ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЕ АНТИТЕЛО, СВЯЗЫВАЮЩЕЕ ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА, ДНК, ПЛАЗМИДНАЯ ДНК И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО АНТИТЕЛА
SINGLE-CHAIN ANTIBODY BINDING TUMOUR NECROSIS FACTOR ALPHA, DNA, PLASMID DNA AND METHOD FOR PRODUCING SINGLE-CHAINED ANTIBODY

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению рекомбинантных производных антитела, специфического к фактору некроза опухолей альфа (ФНО-α) человека. Изобретение может быть использовано для лечения аутоиммунных патологий человека, таких как ревматоидный артрит и болезнь Крона.
Антитела, связывающие ФНО-α человека и блокирующие его взаимодействие с рецептором ФНО-α, являются важным терапевтическим средством при лечении таких тяжелых заболеваний, как анкилозирующий спондилит, болезнь Крона, ревматоидный артрит, являются мощным симптоматическим средством при терапии системной красной волчанки, тироидита, а также при отторжениии трансплантата (GVHD).
ФНО-α продуцируется широким спектром тканей и типов клеток, однако важнейшим продуцентом являются активированные макрофаги (Vassalli, Ann. Rev. Immunol. 10: 411-452 (1992)). ФНО-α является растворимым гомотримером, состоящим из 17-кДа субъединиц (Smith, et aL, J. Biol. Chem. 262: 6951-6954 (1987)). ФНО-α также существует в виде 26-кДа мембраносвязанной формы (Kriegler, et al., Cell 53: 45-53 (1988)). При нормальном ответе организма на внешние угрозы ФНО-α является мощным медиатором воспалительного процесса В патологических состояниях выброс ФНО-α сопровождается повреждением тканей, индукцией прокоагуляционной активности клеток сосудистого эндотелия, усиления адгезии нейтрофилов и лимфоцитов и выбросом фактора активации тромбоцитов из макрофагов, нейтрофилов и клеток сосудистого эндотелия (Pober, et al., J. Immunol. 136: 1680-1687 (1986); Pober, et al. J. Immunol. 138: 3319-3324 (1987); Camussi, et al. J. Exp. Med. 166: 1390-1404 (1987)).
Физиологическое и патологическое действие ФНО-а осуществляется при его связывании с двумя трансмембранными клеточными рецепторами, р55 и р75 (Hohmann, et al., J. Biol. Chem. 264: 14927-14934 (1989); Engelmann, et al. J. Biol. Chem. 265: 1531-1536 (1990)). Экстраклеточные домены этих рецепторов, полученные протеолизом или методами генетической инженерии, ингибируют действие ФНО-α (Kohno, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 8331-8335 (1990)).
ФНО-α ассоциирован с целым рядом патологий, таких как неоплазии, инфекционные и аутоиммунные заболевания (Cerami, et al., Immunol. Today 9: 28-31 (1988); Oliff, et al., Cell 50: 555-563 (1987); Piguet, et al., J. Exp. Med. 166: 1280-1289 (1987)). Оверпродукция ФНО-α ответственна за патологические процессы при сепсисе, церебральной малярии и при аутоиммунных заболеваниях, таких как рассеянный склероз, ревматоидный артрит, системная красная волчанка и болезнь Крона.
Кроме того, ФНО-α может быть вовлечен в патогенез опухолей (см обзоры Zhang and Tracey, The Cytokine Handbook, Thomson AW (ed). pp 517-548 (1998)). ФНО-α может опосредовать кахексию при опухолях, инфекционных патологиях и других патологических катаболических состояниях (см обзор Tracey, et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 587: 325-331 (1990)).
Антитела, нейтрализующие активность ФНО-α, были описаны ранее. Такие антитела могут быть использованы для диагностики и терапии заболеваний, связанных с избыточной продукцией ФНО-α. Представителем группы терапевтических антител, нейтрализующих активность ФНО-α, является инфликсимаб (Ремикейд) (патенты США 5,656,272, 5,698,195, 5,919,452). Инфликсимаб используется для терапии следующих болезней:
Крона, ревматоидного артрита, псориатического артрита и анкилозирующего спондилита. Он также может использоваться для базовой или симптоматической терапии ряда патологий иммунной системы и хронических воспалительных процессов, таких как системная красная волчанка, тиреоидоз, аутоиммунный тиреоидит Хашимото, системная склеродерма, аутоиммунный диабет, болезнь Грейвса, язвенный колит, рассеянная сосудистая коагуляция, отторжение трансплантатов, саркоидоз, хроническое воспаление кишечника, атеросклероз и болезнь Кавасаки.
