Особенности ольфакторного отбора по MHC с позиции репродуктивного потенциала

Вестник КемГУ

№ 4

2009

Биология

УДК 571.27

ОСОБЕННОСТИ ОЛЬФАКТОРНОГО ОТБОРА ПО МНС С ПОЗИЦИИ РЕПРОДУКТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА

А. А. Могилина, А. В. Шабалдин, Л. В. Акинчина, Н. А. Литвинова, В. И. Иванов

Проверялась гипотеза об ассортативном ольфакторном выборе женщинами мужчин в главном комплексе гистосовместимости. С этой целью провели ольфакторное тестирование женщинами мужчин, а также генотипирование всех испытуемых. Было исследовано 48 юношей и 19 девушек, причем девушки оценивали запах мужчин в две фазы овариального цикла: рецептивную и нерецептивную. Установлено, что распределение аллелей HLADRB1 среди испытуемых не отличается от распределения по Харди-Вайнбергу. Также выявлено стойкое, независимо от фазы овариального цикла, неприятие женщинами с HLADRB1 *04 в генотипе запаха мужчин, несущими HLADRB1*15 аллель. Данные аллели связаны с формированием иммунопатологии.

The hypothesis about nonrandom olfactory mate choice in main histocompatibility complex was checked. For this purpose we conducted olfactory testing (women test of men’s smell) and we had typed for all test people’s HLADRB1. There was explored 48 men and 19 women, moreover girls valued the odour of the men in two phases ovarian cycle: receptive and nonreceptive. It is revealed that HLADRB1 distribution amongst test people does not differ from Hardi-Vaynberg distribution. The woman with HLADRB1*04 avoid the man carrying HLADRB1*15 in all phases ovarian. These alleles are entail immune pathology.

Ключевые слова: хемокоммуникация, HLA, репродукция.

Модельные эксперименты на инбредных и кон-генных линиях мышей доказали связь половых предпочтений с главным комплексом гистосовместимости (Н-2). Было показано, что при скрещивании животных превалировал выбор не родственных (не собственных - no self) H-2 гаплотипов [1]. С позиции популяционной генетики, такой отбор целесообразен, так как именно гетерозиготный по генам Н-2 организм идентифицирует более широкий диапазон антигенов и поэтому обладает более эффективной иммунной системой [2].

Было предположено и в экспериментах доказана роль запахового предпочтения при половом отборе по Н-2 [3, 4]. Так, была выдвинута гипотеза о возможной роли главного комплекса гистосовместимости в целом (MHC) в формировании индивидуального запаха особей [5], которая впоследствии была подтверждена Ямадзакой с соавт. [3, 4]. Более того, высказано предположение, что ведущая роль MHC в иммунном ответе имеет вторичное эволюционное значение [6]. Первично эти молекулы участвовали в виде рецепторов для ольфакторных распознаваний в процессе коммуникаций живых систем [7].

Несмотря на доминирование у человека зрительных и слуховых форм общения, обонятельные сигналы продолжают оказывать определенное влияние на физиологическое состояние людей [8]. Wedekind et. al., (1995) на шведской популяции показал феномен ольфакторного отбора в главном комплексе гистосовместимости (HLA) у человека. Суть этого отбора сводится к исключению инцеста по HLA и увеличению в этом локусе гетерозиготности [9]. Работы, проведенные Carol Ober в закрытой секте Хатте-ритов, показали наличие дисассортативности по HLA в брачном выборе [10].

В то же время наличие ассортативности по HLA при образовании супружеских пар может отклонять популяционное равновесие и тем самым изменять степень иммунной адаптации популяции [11].

Исходя из этого, целью настоящего исследования было изучение особенностей ольфакторного отбора по гену НЬАБКБ1 среди неродственных доноров разного пола в восточно-европейской популяции, а также разработка гипотез о механизмах иммунной адаптации в этой популяции.

Материалы и методы

Исследование проводили среди девушек и юношей, в возрасте 18 - 21 года. Донорами запаха явились юноши, реципиентами - девушки. У каждого испытуемого забирался буккальный эпителий.

Образцы пота собирали на фильтровальные диски, которые были пришиты на специальные хлопчатобумажные майки в местах подмышечных впадин. Юноши находились в майках в течение 60 минут. Затем диски помещали в пенициллиновые флаконы с герметичной крышечкой и хранили в холодильнике при - 20°С.

При тестировании запаха девушки заполняли протоколы, где давали субъективную оценку по 10-ти балльной шкале - от очень неприятного (= -5) до очень приятного (= 5). Девушки проводили тестирование в рецептивную и нерецептивную фазы овариального цикла.

