МИКРОФЛЮИДНЫЙ ЧИП ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ МНОГОПАРАМЕТРИЧЕСКОГО ИММУНОАНАЛИЗА

Область техники
Заявляемая полезная модель относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно, к микрофлюидным чипам, которые могут быть использованы в качестве средств проведения иммуноанализа, в частности, для определения уровня цитокинов.
Уровень техники
Микрофлюидные чипы (или микрофлюидные системы) широко применяются в различных областях науки и техники.
Микрофлюидные технологии позволяют работать с очень малыми объемами жидкостей, газов, с пузырьками и каплями, с кристаллическими и полимерными частицами, даже с отдельными биологическими клетками. Причем в процессе исследований можно наблюдать за изучаемыми объектами, манипулировать ими, контролировать протекающие процессы.
В основе микрофлюидики – микрофлюидные чипы, позволяющие управлять микро-, нано- и даже пиколитровыми объемами жидкостей. Это важно для таких операций, как подготовка проб, их транспортировка, смешивание, разделение, детектирование, дозирование и др. Преимущества микрофлюидных технологий заключаются и в том, что реакции проходят в закрытых системах, где исключена контаминация, а объемы реагентов минимальны. В результате можно выполнять в миниатюрном формате не только традиционные исследования, но и проводить анализы, которые ранее были нереализуемы.
Наиболее эффективно микрофлюидные чипы используются в химических, биологических и медицинских исследованиях, например, для культивирования клеток, моделирования тканей и органов человека.
Применение микрофлюидных технологий в сочетании с иммунохимическим анализом является современным направлением развития лабораторных технологий.
микрофлюидная система для проведения иммуноанализа
(
),
Из уровня техники известна RU2510509включающая канал для анализируемой жидкости и еще четыре канала, расположенных перпендикулярно к каналу для анализируемой жидкости и одним концом соединяющихся с ним, при этом один из этих каналов является измерительным и в него помещены рецепторы в жидкой среде, другой канал является опорным и содержит только жидкую среду, а в два остальных канала помещены флуоресцентные метки с иммобилизованным на них субстратом в жидкой среде. Вирусные антигены сорбированы непосредственно на стенке одного из капилляров. Функции капилляров различны. Результат оценивается на основе флюоресценции под микроскопом. Реакция осуществляется на основе свободной иммунодиффузии. Загрузка осуществляется шприцом, способ прокачивания жидкости не описан. Такая система представляет собою один из простейших вариантов микрофлюидного диагностического прибора.
Однако, известному решению микрофлюидной системы присущи следующие недостатки:
в микрофлюидной системе отсутствуют клапаны, обеспечивающие возможность первичного заполнения каналов, без преждевременного смешения реагентов. Кроме того, в такой системе отсутствует средство удаления воздушных пузырей, которые неизбежно возникают при подключении микрофлюидной системы к внешним источникам давления или устройствам создания потоков. Таким образом, данная система, как и большинство других известных микрофлюидных чипов не пригодна для проведения полностью автоматического анализа. Использование таких систем ограничено только экспериментальными лабораторными исследованиями, включающими подбор оптимальных параметров, использование дополнительного лабораторного оборудования, и дополнительной пробоподготовки, а также визуального контроля за процессами, происходящими внутри чипа.
автоматизированная «микрофлюидная» аналитическая тест-система
В публикации US20150177233A1 раскрыта . Одноразовый «смарт-картридж», включающий микрофлюидный чип, несёт на себе как резервуары для реагентов, так и реакционные камеры Реакционные и детекционные камеры покрыты антителами, либо хранят в себе лиофилизированные антитела.
Однако, данному решению присущи следующие недостатки. Буфер и ряд других реагентов заправляются в систему отдельно от чипа перед началом анализа, в количестве, рассчитанном на некоторое число циклов детекции. Более того, система предполагает автоматическое пипетирование, для раскапывания реагентов в системе, что нарушает концепцию замкнутого микрофлюидного расходного чипа.
одноразовый дисковидный картридж для анализа биологических образцов
В публикации US2005/0221281A1 раскрыт , содержащий все необходимые реагенты и микрофлюидную структуру для проведения многоступенчатых реакций.
