СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ МЕТОТРЕКСАТОМ БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
METHOD FOR PREDICTING THE EFFECTIVENESS OF METHOTREXATE THERAPY IN PATIENTS WITH RHEUMATOID ARTHRITIS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, а именно к ревматологии и может быть использовано для прогнозирования эффективности терапии метотрексатом больных ревматоидным артритом (РА), которые ранее не получали метотрексат.
Уровень техники
Ревматоидный артрит (РА) является наиболее распространенным аутоиммунным ревматическим заболеванием, которое включает сложный системный многофакторный воспалительный процесс, приводящий к разрушению суставов. Активация Т-лимфоцитов в ходе заболевания приводит к продукции широкого ряда провоспалительных цитокинов, принадлежащих преимущественно к суперсемействам фактора некроза опухолей (ФНО) и интерлейкинов (ИЛ). Разрушение суставов при РА связано, прежде всего, с разрушением внеклеточного матрикса тканей сустава, которое происходит за счет активации протеаз. Поскольку РА принадлежит к неизлечимым заболеваниям, целью терапии больных РА является достижение ремиссии, когда активность заболевания по индексу DAS28 снижается до значения, не превышающего 2.6, а показатели активности воспаления достигают уровня здоровых лиц. Ремиссия – это состояние отсутствия активности болезни у больных с хроническими неизлечимыми заболеваниями и не исключающее их повторную манифестацию в будущем.
В настоящее время для лечения РА разработано несколько эффективных терапевтических препаратов, которые различаются по механизмам действия. Эффективность терапии больных РА оценивается по снижению уровня активности заболевания в соответствии с индексом DAS28 до достижения низкой активности (2.6<DAS28<3.2) или ремиссии (DAS28<2.6). При этом индекс DAS28 определяют по формуле: deltaDAS28= базальный DAS28 – DAS28 в конце терапии. Эффект от терапии считают умеренно-хорошим при delta DAS28> 1.2. Однако в настоящее время оптимальная стратегия прогнозирования ответа индивидуального больного на терапию до ее начала при РА недостаточно исследована.
Снижение активности заболевания не сопровождается полным выздоровлением больного, а представляет лишь стабилизацию процессов организма на ином уровне равновесия. Поэтому разные терапевтические препараты с различными механизмами действия могут по-разному влиять на метаболизм больного, что связано с активностью различных наборов биомаркеров.
Метотрексат (МТ) является базовым антиревматическим препаратом, с которого начинается лечение всех больных РА. Кроме того, МТ часто назначается в совокупности с другими генно-инженерными биологическими препаратами, обладающими высокой эффективностью. Однако МТ не способен одинаково эффективно купировать заболевание у всех больных РА. А в случае его неэффективности теряется время, что способствует дальнейшему прогрессированию заболевания. В связи с этим актуальным является идентификация больных, для которых МТ окажется эффективным до назначения терапии. Поэтому в настоящее время разрабатываются подходы, позволяющие выявлять ответчиков, способных достичь ремиссии при применении конкретного антиревматического препарата до назначения терапии с целью экономии средств и более качественного лечения больных.
