Особенности кислородного и антиоксидантного статуса крови на фоне заместительной терапии гормоном роста у детей с соматотропной недостаточностью

Особенности кислородного и антиоксидантного статуса крови на фоне заместительной терапии гормоном роста у детей с соматотропной недостаточностью

К.м.н. М.С. ПАНКРАТОВА1*, к.б.н. А.И. ЮСИПОВИЧ2, М.В. ВОРОНЦОВА1, С.С. КОВАЛЕНКО2, к.б.н. А.А. БАЙЖУМАНОВ2, к.б.н. Е.Ю. ПАРШИНА2, к.м.н. Т.Ю. ШИРЯЕВА1, д.б.н. Г.В. МАКСИМОВ2, член-корр. РАМН В.А. ПЕТЕРКОВА1, акад. РАН и РАМН И.И. ДЕДОВ1

Peculiarities of the blood oxygen and antioxidant status in the children presenting

with somatotrophic insufficiency and managed by the substitution treatment with growth hormone

M.S. PANKRATOVA, A.I. YUSIPOVICH, M.V. VORONTSOVA, S.S. KOVALENKO, A.A. BAIZHUMANOV, E.YU. PARSHINA, T.YU. SHIRYAEVA, G.V. MAKSIMOV, V.A. PETERKOVA, I.I. DEDOV

1ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России; 2биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва

Изучалось системное влияние терапии рекомбинантным гормоном роста на кислородный и антиоксидантный статус крови у детей с соматотропной недостаточностью. Обследованы 11 детей (2 девочки и 9 мальчиков, в возрасте от 3 до 9 лет) с подтвержденной соматотропной недостаточностью, не получавших ранее терапию гормоном роста. На фоне 3 мес терапии наблюдалось возрастание доли оксигемоглобина, а также увеличение уровня супероксиддисмутазы в крови. Отмечалась прямая корреляция между показателями оксигемоглобина и SDS скорости роста (r=0,64, p<0,05), отрицательная корреляция между средним содержанием гемоглобина в эритроците (MCHC) и SDS скорости роста (r=-0,69; p<0,05). Результаты свидетельствуют о взаимосвязи между системой гормон роста—ростовые факторы и морфофунк-циональным состоянием эритроцитов. На фоне краткосрочной терапии гормоном роста у детей с соматотропной недостаточностью отмечалось развитие адаптационных механизмов.

Ключевые слова: соматотропная недостаточность, рекомбинантный гормон роста, эритроцит, гемоглобин, эффективность переноса кислорода, антиоксидантный статус.

The present work was designed to study the influence of therapy with recombinant growth hormone on the oxygen and antioxidant blood status in the children presenting with somatotrophic insufficiency. A total of 11 children (2 girls and 9 boys) at the age from 3 to 9 years with confirmed somatotrophic insufficiency were available for the observation. They had never before been treated with growth hormone preparations. The blood oxyhemoglobin level and superoxide dismutase (SOD) activity increased within 3 months after the onset of therapy. There is direct correlation between oxyhemoglobin levels and SDS for the growth rate (r= 0.64; p<0.05) and negative correlation between mean hemoglobin content in erythrocytes (MHCE) and SDS for the growth rate (r=-0.69), p<0.05). The results of the study suggest the close relationship between the system of growth hormone/growth factors and the morphofunctional state of erythrocytes. It is concluded that the short-term treatment of the children suffering somatotrophic insufficiency with recombinant growth hormone appears to promote the development of adaptive mechanisms.

Key words: somatotrophic insufficiency, recombinant growth hormone, erythrocytes, hemoglobin, efficacy of oxygen transport, antioxidant status.

