ПОЛИПЕПТИДЫ АНТИТЕЛ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODY POLYPEPTIDES AND THEIR APPLICATION

Область изобретения
Данное изобретение в целом относится к области терапевтических и диагностических агентов и способов их применения, в частности в области рака предстательной железы.
Уровень техники
В настоящее время рак предстательной железы является наиболее распространенной формой рака у мужчин. Предстательная железа представляет собой железу размером грецкого ореха у мужчин, которая продуцирует жидкость, являющуюся компонентом семенной жидкости. Предстательная железа состоит из двух или более долей, или частей, заключенных во внешний слой ткани. Предстательная железа расположена перед прямой кишкой, сразу ниже мочевого пузыря и окружает мочеиспускательный канал.
Частота встречаемости рака предстательной железы выше всего в северо-западной части Европы и США. Рост опухоли обычно представляет процесс, который продолжается в течение длительного периода времени. Рак предстательной железы, как правило, представляет собой слабую форму рака. Фактически выживает и выздоравливает большинство мужчин, у которых диагностировали рак предстательной железы, только меньшинство из мужчин сталкивается с более агрессивной формой рака предстательной железы, который на ранней стадии образует метастазы. Данная агрессивная форма рака предстательной железы может быть только тогда курабельной, когда она диагностируется на ранней стадии перед распространением раковой опухоли во внешнекапсулярную ткань.
В настоящее время, как правило, диагноз и мониторинг рака предстательной железы выполняют путем измерения концентрации простат-специфического антигена (ПСА) в крови пациента. Если концентрация ПСА в значительной степени превышена при нескольких последовательных измерениях, выполненных в различные моменты времени, то дается оценка относительно существования вероятности наличия рака предстательной железы. В данный момент времени для проверки наличия рака предстательной железы может выполняться биопсия.
ПСА (также известный как калликреин III) представляет собой белок, состоящей из одной цепи, состоящей из 237 аминокислот, который продуцируется в секреторных клетках предстательной железы. Эти секреторные клетки могут обнаруживаться во всей предстательной железе. ПСА является хорошо охарактеризованным и всесторонне исследованным маркером, относящемся к раку предстательной железы. По сравнению со здоровыми клетками продукция ПСА ниже у злокачественных клеток и выше у гиперпластических клеток. Факт того, что концентрация ПСА в крови выше у мужчин, больных раком предстательной железы, является достаточно противоречивым. Однако одним объяснением этого может быть то, что злокачественная клетка обладает поврежденной клеточной структурой, и поэтому более проницаема для ПСА.
Другой важной сериновой протеазой, пригодной в качестве мишени для лечения рака предстательной железы, является гландулярный калликреин 2 (hK2) человека. Ген, кодирующий hK2, расположен на хромосоме 19 вместе с геном, кодирующим ПСА. Как и ПСА, hK2 главным образом экспрессируется тканью предстательной железы. В предстательной железе ПСА представлен в виде неактивной проформы, активируемой посредством действия пептидазы hK2. Иммуногистохимическое исследование в отношении hK2 показало, что hK2 экспрессируется во взаимодействии с уровнем дифференцировки. Это означает, что hK2 экспрессируется с более высоким выходом в ткани с низкой дифференцировкой, такой как ткань, подверженная раку предстательной железы, и с более низким выходом в ткани с высокой дифференцировкой, такой как ткань, подверженная доброкачественной гиперплазии простаты (ДГП), которая является другим распространенным нарушением функции предстательной железы.
Современные виды лечения рака предстательной железы представлены хирургическим вмешательством (например, радикальной простатэктомией), радиационной терапией (включая введение хлорида радия-223, брахиотерапию и наружную дистанционную лучевую терапию), фокусированным ультразвуком высокой интенсивности (HIFU), химиотерапией, пероральными химиотерапевтическими лекарственными средствами, криохирургией (замораживание опухоли), гормональной терапией (такой как антиандрогенная терапия), кастрацией или комбинациями вышеперечисленного.
Однако большинство из данных видов лечения (хирургическое вмешательство или наружная радиационная терапия) применимы для лечения только первичных опухолей и больших метастазов. Химиотерапия используется для диссеминированного рака, но для большинства таких пациентов она оказывает паллиативное действие и/или продлевает период выживания. Поэтому для достижения значительных улучшений в отношении злокачественных заболеваний необходимы другие или дополнительные методы лечения, в частности в случае микрометастазов.
В качестве возможной терапии диссеминированных заболеваний может назначаться такое лечение как иммунотерапия или радиоиммунотерапия с использованием нацеленных молекул, таких как антитела и их фрагменты.
Таким образом, существует необходимость в новых лекарственных средствах и способах лечения и диагностики рака предстательной железы.
Сущность изобретения
Соответственно, данное изобретение направлено на смягчение, облегчение или удаление одной или более недостаточностей в данной области и недостатков по отдельности или в любой комбинации, и преодолевает по меньшей мере вышеупомянутые нарушения путем предоставления лекарственных средств и способов в соответствии с приложенной патентной формулой.
В первом аспекте данного изобретения предложен полипептид антител со специфичностью связывания с простат-специфическим антигеном (ПСА), причем полипептид антител содержит
(a) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3
CDRH1:
TTGMGVS
SEQ ID NO: 1
CDRH2:
HIYWDDDKRYSTSLK
SEQ ID NO: 2
CDRH3:
KGYYGYFDY
SEQ ID NO: 3
и/или
(b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6
CDRL1:
RASQNVNTDVA
SEQ ID NO: 4
CDRL2:
STSYLQS
SEQ ID NO: 5
CDRL3:
QQYSNYPLT
SEQ ID NO: 6
и при этом вариабельный участок тяжелой цепи и вариабельный участок легкой цепи содержат каркасные аминокислотные последовательности из одного или более антител человека.
Представленные выше шесть аминокислотных последовательностей представляют определяющие комплементарность участки (CDR) полипептидов антител по данному изобретению, как определено в соответствии с Kabat et al., (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th edition, NIH, Bethesda, MD (описание которой включено в данный документ путем ссылки).
Термином «полипептид антитела» заявители охватывают практически интактные молекулы антител, одноцепочечные антитела, диатела, биспецифические антитела, тяжелые цепи антител, легкие цепи антител, гомодимеры и гетеродимеры из тяжелой и/или легкой цепей антител, а также антигенсвязывающие фрагменты и их производные.
Термин «аминокислоты», используемый в данном документе, включает стандартные двадцать кодируемых генетически аминокислот и их соответствующие стереоизомеры в D-форме (по сравнению с природной L-формой), омега-аминокислоты других аминокислот природного происхождения, нестандартные аминокислоты (например, α,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты и т.д.) и химически дериватизированные аминокислоты (см. ниже).
Когда аминокислоты конкретно обозначены, например как «аланин», «Ala» или «А», то такие обозначения относятся как к L-аланину, так и к D-аланину, если явным образом не указано иное. Другие нестандартные аминокислоты также могут представлять пригодные компоненты для полипептидов по данному изобретению, при условии, что полипептиду придается требуемое функциональное свойство. Для показанных пептидов каждый кодированный аминокислотный остаток, при необходимости, представлен однобуквенным обозначением, соответствующим тривиальному названию стандартной аминокислоты.
В одном варианте реализации изобретения полипептиды, определенные в данном документе, содержат или состоят из L-аминокислот.
Полипептиды антител по данному изобретению проявляют специфичность к ПСА и предпочтительно к зрелой активной форме ПСА человека.
Аминокислотная последовательность ПСА человека показана ниже
[SEQ ID NO:7]
(где подчеркнута последовательность зрелого активного белка ПСА; см. также по номеру доступа UniProtKB № P07288).
Большая часть ПСА, обнаруживаемая в плазме семенной жидкости, является неактивной и существует в комплексе с ингибитором белком C (PCI). Возможно также, что ПСА образует комплекс с другими внеклеточными ингибиторами протеаз. Исследованиями in vitro показано, что ПСА может связываться с α2-антиплазмином (α2-AP), ACT, AMG, антитромбином III (ATIII), C1-инактиватором и ингибитором-1 активатора плазминогена (PAI-1).
В одном варианте реализации изобретения полипептид антител обладает специфичностью к свободной (т.е. не в виде комплекса) изоформе ПСА по сравнению с изоформой ПСА в виде комплекса. Связывающие фрагменты со специфичностью к свободной изоформе ПСА могут обладать специфичностью связывания к эпитопу, который доступен на свободной изоформе ПСА, но недоступен на изоформе ПСА в виде комплекса, и он может быть линейным или конформационным (т.е. нелинейным) эпитопом. Например, полипептид антител может обладать специфичностью к эпитопу, который включает один или более аминокислотных остатков, являющихся частью каталитической щели ПСА, которая доступна на свободном ПСА и недоступна у изоформы в виде комплекса, такой как форма, присутствующая в семенной жидкости, в которой ПСА образует комплекс с PCI.
Термином «специфичность» заявители обозначают то, что полипептид антител способен связываться с ПСА in vivo, т.е. в физиологических условиях, в которых ПСА существует в организме человека. Предпочтительно, полипептид антител не связывается с любым другим белком in vivo.
Такую специфичность связывания можно определять такими хорошо известными в данной области техники методами, как ELISA, методами иммуногистохимии, иммунопреципитации, Вестерн-блотами и проточной цитометрией с использованием трансфецированных клеток, экспрессирующих ПСА. Преимущественно, полипептид антитела способен селективно связываться с ПСА, т.е. он связывается по меньшей мере в 10 раз сильнее с ПСА, чем с другими белками (в частности, другими калликреинами, такими как простат-специфический антиген или ПСА).
Полипептиды антител по данному изобретению основаны на выбранном гуманизированном варианте антитела 5A10, который проявляет неожиданно благоприятные свойства.
В частности, гуманизированные антитела по данному изобретению проявляют улучшенное поглощение опухолями по сравнению с исходным мышиным антителом 5A10 (m5A10), из которого получены их последовательности CDR (см. пример 6).
Термином «улучшенное поглощение опухолями» заявители обозначают то, что полипептид антитела по данному изобретению (гуманизированная форма антитела 5A10) при введении пациенту с опухолью предстательной железы может обеспечивать более высокую дозу поглощения опухолью, чем исходное мышиное антитело 5A10 c меньшей токсичностью для нормальных органов.
Неожиданно оказалось, что лучшее накопление в опухоли обеспечивает лучший терапевтический профиль антител по данному изобретению. В свою очередь это позволяет использовать более высокие дозы радиации, что приводит к большей эффективности при лечении рака предстательной железы без увеличения побочных эффектов или «сопутствующего повреждения» здоровых тканей и органов.
Гуманизация (также называемая реконструирование или прививание CDR) представляет собой методику снижения иммуногенности моноклональных антител из ксеногенных источников (обычно от таких грызунов как мыши) и улучшение активации ими иммунной системы человека (см. обзор Almagro & Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience 13:1619-1633; описания которого включено в данный документ путем ссылки). Несколько гуманизированных моноклональных антител проходят клинические исследования, а некоторые были одобрены для применения в качестве лекарственных средств. Хотя механизм продуцирования сконструированного моноклонального антитела с использованием методик молекулярной биологии относительно простой, обычное прививание определяющих комплементарность участков (CDR) грызунов на каркасы человека не всегда воссоздает аффинность связывания и специфичность исходного моноклонального антитела. При проведении гуманизации антитела в конструировании гуманизированного антитела при воспроизведении функционирования оригинальной молекулы возникает критический этап.
Конструкция гуманизированного антитела включает несколько ключевых выбираемых параметров, включая протяженности применяемых CDR и применяемых каркасов человека. Однако для того, чтобы сохранять специфичность исходного антитела, также может быть критически важным заменять один или более остатков из mAb грызуна на каркасные участки человека (так называемые обратные мутации). Идентификация положения необходимых обратных мутаций требует подробного анализа последовательности/структуры. Для изменения аминокислот в выбранных положениях недавно использовали фаговые библиотеки. Аналогичным образом, использовано множество подходов для выбора наиболее подходящих каркасов, на которые прививают CDR грызунов. В предыдущих экспериментах использовали ограниченную выборку хорошо охарактеризованных моноклональных антител человека (часто с известной структурой), независимо от идентичности данной последовательности моноклональному антителу грызуна (так называемый подход с фиксированными каркасами). Некоторые группы используют участки с высокой идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к вариабельным участкам грызунов (соответствие гомологии и наилучшее соответствие); другие используют консенсусные последовательности или последовательности зародышевой линии, тогда как остальные выбирают фрагменты каркасных последовательностей в пределах вариабельного участка легкой или тяжелой цепи из различных моноклональных антител человека. Разработаны также подходы к гуманизации, которые заменяют остатки грызунов на поверхности наиболее распространенными остатками, выявленными в моноклональных антителах человека (изменение поверхности или рекомбинация поверхностных остатков), и остатками, к которым применяются отличающиеся определения относительно CDR.
Однако, несмотря на расширенное исследование гуманизации антител, было подтверждено, что некоторые моноклональные антитела грызунов трудно гуманизировать.
Разработка полипептидов антител по данному изобретению требует введения обратных мутаций не только в каркасные участки, но также и в некоторые CDR (см. пример 2 ниже). Таким образом, шесть представленных выше последовательностей CDR в виде SEQ ID NO: от 1 до 6, получены из мышиного анти-ПСА антитела 5A10, но содержат мутации в CDRH2 (SEQ ID NO: 2) и CDRL1 (SEQ ID NO: 4) относительно исходного мышиного антитела. Эти мутации в CDR были введены с целью сообщения гуманизированному варианту 5A10 оптимальной специфичности и стабильности.
D
-9
В одном варианте реализации изобретения полипептиды антител по данному изобретению связывают ПСА с K более 0,1 x 10 M.
D
Методы измерения общей аффинности (K), скорости ассоциации (ka) и диссоциации (kd) взаимодействия (такого как взаимодействие между антителом и лигандом) являются хорошо известными в данной области техники. Типовые методы in vitro описаны ниже в примере 3. Допустимо также применять методы на основе проточной цитометрии (Sklar et al., 2002, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 31:97-119; описание которой включено в данный документ путем ссылки).
