СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПОТЕНЦИАЛА ХИТОЗАНА В ОТНОШЕНИИ СТАФИЛОКОККОВ
METHOD FOR EXPRESS-DETECTION OF ANTIBACTERIAL POTENTIAL OF CHITOSAN IN RESPECT TO STAPHYLOCOCCI

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для определения антибактериального потенциала хитозана в отношении стафилококков путем оценки активации хитозановым полимером ферментативного разрушения клеток бактерий.
Хитозан - группа веществ, представляющая собой сополимер глюкозамина и ацетилглюкозамина, различающихся по молекулярной массе, степени деацетилирования, расположению ацетилированных и деацетилированных остатков вдоль полимерной цепи и другим молекулярно-массовыми параметрами. Такая вариация химической структуры хитозана влияет на проявление им биологической активности, в частности - антибактериальной активности [1, 2]. Стандартное определение антибактериальной активности хитозана сводится к оценке его минимальной бактериостатической (ингибирующей) и/или минимальной бактерицидной концентраций в отношении бактерий, которое требует длительной, от 24 до 48 ч, инкубации [3]. Кроме того, использование живых условно-патогенных бактерий ведет к необходимости соблюдения специальных требований норм безопасности и дополнительных специальных условий, например, наличие стерильного бокса, необходимость подготовки стерильной посуды и питательных сред.
Вместе с тем известно, что антибактериальное действие хитозана, как и других антибактериальных веществ, определяются теми биохимическими процессами, которые подвергаются изменению под их воздействием. Одним из механизмов действия хитозана может являться активация этим полимером ферментативного разрушения клеток бактерий. Известно, что в клеточных стенках всех грам-положительных бактерий, к которым относятся и стафилококки, содержатся автолизины - ферменты, участвующие в деградации гликопептидной основы клеточной стенки в процессе роста и деления бактериальных клеток. В регуляции активности этих ферментов принимают участие тейхоевые и тейхуроновые кислоты - отрицательно заряженные полимерные компоненты клеточных стенок грам-положительных прокариот. Отрицательно заряженные тейхоевые и тейхуроновые кислоты за счет электростатического взаимодействия связывают автолизины, которые заряжены положительно (характерная особенность для всех автолизинов), тем самым препятствуя их чрезмерному вовлечению в деградацию гликопептида клеточной стенки [4]. Поэтому, искусственное высвобождение автолизинов из их комплекса с тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами способно привести к усилению ферментативного расщепления гликопептида клеточной стенки, приводящее к лизису всей клеточной стенки и гибели самой бактериальной клетки. Такими веществами могут выступать положительно заряженные молекулы, в особенности поликатионные, которые будут конкурентно вытеснять автолизины из их комплекса с полианионными кислотами клеточных стенок. В литературе описан эффект усиления действия автолитических ферментов бактерий на клеточные стенки при добавлении положительно заряженных веществ белковой природы, также показано, что это связано именно с препятствованием этими веществами связывания автолизинов с тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами [5]. Учитывая поликатионную природу хитозана он также способен проявлять свои антибактериальные свойства посредством активации ферментативного разрушения клеток бактерий.
Задачей заявленного изобретения является разработка простого способа, позволяющая быстро, менее чем за 1 час, определять антибактериальную активность (потенциал) хитозана в отношении стафилококков, путем оценки активации хитозановым полимером ферментативного разрушения (лизиса) клеток бактерий.
Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает использование суспензии инактивированных (нагреванием на водяной бане при 100°C в течение 15 минут) клеток Staphylococcus aureus в 0,02 М MES-Na буфере с pH 6,50 с оптической плотностью 0,300 при длине волны 600 нм (что соответствует приблизительной концентрации 500 млн клеток в 1 мл суспензии), к которой добавляется аликвота раствора образца хитозана с известной концентрацией, затем к суспензии добавляется раствор лизостафина (Lysostaphin из Staphylococcus staphylolyticus, «Sigma-Aldrich», USA), содержащего 1U фермента, проведение инкубации смеси при 37°C в течение 30 минут с последующей оценкой лизиса клеток бактерий путем определения уменьшения оптической плотности суспензии при длине волны 600 нм.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка быстрого способа определения антибактериального потенциала хитозана в отношении стафилококков, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов, отсутствием необходимости использовать живую культуру бактерий и малым расходом исследуемого вещества.
