СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕМОГЛОБИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
METHOD OF EXAMINING PEROXIDASE ACTIVITY OF BLOOD PLASMA HAEMOGLOBIN

Изобретение относится к биохимической диагностике, а именно к способам определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови.
Определение параметров, характеризующих окислительно-восстановительные и воспалительные процессы в крови, необходимо как для диагностики и прогнозирования течения заболеваний, так и для мониторинга эффективности проводимой терапии. Одним из таких важных показателей является пероксидазная активность плазмы крови, которая определяется преимущественно активностью железосодержащих белков миелопероксидазы (МПО) и гемоглобина и его производных.
Являясь основным компонентом эритроцитов, гемоглобин при патологических процессах в результате разрушения эритроцитов (гемолиза) в достаточно больших количествах (до 15,3 мкМ) может попадать в плазму крови. Так, показано изменение содержания свободного гемоглобина в плазме при гемолитических анемиях, сердечной недостаточности, сахарном диабете и др.
МПО секретируется во внеклеточное пространство в результате дегрануляции или лизиса лейкоцитов в очагах воспаления. Повышение концентрации МПО, а также появление ее биомаркеров обнаружено при атеросклерозе, сердечно-сосудистых, онкологических, нейродегенеративных заболеваниях, нарушении дыхательной функции легких, при заболеваниях почек, системных васкулитах, ревматоидном артрите и др.
Известен способ определения пероксидазной активности МПО в плазме, включающий внесение в плазму крови субстрата пероксидаз, в качестве которого используют о-дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ) в присутствии и в отсутствие ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере (рН 4,5) [1]. Однако данным способом нельзя оценить пероксидазную активность гемоглобина в плазме.
В качестве прототипа принят способ определения общей пероксидазной активности плазмы, включающий внесение в плазму крови субстрата, в качестве которого используют о-дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости его окисления в присутствии пероксида водорода (3 мМ) в фосфатном буфере (рН 6,9) [2].
Однако известный способ имеет недостатки, так как не позволяет оценивать пероксидазную активность присутствующего в плазме гемоглобина, а дает возможность определить лишь общую пероксидазную активность, включающую вклад как МПО, так и гемоглобина.
Задачей изобретения является создание способа быстрого определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови.
Поставленная задача достигается тем, что в способе определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови, включающем внесение субстрата о-дианизидина в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты в фосфат-цитратном буфере (рН 5,5), пероксид водорода используют в концентрации 2 мМ, а пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови определяют как скорость окисления о-дианизидина.
Сущность изобретения состоит в том, что субстрат о-дианизидин вносят в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрически определяют пероксидзаную активность гемоглобина как скорость окисления субстрата после добавления пероксида водорода (2 мМ) в фосфат-цитратном буфере (рН 5,5) в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты. Такие условия измерения позволяют минимизировать вклад миелопероксидазы в определяемую пероксидазную активность гемоглобина.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется чертежами, где:
на фиг.1 показана рН-зависимость пероксидазной активности гемоглобина (1 мкМ) в плазме;
2
2
на фиг.2 приведена зависимость пероксидазной активности гемоглобина (1 мкМ) в плазме от концентрации HO.
Способ позволяет определить пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови. Это дает возможность прогнозировать развитие заболеваний, уточнить диагноз и своевременно принять меры, направленные на регулирование пероксидазной активности гемоглобина, а также провести мониторинг пероксидазной активности плазмы во время клинических испытаний фармакологических препаратов.
Простота и скорость предлагаемого способа обеспечивают возможность его использования в экспресс-диагностике.
Hb
Способ осуществляется следующим образом. Для работы используют спектрофотометр, позволяющий регистрировать оптическую плотность в видимой области спектра. Отделенную от клеточного осадка путем центрифугирования плазму крови в количестве 60-70 мкл вносят в спектрофотометрическую кювету объемом не менее 0,8 мл, содержащую фосфат-цитратный буфер (рН 5,5) в присутствии ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты (50 мкМ), и субстрат о-дианизидин (380 мкМ). После добавления пероксида водорода (2 мМ) пробу (общий объем пробы 0,8 мл) быстро перемешивают непосредственно в кювете и начинают регистрацию увеличения оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450-460 нм в течение 8-10 мин. Оптическим контролем служит проба, содержащая те же компоненты, что и опытная проба, но вместо плазмы добавлен равный объем буферного раствора. Расчет пероксидазной активности гемоглобина (ПА) проводят по формуле:
где ΔD - прирост оптической плотности при 460 нм за t минут;
V - общий объем реакционной смеси (мл);
υ - объем образца плазмы (мл);
Hb
0,0152 - прирост ΔD, соответствующий окислению 1 мкМ о-дианизидина. Данный коэффициент определяли по калибровочной прямой зависимости оптической плотности при 460 нм от концентрации о-дианизидина (25-150 мкМ) после его полного окисления пероксидазой хрена (0,1 мкг/мл) в присутствии пероксида водорода (2 мМ). Единица пероксидазной активности гемоглобина в плазме (ПА) выражена в условных единицах (далее усл. ед.) и соответствует окислению 1 мкМ о-дианизидина за 1 минуту в описанных условиях.
