Нейтрофилы и дисбаланс протеазы/антипротеазы при хроническом бронхиолите у детей

Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, № 1, стр 81-85 © 2002, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

НЕЙТРОФИЛЫ И ДИСБАЛАНС ПРОТЕАЗЫ / АНТИПРОТЕАЗЫ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ БРОНХИОЛ ИТЕ У ДЕТЕЙ

Мурыгина Г.Л., Суркова Е.А., Бойцова Е.В., Сесь Т.П., Богданова А.В., Платонова И.С.

Лаборатория молекулярной пульмонологии, Научно-исследовательский институт пульмонологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург

Резюме. Содержание нейтрофилов, активность эластазы и уровень а-ингибитора протеиназ (основного ингибитора нейтрофильной эластазы) исследовали в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) детей с хроническим бронхиолитом. У всех обследованных детей отмечен высокий уровень нейтрофилов в ЖБАЛ (30-80% от общего числа клеток). Эластазная активность выявлена у всех пациентов как при обострении заболевания, так и в период клинической ремиссии. У детей с тяжелым и среднетяжелым течением заболевания активность эластазы была значительно выше, чем у детей с легким течением болезни и у здоровых лиц, что коррелировало с частотой случаев выявления эмфиземы. Уровень а - ингибитора протеиназ у детей с хроническим бронхиолитом был выше по сравнению с нормальными показателями преимущественно в период клинической ремиссии. Полученные результаты свидетельствуют о наличии дисбаланса в системе протеазы / антипротеазы у детей с хроническим бронхиолитом, особенно при тяжелом течении заболевания, что является важной характеристикой деструктивных процессов, протекающих в легочной ткани и одним из основных патогенетических звеньев развития хронического бронхиолита.

Ключевые слова: хронический бронхиолит, альфа-1-ингибитор протеиназ, активность эластазы, нейтрофилы.

Muryghina G.L., Surkova Е.А., Boitsova Е. V., Ses Т.P., Bogdanova A. V., Platonova I.S.

NEUTROPHILS AND PROTEASE / ANTIPROTEASE IMBALANCE

IN CHILDREN WITH CHRONIC BRONCHIOLITIS

Abstract. The percentage of neutrophils, elastase activity and level of a, -proteinase inhibitor

Введение Патогенез хронического бронхиолита (ХБ) не-

В последние годы одним из приоритетных на- ясен и малоизучен, внимание исследователей, в ос-

правлении в пульмонологии детского возраста является изучение хронических обструктивных забо-

новном, сосредоточено на изучении клиническои картины заболевания и уточнении критериев диагностики. Морфологической основой ХБ является

левании дыхательных путей, к которым относится хронический бронхиолит (с облитерацией). пролиферация фиброзной ткани в стенке или про-

_________________________________________________ свете мелких бронхов и бронхиол, приводящая к нео-

Адрес для переписки: братимой обструкции периферических дыхательных

Мурыгина Галина Леонидовна, научный сотрудник путей, нарушению легочного кровотока и развитию

лаборатории молекулярной пульмонологии НИИ эмфиземы. Подобные изменения с хроническим

пульмонологии СПбГМУ им. акад. И.Г1. Павлова, диффузным воспалением бронхов и локализацией

197089, ул. Рентгена, 12, Санкт-Петербург, Россия максимального повреждения в мелких бронхах и

Тел.: (812) 24-19-24 бронхиолах, определяющим прогрессирующие нару-

Е-таИ: galmur@mail.ru шения вентиляции, выявляются при хронической

обструктивной болезни легких (ХОБЛ) у взрослых, что свидетельствует о сходстве этих состояний. Большое значение в патогенезе хронического воспаления при ХОБЛ придается повышению активности клеток-эффекторов деструкции легочной ткани - альвеолярных макрофагов и нейтрофилов в очаге воспаления и, как следствие, их протеолитической активности. Нейтрофилы играют критическую роль в развитии повреждения тканей и наиболее важным ферментом в механизме повреждения ткани, обусловленном действием нейтрофилов, является нейт-рофильная эластаза [4]. Наряду с нейтрофильными протеиназой 3 и катепсином G этот фермент играет важную роль в разрушении ключевых компонентов тканевого матрикса, таких как эластин, коллаген III и IV типов, ламинин, фибронектин, протеогликаны, приводя, в конечном счете, к формированию эмфиземы легкого [7, 16].