устройство автоматизированной
микрофлюидной системы
Публикация US2004/0152200A1 раскрывает  (от инжекции образца до его детектирования)  для детекции некоего белка, содержащегося в образце посредством ELISA (например, http://www.bialexa.ru/technical-support/methods/elisa/). Такая автоматизация позволяет проводить всю работу без участия специалистов. Для перемещения жидкостей используется сжатый воздух.
Публикация US2011/0020918A1 раскрывает множественные параллельные ELISA-тесты, проведённые посредством точного разделения реагентов на микрофлюидном чипе. Каждое первичное или вторичное антитело доставляется через отдельный канал доставки в реакционную камеру. Чип поддерживает высокую плотность реакционных камер 1,000-4,000 на квадратный сантиметр. Подобная миниатюризация позволяет оперировать объёмами порядка нанолитров. Устройство предполагает использование клапанов и насосов, мембран, обладает сложной топологией и методами контроля движения жидкостей. Описан порядок размещения реагентов, включающий их ковалентную или не ковалентную иммобилизацию в устройстве. Детекция оптическим способом может быть произведена, в частности, с использованием микроскопа в специальных «зонах детекции» на устройстве. Устройство имеет многослойную структуру, может быть изготовлено из эластомерных материалов (например, полидиметилсилоксан PDMS) и хранит в себе необходимые реагенты. Благодаря использованию гидрофобных материалов, хранимые реагенты размещаются в капельках воды, удерживаясь в нужных местах без применения химического связывания. В этом устройстве каждый его слой имеет своё предназначение и в этом ограниченном смысле оно является трёхмерным. Описываемая система может иметь многообразные применения, но не является самостоятельным устройством для прикроватной медицины.
гибридный многослойный микрофлюидный чип
Публикация WO2016/140990A1 описывает  на основе бумаги и полиметилметакрилата. Такой чип направлен на выявление распространённых инфекций малозатратными методами. В таком чипе бумажная часть может составлять большую трёхмерную поверхность, пригодную для иммобилизации антител, либо антигенов, что способствует существенному увеличению чувствительности ELISA.
Вероятные конструкции известных микрофлюидных чипов раскрыты также в публикации http://www.j-analytics.ru/files/article_pdf/6/article_6128_791.pdf.
сменный микрофлюидный модуль
,
Наиболее близким по технической сущности к заявляемой полезной модели является раскрытый в патенте РФ №2380418, включающий приёмную камеру для ввода биологического образца, резервуар для лизиса, содержащий мембрану, резервуары для растворов лизирующего буфера, микроколонку, содержащую твердофазный сорбент для связывания нуклеиновых кислот, резервуары промывочного буфера и этанола для удаления с микроколонки остаточных белков и кристаллов соли, резервуар для элюирующего буфера, выходной порт, совместимый со стандартной микропробиркой, резервуар для сбора отходов реакций.
Все описанные выше устройства не имеют необходимого набора узлов и устройств для обеспечения полностью автоматического проведения анализа. Так, например, в описании большинства приведённых микрофлюидных систем отсутствует интегрированное устройство удаления воздушных пузырей. Воздушные пузыри являются общей проблемой для многих микрофлюидных систем, так как они являются демпферами давления, из-за чего ухудшается управление скоростью потока в микроканалах. Также наличие воздушных пузырей изменяет эффективный объем дозирования, что влечёт за собой снижение точности анализов, проводимых с помощью того или иного микрофлюидного чипа. Кроме того, воздушные пузыри могут закупоривать гидрофильные микрофильтрующие мембраны или другие узлы микрофлюидной системы и препятствовать протеканию жидкости. Следует отметить, что неизбежно воздушные пузыри чаще всего возникают в местах сопряжения микрофлюидных чипов с внешними устройствами и патрубками, в местах герметизации входных отверстий чипа. Поэтому результаты анализов с использованием микрофлюидных чипов, не оборудованных эффективной системой отделения пузырей воздуха, плохо воспроизводятся и не могут быть использованы для полностью автоматизированных медицинских диагностических систем.
Раскрытие сущности полезной модели
Известным чипам при автоматизации процесса подачи и отведения малых объёмов растворов, как правило, присуще неконтролируемое разбавление растворов, их перекрёстное смешение и попадание воздуха в объем.
