Glutathione Reductase of Vacuole. Comparison of Glutathione Reductase Activity of Vacuole and Tissue Extract of Red Beet Root (Beta vulgaris L.)

Journal of Stress Physiology & Biochemistry, Vol. 12 No. 1 2016, pp. 60-73 ISSN 1997-0838 Original Text Copyright © 2015 by Pradedova, Nimaeva and Salyaev

ORIGINAL ARTICLE

Glutathione Reductase of Vacuole. Comparison of Glutathione Reductase Activity of Vacuole and Tissue Extract of Red Beet Root

E.V. Pradedova, O.D. Nimaeva, R.K. Salyaev

Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry, SB RAS, Irkutsk, Russia *E-Mail: praded@sifibr.irk.ru

Received December 23, 2015

Glutathione reductase (GR, EC 1.8.1.7) is the enzyme that reduces oxidized glutathione (GSSG) and thus regulates the redox state of glutathione (GSH/GSSG). GR has been studied in most plants. This enzyme has been identified in chloroplasts and cytosol, so these cellular compartments are considered to be the main place of the enzyme localization. In the same time, just a little is known about GR vacuoles. There are no conclusive evidences to prove the presence or absence of this enzyme in the vacuoles. GR activity was found in the vacuoles of red beet root cells (Beta vulgaris L.). The level of activity, the optimum pH and isoenzyme composition of GR were compared in the vacuoles and tissue extract of beet root. Vacuolar GR activity was quite high, it was 1.5-2 times higher than the activity of the tissue extract. Enzyme pH optimum of all the objects were identical. pH-optimum depend on the pyridine nucleotide nature: pH 7.0-8.0 was an optimal range with NADPH; pH 5.0 - with NADH. GR activity of the vacuoles and tissue extracts decreased in the presence of a noncompetitive inhibitor 1-chloro-2.4-dinitrobenzene (CDNB), indicating the specificity of this enzymatic reaction. Two bands with glutathione reductase activity have been identified in the vacuoles and tissue extracts using zymography method to determine the enzymatic activity in PAAG after electrophoresis of proteins. Belonging to the GR isoforms of these bands was confirmed by enzyme immunoassay (Western blotting). The electric mobility of isoforms of the study objects did not differ significantly. It is concluded that the biochemical characteristics of vacuolar glutathione reductase were substantially identical to the biochemical characteristics of other localization GR.

Key words: Beta vulgaris L., vacuole, glutathione reductase

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

61

Glutathione Reductase of Vacuole...

Одной из многочисленных функций центральной вакуоли клеток растений является защитная функция. Вакуоль вовлечена в детоксикацию ксенобиотиков, активных форм кислорода (АФК), радикальных форм эндогенных метаболитов (прооксидантов) и др. Основную роль вакуоли в детоксикационных процессах видят в депонирование некоторых токсичных соединений в виде конъюгатов с углеводами, аминокислотами и глутатионом (GSH) (Abhilash et al., 2009).

Отмечено, что вакуоль аккумулирует не только конъюгаты с глутатионом, но и окисленный глутатион (GSSG), который является довольно эффективным прооксидантом (Dixon et a/., 1998; Noctor et al., 2011). Эти и ряд других фактов послужили основанием для обсуждения большого вклада центральной вакуоли в регуляцию внутриклеточных редокс-процессов. Не исключают участие вакуоли в тех процессах, в которых GSH играет ключевую роль. Подтвердить это участие можно в ходе всестороннего изучения вакуолярной редокс-системы глутатиона. Эта система представлена самим GSH и глутатион-зависимыми ферментами. В рамках системы глутатиона, наряду с другими ферментами, функционирует фермент глутатионредуктаза (EC 1.8.1.7) (Kulinskiy, Kolesnichenko, 2009). Относимая к семейству флавопротеиновых оксидоредуктаз

глутатионредуктаза (GR), катализирует восстановление дисульфида глутатиона GSSG до его сульфгидрильной формы GSH в присутствии NAD(P)H. Восстанавливая глутатион, GR повышает редокс-соотношение GSH/GSSG. В связи с этим, от

активности фермента в определенной мере зависят редокс-гомеостаз клетки, функционирование редокс-зависимых белков и защита клеток от активных форм кислорода (АФК) (Carlberg, Mannervik, 1985).