Целью исследования было изучение содержания нейтрофилов, эластазной активности и а, - ингибитора протеиназ (alpha-1-proteinase inhibitor, af - PI) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) у детей с ХБ в зависимости от фазы клинического течения и тяжести заболевания.

Материалы и методы

Обследовано 57 больных (39 мальчиков и 18 девочек) с ХБ в возрасте от 7 до 15 лет (средний возраст 10,8+0,4 лет). Диагноз подтверждался данными компьютерной томографии легких (КТ) в случае выявления утолщения стенок и сужения просвета мелких бронхов, участков вздутия легочной ткани, эмфиземы и наличия симптома “воздушной ловушки”. Контрольную группу составили 10 здоровых волонтеров в возрасте 18 лет, которым было выполнено исследование ЖБАЛ. Все дети с ХБ в зависимости от течения заболевания были разделены на 3 группы. Первую группу (I, п=15) составили больные, имеющие тяжелое течение ХБ, с резкими и значительными изменениями бронхиальной проходимости (ОФВг объем форсированного выдоха за 1 сек. по отношению к должному<61%), эмфизематозная перестройка легочной ткани по данным КТ была выявлена у 82% детей. Вторую группу (II, п=15) - больные с среднетяжелым течением ХБ, имеющие умеренные и легкие нарушения бронхиальной проходимости (ОФВ, - 60-78%), эмфизема отмечалась у 67% больных. Третью группу (III, п=27) - больные с легким течением болезни, имеющие нормальные показатели спирографии (ОФВ)>78%), эмфизема была обнаружена у 23% детей этой группы. Больные наблюдались в течение трех лет в периоды обострения заболевания и относительной клинической ремиссии.

Материалом для исследования служила жидкость бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ), взятая в динамике наблюдения с интервалом в 2-3 недели.

Полученную в процессе фибробронхоскопии ЖБАЛ центрифугировали 10 минут при 1500 об/ мин (400g) при 4°С. Надосадочную жидкость разливали на аликвоты и хранили при -20°С для дальнейшего исследования.

Из осадка, полученного после центрифугирования ЖБАЛ, изготовляли мазки, которые фиксировали в смеси Никифорова, окрашивали по Романов-скому-Гимзе и при иммерсионной микроскопии (х 90) подсчитывали 200 клеток. Соотношение клеточных элементов выражали в процентах.

Активность эластазы в жидкости бронхоальвеолярного лаважа определяли спектрофотометрическим методом [12] с использованием синтетического субстрата паранитрофенилового эфира М-бутил-L-аланил-Ь-аланил- L-аланина в ацетонитриле (BANPE, “Serva”, США). 3,1 мг субстрата растворяли в 1 мл (10'2 М р-р) ацетонитрила. К 2,5 мл 0,002М Na-фосфатного буфера (pH 7,5) добавляли 50 мкл раствора субстрата и 100 мкл ЖБАЛ. Контролем служили пробы, в которых вместо исследуемых образцов использовали 0,002М ФБР. Учет реакции производили немедленно на спектрофотометре “Spekol 220” (Германия) при длине волны 400 нм. Оптическую плотность учитывали трижды с интервалом в 1 минуту. Расчет активности эластазы производили исходя из соотношения прироста оптической плотности в исследуемых образцах за единицу времени (минута, секунда) и коэффициента молярной экстинции 8,800 L'3 моль1 см1.

Уровень а, - ингибитора протеиназ (at - PI) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа определяли методом ракетного иммуноэлектрофореза [1]. В качестве электродного буфера использовали веронал-ме-диналовый буфер (pH 8,8). К 9,5 мл 2% раствора агарозы (“Sigma", США) в электродном буфере при 56°С добавляли 0,5 мл поликлональных антител к at - PI и этим раствором сразу заливали стекло размером 9x12 см. Исследуемые образцы ЖБАЛ исследовали без разведения. В качестве стандартного образца использовали стандартный белок a, - PI (IDP standart SEVAC, Чехия). Исследуемые и стандартные образцы в объеме 5 мкл вносили в лунки в агарозном геле при силе тока 10 mA. Длительность электрофореза составила 18 часов (сила тока 20 тА, напряжение 100 В). Затем стекла сушили под прессом при комнатной температуре и 3-5 минут при 56°С, затем окрашивали 0,1% раствором Кумасси R-250 в течение 10-15 минут, отмывали 10% уксусной кислотой. После измерения размеров пиков рассчитывали концентрацию а, - PI в исследуемых образцах по калибровочной кривой.

