Детекция потенциально патогенных бактерий в солоноватых реках Приэльтонья методом высокопроизводительного секвенирования

20.Karuppiah V., Alagappan K., Li Zh. Coral Holobiont Omics: Microbes and Dinoflagellates. In: Marine OMICS: Principles and Applications (Ed. Se-Kwon Kim). Boca Raton: CRC Press, Taylor &Francis Group. 2016, 8:133-163.

21.Kouzuma A., Watanabe K. Exploring the potential of algae/bacteria interactions. Current Opinion in Biotechnology. 2015, 33: 125-129.

22.Krohn-Molt I., Wemheuer B., Alawi M. et al. Metagenome survey of a multispecies and alga-associated biofilm revealed key elements of bacterial—algal interactions in photobioreactors. Appl. Environ. Microbiol. 2013, 79(20): 6196-6206.

23.Lakaniemia A.-M., Hulatt C. J., Wakeman K. D. et al. Eukaryotic and prokaryotic microbial communities during microalgal biomass production. Bioresource Technology. 2012, 124: 387-393.

24.Microbiota of the Human Body, Advances in Experimental Medicine and Biology. (Ed. A. Schwiertz). Switzerland: Springer International Publishing, 2016.

25.Natrah F.M., Bossier P., Sorgeloos P. et al. Significance of microalgal-bacterial interactions for aquaculture. Rev. Aquaculture. 2013, 6: 48-61.

26.Papone T., Kookkhunthod S., Leesing R. Microbial oil production by monoculture and mixed cultures of microalgae and oleaginous yeasts using sugarcane juice as substrate. World Acad. Sci. Eng. Technol. 2012, 64: 1127-1131.

27.Ramanan R., Kim B.H., Cho D.H. et al. Algae-bacteria interactions: Evolution, ecology and emerging applications. Biotechnol. Adv. 2016. 34 (1): 14-29.

28.Rosenberg E., Zilber-Rosenberg I. Symbiosis and Development: The Hologenome Concept. Birth Defects Research (Part C). 2011,93: 56-66.

29. Santos C. A., Reis A. Microalgal symbiosis in biotechnology. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98 (13): 5839-5846.

30.Sule P., Belas R.A. Novel Inducer of Roseobacter Motility Is Also a Disruptor of Algal Symbiosis. J. Bacteriol. 2013, 195 (4): 637-646.

31.Takemura A.F., Chien D.M., Polz M.F. Associations and dynamics of Vibrionaceae in the environment, from the genus to the population level. Front Microbiol. 2014, 5 (38): 1-26.

32.Tate J. J., Gutierrez-Wing M. T., Rusch K. A. et al. The Effects of Plant Growth Substances and Mixed Cultures on Growth and Metabolite Production of Green Algae Chlorella sp. J. Plant Growth Regulation. 2013, 32 (2): 417-428.

33.Yan N., Fan C., Chen Y. et al. The Potential for Microalgae as Bioreactors to Produce Pharmaceuticals. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17 (6): 962-986.

34.Zilber-Rosenberg I., Rosenberg E. Role of microorganisms in the evolution of animals and plants: the hologenome theory of evolution. FEMS Microbiol. Rev. 2008, 32 (5): 723-735.

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018

Е.А.Селиванова1, Ю.А.Хлопко1, Н.Е.Гоголева2-3, А.О.Плотников1

ДЕТЕКЦИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНО ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ В СОЛОНОВАТЫХ РЕКАХ ПРИЭЛЬТОНЬЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

'Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург; 2Казанский институт биохимии и биофизики; 3 Казанский (Приволжский) федеральный университет

Цель. Выявить потенциально патогенных бактерий в планктоне солоноватых рек Приэльтонья методом высокопроизводительного секвенирования участка гена 16S рРНК. Материалы и методы. Образцы воды из солоноватых рек Ланцуг и Чернавка, впадающих в озеро Эльтон, отбирали в объеме 50 мл, фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. Тотальную ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции с предварительной гомогенизацией и ферментативным лизисом. ДНК-библиотеки для секвенирования создавали по протоколу Illumina с праймерами к вариабельному участку V3—V4 гена 16S рРНК. Секвенирование проводили на платформе MiSeq («Illumina», США). Результаты. В планктонных образцах солоноватых рек Приэльтонья были обнаружены филотипы потенциально патогенных бактерий филума Proteobacteria из семейств Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Campylobacteraceae,