На сегодняшний день GR является одним из самых изученных ферментов животных и человека. В то же время для GR растений недостаточно исследованы детали строения ферментативного комплекса, функционирования активного центра, регуляции и компартментации (Edwards et al., 1990). Основным местом локализации GR у растений принято считать хлоропласты (70-80%), однако глутатионредуктазная активность обнаружена в цитозоле, митохондриях и пероксисомах (Edwards et al., 1990; Rao, 2008). Для GR перечисленных компартментов определены изоферментный состав и кинетические характеристики. Следует отметить, что на сегодняшний день о GR вакуолей практически нет информации. Лишь единичные факты говорят о возможности присутствия фермента в этой клеточной структуре (Rautenkranz et al., 1994). Однако имеются дополнительные основания, позволяющие предположить функционирование GR в вакуолях. К ним можно отнести упомянутое выше участие вакуоли в детоксикации, опосредованной GSH, и депонирование GSSG. Кроме того, в вакуолях некоторых растений определена концентрация свободного глутатиона и выявлено преобладание пула GSH над пулом GSSG, несмотря на довольно

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

62

низкое редокс-соотношение GSH/GSSG (Noctor et выделенных фракций вакуолей контролировали

al., 2011). Преимущественная аккумуляция в вакуолях под световым микроскопом (“Carl Zeiss”,

GSSG с одной стороны и преобладание Германия), а также с помощью биохимических

восстановленного пула GSH с другой, позволяют маркеров. Вакуолярные фракции считали чистыми,

предположить функционирование систем, поскольку в них не выявляли активность маркерных

восстанавливающих GSSG и поддерживающих ферментов клеточных структур, потенциальных

восстановленный пул глутатиона (Noctor et al., 2011). контаминантов: каталазы (К.Ф. 1.11.1.6) - маркера

Немаловажное значения в ряду таких систем имеет пероксисом; HAD- и HADP-зависимые

GR. В связи с эти, изучение активности GR в малатдегидрогеназы (К.Ф. 1.1.1.37 и 1.1.1.82 ) -

вакуолях представляется целесообразным. Одна маркеры цитозоля, митохондрий и пластид

из первоочередных задач настоящего (Edwards et al., 1985; Levites, 1986) (Рис. 1).

исследования состояла в выявлении активности Изолированные вакуоли разрушали в

GR в вакуолях клеток корнеплодов столовой гипотоническом растворе, содержащем: 100 мМ

свеклы (Beta vulgaris L.). Другая задача K.Na-фосфатный буфер (pH 7.0), 1 мМ

заключалась в изучении биохимических дитиотрейтола (DTT), 1 мМ EDTA, 1%

характеристик GR вакуолей в сравнении с поливинилпирролидона (PVP). Экстракт

характеристиками GR тканевого экстракта центрифугировали при 13500 g в течение 10 мин.

корнеплодов столовой свеклы. Водные экстракты ткани получали в ходе

MATERIALS AND METHODS гомогенизации ткани корнеплода в среде: 100 мМ

Объектом исследования служили корнеплоды K.Na-фосфатный буфер (pH 7.8); 1 мМ DTT; 1 мМ

столовой свеклы (Beta vulgaris L.) в период их EDTA; 1% PVP. Фильтраты центрифугировали 15

физиологического покоя. Корнеплоды хранили при мин при 13500 g.

4°С. Активность GR определяли

Вакуоли выделяли из тканей корнеплодов с спектрофотометрическим методом в реакционной

помощью модифицированного макрообъемного среде: 50 мМ K-фосфатный буфер (рН 7.0); 1 мМ

метода (Salyaev et al., 1981). Фракцию EDTA; 0.1 мМ NADPH или NADH; 0.5 мМ GSSG

изолированных органелл дополнительно очищали (Anderson et al., 1990). Окисление NAD(P)H

от примесей в ступенчатом градиенте плотности определяли на спектрофотометре S100 (“Karl

сахарозы-KCl (1.050-1.080-1.145-1.180 г/см3). Zeis”, Jena, Германия) при длине волны 340 нм.

Растворы разной удельной плотности для Ферментативную активность рассчитывали с

градиента готовили, смешивая два матричных учетом коэффициента экстинкции для NAD(P)H,

раствора: 1 М KCI и 1.8 М сахароза (20 мМ трис- который соотвествует 6.22 мМ-1 см-1.

HCl, рН 7.4) (Salyaev et al., 1981). Чистоту В том случае, когда исследовали рН-

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

63

Glutathione Reductase of Vacuole...

зависимость фермента, использовали среды с рН: 5.0-6.0-7.0-8.0.

