Характеристика клинических изолятов Escherichia coli, выделенных от пациентов с болезнью Крона

существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина. Журн. микробиол. 2011,33: 99-109.

4. Терентьева Н.А., Тимченко Н.Ф., Балабанова JI.А., Рассказов В.А. Характеристика образования, ингибирования и разрушения биопленок Yersinia pseudotuberculosis, формирующихся на абиотических поверхностях. Журн. микробиол. 2015, 3: 72-78.

5. Терентьева, Н.А. Тимченко Н.Ф., Голотин В.А., Рассказов В.А. Биологическая активность токсинов Yersinia pseudotuberculosis. Журн. микробиол. 2016, 6:10-19.

6. Тимченко Н.Ф., Недашковская Е.П.,ДолматоваЛ.С., Сомова-ИсачковаЛ.М. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток, 2004.

7. Cornelis G.R. Yersinia type III secretion: send in the effectors. J. Cell. Biology. 2002,158 (3): 401-408

8. Costerton J.W., Stewart P.S., Greenberg E.P. Bacterial biofilms:a common cause of persistent infections. Science. 1999, 284:1318-1322.

9. Flemming H.C. EPS — then and now. Microorganisms. 2016, (4): 4. pii: E41 PMID: 27869702.

10. Herrera A., Vu B.G., Stach C.S. et al. Staphylococcus aureus P-toxin mutants are defective in biofilm ligase and sphingomyelinase activity, and causation of infective endocarditis and sepsis. Biochemistry. 2016, 55 (17): 2510-2517. doi: 10.1021/acs.biochem.6b00083.

11. Huseby M.J., Kruse A. C., Digre J. et al. Beta toxin catalyzes formation of nucleoprotein matrix in staphylococcal biofilms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, 107: 14407-14412.

12. Lister J.L., Horswill A.R. Staphylococcus aureus biofilms: recent developments in biofilm dispersal. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014, 4: 178.

13. Schweer J., Kulkarni D., Kochut A. et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 2013, 9 (11): el003746. doi: 10.1371/journal.ppat.l003746.

14. Shak J.R., Ludewick H.P., Howery K.E. et al. Novel role for the Streptococcus pneumoniae toxin pneumolysin in the assembly ofbiofilms. MBio. 2013, 4 (5): e00655-13. doi: 10.1128/ mBio.00655-13.

15. Wen Y., Behiels E., Devreese B. Toxin-Antitoxin systems: their role in persistence, biofilm formation, and pathogenicity. Pathog. Dis. 2014, 70 (3): 240-249. doi: 10.1111/2049-632X.12145.

Поступила 10.06.17

Контактная информация: Терентьева Наталья Александровна, к.б.н.,

690022, Владивосток, пр. 100 лет Владивостоку, 159, р.т. (423)231-07-03

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017

Р.Б.Городничев, Д.В.Ракитина, А.И.Манолов, Ю.П.Байкова, П.Л.Щербаков, Г.Б.Смирнов, Е.Н.Ильина

ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ESCHERICHIA COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины, Москва

Цель. Оценить пул E.coli внутри пораженной зоны кишечника пациентов с болезнью Крона. Материалы и методы. Клинические изоляты (28), а также контрольные образцы были протестированы относительно их возможной принадлежности к определенной филогенетической группе, способности к адгезии и инвазии на модели монослоя эпителиальных клеток СаСо2, способности к формированию биопленки и подвижности. Результаты. Было показано, что E.coli, высеянные из различного биоматериала, отличались по филогенетической принадлежности и способности образовывать биопленку. E.coli, относящиеся к типу адгезивно-инвазивных, обнаруживались преимущественно в материале биопсии слизистой кишечника пациентов с болезнью Крона. Заключение. Есть основания полагать, что тип адгезивно-инвазивных E.coli сложился на стыке экологических ниш просвета и стенки кишечника.