Vibrionaceae, Aeromonadaceae, Moraxellaceae, Legionellaceae, Alcaligenaceae, Campylo-bacteraceae, а также филумов Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria. Вероятным источником бактериального загрязнения является крупный и мелкий рогатый скот. Заключение. Полученные данные демонстрируют, что солоноватые континентальные водоемы наряду с пресными и морскими выполняют резервуарную функцию для потенциально патогенных микроорганизмов. Высокопроизводительное секвенирование может быть использовано для скрининговой оценки присутствия патогенов в воде.

Журн. микробиол., 2018, № 4, С. 87-95

Ключевые слова: высокопроизводительное секвенирование, солоноватые водоемы, потенциально патогенные микроорганизмы, антропогенная нагрузка, бактериоплан-ктон, санитарное состояние

E.A.Selivanova1, Yu.А.Khlopko1, N.E.Gogoleva2-3, A.O.Plotnikov1

DETECTION OF POTENTIALLY PATHOGENIC BACTERIA IN THE BRACKISH RIVERS FLOWING INTO THE ELTON LAKE BY HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING

'Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg; 2Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics; 3 Kazan Federal University, Russia

Aim. To indicate potentially pathogenic bacteria in plankton of the brackish rivers flowing into the Elton Lake by high-throughput sequencing of 16S ssuRNA gene. Materials and methods. The water samples from brackish rivers Lantsug and Chernavka, flowing into the Elton Lake, were taken up in a volume of50 ml, filtered through membrane filters (pore diameter — 0.22 ^m). Total DNAwas obtained by phenol-chloroform extraction with preliminary homogenization and enzymatic lysis. DNA libraries for sequencing were created by protocol Illumina with primers to a variable V3—V4 region of16S ssuRNA gene. Sequencing was performed on a platform MiSeq («Illumina», США). Results.There were found the phylotypes of potentially pathogenic bacteria of Proteobacteria phylum from the families Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Campylobacteraceae, Vibrionaceae, Aeromonadaceae, Moraxellaceae, Legionellaceae, Alcaligenaceae, Campylobacteraceae, and also of Firmicutes, Bacteroidetes, Actinobacteria phyla in the plankton samples of the brackish rivers. Probable source of bacterial contamination is large and small cattle. Conclusion. These data demonstrate that the continental brackish waters, along with freshwater and marine habitats perform a reservoir function to potentially pathogenic microorganisms. High-throughput sequencing can be used to screen the presence of pathogens in water.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2018, No. 4, P. 87—95

Key words: high-throughput sequencing, brackish water bodies, potentially pathogenic bacteria, anthropogenic load, bacterioplankton, sanitary condition

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что патогенные и условно патогенные бактерии могут длительно персистировать в водных экосистемах, используя стратегии выживания, в основе которых лежит индивидуальный ответ бактериальных клеток на стресс или популяционная перестройка (адсорбция к частицам осадка, формирование биопленок или персистенция в организме гидробионтов). Многие виды бактерий способны длительно сохраняться в ассоциациях с простейшими [4]. Способствует сохранению патогенных микроорганизмов и их переходу из покоящегося в вирулентное состояние цветение микроводорослей в водоеме [15].

Существует более 100 признанных видов патогенных микроорганизмов, которые можно обнаружить в загрязненной воде рекреационного и питьевого назначения [15]. Несмотря на постоянные усилия по обеспечению безопасности воды, вспышки инфекций, связанных с передачей через воду, по-прежнему регистрируются по всему миру. Известна возможность передачи водным путем бактерий Salmonella и Campylobacter — частых возбудителей гастроэнтеритов, а также Vibrio cholerae, Shigella, Yersinia. Подробно изучена роль водной среды в передаче и распространении Legionella pneumophila, способной персистировать внутри клеток простейших. Список патогенных и условно патогенных микроорганизмов, для которых вода является вероятным фактором передачи, продолжает расширяться.

