Способ преимплантационного генетического тестирования несиндромальной нейросенсорной тугоухости
METHOD FOR PREIMPLANTATION GENETIC TESTING OF NON-SYNDROMIC SENSORINEURAL HEARING LOSS

Изобретение относится к преимплантационному генетическому тестированию моногенных заболеваний. В настоящее время в мире насчитывается более 350 миллионов людей, страдающих редким заболеванием (по данным RARE Project). Общее количество таких заболеваний по подсчетам European Organization for Rare Diseases (EURORDIS) варьируется от 5 до 7 тысяч. При этом около 80% редких заболеваний имеют генетическую причину. Известная генетическая основа заболевания позволяет с высокой точностью предсказать не только здоровье уже родившегося ребенка, но и оценить риск рождения такого ребенка при анализе генотипов родителей, а также провести генетическую диагностику на самых ранних этапах. Преимплантационное генетическое тестирование (ПГТ) моногенного заболевания становится мощным инструментом для профилактики таких заболеваний.
Настоящее изобретение относится к способу преимплантационного генетического тестирования несиндромальной нейросенсорной тугоухости. Несиндромальная нейросенсорная тугоухость - это наследственное нарушение слуха, передающееся по аутосомно-рецессивному типу наследования. Известно, что всего в мире около 3% людей являются носителями мутаций в гене GJB2, и что мутации в этом гене отвечают за примерно треть случаев серьезного нарушения слуха среди людей детского и молодого возраста. Заболевание несиндромальная нейросенсорная тугоухость приводит к частичной или полной потере слуха при отсутствии нарушений со стороны прочих органов и систем. При аутосомно-рецессивном типе наследования заболевания вероятность рождения ребенка с этим заболеванием в семье составляет 25%.
К заболеванию несиндромальная нейросенсорная тугоухость могут приводить патогенные генетические варианты в гене GJB2, располагающемся на хромосоме 13. [Vona, В. et al. Non-syndromic hearing loss gene identification: A brief history and glimpse into the future. Molecular and Cellular Probes, 2015; 29(5), 260-270] Этот ген кодирует белок Коннексин 26, приничающий участие в создании межклеточных контактов, обеспечивая транспорт ионов и небольших молекул между клетками внутреннего уха.
ПГТ несиндромальной нейросенсорной тугоухости проводится для семей, имеющих подтвержденную молекулярно-генетическую природу заболевания. Важно отметить, что обоснование патогенности и каузативности генетических вариантов происходит до проведения ПГТ моногенного заболевания и не входит ни в цели и задачи ПГТ моногенного заболевания, ни в комплекс мероприятий по проведению ПГТ моногенного заболевания. Оценку патогенности проводят по международному стандарту - по критериям, описанным в 2015 году Американским Колледжем Медицинской генетики и Геномики (American College of Medical Genetics and Genomics-Association for Molecular Pathology (ACMG-AMP)) в ходе поиска молекулярно-генетической причины заболевания. ПГТ рекомендуется семьям с высоким риском рождения ребенка с тяжелым (неизлечимым) наследственным заболеванием с установленными патогенными вариантами, обуславливающими этот риск. ПГТ позволяет выбрать из всех эмбрионов, полученных при ЭКО (экстракорпоральном оплодотворении), эмбрионы без патогенных вариантов в компаунд-гетерозиготе и, следовательно, без риска развития заболевания.
Основной проблемой при генетической диагностике эмбрионов является малое исходное количество биоматериала, так как биоптат содержит от одной до трех клеток. В этом случае для повышения эффективности и точности анализа важно как полностью исключить возможность контаминации, так и нивелировать возможный эффект неравномерной и/или неполной амплификации, а также деградации биоматериала. Это требует разработки тест-системы с особыми характеристиками. При этом тест-система разрабатывается с учетом возможности использовать биоматериал разного типа - тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (Whole Genome Amplification, WGA), а также единичные клетки. Сочетание универсальности по отношению к биоматериалу с поэтапной амплификацией целевых фрагментов позволяет проводить анализ нескольких патогенных вариантов для одного образца, в том числе на единичных клетках, а также выявить ситуацию неполной амплификации, контаминации или деградации образца. Еще одной особенностью ПГТ является отсутствие информации о биологических особенностях эмбриона: в отличие от взрослого человека, у эмбриона могут быть любые хромосомные аномалии, которые усложняют задачу оценки статуса эмбриона по конкретному генетическому варианту. Поэтому тест-система для ПГТ моногенного заболевания должна давать возможность выявить такие случаи и оценить их влияние на достоверность результата диагностики.