Журн. микробиол., 2017, № 6, С. 42—49

Ключевые слова: болезнь Крона, адгезивно-инвазивные E.coli, гетерологические модели, биопленки, филогенетическое разнообразие E.coli

R.B.Gorodnichev, D.V.Rakitina, A.I.Manolov, Yu.P.Baykova, P.L.Scherbakov, G.B.Smirnov, E.N.Ilina

FEATURES OF ESCHERICHIA COLI CLINICAL STRAINS, ISOLATED FROM THE PATIENTS WITH CROHN'S DISEASE

Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Moscow, Russia

Aim. To characterize pool of Crohn's disease-associated E.coli isolated from patients with Crohn's disease. Materials and methods. 28 clinical stains were selected. Clinical isolates, as well as control samples, were tested for their possible belonging to a certain phylogenetic group, the ability to adhere and invade on the model of a monolayer of CaCo2 epithelial cells, the ability to form biofilms and their mobility. Results. We have shown that E.coli, isolated from a different biomaterial, belonged to different phylogenetic groups and differed in their ability to form biofilms. Adhesive-invasive E.coli were found mainly in the material of biopsy of the intestinal mucosa of patients with Crohn's disease. Conclusion. There are reasons to suppose that adhesive-invasive E.coli formed at the junction of ecological niches of the lumen and the intestinal wall.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2017, No. 6, P. 42-49

Keywords: Crohn's disease, adhesive-invasive E.coli, heterological models, biofilms, phylogenetic diversity of E.coli

ВВЕДЕНИЕ

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) и, в том числе, болезнь Крона — это хронические рецидивирующие заболевания, от которых страдают по всему миру до 500 человек на 100 000 населения, особенно в развитых странах [1], [Agus A. et al., 2014]. Существует несколько точек зрения относительно механизмов патогенеза болезни Крона, но в самом общем виде болезнь Крона — это сложное многофакторное воспалительное заболевание кишечника, сопровождающееся чрезмерным иммунным ответом на фоне нарушения микрофлоры кишечника, генетической предрасположенности и неблагоприятных условий среды.

Одним из существенных особенностей патогенеза болезни Крона является нарушение баланса и состава кишечной микрофлоры — снижение доли Firmicutes и увеличение доли Proteobacteria и Bacteroidetes [Agus A. et al., 2014; Oberk A. et al., 2015], особенно за счет увеличения доли кишечной палочки в общем пуле микроорганизмов [3,7]. Существенную роль нарушения микробного баланса микрофлоры кишечника подтверждают данные об успешном лечении пациентов с болезнью Крона методом трансплантации кала здоровых доноров и применением пробиотических штаммов E.coli [1,4]

Особый интерес представляет тот факт, что из клинических образцов пациентов в острой фазе болезни Крона часто выделяют изоляты E.coli, которые не относятся к уже известным шести патоварам. Эти изоляты были выделены в отдельный патовар адгезивно-инвазивных E.coli (АИКП), благодаря их высокой способности к адгезии и инвази in vitro в моделях с применением клеток СаСо2 и 1-407, а также способности выживать и размножаться внутри J774-A1 макрофагов, не вызывая их гибели [7]. Молекулярные основы патогенности подобных изолятов до сих пор не установлены, т.к. эти изоляты обладают набором признаков, характерных для разных патоваров и не всегда обладают

известными факторами адгезии и инвазии [3], [Oberk А. et al., 2015]. Существуют данные о повышенной способности данного патовара образовывать биопленки [7]. Штаммы АИКП клонально разнообразны, но принадлежат, в основном, к филогенетической группе В2 [O'Brien C.L. et al., 2016].

Тот факт, что штаммы АИКП выделяют в 36 — 52% случаев у больных и лишь в 6 — 17% случаев у здоровых пациентов [7], с одной стороны, говорит о том, что этот тип E.coli ассоциирован с болезнью Крона, а с другой, что и в больном, и в здоровом кишечнике человека присутствует неоднородный пул штаммов Е. coli.