D
D
-10
-11
-11
-11
-11
-11
-11
-11
-11
-11
Преимущественно, полипептид антитела по данному изобретению обладает аффинностью (K) к ПСА ниже 1,0 x10 M, например, K ниже 9,0 x10 M, 8,0 x10 M, 7,0 x10 M, 6,0 x10 M, 5,0 x10 M, 4,0 x10 M, 3,0 x10 M, 2,0 x10 M или ниже 1,0 x10 M.
Специалистам в данной области техники будет понятно, что полипептиды антител по данному изобретению могут состоять из тяжелых цепей антител, легких цепей антител, гомодимеров и гетеродимеров из тяжелых и/или легких цепей антител, а также антигенсвязывающих фрагментов и их производных.
В одном варианте реализации изобретения полипептид антитела содержит или состоит из интактного (т.е. целого) антитела, такого как молекула IgA, IgD, IgE, IgG или IgM.
Преимущественно, полипептид антитела содержит или состоит из интактной молекулы IgG или антигенсвязывающего фрагмента или его производного.
Молекула IgG может быть любым известным подтипом, например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
2
H
L
Термином «антигенсвязывающие фрагменты и производные» антител заявители охватывают фрагменты Fv (например, одноцепочечные Fv и связанные посредством дисульфидов Fv), Fab-подобные фрагменты (например, фрагменты Fab, фрагменты Fab’ и фрагменты F(ab)) и доменные антитела (например, отдельные вариабельные домены V или вариабельные домены V).
Например, полипептид антитела может содержать или состоять из фрагмента scFv или Fab.
Дополнительным характерным признаком полипептидов антител по данному изобретению является наличие каркасных аминокислотных последовательностей из одного или более антител человека в вариабельных участках тяжелой или легкой цепи.
Термином «каркасные последовательности» заявители охватывают участки вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, отличающиеся от CDR. Обычно, каждый вариабельный домен будет содержать четыре каркасных участка, обозначенных от FR1 до FR4, в пределах которого расположено последовательности CDR:
FR1 ---- CDR1 ---- FR2 ---- CDR2 ---- FR3 ---- CDR3 ---- FR4.
Следует учитывать, что аминокислотные последовательности каркасных участков могут быть полностью человеческими или могут содержать одну или более обратных мутаций (т.е. аминокислотная последовательность, присутствующая в каркасе человека, может быть заменена аминокислотами, выявленными в соответствующем положении в пределах исходного вариабельного домена грызуна из которого получены CDR). Следовательно, последовательности FR1, FR2, FR3 и/или FR4 вариабельного (-ых) домена (-ов) полипептида антитела по данному изобретению могут быть искусственного происхождения.
В одном варианте реализации изобретения каркасные последовательности полипептида антитела разделяют по меньшей мере 70% идентичности последовательности с каркасными участками из одного или более антител человека, например, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более. Таким образом, полипептид антитела может содержать участок FR1 тяжелой цепи, который разделяет по меньшей мере 70% идентичности последовательности с участком FR1 антитела человека. Однако понятно, что тяжелая и легкая цепи полипептида антитела может сохранять идентичность последовательностей с каркасными участками различных антител человека.
Процентное значение идентичности можно определять, например, программой LALIGN (Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357) на сайте проекта Expasy (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html), используя в качестве параметров опцию общего выравнивания, матрицу оценки BLOSUM62, штраф за открытие гэпа –14, штраф за продолжение гэпа – 4. В альтернативном варианте процентное значение идентичности последовательностей между двумя полипептидами может определяться с использованием подходящих компьютерных программ, например, программы GAP группы по расчету генетических данных университета штата Висконсин и, следует учитывать, что процентное значение идентичности рассчитывается в отношении полипептидов, последовательности которых выровнены оптимальным образом.
Выравнивание может альтернативным образом выполняться с использованием программы Clustal W (как описано в Thompson et al., 1994, Nucl. Acid Res. 22:4673-4680, которая включена в данный документ путем ссылки). Используемые параметры могут быть следующими:
- Параметры быстрого попарного выравнивания: размер K-строки (слова); 1, размер окна; 5, штраф за гэп; 3, количество верхних диагоналей; 5. Метод оценки: x процент.
- Параметры множественного выравнивания: штраф за открытие гэпа; 10; штраф за продолжение гэпа; 0,05.
- Матрица оценки: BLOSUM.
В альтернативном варианте для определения выравниваний локальных выравниваний последовательностей можно использовать программу BESTFIT.
В одном варианте реализации изобретения каркасные последовательности тяжелого вариабельного домена полипептида антитела по данному изобретению кодируются семейством генов иммуноглобулина VH4 человека.
Например, каркасные последовательности могут кодироваться, по меньшей мере частично, геном зародышевой линии VH4-28 (например, FR1, FR2 и FR3 могут кодироваться VH4-28, а FR4 может кодироваться JH1).
Таким образом, в одном варианте реализации изобретения полипептид антитела может содержать или состоять из вариабельного участка тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8 (причем последовательности CDR подчеркнуты и выделены жирным шрифтом):
[SEQ ID NO: 8].
В одном варианте реализации изобретения каркасные последовательности легкого вариабельного домена полипептида антитела по данному изобретению кодируются семейством генов иммуноглобулина V4-каппа человека.
Например, каркасные последовательности могут кодироваться, по меньшей мере частично, геном зародышевой линии IgkV4-B3 (например, FR1, FR2 и FR3 могут кодироваться IgkV4-B3, а FR4 может кодироваться JK2).
Таким образом, в одном варианте реализации изобретения полипептид антитела может содержать или состоять из вариабельного участка легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 (причем последовательности CDR подчеркнуты и выделены жирным шрифтом):
[SEQ ID NO: 9].
Выражением «по меньшей мере в частности» заявители охватывают то, что каркасные последовательности содержат по меньшей мере десять последовательных аминокислот, кодированных эталонным геном, например, по меньшей мере 20 последовательных аминокислот. Заявители также заключают, что один или более, но не все участки FR кодируются эталонным геном (например, FR1 и FR2 могут кодироваться эталонным геном, но не FR3).
В предпочтительном варианте реализации изобретения полипептид антитела содержит вариабельный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:8 и вариабельный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
Необязательно, полипептид антитела по данному изобретению дополнительно содержит константный участок тяжелой цепи или его часть.
В одном варианте реализации изобретения полипептид антитела содержит участок CH1, CH2 и/или CH3 тяжелой цепи IgG (такой как тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4). Таким образом, полипептид антитела может содержать часть или все из константных участков тяжелой цепи IgG1. Например, полипептид антитела может представлять собой фрагмент Fab, содержащий константные участки CH1 и CL.
В одном варианте реализации изобретения полипептид антитела может содержать Fc-участок антитела. Специалисту в данной области техники понятно, что Fc-часть может быть взята из антитела IgG или из другого класса антител (такого как IgM, IgA, IgD или IgE). В одном варианте реализации изобретения Fc-участок взят антитела IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
Fc-участок может быть природного происхождения (например, часть эндогенно продуцируемого антитела) или может быть искусственным (например, содержащим одну или более точечных мутаций относительно Fc-участка природного происхождения и/или модификации в углеводных фрагментах в пределах домена CH2). Преимуществами могут обладать Fc-участки с точечными мутациями, улучшающими способность участков к связыванию FcR, например путем изменения периода полувыведения из сыворотки или путем модуляции (т.е. усиления или снижения) связывания с рецепторами Fcγ (FcγR), вовлеченными в антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ) и КЗЦ (комплемент-зависимую цитотоксичность).
Преимущественно, полипептид антитела может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или ее часть:
A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P E P V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S S S L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K K V E P K S C D K T H T C P P C P A P E L L G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H E D P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T V L H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A P I E K T I S K A K G Q P R E P Q V Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G Q P E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S C S V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K
[SEQ ID NO: 10].
Необязательно, полипептид антитела по данному изобретению дополнительно содержит константный участок легкой цепи или его часть.
В одном варианте реализации изобретения полипептид антитела содержит участок CL легкой цепи IgG (такой как легкая цепь каппа или лямбда).
Например, полипептид антитела может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, или ее часть:
T V A A P S V F I F P P S D E Q L K S G T A S V V C L L N N F Y P R E A K V Q W K V D N A L Q S G N S Q E S V T E Q D S K D S T Y S L S S T L T L S K A D Y E K H K V Y A C E V T H Q G L S S P V T K S F N R G E C
[SEQ ID NO: 11].
Преимущественно, полипептид антитела содержит константный участок тяжелой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, и константный участок легкой цепи, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
В одном предпочтительном варианте реализации изобретения полипептид антитела по данному изобретению содержит:
(а) тяжелую цепь, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12 (причем вариабельный участок выделен жирным шрифтом, а последовательности CDR подчеркнуты)
[SEQ ID NO: 12]
и/или
(b) легкую цепь, которая содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 (причем вариабельный участок выделен жирным шрифтом, а последовательности CDR подчеркнуты)
[SEQ ID NO: 13].
Например, полипептид антитела может содержать аминокислотную последовательность или состоять из двух тяжелых цепей SEQ ID NO: 12 и двух легких цепей SEQ ID NO: 13, соединенных вместе дисульфидными мостиками с образованием типичной структуры антитела IgG.
Полипептиды антител по данному изобретению могут содержать или состоять из одной или более аминокислот, которые были модифицированы или дериватизированы.
Химические производные одной или более аминокислот могут быть получены путем реакции с функциональной боковой группой. Такие дериватизированные молекулы включают, например, те молекулы, в которых свободные аминоногруппы были дериватизированы с образованием гидрохлоридов аминов, п-толуолсульфонильных групп, карбоксибензоксильных групп, трет-бутилокарбонильных групп, хлорацетильных групп или формильных групп. Свободные карбоксильные группы могут быть дериватизированы с образованием солей, метильных и этильных сложных эфиров или других типов сложных эфиров и гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть дериватизированы с образованием O-ацильных или O-алкильных производных. В качестве химических производных включены также те пептиды, которые содержат производные аминокислот природного происхождения из двадцати стандартных аминокислот. Например: 4-гидроксипролин может быть заменой пролина; 5-гидроксилизин может быть заменой лизина; 3-метилгистидин может быть заменой гистидина; гомосерин может быть заменой серина, а орнитин – лизина. Производные также включают пептиды, содержащие одно или более добавлений или делеций, при условии сохранения требуемой активности. Другие включаемые модификации представляют амидирование, аминоконцевое ацилирование (например, ацетилирование или амидирование тиогликолевой кислоты), концевое карбоксиламидирование (например, с помощью аммиака или метиламина) и тому подобные концевые модификации.
Дополнительно специалисту в данной области техники понятно, что также могут использоваться пептидомиметические соединения. Термин «пептидомиметический» относится к соединению, которое имитирует конформацию и требуемые признаки конкретного пептида в форме лекарственного средства.
2
Например, указанный полипептид включает не только молекулы, в которых аминокислотные остатки соединены пептидными (-CO-NH-) связями, но также молекулы, в которых пептидная связь обращена. Такие ретро-инвертированные пептидомиметики могут получать с использованием хорошо известных в данной области техники способов, например, таких как описанные в Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, которая включена в данный документ путем ссылки. В этом подходе создают псевдопептиды, содержащие изменения, включенные в остов, а не изменения ориентации боковых цепей. Ретро-инвертированные пептиды, которые содержат связи NH-CO вместо пептидных связей CO-NH, являются намного более устойчивыми к протеолизу. В альтернативном варианте указанный полипептид может быть пептидомиметическим соединением, в котором один или более аминокислотных остатков вместо традиционной амидной связи соединены связью -y(CHNH)-.
В дополнительном альтернативном варианте пептидная связь может быть распределена со всеми, с тем условием что используется подходящий линкерный фрагмент, который сохраняет промежуток между атомами углерода аминокислотных остатков; для линкерного фрагмента может иметь преимущество наличие практически такого же распределения зарядов и практически такой же планарности как у пептидной связи.
Следует учитывать, что указанный полипептид традиционно можно блокировать по его N- или C-концу, чтобы способствовать снижению чувствительности к экзопротеолитическому расщеплению.
Для модификации пептидов млекопитающих можно также использовать множество некодируемых или модифицированных аминокислот, таких как D-аминокислоты и N-метиламинокислоты. В дополнение к этому, предполагаемая биологически активная конформация может стабилизироваться ковалентной модификацией, такой как циклизация или введение лактамного или иных типов мостиков, например см. Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636 и Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166, которые включены в данный документ путем ссылки.
Специалистам в данной области техники понятно, что полипептиды антител по данному изобретению могут дополняться функциональным фрагментом для облегчения их предполагаемого применения, например в качестве средства для визуализации in vivo или терапевтического средства.
Таким образом, в одном варианте реализации изобретения полипептид антитела прямо или опосредованно связан с терапевтическим фрагментом.
90
32
186
188
166
76
77
89
153
131
177
67
161
105
45
35
51
67
99
m
111
114m
123
125
201
212
213
223
225
212
255
223
149
221
Может применяться любой подходящий терапевтический фрагмент. Подходящий терапевтический фрагмент представляет собой фрагмент, который способен снижать или ингибировать рост или, в частности, уничтожать раковые клетки простаты. Например, терапевтическое средство может представлять собой цитотоксический фрагмент. Цитотоксический фрагмент может содержать или состоять из одного или более радиоизотопов. Например, каждый один или более радиоизотопов могут быть независимо выбраны из группы, состоящей из бета-излучателей, Оже-излучателей, излучателей с конверсией электронов, альфа-излучателей и излучателей фотонов низкой энергии. Может требоваться, чтобы каждый один или более радиоизотопов независимо имели профиль излучения локально поглощенной энергии, который создает высокою поглощенную дозу в непосредственной близости от средства. Типовые радиоизотопы могут включать бета-излучатели дальнего диапазона, такие как Y, P, Re/Re; Ho, As/As, Sr,Sm; бета-излучатели среднего диапазона, такие как I, Lu, Cu,Tb, Rh; бета-излучатели низкой энергии, такие как Ca или S; конверсионные или Оже-излучатели, такие как Cr, Ga, Tc, In,In, I, I, Tl; и альфа-излучатели, такие как Bi, Bi, Ac, Ac, Pb, Fm, Ra, Tb и At. Доступны и будут доступны другие радионуклиды для применения в данной терапии.
