СПОСОБ ГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ СОЗРЕВАНИЯ МЯСА
METHOD OF HISTOLOGICAL ASSESSING MEAT MATURING DEGREE

Изобретение относится к области прикладной биотехнологии, в частности к способу гистологической оценки степени созревания мяса всех видов убойных животных и птицы, и может быть использовано при определении автолитических изменений в мясе.
Известны следующие методы, позволяющие определить степень созревания мяса: органолептические (оценка вареного мяса и бульона); физико-химические (концентрация ионов водорода - pH, содержание гликогена, глюкозы, молочной кислоты, АТФ, определение активности протеолитических ферментов); функционально-технологические (влагосвязывающая способность); структурно-механические (усилие резания) (Антипова, Л.В. Методы исследования мяса и мясных продуктов / Л.В. Антипова, И.А. Глотова, И.А. Рогов // М.: Колос, 2001. - 376 с. ).
Недостатками этих методов является то, что определение одного показателя не дает полной картины автолиза и не может служить достаточным критерием степени созревания мяса. Для выполнения достаточного для объективной оценки комплекса методов требуются дорогостоящие реактивы, необходима трудоемкая подготовка проб, связанная с измельчением и экстрагированием. В результате смешивания мы получаем усредненное представление об изменениях в мышцах.
По сравнению с этими методами более высокой достоверностью и наглядностью отличается гистологическое исследование мяса. Кроме того, оценка микроструктурных показателей мяса позволяет также определить пригодность его к хранению и транспортировке, обоснованно решать вопрос о сроках его реализации и рациональном использовании, определить фальсификацию и степень доброкачественности при разногласиях в санитарной оценке, не допускать потерь ценного белкового продукта (Морфологические исследования в ветеринарных лабораториях: Методическое руководство. Москва: МСХ РФ, Департамент ветеринарии, 2003. С. 69-70).
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятый авторами за прототип является способ гистологического исследования при разногласиях в определении свежести мяса, а также степени его созревания, включающий отбор образца исследуемого мяса, фиксации их обычным (в 20%-ном водном растворе нейтрального формалина) или ускоренным (подогрев проб до кипения в 10%-ном растворе нейтрального формалина), промывании кусочков проточной водой, получении срезов толщиной 15-30 мкм на замораживающем микротоме, наклеивании срезов на предметное стекло, окраски их гематоксилином и эозином. Подготовленные гистологические препараты рассматривают под микроскопом. Степень созревания мяса определяют по интенсивности автолитического распада мышечных волокон на фрагменты, разволокнению фрагментов на микрофибриллы и их распаду в виде зернистой массы, заключенной в эндомизий, сохранению способности к окраске составных элементов волокна (ГОСТ 19496-2013, Мясо и мясные продукты, Метод гистологического исследования, М., Стандартинформ, 2014).
Недостатком данного способа является необходимость получения гистологических срезов с помощью дорогостоящего прибора - замораживающего микротома, низкое качество полученных срезов (толщина более 15 мкм, плохая сохранность структуры мышц), сложность гистологической оценки структуры мышечных волокон в полученных срезах и недостаточная точность полученных результатов вследствие разрушения мышечных волокон при резке их на микротоме.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа гистологической оценки степени созревания мяса, обладающего высокой точностью результатов и простотой обработки проб без использования замораживающего микротома. При этом толщина мазков будет равняться толщине мышечных волокон. Последние будут сохраняться на всем их протяжении, что является идеальным для оценки микроструктуры.
Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к повышению точности оценки и простоте обработки проб.
