СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА
DRUG FOR PREVENTION AND TREATMENT OF DIABETES

Область изобретения
Изобретение относится к области медицины, в частности к фармакологии, и касается средства для предупреждения и лечения диабета.
Уровень техники
Сахарный диабет (лат.diabetes mellltus) - группа эндокринных заболеваний, развивающихся вследствие абсолютной или относительной (нарушение взаимодействия с клетками-мишенями) недостаточности гормона инсулина, в результате чего развивается гипергликемия - стойкое увеличение содержания глюкозы в крови. Заболевание характеризуется хроническим течением и нарушением всех видов обмена веществ: углеводного, жирового, белкового, минерального и водно-солевого. Сахарный диабет (СД) относится к числу основных причин смертности населения в большинстве стран мира. Темпы нарастания распространенности этого заболевания носят угрожающий характер. По оценкам ВОЗ в настоящее время диабетом страдает более 180 млн, а по статистике, приводимой Shaw J.Е., 220 млн человек во всем мире страдают данной патологией [А.А. Спасов. и соавт.//Экстр, и клин. Фармакол. 2011. 74 (11), 14-6]. Прогнозируется, что к 2030 этот показатель удвоится [J.Е. Shaw, R.A. Sicree and P.Z. Zimmet // Diabetes Research and Clinical Practice., 2011, V.87. №1, P.4-14]. Число больных диабетом в России по данным официальной статистики с показателя 8 миллионов в 1994 г. возрастет к 2020 г. до 18 млн.
2
От 80 до 90% случаев сахарного диабета приходится на долю диабета 2-го типа. Диабет 2-го типа - многофакторное заболевание, при котором нарушается взаимодействи инсулина с клетками тканей организма (инсулинорезистентность) как следствие уменьшения количества специфических рецепторов для инсулина, изменения структуры самого инсулина или нарушения внутриклеточных механизмов передачи сигнала от рецепторов органеллам клетки. Помимо накопления глюкозы и продуктов неэнзиматического гликирования протеинов характеризуется изменениями сигнальной трансдукции, активацией протеинкиназы С, инициирующей каскад интрацеллюлярных стресс реакций [Sarsour EH, Kumar MG, Chaudhuri L, et al. Antioxid Redox Signal. 2009; 11(12):2985-3011]. Образующиеся свободные радикалы: перекисные (RO*), алкоксильные (RO*), алкильные (R*), супероксиданионы, синглетный кислород и цитотоксические пероксинитриты вступают в реакцию с фосфолипидами клеточных мембран, что ведет к нарушению их проницаемости и потере эластических свойств, повреждению протеинов, липидов и нуклеиновых кислот и фрагментации ДНК [Р. Packer, I.G Obrosova, J.G. Mabley et al. //Emerging New Therapeutical Strategies Curr Med Chem. 2005. 12(3): 267-275]. Важную роль в дифференцировке и поддержании функционирования бета-клеток поджелудочной железы играет NGF. Бета-клетки поджелудочной железы синтезируют и секретируют NGF, который путем аутокринной регуляции стимулирует секрецию инсулина. Дефицит нейротрофических факторов является одним из важных причин замедленной пролиферации β-клеток при диабете [J.H. Nielsen, E.D. Galsgaard. A. Mmldrup et al. // Diabetes. Feb-, 50 Suppi I. - S25-9. (2001); LudwigBetal. Proc Nati Acad Sci USA. 2010 July 13; 107(28): 12623-12628].
Первостепенной метаболической характеристикой диабета является дефицит системы инкретинов - гормонов желудочно-кишечного тракта: глюкагоно-подобного пептида1(GLP-1) и глюкозо-зависимого инсулинотропного полипептида (GIP), усиливающие секрецию инсулина β-клетками. Функция инкретинов не ограничивается способностью повышать уровень циркулирующего инсулина. Они оказывают также выраженный нейротрофический эффект, повышая выживаемость и пролиферацию β-клеток [Trumper A., Trumper К., Trushheim H. et al. //Molecular Endocrinology 2001. Vol.15, №9, P. 1559-1570]. Поскольку данные пептиды имеют низкую биологическую устойчивость и их невозможно использовать в качестве препаратов для лечения диабета, предложено применять их пептидомиметики либо ингибиторы фермента, осуществляющего их гидролиз - дипептидил пептидазы 4 (ДПП-4) [Lotfy M., Singh J., Kalasz H et al. // Open Medicinal Chemistry Journal 2011. Vol.5. P.82-92].
Таким образом, диабет является заболеванием, характеризующимся сложнейшим многофакторным патогенезом, что определяет целесообразность направленного воздействия на его течение с помощью мультипотентной фармакологической защиты. Одним из препаратов такого рода может явиться Афобазол.
Афобазол {5-этокси 2-[2-(морфолино) этилтио]- бензимидазола дигидрохлорид}-оригинальный селективный анксиолитик, разработанный и внедренный в медицинскую практику в ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН.
