СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АЛЛОГЕННОГО КОСТНОЗАМЕЩАЮЩЕГО МАТЕРИАЛА
METHOD OF PRODUCING ALLOGENIC BONE-REPLACEMENT MATERIAL

Изобретение относится к области медицины, а именно к заготовке костных трансплантатов для реконструктивно-восстановительных операций на скелете в практике травматологов-ортопедов, нейрохирургов-вертебрологов, челюстно-лицевых хирургов.
В реконструктивной хирургии опорно-двигательного аппарата при разной ортопедической патологии широко применяют аллогенные материалы на основе донорских костных тканей. Изготовление таких материалов, происходит в два этапа: 1) очистка костной ткани от клеточных элементов и содержимого миелоидно-жирового костного мозга до минерально-коллагенового костного матрикса; 2) конечная стерилизация. Качественные характеристики получаемого материала, его остеокондуктивные и остеокондуктивные свойства зависят от применяемых методов химического и физического воздействия на костную ткань, времени экспозиции и температурного режима [1]. В проанализированной нами литературе описаны методы очистки и стерилизации, в которых используют химические вещества и концентрации растворов, способные оказывать негативное влияние на свойства конечного продукта, методы с длительным и трудоемким технологическим процессом или требующие специализированного оборудования [2]. Ниже рассмотрим некоторые примеры.
Известен способ [3] изготовления имплантатов из губчатой костной ткани, включающий отмывание костных фрагментов водой и последующим погружением в 6%-ный раствор перекиси водорода на 48 часов при соотношении один объем костных фрагментов на четыре объема раствора перекиси водорода (то есть 1:4) со сменой 4 раза каждые 12 часов, костные фрагменты центрифугируют, затем погружают их в смесь этанола и хлороформа в соотношении 1:1, из расчета 1 объем костных фрагментов на 4 объема смеси, при этом смесь меняют каждые 12 часов 4 раза, повторно центрифугируют костные фрагменты, проветривают на воздухе в течение 24 ч, после чего костные фрагменты замораживают на 24 часа при температуре -70С после чего лиофилизируют в течение 48 часов с достижением остаточной влажности 5%, упаковывают в стандартный двойной пакет и стерилизуют потоком быстрых электронов дозой 18+5 кГр на ускорителе ЛУЭ-8-5М, У003 MB (RU 2172104 С1). Недостатком данного способа является длительные экспозиции в высококонцентрированном растворе перекиси водорода (6%-48 ч), применение хлороформа, что снижает остеоиндуктивность и длительный цикл - 172 ч.
Известен способ получения костного трансплантата, предложенный Кирилловой И.А. [4], в котором очистку и промывку костной ткани, депротеинизацию фрагментов вначале в 0,01%-ном растворе химопсина, затем в 10%-ном растворе перекиси водорода в течение 48 ч, обработку жидким эфиром, высушивание и обработку 10%-ным раствором хлористого лития в течение 16 ч и стерилизацию целевого продукта, при этом аллогенные или ксеногенные фрагменты длинных трубчатых костей депротеинизируют в растворе химопсина в течение 96 ч, а при обработке 10%-ным раствором перекиси водорода их помещают в переменное магнитное поле при 45°С. Недостатками данного способа являются применение высококонцентрированного раствора перекиси водорода 10%, что значительно снижает остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства аллоимплантатов.
В способе изготовления аллотрансплантата вертлужной впадины, предложенном Тихиловым Р.М. [5], фрагмент донорской вертлужной впадины помещают в 10% раствор перекиси водорода, который меняют ежедневно до исчезновения на его поверхности жировых пятен. Выдерживают препарат в течение 24 часов в 0,6 н. растворе бромоводородной кислоты. Производят суточную отмывку препарата дистиллированной водой. Недостатком является длительная экспозиция в 10% процентном растворе перекиси водорода, что приводит к разрушению костного коллагена и снижению прочностных и остеоиндуктивных свойств алломатериала.
