Взаимодействие молекулы ДНК с ионами алюминия в растворе

УДК 577.323.23

Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2012. Вып. 1

Р. А. Белых, И. Л. Волков, Н. А. Касьяненко

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МОЛЕКУЛЫ ДНК С ИОНАМИ АЛЮМИНИЯ В РАСТВОРЕ

Введение. Ионы металлов играют важную роль в биологических системах. Например, их присутствие необходимо для работы ДНК-полимеразы. Они играют и структурообразующую роль, стабилизируя конформацию белков и нуклеиновых кислот. Вместе с тем в ряде случаев ионы металлов могут оказывать отрицательное воздействие на организм. Это происходит, например, при их отклонении от нормальных концентраций. По содержанию ионов металлов в биологических жидкостях и тканях можно судить о развитии тех или иных патологий. Недавние исследования [1-4] показали, что при таких заболеваниях мозга как болезнь Альцгеймера, энцефалопатия, болезнь Паркинсона наблюдается повышенная концентрация алюминия в хроматине ядер поражённых нейронов [5]. Существует мнение, что ионы алюминия прочно связываются с хроматином, увеличивая его структурированность, что проявляется в изменении нуклеазной активности [6]. Отмечалось также, что хроматин мозга более чувствителен к алюминию, чем хроматин, полученный из клеток печени. Это привлекло исследователей к рассмотрению роли ионов алюминия в биосистемах in vivo и in vitro [7], при этом в последнем случае можно более определённо судить о механизме влияния ионов алюминия на биологические макромолекулы. Исследования показали, что ионы алюминия оказывают весьма существенное влияние на конформацию макромолекулы, ответственной за хранение и передачу наследственной информации. Было показано, например, что ионы алюминия индуцируют переход Г—Ц богатых олигонуклеотидов из B в Z форму [8].

К настоящему времени влияние ионов металлов разной валентности на конформа-цию молекулы ДНК в растворе изучено достаточно хорошо. Известно, например, что ионы щелочных и щелочноземельных металлов связываются с фосфатными группами, а переходных — ещё и с азотистыми основаниями ДНК [9]. Следует отметить, что состояние ионов алюминия в водном растворе меняется в результате взаимодействия с молекулами растворителя. Таким образом, при рассмотрении их влияния на конформацию ДНК необходимо учитывать, что в исследуемой системе помимо Al3+ может присутствовать набор продуктов гидролиза: Al3+, AlOH2+, Al(OH)+, Al(OH)3. Преобладание тех или иных форм зависит от кислотности среды. Эти продукты могут по-разному взаимодействовать с биополимерами. Исследование такого взаимодействия в модельных системах (водных растворах ДНК) может раскрыть новые аспекты патогенеза упомянутых выше болезней.

В работе [10] на основании результатов, полученных с использованием флюоресцирующих красителей, методами кругового дихроизма и температурного плавления ДНК, утверждается, что состояние вторичной структуры ДНК и рН среды определяют связывание ионов алюминия с азотистыми основаниями или фосфатными группами макромолекулы. В работе [11] методом ИК фурье-спектрометрии показано, что при низких концентрациях ионов (при отношении молярных концентраций ионов и фосфатных групп ДНК r = 1/80, 1/40) они образуют хелатный комплекс с PO2 группами и с N7 гуанина. При больших концентрациях катионов наблюдается дестабилизация двойной спирали. Авторы указывают также на тенденцию перехода спирали из В в A

© Р. А. Белых, И. Л. Волков, Н. А. Касьяненко, 2012

форму. В работе [12] рассмотрены спектры кругового дихроизма ДНК при взаимодействии с мальтолатом алюминия. Исследователи высказали предположение о способности алюминия при концентрациях порядка 1 мМ вызывать переход ДНК в Z-форму, однако характер наблюдаемых изменений для тимусной ДНК не может однозначно свидетельствовать о реализации конформационного перехода. Вместе с тем такой вывод обоснован при использовании ГЦ-содержащих олигонуклеотидов.

