CDH3-ПЕПТИД И ВКЛЮЧАЮЩЕЕ ЕГО ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО
CDH3-PEPTIDE AND DRUG PREPARATION CONTAINING IT

Область техники
Настоящее изобретение относится к новым пептидам, пригодным в качестве вакцин против раковых заболеваний, при которых высоко экспрессируется P-кадгерин (CDH3), таких как рак поджелудочной железы, холангиоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак толстой кишки и рак легкого, а также настоящее изобретение относится к фармацевтическим агентам, включающим пептид для лечения и предотвращения рака.
Уровень техники
На долю рака поджелудочной железы приходится приблизительно 2-3% от всех злокачественных опухолей. Каждый год примерно 200000 людей по всему миру умирает от рака поджелудочной железы, и по количеству погибших рак поджелудочной железы занимает пятое место по массовости среди злокачественных опухолей. В Японии ежегодно умирает примерно 20000 человек. Факторы риска для развития рака поджелудочной железы включают диабет, хронический панкреатит, курение и им подобные, а также было опубликовано, что семейный анамнез также является одним из факторов риска. Совершались различные попытки с целью ранней диагностики заболевания, включающие улучшение диагностической визуализации; однако у большинства пациентов заболевание диагностировалось на поздних стадиях, когда они демонстрировали устойчивость к химиотерапии. Таким образом, их пятилетняя выживаемость составляет примерно 9,7%, и даже в случаях хирургического удаления опухоли только примерно 13%. Как результат при раке поджелудочной железы дается наиболее неблагоприятный прогноз среди раковых заболеваний пищеварительной системы. Благодаря этой трудности диагностирования наблюдается постепенное увеличение случаев рака поджелудочной железы в качестве причины смерти от рака, особенно в развивающихся странах. Хотя проводятся многоплановые лечения, первичное хирургическое удаление, и другие типы лечения, такие как лучевая терапия и химиотерапия, они не обладают кардинально улучшающими терапевтическими эффектами, и существует экстренная необходимость разработки новых терапевтических стратегий.
На долю холангиоцеллюлярного рака приходится примерно 10% из первичного рака печени, и он представляет собой второе наиболее распространенное раковое заболевание после печеночно-клеточного рака. Это заболевание демонстрирует слабые клинические характеристики, и во многих случаях рак детектируют на поздних стадиях, сопровождающихся метастазированием в лимфатических узлах, внутрипеченочный метастазированием и им подобными. Пятилетняя выживаемость составляет примерно 20%, и 35% в случаях хирургического удаления, но очень слабая, только 7,4% в случаях отсутствия хирургического удаления. Хотя хирургическое удаление представляет собой единственную терапию, которая, как может ожидаться, приводит к длительному выживанию, многие пациенты в момент детектирования уже находятся в неоперабельном состоянии (процент случаев хирургического вмешательства: 66%, процент инкурабельного удаления: 20%). Оба параметра, чувствительность к противораковым лекарственным средствам и радиочувствительность пациентов, являются очень низкими и поэтому является желательным создание терапии для неоперабельных случаев, включающих случаи инкурабельного удаления.
По сравнению с Западными странами уровень заболеваемости раком желудочно-кишечного тракта является высоким среди стран Азии, таких как Япония и Китай. Раннее детектирование рака желудочно-кишечного тракта стало возможным благодаря распространению диагностических тестов и развитию инструментов эндоскопии пищеварительной системы и методов контроля, вследствие чего количество пациентов уменьшилось. Однако рак желудочно-кишечного тракта все еще остается второй ведущей причиной смерти от злокачественных новообразований среди японцев, и его процент среди причин смерти все еще остается высоким. Рак толстой кишки представляет собой второе наиболее распространенное раковое заболевание в Западных странах и является третьей наиболее распространенной причиной смерти от злокачественных новообразований в Японии. Рак желудочно-кишечного тракта и рак толстой кишки лечат, главным образом, с помощью хирургического удаления, а также с помощью химиотерапии, лучевой терапии и им подобных. Иммунотерапия, которая подавляет развитие рака путем повышения иммунитета имеющего рак пациента, привлекает внимание в качестве новой терапии для метастазирующего рака и трудноизлечимого рака, против которого невозможно применение ранее упомянутых терапий.
Заболеваемость раком легкого в последние годы постоянно увеличивается в мире, и в настоящее время примерно один миллион людей в год умирает от рака легкого. Смертность от рака легкого также постоянно увеличивается в Японии и, как считают, в 2015 году достигнет 123000 человек. Он является ведущей причиной смерти от злокачественных новообразований в Японии. Количество пациентов, как считают, увеличивается по мере увеличения возраста популяции. Раннее детектирование и раннее лечение являются важными при лечении рака легкого. Однако недавно было отмечено, что обычная рентгенография грудной клетки и тесты мокроты, проводимые при медицинском осмотре, имеют слабый эффект на раннее детектирование рака легкого и не приводят к уменьшению смертности от рака. Так как количество смертей от рака легкого, как считают, постоянно увеличивается, разработка новой терапевтической стратегии представляется экстренной задачей.
С одной стороны, разработки молекулярной биологии и иммунологии опухолей выявили, что цитотоксические Т-клетки (Т-киллеры) и клетки Т-хелперы распознают пептиды, генерируемые при деградации белков, которые специфично и на высоком уровне экспрессируются в раковых клетках и которые представлены на поверхности раковых клеток или антиген-представляющих клеток посредством HLA-молекул, и Т-клетки вызывают иммунную реакцию, которая разрушает раковые клетки. Кроме того, было идентифицировано много белков опухолевых антигенов и пептидов, полученных из них, которые стимулируют такие иммунные реакции, которые поражают раковые заболевания, и в настоящее время находится в стадии разработки клиническое применение антиген-специфических иммунотерапий опухолей.
Молекула HLA класса I экспрессируется на поверхности всех содержащих ядро клеток организма. Она экспрессируется на клеточной поверхности путем связывания с пептидами, генерированными при внутриклеточной деградации белков, продуцируемых в цитоплазме или в ядре. На поверхности нормальной клетки пептиды, полученные из ее нормальных белков, связываются с молекулами HLA класса I, и Т-клетки иммунной системы не идентифицируют их для разрушения клетки. С другой стороны, в процессе развитие раковой опухоли раковые клетки иногда экспрессируют большое количество белков, которые едва или очень слабо экспрессируются в нормальных клетках. Когда молекулы HLA класса I связываются с пептидами, генерированными при внутриклеточной деградации белков, которые специфично или на высоком уровне экспрессируются в раковых клетках и затем экспрессируются на поверхности раковых клеток, то клетки Т-киллеры будут распознавать их и будут разрушать только раковые клетки. Кроме того, при введении индивидууму таких опухолеспецифичных антигенов или пептидов, то иммунный ответ, который разрушает раковые клетки и подавляет развитие рака, может индуцироваться без вреда для нормальных клеток. Это называется иммунотерапией рака с использованием опухолеспецифичных антиенов. Молекулы HLA класса II, главным образом, экспрессируются на поверхности антиген-представляющих клеток. Молекулы HLA класса II связываются с пептидами, полученными из опухолеспецифичных антигенов, которые генерируются с помощью внутриклеточной деградации опухолеспецифичных антигенов, инкорпорированных в антиген-представляющие клетки извне клеток, и затем экспрессируются на клеточной поверхности. Затем, после их распознавания, активируются клетки Т-хелперы и индуцируют или усиливают иммунную реакцию против опухолей путем продуцирования различных цитокинов, которые активируют другие иммунокомпетентные клетки.
Соответственно, если разработать иммунотерапию, мишенью которой являются антигены, которые специфично и на высоком уровне экспрессируются в этих раковых клетках, то такая терапия может эффективно ликвидировать только раковые клетки, не оказывая какого-либо опасного эффекта на собственные нормальные органы. Также ожидается, что терапия может использоваться для пациентов с любой конечной стадией рака, для которых не следует применять другого лечения. Кроме того, путем предварительного введения опухолеспецифичного антигена и пептида в качестве вакцины индивидуумам с высоким риском развития таких раковых заболеваний, развитие рака может быть предотвращено.
Хотя существуют различные терапии для лечения рака поджелудочной железы, прогноз развития рака является очень неблагоприятным по сравнению с другими типами раковых заболеваний. Это связано с тем, что рак поджелудочной железы трудно детектировать на ранней стадии, он быстро прогрессирует и, таким образом, часто детектируется только очень поздних стадиях. Хотя в настоящее время хирургическое удаление является наиболее обещающим радикальным лечением, операбельные случаи составляют только примерно 20% от общего количества. Хирургия поджелудочной железы также является высоко инвазивной, и поздние стадии демонстрируют очень неблагоприятный прогноз даже после хирургического удаления. Не удаляемые случаи подвергают лечению с помощью химиотерапии, в которой, главным образом, используется гемцитабин, и с помощью лучевой терапии. Однако многие случаи демонстрируют устойчивость к лечению и обладают слабыми циторедуктивными эффектами, что является одной из причин того, почему рак поджелудочной железы является трудноизлечимым. Соответственно, если разработать иммунотерапию, мишенью которой является антиген, который специфично и на высоком уровне экспрессируется в раковых клетках при раке поджелудочной железы, то такая терапия сможет эффективно ликвидировать только раковые клетки, не оказывая какого-либо опасного эффекта на собственные нормальные органы. Также ожидается, что она станет терапией, которая может быть применена для любого пациента с конечной стадией рака. Кроме того, так как рак поджелудочной железы часто рецидивирует на ранней стадии после удаления, то ожидается также, что терапия будет применяться в качестве послеоперационной смежной терапии.
Заявители настоящего изобретения ранее проводили широкогеномный анализ генной экспрессии 27648 генов человека с помощью анализа с использованием кДНК-микрочип для определения профилей их экспрессии в 16 случаях рака поджелудочной железы, в фетальных органах и в различных нормальных органов взрослого человека. В результате они обнаружили, что P-кадгерин (CDH3) высоко экспрессируется в раковых клетках в большинстве случаев рака поджелудочной железы, в то время как он едва экспрессируется в нормальных органах взрослого человека. Кроме того, CDH3, как наблюдалось, также имеет высокий уровень экспрессии в раковых клетках в большинстве случаев холангиоцеллюлярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, рака толстой кишки, немелкоклеточного рака легкого, рака яичка, рака шейки матки, остеосаркомы, саркомы мягкой ткани и им подобных. Этот факт предполагает, что CDH3 может представлять собой опухолеспецифичный антиген многих раковых заболеваний.
HLA-A2 часто наблюдается в популяции людей независимо от расы, и примерно 30% Японцев являются носителями HLA-A2. Таким образом, если может быть идентифицирован пептид, представленный клеткам Т-киллерам с помощью HLA-A2, то он может широко применяться не только среди Японцев, но также среди западноевропейцев и им подобных. Соответственно, идентификация пептидов опухолевых антигенов, представленных клеткам Т-киллерам с помощью HLA-A2, является важной задачей. Может быть в высокой степени полезным применение таких пептидов опухолевых антигенов для иммунотерапии рака легкого, чьи показатели распространенности и смертности являются высокими по всему миру.
Информация о документах известного уровня техники, имеющих отношение к изобретению, раскрытому в настоящей заявке, продемонстрирована ниже.
[Непатентный документ 1] Nakamura, T., et al., Oncogene 23: 2385-2400 (2004)
[Непатентный документ 2] Obama, K., et al., Hepatology 41: 1339-1348 (2005)
[Непатентный документ 3] Taniuchi, K., et al., Cancer Res 65: 3092-3099 (2005)
[Непатентный документ 4] Soler, A. P., et al., Cancer 86: 1263-1272 (1999)
[Непатентный документ 5] Paredes, J., et al., Clin Cancer Res 11: 5869-5877 (2005)
[Непатентный документ 6] Ingunn, M., et al., J Clin Oncol 22: 1242-1252 (2004)
[Непатентный документ 7] Glenn, L., et al., J Cell Biol 139: 1025-1032 (1997)
[Непатентный документ 8] Bauer, R., et al., Exp. Mol. Pathol. 81: 224-230 (2006)
[Непатентный документ 9] Muzon-Guerra, M.F., et al. Cancer 103: 960-969 (2005)
[Непатентный документ 10] Marck, V.V., et al., Cancer Res. 65: 8774-8783 (2005)
Описание изобретения
[Задачи, решаемые с помощью изобретения]
Цель, которую следует достичь с помощью настоящего изобретения, представляет собой разработку способов для реализации иммунотерапии, которая подавляет развитие рака путем повышения иммунитета имеющих рак пациентов, в качестве новой терапии для метастазирующих и трудноизлечимых раковых заболеваний, которые с трудом подвергаются лечению с помощью хирургических способов лечения, с помощью химиотерапии и лучевой терапии, которые используются для лечения рака поджелудочной железы, холангиоцеллюлярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, рака толстой кишки, немелкоклеточного рака легкого и им подобных. В настоящем изобретении предлагается идентифицированные пептиды, которые получены из белков, которые специфично и на высоком уровне экспрессируются в раковых клетках, и представляются клеткам Т-киллерам с помощью HLA-A2. Это дает возможность иммунотерапии, которая может применяться примерно для 30% пациентов Японцев, имеющих различные виды раковых заболеваний, раковые клетки которых экспрессируют на высоком уровне CDH3.