Морские водоемы, имеющие рекреационное значение, наряду с питьевыми источниками и морепродуктами являются важным фактором передачи инфекций водным путем. Примером могут быть случаи цистита, вызванного Vibrio cholerae не O1, у купающихся, тяжелой раневой инфекции, осложнившейся остеомиелитом, септицемией, поражением центральной нервной системы и эндометрита, возбудителем которых явился Vibrio alginolyticus из морской воды, а также гангрена и сепсис, вызванные Vibrio parahaemolyticus [13]. Значение континентальных соленых и солоноватых водоемов как резервуара для потенциально патогенных микроорганизмов изучено в меньшей степени, хотя многие из подобных водоемов активно используются в качестве курортной базы.

Последние публикации свидетельствуют о необходимости усиления мониторинга микробных агентов в водоемах для повышения возможностей раннего предупреждения и профилактики вспышек инфекционных заболеваний с водным путем передачи, особенно в условиях глобальных изменений климата [14].

Культуральные методы могут существенно недооценить присутствие патогенных бактерий в воде вследствие перехода жизнеспособных бактерий в некультивируемое состояние. Поэтому разрабатываются методы прямой детекции патогенов в образцах с использованием молекулярно-генетических методов, таких как ПЦР, мультиплекс-ПЦР, ПЦР в режиме реального времени, FISH-гибридизация, пиросеквенирование, технологии на основе микрочипов, которые позволяют осуществлять прямую детекцию определенных патогенов, идентифицировать, генотипировать, определять численность и жизнеспособность патогенных бактерий, вирусов и простейших, отслеживать источники загрязнения [5]. Использование современных молекулярно-гене-тических технологий важно для выявления источников загрязнений, устранения путей передачи инфекций и более реалистичной оценки уровня риска для здоровья населения. Среди таких методов одним из наиболее точных и перспективных является метагеномный анализ микробных популяций, который позволяет провести тотальную оценку состава микробного сообщества, выявив потенциально патогенные виды, включая некультивируемые формы.

Целью данной работы является детекция потенциально патогенных бактерий в планктоне солоноватых рек Приэльтонья методом высокопроизводительного секвенирования участка гена 16S рРНК на платформе MiSeq (Illumina).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Пробы воды из рек Чернавка и Ланцуг, впадающих в озеро Эльтон (Волгоградская область), были отобраны в августе 2015 г. Минерализация воды в среднем течении рек Ланцуг и Чернавка составляла 21 и 24 % соответственно. Образцы объемом 50 мл фильтровали через мембранные фильтры с

диаметром пор 0,22 мкм. Тотальную ДНК выделяли методом фенол-хлороформной экстракции с предварительной гомогенизацией и ферментативным лизисом. Для исключения возможной контаминации на этапе пробо-подготовки использовали отрицательный контроль. Чистоту ДНК контролировали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и фотометрии на приборе NanoDrop 8000 («Thermo Fisher Scientific Inc.», США). ДНК-библиотеки для секвенирования были созданы по протоколу Illumina с прайме-рами к вариабельному участку V3-V4 гена 16S рРНК S-D-Bact-0341-b-S-17 и S-D-Bact-0785-a-A-2l (Klindworth et al., 2013). Секвенирование проводили на платформе MiSeq («Illumina», США) с использованием набора реактивов MiSeq Reagent Kit V3 PE600 в Центре коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН.

Данные секвенирования обрабатывали комплексом биоинформационных программ USEARCH v8.0.1623_win32 [2], включая слияние парных ридов, фильтрацию ридов по качеству и длине (минимальный размер — 300 bp), удаление химер, даблтонов и синглтонов, кластеризацию ридов в ОТЕ на уровне сходства 97%. Таксономическую классификацию ОТЕ проводили с использованием интерактивного инструмента VAMPS с использованием базы данных RDP (http://rdp.cme.msu.edu). Некоторые ОТЕ выравнивали c использованием алгоритма BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) на базу данных нуклеотидных последовательностей nr/nt (NCBI).