Связь между дефицитом гормона роста (ГР) и повышенной смертностью от заболеваний сердечно-сосудистой системы у взрослых лиц отмечена давно [1]. Дефицит ГР сопровождается изменениями липидного состава крови и инсулинорезистент-ностью, что увеличивает риск повреждения сосудистой стенки, развития атеросклероза и других заболеваний сердечно-сосудистой системы [2, 3]. Одним из главных механизмов повреждения эндотелиоци-тов является окислительный стресс, обусловленный нарушением равновесия между продукцией активных форм кислорода (АФК) и возможностями анти-оксидантной системы клетки. Умеренные количества АФК являются частью нормального метабо-

лизма и производятся in vivo фагоцитами, эндотелио-цитами, фибробластами и миоцитами [4]. При чрезмерной продукции АФК наблюдается повреждение клеток (прежде всего клеточной мембраны) вследствие перекисного окисления липидов и липопро-теинов, приводящее к их гибели. В эксперименте продемонстрирована повышенная резистентность к окислительному стрессу у карликовых крыс после курса лечения препаратами ГР [5].

Влияние терапии ГР на состояние антиокси-дантной защиты при соматотропной недостаточности привлекает пристальное внимание [6, 7].

Важно выяснить, насколько эффективно обеспечиваются кислородом органы и ткани у детей с со-

© Коллектив авторов, 2012 10

*e-mail: ms_pankratova@mail.ru

матотропной недостаточностью при значительном увеличении линейного роста на фоне терапии ГР.

Помимо изменения кислородного статуса возможно прямое влияние ГР и инсулиноподобного ростового фактора 1 (ИФР-1) на эритроцитарную функцию [8]. В экспериментах in vitro и на биологических моделях было показано стимулирующее действие гормона на эритропоэз и гранулоцитопоэз, сопровождавшееся увеличением концентрации гемоглобина в крови [9], а также на объем циркулирующей крови, количество эритроцитов и их способность к агрегации [10, 11]. Влияние ГР на морфологию эритроцитов, в частности, на возможность физиологической деформации клеток изучалось на биологических моделях и у здоровых добровольцев [11], однако полученные результаты немногочисленны и противоречивы.

Изменение кислородного статуса может служить триггером окислительного стресса, что в свою очередь может влиять на метаболические процессы в организме. Оценку кислородного статуса наиболее удобно проводить при помощи спектроскопии комбинационного рассеяния (КР-спектроскопии), позволяющей регистрировать состояние гемоглобина непосредственно в эритроцитах нативной крови в естественном окружении плазмы с собственным значением рН, содержанием газов, белков и белко-во-липидных комплексов.

При увеличения скорости линейного роста также возможно ускорение метаболических процессов, что само по себе или в сочетании с сопутствующим изменением кислородного статуса стимулирует защитные ресурсы организма, в том числе через усиление окислительных процессов и образование АФК, а также других свободных радикалов, накопление которых инициирует дополнительную активацию антиоксидантных систем.

Для оценки антиоксидантного статуса крови нами были выбраны наиболее полно характеризующие его показатели: супероксиддисмутазная активность, каталазная активность [12], уровень небелковых тиолов, уровень церулоплазмина, количество конечных продуктов перекисного окисления липи-дов (ПОЛ), оцениваемого по уровню соединений, связанных с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП) [13]. Супероксиддисмутаза и церулоплазмин ответственны не только за утилизацию супероксид анион-радикала, но и регулируют уровень металлов переменной валентности (меди и железа); каталаза и небелковые тиолы принимают участие в утилизации перекиси водорода, а увеличение уровня продуктов ПОЛ отражает развитие окислительного стресса.

Изменение кислородного статуса и стресс нарушают характеристики эритроцитов, что можно выявить при общем клиническом анализе, а также путем оценки морфологических изменений клеток с

помощью лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) [14].

Не исключено, что в начальном периоде терапии ГР у детей с соматотропной недостаточностью возникает адаптация организма к максимальному ускорению роста, проявляющаяся, в частности, изменением морфофункциональных свойств эритроцитов.

