ПАТОМОРФОЛОГИЯ КОСТНОГО МОЗГА СПФ-ЭМБРИОНОВ и цыплят ПРИ ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ

УДК 619:616.98:578.831:636.5.053

ПАТОМОРФОЛОГИЯ КОСТНОГО МОЗГА СПФ-ЭМБРИОНОВ и цыплят ПРИ ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ

И. Н. ГРОМОВ, М. К. СЕЛИХАНОВА, Д. О. ЖУРОВ

УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»,

г. Витебск, Республика Беларусь, 210026

А. С. АЛИЕВ, С. А. ЕМЕЛЬЯНОВА

ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», г. Санкт-Петербург, Российская Федерация, 196084

Резюме. В статье впервые приведены результаты изучения патоморфологических изменений в костном мозге у СПФ-эмбрионов и цыплят при экспериментальном заражении вирусом инфекционной анемии. Представлены данные о влиянии вируса инфекционной анемии на показатели миелограммы и парциальных формул различных групп кроветворных клеток костного мозга.

Ключевые слова: СПФ-эмбрионы, цыплята, патоморфологические изменения, инфекционная анемия, костный мозг.

Summary. The article presents the results of investigation into the morphological changes in bone marrow of SPF-embryos and chickens which were experimentally infected with anaemia. It also contains information about the impact of the virus of infectious anemia on the indicators of myelogram and partial formulas of hematopoietic cells in the bone marrow.

Key words: SPF-embryos, chickens, pathomorphological changes, infectious anaemia, bone marrow.

Введение. Инфекционная анемия - высококонтагиозная вирусная болезнь цыплят раннего возраста, характеризующаяся поражением кроветворной и иммунной систем, серозными отеками подкожной клетчатки и некрозами кожи [1, 4].

Возбудителем болезни является ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Circoviridae, роду Gyrovirus [3]. Вирус репродуцируется в кроветворных клетках красного костного мозга вызывая массовую гибель клеток всех ростков гемоцитопоэза с последующим замещением красного костного мозга на желтый костный мозг.

Дефицит предшественников Т- и В-лимфоцитов обуславливает развитие атрофии лимфоидной ткани в тимусе, бурсе Фабрициуса, периферических органах иммунитета. Поражение эритроидного кроветворения приводит к развитию общей анемии [11]. На фоне приобретенного иммунодефицита активизируется условно-патогенная микрофлора, появляются некрозы в коже. Инфекционная анемия часто протекает в ассоциации с болезнями Марека и Гамборо [1, 10].

Болезнь впервые зарегистрирована в Японии в 1979 году [1]. В настоящее время вспышки инфекционной анемии регистрируются во многих странах с развитым птицеводством. Результаты исследований В. А. Лобанова и др. [4, 9] свидетельствуют о широком распространении вируса инфекционной анемии цыплят в птицеводческих хозяйствах Республики Беларусь, Российской Федерации и Украины. В крупных птицеводческих хозяйствах промышленного типа инфекционная анемия наносит значительный экономический ущерб, который обусловлен гибелью птицы, низкими приростами и оплатой корма, снижением категорийности тушек, повышенной выбраковкой, расходами на лечение вторичных инфекций и проведение соответствующих ветеринарно-санитарных мероприятий [4].

Анализ источников. Существует ряд работ, как правило, зарубежных исследователей, посвященных изучению патогенеза заболевания, патоморфологических изменений во внутренних органах цыплят, отмеченных при инфекционной анемии. Однако многие аспекты указанных проблем нуждаются в дополнительных исследованиях. Имеющиеся одиночные сообщения зарубежных авторов о динамике патоморфологических изменений при инфекционной анемии цыплят охватывают незначительный срок наблюдения. Необходимы исследования, посвященные возможности регенерации иммуноком-петентных органов, особенно костного мозга в условиях переболевания птиц инфекционной анемией. Кроме того, в настоящее время имеются неполные и не систематизированные сведения по дифференциальной патоморфологической диагностике инфекционной анемии и не отобраны наиболее инфор-

мативные критерии, позволяющие более достоверно решать подобные вопросы. Приведенные данные и актуальность проблемы служат основанием для проведения настоящей работы [3, 4, 12].

