СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ГЕПАРИНА
METHOD OF OBTAINING LOW-MOLECULAR HEPARIN

Изобретение относится к технологии получения фармацевтической субстанции низкомолекулярного гепарина (НМГ) и может быть использовано для производства лекарственных препаратов на основе низкомолекулярного гепарина (НМГ).
Гепарин - антикоагулянт прямого действия, синтезируемый специфическими клетками теплокровных животных. В настоящее время его получают из легких крупного рогатого скота и наиболее часто из слизистой оболочки кишечника свиней экстракцией с последующей очисткой гепарина-сырца.
Нефракционированный гепарин (НФГ) представляет собой смесь сульфатированных полисахаридов различной структуры с молекулярной массой от 3000 до 30000 дальтон (Да), в среднем около 15000-18000 Да.
Препараты НФГ широко используются в медицине при лечении инфаркта, стенокардии, тромботических осложнений, при различных хирургических вмешательствах и во многих других случаях. Крупнейшими российскими и зарубежными производителями препарата «гепарин - раствор для внутривенного и подкожного введения» являются: Московский эндокринный завод, НПО «Микроген» (Томск), АКО «Синтез» (Курган), Б.Браун Мельзунген АГ, Германия (http://www.grls.rosminzdrav.ru/GRLS.aspx).
Препараты НФГ, наряду с несомненными достоинствами, обладают серьезными недостатками, такими как возможность возникновения геморрагических кровотечений, тромбоцитопении, остеопороза, гиперкалиемии, различных проявлений аллергии, необходимостью неоднократного введения в течение суток под контролем параметров свертывания крови.
В последние годы широкое применение получили препараты низкомолекулярного гепарина (НМГ), которые имеют достаточно высокую активность по фактору антикоагулянтной активности анти-Xа и низкую по анти-IIа активности, что объясняет их преимущества по сравнению с препаратами НФГ (В.А.Макаров, Т.Б.Кондратьева "Применение гепаринов в клинической практике": РМЖ №3, с.4, 1998).
Низкомолекулярные гепарины получают химической или ферментативной деполимеризацией НФГ и описаны в заявке №2009134188/04 от 12.02.2008, российских патентах №2295538, №2248801. Они представляют собой полидисперсные фрагменты полимерных макромолекул исходного гепарина более низкой молекулярной массы, в среднем 4000-8000 Да. НМГ, полученные различными способами, отличаются молекулярной массой и молекулярно-массовым распределением, строением концевых групп, активностью относительно минорных факторов свертывания крови и их соотношением.
На практике наиболее часто используют препараты на основе субстанций дальтепарина, тинзапарина и эноксапарина натрия, которые имеют наиболее широкий спектр показаний (Eric Racine "Differentiattion of the Low-Molecular-Weight Heparins". Pharmacotherapy 21(6 Pt2):62S-70S, 2001).
Дальтепарин натрия - продукт деполимеризации НФГ с помощью нитрита натрия или азотистой кислоты (Linhardt R, Gunay N. "Production and chemical processing of low molecular weight heparins". Semin. Thromb. Hemost. 1999; 25 (suppl 3):5-25; EP 1.773.890). В результате получают продукт, имеющий среднюю молекулярную массу около 6000 Да и ангидроманозную концевую группу.
3
1
3
3
Дальтепарин: R=H или SONa; R=C(O)CH или SONa
2
3
R=H или COONa; R=COONa или H
n=3-20
ср
Мм=6000 Да
Тинзапарин натрия - продукт ферментативной деполимеризации НФГ из мукозы свиней, имеющий среднюю молекулярную массу около 4500 и 2-N,6-O-дисульфо-D-глюкозаминовую концевую группу (Dupont Pharma. Innohep (tihzaparin) package insert. Wilmington, DE; July 2000; RU 2.295.538).