Для GR на сегодня не выявлены узко специфичные ингибиторы. Отмечено снижение ферментативной активности в присутствие нитрофуранов и 1-хлор-2.4-динитробензола

Для определения кинетических характеристик Km и Vm использовали грубые экстракты тканей и вакуолей. Кинетические параметры определяли для GSSG в отсутствии или присутствии CDNB. В среды вносили GSSG в конечной концентрации 0.0625-0.125-0.25-0.5 мМ и CDNB в концентрации 2 мМ. Для расчета Km и Vm применяли уравнения линейной регрессии и графический способ в системе обратных координат Лайнуивера-Берка.

Относительную активность GR выражали в нмолях субстрата на мг белка в мин. Количество белка определяли по методу Bradford (1976).

Зимографическим методом выявляли активность GR в полиакриламидном геле (PAAG). Электрофорез белков осуществляли с помощью стандартных методов в 7.5% PAAG при неденатурирующих условиях (Gaal et al., 1980). Ферментативную активность в геле визуализировали двумя способами. Первый предусматривал развитие окраски в агаровом слое, который наносили на PAAG. Этот слой содержал: 200 мМ трис-HCl (pH 8.0); 1 мМ EDTA; 2 мМ 5.5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты (DTNB); 1мМ

GSSG, 0.5 мМ NADPH; 15 мг/мл агара. Разогретую до 45°C смесь наносили на гель, агар застывал и формировал слой, в котором в зонах локализации GR появлялось желтое окрашивание, вызванное образованием в ходе реакции 5-тио-2-нитробензойной кислоты (Levites, 1986). Другой способ предусматривал инкубацию гелей в темноте в реакционной среде: 0.25 М трис-HCl (рН 7.5); 3.4 мМ GSSG; 0.5 мМ NADPH; 1 мг/мл 3-(4.5-диметилтриазол-2-4)2.5-дифенилтетразолиум бромида (MTT); 1 мг/мл 2.6-дихлорофенолиндофенола (DCPIP) (Aravind et al., 2005). В местах локализации GR появлялись синие полосы. Маркером ферментативных реакций служила GR из пекарских дрожжей (Sigma).

Для вестерн-блот анализа изоформ GR использовали поликлональные антитела мыши, полученные для GR пекарских дрожжей (Sigma). Иммунизацию мышей проводили в 2 этапа, вводя антиген внутрибрюшинно дважды с двухнедельным интервалом. Вводимый антиген объединяли с равным количеством полного адъюванта Фрейнда. После 50-60 дней иммунизации производили забор крови, содержащей поликлональные антитела (Catty, 1988).

Для разделения белков вакуолей и тканевого экстракта использовали метод изоэлектрического фокусирования (ИЭФ) в PAAG (Т 5%; С 3%). Гель содержал 10% глицерин и 3% амфолита (рН 3.510.5). Анолитом служила 0.06 N H3PO4, католитом -0.1 N NaOH (Righetti,1983). После ИЭФ в геле определяли активность изоформ с помощью зимографического метода. Гели

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

64

фотографировали. Затем осуществляли перенос числе которых ингибиторный анализ.

белков из PAAG на нитроцеллюлозную мембрану. Специфичных внутриклеточных ингибиторов или

Вестерн-блот анализ проводили согласно активаторов для GR не обнаружено. Показано

общепринятому методу (Yannarelli et al., 2007). ингибирующее действие некоторых нитрофуранов

Первичные антитела мыши, как упоминалось, и ароматических нитросоединений (Bilzer et al.,

получали самостоятельно, а вторичные антитела 1984). Из нитрофуранов в качестве ингибитора для

мыши - производства фирмы Sigma. Так как GR, выявленной в вакуолях и тканях корнеплодов

вторичные антитела были конъюгированны с столовой свеклы, использовали фурацилин. В

пероксидазой хрена, активность последней присутствии фурацилина ферментативная

определяли в реакционном растворе, содержащем: активность снижалась как в тканевом, так и

100 мМ цитратно-фосфатный буфер (рН 5.5), вакуолярном экстракте (Рис. 2). Ингибирование

0.01% Н2О2, 0.1 мМ о-диаминобензидин. вакуолярного фермента было более выраженным.

Полученные электрофореграммы Его активность снижалась в среднем на 50%, тогда

фотографировали с помощью системы DigiDoc-It как активность фермента из экстракта ткани - на

Imaging System (“Bio-Rad”), а также сканировали 25%.

