Хромато-масс-спектрометрическая идентификация продуктов окисления кверцетина кислородом воздуха в водных растворах

2017 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Т. 4 (62). Вып. 1

ФИЗИКА И ХИМИЯ

ХИМИЯ

УДК 547.972.35:543.544.5.068.7 Т. И. Пушкарёва, И. Г. Зенкевич

ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПРОДУКТОВ ОКИСЛЕНИЯ КВЕРЦЕТИНА КИСЛОРОДОМ ВОЗДУХА В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ

Санкт-Петербургский государственный университет,

Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7—9

Информация о структурах и механизмах образования продуктов окисления природного флавоноида — кверцетина позволяет объяснить его антиоксидантную активность. Задачи настоящей работы включали окисление кверцетина кислородом воздуха в водных растворах в слабощелочной среде (рН = 8 + 9) в присутствии этанола (для увеличения растворимости), хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-ЭР-МС-МС) полученной смеси и систематизацию литературных сведений о продуктах окисления для сопоставления с нашими данными. Впервые вычислены индексы удерживания продуктов окисления кверцетина в обращённо-фазовой ВЭЖХ. Подтверждено, что многие из продуктов окисления кверцети-на стабильны только в растворе и выделить их нельзя. Для уточнения структуры некоторых из них были проведены специальные эксперименты. Так, замена этанола на метанол в составе реакционной смеси позволяет в некоторых случаях исключить из рассмотрения этиловые эфиры и уточнить идентификацию, в частности, таких продуктов, как 2-(3,4-дигидрокси-фенил)-2-оксоуксусная и 2-оксо-2-(2,4,6-тригидроксифенил)уксусная кислоты. Для подтверждения хиноидного строения одного из основных продуктов окисления кверцетина был зарегистрирован УФ-спектр реакционной смеси и проведена реакция её с гидроксиламином. Среди продуктов окисления кверцетина обнаружено большое число димеров. Предложен способ отличать их от димеров, образующихся в масс-спектрометре в процессе электрораспылительной ионизации. Два основных обсуждаемых в литературе механизма окисления кверцетина предполагают промежуточное образование соединений с тривиальными названиями «депсид» и «алфитонин». Установлено их совместное присутствие в составе продуктов, но их устойчивость и время жизни в растворах различны. Библиогр. 17 назв. Табл. 1.

Ключевые слова: кверцетин, водные растворы, окисление, кислород воздуха, идентификация.

Для цитирования: Пушкарёва Т. И., Зенкевич И. Г. Хромато-масс-спектрометрическая идентификация продуктов окисления кверцетина кислородом воздуха в водных растворах // Вестник СПбГУ. Физика и химия. 2017. Т. 4 (62). Вып. 1. С. 59-79. БОТ: 10.21638/ /11701/врЪи04.2017.107

© Санкт-Петербургский государственный университет, 2017

T. I. Pushkareva, I. G. Zenkevich

CHROMATO-MASS SPECTROMETRIC IDENTIFICATION OF PRODUCTS OF QUERCETIN OXIDATION BY ATMOSPHERIC OXYGEN IN AQUEOUS SOLUTIONS

St. Petersburg State University,

7—9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russian Federation

The information about structures and formation mechanisms of oxidation products of such natural flavonoid as quercetin allows explaining the nature of its antioxidant activity remaining unexplored up to present. The aims of this paper imply the oxidation of quercetin by air oxygen in water alkaline solutions (pH = 8 + 9) in presence of ethanol (to increase its solubility), mass-spectrometric analysis (HPLC-ES-MS-MS) of the reaction mixture and systematization of literature data on the oxidation products for comparing with our data. The retention indices of the oxidation products of quercetin have been determined in reversed-phase HPLC for the first time. It is confirmed that many of oxidation products of quercetin are stable only in solution and cannot be isolated after drying. In order to clarify the structures of some products, special experiments have been carried out. Thus, the replacement of ethanol with methanol in the composition of the reaction mixture can in some cases eliminate ethyl esters from further consideration and identify such products as 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-oxoacetic acid and 2-oxo-2-(2,4,6-trihydroxyphenyl)acetic acid. To confirm the quinone structure of one of principal products of quercetin oxidation, the UV spectrum of the reaction mixture has been recorded and its reaction with hydroxylamine has been carried out. A large number of isomers have been revealed among the quercetin oxidation products. A method to distinguish them from the dimers formed in the mass spectrometer during the electrospray ionization process has been suggested. The two main oxidation mechanisms of quercetin discussed in the literature involve intermediate formation of compounds with the trivial names "depside" and "alfitonine". Their joint presence in the product composition has been established, but their stability and lifetimes in solution are different. Refs 17. Tables 1.

Keywords: quercetin, water solutions, oxidation, air oxygen, identification.

For citation: Pushkareva T. I., Zenkevich I. G. Chromato-mass spectrometric identification of products of quercetin oxidation by atmospheric oxygen in aqueous solutions. Vestnik SPbSU. Physics and Chemistry. 2017, vol. 4 (62), issue 1, pp. 59-79. DOI: 10.21638/11701/spbu04.2017.107

Введение. Кверцетин 1 является наиболее распространённым представителем такого класса природных соединений, как флавоноиды, обладает широким спектром биологического действия и антиоксидантной активностью, проявляющейся в способности инактивировать различные активные формы кислорода [1].

