ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА
NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF TUBERCULOSIS MYCOBACTERIA

Изобретение, в основном, относится к микробиологии и фтизиатрии и может быть использовано для ускорения роста микобактерий туберкулеза на избирательных (элективных) питательных средах при посеве микроорганизмов, находящихся в образцах почвы, мокроты, промывных водах бронхов и др.
Известны многие стандартные питательные среды для выращивания микобактерий туберкулеза, например среда ФАСТ-3Л, которая содержит необходимые для роста микобактерий туберкулеза органические и неорганические вещества и биостимуляторы, например витамины и аминокислоту глицин, или сухая стандартная питательная среда Левенштейна-Йенсена, содержащая все необходимые для роста микобактерий туберкулеза вещества, например неорганические вещества, яичную массу, аминокислоту L-аспарагин и глицерин [1, 2]. Тем не менее главным недостатком этих питательных сред являются:
1) медленный рост микобактерий туберкулеза в силу их биологических особенностей - при первичном посеве материала рост микобактерий туберкулеза констатируется преимущественно через 14-29 суток, отдельных штаммов даже через 46-60 и более суток;
2) необходимость параллельного применения двух различных питательных сред;
3) необходимость пересевов исследуемого материала из-за отсутствия роста измененных и ослабленных форм микобактерий туберкулеза;
4) необходимость многократных биологических пассажей исследуемого материала на морских свинках, кроликах и других экспериментальных животных в случаях отсутствия роста микобактерий туберкулеза на стандартных питательных средах;
5) большие затраты времени, питательных сред и экспериментальных животных;
Целью изобретения является питательная среда для выращивания микобактерий туберкулеза на стандартной питательной среде.
Для выращивания микобактерий туберкулеза предлагается питательная среда, включающая в себя стерильный односуточный водный экстракт из сухих семян или сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, например кумарины, сапонины, полисахариды, гликопротеиды и другие, индуцирующие пролиферацию и дифференциацию клеток [3, 4, 5], которым перемешивается стандартная питательная среда, например ФАСТ-3Л, или сухая стандартная питательная среда, например Левенштейна-Йенсена. При этом рост микобактерий туберкулеза на среде ФАСТ-3Л, перемешанной стерильным односуточным водным экстрактом из сухих семян или сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, например, кумарины, сапонины, полисахариды, гликопротеиды и другие, индуцирующие пролиферацию и дифференциацию клеток, проявляется в среднем на 5-е сутки или ускоряется в 2,8 раза. Рост микобактерий туберкулеза на сухой стандартной питательной среде Левенштейна-Йенсена, перемешанной стерильным односуточным водным экстрактом из сухих семян или сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, например кумарины, сапонины, полисахариды, гликопротеиды и другие, индуцирующие пролиферацию и дифференциацию клеток, проявляется в среднем на 18-е сутки или ускоряется в 1,5 раза.
3
3
3
3
Предложенная питательная среда для выращивания микобактерий туберкулеза готовится следующим образом: сухие семена или сухие, предварительно измельченные вегетативные стебли растения-паразита повилики японской, содержащие биостимуляторы, промывают проточной водопроводной водой в течение 5 минут и просушивают в термостате при температуре +37°С до их полного высыхания. Затем взвешивают по 10 г отмытых в проточной водопроводной воде и просушенных в термостате при температуре +37°С сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащих биостимуляторы, вносят в стеклянную колбу и заливают 1 л дистиллированной воды. Стеклянную колбу с 10 г сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащих биостимуляторы, и 1 л дистиллированной воды закрывают ватно-марлевой пробкой и помещают на сутки в термостат при температуре 45-50°С для получения водного экстракта. Полученный водный экстракт из 10 г сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, фильтруют через марлевый фильтр, разливают в колбы, колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, поверх которых надевают бумажные колпачки, и стерилизуют в автоклаве при температуре +120°С и давлении 1 атм в течение 15 минут. Остывший стерильный водный экстракт из 10 г сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, в количестве 60 см добавляют в стеклянный флакон с 50 см стандартной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, например, ФАСТ-3Л. После перемешивания стерильного водного экстракта из 10 г сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, со стандартной питательной средой для выращивания микобактерий туберкулеза, например, ФАСТ-3Л предложенную питательную среду разливают в стерильные пробирки и свертывают (уплотняют) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затем стерильные пробирки с затвердевшими косяками предложенной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, состоящей из стандартной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, например, ФАСТ-3Л, перемешанной водным экстрактом сухих семян или сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащим биостимуляторы, например кумарины, сапонины, полисахариды, гликопротеиды, витамины и другие, которые индуцируют пролиферацию и дифференциацию клеток, выдерживают в термостате при температуре +37°С в течение 18-20 часов. Затвердевшие косяки предложенной питательной среды, приготовленной из 60 см стерильного водного экстракта, полученного из 10 г сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, и 50 см стандартной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, например, ФАСТ-3Л повторно свертывают (уплотняют) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 20 минут.
