Применение ПААГ - электрофореза при изучении белков с хитиназной активностью

УДК 543.645.6:579.222.3

Е. В. Петухова, А. Ю. Крыницкая

ПРИМЕНЕНИЕ ПААГ - ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПРИ ИЗУЧЕНИИ БЕЛКОВ С ХИТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Ключевые слова: электрофорез, полиакриламидный гель, ренатурация, хитиназа, хитобиаза, коллоидный хитин,

гликольхитин, эндохитиназная активность.

С помощью ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях с последующей ренатурацией и обнаружением хитиназной активности в геле в культуральной жидкости штамма S. marcescens Вй 211 АТСС 9986 выявлены четыре хитиназы с молекулярными массами 58, 52, 38 и 21 кДа, которые индуцируются хитином и митоми-цином С. Биосинтез хитобиазы индуцируется только субстратом и не входит в систему SOS - ответа клетки.

Keywords: electrophoresis, Polyacrylamide gel, renaturation, chitinase, chitobiase, colloidal chitin, glycolytic chitin, endochitinase

activity.

Using PAÄG electrophoresis in denaturing conditions, followed by renaturation and detection of chitinase activity in the gel in the culture fluid of strain S. marcescens VI 211 of ATSS 9986 identified four chitinases with molecular weights 58, 52, 38 and 21 kDa, which are induced by chitin and mitomycin C. The biosynthesis of chitobiase is induced only by the substrate and not part of the SOS - response cells.

Введение

В настоящее время не ослабевает интерес к хи-тинолитическим ферментам. В первую очередь, это обусловлено проблемой гидролиза хитина и его деацетилированного производного - хитозана, которые находят широкое применение в пищевой промышленности, косметологии, медицине, очистке сточных вод. Хитоолигосахариды и олигосахариды хитозана, получаемые с помощью хитинолитиче-ских ферментов, обладают антимикробным и противовоспалительным воздействием; проявляют противоопухолевое действие; стимулируют рост пробио-тических бифидобактерий кишечника [1,2].

Хитоолигосахариды выступают в роли элисито-ров - модуляторов ответных реакций растения на атаку фитопатогенных организмов. Вероятность деградации крупных хитоолигосахаридов, выделяющихся из клеточной стенки гриба, увеличивается при повышении уровня хитинолитических ферментов и способствует снижению уровня ответных реакций. Поэтому хитиназы наряду с хитоолигоса-харидами могут выступать в качестве модуляторов экзогенных сигналов, а также осуществлять эндогенную функцию, принимая участие в процессах морфогенеза растений [3].

Хитиназы выполняют функцию защитных белков, ответственных за противодействие растения стрессу. В частности, при инфицировании патогенным организмом глюканазы и хитиназы отвечают за нарушение нормальной жизнедеятельности патогена [4]. Изучение экспрессии генов хитиназы и хитино-подобного белка CLP, обнаруженных в обонятельной выстилке млекопитающих, показало участие этих белков в иммунном ответе организма [5]. К семейству хитиназ относится не так давно открытый фермент макрофагов человека - хитотриозидаза, функцию которой также связывают с врожденным иммунитетом и защитой от внешних патогенных факторов, содержащих хитин [6].

На современном этапе научных изысканий хитиназы рассматриваются как эффективное средство борьбы с грибами и беспозвоночными, поражающими сельскохозяйственные культуры. Наиболее перспективными для получения биопрепаратов, используемых в данном направлении, являются микроорганизмы [7,8,9,10,11].

Среди бактерий и микромицетов одним из наиболее активных продуцентов внеклеточных хитино-литических ферментов является представитель семейства Enterobacteriaceae Serratia marcescens.

К хитинолитическим ферментам, согласно общепринятой «номенклатуре ферментов», относятся эндохитиназа (КФ 3.2.1.14) и N-ацетил-р-глюкозаминидаза (КФ 3.2.1.30) или хитобиаза. Эн-дохитиназа расщепляет полимерную цепь в случайных местах, хитобиаза - гидролизует концевые N-ацетил-глюкозаминные остатки хитобиозы или более высшего аналога с невостанавливающего конца. Экзохитиназы или хитобиозидазы, пока не имеющие идентификационного номера, последовательно отщепляют молекулы диацетилхитобиозы от нере-дуцирующего конца молекулы хитина. К хитиноли-тическому комплексу относят также хитозаназу, которая гидролизует связь только между остатками глюкозамина .

Целью работы являлось изучение хитинолитиче-ского комплекса Serratia marcescens с применением электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ-электрофорез).

Объекты и методы исследования

В работе использовали пигментообразующий прототрофный штамм S marcescens Вй 211 АТСС 9986 из коллекции бактериальных культур кафедры микробиологии КГУ.

Бактерии выращивали на следующих средах: среда 1 - модифицированная среда Бантинг [12]; среда 2 - среда с коллоидным хитином [13].

Коллоидный хитин получали по методике Чига-лейчика с соавторами [14].

