КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ДОСТАВКИ АКТИВНЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ
FORMULATIONS FOR THE DELIVERY OF ACTIVE INGREDIENTS

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки США 61/645475, поданной 10 мая 2012 г., содержание которой таким образом для любых целей включено в виде ссылки полностью.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится в общем к in vivo доставке композиций активных ингредиентов. Точнее, настоящее изобретение относится к композициям активных ингредиентов, которые дополнительно включают in vivo стабилизирующее количество агента, способам получения таких композиций и способам применения таковых.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Активные ингредиенты, такие как лекарственные средства, которые содержат пептиды, белки, нуклеиновые кислоты или мелкие органические молекулы, могут вызывать нежелательные эффекты при in vivo введении, например, млекопитающему (например, человеку). Такие эффекты могут существенно уменьшать терапевтические преимущества, обеспечиваемые активным ингредиентом как таковым. Соответственно, существует необходимость в композициях активных ингредиентов, которые минимизируют нежелательные эффекты in vivo введения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение частично основано на открытии, что гомеостатические уровни определенных агентов важны в отношении нежелательных явлений терапевтического препарата, например, активного ингредиента терапевтического препарата. Соответственно настоящее изобретение обеспечивает композиции или рецептуры, способные ингибировать или уменьшать нежелательное явление(я) терапевтического препарата. Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает способы применения композиции или рецептуры для терапевтического лечения.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает композицию, такую как фармацевтическая композиция, включающую активный ингредиент и in vivo стабилизирующее количество агента, где агент ассоциирован с нежелательным эффектом in vivo, вызванным введением активного ингредиента без агента, и где in vivo стабилизирующее количество представляет собой количество, которое по существу насыщает сайты связывания активного ингредиента с агентом.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает способ уменьшения нежелательных явлений активного ингредиента, включающий введение активного ингредиента с in vivo стабилизирующим количеством агента, где агент ассоциирован с нежелательным эффектом активного ингредиента, вызванным введением активного ингредиента без агента, и где in vivo стабилизирующим количеством является количество, которое по существу насыщает сайты связывания активного ингредиента с агентом.
Дополнительно обеспечивают способ лечения или ведения боли у пациента, включающий введение пациенту фармацевтической композиции, как описано в настоящем описании, где активным ингредиентом является олигонуклеотидная ловушка, включающая один или более сайтов связывания для EGR1, и где агентом является ион кальция.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
2
Фиг. 1: оценки клинического ответа композиций олигонуклеотидов. Фиг. 1A: оценку клинического ответа каждой тестируемой композиции рассчитывали как общую сумму клинических признаков и отображали на столбчатой диаграмме (потенциальная максимальная оценка = 13, потенциальная минимальная оценка = 0). Фиг. 1B и 1C представляют собой визуальные диаграммы действия композиций "солевой раствор + олигонуклеотид" и "1:0,0146 олигонуклеотид:кальций", соответственно. Каждый коричневый столбик или поверхность на диаграмме обозначают % появления заданного клинического признака. Молекулярная масса олигонуклеотида = 14092,92 г/моль, молекулярная CaCl=147,02 г/моль, одиночная цепочка = антисмысловая цепочка двухцепочечного олигонуклеотида, олигонуклеотиды вводили в дозе 100 мг/мл, N=2-6 крыс на композицию, Т-критерий, отличие от инъекции солевого раствора: p<0,05.
2
2
2
2
Фиг. 2: анализ взаимоотношений связывания олигонуклеотида-кальция. Олигонуклеотид (0,05 мМ до 3 мМ) инкубировали в присутствии различных концентраций CaCl (0,14-25 мм). После инкубации CaCl и олигонуклеотида количество свободного кальция, остающегося в растворе, измеряли с использованием o-крезолфталеина, красителя, связывающегося со свободным кальцием (Calcium Colorimetric Assay Kit, Bio Vision). Количество кальция, связанного с олигонуклеотидом, рассчитывали как разницу между кальцием, исходно вводимым в раствор и свободным кальцием, оставшимся после инкубации (30-60 мин). Соотношение концентраций кальция, добавленного в раствор, поделенного на концентрацию олигонуклеотида, наносили на график относительно концентрации кальция, связанного с олигонуклеотидом, поделенного на концентрацию олигонуклеотида (кружочки). Взаимоотношение было линейным: R=0,89, уклон = 0,61, показывая, что большая часть кальция связывалась с олигонуклеотидом. Тот же эксперимент проводили в присутствии более высокой ионной силы путем добавления NaCl в 2 (треугольники) или 12 (квадраты) кратном избытке относительно концентрации кальция. N=1-4 на состояние, представлены средние данные, молекулярная масса олигонуклеотида = 14092,92 г/моль, молекулярная масса CaCl=147,02 г/моль.
2
2
2
Фиг. 3: столбчатые диаграммы, представляющие свободный кальций в композициях олигонуклеотида. Олигонуклеотид инкубировали с CaCl в молярном соотношении 1,8±0,3 до предела растворимости олигонуклеотида (13,5 мМ). Три композиции тестировали со следующими концентрациями олигонуклеотида:CaCl (мМ): 0,6:1,08, 7,8:14,04 и 13,5:24,3. После периода инкубации 30 минут свободный кальций выделяли с использованием центрифужных мембран для ультрацентрифугирования (AMICON ULTRA 0.5ML 3KDA, Millipore) и его концентрацию измеряли с использованием электрода кальциевого иона (черный столбик). Похожий эксперимент проводили в условиях с ионной силой, сравнимой со спинномозговой жидкостью (СМЖ (CSF)) (138 мМ NaCl, белый столбик). Заштрихованные столбики представляют собой диапазон эндогенного уровня концентрации кальция в СМЖ (1-1,4 мМ). N=2 на состояние, молекулярная масса олигонуклеотида = 14092,92 г/моль, молекулярная масса CaCl=147,02 г/моль.
2
2
2
2
Фиг. 4A и 4B: исследования аффинности и стабильности олигонуклеотида в присутствии кальция. Фиг. 4A представляет собой столбчатую диаграмму, иллюстрирующую аффинность связывания олигонуклеотида с его мишенью, транскрипционным фактором EGR1, измеряемую с использованием конкурентного анализа ELISA. Биотинилированный EGR1 согласованный тандемный олигонуклеотид (12 пмоль) связывали с планшетом ELISA и инкубировали с экстрактами ядерных белков, содержащими EGR1, в отсутствии (белый столбик) или присутствии (черные столбики) 100 пмоль свободного конкурентного олигонуклеотида, включая различные избыточные молярные соотношения CaCl (X = концентрация CaCl/концентрация олигонуклеотида); Фиг. 4B: олигонуклеотид (4 мкМ) в отсутствии или присутствии увеличивающихся молярных соотношений CaCl (X = концентрация CaCl/концентрация олигонуклеотида) инкубировали в инактивированной сыворотке (лошадиная сыворотка, инактивированная жаром, Invitrogen) при 37°C в течение 10-60 минут. Количество интактного олигонуклеотида, остающегося после инкубации в сыворотке, которая содержит нуклеазы, которые разрушают олигонкулеотиды, измеряли с использованием метода гель-электрофореза и УФ детекции. Данные нормализовали относительно исходного количества олигонуклеотида, исходно вводимого в раствор.
2
Фиг. 5A и 5B показывают эффективность олигонуклеотида в профилактике боли в модели боли при щадящем повреждении нерва (Decosterd and Woolf, Pain 87: 149-158 (2000)). Носитель (треугольники) или олигонуклеотид (кружки) вводили интратекально (чрескожно, L5/6, 0,02 мл) однократно в момент операции. Боль измеряли как механическую гиперчувствительность с использованием нитей фон Фрея (VF). Пять повторных применений для каждой из следующих нитей VF проводили на лапу, ипсилатеральную повреждению: 1-4-6-8-10 (дважды)-26 грамм. Фиг. 5 A: 1,4 мг олигонуклеотида без кальция vs. носитель; Фиг. 5B: 1,4 мг олигонуклеотида с CaCl в массовом соотношении 1:0,0198 vs. носитель и забуферивали при pH 7,5 с помощью Tris 10 мМ. Показаны значения медианы ±40% и 60% процентилей общего ответа на повторные стимуляции VF; N>4 на группу, T-критерий с последующим анализом T-Welsh, распределение данных в течение периода исследования, отличных от носителя; p<0,01 в обоих исследованиях.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение основано, частично, на открытии, что гомеостатические уровни определенных агентов важны в отношении нежелательного явления(й) терапевтического препарата, например, активного ингредиента терапевтического препарата. Соответственно настоящее изобретение обеспечивает композиции или рецептуры, способные ингибировать или уменьшать нежелательные явления(е) терапевтического препарата. Кроме того, настоящее изобретение также обеспечивает способы применения композиций или рецептур для терапевтического лечения.
В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию, такую как фармацевтическая композиция, включающую активный ингредиент и агент, ассоциированный прямо или опосредованно, с одним или более нежелательными явлениями(ем) активного ингредиента. В одном варианте осуществления изобретения агентом является любой препарат, чей гомеостатический уровень прямо или опосредовано связан с одним или более нежелательными явлениями(ем) активного ингредиента. В другом варианте осуществления изобретения агентом является любой препарат, чей гомеостатический уровень изменяется, например, существенно при введении активного ингредиента in vivo. В еще одном варианте осуществления изобретения агентом является любой препарат, чей гомеостатический уровень чувствителен к введению активного ингредиента in vivo. В еще одном варианте осуществления изобретения агентом является любое вещество, которое способно взаимодействовать или взаимодействует, прямо или опосредованно, с активным ингредиентом. В еще одном варианте осуществления изобретения агентом является любое вещество, которое способно связываться или связывается, прямо или опосредованно, с активным ингредиентом.
В соответствии с настоящим изобретением агент может быть различным, например, даже в отношении одного и того же активного ингредиента, в зависимости от ткани или типа клеток, в которые вводят активный ингредиент. В некоторых вариантах осуществления изобретения агентом является ион. Ионом может быть органическая кислота, например, яблочная, аскорбиновая, виннокаменная, молочная, уксусная, муравьиная, щавелевая или лимонная кислота. В некоторых вариантах осуществления изобретения агентом является ион металла, например, железо, цинк, медь, графит и никель и др. В некоторых вариантах осуществления изобретения агент имеет заряд, который противоположен суммарному заряду активного ингредиента. В некоторых вариантах осуществления изобретения агентом является катион или анион. В некоторых других вариантах осуществления изобретения агентом является ион кальция, ион магния или ион калия. В некоторых других вариантах осуществления изобретения агентом является ион, углевод (например, сахара, крахмалы и др.), липид (например, насыщенные жирные кислоты, ненасыщенные жирные кислоты, триацилглицерины, глицерофосфолипиды, сфинголипиды и холестерин и др.), витамин (например, селен, цинк, витамин А, тиамин, рибофлавин, пиридоксин, ниацин, пантотеновая кислота, цианокобаламин, L-аскорбиновая кислота и α-токоферол и др.), или спирт (например, полиолы, такие как глюкоза и маннит, а также, например, этанол и др.) или их комбинации.