РЕЗУЛ ЬТАТЫ

Методом высокопроизводительного секвенирования участка гена 16S рРНК изучен таксономический состав прокариот и проанализировано присутствие потенциально патогенных микроорганизмов (табл.) в планктоне двух солоноватых рек Ланцуг и Чернавка, впадающих в озеро Эльтон (Волгоградская область). Эти реки находятся на территории природного парка Эльтонский, что обусловливает минимальную антропогенную нагрузку. Однако в среднем течении р. Ланцуг проводится выпас крупного и мелкого рогатого скота.

В библиотеках исследованных образцов большинство филотипов потенциально патогенных бактерий относилось к филуму Proteobacteria. В образце из реки Ланцуг среди ОТЕ, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, присутствовали Pantoea vagans, Serratia spр., Rahnella aquatilis, а в образце из реки Чернавка — Escherichia coli, Providencia spр., Morganella morganii и не-идентифицированные представители семейства Enterobacteriaceae. Широко было представлено семейство Vibrionaceae, к которому относился 31 фило-тип из библиотеки образца р. Чернавки и 13 филотипов из р. Ланцуг, среди них большую часть составлял род Vibrio (24 и 10 ОТЕ соответственно), что объяснимо широким распространением галофильных видов вибрионов в природных водоемах. Наряду с видами, характерными для морской воды (V. kanaloae), морских беспозвоночных (V. tritonius) и рыб (V. anguillarum), были выявлены филотипы, близкие к патогенным для человека V. cholerae O1 biovar El Tor и V. alginolyticus (возбудители гастроэнтеритов и раневой инфекции). Семейство Pseudomonadaceae было представлено 2 ОТЕ в образце р. Чернавка и 15 в образце р. Ланцуг, из которых 10 относились к роду Pseudomonas. Среди них присутствовали ОТЕ, принадлежащие к условно патогенным видам Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas stutzeri. Семейство Moraxellaceae было представлено в образце р. Ланцуг 10 ОТЕ, относящими-

Последовательности фрагментов гена 16S рРНК потенциально патогенных бактерий в планктонных образцах солоноватых рек Ланцуг и Чернавка

Филогенетическое положение ОТЕ (L-Ланцуг, Ch- Чернавка) Ближайший культивируемый гомолог в базе данных GenBank (NCBI) (видовое название) (Ac. №) Сходство с гомологом (%) Источник выделения

Proteobacteria L-359 Pantoea vagans (CP014129.2) 99 рана человека

Enterobacteriaceae L-2447 Serratia spp. ATCC 39006 (CP025084.1) 99 солончак, Нью-Джерси, США

L-3018 Enterobacter tabaci (MH005094.1) 99 водоем

Enterobacter cloacae (CP026975.1) 99 прямая кишка человека

L-1692 Rahnella aquatilis (LC191553.1) 99 не указан

L-639 Serratia marcescens (CP026702.1) 99 не указан

L-4214 Enterobacter spp. (KR189508.1) 98 водоем

Klebsiella aerogenes (CP026756.1) 98 не указан

Ch-1401 Escherichia coli (LC144553.1) 99 р. Махананда в Индии

Ch-1145 Providencia vermicola (KT325058.1) 99 с/х почва

Providencia rettgeri ATCC 29944 99 пациент с оппортунистической ин-

(FJ971874.1) фекцией

Ch-2213 Morganella morganii (KR610526.1) 99 кишечник Drosophila ше1апо§а81ег

Proteobacteria L- 77 Vibrio alginolyticus ATCC 33868 (CP014053) 99 морская вода

Vibrionaceae L- 91 Vibrio cholerae O1 biovar El Tor 99 пациент, больной холерой

Proteobacteria L- 381 Pseudomonas aeruginosa (MG546221.1) 99 не указан

Pseudomonadaceae Pseudomonas resinovorans (KT204486.1) 99 загрязненная нефтяными продукта-

