СТЕРИЛЬНЫЙ ПРОЗРАЧНЫЙ КОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ РАСТВОР БИОСОВМЕСТИМОГО КОЛЛАГЕНА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
STERILE TRANSPARENT CONCENTRATED SOLUTION OF BIOCOMPATIBLE COLLAGEN, METHOD FOR PRODUCTION AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины и биологии и посвящено новому продукту: стерильному прозрачному вязко-текучему водно-солевому раствору препарата очищенного коллагена, растворенному в водном растворе 0,1 мМ – 20 мМ кислоты, молекулы которого в этом растворе при температуре от +4℃ до +25℃ сохраняют нативную структуру тройной спирали, т.е. сохраняют способность формировать фибриллы в физиологических условиях. Концентрированный раствор этого коллагена, в котором содержание коллагена составляет более 96% сухой массы общего белка образует в физиологических условиях стабильные полимерные структуры (гидрогели) и может быть использован для изготовления биомедицинских клеточных продуктов и трехмерных ткане-инженерных конструкций без использования химической и/или фотохимической сшивки. Эти конструкции могут быть конструкциями гетерогенной плотности, включая конструкции с разрешением деталей не более 0,3 мм, получаемые методом 3D принтинга, обеспечивающими возможность включения в них живых клеток или клеточных агрегатов, используемых в медицинской практике. Предлагаемый раствор коллагена будет также полезен в качестве материала для формирования гидрогелей, используемых для культивирования клеток. Также изобретение касается способа получения стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена и его применений.
Уровень техники
Проблема нехватки донорских органов для пересадки заставляет искать биомедицинские решения, не требующие использования донорского материала. В настоящее время разработано множество методов, позволяющих приблизится к решению этой проблемы. Суть существующих методов заключается в восстановлении целостности и функций тканей и органов с помощью имплантируемых трехмерных ткане-инженерных конструкций (ТИК). Альтернативой может быть локальное введение биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), состоящих из клеток и биополимерного матрикса. В состав поддерживающего биополимерного матрикса для локализованной имплантации клеток могут также входить факторы роста, которые способны оказывать стимулирующее действие на клетки поврежденной ткани.
Основной функцией биополимерного матрикса является поддержание жизнеспособности включаемых в него клеток, а также механическое сопряжение с окружающими тканями в месте имплантации, с последующим его замещением восстановленным внеклеточным матриксом, построенным клетками. Поэтому принципиально важными свойствами, которыми должны обладать имплантируемые биополимерные матриксы, являются:
- высокая биосовместимость самой конструкции;
- отсутствие реакций иммунной системы на составляющий конструкцию материал;
- геометрическая организация конструкции, которая не ограничивает свободное перемещение жидкости внутри конструкции.
Поскольку скорость свободной диффузии метаболитов, в особенности макромолекул, в гидрогелях невелика, геометрические размеры матрикса, окружающего живую клетку, не должны превышать 0,15 мм. Именно пористая структура биополимерного матрикса способна обеспечить протекание культуральной среды сквозь конструкцию во время подготовки ее к имплантации и движение тканевой жидкости внутри имплантированной конструкции до момента формирования в ней капиллярного кровоснабжения.
Сохранение жизнеспособности клеток в составе биополимерного матрикса требует доставки извне питательных веществ и вывода продуктов метаболизма; в противном случае гибель клеток в замкнутых ишемизированные зонах неизбежна.
Универсальным современным способом создания биополимерного матрикса со сложной заданной геометрией и высоким разрешением деталей является технология 3D печати. Эта технология позволяет ориентировать и совместить в пространстве различным способом дифференцированные живые клетки и элементы структуры поддерживающего их матрикса.
Таким образом, биополимерные матриксы, служащие основой формирования структуры БМКП и трехмерных ТИК, должны быть совместимы как с включенными в них клетками, так и с живыми тканями. Такие матриксы должны медленно распадаться в организме на безвредные компоненты, последовательно замещаясь внеклеточным матриксом, синтезируемым собственно клетками. Иммуногенность материала матрикса и продуктов его распада должна отсутствовать. Для формирования заданных структур с помощью современных методов 3D печати, биополимерный матрикс не должен использовать наполнители или сшивающие агенты, которые могут ухудшить биосовместимость и повысить иммуногенность напечатанного изделия. Иными словами, биополимерный матрикс должен обладать такими физическими характеристиками, которые позволяли бы создавать конструкции с разрешением деталей в 0,3 мм методом 3D печати без использования химической и/или фотохимической сшивки.
TM
В литературе описано большое количество растворов полимеров, используемых для создания БМКП и трехмерных ТИК методом 3D биопечати, в числе которых растворы природных полимеров - альгината (1), хитозана (2), желатина (3), гиалуроновая кислота (4), Matrigel(5), коллаген I типа (6), а также растворы синтетических полимеров - GelMA (7), Pluronic F-127 (8). Однако под требования, предъявляемым к материалам для изготовления БМКП и трехмерных ТИК для медицинского применения, подходит только коллаген .