Расширение спектра патологий, к которым применим инфликсимаб, ставит задачу повышения объемов его производства и понижения стоимости продукта. Вместе с тем, создание высокоэффективного продуцента антитела и получение конечного продукта являются дорогостоящими задачами, в силу чего себестоимость препарата весьма высока.
Производство Ремикейда началось более 15 лет назад, в силу чего, и принимая во внимание особенности цикла регистрации фармакопейных препаратов, для получения продуцента были использованы технологии начала 90-х или даже конца 80-х годов. Эти технологии весьма несовершенны и с точки зрения конструирования эффективного продуцента для повышения уровня продукции белка, и с точки зрения оптимизации экспрессии на уровне ДНК и РНК. За последние 5-7 лет появился ряд важных исследований, свидетельствующих о возможности значительного повышения уровня экспрессии целевого белка за счет манипуляций с кодирующей этот белок последовательностью. Показано, что на эффективную экспрессию влияет процент содержания CG-пар. РНК, богатые АТ-парами, менее стабильны и продуцируют меньше копий белка. Кроме того, на стабильность и интактность мРНК влияет целый ряд факторов, таких как наличие внутренних (аберрантных) сигналов сплайсинга, сайтов незаконного полиаденилирования, коротких открытых рамок считывания (микро-ОРС), длинных гомополимерных последовательностей и прочее (http://www.pubmedcentral.mh.gov/articlerender.fcgi?artid=137409 http://bidlab.life.nctu.edu.tw/RegRNA2/website/browse/index.php).
Важную роль могут играть тугоплавкие вторичные структуры мРНК, препятствующие эффективной трансляции областей тугоплавких шпилек РНК. Все эти факторы могут снижать уровень продукции интактной мРНК и уровень продукции белка в несколько раз [PMID: 14959831 geneart PMID: 16971027]. В приложении к антителам, оптимизация последовательности мРНК может повысить уровень продукции белка даже в оптимизированных по экспрессии продуцентах с высоким выходом целевого продукта [PMID: 17172660]. В приложении к Ремикейду задача оптимизации структуры мРНК для повышения уровня продукции белка ранее не решалась. Описанная в патенте США 6277969 последовательность антитела инфликсимаб не подвергалась оптимизации как минимум по нескольким из вышеперечисленных параметров.
Техническим результатом изобретения является создание последовательностей ДНК вариабельных частей антитела инфликсимаб (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2), содержащих кодоны, оптимизированных для высокоэффективной продукции тяжелой и легкой цепей антитела инфликсимаб, и не содержащих критических сайтов сплайсинга, полиаденилирования, дополнительных открытых рамок считывания, автономно реплицирующихся элементов и сайтов узнавания РНК-связывающими белками.
Способ получения антитела, связывающего человеческий фактор некроза опухоли, состоит в том, что в клетку-хозяина вводят плазмидную ДНК SEQ ID NO: 3, кодирующую кодон-оптимизированный вариабельный фрагмент тяжелой цепи антитела инфликсимаб с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 21, культивируют в среде культивирования в условиях, необходимых для продуцирования антитела, с дальнейшим выделением и очисткой указанного одноцепочного антитела, последовательности вариабельных участков которого имеют, по меньшей мере, 99,5%-99,9% идентичности с последовательностями вариабелыных участков легкой и тяжелой цепей антитела инфликсимаб.
Пример 1. Оптимизация последовательности мРНК, кодирующей вариабельные фрагменты тяжелой и легкой цепей антитела инфликсимаб.