-9
-4
-6
Помимо анксиолитического, афобазол обладает антирадикальными свойствами, что установлено в бесклеточной системе с перекисью водорода и пероксидазой хрена и в суспензии фагоцитов перитонеального экссудата активированных поликатионом-протамином в диапазоне концентраций 10 до 10 М, с максимальным эффектом в концентрации 10 M, а также ингибирует активность нейрональной NO-синтазы [Середенин С.Б., Воронина Т.А., Незнамов Г.Г. и др. Вестник РАМН. - 1998.- №11. - С.3-9; Баласанян М.Г. // Медицинская наука Армении. - 2002. - т.X/LII, N3. - C.25-30].
-8
-8
Исследование эффектов Афобазола на моделях окислительного стресса и глутаматной токсичности in vitro выявило протекторное действие афобазола (10 М) по показателю выживаемости клеток линии НТ-22 (иммортализованные клетки гиппокампа мыши). Также установлено, что афобазол в конечной концентрации 10 М препятствует гиперактивации каспазы-3 [Антипова Т.А., Сапожникова Д.С., Степаничев М.Ю., Онуфриев М.В., Гуляева Н.В., Середенин С.Б. Бюлл. Эксперим. Биол. и мед.2010, т.149, №2, с.161-165], которая рассматривается как один из основных этапов развития апоптотического каскада [Nicholson D.W., Thornberry N.A. II Trends Biochem Sci. - 1997. -V.22. - P.299-306].
1-
3-
1
3
-6
-6
2+
Афобазол взаимодействует с sigma-1, MT, МТ и МАО-А-рецепторами. Установлено, что при вытеснении из мест связывания агониста σ-рецепторов [H](+)-пентазоцина в концентрации 8 нМ величины IC50, Ki и nМ для афобазола составляют 7.1×10 М, 5.9×10 М и 0,9 соответственно [Середенин С.Б., Воронин М.В. (2009) Эксперимент, и клин. Фармакология 2009, 72 (1). с.3-11]. За счет белок-белковых взаимодействий sigma-1 рецептора происходит активация фосфолипазы С, каскада IP3 и диацилглицерола, что в конечном итоге определяет состояние Са зависимых процессов [Vagnerova, К., et al. Anesth Analg, 2006. 103(2): p.430-4]. Инициированный взаимодействием с афобазолом транспорт sigma-1 рецептора в область наружной мембраны может способствовать восстановлению фосфолипидного состава клеточных мембран, который, как известно, нарушается при патологических процессах в результате усиления перекисных реакций [Halliwell, В., Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? J Neurochem, 2006. 97(6): p.1634-58].
-8
-8
-5
Известно, что лиганды sigma-1 рецепторов опосредованно влияют на содержание мозгового нейротрофического фактора BDNF [D. Navaratna,1 S.Guo, К.Hayakawa et al., Diabetes 60:1789-1796, 2011] и фактора роста нервов NGF [Y. Yagasaki, Т. Numakawa et al., J. Biol. Chem. 281 (18), 12941-12049 (2006)]. Показано, что гиперэкспрессия сигма-1 рецепторов усиливает NGF-индуцированный рост нейритов клеток PC 12 [М Takehayashi, Т. Hayashi, T-P Su. J. Hharmacol. Exp.Ther., 303 (3), 1227-1227 (2002)]. В связи с этим важно подчеркнуть, что в опытах на культуре иммортализованных клеток гиппокампа линии НТ-22 была выявлена способность афобазола (10 М) увеличивать содержание NGF, а в конечных концентрациях 10-10 М увеличивать содержание BDNF [Антипова Т.А., Сапожникова Д.С., Бахтина Л.Ю., Середенин С.Б. Экспер. и клинич. Фармакология. 2009, т.72, №1, с.12-14].
В процессе изучения фармакокинетики и метаболизма афобазола методами высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией установлено, что одним из основных продуктов его биотрансформации является 2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио]-5-этоксибензимидазол [С.Б. Середенин, А.О. Виглинская, Т.Я. Можаева, Г.Б. Колыванов, А.А. Литвин, Н.И. Авдюнина, В.Л. Савельев, В.П. Жердев // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - Т. 71. - №2. - С.50-52], представленный в настоящей работе как соединение М-11 [Патент Российской Федерации на изобретение № 2373202. Замещенные 2-[2-(3-оксоморфолин-4-ил)этилтио-бензимидазолы, обладающие анксиолитической активностью. Середенин С.Б., Можаееа Т.Я., Виглинская А.О., Яркова М.А., Колыванов Г.Б., Жердев В.П., Литвинов А.А.// Бюллетень изобретений - №12 - 27.04.2009].
3
3
Афобазол и соединение М-11 являются лигандами мелатониновых рецепторов 3 типа (МТ) [Середенин С.Б., Воронин М.В. // Эксп. клин. фармакол. - 2009. -№1. - С.3-11]. Хотя физиологическая роль МТ рецепторов на сегодняшний день еще недостаточно выяснена, уже установлена их идентичность регуляторному участку фермента хинонредуктазы-2 - важнейшему компоненту естественной антиоксидантной системы организма, катализирующего процессы детоксикации высокореактивных хинонов и предохраняющего клетки от патологического воздействия свободных радикалов [Nosjean О., Fen-o M, Coge F. et al. // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol.275. - P.31311-31317].