Механизм действия кверцетина как антиоксиданта, несмотря на большое число публикаций, до настоящего времени остаётся до конца не выясненным, поэтому важно установить и систематизировать структуры продуктов, получающихся при окислении кверцетина, в частности, кислородом воздуха в водных растворах.

Авторами работ [1-16] были идентифицированы многочисленные продукты и установлены некоторые закономерности окисления кверцетина в различных условиях. Многие продукты ферментативного [2-7], электрохимического [8] и автоокисления (по сво-боднорадикальному механизму) [9-14] и т. д. в слабощелочной среде совпадают. Следовательно, предположения о структурах продуктов, получающихся при окислении квер-цетина, можно использовать для интерпретации масс-спектров веществ, полученных нами, безотносительно к методу окисления, применённому в каждом конкретном случае. Настоящая работа включала окисление кверцетина кислородом воздуха в водных растворах в слабощелочной среде (pH « 8 + 9) в присутствии этанола (для увеличения растворимости кверцетина), хромато-масс-спектрометрический анализ (ВЭЖХ-ЭР-МС-МС) полученной смеси и систематизацию литературных сведений о продуктах окисления для сопоставления с нашими данными.

Экспериментальная часть.

Окисление кверцетина в водных растворах. В работе использовали образец кверцетина дигидрата (не менее 95%, Sigma, CAS № 117-39-5). Готовили раствор в 95% этаноле с концентрацией кверцетина 10 мг/мл, который далее разбавляли в 100 раз до концентрации 100 мкг/мл водным раствором гидрокарбоната аммония с концентрацией 25мМ, pH « 8 + 9 или раствором этанол/водный раствор NH4HCO3 (C = 25мМ) 30/70. Окисление проводили при пропускании воздуха в течение 3 ч через раствор объёмом 100 мл с примерной скоростью 2 л/мин. Перед хроматографическим анализом полученные реакционные смеси подкисляли муравьиной кислотой до её концентрации в пробах 0,1%.

Условия хроматографического анализа. ВЭЖХ анализ проводили на хроматографе Agilent 1290 Infinity с масс-спектрометрическим детектором. Колонка: Zorbax Eclipse XDB-C8 Narrow-Bore 2.1 х 150 мм с диаметром частиц сорбента 3,5 мкм с пред-колонкой, заполненной таким же сорбентом. Использовали режим градиентного элю-ирования; фаза А: вода/ацетонитрил/муравьиная кислота 99/1/0,1 (об./об./об.), фаза В: вода/ацетонитрил/муравьиная кислота 90/10/0,1 (об./об./об.); линейное увеличение содержания фазы В в элюенте с 2 до 80% за 35 мин, далее уменьшение до 2% фазы В за 1 мин, ещё в течение 2 мин — режим установления равновесия. Скорость потока фазы 0,2 мл/мин. Объём дозируемых проб 10 мкл. Температура термостата колонки 30°С. Хроматограммы регистрировали по общему ионному току и в результате изолирования и последующей фрагментации заданных ионов (режим MRM).

Условия масс-спектрометрического детектирования. Масс-спектрометричес-кое определение продуктов окисления кверцетина проводили на масс-спектрометре типа ионная ловушка Bruker amaZON ETD (Германия), метод ионизации — электроспрей, использован режим детектирования отрицательных ионов. Напряжение на капилляре —4,8 кВ. Газ-осушитель — азот, температура 250С, поток 9 л/мин. Диапазон сканируемых масс 70-1000 Да. Каждый спектр получен в результате усреднения пяти сканов.

Для вычисления индексов удерживания продуктов окисления кверцетина было определено время удерживания реперных компонентов: ацетофенона (îr = 18,8 мин), пропиофенона (23,5 мин), бутирофенона (27,3 мин). Мёртвое время установлено по водному раствору тиомочевины to = 1,60 ± 0,05 мин. Расчёт индексов удерживания проводили, внеся ряд изменений в формулу

где Н1Х, ¿х — индекс и время удерживания определяемого соединения; Шп, ¿п — индекс и время удерживания реперного алкилфенилкетона СбН5СОСпН2п+1 с числом атомов углерода в алкильном фрагменте п; К1п+1, ¿п+1 — индекс и время удерживания реперного алкилфенилкетона С6Н5СОСпН2п+1 с числом атомов углерода в алкильном фрагменте п +1. Параметр д вычисляют по времени удерживания всех трёх реперных компонентов.

Расчёт линейно-логарифмических индексов удерживания требует задания трёх реперных точек на границах интервала ¿о — ¿д. Одной из них должно быть само значение ¿о, соответствующее гипотетическому реперному компоненту с нулевым значением индекса. Однако в системе линейно-логарифмических индексов удерживания, так же как и в системе индексов Ковача, это невозможно из-за особой точки функции ^(¿д — ¿о).