Остывший стерильный водный экстракт из 10 г сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, добавляют в герметически укупоренный градуированный флакон с сухой стандартной питательной средой для выращивания микобактерий туберкулеза, например Левенштейна-Йенсена, до метки «100», полностью смываем со стенок герметически укупоренного градуированного флакона сухую стандартную питательную среду для выращивания микобактерий туберкулеза, например Левенштейна-Йенсена, доливаем до метки «200» остывший стерильный водный экстракт из 10 г сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, и помещаем на 3 часа в термостат при +37С, периодически помешивая до полного растворения сухой стандартной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, например Левенштейна-Йенсена. После перемешивания и полного растворения сухой стандартной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, например Левенштейна-Йенсена, стерильным водным экстрактом из 10 г сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, предложенную питательную среду разливают в стерильные пробирки и свертывают (уплотняют) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Стерильные пробирки с затвердевшими косяками предложенной питательной среды для выращивания микобактерий, состоящей из сухой стандартной питательной среды, например Левенштейна-Йенсена, перемешанной и полностью растворенной водным экстрактом сухих семян или сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащим биостимуляторы, в течение 1 суток выдерживают в термостате при температуре +37°С. Затвердевшие косяки предложенной питательной среды, приготовленной из сухой стандартной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, например Левенштейна-Йенсена, и 200 см стерильного водного экстракта, полученного из 10 г сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, повторно свертывают (уплотняют) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 15 минут.
Принципиальное отличие предложенной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза от известной стандартной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, например, ФАСТ-3Л, содержащей биостимуляторы, заключается в том, что для выращивания микобактерий туберкулеза применяют стерильный водный экстракт из сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, например, кумарины, сапонины, полисахариды, гликопротеины и другие, индуцирующие пролиферацию и дифференциацию клеток, которым перемешивают стандартную питательную среду для выращивания микобактерий туберкулеза, например ФАСТ-3Л, содержащую биостимуляторы, например витамины и аминокислоту глицин. На предложенной питательной среде рост микобактерий туберкулеза проявляется в среднем на 5-е сутки или ускоряется в 2,8 раза, что позволяет повысить эффективность диагностики и дифференциальной диагностики туберкулезного процесса. Принципиальное отличие предложенной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза от известной сухой стандартной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, например Левенштейна-Йенсена, содержащей все необходимые для роста микобактерий туберкулеза вещества, например, неорганические вещества, яичную массу, аминокислоту L-аспарагин и глицерин, заключается в том, что для выращивания микобактерий туберкулеза применяют стерильный водный экстракт из сухих семян или сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, например, кумарины, сапонины, полисахариды, гликопротеины и другие, индуцирующие пролиферацию и дифференциацию клеток, которым перемешивают сухую стандартную питательную среду для выращивания микобактерий туберкулеза, например Левенштейна-Йенсена. На предложенной питательной среде рост микобактерий туберкулеза проявляется в среднем на 18 сутки или ускоряется в 1,5 раза, что позволяет повысить эффективность диагностики и дифференциальной диагностики туберкулезного процесса.
Для проверки эффективности предложенной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза суммарно проведено 98 опытных и контрольных исследований. Результаты исследований представлены в табл.1, табл.2 и фиг.1.
3
3
3
Исследование №1 (табл.1А I). 60 см стерильного водного экстракта из сухих семян растения-паразита повилики японской вносили в стеклянный флакон с 50 см стандартной питательной среды ФАСТ-3Л, перемешивали со средой ФАСТ-3Л и предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки. Разлитую в стерильные пробирки предложенную питательную среду свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затвердевшую косяками предложенную питательную среду выдерживали 18-20 часов в термостате при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 20 минут. Затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды засевали коллекционной культурой микобактерий туберкулеза. Посевы инкубировали при температуре +37°С. На 4,4±0,2 сутки на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии микобактерий туберкулеза (фиг.1а). Коллекционная культура микобактерий туберкулеза, посеянная на стандартную питательную среду ФАСТ-3Л, перемешанную с 60 см стерильной дистиллированной воды («контроль» на табл.1 и фиг.1), выросла на 14,3±0,2 сутки (р<0,001.)