via
Одним из известных подходов по поиску ответчиков на терапевтический препарат является анализ метаболического потенциала клеток иммунной системы больных РА, прежде всего учитывающего изменения энергетического метаболизма в клетках крови (Amir Sharabi, George C Tsokos. T cell metabolism: new insights in systemic lupus erythematosus pathogenesis and therapy. Nat Rev Rheumatol. 2020 Feb;16(2):100-112. doi: 10.1038/s41584-019-0356-x). Недавние исследования показали, что контроль преобразования энергии в клетках осуществляется АМРК (АМР-активируемой протеинкиназой), которая регулирует уровни основного энергетического субстрата АТР (аденозинтрифосфорной кислоты), а также провоспалительную активность иммунных клеток (David K Finlay. N-myristoylation of AMPK controls T cell inflammatory function. Nat Immunol. 2019 Mar;20(3):252-254. doi: 10.1038/s41590-019-0322-4). В частности, активация АМРК в синовиоцитах при РА ассоциировалась со снижением продукции провоспалительных цитокинов и металлопротеиназ (Maohua Shi, Jingnan Wang, Youjun Xiao, Cuicui Wang, Qian Qiu, Minxi Lao, Yangtao Yu, Zhifeng Li, Hongwei Zhang, Yujin Ye, Liuqin Liang, Xiuyan Yang, Guoqiang Chen, Hanshi Xu. Glycogen Metabolism and Rheumatoid Arthritis: The Role of Glycogen Synthase 1 in Regulation of Synovial Inflammation  Blocking AMP-Activated Protein Kinase Activation. Front Immunol. 2018 Jul 27;9:1714. doi: 10.3389/fimmu.2018.01714; Robert Terkeltaub, Bing Yang, Martin Lotz, Ru Liu-Bryan. Chondrocyte AMP-activated protein kinase activity suppresses matrix degradation responses to proinflammatory cytokines interleukin-1β and tumor necrosis factor α. Arthritis Rheum. 2011 Jul;63(7):1928-37. doi: 10.1002/art.30333). Известны также публикации, в которых представлены данные о том, что подавление активации АМРК приводило к усилению воспаления в синовиальной ткани (Zhenke Wen, Ke Jin, Yi Shen, Zhen Yang, Yinyin Li, Bowen Wu, Lu Tian, Stanford Shoor, Niall E Roche, Jorg J Goronzy, Cornelia M Weyand. N-myristoyltransferase deficiency impairs activation of kinase AMPK and promotes synovial tissue inflammation. Nat Immunol. 2019 Mar;20(3):313-325. doi: 10.1038/s41590-018-0296-7). Ранее в исследованиях на животных было также показано, что метотрексат может способствовать аккумулированию АМФ в эндотелиальных клетках и, следовательно, активации АМРК (C C Thornton, F Al-Rashed, D Calay, G M Birdsey, A Bauer, H Mylroie, B J Morley, A M Randi, D O Haskard, J J Boyle, J C Mason. Methotrexate-mediated activation of an AMPK-CREB-dependent pathway: a novel mechanism for vascular protection in chronic systemic inflammation. Ann Rheum Dis. 2016 Feb;75(2):439-48. doi: 10.1136/annrheumdis-2014-206305). Вместе с тем, сигнальный путь АМРК контролирует многочисленные процессы в различных тканях организма и клетках иммунной системы, которая сверхактивирована при РА. Однако в настоящее время неизвестно, как исходные концентрации АМРК в клетках могут влиять на результаты терапии РА. Кроме того, из уровня техники не известны способы прогнозирования ответа на терапию метотрексатом по экспрессии гена АМРК.
Известен способ прогнозирования эффективности патогенетической терапии при ревматоидном артрите [патент UA16375U], основанный на оценке результатов определения динамики изменения концентрации белка ФНОα в сыворотке крови больного РА в ходе терапии метотрексатом. При этом уменьшение содержания белка ФНОα в течение 20 дней на 20% свидетельствует о положительном ответе больного на терапию. Достоинством данного способа является то, что установлен биомаркер - точная взаимосвязь между решением о положительном действии терапии метотрексатом и уменьшением концентрации белка ФНОα в течение 20 дней на 20% в сыворотке крови больного РА. Однако способ не позволяет сделать прогноз эффективности терапии метотрексатом до начала лечения. Результат эффективности терапии у пациента получают через 20 дней, в течение которых больные РА повергаются потенциальным побочным действиям от приема данного препарата.
Известен способ прогнозирования ответа на лечение ревматоидного артрита [патент US2012088678A1], согласно которому используют набор иммунологических белковых маркеров в изолированных субпопуляциях моноцитов крови больного РА после стимуляции разными антигенами для предсказания ответа больного РА на терапию метотрексатом. Достоинством данного способа является то, что поскольку ревматоидный артрит является многофакторным заболеванием, использование набора иммунологических маркеров повышает достоверность положительного ответа больного на терапию метотрексатом.
Недостатком известного способа, как и в предыдущем случае, является то, что прогнозирование ответа производят уже после применения терапевтического агента, следовательно, больные подвергаются потенциальным побочным действиям в случае негативного ответа на терапию. Кроме того, способ является многоступенчатым, чрезвычайно сложным в исполнении, а также может быть использован при снижении активности болезни до среднего уровня (DAS28-3.2).
