Молекулярные маркеры в решении сохранения биологического разнообразия и паспортизации сортов сельскохозяйственных культур (часть 1)

УДК 248.23 ^

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ В РЕШЕНИИ СОХРАНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ И ПАСПОРТИЗАЦИИ СОРТОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР

Н.Е. Павловская, д.б.н.

И.Н. Гагарина, к.с.-х н.

В решении проблемы продовольственной безопасности страны важное значение имеет производство зернобобовых и крупяных культур для обеспечения население полноценным питанием.

Широкое распространение зерновых бобовых и крупяных культур в мировом земледелии обусловлено, прежде всего, их способностью накапливать в семенах и вегетативной массе большое количество высококачественного белка и незаменимых аминокислот. Кроме того, преимущество зерновых бобовых над зерновыми культурами заключается в том, что они дают самый дешевый белок, за счет включения в биологический круговорот атмосферного азота, недоступного для других растений. Благодаря азотфиксации они, по сравнению со злаковыми культурами, содержат в семенах в

1,5...2,0 раза больше белковых веществ и обеспечивают самый высокий выход перевариваемого протеина и незаменимых аминокислот с гектара посева. В состав белка зернобобовых входят все необходимые для питания человека и животных аминокислоты.

Решение задач современного производства зернобобовых и крупяных культур в значительной степени зависит от фундаментальных разработок, включающих изучение вопросов рекомбинантных изменений и создание на их основе новых форм и сортов этих культур. В связи с интенсификацией селекционного процесса возникла необходимость в привлечении новых методов, обеспечивающих идентификацию сортов, линий, форм и гибридов, проведение семейного контроля высокой точности и оперативности, оценке и регистрации генофонда культурных растений, выявлении скрытой генетической изменчивости в исходном и селекционном материале и отборе желаемых генотипов. Для решения этих и многих других задач наряду с традиционными методами селекции и семеноводства успешно применяются методы молекулярных белковых и ДНК-маркеров [3].

Одним из эффективных методов исследований на молекулярном уровне, разработанных для использования в сортоиспытании, селекции, семеноводстве и семенном контроле является метод белковых маркеров. Полиморфизм запасных белков семян обусловлен аллельной изменчивостью и наилучшим образом раскрывается электрофорезом [2]. Эта кодоминантная система дает возможность работать с отдельными семенами, т. е. различать генотипы, идентифицировать сорта, биотипы и линии, осуществлять оценку генетической структуры на однородность и стабильность [3,7].

В настоящее время, в соответствии с экономической политикой государства и современной законодательной базой в области селекции и семеноводства под эгидой Министерства сельского хозяйства Российской Федерации разработана Инструкция и методика проведения лабораторного сортового контроля по группам сельскохозяйственных растений. Для идентификации генотипов двудольных сортоспецифичными были признаны запасные глобулины, а для зерновых - глиадины. Вве-

дение методики в практику соргового контроля позволит усилить защиту прав потребителей семян патентообладателей на сорта растений, способствовать повышению качества семенного материала в сгране[1].

Кроме этого современная нормативная база в области семеноводства в целом унифицирована с законодательством развитых стран. Это создает предпосылки для интеграции России в международный рынок семян, признания и поддержки ее авторитетными организациями, такими как ISTA (Международная ассоциация по контролю за качеством семян), UPOV (Международный союз по охране новых сортов растений), ISF (Международная федерация по семеноводству), OECD (Организация экономического сотрудничества и развития) [3].

