КОВАЛЕНТНЫЕ ДИАНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Молекула диантитела, содержащая первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, причем указанные полипептидные цепи ковалентно соединены друг с другом, где
I)где первая полипептидная цепь содержит (i) первый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфичную к первому эпитопу, (ii) второй домен, содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфичную ко второму эпитопу, и (iii) третий домен, содержащий Fc-домен или его часть, причем первый домен и второй домен ковалентно связаны так, чтобы первый домен и второй домен не ассоциировали с образованием участка связывания эпитопа;
II)где вторая полипептидная цепь содержит (i) четвертый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), (ii) пятый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), и (iii) шестой домен, содержащий Fc-домен, причем четвертый домен и пятый домен ковалентно связаны так, чтобы четвертый домен и пятый домен не ассоциировали с образованием участка связывания эпитопа; и
где
(А)первый домен и пятый домен ассоциируют с образованием первого участка связывания (VL1)(VH1), который связывает первый эпитоп;
(B)второй домен и четвертый домен ассоциируют с образованием второго участка связывания (VL2)(VH2), который связывает второй эпитоп; и
(C)(1) указанный второй домен и указанный третий домен; и/или
(2) указанный пятый домен и указанный шестой домен
связаны друг с другом с помощью встроенного между ними полипептидного линкера, состоящего из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 278, 280, 281, 283, 284, 286, 287, 288, 289, 290, 293, 295 и 297.
2. Молекула диантитела по п.1, где третий домен дополнительно содержит шарнирный домен.
3. Молекула диантитела, содержащая первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, причем указанные полипептидные цепи ковалентно соединены друг с другом, где
I)первая полипептидная цепь содержит (i) первый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфичную к первому эпитопу, (ii) второй домен, содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфичную ко второму эпитопу, и (iii) третий домен, содержащий шарнирный домен и Fc-домен или его часть, причем первый домен и второй домен ковалентно связаны так, чтобы первый домен и второй домен не ассоциировали с образованием участка связывания эпитопа; и
II)вторая полипептидная цепь содержит (i) четвертый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), (ii) пятый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), и (iii) шестой домен, содержащий аминокислотную последовательность FNRGEC (SEQ ID NO:23), причем четвертый домен и пятый домен ковалентно связаны так, чтобы четвертый домен и пятый домен не ассоциировали с образованием участка связывания эпитопа; и
где
(А)первый домен и пятый домен ассоциируют с образованием первого участка связывания (VL1)(VH1), который связывает первый эпитоп;
(В)второй домен и четвертый домен ассоциируют с образованием второго участка связывания (VL2)(VH2), который связывает второй эпитоп; и
(С)(1) указанный второй домен и указанный третий домен; и/или
(2) указанный пятый домен и указанный шестой домен
связаны друг с другом с помощью встроенного между ними полипептидного линкера, состоящего из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 278, 280, 281, 283, 284, 286, 287, 288, 289, 290, 293, 295 и 297.
4. Молекула диантитела, содержащая первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, причем указанные полипептидные цепи ковалентно соединены друг с другом, где
I)первая полипептидная цепь содержит (i) первый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфичную к первому эпитопу, (ii) второй домен, содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфичную ко второму эпитопу, и (iii) третий домен, содержащий шарнирный домен, причем первый домен и второй домен ковалентно связаны так, чтобы первый домен и второй домен не ассоциировали с образованием участка связывания эпитопа; и
II)где вторая полипептидная цепь содержит (i) четвертый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), (ii) пятый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), и (iii) шестой домен, содержащий аминокислотную последовательность FNRGEC (SEQ ID NO:23), причем четвертый домен и пятый домен ковалентно связаны так, что четвертый домен и пятый домен не ассоциируют с образованием участка связывания эпитопа; и
где
(А)первый домен и пятый домен ассоциируют с образованием первого участка связывания (VL1)(VH1), который связывает первый эпитоп;
(В)второй домен и четвертый домен ассоциируют с образованием второго участка связывания (VL2)(VH2), который связывает второй эпитоп; и
(С)(1) указанный второй домен и указанный третий домен; и/или
(2) указанный пятый домен и указанный шестой домен
связаны друг с другом с помощью встроенного между ними полипептидного линкера, состоящего из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 278, 280, 281, 283, 284, 286, 287, 288, 289, 290, 293, 295 и 297.