Согласно современным представлениям, основу метаболической патологии при диабете 2 типа составляют нарушение функции митохондриального аппарата и эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы [J. Leemand and E. H. Koh Experimental Diabetes Research Volume 2012, Article ID 242984]. Способность афобазола воздействовать на систему шаперонов эндоплазматического ретикулума посредством взаимодействия с sigma-1 рецептором, препятствовать развитию окислительного стресса, активизировать систему нейротрофинов и таким образом восстанавливать функцию митохондриального аппарата позволяла предположить наличие у препарата антидиабетических свойств. В литературе мы не нашли прямых указаний на наличие у сигма-миметиков антидиабетического эффекта, хотя существуют некоторые косвенные указания на целесообразность изучения этого вопроса. Так имеются сообщения о способности агониста sigma-1 рецептора, (+)- пентазоцина повышать выживаемость ганглионарных клеток сетчатки у мышей на стрептозотоциновой модели диабета [Smith SB, DuplantierJ, Dun Y, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008: 49:4154-61] и о усиленной гибели нейронов у мышей, нокаутированных по sigma рецептору [Т.А. Mavlyutov, R.W. Nickells, L.W. Guo Molecular Vision 2011; 17:1034-1043]. Серия новых агонистов sigma рецепторов заявлена как средство для лечения диабетической нейропатии [Helmut H. Buschmann J. Patent application title: Use of compounds binding to the sigma receptor/or the treatment of diabetes-associated pain Publication date: 2009-12-31 Patent application number: 20090325975]. Данных о гипогликемических эффектах sigma-миметиков нами в литературе не обнаружено.
Сущность изобретения
Сущность изобретения состоит в применении афобазола и его основного метаболита в качестве антидиабетического средства.
Цель была достигнута изучением их эффекта в экспериментах in vivo на стрептозотоциновой модели диабета и экспериментах in vitro на плазме и очищенной ДПП-4.
Техническим результатом изобретения являются сахароснижающий и улучшающий толерантность к глюкозе эффекты афобазола и его основного метаболита М-11.
Diabet Med
Известно, что в эксперименте развитие гипергликемии удается воспроизвести введением диабетогенных токсинов аллоксана и стрептозотоцина, оказывающих прямое цитотоксическое действие на р-клетки поджелудочной железы. Преимущество стрептозотоцина состоит в относительно более высокой метаболической устойчивости, большей длительности гипергликемии, менее выраженном ацидозе и летальности экспериментальных животных [Т. Szkudelski. //Minireview Physiol. Res. 50: 536-546, 2001]. Стрептозотоцин - аклилирующее соединение, производное нитрозомочевины, которое способствует генерации свободных радикалов; алкилирует ДНК, активирует поли-АДФ-рибозосинтетазу, подавляет синтез ДНК и пролиферацию р-клеток; угнетает активный транспорт кальция и кальмодулин-активированную протеинкиназу [D.A. Rees //  2005. Apr; 22(4):359-70]. Учитывая данные о свойствах афобазола как сигма-миметика особый интерес представляет тот факт, что СТЗ снижает плотность сигма-рецепторов мозга крыс [Mardon К., Kassiou M., Donald A. Life Sci. 1999, 65 (23), 281-286].
00
00
Опыты были проведены на полученных из питомника «Столбовая» РАМН самцах белых крыс Вистар массой 210-240 г (в начале эксперимента). Животных содержали в условиях вивария ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по 10 особей в клетке при свободном доступе к стандартизированному корму и воде (за исключением 12 часов, предшествовавших введению СТЗ, когда корм удаляли). Исследования проводили с 10 до 14. Соблюдались этические правила гуманного обращения с животными, изложенные в директивах Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС.
Результаты, полученные в этих экспериментах, иллюстрируются следующими примерами.
Пример 1. Эффект Афобазола при внутрибрюшинном введении на модели развивающегося диабета
Метаболические нарушения в инсулярном аппарате поджелудочной железы предшествуют клинической манифестации диабета, которая возникает только после гибели 80-90% инсулино-продуцирующих клеток. Этот факт диктует целесообразность поиска средств патогенетической терапии, направленных на предотвращение прогрессирования заболевания на его ранних этапах.
Динамика развития диабета 2 типа имитируется повторным введением стрептозотоцина (СТЗ) в малых дозах в экспериментах на крысах [В.И. Новиков, О.В. Молотов, А.П. Подчеко //Сахарный диабет. 1999. №2. С.37-39] и мышах [К. Srinivasan, Р. Ramarao // Indian J Med Res 2007. 125, 451-472]. Нами была применена модель повторного введения малых доз СТЗ на крысах.
Эксперименты выполнены на 3-х группах крыс (n=12 в каждой).
Группа 1 - ФР+ФР. Группа пассивного контроля. Крысам физиологический раствор (ФР) вводился в/бр (0.1 мл/100 г массы тела) в течение 18 дней.
Группа 2 - ФР+СТЗ. Группа активного контроля. Крысам вводили СТЗ в/бр в дозе 30 мг/кг в течение первых 3-х дней эксперимента. За 5 минут до СТЗ вводили ФР в/бр; введение ФР продолжали в течение следующих 15 дней.
Группа 3 -Афобазол+СТЗ. Опытная группа, в которой СТЗ вводили в/бр в дозе 30 мг/кг в течение первых 3-х дней эксперимента. За 5 минут до СТЗ крысам вводили Афобазол в дозе 1 мг/кг в/бр; введение препарата продолжали после трехкратного введения СТЗ еще в течение следующих 15 дней.
