Универсальная аналитическая ванна для проведения мультиплексного дот-иммуноанализа

Полезная модель относится к аналитическим ваннам для проведения мультиплексного дот-иммуноанализа с целью выявления в препаратах крови маркеров определенного спектра инфекционных заболеваний и может быть использована в медицине, ветеринарии, биотехнологии и научных экспериментах.
Мультиплексное выявление маркеров (антигенов или антител) проводится с использованием белковых матриц (иммуночипов), представляющих собой плотную плоскую подложку с дискретно нанесенными на нее реагентами для захвата выявляемых маркеров. В процессе анализа белковая матрица последовательно инкубируется в ряде рабочих и отмывочных растворов. Таким образом, для выполнения каждого теста необходим набор реакционных сосудов, количество которых определяется числом этапов процедуры анализа. Для анализа целесообразно использовать ванну, содержащую необходимое количество изолированных ячеек и заполненную готовыми растворами. Дот-анализ заключается в последовательном переносе (с заданными временными интервалами) иммуночипов по рядам ячеек. Мультиплексный анализ, в зависимости от задач, может выполняться по схемам, значительно различающимся реагентной базой, числом и чередованием стадий (см., например, обзор Espina V. et all. Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologies\\Journal of Immunological Methods, 2004, v. 290: 121-133), и универсальная аналитическая ванна должна позволять их реализацию. Ячейки и иммуночипы должны быть скомпонованы в блоки с взаимно сопоставимыми размерами для одновременного проведения нескольких тестов. Ячейки ванны с реагентами должны быть герметизированы для хранения и удобства использования.
Известна проявочная ванна из наборов серии «Immunocomb» франко-израильской фирмы «Orgenics», описанная в технической документации к указанным диагностическим наборам на сайте http:\\www.biograd.ru. Ванна предназначена для выявления одиночных маркеров методом дот-иммуноанализа с использованием конъюгатов щелочной фосфатазы и представляет собой монолитный блок, выполненный из синтетического материала, объединяющий 6 рядов ячеек для выполнения 12 анализов. Ванна с заполненными ячейками герметизирована фольгой. Эта ванна имеет следующие недостатки:
- все ячейки такой ванны имеют прямоугольное сечение, что не исключает прилипание иммуночипа к стенке ячейки, способное снижать качество анализа и приводить к образованию артефактов;
- верхний край ванны выполнен плоским, что при термической запайке может приводить к деформации верхней части ячеек;
- число рядов ячеек недостаточно для выполнения анализов с большим числом стадий, например, тестов для выявления антигенов или тестов с использованием коллоидного золота.
Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемой полезной модели является ванна для проведения мультиплексного дот-иммуноанализа, описанная в патенте RU №2517035, МПК G01N 33/53, опубл. 27.05.2014 г. Эта ванна выполнена из термопластичного синтетического материала и объединяет 11 рядов ячеек для выполнения 5 анализов. Ячейки ванны в поперечном сечении выполнены в виде вытянутого асимметричного шестиугольника, продольные углы которого служат направляющими при введении в ячейку иммуночипа и препятствуют контакту их поверхностей. По верхнему краю ванны выполнен выпуклый сварочный профиль в виде клиновидных в сечении буртиков, окантовывающих каждую ячейку, который повышает надежность герметизации ячеек и препятствует деформации ячеек при термической запайке.
Основным недостатком прототипа является то, что он приспособлен для выполнения одной конкретной схемы анализа, алгоритм которой задается числом рядов ячеек (11 рядов) и чередованием рядов ячеек с разной площадью сечения (ячейки для рабочих растворов реакции выполнены с меньшей площадью сечения, чем для отмывочных растворов), и затрудняет постановку более сложных схем анализа, например, при выявлении антигенов с использованием вторичных детекторных антител и конъюгатов с третичными антителами (см., например, патент RU №2296995) или вторичных биотинилированных антител и конъюгатов со стрептавидином или авидином (см., например, Espina V. et all. Protein microarray detection strategies: focus on direct detection technologiesW Journal of Immunological Methods, 2004, v. 290: 121-133), схем с применением систем амплификации (см., например, Bhattacharya R. et all. A novel signal amplification technology based on catalyzed reporter deposition in a Dot-ELISA with high sensitivity\\Journal of Immunological Methods, 1999, 227: 31-39) и др. Кроме того, в ванне-прототипе объем ячеек для инкубации иммуночипов с образцом (1-й ряд ячеек) недостаточен для обеспечения высокой чувствительности выявления некоторых маркеров, например, антигенов. Ванна недостаточно удобна при подготовке к работе и в процессе эксплуатации.
