Полиморфизм генов, ассоциированных с локусами количественных признаков, у кабана ( Sus scrofa L. , 1758), обитающего на территории России

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2013, № 2

Биоресурсы: геномное сканирование популяций

УДК 639.1:599.731.11:631.523.5:577.21

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ЛОКУСАМИ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ ПРИЗНАКОВ, У КАБАНА (Sus scrofa L., 1758), ОБИТАЮЩЕГО НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ*

Н.А. ЗИНОВЬЕВА1, О.В. КОСТЮНИНА1, А.В. ЭКОНОМОВ2,

М.С. ШЕВНИНА2, И.А. ДОМСКИЙ2, Е.А. ГЛАДЫРЬ1, Г. БРЕМ3

Проведены генетические исследования кабанов (п = 89) по десяти ДНК-маркерам — RYR1, ESR, FSHB, NCOA1, BF, MUC4, IGF2, MC4R, POU1F1, ECRF18/FUT1. Отнесение исследуемых особей к различным территориальным кластерам было выполнено на основании расчета коэффициента подобия (Q) при k = 2. Среднее значение Q у животных, обитающих в европейской части и в Западной Сибири, составило 0,984±0,005, у особей из Иркутской области и Хабаровского края — 0,994±0,001. Пять ДНК-маркеров (RYR1, ESR, MUC4, IGF2, ECRF18/FUT1) оказались мономорфными в обоих территориальных кластерах. Установлены незначительные различия в частоте аллелей между особями, входящими в условно западный и восточный кластеры, по ДНК-маркерам FSHB (рд равно соответственно 0,462 и 0,250), BF (рд — 0,020 и 0,143), MC4R (рА —0,013 и 0,000) и POU1F1 (pC — 0,000 и 0,111). Достоверные различия между исследуемыми группами отмечены по частотам аллелей NCOA1: рд1 — 0,938 у кабанов, отнесенных к условно западному кластеру, и рд1 = 0,000 — к восточному.

Ключевые слова: кабаны, ДНК-маркеры, полиморфизм, RYR1, ESR, FSHB, NCOA1, BF, MUC4, IGF2, MC4R, POU1F1, ECRF18/FUT1.

Keywords: wild boar, DNA markers, polymorphism, RYR1, ESR, FSHB, NCOA1, BF, MUC4, IGF2, MC4R, POU1F1, ECRF18/FUT1.

Кабан — широко распространенный представитель дикой фауны. На основании фенотипических различий вид Sus scrofa L., 1758 был разделен на четыре расы (западную, восточную, индийскую и индонезийскую), которые, в свою очередь, включают 16 (1), а по некоторым данным, около 27 подвидов (2, 3).

В России, по материалам А.А. Данилкина (4), обитает пять подвидов кабана: центрально-европейский (S. s. scrofa L., 1758), кавказский (S. s. attila Thorn, 1912), сибирский (S. s. sibiricus Staffe, 1922), среднеазиатский (S. s. nigripes Blanf, 1875), уссурийский (S. s. ussuricus Heude, 1888). Четких границ между вышеназванными подвидами не существует, что связано с естественным расселением животных, сезонными кочевками, обусловленными кормовыми ресурсами, паводками, динамикой высоты снегового покрова, высотными миграциями и т.д. Один из важнейших факторов изменения генетической структуры подвидов — работы по акклиматизации. Например, считалось, что уссурийский подвид наиболее крупный, в результате его пытались расселять в европейской части России, в частности завозили в заповедно-охотничье хозяйство «Завидово» (Тверская обл.) (5, 6). Подобная практика имеет место и в настоящее время.

В последние годы активно ведутся работы по изучению генетического разнообразия популяций диких свиней, в том числе на территории Российской Федерации (7-9), и указанное направление исследований вызывает как научный, так и практический интерес.

* Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, шифр 2012-1.412-000-1016-008 и 2012-1.4-12-000-1001-010. В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Развитие молекулярной генетики открывает новые возможности в характеристике групп животных и их генетической дифференциации. Одно из направлений при исследовании популяций кабанов заключается в оценке степени интрогрессии домашней свиньи вследствие случайной гибридизации. С этой целью применяются различные типы ДНК-марке-ров: мтДНК (10), микросателлиты (11), SNP-маркеры (12, 13), ДНК-мар-керы, ассоциированные с локусами количественных признаков (14). Как доказательство наличия домашних свиней среди предков кабанов по материнской линии можно рассматривать присутствие азиатского гаплотипа (А) мтДНК, встречающегося в породах домашних свиней с частотой 29 % (10), вследствие исторической интрогрессии в XVII-XIX в.в. от китайских свиней (15), в то время как у «чистых» популяций европейского кабана проявляются только гаплотипы E1 и E2. В качестве одного из критериев интрогрессии домашних свиней в популяции кабана также используют частоту генов, ассоциированных с локусами количественных признаков (QTL). A. Ojeda с соавт. (14) установили, что частота аллеля Q по IGF2 (мутация G3072A), ассоциированного с усиленным ростом мышечной ткани и мясностью, в заводских породах свиней составляет 86 %, в локальных — 3 % и отсутствует у 120 протестированных европейских кабанов. Y. Kuril с соавт. (16) охарактеризовали полиморфизм генов RYR1, LEP, GH, MYOG, MYF5 и GDF8 в популяции кабанов, обитающей на северо-востоке Польши. Если гены RYR1, LEP и MYF5 оказались мономорф-ными, то для MYOG, GH и GDF8 обнаружили полиморфизм с частотой вариантов соответственно 0,42 (аллель А) и 0,58 (аллель В), 0,56 (аллель «+») и 0,44 (аллель «-»), 0,63 (аллель С) и 0,37 (аллель Т). Показано, что в азиатской и европейской популяциях сегрегируют разные аллели MC1R, обусловливающие окрас и ответственные за различия по цвету шкуры между кабанами и домашними свиньями (6), что было положено в основу при изучении интрогрессии в греческой популяции (7).

Цель настоящих исследований заключалась в характеристике полиморфизма генов, ассоциированных с QTL, у разных групп кабанов, обитающих на территории России.

Методика. Биологическим материалом для исследований служили образцы мышечной ткани диких свиней, обитающих на территории России (п = 89), отобранные в Архангельской области (п = 3), Башкирии (п = 3), Владимирской (п = 3), Волгоградской (п = 5), Вологодской (п = 2), Ивановской (п = 3), Иркутской (п = 2), Калининградской (п = 3), Кировской (п = 8) областях, в Республике Коми (п = 1), Краснодарском крае (п = 1), Курганской (п = 3), Курской (п = 3), Ленинградской областях (п = 8), в Республике Марий-Эл (п = 3), Нижегородской (п = 4), Омской (п = 3), Оренбургской (п = 3), Пензенской (п = 3), Саратовской (п = 1), Свердловской (п = 3), Смоленской (п = 3), Тамбовской областях (п = 4), в Республике Татарстан (п = 1), Тверской области (п = 3), в Удмуртской Республике (п = 2), Хабаровском крае (п = 7) и в Чувашской Республике (п = 1).

Выделение ДНК проводили на колонках Nexttec и с использованием набора реагентов для выделения ДНК DLAtom™ DNA Prep100 (ООО «Компания «Биоком», Россия) в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

Принадлежность исследуемых животных к генетически дифференцированным кластерам определяли на основании анализа 12 микросателлитов (17) с последующим анализом кластерной структуры исследуемой

выборки по методу J.K. Pritchard с соавт. (18). Обработку данных проводили с использованием программного обеспечения Structure (v. 2.3.1) без введения предварительной информации о популяционной принадлежности особей для числа популяций (K-кластеров), равного 2. В качестве ДНК-маркеров QTL использовали гены рианодинового рецептора (RYR1), эстрогенового рецептора (ESR), р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона (FSHB), коактиватора стероидных гормонов (NCOA1), пропер-дина (BF), муцина 4 (MUC4), инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2), рецептора меланокортина 4 (MC4R), гипофизарного транскрипционного фактора (POU1F1), рецептора Escherichia coli (ECRF18/FUT1). При определении полиморфизма по перечисленным генам применяли методики, разработанные в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики (Всероссийский НИИ животноводства).

Информацию об аллелях каждого животного суммировали в электронной таблице Microsoft Excel. Полученная матрица генотипов служила основой для статистической обработки результатов, которую осуществляли по стандартным методикам (19, 20).

Результаты. Данные анализа генетической структуры исследуемой выборки кабанов при k = 2 (рис. 1) выявили четкую генетическую дифференциацию, обусловливающую формирование двух кластеров: условно западного (далее первый) и восточного (второй). Первый включает в себя животных из Центральной России, Кавказа, Урала и Западной Сибири, второй — из Хабаровского края и Иркутской области.