на сканере марки Epson perfection 2480 Photo. Эффективными ингибиторами GR принято

Все эксперименты выполнены в 4-5 считать ароматические нитросоединения.

биологических повторностях, каждая из которых Например, для GR животных организмов в

была представлена тремя аналитическими. На качестве неконкурентного ингибитора довольно

графиках приведены средние арифметические часто используют CDNB (Bilzer et al., 1984). Это

значения и их квадратичные отклонения. соединение подавляло активность GR вакуолей и

RESULTS тканевого экстракта (Рис. 2). Как показали

Определение специфичности результаты дальнейшего исследования, уровень

глутатионредуктазной активности снижения ферментативной активности с CDNB

В вакуолярном содержимом клеток зависел от концентрации GSSG (данные не

корнеплодов столовой свеклы впервые выявили приводятся). С CDNB кинетические параметры

глутатионредуктазную активность. Она оказалась изменялись, происходило снижение максимальной

довольно высокой и при нейтральном pH скорости (Vm) в среднем в 1.5 раза. Следует

реакционной среды почти в 2 раза превосходила отметить, что, несмотря на снижение Vm, сродство

активность GR из тканевого экстракта (Рис. 2). к субстрату оставалось прежним, т.е. значения Km

Предстояло установить специфичность для GSSG практически не изменялись (Табл. 1).

обнаруженной ферментативной активности. Для Графическое выражение полученных величин в

этого применили ряд традиционных подходов, в обратных координатах Лайнуивера-Берка

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

65

Glutathione Reductase of Vacuole...

позволило определить тип взаимоотношений (Boggaram et al., 1978). В наших экспериментах

фермента и ингибитора как неконкурентное активность GR с NADPH и NADH при pH 5.0 также

ингибирование (данные не приводятся). Известно, оказалась одинаковой, в среднем она составляла:

что неконкурентный ингибитор не мешает 5 нмолей NAD^H/мг белка - у вакуолей; 6 нмолей

связыванию субстрата с ферментом. Он способен NAD(P)H /мг белка - у экстрактов ткани (Рис. 3 А,

присоединяться как к свободному ферменту, так и Б).

к фермент-субстратному комплексу с одинаковой Электрофоретическое исследование GR в

эффективностью. Такой ингибитор вызывает PAAG

информационные изменения, которые не Широко применяемый способ идентификации

позволяют ферменту превращать субстрат в ферментативной активности - зимографический

продукт, но не влияют на сродство фермента к метод. Он позволяет выявлять активность

субстрату (Bilzer et a/., 1984). фермента в PAAG после электрофореза,

Зависимость активности GR от pH и природы проводимого при неденатурирующих условиях (так

пиридиннуклеотида называемого нативного электрофореза). Как уже

Флавинсодержащий фермент GR упоминалось выше, применяли два способа

характеризуется выраженной зависимостью от pH- выявления ферментативной активности в PAAG: в

условий. Восстанавливая GSSG, GR в качестве одном случае визуализация проходила с MTT и

субстрата может использовать как NADPH, так и DCPIP (Рис. 4, /); в другом - с DTNB (Рис. 4, //).

NADH. Ферментативная активность с NADPH в Широко используемый метод с MTT и DCPIP не

несколько раз выше, чем с NADH (Vanoni et al., отличался высокой специфичностью. В PAAG

1990). Сродство фермента к пиридиннуклеотидам наряду с активностью GR могла проявляться

определяется условиями pH. Для эффективного активность других NADPH-дегидрогеназ (данные

взаимодействия с NADPH требуются нейтральные не приводятся). В то же время метод с DTNB был

и слабощелочные условия, а с NADH - кислые более специфичным (Levites, 1986). Однако этот

(Shigeoka et al., 1987; Rautenkranz et al., 1994; метод менее популярен так как является довольно

Noctor et al., 2011). Результаты исследования трудоемким. С помощью используемых методов в

показали, что активность GR вакуолей и экстрактов исследуемых образцах выявили по две зоны

тканей с NADPH была намного выше, чем с NADH. активности GR, которые по всей видимости

Оптимумы pH ферментативных реакций с NADPH соответствовали двум изоформам фермента. У

приходились на 7.0-8.0, а с NADH - на 5.0 (Рис. 3 вакуолярного и тканевого экстрактов зоны

А, Б). Ранее обращали внимание на то, что при локализация изоформ GR в PAAG практически

низких значениях pH уровни активности GR с совпадали (Рис. 4). Хорошо были заметны

NADPH и NADH как правило были одинаковыми различия в интенсивности окраски разных

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

66

изоформ (Рис. 4, II). В вакуолярных образцах изоформа с высокой электроподвижностью (Rf 0.47) как правило была выражена слабее, чем изоформа с низкой электроподвижностью (Rf 0.36). Причинами наблюдаемого эффекта могли быть как разная активность изоформ, так и разное их количество в вакуолярном содержимом. У GR экстрактов ткани выраженность аналогичных изоформ (Rf 0.36 и Rf 0.047) была прямо противоположной (Рис. 4, II).