2+
2+
-
-
2-
2-
3
4
4
В дополнительных вариантах осуществления изобретения агент в отношении спинномозговой жидкости является ионом, например, ионами кальция, ионами магния или ионами калия. В еще некоторых других вариантах осуществления изобретения агент в отношении крови является одним или более из электролитов крови и/или основных составляющих внеклеточной, клеточной и интерстициальной жидкости. В некоторых примерных вариантах осуществления изобретения агентом в отношении крови является Na+, K+, Ca, Mg, Cl, бикарбонаты (например, HCO), фосфор (например, HPO), сульфаты (например, SO), органическая кислота, белки, ионы металлов (железо, цинк, медь, графит и никель и др.), углеводы или спирты (например, глюкоза, маннит, этанол), липиды, витамины (например, селен, цинк) или их любая комбинация.
В соответствии с настоящим изобретением количество агента, используемого в композиции активного ингредиента, может быть любым, подходящим для введения активного ингредиента in vivo, например, любым количеством, которое или ингибирует или уменьшает одно или более нежелательных явлений активного(я) ингредиента без агента. В соответствии с настоящим изобретением одно или более нежелательных явлений(я) активного ингредиента включают любой нежелательный или неподходящий эффект, получаемый в результате введения активного ингредиента in vivo. Нежелательным явлением может быть любой продолжительный или короткий эффект, местный или системный эффект, или любой эффект, ассоциированный с токсичностью активного ингредиента. Примерные нежелательные явления включают боль, головную боль, рвоту, аритмию, тремор, угнетение дыхания, головокружение, потерю контроля за движениями, отсутствие координации, утомляемость, нарушение памяти, сыпь или онемение. В одном варианте осуществления изобретения нежелательным явлением в контексте лечения боли олигонуклеотидной ловушкой может быть относительно легкое (например, легкое движение хвоста в модели на грызунах или собаках) или более тяжелое (например, судороги), или может включать мышечный тремор, повышение тонуса мышц конечности, ригидность всего тела, боль или спонтанные вокализации.
В одном варианте осуществления изобретения, агент, используемый в композиции активного ингредиента, находится в in vivo стабилизирующем количестве. Как используется в настоящем описании "in vivo стабилизирующее количество" представляет собой количество агента, которое при введении с активным ингредиентом не вызывает какого-либо материального или определяемого изменения эндогенного уровня, например, гомеостатического уровня агента in vivo. Альтернативно "in vivo стабилизирующее количество" представляет собой количество агента, которое при введении вместе с активным ингредиентом ингибирует или уменьшает одно или более нежелательных явлений активного ингредиента без агента. В некоторых вариантах осуществления изобретения in vivo стабилизирующее количество агента представляет собой количество, которое достаточно насыщает сайты связывания, например, доступные сайты связывания активного ингредиента с агентом. Например, in vivo стабилизирующим количеством агента может быть количество, которое способно связывать или связывается с, по меньшей мере, 0,001%, 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40% или 50% сайтов связывания, например, доступных сайтов связывания активного ингредиента с агентом. В некоторых других вариантах осуществления изобретения in vivo стабилизирующее количество агента представляет собой количество, которое при введении вместе с активным ингредиентом материально не влияет и не вызывает определяемых изменений pH (например, индуцирует изменение менее чем на около 0,5 pH единиц, 0,2 pH единиц, 0,1 pH единиц и др.) местного участка, ткани или окружения клеток и др.
В еще некоторых вариантах осуществления изобретения in vivo стабилизирующее количество агента представляет собой количество, которое при смешивании с активным ингредиентом дает менее чем заранее определенный уровень свободного агента в композиции, например, минимальный или неопределяемый уровень свободного агента в композиции. Например, заранее определенный уровень свободного агента в композиции может составлять, по меньшей мере, менее чем 0,1 мМ, 0,5 мМ, 1 мМ, 1,5 мМ или 2 мМ в композиции, где активным ингредиентом является олигонуклеотидная ловушка и агентом является ион, например, кальция. В другом примере заранее определенный уровень свободного агента в композиции составляет менее чем около 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% эндогенного уровня, например, местной концентрации агента. В еще одном примере заранее определенный уровень свободного агента в композиции определяют на основании уровня насыщения сайтов связывания в активном ингредиенте с агентом.
В соответствии с настоящим изобретением свободным агентом является агент, который не связывается с активным ингредиентом, например, посредством электростатических, ковалентных или гидрофобных взаимодействий, или любым другим типом взаимодействия. Альтернативно, свободным агентом является агент, который способен влиять или вмешиваться в эндогенный уровень агента, например, системно или в локальной области введения.
2
2
2
В других вариантах осуществления изобретения in vivo стабилизирующее количество агента представляет собой количество, которое обеспечивает подходящее соотношение между активным ингредиентом и агентом так, что когда их вводят in vivo, он ингибирует или уменьшает одно или более нежелательных явлений(я) активного ингредиента без агента или альтернативно он не вызывает существенного или определяемого изменения эндогенного уровня, например, гомеостатического уровня агента. В некоторых вариантах осуществления изобретения молярное соотношение или массовое соотношение активного ингредиента к агенту варьируется от около 1:1000 до около 1000:1. Неограничивающие примеры соотношений включают 1:1, 1:5, 1:10, 1:50, 1:100, 1:250, 1:500, 1:1000, 1000:1, 500:1, 250:1, 100:1, 50:1, 10:1, 5:1 и любой диапазон, полученный из них, включая доли целых чисел (например, 100,5, 100,05 и др.). Дополнительные неограничивающие примеры соотношений включают 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1 и 2:1, и любой диапазон, полученный из них, включительно доли целых чисел (например, 1,5, 1,05 и др.). В некоторых вариантах осуществления изобретения активным ингредиентом является нуклеиновая кислота, такая как олигонуклеотид (например, олигонуклеотидная ловушка), и агентом является ион кальция и где массовое соотношение активного ингредиента и агента составляет от около 0,005 до 5, 0,05 до 5, 0,1 до 3, 0,2 до 2,8, 0,5 до 2 или 1 до 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения активным ингредиентом является нуклеиновая кислота, такая как олигонуклеотид (например, олигонуклеотидная ловушка), и агентом является ион кальция, и где массовое соотношение или молярное соотношение активного ингредиента и агента составляет от около 1 до 0,001, 1 до 0,005, 1 до 0,01, 1 до 0,015, 1 до 0,018, 1 до 0,019, 1 до 0,02, 1 до 0,025, 1 до 0,03, 1 до 0,035, 1 до 0,4 или 1 до 0,5. Например, массовое соотношение может составлять 1:1, 2:1, 4:1, 5:1, 15:1, 30:1, 50:1, 100:1, 200:1, 250:1, 300:1, 400:1, 500:1 или 1000:1. Агент, такой как ион (например, ион кальция), может содержаться в композиции, такой как соль (например, CaCl), и молярное количество или массовое количество композиции может быть представлено в соотношении. Соответственно в некоторых вариантах осуществления изобретения агентом является ион кальция, содержащийся в композиции, такой как CaCl, где массовое соотношение активного ингредиента, такого как нуклеиновая кислота (например, олигонуклеотид, олигонуклеотидная ловушка) к композиции, например, CaCl, составляет около 1:1, 2:1, 4:1, 5:1, 15:1, 30:1, 50:1, 100:1, 200:1, 250:1, 300:1, 400:1 или 500:1, или любой диапазон, полученный из них.
Понимают, что точное соотношение активного ингредиента к агенту в композиции может варьироваться, например, в зависимости от химической природы активного ингредиента (например, в контексте нуклеиновой кислоты, где нуклеиновой кислотой является РНК, ДНК, однонитевая или двунитевая, процента содержания GC, или молекулярной массы), агента и его местной концентрации (например, эндогенного уровня) в целевом месте in vivo, и его предназначенном пути доставки. Например, в окружении с более высокой концентрацией эндогенного кальция, предполагают, что соотношение активного ингредиента (например, олигонуклеотидной ловушки): кальция должно быть увеличено в композиции, включающей такие компоненты.
В еще дополнительных вариантах осуществления изобретения in vivo стабилизирующее количество агента представляет собой количество, которое при введении вместе с активным ингредиентом, вызывает минимальное, несущественное или неопределяемое количество взаимодействий, например, связывание между эндогенным агентом и активным ингредиентом.
В соответствии с настоящим изобретением активным ингредиентом является любое вещество в композиции, которое обеспечивает предусматриваемую активность композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения активным ингредиентом является любое терапевтически, профилактически или фармакологически или физиологически активное вещество, или их смесь. В общем, активный ингредиент обычно используют в количестве, достаточном для предотвращения, лечения, диагностики или лечения заболевания или другого состояния, соответственно. Неограничивающие примеры активных ингредиентов включают нуклеиновые кислоты, пептиды и мелкие органические молекулы. Как используется в настоящем описании "мелкая органическая молекула" относится к углерод-содержащему агенту, имеющему молекулярную массу менее чем или равную 1500 г/моль, например, менее чем 1400, менее чем 1300, менее чем 1200, менее чем 1100, менее чем 1000, менее чем 900, менее чем 800, менее чем 700, менее чем 600, менее чем 500, менее чем 400, менее чем 300, менее чем 200 или менее чем 100 г/моль. В некоторых вариантах осуществления изобретения мелкие органические молекулы исключают полимер, такой как полимер нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотид, полинуклеотид, вектор и др.), пептид или белок. В некоторых вариантах осуществления изобретения активным ингредиентом является полимер, такой как полимер нуклеиновой кислоты или белок.