3
3
3
Исследование №2 (табл.1Б 1). 60 см стерильного водного экстракта из сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской вносили в стеклянный флакон с 50 смстандартной питательной среды ФАСТ-3Л, перемешивали со средой ФАСТ-3Л и предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки. Разлитую в стерильные пробирки предложенную питательную среду свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. После этого затвердевшую косяками предложенную питательную среду выдерживали 18-20 часов в термостате при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 20 минут. Затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды засевали коллекционной культурой микобактерий туберкулеза. Посевы инкубировали при температуре +37°С. Через 5,3±0,2 суток на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии микобактерий туберкулеза (фиг.16). Коллекционная культура микобактерий туберкулеза, посеянная на стандартную питательную среду ФАСТ-3Л, перемешанную с 60 смстерильной дистиллированной воды («контроль» на табл.1 и фиг.1), выросла на 14,3±0,2 сутки (р<0,001.)
3
3
3
3
Исследование №3 (табл.1А II). 60 см стерильного водного экстракта из сухих семян растения-паразита повилики японской вносили в стеклянный флакон с 50 см стандартной питательной среды ФАСТ-3Л, перемешивали со средой ФАСТ-3Л и предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки. Разлитую в стерильные пробирки предложенную питательную среду свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затвердевшую косяками предложенную питательную среду выдерживали 18-20 часов в термостате при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 20 минут. В затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды высевали по 0,1 см жидкости из отстоявшейся почвенной суспензии, инфицированной коллекционной культурой микобактерий туберкулеза. Почвенную суспензию, инфицированную коллекционной культурой микобактерий туберкулеза, готовили следующим образом: в 30 г стерильной почвы, находившейся в стерильной колбе, градуированной пипеткой вносили 1 мг коллекционной культуры микобактерий туберкулеза в 1 см стерильной водопроводной воды. Стерильную пробирку с почвой, инфицированной 1 мг коллекционной культуры микобактерий туберкулеза, помещали в термостат и инкубировали при температуре 37°С в течение 72 часов. Затем к 30 г почвы, инфицированной 1 мг коллекционной культуры микобактерий туберкулеза, добавляли 100 см стерильной водопроводной воды и в течение 45 минут перемешивали на электрической качалке. Полученную почвенную суспензию отстаивали на протяжение 30 минут и после выпадения почвенных частиц в осадок жидкость использовали в качестве посевного материала. Посевы инкубировали в термостате при температуре +37°С. Через 4,5±0,3 сутки на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии коллекционной культуры микобактерий туберкулеза (фиг.1а). Коллекционная культура микобактерий туберкулеза, посеянная на стандартную питательную среду ФАСТ-3Л, перемешанную с 60 см стерильной дистиллированной воды («контроль» на табл.1 и фиг.1), выросла на 14,3±0,2 сутки (р<0,001).
3
3
3
3
3
3
Исследование №4 (табл.1Б II). 60 см стерильного водного экстракта из сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской вносили в стеклянный флакон с 50 смстандартной питательной среды ФАСТ-3Л, перемешивали со средой ФАСТ-3Л и предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки. Разлитую в стерильные пробирки предложенную питательную среду свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затвердевшую косяками предложенную питательную среду выдерживали 18-20 часов в термостате при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 20 минут. На затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды высевали по 0,1 см жидкости из отстоявшейся почвенной суспензии, инфицированной коллекционной культурой микобактерий туберкулеза. Почвенную суспензию, инфицированную коллекционной культурой микобактерий туберкулеза, готовили следующим образом: в 30 г стерильной почвы, находившейся в стерильной колбе, градуированной пипеткой вносили 1 мг коллекционной культуры микобактерий туберкулеза в 1 см стерильной водопроводной воды. Стерильную пробирку с почвой, инфицированной коллекционной культурой микобактерий туберкулеза, помещали в термостат и инкубировали при температуре 37°С в течение 72 часов. Затем к 30 г почвы, инфицированной коллекционной культурой микобактерий туберкулеза, добавляли 100 см стерильной водопроводной воды и в течение 45 минут перемешивали на электрической качалке. Полученную почвенную суспензию отстаивали на протяжение 30 минут и после выпадения почвенных частиц в осадок жидкость использовали в качестве посевного материала. Посевы инкубировали в термостате при температуре +37°С. Через 5,5±0,3 сутки на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии коллекционной культуры микобактерий туберкулеза (фиг.1а). Коллекционная культура микобактерий туберкулеза, посеянная на стандартную питательную среду ФАСТ-3Л, перемешанную с 60 смстерильной дистиллированной воды («контроль» на табл.1 и фиг.1), выросла на 14,3±0,2 сутки (р<0,001).
