Исследование эффективности ферментного препарата на основе нового мутантного штамма Trichoderma reesei при гидролизе зерновых смесей

УДК 579.66/ 663.15

исследование эффективности ферментного препарата на основе нового мутантного штамма Trichoderma reesei при гидролизе зерновых смесей

Е. В. КОСТЫЛЕВА, канд. техн. наук; А. С. СЕРЕДА, канд. техн. наук; Н. В. ЦУРИКОВА, канд. техн. наук; И. А. ВЕЛИКОРЕЦКАЯ

ВНИИ пищевой биотехнологии — филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва А. М. АЙСИНА, студент

Московский государственный университет пищевых производств

Е. А. МИХАЙЛИЧЕНКО, студент Московский политехнический университет

В последнее время интенсивно развивается рынок кормовых ферментных препаратов (ФП), значительную долю которых составляют препараты целлюлаз и гемицеллюлаз. Базовые компоненты большинства кормов для сельскохозяйственных животных и птицы в России — злаковые культуры: пшеница, рожь, ячмень с высоким содержанием некрахмальных полисахаридов (НКП), обладающих антипитательными свойствами [1, 2]. Включение ФП карбогидраз, гидролизующих НКП, в рационы на основе зерновых культур приводит к снижению вязкости перевариваемой массы, повышает доступность белка для действия пищеварительных ферментов, способствует нормализации микрофлоры кишечника, увеличивает энергетическую ценность и усвояемость кормов [3, 4].

Традиционно основным источником целлюлаз и гемицеллюлаз являются грибы рода Trichodermа, отличающиеся высокой продуктивностью и широким спектром синтезируемых ферментов. Большинство коммерческих целлюлолитических препаратов получают на основе штаммов гриба Т. reesei, продуцирующего сбалансированный комплекс эндо- и экзокарбогидраз для глубокой декструкции растительных субстратов [5, 6].

При этом ключевую роль в повышении питательной ценности кормов играют карбогидразы эндодействия, главным образом ксиланазы и эндоглюканазы [7]. Ксиланазы расщепляют внутренние связи, удаленные от концов полимерной цепи, в молекуле арабиноксилана — основной гемицеллюлозы зерна, составляющей до 30—35% материала клеточных стенок [8]. Эндоглюканазы гидролизуют внутренние связи целлюлозы в ее аморфных участках с образованием коротких волокон целлюлозы и целлооли-госахаридов. Кроме того, эндоглюканаза способна расщеплять внутренние связи в р-1,4-глюканах [9]. Совместное

Характеристика фП для гидролиза зерновых субстратов

ФП Штамм-продуцент Активность основных ферментов

белка, мг/г Эндоглюканаза (по КМЦ), едг, 50°, рН 5,5 Ксиланаза, ед/г, 50°, рН 5,5

ФП1 ФП2 Т. гевзе1-28 — исходный Т. reese/-28-У-12 — мутантный 162 178 2814 3564 4052 6957

действие ксиланаз и эндоглюканаз на основные НКП зернового сырья обеспечивает быстрое снижение вязкости кормовых смесей и повышение их питательной ценности.

Во ВНИИПБТ методом УФ-мутагенеза был получен штамм Т. reesei28-У-12 с увеличенной активностью ксиланазы и эндоглюканазы. В лабораторных ферментерах наработана культуральная жидкость исходного и мутантного штаммов, получены образцы сухих концентрированных ФП, характеристики которых представлены в таблице.

Цель исследования состояла в определении эффективности применения ФП, полученных на основе исходного и мутантного штаммов Т. reesei, при обработке разных видов зернового сырья для кормопроизводства.

В качестве субстратов использовали ржаную муку и смесь пшеничной (60%) и ячменной муки (40%). Гидролиз субстратов проводили в качалочных колбах объемом 750 мл при 40 °С при 220 мин-1. Концентрация субстрата составляла 50 мг/мл, ФП вносили в дозировке 1, 3 и 5 мг ФП/г субстрата (сырья). Через 3 ч инкубирования полученные гидролизаты центрифугировали при 10 750g в течение 5 мин. В супернатантах определяли содержание растворимого белка по методу Лоури, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин, и восстанавливающих сахаров (ВС) по методу Шомоди — Нельсона. Контрольные варианты инкубировали в аналогичных условиях (3 ч, 40 °С, 220 мин-1) без внесения ФП.