Величины Rf для изоформы GR пекарских дрожжей, которая в этом эксперименте служила контрольным вариантом, составляли: 0.33 - при окраске белка Кумасси R-250 (Рис. 4 а); 0.33-0.36 -при зимографическом определении (Рис. 4 б). Значения Rf одной из изоформ GR вакуолей и тканевого экстракта, отличающихся меньшей электроподвижностью (Rf 0.36), совпадали со значениями Rf для GR пекарских дрожжей.

Figure 1. Активность НАД-малатдегидрогеназы, НАДФ-малатдегидрогеназы и каталазы в PAAG: а - вакуоли, б - тканевой экстракт, к - каталаза из бычьей сыворотки.

ш 60

е;

ш

ю

I 50

х

о.

Q 40 <

л

о 30

5 х

О 20 л

6

X 10

ш

S

н

0

вакуоли

контроль

фурацилин

CDNB

экстракт ткани

Figure 2. Активность глутатионредуктазы (GR) в вакуолях и тканевом экстракте, и ее ингибирование фурацилином (0.1 мг/мл) и CDNB (2 мМ).

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

67

Glutathione Reductase of Vacuole...

А

Figure 3. Изменение активности глутатионредуктазы (GR) в зависимости от pH-условий: А - с

NADPH. Б - с NADH.

метод I метод II Rf

а б в г б в г

Figure 4. Определение активности глутатионредуктазы (GR) в PAAG двумя методами: метод I - с применением MTT и DCPIP; метод II - с DTNB. а - GR пекарских дрожжей, окрашенная Кумасси R-250, служила маркером электроподвижности; б - GR пекарских дрожжей в качестве маркера ферментативной активности; в - активность изоформ GR вакуолей; г -активность изоформ GR экстракта ткани.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

68

Figure 5. Изоэлектрическое фокусирование белков в PAAG (а) с последующим зимографическим окрашиванием c DTNB и (б) иммуноферментным анализом (Вестерн-блоттинг) с антителами на GR пекарских дрожжей. контроль - GR дрожжей. м - маркерные белки.

Table 1. Кинетические параметры глутатионредуктазы

Объект исследования Контроль CDNB

Km, мкМ Vm, мкМ мин-1 Km, мкМ Vm, мкМ мин-1

Вакуоли 16.2±2.9 113.4±18.5 16.3±1.6 78.7±6.9

Экстракт ткани 20.6±4.9 60.9±9.2 21.1±2.9 36.7±6.1

Вестерн-блот анализ

Зимографическое исследование активности фермента в PAAG проводили и после ИЭФ, в ходе которого разделение происходит не по молекулярным массам, а по величинам поверхностного заряда белков (Рис. 5 а). Как видно из рисунка, даже при таком разделении белков также формировались две зоны активности GR. Зоны раздваивались, что являлось особенностью метода ИЭФ. Все выявленные зоны ферментативной активности располагались в области pI ~ 4.0-5.0. После зимографического окрашивания эти же гели использовали для вестерн-блоттинга с антителами, полученными на

GR пекарских дрожжей. Результаты этого анализа подтвердили присутствие в вакуолях GR, которая также как и GR тканевого экстракта была представлена двумя изоформами (Рис. 5 б).

DISCUSSION

В клетках растений глутатион транспортируется в вакуоли в основном в дисульфидной форме (GSSG). Установлено, что скорость переноса GSSG заметно выше скорости переноса GSH (Tommasini et al., 1993; Noctor et al., 2011). Транспорт GSSG в вакуоли может усиливаться при окислительном стрессе (Queval et al., 2011). Высказывалось предположение о важной роли

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

69

Glutathione Reductase of Vacuole...

