СМЕСИ ЖИРНЫХ КИСЛОТ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
FATTY ACID MIXTURES AND USE THEREOF

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В настоящей заявке заявлен приоритет предварительной патентной заявки США №60/817558, озаглавленной «Смеси жирных кислот и их применение», поданной 28 июня 2006, которая включена в данное описание изобретения посредством ссылки во всей ее полноте, включая фигуры.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Предложены масла; смеси масел или жирных кислот; применения таких смесей, включая применения в качестве топлив; и способы получения масел или смесей жирных кислот.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Следующее описание предшествующего уровня техники предложено только в качестве помощи в понимании изобретения и не признается как описывающее или составляющее уровень техники для изобретения.
Растительные масла использовались в качестве альтернативных видов топлива и сырья для получения биодизельных топлив. Обычно используемые масла экстрагируют из растений, растущих в большом количестве в конкретном регионе. Поэтому соевое масло представляет интерес в качестве источника биодизельного топлива в Соединенных Штатах, в то время как рапсовое масло представляет интерес в европейских странах; а страны с тропическим климатом используют кокосовое масло или пальмовое масло (Knothe et al., публикация on-line на www.biodiesel.org/resources/reportsdatabase/reports/gen/19961201_gen-162.pdf).
Композиция триглицеридов, имитирующая масло из VS-320, мутанта Cuphea viscossima, описана в Geller et al. (Transactions of the American Society of Agricultural Engineers 42:859-862, 1999). "Имитированный аналог масла VS-320", описанный в Geller, имеет триглицеридную композицию из 4,2% С6:0; 40,20% С8:0; 36,90% С10:0; 4,80% С12:0; 6,80% С14:0; 3,33% С16:0; 0,00% С18:0; 1,37% С18:1; 2,05% С18:2 и 0,00% С18:3 (смотри Таблицу 1). Geller et al. (1999) сделал вывод, что "данная модель предполагает, что увеличение уровня С8:0 в растительных маслах, так же как и последующее понижение уровня средне- и длинноцепочечных триглицеридов, может приводить к более эффективному, лучше действующему альтернативному дизельному топливу".
12
В Stournas et al. (JACOS, 1995, 72: 433-437) раскрыты характеристики различных масел в качестве топлив и указано "принимая во внимание воспроизводимость определений точки застывания ±3°С, большинство добавленных компонентов не влияли в значительной степени на точку застывания -12°С базового топлива. Основными исключениями являются насыщенные жирные спирты с C и более длинными алкильными цепочками, которые существенно повышают точку застывания; также наблюдались незначительные негативные воздействия некоторых эфиров с более длинной цепью. Следует отметить, что присутствие двойной связи во всех олеатных производных резко улучшает его свойство хладотекучести по сравнению с соответствующими стеаратами" и "если учитывать как воспламеняемость, так и свойство хладотекучести, третичные диметиламины лучше выполняют свои функции; однако третичные амиды также имеют интересные перспективы, так как их получение из глицеридов натуральных растительных масел может быть более простым, чем получение из аминов, как показали некоторые новые исследования."
В Mittelbach (Bioresource Technology, 1996, 56: 7-11) обсуждаются технические характеристики и контроль качества дизельного топлива, полученного из растительных масел, и указано "одним параметром, который еще не включен в Австрийские стандарты для RME, но может быть необходим при определении основных стандартов для метиловых эфиров жирных кислот, является йодное число, которое описывает содержание ненасыщенных жирных кислот и зависит только от происхождения растительного масла. В Германии определено значение 115, которое соответствует рапсовому маслу, но исключает разные виды масел, таких как подсолнечное масло и соевое масло. Может быть необходимым ограничение ненасыщенных жирных кислот из-за того, что нагревание более ненасыщенных жирных кислот приводит к полимеризации глицеридов. Это может приводить к образованию отложений или к ухудшению качества смазывающего масла. Этот эффект возрастает с количеством двойных связей в цепочке жирных кислот. Поэтому представляется, что лучше ограничить содержание более ненасыщенных жирных кислот, таких как линоленовая кислота, чем ограничить степень ненасыщенности йодным числом."
В Graboski (Prog. Energy Combustion Sci, 1998, 24: 125-164) обсуждается "статус дизельных топлив, полученных из жиров и масел в отношении свойств топлива, характеристики двигателя и выбросов" и указано "снижение длины цепочки и/или увеличение разветвлений цепочки могло бы улучшить свойства хладотекучести топлива. Длина цепочки и степень разветвления могут быть изменены посредством как селекции растений и генноинженерных подходов, так и путем химической обработки биодизельного топлива для расщепления некоторых двойных связей или образования разветвленных изомеров. Незначительные практические исследования были выполнены в области химической обработки. Очевидно, что свойства хладотекучести биодизельного топлива представляют собой область, нуждающуюся в существенном исследовании".
В Goodrum et al. (Bioresource Technology, 1996, 56:55-60) рассматриваются "физические свойства низкомолекулярных триглицеридов для разработки моделей биодизельного топлива" и указано "масла, которые содержат значительные фракции низкомолекулярных триглицеридов, могут быть пригодны для непосредственного применения в качестве топливных наполнителей. Действительно, сырье из видов Cuphea (Graham, 1989), содержит масла, главным образом состоящие из таких триглицеридов (в частности трикаприлин и трикаприн). Современные технологии переноса ДНК также могли обеспечить перенос генов, контролирующих синтез низкомолекулярных триглицеридов из таких видов, как Cuphea, в другие более традиционные масличные культуры. Композиция масел затем может быть генетически модифицирована для оптимальных требуемых свойств биодизельного топлива".
В Knothe (Fuel Processing Technology, 2005, 86: 1059-1070) указано "насыщенные жирные соединения имеют значительно более высокие точки плавления, чем ненасыщенные жирные соединения (Таблица 1), и в смеси они кристаллизуются при более высокой температуре, чем ненасыщенные. Такие биодизельные топлива, полученные из жиров или масел со значительными количествами насыщенных жирных соединений, имеют более высокие точки помутнения и точки застывания".
В Kinney et al. (Fuel Processing Technology, 2005, 86: 1137-1147) обсуждаются проблемы, касающиеся модификации соевого масла для усиления производительности биодизельных смесей. В данной статье упоминаются смеси, раскрытые в Geller et al., 1999, и указано "так как точка плавления биодизельного топлива, полученного из таких короткоцепочечных жирных кислот, является довольно высокой, могут потребоваться дополнительные стадии демаргаринизации для улучшения свойств хладотекучести". В Kinney et al. также указано "изменения жирнокислотного профиля, которые повышают содержание насыщенных жирных кислот, увеличивают окислительную стабильность, но ухудшают хладотекучесть, … присутствие двойных связей в жирных кислотах будет понижать цетановое число; следовательно, способы сдвига жирнокислотного пула растительного масла в направлении насыщенных группировок улучшают воспламеняемость полученного биодизельного топлива, но, как и с окислительной стабильностью, могут ухудшаться свойства хладотекучести".
В патенте US №4364743 ("патент '743") раскрыто "синтетическое топливо из эфиров жирных кислот, которое обеспечивает новый источник энергии при сжигании в одиночку или в комбинации с другими известными топливами", и что "эфиры получают предпочтительно посредством реакции трансэтерификации, используя различные масла, такие как соевое масло, пальмовое масло, сафлоровое масло, арахисовое масло, кукурузное масло, масло из семян хлопчатника, льняное масло, ойтисиковое масло, тунговое масло, кокосовое масло, касторовое масло, перилловое масло, рапсовое масло, подсолнечное масло, лярд, сало, рыбьи жиры, ворвань, жиры морских и наземных животных и жиры из растительных источников".
В патенте US №5389113 ("патент '113") раскрыты "смеси, содержащие а) 58-95% масс. по меньшей мере одного эфира с йодным числом от 50 до 150, полученные из жирных кислот, содержащих 12-22 атомов углерода, и низших алифатических спиртов, содержащих 1-4 атомов углерода, б) 4-40% масс. по меньшей мере одного эфира жирных кислот, содержащих 6-14 атомов углерода, и низших алифатических спиртов, содержащих 1-4 атомов углерода, и в) 0,1-2% масс. по меньшей мере одного полимерного эфира."
В публикации патентной заявки US №2006026963 раскрыты "нуклеиновокислотные конструкции и способы получения масляных композиций из измененных семян" и указано "способ для увеличения уровня олеиновой кислоты и снижения уровня насыщенных жирных кислот в растительном семени, включающий 1) уменьшение длины первой гетерологичной последовательности FAD2, пока величина супрессии гена FAD2 из растения, трансформированного первой гетерологичной последовательностью FAD2, по меньшей мере частично не снижается по отношению к величине супрессии гена FAD2 в растительной клетке, содержащей аналогичный генетический фон и вторую гетерологичную последовательности FAD2, где вторая гетерологичная последовательность FAD2 состоит из более эндогенной последовательности FAD2, чем первая гетерологичная последовательность FAD2; 2) экспрессию гетерологичной FATB последовательности, способной по меньшей мере частично снижать экспрессию гена FATB в растительной клетке относительно супрессии FATB в растительной клетке с аналогичным генетическим фоном, но без гетерологичной последовательности FATB; 3) выращивание растения, содержащего геном с первой гетерологичной последовательностью FAD2 и гетерологичной последовательностью FATB; и 4) культивирование растения, которое производит семена с пониженным содержанием насыщенных жирных кислот по сравнению с семенами из растения, имеющего аналогичный генетический фон, но не имеющего первой гетерологичной последовательности FAD2 и гетерологичной последовательности FATB".
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заявитель обнаружил, что смеси растительных масел могут быть выбраны так, чтобы эта смесь имела нужные свойства для использования в качестве альтернативных топлив или в качестве исходного сырья для и биодизельного топлива. Например, такие смеси могут быть выбраны так, чтобы при использовании в качестве топлива в холодном климате смесь с гораздо меньшей вероятностью замерзала. Смеси также могут быть выбраны так, чтобы эта смесь была стабильна при высоких температурах. Кроме того, смеси могут быть выбраны так, чтобы достичь требуемых свойств возгорания, при использовании в качестве топлива в транспортном средстве. Некоторые конкретные примеры свойств смеси масел или жирных кислот по изобретению описаны ниже. Понятно, что смеси масел или жирных кислот в рамках изобретения могут иметь любую комбинацию свойств, раскрытых в нижеприведенных воплощениях. В частности, авторы изобретения обнаружили, что некоторые смеси жирных кислот имеют неожиданно полезные свойства для получения биотоплив. Например, авторами изобретения обнаружено, что конкретные пропорции среднецепочечных жирных кислот и мононенасыщенных жирных кислот могут обладать неожиданно полезными свойствами, например в отношении к характеристкам в условиях холодной погоды. В некоторых воплощениях жирнокислотных смесей, имеющих сбалансированное количество среднецепочечных жирных кислот (например С8, С10 и С12) и мононенасыщенных жирных кислот (предпочтительно С16:1 и С18:1), авторы изобретения обнаружили, что присутствие С16:0 и С18:0 может оказывать особенно неблагоприятные эффекты на свойства хладотекучести, и, следовательно, пониженные уровни С16:0 и С18:0 в биодизельном топливе могут выгодными для характеристик в условиях холодной погоды; и что С14:0, С18:2, C18:3, С20, С22 и С24 также могут отрицательно влиять на свойства хладотекучести; таким образом, уменьшение данных жирных кислот в биодизеле также может быть полезным.
Термин "масло" при использовании в данном описании изобретения относится к веществу, состоящему главным образом из триглицеридов жирных кислот. Растительные масла могут быть экстрагированы из разных частей растения, включая семена, плоды или листья растений. Обычно они жидкие при комнатных температурах. В некоторых воплощениях масла получают из канолы, рапса, пальмы, пальмовых ядер, кокоса, тукума, подсолнечника, сафлора, оливы, макадамии, бабассу, клещевины, арахиса, хлопчатника, льняного семени, льна, кохуны и ятрофы. В дополнительных воплощениях масла могут быть получены из генетически модифицированного растения.
Триглицериды являются главными компонентами растительных масел и животных жиров. Триглицериды могут быть твердыми или жидкими при комнатной температуре. Триглицерид, также называемый триацилглицерином (TAG), представляет собой химическое соединение, образованное одной молекулой глицерина и тремя жирными кислотами. Глицерин представляет собой трехосновный спирт (содержащий три гидроксильные группы), который может объединяться с жирными кислотами, в количестве вплоть до трех, с образованием моноглицеридов, диглицеридов и триглицеридов, при объединении с одной, двумя или тремя жирными кислотами соответственно. Моноглицериды, диглицериды и триглицериды классифицируют как эфиры, которые представляют собой соединения, получаемые при реакции между кислотами и спиртами, при которой высвобождается вода в качестве побочного продукта. Жирные кислоты можно комбинировать с любой из трех гидроксильных групп с образованием сложноэфирной связи и получением широкого разнообразия соединений. Кроме того, жирные кислоты, имеющие различные длины, можно комбинировать с индивидуальной молекулой глицерина. Таким образом, полученный диглицерид или триглицерид может содержать разные жирные кислоты в одной и той же молекуле триглицерида.
Жирные кислоты состоят из углерода, водорода и кислорода, организованных в виде каркаса из углеродной цепи с карбоксильной группой на одном конце. Жирные кислоты могут быть насыщенными жирными кислотами (SFAs) и не иметь двойных связей углерод-углерод, мононенасыщенными (MUFAs) и иметь одну углерод-углерод двойную связь, или полиненасыщенными жирными кислотами (PUFAs) и иметь более одной углерод-углерод двойной связи. Количество атомов углерода в цепи жирных кислот и число двойных связей углерод-углерод обычно выражают в виде "число атомов углерода:число двойных связей углерод-углерод". Например, олеиновая кислота, которая имеет 18 атомов углерода и одну двойную связь, может быть представлена как "С18:1" или "18:1."
"Среднецепочечные жирные кислоты" при использовании в данном описании изобретения относятся к жирным кислотам, содержащим 6-14 атомов углерода, предпочтительно 8-12 атомов углерода.
"Длинноцепочечные жирные кислоты" при использовании в данном описании изобретения относятся к жирным кислотам, содержащим более 14 атомов углерода, или более 16 атомов углерода, или даже более 18 атомов углерода.
В одном аспекте предложены смеси жирных кислот.
В некоторых предпочтительных воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, лауриновая кислота составляет 6-20% смеси; более предпочтительно 6-10% смеси.
В некоторых предпочтительных воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, каприловая кислота (С8:0), каприновая кислота (С10:0) и лауриновая кислота (С12:0), взятые вместе, составляют 20-40% смеси; или 20-30% смеси; или 30-40% смеси; или 25-35% смеси. В других воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, каприловая кислота (С8:0), каприновая кислота (С10:0) и лауриновая кислота (С12:0) вместе составляют 60-85% смеси; или 60-70% смеси; или 70-85% смеси; или 65-75% смеси. В других воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, каприловая кислота (С8:0), каприновая кислота (С10:0) и лауриновая кислота (С12:0) вместе составляют 40-60% смеси; или 40-50% смеси; или 50-60% смеси; или 45-55% смеси.
В некоторых предпочтительных воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, мононенасыщенные жирные кислоты составляют 5-95% смеси; предпочтительно мононенасыщенные жирные кислоты составляют более 10%, или более 15%; или более 20%; или более 25%; или более 30%; или более 35%; или более 40%; или более 45; или более 50%; или более 60%; или более 65%; или более 70%; или более 80%; или более 85% смеси.
В некоторых предпочтительных воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, олеиновая кислота (С18:1) и пальмитолеиновая кислота (16:1), взятые вместе, составляют 20-85% смеси; или 20-40% смеси; или 20-30% смеси; или 30-40% смеси; или 25-35% смеси; или 40-60% смеси; или 35-55% смеси; или 55-65% смеси; или 60-85% смеси; или 60-70% смеси; или 70-85% смеси; или 65-75% смеси.
В некоторых предпочтительных воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, каприловая кислота (С8:0), каприновая кислота (С10:0), лауриновая кислота (С12:0), олеиновая кислота (C18:1) и пальмитолеиновая кислота (16:1), взятые вместе, составляют более 50% смеси; или более 55% смеси; или более 60% смеси; или более 65% смеси; или более 70% смеси; или более 75% смеси; или более 80% смеси; или более 85% смеси; или более 90% смеси.
В некоторых предпочтительных воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, стеариновая (18:0) и пальмитиновая кислота (16:0), взятые вместе, составляют менее 25% смеси; более предпочтительно менее 15% смеси; более предпочтительно менее 10% смеси; более предпочтительно менее 8% смеси; более предпочтительно менее 6% смеси; более предпочтительно менее 5% смеси; более предпочтительно менее 4% смеси; более предпочтительно менее 3% смеси; более предпочтительно менее 2% смеси; или менее 1% смеси; или менее 0.5% смеси; или в некоторых предпочтительных воплощениях смесь жирных кислот по существу не содержит стеариновой (18:0) и пальмитиновой кислот (16:0).
В некоторых предпочтительных воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, миристиновая кислота (14:0) составляет менее 25% смеси; более предпочтительно менее 15% смеси; более предпочтительно менее 10% смеси; более предпочтительно менее 8% смеси; более предпочтительно менее 6% смеси; более предпочтительно менее 5% смеси; более предпочтительно менее 4% смеси; более предпочтительно менее 3% смеси; более предпочтительно менее 2% смеси; или менее 1% смеси; или менее 0,5% смеси; или в некоторых предпочтительных воплощениях смесь жирных кислот по существу не содержит миристиновой кислоты (14:0).
В некоторых предпочтительных воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, линолевая кислота (18:2) и линоленовая кислота (18:3), взятые вместе, составляют менее 25% смеси; более предпочтительно менее 15% смеси; более предпочтительно менее 10% смеси; более предпочтительно менее 8% смеси; более предпочтительно менее 6% смеси; более предпочтительно менее 5% смеси; более предпочтительно менее 4% смеси; более предпочтительно менее 3% смеси; более предпочтительно менее 2% смеси; или менее 1% смеси; или менее 0,5% смеси; или в некоторых предпочтительных воплощениях смесь жирных кислот по существу свободна от линолевой кислоты (18:2) и линоленовой кислоты (18:3).
В некоторых предпочтительных воплощениях смесей жирных кислот, предлагаемых в данном описании изобретения, арахидоновая кислота (С20:0), бегеновая кислота (С22:0) и лигноцериновая кислота (С24:0), взятые вместе, составляют менее 25% смеси; более предпочтительно менее 15% смеси; более предпочтительно менее 10% смеси; более предпочтительно менее 8% смеси; более предпочтительно менее 6% смеси; более предпочтительно менее 5% смеси; более предпочтительно менее 4% смеси; более предпочтительно менее 3% смеси; более предпочтительно менее 2% смеси; или менее 1% смеси; или менее 0,5% смеси; или в некоторых предпочтительных воплощениях смесь жирных кислот по существу свободна от арахидоновой кислоты (С20:0), бегеновой кислоты (С22:0) и лигноцериновой кислоты (С24:0).