Таким образом, в ряде работ отмечено значительное влияние ионов алюминия на вторичную структуру молекулы ДНК. Следует отметить также, что существуют данные о способности трёхвалентных ионов металлов образовывать внутримолекулярные сшивки [13, 14]. Такие сшивки, например, предотвращают ренатурацию ро1у^А^). Однако они разрушаются при повышении рН и титровании ЭДТА. Насыщение связывания, приводящего к образованию сшивок, наступает при отношении концентраций алюминия и фосфатных групп около 0,4. При рассмотрении комплексов алюминия с нуклеотидами методом ЯМР было выявлено, что алюминий преимущественно связывается с имидазольным кольцом аденина.

Имеются данные о возможном влиянии ионов алюминия на структурную динамику так называемых триплетных повторов. Функциональная роль триплетных повторов, локализованных в кодирующей и некодирующей областях гена, практически не изучена. Они встречаются в регуляторных районах ряда генов млекопитающих. Существует мнение, что распространение ДНК-триплетных повторов определяет новый тип мутации в геноме, а именно «динамическую мутацию», вызывающую генетическую нестабильность. В зависимости от того, где именно расположен участок с повторами, он может вызывать различные последствия, от остановки транскрипции до токсичности продуцируемых белков. Например, аномальное распространение повторов ЦЦГ, ЦГГ, ЦТГ, ЦАГ отмечается при двенадцати неврологических заболеваниях, а триплетные повторы ЦЦГ, ЦГГ, ГЦЦ, ГГЦ характерны для синдрома ломкой Х-хромосомы. Обнаружено, что в малых концентрациях (10~7М) алюминий провоцирует образование ошибочного Ц—Ц спаривания, в то время как высокие концентрации алюминия (10~4 М) уменьшают число Ц—Ц пар, тем самым усиливая стабильность конформации ДНК [8]. Было показано также, что алюминий в концентрации 10~4 и 10~5М вызывает В—Z переход для последовательностей (ЦЦГ) 12. Полное удаление алюминия хелирующим препаратом десфероксимином не переводило ДНК обратно в В форму, что говорит о необратимом переходе в стабильную конформацию. Интересно, что молярная концентрация алюминия при синдроме Мартина—Белла (синдром ломкой Х-хромосомы) имеет тот же порядок (1,8 • 10~4М).

Методы и материалы.

Вискозиметрия. Относительную вязкость цг = п/п0 (п и По — вязкости раствора и растворителя) растворов ДНК разной концентрации С определяли с помощью ротационного низкоградиентного вискозиметра типа Зимма—Крозерса при разных градиентах скорости д с последующей экстраполяцией к д = 0. Характеристическая вязкость молекулы ДНК пропорциональна её удельному объёму в растворе. Согласно формуле Флори

М = Ф К^М!.» ,„

1 М М 1 '

Здесь М — молекулярная масса полимера; А — длина статистического сегмента; Ь — гидродинамическая длина цепи; а = (/?2) 2/(/?д) 2 — коэффициент линейного набухания, где (/?2) 2 и {} 2 — среднеквадратичное расстояние между концами набухшей

и невозмущённой цепи соответственно; Ф — параметр Флори, зависящий от сродства полимера к растворителю и жёсткости полимерной цепи.

Спектральные методы. Спектры кругового дихроизма (КД) ДНК регистрировали на приборе "Mark 4" ("Jobin Ivon", Франция). Спектры поглощения ДНК и оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре СФ-56.

Атомная силовая микроскопия. АСМ изображения получены с помощью микроскопа NanoScope 4a (Veeco). Образцы готовили методом адсорбции ДНК на поверхность слюды в присутствии ионов магния Mg2+, которые добавляли в раствор непосредственно перед фиксацией. После помещения капли раствора ДНК на поверхность слюды и выдержки при комнатной температуре в течение 2 мин образцы промывали дистиллированной водой, высушивали струёй воздуха, а затем в вакуумном сушильном шкафу. Образцы сканировали методом прерывистого контакта на воздухе.