Изучаемые особи

Рис. 1. Генетическая структура изучаемой выборки дикого кабана (Sus scrofa L., 1758) по 10 ДНК-маркерам QTL: 1-3 — особи из Архангельской области, 4-6 — из Башкирии, 7-9 — Владимирской области, 10-14 — Волгоградской области, 15-16 — Вологодской области, 1719 — Ивановской области, 20-22 — Калининградской области, 23-30 — Кировской области, 31 — Республики Коми, 32 — Краснодарского края, 33-35 — Курганской области, 36-38 — Курской области, 39-46 — Ленинградской области, 47-49 — Республики Марий-Эл, 50-53 — Нижегородской области, 54-56 — Омской области, 57-59 — Оренбургской области, 60-62 — Пензенской области, 63 — Саратовской области, 64-66 — Свердловской области, 67-69 — Смоленской области, 70-73 — Тамбовской области, 74 — Татарстана, 75-77 — Тверской области, 78-79 — Удмуртии, 80 — Чувашии, 81-82 — Иркутской области, 83-89 — Хабаровского края; а — Q1, б — Q2. Расчеты выполнены по методу J.K. Pritchard с соавт. (18) для k = 2. Описание маркеров см. в разделе «Методика».

Среднее значение коэффициента подобия (Q) у особей, обитающих на европейской территории и в Западной Сибири, в первом кластере составило Q1 = 0,984+0,005 с индивидуальными вариациями от 0,679 до

0,998, при этом у 78 из 80 исследованных животных значения Q1 оказались выше 0,900 и лишь у двух особей из Республики Марий-Эл и Башкирии составили соответственно 0,679 и 0,855, что позволяет предполагать

у них интрогрессию от предков из второго кластера. Среднее значение Р у животных, которые обитали на территории Иркутской области и Хабаровского края, во втором кластере составило = 0,994+0,001 с вариациями от 0,989 до 0,997. Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о достоверных генетических различиях изучаемых особей, отнесенных к условно западному и восточному кластерам.

Распределение генотипов по ДНК-маркерам QTL в изучаемой выборке кабанов

Генотип, кластер Частота генотипа, %

По маркеру

Генотип NN Nn nn

в условно западном кластере 100,0 0,0 0,0

в восточном кластере 100,0 0,0 0,0

По маркеру БІЇЯ

Генотип АЛ АВ ВВ

в условно западном кластере 100,0 0,0 0,0

в восточном кластере 100,0 0,0 0,0

По маркеру

Генотип АА АВ ВВ

в условно западном кластере 32,9 26,6 40,5

в восточном кластере 0,0 50,0 50,0

По маркеру ЖОЛ1

Генотип А1А1 A1A2 A2A2

в условно западном кластере 87,5 12,5 0,0

в восточном кластере 0,0 0,0 100,0

По маркеру BF

Генотип АА АВ ВВ

в условно западном кластере 1,4 1,4 97,3

в восточном кластере 0,0 28,6 71,4

По маркеру МиС4

Генотип СС CG GG

в условно западном кластере 100,0 0,0 0,0

в восточном кластере 100,0 0,0 0,0

По маркеру ЮБ2

Генотип йй Qq qq

в условно западном кластере 100,0 0,0 0,0

в восточном кластере 100,0 0,0 0,0

По маркеру МС4Я

Генотип АЛ AG GG

в условно западном кластере 0,0 2,5 97,5

в восточном кластере 0,0 0,0 100,0

По маркеру РОШ¥1

Генотип СС CD DD

в условно западном кластере 0,0 0,0 100,0

в восточном кластере 0,0 22,2 77,8

По м а ркеру ЕСЯ¥18/¥1ТТ1

Генотип АЛ AG GG

в условно западном кластере 0,0 0,0 100,0

в восточном кластере 0,0 0,0 100,0

Мы сравнили частоту генотипов и аллелей по ДНК-маркерам у протестированных животных (табл., рис. 2). Из 10 исследованных ДНК-маркеров пять (ЯУЯ1, ЕБЯ, МиС4, ЮЕ2, ЕСЯЕ18/ЕиТ1) оказались моно-морфными в обоих территориальных кластерах. Это позволяет предполагать, что мутации, обусловливающие полиморфизм указанных генов, произошли после одомашнивания свиней. Незначительные различия в частоте аллелей ДНК-маркеров между группами особей, входящими в условно западный и восточный кластеры, наблюдались по ЕБНБ (рд — соответственно 0,462 и 0,250), БЕ (рА — 0,020 и 0,143), МС4Я (рА — 0,013 и 0,000) и

роит (рс — 0,000 и 0,111).

