СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЗУЛЬТАТИВНОСТИ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ
METHOD FOR PREDICTING THE PERFORMANCE OF THE IN VITRO FERTILIZATION PROGRAM

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, гинекологии, репродуктологии и иммунологии, и может быть использовано для прогнозирования исходов программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин с трубно-перитонеальной формой бесплодия.
Бесплодный брак значительно влияет на демографические показатели, являясь не только медико-биологической, но и социальной проблемой [1]. Особую значимость проблема бесплодия приобретает в связи с низким естественным приростом населения. Частота бесплодных браков в Российской Федерации превышает 15%, что по данным Всемирной Организации Здравоохранения считается критическим уровнем. Так, если до конца 1990-х гг. количество бездетных пар составляло 7-8%, то к 2015 г. этот показатель увеличился и, по оценкам российских демографов, составил 19%. В этой связи в последнее время все большую популяризацию имеют вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ), такие как ЭКО. Однако частота наступления беременности все еще остается низкой. Известно о наступлении 9118 беременностей в программах ЭКО за 2014 г., что составляет лишь 31,5% от общего количества проведенных циклов [2]. Ввиду высокой стоимости протоколов ЭКО и достаточно низкой результативности существует необходимость во внедрении метода прогнозирования циклов ЭКО для персонализированного подхода к решению проблемы бесплодия. Разработка прогностических критериев исхода цикла ЭКО позволит оценить вероятность эффективности процедуры еще на подготовительном этапе, до момента непосредственного включения пациенток в программу. И, таким образом, данный метод позволит снизить затраты государства и частных лиц за счет выделения групп с высокой, средней и низкой эффективностью процедуры ЭКО.
Классические прогностические критерии отбора женщин для проведения цикла ЭКО основаны на показателях овариального резерва [3], возраста [4], курения [5] и ожирения [6]. Данные критерии недостаточно отражают репродуктивные возможности женщин, в связи с этим существует необходимость в разработке более сложных способов прогнозирования результативности программы ЭКО. Ввиду вышеизложенных фактов наибольшую актуальность представляет определение прогностического значения иммунных факторов в циклах ЭКО.
Известен способ прогнозирования результатов лечения бесплодия методом ЭКО, включающий проведение трансвагинальной пункции фолликулов под контролем ультразвукового исследования (УЗИ) с последующим исследованием полученной фолликулярной жидкости. Фолликулярную жидкость подвергают хемилюминесцентному анализу по стандартной методике, определяют свободнорадикальную активность образцов и по показателю общей антиоксидантной активности дают прогноз наступления беременности. При показателях общей антиоксидантной активности 0,05 и выше дают неблагоприятный прогноз, при показателях общей антиоксидантной активности ниже 0,05 дают благоприятный прогноз - вероятность наступления беременности более 50% [7].
Недостатками способа являются высокий риск возникновения осложнений, связанных с выполнением трансвагинальной пункции фолликулов, которая проводится под общим наркозом и может осложниться кровотечением, невозможность коррекции тактики ведения пациентки, так как способ осуществляется на этапе пункции фолликулов, когда женщина уже включена в программу ЭКО.
Известен способ прогнозирования исхода программы ЭКО и переноса эмбрионов (ПЭ), в котором у женщин с бесплодием исследуют в периферической венозной крови антигены комплекса гистосовместимости до начала стимуляции суперовуляции. В лейкоцитах определяют полиморфизм генов HLA II класса и при обнаружении носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 или DQA1*0102-DQB1*0502 прогнозируют неблагоприятный исход, а при отсутствии носительства гаплотипов DQA1*0101-DQB1*0501 и DQA1*0102-DQB1*0502 - благоприятный исход программы ЭКО и ПЭ [8].
Недостатками способа являются необходимость определения большого числа антигенов комплекса гистосовместимости и сложность математического расчета прогностического индекса.
Известны способы прогнозирования результативности циклов ЭКО на основе определения IL-12, IL-15, IL-18 и NK-клеток в смывах из полости матки или биоптате эндометрия [9] и уровня матриксных металлопротеиназ 2, 9, IL-1, IL-1, INF-γ в смывах из полости матки [10].
