Способ получения цитогенетических препаратов клеток эпителия для проведения реакции флуоресцентной in situ гибридизации
METHOD OF PRODUCING CYTOGENETIC EPITHELIAL CELL PREPARATIONS FOR CARRYING OUT A FLUORESCENT IN SITU HYBRIDISATION REACTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и используется при проведения интерфазной флуоресцентной in situ гибридизации.
В настоящее время метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) активно используется в клинической практике для диагностики, выбора тактики лечения и оценки прогноза течения заболевания, а также в научных исследованиях для получения знаний в области биологии злокачественных опухолей. Поскольку этот метод имеет высокую себестоимость и трудоемкость, то этапы фиксации биологического материала и получения препаратов становятся ключевыми моментами для успешного проведения FISH-исследования с использованием коммерческих ДНК-зондов. При использовании в клинической практике для достижения достоверности FISH-исследования результат гибридизации можно считать успешным, если флуоресцентные сигналы от гибридизированных участков ДНК являются яркими, т.е. контрастно визуализируются по отношению к фоновой флуоресценции и их количество может быть подсчитано достоверно. Кроме этого требуется, чтобы на препарате клетки лежали отдельно друг от друга, их границы четко определялись, а количество их в гибридизированной области было достаточным для получения статистически достоверных результатов. При злокачественных опухолях эпителиального происхождения, таких как рак слизистой оболочки полости рта, рак шейки матки, FISH-исследования выполняют на мазках, с последующей их фиксацией, или на препаратах, полученных при нанесении суспензии предварительно зафиксированных клеток (Метод жидкостной цитологии в диагностике заболеваний шейки матки: учебно-методическое пособие. - М: РМАПО. - 2012. 23 с.). Постоянно увеличивающийся спрос на FISH-исследования обуславливает потребность в малозатратных способах фиксации биологического материала и его длительного хранения.
Известен способ, при котором FISH-реакцию проводят на традиционном мазке из шейки матки (мазок Папаниколау), представленный в статье Heselmeyer-Haddad K. и соавт. (Heselmeyer-Haddad K., Sommerfeld K., White N.M. et al. Genomic amplification of the Human Telomerase Gene (TERC) in Pap smears predicts the evelopment of cervical cancer/American Journal of Pathology, 2005, Vol. 166, №. 4, p. 1229-1238, doi: 10.1016/S0002-9440(10)62341-3). В способе сначала выполняют цитологическое исследование, для чего все мазки фиксируют, окрашивают согласно стандартным процедурам и заливают специальным клеем под покровное стекло. Когда препараты подготавливают для выполнения FISH, то покровные стекла удаляют путем инкубации препаратов в ксилоле в течение 2-4 дней, затем препараты дважды промывают в ксилоле, дегидратируют и обесцвечивают в смеси 0,5% HCl и 70% этанола в течение 1-2 часов.
Недостатки способа заключаются в неравномерном распределении клеток на предметном стекле, многослойности, потере клеток при фиксации, наличии элементов, приводящих к высокой фоновой флуоресценции.
Известен способ «Стандартизированная аналитическая технология «метод жидкостной цитологии» (Шабалова И.П., Джангирова Т.В. Никитина Л.В. и др. Проблемы стандартизации в здравоохранении, 2012, №7-8, стр. 48-58). В способе биологический материал помещают и хранят в специальной транспортной среде, цитологический препарат готовят осаждением клеток на предметное стекло посредством центрифугирования клеточного материала на цитоцентрифуге, а фиксацию мазков выполняют либо как предварительный этап перед окрашиванием, либо одновременно с окрашиванием.
Недостатком способа является малая доступность и дороговизна ввиду применения только уникальных стандартизированных реактивов, расходных материалов и необходимости дорогостоящего импортного оборудования, отсутствие возможности наносить на одно стекло суспензии клеток нескольких человек.
2
Известен «Усовершенствованный способ приготовления препаратов фиксированных клеток для флуоресцентной in situ гибридизации» (патент RU 2490635), при котором суспензии фиксированных клеток в объеме 5 мкл наносят на дно лунок, сформированных поверхностью предметного стекла и 8 круглыми отверстиями диаметром 9 мм в герметично приклеенной к стеклу полоске парафильма размерами 26×56 мм. Прилепляют полоску парафильма к предметному стеклу, нагревая стекло с парафильмом при температуре 60°С и одновременно раскатывая валиком в течение 3-5 сек. Впоследствии указанную полоску вместе с предметным стеклом нагревают при 95°С в течение 2 мин и затем сдирают ее со стекла.
Недостатком способа является трудоемкость, а также то, что в пределах одной лунки у исследователя нет возможности выбрать лучшую область для гибридизации.
