КОМПЛЕКСНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОТДАЛЕННЫХ ПОСЛЕДСТВИЙ ОТРАВЛЕНИЙ МЕТГЕМОГЛОБИНОБРАЗОВАТЕЛЯМИ
COMPLEX MEDICATION FOR TREATMENT OF REMOTE EFFECTS OF POISONING BY METHEMOGLOBIN GENERATORS

Изобретение относится к области медицины, в частности к новым комплексным средствам, предназначенным для лечения отравлений метгемоглобинобразователями (МГО).
Метгемоглобинемия - одна из тяжелых форм токсической патологии крови при воздействии МГО, приводящая к развитию вторичной тканевой гипоксии и требующая немедленной терапии и коррекции отдаленных последствий [Hall A.H., Kulig K.W., Rumack B.H. Drug-and chemical-induced methaemoglobinaemia: clinical features and management. - Med. Toxicol. - 1986. - №1. - pp. 253-260].
Известен препарат «Адаптовит», содержащий в своем составе семена лимонника, который может быть использован для профилактики функциональных расстройств и заболеваний, обусловленных, в том числе, воздействием на организм МГО [RU №2114628]. Однако, помимо антигипоксического действия, учитывая весь комплекс патологических синдромов, развивающихся вследствие отравлений МГО, желательно наличие у лечебного средства, применяющегося в терапевтических целях, выраженных антиоксидантных свойств системного характера (метаболической коррекции). Таким средством может являться препарат цитофлавин - метаболический корректор с выраженным антиоксидантным действием, выпускаемый в промышленных масштабах и широко использующийся в качестве метаболического средства, применяемого в комплексной терапии хронической ишемии головного мозга 1-2 стадии и астенического синдрома [Копцов С.В., Вахрушев А.Е., Павлов Ю.В. Современные аспекты применения антигипоксантов в медицине критических состояний [Новые Санкт-Петербургские врачебные ведомости, 2002. - №2. - С.54-56, Афанасьев В.В. Цитофлавин в интенсивной терапии: Пособие для врачей. - СПб., 2005. - 36 с.].
Задачей настоящего изобретения является создание комплексного средства, включающего сухой экстракт из плодов и семян лимонника, стандартизированный по содержанию суммы лигнанов не менее 2,5% (далее - лимонник) и цитофлавин, с целью расширения арсенала средств, предназначенных для лечения отдаленных последствий отравлений метгемоглобинобразователями (МГО) на основе доступного отечественного сырья.
Способ приготовления сухого экстракта: 100,0 г высушенных плодов с семенами лимонника китайского измельчают до размеров частиц, проходящих сквозь сито 1-2 мм. Количественно переносят в перколятор и проводят извлечение экстрактивных веществ в градиенте спирта этилового от 35 до 90% (массо-объемное соотношение). Мацерационная пауза составляет 12 часов. Соотношение сырья и экстрагента без учета влагопоглощения составляет 1:50. Полученные вытяжки объединяют и проводят сгущение под уменьшенным давлением до соотношения 1:10, после чего направляют в установку получения сухого экстракта методом сушки в псевдоожижженом слое. Полученные экстракты плодов и семян лимонника хранят плотно укупоренными в склянках темного стекла в эксикаторе.
Полученный экстракт стандартизировали в соответствии с нормативной документацией [Государственная Фармакопея Российской Федерации, издание XII / «Издательство «Научный центр экспертизы средств медицинского применения», 2008 г. - 704 с.: ил.] на физико-химические методы исследования лекарственных препаратов. Содержание суммы действующих веществ сухого экстракта из плодов и семян лимонника (лигнаны, в пересчете на схизандрин) определяли методом высоко-эффективной жидкостной хроматографии. Количество лигнанов вычисляли по площади под кривой поглощения основного пика схизандрина, используя ГСО в качестве калибратора.
Для изучения эффективности готовили композиции, содержащие цитофлавин и лимонник, следующим образом: фиксированные комбинации - смешивали сухой экстракт лимонника с субстанцией цитофлавина в соотношениях 1:2-21; свободные комбинации - смешивали сухой экстракт лимонника с субстанцией цитофлавина в различных пропорциях. Полученные смеси использовали для приготовления растворов.