Техническая проблема, на решение которой направлена заявляемая полезная модель, заключается в необходимости преодоления недостатков, присущих аналогам и прототипу посредством создания микрофлюидного чипа многослойной конструкции, обеспечивающего сепарацию пробы и реагентов, их фильтрацию, удаление воздушных пузырей из микроканалов, контролируемое смешение и инкубацию, что позволит проводить полностью автоматизированное манипулирование пробой и реагентами, необходимыми для проведения иммунофлуоресцентного анализа на микросферах.
автоматизации
при которой
Технический результат, достигаемый при использовании заявляемой полезной модели микрофлюидного чипа, заключается в обеспечении полной  процесса последовательной подачи и отведения малых объёмов растворов реагентов для проведения флуоресцентного иммуноанализа на микросферах, , за счёт конструктивных особенностей данного микрофлюидного чипа, исключаются неконтролируемые изменения объёмов данных растворов, в том числе перекрёстное смешение проб и реагентов, их концентраций и скорости подачи.
При этом конструкция чипа выполнена таким образом, что при его использовании на всех стадиях анализа для манипулирования пробой и реагентами внутри микроканальной системы чипа требуется один внешний источник давления или потока.
Система обратных клапанов чипа автоматически предотвращает нежелательное преждевременное смешение пробы и реагентов вне реакционной камеры. Оригинальная конструкция обратных клапанов в данном чипе не требует внешнего управления – их положение контролируется исключительно направлением потока, которое создаёт один внешний источник давления. Микрофлюидный чип также содержит узел автоматического удаления воздушных пузырей из объёма пробы и реагентов, за счёт чего отпадает необходимость предварительной дегазации используемых жидкостей, или визуального контроля для выявления их наличия.
Заявляемый микрофлюидный чип может быть использован при проведении полностью автоматизированного количественного анализа, позволяющего измерить концентрации белковых маркеров, в малых объёмах исследуемых проб. При этом, за счёт полного исключения из процесса проведения анализа человеческого фактора, проведение такого анализа не требует участия медицинского или лабораторного сотрудника. Такая автоматизация позволяет повысить точность, воспроизводимость и степень достоверности проводимых анализов. Использование одноразовых персонализированных микрофлюидных чипов заявляемой конструкции, позволяет производить исследование по индивидуальному набору белковых маркеров и исключает перекрёстное загрязнение проб.
согласно техническому решению
Поставленная задача решается тем, что , заявляемый микрофлюидный чип, представляющий собой корпус, выполненный из оптически прозрачного материала, снабжённый технологическими отверстиями для подачи растворов пробы, буфера и реагентов, внутри которого вплотную друг к другу размещены слои из оптически прозрачного материала, снабжённые прорезями и отверстиями, образующими при сборке резервуары и камеры, расположенные в технологическом порядке по направлению движения потока и соединённые между собой системой микрофлюидных каналов:
- проточную камеру фильтрации пробы, снабжённую трековой мембраной и обратным клапаном,
- проточный отделитель пузырей воздуха в пробе, выполненный в виде камеры, снабжённой микрофильтрующей мембраной и обратным клапаном,
- реакционную камеру, предназначенную смешивания подготовленной пробы с флуоресцентно меченными полимерными микросферами, выполненную с возможностью подачи в её объем реагентов, и содержащую гидрофильную микрофильтрующую мембрану, с размером пор меньшим, чем размер микросфер,
- камеру сбора отработанных реагентов, соединённую каналом с реакционной камерой,
при этом в технологическом отверстии, предназначенном для подачи пробы, установлена мембрана с полной остаточной деформацией, обеспечивающая возможность мембранного впрыскивания пробы в чип. Обратные клапаны, установленные на входе в проточный отделитель пузырей воздуха и проточную камеру фильтрации пробы, представляют собой эластичную плёнку, размещённую с натяжением на входе в соответствующую камеру.
В качестве пробы используют цельную капиллярную кровь или сыворотку крови человека, разбавленную в 5 раз или любую другую биологическую жидкость, при этом объём пробы составляет не более 50 мкл. Материал мембраны выбран таким образом, чтобы спектр его флуоресценции, при наличие таковой, не перекрывался со спектрами флуоресценции красителей, используемых в реализуемой методике иммуноанализа.
Краткое описание чертежей
Заявляемая полезная модель поясняется следующими чертежами и схематичными изображениями.
На фиг. 1 представлена схема расположения слоёв заявляемого чипа.
На фиг.2-16 представлены изображения каждого из слоёв, образующих заявляемый чип.