3
3
Исследование №5 (табл.1А III). 60 см стерильного водного экстракта из сухих семян растения-паразита повилики японской вносили в стеклянный флакон с 50 см стандартной питательной среды ФАСТ-3Л, перемешивали со средой ФАСТ-3Л и предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки. Разлитую в стерильные пробирки предложенную питательную среду свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затвердевшую косяками предложенную питательную среду выдерживали 18-20 часов в термостате при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 20 минут. Затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды засевали нейтрализованным 2 каплями соляной кислоты центрифугатом мокроты, предварительно обработанной 4%-ным раствором едкого натрия, от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких. Посевы инкубировали при температуре +37°С. Через 4,7±0,3 сутки на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии микобактерий туберкулеза (фиг.1а). При посеве нейтрализованного 2 каплями соляной кислоты центрифугата мокроты, предварительно обработанной 4%-ным раствором едкого натрия, от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких на стандартную питательную среду ФАСТ-3Л, перемешанную с 60 см стерильной дистиллированной воды, микобактерий туберкулеза выросли («контроль» на табл.1 и фиг.1) на 14,3±0,2 сутки (р<0,001).
3
3
3
Исследования №6 (табл.1Б III). 60 см стерильного водного экстракта из сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской вносили в стеклянный флакон с 50 смстандартной питательной среды ФАСТ-3Л, перемешивали со средой ФАСТ-3Л и предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки. Разлитую в стерильные пробирки предложенную питательную среду свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затвердевшую косяками предложенную питательную среду выдерживали 18-20 часов в термостате при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 20 минут. Затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды засевали нейтрализованным 2 каплями соляной кислоты центрифугатом мокроты, предварительно обработанной 4%-ным раствором едкого натрия, от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких. Посевы инкубировали при температуре +37°С. Через 5,8±0,4 суток на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие колонии микобактерий туберкулеза (фиг.1б). При посеве нейтрализованного 2 каплями соляной кислоты центрифугата мокроты, предварительно обработанной 4%-ным раствором едкого натрия, от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких на стандартную питательную среду ФАСТ-3Л, перемешанную с 60 см стерильной дистиллированной воды, микобактерии туберкулеза выросли («контроль» на табл.1 и фиг.1) на 14,3±0,2 сутки (р<0,001).
3
Исследование №7 (табл.2А I). Стерильный водный экстракт из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, добавляли в герметически укупоренный градуированный флакон с сухой стандартной питательной средой Левенштейна-Йенсена до метки «100», полностью смывали со стенок герметически укупоренного градуированного флакона сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, затем до метки «200» доливали стерильный водный экстракт из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, и помещали на 3 часа в термостат при +37°С, периодически помешивая до полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена. После полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена стерильным водным экстрактом из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки и свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затем стерильные пробирки с затвердевшими косяками предложенной питательной среды помещали в термостат, в течение 1 суток выдерживали при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 15 минут. Затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды засевали коллекционной культурой микобактерии туберкулеза. Посевы инкубировали при температуре +37°С. На 16,8±0,34 сутки на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии микобактерии туберкулеза (фиг.1а). Коллекционная культура микобактерий туберкулеза, посеянная на сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, перемешанную с 200 см стерильной дистиллированной воды («контроль» на табл.2 и фиг.1), выросла на 28,43±1,39 сутки (р<0,001).