Коллаген - основной структурный элемент соединительной ткани, который составляет каркасную основу внеклеточного матрикса. Коллаген распространен в интерстициальной ткани практически всех паренхиматозных органов. Для коллагена характерно значительное сходство аминокислотной последовательности этого белка у различных видов, что позволяет применять в клинике коллагены животных. Однако существуют несколько основных проблем производства медицинских продуктов на основе коллагена – иммуногенность большинства препаратов животного коллагена вследствие содержащихся в них белковых и других полимерных примесей, наличие в препаратах коллагена эндотоксинов. Также очень важны проблемы получения стерильных препаратов коллагена без повреждения нативной структуры трехспиральной молекулы. Следствием нерешенных проблем являются слабые механические свойства БМКП и трехмерных ТИК, созданных из существующих препаратов коллагена. Вероятность развития иммунного ответа на инъецируемый препарат, содержащий коллаген, зависит от содержания формы коллагена, содержания белковых и небелковых примесей; таким образом иммуногенность препаратов коллагена в большей степени зависит от степени очистки и сохранения нативности белка (9, 10). Проблема слабых механических свойств БМКП и трехмерных ТИК, созданных из существующих препаратов коллагена, обусловлена в первую очередь тем, что требуется продолжительное время (около 30-40 мин) для перехода раствора в состояние гидрогеля, а это необходимо для фиксации формы напечатанной конструкции. Укрепление конструкции достигается путем химической модификации коллагена в изготовленной БМКП и трехмерной ТИК, однако химическое изменение структуры коллагена приводит к тому, что полученное изделие теряет свое основное свойство - биосовместимость (11).
Близким к заявляемому специфическому раствору коллагена по технической сущности является описанный ранее вязко-эластичный раствор химически-модифицированного коллагена (12), в котором концентрация белка-коллагена находится в диапазоне 5-50 мг/мл. Недостатком указанного препарата является химическая модификация коллагена, который является менее биосовместимым по сравнению с коллагеном, имеющим структуру, приближенную к нативной.
Кроме того, для создания БМКП и трехмерных ТИК, раствор коллагена должен быть стерильным, а уровень эндотоксинов в нем не должен превышать 10 Ед/мл, что не учитывается в упомянутом выше изобретении.
TM
Другим близким аналогом изобретения, совпадающим по ранее обозначенным необходимым свойствам препарата коллагена (биосовместимость, стерильность, уровень эндотоксина) является Matrigel.
Этот препарат коллагена успешно был применен для создания трехмерный ТИК (5). Однако следует отметить, что раствор полимера на основе Матригеля имеет существенный недостаток, заложенный в природе матрикса и в технологии его получения. Матригель - это содержащий коллаген препарат экстракта белков внеклеточного матрикса, получаемый̆ из саркомы EHS, злокачественной опухоли мышей. Поэтому он не может быть использован для создания БМКП и трехмерных ТИК для клинического использования.
Близким к заявляемому стерильному прозрачному концентрированному раствору биосовместимого коллагена является стерильный раствор коллагена, содержащий помимо основного белка (коллагена), концентрация которого в растворе равна 12,5 мг/мл, другой белок (фибронектин), а также смесь ростовых факторов. Такой сложносоставной препарат был успешно применен для восстановления фертильности у модельных животных (13). Недостатком данного препарата является его сложный состав: фибронектин и слабо характеризованная смесь различных факторов роста - что также ограничивает возможность его клинического применения. Кроме того, сложный состав приводит к существенному увеличению стоимости целевого продукта. Отметим, что при создании БМКП и трехмерных ТИК уровень эндотоксинов у них в случае медицинского применения не должен превышать 10 Ед/мл, что не учитывается в упомянутой статье.
Другим близким аналогом является, нейтрализованный раствор коллагена используемый для изготовления мембраны для замещения стенки мочевого пузыря (14). Несмотря на то, что мембрана изготовленная из этого раствора коллагена была успешно применена в in vivo моделях с использованием экспериментальных животных, у данного раствора есть существенный недостаток, который заключается в том, что используемый нейтрализованный коллагеновый раствор требует строгого соблюдения температурного режима: температура не должна быть ниже 4℃ и выше 10℃. Нарушение указанного режима, особенно при транспортировке раствора до конечного пользователя, приведут к полной полимеризации препарата и невозможности его использования для обозначенной задачи, поэтому его коммерческое применение существенно затруднено.
Стоит отметить, что заявленный стерильный прозрачный концентрированный раствор биосовместимого коллагена лишен обозначенного выше недостатка и может храниться при комнатной температуре в течение недели. В дополнение стоит отметить, что заявленный раствор позволяет создавать прозрачные мембраны, которые сохраняют свою прозрачность в физиологических условиях. Это свойство будет облегчать работу хирурга при фиксации данной мембраны в месте аппликации, позволяя полностью следить за операционным полем.
Наиболее близким к заявляемому продукту, стерильному прозрачному концентрированному раствору биосовместимого коллагена, по способу использования и технической сущности является стерильный концентрированный нейтральный раствор коллагена, с концентрацией белка-коллагена в диапазоне от 20 до 40 мг/мл, используемый для создания структур методом 3D принтинга (15). Несмотря на успешное применение этого препарата коллагена для создания трехмерных структур методом 3D принтинга, его существенным недостатком является необходимость строгого соблюдения температурного режима, нарушения которого приведут к тому, что его будет невозможно использовать для создания структур методом 3D принтинга. Стоит отметить, что заявленный раствор коллагена лишен указанного недостатка, что существенно облегчает логистику и уменьшает себестоимость самого продукта. В дополнение, также стоит отметить что заявленный раствор позволяет создавать прозрачные структуры. Эта особенность позволит пользователям следить за поведением клеток, включенных в структуру как методами классической световой микроскопии, так и методами конфокальной микроскопии.