Недостатками данных способов являются их инвазивность (забор биоптата или смыва из полости матки), сложность интерпретации результатов при проведении анализа.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому решению является метод оценки эффективности лечения бесплодия, заключающийся в проведении трансвагинальной пункции фолликулов под контролем УЗИ и анализе фолликулярной жидкости на наличие цитокинов методом проточной флюориметрии на двухлучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-Plex Protein Assay System ("Bio-Rad", США) с использованием коммерческих тест-систем 17-Р1ех. При критически низком уровне IL-7 (≤6 пг/мл), IL-4 (≤2 пг/мл) и IL-2 (≤7 пг/мл), относительном дефиците G-CSF (≤50 пг/мл) и MIP-1β (≤55 пг/мл), а также избыточной концентрации IL-13 (≥40 пг/мл) и IL-8 (≥25 пг/мл) дается отрицательный прогноз для наступления беременности. Позитивный прогноз проведения цикла ЭКО предопределяют уровни цитокинов: IL-4≥8 пг/мл, IL-7≥11 пг/мл, IL-2≥26 пг/мл, G-CSF≥157 пг/мл, IL-8≤15 пг/мл, IL-13≥26 пг/мл, MIP-1β≥81 пг/мл [11].
Авторы известного метода указывают на недостаточно высокую чувствительность большинства выделенных диапазонов, кроме того, лабораторную оценку уровня цитокинов в фолликулярной жидкости методом проточной флюориметрии нельзя признать доступной для широкого практического использования. Недостатками метода являются его высокая стоимость из-за необходимости использования в большом количестве дорогостоящих реактивов, сложность исполнения анализа, большое количество оцениваемых показателей, необходимость в наличии специализированной лаборатории для определения концентрации цитокинов, недостаточная чувствительность метода (чувствительность большинства из выделенных диапазонов показателей была 39-61%). Таким образом, для городских лечебно-профилактических учреждений данный анализ вряд ли может быть доступным.
Технический результат заключается в повышении чувствительности и точности прогнозирования наступления беременности в программе ЭКО за счет персонализированного подхода к включению в программу женщин с трубно-перитонеальной формой бесплодия на этапе планирования беременности путем определения двух показателей: уровень макрофагального-колониестимулирующего фактора (MCSF, CSF1) в сыворотке периферической крови и полиморфные варианты гена его рецептора (CSF1R, MCSFR) в лейкоцитах, что упрощает исследования и делает доступным применение способа в лечебно-профилактических учреждениях.
Сущность изобретения заключается в том, что на этапе включения пациентки в программу ЭКО - до начала стимуляции суперовуляции, определяют содержание уровня MCSF в периферической венозной крови, в лейкоцитах - полиморфизм гена CSF1R. При сывороточном уровне MCSF от 241,11 до 320,6 пг/мл и полиморфных вариантах гена CSF1R ТС/С А в rs386693509 и del/G в rs3216780 3'UTR области гена прогнозируют высокую вероятность наступления беременности. При значениях MCSF от 405,81 пг/мл и выше и полиморфных вариантах гена CSF1R ТС/ТС в rs386693509 и G/G в rs3216780 3'UTR области гена прогнозируют среднюю вероятность наступления беременности. При уровне MCSF менее 241,10 пг/мл и от 320,61 до 405,8пг/мл и полиморфных вариантах гена CSF1R СА/СА в rs386693509 и del/del в rs3216780 3'UTR области гена прогнозируют низкую вероятность наступления беременности.
В таблице (см. в конце описания) указан уровень MCSF и полиморфные варианты гена CSF1R у женщин с трубно-перитонеальной формой бесплодия и результативность программы ЭКО.
Эмпирически установлено, что уровень MCSF в периферической венозной крови и полиморфизм гена CSF1R в лейкоцитах оказались информативным прогностическим показателем наступления беременности в программе ЭКО. Установленные критерии объективно оценивают преимплантационное состояние эндометрия, сопряженное с процессом ангиогенеза. Полученный показатель делает возможным с большей вероятностью прогнозировать успешную инвазию трофобласта и наступление беременности.
Предлагаемый способ достаточно прост и доступен ввиду оценки двух показателей, и получение исследуемого материала (периферической венозной крови) не связано с проведением инвазивных процедур. Кроме того, так как способ основан на оценке полиморфных вариантов гена CSF1R, достаточно однократного исследования, результат которого будет действителен при проведении возможных повторных циклов ЭКО.