3
Исследование №8 (табл.2Б 1). Стерильный водный экстракт из 10 г сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, добавляли в герметически укупоренный градуированный флакон с сухой стандартной питательной средой Левенштейна-Йенсена до метки «100», полностью смывали со стенок герметически укупоренного градуированного флакона сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, затем до метки «200» доливали стерильный водный экстракт из 10 г сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, и помещали на 3 часа в термостат при +37°С, периодически помешивая до полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена. После полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена стерильным водным экстрактом из 10 г сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки и свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затем стерильные пробирки с затвердевшими косяками предложенной питательной среды помещали в термостат, в течение 1 суток выдерживали при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 15 минут. Затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды засевали коллекционной культурой микобактерий туберкулеза. Посевы инкубировали при температуре +37°С. На 17,0±0,43 сутки на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии микобактерий туберкулеза (фиг.1б). Коллекционная культура микобактерий туберкулеза, посеянная на сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, перемешанную с 200 см стерильной дистиллированной воды («контроль» на табл.2 и фиг.1), выросла на 28,43±1,39 сутки (р<0,001).
3
3
3
3
Исследование №9 (табл.2А II). Стерильный водный экстракт из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, добавляли в герметически укупоренный градуированный флакон с сухой стандартной питательной средой Левенштейна-Йенсена до метки «100», полностью смывали со стенок герметически укупоренного градуированного флакона сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, затем до метки «200» доливали стерильный водный экстракт из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, и помещали на 3 часа в термостат при +37°С, периодически помешивая до полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена. После полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена стерильным водным экстрактом из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки и свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затем стерильные пробирки с затвердевшими косяками предложенной питательной среды помещали в термостат, в течение 1 суток выдерживали при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 15 минут. На затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды высевали по 0,1 см жидкости из отстоявшейся почвенной суспензии, инфицированной коллекционной культурой микобактерий туберкулеза. Почвенную суспензию, инфицированную коллекционной культурой микобактерий туберкулеза, готовили следующим образом: в 30 г стерильной почвы, находившейся в стерильной колбе, градуированной пипеткой вносили 1 мг коллекционной культуры микобактерий туберкулеза в 1 см стерильной водопроводной воды. Стерильную пробирку с почвой, инфицированной 1 мг коллекционной культуры микобактерий туберкулеза, помещали в термостат и инкубировали при температуре 37°С в течение 72 часов. Затем к 30 г почвы, инфицированной 1 мг коллекционной культуры микобактерий туберкулеза, добавляли 100 см стерильной водопроводной воды и в течение 45 минут перемешивали на электрической качалке. Полученную почвенную суспензию отстаивали на протяжение 30 минут и после выпадения почвенных частиц в осадок жидкость использовали в качестве посевного материала. Посевы инкубировали в термостате при температуре +37°С. На 18,3±0,53 сутки на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии коллекционной культуры микобактерий туберкулеза (фиг.1а). Коллекционная культура микобактерий туберкулеза, посеянная на сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, перемешанную с 200 см стерильной дистиллированной воды («контроль» на табл.2 и фиг.1), выросла на 28,43±1,39 сутки (р<0,001).
3
3
3
3
Исследование №10 (табл.2Б II). Стерильный водный экстракт из 10 г сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, добавляли в герметически укупоренный градуированный флакон с сухой стандартной питательной средой Левенштейна-Йенсена до метки «100», полностью смывали со стенок герметически укупоренного градуированного флакона сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, затем до метки «200» доливали стерильный водный экстракт из 10 г сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, и помещали на 3 часа в термостат при +37°С, периодически помешивая до полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена. После полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена стерильным водным экстрактом из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки и свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затем стерильные пробирки с затвердевшими косяками предложенной питательной среды помещали в термостат, в течение 1 суток выдерживали при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 15 минут. На затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды высевали по 0,1 см жидкости из отстоявшейся почвенной суспензии, инфицированной коллекционной культурой микобактерий туберкулеза. Почвенную суспензию, инфицированную коллекционной культурой микобактерий туберкулеза, готовили следующим образом: в 30 г стерильной почвы, находившейся в стерильной колбе, градуированной пипеткой вносили 1 мг коллекционной культуры микобактерий туберкулеза в 1 см стерильной водопроводной воды. Стерильную пробирку с почвой, инфицированной коллекционной культурой микобактерий туберкулеза, помещали в термостат и инкубировали при температуре 37°С в течение 72 часов. Затем к 30 г почвы, инфицированной коллекционной культурой микобактерий туберкулеза, добавляли 100 см стерильной водопроводной воды и в течение 45 минут перемешивали на электрической качалке. Полученную почвенную суспензию отстаивали на протяжение 30 минут и после выпадения почвенных частиц в осадок жидкость использовали в качестве посевного материала. Посевы инкубировали в термостате при температуре +37°С. На 18,7±0,68 сутки на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии коллекционной культуры микобактерий туберкулеза (фиг.1а). Коллекционная культура микобактерий туберкулеза, посеянная на сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, перемешанную с 200 см стерильной дистиллированной воды («контроль» на табл.2 и фиг.1), выросла на 28,43±1,39 сутки (р<0,001).
