БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ БЕТА-АМИЛОИДУ/ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ РЕЦЕПТОРУ ТРАНСФЕРРИНА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
BISPECIFIC ANTIBODIES TO HUMAN BETA-AMYLOID / HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR AND METHODS OF USING THEM

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к биспецифическим антителам к человеческому бета-амилоиду и человеческому рецептору трансферрина, способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела и их применению.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ  УРОВЕНЬ  ТЕХНИКИ
Приблизительно 70% всех случаев деменции являются следствием болезни Альцгеймера, связанной с избирательным повреждением участков мозга и нейронных цепей, играющих ключевую роль в когнитивном процессе. Болезнь Альцгеймера характеризуется появлением нейрофибриллярных клубков, в частности, в пирамидальных нейронах гиппокампа, а также многочисленных амилоидных бляшек, имеющих плотное ядро, состоящее из отложений амилоида, окруженное бледным ореолом.
Внеклеточные сенильные бляшки содержат большое количество преимущественно фибриллярного пептида, обозначаемого «амилоид β», «бета-амилоид», «Aβ4», «β-A4» или «Aβ»; см. Selkoe, Ann. Rev. Cell Biol. 10 (1994) 373-403; Koo PNAS 96 (1999) 9989-9990; US 4,666,829; Glenner BBRC 12 (1984) 1131). Данный амилоид образуется из «белка-предшественника бета-амилоида» APP (от англ. Alzheimer precursor protein или β-amyloid precursor protein). АРР представляют собой интегральные мембранные гликопротеины (см. Sisodia PNAS 89 (1992) 6075) и подвергаются эндопротеолитическому расщеплению внутри последовательности AP α-секретазой, протеазой, связанной с плазматической мембраной (см. Sisodia (1992), Joe. cit.). Кроме того, благодаря активности других секретаз, в частности, β-секретазы и γ-секретазы, происходит внеклеточное высвобождение амилоида-β (Aβ), содержащего 39 аминокислот (Aβ39), 40 аминокислот (Aβ 40), 42 аминокислоты (Aβ 42) или 43 аминокислоты (Aβ 43) (см. Sinha PNAS 96 (1999) 11094-1053; Price, Science 282 (1998) 1078-1083; WO 00/72880 или Hardy, TINS 20 (1997) 154).
Следует отметить, что бета-амилоид имеет несколько форм естественного происхождения, при этом человеческие формы обозначаются, как указано выше: Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 и Aβ43. Наиболее распространенная форма, Aβ42, имеет аминокислотную последовательность (начиная с N-конца): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 05). У Aβ41, Aβ40, Aβ39 отсутствуют C-концевые аминокислоты A, IA и VIA, соответственно. У формы Aβ43 на C-конце приведенной выше последовательности находится дополнительный остаток треонина.
Показано, что время, необходимое для образования ядра из фибрилл Aβ40 существенно больше, чем для образования ядра из фибрилл Aβ42 (см., например, Lansbury, Jr., P. T. and Harper, J. D., Ann. Rev. Biochem. 66 (1997) 385-407). Как указано в обзоре Wagner (J. Clin. Invest. 104 (1999) 1239-1332), Aβ42 чаще всего обнаруживается ассоциированным с сенильными бляшками и имеет большую склонность к образованию фибрилл in vitro. Кроме того, предполагают, что Aβ42 служит «затравкой» при полимеризации упорядоченных некристаллических пептидов Aβ, связанной с образованием ядра (см., например, Jarrett, Cell 93 (1993) 1055-1058). Процессинг модифицированного АРР и/или образование внеклеточных бляшек, содержащих белковые отложения, известны не только при болезни Альцгеймера, но также и у субъектов, страдающих другими неврологическими и/или нейродегенеративными расстройствами. Такие расстройства включают в том числе синдром Дауна, наследственную церебральную геморрагию с амилоидозом голландского типа, болезнь Паркинсона, БАС (боковой амиотрофический склероз), болезнь Крейцфельда-Якоба, ВИЧ-ассоциированную деменцию и моторную нейропатию.
На данный момент известно лишь ограниченное число схем лечения заболеваний, связанных с отложением амилоида. Например, обсуждалось, что ингибиторы холинэстераз, такие как галантамин, ривастигмин или донезепил оказывали благотворное действие только на пациентов с болезнью Альцгеймера легкой и умеренной степени тяжести. При этом также были зарегистрированы нежелательные явления, связанные с холинэргическим действием указанных препаратов. Поскольку указанные холинергические препараты приносят лишь некоторое симптоматическое облегчение, ответ на терапию у большинства пациентов является неудовлетворительным. Согласно оценкам, существенное когнитивное улучшение наблюдается только у 5% пациентов, получавших терапию, и существует мало доказательств, что терапия существенным образом влияет на течение данного прогрессирующего заболевания.
Следовательно, по-прежнему существует огромная потребность в более эффективных препаратах и, в частности, в таких, которые могут останавливать или замедлять прогрессирование заболевания. Недавно начали также применять антагонисты рецепторов NMDA, такие как мемантин.
Однако, были зарегистрированы нежелательные явления, связанные с их фармакологической активностью. Кроме того, такое лечение указанными антагонистами рецепторов NMDA можно считать всего лишь симптоматическим, но не меняющим течение заболевания.
Также были предложены иммуномодулирующие методы лечения расстройств, связанных с отложением амилоида. WO 99/27944 описывает конъюгаты, содержащие части бета-амилоида и молекулы-носители, где указанная молекула-носитель должна усиливать иммунный ответ. Другой подход с активной иммунизацией упоминается в WO 00/72880, где фрагменты бета-амилоида применяют для индукции иммунного ответа.
В WO 99/27944 или WO 01/62801 предложены способы пассивной иммунизации антителами к целому бета-амилоиду, а в WO 02/46237, WO 02/088306 и WO 02/08830 описаны специфические гуманизированные антитела, направленные против частей бета-амилоида. WO 00/77178 описывает антитела, связывающие β-амилоид в переходном состоянии, которое он принимает в процессе гидролиза. WO 03/070760 описывает молекулы антител, распознающие две прерывистые аминокислотные последовательности бета-амилоида.
WO 2014/033074 относится к челнокам, проходящим через гематоэнцефалический барьер, которые связываются с рецепторами гематоэнцефалического барьера, и способам их применения. Доставка лекарственных средств через гематоэнцефалический барьер при помощи белков, слитых с доменом IgG, представляющего собой моноклональное антитело к рецептору трансферрина, описана Pardridge, W. (Exp. Opin. Drug Deliv. 12 (2015) 207-222). Yu, Y.J. et al. (Sci. Translat. Med. 6 (2014) 261ra154-261ra154) описывает терапевтические биспецифические антитела, пересекающие гематоэнцефалический барьер у приматов, не являющихся человеком. Дезагрегация амилоидной бляшки в головном мозге трансгенных мышей с болезнью Альцгеймера при ежедневном подкожном введении четырехвалентного биспецифического антитела, направленного против рецептора трансферрина и бета-амилоидного пептида, описано Sumbria, R.K., et al. (Mol. Pharm. 10 (2013) 3507-3513). Niewoehner, J., et al. (Neuron 81 (2014) 49-609 описывает улучшенное проникновение в мозг и эффективность терапевтического антитела, работающего по принципу одновалентного молекулярного челнока.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предложено биспецифическое антитело, содержащее:
а) одно (полноразмерное) антитело, содержащее по две пары легких (полноразмерных) цепей антитела и тяжелых (полноразмерных) цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой тяжелая (полноразмерная) цепь антитела и легкая (полноразмерная) цепь антитела специфически свяываются с первым антигеном, и
б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей (полноразмерного) антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,
где каждая из (полноразмерных) легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),
где каждая из (полноразмерных) тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),
где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и
где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.
В одном воплощении дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом тяжелой цепи посредством пептидного линкера.
В одном воплощении N-конец вариабельного домена тяжелой цепи Fab фрагмента слит с C-концом полноразмерной тяжелой цепи или с C-концом пептидного линкера.
В одном воплощении
а) полноразмерная тяжелая цепь, которая слита с дополнительными Fab-фрагментами имеет в качестве C-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи трипептид LSP, пролин которого непосредственно слит с первым аминокислотным остатком дополнительного Fab-фрагмента или пептидного линкера посредством пептидной связи, и
б) полноразмерная тяжелая цепь, которая не слита с дополнительными Fab-фрагментами, имеет в качестве C-концевых аминокислотных остатков тяжелой цепи трипептид LSP или SPG или PGK.
В одном воплощении (полноразмерное) антитело представляет собой
а) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1,
б) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4,
в) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G,
г) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G,
д) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно,
е) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно,
ж) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, I253A, H310A и H435A в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно, или
з) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T и T256E в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно.
В одном воплощении (полноразмерное) антитело представляет собой
а) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1,
б) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4,
в) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G,
г) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G,
д) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно,
е) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно,
ж) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, I253A, H310A и H435A в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно,
з) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T и T256E в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно, или
и) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, H310A, H433A и Y436A в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно.
В одном воплощении дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом тяжелой цепи, содержащей мутацию T366W, или с C-концом тяжелой цепи, содержащей мутации T366S, L368A и Y407V.
В одном воплощении
полноразмерное антитело относится к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A и P329G в обеих тяжелых цепях и мутациями T366W и S354C в одной тяжелой цепи и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другой тяжелой цепи, соответственно, и
дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом тяжелой цепи, содержащей мутацию T366W, или с C-концом тяжелой цепи, содержащей мутации T366S, L368A и Y407V.
В одном воплощении всех аспектов сайт связывания человеческого бета-амилоида содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 18, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 19, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.
В одном воплощении всех аспектов сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 20, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 21, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит
i) легкую цепь с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO: 01 на 70% или более,
ii) тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO: 02 на 70% или более,
iii) легкую цепь с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO: 03 на 70% или более,
iv) Fab фрагмент тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности SEQ ID NO: 04 на 70% или более,
где
SEQ ID NO: 01 имеет аминокислотную последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC,
SEQ ID NO: 02 имеет аминокислотную последовательность QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,
SEQ ID NO: 03 имеет аминокислотную последовательность AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYASSNVDNTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC и
SEQ ID NO: 04 имеет аминокислотную последовательность QSMQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSSYAMSWIRQHPGKGLEWIGYIWSGGSTDYASWAKSRVTISKTSTTVSLKLSSVTAADTAVYYCARRYGTSYPDYGDASGFDPWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело, содержащее (полноразмерную) легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01, (полноразмерную) тяжелую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 02, (полноразмерную) легкую цепь, которая имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 03, и Fab фрагмент антитела, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 04.
В одном воплощении биспецифическое антитело является моноклональным.
Одним аспектом по данному описанию является выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело по данному описанию.
Одним аспектом по данному описанию является клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по данному описанию, кодирующую биспецифическое антитело по данному описанию.
Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ получения биспецифического антитела по данному описанию, включающий следующие стадии:
а) культивирование клетки-хозяина по данному описанию с продуцированием биспецифического антитела и
б) выделение биспецифического антитела из клетки или среды культивирования и, таким образом, получение биспецифического антитела по данному описанию.
Одним аспектом по данному описанию является иммуноконъюгат, содержащий биспецифическое антитело по данному описанию и цитотоксический агент.
Одним аспектом по данному описанию является фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело по данному описанию и фармацевтически приемлемый носитель.
Одним аспектом по данному описанию является антитело по данному описанию для применения в качестве лекарственного средства.
Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в лечении болезни Альцгеймера.
Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в ингибировании/замедлении образования бляшек в головном мозге.
Одним аспектом по данному описанию является биспецифическое антитело по данному описанию для применения в дезинтеграции β-амилоидных бляшек.
Одним аспектом по данному описанию является применение биспецифического антитела по данному описанию для изготовления лекарственного средства.
В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения амилоидозов.
В одном воплощении лекарственное средство предназначено для предупреждения и/или лечения заболевания, ассоциированного с амилоидогенезом и/или образованием амилоидых бляшек. В одном воплощении заболевание выбрано из группы, состоящей из деменции, болезни Альцгеймера, моторной нейропатии, синдрома Дауна, болезни Крейтцфельдта-Якоба, наследственной церебральной гемморагии с амилоидозом голландского типа, болезни Паркинсона, ВИЧ-ассоциированной деменции, БАС или нейрональных расстройств, связанных со старением. В одном предпочтительном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения болезни Альцгеймера.
В одном воплощении лекарственное средство предназначено для ингибирования/замедления образования бляшек в головном мозге. В одном воплощении лекарственное средство представляет собой лекарственное средство для дезинтеграции β-амилоидных бляшек.
Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ лечения индивидуума, страдающего заболеванием, ассоциированным с амилоидогенезом и/или образованием амилоидных бляшек, включающий введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию.
Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ лечения индивидуума, страдающего болезнью Альцгеймера, включающий введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию.
Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ дезинтеграции β-амилоидных бляшек в головном мозге индивидуума, включающий введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию для дезинтеграции β-амилоидных бляшек в головном мозге.
Один аспект согласно данному описанию представляет собой способ ингибирования/замедления образования бляшек в головном мозге индивидуума, включающий введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела по данному описанию для ингибирования/замедления образования бляшек в головном мозге.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Димеризуемые модули выступы-в-впадины и их применение в инженерии антител описано Carter P.; Ridgway J.B.B.; Presta L.G.: Immunotechnology, Volume 2, Number 1, February 1996, pp. 73-73. Образование дополнительных дисульфидных мостиков в CH3 домене описано Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681.
Общая информация, относящаяся к нуклеотидным последовательностям легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов человека, приведена Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).
В данном описании положения аминокислот всех константных областей и доменов тяжелой и легкой цепей пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat, описанной Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), которая обозначается в данном описании «системой нумерации Kabat». В частности, систему нумерации Kabat (см. стр. 647-660) Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) используют для константного домена легкой цепи CL изотипов каппа и лямбда, а систему нумерации EU-индекс, предложенную Kabat (см. стр. 661-723), которая в целях ясности обозначается в данном описании «системой нумерации EU-индекс, предложенной Kabat», используют для константных доменов тяжелой цепи (CH1, шарнирный участок, CH2 и CH3).
I. ТЕРМИНОЛОГИЯ
«Гематоэнцефалический барьер», или ГЭБ относится к физиологическому барьеру между периферической системой кровообращения и головным и спинным мозгом, образованному плотными контактами в плазматической мембране эндотелия капилляров мозга, создающими плотный барьер, ограничивающий транспортировку в мозг молекул, даже таких небольших, как мочевина (60 Дальтон). ГЭБ в головном мозге, гематоспинальный барьер в спинном мозге и гематоретинальный барьер в роговице представляют собой непрерывный барьер между капиллярной кровью и ЦНС и в данном описании вместе обозначаются гематоэнцефалическим барьером, или ГЭБ. ГЭБ также охватывает гематоликворный барьер (хороидные сплетения), где барьер скорее состоит из эпендимоцитов, чем из эндотелиальных клеток капилляров.