На фиг.17 представлена проекция схемы расположения слоёв заявляемого чипа
На фиг.18-19 схематично представлено устройство проточного отделителя воздушных пузырей.
На фиг.20 представлено изображение флуоресцентных микросфер на мембране из SiO2.
На фиг.21-22 представлена схема работы обратного клапана.
На фиг.23 представлена схема иммунодетекции микрофлюидного чипа с использованием микросфер.
На фиг.24 представлено фото заявляемого чипа.
Позициями на чертежах обозначены:
1- слой 1,
2- слой 2,
3- слой 3,
4- слой 4,
5- слой 5,
6-  слой 6,
7-  слой 7,
8- слой 8,
9- слой 9,
10- слой 10,
11- слой 11,
12- слой 12,
13- слой 13,
14- слой 14,
15- слой 15,
16- мембрана реакции,
17- мембрана тефлоновая,
18- мембрана трековая,
19- корпус устройства,
20- резервуар для хранения пробы (Р1)
21- резервуар хранения реагентов (Р2)
22- резервуар хранения реагентов (Р3)
23- камера фильтрации пробы (ФК),
24- проточный отделитель пузырей воздуха (Ф),
25- реакционная камера (РК),
26- камера сбора отработанных реагентов (КОР),
27- отверстие сброса давления из резервуара сбора отработанных реагентов,
28- порт подключения внешнего источника давления с раствором для промывки реакционной камеры,
29- порт подключения внешнего источника давления для перемещения пробы из резервуара Р1 по микрофлюидной системе чипа вплоть до реакционной камеры РК.
30- порты для загрузки пробы в резервуар Р1.
31- порт для подключения внешнего источника давления для промывки нижней части камеры фильтрации пробы ФК.
32- порт подключения внешнего источника давления для создания потока и перемещения реагента из резервуара Р2 по микрофлюидной системе чипа до реакционной камеры РК.
33- порт подключения внешнего источника давления для создания потока и перемещения реагента из резервуара Р3 по микрофлюидной системе чипа до реакционной камеры РК.
34- порт подключения внешней вакуумной линии, для обеспечения работы отделителя воздушных пузырей Ф.
35- обратный клапан К1 канала подвода промывочного раствора от отверстия 28 к реакционной камере РК,
36- обратный клапан К2 канала, соединяющего резервуар с пробой Р1 с верхней частью камеры фильтрации пробы ФК,
37- обратный клапан К3 канала подвода промывочного раствора из отверстия 31 к нижней части фильтрующей камеры ФК,
38- обратный клапан К4 канала, соединяющего нижнюю часть фильтрующей камеры пробы ФК с верхней частью реакционной камеры РК,
39- обратный клапан К5 канала, соединяющего резервуар Р2 с раствором реагента с верхней частью реакционной камеры,
40- обратный клапан К6 канала, соединяющего резервуар Р3 с раствором реагента с верхней частью реакционной камеры.
41- входное отверстие проточного отделителя пузырей воздуха (Ф1),
42- выходное отверстие проточного отделителя пузырей воздуха (Ф2),
43- биоконъюгированная микросфера,
44- биологический маркер,
45- флуоресцентная метка,
46- оптическая система детекции.
Осуществление полезной модели
Заявляемый микрофлюидный чип представляет собой одноразовый сенсор, предназначенный для проведения иммунологического многопараметрического анализа.
Микрофлюидный чип выполнен в виде прозрачного корпуса, в котором размещены склеенные под давлением тонкие слои из разных оптически прозрачных материалов с нанесёнными на них сквозными прорезями разной толщины и закреплённых мембран и клапанов. Внешние размеры чипа продиктованы размерами камер и оборудования, на которых он работает, а также эстетически-практическими соображениями. В слоях и корпусе выполнены технологические отверстия (порты) для подключения средств подачи растворов образца, буфера и реагентов. Все слои имеют своё функциональное значение.
В состав чипа входят: пять слоёв, выполненных из полиметилметакрилата (ПММА) толщиной не более 1 мм, 2 слоя плёнки из поликарбоната толщиной 0,2 мм и 8 адгезионных (клеящих) слоёв из безосновной двухслойной клейкой ленты 3М 468МР, причём адгезионные слои 6 и 7 имеют толщину около 0,05 мм, а остальные – около 0,1 мм. Адгезионные слои предназначены для соединения остальных слоёв и мембран. Далее приведено описание всех слоёв заявляемого чипа, начиная с верхнего слоя.