Последовательность вариабельных фрагментов легкой цепи антитела инфликсимаб была подвергнута нескольким раундам оптимизации. Исходная последовательность, содержащая кодоны, характерные для генома мыши, была оптимизирована с учетом наиболее часто встречающихся кодонов китайского хомячка с использованием алгоритмов, описанных в работе [PMID: 16376569]. Была использована база данных часто встречающихся кодонов китайского хомячка (http://www.kazusa.or.ip/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=10029). После общей оптимизации использования кодонов в каждом положении был проведен отбор кодонов, характеризующихся одновременно частым использованием и высоким содержанием GС-пар. Например, наиболее часто употребляющиеся триплеты ССС и ССТ кодируют пролин с примерно одинаковой частотой. Для увеличения содержания GC-пар и понижения деградации мРНК из этих двух кодонов выбирался ССС. В ряде случаев, часто употребимые кодоны, полностью состоящие из АТ-нуклеотидов, заменялись вторыми по частоте встречаемости, но состоящими, в основном, из GC-нуклеотидов. Высокое содержание GС-пар эффективно снижает скорость деградации РНК, обеспечивая в клетке повышенный динамический уровень мРНК, кодирующей целевой белок.
По окончании работ с составом кодонов и процентом GC были проведены работы по детекции и удалению криптических донорных и акцепторных сатов сплайсинга мРНК. Сайты сплайсинга представляют собой участки РНК длиной 8-15 нуклеотидов, содержащие донорный (GT) или акцепторный (AG) сайты сплайсинга. Сплайсинг зрелой мРНК по таким криптическим аберрантным сайтам может значительно снижать уровень полноразмерных транскриптов. Анализ сайтов сплайсинга проводили при помощи нескольких различных алгоритмов (PMID: 9278062, PMID: 18269701 PMID: 11222768). Полученные данные использовали для внесения модификаций в оптимизированную по кодонам и GC-составу мРНК.
Преждевременное полиаденилирование приводит к продукции аберрантных мРНК, не кодирующих целевой продукт. Для поиска криптических сайтов полиаденилирования в последовательностях вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей антитела инфликсимаб использовался алгоритм, описанный в работе PMID: 10231571. При обнаружении криптических сайтов полиаденилирования производили их удаление с помощью внесения вариаций в кодоны и повторного тестирования.
Присутствие CpG-островков в мРНК, как правило, не оказывает прямого влияния на эффективность экспрессии. Однако CpG-островки могут быть иммуногенны в составе векторной ДНК, а также могут иметь аберрантный паттерн метилирования [PMID: 16487676], что может негативно сказываться на эффективности экспрессии целевого белка. Поэтому в последовательностях с процентом GС-пар выше, чем 40-50, необходимо анализировать возможность появления CpG-островков и проводить их элиминирование. Анализ наличия CpG-островков проводили при помощи алгоритма, описанного в работе (Rice, P., Longden, I. and Bleasby, A. (2000) EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends Genet, 16, 276-277).
Наличие в составе мРНК так называемых ARE-элементов первого, второго и третьего типа может значительно сокращать время жизни мРНК, снижая уровень экспрессии целевого белка. Как правило, в организме ARE-элементы встречаются в 3'-нетранслируемых областях РНК, в особенности в РНК, кодирующей цитокины PMID: 1398070. В результате манипуляций с последовательностью ДНК в процессе оптимизации возникает отличная от нуля вероятность внесения ARE-элементов в тело мРНК. Для предотвращения образования ARE-элементов последовательность мРНК была сначала подвергнута визуальной инспекции (наличие мотивов AUUUA и подобных им), а затем дополнительно проанализирована в ходе поиска других нежелательных элементов с использованием алгоритма, описанного в работе PMID: 16845041.
Хорошо известно, что развитая вторичная структура РНК с тугоплавкими шпильками затрудняет транскрипцию и особенно трансляцию РНК PMID: 6328446. При повышении уровня GC-пар в последовательности вероятность возникновения тугоплавких шпилек в продуцируемой мРНК существенно возрастает. Поэтому полученные оптимизированные по нескольким параметрам гены проанализировали на наличие тугоплавких шпилек в мРНК. Тугоплавкими считались все шпильки, способные сохранять стабильность при 37°С (энергия более 15 ккал/моль, рассчитанная на основании образования классических уотсон-криквских пар нуклеотидов), иначе говоря, при температуре роста клеток и продукции белка.
Расчеты проводили на основании алгоритма, описанного в работе (Nucleic Acids Res. 31: 3429-3431 (2003)). На основании полученных результатов проводили последовательные замены пар, образующих шпильки (предпочтительно (/ на GC-пары) и повторный анализ вторичной структуры РНК. Циклы повторяли до достижения желаемого результата с точки зрения свободной энергии остаточных вторичных структур РНК.
