Сопоставление гастропротекторных свойств семакса и его метаболитов

ФИЗИОЛОГИЯ

УДК 577.112.6:577.112.382

СОПОСТАВЛЕНИЕ ГАСТРОПРОТЕКТОРНЫХ СВОЙСТВ СЕМАКСА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ

З.В. Бакаева, К.Е. Багликова, П.А. Климова*, Л.А. Андреева*, Г.Е. Самонина

Семакс (MEHFPGP) увеличивает гомеостаз слизистой оболочки желудка к действию таких ульцерогенных факторов, как этанол и стресс. На стрессорной модели язвообра-зования семакс и его два метаболита — HFPGP и FPGP в большом диапазоне доз 0,06—3,7 мкмоль/кг, внутрибрюшинно, проявляют протекторные противоязвенные эффекты. На этаноловой модели только семакс в двух использованных дозах (0,06 и 0,37 мкмоль/кг) демонстрировал достоверное противоязвенное свойство. Предположили, что гастропротек-торная активность семакса на периферические механизмы ульцерогенеза не зависит от активности его метаболитов. В отличие от этого, гастропротекторная активность семакса на центральные механизмы ульцерогенеза может определяться и активностью двух его метаболитов — HFPGP и FPGP.

Ключевые слова: семакс, метаболиты, гастропротекторные свойства.

Семакс был получен путем присоединения последовательности Pro-Gly-Pro к С-концу нестабильного пептида Met-Glu-His-Phe — фрагмента гипо-физарного гормона кортикотропина — АКТГ(4—7). Полученный таким образом пептид MEHFPGP проявил большую устойчивость к действию протеаз, что позволило существенно увеличить длительность его действия (Ашмарин и др., 1997).

Семакс, не обладая гормональной активностью, стимулирует обучение животных в различных тестах в норме и при патологии (Яснецов и др., 1995; Ашмарин и др., 1997), проявляет антигипокси-ческие и антиамнестические свойства (Каплан и др., 1992; Яснецов и др., 1998), улучшает кровообращение мозга у людей и животных (Ашмарин и др., 1997; Хугаева, Александрин, 1997). В клинике семакс применяется для лечения больных с ишемическим инсультом (Мясоедов и др., 1999).

Изучение влияния семакса на процессы крове-свертывания и тромбоза показало, что присоединение последовательности PGP к АКТГ4—7 не только усилило его изначальную биологическую активность, но и дополнило ее эффектами самого PGP. Так, in vivo семакс обладает несколько меньшей, чем у глипролинов, но достаточно выраженной ан-тикоагулянтной, фибринолитической и антитром-ботической активностью. In vitro семакс нейтрален по отношению к параметрам гемостаза, что наводит на мысль о том, что для осуществления влияния на процессы фибринолиза и тромбоза необходим гидролиз семакса до PGP (Ашмарин и др.,

* ИМГ РАН, г. Москва.

1996). Сам PGP является классическим глипроли-ном с ярко выраженным антитромботическим, фиб-ринолитическим и антикоагулянтным свойствами (Пасторова и др., 1998).

Семакс повышает устойчивость слизистой оболочки желудка (СОЖ) к действию ряда ульцерогенных факторов, таких как этанол и стресс. Он также препятствует развитию ацетатных язв и ускоряет их заживление (Жуйкова и др., 2000).

Показано, что в присутствии плазматических мембран мозга крысы время полураспада семакса превышает 1 ч. Биодеградация пептида осуществляется преимущественно отщеплением N-концевых аминокислот от исходной пептидной последовательности. Основными продуктами биодеградации гептапептида являются HFPGP, FPGP и PGP с преобладанием пентапептида и трипептида (Долотов и др., 2004).

Защитные свойства PGP в отношении слизистой оболочки желудка (СОЖ) были показаны на различных классических экспериментальных моделях язвообразования (Абрамова и др., 1996; Samo-nina et al., 2000; Бакаева, Самонина, 2005). Метаболиты PGP — дипептиды PG и GP обнаруживаются в крови крыс уже через 30 мин (Золотарев и др., 2003) и обладают собственной дифференцированной гастропротективной активностью. PG более эффективен на моделях повреждения СОЖ, вызванных нарушением в основном периферических механизмов поддержания желудочного гомеостаза, GP — центральных (Абрамова и др., 1996).