Пример 1, демонстрирующий выбор оптимального рН при определении пероксидазной активности гемоглобина в плазме.
2
4
В одну опытную кювету вносили фосфат-цитратный буфер (0,05 М NaHPO/0,025 М), 60 мкл плазмы, содержащей гемоглобин в концентрации 13,3 мкМ, и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В контрольную кювету - те же компоненты за исключением того, что вместо плазмы вносили 60 мкл фосфат-цитратного буфера. Общий объем образца - 0,8 мл. Растворы в кюветах тщательно перемешивали и одновременно в две кюветы добавляли раствор пероксида водорода (1 мМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и регистрировали оптическую плотность в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин. Предлагаемым способом была измерена пероксидазная активность гемоглобина в плазме при различных значениях рН: 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 и 7,0, что достигалось путем использования фосфат-цитратного буфера с указанными значениями рН.
Пероксидазная активность гемоглобина в плазме рассчитывалась согласно формуле:
Hb
где ΔD и ΔD - прирост оптической плотности за t мин в присутствии и в отсутствие добавленного извне гемоглобина соответственно;
0,8 - объем реакционной смеси (мл);
0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл).
Результаты измерений приведены на фиг.1, откуда следует, что зависимость пероксидазной активности гемоглобина в плазме от рН имеет максимум в диапазоне рН 4,5-5,5. Однако ранее было показано, что зависимость активности МПО от рН носит экстремальный характер с максимумом при рН 4,5 и значительно снижается при рН 5,5. Поэтому анализ данных, приведенных на фиг.1, позволяет сделать вывод о том, что значение рН 5,5 оптимально для измерения активности гемоглобина в плазме с миминальным вкладом активности МПО.
Пример 2, демонстрирующий выбор оптимальной концентрации пероксида водорода при определении пероксидазной активности гемоглобина в плазме.
Определение пероксидазной активности гемоглобина плазмы проводили, как описано в примере 1, но при различных концентрациях пероксида водорода в диапазоне 100-4000 мкМ. Используемый фосфат-цитратный буфер имел значение рН 5,5.
2
2
Результаты определения активности гемоглобина при разных добавках пероксида водорода приведены на фиг.2, откуда следует, что пероксидазная активность гемоглобина в плазме практически линейно увеличивалась с ростом концентрации HO вплоть до 2 мМ. Анализ этих данных позволяет сделать вывод о том, что концентрация пероксида водорода, равная 2 мМ, оптимальна для определения пероксидазной активности гемоглобина.
Пример 3. Предлагаемым способом измерена активность гемоглобина в плазме крови 5 человек.
2
4
В одну опытную кювету вносили 60 мкл плазмы, фосфат-цитратный буфер (0,05 М NaHPO/0,025 М), (рН 5,5), гидразид 4-аминобензойной кислоты в концентрации 50 мкМ и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В контрольную кювету - те же компоненты за исключением того, что вместо плазмы вносили 60 мкл фосфат-цитратного буфера. Содержание кювет тщательно перемешивали и одновременно в две кюветы добавляли раствор пероксида водорода (2 мМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и начинали регистрацию плотности в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в течение 8-10 мин.
Пероксидазная активность гемоглобина в плазме рассчитывалась согласно формуле:
где ΔD - прирост оптической плотности плазмы крови за t мин;
0,8 - объем реакционной смеси (мл);
0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл).
Полученные результаты приведены в таблице.
Таблица
Показатель пероксидазной активности гемоглобина в плазме
Номер образца
ПА<sub>Hb</sub>, усл. ед.
1
0,855
2
0,789
3
6,776
4
0,461
5
5,263
Анализ данных, приведенных в таблице, позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ пригоден для определения пероксидазной активности гемоглобина в плазме крови.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и реально определить пероксидазную активность гемоглобина в плазме крови.
Источники информации
1. Патент BY №13675, G01N 33/48, 30.10.2010.
2. Waugh W.H. (2003) J. Pediatr. Hematol. Oncol, 25, 831-834.