Термины «антитело к человеческому бета-амилоиду» и «антитело, специфически связывающееся с человеческим бета-амилоидом» относится к антителу, которое споосбно связываться с человеческим пептидом бета-амилоидом с достаточной аффинностью, так что антитело может применяться в качестве диагностического и/или терапевтического агента, мишенью которого является пептид бета-амилоид.
Следует отметить, что человеческий бета-амилоид существует в виде нескольких встречающихся в естественном состоянии форм, при этом встречающиеся в организме человека формы обозначают Aβ39, Aβ40, Aβ41, Aβ42 и Aβ43. Наиболее распространенная форма, Aβ42, имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05. У Aβ41, Aβ40, Aβ39 отсутствуют C-концевые аминокислоты A, IA и VIA, соответственно. У формы Aβ43 имеется дополнительный остаток треонина на C-конце последовательности SEQ ID NO: 05. В одном воплощении человеческий белок бета-амилоид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 05.
Таким образом, термин также охватывает антитела, которые связываются с укороченным фрагментом человеческого полипептида бета-амилоида.
«Центральная нервная система» или «ЦНС» относится к комплексу нервных тканей, контролирующих функции организма, и охватывает головной мозг и спинной мозг.
«Рецептор гематоэнцефалического барьера» (сокращённо «РГЭБ») представляет собой внеклеточный мембрано-связанный белок-рецептор, экспресируемый эндотелиальными клетками головного мозга, способный переносить молекулы через ГЭБ или использоваться для переноса введенных экзогенных молекул. Примеры РГЭБ в данном описании включают: рецептор трансферрина (TfR), рецептор инсулина, рецептор инсулиноподобного фактора роста (IGF-R), рецепторы липопротеинов низкой плотности, включая, без ограничения, родственный рецептору липопротеинов низкой плотности белок 1 (LRP1) и родственный рецептору липопротеинов низкой плотности белок 8 (LRP8), а также гепарин-связывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста (HB-EGF). Одним из предпочтительных РГЭБ является рецептор трансферрина (TfR).
«Рецептор трансферрина» (TfR) представляет собой трансмембранный гликопротеин (с молекулярной массой приблизительно 180 000 Да), состоящий из двух субъединиц, связанных дисульфидными связями (каждая имеет кажущуюся молекулярную массу приблизительно 90 000 Да), задействованный в поглощении железа у позвоночных. В одном воплощении указанный TfR представляет собой человеческий TfR, содержащий аминокислотную последовательность, указанную, например, Schneider et al (Nature 311 (1984) 675-678). В одном воплощении человеческий рецептор трансферрина имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
2
«Мультиспецифическое антитело» обозначает антитело, специфически связывающееся по меньшей мере с двумя различными эпитопами одного и того жа антигена или двух различных антигенов. Примеры мультиспецифических антител могут связываться как РГЭБ, так и с антигеном головного мозга. Мультиспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или в виде фрагментов антител (например, биспецифические антитела F(ab') ) или их комбинаций (например, полноразмерное антитело плюс дополнительные scFv или Fab фрагменты). Также описаны модифицированные антитела с двумя, тремя или более (например, четырьмя) функциональными антигенсвязывающими сайтами (см., например, US 2002/0004587 A1).
«Акцепторные каркасные участки человеческого происхождения» в целях данного описания представляют собой каркасные участки, содержащие аминокислотную последовательность каркасных участков вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасных участков вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящие из каркасной последовательности иммуноглобулина человека или консенсусной каркасной последовательности человеческого происхождения, согласно описанию, приведенному ниже. Акцепторные каркасные участки «происходящие из» каркасных участков иммуноглобулина человека или консенсусных каркасных участков человеческого происхождения могут содержать такую же аминокислотную последовательность или могут иметь замены аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях число аминокислотных замен составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых воплощениях последовательность акцепторной каркасной последовательности VL человеческого происхождения идентична последовательности каркасных участков VL иммуноглобулина человека или консенсусной последовательности каркасных участков человеческого происхождения.
d
«Аффинность» относится к прочности суммы всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и его партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, в данном описании «аффинность связывания» обозначает собственную аффинность связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно в целом охарактеризовать константой диссоциации (k). Аффинность можно определить стандартными способами, известными в области техники, включая описанные в данном документе.
Антитело «зрелой аффинности» относится к антителу с одной или несколькими модификациями в одной или более чем одной гипервариабельной области (HVR, от англ. hypervariable regions), по сравнению с родительским антителом, которое не имеет таких модификаций, указанные модификации приводят к улучшению аффинности антитела или антигена.
Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и охватывает различные структуры антител, включая моноклональные антитела, поликлональные антитела и мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязыващую активность, но не ограничивается ими.
51
51
Термин «антитело-зависимая клеточная цитотоксичность» (ADCC, от англ. antibody-dependent cellular cytotoxicity) обозначает функцию, опосредуемую связыванием Fc-рецептора, и относится к лизису клеток-мишеней, вызываемому антителом по данному описанию в присутствии эффекторных клеток. В одном воплощении ADCC определяют при воздействии на препарат экспрессирующих CD19 клеток эритроидного ряда (например, клеток К562, экспрессирующих рекомбинантный человеческий CD19) антитела по данному описанию в присутствии эффекторных клеток, таких как свежевыделенные МКПК (мононуклеарные клетки периферической крови) или эффекторные клетки, выделенные из лейкоконцентрата, такие как моноциты или естественные киллерные (NK, от англ. natural killer) клетки. Клетки-мишени метят Cr и затем инкубируют с антителом. Меченные клетки инкубируют с эффекторными клетками и анализируют высвобождение Cr в надосадочную жидкость. Контроли включают инкубацию эндотелиальных клеток-мишеней с эффекторными клетками, но в отсутствие антитела. Способность антитела запускать начальные стадии, опосредующие ADCC, исследуют, определяя их связывание с клетками, экспрессирующими рецепторы Fcγ, такими как клетки с рекомбинантной экспрессией FcγRI и/или FcγRIIA или NK клетки (экспрессирующими в основном FcγRIIIA). В одном предпочтительном воплощении определяют связывание с FcγR на NK клетках.
2
«Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, содержащей часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, c которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают Fv, Fab, Fab', Fab’-SH, F(ab'), диатела, линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител (например, scFv) и мультиспецифические антитела, образованные фрагментами антител, но не ограничиваются ими.
Термин «химерное антитело» относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из определенного источника или биологического вида, тогда как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или биологического вида.
1
2
3
4
1
2
«Класс» антитела обозначает тип константного домена или константной области его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них далее подразделяются на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают α, δ, ε, γ и μ, соответственно.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
Термин «цитотоксический агент», используемый в данном описании, относится к веществу, которое ингибирует или препятствует клеточной функции и/или вызывает клеточную гибель или деструкцию. Цитотоксические агенты включают, без ограничения, радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты, подавляющие рост; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или обладающие ферментативной активностью токсины бактерий, грибов, растений или животных, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже.
Термин «комплемент-зависимая цитотоксичность» (CDC, от англ. complement-dependent cytotoxicity) относится к лизису клеток, вызванному антителом по данному описанию в присутствии комплемента. В одном воплощении CDC определяют при воздействии антитела по данному описанию на экспрессирующие CD19 эндотелиальные человеческие клетки в присутствии комплемента. В одном воплощении клетки помечены кальцеином. О наличии CDC свидетельствует лизис 20% или более клеток-мишеней при концентрации 30 мкг/мл. Связывание с компонентом комплемента C1q можно определить посредством ИФА (иммуноферментного анализа). В таком исследовании на поверхности планшета для ИФА иммобилизуют антитело в диапазоне концентраций и добавляют очищенный человеческий C1q или человеческую сыворотку. Связывание C1q определяют при помощи антитела, направленного против C1q, с последующим добавлением меченного пероксидазой конъюгата. Связывание (максимальное связывание Bmax) определяют, как оптическую плотность при 405 нм (OD405) для субстрата пероксидазы ABTS (2,2'-азино-ди-[3-этилбензтиазолин-6-сульфонат (6)]).
«Эффекторные функции» относятся к такой биологической активности, присущей Fc области антитела, которая варьируется в зависимости от класса антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: Связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), связывание Fc-рецепторов, антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточных рецепторов) и активацию B клеток.
Эффекторные функции, зависящие от связывания Fc-рецепторов, могут быть опосредованы взаимодействием Fc-области антитела с Fc-рецепторами (FcR), которые представляют собой специализированные рецепторы клеточной поверхности гемопоэтических клеток. Fc-рецепторы относятся к суперсемейству иммуноглобулинов, и показано, что они опосредуют как элиминацию покрытых антителом патогенов вследствие фагоцитоза иммунных комплексов, так и лизис эритроцитов и многих других клеток-мишеней (например, опухолевых клеток), покрытых соответствующим антителом, благодаря антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см., например, Van de Winkel, J.G. and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524). FcR классифицируют по их специфичности в отношении изотипов иммуноглобулинов: Fc рецепторы к антителам IgG обозначают FcγR. Связывание Fc рецепторов описано, например, Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492; Capel, P.J., et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34; de Haas, M., et al., J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341; and Gessner, J.E., et al., Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248.
Перекрестное связывание рецепторов с Fc-областями IgG антител (FcγR) запускает огромное разнообразие эффекторных функций, включая фагоцитоз, антитело-зависимую клеточную цитотоксичность и высвобождение воспалительных медиаторов, а также удаление иммунных комплексов и регуляцию выработки антител. У человека описано три класса FcγR, а именно:
-
FcγRI (CD64) связывает мономерный IgG с высокой аффинностью и экспрессируется на макрофагах, моноцитах, нейтрофилах и эозинофилах. Модификации Fc-области IgG по меньшей мере по одному аминокислотному остатку из E233-G236, P238, D265, N297, A327 и P329 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat) уменьшают связывание с FcγRI. Остатки в положениях 233–236 IgG2, встроенные в IgG1 и IgG4, уменьшали связывание с FcγRI в 10³ раз и устраняли ответ моноцитов человека на сенсибилизированные антителом красные кровяные клетки (Armour, K.L., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613–2624).
-
FcγRII (CD32) связывает комплексы IgG с афинностью от умеренной до средней и широко экспрессируется. Данный рецептор можно подразделить на два подтипа, FcγRIIA и FcγRIIB. FcγRIIA обнаруживается на многих клетках, задействованных в киллинге (например, макрофагах, моноцитах, нейтрофилах) и по-видимому, способен активировать процесс килинга. FcγRIIB по-видимому играет роль в процессе ингибирования и обнаруживается на B-клетках, макрофагах, а также на тучных клетках и эозинофилах. На B-клетках его функция, по-видимому, заключается в подавлении дальнейшего образования иммуноглобулинов и переключении изотипов, например, на класс IgE. FcγRIIB, находящийся на макрофагах, ингибирует фагоцитоз, опосредуемый FcγRIIA. B-форма, находящаяся на эозинофилах и тучных клетках, может способствовать подавлению активации указанных клеток, опосредованной связыванием IgE с его отдельным рецептором. Сниженное связывание с FcγRIIA обнаруживается, например, у антител, содержащих Fc-область IgG с мутациями по меньшей мере одного аминокислотного остатка из E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 и K414 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat).
-
FcγRIII (CD16) связывает IgG с афинностью от умеренной до средней и существует в двух формах. FcγRIIIA обнаруживается на NK клетках, макрофагах, эозинофилах и некоторых моноцитах и T клетках и опосредует ADCC. FcγRIIIB экспрессируется на высоком уровне на нейтрофилах. Сниженное связывание с FcγRIIIA обнаруживается, например, у антител, содержащих Fc-область IgG с мутациями по меньшей мере одного аминокислотного остатка из E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 и D376 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat).
Картирование сайтов связывания IgG1 человека с Fc-рецепторами, указанные выше сайты мутаций и способы определения связывания с FcγRI и FcγRIIA описаны Shields, R.L., et al. J. Biol.  Chem. 276 (2001) 6591-6604.
«Эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, обозначает количество, эффективное для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата при необходимых дозировках и в течение необходимого периода времени.
Термин «Fc рецептор», используемый в данном описании, относится к активирующим рецепторам, отличающимся наличием цитоплазматическогй последовательности ITAM, ассоциированной с рецептором (см., например, Ravetch, J.V. and Bolland, S., Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290). Такими рецепторами являются FcγRI, FcγRIIA и FcγRIIIA. Термин «отсутствие связывания с FcγR» означает, что при концентрации антитела 10 мкг/мл связывание антитела, описанного в данном документе, с NK клетками составляет 10% или менее от связывания, зарегистрированного для анти-OX40L антитела LC.001, согласно описанию в WO 2006/029879.
Тогда как IgG4 демонстрирует сниженное связывание с FcR, антитела других подклассов IgG демонстрируют выраженное связывание. Однако, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (потеря углевода Fc), Pro329 и 234, 235, 236 и 237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 и His435 представляют собой остатки, модификация которых также снижает связывание с FcR (Shields, R.L., et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; и EP 0 307 434). В одном воплощении антитело по данному описанию относится к подклассу IgG1 или IgG2 и содержит мутацию PVA236, GLPSS331 и/или L234A/L235A. В одном воплощении антитело по данному описанию относится к подклассу IgG4 и содержит мутацию L235E. В одном воплощении антитело дополнительно содержит мутацию S228P.
Термин «Fc область» в данном документе обозначает C-концевой участок тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий по меньшей мере часть константной области.  Термин охватывает последовательности нативных Fc областей и вариантов Fc областей. В одном воплощении Fc область тяжелой цепи IgG человека располагается между Cys226 или Pro230 и карбокси-концом тяжелой цепи. При этом С-концевой лизин (Lys447) Fc области может присутствовать или отстуствовать. Если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков Fc области или константной области соответствует системе нумерации EU, также обозначаемой EU-индекс, описанной Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.
Антитела по данному описанию содержат Fc-область, в одном воплощении Fc-область имеет человеческое происхождение. В одном воплощении Fc-область содержит все части константной области человеческого происхождения. Fc-область антитела непосредственно вовлечена в активацию комплемента, связывание C1q, активацию C3 и связывание Fc-рецепторов. При том, что влияние антитела на систему комплемента зависит от некоторых условий, связывание с C1q обусловлено определенными сайтами связывания в Fc-области. Такие сайты связывания известны в области техники и описаны, например, Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; and EP 0 307 434. Такими сайтами связывания являются, например, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 и P329 (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat; если не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области осуществляется согласно системе нумерации EU, также обозначаемой EU-индекс, описанной Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242). Антитела подклассов IgG1, IgG2 и IgG3 обычно демонстрируют способность активировать комплемент, связывать C1q и активировать C3, тогда как IgG4 не активирует систему комплемента, не связывает C1q и не активирует C3. Термин «Fc-область антитела» хорошо известен специалистам в области техники и основывается на расщеплении антител папаином. В одном воплощении Fc-область представляет собой Fc-область человеческого происхождения. В одном воплощении Fc-область относится к подклассу IgG4, содержит мутации S228P и/или L235E (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat). В одном воплощении Fc-область относится к подклассу IgG1, содержит мутации L234A и/или L235A (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat).
