Способ прогнозирования эволюции церебральных глиом
METHOD FOR PREDICTION OF EVOLUTION OF CEREBRAL GLIOMAS

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано в клинической практике для прогнозирования эволюции глиальных церебральных опухолей (ГЦО) и оптимизации проводимой терапии.
Заболеваемость ГЦО представляет существенную не только биологическую, но и медико-социальную, а также экономическую проблему. Церебральная глиома - наиболее распространенная опухоль головного мозга, берущая свое начало из различных клеток глии. Среди всех опухолей головного мозга на долю глиом приходится около 60%.
Клинические проявления глиомы зависят от ее расположения и могут включать головную боль, тошноту, вестибулярную атаксию, расстройство зрения, парезы и параличи, дизартрию, нарушения чувствительности, судорожные приступы и пр.
В соответствии с классификацией ВОЗ выделяют 4 степени злокачественности глиом головного мозга. К I степени относится доброкачественная медленно растущая глиома (ювенильная астроцитома, плеоморфная ксантоастроцитома, гигантоклеточная астроцитома). Глиома II степени злокачественности считается «пограничной». Она отличается медленным ростом и имеет только один признак злокачественности, в основном клеточную атипию. Однако такая глиома может трансформироваться в глиому III и IV степени злокачественности. При III степени злокачественности глиома головного мозга имеет два из трех признаков: фигуры митозов, ядерную атипию или микропролиферацию эндотелия. Глиома IV степени злокачественности отличается наличием области некроза (глиобластома).
ГЦО, особенно злокачественные, характеризуются выраженной способностью к церебральной инвазии с отсутствием ее четких границ и способностью к продолженному росту, несмотря на активное комбинированное лечение [Коновалов А.Н., Потапов А.А., Лошаков В.А. и др. Стандарты, рекомендации и опции в лечении глиальных опухолей головного мозга у взрослых // Ж. «Вопросы нейрохирургии» им. Н.Н. Бурденко. - 2006. -Т. 2. - С. 3-11].
Глиомы головного мозга имеют преимущественно неблагоприятный прогноз. Неполное удаление опухоли приводит к ее быстрому рецидивированию. Если глиома головного мозга имеет высокую степень злокачественности, то в половине случаев больные погибают в течение 1 года и только четверть из них живет дольше 2 лет. Более благоприятный прогноз имеет глиома головного мозга I степени злокачественности. В случаях, когда удается произвести ее полное удаление с минимальным послеоперационным неврологическим дефицитом, более 80% прооперированных живут дольше 5 лет.
Наряду с известными способами диагностики церебральных глиом с помощью нейровизуализационных методик - магнитно-резонансной томографии (MPT) головного мозга с контрастным усилением и позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) {Brandsma, D. Pseudoprogression and pseudoresponse in the treatment of gliomas /D. Brandsma, MJ. van den Bent // Curr. Opin. Neurol. - 2009. - Vol.22. - P. 633-638), в последние годы хорошо зарекомендовали себя методики, основанные на исследовании уровней экспрессии различных генов микроРНК в плазме крови {Roth P. et al. A specific miRNA signature in the peripheral blood of glioblastoma patients // J Neurochem. 2011 Aug; 118(3):449-57), позволяющие диагностировать стадии патологического процесса {Visani Μ, et al. Expression of 19 microRNAs in glioblastoma and comparison with other brain neoplasia of grades I-III // Mol Oncol. 2014 Mar; 8(2):417-30), оценивать эффективность специфической терапии {Zhang KL, et al. Blockage of a miR-21/EGFR regulatory feedback loop augments anti-EGFR therapy in glioblastomas Cancer Lett. 2014 Jan 1; 342(1): 139-49).
Изучению микроРНК (некодирующих молекул РНК длиной 20-25 нуклеотидов, участвующих в регуляции экспрессии генов на транскрипционном и посттрансляционном уровнях) отводится особая роль, так как они, являясь одним из элементов патогенеза глиальных церебральных опухолей, потенциально перспективны в решении проблем диагностики, прогнозирования и перспектив лечения ГЦО. При этом показано, что уровень экспрессии мРНК одинаков в большинстве клеток ГЦО и пропорционален экспрессии мРНК в нативном материале (кровь, слюна), что может отражать эволюцию опухоли при оценке эффективности проводимого лечения [Ambros V. The functions of animal microRNAs // Nature. - 2004. - Vol.431. - P. 350-355].