В настоящее время хорошо известны многочисленные способы получения коллагена из различных сырьевых источников (16, 17, 18, 19, 20, 21). Однако раскрытые в этих ссылках методы не позволяют получить стерильный раствор коллагена, в котором уровень эндотоксинов не превышает 10 Ед/мл, и в котором коллаген сохраняет способность формировать прочные и прозрачные гидрогели в физиологических условиях. Кроме того, чтобы использовать такие растворы коллагена, изготовленные по обозначенным выше методам, для создания структур с разрешением деталей 0,3 мм методом 3D печати необходимо использовать химическую модификацию коллагена, которая приведет к ухудшению биосовместимости напечатанной конструкции.
Наиболее близким аналогом изобретения по способу получения стерильного раствора коллагена и по свойствам полученного раствора коллагена, является метод описанный в патенте (20). Это изобретение описывает раствор коллагена, имеющий следующие свойства:
2(I)1
1(I)1
- соотношение α/αот 0,48 до 0,52;
- стерильность в соответствии со стандартом Европейской Фармакопеи;
- общее содержание азота от 17,0 до 18,7%;
- гидроксипролин от 12 до 13,9%;
- не содержит триптофан, аминогликаны и полипептиды с мол.м. <95000 Да;
- липиды <1%;
- серосодержащая зола <2%.
В изобретении описан способ получения раствора коллагена с указанными свойствами, включающий две стадии:
1. стадию перемешивания и сдвига кислого раствора коллагена в смесителе с двойными поперечными резцами при поэтапном повышении первоначальной скорости перемешивания на 500-1000 об/мин без превышения скорости 10000 об/мин и при поэтапном повышении таким образом, чтобы увеличить исходную окружающую температуру экстракта до максимально контролируемой температуры, составляющей не выше 50℃, а затем
2) стадию стерилизации в жидкой среде с использованием мембранной фильтрации или надуксусной кислоты.
Однако следует отметить, что описанный препарат коллагена имеет критический недостаток, заложенный в технологии его изготовления. Дело в том, что нагрев кислого раствора коллагена выше 40℃, может привести к полной денатурации коллагена, в результате чего он переходит в форму желатина, при этом возрастает иммуногенность полученного препарата и ухудшаются физические характеристики раствора, которые в конечном счете существенно ухудшают стабильность созданных из него БМКП и трехмерных ТИК.
В отличие от указанных выше аналогов, заявленный стерильный прозрачный концентрированный раствор биосовместимого коллагена, не имеет перечисленных выше недостатков, поскольку благодаря способу его получения обладает особыми свойствами:
- раствор стерилен, и сохраняет биосовместимость и структуру тройной спирали белка-коллагена;
- уровень эндотоксинов в растворе составляет менее 10 Ед/мл;
- раствор является прозрачным;
- раствор пригоден для создания биомедицинских клеточных продуктов;
- раствор пригоден для создания трехмерных ткане-инженерных конструкций с разрешением деталей в 0,3 мм;
- раствор пригоден для создания прозрачных структур;
- раствор сохраняет свои свойства и функциональность при комнатной температуре;
Раскрытие изобретения
Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, являлось создание такого препарата - раствора коллагена, который будет пригоден для создания БМКП и трехмерных ТИК для клинического использования, различными методами, в том числе и методом 3D печати. Было высказано предположение, что для улучшения механических характеристик/свойств изготавливаемых БМКП и трехмерных ТИК методом 3D печати с разрешением деталей до 0,3 мм без использования химической модификации, лучше всего использовать концентрированные растворы коллагена (более 20 мг/мл), в отличие от широко используемых растворов коллагена (менее 10 мг/мл). Предлагаемый при этом подходе коллаген, находясь в растворе уксусной кислоты, должен сохранять структуру тройной спирали, а при переводе в физиологические условия должен быстро формировать (менее 5 минут) стабильные полимерные структуры (гидрогели).
Поскольку существует потребность в оценке эффективности использования такого препарата коллагена с точки зрения поведения клеток внутри сформированных гидрогелей, возникает требование прозрачности таких гидрогелей, которые можно получить, используя исходно прозрачный раствор коллагена.
Таким образом, первый аспект предлагаемого изобретения касается раствора коллагена, который характеризуется следующими свойствами:
Основной белковый состав препарата
Коллаген I типа 96-99%
Желатин (денатурированная форма коллагена I типа) 1-4%
Биохимические параметры препарата
Концентрация коллагена в растворе 20-200 мг/мл
Растворитель водный раствор, содержащий
0,0005-0,02М уксусной кислоты
Уровень эндотоксинов не более 10 Ед/мл
Стерильность в соответствии со стандартами Европейской Фармакопеи.
Физические параметры препарата
Реологические свойства: Значение модуля упругости при сдвиге (G’) превышает значение модуля вязкости при сдвиге (G’’) более чем на 500 кПа.
Прозрачность: В физиологических условиях формирует стабильные прозрачные полимерные структуры (гидрогели), прозрачность которых является достаточной, для проведения исследований методами конфокальной и классической световой микроскопии; коэффициент пропускания света в диапазоне длин волн от 400 нм до 780 нм составляет не менее 85% при толщине слоя 1,0 мм и концентрации коллагена в растворе 20 мг/мл.
Полимеризация: Время полимеризации раствора после нейтрализации его при температуре +37℃ составляет не более 5 минут в вышеуказанном диапазоне концентраций коллагена в этом растворе.
Вторым аспектом изобретения является способ получения коллагена, охарактеризованного выше.
