СПОСОБЫ УЛУЧШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОДНОВРЕМЕННО ПРОТЕКАЮЩИХ РЕАКЦИЙ ОСАХАРИВАНИЯ И ФЕРМЕНТАЦИИ

1. Способ одновременных осахаривания и ферментации (SSF), включающий культивирование полной среды для ферментации, причем указанная полная среда для ферментации содержит по меньшей мере один ферментирующий микроорганизм, по меньшей мере одну ксилан-содержащую биомассу, по меньшей мере одну целлюлазу, по меньшей мере одну гемицеллюлазу и по меньшей мере один фермент с обращающей β-ксилозидазной активностью, в течение периода и при условиях, пригодных для получения продукта ферментации.
2. Способ по п.1, где полная среда для ферментации содержит такое эффективное количество обращающей β-ксилозидазы, чтобы полная среда для ферментации давала меньше алкил-β-ксилопиранозида («AXP») с кототкой цепью по сравнению с контрольной средой для ферментации без обращающей β-ксилозидазы.
3. Способ по п.1 или 2, где полная среда для ферментации содержит такое эффективное количество обращающей β-ксилозидазы, чтобы полная среда для ферментации давала по меньшей мере на 40%, 50%, 60% или 70% меньше AXP по сравнению с контрольной средой для ферментации без обращающей β-ксилозидазы.
4. Способ по п.1, где AXP представляет собой метил-β-ксилопиранозид (“MXP”), этил-β-ксилопиранозид (“EXP”), пропил-β-ксилопиранозид (“PXP”) или бутил-β-ксилопиранозид (“BXP”).
5. Способ по п.1, где полная среда для ферментации содержит эффективное количество обращающей β-ксилозидазы для увеличения выхода продукта ферментации, по сравнению с выходом продукта ферментации, при культивировании контрольной среды для ферментации без обращающей β-ксилозидазы.
6. Способ по п.5, где выход продукта ферментации увеличивается по меньшей мере на 1%, 2%, 5%, 7,5% или 10%.
7. Способ по п.1, где продукт ферментации представляет собой спирт.
8. Способ по п.7, где спиртом является метанол, этанол, пропанол, пропан-1,3-диол или бутанол.
9. Способ по п.1, где обращающая β-ксилозидаза представляет собой фермент семейства GH43.
10. Способ по п.9, где обращающая β-ксилозидаза является полипептидом Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A или XynB3.
11. Способ по п.10, где:
полипептид Fv43D имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:2 или остаткам с 21 по 350 SEQ ID NO:2;
полипептид Pf43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:8 или 21-445 остаткам SEQ ID NO:8;
полипептид Fv43E имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:10 или 19-530 остаткам SEQ ID NO:10;
полипептид Fv43B имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:12 или 17-574 остаткам SEQ ID NO:12;
полипептид Af43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:14 или 15-558 остаткам SEQ ID NO:14;
полипептид Fo43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:24 или 21-348 остаткам SEQ ID NO:24;
полипептид Gz43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:22 или 19-340 остаткам SEQ ID NO:22; и
полипептид XynB3 имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:25.
12. Способ по п.1, где обращающая β-ксилозидаза присутствует в полной среде для ферментации в концентрации от 0,3 мг до 10 мг, от 0,4 мг до 10 мг или от 0,3 мг до 3 мг на грамм ксилана в ксилан-содержащей биомассе.
13. Способ по п.1, который представляют в качестве непрерывного, периодического или с подпиткой процесса SSF.
14. Способ по п.1, дополнительно включающий этап образования полной среды для ферментации.
15. Способ по п.14, где этап образования полной среды для ферментации, включает комбинирование (a) ферментирующего микроорганизма, (b) ксилан-содержащей биомассы, (c) целлюлазы, (d) гемицеллюлазы, (e) обращающей β-ксилозидазы и (f) средой без одного или более компонентов (a)-(e).
16. Способ по п.15, где целлюлаза присутствует в форме препарата общей целлюлазы.
17. Способ по п.16, где препарат общей целлюлазы включает гемицеллюлазу.