Наиболее близким техническим решением является проведение ПГТ несиндромальной нейросенсорной тугоухости, предложенное G. Altarescu и коллегами [G. Altarescu et al, 2009] для детекции мутаций в гене GJB2 с помощью мультплексной гнездовой ПЦР в 2 раунда на единичных клетках, с применением прямой диагностики мутации и косвенной диагностики с помощью анализа наследовани аллелей полиморфных маркеров, сцепленных с патогенным вариантом. Важным отличием предлагаемого нами подхода является проведение полногеномной амплификации перед диагностикой, что позволяет, при необходимости, провести реакции на биоматериале одного и того же эмбриона при разных условиях, чтобы добиться амплификации максимального количества полиморфных маркеров. Проведение полногеномной амплификации также позволяет провести дополнительные исследования для рекомендованных к переносу эмбрионов (например, скрининг на хромосомные аномалии) без повторной биопсии эмбриона. Также преимуществом предлагаемого нами подхода является более высокая специфичность праймеров, что позволяет минимизировать вероятность амплификации неспецифических продуктов ПЦР.
Представленный нами метод ПГТ несиндромальной нейросенсорной тугоухости решает задачу разработки более точного способа преимплантационного генетического тестирования этого моногенного заболевания без использования дорогостоящих приборов и реагентов, который можно было бы применять на биоматериале различного типа: ДНК, выделенную из разных тканей, продукт полногеномной амплификации (WGA), единичные клетки.
Техническим результатом стало создание тест-системы для диагностики патогенных вариантов (номер нуклеотида в референсной последовательности геномной ДНК обозначен префиксом NC, номер нуклеотида в референсной последовательности кодирующего транскрипта обозначен префиксом NM): NC_000013.10:g.20763691del(NM_004004.6:c.35delG, p.Gly12fs) и NC_000013.10:g.20763554del(NM_004004.6:c.167del, p.Leu56fs) в гене GJB2 [Snoeckx, R.L. et al. GJB2 Mutations and Degree of Hearing Loss: A Multicenter Study. The American Journal of Human Genetics, 2005; 77(6), 945-957] с двойной системой детекции - прямой и косвенной. Такая система необходима при работе с малым количеством биоматериала, так как нестабильная амплификация может привести к потере информации или сниженной точности анализа. Прямая диагностика подразумевает анализ непосредственно наличия-отсутствия патогенного варианта. В данном случае для генетических вариантов NC_000013.10:g.20763691 del(NM_004004.6:c.35delG, p.Gly12fs) и NC_000013.10:g.20763554del(NM_004004.6:c.167del, p.Leu56fs) типа делеция (отсутствие нескольких нуклеотидов, англ. Deletion del) были подобраны праймеры, которые позволяют произвести детекцию мутации по разнице длин фрагментов с помощью капиллярного электрофореза. Косвенная диагностика заключается в анализе наследования молекулярно-генетических маркеров, сцепленных с мутацией, т.е. наследуемых вместе с ней. Для этого на расстоянии не более 3 мБ (что соответствует 3% кроссинговера в среднем) от гена GJB2 в каждую сторону были выбраны полиморфные локусы, называемые STR (short tandem repeat - короткий тандемный повтор), с гетерозиготностью не менее 0,70 для обеспечения максимальной информативности косвенной диагностики. STR представляют собой повторы 2х и более нуклеотидов расположенные друг за другом (например пара аденин-цитозин (АЦ), повторяющаяся несколько раз подряд: АЦАЦАЦАЦ) и в большом количестве присутствуют в геноме человека. Количество повторов в каждом из них может варьироваться от индивидуума к индивидууму, а также может быть разным у одного и того же человека на 2х гомологичных хромосомах. Гетерозиготность выше 0,70 означает, что высока вероятность того, что у одного и того же человека количество повторов нуклеотидов в данном STR на одной хромосоме будет отличаться от количества повторов в этом же STR на гомологичной хромосоме, другими словами, аллели данного маркера у этого человека будут отличаться между собой по длине. При амплификации фрагмента, содержащего такой маркер, будут получены ампликоны двух разных длин. Проанализировав количество повторов в