Наличие в составе мРНК дополнительных рамок считывания (micro-ORF), а также сайтов связывания РНК с различными РНК-взаимодействующими белками может оказывать существенное негативное влияние на эффективность продукции белка, блокируя трансляцию полноразмерного продукта. Поиск микро-ORF и сайтов, потенциально взаимодействующих с РНК-связывающими белками, проводили при помощи алгоритмов, описанных в работе 16845041.
Значительные изменения, вносимые в состав мРНК в процессе описанных выше преобразований, могут генерировать нежелательные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, которые могут в дальнейшем мешать как сборке генов, кодирующих целевой белок, так и переносу их в различные экспрессионные векторы. Поэтому последовательности, кодирующие мРНК обоих фрагментов антитела, тестировали на наличие нежелательных сайтов рестрикции при помощи программы Webcutter 2.0 (http://ma.lundberg.gu.se/cutter2/). Нежелательные сайты рестрикции удаляли с учетом сохранения описанных выше параметров.
Для обеспечения сохранения оптимизированных параметров последовательности мРНК после проведения описанных аналитических и модификационных процедур с полученной последовательностью проводили повторный цикл оптимизации, сохраняя последовательность действий, указанных выше. Если это было необходимо, проводили несколько повторных циклов оптимизации последовательности мРНК. На промежуточных стадиях повторения оптимизационного цикла вводили сайты рестрикции для последующей сборки генов.
Пример 2. Дизайн и синтез олигонуклеотидных последовательностей на основании оптимизированных мРНК вариабельных фрагментов генов иммуноглобулина инфликсимаб.
Сборку последовательностей, кодирующих вариабельные фрагменты антитела инфликсимаб, проводили путем получения отдельных сегментов ДНК и дальнейшего их соединения по сайтам рестрикции. Возможна сборка фрагментов антитела мультиплексным ПЦР, однако, в случае относительно GC-богатых последовательностей, сборка методом мультиплексного ПЦР может приводить к некорректному отжигу фрагментов и появлению точечных мутаций. Поэтому предпочтительным методом сборки является однократная достройка длинных L фрагментов целевых последовательностей, отожженных друг на друга небольшими (15-19 пар нуклеотидов) комплементарными участками с последующим объединением фрагментов при помощи сайтов рестрикции. Дизайн рестриктных сайтов на основе существующей полипептидной последовательности проводят при помощи программы SILMUT. Синтез олигонуклеотидов осуществляют на автоматическом синтезаторе "Glen Research" или аналогичном.
Для конструирования кодон-оптимизированного фрагмента тяжелой цепи антитела инфликсимаб пептидная последовательность вариабельного фрагмента тяжелой цепи была разделена на три субфрагмента. Объединение субфрагментов проводили при помощи лигирования этих субфрагментов, расщепленных в концевых областях эндонуклеазами рестрикции. Сайты для расщепления эндонуклеазами рестрикции были введены в ДНК, используя вырожденность триплетного кодирования аминокислот. Предпочтительными эндонуклеазами для сборки тяжелой цепи являются Sac I, Nco I Xba I, Bgl II и Pst I. Для сборки вариабельной части тяжелой цепи были синтезированы олигонуклеотиды SEQ ID NO: 3-SEQ ID NO: 12. Комплементарная пара, образующая первый субфрагмент, формируется олигонуклеотидами SEQ ID NO: 3-4. Завершение сборки первого субфрагмента проводится амплификацией продукта отжига и достройки олигонуклеотидов SEQ ID NO: 3-4 с помощью олигонуклеотидов SEQ ID NO: 5-6.
Первый субфрагмент, кодирующий N-концевую часть вариабельного фрагмента тяжелой цепи антитела, ограничен сайтами Nco I и Xba I (аминокислотные последовательности АМАЕ и GLE, соответственно). Первый субфрагмент содержит d 5'-концевой области сайт узнавания эндонуклеазы Sac I для сборки с использованием плазмиды pBluescript II SK- и ее полилинкерного участка.
Второй субфрагмент ограничен сайтами Xba I и Bgl II (аминокислоты GLE и TDL). Для сборки второго субфрагмента проводят отжиг и достройку олигонуклеотидов SEQ ID NO: 7-8. Полученный двухцепочечный фрагмент ДНК амплифицируют при помощи ПЦР с пары олигонуклеотидов SEQ ID NO: 9-10.