Целью нашего исследования было оценить пул Е. coli внутри пораженной зоны кишечника пациентов с болезнью Крона. Для более полного изучения пула E.coli у пациентов с диагностированной болезнью Крона был взят биоматериал двух типов: биопсия слизистой кишечника из мест, охваченных воспалительным процессом, и материал просвета кишечника над местами поражения. Для поиска различий в составе пула кишечной палочки все клинические изоляты и контрольные образцы были протестированы относительно принадлежности к определенной филогенетической группе, способности к адгезии и инвазии, способности к формированию биопленки и подвижности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованные в работе изоляты E.coli были отобраны от 3 пациентов с подтвержденной болезнью Крона.

Критериями включения пациентов в исследование являлись: возраст от 18 до 65 лет, подтвержденная эндоскопически и гистологически болезнь Крона с поражением подвздошной кишки, исключение у них недифференцированного колита, отсутствие каких-либо инфекционных заболеваний, отсутствие в анамнезе оперативных вмешательств на кишечнике, отказ от приема антибиотиков за последние 6 мес.

Все пациенты были проинформированы об участии в исследовании и дали свое согласие.

В исследование были включены две женщины 29 и 40 лет с терминальным илеитом и мужчина 23 лет с илеоколитом, которые проходили амбулаторное лечение в Центральном научно-исследовательском институте гастроэнтерологии и Государственном научном центре колопроктологии в Москве с 2012 по 2014 гг.

Подготовку кишечника пациентов к колоноскопии проводили по стандартной методике. После соблюдения больными в течение 3 дней бесшлаковой диеты, они принимали раствор полиэтиленгликоля 4000. Стандартный объем полиэтиленгликоля рассчитывается как 1 литр раствора на 20 кг веса. Однако учитывая анамнез больных, наличие у них многократного (более 6 раз в день) стула, ограничились половинной дозой полиэтиленгликоля, который больные принимали накануне исследования. Данная схема подготовки позволила качественно провести колоноилеоскопию. Небольшое количество прозрачной жидкости, которое находилось у больных в просвете толстой кишки легко аспирировалось. В то же время, половинный объем принятого полиэтиленгликоля позволил сохранить кишечное содержимое в просвете подвздошной кишки.

Отбор биоматериала пациентов проводили во время проведения илеоско-пии. В процессе эндоскопии из просвета подвздошной кишки аспирировали содержимое в стерильные контейнеры в объеме 20 — 40 мл. Биопсию слизи-

стой оболочки проводили после аспирации содержимого. Биоптаты брали из измененной периульцерозной слизистой оболочки. У каждого больного брали по 4 биопитата: 2 фрагмента СО помещались в стерильную сухую пробирку для проведения в дальнейшем исследования микрофлоры, 2 помещали в 10% раствор формалина для проведения гистологического исследования.

Жидкость, отобранную из просвета кишечника, разводили примерно х106 раз стерильным РВ5(фосфатный буфер), образцы биопсии слизистой кишечника размешивали в 0,2 мл стерильного PBS. Полученный инокулят в объеме 0,1 мл наносили на чашки с LB агаром (Amresco, USA). После инкубации в течение ночи при 37°С образовавшиеся колонии были идентифицированы с помощью Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization (MALDI) Biotyper software (Bruker Daltonics, Germany) с использованием Microflex LT (Bruker Daltonics, Germany).

В исследование были включены 28 клинических изолятов E.coli, высеянных из материала трех пациентов с диагностированной болезнью Крона. Контрольную группу составили 5 образцов E.coli, 2 из которых были лабораторными штаммами (MG1655 и Nisslel917), а 3 были высеяны из кала здоровых пациентов.

