Гистоспектрофотометрическое и иммуногистохимическое исследование ренальной интратубулярной неоплазии в перитуморозной зоне рака почки

Гистоспектрофотометрическое и иммуногистохимическое исследование ренальной интратубулярной неоплазии в перитуморозной зоне рака почки

Т.М. Черданцева, И.П. Бобров, В.В. Климачев, В.М. Брюханов,

А.Ф. Лазарев, А.М. Авдалян, В.Я. Гервальд, Е.И. Сеченев

Алтайский ГМУ, Алтайский филиал ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Барнаул

Контакты: Татьяна Михайловна Черданцева drakon@agmu.ru

В работе изучены проявления ренальной интратубулярной неоплазии (РИН) в перитуморозной зоне (ПЗ) рака почки. Материалом для исследования послужил операционный материал от 42 больных. Средний возраст пациентов составил 57,4 + 1,4 года. Мужчин было 25, женщин — 17. С помощью гистологического, гистоспектрофотометрического и иммуногистохимического методов была исследована морфо-функциональная характеристика эпителия канальцев в ПЗ рака почки. Показано, что в ПЗ опухолей высокой степени злокачественности проявления РИН встречались значительно чаще, чем при опухолях низких степеней анаплазии. В опухолях высокой степени анаплазии в эпителии канальцев ПЗ отмечали увеличение ядер, плоидности и экспрессии А^,ЖШ, Ш-67, р53 и Ьс1-2. Наличие проявлений РИН в канальцевом эпителии ПЗ при раке почки следует учитывать при органосохраняющих операциях.

Ключевые слова: рак почки, перитуморозная зона, ренальная интратубулярная неоплазия

Histospectrophotometrical and immunohistochemistrical research of renal intratubular neoplasia in peritumourous zone of a renal carcinoma

T.M. Cherdantseva, I.P. Bobrov, V.V. Klimachev, V.M. Brjuhanov, A.F. Lazarev, A.M. Avdalyan, V.Ya. Gervald, E.I. Sechenev

The Altay state of medical university;

The Altay branch GU«The Russian oncological centre of N.N. Blohina» of the Russian Academy of Medical Science, Barnaul

In this work displays renal intratubular neoplasia (RIN) in peritumourous zone of a renal carcinoma have been studied. The object of our work, are the operative materials of 42patients. Middle age of patients has made 57,4 + 1,4year. Men was 25, women — 17. Characteristic of tubular epithelium in PZa renal carcinoma have been studied morphofunctional by means of histological, histospectrophotometrical and immunohistochemistrical methods. It is shown, that in PZ tumors of a high degree displays, of RIN much more often, than in tumors of low degree ana-plasia. In tumors of a high degree anaplasia in tubular epithelium PZ registered increasing of nucleus, ploidy and expression of AgNORs, Ki-67, p53 and bcl-2. The presence of displays RIN in tubular epithelium PZ at a renal carcinoma should be considered at surgery operations.

Key words: renal carcinoma, peritumourous zone, renal intratubular neoplasia

Введение

Проблема предраковых изменений относительно почечно-клеточного рака (ПКР) остается малоизученной [1]. Одним из первых сообщений о наличии морфологических изменений в тубулярном эпителии в виде гиперплазии извитых канальцев и их отношение к ПКР принадлежит A. Prinke (1936). Данные изменения автор рассматривал как компенсаторные по периферии рубца. Использование термина «дисплазия эпителия канальцев» принадлежит R. Warter (1983). В 1994 г. W. Мourad и соавт. [2] впервые описали зоны интратубулярной эпителиальной дисплазии в периту-морозной зоне (ПЗ) при ПКР, преимущественно в корковом слое, которые выявлялись более чем в 25 % случаев. В последующей работе они выявили такие зоны уже в 54 % случаев. K. Ybrycoglu и соавт. [3] описали подобные изменения у 14 (23 %) из 62 больных ПКР, причем в 3 (5 %) случаях в виде карциномы in situ. Зоны пролиферации и дисплазии эпителия сосочковых

протоков, связанные с развитием рака собирательных протоков, впервые были описали S. Fleming и H. Lewi (1986), а также S. Kinnedy и соавт. [4].

