СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИРОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В СОСТАВЕ БЕЛКОВ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ
METHOD FOR DETERMINATION OF NATURAL AMINO ACIDS IN FOOD PRODUCTS PROTEIN COMPOSITION

Изобретение относится к области анализа биологической ценности объектов пищевого и медицинского назначения, в частности животного сырья и продукции на его основе, и может быть использовано в медицине, пищевой и парфюмерной промышленности, а также сельском хозяйстве.
Известны разные методы определения состава аминокислот в белках. Наиболее часто используют метод классической высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), который дает возможность осуществлять разделение и идентификацию большинства аминокислот в смеси, однако недостаточная специфичность метода не позволяет проводить полное дифференцирование всех 20-ти природных аминокислот, в частности не происходит полное разделение и соответствующая идентификация серина от валина, фенилаланина от пролина и некоторых др. пар аминокислот, имеющих близкую хроматографическую подвижность в условиях ВЭЖХ [Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Коллаген: получение, свойства и применение: монография. - М.: ГОУ ВПО МГУЛ, 2007].
Известен также способ повышения точности определения последовательности аминокислотных остатков биополимеров по данным масс-спектрометрического анализа с использованием вычислительной системы [Патент RU №2408011 C2]. Метод отличается точностью, но является сложным по техническому осуществлению и требует применения дорогостоящего масс-спектрометрического детектирования.
Известен способ идентификации 11-16 аминокислот методом капиллярного электрофореза [Патент RU №2346931 C1], однако указанный способ не позволяет определять весь спектр природных аминокислот.
Наиболее близким к заявленному является способ разделения основных аминокислот, который заключается в том, что аминокислоты разделяют двумерной тонкослойной хроматографией и последовательным использованием двух новых хроматографических систем растворителей: изопропиловый спирт - ацетон - 24-25% раствор аммиака - вода в соотношении (19,0-27,0):(20,0-26,0):(3,0-6,5):(6,0-10,0) (по объему) и хлороформ - этанол - ледяная уксусная кислота - вода в соотношении (23,0-27,0):(13,5-16,0):(1,3-3,5) (по объему). Для детектирования аминокислот используют нингидриновый реактив и дополнительно реактивы Эрлиха или Несслера [Заявка RU №94028253 A1, кл. G01N 30/02]. Способ является трудоемким и не позволяет осуществлять быструю идентификацию в автоматической режиме.
Технической задачей заявленного изобретения является ускорение процесса выделения аминокислот из пищевого продукта и повышение точности определения за счет сокращения потерь и применения высокочувствительного материала.
Поставленная задача решается в способе, предусматривающем кислый гидролиз образца, фильтрацию и хроматографическое разделение гидролизата с последующей автоматической идентификацией и количественной оценкой содержания аминокислот на автоматическом анализаторе.
Технический результат заключается в определении аминокислот в составе белков пищевого продукта при их содержании порядка 0,1-3,5 г/100 г продукта (1,5-17 г/100 г белка) с применением последовательного элюирования аминокислот смесью буферных растворов и одновременным детектированием компонентов при двух длинах волн 440 и 570 нм.
Заявляемый способ определения осуществляют по следующей методике.
Анализ содержания аминокислот выполняют на аминокислотном анализаторе, в который вводят гидролизат пищевого продукта. Для разделения аминокислот используют буферную систему компонентов A-F, состав буферных растворов указан в табл.1. pH буферных растворов предварительно устанавливают с помощью ортофосфорной кислоты и гидрооксида натрия, растворы перед введением в анализатор подвергают фильтрованию через фторопластовый фильтр с размером пор 0,22 мкм.