В некоторых аспектах предлагается смесь жирных кислот, где насыщенные жирные кислоты, имеющие 8-12 атомов углерода, и мононенасыщенные жирные кислоты, имеющие 12-18 атомов углерода, составляют 80-100% смеси, каприловая кислота (С8:0) и каприновая кислота (С10:0) составляют 5-80% смеси, лауриновая кислота составляет менее 20% смеси, и полиненасыщенные жирные кислоты и насыщенные жирные кислоты, имеющие более 12 атомов углерода, взятые вместе, составляют менее 20% смеси. В некоторых предпочтительных воплощениях вышеуказанной смеси жирных кислот каприловая кислота (С8:0), каприновая кислота (С10:0) и лауриновая кислота (С12:0), взятые вместе, составляют 20-40% смеси; предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-20% смеси, более предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-10% смеси. В некоторых предпочтительных воплощениях смеси олеиновая кислота (С18:1) и пальмитолеиновая кислота (16:1), взятые вместе, составляют 50-85% смеси.
В некоторых аспектах предлагается смесь жирных кислот, где насыщенные жирные кислоты, имеющие 8-12 атомов углерода, и мононенасыщенные жирные кислоты, имеющие 12-18 атомов углерода, составляют 80-100% смеси, каприловая кислота (С8:0) и каприновая кислота (С10:0) составляют 5-80% смеси, лауриновая кислота составляет менее 20% смеси, и полиненасыщенные жирные кислоты и насыщенные жирные кислоты, имеющие более 12 атомов углерода, взятые вместе, составляют менее 20% смеси. В некоторых предпочтительных воплощениях вышеуказанной смеси жирных кислот каприловая кислота (С8:0), каприновая кислота (С10:0) и лауриновая кислота (С12:0), взятые вместе, составляют 20-40% смеси; предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-20% смеси, более предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-10% смеси; и олеиновая кислота (С18:1) и пальмитолеиновая кислота (16:1) взятые вместе составляют 50-85% смеси. В других предпочтительных воплощениях вышеуказанной смеси каприловая кислота (С8:0), каприновая кислота (С10:0), и лауриновая кислота (С12:0), взятые вместе, составляют 60-85% смеси; предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-20% смеси, более предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-10% смеси; и олеиновая кислота (С18:1) и пальмитолеиновая кислота (16:1), взятые вместе, составляют 20-40% смеси.
В один аспект изобретения включены смеси двух или более масел, где по меньшей мере 50% масс. жирных кислот представляют собой среднецепочечные жирные кислоты, и где каприловая кислота (С8:0) составляет вплоть до 25% готовой смеси и менее 20% составляют длинноцепочечные жирные кислоты.
В родственном аспекте изобретение включает смеси жирных кислот, где по меньшей мере 50% масс. жирных кислот представляют собой среднецепочечные жирные кислоты, и где каприловая кислота (С8:0) составляет вплоть до 25% готовой смеси и менее 20% составляют длинноцепочечные жирные кислоты.
В некоторых воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению эти смеси содержат по меньшей мере 60% среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 65% среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере среднецепочечных 70% жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 75% среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 80% среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 85% среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 90% среднецепочечных жирных кислот или предпочтительно по меньшей мере 95% среднецепочечных жирных кислот.
В конкретных воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению эти смеси содержат 5-25% каприловой кислоты (С8:0); 10-25% каприловой кислоты (С8:0); 10-20% каприловой кислоты (С8:0) или 15-25% каприловой кислоты (С8:0).
В конкретных воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению эти смеси содержат 30-60% каприновой кислоты (С10:0); 25-55% каприновой кислоты (С10:0); 30-50% каприновой кислоты (С10:0) или 40-50% каприновой кислоты (С10:0).
В конкретных воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению эти смеси содержат 5-35% лауриновой кислоты (С12:0); 10-20% лауриновой кислоты (С12:0); 15-25% лауриновой кислоты (С12:0); 20-30% лауриновой кислоты (С12:0) или 25-35% лауриновой кислоты (С12:0).
В других воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению эти смеси содержат менее 15% длинноцепочечных жирных кислот, предпочтительно менее 10% длинноцепочечных жирных кислот, предпочтительно менее 7% длинноцепочечных жирных кислот, предпочтительно менее 5% длинноцепочечных жирных кислот или предпочтительно менее 3% длинноцепочечных жирных кислот.
В других воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению эти смеси содержат менее 15% мононенасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 10% мононенасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 7% мононенасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 5% мононенасыщенных жирных кислот или предпочтительно менее 2% мононенасыщенных жирных кислот.
В других воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению эти смеси включают в себя менее 10% полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 7% полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 5% полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 3% полиненасыщенных жирных кислот или предпочтительно менее 1% полиненасыщенных жирных кислот.
В конкретных воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению капроновая кислота (6:0) может составлять от примерно 0 до примерно 5% масс. смеси; каприловая кислота (8:0) может составлять от примерно 5 до примерно 25% масс. смеси; каприновая кислота (10:0) может составлять от примерно 30 до примерно 60% масс. смеси; лауриновая кислота (12:0) может составлять от примерно 5 до примерно 30% масс. смеси; миристиновая кислота (14:0) может составлять от 0 до примерно 5% масс. смеси; пальмитиновая кислота (16:0) может составлять от 0 до примерно 5% масс. смеси; пальмитолеиновая кислота (16:1) может составлять от 0 до примерно 10% масс. смеси; стеариновая кислота (18:0) может составлять от 0 до примерно 5% масс. смеси; олеиновая кислота (18:1) может составлять от 0 до примерно 10% масс. смеси; линолевая кислота (18:2) может составлять от 0 до примерно 5% масс. смеси; линоленовая кислота (18:3) может составлять от 0 до примерно 1% масс. смеси; арахидоновая кислота (20:0) может составлять от 0 до примерно 3% масс. смеси; бегеновая кислота (22:0) может составлять от 0 до примерно 3% масс. смеси; эруковая кислота (22:1) может составлять от 0 до примерно 5% масс. смеси и лигноцериновая кислота (24:0) может составлять от 0 до примерно 3% масс. смеси.
В некоторых воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению триглицериды масел или жирных кислот превращаются в алкиловые эфиры жирных кислот. В конкретных воплощениях алкиловые эфиры представляют собой метиловые эфиры, этиловые эфиры, пропиловые эфиры, изопропиловые эфиры или бутиловые эфиры. В предпочтительных воплощениях алкиловые эфиры представляют собой метиловые эфиры.
В одном воплощении изобретения предложена смесь алкиловых эфиров жирных кислот, содержащая по меньшей мере 50% масс. алкиловых эфиров насыщенных жирных кислот, содержащих 6-14 атомов углерода, алкилового эфира миристоленовой кислоты и алкиловых эфиров мононенасыщенных жирных кислот, содержащих более 14 атомов углерода, менее 10% масс. алкилового эфира миристиновой кислоты и алкиловых эфиров насыщенных жирных кислот, содержащих более 18 атомов углерода; и где: 1) указанные алкиловые эфиры жирных кислот содержат алкиловый эфир лауриновой кислоты (С12:0), и где указанный алкиловый эфир лауриновой кислоты составляет от 5% до 20% масс. от массы смеси; или 2) где указанная смесь содержит от 15% до 40% алкиловых эфиров жирных кислот, содержащих 6-14 атомов углерода и от 60% до 85% алкиловых эфиров мононенасыщенных жирных кислот, содержащих более 18 атомов углерода.
В более конкретном воплощении указанная непосредственно выше смесь содержит по меньшей мере 50% масс. алкиловых эфиров насыщенных жирных кислот, содержащих 8-12 атомов углерода, алкилового эфира миристоленовой кислоты и алкиловых эфиров мононенасыщенных жирных кислот, содержащих более 14 атомов углерода.
В некоторых воплощениях смесей масел по изобретению эти масла получают из растительных масел или животных жиров. В предпочтительных воплощениях масло выбирают из группы, состоящей из канолы, рапсового масла, пальмового масла, пальмоядерного, кокосового, тукумы, подсолнечного, сафлорового, куфеи, оливкового, макадамии, бабассу, касторового, арахисового, хлопкового, льняного, масла из льняного семени, кохунового и масла ятрофы. В некоторых воплощениях смесей масел по изобретению эти масла получают из генетически модифицированного растения. В конкретных воплощениях масло получают из генетически модифицированного растения, где растение было модифицировано так, чтобы оно продуцировало увеличенное количество среднецепочечных жирных кислот по сравнению с нативным растением. В дополнительных воплощениях одно или более масло из нативного растения или растений может быть смешано с одним или более маслом, полученным из генетически модифицированных растений.
В некоторых воплощениях смесей масел или жирных кислот по изобретению масляная смесь или жирнокислотная смесь пригодна в качестве топлива для двигателя внутреннего сгорания. В других воплощениях масляную смесь или смесь жирных кислот используют в качестве сырья в получении присадки к топливу, функциональной жидкости, антифризной присадки к топливу, биодизельного топлива, авиационного топлива, топлива для обогрева дома или заменителя керосина.
В родственном аспекте изобретение включает смеси алкиловых эфиров жирных кислот, где по меньшей мере 50% алкиловых эфиров жирных кислот представляют собой алкиловые эфиры среднецепочечных жирных кислот и менее 20% представляют собой алкиловые эфиры длинноцепочечных жирных кислот.
В конкретных воплощениях смесей алкиловых эфиров жирных кислот по изобретению такие смеси включают по меньшей мере 60% алкиловых эфиров среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 65% алкиловых эфиров среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 70% алкиловых эфиров среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 75% алкиловых эфиров среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 80% алкиловых эфиров среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 85% алкиловых эфиров среднецепочечных жирных кислот, предпочтительно по меньшей мере 90% алкиловых эфиров среднецепочечных жирных кислот или предпочтительно по меньшей мере 95% алкиловых эфиров среднецепочечных жирных кислот.
В других воплощениях смесей алкиловых эфиров жирных кислот по изобретению эти смеси включают менее 15% алкиловых эфиров длинноцепочечных жирных кислот, предпочтительно менее 10% алкиловых эфиров длинноцепочечных жирных кислот, предпочтительно менее 7% алкиловых эфиров длинноцепочечных жирных кислот, предпочтительно менее 5% алкиловых эфиров длинноцепочечных жирных кислот или предпочтительно менее 3% алкиловых эфиров длинноцепочечных жирных кислот.
В других воплощениях смесей алкиловых эфиров жирных кислот по изобретению эти смеси включают менее 15% алкиловых эфиров мононенасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 10% алкиловых эфиров мононенасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 7% алкиловых эфиров мононенасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 5% алкиловых эфиров мононенасыщенных жирных кислот, или предпочтительно менее 2% алкиловых эфиров мононенасыщенных жирных кислот.
В других воплощениях смесей алкиловых эфиров жирных кислот по изобретению эти смеси включают менее 10% алкиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 7% алкиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 5% алкиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно менее 3% алкиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот или предпочтительно менее 1% алкиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот.
В конкретных воплощениях смесей алкиловых эфиров жирных кислот по изобретению алкиловые эфиры жирных кислот выбирают из группы, состоящей из метиловых эфиров, этиловых эфиров, пропиловых эфиров и бутиловых эфиров. В других воплощениях алкиловые эфиры жирных кислот выбирают из группы, состоящей из изопропилового эфира, трет-бутилового эфира или вторичного бутилового эфира. В предпочтительных воплощениях алкиловые эфиры жирных кислот представляют собой метиловые эфиры. В некоторых воплощениях метиловый эфир капроновой кислоты (6:0) может составлять 0 до примерно 5% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир каприловой кислоты (8:0) может составлять от примерно 5 до примерно 35%, или от примерно 10 до примерно 30%, или от примерно 15 до примерно 25% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир каприновой кислоты (10:0) может составлять от примерно 20 до примерно 60%, или от примерно 30 до примерно 50%, или от примерно 40 до примерно 50% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир лауриновой кислоты (12:0) может составлять от примерно 5 до примерно 30%, или от примерно 10 до примерно 30%, или от примерно 15 до примерно 25% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир миристиновой кислоты (14:0) может составлять от 0 до примерно 5% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир пальмитиновой кислоты (16:0) может составлять от 0 до примерно 5% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир пальмитолеиновой кислоты (16:1) может составлять от 0 до примерно 10% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир стеариновой кислоты (18:0) может составлять от 0 до примерно 5% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир олеиновой кислоты (18:1) может составлять от 0 до примерно 10% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир линолевой кислоты (18:2) может составлять от 0 до примерно 5% по массе от общей смеси метиловых эфира жирных кислот; метиловый эфир линоленовой кислоты (18:3) может составлять от 0 до примерно 1% по массе от общей смеси метилового эфира жирных кислот; метиловый эфир арахидоновой кислоты (20:0) может составлять от 0 до примерно 3% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир бегеновой кислоты (22:0) может составлять от 0 до примерно 3% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; метиловый эфир эруковой кислоты (22:1) может составлять от 0 до примерно 5% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот; и метиловый эфир лигноцериновой кислоты (24:0) может составлять от 0 до примерно 3% по массе от общей смеси метиловых эфиров жирных кислот.
В дополнительных воплощениях вышеуказанных аспектов по изобретению смеси масел, или жирных кислот, или алкиловых эфиров жирных кислот имеют точку плавления менее или равную 0°С, предпочтительно менее или равную -10°С, предпочтительно менее или равную -15°С, предпочтительно менее или равную -20°С или предпочтительно менее или равную -25°С.
В дополнительных воплощениях вышеуказанных аспектов по изобретению смеси масел, или жирных кислот, или алкиловых эфиров жирных кислот имеют точку помутнения менее или равную 0°С, предпочтительно менее или равную -10°С, предпочтительно менее или равную -15°С, предпочтительно менее или равную -20°С или предпочтительно менее или равную -25°С.
В дополнительных воплощениях вышеуказанных аспектов по изобретению смеси масел, или жирных кислот, или алкиловых эфиров жирных кислот имеют точку застывания менее или равную 0°С, предпочтительно менее или равную -10°С, предпочтительно менее или равную -15°С, предпочтительно менее или равную -20°С или предпочтительно менее или равную -25°С.
В некоторых воплощениях вышеуказанных аспектов изобретения смеси масел, или жирных кислот, или алкиловых эфиров жирных кислот пригодны для применения в качестве топлива в двигателе внутреннего сгорания, в качестве топливной присадки, функциональных жидкостей, антифризной присадки к топливу, топлива для отопления домов, авиационного или реактивного топлива или заменителя керосина.
Выражение "пригодный для применения в двигателе внутреннего сгорания" относится к свойствам топлива, которые позволяют применять его для приведения в действие двигателя внутреннего сгорания. В некоторых воплощениях пригодное топливо имеет цетановое число 40-100; 40-80; или предпочтительно 40-70; или предпочтительно 40-60; или предпочтительно 40-55; или предпочтительно 40-50. В других воплощениях пригодное топливо имеет йодное число 20-130; предпочтительно 40-100; предпочтительно 20-50, или предпочтительно 10-20. В дополнительных воплощениях пригодное топливо имеет точку плавления менее или равную 0°С, предпочтительно менее или равную -10°С, предпочтительно менее или равную -15°С, предпочтительно менее или равную -20°С, или предпочтительно менее или равную -25°С. В других воплощениях пригодное топливо имеет точку помутнения менее или равную 0°С, предпочтительно менее или равную -10°С, предпочтительно менее или равную -15°С, предпочтительно менее или равную -20°С или предпочтительно менее или равную -25°С. В еще одних воплощениях пригодное топливо имеет точку застывания менее или равную 0°С, предпочтительно менее или равную -10°С, предпочтительно менее или равную -15°С, предпочтительно менее или равную -20°С или предпочтительно менее или равную - 25°С.
В других воплощениях вышеуказанного аспекта изобретения смеси жирных кислот или алкиловых эфиров жирных кислот используют в качестве биодизельного топлива и смешивают с дизельным топливом на нефтяной основе с образованием биодизельной смеси для использования в качестве топлива. В конкретных воплощениях биодизельное топливо содержит 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% или даже 75% биодизельной смеси, с дизельным топливом на нефтяной основе, составляющим оставшуюся часть. Американское общество испытаний и материалов (ASTM) различает два сорта дизельного топлива, дизельное топливо №1 и дизельное топливо №2. В конкретных воплощениях биодизельное топливо смешивают с дизельным топливом №1, дизельным топливом №2 или смешивают со смесью дизельных топлив №1 и №2.
В еще одном аспекте изобретение включает генетически измененное растение, где это растение экспрессирует один или более модифицированный фермент, имеющий одну или более мутацию, такую, что растение продуцирует увеличенные количества среднецепочечных жирных кислот по сравнению с нативным растением. В предпочтительных воплощениях генетически измененное растение предпочтительно продуцирует среднецепочечные жирные кислоты, имеющие 8, 10 или 12 атомов углерода. При использовании в данном описании изобретения термин "предпочтительно продуцирует среднецепочечные жирные кислоты, имеющие 8, 10 или 12 атомов углерода" означает, что по меньшей мере 50% по массе жирных кислот, производимых генетически измененным растением, представляют собой среднецепочечные жирные кислоты, имеющие 8, 10 или 12 атомов углерода; более предпочтительно по меньшей мере 60%; более предпочтительно по меньшей мере 70%; более предпочтительно по меньшей мере 75%; более предпочтительно по меньшей мере 80%; более предпочтительно по меньшей мере 85%; более предпочтительно по меньшей мере 90%; более предпочтительно по меньшей мере 95%; более предпочтительно по меньшей мере 98% по массе жирных кислот, произведенных генетически измененным растением, представляют собой среднецепочечные жирные кислоты, имеющие 8, 10 или 12 атомов углерода.