Известен способ прогнозирования эффективности включения инфликсимаба в традиционную терапию пациентов с ревматоидным артритом (РА) [патент RU2416799], согласно которому перед терапией в общей фракции лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих рецепторы ФНОα-CD120a спонтанно или при стимуляции, определяют уровни продукции белков ФНОα или ИЛ6 с последующим расчетом индекса эффективности терапевтического препарата как частное от деления уровня продукции цитокина после стимуляции на уровень его спонтанной продукции. Достоинством данного способа является то, что анализ продукции белков ФНОα или ИЛ6 производится перед терапией in vitro, что позволяет не подвергать пациента действию препарата, который может оказать неблагоприятное действие на течение заболевания, т.е. прогнозировать лечение больных РА.
Недостатком известного способа является то, что продукция белков цитокинов может быть отложена по времени вследствие нарушения процесса трансляции и, следовательно, могут быть получены ложные результаты, так как отсутствие различий между уровнем продукции белков ФНОα или ИЛ6 в ответ на терапевтический препарат вследствие замедления процесса трансляции по сравнению с его спонтанной продукцией может быть неправильно истолковано - как отсутствие эффекта данного препарата. Кроме того, предложенный способ достаточно трудоемок, поскольку включает выделение мононуклеарных клеток крови, инкубацию их в присутствии или без ФГА, а также в присутствии или без ФНОα или ИЛ6 и определение в процентах относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ФНОα-CD120a. Способ направлен на контроль снижения активности заболевания.
1
l
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ определения экспрессии гена синовиолина для прогнозирования эффективности использования инфликсимаба (препарат химерных мышино-человеческие IgG моноклональных антител, состоящих из вариабельной (Fv) области высокоаффинных нейтрализующих мышиных моноклональных антител к фактору некроза опухоли-альфа и фрагмента молекулы IgG человека) в терапии больных РА [международная заявка WO2006092530]. Согласно способу в клетках периферической крови и синовиальной жидкости определяют уровень экспрессии гена, кодирующего синовиолин. Полученные данные сравнивают со значениями экспрессии данного гена у здоровых лиц. Если у пациентов показатели экспрессии гена, кодирующего синовиолин выше, чем у здоровых лиц, то прогнозируют низкий терапевтический эффект инфликсимаба для больных РА. Достоинством данного способа является то, что для прогнозирования эффективности терапии in vitro анализируют уровень экспрессии гена (синовиолина) по сравнению со здоровыми лицами, причем анализ производят до терапии у больных, ранее не получавших терапию инфликсимабом.
Однако способ применим только для терапии инфликсимабом. Кроме того, до терапии (в момент прогнозирования) экспрессия синовиолина в крови как у ответчиков (0.55±0.27), так и у неответчиков (1.25±0.6) значительно выше уровня экспрессии того же гена у контрольных лиц (0.31±0.1). В связи с разбросом значений экспрессии у конкретных больных невозможно прогнозировать результат у больных со значениями экспрессии от 0.65 до 0.82 (0.55+0.27=0.82) и (1.25-0.6=0.65). Кроме того, поскольку для проведения ОТ-ПЦР в реальном времени используются несертифицированные праймеры, требуется их верификация при помощи электрофореза в агарозном геле с мечением этидием бромида, что является трудоемким и длительным по времени процессом.
Технической проблемой является отсутствие простых, достоверных способов прогнозирования результата терапии метотрексатом больных ревматоидным артритом до начала самой терапии.
Раскрытие изобретения
Технический результат изобретения состоит в получении достоверного прогноза результата терапии метотрексатом больных ревматоидным артритом до ее начала при упрощении способа прогнозирования.
Упрощение способа прогнозирования эффективности терапии метотрексатом больных ревматоидным артритом достигается в связи с использованием сертифицированных праймеров, а следовательно, отсутствием необходимости верификации праймеров, что значительно сокращает время подготовки материалов для проведения анализа и гарантирует достоверность результатов. Достоверность прогнозирования результата терапии РА метотрексатом до ее начала определяется выявленной взаимосвязью уровня экспрессии гена АМРК с эффективностью терапии метотрексатом, а также пороговым значением экспрессии данного гена, равного 3.83, сравнение с которым позволяет сделать вывод о высокой или низкой вероятности положительного эффекта терапии.