В другом варианте реализации изобретения может требоваться, чтобы терапевтический фрагмент или цитотоксический фрагмент не являлись фрагментом, описанным как «трейсер» в WO 2006/087374 A1, конкретно на с. 11, строки 7-15.
177
В одном предпочтительном варианте реализации изобретения полипептид антитела связан с (или иным образом маркирован) радиоизотопом Lu.
В альтернативном варианте терапевтический фрагмент может содержать или состоять из одного или более терапевтических (таких как цитотоксических) средств, например, цитостатического лекарственного средства; антиандрогенного лекарственного средства; кортизона и его производных; фосфоната; ингибитора тестостерон-5-α-редуктазы; соединения с присоединенным бором; цитокина; тапсигаргина и его метаболитов; токсина (такого как сапонин или калихеамицин); химиотерапевтического средства (такого как антиметаболит) или любого другого терапевтического или цитотоксического средства, используемого при лечении карциномы простаты.
Типовые терапевтические/цитотоксические средства могут, например, включать:
• Цитостатики, в частности с ограничивающими дозу побочными эффектами, включающими, но ограничивающимися ими, циклофосфамид, хлорамбуцил, ифосфамид, бусульфан, ломустин, таксаны, эстрамустина фосфат и другие азотные иприты, антибиотики (включая доксорубицин, калихеамицины и эсперамицин), алкалоиды барвинка, азаридины, содержащие платину соединения, эндостатин, алкилсульфонаты, нитрозомочевины, триазены, аналоги фолиевой кислоты, аналоги пиримидина, аналоги пурина, ферменты, замещенную мочевину, производные метилгидразина, даунорубицин, амфипатические амины,
• Антиандрогены, такие как флутамид и бикалутамид, и их метаболиты;
• Кортизон и его производные;
• Фосфонаты, такие как дифосфонат и буфосфонат;
• Ингибиторы тестостерон-5-α-редуктазы;
• Соединения с присоединенным бором;
• Цитокины;
• Тапсигаргин и его метаболиты;
• Другие средства, применяемые при лечении карциномы простаты.
В альтернативном варианте цитотоксический фрагмент может содержать или состоять из одного или более фрагментов, пригодных для применения в радиационной терапии, такой как фотонная радиационная терапия, нейронная радиационная терапия, нейтронно-индуцированная Оже-электронная терапия, терапия с синхротронным облучением и рентгеновская фотонная радиационная терапия низкой энергии.
Например, вместе с полипептидами антител по данному изобретению существует возможность использования синхротронного облучения (или рентгеновского излучения низкой энергии) для расширенной радиотерапии, первичного фокусирования при так называемой фото-активационной радиотерапии (ФАТ), в которой локальное накопление энергии в раковой ткани от внешнего рентгеновского излучения усиливается путем взаимодействия с предварительно введенным нацеленным на опухоль средством с большим атомным номером.
В способе лечения ФАТ используют монохроматическое рентгеновское излучение из синхротронного источника, предоставляемое биомедицинским излучателем ID17 в Европейском центре синхротронной радиации (ESRF) в городе Гренобль, и как предположительно будет возможно в будущем в других центрах, таких как новый Шведский синхротронный центр, Max-IV.
7
157
В качестве потенциального способа лечения проходит исследование «индуцированная Оже-электронная терапия опухолей» на Европейском источнике нейронов ядерного деления (ESS) в г. Лунд, также являющегося медицинской экспериментальной установкой. Реактор, генерирующий тепловые и полутепловые нейтроны, долгое время использовали для бор-нейтрон-захватной терапии, BNCT, как в доклинических экспериментах, так и для лечения опухолей мозга, с индуцированными альфа-частицами и ядром отдачи (Li), которое дает высокую плотность локально поглощенной энергии (поглощенной дозы). Сходный подход заключается в применении нейронов и подходящих нацеливающихся на опухоли молекул, меченых стабильными атомными ядрами с высоким сечением захвата нейтронов. Антитела или пептиды можно, к примеру, метить стабильным гадолинием (Gd) и использовать в качестве целевой молекулы для нейтронов, которые захватываются ядром Gd, так называемая гадолиний-нейтрон-захватная терапия (GdNCT). Методами Монте-Карло рассчитывают распределение дозы в опухоли и окружающих тканях, получающееся в результате действия γ-фотонов, нейтронов, ядер отдачи, а также характерного рентгеновского излучения, внутренней конверсии и Оже-электронов, образующихся из гадолиния или других потенциальных элементов.
Как обсуждается выше, терапевтический фрагмент (такой как радиоизотоп, цитотоксический фрагмент или т.п.) может быть прямо или опосредованно соединен со связывающим фрагментом (таким как антитело или его фрагмент). Подходящие линкеры известны в данной области техники и включают, например, простетические группы, нефенольные линкеры (производные N-сукцимидилбензоатов; додекаборат), хелатирующие фрагменты как макроциклических, так и ациклических хелатирующих веществ, таких как производные 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA), дефероксамина (DFO), производные диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), производные S-2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусной кислоты (NOTA) и производные 1,4,8,11-тетраазациклододекан-1,4,8,11-тетрауксусной кислоты (TETA), производные 3,6,9,15-тетраазабицикло[9.3.1]-пентадека-1(15),11,13-триен-4-(S)-(4-изотиоцианато-бензил)-3,6,9-триуксусной кислоты (PCTA), производные 5-S-(4-аминобензил)-1-окса-4,7,10-триазациклододекан-4,7,10-трис(уксусной кислоты) (DO3A) и другие хелатирующие фрагменты. Применение таких линкеров может быть особенно приемлемо в случаях, когда средство содержит или состоит из антитела или его фрагмента, в качестве связывающего фрагмента, присоединенного посредством линкера к радиоизотопу в виде терапевтического фрагмента.
177
Один предпочтительный линкер представляет собой DTPA, например, применяемый в Lu-DTPA-[полипептид антитела по данному изобретению].
89
Дополнительный предпочтительный линкер представляет собой дефероксамин, DFO, например, применяемый в Zr-DFO-[полипептид антитела по данному изобретению], предпочтительно для диагностического применения.
99m
111
67
68
72
89
123
201
86
90
124
211
Необязательно, полипептид антитела по данному изобретению может дополнительно содержать (или не содержать) выявляемый фрагмент. Например, выявляемый фрагмент может содержать или состоять из радиоизотопа, такого как радиоизотоп, выбранный из группы, состоящей из Tc, In, Ga, Ga, As,Zr, I и Tl. Необязательно, средство может содержать пару из выявляемого и цитотоксического радионуклидов, таких как Y/Y или I/At. В альтернативном варианте средство может содержать радиоизотоп, способный одновременно действовать комбинированным способом, как выявляемый фрагмент, а также как цитотоксический фрагмент для получения так называемых «комбинированных тераностических средств». Таким образом, связывающие фрагменты можно соединять с наночастицами, которые обладают способностью обеспечивать мультивизуализацию (например, ОФЭКТ (однофотонная эмиссионная компьютерная томография), ПЭТ (позитронно-эмиссионная томография), магниторезонансная томография (МРТ), оптическая или ультразвуковая визуализация), вместе с терапевтической способностью используемых цитотоксических лекарственных средств, таких как радионуклиды или химиотерапевтические средства. В данное изобретение также включена возможность лечения методом гипертермии с использованием высокочастотных переменных магнитных полей и сопровождающей ультразвуковой визуализации.
157
55
162
52
56
В альтернативном варианте выявляемый фрагмент может содержать или состоять из парамагнитного изотопа, такого как парамагнитный изотоп, выбранный из группы, состоящей из Gd, Mn, Dy, Cr и Fe.
В случае, если полипептид антитела содержит выявляемый фрагмента, впоследствии выявляемый фрагмент может выявляться такой методикой визуализации, как ОФЭКТ, ПЭТ, МРТ, оптической или ультразвуковой визуализацией.
Терапевтические и выявляемые фрагменты могут быть конъюгированы или другим образом комбинированы с полипептидом антитела с использованием хорошо известных в данной области техники способов (например, существующей терапией иммуноконъюгатами, гентузумабом озогамицином [торговая марка: Mylotarg], содержащим моноклональное антитело, присоединенное к цитотоксину калихеамицину).
В дополнительном варианте реализации изобретения полипептид антитела по данному изобретению применяют для лечения рака предстательной железы в форме состава, содержащего популяцию молекул полипептидов антитела. В одном варианте все (или практически все, например, по массе более 90%, 95%, 99%, 99,9% или более) молекул полипептида антитела в популяции могут содержать одинаковый терапевтический фрагмент. В другом варианте популяция содержит смесь других средств с различными терапевтическими фрагментами. Данный вариант предоставляет возможности усиления воздействий нацеленной радионуклидной терапии с использованием различных средств, таких как химиотерапевтические средства, гормональные терапевтические средства или другие комбинации видов терапии, в который нацеливающее средство не только доставляет терапевтически активные радионуклиды к ассоциированным с опухолями антигенам, но также одновременно радиосенсибилизирует целевые опухолевые клетки путем модуляции (например, запуска или блокирования) внутриклеточного каскада передачи сигнала. Данный вариант также пригоден при лечении рака предстательной железы смесью цитотоксических средств, например, используя для комбинированного лечения больших опухолей, микрометастазов и одиночных опухолевых клеток смесь альфа-излучателей и бета-излучателей различных диапазонов или смесь радионуклидов с различным диапазоном, LET (линейная передача энергии) и RBE (относительный биологический эффект). В одном варианте реализации изобретения для лечения больших опухолей можно использовать излучатели дальнего диапазона, а для лечения более мелких опухолей, таких как микрометастазы и одиночные опухолевые клетки можно использовать излучатели ближнего диапазона.
Необязательно, полипептид антитела по данному изобретению может дополнительно содержать (или не содержать) фрагмент для увеличения периода полувыведения средства in vivo. Типовые фрагменты для увеличения периода полувыведения агента in vivo могут содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ), человеческий сывороточный альбумин, группы гликозилирования, жирные кислоты и декстран. В частности, предполагается ПЭГ.
Следует учитывать, что полипептиды по данному изобретению можно лиофилизировать для хранения и растворения в подходящем носителе перед использованием, например, посредством сублимационной сушки, распылительной сушки, распылительного охлаждения или посредством применения способа образования частиц (преципитации) из диоксида углерода в сверхкритическом состоянии. Можно применять любой подходящий способ лиофилизации (например, сублимационная сушка, распылительная сушка, высушивание замороженного продукта) и/или методики растворения. Специалистам в данной области техники понятно, что лиофилизация и растворение могут приводить к переменной степени потери активности и что используемые концентрации могут требовать корректировки в сторону повышения с целью компенсации потерь. Предпочтительно потери лиофилизированного (сублимационно высушенного) полипептида при регидратации не превышают около 1% его активности (до лиофилизации) или не превышают около 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или более около 50% его активности (до лиофилизации) при регидратации.
Способы продукции полипептидов по данному изобретению хорошо известны в данной области техники.
Традиционно, полипептид представляет собой или содержит рекомбинантный полипептид. Подходящие способы продукции таких рекомбинантных полипептидов хорошо известны в данной области техники, например, экспрессия в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах (например, см. Sambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York, соответствующие описания которой явным образом включены в данный документ путем ссылки).
Полипептиды антител по данному изобретению также можно продуцировать с использованием коммерчески доступных систем трансляции in vitro, таких как лизат ретикулоцитов кроликов или лизат зародышей пшеницы (доступны у Promega). Предпочтительно, система трансляции представляет собой лизат ретикулоцитов кролика. Традиционно, система трансляции может быть соединена с системой транскрипции, такой как система транскрипции-трансляции TNT (Promega). Данная система обладает преимуществом продуцирования подходящего транскрипта мРНК из кодирующего ДНК-полинуклеотида в той же реакции, что и трансляция.
Специалистам в данной области понятно, что полипептиды по данному изобретению в альтернативном варианте можно синтезировать искусственно, например, с использованием хорошо известной жидкофазной или твердофазной методики синтеза (такой как твердофазный синтез пептидов т-Boc или Fmoc).
Во втором аспекте изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид антитела по данному изобретению, или компонент его полипептидной цепи. Термином «молекула нуклеиновой кислоты» заявители охватывают молекулы ДНК (например, геномную ДНК или комплементарную ДНК) и мРНК, которые могут быть одно- или двухцепочечными.
В одном варианте реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу кДНК.
Специалистам в данной области понятно, что молекула нуклеиновой кислоты может быть кодоноптимизированной для экспрессии полипептида антитела в конкретной хозяйской клетке, например для экспрессии в человеческих клетках (например, см. Angov, 2011, Biotechnol. J. 6(6):650-659).
В предпочтительном варианте реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению содержит:
(a) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 14
CAGGTCACACTGAAGGAATCTGGGCCTGCTTTGGTGAAGCCCACTCAGACTCTGACACTCACATGCACCTTCTCCGGGTTTAGCCTGTCAACCACCGGTATGGGCGTGAGTTGGATTCGCCAACCACCGGGTAAAGCGCTTGAGTGGCTTGCACACATCTATTGGGACGATGACAAGCGGTACAGTACTAGCCTGAAAACGAGACTGACCATAAGCGAGGACTCATCCAAGAATCAGGTGGTACTGACGATGACCAACATGGATCCCGTTGATACCGCCACATACTACTGTGCCAGGAAAGGCTACTATGGCTATTTCGACTATTGGGGACAGGGAACACTCGTCACTGTGTCCTCT
[SEQ ID NO: 14]
и/или
(b) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 15
GACATCCAGATGACCCAATCTCCCTCTAGCTTGTCCGCTAGTGTCGGTGATAGGGTGACAGTGACATGCAGAGCTAGCCAGAATGTCAACACAGACGTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCACCCAAAGCCCTCATCTTCTCCACGTCATATCTGCAAAGCGGAGTACCTTCCCGGTTTAGTGGGTCTGGGTCAGGCACTGACTTCACCCTGACCATATCCAGCCTTCAACCGGAAGATTTCGCGACCTACTACTGTCAGCAGTACAGCAACTATCCTCTGACTTTTGGACAGGGCACTAAGGTGGAGATTAAGCGT
[SEQ ID NO: 15].
Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты по данному изобретению может содержать
(a) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 16
CAGGTCACACTGAAGGAATCTGGGCCTGCTTTGGTGAAGCCCACTCAGACTCTGACACTCACATGCACCTTCTCCGGGTTTAGCCTGTCAACCACCGGTATGGGCGTGAGTTGGATTCGCCAACCACCGGGTAAAGCGCTTGAGTGGCTTGCACACATCTATTGGGACGATGACAAGCGGTACAGTACTAGCCTGAAAACGAGACTGACCATAAGCGAGGACTCATCCAAGAATCAGGTGGTACTGACGATGACCAACATGGATCCCGTTGATACCGCCACATACTACTGTGCCAGGAAAGGCTACTATGGCTATTTCGACTATTGGGGACAGGGAACACTCGTCACTGTGTCCTCTGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
[SEQ ID NO: 16]
и/или
b) нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 17
GACATCCAGATGACCCAATCTCCCTCTAGCTTGTCCGCTAGTGTCGGTGATAGGGTGACAGTGACATGCAGAGCTAGCCAGAATGTCAACACAGACGTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCAAAGCACCCAAAGCCCTCATCTTCTCCACGTCATATCTGCAAAGCGGAGTACCTTCCCGGTTTAGTGGGTCTGGGTCAGGCACTGACTTCACCCTGACCATATCCAGCCTTCAACCGGAAGATTTCGCGACCTACTACTGTCAGCAGTACAGCAACTATCCTCTGACTTTTGGACAGGGCACTAAGGTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
[SEQ ID NO: 17].
В объем данного изобретения также включены следующие аспекты:
(a) в третьем аспекте изобретения предложен вектор (такой как экспрессионный вектор), содержащий молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом изобретения;
(b) в четвертом аспекте изобретения предложена хозяйская клетка (такая как клетка млекопитающего, например клетка человека), содержащая молекулу нуклеиновой кислоты в соответствии со вторым аспектом изобретения или вектор в соответствии с третьим аспектом изобретения; и
(c) в пятом аспекте изобретения предложен способ получения полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения, включающий культивирование популяции клеток-хозяев в соответствии с четвертым аспектом изобретения в условиях, в которых указанный полипептид экспрессируется, и выделение из нее данного полипептида.
В шестом аспекте изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически эффективное количество полипептида антитела по первому аспекту изобретения и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель.
В фармацевтические композиции также можно включать дополнительные соединения, включая хелатирующие вещества, такие как ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота), цитрат, ЭГТК (этиленгликольтетрауксусная кислота) или глутатион.
Фармацевтические композиции могут получать известным в данной области техники способом, который обеспечивает достаточную стабильность при хранении и пригодность для введения людям и животным. Например фармацевтические композиции можно лиофилизировать, например, посредством сублимационной сушки, распылительной сушки, распылительного охлаждения или посредством применения способа образования частиц из диоксида углерода в сверхкритическом состоянии.
Термином «фармацевтически приемлемый» заявители обозначают нетоксическое вещество, которое не снижает эффективность в отношении активности связывания белка калликреина средства по данному изобретению. Такие фармацевтически приемлемые буферы, носители или наполнители хорошо известны в данной области техники (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000), описания которых включены в данный документ путем ссылки).
Термин «буфер» предназначен для обозначения водного раствора, содержащего кислотно-основную смесь с целью стабилизации pH. Примеры буферов включают Тризма, Бицин, Трицин, MOPS, MOPSO, MOBS, Трис, Гэпэс, HEPBS, MES, фосфат, карбонат, ацетат, цитрат, гликолят, лактат, борат, ACES, ADA, тартрат, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, какодилат, CHES, DIPSO, EPPS, этаноламин, глицин, HEPPSO, имидазол, имидазолмолочную кислоту, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO и TES.
Термин «разбавитель» предназначен для обозначения водного раствора, содержащего водный или неводный раствор с целью разбавления средства в фармацевтическом препарате. Разбавитель может быть одним или более из солевого раствора, воды, полиэтиленгликоля, пропиленгликоля, этанола или масел (таких как сафлоровое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кунжутное масло).
Термин «адъювант» предназначен для обозначения любого соединения, добавляемого к составу для увеличения биологического действия средства по данному изобретению. Адъювант может быть одним или более из солей цинка, меди или серебра с различными анионами, например, но не исключая их, фторид, хлорид, бромид, йодид, тиоцианат, сульфит, гидроксид, фосфат, карбонат, лактат, гликолят, цитрат, борат, тартрат и ацетаты из различных ацильных соединений. Адъювант также может представлять собой катионные полимеры, такие как катионные сложные эфиры целлюлозы, деацетилированную гиалуроновую кислоту, хитозан, катионные дендримеры, катионные синтетические полимеры, такие как поли(винилимидазол) и катионные полипептиды, такие как полигистидин, полилизин, полиаргинин и пептиды, содержащие эти аминокислоты.
Наполнитель может представлять собой один или более из углеводов, полимеров, липидов и минеральных веществ. Примеры углеводов включают лактозу, глюкозу, сахарозу, маннит и циклодекстрины, которых добавляют к композиции, например для облегчения лиофилизации. Примерами полимеров являются крахмал, сложные эфиры целлюлозы, целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, карагинаны, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, полисульфонат, полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид, сополимеры полиэтиленоксида/полипропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинилацетат различной степени гидролиза и поливинилпирролидон, все с различной молекулярной массой, которые добавляют к композиции, например для контроля вязкости, для достижения биоадгезии или для защиты липида от химической и протеолитической деградации. Примерами липидов являются жирные кислоты, фосфолипиды, моно-, ди- и триглицериды, церамиды, сфинголипиды и гликолипиды, все с различной длиной ацильной цепи и насыщения, яичный лецитин, соевый лецитин, гидрогенизированный яичный и соевый лецитин, которые добавляют к композиции по причинам, сходным с таковыми для полимеров. Примерами минеральных веществ являются тальк, оксид магния, оксид цинка и оксид титана, которые добавляют в композицию для получения таких преимуществ, как снижение накопления жидкости или преимущества свойств пигментов.
Полипептиды антител по данному изобретению можно готовить в виде любого типа фармацевтической композиции, известной в данной области техники, пригодной для их доставки.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтические композиции по данному изобретению могут существовать в форме липосомы, в которой полипептид антитела сочетается, в дополнение к другим фармацевтически приемлемым носителям, с амфипатическими средствами, такими как липиды, существующими в агрегированных формах в виде мицелл, нерастворимых монослоев и жидких кристаллов. Подходящие липиды для липосомального состава включают, без ограничений, моноглицериды, диглицериды, сульфатиды, лизолецитин, фосфолипиды, сапонин, желчные кислоты и тому подобное. Подходящие липиды также включают упомянутые выше липиды, модифицированные в полярной головной группе поли(этиленгликолем) для продления времени циркуляции в кровотоке. Способ получения таких липосомальных составов можно найти, например, в патенте США 4235871, описание которого включено в данный документ путем ссылки.
Фармацевтические композиции по данному изобретению также могут существовать в форме биоразлагаемых микросфер. При получении микросфер в качестве биоразлагаемых полимеров широко используются алифатические сложные полиэфиры, такие как поли(молочная кислота) (PLA), поли(гликолевая кислота) (PGA), сополимеры PLA и PGA (PLGA) или поли(капролактон) (PCL), и полиангидриды. Способы получения таких микросфер можно найти, например, в патенте США 5851451 и EP 0 213 303, описания которых включены в данный документ путем ссылки.
В дополнительном варианте реализации изобретения фармацевтические композиции по данному изобретению представлены в форме полимерных гелей, в которых такие полимеры как крахмал, сложные эфиры целлюлозы, целлюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, этилгидроксиэтилцеллюлоза, альгинаты, карагинаны, гиалуроновая кислота и ее производные, полиакриловая кислота, поливинилимидазол, полисульфонат, полиэтиленгликоль/полиэтиленоксид, сополимеры полиэтиленоксида/полипропиленоксида, поливиниловый спирт/поливинилацетат различной степени гидролиза и поливинилпирролидон, используют для загущения содержащего средство раствора. Полимеры также могут содержать желатин или коллаген.
В альтернативном варианте полипептиды антител можно просто растворять в солевом растворе, воде, полиэтиленгликоле, пропиленгликоле, этаноле или маслах (таких как сафлоровое масло, кукурузное масло, арахисовое масло, хлопковое масло или кунжутное масло), трагакантовой камеди и/или различных буферах.
Следует учитывать, что фармацевтические композиции по данному изобретению могут содержать ионы и иметь определенное значение pH для потенциирования действия активного полипептида антитела. Фармацевтические композиции можно подвергать обычным фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или они могут содержать обычные адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты, эмульгаторы, буферы, наполнители и тому подобное.
Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением можно вводить посредством любого подходящего пути, известного специалисту в данной области техники. Таким образом, пути введения включают парентеральное (внутривенное, подкожное и внутримышечное), местное, внутриглазное, назальное, легочное, буккальное, пероральное, парентеральное и ректальное. Возможно также введение посредством имплантов. Желательным путем может быть инфузия из-за потенциально высокой цитотоксичности вводимого средства.
В одном варианте реализации изобретения фармацевтические композиции вводят парентерально, например, внутривенно, интрацеребровентрикулярно, внутрисуставно, внутриартериально, внутрибрюшинно, интратекально, интравентрикулярно, внутригрудинно, интракраниально, внутримышечно или подкожно, или их можно вводить путем инфузионных методик. Композиции традиционно применяют в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточное количество солей или глюкозы для того, чтобы получить раствор, являющийся изотоничным по отношению к крови. Водные растворы должны быть соответствующим образом забуференными (например, до рН от 3 до 9), если это необходимо. Приготовление подходящих парентеральных составов в стерильных условиях легко осуществлять с помощью стандартных фармацевтических методик, хорошо известных специалистам в данной области техники.
Составы, пригодные для парентерального введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты и растворенные вещества, которые делают композицию изотоничной по отношению к крови предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Составы могут быть представлены в однодозовых или мультидозовых контейнерах, например, герметично закрытых ампулах или флаконах, и могут храниться в высушенном после замораживания (лиофилизированном) состоянии, которые непосредственно перед применением требует всего лишь добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекций. Экстемпоральные инъекционные растворы и суспензии можно готовить из стерильных порошков, гранул и таблеток, в описанном выше виде.
Таким образом, фармацевтические композиции по данному изобретению, в частности, пригодны для парентерального, например внутривенного введения или местного введения, в опухоль в организме пациента (например, внутрь опухоли или перитуморально).
Фармацевтические композиции должны вводить пациенту в фармацевтически эффективной дозе, т.е. терапевтически эффективной поглощенной дозе терапевтического радионуклида.
В контексте терапевтического применения полипептидов антител по данному изобретению «фармацевтически эффективное количество» или «эффективное количество», или «терапевтически эффективное», как используется в данном документе, относится к количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект по отношению к данному патологическому состоянию и способу введения. Данное предварительно определенное количество активного вещества рассчитано для целей получения требуемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемой добавкой или разбавителем, т.е. носителем или средством доставки при введении. Дополнительно, необходимо понимать, что количество достаточно для уменьшения и/или предотвращения клинически значимого дефицита активности, функционирования и ответной реакции организма хозяина. В альтернативном варианте терапевтически эффективное количество достаточно для того, чтобы вызывать улучшение клинически значимого состояния в организме хозяина. Как очевидно специалистам в данной области техники, количество соединения может изменяться в зависимости от его специфической активности. Подходящие количества доз могут содержать предварительно определенное количество активной композиции, рассчитанное для целей получения требуемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым разбавителем. В способах и применении для производства композиций по данному изобретению предложено терапевтически эффективное количество активного компонента. Терапевтически эффективное количество может определять медицинский работник средней квалификации на основании таких характеристик пациента, как возраст, вес, пол, состояние, осложнения, другие заболевания и т.д., а также оно известно в данной области (см. ниже пример 6). Введение фармацевтически эффективной дозы может выполняться как путем однократного введения в форме отдельной дозированной единицы, или иначе – несколькими меньшими дозированными единицами, а также путем многократных введений разделенных доз через конкретные интервалы. В альтернативном варианте дозы могут назначаться в виде непрерывной инфузии в течение продолжительного периода времени.
В контексте диагностического применения полипептидов антител по данному изобретению «фармацевтически эффективное количество» или «эффективное количество», или «диагностически эффективное», как используется в данном документе, относится к количеству, которое обеспечивает выявляемый сигнал для целей визуализации in vivo.
Полипептиды антител по данному изобретению можно готовить в различных концентрациях, в зависимости от эффективности/токсичности применяемого соединения. Лекарственная форма может содержать полипептид в концентрации между 0,1 мкM и 1 мМ, между 1 мкM и 500 мкM, между 500 мкM и 1 мМ, между 300 мкM и 700 мкM, между 1 мкM и 100 мкM, между 100 мкM и 200 мкM, между 200 мкM и 300 мкM, между 300 мкM и 400 мкM, между 400 мкM и 500 мкM и около 500 мкM.
Как правило, терапевтическая доза полипептида антитела (с терапевтическим фрагментом или без него) для пациента-человека должна находиться в диапазоне от 100 мкг до 700 мг на введение (на основании массы тела 70 кг). Например, максимальная терапевтическая доза может находиться в диапазоне от 0,1 до 10 мг/кг на введение, например между 0,1 и 5 мг/кг или между 1 и 5 мг/кг, или между 0,1 и 2 мг/кг. Следует учитывать, что такую дозу можно вводить через различные интервалы, определенные онкологом/лечащим врачом; например, дозу можно вводить ежедневно, дважды в неделю, еженедельно, раз в две недели или ежемесячно.