Известен способ удаления костного мозга из губчатых костных трансплантатов [6], методика основана на воздействии на них химическими веществами и отмывке их проточной водой, в котором на предварительно отмытые проточной водой костные трансплантаты после воздействия на последние липосистемами и перекисью водорода воздействуют на низкочастотными ультразвуковыми колебаниями с частотой 24,5-28,5 кГц в течение 1 минуты, после чего, произведя их отмывку проточной водой, помещают в спиртоэфирный раствор, выдерживая их в последнем 0,5-1,5 часа. Недостатком известного способа является то, что обезжиривание осуществляется спиртоэфирным раствором, в связи с чем, требует длительной последующей отмывки спиртом и дистиллированной водой, поскольку остатки спиртоэфирной смеси могут провоцировать воспаление, обладает цитотоксическим действием, что негативно сказывается на процессах ремоделирования.
Технический результат, на достижение которого направлено создание настоящего изобретения, является повышение эффективности очистки губчатого вещества костной ткани от клеточных элементов, миелоидно-жирового костного мозга и растворимых белков до минерально-коллагенового матрикса, улучшение качества изготавливаемого костнозамещающего материала за счет снижения вероятности воспалительного ответа.
Поставленный технический результат достигается тем, что в способе изготовления аллогенного костнопластического материала после очистки фрагментов костной ткани от органических компонентов костного мозга и клеточных элементов до минерально-коллагенового матрикса, согласно изобретению, костные блоки, полученные из изъятых и очищенных головок бедренных костей, погружают в физиологический раствор, содержащий 1 г цефтриаксона на каждые 400 мл, и оставляют на ночь в холодильнике при температуре +4°С, после экспозиции в растворе антибиотика, блоки промывают в водяной шейкерной бане в течение 1 часа в дистиллированной воде, предварительно разогретой до 59°С, затем костные блоки промывают 15 минут проточной водой под давлением, далее отмывку осуществляют циклически: на первом цикле блоки промывают в водяной шейкерной бане 20 минут в 10% водном растворе гидрокарбоната натрия, далее 15 минут промывают водой под давлением, затем блоки помещают в 10% водном растворе гидрокарбоната натрия и 20 минут обрабатывают ультразвуком при частоте - 35-40 кГц и температуре 59°С; после чего повторно промывают проточной водой под давлением в течение 15 минут, затем блоки 15 минут промывают 10% водным раствором гидрокарбоната натрия в орбитальном шейкере и осуществляют замер растворимого белка; на втором цикле используют такую же последовательность этапов промывок, но отмывку осуществляют дистиллированной водой, циклы повторяют до отсутствия белка в промывной жидкости, далее выполняют промывание костных фрагментов 3% раствором перекиси водорода, предварительно разогретой до 57°С в следующей последовательности - водяная шейкерная баня, ультразвуковая мойка, орбитальный шейкер по 20 минут, затем блоки промывают раствором этанола 70% по 20 минут при температуре 57°С - в следующей последовательности - водяная шейкерная баня, ультразвуковая мойка, орбитальный шейкер по 20 минут, после чего 3-х кратно промывают стерильной водой при температуре 59°С в орбитальном шейкере по 15 минут; высушивают, замораживают при температуре -80°С, затем подвергают лиофилизации, герметично пакуют в двойной стерильный пакет, стерилизуют потоком быстрых электронов дозой 25 кГр.
На фигурах изображено:
Фигура 1 - Жизнеспособность ММСК при культивировании с экстрактами в течение 72-х часов. Флуоресцентная микроскопия, где А - ядра клеток (DAPI), В - ядра мертвых клеток (NUC Green), С - DAPI/NUC Green
Фигура 2 - Жизнеспособность ММСК при культивировании в костных блоках. Показатели оптической плотности на 3 и 7 сутки культивирования.
Фигура 3 - Микрофотографии минерально-коллагенового матрикса губчатого вещества аллокости. СЭМ. Напыление золото-палладий. Кратность увеличения 330-1300 (контрольный штрих указан на рисунке).