Фармакологические исследования проводили на нелинейных мышах самцах и крысах самцах линии Sprague-Dawley. Экспериментальные животные содержались в стандартных условиях вивария.
Для введения животным ежедневно готовили ряд растворов комбинации сухого экстракта из плодов и семян лимонника с цитофлавином путем растворения компонентов комбинаций в физиологическом растворе натрия хлорида. Животным вводили изучаемые комбинации внутрижелудочно из расчета оптимального объема 0.1 мл на 10 г массы тела [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, М.: «Медицина», 2005 г, с.41-54]. Во всех экспериментах использовали растворы комбинаций лимонника с цитофлавином, приготовленные по вышеуказанной технологии.
Примеры, подтверждающие эффективность предлагаемого комплексного средства для лечения отдаленных последствий отравления МГО в сравнении с лимонником, представлены ниже (примеры 1-4).
Пример 1. Применение комплексного средства при острой гипоксической гипоксии. Острую гипоксическую гипоксию, возникающую в результате недополучения кислорода при его дефиците во вдыхаемом воздухе, воспроизводили на модели острой гипобарической гипоксии (ОГБГ) [Лукьянова Л.Д., Гацура В.В., Пастушенков Л.В. и др. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических веществ. М. МЗ СССР, Одобрены Фармакологическим комитетом 11.04.1990. (протокол №7)]. Животных помещали в барокамеру с приточно-вытяжной вентиляцией и создавали разряжение воздуха, соответствующее высоте 11000 м над уровнем моря. Скорость подъема составляла 50 м/с. У животных уже на высоте 3000 м начиналось беспокойство, появлялись цианоз, одышка и тремор. В дальнейшем развивались судороги, перемежавшиеся периодами мышечной слабости и адинамии. Гибель наступала от остановки дыхания. Каждая экспериментальная группа состояла из 10 мышей самцов. Изучаемые препараты и их комбинации вводили ежедневно в течение 14 дней атравматичным зондом внутрижелудочно. Контрольным животным вводили воду. На 14-й день опыта, через 60 минут после последнего введения изучаемых соединений, осуществляли «подъем» животных в барокамере на предельную «высоту» 11000 м над уровнем моря. Регистрировали продолжительность жизни и выживаемость животных. Полученные результаты представлены в таблице 1. Анализ полученных данных установил, что оба препарата проявили антигипоксическое действие в условиях ОГБГ. Максимальное увеличение выживаемости и длительности жизни обеспечивало введение комплекса, состоящего из цитофлавина и лимонника. Выживаемость при этом составила 90%, что превосходило результаты, полученные при введении каждого препарата по отдельности. Таким образом, имел место аддитивный синергизм.
Пример 2. Применение комплексного средства при острой тканевой (гистотоксической) гипоксии (ОТГ). Тканевую (гистотоксическую) гипоксию, возникающую в результате невозможности усвоения кислорода тканями, воспроизводили путем блокады цитохромоксидазы - фермента терминального участка дыхательной цепи нитропруссидом натрия в рекомендованной дозе 20 мг/кг [Лукьянова Л.Д., Гацура В.В., Пастушенков Л.В. и др. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических веществ. М. МЗ СССР, Одобрены Фармакологическим комитетом 11.04.1990. (протокол №7)]. Каждая экспериментальная группа состояла из 10 мышей самцов. Изучаемые препараты и их комбинации вводили ежедневно в течение 14 дней атравматичным зондом внутрижелудочно. На 14-й день опыта через 30 минут после последнего введения изучаемых соединений животным внутрибрюшинно вводили раствор нитропруссида натрия. Регистрировали продолжительность жизни и выживаемость животных. При введении комбинации цитофлавина с лимонником в дозах 10-100 мг/кг и 2.35-100.0 мг/кг, соответственно, было выявлено потенцирование эффекта, поскольку удалось добиться выживаемости животных, чего не наблюдали ни в одной из других групп (таблица 2).