Исследование уровней экспрессии генов микроРНК-21, -128 и -342 в слюне позволяет эффективно производить комплексную оценку состояния патологического процесса при церебральных глиомах, включающую диагностику, активность, чувствительность к химиопрепаратам, мониторирование пациентов на фоне проводимой терапии и оценку эффекта от оперативного вмешательства, проводимые неинвазивными средствами. (Зарайский М.И. и др. Способ диагностики и мониторирования течения церебральных глиом. - Патент RU 2656182, заявл. 09.01.2017; опубл. 31.05.2018, Бюл. №16).
Наряду с адекватной диагностикой и мониторированием опухоли чрезвычайно важным для клинической практики является прогнозирование течения заболевания, разработка критериев оценки эволюционирования ГЦО на различных этапах комбинированного лечения.
Целью настоящего изобретения явилось создание способа прогнозирования эволюции церебральных глиом на основе исследования уровней экспрессии генов отдельных микроРНК в плазме крови и в слюне пациентов.
Для выбора оптимальной стратегии хирургического и дальнейшего комплексного лечения ГЦО необходимо формирование обоснованного прогностического заключения, принципиально сводящегося к одному из трех выводов:
1 - «прогрессирование опухоли с неблагоприятным прогнозом с необходимостью дополнительного лечения или коррекции проводимого лечения»;
2 - «стабилизации опухоли с высокой вероятностью прогрессии» и
3 - «стойкая стабилизация с низкой вероятностью прогрессии». Задача, таким образом, состояла в том, чтобы выбрать микроРНК,
наиболее информативные в отношении оценки таких ключевых характеристик опухоли как ее активность (объем), пролиферативная способность и инвазивность, провести сравнительное исследование уровней экспрессии генов выбранных микроРНК в плазме крови и в слюне здоровых и больных ГЦО и на этой основе выработать критерии принятия прогностического заключения относительно прогрессии или стабилизации ГЦО.
Понятия "активность опухолевого процесса" и "объем опухоли" не дифференцировали, так как продукция "онко"-микроРНК зависит как от объема опухоли (остаточная часть опухоли при неполном удалении, прогрессия опухоли), так и от ее активности, то есть степени злокачественности. Поэтому, на данном этапе исследования руководствовались тем, что чем больше степень злокачественность опухоли (Grade I-IV), тем больше экспрессия "онко" микроРНК. С другой стороны, доброкачественная опухоль с большим объемом продуцирует микроРНК также активно, как и злокачественная с меньшим объемом. Конечно, разрешить данную проблему может только сравнение результатов по микроРНК и реального (остаточного) объема опухоли.
Пролиферативную активность опухоли мы не интерполировали на активность опухолевого роста, так как этот показатель является не столько характеристикой самой опухоли, поскольку в ней она высока по определению, сколько отражает состоятельность функционирования систем "противоопухолевого надзора" за пролиферацией клеток опухоли, что, в частности, более значимо для прогноза заболевания.
При ГЦО выявлено несколько аномально экспрессирующихся микроРНК. В частности, для первичных глиобластом характерна гиперэкспрессия микроРНК-21. Последняя обладает антиапоптотической и проинвазивной функцией в эволюционировании ГЦО, способствуя росту и пролиферации опухолевых клеток посредством сайлесинга онкосупрессора PTEN (за счет активации Akt-зависимых сигнальных путей, связанных с усиленным синтезом проонкогенных рецепторов EGFR, IGFR и VEGFR). Уровень микроРНК-21 существенно выше в глиобластомах (и в их клеточных линиях) по сравнению с нормальными клетками мозга. В ряде работ показано, что ингибирование микроРНК-21 в клеточных линиях глиобластом вызывает активацию каспаз и индукцию апоптоза [Хu L.F., Wu Z.P. et al. MicroRNA-21 (miR-21) regulates cellular proliferation, invasion, migration, and apoptosis by targeting PTEN, RECK and Bcl-2 in lung squamous carcinoma, Gejiu City, China // PLoS One. - 2014. - Vol. 9. - e103698; Zhou X, Ren Y. et al. Downregulation of miR-21 inhibits EGFR pathway and suppresses the growth of human glioblastoma cells independent of PTEN status // Laboratory Investigations. - 2010. - Vol. 90. - P. 144-155].
