СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ ФИЗИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ПОВЫШЕНИЯ ПОРИСТОСТИ ЖЕЛАТИНА ПУТЕМ МОДИФИКАЦИИ ЕГО РИБОЗОЙ И ХЛОРИДОМ НАТРИЯ
METHOD FOR IMPROVING PHYSICAL PROPERTIES AND INCREASING POROSITY OF GELATINE BY MODIFYING IT WITH RIBOSE AND SODIUM CHLORIDE

Настоящее изобретение относится к биомедицине, а именно к способам улучшения физических свойств и повышения пористости желатина для изготовления биомедицинских клеточных продуктов.
В настоящее время желатин является одним из основных естественных материалов, который используется для создания структурных компонентов матрикса большинства биомедицинских клеточных продуктов. Это связано с его способностью переносить значительные физические нагрузки и хорошей совместимостью с биологическими объектами (Deo K, Singh K, Peak C, Alge D, Gaharwar A. Bioprinting 101: Design, Fabrication, and Evaluation of Cell-Laden 3D Bioprinted Scaffolds. Tissue Eng Part A. 2020; 26(5-6): 318-338. doi:10.1089/ten.TEA.2019.0298).
Основной недостаток использования чистого желатина для этих целей заключается в низкой термостабильности и ферментативной устойчивости, что приводит к потере структурных свойств желатина даже при незначительном повышении температуры или при воздействии малого количества гидролитических ферментов. Повышение пористости желатина позволяет заселять в ограниченном объеме желатина большее число клеток. Сегодня существуют различные способы повышения термостабильности, ферментативной устойчивости и пористости желатина.
В результате проведенного патентно-информационного поиска были обнаружены ряд аналогов. Так был найден способ повышения термостабильности желатина с помощью 1% раствора глутарового альдегида (Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baharvand, H., & Daemi, H. (2018). Chemical crosslinking of biopolymeric scaffolds: Current knowledge and future directions of crosslinked engineered bone scaffolds. International Journal of Biological Macromolecules, 107, 678–688, doi:10.1016/j.ijbiomac.2017.08.184). Способ показал себя эффективным для повышения механических свойств желатина за счет сшивания желатина путем Шифф-реакции, однако для данного способа необходима длительная процедура промывки ввиду токсичности глутарового альдегида.
Прямым аналогом является патент РФ № 2687559. Способ включает смешивание 20% раствора желатина с 0,1% раствором глутарового альдегида, приготовленных на изотоническом растворе NaCl или дистиллированной воде, в объемном соотношение растворов 9:1 соответственно, с последующей инкубацией смеси в течение 30 минут при температуре 4°С и экспозиции смеси в чашке Петри в течение 30 минут при температуре 37°С и влажности воздуха 50-70%. Предлагаемый способ позволяет получить модифицированный желатин, обладающий повышенной температурной стойкостью более трех дней.
Недостатками способа являются использование высокотоксичного вещества для модификации желатина, необходимость тщательной промывки от избытка глутарового альдегида.
0
Также был найден патент US №5834232A. Патент включает в себя несколько способов модификации желатина и коллагена путем добавления трансглутаминазы. Так для получения модифицированного желатина был приготовлен раствор №1: смешать лиофилизат человеческого фактора роста XIII A2 димера, содержащего 13.2 мг фактора XIII, 0.66 мкмоль этилендиаминтетрауксусной кислоты, 6.60 мкмоль глицина и 0.13 г бычьей сыворотки, с 1 мл дистиллированной воды. Далее приготовить раствор №2: 10% по весу водный раствор желатина телячьей кожи типа A оставить при температуре 37С до полного растворения желатина, затем желатин оставить на ночь при температуре 4°C, после поместить на 2 часа в условия комнатной температуры, после чего снова растворить при температуре 37° и смешать с 4% по весу раствором CaCl2 в Трис-буфере (25 мкмоль Трис, pH 7.4, 120 ммоль NaCl, 0.2% NaN3). Полученный раствор распределить по 1-мл пробиркам. Далее в каждую пробирку добавить по 1 мг раствора №1 и 10 единиц бычьей сыворотки. Пробирки инкубировать при температуре 27° C до полного перехода смеси из состояния геля в жидкое, величину вязкости измерять каждые 290 минут. По результатам измерений был сделан вывод, что полученный модифицированный желатин обладает высокой термостабильностью и ферментативной устойчивостью. Однако необходимость использования бычьей сыворотки увеличивает время и стоимость каждого приготовления модифицированного желатина.
Технический результат от использования способа:
1. Возможность создать устойчивый к ферментам в течение 285 минут и повышенным  температурам в течение 1 недели скаффолд с сохранением его 3D архитектоники.
2. Низкая стоимость реагентов: хлорида натрия и рибозы.
3. Простота способа: протокол приготовления модифицированного желатина не требует специального дорогостоящего оборудования.