Техническим результатом настоящей полезной модели является расширение функциональных возможностей аналитической ванны за счет обеспечения возможности заполнения ячеек ванны реакционными и отмывочными растворами в любой необходимой последовательности и реализации различных схем иммуноанализа, а также повышение удобства подготовки ванны к работе и ее эксплуатации за счет упрощения процесса и повышения надежности герметизации ячеек ванны фольгой и устранения возможных ошибок при ориентации и более надежного удержания ванны в рабочем положении во время выполнения иммуноанализа.
Указанный технический результат достигается тем, что в аналитической ванне для проведения многопрофильного мультиплексного дот-иммуноанализа, выполненного в виде монолитного блока из химически инертного термопластичного материала с набором реакционных ячеек для рабочих и отмывочных растворов, расположенных рядами и в поперечном сечении имеющих вид вытянутых ассиметричных шестиугольников с острыми противоположно расположенными углами, предназначенными в качестве направляющих при введении в ячейки ванны пластин иммуночипа для предотвращения их контакта с внутренней поверхностью ванны, а по верхнему краю ванны выполнен выпуклый сварочный профиль в виде буртиков, окантовывающих ячейки, для их термической герметизации фольгой, согласно полезной модели, все ячейки ванны выполнены одинаковыми по объему и размерам; два внешних угла ванны со стороны крайнего ряда ячеек, от которых начинается обработка реагентами пластин иммуночипа, скошены; с внешней стороны в стенках ванны выполнены выемки; а сварочный профиль в виде буртиков по верхнему краю ванны имеет в сечении полукруглую форму.
Описание графических материалов. На фиг. 1 приведена схема универсальной аналитической ванны для выполнения пяти мультиплексных иммуноанализов: 1 - скошенные углы ванны, 2 - блок ванны, 3 - модули, 4 - ячейки, 5 - сварочный контур, 6 - ряды однотипных ячеек.
На фиг. 2 приведена конфигурация внешних стенок ванны.
На фиг. 3 приведены схема нанесения на иммуночип реагентов захвата: К+ (IgG человека), антигенов возбудителей гемотрансмиссивных инфекций (аббревиатуры приведены в описании примера 2), зона К- без антигенов; а также результаты мультиплексного дот-иммуноанализа образцов сыворотки крови, выполненного с применением биотинтирамидной амплификации.
На фиг. 4 приведены схема нанесения на иммуночип реагентов захвата: К+ (IgG человека), антигенов возбудителей детских вакциноуправляемых инфекций, зона К- без антигенов; а также результаты мультиплексного дот-иммуноанализа образцов сыворотки крови, выполненного с применением конъюгата видовых антител с щелочной фосфатазой.
На фиг. 5 приведены схема нанесения на иммуночип реагентов захвата: К- (асцитическая жидкость, не содержащая специфических антител); К+ (IgG человека); моноклональных антител к возбудителям урогенитальных инфекций; а также результаты мультиплексного дот-иммуноанализа шести образцов вагинальных смывов, выполненного с применением вторичных антител и конъюгата третичных антивидовых антител с коллоидным золотом.
Описание конструкции заявляемой аналитической ванны. Аналитическая ванна изготавливается из инертного термопластичного синтетического материала, например из полипропилена, литьем под давлением в пресс-форме определенной конфигурации (фиг. 1) со скошенными углами 1 со стороны начала старта анализа и фасончатыми внешними стенками (фиг. 2), что способствуют предотвращению возможных ошибок при ориентации ванны во время выполнения анализа и сокращает расход полимерного материала. Ванна может быть изготовлена в виде монолитного блока 2, объединяющего разное число модулей 3, рассчитанных на выполнение одного анализа. Модули 3 промаркированы на верхней поверхности ванны рельефными буквами латинского алфавита (А-Е) и имеют по двенадцать ячеек 4. Ячейки 4 в поперечном сечении имеют вид вытянутых ассиметричных шестиугольников с острыми противоположно расположенными углами, предназначенными в качестве направляющих при введении в указанные ячейки 4 пластин иммуночипа для предотвращения их контакта с внутренней поверхностью ванны. Все ячейки 4 ванны выполнены одинаковыми по объему и размерам. Каждая ячейка 4 по верхнему краю обнесена сварочным профилем 5 (буртиком) полукруглого сечения, высотой 0,5 мм. В ванне однотипные ячейки 4 модулей образуют ряды 6, каждый из которых заполнен определенным рабочим раствором, ряды однотипных ячеек 4 промаркированы на верхней поверхности ванны рельефными цифрами (1-12). Заполненная ванна с помощью термопресса запаивается укупорочным материалом, например, комбинированным материалом «Colflex». При этом температура и давление пресса подбираются таким образом, чтобы расплавлялись только внутренний слой пластика на укупорочном материале и сварочный профиль 5 (буртик). Фасончатые внешние стенки ванны имеют выемки 7 (фиг. 2) для снижения расхода полимерного материала и более удобного удержания ванны в рабочем положении.