Пример 3. Применение комплексного средства с лимонником при острой гемической гипоксии (ОГГ). Острую гемическую гипоксию, возникающую в результате уменьшения кислородной емкости гемоглобина, воспроизводили путем отравления животных метгемоглобино-образователем натрия нитритом в дозе 300 мг/кг [Лукьянова Л.Д., Гацура В.В., Пастушенков Л.В. и др. Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических веществ. М. МЗ СССР. Одобрены Фармакологическим комитетом 11.04.1990. (протокол №7)]. Каждая экспериментальная группа состояла из 10 мышей самцов. Изучаемые препараты вводили ежедневно в течение 14 дней атравматичным зондом внутрижелудочно. На 14-й день опыта через 30 минут после последнего введения изучаемых соединений животным внутрибрюшинно вводили раствор нитрита натрия в дозе 300 мг/кг. При моделировании гемической гипоксии у животных контрольной группы через 2-3 минуты после введения нитрита натрия появлялись одышка, цианоз слизистых оболочек и кожных покровов, развивалось дыхание Чейна-Стокса. У части животных наблюдались клонико-тонические судороги.
На модели острой гемической гипоксии практически полностью воспроизвелись результаты, полученные в условиях тканевой гипоксии (таблица 3). Была выявлена выживаемость животных, которая составила 10-20% при отсутствии таковой на фоне монотерапии, при сочетанном введении препаратов в широком диапазоне доз, а продолжительность жизни животных была достоверно выше, чем на фоне монотерапии цитофлавином или лимонником.
Таким образом, была доказана возможность достижения аддитивного синергизма, а на моделях гемической и тканевой гипоксии и потенцирования антигипоксического эффекта, при сочетанном применении цитофлавина и лимонника.
50
Пример 4. Применение комплексного средства при субхроническом отравлении анилином. Анилина гидрохлорид (A) вводили в дозе 500 мг/кг (доза, равная ½ ЛД) внутрижелудочно ежедневно в течение 10-ти дней. В этот же период времени, ежедневно, за 2 часа до поступления анилина, внутрижелудочно в виде водных растворов вводили изучаемые препараты и их комбинации. Каждая экспериментальная группа содержала по 10 крыс-самцов. Полученные данные представлены в таблицах 4-6. Как следует из данных, представленных в таблицах, выраженный эффект получен в диапазоне доз для цитофлавина от 10 до 200 мг/кг и от 2.35 до 23.50 мг/кг для лимонника. Их действие реализовывалось на различных этапах патогенеза гипоксии, вызванной токсическим действием анилина. Так, цитофлавин в большей степени воздействовал на показатели тканевого дыхания, преимущественно усиливая дегидрогеназную активность, и способствовал восстановлению двухвалентного железа за счет увеличения пула глутатиона. В действии лимонника, в большей мере проявилась мембранопротекторная активность. При совместном введении этих препаратов их действие при отравлении анилином усиливалось, что выражалось в нормализации оцениваемых показателей, а оптимальными дозами ингредиентов явились 2.35 мг/кг (для лимонника) и 50 мг/кг (для цитофлавина) - комбинация с соотношением компонентов 1:21.
