Применение метода мультилокусного секвенирования для наблюдения за циркулирующими штаммами B. pertussis

28

ЗНиСО сентябрь №9

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА МУЛЬТИЛОКУСНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДЛЯ НАБЛЮДЕНИЯ ЗА ЦИРКУЛИРУЮЩИМИ ШТАММАМИ B. PERTUSSIS

Г.А. Ивашинникова, О.Ю. Борисова, Н.Т. Гадуа, И.А. Рудакова, И.К. Мазурова

USE OF MULTILOCUS SEQUENCE TYPING FOR MONITORING

THE B. PERTUSSIS CIRCULATING POPULATION

G.A. Ivasinnikova, O.Yu. Borisova, N.T. Gadua, I.A. Rudakova, I.K. Mazurova

ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, г. Москва

В работе представлены результаты мультилокусного секвенирования (МЛСТ) 71 штамма B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в России в период 2005—2011 гг. Метод МЛСТ основан на изучении комбинаций аллелей генов ptxA, ptxC и tcfA. Показано, что в последние 5 лет циркулирующая популяция штаммов B. pertussis в основном представлена штаммами сиквенс-типа ST-5 (86 % штаммов), относящегося к новому, современному клональному комплексу ST5-ST8. Так же выделены штаммы сиквенс-типов ST3, ST2, ST1 и ST8. Проведен филогенетический анализ штаммов различных сиквенс-типов, отражающий изменения, которые происходят в генотипе популяции B. pertussis.

Ключевые слова: B. pertussis, генотипирование, секвенирование, филогенетический анализ, сиквенс-тип.

In this work the results of multilocus sequence typing (MLST) of 71 B. pertussis strains isolated from pertussis patient in Russia in 2005-2011 presented. MLST is based on researching the allele combinations of ptxA, ptxC and tcfA genes. It is shown that in the last 5 years the new sequence type ST5 have been dominating (86 % of B. pertussis strains) in B. pertussis circulating population. Also the strains with ST3, ST2, ST1 and ST8 sequence types were identified in minor percentage. The phylogenetic analysis was made for all sequence data and the evolution of B. pertussis strains was shown.

Keywords: B. pertussis, genotyping, sequencing, phylogenetic analysis, sequence type.

CB

Достижения молекулярной биологии в последние 20 лет и разработка молекулярно-генетических методов позволяют осуществлять не только быструю диагностику инфекционных заболеваний, но и на высокотехнологическом уровне следить за их возбудителями. Очевидные недостатки фенотипических методов способствовали развитию современных методов генотипиро-вания, оценивающих взаимосвязь между биологическими свойствами штаммов (иммунотип), их эволюционным происхождением и клональной принадлежностью [2; 4]. Среди таких методов — мультилокусное секвенирование (МЛСТ) — один из наиболее перспективных методов типирования микроорганизмов, который позволяет охарактеризовать штаммы микроорганизмов с использованием ДНК-секвенирования внутренних фрагментов генов с определением их аллельных вариаций и сиквенс-типа. Метод МЛСТ дает возможность получить генетическую характеристику эпидемически связанных штаммов, оценивать распространение штаммов с различной генетической структурой, дифференцировать штаммы не только в пределах одной страны, но и сопоставлять с международной базой сиквенс-типов (www.mlst. net). В последние годы МЛСТ является одним из самых высокоинформативных и высоковоспроиз-водимых методов генотипирования [3; 5]. Метод МЛСТ используется во многих европейских странах для генетической характеристики циркулирующих штаммов B. pertussis [2; 5].

Материалы и методы. Впервые с помощью мультилокусного секвенирования проведено изучение 71 штамма B. pertussis, выделенного от больных коклюшем в России в период с 2005— 2011 гг. В исследование включены три вакцинных штамма, используемых в настоящее время для производства АКДС-вакцины в нашей стра-

не (из коллекции ГНИИСК им. Л.А. Тарасевича). Материалом для исследования были назофарин-геальные тампоны, взятые у больных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания в ЛПО и ФБУЗ ЦГиЭ в различных субъектах Российской Федерации. Микробиологическое исследование штаммов B. pertussis проводилось согласно «Инструкции по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше» (1983 г.). Исследуемый материал засевался на казеиново-угольный агар (КУА), у выделенных культур изучались морфологические, культуральные и серологические свойства. Выделение ДНК штаммов B. pertussis осуществлялось методом кипячения.

Учитывая особенности, характерные для проведения лабораторных исследований в России (характеристики лабораторного оборудования, спектр материалов, реактивов и др.), была индивидуализирована и отработана схема проведения МЛСТ для штаммов возбудителя коклюша. МЛСТ при типировании B. pertussis основано на идентификации фрагментов трех генов, кодирующих основные факторы патогенности возбудителя. Выбор фрагментов генов объясняется тем, что каждая из последовательностей должна быть представлена не менее чем двумя аллельными вариантами, т. е. обладать достаточной степенью полиморфизма. Поэтому для оценки сиквенс-типов штаммов B. pertussis использовались фрагменты — ptxA гена, кодирующего S1 субъединицу КТ и имеющего, согласно базе данных EMBI/ GeneBank, 8 аллелей; фрагмент ptxC гена, кодирующего S3 субъединицу КТ и имеющего 2 аллель-ных варианта, и фрагмент tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи — уникальный фактор патогенности возбудителя и имеющего 5 аллель-ных вариантов [2; 4; 5]. Идентификация аллелей

сентябрь №9 (234) ЗНифО

29

100%-

св

60%-40%-20%-0%

86%

1,4%

4,2%

>

^ **

Рис. 1. Удельный вес штаммов B. pertussis различных сиквенс-типов

и сиквенс-типов осуществлялась согласно международной базе данных EMBL/GenBank (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez). Всего выделено и описано 11 сиквенс-типов штаммов B. pertussis (ST-1 - ST-11) [5].