В то же время микроРНК-128 в нормальной ткани мозга имеет высокий уровень экспрессии и активирует ряд генов, отвечающих за механизмы подавления опухолевого роста, ингибирование ангиогенеза глиальных клеток, их самообновление и пролиферацию. При развитии ГЦО уровень экспрессии микроРНК-128 понижается. Отмечена также связь экспрессии микроРНК-128 с химиорезистентностью при ГЦО. Так, на фоне терапии темозоломидом синтезируется избыточное количество микроРНК-128, запускающее процесс апоптоза и, соответственно, разрушение клеток ГЦО [Karsy Μ, Arslan Ε., Moy F. Current progress on understanding microRNAs in glioblastoma multiforme // Genes Cancer. - 2012. - Vol. 3. - P. 3-15.; Slaby O., Lakomy R., et al. MicroRNA-181 family predicts response to concomitant chemoradiotherapy with temozolomide in glioblastoma patients // Neoplasma. - 2010. - Vol. 57. - P. 264-269].
Недавние исследования показали, что микроРНК-15 непосредственно играет роль супрессора ГЦО, ингибируя клеточную пролиферацию, инвазию и индуцируя апоптоз [Chen LP, Zhang NN, Ren XQ, He J, Li Y miR-103/miR-195/miR-15b Regulate SALL4 and Inhibit Proliferation and Migration in Glioma. Molecules. 2018 Nov 10;23(11)]. МикроРНК-15 блокирует высокую экспрессию гена SALL4, который тесно связан с глиомагенезом и оказывает свою онкогенную активность посредством активации пути β-catenin и участия в сигнальном пути Wnt. Сайлейсинг гена SALL4 уменьшает туморогенность с участием эпителиально-мезенхимального перехода через путь Wnt / β-catenin и проявляется в замедлении пролиферации и инвазии при глиоме [Sun, G., Shi, L. et al. MiR-15b targets cyclin Dl to regulate proliferation and apoptosis in glioma cells. Biomed. Res. Int. 2014, 2014, 687-826.]. Ген/белок BCL2 является онкогеном, находится в митохондриях и, выходя из них, блокирует апоптоз при развитии глиомы [Alderson LM, Castleberg RL, Harsh GR, 4th, Louis DN, Henson JW. Human gliomas with wild-type p53 express bcl-2. Cancer Res. 1995; 55: 999-1001].
Показано, что увеличение степени злокачественности в глиоме сопровождается постепенным снижением экспрессии белка BCL2 и имеет обратную корреляцию с уровнем экспрессии микроРНК-16, которая непосредственно подавляет экспрессию гена BCL2, индуцируя апоптоз и рассматривается как целевая мишень в плане терапии опухолей [Yang TQ, Lu XJ, et al. MicroRNA-16 inhibits glioma cell growth and invasion through suppression of BCL2 and the nuclear factor-KBl/MMP9 signaling pathway. Cancer Sci. 2014 Mar; 105(3):265-71.doi: 10.1111/cas.12351. Epub 2014 Feb 11.].
Экспрессия микроРНК-34 заметно снижена в р53-мутантных клетках линии глиомы человека (U251) в сравнении с клетками линий мозга человека А172 и SHG-44, экспрессирующих р53. Гиперэкспрессия микроРНК-34 в клетках U251 приводит к ингибированию роста опухолевых клеток в фазе G0-G1 и последующему апоптозу, а восстановление экспрессии микроРНК-34 значительно уменьшает возможности инвазии клеток глиомы in vitro.