Достоверные различия между исследуемыми территориальными группами отмечались по частоте аллелей ЫСОЛЪ в первом кластере рд1 = 0,938, во втором кластере рд1 = 0,000. Присутствие аллеля А2 МСОЛ1 в условно западном кластере кабанов можно рассматривать как следствие интрогрес-

сии от китайских свиней в ХУІІ-ХІХ в.в. (15). В то же время распространение аллеля А2 среди домашних свиней с частотой от 0,722 до 1,000 (21) означает, что нельзя исключать его интродукцию в результате гибридизации с домашними свиньями.

Рис. 2. Распределение аллелей ДНК-маркеров QTL у кабана (Sus scrofa L., 1758) в западном (3) и восточном (В) территориальных кластерах: а и б — соответственно аллели 1 и 2. Аллель 1 — N по RYR1, A по ESR, A по FSHB, A1 по NCOA1, A по BF, C по MUC4, Q по IGF2, A по MC4R, C по POU1F1, A по ECRF18/FUT1; аллель 2 — n по RYR1, B по ESR, B по FSHB, A2 по NCOA1, B по BF, G по MUC4, q по IGF2, G по MC4R, D по POU1F1, G по ECRF18/FUT1.

Итак, изученные территориальные группы кабана Sus scrofa дифференцированы не только по анонимным ДНК-маркерам, но и по некоторым генам, ассоциированным с локусами количественных признаков у свиней.

ЛИТЕРАТУРА

1. Groves C. Ancestors for the pigs: taxonomy and phylogeny of the genus Sus. Research School of Pacific Studies, Australian National University. Canberra, Australia, 1981.

2. Heere W., Rohrs M. Zoological considerations on the origins of farming and domestication. In: Origins of agriculture /C.A. Reed (ed.). Mouton, The Hague, 1977: 245-279.

3. Epstein H. Pig. In: Evolution of domesticated animals /I.L. Mason (ed.). Longman, London, 1984: 145-162.

4. Данилкин A.A. Свиные (Серия «Млекопитающие России и сопредельных регионов»). М., 2002.

5. Павлов М.П. Акклиматизация охотничье-промысловых зверей и птиц в СССР. Киров, 1999.

6. Павлов М.П., К о р с а к о в а И.Б., Лавров Н.П. Акклиматизация охотничье-про-мысловых зверей и птиц в СССР. Киров, 1974.

7. Ли X., Мин М.С., Ким К.С., Ан Дж., Ли М.Е. Состояние исследования генетического банка по сохранению диких животных Республики Корея и Лазовского заповедника. Мат. науч.-практ. конф., посвященной 75-летию Лазовского заповедника. Владивосток, 2010: 153-158.

8. Варнаков А.П., Данкверт С.А., Давыдова Е.Е., Давыдов А.В., Солтын-ская И.В., Селивё рстова А.С., Игнатова И.А., Проняев А.В., Вольф С.А., Соинова О.Л., Марков Н.И., Рожков Ю.И. Предварительный анализ изменчивости митохондриальной ДНК (D-петля) в популяциях европейского кабана (Sus scrofa L.). Вестник охотоведения, 2011, 8(2): 173-178.

9. Ким Сунг Кионг, Ли Кианг Сеок, Марков Н.И., Варнаков А.П., Данкверт С.А., Проняев А.В., Давыдов А.В., Рожков Ю.И. Генетическое разнообразие кабана Евразии на основе анализа микросателитных лоскусов и мтДНК. Вестник охотоведения, 2012, 9(2): 209-214.

10. Fang M., Andersson L. Mitochondrial diversity in European and Chinese pigs is consistent with population expansions that occurred prior to domestication. Proc. the Royal Society B: Biological Sciences, 2006, 273: 1803-1810.

11. Гладырь Е.А., Эрнст Л.K., Костюнина О.В. Изучение генома свиней (Sus scrofa) с использованием ДНК-маркеров. Сельскохозяйственная биология, 2009, 2: 16-26.

12. Fang M., Larson G., Soares Ribeiro H., Andersson L. Contrasting mode of evolution at a coat color locus in wild and domestic pigs. PLoS Genetics, 2009, 5: 1-6.