«Каркасные участки» или «FR» (от англ. framework regions) обозначают остатки в составе вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельных участков (HVR, от англ. hypervariable region). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно располагаются в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Термин «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «целое антитело» в данном описании используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу аналогичную структуре нативного антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc область, описанную в данном документе. «Полноразмерное антитело» представляет собой антитело, содержащее вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи (VL, VH), а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут представлять собой константные домены с нативной последовательностью (например, константные домены с нативной последовательностью человеческого происхождения) или варианты аминокислотной последовательности. Более конкретно, полноразмерное антитело содержит две легких цепи антитела (каждая содержит вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи) и две тяжелых цепи антитела (каждая содержит вариабельный домен тяжелой цепи, шарнирный участок и константные домены тяжелой цепи CH1, CH2 и CH3). С-концевые аминокислотные остатки K или GK в двух тяжелых цепях полноразмерного антитела могут присутствовать или отсутствовать, независимо друг от друга. Кроме того, полноразмерное антитело может иметь в составе доменов вставки, мутации и делеции аминокислот, но не делеции целого домена.
Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была внедрена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомков этих клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичные трансформированные клетки и их потомков, независимо от числа пассажей.  Потомство может не быть абсолютно идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновых кислот, но может иметь мутации.  Термины также охватывают потомков с мутациями, обладающих такой же функцией или биологической активностью, как и исходно трансформированные клетки, прошедшие скрининг или отбор.
«Консенсусная каркасная область человеческого происхождения» обозначает каркасную область, представляющую собой наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в выборке каркасных последовательностей VL или VH иммуноглобулина человека. Как правило, последовательности VL или VH иммуноглобулина человека выбирают из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, как в описании Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении, применительно к VL, подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, как в описании Kabat et al., см. выше. В одном воплощении, применительно к VH, подгруппа представляет собой подгруппу III, как в описании Kabat et al., см. выше.
«Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки HVR, не являющиеся человеческими, и аминокислотные остатки FR человеческого происхождения. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, а обычно, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из HVR (например, CDR) соответствуют таковым из иммуноглобулинов, не являющихся человеческими, и все или по существу все FR соответствуют таковым человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящую из человеческого антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например, антитела, не являющегося человеческим, относится к антителу, которое прошло гуманизацию.
Термин «гипервариабельный участок», или «HVR» (от англ. hypervariable region) в данном документе обозначает каждый из участков вариабельных доменов антитела, содержащих гипервариабельные аминокислотные остатки («участки, определяющие комплементарность», или CDR (от англ. сomplementarity determining regions)) и/или формирующих петли определенной структуры («гипервариабельные петли») и/или содержащих остатки, контактирующие с антигеном («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в составе VH (H1, H2, H3) и три в составе VL (L1, L2, L3).
HVR включают:
(а) гипервариабельные петли, образованные аминокислотными остатками 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) (Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(б) CDR, образованные аминокислотными остатками 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(в) контакты с антигеном, образованные аминокислотными остатками 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) и 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); и
(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включая аминокислотные остатки 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) и 94-102 (H3).
Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в составе вариабельного домена (например, остатки FR) пронумерованы согласно Kabat et al., см. выше.
«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более чем одной гетерологичной молекулой, включая цитотоксический агент, но не ограничиваясь им.
«Индивидуум» или «субъект» в данном описании является млекопитающим. Млекопитающие включают одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и не являщихся человеком приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс), но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях индивидуумом или субъектом является человек.
«Выделенное» антитело обозначает антитело, изолированное от компонентов его естественного окружения.  В некоторых воплощениях антитело очищено до степени чистоты более чем 95% или 99% по данным, например, электрофоретического (например, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецил-сульфата натрия (ДСН-ПААГ), изоэлектрического фокусирования (ИЭФ), капиллярного электрофореза) или хроматографического определения (например, с помощью ионообменной или обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)). Обзор способов оценки чистоты антител представлен, например, Flatman et al., J. Chromatogr.  B 848 (2007) 79-87.
«Выделенная» нуклеиновая кислота обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, изолированную от компонентов ее естественного окружения.  Выделенная нуклеиновая кислота охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, как правило содержащих молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты находится внехромосомно или в участке хромосомы, отличном от ее естественного положения на хромосоме.
«Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина» относится к одной или более чем одной молекуле, кодирующей тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такие молекулы нуклеиновых кислот в составе одного вектора или в отдельных векторах, и такие молекулы нуклеиновых кислот присутствуют в клете-хозяине в одном или более чем одном местоположении.
Термин «моноклональное антитело» (mAb) в данном документе обозначает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих естественные мутации или образующиеся в ходе получения препарата моноклональных антител, указанные варианты обычно присутствуют в незначительном количестве. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено против единственной детерминанты антигена. Так, прилагательное «моноклональное» указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с данным изобретением, могут быть получены множеством способов, включая гибридомную технологию, способы ДНК-рекомбинации, способы фагового дисплея и способы, в которых применяют трансгенных животных, содержащих все или часть иммуноглобулиновых локусов человека, но не ограничиваясь ими, такие способы и другие приведенные в качестве примера способы получения моноклональных антител описаны в данном документе.
«Голое антитело» относится к антителу, не конъюгированному с гетерологичной группировкой (например, цитотоксической группировкой) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.
«Нативные антитела» относятся к молекулам иммуноглобулинов естественного происхождения, имеющим различные структуры. Например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины размером приблизительно 150 000 дальтон, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными связями. В направлении от N-конца к C-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также обозначаемую вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следуют три константных домена (CH1, CH2 и CH3), при этом между первым и вторым константными доменами расположен шарнирный участок. Аналогично, в направлении от N-конца к C-концу каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также обозначаемую вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен (CL). В зависимости от аминокислотной последовательности ее константного домена легкая цепь антитела может относиться к одному из двух типов, обозначаемых каппа (κ) и лямбда (λ).
Термин «листовка-вкладыш» используется для обозначения инструкций по применению, обычно вкладываемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях к применению, применении, дозировках, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения этих терапевтических продуктов.
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно референтной полипептидной последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в референтной полипептидной последовательности после выравнивания последовательностей и расстановки пропусков (гэпов), если это необходимо для достижения наибольшего процента идентичности последовательностей, и без принятия каких-либо консервативных замен за часть идентичной последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности может выполняться различными способами, известными в данной области техники, например, с помощью общедоступных компьютерных программ, таких как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить надлежащие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижеия максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для целей настоящего описания, значения % идентичности аминокислотных последовательностей получены при помощи компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 была разработана в компании Genentech, Inc., исходный код был представлен вместе с пользовательской документацией в бюро по охране авторских прав США, Washington D.C., 20559, где было зарегистрировано авторское право под номером TXU510087. Доступ к программе ALIGN-2 можно получить в компании Genentech, Inc., Южный Сан Франциско, Калифорния, или код программы может быть скомпилирован на основе исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилирована для работы на платформе UNIX, включая платформу digital UNIX V4.0D. Все параметры для сравнения последовательностей заданы программой ALIGN-2 и остаются неизменными.
В случаях, когда для сравнения аминокислотных последовательностей используют ALIGN-2, процент идентичности заданной аминокислотной последовательности A с последовательностью В, относительно последовательности В или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью B (что можно также сформулировать как заданная аминокислотная последователность A, имеющая или содержащая определенный процент идентичной аминокислотной последовательности с последовательностью В, относительно последовательности В или по сравнению с заданной аминокислотной последовательностью B) рассчитывают по формуле:
X/Y x 100,
где X это число аминокислотных остатков, которые были расценены программой для выравнивания последовательностей ALIGN-2 как абсолютные совпадения при выравнивании A и B в рамках этой программы, и где Y это общее число аминокислотных остатков в B. Следует принимать во внимание, что когда длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, процент идентичности аминокислотной последовательности A с последовательностью B не будет равен проценту идентичности аминокислотной последовательности B с последовательностью A. Если не указано иначе, все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, приведенные здесь, получены согласно описанию в предыдущем параграфе о применении компьютерной программы ALIGN-2.
Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, которая обеспечивает эффективное проявление биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будут вводить композицию.
«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.
Используемый в данном документе термин «лечение» (и его грамматические производные, такие как «лечить» или «проводить лечение») обозначает клиническое вмешательство в попытке изменить естественный ход заболевания у индивидуума, получающего лечение, и может осуществляться как для профилактики, так и при наличии патологического состояния. Желательные эффекты лечения включают предупреждение возникновения или повторного проявления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение любых прямых или непрямых патологических последствий заболевания, предупреждение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях антитела по изобретению применяют, чтобы отсрочить развитие заболевания или чтобы замедлить прогрессирование заболевания.
Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» обозначает домен тяжелой или легкой цепи антитела, который вовлечен в связывание антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют схожую структуру, каждый домен содержит четыре консервативных каркасных области (FR) и три гипервариабельных области (HVR). (См., например, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91). Для обеспечения антигенсвязывающей специфичности может быть достаточно одного домена VH или VL. Кроме того, антитела, связывающиеся с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH или VL домен антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL или VH доменов, соответственно. См., например, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).
Термин «вектор», используемый в данном документе, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной передавать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин охватывает вектор как самореплицирующуюся нуклеиновокислотную структуру, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в данном документе обозначают «экспрессирующими векторами».
II. КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ
В одном аспекте изобретение основано на том, что, с одной стороны биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина по данному описанию обладает улучшенными свойствами. В некоторых воплощениях предложены биспецифические антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина. Предложенные в данном изобретении антитела могут найти применение, например, в диагностике или лечении болезни Альцгеймера.
А. Примеры биспецифических антител к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина
В одном аспекте изобретения предложены выделенные биспецифические антитела, которые связываются с человеческим бета-амилоидом и человеческим рецептором трансферрина. Антитела представляют собой биспецифические антитела, состоящие из полноразмерного основного антитела и слитого Fab-фрагмента с перекрестной заменой некоторых доменов. Таким образом, полученное биспецифическое антитело является асимметричным. Таким образом, биспецифическое антитело получают при помощи технологии гетеродимеризации, называемой выступы-во-впадины, используя первую тяжелую цепь с так называемыми мутациями типа «выступ» (HCknob) и вторую тяжелую цепь с так называемыми мутациями типа «впадина» (HChole).
Антитело 0012, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из четырех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 06 - 09.
Антитело 0012 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее
а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и
б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,
где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домен легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),
где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),
где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что вариабельный домен легкой цепи (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) заменены друг на друга, и
где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.
Антитело 0015, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из четырех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 01 - 03 и последовательность SEQ ID NO: 10.
Антитело 0015 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее
а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и
б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,
где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домен легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),
где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),
где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и
где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.
Антитело 0020, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из трех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 - 13.
Антитело 0020 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее
а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и
б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,
где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),
где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),
где дополнительный Fab-фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, представляет собой одноцепочечный Fab-фрагмент и
где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.
Антитело 0024, которое также представляет собой аспект данного изобретения, состоит из четырех полипептидов, которые имеют аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 - 17.
Антитело 0024 представляет собой биспецифическое антитело, содержащее
а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и
б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,
где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и
где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.
Для рекомбинантного получения биспецифических антител применяли различные расположения/комбинации соответствующих полипептидов в различных экспрессирующих плазмидах и различные соотношения полученных плазмид. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.
<b>антитело</b>
<b>соотношение плазмид</b>
<b>относительная площадь пика [%]</b><b>(КЭ-ДСН; невосстанавливающие условия)</b>
LC
½ mAb впадина
димер с цепями  впадина-впадина
мономер антитела
0012
1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
12
9
78
0012
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
1
9
9
79
0012
1(LC+HChole):3(Hcknob+LC):1(LCcross)
6
9
9
75
0015
1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
7
23
62
0015
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
4
17
75
0015
1(LC+HChole):3(Hcknob+LC):1(LCcross)
4
20
66
0020
1(HChole+LC):4(HCknob+LCcross)
16
11
72
Биспецифические антитела получали в небольшом количестве и анализировали спектр побочных продуктов после первой стадии очистки посредством аффинной хроматографии с белком А и после второй стадии очистки посредством эксклюзионной хроматографии. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.
<b>антитело</b>
<b>соотношение плазмид</b>
<b>выход мономерного продукта при культивировании в 3 л после препаративной очистки с белком А</b><b>(КЭ-ДСН невосстан./</b><b>выход)</b>
<b>спектр побочных продуктов</b><b>(КЭ-ДСН невосстан.)</b>
<b>LC</b>
<b>½ mAb впадина</b>
<b>димер с цепями впадина-впадина + </b><sup><b>3</b></sup><b>/</b><sub><b>4</b></sub><b> mAb</b>
0012
1:1:3
65 %13,3 мг
3 %
28 %
3,5 %
0024
1:1:3
70 %14,8 мг
6 %
15 %
7 %
0015
1:1:3
85 %15,8 мг
4 %
5 %
5 %
0020
1:4
29 %6 мг
11 %
44 %
8 %
<b>антитело</b>
<b>соотношение плазмид</b>
<b>выход мономерного продукта при культивировании в 3 л после препаративной очистки с белком А и препаративной ЭХ</b><b>(КЭ-ДСН невосстан./</b><b>выход)</b>
<b>спектр побочных продуктов</b><b>(КЭ-ДСН невосстан.)</b>
<b>LC</b>
<b>½ mAb впадина</b>
<b>димер впадина-впадина + </b><sup><b>3</b></sup><b>/</b><sub><b>4</b></sub><b> mAb</b>
0012
1:1:3
>90 %2,8 мг
5 %
3 %
2,5 %
0024
1:1:3
78 %4 мг
11 %
5 %
6 %
0015
1:1:3
>95 %5,8 мг
1 %
0,5 %
1 %
0020
1:4
68 %0,8 мг
13 %
10 %
8,6 %
<b>антитело</b>
<b>соотношение плазмид</b>
<b>выход мономера из 3 л после препаративной очистки  с белком A</b><b>по данным ЭХ</b>
<b>побочные продукты по данным ЭХ  [%]</b>
<b>конечный продукт по данным ЭХ</b>
<b>побочные продукты по данным ЭХ  [%]</b>
<b>ВМ</b>
<b>НМ</b>
<b>ВМ</b>
<b>НМ</b>
0012
1:1:3
78 %
0
22
97,5 %
0
2,5
0024
1:1:3
80 %
0
20
96 %
0
4
0015
1:1:3
87 %
0
13
97 %
0
3
0020
1:4
53 %
7
40
97 %
0
3
Сайт связывания бета-амилоида содержит дополнительный сайт гликозилирования. Поэтому исследовали гликозилирование. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.