Активность ксиланазы и эндоглюканазы в препаратах определяли по начальным скоростям образования ВС при гидролизе ксилана из древесины березы и водорастворимой №-соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) соответственно [9]. Содержание ВС определяли по методу Шомо-ди — Нельсона. Содержание белка в ФП определяли по методу Лоури.

Из представленных результатов очевидна эффективность ФП целлюлаз и гемицеллюлаз при обработке зерновых субстратов. Выход восстанавливающих сахаров увеличился более чем в 3 раза при использовании ФП2, полученного на основе мутантного штамма, в дозировке 5 мг/г сырья как на ржаной муке, так и на смеси пшеница — ячмень. Содержание растворимого белка после обработки ФП2 в максимальной дозировке увеличилось в 2,6 раза на всех исследованных видах сырья по сравнению с контрольным вариантом без внесения ФП.

3,5 3

3,5-г 3-

ФП1

б

ФП2

ФП2 ФП1

а

Без ФП 1 мг/г сырья 3 мг/г сырья 5 мг/г сырья Рис. 1. Выход восстанавливающих Сахаров при гидролизе ржаной муки (а) и смеси пшеничной и ячменной муки (б) ферментными препаратами, полученными на основе исходного и мутантного штаммов T. reesei, в различных дозировках

с

о ю

3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

Рожь

Пшеница/ячмень Без ФП ФП1 ФП2

Рис. 2. Содержание растворимого белка в гидролизатах ржаной муки и смеси пшеничной и ячменной муки ферментными препаратами, полученными на основе исходного и мутантного штаммов Т. reesei, в дозировке 5 мг/г сырья

За счет увеличенной активности ксиланазы и эндоглю-каназы ФП2 более эффективно гидролизовал НКП зерновых субстратов, что подтверждается повышением выхода ВС и высвобождением большего количества растворимого белка. По отношению к ФП1, полученному на осно-

ве исходного штамма, выход ВС при обработке субстратов ФП2 увеличился в среднем на 20%, выход растворимого белка — на 10—15%. Следует отметить, что увеличение активности препарата позволяет существенно сократить его расход. Так, использование 3 мг/г сырья ФП2 обеспечивает такой же выход редуцирующих сахаров, как ФП1 в максимальной дозировке, — 5 мг/г сырья, что позволяет сократить расход ФП на 35—40%.

Полученные результаты подтверждают перспективность применения ФП целлюлолитического и гемицел-люлолитического действия, полученного на основе нового мутантного штамма Т. гее5ег'-28-У-12 с увеличенной активностью ксиланазы и эндоглюканазы, при обработке кормовых смесей на основе зерна.

Научно-исследовательская работа по подготовке рукописи проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы Фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013—2020 гг. (тема № 0529-2016-0045).

Литература

1. Bedford, M. R. Enzymes in farm animal nutrition / M. R. Bedford, G. G. Partridge. — UK: CAB International, 2010. — 319 p.

2. Богомолова, И. П. Научное исследование динамики и тенденций развития отечественной комбикормовой промышленности / И. П. Богомолова, И. Н. Василенко, С. Д. Силва // Вектор экономики. — 2016. — № 6 (6). — С. 46.

3. Кононенко, С. И. Ферментный препарат в кормлении свиней / С. И. Кононенко // Научный журнал КубГАУ — 2012. — № 78 (04). — С. 1-23.

4. Khattak, F. M. Enzymes in poultry nutrition / F. M. Khattak [et al] // J. Anim. Pl. Sci. — 2006. — V 16 (1-2). — P. 1-7.

5. Peterson, R. Trichoderma reesei RUT- C30 — Thirty years of strain improvement / R. Peterson, H. Nevalainen // Microbiology. — 2012. — № 158 (1), IP 58-68.