Третий субфрагмент ограничен сайтами Bgl II и Pst I (аминокислоты TDL и SAG). Для сборки третьего субфрагмента использовали отжиг и достройку олигонуклеотидов SEQ ID NO: 11-12.
Последовательность аминокислот SAG для внесения сайта узнавания эндонуклеазы Pst I является предпочтительной для конструирования одноцепочечного антитела (scFv) на основе вариабельных фрагментов антитела инфликсимаб. Предпочтительными сайтами для конструирования полноразмерного химерного антитела инфликсимаб являются сайты узнавания эндонуклеазами Sac I или Xho I с их изошизомерами, кодирующие аминокислотную последовательность VSS.
Конструирование сегментов ДНК, кодирующей кодон-оптимизированный вариабельный фрагмент легкой цепи, проводилось по аналогичной схеме. Для конструирования вариабельного фрагмента легкой цепи того же антитела синтезируют олигонуклеотиды SEQ ID NO: 13-SEQ ID NO: 18. Предпочтительными эндонуклеазами для сборки являются Barn HI, Kpn I и Eco RI. Сборку проводят на основе вектора pBluescript II SK (-). Схема сборки генов, кодирующих вариабельные фрагменты цепей антитела инфликсимаб, приводится на Фиг.1.
Первый субфрагмент получают отжигом и достройкой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 13-14. Сайт узнавания Вarn HI кодируется в составе аминокислот GS в линкере, являющемся составной частью одноцепочечного антитела (scFv) и является предпочтительным для конструирования scFv и клонирования в эту конструкцию вариабельного фрагмента легкой цепи. Сайт узнавания Kpn I первого субфрагмента легкой цепи кодируется в составе аминокислот WYQ.
Второй субфрагмент получают отжигом и достройкой олигонуклеотидов SEQ ID NO: 15-16. Второй (3'-концевой) сайт узнавания Kpn I второго фрагмента кодируется в составе аминокислот GT.
4
Третий субфрагмент получали при отжиге и достройке олигонуклеотидов SEQ ID NO: 17-18. 5'-концевой сайт Kpn I кодируется в составе аминокислот GT. 3'-концевой сайт EcoR I является предпочтительным для конструирования scFv на основе вариабельных фрагментов антитела инфликсимаб. Области ДНК, кодирующие аминокислотную последовательность 3'-концевой области рекомбинантного конструкта, а также область пептидного линкера (GGGS) между вариабельными фрагментами легкой и тяжелой цепи антитела инфликсимаб, кодируются фрагментом ДНК, полученным при отжиге и достройке олигонуклеотидов SEQ ID NO: 19-20. Все субфрагменты ДНК, составляющие ДНК вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей после получения расщепляют соответсвующими эндонуклеазами рестрикции и лигируют друг с другом (Пример 3 и Фиг.1)
Пример 3. Сборка фрагментов ДНК, кодирующих цепи рекомбинантного антитела инфликсимаб.
Отжиг и достройка частично комплементарных олигонуклеотидов при помощи фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. Coli для получения предшественников фрагментов цепей.
Олигонуклеотиды HCHRev1 и HCHForl, HCHRev2 и HCHFor2, HCHFor3Bgl и HCHRev3Pst, LCHlForBam и LCHRevKpRI, LCH2ForKpn и LCH2RevKpn, LCH3ForKpn и LCH3RevRI (no 20 пм каждого) смешивают попарно с однократным буфером для фрагмента Кленова и 0.25 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатами (ATGC) в конечном объеме 50 мкл. Смесь нагревают до 90°С и медленно охлаждают в ДНК-амплификаторе до 45°С в течение 20 мин и с 45°С до комнатной температуры в течение 10 мин. После окончания отжига немедленно добавляют 1 единицу активности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli и инкубируют при 37°С в течение 30 минут.
Полимеразная цепная реакция для достройки предшественников фрагментов цепей и встраивания сайтов узнавания эндлонуклеаз рестрикции.
Фрагменты ДНК, представляющие собой предшественники фрагментов цепей, полученные отжигом и достройкой праймеров HCHRevl и HCHForl, HCHRev2 и HCHFor2, применяют в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции с целью получения фрагментов тяжелой цепи, используемых при сборке. Смесь для полимеразной цепной реакции содержит буфер для Pwo-полимеразы и 1 единицу активности Pwo-полимеразы (Roches), 0.2 мМ дезоксинуклеотидтрифосфатов (ATGC) и праймеры HCHForSacNc и HCHRevlXba (для продукта отжига и достройки первой пары праймеров) либо HCHFor2Xba и НСН Rev2 Bgl (для продукта отжига и достройки второй пары праймеров). Количество каждого праймера в реакции составляет 20 пМ. Полимеразная цепная реакция состоит из 25 циклов 30 секундной денатурации, отжига праймеров на матрице при 56°С в течение 30 секунд и 30 секунд элонгации последовательности ДНК.