<b>антитело</b>
<b>соотношение плазмид</b>
<b>HChole HCknob</b>КЭ-ДСН; восстан.;отн. площ. пика [%]
неглик.
глик.
неглик.
глик.
0012
1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
10
14
8
18
0012
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
9
13
8
21
0012
1(LC+HChole):3(Hcknob+LC):1(LCcross)
10
13
7
18
0015
1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
7
16
5
25
0015
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
6
16
5
29
0015
1(LC+HChole):3(Hcknob+LC):1(LCcross)
7
15
6
26
0020
1(HChole+LC):4(HCknob+LCcross)
9
18
7
21
Процентная доля негликозилированного Fab при культивировании в объеме 3 л после очистки с применением белка А
<b>антитело</b>
<b>соотношение плазмид</b>
<b>HChole HCknob</b>
КЭ-ДСН; восстанавл.
неглик.
глик.
неглик.
глик.
0012
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
23
77
10
90
0015
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
16
84
8
92
0024
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
16
84
7,5
92,5
Процентная доля негликозилированного Fab при культивировании в объеме 3 л после очистки с применением белка А и эксклюзионной хроматографии
<b>антитело</b>
<b>соотношение плазмид</b>
<b>HChole HCknob</b>
КЭ-ДСН; восстанавл.
неглик.
глик.
неглик.
глик.
0012
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
8
92
6
94
0015
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
10
90
4,5
95,5
0024
1(LC):1(HChole+LC):3(HCknob+LCcross)
8
92
4,5
95,5
Стабильность биспецифических антител исследовали при инкубации в течение 14 суток в буферном растворе с определенными значениями pH. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.
<b>параметр</b>
<b>антитело 0012</b>
<b>антитело 0015</b>
<b>антитело 0024</b>
относительное связывание с бета-амилоидом (1-40) по данным BIAcore
14 суток, pH 6,0, 40 °C, His/NaCl буфер
87 %
96 %
97 %
14 суток, pH 7,4, 37 °C, PBS буфер
82 %
86 %
101 %
относительное связывание с человеческим рецептором трансферрина по данным  BIAcore
14 суток, pH 6,0, 40 °C, His/NaCl буфер
101 %
91 %
93 %
14 суток, pH 7,4, 37 °C, PBS буфер
78 %
85 %
90 %
Температура агрегации антител 0015 и 0024 составляла приблизительно 53-55°C, а для антитела 0012 приблизительно 54-56°C.
d
Скорость диссоциации (k в [1/мс]) при связывании человеческого рецептора трансферрина по результатам определения на биоанализаторе BIAcore была сопоставимой для антител 0015 и 0024, а также для родительского антитела к человеческому рецептору трансферрина при 25 °C, 37 °C и 40 °C: от 1,86E-02 до 1,97E-02, от 1,98E-2 до 2,03E-2 и 1,44E-02, соответственно.
Бета-амилоид-специфическая эффекторная функция всех антител была сопоставима с родительским моноспецифическим антителом к бета-амилоиду при исследовании с использованием клеток U937. Результаты представлены в таблице, приведенной ниже.
<b>антитело</b>
<b>IL-8 [нг/мл]</b>
<b>IP-10 [нг/мл]</b>
родительское антитело к бета-амилоиду
5
4,3
антитело-0012
7
5,3
антитело-0015
-
5
антитело-0020
7
4,5
антитело-0024
8
5,2
Ни одно из биспецифических антител не демонстрировало активации нейтрофилов in vitro.
Таким образом, антитело 0015 демонстрировало подходящие свойства и, следовательно, является предпочтительным аспектом изобретения. Кроме того, данное антитело обладает улучшенными свойствами, которые, среди прочих, включают улучшенный профиль побочных продуктов.
В одном аспекте данного изобретения предложено биспецифическое антитело, содержащее:
а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и
б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,
где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),
где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо аминокислотного остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),
где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и
где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид, и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина.
Другим аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее
а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и
б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,
где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),
где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо аминокислотного остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),
где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и
где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина,
где сайт связывания человеческого бета-амилоида содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 18, и последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 19 и
где сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 20, и последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную SEQ ID NO: 21.
В некоторых воплощениях последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно референтной последовательности, но при этом сайт связывания, содержащий указанную последовательность, сохраняет способность связываться со своим антигеном. В некоторых воплощениях осуществлена замена, вставка и/или делеция всего от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 18 или 20. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции возникают в участках за пределами HVR (т.е. в FR).
В некоторых воплощениях последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции относительно референтной последовательности, но при этом сайт связывания, содержащий указанную последовательность, сохраняет способность связываться со своим антигеном. В некоторых воплощениях осуществлена замена, вставка и/или делеция всего от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 19 или 21. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции возникают в участках за пределами HVR (т.е. в FR).
В одном воплощении сайт связывания человеческого бета-амилоида содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 18, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 19, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.
В одном воплощении сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит последовательность VH, приведенную в SEQ ID NO: 20, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности, и последовательность VL, приведенную в SEQ ID NO: 21, включая посттрансляционные модификации указанной последовательности.
В одном воплощении биспецифическое антитело содержит
i) легкую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 01 на 70-100 %, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,
ii) тяжелую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 02 на 70-100 %, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,
iii) легкую цепь, последовательность которой идентична SEQ ID NO: 03 на 70-100 %, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более, и
iv) Fab фрагмент тяжелой цепи, последовательность которого идентична последовательности SEQ ID NO: 04 на 70-100 %, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или 95% или более,
где
SEQ ID NO: 01 имеет аминокислотную последовательность DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC,
SEQ ID NO: 02 имеет аминокислотную последовательность QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG,
SEQ ID NO: 03 имеет аминокислотную последовательность AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYRASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYASSNVDNTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC и
SEQ ID NO: 04 имеет аминокислотную последовательность QSMQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSSYAMSWIRQHPGKGLEWIGYIWSGGSTDYASWAKSRVTISKTSTTVSLKLSSVTAADTAVYYCARRYGTSYPDYGDASGFDPWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.
Другим аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее
а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи специфически свяываются с первым антигеном, и
б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,
где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),
где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо аминокислотного остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),
где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и
где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина,
где сайт связывания человеческого бета-амилоида содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19 и
где сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
Другим аспектом, описанным в данном документе, является биспецифическое антитело, содержащее
а) одно полноразмерное антитело, содержащее по две пары полноразмерных легких цепей антитела и полноразмерных тяжелых цепей антитела, где сайты связывания, образованные каждой парой полноразмерной тяжелой цепи и полноразмерной легкой цепи, специфически свяываются с первым антигеном, и где полноразмерное антитело содержит Fc-область, образованную полипептидами Fc-области, каждый из которых содержит домены CH1, CH2 и CH3, двух полноразмерных тяжелых цепей и
б) один дополнительный Fab фрагмент, где дополнительный Fab фрагмент слит с C-концом одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела, где сайт связывания дополнительного Fab фрагмента специфически связывается со вторым антигеном,
где каждая из полноразмерных легких цепей антитела содержит в константном домене легкой цепи (CL) в положении 123 аминокислотный остаток аргинин (вместо остатка дикого типа - глутаминовой кислоты; мутация E123R) и в положении 124 аминокислотный остаток лизин (вместо остатка дикого типа - глутамина; мутация Q124K) (нумерация согласно Kabat),
где каждая из полноразмерных тяжелых цепей антитела содержит в первом константном домене тяжелой цепи (CH1) в положении 147 остаток глутаминовой кислоты (вместо остатка дикого типа - лизина; мутация K147E) и в положении 213 остаток глутаминовой кислоты (вместо аминокислотного остатка дикого типа - лизина; мутация K213E) (нумерация согласно системе EU-индекс, предложенной Kabat),
где дополнительный Fab фрагмент, специфически связывающийся со вторым антигеном, содержит кроссовер доменов, так что константный домен легкой цепи (CL) и 1 константный домен тяжелой цепи (CH1) заменены друг на друга, и
где первый антиген представляет собой человеческий белок бета-амилоид и второй антиген представляет собой человеческий рецептор трансферрина,
где сайт связывания человеческого бета-амилоида содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19,
где сайт связывания человеческого рецептора трансферрина содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и
где полипептиды Fc-области относятся
а) к подклассу IgG1 человека,
б) к подклассу IgG4 человека,
в) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A и P329G,
г) к подклассу IgG4 человека с мутациями S228P, L235E и P329G,
д) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A и P329G в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно,
е) к подклассу IgG4 человека с мутациями S228P и P329G в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно,
ж) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A, P329G, I253A, H310A и H435A в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно,
з) к подклассу IgG1 человека с мутациями L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T и T256E в обоих полипептидах Fc-области и мутациями T366W и S354C в одном полипептиде Fc-области и мутациями T366S, L368A, Y407V и Y349C в другом полипептиде Fc-области, соответственно, или
и) полноразмерное человеческое антитело подкласса IgG1 с мутациями L234A, L235A, P329G, H310A, H433A и Y436A в обеих тяжелых цепях и мутациями i) T366W и ii) S354C или Y349C в одной тяжелой цепи и мутациями i) T366S, L368A и Y407V и ii) Y349C или S354C в другой тяжелой цепи, соответственно.
В следующем аспекте биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина согласно любому из вышеуказанных воплощений может иметь любой из признаков, описанных в разделах 1-3 ниже, в отдельности или в комбинации.
1. Химерные и гуманизированные антитела
,
В некоторых воплощениях предложенное антитело представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в патенте US 4,816,567, а также Morrison, S.L. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). В одном примере химерное антитело содержит вариабельный участок, не являющийся человеческим (например, вариабельный участок, происходящий из организма мыши, крысы, хомяка, кролика или не являющегося человеком примата, такого как обезьяна), и константный участок человеческого происхождения. В следующем примере химерное антитело представляет собой антитело «с переключенным классом», у которого класс или подкласс были изменены по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела включают также их антигенсвязывающие фрагменты.
В некоторых воплощениях химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело, не являющееся человеческим, подвергают гуманизации, чтобы снизить иммуногенность для человека, при этом сохраняя специфичность и аффинность родительского антитела, не являющегося человеческим. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или более чем один вариабельный домен, в котором HVR, например, CDR (или их части) происходят из антитела, не являющегося человеческим, а каркасные участки FR (или их части) происходят из последовательностей антитела человека. Гуманизированное антитело необязательно может также содержать по меньшей мере часть константной области человеческого антитела. В некоторых воплощениях некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками антитела, не являющегося человеческим (например, антитела из которого получены аминокислотные остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.
,
Гуманизированные антитела и способы их получения описаны, например, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, и дополнительно описаны, например, Riechmann, I. et al.Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5, 821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, and US 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (описание пересадки областей, определяющих специфичность (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (описание «изменения поверхности»); Dall’Acqua, W.F., et al., Methods 36 (2005) 43-60 (описание «перетасовки FR»); Osbourn, J., et al., Methods 36 (2005) 61-68; and Klimka, A., et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (описание подхода «направленного отбора» при перетасовке FR).
Каркасные области человеческого происхождения, которые можно использовать для гуманизации, включают: каркасные области, выбранные с помощью метода «наилучшего соответствия» (см., например, Sims, M.J., et al.,J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; каркасные области, происходящие из консенсусной последовательности человеческих антител с вариабельными участками легких или тяжелых цепей определенной подгруппы (см., например, Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; and Presta, L.G., et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); зрелые каркасные области человеческого происхождения (с соматическими мутациями) или каркасные области первичных антител (см., например, Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633) и каркасные области, полученные при скрининге библиотек FR (см., например, Baca, M., et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684; and Rosok, M.J., et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618), но не ограничиваются ими.
2. Человеческие антитела
В некоторых воплощениях предложенное антитело представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получать различными способами, известными в области техники. Человеческие антитела описаны van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 and Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.
TM
Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному, чтобы продуцировать интактные человеческие антитела или интактные антитела с вариабельными участками человеческого происхождения в ответ на введение антигена. Такие животные обычно имеют все или часть локусов иммуноглобулинов человека, заменяющие локусы эндогенных иммуноглобулинов, находящиеся вне хромосом или случайным образом интегрированные в хромосомы животных. У таких трансгенных мышей локусы эндогенных иммуноглобулинов обычно бывают инактивированы. Обзор способов получения человеческих антител в трансгенных животных представлен Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125. См. также, например, US 6,075,181 и US 6,150,584, где описана технология XENOMOUSE; US 5,770,429 где описана технология HuMab; US 7,041,870 где описана технология K-M MOUSE, и US 2007/0061900, где описана технология VelociMouse). Вариабельные участки человеческого происхождения интактных антител, полученных в таких животных, могут быть далее модифицированы, например, путем комбинации с различными константными участками человеческого происхождения.
,
Антитела человека могут также быть получены при помощи гибридомной технологии. Описаны клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мышь-человек для продукции моноклональных человеческих антител. (См., например, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63; and Boerner, P. et al.,J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Также описаны человеческие антитела, полученные с применением гибридомной технологии с использованием B-клеток человека Li, J. et al.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Дополнительные способы включают те, что описаны, например, в патенте US 7,189,826 (описание получения моноклональных антител человека класса IgM из гибридомных клеточных линий) и Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (описание гибридом человек-человек). Технология человеческих гибридом (технология триом) также описана Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 и Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.
Человеческие антитела могут быть получены путем выделения последовательностей вариабельных доменов Fv клонов, отобранных из библиотек фагового дисплея, созданных на основе генов человека. Такие последовательности вариабельных доменов затем могут быть объединены с необходимым константным доменом человека. Технологии для отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
3. Варианты антител
В некоторых воплощениях рассматриваются варианты аминокислотных последовательностей предложенных в данном документе антител.  Например, может требоваться улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела.  Варианты аминокислотных последовательностей антитела могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки и/или замены остатков в составе аминокислотной последовательности антитела. Для получения конечной конструкции можно осуществлять любые комбинации делеций, вставок и замен, при условии, что конечная конструкция будет обладать желаемыми характеристиками, например, связыванием антигена.
а) Варианты с заменами, вставками и делециями
В некоторых воплощениях предложены варианты антитела, имеющие одну или более аминокислотных замен. Сайты, предствляющие интерес для проведения замещающего мутагенеза включают HVR и FR. Консервативные замены представлены в Таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более значительные замены представлены в Таблице 1 под заголовком «примеры замен» и подробнее описаны ниже, с указанием классов боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно вводить в антитело, представляющее интерес, и проводить скрининг полученных продуктов на предмет желаемой активности, например, сохранения/улучшения связывания антигена или понижения иммуногенности или улучшения ADCC или CDC.