Технический результат достигается способом, согласно которому перед началом терапии у больного ревматоидным артритом, ранее не получавшего терапию данным препаратом, определяют показатель У, характеризующий уровень относительной экспрессии гена АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК) (т.е. уровень экспрессии гена АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК) у больного по сравнению с уровнем экспрессии данного гена у контрольной группы здоровых лиц - усредненной экспрессией гена АМРК здоровых лиц). При получении значения уровня относительной экспрессии гена АМФ-активируемой протеинкиназы (АМРК) У≥3.83 прогнозируют высокую эффективность терапии метотрексатом.
Согласно заявляемому способу перед началом терапии производят забор крови из вены больного РА, из нее выделяют общую рибонуклеиновую кислоту (РНК), которую переводят в комплементарную дезоксирибонуклеиновую кислоту (кДНК) в реакции обратной транскрипции, определяют уровень относительной экспрессии гена АМРК. При этом уровень относительной экспрессии гена может быть определен по известной методике [Livak KJ (1997) Comparative Ct method. ABI Prism 7700 sequence detection system,” in User Bulletin No. 2. Foster City, PE Applied Biosystems, Foster City, Calif, USA].
Заявляемый способ основан на определении уровня относительной экспрессии одного гена АМФ-активируемой протеинкиназы (AMPK) в крови больного РА по сравнению со здоровыми лицами (контроль), и позволяет дифференцировать больных, способных с разной эффективностью отвечать на терапию метотрексатом у больных РА, ранее не получавших терапию препаратами, модифицирующими заболевание, а также выявлять больных, чувствительных к терапии метотрексатом.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлена ROC-кривая относительной экспрессии гена АМРК при оценке ее значения для прогнозирования ответа больного РА на метотрексат с указанием площади под кривой (AUC) и наилучшего сочетания чувствительности и специфичности (AUC 0.720, чувствительность 74.2%, специфичность 77.8%).
Осуществление изобретения
Ниже представлено описание проведенного исследования, включая более детальное описание осуществления заявляемого способа. В исследование были включены больные РА (n=40), отвечающие следующим критериям: возраст от 18 до 70 лет; достоверный диагноз РА (по критериям Европейского Колледжа по ревматологии 2010 г. и Американского Колледжа по ревматологии 1987 г.); длительность РА не более 2 лет; средняя и высокая активность заболевания (индекс DAS28>3,2). В качестве контрольной группы (здоровых лиц, n=20) выступали субъекты, сопоставимые по возрасту и полу с больными РА без каких-либо серьезных заболеваний.
1. Сбор материала
Периферическую кровь из локтевой вены больных РА (n=40) и здоровых лиц (n=20; контроль) забирали по утрам с 7 до 9 час утра натощак в стерильные пробирки, содержащие антикоагулянт ЭДТА. Содержимое пробирок с кровью и антикоагулянтом тщательно перемешивали, аккуратно переворачивая пробирку пробкой вниз несколько раз.
2. Выделение общей РНК и обратная транскрипция (ОТ).
Общую РНК выделяли из периферической крови сразу после забора крови, используя набор Рибозоль А в соответствии с рекомендациями производителя (ИнтерЛабСервис, Россия). С этой целью в пробирки с 750 мкл лизирующего раствора (рибозоля) вносили 100 мкл образца крови, перемешивали на вортексе и прогревали 5 мин при 60°С. Далее к смеси добавляли 110 мкл раствора В, перемешивали на вортексе и смесь центрифугировали при 13-14 тыс. об/мин в течение 10 мин. Далее 450 мкл верхней (водной) фазы в пробирку, содержащую 450 мкл раствора С и после перемешивания и инкубации смеси при -20°С в течение 20 мин ее центрифугировали при 13-14 тыс. об/мин в течение 10 мин. Далее осадок промывали 1 мл раствора для отмывки и после его подсушивания при 60°С в течение 5 мин растворяли в 30 мкл РНК-элюента.
2
2
В реакции ОТ синтезировали комплементарной ДНК (кДНК) на матрице матричной РНК, входящей в состав общей РНК клеток крови, используя набор Реверта А в соответствии с рекомендациями производителя (ИнтерЛабСервис, Россия). С этой целью к РНК в количестве не более 1 мкг, растворенной в 10 мкл DEPC-HO, добавляли 1 мкл смеси случайных гексануклеотидов (Rand-oligo) прогревали при 70°С 5 мин, а затем охлаждали при 10°С 10 мин. Далее к данной смеси добавляли 10 мкл реакционной смеси, содержащей 4 мкл 5-х ОТ буфера, 4 мкл смеси dNTP, 1.5 мкл DEPC-HO и 0.5 мкл M-MLV ревертазы. Смесь инкубировали при 37°С 30 мин.