[Способы решения задач]
Заявители настоящего изобретения с помощью анализа тканей рака поджелудочной железы с использованием кДНК-микрочипа идентифицировали CDH3 (Регистрационный No. GenBank NM_001793) в качестве гена, который высоко экспрессируется в клетках рака поджелудочной железы. С целью определения индуцируется или нет противоопухолевый иммунитет с помощью CDH3-специфичных клеток Т-киллеров, использовали трансгенных по HLA-A2 мышей, экспрессирующих HLA-A2, носителями которого являются примерно 30% Японцев. Конкретно, трансгенных по HLA-A2 мышей иммунизировали с помощью полученных из костного мозга дендритных клеток, стимулированных с помощью человеческого CDH3-пептида, содержащего мотив связывания с HLA-A2, для того, чтобы определить будут ли индуцироваться HLA-A2-рестриктированные пептидоспецифичные клетки Т-киллеры. Метод ELISPOT использовали для детектирования γ-интерферона (IFN-γ), продуцируемого клетками Т-киллерами, которые активировались путем распознавания пептида, представленного HLA-A2, и таким образом определяли, индуцируются или нет в клетках селезенки иммунизированных мышей клетки Т-киллеры, специфичные к CDH3-пептиду. В результате заявители настоящего изобретения идентифицировали два новых CDH3-пептида, применимых для иммунотерапии для HLA-A2-положительных имеющих рак пациентов. Кроме того, было обнаружено, что CDH3-респонсивные клетки ЦТЛ (CTL), индуцированные путем использования этих пептидов, обладают цитотоксичностью, специфичной к раковым клеткам, экспрессирующим эндогенные молекулы CDH3 и HLA-A2, и что клетки ЦТЛ распознавали клетки-мишени с помощью рестрикции по HLA-класса I. Кроме того, также было обнаружено, что рост опухолей, трансплантированных мышам NOD/SCID, значительно подавлялся с помощью внутривенной инъекции CD8-положительных клеток, индуцированных пептидами (метод ЦТЛ-адоптивного иммунитета).
Более конкретно, в настоящем изобретении предлагается:
(1) пептид, соответствующий (A) или (B):
(A) пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2;
(B) пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, где одна, две или несколько аминокислот заменены, делетированы, вставлены и/или добавлены и где пептид обладает активностью индуцирования цитотоксической (Т-киллера) T-клетки;
(2) пептид по п. 1, где вторая аминокислота от N-конца представляет собой лейцин или метионин;
(3) пептид по п. 1, где C-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин;
(4) агент для индуцирования иммунитета против рака, включающий в качестве активного ингредиента один или более пептидов по п. 1;
(5) агент для лечения и/или предотвращения рака, включающий в качестве активного ингредиента один или более пептидов по п. 1;
(6) агент для индуцирования антиген-представляющей клетки, обладающей активностью индуцирования цитотоксической Т-клетки (Т-киллера), включающий в качестве активного ингредиента один или более пептидов по п. 1;
(7) агент для индуцирования антиген-представляющей клетки, обладающей активностью индуцирования цитотоксической Т-клетки (Т-киллера), включающий в качестве активного ингредиента один или более полинуклеотидов, кодирующих пептид по п. 1;
(8) агент для индуцирования цитотоксической Т-клетки (Т-киллера), включающий в качестве активного ингредиента один или более пептидов по п. 1;
(9) антитело к пептиду по п. 1;
(10) клетка Т-хелпер, цитотоксическая Т-клетка (Т-киллер) или группа иммуноцитов, включающих эти клетки, которые индуцируются путем применения пептида по п. 1;
(11) антиген-представляющая клетка, которая представляет комплекс, включающий пептид по п. 1 и HLA-антиген;
(12) антиген-представляющая клетка по п. 11, которая индуцируется агентом по п. 6 или 7;
(13) экзосома, которая представляет комплекс, включающий пептид по п. 1 и HLA-антиген;
*
(14) экзосома по п. 13, где HLA-антиген представляет собой HLA-A2 (HLA-A20201);
(15) способ индуцирования антиген-представляющей клетки, обладающей активностью индуцирования цитотоксической Т-клетки (Т-киллера), включающий стадию контактирования антиген-представляющей клетки с пептидом по п. 1;
(16) способ индуцирования антиген-представляющей клетки, обладающей активностью индуцирования цитотоксической Т-клетки (Т-киллера), включающий стадию трансфекции полинуклеотида, кодирующего пептид по п. 1, в антиген-представляющую клетку;
(17) способ индуцирования цитотоксической Т-клетки (Т-киллера), включающий стадию контактирования Т-клетки с пептидом по п. 1;
(18) способ индуцирования иммунитета против рака, включающий стадию введения субъекту пептида по п. 1;
(19) способ лечения и/или предотвращения рака, включающий стадию введения субъекту пептида по п. 1;
(20) применение пептида по п. 1 для получения агента, предназначенного для индуцирования иммунитета против рака;
(21) применение пептида по п. 1 для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения и/или предотвращения рака.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 продемонстрирована схема идентификации CDH3-пептидов, распознаваемых HLA-A2-рестриктированных клеток Т-киллеров. (День, в который были изолированы клетки селезенки из иммунизированных мышей, представлен как “День 0”).
На Фиг. 2 изображен график, демонстрирующий результат анализа ELISPOT для 18 CDH3-пептидов. Анализ ELISPOT использовали для определения могут ли клетки Т-киллеры, полученные из иммунизированных мышей, специфично реагировать с клетками, стимулированными с помощью CDH3-пептидов, и продуцировать IFN-γ. Клетки Т-киллеры, индуцированные с помощью CDH3-4-пептида или CDH3-7-пептида, специфично распознавали клетки КМ-ДК (BM-ДК), стимулированные с помощью CDH3-пептидов, и продуцировали IFN-γ; однако клетки T-киллеры, индуцированные с помощью других пептидов, не демонстрировали CDH3-специфичного иммунного ответа. Таким образом, пептиды CDH3-4 и CDH3-7, как подтвердилось, представляют собой эпитопные пептиды, способные индуцировать CDH3-специфичные HLA-A2-рестриктированные клетки Т-киллеры. Номера CDH3-пептидов, продемонстрированные на Фигуре 2, соответствуют пептидным номерам, продемонстрированным в колонке “положение” в Таблице 2, а не номерам последовательностей SEQ ID NO, описанным в настоящей заявке.
655-663
757-765
На Фиг. 3 изображены фотографии, демонстрирующие результаты анализа ELISPOT, детектирующего IFN-γ, продуцированного клетками Т-киллерами, активированными посредством специфичного распознавания CDH3-пептидов. CD4-отрицательные клетки селезенки продемонстрировали 283,7±40 пятен/на лунку в ответ на клетки КМ-ДК, стимулированные с помощью пептида CDH3-4 (слева в A и выше в B), при этом они демонстрировали 48,7±11,9 пятен/на лунку в ответ на клетки КМ-ДК в отсутствие пептидного стимула (справа в A и нижний ряд B) (P<0,05). Подобным образом, CD4-отрицательные клетки селезенки продемонстрировали 79,3±3,2 пятен/на лунку в ответ на клетки КМ-ДК, стимулированные с помощью пептида CDH3-7 (верхний ряд в C), при этом они демонстрировали 42,7±2,5 пятен/на лунку в ответ на клетки КМ-ДК в отсутствии пептидного стимула (нижний ряд в C) (P<0,05).
Анализ проводили дважды и получали такие же результаты.
655-663
757-765
655-663
757-765
2a
2a
655-663
757-765
51
+
+
+
+
+
51
На Фиг. 4 изображены линейные графики, демонстрирующие результат индуцирования CDH3-специфичных человеческих клеток ЦТЛ из клеток мононуклеаров периферической крови МКПК (PBMC) HLA-A2-положительных здоровых доноров и пациентов, имеющих рак. A: клетки ЦТЛ, реактивные к CDH3-пептиду, индуцировали из клеток МКПК HLA-A2-положительных здоровых доноров. После стимулирования три раза с помощью аутологичных, полученных из моноцитов дендритных клеток ДК (DC), стимулированных с помощью пептида CDH3-4 (выше) или CDH3-7 (ниже), оценивали цитотоксичность против клеток T2 (HLA-A2-положительных, TAP-дефицитных), стимулированных или не стимулированных каждым пептидом, с помощью стандартного анализа высвобождения Cr. Клетки ЦТЛ продемонстрировали цитотоксичность к клеткам T2, стимулированным пептидом CDH3-4 (выше) или CDH3-7 (ниже), но не продемонстрировали цитотоксичность к клеткам T2, не стимулированным с помощью пептида. B: Клетки ЦТЛ продемонстрировали цитотоксичность к CDH3 HLA-A2 клеткам клеточной линии HCT116 человека, и к клеткам плоскоклеточного рака полости рта клеточной линии HSC3, а также к клеткам PANC1/CDH3, которые представляют собой CDH3- HLA-A2 клетки клеточной линии PANC1 рака поджелудочной железы человека, трансформированные геном CDH3. Однако клетки ЦТЛ не демонстрируют цитотоксичность к CDH3- HLA-A2 клеткам клеточной линии SKHep1 рака печени человека, к клеткам PANC1, и к CDH3 HLA-A2- клеткам клеточной линии PK8 рака поджелудочной железы человека. C: CDH3-реактивные клетки ЦТЛ, индуцированные из клеток МКПК HLA-A2-положительных пациентов, имеющих рак поджелудочной железы (PC), и пациентов, имеющих рак желудочно-кишечного тракта (GC), демонстрировали цитотоксичность к клеткам HCT116 и PANC1/CDH3, но не демонстрировали цитотоксичность к клеткам PANC1 и PK8. D: Продемонстрировано ингибирование цитотоксичности с помощью моноклонального антитела к HLA класса I. После инкубирования клеток-мишеней, SKHep1/CDH3 и HSC3, с моноклональным антителом к HLA класса I (W6/32, IgG) или с моноклональным антителом к HLA-DR (H-DR-1, IgG) в течение часа, добавляли клетки ЦТЛ, индуцированные из клеток МКПК здоровых доноров, стимулированные с помощью пептида CDH3-4 (слева, середина) или CDH3-7 (справа). Продуцирование IFN-γ (слева и справа, IFN-γ-ELISPOT-анализ) и цитотоксичность (середина, анализ высвобождения Cr) заметно ингибировались с помощью W6/32, но не ингибировались с помощью H-DR-1.
+
+
2
+
+
655-663
757-765
На Фиг. 5 изображена in vivo-противоопухолевая активность клеток ЦТЛ, индуцированных с помощью CDH3, против раковых клеток человека, трансплантированных мышам NOD/SCID. A: Ингибирование роста клеток клеточной линии HCT116 (CDH3, HLA-A2) рака ободочной и прямой кишки, привитых мышам NOD/SCID, после трансплантации клеток ЦТЛ. Когда размер опухоли достигает 25 мм на 7 день после подкожной имплантации опухоли, то инокулировали внутривенно человеческие клетки ЦТЛ, реактивные к пептиду CDH3-4 () и к пептиду CDH3-7 (). На 14 день клетки ЦТЛ инокулировали снова таким же способом. Контрольные CD8 T-клетки, стимулированные с помощью HLA-A2-рестриктированного HIV-пептида, не демонстрировали цитотоксичности (◊). Продемонстрированы размеры опухолей у мышей NOD/SCID, которые получали два введения CDH3-реактивных клеток ЦТЛ (n=7), контрольных CD8 T-клеток (n=7), или индивидуально PBS (○, n=7), на 7 и на 14 день. Размеры опухолей выражены в квадратных миллиметрах. B: Размер опухоли в каждой группе продемонстрирован со стандартным отклонением ± SD (n=7).
Способ осуществления изобретения
Термины “a”, “an” и “the” при использовании в настоящей заявке обозначают “по меньшей мере, один” до тех пор, пока не определено по-другому.
До тех пор, пока не определено по-другому, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют такое же значение, какое является общепринятым среди специалистов в данной области, к которой принадлежит настоящее изобретение.
Пептид согласно настоящему изобретению представляет собой эпитоп, рестриктированный по HLA-A2, который представляет собой аллель HLA, как правило, обнаруживаемый в популяциях Японцев и Европейцев. Конкретно, кандидаты HLA-A2-связывающих пептидов, полученных из CDH3, были выбраны с использованием в качестве показателя их аффинности связывания с HLA-A2. Выбранные пептиды оценивали путем тестирования того, будут ли индуцироваться клетки Т-киллеры в организме трансгенной по HLA-A2 мыши с помощью дендритных клеток, полученных из клеток костного мозга (КМ-ДК) трансгенной по HLA-A2 мыши, стимулированных с помощью выбранного пептида. Клетки Т-киллеры индуцировались с помощью CDH3-4 (FILPVLGAV (SEQ ID NO: 1)) и CDH3-7 (FIIENLKAA (SEQ ID NO: 2)), в организме трансгенной по HLA-A2 мыши. Клетки Т-киллеры, индуцированные с помощью этих пептидов, демонстрировали иммунный ответ на клетки КМ-ДК, к которым добавляли эти пептиды. Однако эти клетки Т-киллеры не демонстрировали иммунного ответа на клетки КМ-ДК, к которым пептиды не добавлялись. Эти результаты демонстрируют, что пептиды, полученные из CDH3, пригодны для использования в качестве пептидов для индуцирования иммунной реакции против CDH3-представляющих клеток, и что пептиды, полученные из CDH3, представляют собой HLA-A2-рестриктированные эпитопные пептиды. CDH3 имеет высокий уровень экспресси в раковых клетках в большинстве случаев раковых заболеваний, таких как рак поджелудочной железы, холангиоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак толстой кишки, немелкоклеточный рак легкого, рак яичка, рак шейки матки, остеосаркома и опухоли мягких тканей. Это выявляет, что CDH3 пригоден для использования в качестве мишени для иммунотерапии при многих раковых заболеваниях.