Материалы. В работе использовали коммерческий препарат ДНК тимуса телёнка ("Sigma"). Молекулярную массу (М = 11 • 106 Да) находили из характеристической вязкости в 0,15М NaCl. ДНК растворяли в дистиллированной воде и после 3 сут выдержки при температуре 4 °С добавляли раствор NaCl до концентрации 0,005М. Концентрацию ДНК в растворе находили по разнице оптического поглощения при 270 и 290 нм гид-ролизованных в течение 15 мин в 6%-ной HCIO4 при температуре 100 °С и быстро охлаждённых растворов. После фильтрации базового раствора и определения концентрации ДНК готовили её комплексы с ионами металлов, сливая равные объёмы растворов компонентов соответствующей ионной силы. Все растворы ДНК содержали NaCl в концентрации 0,005М или 1М и разные концентрации AICI3, а при получении АСМ изображений и 5- 10-4М MgCl2. Все соли имели квалификацию х.ч. Нужную концентрацию солей получали из насыщенных растворов. Измерения производили через 15 мин после приготовления растворов. Нативность ДНК в ходе эксперимента контролировали по гиперхромному эффекту при её денатурации.

Результаты и их обсуждение. Поскольку состояние ионов алюминия в растворе зависит от рН, исследование их взаимодействия с ДНК обычно проводят с использованием буферных растворов. Однако особый интерес представляет изучение взаимодействия в водных растворах ДНК, содержащих лишь NaCl и AICI3 без дополнительных компонентов, затрудняющих интерпретацию полученных данных. В результате гидролиза в воде образуются комплексы

[Al(H2O)6]3+ ^ [Al(H2O)5(OH)2+] ^ [Al(H2O)4(OH)2]+ ^ Al(OH)s ^ [Al(OH)4-

В зависимости от рН наблюдается превалирование той или иной формы. Эксперимент показал, что увеличение концентрации А1С1з в воде приводит к снижению рН раствора за счёт роста количества протонов согласно приведённой выше схеме. На рис. 1 показано, что присутствие МаС1 в концентрации 0,005М и ДНК (С = 0,005 %) практически не оказывает влияния на ход зависимости рН от концентрации алюминия в растворе. При используемых в работе концентрациях алюминия, обеспечивающих диапазон рН

1

♦ 2  3 • 4

Рис. 1. рН растворов AlCl3 в воде

4

от 4,5 до 6 (в 1М ^С1) и от 5,2 до 6 (в 0,005М ^С1), изменение рН раствора не оказывает влияния на структуру и свойства молекулы ДНК [15]. В этих условиях в растворе присутствуют ионы [А1(Н20)6]3+, [А1(Н20)5(0Н)]2+, [А1(Н20)4(0Н)2]+ [8].

Молекула ДНК в водном растворе является сильно заряженным полиионом, размер клубка которого в значительной степени зависит от ионной силы раствора. На рис. 2 приведена зависимость характеристической вязкости используемого в работе образца ДНК от (/ — ионная сила раствора). Эта зависимость отражает хорошо известное полиэлектролитное набухание заряженных макромолекул, приводящее к линейной зависимости величины [г|] от 1~ з в широкой области ионных сил.

9080706050-

[П], дл/г

0

4 6 8 10 12 14 ¡-1

Рис. 2. Зависимость характеристической вязкости ДНК от I

Согласно формуле Фиксмана, коэффициент линейного набухания а в формуле Фло-ри (*) связан с параметром исключённого объёма г соотношением

а3 = 1 + 2г; 3 ^

2л:)

А3

где в* — исключённый объём сегмента; N — количество сегментов длиной А. Для незаряженных полимеров величина в* может выражаться через эффективный (с учётом взаимодействия с растворителем) потенциал взаимодействия двух сегментов ф(г):

в*

4п

1-е кт

г2 ¿г.

Для полиионов величина г определяется дебаевским радиусом г о = 1, где — параметр Дебая, зависящий от ионной силы раствора (концентрации противоионов а3), Хя = (8л:/дся)2; 1в = </2/(еА;Т) —бьеррумовская длина; е — диэлектрическая постоянная среды; д — заряд электрона; к — постоянная Больцмана; Т — абсолютная температура:

2е1

32 1 -—Г ь* гпаг 4л 2

где Ь — гидродинамическая длина цепи; а = ао + ае1 (щ — персистентная длина полииона, состоящая из «скелетной» ао и «полиэлектролитной» ае1 частей [16]).

Таким образом, представленная на рисунке зависимость отражает полиэлектролитное набухание молекулы ДНК с уменьшением ионной силы раствора, что хорошо согласуется с теоретическими представлениями о поведении жёстких полиэлектролитов

[17, 18].