Способность штаммов E.coli к адгезии и инвазии на модели клеточной линии СаСо2 оценивали аналогично стандартным методикам с небольшими модификациями [2, 6, 8]. Клеточную линию дифференцированных эпителиальных клеток кишечника СаСо2 выращивали в 24-луночном планшете в среде DMEM (DMEM,Gibco,Life Technologies,Carlsbad, CA, USA) с добавлением 20% бычьей эмбриональной сыворотки до развития монослоя клеток (5х105 кл/лунку). Монослой заражали нормированной (D62o=0,5) суспензией E.coli и инкубировали 2 часа в термостате при температуре 37°С. После инкубации монослой промывали, лизировали 1 % раствором NP40 (Sigma), а количество адгезированных клеток определяли методом посева на чашки с LB агаром. Параллельно над монослоем, инкубированным с суспензией E.coli, меняли культуральную среду на среду, содержащую 1мг/мл меропенема (BIOPHARM, Pvt. Ltd, Индия) для того, чтобы убить все внеклеточные бактерии. После часовой инкубации в присутствии антибиотика монослой промывали, лизировали 1% раствором NP40 (Sigma), и количество инвазирован-ных клеток определяли методом посева на чашки с LB агаром.

Способность к инвазии определяли как отношение количества инвазиро-ванных клеток к исходному количеству E.coli, инокулированных в начале опыта, выраженное в процентах. Способность к адгезии определяли как разницу между количеством клеток на монослое после 2 часов инкубации и количеством инвазированных клеток, поделенную на количество клеток СаСо2 в монослое, и выражали в КОЕ E.coli на клетку СаСо2. Каждое измерение проводили троекратно.

Способность образовывать биопленку оценивали по методике определения формирования биопленки на абиогенных поверхностях [Coffey В. et al., 2014]. В эксперименте использовали ночные культуры кишечной палочки (18 часов инкубации в бульоне LB в термостате при температуре 37°С), приведенные к оптической плотности D57o=0,5. В лунку 96-луночного планшета добавляли 190 мкл бульона LB и инокулировали его 10 мкл подготовленной суспензии кишечной палочки, по 5 статистических повторов для каждого образца. Планшеты с инокулированной средой инкубировали в термостате при температуре 37°С в трех параллелях — 5, 9 и 24 часа. После инкубации среду убирали, лунки трижды промывали дистиллированной водой. Для окрашива-

ния биопленок в каждую лунку добавляли 180 мкл дистиллированной воды и 20 мкл 1% спиртового раствора кристаллического фиолетового и окрашивали в течение 45 минут. По истечении времени краситель сливали, лунки промывали дистиллированной водой 3 раза и добавляли 200 мкл 95% этанола на 45 минут для экстракции красителя. После экстракции количество красителя определяли на планшетном фотометре (Thermo Fisher Scientific Multiscan Ascent) при длине волны 570 нм. В качестве контроля использовали среду без бактерий.

Ночные культуры E.coli, выращенные на LB агаре, вкалывали стерильной зубочисткой в среду, содержащую 1% триптона и 0,25% NaCl и 0,3% агара [9]. Подвижность оценивали по диаметру ореола в мм на 5, 7, 9 и 12 час инкубации.

Определение филогенетической принадлежности изолятов E.coli проводили стандартным методом с применением ПЦР [5]. Праймеры на исследуемые гены: ChuA.l (5' TGGGСGAACTGAAAATCTGG 3') и ChuA.2 (5' CGGCAAATAGAGTGGAACGG 3'), YjaA.l (5'AGACGCTGCCTTCAGTAACC 3') и YjaA.2 (5' AACCTGTGACAAACCGCCC 3') и TspE4C2.1 (5' ATTCAGa GGTGACACTATTCG 3') и TspE4C2.2 (5' TTGCGGGTGAGACAGAAACG 3') были подобраны так, чтобы в процессе амплификации получались фрагменты длиной в 440, 181 и 131 пар нуклеотидов соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Все проанализированные нами изоляты E.coli показали филогенетическое разнообразие и являлись представителями филогенетических групп А, В2 и D. Изоляты E.coli, высеянные из кала здоровых доноров, также принадлежали к филогенетическим группам А, В2 и D, что является свидетельством наличия в организме здорового человека неоднородного пула E.coli различного филогенетического состава.