В некоторых других вариантах осуществления изобретения активным ингредиентом является олигонуклеотид. Например, олигонуклеотидом может быть олигонуклеотидная ловушка, такая как описанная в патентах США №№ 7943591 и 8093225. "Олигонуклеотидная ловушка" относится к любому двухцепочечному содержащему нуклеиновую кислоту полимеру, обычно менее чем приблизительно 200 нуклеотидов (или 100 пар оснований), и включающему, без ограничения, ДНК, РНК и РНК-ДНК гибриды. Термин охватывает последовательности, которые включают любые из известных основных аналогов ДНК или РНК, включая, без ограничения 2,6-диаминопурин, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, урацил-5-оксиуксусная кислота, N6-изопентениладенин, 1-метиладенин, N-урацил-5-оксиуксусной кислоты метиловый эфир, квенозин, 2-тиоцитозин, 5-бромурацил, метилфосфонат, фосфородитиоат, ормацеталь, 3'-тиоформацеталь, нитроксидная основа, сульфон, сульфамат, производные морфолина, производные блокированной нуклеиновая кислота (LNA), или производные пептидной нуклеиновой кислоты (PNA). В некоторых вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная основа состоит из двух комплементарных одноцепочечных олигонуклеотидов, которые отожжены вместе. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная основа состоит из однонитевого олигонуклеотида, который образует интрамолекулярные пары оснований для создания по существу двунитевой структуры.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают один или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 и др.) сайтов связывания факторов транскрипции. В связанных вариантах осуществления изобретения каждый сайт связывания фактора транскрипции связывается с фактором транскрипции, выбираемым из группы, состоящей из POU1F1, POU2F, POU3F, POU4F1, POU5F1, USF, EGR1, CREB/ATF, API, CEBP, SRF, ETS1, MEF2, SP1, RUNX, NFAT, ELK1, факторов тройного комплекса, STAT, GATA1, ELF1, ядерного фактора - гранулоцитов/макрофагов a, FiNF1, ZFHX3, IRF, TEAD1, TBP, NFY, caccc-box связывающих факторов, KLF4, KLF7, IKZF, MAF, REST, HSF, KCNIP3 и PPAR транскрипционных факторов. В определенных вариантах осуществления изобретения сайты связывания транскрипционных факторов связываются с одним или более членами семейства тесно-связанных факторов транскрипции. Характерные члены таких семейств факторов транскрипции могут быть выбраны из группы, состоящей из POU1F1, POU2F, POU3F, POU4F1, POU5F1, USF, EGR1, CREB/ATF, API, CEBP, SRF, ETS1, MEF2, SP1, RUNX, NFAT, ELK1, факторов тройного комплекса, STAT, GATA1, ELF1, ядерного фактора - гранулоцитов/макрофагов a, HNF1, ZFHX3, IRF, TEAD1, TBP, NFY, caccc-box связывающих факторов, KLF4, KLF7, IKZF, MAF, REST, HSF, KCNIP3 и PPAR факторов транскрипции. Следовательно, в определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, которая связывается, например, с EGR1, также может связываться с одним или более дополнительными членами семейства, например, EGR2, EGR3, EGR4.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают два или более сайтов связывания факторов транскрипции (например, 2, 3, 4, 5 и др). В связанных вариантах осуществления изобретения каждый сайт связывания факторов транскрипции связывается с фактором транскрипции, выбираемым из группы, состоящей из POU1F1, POU2F, POU3F, POU4F1, POU5F1, USF, EGR1, CREB/ATF, API, CEBP, SRF, ETS1, MEF2, SP1, RUNX, NFAT, ELK1, факторов тройного комплекса, STAT, GATA1, ELF1, ядерного фактора - гранулоцитов/макрофагов a, HNF1, ZFHX3, IRF, TEAD1, TBP, NFY, caccc-box связывающих факторов, KLF4, KLF7, IKZF, MAF, REST, HSF, KCNIP3 и PPAR факторов транскрипции. В определенных вариантах осуществления изобретения относительное положение двух или более сайтов связывания факторов транскрипции в основе модулирует (например, увеличивает или снижает) аффинность связывания между целевым фактором транскрипции (т.е. фактором транскрипции, для которого создан определенный сайт связывания) и его сайтом связывания фактора транскрипции, например, при сравнении с аффинностью связывания между фактором транскрипции и основой, имеющей один сайт связывания фактора транскрипции (например, согласованный сайт связывания), специфический для транскрипционного фактора. Следовательно, относительное положение двух сайтов связывания факторов транскрипции в олигонуклеотидной ловушке по изобретению может увеличивать аффинность олигонуклеотидной ловушки к целевому фактору транскрипции (например, к одному или более факторов транскрипции, мишеней ловушки). В определенных вариантах осуществления изобретения увеличение аффинности олигонуклеотидной ловушки к целевому фактору транскрипции составляет в 1,2 раза или более (например, около 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0 раз или более). В определенных вариантах осуществления изобретения относительное положение двух сайтов связывания факторов транскрипции в олигонуклеотидной ловушке обеспечивает взаимодействия типа белок-белок между факторами транскрипции, связанными с сайтами, например, гомодимеризацию или гетеродимеризацию факторов транскрипции. В определенных вариантах осуществления изобретения такие взаимодействия типа белок-белок между факторами транскрипции стабилизируют их взаимодействия, например, связывание с олигонуклеотидной ловушкой, таким образом увеличивая аффинность связывания олигонуклеотидной ловушки с одним или более целевыми факторами транскрипции.
В определенных вариантах осуществления изобретения сайты связывания факторов транскрипции олигонуклеотидной ловушки каждый связываются с одним и тем же фактором транскрипции, например, EGR1. В других вариантах осуществления изобретения сайты связывания факторов транскрипции олигонуклеотидной ловушки связываются с различными факторами транскрипции, например, различными членами тесно связанного семейства факторов транскрипции (например, различными членами семейства EGR1) или комбинации факторов транскрипции, выбираемых из группы, состоящей из POU1F1, POU2F, POU3F, POU4F1, POU5F1, USF, EGR1, CREB/ATF, API, CEBP, SRF, ETS1, MEF2, SP1, RUNX, NFAT, ELK1, факторов тройного комплекса, STAT, GATA1, ELF1, ядерного фактора - гранулоцитов/макрофагов a, FINF1, ZFHX3, IRF, TEAD1, TBP, NFY, caccc-box связывающих факторов, KLF4, KLF7, IKZF, MAF, REST, HSF, KCNIP3 и PPAR факторов транскрипции.
В определенных вариантах осуществления изобретения сайты связывания факторов транскрипции олигонуклеотидной ловушки отделены друг от друга линкерной последовательностью. Линкерные последовательности могут иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, или более пар оснований в длину. Обычно линкерные последовательности имеют от двух до пяти пар в длину. В других вариантах осуществления изобретения сайты связывания факторов транскрипции могут находиться непосредственно друг за другом (например, без линкерной последовательности) или перекрываться. В случаях, когда сайты связывания факторов транскрипции перекрываются, сайты связывания факторов транскрипции могут делить 1, 2, 3, 4, 5 или более пар оснований. Альтернативно, один или оба сайта связывания факторов транскрипции могут не иметь пар оснований, которые иным образом образуют часть консенсусной связывающей последовательности для фактора(ов) транскрипции, которые связываются с сайтом. В общем, однако, пары оснований, которые являются критичными для связывающих взаимодействий между сайтом связывания фактора транскрипции и факторами транскрипции, которые связываются с сайтом (например, пары оснований, которые по существу инвариантны в консенсусных связывающих последовательностях для определенного фактора транскрипции) не разделяют или отсутствуют, когда транскрипционные связывающие последовательности перекрываются.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают боковые последовательности, расположенные на каждом конце последовательности ловушки. Боковые последовательности могут иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6 или более пар оснований в длину. В общем, боковые последовательности имеют от двух до пяти пар оснований в длину. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения 5' боковые последовательности начинаются с пары оснований G/C и 3' боковые последовательности заканчиваются парой оснований G/C. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, боковые последовательности не образуют части сайта связывания фактора транскрипции и не взаимодействуют и не связываются с факторами транскрипции. В других вариантах осуществления изобретения боковые последовательности образуют слабые взаимодействия с факторами транскрипции, связанными с соседним сайтом связывания фактора транскрипции.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки имеют, по меньшей мере, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более пар оснований в длину. В связанных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки имеют обычно менее чем 65, 60, 55, 50 или 45 пар оснований в длину. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки имеют около 20-40 пар оснований в длину. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки имеют около 20-35, 25-40 или 25-35 пар оснований в длину.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает: (a) последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-40, 42, 45 и 47-53; или (b) последовательность, имеющую, по меньшей мере, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-40, 42, 45 и 47-53. В связанных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-39, 42, 45 и 47-52. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают последовательность, имеющую, по меньшей мере, 85% идентичности последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-17, 19-39, 42, 45 и 47-53. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-5, 7-17, 19-39, 42, 45 и 47-53. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-4, 7-9, 13, 15-17, 19-23, 26-39, 45, 48, 50, 51 и 53. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают последовательность, имеющую, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-3, 7-9, 13, 15-17, 19-23, 26, 28, 30, 32, 34-36, 38-39 и 48. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают последовательность, имеющую, по меньшей мере, 65% идентичности последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-3, 9, 13, 15-16, 19-23, 26, 28, 30, 32, 34-36, 38 и 39. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают последовательность, имеющую, по меньшей мере, 60% идентичности последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 13, 15-16, 21, 23, 26, 30, 32, 34-36, 38 и 39. В еще дополнительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают последовательность, имеющую, по меньшей мере, 55% идентичности последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 23, 30, 32, 34, 35, 38 и 39. В еще других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки включают последовательность, имеющую, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности, выбираемой из группы, состоящей из SEQ ID NO: 30, 32, 35 и 38.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (1):
,
где "A" является нуклеотидом аденином, "C" является нуклеотидом цитозином, "G" является нуклеотидом гуанином, "T" является нуклеотидом тимином, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "D" может быть нуклеотидом A, G или T, "B" может быть нуклеотидом C, G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарная цепь включается как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (1), имеет, по меньшей мере, около 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 1. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции POU2F1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции POU2F1, такими как POU2F2, POU3F1-2 и POU5F1.
11
12
13
14
15
16
17
11
12
13
14
15
16
17
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (1), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из d, d, n, n, n, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из d, d, n, n, n, n и n, имеют, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 1.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (2):
,
где "A" является нуклеотидом аденином, "C" является нуклеотидом цитозином, "G" является нуклеотидом гуанином, "T" является нуклеотидом тимином, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "D" может быть нуклеотидом A, G или T, "B" может быть нуклеотидом C, G или T, "R" может быть G или A, "V" может быть A, C или G, "Y" может быть C или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (2), имеет, по меньшей мере, около 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 2. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции USF1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции USF1, такими как USF2.
14
15
16
17
18
19
20
21
22
14
15
16
17
18
19
20
21
22
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (2), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, c, v, y, d, b, g и y. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делеции одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, c, v, y, d, b, g и y, имеют, по меньшей мере, 60% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 2.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (3):
,
где "A" является нуклеотидом аденином, "C" является нуклеотидом цитозином, "G" является нуклеотидом гуанином, "T" является нуклеотидом тимином, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, W может быть A или T, "D" может быть нуклеотидом A, G или T, "R" может быть G или A, "K" может быть T или G, "M" может быть C или A, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительном варианте осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (3), имеет, по меньшей мере, около 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 3. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции EGR1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции EGR1, такими как EGR2-4.
14
15
16
17
18
19
20
21
22
14
15
16
17
18
19
20
21
22
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (3), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, w, w, w, g, s и g. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, w, w, w, g, s и g, имеют, по меньшей мере, 65% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 3.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (4):
,
где "A" является нуклеотидом аденином, "C" является нуклеотидом цитозином, "G" является нуклеотидом гуанином, "T" является нуклеотидом тимином, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "D" может быть нуклеотидом A, G или T, "B" может быть C, G или T, "K" может быть T или G, "M" может быть C или A, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарная цепь включается как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (4), имеет, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 4. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции CREB 1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции CREB 1, такими как CREB3-5 и ATF1-7.
