Влияние интерферона на мутагенное и цитотоксическое действие вируса гриппа у лабораторных мышей

Влияние интерферона на мутагенное и цитотоксическое действие вируса гриппа у лабораторных мышей

А.Г. Пирцхелани, Н.А. Пирцхелани, Н.В. Мамаладзе,

Г.А. Пирцхелани, Н.Г. Джаджанидзе, Г.Д. Капанадзе

Тбилисский Государственный Университет,

Тбилисский Государственный медицинский Университет,

Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва

На лабораторных мышах и их эмбрионах изучено антииммуногенное и антицитотокси-ческое действие эндогенного интерферона при индукции мутации вирусом гриппа А0/РЯ8. В работе применены цитогенетические и вирусологические методы исследования. Вирус гриппа А0 характеризуется мутагенным и цитотоксическим действием. Однократное интраназальное введение животным в разные сроки беременности вируса гриппа А0 (по 0,2 мл) вызывает достоверное (р<0,001) повышение количества структурных нарушений хромосом (единичные и парные фрагменты, лизис), мутаций (триплои-дия, тетраплоидия, анеуплоидия) патологических митозов (полая метафаза, деспира-лизация, набухание и слипание хромосом), центромерных ассоциаций хромосом и нарушение интерфазных ядер (полое ядро), как у беременных мышей, так и у их эмбрионов. Хромосомы эмбрионов более чувствительны к воздействию вируса гриппа А0, чем хромосомы взрослых животных, как до имплантаций (бластоцисты), так и на стадии активного органогенеза. Эндогенный интерферон характеризуется выраженным антиму-тагенным и антицитотоксическим действием. Он в три раза уменьшает частоту мутагенных и цитоксических эффектов вируса гриппа А0.

Ключевые слова: Вирус гриппа, интерферон, митозы, хромосомы, мыши, эмбрионы.

Среди причин перинатальной заболеваемости и смертности исключительно важное место принадлежит инфекциям беременных, в частности вирусным болезням. Особенно тяжело эти инфекции протекают у эмбрионов и плодов, так как интенсивное клеточное деление создает благоприятную среду для размножения вирусов, которые оказывают выраженное цитопатогенное воздействие на клетки эмбриона, нарушают их генетический аппарат и часто приводят к гибели.

Если проблема перинатальной вирусной инфекции в настоящее время привлекает к себе все большее внимание, то вопрос о влиянии противовирусных препаратов, в том числе и интерферона на хромосомы эмбрионов при гриппозной инфекции изучен крайне недостаточно.

Имеются единичные сведения о влиянии экзогенного интерферона на хромосомы клеток людей, инфицированных вирусом гриппа [15]. Авторы показали, что экзогенный интерферон снижает число структурных нарушений хромосом.

В наших предыдущих работах было показано, что вирус гриппа А0 обладает выраженным эмбриотоксическим и мутагенным действием, как в клетках беременных мышей, так и в клетках плодов [13]. Мутагенное действие вируса гриппа установлено также в культурах лимфоцитов человека [11].

Исходя из этого, изыскание препаратов, уменьшающих указанный эффект вирусов, представляется исключительно важным.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния эндогенного

интерферона на хромосомы беременных мышей и их эмбрионов при гриппозной инфекции.

Материал и методы

Опыты проводились на нелинейных мышах разводки Тбилисского государственного медицинского университета. Первым днем беременности считали день обнаружения влагалищных пробок у самок после подсаживания к ним самцов. В работе использованы патогенный для мышей вирус Ао/РЯв (в тексте обозначается А0), который вводили инт-раназально однократно в дозе 104 ЭИД50/0,2 мл и индуктор интерферона вирус болезни Ньюкасла (в тексте обозначается ВБН) в дозе 107 ЭИД50/0,2 мл — вводили внутривенно.

Всего исследовано 22-е беременные мыши, 40 эмбрионов на стадии органогенеза и 121 4-х дневный эмбрион, которые распределены в 4 группы: 1) через 6 часов индукции интерферона у беременных мышей их заражали вирусом гриппа А0; 2) мышей заражали только вирусом гриппа А0; 3) вирусом болезни Ньюкасла; 4) контрольная группа.