Технический результат достигается с помощью способа гистологической оценки степени созревания мяса, включающего приготовление пробы и ее исследование. Причем пробу готовят путем щелочной диссоциации фиксированных в формалине кусочков мышц, разделения мышечных волокон путем встряхивания, изготовления мазков и окраски их гистологическими красителями с последующей оценкой степени созревания мяса по микроструктуре миофибрилл. При этом фиксацию кусочков мышц размером 0,3*0,3*0,3 см проводят в 10%-ном водном растворе формалина в течение 12-24 часов. Затем кусочки инкубируют в 40-50%-ном растворе щелочи КОН в течение 18-24 часов, переносят в большой объем дистиллированной воды и выдерживают в холодильнике 40-50 часов. Полученную в результате щелочной диссоциации взвесь мышечных волокон сливают в чашку Петри и интенсивно встряхивают для окончательного разделения мышц на отдельные волокна, из которых готовят мазки, высушивают их на воздухе, и после окрашивания гистологическими красителями оценивают целостность мышечных волокон, их фрагментацию, сохранение клеточных ядер, наличие поперечной и продольной исчерченности.
Первый этап созревания мяса характеризуется тем, что в мазках обнаруживаются поперечно-щелевидные нарушения целостности или фрагментация отдельных мышечных волокон при сохранении во фрагментах структуры ядер, поперечной и продольной исчерченности. Второй этап созревания мяса отличается тем, что в мазках обнаруживаются множественные поперечно-щелевидные нарушения целостности или фрагментация многих мышечных волокон при сохранении в фрагментах структуры ядер, поперечной и продольной исчерченности. Для третьего этапа созревания мяса характерен распад отдельных фрагментов на миофибриллы, а миофибрилл - на саркомеры в виде зернистой массы, заключенной в эндомизий. Ядра, поперечная и продольная исчерченность практически не выявляются.
Пример конкретного осуществления способа гистологической оценки степени созревания мяса.
Исследовали автолитические изменения в мышцах индеек, кур-несушек, лошадей и крупного рогатого скота. Изучали изменения гистоструктуры при охлаждении и хранении мяса. Для гистологического исследования отбирали пробы через определенные промежутки времени. Пробы размером 0,3*0,3*0,3 см фиксировали в 10%-ном водном растворе формалина в течение 12-24 часов. Затем кусочки инкубировали в 40-50%-ном растворе щелочи КОН в течение 18-24 часов, переносили в большой объем дистиллированной воды и выдерживали в холодильнике 40-50 часов. Полученную в результате щелочной диссоциации взвесь мышечных волокон сливали в чашку Петри и интенсивно встряхивали для окончательного разделения мышц на отдельные волокна, из которых готовили мазки, высушивали их на воздухе. После окрашивания мазков гематоксилином и эозином оценивали целостность мышечных волокон, их фрагментацию, сохранение клеточных ядер, наличие поперечной и продольной исчерченности.
У индеек через 15 мин после убоя мышечные волокна находятся в расслабленном состоянии. Они прямые, ровные с отчетливо выраженной поперечной исчерченностью. Мышечные волокна грудной мышцы отличаются большим диаметром по сравнению с мышцей бедра. Через 2 ч мышечные волокна набухают, что подтверждается увеличением их диаметра. Поперечная исчерченность на отдельных участках сохраняется и наиболее выражена в бедренной мышце. Исчезновение поперечной исчерченности мышечных волокон - характерная черта развивающегося автолиза. После 4 ч хранения мышечные волокна утолщаются, их границы приобретают менее отчетливые формы. Большинство мышечных волокон грудной мышцы принимают слабозаметную волнообразную конфигурацию. Ядра имеют нечеткую форму. Это означает, что в грудной мышце протекает более интенсивный гликолиз. При последующем хранении (6 ч) форма мышечных волокон грудной мышцы принимает вид изогнутой волнистой линии. Мышечные волокна в образце бедренной мышцы имеют участки с гомогенизацией. При созревании мяса (8 ч) в грудной мышце отмечаются гомогенизированные участки, в бедренной мышце - утолщения и сжатия мышечных волокон, с которыми сливается эндомизий. Это свидетельствует об окоченении мышц. Хранение мяса в течение 10 ч приводит к набуханию мышечных волокон, границы между ними неясные. Через 12 ч толщина мышечных волокон уменьшается, что связано с распадом актиномиозинового комплекса и разрешением посмертного окоченения. Через 24 ч после убоя в образцах отмечается деструкция миофибрилл на отдельные саркомеры в виде зернистой массы, отмечаются разрывы и трещины. Такие изменения структуры происходят обычно на стадии созревания мяса, когда увеличивается нежность, улучшается вкус и аромат мяса.