ми почва

L-301 Pseudomonas sp. (HM038236.1) 99 экскременты носорога

Ch-3149 Pseudomonas stutzeri (KY643712.1) 99 ризосфера

Pseudomonas xanthomarina (KY617784.1) 99 компост из навоза свиней

Proteobacteria L-187 Acinetobacter spp. (KT372439.1) 99 компост

Moraxellaceae Acinetobacter lwoffi ATCC 17925 (U10 875.1) 98 не указан

L-3658 Acinetobacter johnsonii (MF372965.1) 98 вода

L-1863 Acinetobacter schindleri (KY616647.1) 97 свежий навоз

L-875 Acinetobacter beijerinckii (KM114925.1) 99 кожа жаб и лягушек

Ch -42-166 Acinetobacter lwoffii (LN774707.1) 99 образец воздуха в туристической

пещере

Ch -1898 Acinetobacter lwoffii (KY616668.1) 99 дренажная вода

Ch -4345 Acinetobacter calcoaceticus ( KC305040.1) 93 госпитальный штамм

L-1321 Alkanindiges hongkongensis (NR_115179.1) 96 пациент с абсцессом околоушной

железы

Proteobacteria Ch -1880 Aeromonas diversa 99 поверхностный водоем

Aeromonadaceae

L-738 Aeromonas intestinalis (LT630759.1) 99 фекалии человека

Proteobacteria L-218 Legionella donaldsonii (KM504126.1) 99 пациент с раком

Legionellaceae L-1701 Legionella pneumophila (LT906452.1) 96 легкие человека

L-3825 Legionella pneumophila OLDA 97 пациент, больной легионеллезом

Proteobacteria Ch -380 Francisella philomiragia (KU593488.1) 99 пациент

Francisellaceae

Proteobacteria L-646 Alcaligenes sp. (AJ133493.2) 99 пациент с септическим артритом

Alcaligenaceae L-2867 Achromobacter pulmonis (KP318449.1) 99 нематоды

L-30 Bordetella spp. (KF851340.1) 98 поверхностные морские воды

Ch -90 99

Proteobacteria L-66 Arcobacter cryaerophilus (KT225286) 98 содержимое матки коровы

Campylobacteraceae

L-486 Arcobacter defluvii (MG195894.1) 99 дренажная вода

L-2265 Arcobacter spp. (LT629995.1) 98 сточные воды

L-627 Arcobacter skirrowii (MG195899.1) 99 канал, загрязненный городскими

сточными водами

Ch -54 Arcobacter bivalviorum (MF155896.1) 99 моллюски

Firmicutes L-157 Staphylococcus equorum ( MG937677.1) 99 кожа здоровых лошадей

Staphylococcaceae

Firmicutes L-2306 Enterococcus spp. 99 кишечник червя

Enterococcaceae MF134667.1

Enterococcus gallinarum (CP014067.2) 99 локтевая ямка человека

Bacteroidaceae L-1019 Bacteroides ihuae (NR_147391.1) 98 мокрота человека

Bacteroidetes

Actinobacteria L-3759 Mycobacterium paraense (KJ949001.1) 98 легкие человека

Mycobacteriaceae

ся к родам Acinetobacter, Alkanindiges, Psychrobacter, в р. Чернавка — 3 ОТЕ рода Acinetobacter. Наряду с повсеместной распространенностью этих свободно живущих сапрофитов, среди них выявлены представители, способные вызывать оппортунистические инфекции: Acinetobacter lwoffi, A. johnsonii, A. schindleri, A. beijerinckii, A. calcoaceticus, Alkanindiges hongkongensis. Внутри семейства Aeromonadaceae были обнаружены ОТЕ, близкие к Aeromonas intestinalis, выделенному у пациента с гастроэнтеритом [3] и A. diversa, выделенному из гнойной раны [9].

В образце из р. Чернавка было обнаружено 12 ОТЕ неидентифицирован-ных представителей семейства Legionellaceae, в образце р. Ланцуг — 3 ОТЕ, две из которых были отнесены к хорошо известному патогенному виду рода Legionella — L. pneumophila, вызывающему тяжелую пневмонию, и один — к L. donaldsonii, для которого недавно была описана способность вызывать пневмонию у пациентов с онкологическими заболеваниями [6]. Эта находка интересна, поскольку об обнаружении этих микроорганизмов в морских водоемах имеются лишь единичные данные, и традиционно считается, что легионеллы не способны к выживанию и персистенции в соленых водоемах. Вероятно, сохранению легионелл способствует персистенция внутри клеток галофильных протистов, способствующая увеличению их вирулентности [4].