Способ осуществляют следующим образом. В качестве исходного материала используют губчатую кость из головок бедренных костей, резецированных в ходе операции первичной тотальной артропластики тазобедренного сустава. Изъятие головок выполняют согласно внутреннему протоколу, в условиях операционной и исследуют согласно установленным правилам и сохраняют при температуре -80С. Оттаивание происходит в течение 8 часов при комнатной температуре. Далее в стерильных условиях в ламинарном шкафу головки очищают от мягких тканей и хряща, макроскопически оценивают участки с условно-здоровой губчатой костью, далее губчатое вещество из головок разделяют на фрагменты. Подготовленные блоки погружают в физиологический раствор 400 мл, содержащий 1 г цефтриаксона, и оставляют на ночь в холодильнике при температуре +4С.
После экспозиции в растворе антибиотика, блоки промывают в водяной шейкерной бане в течение 1 часа в дистиллированной воде, предварительно разогретой до 59°С. После чего выполняют промывку 15 минут проточной водой под давлением. Далее отмывку костных блоков от клеток и других органических компонентов до минерально-коллагенового матрикса осуществляют циклическим способом. На первом цикле блоки промывают в водяной шейкерной бане 20 минут в 10% водном растворе гидрокарбоната натрия, далее 15 минут промывают водой под давлением, затем блоки помещают в 10% водном растворе гидрокарбоната натрия и 20 минут обрабатывают ультразвуком при частоте - 35-40 кГц и температуре 59°С. После чего повторно выполняют промывку проточной водой под давлением в течение 15 минут. Затем блоки 15 минут промывают 10% водном растворе гидрокарбоната натрия в орбитальном шейкере 220 об/минуту. После чего осуществляют замер растворимого белка в промывной жидкости на приборе QUBIT. На втором цикле используют такую же последовательность этапов промывок, но отмывку осуществляют дистиллированной водой, циклы повторяют до отсутствия белка в промывной жидкости. Далее выполняют промывание костных фрагментов 3% раствором перекиси водорода, предварительно разогретой до 57°С в следующей последовательности - водяная шейкерная баня, ультразвуковая мойка, орбитальный шейкер 220 об/мин по 20 минут. Затем блоки промывают раствором этанола 70% по 20 минут при температуре 57°С - в следующей последовательности - водяная шейкерная баня, ультразвуковая мойка, орбитальный шейкер 220 об/мин по 20 минут. После чего 3-х кратно промывают стерильной водой при температуре 59°С в орбитальном шейкере по 15 минут. Блоки высушивают в течение 2-х часов в термостате при температуре 45°С. Выполняют заморозку при температуре -80 в течение 1 часа. После чего блоки сублимируют на лиофильной установке при отрицательном давлении с постепенным нагревом от -40°С до +40°С, с нагреванием на +20°С каждые 8 часов, общее время составляет 40 часов и включает в себя 5 этапов нагрева по 8 часов. Далее блоки герметично пакуют в двойную полиэтиленовую упаковку «КЛИНИПАК». Конечную стерилизацию осуществляют ионизирующим излучением потоком быстрых электронов на радиационно-технологической установке с линейным ускорителем электронов УЭЛР-10-10-С2 дозой излучения 25 кГр.
Ультразвуковые колебания способны создавать микровибрации, приводящие к разрыву клеточных мембран, разрушению коллоидов, белковых комплексов и макромолекул. За счет того, что ультразвуковая волна способна распространятся на весь фрагмент ткани, разрушение происходит и в труднодоступных местах.
Центрифугирование позволяет использовать эффект центробежной силу, что способствует отторжению органических компонентов минерально-коллагенового матрикса губчатого вещества кости и осаждению их на дне сосуда.
Водяная шейкерная баня позволяет выполнять механическую очистку - промывание фрагментов костной ткани в дистиллированной воде при заданной температуре 57-59°С, что приводит к разрушению растворимых белков, при сохранении волокон костного коллагена, а колебания частоты 220 об/мин обеспечивают достаточное вымывание разрушенных органических компонентов клеток и содержимого костного мозга из межтрабекулярных пространств костного матрикса.