ТАБЛИЦА
<b>Исходный остаток</b>
<b>Примеры замен</b>
<b>Предпочтительные замены</b>
Ala (A)
Val; Leu; Ile
Val
Arg (R)
Lys; Gln; Asn
Lys
Asn (N)
Gln; His; Asp, Lys; Arg
Gln
Asp (D)
Glu; Asn
Glu
Cys (C)
Ser; Ala
Ser
Gln (Q)
Asn; Glu
Asn
Glu (E)
Asp; Gln
Asp
Gly (G)
Ala
Ala
His (H)
Asn; Gln; Lys; Arg
Arg
Ile (I)
Leu; Val; Met; Ala; Phe; норлейцин
Leu
Leu (L)
норлейцин; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Ile
Lys (K)
Arg; Gln; Asn
Arg
Met (M)
Leu; Phe; Ile
Leu
Phe (F)
Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr
Tyr
Pro (P)
Ala
Ala
Ser (S)
Thr
Thr
Thr (T)
Val; Ser
Ser
Trp (W)
Tyr; Phe
Tyr
Tyr (Y)
Trp; Phe; Thr; Ser
Phe
Val (V)
Ile; Leu; Met; Phe; Ala; норлейцин
Leu
Аминокислоты можно разбить на группы с общими свойствами боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) отрицательно заряженные: Asp, Glu;
(4) положительно заряженные: His, Lys, Arg;
(5) влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены влекут за собой замещение представителя одного из этих классов представителем другого класса.
Один вид замен включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(е) вариант(ы), отбираемый(е) для дальнейшего изучения, будет(ут) иметь модификации (например, улучшение) определенных биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) по сравнению с родительским антителом и/или будут по существу сохранять определенные биологические свойства родительского антитела. Примером варианта с заменами является антитело, прошедшее аффинное созревание, которое может получено стандартным способом, например, технологии аффинного созревания на основе фагового дисплея, описанной в данном документе. Вкратце, осуществляют мутации одного или более чем одного остатка HVR и проводят скрининг вариантов антитела, экспрессируемых фагом, по определенной биологической активности (например, аффинности связывания).
Изменения (например, замены) могут осуществляться внутри HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения можно проводить в «горячих точках» HVR, т.е. в остатках, кодируемых кодонами, которые в процессе соматического созревания с высокой частотой подвергаются мутациям (см., например, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), и/или остатках, контактирующих с антигеном, а у полученных вариантов VH или VL исследовать аффинность связывания. Увеличение аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. В некоторых воплощениях для повышения аффинности увеличивают разнообразие вариабельных генов, выбранных для аффинного созревания, любым из существующих способов (например, ПЦР пониженной точности, комбинирования вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). После этого создают вторичную библиотеку. Затем проводят скрининг библиотеки для выявления любых вариантов антител с необходимой аффинностью. Другой способ повышения изменчивости включает методы, нацеленные на изменение HVR, в которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, одновременно 4-6 остатков). HVR остатки, задействованные в связывании антигена, можно специально идентифицировать, например, при помощи аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. В частности, изменениям часто подвергаются CDR-H3 и CDR-L3.
В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции могут возникать в составе одного или нескольких HVR, при условии, что такие изменения существенным образом не снижают способность антитела связывать антиген. Например, могут быть выполнены консервативные замены в HVR (например, консервативные замены, представленные в данном документе), которые существенным образом не снижают аффинность связывания. Такие замены, например, могут не затрагивать остатки HVR, контактирующие с антигеном. В некоторых воплощениях каждый HVR либо остается без изменений, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен в составе вариантов последовательностей VH и VL, приведенных выше.
Эффективным способом выявления остатков или участков антитела, которые могут быть мишенями направленного мутагенеза, является так называемый "аланин-сканирующий мутагенез", описанный Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. В этом способе выявляют аминокислотный остаток или группу таргетных остатков (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) и замещают нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), чтобы выяснить, изменится ли взаимодействие антитела с антигеном. Если при первоначальной замене аминокислот происходят изменения функциональных свойств молекулы, в этих положениях можно проводить дальнейшие замены. В альтернативном варианте или в качестве дополнения можно провести анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для выявления точек контакта между антителом и антигеном. Такие остатки, задействованные в контактах, а также соседние с ними остатки могут быть выбраны или не выбраны в качестве кандидатов для замен. Можно проводить скрининг вариантов, чтобы выявить у них наличие желаемых свойств.
Вставки аминокислотных последовательностей включают слияния по амино- и/или карбокси-концу, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сотни или более остатков, а также вставки одного или нескольких аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионила. Другие варианты молекулы антитела с вставками включают слияние N- или C-конца антитела с ферментом (например, ADEPT) или полипептидом, увеличивающим время полужизни антитела в сыворотке.
б) Варианты с измененным гликозилированием
В некоторых воплощениях предложенное антитело модифицировано для повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования антитела можно осуществлять стадартным способом, изменяя аминокислотную последовательность таким образом, чтобы создать или удалить один или несколько сайтов гликозилирования.
В случае, когда антитело содержит Fc область, можно изменять присоединенные к ней углеводы. Нативные антитела, продуцируемые в клетках млекопитающих, обычно содержат разветвленные двухантенные олигосахариды, которые, как правило, присоединены посредством N-гликозидной связи к Asn297 CH2 домена Fc области. См., например, Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32. Олигосахариды могут включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволе» двухантенной олигосахаридной структуры. В некоторых воплощениях для создания вариантов антитела с некоторыми улучшенными свойствами можно модифицировать олигосахариды в составе антитела, предложенного в данном описании.
В одном воплощении предложены варианты антител, имеющие углеводную структуру, присоединенную (напрямую или опосредовано) к Fc участку, в которой отсутствует фукоза. Например, содержание фукозы в таком антителе может составлять от 1% до 80%, от 1% до 65%, от 5% до 65% или от 20% до 40%. Количество фукозы определяют путем расчета среднего содержания фукозы в составе углеводной цепи, присоединенной к Asn297, относительно суммы всех гликоструктур, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), при масс-спектрометрическом определении MALDI-TOF, например, согласно описанию WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, находящийся приблизительно в положении 297 в области Fc (нумерация остатков в области Fc приведена в соответствии с системой EU); однако, вследствие незначительных вариаций в последовательности антител Asn297 может также находиться на расстоянии ± 3 аминокислот от положения 297 по ходу или против хода танскрипции, т.е., между положениями 294 и 300. Такие варианты с модифицированным фукозилированием могут проявлять повышенную ADCC. См, например, US 2003/0157108; US 2004/0093621. Примеры публикаций, относящихся к «дефукозилированным» или «лишенным фукозы» вариантам антител, включают: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO 2005/053742; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al.,J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N. et al.,Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622. Примеры клеточных линий, способных продуцировать дефукозилированные антитела, включают клетки Lec13 CHO с нарушением фукозилирования белков (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys.249 (1986) 533-545; US 2003/0157108 и WO 2004/056312, в частности, Пример 11) и клеточные линии с нокаутом, например, гена α-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, клетки CHO с нокаутом (см., например, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688 и WO 2003/085107).
Также известны варианты антител с разделенными надвое олигосахаридами, например, в которых двухантенный олигосахарид, присоединенный к Fc области антитела, разделен надвое GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь пониженное содержание фукозы и/или повышенную ADCC. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в WO 2003/011878; US 6,602,684; and US 2005/0123546. Также предложены варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в составе олигосахарида, присоединенного к Fc области. Такие варианты антител могут обладать улучшенной CDC функцией. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.
в) Варианты с модификациями Fc области
В некоторых воплощениях в Fc область антитела, описанного в данном документе, могут быть введены одна или две аминокислотные модификации, и таким образом получены варианты Fc области. Вариант с модификацией Fc области может содержать последовательность Fc области человеческого происхождения (например, Fc области IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях.
in vivo
in vitro
in vivo
in vitro
in vivo
in vivo
В некоторых воплощениях изобретения рассматривается вариант антитела, обладающий некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, которые делают его подходящим кандидатом для применений, в которых важное значение имеет время полужизни антитела , однако некоторые эффекторные функции (например, комплемент- и антитело-зависимая клеточная цитотоксичность) являются необязательными или нежелательными. Для подтверждения снижения/устранения CDC и/или ADCC активностей можно проводить исследование цитотоксичности  и/или . Например, исследование связывания с Fc рецепторами (FcR) можно проводить для подтверждения того, что антитело не связывается с FcγR (следовательно, по всей вероятности, не обладает ADCC активностью), но сохраняет способность связывать FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные, касающиеся экспрессии FcR на гемопоэтических клетках, кратко изложены в Таблице 3 на стр. 464 в публикации Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Не являющиеся исчерпывающими примеры исследований , позволяющих оценить ADCC активность молекулы, представляющей интерес, описаны в US 5,500,362 (см., например, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063 и Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5,821,337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). В альтернативном варианте можно использовать нерадиоактивные методы исследования (см., например, нерадиоактивный метод исследования цитотоксичности для проточной цитометрии ACTI™ (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; и нерадиоактивный метод исследования цитотоксичности CytoTox 96 (Promega, Madison, WI).  Подходящие эффекторные клетки для таких исследований включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и естественные киллерные клетки (NK). В альтернативном варианте или в качестве дополнения ADCC активность молекулы, представляющей интерес, можно оценивать , например, в модели на животных, такой как описанная Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Можно также исследовать связывание C1q для подтверждения того, что антитело не способно связывать C1q и, следовательно, не обладает CDC активностью. См., например, определение связывания C1q и C3c методом ИФА в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно выполнять исследование CDC (см., например, Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). Можно также исследовать связывание FcRn и клиренса/времени полужизни , используя способы, известные в области техники (см., например, Petkova, S.B. et al., Int.  Immunol. 18 (2006: 1759-1769).
Антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких остатков в положениях 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 Fc области (US 6,737,056). Такие мутанты Fc области включают мутанты Fc области с заменами двух или более аминокислот в положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемые Fc мутанты «DANA» с заменой остатков в положениях 265 и 297 на аланин (US 7,332,581).
Описаны некоторые варианты антител с улучшенным или ослабленным связыванием с FcR. (См., например, US 6,737,056; WO 2004/056312, and Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
В некоторых воплощениях вариант антитела содержит Fc область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые улучшают ADCC, например, заменами в положениях 298, 333 и/или 334 в Fc области (нумерация остатков согласно EU).
В некоторых воплощениях изменения затрагивают Fc область и вызывают изменение (т.е. улучшение или ослабление) связывания C1q и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в US 6,194,551, WO 99/51642 и Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.
Антитела с увеличенным временем полужизни и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором FcRn, отвечающим за транспорт материнских IgG к плоду (Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, and Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), описаны в US 2005/0014934. Эти антитела содержат Fc область с одной или несколькими заменами, которые улучшают связывание Fc области с FcRn. Такие варианты с модификациями Fc включают варианты с заменами одного или нескольких остатков Fc области в положениях: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, с заменой остатка в положении 434 в Fc области (US 7,371,826).
См. также Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821 и WO 94/29351, касающиеся других примеров вариантов с модификациями Fc области.
г) Модифицированные цистеином варианты антител
В некоторых воплощениях может быть целесообразным создание модифицированных цистеином антител, например, «thioMAbs», в которых один или несколько остатков антитела заменены остатками цистеина. В конкретных воплощениях замененные остатки располагаются в доступных сайтах антитела. При замене этих остатков на цистеин реакционноспособные тиоловые группы размещаются в доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгирования антитела с другими группировками, например, лекарственными группировками или группировками линкер-лекарство, для создания конъюгата антитела, согласно описанию ниже. В некоторых воплощениях цистеином могут быть заменены любой или любые из следующих остатков: V205 легкой цепи (нумерация по Кабат); A118 тяжелой цепи (нумерация EU) и S400 тяжелой цепи (нумерация EU) Fc области тяжелой цепи. Модифицированные цистеином антитела могут быть получены, как описано, например, в патенте US 7,521,541.
д) Производные антител
В некоторых воплощениях предложенное антитело может быть также модифицировано с целью введения дополнительных небелковых группировок, известных в данной области техники и легко доступных. Группировки, подходящие для получения производных антитела, включают водорастворимые полимеры, но не ограничиваются ими. Не являющиеся исчерпывающими примеры водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1, 3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и случайные сополимеры) и декстран или поли(n-винил пирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пролипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерол), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются ими. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества при производстве благодаря своей стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать и в случае присоединения более, чем одного полимера, их молекулы могут быть идентичными или различаться. Как правило, число и/или тип полимеров, применяемых для получения производных, может определяться исходя из того, какие конкретные свойства или функции антитела нуждаются в улучшении, и того, будет ли производное антитела применяться в терапии при определенных условиях, и т.д., но не ограничиваться данными соображениями.
В другом воплощении предложены конъюгаты антитела и небелковые группировки, которые могут избирательно нагреваться под воздействием излучения. В одном воплощении, небелковая группировка представляет собой углеродную нанотрубку (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). Излучение может иметь любую длину волны, включая, но не ограничиваясь длинами волн, не повреждающими обычные клетки, но нагревающими небелковый компонент до температуры, которая вызывает гибель клеток, расположенных вблизи небелковой группировки антитела.
Б. Рекомбинантные способы и композиции
Антитела могут быть получены с применением рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте US 4,816,567. В одном воплощении предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина, описанное в данном документе. Такая нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, содержащую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела).  В следующем воплощении предложены один или более векторов (например, экспрессирующие векторы), содержащие такую нуклеиновую кислоту.  В следующем воплощении предложена клетка-хозяин, содержащая такую нуклеиновую кислоту. В одном из таких воплощений клетка-хозяин содержит (например, в результате трансформации): 1) вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В одном воплощении клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (CHO, от англ. Chinese Hamster Ovary) или лимфоидную клетку (например, клетку Y0, NS0, Sp20).  В одном воплощении предложен способ получения биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, описанное выше, при условиях, подходящих для экспрессии антитела, и возможно, выделение антитела из клетки-хозяина (или среды культивирования клетки-хозяина).
Для рекомбинантной продукции биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина выделяют нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, как описано выше, и встраивают в один или несколько векторов для последующего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанную нуклеиновую кислоту можно легко выделить и секвенировать при помощи стандартных методов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, способных специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).
E. coli
Клетки-хозяева, подходящие для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают клетки прокариот или эукариот, описанные в данном документе. Например, антитела могут производиться в бактериях, в частности, когда гликозилирование и эффекторные функции Fc не являются необходимыми. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, US 5,648,237, US 5,789,199 и US 5,840,523. (См. также Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254, описывающие экспрессию фрагментов антител в). После экспрессии антитело можно выделить из бактериальной массы в виде растворимой фракции и затем очистить.