В результате исследований диаметра мышечных волокон в мясе индейки установлено, что их наибольшие значения были в период максимального окоченения мышц: через 6 ч - для грудной мышцы и 8 ч - для бедренной мышцы. Таким образом, в результате экспериментальных исследований установлено, что мясо индеек отличается от других видов мяса птицы скоростью протекания автолитических процессов. При идентичном характере автолитических изменений в грудных мышцах, по сравнению с бедренными, отмечается более ранний и глубокий гликолиз, что отражается на качестве мяса. Выявленные особенности автолиза указывают на необходимость дифференцированного подхода к возможным срокам использования отдельных участков тушки индейки при производстве мясных продуктов.
У кур-несушек через 30 минут после убоя в грудных мышцах наблюдается переход от посмертного расслабления к посмертному окоченению. Через 1 ч происходит уменьшение длины саркомеров, т.е. к переход к более выраженному и распространенному сокращению актиномиозинового комплекса. Через 2 ч после убоя в грудных мышцах кур происходит комплекс структурных изменений характерных для посмертного окоченения. В бедренных мышцах в это время отмечается нарастание проявлений посмертного окоченения с сокращением и укорочением саркомеров. Через 4 ч после убоя волокна грудных мышц кур имеют преимущественно выпрямленную форму. Таким образом, использование мяса кур-несушек возможно уже спустя 4-6 ч после убоя, т.к. к этому времени завершается посмертное окоченение, а в дальнейшем будет происходить созревание мяса.
В парной конине мышечные волокна находятся в расслабленном состоянии: они набухают с отчетливо выраженной поперечной исчерченностью, продольная же исчерченность сглажена. Ядра имеют вытянутую палочковидную и зернисто-глыбчатую структуру хроматина. Через 8 ч после убоя большинство мышечных волокон становятся прямыми или обретают слабо заметную волнообразную конфигурацию. После 24 ч хранения конфигурация мышечных волокон приобретает извитые очертания, поперечная исчерченность сохраняется только в четырехглавой бедренной мышце. Это означает, что в длиннейшей мышце спины протекает более интенсивный гликолиз. На 2-е сутки хранения волнообразную конфигурацию приобретают мышечные волокна четырехглавой бедренной мышцы. На 4-е сутки после убоя мышечные волокна набухают, поперечная исчерченность сглаживается, проявляется продольная фибриллярность. Ядра становятся овальными, различимо определяется структура хроматина. На 7-е сутки хранения поперечная и продольная исчерченность становится незаметной, ядра нечеткие, хроматиновая структура в них не просматривается. На некоторых волокнах наблюдается распад саркомеров до зернистой массы. На 10-е сутки хранения мышечные волокна становятся набухшими, нарушается целостность или появляется фрагментация их с сохранением структуры ядер. Такие глубокие изменения структуры отмечаются на стадии созревания мяса, когда увеличивается нежность, улучшается аромат и вкус мяса.
Установили, что гистологические изменения, протекающие в мышечной ткани лошадей, аналогичны изменениям, протекающим в говядине, однако по времени достижения определенной стадии автолиза различных мышц имеются различия. В мышечной ткани говядины стадия посмертного окоченения начинается спустя 18-24 ч и протекает до 2-3 суток, а собственно созревание мяса начинается уже на 6-е сутки. Такие различия связаны с разной двигательной активностью животных.
Способ гистологической оценки степени созревания мяса позволяет достаточно точно, быстро, без трудоемкой обработки проб определить изменения мышечных волокон, в том числе с помощью количественных морфометрических методов и на этом основании констатировать стадии созревания мяса. Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими техническими решениями имеет следующие преимущества: высокую точность оценки степени созревания мяса, простоту выполнения без необходимости получения гистологических срезов с помощью дорогостоящего прибора - замораживающего микротома.