Статистическая обработка цифровых результатов осуществлялась на персональном компьютере IBM PC Pentium II с помощью прикладных программ “Statistica” (версия 5,5а) и “Биостатистика”. Достоверность различий оценивали по t - критерию Стьюден-та и непараметрическому критерию Манна - Уитни.

Результаты и обсуждение

Цитологическое исследование ЖБАЛ детей с ХБ показало, что доминирующим типом клеток в группах с тяжелым, среднетяжелым и легким течением болезни были нейтрофилы, доля которых на протяжении всего периода исследования составляла от 30 до 80% от общего числа клеток, что превышало число нейтрофилов у здоровых лиц в 11-27 раз (рис. 1). Следует отметить, что высокое содержание нейтрофилов в ЖБАЛ больных с ХБ выявлялось у 97% больных независимо от варианта течения и периода болезни. Столь выраженная миграция нейтрофилов в очаг воспаления может быть связана не только с действием различных хемотаксических факторов, синтезируемых макрофагами, эпителиальными клетками, фиб-робластами и другими клетками, но и способностью самих нейтрофилов продуцировать интерлейкип-8 (1Ь-8), лейкотриен В4 (ЬТВ,,) и фактор активации тромбоцитов, которые способствуют дополнительному привлечению нейтрофилов в очаг воспаления и хронизации воспаления [15, 18]. Как правило, повышение числа нейтрофилов в очаге воспаления, в основном, связывают с бактериальной инфекцией, например, при хроническом бронхите и муковисцидозе у детей [2, 3]. Однако показана роль нейтрофилов в патогенезе обструктивных заболеваний легких у детей, в формировании которых, как известно, большое значение имеют респираторные вирусные инфекции [6]. Значительное повышение нейтрофилов в ЖБАЛ отмечалось у детей со свистящим дыханием, РС-ви-русным бронхиолитом и бронхиальной астмой [5,11]. Полученные нами данные о содержании нейтрофилов в ЖБАЛ детей с ХБ подтверждаются результатами других исследователей [8, 10].

% ______________________________________________________

100 —

I группа* II группа*

80-------------------------=----------------------------

III группа*

ТЕ

Нейтрофилы

в Контроль я Обострение в Ремиссия

Рис. 1. Число нейтрофилов в ЖБАЛ детей с различным течением хронического бронхиолита: I*, II*, III* - достоверность различий по сравнению с показателями здоровых лиц;

* р<0,001 достоверность различий по сравнению с периодом обострения; 1,Н—III р<0,001 достоверность различий в период обострения; 1,Н—III р<0,05 достоверность различий в период ремиссии

Показатели определения активности эластазы в ЖБАЛ больных с ХБ, а также ее основного ингибитора в легочной ткани а) - Р1 представлены в таблице 1. У здоровых лиц активность эластазы в ЖБАЛ в среднем составляет 0,09±0,02 нмоль/мл.сек. Как видно из таблицы, у больных с легким течением ХБ, среди которых лишь 23% детей, по данным КТ, имело эмфизематозную перестройку легочной ткани, в дистальных отделах респираторного тракта наблюдалось повышение эластазной активности по сравнению с контролем (р<0,05). По мере нарастания тяжести заболевания активность этого фермента повышалась и оставалась высокой как в период обострения заболевания, так и в период относительной клинической ремиссии. Причем у детей с тяжелым и среднетяжелым течением ХБ не наблюдалось различий в активности эластазы, что коррелировало с частотой случаев выявления эмфиземы у данных больных (82% и 63% соответственно).

Табл. 1. УРОВНИ а, - ИНГИБИТОРА ПР0ТЕИНАЗ И ЭЛАСТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (М±пл) В ЖБАЛ У ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКИМ БРОНХИОЛИТОМ

Фаза заболевания I группа II группа III группа Здоровые

п=20 п=18 п=28 п=10

а, - Р1 мкг/мл 5,57+1,02 ** 4,20±0,69 •" 2,66+0,66“

2,90±0,40

Обострение

ЭА нмоль/мл.мин 12,26±4,21 *** 9,03+2,51** 3,61+1,15*

а, - Р1 мкг/мл 9,24+1,10 *** 8,33+0,80*** 5,80+0,81**

Ремиссия 0,09±0,02

ЭА нмоль/мл.мин 14,50+4,75 *** 10,28±1,91 *** 3,05+1,25*

п - количество исследований

* р<0,05; ** р<0,005; *** р<0,001 достоверность различий по сравнению с показателями здоровых лиц;

