СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ НЕЙРОТОКСИЧНОСТИ С ПОМОЩЬЮ КОМПЛЕКСА ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ И АНТИМИКРОБНЫХ ПРЕПАРАТОВ
METHOD FOR MODELING DRUG NEUROTOXICITY USING COMPLEX OF ANTI-TUBERCULOSIS AND ANTIMICROBIAL DRUGS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к экспериментальной медицине и фармакологии и может быть использовано для изучения токсического действия лекарственных препаратов на центральную и периферическую нервную систему, для оценки нейропротекторов на этапе доклинических исследований, изучения механизмов их действия и в разработке новых способов лечения.
Уровень техники
Нейротоксичность можно определить, как свойство токсического агента действовать на центральную нервную систему (ЦНС), вызывая повреждение ее структуры и нарушение функционирования [Куценко С.А. Основы токсикологии. - СПб.: Фолиант, 2004.-715]. Токсический процесс может быть основан на любом изменении энергетического обмена, нарушении формирования или проведения нервного импульса, повреждении мембран клеток и синапсов. Проявления нейротоксических процессов возможны в разной форме: нарушения моторной, сенсорной, когнитивной функций, эмоционального статуса [Великородная, Ю. И., Мамулайшвили Н. И., Почепцов А. Я. Нейротоксические эффекты в центральной нервной системе при хронической интоксикации фосфорорганическими соединениями (экспериментальное исследование) // Вестник ВолГМУ. - 2013. - № 3(47). – С 56-61]. Экспериментальные модели токсического поражения ЦНС широко используются для изучения механизмов формирования патологических процессов, выяснения роли различных факторов внешней и внутренней среды в развитии нейротоксичности , дают возможность изыскать средства для рационального терапевтического вмешательства и профилактики. Методы исследования поведенческих реакции следует рассматривать в качестве интегральных показателей состояния организма, а при выраженном нейротоксическом действии - в качестве чувствительных специфических тестов.
Чаще всего для моделирования острой и хронической нейротоксичности используют различные токсиканты [Мажитова М.В., Ломтева Н.А., Теплый Д.Л., Тризно Н.Н., Кондратенко Е.И. Влияние сероводородсодержащего газа на поведенческие реакции белых крыс// Известия Самарского научного центра Российской академии наук, т. 11, №1(5), 2009, 988- 990; Касенов, Б. Ж. Балабекова М. К., Ахмедшина Д. А., Трубачев В. В.  Способность к обучению у крыс при отравлении свинцом и кадмием [Электронный ресурс] / Б. Ж. Касенов, // Современные проблемы науки и образования. -2016. - № 2. Режим доступа: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=24443; Кострова Т. А. Биохимические и поведенческие показатели в отдаленный период после острых отравлений нейротоксикантами и их фармакологическая коррекция (экспериментальное исследование). Автореф. дисс. к.м. н.,- Санкт-Петербург 2020; Якимова Н.Л., Титов Е.А. Изменения поведенческих и морфологических показателей у крыс при свинцовой интоксикации, отягощенной лекарственным гипотиреозом // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. 2021. № 1. С. 89–96.;] или лекарственные препараты депримирующего действия [Лапина Н. В Кашуро В. А., Батоцыренова Е. Г. и др.. Экспериментальное моделирование последствий тяжелых острых отравлений веществами депримирующего действия // Актуальные проблемы диагностики, профилактики и лечения профессионально обусловленных заболеваний : материалы IV Всероссийской науч.-прак. конф., 18-20 окт. 2016 г. - Сочи, 2016. -С.295-297.]
Однако нейротоксичность как нежелательное явление нередко возникает при использовании многих лекарственных препаратов, применяемых в терапевтических дозах, особенно в условиях длительного и комплексного применения.