Выбор условий эксперимента (0,005 и 1М ^С1) обусловлен следующими соображениями. В растворе 1М МаС1 полиэлектролитное набухание ДНК практически полностью подавлено и объём макромолекулы определяется объёмными эффектами неэлектростатической природы, а в 0,005М МаС1 наряду со значительными объёмными эффектами не наблюдается ещё заметного изменения персистентной длины ДНК. Действительно, на рисунке зависимость носит линейный характер во всей используемой области

X.

о

а 2

концентраций ^С1, что отражает отсутствие заметного вклада изменения ближних электростатических взаимодействий в наблюдаемое возрастание объёма ДНК [18].

На рис. 3 представлены результаты измерения приведённой вязкости растворов ДНК в зависимости от концентрации А1С13 в 0,005М и 1М ^С1. Опыт показал, что в 1М МаС1 присутствие ионов алюминия в растворе в концентрациях менее 10~4М не оказывает заметного влияния на объём молекулы ДНК, что отличается от действия других трёхвалентных ионов металлов [19]. При концентрации алюминия более 10~4М ДНК выпадает в осадок. В растворах малой ионной силы (0,005М ^С1) увеличение концентрации А1С1з в диапазоне до 5• 10~5М приводит к падению объёма макромолекулы из-за экранировки её отрицательного заряда ионами алюминия. Следует отметить, в этом случае превышение концентрацией А1С1з в растворе ДНК значения в 6 • 10~5М приводит к выпадению ДНК в осадок, что фиксируется визуально по появлению рыхлых хлопьев.

Как было сказано ранее, в водном растворе присутствуют ионы алюминия и продукты гидролиза, которые имеют заряд от 1+ до 3+ в используемом диапазоне рН. Однозарядные ионы [А1(Н0^(0Н)2] + при используемых концентрациях не могут вызывать наблюдаемого падения вязкости растворов ДНК в 0,005М ^С1. Взаимодействие ДНК с [А1(Н20)6]3+, вероятно, привело бы к падению приведённой вязкости раствора в 1М ^С1, характерному для связывания ДНК с трёхвалентными ионами металлов. Так, известно, что ионы Fe3+, La3+ и Со3+ вызывают уменьшение объёма молекулярного клубка ДНК из-за внутримолекулярных сшивок, формируемых трёхвалентными ионами в результате связывания с фосфатными группами макромолекулы [7, 19]. Следовательно, наблюдаемый характер гидродинамического поведения ДНК позволяет предположить, что взаимодействующие с макромолекулой ионы алюминия имеют преимущественно заряд 2+. Это не противоречит данным, указывающим на преобладание [А1(Н20)5(0Н)]2+ в водных растворах при рН = 5 + 6 [8].

При взаимодействии ДНК с ионами алюминия с зарядом 2+ можно ожидать реализации одной из известных моделей связывания двухвалентных ионов металлов. Как было показано ранее, ионы щелочноземельных металлов (Mg2+, Ва2+, Са2+) связываются с фосфатными группами ДНК, а переходных (Мп2+, Zn2+) — с фосфатами и основаниями по положению N7 гуанина [20]. Для решения вопроса о месте связывания ионов алюминия с макромолекулой рассмотрим спектральные данные.

На рис. 4 представлены спектры УФ (а) и КД ДНК (б) в присутствии двух концентраций алюминия в растворе. Там же приведены спектры для аналогичных растворов ДНК без алюминия. При концентрации А1С13 до 1 • 10~5М видимых изменений спектральных свойств ДНК не наблюдается, а при концентрации 5 • 10~5М существенно изменяется лишь спектр КД при неизменности спектра УФ поглощения ДНК. В растворе 1М МаС1 спектральных изменений УФ поглощения при добавлении А1С13 до концентрации 5 • 10~5М также не наблюдается (рис. 4, в). При концентрации алюминия более 10~4М в растворе появляется осадок. В отличие от 0,005М ^С1, в 1М МаС1 в спектре

п /п 0

пр. 'пр.и

Рис. 3. Зависимость относительного изменения приведённой вязкости растворов ДНК от концентрации ЛЮ1з в растворе 0,005М ШС1 (1) и 1Ы 0 1,0-10-5 2,0-10-5 3,0-10-5 4,0-10-5 5,0- 10-

ша (2) СА1, М

в 1,0

220 240 260 280 Я, нм

300 320

220 240 260 280 300 320 Я, нм

в 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

Рис.