3
1
3
Тинзапарин: R=H или SONa; R=H или SONa
2
3
R=H или COONa; R=COONa или H
n=10-25
ср
Мм=4500 Да
В последние годы наиболее широкое распространение получили препараты на основе эноксапарина, являющегося продуктом щелочной деполимеризации бензилового эфира НФГ. Его структура содержит 2-O-сульфо-4-енопирнозуроновую кислотную группу на нередуцированном и 2-N, 6-O-дисульфо-D-глюкозаминовую на другом - редуцированном концах цепи (Ph Eur monograph. 1097; РЛС, Энциклопедия лекарств, вып. 20 (2012).
R=H - Нередуцированный конец
1
3
2
3
3
R=H или SONa; R=SONa или C(O)CH
n=1,6-ангидро от 1 до 20
ср
Мм=4500 Да
Эноксапарин
Эноксапарин характеризуется средней молекулярной массой около 4500 Да, высокой анти-Xа активностью (100 анти-Xа МЕ/мг) и слабой ингибирующей активностью в отношении фактора IIа (тромбина).
В Европе и США запатентованы различные модификации способов получения эноксапарина, приводящие к получению продуктов, в той или иной степени удовлетворяющих требованиям Европейской (EP), Американской (USP), Британской фармакопеи (BP): (EP 0.337.327, 1989 г.; US 5.849.721, 1998 г.; EP 1.510.528, 2003 г.; US RE 38743 2005 г.).
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения, описанный в Европейском патенте (EP) №1/510.528 (2003 г.). Сущность этого способа заключается в проведении всех стадий процесса на инертной дисперсной твердой фазе, которая является одновременно фильтровальным материалом при выделении и промывке промежуточных и конечного продуктов. При этом на стадии синтеза бензетониевой соли гепарина выход этого продукта менее 70%; на стадии бензилирования выход бензилового эфира гепарина менее 40% и на стадии гидролиза бензилового эфира НФГ выход НМГ не превышает 35%. Результирующий выход cырца НМГ составляет не более 15%. Потери на отдельных стадиях процесса связаны не только с неполным использованием реактивов, но и с необходимостью отмывки промежуточных продуктов, которые представляют собой набухшие глинообразные осадки, очень большими количествами растворителей. Так, например, на промывку 10 кг гепарината бензетония на носителе перлите расходуется более 800 л дистиллированной воды. На осаждение и промывку продукта бензилирования требуется более 45 л метанола. Все это в совокупности значительно увеличивает материальные и трудозатраты, а также себестоимость конечного продукта.
Целью настоящего изобретения является повышение качества НМГ, с содержанием минимального количества примесей, увеличение выхода НМГ и снижение затрат на производство НМГ за счет использования минимального количества реагентов, растворителей.
Поставленная цель достигается путем:
- получения бензетониевой соли нефракционированного гепарина (ГБ) в 0,01-0,5 М водном растворе натрия хлорида при температуре 50-60°C, pH=8,2-8,8 и массовом соотношении гепарин/бензетоний 1/(2,35-2,70),
- проведения бензилирования бензетониевой соли гепарина в течение 2-3 часов среде биполярного апротонного растворителя бензилхлоридом (БХ) в соотношении гепаринат/бензилхлорид 1/(0,2-0,8), который предварительно активируют в апротонном растворителе в течение 15-20 мин,
- проведения осаждения бензилового эфира гепарината бензетония этиловым спиртом, предварительно насыщенным безводным натрия ацетатом с одновременным снятием защиты с сульфогруппы,
- β-элиминированием бензилового эфира гепарина 1±0,5N щелочью (NаОН), при температуре 55±5°C, длительности процсесса 40-60 мин и массовым соотношением реагентов бензиловый эфир/натрия гидроксид 1/(0,5-2).
С этой целью первую стадию - синтез бензетониевой соли гепарина (гепарината бензетония), проводят в водной среде без применения инертного носителя в специальных условиях, обеспечивающих поддержание определенной конформации макромолекул гепарина.