нескольких маркерах, окружающих патогенный вариант, и изучив то, как они наследуются в тестируемой семье, можно установить сцепление между аллелями маркеров и патогенным вариантом. Диагностическая ценность исследования количества повторов в данных маркерах у эмбрионов состоит в том, что по тому, какой аллель каждого из маркеров был унаследован эмбрионом, можно судить о том, унаследовал ли эмбрион ген GJB2, несущий патогенный вариант, или же он унаследовал ген GJB2 с другой, гомологичной хромосомы, не содержащий патогенный вариант. Для каждого из этих локусов были подобраны праймеры для амплификации по типу гнездовой или полугнездовой ПЦР в 2 раунда, позволяющей повысить точность и эффективность амплификации. В тест-систему были включены 12 STR локусов для гена GJB2: D13AC19.7, D13S1316, D13AC20.1, D13S141, D13S175, D13S633, D13S250, D13S1236, D13S1275, D13S292, D13S1243, D13S283. Праймеры для амплификации находятся на 13 хромосоме в районе координат 19907040-25600789 (в соответствии с hg19). Последовательности праймеров для амплификации фрагментов ДНК, содержащих перечисленные STR локусы указаны в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-45. Важно отметить, что при подборе праймеров соблюдали ряд особенных требований: длина продукта с внешними праймерами для первого раунда ПЦР не должна превышать 500 п.н. (для наработки с фрагментов, получаемых при полногеномной амплификации), длина продукта с внутренних праймеров для второго раунда ПЦР от 120 до 350 п.н., высокая специфичность внешних праймеров, температура отжига не отличается более, чем на 1°С.
Подготовительный этап ПГТ
На подготовительном этапе проводится отработка тест-системы: подбор условий амплификации, оптимальных для работы праймеров, анализ эффективности и специфичности ПЦР-амплификации в обоих раундах, оценки универсальности тест-системы для биообразцов различного типа (ДНК, продукт NGA, единичные клетки). При отработке тест-системы были приготовлены стоковые разведения праймеров с концентрацией 100 mM, и рабочие разведения комбинаций праймеров (комбинация пар праймеров для 1 и 2 раунда ПЦР) с концентрацией ЮтМ каждого праймера в растворе. Так как в рамках диагностики клинического материала могут быть использованы различные типы матриц, при отработке тест-системы были использованы две биопсии единичных клеток, находящихся в специальном лизирующем буфере (1*PCR Buffer, 0,1% Tween-20, 0,1% Triton X-100, 1 мкг Proteinase K), два образца продуктов полногеномной амплификации биопсиий эмбриона (WGA), а также тотальной ДНК членов семьи, выделенной из крови, для составления родословной и выявления сцепления патогенного варианта с аллелями полиморфных маркеров.
В рамках гнездовой и полугнездовой ПЦР амплификация проводится в два этапа. На первом этапе проводится мультиплексная ПЦР со всеми внешними праймерами для всех локусов, входящих в тест-систему, для обогащения образца всеми целевыми фрагментами. На втором этапе проводится индивидуальная амплификация каждого фрагмента с внутренними праймерами.
Полугнездовая ПЦР
Для первого этапа были подобраны внешние высокоспецифичные праймеры для амплификации фрагментов от 300 до 500 п.н. Для второго этапа были подобраны праймеры для амплификации фрагментов длиной не более 350 пар оснований, а также были введены метки для детекции методом фрагментного анализа. Последовательности праймеров для амплификации фрагментов ДНК, содержащих STR локусы указаны в формуле изобретения в перечне SEQ ID NO 1-45. ПЦР-смесь для первого раунда амплификации содержала 1×ПЦР буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.1 тМ каждого деоксинуклеотида, 0.15 μМ каждого праймера, 2,5 U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 мкл тотальной ДНК или 2,5 мкл WGA или 5 мкл лизирующего буфера с образцом в качестве матрицы. Первый этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 94°С в течение 2 минут, 30 циклов с понижением температуры отжига праймеров с 62 до 45°С в каждом, этап достройки всех матриц 72°С 10 минут. Далее продукты 1-ого этапа были разнесены в индивидуальные пробирки с одной парой праймеров на определенный локус.