6. Gupta, V. G. Biotechnology and biology of Trichoderma / V. G. Gupta [et al] // Newnes. — 2014.

7. Синицын, А П. Ферментные новшества / А. П. Синицын, О. А. Синицына, О. Г Короткова // Агробизнес. — 2016. — Т 38. — № 4. — С. 88-92.

8. Meng, X. Degradation of Cell Wall Polysaccharides by Combinations of Carbohydrase Enzymes and Their Effect on Nutrient Utilization and Broiler Chicken Performance / X. Meng [et al] // Poultry Science. — 2005. — V. 8. — P. 37-47.

9. Sajith, S. An Overview on Fungal Cellulases with an Industrial Perspective / S. Sajith [et al] // J Nutr Food Sci. — 2016. — V 6 (1): 461.

References

1. Bedford M. R. Enzymes in farm animal nutrition / M. R. Bedford, G. G. Partridge. UK: CAB International, 2010, 319 p.

2. Bogomolova I. P. Nauchnoe issledovanie dinamiki i tendentsii raz-vitiya otechestvennoi kombikormovoi promyshlennosti / I. P. Bogomolova, I. N. Vasilenko, S. D. P D. Silva// Vektor ekonomiki, 2016, no. 6 (6), p. 46.

3. Kononenko S.I. Fermentnyi preparat v kormlenii svinei / S. I. Kono-nenko // Nauchnyi zhurnal KubGAU, 2012, no. 78 (04), p. 1-23.

4. Khattak F. M. Enzymes in poultry nutrition / F M. Khattak [et al] // J. Anim. Pl. Sci, 2006, vol. 16 (1-2), p. 1-7.

5. Peterson R. Trichoderma reesei RUT-C30 — Thirty years of strain improvement / R. Peterson, H. Nevalainen // Microbiology, 2012, no. 158 (1), p. 58-68.

6. Gupta V. G. Biotechnology and biology ofTrichoderma / V G. Gupta [et al] // Newnes, 2014.

7. Sinitsyn A P. Fermentnye novshestva / A. P Sinitsyn, O. A. Sinitsyna, O. G. Korotkova // Agrobiznes, 2016, vol. 38, no. 4, p. 88-92.

8. MengX. Degradation of Cell Wall Polysaccharides by Combinations of Carbohydrase Enzymes and Their Effect on Nutrient Utilization and Broiler Chicken Performance / X. Meng [et al] // Poultry Science, 2005, vol. 8, p. 37-47.

9. Sajith S. An Overview on Fungal Cellulases with an Industrial Perspective / S. Sajith [et al] // J Nutr Food Sci, 2016, vol. 6 (1): 461.

исследование эффективности ферментного препарата на основе нового мутантного штамма Trichoderma reesei при гидролизе зерновых смесей

Ключевые слова

зерновые смеси; кормовые ферментные препараты; ксиланаза; Trichoderma reesei; эндоглюканаза.

реферат

Большинство кормов для сельскохозяйственных животных в России производится на основе зернового сырья с высоким содержанием некрахмальных полисахаридов, оказывающих неблагоприятное действие на организм животных с однокамерными желудками и птицы. В связи с этим основную долю кормовых ферментов составляют эндоглюканазы и ксиланазы, способные разрушать антипитательные углеводные компоненты зернового сырья — целлюлозу и арабиноксилан, соответственно с образованием усвояемых сахаров и пребиотических олигосахаридов. С целью повышения экономических показателей процесса производства ферментных препаратов и эффективности их применения в кормовой отрасли проводятся исследования по получению высокоактивных продуцентов эндоглюканазы и ксиланазы. Во ВНИИПБТ методом УФ-мутагенеза был получен штамм T. reesei 28-У-12 с увеличенной активностью ксила-назы и эндоглюканазы, получены образцы сухих концентрированных препаратов на основе исходного и мутантного штаммов. Цель работы — определить эффективность применения полученных препаратов при обработке ржаной муки и смеси пшеничной (60%) и ячменной (40%) муки. Гидролиз субстратов проводили в качалочных колбах при 40 °С при 220 мин-1. Концентрация субстрата составляла 50 мг/мл, препараты вносили в дозировке 1, 3 и 5 мг на 1 г сырья. В супернатантах полученных гидролизатов определяли содержание растворимого белка и восстанавливающих сахаров. Применение препаратов эндоглюканазы и ксиланазы в 2-3 раза увеличивало выход восстанавливающих сахаров на всех видах сырья. При этом использование препарата, полученного на основе мутантного штамма, за счет повышенной активности ключевых ферментов позволяло сократить расход препарата на 35-40% по сравнению с препаратом на основе исходного штамма. Применение препарата на основе мутантного штамма также способствовало увеличению выхода растворимого белка на 10-15%.