вакуолей в поддержании редокс-статуса растительных организмов. Ее оптимумы рН

глутатиона в растительной клетке (Tommasini et a/., совпадали с оптимумами рН GR других растений. У

1993). В качестве основного пути метаболизма разных организмов оптимумы рН для GR с NADPH

транспортируемого в вакуоль GSSG рассматривали обычно находятся в пределах 7.0-8.0. Например,

его гидролиз до аминокислот вакуолярными для GR клеток игл сосны

ферментативными системами (Tommasini et a/., оптимальными были рН 7.25-7.75, а эвглены

1993; Zechmann et a/., 2006; Queval et a/., 2011). (Euglena viridis) - pH 8.2 (Shigeoka et al., 1987;

Однако при этом неоднократно отмечали Anderson et al., 1990). Следует отметить, что GR не

преобладание восстановленного пула глутатиона всех организмов взаимодействовали с NADH как с

над окисленным (Noctor et a/., 2011), что могло альтернативным донором электронов. Например,

указывать на другой путь метаболизма, а именно, для GR эвглены донором электронов являлся

на активное восстановление GSSG до GSH. только NADPH (Shigeoka et al., 1987). Тогда как

Главную роль в поддержании восстановленного для GR шпината (Spinacia oleracea L.), дрожжей

пула глутатиона играют специфичные (Saccharomyces cerevisiae) и Escherichia coli при

глутатионредуктазы, имеющие высокое сродство к восстановлении GSSG наряду с NADPH

GSSG и NADPH. В клетках растений GR, т.е. субстратом служил и NADH (Vanoni et al., 1990).

изоформы этого фермента обнаружены в Для GR клеток корнеплодов столовой свеклы, как

цитозоле, пластидах, митохондриях и показали результаты, NADH также являлся

пероксисомах (Noctor et a/., 2011). В вакуолярном альтернативным донором электрона.

содержимом также выявлена Ингибиторный анализ необходим для

глутатионредуктазная активность, однако определения специфичности ферментативных

сведений о ней крайне мало (Rautenkranz et a/., реакций. Как упоминалось выше, для GR не

1994). Известно только то, что в проростках ячменя установлены природные или узко специфичные

(Hordeum vulgare L.) активность GR вакуолей в ингибиторы. Однако показано ингибирующее

несколько раз ниже активности GR хлоропластов и действие некоторых широко используемых

экстрактов ткани (Rautenkranz et al., 1994). Эти соединений. Так для GR животных был установлен

данные не соответствовали данным, полученным неконкурентный тип ингибирования CDNB.

для GR вакуолей клеток корнеплодов столовой Высказывалось предположение, что ингибитор

свеклы, активность которой была довольно связывается с GR в одном из промежуточных

высокой и при определенных условиях состояний, в которое фермент переходит в ходе

превосходила активность GR экстрактов ткани. катализа (Pai, Schulz, 1983; Bilzer et al., 1984).

В целом GR корнеплодов столовой свеклы Также установлено, что CDNB при длительном

практически не отличалась от GR других инкубировании приводит к необратимому

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

70

подавлению фермента. Следует отметить, что аллостерического ингибиторования (Bilzer et al.,

CDNB часто используют в качестве модельного 1984).

субстрата для глутатион^-трансфераз (GST), Специфичность ферментативных реакций

которые катализируют конъюгацию соединения с также подтвердили результаты зимографического

GSH. Ранее в вакуолярном содержимом клеток и иммуноферментного исследования. Локализация

корнеплодов столовой свеклы была обнаружена GR в PAAG практически совпадала с локализацией

GST, проявляющая довольно высокую активность с маркера - GR пекарских дрожжей с молекулярной

CDNB (Pradedova et al., 2010). В водных экстрактах массой 118 кДа. В отличие от GR дрожжей,

вакуолей и тканей из-за участия CDNB в реакциях фермент вакуолей и экстрактов ткани корнеплодов

конъюгации выраженное ингибирующее действие столовой свеклы был представлен двумя

можно было ожидать только при более высоком изоформами. Две изоформы

содержании соединения. Возможно в связи с этим идентифицированы в листьях Pinus strobus

заметный эффект CDNB отмечен при (Anderson et al., 1990). У Arabidopsis thaliana тоже

концентрации 2 мМ. Тогда как на других объектах определены две изоформы GR, кодируемые

показана высокая эффективность CDNB при более аллельными генами (Marty et al., 2009). У Triticum

низких концентрациях. Например, в тех случаях, aestivum две изоформы GR выявлены в листьях,

когда изучали подавление CDNB активности тогда как в корнях оказалось три изоформы

очищенной GR из клеток животных, ингибитор (Yannarelli et al., 2007).

