СПОСОБ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ПСИХОСОМАТИЧЕСКИХ ФУНКЦИЙ У ПАЦИЕНТОВ С ДИСЦИРКУЛЯТОРНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИЕЙ
MOLECULAR DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR PSYCHOSOMATIC FUNCTION STATE IN PATIENTS WITH DISCIRCULATORY ENCEPHALOPATHY

Изобретение относится к области медицины, в частности к способам определения состояния психосоматических функций у мужчин и женщин с нарушениями мозгового кровообращения, и может быть использовано для повышения точности и надежности молекулярной диагностики хронической формы цереброваскулярных заболеваний, а именно дисциркуляторной энцефалопатии.
В структуре хронических заболеваний человека высокий удельный вес занимают сосудистые заболевания головного мозга, которые являются одной из основных причин летальности и стойкой утраты трудоспособности населения как в Российской Федерации, так и во всем мире. Исключительно широкое распространение имеют хронические расстройства мозгового кровообращения. В отечественной классификации такие состояния описываются как дисциркуляторная энцефалопатия (ДЭ) [Шмидт Е.В., 1985], под которой подразумевается медленно прогрессирующая недостаточность мозгового кровоснабжения, приводящая к развитию множественных мелкоочаговых некрозов мозговой ткани, проявляющаяся постепенно нарастающими дефектами функций мозга. ДЭ может быть вызвана повторными эпизодами дисциркуляции (острое нарушение мозгового кровообращения - ОНМК) или устойчивой длительной недостаточностью мозгового кровообращения. Клиническими признаками ДЭ является выраженная психосоматическая симптоматика, которая проявляется неврологическими, эмоциональными, когнитивными (интеллектуальными), психическими нарушениями [Скоромец А.А., Скоромец А.П., 2005]. Психосоматические и психоэмоциональные нарушения обусловливают снижение работоспособности и качества жизни пациентов, а в ряде случаев приводят к возникновению нервно-психической патологии [Александер Ф., 2002; Вишневская В.П., 2004].
Известен способ оценки степени тяжести (выраженности) энцефалопатии, развившейся на фоне тяжелого сепсиса, заключающийся в измерении в сыворотке крови пациентов концентрации маркера повреждения нервной ткани белка S100B (Piazza О, Russo Е, Cotena S, Esposito G, Tufano R. Elevated S100B levels do not correlate with the severity of encephalopathy during sepsis. Br J Anaesth 2007; 99: 518-21). С целью установления взаимосвязи между концентрацией белка S100B и выраженностью энцефалопатии авторы измеряли содержание белка S100B, используя коммерческий набор для определения данного белка у 21 пациента с ДЭ и с выраженным сепсисом в сыворотке крови. Результаты показали, что у 14 пациентов с инфекцией выявлено повышенное содержание данного белка по сравнению с контрольной группой. Вместе с тем, известный способ обладает существенными недостатками, поскольку однократное количественное определение в сыворотке крови концентрации белка S100B, как маркера повреждения нервной ткани, не позволяет установить прямую корреляцию между содержанием S100B и степенью выраженности энцефалопатии; кроме того, применение одиночного биомаркера в данном способе не позволяет оценить функциональное состояние как нервной системы, так и других регуляторных систем организма и, тем самым, предоставить надежный прогноз дальнейшего развития заболевания.
2+
2+
Современные представления о патогенезе ДЭ подчеркивают ключевую роль нарушений микроциркуляции и клеточных процессов в нервной ткани, сопряженных с недостаточностью трофического обеспечения нейронов, а также и развитием аутоиммунных реакций к нейротропным антигенам при ишемии мозга (Гусев Е.И., Скворцова В.И. 2001, Верещагин Н.В. и др. 2003, Яхно Н.Н. и др. 2000, Carlson et.al., 1994, Emery et.al., 1997, Williams et.al., 2004). Имеются убедительные данные об участии в молекулярных патогенетических механизмах цереброваскулярных заболеваний белковых факторов, регулирующих выживаемость и гибель эндотелиальных, нервных и глиальных клеток. К числу таких молекулярных факторов, наиболее перспективных в качестве прогностических и диагностических индикаторов (биомаркеров) ДЭ, являются следующие белки - Са и Zn -связывающий нейротрофический фактор S100B и фактор дифференцировки клеток HLDF (human leuchemia differentiation factor), а также идиотипические (первичные) и антиидиотипические (вторичные) аутоантитела к ним, также выступающие в качестве регуляторов процессов развития и гибели клеток нервной, сердечно-сосудистой систем и иммунной систем. С учетом сказанного, задача, решаемая созданием предлагаемого способа молекулярной диагностики, состоит в устранении недостатков известного способа, при этом технический результат, достигаемый при решении такой задачи, состоит в повышении специфичности, точности, чувствительности и надежности способа молекулярной диагностики психосотатической симптоматики дисциркуляцнонной энцефалопатии посредством применения высокочувствительных иммуноферментных тест-систем для детекции нанограмовых количеств белков S100b и HLDF.