Прототипом предлагаемого изобретения является способ получения, фиксации и приготовления препарата слущенных с цервикального канала клеток эпителия, изложенный в статье Li Т. et al. (Li Т, Tang L, Bian D, Jia Y, Huang X, Zhang X. Detection of hTERC and C-MYC genes in cervical epithelial exfoliated cells for cervical cancer screening. Int J Mol Med. 2014 May; 33(5):1289-97. doi: 10.3892/ijmm. 2014.1699.). Способ реализуют в следующей последовательности:
1. При помощи цервикальной щетки (Pap Brush; Beijing ТСТ Medical Technology Company, Ltd., Beijing, China) слущивают эпителиальные клетки.
2. Помещают слущенные клетки в фосфатно-солевой буфер (PBS) и хранят при 4°С до выполнения FISH-исследования.
3. Примерно 5-10 мл PBS, содержащего слущенные клетки, помещают в центрифужную пробирку, добавляют 3 мл коллагеназы и центрифугируют при 1300 об/мин в течение 10 мин и удаляют надосадочную жидкость.
4. Ресуспендируют осадок, добавляют воду и инкубируют при 37°С в течение 20-30 мин.
5. Полученную клеточную суспензию центрифугируют при 1300 об / мин в течение 10 мин и удаляют супернатант.
6. Ресуспендируют осадок, добавляют 5 мл воды и инкубируют при 37°С в течение 20 мин.
7. Добавляют 2 мл фиксирующего раствора, входящего в набор для отмывки (состав является коммерческой тайной), центрифугируют при 1300 об/мин в течение 10 мин и удаляют надосадочную жидкость.
8. Затем добавляют 5 мл фиксирующего раствора, центрифугируют при 1300 об/мин в течение 10 мин и удаляют надосадочную жидкость.
9. Еще раз добавляют 5 мл фиксирующего раствора, центрифугируют при 1300 об/мин в течение 10 мин и удаляют надосадочную жидкость.
10. Осадок ресуспендируют и раскапывают на предметные стекла, которые оставляют для высыхания на воздухе в течение ночи при комнатной температуре.
Недостатки способа - непродолжительный срок хранения биологического материала, затратная по времени процедура фиксации (90-100 мин), малое количество клеток в области гибридизации, неизвестный состав фиксирующего раствора.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в увеличении длительности хранения образцов биологического материала, обеспечении возможности контроля плотности клеток в области гибридизации ДНК зондов, увеличении яркости флуоресцентного сигнала, уменьшении расхода реактивов и увеличении производительности труда.
Сущность предлагаемого решения, включает слущивание цитощеткой клеток эпителия, помещение их в пробирку с фосфатно-солевым буфером, центрифугирование полученной смеси в течение 10 мин с последующим удалением надосадочной жидкости и добавлением к осадку фиксирующего раствора, состоящего из смеси метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, двукратное очищение полученной суспензии путем центрифугирования в течение 15 мин при 1000 об/мин, удаления надосадочной жидкости с добавлением фиксирующего раствора и хранением суспензии клеток в условиях -20°С, при использовании их повторно очищают, ресуспендируют и наносят на зонированные предметные стекла с контролем плотности клеток, для увеличения яркости флуоресцентных сигналов их обрабатывают 2% раствором Carbowax в течение 2-20 часов при 4°С.
Перечень фигур.
Фиг. 1. Примеры зонирования предметного стекла: 1 - круги, 2 - прямоугольники, 3 - квадраты.
Фиг. 2а. Фото клеток слущенного эпителия после обработки раствором Carbowax: яркие (контрастные по отношению к фоновой флуоресценции) флуоресцентные сигналы 4 - зеленые, 5 - красные.
Фиг. 2б. Фото клеток слущенного эпителия без обработки раствором Carbowax: неяркие (неконтрастные по отношению к фоновой флуоресценции) флуоресцентные сигналы 4 - зеленые, 5 - красные.
Порядок реализации способа.
1. Эпителиальные клетки слущивают с помощью одноразовой цервикальной щетки (Зонд урогенитальный однаразовый стерильный Тип D модель 2, Jiangsu SUYUN Medical Materials Co., Ltd, China).
2. Сразу после забора материала щетку помещают в центрифужную пробирку с 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) (рН=7.0-7.2) (при необходимости этот материал можно хранить при 4°С, но не более 3 суток).
3. Клетки со щетки смывают на лабораторном вортексе, держа ее при помощи пинцета, в течение 15 сек, затем щетку удаляют из пробирки.
4. Слущенные клетки центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин. После центрифугирования удаляют надосадочную жидкость.
5. К ресуспендированному осадку аккуратно, постоянно перемешивая, добавляют по каплям 1 мл свежеприготовленного фиксирующего раствора (фиксатор) (метанол и уксусная кислоты в соотношении 3:1), а затем доливают фиксатор до 10 мл, центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин и удаляют надосадочную жидкость.