(1) Пептиды согласно настоящему изобретению и агенты для индуцирования иммунитета против рака, содержащие эти пептиды
Пептид согласно настоящему изобретению представляет собой любой из следующих пептидов:
(A) пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2;
(B) пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, где одна, две или несколько аминокислот заменены, делетированы, вставлены и/или добавлены и где пептид обладает активностью индуцирования клеток Т-киллеров;
(C) пептид (B), в котором вторая аминокислота из N-конца представляет собой лейцин или метионин; и
(D) пептид (B), в котором C-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин.
Пептид согласно настоящему изобретению представляет собой эпитопный пептид, содержащий менее чем 40 аминокислот, предпочтительно менее чем 20 аминокислот, более предпочтительно, менее чем 15 аминокислот, который включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, и обладает активностью индуцирования клеток Т-киллеров. Альтернативно, эпитопный пептид может включать пептид, включающий аминокислотную последовательность of SEQ ID NO: 1 или 2, где одна, две или несколько аминокислот заменены, делетированы, вставлены и/или добавлены при условии сохранения активности индуцирования клеток Т-киллеров. Количество замененных, делетированных, вставленных и/или добавленных остатков составляет, как правило, 5 аминокислот или менее, предпочтительно 4 аминокислоты или менее, более предпочтительно 3 аминокислоты или менее, и еще более предпочтительно 1 аминокислоту или 2 аминокислоты.
Вариант-специфичные пептиды (т.e. пептиды, включающие аминокислотные последовательности, полученные путем изменения исходных аминокислотных последовательностей с помощью замены, делеции, вставки и/или добавления одной, двух или нескольких аминокислотных остатков), как известно, сохраняют исходные биологические активности (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10: 6487-500; Dalbadie-McFarland G et al., (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13). Аминокислотные изменения предпочтительно сохраняют свойства исходных аминокислотных боковых цепей. Примеры свойств аминокислотных боковых цепей представляют собой гидрофобные аминокислоты (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), гидрофильные аминокислоты (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), и боковые цепи, обладающие следующими функциональными группами или совокупными характеристиками: алифатическими боковыми цепями (G, A, V, L, I, P); боковыми цепями, содержащими гидроксильные группы (S, T, Y); боковыми цепями, содержащими атом серы (C, M); боковыми цепями, содержащими карбоновые кислоты и амиды (D, N, E, Q); боковыми цепями, содержащими основания (R, K, H); и боковыми цепями, содержащими компонент ароматического ряда (H, F, Y, W), где буквы в скобках обозначают буквенные коды аминокислот.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, пептиды по настоящему изобретению (иммуногенные пептиды) представляют собой нонапептиды (9-меры) или декапептиды (10-меры).
В настоящей заявке пептид, обладающий активностью индуцирования клеток Т-киллеров, обозначает пептид, обладающий активностью индуцирования клеток Т-киллеров, который стимулирует клетки Т-киллеры (цитотоксические Т-клетки/ЦТЛ).
С целью получения пептидов с высокой аффинностью связывания и активностью индуцирования клеток Т-киллеров аминокислотная последовательность неполного пептида природного CDH3 может быть изменена с помощью замены, делеции или добавления одной, двух или нескольких аминокислот. В настоящей заявке термин “несколько” обозначает 5 или менее, предпочтительно 3 или менее, более предпочтительно 2 или менее. Кроме того, так как известна закономерность пептидных последовательностей, обладающих высокой аффинностью к HLA-антигенам (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152: 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41: 178-228; Kondo A, et al. (1995) J.Immunol. 155: 4307-12), то пептиды по настоящему изобретению (эпитопные пептиды) могут быть изменены с целью улучшения их аффинности к HLA-антигенам на основе известной закономерности. Например, пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-2, могут быть получены путем замены второй аминокислоты с N-конца на лейцин или метионин. Подобным образом, пептиды с высокой аффинностью связывания с HLA-2, также могут быть получены путем замены C-концевой аминокислоты на валин или лейцин.
Когда последовательность эпитопного пептида является такой же, как часть аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, имеющего отличную функцию, то этим могут быть вызваны побочные эффекты, такие как аутоиммунные расстройства или аллергические симптомы против специфического вещества. С целью избежания таких побочных эффектов, измененный эпитопный пептид не должен быть идентичен аминокислотным последовательностям известных белков. Для этой цели необходимо проводить поиск гомологий с использованием баз данных для подтверждения того, что не существует эндогенного или экзогенного белка с отличной функцией, который бы демонстрировал 100%-гомологию с измененным эпитопным пептидом. Таким способом можно избежать рисков, вызванных вышеупомянутым изменением аминокислотной последовательности для увеличения аффинности связывания с HLA-антигеном и/или для увеличения активности индуцирования клеток Т-киллеров.
51
Хотя вышеописанные пептиды, обладающие аффинностью связывания с HLA-антигенами, как ожидается, являются высокоэффективными в качестве вакцин против рака, кандидатные пептиды, выбранные с использованием в качестве показателя высокой аффинности, должны быть исследованы на предмет того, действительно ли они обладают активностью индуцирования клеток Т-киллеров. Активность индуцирования клеток Т-киллеров может быть подтверждена с помощью: индуцирования антиген-представляющих клеток, имеющих человеческий MHC-антиген (например, B-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток), или, более конкретно, с помощью индуцирования дендритных клеток, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека; с помощью стимулирования их с помощью пептида, представляющего интерес; затем смешивания их с CD8-положительными клетками; измерения цитотоксической активности против клетки-мишени. В качестве реакционной системы могут быть использованы трансгенные животные, которые экспрессируют человеческий HLA-антиген (как описано, например, в публикации BenMohamed L, et al., (2000) Hum. Immunol. 61 (8): 764-79, Родственные статьи, Книги и библиотека Linkout). Например, клетки-мишени могут быть радиоактивно меченными с помощью Cr или подобным образом, и цитотоксическая активность может рассчитываться исходя из радиоактивности, высвобождающейся из клеток-мишеней. Альтернативно, клетки-мишени могут быть исследованы с помощью: измерения IFN-γ, продуцированного и высвобожденного из клеток Т-киллеров в присутствии антиген-представляющих клеток, имеющих иммобилизованный пептид; и визуализации зоны продуцирования IFN-γ на культуральной среде с использованием моноклонального антитела к IFN-γ.
Как продемонстрировано в Примерах, результат исследования пептидной активности индуцирования клеток Т-киллеров демонстрирует, что пептиды, обладающие высокой аффинностью связывания с HLA-антигеном, необязательно обладают высокой активностью индуцирования клеток Т-киллеров. Однако пептиды, содержащие аминокислотную последовательность CDH3-4 (FILPVLGAV (SEQ ID NO: 1)) или CDH3-7 (FIIENLKAA (SEQ ID NO: 2)), демонстрируют особенно высокую активность индуцирования клеток Т-киллеров.
Как описано выше, в настоящем изобретении предлагаются пептиды, обладающие активностью индуцирования клеток Т-киллеров, более конкретно, пептиды, включающие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, или их варианты (т.e., аминокислотные последовательности, в которых одна, две или несколько аминокислот заменены, делетированы, вставлены и/или добавлены). Аминокислотные последовательности пептидов, содержащие девять аминокислот SEQ ID NO: 1 или 2, или их варианты предпочтительно не являются идентичными последовательностям других эндогенных белков. Особенно пептиды с высокой аффинностью связывания HLA-A2 могут быть получены путем замены второй аминокислоты от N-конца на лейцин или метионин и/или путем замены C-концевой аминокислоты на валин или лейцин.
Пептиды по настоящему изобретению могут включать модификации, такие как гликозилирование, окисление в боковой цепи и фосфорилирование, если только пептиды не теряют их активности индуцирования клеток Т-киллеров. Другие модификации включают, например, D-аминокислоты или другие аналоги аминокислот, которые могут использоваться для увеличения периода полужизни пептидов в сыворотке.
Методы получения и производства пептидов по настоящему изобретению особо не ограничены. Пептиды могут быть химически синтезированными или рекомбинантными, полученными с помощью генно-рекомбинантной технологии.
Химически синтезированные пептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы согласно методам химического синтеза, таким как Fmoc-метод (метод, использующий флуоренилметилоксикарбонил) и t-Boc-метод (метод, использующий трет-бутилоксикарбонил). Пептиды по настоящему изобретению также могут быть синтезированы с применением различных коммерчески доступных пептидных синтезаторов.
Пептиды по настоящему изобретению могут быть произведены в виде рекомбинантных белков путем получения молекул ДНК, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие пептиды, или их варианты или гомологи, и путем их введения в подходящие экспрессирующие системы.
Используемые экспрессирующие векторы предпочтительно могут представлять собой любые векторы, которые могут автономно реплицироваться в клетках-хозяевах, или могут быть инкорпорированы в хромосому клетки-хозяина, и содержат промотор в подходящем локусе, позволяющий экспрессию гена, кодирующего пептид. Трансформанты, имеющие ген, кодирующий пептид по настоящему изобретению, могут быть получены путем введения вышеупомянутого экспрессирующего вектора в организм-хозяин. Организмом-хозяином могут выступать бактериальные, дрожжевые, животные клетки или клетки насекомых, и введение экспрессирующего вектора в организм-хозяин может проводиться с использованием известных методов в зависимости от организма-хозяина.
В настоящем изобретении рекомбинантный пептид по настоящему изобретению может быть изолирован путем культивирования трансформанта, полученного, как описано выше, получения и накопления пептида в культуре и сбора пептида из культуры.
Когда трансформантом является прокариот, такой как E. coli, или эукариот, такой как дрожжи, то культуральная среда для культивирования этих микроорганизмов может быть или натуральной, или синтетической средой при условии, что она содержит источник углерода, источник азота, минералы и тому подобное, что может использоваться микроорганизмами и позволяет эффективное культивирование трансформанта. Условия культивирования могут быть обычными условиями, используемыми для культивирования микроорганизмов. После культивирования пептид по настоящему изобретению может быть изолирован и очищен из культуры трансформанта с использованием стандартных методов изолирования и очистки пептидов.
Пептиды, включающие аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены или добавлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, могут быть подходящим образом произведены или получены специалистом в данной области на основе информации о нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2. Конкретно, ген, кодирующий пептид, который содержит аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, делетированы, вставлены и/или добавлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, и который обладает активностью индуцирования клеток Т-киллеров, также может быть получен с помощью любого метода, известного специалисту в данной области, такого метода, как химический синтез, методы генетической инженерии или мутагенез. Например, используется метод сайт-направленного мутагенеза, который является одним из методов генетической инженерии, так как с его помощью можно вводить конкретную мутацию в конкретное положение. Он может проводиться согласно методам, описанным в книге Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (далее для краткости указан как Molecular Cloning 2nd Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (далее для краткости указан как Current Protocols in Molecular Biology), и тому подобное.
Вышеописанные пептиды по настоящему изобретению могут индуцировать иммунитет против рака, что также показано ниже в Примерах. Таким образом, согласно настоящему изобретению также предлагаются агенты для индуцирования иммунитета против рака, содержащие пептиды по настоящему изобретению. Агенты для индуцирования иммунитета по настоящему изобретению также могут быть получены в виде смешанной композиции путем объединения двух или более из эпитопных пептидов. Агенты для индуцирования иммунитета, представленные в композиции путем объединения множества типов пептидов, могут представлять собой коктейль или могут быть взаимосвязаны с использованием стандартных методов. Эпитопные пептиды, которые следует объединить, могут представлять собой пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, полученные из одного и того же гена, или могут представлять собой пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, полученные из разных генов. Когда пептиды по настоящему изобретению вводят субъекту, то введенные пептиды компактно представлены на HLA-антигенах и, следовательно, индуцируются клетки Т-киллеры, которые специфично реагируют с комплексами, образованными между введенными пептидами и HLA-антигенами. Альтернативно, могут быть получены антиген-представляющие клетки, которые представляют пептиды по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности, путем контактирования дендритных клеток, собранных от субъекта, с пептидами по настоящему изобретению (или путем стимулирования дендритных клеток, собранных от субъекта, пептидами по настоящему изобретению). Путем введения этих антиген-представляющих клеток обратно каждому субъекту в организме субъекта индуцируются клетки Т-киллеры, и в результате может усиливаться иммунный ответ на клетки-мишени, представляющие пептиды по настоящему изобретению.