5. Молекула диантитела, содержащая первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, причем указанные полипептидные цепи ковалентно соединены друг с другом, где
I)где первая полипептидная цепь содержит (i) первый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфичную к первому эпитопу, (ii) второй домен, содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфичную ко второму эпитопу, и (iii) третий домен, содержащий Fc-домен или его часть, причем первый домен и второй домен ковалентно связаны так, чтобы первый домен и второй домен не ассоциировали с образованием участка связывания эпитопа; и
II)вторая полипептидная цепь содержит (i) четвертый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), и (ii) пятый домен, содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), причем четвертый домен и пятый домен ковалентно связаны так, чтобы четвертый и пятый домены не ассоциировали с образованием участка связывания эпитопа; и
где
(А)первый домен и пятый домен ассоциируют с образованием первого участка связывания (VL1)(VH1), который связывает первый эпитоп;
(В)второй домен и четвертый домен ассоциируют с образованием второго участка связывания (VL2)(VH2), который связывает второй эпитоп; и
(С)указанный второй домен и указанный третий домен связаны друг
с другом с помощью встроенного между ними полипептидного линкера, состоящего из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 278, 280, 281, 283, 284, 286, 287, 288, 289, 290, 293, 295 и 297.
6. Молекула диантитела по п.5, где третий домен дополнительно содержит шарнирную область.
7. Молекула диантитела по любому из пп.1-6, где
(А)первый домен и третий домен ассоциируют с образованием первого участка связывания (VL1)(VH1), который связывает первый эпитоп, и этот участок связывания эпитопа является специфичным к CD32B; и
(В)второй домен и четвертый домен ассоциируют с образованием второго участка связывания (VL2)(VH2), который связывает второй эпитоп, и этот участок связывания эпитопа является специфичным к CD16.
8     8. Молекула диантитела, содержащая первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, причем указанные полипептидные цепи ковалентно соединены друг с другом, где
(A)указанная первая полипептидная цепь содержит:
(i) домен (A), содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфичную к эпитопу (1);
(ii) домен (B), содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфичную к эпитопу (2); и
(iii) домен (C), содержащий константную область легкой цепи (CL) или ее часть;
(B)указанная вторая полипептидная цепь содержит:
(i) домен (D), содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфичную к указанному эпитопу (2);
(ii) домен (E), содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфичную к указанному эпитопу (1);
(iii) домен (F), содержащий константную область тяжелой цепи 1 (CH1) или ее часть, и
(iv) шарнирную область, константную область тяжелой цепи 2 (CH2) и константную область тяжелой цепи 3 (CH3);
где:
указанные домены (A) и (B) не ассоциируют друг с другом с образованием участка связывания эпитопа;
указанные домены (D) и (E) не ассоциируют друг с другом с образованием участка связывания эпитопа;
указанные домены (A) и (E) ассоциируют с образованием участка связывания, который связывает указанный эпитоп (1);
указанные домены (B) и (D) ассоциируют с образованием участка связывания, который связывает указанный эпитоп (2);
указанный домен (C) и указанная шарнирная область ассоциируют через дисульфидную связь; и
где:
(1) указанные домены (B) и (C); и/или
(2) указанные домены (E) и (F)
связаны друг с другом с помощью встроенного между ними полипептидного линкера, состоящего из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 278, 280, 281, 283, 284, 286, 287, 288, 289, 290, 293, 295 и 297.
9. Молекула диантитела по п.8, где указанная молекула дополнительно содержит третью полипептидную цепь и четвертую полипептидную цепь, причем указанные третья и четвертая полипептидные цепи ковалентно соединены друг с другом, где:
(A)указанная третья полипептидная цепь содержит:
(i) домен (G), содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи первого иммуноглобулина (VL1), специфичную к эпитопу (3);
(ii) домен (H), содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи второго иммуноглобулина (VH2), специфичную к эпитопу (4); и
(iii) домен (I), содержащий константную область легкой цепи (CL) или ее часть;
(B)указанная четвертая полипептидная цепь содержит:
(i) домен (J), содержащий связывающую область вариабельного домена легкой цепи второго иммуноглобулина (VL2), специфичную к указанному эпитопу (4);
(ii) домен (K), содержащий связывающую область вариабельного домена тяжелой цепи первого иммуноглобулина (VH1), специфичную к указанному эпитопу (3);
(iii) домен (L), содержащий константную область тяжелой цепи 1 (CH1) или ее часть; и
где:
указанные домены (G) и (H) не ассоциируют друг с другом с образованием участка связывания эпитопа;
указанные домены (J) и (K) не ассоциируют друг с другом с образованием участка связывания эпитопа;
указанные домены (G) и (K) ассоциируют с образованием участка связывания, который связывает указанный эпитоп (3);
указанные домены (H) и (J) ассоциируют с образованием участка связывания, который связывает указанный эпитоп (4);
указанный домен (I) и указанная шарнирная область ассоциируют через дисульфидную связь; и
указанные шарнирная область, константная область тяжелой цепи 2 (CH2) и указанная константная область тяжелой цепи 3 (CH3) указанной второй и четвертой полипептидных цепей ассоциируют с образованием Fc-домена; и
где:
(1) указанные домены (H) и (I); и/или
(4) указанные домены (K) и (L)
связаны друг с другом с помощью встроенного между ними полипептидного линкера, состоящего из последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 278, 280, 281, 283, 284, 286, 287, 288, 289, 290, 293, 295 и 297.