6. Ресуспендируют осадок, доливают фиксатор до 10 мл, центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин и удаляют надосадочную жидкость.
7. Ресуспендируют осадок, доливают фиксатор до 10 мл и помещают в морозильную камеру (-20°С) минимум на 8 часов для завершения фиксации клеток или на хранение. В фиксаторе суспензию зафиксированных клеток можно хранить длительно (минимум 5 лет) при -20°С.
8. Помещают чистое предметное стекло (Menzel-Glaser, Thermo Fisher Scientific, артикул AA00000112E) на термостолик (30°С) и зонируют его посредством нанесения полосок резинового клея (Fixogam Rubber Cement, Kreactech (кат.номер LK-071A) или любой другой резиновый клей из натурального каучука), ограничивающих площадь, необходимую для нанесения клеточной суспензии и ждут полного высыхания клея.
9. Пробирку с клеточной суспензией центрифугируют 15 мин при 1000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость, оставляя 0,2-1,0 мл и осадок ресуспендируют.
10. На предметное стекло, лежащее на термостолике (30°С), в область, ограниченную полосками клея, наносят клеточную суспензию по 5-30 мкл.
11. Оценивают плотность клеток под световым микроскопом и, если она недостаточная, то добавляют еще клеточной суспензии до достижения необходимой плотности клеток в предполагаемой области гибридизации.
12. После полного высыхания цитогенетического препарата с него удаляют полоски клея при помощи пинцета.
13. Затем препарат помещают в стакан с 2% раствором Carbowax (2 мл полиэтиленгликоля (Sigma-Aldrich, кат.номер. Р 5402) и 98 мл смеси 95% этанола и дистиллированной воды в соотношении 1:1) на 2-20 часов при 4°С.
14. Вынимают препарат из раствора Carbowax, аккуратно стряхивают излишки жидкости и помещают его в термостат (37°С) на 16-20 часов для дегидратации.
Примеры реализации способа.
Пример 1.
С использованием представленного способа у 32 больных раком слизистой оболочки полости рта, поступивших на лечение в МРНЦ им. А.Ф. Цыба в 2014-2019 гг, с опухоли был осуществлен забор эпителиальных клеток и их фиксация. Сроки хранения образцов до выполнения FISH-реакции колебались от 0 до 5 лет (медиана 3 года). В соответствии с предлагаемым способом были приготовлены цитогенетические препараты. Суспензии клеток были нанесены на 8 предметных стекол, каждое из которых зонировано на восемь квадратных частей (фиг. 1), т.е. на каждое предметное стекло раскапывалась суспензия клеток 4 человек. Под световым микроскопом в предполагаемых областях гибридизации осуществляли контроль плотности клеток. При недостаточной плотности клеток добавляли клеточной суспензии. Цитогенетические препараты прошли обработку 2% раствором Carbowax и дегидратацию в термостате при 37°С в течение 16 часов. Пред- и пост-гибридизационные отмывки цитогенетических препаратов выполнялись в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя ДНК-зондов (Kreatech Biotechnology, Голландия). Каждую из процедур пред- и пост-гибридизационных отмывок выполняли одновременно для 4 цитогенетических препаратов (т.е. для 16 человек или 32 областей гибридизации). Таким образом при выполнении пред- и пост-гибридизационных отмывок для каждого пациента в 4 раза снизился расход отмывочных реактивов и время, затрачиваемое на их выполнение. Для каждого пациента было исследовано по два набора коммерческих ДНК-зондов, окрашенных одинаковыми флуорохромами: ген CCND1 с центромерой хромосомы 11 (флуорохромы красный и зеленый соответственно) и ген EGFR с центромерой хромосомы 7 (флуорохромы красный и зеленый соответственно). ДНК-зонды объемом по 2,2 мкл для каждого изучаемого гена наносили на предварительно выбранную в пределах зонирования область и закрывали круглым покровным стеклом диаметром 10 мм. Гибридизация была успешной во всех случаях, т.е. флуоресцентные сигналы гибридизированных участков ДНК были контрастными по отношению к фоновой флуоресценции (фиг. 2а). Следовательно, предлагаемое решение дает возможность увидеть квазичастицы живого вещества, анализировать их структуру, а также изучать физико-химические и функциональные особенности.
Для каждого пациента анализировали не менее 100-200 клеток (в зависимости от доли клеток с нарушениями) для каждого изучаемого гена, что свидетельствует о высокой плотности эпителиальных клеток в области гибридизации. При этом вследствие уменьшения площади гибридизации расход дорогостоящих ДНК-зондов снизился в 4 раза (с рекомендованных фирмой-изготовителем 10 мкл до 2,2 мкл).
Пример 2.