изониазида,
этамбутола
аминогликозидами,
Для лекарственных препаратов, применяемых для лечения туберкулеза, применяемых длительно и обязательно комплексно, характерен весь спектр нейротоксических реакций, которые могут проявляться в форме нарушений моторных, сенсорных функций, интегративных функций мозга и эмоционального статуса (Kass J.S., Shandera W.X. Nervous system effects of antituberculosis therapy.// CNS Drugs. 2010 Aug;24(8):655-67). Наиболее часто поражение нервной системы у впервые выявленных больных туберкулезом  регистрируют при приеме  которые могут проявляться головной болью, головокружением, нарушением сна, невритом или атрофией зрительного нерва, периферическими полиневритами, мышечными подергиваниями и судорогами [Тюлькова Т. Е. Влияние пиридоксина и препаратов гидразида изоникотиновой кислоты на нервную систему при лечении туберкулеза // Туберкулёз и болезни лёгких. – 2018. – Т. 96, № 11. – С. 69-73]. Оптическая нейропатия является известным нейротоксическим проявлением  [Rezaei N.J., Bazzazi A.M., Naseri Alavi S.A. Neurotoxicity of the antibiotics: A comprehensive study. Neurol India 2018;66:1732-40]. Наиболее распространенным нейротоксическим эффектом, связанным с является ототоксичность и вестибулотоксичность [Вавилова А.А., Кочергин Г.А. К вопросу о вестибулотоксическом действии антибиотиков-аминогликозидов // РМЖ.-. 2017. № 6. С. 435–438].
Современная тенденция химиотерапии больных туберкулезом органов дыхания, при наличии множественной или широкой лекарственной устойчивости возбудителя, направлена на формирование краткосрочных, полностью пероральных режимов лечения, основанных на применении комбинаций наиболее эффективных препаратов: фторхинолонов (моксифлоксацин, левофлоксацин), бедаквилина, линезолида в сочетании с резервными и новыми (деламанид, клофазимин) ПТП и некоторыми антимикробными препаратами.
циклосерина
фторхинолонами
Линезолид
Нейротоксичность может проявляться нарушением зрения, полиневритами, головной болью, головокружением, нарушением сна, дизартрией, нарушением ориентации, сопровождающееся потерей памяти, психозом, приступами клонических судорог [Jain M., Lewis C., Moriarty M., Hussain S. Neuropsychiatric toxicity of cycloserine in multidrug-resistant tuberculosis patient with reversible MRI changes. Am J Respir Crit Care Med.- 2016-19(4): 417-19]. Кроме ототоксичности известны периферическая невропатия, энцефалопатия, а также нервно-мышечная блокада [Grill M.F., Maganti R.K. Neurotoxic effects associated with antibiotic use: Management considerations. Br J Clin Pharmacol 2011;72:381-93]. Побочные эффекты со стороны ЦНС, вызываемые , такие как бессонница, головная боль, головокружение, нервозность и беспокойство за последнее десятилетие уступили место психическим нарушениям (расстройства внимания, дезориентация, ажитация, нервозность, снижение памяти, бред, эпилептические приступы) [Sowell R.S., Pinner N. A. Quinolone Neurotoxicity: How to Avoid or Minimize the Risk//Patient Care/-2009 v 49 August 17]. может вызывать нейротоксичность в виде энцефалопатии, периферической невропатии, оптической невропатии, паралича Белла [Fletcher J., Aykroyd L.E., Feucht E.C., Curtis J.M. Early onset probable linezolid-induced encephalopathy. J Neurology 2010;257:433-5]. По потенциалу периферического нейротоксического действия линезолид уступает лишь изониазиду [Иванова Д.А., Заруди Ж.Х., Иванова Т.И. Периферическая полиневропатия на фоне противотуберкулезной химиотерапии //Туберкулёз и социально значимые заболевания. - 2014.-№3.-С.58-64].