Цель исследования — изучение системного влияния краткосрочной терапии рекомбинантным ГР на кислородный и антиоксидантный статус крови у детей с соматотропной недостаточностью.

Материал и методы

В исследовании приняли участие 11 пациентов (2 девочки и 9 мальчиков в возрасте от 3 до 9 лет) с соматотропной недостаточностью, не получавших ранее терапию ГР. С изолированной формой ГР-дефицита — 10 человек, с множественным дефицитом гормонов аденогипофиза (МДГА) — 1 человек (СТГ/ТТГ). Хронологический возраст (ХВ) составлял 6,1±2,2 года, костный возраст (КВ) — 2,6±0,9 года.

Всем пациентам проводилось стандартное кли-нико-лабораторно-инструментальное обследование на базе ЭНЦ, включавшее физикальное обследование и антропометрию, рентгенографию кисти с лу-чезапястным суставом (при включении в исследование), МРТ или КТ головного мозга (при включении в исследование). Для верификации диагноза ГР-стимулирующие пробы: с клофелином — определение ГР в 5 точках (0, 30, 60, 90 и 120 мин) и с инсулином — определение ГР в 7 точках (0, 15, 30, 45, 60, 90 и 120 мин). Лабораторные исследования [общий и биохимический анализ крови, исследование уровня ИРФ-1 и связывающего инсулиноподобный росто-вый фактор белка 3 (ИРФСБ-3)] проводили перед началом лечения и через 3 мес терапии. Рекомби-нантный ГР вводили подкожно ежедневно 1 раз в день (вечером, перед сном). Доза препарата составляла 0,033 мг на 1 кг массы тела в день.

Исследование антиоксидантного и кислородного статуса проводили в пробах цельной крови, отбираемых натощак, до начала и через 3 мес терапии ГР (кафедра биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова) с использованием спектроскопии комбинационного рассеяния (КР), лазерной интерференционной микроскопии и биохимического анализа показателей антиоксидантного статуса.

Спектроскопия комбинационного рассеяния. Данный метод использовался для исследования кон-формации гемопорфирина (ГП), позволяющий оценить изменения лигандсвязывающих свойств гемоглобина. Стеклянный капилляр с цельной кровью помещали в ячейку спектрометра и фокусировали на нем луч лазера (Х=473 нм, Р=18—20 мВт). Для

каждой пробы отбирали 3 капилляра, каждый из которых оценивали независимо; полученные значения усреднялись. Измеренный в таких условиях спектр КР крови в диапазоне 1200—1700 см-1 (рис. 1) представляет собой набор полос, соответствующих спектру гемопорфирина [15]. По отношениям интенсивности полос можно оценить долю оксигемо-глобина, способность гемоглобина связывать и отдавать кислород, сродство гемоглобина к кислороду, а также долю комплексов гемоглобин/оксид азота (NO) (табл. 1).

Лазерная интерференционная микроскопия. Морфологические характеристики клеток исследовали методом лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) [14] в условиях in vitro. Методика приготовления образцов описана ранее [16]. В каждой пробе оценивали не менее 100 клеток. Для обработ-

400

300

1355 см »

1375 см

1300 1400 1500

Частотный сдвиг, см-1

1700

Рис. 1. Типичный спектр комбинационного рассеяния цельной крови.

ки изображений использовали программу FUI [17]. Состояние эритроцитов характеризовали морфологическим индексом (МИ) [18]. При расчете МИ каждой форме эритроцита присваивается определенная сумма баллов (рис. 2).

Биохимические методы. Антиоксидантная активность цельной крови оценивали по изменению су-пероксиддисмутазной и каталазной активности и по количеству небелковых тиолов; в плазме определяли количество церулоплазмина и ТБК-активных продуктов (продукты гомолитического распада, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП).