Буккальный эпителий собирали с внутренней поверхности щеки в пробирки Эппендорф. Из клеток буккального эпителя выделяли ДНК методом фе-нол-хлороформной экстракции. Для типирования гена НЬА БКБ1* использовали тест-систему НЬА-ДНК-ТЕХ. Для амплификации участка, определяющего полиморфизм гена НЬА БКБ1* (в 3 экзоне), проводилась 2-этапная ПЦР на амплификаторе «Терцик». Детекцию продуктов амплификации проводили при помощи электрофореза в 3 % агарозном геле (рис. 1).

| Вестник КемГУ № 4 2009 Биология

Рис. 1. Детекция продуктов амплификации гена НЬЛВКБ1* в 3 % агарозном геле

Таблица 1

Доли частот сочетаний женских и мужских аллелей НЬАБКБ1 при отрицательном ольфакторном выборе женщин, находящихся в рецептивной фазе овариального цикла

Положительные оценки Отрицательные оценки

нерецептивные женщины

сочетание аллелей Р() сочетание аллелей Р

HLADRB1 *07 с НЬАБИВ 1*14 0.021544231 HLADRB1 *04 с HLADRB1 *04 0.000196816

НЬАЭКВ1*15 с НЬАЭКВ1*01 0.003249904 HLADRB 1*04 с HLADRB 1*15 0.004610958

рецептивные женщины

НЬАЭКВ1*16 с НЬАЭКВ1*04 0.010957573 HLADRB 1*04 с HLADRB1*15 0.010519651

НЬАЭКВ1*12 с НЬАЭКВ1*01 0.019326593

Примечание: в сочетании HLADRB1 аллелей: первый аллель женский, второй - мужской.

Статистическая обработка

Для каждого аллеля определялась его частота в выборе и подсчитывалась вероятность встречи с любым аллелем противоположного пола, допуская, что вероятность комбинирования каждого из аллелей гетерозиготы не влияет на вероятность комбинирования другого.

Полученные результаты отражены в табл. 1, где в каждой ячейке указаны расчетные частоты встречаемости соответствующих аллелей.

Наблюдаемые частоты сочетаний женских и мужских аллелей НЬАВКБ1 были получены путем подсчета оценок запаховой привлекательности. Отбор сочетаний НЬОКБ1 аллелей проводился по 4 типам оценок:

— первый тип оценок - женщины в нерецептивной фазе овариального цикла оценивают запах как привлекательный;

— второй тип оценок - женщины в нерецептивную фазу овариального цикла оценивают мужской запах как неприятный;

— третий тип оценок - женщины в рецептивную фазу дают оценку мужскому запаху как привлекательному;

— четвертый тип оценок - рецептивные женщины оценивают мужской запах как неприятный.

Для проверки гипотезы при случайном подборе супружеских пар по локусу НЬАВКБ1 оценили отклонение наблюдаемых частот всех встречавшихся комбинаций НЬАВКБ1 мужчины и женщины от расчетных, по формуле Харди-Вайнберга, или ожидаемых, в соответствии с частотами аллелей при помощи х2. Для характеристики выбора по отдельным аллелям НЬАВКБ1 провели попарное сравнение частот сочетаний женских и мужских НЬАЭКШ аллелей с расчетными для случайного выбора с помощью Т-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение Ольфакторный брачный выбор по НЬА относится к популяционному фактору динамики. При выраженном влиянии на популяцию внешних факторов может проявляться ассортативность при образовании супружеских пар, особенно если этот фактор имеет векторную направленность. С точки зрения популяционной генетики, известно, что одним из признаков популяции является ее устойчивость во времени. Этот закон отражен в уравнении Харди-Вайнберга. Закон Харди-Вайнберга для особей с диплоидным набором хромосом определяет, что квадрат сумм конкурентных аллелей является постоянным и равен 1 в равновесных популяциях, т. е. изменчивость будет оставаться на одном и том же уровне. Результаты сравнения наблюдаемых частот сочетаний НЬАЭКШ с расчетными по формуле

Харди-Вайнберга p2 + 2pq + q2 = 1 показали следующее. Так, достоверных отличий между расчетным и полученным распределениями частот сочетаний женских и мужских аллелей для всех четырех типов оценок не обнаружено, что указывает на отсутствие общей ассортативности по HLADRB1 в любую фазу овариального цикла.

В последнем случае неслучайность в образовании супружеских пар также приобретает полярность, которая может потенциировать высокий риск гомозиготности в последующих поколениях. В то же время по полученным результатам можно утверждать, что на исследуемую популяцию не действуют факторы внешней среды, или их действия компенсированы и тем самым ассортативность по HLA либо отсутствует, либо компенсирована. Одним из механизмов коменсации может быть разнонаправ-ленность ассортативности по отдельным аллелям, что было исследовано на следующем этапе работы.