• р<0,05; **р<0,01; •** р<0,005 достоверность различий по сравнению с периодом ремиссии;

ЭА (эластазная активность): 1,11-Ш р<0,05 в периоды обострения и ремиссии;

а, - Р1: 1,11-Ш р<0,05 в период ремиссии; 1-Ш р<0,05 в период обострения

Табл.2. КОЭФФИЦИЕНТ СООТНОШЕНИЯ “АКТИВНОСТЬ ЭЛАСТАЗЫ / а, - РГ В ЖБАЛ ДЕТЕЙ С ХРОНИЧЕСКИМ БРОНХИОЛИТОМ

Группы больных, период 1 группа п=20 II группа п=18 III группа п=28 Контроль п=10

Обострение 2,2 2,2 1,4 0,03

Ремиссия 1,6 1,2 0,5

Уровни а, - Р1 в группах детей с легким и среднетяжелым течением ХБ были повышены по сравнению с показателями здоровых лиц (р<0,005) только в период относительной клинической ремиссии. У детей с тяжелым течением ХБ показатели а, - Р1 были повышены по сравнению с контролем на протяжении всего периода наблюдения, с достоверным возрастанием (р<0,05) в период относительной клинической ремиссии. При использовании коэффициента соотношения “активность эластазы / а, - РГ’, приведенного в таблице 2, было установлено, что в период обострения у больных с ХБ дисбаланс в системе протеазы / антипротеазы более выражен, чем в период относительной клинической ремиссии. Причем максимальный коэффициент был выявлен в группах с тяжелым и среднетяжелым течением ХБ, что свидетельствует о прямой связи между тяжестью заболевания, активностью воспалительного процесса и активностью эластазы, а, следовательно, и интенсивностью повреждения.

Выявление в ЖБАЛ эластазной активности при остром воспалительном процессе рассматривается и как результат адаптивной реакции на инфекцию, поскольку эластаза обладает антибактериальным эффектом, а также стимулирует бокаловидные клетки к продукции слизи, что способствует элиминации чужеродных патогенов [16]. Однако, при хроническом воспалительном процессе высвобождаемая ней-трофильная эластаза инактивируется протеиназны-ми ингибиторами лишь частично и подвергает про-теолитическому повреждению компоненты тканевого матрикса, а также эпителий респираторного тракта, способствуя метаплазии бокаловидных клеток, что, в свою очередь, приводит к восприимчивости бронхолегочного эпителия к вирусам и бактериям [9]. Эластаза стимулирует альвеолярные макрофаги к продукции ЬТВ,, который наряду с ЬТВ^ и 1Ь-8, синтезируемыми активированными нейтрофилами, привлекает дополнительно нейтрофилы в очаг воспаления. Таким образом, возникает порочный круг: нейтрофил - активация - эластаза - повреждение тканей - эластаза - макрофаг - нейтрофил, при котором происходит амплификация процессов деструкции легочной ткани [16], что приводит к формированию перибронхиального фиброза, как это показано у больных с ХОБЛ [13] и фиброзирующими процессами легких [17]. Помимо изучаемого нами а.

- PI, ингибиторами сериновых протеиназ также являются секреторный ингибитор лейкопротеиназ (SLPI) и специфический ингибитор эластазы (ESI), секретируемые эпителиальными клетками респираторного тракта, в том числе клетками Clara и альвеолярными клетками II типа. В условиях обширного повреждения эпителия в результате активного действия эластазы происходит подавление синтеза этих протеиназных ингибиторов, что способствует формированию эмфиземы легких [14]. Наряду с этим, в молекулярных механизмах патогенеза хронических обструктивных болезней легких ключевую роль играют активные формы кислорода, основными эндогенными источниками которых являются активированные нейтрофилы и альвеолярные макрофаги [3]. Показано, что многие компоненты перикисного окисления, например НОС1 (гипохлорная кислота), помимо окислительного повреждения тканей инактивируют а, - PI посредством окисления молекулы

а, - PI через взаимодействие с Met-358, что, при суммировании с другими факторами, также способствует локальному дефициту антипротеаз и неконтролируемому действию нейтрофильной эластазы [4].

Таким образом, характерной чертой воспалительного процесса при хроническом бронхиолите у детей является повышение протеолитической активности эластазы в результате значительного скопления нейтрофилов в дистальных отделах респираторного тракта и недостаточности протеиназных ингибиторов, что создает дисбаланс в системе протеазы / антипротеазы, и является не только важной характеристикой интенсивности деструктивных процессов, протекающих в легочной ткани у этих больных, но одним из патогенетических звеньев развития тяжелых форм хронического бронхиолита.