В 2000 г. группой европейских патологов для обозначения указанных изменений был предложен термин «ренальная интратубулярная неоплазия» (РИН). Последняя обычно представлена в виде зон, расположенных невдалеке от опухолевого узла и нередко ассоциирующихся с явлениями нефросклероза. Эпителиальные клетки в таких зонах варьируют в размере, и их ядра увеличены [5].

В литературе имеется небольшое количество работ, посвященных гистоспектрофотометрическому и имму-ногистохимическому (ИГХ) исследованию РИН. Так, было показано, что положительная корреляционная связь между показателями экспрессии PCNA, K-ras и c-erb-B-2 в опухолевой ткани и очагах РИН служит веским аргументом в пользу предракового характера РИН [6].

Цель исследования — гистоспектрофотометричес-кое и ИГХ-исследование эпителия канальцев в ПЗ рака почки.

Материалы и методы

Изучен операционный материал 42 больных ПКР. Средний возраст пациентов составил 57,4 ± 1,4 года. Мужчин было 25 (59,5 %), женщин — 17 (40,5 %). По гистологическому строению опухоли были представлены следующим образом: светлоклеточный рак — 28 случаев; зернистоклеточный рак — 8; папиллярный рак — 5 и саркоматоидный рак — 1.

При группировке опухолей по клиническим стадиям (1-ГУ) было выделено: I стадии (ТШ0М0) соответствовали 22 (52,4 %) наблюдения; II стадии (Т2ШМ0) — 1 (2,4 %) наблюдение; III стадии (ТШ1М0, Т2ШМ0, Т3ШМ0, Т3ММ0) — 8 (19 %) и IV стадии

(Т4№М0, Т4ММ0, Т(любая)К2М1, Т(любая)^(любая)М1) —

11 (26,2 %) наблюдений. Степень злокачественности оценивали по классификации Б.А. Fuhrman и соавт. (1982) [7]. В изученном материале было 2 (4,8 %) опухоли степени анаплазии Gl; 11 (26,2 %) опухолей степени анаплазии G2; 22 (52,4 %) — степени анаплазии Gз и 7 (16,7 %) — степени G4.

Материал забирали из центра опухоли, ПЗ (за ПЗ принимали непосредственно прилежащую в псевдокапсуле опухолевую ткань, псевдокапсулу и ткань, расположенную за псевдокапсулой до неизмененной ткани почки) и неизмененной ткани почки, из максимально отдаленных от опухоли участков. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, на коллаген по ван Гизону и на эластические волокна резорцин-фуксином по Вейгерту.

В процессе исследования больные были разделены на 2 группы. В 1-ю группу вошли пациенты с диплоидными, триплоидными (в среднем 3,4 с) опухолями небольшого размера (< 7 см), степени злокачественности Gl_2, с низкими значениями AgNORs (< 5 AgNORs) и отсутствием метастазов. Во 2-ю группу были включены больные с полиплоидными и анеуплоидными (в среднем 5,6 с) опухолями большого размера (> 7 см), степенями злокачественности Gз_4, с высокими значениями AgNORs (> 5 AgNORs) и наличием метастазов.

Активность аргирофильных белков, ассоциированных с областью ядрышкового организатора (AgNOR) выявляли с помощью 2-ступенчатого метода по У Daskal и соавт. [8] в нашей модификации [9].

Морфометрическое и гистоспектрофотометричес-кое исследования проводили с использованием системы компьютерного анализа изображений, состоящей из микроскопа Ьеюа DМЕ, цифровой камеры Ьеюа ЕС3 (Ьеюа Microsystems AG, Германия), персонального компьютера и программного обеспечения ВидеоТест — Морфология 5.2. Плоидометрию ДНК

проводили на гистологических срезах, окрашенных по Фельгену. Среднее содержание ДНК в ядрах малых лимфоцитов принимали за диплоидное (2 с) и использовали в качестве стандарта. Для получения стандарта в каждом срезе оценивали 25-30 лимфоцитов. Затем в исследуемых клетках высчитывали индекс накопления ДНК (ИН ДНК) в единицах плоидности (с).

Уровень экспрессии молекулярно-биологических маркеров р53 (клон DO-7, DAKO), Bcl-2 (клон 124, DAKO), CD31 (клон JC70A, DAKO) и Ki-67 (клон MIB-1, DAKO) определяли при помощи ИГХ-метода по рекомендованным производителями протоколам.