Специалистам в данной области очевидно, что фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить самостоятельно или в комбинации с другими терапевтическими средствами, применяемыми для лечения рака предстательной железы, либо перед, после, либо в один и тот же момент времени с лечением пациента другими терапевтическими методами в отношении лечения рака предстательной железы, такими как другие терапевтические антитела, хирургическое вмешательство (например, радикальная простатэктомия), радионуклидная терапия, брахитерапия, наружная дистанционная лучевая терапия, фокусированный ультразвук высокой интенсивности (HIFU), химиотерапия, пероральные химиотерапевтические средства, криохирургия (замораживание опухоли), гормональная терапия (такая как антиандрогенная терапия), кастрация или комбинации вышеприведенного.
В седьмом аспекте изобретения предложен набор, содержащий полипептид антитела в соответствии с первым аспектом изобретения или фармацевтическую композицию в соответствии с шестым аспектом изобретения, вместе с инструкциями по их применению.
В восьмом аспекте изобретения предложен полипептид антитела в соответствии с первым аспектом изобретения для применения в медицине.
В девятом аспекте изобретения предложен полипептид антитела в соответствии с первым аспектом изобретения для применения при лечении и/или диагностике рака предстательной железы.
В десятом аспекте изобретения предложен способ лечения рака предстательной железы у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения.
Термином «лечение» авторы охватывают как терапевтическое, так и профилактическое лечение пациента. Термин «профилактический» используется для охвата применения средства или его состава, как описано в данном документе, которое либо предотвращает, либо снижает вероятность возникновения рака предстательной железы, либо распространение, диссеминацию или метастазы локализированного рака предстательной железы у пациента или субъекта. Термин «профилактический» используется для охвата применения средства или его состава, как описано в данном документе, для предотвращения рецидива рака предстательной железы у пациента, которого раннее лечили от рака предстательной железы.
В одиннадцатом аспекте изобретения предложен способ диагностики рака предстательной железы у субъекта, включающий введение субъекту диагностически эффективного количества полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения.
Термином «диагноз» заявители охватывают выявление клеток рака предстательной железы, либо in vivo (т.е. внутри тела пациента), либо ex vivo (т.е. внутри образца ткани или клеток, удаленных из тела пациента).
Рак предстательной железы, подлежащий лечению или диагностике, может локализироваться в предстательной железе или может быть нелокализированным (а именно, диссеминированным) раком предстательной железы. Рак предстательной железы, локализированный в предстательной железе, может, например, классифицироваться как клиническая форма рака T1 или T2, в соответствии с системой TNM (сокращение от опухоль/узел/метастазы), тогда как нелокализированный/диссеминированный рак предстательной железы может, например, классифицироваться как клиническая форма рака T3 или T4.
Рак предстательной железы, подлежащий лечению или диагностике, может быть метастатическим раком предстательной железы. Метастазы относятся к распространению раковой опухоли из его начального расположения в другие места организма. Например, подлежащий лечению или диагностике метастатический рак предстательной железы может проявляться в виде метастазов в лимфатической системе; в костях (включая позвоночник, позвонки, таз, ребра); метастазы внутри таза, прямой кишки, мочевого пузыря или мочеиспускательного канала. С помощью данного изобретения можно также лечить метастазы, находящиеся в других менее распространенных местах. Метастазы могут представлять собой микрометастазы. Микрометастазы являются формой метастазов, при которых новообразованные опухоли в целом слишком малы для выявления или выявляются с трудом. Например, данное изобретение обеспечивает специалиста в данной области способом лечения одиночных раковых клеток или кластеров клеток, даже если наличие таких клеток или кластеров невозможно диагностировать, но они существуют, к примеру, в виде скрытого диссеминированного заболевания.
Соответственно, предполагается, что особо важное техническое преимущество данного лечения, предложенное данным изобретением по сравнению с видами лечения рака предстательной железы предыдущего уровня техники, заключается в повышенной эффективности лечения диссеминированого и/или метастатического (включая микрометастатический) рака предстательной железы.
Таким образом, в одном варианте реализации изобретения предложены полипептиды антител и способы предотвращения или лечения метастазов первичной опухоли предстательной железы.
Рак предстательной железы склонен развиваться у мужчин старше пятидесяти, чаще у мужчин старше 60, 65 или 70 лет, и хотя это один из наиболее распространенных типов рака у мужчин, у многих из них никогда не проявляются симптомы, они не проходят лечение и в конце концов умирают от других причин. Так происходит потому что, в большинстве случаев, рак предстательной железы является медленно развивающимся бессимптомным, а поскольку мужчины с данным патологическим состоянием находятся в пожилом возрасте, то они часто умирают по несвязанным с раком предстательной железы причинам, таким как заболевания сердца/кровообращения, пневмония, других несвязанных видов рака или пожилого возраста. Хотя около двух третей случаев рака предстательной железы являются медленно развивающимися, одна треть – более агрессивна и быстроразвивающаяся.
Соответственно, разработка эффективных способов лечения и диагностики рака простаты является особенно важной для контроля более агрессивных и быстроразвивающихся форм рака, особенно у более молодых пациентов. Соответственно, в одном варианте реализации изобретение относится к лечению или диагностике рака предстательной железы у пациента, которому по возрасту менее 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 или менее лет, с диагнозом рак предстательной железы и/или в момент прохождения лечения.
Считается, что мужчины с родственником первой степени наследования (отец или брат) в отношении рака предстательной железы имеют в два раза больший риск развития рака предстательной железы и считается, что мужчины с пораженными двумя родственниками первой степени наследования имеют пятикратный больший риск по сравнению с мужчинами без семейного анемнеза. Соответственно, данное изобретение может относиться к лечению или диагностике рака предстательной железы у пациента, для которого характерно наличие одного, двух или более членов семьи, в частности, членов семьи первой степени наследования (таких как отец или брат), у которых раннее диагностировали рак предстательной железы.
Данное изобретение также относится к лечению или диагнозу рака предстательной железы у пациента, причем подлежащий лечению рак предстательной железы является кастрационно-резистентным раком предстательной железы (CRPC). CRPC может характеризоваться, как правило, по возникновению резистентности к гормональному лечению после от одного до трех лет и по возобновлению роста, несмотря на гормональную терапию.
В целях медицинских применений и способов по данному изобретению, полипептид антитела, как правило, вводят в организм пациента инъекцией или инфузией. Затем in vivo полипептид антитела связывается с тканями, которые продуцируют целевой антиген, ПСА; главным образом, это раковые клетки предстательной железы и их метастазы. После связывания полипептид антитела может непосредственно вызывать терапевтический эффект (например, индуцируя гибель клеток посредством АЗКЦ, КЗЦ или путем переноса радиоизотопа или другого цитотоксического фрагмента). В альтернативном варианте связанный полипептид антитела может служить в качестве диагностического средства (средства визуализации), которое может определять выбор терапии или способствовать хирургическому удалению раковых клеток.
Специалистам в данной области техники понятно, что полипептиды антител по данному изобретению могут применяться в комбинации с другими терапевтическими и/или диагностическими средствами/лечением, например, наружной радиотерапией, хирургическим вмешательством, цитостатическими и андрогенными видами лечения.
Последующее описание сосредоточено на вариантах реализации по данному изобретению, применимых к способам лечения и диагностики рака простаты. Однако, следует учитывать, что изобретение не ограничивается такими применениями, которые могут быть пригодными для послеоперационных исследований и исследований во время или после радиационных, цитостатических и андрогенных видов лечения.
В другом варианте реализации изобретения для идентификации меченных трейсерами полипептидов антител по данному изобретению во время и/или перед хирургическим вмешательством могут применять радиоуправляемую хирургию (RGS) или хирургию под визуализационным контролем (IGS). Таким образом, полипептид антитела, содержащий обсуждаемый выше выявляемый фрагмент, можно вводить во время и/или перед хирургическим вмешательством. В таком варианте реализации изобретения сначала инфузионно вводят полипептиды антител. После чего, для идентификации продуцирующей ПСА ткани во время или перед хирургическим вмешательством можно использовать RGS/IGS с чувствительным к выявляемому фрагменту прибором выявления. Выявляемый фрагмент, например, может быть излучателем радиации или магниточувствительным выявляемым фрагментом; он, например, может быть излучателем радиации Черенкова и/или Бремштралунга; он может быть флуоресцентной меткой и/или магнитной или намагничиваемой меткой. Соответственно, RGS/IGS в соответствии с данным изобретением, например, может быть способом, основанным на выявлении оптического излучения, излучения Черенкова, Бремштралунга или бета-радиации; выявлении радионуклидной метки и/или может вовлекать магнитометрию. RGS хорошо известно специалисту в данной области в качестве хирургической методики, которая позволяет хирургу идентифицировать ткань, «меченую» выявляемой меткой.
Результаты визуализации, полученные в соответствии с вышеприведенными способами, можно сочетать с другими способами радиологической визуализации, такими как ОФЭКТ/ПЭТ, компьютерная томография (КТ), ультразвук (УЗ) и магниторезонансная томография (МРТ).
Соответственно, в дополнительном аспекте в данном изобретении также предложены полипептиды антител для применения в медицине путем введения пациенту, болеющему раком предстательной железы, до или во время хирургического вмешательства, такого как операция радиоуправляемой хирургии или хирургии под визуализационным контролем.
В еще одном дополнительном аспекте изобретения предложен способ выявления in vitro опухолевых клеток предстательной железы в крови субъекта, включающий:
(a) получения у субъекта, подлежащего исследованию, образца крови;
(b) необязательно, извлечение и/или очистка присутствующих в образце крови клеток;
(c) приведение в контакт полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения с клетками, присутствующими в образце крови;
(d) определение (прямое или опосредованное) наличия связывания полипептида антитела со свободным (т.е. не в виде комплекса) ПСА;
причем связывание полипептида антитела со свободным ПСА является показателем наличия опухолевых клеток предстательной железы в крови субъекта.
Таким образом, данный способ включает проведение анализа для определения содержания в образце крови свободного ПСА; наличие свободного ПСА является показателем наличия опухолевых клеток предстательной железы в крови субъекта.
Специалистам в данной области понятно, что существует множество путей выполнения такого анализа. Например, иммуноанализ может быть либо гомогенным, либо предпочтительнее гетерогенным. Анализ также может выполняться либо в конкурентном, либо предпочтительнее неконкурентном формате.
В случае гетерогенного неконкурентного анализа, типовой протокол может быть таким:
(a) получения у субъекта, подлежащего исследованию, образца крови;
(b) необязательно, извлечение и/или очистка присутствующих в образце крови клеток;
(c) приведение в контакт иммобилизированного на твердой фазе полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения с клетками, присутствующими в образце крови;
(d) промывка для удаления растворимых компонентов (не связавшихся с твердой поверхностью);
(e) добавления трейсера, т.е. другого анти-ПСА специфического антитела, меченого репортерной молекулой/частицей;
(f) промывка для удаления не связавшегося антитела-трейсера и
(g) выявление сигнала от антитела-трейсера.
Между этапами b и c или c и d, как правило должен быть период инкубации для обеспечения клеткам возможности продуцировать растворимый ПСА, чтобы впоследствии его можно было выявлять.
В дополнительном аспекте изобретения предложен способ выявления in vitro опухолевых клеток предстательной железы в ткани субъекта, включающий:
(a) получения у субъекта, подлежащего исследованию, образца ткани (такого как гистологический образец);
(b) необязательно, извлечение и/или очистка присутствующих в образце ткани клеток;
(c) приведение в контакт полипептида антитела в соответствии с первым аспектом изобретения с клетками, присутствующими в образце ткани;
(d) определение (прямое или опосредованное) наличия связывания полипептида антитела со свободным (т.е. не в виде комплекса) ПСА;
причем связывание полипептида антитела со свободным ПСА является показателем наличия опухолевых клеток предстательной железы в ткани субъекта.
В одном варианте реализации вышеприведенных способов in vitro этап (d) выполняют методом ELISA. Однако можно применять любой анализ, подходящий для выявления взаимодействий антитело-антиген in vitro.
В дополнительном варианте реализации изобретения способ дополнительно включает количественное определение в образце опухолевых клеток предстательной железы.
В дополнительном варианте реализации вышеприведенных способов in vitro предложен способ, предназначенный для диагностики у субъекта рака предстательной железы.
Использование слова в единственном числе при применении в сочетании с термином «содержащий» в формуле изобретения и/или описании может означать «один», но оно также соответствует значению «один или более», «по меньшей мере один» и «один или более одного».
Эти и другие варианты реализации изобретения можно будет лучше оценивать и понимать при рассмотрении в сочетании со следующим описанием и прилагаемыми графическими материалами. Однако следует понимать, что вышеприведенное описание с указанием различных вариантов реализации изобретения и многочисленных конкретных его подробностей приводится с целью иллюстрации, а не ограничения. Многие замены, модификации, добавления и/или перестановки могут быть сделаны в рамках объема данного изобретения без отступления от его сущности, причем данное изобретение включает в себя все такие замены, модификации, добавления и/или перестановки.
Приведенные ниже графические материалы являются частью данного описания и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов данного изобретения. Данное изобретение можно легче понимать, учитывая одну или более из этих графических фигур в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов реализации изобретения, представленных в данном документе.
111
Фиг. 1. Репрезентативные изображения ОФЭКТ/ПЭТ ксенотрансплантатов LNCaP, отсканированные в течение до 7 суток после инъекции In-DTPA-h5A10.
111
Фиг. 2. Репрезентативные изображения ОФЭКТ/ПЭТ ксенотрансплантатов LNCaP, отсканированные в течение до 7 суток после инъекции In-DTPA-m5A10.
Фиг. 3. Анализ соотношений m5A10 и h5A10 для опухоли и лежащей на противоположной стороне ткани у мышей с ксенотрансплантатами LNCaP.