Заявляемый способ получения коллагена включает несколько этапов, выполняемых в заданной последовательности:
2
4
2
4
1) экстракция коллаген-содержащей ткани, таких как сухожилия, плацента млекопитающих животных, таких как бык, свинья, крыса и человек, в раствор разбавленной (не более 0,5 М) органической кислоты после тщательной отмывки от белковых не коллагеновых примесей щелочными или нейтральными водно-солевыми растворами (например, 0,5М NaHPO) и органическими растворителями (например, ацетон, этанол, ацетонитрил) от примесных белков, гликопротеинов, жиросодержащих агрегатов; или экстракция коллаген-содержащей ткани, таких как сухожилия, плацента млекопитающих животных, таких как бык, свинья, крыса и человек, в раствор разбавленной (не более 0,5 М) органической кислоты после тщательной отмывки от белковых не коллагеновых примесей щелочными или нейтральными водно-солевыми растворами (например, 0,5М NaHPO) и органическими растворителями (например, ацетон, этанол, ацетонитрил) от примесных белков, гликопротеинов, жиросодержащих агрегатов, включающий обработку указанной ткани протеолитическими ферментами, отщепляющими только глобулярные телопептиды (например, пепсин) (22);
2) многократная (не менее 3 раз) очистка кислого водно-солевого экстракта от потенциально иммуногенных макромолекул способом избирательного осаждения коллагена, высокими концентрациями хлорида натрия (до 3М) при низкой температуре раствора (менее 10℃) (23);
3) Очистка кислого водно-солевого экстракта от оставшихся примесей потенциально иммуногенных макромолекул методом адсорбции оставшихся примесей на ДЭАЭ-целлюлозе (23);
4) Очистка от пирогенных примесей методом адсорбции липосахаридов на аффинном сорбенте (например, с иммобилизованным полимиксином (Affi-Prep) или специфичными к ЛПС антителами) (24);
5) Очистка от примесей обычных и спорообразующих микроорганизмов, а также надмолекулярных агрегатов коллагена методом микрофильтрации кислых растворов коллагена через мембраны с диаметром пор 0,22-0,45 мкм (19);
6) Доведение раствора коллагена до требуемой концентрации в нем белка-коллагена, молекулы которого сохраняют структуру тройной спирали и имеют молекулярную массу не менее 300 кДа, одним из известных методов: ультрафильтрации, упаривания, лиофилизации и растворения, или водо-абсорбции нерастворимыми гидрофильными полимерами (6, 21, 25).
Предлагаемый способ получения раствора коллагена основан на использовании стандартных методов очистки белков в заданной последовательности, которые до этого не использовались совместно для получения нового продукта - стерильного прозрачного концентрированного биосовместимого вязко-текучего водно-солевого закисленного раствора коллагена, молекулы которого сохраняют структуру тройной спирали, в котором уровень эндотоксинов не превышает 10 Ед/мл., который может быть использован для изготовления биомедицинских клеточных продуктов и трехмерных ткане-инженерных конструкций, в том числе с разрешением деталей не более 0,3 мм методом 3D принтинга с возможностью включения живых клеток или клеточных агрегатов, для широкого медицинского применения, а также для культивирования клеток.
Третьим аспектом изобретения являются способы применения раствора коллагена, охарактеризованного выше, в создании биомедицинских клеточных продуктов и трехмерных ткане-инженерных конструкций для последующих медицинских применений (но не ограничивающихся ими):
- в заместительной пластике хирургических дефектов мочевого пузыря;
- в создании искусственного аналога роговицы;
- для введения эмбриональных клеток в ствол спинного мозга в модели спинальной травмы;
- для использования биосовместимого носителя для пролонгирования действия факторов роста в модели лечения крипторхизма;
- в стоматологии - получение костно-пластического материала;
- биосовместимая пластина при хирургии головного мозга;
- в качестве одной из основных составляющих компонентов биочернил используемых для 3D печати трехмерных ткане-инженерных конструкций.
Осуществление изобретения
Далее заявленный стерильный прозрачный концентрированный раствор биосовместимого коллагена, способ его получения, методы его тестирования и использования описаны более детально в примерах. Приведенные примеры являются исключительно иллюстративными и не должны ограничивают область притязаний изобретения.
Пример 1. Способ приготовления стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена в нативной форме
Стадия 1. Экстракция
Очищенные свиные сухожилия последовательно отмывают 3 раза физиологическим раствором и 5 раз дистиллированной водой, затем полученный материал измельчают. Далее проводят экстракцию коллагена 0,5 М уксусной кислотой в течение 12-24 часов при температуре от +4℃ до +10℃. Не растворившуюся ткань отделяют от экстракта центрифугированием.
Стадия 2. Дифференциальное переосаждение
Очистку кислого водно-солевого экстракта коллагена от потенциально иммуногенных макромолекул проводят многократным применением метода дифференциального осаждения коллагена, описанного в литературе. Для этого в водно-солевом экстракта коллагена поднимают концентрацию хлорида натрия до 1,0 М. Проводят инкубацию в течение 30 минут при температуре +4℃ при постоянном перемешивании. Полученный осадок коллагена отделяют от раствора путем центрифугирования. Для растворения осадка к нему добавляют раствор 0,1 М уксусной кислоты исходя из следующего соотношения: к одному грамму осадка коллагена нужно добавить 10 мл 0,1 М уксусной кислоты. Далее, в полученном растворе коллагена снова поднимают концентрацию хлорида натрия до 1,0 М и повторяют процедуру осаждения коллагена еще два раза. Раствор коллагена, полученный в результате трех осаждений 1,0 М хлорида натрия, нейтрализуют путем добавления к нему концентрированного раствора NaOH. В полученном водно-солевом нейтральном растворе коллагена поднимают концентрацию хлорида натрия до 4,0 М, проводят инкубацию в течение 30 минут при температуре 4℃ и при постоянном перемешивании. Полученный осадок коллагена отделяют от раствора путем центрифугирования. Для растворения осадка к нему добавляют раствор 0,1 М уксусной кислоты, исходя из следующего соотношения: к одному грамму осадка коллагена нужно добавить 10 мл раствора, содержащего 0,1 M хлорида натрия, 1,0 М мочевины, 0,05 М Трис-Cl, pH 7,5. Поле растворения осадка проводят диализ полученного раствора коллагена против раствора, содержащего 0,1 M хлорида натрия, 1,0 М мочевины, 0,05 М Трис-Cl, pH 7,5.