Интенсивность ИГХ-окрашивания р53 оценивали как негативную (нет окрашивания), слабоположительную (< 5 % окрашенных клеток), умеренно положительную (> 5 % средней интенсивности окраски) и сильноположительную (> 5 % высокой интенсивности окраски).

При оценке ИГХ-окрашивания bcl-2 использовали полуколичественный метод: 0 баллов — отсутствие окрашивания; + (1 балл) — более 20 % клеток со слабой интенсивностью окрашивания цитоплазмы; ++ (2 балла) — умеренное окрашивание цитоплазмы; +++ (3 балла) — интенсивное окрашивание цитоплазмы; ++++ (4 балла) — интенсивное окрашивание цитоплазмы более чем 80 % клеток. В тех случаях, когда интенсивность окрашивания варьировала, например от + (1 балл) до ++ (2 балла), получали среднее —

1,5 балла. Когда выявляли равномерное окрашивание цитоплазмы всех клеток, цифра, характеризующая интенсивность окрашивания, была круглой: + (1), ++ (2), +++ (3) или ++++ (4 балла).

Пролиферативную активность (ПА) эпителия определяли путем выявления в ядрах клеток антигена Ki-67. Подсчет проводили на 1000 клеток на цифровых микрофотографиях с помощью морфометрической программы Image Tool 3.0, с последующим выражением результата в процентах. Индекс мечения (ИМ) маркера менее 5,0 % считали проявлением низкой, а 5,0 % и более — высокой ПА.

Подсчет микрососудов проводили, оценивая положительно окрашенный эндотелий к CD31. Плотность микроциркуляторного русла (ПМЦР) высчитывали при увеличении х 400 в 6 полях зрения (что составляло в абсолютных размерах площади 0,73 мм2).

Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0. При нормальном распределении данных при проверке статистических гипотез применяли методы параметрической статистики (t-test Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро—Уилка W = 0,89, p < 0,01), применяли тест Колмогорова-Смирнова или U-тест Манна-Уитни. Данные считали достоверными прир < 0,05.

f

& d£

%

h)

Рис. 1. ИМ Кг-67 в эпителии канальцев в ПЗ в группах исследования: а — низкий ИМ Кг-67 в эпителии канальцев в ПЗ в 1-й группе исследования; б — высокий ИМ Кг-67 эпителия канальцев в ПЗ во 2-й группе исследования. ИГХ-окрашивание; х 1000

б

а

Результаты

Результаты проведенного исследования показали, что гистологическое строение, ПМЦР, активность пролиферативных процессов и апоптоза в ПЗ в группах исследования зависели прежде всего от молекулярно-биологических и анатомических особенностей опухолей (табл. 1).

В ПЗ 1-й группы больных элементы канальцевого эпителия встречались в небольшом количестве. Они мало отличались от канальцев неизмененного эпителия почки. Число AgNORs составило 2,25 ± 0,2 на 1 ядро эпителия канальцев (табл. 2). Площадь ядра клеток в среднем составила 37,9 ± 2,0 мкм2. ИН ДНК составил 3,9 ± 0,2 с.

В ПЗ 2-й группы больных элементы канальцевого аппарата почки отмечали в большем количестве. Канальцы выглядели замурованными в плотной склеро-зированной и гиалинизированной соединительной ткани, с выраженным эластозом и содержали неболь-

Таблица 1. Биологические и клинико-анатомические параметры опухолей в группах исследования

шое число клеточных элементов. Клетки нефротелия имели признаки атипизма: полиморфизм, гиперхро-мию ядра и увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения. Число AgNORs в клетках нефротелия достигало 5,15 ± 0,35 на 1 ядро (см. табл. 2.). Средняя площадь ядра составила 54,2 ± 5,3 мкм2. ИН ДНК был равен 5,5 ± 0,2 с.

При ИГХ-исследовании в неизмененной ткани почки, взятой из максимально удаленных от опухоли участков, в канальцевом эпителии ИМ маркера пролиферации Ю-67 колебался от 0 до 8 % (в среднем

1,6 ± 0,6 %). При этом в неизмененном эпителии почки больных 1-й группы ИМ Ю-67 составил 1,0 ± 0,4 %, а во 2-й группе возрастал до 2,9 ± 1,1 %. ИМ Ю-67 в эпителии канальцев в ПЗ 1-й группы варьировал в пределах от 0 до 3 % и в среднем составил 1,8 ± 0,5, а во 2-й группе возрастал до 3,5 ± 0,9, пределы колебаний составили от 0 до 8 % (рис. 1а, б).

