Способ моделирования ишемии конечности
METHOD OF EXTREMITY ISCHEMIA SIMULATION

Изобретение относится к медицине, касается экспериментальных и доклинических исследований и может быть использовано в сердечно-сосудистой хирургии для тестирования препаратов, предназначенных для лечения ишемии нижних конечностей.
На сегодняшний день существует множество способов моделирования ишемии задней конечности у лабораторных животных. Данные способы преимущественно заключаются в "окклюзионной методике", т.е. перекрытия кровотока в магистральной артерии. Однако вследствие различных межвидовых анатомо-физиологических особенностей различных животных существуют определенные трудности экстраполяции одно и того же метода моделирования ишемии на различных животных. В связи с этим зачастую требуется разработка нового способа создания ишемии на определенном виде животного. Трудность процесса заключаются не только в подборе определенных оперативных методик при достаточно узкой, но в тоже время весьма распространенной у человека патологии - ишемии конечностей, но и способов верификации созданной ишемии.
Известен способ моделирования облитерирующего эндартериита путем парентерального введения животному антигенного материала, предварительно частично пережимают сосуды задних конечностей животного [см. авт. св-во СССР 679207, М. кл. А 61 3 10/00, G09B 23/28, опубл. 15.08.79 г.]. Известный способ исключает побочные аллергические реакции при воспроизведении заболевания и позволяет создать модель с изолированным поражением внутренней оболочки сосудов, с развитием в ней склеротических процессов, соответствующих проявлению этого заболевания у людей. При этом по сравнению с ранее известными способами он имеет более упрощенные технические приемы для создания модели облитерирующего эндартериита. Однако использование в качестве антигенного материала экстракта интимы аорты, полученной от животных того же вида, значительно удорожает создание модели заболевания, поскольку получение экстракта достаточно трудоемкий и длительный по времени процесс, требует дополнительного оборудования, препаратов и специально подготовленного персонала.
Известен способ моделирования хронической ишемии конечности у экспериментального животного, включающий использование кетгутовой нити для прекращения кровотока по артерии, отличающийся тем, что нить не завязывают, а накручивают на артерию в виде спирали с сужением просвета сосуда на 1/2 его диаметра; развитие ишемии конечности наступает постепенно в результате набухания кетгутовой нити с последующим ее рассасыванием и восстановлением кровотока [см. заявка на изобретение РФ №99125157, МПК G09B 23/28, дата публ. 20.08.2001].
Известен способ ишемии спинного мозга у крыс путем введения катетера через левую сонную артерию в нисходящую аорту выше уровня диафрагмы, отличающийся тем, что дополнительно через бедренные артерии в подвздошные артерии вводят окклюдеры из хромированного кетгута, а через левую сонную артерию по направлению к окклюдерам вводят 0,3 мл 1%-ного раствора феракрила и через 40-45 мин окклюдеры извлекают [см. патент РФ №2212058, МПК G09B 23/28, опубл. 10.09.2003, БИ №25].
Известен способ моделирования ишемии конечности, выбранный в качестве ближайшего аналога, заключающиеся в перекрытии кровотоков в артериях 1-го и 2-го порядка соответственно от наружной подвздошной до подколенной артерии и расположенных ниже подколенной артерии, осуществляемые из обычного доступа по внутренней поверхности бедра [см. патент РФ №2210816, МПК G09B 23/28, опубл. 20.08.2003, БИ №23]. Данный способ позволяет создать модель с высокой стойкостью хронической ишемии конечности для изучения данного заболевания. Однако использование склерозирующего раствора для обеспечения перекрытия кровотока в артериях 2-го порядка, расположенных ниже подколенной артерии, как подтверждают проведенные эксперименты, может вызвать гангрену оперированной конечности даже в случае введения в культю подколенной артерии заявленного количества склерозирующего раствора, что делает его не обеспечивающим создание качественной модели хронической ишемии конечности. Кроме того, благодаря тому, что способ не предусматривает перекрытия кровотока в артериях 2-го порядка, отходящих от артерий 1-го порядка на участке от наружной подвздошной до подколенной артерии, достаточно быстро восстанавливается кровоток и компенсируются функциональные показатели кровообращения и метаболизм тканей в поздние сроки, что также делает этот способ, не обеспечивающим создания качественной модели для изучения хронической ишемии конечности. При этом использование известного способа не позволяет добиться максимального приближения течения патологии к клиническому течению заболевания.