Поставленный результат в заявленном способе молекулярной диагностики состояния психосоматических функций у пациентов с дисциркуляторной энцефалопатией достигается посредством первоначального установления численных интервалов концентрации белков S100B и HLDF и титров первичных AT и вторичных антиидиотипических AT (AAT) к указанным белкам в сыворотке крови в зависимости от степени дисциркуляторной энцефалопатии, соответствующей определенному состоянию психосоматических функций, и последующем определении концентрации в сыворотке крови пациента белков S100B и HLDF, а также титров первичных AT и вторичных антиидиотипических AT (AAT) к указанным белкам, сравнении полученных результатов содержания с ранее установленными численными интервалами и определении состояния по результатам сравнения.
Возможность достижения поставленного результата в заявленном способе обусловлена в первую очередь тем, что используемые для диагностики показатели веществ (белки S100B и HLDF и титры AT и аu-АТ к таким белкам) отражают на молекулярном уровне функциональное состояние нервной, сосудистой и иммунной систем организма - определенные в качестве компонентов данной тест-системы белки участвуют в сопряженных физиологических процессах, связанных с процессами развития и гибели клеток нервной и сосудистой систем организма, а аутоантитела к ним отражают изменения в иммунной системе, сопровождающие развитие дисциркуляторной энцефалопатии. Проводимый согласно способу комплексный анализ определения концентрации в сыворотке крови пациента белков S100B и HLDF, а также уровня в виде титра тропных к ним идиотипических антител и комплиментарных им антиидиотипических антител обусловлен, в том числе, тем, что белок S100B является маркером повреждения нервной ткани, а HLDF (Human leukemia differentiation factor) -фактором дифференцировки клеток, в том числе эндотелия сосудов. Идио- и антиидиотипические антитела к обоим факторам являются не только индикаторами состояния иммунной системы при ДЭ, но и активными регуляторами молекулярных процессов, протекающих при ДЭ.
Белки HLDF, S100B, и ауто-антитела к ним определяли в сыворотке периферической крови, взятой из кубитальной вены по стандартной методике в условиях асептики. Образцы крови центрифугировали при 3000 об/мин, сыворотку отбирали, аликвотировали и хранили при -80°С до проведения исследования.
Для определения содержания белка S100B во все лунки полистиролового 96-луночного планшета вносили в 6-ти повторностях в объеме 100 мкл образцы исследуемых сывороток пациентов с ДЭ и контрольной группы, разведенные в 10 раз 0,1М бикарбонатным буфером (рН 8,7). В отдельные ряды лунок вносили в том же объеме стандартные пробы с известной концентрацией S100B в диапазоне от 5 нг/мл до 500 нг/мл, приготовленные на основе лиофилизованного коммерческого препарата белка S100B. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С. Отмывали 3 раза трис-НСl-буфером с твином-20 (рН 7,5) и 2 раза дистиллированной водой (рН=5,5). На следующем этапе добавляли раствор кроличьих моноспецифических поликлональных антител к белку S100B с рабочим титром 1:500. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С. Отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН=7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН 6,0). Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора антител козы против IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена в рабочем титре 1:1000. Проводили инкубацию в течение 2-х часов при температуре +37° C. Отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН=7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН 6,0). Затем вносили во все лунки по 100 мкл 0,05% раствора тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратном буфере, содержащего 0,01% перекись водорода (субстратная смесь, рН 6,0). Ферментативную реакцию проводили в отсутствие освещения при комнатной температуре в течение 30 минут. Останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл 0,5N серной кислоты и измеряли оптическую плотность содержимого лунок при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан», Россия.
Содержание S100B определяли по калибровочному графику, представляющему собой зависимость оптической плотности раствора субстрата после окончания ферментативной реакции от стандартных концентраций белка S100B в диапазоне от 5 нг/мл до 500 нг/мл.