Фиг. 4. Анализ соотношений m5A10 и h5A10 для печени и опухоли у мышей с ксенотрансплантатами LNCaP.
111
111
Фиг. 5. Анализ биораспределения In-DTPA-m5A10 и In-DTPA-h5A10 у мышей с ксенотрансплантатами LNCaP.
Следующие примеры включены для демонстрации конкретных вариантов осуществления данного изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что методики, описанные далее в примерах, представляют собой методики, раскрытые авторами изобретения с целью надлежащего функционирования при практическом воплощении данного изобретения и, таким образом, могут считаться конкретными способами для его реализации. Однако специалистам в данной области техники в свете данного описания следует понимать, что в конкретных описанных вариантах реализации могут быть воплощены многие изменения с получением по-прежнему аналогичного или сходного результата без отступления от сущности и объема изобретения.
Примеры
Пример 1. Клонирование мышиного моноклонального антитела 5A10 в формате FAb
Реактивы
Ферменты рестрикции получали у компаний Fermentas и Promega, щелочную фосфатазу у Amersham Pharmacia Biotech, а дНТФ (динуклеотидтрифосфаты) и ДНК-лигазу T4 – у Fermentas. Праймеры получали в университете г. Турку, отдел биотехнологии, и у Eurogentec. Для очистки ДНК использовали наборы компании Qiagen.
Экстракция мРНК и синтез кДНК
Из продуцирующих MAb 5A10 гибридомных клеток (2E6 клеток; Lilja et al, 1991) с помощью магнитных гранул с поли-дТ Dynal экстрагировали мРНК в соответствии с процедурой, описанной производителем в Biomagnetic Techniques in Molecular Biology: Technical handbook (Dynal A.S, 2nd edition, 1995). Синтез кДНК из мРНК выполняли с помощью фермента Super Script (Gibco BRL). Сначала магнитные частицы, связавшиеся с мРНК, инкубировали при 42°C в течение 2 мин в реакционной смеси, содержащей 1x реакционный буфер, 0,1 M ДТТ (дитиотреитол), 2 мM дНТФ и ингибитор РНКазы (1,5 мкл в общем реакционном объеме 50 мкл). Затем добавляли 1 мкл Super Script (200 Ед) и проводили реакцию 1 час при 42°C. После завершения синтеза кДНК коллектором магнитных частиц разделяли реакционную смесь и частицы, удаляли жидкость, суспендировали частицы в буфере TE и инкубировали при 95°C в течение 1 мин для высвобождения мРНК. После инкубации собирали связанную с частицами кДНК, удаляли содержащий мРНК буфер, промывали частицы TE и в заключение суспендировали их в 50 мкл TE для хранения.
Амплификация генов антител из кДНК и клонирование
Определяли N-концевые аминокислотные последовательности легких и тяжелых цепей методом деградации Эдмана в университете г. Турку, центр биотехнологии, сервис по секвенированию. Последовательностями, полученными из легкой и тяжелой цепи, были DIVMTQS [SEQ ID NO: 18] и EVQLVESG [SEQ ID NO: 19], соответственно. На основе N-концевых аминокислотных последовательностей выполняли поиск по базе данных (SwissProt) для идентификации соответствующих нуклеотидных последовательностей среди V-генов иммуноглобулинов зародышевой линии мыши. На основе этого поиска конструировали комплементарные участки прямых праймеров ПЦР для клонирования тяжелых и легких цепей. Обратные праймеры конструировали для связывания, соответственно, CH1 и CL. Праймеры также содержат сайты узнавания ферментами рестрикции, необходимые для клонирования (далее подчеркнуты).
Реакции ПЦР проводили в следующих условиях (за исключением замены праймеров и матриц): 125 мкM дНТФ, 0,5 мкM прямых и обратных праймером, 1x реакционный буфер Pfu и 2,5 Ед ДНК-полимеразы (Stratagene). Амплификацию выполняли проведением 30 циклов при 95°C 30 с, 55°C 1 мин и 72°C 1 мин 30 с.
Амплифицировали легкую цепь из кДНК со следующими праймерами:
• 5A10-L (5’-CCAGCCATGGCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCA-3’, NcoI [SEQ ID NO:20]) и
• WO252 (5’-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3’, XbaI [SEQ ID NO:21]).
Расщепляли легкую цепь и вектор pComb3, содержащий гены нерелевантного Fab (Barbas et al., 1991), с помощью NcoI и XbaI (для вектора выполняли частичное расщепление NcoI), очищали на агарозном геле и лигировали. Продуктом лигирования трансформировали E. coli XL1-Blue с получением плазмиды p5A10-L.
Амплифицировали цепь Fd (VH+CH1) с помощью следующей пары праймеров: 5A10-H (5’-CCAGCCATGGCTGAGGTGCAATTGGTGGAGTCTGG -3’, NcoI [SEQ ID NO:22]) и WO267 (5’-CTAGACTAGTACAATCCCTGGGCACAATTTTC-3’, SpeI [SEQ ID NO:23]). Клонировали цепь Fd в вектор pComb3 с заменой гена Fd другого Fab, который нес вектор. Продукты ПЦР и вектор расщепляли с помощью NcoI (частичное расщепление NcoI как вектора, так и вставки) и SpeI (New England Biolabs), очищали на агарозном геле и лигировали. Продуктом лигирования трансформировали E. coli XL1-Blue с получением вектора p5A10-H.
С помощью SpeI и XbaI из плазмиды p5A10-L выщепляли легкую цепь 5A10 и, после очистке на геле, лигировали с очищенной на геле плазмидой p5A10-H, также расщепленной соответствующими ферментами. Продуктом лигирования трансформировали E. coli XL1-Blueto с получением плазмиды pComb3-5A10, содержащей как легкую цепь, так и Fd-цепь Fab 5A10. Для удаления гена gIIIp фаговой оболочки, слитого с Fd-цепью, дополнительно с помощью SpeI и NheI расщепляли pComb3-5A10, проводили самолигирование и трансформировали E. coli XL1-Blue. Плазмида pComb3-5A10DIII обладала возможностью экспрессии растворимого функционального Fab 5A10.
Список литературы
Barbas CF 3rd, Kang AS, Lerner RA, Benkovic SJ. (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: The gene III site. Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 88, pp. 7978-7982.
Biomagnetic Techniques in Molecular Biology: Technical handbook. Dynal A.S, 2nd edition, 1995.
Lilja H, Christensson A, Dahlén U, Matikainen MT, Nilsson O, Pettersson K, Lövgren T. (1991) Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with alpha 1-antichymotrypsin. Clin Chem. 37(9):1618-25.
Пример 2. Экспрессия и очистка гуманизированного антитела 5A10
6
Клетки HEK293 размножали в суспензионной культуре объемом 2 л в среде для экспрессии FreeStyle 293 (Life Technologies). Плотность клеток на день проведения трансфекции составляла 1 x 10 клеток/мл.
2
Нуклеотидные последовательности, кодирующие компоненты тяжелой или легкой цепей (т.е. SEQ ID NO: 16 и 17, соответственно) были кодоноптимизированными для экспрессии в клетках млекопитающих, их синтезировали и клонировали в векторах экспрессии IgG. Плазмидную ДНК (экспрессионный вектор), содержащую нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепей, затем смешивали с трансфекционным агентом и инкубировали в течение 10 мин при КТ (комнатной температуре). Смесь ДНК-трансфекционный агент медленно добавляли к культуре клеток при медленном вращении колбы. Затем трансфицированную культуру клеток инкубировали при 37°C, 8% CO на платформе орбитального встряхивателя при скорости вращения приблизительно 135 об/мин в течение семи дней.
Среду культивирования собирали путем центрифугирования и фильтровали через системы фильтрования с размерами пор 5 мкм, 0,6 мкм и 0,22 мкм.
Антитела очищали хроматографией на белке G и заменяли буфер на ФСБ (фосфатно-солевой буфер) с pH 7,4 путем диализа; впоследствии антитела концентрировали путем ультрафильтрации.
Концентрацию измеряли по поглощению света.
ДНК:
Легкая цепь: p5A10VLhDhk (4300 п. н.) количество: 0,35 мг,
Тяжелая цепь: p5A10VHhDhIgG1 (4900 п. н.) количество: 0,60 мг.
Количества ДНК не оптимизировали.
Трансфекционный агент: патентованный (однако легко доступны подходящие имеющиеся в продаже трансфекционные агенты, такие как реагент для трансфекции Xfect™ (Clontech), липофектамин (Life Technologies), реагент для трансфекции FuGENE HD (Promega), реагент FreeStyle™ Max (Invitrogen), ДЭАЭ-декстран, полиэтиленимин и фосфат кальция).
Общий выход: 15 мг (7,5 мг/л).
Пример 3. Определение характеристик h5A10: аффинность
Цели исследования
Целью исследования было изучение кинетики связывания между восемью вариантами антитела 5A10 и антигеном ПСА путем использования методики поверхностного плазмонного резонанса (ППР) на приборе Biacore.
Для изучения качества образцов белков (антител и антигена) перед экспериментами с ППР был проведен ДСН-ПААГ-электрофорез.
В предварительном исследовании изучали различные параметры для выявления подходящих условий для экспериментов данного исследования.
on
off
В исследовании выполняли множество измерений связывания для восьми антител и антигена. По собранным данным рассчитывали константы скоростей ассоциации и диссоциации (k и k) и константы диссоциации (KD), которые представлены в данном документе.
Данные о реактивах и приборах
Компанией Diaprost AB были представлены следующие растворы восьми антител и одного антигена:
• ПСА 169 мкг/мл
• m5A10 (141203) 1 мг/мл
• m5A10 (140905) 4 мкM
• m5A10-DFO (140905) 4 мкM
• m5A10-DOTA (140905) 4 мкM
• m5A10-DTPA (140905) 4 мкM
• h5A10 (141203) 1 мг/мл
• h5A10-DFO (141203) 2 мг/мл
• h5A10-DTPA (141203) 1 мг/мл
• h5A10-DOTA (141211) 2,5 мкM
Перед анализом отбирали аликвоты всех образцов и хранили их при -20°C в морозильнике.
Все эксперименты по связыванию выполняли на чипе CM4 на приборе Biacore 3000. Чип и все реактивы, необходимые для активации, иммобилизации, дезактивации, связывания и регенерации приобретали у компании GE Healthcare и применяли в соответствии с руководствами производителя.
ДСН-ПААГ-электрофорез
(a) Описание эксперимента
Реактивы, предоставленные Diaprost AB, использовали при анализе на 10-20% акриламидном геле ТРИС-Трицин, полученном у Novex, в соответствии с руководствами производителя.
На одинаковом геле вместе со стандартным образцом анализировали две серии образцов белков, нативных и восстановленных.
Каждый образец в нативной серии содержал: 1-1,3 мкг белка, ТРИС-буфер с pH 7,4, ДСН (додецилсульфат натрия) и буфер для нанесения.
Каждый образец в восстановленной серии содержал: 1-1,3 мкг белка, ТРИС-буфер с pH 7,4, ДСН и 0,04% об./об. бета-2-меркаптоэтанола (буфер для нанесения).
Окрашивание геля выполняли в растворе кумасси бриллиантового синего, составленного из уксусной кислоты, этанола и воды в соответствующих пропорциях 0,7, 3,0, 6,3.
Обесцвечивание геля выполняли в растворе уксусной кислоты, этанола и воды в соответствующих пропорциях 0,7, 3,0, 6,3.
(b) Результаты и выводы
Из полученных результатов очевидно, что образцы антител и антигена имеют высокое качество и чистоту (результаты не показаны).
Исследование аффинности
(a) Для определения аффинности взаимодействий выполняли два эксперимента с применением описанных ниже условий.
Иммобилизация антигена на чипе CM4.
Выполняли активацию чипа CM4-1 в соответствии с руководствами производителя для аминного связывания с использованием смеси EDC и NHS.
Для иммобилизации антигена на чипе через каналы fc2-4 на чипе CM4-1 пропускали раствор, содержащий 3,00 мкг/мл антигена ПСА (основной раствор ПСА разбавляли в 10 мМ буфере NaAc pH 3,8). Скорость потока: 5 мкл/мин, объем: 200 мкл.
Целевое значение RU ≤ M<sub>W</sub>/10
M<sub>W</sub>(ПСА) = 30 000 Да
Целевое значение RU (ПСА) ≤ 3000
Канал fc1 использовали в качестве контроля.
После прохождения иммобилизации в первом эксперименте получено:
fc2 = 1450 RU
fc3 = 850 RU
fc4 = 900 RU
После прохождения иммобилизации во втором эксперименте получено:
fc2 = 1325 RU
fc3 = 890 RU
fc4 = 1060 RU
После активации и иммобилизации все каналы (fc1-4) блокировали этаноламином.
Полученные данные демонстрируют, что используя 3,00 мкг/мл антигена достигали приемлемой иммобилизации.
- (a) Изучение фазы ассоциации
Через 5 минут проводили фазу ассоциации восьми антител на чипе CM4-1, в ходе которой через каналы fc2-4 на чипе CM4-1 со скоростью протока 30 мкл/мин пропускали растворы 4 различных концентраций каждого антитела (основные растворы, разведенные в буфере HSP).
Изучаемые концентрации каждого антитела составляли: 100, 50, 25 и 12,5 нM.
Из экспериментов, в которых процесс диссоциации продолжался в течение 8 часов, получали дополнительные данные по ассоциации.
В целом, для каждого антитела выполняли 3-9 отдельных экспериментов по ассоциации.
Из всех данных вычитали сигнал, полученный от контроля, fc1.
Заявители обнаружили, что через 5 минут, они были способны подбирать соответствие данных процессам ассоциации.
(b) Изучение фазы диссоциации
Для каждого антитела фаза диссоциации продолжалась в течение 8 часов.
Из всех данных, использованных при расчетах константы скорости диссоциации, вычитали сигнал, полученный от контроля, fc1.