Таблица 1
Результаты сравнительной оценки антигипоксической активности предлагаемого комплексного средства и его компонентов у мышей самцов в условиях ОГБГ
Экспериментальные группы
Доза, мг/кг
Время жизни на предельной высоте, мин (M±m)
Прирост времени жизни, %
Выживаемость, %
Контроль
-
4.3±0,1
-
0
Цитофлавин
1.0
10.9±0.1
+154
0
Цитофлавин
10.0
11.4±0.4*
+165
10
Цитофлавин
50.0
12.1±0.3*
+181
20
Цитофлавин
100.0
13.2±0.1*
+206
40
Цитофлавин
200.0
14.8±0.1*
+244
40
Лимонник
0.05
12.8±0.5*
+197
40
Лимонник
2.35
16.9±0.8*
+293
80
Лимонник
4.70
17.6±0.6*
+309
80
Лимонник
23.5
18.1±0.9*
+321
60
Лимонник
47.0
15.7±0.6*
+265
60
Лимонник
100.0
15.9±0.6*
+265
60
Цитофлавин + лимонник
200+0.05
16.2±0.5*
+276
50
Цитофлавин + лимонник
200+2.35
16.4±0.9*
+281
50
Цитофлавин + лимонник
200+4.70
14.0±0.7*
+225
40
Цитофлавин + лимонник
200+23.5
13.1±0.5*
+204
40
Цитофлавин + лимонник
200+47.0
12.7±0.8*
+295
40
Цитофлавин + лимонник
200+100.0
12.7±0.8*
+295
40
Цитофлавин + лимонник
100+0.05
16.6±0.8*
+286
50
Цитофлавин + лимонник
100+2.35
17.3±0.8*
+302
60
Цитофлавин + лимонник
100+4.70
17.8±0.4*
+313
60
Цитофлавин + лимонник
100+23.5
18.3±0.5*
+325
70
Цитофлавин + лимонник
100+47.0
18.9±0.7*
+439
70
Цитофлавин + лимонник
100+100.0
18.9±0.7*
+439
70
Цитофлавин + лимонник
50+0.05
19.8±0.5*
+360
90
Цитофлавин + лимонник
50+2.35
19.3±0.8*
+349
90
Цитофлавин + лимонник
50+4.70
19.2±0.6*
+346
90
Цитофлавин + лимонник
50+23.5
19.6±1.1*
+355
80
Цитофлавин + лимонник
50+47.0
16.3±1.0*
+279
50
Цитофлавин + лимонник
50+100.0
16.3±1.0*
+279
50
Цитофлавин + лимонник
10+2.35
18.1±1.2*
+321
70
Цитофлавин + лимонник
10+4.70
17.1±0.8*
+298
60
Цитофлавин + лимонник
10+23.5
15.6±0.7*
+262
50
Цитофлавин + лимонник
10+47.0
14.1±0.8*
+228
40
Цитофлавин + лимонник
10+100.0
14.1±0.8*
+228
40
Цитофлавин + лимонник
1.0+2.35
15.9±1.1*
+269
50
Цитофлавин + лимонник
1.0+4.70
15.4±0.9*
+258
50
Цитофлавин + лимонник
1.0+23.5
16.0±0.7*
+272
60
Цитофлавин + лимонник
1.0+47.0
14.2±1.4*
+230
40
Цитофлавин + лимонник
1.0+100.0
14.1±1.4*
+230
40
Примечание: -*- p≤0.05 по отношению к контролю
Таблица 2
Результаты сравнительной оценки антигипоксической активности предлагаемого комплексного средства и его компонентов у мышей самцов в условиях ОТГ
Экспериментальные группы
Доза, мг/кг
Длительность жизни в мин (M±m)
Прирост времени жизни, %
Выживаемость, %
Контроль
-
6.3±0.3
-
0
Цитофлавин
100.0
26.0±0.7
+313
0
Лимонник
4.70
12.3±0.6
+95
0
Цитофлавин + лимонник
200+0.05
26.8±1.4
+325
0
Цитофлавин + лимонник
200+2.35
29.0±1.2
+360
10
Цитофлавин + лимонник
200+4.70
27.4±1.5
+335
10
Цитофлавин + лимонник
200+23.5
28.9±0.9
+359
0
Цитофлавин + лимонник
200+47.0
25.0±2.3