В предпочтительных воплощениях вышеуказанного аспекта изобретения генетически измененное растение происходит от растения, которое, в его нативном состоянии, продуцирует масло, имеющее более 40% длинноцепочечных жирных кислот. В некоторых воплощениях генетически измененное растение получают из нативного ратения, которое не является видами Cuphea. Cuphea имеет определенные особенности, которые могут являться недостатками в некоторых воплощениях изобретения. Например, "зародышевая плазма дикого типа Cuphea разрушается и, вследствие этого, не может культивироваться в промышленных масштабах" (Knapp et al. "Modifying the seed storage of lipids of Cuphea: A source of medium chain triglycerides." In Seed Oils for the Future, 142-154, Champaign, 111, AOCS Press). Кроме того, "оно не переносит заморозки, семена легко осыпаются, цветение непрогнозируемо, и стебли, листья и цветы покрывают липкие эластичные волоски… [и] прорастание медленное (14-20 дней)" (Ag Innovation News, Jul-Sept. 2003, Vol.12, №3). Кроме того, получение достаточных количеств масла из Cuphea может затруднить возможность продуцировать достаточные количества масла, чтобы сделать Cuphea коммерчески полезной. Однако в некоторых воплощениях некоторые другие особенности Cuphea могут обеспечить благоприятное для модификации растение. Например, " растения растут быстро, и семена созревают всего за шесть недель, что делает их идеальными для умеренного климата с коротким вегетационным периодом" (Ag Innovation News, Jul-Sept. 2003, Vol.12, №3). Соответственно, в некоторых воплощениях предложено генетически измененное растение Cuphea, которое продуцирует смесь масел, как раскрыто в данном описании изобретения.
В некоторых воплощениях вышеуказанного аспекта изобретения растение, экспрессирующее модифицированный фермент, представляет собой растение, которое выбирают из группы, состоящей из рапса, хлопчатника, льна, арахиса, пальмы, сафлоры, сои, подсолнечника, клещевины и кукурузы. В предпочтительных воплощениях растение представляет собой сою, более предпочтительно пальму, или более предпочтительно клещевину, или более предпочтительно рапс. В конкретных воплощениях растение представляет собой виды рапса, предпочтительно Brassica napus, Brassica juncea, Brassica rapa, Brassica oteracea, Brassica nigra, Brassica carinata и Sinapis alba (Brassica alba Rabenh.).
В предпочтительных воплощениях вышеуказанного аспекта изобретения включенную мутацию вводят в фермент, применяя олигонуклеооснование генной репарации, содержащее данную мутацию.
Нуклеооснование содержит основание, которое представляет собой пурин, пиримидин или их производное или аналог. Нуклеозиды представляют собой нуклеооснования, которые содержат пентозафуранозильную группировку, например возможно замещенный рибозид или 2'-дезксирибозид. Нуклеозиды могут быть соединены одной из несколькими связывающими молекулами, которые могут содержать или могут не содержать фосфор. Нуклеозиды, которые соединены незамещенными фосфодиэфирными связями, называются нуклеотидами. При применении в данном описании изобретения "нуклеооснования" включают пептидные нуклеооснования, субъединицы пептидных нуклеиновых кислот и морфолиновые нуклеооснования, а также нуклеозиды и нуклеотиды.
Олигонуклеооснование представляет собой полимер из нуклеооснований, который может гибридизоваться посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику с ДНК, имеющей комплементарную последовательность. Олигонуклеоосновная цепь имеет одиночные 5- и 3'-концы, которые представляют собой крайние нуклеиновые основания полимера. Конкретная цепь олигонуклеооснований может содержать нуклеооснования всех типов. Олигонуклеооснование представляет собой соединение, содержащее одну или более олигонуклеотидных цепей, которые являются комплементарными и гибридизованы спариванием оснований по Уотсону-Крику. Нуклеооснования являются либо дезоксирибо-типом, так и рибо-типом. Нуклеиновые основания рибо-типа представляют собой пентозафуранозил, содержащий нуклеиновые основания, где 2' атом углерода представляет собой метилен, замещенный гидроксилом, алкилокси или галогеном. Нуклеооснования дезоксирибо-типа представляют собой нуклеооснования, отличные от нуклеооснований рибо-типа, и включают все нуклеооснования, которые не содержат группировку пентозафуранозил.
Нити олигонуклеооснований в общем случае включают как цепи олигонуклеооснований, так и сегменты или участки цепей олигонуклеооснований. Нить олигонуклеооснований имеет 3'-конец и 5'-конец. Если нить олигонуклеооснований имеет одинаковую протяженность с цепью, то 3'- и 5-концы нити также представляют собой 3'- и 5'- концы цепи.
Термин "олигонуклеооснование генной репарации" применяют в данном описании изобретения к обозначению олигонуклеооснований, включающих смешанные дуплексы олигонуклеотидов, молекул, содержащих ненуклеотиды, одноцепочечные олигодезоксинуклеотиды и другие молекулы генной репарации, как подробно описано ниже.
В дополнительных воплощениях вышеуказанного аспекта изобретения фермент, который модифицируют, представляет собой ацил-АСР-тиоэстеразу. В некоторых воплощениях модифицированная ацил-АСР-тиоэстераза находится в растении, выбранном из группы, состоящей из рапса, хлопчатника, льна, арахиса, пальмы, сафлора, сои, подсолнечника, клещевины и кукурузы. В предпочтительных воплощениях модифицированная ацил-АСР-тиоэстераза находится в различных семенах рапса, предпочтительно Brassica napus, Brassica juncea, Brassica rapa, Brassica oleracea, Brassica nigra, Brassica carinata, Sinapis alba (Brassica alba Rabenh.), предпочтительно Brassica napus. В конкретных воплощениях одна или более мутаций включены в участок, соответствущий аминокислотным остаткам 91-397 из SEQ ID NO:2; предпочтительно одна или более предусмотренная мутацию включена в участок, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных остатков 128-147 из SEQ ID NO:2, аминокислотных остатков 175-206 из SEQ ID NO:2, аминокислотных остатков 254-297 из SEQ ID NO:2, аминокислотных остатков 333-335 из SEQ ID NO:2 или аминокислотных остатков 365-397 из SEQ ID NO:2. В некоторых предпочтительных воплощениях ацил-АСР-тиоэстераза представляет собой пальмитоил-АСР-тиоэстеразу (РТЕ).
В других воплощениях вышеуказанного аспекта изобретения фермент, который модифицируют, представляет собой кетоацилсинтазу (KAS). В конкретных воплощениях фермент KAS может быть модифицирован так, что его активность понижена или аннулирована. В других воплощениях фермент KAS модифицируют таким образом, что его субстратная селективноть изменена. В предпочтительных воплощениях фермент KAS представляет собой KAS II, и одна или более мутация присутствует в положениях участка, соответствующего аминокислотным остаткам 328-385. В предпочтительных воплощениях одна или более мутация присутствует в участке, соответствующем аминокислотным остаткам 325-352 из SEQ ID NO:3 или аминокислотным остаткам 355-385 из SEQ ID NO:3. В более предпочтительных воплощениях одна или более мутация присутствует в участке, соответствующем аминокислотным остаткам 325-340 из SEQ ID NO:3, или даже аминокислотным остаткам 331-337 из SEQ ID NO:3. В некоторых воплощениях аминокислота, соответствующая консервативному остатку лейцина в положении 337 из SEQ ID NO:3, подвергнута мутации.
В еще одном аспекте изобретения предложены трансгенные растения, содержащие два экспрессируемых трансгена, кодирующие ацил-АСР-тиоэстеразы, где каждая тиоэстераза имеет активность в отношении среднецепочечных жирных кислот, имеющих различную длину. Таким образом, такое трансгенное растение будет экспрессировать обе тиоэстеразы и продуцировать смесь среднецепочечных жирных кислот.
9
9-
9
9-
9
9
В некоторых воплощениях фермент, который модифицируют, представляет собой Δ-стеароил-ацил-АСР-десатуразу. В предпочтительных воплощениях увеличена активность или экспрессия Δстеароил-ацил-АСР-десатуразы. В предпочтительных воплощениях увеличение активности Δ-стеароил-ацил-АСР-десатуразы в генетически модифицированном растении приводит к генетически модифицированному растению, продуцирующему повышенные уровни С16:1 и/или С18:1; и/или пониженные уровни С16:0 и/или пониженные уровни С18:0 по сравнению с нативным растением. В некоторых предпочтительных воплощениях ген Δстеароил-ацил-АСР-десатуразы модифицируют так, что генетически модифицированное растение продуцирует повышенные уровни С16:1. В некоторых воплощениях ген Δ-стеароил-ацил-АСР-десатуразы модифицируют так, что он демонстрирует повышенную активность пальмитоил-АСР; или в генетически модифицированном растении, представляющем собой хлопчатник, лен, арахис, пальму, сафлору, сою, подсолнечник, Cuphea, клещевину или кукурузу, и повышенное продуцирование С16:0 достигается посредством трансформации семени рапса геном Δ-стеароил-ацил-АСР из макадамии (Macadamia integrifolia), облепихи (Hippophae rhamnoides) или кошачьего когтя (Doxantha unguis-catï).
В некоторых воплощениях фермент, который модифицируют, представляет собой Δ12-десатуразу (кодируемую геном FAD2). В предпочтительных воплощениях активность или экспрессию Δ12-десатуразы подавляют или ослабляют. В предпочтительных воплощениях подавление или ослабление активности или экспрессии Δ12-десатуразы в генетически модифицированном растении вызывает продуцирование генетически модифицированным растением пониженных уровней С18:2 и/или С18:3 и повышенных уровней С18:1 по сравнению с нативным растением.
В некоторых воплощениях вышеуказанного аспекта первая ацил-АСР-тиоэстераза, обладающая активностью в отношении С8 и С10 жирнокислотных ацил-АСР-субстратов, и экспрессируемый трансген, кодирующий вторую ацил-АСР-тиоэстеразу, обладающую активностью в отношении С12 жирнокислотных ацил-АСР-субстратов. В конкретном воплощении первая ацил-АСР-тиоэстераза происходит из видов Cuphea и вторая ацил-АСР-тиоэстераза происходит из видов Ulmus.
В некоторых аспектах изобретения предложено генетически модифицированное растение, которое генетически модифицировано так, чтобы производить масло, имеющее смесь жирных кислот, описанную в данном описании изобретения. Например, в некоторых предпочтительных воплощениях предлагается растение, которое продуцирует смесь жирных кислот, где насыщенные жирные кислоты, имеющие 8-12 атомов углерода, и мононенасыщенные жирные кислоты, имеющие 12-18 атомов углерода, составляют 80-100% смеси, каприловая кислота (С8:0) и каприновая кислота (С10:0) составляют 5-80% смеси, лауриновая кислота составляет менее 20% смеси, и полиненасыщеные жирные кислоты и насыщенные жирные кислоты, имеющие более 12 атомов углерода, взятые вместе, составляют менее 20% смеси. В некоторых предпочтительных воплощениях генетически модифицированного растения это растение продуцирует вышеуказанную смесь жирных кислот, где каприловая кислота (С8:0), каприновая кислота (С10:0) и лауриновая кислота (С12:0), взятые вместе, составляют 20-40% смеси; предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-20% смеси, более предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-10% смеси; и олеиновая кислота (С18:1) и пальмитолеиновая кислота (16:1), взятые вместе, составляют 50-85% смеси. В некоторых предпочтительных воплощениях генетически модифицированного растения это растение продуцирует вышеуказанную смесь жирных кислот, где каприловая кислота (С8:0), каприновая кислота (С10:0) и лауриновая кислота (С12:0), взятые вместе, составляют 60-85% смеси; предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-20% смеси, более предпочтительно лауриновая кислота (С12:0) составляет 6-10% смеси; и олеиновая кислота (С18:1) и пальмитолеиновая кислота (16:1), взятые вместе, составляют 20-40% смеси. В некотором особенно предпочтительном воплощении предложено генетически модифицированное растение, которое продуцирует масло, имеющее примерно 10% С8; примерно 20% С10; примерно 10% С12; и примерно 60% С16:1 и/или С18:1. В другом, особенно предпочтительном воплощении предложено генетически модифицированное растение, которое продуцирует масло, имеющее примерно 5% С8; примерно 5% С10; примерно 15% С12; примерно 70% С16:1 и/или С18:1 и примерно 1% или менее для каждой С14:0, С16:0, С18:0, С18:2 и С18:3.
В некоторых воплощениях вышеуказанных аспектов изобретения генетически модифицированное растение получают из растения, выбранного из группы, состоящей из семян рапса, хлопчатника, льна, арахиса, Cuphea, сафлора, сои, подсолнечника, клещевины и кукурузы. В конкретних воплощениях растение представляет собой разновидность семян рапса, предпочтительно Brassica napus, Brassica juncea, Brassica rapa, Brassica oleracea, Brassica nigra, Brassica carinata и Sinapis alba (Brassica alba Rabenh).
В некоторых особенно предпочтительных воплощениях вышеуказанных аспектов генетически модифицированное растение представляет собой генетически измененное растение; в других предпочтительных воплощениях генетически модифицированное растение представляет собой трансгенное растение. Дополнительные воплощения представляют собой растение, которое включает и трансгенные, и генетические изменения.
В одном воплощении генетически модифицированное растение модифицируют таким образом, что это генетически модифицированное растение продуцирует повышенные уровни среднецепочечных жирных кислот (предпочтительно повышенные уровни С8:0, С10:0 и С12:0 в соответствии с предпочтительными смесям жирных кислот, предложенным в данном изобретении) и/или пониженные уровни пальмитиновой кислоты (С16:0) и/или пониженные уровни С18:0. В других предпочтительных воплощениях генетически модифицированное растение модифицируют таким образом, что оно продуцирует повышенные уровни мононенасыщенных жирных кислот, предпочтительно повышенные уровни С16:1 и С18:1 мононенасыщенных жирных кислот; и продуцирует более низкие уровни насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно более низкие уровни С16:0, С18:0, С18:2 и/или С18:3. В особенно предпочтительных воплощениях генетически модифицированное растение модифицируют для продуцирования повышенных уровней среднецепочечных жирных кислот (предпочтительно повышенные уровни С8:0, С10:0 и/или С12:0); пониженных уровней С16:0 и С18:0 и повышенных уровней С16:1 и С18:1.
В одном особенно предпочтительном воплощении вышеуказанных аспектов предложено рапсовое растение, которое генетически модифицировано, чтобы продуцировать масло, имеющее смесь жирных кислот, предложенную в данном описании изобретения. В некоторых предпочтительных воплощениях генетически модифицированное рапсовое растение модифицируют так, что, относительно нативного рапсового растения, генетически модифицированное рапсовое растение продуцирует повышенные уровни среднецепочечных жирных кислот (предпочтительно повышенные уровни С8:0, С10:0 и С12:0 в соответствии со смесям жирных кислот, предлагаемыми в данном изобретении) и/или пониженные уровни пальмитиновой кислоты (С16:0) и/или пониженные уровни С18:0. В других предпочтительных воплощениях генетически модифицированное рапсовое растение модифицируют так, что относительно нативного рапосового растения генетически модифицированное рапсовое растение продуцирует повышенные уровни мононенасыщенных жирных кислот, предпочтительно повышенные уровни С16:1 и С18:1 мононенасыщенных жирных кислот, и продуцирует более низкие уровни насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно более низкие уровни С16:0, С18:0, С18:2 и С18:3. В особенно предпочтительных воплощениях генетически модифицированное рапсовое растение модифицируют для получения повышенных уровней среднецепочечных жирных кислот (предпочтительно повышенные уровни С8:0, С10:0 и/или С12:0); пониженных уровней С16:0 и С18:0 и повышенных уровней С16:1 и/или С18:1.
В еще одном особенно предпочтительном воплощении вышеуказанных аспектов предложено соевое растение, которое генетически модифицировано для продуцирования масла, имеющего смесь жирных кислот, предложенную в данном изобретении. В некоторых предпочтительных воплощениях генетически модифицированное соевое растение модифицируют так, что, относительно нативного соевого растения, генетически модифицированное соевое растение продуцирует повышенные уровни среднецепочечных жирных кислот (предпочтительно повышенные уровни С8:0, С10:0 и С12:0 в соответствии с жирнокислотным смесям, предлагаемым в данном изобретении), и/или пониженные уровни пальмитиновой кислоты (С16:0), и/или пониженные уровни С18:0. В Других предпочтительных воплощениях генетически модифицированное соевое растение модифицируют так, что, относительно нативного соевого растения, генетически модифицированное соевое растение продуцирует повышенные уровни мононенасыщенных жирных кислот, предпочтительно повышенные уровни С16:1 и С18:1 мононенасыщенных жирных кислот, и продуцирует более низкие уровни насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот, предпочтительно более низкие уровни С16:0, С18:0, С18:2 и С18:3. В особенно предпочтительных воплощениях генетически модифицированное соевое растение модифицируют для продуцирования повышенных уровней среднецепочечных жирных кислот (предпочтительно повышенных уровней С8:0, С10:0 и/или С12:0); пониженных уровней С16:0 и С18:0 и повышенных уровней С16:1 и/или С18:1.
В дополнительных воплощениях вышеуказанных аспектов изобретения предложены семена для получения генетически измененных или трансгенных растений.
В других воплощениях вышеуказанных аспектов изобретения предложены масла или смеси жирных кислот, экстрагированные из семян, плодов или листьев вышеуказанных генетически измененных или трансгенных растений.
В еще одном аспекте изобретения предложены способы получения биодизельного топлива из масла, полученного из измененного растения или трансгенного растения. В некоторых воплощениях масло из генетически измененного растения или трансгенного растения используют только в качестве масла в изготовлении биодизельного топлива. В других воплощениях масло из генетически измененного растения смешивают с маслом из нативного растения, трансгенного растения или с обоими, и используют в изготовлении биодизельного топлива. В конкретных воплощениях масло получают из генетически измененного растения, в которое введена одна или более чем одна мутация, с использованием олигонуклеооснований генной репарации, такие масла можно использовать самостоятельно или в комбинации с одним или более маслами, полученными из трансгенного растения, или нативного растения, или другого генетически измененного растения. В некоторых воплощениях способ включает трансэтерификацию масла, экстрагированного из семян, фруктов или листьев одного или более генетически измененного растения или трансгенных растений, смешанного с маслом, полученным из одного или более нативного растения, для получения биодизельного топлива, содержащего алкиловые эфиры жирных кислот. В некоторых воплощениях трансэтерификацию осуществляют путем взаимодействия указанного масла со спиртом и основным катализатором. В дополнительных воплощениях способ дополнительно включает очистку алкиловых эфиров жирных кислот, такая очистка может включать удаление катализатора, глицерина и воды.
В других воплощениях масло из трансгенного растения смешивают с одним или более маслом из генетически измененного растения, нативного растения или их обоих, и используют в изготовлении биодизельного топлива. В конкретных воплощениях трансгенное растение экспрессирует один или более чем один трансген. В конкретных воплощениях трансген экспрессирует белок, который изменяет содержание среднецепочечных жирных кислот, продуцированных растением. В предпочтительных воплощениях трансгенное растение продуцирует более высокие количества среднецепочечных жирных кислот, чем нативное растение. В более предпочтительных воплощениях трансгенное растение предпочтительно продуцирует среднецепочечные жирные кислоты, имеющие 8, 10 или 12 атомов углерода. В более предпочтительных воплощениях трансгенное растение продуцирует масло, имеющее менее длинные цепочки жирных кислот, чем нативное растение.