При использовании in vitro или in vivo, предпочтительно in vitro, агенты для индуцирования иммунитета против рака согласно настоящему изобретению могут индуцировать клетки Т-хелперы, клетки Т-киллеры или группу иммуноцитов, включающих эти клетки, посредством чего придается иммунитет против рака.
(2) Фармацевтические агенты для лечения и/или предотвращения рака согласно настоящему изобретению (вакцины против рака)
В Примерах было продемонстрировано, что пептиды по настоящему изобретению могут индуцировать in vivo клетки Т-киллеры, специфичные к раковым клеткам. Кроме того, было продемонстрировано в предыдущем изобретении, что CDH3 имеет высокий уровень экспрессии в раковых клетках в большинстве случаев раковых заболеваний, таких как рак поджелудочной железы, холангиоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак толстой кишки, немелкоклеточный рак легкого, рак яичка, рак шейки матки, остеосаркома, саркома мягкой ткани и тому подобное. Соответственно, агенты для индуцирования иммунитета, включающие пептиды по настоящему изобретению, как ожидается, являются эффективными агентами для лечения и/или предотвращения рака. То есть путем инъекции в организм пептидов по настоящему изобретению вместе, подходящим адъювантом или после стимулирования с помощью пептидов антиген-представляющих клеток, таких как дендритные клетки, индуцируются или активируются клетки Т-киллеры, атакующие опухоль, и в результате может ожидаться проявление противоопухолевых эффектов. Кроме того, гены, кодирующие пептиды по настоящему изобретению, могут быть инкорпорированы в подходящие векторы. Человеческие антиген-представляющие клетки (дендритные клетки и т.д.) и бактерии, такие как БЦЖ Mycobacterium tuberculosis, которые трансформированы с помощью рекомбинантной ДНК, или вирусы, такие как вирус осповакцины, который содержит интегрированную в геном ДНК, кодирующую пептид по настоящему изобретению, могут эффективно использоваться в качестве живых вакцин для лечения и/или предотвращения рака у человека. Дозировки и способы введения для вакцин против рака являются такими же, как вакцины против оспы или БЦЖ-вакцины.
Что касается настоящего изобретения, то термин “вакцина” (также называемый иммуногенной композицией) обозначает вещество, которое индуцирует противоопухолевый иммунитет или подавляет различные раковые заболевания при инокулировании животному. Согласно настоящему изобретению предположили, что пептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, представляет собой HLA-A2-рестриктированный эпитопный пептид, который индуцирует сильный и специфичный иммунный ответ против CDH3-представляющих клеток. Соответственно, настоящее изобретение также включает способы индуцирования противоопухолевого иммунитета с помощью использования пептидов, включающих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, или их вариантов, которые включают замены, делеции или добавления одной, двух или более аминокислот. Как правило, потивоопухолевй иммунитет включает следующий иммунный ответ:
(1) индуцирование клеток Т-киллеров против опухолей, содержащих клетки, экспрессирующие CDH3;
(2) индуцирование антител, которые распознают опухоли, содержащие клетки, экспрессирующие CDH3; и
(3) индуцирование продуцирования противораковых цитокинов.
Когда конкретный пептид индуцирует один из этих иммунных ответов посредством инокулирования животному, то такой пептид определяется как обладающий эффектом индуцирования противоопухолевого иммунитета. Индуцирование противоопухолевого иммунитета с помощью пептида может быть детектировано с помощью наблюдения in vivo- или in vitro-ответов иммунной системы организма-хозяина на пептид.
+
+
+
Например, методы детектирования индуцирования клеток Т-киллеров хорошо известны. Чужеродное вещество, которое проникает в живой организм, представляется Т-клеткам и В-клеткам путем функционирования антиген-представляющих клеток (APC). T-клетки, которые реагируют на антигены, представленные антиген-представляющими клетками, дифференцируются антиген-специфичным образом в клетки Т-киллеры (также называемые цитотоксическими Т-лимфоцитами или ЦТЛ) посредством стимулирования антигенами и затем пролиферируют. В настоящей заявке этот процесс называется “активацией” T-клеток. Индуцирование клетки Т-киллера с помощью специфичного пептида может оцениваться с помощью представления пептида на Т-клетках с использованием стимулированных пептидом антиген-представляющих клеток, и затем детектируется индуцирование клеток Т-киллеров. Кроме того, антиген-представляющие клетки обладают эффектом активации CD4 T-клеток, CD8 T-клеток, макрофагов, эозинофилов и NK-клеток. Так как CD4 T-клетки являются важными в противоопухолевом иммунитете, то эффект индуцирования противоопухолевого иммунитета пептида может оцениваться с использованием эффектов активации этих клеток в качестве показателей.
51
3
Методы оценки эффектов индуцирования клеток Т-киллеров, где клетки Т-киллеры индуцируются с использованием дендритных клеток (ДК) в качестве антиген-представляющих клеток, хорошо известны из уровня техники. Среди антиген-представляющих клеток ДК обладают сильнейшим эффектом индуцирования клеток Т-киллеров. Этот метод включает сначала контактирование тестируемого пептида с клетками ДК и затем контактирование клеток ДК с Т-клетками. T-клетки, обладающие цитотоксическими эффектами на клетки-мишени, детектируются из Т-клеток, вступивших в контакт с клетками ДК. Если T-клетки демонстрируют цитотоксическую активность против клеток-мишеней, то это означает, что тестируемый пептид обладает активностью индуцирования цитотоксических Т-клеток. Активность клеток Т-киллеров против клеток-мишеней, таких как опухолевые клетки, может быть детектирована, например, с использованием лизиса Cr-меченых опухолевых клеток в качестве показателя. Альтернативно, степень разрушения опухолевых клеток может оцениваться с использованием активности поглощения H-тимидина или с использованием в качестве показателя высвобождения лактозодегидрогеназы (LDH).
Тестируемые пептиды, для которых подтверждено с помощью этих методов, что они обладают активностью индуцирования клеток Т-киллеров, представляют собой пептиды, обладающие эффектами активации клеток ДК и, следовательно, активностью индуцирования клеток Т-киллеров. Таким образом, пептиды, которые индуцируют клетки Т-киллеры против опухолевых клеток, будут пригодны для использования в качестве вакцин против раковых клеток, представляющих CDH3. Кроме того, антиген-представляющие клетки, которые приобрели способность индуцировать клетки Т-киллеры против раковых клеток посредством контактирования с пептидом, будут пригодны для использования в качестве вакцин против рака. Кроме того, клетки Т-киллеры, которые приобрели цитотоксичность путем представления пептидов антиген-представляющими клетками, также могут использоваться в качестве вакцин против раковых клеток, представляющих CDH3. Способ лечения рака с использованием противоопухолевого иммунитета с помощью антиген-представляющих клеток и клеток Т-киллеров называется цитоиммунотерапией.
Как правило, при использовании пептидов для цитоиммунотерапии, эффективность индуцирования клеток Т-киллеров может быть усилена путем объединения множества пептидов, имеющих различные структуры. Таким образом, при стимулировании клеток ДК с помощью белковых фрагментов, предпочтительно использование смеси из более чем одного типа пептидных фрагментов.
Индуцирование противоопухолевого иммунитета с помощью пептидов также может оцениваться с помощью наблюдения за индуцированием продуцирования антител против опухолей. Например, когда антитела против пептидов индуцируются у лабораторных животных, иммунизированных с помощью пептидов, и когда рост, пролиферация и/или метастазирование опухолевых клеток подавляется этими антителами, то определяют, что пептиды индуцируют противоопухолевый иммунитет.
Противоопухолевый иммунитет может индуцироваться путем введения вакцины по настоящему изобретению, и индуцирование противоопухолевого иммунитета дает возможность лечения и предотвращения рака. Эффекты лечения рака или предотвращения возникновения рака могут включать ингибирование роста раковых клеток, регрессию раковых клеток и подавление развития раковых клеток. Уменьшение смертности индивидуумов, имеющих рак, уменьшение уровня опухолевых маркеров в крови и уменьшение детектируемых симптомов, сопровождающих рак, также включены в эффекты лечения или предотвращения рака. Такие терапевтические или превентивные эффекты вакцины против рака предпочтительно являются статистически значимыми по сравнению с эффектами контролей без введения вакцины. Например, эффекты наблюдаются при уровне значимости, составляющем 5% или менее. Статистические методы, которые могут использоваться для определения статистической значимости, представляют собой, например, t-тест Стьюдента, U-критерий Манна-Уитни или ANOVA.
В настоящем изобретении субъектом предпочтительно является млекопитающее. Примеры включают людей, всех приматов, кроме людей, мышей, крыс, собак, кошек, лошадей или крупный рогатый скот, но не ограничены ими.
Пептиды по настоящему изобретению могут вводиться субъекту in vivo или ex vivo. Кроме того, для получения иммуногенной композиции для лечения или предотвращения рака может быть использован иммуногенный пептид по настоящему изобретению, то есть аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 или 2, или нонапептиды, выбранные из вариант-специфичных пептидов.
Более конкретно, в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические агенты для лечения опухоли или для предотвращения роста, метастазирования опухолей и тому подобного, включающие в качестве активных ингредиентов один или более пептидов по настоящему изобретению. Пептиды по настоящему изобретению конкретно пригодны для использования в лечении рака поджелудочной железы, холангиоцеллюлярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, рака толстой кишки, немелкоклеточного рака легкого, рака яичка, рака шейки матки и опухолей, таких как остеосаркома и саркома мягкой ткани.
Пептиды по настоящему изобретению могут вводиться непосредственно субъекту в виде фармацевтического агента в составе фармацевтической композиции с помощью стандартных методов создания фармацевтических композиций. Такая фармацевтическая композиция, если необходимо, может включать дополнительно к пептидам по настоящему изобретению фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества и тому подобное. Фармацевтические агенты по настоящему изобретению могут использоваться для лечения и предотвращения различных опухолей.
Кроме того, для эффективного создания клеточного иммунитета адъюванты могут быть смешаны с фармацевтическими агентами для лечения и/или предотвращения опухолей, включающих в качестве активных ингредиентов один или более пептидов по настоящему изобретению. Альтернативно, эта композиция может вводиться совместно с другими активными ингредиентами, такими как противоопухолевые агенты. Подходящие фармацевтические композиции также включают гранулы. Подходящие адъюванты описаны в публикациях (Johnson AG., (1994) Clin. Microbiol. Rev., 7: 277-89). Примеры адъювантов включают неполный адъювант Фрейнда, БЦЖ, димиколят трегалозы (TDM), липополисахарид (LPS), квасцовый адъювант, адъювант на основе диоксида кремния, фосфат алюминия, гидроксид алюминия и калиево-алюминиевые квасцы, но не ограничиваясь ими. Кроме того, могут использоваться стандартным способом липосомные фармацевтические композиции, гранулярные фармацевтические композиции, в которых лекарственное средство прикреплено к гранулам, имеющим диаметр, составляющий несколько мкм, и фармацевтические композиции, в которых липиды связаны с вышеуказанными пептидами. Способы введения могут представлять собой: пероральное введение, внутрикожная инъекция, подкожная инъекция, внутривенная инъекция и тому подобное и могут включать системное введение или местное введение вблизи опухоли-мишени.
Доза пептидов по настоящему изобретению может регулироваться подходящим образом соответственно заболеванию, которое подвергается лечению, возрасту и весу тела пациента, способу введения и тому подобное. Доза обычно составляет 0,001 мг - 1000 мг, предпочтительно, 0,01 мг - 100 мг, и более предпочтительно, 0,1 мг - 10 мг. Предпочтительно введение осуществляется от одного раза в несколько дней, до одного раза в несколько месяцев, но специалист в данной области может легко выбрать подходящие дозы и способы введения, причем выбор и оптимизация этих параметров находятся целиком в рамках стандартного метода. Форма фармацевтической композиции также конкретно не ограничена, и она может быть лиофилизованной или гранулированной с добавлением вспомогательных веществ, таких как сахар.
Для увеличения активности индуцирования опухоле-респонсивных Т-клеток к фармацевтическим агентам по настоящему изобретению могут быть добавлены адъюванты, которые включают бактериальные компоненты бактерий БЦЖ и тому подобные, включающие мурамил дипептид (MDP), ISCOM, упоминаемый в Nature, vol. 344, p.873 (1990), QS-21 ряда сапонина, описанный в J. Immunol. vol. 148, p.1438 (1992), липосому и гидроксид алюминия. Кроме того, также могут быть использованы в качестве адъювантов иммуностимуляторы, такие как лентинан, сизофиран и пицибанил. Также могут быть использованы в качестве адъювантов цитокины и такие вещества, которые усиливают пролиферацию и дифференцировку Т-клеток, такие как IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6 и TNF, а также CpG и липополисахариды (LPS), которые активируют собственную иммунную систему путем связывания с Toll-подобными рецепторами, и α-галактозилцерамид.