+297
0
Цитофлавин + лимонник
200+100.0
25.0±2.3
+297
0
Цитофлавин + лимонник
100+0.05
26.0±0.7
+312
0
Цитофлавин + лимонник
100+2.35
29.0±1.0
+360
0
Цитофлавин + лимонник
100+4.70
28.8±0.9
+357
10
Цитофлавин + лимонник
100+23.5
30.5±0.8*
+384
10
Цитофлавин + лимонник
100+47.0
33.8±1.2*
+436
20
Цитофлавин + лимонник
100+100.0
33.8±1.2*
+436
20
Цитофлавин + лимонник
50+0.05
29.3±0.8*
+365
10
Цитофлавин + лимонник
50+2.35
30.3±0.9*
+380
20
Цитофлавин + лимонник
50+2.35
30.3±0.9*
+380
20
Цитофлавин + лимонник
50+4.70
24.2±0.7
+284
0
Цитофлавин + лимонник
50+23.5
28.2±0.8*
+348
10
Цитофлавин + лимонник
50+47.0
29.2±1.5*
+363
10
Цитофлавин + лимонник
50+100.0
29.1±1.5*
+363
10
Цитофлавин + лимонник
10+0.05
28.0±0.8
+344
0
Цитофлавин + лимонник
10+2.35
29.7±1.2
+371
10
Цитофлавин + лимонник
10+4.70
31.8±1.0
+404
10
Цитофлавин + лимонник
10+23.5
30.1±1.7
+378
10
Цитофлавин + лимонник
10+47.0
32.1±1.1*
+318
10
Цитофлавин + лимонник
10+100.0
32.12±1.1*
+318
10
Примечания. Отличия во всех опытных группах существенны по отношению к контролю. *- p≤0.05 по отношению к цитофлавину
Таблица 3
Результаты сравнительной оценки антигипоксической активности предлагаемого комплексного средства и его компонентов у мышей самцов в условиях ОГГ
Экспериментальные группы
Доза, мг/кг
Длительность жизни в мин (M±m)
Прирост времени жизни, %
Выживаемость, %
Контроль
-
10.1±0.3
-
0
Цитофлавин
100.0
36.1±0.6*
+257
0
Лимонник
4.70
29.2±0.4*
+189
0
Цитофлавин + лимонник
200+0.05
30.5±1.4
+202
0
Цитофлавин + лимонник
200+2.35
47.3±1.2
+368
10
Цитофлавин + лимонник
200+4.40
39.0±1.4
+286
0
Цитофлавин + лимонник
200+23.6
38.7±0.8
+283
0
Цитофлавин + лимонник
200+47.0
38.2±1.0
+279
0
Цитофлавин + лимонник
200+100.0
38.2±1.0
+279
0
Цитофлавин + лимонник
100+0.05
38.8±0.7
+284
0
Цитофлавин + лимонник
100+2.35
41.0±1.0*
+306
10
Цитофлавин + лимонник
100+4.70
44.8±1.2*
+343
10
Цитофлавин + лимонник
100+23.5
42.4±1.1*
+320
10
Цитофлавин + лимонник
100+47.0
40.8±1.6*
+303
10
Цитофлавин + лимонник
100+100.0
40.8±1.6*
+303
10
Цитофлавин + лимонник
50+0.05
46.2±1.3*
+357
10
Цитофлавин + лимонник
50+2.35
56.3±1.8*
+457
20
Цитофлавин + лимонник
50+4.70
49.2±1.4*
+387
10
Цитофлавин + лимонник
50+23.5
52.1±1.1*
+415
20
Цитофлавин + лимонник
50+47.0
42.5±0.6*
+321
10
Цитофлавин + лимонник
50+100.0
42.5±0.6*
+321
10
Цитофлавин + лимонник
10+0.05
37.3±1.2
+269
0
Цитофлавин + лимонник
10+2.35
39.6±1.0*
+292
10
Цитофлавин + лимонник
10+4.70
41.8±1.2*
+313
10
Цитофлавин + лимонник
10+23.5
42.8±1.5*
+324
10
Цитофлавин + лимонник
10+47.0
40.1±1.3*
+297
10
Цитофлавин + лимонник
10+100.0
40.1±1.3*
+297
10
Примечания. Отличия во всех опытных группах существенны по отношению к контролю. *- p≤0.05 по отношению к цитофлавину