RIx = RIn +

f(U)-f(tn) .

f(t»+i)-f(tny

-n+l

f (tR) = tR + q lg(tR — to),

Для устранения этой неопределённости значение Rio = 0 целесообразно присвоить не моменту времени to, а îr = to + x, x ^ to. Кроме того, требуются данные ещё о двух реальных реперных компонентах, например îri и îr2 . Необходимость контроля вычисляемых значений индексов удерживания в каждых конкретных условиях заставляет предпочесть иной вариант их выбора: расчётное уравнение рациональнее строить по значениям t0 + x (RI0 = 0), tR1 (RIi = 800) и tR3 (RI3 = 1000), используя время удерживания второго реперного компонента для проверки совпадения его вычисленного индекса удерживания с постулированным значением RI2 = 900. Оптимизации требует отношение области времени удерживания, ограниченной реперными компонентами, т. е. îr3 — îri = b, к характеризуемому интервалу îri — to = а. В градиентных режимах элюирования с высокими начальными содержаниями воды в элюенте b/а « 1. Это соответствует явно неблагоприятным условиям экстраполяции индексов удерживания за пределы области, ограниченной реперными компонентами. С целью искусственного создания более удобных для экстраполяции условий (b/а > 1) проведено преобразование значений реального времени удерживания в шкалу их квадратов [15].

Дополнительные эксперименты для уточнения структуры продуктов окисления. Для установления влияния этанола, присутствующего в реакционной смеси, на состав продуктов окисления кверцетина готовили раствор кверцетина (C = = 10 мг/мл) в метаноле, который далее разбавляли в 100 раз до концентрации 100 мкг/мл раствором гидрокарбоната аммония с концентрацией 25мМ, pH « 8 + 9. Окисление проводили в течение 3 ч при продувке воздуха через раствор. Большая часть полученных в таких условиях продуктов окисления кверцетина совпадает с продуктами окисления кверцетина в водно-этанольных смесях. Компоненты, интенсивности хроматографических пиков которых «чувствительны» к замене этанола на метанол, отмечены специальными комментариями в таблице.

Для подтверждения хиноидного строения соединения 2 со временем удерживания îr = 9,6 мин и M = 332 окисление кверцетина проводили в течение 6 ч при барботиро-вании воздуха через раствор и 6 сут в условиях контакта с воздухом без барботирования и перемешивания, после чего реакционная смесь была обработана гидроксиламином. К 2 мл реакционной смеси добавили 0,02 г гидрохлорида гидроксиламина. Реакцию проводили при 70°С в течение суток. В результате на хроматограмме реакционной смеси исчезает пик продукта 2 со временем удерживания îr = 9,6 мин и M = 332, что не противоречит предположению о его хиноидной структуре. Кроме того, для подтверждения хиноидной структуры этого продукта был зарегистрирован УФ-спектр реакционной смеси, в которой наличие других компонентов было незначительным. В качестве образца сравнения использовали раствор гидрокарбоната аммония. Спектр получен на спектрометре Epoch (BioTek Instruments, США). Выявлен максимум поглощения при длине волны 325 нм. Спектр схож с полученным ранее спектром хинона, образующимся в результате окисления кверцетина [13].

С целью выяснения природы димеров (димерами авторы обозначают компоненты с молекулярной массой M = 2Мкверцетин и продукты дегидродимеризации с M = = 2MKBepu;eraH — 2H), обнаруживаемых в больших количествах при хромато-масс-спек-трометрическом анализе продуктов окисления кверцетина, реакционную смесь разбавили в 10 раз, при этом интенсивность всех хроматографических пиков пропорционально уменьшилась. При увеличении концентрации кверцетина в реакционной смеси вдвое по сравнению с исходной увеличилась интенсивность только пика кверцетина. Из этого следует, что образование димерных продуктов окисления преимущественно происходит в процессе реакции. Однако было отмечено и появление пиков ионов [M — 1]_ димеров

в масс-спектрах мономерных продуктов, образование которых происходило в масс-спектрометре в процессе электрораспылительной ионизации. Оптимизация условий масс-спектрометрического детектирования позволила снизить интенсивность пиков ионов [М — 1]_ димеров в масс-спектрах, что во многих случаях позволило обнаружить пики ионов [М —1]_ мономерных продуктов. Основную роль сыграло изменение напряжения на выходном капилляре с —140 до —240 В.

Для окисления кверцетина в условиях реакции Фентона смешивали 1 мл водного раствора Н202 (3%), 1 мл водного раствора FeSO4 с концентрацией 10 мг/мл и 1 мл раствора кверцетина в этаноле с концентрацией 10 мг/мл, а также готовили смесь этих компонентов в таких же соотношениях, но с уменьшенными в 10 раз концентрациями. Пробы реакционных смесей отбирали через 15 мин, 1 и 2 ч после начала реакции. Показано, что продукты окисления кверцетина в таких условиях не совпадают с продуктами окисления, полученными при окислении кверцетина кислородом воздуха, и, следовательно, заслуживают отдельного рассмотрения.