Вторую стадию - синтез сложного бензилового эфира гепарината бензетония проводят в апротонном неводном растворителе с предварительным активированием бензилирующего агента в том же или близком по природе растворителе.
Осаждение полученного бензилового эфира гепарината бензетония проводят методом Спиро этанолом, который предварительно насыщают безводным ацетатом натрия. Осажденный эфир гепарината бензетония обрабатывают порциями насыщенного спиртового раствора уксуснокислого натрия с целью удаления защиты с сульфогруппы гепарина натрия.
После деструкции бензилового эфира гепарина щелочным β-элиминированием и формированием концевых групп действием сильного восстановителя борогидридом натрия проводят выделение необходимой фракции НМГ гельфильтрацией и готовый продукт высушивают лиофилизацией.
В соответствии с настоящим изобретением неожиданно обнаружено, что бензетониевая соль гепарина, получаемая в водной среде, содержащей низкомолекулярный электролит в количестве 0,01-0,5 моль/л при pH 8,2-8,8, температуре 50-60°C и соотношении реагентов гепарин/бензетоний 1/(2,35-2,70), то есть неожиданно обнаружено, что бензетониевая соль гепарина, получаемая в водной среде, содержащей низкомолекулярный электролит, необходимая для создания условий образования максимально компактной и оптимальной конформации полимерной цепи гепарина, в количестве 0,05-1 моль/л при pH 8,2-8,8 и температуре 50-60°C, образуется при практически стехиометрическом соотношении реагентов гепарин/бензетоний 1/(2,25-2,50).
Полученный таким образом продукт свободен от примесей исходных реагентов, легко фильтруется и отмывается от избытка бензетония хлорида небольшим количеством воды. При этом выход целевого продукта - гепарината бензетония, достигает 85-95%.
Было также неожиданно обнаружено, что предварительное активирование бензилрующего агента в апротонном растворителе позволяет эффективно провести бензилирование гепарината бензетония при оптимальном соотношении гепаринат/бензилхлорид 1/(0,2-1) в течение всего 2-3 часов.
В соответствии с настоящим изобретением осаждение бензилового эфира гепарината бензетония и снятие защиты с сульфогрупп эффективно проводится насыщенным раствором безводного ацетата натрия в этиловом спирте. Отсутствие в процессе инертного носителя позволяет значительно снизить потери и получить продукт, свободный от хромофоров, что положительно влияет на качество конечного продукта.
Было также неожиданно обнаружено, что проведение β-элиминирования бензилового эфира со степенью этерификации гепарина 9-13% 1±0,5 N NaOH при температуре 55±5°C, длительности процесса 40-60 мин и массовым соотношением реагентов бензиловый эфир/натрия гидроксид 1/(0,5-2), позволяет получить необходимый продукт с выходом на этой стадии более 70%, узким молекулярно-массовым распределением (рис.1), характерным для эноксапарина натрия. Очистку полученного продукта и восстановление концевых групп проводят с помощью борогидрида натрия с последующим фракционированием низкомолекулярного гепарина гельфильтрацией с применением селективных сорбентов.
Пример 1. Синтез бензетониевой соли гепарина.