использовали в мкмолярных концентрациях. Так в Значения pI для выявленных в вакуолях

реакционных условиях с 200 мкМ GSSG, 100 мкМ изоформ GR находились в пределах 4.0-5.0.

NADPH и 50 мкМ CDNB активность GR клеток Близкие значения получены для GR других видов

печени крыс снижалась в среднем на 25% (Bilzer et растений, у которых обнаруживали две и более

al., 1984). В наших экспериментах при изоформ этого фермента с pI от 4.1 до 4.9

концентрациях CDNB, которые были на несколько (Edwards et al., 1990; Anderson et al., 1995; Marty et

порядков выше, происходило снижение активности al., 2009). Несмотря на существенные различия в

в среднем на 60%. CDNB является неконкруентным изоферментном составе, для GR разного

ингибитором, он не конкурирует в виде происхождения характерна высокая степень

глутатионового S-конъюгата с GSSG за место гомологии аминокислотной последовательности

связывание в активном центре фермента. Следует апофермента (Contour-Ansel et al., 2006). Кроме

отметить, что эффективная концентрация CDNB (2 того, третичная структура GR, включающая четыре

мМ) значительно превышала внутриклеточную домена, у ферментов разных организмов крайне

концентрацию субстрата GSSG (определяемую в консервативна (Rao, Reddy 2008). Поэтому

мкмолях), обычно это характерно для антитела, полученные для GR дрожжей, оказались

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

71

Glutathione Reductase of Vacuole...

специфичными для GR растительного объекта. Сходство в электроподвижности с GR дрожжей и взаимодействие с антителами, полученными для нее, говорит о том, что вакуолярные изоформы GR близки по третичной структуре к изоформе GR дрожжей.

В целом результаты ингибиторного, зимографического и иммуноферментного анализа подтвердили присутствие GR в вакуолях. Фермент вакуолярной локализации при определенных условия способен довольно эффективно восстанавливать GSSG до GSH. По всей видимости, транспортируемый в вакуоль GSSG не просто депонируется в этом компартменте, а после восстановления вовлекается во внутривакуолярные метаболические процессы.

ACKNOWLEDGMENT

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Правительства Иркутской области, проект № 14-4404059 р_сибирь_а.

REFERENCES

Abhilash P.C., Jamil S., Singh N. (2009) Transgenic plants for enhanced biodegradation and phytoremediation of organic xenobiotics. Biotechnology Advances, 27, 474-488.

Anderson J.V., Hess J.L., Chevone B. (1990) Purification, Characterization, and Immunological Properties for Two Isoforms of Glutathione Reductase from Eastern White Pine Needles. Plant Physiol., 94, 1402-1409.

Aravind P., Narasimha M., Prasad V.

Modulation of cadmium-induced oxidative stress in Ceratophyllum demersum by zinc involves ascorbate-glutathione cycle and glutathione metabolism. Plant Physiol. Biochem., 43, 107116.

Bilzer M., Krauth-Siegel R.L., Schirmer R.H., Akerboom T.P.M., Sies H., Schulz G.E. (1984) Interaction of a glutathione S-conjugate with glutathione reductase Kinetic and X-ray crystallographic studies. Eur. J. Biochem., 138, 373-378.

Boggaram V., Larson K., Mannervik B. (1978) Characterization of glutathione reductase from porcine erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta, 527, 337-347.

Bradford M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Protein Utilising the Principal of Protein-dye Binding. Anal. Biochem., 72, 248254.

Buzard J.A., Kopko F. (1963) The Flavin Requirement and Some Inhibition Characteristicsof Rat Tissue Glutathione Reductase. J. of Biol. Chemistry, 238, 464-468.

Carlberg I., Mannervik B. (1985) Glutathione reductase. Methods Enzymol. 113, 484-490.

Catty D. (1988) Antibodies, Volume 1: A practical approach. D. Catty (ed), IRL Press: Oxford and Washington, 203 p.

Dixon D.P., Cummins I., Cole D.J., Edwards R. (1998) Glutathione-mediated detoxification systems in plants. Current Opinion in Plant Biology., 1, 258266.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

Pradedova et al.

72

Edwards G.E., Nakamoto H., Bunell J.N., Hatch M.D. (1985) Pyruvate, Pi dikinase and NADP-malate dehydrogenase in C4 photosynthesis: properties and mechanism of light/dark regulation. Annu. Rev. Plant Physiol., 36, 255-286.