Слой 15 (см. фиг.2) выполнен из полиметилметакрилата толщиной не более 1 мкм. Данный слой является верхней стенкой всего микрофлюидного чипа, в нем расположены все отверстия 27-34 для подключения внешних источников давления и разряжения, заполнения резервуаров.
Слой 14 (см. фиг.3) выполнен из клейкого материала, например, клейкой ленты 3М 468МР толщиной не более 120 мкм. В данном слое расположены верхние камеры обратных клапанов К1, К2, К3, К4, К5 и К6, резервуары для хранения пробы Р1 объемом ~50 мкл, и реагентов Р2, Р3 объемами ~30 мкл, и каналы, соединяющие указанные резервуары с соответствующими отверстиями 27-34.
Слой 13 (см. фиг.4), аналогично Слою 1 выполнен из полиметилметакрилата толщиной не более 1 мкм. Данный слой предназначен для придания верхним камерам обратных клапанов К1, К2, К3, К4, К5 и К6, необходимой толщины, для обеспечения их корректной работы. Кроме того, в данном слое также расположен основной объем резервуаров Р1, Р2, Р3. Данный слой также является верхней стенкой реакционной камеры РК, сквозь которую происходит детекция флуоресцентных сигналов от микросфер.
Слой 12 (см. фиг.5) выполнен из клейкого материала, например, 3М 468МР толщиной не более 120 мкм. В данном слое расположены верхние камеры обратных клапанов К1, К2, К3, К4, К5 и К6, а также верхняя часть реакционной камеры РК, резервуары для хранения пробы Р1 и реагентов Р2, Р3, и каналы, соединяющие данные узлы с соответствующими отверстиями 27-28, 30, 34.
Слой 11 (см. фиг.6) выполнен из плёнки полиэтилентерефталата (ПЭТ) толщиной не более 120 мкм. В данном слое расположены верхние камеры обратных клапанов К1, К2, К3, К4, К5 и К6, а также верхняя часть реакционной камеры РК. Плёнка ПЭТ предназначена для придания глубины реакционной камере РК, для выравнивания потока через мембрану SiO2. Кроме того данный слой является нижней стенкой резервуаров для хранения пробы Р1 и реагентов Р2, Р3, и отделяет их от остальной системы микрофлюидных каналов.
Слой 10 (см. фиг.7) выполнен из клейкого материала, например, 3М 467МР толщиной не более 60 мкм. В данном слое расположены верхние камеры обратных клапанов К1, К2, К3, К4, К5 и К6, а также верхняя часть реакционной камеры РК, верхняя часть камеры фильтрации пробы ФК и верхняя часть отделителя пузырей воздуха Ф, которая является вытянутой проточной микрофлюидной ячейкой.
Слой 9 (см. фиг.8) выполнен из клейкого материала, например, 3М 467МР толщиной не более 60 мкм. В данном слое расположены отверстия для крепления мембран 16 и 18, а также верхняя часть камеры фильтрации пробы ФК.
Слой 8 (см. фиг.9) выполнен из клейкого материала, например, 3М 468МР толщиной не более 120 мкм. В данном слое расположены нижние камеры обратных клапанов К1, К2, К3, К4, К5 и К6, а также нижняя часть реакционной камеры РК, нижняя часть камеры фильтрации пробы ФК с поддерживающими ламелями.
Слой 7 (см. фиг.10) выполнен из плёнки полиэтилентерефталата (ПЭТ) толщиной не более 120 мкм. В данном слое расположены нижние камеры обратных клапанов К1, К2, К3, К4, К5 и К6, а также нижняя часть реакционной камеры РК и проточного отделителя пузырей Ф. Плёнка ПЭТ предназначена для придания глубины реакционной камере РК, для выравнивания потока через мембрану SiO2.
Слой 6 (см. фиг.11) выполнен из клейкого материала, например, 3М 468МР толщиной не более 120 мкм. В данном слое расположены нижние камеры обратных клапанов К1, К2, К3, К4, К5 и К6, а также нижняя часть реакционной камеры РК, и каналы, соединяющие данные узлы с соответствующими отверстиями.
Слой 5 (см. фиг.12) выполнен из полиметилметакрилата толщиной не более 1 мкм. Данный слой является верхней стенкой камеры сбора отработанных реагентов КОР и отделяет этот резервуар от остальной системы каналов. В данном слое расположены отверстия 27, 34, и проточный отделитель пузырей Ф.