Стадия 3. Удаление оставшихся примесей потенциально иммуногенных макромолекул
Полученный на стадии 2 водно-солевой раствор коллагена пропускают через хроматографическую колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, которую предварительно уравновесили водным раствором, содержащим 0,1 M хлорида натрия, 1,0 М мочевины, 0,05 М Трис-Cl, pH 7,5. Температура колонки во время процесса хроматографии поддерживается на уровне 4℃, а скорость протока - 2,5 объема колонки/час. В данных условиях коллаген не задерживается на сорбенте и собирается в проскоке. Далее проводят диализ полученного раствора коллагена против раствора, содержащего 0,1 M хлорида натрия, 0,02 M ацетата натрия, pH 5,5.
Стадия 4. Удаление эндотоксина
Полученный на стадии 3 водно-солевой раствор коллагена инкубируют с сорбентом с иммобилизованным полимиксином (Affi-PrepPolymyxin Matrix), который был предварительно промыт водным раствором, содержащим 0,1 M хлорида натрия и 0,02 M ацетата натрия, pH 5,5, в течение 24 часов при температуре +4℃ и аккуратном перемешивании. Далее сорбент отделяют от раствора коллагена путем центрифугирования. Полученный препарат коллагена диализуют против водного раствора 0,02 M ацетата натрия, pH 5,5 (не содержащего пирогенов).
Стадия 5. Очистка от примесей обычных и спорообразующих микроорганизмов
Очистку от примесей обычных и спорообразующих микроорганизмов, а также надмолекулярных агрегатов коллагена проводят методом каскадной микрофильтрации сначала через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм, а затем 0,22 мкм.
Стадия 6. Доведение раствора коллагена до нужной концентрации
Доведение раствора коллагена до требуемой концентрации в нем белка-коллагена проводят одним из известных методов: ультрафильтрации, упаривания, лиофилизации и растворения, или водо-абсорбции нерастворимыми гидрофильными полимерами. В качестве примера, рассмотрим метод лиофилизации и растворения. Полученный на стадии 5 водно-солевой раствор коллагена заливают в емкость для сушки, таким образом, чтобы толщина слоя не превышала 1 см, и замораживают при -70℃. Далее проводят лиофильное высушивание. После лиофилизации сухой препарат коллагена взвешивают и к нему добавляют требуемое количество стерильного апирогенного раствора уксусной кислоты 0,0005 - 0,02 М. Например, для получения раствора коллагена с концентрацией 80 мг/мл, к 800 мг сухого коллагена необходимо добавить 9,2 мл раствора уксусной кислоты.
Пример 2. Способ приготовления раствора стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого ателоколлагена (коллагена без телопептидов) .
Стадия 1. Экстракция
Очищенные свиные сухожилия последовательно отмывают 3 раза физиологическим раствором и 5 раз дистиллированной водой, затем полученный материал измельчают. Далее проводят экстракцию коллагена водным раствором 0,5 М уксусной кислоты, содержащим 0,3 г/л пепсина в течение 12-24 часов при температуре 4-10℃. Не растворившуюся ткань отделяют от экстракта центрифугированием.
Стадия 2. Дифференциальное переосаждение
Очистку кислого водно-солевого экстракта коллагена от потенциально иммуногенных макромолекул проводят многократным применением метода дифференциального осаждения коллагена, описанного в литературе. Для этого в водно-солевом экстракта коллагена поднимают концентрацию хлорида натрия до 1,0 М. Проводят инкубацию в течение 30 минут при температуре 4℃ при постоянном перемешивании. Полученный осадок коллагена отделяют от раствора путем центрифугирования. Для растворения осадка к нему добавляют раствор 0,1 М уксусной кислоты исходя из следующего соотношения: к одному грамму осадка коллагена нужно добавить 10 мл 0,1 М уксусной кислоты. Далее, в полученном растворе коллагена снова поднимают концентрацию хлорида натрия до 1,0 М и повторяют процедуру осаждения коллагена еще два раза. Раствор коллагена, полученный в результате трех осаждений 1,0 М хлорида натрия, нейтрализуют путем добавления к нему концентрированного раствора NaOH. В полученном водно-солевом нейтральном растворе коллагена поднимают концентрацию хлорида натрия до 4,0 М, проводят инкубацию в течение 30 минут при температуре 4℃ и при постоянном перемешивании. Полученный осадок коллагена отделяют от раствора путем центрифугирования. Для растворения осадка к нему добавляют раствор 0,1 М уксусной кислоты, исходя из следующего соотношения: к одному грамму осадка коллагена нужно добавить 10 мл раствора, содержащего 0,1 M хлорида натрия, 1,0 М мочевины, 0,05 М Трис-Cl, pH 7,5. Поле растворения осадка проводят диализ полученного раствора коллагена против раствора, содержащего 0,1 M хлорида натрия, 1,0 М мочевины, 0,05 М Трис-Cl, pH 7,5.