Характеристика особенностей ольфакторного выбора по отдельным аллеям HLADRB1 показала следующее. Как видно из представленных данных, при анализе положительного и отрицательного оль-факторного выбора женщинами мужчин было выявлено как преобладание опытных частот сочетаний женского и мужского аллелей над расчетными, так и их дефицит. Чтобы адекватно оценить биологический смысл этих фактов, провели сравнение комбинаций женского и мужского HLADRB1 при достоверном преобладании этих комбинаций в положительном ольфакторном выборе (например женского HLADRB1*07 с мужским HLADRB1*14) с их дефицитом в случае отрицательного ольфакторного выбора. Если достоверно различимые частоты сочетаний комбинаций встречались в обеих вышеуказанных группах, то можно было утверждать, что женщины с DRB1*07 аллелем, с одной стороны, предпочитают запах мужчин - носителей аллеля HLADRB1*14, а с другой - игнорируют отрицательную оценку этого аллеля, то есть фактически притягивают этот аллель. Именно такие комбинации можно было считать как наиболее полно отражающими положительный или отрицательный выбор. Этот методический подход использовали как для оценок нерецептивной, так и для рецептивной фаз овариального цикла женщин. Выявили следующие стойкие комбинации (табл. 1): положительный оль-факторный выбор в нерецептивную фазу достоверен для сочетаний женского HLADRB1 с мужским HLADRB1; HLADRB1*07 с HLADRB 1*14 и HLADRB 1*15 с HLADRB 1*01; а отрицательный -для сочетаний HLADRB 1*04 с HLADRB 1*04 и HLADRB 1*04 с HLADRB 1*15. Стойкое ольфактор-ное притягивание в рецептивную фазу овариального цикла было характерно для женского HLADRB 1*16 с мужским HLADRB 1*04, а отрицательная ассорта-тивность в рецептивную фазу характерна для женского HLADRB 1*04 с мужским HLADRB 1*15 и HLADRB 1*12 с HLADRB1*01.

Анализ положительной ассортативности показал отсутствие общих комбинаций женских с мужскими

Биология

HLADRB 1 аллелями для нерецептивных и рецептивных фаз овариального цикла. В то время как анализ отрицательной ассортативности показал наличие общей комбинации для рецептивной и нерецептивной фаз - это сочетание женского HLADRB 1 *04 аллелеля с мужским HLADRB 1*15. Кроме того, для нерецептивной фазы выявили избегание сочетания идентичных HLADRB 1 *04 аллелей.

Чтобы понять биологический смысл отторжения женского HLADRB 1*04 аллеля от мужского HLADRB 1*15, охарактеризовали ассоциации HLADRB1*04 - HLADRB 1*15 специфичностей с патологией иммунной системы и репродукции. Известно, что DRB1*04 аллель является «классическим» маркером аутоиммунных заболеваний, причиной которых могут быть и репродуктивные проблемы [12]. Так, HLADRB1*04-специфичность ассоциирована с развитием целого ряда заболеваний, таких как сахарный диабет 1 типа, ревматоидный артрит, аутоиммунный тиреоидит, ювенильный ревматоидный артрит [11, 12, 14]. Все эти заболевания относятся к аутоиммунной патологии, формирующейся при гиперактивной иммунной системе. Эту гиперактивность иммунной системы и определяет специфичность DRB1*04, которая формирует устойчивость к инфекциям, а также высокий иммунный ответ и к собственным тканям [9]. Именно это детерминирует формирование антифосфолипид-ного синдрома, который в 50 % случаев является причиной иммунной формы невынашивания беременности [12].

Что же касается DRB1*15, то данная специфичность ассоциирована одновременно с чувствительностью к развитию аутоиммунной патологии ЦНС (рассеянный склероз) и одновременно с выраженной чувствительностью к инфекциям, в том числе хроническим (положительные ассоциации со слабым типом иммунного ответа к инфекционным антигенам: столбняка, туберкулеза, хламидиоза) [16]. В то же время DRB1*15 связан с развитием тяжелых вирусных инфекций и инвазий, таких как гепатит В, гепатит С и гистоплазмоз [17]. Становится очевидным биологический смысл ольфакторного блока в образовании супружеских пар с двумя аллелями, детерминирующими иммунные нарушения и репродуктивные потери. Причем изменение фазы овариального цикла не отменяет этот блок.

Выводы

1. Представленное исследование показало отсутствие или компенсацию ольфакторного отбора по HLADRB 1 как популяционного фактора динамики.

2. Попарный анализ изменений частот комбинаций в зависимости от фазы овариального цикла женщины показал, что ольфакторное отталкивание по HLADRB 1 превалирует над притягиванием по HLADRB1.