Результаты. Среди 71 изученного штамма B. pertussis были выявлены аллели, формирующие четыре сиквенс-типа — ST-1, ST-2, ST-3 и ST-5, из которых ST1 соответствовал ptxA4, ptxC1, tcfA2 аллельный профиль, ST2 — ptxA2, ptxC1, tcfA2 профиль, ST3 — ptxA1, ptxC1, tcfA2 профиль и ST5 — ptxA1, ptxC2, tcfA2 профиль (рис. 1) [5]. Среди выявленных сиквенс-типов — ST-1 и ST-2 являются старыми «вакцинными» типами, а ST-3 и ST-5 — новые «невакцинные» типы.

Два вакцинных штамма B. pertussis, используемых для производства коклюшного компонента АКДС-вакцины, относились к сиквенс-типу ST-1 и один штамм — к сиквенс-типу ST-2. Среди изученных штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в 2005—2011 гг., большинство штаммов (86,0 %) имели сиквенс-тип ST-5, 7,0 % штаммов — ST-3, 1,4 % штаммов — ST1 и 4,2 % штаммов — ST2, 1,4 % штаммов — ST8 (рис. 1). Следовательно, в последние годы в нашей стране циркулирующая популяция штаммов B. pertussis в основном представлена штаммами с новой кло-нальной структурой — ST-5. В настоящее время ST-5 является наиболее распространенным среди штаммов B. pertussis, циркулирующих в странах Европы и в США, а ST-3 встречается в 20—30 % случаев в Европейских странах и доминирует в Финляндии [1; 4; 5].

Для выяснения филогенетических взаимоотношений между различными видами микроорганизмов и уточнения времени их дивергенции были использованы методы определения эволюционных дистанций, основанные на сравнении нукле-отидных последовательностей гомологичных генов. По степени сходства нуклеотидных последовательностей гомологичных генов у микроорганизмов можно судить о степени филогенетического родства представителей различных видов, а также о внутривидовом разнообразии.

Анализ полученных в МЛСТ данных и визуализация филогенетических отношений осуществлялись путем построения дендрограммы с

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное методом Присоединения соседей (NJ) с использованием последовательностей фрагментов аллельных вариантов ptxA, ptxC, tcfA генов

помощью программного обеспечения MEGA 5.0 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) (рис. 2). Для проведения первичной оценки эволюционных связей между штаммами B. pertussis различных сиквенс-типов был выбран метод присоединения (связывания) ближайших соседей (NJ). Метод связывания ближайших соседей (Neighbour-joining — NJ) — самый распространенный дистанционно-матричный метод построения дендрограмм. Важно отметить, что при использовании данного метода при создании матрицы учитываются различия в скоростях эволюции последовательностей. Полученная дендрограмма демонстрирует динамику формирования популяции и показывает, что наиболее раннее происхождение (в эволюционном отношении) имеет ST1, далее последовательно появились штаммы ST2 и ST3. Наиболее позднее происхождение имеет клональный комплекс ST5-ST8.

Выводы. Таким образом, применение МЛСТ для наблюдения за циркулирующими штаммами B. pertussis позволяет оценить взаимосвязь между штаммами, выделенными на разных территориях, помогает выявить и определить закономерности распространения и эволюции штаммов возбудителя коклюша в России. Так же МЛСТ является унифицированным методом наблюдения за возбудителем коклюша в мире и дает возможность сопоставления результатов, полученных в разных странах.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ивашинникова Г.А., Борисова О.Ю., Гадуа Н.Т., Рудакова И.А., Мазурова И.К. Применение метода мультилокусного секвенирования для наблюдения за циркулирующими штаммами B. pertussis // Фундаментальные и прикладные аспекты анализа рисков здоровью населения: материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора (г. Пермь, 16-18 мая 2012 г.). Пермь, 2012. Т. 1. С. 243—247.

2. Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю. и др. Динамика изменчивости основных генов пато-генности штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве (1948—2005 гг.) //Журнал молекулярной медицины. 2008. № 1. С. 40—45.

30

ЗНиСО сентябрь №9

4.

5.

Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E., Morelli G., Russell J.E., Urwin R., Zhang Q., Zhou J., Zurth K., Caugant D.A., Feavers I.M., Achtman M., Spratt B.G. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms //Microbiology. 1998. № 95 (6). P. 3140—3145.

Petersen R.F., Dalby T., Dragsted D.M., Mooi F., Lambertsen L. Temporal trends in Bordetella pertussis populations, Denmark, 1949-2010 //Emerg Infect Dis. 2012, May. Vol. 18 (5). P. 767-774. Van Loo I.H., Heuvelman K.J, King A.J., Mooi F.R. Multilocus sequence typing of Bordetella pertussis

based on surface protein genes //J. Clin Microbiol. 2002. № 40. P. 1994—2001.

Контактная информация:

Ивашинникова Галина Антоновна, тел. 8 (495) 459-21-46, 8 (926)754-87-88, e-mail: ivashinnikova@gmail.com

Contact information:

Ivasinnikova Galina,

phone: 8 (495) 459-21-46, 8 (926) 754-87-88, e-mail: ivashinnikova@gmail.com

ü