Данные указывают, что процессы диссоциации проходят очень медленно.
off
(c) Оценка константы скорости диссоциации (k)
off
Подбирали зависимость для данных фазы диссоциации и оценивали константы скорости диссоциации (k) (см. таблицу 1).
on
(d) Оценка константы скорости ассоциации (k)
С целью оценки констант скорости ассоциации в подобранных уравнениях использовали константы скорости диссоциации (таблица 1).
D
(e) Оценка константы диссоциации (k)
D
Константа диссоциации (K) для каждого из исследованных антител, показана в таблице 1.
Таблица 1
Антитело
K<sub>off</sub> (10<sup>-6</sup> с<sup>-1</sup>)
K<sub>on</sub> (10<sup>6</sup> M<sup>-1</sup>с<sup>-1</sup>)
K<sub>D</sub> (10<sup>-11</sup> M)
m5A10 (140905)
6,3
0,29
2
m5A10 (141203)
5,4
0,25
2
hu5A10 (141203)
4,8
0,62
1
m5A10-DFO (140905)
6,6
0,29
2
h5A10-DFO (141203)
8,3
0,17
5
m5A10-DOTA (140905)
6,3
0,28
2
h5A10-DOTA (141211)
11,7
0,54
2
m5A10-DTPA (140905)
6,3
0,27
2
h5A10-DTPA (141203)
4,8
0,39
1
D
-11
Для всех восьми антител константы диссоциации (K) находятся в диапазоне 10 M.
Несмотря на отсутствие статистической значимости, константа диссоциации гуманизированного антитела оказывается выше такого значения для исходного мышиного антитела.
D
Оказывается, что конъюгация гуманизированных антител существенно не влияет на аффинность, поскольку K значимо не изменяется.
Резюме
on
5
-1
-1
• Для всех антител процессы ассоциации являются очень быстрыми и все значения констант скорости ассоциации (k), полученные на основании 3-9 экспериментов для каждого антитела, находятся в диапазоне 10 M с.
off
-6
-1
• Процессы диссоциации являются очень медленными и находятся на пределе диапазона технических ограничений Biacore. Все значения констант скорости диссоциации (k), полученные на основании 3-9 экспериментов для каждого антитела, находятся в диапазоне 10 с.
D
-11
• Для всех антител константы диссоциации (K) находятся в диапазоне 10 M.
Пример 4. Определение характеристик h5A10: агрегация
Краткое резюме
Для исследования склонности к агрегации на 6 вариантах IgG провели исследования по динамическому рассеянию света (ДРС). Результаты ДРС показывают, что все конструкции имеют приемлемый размер (200 кДа или слегка больше 200 кДа из расчета сферического белка) и не склонны к агрегации или склонны в незначительной степени.
Цель
Определение характеристик шести конструкций IgG применительно к олигомерному состоянию, используя динамическое рассеяние света.
Результаты
Динамическое рассеяние света
Измеряли динамическое рассеяние света при 20°C в двух параллельных образцах с использованием оборудования Malvern Zetasizer APS. Каждый образец измеряли три раза. В качестве контроля для подтверждения того, что буфер является в приемлемой степени свободным от загрязнений и агрегатов, использовали буфер HBS-EP (получен от заказчика). Не было получено никаких достоверных измерений наличия агрегатов в буфере HBS-EP, что является хорошим признаком, поскольку буфер должен быть свободным от агрегатов. Для всех образцов должны достоверно проходить измерения с использованием функции численного распределения. Вместе с полидисперсностью типов рассчитывали средний радиус наиболее многочисленных типов. Рассчитывали также среднемассовое распределение этих типов, см. таблицу 2.
Таблица 2
Данные динамического рассеяния света, полученные из распределения размеров
Конструкция
Средний радиус (нм)
Полидисперсность(%)
Массовое распределение (%)
m5A10-DFO
6,1
22,7
100
h5A10-DFO
6,3
10,2
98,7
m5A10-DOTA
6,2
24,6
100
h5A10-DOTA
6,4
11,3
99,1
m5A10-DTPA
6,2
27,5
100
h5A10-DTPA
6,2
10,6
98,9
Полидисперсность = Стандартное отклонение значения радиуса / Средний радиус x 100%
Радиус 5,7 нм соответствует молекулярной массе белка около 200 кДа, который имеет идеальную сферическую форму. Радиус 6,1 нм соответствует молекулярной массе белка около 230 кДа, который имеет идеальную сферическую форму. Это приемлемо близко к молекулярной массе молекул IgG равной 150 кДа и означает, что большинство образцов преимущественно состоит из мономерных и/или димерных молекул IgG. Причиной, по которой не исключаются димеры, является то, что рассеяние света дает грубую оценку размера на основании молекулярной формы, и это создает трудности для разделения мономеров и димеров, но легко отделяет от мономеров большие агрегаты. В образцах IgG мыши были обнаружены малые частицы меньше 1 кДа. Эти частицы не учитывали в таблице 1, поскольку предполагалось, что из-за их малого размера они принадлежат к компоненту, обнаруженному в буфере. И наоборот во всех IgG человека, но не в IgG мыши, обнаружена малая фракция более крупных агрегатов.
Выводы
Исследование динамического рассеяния света показывает, что все конструкции имеют приемлемый размер и не склонны к агрегации или склонны в незначительной степени. Распределения размеров для всех шести конструкций являются перекрывающимися. Неожиданно обнаружены частицы похожие на частицы буфера (< 1 кДа) во всех образцах IgG мыши, тогда как более крупные агрегаты обнаружены только в образцах IgG человека.
Пример 5. Определение характеристик h5A10: биораспределение in vivo
111
В данном исследовании сравнивают биораспределение in vivo 5A10 мыши и 5A10 человека при их маркировке In.
Материалы и методы
Гуманизированное антитело-аналог, h5A10, продуцировали, как описано ниже.
• Антитела: Типовое гуманизированное моноклональное антитело 5A10 (IgG1/каппа, транзиентно экспрессируемое в клетках HEK 293; см. пример 2), содержащее тяжелую цепь в соответствии с SEQ ID NO:12 и легкую цепь в соответствии с SEQ ID NO:13 предоставлено Innovagen AB, г. Лунд (серия № 90475.33, конц. 1,0 мг/мл в ФСБ, pH 7,4). В качестве изотипного контроля использовали неспецифическое антитело IgG (антитело IgG из сыворотки мыши, Sigma I-8765).
Конъюгация и радиомаркировка
Конъюгация CHX-A’’-DTPA с 5A10 Растворы мышиных и гуманизорованных mAb 5A10 в ФСБ или NaCl корректировали до значения pH 9,2 с использованием 0,07 М буфера бората натрия (Sigma Aldrich). Затем раствор вводили в конъюгацию с помощью хелатирующего агента CHX-A’’-DTPA (Macrocyclics, США) в молярном соотношении хелатирующего агента к антителу 3:1 при 40°C в течение 4 ч. Останавливали реакцию и отделяли CHX-A’’-DTPA-11B6 (DTPA-11B6) от свободного хелатирующего агента эксклюзионной хроматографией на колонке NAP-5 (GE Healthcare), уравновешенной 20 мл 0,2 М буфера ацетата аммония, pH 5,5. Коньюгированные антитела 5A10 разбавляли 1 мл буфера ацетата аммония и хранили аликвоты образцов по 200 мкл при -20°C.
111
111
3
Радиомаркировка DTPA-5A10 Смешивали мышиное и гуманизированное DTPA-5A10 в буфере ацетата аммония с pH 5,5 с предварительно заданным количеством InCl(Mallinkrodt Medical, г. Дублин, Ирландия). После инкубации при комнатной температуре в течение 2 ч, останавливали введение метки и проводили очистку на колонке NAP-5, уравновешенную ФСБ (Thermo Scientific, США). Контролировали эффективность и кинетику маркировки методом быстрой тонкослойной хроматографии (ITLC) (Biodex, г. Ширли, штат Нью-Йорк, США) при элюировании 0,2 М лимонной кислотой (Sigma Aldrich). В данной системе радиомеченый конъюгат остается на линии старта при свободном движении In. Радиоактивное распределение определяли с использованием системы циклонного сохранения люминофора с программным обеспечением для количественного определения Optiquant (Perkin Elmer; г. Уолтем, штат Массачусетс, США).
Исследования на животных
°
2
Для исследований in vivo применяли линии клеток карциномы предстательной железы LNCaP, экспрессирующих hK2 (ATCC, г. Манассас, штат Вирджиния, США). Клетки культивировали в среде RPMI 1640 (Thermo Scientific) с добавками 10% фетальной бычьей сыворотки и PEST (пенициллин 100 Ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина) от компании Thermo Scientific. Поддерживали клетки при 37C в инкубаторе с влажной атмосферой и 5% CO и снимали их с поверхности с помощью раствора трипсин-ЭДТК (этилендиаминтетрауксусная кислота) (0,25% трипсин, 0,02% буфер ЭДТК, Thermo Scientific). При ксенотрансплантации клеток LNCaP использовали матрицу Matrigel (BD-Biosciences, г. Сан-Хосе, штат Калифорния, США).
Все эксперименты на животных выполняли в соответствии с национальным законодательством по защите лабораторных животных и с одобрения Комитета по этике исследований на животных (университет Лунда, Швеция).
Для данного исследования использовали самцов бестимусных иммунодефицитных мышей NMRI-Nu, возрастом 6-8 недель (Janvier Labs, Франция). Всем мышам в левый бок подкожно вводили ксенотрансплантаты с клетками LNCaP, 5-6 миллионов клеток в 100 мкл среды для выращивания и 100 мл Matrigel. Давали возможность ксенотрансплантатам расти в течение 6-8 недель.
Исследования с визуализацией ОФЭКТ/КТ
111
111
111
111
Исследования с визуализацией ОФЭКТ/КТ выполняли на In-DTPA-h5A10 и In-DTPA-m5A10. Во время визуализации проводили анестезию газом изофураном в концентрации от 2% до 3% (Baxter; г. Дирфилд, штат Иллинойс, США). Мышам NMRI-nu с п/к введенными ксенотрансплантатами LNCaP в хвостовую вену инъецировали In-DTPA-h5A10 (n = 4) или In-DTPA-h5A10 (n = 4) с приблизительно 13-15 МБк, 50 мкг mAb в 100 мкл ФСБ. Животным проводили визуализацию в течение 1 ч с использованием сканера ОФЭКТ/КТ для доклинических исследований (NanoSPECT/CT Plus, Bioscan; г. Вашингтон, округ Колумбия, США) с многоточечным коллиматором для мышей NSP-106. Выполняли визуализацию через 1, 2, 3 и 7 суток после инъекции. Данные ОФЭКТ воспроизводили с использованием программного обеспечения HiSPECT (SciVis; г. Геттинген, Германия). Визуализацию КТ завершали до проведения ОФЭКТ всего тела. Изображения ОФЭКТ/КТ анализировали с использованием программного обеспечения InVivoScope 2.0 (inviCRO; г. Бостон, штат Массачусетс, США), а интересующие области, ROI, строили с использованием изображения КТ в качестве анатомического шаблона.
Исследования биораспределения
111
111
111
111
Исследования биораспределения выполняли как на In-DTPA-h5A10, так и In-DTPA-m5A10. Группам животных (n=12), состоящих из мышей, внутривенно вводили In-DTPA-h5A10 (приблизительно 3-4 MБк, 50 мкг mAb в 100 мкл ФСБ) или In-DTPA-m5A10 (3-4 MБк, 50 мкг mAb в 100 мкл ФСБ). Умерщвляли животных через 7 суток после инъекции, собирали интересующие органы и анализировали их с помощью автоматизированного счетчика для лунок NaI(Tl) с 3-дюймовым детектором NaI (Tl) (1480 WIZARD, Wallac Oy, г. Турку, Финляндия).
Величину поглощения тканями, выраженную как процент введенной дозы на грамм ткани (% ВА/г), рассчитывали как:
% ВА/г = (радиоактивность ткани/введенная радиоактивность)/масса органа x 100,
где в/в инъекций:
Введенная радиоактивность = Радиоактивность в шприце
− радиоактивность, оставшаяся в использованном шприце,
− радиоактивность в хвосте.
После препарирования также взвешивали органы. Данные собирали для фонового и физического распада.
Результаты
Визуализация ОФЭКТ/КТ
111
111
111
111
Репрезентативные изображения ОФЭКТ/ПЭТ ксенотрансплантатов LNCaP, отсканированные в течение до 7 суток после инъекции In-DTPA-h5A10 и In-DTPA-m5A10 показаны на фиг. 1 и 2. Радиоактивность быстро накапливалась в опухоли LNCaP в течение 24 часов и радиоактивность оставалась высокой на 7 сутки после инъекции. Высокое накопление радиоактивности также обнаружили в печени. Анализ ROI показал, что соотношение для опухолевой и мягкой ткани противоположной ноги составило 5,2 ± 0,84 для In-DTPA-m5A10 и 6,4 ± 1,3 для In-DTPA-h5A10 на 7 сутки после инъекции.
Биораспределение
Для более всестороннего исследования накопления радиоактивности в различных органах на большом количестве животных (n =12 на антитело) проводили определение биораспределения ex vivo.
111
111
Соотношения радиоактивности для опухолей и противоположных тканей для In-DTPA-m5A10 и In-DTPA-h5A10 с течением времени показаны на фиг. 3. Неожиданно обнаружено, что это соотношение было значительно больше для гуманизированного антитела, чем для «исходного» мышиного антитела.
111
111
Соотношения радиоактивности для опухолей и печени для In-DTPA-m5A10 и In-DTPA-h5A10 с течением времени показаны на фиг. 4. Снова неожиданно обнаружено, что это соотношение было значительно больше для гуманизированного антитела, чем для «исходного» мышиного антитела.
111
111
Данные по биораспределению In-DTPA-m5A10 и In-DTPA-h5A10 показаны на фиг. 5.
Биораспределение мышиного и гуманизированного 5A10 у мышей при МРТВ (визуализация магниторезонансной томографией) с ксенотрансплантатами LNCaP, показала высокое накопление опухолями на 7 сутки, тогда как накопление в других органах, таких как кости, мышцы была намного более низкой.