В реактор вместимостью 2000 мл с механической мешалкой, помещенный в термостатируемую водяную баню, наливают 450 мл 0,2 М раствора натрия хлорида и при работающей мешалке небольшими порциями прибавляют 50,0 г мукозного гепарина (активность 218 МЕ/мг, соотношение сульфо-/карбоксильных групп по данным кондуктометрии 2,48, влагосодержание 8,6%), После полного растворения гепарина устанавливают pH=8,2-8,3. В другом реакторе с механической мешалкой вместмостью 1000 мл готовят раствор бензетония хлорида. В реактор наливают 875 мл воды очищенной и при включенной мешалке небольшими порциями прибавляют 117,5 г бензетония хлорида. Перемешивание продолжают до полного растворения реактива, после чего устанавливают pH=6,4-7,0. В реакторе с раствором гепарина повышают температуру до 60±2°C и при работающей мешалке с помощью дозирующего насоса прибавляют раствор бензетония хлорида в течение 20-25 мл/мин. После прибавления всего раствора бензетония реакцию продолжают еще 20-30 мин и выключают обогрев реактора. Образовавшийся осадок горячим отделяют фильтрациецй на воронке Бюхнера. Жидкую фазу отбрасывают, а осадок переносят в реактор, прибавляют 500 мл воды очищенной и перемешивают при температуре 55-60°C 10-15 мин. Осадок горячим отделяют на воронке Бюхнера. Оптическая плотность фильтрата при 270 нм составляет не более 1,5, что соответствует концентрации бензетония хлорида в маточнике 0,6 мг/мл. Осадок высушивают лиофилизацией до остаточной влажности не более 4,5%. Получают 156,4 г бензетониевой соли гепарина (гепаринат бензетония, "ГБ"), что соответствует выходу по стадии 93,4%.
Схема синтеза гепарината бензетония
1,2
3
3
R=CH, R=
,
или H
Таблица 1
Влияние условий синтеза гепарината бензетония на свойства продукта
Серия
Концентрация NaCl, Моль/л
Соотношение гепарин/безетоний, г/г
Расход воды на промывку, мл/см<sup>3</sup>
Выход продукта, %
1.1
0,01
1/2,35
3,5-4,0
85,3
1.2
0,07
1/2,50
3,0-3,2
93,6
1.3
0,5
1/2,70
4,0-5,0
88,4
Пример 2. Бензилирование гепарината бензетония.
1. В реактор-котелок вместимостью 1000 мл, снабженный мешалкой, гидрозатвором и хлоркальциевой трубкой, помещенный в термостатируемую водяную баню, наливают 200 мл N,N-диметилформамида (ДМФА) и прибавляют 30 г гепарината бензетония, полученного по примеру 1 (образец с.1.2). Включают мешалку и производят растворение гепартната бензетония в течение 30 минут. В другой реактор вместимостью 50 мл, снабженный мешалкой, гидрозатвором и хлоркальциевой трубкой, добавляют:
1.1. 20 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и 17 мл бензилхлорида. Процесс растворения и активирования бензилхлорида в ДМСО проводят при температуре 20-25°C в течение 10-20 мин. Затем в реакторе с гепаринатом бензетония при комнатной температуре и при перемешивании медленно прибавляют раствор бензилхлорида в ДМСО. Реакцию продолжают при 20-25°C и интенсивном перемешивании 2-3 часа.
1.2. 20 мл диметилфорамида (ДМФА) и 17 мл бензилхлорида. Процесс растворения и активирования бензилхлорида в ДМФА проводят при температуре 20-25°C в течение 10-20 мин. Затем в реакторе с гепаринатом бензетония при комнатной температуре и при перемешивании медленно прибавляют раствор бензилхлорида в ДМФА. Реакцию продолжают при 20-25°C и интенсивном перемешивании 2-3 часа.
Пример 3. Осаждение бензилового эфира гепарината бензетония и снятие бензетониевой защиты с сульфогрупп.
Осаждение бензилового эфира гепарината бензетония, полученного в примере 3, проводят насыщенным раствором безводного ацетата натрия в этиловом спирте по методу Спиро (наращивания) для получения укрупненных частиц осадков с хорошей фильтруемостью. Осаждение проводят в несколько повторяющихся циклов наращивания частиц, в каждом из которых осадок, полученный в предыдущие цикле, остается в реакторе, и в его присутствии в качестве затравки ведут осаждение новых порций осадка. На осаждение бензилового эфира гепарината бензетония расходуется 400 мл насыщенного раствора ацетата натрия в этаноле при перемешивании. Осадок отфильтровывают и проводят снятие бензетониевой защиты сульфогрупп полученного эфира, дважды промывая по 400 мл тем же раствором. Полученный осадок фильтруют и промывают его 100 мл ацетона. Осадок высушивают в вакууме при температуре 40-45°C до остаточной влажности не более 5%. Получают 15,5 г продукта, содержащего 14,1 г бензилового эфира гепарина со степенью этерификации по карбоксильным группам (определенной методом Высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ)) 10,72%. Выход бензилового эфира гепарина на этой стадии составляет 89,5%.