Стадия 3. Удаление оставшихся примесей потенциально иммуногенных макромолекул
Полученный на стадии 2 водно-солевой раствор коллагена пропускают через хроматографическую колонку с ДЭАЭ-целлюлозой, которую предварительно уравновесили водным раствором, содержащим 0,1 M хлорида натрия, 1,0 М мочевины, 0,05 М Трис-Cl, pH 7,5. Температура колонки во время процесса хроматографии поддерживается на уровне 4℃, а скорость протока - 2,5 объема колонки/час. В данных условиях коллаген не задерживается на сорбенте и собирается в растворе, выходящем из колонки с сорбентом. Далее проводят диализ полученного раствора коллагена против раствора, содержащего 0,1 M хлорида натрия, 0,02 M ацетата натрия, pH 5,5.
Стадия 4. Удаление эндотоксина
Полученный на стадии 3 водно-солевой раствор коллагена инкубируют с сорбентом с иммобилизованным полимиксином (Affi-PrepPolymyxin Matrix), который был предварительно промыт водным раствором, содержащим 0,02 M ацетата натрия при pH 5,5 и 0,1 M хлорида натрия, в течение 24 часов при температуре 4℃ и аккуратном перемешивании. Далее сорбент отделяют от раствора коллагена путем центрифугирования. Полученный препарат коллагена диализуют против водного раствора 0,02 M ацетата натрия pH 5,5 (не содержащего пирогенов).
Стадия 5. Очистка от примесей обычных и спорообразующих микроорганизмов
Очистку от примесей обычных и спорообразующих микроорганизмов, а также надмолекулярных агрегатов коллагена проводят методом каскадной микрофильтрации сначала через мембраны с диаметром пор 0,45 мкм, а затем 0,22 мкм.
Стадия 6. Доведение раствора коллагена до нужной концентрации
Доведение раствора коллагена до требуемой концентрации в нем белка-коллагена проводят одним из известных методов: ультрафильтрации, упаривания, лиофилизации и растворения, или водо-абсорбции нерастворимыми гидрофильными полимерами. В качестве примера, рассмотрим метод лиофилизации и растворения. Полученный на стадии 5 водно-солевой раствор коллагена заливают в емкость для сушки, таким образом, чтобы толщина слоя не превышала 1 см, и замораживают при -70℃. Далее проводят лиофильное высушивание. После лиофилизации сухой препарат коллагена взвешивают и к нему добавляют требуемое количество стерильного апирогенного раствора уксусной кислоты 0,0005 - 0,02 М. Например, для получения раствора коллагена с концентрацией 80 мг/мл, к 800 мг сухого коллагена необходимо добавить 9,2 мл раствора уксусной кислоты.
Пример 3. Соотнесение соотношения коллаген/желатин в растворе коллагена со временем желирования в физиологических условиях.
Любой используемый способ получения стерильного коллагена, как и его длительное хранение в растворах уксусной кислоты, может приводить к его денатурации, переходу в форму желатина (развернутой тройной спирали нативной структуры молекулы коллагена). Наличие желатина в препарате нативного коллагена влияет на скорость индуцированного гелеобразования, формирования стабильных прочных структур. Чтобы обеспечить технически возможность создания биомедицинских клеточных продуктов и трехмерных ткане-инженерных конструкций, используя растворы коллагена, время перехода в состояние гидрогеля в физиологических условиях не должно превышать 5 минут.
По методике, описанной в пункте 1, была приготовлена линейка растворов коллагена с концентрацией коллагена до 40 мг/мл. Концентрацию желатина в них определяли с помощью коммерческой ИФА тест-системы «Желатин-тест» (ООО фирмы «Имтек», Россия). Концентрация желатина в них не превышала 1 %. В части приготовленных растворов весь содержащийся в них коллаген был переведен в форму желатина путем нагрева до 50℃ в течение 3 часов. Далее, смешивая растворы коллагена с концентрацией коллагена 40 мг/мл, с растворами, содержащими желатин в концентрации 40 мг/мл, получали растворы коллагена c различным соотношением коллаген/желатин. Для нейтрализации полученные растворы смеси коллагена и желатина смешивали с фосфат забуференным физиологическим раствором в соотношении объемов 1:1. Время перехода раствора в состояния гидрогеля определялась при помощи ротационного реометра (Anton-Paar). Для чего полученные нейтральные растворы коллагена c различным соотношением коллаген/желатин помещались между двух пластин реометра, температура которых поддерживалась на уровне 37℃ в течение всего времени измерения. Из результатов, представленных в таблице, видно, что когда количество желатина превышает 4% в растворе коллагена, то время полного затвердевания геля начинает превышать 5 минут.