Обсуждение результатов. В результате окисления кверцетина в водно-спиртовом растворе в слабощелочной среде кислородом воздуха, хромато-масс-спектрометричес-кого анализа полученной смеси, систематизации литературных данных о продуктах окисления кверцетина и их сопоставления с полученными нами данными удалось соотнести основные известные продукты окисления кверцетина с параметрами удерживания зарегистрированных нами компонентов. Продукты окисления кверцетина и важнейшие параметры для их ВЭЖХ-МС анализа приведены в таблице в порядке увеличения времени удерживания; для всех компонентов указаны индексы удерживания.

ОН

Структуры соединений, образующихся в результате окисления кверцетина кислородом воздуха в водно-спиртовом растворе в слабощелочной среде

Кислоты. Сопоставление литературных данных с нашими результатами позволяет установить структуры карбоновых кислот, а именно 2,4,6-тригидроксибензойной кислоты 3 (tR = 6,0 мин) и 3,4-дигидроксибензойной кислоты 4 (tR = 6,9 мин). Однако флороглюцин, который упоминается в литературе как продукт декарбоксилирования 2,4,6-тригидроксибензойной кислоты 3, в нашем случае не был обнаружен, так как декарбоксилирование происходит при нагревании, в том числе при высушивании продуктов окисления [14].

На хроматограмме смеси продуктов окисления был обнаружен пик неизвестного соединения со временем удерживания 2,9 мин и приведёнными в таблице главными сигналами масс-спектра. Для этого соединения в результате сопоставления с литературными данными можно предложить две структуры: 2-(3,4-дигидроксифенил)-2-оксоуксусной кислоты 5 и этил-3,4-дигидроксибензоата. Однако наиболее вероятна именно структура кислоты, так как при замене этанола на метанол в составе растворителя положение и относительная интенсивность пика этого продукта на хроматограмме не изменяются. Образование 2-(3,4-дигидроксифенил)-2-оксоуксусной кислоты 5 отмечают авторы статьи [8], где описано электрохимическое окисление кверцетина в растворе этанол/натрий-фосфатный буферный раствор (1 : 1, v/v, pH = 7,4). Полученные нами результаты позволяют уточнить структуру соединения с временем удерживания 5,2 мин. Можно предположить, что это не этил-2,4,6-тригидроксибензоат, а 2-оксо-2-(2,4,6-тригидрок-сифенил)уксусная кислота 6 (идентифицирована в работе [8]), потому что сигнал этого компонента также сохраняется на хроматограмме реакционной смеси, содержащей метанол вместо этанола. Ещё одним доводом в пользу наших рассуждений служат расчётные коэффициенты гидрофобности этил-3,4-дигидроксибензоата и этил-2,4,6-три-гидроксибензоата: они больше, чем коэффициенты гидрофобности 2,4,6-тригидроксибензойной 3 и 3,4-дигидроксибензойной 4 кислот, элюирующихся с временем удерживания 6,0 и 6,9 мин соответственно; следовательно, продукты окисления кверцетина с временем удерживания 2,9 мин и 5,2 мин по этому критерию не являются этиловыми эфирами.

Среди продуктов окисления присутствует компонент со временем удерживания 8,8 мин и массовым числом иона [M — H]- = 351. В статье [8] описан продукт с молекулярной массой 352 и структурой 2-карбокси(3,4-дигидроксифенил)(гидрокси)меток-си-4,6-дигидроксибензойной кислоты 7. В результате гидролиза соединения 7 могут образовываться 2-(3,4-дигидроксифенил)-2-оксоуксусная кислота 5 и 2,4,6-тригидрок-сибензойная кислота 3 .

Кетали и полукетали. В соответствии с литературными данными [5, 8, 11, 12] можно предположить, что продукт со временем удерживания 14,7 мин и массовым числом иона [M — H]- = 363 имеет структуру 1-(3,4-дигидроксифенил)-2-этокси-2-гид-рокси-3-(2,4,6-тригидроксифенил)пропан-1,3-диона 8. Доказательством такого предположения является тот факт, что интенсивность пика этого соединения уменьшается в 10 раз на хроматограмме смеси, полученной в растворе, содержащем метанол вместо этанола. Это соединение относится к классу этиловых эфиров кеталей, существующих только в растворах, поэтому его выделение в индивидуальном виде представляется маловероятным.

К этому же типу продуктов относятся обнаруженные нами алфитонин 2-(3,4-ди-гидроксибензоил)-2,4,6-тригидроксибензофуран-3(2Н)-он 9 (tR = 11,1 мин) [5, 7, 11] и 2-(3,4-дигидроксифенил)-2,5,7-тригидроксихроман-3,4-дион 10 (tR = 10,3 мин). Соединения 9 и 10 являются полукеталями и, следовательно, существуют только в растворах.