Новизна предлагаемого способа заключается в том, что впервые предложено предопределять прогноз исхода программы ЭКО у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, основываясь на сывороточной концентрации MCSF и полиморфизме гена CSF1R.
Способ прогнозирования осуществляется следующим образом:
1. Женщинам с диагнозом трубно-перитонеальное бесплодие, до включения в программу ЭКО на 3-4 день менструального цикла проводится забор крови в две пробирки:
I - для генетического анализа: в вакуумную пробирку для венозной крови объемом 2-5 мл с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) (рекомендуется проведение анализа в течение 1-4 ч). После заполнения пробирки кровью до указанного на ней объема пробу осторожно перемешивают плавным переворачиванием и вращением пробирки в течение не менее 2 мин (переворачивание 8-10 раз). Транспортировку и хранение производят при температуре 18-23°С в вертикальном положении. Выделяют ДНК (минимум 40 нг) из образца жидкой крови по протоколу производителя. Образцы выделенной ДНК исследуют методом полимеразной цепной реакции (ПНР) по полиморфным маркерам гена CSF1R. Используют референсную нуклеотидную последовательность NG_012303,1 из Базы данных NCBI. Приготовление реакционной смеси, программирование термоциклера и детекция продуктов амплификации осуществляют по протоколу производителя.
II - для определения MCSF иммуноферментным методом проводят забор крови в вакуумную пробирку для сыворотки с индуктором свертывания. Дожидаются завершения процесса свертывания (30 мин) и центрифугируют пробирку со свернувшейся кровью не менее 10 мин с ускорением 1500 G (примерно 3000 об/мин). Отделяют сыворотку от сгустка и хранят при температуре -20°С. Рекомендуется выделение и замораживание сыворотки в течение 120 мин с момента забора крови во избежание разрушения MCSF и искажения полученных результатов. Затем с помощью иммуноферментного набора для количественного определения человеческого MCSF в сыворотке крови в соответствии с инструкциями производителя определяют уровень MCSF.
2. Определяют вероятность наступления беременности с точностью 85%. Высокую вероятность (85%) прогнозируют при сывороточном уровне MCSF 241,11 - 320,6 и полиморфных вариантах гена CSF1R ТС/СА в rs386693509, del/G в rs3216780 3'UTR области гена. Среднюю вероятность (45%) прогнозируют при сывороточном уровне MCSF выше 405,81 и полиморфных вариантах CSF1R ТС/ТС в rs386693509, G/G в rs3216780 3'UTR области гена. Низкую вероятность (менее 15%) прогнозируют при сывороточном уровне MCSF менее 241,10 и от 320,61 до 405,8 и полиморфных вариантах гена CSF1R СА/СА в rs386693509, del/del в rs3216780 3'UTR области гена.
В основу предлагаемого способа прогнозирования результативности программы ЭКО положено следующее обоснование. Общеизвестно, что иммунокомпетентные клетки и продуцируемые ими цитокины (ростовые факторы, интерлейкины, хемокины) участвуют в основных репродуктивных процессах: фолликулогенезе, овуляции, формировании и функционировании желтого тела, оплодотворении и имплантации плодного яйца (Gleicher N., 1988; Buculmez О., Arid А., 2000; Bellver J., 2008). MCSF - это гемопоэтический фактор роста, отвечающий за пролиферацию, дифференцировку и выживание моноцитарно-макрофагальной клеточной линии. Свои биологические эффекты MCSF реализует через взаимодействие со специфическим клеточно-опосредованным рецептором CSF1R [12]. MCSF может продуцироваться интрафолликулярно, оказывая аутокринную и паракринную регуляцию фолликулогенеза и овуляции [13], определяя таким образом зрелость фолликула. Более того, во время децидуализации данный ростовой фактор экспрессируется клетками эндометрия и децидуальными клетками в месте имплантации плодного яйца. Продукция MCSF маткой и CSF1R трофобластом коррелируют с периодом максимальной пролиферации трофобласта и роста плаценты [14]. Вероятно, одной из причин предрасположенности к неудачной попытке ЭКО является изменение синтеза макрофагального колониестимулирующего фактора, а также полиморфизм гена, определяющего активность его мембранного рецептора. Практическое применение результатов уровней MCSF имеет ряд ограничений ввиду индивидуальных референсных значений. В ходе проведения собственных исследований выявлена связь между сывороточными уровнями MCSF и полиморфными вариантами гена CSF1R в rs386693509, rs3216780 3'UTR области гена. Таким образом, MCSF является предиктором имплантации эмбриона для циклов ЭКО.
