СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕГИДРОГЕНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ
METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINATION OF DEHYDROGENASE ACTIVITY OF MICROORGANISMS

Изобретение относится к аналитическим способам определения ферментативной активности микроорганизмов и может быть использовано для оценки дегидрогеназной активности активного ила.
В настоящее время известен лишь один способ количественного определения дегидрогеназной активности микроорганизмов [Методические рекомендации по определению дегидрогеназной активности при технологическом контроле за работой аэротенков. - Министерство жилищно-коммунального хозяйства РСФСР Ордена Трудового Красного знамени, Академия коммунального хозяйства им. К.Д.Памфилова. - Москва, 1978]. Этот способ заключается в следующем: пробу микроорганизмов (активного ила) помещают в три центрифужные пробирки, доводят рН до 7 и центрифугируют. Затем из пробирок сливается надосадочная жидкость, и вместо нее добавляется водопроводная вода и неочищенная сточная вода. После перемешивания добавляют 0,5%-ный раствор 2,3,5-трифенилтетразол хлорида (ТТХ). Пробирки плотно закрывают, перемешивают и ставят в термостат на 55 минут при 37°С. Одновременно в термостат ставят четвертую пробирку с илом без ТТХ, служащую контролем. Через 55 минут пробы центрифугируются, надосадочная жидкость сливается и к осадку приливается 10 мл этанола. Содержимое пробирок перемешивается, а затем периодически встряхивается до полного обесцвечивания хлопьев ила, которое в зависимости от его качества происходит за 15-30 минут. После обесцвечивания пробы центрифугируются еще раз. Окрашенный спиртовой раствор из каждой пробы сливается в пробирку, перемешивается и колориметрируется на фотоэлектрическом колориметре (ФЭК) с синим светофильтром №5 (490 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5 см. Дегидрогеназная активность выражается в миллиграммах восстановленного формазана на 1 г сухого или беззольного вещества ила (удельная активность), или на 1 л смеси (общая активность).
Данный способ определения дегидрогеназной активности принят в качестве прототипа и характеризуется следующими недостатками:
1) длительность;
2) трудоемкость;
3) многостадийность;
4) продолжительность культивирования (55 минут). За это время клетка может выработать дополнительное количество необходимых ферментов. В то же время количество дегидрогеназ может уменьшаться за счет действия протеаз;
5) не учитывается специфика питательной среды для микроорганизмов (активного ила), поскольку при условии недостаточного углеродного питания скорость дегидрогеназной реакции будет определяться не непосредственно дегидрогеназной активностью, а концентрацией субстрата;
6) за такое длительное время и в случае нелинейности процесса одно и то же количество ТТХ может быть восстановлено различным количеством фермента;
7) не учитывается возможность содержания в микроорганизмах значительного количества веществ, способных восстанавливать ТТХ без наличия дегидрогеназ.
Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является разработка способа, позволяющего оперативно количественно оценить дегидрогеназную активность микроорганизмов и обладающего хорошей воспроизводимостью.
Это достигается тем, что при количественном определении дегидрогеназной активности микроорганизмов, предусматривающем их контакт с субстратом и акцептором водорода, в качестве акцептора водорода используют краситель метиленовый синий, а активность дегидрогиназ определяют по скорости изменения концентрации метиленового синего в линейной фазе ферментативной реакции.
О степени дегидрогеназной активности микроорганизмов в предлагаемом способе судят по убыли концентрации метиленового синего в ячейке, которую непрерывно регистрируют оптическим способом. Исследуемую суспензию микроорганизмов вводят в измерительную термостатируемую ячейку, включающую систему регистрации сигнала (светодиод, фотодатчик), в ячейке создаются анаэробные условия; сюда же вводят субстрат (например, глюкозу) и раствор метиленового синего в качестве акцептора водорода. Длительность эксперимента составляет 5-7 минут.
Иллюстративный пример реализации заявляемого способа включает выполнение следующих действий: в стакан измерительной ячейки на 100 мл вносили 60 мл дистиллированной воды, определенное количество тщательно перемешанной суспензии активного ила (1-2 мл), 1 мл 10%-ного раствора глюкозы. На стакан устанавливали крышку с встроенной системой регистрации сигнала измерительной ячейки. Доводили объем воды до метки (83 мл), обеспечивая анаэробные условия. После этого включали светодиод с фотодатчиком, мешалку. Помещали стакан в термостат и устанавливали требуемую температуру. После этого ожидали термостабилизации ячейки и стабилизации показаний фотодатчика, с помощью дозатора вводили 50 мкл 0,2%-ного раствора метиленового синего. Фотодатчик начинал фиксировать уменьшение концентрации метиленового синего в ходе ферментативной реакции.