Частота и проявление нейротоксических реакций у больных туберкулезом во многом зависит от схемы химиотерапии [Степанова Н.А., Стрельцова Е.Н., Галимзянов Х.М., Кантемирова Б.И. Нежелательные побочные реакции на противотуберкулезные препараты основного ряда// Туберкулез и болезни лёгких.- 2016.- Том 94, № 5.-С.42-45] Известно, что у впервые выявленных больных туберкулезом, получавших лечение по режиму химиотерапии, включающему изониазид, рифампицин, этамбутол, пиразинамид, нежелательные побочные реакции со стороны нервной системы проявлялись в виде головных болей у 26,3% или в виде расстройства сна у 18,4%. При лечении больных с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя по схемам с включением фторхинолонов, циклосерина и других резервных препаратов, неврологические побочные реакции встречались почти у каждого второго пациента (50,8%) [Щегерцов Д. Ю., Филинюк О. В., Буйнова Л. Н., Земляная Н. А., Кабанец Н. Н., Аллилуев А. С. Нежелательные побочные реакции при лечении больных туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя // Туберкулёз и болезни лёгких. – 2018. – Т. 96, № 3 – С. 35-43]. Нарушение сна (64,9%) и головная боль (32,0%) были наиболее частыми неврологическими нарушениями. Депрессивные расстройства, выражающиеся в виде тревоги (39,6%) и подавленности (22,1%), встречались почти у каждого третьего пациента. При включении в схемы лечения линезолида, преобладали нейротоксические реакции в виде периферического неврита и зрительного неврита [Singla R., Caminero J.A., Jaiswal A., Singla N., Gupta S., Bali R.K, Behera D. Linezolid: an effective, safe and cheap drug for patients failing multidrug-resistant tuberculosis treatment in India//Eur Respir J. 2012 Apr;39(4):956-62]. При развитии нейротоксических реакций у больных туберкулезом возникает необходимость отмены ответственного за нейротоксичность препарата или снижение его дозы, что может негативно сказаться на эффективности лечения, или применение нейрокорректоров.
Учитывая высокую частоту развития нейротоксичности у больных туберкулезом (от 41 до 48%), актуальна профилактика ее с подбором эффективных препаратов и схем лечения на экспериментальных моделях.
Наиболее близкими по совокупности существенных признаков к заявляемому изобретению являются следующие способы моделирования и изучения нейротоксичности.
3
Известен способ моделирования, заключающийся в том, что крысам в течение 1,5 мес ингаляторно по 4 часа в день вводили сероводородсодержащий газ в дозе 150 мг/м(Мажитова М.В., Ломтева Н.А., Теплый Д.Л., Тризно Н.Н., Кондратенко Е.И. Влияние сероводородсодержащего газа на поведенческие реакции белых крыс//Известия Самарского научного центра Российской академии наук.-2009.-Т.11,№1(5).-С.988-990). Сероводородсодержащий газ обладает выраженным нейротоксическим действием для человека. Целью исследования было изучение проявления нейротоксичности газа для крыс в тесте «Открытое поле» и возможность коррекции антиоксидантами. Использование этого способа позволило выявить половые различия в поведенческих реакциях под действием сероводородсодержащего газа. Показано лишь частичное восстановление параметров под действием различных антиоксидантов. Недостатком данного способа является использование токсиканта и достаточно длительный период моделирования (1,5 месяца введения сероводородсодержащего газа).
Известно моделирование нейродегенеративных изменений, вызванных свинцовой интоксикацией в сочетании с тирозоловым гипотиреозом у крыс и изучение поведенческих реакций у крыс по тесту «открытое поле» активности (Якимова Н.Л., Титов Е.А. Изменения поведенческих и морфологических показателей у крыс при свинцовой интоксикации, отягощенной лекарственным гипотиреозом // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях.- 2021. № 1.- 89-96). Свинцовую интоксикацию вызывали ацетатом свинца в дозе 60 мг/кг массы тела в поилках с питьевой водой ежедневно в течение 30 сут. В условиях сочетанного действия свинца и тиреостатика тирозола выявлено преобладание необратимых нейродегенеративных процессов в мозге крыс, снижение исследовательской и локомоторной. Недостатком данного способа является использование нейротоксиканта- свинца и длительный период создания свинцовой интоксикации (30 суток).
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа моделирования нейротоксичности, наиболее полно отражающего лекарственную токсическую этиологию и патогенез развития в короткие сроки (до 2-х недель) и минимальной общей токсичностью для лабораторных животных.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка простого в исполнении, отличающегося хорошей воспроизводимостью, отсутствием летального исхода у экспериментальных животных способа моделирования нейротоксичности с помощью комплекса препаратов с противотуберкулезной активностью, используемых в терапевтических дозах. Заявляемый способ позволяет в короткие сроки (2 недели) и с минимальной общей токсичностью (отсутствие отрицательного влияния на динамику массы тела и пищевое поведение) для лабораторных животных создать модель нейротоксичности.