При получении бесклеточного экстракта клетки, осажденные центрифугированием, отмывали 0.14 М раствором ЫаС1 и разрушали многократным замораживанием с последующим оттаиванием. Неразрушенные клетки удаляли центрифугированием.

Хитиназную активность определяли по количеству образующихся при гидролизе хитина редуцирующих сахаров с динитросалициловым реагентом [14]. Активность хитобиазы определяли, используя в качестве субстрата п-нитрофенил-Ы-ацетил-р-Э-глюкозамид [15]. Эндохитиназную активность определяли вискозиметрически по действию на гликоль-хитин, полученный из хитина по методике следующих авторов [16].

Разделение белков проводили с помощью вертикального электрофореза в 12,5 %-ном полиакрила-мидном геле ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия ЭБ-Ыа [17].

Определение хитиназной активности белковых фракций в геле после электрофореза в денатурирующих условиях осуществляли по методике следующих авторов [18].

Результаты и их обсуждение

Исследовано влияние хитина и митомицина С (МС) - индуктора 808-функций клетки на хитиназ-ную активность и активность хитобиазы штамма & marcescens Вй 211 АТСС 9986.

Культуру выращивали на модифицированной среде Бантинг (среда 1) и на солевой среде с коллоидным хитином в качестве единственного источника азота и углерода (среда 2) без МС (контроль) и в присутствии МС в течение 48 часов.

В культуральной жидкости определяли общую хитиназную активность и активность эндохитиназы, а в бесклеточных экстрактах - общую хитиназную активность. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Хитиназная активность S. marcescens Вй 211 АТСС 9986 под влиянием митомицина С и хитина

Варианты Хитиназная активность, ед.- мг-1

опыта белка

ДНС - метод Вискози-метрический метод

Культу- Бескле- Культу-

ральная точный ральная

жидкость экстракт жидкость

Среда 1

Контроль 1.5+0.03 1.6+0.02 13.4+0.25

МС 24.9+0.50 2.0+0.03 216.0+5.0

Среда 2

Контроль 11.0+0.20 2.6+0.03 100.0+3.0

МС 19.7+0.35 2.0+0.02 183.0+4.0

При выращивании бактерий на полноценной среде 1 без добавления хитина и МС в культураль-ной жидкости обнаруживается следовая хитиназная активность. На среде с МС достигается максимальный уровень как общей, так и эндохитиназной ак-

тивности, что свидетельствует об одновременной индукции как эндо-, так и экзохитиназ. Хитин также индуцирует синтез ферментов при добавлении его в среду в качестве единственного источника углерода и азота. Добавление МС в среду с хитином увеличивает активность фермента в 2 раза, в результате достигается величина хитиназной активности, полученная ранее на среде без хитина с добавлением МС.

В бесклеточных экстрактах во всех вариантах наблюдается низкий уровень общей хитиназной активности, что свидетельствует о ненакапливании хитиназ внутри клетки, в том числе в периплазмати-ческом пространстве.

Исследование активности хитобиазы в культу-ральной жидкости и бесклеточных экстрактах 48-часовой культуры (таб. 2), показало, что во всех случаях удельная активность фермента внутри клетки многократно превышает внеклеточную активность. На среде с хитином внутриклеточная хитоби-азная активность в 20-30 раз превышает активность, достигнутую на среде без хитина. МС не индуцирует синтез хитобиазы, в тоже время в культуральной жидкости хитобиазная активность заметно повышается в присутствии МС, что связано, возможно, с изменением проницаемости клеточной мембраны или лизисом клеток.

Таблица 2 - Хитобиазная активность S. marcescens Вй 211 АТСС 9986 под влиянием ми-томицина С и хитина

Варианты опыта Хитобиазная активность, ед. - мг-1 белка

Культуральная Бесклеточный

жидкость экстракт

Среда 1

Контроль 8 + 0.16 109 + 3.2

МС 92 + 2.5 62 + 3.0

Среда 2

Контроль 60 + 1.5 3009 + 48.0

МС 741 + 20.0 263 + 12.0

Состав внеклеточных хитиназ S. marcescens изучали методом электрофореза в 12.5 %-ном ПААГ с гликольхитином в денатурирующих условиях (рис.1) с последующей ренатурацией и обнаружением хитиназной активности в геле с помощью флуоресцентного красителя Calcofluor white M2R (рис.2).

Результаты исследований показали, что при росте исходного штамма в отсутствии индукторов в культуральной жидкости на 12-й час культивирования обнаруживается один белок с хитиназной активностью с М.М. 38 кДа (рис. 1а, 2а). Добавление МС индуцирует синтез большого количества внеклеточных белков (рис.1б), в том числе четырех белков с хитиназной активностью с М.М. 58, 52, 38 и 21 кДа (рис. 2 б). Хитиназы выявляются в культу -ральной жидкости на 12-й час роста культуры (переход к стационарной фазе роста).