Таким образом, перечисленные способы моделирования ишемии конечности требуют введения различных химических агентов, что усложняет и удорожает процедуру и, кроме того, не позволяют добиться максимального приближения течения патологии к клиническому течению заболевания.
Задачей предлагаемого изобретения является создание эффективного способа моделирования ишемии для тестирования препаратов, стимулирующих ангиогенез, с максимальным приближением течения патологии к клиническому течению заболевания.
Поставленная задача решается способом моделирования ишемии конечности с перекрытием кровотоков в артериях 1 и 2 порядка соответственно, от общей подвздошной артерии, осуществляемым из доступа по внутренней поверхности бедра. Отличием является то, что осуществляют полулунный разрез по медиальной поверхности бедра от паховой связки в дистальном направлении длиной 10-12 см, ниже паховой связки тупым путем выделяют отходящую от аорты общую подвздошную артерию, наружную подвздошную артерию и внутреннюю подвздошную артерии, на устье общей подвздошной артерии накладывают лигатуру из нерассасывающегося шовного материала, внутреннюю подвздошную артерию перевязывают и отсекают, наружную подвздошную артерию перевязывают и прошивают нерассасывающимся шовным материалом, резецируют сегмент 4-5 см наружной подвздошной артерии, выделяют общую бедренную артерию, проксимальные сегменты глубокой бедренной и поверхностной бедренной артерии, отдельно перевязывают устье поверхностной и глубокой бедренных артерий нерассасывающимся шовным материалом.
Заявленный способ осуществляется следующим образом: перед началом манипуляций свиньи подвергались фармакологической иммобилизации с использованием комбинации препаратов Медетомидин (Медитин 0,1%, ООО «Апиценна», Россия) 0,06-0,07 мг/кг и Тилетамин/Золазепам (Золетил 100, «Virbac Same Animale», Франция) 2-3 мг/кг. Препараты вводились внутримышечно. Для индукции применялся ингаляционный анестетик Изофлуран (Испания). Подача анестетика осуществлялась при помощи ингаляционной маски. После угнетения гортанных и глоточных рефлексов проводилась интубация трахеи. Использовались эндотрахеальные трубки с манжетой размером 4,0-4,5. Для поддержания анестезии применялся Изофлуран в дозе 2-3 об % и Золетил 100 в дозе 3-6 мг/кг/час. Для постоперационной анальгезии применялся Кетопрофен (Флексопрофен 2,5%, ГК ВИК, Россия) внутримышечно в дозе 3 мг/кг, сразу после операции и еще в течении 2х дней после 1 раз в сутки. Для профилактики хирургической инфекции использовали Цефазолин (ОАО «Биосинтеза, Россия) в дозе 30 мг/кг внутривенно за 30 минут до начала хирургического вмешательства.
Моделирования ишемии всегда производили на левой конечности. Положение животного на операционном столе на спине. Отличием является то, что осуществляют полулунный разрез по медиальной поверхности бедра от паховой связки в дистальном направлении, длиной 10-12 см, ниже паховой связки тупым путем выделяют отходящую от аорты общую подвздошную артерию, наружную подвздошную артерию и внутреннюю подвздошную артерии, на устье общей подвздошной артерии накладывают лигатуру из нерассасывающегося шовного материала, внутреннюю подвздошную артерию перевязывают и отсекают, наружную подвздошную артерию перевязывают и прошивают нерассасывающимся шовным материалом, резецируют сегмент 4-5 см наружной подвздошной артерии, выделяют общую бедренную артерию, проксимальные сегменты глубокой бедренной и поверхностной бедренной артерии, отдельно перевязывают устье поверхностной и глубокой бедренных артерий нерассасывающимся шовным материалом. Следует отметить, что наши эксперименты показали, что свинья является достаточно устойчивым к ишемии видом животного ввиду развитого коллатерального кровообращения в задних конечностях, в этой связи операции были выполнены более радикальным способом.
Контроль наступления ишемии проводили по следующим критериям:
1. Лазерная допплеровская флоуметрия. Данный метод позволяет количественно оценить перфузию тканей дистальнее место проведения иссечения артерии, тем самым показывая выраженность созданной ишемии. Также данный аппарат:позволял получать значения сатурации тканей кислородом и измерять температуру конечности в реальном времени. Сроки проведения - до операции, сразу после операции, спустя 7 суток после операции, на 28 сутки.
2. Биохимический анализ венозной крови на маркеры ишемии - определение лактата и креатинкиназы (маркер гипоперфузии и повреждения мышечной ткани). Сроки проведения - до операции, сразу после операции, спустя 7 суток после операции, на 28 сутки после операции.