Технический результат достигается способом моделирования медикаментозной нейротоксичности заключающийся в том, что животным ежедневно в течение 14 дней вводят комплекс противотуберкулезных препаратов - моксифлоксацина, линезолида, циклосерина и протионамида, при этом для моделирования использовали самок крыс в возрасте 10-12 мес. и массой 330-350 г. Препараты - моксифлоксацин, линезолид, циклосерин, протионамид вводят внутрижелудочно в 0,1% крахмальном геле в следующих дозах моксифлоксацин - 36 мг/кг, линезолид - 54 мг/кг, протионамид - 90 мг/кг, циклосерин - 90 мг/кг. При этом препараты вводят практически одновременно.
Способ позволяет получить экспериментальную модель нейротоксичности медикаментозного генеза с помощью комплекса противотуберкулезных препаратов. Предложенный способ прост в исполнении, отличается хорошей воспроизводимостью, отсутствием летального исхода у экспериментальных животных.
Осуществление изобретения
Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 18 до 25ºC.
Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.
Способ позволяет приблизить к клиническому течению данной патологии у больных лекарственно-устойчивым туберкулезом органов дыхания, нуждающихся в лечении комбинациями из противотуберкулезных и антимикробных препаратов в краткосрочных, полностью пероральных схемах, включающих фторхинолоны, линезолид, бедаквилин, циклосерин и другие резервные препараты, и создать модель нейротоксичности в короткие сроки.
Нейротоксичность у крыс исследуется в тесте «Открытое поле», который является интегральным показателем изменения поведенческих реакций. Оцениваются: двигательная активность животного, которая может служить объективным показателем возбудимости ЦНС; исследовательская активность, груминг и вегетативные функции (дефекация, уринизация), по которым можно судить о чувстве страха и тревожности.
Способ представляет собой введение лабораторному животному (крыса) комплекса препаратов, который обладает выраженным потенциалом нейротоксичности. Комплексная схема представляет собой сочетание препаратов с различными механизмами нейротоксического действия, а именно, ингибирование рецепторов ГАМК или активации возбуждающих NMDA рецепторов в случае действия фторхинолонов, или ингибированием фермента МАО при применении линезолида и т.д.
Одномоментно внутрижелудочно вводили моксифлоксацин + линезолид + циклосерин + протионамид (Mxf+ Lzd+ Cs+ Pto). Дозы препаратов соответствуют терапевтическим дозам для человека. До начала введения комплекса препаратов крыс помещали в прибор «открытое поле» и оценивали их исходные поведенческие реакции. Подсчитывали количество пересеченных квадратов и вертикальных стоек, которые характеризуют двигательную активность; количество заглядывания в норки как показатель исследовательской активности; груминг (почесывание носа, умывание), количество актов дефекации и уринизации, отвечающие за чувство страха и тревожности. Через 14 дней непрерывного введения комплекса препаратов поведенческие реакции оценивали повторно и анализировали их отклонения от исходных показателей.
Использовали 30 нелинейных самок крыс массой 330-350 г в возрасте 10-12 мес. Для создания модели животные были поровну распределены на 3 группы случайным образом без подбора по типу возбудимости и получали комбинации препаратов, обладающих различными профилями безопасности, которые могут использоваться для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя. В 1 группе крысы получали комбинацию моксифлоксацин + линезолид + циклосерин + протионамид (Mxf+ Lzd+ Cs+ Pto), в которой все препараты имеют нейротоксичный потенциал. Во 2 группе комбинация составлена из моксифлоксацин + бедаквилин + циклосерин + пиразинамид  (Mxf + Bdq + Cs+ Z). В 3 группе крысы получали комбинацию бедаквилин + линезолид + клофазимин + пиразинамид (Bdq + Lzd + Cfz + Z). Все препараты вводили внутрижелудочно в 0,1% крахмальной взвеси одномоментно ежедневно в течение 14 дней. Дозы препаратов: моксифлоксацин-36 мг/кг; бедаквилин -36 мг/кг; циклосерин - 90 мг/кг; пиразинамид - 225 мг/кг; протионамид - 90 мг/кг; клофазимин – 27 мг/кг- соответствовали терапевтическим дозам для человека.
