Молекулярно-генетическое исследование клональности ви Т-лимфоцитов в диагностике неходжкинских лимфом

Приложение

паратов и диагностических средств, по-прежнему актуально. Известно, что для этих целей с точки зрения эффективности достаточно привлекательными являются методы, в основе которых лежит биоспецифическая хроматография. Цель работы -синтезировать биоимитирующие хроматографические сорбенты на основе кремнеземных носителей и лигандов - активных триазинових красителей, изучить их возможности сорбции и десорбции VII плазменного фактора свертывания крови.

Материалы и методы. Использовали кремнеземный носитель Диасорб аминопропиловый, активные триазиновые красители. Связывание красителей к матрице проводили по методике "с включением соли". Исходным сырьем для исследований были фракции II + III и III плазмы крови по Кону. Белковый состав фракций плазмы, а также чистоту получен-

ных белковых препаратов исследовали электрофоретически в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (система Леммли). Активность фактора VII определяли коагулологи-ческим методом по времени образования тромбина, а также с использованием хромогенных пептидных субстратов.

Результаты и обсуждение. Синтезировано 16 хроматографических сорбентов, изучены их свойства относительно сорбции и десорбции фактора свертывания крови VII. По своим свойствам сорбенты разделены на 5 разных групп.

Заключение. На основе макропористых кремнеземных матриц и красителей-лигандов созданы биоимитирующие хроматографические сорбенты, которые могут быть применимы в процессе получения очищенных белковых препаратов, в частности, фактора свертывания VII.

Морфо-функциональное состояние миокарда у детей после трансплантации аллогенных

гемопоэтических стволовых клеток

И.В. Маркова \ Л.С. Зубаровская \ А.В.Козленок2, А.Я. Гудкова 2, Б.В. Афанасьев1 Институт детской гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой ГБОУ ВПО Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова; 2 ФЦ сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург

Введение. Структурно-функциональное состояние миокарда и изменения внутрисердечной гемодинамики могут определять выживаемость и качество жизни больных после трансплантации аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (алло-ТГСК), определяя актуальность мониторирова-ния этих показателей.

Материалы и методы. В исследование включены 20 пациентов в возрасте от 2 до 19 лет с различными злокачественными заболеваниями системы крови (острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) - 7, острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) - 4, хроническим миелолейкозом (ХМЛ) - 4, миелодиспластическим синдромом (МДС) - 1), а также апластической анемией, тяжелой степени - у 2, анемией Фанкони - у 1 больных, в лечении которых применяли алло-ТГСК. У 8 больных использовали миелоабла-тивный режим кондиционирования, у 12 - немиелоаблативный режим. Длительность наблюдения после алло-ТГСК варьировала от 9 мес до 3,5 лет. Инструментальное исследование сердечно-сосудистой системы включало эхо-кардиографию (ЭхоКГ) (М-модальный, двумерный и допплеровский режимы). Систолическое давление в легочной артерии рассчитывали исходя из величины градиента давления трикуспидальной регургитации.

Результаты и обсуждение. У 7 (33%) из 20 больных обнаружены пограничные значения систолического давления в легочной артерии (СДЛА). Значения СДЛА варьировали от 30 до 34 мм рт.ст. У 1 больного в возрасте 19 лет, наряду с пограничными цифрами легочной гипертензии (ЛГ), выявлена небольшая дилатация правого желудочка (ПЖ), у 1 - пограничные значения ЛГ сочетались с умеренной дилатацией левого предсердия (ЛП) и нарушением диастолической функции ПЖ. Диастолическая дисфункция ПЖ вне структурных изменений миокарда и нарушений внутрисердечной гемодинамики обнаружена еще у 3 (19%) больных (6, 11 и 8 лет), причем в последнем случае имелась диастолическая дисфункция обоих желудочков. Клинические проявления хронической сердечной недостаточности с сохранной фракцией выброса отсутствовали.

Заключение. Обнаружена высокая частота выявления диастолической дисфункции ПЖ и/или пограничная легочная гипертензия у детей перенесших алло-ТГСК. Необходимо мониторирование этих показателей для оценки их вклада в последующем в формирование сердечной недостаточности у этой группы больных.