Статистическая обработка проводилась с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0. Данные представлены в виде M±SD. При сравнении параметров до и через 3 мес лечения использовали непараметрический критерий Уилкоксона. Корреляционные связи оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Статистически значимыми считались изменения при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Основные антропометрические и лабораторные показатели детей с соматотропной недостаточностью до и на фоне 3 мес заместительной терапии ГР приведены в табл. 2. На фоне 3-месячного лечения ГР отмечалось статистически значимое и клинически выраженное увеличение как основных антропометрических показателей, так и концентрации ростовых факторов, что свидетельствует о высокой эффективности применяемой терапии.

Рис. 2. Расчет морфологического индекса для различных форм эритроцитов и их фазовых изображений.

Верхний ряд: поперечные сечения стоматоцита 3-го типа (а), 2-го типа (б), первого типа (в), дискоцита (г), эхиноцита 1-го (д), 2-го (е) и 3-го (ж) типов. Нижний ряд: сечения фазовых портретов-клеток. Цифрами указана сумма баллов, присваиваемая каждой морфологической форме эритроцита. Морфологический индекс определяется как среднее арифметическое суммы баллов всех эритроцитов.

Таблица 1. Отношения интенсивности пиков КР-спектра

Отношение полос,см-1 Характеристика

1 11375/(11355+11375) Относительное количество оксигемоглобина в эритроцитах крови

2 11355/11552 Способность молекул гемоглобина в эритроцитах связывать молекулы кислорода

3 11375/11580 Способность молекул гемоглобина в эритроцитах отдавать молекулы кислорода

4 (11355/11552)/(11375/11580) Сродство молекул гемоглобина к кислороду в эритроцитах

5 11618/ (1 1355 + 1 1375) Способность молекул гемоглобина связывать молекулы N0

Таблица 2. Основные антропометрические и лабораторные показатели у детей с соматотропной недостаточностью до и после терапии ГР

Параметр До лечения Через 3 мес

Рост, см 96,2±10,5 100,4±9,7*

Масса тела, кг 15,2±3,9 15,7±4,0*

Скорость роста, см/год 3,4±1,2 14,7±4,9*

SDS роста -3,6±0,9 -3,1±1,2*

SDS скорости роста —3,3±1,8 9,9±4,8*

ИФР-1, нмоль/л 5,7±4,1 11,3±8,7*

ИФРСБ-3, нмоль/л 51,9±36,1 95,1±24,3*

Примечание. Здесь и в табл. 3, 4: *—р<0,05 по сравнению с данными до лечения.

Таблица 3. Морфофункциональные свойства эритроцитов у детей с соматотропной недостаточностью до и после терапии гормоном роста

Параметр

До лечения

Через 3 мес

Эритроциты, 109/л Гемоглобин, г/л МСН, пг МСНС, г/дл МСУ, мкм3

Морфологический индекс

Доля оксигемоглобина, 11375/

способность молекул гемоглобина связывать кислород, 11355/11, способность гемоглобина отдавать кислород, 11375/11580 сродство гемоглобина к кислороду,

4,20±0,36 117,1±11,5 28,28±1,66 33,89±0,92 83,5±3,0 0,55±0,26 0,57±0,16 3,13±1,226 2,99±0,82 0,86±0,31 0,173±0,102

4,22±0,34 115,5±9,9 27,38±1,14* 33,40±0,65* 81,9±2,7 0,75±0,55 0,66±0,14 2,32±0,70 2,91±0,72 0,68±0,30 0,119±0,045*

Основные морфофункциональные характеристики эритроцитов у обследуемых пациентов до и на фоне терапии представлены в табл. 3.

Количество эритроцитов, общее количество гемоглобина, а также объем эритроцитов (МСУ) практически не изменялись, однако наблюдалось статистически значимое уменьшение МСН (средняя концентрация гемоглобина) и МСНС (средняя концентрация гемоглобина в эритроците). Таким образом, можно говорить о развитии незначительной анемии как адаптивной реакции организма. Эритроциты пациентов были представлены главным образом дискоцитами и эхиноцитами первого типа, реже стоматоцитами различных типов и эхиноцитами второго и третьего типов. За период терапии наблюдалась тенденция к увеличению МИ эритроцитов.