Для приготовления хромосомных препаратов из клеток беременных мышей использовали метод Форда-Уолла-ма [16]. Хромосомные препараты из зародышей периода органогенеза (9-12 дневные) готовили по методу Врублев-ской-Дыбана [18]. Зародышей периода дробления и на стадии бластоцисты исследовали под бинокулярной лупой МБС-2. Подсчет числа бластомеров и хромосомный анализ проводился на препаратах, приготовленных по методу Тарковского [19]. Учет структурных нарушений хромосом проводился по классификации Н.П. Бочкова [5], геномных мутаций Н.П. Дубинина [7], патологи-

ческих митозов — И.А. Алова [2]. Изучение нарушения интерфазных ядер проводились по модифицированному методу А. Пирцхелани, Н. Мамаладзе [12]. Все полученные данные обработаны статистическими методами.

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ полученных данных показал (таблица), что вирус гриппа А в клетках взрослых мышей вызывает резкое возрастание частоты хромосомных аномалий (структурные нарушения хромосом, геномные мутации). Со дня инфицирования частота этих нарушений постепенно возрастает и на седьмой день достигает 40, 47% (в контроле 2,0%). Аналогичные данные получены клиническими наблюдениями некоторых авторов [9,10].

Следует отметить, что из структурных нарушений в три раза чаще наблюдается лизис хромосом, чем единичные и множественные фрагменты (табл.). Кроме хромосомных аномалий вирус гриппа А0 характеризуется высоким цитотоксическим действием. Он часто вызывает образование патологических митозов и на 7-й день инфицирования достигает 27,9%. Из патологических митозов при влиянии вируса гриппа А0 наиболее чаще наблюдается полая метафаза, деспирализация и склеивание хромосом, значительно реже трехгрупповая метафаза и набухание хромосом. Из патологических митозов в контроле наблюдается только полая метафаза и склеивание хромосом.

Анализ полученного нами материала показал также, что вирус гриппа А0 вызывает нарастание нарушения интерфазных ядер: плотноконденсированный хроматин распологается в виде кольца по периферии клетки, а середина остается пустой. Микроскопический анализ

Таблица 1

Антимутагенное и антицитотоксическое действие эндогенного интерферона в клетках взрослых мышей и эмбрионов в условиях индукции мутации вирусом гриппа А0.

Варианты Группа животных Количество животных Дни исследования Число метафаз Общее число структурных нарушений хромосом (%± ст. от) Число геномных мутации (%±ст. от.) Число патологических митозов (%) Р

Л) Взрослые мыши 5 6 5 53 7 15 500 340 500 11,29+1,3 40,2+2,6 4,0+0,9 , , , 623 ± ± ± ЯЯ 0 476 19,15+1,8 27,9+1,9 7,3+1,3

Инт+ А0* 6 7 400 13,5!1,4 10,5±0,4 11,3+1,5 <0,001

Л) 9-12 дн. эмбрионы 20 10 3 5 350 300 33,3+2,6 48,0+4,0 8,9±2,8 5,5±1,7 29,8+2,3 45,0+4,0

Инт+ А0* 10 5 350 13,0+2,1 2,0±0,7 19,0+2,0 <0,001

Ао 4 дн. эмбрионы 45 46 2 3 75 100 30,0+4,6 37,0+4,0 9,0±2,9 13,7±2,0 28,3+5,2 35,0+4,7

Инт+ А0* 30 3 50 7,8+4,2 2,2±0,8 12,0+3,8 <0,001

* — Вирусом гриппа А мышей заражали через 6 часов индукуции интерферона.

таких ядер проводился в тех же препаратах, где проводился учет хромосомных аномалий. При влиянии вируса гриппа А, в клетках взрослых мышей на седьмой день инфицирования частота нарушений интерфазных ядер достигала 3,4% (в контроле 1,1%). Цитогенетический анализ показал, что под влиянием вируса гриппа резко возрастает частота центромерных ассоциаций хромосом и на 7-е сутки после инфицирования в клетках взрослых мышей они достигали 30,0 % (в контроле 0,8 %).

Мутагенная и цитотоксическая активность вируса гриппа А0 еще более выражена в эмбриональных клетках (9-12 дневные). Цитогенетический анализ показал, что под влиянием вируса гриппа А0 на 5-е сутки после инфицирования в клетках эмбрионов число структурных

изменений хромосом составляло 48%, а число патологических митозов — 45% (см. табл.).

Из цитогенетического анализа явствует, что вирус гриппа А0 в клетках 4-дневных эмбрионов вызывает высокую частоту как структурных нарушений хромосом, так и геномных мутаций и патологических митозов. Например, число структурных нарушений хромосом на 3-и сутки после инфицирования было 17,0%; Геномные мутации 4,0%, а число патологических митозов достигает 35,3%.