Описание процесса использования заявляемой аналитической ванны. Ряды ячеек 4 ванны заполняют готовыми рабочими растворами в объеме, позволяющем полностью погружать в них рабочую часть пластины иммуночипа (фиг.3-5). Порядок заполнения рядов ячеек 4 растворами определяется алгоритмом проведения анализа. Заполненная ванна с помощью термопресса запаивается укупорочным материалом, например, комбинированным материалом «Colflex». При этом температура и давление пресса подбираются таким образом, чтобы расплавлялись только внутренний слой пластика на укупорочном материале и сварочный профиль 5 (буртик). При выполнении анализа ячейки 4 вскрывают перфоратором, в первый ряд ячеек вносят исследуемые образцы (препараты крови, смывы, суспензии соскобов и т.п.) и погружают в них пластины иммуночипов (фиг.3-5). Затем иммуночипы вынимают и через определенные интервалы времени последовательно переносят по следующим рядам ячеек 6, после выемки из последнего ряда визуально учитывают результат по наличию или отсутствию темных пятен в местах нанесения на иммуночип иммунореагентов. Для одиночных анализов вскрывают и используют отдельные модули 3.
Пример 1. Использование аналитической ванны для выявления в препаратах крови антител к возбудителям гемотрансмессивных инфекций с использованием биотинтирамидной амплификации
Методология выполнения анализа описана в статье R. Bhattacharya, D. Bhattacharya, Т.К. Dhar A novel signal amplification technology based on catalyzed reporter deposition in a Dot-ELISA with high sensitivity\\Journal of Immunological Methods, 1999, 227: 31-39. При выполнении анализа используют иммуночипы с нанесенными антигенами возбудителей гемотрансмиссивных инфекций: вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса гепатита С (ВГС), вируса гепатита В (ВГВ), цитомегаловируса (ЦМВ), возбудителей сифилиса (Т. pallidum) и токсоплазмоза (Т. gondii). Ванну для анализа заполняют растворами:
- ряд 1 - раствор для разведения образцов;
- ряды 2, 3, 5, 7, 9, 10, 12 - раствор для отмывок;
- ряд 4 - конъюгат антител против IgG человека с пероксидазой хрена;
- ряд 6 - раствор биотинтирамида в боратном буферном растворе;
- ряд 8 - конъюгат авидина с пероксидазой хрена;
- ряд 11 - субстратная смесь на основе диаминобензидина;
Заполненные ванны герметизируют. При выполнении анализа герметизирующее покрытие вскрывают перфоратором. Анализ выполняют при комнатной температуре. Перечень и время выполнения отдельных операций при выполнении анализа препаратов крови приведены в таблице 1.
После выемки из ячеек 4 (ряда 12) иммуночипы подсушивают на воздухе и визуально учитывают результаты по наличию темных пятен в местах нанесения вирусных антигенов. Контролем работоспособности теста служит наличие темного пятна в зоне К+ (IgG-человека), оценку фоновых явлений проводят по зоне К- (без антигенов). Схема нанесения антигенов на иммуночип и результаты мультиплексного дот-иммуноанализа шести образцов сыворотки крови приведены на фиг. 3.
Пример 2. Использование аналитической ванны для выявления в препаратах крови антител к возбудителям вакциноуправляемых детских инфекций с использованием конъюгата антивидовых антител с щелочной фосфатазой.
Методология выполнения анализа описана в статье Полтавченко А.Г., Ерш А.В., Крупницкой Ю.А. Выбор системы детекции для мультиплексного дот-иммуноанализа антител//Клиническая лабораторная диагностика. - 2016. - №4. - С. 229-233. При выполнении анализа используют иммуночипы с нанесенными антигенами возбудителей вакциноуправляемых инфекций: вируса кори, вируса паротита, вируса краснухи и вируса полиомиелита.
Ванну для анализа заполняют растворами:
- ряд 1 - раствор для разведения образцов;
- ряды 2, 3, 5, 6 - раствор для отмывок;
- ряд 4 - конъюгат антител против IgG человека с щелочной фосфатазой;
- ряд 7 - готовый к применению субстрат для проявления щелочной фосфатазы BCIP/NBT Liquid Substrate System (Sigma, США);
- ряд 8 - дистиллированная вода.