Противоязвенная активность других метаболитов семакса ранее не изучалась, поэтому целью настоящей работы было исследование возможного влияния этих пептидов на устойчивость СОЖ к таким повреждающим факторам, как этанол и стресс, а также анализ роли дериватов семакса в проявлении его гастропротекторных свойств.

Материалы и методы

Активность семакса (MEHFPGP) и его метаболитов — HFPGP, FPGP и PGP, синтезированных в Институте молекулярной генетики РАН, исследовали на двух экспериментальных моделях язвообра-зования: этаноловой в дозах 0,06 и 0,37 мкмоль/кг, и стрессорной водоиммерсионной в дозах 0,06, 0,37 и 3,7 мкмоль/кг. Увеличение классической клинической дозы (0,06 мкмоль/кг) семакса и его метаболитов до 0,37 и 3,7 мкмоль/кг позволило нам сравнить противоязвенные эффекты исследуемых пептидов с эффектами глипролинов (PGP, PG и GP), известными противоязвенными агентами.

В качестве подопытных животных использовали в первом случае самцов беспородных белых крыс, во втором — самцов крыс линии Вистар массой 200—300 г. За сутки до опыта животных лишали пищи, а при этаноловой модели и воды, и помещали в клетку с решетчатым дном для предотвращения капрофагии. Опытным и контрольным животным за 1 ч до ульцерогенеза внутри-брюшинно вводили исследуемый препарат в объеме 0,5 мл/200 г веса или физиологический раствор в таком же объеме.

Спустя 1 ч после инъекции препарата крысам интрагастрально вводили 96%-й этанол в объеме 1 мл/200 г массы тела или помещали в бассейн с водой (температура воды 21°), где они плавали в течение получаса. Далее животных обтирали и помещали в теплые обогреваемые клетки. Через 1 ч крыс умерщвляли эфиром.

Площадь каждого язвенного поражения в мм2 оценивали с помощью бинокуляра с окулярмикро-метром. Далее вычисляли суммарную площадь повреждений в каждом желудке. Так как средняя площадь повреждений у контрольных животных в разных экспериментах значительно варьировала, площади повреждения нормировали, т.е. представляли в процентах к среднему контрольному значению в каждом конкретном эксперименте. Для каждой группы вычисляли среднюю площадь язвенных поражений, т.е. величину повреждений в процентах к контролю. Противоязвенное действие препаратов выражали как обратную величину, т.е. на сколько процентов действие пептидов уменьшает среднюю площадь опытных язв по сравнению с контролем. Для оценки статистической достоверности различий групп использовали компьютерную программу Statistica 5.0, LSD-тест.

Эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом и Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным.

Результаты и обсуждение

Через 1 ч после введения этанола на СОЖ выявляются большие повреждения, выражающиеся в значительных геморрагиях и эрозиях большой протяженности. При стрессорном методе вызова язв на слизистой оболочке образуются точечные эрозивные повреждения размером от 0,1 х 0,1 мм до 1x1 мм, которые в литературе называются стрес-сорными язвами.

В развитии язвенных повреждений участвуют как периферические, так и центральные механизмы, которые могут иметь различный вклад в развитие язвенной болезни желудка. Развитие этано-ловых повреждений СОЖ в основном связано с периферическими механизмами ульцерогенеза (Si-bilia et al., 2003), стрессорное действие холодового плавания — с центральными механизмами (Mayer, 2000).

Этаноловая модель язвообразования. В группе, предварительно получившей семакс в классической клинической дозе 0,06 мкмоль/кг, этаноловые повреждения составили 36% по сравнению с площадью повреждения у контрольных животных, принятой за 100% (рис. 1). Противоязвенный эффект составил 64%. Несколько меньший противоязвенный эффект (60%) проявил тетрапептид FPGP. Пен-тапетид HFPGP практически не влиял на этаноло-вое язвообразование.