Определение уровня глюкозы в крови, взятой из хвостовой вены крыс глюкометром One Touch Ultra (USA) проводили на 4-й (считая от дня первого введения СТЗ), затем на 12-й и 19-й день эксперимента. Наряду с определением базального (натощак) уровня глюкозы в крови, на крысах всех групп проводили пробу на толерантность к глюкозе, для чего ее вводили в/бр в дозе 1000 мг/кг; содержание глюкозы в крови определяли через 1 и 2 часа после нагрузки. Взвешивание животных проводилось каждые 3 дня.
При статистической обработке данных достоверность различий между группами по всем показателям определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (после предварительной оценки по критерию Крускалл-Уоллиса).
Сравнительную эффективность Афобазола при разных режимах введения оценивали, рассчитывая коэффициент антигипергликемической активности (Аг) по формуле:
Аг=(ФР+СТЗ) - (Препарат+СТЗ) / (ФР+СТЗ) - (ФР+ФР) × 100%,
где (ФР+СТЗ) - уровень глюкозы в крови в группе активного контроля;
(Препарат+СТЗ) - уровень глюкозы в крови в группах (Афобазол+СТЗ) или (М11+СТЗ);
(ФР+ФР) - уровень глюкозы в крови в группе пассивного контроля.
Если в группе пассивного контроля исходный уровень глюкозы составлял 4,9 ммоль/л, а при нагрузке через 1 и 2 часа достоверно не отличался от контрольного (5,3 и 5,1 ммоль/л соответственно), то в группе животных, которым вводился СТЗ (активный контроль) на следующий день после третьего введения СТЗ наблюдалось не только нарастание фонового уровня глюкозы (до 13,1 ммоль/л), но и снижение толерантности к глюкозе - через 1 час после нагрузки уровень глюкозы в крови составлял 16,1 ммоль/л, а через 2 часа - 15,4 ммоль/л. На 12-й день эксперимента фоновый уровень глюкозы начинал снижаться, но толерантность к глюкозе оставалась нарушенной; на 19-й день эксперимента в этой группе отмечалась полная нормализация фонового уровня при еще сниженной толерантности к глюкозной нагрузке (Таблица 1).
В группе крыс, которым Афобазол вводился в/бр, уже на следующий день после окончания введения СТЗ (4-й день эксперимента) отмечалось, во-первых, достоверное выраженное снижение показателя фонового уровня глюкозы (до 7,1 ммоль/л). Кроме того, Афобазол уже в начале эксперимента улучшал переносимость глюкозной нагрузки - уровень глюкозы в крови и через 1 час, и через 2 часа был достоверно ниже, чем в группе активного контроля (12,1 и 10,7 соответственно). Через 9 дней после окончания воздействия диабетогенного токсина (12-й день эксперимента), в группе крыс, леченых Афобазолом, содержание глюкозы в крови было достоверно ниже, чем в группе активного контроля, как для фоновой гликемии, так и для нагрузочной. При тестировании через 19 дней (15 дней после окончания введения токсина) в опытной группе имело место восстановление спонтанного уровня гликемии, хотя показатели толерантности в глюкозной нагрузке через 1 час после введения глюкозы еще не восстановились.
Табл.1
Влияние Афобазола, вводимого в/бр в дозе 1 мг/кг, на фоновый уровень глюкозы в крови крыс (ммоль/л) и показатели гипергликемии через 1 час и 2 часа после введения глюкозы (1000 мг/кг в/бр) на модели развивающегося диабета (введение СТЗ по 30 мг/кг в/бр в течение трех последовательных дней) (М±SM).
12-й день после введения СТЗ
19-й день после введения СТЗ*
Название группы
4-й день после введения СТЗ
пассив контроль ФР+ФР
фон
1 час
2 часа
фон
1 час
2 часа
фон
1 час
4,98±0,24
5,28±0,13
5,1±0,18
3,82±0,17
5,5±0,18
4,46±0,1
3,98±0,16
4,7±0,4
актив контроль ФР+СТЗ
13,1±2,16*
16,06±1,36*
15,41±1,96*
5,74±0,57*
10,63±1,13*
9,66±1,46*
4,98±0,33
9,63±0,53*
Опыт Афобазол+СТЗ
7,08±0,86#
12,06±1,72#
10,69±1,86#
4,47±0,64#
7,28±0,81#
5,77±0,75#
3,97±0,12#
8,48±1,17
Аг, %, Афобазол
74,14
37,12%
45,78%
66,15%
65,3%
74,81%
101.75%
28,33%
Достоверные различия (р<0,05) согласно непараметрическому критерию Mann-Whitney представлены как: * - достоверность различий между пассивным контролем (ФР) и активным контролем (СТЗ). # - достоверность различий между активным контролем (СТЗ) и афобазолом.
Как следует из приведенного примера, Афобазол в условиях внутрибрюшинного введения проявляет антигипергликемический эффект на модели развивающегося диабета. Этот эффект проявляется как в отношении фоновой гипергликемии, так и в отношении толерантности к глюкозной нагрузке.