13
14
15
16
13
14
15
16
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (4), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3 или 4) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из b, m, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из b, m, n и n,имеют, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 4.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (5):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "R" может быть G или A, "K" может быть T или G, "H" может быть C, T или A, строчные буквы необязательно могут быть удалены, и цифры в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарная цепь включается как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (5), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 5. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с факторами транскрипции AP1/JUN. В определенных вариантах осуществления изобретения, такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с факторами транскрипции AP1/JUN, такими как AP1/JUN-B, -D и AP1/FOS.
11
12
13
14
15
16
17
11
12
13
14
15
16
17
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (5), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из k, n, h, r, r, r и t. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, включающая делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из k, n, h, r, r, r и t, имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 5.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (6):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "K" может быть T или G, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарная цепь включена как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (6), имеет, по меньшей мере, около 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 6. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции CEBPA. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции CEBPA, такими как CEBP-B, -D, -E, -G, -Z.
15
16
17,
18
19
20
2l
22
15
16
17,
18
19
20
2l
22
В определенных вариантах осуществления, олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (6), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, s, a a, k, s, n и g. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, s, a a, k, s, n и g, имеют, по меньшей мере, 85% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 6.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (7):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, Y может быть C или T, "R" может быть G или A, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (7), имеет, по меньшей мере, около 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO:7. Такая олигонуклеотидная ловушка может связываться с фактором транскрипции SRF. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции SRF, такими как ELK1.
7
8
9
10
11
12
23
24
25
26
27,
28,
29
30
31
32
33
7
8
9
10
11
12
23
24
25
26
27,
28,
29
30
31
32
33
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (7), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из g, g, a, t, r, t, a, g, a, t, n n n, n, w, w и S. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из g, g, a, t, r, t, a, g, a, t, n n n, n, w, w и S, имеют, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 7.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (8):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "D" может быть A, T или G, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (8) имеет, по меньшей мере, около 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 8. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции SRF. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции SRF, такими как ETS 1.
11
12
13
14
15
16
17
18
19
11
12
13
14
15
16
17
18
19
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (8), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из d, d, d, d, d, d, d, d и d. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из d, d, d, d, d, d, d, d и d, имеют, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:8.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (9):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "M" может быть C или A, представляет собой нуклеотид, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (9), имеет, по меньшей мере, около 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 9. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции MEF2A. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции MEF2A, такими как MEF2B-C.
16
17
18
19
20
21
16
17
18
19
20
21
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (9), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, c и t. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, c и t, имеют, по меньшей мере, 65% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 9.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную пследовательность, представленную формулой (10):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "K" может быть T или G, "R" может быть G или A, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (10), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 10. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции SP1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции SP1, такими как SP2-8.
12
13
14
15
16
17
18
16
17
18
19
20
21
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (10), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из r, r, n, n, n, r и r. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, c и t имеют, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 10.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (11):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (11), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 11. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции SP1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции SP1, такими как SP2-8.
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (11), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, s, s, s, s, s, s, s, s, s и s. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, s, s, s, s, s, s, s, s, s и s, имеют, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 11.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (12):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, «Y» может быть C или T, "D" может быть A, T или G, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (12), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 12. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции RUNX1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции RUNX1, такими как RUNX2-3.
11
12
13
14
15
16
11
12
13
14
15
16
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (12), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из t, h, h, h, h и g. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из t, h, h, h, h и g, имеют, по меньшей мере, 80% идентичности с последовательностью нуклеотидов SEQ ID NO: 12.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (13):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (13), имеет, по меньшей мере, около 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 13. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции RUNX1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции RUNX1, такими как RUNX2-3.
17
18
19
20
17
18
19
20
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (13), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3 или 4) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n и n, имеют, по меньшей мере, 60% идентичности последовательности нуклетидов SEQ ID NO: 13.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (14):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "R" может быть G или A, "H" может быть A, T или C, "Y" может быть C или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (14), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 14. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции ETS1. В определенных вариантах осуществления изобретения такое олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции ETS1, такими как ELK1.
14
15
16
17
18
14
15
16
17
18
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (14), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или 5) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, n, n, n и c. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, n, n, n и c, имеют, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 14.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (15):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "D" может быть A, G или T, "W" может быть A или T, "M" может быть C или A, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (15), имеет, по меньшей мере, около 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 15. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции NFATC1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции NFATC1, такими как NFATC2-4.
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (15), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, d, w, w, g, g, a, a, a, a, n, n, d и w. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотиды, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, d, w, w, g, g, a, a, a, a, n, n, d и w, имеют, по меньшей мере, 60% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 15.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклетидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (16):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "Y" может быть T или C, "V" может быть G, A или C, "M" может быть C или A, строчные буквы могут необязательно быть удалены и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (16), имеет, по меньшей мере, около 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 16. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции ELK1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции ELK1, такими как ETS 1.
14
15
16
17
18
19
20
21
14
15
16
17
18
19
20
21,
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (16), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) нуклеоидов, выбираемых из группы, состоящей из y, v, m, n, n, n, y и v. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, v, m, n, n, n, y и v имеют, по меньшей мере, 55% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 16.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (17):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (17), имеет, по меньшей мере, около 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 17. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с факторами тройного комплекса. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с факторами тройного комплекса, такими как SRF.
15
16
17
18
19
15
16
17
18
19
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (17), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или 5) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из g, g, c, c и t. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из g, g, c, c и t, имеют, по меньшей мере, 70% идентичность последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 17.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (18):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (18), имеет, по меньшей мере, около 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:18. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции STAT1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции STAT1, такими как STAT2-6.
15
16
17
18
19
20
21
15
16
17
18
19
20
21
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (18), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, w, g, g, w, w и w. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, w, g, g, w, w и w, имеют, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 18.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (19):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (19), имеет, по меньшей мере, около 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 19. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции GATA1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции GATA1, такими как GATA2-4.
15
16
17
18
19
20
15
16
17
18
19
20,
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (19), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из c, t, n, n, g и g. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из c, t, n, n, g и g имеют, по меньшей мере, 65% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 19.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (20):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (20), имеет, по меньшей мере, около 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 20. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции ELF1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции ELF1, такими как POU1F1.
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (20), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, w, g, a, g, g, a, a, a, a, w и w. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, w, g, a, g, g, a, a, a, a, w и w, имеют, по меньшей мере, 65% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 20.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (21):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "K" может быть G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (21), имеет, по меньшей мере, около 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 21. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с факторами транскрипции "ядерный фактор - гранулоцитов/макрофагов a". В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с факторами транскрипции "ядерный фактор - гранулоцитов/макрофагов a", такими как "ядерный фактор-гранулоцитов/макрофагов b-c".
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (21), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из k, c, a, c, n, n, n, g, a, g, a и t. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из k, c, a, c, n, n, n, g, a, g, a и t,имеют, по меньшей мере, 60% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 21.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (22):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "K" может быть G или T, "M" может быть A или C, "R" может быть A или G, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (22), имеет, по меньшей мере, около 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 22. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции POU4F1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции POU4F1, такими как POU4F2-3.
13
14
15
16
17
18
20
13
14
15
16
17
18
20
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (22) включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из t, r, m, w, n, r и w. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из t, r, m, w, n, r и w, имеет, по меньшей мере, 65% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 22.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (23):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "Y" может быть T или C, "V" может быть G, A или C, "K" может быть T или G, "D" может быть G, A или T, "H" может быть A, T или C, "W" может быть A или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (23), имеет, по меньшей мере, около 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 23. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции HNFIA. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции FINF1A, такими как HNF1B-C.
15
16
17
18
19
20
21
22
15
16
17
18
19
20
21
22
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (23), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из h, h, h, n, n, n, h и h. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из h, h, h, n, n, n, h и h, имеет, по меньшей мере, 55% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 23.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (24):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (24), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:24. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции ZFHX3. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции ZFHX3, такими как ZFHX-2, -4.
11
12
13
14
15
11
12
13
14
15
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (24), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4 или 5) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из t, n, n, a и t. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из t, n, n, a и t,имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 24.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (25):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "D" может быть A, G или T, "H" может быть A, C или T, "M" может быть A или C, "K" может быть G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (25), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 25. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции IRF1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции IRF1, такими как IRF2.
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (25), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из k, w, w, m, c, s, s, d, h, w, m, S и h. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из k, w, w, m, c, s, s, d, h, w, m, S и h, имеют, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 25.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (26):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "Y" может быть T или C, "V" может быть G, A или C, "K" может быть T или G, "D" может быть G, A или T, "H" может быть A, T или G, "B" может быть C, G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (26), имеет, по меньшей мере, около 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:26. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции TEAD1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции TEAD1, такими как TEAD2-4.
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (26), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, h, b, b, n, n, n, y, h, b, b и k. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, h, b, b, n, n, n, y, h, b, b и k,имеет, по меньшей мере, 60% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:26.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (27):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "D" может быть A, G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (27), имеет, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 27. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции TBP. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции TBP, такими как TBPL1-2.
10
11
12
13
14
15
16
17
18
21
22
23
24
25
10
11
12
13
14
15
16
17
18
21
22
23
24
25
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (27), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, w, n, n, d, n, t, a, t, w, w, n, n и w. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, w, n, n, d, n, t, a, t, w, w, n, n и w,имеет, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 27.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (28):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "K" может быть G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (28), имеет, по меньшей мере, около 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 28. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции TBP. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции TBP, такими как TBPL1-2.
12
13
14
15
16
17
18
12
13
14
15
16
17
18
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (28), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, w, w и w. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, w, w и w,имеет, по меньшей мере, 65% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 28.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (29):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "M" может быть A или C, "K" может быть G или T, "Y" может быть C или T, "B" может быть C, G или T, "D" может быть A, G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (29), имеет, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 29. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции NFYA. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции NFYA, такими как NFYB-C.
13
14
15
16
13
14
15
16
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (29), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3 или 4) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из t, m, b и y. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из t, m, b и y, имеет, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 29.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (30):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "Y" может быть T или C, "H" может быть A, T или C, "B" может быть C, G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (30), имеет, по меньшей мере, около 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 30. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции NFYA. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции NFYA, такими как NFYB-C.
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (30), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, h, y, b, n, n, n, y, y, h, h и v. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, h, y, b, n, n, n, y, y, h, h и v, имеют, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 30.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (31):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (31), имеет, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 31. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с факторами связывания CACCC-box.