Увеличение дозы семакса в 6 раз почти не изменило его гастропротекторного действия (рис. 1). Интересно, что в дозе 0,37 мкмоль/кг произошла инверсия эффектов пента- и тетрапептидов. У HFPGP наблюдалась значительная гастропротекция — 80%, FPGP проявлял лишь тенденцию.

Рис. 1. Влияние семакса и его метаболитов на этаноловое язво-образование у крыс. *P < 0,05; **P < 0,01 к контролю, n — количество животных в группе. 1 — контроль, 2 — MEHFPGP, 3 — HFPGP, 4 — FPGP, 5 — PGP

Известно, что гастропротекторный эффект три-пептида PGP стабилен в широком диапазоне доз от 0,5 до 53 мкмоль/кг. Аналогично ему действует дипептид PG, а вот GP уменьшает этаноло-вые повреждения только при увеличение дозы до 53 мкмоль/кг (Жуйкова и др., 2003).

Вероятно, дальнейший гидролиз FPGP не дает метаболита PGP, так как в классической дозе гли-пролинов 3,7 мкмоль/кг тетрапептид не действует (на рис. 1 не показано), в то время как трипеп-тид обладает ярко выраженной противоязвенной активностью (Жуйкова и др., 2003). Эффект FPGP, а точнее его отсутствие, напоминает индифферентные свойства GP в отношении повреждений, вызванных периферическими механизмами ульцеро-генеза. Поэтому можно предположить, что дальнейшим продуктом гидролиза FPGP может быть именно GP, не проявляющий защитных свойств на этаноловой модели язвообразования. Не исключено, что методика, используемая авторами (Долотов и др., 2004) при исследовании биодеградации се-макса в присутствии плазматических мембран мозга крысы, не позволила выявить короткие дипеп-тиды в инкубационной смеси.

Таким образом, защита семаксом СОЖ от эта-ноловых повреждений определяется, по-видимому, действием гептапептида в целом, при этом его метаболиты обладают собственными, зависимыми от дозы гастропротекторными эффектами. В нашей практике имеются результаты, указывающие на противоязвенную активность таких тетрапептидов, как GPGG (Абрамова и др., 1996) и GPGP (Багликова и др., 2009), хотя FPGP нельзя отнести к глипро-линам из-за наличия в молекуле фенилаланина.

Стрессорная водоиммерсионная модель язвообра-зования. На стрессорной модели семакс в дозах 0,06 и 0,37 мкмоль/кг имел примерно одинаковую противоязвенную активность — 60%, в дозе 3,7 мкмоль/кг — 89% (рис. 2). Этот эффект на 18% больше, чем действие самого активного в отношении стрессорных язв глипролина — дипептида GP в классической дозе 3,7 мкмоль/кг (Жуйкова и др., 2003а). Дериваты семакса HFPGP и FPGP в дозе 0,06 мкмоль/кг проявили значительные гастропро-текторные эффекты — 92 и 90% соответственно. Увеличение доз в 6 и 60 раз практически не изменило эти свойства. Сопоставление противоязвенных эффектов MEHFPGP и его непосредственных метаболитов — HFPGP, FPGP и PGP — при введении их в дозе 3,7 мкмоль/кг показало достоверное повышение устойчивости СОЖ к действию стресса с наибольшей тенденцией эффективности для MEHFPGP.

Рис. 2. Влияние семакса и его метаболитов на стрессорное язво-образование у крыс. *P < 0,005; **P < 0,001 к контролю. 1 — MEHFPGP, 2 — HFPGP, 3 — FPGP PGP. 4 — Остальные обозначения те же, что и на рис. 1

Таким образом, метаболиты семакса — HFPGP и FPGP — обладают собственным гастропротек-торным потенциалом в большом диапазоне доз — от 0,06 до 3,7 мкмоль/кг при внутрибрюшинном введении и могут вносить свой вклад в проявление защитных свойств MEHFPGP в отношении слизистой желудка от воздействия стресса. Достоверно высокий протекторный эффект гептапептида выявляется только при самой большой используемой дозе.