Слой 4 (см. фиг.13) выполнен из клейкого материала, например, 3М 468МР толщиной не более 120 мкм. Данный слой повторяет геометрию Слоя 14 и предназначен для соединения Слоя 13 и Слоя 11 между собой.
3
Слой 3 (см. фиг.14) выполнен из полиметилметакрилата толщиной не более 1 мкм. Данный слой повторяет геометрию Слоя 14 и предназначен для придания камере сбора отработанных реагентов КОР необходимого объёма ~ 1см. Также с помощью этого слоя придаётся необходимая глубина каналу, соединяющему отверстие 34 с отделителем пузырей воздуха Ф, для эффективной передачи разрежения в нижнюю вакуумируемую камеру.
Слой 2 (см. фиг.15) выполнен из клейкого материала, например, 3М 468МР толщиной не более 120 мкм – содержит камеру сбора отработанных реагентов КОР, которая соединена с отверстием 27 для сброса давления из данного резервуара. Кроме того, данный слой содержит нижнюю вакуумированную камеру отделителя воздушных пузырей Ф, соединённую с отверстием 34 для подключения внешней вакуумной линии.
Слой 1 (см. фиг.16) выполнен из полиметилметакрилата толщиной не более 1 мкм и является основанием чипа, содержит только технические центровочные отверстия по углам, необходимые для сборки чипа и фиксации слоёв при сборке.
Камера сбора отработанных реагентов (КОР) представляет собой прямоугольный резервуар объемом ~ 1млм, основной объем которого находится в Слое 3. Резервуар соединён с нижней частью реакционной камеры РК откуда поступают отработанные реагенты, и имеет выход для сброса давления.
Проточный отделитель воздушных пузырей Ф представляет собой камеру, разделённую по горизонтали гидрофобной мембраной №17, изготовленной из политетрафторэтилена (ПТФЭ), которая имеет диаметр пор ~1 мкм. Нижняя часть отделителя воздушных пузырей представляет собой вакуумируемую камеру, в которую через мембрану откачиваются воздушные пузыри из растворов. Верхняя часть отделителя воздушных пузырей представляет собой проточную микрофлюидную ячейку, нижней стенкой которого является ПТФЭ мембрана. Через проточную ячейку прокачивают все растворы, последовательно поступающие в реакционную камеру. При этом из-за гидрофобных свойств мембраны жидкость не проходит сквозь её поры и не попадает в вакуумируемую камеру, а воздушные пузыри удаляются с помощью разряжения нижней вакуумируемой камеры. Отсутствие воздушных пузырей позволяет исключить их влияние на скорости прокачки и изменения эффективного объёма пробы или реагента. ПТФЕ мембрана №17 расположена в Слое 9 и представляет собой прямоугольник размером 4*8 мм. Схема работы отделителя воздушных пузырей в разрезе приведена на фиг. 18-19.
2
Реакционная камера (РК) представляет собой камеру, разделённую по горизонтали гидрофильной мембраной №16, изготовленной из волокон SiO. Эффективный диаметр пор такой мембраны составляет ~0.5 мкм. При сборке микрофлюидного чипа в верхнюю часть РК на мембрану для детекции наносят флуоресцентные конъюгированные микросферы с иммобилизованными антителами. При процессировании чипа все реагенты последовательно проходят сквозь мембрану и через слой микросфер на её поверхности. При этом на поверхности микросфер происходит специфическое связывание белковых маркеров из пробы и их последующая проявка. Данный узел позволяет обеспечить реакцию всего объёма пробы или реагента с поверхностью микросфер. После прокачки растворов сквозь мембрану они попадают в нижнюю часть реакционной камеры, которая соединена каналом с камерой сбора отработанных реагентов. Мембрана из SIO2 №16 расположена между Слоем 9 и Слоем 10 и представляет собой квадрат размером 5*5 мм. Такое конструктивное решение РК позволяет преодолеть диффузионные ограничения в процессе связывания белковых маркеров из пробы с микросферами. Флуоресцентное изображение микросфер на этой мембране приведено на фиг.20 (поле зрения 1 мм).