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (31), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, a, s, s, s, w, s, s, s и w. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, a, s, s, s, w, s, s, s и w, имеет, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 31.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (32):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "Y" может быть T или C, "W" может быть A или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (32), имеет, по меньшей мере, около 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 32. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции KLF4. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции KLF4, такими как KLF-1, -5.
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (32), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, y, y, y, y, n, n, n, y, y, y, y и y. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, y, y, y, y, n, n, n, y, y, y, y и y,имеет, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 32.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (33):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "D" может быть A, G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (33), имеет, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:33. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции KLF7. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции KLF7, такими как KLF-1, -2 и -5.
11
12
13
14
15
16
17
18
11
12
13
14
15
16
17
18
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (33), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, d, g, n, n, w, w и w. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, d, g, n, n, w, w и w, имеет, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 33.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (34):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (34), имеет, по меньшей мере, около 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 34. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции MAFG. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции MAFG, такими как MAF-A, -B, -F, -K.
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (34), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, w, w, w, C, g, g, w, g и w. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из w, w, w, w, C, g, g, w, g и w, имеет, по меньшей мере, 55% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 34.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (35):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, Y может быть C или T, "H" может быть A, T или C, "R" может быть G или A, "D" может быть G, A или T, "Y" может быть C или T, "B" может быть C,G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (35), имеет, по меньшей мере, около 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 35. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции REST.
25
26
27
25
26
27
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (35), включает делецию одного или более (например, 1, 2 или 3) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n и n,имеет, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 35.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (36):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "M" может быть A или C, "R" может быть A или G, "K" может быть G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (36), имеет, по меньшей мере, около 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 36. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции KCNIP3.
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (36), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из k, s, a, g, k, n, n, n, n, g, a, r и m. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из k, s, a, g, k, n, n, n, n, g, a, r и m, имеют, по меньшей мере, 60% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 36.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (37):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "M" может быть A или C, "R" может быть A или G, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (37), имеет, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:37. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции KCNIP3.
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (37), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, w, g, w, n, n, n, n, g, a и r. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, w, g, w, n, n, n, n, g, a и r, имеет, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:37.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (38):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "V" может быть A, C или G, "D" может быть G, A или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (38), имеет, по меньшей мере, около 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:38. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции PPARA. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции PPARA, таких как PPAR-D, -G.
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (38), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, s, n, v, v, n, n, n, s и g. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, s, n, v, v, n, n, n, s и g, имеет, по меньшей мере, 50% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 38.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (39):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "R" может быть A или G, "M" может быть A или C, "Y" может быть C или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (39), имеет, по меньшей мере, около 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 39. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции HSF1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции HSF1, такими как HSF2.
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (39), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, w, m, g, n, n, a, r, m, r, w, w и y. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из y, w, m, g, n, n, a, r, m, r, w, w и y,имеет, по меньшей мере, 55% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 39.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (47):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (47), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 47. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции ELK1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции ELK1, такими как ETS1.
2
3
4
5
6
17
18
19
20
21
2
3
4
5
6
17
18
19
20
21
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (47), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, n, n, n, n, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, n, n, n, n, n и n, имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 47.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (48):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "Y" может быть T или C, "V" может быть G, A или C, "K" может быть T или G, "D" может быть G, A или T, "W" может быть A или T, "M" может быть C или A, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (48), имеет, по меньшей мере, около 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 48. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции HNF1A. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции HNF1A, такими как HNF1B-C.
2
3
4
5
6
21
22
23
24
25
2
3
4
5
6
21
22
23
24
25
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (48), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, n, n, n, n, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, n, n, n, n, n и n, имеет, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 48.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (49):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "Y" может быть T или C, "B" может быть C, G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (49), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO:49. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции NFYA. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции NFYA, такими как NFYB-C.
2
3
20
2
3
20
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (49) ключает делецию одного или более (например, 1, 2 или 3) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n и n, имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 49.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (50):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "R" может быть G или A, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (50), имеет, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 50. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции KLF4. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции KLF4, такими как KLF-1, -5.
2
3
4
5
6
21
22
23
24
25
2
3
4
5
6
21
22
23
24
25
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (50), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, n, r, r, n, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, n, r, r, n, n и n, имеет, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 50.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (51):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "H" может быть A, T или C, "R" может быть G или A, "D" может быть G, A или T, "Y" может быть C или T, "B" может быть C, G или T, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (51), имеет, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 51. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции REST.
2
3
4
5
27
28
29
30
2
3
4
5
27
28
29
30
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (51), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, n, n, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из n, n, n, n, n, n, n и n, имеет, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 51.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (52):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "W" может быть A или T, "R" может быть G или A, "M" может быть C или A, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (52), имеет, по меньшей мере, около 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 52. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции PPARA. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции PPARA, такими как PPAR-D, -G.
2
3
4
19
20
21
22
23
2
3
4
19
20
21
22
23
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (52), включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из m, r, m, n, n, n, n и g. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из m, r, m, n, n, n, n и g, имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 52.
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка включает двухцепочечную последовательность, представленную формулой (53):
,
где "A" представляет собой нуклеотид аденин, "C" представляет собой нуклеотид цитозин, "G" представляет собой нуклеотид гуанин, "T" представляет собой нуклеотид тимин, "S" может быть нуклеотидом G или C, "N" может быть любым нуклеотидом, "Y" может быть T или C, "K" может быть T или G, строчные буквы могут необязательно быть удалены, и числа в индексе представляют собой положение нуклеотида в последовательности. Хотя формула показывает одиночную цепь, необходимо понимать, что комплементарную цепь включают, как часть структуры. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, имеющая последовательность, представленную формулой (53), имеет, по меньшей мере, около 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 53. Такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с фактором транскрипции TEAD1. В определенных вариантах осуществления изобретения такие олигонуклеотидные ловушки могут связываться с одним или более факторами транскрипции, тесно связанными с фактором транскрипции TEAD1, такими как TEAD2-4.
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
18
19
20
21
22
23
24
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
18
19
20
21
22
23
24
В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидная ловушка, представленная формулой (53) включает делецию одного или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17) нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, c, t, t, g, y, k, g, y, k, c, g, n, n, n, n и n. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки, включающие делецию одного или более нуклеотидов, выбираемых из группы, состоящей из s, c, t, t, g, y, k, g, y, k, c, g, n, n, n, n и n, имеет, по меньшей мере, 75% идентичности последовательности нуклеотидов SEQ ID NO: 53.
Двухцепочечный олигонуклеотид, имеющий определенный процент (например, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%) идентичности последовательности с другой последовательностью обозначает, что, при выравнивании, указанный процент определяет уровень соответствия расположения оснований при сравнении двух последовательностей. Такое выравнивание и процент гомологии или идентичности могут быть определены с использованием любого подходящего программного обеспечения, известного в области техники, которое позволяет локальное выравнивание. Программное обеспечение должно быть способно обнаруживать участки локальной идентичности между двумя последовательностями, без необходимости включения полной длины последовательностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения такая программа включает, без ограничения, алгоритм попарного выравнивания EMBOSS (доступный от European Bioinformatics Institute (EBI)), программу ClustalW (также доступную от European Bioinformatics Institute (EBI)), или программу BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Natl Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med. (NCIB NLM NIH), Bethesda, Md., and Altschul et al, (1997) NAR 25:3389 3402).
Специалист в области техники понимает, что последовательности, включенные в настоящее описание, включают таковые, которые гибридизуются в строгих условиях гибридизации с примерной последовательностью (например, SEQ ID NO: 1-42, 45 и 47-53). Нуклеиновая кислота является гибридизуемой с другой нуклеиновой кислотой, когда одноцепочечная форма может отжигаться с другой одноцепочечной нуклеиновой кислотой в соответствующих условиях температуры и ионной силы раствора. Условия гибридизации хорошо известны в области техники. В некоторых вариантах осуществления изобретения отжиг может происходить во время медленного снижения температуры от денатурирующей температуры (например, 100°C) до комнатной температуре в сольсодержащем растворе (например, буфере Tris-EDTA).
Олигонуклеотидные ловушки, описанные в настоящем описании, могут быть химически модифицированы методами, хорошо известными специалисту в области техники (например, включение фосфоротиоата, метилфосфоната, фосфородитиоата, фосфорамидатов, карбоната, тиоэфира, силоксана, ацетамида или карбоксиметил эфирных связей между нуклеотидами) для предотвращения деградации нуклеазами в клетках и внеклеточных жидкостях (например, сыворотке, спинномозговой жидкости). Также могут быть созданы олигонуклеотидные ловушки, которые образуют шпилькообразные и гантелевидные структуры, которые также предотвращают или препятствуют деградации нуклеазами. Кроме того, олигонуклеотидные ловушки также могут быть вставлены как часть более крупной плазмиды, способной к эписомальному поддержанию или конституциональной репликации в целевой клетке с целью обеспечения длительного, усиленного внутриклеточного воздействия на последовательность ловушки или уменьшения ее деградации. Соответственно, любая химическая модификация или структурное изменение, известные в области техники для усиления стабильности олигонуклеотидов, находятся в рамках настоящего описания. В некоторых вариантах осуществления изобретения олгонуклеотидные ловушки, описанные в настоящем описании, могут быть прикреплены, например, к полимерам полиэтиленгликоля, пептидам (например, домену транслокации белка) или белкам, которые улучшают терапевтический эффект олигонуклеотидных ловушек. Такие модифицированные олигонуклеотидные ловушки могут предпочтительно пересекать клеточную мембрану.
В определенных вариантах осуществления изобретения, олигонуклеотидные ловушки обеспечивают в виде солей, гидратов, сольватов или производных N-оксида. В определенных вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки обеспечивают в растворе (например, солевом растворе, имеющем физиологический pH) или в лиофилизированной форме. В других вариантах осуществления изобретения олигонуклеотидные ловушки обеспечивают в липосомах.
В определенных вариантах осуществления изобретения, олигонуклеотидные ловушки включают, без ограничения, последовательности, представленные в таблице A. В общем, олигонуклеотидную ловушку создают путем отжига последовательности, представленной в таблице, с комплементарной последовательностью. Для создания несоответствующего двухцепочечного олигонуклеотида последовательность, обеспеченная в таблице, может быть отожжена с последовательностью, которая только частично комплементарна. Например, SEQ ID NO:43 может быть отожжена с SEQ ID NO:46 для получения несоответствующей последовательности, SEQ ID NO:43/46.
Таблица A
<img file="00000047.jpg" he="224" wi="144" img-content="undefined" img-format="jpg" />
<img file="00000048.jpg" he="54" wi="143" img-content="undefined" img-format="jpg" />
В соответствии с настоящим изобретением композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать буфер. Любой подходящий буфер может быть использован для композиции по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления изобретения буферная система, используемая для композиции, является совместимой с активным ингредиентом и/или агентом в композиции. В некоторых других вариантах осуществления изобретения буферная система, используемая для композиции по настоящему изобретению, улучшает или стабилизирует активный ингредиент и/или агент. В некоторых вариантах осуществления изобретения, буферная система, используемая для композиции настоящего изобретения, является органическим или неорганическим буфером. Примеры буферов включают фосфатные буферы, цитратные буферы, боратные буферы, бикарбонатные буферы, карбонатные буферы ацетатные буферы, буферы аммония и буферы трометамина (Tris).