Итак, полученные нами данные еще раз свидетельствуют о том, что гастропротективные свойства семакса могут осуществляться как на периферическом, так и на центральном уровне. Основными механизмами противоязвенного действия семак-са могут быть его влияние на кровоток (Жуйкова и др., 2002), на желудочную секрецию (Жуйкова и др., 2003б) и на ЦНС (Яснецов и др., 1995; Аш-марин и др., 1997).

Следует полагать, что противоязвенная активность семакса в отношении повреждений, вызванных периферическими механизмами ульцерогенеза, в основном определяется эффектами самого гепта-пептида и почти не зависит от продуктов его гидролиза. Гастропротекторное действие MEHFPGP в отношении язв, вызванных центральными нарушениями регуляции желудочного гомеостаза, может быть связана с высвобождением его метаболитов — HFPGP и FPGP.

* * *

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 06—04 48833).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Абрамова М.А., Самонина Г.Е., Аш- держащие фрагменты нейропептидов модулируют через марин И. П. 1996. Пролин и простейшие пролинсо- центральные и периферические механизмы состояние

слизистой оболочки желудка // Нейрохимия. 13. Вып. 3. 209-214.

Ашмарин И.П., Ляпина Л.А., Пасторов а В . Е . 1996. Модуляция гемостатических реакций in vitro и in vivo представителями семейств регуляторных пептидов // Вестн. РАМН. № 6. 50—57.

Ашмарин И.П., Незавибатько В.Н., Мясоедов Н.Ф., Каменский А.А., Гривенников И.А., Пономарева-Степная М.А., Андреева Л.А., Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Рясина Т.В. 1997. Ноотропный аналог адренокорти-котропина 4—10 — семакс (15-летний опыт разработки и изучения) // Журн. высш. нервн. деятельности. 47. Вып. 2. 420—430.

Багликова К.Е., Труфанова А.В., Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Андреева Л.А., Климова П.А., Васьковский Б.В. 2009. Влияние гидроксипролин- и пролинсодержащих глипроли-нов на этаноловое язвообразование у крыс // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 1. 3—8.

Бакаева З.В., Самонина Г.Е. 2005. Влияние глипролинов на развитие и заживление ацетатных язв у крыс // Патофизиол. и эксперимент. терапия. № 2. 25—27.

Долотов О.В., Золотарев Ю.А., Дорохова Е.М., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. 2004. Связывание аналога АСТН-(4—10)-гептапептида семакс с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы и его биодеградация // Биоорган. химия. 30. № 3. 241—246.

Жуйкова С.Е., Смирнова Е.А., Бакаева З.В., Самонина Г.Е. 2000. Влияние семакса на гомеостаз слизистой оболочки желудка белых крыс // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 129. № 10. 300—302.

Жуйкова С.Е., Сергеев В.И., Самонина Г.Е., Мясоедов Н.Ф. 2002. Влияние семакса на индометациновое язвообразование у крыс и один из возможных механизмов его действия // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 133. № 6. 665—667.

Жуйкова С.Е., Бакаева З.В., Самонина Г.Е. 2003а. Дифференцированные противоязвенные эффекты возможных метаболитов пептида PGP—PG и GP — на этаноловой и стрессорной моделях вызова язв у крыс // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 2. 20—22.

Жуйкова С.Е., Хропычева Р.П., Золотарев ВА., Поленов С.А., Самонина Г.Е. 2003б. Новые пептидные регуляторы желудочной секреции крыс (амилин, PGP и семакс) // Эксперимент. и клинич. гастроэнтерология. № 2. 86—91.

Золотарев Ю.А. Жуйкова С.Е., Ашмарин И.П., Мясоедов Н.Ф., Васьковский Б.В., Самонина Г.Е. 2003. Метаболизм пептида PGP при разных способах введения // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 135. № 4. 423—426.

Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Незавибатько В.Н., Ашмарин И.П. 1992. Повышение устойчивости организма к гипоксии с помощью нейро-пептидного лекарственного препарата семакс // Физиология человека. 18. № 5. 104—107.

Мясоедов Н.Ф., Скворцова В.И., Насонов Е.Л., Журавлева Е.Ю., Гривенников И.А., Арсеньева Е.Л., Суханов И.И. 1999. Изучение механизмов нейропротективного действия семакса в остром периоде ишемического инсульта // Журн. неврол. психиат. 99. № 5. 15—19.

Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Смолина Т.Ю., Ашмарин И.П. 1998. Антикоагулянт-ные и фибринолитические эффекты коротких пролин-содержащих пептидов // Изв. РАН. Сер. биол. № 3. 390—394.

Хугаева В.К., Александрин В.В. 1997. Зависимость терапевтического эффекта пептидного препарата семакс от степени тяжести ишемии мозга // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 124. № 7. 39—42.

Яснецов В.В., Попов В.М., Кисиле-ва Н.М., Каменский А.А., Незавибатько В.Н. 1995. Вестибулярные и антиамнестические свойства фрагментов адренокортикотропного гормона и их аналогов // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 119. № 6. 634—636.

Яснецов В.В., Крылова И.Н., Провор-нова Н.А. 1998. Фармакологическая коррекция нарушений мнестических функций, вызванных гипоксией и ишемией головного мозга у крыс // Авиакосмическая и экологическая медицина. 132. № 1. 55—60.

Mayer E.A. 2000. The neurobiology of stress and gastrointestinal disease (review) // Gut. 47. 861—869.

Samonina G., Lyapina L., Kopylova G., Pastorova V., Bakaeva Z., Jeliaznik N., Zuykova S., Ashmarin I. 2000. Protection of gastric mucosal integrity by gelatin and simle proline-containing peptides // Pathophysiology. N 7. 69—73.

Sibilia V., Rindi G., Pagani F., Rapet-ti D., Locatelli V., Torsello A., Campanini N., Deghenghi R., Netti C. 2003. Ghrelin protects against ethanol-induced gastric ulcers in rats: studies on the mechanisms of action // Endocrinology. 144. N 1. 353—359.

Поступила в редакцию 25.12.06

THE COMPARISON OF GASTROPROTECTIVE PROPERTIES

OF SEMAX AND ITS METABOLITES

Z.V. Bakaeva, K.E. Baglikova, P.A. Klimova, L.A. Andreeva, G.E. Samonina

Semax (MEHFPGP) increases of gastric mucosal homeostasis to such ulcerogenic factors as ethanol and stress. On stress ulcer model Semax and its two metabolites — HFPGP and FPGP in the wide range of doses — 0,06—3,7 mkmol/kg show protective antiulcer properties. On ethanol ulcer model only Semax in both of used doses (0,06 and 0,37 mkmol/kg) demonstrates reliable protective antiulcer property. It was supposed that Semax's gastroprotective activity concerning of

peripheral mechanisms of ulcerogenese did not depend on its metabolites. On the contrary to this fact Semax's gastroprotective activity connected with central mechanisms of ulcerogenesis may be caused and gastroprotective activity of HFPGP and FPGP.

Key words: semax, metabolites, gastroprotective activity.

Сведения об авторах

Бакаева Занда Валерьевна — докторант кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. (495) 939-46-04; e-mail: Элиста.Zanda@bk.mail.ru

Багликова Кермен Евгеньевна — преподаватель Калмыцкого государственного университета. Тел. (495) 939-46-04; e-mail: kermenev@mail.ru

Климова Полина Александровна — лаборант ИМГ РАН. Тел. (495) 939-46-04; e-mail: g_samonina@gmail.com Андреева Людмила Александровна — зав. сектором ИМГ РАН. Тел. (495) 939-46-04; e-mail: landr@img.ras.ru

Самонина Галина Ефимовна — докт. биол. наук, проф. кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ. Тел. (495) 939-46-04; e-mail: g_samonina@gmail.com