Таким образом, эмбриональные клетки оказались более чувствителными к действию вируса гриппа, чем клетки взрослых мышей. Этот факт согласуется с данными других авторов, показавших, что при действии разных факторов внешней среды в большей степени поврежда-

ются клетки плода и эмбриона, чем клетки взрослого организма [3, 6], что, по их мнению, связано с несовершенством защитно-приспособительных механизмов эмбриона.

На возможную связь между цитогенетическим нарушением и эмбриотоксиче-ским эффектом вируса гриппа, с одной стороны, указывает совпадение пиков их действия, и, с другой стороны, известно [11], что клетки с грубыми нарушениями хромосом (лизис, деспирализация, полая метафаза, фрагментация) в дальнейшем элиминируется, так как в изученных нами случаях около 50% делящихся эмбриональных клеток были повреждены указанными изменениями. С большой долей вероятности можно допустить, что эмбрионы с подобными повреждениями хромосом оказывались нежизнеспособными и погибали, т.е. эмб-риотоксическое действие вируса было обусловлено его мутагенным и цитоток-сическим эффектом.

Таким образом, гриппозная инфекция характеризуется высоким летальным, эмб-риотоксическим, мутагенным и цитоток-сическим действием. Исходя из этого, большое внимание было уделено выявлению и использованию протекторных веществ, которые уменьшали бы до минимума как нарушения хромосомного аппарата, так и гибель животных и их эмбрионов.

Раньше нами было установлено, что вирус гриппа А2/А1еЫ характеризуется высоким мутагенным действием. Эндогенный интерферон, индуцированный вирусом болезни Ньюкасла, обладает способностью снижать смертность мышей от гриппозной инфекции, а также существенно угнетает мутагенный эффект вируса гриппа [15].

Отмечено, что влияние противовирусных препаратов, в том числе интерферона на генетический аппарат эмбрионов (стадия бластоциста и стадия активного орга-

ногенеза) при гриппозной инфекции изучен крйне недостаточно.

Беременным мышам до моделирования гриппозной инфекции вводили вирус болезни Ньюкасла (ВБН), который вызывает индукцию эндогенного интерферона. Результаты опытов показали, что число аномальных метафаз на фоне эндогенного интерферона уменьшалось с 40,4% (7ые сутки вируса гриппа А0 ) до 13,5% (р<0,001) (таблица). На фоне интерферона в клетках беременных мышей аналогично уменьшилось число патологических митозов.

Следующая серия опытов проведена на 9-12-и дневных и на 4 дневных эмбрионах. Было показано, что эндогенный интерферон как в клетках 9-12-и дневных эмбрионов, так и в клетках 4-х дневных эмбрионов, в среднем, в три раза уменьшает частоту хромосомных аномалий и патологических митозов. Под влиянием интерферона в три раза снижалась также гибель животных и их эмбрионов. Достоверность наших полученных данных об антимута-генном действии, как экзогенных так и эндогенных интерферонов подтверждена нами и другими авторами [4, 8, 17].

При изучении механизмов действия антимутагенов основную сложность представляет то, что они относятся к соединениям разных классов. Антимутагены обладают свойством включаться в разные биологические процессы. Один из способов реализации протекторных свойств — это дисмутагенизация, т.е. инактивация вредного агента антимутагенном. Второй путь — это участие антимутагенов в активации репарационных процессов. Указанные механизмы изучены и доказаны экспериментально [1, 8]. Исходя из вышесказанного, представляется перспективным использование антимутагенов с лечебнопрофилактической целью людьми, имеющими контакт с вирусными инфекциями и другими вредними веществами.

Выводы

1. Вирус гриппа А0 обладает мутагенной и цитотоксической активностью, которые зависят от стадии онтогенеза и сроки заражения. Хромосомы эмбрионов более чувствительны к воздействию вируса, чем хромосомы взрослых животных.

2. Вирус гриппа А0 вызывает в генетическом аппарате 5 типов повреждений:1. хромосомные аберрации (одиночные и множественные фрагменты. лизис хромосом); 2. геномные мутации (анеупло-идия, триплоидия, тетраплоидия); 3. патологические митозы (полая метафаза, деспирализация, трехгрупповая метафаза, набухание и слипание хромосом); 4. нарушение интерфазных ядер (полое ядро); 5. вирус гриппа вызывает резкое возрастание частоты центромерных ассоциаций хромосом.

3. Эндогенный интерферон обладает выраженным антимутагенным и антици-тотоксическим действием. Он в три раза уменьшает мутагенный и цитото-ксический эффект вируса гриппа А0.