Раствор Коллагена
Желатин (денатурированный коллаген I типа)
Время образования геля, мин
99 %
1 %
3.5±0.3
98 %
2 %
3.9±0.2
97 %
3 %
4.3±0.1
96 %
4 %
4.8±0.3
95 %
5 %
5.3±0.3
Пример 4. Влияние концентрации коллагена на разрешение деталей при 3D печати
Для того, чтобы клетки, помещенные в трехмерные ткане-инженерные конструкции могли выживать, необходимо обеспечить эффективный отвод продуктов жизнедеятельности клеток и подвод питательных веществ к клеткам. Поэтому матрикс, окружающий клетку не должен превышать в размерах 0,3 мм. По методике, описанной в пункте 1, была приготовлена серия растворов коллагена с различной концентрацией коллагена. Для нейтрализации растворы коллагена смешивали с забуференным фосфатом физиологическим раствором в соотношении объемов 1:1 и переносили их в шприц для 3D печати. На шприц был одет конический носик, выходное отверстие которого имело диаметр 0,15 мм. Для печати использовали коммерческий экструзионный 3D принтер (RegenHU), который обеспечивал охлаждение коллагена в шприце в процессе печати и нагрев поверхности, на которой производилась печать. Разрешение деталей в напечатанной структуре (решетке) определяли методами световой микроскопии. Из результатов, представленных в таблице, видно, что при концентрации коллагена более 20 мг/мл в нейтральном растворе коллагена, разрешение деталей поддерживается на необходимом уровне. Однако, при превышении концентрации более 200 мг/мл возникли трудности, связанные с тем, что было невозможно выдавить коллаген такой концентрации из носика с таким диаметром. Поэтому оптимальным диапазоном концентрации коллагена для 3D печати является интервал от 20 мг/мл до 200 мг/мл.
Концентрация коллагена, мг/мл
Разрешение деталей напечатанной конструкции, мм
10
0,8±0.1
15
0,6±0.2
20
0,3±0.1
40
0,3±0.1
60
0,27±0.05
100
0,2±0.1
130
0,17±0.03
170
0,17±0.02
200
0,17±0.02
210
-
240
-
Пример 5. Влияние буферного состава раствора коллагена на содержание в нем желатина при длительном хранении.
Как было показано в примере 3, желатин в растворе коллагена оказывает существенное влияние на время его перехода в форму геля. Известно, что при длительном хранении коллаген в кислых растворах переходит в форму желатина. С точки зрения конечного потребителя, такой продукт, раствор такого препарата очищенного коллагена, молекулы которого в данных условиях сохраняют структуру тройной спирали, должен храниться как минимум год. По методике, описанной в пункте 1, была приготовлена линейка растворов коллагена в водных растворах с различным содержанием уксусной кислоты. Данные препараты хранились в течение 1 года при температуре 4-10℃. Количество денатурированного коллагена в них определяли с помощью коммерческой ИФА тест-системы «Желатин-тест» (ООО фирмы «Имтек», Россия). Из результатов, представленных в таблице, видно, что оптимальный диапазон концентрации уксусной кислоты в водном растворе с точки зрения стабильности коллагена находится в диапазоне от 0,0005 М до 0,02 М. Стоит отметить, что не удалось полностью растворить коллаген в растворе уксусной кислоты с концентрацией менее 0,0005 М.
Концентрация уксусной кислоты, М
Количество желатина в растворе коллагена через 1 год, %
0,0005
1.1±0.2
0,001
1.2±0.3
0,015
2.0±0.1
0,02
2.5±0.3
0,03
4.2±0.3
0,1
20±2
Пример 6. Роль реологических свойств раствора коллагена на 3D печать многослойных макрообъектов.
Для того, чтобы можно было создавать большие трехмерные ткане-инженерные конструкции методом 3D печати, раствор коллагена после выдавливания через тонкую иглу должен сохранять свою форму в течение 5 минут, пока полностью не пройдет процесс его фиксации путем образования геля в физиологических условиях. Это возможно только для таких растворов коллагена, у которых значение модуля упругости (G’) превышает значения модуля вязкости (G’’). Величину этой разности необходимо определить. По методике, описанной в пункте 2, была приготовлена линейка растворов коллагена с концентрацией коллагена 80 мг/мл в растворе 0,02 М уксусной кислоты. Для того, чтобы влиять на значения модулей G’ и G’’, не меняя при этом концентрацию коллагена, в растворитель была введена мочевина. Таким образом, было приготовлено несколько групп растворов коллагена, по 10 образцов в каждой, с различными значениями модулей G’ и G’’. Значения модулей определяли при помощи ротационного реометра (Anton-Paar). Далее определяли пригодность приготовленных растворов коллагена для прямой экструзионной 3D печати многослойных макрообъектов: способность удержания формы в течение 5 минут. Результаты опытов представлены в таблице.
Разница между G’ и G’’, кПа
Пригодность для 3D печати
100±10
нет
300±14
нет
450±25
нет
500±7
да
1000±40
да
3000±80
да
Пример 7. Использование стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена для образования биополимерного матрикса с включением живых клеток человека
Используют коллаген, полученный в примере 1, в водном растворе 0,001 М уксусной кислоты с концентрацией коллагена 40 мг/мл. Данный продукт смешивают с раствором, содержащим суспензию живых клеток, в соотношении объемов 1:3 или 1:1. Полученный биомедицинский клеточный продукт при введении в организм человека формирует матрикс, поддерживающий функциональную активность содержащихся в нем клеток человека. Например, при смешивании такого коллагена с суспензией мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из пуповинной крови, можно создать биомедицинский клеточный продукт для восстановления двигательной функции конечностей, которые утратили ее в результате спинальной травмы.
Пример 8. Использование стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена для образования прочной мембраны пригодной для имплантации с целью хирургического замещения поврежденных естественных биомембран.