X
X
X
X
В еще одном аспекте изобретения предложен способ прогнозирования теоретической точки плавления смеси метиловых эфиров жирных кислот. Такой способ вычисляет суммарное содержание продукта из: процента (масс./масс.) конкретного метилового эфира жирных кислот (X), точки плавления этого эфира (MP), и фактора (F) для каждого ME (метилового эфира) жирной кислоты, содержащейся в этой смеси. Таким образом, существует выражение для каждого метилового эфира, соответствующее, например, (X*MP*F). Численные определения точек плавления и факторов, используемых в способе, могут варьироваться и все же давать достоверную промежуточную величину. Термин "фактор", как он используется в данном описании изобретения, относится к постоянной величине, соответствующей метиловому эфиру жирных кислот. Фактор умножают на процентное содержание данного ME жирных кислот и точку плавления данного ME жирных кислот с получением выражения для того ME жирных кислот, который используют в способе. Например, индивидуальные точки плавления могут отличаться на плюс или минус 2°С, или 5°С, или даже 10°С, и индивидуальные факторы могут отличаться на 5%, или 10%, или даже 20%, и все же дают достоверную прогнозируемую температуру плавления смеси.
Tm
В некоторых воплощениях предлагается способ вычисления точки плавления смеси, где прогнозируемую точку плавления, P, рассчитывают следующим образом:
Tm
A
A
B
B
C
C
D
D
E
E
F
F
G
G
H
H
I
I
J
J
K
K
L
L
M
M
P=[(A*MP*F)+(B*MP*F)+(C*MP*F)+(D*MP*F)+(E*MP*F)+(F*MP*F)+(G*MP*F)+(H*MP*F)+(I*M,*F,)+(J*MP*F)+(K*MP*F)+(L*MP*F)+(М*MP*F]*(0,01),
где А представляет собой процент (масс./масс.) ME капроновой кислоты (6:0) в смеси;
В представляет собой процент (масс./масс.) ME каприловой кислоты (8:0) в смеси;
С представляет собой процент (масс./масс.) ME каприновой кислоты (10:0) в смеси;
D представляет собой процент (масс./масс.) ME лауриновой кислоты (12:0) в смеси;
Е представляет собой процент (масс./масс.) ME миристиновой кислоты (14:0) в смеси;
F представляет собой процент (масс./масс.) ME пальмитиновой кислоты (16:0) в смеси;
G представляет собой процент (масс./масс.) ME стеариновой кислоты (18:0) в смеси;
Н представляет собой процент (масс./масс.) ME олеиновой кислоты (18:1) в смеси;
I представляет собой процент (масс./масс.) ME линолевой кислоты (18:2) в смеси;
J представляет собой процент (масс./масс.) ME линоленовой кислоты (18:3) в смеси;
К представляет собой процент (масс./масс.) ME арахидоновой кислоты (20:0) в смеси;
L представляет собой процент (масс./масс.) ME бегеновой кислоты (22:0) в смеси;
М представляет собой процент (масс./масс.) ME лигноцериновой кислоты (24:0) в смеси;
A
MP составляет от -81°С до -61°С включительно;
B
MP составляет от -50°С до -30°С включительно;
C
MP составляет от -28°С до -8°С включительно;
D
MP составляет от -5°С до 15°С включительно;
E
MP составляет от 9°С до 29°С включительно;
F
MP составляет от 21°С до 41°С включительно;
G
MP составляет от 28°С до 48°С включительно;
H
MP составляет от -30°С до -10°С включительно;
I
MP составляет от -45°С до -25°С включительно;
J
MP составляет от -67°С до -47°С включительно;
K
MP составляет от 45°С до 65°С включительно;
L
MP составляет от 43°С до 63°С включительно;
M
MP составляет от 48°С до 68°С включительно;
A
F составляет 8-12 включительно;
B
F составляет 3,5-5,5 включительно;
C
F составляет 1,0-1,4 включительно;
D
F составляет 0,8-1,2 включительно;
E
F составляет 0,5-0,7 включительно;
F
F составляет 1,1-1,6 включительно;
G
F составляет 1,8-2,6 включительно;
H
F составляет 0,9-1,3 включительно;
I
F составляет 0,5-0,8 включительно;
J
F составляет 0,15-0,25 включительно;
K
F составляет 8-12 включительно;
L
F составляет 1,6-2,4 включительно;
M
F составляет 1,6-2,4 включительно.
В конкретном воплощении вышеуказанного аспекта изобретения прогнозируемую точку плавления рассчитывают следующим образом:
Tm
P=[А(-71,0)(10,0)+В(-40,0)(4,5)+С(-18,0)(1,2)+D(5,2)(1,0)+Е(19,0)(0,60)+F(30,7)(1,35)+G(37,8)(2,15)+Н(-19,9)(1,10)+1(-35,0)(0,65)+J(-57)(0,2)+К(54,5)(10,0)+L(53,0)(2,0)+М(57,4)(2,0)]*(0,01), и А-М определены, как изложено выше.
Tm
В родственном воплощении вышеуказанного аспекта применяют алгоритм для идентификации смесей метиловых эфиров жирных кислот, которые пригодны для применения в качестве биодизельного топлива, где рассчитывают прогнозируемую точку плавления смеси и сравнивают с пороговой величиной. "Пороговая величина" при использовании в данном описании изобретения относится к нужной точке плавления, где смеси, имеющие P меньше или равную этой нужной точке плавления, пригодны для применения в качестве биодизельного топлива. В конкретных воплощениях пороговая величина составляет 0°С, предпочтительно -5°С, предпочтительно -10°С, предпочтительно -15°С, предпочтительно -20°С, предпочтительно 0°С, или предпочтительно -20°С.
Термин "процент по массе" при использовании в данном описании изобретения относится к количеству компонента в смеси. Как правило, он относится к граммам компонента на 100 граммов смеси. Например, смесь, имеющая "10% по массе соединения X" относится к 10 граммам соединения Х в 100 граммах смеси.
Термин "биодизельное топливо" при использовании в данном описании изобретения относится к топливу, полученному из растительного масла или животного жира. Как правило, биодизельное топливо состоит главным образом из алкиловых эфиров жирных кислот. Предпочтительно биодизельное топливо пригодно для применения в двигателе внутреннего сгорания.
Термин "биодизельная смесь" относится к топливу, которое представляет собой смесь биодизельного топлива и другого топлива. Как правило, биодизельные топлива смешивают с нефтяным топливом (то есть с нефтедизельным топливом). Биодизельные смеси называют ВХХ. "XX" указывает количество биодизельного топлива в смеси. В100 представляет собой 100% биодизельное топливо или "чистое " биодизельное топливо. Смесь В20, например, представляет собой 20% объемную смесь биодизельного топлива с 80% нефтедизельного топлива.
Термин "топливо" относится к веществу, которое сжигают для получения тепла или энергии. Примеры включают жидкости, такие как бензин, масло доя обогрева домов, авиационный бензин, керосин, дизельное топливо, биодизельное топливо, растительное масло и биодизельные смеси. Некоторые виды топлива, например бензин, дизельное топливо, биодизельное топливо, растительное масло или биодизельные смеси, можно использовать для приведения в действие двигателя внутреннего сгорания.
Выражение "генетически модифицированное растение" относится к трансгенному растению или генетически измененному растению.
Термин "нативное растение" при использовании в данном описании изобретения относится к растению, которое не является генетически модифицированным (то есть трансгенным или генетически измененным). Нативные растения включают растения дикого типа, а также растения, которые селективно вывели для получения конкретных параметров.
Выражение "трансгенное растение" относится к растению, имеющему ген других растительных видов или нерастительных видов. Такой ген может быть назван "трансгеном."
Выражение "генетически измененное растение" относится к растению, имеющему одну или более генетическую модификацию, такую как трансгены и/или модифицированные ферменты, которые содержат одну или более сконструированную мутацию(и). Такие сконструированные мутации приводят к модифицированному ферменту, имеющему активность, отличную от активности нативного фермента. Такие отличия могут включать отличия в субстратной специфичности или в уровне активности. При использовании в данном описании изобретения "трансгенное растение" представляет собой один тип "генетически измененного растения".
Выражение "присадка к топливу" относится к жидкому веществу, которое добавляют к топливу, и составляющему менее 5% масс. конечного топлива.
Выражения "смесь жирных кислот" или "жирнокислотная смесь" можно использовать взаимозаменяемо и они относятся к композиции, которая включает различные жирные кислоты. В некоторых воплощениях смесь жирных кислот может представлять собой масло или смесь масел, в других воплощениях смесь жирных кислот может представлять собой смесь свободных жирных кислот, или смесь свободных жирных кислот и масла, или смесь масел. В некоторых воплощениях некоторые или все жирные кислоты в смеси жирных кислот могут быть модифицированы с образованием алкиловых эфиров жирных кислот, например метиловых эфиров жирных кислот, этиловых эфиров жирных кислот, пропиловых эфиров жирных кислот и подобное. В некоторых предпочтительных воплощениях алкиловые эфиры жирных кислот включают метиловые эфиры. Соответственно, если не указано иное, выражение "смесь жирных кислот" при использовании в данном описании изобретения охватывает смеси жирнокислотных алкиловых эфиров жирных кислот, указанных в смеси. Аналогично, если не указано иное, термин "жирная кислота" при использовании в данном описании изобретения включает алкиловые эфиры жирной кислоты.
Выражение "функциональные жидкости" относится к жидкому веществу, добавленному к топливу, и составляющему более 5% масс. конечного топлива.
Выражение "антифризная присадка к топливу" относится к жидкому веществу, добавленному к топливу для понижения точки замерзания этого топлива.
"Цетановое число" или CN является мерой параметров воспламенения топлива и коррелирует с периодом задержки воспламенения. Например, топливо с высоким цетановым числом начинает возгораться вскоре после его впрыскивания в цилиндр (то есть оно имеет короткий период задержки воспламенения). Наоборот, топливо с низким цетановым числом имеет более длинный период задержки воспламенения. Кроме того, более высокое цетановое число коррелирует с улучшенным воспламенением, улучшенным холодным запуском, пониженным шумом, пониженной дымностью и пониженным выбросом НС, СО и пыли, особенно в течение фазы раннего разогрева. Имеющееся в продаже нефтяное дизельное топливо, как правило, находится в двух интервалах CN: 40-46 для стандартного дизельного топлива и 45-50 для высшего сорта.
"Йодное число" определяют при помощи стандартного анализа натурального масла для измерения степени ненасыщенности растительных масел и жиров.
"Точка помутнения" относится к температуре, при которой появляются первые кристаллы воска, и для определения этой температуры используют протокол стандартизированного теста от Американского общества испытаний и материалов (ASTM).
"Точка застывания" относится к температуре, при которой топливо уже не льется. Точка застывания, как правило, ниже точки помутнения. Некоторые двигатели не запускаются при точке помутнения, но, как правило, все двигатели не работают при точке застывания.
"Точка плавления" кристаллического твердого вещества относится к температуре, при которой оно изменяет состояние с твердого на жидкое. Если рассматривается температура обратного изменения (то есть из жидкого в твердое), ее называют "точкой замерзания." Для большинства веществ точки плавления и замерзания равны. Точка плавления или точка замерзания ниже точки застывания.
"Сырье", при использовании в данном описании изобретения, относится к веществу, состоящему из жиров, жирных кислот или триглицеридов, которые можно использовать в качестве исходного вещества для получения биодизельного топлива. Примеры сырья, которое может применяться при получении видов биодизельного топлива, включают растительное масло, отходы растительного масла и животные жиры. Другие виды сырья включают смеси жирных кислот или алкиловых эфиров жирных кислот.
Термин "примерно" при использовании в данном описании изобретения означает в количественном выражении плюс или минус 10%. Например, "примерно 3%" охватывает 2,7-3,3% и "примерно 10%" охватывает 9-11%.
Если не указано иное, любые процентные концентрации, приведенные в данном описании изобретения, представляет собой процент по массе.
Другие особенности и преимущества изобретения будут очевидны из следующего описания предпочтительных воплощений и из формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг.1 представляна неполная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1) ацил-АСР-тиоэстеразы (пальмитоил-АСР-тиоэстеразы или РТЕ) из Brassica napus.
На Фиг.2 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) ацил-АСР-тиоэстеразы (пальмитоил-АСР-тиоэстераза или РТЕ) из Arabidopsis.
На Фиг.3 представлена аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3) кетоацилсинтазы II (KAS II) из Arabidopsis ihaliana (Gen Bank Accession No. NP_849888).
На Фиг.4 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:4) кетоацилсинтазы II (KAS II) из Arabidopsis thaliana (GenBank Accession No. NM_179557).
На Фиг.5 представляет два пути, посредством которых может быть получено биодизельное топливо из масла или жира.
На Фиг.6 представлен жирнокислотный состав некоторых типичных масел.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Смешанные масла
Масла, содержащие различные составы среднецепочечных жирных кислот, можно смешивать для получения нужной смеси среднецепочечных жирных кислот. Масла смешивают на массовой основе. Например, объем рапсового масла для использования в 100 граммах смеси, составленной из 25% рапсового масла, определяют путем деления граммов рапсового масла в конечной смеси на относительную плотность рапсового масла (то есть 25 г/0,915 г/мл = 27,3 мл).
На Фиг.6 представлена таблица, включающая некоторые типичные масла, и содержание жирных кислот в их составе. Такие масла имеются в продаже у многих поставщиков. Следует отметить, что значения уровней жирных кислот выражены как интервалы, потому что, как это известно в данной области техники, количества конкретных жирных кислот, присутствующих в конкретном растении, могут значительно варьироваться. Таким образом, масла, экстрагированные из таких растений, могут иметь разные количества любой или всех жирных кислот от партии к партии. Следовательно, обычно неоходимо определять жирнокислотный состав масел, фактически применяемых для получения смесей или биодизельного топлива.
Получение алкиловых эфиров жирных кислот
Алкиловые эфиры жирных кислот могут быть получены из жирных кислот или из триглицеридов. В общем случае алкиловые эфиры жирных кислот получают посредством трансэтерификации триглицеридов жиров или масел или этерификацией свободных жирных кислот (Фиг.5). Кроме того, жирные кислоты могут быть отщеплены от триглицеридов посредством гидролиза и затем подвергнуты этерификации с получением эфира жирных кислот.
Алкиловые эфиры жирных кислот могут быть получены с помощью реакции трансэтерификации триглицеридов, обнаруженных в разных маслах растительного происхождения, таких как соевое масло, пальмовое масло, сафлоровое масло, арахисовое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, льняное масло, кокосовое масло, касторовое масло, рапсовое масло, подсолнечное масло и разные масла, полученные из животных жиров. Эти масла взаимодействуют со спиртом (например, метанолом, этанолом, пропанолом, бутанолом) в присутствии основного катализатора, такого как алкилат натрия, гидроксид натрия или калия или тетраизопропилат титана. Условия реакции, такие как температура и давление, могут быть выбраны исходя из конкретного используемого спирта. Количество катализатора обычно находится в интервале от примерно 0,1 до примерно 0,5% по массе из расчета на жирные кислоты. Этим способом получают алкиловый эфир жирных кислот, где алкильная группа получена от спирта. Таким образом, взаимодействие, в котором метанол использовали в качестве спирта, будет давать метиловый эфир жирных кислот. Другие побочные продукты включают глицерин. Продукты трансэтерификации выделяют путем фракционирования при пониженном давлении посредством дистилляции на ректификационной колонке.
Алкиловые эфиры жирных кислот могут быть получены из свободных жирных кислот посредством этерификации. Свободные жирные кислоты имеются в продаже у многих поставщиков, или могут быть получены, например, из вышеуказанных масел, которые могут взаимодействовать со спиртом в присутствие кислотного катализатора, такого как серная кислота, арилсульфоновые кислоты или алкилсульфоновые кислоты. Условия реакции, такие как температура и давление, могут быть выбраны исходя из конкретного используемого спирта. Эфиры жирных кислот могут быть выделены путем нейтрализации серной кислоты и последующей очистки для удаления водных компонентов реакции.
Смешивание эфиров жирных кислот
Эфиры жирных кислот имеются в продаже или могут быть получены этерификацией жирных кислот, как описано выше. Жирные кислоты смешивают, чтобы получить смесь, имеющую полезные свойства для использования в качестве биодизельного топлива, присадки к топливу, функциональной жидкости, авиационного или ракетного топлива, масла для обогрева домов или керосина. Свойства, которые следует учитывать при оценке смесей, могут включать точку плавления, точку помутнения, точку застывания, йодное число, цетановое число, вязкость, устойчивость к окислению и характеристики износа при трении.
Смеси изготавливают на основе массовых процентов. Для метиловых эфиров жирных кислот (FAMEs) нужный процент по массе каждого компонента FAME делят на относительную плотность данного FAME. Это дает объем FAME на 100 грамм готовой смеси. Например, для получения смеси, содержащей 14% (масс.%) метилового эфира каприновой кислоты (имеющего относительную плотность 0,877 г/мл), объем метилового эфира каприновой кислоты для применения в изготовлении 100 грамм готовой смеси определяют следующим образом.
Объем метилового эфира каприновой кислоты = (14 г/0,877 г/мл) = 15,96 мл
Таким образом, для каждых 100 г конечной смеси требуется 15,96 мл метилового эфира каприновой кислоты.
Определение процента по массе в смеси FAMEs или FAME смеси, полученной при превращении жирных кислот, содержащихся в масляной смеси, в эфиры жирных кислот, выполняют, используя капиллярную газовую хроматографию (Agilent Model 6890) (колонка-Supelco SPB-225, 30 M×0,32 мм, пленка толщиной 0,25 мкм), оборудованную пламенно-ионизационным детектором (FID). Для определения массы каждого FAME в образце площадь пика образца сравнивают с площадью пика известной массы калибровочного стандарта FAME для каждого пика. Все массы суммируют, и отношение массы конкрентного FAME к общей (после перевода в процент) представляет собой процент по массе.
Точка плавления. Низкая точка плавления смеси жирнокислотных эфиров является желательной для предотвращения замерзания, когда такую смесь используют в холодных климатических условиях. Способы достижения низкой точки плавления смеси метиловых эфиров жирных кислот обычно включают смешивание с обычным дизельным топливом, включение присадок, имеющих эфиры с разветвленными цепочками, и/или объемных заместителей в алкильную цепь, и/или демарганизацию смеси. Смеси по настоящему изобретению достигают низкой точки плавления благодаря включению метиловых эфиров среднецепочечных жирных кислот, в частности метиловых эфиров С8 и С10. Таким образом, эфиры жирных кислот можно смешивать для достижения конкретной точки плавления, и может быть определена точка плавления полученной смеси.