Вакцинные композиции по настоящему изобретению включают компонент, который стимулирует клетки Т-киллеры. Липиды были идентифицированы как вещества, которые стимулируют клетки против вирусных антигенов in vivo. Например, остатки пальмитиновой кислоты могут присоединяться к ε-аминогруппе и α-аминогруппе остатка лизина и затем связываются с иммуногенным пептидом по настоящему изобретению. Липидированный пептид может затем вводиться непосредственно с помощью любого способа введения в мицелле или частице, будучи инкапсулированным в липосоме или эмульгированным в адъюванте. Другой возможный пример липидного стимулирования представляет собой стимулирование с помощью липопротеина Escherichia coli (E. coli), такого как трипальмитоил-S-глицерилцистеинил-серил-серин (P3CSS), когда образуется ковалентная связь с подходящим пептидом (Deres K., et al., (1989) Nature 342: 561-4).
Иммуногенные пептиды по настоящему изобретению также могут экспрессироваться вирусными векторами или бактериальными векторами. Примеры подходящих экспрессирующих векторов включают: вирусные хозяева с ослабленной вирулентностью, такие как вирус осповакцины или вирус оспы птиц. Например, вирус осповакцины может использоваться в качестве вектора для экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид. Иммуногенные пептиды экспрессируются путем введения клетки-хозяина, и это вызывает иммунный ответ. Метод иммунизации с использованием векторов вируса осповакцины описан, например, в патенте США № 4722848. Bacille de Calmette et Guerin (БЦЖ) также может использоваться. БЦЖ-векторы описаны в публикации Stover CK, et al., (1991) Nature 31: 456-60. Из уровня техники известно широкое разнообразие других векторов, пригодных для использования для терапевтического введения или иммунизации, включающих адено- и адено-ассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы, вектор брюшнотифозной палочки (Salmonella typhi), векторы нейтрализованного токсина сибирской язвы. Смотри, например, публикации Shata MT, et al., (2000) Mol. Med. Today 6: 66-71; Shedlock DJ and Weiner DB et al., (2000) J. Leukoc. Biol. 68: 793-806; и Hipp JD, et al., (2000) In Vivo 14: 571-85.
Кроме того, для эффективного индуцирования клеток Т-киллеров в организме пациента, in vitro добавляют антигенный пептид для представления антигена клеткам, собранным от пациента, или клеткам другого индивидуума, совместно использующего часть HLA-аллеля (алло), и затем клетки вводят пациенту внутрисосудистым образом или местно в опухоль. Альтернативно, после индуцирования клеток Т-киллеров in vivo путем добавления пептида к лимфоцитам периферической крови пациента и культивирования in vivo, клетки могут вводиться пациенту внутрисосудистым образом или местно в опухоль. Такую обработку с помощью клеточной трансплантации уже проводили в качестве терапии против рака, и она хорошо известна специалистам в данной области.
Типы раковых заболеваний в настоящем изобретении конкретно не ограничены, и конкретные примеры включают рак пищевода, рак груди, рак щитовидной железы, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, злокачественную меланому, злокачественную лимфому, остеосаркому, феохромоцитому, рак головы и шеи, рак матки, рак яичников, опухоль мозга, хроническую миелоидную лейкемию, острую миелоидную лейкемию, рак почки, рак предстательной железы, рак легкого, рак желудочно-кишечного тракта, рак печени, рак желчного пузыря, рак яичка, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, и саркому. Примеры раковых заболеваний, для которых является подходящим применение по настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой рак поджелудочной железы, холангиоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак толстой кишки или рак легкого.
(3) Антитела по настоящему изобретению
Настоящее изобретение относится к антителам, которые распознают часть пептида или цельный пептид по настоящему изобретению, упомянутому выше как эпитоп (антиген), а также относится к клеткам Т-киллерам, которые индуцируются с помощью in vitro-стимулирования с использованием белков или пептидов. Вообще, клетки Т-киллеры демонстрируют более сильную противоопухолевую активность, чем антитела.
Кроме того, подобно пептидам по настоящему изобретению антитела по настоящему изобретению пригодны для использования в качестве агентов для предотвращения и/или лечения раковых заболеваний, при которых раковые клетки экспрессируют CDH3, при условии, что агенты могут подавлять активность антигена CDH3 раковых клеток. В одном конкретном применении пептиды или антитела по настоящему изобретению могут вводиться сами по себе или вместе с фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем, если необходимо, с адъювантом, путем инъекции или путем распыления с помощью трансдермального поглощения через слизистую оболочку или подобным методом. Более конкретно, человеческий сывороточный альбумин может быть приведен в качестве примера носителя, упомянутого в настоящей заявке, а также PBS, дистиллированная вода и тому подобное могут быть приведены в качестве примера разбавителя.
Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой поликлональные антитела или моноклональные антитела и могут быть получены методами, известными специалистам из уровня техники.
Например, поликлональные антитела могут быть получены с помощью иммунизации млекопитающих или видов птиц с использованием в качестве антигена пептида по настоящему изобретению, с помощью забора крови от млекопитающих или видов птиц и с помощью отделения и очистки антител из собранной крови. Например, могут быть иммунизированы млекопитающие, такие как мышь, хомяк, морская свинка, курица, крыса, кролик, собака, коза, овца и крупный рогатый скот или виды птиц. Методы иммунизации известны специалистам в данной области, и антиген может вводиться, например, два или три раза с интервалами, составляющими 7-30 дней. Доза может составлять, например, приблизительно 0,05 мг - 2 мг антигена на одно введение. Может быть выбран подходящий путь введения, выбранный из подкожного, внутрикожного, внутрибрюшинного, внутривенного, внутримышечного введения и тому подобное, но не ограничиваясь никаким из этих путей. Кроме того, антиген может использоваться после растворения в подходящем буфере, например в буфере, содержащем стандартный адъювант, такой как полный адъювант Фрейнда или гидроксид алюминия.
Иммунизированных млекопитающих или виды птиц откармливают в течение определенного периода времени и, когда увеличится титр антитела их дополнительно иммунизируют антигеном в количестве, составляющем, например, 100 мкг - 1000 мкг. Забор крови у иммунизированных млекопитающих или видов птиц осуществляют через один или два месяца после последнего введения, и клетки крови могут разделять и очищать с помощью стандартных методов, таких как центрифугирование, преципитация с использованием сульфата аммония или полиэтиленгликоля, и хроматографии, такой как гель-фильтрационная хроматография, ионообменная хроматография и аффинная хроматография с получением поликлональных антител, которые распознают пептиды по настоящему изобретению в качестве поликлональной антисыворотки.
Моноклональные антитела могут быть получены с помощью приготовления гибридом. Например, гибридомы могут быть получены путем слияния клеток, продуцирующих антитела, с клетками миеломных клеточных линий. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью методов слияния клеток, таких как методы, описанные ниже.
Клетки селезенки, клетки лимфатического узла, B-лимфоциты и тому подобные клетки иммунизированных животных используются в качестве клеток, продуцирующих антитела. Пептиды по настоящему изобретению используются в качестве антигена. Животные, такие как мышь и крыса, могут использоваться в качестве иммунизированных животных, и введение эти животным антигенов проводят стандартными методами. Например, животных иммунизируют с помощью внутривенного, подкожного, внутрикожного, внутрибрюшинного и так далее, введения в количестве нескольких раз суспензии или эмульсии пептида по настоящему изобретению, который представляет собой антиген, и адъюванта, такого как полный адъювант Фрейнда или неполный адъювант Фрейнда. Клетки, продуцирующие антитело, такие как клетки селезенки, получают из иммунизированных животных, и эти клетки могут быть слиты с миеломными клетками с помощью известных методов (G. Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)) с получением гибридом.
Мышиные клеточные линии P3X63Ag8, P3U1, Sp2/0 и так далее могут быть приведены в качестве примера миеломных клеточных линий, используемых для слияния клеток. Для слияния клеток используется агент, стимулирующий слияние, такой как полиэтиленгликоль или вирус Сендай, а также после слияния клеток для селекции гибридом стандартным методом используется среда гипоксантин/аминоптерин/тимидин (HAT). Гибридомы, полученные с помощью слияния клеток, клонируют с помощью метода, такого как метод серийных разведений. Если необходимо, клеточные линии, продуцирующие моноклональные антитела, которые специфично распознают пептиды по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью скрининга с использованием метода иммуноферментного анализа с использованием пептидов по настоящему изобретению.
Дополнительно к вышеописанным методам иммунизированные клетки могут быть получены с помощью стимулирования человеческих лимфоцитов, таких как лимфоциты, инфицированные EB-вирусом, с in vitro-использованием пептидов по настоящему изобретению, клеток, экспрессирующих пептиды, или их лизатов. Человеческие антитела, которые связываются с пептидами по настоящему изобретению, также могут быть получены с помощью слияния таких иммунизированных лимфоцитов с полученными человеческими костно-мозговыми клетками, такими как U266 (Японская Патентная Заявка Kokai, Публикация No. (JP-A) S63-17688 (нерассмотренная, опубликованная Японская патентная заявка)).
С целью продуцирования целевых моноклональных антител из полученных таким способом гибридом, гибридомы могут культивироваться с помощью стандартных методов культивирования или с помощью методов с образованием асцитов, и моноклональные антитела могут быть очищены из супернатантов культур или из асцитов. Очистка моноклональных антител из супернатантов культур или из асцитов может осуществляться с помощью стандартных методов. Например, если необходимо, могут быть использованы в комбинации фракционирование с использованием сульфата аммония, гель-фильтрация, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и так далее.
Кроме того, трансгенные животные, имеющие группу генов человеческих антител, так же могут быть иммунизированы с использованием пептидов по настоящему изобретению, клеток, экспрессирующих пептиды, или их лизатов. Клетки, продуцирующие антитела, могут быть собраны от иммунизированных трансгенных животных с получением гибридом путем слияния с вышеуказанными клетками миеломных клеточных линий. Целевые моноклональные антитела затем могут продуцироваться гибридомами (WO92-03918; WO94-02602; WO94-25585; WO94-33735; WO96-34096).
Альтернативно, иммунные клетки, продуцирующие антитела, такие как иммунизированные лимфоциты, также могут быть иммортализованы с использованием онкогенов для получения моноклональных антител.
Полученные таким способом антитела также могут быть модифицированы с использованием технологий работы с генами (Borrbaeck and Larrick, (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies). Например, могут быть получены рекомбинантные антитела путем клонирования ДНК, кодирующей антитело, выделенной из клеток, продуцирующих антитела, таких как гибридомы и иммунизированные лимфоциты, вставки ДНК в подходящий вектор и путем трансфекции полученной конструкции в клетки-хозяева.
Антитела по настоящему изобретению также могут представлять собой фрагменты антител или модифицированные антитела при условии, что они связываются с пептидами по настоящему изобретению. Фрагменты антител могут представлять собой Fab, F(ab')2, Fv, или одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), в котором Fv-фрагменты, полученные из цепей H и L, связаны вместе с помощью подходящего линкера (Huston et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83). Более конкретно, фрагменты антител могут быть получены путем обработки антител с помощью фермента, такого как папаин и пепсин (Co et al., (1994) J Immunol 152: 2968-76; Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178: 476-96; Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Emzymol 178: 497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol 121: 652-63; Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol 121: 663-9; Bird and Walker, (1991) Trends Biotech 9: 132-7).
Антитела по настоящему изобретению включают модифицированные антитела, которые получены с помощью сшивки различных молекул, таких как полиэтиленгликоль (PEG). Антитела могут быть модифицированы с помощью стандартных методов химической модификации, известных из области техники.
Антитела по настоящему изобретению включают химерные антитела, включающие вариабельный участок, полученный из отличного от человеческого антитела, и константный участок, полученный из человеческого антитела, гуманизированные антитела, включающие гипервариабельный участок (CDR), полученный из отличного от человеческого антитела, каркасный участок (FR), полученный из человеческого антитела, и константный участок, полученный из человеческого антитела. Такие антитела могут быть получены с помощью стандартных методов, известных из области техники. Гуманизированные антитела получают путем замены участка CDR-последовательности человеческого антитела на CDR-участок грызунов, обладающий целевой активностью связывания (Verhoeyen et al., (1988) Science 239: 1534-6). Соответственно, по сравнению с химерными антителами гуманизированные антитела представляют собой антитела, в которых более короткий участок человеческого антитела заменен на соответствующий участок с происхождением из вида, отличного от человека.
Так же может быть получено полное человеческое антитело, содержащее человеческий вариабельный участок дополнительно к человеческому каркасному и константному участку. Например, в in vitro-методе может быть проведен скрининг с использованием рекомбинантной библиотеки бактериофагов, содержащей фрагменты человеческих антител (Hoogenboom and Winter, (1992) J Mol Biol 227: 381-8). Подобным образом человеческие антитела могут быть получены путем введения человеческих иммуноглобулиновых локусов трансгенным животным, чьи эндогенные иммуноглобулиновые гены частично или полностью инактивированы (US6150584, US5545807, US5545806, US5569825, US5625126, US5633425, US5661016).
