СПОСОБ ГОМОГЕНИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ, СОДЕРЖАЩИХ МАГНИТНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ, ПРИ ВЫДЕЛЕНИИ ДНК В ПРОЦЕССЕ АВТОМАТИЧЕСКОЙ ПРОБОПОДГОТОВКИ ДЛЯ ПЦР АНАЛИЗА
METHOD FOR HOMOGENISING BIOLOGICAL SAMPLES CONTAINING MAGNETIC NANOPARTICLES WHEN EXTRACTING DNA DURING AUTOMATIC SAMPLE PREPARATION FOR PCR ANALYSIS

1. Область техники
2
Изобретение относится к области молекулярной биологии и химии. Данное изобретение применяется в лабораторной диагностике для подготовки пробы к постановке ПЦР, в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепаратов и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации. Изобретение представляет способ растирания концентрационных неоднородностей, образующихся при смешивании в лизирующем растворе образца крови с магнитными наночастицами оксида железа, покрытыми адсорбентом SiO.
2. Уровень техники
Использование магнитных частиц ничем принципиальным не отличается от использования других типов сорбентов (латексы, полимерные сорбенты, стекло), но позволяет применять магнитное разделение вместо центрифугирования и фильтрации. В основе магнитных частиц используются получаемые наночастицы оксида железа, обладающие суперпарамагнитными свойствами. Частицы на основе оксида железа с суперпарамагнитными свойствами обладают целым рядом преимуществ, наиболее важные из которых следующие:
- такие частицы имеют практически нулевую степень остаточной намагниченности, то есть после снятия внешнего магнитного поля (переноса из магнитного штатива в обычный) эти частицы не слипаются и могут быть легко ресуспендированы;
- такие частицы химически инертны и могут долго храниться в водных растворах, не ингибируют ферментативные реакции, их можно использовать в экспериментах in vitro и in vivo без риска нежелательных последствий;
- такие частицы открывают широкие возможности для автоматизирования процессов выделения нуклеиновых кислот, белков, клеток.
Из уровня техники известны следующие способы получения нуклеиновых кислот с использованием магнитных частиц:
A. Способ очистки с применением магнитных частиц (патент №WO 00/42432 от 20.07.2000)
Данный способ очистки вещества состоит в том, что материал, содержащий вещество и магнитные частицы, покрытые и обработанные реагентом, который связывает частицы с веществом, размещают в первой среде, создают возможность для протекания связывающей реакции, в которой вещество связывается с частицами, и вводят в среду магнитный зонд, в результате чего частицы прилипают к зонду, и зонд вместе с частицами и веществом, связанным с ними, переносят во вторую среду и, если нужно, выделяют из второй среды и переносят в третью среду, отличающийся тем, что в нескольких средах предпочтительно по меньшей мере в первой среде, а наиболее предпочтительно во всех средах, до того как зонд и частицы перенесут из соответствующей среды, размещают агент, ослабляющий поверхностное натяжение.
Основным недостатком этого способа очистки является необходимость переноса магнитного зонда с прилипшими к нему магнитными частицами между различными средами, что резко увеличивает риск контаменации исследуемого образца.
Б. Магнитные полимерные частицы на основе поливинилового спирта, способ их получения (патент №WO 97/04862 от 13.02.1997)
Изобретение относится к магнитным гранулообразным носителям, которые получают суспендированием содержащей магнитные коллоиды поливинилового спирта - полимерной фазы в органической фазе, которая содержит специальную смесь эмульгаторов. Получают частицы с размером частиц 1-8 мкм, которые могут химически связывать лиганды. Носители можно применять для выделения и обнаружения биомолекул, клеток, антител и нуклеиновых кислот.
B. Способ обнаружения анализируемого вещества при помощи коллоидных магнитных частиц (патент №WO 03/04453 от 30.05.2003)
Данный способ обнаружения и количественного определения характеризуется тем, что в нем используют магнитные коллоидные частицы, функционализированные по поверхности одним специфическим лигандом, подлежащим обнаружению или количественному определению анализируемого вещества. Для магнитного разделения используют сильные магниты на основе редкоземельных элементов. Чтобы полностью собрать магнитные частицы в магнитном штативе, требуется, как правило, от нескольких секунд до нескольких минут. Время разделения зависит от объема и вязкости жидкости, из которой собираются магнитные частицы.
Проблема, которая возникает при использовании магнитных частиц (после адсорбции - «прилипания» ДНК на поверхности магнитных частиц и сбора магнитных частиц магнитным полем на одной из стенок пробирки), - это образование «клубка» магнитных частиц, «опутанных» ДНК, что затрудняет проведение дальнейших этапов промывки и исключает в дальнейшем возможность проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени для анализа ДНК.