Молекулярно-генетическое исследование клональности В- и Т-лимфоцитов в диагностике неходжкинских лимфом

А.Э. Мационис, П.Э. Повилайтите, А.В. Петров

ГБУ Ростовской области Патологоанатомическое бюро, отделение экспериментальной патоморфологии и электронной микроскопии

Введение. На сегодняшний день при морфологическом исследовании материала пациентов с подозрением на лимфопролиферативное заболевание, в большинстве случаев, для точной диагностики достаточно совокупности клинических, морфологических данных, результатов проточной цитометрии и иммуногистохимии. Однако у 5-10% больных постановка диагноза затруднена. И даже опытным морфологам необходима дополнительная информация. В этом случае применение молекулярно-генетических методов может оказаться полезным в комплексном анализе конкретного случая. Ценность определения "клональности" В- и Т-лимфоцитов для диагностики основано на том, что опухолевые лимфоидные клетки имеют общего предшественника, а значит, несут идентичный набор генетических перестроек. Практически все лимфоидные неоплазии В- или Т-линии несут клонально перестроенные гены иммуноглобулинов и/или Т-клеточных рецепторов соответственно. Доклад посвящен рассмотрению диагностической значимости, достоинствам и недостаткам метода мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) для исследования клональности B- и Т-лимфоцитов.

Материалы и методы. Обычно в качестве материала для анализа выступают образцы лимфоидной ткани в парафиновых блоках. Реже на исследование доставляется нативный, нефиксированный операционный материал. Ткани заклю-

ченные в парафин - является проблемным диагностическим материалом, поскольку ДНК в этом случае подвергается значительной деградации, межмолекулярным ковалентным сшивкам и др., и не всегда полноценно пригодна для анализа. Поэтому после выделения ДНК, для исключения ложноотрицательных результатов, каждый образец подвергают анализу на качество. Только ДНК приемлемого качества может быть использована для постановки мультиплексных ПЦР к полной и/или неполной перестройке генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (генов у- и/или p-цепей Т-клеточного рецептора, в зависимости от того, какая В- или Т-клеточная лимфома заподозрена патологом в исследуемом образце ткани). Для исследования используем тест-системы IdentiClone IGH Gene Clonality Assay , IdentiClone TCRB Gene Clonality Assay или IdentiClone TCRG Gene Clonality Assay ("In Vivo Scribe Technologies", США) согласно инструкции производителя. Детекцию результатов проводим методом капиллярного электрофореза на приборе 3100-Avant Genetic Analyzer ("Applied Biosystems", США).

Результаты и обсуждение. Если на электрофореграмме в ожидаемой области длин наблюдается один или два выраженных пика, то такие результаты свидетельствуют о наличии в анализируемом материале клональной В- или Т-клеточной популяции. Если же пики образуют куполообразную форму

125

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 3

по типу Гауссовского распределения, то это означает, что лимфоидные клетки в образце имеют поликлональную генетическую природу, что характерно для реактивных процессов.

Заключение. Молекулярно-генетическое исследование клональной перестройки генов тяжелых цепей иммуноглобу-

линов (генов у- и/или p-цепей Т-клеточного рецептора) может дать патологу дополнительную информацию в решении вопроса является ли данная лимфоидная ткань злокачественной опухолью или представляет собой доброкачественный процесс.

Роботизированная микроскопия и информационные технологии увеличивают точность, чувствительность и доступность методик анализа морфологии клеток крови

В.С. Медовый

ЗАО Медицинские компьютерные системы (МЕКОС), Москва

Современные роботизированные комплексы микроскопии (РКМ) выполняют автоматический просмотр мазка крови с адаптацией к качеству биоматериала, условиям пробоподготовки, распределению материала в препарате, влиянию патологии на морфологию клеток, качеству съемки в микроскопе, обеспечивая выполнение всех рекомендаций ручной методики анализа. Применение РКМ радикально улучшает условия труда и увеличивает производительность. Выходная информация РКМ, представленная в форме сортированных галерей изображений клеток выборки, может рассматриваться как представительная концентрированная цифровая модель натурального препарата (ЦМП). ЦМП пригодна для удаленных визуальных телемедицинских консультаций, в том числе через Интернет. Благодаря увеличению выборки появилась возможность впервые в массовом порядке обнаруживать и визуально идентифицировать патологические признаки и объекты при их низкой концентрации. РКМ способны изготавливать также более полные ЦМП - виртуальные слайды (ВС). Из-за значительного объема ВС используются главным образом для исследовательских целей, контроля качества и обучения. РКМ МЕКОС-Ц2 использует средства экспорта ЦМП по линиям связи в сервисный центр МЕКОС в качестве постоянно действующей компоненты эксплуатации и модернизации МЕКОС-Ц2, обеспечивающей контроль

автоматических функций РКМ и создающей кооперацию разработчиков и потребителей для испытаний новых версий МЕКОС-Ц2. Постоянно пополняемый за счет многих лабораторий, архив ЦМП МЕКОС используется в качестве модели внешней среды для оптимизации аналитических функций МЕКОС-Ц2. Накопленная выборка ЦМП обеспечивает объем и представительность испытаний при различных патологиях, методиках пробоподготовки, особенностях контингента больных, недостижимую при обычных натурных испытаниях. Указанная технология создания коллективного архива "референсных ЦМП", предлагаемая научно-методическим центром МЕКОС, может применяться потребителями для исследовательских медицинских целей. Информационной поддержкой методик РКМ-ЦМП является интернет ресурс MECOS-Virt для передачи, хранения, удаленного доступа, поддержки телемедицинских консультаций ЦМП.