220 240 260 280 Я, нм

300 320

2 1 0 -1 -2 -3

Де

220

240

260 280 Я, нм

300

4. Спектры УФ поглощения и кругового дихроизма ДНК в присутствии А1С13 в 0,005М ШС1

б

а

г

в

КД ДНК (рис. 4, г) существенных изменений в диапазоне концентраций алюминия до 5 • 10-5М нет. Это, наряду с данными вискозиметрии, может свидетельствовать об отсутствии взаимодействия ионов алюминия с ДНК в растворе большей ионной силы. Однако повышение концентрации алюминия более 10-4М влечёт уменьшение рН раствора (см. рис. 1), что приводит к появлению в растворе большего количества ионов алюминия в состоянии [А1(Н20)б]3+ [8]. Трёхвалентные ионы могут взаимодействовать с ДНК в условиях большей ионной силы, что и провоцирует её выпадение в осадок. Аналогично, выпадение ДНК в осадок при концентрациях А1С13 > 6 • 10-5М в 0,005М МаС1 может свидетельствовать о формировании ионной связи А13+ с фосфатной группой ДНК, что ведёт к уменьшению гидрофильности макромолекулы и ухудшению сродства полимер—растворитель. В 1М МаС1 выпадение в осадок происходит при более высоких концентрациях алюминия, из-за более эффективного экранирования фосфатных групп ионами натрия.

Заметим, что ионы щелочноземельных металлов с зарядом 2+ ни при каких концентрациях не вызывают выпадения ДНК в осадок, тогда как ионы переходных металлов при очень значительных концентрациях (более 1М) могут вызвать некоторую дестабилизацию вторичной структуры ДНК из-за комплексообразования с участием

азотистых оснований. При определённых условиях это обстоятельство может привести к нарушению молекулярности растворов. Однако в нашем случае неизменность спектра УФ поглощения ДНК исключает взаимодействие ионов алюминия 2+ с азотистыми основаниями ДНК и дестабилизацию двойной спирали.

Обратимся к результатам, полученным с использованием метода атомно-силовой микроскопии. На рис. 5, а представлено АСМ изображение свободных молекул ДНК, зафиксированных на слюде в присутствии ионов магния. При фиксации ДНК из раствора, содержащего помимо ионов магния AICI3 в концентрации 5 • 10_6M (рис. 5, б) и 1 • 10_5M (рис. 5, в), на изображении видно некоторое «поджимание» клубков ДНК. Эти результаты согласуются с результатами метода вискозиметрии, указывающими на уменьшение объёма молекулярного клубка при взаимодействии с ионами алюминия.

0,0 0,5 1,0 1,5 мкм 0,0 0,5 1,0 1,5 мкм 0,0 0,5 1,0 1,5 мкм нм

Рис. 5. Данные атомно-силовой микроскопии, СДНК = 5 • 10 5 %, добавки:

а - MgCl2 3,3 • 10-4M; б - AICI3 5 • 10-6M, MgCl2 3,3 • 10-4M; в - AICI3 10-5M, MgCl2 3,3 • 10-4M

Следует заметить, что на основании представленных данных мы не исключаем возможности формирования внутри- и межмолекулярных сшивок, что может указывать на присутствие в растворе ДНК также ионов алюминия с зарядом 3+.

Суммируя выводы, которые можно сделать на основании экспериментальных данных, отметим, что в рассматриваемых системах, по-видимому, с ДНК взаимодействуют продукты гидролиза AlCl3 с зарядом 2+ и 3+ одновременно. Наиболее вероятным местом связывания являются фосфатные группы. Увеличение концентрации алюминия в растворе ДНК свыше 5 • 10_5М смещает pH раствора в кислую область, что приводит к возрастанию доли Al3+ и может быть причиной выпадения ДНК в осадок из-за формирования ионной связи.