При измерениях методом КР-спектроскопии было установлено значимое уменьшение содержания комплексов №-N0 (характеризующихся связью атома Fe2+ с глобином). Оксид азота играет важ-

ную роль в регуляции транспорта О2 эритроцитами и обмена О2 в тканях [19]. Важно то, что, синтезируясь в определенном месте, N0 переносится гемоглобином по всему организму [20]. Константа сродства N0 к атому железа ^е2+) порфирина на 5—7 порядков выше, чем О2, и поэтому N0 способен конкурировать с кислородом за связывание гемоглобином [21]. Связываясь с атомом Fe2+ гемоглобина, N0 способен изменять конформацию гемопор-фирина гемоглобина и менять сродство гемоглобина к О2 [20]. Экзогенный N0 может увеличивать выделение О2 из эритроцитов [19]. Таким образом, уменьшение доли N0 способствует увеличению доли оксигемоглобина в крови, что и подтверждается экспериментально. Действительно, в процессе терапии наблюдалась тенденция к увеличению содержания оксигемоглобина в эритроцитах, способность гемоглобином связывать лиганды уменьшалась, имело место также уменьшение сродства гемоглобина к кислороду.

Таблица 4. Маркеры антиоксидантного статуса у детей с соматотропной недостаточностью на фоне терапии гормоном роста

Параметр До лечения Через 3 мес

Небелковые тиолы на Hb, нмоль/мг 6,0+2,1 7,8+2,3

ТБК-активные продукты, г/л 3,23+0,68 2,90+0,53

СОД, отн.ед/г Hb 17,49+3,53 21,97+3,88*

Каталаза ед/г Hb 215,1+64,3 210,8+44,0

Церулоплазмин, мкг/мл 568,4+103,8 568,2+101,9

Различия в отношениях, характеризующих способность гемоглобина связывать кислород и сродство гемоглобина к кислороду, по сравнению с аналогичными показателями до начала терапии могут быть частично объяснены увеличением доли окси- и соответственно уменьшением доли дезоксигемогло-бина в эритроците. Тенденция к увеличению доли оксигемоглобина, возможно, является адаптивным механизмом, направленным на сохранение кислорода в организме при уменьшении его количества в клетках.

Изменения основных маркеров антиоксидант-ной системы у обследуемых пациентов представлены в табл. 4. Обнаружено статистически значимое увеличение активности СОД через 3 мес после начала лечения. При этом не было значимых различий между активностью каталазы, уровнем церулоплаз-мина, небелковых тиолов и концентрацией ТБК-активных продуктов в плазме до и после проводимой терапии. Возрастание активности СОД связано с увеличением генерации супероксиданион радикала. Известно, что в эритроцитах окисление иона железа гемоглобина способствует образованию супер-оксиданион радикала; это может быть обусловлено адаптационными процессами, развивающимися в ответ на изменение кислородного обмена в тканях, и свидетельствует о повышении антиокислительной активности крови. Отсутствие значимых различий в концентрации ТБК-активных продуктов (непосредственных маркеров окислительного стресса) свидетельствует об отсутствии окислительного стресса у обследуемых пациентов. Таким образом, полученный результат можно интерпретировать как адаптивные изменения антиоксидантной системы крови.

Нами выявлены статистически значимые корреляции ряда исследуемых параметров: отрицательная корреляция между относительным количеством комплексов N0 с гемоглобином и содержанием ок-сигемоглобина (/=—0,79; £<0,05) и положительная корреляция данных комплексов с концентрацией гемоглобина (г=0,67; £<0,05). Отмечена положительная корреляция (г=0,64; £<0,05) между изменениями SDS скорости роста и оксигемоглобина, т.е. чем выше скорость роста, тем больше доля оксиге-моглобина. Также имелась отрицательная корреляция между МСНС (средней концентрацией гемоглобина в эритроците) и SDS скорости роста (/=-0,69; £<0,5).