С использованием представленного способа у 8 больных раком слизистой оболочки полости рта, поступивших на лечение в МРНЦ им. А.Ф. Цыба в 2014 г. с опухоли был осуществлен забор эпителиальных клеток, их фиксация, хранение (1 год) и нанесение на 4 зонированных предметных стекла. Каждое предметное стекло было зонировано резиновым клеем на 4 прямоугольные области (фиг. 1), в которые наносились суспензии клеток в виде капель, т.е. на каждое предметное стекло помещали суспензию 2 человек в 2 области на каждого. Одна область предназначалась для выполнения гибридизации с ДНК-зондами гена CCND1 и центромерой хромосомы 11, вторая - гена EGFR с центромерой хромосомы 7. Пред- и пост-гибридизационные отмывки цитогенетических препаратов выполнялись в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя ДНК-зондов (Kreatech Biotechnology, Голландия). Обработка препаратов 2% раствором Carbowax не проводилась. Каждую из процедур пред- и посттибридизационных отмывок выполняли одновременно для 4 цитогенетических препаратов. Во всех случаях гибридизацию нельзя было считать успешной, поскольку флуоресцентные сигналы (особенно зеленые) были неконтрастными по отношению к фоновой флуоресценции (фиг.26) и это не позволяло достоверно определять количество флуоресцентных сигналов в исследуемых клетках.
Пример 3.
С использованием представленного способа у 12 больных раком шейки матки, поступивших на лечение в МРНЦ им. А.Ф. Цыба в 2013-2015 гг, был осуществлен забор эпителиальных клеток, их фиксация и консервация. Срок хранения образцов до выполнения FISH-реакции колебался от 3 до 6 лет (медиана 4 года). В соответствии с представленным способом суспензии клеток были нанесены на 4 зонированных на 3 круглые области (фиг. 1) предметного стекла, т.е. на каждое предметное стекло раскапывалась суспензия 3 человек. Цитогенетические препараты прошли обработку 2% раствором Carbowax и дегидратацию в термостате при 37°С в течение 16 часов. Пред- и пост-гибридизационные отмывки цитогенетических препаратов выполнялись в соответствии с протоколом фирмы-изготовителя ДНК-зондов (Abbott Molecular, США). Каждую из процедур пред- и посгибридизационных отмывок выполняли одновременно для 4 предметных стекол (т.е. для 12 человек или 12 областей гибридизации), таким образом для каждого пациента в 3 раза снизился расход отмывочных реактивов и время, затрачиваемое на их выполнение. Для каждого пациента было исследовано по 2 коммерческих ДНК-зонда: ген TERC (красный флуорохром), СЕР3 (зеленый флуорохром). Гибридизация была успешной во всех случаях, т.е. флуоресцентные сигналы гибридизированных участков ДНК были контрастными по отношению к фоновой флуоресценции (фиг. 2а). Для каждого пациента анализировали не менее 100-200 клеток (в зависимости от доли клеток с нарушениями) для каждого изучаемого гена, что свидетельствует о высокой плотности эпителиальных клеток в области гибридизации. При этом вследствие уменьшения площади гибридизации расход дорогостоящих ДНК-зондов снизился в 4 раза (с рекомендованных фирмой-изготовителем 10 мкл до 2,2 мкл).
Подтверждение достижения технического результата.
На цитогенетических препаратах, полученных с использованием представленного способа, выполнено FISH-исследование для 32 больных раком слизистой оболочки полости рта и 12 больных раком шейки матки. Во всех случаях гибридизация была успешной, т.е. флуоресцентные сигналы гибридизированных участков ДНК контрастно визуализировались по отношению к фоновой флуоресценции, что позволило достоверно определять количество флуоресцентных сигналов, в то время как на препаратах, которые были получены без обработки раствором Carbowax, гибризизацию нельзя было считать успешной. На препаратах, полученных в соответствии с предлагаемым способом, для всех больных было проанализировано такое количество клеток, которое было необходимо для получения достоверных результатов. Предлагаемое изобретение при использовании обеспечивает следующий технический эффект: благодаря фиксации клетки эпителия длительно (5-6 лет) сохраняют ДНК пригодной для прохождения гибридизации с ДНК-зондами при хранении их в условиях -20°С. Проведение предварительной обработки препаратов раствором Carbowax создает хорошие условия для прохождения гибризации, что наблюдается в виде увеличения яркости флуоресцентного сигнала по сравнению с яркостью флуоресцентных сигналов без такой обработки: зонирование позволяет наносить на одно предметное стекло суспензии клеток нескольких человек, что приводит к значительному (в 3-4 раза) снижению расхода пред- и пост-гибридизационных отмывочных растворов, а также увеличивает производительность труда. Возможность контроля плотности клеток позволяет уменьшить площадь гибридизации, что в свою очередь ведет к уменьшению в несколько раз расхода дорогостоящих ДНК-зондов.