В соответствии с настоящим изобретением в некоторых вариантах осуществления изобретения, когда активным ингредиентом является олигонуклеотид и агентом является ион, например, кальций, буфером является буфер на нефосфатной основе. Количество используемого буфера определяется специалистом в области техники, например, количество, варьирующееся от 0,01 мМ до 1 M, например, 10 мМ.
В соответствии с настоящим изобретением, композиция по настоящему изобретению может быть фармацевтической композицией, например, включающей фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемые носители могут содержать физиологически приемлемое соединение, которое действует, например, стабилизируя композицию или увеличивая или уменьшая абсорбцию активного ингредиента и/или фармацевтической композиции. Физиологически приемлемые соединения могут включать, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глютатион, хелатирующие агенты, низкомолекулярные белки, композиции, которые снижают клиренс или гидролиз любого совместно вводимого агента, или вспомогательного вещества, или другие стабилизаторы и/или буферы. Детергенты также могут быть использованы для стабилизации композиции или для увеличения или снижения абсорбции. Специалист в области техники понимает, что выбор фармацевтически приемлемого носителя, включая физиологически приемлемое соединение, зависит, например, от пути введения настоящих порошков и от определенных физико-химических характеристик любого совместно вводимого агента.
В некоторых вариантах осуществления подходящие фармацевтические носители или растворители включают вспомогательные вещества, такие как крахмал, глюкоза, лактоза, сахароза, желатин, солод, рис, мука, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропилен, гликоль, вода, этанол и подобные. В некоторых вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция также может содержать минорные количества увлажняющих или эмульгирующих агентов, или pH буферных агентов. Кроме того, могут быть использованы вспомогательные, стабилизирующие, загущающие, смазывающие вещества и красители.
Фармацевтические композиции могут быть произведены посредством процессов обычного смешивания, растворения, гранулирования, создания драже, выщелачивания, эмульгации, инкапсуляции, захвата или лиофилизации. Фармацевтические композиции могут быть рецептированы обычным образом с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей, разбавителей, вспомогательных веществ или добавок, которые облегчают обработку соединений, описанных в настоящем описании, в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически. Соответствующая композиция зависит от выбранного пути введения.
Настоящие фармацевтические композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, лепешек, капсул, капсул, содержащих жидкость, порошков, композиций с замедленным высвобождением, суппозиториев, аэрозолей, спреев, суспензий, или любой другой формы, подходящей для применения. Другие примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в области техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, Philadelphia College of Pharmacy and Science, 19th Edition, 1995).
В соответствии с другим аспектом изобретения, оно обеспечивает способы применения композиции по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению может быть использована для ингибирования, уменьшения или минимизирования одного или более нежелательных эффектов активного ингредиента, например, без агента. В другом варианте осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению может быть использована для лечения одного или более состояний или заболеваний, которые лечат активным ингредиентом, например, путем введения композиции активного ингредиента и агента, и др. В еще одном варианте осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению может быть использована для лечения одного или более состояний или заболеваний, которые лечат активным ингредиентом, со сниженным или подавленным нежелательным эффектом(ами) активного ингредиента. В других вариантах осуществления изобретения активным ингредиентом является олигонуклеотидная ловушка, включающая один или более сайтов связывания EGR1, и композиция по настоящему изобретению, включающая активный ингредиент, может быть использована для лечения боли или связанных состояний.
В общем, "лечение" или "терапия" любого состояния, заболевания или расстройства относится в некоторых вариантах осуществления изобретения к облегчению состояния, заболевания или расстройства (т.е. остановке или замедлению развития заболевания или, по меньшей мере, одного из его клинических симптомов). В некоторых вариантах осуществления изобретения "лечение" или "терапия" относятся к облегчению, по меньшей мере, одного физического параметра, который может не восприниматься пациентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения "лечение" или "терапия" относится к ингибированию состояния, заболевания или расстройства или физически (например, стабилизации воспринимаемого симптома), физиологически (например, стабилизации физического параметра) или обоих. В некоторых вариантах осуществления изобретения "лечение" или "терапия" относятся к задержке развития состояния, заболевания или расстройства.
Термины "минимизация", "ингибирование", и "уменьшение", или любые варианты указанных терминов включают любое измеримое уменьшение или полное ингибирование или снижение для достижения желаемого результата. Например, это может быть снижение на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более или любой диапазон, полученный из них, снижение активности по сравнению с нормальной. "Предотвращение" или "профилактика" относится к (1) снижению риска развития заболевания или расстройства (например, к тому что, по меньшей мере, один клинический симптом заболевания не развивается у пациента, который может подвергаться или быть предрасположен к заболеванию, но еще не страдает от или не проявляет симптомов заболевания), или (2) снижению вероятной тяжести симптома, ассоциированного с заболеванием или расстройством (например, снижению вероятной тяжести, по меньшей мере, одного из клинических симптомов заболеваний у пациента, который может подвергнуться или быть предрасположен заболеванию, но еще не испытывает или не проявляет симптомов заболевания).
В еще некоторых вариантах осуществления изобретения активным ингредиентом является олигонуклеотидная ловушка, включающая один или более сайтов связывания EGR1, и композиция по настоящему изобретению, включающая активный ингредиент, может быть использована для лечения, предварительного лечения или профилактики боли или связанных состояний. В общем, "боль" относится к неприятному сенсорному и эмоциональному ощущению, которое ассоциировано с реальным или потенциальным повреждением ткани или описывается такими терминами. Включают все различные проявления и качества боли, включая механическую боль (например, индуцированную механическим стимулом или движением тела; механическую гипералгезию иди аллодинию), боль, индуцированную температурой (например, боль, индуцированную горячей, теплой или холодной температурами), и химически индуцированную боль (например, боль, индуцированную химическим веществом). В определенных вариантах осуществления изобретения боль является хронической, суб-хронической, острой или подострой. "Хронический" относится к периоду времени, включающему месяцы (например, по меньшей мере, два месяца) или годы. "Подострый" относится к периоду времени, включающему часы (например, 1 ч-24 ч). "Суб-хронический" относится к периоду времени, включающему дни или месяцы (например, менее чем два месяца). В определенных вариантах осуществления изобретения, боль характеризует гипералгезию (т.е. повышенную чувствительность к болевому стимулу) или аллодинию (т.е. болезненный ответ на обычно неболевой стимул). Болью может быть воспалительная боль, нейропатическая боль, мышечная боль, скелетная боль, пост-хирургическая боль, артритическая боль или боль при диабете. В определенных вариантах осуществления изобретения боль у пациента существует ранее. В других вариантах осуществления изобретения боль является ятрогенной, индуцированной у пациента (например, послеоперационная боль).
В некоторых вариантах осуществления изобретения боль или состояния, связанные с болью, включают ноцицептивный сигнал. В общем "передача ноцицептивного сигнала" относится к молекулярным и клеточным механизмам, вовлеченным в определение болевого раздражителя, или потенциально повреждающего стимула, что приводит к ощущению боли, включая синтез и высвобождение нейротрансмиттеров, передачу сигнала, индуцированную нейротрансмиттерами, и связанные внутриклеточные и межклеточные сигнальные события.
В некоторых других вариантах осуществления изобретения боль или состояния, связанные с болью, включают послеоперационную боль, хроническую боль, воспалительную боль, нейропатическую боль, мышечную боль и скелетную боль. В определенных вариантах осуществления изобретения композиции могут быть использованы для профилактики одного аспекта боли при сопутствующем лечении другого симптома боли.
В определенных вариантах осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению может быть использована для лечения или профилактики боли у пациента путем введения композиции олигонуклеотидной ловушки и агента, где олигонуклеотидная ловушка не связывается с факторами транскрипции API, ETS1 и STAT. В других вариантах осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению может быть использована для лечения или профилактики боли у пациента путем введения композиции олигонуклеотидной ловушки и агента, где олигонуклеотидная ловушка связывается с одним или более факторами транскрипции, выбираемыми из группы, состоящей из факторов транскрипции API, ETS1, GATA и STAT, с условием, что боль не является болью в пояснице из-за поражения межпозвоночных дисков.
В определенных вариантах осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению может быть использована для модуляции транскрипции гена, представленного в клетке, вовлеченной в передачу ноцицептивного сигнала или ощущение боли у пациента, путем введения композиции олигонуклеотидной ловушки, например, олигонуклетидной ловушки, включающей один или более сайтов связывания EGR1 и агента. В определенных вариантах осуществления изобретения модуляция включает супрессию или подавление экспрессии гена. "Модуляция уровня экспрессии гена" относится к любому изменению экспрессии гена, включая индукцию или активацию (например, увеличение экспрессии гена), ингибирование или подавление (например, снижение экспрессии гена), или стабилизацию (например, профилактику стимуляции или подавления гена, которая обычно появляется в ответ на стимул, такой как стимул, индуцирующий боль). В других вариантах осуществления изобретения модуляция включает стабилизацию экспрессии гена. В дополнительных вариантах осуществления изобретения модуляция включает активацию или индукцию экспрессии гена. В определенных вариантах осуществления изобретения ген вовлечен в передачу ноцицептивного сигнала. Гены, вовлеченные в передачу ноцицептивного сигнала, включают, без ограничения, гены, кодирующие мембранные белки (например, ионные каналы, мембранные рецепторы и др.), растворимые сигнальные молекулы (например, внутриклеточные сигнальные молекулы или нейротрансмиттеры), синтетические ферменты (например, ферменты синтеза нейротрансмиттеров), факторы транскрипции. Специфические примеры таких генов включают, без ограничения, BDKRB2, HTR3A, SCN9A, BDNF, GRM5, NOS1, GCH1, CDK5R1, CACNA1B, P2XR3 и PNMT.
В других вариантах осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению может быть использована для модуляции передачи ноцицептивного сигнала в клетке посредством контакта клетки с композицией олигонуклеотидной ловушки, например, олигонуклеотидной ловушки, включающей один или более сайтов связывания EGR1 и агента. В определенных вариантах осуществления изобретения модуляция включает супрессию или подавление ноцицептивного сигнала. В определенных вариантах осуществления изобретения модуляция передачи ноцицептивного сигнала в клетке включает модуляцию, например, увеличение, протеолиза белка, вовлеченного в передачу ноцицептивного сигнала в указанной клетке. Например, патологически высокая протеасомная активность была связана с сильным дефицитом нейрональной пластичности (т.е. основной клеточной характеристики боли). В определенных вариантах осуществления изобретения модуляция включает активацию ингибитора передачи ноцицептивного сигнала.