Коэффициент корреляции между активностью каталазы и концентрацией ИФРСБ-3 составил —0,67 (р<0,05), а между относительным содержанием оксигенированного гемоглобина и МИ — 0,67 (^<0,05). Выявлена отрицательная корреляция между содержанием оксигемоглобина и концентрацией ИФР-1 (/=—0,72; ^<0,05).

Обнаруженные значимые корреляции показателей роста, ростовых факторов и показателей кислородного и антиоксидантного статуса свидетельствуют о взаимосвязи между системой ГР— ИФР-1 и функциональными свойствами эритроцитов, отражающей в первую очередь развитие адаптивных механизмов в ответ на увеличение линейного роста.

Заключение

Полученные данные свидетельствуют о взаимосвязи системы ГР—ИФР-1 с морфофункцио-нальным состоянием эритроцитов. На фоне краткосрочной терапии ГР у детей с соматотропной недостаточностью отмечается формирование адаптивных механизмов, препятствующих развитию гипоксии и окислительного стресса.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.С. Панкратова, А.И. Юсипович, Т.Ю. Ширяева, Г.В. Максимов, В.А. Петеркова, И.И. Дедов

Сбор и обработка материала — М.С. Панкратова, А.И. Юсипович, М.В. Воронцова, С.С. Коваленко, А.А. Байжуманов, Е.Ю. Паршина, Т.Ю. Ширяева

Статистическая обработка данных — М.С. Панкратова, А.И. Юсипович, С.С. Коваленко, А.А. Бай-жуманов

Написание текста — М.С. Панкратова, А.И. Юсипович, М.В. Воронцова, С.С. Коваленко

Редактирование — Т.Ю. Ширяева, Г.В. Максимов, В.А. Петеркова, И.И. Дедов

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Статья выполнена в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009— 2013 гг.

ЛИТЕРАТУРА

1. Rosen T., Bengtsson B.A. Premature mortality due to cardiovascular disease in hypopituitarism. Lancet 1990; 336: 8710: 285—288.

2. Johansson J.O., Fowelin J., Landin K., Lager I., Bengtsson B.A. Growth hormone-deficient adults are insulin-resistant. Metabolism 1995; 44: 9: 1126—1129.

3. Russell-JonesD.L., Watts G.F., WeissbergerA., NaoumovaR., Myers J., Thompson G.R., Sonksen P.H. The effect of growth hormone replacement on serum lipids, lipoproteins, apolipoproteins and cholesterol precursors in adult growth hormone deficient patients. Clin Endocrinol (Oxford) 1994; 41: 3: 345—350.

4. Kerr M.E., Bender C.M., Monti E.J. An introduction to oxygen free radicals. Heart Lung 1996; 25: 3: 200—209; 210—211.

5. Ungvari Z., Sosnowska D., Podlutsky A., Koncz P., Sonntag W.E., Csiszar A. Free radical production, antioxidant capacity, and oxidative stress response signatures in fibroblasts from Lewis dwarf rats: effects of life span-extending peripubertal GH treatment. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2011; 66: 5: 501—510.

6. Evans L.M., Davies J.S., Anderson R.A., Ellis G.R., Jackson S.K., Lewis M.J., Frenneaux M.P., Rees A., Scanlon M.F. The effect of GH replacement therapy on endothelial function and oxidative stress in adult growth hormone deficiency. Eur J Endocrinol 2000; 142: 3: 254—262.

7. Ferrari R., Guardigli G., Mele D., Percoco G.F., Ceconi C., Curello S. Oxidative stress during myocardial ischaemia and heart failure. Curr Pharm Des 2004; 10: 14: 1699—1711.