Edwards E.A., Rawsthorne S., Mullineaux P.M. (1990) Subcellular distribution of multiple forms of glutathione reduetase in leaves of pea (Pisum sativum L.). Planta, 180, 278-284.

Gaal O., Medgyesi G.A., Vereczkey L. (1980) Electrophoresis in the separation of biological macromolecules. New York: John Wiley & Sons Ltd, 422 p.

Kulinskiy V.I., Kolesnichenko L.S. (2009) System of glutathione I. Synthesis, transport, glutathione transferase, glutathione peroxidase. Biomedical Chemistry, 55, 255-277.

Levites E.V. (1986) Genetics of plant isozymes. Nauka: Sibir. Dep., 144 p.

Marty L., Siala W., Schwarzlander M., Fricker M.D., Wirtz M., Sweetlove L.J., Meyer Y., Meyer A.J., Reichheld J.P., Hell R. (2009) The NADPH-dependent thioredoxin system constitutes a functional backup for cytosolic glutathione reductase in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 106, 9109-9114.

Noctor G., Queval G., Mhamdi A. Chaouch S., Foyer C.H. (2011) Glutathione. The Arabidopsis Book. Published By: The American Society of Plant Biologists 9, 2-32. URL:

http://www.bioone.org/doi/full/10.1199/tab.0142

Pai E.F., Schulz G.E. (1983) The catalytic mechanism

of glutathione reductase as derived from X-ray diffraction analyses of reaction intermediates. J. Biol. Chem., 258, 1752-1757.

Pradedova E.V., Tolpygina O.A., Isheeva O.D., Putilina T.E., Salyaev R.K. (2010) Glutathione and glutathione-S-transferase activities of the vacuoles of the beet roots (Beta vulgaris L.). Doklady Biological Sciences, 433, 275-278.

Queval G., Jaillard D., Zechmann B., Noctor G. (2011) Increased intracellular H2O2 availability

preferentially drives glutathione accumulation in vacuoles and chloroplasts. Plant Cell and Environ., 34, 21-32.

Rao C., Reddy A.R. (2008) Glutathione reductase: a putative redox regulatory system in plant cells / Sulfur assimilation and abiotic stress in plants. N.A. Khan, S. Singh, S. Umar (ed). The Netherlands: Springer-Verlag,111-147.

Rautenkranz A.F., Li L., Machler F., Martinoia E., Oertli J. J. (1994) Transport of Ascorbic and Dehydroascorbic Acids across Protoplast and Vacuole Membranes Isolated from Barley (Hordeum vulgare l. cv Gerbel) Leaves. Plant Physiol., 106, 187-193.

Righetti P.G. (1983). Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications. Elsevier: Amsterdam, 385 c.

Salyaev R.K., Kuzevanov V.Y., Khaptogaev S.B. and Kopytchuk V.N. (1981) Isolation and purification of vacuoles and vacuolar membranes from plant cells. Russ. J. Plant Physiol., 25, 1295-1305.

Shigeoka S., Onishi T., Nakano Y. and Kitaoka S.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016

73

Glutathione Reductase of Vacuole...

(1987) Characterization and physiological function of glutathione reductase in Euglena gracilisz. Biochem. J, 242, 511-515.

Tommasini R., Martinoia E., Grill E., Dietz K.J. and Amrhein N. (1993) Transport of oxidized glutathione into barley vacuoles: evidence for the involvement of the glutathione-S-conjugate ATPase. Zeitschrift Naturforsch., 48, 867-871.

Vanoni M.A., Wong K.K., Ballou D.P. and Blanchard J.S. (1990) Glutathione reductase: comparison of steady-state and rapid reaction primary kinetic isotope effects exhibited by the yeast, spinach,

and Escherichia coli enzymes. Biochemistry, 29, 5790-5796.

Yannarelli G.G., Fernandez-Alvarez A.J., Santa-Cruz D.M. and Tomaro M.L. (2007) Glutathione reductase activity and isoforms in leaves and roots of wheat plants subjected to cadmium stress. Phytochemistry, 68, 505-512

Zechmann B., Zellnig G. and Muller M. (2006) Immunocytochemical localization of glutathione precursors in plant cells. J. Electron Microscopy, 55, 173-181.

JOURNAL OF STRESS PHYSIOLOGY & BIOCHEMISTRY Vol. 12 No. 1 2016