СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ФЕНИЛПРОПАНОИДОВ В МОРИНГИ МАСЛИЧНОЙ ЛИСТЬЯХ
METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE AMOUNT OF PHENYLPROPANOIDS IN MORINGA OIL LEAVES

Moringa oleifera
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы фенилпропаноидов в моринге масличной листьях ().
Действующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ (1).
Моринги масличной листья обладают широким спектром действия, поэтому могут применятся для профилактики и лечения таких заболеваний, как сердечно-сосудистые, гиперлипидемии и сахарный диабет (2). Проблема стандартизации растительного сырья на основе моринги масличной является достаточно актуальной. Моринга масличная содержит фенилпропаноиды - биологически активные соединения, обладающие противовоспалительными, антиоксидантными, и тонизирующими свойствами (3). В настоящее время для идентификации и количественного определения фенилпропаноидов в лекарственных растениях используют спектрофотометрические методы (4). Они быстры, удобны и не требуют сложного оборудования.
Известен способ количественного определения суммы фенилпропаноидов в траве эхинацеи пурпурной методом прямой спектрофотометрии. Для проведения исследования по данному методу необходимы щавелевая кислота, магнитная мешалка, центрифуги, механический встряхиватель и пластины для тонкослойной хроматографии (5).
Наиболее близким к заявленному способу является способ количественного определения фенолкарбоновых кислот экстракционно-спектрофотометрическим методом (6), взятый за прототип. Данная методика включает в себя трехкратную экстракцию измельченного сырья, упаривание и использование буферного раствора (pH 2,0±0,1), получение этилацетатного извлечения с фильтрованием через безводный натрий сульфат.
Недостатками известного способа является длительность и трудоемкость методики. Как видно из описания, этот способ многостадиен, трудоемок, включает использование токсичного растворителя (этилацетат). В связи с этим целью изобретения является разработка способа определения суммы фенилпропаноидов моринги масличной листьев.
Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы фенилпропаноидов в моринге масличной листьях в пересчете на хлорогеновую кислоту. Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 70% в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:200. Количественное определение суммы фенилпропаноидов в пересчете на хлорогеновую кислоту, моринги масличной листьев проводят при длине волны 330±2 нм.
В случае отсутствия стандартного образца хлорогеновой кислоты содержание суммы фенилпропаноидов (X в процентах) для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения  = 497:
где, D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
W - потеря в массе при высушивании сырья (влажность), %;
497 - удельный показатель поглощения (оптическая плотность раствора вещества с концентрацией 1 г/100 мл в кювете с толщиной слоя 1 см) стандартного образца хлорогеновой кислоты при 330±2 нм.
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно хлорогеновая кислота определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из моринги масличной листьев (фиг., где кривая 1 исходный раствор извлечения из моринги, кривая 2 исходный раствор хлорогеновой кислоты).
Изучение УФ-спектров спиртовых извлечений из моринги масличной листьев показало, что максимумы собственного поглощения фенилпропаноидов спиртовых экстрактов из моринги масличной листьев - 290±2 нм (плечо) и 330±2 нм (максимум). Раствор СО хлорогеновой кислоты имеет максимум поглощения при 330±2 нм и «плечо» при 290±2 нм. Ввиду близкого расположения максимумов поглощения исследуемого извлечения из сырья моринги масличной и вещества-стандарта хлорогеновой кислоты, целесообразным является пересчет содержания суммы фенилпропаноидов на хлорогеновую кислоту с использованием метода прямой спектрофотометрии. Положение максимумов не меняется при использовании в качестве экстрагента этанола 40%, 70% и 95%. Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы фенилпропаноидов в моринги масличной листьях при аналитической длине волны 330±2 нм.
При разработке методики было изучено влияние на выход фенилпропаноидов следующих факторов: степень измельченности сырья, экстрагента, соотношение сырье: экстрагент, длительность и температура экстракции (табл. 1, 2, 3, 4).
Зависимость выхода биологически активных соединений моринги от степени измельченности сырья представлена в таблице 1. Следует отметить, что, по нашим данным, степень измельчения от 0,5 до 2 мм сильного влияния на экстракцию не оказывает. Однако в качестве оптимальной нами выбрана степень измельчения 1 мм.
Таблица 1. Зависимость выхода БАС моринги листьев от степени измельченности сырья
№ п/п
Размер частиц
Содержание суммы фенилпропаноидов в пересчете на абсолютно сухое сырье и хлорогеновую кислоту
1
3,04±0,08%
2
3,07±0,07%
3
3,05±0,12%
4
2,99±0,10%
Проводилось исследование зависимости различных параметров экстракции на выход действующих веществ из сырья. Изучалось влияние экстрагента на процесс экстракции (табл.2). При этом спирт этиловый 70%-ной концентрации был выбран в качестве оптимального экстрагента.
Результаты определения количественного содержания суммы фенилпропаноидов в высушенных моринги листьях представлены в таблице 2.
Таблица 2. Содержание суммы фенилпропаноидов в высушенных моринги листьях, %
№ п/п
Этанол, %
Содержание суммы фенилпропаноидов, %
1.
40
3,01±0,11
2.
70
3,07±0,07
3.
95
2,67±0,08
Результаты исследований по выбору оптимального соотношения «сырье-экстрагент» приведены в таблице 3. Оптимальными параметрами экстракции являются: извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:200.