Ранее подчеркивалась актуальность поиска средств патогенетической терапии, направленных на предотвращение прогрессирования заболевания на его ранних этапах. Очевидно, что для осуществления длительного применения препарата наиболее адекватным является пероральный путь его введения. Фармакокинетическими исследованиями показано, что афобазол при пероральном введении быстро поступает в кровь и паренхиматозные органы с образованием нескольких метаболитов, основным из которых является М-11 (Середенин С.Б., Вигчинская А.О., Колыванов Г.Б., Литвин А.А., Кравцова О.Ю., Жердев В.П. Эксп клин форм., 2007, т.70, N 2, 59-64. А.О. Виглинская, Д.В. Бастрыгин, Г.Б. Колыванов, А.А. Литвин, В.П. Жердев, Т.Я. Можаева //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - № 149. - С.294-295).
В связи с изложенным представляется целесообразным показать на используемой модели развивающегося диабета эффекты афобазола и соединения М-11 в условиях их перорального введения.
Пример 2. Эффект Афобазола при пероральном введении на модели развивающегося диабета
Дизайн эксперимента аналогичен таковому, описанному в примере 1, за тем исключением, что Афобазол вводился перорально в дозе 5 мг/кг.
Если в группе пассивного контроля исходный уровень глюкозы составлял 5,0 ммоль/л, а при нагрузке через 1 часа достоверно не отличался от контрольного (5,3 ммоль/л), то в группе животных, которым вводился СТЗ (активный контроль), на следующий день после третьего введения СТЗ отмечалось не только нарастание фонового уровня глюкозы (до 10,8 ммоль/л), но и снижение толерантности к глюкозе - через 1 час после нагрузки уровень глюкозы в крови составлял 17,2 ммоль/л, а через 2 часа - 17,9 ммоль/л. На 12-й день эксперимента фоновый уровень глюкозы начинал снижаться, но толерантность к глюкозе оставалась нарушенной; на 19-й день эксперимента в этой группе имела место нормализация фонового уровня при еще сниженной толерантности к глюкозной нагрузке (Табл.2).
Табл. 2
Влияние Афобазола, вводимого per os в дозе 5 мг/кг, на фоновый уровень глюкозы крови крыс (ммоль/л) и показатели гипергликемии через 1 час и 2 часа после введения глюкозы (1000 мг/кг в/бр) на модели развивающегося диабета (введение СТЗ по 30 мг/кг в/бр в течение трех последовательных дней) (M±SM).
На звание группы
4-й день после введения СТЗ
12-й день после введения СТЗ
19-й день после введения СТЗ
фон
1 час
2 часа
фон
1 час
2 часа
фон
1 час
пассив контроль ФР+ФР
4,98±0,24
5,28±0,13
5,1±0,18
3,82±0,17
5,5±0,18
4,46±0,1
3,98±0,16
4,7±0,4
актив контроль ФР+СТЗ
10,84±1,31*
17.15±1,74*
17,93±2,05*
6,74±1,4*
15,67±1,75*
9,86±1,9*
5,27±0,44*
12±1,9*
Опыт Афобазол + СТЗ Аг, %, Афобазол
10,85±1,9
10,67±1,36#
10,53±1,33#
5,08±0,47
7,96±0,95#
4,77±0,66#
3,88±0,21#
6,99±0,91#
-0,17%
54,55%
57,58%
56,85%
75,81%
94,26%
107,75%
68,63%
Достоверные различия (р<0.05) согласно непараметрическому критерию Mann-Whitney представлены как: * - достоверность различий между пассивным контролем (ФР) и активным контролем (СТЗ). # - достоверность различий между активным контролем (СТЗ) и афобазолом.
В группе крыс, которым Афобазол вводился перорально, на следующий день после окончания введения СТЗ (4-й день эксперимента) при первом тестировании Афобазол не проявил активности в отношении фонового уровня гипергликемии, но уже на этих ранних сроках переносимость глюкозной нагрузки улучшалась - уровень глюкозы в крови через 1 час, и через 2 часа был достоверно ниже, чем в группе активного контроля (10,7 и 10,5 ммоль/л соответственно). Через 9 дней после окончания воздействия диабетогенного токсина (12-й день эксперимента), в группе крыс, леченых Афобазолом, содержание глюкозы в крови при нагрузке было достоверно ниже, чем в группе активного контроля. Наконец, при тестировании через 19 дней (15 дней после окончания введения токсина) у животных группы активного контроля и в опытной группе имело место восстановление спонтанного уровня гликемии; в условиях нагрузки (она проводилась через 1 час) Афобазол достоверно ослаблял выраженность гипергликемии. Полученные данные свидетельствуют о том, что Афобазол сохраняет свою антигипергликемическую активность в условиях перорального введения. Сравнение динамики изменения его эффективности при внутрибрюшинном (табл.1) и при пероральном (табл.2) - путях введения свидетельствует о том, что при пероральном пути введения эффект развивается с некоторой задержкой, но к концу наблюдения препарат достигает той же степени эффективности, что и при внутрибрюшинном введении.