Точку плавления можно определить способами, известными в данной области техники. В одном способе точку плавления смеси метиловых эфиров жирных кислот определяют, помещая аликвоты смеси в стеклянную капиллярную трубку с закрытым концом и уравновешивая трубки в водяной бане или этиленгликолевой бане, поддерживаемой при температуре, которая ниже ожидаемой точки плавления смеси. После периода времени, достаточного, чтобы позволить трубке и ее содержимому достичь равновесия, температуру водяной бани медленно снижают. За трубкой наблюдают визуально или используя прибор для измерения светорассеяния (спектрофотометр). Температуру, при которой наблюдается переход из твердого состояния в жидкое или при которой рассеяние света уменьшается, регистрируют как точку плавления образца.
Альтернативой простой точке плавления, как объясняется выше, является "скользящая точка плавления". В данном способе небольшое количество образца помещают в капилляр с закрытым концом таким образом, что образец подвешен в центре трубки в продольном направлении. После уравновешивания в водяной бане температуру медленно превышают, и температуру, при которой подвешенный образец только начинает падать или "скользить" в капилляре, регистрируют как скользящую точку плавления.
Определение точки плавления твердого жира также подробно описано в способах, запрещенных Американским Обществом по химии зерна (ААСС), способ номер 58-40 "Melting Point-Capillary Method" и способ номер 58-53 Slip Melting point. Кроме того, также доступны способы Американского общества нефтехимиков (AOCS), официальный способ Сс 1-25 "Melting Point Capillary Tube Method" и официальный способ AOCS Сс 3-25 "Slip Melting Point AOCS Standard Open Tube Melting Point".
Альтернативно прогнозируемая точка плавления может быть рассчитана с использованием алгоритма, содержащегося в данном описании изобретения.
Точка помутнения и точка застывания. Точка помутнения и точка застывания могут быть определены в одинаковых эскпериментах с использованием одного прибора. Описывая кратко, образец охлаждают в приборе для определения точек помутнения и застывания и периодически проверяют во время охлаждения. Самая высокая температура, при которой набдлюдается помутнение, представляет собой точку помутнения. Самая низкая температура, при которой наблюдается движение масла, представляет собой точку застывания. Этот способ соответствует ASTM D97, D2500 и родственным документам. Такой прибор (К46100 Cloud Point & Pour Point Apparatus Cloud and Pour Point Chamber) доступен от Koehler Instrument Company, Inc., 1595 Sycamore Avenue, Bohemia, New York 11716, USA.
16
34
16
34
Цетановое число. Воспламеняемость дизельного топлива (DF) обычно определяют посредством способа тестирования ASTM D613 Американского общества испытаний и материалов (ASTM) и указывают как цетановое число (CN). Воспламеняемость определяют по времени задержки воспламенения топлива в двигателе. Чем короче время задержки воспламенения, тем выше CN. Соединения делят на категории согласно цетановой шкале. Цетан (СН или гексадекан) имеет очень короткую задержку воспламенения и ему присвоено CN 100. На другом конце шкалы находится 2,2,4,4,6,8,8-гептаметилнонан (HMN; также СН), который имеет плохую воспламеняемость и ему присвоено CN 15. В общем случае неразветвленные, насыщенные длинноцепочечные углеводороды (алканы) имеют высокие CN и хорошую воспламеняемость, в то время как разветвленные углеводороды (и другие вещества, такие как ароматические соединения) имеют низкие CN и плохую воспламеняемость. Кроме того, присутствие двойных связей или степеней ненасыщенности в жирной кислоте снижают цетановое число.
Поскольку как слишком высокое, так и слишком низкое CN может вызывать эксплуатационные проблемы (в случае слишком высокого CN возгорание может произойти до того, как топливо и воздух будут как следует смешаны, что приводит к неполному сгоранию и дыму; в случае слишком низкого CN имеют место неровная работа двигателя, перебой зажигания, повышенные температуры воздуха, более медленный прогрев двигателя и также неполное сгорание), большинство производителей двигателей указывают интервал требуемого CN для своих двигателей. В большинстве случаев такой интервал CN составляет примерно 40-50. Например, технические условия ASTM для обычного дизельного топлива (ASTM D975) требуют CN минимум 40.
Йодное число. Йодное число представляет собой широко используемую оценку насыщения и, следовательно, является индикатором устойчивости к окислению. Как отмечалось ранее, ненасыщенные молекулы являются более чувствительными к окислению, чем насыщенные молекулы. В данном тесте используют йод для определения числа двойных связей в масле или топливе. Таким образом, масла с высокими йодными числами, такие как соевое масло (IN=130-135), являются очень чувствительными к окислению, в то время как животные жиры с низкими йодными числами, такие как говяжий жир (IN=30-48), являются значительно меньше чувствительными. Основным недостатком йодного числа является то, что оно не различает, что некоторые двойные связи окисляются более легко, чем другие. Метиллинолеат с двумя двойными связями окисляется приблизительно в 50 раз быстрее, чем метилолеат только с одной двойной связью. Метиллинолеат с тремя двойными связями окисляется даже еще быстрее, хотя и не с такой степенью увеличения. Таким образом, ожидается, что смеси преимущественно насыщенных, среднецепочечных жирных кислот должны иметь низкие йодные числа, и, следовательно, показывать хорошую устойчивость к окислению.
Получение генетически измененного растения, которое продуцирует масла с измененными композициями жирных кислот.
В патенте US №6150512 раскрыто, что "предложены способы изменения субстратной специфичности растительных ацил-АСР-тиоэстераз, и также полученных генно-инженерных растительных ацил-АСР-тиоэстераз", в частности, "мангустановой тиоэстеразы Garm FatAl 18:1, в которой быда увеличена относительная 18:0 активность."
В патенте US №5955329 раскрыты "способы изменения субстратной специфичности растительных ацил-АСР-тиоэстераз и генно-инженерных растительных ацил-АСР-тиоэстераз." В частности, раскрыто, что "С12 предпочтительная растительная ацил-АСР-тиоэстераза, описанная в данном описании изобретения, может быть изменена с получением растительной тиоэстеразы, имеющей приблизительно равную активность на субстратах С14 и С12."
В Carlsson et al. (Plant Journal 29(6):761-770, 2002) описан "fab1 мутант Arabidopsis, который частично лишен активности (3-кетоацил-[белок-переносчик ацила]-синтазы II (KASII)." Мутация fab1 описана как "изменение одного нуклеотида в последовательности Arabidopsis KAS2, которое приводит к замещению Leu337Phe."
В Knapp et al. ("Modifying the seed storage of lipids of Cuphea: A source of medium chain triglycerides." In Seed Oils for the Future, 142-154, Champaign, 111, AOCS Press) раскрыта мутантная Cuphea viscosissima, созданная посредством случайного мутагенеза, которая продуцирует масла, имеющие измененные составы триглицеридов.
В патентах US №№5667997, 5455167, 5298421 и 5512482 раскрыты нуклеотидные и аминокислотные последовательности ацил-АСР-тиоэстераз, имеющие специфичность в отношении среднецепочечных жирных кислот, и соответствующие трансгенные растения, экспрессирующие каждую из таких тиоэстераз.
Генетически измененное растение, продуцирующее среднецепочечные жирные кислоты, может быть получено посредством мутации или модифицирования одного или более фермента в рамках способа биосинтеза жирных кислот. Биосинтез жирных кислот происходит в пластиде растений. Синтез жирных кислот протекает от двухуглеродного предшественника, связанного с ацил-переносящим белком (АСР), через последующее добавление двух углеродов в реакцию, катализируемой ферментом кетоацилсинтазой (KAS). Во время этого процесса жирная кислота остается этерифицированной до АСР, приводя к пулам промежуточных продуктов ацил-АСР, в которых ацильная часть имеет варьирующуюся длину. Тиоэстеразы, присутствующие в пластиде, гидролизуют тиол-эфирную связь между жирной кислотой и АСР, высвобождая, таким образом, жирную кислоту, которая затем может выйти из пластиды и быть собрана в триглицериды.
Некоторые изомеры KAS имеют аффинности к ацильным цепочкам конкретных длин. Например, фермент KAS I из, например, Brassica napus, имеет незначительную аффинность к ацильным цепочкам длиннее 16 атомов углерода, так что этот фермент не будет удлинять ацильную цепь сверх 16 атомов углерода. KAS II специфически катализирует реакцию удлинения ацильных цепочек с 16 атомами углерода до ацильных цепочек с 18 атомами углерода. KAS II имеет незначительную аффинность к ацильным цепочкам длиннее или короче 16 атомов углерода.
Аналогично, были идентифицированы ацил-АСР-тиоэстеразы, имеющие предпочтительную активность в отношении ацильных цепей конкретной длины. Существуют, например, тиоэстеразы, которые преимущественно гидролизуют ацил-АСР, имеющие жирные кислоты с 18 атомами углерода (например, олеил-АСР-тиоэстераза или ОТЕ). Аналогично, существуют тиоэстеразы, имеющие предпочтительную активность к ацил-АСР, имеющим жирные кислоты с 16 атомами углерода (например, пальмитоил-АСР-тиоэстераза или РТЕ). Кроме того, сообщалось о тиоэстеразах, имеющих предпочтительную активность к различным среднецепочечным жирным кислотам. "Предпочтительная активность" растительной тиостеразы по отношению к жирнокислотному ацил-переносящему субстрату с конкретной длиной цепи определяют путем сравнения количеств полученного жирнокислотного продукта на субстратах с разной длиной цепи. Например, под "С12-предпочтительной" подразумевается, что гидролитическая активность ферментного препарата демонстрирует предпочтение к лауроилу, и возможно, деканоилу, по сравнению с другими ацил-субстратами с разной длиной углеродной цепи. Аналогично, растительная тиоэстераза, имеющая "С10-предпочтительную" активность, будет демонстрировать более высокие уровни активности в отношении деканоильных субстратов, и возможно октаноила, перед другими субстратами с разными длинами углеродной цепи. Следует отметить, что некоторая активность, значительно меньшей величины, может наблюдаться для жирнокислотных субстратов с другой длиной цепи. Таким образом, это предпочтение может быть существенным, но может не являться абсолютным.
В предпочтительных воплощениях генетически измененное растение, экспрессирующее модифицированный фермент, получают путем введения мутации в фермент с использованием олигонуклеооснования генной репарации, как описано в данном описании изобретения. Способ включает введение олигонуклеотидного основания генной репарации, содержащего конкретную мутацию для целевого интересующего гена, в растительную клетку любым из ряда способов, хорошо известных в данной области техники (например, микроносители, микроволокна, электропорация и микроинъекция), и идентификацию клетки, семени или растения, имеющего мутированный фермент.
При использовании в данном описании изобретения термин "целевой ген" относится к гену, кодирующему фермент, подлежащий модификации.
Олигонуклеооснования генной репарации
Данное изобретение можно осуществлять на практике с "олигонуклеооснованиями генной репарации", имеющими конформации и химические составы, подробно описанные ниже. "Олигонуклеооснования генной репарации" по изобретению включают смешанные двойные олигонуклеотиды, молекулы, содержащие ненуклеотиды, однонитевые олигодезоксинуклеотиды и другие молекулы генной репарации, раскрытые в указанных ниже патентах и патентных публикациях. "Олигонуклеооснования генной репарации" по изобретению описаны также в опубликованной научной и патентной литературе, с использованием других названий, включая "рекомбинагенные олигонуклеотидные основания", "РНК/ДНК химерные олигонуклеотиды", "химерные олигонуклеотиды", "смешанные двойные олигонуклеотиды (MDONs)", "РНК ДНК олигонуклеотиды (RDOs)", "олигонуклеотиды генной направленности", "генопласты", "однонитевые модифицированные олигонуклеотиды", "однонитевые олигонуклеотидные мутационные векторы", "двойные мутационные векторы" и "гетеродвойные мутационные векторы."
Олигонуклеооснования, имеющие конформации и химические составы, описанные в патенте US №5565350 Kmiec (Kmiec I) и патенте US №5731181 Kmiec (Kmiec II), включенные в данное описание изобретения посредством ссылки, являются пригодными для использования в качестве "олигонуклеооснований генной репарации" по изобретению. Олигонуклеооснования генной репарации в Kmiec I и/или Kmiec II содержат две комплементарные нити, одна из которых содержит по меньшей мере один сегмент нуклеотида РНК-типа ("сегмент РНК"), которые представляют собой основание, спаренное с нуклеотидами ДНК-типа другой нити.
В Kmiec II раскрывается, что ненуклеотиды, содержащие пуриновое и пиримидиновое основание, могут быть замещены на нуклеотиды. Дополнительные молекулы генной репарации, которые могут использоваться для настоящего изобретения, описаны в патентах US №№5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804 и 6010907 и в международном патентной заявке № PCT/US00/23457; и в международных патентных заявках №№ WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 и WO 99/40789, каждый из которых включен в данное описание изобретения во всей их полноте.
В одном воплощении олигонуклеотидное основание генной репарации представляет собой смешанный двойный олигонуклеотид, в котором нуклеотидам РНК-типа смешанного двойного олигонуклеотида придают резистентность к РНК-азе путем замены 2'-гидроксила на функциональную группу фтор, хлор или бром или помещая заместитель на 2'-O. Подходящие заместители включают заместители, указанные в Kmiec II. Альтернативные заместители включают заместители, указанные в патенте US №5334711 (Sproat), и заместители, указанные в патентных публикациях ЕР 629387 и ЕР 679657 (коллективно, Martin Applications), которые включены в данное описание изобретения посредством ссылки. При использовании в данном описании изобретения 2-фтор-, хлор- или бром-производное рибонуклеотида или рибонуклеотид, имеющий 2'-ОН, замещенный заместителем, описанным в Martin Applications или Sproat, называют "2'-замещенный рибонуклеотид". При использовании в данном описании изобретения термин "нуклеотид РНК-типа" означает 2'-гидроксил или 2'-замещенный нуклеотид, который соединен с другими нуклеотидами смешанного двойного олигонуклеотида с помощью незамещенной фосфодиэфирной связи или любыми искусственными связями, указанными в Kmiec I или Kmiec II. При использовании в данном описании изобретения термин "нуклеотид дезоксирибо-типа" означает нуклеотид, имеющий группу 2'-Н, которая может связана с другими нуклеотидами олигонуклеооснования генной репарации посредством незамещенной фосфодиэфирной связи или любыми искусственными связями, указанными в Kmiec I или Kmiec II.
В конкретном воплощении настоящего изобретения олигонуклеооснование генной репарации представляет собой смешанный двойный олигонуклеотид, который соединен исключительно с помощью незамещенных фосфодиэфирных связей. В альтернативных воплощениях связь осуществляется с помощью замещенных фосфодиэфиров, производных фосфодиэфиров и связями, не основанными на фосфоре, как указано в Kmiec II. В еще одном воплощении каждый нуклеотид РНК-типа в смешанном двойном олигонуклеотиде представляет собой 2'-замещенный нуклеотид. Конкретные предпочтительные воплощения 2'-замещенных рибонуклеотидов представляют собой 2'-фтор-, 2'-метокси-, 2'-пропилокси-, 2'-аллилокси-, Т-гидроксил-этилокси-, 2'-метоксиэтилокси-, 2'-фтор-пропилокси- и 2'-трифтор-пропилокси-замещенные рибонуклеотиды. Более предпочтительные воплощения 2'-замещенных рибонуклеотидов представляют собой 2'-фтор, 2'-метокси, 2'-метоксиэтилокси и 2'-аллилокси замещенные нуклеотиды. В еще одном воплощении смешанный двойный олигонуклеотид соединен с помощью незамещенных фосфодиэфирных связей.
Несмотря на то, что более удобно синтезировать смешанные двойные олигонуклеотиды, имеющие только один тип 2'-замещенного нуклеотида РНК-типа, способы по изобретения можно осуществить на практике со смешанными двойными олигонуклеотидами, имеющими два или более типа нуклеотидов РНК-типа. На функцию РНК-сегмента может не влиять прерывание, вызванное введением дезоксинуклеотида между двумя тринуклеотидами РНК-типа, соответственно, термин «сегмент РНК» включает в себя "прерванный сегмент РНК". Непрерванный сегмент РНК называют непрерывным сегментом РНК. В альтернативном воплощении сегмент РНК может содержать измененные устойчивые к РНК-азе и незамещенные 2'-ОН нуклеотиды. Смешанные двойные олигонуклеотиды предпочтительно имеют менее 100 нуклеотидов и более предпочтительно менее 85 нуклеотидов, но более 50 нуклеотидов. Первая и вторая нити представляют собой спаренные основания Уотсона-Крика. В одном воплощении нити смешанного двойного олигонуклеотида ковалентно связаны с помощью линкера, такого как однонитевый гекса-, пента- или тетрануклеотид, так что первая и вторая нити представляют собой сегменты одиночной олигонуклеотидной цепи, имеющей один 3'- и один 5'-конец. 3'- и 5'-концы могут быть защищены путем добавления "шпилечного кэпа", в результате чего 3'- и 5'-концевые нуклеотиды спариваются по Уотсон-Крику с соседними нуклеотидами. Второй шпилечный кэп может быть помещен дополнительно в месте соединения между первой и второй нитями, в отдалении от 3'- и 5'-концов, так что спаривание Уотсона-Крика между первой и второй нитями стабилизируется.
Первая и вторая нити содержат два участка, которые гомологичны двум фрагментам гена-мишени, то есть имеют такую же последовательность, как ген-мишень. Гомологичный участок содержит нуклеотиды сегмента РНК и может содержать один или более нуклеотидов ДНК-типа соединяющего сегмента ДНК и также может содержать нуклеотиды ДНК-типа, которые не располагаются внутри промежуточного сегмента ДНК. Два участка гомологии разделены участком, и каждый является соседним участку, имеющему последовательность, которая отличается от последовательности гена-мишени, называющемуся "гетерологичным участком". Гетерологичный участок может содержать один, два или три несопряженных нуклеотида. Несопряженные нуклеотиды могут быть непрерывными или, альтернативно, могут быть разделены одним или двумя нуклеотидами, которые гомологичны гену-мишени. Альтернативно, гетерологичный участок также может содержать вставку или один, два, три или от пяти или менее нуклеотидов. Альтернативно, последовательность смешанного двойного олигонуклеотида может отличаться от последовательности гена-мишени только делецией одного, двух, трех, или пяти или менее нуклеотидов данного смешанного двойного олигонуклеотида. Длину и положение гетерологичного участка считают, в этом случае, длиной делеции, даже если в гетерологичном участке нет нуклеотидов смешанного двойного олигонуклеотида. Расстояние между фрагментами гена-мишени, которые комплементарны двум гомологичным участкам, идентично длине гетерологичного участка, где предполагается(ются) замещение или замещения. Если гетерологичный участок содержит вставку, гомологичные участки тем самым отделены в смешанном двойном олигонуклеотиде дальше, чем их комплементарные гомологичные фрагменты в гене, и применимо обратное, если гетерологичный участок кодирует делецию.