13. K o u t s o g i a n n o u l i E.A., Moutou K.A., Sarafidou T., Stamatis C., Mam u r i s Z. Detection of hybrids between wild boars (Sus scrofa scrofa) and domestic pigs (Sus scrofa f. domestica) in Greece, using the PCR-RFLP method on melanocortin-1 receptor (MC1R) mutations. Mammal. Biol., 2010, 75: 69-73.

14. Ojeda A., Huang L.S., Ren J., Angiolillo A., Cho I.C., Soto H., Lemus-Flores C., Makuza S.M., Folch J.M., Perez-Enciso M. Selection in the making: a worldwide survey of haplotypic diversity around a causative mutation in porcine IGF2. Genetics, 2008, 178: 1639-1652.

15. Giuffra E., Kijas J.M.H., Amarger V., Carlborg O., Jeon J.-T., Andersson L. The origin of the domestic pig: independent domestication and subsequent introgression. Genetics, 2000, 154: 1785-1791.

16. Kuryl J., Zurkowski M., Urbanski P., Wyszynska-Koko J. Distribution of the polymorphic variants of genes RYR1, LEP, GH, MYOG, MYF5, and GDF8 in wild boars from North-East of Poland. Animal Science Papers and Reports, 2004, 22(3): 271-278.

17. Зиновьева Н.А., Гладырь Е.А. Генетическая экспертиза сельскохозяйственный животныгх: применение тест-систем на основе микросателлитов. Достижения науки и техники АПК, 2011, 9: 19-20.

18. Pritchard J.K., Stephens M., Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data. Genetics, 2000, 155: 945-959.

19. Вейр Б. Анализ генетических данный /Пер. с англ. Д.В. Зайкина, А.И. Пудовкина, А.Н. Татаренкова. М., 1995.

20. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М., 1991.

21. Зиновьева Н.А., Костюнина О.В., Гладырь Е.А., Банникова А.Д., Харзинова В.Р., Ларионова П.В., Шавырина К.М., Эрнст Л.К. Роль ДНК-маркеров признаков продуктивности сельскохозяйственных животных. Зоотехния, 2010, 1: 8-10.

1ГНУ Всероссийский НИИ животноводства Россельхозакадемии,

142132 Московская обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы e-mail: n_zinovieva@mail.ru;

2ГНУ Всероссийский НИИ охотничьего хозяйства и звероводства им. Б.М. Житкова Россельхозакадемии,

610000 г. Киров, ВНИИОЗ, e-mail: vniioz@mail.ru;

3 Veterinärmedizinische Universität (Институт животноводства и генетики Ветеринарно-медицинского университета),

Veterinaerplatz 1, A-1210, Vienna, Austria, e-mail: gottfried.brem@agrobiogen.de

POLYMORPHISM OF GENES ASSOCIATED WITH THE QUANTITATIVE TRAIT LOCI IN WILD BOAR (Sus scrofa L., 1758) IN RUSSIA

N.A Zinovieva1, O.V. Kostyunina1, A.V. Ekonomov2, M.S. Shevnina2,

I.A. Domskij2, E.A. Gladyr’1, G. Brem3

Summary

The genetic studies of wild boar (Sus scrofa L., 1758) (n = 89) inhabited in Russia using ten DNA markers RYR1, ESR, FSHB, NCOA1, BF, MUC4, IGF2, MC4R, POU1F1, ECRF18/FUT1 were carried out. The assignment of individuals to different territorial clusters was performed based on similarity coefficient (Q) calculation for k = 2. The average Q values in individuals inhabited on European part and in East Siberian was 0.984+0.005 and in Irkutsk region and Khabarovsk Kraj was 0.994+0.001. Five DNA markers (RYR1, ESR, MUC4, IGF2, ECRF18/FUT1) were monomorphic in both of territorial clusters. The non-significant differences in allele frequencies of FSHB, BF, MC4R and POU1F1 genes between individuals assigned to the west and east clusters were observed: pa = 0.462 and 0.250, pa = 0.020 and 0.143, pa = 0.013 and 0.000, pc = 0.000 and 0.111, respectively. The studied territorial groups significantly differed in NCOA1 allele frequencies: pa1 = 0.938 in wild boars assigned to the west cluster and pa1 = 0,000 to the east cluster.

Поступила в редакцию 19 января 2013 года