Пример 3. Эффект соединения М-11 при пероральном введении на модели развивающегося диабета
Дизайн эксперимента аналогичен таковому, описанному в примере 1. Соединение М-11 вводилось перорально в дозе 5 мг/кг. Как следует из данных, представленных в таблице 3, если в группе пассивного контроля исходный уровень глюкозы составлял 5,0 ммоль/л, а при нагрузке через 1 час достоверно не отличался от контрольного (5.3 ммоль/л), то в группе животных, которым вводился СТЗ (активный контроль) на следующий день после третьего введения СТЗ отмечалось не только нарастание фонового уровня глюкозы, но и снижение толерантности к глюкозе. Терапия соединением М-11 в первые дни эксперимента не сопровождалась снижением фонового уровня глюкозы: и на 4-й, и на 12-й день эксперимента он оставался повышенным. Эффект соединения в ранние сроки терапии проявлялся лишь некоторым улучшением толерантности к глюкозной нагрузке через 2 часа после ее начала. И лишь на 19-й день эксперимента (считая от дня первого ввведения СТЗ) антигипергликемический эффект соединения М-11 четко проявлялся. Он касался как фонового уровня глюкозы, так и толерантности к глюкозной нагрузке.
Табл. 3
Влияние соединения М-11, вводимого per os в дозе 5 мг/кг, на фоновый уровень глюкозы в крови крыс (ммоль/л) и показатели гипергликемии через 1 час и 2 часа после введения глюкозы (1000 мг/кг в/бр) на модели развивающегося диабета (введение СТЗ по 30 мг/кг в/бр в течение трех последовательных дней) (М±SM).
Название группы
4-й день после введения СТЗ
12-й день после введения СТЗ
19-й день после введения СТЗ*
фон
1 час
2 часа
фон
1 час
2 часа
фон
1 час
пассивный Контроль ФР-ФР
4,01±0,13
5,42±0,17
5,63±0,46
4,47±0,38
5,42±0,17
5,63±0,46
4,5±0,065
73±0,03
актив контроль ФР+СТЗ
7,03±0,47*
16,75±0,51*
14,87±0,97*
7,16±1,1*
15,18±1,63*
13,21±1,59*
10,99±1,41*
17,69±2,67*
Опыт М-11+СТЗ
9,35±, 0,75#
17,51±0,95
14,02±1,02
8,55±1,04
16,44±1,32
11,03±1,22
6,51±0,76#
12,67±1,15#
Аг, %, М-11
76,82%
6,71%
9,2%
51,70%
12,90%
28,76%
69,03%
41,97%
Достоверные различия (р<0,05) согласно непараметрическому критерию Mann-Whitney представлены как: * - достоверность различий между пассивным контролем (ФР) и активным контролем (СТЗ). # - достоверность различий между активным контролем (СТЗ) и соединением М-11.
Сравнение выраженности антигипергликемического эффекта афобазола и его основного метаболита соединения М-11 свидетельствует о том, что соединение М-11 менее эффективно, чем исходное вещество афобазол, и что эффект от его применения развивается медленнее. Фармакокинетическими исследованиями (Бастрыгин Д.В. Экспериментальное изучение биотрансформации и фармакокинетики основного метаболита афобазола - соединения М-11. Автореф. К.б.н., 2012) показано, что содержание М-11 в плазме крови крыс достигает максимума в среднем через 0,5 ч, а затем наблюдается быстрое снижение концентрации этого соединения. Установлено, что при распределении в системе гексан:вода соединение М-11 обладает менее выраженными липофильными свойствами по сравнению с афобазолом, что связано с наличием в структуре соединения М-11 морфолонового цикла. Можно предположить, что накопление М-11 в васкуляризированных органах, к числу которых относится и поджелудочная железа, происходит медленнее, чем накопление афобазола.
Пример 4. Влияние Афобазола и соединения М-11 на активность дипептидилпептидазы-IV
Регуляция гомеостаза глюкозы в организме осуществляется сложной полигормональной системой, включающей гормоны поджелудочной железы и пептиды инкретины, вырабатываемые в кишечнике в ответ на прием пищи. Ферментом, осуществляющим расщепление инкретинов является Дипептидилпептидаза-IV (ДПП-4). (Lotfy M., Singh J., Kalasz H et al. // Open Medicinal Chemistry Journal 2011. Vol.5. P. 82-92). Учитывая полученные данные об антигипергликемическом эффекте Афобазола и его основного метаболита М-11, далее было изучено влияние указанных соединений на активность данного фермента, а также на активность родственных ферментов для выяснения специфичности действия.
Эксперименты по определению активности фермента, определяющего состояние метаболизма инкретинов, ДПП-4, и родственных ферментов проводили с помощью стандартных методов.
Методы исследования
А. Выделение ферментов
Дипептидилпептидаза-IV (ДПП-4).
Выделение ДПП-4 из плазмы крови человека проводили методами осаждения сульфатом аммония и хроматографией на фенил-сефарозе, сефадексе G-100, конканавалин-А-сефарозе и MonoQ (все сорбенты Amersham-Pharmacia). Полученный препарат ДПП-4 был гомогенен при электрофорезе в геле полиакриламида в присутствии додецилсульфата Na и имел значение молекулярной массы для мономера около 110 Kd. Очищенную ДПП-4 хранили при -80°С.
Дипептидилпептидаза-II (ДПП-2).