Семейство Francisellaceae было представлено 4 ОТЕ в р. Чернавка, из которых одна была идентифицирована как Francisella philomiragia — патогенный для человека вид, и 1 ОТЕ в р. Ланцуг идентифицирована как F. endociliophora

Семейство Alcaligenaceae было представлено в р. Ланцуг 9 ОТЕ, относительное обилие которых составило 1,16% от общей численности ридов. Среди них были обнаружены филотипы Alcaligenes sрp., Achromobacter pulmonis, которые широко распространены в объектах окружающей среды, но могут вызывать оппортунистические инфекции у людей. В образцах обеих рек также зарегистрировано присутствие неидентифицированных до вида бактерий рода Bordetella, лишь отдельные представители которого, например Bordetella petrii, обитают во внешней среде.

Семейство Campylobacteraceae, самое крупное и наиболее разнообразное среди класса Epsilonproteobacteria, составляло значительную долю среди всех ОТЕ образцов. Среди них обнаруживались представители непатогенного рода SulfUrospirillum и малоизученного рода Arcobacter, среди представителей которого описаны виды, способные вызывать заболевания человека. К роду Arcobacter было отнесено 28 ОТЕ из образца р. Чернавка (8,91%), 20 — из образца р. Ланцуг (1,83%). Несмотря на высокие показатели относительного обилия, потенциально патогенных видов в Чернавке выявлено не было, в основном это были азотфиксирующие A. nitrofigilis и другие свободножи-вущие представители морского бактериопланктона. Единственный вид, о патогенности которого нет данных — это выделенный ранее из моллюсков A. bivalviorum. Напротив, в реке Ланцуг были выделены ОТЕ, наиболее сходные с A. cryaerophilus и A. skirrowii, способными вызывать развитие инфекционного процесса у человека и животных (энтерит, бактериемия) и филотип A. defluvii, выделявшийся ранее из сточных вод [7].

Среди филума Firmicutes также были обнаружены условно патогенные представители. Так, в образце из р. Ланцуг были выявлены филотипы Enterococcus sрp. и Staphylococcus equorum, вида, который является пред-

ставителем нормофлоры и обладает низкой вирулентностью, однако описаны случаи его выделения из клинических образцов как животных, так и человека [11]. Кроме того, среди фирмикут были разнообразно представлены филотипы, относящиеся к семействам Lachnospiraceae (роды Roseburia, Cellulosilyticum, Blautia и др.), Ruminococcaceae, Clostridiaceae, которые, по данным метагеномных исследований, составляют большую долю кишечного микробиома млекопитающих [12]. Большинство из этих последовательностей не были идентифицированы. Важно отметить, что семейство Lachnospiraceae некоторыми исследователями предлагается в качестве альтернативного индикатора фекального загрязнения воды. Также в образцах обнаруживались единичные ОТЕ, принадлежащие к семействам Peptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Erysipelotrichaceae, представители которых присутствуют в микробиоме кишечника, что может свидетельствовать о фекальном загрязнении исследуемых рек Приэльтонья.

Среди представителей филума Bacteroidetes были выявлены филотипы, принадлежащие к роду Bacteroides (6 ОТЕ — в р. Ланцуг, 7 ОТЕ — в р. Чернавка), которые наряду с обитанием в кишечнике могут выступать в качестве этиологического фактора «анаэробных» инфекций и также рассматриваются как возможный индикатор фекального загрязнения. Среди Actinobacteria был зарегистрирован филотип, близкий к Mycobacterium paraense, выделенной из образца легких.

Обращает на себя внимание присутствие большого числа филоти-пов, являющихся симбионтами простейших, таких как бактерии родов Polynucleobacter, Neochlamydia, Parachlamydia, семейства Rickettsiaceae и др., что свидетельствует о хороших условиях для формирования симбиотических связей между простейшими и бактериями в солоноватых континентальных водоемах и, возможно, о существенной роли протистов в персистенции патогенных и условно патогенных бактерий.

ОБСУЖДЕН И Е

Анализ полученных данных позволил выявить в планктоне солоноватых рек Приэльтонья бактерий организменного происхождения, в том числе и потенциально патогенных. Обнаруженные филотипы согласуются с многочисленными публикациями о регистрации патогенных микроорганизмов в морской воде, таких как Vibrio (нетоксигенные V. cholerae, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus и др.) [10], Staphylococcus aureus [8], псевдомонады и Escherichia coli [1].