В состав ПЦР смеси для второго этапа входили 1×ПЦР буфер с Mg2+ (Евроген, Россия), 0.5×RediLoad™ загрузочный буфер (Thermo Fisher Scientific, USA), 0.2 mM каждого деоксинуклеотида, 0.2 μМ каждого праймера, 1U/μl ДНК полимеразы HsTaq (Евроген, Россия), 6% диметилсульфоксида (DMSO) и 1 μl ПЦР-продукта первого этапа амплификации в качестве матрицы. Второй этап амплификации проводился по следующему протоколу: этап денатурации 95°С в течение 2 минут, 35 циклов: денатурация 95°С 30 секунд, отжиг праймеров - 57°С 30 секунд, синтез матрицы - 72°С 1 минута, этап достройки всех матриц 72°С 5 минут. Оценку эффективности и специфичности амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле. Результат электрофореза в агарозном геле позволяет определить необходимую степень разведения продуктов амплификации для нанесения на фрагментный анализ (продукты амплификации ДНК членов семьи).
Фрагментный анализ продуктов амплификации проводили с помощью капиллярного электрофореза на приборе 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). По результатам фрагментного анализа составляется родословная и отмечаются информативные полиморфные STR-локусы для каждой семьи, которые в дальнейшем будут использованы в клинической диагностике. Локусы делятся на неинформативыне (носитель патогенного варианта гомозиготен по этому локусу), полуинформативные (на некоторых и родительских хромосом аллели по этому маркеру совпадают), информативные (на всех хромосомах родителей аллели этого маркера разные, что дает возможность отличить каждую из них при анализе генотипа эмбриона). Детекция патогенного варианта NC_000013.10:g.20763691 del (NM_004004.6:c.35delG, p.Gly12fs) проводилась с помощью праймеров для амплификации:
Внешние: 5'-GTAGCACACGTTCTTGCAGC-3' и 5'-TTCCAGAGCAAACCGCC-3'
Внутренние: 5'-(FAM)ACGGTGAGCCAGATCTTTCC-3' и 5'-TTCCAGAGCAAACCGCC-3'
Детекция патогенного варианта NC_000013.10:g.20763554del (NM_004004.6:c.167del, p.Leu56fs) проводилась с помощью праймеров для амплификации:
Внешние: 5'-GTAGCACACGTTCTTGCAGC-3' и 5'-TTCCAGAGCAAACCGCC-3'
Внутренние: 5'-GTAGCACACGTTCTTGCAGC-3' и 5'-(FAM)GATCTGGCTCACCGTCCT-3'
Пример 1
Пациенты А
В ЦГРМ Генетико обратилась семья А, в которой родился ребенок с заболеванием несиндромальная нейросенсорная тугоухость с компаунд-гетерозиготным носительством патогенных вариантов NC_000013.10:g.20763691del(NM_004004.6:c.35delG,p.Gly12fs) и NC_000013.10:g.20763554del(NM_004004.6:c.167del, p.Leu56fs) в гене GJB2. Паре было рекомендовано проведение ПГТ заболевания несиндромальная нейросенсорная тугоухость в рамках ЭКО для отбора эмбрионов, не унаследовавших заболевание.
Гаплотипирование семьи
На первом этапе был получен биоматериал (периферическая кровь) членов семьи для детекции патогенного варианта и выявления групп сцепления аллелей полиморфных маркеров. Было проанализировано 12 STR локусов. Из них 7 оказались информативными по матери и/или отцу. Таким образом, образцы эмбрионов тестировались только на информативные маркеры.
Определение групп сцепления проводилось следующим образом. Аллели полиморфных маркеров, совпадающие у родителя-носителя патогенного варианта в гене GJB2 и у ребенка с заболеванием несиндромальная нейросенсорная тугоухость признаются сцепленными с соответствующим патогенным вариантом и друг с другом. Аллели полиморфных маркеров, не совпадающие у таких родителей и ребенка с заболеванием, признаются сцепленными друг с другом и с нормальным аллелем гена GJB2. Косвенная диагностика позволяет сделать вывод о наследовании нормального или мутантного аллеля гена даже в случае выпадения аллеля или непрохождения реакции при амплификации фрагментов ДНК для прямой диагностики.