Таблица 2
Влияние условий синтеза бензилового эфира гепарина натрия на степень этерификации
Серия
Соотношение ГБ/БХ
Степень этерификации, %
с.1.2.1
1/0,20
9,07
с.1.2.2
1/0,66
10,72
с.1.2.3
1/1
12,95
Схема реакций получения бензилового эфира гепарина
Пример 4. β-элиминирование бензилового эфира бензетониевой соли гепарина
В трехгорлую колбу вместимостью 250 мл, снабженную мешалкой и помещенную в водяную термостатируемую баню, наливают 140 мл воды очищенной и при перемешивании прибавляют 15,5 г продукта, полученного по примеру 2 (образец серии с.1.2.2), содержащего 14,1 г бензилового эфира гепарина. Температуру реакционной среды повышают до 60°C и после полного растворения порошка с помощью капельной воронки прибавляют 12 мл свежеприготовленного 0,5 М раствора натрия гидроксида. Реакцию продолжают 45 мин, поддерживая pH среды не менее 11. По окончании выдержки охлаждают реакционную массу до комнатной температуры, устанавливают pH=6,0±0,2 добавлением разбавленной соляной кислоты (1:3) и прибавляют 10 г безводного ацетата натрия. Полученный раствор фильтруют, фильтрат охлаждают до температуры 0-4°C и осаждают продукт тремя объемами охлажденного 96%-ного этанола. Раствор помещают в холодильник и оставляют для «созревания» осадка на 12 часов. Надосадочную жидкость декантируют и образовавшийся осадок растирают с 20-25 мл холодного 96%-ного этанола до получения твердого осадка. Осадок отделяют центрифугированием при 2500 об/мин и дважды промывают 10-15 мл насыщенного раствора безводного ацетата натрия в этаноле. Полученный продукт высушивают в вакууме при температуре 35-40°C до постоянного веса. Получают 7,48 г НМГ-сырца, имеющего соотношение . Выход по стадии составляет 93%. Очистку полученного продукта и восстановление концевых групп проводят с использованием борогидрида натрия в водном растворе в течение 30-40 мин при комнатной температуре. Осаждают НМГ тремя объемами холодного этанола. Выход составляет 7,3 г (98%). Обессоливание и фракционирование проводят методом гельфильтрации на колонках с сефадексом G-25 и G-50 (Pharmacia, Швеция) по известным методикам. Фракции с Мм более 8000 Да и менее 1000 Да отбрасывают. Целевую фракцию высушивают лиофилизацией. Получали 5,38 г порошка, свойства которого приведены в табл.3. Подлинность подтверждали ПМР-спектроскопией (рис.2) и определением биологической активности по анти Xа/анти IIа факторам свертывания крови.
Схема реакции β-элиминирование бензилового эфира гепарина и образования концевых групп НМГ
Таблица 3
Влияние условий гидролиза бензилового эфира гепарина на характеристики конечного продукта фракционированного низкомолекулярного гепарина
Серия
Исходная с NaOH, моль/л
Массовое соотношение БЭ/щелочь
Мм<sub>ср,</sub> Да
Соотношение <img file="00000021.tif" he="7" wi="24" img-content="undefined" img-format="tif" />
Активность, МЕ/мг
Соотношение Xa/IIa
Анти Xa
Анти IIa
с.1.2.2. 1.
0,5
1/2
4400
2,13
109,8
31,2
3,52
с.1.2.2. 2.
1
1/3
4450
2,2
104,3
22,6
4,62
с.1.2.2. 3.
1,5
1/0,5
4100
1,88
107,9
20,8
5,19