При рассмотрении филогенетической принадлежности изолятов E.coli, высеянных из биоматериала пациентов с болезнью Крона, прослеживается зависимость филогенетической принадлежности E.coli от типа биоматериала. Так, 12 из 17 (76%) изолятов E.coli, высеянных из материала биопсий слизистой кишечника, взятых из воспаленной ткани вблизи язвы, принадлежали к филогенетической группе А, а 8 из 12 (67%) изолятов E.coli, высеянных из материала просвета кишечника, принадлежали к филогенетической группе В2. Изоляты E.coli коменсальной флоры кишечника, как правило, принадлежат к филогенетической группе А, а патогенные внекишечные штаммы чаще всего относятся к филогруппам В2 и D [5]. Это представляется значимым наблюдением в связи с тем, что в месте воспаления мы обнаруживаем доминирование изолятов E.coli, принадлежащих к филогенетической группе А, т.е. представителей коменсальной флоры, а изоляты E.coli, принадлежащие к филогенетической группе В2, наоборот, чаще доминируют в просвете кишечника.

Учитывая принцип Гаузе, подобное распределение филогенетической принадлежности со значительным превалированием одной филогенетической группы в одном типе биоматериала может являться косвенным свидетельством наличия двух экологических ниш в месте воспаленной ткани эпителия кишечника и в просвете кишечника.

Одним из основных признаков вирулентности бактерий считается способность к адгезии и инвазии при взаимодействии с эукариотическим клетками. Способность проникать и развиваться внутри человеческих клеток — одно из

свойств, способствующих возникновению воспалительного процесса, который, в свою очередь, является неотъемлемой частью патогенеза болезни Крона.

Способность к адгезии и инвазии E.coli была протестирована в модельных опытах in vitro с использованием монослоя эпителиальных клеток СаСо2. Мы ожидали увидеть разницу в способности к адгезии и инвазии между изолята-ми E.coli, высеянными из материала биопсии слизистой кишечника, и E.coli, высеянными из материала просвета кишечника, но изоляты E.coli, полученные из различного типа биоматериала, достоверно не отличались по способности к адгезии и проникновению в монослой эпителиальных клеток СаСо2.

Способность к адгезии изолятов E.coli с использованием монослоя эпителиальных клеток СаСо2 колебалась от 0,7 до 10 кл. E.coli на клетку СаСо2, способность к инвазии — от 0 до 0,25%. По способности к адгезии клинические изоляты в среднем слабо отличались от контрольной группы. Способность к инвазии клинических изолятов, напротив, в среднем, была несколько выше контрольных значений.

Способность образовывать биопленку является важной характеристикой клинических изолятов. Количество образованной биопленки, как правило, зависело от времени инкубации и было максимальным на 5 и 9 час инкубации, а к 24 часу клетки преимущественно переходили в планктонную форму. Количество образованной биопленки, измеряемое величиной светопоглоще-ния, варьировало в пределах от 0 до 1 и в среднем равнялось 0,35 на 5 и 9 час инкубации, а на 24 час инкубации среднее значение биопленкообразования составляло всего 0,1.

Количество образованной биопленки на 5 и 9 час инкубации было в среднем достоверно выше в образцах E.coli, высеянных из материала биопсии слизистой кишечника, взятого из воспаленной ткани вблизи язвы, и образцах контрольной группы, чем в образцах E.coli, высеянных из материала просвета кишечника.

Подвижность — важный физиологический показатель, позволяющий оценить способность клеток активно перемещаться в сторону более благоприятных условий. Наличие у Е. coli длинных полярных фибрилл и пилей является основным механизмом клеточного движения, а также может являться одним из факторов адгезии. Хотя логично было предположить более высокий показатель подвижности изолятов E.coli, высеянных из материала просвета кишечника, динамика подвижности всех изолятов E.coli имела вид линейной зависимости и зависела скорее от характеристик каждого конкретного образца, чем от типа биоматериала, из которого E.coli были высеяны.