Каждый из обратных клапанов К1-К6 представляет собой камеру, разделённую по горизонтали эластичной мембраной №19, которая может быть изготовлена из резины толщиной 0,1 мм и имеет единичное перфорированное отверстие в центре диаметром 0,7 мм. Нижняя часть камеры обратного клапана, находящаяся под мембраной, имеет глубину 0,2 мм; верхняя часть камеры обратного клапана, имеет глубину 1,2мм. Таким образом, когда поток жидкости поступает снизу вверх, эластичная мембрана выгибается, перфорированное отверстие растягивается и жидкость протекает сквозь клапан. В обратном случае, когда поток жидкости поступает сверху вниз, эластичная мембрана прижимается к нижней стенке камеры обратного клапана, перфорированное отверстие остаётся сомкнутым и жидкость не протекает сквозь клапан. Таким образом, обратные клапаны такой конструкции не требуют дополнительного внешнего управления, их пропускная способность зависит только от направления тока жидкости через них. Обратные клапаны препятствуют неконтролируемому разбавлению растворов пробы и реагентов и их преждевременному смещение вне реакционной камеры. Эластичная мембрана №19 расположена в Слое 9 и представляет собой квадрат размером 5*5 мм. Схема работы обратного клапана в разрезе приведена на фиг.21-22, стрелками указаны направления потока жидкости.
Камера фильтрации пробы (ФК) представляет собой камеру, разделённую по горизонтали трековой мембраной №18 (способ изготовления трековой мембраны раскрыт, например, в патенте RU 2325944), которая может быть изготовлена из лавсана толщиной 0,012 мм и имеет поры диаметром ~480 нм. В верхнюю часть ФК поступает проба из резервуара Р1, проба проходит сквозь мембрану, при этом объекты, размер которых больше диаметра пор, остаются на мембране. Отфильтрованная проба поступает в нижнюю часть ФК, которая сообщается с реакционной камерой РК. Мембрана №18 расположена между Слоем 8 и Слоем 9 и представляет собой прямоугольник размером примерно 17*22 мм. При этом в Слое 8 расположены ламели, поддерживающие мембрану №18 для избегания её провисания.
Заявляемый чип изготавливают следующим образом.
С помощью программируемого лазерного гравера Laser Pro GCC Spirit GLS 100, производят изготовление (раскройку) слоёв (деталей) чипа из соответствующих материалов и подготавливают их к сборке. Осуществляют частичное совмещение слоёв (деталей чипа), в результате которого получают 4 части чипа, включающие соответствующие слои и мембраны: слои 15-12; слои 11-8, слои 7-5, слои 4-1.
На микрофильтрующую мембрану из SiO2 находящуюся в 3-ий части чипа c помощью лабораторного дозатора наносят раствор, содержащий микросферы. После чего мембрану просушивают в потоке воздуха. 4 части чипа по отдельности спрессовывают под вакуумом с помощью гидравлического пресса с давлением порядка 800 кг на каждую часть. После чего 4 части чипа совмещают и спрессовывают под вакуумом с помощью гидравлического пресса с давлением порядка 800 кг на чип. Через отверстия 32 и 33 с помощью лабораторного дозатора заполняют необходимыми реагентами резервуары Р2, и Р3. Все отверстия чипа запечатывают клейкой плёнкой. В таком виде чип хранится до начала анализа при температуре +4 градуса Цельсия.
Совмещённые отверстия и прорези в слоях образуют порты и каналы, в которых происходит как латеральное, так и поперечное движения жидкости.
Клапаны перенаправляют потоки, а резервуары служат для их замедления или хранения жидкости.
Микрофлюидный чип выполняет задачу доставки реактивов из различных внутренних камер и сыворотки крови к реакционной камере, мембраны служат как для разделения крови на сыворотку и форменные элементы, так и для удержания микросфер с закреплёнными на них молекулярными комплексами.
Внутренние размеры каналов, клапанов, камер, а также вся архитектура микрофлюидного чипа экспериментально подобраны в соответствии с требованием к скорости протекания, давлению жидкости и выполнением поставленных перед ним задач - доставку реактивов из различных внутренних камер и сыворотки крови к реакционной камере. Мембраны предназначены как для разделения крови на сыворотку и форменные элементы, так и для удерживания микросфер с закреплёнными на них иммуноферментными комплексами. Состав и материалы слоёв чипа продиктованы выполняемыми задачами – оптическая прозрачность - и возможностями имеющегося оборудования для производства чипов – пригодностью к лазерной и механической обработке.