Задача
Задачей настоящего изобретения является создание способа гомогенизации-ресуспендирования раствора адсорбированных на магнитных частицах ДНК посредством частичной ее дефрагментации и уменьшения сверхспиральности, эффективной промывки и эллюирования - отделения ДНК от магнитных частиц без переноса магнитного зонда, с риском контаменации, между различными объемами, и обеспечения наиболее благоприятных условий для флюоресцентного анализа выделенной и очищенной ДНК приборами «PCR RealTime» и, таким образом, автоматизирования всего цикла проведения анализа ДНК.
3. Раскрытие изобретения
Поставленная задача создания однородного раствора магнитных наночастиц с адсорбированными на них образцами ДНК, выделенными из клеток крови, решается новым способом частичной дефрагментации молекул ДНК, а именно растиранием любых неоднородностей концентрации магнитных частиц, зажатых сильным неоднородным магнитным полем между внутренней поверхностью пробирки и вращающимся вокруг своей оси магнитным зондом. Вращение магнитного зонда с одновременным его прижимом к внутренней стенке пробирки осуществлялось вращающимися магнитными (1.2-1.3 Тл) шариками штатива.
В пробирку, стандартно используемую для выделения ДНК, объемом 1.5 мл вводилось:
1) 5 мкл магнитных частиц в концентрации 5 мг/мл;
2) 50 мкл крови для выделения ДНК;
3) 150 мкл лизирующего раствора;
4) магнитный цилиндрический зонд.
Вращение магнитного зонда вокруг своей оси, коллинеарной оси пробирки и создание микротурбулентных течений способствовало максимально полной адсорбции - «прилипанию» ДНК на поверхности магнитных частиц. После остановки вращательного движения зонда и сбора магнитных наночастиц с ДНК сильным неоднородным магнитным полем шариков штатива на внутренней поверхности пробирки и, частично, на поверхности магнитного зонда магнитные частицы, «опутанные» ДНК, образуют «клубок», представляющий собой очень эластичную пористую среду с высокой прочностью на разрыв, что и было основной преградой на пути использования стандартного метода выделения ДНК с использованием магнитных частиц и магнитного штатива.
Предпринимались различные неудачные попытки для устранения (разбиения) комкования магнитных частиц, такие как многократное пипетирование, разрезание ножами миксера при оборотах более 50 Гц, разбиение более крупными ферромагнитными частицами по принципу работы шаровых мельниц. Таким образом, становилось невозможным проведение дальнейших стандартных стадий пробоподготовки - три промывки и элюирование ДНК от магнитных частиц, и следовательно, невозможность выделения чистых, пригодных для ПЦР анализа образцов ДНК.
остаточное
остаточное
Положительный результат - создание гомогенного раствора магнитных частиц с ДНК - был получен лишь с использованием принципа растирания микронеоднородностей, зажатых между двумя поверхностями. Микронеоднородности с магнитными частицами - «комки» втягиваются в область высокого магнитного поля, прижимаясь к стенкам пробирки, как это реализуется в стандартном магнитном штативе со стационарным магнитным полем. В качестве магнитов штатива нами используются магнитные (Nd-Fe-B) шарики диаметром 5 мм (B≈1.2-1.3 Тл), расположенные с внешней стороны пробирки, способные свободно вращаться вокруг любой из своих осей. Второй, прижимающей, поверхностью в предлагаемой нами методике является вводимый внутрь пробирки магнитный зонд - цилиндрик диаметром 1.5-2.0 мм и длиной 6-8 мм, намагниченный поперек оси цилиндра (параллельно оси пробирки) и имеющий B0.2-0.3 Тл на поверхности. В качестве материала для изготовления магнитного цилиндрика использовался магнитопласт, получаемый методом литья (силикон с добавлением 80% быстрозакаленного магнитного порошка неодимового сплава), с последующим намагничиванием его с помощью индуктора.
Магнитный цилиндрик-зонд, притягиваемый сильным магнитом, зажимал «комки» между собой и внутренней стенкой пробирки. Вращаясь вокруг своей оси и оставаясь всегда прижатым к внутренней стенке пробирки, магнитный зонд эффективно растирает «комки» магнитных частиц «опутанных» ДНК, частично (как показал последующий электрофорез) дефрагментируя саму ДНК.
В пробирке при этом образуется суспензия из магнитных частиц с адсорбированными на них ДНК.
4. Осуществление изобретения
4.1 Описание конструкции модели прибора, с помощью которого проводились испытания.