3. Определение посредством ПЦР в режиме реального времени уровня относительной экспрессии гена АМФ-активируемой протеинкиназы (Х).
Т
Количественный анализ уровня экспрессии мРНК в крови проводили с использованием готовых наборов праймеров и зондов (TaqMan): AMPK (Hs01562315_m1) (Applied Biosystems), где в качестве эндогенного контроля использовали β-актин, с помощью системы ПЦР в режиме реального времени 7300 (Applied Biosystems). Продукт обратной транскрипции амплифицировали в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 7,5 мкл TaqMan универсальной реакционной смеси, 900 нМ прямого и обратного праймеров, 50 нМ зонда и 1мкл кДНК. После первого цикла при 50°С в течение 2 мин и начальной активации при 95°С в течение 10 мин, проводили 40 циклов амплификации, каждый из которых включал стадию денатурации 15 сек при 95°С и стадии отжига и синтеза в течение 1 мин при 60°С. Пограничным (threshold) циклом (С) считали тот, при котором начиналась экспоненциальная стадия амплификации продуктов ПЦР.
Т
T
T
T
T
T
T
T
T
-ddC
Относительную экспрессию гена рассчитывали c использованием дельта-дельтаС (ddC) метода в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosystems) [Livak KJ (1997) Comparative Ct method. ABI Prism 7700 sequence detection system,” in User Bulletin No. 2. Foster City, PE Applied Biosystems, Foster City, Calif, USA]. Значение dCрассчитывали, вычитая значение Cдлягена конститутивно экспрессируемого (housekeeping) – β-актина из значения C гена AMPK. Далее значение ddC определяли, вычитая усредненное значение dC контрольных лиц из значения dC в клетках крови больного РА. Величину изменения экспрессии (ВИЭ) по сравнению с контролем рассчитывали по формуле: ВИЭ = 2. В ПЦР синтезировался только один ампликон по показаниям профилей температуры плавления конечного продукта, а также по электрофоретической подвижности тестовых ПЦР. Для каждого больного образцы его кДНК анализировали в двух повторностях. Три контрольных образца, амплифицируемых в отсутствии «матрицы» давали отрицательную реакцию.
T
T
T
T
T
T
Для определения экспрессии гена АМРК у здоровых лиц в половину лунок планшета с TaqMan реакционной смесью добавляли праймеры набора для экспрессии гена АМРК, а во вторую половину лунок - гена домашнего хозяйства β-актина. 1 мкл кДНК здоровых лиц добавляли во все лунки планшета. Реакцию и расчеты уровня экспрессии проводили, как описано выше. А именно: значение dCрассчитывали, вычитая значение Cдлягена конститутивно экспрессируемого (housekeeping) – β-актина из значения C гена AMPK. Далее значение ddC определяли, вычитая усредненное значение dC контрольных лиц из значения dC тех же контрольных лиц.
T
T
T
T
T
T
T
-ddC
Для определения экспрессии гена АМРК у больных РА по сравнению со здоровыми лицами в половину лунок планшета с TaqMan реакционной смесью добавляли праймеры набора для экспрессии гена АМРК, а во вторую половину лунок - гена домашнего хозяйства β-актина. В лунки, содержащие праймеры для экспрессии гена АМРК, добавляли 1 мкл кДНК здоровых лиц [8 (здоровые лица) х 2 (повторности) =16 лунок планшета], в остальные лунки, содержащие праймеры для экспрессии гена АМРК, добавляли 1 мкл кДНК больных РА в двух повторностях. В лунки, содержащие праймеры для экспрессии гена домашнего хозяйства β-актина добавляли 1 мкл кДНК здоровых лиц [8 (здоровые лица) х 2 (повторности) =16 лунок планшета], в остальные лунки, содержащие праймеры для экспрессии домашнего хозяйства β-актина, добавляли 1 мкл кДНК больных РА в двух повторностях. Реакцию и расчеты уровня экспрессии проводили, как описано выше. А именно: значение dCрассчитывали, вычитая значение Cдлягена конститутивно экспрессируемого (housekeeping) – β-актина из значения C гена AMPK. Далее значение ddC определяли, вычитая усредненное значение dC контрольных лиц из значения dC в клетках крови больного РА. Величину изменения экспрессии (ВИЭ) по сравнению с контролем рассчитывали по формуле: ВИЭ = 2 для каждого контроля и больного РА. Далее рассчитывали среднее арифметическое для каждого контроля и больного РА, что и составляет значение относительной экспрессии гена АМРК.