Заявляемый микрофлюидный чип работает следующим образом.
Через отверстие 30 в резервуар Р1 заявляемого чипа вводят пробу объемом 50 мкл, после чего порт герметизируют, например, при помощи клейкой ленты. Чип помещают в анализатор, после чего в автоматическом режиме ведут процесс иммунного анализа. К внешнему порту 34 подключают внешнюю вакуумную линию для обеспечения работы системы отделения воздушных пузырей. Далее через порт 28 происходит первичное заполнение реакционной камеры объемом 60 мкл промывочным раствором с линейной скоростью около 50 мкл/сек, которая проходит через следующие точки чипа (см. схемы слоев): К1 - К5 - К6 - Ф1 - Ф2 - РК и далее поступает в камеру сбора отработанных реагентов (КОР).
Через порт 29 с помощью прокачки буферного раствора подается давление 0,12 -0,2 МПа и проба крови из резервуара Р1 перемещается в обратный клапан К2, а затем в камеру фильтрации крови (ФК), далее через клапан К4, затем точки Ф1 - Ф2 попадает в реакционную камеру РК.
Через порт 31 подается буфер для промывки ФК. Он проходит через обратный клапан К3, затем через ФК, К4, Ф1 - Ф2 - РК, и сбрасывается в контейнер отработанных реактивов (КОР).
Через порт 32 с помощью прокачки буферного раствора подается давление 0,12 -0,2 МПа в резервуар с реагентом (Р2). Жидкости проходят через К5 и К6, Ф1 - Ф2 - РК и утилизируются в КОР.
После этого следует промывка чипа буфером по маршруту К1 - К5 - К6 - Ф1 - Ф2 - РК.
Через порт 33 в резервуар Р2 с помощью прокачки буферного раствора подается давление 0,12 -0,2 МПа, жидкости проходят через К6, Ф1 - Ф2 - РК и утилизируются в КОР.
Затем следует финальная промывка чипа К1 - К5 - К6 - Ф1 - Ф2 - РК.
При этом давление подают с таким расчетом, чтобы скорость движения жидкостей в чипе составляет 0,08 мкл/с. Объём промывки составляет 80 мкл. Объем вносимой пробы составляет 50 мкл. Объёмы реактивов, размещаемых на чипе (Р2 и Р3) составляют по 30-40 мкл.
Обратные клапаны К1 - К6 обеспечивают предотвращение попадания сыворотки в смежные микроканалы и смешивание реактивов на чипе.
Гидрофобная полупроницаемая мембрана предназначена для отделения микропузырьков воздуха из реагентов и предотвращения попадания пузырьков в РК.
Пример конкретного выполнения
Микрофлюидный чип заявляемой конструкции был изготовлен для одновременного определения концентраций 4 интерлейкинов IL1b, IL6, IL8, IL10 и белка теплового шока HSP70 человека в сыворотках крови.
Основные технические характеристики изготовленного чипа представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Основные технические характеристики
№п/п
Наименование
Значение
1
Габаритные размеры прибора (ДхШхВ), мм
74х50х6,1 (размеры после опрессовывания)
2
Масса прибора, кг
0,020
3
Материалы послойно:
ПММА
Полиметилметакрилат ГОСТ 10667-90
Адгезионный слой
Безосновная двухслойная клейкая лента 3М 468МР ГОСТ 20477-86
Плёнка
Поликарбонат ГОСТ 25288-82
4
Нагрузка для опрессовывания
800кг
При сборке чипа на мембрану реакции вносили по 2 мкл магнитных микросфер каждого типа с иммобилизованными моноклональными антителами к IL1b, IL6, IL8, IL10 (BioPlex ProTM Hu Cyto Grp I, Bio-Rad) и HSP70. В качестве реагента Р2 использовали раствор смеси биотинилированных детектирующих антител к соответствующим белкам. В качестве реагента Р3 для детектирования комплексов антигенов и биотинилированных антител использовали стрептавидин, конъюгированный с фикоэритрином. Таким образом, чем выше концентрация данных белковых маркеров в исследуемой пробе, тем большее количество флуоресцентного красителя связывается с поверхностью микросфер. Флуоресцентный сигнал от микросфер детектируется, например, посредством эпифлуоресцентного микроскопа и с помощью калибровки пересчитывается в значение концентрации белковых маркеров.