Рибоза представляет собой моносахарид, хорошо растворимый в воде и способный при незначительном температурном воздействии входить в реакцию Майяра с полипептидами (Wattanachant, S., Muhammad, K., Mat Hashim, D., & Rahman, R. A. Effect of crosslinking reagents and hydroxypropylation levels on dual-modified sago starch properties. Food Chemistry. 2003; 80(4): 463–471. doi:10.1016/S0308-8146(02)00314-X). На примере исследования рыбьего желатина было показано, что полипептиды после реакции Майяра имеют более крепкие ковалентные связи, что повышает их термостабильность и ферментативную устойчивость (Kchaou, H., Benbettaïeb, N., Jridi, M., Abdelhedi, O., Karbowiak, T., Brachais, C.-H. Enhancement of structural, functional and antioxidant properties of fish gelatin films using Maillard reactions. Food Hydrocolloids. 2018; 83: 326–339. doi:10.1016/j.foodhyd.2018.05.011). Данный эффект можно экстраполировать на пищевой желатин, поскольку он также является продуктом гидролиза коллагена.
Для создания высокой пористости в желатине существуют несколько способов. Наиболее эффективным показал себя способ выщелачивания, в котором в качестве соли чаще всего используется хлорид натрия, который при добавлении в желатин в концентрации выше 25% от массовой доли, подвергается перекристаллизации. После вымывания избытка хлорида натрия из пространств, ранее занятых частицами NaCl, образуется множество макро- и микропор (Lee S., Kim Y., Chong M., Hong S., Lee Y. Study of gelatin-containing artificial skin V: fabrication of gelatin scaffolds using a salt-leaching method. Biomaterials. 2005; 26(14): 1961-1968. doi:10.1016/j.biomaterials.2004.06.032).
Способ получения модифицированного желатина осуществляют следующим образом.
Приготавливают 20% раствор желатина, смешивают его с рибозой до достижений 4,5% ее содержания в смеси и добавлением хлорида натрия в весовом соотношении 2:1 соответственно, после чего смесь помещается на 72 часа в термостат при температуре 50°С. После инкубирования образцы промывают в дистиллированной воде в течение 48 часов.
0
Изобретение было проверено в нескольких экспериментах, основанных на изучении пористости, термостабильности и ферментативной устойчивости при температуре 37С раствора желатина и его следующих модификаций: желатин 20%; желатин и глутаровый альдегид с хлоридом натрия в соотношении 9:1; желатин и рибоза с  массовой долью рибозы 4,5% с хлоридом натрия в весовом соотношении 2:1; 3:1; 9:1; 10:1 соответственно; желатин и рибоза с массовой долью рибозы 4,5%.
Оценка пористости производилась на основе данных сканирующей электронной микроскопии. Путем оценки размера пор в образцах было выявлено, что наибольший размер пор достигнут в модификации желатин 20% и рибоза 4,5% с хлоридом натрия 2:1 (фиг.).
Сканирующая электронная микроскопия, разрешение 400 мкм. Выявлены многочисленные поры со средним диаметром 63,3 мкм.
Эксперименты по изучению термостабильности желатина и его модификаций при 37°С (таблица 1) показали статистически значимое (ANOVA, p<0,05, α<0,05, F=180,6, Fкр=4,8) повышение времени начала растворения желатина в модификации желатин 20% и рибоза 4,5% с хлоридом натрия 2:1.
Эксперименты по изучению ферментативной устойчивости желатина и его модификаций при 37°С (таблица 2) показали статистически значимое (ANOVA, p<0,05, α<0,05, F=69,9, Fкр=4,9) повышение времени начала растворения желатина и статистически значимое (ANOVA, p<0,05, α<0,05, F=123,7, Fкр=4,9) повышение времени его полного растворения в модификации желатин 20% и рибоза 4,5% с хлоридом натрия 2:1.
Таблица 1. Оценка термостабильности желатина разных модификаций
Вид модификации желатина
Время начала растворения (мин)
Время окончания растворения (мин)
Желатин 20%
40
75
Желатин 20% + глутаровый альдегид 2,5% и хлорид натрия 9:1
73
более 20160
Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 2:1
97
10080
Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 3:1
75
10080
Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 9:1
68
10080
Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 10:1
60
10080
Желатин 20% + рибоза 4,5%
10080
более 20160
Таблица 2. Оценка ферментативной устойчивости желатина
разных модификаций
Вид модификации желатина
Время начала растворения (мин)
Время окончания растворения (мин)
Желатин 20%
30
57
Желатин 20%+ глутаровый альдегид 2,5% и хлорид натрия 9:1
67
10080
Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 2:1
45
285
Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 3:1
26
50
Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 9:1
25
40
Желатин 20% + рибоза 4,5% и хлорид натрия 10:1
22
33
Желатин 20% + рибоза 4,5%
113
10080