МикроРНК-210 активизируется в различных типах солидных опухолей, в том числе и ГЦО, и влияет на клеточную функцию через различные пути, например, белок сборки цитохромоксидазы, гомолог железосодержащих кластеров, субъединица комплекса сукцинатдегидрогеназы D, BCL-2. МикроРНК-210 является достоверным циркулирующим биомаркером глиом человека, а высокие уровни ее экспрессии связаны с плохим прогнозом у пациентов с ГЦО. Поэтому уровень микроРНК-210 в сыворотке крови можно использовать для идентификации у пациентов ГЦО с высокой чувствительностью и специфичностью [Lai NS, Wu DG, Fang XG, Lin YC, Chen SS, Li ZB, Xu SS. Serum microRNA-210 as a potential noninvasive biomarker for the diagnosis and prognosis of glioma. Br J Cancer. 2015 Mar 31; 112(7):1241-6; Wang Z, Yin B, Wang Β, Ma Z, Liu W, Lv G. MicroRNA-210 promotes proliferation and invasion of peripheral nerve sheath tumor cells targeting EFNA3. Oncol Res. 2014; 21:145-154].
МикроРНК-126 негативно воздействует на пролиферацию, инвазию опухолевых клеток посредством связывания со специфическими генами, включая VEGF, рецептор инсулина и PIK3R2. Целевое связывание микроРНК-126 с геном KRAS, может регулировать путь ERK для подавления пролиферации и инвазия клеток глиомы. В результате экспрессия микроРНК-126 оказывает ингибирующее действие на опухоль и часто является аномально низкой у пациентов с ГЦО. Так, показано, что экспрессия микроРНК-126 бывает значительно подавлена в тканях и клетках пациентов со злокачественной ГЦО, а прогноз у пациентов с низким уровнем микроРНК-126 значительно хуже. Таким образом, низкий уровень микроРНК-126 ингибирует течение глиомы посредством направленной регуляции пути PTEN / PI3K / Akt и MDM2-p53, и, следовательно, может быть использован в качестве нового потенциального биомаркера для диагностики и прогнозирования течения ГЦО.
МикроРНК-342 высоко экспрессирована в нормальной ткани мозга, но ее уровень уменьшается на фоне развития ГЦО. Основной целью для микроРНК-342 является РНК гена FOXM1. Последний участвует в пролиферации клеток, активации клеточного цикла, дифференцировки клеток, усилении ангиогенеза, а также играет существенную роль в инвазии опухолевых клеток. Уровень экспрессии микроРНК-342 в плазме с высокой специфичностью и чувствительностью отличается у пациентов с ГЦО в сравнении с референтом, положительно коррелируя с гистологическими типами глиомы [Liu В, Peng ХС, Zheng XL, Wang J, Qin YW. MiR126 restoration down-regulate VEGF and inhibit the growth of lung cancer cell lines in vitro and in vivo. Lung Cancer 2009; 66: 169-175].
Упомянутые выше микроРНК (15, 16, 21, 34, 126, 128, 210 и 342) были выбраны в качестве основы для выработки прогностического заключения в сопоставлении с клинической картиной течения заболевания, результатами нейровизуализационного (МРТ, ПЭТКТ) и клинического исследований.
Заявляемый способ заключается в том, что в пробах плазмы крови и в слюне пациентов определяют уровни экспрессии генов микроРНК -15, -16, -21, -34, -126, -128, -210 и -342 и сравнивают их с референтными значениями, характерными для здоровых людей, полученными в результате обобщения литературных данных и подтвержденными в исследованиях на группе практически здоровых волонтеров.
Границы референтных значений экспрессии микроРНК для плазмы крови и слюны практически здоровых людей представлены в таблице 1 в относительных единицах (ОЕ).
Степень активности (объем) опухоли оценивают по уровням микроРНК -21 и -210. В случае если обе микроРНК выше референта хотя бы в одном (любом) клиническом материале, делают вывод о прогрессии ГЦО с неблагоприятным прогнозом; если лишь одна из микроРНК выше референта хотя бы в одном (любом) клиническом материале, делают вывод о стабилизации опухоли с высокой вероятностью прогрессии; в случае если обе микроРНК имеют уровень равный или меньше референтного, делают вывод о стойкой стабилизации с низкой вероятностью прогрессии.