Кроме прокариот в качестве хозяев для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитела, подходят микроорганизмы-эукариоты, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, у которых пути гликозилирования были «гуманизированы» для обеспечения продукции антитела с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. См. Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414 и Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
Spodoptera frugiperda
Клетки-хозяева, подходящие для экспрессии гликозилированных антител, также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Также были найдены многочисленные штаммы бакуловирусов, которые могут использоваться совместно с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток .
TM
В качестве хозяев также можно использовать культуры клеток растений. См., например, патенты US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 и US 6,417,429 (описывающие технологию PLANTIBODIES для получения антител в трансгенных растениях).
В качестве хозяев также могут использоваться клетки позвоночных.  Например, можно использовать линии клеток млекопитающих, адаптированные для роста в суспензии. Другими примерами линий клеток млекопитающих, используемых в качестве хозяев, являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированных SV40 (COS-7); линия человеческих эмбриональных клеток почки (293 или клетки 293, например, согласно описанию Graham, F.L., et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); клеток почки новорожденного хомяка (BHK); мышиных клеток Сертоли (клетки TM4, например, согласно описанию Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); клеток почки обезьяны (CV1); клеток почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клеток карциномы шейки матки человека (HELA); клеток почки собаки (MDCK); клеток печени крысы буффало (BRL 3A); клеток легких человека (W138); клеток печени человека (Hep G2); клеток опухоли молочной железы мыши (MMT 060562); клеток TRI (например, согласно описанию Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68); клеток MRC 5 и клеток FS4. Другие линии клеток млекопитающих, используемых в качестве хозяев, включают клетки яичников китайского хомячка (CHO), включая клетки DHFR- CHO (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220) и линии клеток миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток млекопитающих, подходящих в качестве хозяев для получения антител, представлен, например, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268.
В. Способы и композиции для диагностики и определения
В некоторых воплощениях любое из предложенных в данном документе биспецифических антител к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина можно применять для определения наличия бета-амилоида в биологическом образце. Термин «определение» в данном описании охватывает количественное и качественное определение. В некоторых воплощениях биологический образец включает клетку или ткань.
in vitro
in vivo
В одном воплощении предложено биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина для применения в способе диагностики или определения. В следующем аспекте предложен способ определения наличия бета-амилоида в биологическом образце. В некоторых воплощениях способ включает приведение в контакт биологического образца с биспецифическим антителом к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина, описанным в данном документе, в условиях, подходящих для связывания биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина, и определение, образовался ли комплекс между биспецифическим антителом к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина и бета-амилоидом. Такой способ может представлять собой способ  или способ .
32
14
125
3
131
В некоторых воплощениях предложены меченые биспецифические антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина. Метки охватывают детектируемые напрямую метки или группировки (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также группировки, например, ферменты или лиганды, детектируемые опосредовано, например, при помощи ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия, но не ограничиваются ими. Примеры меток включают радиоизотопы P, C, I, H и I, флуорофоры, например, хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (US 4,737,456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP, от англ. horseradish peroxidase), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уриказа и ксантин-оксидаза, связанные с ферментом, использующим пероксид водорода для окисления хромогена, таким как пероксидаза хрена, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы, и им подобные, но не ограничиваются ими.
Г. Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина, описанные в данном документе, изготавливают в форме лиофилизированных композиций или водных растворов путем смешивания такого антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими возможными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). Фармацевтически приемлемые носители в используемых дозировках и концентрациях, как правило, являются нетоксичными для реципиентов и включают: буферы, например, фосфатный, цитратный и содержащие другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; углеводы, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлами (например, комплексы  Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), но не ограничиваются ими. Примеры фармацевтически приемлемых носителей в данном документе также включают средства диспергирования лекарственных средств в интерстициальном пространстве, такие как активные в нейтральных условиях растворимые гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы PH-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX, Baxter International, Inc.). Примеры некоторых sHASEGPs и способов их применения, включая rHuPH20, описаны в US 2005/0260186 и US 2006/0104968. В одном аспекте sHASEGP дополнительно комбинируют с одной или более чем одной гликозаминогликаназой, такой как хондроитиназа.
Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в патенте US 6,267,958. Водные композиции антител включают описанные в патентах US 6,171,586 и WO 2006/044908, композиции в последнем включают гистидин-ацетатный буфер.
Композиции могут также содержать более одного активного ингредиента, необходимых при конкретных показаниях к терапии, предпочтительно, обладающих комплементарной активностью и не оказывающих друг на друга отрицательного влияния. Такие активные ингредиенты соответственно находятся в комбинации в количествах, эффективных для намеченного использования.
Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, приготовленные, например, с помощью технологии коацервации или полимеризации на границе раздела фаз, например, в микрокапсулы гидроксиметилцеллюлозы или желатина и микрокапсулы поли-(метилметакрилата), соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных препаратов (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики описаны Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980).
Можно изготавливать препараты с пролонгированным высвобождением. Примеры подходящих препаратов с пролонгированным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, в которых матрицы находятся в форме профилированных изделий, например, в виде пленок или микрокапсул. Примеры матриц с пролонгированным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт)), полилактиды (US 3,773,919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и γ этил-L-глутамата, недеградируемый этилен-винилацетат, деградируемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимеров молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролида ацетата) и поли-D-(-)-3-гидроксибутировую кислоту.
Композиции, предназначенные для введения in vivo, как правило, стерильны. Стерильность может быть достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. В одном воплощении композиция является изотонической.
Д. Терапевтические способы и композиции
В терапевтических способах может применяться любое биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина, предложенное в данном изобретении.
В одном аспекте предложено биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина для применения в качестве лекарственного средства. В других аспектах предложено биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина для применения в предупреждении и/или лечении заболевания, ассоциированного с амилоидогенезом и/или образованием амилоидных бляшек. В некоторых воплощениях предложено биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина для применения в способе лечения. В некоторых воплощениях предложено биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина для применения в способе лечения индивидуума, имеющего заболевание, ассоциированное с амилоидогенезом и/или образованием амилоидных бляшек, включающем введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, такого как перечисленные ниже агенты, или антитела к pTau или альфа-синуклеину. В следующих воплощениях предложено биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина для применения в ингибировании образования бляшек и/или дезинтеграции β-амилоидных бляшек. В некоторых воплощениях предложено биспецифическое антитело к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина для применения в способе ингибирования образования бляшек и/или дезинтеграции β-амилоидных бляшек у индивидуума, включающем введение индвидууму эффективного количества биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина для ингибирования образования бляшек и/или дезинтеграции β-амилоидных бляшек. «Индивидуум» согласно любому из вышеперечисленных воплощений предпочтительно является человеком.
В следующем аспекте изобретения предложено применение биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина в изготовлении лекарственного средства. В одном воплощении лекарственное средство предназначено для лечения заболевания, ассоциированного с амилоидогенезом и/или образованием амилоидых бляшек. В следующем воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения заболевания, ассоциированного с амилоидогенезом и/или образованием амилоидных бляшек, включающем введение индвидууму, имеющему заболевание, ассоциированное с амилоидогенезом и/или образованием амилоидных бляшек, эффективного количества лекарственного средства. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, такого как перечисленные ниже агенты, или антитела к pTau или альфа-синуклеину. В следующем воплощении лекарственное средство предназначено для ингибирования образования бляшек и/или дезинтеграции β-амилоидных бляшек. В следующем воплощении лекарственное средство предназначено для применения в способе ингибирования образования бляшек и/или дезинтеграции β-амилоидных бляшек у индивидуума, включающем введение индвидууму эффективного количества лекарственного средства для ингибирования образования бляшек и/или дезинтеграции β-амилоидных бляшек. «Индивидуум» согласно любому из вышеперечисленных воплощений может быть человеком.
В следующем аспекте изобретения предложен способ лечения заболевания, ассоциированного с амилоидогенезом и/или образованием амилоидных бляшек. В одном воплощении способ включает введение индивидууму, имеющему заболевание, ассоциированное с амилоидогенезом и/или образованием амилоидных бляшек, эффективного количества биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина. В одном из таких воплощений способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, такого как перечисленные ниже агенты, или антитела к pTau или альфа-синуклеину. «Индивидуум» согласно любому из вышеперечисленных воплощений может быть человеком.
В следующем аспекте предложен способ ингибирования образования бляшек и/или дезинтеграции β-амилоидных бляшек у индивидуума. В одном воплощении способ включает введение индивидууму эффективного количества биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина для ингибирования образования бляшек и/или дезинтеграции β-амилоидных бляшек. В одном воплощении «индивидуум» является человеком.
В следующем аспекте предложены фармацевтические композиции, включающие любое из биспецифических антител к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина, предложенных в данном изобретении, например, для применения в любом из описанных выше терапевтических способов. В одном воплощении фармацевтическая композиция содержит любое из биспецифических антител к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина, предложенных в данном изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель.  В другом воплощении фармацевтическая композиция содержит любое из биспецифических антител к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина, предложенных в данном изобретении, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, приведенный ниже, или антитело к pTau или альфа-синуклеину.
Антитела, описанные в данном документе, могут применяться либо в виде монотерапии, либо в комбинации с другими агентами. Например, антитело, описанное в данном документе, можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом.  В некоторых воплощениях дополнительный терапевтический агент является эффективным для лечения того же неврологического нарушения, для лечения которого применяют биспецифическое антитело, описанное в данном документе, или иного неврологического нарушения. Примеры дополнительных терапевтических агентов включают: различные неврологические препараты, описанные выше, ингибиторы холинэстеразы (такие как донезепил, галантамин, ровастигмин и такрин), антагонисты рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDA) (такие как мемантин), ингибиторы агрегации бета-амилоида, антиоксиданты, модуляторы γ-секретазы, миметики фактора роста нервов (NGF, от англ. nerve growth factor) или генную терапию NGF, агонисты рецепторов, активируемых пероксисомными пролифераторами (PPARy, от англ. Peroxisome proliferator-activated receptors), ингибиторы 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент А редуктазы (статины), ампакины, блокаторы кальциевых каналов, антагонисты рецептора гамма-аминомасляной кислоты, ингибиторы киназы гликогенсинтазы, внутривенный иммуноглобулин, агонисты мускариновых рецепторов, модуляторы никотинового рецептора, активную или пассивную иммунизацию бета-амилоидом, ингибиторы фосфодиэстеразы, антагонисты серотониновых рецепторов и антитела к бета-амилоиду, но не ограничиваются ими. В некоторых воплощениях по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент выбирают по его способности подавлять один или более чем один побочный эффект неврологического препарата.
Такие комбинированные терапии, упомянутые выше, включают комбинированное введение (когда два или более терапевтических агентов включены в состав одного или нескольких препаратов) и раздельное введение, когда введение антитела по изобретению осуществляют до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента или агентов. В одном воплощении введение введение биспецифического антитела к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина и введение дополнительного терапевтического агента происходит в течение приблизительно одного месяца или в течение приблизительно одной, двух или трех недель, или в течение приблизительно одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дней. Антитела, описанные в данном документе, также можно применять в комбинации с другими вмешательствами, такими как лучевая терапия, психотерапия или другие виды терапии, известными в области техники и подходящими для лечения или предупреждения неврологического нарушения.
Антитело, описанное в данном документе (и любой дополнительный терапевтический агент), можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, при необходимости местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять любым подходящим способом, например, посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является ли введение краткосрочным или длительным. В данном описании предусматриваются различные режимы дозирования, включающие однократное или многократное введение через различные промежутки времени, болюсное введение и пульсовое введение, но не ограничивающиеся ими.
Антитела, предложенные в данном изобретении, изготавливают, дозируют и вводят в соответствии с требованиями надлежащей медицинской практики. Факторы, которые необходимо при этом учитывать, включают конкретное заболевание, лечение которого осуществляют, конкретное млекопитающее, получающее лечение, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место введения агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные медицинскому персоналу. Антитело не обязательно, но возможно находится в комбинации с одним или более чем одним агентом, используемым на данный момент для предупреждения или лечения обсуждаемого нарушения. Эффективное количество этих иных агентов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа нарушения или лечения, а также других факторов, обсуждавшихся выше. Как правило, их применяют в таких же дозировках и вводят такими же способами, как описанные в данном документе, или как приблизительно от 1 до 99% описанных здесь дозировок, или в любой дозировке и любым способом, который считаются подходящим на основе эмпирических/клинических данных.
Способы переноса слитой конструкции или соединения через ГЭБ, основанные на использовании липидов, включают инкапсулирование слитой конструкции или соединения в липосомы с присоединенным к ним моновалентным связывающим компонентом, который связывается с рецепторами на сосудистом эндотелии ГЭБ (см., например, US 2002/0025313), и заключение моновалентного связывающего компонента в частицы липопротеина низкой плотности (см., например, US 2004/0204354) или связывание с аполипопротеином Е (см., например, US 2004/0131692), но не ограничиваются ими.
Соответствующая дозировка антитела по изобретению (при использовании отдельно или в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами) для предупреждения или лечения заболевания будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводят ли антитело в целях профилактики или лечения, от предшествующего лечения, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также от выбора лечащего врача. Подходящим является введение антитела пациенту однократно или в ходе серии процедур. В зависимости от типа и тяжести заболевания возможная первоначальная дозировка антитела для введения пациенту может составлять от приблизительно 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5 мг/кг - 10 мг/кг), например, в виде одного или нескольких отдельных введений, или в виде непрерывной инфузии. Типичная суточная доза может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. При повторном введении на протяжении нескольких дней или более, в зависимости от патологического состояния, лечение должно длиться до тех пор, когда не наступит желаемое подавление симптомов заболевания. Одним из примеров дозировки антитела может быть диапазон от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту можно вводить одну или несколько доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации). Эти дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получил от приблизительно двух до приблизительно двадцати, или, например, приблизительно шесть доз антитела). Можно производить введение первоначальной ударной дозы с последующим введением одной или нескольких более низких доз. Однако, можно применять и другие режимы дозирования. Успешность такой терапии легко отслеживать при помощи известных методик и тестов.
Очевидно, что в любой из вышеупомянутых комбинаций или в любом из вышеупомянутых терапевтических способов в качестве альтернативы или дополнения к биспецифическому антителу к человеческому бета-амилоиду/человеческому рецептору трансферрина можно применять иммуноконъюгат, описанный в данном документе.