Известно, что высокие урожаи можно получать только от хороших семян. В современном представлении, это семена высокой сорговой чистоты и первоклассных посевных качеств. Оценку качества семян на чисгосортность у самоопыляющихся культур и на типичность у перекрестноопы-ляющихся проводят разными способами, в том числе некоторые из которых полевая апробация посевов, лабораторный анализ и грунт- контроль. О подлинности и сортовой чистоте семян в этих случаях обьгчно судят по морфологическим признакам. Однако число таких признаков ограничено, и они не всегда стабильны. Полевые методы трудоемки, возможны случаи засорения семян при уборке урожая, последующей обработке и даже при хранении. Более надежным было бы определение сортовой чистоты зерна непосредственно перед посевом. Наша лаборатория аккредитована в системе Министерства сельского хозяйства для осуществления семенного контроля за чистотой семян и является методическим центром по обучению методикам идентификации сортов гороха, гречихи, проса, а также способна осуществлять аналогичные исследования по другим культурам (фасоли, пшенице, ячменя, овса).

Целью наших исследований является паспортизация районированных сортов гороха, фасоли, гречихи, проса, пшеницы и других культур с помощью белковых формул, исследование изменения состава белкового комплекса зерна в зависимости от сроков хранения, развитие компьютерных исследований на основе ДНК-технологнй и применения методов PCR- анализа для идентификации генотипов растений. В данной статье представлены данные, полученные на фасоли.

* ;г'

Материал и методика исследований

1. Для определения полиморфизма в работе анализировались образцы фасоли из коллекции ВИР и селекции ВНИИЗБК (Всего 15 образцов), отличающиеся морфобиологическими и биохимическими особенностями.

2. Электрофоретическое фракционирование белков

Сортовая идентификация и регистрация сортов и

форм фасоли проводилось методом SDS-ПААГ электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии редуцирующего агента с использованием додецил-сульфэта натрия (DS-Na) и меркаптоэтанола [2]. Идентификация сорта, а также определение степени внутри-сортового полиморфизма включают анализ отдельных семян, взятых из случайной выборки.

Электрофорез белков семян фасоли проводили в электрофоретической камере фирмы «Хеликон» методом В.Г. Конарева [3]. Регистрацию спектров фасоли осуществляли с помощью скользящей шкалы. В качестве эталона использовали стабильный спеюр семян сои.

В настоящее время существует много современных подходов (технологий) выявления полиморфизма на

уровне ДІЖ, среди которых можно выделить следующие: анализ полиморфизма длины ресгриктных фрагментов ДНК; «целенаправленная» ПЦР; ДНК - сиквенс.

Метод ПЦР предполагает использование специфических праймеров и получение дискретных ДНК - продуктов. Большое число родственных технологий построено на этом принципе. Полиморфизм определяется как присутствие - отсутствие в электрофоретических спектрах специфических фрагментов ДНК, обусловле-ных различиями последовательностей ДНК в местах просадки праймеров. Подход методически отноаггель-но прост и может применяться для изучения разнообразия на внутривидовом уровне, включая популяционные исследования. Только анализ ДНК, который напрямую характеризует геном, а не его фенотипические проявления, может дать устойчивые характеристики растения, нейтральные по отношению к среде обитания и практически пригодны для идентификации и различения генотипов, регистрации сортов и маркирования хозяйственно ценных генов и признаков 18].

3. Дія амплификации геномной ДНК использовали праймеры: Ваге, Paw S5. Paw S6. Paw SI 1. Paw SI6. P2I (перечислить), P27, P54. PI91, PI96. PI98. P200. Праймеры применяли в различной комбинации попарно и по одному.

Результаты н их обсуждение

Анализ полиморфизма образцов фасоли по белковым спектрам показал гетерогенность суммарных белков семян (рис.1). Результаты анализа форетических спектров белков записываются так называемыми белковыми формулами, представленными в таблице I, 2.

Известно, что при поэерновом анализе электрофорез полиморфного белка у самоопылителей выявляет две категории сортов: монотипные (габл. 2) по данному белку и политипные (габл. 2). Первые даюг лишь один тип спектра маркерного белка и представляет собой, по существу, простые белковые типы н белковые ЛИНИИ. ГІО-литипные сорта состоят из двух и более белковых типов [4, 5]. В силу генетической изоляции белковые биотипы таких сортов у строгих самоопылителей представляют собой гомозиготные линии. В большинстве случаев, однако, возможны переопыления, благодаря чему наряду с истинными стабильными биотипами в составе сорта может быть примесь семян с межбиотипнымн и даже межсортовыми «гибридными» спектрами маркерного белка. Как правило, сложный биотипный состав имеют стародавние сорта и сорта народной селекции [6].