Антитела, полученные, как установлено выше, могут быть очищены до гомогенного состояния с помощью стандартных методов, известных из области техники. Например, могут использоваться общепринятые методы разделения и очистки белков. Антитела могут быть разделены и очищены с использованием комбинации колоночной хроматографии, такой как аффинная хроматография, фильтрации, ультрафильтрации, высаливания, диализа, электрофореза в SDS-полиактирамидном геле, электрофореза с изоэлектрическим фокусированием и так далее; однако методы разделения и очистки не ограничиваются этими методами (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, (1988) Cold Spring Harbor Laboratory). Колонки с белком A и колонки с белком G могут использоваться в качестве аффинных колонок. Примером колонки с белком A может быть HyperD, POROS и Сефароза F.F (Pharmacia).
Примером отличной от аффинной хроматографии может быть ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография, гель-фильтрация, хроматография с обращенной фазой, адсорбционная хроматография и так далее (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. et al.). Жидкостная хроматография, такая как HPLC и FPLC, также может использоваться в качестве хроматографии.
Антиген-связывающая аффинность антител по настоящему изобретению может измеряться с использованием, например, определения поглощения, с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), иммуноферментного анализа (EIA), радиоиммуноанализа (RIA), и иммунофлуоресцентного анализа; однако методы не ограничены этими методами. Для проведения анализа ELISA, антитела по настоящему изобретению иммобилизуют на чашке, добавляют пептиды по настоящему изобретению, и затем добавляют образец, содержащий супернатнат культуры клеток, продуцирующих антитела, или очищенные антитела. В следующей стадии добавляют вторичное антитело, содержащее детектируемую метку, и распознающее антитело, чью антиген-связывающую активность необходимо измерить. После промывания чашки, добавляют реагенты для детектирования метки на вторичном антителе, и определяют поглощение или подобную измеряемую величину. Например, в качестве метки для вторичного антитела могут использоваться ферменты, такие как щелочная фосфатаза, и в качестве реагентов для детектирования могут использоваться субстраты ферментов, такие как п-нитрофенилфосфат. BIAcore (Pharmacia) также может использоваться для оценки активности антител.
Антитела по настоящему изобретению могут детектировать пептиды по настоящему изобретению, содержащиеся в образцах. А именно может быть подтверждено присутствие пептидов по настоящему изобретению в раковых тканях, например, путем экспонирования биопсийных образцов раковых тканей с антителами по настоящему изобретению.
Перед стадией лечения и/или предотвращения рака с использованием пептидов по настоящему изобретению, перед началом лечения может быть сделан прогноз относительно субъектов, эффективно подвергающихся лечению, с помощью подтверждения экспрессии пептидов по настоящему изобретению в раковых клетках, которые следует подвергнуть лечению с использованием антител по настоящему изобретению.
Кроме того, так как антитела по настоящему изобретению распознают фрагменты пептида CDH3, чья экспрессия увеличивается в различных раковых клетках, ожидается, что они применимы не только для диагностики, но также для лечения.
(4) Клетки T-хелперы, клетки T-киллеры или включающая их группа иммуноцитов
Настоящее изобретение также относится к клеткам Т-хелперам, клеткам Т-киллерам или к включающей их группе иммуноцитов, индуцированным с помощью in vitro-стимулирования с использованием пептидов по настоящему изобретению. Например, опухолереактивные активированные Т-клетки индуцируются, когда лимфоциты периферической крови стимулируют in vitro с использованием пептидов по настоящему изобретению, и эти активированные T-клетки могут эффективно использоваться для адаптивной иммунотерапии. Также, дендритные клетки, которые являются эффективными антиген-представляющими клетками, могут быть стимулированы с помощью пептидов по настоящему изобретению или могут быть генетически трансформированы для экспрессии этих пептидов, эти клетки затем могут быть использованы для стимулирования Т-клеток in vivo или in vitro для индуцирования противоопухолевого иммунного ответа.
Предпочтительно клетки Т-хелперы, клетки Т-киллеры или включающая их группа иммуноцитов могут быть индуцированы с помощью in vitro-стимулирования с использованием пептидов по настоящему изобретению и иммуностимуляторов. Термин иммуностимулятор в настоящем описании включает факторы роста клеток или цитокины.
Опухоли могут подавляться, и раковые заболевания могут предотвращаться и/или подвергаться лечению с помощью трансфузии в организм клеток Т-хелперов, клеток Т-киллеров или включающей их группы иммуноцитов, как описано выше.
Клетки T-хелперы, клетки Т-киллеры или включающая их группа иммуноцитов, которые могут подавлять опухоли, как описано выше, также могут быть получены с использованием пептидов по настоящему изобретению. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются среды клеточной культуры, содержащие пептиды по настоящему изобретению. Клетки T-хелперы, клетки Т-киллеры или включающая их группа иммуноцитов, которые могут подавлять опухоли, как описано выше, могут быть получены с использованием таких сред клеточной культуры. Кроме того, в настоящем изобретении предлагается набор реагентов для клеточной культуры, содержащий среду клеточной культуры, описанную выше, и флакон клеточной культуры для получения клеток T-хелперов, клеток T-киллеров или включающей их группы иммуноцитов.
(5) Антиген-представляющие экзосомы
В настоящем изобретении дополнительно предлагаются эндоцитозные везикулы, называемые “экзосомами”, которые представляют на своей поверхности комплекс, образованный между пептидом по настоящему изобретению и HLA-антигеном. Экзосомы могут быть получены, например, с помощью методов, подробно описанных в Японском переводе Японской патентной заявки Kohyo Публикация No. (JP-A) H11-510507 (нерассмотренная Японская заявка в фазе национальной публикации, соответствующая не Японской международной публикации) и JP-A (Kohyo) 2000-512161. Предпочтительно, экзосома может быть получена с использованием антиген-представляющих клеток, полученных от целевого субъекта для лечения и/или предотвращения заболевания. Экзосомы по настоящему изобретению могут инъецироваться в качестве вакцины против рака способом, подобным для пептидов по настоящему изобретению.
Антигенный HLA-тип, используемый в настоящем изобретении, должен подходить антигенному HLA-типу субъекта, нуждающегося в лечении т/или предотвращении заболевания. Примером является HLA-A2, и, предпочтительно, HLA-A2 (HLA-A*0201). “HLA-A2” обозначает белок, в то время как “HLA-A*0201” обозначает ген, соответствующий сегменту белка (этот термин используется, поскольку не существует в настоящее время доступных терминов, обозначающих сегменты белка).
(6) Способы индуцирования антиген-представляющих клеток и клеток Т-киллеров
В настоящем изобретении предлагаются способы индуцирования антиген-представляющих клеток с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Антиген-представляющие клетки могут быть индуцированы путем стимулирования дендритных клеток, индуцированных из моноцитов периферической крови, с помощью одного или более пептидов по настоящему изобретению для стимулирования клеток. Когда пептиды по настоящему изобретению вводят субъекту, антиген-представляющие клетки, представляющие на своей поверхности пептиды по настоящему изобретению, могут индуцироваться в организме субъекта. Альтернативно, после контактирования антиген-представляющих клеток с пептидами по настоящему изобретению (или после стимулирования антиген-представляющих клеток пептидами по настоящему изобретению), клетки могут быть введены субъекту в качестве вакцины с использованием метода ex vivo. Например, ex vivo-введение может включать стадии:
(1) сбора антиген-представляющих клеток от субъекта; и
(2) контактирования антиген-представляющих клеток стадии (1) с пептидами по настоящему изобретению (или стимулирование антиген-представляющих клеток стадии (1) пептидами по настоящему изобретению).
Антиген-представляющие клетки, полученные в стадии (2), могут вводиться субъекту в качестве вакцины.
В настоящем изобретении также предлагаются способы индуцирования антиген-представляющих клеток, обладающих высоким уровнем активности индуцирования клеток Т-киллеров. Способы включают in vitro-стадию трансфекции в антиген-представляющие клетки гена, включающего полинуклеотид, кодирующий один или более пептидов по настоящему изобретению. Ген, который следует трансфицировать, может быть представлен в виде ДНК или РНК. В качестве метода трансфекции могут быть использованы подходящим образом различные методы, которые стандартно используются в области техники, такие как липофекция, электропорация и кальций фосфатный метод, но не ограничиваясь ими. Более конкретно, трансфекция может осуществляться, как описано в публикациях Reeves ME, et al., (1996) Cancer Res., 56: 5672-7; Butterfield LH, et al., (1998) J. Immunol., 161: 5607-13; Boczkowski D, et al., (1996) J Exp. Med., 184:465-72; и в опубликованном Японском переводе WO2000-509281. Когда гены трансфицированы в антиген-представляющих клетках, то они транскрибируются и транслируются в этих клетках. Полученные таким способом белки последовательно процессируются по пути MHC класса I или класса II и представляются на поверхности антиген-представляющих клеток в виде неполных пептидов посредством антиген-представляющего пути.
В настоящем изобретении дополнительно предлагаются способы индуцирования клеток Т-киллеров с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. С помощью введения субъекту одного или более пептидов по настоящему изобретению, клетки Т-киллеры могут индуцироваться в организме субъекта, усиливая таким способом иммунную систему, которая нацеливается на раковые клетки, представляющие CDH3, в опухолевых тканях. Альтернативно, активированные клетки Т-киллеры могут индуцироваться путем контактирования in vitro антиген-представляющих клеток, полученных от субъекта, и CD8-положительных клеток с одним или более пептидами по настоящему изобретению, и путем дополнительного контактирования мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с антиген-представляющими клетками in vitro для стимулирования клеток. В ex vivo-методах лечения, иммунная система, которая нацеливается на раковые клетки, представляющие CDH3, в опухолевых тканях субъекта, может быть усилена с помощью возврата активированных клеток Т-киллеров субъекту. Например, способы включают стадии:
(1) сбора антиген-представляющих клеток от субъекта;
(2) контактирования антиген-представляющих клеток стадии (1) с пептидами по настоящему изобретению (или стимулирование антиген-представляющих клеток стадии (1) пептидами по настоящему изобретению);
+
(3) смешивания и совместного культивирования антиген-представляющих клеток стадии (2) с CD8 T-клетками для индуцирования цитотоксических T-клеток; и
+
(4) сбора CD8 T-клеток из совместной культуры стадии (3).
+
CD8 T-клетки, обладающие цитотоксической активностью, полученные в стадии (4), могут вводиться субъекту в качестве вакцины.
В настоящем изобретении дополнительно предлагаются изолированные клетки Т-киллеры, которые индуцируются с использованием одного или более пептидов по настоящему изобретению. Предпочтительно, клетки T-киллеры, индуцированные с помощью способа по настоящему изобретению, получают от субъекта, заболевание которого следует подвергнуть лечению и/или предотвратить. Они могут вводиться в комбинации с другими агентами, включающими антиген-представляющие клетки или экзосомы, представляющие один или более пептидов по настоящему изобретению. Полученные клетки Т-киллеры являются специфичными для клеток-мишеней, представляющих пептид, который является тем же, что используется для индуцирования. Клетки-мишени представляют собой те клетки, которые эндогенно экспрессируют CDH3, или те, которые трансфицированы геном CDH3. Клетки, представляющие на своей поверхности пептиды по настоящему изобретению с помощью стимулирования пептидами по настоящему изобретению, такие как раковые клетки рака поджелудочной железы, холангиоцеллюлярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, рака толстой кишки, немелкоклеточного рака легкого, рака яичка, рака шейки матки, остеосаркомы и саркомы мягких тканей, могут представлять собой мишень для атаки.
В настоящем изобретении также предлагаются антиген-представляющие клетки, которые представляют комплекс, образованный между HLA-антигеном и одним или более пептидами по настоящему изобретению. Антиген-представляющие клетки, экспрессирующие один или более пептидов по настоящему изобретению или нуклеотиды, кодирующие такие пептиды, предпочтительно собирают от субъекта, заболевание которого следует подвергнуть лечению и/или предотвратить. Пептиды по настоящему изобретению, антиген-представляющие клетки, представляющие пептиды, экзосомы или активированные клетки Т-киллеры могут вводиться в качестве вакцины в комбинации с другими агентами.
Настоящее изобретение дополнительно объясняется с помощью Примеров, описанных ниже. Однако оно не ограничено этими Примерами.
Все ссылки на известный уровень техники, цитированные в настоящей спецификации, введены в настоящую заявку с помощью ссылок.
Примеры
[Пример 1]
Экспрессия CDH3 в злокачественных опухолях
Согласно проведенным ранее анализам с использованием кДНК-микрочипов было обнаружено, что экспрессия CDH3 увеличивалась в различных злокачественных опухолях, включающих рак желудочно-кишечного тракта, рак толстой кишки и так далее по сравнению с экспрессией в нормальных соседних тканях (Таблица 1) (Nakamura T, et al., Oncogene 2004; 23: 2385-2400; Kitahara O, Cancer Res 2001; 61: 3544-3549., Obama K, et al., Hepatology 2005; 41: 1339-1348.).
[Таблица 1]
N
Положительный коэффициент* (%)
Отношение относительной экспрессии (среднее значение)
Рак поджелудочной железы
16/16
100
1900000
Рак яичка
10/10
100
396000
Опухоль мягкой ткани
21/21
100
248000
Холангиоцеллюлярный рак
19/19
100
3600
Немелкоклеточный рак легкого
35/37
95
73000
Рак ободочной и прямой кишки
31/34
91
84000
Рак шейки матки
14/19
74
1500
Рак желудочно-кишечного тракта
20/28
71
35000
Рак мочевого пузыря
24/34
71
30
Мелкоклеточный рак легкого
3/14
21
7
Рак груди
5/81
6
1
Рак предстательной железы
2/57
4
1500
Почечноклеточный рак
0/20
0
0
Рак пищевода
0/19
0
2
*“Положительный” обозначает, когда отношение относительной экспрессии (раковая ткань/нормальная ткань) составляет >5.