Индукция хитиназ при остановке деления клеток в результате блокирования репликации ДНК под влиянием МС свидетельствует о том, что экспрессия

генов, кодирующих эти белки, регулируется по типу SOS - ответа. Одновременный синтез всех четырех хитиназ позволяет предположить, что структурные гены этих ферментов экспрессируются координировано и, по-видимому, находятся под контролем одного белка-репрессора.

20-1 — Ф

12 3 4 а 12345

Рис. 1 - Изменение состава внеклеточных белков в процессе культивирования S. тагсе8сет: а -среда 1, б - среда 1 + МС, М - маркерные белки; время культивирования штамма, час: 1-6, 2-12, 3-18, 4-24, 5-48; цифрами указаны молекулярные массы маркерных белков

л 6

3 4 3 2 I 54 3 2

Рис. 2 - Изменение состава внеклеточных белков с хитиназной активностью в процессе культивирования S. marcescens: а - среда 1, б - среда 1 + МС; время культивирования штамма, час: 1-6, 2-12, 3-18, 4-24, 5-48

Выводы

1. В отсутствии МС и хитина у S. marcescens АТСС 9986 хитинолитические ферменты не синтезируются.

2. Биосинтез хитиназ помимо хитина индуцируется митомицином С - индуктором SOS - функций клетки.

3. В бесклеточных экстрактах хитиназная активность не обнаруживается, что свидетельствует о ненакапливании фермента в периплазматическом пространстве клеток.

4. Биосинтез хитобиазы индуцируется только субстратом и не входит в систему SOS-ответа клетки.

5. В культуральной жидкости обнаруживается четыре белка с хитиназной активностью с М.М. 58, 52, 38 и 21 кДа.

Литература

1. Н.А. Собгайда, В.Ф. Абдулин, Н.А. Влазнева, Д. А. Лав-ренов, К. И. Шайхиева, Вест. Каз. Технол. Ун-та, 17, 14, 397-399 (2014).

2. Н.Г. Васильева, Вест. Каз. Технол. Ун-та, 17, 16, 110111 (2014).

3. И.А. Граскова. Дисс. докт. биол. наук, Сибирский институт физиологии и биохимии растений Ордена Ленина Сибирского отделения РАН, Иркутск, 2008. 329 с.

4. Т.М. Одинцова. Дисс. докт. биол. наук, Инст. общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, 2010. 464 с.

5. Е.В. Ильницкая. Дисс. канд. хим. наук, Инст. биоорг. химии им. Акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва, 2012. 111 с.

6. Т.А. Короленко, М.С. Черканова, Вест. Росс. Акад. мед. наук, 11, 39-45 (2009).

7. О.В. Смирнов, С.Д. Гришечкина, Сельскохозяйственная биология, 3, 123-126

8. А.Ю. Крыницкая, В.С. Гамаюрова, М.Н. Астраханцева, П.П. Суханов, Ю.Е. Седельников, Е.В. Петухова, Вест. Каз. Технол. Ун-та, 7, 181-183 (2011).

9. З.Ю. Сираева, Дисс. канд. биол. наук, Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, 2012. 181 с.

10. Л.А. Овчинникова. Дисс. канд. сельс. наук, Новосибирский государственный аграрный университет, Новосибирск, 2002. 128 с

11. А.А. Беляев, Т.В. Шпатова, М.В. Штерншис, А.В. Ду-жак, З.И. Панфилова. АгроХХ1, 7-9, 23-24

12. Д.В. Юсупова, А.З. Гарейшина, М.И. Беляева, Приклад. биох. и микробиол., 8, 6, 922-926 (1972).

13. А.Г. Чигалейчик, Д.А. Пириева, Приклад. биох. и микробиол., 12, 2, 238-242 (1976).

14. А.Г. Чигалейчик, Д. А. Пириева, С. С. Рылкин, Приклад. биох. и микробиол., 12, 4, 581-586 (1976).

15. И.А. Стояченко, В.П. Варламов, В.А. Даванков, Н.Я. Кобзева, Н.А. Тиунова, А.М. Безбородов, Приклад. биох. и микробиол., 27, 1, 45-52 (1991).

16. H.Yamada, T.A. Imoto, Carbohudr. Res., 92, 160-162 (1981).

17. U.K. Laemmli, Nature (London), 227, 15, 680-685 (1970).

18. J. Trudel, A. Asselin, Anal. Biochem, 189, 2, 249-253 (1990).

© Е. В. Петухова - канд. биол. наук, доц. каф. Пищевой биотехнологии КНИТУ, petel07@yandex.ru; А. Ю. Крыницкая -канд. тех. наук, доц. каф. Пищевой биотехнологии КНИТУ, paulalla@yandex.ru.

© E. V. Petukhova - Ph.D, Associate Professor, Department of Food Biotechnolody, KNRTU, petel07@yandex.ru; A. Y. Krynicka -Ph.D, Associate Professor, Department of Food Biotechnolody, KNRTU, paulalla@yandex.ru.