Заполненные ванны герметизируют. При выполнении анализа герметизирующее покрытие вскрывают перфоратором. Анализ выполняют при комнатной температуре. Перечень и время выполнения отдельных операций при выполнении анализа препаратов крови приведены в таблице 2.
После выемки из ячеек 4 (ряда 8) иммуночипы подсушивают на воздухе и визуально учитывают результаты по наличию темных пятен в местах нанесения вирусных антигенов. Контролем работоспособности теста служит наличие темного пятна в зоне К+ (IgG-человека), оценку фоновых явлений проводят по зоне К- (без антигенов). Схема нанесения антигенов на иммуночип и результаты мультиплексного дот-иммуноанализа пяти образцов сыворотки крови приведены на фиг. 4.
Пример 3. Использование аналитической ванны для выявления антигенов возбудителей урогенитальных инфекций в вагинальных смывах с использованием конъюгата на основе коллоидного золота.
Методология выполнения анализа описана в статье Полтавченко А.Г. и др. Многопрофильная иммунохимическая индикация возбудителей инфекционных заболеваний\\Клиническая лабораторная диагностика, 2006, №5: 39-42. При выполнении анализа используют иммуночипы с нанесенными моноклональными антителами к антигенам возбудителей урогенитальных инфекций: Trichomonas vaginalis (Т. vaginalis), Mycoplasma hominis (M. hominis), Neisseria gonorrhoeae (N. gonorrhoeae), Chlamydia trachomatis (C. trachomatis), Ureaplasma urealyticum (U. urealyticum), Gardnerella vaginalis (G. vaginalis) и положительным контролем K+ (IgG человека).
Ванну для анализа заполняют растворами:
- ряд 1 - раствор для разведения образцов;
- ряды 2, 4, 6 - раствор для отмывок;
- ряд 3 - иммунная сыворотка (смесь сывороток) содержащая антитела ко всему спектру выявляемых антигенов;
- ряд 5 - конъюгат коллоидного золота с антивидовыми антителами;
- ряды 7, 8, 10, 12 - дистиллированная вода;
- ряд 9 таблетки сухого компонента проявителя на основе метола, при приготовлении проявителя за 5 мин до проявления в ячейки ряда 9 вносят дистиллированную воду ( объема ячейки), а непосредственно перед проявлением - 0,4%-й водный раствора нитрата серебра ( объема ячейки).
- ряд 11 - усилитель и стабилизатор оптического сигнала - щелочной раствор тиомочевины.
Заполненные ванны герметизируют. При выполнении анализа герметизирующее покрытие вскрывают перфоратором. Анализ выполняют при комнатной температуре. Перечень и время выполнения отдельных операций при выполнении анализа препаратов крови приведены в таблице 3.
После выемки из ячеек 4 (ряда 12) иммуночипы подсушивают на воздухе и визуально учитывают результаты по наличию темных пятен в местах нанесения вирусных антигенов. Контролем работоспособности теста служит наличие темного пятна в зоне К+ (IgG человека), оценку фоновых явлений проводят по зоне К- (нормальная асцитическая жидкость мышей). Схема нанесения антител на иммуночип и результаты мультиплексного дот-иммуноанализа шести образцов вагинальных смывов приведены на фиг. 5.
Выше приведенное описание заявки на полезную модель подтверждает достижение заявленного технического результата, а именно:
- ячейки ванны выполнены одинаковыми по объему и размерам и идентичны ячейкам для отмывочных растворов, что позволяет заполнять их реакционными и отмывочными растворами в любой необходимой последовательности и реализовывать различные схемы анализа, в том числе с использованием сложных конъюгатов и многостадийных вариантов усиления оптического сигнала, что расширяет функциональные возможности ванны;
- размеры ячеек для инкубации имуночипов с образцом увеличены до размера ячеек с отмывочными растворами, по сравнению с прототипом, что позволяет повысить чувствительность анализа за счет большего объема исследуемого образца;
- сварочный профиль по верхнему краю ванны выполнен в виде полукруглых в сечении буртиков окантовывающих каждую ячейку, что повышает надежность герметизации ячеек ванны и упрощает технологию отливки ванны;
- из внешних стенок ванны удалены значительные фрагменты, что снижает расход синтетического материала на изготовление аналитической ванны и, соответственно, массу ванны.
- скошенные углы ванны способствуют предотвращению возможных ошибок при ориентации ванны во время выполнения анализа, а выемки в стенках ванны облегчают удержание ванны в рабочем положении.