3
Исследование №11 (табл.2А III). Стерильный водный экстракт из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, добавляли в герметически укупоренный градуированный флакон с сухой стандартной питательной средой Левенштейна-Йенсена до метки «100», полностью смывали со стенок герметически укупоренного градуированного флакона сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, затем до метки «200» доливали стерильный водный экстракт из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, и помещали на 3 часа в термостат при +37°С, периодически помешивая до полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена. После перемешивания и полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена стерильным водным экстрактом из 10 г сухих семян растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки и свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затем стерильные пробирки с затвердевшими косяками предложенной питательной среды помещали в термостат, в течение 1 суток выдерживали при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 15 минут. Затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды засевали нейтрализованным 2 каплями соляной кислоты центрифугатом мокроты, предварительно обработанной 4%-ным раствором едкого натрия, от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких. Посевы инкубировали при температуре +37°С. Через 19,3±0,52 сутки на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие, различной величины и формы колонии микобактерий туберкулеза (фиг.1а). При посеве нейтрализованного 2 каплями соляной кислоты центрифугата мокроты, предварительно обработанной 4%-ным раствором едкого натрия, от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких на сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, перемешанную с 200 смстерильной дистиллированной воды, микобактерий туберкулеза выросли («контроль» на табл.1 и фиг.1) на 28,43±1,39 сутки (р<0,001).
3
Исследования №12 (табл.2Б III). Стерильный водный экстракт из 10 г сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, добавляли в герметически укупоренный градуированный флакон с сухой стандартной питательной средой Левенштейна-Йенсена до метки «100», полностью смывали со стенок герметически укупоренного градуированного флакона сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, затем до метки «200» доливали стерильный водный экстракт из 10 г сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащий биостимуляторы, и помещали на 3 часа в термостат при +37°С, периодически помешивая до полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена. После полного растворения сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена стерильным водным экстрактом из 10 г сухих, предварительно измельченных вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащего биостимуляторы, предложенную питательную среду разливали в стерильные пробирки и свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 30 минут. Затем стерильные пробирки с затвердевшими косяками предложенной питательной среды помещали в термостат, в течение 1 суток выдерживали при температуре +37°С и повторно свертывали (уплотняли) в электрическом свертывателе питательных сред при температуре +85°С в течение 15 минут. Затвердевшие и остывшие в каждой пробирке косяки предложенной питательной среды засевали нейтрализованным 2 каплями соляной кислоты центрифугатом мокроты, предварительно обработанной 4%-ным раствором едкого натрия, от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких. Посевы инкубировали при температуре +37°С. Через 19,5±0,53 суток на поверхности косяков предложенной питательной среды выросли сухие колонии микобактерий туберкулеза (фиг.1б). При посеве нейтрализованного 2 каплями соляной кислоты центрифугата мокроты, предварительно обработанной 4%-ным раствором едкого натрия, от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких на сухую стандартную питательную среду Левенштейна-Йенсена, перемешанную с 200 см стерильной дистиллированной воды, микобактерий туберкулеза выросли («контроль» на табл.2 и фиг.1) на 28,43±1,39 сутки (р<0,001).
Таким образом, при применении предложенной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, состоящей из стандартной питательной среды ФАСТ-3Л, перемешанной водным экстрактом сухих семян или сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащим биостимуляторы, например кумарины, сапонины, полисахариды, гликопротеиды, витамины и другие, которые индуцируют пролиферацию и дифференциацию клеток, рост микобактерий туберкулеза проявлялся в среднем на 5-е сутки или ускорялся в 2,8 раза. При применении предложенной питательной среды для выращивания микобактерий туберкулеза, состоящей из сухой стандартной питательной среды Левенштейна-Йенсена, перемешанной водным экстрактом сухих семян или сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской, содержащим биостимуляторы, например кумарины, сапонины, полисахариды, гликопротеиды, витамины и другие, которые индуцируют пролиферацию и дифференциацию клеток, рост микобактерий туберкулеза проявлялся в среднем на 18-е сутки или ускорялся в 1,5 раза.