Таблица 1
Состав буферных растворов
Наименование
A
B
C
D
F
pH
3,3
3,6
4,5
11,0
11,0
Нормальность
0,10
0,10
0,10
0,25
0,3
Ацетат натрия, г
8,2
8,2
8,2
8,2
0
Метанол, мл
75
0
0
0
0
Муравьиная кислота, мл
3,0
3,0
2,0
1,2
0
Уксусная кислота, мл
15,0
20,0
1,5
5,0
0
Борная кислота, г
0
0
0
2,0
0
Этилендиаминтетраацетата динатриевая соль, г
0
0
0
0,5
0
Гидроксид натрия, г
0
0
0
6,0
12,0
Каприловая кислота, мкл
100
100
100
100
100
Вода деионизированная для ВЭЖХ, л
до 1
до 1
до 1
до 1
до 1
+
Принцип определения аминокислот заключается в следующем. 20 мкл анализируемой пробы помещают в пластиковый сосуд, который устанавливают в поворачивающийся штатив автоматического термостатированного инжектора. Закол пробы осуществляется в соответствии с программой после промывки и регенерации хроматографической колонки, имеющей температуру 47°C и заполненной ионообменником - катионитом с карбоксильными ионогенными группами в Na-форме. Подача элюента осуществляется по капиллярным шлангам высокого давления с внутренним диаметром 0,2 мм. Разделение аминокислот осуществляется автоматически в соответствии с заданной программой (табл.2). После разделительной колонки раствор поступает в термостатированный реактор для проведения цветной реакции. Подача в реактор нингидринового раствора, содержащего: 15 г/л нингидрина, 0,55 г/л гидридантингидрата, 1% метилцеллозольва, 10% метанола в 0,1 M ацетатном буфере pH 4,8, позволяет при температуре реактора 125°C осуществлять цветную реакцию анализируемых и прошедших аминокислот с нингидрином. Далее окрашенный раствор с комплексом аминокислот с нингидрином подается насосом в УФ детектор. Регистрацию аминокислот, связанных в комплексе с нингидрином, осуществляют автоматически одновременно при 570 нм, пролин анализируют при 440 нм, т.к. это является максимальной абсорбцией для данных определяемых аминокислот.
Работа анализатора выполняется по программе, предусматривающей одновременное ступенчатое изменение вида буфера и температуры хроматографической колонки на каждой стадии. Стандартное время анализа от момента ввода пробы до завершения выхода последнего пика, соответствующего аргинину, составляет 50 минут при скорости подачи элюента 0,2 мл/мин.
Таблица 2
Программа анализа аминокислот (P в колонке 50 атм, поток 0,2 мл/мин)
1
2
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Время, мин
12,0
5,5
7,5
9,0
3,0
11,0
9,0
8,0
0,1
8,0
4,0
6,1
0,4
Ввод образца
X
Нингидриновый буфер
X
X
X
X
X
X
X
X
Буфер A
X
X
Буфер B
X
Буфер C
X
X
Буфер D
X
X
X
Буфер F
X
X
X
X
X
Температура колонки, °C
47
47
48
48
49
52
56
60
60
70
70
55
55
Используемый метод позволяет определять с точностью ±(5-10)% наличие всех природных аминокислот с минимальным уровнем их содержания в растворе (0,500±0,006) мкмоль/мл. Минимальный интервал надежного определения сигнала аминокислот, составляющий >200 мВ, получают для концентрации >0,3 мкг/мл взятого на анализ белка в пробе.
Пример. 0,1 г образца (пищевого продукта или белка неизвестного состава с содержанием белкового компонента более 20%) обрабатывают 6 M раствором HCl в количестве 1 мл при температуре 120°C в течение 24 ч в атмосфере Ar, полученный гидролизат смешивают с 5 мл буфера с pH 2,2, содержащим: цитрата натрия 9,8 г, концентрированной HCl 8,3 мл, тиодигликоля 1 мл и каприловой кислоты 50 мкл на литр, фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм и вводят в анализатор аминокислот.
1
2
1
2
По завершении автоматического анализа получают хроматограмму, содержание аминокислоты (X) в мкМ/мл (или в мг/мл, %, условных машинных единицах или мм по высоте или площади пиков в соответствии с заданной автоматической градуировкой обсчета хроматограмм) осуществляют автоматически по формуле: X=S/S·C, где S - площадь пика определяемой аминокислоты на аминограмме; S - площадь пика той же аминокислоты в стандартной смеси; C - концентрация аминокислоты в стандартной смеси, мкМ/мл. В качестве градуировки используют стандартный раствор, содержащий по 2,5 мкМоль/мл ASP, THR, GLU, PRO, GLY, ALA, CYS, VAL, MET, ILEY, LEY, TYR, PHE, HIS, LYS, TRP и ARG. Результаты определения рассчитывают до второго десятичного знака и округляют до первого десятичного знака после запятой.