18. Способ по п.16, где препарат общей целлюлазы является культуральной жидкостью, полученной в результате культивирования мицелиального гриба.
19. Способ по п.18, где мицелиальный гриб представляет собой T. reesei.
20. Способ по п.19, где T. reesei сконструирован так, чтобы нативный ген β-ксилозидазы был удален или инактивирован.
21. Способ по п.1, где ферментирующим микроорганизмом является гриб.
22. Способ по п.21, где грибом являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae.
23. Способ по п.1, где ферментирующим микроорганизмом является бактерия.
24. Способ по п.23, где бактерией является Zymomonas mobilis.
25. Способ по п.1, где ксилан-содержащая биомасса представляет собой, например, кукурузную солому, багассы, сорго, арундо тростниковый, пеннисетум красный, мискантус, криптомерию японскую, солому пшеницы, просо прутьевидное, целлюлозу из лиственной древесины или целлюлозу из хвойной древесины.
26. Способ по п.25, где ксилан-содержащая биомасса находится в виде суспензии.
27. Способ по п.25, где ксилан-содержащую биомассу предварительно обработали.
28. Способ по п. 1 или 24, дополнительно включающий этап восстановления продукта ферментации.
29. Способ по п.1, где полная среда для ферментации включает большее количество обращающих β-ксилозидаз, чем количество сохраняющих β-ксилозидаз, в расчете на моль, в расчете на молекулярный вес или в расчете, и на моль, и на молекулярный вес.
30. Способ по п.29, где отношение обращающих β-ксилозидаз к сохраняющим β-ксилозидазам в полной среде для ферментации составляет по меньшей мере 2:1, в расчете на моль, в расчете на молекулярный вес, или в расчете, и на моль, и на молекулярный вес.
31. Клетка T. reesei, которая была сконструирована так, чтобы нативный ген β-ксилозидазы был удален или, чтобы она не обладала определяемой β-ксилозидазной активностью.
32. Клетка T. reesei по п.31, которая конструируют для рекомбинантной экспресии ферментов GH43 семейства.
33. Клетка T. reesei по п.31, которая конструируют для рекомбинантной экспресии полипептида Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A или XynB3.
34. Клетка T. reesei по п.33, где:
полипептид Fv43D имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:2 или 21-350 остаткам SEQ ID NO:2;
полипептид Pf43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:8 или 21-445 остаткам SEQ ID NO:8;
полипептид Fv43E имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:10 или 19-530 остаткам SEQ ID NO:10;
полипептид Fv43B имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:12 или 17-574 остаткам SEQ ID NO:12;
полипептид Af43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:14 или 15-558 остаткам SEQ ID NO:14;
полипептид Fo43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:24 или 21-348 остаткам SEQ ID NO:24;
полипептид Gz43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:22 или 19-340 остаткам SEQ ID NO:22; и
полипептид XynB3 имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:25.
35. Способ получения препарата целлюлазы, содержащего культивирование клетки T. reesei по любому из пп.32-34 при условиях, которые приводят к получению препарата целлюлазы.
36. Способ по п.35, дополнительно включающий восстановление препарата целлюлазы.
37. Препарат целлюлазы, полученный способом по пп.35 или 36.
38. Культуральная жидкость, полученная с помощью культивирования клетки T. reesei по любому из пп.32-34.
39. Способ осахаривания биомассы, включающий контактирование биомассы с препаратом целлюлозы по п.37.
40. Способ осахаривания биомассы, включающий контактирование биомассы с культуральной жидкостью по п.38.
41. Композиция, включающая, по меньшей мере один ферментирующий микроорганизм, по меньшей мере одну ксилан-содержащую биомассу, по меньшей мере одну целлюлазу, по меньшей мере одну гемицеллюлазу и по меньшей мере одну обращающую β-ксилозидазу.
42. Композиция по п.41, где обращающая β-ксилозидаза представляет собой фермент семейства GH43.
43. Композиция по п.41, где обращающая β-ксилозидаза является полипептидом Fv43D, Pf43A, Fv43E, Fv43B, Af43A, Fo43A, Gz43A или XynB3.