Для поиска оптимальной точки разделения показателя АМРК (cut-off point) c целью определения порогового значения при прогнозировании высокой вероятности положительного ответа на терапию был выполнен ROC-анализ. Выбор точки разделения осуществлялся на основе оптимальных значений чувствительности и специфичности. В соответствии с результатами ROC-анализа, который подтвердил статистически достоверную (Р=0.04) ассоциацию между относительной экспрессией гена АМРК и величиной dDAS28 (AUC=0.720, 95% CI 0.526–0.915), при пороговом значении У≥3.83 (чувствительность=0.742, специфичность=0.778) прогнозируют высокую вероятность положительного эффекта терапии метотрексатом (dDAS28>1.2), тогда как при У<3.83  прогнозируют низкую вероятность  положительного эффекта на терапию.
Для анализа прогностического значения экспрессии гена АМРК для оценки определения чувствительности больных РА к терапии метотрексатом использовали бинарный линейный классификатор. Входными данными этого классификатора являлись уровни экспрессии гена АМРК, измеренные перед терапией, результатом классификации - отнесение образца к одному из двух классов: чувствительность к терапии (dDAS28>1.2) или отсутствие чувствительности к терапии (dDAS28<1.2). Далее оценивали параметры достоверности классификации (чувствительность, специфичность). Наилучшую прогностическую точность при определении чувствительности больного РА к терапии метотрексатом, включали значения уровня экспрессии АМРК =3.83 при максимальной чувствительности и специфичности (чувствительность = 0.742, специфичность = 0.778) (фиг. 1).
4. В результате проведенных исследований была выявлена зависимость эффективности терапии метотрексатом от уровня экспрессии гена АМРК, определяемой по значению У.
В результате, из 40 больных 25 пациентов имели уровень относительной экспрессии АМРК перед терапией от 4.1 до 85.8 (АМРК>3.83). После терапии 24 пациента оказались ответчиками на терапию, они имели dDAS28>1.2 (dDAS28 этих больных составляла от 1.3 до 6.68), а один пациент после терапии имел dDAS28 =0.82, то есть оказался нечувствителен к терапии. Следовательно, при уровне относительной экспрессии АМРК>3.83 перед терапией вероятность положительного ответа больных на терапию составляет 96%.  У 15 больных РА относительная экспрессия АМРК до терапии составляла от 0 до 3.6 (АМРК<3.83), а dDAS28 после терапии составляла от -2.4- до 3.4. Из них 7 пациентов оказались неответчиками на терапию (47%), а у 8 пациентов (53%) dDAS28 оказалась >1.2, следовательно, они оказались чувствительны к терапии метотрексатом. Таким образом, достоверно эффективность терапии прогнозируют при получении значения У≥3.83.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Пациент Х, 52 г., диагноз ранний РА. Перед назначением терапии был проведен анализ экспрессии гена АМРК в крови больного. Для этого из вены отобрано 5 мл крови, из которой выделена общая РНК и проведена реакция обратной транскрипции для получения кДНК. Далее кДНК больного была внесена в 2 лунки планшета, содержащие реакционную смесь для оценки гена домашнего хозяйства (β-актина) и в 2 лунки планшета, содержащие реакционную смесь для оценки экспрессии гена АМРК. Предварительно в 18 лунок планшета внесена реакционная смесь для оценки гена домашнего хозяйства (β-актина) и в следующие 18 лунок планшета - реакционная смесь для оценки экспрессии гена АМРК. В 16 лунок планшета, содержащего реакционную смесь для анализа β-актина, внесена кДНК 8 контролей (здоровых лиц) в двух повторностях каждая, а в 2 оставшиеся лунки - кДНК  больного РА. В остальные 16 лунок планшета, содержащего реакционную смесь для анализа АМРК, внесена кДНК 8 контролей (здоровых лиц) в двух повторностях каждая, а в 2 оставшиеся лунки - кДНК больного РА. Проведена амплификация кДНК в амплификаторе реального времени и рассчитана относительная экспрессия гена АМРК, как описано выше.