Вероятным источником бактериального загрязнения солоноватых рек Приэльтонья является крупный и мелкий рогатый скот, о чем свидетельствует обнаружение в большом количестве в планктонных образцах представителей семейств Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Clostridiaceae, Peptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Erysipelotrichaceae, порядка Bacteroidales, составляющих большую долю нормальной микрофлоры кишечника, а также представителей рода Arcobacter, поражающих домашних животных и вызывающих диарею у людей, для которых была показана возможность водного пути передачи [5]. Вероятно, данные микроорганизмы попадают в воду непосредственно при выпасе скота, как наблюдается в среднем течении р. Ланцуг, или за счет дождевых стоков с прилегающих территорий, как происходит в реке Чернавка. Полученные результаты демонстрируют, что соленые континен-

тальные водоемы, наряду с пресными и морскими, выполняют резервуарную функцию для потенциально патогенных микроорганизмов. Рекреационное значение подобных водоемов и частое использование как курортной базы делает необходимым мониторинг их экологического и санитарного состояния.

Применение метода высокопроизводительного секвенирования открывает широкие возможности для преодоления существующих ограничений традиционных методов оценки микробиологической безопасности водных источников. Метод позволяет осуществлять прямую детекцию патогенов в образце, а не судить косвенно о возможном их присутствии по индикаторным видам; может применяться к образцам из самых различных объектов; позволяет обнаружить некультивируемые микроорганизмы и получить информацию о новых, неизученных или малоизученных видах, в том числе и патогенных. Все эти достоинства делают перспективным использование методов высокопроизводительного секвенирования для скрининговых исследований с целью оценки спектра потенциально патогенных микроорганизмов в водоеме. Однако, несмотря на преимущества, метод имеет ряд существенных недостатков и ограничений, так как обнаружение ДНК микроорганизмов не дает информации об их жизнеспособности, вирулентности и абсолютном содержании, а соответственно степени риска для населения. Длина последовательностей, расшифровать которые можно на платформе MiSeq, ограничена 550 н.п., что делает затруднительной идентификацию на уровне вида. Таким образом, необходимо совершенствование методических подходов к оценке качества воды, в том числе и в континентальных солоноватых водоемах, и расширение данных о микробном составе микроорганизмов различных биотопов с целью разработки алгоритмов оценки рисков здоровью человека из-за наличия патогенов в воде.

Работа выполнена в ЦКП «Персистенция микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (Оренбург) и частично поддержана грантами РФФИ №№ 16-44-560316 и 17-04-00135.

Л ИТЕРАТУРА

1. Davies C.M., Long J.A.H., Donald M., Ashbolt N.J. Survival of Fecal Microorganisms in Marine and Freshwater Sediments. Appl. Env. Microbiology. 1995, 61 (5):1888-1896.

2. Edgar R.C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics. 2010, 26 (19): 2460-2461. doi: 10.1093/bioinformatics/btq461.

3. Figueras M. J., Latif-Eugenнn F., Ballester F. et al. Aeromonas intestinalis and Aeromonas enterica isolated from human faeces, Aeromonas crassostreae from oyster and Aeromonas aquatilis isolated from lake water represent novel species. New Microbe and New Infect. 2017, 15: 74-76.

4. Gast R.J., Moran D.M., Dennett M.R. et al. Amoebae and Legionella pneumophila in saline environments. J. Water Health. 2011, 9(1): 37-52.

5. Girones R., Ferrus M.A., Alonso J.L. et al. Molecular detection of pathogens in water. The pros and cons of molecular techniques. Water Research. 2010, 44: 4325-4339.

6. Han X.Y, Ihegword A., Evans S.E. et al. Microbiological and Clinical Studies of Legionellosis in 33 Patients with Cancer. J. Clin. Microbiol. 2015, 53 (7): 2180-2187.

7. Lastovica A.J., On S.L.W., Zhang L. The Family Campylobacteraceae. In: Rosenberg E. et al. (Ed.). The Prokaryotes. Springer, Berlin, Heidelberg, 2014.