Для определения содержания белка HLDF во все лунки полистиролового планшета вносили раствор антител крысы к белку HLDF, Проводили инкубацию, после чего планшет отмывали и неспецифическое связывание антител с полистирольным покрытием блокировали. Отмывали планшет и вносили в лунки сыворотки обследуемых пациентов. В отдельные ряды лунок вносили стандартные пробы с известной концентрацией HLDF. Проводили инкубацию и отмывали, после чего вносили во все лунки раствор антител кролика к белку HLDF. Отмывали и вносили в лунки раствор антител козы против IgG кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена. Проводили инкубацию и отмывали последующим внесением во все лунки раствора 3,3'5'- тетраметилбензидина гидрохлорида (ТМБ), содержащего перекись водорода, в цитратном буфере. Ферментативную реакцию проводили в отсутствие освещения при комнатной температуре. Останавливали реакцию добавлением в каждую лунку серной кислоты и измеряли оптическую плотность содержимого лунок при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан», Россия.
Содержание HLDF определяли по калибровочному графику, представляющему собой зависимость оптической плотности раствора субстрата после окончания ферментативной реакции от стандартных концентраций белка HLDF. Для определения титра AT к белку S100B во все лунки полистиролового 96-луночного планшета вносили по 100 мкл раствора белка S100B в 0,1М бикарбонатном буфере (рН 8,7) с концентрацией 12,5 мкг/мл. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С, после чего планшет отмывали 3 раза трис-НСl-буфером с твином (рН 7,5) и 2 раза дистиллированной водой (рН=6,0). Неспецифическое связывание белков с полистирольным покрытием блокировали добавлением в каждую лунку по 100 мкл 1%-ного раствора БСА с последующей инкубацией в течение 2-х часов при комнатной температуре. На следующем этапе проводили титрование исследуемых образцов сыворотки. Для этого во все ряды, кроме первого, вносили по 100 мкл трис-НСl-буфера с твином-20 (рН 7,5). Затем в лунки первого ряда (кроме контрольной) помещали по 200 мкл разведенных в 100 раз тем же буфером образцов сыворотки. Многоканальной пипеткой переносили по 100 мкл исходного образца из первого во второй ряд, перемешивали с помощью пипетирования, переносили 100 мкл в третий ряд и так далее до последнего ряда. 100 мкл из последнего ряда сбрасывали в дезинфицирующий раствор. Таким образом получали последовательное разведение исследуемых сывороток от 1:100 до 1:12800. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С, после чего планшет отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН 7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН 5,5). Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора антител овцы против IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена с рабочим титром 1:6000. Проводили инкубацию в течение 2-х часов при температуре +37°С. Отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН=7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН 6,0). Затем вносили во все лунки по 100 мкл 0,05% раствора ТМБ в цитратном буфере, содержащего 0,01% перекись водорода (рН 6,0). Ферментативную реакцию проводили в отсутствие освещения при комнатной температуре в течение 30 минут. Останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл 0,5N серной кислоты и измеряли оптическую плотность содержимого лунок против оптической плотности контрольной лунки при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан». Результат выражали в титрах - максимальное разведение сыворотки, при котором регистрировалась оптическая плотность, превышающая таковую в контрольной лунке.
Для определения титра AT к белку HLDF во все лунки полистиролового 96-луночного планшета вносили по 100 мкл раствора белка HLDF в 0,1М бикарбонатном буфере (рН 8,7) с концентрацией 12,5 мкг/мл. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С, после чего планшет отмывали 3 раза трис-НСl-буфером с твином (рН 7,5) и 2 раза дистиллированной водой (рН 6,0). Неспецифическое связывание белков с полистирольным покрытием блокировали добавлением в каждую лунку по 100 мкл 1%-ного раствора БСА с последующей инкубацией в течение 2-х часов при комнатной температуре. На следующем этапе проводили титрование исследуемых образцов сыворотки. Для этого во все ряды, кроме первого, вносили по 100 мкл трис-НСl-буфера с твином-20 (рН 7,5). Затем в лунки первого ряда (кроме контрольной) помещали по 200 мкл разведенных в 100 раз тем же буфером образцов сыворотки. Многоканальной пипеткой переносили по 100 мкл исходного образца из первого во второй ряд, перемешивали пипетированием, переносили 100 мкл в третий ряд и так далее до последнего ряда. 100 мкл из последнего ряда сбрасывали в дезинфицирующий раствор. Таким образом получали последовательное разведение исследуемых сывороток от 1:100 до 1:12800. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С, после чего планшет отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН 7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН 6,0). Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора антител овцы против IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена с рабочим титром 1:6000. Проводили инкубацию в течение 2-х часов при температуре +37°C. Отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН 7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН 6,0) Затем вносили во все лунки по 100 мкл 0,05% раствора ТМБ в цитратном буфере, содержащего 0,01% перекись водорода (рН=6,0). Ферментативную реакцию проводили в отсутствие освещения при комнатной температуре в течение 30 минут. Останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл 0,5N серной кислоты и измеряли оптическую плотность содержимого лунок против оптической плотности контрольной лунки при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан»,Россия. Результаты выражали в титрах - максимальное разведение сыворотки, при котором регистрировалась оптическая плотность, превышающая таковую в контрольной лунке и неизменяющаяся при последующих разведениях.