Аналитические параметры продуктов окисления кверцетина кислородом воздуха в водных растворах

tR Ш т/ г [М-Н]~ Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения (^Р), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

2,9(А) - 109 181 ОН у^оя он 2-(3,4-дигидроксифенил)-2-оксо-уксусная кислота [1] (0,35°, 0Д0Ь) НО""^ он этил-3,4-дигидроксибензоат [2] (1,41ь) [Структура, исключена, см. текст] 97; 125; 137 (I);

4,0

5,2 - 197 197 О он он 2-оксо-2-

5,5 - 180; 109 197 ОН А/Ч он Д / он шг 0 2,2,5,7-тетрагидроксибензофуран-3

^ к Ш т/ г [М-Н]~ Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения (^-Р), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

соон

НОчД/ОН

6,0 670 169 169 151

он

2,4,6-тригидроксибензойная кислота [3, 4, 8, 14, 16]

6,8 С 671 243; 279 Не идентифицирован 151; 169; 287 (I) 173; 193; 243;

СООН 1

6,9 671 153 153 он 3,4-дигидроксибензойная кислота [3, 4, 8, 9, 14, 16] (0,81а, 1,01ь) 109; 113; 153) 125 (I); 109 (II;

7,1 672 615 Не идентифицирован 153; 169; 330; 485; 285; 303; 317; 569

7,3 672 Не идентифицирован 269; 287; 331

8,6 677 635; 317 317 Не идентифицирован 191; 299; 441; 657

8,8 678 351 351 НЧ гоон/он у"ч:оон он 169; 271; 289; 317; 333; 483; 497

2-

О)

о

^ к Ш т/ г [М - щ- Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения (^-Р), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

8,8 678 317 Не идентифицирован 113; 207; 431; 561

9,1 680 191; 351 Не идентифицирован 151; 163; 169; 207; 273; 273; 289; 299; 307; 317; 333; 339; 347; 361

9,6 683 179; 333; 667 333 О ОН он он 2-

ос

^ к ш т/ г [М-Н]~ Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения (^Р), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

9,6 Со О) о 3 г г я § о\ © г 683 179; 333; 667 333 ^уОН |,0у^0ТТ оп О- О' он о анион-радикал [10]

к й р г в г к г ^ 9,6 -к № о 683 331 331 ноо \ \ ОН О 2-

00 1 га | Вып. 1 684 179 Не идентифицирован 107; 153; 197; 281; 299; 317; 333; 355

^ к ш т/ г [м- щ- Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения (^Р), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

10,3 688 317; 635 317 "" и........ ......." ' ........ „„ ......... Г " ОН О 2-

10,6 690 317; 635 Не идентифицирован 191; 207; 287; 331; 497; 513; 649

11,1 695 635; 299 317 ОН /ОН Т \Х о он ° 2-

^ к Ш т/ г [м- щ- Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения (^-Р), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

11,4 697 Не идентифицирован 163; 191; 207; 231; 245; 255; 273; 299

но, ОН

11,6 699 453 453 {Г ^Г ^Ьоно 317; 333; 434; 497; 617;

он о

11,7 700 Не идентифицирован 253; 317; 333; 434; 452; 468; 497; 591; 609; 630; 647

ОН

гЛ °

12,ОБ 703 497 305 /к/к НО у^ О I I 2-

12,3 706 Не идентифицирован 271; 289; 315; 333; 667; 689

tR RI (nï/5)MaKc. m / z [M-H]~ Предпол значения агаемые структуры компонента, ссылка, (lg-P), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

12,3 706 Не идентифицирован 317; 333; 434; 453; 497; 519; 617; 633

12,8 711 331; 453; 499 Не идентифицирован 434; 627; 869; 891

12,9 712 331 Не идентифицирован 434; 452; 497; 615; 633

13,2 716 Не идентифицирован 303; 317; 331; 499; 435; 453; 615; 633; 751; 766

ОН А/ОН

13,7 722 331 111 он ОН О 303; 423; 434; 445; 465; 481; 499; 631; 663

^)-3-

14,2 728 Не идентифицирован 311; 355; 421; 437; 465; 479

14,4 731 897 Не идентифицирован 303; 331; 347; 448; 485; 515; 562; 633; 753; 779; 829; 867; 933

^ к Ш т/ г [М-Н]~ Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения (^Р), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

14,5 732 345; 363 но. /О. /° /==\ ТХ он Уг° он ОН О 2-

14,6 733 Не идентифицирован 303; 347; 448; 481; 630; 744; 779; 933

14,7 735 727; 363 363 НО. /ОН /-1 Т Т онГ он о он 1-

15,6 747 465 Не идентифицирован 617

16,8 765 331 Не идентифицирован 113; 331; 379; 453; 483; 615; 634

1 к

Ш

т/ г [М - Н\

Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения

Массовые числа других интенсивных сигналов

17,2

772

601

Не идентифицирован

327; 451; 517; 601; 631; 653; 725

ОН

НО

17,6

779

603

301

он

он он о

Кверцетин

301; 415; 603

18,9

802

617

Не идентифицирован

573; 599

20,0

823

435; 871

Не идентифицирован

113; 389; 500

ОН

но.