10. Молекула диантитела по любому из пп.1-6, где указанная первая или указанная вторая полипептидные цепи указанного диантитела дополнительно содержат разделитель в виде E-спирали или K-спирали.
11. Молекула диантитела по п.10, где одна из указанных первой и второй полипептидных цепей указанной молекулы диантитела содержит разделитель в виде E-спирали, а другая из указанных первой и второй полипептидных цепей указанной молекулы диантитела содержит разделитель в виде K-спирали.
12. Молекула диантитела по п.10, где указанный разделитель в виде E-спирали или K-спирали связан с Fc-доменом или его фрагментом.
13. Молекула диантитела по п.11, где указанный разделитель в виде E-спирали или K-спирали связан с Fc-доменом или его фрагментом.
14. Молекула диантитела по п.10, где указанный разделитель в виде E-спирали или K-спирали связан с полипептидной частью белка, который связывается с сывороточным белком, причем указанная полипептидная часть способна связываться с указанным сывороточным белком.
15. Молекула диантитела по п.14, где указанный белок, который связывается с сывороточным белком, представляет собой альбумин-связывающий белок.
16. Молекула диантитела по п.15, где указанный альбумин-связывающий белок представляет собой стрептококковый белок G, а указанная полипептидная часть представляет собой альбумин-связывающий домен (ABD) указанного стрептококкового белка G.
17. Молекула диантитела по п.16, где указанный альбумин-связывающий домен (ABD) указанного стрептококкового белка G представляет собой альбумин-связывающий домен 3 (ABD3) белка G штамма Streptococcus G148.
in vivo
18. Молекула диантитела по п.15, где указанная молекула диантитела проявляет время полужизни в сыворотке  более 2 часов.
in vivo
19. Молекула диантитела по п.18, где указанная молекула диантитела проявляет время полужизни в сыворотке  более 10 часов.
in vivo
20. Молекула диантитела по п.18, где указанная молекула диантитела проявляет время полужизни в сыворотке  более 20 часов.
21. Молекула диантитела по любому из пп.1-6, 8, 9 и 11-20, имеющая домен, который представляет собой связывающий лиганд для рецептора естественных киллеров группы 2D (NKG2D).
22. Молекула диантитела по любому из пп.1-6, 8, 9 и 11-20, имеющая домен, который представляет собой связывающий лиганд для домена, связывающий T-клеточный рецептор (TCR).
23. Молекула диантитела по любому из пп. 1-6, 8, 9 и 11-20, где указанная молекула диантитела дополнительно связывается с ассоциированным с опухолью антигеном.
24. Молекула диантитела по п.23, где указанный ассоциированный с опухолью антиген представляет собой антиген рака молочной железы, антиген рака яичника, антиген рака предстательной железы, антиген рака шейки матки, антиген карциномы поджелудочной железы, антиген рака легкого, антиген рака мочевого пузыря, антиген рака толстого кишечника, антиген рака яичка, антиген злокачественной глиобластомы, антиген, ассоциированный с B-клеточной злокачественной опухолью, антиген, ассоциированный с множественной миеломой, антиген, ассоциированный с неходжкинской лимфомой, или антиген, ассоциированный с хроническим лимфоцитарным лейкозом.
25. Молекула диантитела по п.23, где указанный ассоциированный с опухолью антиген представляет собой A33; ADAM-9; ALCAM; B1; BAGE; бета-катенин; CA125; карбоксипептидазу M; CD5; CD19; CD20; CD22; CD23; CD25; CD27; CD28; CD32B; CD36; CD40; CD45; CD46; CD56; CD79a; CD79b; CD103; CD154; CDK4; CEA; CTLA4; цитокератин 8; EGF-R; рецептор эфрина; ErbB1; ErbB3; ErbB4; GAGE-1; GAGE-2; GD2; GD3; GM2; gp100; HER-2/neu; E6 вируса папилломы человека; E7 вируса папилломы человека; интегрин альфа-V-бета-6; JAM-3; KID3; KID31; KSA (17-1A); LUCA-2; MAGE-1; MAGE-3; MART; MUC-1; MUM-1; N-ацетилглюкозаминилтрансферазу; онкостатин M (рецептор-бета онкостатина); p15; PIPA; PSA; PSMA; RAAG10; ROR1; SART; sTn; TES7; рецептор TNF-α; рецептор TNF-β; рецептор TNF-γ; рецептор трансферрина или рецептор VEGF.
26. Молекула диантитела по п.25, где указанный ассоциированный с опухолью антиген представляет собой HER-2/neu.