Список литературы

1. Аксельсен Н., Крелль И., Вике Б. Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу. - М.: Мир, 1977. -С.1-120.

2. Armstrong D.S., Grimwood К., Carzino R., Carlin J.B., Olinsky A., Phelan P.D. Lower respiratory infection and inflammation in infants with newly diagnosed cystic fibrosis // Br. Med. J. - 1995. - Vol.310. -P. 1571 —1572.

3. Barnes P.J. Chronic Obstructive Pulmonary Disease // The New England Journal of Medicine. - 2000.

- Vol.343. - P.269-280.

4. Dallergi F., Ottonello L. Tissue injury in neutrophilic inflammation // Inflamm. Res. - 1997. - Vol.46.

- P.382-391.

5. Everard M.L., Swarbrick A., Wrightham M., McIntyre J., Dunkley C., James P.D., Sewell H., Milner A.D. Analysis of cells obtained by bronchial lavage of infants with respiratory syncytial virus infection // Arch. Dis. Child. - 1994. - Vol.71. - P.428-432.

6. Hogg J.C. Childhood viral infection and pathogenesis of asthma and chronic obstructive lung disease

I // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1999. - Vol.160. -P.26-28.

i 7. Janoff A. Elastases and emphysema. Current as-

sessment of the protease-antiprotease hypothesis //Am. Rev. Respir. Dis. -1985. - Vol. 132. - P.417-33.

8. Kindt G.C., Weiland J.E., Davis W.B., GadekJ.E., Dorinsky P.M. Bronchiolitis in adult. A reversible cause of airway obstruction associated with airway neutrophils and neutrophil products // Am. Rev. Respir. Dis. - 1989.

- Vol.l40,№2. - P.483-492.

9. Klotowski M.C., Bajolek-Laudinat 0., Puchelle E. Cellular and molecular mechanisms of bacterial adhesion to respiratory mucosa // Eur. Respir. J. - 1993.

- Vol.6.-P.903-916.

10. Lugo R.A., Nahata M.C. Pathogenesis and treatment of bronchiolitis // Clin. Ehafm. - 1993. - Vol.12, N2. - P.95-116.

11. Marguet C., Jouen-Boedes F., Dean T.P., Warner J.O. Bronchoalveolar cell profiles in children with asthma, infantile wheeze, chronic cough, or cystic fibro-

sis // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1999. - Vol.159.

- P.1533-1540.

12. Meyer K.C., Lewandoski J.R., Zimmerman J.J., Nunley D., Calhoun W.J., Dopico G.A. Human neutrophil elastase and elastase / alpha( - antiprotease complex in cystic fibrosis //Am. Rev. Respir. Dis. - 1991. — Vol.144. - P.580-585.

13. Rennard S.I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease // Am. J. Respir. Crit. Care Med. - 1999. - Vol.160. - P.S12-S16.

14. Sallenave J.M., Shulmann J., Crossley .J., Jordana М., Gauldie J.K. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) and elastase specific inhibitor (ESI-elafin) in human airway epithelial cells by cytokines and neutrophilic enzymes // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 1994. -Vol.11. - P.733-741.

15. Scapini P., Lapinet-Vera J.A., Gasperini S., Calzetti F., Bazzoni F., Cassatella M.A. The neutrophil as a cellular source of chemokines // Immunol. Rev. -2000. - Vol.177. - P.195-203.

16. Stockley R.A. Neutrophil and protease / antiprotease imbalance // Am.J. Respir. Crit. Care Med. - 1999.

- Vol. 160. - P.S49-S52.

17. Yamanouchi H., Fujita J., Hojo S., Yoshinouchi Т., Kamei Т., Yamadori I., Ohtsuki Y., Ueda N., Taka-hara J. Neutrophil elastase: alpha-1-proteinase inhibitor complex in serum and bronchoalveolar lavage fluid in patients with pulmonary fibrosis // Eur. Respir. J. -1998. -Vol.il,- P.120-125.

18. Zimmerman G.A., Prescott S.M., McIntyre T.M. Plate-let-activating factor. In: Gallin JI, Goldstein IM, Snyderman R, editors. Inflammation: basic principles and clinical correlates. New York: Raven Press. - 1992. - P.149-176.

поступила в редакцию 21.09.2001 отправлена на доработку 21.10.2001 принята к печати 25.10.2001