Одним из возможных путей патогенеза при болезни Крона является наличие особого типа кишечной палочки — адгезивно-инвазивной кишечной палочки. Эту группу, не имеющую молекулярно-биологических маркеров, выделяют по нескольким физиологическим характеристикам, в т.ч. способности к адгезии на клетках монослоя эпителиалия СаСо2, превышающей 1 кл E.coli на клетку СаСо2, и способности к инвазии, превышающей 0,1 % [7].

Среди исследованных изолятов E.coli критериям АИКП удовлетворяли 9 клинических изолятов, выделенных от пациентов с болезнью Крона. Изоляты E.coli, соответствующие критериям АИКП, были обнаружены у всех трех пациентов с болезнью Крона и не обнаружены среди контрольных образцов. Среди них преобладали изоляты, выделенные из материала биопсии слизистой кишечника (три от пациента PI, два от пациента Р2 и три от пациента РЗ).

Один клинический изолят E.coli, удовлетворяющий критериям АИКП, был обнаружен в материале просвета кишечника пациента PI.

Сравнивая группу АИКП с общим пулом изолятов, можно наблюдать сближение средних значений способности к адгезии и инвазии оставшихся изолятов E.coli, выделенных из различного биоматериала пациентов с болезнью Крона, а также уменьшение разброса внутри отдельных групп.

Филогенетическая характеристика этих изолятов E.coli показала, что 4 из 9 (1 изолят E.coli, высеянный из материала просвета кишечника, и 3 изолята E.coli из материала биопсии слизистой кишечника) принадлежали к филогенетической группе В2, а 5 изолятов E.coli, высеянных из материала биопсии слизистой кишечника, принадлежали к филогенетической группе А. Таким образом, из 4 изолятов E.coli, высеянных из материала биопсии слизистой кишечника и принадлежащих к филогенетической группе В2,3 отвечали критериям АИКП, а их доля среди всех изолятов E.coli, высеянных из материала биопсий слизистой кишечника и отвечающих критериям АИКП, составляла 44%. Доля изолятов E.coli, принадлежащих к филогенетической группе В2, в общем пуле изолятов E.coli, высеянных из материала биопсии слизистой кишечника, была ниже и составляла всего 29%. Это подтверждает наблюдения, что изоляты адгезивно-инвазивных E.coli чаще являются представителями филогенетической группы В2 [O'Brien C.L. et al., 2016].

Изоляты адгезивно-инвазивных E.coli не отличались от остальных изолятов подвижностью.

При сравнении изолятов E.coli, отвечающих критериям АИКП, с общим пулом изолятов E.coli можно наблюдать промежуточное положение группы АИКП между изолятами E.coli, высеянными из материала биопсии слизистой кишечника и просвета кишечника, по способности к формированию биопленки.

Ранее было показано, что способность к формированию биопленки достоверно разделяет изоляты E.coli по типу биологического материала, из которого они были получены. Промежуточное положение и большой разброс способности к образованию биопленки в группе АИКП может свидетельствовать о том, что E.coli, отвечающие критериям АИКП, существуют на стыке экологических ниш и экологическое преимущество от способности образовывать биопленку не постоянно во времени.

Косвенным свидетельством правомерности выделения группы адгезивно-инвазивных E.coli является наличие достоверных корреляционных связей между исследуемыми параметрами внутри этой группы и отсутствием подобных связей во всем пуле изолятов или в группах, выделяемых по типу исходного биоматериала. Так, внутри группы адгезивно-инвазивных E.coli между собой (с достоверностью р=0,05 и коэффициентом корреляции по Спирману выше 0,7) были связаны количество образуемой биопленки, подвижность и принадлежность к филогенетической группе. Высокая подвижность, как правило, коррелировала с высоким количеством образованной биопленки и филогенетической группой А. Связь между подвижностью и способностью образовывать биопленку ранее уже описывалась в литературе [9].