Обычно у политнпных сортов определяющими являются один - три биотипа (генотипа), на которые при-

Таблица I Полипептндный состав семян copra Оран

‘ Vo Состав и интенсивность полипептидов, балл

II 1'« Г 19 20 24 29 31 39 41 43 45

\ 2 2 2 2 ' 1 2 2 1 1 3 1 1 2

П "2 2 2 2 1 2 2 1 1 3 3 1 Г 2

Продолжение таблицы 1

' 50 1 зг 60 7S 64 66 ¡а 69 "72 тг 79 85 ч(» ' ЧВ.%

1 2 і ' Т Í 1 1 1 1 2 1 "Г і 50

1 2 1 1 Í “I 1 1 2 ' I 1 ... 2 .. 37

Таблица 2 - Полипептндный состав семян линии Л 202

V. Состав и интенсивность полипептидов, оатл

9 10 12 16 17 І» 21 22 М 26 29 30 32 33

1 2 3 3 2'" 2 2 3 3 '2 2 2 3 _ 3 . ' 1

Продолжение таблицы 2

34 40' 44 4<Г 52" 56 f.2 6В 1\ 7<> 80 Я6~ 4ñ.*i

2 2 1 Г І Г 1 2 2 2 1 2 1 ' ~пя» 1

--------ai

холится 80,..90% сорта. Они служат его главным критерием. Поэтому для оценки образца на сортовую при-наглежность и чистоту достаточно выборки из 50-ти семян, а простое определение идентичности может быть выполнено даже при меньшей выборке [2].

По результаты электрофоретического разделения белков образцов фасоли проведена идентификация и регистрация по полипегттидному составу семян случайных выборок по 50 семян каждая. Все исследованные сортообразиы оказались не идентичными по уровню и характеру изменчивости полипептндиых спектров, что отражает уровень и характер внутрисортового полиморфизма. На основании визуальной оценки гелей был составлен электронный каталог зарегистрированных полнпептидных спектров (таблицы).

Л 202

Рисунок I - Электрофорсграммы запасных белков семян фасоли

При изучении 15 образцов фасоли было выявлено 37 различных электрофоретических спектров.

Наиболее стабильный и интенсивный компонент

11,17 присутствует у всех сортов и образцов. Частота встречаемости компонента составляет 100%. К редким компонентам можно отнести 90, 88 с частотой встречаемости 4,8...21.2%, К числу довольно распространенных, присущих большинству образцов, относятся компоненты с частотой их встречаемости 59,5...79,8%. Результаты электрофоретического разделения белков сорта показывают, что линии состоят из одного типа спектра, сорта и коллекционные образцы из двух и более. Определяющим по всем исследованным образцам является первый тип спектра, на его долю приходится наибольший процент встречаемости

На основании полученных электрофореграмм белков семян полной спелости составлены формулы 15 образцов. Данные формулы можно использовать для составления каталога районированных сортов фасоли.

Достижения в молекулярной биологии, в частности, разв1гтие таких технологий, как полимеразная цепная реакция (ПЦР) - амплификация ДНК, сиквенс ДНК -определение последовательности ДНК, современные методы анализа и обработки данных значительно повысили возможности молекулярных технологий 8 скрининге и оценке генетического разнообразия [4].

