Способ иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения ее в качестве носителя культивированных клеток
METHOD OF IMMOBILIZATION OF NATIVE AMNIOTIC MEMBRANE FOR TRANSPORTATION, PRESERVATION AND ITS APPLICATION AS A CARRIER OF CULTURED CELLS

Изобретение может применяться в медицине, в частности в офтальмологии с целью создания биоинженерных трансплантатов, необходимых для реконструкции поврежденных тканей, например передней поверхности глаза, и позволяет оптимизировать транспортировку, консервацию и применение нативной амниотической мембраны в качестве носителя культивированных эпителиальных клеток в жидких системах для культивирования, транспортировки и консервации, путем создания надежной фиксации в расправленном состоянии подложки-носителя клеток (например нативной амниотической мембраны), что предотвращает ее деформацию в результате движения жидкостей в условиях транспортировки и консервации, а также применения нативной или консервированной амниотической мембраны в качестве носителя клеток.
Для реконструкции поврежденных эпителиальных тканей в медицине применяется трансплантация культивированных эпителиальных клеток, различного происхождения в том числе и стволовых, на различных подложках-носителях.
Например, в офтальмологии для культивирования клеток эпителия эктодермального происхождения (роговичного, буккального и т.д.) с целью их последующего использования в реконструктивной хирургии глазной поверхности в настоящее время применяется амниотическая мембрана [Tsai, R.J., Li, L.M., Chen, J.K., 2000. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N. Engl. J. Med. 343, 86-93; Nakamura, Т., Endo, K., Cooper, L.J., Fullwood, N.J., Tanifuji, N., Tsuzuki, M., Koizumi, N., Inatomi, Т., Sano, Y., Kinoshita, S., 2003. The successful culture and autologous transplantation of rabbit oral mucosal epithelial cells on amniotic membrane. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 106-116], известная своими положительными свойствами и лечебным эффектом при использовании ее в реконструктивной хирургии глазной поверхности, а также хорошими адгезивными свойствами для культивируемых эпителиальных клеток. При этом транспортировка и консервация нативной амниотической мембраны, а также подготовка на ее основе биотрансплантата с культивированными эпителиальными, в том числе и стволовыми клетками, зачастую является достаточно трудной задачей, так как в результате движения жидкостей транспортной среды, среды для консервирования, а также культуральной системы, не иммобилизированная амниотическая мембрана, имеющая толщину около 30 мкм, легко деформируется и сворачивается в тканевой конгломерат. Ее сложно поддерживать в расправленном состоянии. Это приводит к трудности определения необходимой для культивирования и трансплантации поверхности амниотической мембраны, неэффективной ее консервации, неправильному распределению культивированных клеток и к невозможности получения их качественного монослоя.
Известен способ культивирования эпителиальных стволовых клеток, в качестве подложки-носителя при котором используется капсула хрусталика [Galal, A., Perez-Santonja, J.J., Rodriguez-Prats, J.L., Abad, М., Alio, J., 2007. Humananterior lens capsule as a biologic substrate for the ex vivo expansion of limbalstem cells in ocular surface reconstruction. Cornea 26, 473-478]. Этот способ также не предусматривает фиксацию подложки-носителя, что при транспортировке, консервации и использовании ее в жидких культуральных системах приводит к деформированию подложки-носителя, что существенно затрудняет транспортировку, консервацию и использование ее в качестве носителя культивированных клеток.
Наиболее близким к заявленному изобретению является разработанный нами ранее «Способ иммобилизации клеточной подложки на основе биомембран в условиях жидкой культуральной системы» патент RU №2646162 от 06.02.2018 г. Этот способ позволяет оптимизировать культивирование эпителиальных стволовых клеток в жидких культуральных системах, путем создания надежной фиксации подложки-носителя клеток (на основе биомембран), путем надежной фиксации подложки-носителя клеток на основе биологической мембраны. Это достигается благодаря тому, что подложку-носитель клеток на основе биологической мембраны механически фиксируют в расправленном состоянии на предварительно залитом в чашку Петри стерильном агар-агаре при помощи стерильных игл от инсулиновых шприцев под углом вкола от 10 до 60 градусов, вершина которого направлена к подложке-носителю клеток. Это предотвращает ее деформацию в результате движения жидкостей культуральной системы в течение всего периода культивирования и транспортировки, а также позволяет консервировать подложку на основе биомембран в расправленном состоянии, однако такой способ фиксации не позволяет перенести в расправленном состоянии амниотическую мембрану с культивированными клетками на глазную поверхность, что определяет ряд технических трудностей при выполнении трансплантации амниотической мембраны как без, так и с культивированными клетками.