Каждый из сегментов РНК смешанных двойных олигонуклеотидов представляет собой часть гомологичного участка, то есть участка, который идентичен по последовательности фрагменту гена-мишени, эти сегменты вместе предпочтительно содержат по меньшей мере 13 нуклеотидов РНК-типа и предпочтительно от 16 до 25 нуклеотидов РНК-типа или еще более предпочтительно 18-22 нуклеотидов РНК-типа или более предпочтительно 20 нуклеотидов. В одном воплощении РНК-сегменты участков гомологии разделены при помощи и расположены рядом с, то есть "соединены посредством" промежуточного сегмента ДНК. В одном воплощении каждый нуклеотид гетерологичного участка представляет собой нуклеотид промежуточного сегмента ДНК. Промежуточный сегмент ДНК, который содержит гетерологичный участок смешанного двойного олигонуклеотида, называют "мутаторным сегментом".
В еще одном воплощении настоящего изобретения олигонуклеооснование генной репарации представлет собой однонитевый олигодезоксинуклеотидный мутационный вектор (SSOMV), который раскрыт в международной патентной заявке PCT/US00/23457, в патентах US 6271360, 6479292 и 7060500, которые включены посредством ссылки во всей их полноте. Последовательность SSOMV основана на тех же принципах, что и мутационные векторы, описанные в патентах US 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804 и 6010907, и в международных публикациях WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 и WO 99/40789. Последовательность SSOMV содержит два участка, которые гомологичны последовательности-мишени, разделенной участком, который содержит нужные генетические изменения, называемым мутаторным участком. Мутаторный участок может иметь последовательность, которая имеет ту же длину, что и последовательность, которая разделяет гомологичные участки в последовательности-мишени, но имеет другую последовательность. Такой мутаторный участок может вызывать замену. Альтернативно, гомологичные участки в SSOMV могут быть непрерывными друг с другом, в то время как участки в гене-мишени, имеющие ту же последовательность, отделены одним, двумя или более нуклеотидом. Такая SSOMV вызывает делецию из гена-мишени нуклеотидов, которые отсутствуют в SSOMV. Наконец, последовательность гена-мишени, которая идентична гомологичным участкам, может быть соседней с геном-мишенью, но разделена одним, двумя или более нуклеотидами в последовательности SSOMV. Такая SSOMV обуславливает вставку в последовательность гена-мишени.
Нуклеотиды SSOMV представляют собой дезоксирибонуклеотиды, которые соединены немодифицированными фосфодиэфирными связями за исключением 3'-концевой и/или 5'-концевой межнуклеотидной связи, или альтернативно двух 3-концевых и/или 5'-концевых межнуклеотидных связей, которые могут быть фосфоротиоатными или фосфороамидатными. При использовании в данном описании изобретения, межнуклеотидная связь представляет собой связь между нуклеотидами SSOMV и не включает связь между 3'-концом нуклеотида или 5'-концом нуклеотида и блокирующим заместителем, смотри выше. В конкретном воплощении длина SSOMV составляет 21-55 дезоксинуклеотидов, и длины гомологичных участков имеют, соответственно, общую длину по меньшей мере 20 дезоксинуклеотидов, и каждый из по меньшей мере двух участков гомологии может иметь длину по меньшей мере 8 дезоксинуклеотидов.
SSOMV может быть сконструирована комплементарной либо кодирующей, либо некодирующей нити гена-мишени. Если нужная мутация представляет собой замещение одного основания, предпочтительно, чтобы оба мутаторных нуклеотида представляли собой пиримидин. В тех случаях, когда это находится в соответствии с достижением требуемого функционального результата, предпочтительно, чтобы как мутаторный нуклеотид, так и нацеленный нуклеотид в комплементарной нити представляли собой пиримидины. Особенно предпочтительными являются SSOMV, которые кодируют трансверсионные мутации, то есть С или Т мутаторный нуклеотид не сопряжен, соответственно, с С или Т нуклеотидом в комплементарной нити.
В дополнение к олигодезоксинуклеотиду SSOMV может содержать 5'-блокирующий заместитель, который присоединен к атомам углерода 5'-конца посредством линкера. Химическая природа линкера является не критичной, в отличие от его длины, которая предпочтительно должна составлять по меньшей мере 6 атомов, и сам линкер должен быть гибким. Можно использовать множество нетоксичных заместителей, таких как биотин, холестерин или другие стероиды или неинтеркалирующий катионный флуоресцентный краситель. Особенно предпочтительными в качестве реагентов для создания SSOMV являются реагенты, продаваемые как Cy3.ТМ. и CyS.TM. в Glen Research, Sterling Va., которые блокируют фосфорамидиты, которые при включении в олигонуклеотид дают 3,3,3',3'-тетраметил-N,N'-изопропил, замещенный индомонокарбоцианиновым и индодикарбоцианиновым красителями соответственно. Cy3 является наиболее предпочтительным. Если индокарбоцианин представляет собой N-оксиалкил-замещенный, он может быть удобно связан с 5'-концом олигодезоксинуклеотида, например, через фосфодиэфир с 5'-концевым фосфатом. Химическое строение красящего линкера между красителем и олигодезоксинуклеотидом не является критичным, и его выбирают для удобства синтеза. Если используют имеющийся в продаже фосфорамидит Cy3, как указано, то полученная 5'-модификация состоит из блокирующего заместителя и линкера вместе, которые представляют собой N-гидроксипропил, N'-фосфатидилпропил 3,3,3',3'-тетраметил-индомонокарбоцианин.
В предпочтительном воплощении индокарбоцианиновый краситель является тетра-замещенным в 3- и 3'- положениях индольных колец. Без ограничения теорией такие заместители предотвращают, чтобы краситель являлся интеркалирующим красителем. Идентификация заместителей в виде этих положений не является критичной. SSOMV может, кроме того, иметь 3'-блокирующий заместитель. Опять же, химическое строение 3'-блокирующего заместителя не является критичным.
Модифицированные ферменты
9
Гены, кодирующие ферменты, вовлеченные в цикл биосинтеза жирных кислот, являются предпочтительными мишенями для мутации. В некоторых воплощениях ген-мишень кодирует ацил-АСР-тиоэстеразу. В других воплощениях ген-мишень кодирует кетоацилсинтазу (KAS). Мутации могут быть сконструированы так, чтобы снизить или аннулировать активность фермента или чтобы изменить активность фермента (например, изменить субстратную селективность). В некоторых воплощениях ген Δ-стеароил-ацил-АСР десатуразы модифицирован. В некоторых воплощениях ген FAD2, кодирующий Δ12-десатуразу, нацелен для уменьшения уровней линоленовой кислоты (18:3) и линолевой кислоты (18:2) и увеличения уровней олеиновой кислоты (18:1).
В конкретных воплощениях изобретения нативная ацил-АСР-тиоэстераза подвергнута мутации. В одном примере подвергают мутации ацил-АСР-тиоэстеразу из Brassica napus в участке, соответствующем аминокислотным остаткам 91-397 в SEQ ID NO:2. В предпочтительных воплощениях одна или более чем одна мутация присутствует в положениях в участке, соответствующем аминокислотным остаткам 128-147 в SEQ ID NO:2, аминокислотным остаткам 175-206 в SEQ ID NO:2, аминокислотным остаткам 254-297 в SEQ ID NO:2, аминокислотным остаткам 333-335 в SEQ ID NO:2 или аминокислотным остаткам 365-397 в SEQ ID NO:2.
В других воплощениях изобретения подвергнут мутации нативный фермент кетоацилсинтаза (KAS). В одном примере фермент KAS представляет собой KAS II и он подвергнут мутации в участке, соответствующем аминокислотным остаткам 325-385 в SEQ ID NO:3. В предпочтительных воплощениях одна или более мутация присутствует в положениях на участке, соответствующим аминокислотным остаткам 325-352 в SEQ ID NO:3 или аминокислотным остаткам 355-385 в SEQ ID NO:3. В более предпочтительных воплощениях одна или более чем одна мутация находится в участке, соответствующем аминокислотным остаткам 325-340 в SEQ ID NO:3, или даже аминокислотным остаткам 331-337 в SEQ ID NO:3. В некоторых воплощениях подвергают мутации аминокислоту, соответствующую консервативному остатку лейцина в положении 337 в SEQ ID NO:3. В конкретных воплощениях аминокислота, соответствующая консервативному остатку лейцина в положении 337 в SEQ ID NO:3, мутирована в фенилаланин, тирозин, триптофан или гистидин. В других воплощениях мутирована аминокислота, соответствующая консервативному остатку фенилаланина в положении 331 в SEQ ID NO:3. В некоторых воплощениях аминокислота, соответствующая консервативному остатку фенилаланина в положении 331 в SEQ ID NO:3, мутирована в глицин, аланин, серин, треонин, цистеин или валин.
Доставка олигонуклеооснований генной репарации в растительные клетки
Любой хорошо известный способ можно использовать в способах по настоящему изобретению для преобразования растительной клетки олигонуклеооснованиями генной репарации. Типичные способы включают использование микроносителей или микроволокон, электропорацию и микроинъекцию и описаны ниже.
В некоторых воплощениях используют металлические микроносители (микросферы) для введения больших фрагментов ДНК в растительные клетки, имеющие целлюлозные клеточные стенки, при помощи метательного проникновения (биолистическая доставка) и хорошо известны специалистам в данной области техники. Обычные методики подбора микроносителей и устройств для их проектирования раскрыты в патентах US №№4945050; 5100792 и 5204253.
2
2
2
Конкретные условия использования микроносителей в способах по настоящему изобретению раскрыты в международной публикации WO 99/07865, US 09/129298. Например, ледяные микроносители (60 мг/мл), смешанный двойный олигонуклеоитид (60 мг/мл), 2,5 М CaCl и 0,1 М спермидин добавляют в указанном порядке; смесь осторожно перемешивают, например посредством встряхивания, в течение 10 минут и оставляют стоять при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего микроносители разбавляют 5 объемами этанола, центрифугируют и перерастворяют в 100% этаноле. Типичные концентрации компонентов в липком растворе включают 8-10 мкг/мкл микроносителей, 14-17 мкг/мкл смешанного двойного олигонуклеотида, 1,1-1,4 м CaCl и 18-22 мм спермидина. В одном примере концентрации компонентов составляют 8 мкг/мкл микроносителей, 16,5 мкг/мкл смешанного двойного олигонуклеотида, 1,3 м CaCl и 21 мм спермидина.
Олигонуклеотидные основания генной репарации также могут быть внедрены в растительные клетки для практического воплощения настоящего изобретения с использованием микроволокон для проникновения через клеточную стенку и клеточную мембрану. В патенте US №5302523 Coffee et al. раскрыто использование 30×0,5 мкм и 10×0,3 мкм волокон карбида кремния для облегчения трансформации суспензионных культур кукурузы Black Mexican Sweet. Любые механические методы, которые могут использоваться для внедрения ДНК с целью трансформации растительной клетки с использованием микроволокон, можно использовать для доставки олигонуклеотидных оснований генной репарации.
Один пример микроволоконной доставки олигонукеотидного основания генной репарации состоит в следующем. Стерильные микроволокна (2 мкг) суспендируют в 150 мкл растительной культуральной среды, содержащей примерно 10 мкг смешанного двойного олигонуклеотида. Суспензионной культуре дают возможность отстояться, и равные объемы уплотненных клеток и стерильной суспензии волокно/нуклеотид встряхивают в течение 10 минут и помещают на планшеты. Селективную среду вносят сразу же или с задержкой вплоть до примерно 120 часов, как это подходит для конкретного свойства.
5
В альтернативном воплощении олигонуклеооснования генной репарации могут быть доставлены к растительной клетке при помощи электропорации протопласта, полученного из части растения. Протопласты образуются при ферментной обработке части растения, в частности листа, согласно способам, хорошо известным специалистам в данной области техники (смотри, например, Gallois et al., 1996, in Methods in Molecular Biology 55: 89-107, Humana Press, Totowa, N. J.; Kipp et al., 1999, in Methods in Molecular Biology 133: 213-221, Humana Press, Totowa, NJ.). Протопласты не требуется культивировать в ростовой среде перед электропорацией. Иллюстративные условия электропорации представляют собой 3×10 протопластов в общем объеме 0,3 мл с концентрацией олигонуклеооснования генной репарации 0,6-4 мкг/мл.
В еще одном альтернативном воплощении олигонуклеооснование генной репарации может быть доставлено в растительную клетку при помощи вискеров (микроволокна Whiskers) или микроинъекции растительной клетки. Так называемые вискерные методики выполняют, в основном, как описано в Frame et al, 1994, Plant J. 6: 941-948. Олигонуклеооснование генной репарации добавляют к вискерам и используют для трансформации растительных клеток. Олигонуклеооснование генной репарации можно совместно инкубировать с плазмидами, содержащими последовательности, кодирующие белки, способные образовывать рекомбиназу, и/или комплексы генной репарации в растительных клетках, так что катализируют репарацию гена между олигонуклеотидом и последовательностью-мишенью в гене-мишени.
Селекция растений, имеющих модифицированный фермент
Растения или растительные клетки, экспрессирующие модифицированный фермент, могут быть идентифицированы любым из ряда способов. В одном способе прием в стратегии совместной конверсии используют олигонуклеооснования генной репарации (RONs), имея целью и селектируемую конверсию (то есть маркер) и неселектируемую конверсию (например, представляющий интерес ген-мишень) в том же самом эксперименте. Например, ген ALS (или AHAS) в каноле может быть модифицирован посредством одной аминокислотной замены с получением устойчивости (посредством конверсии генов) к гербицидам класса имидазолинонов (IMI) in vitro. Одновременная доставка олигонуклеооснований генной репарации, направляющих конверсию гена ALS и другого гена(ов)/аллели(ей)-мишени и выбор полученного регенерирующего каллуса на IMI, идентифицирует конверсионно-компетентную популяцию. Таким образом, клетки, к которым RONs не были доставлены или которые были неспособны к передаче конверсии, определяемых RON, должны быть удалены. Поскольку доставка RONs, направляющих неродственные гены, не предполагает селективность, ожидается, что при некоторой частоте регенерирующий каллус, имеющий конверсию ALS, также будет иметь конверсию в одном из других генов-мишеней. Результаты конверсии будут разделены посредством анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP).
Таким образом, геномную ДНК экстрагируют из листового материала отдельных растений, регенерированных из протопластов, считающихся конверсионнокомпетентными, и отбирают отдельные образцы ДНК, используя технологию обнаружения SNP, например аллель-специфичную полимеразную цепную реакцию (ASPCR) для каждой мишени. Предполагаемые позитивные растения для каждой мишени могут быть закалены и перенесены в грунт. Чтобы независимо подтвердить изменение последовательности в позитивных растениях, подходящий участок гена-мишени может быть амплифициован посредством PCR и полученный ампликон или секвенирован непосредственно, или клонирован, и множественные вставки секвенируют. Когда многочисленные изменения создают в одном и том же гене, продукт конверсии может быть обратно скрещен с его родителем, что делает возможным расщепление конвертированного гена устойчивости ALS из гена-мишени.
Альтернативно, включение мутации в ген, представляющий интерес, может быть идентифицировано любым из ряда молекулярно-биологических методов, предназначенных для обнаружения однонуклеотидных мутаций в экстрагированной нуклеиновой кислоте (например, методами амплификации, такими как PCR (полимеразная цепная реакция) и анализ одиночных нуклеотидов методом удлинения праймера). Более значительные мутации могут быть определены посредством амплификации и секвенирования участка гена-мишени, который подлежит мутированию.
Альтернативно, растения или растительные клетки, содержащие модифицированный фермент, могут быть идентифицированы, например, посредством анализа композиции жирных кислот, продуцируемой растением.
Таким образом, растение может быть выращено и масла экстрагированы и проанализированы с использованием способов, известных в данной области техники (например, газовой хроматографии).
Получение трансгенного растения, экспрессирующего трансгены двух тиоэстераз
Трансгенные растения, экспрессирующие два трансгена, кодирующие тиоэстеразы, имеющие предпочтение к ацильным субстратам с разными длинами из среднецепочечных жирных кислот, могут быть получены способами, хорошо известными в данной области техники.
Таким образом, растительные тиоэстеразы могут быть получены из различных источников. Растения, продуцирующие значительные количества среднецепочечных жирных кислот, являются предпочтительными источниками последовательностей ДНК, кодирующих растительные тиоэстеразы, предпочитающие среднюю длину цепи. Например, некоторые виды семейства Cuphea накапливают триглицериды, содержащие в своих семенах среднецепочечные жирные кислоты, например procumbens, lutea, hookeriana, hyssopifolia, wrightii и inflate. Кроме того, обнаружено, что вяз (Ulmus americana) содержит существенное количество среднецепочечных жирных кислот. Кроме того, члены семейства Lauraceae: например, Pisa (Actinodophne hookeri), Sweet лавр (Laurus nobilis), и калифорнийский лавр (Umbellularia californica) продуцируют семена, имеющие среднецепочечные жирные кислоты. Дополнительные источники включают Myristicaceae, Simarubaceae, Vochysiaceae и Salvadoraceae, и тропические виды Erisma, Picramnia и Virola, которые, как сообщается, накапливают жирные кислоты С14. Некоторые примеры растений, содержащих тиоэстеразы, предпочитающие среднюю длину цепи, и их предпочтительные субстраты показаны в Таблице 1.
Таблица 1
Тиоэстеразы и их субстраты
Длина цепи субстрата тиоэстеразы
Типичные источники тиоэстеразы
С8
Cuphea hookeriana, Cuphea palustris
C10
Cuphea hookeriana, Ulmus americana
С12
Umbrellularia californica
Другие растения также могут быть источниками нужных тиоэстераз, предпочитающих конкретные длины жирнокислотной ацильной цепи. Такие дополнительные растительные тиоэстеразы могут быть идентифицированы путем анализа триглицеридного состава различных растительных масел. Присутствие конкретной тиоэстеразы может быть подтверждено анализами с использованием подходящего ацил-АСР-субстрата. Например, анализ на ацил-АСР-тиоэстеразу с С10-предпочтением описан в WO 91/16421, и он может быть использован для такого анализа.
Растительные экспрессирующие конструкции, содержащие последовательность ДНК, кодирующую представляющую интерес растительную тиоэстеразу, можно использовать в широком ряде растений, в частности, в растениях, применяющихся в изготовлении растительных масел пищевого и технического использования. Предпочтительные растения представляют собой масличные культуры, включая, но без ограничения ими, рапс (канолу и сорта с высоким содержанием эруковой кислоты), сафлор, подсолнечник, хлопчатник, куфею, сою, арахис, кокосовую и масличную пальмы и кукурузу.