111
111
Сравнение данных биораспределения для гуманизированного In-DTPA-h5A10 с исходным мышиным антителом (In-DTPA-m5A10) выявило неожиданное и преимущественное различие. Накопление опухолями было в значительной степени намного выше для гуманизированного, чем для мышиного антитела с показателем 7,4 ± 1,4% ВA/г для h5A10 по сравнению с 2,7 ± 0,75% ВA/г для m5A10 (p < 0,001) на 7 сутки после инъекции (фиг. 6). Накопление радиоактивности в других органах было приблизительно на аналогичном уровне для обоих антител, что делает соотношения для опухоли-органов намного выше в отношении гуманизированного h5A10, чем исходного мышиного m5A10 антитела (таблица 3).
Таблица 3
Соотношения для опухоли-органов
h5A10
m5A10
Кровь
2,9
1,1
Сердце
7,9
3,4
Легкие
4,7
2,0
Печень
3,0
0,9
ЖК-тракт
21,7
10,8
Почки
9,1
3,6
Слюнные железы
5,1
2,7
Кожа
4,9
3,0
Мышцы
44,2
17,6
Яички
9,1
4,8
Кости
7,3
3,1
Выводы и обсуждение
Результаты данного исследования демонстрируют следующее:
111
• гуманизированное антитело 5A10, In-h5A10, эффективно нацеливается на опухоли предстательной железы in vivo;
• гуманизированное антитело 5A10 проявляет неожиданно лучшее накопление опухолями, чем мышиное антитело, и
• гуманизированное антитело 5A10 обеспечивает лучшую контрастность при визуализации (как показано более высокими соотношениями опухоли-органы), чем мышиное антитело.
В совокупности, данные сведения обеспечивают убедительные доказательства лучших свойств нацеливания гуманизированных антител 5A10 при диагностике и, вероятно, лучшую терапевтическую эффективность при лечении рака предстательной железы.
Пример 6. Дозиметрическое планирование радионуклидной терапии и лечение рака предстательной железы у пациента
Для радионуклидной терапии (РНТ) источник радиации распределяется по всему организму и радиоактивность обычно вводится системно в виде радиофармацевтического средства. Распределение радиоактивности зависит от радиофармацевтического средства, которое с течением времени накапливается в различных тканях, что иногда различается для разных пациентов (1).
P
T
Лечение РНТ должно основываться на назначаемой поглощенной дозе (2). Затем сначала пациент должен проходить предтерапевтическое исследование с использованием следового количества радиофармацевтического средства и определение поглощение опухолью и органами. Обычно данная информация выражается в виде коэффициента, описывающего поглощенную дозу органами на единицу введенной радиоактивности в единицах мГр/МБк; D(орган).
Если затем проводится терапевтическое введение в аналогичных условиях, то этот коэффициент можно использовать для определения радиоактивности, которую необходимо вводить для доставки назначаемой поглощенной дозы в данный орган, ткань или опухоль (4, 6).
111
111
111
177
P
T
T
В случае лечения рака предстательной железы радиоизотопно мечеными антителами h5A10 предтерапевтическое исследование должно основываться на визуализации In с помощью In-h5A10. Для количественной (планарной/ОФЭКТ) визуализации лучше всего подходит In, чтобы после нее можно было использовать Lu как терапевтический радионуклид. Чтобы после определения D(орган) можно было проводить терапию с помощью терапевтической радиоактивности A, получая назначенный терапевтический эффект. Во время получения лечения на основании визуализации необходимо рассчитывать распределение радиоактивности и соответствующую мощность дозы для получения действительной терапевтической поглощенной дозы, приложенной к опухоли и нормальным органам, что требуется для оценки лечения.
В случае, когда при терапии достигают уровня токсичности для костного мозга в результате планирования лечения, тогда необходима поддержка костного мозга на основании дозиметрических расчетов полости костного мозга и необходимо определять время для реинфузии стволовых клеток.
Вкратце, следующая схема лечения должна планироваться соответствующим образом.
Предтерапевтическое дозиметрическое исследование
111
1. Инъекция In-меченого h5A10 (200-300 MБк).
2. Отбор образцов крови – на первой неделе определяют концентрацию радиоактивности в крови и плазме.
3. Визуализация (ОФЭКТ/Планар) в течение по меньшей мере 1 недели (3-5 раз).
4. Дозиметрия органов на основании схемы LundaDose (3) или эквивалентной программы.
5. Терапевтическая активность, которую определили, ограничена установленной поглощенной дозой для радиочувствительных органов, таких как костный мозг (2-3 Гр), почки (20-30 Гр) и печень (12-36 Гр).
Терапия, включающая внутритерапевтическую дозиметрию
177
1. Введение Lu-меченого h5A10 (на основе педтерапевтической дозиметрии).
2. Отбор образцов крови – концентрация радиоактивности в крови и плазме.
3. Визуализация в течение по меньшей мере 1 недели (3-5 раз).
4. Дозиметрия органов на основании схемы LundaDose (3) или эквивалентной программы => верификация предписанной терапевтической поглощенной дозы.
Особые замечания по дозиметрии
Кумулятивная радиоактивность представляет собой число распадов, которое происходит в данной области в течение некоторого периода времени. Ее единицей измерения является Бк с или Бк ч. Когда ионизирующая радиация проходит сквозь вещество, она взаимодействует и привносит энергию. Сообщенная энергия представляет собой сумму всех внесенных в данный объем энергий. Поглощенная доза представляет собой соотношение сообщенной энергии и массы данного объема. Единицей измерения поглощенной дозы является Грей (Гр), 1 Гр равен 1 Дж/кг.
По значениям радиоактивности в ткани в различные моменты времени путем интегрирования определяют кумулятивную радиоактивность и можно определять поглощенную дозу. Измерения радиоактивности производят с использованием планарной визуализации при дозиметрии целых органов. Количественная ОФЭКТ/КТ позволяет проводить дозиметрию в меньших объемах, используя методы на основе вокселей.
По значениям трехмерного распределения концентраций радиоактивности можно рассчитывать степень распределения поглощенной дозы, используя так называемые ядра точечных доз или воксельные S-значения, описывающие шаблон распределения энергии вокруг точечного источника, расположенного в ткани. В данном методе предполагается, что анатомическая область является гомогенной в понятии плотности, так что мягкие ткани находятся внутри ствола. Для областей тела, в которых плотность гетерогенна, например легких, предпочтительно применять прямой расчет по методу Монте-Карло. В этом случае распределение радиоактивности по ОФЭКТ или ПЭТ применяют как входные данные для кода расчета доз методом Монте-Карло.
Список литературы
1. Strand S-E, Zanzonico P, Johnson TK. Pharmacokinetic modeling. Med Phys 1993;20(2):515-27.
2. ICRU report nr 67 - Dose Specifications in Nuclear Medicine. Adelstein SJ, DeLuca P, Feinendegen LE, Green L, Howell RW, Humm JL, Strand SE ICRU; 2002.
3. The LundADose Method for Planar Image Activity Quantification and Absorbed-Dose Assessment in Radionuclide Therapy. Sjogreen K., Ljungberg M., Wingardh,K., Minarik,D., and Strand,S.E. (2005): Cancer Biother.Radiopharm., 20:92-97.
4. Quantitative imaging for clinical dosimetry. Bardies M, Flux G, Lassman M, Monsieurs N, Savolainen S, Strand S-E Nucl Instr and Methods 2006:569:467-471.
5. 177Lu-[DOTA0,Tyr3] octreotate therapy in patients with disseminated neuroendocrine tumors: Analysis of dosimetry with impact on future therapeutic strategy.
Garkavij Michael, Nickel Mattias, Sjögreen-Gleisner Katarina, Ljungberg Michael, Ohlsson Tomas, Wingårdh Karin, Strand Sven-Erik, Tennvall Jan.
Cancer 2010:116(4 Suppl):1084-92.
6. Dosimetry in patients with B-cell lymphoma treated with [(90)Y]ibritumomab tiuxetan or [(131)I]tositumomab Sjögreen-Gleisner K., Dewaraja YK., Chisea C., Tennvall J., Lindén O., Strand SE, Ljungberg M.. Q J Nucl Med Mol Imaging, 2011 April;55(2):126-54.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> FredAx AB
<120> ANTIBODY POLYPEPTIDES AND USES THEREOF
<130> FREBA/P61995PC
<160> 23
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region CDRH1
<400> 1
Thr Thr Gly Met Gly Val Ser
1               5
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region CDRH2
<400> 2
His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Thr Ser Leu Lys
1               5                   10                  15
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region CDRH3
<400> 3
Lys Gly Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region CDRL1
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asp Val Ala
1               5                   10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region CDRL2
<400> 5
Ser Thr Ser Tyr Leu Gln Ser
1               5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region CDRL3
<400> 6
Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 7
<211> 244
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Amino acid sequence of human PSA
<400> 7
Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu Lys
1               5                   10                  15
His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala Val
20                  25                  30
Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala His
35                  40                  45
Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu Phe
50                  55                  60
His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe Pro
65                  70                  75                  80
His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg Pro
85                  90                  95
Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu Pro
100                 105                 110
Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln Glu
115                 120                 125
Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile Glu
130                 135                 140
Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His
145                 150                 155                 160
Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val Thr
165                 170                 175
Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr Cys
180                 185                 190
Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln Gly
195                 200                 205
Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro Ser
210                 215                 220
Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr Ile
225                 230                 235                 240
Val Ala Asn Pro
<210> 8
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain variable region amino acid sequence
<400> 8
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Thr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Thr Ser
50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Glu Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Lys Gly Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain variable region amino acid sequence
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asp
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35                  40                  45
Phe Ser Thr Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210> 10
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antibody amino acid sequence
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210> 11
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Antibody amino acid sequence
<400> 11
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1               5                   10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65                  70                  75                  80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85                  90                  95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210> 12
<211> 449
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain amino acid sequence
<400> 12
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Thr
20                  25                  30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35                  40                  45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Thr Ser
50                  55                  60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Glu Asp Ser Ser Lys Asn Gln Val
65                  70                  75                  80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Lys Gly Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain amino acid sequence
<400> 13
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asn Thr Asp
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile
35                  40                  45
Phe Ser Thr Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 14
<211> 357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..357
<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Nucleic acid sequence"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 14
caggtcacac tgaaggaatc tgggcctgct ttggtgaagc ccactcagac tctgacactc      60
acatgcacct tctccgggtt tagcctgtca accaccggta tgggcgtgag ttggattcgc     120
caaccaccgg gtaaagcgct tgagtggctt gcacacatct attgggacga tgacaagcgg     180
tacagtacta gcctgaaaac gagactgacc ataagcgagg actcatccaa gaatcaggtg     240
gtactgacga tgaccaacat ggatcccgtt gataccgcca catactactg tgccaggaaa     300
ggctactatg gctatttcga ctattgggga cagggaacac tcgtcactgt gtcctct        357
<210> 15
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..324
<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Nucleic acid sequence"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 15
gacatccaga tgacccaatc tccctctagc ttgtccgcta gtgtcggtga tagggtgaca      60
gtgacatgca gagctagcca gaatgtcaac acagacgttg cctggtatca gcagaagcca     120
ggcaaagcac ccaaagccct catcttctcc acgtcatatc tgcaaagcgg agtaccttcc     180
cggtttagtg ggtctgggtc aggcactgac ttcaccctga ccatatccag ccttcaaccg     240
gaagatttcg cgacctacta ctgtcagcag tacagcaact atcctctgac ttttggacag     300
ggcactaagg tggagattaa gcgt                                            324
<210> 16
<211> 1350
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..1350
<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Nucleic acid sequence"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 16
caggtcacac tgaaggaatc tgggcctgct ttggtgaagc ccactcagac tctgacactc      60
acatgcacct tctccgggtt tagcctgtca accaccggta tgggcgtgag ttggattcgc     120
caaccaccgg gtaaagcgct tgagtggctt gcacacatct attgggacga tgacaagcgg     180
tacagtacta gcctgaaaac gagactgacc ataagcgagg actcatccaa gaatcaggtg     240
gtactgacga tgaccaacat ggatcccgtt gataccgcca catactactg tgccaggaaa     300
ggctactatg gctatttcga ctattgggga cagggaacac tcgtcactgt gtcctctgct     360
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc     420
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg     480
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga     540
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac     600
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa     660
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg     720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag     780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac     840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc     900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag     960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa    1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg    1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc    1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg    1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag    1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag    1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga                                     1350
<210> 17
<211> 642
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..642
<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Nucleic acid sequence"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 17
gacatccaga tgacccaatc tccctctagc ttgtccgcta gtgtcggtga tagggtgaca      60
gtgacatgca gagctagcca gaatgtcaac acagacgttg cctggtatca gcagaagcca     120
ggcaaagcac ccaaagccct catcttctcc acgtcatatc tgcaaagcgg agtaccttcc     180
cggtttagtg ggtctgggtc aggcactgac ttcaccctga ccatatccag ccttcaaccg     240
gaagatttcg cgacctacta ctgtcagcag tacagcaact atcctctgac ttttggacag     300
ggcactaagg tggagattaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca     360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat     420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag     480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg     540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc     600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt                        642
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N terminal amino acid sequence from light chain of antibody
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser
1               5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N terminal amino acid sequence from heavy chain of antibody
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly
1               5
<210> 20
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..35
<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Light chain primer 5A10-L "
/organism="Artificial Sequence"
<400> 20
ccagccatgg ctgacattgt gatgacccag tctca                                35
<210> 21
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..34
<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Light chain primer WO252"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 21
gcgccgtcta gaattaacac tcattcctgt tgaa                                 34
<210> 22
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..35
<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Fd chain primer 5A10-H "
/organism="Artificial Sequence"
<400> 22
ccagccatgg ctgaggtgca attggtggag tctgg                                35
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<222> 1..32
<223> /mol_type="unassigned DNA"
/note="Fd chain primer WO267"
/organism="Artificial Sequence"
<400> 23
ctagactagt acaatccctg ggcacaattt tc                                   32
<---