Результаты экспрессии гена АМРК пациента Х представлены в таблице 1:
Таблица 1.
Ген
Экспрессия гена в контроле
Относительная экспрессия до терапии гена у больного РА, относительные единицы по сравнению с контролем (У)
Прогнозируемое действие препарата
AMPK
1.01±0.11
7.92±0.24
Терапия метотрексатом эффективна
Поскольку относительная экспрессия гена АМРК до терапиипревышает значение 3.83 (У>3.83) прогнозируют высокую вероятность положительного эффекта терапии метотрексатом. Больному Х была назначена терапия метотрексатом 10 мг в неделю, а через 2 недели доза была увеличена до 15 мг в неделю. После приема препарата метотрексата в течение 2 лет по данной схеме состояние здоровья больного РА значительно улучшилось. Клинические данные пациента Х представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Параметры
АЦЦП(антителациклическому цитруллиновому пептиду
РФ(ревматоидный фактор)
СРБ(С-реактивный белок)
DAS28 (активность заболевания
Скованность
Число припухших суставов
Число болезненных суставов
Общий счет эрозий по Шарпу
Общий счет сужений по Шарпу
До терапии
0.1
9.5
4.38
5.1
180
16
16
0
6
Через 2 года терапии метотрексатом
0.9
9.5
1.54
3.63
10
1
3
0
6
Клинические данные пациента Х показывают положительный эффект терапии метотрексатом (delta DAS28 = 1.47). У больного Х снизился уровень воспаления, скованность и при этом не увеличился уровень разрушения костной ткани и суставного хряща.
Пример 2. Пациент У., 45 лет, диагноз ранний РА. Перед назначением терапии был проведен анализ экспрессии гена АМРК в крови больного. Для этого из вены отобрано 5 мл крови, из которой выделена общая РНК и проведена реакция обратной транскрипции для получения кДНК. Далее кДНК больного была внесена в 2 лунки планшета, содержащие реакционную смесь для оценки гена домашнего хозяйства (β-актина) и в 2 лунки планшета, содержащие реакционную смесь для оценки экспрессии гена АМРК. Предварительно в 18 лунок планшета внесена реакционная смесь для оценки гена домашнего хозяйства (β-актина) и в следующие 18 лунок планшета - реакционная смесь для оценки экспрессии гена АМРК. В 16 лунок планшета, содержащего реакционную смесь для анализа β-актина, внесена кДНК 8 контролей (здоровых лиц) в двух повторностях каждая, а в 2 оставшиеся лунки - кДНК больного РА. В остальные 16 лунок планшета, содержащего реакционную смесь для анализа АМРК, вносится кДНК 8 контролей (здоровых лиц) в двух повторностях каждая, а в 2 оставшиеся лунки - кДНК больного РА. Проведена амплификация кДНК в амплификаторе реального времени и рассчитана относительная экспрессия гена АМРК, как описано выше. Результаты экспрессии гена АМРК пациента Y представлены в таблице 3:
Таблица 3.
Ген
Экспрессия гена в контроле
Относительная экспрессия до терапии гена у больного РА, относительные единицы по сравнению с контролем (У)
Прогнозируемое действие препарата
АМРК
1.01±0.11
1.55±0.13
Терапия метотрексатом не эффективна
Поскольку относительная экспрессия гена АМРК данного больного до терапии ниже значения 3.83 (У=1.55) прогнозируют низкую вероятность положительного эффекта на терапию метотрексатом. Однако терапия метотрексатом была назначена пациенту Y, поскольку метотрексат считается препаратом первого порядка обязательным к назначению первичным больным. Клинические данные пациента Y представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Параметры
АЦЦП(антителациклическому цитруллиновому пептиду
РФ(ревматоидный фактор)
СРБ(С-реактивный белок)
DAS28 (активность заболевания
Скованность
Число припухших суставов
Число болезненных суставов
Общий счет эрозий по Шарпу
Общий счет сужений по Шарпу
До терапии
100
1014
140.8
6.3
360
10
12
0
5
Через 2 года терапии метотрексатом
416.2
250.1
17.9
6.2
180
14
14
5
18
Клинические данные пациента Y показывают отсутствие эффекта на терапию метотрексатом (delta DAS28 = 0.1). У больного Y активность заболевания не изменилась, хотя наблюдалось некоторое снижение уровня РФ и СРБ, которые не достигли нормальных значений. При этом наблюдалось повышение числа припухших и болезненных суставов, что свидетельствует о сохранении воспалительного процесса. В то же время, увеличение уровня АЦЦП, числа эрозий и сужений по Шарпу свидетельствует об активном процессе разрушения костной ткани и суставного хряща.