Обработка синтезированных фрагментов ДНК эндонуклеазами рестрикции и киназой фага Т4 и очистка продуктов рестрикции в акриламидном геле.
Для получения липких концов ДНК, используемых при клонировании фрагментов цепей, фрагменты цепей антитела, полученные в результате отжига и достройки либо полимеразной цепной реакции, обрабатывают смесью фенол-хлороформ, осаждают тремя объемами этанола и расщепляют эндонуклеазами рестрикции (1 фрагмент тяжелой цепи Sad и Xbal, 2 фрагмент тяжелой цепи Xbal, 3 фрагмент тяжелой цепи BglII и PstI, второй фрагмент легкой цепи Kpnl, третий фрагмент легкой цепи Kpnl и EcoRI) с использованием соответствующих буферных растворов согласно рекомендации производителя (Fermentas). Реакция расщепления проводится при температуре 37°С в течение 1 часа. 1 фрагмент легкой цепи и второй фрагмент тяжелой цепи антитела подвергаются реакции кинирования в буфере для киназы фага Т4. Смесь для кинирования содержит 1 мМ АТФ и 2 единицы активности киназы. Реакция кинирования проводится при температуре 37°С в течение 1 часа.
Продукты рестрикции обрабатывают смесью фенол-хлороформ, разделяют в 10% акриламидном геле (соотношение акриламида к метиленбисакриламиду 19:1) в трис-боратном буфере, вырезают окрашенные бромистым этидием продукты реакции и элюируют в диализных мешках в камере для горизонтального электрофореза. Очищенные продукты осаждают тремя объемами этанола и растворяют в 5 мкл бидистиллированной воды.
Подготовка векторов для клонирования фрагментов ДНК антитела
Сборку цепей антитела проводят во вспомогательном векторе Bluescript IISK-(Stratagene). Плазмидную ДНК обрабатывают необходимыми эндонуклеазами рестрикции (Smal и Xbal для встраивания второго фрагмента тяжелой цепи, PvuII для встраивания кинированного первого фрагмента легкой цепи и так далее согласно требуемым для клонирования эндонуклеазам рестрикции, которые были ранее использованы для обработки фрагментов) и разделяют в агарозном геле. Векторную ДНК вырезают из агарозного геля и очищают с использованием Gel Extraction Kit (Qiagen) согласно инструкциям производителя. Аналогичным образом подготавливают векторы для сборки цепей антитела в одноцепочечном формате в векторе pET22b(+) (Novagen).
Лигирование фрагментов цепей в вектор и трансформация плазмидной ДНК Лигирование фрагментов цепей с векторной ДНК проводят с использованием Rapid Ligation Kit (Roche) с использованием рекомендаций производителя. Молярное соотношение вектор/вставка составляет 1:3 при лигировании липких концов ДНК и 1:1 при лигировании тупых концов ДНК.
Трансформацию полученной рекомбинантной ДНК проводят в электрокомпетентные клетки Е.coli при помощи электропорации. Трансформированные бактерии высевают на чашку с 1.5% агаром, приготовленным на среде 2xYT и содержащим 50 мкг ампициллина на 1 мл, и выращивают в течение ночи при 37°С. Полученные клоны анализируют на наличие целевой вставки полимеразной цепной реакцией с праймеров, использованных для синтеза цепей или внешних универсальных праймеров, последовательности которых входят в состав векторной ДНК.
Положительные клоны выращивают на среде 2xYT в течение ночи и выделяют плазмидную ДНК с применением Plasmid Purification Kit (Qiagen). Из полученной плазмидной ДНК приготавливают векторы для следующей стадии сборки цепей антитела. По завершении сборки проводят окончательную проверку правильности встраивания фрагментов рестриктным картированием и верификацию последовательности синтезированных цепей антитела секвенированием конечной плазмидной ДНК.