3. Морфологические методы (окрашивание забранных мышц на наличие соединительной ткани) - окрашивание по Ван-Гизону, окрашивание мышц на общее повреждение гематоксилин-эозином). Сроки проведения - на 28 сутки после операции. Контролем служат мышцы, забранные со здоровой конечности (правой) у этого же животного.
4. Клиническое наблюдение - для выявления наличия хромоты (патогномоничный признак при ишемии нижних конечностей у человека). Сроки проведения - до операции, сразу после операции, спустя 7 суток после операции, на 28 сутки после операции. Клиническое наблюдение проводили на следующее утро и спустя 7 суток после проведения оперативного вмешательства.
Заявленный способ иллюстрируется следующими примерами:
Пример №1
Лазерная допплеровская флоуметрия
Результаты: непосредственно после операции и на последующие сроки выявлено значительное снижение кровотока в прооперированной конечности: 79,3±110,4 до операции; 36,2±48,1 сразу после операции, 34,0±10,9 на 7 сутки, 62,3±36,3 на 28 сутки после операции, понижение температуры прооперированной конечности (в среднем на 2,5 градуса по сравнению со здоровой ногой), что свидетельствует о наступлении ишемии.
Биохимический анализ венозной крови на маркеры ишемии
Результаты: сразу после операции наблюдается выраженное повышение маркера ишемии - лактата и маркера повреждения мышечной ткани - креатинкиназы (24.6 мг/дл и 139.3 Ед/л) до операции, и (36.3 мг/дл и 223.2 Ед/л) непосредственно после операции. Наши исследования показали, что оценивать биохимические маркеры ишемии у свиней следует непосредственно после проведения операции по моделированию ишемии, последующие измерения не информативны.
Окрашивание на соединительную ткань по Ван-Гизону
Результаты: статистически значимые различия имеются в отношении увеличения площади соединительной ткани в скелетной мышце, что характерно для ишемического повреждения мышцы.
Клиническое наблюдение
Результаты: При начале ходьбы у животного отмечали выраженные признаки ишемии конечности - наличие хромоты, также животное постоянно стремилось "поджать" оперированную конечность к телу и минимизировать опору на нее. Указанный признак сохранялся до 7 суток, после чего функция нижней конечности восстанавливалась, что свидетельствует о возможной активизации коллатерального кровотока и регенераторных возможностях свиньи.
Пример №2
Лазерная допплеровская флоуметрия
Результаты: непосредственно после операции и на последующие сроки выявлено значительное снижение кровотока в прооперированной конечности: 80,2±60,4 до операции; 40,2±31,5 сразу после операции, 36,0±12,3 на 7 сутки, 42,8±31,7 на 28 сутки после операции, понижение температуры прооперированной конечности (в среднем на 2,4 градуса по сравнению со здоровой ногой), что свидетельствует о наступлении ишемии.
Биохимический анализ венозной крови на маркеры ишемии
Результаты: сразу после операции наблюдается выраженное повышение маркера ишемии -лактата и маркера повреждения мышечной ткани - креатинкиназы (33.9 мг/дл и 98.9 Ед/л) до операции, и (47.7 мг/дл и 540.8 Ед/л) непосредственно после операции.
Окрашивание на соединительную ткань по Ван-Гизону
Результаты: статистически значимые различия имеются в отношении увеличения площади соединительной ткани в скелетной мышце, что характерно для ишемического повреждения мышцы.
Клиническое наблюдение
Результаты: При начале ходьбы у животного отмечали выраженные признаки ишемии конечности - наличие хромоты, также животное постоянно стремилось "поджать" оперированную конечность к телу и минимизировать опору на нее. Указанный признак сохранялся до 7 суток, после чего функция нижней конечности восстанавливалась, что свидетельствует о возможной активизации коллатерального кровотока и регенераторных возможностях свиньи.
Таким образом, наши эксперименты показывают, что свинья является достаточно устойчивым к ишемии видом животного ввиду развитого коллатерального кровообращения в задних конечностях, в этой связи операции были выполнены более радикальным способом. По сравнению с иными способами создания ишемии, данный способ технически прост, доступен и может быть воспроизведен в любой лаборатории. Результаты использования предлагаемого изобретения в экспериментальной медицине позволят тестировать препараты, применяющиеся для лечения острой и хронической ишемии нижних конечностей и при этом с максимальным учетом приближения течения патологии к клиническому течению заболевания.