3. Выявлено стойкое и значимое отрицательно ассортативное сочетание женского HLADRB 1*04 и

№ 4

2009

| Вестник КемГУ № 4 2009 Биология

мужского HLADRB 1*15, которые ассоциированы с различной репродуктивной и иммунной патологией.

Литература

1. Yamazaki, K. HLA-B transgenic mice roduce a unique odor type / K. Ymazaki, G. K. Beauchamp, J. Bard, E. Lacy, E. A. Boyse // Behav Genet. - 1990. -V. 20. - 755 p.

2. Doherty, P. C. Enhanced immunological surveillance in mice heterozygous at the H-2 gene complex / P. C. Doherty, R. M. Zinkernagel // Nature - 1975. -V. 256 - P. 50-52.

3. Yamazaki, K. Recognition among mice evi-danse from the use of Y-mase dofferentially scented by congenic mice of different histocompatibility complex / K. Yamazaki, M. Yamaguchi, L. Baranoski, J. Bard,

E. A. Boyse, L. Thomas // J. Exp. Med. - 1979. -V. 150. - P. 755.

4. Yamazaki, K. Sensory distinction between H-2b and H-2 bm1 mutant mice / K. Ymazaki, G. K. Beauchamp, I. K. Egorov, J. Bard, E. A. Boyse // Proc Natl Acad Sci USA. -1983. - V. 80. - P. 56855688.

5. Thomas, L. Symbiosis as an immunologic problem / L. Thomas // Basel: S. Karger. - 1975. -P. 2 - 11.

6. Киндт, Т. Дж. Антигены главного комплекса гистосовместимости / Т. Дж. Киндт, М. Э. Робинсон // Иммунология / под ред. У. Пола. - М.: Мир, 1988. - Т. 2. - С. 73 - 116.

7. Wysocki, C. J. Mice (Mus musculus) lacking a vomeronasal organ can discriminate MHC-determined odortypes / C. J. Wysocki, K. Yamazaki, M. Curran, L. M. Wysocki, G. K. Beauchamp // Horm. Behav. -2004. - V. 46. - № 3. - P. 241 - 246.

8. Wedekind, C. MHC-dependent mate preference in humans / C. Wedekind, T. Seebeck, F. Bettens, A. Paepke // Proc. R. Soc. Lond. B. - 1995. - V. 260. -P. 245 - 249.

9. Болдырева, М. Н. HLA и естественный отбор. Гипотеза «Преимущества функциональной ге-

терозиготности» / М. Н. Болдырева, Л. П. Алексеев // Иммунология. - М., 2006. - № 3. - С. 172 - 175.

10. Ober, C. HLA and mate choice in humans / C. Ober, L. R. Weitkamp, N. Cox, H. Dytch, D. Kostyu,

S. Elias // Am. J. Hum. Genet. - 1997. - № 61. -P. 497 - 504.

11. Коненков, В. И. Медицинская и экологическая иммуногенетика / В. И. Коненков. - Новосибирск, 1999. - 276 с.

12. Шабалдин, А. В. Иммуногенетические аспекты раннего онтогенеза / А. В. Шабалдин: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. - Челябинск, 2004. - 44 с.

13. Schipper, R. F. HLA class II associations with Type 1 diabetesmellitus: a multivariate approach / R. F. Schipper, B. P. Koeleman, G. J. Bruining, G. M. Schreuder, W. Verduijn, R. R. Vries, B. O. Roep // Tissue Antigens. - 2001. - Vol. 57(2). - P. 144 - 50.

14. Zanelli, E. HLA class II association with rheumatoid arthritis: facts and interpretations / E. Zanelli,

F. C. Breedveld, R. R. de Vries // Hum. Immunol. -

2000. - Vol. 61(12). - P.1254 - 61.

15. Petrone, A. Association of DRB1*04-DQB 1*0301 haplotype and lack of association of two polymorphic sites at CTLA-4 gene with Hashimoto’s thyroiditis in an Italian population / A. Petrone,

G. Giorgi, C. A. Mesturino, M. Capizzi, I. Cascino, L. Nistico, J. Os, U. Di Mario, R. Buzzetty // Thyroid. -

2001. - Vol. 11(2). - P. 171 - 175.

16. Terasaki, P. I. US Normal. In HLA 1997 / P. I. Terasaki, D. W. Gjertson // UCLA Tissue Typing Laboratory, Los Angeles, California. - 1997. - 475 p.

17. Алексеев, Л. П. Иммуногенетическое обследование семей с близкородственными браками / Л. П. Алексеев, Н. М. Хаитова, Н. Г. Дмитриева, М. Н. Болдырева и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1988. - № 31. -С. 60 - 62.

Рецензент - А. В. Будаев, ГОУ ВПО «Кемеровская медицинская академия Росздрава».