16 пробирок с одноразовыми магнитными цилиндрическими зондами внутри располагались равномерно по окружности в штативе. Между каждой из 8 пар пробирок в цилиндрические полости (диаметром 5.1 мм) штатива помещались 8 супермагнитных (1.2-1.3 Тл) шариков диаметром 5 мм, имеющих возможность свободно вращаться вокруг любой своей оси. Вид модели без пробирок представлен на фиг.1. Вращение восьми супермагнитных шариков штатива осуществлялось посредством создания вращающегося в горизонтальной плоскости вектора индукции магнитного поля в плоскости окружности их расположения. Создание вращающегося с частотой 10-30 Гц магнитного поля в нашей модели обеспечивалось вращением в радиальной плоскости одного стержневого магнита, расположенного вдоль диаметра окружности пробирок.
На фиг.2, изображен вид модели снизу, где показано расположение стержневого магнита, создающего вращающееся магнитное поле. Приводом служил электромотор, питаемый от батареек (3-6 В), с частотой вращения 30-50 Гц. Лунки штатива для пробирок прокладывались гибким нагревательным элементом (нихром в карбоновой ленте, мощность около 10 Вт), для нагрева до 50-60°С после третьей стадии промывки - сушки (5 минут), а также для нагрева до 60-65°С (10 минут) в эллюирующем растворе для отделения ДНК от сорбента на поверхности магнитных частиц. Гибкая нагревательная карбоновая лента с двумя нихромовыми нитями, также видна на фиг.1 и фиг.2.
Последней стадией пробоподготовки является сбор магнитных частиц на стенке пробирки и магнитном зонде. Выделенная и очищенная ДНК остается в растворе.
Этапы выделения ДНК из биологического образца с использованием изобретения
ДНК выделяют из образцов крови при помощи стандартного набора реагентов. На одну пробирку 1.5 мл используют:
1 этап
- 50 мкл крови + 150 мкл лизирующего раствора + 5 мкл стандартной концентрации магнитных частиц;
- Промывка;
- Удержание магнитных частиц на стенке пробирки;
- Удаление жидкой фазы из пробирки;
2 этап
- 400 мкл стандартного промывочного раствора №1;
- Промывка;
- Удержание магнитных частиц на стенке пробирки;
- Удаление жидкой фазы из пробирки;
3 этап
- 200 мкл стандартного промывочного раствора №2;
- Промывка;
- Удержание магнитных частиц на стенке пробирки;
- Удаление жидкой фазы из пробирки;
4 этап
- 200 мкл стандартного промывочного раствора №3;
- Промывка;
- Удержание магнитных частиц на стенке пробирки;
- Удаление жидкой фазы из пробирки;
- Сушка содержимого пробирки в течение 5 минут при температуре 50-65°С;
5 этап
- 100 мкл стандартного эллюирующего раствора в течение 10 минут при температуре 50-65°С;
- Удержание магнитных частиц на стенке пробирки;
- Сбор выделенных и очищенных ДНК из пробирки для последующего анализа.
Пример конкретного выполнения
Для выделения ДНК из клеток крови в модель прибора устанавливалось 16 пробирок объемом по 1.5 мл. Одна пробирка использовалась для контроля температурного режима на 4 и 5 этапах пробоподготовки. Для этого в шестнадцатую пробирку вводился цифровой датчик температуры. В остальных 15 пробирках размещался магнитный цилиндрический зонд.
1 этап
После введения в пробирку раствора, содержащего 50 мкл крови + 150 мкл лизирующего раствора, в нее добавлялось 5 мкл стандартной концентрации магнитных частиц. Включением на 5-10 секунд вращающегося магнитного поля, за счет вращения магнитного зонда, достигалось равномерное перемешивание магнитных частиц в растворе и создание оптимальных условий для адсорбции ДНК на их поверхности. Как показали опыты, частота вращения магнитного зонда не должна превышать 50 Гц. Противное приводит к вспениванию раствора, а также к разбрызгиванию его по стенкам пробирки.
После остановки вращательного движения супермагнитные шарики штатива собирали магнитные частицы на стенке пробирки на высоте около 100 мкл. Одновременно с этим к стенке пробирки прижимался и магнитный цилиндрический зонд. Часть магнитных частиц оседала также на поверхности магнитного зонда. Дрейф магнитных частиц из раствора и их оседание на стенки пробирки и поверхность зонда длился около 1 минуты. Затем жидкая фаза удалялась из пробирки стандартной пипеткой с одноразовыми носиками.