Принимая во внимание тот факт, что в группе адгезивно-инвазивных E.coli при доминировании изолятов, высеянных из материала биопсии слизистой кишечника, выше представленность E.coli филогенетической группы В2, а по количеству образуемой биопленки адгезивно-инвазивные E.coli занимают промежуточное положение между изолятами E.coli, высеянными из материала биопсии слизистой кишечника и просвета кишечника, а также принцип

Гаузе, ограничивающий возможность разным видам занимать одну экологическую нишу — есть основание предполагать, что формирование группы адгезивно-инвазивных E.coli происходило на стыке двух экологических ниш поверхности эпителия и просвета кишечника.

Авторы благодарят за помощь в подготовке и выполнении исследования Лазорева В.Н., Шитикова Е.С. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ №16-15-00258.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ahmed I., Roy В. С., Khan S. A. et al. Microbiome, metabolome and inflammatory bowel disease. Microorganisms. 2016,4 (2): 20.

2. Baumgart M., Dogan В., Rishniw M. et al. Culture independent analysis of ileal mucosa reveals a selective increase in invasive Escherichia coli of novel phylogeny relative to depletion of clostridiales in Crohn's disease involving the ileum. ISME J. 2007, 1 (5): 403-418.

3. Carrière J., Darfeuille-Michaud A., Nguyen H. T. Infectious etiopathogenesis of Crohn's disease. World J. Gastroenterol. 2014, 20 (34): 12102-12117.

4. Comito D., Cascio A., Romano C. Microbiota biodiversity in inflammatory bowel disease. Italian J. Pediatrics. 2014,40 (1): 1.

5. Clermont O., Bonacorsi S., Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Applied Environmental Microbiology. 2000, 66 (10): 4555-4558.

6. Liang X., Ji Y. Comparative analysis of staphylococcal adhesion and internalization by epithelial cells. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) protocols. 2007, p. 145-151.

7. Martinez-Medina M., Garcia-Gil L.J. Escherichia coli in chronic inflammatory bowel diseases: An update on adherent invasive Escherichia coli pathogenicity. World J, Gastrointest. Pathophysiol. 2014, 5 (3): 213-227.

8. Martinez-Medina M., Aldeguer X., Lopez-Siles M. et al. Darfeuille-michaud a molecular diversity of Escherichia coli in the human gut: new ecological evidence supporting the role of adherent-invasive E. coli (AIEC) in Crohn's disease. Inflammatory Bowel Diseases. 2009, 15 (6): 872-882.

9. Wood Т.К., Barrios A.F.G., Herzberg M., Lee J. Motility influences biofilm architecture in Escherichia coli. Applied Microbiology Biotechnology. 2006, 72 (2): 361-367.

Поступила 20.03.17

Контактная информация: Городничев Р.Б., 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, 1а

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017

А.М.КудряшоваО.В.Борисова1, Н.А.Михайлова1Д.В.Лоншаков2, А.В.Катлинский2

ВЛИЯНИЕ МЕТОДОВ ИММОБИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОПОЭТИНА НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДО К чЭПО В СЫВОРОТКАХ КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ЖИВОТНЫХ

'НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, 2Биофармацевтическая компания ООО «Форт», Москва

Цель. Исследование влияния методов иммобилизации эритропоэтина на чувствительность выявления специфических к человеческому эритропоэтину (чЭПО) в сыворотках крови экспериментальный животных. Материалы и методы. В работе использовали сыворотки крови кроликов и морских свинок, полученных после введения препаратов эритропоэтина. Схемы иммуноферментного метода включали варианты пассивной иммобилизации человеческого рекомбинантного эритропоэтина (чрЭПО) на планшете и два варианта иммунохимической иммобилизации: связывание биотинилированного чрЭПО в лунках планшета с пассивно иммобилизованным стрептавидином и связывание чрЭПО с пассивно иммобилизованными на планшетах антителами к эритропоэтину. Результаты. Показано, что иммунохимическая иммобилизация приводит к повышению чувствительности в диапазоне от 2 до 10 раз при выявлении антител к чЭПО по сравнению