В условиях избытка субстрата и акцептора водорода ход реакции линеен в течение примерно 300 секунд, по истечении которых процесс измерения останавливали. Показания фотодатчика фиксировали один раз в секунду, поэтому аппроксимировали показания прибора от времени по линейной зависимости (фиг.1).
Далее, исходя из тангенса наклона указанной линейной зависимости, соответствующей линейной фазе ферментативной реакции, рассчитывали дегидрогиназную активность, составляющую в данном случае
На фиг.2 установлена взаимосвязь между показаниями прибора (фотодатчика) и количеством внесенного в ячейку метиленового синего, характеризующаяся уравнением у=-0,02512х+1137,2263. То есть определено, что в используемом диапазоне концентраций увеличение показаний прибора на 1 соответствует уменьшению содержания метиленового синего в ячейке на 0,02512 нмоля. Вносимые в ячейку микроорганизмы, как правило, значительно рассеивают и поглощают свет, увеличивая коэффициент 1137,2263, однако величина 0,02512 остается неизменной.
В целом приведенные расчеты поясняют, что скорость протекания реакции равна W=10,68·0,02512 нмоль/с и с учетом того, что для реакции взято 2 мл суспензии микроорганизмов активность ферментов А=10,68·0,02512·60/2=8,05 нмоль/(мин·мл), где 60 - перевод в минуты.
Таким образом, исходя из тангенса наклона указанной линейной зависимости, соответствующей линейной фазе ферментативной реакции, рассчитывали дегидрогиназную активность, составляющую в данном случае 8,05 нмоль/(мин·мл).
В целом формулу расчета дегидрогеназной активности, исходя из тангенса угла наклона зависимости (фиг.1) и концентрации метиленового синего, можно представить следующим образом:
-1
-1
где A - активность фермента, моль·мин·мл;
-1
С - концентрация метиленового синего, моль·мл;
p
V - объем реакционной ячейки (в примере 83 мл), мл;
V - объем пробы микроорганизмов, мл;
t - продолжительность ферментативной реакции, мин;
D - оптическая плотность реакционной смеси;
1
-1
К - коэффициент пропорциональности между С и D, равный произведению коэффициента экстинкции на длину пути света в растворе (закон Бугера-Ламберта-Бера (D=EL С)), мл·моль;
П - цифровые показания фотодатчика;
2
К - коэффициент пропорциональности между П и D;
p
2
1
VK/K - коэффициент пропорциональности между С и П с учетом объема реакционной ячейки, моль; определяется экспериментально (фиг.2). В нашем случае равен -0,02512.
-1
dП/dt - скорость изменения показаний прибора во времени, с.
Коэффициент 10,68 в уравнении у=10,68х+37205 является тангенсом угла наклона прямой при изучении ферментативной реакции (фиг.1).
Итоговая формула может быть представлена:
Средство (прибор) измерения оптической плотности, подходящее для определения, известны специалисту в данной области техники. В частности, может быть использован спектрофотометр (колориметр или аналоги), имеющий интерфейс с ЭВМ, обладающий термостатируемой ячейкой, обеспечивающий перемешивание раствора и определение оптической плотности или другой, связанной с ней, величины. Предварительно должна быть произведена калибровка между этой величиной и количеством метиленового синего в ячейке (что очевидно для специалиста в данной области техники).
Результаты экспериментов воспроизводимы, так как опираются не на одно-два измерения, а на несколько сотен. При этом погрешность составляет менее 5%.
Существенными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются следующие:
1) в качестве акцептора водорода используют метиленовый синий;
2) расходование метиленового синего определяют путем непрерывной регистрации концентрации метиленового синего фотометрическим способом;
3) регистрация изменения концентрации метиленового синего проводится в течение 5 минут;
4) количественно дегидрогеназная активность микроорганизмов выражается числом наномолей метиленового синего на единицу объема ила (массы сухого вещества микроорганизмов) в единицу времени.
Преимуществами предлагаемого способа по сравнению с прототипом является следующее:
1) быстрота (способ позволяет выполнить анализ за 5-7 минут);
2) значительное упрощение (меньше операций, автоматическая регистрация показаний, термостатирование);
3) исключение изменения концентрации дегидрогеназ, которое может происходить вследствие процессов, протекающих в живой клетке;
4) исключение влияния цветности среды, так как проводится измерение не абсолютного значения оптической плотности, а кинетики ее изменения, что особенно важно в случае окрашенных жидкостей сточных вод.