Пролиферативную способность опухоли оценивают по уровням микроРНК-15,-16, -34, -126 и -342. В случае если не менее четырех микроРНК ниже референта в любом клиническом материале, делают вывод о прогрессии ГЦО с неблагоприятным прогнозом; если не более трех микроРНК ниже референта в любом клиническом материале, делают вывод о стабилизации опухоли с высокой вероятностью прогрессии; в случае если не более одной микроРНК ниже референта в любом клиническом материале, делают вывод о стойкой стабилизации с низкой вероятностью прогрессии.
Инвазивность опухоли оценивают по уровню микроРНК-128. В случае если ее уровень ниже референта во всех клинических материалах, делают вывод о прогрессии ГЦО с неблагоприятным прогнозом; если этот уровень равен или ниже референта в одном (любом) клиническом материале, делают вывод о стабилизации опухоли с высокой вероятностью прогрессии; в случае если ее уровень в норме или выше референта в любом клиническом материале при нормальной экспрессии микроРНК-21 и -210, делают вывод о стойкой стабилизации с низкой вероятностью прогрессии.
При этом если выводы при оценке каждой из вышеуказанных характеристик опухоли различаются, то итоговый клинический прогноз делают на основе наихудшего вывода. Алгоритм формирования заключения представлен в таблице 2.
Пример.
Исследование проведено на группе 14 пациентов ГЦО в процессе мониторинга их комплексного лечения (4 мужчин и 10 женщин в возрасте от 24 до 71 лет; средний возраст 43,8 лет). Пациентов отбирали в группу на основе верифицированного диагноза ГЦО. Пациенты основной группы находились на различных этапах комплексного лечения ГЦО: хирургическое лечение (стереотаксическая биопсия, костно-пластическая трепанация черепа с парциальным или субтотальным удалением опухоли), лучевая и химиотерапия. ГЦО имели супратенториальную локализацию.
Все пациенты основной группы были в ясном сознании. Неврологически чаще имели место: умеренные афатические расстройства, контралатеральная опухолевому очагу пирамидная недостаточность и/или гемигипестезия, а также ирритативный синдром. При этом, у 25,7% больных преобладала очаговая, а у 20,8% - общемозговая симптоматика. При оценке по шкале функциональной активности Карновского, наблюдаемые в среднем имели 90±3,95 балла, а по шкале MMSE 26±3,97 баллов. Офтальмологически наиболее частыми изменениями глазного дна были: полнокровие вен и расширение вен сетчатки, нередко в сочетании с сужением артерий. Периметрически чаще всего определялись гемианоптические выпадения, соответствующие опухолевой локализации.
В целях достижения максимальной сопоставимости результатов в качестве основного критерия оценки ГЦО (по классификации ВОЗ) была выбрана градация ГЦО по степени злокачественности (Grade I-IV).
Для контроля исходных референтных значений уровней экспрессии МРНК-15, -16, -21, -34, -126, -128, -210, -342, молекулярно-генетические исследования проведены также в группе потенциально здоровых добровольцев (N=10). Они составили группу контроля (7 женщин и 3 мужчин, средний возраст 30,2 лет).
Исследования проведены на позитронно-эмиссионном томографе «Scanditronix PC 2048» с анализом изображений на рабочей станции "Scanditronix" (Швеция). Радиофармпрепарат (РФП) L-[метил-11С]-метионин (ПС-метионин) с расчетом его индекса накопления (ИН), размеров новообразования. МРТ с КУ проводили с применением парамагнетика: «Гадовист», «Омнискан», «Магневист» с помощью прибора MRI Achieva ЗТ. Оценивали форму, размеры, образования, зону перифокального отека, масс-эффект.