[Пример 2]
Выбор состава CDH3-пептида, обладающего аффинностью к HLA-A2
Поиск человеческой аминокислотной последовательности CDH3 проводили с использованием системы BIMAS, и было выбрано 18 пептидов в порядке убывания ожидаемой аффинности связывания с HLA-A2 (Таблица 2).
HLA-A2-рестриктированные эпитопы клеток Т-киллеров, идентифицированные в настоящем изобретении, демонстрируются с использованием подчеркивания.
[Пример 3]
5
+
+
Сначала дендритные клетки (ДК) индуцировали из костномозговых клеток трансгенных по HLA-A2 мышей с использованием описанного ранее метода (Komori H et al. Clinical Cancer Research 12: 2689-2697, 2006). Затем полученные таким способом клетки КМ-ДК стимулировали с помощью CDH3-пептидов (10 мкМ) и затем вводили внутрибрюшинно трансгенным по HLA-A2 мышам в количестве, составляющем 5×10клеток/на мышь. После иммунизации путем введения дважды с недельными интервалами клетки селезенки мыши собирали и использовали для детектирования клеток Т-киллеров. С целью точно детектировать индуцирование клеток Т-киллеров, полученных из CD8 T-клеток, использовали клетки селезенки, которые были получены путем исключения CD4 T-клеток с использованием гранул MACS после удаления селезенки.
На Фигуре 1 представлен протокол определения CDH3-пептидов, распознаваемых HLA-A2-рестриктированными клетками Т-киллерами в трансгенных по HLA-A2 мышах. День, когда клетки селезенки собирали от иммунизированных мышей, представлен как “День 0”.
День-21: (1) Индуцирование полученных из костного мозга дендритных клеток (далее в настоящем описании, называемых “КМ-ДК”) инициировали путем добавления GM-CSF к клеткам костного мозга трансгенных по HLA-A2 мышей.
5
День-14: (2) Смесь трех типов CDH3-пептидов добавляли к индуцированным клеткам КМ-ДК. Через два часа клетки КМ-ДК вводили внутрибрюшинно в количестве 5×10 клеток/на мышь.
(1) и (2) повторяли дважды с недельными интервалами.
День 0: Клетки селезенки собирали от иммунизированных трансгенных по HLA-A2 мышей и культивировали совместно с клетками КМ-ДК, которые снова инкубировали с CDH3-пептидом в течение двух часов и культивировали в течение шести дней.
День 6: Для детектирования клеток T-киллеров, которые специфично распознают CDH3-пептиды, T-клетки, продуцирующие гамма-интерферон (IFN-γ), оценивали количественно с помощью анализа ELISPOT после антигенного стимулирования. Стимулированные с помощью CDH3-пептида клетки КМ-ДК и не стимулированные клетки КМ-ДК использовали в качестве клеток-мишеней.
Исследование активности CDH3-специфичных клеток Т-киллеров с помощью анализа ELISPOT:
Для того, чтобы подтвердить, что клетки T-киллеры, специфично реагирующие CDH3 с продуцированием IFN-γ, реально существуют среди этих клеток, проводили исследование с помощью анализа ELISPOT. IFN-γ детектировали с использованием набора реагентов Mouse IFN-γ ELISPOT Set (BD Biosciences). Когда клетки T-киллеры (эффектор) реагируют на стимулирующие клетки (мишень) и продуцируют IFN-γ, то IFN-γ будет детектироваться в виде красных пятен. Клетки КМ-ДК или стимулированные CDH3-пептидом клетки КМ-ДК использовали в качестве клеток-мишеней. Сначала ELISPOT-планшет (BD Biosciences) покрывали мышиным антителом к IFN-γ в течение 18 часов и затем блокировали с использованием 10% FCS/RPMI в течение двух часов. Эффекторные клетки (100 мкл/на лунку) и клетки-мишени (100 мкл/на лунку) смешивали и культивировали в течение 22 часов при 37°C. Эксперимент проводили при отношении эффектор/мишень (отношение E/T), составляющем 10:1. Планшет затем промывали с помощью стерильной воды, обрабатывали с помощью биотинилированного мышиного антитела к IFN-γ в течение двух часов и далее обрабатывали с помощью стрептавидина-пероксидазы хрена в течение одного часа. IFN-γ-положительные пятна детектировали в растворе субстрата. Программное обеспечение MINERVA TECH для исследования с помощью автоматического анализатора использовали для подсчета пятен. В результате, наблюдали иммунный ответ CDH3-специфичных клеток Т-киллеров для клеток Т-киллеров, индуцированных с помощью пептида CDH3-4 или CDH3-7, тогда как не наблюдали CDH3-специфичного иммунного ответа для клеток Т-киллеров, индуцированных с помощью других пептидов (Фигуры 2 и 3).
Результат анализа ELISPOT для клеток T-киллеров, индуцированных с помощью пептида CDH3-4 (SEQ ID NO: 1) и пептида CDH3-7 (SEQ ID NO: 2), продемонстрирован на Фигуре 3.
Клетки T-киллеры продемонстрировали 283,7±40,0 пятен/на лунку в ответ на клетки КМ-ДК, стимулированные с помощью пептида CDH3-4 (SEQ ID NO: 1), тогда как они продемонстрировали 48,7±11,9 пятен/на лунку в присутствии клеток КМ-ДК без стимулирования пептидом (P<0,05). Аналогично, клетки Т-киллеры продемонстрировали 79,3±3,2 пятен/на лунку в ответ на клетки КМ-ДК, стимулированные с помощью пептида CDH3-7 (SEQ ID NO: 2), тогда как они продемонстрировали 42,7 пятен/на лунку в присутствии клеток КМ-ДК без стимулирования с помощью пептида (P<0,05).
Статистический анализ:
Двусторонний критерий Стьюдента использовали для оценки статистической значимости в данных, полученных с помощью анализа ELISPOT, и данных размера опухолей между группами с различной обработкой. Значение P<0,05 рассматривали как значимое. Статистический анализ осуществляли с использованием коммерчески доступного пакета статистического программного обеспечения (SPSS для Windows (TM), версия 11.0, Chicago, IL, USA).
[Пример 4]
Клеточные линии и экспрессия HLA:
2
Клетки рака поджелудочной железы человеческой клеточной линии PANC1, клетки рака полости рта клеточной линии HSC3, и клетки дефицитной по TAP и HLA-A2 (A*0201)-положительной клеточной линии T2, использованные для оценки цитотоксической активности, были приобретены в Клеточном Банке Riken (Tsukuba, Japan). Клетки рака поджелудочной железы человеческой клеточной линии PK8 были любезно предоставлены Центром Клеточных Ресурсов для Биомедицинских Исследований, Института Роста, Старения и Рака, Университета Тохоку. Клетки рака толстой кишки клеточной линии HCT116 были любезно предоставлены Др. Б. Вогелштейном (B. Vogelstein), Университет Джона Хопкинса (Балтимор, MD). Клетки рака печени клеточной линии SKHep1 были любезно предоставлены Профессором Киого Ито (Kyogo Ito), Университет Куруме (Курумн, Япония). Экспрессию HLA-A2 определяли с помощью проточной цитометрии с использованием анти-HLA-A2 моноклонального антитела (mAb) BB7.2 (One Lambda, Inc., Canoga Park, CA, USA) с целью селекции HLA-A2-положительных доноров крови и клеточных линий-мишеней для анализа цитотоксичности. Эти клетки поддерживали в среде RPMI 1640 или DMEM с добавлением 10% FCS в атмосфере 5% CO при 37ºC.
Лентивирусный перенос генов:
4
Опосредованный лентивирусными векторами перенос генов осуществляли, как описано ранее (Tahara-Hanaoka S, et al. Exp Hematol 2002; 30: 11-17). Вкратце, 17 мкг самоинактивирующихся векторов CSII-CMV-RfA и CSIIEF-RfA (Miyoshi H, et al. J Virol 1998; 72: 8150-8157), несущих CDH3-кДНК, и 10 мкг pCMV-VSV-G-RSV-Rev и pCAG-HIVgp трансфицировали с использованием Липофектамина 2000 (Invitrogen Corporation, CA, USA) в клетки 293T, выращенные в 10-см-культуральном флаконе. Через 60 часов культуральную среду извлекали, и вирусные частицы осаждали с помощью центрифугирования (50000×g, два часа). Осадок суспендировали в 50 мкл среды RPMI 1640 и добавляли 10 мкл вирусной суспензии к клеткам PANC1 или к SKHep1, которые рассевали в плоскодонном 96-луночном планшете с плотностью 5×10 клеток на лунку. Экспрессию трансфицированного CDH3 подтверждали с помощью Вестерн-блот-анализа.
Индуцирование CDH3-реактивных человеческих клеток ЦТЛ:
5
6
+
51
3
51
Клетки МКПК, полученные из обработанной гепарином крови HLA-A2-положительных пациентов, имеющих рак поджелудочной железы, пациентов, имеющих рак желудочно-кишечного тракта, пациентов, имеющих колоректальный рак, или здоровых доноров изолировали с помощью центрифугирования в градиенте плотности раствора Ficoll-Conray. Полученные из мононуклеарных клеток периферической крови (моноцитов) клетки ДК получали согласно ранее опубликованному методу (Yoshitake Y, et al. Clin Cancer Res 2004; 10: 6437-6448, Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12: 2689-2697). Клетки ДК стимулировали с помощью 20 мкг/мл кандидатного пептида в присутствии 4 мкг/мл β2-микроглобулина (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) в течение двух часов при 37°C в среде AIM-V (Invitrogen), содержащей 2%-ную инактивированную нагреванием аутологичную плазму. Эти клетки ДК затем облучали (40 Gy) и инкубировали вместе с CD8-положительными клетками. Инкубирование проводили в 24-луночных планшетах, которые готовили так, что в каждой лунке содержалось 2 мл среды AIM-V с добавлением 2% аутологичной плазмы, 1×10 стимулированных с помощью пептида клеток ДК, 2×10 CD8 T-клеток и 5 нг/мл человеческого рекомбинантного IL-7 (Wako, Osaka, Japan). Через два дня в эти культуры добавляли человеческий рекомбинантный IL-2 (PeproTec Inc.) до конечной концентрации 20 IU/мл. Проводили два дополнительных стимулирования раз в неделю с помощью тех же стимулированных пептидом аутологичных ДК с использованием такой же процедуры на 7 и 14 день. Через шесть дней после последнего стимулирования антиген-специфичный ответ индуцированных клеток ЦТЛ оценивали с помощью анализа высвобождения Cr и анализа ELISPOT для IFN-γ. Различные раковые клетки или стимулированные пептидом клетки T2 (5×10 клеток/на лунку), использованные в качестве клеток-мишеней, культивировали совместно с клетками ЦТЛ с подходящим соотношением эффектор/мишень для проведения анализа высвобождения Cr с помощью известного метода (Komori H, et al., Clin Cancer Res 2006; 12: 2689-2697).
655-663
757-765
655-663
757-765
51
Была осуществлена попытка индуцирования CDH3-специфичных клеток ЦТЛ из клеток МКПК HLA-A2-положительных здоровых доноров и различных пациентов, имеющих рак, с помощью стимулирования пептидов CDH3-4 и CDH3-7. CD8+ T-клетки, сортированные из клеток МКПК, инкубировали с полученными из аутологичных мононуклеарных клеток (моноцитов) клетками ДК, стимулированными каждым пептидом. После трех стимулирований с помощью анализа высвобождения Cr и с помощью анализа ELISPOT для IFN-γ оценивали эффект, убивающий клетки, против стимулированных пептидом клеток T2 (Фигура 4A). Клетки ЦТЛ, индуцированные из клеток МКПК здоровых доноров, продемонстрировали эффект, убивающий клетки, против клеток T2, стимулированных с помощью пептидов CDH3-4 или CDH3-7, но не против клеток T2, которые не стимулировали с помощью пептидов. Подобные ответы наблюдали в отношении других доноров. Эти результаты выявляют, что эти клетки ЦТЛ обладают пептидо-специфичной цитотоксичностью.
655-663
757-765
Затем тестировали цитотоксическую активность этих клеток ЦТЛ против клеток человеческой раковой клеточной линии, экспрессирующих CDH3 и HLA-A2. Как продемонстрировано на Фигуре 4B, CDH3-реактивные клетки ЦТЛ, стимулированные с помощью пептида CDH3-4, демонстрировали у здоровых доноров цитотоксичность к HCT116 (CDH3+, HLA-A2+), HSC3 (CDH3+, HLA-A2+), и PANC1/CDH3 (CDH3+, HLA-A2+), в которых ген CDH3 был трансфицирован в клетки PANC1; однако они не демонстрировали такого же эффекта по отношению к PANC1 (CDH3-, HLA-A2+), SKHep1 (CDH3-, HLA-A2+), и PK8 (CDH3+, HLA-A2-). Подобным образом клетки ЦТЛ, стимулированные с помощью пептида CDH3-7, демонстрировали цитотоксичность по отношению к HSC3, но не к PANC1, PK8 и SKHep1. Эти цитотоксические активности наблюдали для клеток ЦТЛ, полученных от различных пациентов, имеющих рак (Фигура 4C).