Пример 1. Экспресс-определение антибактериального потенциала хитозана в отношении S. aureus. В пробирки вносят суспензию клеток S.aureus (предварительно инактивированных нагреванием на водяной бане при 100°C в течение 15 минут) в 0,02 М MES-Na буфере с pH 6,50 с оптической плотностью 0,300 при длине волны 600 нм (что соответствует приблизительной концентрации 500 млн клеток в 1 мл суспензии). Добавляют к суспензии клеток 2,5 мкл раствора хитозана с молекулярной массой 1 кДа (или 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15, 20, 100, 600 кДа) в концентрации 8 мг/мл и смесь тщательно перемешивают (в контрольный вариант добавляют 2,5 мкл воды). Затем добавляют 25 мкл раствора, содержащего 1U лизостафина (фермента). Полученную смесь тщательно перемешивают и помещают на инкубацию при 37°C. По истечении 15 минут инкубации проводят измерение оптической плотности суспензий при длине волны 600 нм. За условную еденицу активности фермента принимают изменение оптической плотности суспензии на 0,001 за 15 минут. После измерения подсчитывают и сравнивают уровень активации хитозановым полимером ферментативного разрушения клеток бактерий посредством определения условных едениц активности фермента (лизостафина), активируемое хитозаном. Для этого из разницы оптических значений между опытом с хитозаном (суспензия + хитозан) и опытом с добавлением фермента и хитозана (суспензия + фермент + хитозан) вычитаем разницу оптических значений между контролем (суспензия) и опытом с ферментом (суспензия + фермент). Полученные результаты приведены в таблице 1. Сопоставление условных едениц активности фермента, активированная хитозанами с показателями минимальных ингибирующих концентраций (МИК) этих же образцов хитозана позволяет сделать вывод о пригодности заявляемого способа для экспресс-определения антибактериального потенциала хитозанов.
Пример 2. Экспресс-определение антибактериального потенциала хитозана проводят аналогично примеру 1, но в качестве тест-объекта используют суспензию Staphylococcus epidermidis. Полученные результаты приведены в таблице 2.
ЛИТЕРАТУРА
1. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С., Варламов В.П. / Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана: механизмы действия и роль структуры // Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии, 2009, №5, с.91-97.
2. Tharanathan R.N., Kittur F.S. Chitin - the undisputed biomolecule of great potential. Crit. Rev. Nutr. 2003. V.43. P.61-87.
3. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е., Зуева О.Ю., Варламов В.П. / Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов. // Прикл. биохим. микробиол. 2004. Т.40. №3. С.301-306.
4. Дмитриева Н.Ф., Тимофеев Ю.М. / Липотейхоевые и тейхоевые кислоты патогенных стрептококков: структура, функции, роль во взаимодействии возбудителя с макроорганизмом // Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии. 2007, №6: с.100-107.
5. Bierbaum G., Sahl H.G. / Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: influence of cationic peptides on activity of N-acetylmuramoil-L-alanine amidase. // J. Bacteriol. 1987, V.169, p.5452-5458.
Таблица 1
Изменение оптической плотности (ОП) суспензии S.aureus
Хитозан, кДа
Суспензия + фермент, ОП
Суспензия + хитозан, ОП
Суспензия + фермент + хитозан, ОП
Ус.ед. активности фермента, активируемая хитозаном
МИК хитозана в МИК, мкг/мл опыт in vitro
1
0,230
0,300
0,220
10
≥2000
2
0,230
0,300
0,215
15
2000
3
0,230
0,305
0,190
45
500
4
0,230
0,310
0,170
70
250
5
0,230
0,320
0,165
85
250
8
0,230
0,325
0,135
120
125
10
0,230
0,330
0,135
125
125
15
0,230
0,330
0,135
125
125
20
0,230
0,340
0,145
125
125
100
0,230
0,340
0,150
120
125
600
0,230
0,340
0,180
90
250
* ОП контрольного варианта (суспензия) равна 0,300
Таблица 2
Изменение оптической плотности (ОП) суспензии S. epidermidis
Хитозан, кДа
Суспензия + фермент, ОП
Суспензия + хитозан, ОП
Суспензия + фермент + хитозан, ОП
Ус.ед. активности фермента, активируемая хитозаном
МИК хитозана, мкг/мл
1
0,250
0,300
0,240
10
250
2
0,250
0,300
0,225
25
62
3
0,250
0,305
0,225
30
31
4
0,250
0,315
0,230
35
15
5
0,250
0,320
0,230
40
7,5
8
0,250
0,330
0,230
50
1
10
0,250
0,335
0,230
55
1
15
0,250
0,335
0,220
65
0,5
20
0,250
0,340
0,220
70
0,5
100
0,250
0,340
0,220
70
0,5
600
0,250
0,345
0,245
50
1
* ОП контрольного варианта (суспензия) равна 0,300