По методике, описанной в пункте 2 был приготовлен коллаген с концентрацией коллагена 25 мг/мл в водном растворе 0,01 М уксусной кислоты. Такой коллаген в количестве 0,5 мл заливают лунку 24-х луночного полистирольного планшета (92424, Tissue Plastic Production). Для достижения ровного слоя планшет с раствором белков инкубировали при температуре +37°C в парах аммиака в течение 3 часов. В результате в каждой лунке планшета был сформирован коллагеновый гидрогель. Затем полученные гидрогели извлекали из планшета и высушивали в асептических условиях при температуре, не превышающей +30°C и при относительной влажности 40%. Сушка считалась полностью завершенной при переходе коллагенового гидрогеля в форму жесткой стеклоподобной мембраны. Приготовленную таким образом мембрану можно использовать для хирургического замещения поврежденных естественных биомембран, например, для ушивания дефекта стенки мочевого пузыря, восстановления твердой мозговой оболочки и роговицы.
Пример 9. Использование стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена для создания прозрачного гидрогеля, поддерживающего пролиферацию клеток в трехмерной культуре.
По методике, описанной в пункте 2, был приготовлен коллаген с концентрацией коллагена 40 мг/мл в водном растворе 0,001 М уксусной кислоты. К 1,0 мл раствора коллагена добавляют 3,0 мл суспензии клеток млекопитающих (например, фибробласты человека) в среде для культивирования и быстро перемешивают при температуре, не превышающей +10°C. Полученную смесь аккуратно заливают в ячейки изделий для культивирования клеток (например, используя 24-х луночный планшет) таким образом, чтобы толщина слоя полученного гидрогеля не превышала 1 мм и инкубируют при 37°C в течение 30 минут. Полученный таким образом коллагеновый гидрогель, обладает прозрачностью, достаточной для проведения исследований методами конфокальной микроскопии или классической световой микроскопии на протяжении всего времени культивирования клеток. Кроме того, полученный гидрогель обеспечивает возможность пролиферации клеток и сохраняет их жизнеспособность.
Список литературы
1.Markstedt K, Mantas A, Tournier I, et al. 2015. 3D Bioprinting Human Chondrocytes with Nanocellulose-Alginate Bioink for Cartilage Tissue Engineering Applications. Biomacromolecules 16: 1489−1496.
2. Zhang Y, Yu Y, Ozbolat IT, 2013. Direct Bioprinting of Vessel-Like Tubular Microfluidic Channels. J. Nanotechnol. Eng. Med. 4: 20902.
3. Wang X, Yan Y, Pan Y, Xiong Z, et al. 2006. Generation of three-dimensional hepatocyte/gelatin structures with rapid prototyping system. Tissue Eng. 12: 83–90.
4. Skardal A, Zhang J, Prestwich GD, 2010c. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials 31: 6173– 6181.
5. Snyder JE, Hamid Q, Wang C, et al. 2011. Bioprinting cell-laden matrigel for radioprotection study of liver by pro-drug conversion in a dual-tissue microfluidic chip. Biofabrication 3: 34112.
6. Rhee S, Puetzer JL, Mason BN, et al. 2016. 3D Bioprinting of Spatially Heterogeneous Collagen Constructs for Cartilage Tissue Engineering. ACS Biomater Sci Eng; 2(10): 1800-1805.
7. Du M, Chen B, Meng et al. 2015. 3D bioprinting of BMSC-laden methacrylamide gelatin scaffolds with CBD-BMP2-collagen microfibers. Biofabrication 7: 44104.
8. Wu W, DeConinck A, Lewis J, 2011. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Adv. Mater. 23: H178-83.
9. Lynn AK, Yannas IV, Bonfield W. 2004. Antigenicity and Immunogenicity of Collagen. J Biomed Mater Res. 71B(2): 343-354
10. Timpl R. 1982. Antibodies to collagen and procollagen. Meth. Enzymol. 82 : 482—98.
11. Courtman DW, Errett BF, Wilson GJ. 2001. The role of crosslinking in modification of the immune response elicted against xenogenic vascular acellular matrices. J Biomed Mater Res; 55(4): 576-586.
12. US4713446A.
13. Kamalov AA, Kirpatovsky VI, Ohobotov DA, et al. 2017. The application of a novel biomaterial based on the secreted products of human mesenchymal stem cells and collagen for spermatogenesis restoration in the model of experimental cryptorchidism. Res J Pharm Biol Chem Sci; 8(1):2083-2094.
14. Kirpatovckii VI, Kamalov DM, Efimenko AY, et al. 2016. Urinary bladder substitution using combined membrane based on secretions of human mesenchymal stem cells and type I collagen. Urologiia;(6):34–42.
15. Osidak EO, Karalkin PA, Osidak MS, et al. 2019. Viscoll collagen solution as a novel bioink for direct 3D bioprinting. J Mater Sci: Mater Med. In press. 16. US4389487A
17. RU 2272808
18. RU 2094999
19. RU 2214827
20. RU2188206C2
21. US20170334969A1
22. Кухарева ЛВ, Шамолина ИИ, Полевая ЕВ. 2010. Метод получения коллагена из телячей шкуры для тканевой инженерии и клеточного культивирования. Цитология. 52(7): 597-602.
23. Deyl Z, Miksik I, Eckhardt A. 2003. Preparative procedures and purity of collagen proteins. J Chromatography. 790: 245-375.
24. Hirayama C. Sakata M. 2002. Chromatographic removal of endotoxin from protein solutions by polymer particles. J Chromatography. 781(1-2): 419-432.
25. Tidu A, Ghoubay-Banallaoua D, Lynch B. 2015. Development of human corneal epithelium on organized fibrillated transparent collagen matrices synthesized at high concentration. Acta Biomaterialia. 22(2015): 50-58.