Пример 4. Сборка экспрессионной конструкции для продукции одноцепочечного антитела инфликсимаб в E.coli, очистка рекомбинантного антитела и детекция его иммунологической активности.
Сборка экспрессионной конструкции одноцепочечного антитела проводится на базе вектора pET22b(+) (Novagen). В вектор по сайтам эндонуклеаз рестрикции Ndel и Sail вводят синтетическую последовательность ДНК, соответствующую лидерной последовательности pel В, но переводящую содержащийся ранее в векторе сайт Ncol в требуемую для корректного встраивания цепей антитела рамку считывания.
В полученную плазмиду по сайтам эндонуклеаз рестрикции Ncol и Xhol клонируют синтетический полилинкер, имеющий в своем составе сайты эндонуклеаз рестрикции, необходимые для встраивания цепей антитела и линкерную последовательность, соединяющую цепи антитела в один полипептид. Данный полилинкер обеспечивает корректный фолдинг вариабельных доменов цепей антитела в составе одноцепочечного антитела. Далее в полученный вектор клонируют полученный сборкой конечный фрагмент тяжелой цепи антитела по сайтам эндонуклеаз рестрикции Ncol и Pstt и конечный фрагмент легкой цепи антитела по сайтам BamHI и EcoRI. Правильность встраивания цепей подтверждают рестриктным картированием и секвенированием ДНК полученной экспрессионной конструкции.
Плазмидной ДНК, содержащей экспрессионную конструкцию одноцепочечного антитела, трансформируют электрокомпетентные клетки E.coli штамма BL21DE(3) и высевают трансформантов на чашки с 1,5% агаром, приготовленным на среде 2xYT и содержащим 50 мкг ампициллина на 1 мл, и выращивают в течение ночи при 37°С. Трансформантов смывают с чашки средой 2xYT, подращивают в 1 л среды 2xYT, содержащей 0,1% глюкозы, и индуцируют синтез белка добавлением в среду ИПТГ до конечной концентрации 0.2 мМ. Продукцию белка ведут при температуре 25°С в течение 5 часов.
2
3
Клеточную биомассу собирают центрифугированием при 5000g в течение 15 минут, отбрасывают супернатант и выделяют периплазматическую фракцию. Для этого клетки суспендируют в растворе, содержащем 30 мМ трис-HCl, pH 8, 20% сорбитола, 20 мкг/мл лизоцима и 1 мМ ЭДТА. Полученную периплазматическую фракцию отделяют от клеточной массы центрифугированием при 10000g в течение 30 минут. Очистку белка одноцепочечного антитела проводят двумя последовательными раундами ионообменной хроматографии на колонках Q-Sepharose и DEAE-Sepharose (Pharmacia) в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, pH 8.5. Элюцию с колонок проводят градиентом хлорида натрия от 0 до 0,5 М в том же буфере в течение 1 часа. Анализируют фракции белка, сошедшие с колонки Q-Sepharose, электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле по методике Лэмли и отбирают фракции, обладающие наибольшей чистотой и концентрацией целевого белка. Их подвергают дальнейшей очистке на колонке DEAE в тех же условиях. Фракции, отобранные после очистки на колонке DEAE-Sepharose, обладающие 80% чистотой, анализируют на специфическое связывание с ФНО-α, с применением методики иммуноферментного анализа (ELISA). Для этого белок ФНО-α иммобилизуют в течение часа при 37°С на иммунологическом планшете в карбонатном буфере (100 мМ NaCO, pH 9,0). Промывают лунки планшета фосфатным буфером (PBS), блокируют поверхность плашек 3% раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS, вновь троекратно промывают PBS и инкубируют с различными концентрациями одноцепочечного антитела в течение 1 часа при 37°С со встряхиванием в растворе PBS.
После троекратной промывки лунок PBS в лунки добавляют раствор пероксидазного конъюгата поликлонального мышиного антитела, специфичного к целому антителу человека, и инкубируют в течение 2 часов при 37°С со встряхиванием. Лунки промывают от конъюгата троекратно раствором PBS и проявляют добавлением раствора перекиси водорода и субстрата пероксидазы хрена тетраметилендиамина (ТМВ). Детектируют синее окрашивание раствора, свидетельствующее о связывании одноцепочечного антитела с ФНО-α. Остановку реакции проводят добавлением серной кислоты до конечной концентрации 4%. Измерения проводят при длине волны 405 нм.