20,1

825

285

601

о мг .он с

^о

fYcA- и

он о II У^-ОН

но у

он

ОН

.он

1а,-

ОН

299; 327; 431; 449; 465; 513; 557

1 а,- (3,4-диги дроксифени л)-4,6-дигид-рокси-7а,- (2-гидрокси-4- (3,5,7-тригид-рокси-4-оксо-4Н-хромен-2-ли)фенок-си)-1аН-оксирено[2,3-Ь]хро-мен7(7аН)-он, димер [9, 11]

-J

tR RI (п?/,г)макс. т/ z [м- н]- Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения (lg Р), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

20,3 829 601 Не идентифицирован 285; 435; 571; 871; 901

20,5 833 449 601 Димер кверцетина 431; 449

21 844 901 Не идентифицирован 299; 329; 397; 663; 685; 777; 901; 993

21,2 848 901 Не идентифицирован 299; 329; 663; 685; 731; 753; 777; 901

to CD О 3 s 21,4 § — o\ © e e 852 435 315 fY°H НО\ /О. /L он он о

e S 21,6 £ e 856 901 Не идентифицирован 113; 145; 191; 218; 347; 381; 485; 520; 587; 677; 711; 776; 805; 901; 917

^ 22,0 865 615 Не идентифицированы 585

-к 22,1 868 463 571; 463

^ 22,4 № 874 917 299; 459; 617; 963

S 22,5 876 303; 585 449; 621; 735; 917

to I 22,8 883 603 299; 345; 603; 648; 695; 715; 902; 931

г

г я

О

ы

а ©

г

t-R RI ('т/г)макс. т/ z [М-Н]~ Предполагаемые структуры компонента, ссылка, значения (^-Р), комментарии (выделены курсивом) Массовые числа других интенсивных сигналов

23,0 888 601 901 271; 299

23,3 895 901 901 299; 329; 435; 451; 601; 937

23,7 905 901 901 Тримеры кверцетина 435; 599; 693; 735; 825; 849; 901

23,9 910 901 901 435; 599; 635; 735; 901

24,7 930 901 901 113; 319; 363; 547; 597; 613; 697; 727

<!

Со

g

S

Примечания. (I) — режим съёмки спектра по общему ионному току (АиЬзМЭ);

(II; М) — режим съёмки спектра в условиях изолирования и фрагментации иона с указанным в скобках массовым числом (МЯМ).

Жирным шрифтом выделено время удерживания компонентов, присутствующих во всех реакционных смесях и стабильных при их хранении;

Курсивом выделено время удерживания компонентов, содержание которых в реакционных смесях увеличивается со временем;

Подчёркнуто время удерживания нестабильных компонентов, которые могут быть обнаружены в реакционых смесях в течение не более 3 ч после начала процесса ; время удерживания депсида , хроматографический пик которого появляется приблизительно через 1 ч после начала процесса и исчезает через 3 ч.

Надстрочным символом а обозначены коэффициенты гидрофобности, вычисленные в программе СЬетОгада, надстрочным символом ь обозначены коэффициенты гидрофобности, посчитанные в программе АСБ.

Сл

Пероксиды. В составе реакционных смесей был зафиксирован нестабильный продукт с временем удерживания 9,6 мин, пиками ионов [М — Н]- = 333 в масс-спектрах и возможной структурой 2-(3,4-дигидроксифенил)-2-гидроперокси-5,7-дигидрок-сихроман-3,4-диона 11. Дальнейшее окисление этого интермедиата может приводить к образованию 2-(3,4-диоксоциклогекса-1,5-диен-1-ил)-2-гидроперокси-5,7-дигидрокси-хроман-3,4-диона 2, содержание которого в смеси увеличивается со временем. После завершения барботирования кислорода через раствор этот продукт регистрируется в смеси в течение недели и дольше, поэтому его можно считать одним из самых стабильных продуктов этой реакции. Для доказательства его хиноидной структуры реакционная смесь была обработана гидроксиламином. О протекании реакции судили по исчезновению пика соединения с массовым числом иона [М — Н]- = 331 на хроматограмме. Параллельно был зарегистрирован УФ-спектр смеси, в которой соединение 2 было основным компонентом; максимум поглощения в этом спектре соответствует 325 нм. Ранее в работе [13] был опубликован спектр смеси, полученной в ходе окисления кверцетина кислородом воздуха в водных растворах в щелочной среде, положение максимума в котором составляло 314 нм. Авторы статьи [13] приписывают основному продукту этой смеси хиноидную структуру. При титровании раствора кверцетина с целью установления его константы кислотности [14] был зарегистрирован УФ-спектр смеси продуктов окисления кверцетина при pH =10 с максимумом поглощения 324 нм.

Значительный интерес представляет сравнение двух обсуждаемых в литературе механизмов окисления кверцетина кислородом воздуха в водных растворах. Первый из них в качестве промежуточного продукта предполагает образование так называемого депсида 2-((3,4-дигидроксибензоил)окси)-4,6-дигидроксибензойнойкислоты 15 (Схема 1) [4, 11, 16], второй — алфитонина (2-(3,4-дигидроксибензоил)-2,4,6-тригидрокси-бензофуран-3(2H)-она) 9 [5, 7, 11]. В полученной нами смеси продуктов окисления кверцетина присутствует депсид 15 со временем удерживания = 12,00 мин (Схема 1).