Экспрессирующие конструкции, для которых клетка-хозяин представляет собой растительную клетку, включают регуляторные участки (например, промоторы и участки терминации), которые являются функциональными в растениях. Таким образом, открытую рамку считывания (ORP), кодирующую белок, который будет эскпрессироваться полученным трансгенным растением, присоединяют ее 5'-концом к регуляторному участку инициации транскрипции или промотору, такому как промотор, обнаруженный в нативном гене. Имеются в наличии многочисленные другие участки инициации транскрипции, которые обеспечивают широкое разнообразие конститутивной или индуцируемой транскрипции функций структурного гена. В число участков инициации транскрипции, используемых для растений, входят такие участки, соединенные со структурными генами, например для CaMV 35S и нопалин и маннопин-синтаз, или с напином, АСР-промоторами и подобными. Участки инициации транскрипции/трансляции, соответствующие таким структурным генам, находятся непосредственно против хода транскрипции от 5' относительно соответствующих стартовых кодонов. Если требуется конкретный промотор, такой как промотор, нативный к растению-хозяину, представляющему интерес, или модифицированный промотор, то есть имеющий участки инициации транскрипции, полученные из одного генного источника, и участки инициации трансляции, полученные из разных генных источников, включающий последовательность, кодирующую растительную тиоэстеразу, представляющую интерес, или усиленные промоторы, такие как двойные промоторы 35S CaMV, то последовательности могут быть соединены вместе с использованием стандартных методик. Для большинства применений, для которых требуется экспрессия в растениях тиоэстераз для средней длины цепи, предпочтительно использование конкретных промоторов из семян. Кроме того, в зависимости от способа введения рекомбинантных конструкций в клетку-хозяин, могут требоваться дополнительные компоненты в экспрессирующей конструкции. Например, ДНК, кодирующая селективный маркер для трансформированных клеток, может быть включена в экспрессирующую конструкцию. Таким образом, конструкция может обеспечивать резистентность к цитотоксичному агенту (например, антибиотику, тяжелому металлу, токсину и так далее), комплементацию, обеспечивающую прототрофию к ауксотрофному хозяину, вирусную иммунность или подобное. В зависимости от количества разных видов растений-хозяев, в которые вводят экспрессирующую конструкцию или ее компоненты, можно использовать один или более чем один маркер, где для разных хозяев используют разные условия селекции.
Различные способы трансформации растений хорошо известны в данной области техники. Например, обычно используют трансформацию посредством инъекции Agrobacterium, микроинъекции, бомбардировку ДНК микрочастицами и электропорацию. Кроме того, когда появляются более новые доступные способы для преобразования зерновых, такие способы также могут использоваться. Примеры трансформации растений можно обнаружить в патенте US №5667997.
Для того чтобы экспрессировать более одного трансгена, экспрессирующая конструкция может быть создана для каждого трансгена. Затем растения можно трансформировать первой экспрессирующей конструкцией, содержащей первый трансген и растительный селектируемый маркер. Регенеранты, выращенные на селективной среде, можно отобрать исходя из экспрессии трансгена, используя, например, способы вестерн-блоттинга. Растения, экспрессирующие трансген, выращивают до зрелости и им позволяют завязать семена, из которых может быть создана вторая генерация растений (Т2).
Генерацию Т2 используют для второго цикла трансформации, теперь со второй экспрессирующей конструкцией, содержащей второй трансген и второй растительный селектируемый маркер. (Способы удаления или инактивации растительных селектируемых маркеров известны в данной области техники (например, раскрыты в WO 92/01370.) Регенеранты выращивают на селективной среде до зрелости и позволяют завязать семена, из которых выращивают следующую генерацию растений (Т3). Генерацию Т3 отбирают, исходя из увеличения среднецепочечных жирных кислот по сравнению с растением дикого типа.
Создание генетически модифицированных растений, имеющих масло с нужным балансом среднецепочечных жирных кислот и мононенасыщенных жирных кислот.
В некоторых воплощениях пониженные уровни линоленовой кислоты (18:3) и линолевой кислоты (18:2), а также повышенные уровни олеиновой кислоты (18:1) достигаются в генетически модифицированном растении путем снижения экспрессии или активности Δ12-десатуразы (ген FAD2); предпочтительно целевой ген FAD2 представляет собой ген FAD2 рапса, хлопчатника, льна, арахиса, пальмы, сафлора, сои, подсолнечника, куфеи или кукурузы. В предпочтительных воплощениях экспрессию или активность FAD2 снижают, создавая стоп-кодон в кодирующей последовательности гена; или путем делеции или добавления нуклеотида для создания мутации со сдвигом рамки.
9
9
9
9
9
9
В некоторых предпочтительных воплощениях в генетически модифицированном растении модифицируют ген Δ-стеароил-ацил-АСР-десатуразы для увеличения уровней пальмитолеиновой кислоты (С16:1) и/или олеиновой кислоты (18:1); предпочтительно генетически модифицированное растение выбирают из группы, состоящей из рапса, хлопчатника, льна, арахиса, пальмы, сафлора, сои, подсолнечника, куфеи и кукурузы. В некоторых предпочтительных воплощениях увеличивают экспрессию и/или активность Δ-стеароил-ацил-АСР-десатуразы, чтобы облегчить увеличение продуцирования мононенасыщенных жирных кислот и уменьшение насыщенных жирных кислот; более предпочтительно повышены уровни С16:1 и/или С18:1 и понижены уровни С16:0 и/или С18:0 в генетически измененном растении по сравнению с нативным растением. В других воплощениях модифицируют ген Δ-стеароил-ацил-АСР-десатуразы так, что генетически модифицированное растение продуцирует повышенные уровни С16:1. В некоторых воплощениях ген Δ-стеароил-ацил-АСР-десатуразы модифицируют так, что он демонстрирует повышенную активность в отношении пальмитоил-АСР. (Смотри, например, Cahoon, E.В. и Shanklin, J, 2000. Substrate-dependent mutant complementation to select fatty acid desaturase variants for metabolic engineering of plant seed oil. Proc. Nat. Acad. Sci. 97(22); 12350-12355). В родственных воплощениях повышенное продуцирование С16:0 достигается посредством трансформации рапса геном Δ-стеароил-ацил-АСР из макадамии (Macadamia integrifolia), облепихи (Hippophae rhamnoides) или кошачьего когтя (Doxantha unguis-cati). В некоторых воплощениях снижают активность или экспрессию гена KASII, используя способы, как описано в данном описании изобретения, в дополнение к модификации гена Δ-стеароил-ацил-АСР для достижения еще более высоких уровней жирных кислот 18:1 и 16:1; в более предпочтительных воплощениях ферменты РТЕ из генетически модифицированного растения также модифицируют, как описано в данном описании изобретения, для продуцирования повышенных уровней короткоцепочечных жирных кислот; в более предпочтительных воплощениях Δ12-десатуразу генетически модифицированного растения также модифицируют для снижения активности или экспрессии.
9
В некоторых предпочтительных воплощениях растение, предпочтительно рапс, хлопчатник, лен, арахис, пальма, сафлор, соя, подсолнечник или кукурузное растение, генетически модифицируют, чтобы иметь повышенные уровни коротко/среднецепочечных жирных кислот, как раскрыто в данном описании изобретения, путем (1) изменения субстратной специфичности пальмитоил-тиоэстеразы (РТЕ) с целью увеличения активности в отношении каприлоил-АСР (С8), капроил-АСР (С10) и лауроил-АСР (С12), или путем трансформации ацил-АСР-тиоэстеразными генами, имеющими специфичность к цепям короткой длины, из куфеи, кокоса, пальмы, бабассу, тукума (Astrocaryum vulgarej), ильма (Ulmus Americana), японской дзельковы (Zeikova serrata) или калифорнийского лавра (Umbellularia californica); и (2) снижения активности гена KASII. В некоторых предпочтительных воплощениях растение генетически модифицируют, чтобы получить повышенные уровни коротко/среднецепочечных жирных кислот путем изменения генов РТЕ и/или KASII, как раскрыто в данном описании изобретения; и дополнительно модифицируют для получения пониженных уровней полиненасыщенных жирных кислот (предпочтительно пониженные уровни С18:2 и С18:3) путем снижения экспрессии или активности Δ12-десатуразы; более предпочтительно растение дополнительно модифицируют модифицированным геном Δ-стеароил-ацил-АСР-десатуразы для увеличения уровней пальмитолеиновой кислоты (С16:1) и/или олеиновой кислоты (18:1) и получения пониженных уровней С16:0 и/или С18:0.
Вычисление прогнозируемой точки плавления метиловых эфиров жирных кислот.
Tm
Прогнозируемая точка плавления, P, смеси метиловых эфиров жирных кислот может быть рассчитана с использованием количества каждого жирнокислотного метилового эфира, выраженного как масса/100 г смеси, и следующего уравнения.
Tm
P=[А(-71,0)(10,0)+В(-40,0)(4,5)+С(-18,0)(1,2)+D(5,2)(1,0)+E(19,0)(0,60)+F(30,7)(1,35)+G(37,8)(2,15)+H(-19,9)(1,10)+I(-35,0)(0,65)+J(57X0,2)+K(54,5)(10,0)+L(53,0)(2,0)+М(57,4)(2,0)]*(0,01),
А представляет собой процент (масс./масс.) ME капроновой кислоты (6:0) в смеси;
В представляет собой процент (масс./масс.) ME каприловой кислоты (8:0) в смеси;
С представляет собой процент (масс./масс.) ME каприновой кислоты (10:0) в смеси;
D представляет собой процент (масс./масс.) ME лауриновой кислоты (12:0) в смеси;
Е представляет собой процент (масс./масс.) ME миристиновой кислоты (14:0) в смеси;
F представляет собой процент (масс./масс.) ME пальмитиновой кислоты (16:0) в смеси;
G представляет собой процент (масс./масс.) ME стеариновой кислоты (18:0) в смеси;
Н представляет собой процент (масс./масс.) ME олеиновой кислоты (18:1) в смеси;
I представляет собой процент (масс./масс.) ME линолевой кислоты (18:2) в смеси;
J представляет собой процент (масс./масс.) ME линоленовой кислоты (18:3) в смеси;
К представляет собой процент (масс./масс.) ME арахидоновой кислоты (20:0) в смеси;
L представляет собой процент (масс./масс.) ME бегеновой кислоты (22:0) в смеси; и
М представляет собой процент (масс./масс.) ME лигноцериновой кислоты (24:0) в смеси.
В некоторых воплощениях прогнозируемая точка плавления может использоваться для идентификации смесей, которые пригодны для использования в качестве биодизельного топлива. В таких воплощениях прогнозируемую точку плавления сравнивают с пороговым значением (то есть с нужной точкой плавления для биодизельного топлива). Такие смеси, имеющие прогнозируемую точку плавления, менее или равную пороговому значению, пригодны для использования в качестве биодизельного топлива.
Следующие примеры служат для иллюстрации настоящего изобретения. Предполагается, что данные примеры ни коим образом не ограничивают объем данного изобретения.
ПРИМЕР 1
Смесь 1 метиловых эфиров жирных кислот
Смесь метиловых эфиров жирных кислот ("Смесь 1"), имеющую состав метиловых зфиров жирных кислот, указанный в таблице ниже, получают путем смешивания вместе метиловых эфиров жирных кислот, используя объемы, представленные в таблице ниже, для изготовления 100 г Смеси 1.
Компонент
Смесь 1
мл/100 г
ME капроновой кислоты (6:0)
1%
1,1
ME каприловой кислоты (8:0)
20
22,8
ME каприновой кислоты (10:0)
30
34,4
МЕ лауриновой кислоты (12:0)
20
23,0
ME миристиновой кислоты (14:0)
4
4,7
ME пальмитиновой кислоты (16:0)
2
2,3
ME стеариновой кислоты (18:0)
2
2,1
ME олеиновыой кислоты (18:1)
15
17,1
ME линолевой кислоты (18:2)
1
1,1
ME линоленовой кислоты (18:3)
1
1,1
ME арахидоновой кислоты (20:0)
1
1,2
ME бегеновой кислоты (22:0)
1
1,2
ME лигноцериновой кислоты (24:0)
1
1,2
Tm
Прогнозируемая точка плавления Смеси 1, P, рассчитанная методами по изобретению, составляет -41,6°С.
ПРИМЕР 2
Смесь 2 метиловых эфиров жирных кислот
Смесь метиловых эфиров жирных кислот ("Смесь 2"), имеющую состав метиловых эфиров жирных кислот, указанный в таблице ниже, получают путем смешивания вместе метиловых эфиров жирных кислот, используя объемы, представленные в таблице, для изготовления 100 г Смеси 2.
Компонент
Смесь 2
мл/100 г
ME капроновой кислоты (6:0)
1%
1,1
ME каприловой кислоты (8:0)
10
11,4
ME каприновой кислоты (10:0)
35
40,1
ME лауриновой кислоты (12:0)
25
28,7
ME миристиновой кислоты (14:0)
5
5,8
ME пальмитиновой кислоты (16:0)
2
2,3
ME стеариновой кислоты (18:0)
2
2,1
ME олеиновой кислоты (18:1)
15
17,1
ME линолевой кислоты (18:2)
1
1,1
ME линоленовой кислоты (18:3)
1
1,1
ME арахидоновой кислоты (20:0)
1
1,2
ME бегеновой кислоты (22:0)
1
1,2
ME лигноцериновой кислоты (24:0)
1
1,2
Tm
Прогнозируемая точка плавления Смеси 2, P, рассчитанная методами по изобретению, составляет -24,3°С.
ПРИМЕР 3
Смесь 3 метиловых эфиров жирных кислот
Смесь метиловых эфиров жирных кислот ("Смесь 3"), имеющую состав метиловых эфиров жирных кислот, указанный в таблице ниже, получают путем смешивания вместе метиловых эфиров жирных кислот, используя объемы, представленные в таблице, для изготовления 100 г Смеси 3.
Компонент
Смесь 3
мл/100 г
ME капроновой кислоты (6:0)
1
1,1
ME каприловой кислоты (8:0)
5
5,7
ME каприновой кислоты (10:0)
35
40,1
ME лауриновой кислоты (12:0)
30
34,5
ME миристиновой кислоты (14:0)
5
5,8
ME пальмитиновой кислоты (16:0)
2
2,3
ME стеариновой кислоты (18:0)
2
2,1
ME олеиновой кислоты (18:0)
15
17,1
ME линолевой кислоты (18:2)
1
1,1
ME линоленовой кислоты (18:3)
1
1,1
ME арахидоновой кислоты (20:0)
1
1,2
ME бегеновой кислоты (22:0)
1
1,2
ME лигноцериновой кислоты (24:0)
1
1,2
Tm
Прогнозируемая точка плавления Смеси 3, P, рассчитанная методами по изобретению, составляет -15,0°С.
ПРИМЕР 4
Смесь 4 метиловых эфиров жирных кислот
Смесь метиловых эфиров жирных кислот ("Смесь 4"), имеющую состав метиловых эфиров жирных кислот, указанный в таблице ниже, получают путем смешивания вместе метиловых эфиров жирных кислот, используя объемы, представленные в таблице, для изготовления 100 г Смеси 4.
Компонент
Смесь 4
мл/100 г
ME капроновой кислоты (6:0)
1%
1,1
ME каприловой кислоты (8:0)
5
5,7
ME каприновой кислоты (10:0)
30
34,4
ME лауриновой кислоты (12:0)
30
34,5
ME миристиновой кислоты (14:0)
5
5,8
ME пальмитиновой кислоты (16:0)
7
8,2
ME стеариновой кислоты (18:0)
2
2,1
ME олеиновой кислоты (18:0)
15
17,1
ME линолевой кислоты (18:2)
1
1,1
ME линоленовой кислоты (18:3)
1
1,1
ME арахидоновой кислоты (20:0)
1
1,2
ME бегеновой кислоты (22:0)
1
1,2
ME лигноцериновой кислоты (24:0)
1
1,2
Tm
Прогнозируемая точка плавления Смеси 4, P, рассчитанная методами по изобретению, составляет -11,9°С.
ПРИМЕР 5
Смесь масел А
Смесь двух масел ("Смесь 4"), имеющую жирнокислотный состав, указанный ниже, получают смешиванием вместе кокосового масла и масла Cuphea lanceolata, имеющего жирнокислотный состав, указанный ниже.
Компонент
Смесь А
Масло куфеи ланцетовидной
Кокосовое масло
капроновая кислота (6:0)
0,4%
0
0,5
каприловая кислота (8:0)
5,5
0,6
7,1
каприновая кислота (10:0)
25
83,2
6
лауриновая кислота (12:0)
36
2,1
47,1
миристиновая кислота (14:0)
14
2
18,5
пальмитиновая кислота (16:0)
7,7
3,4
9,1
стеариновая кислота (18:0)
2,1
0
2,8
олеиновая кислота (18:0)
6,0
3,4
6,8
линолевая кислота (18:2)
2,6
4,6
1,9
линоленовая кислота (18:3)
0,1
0,1
арахидоновая кислота (20:0)
0,1
0,1
бегеновая кислота (22:0)
0
0
0
лигноцериновая кислота (24:0)
0
0
0
Смесь А можно получить, смешивая 75% масс. вышеуказанного кокосового масла с 25% масс. вышеуказанного масла Cuphea lanceolate. 25 г масла куфеи ланцетовидной (25 г/0,92 г/мл = 27,2 мл) комбинируют с 75 г соевого масла (75 г/0,924 г/мл = 81,2 мл) для изготовления 100 г Смеси А.
ПРИМЕР 6
Превращение масел в FAMES
Различные типы имеющегося в продаже растительного масла (включая соевое, каноловое, кукурузное, макадамии, оливковое, сафлоровое, подсолнечное, арахисовое, грецкого ореха, пальмовое, кокосовое и касторовое масло) получали из розничной торговли. 200 г каждого масла взвешивали в стеклянном флаконе с завинчивающейся крышкой и объединяли с 2 объемами (масс./об.) реагента метилат натрия (5% масс./об. метилата натрия/метанол). После смешивания в течение 2 часов при комнатной температуре добавляли 50 мл гексана, интенсивно перемешивали, и фазам давали возможность разделиться. Нижний глицеринсодержащий слой удаляли и отбрасывали. Верхний слой обрабатывали под вакуумом в роторном испарителе для удаления гексана и любых оставшихся летучих компонентов. Готовый раствор FAME хранили в атмосфере газообразного азота при комнатной температуре в плотно закрытом стеклянном флаконе.