В еще дополнительных вариантах осуществления изобретения композиция по настоящему изобретению может быть использована для модуляции белка, вовлеченного в передачу ноцицептивного сигнала в клетке посредством контакта клетки с композицией олигонуклеотидной ловушки, например, олигонуклеотидной ловушки, включающей один или более сайтов связывания EGR1 и агента. В определенных вариантах осуществления изобретения модуляция стимулов деградации белка включает функцию стимуляции протеосомы. В определенных вариантах осуществления изобретения белок вовлечен в передачу ноцицептивного сигнала. Белки, вовлеченные в передачу ноцицептивного сигнала, включают, без ограничения, мембранные белки (например, ионные каналы, мембранные рецепторы и др.), растворимые сигнальные молекулы (например, внутриклеточные сигнальные молекулы или нейротрансмиттеры), синтетические ферменты (например, ферменты синтеза нейротрансмиттеров), и факторы транскрипции. Специфические примеры таких белков включают, без ограничения BDKRB2, HTR3A, SCN9A, BDNF, GRM5, NOS1, GCH1.
Как используется в настоящем описании термин "эффективный" (например, "эффективное количество") обозначает адекватное для осуществления желаемого, ожидаемого или предназначенного результата. Эффективным количеством может быть терапевтически эффективное количество. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству активного ингредиента, которое при введении пациенту достаточно для осуществления такого лечения определенного заболевания или состояния. "Терапевтически эффективное количество" варьируется в зависимости от активного ингредиента, заболевания или состояния, тяжести заболевания или состояния и возраста, массы тела и др. пациента, получающего лечение.
В определенных вариантах осуществления изобретения один или более активных ингредиентов, таких как олигонуклеотидные ловушки, необязательно в композиции (например, фармацевтической композиции), включающей in vivo стабилизирующее количество агента, обеспечивают в наборе. В определенных вариантах осуществления изобретения набор включает инструкцию, например, для использования указанного одного или более активных ингредиентов или композиции, включающей активные ингредиенты. В определенных вариантах осуществления изобретения указанная инструкция описывает один или более методов по настоящему изобретению, например, метод для профилактики или лечения боли, метод модуляции экспрессии гена в клетке, метод для модуляции передачи ноцицептивного сигнала в клетке, метод для модуляции деградации белка в клетке и др. В определенных вариантах осуществления изобретения активные ингредиенты, необязательно в композиции (например, фармацевтической композиции) обеспечивают в наборе в лиофилизированной форме. В определенных связанных вариантах осуществления изобретения набор, который включает один или более лиофилизированных компонентов, дополнительно включает раствор (например, фармацевтически приемлемый солевой раствор) который может быть использован для ресуспендирования указанного одного или более активных ингредиентов и необязательного агента.
В общем, композиции по настоящему изобретению можно вводить любым обычным путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или слизисто-кожные оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и др.), или перорально. Введение может быть системным или локальным. Известны различные системы доставки, включая, например, инкапсуляцию в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, капсулы и др., которые могут быть использованы для целей введения. Методы введения включают, без ограничения, интрадермальные, внутримышечные, внутривенные, подкожные, интраназальные, эпидуральные/перидуральные, пероральные, сублингвальные, интраназальные, интрацеребральные, интравагинальные, трансдермальные, ректальные, посредством ингаляций или местные, особенно в уши, нос, глаза или на кожу. В определенных вариантах осуществления изобретения более чем один активный ингредиент вводят пациенту в композиции, включающей агент, и необязательно более чем один агент. Предпочтительный путь введения остается на усмотрение врача и будет зависеть частично от области медицинского состояния.
В специфических вариантах осуществления изобретения может быть желательно вводить одну или более композиций местно в область, нуждающуюся в лечении. Это может быть достигнуто, например, и не в качестве ограничения, посредством местной инфузии во время операции, местного нанесения (например, в сочетании с раневыми повязками после операции), посредством инъекции, посредством катетера, посредством суппозитория, или посредством имплантата, указанный имплантат состоит из пористого, непористого или гелеобразного материала, включая мембраны, такие как сиаластические мембраны, или волокна. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение может осуществляться посредством инъекции в область (например, прежнего, существующего или ожидаемого участка) боли.
В определенных вариантах осуществления изобретения может быть желательно вводить одну или более композиций в нервную систему любым подходящим путем, включая, без ограничения, интравентрикулярный, интратекальный, периневральный или эпидуральную/перидуральную инъекцию. Интравентрикулярная инъекция может быть обеспечена посредством интравентрикулярного катетера, например, прикрепленного к резервуару, такому как резервуар Ommaya.
Легочное введение также может быть использовано, например, посредством использования ингалятора или небулайзера, и композиции с аэрозольным агентом или посредством перфузии во фторводороде или синтетическом легочном сурфактанте.
Доза может быть введена и затем повторена при необходимости, что определяет обычный специалист в области техники. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления изобретения предусматривается разовая доза. В других вариантах осуществления изобретения предусматриваются две или более дозы. Когда пациенту вводят более чем одну дозу, интервал между дозами может быть любым временным интервалом, определяемым специалистом в области техники. Например, временной интервал между дозами может составлять от около 1 часа до около 2 часов, от около 2 часов до около 6 часов, от около 6 часов до около 10 часов, от около 10 часов до около 24 часов, от около 1 дня до около 2 дней, от около 1 недели до около 2 недель или дольше, или любой временной интервал, получаемый из любого из представленных диапазонов. Стандартные лекарственные формы, например, могут быть адаптированы для введения пациенту не более чем определенное количество раз в сутки, например не более чем дважды в сутки или только один раз в сутки. Дозировки могут быть обеспечены отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами и могут продолжаться пока требуется для эффективного лечения или профилактики боли.
Комбинированная терапия
В определенных вариантах осуществления изобретения композиции по настоящему изобретению могут быть использованы в комбинированной терапии с, по меньшей мере, одним другим терапевтическим средством. Другим терапевтическим средством может быть другая композиция, включающая активный ингредиент. Композиция активного ингредиента/агента и терапевтического агента может действовать аддитивно или синергически. В некоторых вариантах осуществления изобретения введение и композиции активного ингредиента/агента и терапевтического средства проводят совместно. В других вариантах осуществления изобретения композицию активного ингредиента/агента вводят перед или после введения другого терапевтического средства.
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, как понимает обычный специалист в области техники, к которой принадлежит настоящая заявка. Хотя любые методы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем описании, могут быть использованы в осуществлении или тестировании настоящей заявки, характерные методы и материалы описаны в настоящем описании.
Следуя длительной конвенции патентного права, термины "a", "an", и "the" относятся к "одному или более" при использовании в настоящей заявке, включая формулу изобретения. Следовательно, например, ссылка на "носитель" включает смеси одного или более носителей, двух или более носителей и подобного.
Применение термина "или" в формуле изобретения используют для обозначения "и/или" если однозначно не указано отношение только к альтернативам или альтернативы являются взаимоисключающими. Специфически предусматривается, что любой список пунктов с использованием термина "или" обозначает, что любой из таких перечисленных пунктов также может быть специфически исключен из связанного варианта осуществления изобретения.
На всем протяжении настоящей заявки, термин "около" используют для обозначения того, что значение включает стандартное отклонение ошибки для устройства или метода, используемого для определения значения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Клиническая шкала ответа олигонуклеотидных композиций
Способ разрабатывали для определения соответствующего количества кальция для добавления к композиции с целью предотвращения клинических признаков и нежелательных явлений после интратекального введения олигонуклеотида.
Коротко, крыс наркотизировали изофлураном, проводили интратекальную инъекцию (чрескожное введение, L5/6, 0,02 мл), помещали в клетку для восстановления и их поведение записывали в течение -60 мин. С использованием композиции солевого раствора + олигонуклеотид (двухцепочечный, 23 пары оснований, молекулярная масса = 14092,92 г/моль, %GC=69,5%, смысловая цепь: 5'-GTATGCGTGGGCGGTGGGCGTAG-3'), идентифицировали тринадцать спонтанных или индуцированных клинических признаков, которые появлялись после введения олигонуклеотида: встряхивание хвостом, ригидность хвоста, виляние хвостом, выгибание спины, вокализация, беспокойство, замирание, дистресс/судороги, моторная дисфункция зада/задней лапы, сильная вокализация после ущемления хвоста, усиленное избегание после ущемления хвоста, индуцированное виляние/ригидность после ущемления хвоста. Наличие или отсутствие признака в течение периода наблюдения численно записывали как 1 или 0, соответственно. Действие композиции для предотвращения развития таких признаков оценивали на основании общего числового значения из 13 и сравнивали с оценкой контроля, солевой интратекальной инъекцией.
2
2
2
2
2
2
У крыс разрабатывали скрининговый метод для определения соответствующего молярного соотношения CaCl (дигидрата CaCl⋅2HO, молекулярная масса = 147,02 г/моль) относительно олигонуклеотида, который устранял указанные эффекты. Коротко, крыс слегка наркотизировали с целью проведения чрескожной поясничной IT инъекции композиции олигонуклеотида (100 мг/мл, 0,02 мл). После инъекции животным позволяли восстановиться от анестезии и помещали в клетку. Клинические признаки наблюдали в течение приблизительно 1 ч и рассчитывали клиническую оценку на основании развития заранее определенных клинических признаков. Итеративным образом тестировали несколько композиций олигонуклеотида, которые содержали массовые соотношения олигонуклеотида: CaCl, варьирующиеся от 1:0,002 грамм (молярное соотношение 1:0,2) до 1:0,026 грамм (молярное соотношение 1:2,64). Результаты показали, что клинические признаки устранялись, начиная с массового соотношения олигонуклеотида:CaCl 1:0,0155 грамм (молярное соотношение 1:1,4 M). Эффект сохранялся до наивысшего тестируемого соотношения. На основании полученных результатов фиксированное массовое соотношение олигонуклеотида:CaCl 1:0,0198±0,003 (молярное соотношение 1:1,8±0,3 M) определяли, как оптимальное для предотвращения клинических признаков, которые могут появиться при введении олигонуклеотида в ЦНС (фиг. 1). Дополнительные эксперименты показали, что введение одноцепочечного олигонуклеотида давало те же клинические реакции по сравнению с двухцепочечным, подтверждая классовый эффект для соединений на основе нуклеотидов (фиг. 1).
Пример 2: Характеристика взаимоотношения связывания олигонуклеотида:кальция
Проводили эксперименты для характеристики взаимоотношений связывания олигонуклеотида:кальция. Определенные попытки были посвящены характеристике количества кальция, остающегося свободным, несвязанным с олигонуклеотидом примера 1, так как концентрация кальция, которую вводят в композицию в зависимости от концентрации олигонуклеотида, может превосходить эндогенную концентрацию кальция СМЖ. Широкий диапазон композиций, содержащих 1,4-250 кратный избыток кальция относительно концентрации олигонуклеотида, получали и измеряли свободный кальций (фиг. 2).