Схема 1

Однако мы обнаружили и алфитонин 2-(3,4-дигидроксибензоил)-2,4,6-тригидроксибен-зофуран-3(2^-он 9, время удерживания которого составляет = 11,1 мин. Механизм образования алфитонина включает окисление кето-таутомера кверцетина с образованием гидроксильной группы в положении 2 (формально — полукеталь 10) с последующей его изомеризацией и образованием нового полукеталя 9, содержащего пятичлен-ный цикл вместо шестичленного. Следует заметить, что в составе реакционных смесей

были обнаружены три компонента с пиками ионов [M — H= 317 в масс-спектрах. Возможно, что они относятся к нестабильным интермедиатам 10, 16 (Схема 2).

Схема 2

Заключение. В результате окисления кверцетина кислородом воздуха в водных растворах в слабощелочной среде (pH « 8 + 9) в присутствии этанола (для увеличения растворимости), хромато-масс-спектрометрического анализа продуктов реакции и систематизации литературных сведений о продуктах окисления были установлены основные продукты. Подтверждено, что многие из продуктов окисления кверцетина относятся к таким классам органических соединений как: кетали, полукетали и перок-сиды и, следовательно, стабильны только в растворах.

Два основных обсуждаемых в литературе механизма окисления кверцетина предполагают промежуточное образование соединений с тривиальными названиями «депсид» и «алфитонин». Установлено их совместное присутствие в составе продуктов, но показана их различная устойчивость и время жизни в растворах.

Авторы выражают благодарность руководству ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России за возможность использования оборудования для выполнения данной работы.

Литература

1. Тюкавкина Н. А., ЗурабянС.Э., Белобородое В. Л. Органическая химия: в 2 кн. Кн. 2: Специальный курс. М.: Дрофа, 2008. 592 с.

2. Ramos F. A., Takaishi Y., ShirotoriM., Kawaguchi Y. et. al. Antibacterial and antioxidant activities of quercetin oxidation products from yellow onion (Allium cepa) skin // Agr. Food Chem. 2006. Vol. 54. P. 3551-3557.

3. Schreier P., Miller E. Studies on flavonol degradation by peroxidase (Donor: H2O2-oxidoreductase, EC 1.11.1.7). Part 2 — Quercetin // Food Chem. 1985. Vol. 18. P. 301-317.

4. Brown S. B., Rajananda V., Holroyd J. A., EvanstE. G. V. A study of the mechanism of quercetin oxygenation by 18O labelling. A comparison of the mechanism with that of haem degradation // Biochem. J. 1982. Vol. 205. P. 239-244.

5. Awad H. M., Boersma M. G., Vervoort J., Rietjens I. M. C. M. Peroxidase-catalyzed formation of quercetin quinone methide-glutathione adducts // Arch. Biochem. Biophys. 2000. Vol. 378, N. 2. P. 224-233.

6. Osman A., MakrisD.P., Kefalas P. Investigation on biocatalytic properties of a peroxidase-active homogenate from onion solid wastes: An insight into quercetin oxidation mechanism // Process Biochem. 2008. Vol. 43. P. 861-867.

7. Kubo I., NiheiK., ShimizuK. Oxidation products of quercetin catalyzed by mushroom tyrosinase // Bioorg. Med. Chem. 2004. Vol. 12. P. 5343-5347.

8. Zhou A., Kikandi S., Sadik O. A. Electrochemical degradation of quercetin: Isolation and structural elucidation of the degradation products // Electrochem. Commun. 2007. Vol. 9. P. 2246-2255.

9. Buchner N., Krumbein A., RohnS, KrohL. W. Effect of thermal processing on the flavonols rutin and quercetin // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006. Vol. 20. P. 3229-3235.

10. Mocek M., Richardson P. J. Kinetics and mechanism of quercetin oxidation //J. Inst. Brew. 1972. Vol. 78. P. 459-465.

11. Krishnamachari V., LevineL.H., ZhouC., Pare P. W. In vitro alavon-3-ol oxidation mediated by a B ring hydroxylation pattern // Chem. Res. Toxicol. 2004. Vol. 17. P. 795-804.

12. Hvattum E., Stenstrom Y., EkebergD. Study of the reaction products of flavonols with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl using liquid chromatography coupled with negative electrospray ionization tandem mass spectrometry // J. Mass Spectrom. 2004. Vol. 39. P. 1570-1581.

13. YangL., LiP., Gao Y., WuD. Qualitative observation of chemical change rate for quercetin in basic medium characterized by time resolved UV-vis spectroscopy //J. Mol. Liq. 2010. Vol. 151. P. 134-137.

14. Zenkevich I. G., Eshchenko A. Y., Makarova S. V., Vitenberg A. G. et. al. Identification of the products of oxidation of quercetin by air oxygen at ambient temperature // Molecules. 2007. Vol. 12. P. 654-672.

15. Зенкевич И. Г. Особенности использования линейно-логарифмических индексов удерживания в обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журн. прикл. химии. 1995. Т. 68. P. 1321-1327.

16. FahlmanB.M., KrolE.S. UVA and UVB radiation-induced oxidation products of quercetin //J. Photochem. Photobiol. (B). 2009. Vol. 97. P. 123-131.