В настоящее время существует много современных подходов (технологий) выявления полиморфизма на уровне ДНК, среди которых можно выделить следующие: анализ полиморфизма длины рестриктных фрагментов Д! IK; «целенаправленная» ПЦР; ДНК - сиквенс

Метод ПЦР предполагает использование специфических праймеров и и получение дискретных ДНК -продуктов. Большое число родственных технологий построено на тгом принципе. Полиморфизм определяется как присутствие - отсутствие в электрофоретических спектрах специфических фрагментов ДНК обусловлены различиями последовательностей ДНК в местах просадки праймеров. Подход методически относительно прост и может применяться для изучения разнообразия на внутривидовом уровне, включая популяционные исследования. Только анализ ДНК, который напрямую характеризует геном, а не cm фенотипические проявления, может дать устойчивые характеристики растения, нейтральные по отношению к среде обитания н практически пригодны для идентификации и различения генотипов, регистрации сортов и маркирования хозяйственно ценных генов и признаков [8].

В результате ПЦР анализа образцов фасоли установлены межвидовые различия по всем образцам фасоли при использовании праймеров Ваге.

Выявлено, что образцы фасоли, имеющие основные фрагменты находятся в зоне работы маркера от 600 до 1000 п.н. Для большинства исследованных образцов характерно наличие фрагмента в зоне около 600 п.н. у трех образцов: Л 179, Шоколадница К 15196 нет таких фрагментов (Рис. 2). Вторым характерным моментом является наличие фрагмента в зоне около 450...550 п.н. Во всех образцах имеются фрагмс1ггы около 150 н.п. Таким образом установлены фрагменты продукта амплификации ДНК методом Полимеразной цепной реакции соответствующие 600, 450...550 и 250 п.н. характерные для всех сортов фасоли, наряду с этим в зоне от 100 до 550 п.н. обнаружены фрашенты ДНК дающие возможность выявлять межсортовой полиморфизм по ДНК маркерам.

I - Контроль; 2 - Оран; 3 - Рубин; 4 - Л 543/84; 5 - Ока;

6 - Нерусса; 7 - Л 202; 8-Л 714; 9-Л 179; 10-Шоколадница; 11 - К 15038; 12 - К 15077; 13 - К 13627;

14-К 15196; 15-К 15127; 16-Вельская 16; 17-Маркер

Рисунок 2 - Продукты амплификации ДНК образцов фасоли с праймером Ваге

Выводы

Проведена идентификация образцов фасоли и составлены белковые формулы, которые могут быть использованы для проведения генетической паспортизации, решения арбтражных споров, установления авторства

Методом полимеразной цепной реакции выявлены фрагменты амплификации ДНК соответствующие 600,

450...550 и 250 п.н. характерные для всех сортов фасоли. а в зоне от 150 до 550 п.н. обнаружены ДНК маркеры. специфические для образцов Шоколачница, К 13627, К 15127, Вельская 16.

Литература

1. Гайденкова Н.В. Иленгификацня и регистрация пшениц Крымок по спектрам глиаанна / Н.В. Гайденкова //Бюллетень ВИР. Вып. 165-Л.: ВИР, 1986. - С.7-9.

2. Конарев. A.B. Белки семян как маркеры / A.B. Конарев // Вестник семеноводства в СНГ. - 2000. №2. — С.24-25.

3. Конарев, A.B. Адаптивный характер молекулярного полиморфизма и его использование в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции A.B. Конарев // Аграрная Россия. 2002. - №3. - С.4-11

4. Конарев, В.Г. Белки пшеницы / В.Г'. Конарев -M.: Колос, 1980. -350 с.

5. Конарев. В.Г. Ресурсы растительного белка и проблемы его качества / В.Г.Конарев II Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции - 1981. - Т. 70. вып. 2. - С. 71-84.

6. Перуанский, Ю.В. Множественность глиади-новых биотипов у сортов пшеницы / Ю.В.Перуанский. А.И.Абугалиева // Селекция и семеноводство. 1985. -№ 3. - С. 23-24.

7. Созинов, A.A. Генетические маркеры у растений / А.А.Созинов // Цитология и генетика. - 1993. Т.27. -№ 5. -С. 15-23.

8. Хавкин, Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур / Э.Е.Хавкин // Сельскохозяйственная биология. - 2003.-№ 3.- С.28-41.