Фермент получали из плаценты крупного рогатого скота. Разделение активностей ДПП-2 и ДПП-4 в процессе выделения контролировали по гидролизу субстрата Lys-Ala-АМС при рН 5.5 (специфично для ДПП-2) в отличие от гидролиза Gly-Pro-AMC, расщепляемого оптимально рН при 7.5. Частичную очистку ДПП-2 из гомогената проводили фракционированием сульфатом аммония, хроматографированием. используя DEAE-целлюлозу (Wathman) и фенил-сефарозу (Amesham-Pharmacia). Полученный препарат фермента хранили при -80°С.
Пролилэндопептидаза (ПЭП).
Очистку пролилэндопептидазы из эритроцитов крови человека проводили хроматографированием на DEAE-сефадексе А-50, сефадексе G-75 и MonoQ (все сорбенты Amersham-Phamacia). Полученный препарат был гомогенен при элетрофорезе в геле полиакриламида в присутствии додецилсульфата Na и имел значение молекулярной массы 75 Kd. Очищенную ПЭП хранили при -80°С.
Б. Определение активности пептидаз
За единицу активности фермента принимали его количество, расщепляющее 1 мкмоль субстрата за 1 мин.
Определение дипептидилпептидазы-IV (КФ 3.4.14.5, CD26).
Активность ДПП-4 определяли по гидролизу субстрата Gly-Pro-7-амино-4-метилкумарина (Bachem) флуорометрически.
Определение дипептидилпептидазы-11 (КФ 3.4.14.2, ДПП-2)
Активность ДПП-2 определяли по гидролизу субстрата Lys-Ala-7-aMHHO-4-метилкумарина (Bachem) флуорометрически при рН 5.5 (для гидролиза субстрата Gly-Pro-AMC оптимум наблюдали при рН 8)
Определение дипептидилпептидазы-1 (КФ 3.4.14.1; катепсин С, ДПП-1)
В эксперименте использовали коммерческий препарат катепсина С из селезенки быка (С-8511, Sigma-Aldrich) с удельной активностью ≥ 5 ед./мг белка.
Активность ДПП-1 определяли двумя способами - спектрофотометрически с субстратом His-Ser-p-нитроанилидом (His-Ser-pNA, Bachem, Heidelberg, Germany) и флуорометрически с субстратом Gly-Arg-7-амино-4-метилкумарином (Gly-Arg-AMC. Bachem).
Дипептидилпептидаза 8/9 (ДПП-8/9)
Для определения активности дипептидилпептидазы 8/9 использовали так называемый «желатиназный» метод, основанный на том, что в отличие от других дипептидилпептидаз она гидролизует желатину. Ферментный препарат получали из лейкоцитов периферической крови человека различными хроматографическими процедурами.
Пролилэндопептидаза (КФ 3.4.21.26, ПЭП)
Активность ПЭП определяли аналогично определению ДПП-4 с использованием флуорогенного субстрата Z-Ala-Pro-AMC, где Z=бензилоксикарбонил).
Пролидаза (КФЗ.4.13.9).
В эксперименте использовали очищенную из почек свиньи пролидазу (Sigma-Aldrich, P6675). Фермент избирательно гидролизует дипептиды типа Хаа-Pro (частично Хаа-Нур) и не гидролизует дипептид Pro-Pro.
Принцип определения фермента основан на мониторинге катализируемого ферментом расщепления субстрата Gly-L-Pro (Sigma-Aldrich, G-3002) при 40°С и рН 8.0 в кювете спектрофотометра при длине волны 242 нм.
Определение степени ингибирования (IC50) пептпдаз афобазолом и соединением М-11.
В эксперименте использовали соединения концентрации 0.1, 1, 10 и 100 микромоль/л, для каждой из которых измерения проводили в присутствии различных концентраций Gly-Pro-AMC (0.006, 0.024, 0.10, 0.39, 1.56, 1.25, 6.25, 25 и 100 наномоль/л. Было проведено три отдельных эксперимента в трех параллельных измерениях.
Параметры ингибирования определяли в программе Prism-4 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).
Дизайн эксперимента:
К 20 мл раствора фермента (около 5 мг/мл белка) или неочищенной плазмы крови, полученных от больных диабетом типа 2 и здоровых добровольцев, добавляли 740 мкл 0,02 М Трис-HCl с рН 8.0, 20 мкл раствора афобазола, ситаглиптина или вилдаглиптина и преинкубировали при 37°С в течение 30 мин. Затем к смеси добавляли 20 мкл раствора субстрата в DMSO и продолжали инкубировать в тех же условиях в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 20% раствора уксусной кислоты. Флуоресценцию освободившегося в процессе ферментативной реакции 4-метил-кумарил-7-амида измеряли при длине волны возбуждения 380 нм и флуоресценции 460 нм.
Все работы по получению ферментных препаратов проводили при 4°С.
Результаты
1. Влияние Афобазола и соединения М-11 на активность дипептидилпептидазы-IV из неочищенной плазмы крови больных диабетом типа 2 и здоровых добровольцев.
Значение активности ДПП-4 в плазме крови здоровых добровольцев составляла 2,37±0,07 нмоль/мин/мл (n=17). В плазме крови от пациентов с диабетом типа 2 -3,62±0,34 нмоль/мин/мл (n=9).
В таблице 4 представлены результаты изучения влияния Афобазола и соединения М-11 на активность ДПП-4 в образцах плазмы крови человека.