17. Jurasekova Z., Torreggiani A., Tamba M., Sanchez-Cortes S., Garcia-Ramos J. V. Raman and surface-enhanced Raman scattering (SERS) investigation of the quercetin interaction with metals: Evidence of structural changing processes in aqueous solution and on metal nanoparticles // J. Mol. Struct. 2009. Vol. 918. P. 129-137.

References

1. Tyukavkina N.A., Zurabyan S. E., Beloborodov V. L. Organicheskaia khimiia [Organic chemistry. In two books. Book Two: Special Course]. Moscow, Drofa, 2008. 592 p.

2. Ramos F. A., Takaishi Y., Shirotori M., Kawaguchi Y. et. al. Antibacterial and antioxidant activities of quercetin oxidation products from yellow onion (Allium cepa) skin. Agr. Food Chem., 2006, vol. 54, pp. 3551-3557.

3. Schreier P., Miller E. Studies on flavonol degradation by peroxidase (Donor: H2O2-oxidoreductase, EC 1.11.1.7). Part 2 — Quercetin. Food Chem., 1985, vol. 18, pp. 301-317.

4. Brown S. B., Rajananda V., Holroyd J. A., Evanst E. G.V. A study of the mechanism of quercetin oxygenation by 18O labelling. A comparison of the mechanism with that of haem degradation. Biochem. J., 1982, vol. 205, pp. 239-244.

5. Awad H. M., Boersma M. G., Vervoort J., Rietjens I. M. C. M. Peroxidase-catalyzed formation of quercetin quinone methide-glutathione adducts. Arch. Biochem. Biophys., 2000, vol. 378, no. 2, pp. 224-233.

6. Osman A., Makris D.P., Kefalas P. Investigation on biocatalytic properties of a peroxidase-active homogenate from onion solid wastes: An insight into quercetin oxidation mechanism. Process Biochem., 2008, vol. 43, pp. 861-867.

7. Kubo I., Nihei K., Shimizu K. Oxidation products of quercetin catalyzed by mushroom tyrosinase. Bioorg. Med. Chem., 2004, vol. 12, pp. 5343-5347.

8. Zhou A., Kikandi S., Sadik O. A. Electrochemical degradation of quercetin: Isolation and structural elucidation of the degradation products. Electrochem. Commun., 2007, vol. 9, pp. 2246-2255.

9. Buchner N., Krumbein A., Rohn S., Kroh L. W. Effect of thermal processing on the flavonols rutin and quercetin. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2006, vol. 20, pp. 3229-3235.

10. Mocek M., Richardson P. J. Kinetics and mechanism of quercetin oxidation. J. Inst. Brew., 1972, vol. 78, pp. 459-465.

11. Krishnamachari V., Levine L. H., Zhou C., Pare P. W. In vitro alavon-3-ol oxidation mediated by a B ring hydroxylation pattern. Chem. Res. Toxicol., 2004, vol. 17, pp. 795-804.

12. Hvattum E., Stenstrom Y., Ekeberg D. Study of the reaction products of flavonols with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl using liquid chromatography coupled with negative electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom., 2004, vol. 39, pp. 1570-1581.

13. Yang L., Li P., Gao Y., Wu D. Qualitative observation of chemical change rate for quercetin in basic medium characterized by time resolved UV-vis spectroscopy. J. Mol. Liq., 2010, vol. 151, pp. 134-137.

14. Zenkevich I.G., Eshchenko A. Y., Makarova S. V., Vitenberg A.G. et. al. Identification of the products of oxidation of quercetin by air oxygen at ambient temperature. Molecules, 2007, vol. 12, pp. 654-672.

15. Zenkevich I. G. Osobennosti ispol'zovaniia lineino-logarifmicheskikh indeksov uderzhivaniia v obra-shchenno-fazovoi vysokoeffektivnoi zhidkostnoi khromatografii [Features of the application of linear-loga-

rithmic retention index system in reversed phase high performance liquid chromatography]. Журн. прикл. химии., 1995, vol. 68, pp. 1321-1327.

16. Fahlman B. M., Krol E. S. UVA and UVB radiation-induced oxidation products of quercetin. J. Photochemn. Photobiol. (B), 2009, vol. 97, pp. 123-131.

17. Jurasekova Z., Torreggiani A., Tamba M., Sanchez-Cortes S., Garcia-Ramos J. V. Raman and surface-enhanced Raman scattering (SERS) investigation of the quercetin interaction with metals: Evidence of structural changing processes in aqueous solution and on metal nanoparticles. J. Mol. Struct., 2009, vol. 918, pp. 129-137.

Стaтья пoступилa в pедaкцию 16 декабря 2016 г.

Контактная информация

Пушкарёва Татьяна Ивановна — аспирантка; e-mail: tatyana_pushkareva93@mail.ru

Зенкевич Игорь Георгиевич — доктор химических наук, профессор; e-mail: izenkevich@mail15.com

Pushkareva Tatiana I. — post-graduate student; e-mail: tatyana_pushkareva93@mail.ru Zenkevich Igor G. — Doctor of Chemistry, Professor; e-mail: izenkevich@mail15.com