Способ прогнозирования разрабатывался на основании исследования, в которое были включены 100 женщин с трубно-перитонеальной формой бесплодия. Группу сравнения составили 50 женщин с доказанной фертильностью, сопоставимых по возрасту. Критерии включения в исследование: женщины с бесплодием, участвующие в программе ЭКО, возраст на момент начала исследования до 45 лет, подписание пациентом информированного согласия. Критерии исключения пациента из исследования: другие формы бесплодия, эндометриоз, наличие ассоциированных клинических состояний (на момент начала наблюдения), сахарного диабета, аутоиммунной патологии, перенесенные за месяц до начала исследования инфекционные заболевания, психические заболевания, в том числе вследствие злоупотребления алкоголя или наркотиков; отказ пациента от долгосрочного участия в исследовании (таблица).
В предлагаемом способе при определении прогноза наступления беременности в результате программы ЭКО, основываясь только на сывороточной концентрации MCSF, определяли низкую чувствительность (50%) и специфичность (59%) способа. Поэтому для повышения данных характеристик способа учитывают индивидуальные полиморфные варианты гена CSF1R в rs386693509 и rs3216780 3'UTR области гена. Таким образом, чувствительность предлагаемого способа прогнозирования составляет 79%, специфичность - 87%, точность - 85%.
Данные, подтверждающие реализацию предлагаемого изобретения и достижение технического результата:
Пример 1. Больная А., 29 лет, проходила обследование и лечение в ГБУЗ РМ «Мордовский республиканский клинический перинатальный центр» по поводу бесплодия трубно-перитонеального генеза. При УЗИ органов малого таза определен нормальный фолликулярный резерв. При анализе сывороточного уровня MCSF определен уровень 308,8 пг/мл, при анализе гена CSF1R определены полиморфные варианты ТС/С А в rs386693509 и del/G в rs3216780 3'UTR области гена. Дан благоприятный прогноз наступления беременности. Женщина включена в программу ЭКО. Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции получено 8 зрелых ооцитов. В результате стандартной процедуры ЭКО было получено 8 зигот с двумя пронуклеусами. На 3-й сутки произведен перенос 2 эмбрионов в полость матки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сут после переноса эмбрионов анализ крови на содержание β-хорионического гонадотропина (ХГЧ) показал наступление беременности (396 мМед/мл).
Пример 2. Больная Б., 32 лет, проходила обследование и лечение в ГБУЗ РМ «Мордовский республиканский клинический перинатальный центр» по поводу бесплодия трубно-перитонеального генеза. При УЗИ органов малого таза определен нормальный фолликулярный резерв. При анализе сывороточного уровня MCSF определен уровень 421,5 пг/мл, при анализе гена CSF1R определены полиморфные варианты ТС/ТС в rs386693509 и G/G в rs3216780 3 UTR области гена. Дана средняя вероятность наступления беременности. Женщина включена в программу ЭКО. Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции получено 6 зрелых ооцитов. В результате стандартной процедуры ЭКО было получено 6 зигот с двумя пронуклеусами. На 3-й сут произведен перенос 2 эмбрионов в полость матки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сут после переноса эмбрионов анализ крови на содержание ХГЧ показал наступление беременности (152 мМед/мл). Через 1 неделю произошел самопроизвольный выкидыш.
Пример 3. Больная В., 30 лет, проходила обследование и лечение в ГБУЗ РМ «Мордовский республиканский клинический перинатальный центр» по поводу бесплодия трубно-перитонеального генеза. При УЗИ органов малого таза определен нормальный фолликулярный резерв. При анализе сывороточного уровня MCSF определен уровень 121 пг/мл, при анализе гена CSF1R определены полиморфные варианты С А/С А в rs386693509 и del/del в rs3216780 3 UTR области гена. Дана низкая вероятность наступления беременности. Женщина включена в программу ЭКО. Стимуляция суперовуляции проводилась по короткому протоколу. В результате трансвагинальной пункции получено 6 зрелых ооцитов. В результате стандартной процедуры ЭКО было получено 10 зигот с двумя пронуклеусами. На 3-й сут произведен перенос 2 эмбрионов в полость матки, назначена поддерживающая терапия. На 14-е сут после переноса эмбрионов анализ крови на содержание ХГЧ показал, что беременность не наступила (1,8 мМед/мл).