Табл.4
Влияние афобазола и соединения М-11 на остаточную активность дипептидшпептидазы IV в плазме крови больных диабетом типа 2 (n=7) и здоровых добровольцев (n=6)
Препарат
Остаточная активность дипептидилпептндазы IV (%)
Концентрация соединения наномоль/л
0
1
10
100
Плазма 1 (здоровые)
100.0±8.2
-
-
-
Плазма 1 + Афобазол
100.0±8.2
79.5±5.8
29.8±2.4
3.6±0.4
Плазма 1 + М-11
100.0±8.2
82.4±6.1
19.9±1.7
2.4±0.5
Плазма 2 (диабет типа 2)
100.0±5.9
-
-
-
Плазма 2 + Афобазол
100.0±5.9
85.4±7.5
30.6+4.5
4.6±1.8
Плазма 2 + М-11
100.0±5.9
75.3±6.9
26.1+5.3
3.1±0.9
Как следует из данных, представленных в таблице 4, активность ДПП-4 в плазме крови здоровых добровольцев и больных диабетом типа 2 угнеталась дозозависимым образом обоими изученными препаратами в диапазоне концентраций от 1 до 100 наномоль/л.
Для сравнения ингибиторных свойств Афобазола и соединения М-11 было проведено исследование кинетики ингибирования очищенного из плазмы крови человека фермента.
2. Изучение кинетики ингибирования очищенной дипептидилпептидазы IV Афобазолом и соединением М-11.
Ингибирование Афобазолом активности очищенной ДПП-4 иллюстрируется фигурой 1.
Как следует из данных, представленных на фиг.1, ДПП-4 ингибируется Афобазолом достаточно эффективно.
В следующем эксперименте было проведено сравнительное изучение ингибиторной активности Афобазола и соединения М-11.
Результат этого эксперимента приведен на фигуре 2.
Как следует из данных, представленных на фиг.2, значения IC50 для Афобазола и соединения М-11 были примерно одинаковы и составляли 142.5±16.4 и 129.3±17.1 наномоль/л, соответственно.
Пример 5. Влияние Афобазола и соединения М-11 на активность родственных ДПП-4 ферментов.
Взаимодействие Афобазола и соединения М-11 с другими родственными ДПП-4 ферментами изучали на очищенных коммерческих препаратах пролидазы и катепсина С (ДПП-1).
Пролилэндопептидаза, ДПП-2 и ДПП-4 были выделены и очищены в лаборатории психофармакологии ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН.
Исследовано влияние Афобазола и соединения М-11 на активность ДПП-1. ДПП-2, пролидазы, пролилэндопептидазы. Результаты этого исследования представлены в таблице 5.
Табл.5
Влияние Афобазола и соединения М-11 на активность дипептидшпептидаз 1, 2, 8/9, пролилэндопептидазы и пролидазы
Препарат
IC50 (микро Моль/л)
ДПП 8/9
ДПП-2
ДПП-1
ПЭП
Пролидаза
Афобазол
18±4
1800±220
3340±198
6780±590
>900000
М-11
23±6
2030±340
4140±278
7485-J439
>700000
Как следует из данных, представленных в таблице 5, оба исследованных препарата практически не проявляли ингибиторной активности по отношению к другим пролин-специфичным ферментам, что указывает на избирательность действия Афобазола и соединения М-11 в отношении ДПП-4 как ключевого метаболизма инкретинов.
Таким образом, установлен антигипергликемический эффект Афобазола и его основного метаболита соединения М-11 и выявлена их способность к угнетению фермента ДПП-4, указывающая на возможность вовлечения инкретиновых механизмов в реализацию этого эффекта. Гипогликемическая активность афобазола может быть обусловлена действием не только исходной молекулы, но и ее основного метаболита. В этом отношении афобазол обладает определенным преимуществом перед применяемыми в практической медицине ингибиторами ДПП-4, янувией и галвусом, метаболиты которых в отличие от исходных препаратов лишены гипогликемических свойств (Deacon C.F. Dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in the treatment of type 2 diabetes: a comparative review Diabetes, Obesity and Metabolism 13: 7-18, 2011).
Совокупность полученных данных свидетельствует о целесообразности применения Афобазола в качестве средства патогенетической терапии, действие которого направлено на предотвращение прогрессирования диабета.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 изображено влияние Афобазола на активность очищенной из плазмы крови человека дипептидилпептидазы IV при различных концентрациях субстрата Gly-Рго-АМС. По оси абсцисс представлена концентрация субстрата [S] в реакционной смеси (нмоль/л). По оси ординат представлена остаточная активность ДПП-4 (доля активности фермента без добавления Афобазола). Все значения точек на кривых представлены в виде средних значений.
На фиг.2 изображено влияние различных концентраций Афобазола и соединения М-11 на активность очищенной из плазмы крови человека дипептидилпептидазы IV. По оси абсцисс представлен логарифм концентрации (нМоль/л) Афобазола и соединения М-11 в реакционной среде.
По оси ординат представлена остаточная активность фермента (доля остаточной активности относительно контроля). Все значения точек на кривых представлены в виде средних значений (M±SEM). Значения IC50 для Афобазола и соединения М-11 составляли 142.5±16.4 и 129.3±17.1 нмоль/л, соответственно.