44. Композиция по п.43, где:
полипептид Fv43D имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:2 или 21-350 остаткам SEQ ID NO:2;
полипептид Pf43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:8 или 21-445 остаткам SEQ ID NO:8;
полипептид Fv43E имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:10 или 19-530 остаткам SEQ ID NO:10;
полипептид Fv43B имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:12 или 17-574 остаткам SEQ ID NO:12;
полипептид Af43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:14 или 15-558 остаткам SEQ ID NO:14;
полипептид Fo43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:24 или 21-348 остаткам SEQ ID NO:24;
полипептид Gz43A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:22 или 19-340 остаткам SEQ ID NO:22; и
полипептид XynB3 имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:25.
45. Композиция по п.41, где ксилан-содержащая биомасса представляет собой, например, кукурузную солому, багассы, сорго, арундо тростниковый, пеннисетум красный, мискантус, криптомерию японскую, солома пшеницы, просо прутьевидное, целлюлозу из лиственной древесины или целлюлозу из хвойной древесины.
46. Композиция по п.41, где ферментирующим микроорганизмом является гриб или бактерия.
47. Композиция по п.46, где грибом являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae.
48. Композиция по п.46, где бактерией является Zymomonas mobilis.
49. Композиция по п.41, где целлюлаза присутствует в форме препарата общей целлюлазы.
50. Композиция по п.49, где препарат целлюлазы включает гемицеллюлазу.
51. Композиция по п.41, где композиция по существу не содержит сохраняющую β-ксилозидазую или не обладает определяемой сохраняющей β-ксилозидазной активностью.
52. Способ получения продукта ферментации, включающий культивирование композиции по любому из пп.41-51 в течение периода времени.
53. Способ по п.52, где продуктом ферментации является спирт.
54. Способ по п.53, где спиртом является метанол, этанол, пропанол, пропан-1,3-диол или бутанол.
55. Способ одновременных осахаривания и ферментации (SSF), включающий культивирование полной среды для ферментации, указанная полная среда для ферментации, содержащая по меньшей мере один ферментирующий микроорганизм, по меньшей мере одну ксилан-содержащую биомассу, по меньшей мере одну целлюлазу, по меньшей мере одну гемицеллюлазу и по меньшей мере одну сохраняющую β-ксилозидазу, на время и при условиях, подходящих для образования алкил-β-ксилопиранозида («AXP»)
56. Способ по п.55, где полная среда для ферментации содержит такое эффективное количество сохраняющих β-ксилозидаз, чтобы полная среда для ферментации продуцировала больше AXP, чем контрольная среда для ферментации без обращающей β-ксилозидазы.
57. Способ по п.55, где AXP представляет собой метил-β-ксилопиранозид (“MXP”), этил-β-ксилопиранозид (“EXP”), пропил-β-ксилопиранозид (“PXP”) или бутил-β-ксилопиранозид (“BXP”).
58. Способ по п.55, где сохраняющая β-ксилозидаза является ферментом семейства GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54 или GH116.
59. Способ по п.55, где сохраняющая β-ксилозидаза является полипептидом XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B или XynB.
60. Способ по п.59, где:
полипептид XlnD имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:40 или 18-804 остаткам SEQ ID NO:40;
полипептид Fv30A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:42, или 20-537 остаткам SEQ ID NO:42;
полипептид Fv30B имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:44 или 25-485 остаткам SEQ ID NO:44;
полипептид Fv39A имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:46 или 20-439 остаткам SEQ ID NO:46;
полипептид Fv39B имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:48 или 19-456 остаткам SEQ ID NO:48;
полипептид XynB имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:50;
полипептид XylA имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:52 или 19-705 остаткам SEQ ID NO:52; и
полипептид Xyl1 имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, которая соответствует SEQ ID NO:54.
61. Способ по п.55, который представляют в качестве непрерывного, периодического или с подпиткой процесса SSF.
62. Способ по п.55, дополнительно включающий этап образования полной среды для ферментации.
63. Способ по п.62, где этап образования полной среды для ферментации, включающей комбинирование (a) ферментирующего микроорганизма, (b) ксилан-содержащей биомассы, (c) целлюлазы, (d) гемицеллюлазы, (e) сохраняющей β-ксилозидазы и (f) средой без одного или более компонентов (a)-(e).