III. Изделия
В другом аспекте изобретения предложено изделие, содержащее материалы, которые могут найти применение в лечении, предупреждении и/или диагностике нарушений, описанных выше. Изделия содержат контейнер и этикетку или листовку-вкладыш, размещенную на контейнере или ассоциированную с контейнером. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, пакеты с раствором для внутривенного введения и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая самостоятельно или в комбинации с другой композицией является эффективной при лечении, предупреждении и/или диагностике патологических состояний, и может иметь отверстие для стерильного доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон с пробкой, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный ингредиент в композиции представляет собой антитело, предложенное в данном документе. На этикетке или листовке-вкладыше указано, что композицию применяют для лечения соответствующего патологического состояния. Кроме того, изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит антитело по изобретению и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Изделие в данном воплощении может дополнительно содержать листовку-вкладыш с указанием, что композиции можно применять в лечении конкретного патологического состояния. В качестве альтернативы или дополнения изделие может также содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, например, бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может также содержать другие материалы, привлекательные с коммерческой и с потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Очевидно, что любое из вышеупомянутых изделий в качестве альтернативы или дополнения к биспецифическому антителу, описанному в данном документе, может включать в себя иммуноконъюгат, описанный в данном документе.
IV. ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ниже приведены примеры способов и композиций по изобретению. Следует понимать, что возможны и другие варианты воплощений, в соответствии с приведенным выше описанием.
Материалы и общие методы
Общая информация, относящаяся к нуклеотидным последовательностям легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов человека, представлена Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Нумерация аминокислот в цепях антитела указана согласно Kabat (Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
Методы рекомбинирования ДНК
Для манипуляций с ДНК применяли стандартные методы, описанные Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали в соответствии с инструкциями производителя.
Синтез генов
Необходимые генные сегменты получали из олигонуклеотидов, полученных при помощи химического синтеза. Длинные генные сегменты, фланкированные уникальными сайтами для расщепления рестрикционными эндонуклеазами, собирали путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая амплификацию ПЦР, и затем клонировали по указанным сайтам рестрикции. Последовательности ДНК субклонированных фрагментов генов верифицировали посредством секвенирования ДНК. Фрагменты синтезируемых генов заказывали в соответствии с техническими условиями Geneart (Регенсбург, Германия).
Определение последовательности ДНК
Последовательности ДНК определяли посредством секвенирования двух цепей в компаниях MediGenomix GmbH (Мартинсрид, Германия) или SequiServe GmbH (Фатерштеттен, Германия).
Анализ последовательностей ДНК и белка и обработка данных секвенирования
Для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей использовали пакет программ GCG's (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) версии 10.2 и набор программных инструментов Infomax's Vector NT1 Advance версии 8.
Экспрессирующие векторы
Для экспрессии описанных биспецифических антител можно применять экспрессирующие плазмиды для транзиторной экспрессии (например, в клетках HEK293), используя промотор CMV с интроном А или без интрона А при организации в виде кДНК либо промотор CMV при организации в виде геномной ДНК.
Помимо кассеты для экспрессии антитела векторы содержат:
- ориджин репликации, позволяющий данной плазмиде реплицироваться в E. coli, и
- ген ß-лактамазы, обеспечивающий резистентность E. coli к ампициллину.
Транскрипционная единица гена антитела состоит из следующих элементов:
- уникальный(е) сайт(ы) рестрикции на 5’ конце,
- немедленный ранний энхансер и промотор цитомегаловируса человека,
- последовательность интрона A в случае организации в виде кДНК,
- 5’-нетранслируемая область, происходящая из гена антитела человека,
- сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
- нуклеиновая кислота, кодирующая соответствующую цепь антитела, либо в виде кДНК, либо имеющая геномную экзон-интронную организацию,
- 3’ нетранслируемая область с сигнальной последовательностью полиаденилирования и
- уникальный(е) сайт(ы) рестрикции на 3’ конце.
Слитые гены, кодирующие цепи антитела, получают при помощи ПЦР и/или синтеза генов и осуществляют их сборку известными рекомбинантными способами и методами, соединяя соответствующие сегменты нуклеиновых кислот, например, используя уникальные рестрикционные сайты в соответствующих векторах. Последовательности субклонированных нуклеиновых кислот верифицировали посредством секвенирования ДНК. Для транзиторной трансфекции плазмиды получали в большем количестве, выделяя плазмиды из культур трансформированных E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).
Для всех конструкций применяли технологию гетеродимеризации выступы-во-впадины с типичной заменой T366W, приводящей к образованию выступа в первом CH3 домене и соответствующими заменами T366S, L368A и Y407V, приводящими к образованию впадин во втором CH3 домене (а также дополнительно внедряли два остатка цистеина S354C/Y349’C) (располагающиеся в соответствующих последовательностях тяжелой цепи (HC), приведенных выше).
Методы культивирования клеток
Использовали стандартные методы культивирования клеток, описанные в Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.
Транзиторные трансфекции в системе HEK293-F
6
6
2
Биспецифические антитела получали посредством транзиторной экспрессии. Для этого осуществляли трансфекцию соответствующими плазмидами с использованием системы HEK293-F (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Вкратце, клетки HEK293-F (Invitrogen), культивируемые в суспензии либо во встряхиваемой колбе, либо в ферментере с перемешиванием в бессывороточной среде для экспрессии FreeStyle™ 293 (Invitrogen), трансфицировали смесью соответствующих экспрессирующих плазмид с помощью реагента 293fectin™ или fectin (Invitrogen). Для 2 л встряхиваемой колбы (Corning) клетки HEK293-F высаживали в плотности 1,0*10 клеток/мл в 600 мл и инкубировали при 120 об/мин, 8% CO. На следующие сутки клетки трансфицировали в плотности приблизительно 1,5*10 клеток/мл с использованием приблизительно 42 мл смеси: A) 20 мл среды Opti-MEM (Invitrogen), содержащей суммарно 600 мкг плазмидной ДНК (1 мкг/мл) и B) 20 мл среды Opti-MEM с добавлением 1,2 мл реагента 293 fectin или fectin (2 мкг/мл). В зависимости от потребления глюкозы в процессе ферментации добавляли раствор глюкозы. Надосадочную жидкость, содержащую секретируемое антитело, собирали через 5-10 суток и либо выделяли антитела непосредственно из надосадочной жидкости, либо надосадочную жидкость замораживали и хранили.
Определение белка
Для очищенных антител и производных определяли концентрацию белка путем измерения оптической плотности (ОП) при 280 нм, с использованием молярного коэффициента экстинкции, рассчитанного на основе аминокислотной последовательности согласно Pace, et al., Protein Science 4 (1995) 2411-1423.
Определение концентрации антител в надосадочной жидкости
Концентрацию антител и производных в культуральной надосадочной жидкости оценивали посредством иммунопреципитации с использованием гранул агарозы с белком А (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия). Так, 60 мкл гранул агарозы с белком А трехкратно промывали TBS-NP40 (50 мМ Tris буфер, pH 7,5 с добавлением 150 мМ NaCl и 1% Nonidet-P40). Затем 1-15 мл культуральной надосадочной жидкости наносили на гранулы агарозы с белком А, предварительно уравновешенные TBS-NP40. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре гранулы промывали однократно на колонке Ultrafree-MC-filter (Amicon) 0,5 мл TBS-NP40, двукратно 0,5 мл 2x фосфатно-солевым буфером (2xPBS, Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) и быстро четырехкратно 0,5 мл 100 мМ Na-цитратным буфером (pH 5,0). Связанное антитело элюировали добавлением 35 мкл буфера для нанесения образца NuPAGE LDS (Invitrogen). Половину образца смешивали с восстанавливающим агентом для образца NuPAGE или оставляли невосстановленным, соответственно, и нагревали в течение 10 мин при 70°C. Затем 5-30 мкл вносили в 4-12% гель NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen) (с буфером MOPS для электрофореза в ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях и буфером MES с добавлением реагента NuPAGE antioxidant (Invitrogen) в электродный буфер для ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях) и окрашивали Кумасси синим.
2
4
Количественное определение концентрации антител в культуральной надосадочной жидкости осуществляли при помощи аффинной ВЭЖХ. Вкратце, культуральную надосадочную жидкость, содержащую антитела, которые связывались с белком А, наносили на колонку Applied Biosystems Poros A/20 в 200 мМ KHPO, 100 мМ цитрата натрия, pH 7,4 и элюировали  200 мМ NaCl, 100 мМ лимонной кислоты, pH 2,5 в системе Agilent HPLC 1100. Количественное определение элюированного антитела проводили по поглощению в УФ области, измеряя площади пиков. В качестве стандарта использовали очищенное стандартное IgG1 антитело.
В альтернативном варианте концентрацию антител и производных в культуральной надосадочной жидкости определяли посредством сэндвич-IgG-ИФА. Вкратце, на 96-луночных планшетах для микротитрования StreptaWell с высокой связывающей способностью, покрытых стрептавидином (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия), иммобилизовали биотинилированные молекулы F(ab’)2<h-Fcγ> BI (Dianova), захватывающие человеческий IgG, по 100 мкл/лунку в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре или, в альтернативном варианте, в течение ночи при 4°C и затем промывали трехкратно 200 мкл/лунку PBS, содержащим 0,05% Tween (PBST, Sigma). Затем в лунки добавляли серийные разведения в PBS (Sigma) культуральной надосадочной жидкости, содержащей соответствующее антитело, по 100 мкл/лунку и инкубировали в течение 1-2 ч на качалке при комнатной температуре. Лунки трехкратно промывали PBST в количестве по 200 мкл/лунку и для определения связанного антитела добавляли детектирующее антитело F(ab‘)2<hFcγ>POD (Dianova) в количестве 100 мкл и концентрации 0,1 мкг/мл и инкубировали в течение 1-2 часов на качалке при комнатной температуре. Несвязанное детектирующее антитело удаляли посредством трехкратной промывки PBST по 200 мкл/лунку. Связанное детектирующее антитело определяли путем добавления ABTS по 100 мкл/лунку и последующей инкубации. Поглощение при длине волны 405 нм определяли при помощи спектрометра Tecan Fluor (референтная длина волны 492 нм).
Препаративная очистка антитела
Антитела выделяли из профильтрованной культуральной надосадочной жидкости в соответствии со стандартными протоколами. Вкратце, антитела наносили на колонку с сефарозой, конъюгированной с белком А (GE healthcare), и промывали PBS. Антитела элюировали при pH 2,8 с последующей немедленной нейтрализацией. Агрегированный белок отделяли от мономерных антител посредством эксклюзионной хроматографии (Superdex 200, GE Healthcare) в PBS или в 20 мМ гистидиновом буфере, содержащем 150 мМ NaCl (pH 6,0). Фракции, содержащие мономерное антитело, объединяли, концентрировали (при необходимости), например, используя центрифужный концентратор MILLIPORE Amicon Ultra (НОММ 30), замораживали и хранили при -20°C или -80°C. Часть образцов использовали для последующего определения белка и аналитического исследования, например, посредством ДСН-ПААГ, эксклюзионной хроматографии (ЭХ) или масс-спектрометрии.
ДСН-ПААГ
Готовые системы гелей NuPAGE (Invitrogen) использовали в соответствии с инструкциями производителя. В частности, использовали готовые системы 10% или 4-12% гелей NuPAGE Novex Bis-TRIS (pH 6,4) и электродный буфер NuPAGE MES (для электрофореза в восстанавливающих условиях, с добавлением в электродный буфер реагента NuPAGE antioxidant) или MOPS (для электрофореза в невосстанавливающих условиях).
Капиллярный электрофорез в присутствии ДСН (КЭ-ДСН)
Чистоту и интактность антитела исследовали посредством КЭ-ДСН, используя микрофлюидную технологию Labchip (PerkinElmer, USA). Так, 5 мкл раствора антитела подготавливали для анализа КЭ-ДСН с использованием набора реагентов HT Protein Express согласно инструкциям производителя и анализировали с использованием системы LabChip GXII и чипа HT Protein Express. Для анализа данных использовали программу LabChip GX.
Аналитическая эксклюзионная хроматография
2
4
2
4
Для определения агрегации и олигомерного состояния антител выполняли ВЭЖХ в варианте эксклюзионной хроматографии (ЭХ). Вкратце, антитела, очищенные с использованием белка А, наносили на колонку Tosoh TSKgel G3000SW в 300 мМ NaCl, 50 мМ KHPO/KHPO буфере (pH 7,5) в системе Dionex Ultimate (Thermo Fischer Scientific) или на колонку Superdex 200 (GE Healthcare) в 2 x PBS в системе Dionex HPLC. Количественное определение элюированного антитела проводили по поглощению в УФ области, измеряя площади пиков. В качестве стандарта использовали стандарт для гель-фильтрации BioRad 151–1901.
Масс-спектрометрия
В данном разделе описано исследование характеристик биспецифических антител с уделением особого внимания правильности их сборки. Искомые первичные структуры анализировали посредством масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (ESI-MS) дегликозилированного интактного антитела и в особых случаях дегликозилированного антитела, подвергшегося ограниченному расщеплению эндопротеиназой LysC.
Дегликозилирование антител осуществляли с помощью N-гликозидазы F в фосфатном или Tris буфере при 37°C в течение времени до 17 ч при концентрации белка 1 мг/мл. Осуществляли ограниченное расщепление 100 мкг дегликозилированного антитела с помощью LysC (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) в Tris буфере (pH 8) при комнатной температуре в течение 120 часов или при 37°C в течение 40 мин, соответственно. Перед масс-спектрометическим анализом образцы обессоливали при помощи ВЭЖХ на колонке Sephadex G25 (GE Healthcare). Общую массу определяли посредством ESI-MS с использованием системы maXis 4G UHR-QTOF MS (Bruker Daltonik), оборудованной источником ионов TriVersa NanoMate (Advion).
Анализ химического разрушения
Образцы делили на три аликвоты и забуферивали 20 мМ His/His*HCl, 140 мМ NaCl, pH 6,0 или PBS, соответственно, и хранили при 40 °C (His/NaCl) или 37 °C (PBS). Контрольный образец хранили при -80 °C.
После окончания инкубации определяли относительную активную концентрацию (BIAcore), агрегацию (ЭХ) и фрагментацию (капиллярный электрофорез или ДСН-ПААГ) и сравнивали с контролем, который не подвергался воздействию.
Термостабильность
Готовили образцы с концентрацией 1 мг/мл в 20 мМ растворе гистидин/гистидина хлорид, 140 мМ NaCl, pH 6,0, переносили в оптически прозрачный 384-луночный планшет путем центрифугирования через 0,4 мкм фильтровальный планшет и покрывали парафиновым маслом. Гидродинамический радиус определяли по динамическому светорассеиванию с помощью считывающего устройства для планшетов DynaPro (Wyatt) при нагревании образцов от 25 °C до 80 °C со скоростью 0,05 °C/мин.
В альтернативном варианте образцы переносили в 10 мкл микрокюветы и регистрировали статическое светорассеивание и флуоресценцию при возбуждении лазерным излучением с длиной волны 266 нм при помощи инструмента Optim1000 (Avacta Inc.) при нагревании от 25 °C до 90 °C со скоростью 0,1 °C/мин.