Для определения титра аu-АТ к белку S100B во все лунки полистиролового 96-луночного планшета вносили по 100 мкл раствора моноспецифических поликлональных AT кролика к белку S100B в 0,1М бикарбонатном буфере (рН 8,7) с концентрацией 12,5 мкг/мл. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С, после чего планшет отмывали 3 раза трис-НСl-буфером с твином (рН 7,5) и 2 раза дистиллированной водой (рН 6,0). Неспецифическое связывание белков с полистирольным покрытием блокировали добавлением в каждую лунку по 100 мкл 1%-ного раствора БСА с последующей инкубацией в течение 2-х часов при комнатной температуре. На следующем этапе проводили титрование исследуемых образцов сыворотки. Для этого во все ряды, кроме первого, вносили по 100 мкл трис-НСl-буфера с твином-20 (рН 7,5). Затем в лунки первого ряда (кроме контрольной) помещали по 200 мкл разведенных в 100 раз тем же буфером образцов сыворотки. Многоканальной пипеткой переносили по 100 мкл исходного образца из первого во второй ряд, перемешивали пипетированием, переносили 100 мкл в третий ряд и так далее до последнего ряда. 100 мкл из последнего ряда сбрасывали в дезинфицирующий раствор. Таким образом, получали последовательное разведение исследуемых сывороток от 1:100 до 1:12800. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С, после чего планшет отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН=7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН 5,5). Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора антител овцы против IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена с рабочим титром 1:6000. Проводили инкубацию в течение 2-х часов при температуре +37°С.Отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН 7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН 5,5). Затем вносили во все лунки по 100 мкл 0,05% раствора ТМБ в цитратном буфере, содержащего 0,01% перекись водорода (рН 6,0). Ферментативную реакцию проводили в отсутствие освещения при комнатной температуре в течение 30 минут. Останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл 0,5N серной кислоты и измеряли оптическую плотность содержимого лунок против оптической плотности контрольной лунки при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан», Россия. Результаты выражали в титрах - максимальное разведение сыворотки, при котором регистрировалась оптическая плотность, превышающая таковую в контрольной лунке и неизменяющаяся при последующих разведениях.
Для определения титра аu-АТ к белку HLDF во все лунки полистиролового 96-луночного планшета вносили по 100 мкл раствора моноспецифических поликлональных AT кролика к белку HLDF в 0,1М бикарбонатном буфере (рН 8,7) с концентрацией 12,5 мкг/мл. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С, после чего планшет отмывали 3 раза трис-НСl-буфером с твином (рН 7,5) и 2 раза дистиллированной водой (рН 6,0). Неспецифическое связывание белков с полистирольным покрытием блокировали добавлением в каждую лунку по 100 мкл 1%-ного раствора БСА с последующей инкубацией в течение 2-х часов при комнатной температуре. На следующем этапе проводили титрование исследуемых образцов сыворотки. Для этого во все ряды, кроме первого, вносили по 100 мкл трис-НСl-буфера с твином-20 (рН 7,5). Затем в лунки первого ряда (кроме контрольной) помещали по 200 мкл разведенных в 100 раз тем же буфером образцов сыворотки. Многоканальной пипеткой переносили по 100 мкл исходного образца из первого во второй ряд, перемешивали пилотированием, переносили 100 мкл в третий ряд и так далее до последнего ряда. 100 мкл из последнего ряда сбрасывали в дезинфицирующий раствор. Таким образом получали последовательное разведение исследуемых сывороток от 1:100 до 1:12800. Проводили инкубацию в течение 16 часов при температуре +4°С, после чего планшет отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН 7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН 6,0). Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл раствора антител овцы против IgG человека, конъюгированных с пероксидазой хрена с рабочим титром 1:6000. Проводили инкубацию в течение 2-х часов при температуре +37°С. Отмывали 6 раз трис-НСl-буфером с Твином-20 (рН 7,5) и 3 раза дистиллированной водой (рН=6,0). Затем вносили во все лунки по 100 мкл 0,05% раствора ТМБ в цитратном буфере, содержащего 0,01% перекись водорода (рН 6,0). Ферментативную реакцию проводили в отсутствие освещения при комнатной температуре в течение 30 минут. Останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл 0,5N серной кислоты и измеряли оптическую плотность содержимого лунок против оптической плотности контрольной лунки при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан». Результат выражали в титрах - максимальное разведение сыворотки, при котором регистрировалась оптическая плотность, превышающая таковую в контрольной лунке.