ПРИМЕР 7
Превращение жирных кислот в FAMES
100 грамм различных жирных кислот или смесей жирных кислот взвешивали в стеклянном флаконе и объединяли с 200 мл смеси безводный метанол/1% серная кислота. Каждую смесь помещали под газообразный азот и контейнер плотно закрывали. Флакон с реакционной смесью помещали в термостат на 4 ч при 50°С. Во время инкубации смесь периодически встряхивали для смешивания реагентов. Смесь перемещали в стеклянную делительную воронку и объединяли с 100 мл 5% (масс./об.) водного раствора хлорида натрия. Смесь интенсивно встряхивали и фазам давали возможность разделиться при стоянии. Нижний водный слой удаляли и отбрасывали. Верхний слой перемещали в чистый сухой флакон и комбинировали с 5 г безводного сульфата натрия. Эту смесь интенсивно встряхивали до тех пор, пока не были удалены все видимые водяные капельки. Затем смесь фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman 1. Сульфат натрия и фильтровальный аппарат промывали гексаном для извлечения дополнительного FAME и промывные воды добавляли к неводной фракции. Комбинированный фильтрат и промывные воды помещали в роторный испаритель под вакуум для удаления гексана и оставшихся летучих веществ. Готовый раствор FAME перемещали в коричневый стеклянный флакон, помещали под газообразный азот, плотно закрывали покрытой тефлоном крышкой и хранили при 4°С. Другие эфиры синтезировали, используя этот протокол, используя этанол, н-пропанол, изопропанол, н-бутанол, вторичный бутанол, или трет-бутанол вместо метанола, использованного выше.
ПРИМЕР 8
Низкотемпературное тестирование смесей алкиловых эфиров
Низкотемпературные свойства алкиловых эфиров и эфирных смесей тестировали путем пипетирования аликвот чистых алкиловых эфиров или эфирных смесей, полученных из масел или жирных кислот, как описано выше, в 10 мм × 100 мм стеклянные пробирки, до общего объема 1,0 мл. Пробирки закрывали полипропиленовыми колпачками и помещали в пластиковые штативы. Помещенные в штативы пробирки затем погружали на глубину 1-2 см выше верха образца в охлажденный раствор 50% этиленгликоль/вода. Использовали ряд водных бань для последовательно исследуемых образцов при 0, -10, -15, -20, и -25°С. Образцы выдерживали при исследуемой температуре в течение 1 ч и каждую пробирку вынимали и проверяли на присутствие мутности, отвердевание и характеристики застывания/текучести. Кроме того, отобранные образцы отсылали в лабораторию независимого тестирования (Intertek-Caleb-Brett Laboratories) и оценивали точку застывания, точку помутнения и предельную температуру фильтруемости, используя подходящие стандартные методы ASTM для дизельного топлива (ASTM D-97-06, ASTM D-2500-05 и ASTM D6371). Точки помутнения эфиров и эфирных смесей также определяли, используя портативный анализатор точки помутнения дизельного топлива, модель СРА-ТЗО (Phase Technology Corp.). 10 мл пластиковый шприц заполняли эфиром или эфирной смесью и впрыскивали в устройство. Через 10 минут показывало точное значение температуры точки помутнения.
ПРИМЕР 9
Точки плавления масел из семян В100 и дизельного топлива №2
Ряд биодизельных жидкостей В100 (алкиловых эфиров жирных кислот) получали из растительных масел, включающих соевое, каноловое, кукурузное, макадамии, оливковое, сафлоровое, подсолнечное, арахисовое, грецкого ореха, пальмовое, кокосовое и касторовое масла, согласно способам, описанным в Примере 6. Эти виды топлива сравнивали с полученным в продаже нефтяным дизельным топливом №2 (Shell Oil Co., San Diego, CA) в отношении свойств хладотекучести, согласно способам, описанных в Примере 8. Результаты выдерживания каждой жидкости при различных температурах между +20 и -20°С представлены в таблице ниже, которая показывает, представляла ли собой текучая среда жидкость или твердое вещество после выдерживания при данной температуре в течение 1 ч (точка застывания). Дизельное топливо оставалось жидким до -15°С, но было твердым через 1 ч при -20°С. Напротив, метиловые эфиры жирных кислот из растительного масла отвердевали при более низких температурах. Метиловый эфир пальмового масла был твердым при +5°С. Лучшими являлись эфиры из растительного масла канолы и кастрового, которые представляли собой твердые вещества при -15°С. Таким образом, ни один из метиловых эфиров растительного масла не имел низкотемпературных свойств, равных дизельному топливу или целевой точки помутнения ниже -20°С.
Основное масло
%
RT
0°С
-10°С
-15°С
-20°С
СОЯ
100
L
L
S
S
S
КАНОЛА
100
L
L
L
CL
S
КУКУРУЗА
100
L
L
S
S
S
МАКАДАМИЯ
100
L
S
S
S
S
ОЛИВА
100
L
L
S
S
S
САФЛОР
100
L
L
S
S
S
ПОДСОЛНЕЧНИК
100
L
CL
S
S
S
АРАХИС
100
L
S
S
S
S
ГРЕЦКИЙ ОРЕХ
100
L
L
S
S
S
ПАЛЬМА
100
L
S
S
S
S
КОКОС
100
L
L
S
S
S
КЛЕЩЕВИНА
100
L
L
L
S
S
ДИЗЕЛЬНОЕ ТОПЛИВО №2
100
L
L
L
L
L
Обозначения:L = жидкостьS = твердое веществоCL = мутная жидкостьРТ = комнатная температура
ПРИМЕР 10
С8 и С10 FAMES снижают точку плавления соевого и канолового В100
Низкотемпературные свойства метиловых эфиров из растительного масла улучшали путем добавления метиловых эфиров короткоцепочечных жирных кислот. Метиловый эфир соевого масла представлял собой твердое вещество при -10°С. Если 30% (об./об.) метилового эфира С8 (метилоктаноат) добавляли к метиловому эфиру соевого масла, смесь оставалась жидкой при -10°С. Если содержание метилового эфира С8 увеличивали до 60% (об./об.), то смесь оставалась жидкой до -20°С. Добавление метилового эфира С10 (метилдеканоат) оказывало такое же влияние на точку застывания метилового эфира из соевого масла. Низкотемпературные показатели метилового эфира из канолового масла также улучшали путем добавления метиловых эфиров с короткой цепью. Добавление 40% метилового эфира С8 к метиловому эфиру канолового масла снижало наблюдаемую точку застывания до -20°С. Добавление метилового эфира С10 к каноловому маслу оказывало аналогичное влияние на наблюдаемые точки застывания. Добавление смеси эфиров С8/С10 к метиловым эфирам канолового или соевого масла также снижало точку застывания смеси.
Базовое масло
%
С8МЕ
С10МЕ
RT
0°С
-10°С
-15°C
-20°C
СОЯ
100
0
L
L
S
S
S
СОЯ
90
10
L
L
S
S
S
СОЯ
80
20
L
L
S
S
S
СОЯ
70
30
L
L
S
S
S
СОЯ
60
40
L
L
L
S
S
СОЯ
50
50
L
L
L
S
S
СОЯ
100
0
L
L
S
S
S
СОЯ
90
10
L
L
S
S
S
СОЯ
80
20
L
L
S
S
S
СОЯ
70
30
L
L
L
S
S
СОЯ
60
40
L
L
L
S
S
СОЯ
50
50
L
L
L
S
S
СОЯ
40
60
L
L
L
L
L
СОЯ
30
70
L
L
L
L
L
СОЯ
20
80
L
L
L
L
L
СОЯ
10
90
L
L
L
L
L
КАНОЛА
100
0
L
L
CL
S
S
КАНОЛА
90
10
L
L
CL
S
S
КАНОЛА
80
20
L
L
CL
CL
S
КАНОЛА
70
30
L
L
L
CL
S
КАНОЛА
60
40
L
L
L
CL
CL
КАНОЛА
50
50
L
L
L
CL
CL
КАНОЛА
40
60
L
L
L
L
CL
КАНОЛА
30
70
L
L
L
L
L
КАНОЛА
20
80
L
L
L
L
L
КАНОЛА
10
90
L
L
L
L
L
КАНОЛА
0
100
L
L
L
L
L
КАНОЛА
100
0
L
L
CL
S
S
КАНОЛА
90
10
L
L
CL
S
S
КАНОЛА
80
20
L
L
CL
CL/S
S
КАНОЛА
70
30
L
L
L
CL
CL
КАНОЛА
60
40
L
L
L
CL
CL
КАНОЛА
50
50
L
L
L
CL
CL
Обозначения:L = жидкостьS = твердое веществоCL = мутная жидкостьКТ = комнатная температураС8МЕ = метилоктаноатС10МЕ = метилдеканоат
ПРИМЕР 11
Характеристики плавления различных биодизельных смесей на основе
необработанных масел В2-В100
Также тестировали в отношении низкотемпературных свойств смеси дизельного топлива с метиловыми эфирами из растительного масла. Тестировали дизельное топливо с 2% (В2), 5% (B5), 20% (В20) (об./об.) метилового эфира из растительного масла, наряду с чистым метиловым эфиром из растительного масла (В100). Добавление метилового эфира из растительного масла к дизельному топливу не оказывало наблюдаемого влияния на точки застывания смесей, за исключением смесей В20. Каноловое, касторовое и соевое масло не влияли на точку застывания В20, в то время как масла кукурузы, оливы, сафлора, подсолнечника, арахиса, пальмы и кокоса все повышали наблюдаемые точки застывания смесей В20 по сравнению с чистым дизельным топливом.
Базовое масло
RT
0°С
-10°С
-15°С
-20°С
СОЯ В2
L
L
L
L
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
S
S
В100
L
L
S
S
S
КАНОЛА В2
L
L
L
L
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
L
S
В100
L
L
S
S
S
КУКУРУЗА В2
L
L
L
L
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
S
S
В100
L
L
S
S
S
ОЛИВА В2
L
L
L
L
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
S
S
В100
L
L
S
S
S
САФЛОР В2
L
L
L
L
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
L
S
В100
L
L
S
S
S
ПОДСОЛНЕЧНИК В2
L
L
L
L
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
S
S
В100
L
L
S
S
S
АРАХИС В2
L
L
L
L
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
S
S
В100
L
S
S
S
S
ПАЛЬМА В2
L
L
L
S
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
S
S
В100
L
S
S
S
S
КОКОС В2
L
L
L
L
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
L
S
В100
L
L
S
S
S
КАСТОР В2
L
L
L
L
S
В5
L
L
L
L
S
В20
L
L
L
L
S
В100
L
L
L
S
S
Обозначения:В2 = 2% метилового эфира + 98% дизельного топлива №2В5 = 5% метилового эфира + 95% дизельного топлива №2В20 = 20% метилового эфира + 80% дизельного топлива №2В100 = 100% метилового эфираL = жидкостьS = твердое вещество
ПРИМЕР 12
Влияние насыщенных длинных цепочек на точку плавления
Метиловые эфиры жирных кислот тестировали на поведение в условиях низких температур, как подробно рассказано выше. В таблице ниже показан результат добавления насыщенных длинноцепочечных жирных кислот к метиловому эфиру С18:1 (метилоктадеценоат). Чистый метиловый эфир С18:1 представляет собой жидкость при -20°С, но добавление метилового эфира С18:0 (метилоктадеканоат) повышает наблюдаемую точку застывания до +5°С с 2% С18:0, присутствующим в смеси; при 1% С18:0 точка застывания смеси составляет 0°С. Аналогично, смеси С16 с С18:1 значительно повышают точку застывания. Смесь 9% (об./об.)метилового эфира С16 (метилгексадеканоат) с 91% С18:1 представляла собой твердое вещество при -5°С. Содержание С16:0 3% приводило к затвердеванию при -15°С. Метиловый эфир С14:0 (метилтетрадеканоат) при концентрациях 1% приводил к затвердеванию при -20°С, а 30% С14:0 затвердевали при -10°С. Смеси с С12:0 (метилдодеканоат) демонстрировали интересный и неожиданный результат. При уровнях С12 1-5% смеси представляли собой твердое вещество при -20°С, но при уровнях 6-20% смеси С12 с С18:1 оставались жидкими при -20°С. Следовательно, присутствие С12:0 в биодизельном топливе в количестве 6-20%; или более предпочтительно в количестве 6-10%, оказывает неожиданный полезный эффект на свойства хладотекучести. Таким образом, несмотря на то что насыщенные длинноцепочечные FAME значительно повышали точку застывания смесей с С18:1, С14 оказывали намного меньшее влияние, а С12 почти не оказывали влияния при концентрациях вплоть до 20% (об./об.).
С12МЕ
С14МЕ
С16МЕ
С18МЕ
С18:1МЕ
RT
0°С
-10°С
-15°С
-20°C
1
99
L
L
L
L
S
2
98
L
L
L
L
S
3
97
L
L
L
L
S
4
96
L
L
L
L
S
5
95
L
L
L
L
S
6
94
L
L
L
L
CL
7
93
L
L
L
L
CL
8
92
L
L
L
L
CL
9
91
L
L
L
L
CL
10
90
L
L
L
L
CL
1
99
L
L
L
L
S
2
98
L
L
L
L
S
3
97
L
L
L
L
S
4
96
L
L
L
L
S
5
95
L
L
L
L
S
6
94
L
L
L
L
S
7
93
L
L
L
L
S
8
92
L
L
L
L
S
9
91
L
L
L
L
S
10
90
L
L
L
L
S
1
99
L
L
L
L
S
2
98
L
L
L
L
S
3
97
L
L
L
S
S
4
96
L
L
L
S
S
5
95
L
L
L
S
S
6
94
L
L
L
S
S
7
93
L
L
L
S
S
8
92
L
L
CL
S
S
9
91
L
L
S
S
S
10
90
L
L
S
S
S
1
99
L
L
CL
S
S
2
98
L
CL
S
S
S
3
97
L
CL
S
S
S
4
96
L
CL
S
S
S
5
95
L
S
S
S
S
6
94
L
S
S
S
S
7
93
L
S
S
S
S
8
92
L
S
S
S
S
9
91
L
S
S
S
S
10
90
L
S
S
S
S
Обозначения:L = жидкостьS = твердое веществоCL = мутная жидкостьКТ = комнатная температураС12МЕ = метилдодеканоатС14МЕ = метилтетрадеканоатС16МЕ = метилгексадеканоатС18МЕ = метилоктадеканоатС18:1МЕ = метилоктадеценоат
ПРИМЕР 13
Генетически модифицированное рапсовое растение
9
9
Рапсовое растение генетически модифицируют для продуцирования масла с нужным балансом среднецепочечных жирных кислот и мононенасыщенных жирных кислот, как обсуждается в данном описании изобретения, а именно: рапсовое растение генетически модифицируют так, чтобы иметь относительно повышенные уровни коротко/среднецепочечных жирных кислот; относительно повышенные уровни мононенасыщенных жирных кислот С16:0 и С18:0; и относительно пониженные уровни полиненасыщенных жирных кислот С18:2 и С18:3. Выполняют следующие генетические модификации: (1) Активность Δ12 десатуразы снижают, используя олигонуклеооснования генной репарации для введения стоп-кодона в кодирующую последовательность гена FAD2 для снижения уровня линоленовой кислоты (18:3) и линолевой кислоты (18:2), а также для повышения уровня олеиновой кислоты (18:1); (2) активность гена Δ-стеароил-ацил-АСР-десатуразы модифицируют путем преобразования рапсового растения Δ-стеароил-ацил-АСР-геном из макадамии (Macadamia integrifofia) для повышения уровней пальмитолеиновой кислоты (16:1); (3) активность кетоацил-АСР-синтазы (KASII) снижают, используя олигонуклеооснования генной репарации для внедренния стоп-кодона в кодирующую последовательность гена KASII; (4) субстратную специфичность пальмитоил-тиоэстеразы (РТЕ) изменяют для увеличения активности в отношении каприлоил-АСР (С8), капроил-АСР (С10) и лауроил-АСР (С12) и, в свою очередь, повышения уровней коротко- и среднецепочечных жирных кислот путем трансформации рапсового растения геном ацил-АСР-тиоэстеразы куфеи, имеющей специфичность к цепочкам с короткой длиной. Генетически модифицированное рапсовое растение продуцирует масло, имеющее следующий жирнокислотный состав: С8 составляет примерно 5% масла; С10 составляет примерно 5% масла; С12 составляет примерно 15% масла; С16:1 и С18:1 вместе составляют примерно 70% масла; и каждый из С14:0, С16:0, С18:0, С18:2 и С18:3 составляет менее 1% масла. Метиловый эфир масла представляет собой жидкость при приблизительно -20°С.
Если не установлено иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании изобретения, имеют то же самое значение, которое обычно понятно любому специалисту в данной области техники, к которой относится данное изобретение.
Изобретения, иллюстративно изложены в данном описании изобретения, могут подходящим образом быть осуществлены на практике в отсутствие любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, не раскрытых конкретно в данном описании изобретения. Таким образом, например, термины "содержащий", "включающий", "составляющий" и так далее должны читаться в широком смысле и без ограничения. Кроме того, термины и выражения, используемые в данном описании изобретения, использовали в качестве терминов описания, но не ограничения, и нет намерения использовать такие термины и выражения для исключения любых эквиваленты признаков, показанных и описанных или каких-либо их частей, но следует учитывать, что возможны различные модификации в рамках объема заявленного изобретения.
Таким образом, следует понимать, что, хотя изобретение конкретно раскрыто предпочтительными воплощениями, и специалисты в данной области техники могут прибегать к раскрытым в данном описании изобретения возможным аспектам, модификациям, усовершенствованиям и вариациям изобретений, воплощенным здесь, и предполагается, что такие модификации, усовершенствования и вариации входят в рамки данного изобретения. Вещества, способы и примеры, предложенные здесь, представляют собой пример предпочтительных воплощений, являются типичными, и не предполагаются для ограничения объема изобретения.
В данном документе изобретение описано в общем и широко. Каждый из более узких видов и субродовых групп, входящий в рамки общего описания изобретения, также составляет часть изобретения. Оно включает общее описание изобретения при условии или негативном ограничении, исключающем любой объект из рода, независимо от того, конкретно указан или нет исключенный материал.
Кроме того, когда признаки или аспекты изобретения описаны в терминах групп Маркуша, специалистам в данной области техники понятно, что тем самым изобретение также описано в терминах любого отдельного представителя или подгруппы представителей группы Маркуша.
Все публикации, патентные заявки, патенты и другие документы для ссылок, упомянутые в данном описании изобретения, специально включены посредством ссылки во всей их полноте, в той же степени, как если бы каждый из них был включен посредством ссылки в индивидуальном порядке. В случае противоречия настоящее описание изобретения, включающее в себя объяснения, имеет преимущественную силу.