Температуру начала агрегации определяли, как температуру, при которой гидродинамический радиус (DLS) или интенсивность рассеянного светового излучения (Optim1000) начинали увеличиваться.
В альтернативном варианте образцы переносили в 9 мкл ячейки мультикюветы. Мультикюветы, помещенные в инструмент Optim1000 (Avacta Analytical Inc.), нагревали от 35 °C до 90 °C с постоянной скоростью 0,1 °C/минуту. Прибор непрерывно регистрирует интенсивность рассеянного лазерного излучения с длиной волны 266 нм приблизительно через каждые 0,5 °C. На графике откладывали зависимость интенсивности рассеянного светового излучения от температуры. Температуру начала агрегации (T_agg) определяли, как температуру, при которой интенсивность рассеянного светового излучения (Optim1000) начинала увеличиваться.
Температуру плавления определяли, как точку перегиба графика зависимости интенсивности флуоресценции от длины волны.
Пример 1
Экспрессия и очистка
Биспецифические антитела получали, как описано выше в разделе «Материалы и методы».
Биспецифические антитела выделяли из надосадочной жидкости при помощи аффинной хроматографии с белком А и эксклюзионной хроматографии. Полученные продукты идентифицировали посредством масс-спектрометрии, аналитические характеристики, такие как чистота, определяли при помощи КЭ-ДСН, а также определяли содержание мономеров и стабильность.
Искомые первичные структуры анализировали посредством масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (ESI-MS) дегликозилированного интактного антитела и дегликозилированного антитела, подвергнутого расщеплению плазмином, или в альтернативном варианте дегликозилированного антитела, подвергнутого ограниченному расщеплению эндопротеиназой LysC, как описано в разделе «Общие методы».
Дополнительные аналитические методы (например, исследование термостабильности, масс-спектрометрический анализ и исследования функциональной активности) применяли только после очистки с использованием белка А и эксклюзионной хроматографии.
Пример 2.
Определение связывания с фибриллами Aβ1-40 in vitro при помощи ИФА
Связывание биспецифических антител с фибриллярным Aβ определяли при помощи ИФА. Вкратце, Aβ(1-40) в концентрации 7 мкг/мл в PBS иммобилизовали на планшетах Maxisorb в течение 3 суток при 37°C для получения фибриллярного A-бета и затем высушивали в течение 3 ч при комнатной температуре. Планшет блокировали 1% раствором CroteinC и 0,1% RSA в PBS (блокирующий буфер) в течение 1 ч при комнатной температуре и затем однократно промывали отмывочным буфером. Биспецифические антитела или контроли добавляли в концентрации до 100 нМ в блокирующем буфере и инкубировали при 4°C в течение ночи. После 4 стадий отмывки конструкции определяли посредством добавления антитела к IgG человека, конъюгированного с пероксидазой хрена (Jackson Immunoresearch), в разведении 1:10 000 в блокирующем буфере (1 час при комнатной температуре), после чего осуществляли 6-кратную отмывку и инкубировали с тетраметилбензидином (TMB) (Sigma). Развитие окрашивания останавливали добавлением 1 N HCl и определяли поглощение при 450 нм.
Пример 3.
Определение связывания с рецептором трансферрина in vitro
4
Связывание биспецифических антител с мышиным рецептором трансферрина определяли при помощи проточной цитометрии (FACS) с использованием клеток миеломы мыши X63.AG8-563. Если антитело к Aβ демонстрирует некоторую тенденцию к неспецифическому связыванию с клетками Ag8, специфическое связывание можно определить при совместной инкубации с 20-кратным избытком антитела к TfR мыши. Клетки собирали посредством центрифугирования, однократно отмывали PBS и 5x10 клеток инкубировали с серией разведений от 1,5 пМ до 10 нМ слитого полипептида с добавлением или без добавления 200 нМ антитела к TfR мыши в 100 мкл RPMI/10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS) в течение 1,5 ч на льду. После 2 отмывок RPMI/10% FCS клетки инкубировали с козьим антителом к IgG человека, конъюгированным с фикоэритрином (Jackson Immunoresearch) в разведении 1:600 в RPMI/19% FCS в течение 1,5 ч на льду. Затем клетки снова промывали, ресуспендировали в RPMI/10% FCS и определяли флуоресценцию фикоэритрина на приборе FACS-Array (Becton-Dickinson).
Пример 4.
Исследование взаимодействия с человеческим TfR методом поверхностного плазмонного резонанса
Исследование связывания проводили на биоанализаторе BIAcore B 4000 (GE Healthcare) с сенсор-чипом C1 (GE Healthcare, кат. номер BR1005-35), предварительно обработанным для захвата Fab фрагментов антитела человека (GE Healthcare, кат. номер 28-9583-25) с использованием стандартной процедуры связывания по аминогруппе согласно инструкциям производителя.
Для измерения кинетики образцы антитела иммобилизовали в течение 60 секунд при скорости тока 10 мкл/мин в фосфатно-солевом буфере pH 7,4, 0,05 % Tween 20 при 25 °C. Рекомбинантный человеческий рецептор трансферрина с гексагистидиновой меткой (R&D systems, кат. номер 2474-TR-050) использовали в увеличивающихся концентрациях и регистрировали сигнал с течением времени. В среднем интервал времени, в течение которого регистрировали ассоциацию, составлял 150 секунд, а интервал времени, в течение которого регистрировали диссоциацию, составлял 600 секунд, скорость потока составляла 30 мкл/мин. Данные аппроксимировали с использованием модели связывания 1:1 (изотерма Ленгмюра).
Пример 5.
Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание нативных β-амилоидных бляшек человека на срезах головного мозга пациентов с болезнью Альцгеймера с использованием биспецифического антитела, предложенного в изобретении
Биспецифические антитела также можно исследовать по способности окрашивать нативные β-амилоидные бляшки человека в иммуногистохимическом иследовании с использованием метода непрямой иммунофлуоресценции. Таким образом можно продемонстрировать специфическое и чувствительное окрашивание естественных человеческих β-амилоидных бляшек. Криостатные срезы нефиксированной ткани височных долей коры, полученной посмертно у пациентов с положительным диагнозом болезни Альцгеймера, окрашивали методом непрямой иммунофлуоресценции. Для определения связывания биспецифического антитела проводили двухстадийную инкубацию, для детекции использовали аффинно очищенное козье антитело (GAH555) к IgG (H+L) человека, конъюгированное с красителем Alexa 555 (Molecular Probes). Контроли могут включать посторонние IgG1 антитела человека (Sigma), а также только вторичное антитело, и должны давать отрицательные результаты.
Пример 6.
Окрашивание β-амилоидных бляшек in vivo при помощи биспецифического антитела, предложенного в данном изобретении, на модели болезни Альцгеймера у мышей
Биспецифическое антитело можно исследовать на мышах, трансгенных по APP/PS2, мышиной модели амилоидоза, ассоциированного с БА (Richards, J. Neuroscience, 23 (2003) 8989-9003), по способности к иммунному окрашиванию β-амилоидных бляшек in vivo. Это позволяет оценить степень проникновения в головной мозг и связывания с β-амилоидными бляшками. Слитый полипептид можно вводить в различных дозировках в сравнении с голым моноклональным антителом к Aβ, через 6 суток вводить животному фосфатно-солевой буферный раствор, замораживать головной мозг на сухом льду и подготавливать для изготовления срезов.
Наличие антител, связанных с β-амилоидными бляшками, можно оценивать методом непрямой флуоресценции с одним маркером, инкубируя нефиксированные криостатные срезы с козьим антителом к IgG (H+L) человека, конъюгированным с красителем Alexa555 (GAH555) (Molecular Probes), в концентрации 15 мкг/мл в течение 1 часа при комнатной температуре. Контр-окрашивание амилоидных бляшек можно осуществлять путем инкубации с BAP-2, мышиным моноклональным антителом к Aβ, конъюгированным с Alexa 488 в концентрации 0,5 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре. Слайды заключают в заливочную среду (S3023 Dako) и визуализируют при помощи конфокальной лазерной микроскопии.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в некоторых деталях при помощи иллюстраций и примеров в целях исключения двусмысленного толкования, описания и примеры не должны рассматриваться как исчерпывающие. Описания всех патентов и научных публикаций, процитированных в данном документе, явным образом включены во всей полноте путем ссылок.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  F. Hoffmann-La Roche AG
<120>  БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ БЕТА-АМИЛОИДУ/ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ
РЕЦЕПТОРУ ТРАНСФЕРРИНА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>  P33106-WO
<150>  EP 15188064.8
<151>  2015-10-02
<160>  22
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  215
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0015-LC1
<400>  1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro
85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  2
<211>  455
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0015-HC1
<400>  2
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val
210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450                 455
<210>  3
<211>  215
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0015-LC2
<400>  3
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn
85                  90                  95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser
100                 105                 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115                 120                 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130                 135                 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165                 170                 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180                 185                 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195                 200                 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215
<210>  4
<211>  229
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0015-Fab
<400>  4
Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20                  25                  30
Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50                  55                  60
Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr
85                  90                  95
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130                 135                 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145                 150                 155                 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165                 170                 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195                 200                 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210                 215                 220
Asn Arg Gly Glu Cys
225
<210>  5
<211>  42
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35                  40
<210>  6
<211>  215
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0012-LC1
<400>  6
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro
85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  7
<211>  455
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0012-HC1
<400>  7
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val
210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450                 455
<210>  8
<211>  229
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0012-LC2
<400>  8
Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20                  25                  30
Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50                  55                  60
Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr
85                  90                  95
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro
115                 120                 125
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
130                 135                 140
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
145                 150                 155                 160
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
165                 170                 175
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
195                 200                 205
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
210                 215                 220
Asn Arg Gly Glu Cys
225
<210>  9
<211>  688
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0012-HC2
<400>  9
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val
210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450                 455                 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser
465                 470                 475                 480
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
485                 490                 495
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
500                 505                 510
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala
515                 520                 525
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
530                 535                 540
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
545                 550                 555                 560
Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly
565                 570                 575
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
580                 585                 590
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
595                 600                 605
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
610                 615                 620
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
625                 630                 635                 640
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
645                 650                 655
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
660                 665                 670
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
675                 680                 685
<210>  10
<211>  702
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0015-HC2
<400>  10
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val
210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450                 455                 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly
465                 470                 475                 480
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
485                 490                 495
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln His
500                 505                 510
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser
515                 520                 525
Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr
530                 535                 540
Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
545                 550                 555                 560
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr
565                 570                 575
Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
580                 585                 590
Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
595                 600                 605
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
610                 615                 620
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
625                 630                 635                 640
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
645                 650                 655
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
660                 665                 670
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
675                 680                 685
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
690                 695                 700
<210>  11
<211>  215
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0020-LC1
<400>  11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro
85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  12
<211>  457
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0020-HC1
<400>  12
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val
210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
450                 455
<210>  13
<211>  947
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0020-HC2
<400>  13
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val
210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450                 455                 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser
465                 470                 475                 480
Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
485                 490                 495
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
500                 505                 510
Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala
515                 520                 525
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
530                 535                 540
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr
545                 550                 555                 560
Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly
565                 570                 575
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
580                 585                 590
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
595                 600                 605
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
610                 615                 620
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
625                 630                 635                 640
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
645                 650                 655
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
660                 665                 670
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
675                 680                 685
Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
690                 695                 700
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
705                 710                 715                 720
Gly Gly Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser
725                 730                 735
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser
740                 745                 750
Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
755                 760                 765
Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala
770                 775                 780
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys
785                 790                 795                 800
Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
805                 810                 815
Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp
820                 825                 830
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
835                 840                 845
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
850                 855                 860
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
865                 870                 875                 880
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
885                 890                 895
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
900                 905                 910
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
915                 920                 925
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
930                 935                 940
Lys Ser Cys
945
<210>  14
<211>  215
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0024-LC1
<400>  14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro
85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  15
<211>  455
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0024-HC1
<400>  15
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
450                 455
<210>  16
<211>  215
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0024-LC2
<400>  16
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn
85                  90                  95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser
100                 105                 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115                 120                 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130                 135                 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165                 170                 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180                 185                 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195                 200                 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210                 215
<210>  17
<211>  702
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  0024-HC2
<400>  17
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115                 120                 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
130                 135                 140
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145                 150                 155                 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165                 170                 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180                 185                 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
195                 200                 205
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
210                 215                 220
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
225                 230                 235                 240
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
245                 250                 255
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
260                 265                 270
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
275                 280                 285
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
290                 295                 300
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
305                 310                 315                 320
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
325                 330                 335
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
340                 345                 350
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
355                 360                 365
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
370                 375                 380
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
385                 390                 395                 400
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
405                 410                 415
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
420                 425                 430
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
435                 440                 445
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450                 455                 460
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly
465                 470                 475                 480
Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val
485                 490                 495
Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln His
500                 505                 510
Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser
515                 520                 525
Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr
530                 535                 540
Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr
545                 550                 555                 560
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr
565                 570                 575
Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
580                 585                 590
Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
595                 600                 605
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
610                 615                 620
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
625                 630                 635                 640
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
645                 650                 655
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
660                 665                 670
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
675                 680                 685
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
690                 695                 700
<210>  18
<211>  126
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr
100                 105                 110
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  19
<211>  108
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro
85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  20
<211>  122
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  299-023 VH гуманизированного варианта_DASG
<400>  20
Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr
1               5                   10                  15
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20                  25                  30
Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
35                  40                  45
Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser
50                  55                  60
Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser
65                  70                  75                  80
Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr
85                  90                  95
Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  21
<211>  110
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  299-009 VL гуманизированного варианта_NYA
<400>  21
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn
85                  90                  95
Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  22
<211>  760
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1               5                   10                  15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
20                  25                  30
Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35                  40                  45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50                  55                  60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65                  70                  75                  80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
85                  90                  95
Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro
100                 105                 110
Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115                 120                 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
130                 135                 140
Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
145                 150                 155                 160
Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
165                 170                 175
Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180                 185                 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
195                 200                 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210                 215                 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225                 230                 235                 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245                 250                 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260                 265                 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275                 280                 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290                 295                 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305                 310                 315                 320
Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325                 330                 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340                 345                 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
355                 360                 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
370                 375                 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385                 390                 395                 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405                 410                 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420                 425                 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435                 440                 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450                 455                 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465                 470                 475                 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485                 490                 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
500                 505                 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515                 520                 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530                 535                 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
545                 550                 555                 560
Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565                 570                 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580                 585                 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
595                 600                 605
Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
610                 615                 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
625                 630                 635                 640
Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
645                 650                 655
Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
660                 665                 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
675                 680                 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
690                 695                 700
Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
705                 710                 715                 720
Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725                 730                 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740                 745                 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
755                 760
<---