В результате гаплотипирования и определения групп сцепления для семьи А из примера были получены результаты, представленные в таблице 1. Аллели, указанные на одной строке, располагаются на одной хромосоме, то есть, представляют группу сцепления. Таким образом для каждого члена семьи представлено 2 группы сцепления, соответствующие каждой из двух тринадцатых хромосом. N в таблице обозначает отсутствие патогенного варианта, mut - его присутствие. Цифрами записаны длины ампликонов в парах нуклеотидов; их длины зависят от количества повторов в маркере STR. Патогенный вариант NC_000013.10:g.20763691del(NM_004004.6:c.35delG, p.Gly12fs) в гене GJB2 в таблице обозначен как GJB2 c.35delG. Патогенный вариант NC_000013.10:g.20763554del(NM_004004.6:c.167del, p.Leu56fs) в гене GJB2 в таблице обозначен как GJB2 c.167del.
В результате гаплотипирования был сделан вывод, что у партнера пациентки с патогенным вариантом были сцеплены следующие аллели STR-маркеров: D13AC19.7 - 197, D13AC20.1 - 218, D13S141 - 124, D13S175 - 101, D13S1236- 117, D13S1275-207, D13S1243 - 251.
У пациентки с патогенным вариантом были сцеплены следующие аллели STR-маркеров: D13AC19.7 - 191, D13AC20.1 - 216, D13S141 - 124, D13S175 -101, D13S1236- 115, D13S1275-201, D13S1243 - 251.
Преимплантационное генетическое тестирование
В цикле ЭКО было получено 3 эмбриона, проведена биопсия на 5 день развития (в клинике ЭКО), биоптат в буфере для WGA (1xPBS (Invitrogen, США), 1% поливинилпирролидона (PVP) (Fertipro, Бельгия)) направлен в лабораторию «Генетико». Для контроля контаминации на разных этапах работы с образцом в лаборатории разработана система контролей: контроль контаминации буфера для биопсии, контроль контаминации при транспортировке (одна пробирка с буфером не открывается эмбриологом), контроль контаминации каждого образца (проба среды из последней отмывочной капли биопсиийного материала). Все эти контроли вместе с образцами проходят этап полногеномной амплификации, после которого будет заметно малейшее количество ДНК, контаминировавшей контроли. Полногеномную амлификацию проводили с помощью коммерческого набора SurePlex (lllumina, США).
Продукт полногеномной амплификации, а также ДНК всех членов семьи амплифицировали на 1 этапе в мультиплексной ПЦР с праймерами для детекции патогенного варианта и праймерами для информативных для семьи А полиморфных маркеров в соответствии с разработанным в рамках подготовительного этапа протоколом для тест-системы. На 2 этапе амплификацию проводили для каждого маркера отдельно в соответствии с разработанным протоколом для тест-системы. Таким образом были установлены группы сцепления, унаследованные каждым эмбрионом. Полученные результаты представлены в таблице 1.
По результатам прямой и косвенной диагностики 2 эмбрионов (эмбрион 1 и 3) не унаследовали заболевание, у 1 эмбрионов (эмбрион 2) выявлен гаплотип, соответствующий унаследованному заболеванию. Эмбрион 1 оказался носителем патогенного варианта NC_000013.10:g.20763691 del(NM_004004.6:c.35delG,p.Gly12fs). С согласия родителей для эмбрионов, не унаследовавших заболевание, провели преимплантационный генетический скрининг хромосомных аномалий. По результатам всех проведенных анализов эмбрион 1 был рекомендован к переносу. Эмбрион 3 не был рекомендован в связи с выявленными хромосомными аномалиями.