Авторы

Костылева Елена Викторовна, канд. техн. наук; Середа Анна Сергеевна, канд. техн. наук; Цурикова Нина Васильевна, канд. техн. наук; Великорецкая Ирина Александровна ВНИИ пищевой биотехнологии —

филиал ФИЦ питания, биотехнологии и безопасности пищи, 111033, Москва, ул. Самокатная, д. 4б, ekostyleva@list.ru, as.sereda@gmail.com, nina.tsurikova@gmail.com, smirnova_i.a@mail.ru Айсина Алина Мэнировна, студент

Московский государственный университет пищевых производств, 125080, Москва, Волоколамское ш., д. 11, alinka.aysina@mail.ru Михайличенко Елизавета Алексеевна, студент Московский политехнический университет, 107023, Москва, Большая Семеновская ул., д. 38, liza.lyubimowa@yandex.ru

A Study of the Effectiveness of an Enzyme preparation obtained from a New Mutant Trichoderma Reesei Strain in the cereal mixtures Hydrolysis

Key words

cereal mixtures; fodder enzyme preparations; xylanase; Trichoderma reesei; endoglucanase.

abstract

Most of the farm animals feeds in Russia are produced on the basis of grain raw materials with a high content of non-starch polysaccharides, which have an adverse effect on the organism of monogastric animals and poultry. Therefore, the bulk of feed enzymes comprise endoglucanases and xylanases capable of destroying the anti-nutritional carbohydrate components of the grain raw materials — cellulose and arabinoxylan, respectively, with the formation of digestible sugars and prebiotic oligosaccharides. In order to increase the economic indicators of the enzyme preparations production and the effectiveness of their use in the feed industry, studies are being conducted to obtain high-producing strains. In VNIIPBT using UV-muta-genesis T. reesei 28-U-12 strain was obtained with increased xylanase and endoglucanase activity. Samples of dry concentrated preparations based on the initial and mutant strains were produced. The purpose of the work was to determine the effectiveness of the preparations in processing of rye meal and wheat / barley meal mixture. The hydrolysis of the substrates was carried out in shaking flasks at 220 rpm at 40 °C. Substrate concentration was 50 mg/ml; preparations were added at dosages of 1, 3, and 5 mg per 1 g of raw materials. Soluble protein and reducing sugars content was determined in supernatants of the obtained hydrolysates. The use of endo-glucanase and xylanase preparations increased the yield of reducing sugars by 2-3 times on all types of raw materials. Increased activity of key enzymes in the mutant strain allowed to reduce the consumption of the preparation by 35-40% compared to the preparation from the original strain. The use of the preparation on the basis of a mutant strain also contributed to an increase in the yield of soluble protein by 10-15%.

Authors

Kostyleva Elena Viktorovna, Candidate of Technical Sciences; Sereda Anna Sergeevna, Candidate of Technical Sciences; Tsurikova Nina Vasilevna, Candidate of Technical Sciences; Velikoretskaya Irina Aleksandrovna

All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology — a branch of the FRC of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 4b Samokatnaya st., Moscow, 111033, Russia, ekostyleva@list.ru, as.sereda@gmail.com, nina.tsurikova@gmail.com, smirnova_i.a@mail.ru Aisina Alina Menirovna, Student Moscow State University of Food Production, 11 Volokolamskoe highway, Moscow, 125080, Russia, alinka.aysina@mail.ru

Mikhailichenko Elizaveta Alekseevna, Student Moscow Polytechnic University,

38 Bolshaya Semionovskaya st., Moscow, 107023, Russia, liza.lyubimowa@yandex.ru