Для подтверждения возможности реализации способа было обследовано 164 пациента - 64% женщин и 46% мужчин с дисциркуляторной энцефалопатией (ДЭ) различной степени тяжести, в анамнезе которых присутствовала гипертоническая болезнь различной степени. Из указанного количества доли пациентов с ДЭ различных степеней распределились следующим образом: ДЭ 1 ст.- 45 человек, ДЭ 2 ст.- 48 человек, ДЭ 3 ст.-40 человек. Средний возраст больных составил 63,2±10,8 лет. Для сравнительного анализа были выделены две группы пациентов сопоставимого возраста: пациенты (п=31) с начальными проявлениями нарушений мозгового кровообращения и условно здоровые люди (п=26) без неврологической симптоматики и диагносцируемой гипертонической болезнью. Больных отбирали посредством методики стратифицированной рандомизации с применением критериев исключения: нейродегенеративные заболевания, нарушение когнитивных функций вследствие травмы головного мозга; эпилепсия или клинически значимые психические заболевания; инфекции; опухоли головного мозга; гемодинамически значимые стенозы брахиоцефальных артерий; хронические заболевания с печеночной, почечной и легочной недостаточностью; инсульт; сахарный диабет.
Всем пациентам проводили стандартное терапевтическое, неврологическое, инструментальное исследования, нейрофункциональное и нейровизуализационные исследования. Проводили оценку степени выраженности и стадии развития цереброваскулярного заболевания в соответствии с классификацией сосудистых поражений головного мозга Е.В.Шмидта (1985) в модифицированном варианте (Одинак М.М. и др., 1997). При анализе ДЭ учитывали длительность заболевания, обычные средние значения артериального давления (АД), степень подъема и суточный профиль АД, наличие и регулярность терапии, систематичность контроля АД, изменение самочувствия пациентов в процессе приема препаратов. Всем больным проводили клинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи. Определение содержания S100B и HLDF и антител в сыворотке крови проводили методом иммуноферментного анализа.
Основной подход к анализу данных заключался в выделении групп пациентов по качественным (отражающим условную степень выраженности какого-либо признака) или количественным группирующим признакам. На первом этапе группы выделялись по таким порядковым качественным признакам, как степень энцефалопатии, степень гипертонической болезни, выраженность субъективных симптомов и объективных клинических показателей. Проводили сравнение групп с целью выявления различий в содержании белка S100B, титра AT к белку S100B (AS 100 В), титра au -AT к белку S100B (AAS100B), белка HLDF, титра AT к белку HLDF (AHLDF), титра аu-АТ к белку (AAHLDF).
На втором этапе анализа в качестве группирующих признаков использовали содержание белков и антител к ним в крови. Произвели разбивку областей значений данных количественных признаков на интервалы. Выделение интервалов значений содержания белков в сыворотке крови проводили на основании анализа гистограмм с учетом относительно равномерного распределения пациентов в группах. Выделение групп пациентов, различающихся по титрам антител, проводили с учетом дискретного характера значений, группируя вокруг наиболее часто встречающихся (100, 200, 400, 800, 1600, 3200 и более). Выделенные группы сравнивали по значениям клинических показателей.
Полученные данные позволяли однозначно установить, что, в частности, зависимость между степенью энцефалопатии с определенным психосоматическим состоянием и содержанием белка S100B имеет нелинейный характер. Меньшая степень энцефалопатии как интегральной характеристики и меньшая выраженность ряда симптомов, в том числе психосоматические (умеренные когнитивные нарушения лобно-подкоркового характера, такие как нарушения памяти, внимания, познавательной активности) наблюдаются в группе пациентов с содержанием белка S100B от 4,8 до 12,0 нг/мл. Анализ подтвердил наличие обратной линейной взаимосвязи между степенью энцефалопатии и титром AT к белку S100B. Так, наиболее характерные диапазоны значений титра AT к белку S100B для пациентов без энцефалопатии составили от 3200 до 12800, с энцефалопатией 3-й степени с когнитивными нарушениями, достигающими степени умеренной или тяжелой деменции и сопровождающимися грубыми аффективными и поведенческими нарушениями (грубым снижением критики, апатико-абулическим синдромом, расторможенностью, эксплозивностью) до 150.