Литература

1. CrapperD. R., KrishnanS. S., DaltonA. J. Brain aluminium distribution in Alzheimer's disease andespecially neurofibrillary degeneration // Science. 1973. Vol. 180. P. 511-513.

2. CrapperD. R, Krishnan S. S., QuittkatS. Aluminium, neurofibrillary degeneration and Alzheimer's disease // Brain. 1976. Vol. 99. P. 67.

3. Trapp G. A., Miner G. D., Zimmerman R. L. et al. Aluminum levels in brain in Alzheimer's disease // Biol. Psychiatry. 1978. Vol. 13. P. 709.

4. Yase Y. The basic process ofamyotrophic lateral sclerosis as reflected in Kii Peninsula and Guam // Exerpta Medica Int. Congr. Ser.-Excerpta Med. 1977. N 434. P. 43.

5. Yoshimasu F., Uebayashi Y., Yase Y. et al. Studies on amyo- trophic lateral sclerosis by neuron activation analysis // Folia Psychiatr. Neurol. Jpn. 1976. Vol. 30. P. 49.

6. Walker P. R., LeBlane J, S'ikorska M. Effects of aluminum and other cations on the structure of brain and liver chromatin // Biochemistry. 1989. Vol. 28. P. 3911.

7. Касьяненко Н. А., Богданов А. А., Дефрене С. Взаимодействие молекулы ДНК с координационными соединениями платины и кобальта в растворе // Биофизика. 2002. Т. 47. Вып. 3. C. 449-453.

8. Rao K. S. J. Thecomplexity of Aluminum-DNA interactions: Relevance to Alzheimer'sand other neurological diseases // Structure and Bonding. 2003. Vol. 104. P. 80-96.

9. КасьяненкоН. А., Сельман-Хусейн СосаГ., ФрисманЭ.В. Исследование влияния ионов Mg+2 и Mn+2 на конформацию молекулы ДНК // Мол. биол. 1987. Т. 21. Вып. 1. С. 140-146.

10. KarlikS. J., Eichhorn G. L., Lewis P. N., Crapper D. R. Interaction of Aluminum species with Deoxyribonucleic Acid // Biochemistry. 1980. Vol. 19. P. 5991-5998.

11. Ahmad R., NaouiM., NaeultJ. F. et al. An FTIR spectroscopic study of calf-thymus DNA complexation with Al(III) and Ga(III) cations //J. Biomol. Struct. Dynam. 1996. Vol. 10. P. 865.

12. Rao K. S. J., DivakarS. Spectroscopic studies of Al-DNA interactions // Bull. Environmental Contamn. Toxicol. 1993. Vol. 50. P. 92.

13. Kasyanenko N., ArikainenN., Frisman E. Investigation of DNA complexes with iron ions in solution // Biophys. Chem. 1998. Vol. 70. P. 93-100.

14. KarlikS. J., Eichhorn G. L. Polynucleotide cross-linking by aluminum //J. Inorg. Biochem. 1989. Vol. 37. Iss. 4. P. 259-269.

15. Kasyanenko N. A., Prokhorova S., Haya E. E. F. et al. Interaction of protonated DNA with trans-diclorodiammineplatinum(II) // Colloids Surf. (A). 1999. Vol. 148. P. 121-128.

16. OdijkT. Ionic-Strength dependence of the inyrinsic-viscosity of DNA // Biopolymers. 1979. Vol. 18. N 12. P. 3111-3113.

17. SkolnikJ., Fixman M. Electrostatic persistence length of a wormlike polyelectrolyte // Mac-romolecules. 1977. Vol. 10. P. 944.

18. ФрисманЭ. В., КасьяненкоН. А. Гидродинамическое и оптическое поведение молекулы ДНК в области больших ионных сил // Мол. биол. 1990. Т. 24. С. 318-324.

19. Kasyanenko N., ZaninaA., Nazarova O., Panarin E. DNA interaction with Complex Ions in Solution // Langmuir. 1999. Vol. 15. N 23. P. 7912-7917.

20. Касьяненко Н. А., Мухин Д. А., Перевязко И. Ю. // Высокомол. соединения. 2010. Т. 52. № 7. С. 1360-1372.

Статья поступила в редакцию 27 сентября 2011 г.