Таблица 2. Гистоспектрофотометрические параметры элементов ПЗ в группах исследования

Параметр опухолей Значение параметра

1-я группа 2-я группа

ИН ДНК, с 3,4 ± 0,1* 5,6 ± 0,2*

Количество AgNORs на 1 ядро 5,3 ± 0,2* 14,4 ± 0,5*

Размер опухолевого узла, см < 7 > 7

Степень анаплазии по Fuhrman (G) I, II III, IV

Наличие метастазов N- N+

*p < 0,05.

Параметр эпителия канальцев Значение параметра

1-я группа 2-я группа

Площадь ядра эпителия канальцев, мкм2 37,9 ± 2,0* 54,2 ± 5,3*

Количество AgNORs в эпителии канальцев 2,25 ± 0,2* 5,15 ± 0,35*

ИН ДНК, с 3,9 ± 0,2* 5,5 ± 0,2*

ПМЦР 23,4 ± 1,7* 43,5 ± 2,4*

*p < 0,05.

.*' ^ п. % л

# _5к» ^ 4 * ,

яітег-*а*а

*> : ' 9 ^

Рис. 2. Иммуноокрашивание Ьс1-2 в эпителии канальцев в ПЗ в группах исследования: а — отрицательное и слабое иммуноокрашивание на Ьс1-2 эпителия канальцев в ПЗ в 1-й группе исследования; б — умеренное и интенсивное иммуноокрашивание на Ьс1-2 эпителия канальцев в ПЗ во 2-й группе исследования. ИГХ-окрашивание; х 400

При исследовании экспрессии белка-супрессора апоптоза Ьс1-2 в неизмененной ткани почки иммуноокрашивание маркера обнаруживали во всех случаях и ее интенсивность в среднем составила 1,8 ± 0,1 балла. Результаты иммуноокрашивания Ьс1-2 в цитоплазме клеток эпителия канальцев в ПЗ в 1-й группе больных либо отрицательные (0 баллов), либо имеют слабую окраску (1 балл). В ПЗ 2-й группы экспрессия маркера в эпителии во всех случаях была интенсивной (3 и 4 балла) (табл. 3, рис. 2а, б).

При исследовании экспрессии гена-активатора апоптоза р53 в неизмененной ткани почки иммуноокрашивание маркера обнаруживали р53 во всех случаях, слабоположительное окрашивание отмечали в 86,9 %

случаев, умеренно положительное в 13,1 % случаев. Иммуноокрашивание ядер клеток эпителия канальцев в ПЗ на р53 в 1-й группе пациентов в 9,1 % случаев было отрицательным, в 72,7 % слабоположительным, в 9,1 % — умеренно положительным и в 9,1 % — сильноположительным. Во 2-й группе исследования отрицательной реакции не отмечено, слабоположительное окрашивание отмечали в 27,2 % случаев, умеренно положительное — в 36,4 % и сильноположительное — в 36,4 % (рис. 3а, б).

По данным ИГХ-анализа по выявлению маркера CD31 в неизмененной ткани почки, взятой из максимально удаленных от опухоли участков, число микрососудов колебалась от 12 до 104 (в среднем 47,8 ± 1,3).

Таблица 3. ИГХ-параметры пролиферации и апоптоза эпителия канальцев ПЗ в группах исследования

Интенсивность экспрессии маркера Группы пациентов

1-я 2-я

ВСЬ-2, баллы 0,6 3,8

р53, %:

негативное окрашивание 9,1 0

слабоположительное окрашивание 72,7 27,2

умеренно положительное окрашивание 9,1 36,4

сильноположительное окрашивание 9,1 36,4

ИМ Кь67 1,8±0,5* 3,5±0,9*

* р < 0,05.

Рис. 3. Иммуноокрашивание на р53 в эпителии канальцев в ПЗ в группах исследования: а — слабая интенсивность иммуноокрашивания р53 эпителия канальцев в ПЗ в 1-й группе исследования; б — сильная интенсивность иммуноокрашивания р53 эпителия канальцев в ПЗ во 2-й группе исследования. ИГХ-окрашивание; х 1000

. .Л. №*г 4^*4. 5 а*.