Таблица 3. Зависимость выхода БАС листьев моринги от соотношения «сырье-экстрагент»
№п/п
Соотношение «сырье-экстрагент»
Содержание суммы фенилпропаноидов, %
1
1:25
3,01±0,10
2
1:50
3,07±0,07
3
1:100
3,12±0,08
4
1:200
3,16±0,09
5
1:300
2,98±0,07
Нами также изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане (табл.4).
Таблица 4. Зависимость выхода БАС листьев моринги от времени настаивания на кипящей водяной бане
№п/п
Время настаивания на кипящей водяной бане
Содержание суммы фенилпропаноидов, %
1
30 мин
3,12±0,10
3
60 мин
3,16±0,09
4
90 мин
3,14±0,07
Полученные результаты позволяют поставить моринги масличной листья по содержанию фенилпропаноидов в один ряд с известными лекарственными растениями - источниками фенилпропаноидов.
Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 60 минут в соотношении «сырье-экстрагент» - 1:200.
Принимая по внимание тот факт, что основным действующим веществом в моринги масличной листьях является хлорогеновая кислота, а максимумы поглощения раствора хлорогеновой кислоты и водно-спиртового извлечения моринги масличной листьев находятся в области - 290±2 нм (плечо) и 330±2 нм (максимум), целесообразным является определение содержания суммы фенилпропаноидов в пересчете на хлорогеновую кислоту при длине волны 330±2 нм.
Способ реализуется следующим образом.
Аналитическую пробу сырья моринги масличной измельчают до размера частиц 1 мм. Около 0,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливали 100 мл экстрагента спирта этилового 70%, присоединяли к обратному холодильнику, нагревали на кипящей водяной бане в течение 60 минут с момента закипания экстрагента в колбе. После охлаждения полученные извлечения фильтровали через бумажный фильтр, смоченный тем же спиртом, отбирая первые 10 мл фильтрата (раствор А). Затем в мерную колбу вместимостью 50 мл помещали 1,0 мл полученного фильтрата и доводили объём экстрагентом до метки (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряли на спектрофотометре при длине волны 330±2 нм. В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый концентрации 70%. Измерение оптической плотности проводят сразу после приготовления раствора.
Содержание суммы фенилпропаноидов в пересчете на хлорогеновую кислоту и воздушно-сухое сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле
,
где D - оптическая плотность испытуемого раствора;
m - масса сырья, г;
W - потеря в массе при высушивании сырья (влажность), %;
497 - удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты при 330±2 нм.
Предлагаемый способ поясняется следующим примером.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц 1,0 мм. Около 0,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливали 100 мл экстрагента спирта этилового 70%, присоединяли к обратному холодильнику, нагревали на кипящей водяной бане в течение 60 минут с момента закипания экстрагента в колбе. После охлаждения полученные извлечения фильтровали через бумажный фильтр (красная полоса), смоченный тем же спиртом, отбирая первые 10 мл фильтрата (раствор А).
Испытуемый раствор для анализа суммы фенилпропаноидов готовят следующим образом: 1,0 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 70% (испытуемый раствор). В качестве раствора сравнения использовали спирт этиловый концентрации 70%.
После измерения оптической плотности извлечения из моринги масличной листьев при длине волны 330±2 нм, содержание суммы фенилпропаноидов (X в процентах) в пересчете на хлорогеновую кислоту и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле, используя теоретическое значение удельного показателя поглощения хлорогеновой кислоты  = 497:
,
где 0,1394 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,490 - масса сырья, г;
11 - потеря в массе при высушивании сырья (влажность), %;
497 - удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты при 330±2 нм.
Содержание суммы фенилпропаноидов в пересчете на хлорогеновую кислоту = 3,16%.
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±3,07%.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы фенилпропаноидов в пересчете на хлорогеновую кислоту в моринге листьях с использованием прямой спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный метод является более специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно 70% этиловым спиртом, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (фенилпропаноиды).
2. Пересчет суммы фенилпропаноидов идет на специфическое для моринги листьев вещество - хлорогеновую кислоту.
3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±3,07%, что свидетельствует об объективности разработанного способа и высокой точности.
Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа моринги масличной листьев (Moringa oleifera Lam.).
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). - 3-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт»; ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - 1279 с.
2. Fahey, J.W. Moringa oleifera: A review of the medical evidence for its nutritional, therapeutic, and prophylactic properties. Part 1. Trees for Life Journal. - 2005. - №1. - 5 р.
3. Куркин В.А. Фенилпропаноиды лекарственных растений. Распространение, классификация, структурный анализ, биологическая активность // Химия природ. соединений. 2003. № 2. С. 87-110.
4. Куркин В.А., Авдеева Е.В. Проблемы стандартизации растительного сырья и препаратов, содержащих фенилпропаноиды // Фармация. 2009. Т. 57 (1). С. 51-54.
5. Государственная фармакопея 14 издание. Электронное издание. - 2018. URL:http://femb.ru/femb/pharmacopea.php [Gosudarstvennaya farmakopeya 14 izdanie. State Pharmacopoeia 14th edition. Elektronnoe izdanie. - 2018. URL:http://femb.ru/femb/pharmacopea.php.
6. Ларькина М.С., Кадырова Т.В., Ермилова Е.В. Изучение динамики накопления фенолкарбоновых кислот в надземной части василька шероховатого // Химия растительного сырья. 2008. №3. С. 71-74.
7. Курдюков Е.Е., Водопьянова О.А., Митишев А.В., Моисеев Я.П., Семенова Е.Ф. Методика количественного определения суммы фенилпропаноидов в сырье стевии // Химия растительного сырья. 2020. №3. С. 115-121. DOI: 10.14258/jcprm.2020037141.