655-663
757-765
Для того чтобы подтвердить могут ли такие пептиды процессироваться из CDH3-белка в естественных условиях, использовали PANC1/CDH3 и SKHep1/CDH3 (CDH3+, HLA-A2+), в которых ген CDH3 был трансфицирован в клетках SKHep1, в качестве клеток-мишеней. Как продемонстрировано на Фигуре 4C, клетки ЦТЛ, индуцированные с помощью стимулирования пептидом CDH3-4 или CDH3-7, демонстрировали цитотоксичность против HCT116, PANC1/CDH3, и SKHep1/CDH3, но не против PANC1, SKHep1 и PK8. Вышеуказанные результаты предполагают, что в естественных условиях эти пептиды процессируются и представляются на поверхности раковых клеток с помощью молекул HLA-A2. CDH3-реактивные клетки ЦТЛ обладают цитотоксичностью, специфичной к раковым клеткам, которые экспрессируют эндогенно одновременно молекулы CDH3 и HLA-A2.
Подтверждение рестрикции по HLA класса I:
51
51
655-663
757-765
Для того чтобы подтвердить, могут ли индуцированные клетки ЦТЛ распознавать клетки-мишени способом рестрикции по HLA-класса I, раковые клетки-мишени инкубировали вместе с 10 мкг/мл моноклонального антитела анти-HLA-класс I mAb (W6/32) или с 10 мкг/мл анти-HLA-DR mAb (H-DR-1) в течение одного часа перед совместным культивированием клеток ЦТЛ и клетками раковой клеточной линии для осуществления анализа высвобождения Cr или анализа ELISPOT, и исследовали с помощью известных методов эффекты моноклональных антител mAb на цитотоксическую активность клеток ЦТЛ или продуцирование на IFN-γ (Gomi S, et al., J Immunol 1999; 163: 4994-5004). В результате антитело анти-HLA-класс I могло ингибировать продуцирование IFN-γ на статистически значимую величину в анализе ELISPOT для клеток ЦТЛ, генерированных путем стимулирования с помощью пептида CDH3-4, против SKHep1/CDH3 (Фигура 4D, слева, P<0,01). Оно также могло ингибировать цитотоксическую активность против клеток HCT116 в анализе высвобождения Cr (Фигура 4D, середина). Подобным образом антитело анти-класс I могло ингибировать продуцирование IFN-γ на статистически значимую величину в анализе ELISPOT для клеток ЦТЛ, генерированных путем стимулирования с помощью пептида CDH3-7 против клеток HSC3 (Фигура 4D, справа, P<0,01). Эти результаты выявляют, что индуцированные клетки ЦТЛ распознают экспрессирующие CDH3 клетки-мишени способом рестрикции по HLA-класса.
[Пример 5]
Адоптивная иммунотерапия
In vivo-активность против рака индуцированных с помощью CDH3 человеческих клеток ЦТЛ использовали для адоптивной иммунизации мышей NOD/SCID:
6
2
+
6
655-663
757-765
Для того чтобы оценить терапевтический эффект введения CDH3-реактивных клеток ЦТЛ мышам, которым трансплантировали CDH3-положительные человеческие раковые клетки, проводили экспериментальную адоптивную иммунотерапию, как описано ранее (Komori H, et al. Clin Cancer Res 2006; 12: 2689-2697). Вкратце, клетки HCT116 (4×10 клеток), положительные одновременно для HLA-A2 и эндогенного CDH3, инокулировали мышам NOD/SCID с помощью подкожной инъекции в правый бок. Когда размер опухоли достиг 25 мм на 7 день после инокулирования опухоли мышам, то внутривенно инъецировали линию клеток ЦТЛ, специфичных к пептиду CDH3-4 или к CDH3-7 в качестве негативного контроля, линию CD8 T-клеток, стимулированных с помощью HLA-A2-рестриктированного HIV-пептида (SLYNTYATL, SEQ ID NO: 19), полученную от пяти здоровых доноров и суспендированную в 100 мкл (4×10). T-клетки снова внутривенно инъецировали на 14 день. Размеры опухолей измеряли дважды в неделю и оценивали с помощью измерения двух перпендикулярных друг другу диаметров с использованием циркуля. Двусторонний критерий Стьюдента использовали для оценки статистической значимости размеров опухолей. Значение P<0,05 рассматривали как значимое. Статистический анализ осуществляли с использованием коммерчески доступного пакета статистического программного обеспечения (SPSS для Windows (TM), версия 11.0, Chicago, IL, USA).
Контрольные стимулированные HIV-пептидом CD8+ T-клетки не демонстрировали цитотоксичности in vitro против клеток HCT116. И оценивали размеры опухолей семи индивидуальных мышей в каждой группе (Фигура 5A) и среднее значение размеров опухоли ± стандартное отклонение в каждой группе (Фигура 5B). Контрольная Т-клеточная линия и один PBS не демонстрировали ингибирующего эффекта на рост опухоли. Размер опухоли мышей, инокулированных стимулированными с помощью CDH3 клетками ЦТЛ, был значительно меньше, чем размер опухоли у мышей, инокулированных контрольными индуцированными с помощью HIV-пептида CD8+ T-клетками или одним PBS (P<0,001). Эти результаты выявляют эффективность адаптивной трансплантационной терапии с помощью CDH3-реактивных человеческих клеток ЦТЛ против CDH3+ опухоли человека у мышей NOD/SCID.
Обсуждение:
В настоящем исследовании авторы настоящего изобретения идентифицировали Кадгерин 3 (CDH3)/P-кадгерин в качестве нового TAA посредством анализа рака поджелудочной железы с использованием кДНК-микрочипа. На основе анализа с использованием кДНК-микрочипа обнаружили, что CDH3 экспрессировался на высоком уровне в раковых клетках рака поджелудочной железы и экспрессировался на низком уровне в раковых клетках рака яичка и молочной железы. Экспрессию CDH3 едва детектировали в других критических органах. Кроме того, данные, полученные с использованием микрочипа и ПЦР в реальном времени (RT-PCR), продемонстрировали, что CDH3 экспрессировался в раковых клетках при раке желудочно-кишечного тракта и при раке толстой кишки, а также при раке поджелудочной железы, но едва экспрессировался в аналогичных нормальных тканях. Уже сообщалось, что CDH3 сверхэкспрессировался в большей части ткани рака поджелудочной железы, тогда как нормальные клетки протоков и ацинарные клетки в поджелудочной железе почти не демонстрировали экспрессии CDH3 с помощью иммуногистохимического окрашивания (Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65: 3092-3099). Эти результаты предполагают, что CDH3 может представлять собой новую мишень иммунотерапии для вышеупомянутых раковых заболеваний, которая сопряжена с низким риском индуцирования аутоиммунного ответа.
Семейство кадгерина классифицируется на два различных подсемейства, включающих Кадгерин 1 (CDH1)/E-кадгерин, Кадгерин 2 (CDH2)/N-кадгерин и Кадгерин 3 (CDH3)/P-кадгерин согласно их распределению в тканях. CDH1 является преобладающим членом семейства кадгеринов, который экспрессируется во всех эпителиальных тканях. Предполагается, что CDH1 функционирует как подавляющий опухоль фактор, который негативно регулирует инвазию и метастазирование раковых клеток (Frixen U H, et al. J Cell Biol 1991; 113: 173-185, Berx G, et al. Genomics 1995; 26: 281-289, Oka H, et al. Cancer Res 1993; 53: 1696-1701). Экспрессия CDH2 увеличивается в раковых клетках при инвазивных раковых заболеваниях, а также CDH2 способствует инвазивному феномену с помощью взаимодействия с рецептором фактора роста фибробластов (FGF) и через последующие реакции каскада (Suyama K, et al. Cancer Cell 2002; 2: 301-314). Экспрессия и роль CDH3 в раковых заболеваниях недостаточно ясна. В проведенном ранее исследовании Taniuchi et al. предположили, что увеличение экспрессии CDH3, вероятно, является фактором, который усиливает инвазивность раковых клеток рака поджелудочной железы путем взаимодействия с p120ctn и GTP-азой семейства Rho, Rac1 и СДК42 (Taniuchi K, et al. Cancer Res 2005; 65: 3092-3099). В других проведенных ранее исследованиях предположили, что CDH3 также представляет собой фактор увеличения инвазивности и неблагоприятного прогноза при раке груди (Palacios J, et al. Am J Pathol 1995; 146: 605-612, Paredes J, et al. Clin Cancer Res 2005; 11: 5869-5877, Peralta Soler A, et al. Cancer 1999; 86: 1263-1272) и при раке эндометрия (Stefansson I M, et al. J Clin Oncol 2004; 22: 1242-1252.).
Во всех взятых вместе опубликованных ранее сообщениях целевой показатель ответной реакции вакцин против рака в клинических исследованиях составляет настолько низкое значение как 2,6% (Rosenberg S A, et al. Nat Med 2004; 10: 909-915). Один вариант состоит в том, что раковые клетки избегают иммунитета благодаря делеции, мутации или даун-регуляции опухоле-ассоциированных антигенов (TAA) в следствие иммуно-индуцирующей терапии. На основе точки зрения, что опухолевые клетки не могут потерять антигены, которые требуются для онкогенеза, CDH3 будет пригодным для использования кандидатом TAA для иммунотерапии против рака.
655-663
757-765
В настоящем изобретении авторы настоящего изобретения идентифицировали среди 18 кандидатных пептидов, выбранных с помощью алгоритма BIMAS, два HLA-A2-рестриктированных CDH3 эпитопных пептида, для которых подтверждено, что они индуцируют HLA-A2-рестриктированные мышиные клетки ЦТЛ в трансгенных по HLA-A2.1 (HHD) мышах. Кроме того, авторы настоящего изобретения подтвердили, что CDH3-реактивные клетки ЦТЛ были генерированы с использованием этих пептидов из клеток МКПК, полученных от здоровых доноров и от пациентов, имеющих рак (Фигура 4). Эти клетки ЦТЛ демонстрировали эффект, убивающий клетки, не только по отношению к T2-клеткам, стимулированным соответствующим пептидом, но также по отношению к клеткам раковых клеточных линий, экспрессирующих CDH3 и HLA-A2. На основании вышесказанного предположили, что настоящие CDH3-пептиды (CDH3-4 и CDH3-7) продуцируются естественным образом при процессинге из CDH3-белка в раковых клетках, становятся представленными на клеточной поверхности вместе с молекулами HLA-A2 и затем распознаются клетками ЦТЛ.
51
Цитотоксичность CDH3-реактивных клеток ЦТЛ по настоящему изобретению подтверждали не только in vitro с помощью анализа высвобождения Cr, но также in vivo с помощью ЦТЛ-адоптивной иммунотерапии. Как продемонстрировано на Фигуре 5, внутривенная инъекция CD8+ клеток, индуцированных с помощью пептидов по настоящему изобретению, значительно ингибировала рост опухолей, трансплантированных мышам NOD/SCID, по сравнению с контрольными CD8+ клетками и другими контролями.
HLA-A2 (A*0201) представляет собой один из наиболее распространенных HLA-аллелей у различных этнических групп, включающих азиатов, африканцев, афроамериканцев и европейцев (Browning M. et al. Immunol Today 1996; 17: 165-170). Таким образом, пептиды, идентифицированные в настоящем изобретении, которые представляются клеткам Т-киллерам посредством HLA-A2, обладают потенциалом клинического применения по всему миру, если их безопасность и эффективность в иммунотерапии рака продемонстрированы в исследовательской медицине. Кроме того, идентификация пептидов, которые представляются клеткам Т-киллерам посредством HLA-A2, носители которого часто встречаются не только в Японии, но также среди людей по всему миру, вероятно, приведет к разработке лекарственных средств для иммунотерапии против рака, применимой примерно для 30% пациентов, имеющих рак поджелудочной железы, по всему миру.
Промышленная применимость
HLA-A2 представляет собой аллель HLA класса I, носителями которого являются примерно 30% популяции Японцев. Когда трансгенных мышей, экспрессирующих человеческий HLA-A2, иммунизируют с помощью CDH3-пептидов по настоящему изобретению, пептиды могут индуцировать цитотоксические T-клетки, которые распознают пептиды, связанные с молекулами HLA-A2, с индуцированием иммунного ответа. Имеется высокая вероятность того, что также у людей эти пептиды могут индуцировать человеческие цитотоксические Т-клетки, которые разрушают раковые клетки, экспрессирующие комплексы пептидов и молекул HLA-A2. Таким образом, пептиды по настоящему изобретению могут применяться для иммунотерапии против рака поджелудочной железы, холангиоцеллюлярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, рака толстой кишки и немелкоклеточного рака легкого у HLA-A2-положительных пациентов. Таким образом, пептиды, как ожидается, улучшат качество жизни пациентов путем подавления пролиферации и/или прогрессии таких раковых заболеваний.