Пример 3. Пациент Z, 51 год, диагноз ранний РА. Перед назначением терапии был проведен анализ экспрессии гена АМРК в крови больного. Для этого из вены отобрано 5 мл крови, из которой выделена общая РНК и проведена реакция обратной транскрипции для получения кДНК. Далее кДНК больного была внесена в 2 лунки планшета, содержащие реакционную смесь для оценки гена домашнего хозяйства (β-актина), и в 2 лунки планшета, содержащие реакционную смесь для оценки экспрессии гена АМРК. Предварительно в 18 лунок планшета внесена реакционная смесь для оценки гена домашнего хозяйства (β-актина) и в следующие 18 лунок планшета - реакционная смесь для оценки экспрессии гена АМРК. В 16 лунок планшета, содержащего реакционную смесь для анализа β-актина, внесена кДНК 8 контролей (здоровых лиц) в двух повторностях каждая, а в 2 оставшиеся лунки - кДНК больного РА. В остальные 16 лунок планшета, содержащего реакционную смесь для анализа АМРК, внесена кДНК 8 контролей (здоровых лиц) в двух повторностях каждая, а в 2 оставшиеся лунки - кДНК больного РА. Проведена амплификация кДНК в амплификаторе реального времени и рассчитана относительная экспрессия гена АМРК, как описано выше. Результаты экспрессии гена АМРК пациента Z представлены в таблице 5.
Таблица 5.
Ген
Экспрессия гена в контроле
Относительная экспрессия до терапии гена у больного РА, относительные единицы по сравнению с контролем (У)
Прогнозируемое действие препарата
АМРК
1.01±0.11
2.5±0.04
Терапия метотрексатом может быть частично эффективна
Поскольку относительная экспрессия гена АМРК до терапии
ниже значения 3.83, (У=2.5) прогнозируют низкую вероятность положительного эффекта терапии метотрексатом. Однако терапия метотрексатом была назначена пациенту Z, поскольку метотрексат считается препаратом первого порядка обязательным к назначению первичным больным. Клинические данные пациента Z представлены в таблице 6.
Таблица 6.
Параметры
АЦЦП(антителациклическому цитруллиновому пептиду
РФ(ревматоидный фактор)
СРБ(С-реактивный белок)
DAS28 (активность заболевания
Скованность
Число припухших суставов
Число болезненных суставов
Общий счет эрозий по Шарпу
Общий счет сужений по Шарпу
До терапии
100
100
13.8
4.41
60
10
6
0
13
Через 2 года терапии метотрексатом
388.8
311.7
4.46
3.39
9
2
3
0
14
Клинические данные больного Z показывают недостаточную эффективность терапии метотрексатом, поскольку delta DAS28< 1.2 (delta DAS28 = 1.01). У больного Z активность заболевания снизилась незначительно, что сопровождалось некоторым уменьшением числа припухших и болезненных суставов. Однако при этом уровни АЦЦП и РФ по итогам терапии значительно повысились, что свидетельствует о сохранении аутоиммунного процесса, ассоциированного с разрушением сустава, что дополнительно подтверждается увеличением показателя сужений по Шарпу - индикатора разрушения суставного хряща.
Положительный эффектот применения предлагаемого способа связан с его упрощением в связи с отсутствием необходимости верификации праймеров. Кроме того, способ позволяет четко дифференцировать ответчиков, неответчиков на терапию метотрексатом и лиц с промежуточным эффектом на терапию, т.е. предсказывать эффективность терапии метотрексатом до начала терапии. При этом способ характеризуется высокой достоверностью прогнозирования результата терапии.