2 этап
После введения в пробирку 400 мкл промывочного раствора №1 модель прибора включалась приблизительно на 1 минуту. Вращающийся магнитный зонд, будучи прижатым к стенке пробирки супермагнитным шариком штатива, растирал о внутреннюю стенку пробирки любые неоднородности, содержащие магнитные частицы, создавая суспензию магнитных частиц. Микротурбулентное вращательное движение жидкости в пробирке способствовало тщательной промывке ДНК.
После остановки вращательного движения супермагнитные шарики штатива собирали магнитные частицы на стенке пробирки на высоте около 100 мкл. Одновременно с этим к стенке пробирки прижимался и магнитный цилиндрический зонд. Часть магнитных частиц оседала, также на поверхности магнитного зонда. Дрейф магнитных частиц из раствора и их оседание на стенки пробирки и поверхность зонда длится около 1 минуты. Затем жидкая фаза удалялась из пробирки стандартной пипеткой с одноразовыми носиками.
3 этап
После введения в пробирку 200 мкл промывочного раствора №2 этап проводился аналогично.
4 этап
После введения в пробирку 200 мкл промывочного раствора №3 этап проводился аналогично. Однако после удаления жидкой фазы следовало осушить содержимое пробирки в течение 5 минут при температуре 50-65°С. Для того включался гибкий нагревательный элемент, опоясывающий все 16 пробирок в их посадочных местах в штативе. Нагревательный элемент запитывался от стандартного источника питания HY3005С напряжением около 15 В. Контроль температуры осуществлялся по цифровому датчику температуры, расположенному в шестнадцатой пробирке. Процедура сушки должна выполняться тщательно, так как промывочный раствор №3 блокирует реакцию амплификации ДНК.
5 этап
После введения в пробирку 100 мкл эллюирующего раствора, отделяющего ДНК от магнитных частиц, также включался гибкий нагревательный элемент, и в пробирках на 10 минут устанавливалась температура 50-65°С. В течение этого времени вращение магнитного зонда осуществлялось периодически на 10-15 секунд каждую минуту. Это позволяло гомогенизировать раствор, с одной стороны, и не допускало чрезмерной дефрагментации молекул ДНК.
После отключения прибора магнитные частицы в течение минуты собирались на боковых стенках пробирки и одноразовом магнитном зонде под действием неоднородного магнитного поля шариков.
Очищенные ДНК оставались в растворе, готовые для дальнейшего анализа.
Для сравнения количества ДНК, выделенного стандартным способом и с помощью модели прибора, в том числе и в разных пробирках, были проведены реакции амплификации с образцами каждого вида. Амплификацию проводили с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития №ФСР 2007/01250 от 20 ноября 2007 года). Результаты проведенной амплификации представлены на фиг.6. Характерный номер цикла начала реакции в обоих случаях равен 27.
Степень дефрагментации ДНК, выделенной моделью прибора, можно проанализировать по проведенной электрофорограмме фиг.7.
5. Краткое описание чертежей
Вид модели прибора, с помощью которого проводились испытания, представлен на фиг.1. Видны 8 супермагнитных шариков и гибкий нагревательный элемент. На фиг.2, изображающем вид модели снизу, показано расположение стержневого магнита, создающего вращающееся магнитное поле. Приводом служил электромотор, питаемый от батареек (3-6 В), с частотой вращения 30-50 Гц. Лунки штатива для пробирок прокладывались гибким нагревательным элементом (нихром в карбоновой ленте), для нагрева до 50-60°С после третьей стадии промывки - сушки (5 минут), а также для нагрева до 60-65°С (10 минут) в эллюирующем растворе для отделения ДНК от сорбента на поверхности магнитных частиц. Гибкая нагревательная карбоновая лента с двумя нихромовыми нитями, также видна на фиг.1 и фиг.2.
На фиг.3 представлен общий вид модели во время испытаний.
На фиг.4 представлены магнитные частицы с адсорбированной на них ДНК после 2 промывочного раствора.
Фиг.5 изображает способ растирания неоднородностей, зажатых между вращающимся вокруг своей оси магнитным зондом и стенкой пробирки.
Фиг.6 изображает сравнительные результаты качественного ПЦР анализа для ручного стандартного метода выделения ДНК и метода с использованием модели прибора для пробоподготовки. Совпадение кривых указывает на хорошую работу модели. Фиг.7 показывает сравнительные результаты качественного ПНР анализа ДНК, полученной с применением стандартной пробоподготовки, и анализа ДНК, полученной способом гомогенизации с использованием модели прибора для пробоподготовки. Результаты электрофореза демонстрируют некоторую дефрагментацию ДНК, выделенную моделью прибора (первые 6 колонок) по сравнению со стандартным ручным методом (7 и 8 колонки).