.7437-7444.
Интенсивность бластной трансформации лимфоцитов периферической крови у больных ИКБ и здоровых доноров
Характеристика пациентов
РБТЛ ФГА, % бластных клеток
РБТЛ Аг, % бластных клеток
К
Здоровые доноры (n25)
64,00±3,20
16,4±1,12
26,50±2,00
Пациенты с острым ИКБ (n33)
38,00±2,86*
31,5±2,9*
72,00±6,00*
Пациенты с хроническим ИКБ (n23)
37,00±4,48*
26±2,54*
67,50±6,90*
Пациенты с серонегативным вариантом ИКБ (n13)
4,00±5,35
36±4,26*
82,00±11,00*
* - Достоверность различий при сравнении с аналогичным показателем контрольной группы (р<0,05)