64. Способ по п.63, где целлюлаза присутствуют в форме препарата общей целлюлазы.
65. Способ по п.64, где препарат общей целлюлазы содержит гемицеллюлазу.
66. Способ по п.64, где препарат общей целлюлазы является культуральной жидкостью, полученной в результате культивирования мицелиального гриба.
67. Способ по п.66, где мицелиальным грибом является T. reesei.
68. Способ по п.67, где T. reesei сконструирован для сверхэкспрессии нативного гена сохраняющей β-ксилозидазы или для экспрессии чужеродного гена сохраняющей β-ксилозидазы.
69. Способ по п.55, где ферментирующим микроорганизмом является гриб или бактерия.
70. Способ по п.55, где ксилан-содержащая биомасса представляет собой, например, кукурузную солому, багассы, сорго, арундо тростниковый, пеннисетум красный, мискантус, криптомерию японскую, солома пшеницы, просо прутьевидное, целлюлозу из лиственной древесины или целлюлозу из хвойной древесины.
71. Способ по п.70, где ксилан-содержащую биомассу предварительно обработали.
72. Способ по п.55 или 62, дополнительно содержащий этап восстановления AXP соединение.
73. Способ по п.55, где полная среда для ферментации содержит большее количество сохраняющих β-ксилозидаз, чем обращающих β-ксилозидаз, в расчете на моль, в расчете на молекулярный вес или в расчете, и на моль, и на молекулярный вес.
74. Клетка T. reesei, которая была сконструирована так, чтобы ее нативный ген β-ксилозидазы сверхэкспрессировался или, чтобы она экспрессировала чужеродный ген β-ксилозидазы.
75. Клетка T. reesei по п.74, которую конструируют для рекомбинантной экспресии фермента семейства GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54 или GH116.
76. Клетка T. reesei по п.75, которую конструируют для рекомбинантной экспресии полипептида XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA или Xyl1.
77. Способ получения препарата целлюлазы, включающий культивирование клеток T. reesei по любому из пп.74-76 при условиях, которые приводят к получению препарата целлюлазы.
78. Способ по п.77, дополнительно включающий этап восстановления препарата целлюлазы.
79. Препарат целлюлазы полученный выполнением способа по п.77 или 78.
80. Культуральная жидкость, полученная при культивировании клетки T. reesei по одному из пп.74-76.
81. Способ осахаривания биомассы, включающий контактирование биомассы с препаратом целлюлозы по п.79.
82. Способ осахаривания биомассы, включающий контактирование биомассы с культуральной жидкостью по п.80.
83. Композиция, включающая, по меньшей мере один ферментирующий микроорганизм, по меньшей мере одну ксилан-содержащую биомассу, по меньшей мере одну целлюлазу, по меньшей мере одну гемицеллюлазу и по меньшей мере одну сохраняющую β-ксилозидазу.
84. Композиция по п.83, где сохраняющая β-ксилозидаза является ферментом семейства GH3, GH30, GH31, GH39, GH52, GH54 или GH116.
85. Композиция по п.83, где обращающая β-ксилозидаза является полипептидом XlnD, Fv30A, Fv30B, Fv39A, Fv39B, XynB, XylA или Xyl1.
86. Композиция по п.83, где ксилан-содержащая биомасса представляет собой, например, кукурузную солому, багассы, сорго, арундо тростниковый, пеннисетум красный, мискантус, криптомерию японскую, солома пшеницы, просо прутьевидное, целлюлозу из лиственной древесины или целлюлозу из хвойной древесины.
87. Композиция по п.83, где ферментирующим микроорганизмом является гриб или бактерия.
88. Композиция по п.83, где целлюлаза присутствуют в форме препарата общей целлюлазы.
89. Композиция по п.88, где препарат общей целлюлазы включает гемицеллюлазу.
90. Композиция по п.83, где композиция по существу не содержит обращающую β-ксилозидазу или не обладает определяемой обращающей β-ксилозидазной активностью.
91. Способ получения AXP соединения, включающий культивирование композиции по любому из пп.83-90 в течение периода времени.