Анализ ЭЭГ осуществляли в основной группе. Для регистрации ЭЭГ использовали компьютерный электроэнцефалограф «Neurotravel» и 21-канальный электроэнцефалограф «Мицар».При ДБЦС (допплерограф Multi-Dop L1) проводили определение паттернов "опухолевого шунтирующего" кровотока, степень венозной дисгемии, либо снижение церебральной перфузии, оценку артерио-венозного равновесия (АВР) и допплеровского ЭВЧД.
Забор материала для исследования уровней экспрессии мРНК у пациентов с ГЦО и в группе сравнения проводили в следующем порядке.
1. Плазма крови. Подготовка пациента: сбор материала проводится натощак. Кровь в объеме 3-5 мл забирали в вакутейнер с фиолетовой крышкой (консервант ЭДТА). После забора крови вакутейнер несколько раз переворачивали для перемешивания крови с консервантом.
2. Слюна. Подготовка пациента: сбор материала проводился натощак. Полость рта ополаскивали два раза стерильной водой. Затем без стимуляции пациент собирал слюну в вакутейнер без консерванта, в объеме около 1 мл.
В работе были исследованы уровни экспрессии генов микроРНК-15, -16, 21, -34, 126, -128, -210 и -342. В качестве гена сравнения использовалась малая ядерная РНК - U6.
Методика определения уровней экспрессии микроРНК в нативном биоматериале заключалась в выделении тотальной РНК с помощью фенольного реактива (Trireagent-LS) и последующей ее экстракцией хлороформом. Реакцию обратной транскрипции для приготовления "копийной" ДНК (далее - кДНК) проводили по технологии "Stem Loop" раздельно для исследуемых микроРНК. Последовательности праймеров приведены в таблице 3.
Температурный профиль приготовления кДНК был следующий: 16°С - 30 мин, 34°С - 30 мин, 85°С - 5 минут.
Отработку нового протокола оценки экспрессии микроРНК проводили с помощью амплификации, в присутствии пробы типа TaqMan, специфичной для каждой микроРНК. Дизайн пробы подразумевал ее положение между специфическими праймерами, а также пробы были мечены с одной стороны флюоресцентным красителем FAM, а с другой стороны - гасителем флюоресценции (RTQ1). Полимеразная цепная реакция проводилась в раздельных пробирках, содержащих прямой праймер, специфичный для микроРНК, общий обратный праймер и пробу, меченую флюоресцеином. Последовательности праймеров приведены в таблице 4.
Температурный профиль реакции был - 95°С - 10 мин (однократно), 95°С - 15 сек, 60°С - 1 минута - 40 циклов.
-ΔΔCt
При расчетах уровней экспрессии генов микроРНК использовали полуколичественную оценку по протоколу 2, где -ΔΔCt - разница между расчетными уровнями выхода на плато амплификационных кривых исследуемой микроРНК и геном сравнения U6.
В группе практически здоровых волонтеров (N=10), показатели микроРНК оставались в пределах референтных значений.
При сопоставлении данных экспрессии микроРНК в группе испытуемых, уровень сопряженности характеристик опухоли и данных нейровизуализации и ПЭТ составил r=+0,98. Различия по уровням экспрессии исследуемых микроРНК между основной и контрольной (практически здоровые волонтеры) группами были статистически значимыми с р<0,01. Заключение.
Злокачественные глиальные церебральные опухоли (ГЦО) являются наиболее частыми опухолями центральной нервной системы. Их устойчивый рост детерминирован не только высоким уровнем генетических мутаций (верифицируются в 30-40% случав), но и рядом известных эпигенетических факторов - различных модификаций генома, а также уровнем экспрессии микроРНК. Последние представляют собой короткие транскрипционные последовательности и осуществляют контроль синтеза белка, принимая участие в жизнедеятельности клетки на различных уровнях.
Взаимодействие микроРНК и ее мишени (белок-кодирующие гены человека) происходит в комплексе RISC (RNA-induced silencing complex) с подавлением функции гена, обеспечивая любой тип течения патофизиологического процесса. Экспрессия микроРНК-15, -16, -21, -34, -126, -128, -210 и 342 коррелирует с эволюционированием ГЦО (стабилизация, стойкая стабилизация, прогрессия).