Литература

1. Алакперов У.К. Антимутагенез. — М.: Наука, с. 13-17, 1984.

2. Алов И.А. Цитофизиология и патология митоза. — М., 263 с., 1972.

3. Барилян И.Р. Особенности эмбриотокси-ческого действия вируса гриппа. // Арх. анат. гист. и эмбриол., № 2, с. 53-58.1985.

4. Бичикашвили Н. — Автореф. канд. дисс., 2003г.

5. Бочков Н.П., Демин Ю.С., Лучник И.В. Классификация и методы учета хромосомных аберрации в соматических клетках. // Генетика, 8, 5, с. 138-142, 1972.

6. Дыбан А.П., Удалова Л.Д. Изучение хромосомных нарушений на началь-

ных стадиях эмбриогенеза млекопитающих. // Генетика, 4, с. 52-65, 1967.

7. Дубинин Н.П. //В кн. Общая генетика. — М. Наука, с. 145-160, 1976.

8. Засухина Г.Д. Репаративные механизмы клеток и проблемы окружающей среды.— М.: Наука, 183 с., 1979.

9. Канторович Р.А., Соколова Н.М., Гаврина Е.М. и др. Действие вируса гриппа на хромосомы человека. // Биол. экпе-рим. бол., 77, 2, с. 99-102, 1974.

10. Кучерова Н.Г. Влияние гриппозной инфекций на хромосомы клеток человека и животных. // XIVМеждународный генетический конгресс. Тезисы докладов. — М., 343 с., 1983.

11. Михайлова Г.Р., Горшунова Л.П. Цитологическое и кариологическое изучение культур клеток человека. Хроническая инфекция вируса гриппа. // Цитол. и генетика. 10, 6, с. 582534, 1980.

12. Пирцхелани А.Г., Мамаладзе И.В. Нарушение интерфазных ядер митозов и хромосом как показатель общетоксического и мутагенного действия факторов среды на организм. Методические рекомендации. — Тбилиси, 1991.

13. Пирцхелани А.Г. Дисс. ... соиск. степ. докт. мед. н.. 1994.

14. Фролов А.Ф., Дядюн С.Т., Дзяблик И.В. // Цитол. Генет., №1, с. 18-20, 1982.

15. Шелия Г.П., Кинтрая П.Я., Корсантия Б.М., Пирцхелани А.Г. Влияние эндогенного интерферона на эмбриональное и мутагенное действие вируса гриппа у белых мышей. // Вопросы вирусологии, № 2, с. 179-183, 1984.

16. Ford E., Wollam D. A study of the mitotic chromosomes of nice of the strong a line. // Exp. Gell. Res, v. 32, p. 320, 1963.

17. Pirtskhelani A., Pirtskhelani G. Investication of antimutagenous and antitoxic action of interferon and a-toco-pherol on the background of metapyrin. //

Proc. Georgian Acad. Sci. Biol. Ser, vol. 24. v. 1-6, p. 299-301, 1998.

18.Tarkowski A. An air-drying method for chromosome preparation from mouse ages cytogenetics. 1966, v.5, p.394.

19. Wroblewska L. Dyban A Chromosome preparations from mouse embryons during early organogenesis dissociation after fica-tion followed by air — drying Stain Technol. 1969, v.44, p. 147.

THE INFLUENCE OF INTERFERON ON THE MUTAGENIC AND CYTOTOXIC EFFECT OF INFLUENZA VIRUS IN WHITE MICE AND EMBRYONIC A.Pirtskhelani, N.Pirtskhelani, N.Mamaladze, G.Pirtskhelani, N.Jajanidze,

G.J.Kapanadze

Tbilisi State University,

Tbilisi Medical State University,

The Research Center for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow

Key words: influenza virus, interpheron, mitosis, chromosomes, mice, embryones.

In the laboratory mice and embryon antimutagenic and anticitotoxic effects of the endogenous interpheron has been studied during mutation influenza virus A0 (Strain PR8). The ten-day administration of influenza virus A0 (0,2 ml dose) induced high incidence of structural aberrations of the chromosomes (deletions, multiple fragments, lyses) genomic mutations (triploid, tetraploidy) the chromosomal centromere associations and pathologic mitosis (hollow metaphase, K mitosis, chromosomal adhesion) and deterioration of the interphase nuclei (hollow nucleus) as mice and their embryon. Endogenous interferon exerted higly effective antimutagenic and anticytotoxic action. It’s decreased incidence and mutagenic and cytotoxic effects of the influenza virus A0 about 3 times.