8. Brun J.F. Hormones, metabolism and body composition as major determinants of blood rheology: potential pathophysiological meaning. Clin Hemorheol Microcirc 2002; 26: 2: 63—79.

9. Sohmiya M., Kato Y. Effect of long-term administration of recombinant human growth hormone (rhGH) on plasma erythropoietin (EPO) and haemoglobin levels in anaemic patients with adult GH deficiency. Clin Endocrinol (Oxford) 2001; 55: 6: 749—754.

10. Christ E.R., Cummings M.H., Westwood N.B., Sawyer B.M., Pearson T.C., Sonksen P.H., Russell-JonesD.L. The importance of growth hormone in the regulation of erythropoiesis, red cell mass, and plasma volume in adults with growth hormone deficiency. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 9: 2985—2990.

11. Ramos S.B., Brun J.F., Gray B., Rogerson S., Weatherby R.P., Tajouri L., Marshall-Gradisnik S.M. The effects of short term recombinant human growth hormone (rhGH) on blood rheology in healthy young males. Clin Hemorheol Microcirc 2011; 47: 2: 121—129.

12. Brazhe N.A., Baizhumanov A.A., Parshina E.I., Iusipovich A.I., Akhalaia M.I., Iarlykova I., Labetskaia O.I., Ivanova S.M., Morukov B. V., Maksimov G. V. Studies of the blood antioxidant system and oxygen-transporting properties of human erythrocytes during 105-day isolation. Aviakosm Ekolog Med 2011; 45: 40— 45.

13. Akhalaia M.I., Baizhumanov A.A., Brazhe N.A., Luneva O.G., Mikhailov I.V., Bryzgalova N.Y., Parshina E.Y., Maksimov G.V., Rubin A.B. Modifying effect of nitric oxide on rat blood plasma proteins and hemoglobin. Dokl Biochem Biophys 2007; 415: 222—224.

14. Yusipovich A.I., Parshina E.Y., Brysgalova N.Y., Brazhe A.R., Brazhe N.A., Lomakin A.G., Levin G.G., Maksimov G.V. Laser interference microscopy in erythrocyte study. J Appl Phys 2009; 105: 102037—1—102037—7.

15. Соловьев К.Н., Гладков Л.Л., Старухин А.С., Шкирман С.Ф. Спектроскопия порфиринов: Колебательные состояния. Наука и техника (Минск) 1985.

16. Юсипович А.И., Брызгалова Н.Ю., Паршина Е.Ю., Ломакин А.Г., Родненков О.В., Левин Г.Г., Максимов Г.В., Рубин А.Б. Применение лазерной интерференционной микроскопии для оценки формы и состояния эритроцитов. Бюлл эксп биол 2008; 3: 357—360.

17. Schindelin J., Arganda-Carreras I., Frise E., Kay nig V., Longair M., Pietzsch T., Preibisch S., Rueden C., Saalfeld S., Schmid B., Tinevez J.Y., White D.J., Hartenstein V., Eliceiri K., Tomancak P., Cardona A. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth 2012; 9: 676—682.

18. Gedde M.M., Yang E., Huestis W.H. Shape response of human erythrocytes to altered cell pH. Blood 1995; 86: 1595—1599.

19. Kosaka H., Seiyama A. A physiological role of nitric oxide as an enhancer of oxygen transfer from erythrocytes to tissues. Biochem Biophys Res Commun 1996; 218: 749—752.

20. Hobbs A.J., Gladwin M.T., Patel R.P., Williams D.L., Butler A.R. Haemoglobin: NO transporter, NO inactivator or №ne of the above? Trends Pharmacol Sci 2002; 23: 406—411.

21. Stamler J.S., Simon D.I., Osborne J.A., Mullins M.E., Jaraki O., Michel T., Singel D.J., Loscalzo J. S-nitrosylation of proteins with nitric oxide: synthesis and characterization of biologically active compounds. Proceedings of the National Academy. Sciences 1992; 89: 444—448.