Поэтому для решения этих проблем предлагается использовать «Способ иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения ее в качестве носителя культивированных клеток», что позволит оптимизировать транспортировку, консервацию и применение нативной амниотической мембраны в качестве носителя культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток, путем создания надежной фиксации подложки-носителя клеток (например нативной амниотической мембраны) в жидких системах для культивирования, транспортировки и консервации, что предотвратит ее деформацию в результате движения жидкостей в условиях транспортировки и консервации, а также применения нативной или консервированной амниотической мембраны в качестве носителя клеток.
Технический результат предлагаемого изобретения - обеспечение надежной фиксации нативной амниотической мембраны в специальном одноразовом стерильном зажимном устройстве состоящем из чашки Петри диаметром 3 см со срезанным дном и зажимного хомута, предназначенным для транспортировки, консервации и применения амниотической мембраны в качестве носителя для культивированных эпителиальных стволовых клеток в жидких системах.
Технический результат достигается благодаря тому, что в способе иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения ее в качестве носителя культивированных клеток нативную амниотическую мембрану механически фиксируют в расправленном состоянии к гладким краям стерильной чашки Петри диаметром 3 см со срезанным дном при помощи стерильного зажимного хомута таким образом, чтобы оставался запас мембраны от гладких краев не меньше, чем ширина одноразового стерильного зажимного хомута.
Изобретение поясняется фиг. 1-3, на которых показаны этапы фиксации мембраны.
Способ иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения ее в качестве носителя культивированных клеток подразумевает несколько этапов:
1. Дно стерильной чашки Петри диаметром 3 см срезается (Фиг. 1).
2. Нативная амниотическая мембрана укладывается в расправленном состоянии на гладкие края стерильной чашки Петри диаметром 3 см со срезанным дном 1 таким образом, чтобы оставался запас мембраны от гладких краев 3 не меньше чем ширина одноразового стерильного зажимного хомута 2 (Фиг. 2).
3. При помощи одноразового стерильного зажимного хомута 2 нативная амниотическая мембрана механически надежно фиксируется в расправленном состоянии к наружной поверхности подготовленной чашки Петри 4 (Фиг. 3).
К особенностям предлагаемого «Способа иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения ее в качестве носителя культивированных клеток», позволившим достичь технический результат, относится:
1. Стерильная чашка Петри диаметром 3 см со срезанным дном 1 - является прочной, ареагенной деталью одноразового стерильного зажимного устройства, изготавливающаяся в стерильных условиях или вторично стерилизующаяся, которая, во-первых, не влияет на условия культивирования клеток, во-вторых, из-за широкой наружной поверхности подготовленной чашки Петри 4, дает возможность надежно зафиксировать нативную амниотическую мембрану, и в третьих, ввиду стерильности, исключает контаминацию амниотической мембраны и/или находящуюся на ней клеточную культуру.
2. Одноразовый стерильный зажимной хомут 2 позволяет надежно зафиксировать нативную амниотическую мембрану без риска нарушения ее стерильности, при этом его ширина соответствует ширине наружной поверхности подготовленной чашки Петри 4, что создает условия для максимально надежной фиксации.
3. Запас мембраны равный по размеру не меньше чем ширина одноразового стерильного зажимного хомута 2 исключает возможность соскальзывания нативной амниотической мембраны с гладких краев 3.
Способ осуществляется следующим образом.
Подготовленная в стерильных условиях нативная амниотическая мембрана сперва укладывается на гладкие края 3 стерильной чашки Петри диаметром 3 см со срезанным дном 1. Затем нативная амниотическая мембрана механически надежно фиксируется в расправленном состоянии к наружной поверхности подготовленной чашки Петри 4 при помощи одноразового стерильного зажимного хомута 2, выполненного из ареактивного для клеток материала. Это позволяет выполнить надежную фиксацию нативной амниотической мембраны, транспортировать, консервировать, трансплантировать ее в таком виде на глазную поверхность, а также использовать в качестве носителя культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток в любой жидкой среде без риска деформации и контаминации подложки и/или находящейся на ней культуры клеток.
Таким образом, «Способ иммобилизации нативной амниотической мембраны для транспортировки, консервации и применения ее в качестве носителя культивированных клеток» позволяет выполнить надежную фиксацию нативной амниотической мембраны, транспортировать, консервировать, трансплантировать ее в таком виде на глазную поверхность, а также использовать в качестве носителя культивированных эпителиальных, в том числе и стволовых клеток в любой жидкой среде без риска деформации и контаминации подложки.