2
2
Результаты показали, что количество кальция, который связывается с олигонуклеотидом, следует линейному взаимоотношению (R=0,89), которое нарастает с избытком CaCl. Чем больше кальция добавляют, тем больше связывается с олигонуклеотидом до достижения плато насыщения связывания. На связывание также влияет общая ионная сила тестируемого раствора, которую модифицировали путем добавления NaCl: чем выше ионная сила, тем больше связывание кальция (фиг. 2). В целом полученная серия результатов показала, что в присутствии олигонуклеотида в композиции только небольшая часть кальция остается свободной. Из-за технических ограничений, связанных с анализом определения кальция, начальные эксперименты проводили с низкими концентрациями олигонуклеотидов (0,1-3 мМ). Комплементарные методики, допускающие тестирование экспериментальных условий с более высокими концентрациями олигонуклеотида, подтвердили, что до предела растворимости олигонуклеотида (13,5 мМ) количество кальция, который оставался свободным, было минимальным относительно концентрации, исходно вводимой в композицию, и в рамках диапазона эндогенной концентрации СМЖ (фиг. 3).
В общем, полученные данные показывают, что при определенном соотношении олигонуклеотида:кальция кальций, вводимый в композиции, адекватно насыщает сайты связывания кальция, присутствующие на олигонуклеотиде, для предотвращения забуферивания кальция СМЖ. Кроме того, они демонстрируют, что композиция не проявляет потенциальной токсичности в отношении искусственно вводимой высокой концентрации кальция в СМЖ.
Пример 3: Фармакологический анализ композиции олигонуклеотида
Комплементарные эксперименты проводили для подтверждения того, что присутствие кальция в композиции примера 1 не изменяет фармакологических свойств олигонуклеотида. Тестируемый олигонуклеотид представляет собой ловушку фактора транскрипции, ингибирующую фактор транскрипции EGR1, и предотвращает развитие боли после повреждения. Эксперименты конкурентного ELISA показали, что кальций даже в большом избытке концентрации не влияет ни на аффинность олигонуклеотида к EGR1 (фиг. 4A) ни на его стабильность (фиг. 4B). Поведенческое тестирование в доклинических моделях боли - инцизионной модели и щадящего повреждения нерва показали сходную эффективность с композициями в присутствии или отсутствии кальция (фиг. 5).
Пример 4: Исследование длительной стабильности композиции олигонуклеотида
После определения оптимального соотношения олигонуклеотида:кальция относительно олигонуклеотида примера 1 проводили эксперименты для дополнительной разработки подходящей композиции, которая сможет обеспечить адекватную длительную стабильность жидкого раствора, содержащего олигонуклеотид/кальций. Начальные эксперименты оценивали необходимость в буферном агенте путем получения растворов олигонуклеотида/кальция в воде, так как известно, что олигонуклеотиды содержат определенное количество буферной емкости. После доведения рН до ~7,5, pH раствора оценивали в течение 2 недельного периода. pH не поддерживали и в растворе отмечали "колебания" рН (таблица 1). Следовательно, дополнительные эксперименты проводили для выбора соответствующего буфера, который может обеспечить адекватный контроль pH и также быть совместимым с предложенным путем введения (интратекальный). Фосфат натрия был исходным выбранным буфером, однако эксперименты показали проблемы совместимости с соединением. Низкие концентрации фосфата натрия (<5 мМ) не обеспечивали адекватной буферной емкости для поддержания pH, тогда как более высокие концентрации (>5 мМ) приводили к видимому осаждению из-за образования фосфата кальция (таблица 2). Следовательно, трометамин (Tris), который не содержит фосфатов, оценивали в отношении совместимости и буферной емкости. Эксперименты показали, что 10 мМ трометамина (Tris) обеспечивали адекватный контроль pH (стабильный при pH 7,5) и не наблюдали проблем совместимости с раствором, содержащим олигонуклеотид:кальций (Таблица 3).
Таблица 1Стабильность композиции олигонуклеотида: кальция в отсутствии буфера
Временной интервал
Концентрация олигонуклеотида (мг/мл)
рН
Холодильник (5°С)
Морозильная камера(-20°С)
Холодильник (5°С)
Морозильная камера(-20°С)
День 0
7,47
7,5
День 3
47,7
46,8
8,28
7,58
190
186,8
8,02
7,61
День 7
44
46,3
7,9
7,67
192
187,6
7,85
7,61
День 10
47,1
46,7
193,8
193,8
2
Олигонуклеотид рецептировали с хлоридом кальция в HO в массовом соотношении 1:0,0155 (молярное соотношение 1:1,55) и pH доводили до 7,5 с помощью небольшого количества разведенного гидроксида натрия и разведенной соляной кислоты. Исследование проводили с ~190 мг/мл и ~50 мг/мл концентрациями олигонуклеотида при двух различных температурах хранения 5°C и -20°C. Концентрацию общего олигонуклеотида и pH композиции AYX1 отслеживали в течение периода 10 дней.
Таблица 2Стабильность композиции олигонуклеотида:кальция с натрий-фосфатным буфером
Композиция олигонуклеотида
Результаты день 0
Результаты день 3
Результаты день 7
Результаты день 10
Визуально
рН
Визуально
рН
Визуально
рН
Визуально
рН
1:0,001 CaCl<sub>2</sub>, без фосфата натрия буфера, 4,5 мг/мл NaCl, общий объем 1,325 мл<sup>2</sup>
Прозрачный, бесцветный
7,555
Прозрачный, бесцветный
7,434
Прозрачный, бесцветный
7,41
Прозрачный, бесцветный
7,328
1:0,001 CaCl<sub>2</sub>, 2,5 мМ фосфата натрия буфера, 4,5 мг/мл NaCl, общий объем 1,25 мл
Прозрачный, бесцветный
7,491
Прозрачный, бесцветный
7,47
Прозрачный, бесцветный
7,457
Прозрачный, бесцветный
7,415
1:0,001 CaCl<sub>2</sub>, 5,0 мМ фосфата натрия буфера, 4,5 мг/мл NaCl, общий объем 1,25 мл
Прозрачный, бесцветный
7,466
Прозрачный, бесцветный
7,466
Прозрачный, бесцветный
7,454
Прозрачный, бесцветный
7,393
1:0,002 CaCl<sub>2</sub>, без фосфата натрия буфера, 4,5 мг/мл NaCl, общий объем 1,25 мл
Прозрачный, бесцветный
7,498
Прозрачный, бесцветный
7,317
Прозрачный, бесцветный
7,281
Прозрачный, бесцветный
7,209
1:0,002 CaCl<sub>2</sub>, 2,5 мМ фосфата натрия буфера, 4,5 мг/мл NaCl, общий объем 1,25 мл
Прозрачный, бесцветный
7,546
Прозрачный, бесцветный
7,521
Прозрачный, бесцветный
7,478
Прозрачный, бесцветный
7,421
1:0,002 CaCl<sub>2</sub>, 5,0 фосфата натрия буфера, 4,5 мг/мл NaCl, общий объем 1,25 мл
Прозрачный, бесцветный
7,508
Немного мутный
6,743
Немного мутный
6,724
Немного мутный
6,654
2
Олигонуклеотид (112 мг/мл, 7,95 мМ) рецептировали с хлоридом кальция в HO в массовом соотношении 1:0,01 или 1:0,02 (молярное соотношение 1:1-1:2) и pH доводили до 7,5 с помощью небольшого количества разведенного гидроксида натрия и разведенной соляной кислоты. Фосфат натрия добавляли для забуферивания композиций, и хлорид натрия добавляли в качестве вспомогательного вещества для коррекции осмолярности композиции. Тестирование проводили при температуре хранения 5°C. Стабильность и pH композиций отслеживали в течение периода 14 дней. Мутность демонстрировала осаждение, развивающееся в растворе.
Таблица 3Стабильность композиции олигонуклеотида:кальция с буфером Tris
A. Стабильность в течение пятнадцати дней
Временной интервал
Описание образца
Визуальная оценка
рН
Ионообменная ВЭЖХ
Эксклюзионная ВЭЖХ
Чистота (площадь %)
Чистота (площадь %)
День 0
Лекарственный продукт
Прозрачный, бесцветный
7,451
93,39
99,3
Плацебо
Прозрачный, бесцветный
7,4
NA
NA
День 3
Лекарственный продукт
Прозрачный, бесцветный
7,522
NA
NA
Плацебо
Прозрачный, бесцветный
7,439
NA
NA
День 7
Лекарственный продукт
Прозрачный, бесцветный
7,331
NA
NA
Плацебо
Прозрачный, бесцветный
7,546
NA
NA
День 10
Лекарственный продукт
Прозрачный, бесцветный
7,484
93,53
99,2
Плацебо
Прозрачный, бесцветный
7,367
NA
NA
В. Стабильность в течение трех месяцев
<img file="00000049.jpg" he="158" wi="160" img-content="undefined" img-format="jpg" />
2
2
Стабильность композиции олигонуклеотида:кальция, забуференной Tris. Таблица 3A: Олигонуклеотид (112 мг/мл, 7,95 мМ) рецептировали с хлоридом кальция в HO в массовом соотношении 1:0,02 (молярном соотношении 1:2) и pH доводили до 7,5 с помощью небольшого количества разведенного гидроксида натрия и разведенной соляной кислоты. Tris (10 мМ конечная концентрация) добавляли для забуферивания композиции и раствор хлорида натрия добавляли в качестве вспомогательного вещества для регуляции осмолярности композиции. Тестирование проводили при температуре хранения 5°C. Стабильность и pH композиций отслеживали в течение периода 14 дней. Дополнительные оценки стабильности и целостности олигонуклеотида (чистота по ионобменной ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ) проводили в момент времени ноль и через 14 дней. Таблица 3В: длительная стабильность композиции олигонуклеотида:кальция. Олигонуклеотид (110 мг/мл, 7,8 мМ) рецептировали с хлоридом кальция в HO в массовом соотношении 1:0,018 (молярном соотношении 1:1,8), pH доводили до 7,5 и добавляли Tris (10 мМ конечная концентрация). pH, осаждение (визуальное наблюдение) и целостность олигонуклеотида (эксклюзионная ВЭЖХ, ионобменная ВЭЖХ) оценивали в течение 3 месяцев. Тестировали три варианта условий хранения: 5°C, 25°C и 40°C, со сходными результатами. Показаны результаты условий хранения при 5°C.
Специалисту в области техники очевидно, что множество модификаций, в отношении и материалов и методов, могут быть осуществлены без отклонения от рамок настоящего описания. Соответственно, настоящие варианты осуществления изобретения расцениваются как иллюстративные и не ограничивающие, и изобретение не ограничено подробностями, представленными в настоящем описании, а может быть модифицировано в рамках и эквивалентах приложенной формулы изобретения.
Все публикации и патенты, цитированные в настоящем описании, включены в виде ссылки полностью.