Таблица 4
Влияние предлагаемого комплексного средства и его компонентов на летальность крыс самцов в условиях субхронической интоксикации анилином
Экспериментальные группы
Пало животных/всего
Летальность, %
Контроль (вода)
0/8
0.0
А, 500 мг/кг
3/8
37.5
А+Ц, 100 мг/кг
0/8
0.0
А+Л, 4.7 мг/кг
0/8
0.0
А+Ц+Л, 200+2.35 мг/кг
0/8
0.0
А+Ц+Л, 100+4.70 мг/кг
0/8
0.0
А+Ц+Л, 50+2.35 мг/кг
0/8
0.0
А+Ц+Л, 10+23.5 мг/кг
0/8
0.0
Таблица 5
Влияние предлагаемого комплексного средства и его компонентов на уровень метгемоглобина и гемопигментов в периферической крови в условиях субхронической интоксикации анилином
Экспериментальные группы
MetHb, %
Гемопигменты, мкг/л
Контроль (вода)
1.6±0.4
67.0±14.0
А, 500 мг/кг
19.4±1.6*
738.0±41.0*
А+Ц, 100 мг/кг
6.9±0.8*<sup>∧</sup>
336.0±57.0*<sup>∧</sup>
А+Л, 4.7 мг/кг
10.1±1.2*<sup>∧</sup>
288.0±43.0*<sup>∧</sup>
А+Ц+Л, 200+2.35 мг/кг
5.9±1.1*<sup>∧</sup>
159.0±15.0*<sup>∧</sup>
А+Ц+Л, 100+4.70 мг/кг
5.4±0.9*<sup>∧</sup>
144.0±14.0*<sup>∧</sup>
А+Ц+Л, 50+2.35 мг/кг
4.2±0.7*<sup>∧</sup>
112.0±17.0*<sup>∧</sup>
А+Ц+Л, 10+23.5 мг/кг
4.4±0.6*<sup>∧</sup>
123.0±15.0*<sup>∧</sup>
Примечание - * - p≤0.05 по отношению к группе интактных животных; <sup>∧</sup> - p≤0.05 по отношению к группе животных, не получавших лечения
Таблица 6
Влияние предлагаемого комплексного средства и его компонентов на показатели функционального состояния печени и почек крыс в условиях субхронической интоксикации анилином
Экспериментальные группы
Билирубин общий, мкмоль/л
АлАТ, ммоль/ч·л
АсАТ, ммоль/ч·л
ЩФ, нмоль/с·л
Мочевина, ммоль/л
Контроль (вода)
10.60±0.40
0.23±0.06
0.38±0.10
308±41
4.90±0.50
А г/х, 500 мг/кг
24.50+1.80*
4.64±0.45*
2.81±0.41*
1789+102 *
9.90±0.60*
А+Ц, 100 мг/кг
13.40±0.90*<sup>∧</sup>
1.39±0.26*<sup>∧</sup>
1.16±0.51*<sup>∧</sup>
689±58*<sup>∧</sup>
6.40±0.20*<sup>∧</sup>
А+Л, 4.70 мг/кг
11.40±1.10<sup>∧</sup>
1.35±0.61 *<sup>∧</sup>
1.28±0.33*<sup>∧</sup>
885±92*<sup>∧</sup>
5.90±0.70<sup>∧</sup>
А+Ц+Л, 200+2.35 мг/кг
12.90±1.20<sup>∧</sup>
1.49±0.22*<sup>∧</sup>
1.24±0.31*<sup>∧</sup>
656±54*<sup>∧</sup>
6.30±0.40*<sup>∧</sup>
А+Ц+Л, 100+4.70 мг/кг
11.80±1.40<sup>∧</sup>
1.22±0.10*<sup>∧</sup>
1.10±0.12*<sup>∧</sup>
652±47*<sup>∧</sup>
7.10±0.80*<sup>∧</sup>
А+Ц+Л, 50+2.35 мг/кг
11.20±1.70<sup>∧</sup>
1.79±0.18*<sup>∧</sup>
1.42±0.27*<sup>∧</sup>
841±67*<sup>∧</sup>
6.50±0.60*<sup>∧</sup>
А+Ц+Л, 10+23.5 мг/кг
12.40±1.40<sup>∧</sup>
1.81±0.13*<sup>∧</sup>
1.65±0.19*<sup>∧</sup>
856±52*<sup>∧</sup>
7.20±0.90*<sup>∧</sup>
Примечание - * - p≤0.05 по отношению к интактным животным; <sup>∧</sup> - p≤0.05 по отношению к группе животных, не получавших лечения