8. Levin-Edens E., Bonilla N., Meschke J. Scott et al. Survival of environmental and clinical strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in marine and fresh waters. Water Research. 2011, 45: 5681-5686.

9. Micana-Galbis D., Farf6n M., Gaspar Loren J. Proposal to assign Aeromonas diversa sp. nov. as a novel species designation for Aeromonas group 501. Systematic Applied Microbiology. 2010, 33: 15-19.

10.Ng C., Goh S.G., Saeidi N. et al. Occurrence of Vibrio species, beta-lactam resistant Vibrio species, and indicator bacteria in ballast and port waters of a tropical harbor. Science of the Total Environment. 2018, 610-611: 651-656.

11.Novakova D., Sedlacek I., Pantucek R. Staphylococcus equorum and Staphylococcus succinus isolated from human clinical specimens. J. Medical Microbiology. 2006, 55: 523-528.

12. Rajilic -Stojanovic M.,deVosWM.The first 1000 cultured speciesofthe human gastrointestinal microbiota. FEMS Microbiol. Rev. 2014, 38 (5): 996-1047.

13.RamHrez-Castillo F.Y, Loera-Muro A., Jacques M. et al. Waterborne Pathogens: Detection Methods and Challenges. Pathogens. 2015, 4: 307-334.

14.Robins P.E., Skov M.W., Lewis Matt J. et al. Impact of climate change on UK estuaries: A review of past trends and potential projections. Estuarine Coastal Shelf Science. 2016, 169: 119-135.

15.Rose J.B., Epstein P.R., Lipp E.K. et al. Climate Variability and Change in the United States: Potential Impacts on Waterand Foodborne Diseases Caused by Microbiologic Agents Environmental Health Perspectives. 2001, 109 (suppl. 2): 211-221.

© Т.Н.ЯЦЕНКО-СТЕПАНОВА, М.Е.ИГНАТЕНКО, 2018

Т.Н.Яценко-Степанова, М.Е.Игнатенко

ПОТЕНЦИАЛЬНО ОПАСНЫЕ CYANOBACTERIA ЛЕЧЕБНЫХ ГРЯЗЕЙ

Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург

Цель. Определение видового состава Cyanobacteria грязе-рапного участка реки Тузлукколь и выявление потенциально опасных представителей данной группы микроорганизмов. Материалы и методы. Исследовано 270 образцов (из них 135 количественные), отобранных в весенне-осенний период 2012-2017 гг. в соответствии с общепринятыми методиками. Идентификацию цианобактерий проводили согласно определителям отечественных и зарубежных авторов, для подсчета численности использовали камеру Нажотта объемом 0,01 см3, биомассу определяли расчетно-объемным методом. Результаты. Выявлено 25 видов, разновидностей и форм Cyanobacteria. Четыре рода (Anabaena, Oscillatoria, Nodularia и Lyngbya) — потенциально способны продуцировать гепато-, нейро- и дерматотоксины. Общее количество цианобактерий в отдельные периоды превышало показатели, рекомендованные ВОЗ в водах для купания почти в 5 раз. Заключение. Результаты исследования доказывают необходимость систематического контроля Cyanobacteria (видовой состав и количественное развитие), без которого используемый населением в бальнеологических целях грязе-рапный участок не может считаться безопасным для здоровья людей.

Журн. микробиол., 2018, № 4, С. 95—100

Ключевые слова: Cyanobacteria, токсины, автотрофные микроорганизмы, минерализация T.N.Yatsenko-Stepanova, M.E.Ignatenko

POTENTIALLY DANGEROUS CYANOBACTERIA OF THERAPEUTIC MUD

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Orenburg, Russia

Aim. Determination of Cyanobacteria species composition in the Tuzlukkol River part with mud and brine and identification of potentially dangerous representatives of this group of microorganisms. Materials and methods. 270 samples were analyzed (135 of them — quantitatively), selected in the spring-autumn periods 2012-2017 in accordance with generally accepted methods. Identification of cyanobacteria was carried out according to the algae identification guides of domestic and foreign authors, the chamber of Najotta with a volume of 0.01 cm3 was used to calculate the algae quantity. The algae biomass was calculated taking into account the