Роботизированные функции РКМ позволяют внедрить углубленные методики и эффективно использовать время врача лаборатории, сетевые функции РКМ-ЦМП позволяют рационально использовать интеллектуальные ресурсы больницы, Интернет функции РКМ-ЦМП-MECOS-Virt открывают возможности поднять качество анализов за счет эффективного использования высококвалифицированного персонала в масштабах региона и страны в целом.

Многоцентровая болезнь Кастлемана и РОЕМS-синдром: результаты клинико-морфологического

обследования и вариантов лечения

А.М. Михайлов1, С.С. Бессмельцев2, Т.И. Агеева3, В.В. Байков 4, А.Ю. Зарицкий 5, Н.В. Ильин 6, Н.М. Калинина 7, Ю.А. Криволапов 8,

К.М. Пожарисский 6, Т.И. Поспелова 9

'Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, "Государственный медицинский Университет, Новосибирск, 4Государственный медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова, "Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова, 6Федеральный центр радиологии и хирургических технологий, всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. Н.М. Никифорова, "Ленинградское областное патологоанатомическое бюро,

Санкт-Петербург, 9НИИ травматологии и ортопедии, Новосибирск

Введение. Болезнь Кастлемана (БК) представляет собой редкое лимфопролиферативное доброкачественное заболевание с непредсказуемым течением и риском трансформации в лимфому. Несмотря на хорошо описанную гистологическую характеристику опухоли, диагностика и лечение БК остается трудной задачей.

Материалы и методы. Под наблюдением находилось 11 больных мультицентровой формой болезни Кастлемана (МБК). Период наблюдения за больными от 1 года до 4 лет. Диагноз был установлен на основании гистологического и иммуногистохимического исследований ткани лимфатических узлов. Мультицентровость доказана методом спиральной компьютерной томографии. У 4 пациентов верифицирован плазмоклеточный вариант МБК, у 7 - гиалиново-васкулярный. У 6 больных в процессе болезни развился РОЕМS-синдром (полинейропатия, органомегалия, эндокринопатия, М-протеин, изменения кожи). У пациентов с РОЕМS-синдромом, наряду с классическими проявлениями, выявлялись массивные полостные отеки, рефрактерные к эвакуациям, а у 3 человек они сочетались с периферической демиелинизирующей полинейропатией, зарегистрированной электро-нейромиографией. У 3 человек в сыворотке крови, а у 1 больного еще и в ликворе выявлен высокий уровень интерлейкина-6 (ИЛ-6). Трое пациентов были инфицированы герпесвирусом человека 8-го типа (HHV 8-го типа) (ДНК вируса выявлена в сыворотке крови и в ткани лимфатических узлов иммуногистохимическим мето-

дом). У всех больных с РОЕМS-синдромом в крови и суточной моче были увеличены Х-цепи иммуноглобулинов. При гистохимическом исследовании в ткани лимфатических узлов при РОЕМS-синдроме определялось обильное развитие капиллярной сети (по экспрессии CD31) и тотальная секреция сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) всеми структурами лимфатического узла.

Результаты и обсуждение. Для лечения больных использовали различные методы. В настоящее время живы 8 больных. У 6 больных была получена ремиссия. При этом у 2 больных с плазмоклеточным вариантом МБК и РОЕМS-синдромом была применена высокодозовая химиотерапия с трансплантацией аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (длительность ремиссии на момент обсчета результатов 1 год). Ремиссия была получена также у пациента с плазмоклеточным вариантом МКБ после использования анти-интерлейкина-6 в течение 1 года. Больной продолжает получать этот препарат. Результаты применения анти-интерлейкина-6 еще у 1 больного пока оценить не представляется возможным. 1 больной МБК и РОЕМS-синдромом получил 6 циклов СНОР-21 с достижением ремиссии. С целью поддерживающей терапии ему был назначен штерферон-а. Отмечена санацией крови от ДНК HHV 8-го типа и нормализация уровня ИЛ-6. Ремиссия сохраняется в течение 2 лет. 1 больной пролечен ритуксимабом (4 введения) и 1 больной МБК без РОЕМS - рофероном. Достигнута ремиссия. Срок наблюдения 6 и 12 мес соответственно. У 1 больной МБК

126