Комплексы препаратов готовили ex tempore следующим образом: таблетку каждого препарата тщательно растирали в фарфоровых ступках и добавляли необходимый объем 0,1% крахмального геля с тем, чтобы нужное количество препарата содержалось в 0,5 мл крахмальной взвеси. Непосредственно перед введением все препараты набирали в один шприц и одномоментно в общем объеме 2 мл вводили в желудок крысе. Через 14 дней всех крыс выводили из эксперимента, предварительно проведя исследование в «открытом поле».
Критериями оценки нейротоксичности являлись: клиническая картина интоксикации, динамика массы тела, результаты исследования поведенческих реакций. Поведенческие реакции оценивали в тесте «Открытое поле» в установке для больших крыс с видеонаблюдением (модификация А.Л. Маркеля). В течение 3 мин фиксировали количество пересеченных квадратов и стоек, что характеризует горизонтальную и вертикальную активность, заглядываний в норки (исследовательская активность), количество грумингов (умываний, почесываний), физиологические отправления (количество дефекаций и уринизаций). Статистическую значимость различий оценивали с помощью дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса
Результаты исследования
.
Животные всех групп в течение всего периода исследования удовлетворительно переносили манипуляции, отрицательного влияния на динамику массы тела не наблюдали.
Результаты исследования в «открытом поле» представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Показатели поведенческих реакций у крыс опытных групп до (исходные) и после окончания введения комбинаций препаратов (через 14 суток)
Группа/Показатели
Пересеченные квадраты
Стойки
Заглядывания в норки
Груминг
Дефекации
Уринизации
1, исходные1, через 14 суток
41,6±5,5928,1±3,0
8,1±1,717,5±1,13
5,2±1,241,0±0,26
1,7±0,650,6±0,22
1,0±0,671,5±0,6
0,7±0,210,7±0,21
2, исходные2, через 14 суток
41,4±3,6633,0±5,09
11,2±1,7511,2±1,79
5,0±0,783,4±0,69
3,8±0,830,4±0,16
0,2±0,20,7±0,34
0,6±0,270,5±0,17
3,исходные3, через 14 суток
32,8±5,028,7±5,74
11,6±2,139,0±1,95
2,9±0,812,9±1,08
4,3±1,170,4±0,16
0,5±0,310,7±0,21
1,8±0,771,3±0,16
Во 1 группе крыс, получавших комбинацию Mxf+ Lzd+ Cs+ Pto, наблюдали значительное ограничение горизонтальной двигательной активности на 47,6% по сравнению с исходными показателями, резкое снижение (в 5 раз) исследовательской активности и в 2,8 раза уменьшение количества грумингов, что свидетельствует об эмоциональном угнетении. Частота физиологических отправлений не изменилась или даже увеличилась (дефекации), что говорит об отсутствии чувства страха у животных. В 2 группе, у крыс, получавших комбинацию Mxf + Bdq + Cs+ Z, снижение горизонтальной активности было незначительным (на 20,3% по сравнению с исходными значениями), в 1,5 раза снизилась исследовательская активность, и резко (в 9,5 раз) уменьшилось количество грумингов. У крыс не наблюдалось угнетения физиологических отправлений. В 3 группе крыс, получавших комбинацию Bdq + Lzd + Cfz + Z, наблюдалось выраженное эмоциональное угнетение : количество грумингов более, чем в 10 раз было меньше, по сравнению с исходными данными у этих животных. Изменения других показателей (локомоция, исследовательская реакция, физиологические отправления) были несущественными.
Вывод: у крыс 1 группы наблюдалось снижение двигательной и исследовательской активности и эмоциональное угнетение, что позволяет сделать вывод о более выраженном нейротоксическом эффекте комбинации Mxf + Lzd + Cs+ Pto.
Таким образом, проведенные исследования позволили получить экспериментальную модель нейротоксичности, в основе которой лежит комплексное сочетание нейротоксических потенциалов противотуберкулезных препаратов разного механизма действия.