Перечень последовательностей праймеров:
D13AC19.7
SEQ ID NO  1: 5’-CACTGTGCCTGGTCCG-3’ (Fout);
SEQ ID NO  2: 5’-CAAGTGACAGCCAATGCTGG-3’ (Rout);
SEQ ID NO  3: 5’-*ACACCTGGCTCTGTAACGTC-3’ (Rin),
D13S1316
SEQ ID NO  4: 5’-TGTGAGACCTCTCGCCATT-3’ (Fout);
SEQ ID NO  5: 5’-CACATAGCTGAAGAAAGAATAGGTG-3’ (Rout)
SEQ ID NO  6: 5’-CTACTGGGGAGGCTGG-3’ (Fin);
SEQ ID NO  7: 5’-CATGTCTCTGAATCGCTTTT-3’ (Rin),
D13AC20.1
SEQ ID NO  8: 5’-GCGTTGCTCTTGCATTCCAT-3’ (Fout);
SEQ ID NO  9: 5’-AGGCTGTGTTTGATACTGTAATTTG-3’ (Rout)
SEQ ID NO  10: 5’-*TCTCCAGTGGGATGAGCAGA-3’(Fin),
D13S141
SEQ ID NO  11: 5’-CAGCTTCCCCTTTCAGGCAG-3’ (Fout);
SEQ ID NO  12: 5’-CACTGCCTGTATTCCCGAGG-3’ (Rout)
SEQ ID NO  13: 5’-GTCCTCCCGGCCTAGTCTTA-3’ (Fin);
SEQ ID NO  14: 5’-ACCACGGAGCAAAGAACAGA-3’ (Rin),
D13S175
SEQ ID NO  15: 5’-CGCGTGTTTGCTCTGTAAGG-3’ (Fout);
SEQ ID NO  16: 5’-ACATCTTGAAATGATTACCGCAA-3’ (Rout)
SEQ ID NO  17: 5’-TATTGGATACTTGAATCTGCTG-3’ (Fin);
SEQ ID NO  18: 5’-TGCATCACCTCACATAGGTTA-3’ (Rin),
D13S633
SEQ ID NO  19: 5’-TAAGACTCGAACTGCTTTGCTTCT-3’ (Fout);
SEQ ID NO  20: 5’-CCCTCCAATCTCTTTCATATCCCA-3’ (Rout)
SEQ ID NO  21: 5’-ACCTAAAATCTCCCAAATTGT-3’ (Fin);
SEQ ID NO  22: 5’-ACGCTTTACCCCTGAAATC-3’ (Rin),
D13S250
SEQ ID NO  23: 5’-ACTGTCCCCCTATTTTTATTTCCT-3’ (Fout);
SEQ ID NO  24: 5’-TGCTAGAGTATTGAAAACCAGACT-3’ (Rout)
SEQ ID NO  25: 5’-ACAGGATATCCCCCAGCAG-3’ (Fin);
SEQ ID NO  26: 5’-GAAGACAGGGTTATGCCCA-3’ (Rin),
D13S1236
SEQ ID NO  27: 5’-AAGTGACCTGAACAGCCCAA-3’ (Fout);
SEQ ID NO  28: 5’-CCCAACTCCCCTTCCAGTTC-3’ (Rout)
SEQ ID NO  29: 5’-GCACTTGGCCTGGGTAA-3’ (Fin);
SEQ ID NO  30: 5’-AAGGGGCTGGCTCTTCA-3’ (Rin),
D13S1275
SEQ ID NO  31: 5’-AGCGTCTAAGTAAAGTGGGTGC-3’ (Fout);
SEQ ID NO  32: 5’-TTGTCCATTTGTTGGAGTGTGAAT-3’ (Rout)
SEQ ID NO  33: 5’-ATCACTTGAATAAGAAGCCATTTG-3’ (Fin);
SEQ ID NO  34: 5’-CCAGCATGACCTTTACCAG-3’ (Rin),
D13S292
SEQ ID NO  35: 5’-TGTCTTCTCAAGGATTCGGGGA-3’ (Fout);
SEQ ID NO  36: 5’-GTTCCACTGTCCAGTTCTGGGTTT-3’ (Rout)
SEQ ID NO  37: 5’-TAATGGCGGACCATGC-3’ (Fin);
SEQ ID NO  38: 5’-TTTGACACTTTCCAAGTTGC-3’ (Rin),
D13S1243
SEQ ID NO  39: 5’-GTTCTAGCCAGAGTGAGGACC-3’ (Fout)
SEQ ID NO  40: 5’-GCAGTACATCATGACAAGTTGAT-3’ (Rout)
SEQ ID NO  41: 5’-TGCTGACAGGCTACAGAACTTT-3’ (Fin);
SEQ ID NO  42: 5’-CTCTTGTGCAGGTATAGGGG-3’ (Rin),
D13S283
SEQ ID NO  43: 5’-TGTCATTGTCAGCTCACTTCTA-3’ (Fout);
SEQ ID NO  44: 5’-GCCATTCCAAGCGTGT-3’ (Rout)
SEQ ID NO  45: 5’-TCTCATATTCAATATTCTTACTGCA-3’ (Fin)