— - &

• V Чз*

V -Ч/,. I

С

йг,;

Рис. 4. Иммуноокрашивание на СВ31 в эндотелии сосудов в ПЗ в группах исследования: а — небольшое количество сосудов в ПЗ в 1-й группе исследования; б — большое количество сосудов в ПЗ во 2-й группе исследования. ИГХ-окрашивание; х 200

б

При этом в неизмененных почках 1-й группы больных ПМЦР составила 61,9 ± 1,8 %, а во 2-й группе уменьшалась до 39,9 ± 1,2. ПМЦР в ПЗ в 1-й группе пациентов составила 23,4 ± 1,7, а во 2-й группе достоверно увеличивалось до 43,5 ± 2,4 (рис. 4а, б).

Заключение

Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что в ПЗ рака почки возникают явления РИН, которые проявляются дисбалансом процессов пролиферации и апоптоза. Степень тяжести РИН зависит прежде всего от биологических и клинико-анатомических особенностей опухоли. Так, в ПЗ опухолей

высокой степени злокачественности по сравнению с опухолями низкой степени злокачественности в эпителии канальцев отмечали более высокие значения пло-идности и площади ядра, экспрессии AgNORs, Ю-67, р53, Ьс1-2 и активности ангиогенеза. Как известно, почка является «тихим» органом в отношении пролиферации и поэтому было интересно отметить, что в неизмененной ткани почки отмечались аналогичные с ПЗ тенденции: чем выше была злокачественность и размер опухоли, тем более возрастала в эпителии канальцев почки экспрессия маркеров пролиферации и апоптоза, а активность ангиогенеза снижалась. Из этого может следовать, что почка реагирует на рост злокачественной

опухоли не только перитуморозной зоной, но и как орган в целом. По-видимому, динамику параметров изученных маркеров в ПЗ можно трактовать следующим образом: увеличение ИН ДНК может говорить о нарастающей нестабильности генетического материала в ядрах клеток; увеличение ИМ р53 может свидетельствовать о мутации данного гена; возрастание ИМ К1-67 говорит об увеличении пролиферативных процессов в эпителии; увеличение экспрессии AgNORs указывает на повышение скорости пролиферации и возрастание экспрессии Ьс1-2 указывает на блокаду апоптоза. Осо-

бенно следует отметить возрастание экспрессии ингибитора апоптоза Ьс1-2, активность которого может способствовать выживанию патологических пулов клеток, образующих РИН.

Таким образом, на фоне склеротических процессов в условиях гипоксии в прилежащих к опухоли областях формируются очаги РИН, тяжесть которой непосредственно зависит от биологических и клинико-анатомических особенностей опухоли, что следует учитывать при органосберегающих операциях при раке почки.

ЛИТЕРАТУРА

1. Непомнящий В.М., Романенко А.М., Данилец Р.О. Ренальная интратубулярная неоплазия — предрак? Материалы I конгресса Российского общества онкоурологов. Москва, 4-5 октября, 2006. С. 156-157 Mourad W.A., Nestok B.R., Saleg G.Y. et al. Dysplastic tubular epithelium in «normal» kidney associated with renal cell carcinoma. Am J Surg Pathol 1994;18:1117-24.

2. Yorukoglu O.K., Aktas S., Mungan S.U., Kirkali Z. Tubular dysplasia and carcinoma in situ: precursor of renal cell carcinoma.

Urol 1999;53:684-9.

3. Kennedy S., Merino M., Lineham W. et al. Collecting duct carcinoma of the kidney.

Hum Pathol 1990;21:449-53.

4. Романенко А.М. Иммуногистохимическая диагностика опухолей почек. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Под ред. С.В. Петрова

и Н.Т. Райхлина. 2004.

5. Романенко А.М., Возианов А.М., Непомнящий В.М. и др. Реальная интра-тубулярная неоплазия как предрак почки. Урология 2003;(4):4-9.

6. Fuhrman S.A., Lasky L.C., Limas C.

Prognostic significance of morfologic parameters in renal cell carcinoma.

Am J Surg Pathol 1982;6:655-63.

7. Daskal Y., Smetana K., Buch H. Evedence from studies on segregated that nucleolar silver proteins C23 and B23 are in fibrillar components. Exp Cell Res 1980;127:285-91.

8. Бобров И.П., Авдалян А.М.,

Климачев В.В. и др. Модификация гистохимического метода выявления ядрышковых организаторов на гистологических срезах. Арх патол 2010; (3):35-7.