Источники информации
1. Рабухин А.Е. Туберкулез органов дыхания у взрослых. - М.: Медицина, 1976. С.87-88.
2. Рудой Н.М. Туберкулез и бацилловыделение (Вопросы микробиологии, клиники и эпидемиологии). - М.: Медицина, 1975. С.40-42.
3. Jian-Hui L., Во J., Yong-Ming В., Li-Jia A. Effect of Cuscuta chinensis glucoside on the neuronal differentiation of rat pheochromocytoma PC 12 cells. // Int. 3. Dev. Neurosci. 2003. Vol.21, №5. P.277-281.
4. Umehara К., Nemoto К., Ohcudo Т. et al. Isolation of a new 15-membered macrocyclyc glycolipid lactone, Cuscutic Resinoside, from the seeds of Cuscuta chinensis: a stimulator of breast cancer cell proliferation. // Planta Med. 2004. Vol.70, №4. P.111-117.
5. Zhelev Z.D., Stanilova S.A., Carpenter B.G. Isolation, partial characterization and complement inhibiting activity of a new glycoprotein from Cuscuta europea II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol.202, №1. P.186-194.
Таблица 1
ВРЕМЯ РОСТА (В СУТКАХ) МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА НА ПРЕДЛОЖЕННОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ (среде ФАСТ-3Л, растворенной водным экстрактом из сухих семян или сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской)
А
Б
Контроль (n=7)
I (n=7)
II (n=7)
III (n=7)
I (n=7)
II (n=7)
III (n=7)
4
4
4
5
5
6
14
5
4
4
6
5
5
14
4
4
4
6
6
7
15
4
5
6
5
7
7
15
5
5
6
5
6
6
14
5
6
5
5
5
5
14
4
4
4
5
5
5
15
4,4±0,2
4,5±0,3
4,7±0,3
5,3±0,2
5,5±0,3
5,8±0,4
14,3±0,2
р<0,001
р<0,001
p<0,001
p<0,001
p<0,001
p<0,001
p<0,001
Примечания. А - время роста микобактерий туберкулеза на предложенной питательной среде, содержащей водный экстракт из сухих семян растения-паразита повилики японской; Б - время роста микобактерий туберкулеза на предложенной питательной среде, содержащей водный экстракт из сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской; I - время роста коллекционной культуры микобактерий туберкулеза; II - время роста микобактерий туберкулеза при посеве почвенного раствора, инфицированного коллекционной культурой микобактерий туберкулеза; III - время роста микобактерий туберкулеза при посеве мокроты от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких; Контроль - время роста коллекционной культуры микобактерий туберкулеза на стандартной питательной среде ФАСТ-3Л; n - объем выборок (количество опытов); р - достигнутый уровень значимости.
Таблица 2
ВРЕМЯ РОСТА (В СУТКАХ) МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА НА ПРЕДЛОЖЕННОЙ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ(среде Левенштейна-Йенсена, растворенной водным экстрактом из сухих семян или сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской)
А
Б
Контроль (n=7)
I (n=7)
II (n=7)
III (n=7)
I (n=7)
II (n=7)
III (n=7)
17
17
20
16
18
21
25
18
20
21
17
19
22
28
16
18
19
18
20
20
29
16
19
20
16
21
19
35
17
17
20
19
20
21
30
16
20
18
17
16
18
24
18
17
17
19
17
19
28
16,8±0,34
18,3±0,53
19,3±0,52
17,0±0,43
18,7±0,68
19,5±0,53
28,43±1,39
р<0,001
р<0,001
p<0,001
p<0,001
p<0,001
p<0,001
p<0,001
Примечания. А - время роста микобактерий туберкулеза на предложенной питательной среде, содержащей водный экстракт из сухих семян растения-паразита повилики японской; Б - время роста микобактерий туберкулеза на предложенной питательной среде, содержащей водный экстракт из сухих вегетативных стеблей растения-паразита повилики японской; I - время роста коллекционной культуры микобактерий туберкулеза; II - время роста микобактерий туберкулеза при посеве почвенного раствора, инфицированного коллекционной культурой микобактерий туберкулеза; III - время роста микобактерий туберкулеза при посеве мокроты от больного фиброзно-кавернозным туберкулезом легких; Контроль - время роста коллекционной культуры микобактерий туберкулеза на сухой стандартной питательной среде Левенштейна-Йенсена; n - объем выборок (количество опытов); р - достигнутый уровень значимости.