По сравнению с известным решением предлагаемое позволяет повысить чувствительность и точность способа прогнозирования наступления беременности в программе ЭКО за счет персонализированного подхода к включению в программу женщин с трубно-перитонеальной формой бесплодия на этапе планирования беременности путем определения двух показателей: уровень макрофагального-колониестимулирующего фактора (MCSF, CSF1) в сыворотке периферической крови и полиморфные варианты гена его рецептора (CSF1R, MCSFR) в лейкоцитах, что упрощает исследования и делает доступным применение способа в лечебно-профилактических учреждениях.
Источники информации
1. Овсянникова Т.В., Макаров П.О., Камилова Д.П. Бесплодный брак: принципы диагностики и лечения // Эффективная фармакотерапия. Акушерство и гинекология. - 2012. - №1. - С. 7-9.
2. Регистр ВРТ. Юбилейный 20-й отчет за 2014 год. - Санкт-Петербург: Лакшери Принт, 2016. - 31 с.
3. Dave J Hendriks, Egbert R te Velde, Caspar EN Looman, Laszlo FJMM Bancsi, Frank JM Broekmans. Expected poor ovarian response in predicting cumulative pregnancy rates: a powerful tool. Reproductive biomedicine online. 2008, 17(5): 727-736.
4. Белоцерковцева Л.Д., Коваленко Л.В., Корнеева E.B., Бондарева Е.В., Шишанок О.Ю. Влияние возраста пациенток на частоту биологических потерь в программах ЭКО: опыт работы // Проблемы репродукции. - 2008. - №3. - С. 53-56.
5. Айзикович И.В., Айзикович Б.И., Зотов СВ., Медведева И.В. Влияние курения женщин на качество ооцитов и исходы вспомогательных репродуктивных технологий // Вестник новосибирского Государственного университета. Серия: биология, клиническая медицина. - 2012. - Т. 10, №2. - С. 165-168.
6. Raoul Orvieto, Ravit Nahum, Simion Meltcer, Roy Homburg, Jacob Rabinson, Eyal YAnteby, Jacob Ashkenazi. Ovarian stimulation in polycystic ovary syndrome patients: the role of body mass index. Reproductive Biomedicine Online. 2009, 18(3): 333-336.
7. RU 2357673, МПК A61B 10/00, G01N 33/52, опубл. 10.06.2009.
8. RU 2474822, МПК G01N 33/53, опубл. 10.02.2013.
9. Ledee-Bataille  N, Bonnet-Chea K, Hosny G, Dubanchet S, Frydman R, Chaouat G. Role of the endometrial tripod interleukin-18, -15, and -12 in inadequate uterine receptivity in patients with a history of repeated in vitro fertilization-embryo transfer failure. Fertility Sterility 2005 Mar; 83(3):598-605.
10. Inagaki N, Stern C, Mc Bain J, Lopata A, Kornman L, Wilkinson D. Analysis of intra-uterine cytokine concentration and matrix-metalloproteinase activity in women with recurrent failed embryo transfer. Human Reproduction 2003 Mar; 18(3):608-615.
11. Останин A.A., Айзикович Б.И., Айзикович И.В., Черных Е.Р. Прогностическая модель оценки эффективности лечения бесплодия с помощью ЭКО // Проблемы репродукции. - 2006. - №4. - С. 63-69.
12. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. - Санкт-Петербург, 2008. - С. 70-71.
13. Ali Salmassi, Ph.D., Liselotte Mettler, M.D., Walter Jonat, M.D., Sybille Buck, M.T.A., Kerstin Koch, M.T.A., and Andreas G. Schmutzler, M.D. Circulating level of macrophage colony-stimulating factor can be predictive for human in vitro fertilization outcome. Fertility and Sterility. Vol. 93, No. 1, January 2010, pp. 116-123.
14. Arceci RJ, Shanahan F, Stanley ER, Pollard JW. Temporal expression and location of colony-stimulating factor 1 (CSF-1) and its receptor in the female reproductive tract are consistent with CSF-1-regulated placental development. Proc Natl Acad Sci USA. 1989 Nov; 86(22):8818