Для обезжиривания в технологическом процессе применяется 10% раствор гидрокарбоната натрия, что приводит к ощелачиванию среды и омылению жиров, данный эффект усиливается за счет разогрева раствора до 57-59°С.
Разработанные материалы были исследованы на цитотоксичность и биосовместимость, для этого была проведена серия экспериментов in vitro. Из образцов материалов получали экстракт, который добавляли в клеточную культуру, определяли жизнеспособность клеток в динамике используя МТТ-тест, выполняли подсчет клеток, после 72 часов культивирования доля мертвых клеток составила 20% (Фигура 1). Также выполняли заселение костных блоков культурой клеток, после чего определяли жизнеспособность ММСК в динамике путем определения оптической плотности. Показатели оптической плотности на 3 и 7 сутки составили - 0,36±0,12 и 0,5±0,21, соответственно (Фигура 2). Проведенные исследования показали, что полученный материал не обладает цитотоксическим действием.
С целью контроля степени очистки от органических компонентов, после каждого цикла очистки измеряли концентрацию растворимого белка на приборе Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, USA), для этого после промывки костных блоков дистиллированной водой забирали 20 мл и, после центрифугирования, определяли концентрацию белка в осадке. Содержание растворимого белка составило - 21±3,1 мкг/мл, что свидетельствует о достаточной очистке.
Кроме этого, оценка качество очистки определяли при визуализации данных фотоизображений минерально-коллагенового матрикса губчатого вещества полученных образцов материалов, выполненных с помощью сканирующей электронной микроскопии на разных увеличениях кратности 330 до 13000 (Фигура 3). Данные фотоизображений СЭМ, подтверждают достаточную степень очистки губчатого вещества костной ткани.
Костнозамещающие материалы, изготовленные по предложенному способу, подтвердили свою стерильность, безопасность, отсутствие цитотоксичности и остеогенные свойства в серии экспериментов in vivo и in vitro. Данный способ изготовления позволяет повысить технологичность и получить новый костнозамещающий материал с улучшенными свойствами.
Список использованной литературы:
1) Mohr J, Germain М, winters М, Fraser S, Duong A, Garibaldi A, Simunovic N, Alsop D, Dao D, Bessemer R, Ayeni OR. Bioburden Steering Committee and Musculoskeletal Tissue working group.Disinfection of human musculoskeletal allografts in tissue banking: a systematic review. Cell Tissue Bank. 2016; 17(4):573-584. DOI: 10.1007/s10561-016-9584-3.
2) Воробьев K.A., Божкова C.A., Тихилов P.M., Черный А.Ж. Современные способы обработки и стерилизации аллогенных костных тканей (обзор литературы) // Травматология и ортопедия России. 2017. Т. 23. №3. С. 134-147. [Vorobyov KA, Bozhkova SA, Tikhilov RM, Cherny AZh. Current Methods of processing and Sterilization of Bone Allografts (Review). Travmatologiya i ortopediya Rossii. 2017; 23(3):134-147. in Russian]. DOI: 10.21823/2311-2905-2017-23-3-134-147.
3) Патент РФ №2172104, Способ изготовления имплантатов из губчатой костной ткани. Патентообладатель: ФГБУ «НМИЦ ТО им. Н.Н. Приорова» МЗ РФ, авторы: Лекишвили М.В., Михайлов А.Ю., Васильев М.Г.
4) Патент РФ №2223104, Способ получения костного трансплантата, патентообладатель: Новосибирский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии, авторы: Кирилова И.А., Подорожная В.Т.
5) Патент РФ №2377959, Способ изготовления аллотрансплантата вертлужной впадины, патентообладатель: ФГБУ "РНИИТО им. P.P. Вредена" Минздрава России, авторы: Тихилов Р.М., Савельев В.И., Рыков Ю.А., Булатов А.А.
6) Патент РФ №2166252, Способ удаления костного мозга из губчатых костных трансплантатов, авторы и патентообладатели: Волова Л.Т., Кириленко А.Г.