Установлено, что вирус ИАЦ передается горизонтально и вертикально. При этом вертикальный способ передачи вируса через инкубационное яйцо принято считать основным источником распространения возбудителя. Источником вертикальной трансмиссии инфекции может служить сперма больных петухов. При наличии антител у 80 % кур-несушек в стаде процент неинфицированного потомства может составить до 20. Следует отметить, что патоморфологические изменения у куриных эмбрионов, развивающиеся при заражении вирусом ИАЦ, остаются мало изученными. Решение данной проблемы позволит значительно повысить достоверность, упростить и ускорить сроки постановки патологоанатомического диагноза на инфекционную анемию [4].

Цель работы - изучить патоморфологические изменения в костном мозге у СПФ-эмбрионов и цыплят при экспериментальном заражении вирусом инфекционной анемии.

Материал и методика исследований. Исследования были проведены на СПФ-эмбрионах и цыплятах суточного возраста. Эмбрионы были подобраны по принципу аналогов и разделены на 2 группы по 10 эмбрионов в каждой. Цыплята также были подобраны по принципу аналогов и разделены на 2 группы по 16 цыплят в каждой.

Эмбрионов опытной группы в суточном возрасте заражали изолятом «Краснодарский» («АБИМ») вируса инфекционной анемии (депонирован в Государственной коллекции вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского под № 2722) в суточном возрасте в желточный мешок. Вируссодержащим материалом служил стерильный 20 %-ный гомогенат печени экспериментально зараженных вирусом ИАЦ СПФ-цыплят, обработанный по общепринятой методике.

Цыплят опытной группы в суточном возрасте внутримышечно заражали тем же штаммом («Краснодарский») вируса инфекционной анемии. Интактные СПФ-цыплята и эмбрионы 2 группы служили контролем.

За всеми цыплятами и эмбрионами было установлено клиническое наблюдение. На 19 день после заражения эмбрионы 1 и 2 групп охлаждали при t=4 0C в течение 12 часов. Затем производили отбор трубчатых костей - бедренной и большеберцовой.

На 4, 8, 15, 21 сутки СПФ-цыплят опытной и контрольной групп убивали с последующим отбором трубчатых костей (также бедренной и большеберцовой).

Кусочки трубчатых костей фиксировали в 10 %-ном растворе нейтрального формалина, а затем декальцинировали в 10 %-ном растворе уксусной кислоты. Зафиксированный материал обезвоживали в этиловом спирте возрастающей концентрации, а затем подвергали уплотнению путем заливки в парафин по общепринятой методике [7, 9]. Обезвоживание и парафинирование кусочков органов проводили с помощью автомата для гистологической обработки тканей «MICROM STP 120» (Германия) типа «Карусель». Для заливки кусочков и подготовки парафиновых блоков использовали автоматическую станцию «MICROM EC 350». Гистологические срезы кусочков органов, залитых в парафин, готовили на роторном (маятниковом) микротоме «MICROM HM 340 E».

Для изучения общих структурных изменений срезы окрашивали гематоксилин-эозином [6-8]. Депарафинирование и окрашивание гистосрезов проводили с использованием автоматической станции «MICROM HMS 70». Миелограмму выводили, исходя из подсчета 1000 клеток в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза [2]. При подсчете костномозговых клеток поддерживались унитарной теории кроветворения, дополненной И. А. Болотниковым иЮ. В. Соловьевым [1].

Наряду с оценкой миелограммы выводили парциальные формулы различных групп клеток костного мозга [2, 3]: лейкоэритробластический индекс - соотношение костномозговых элементов лейкоцитарного и эритроцитарного ростков; костномозговой индекс созревания псевдоэозинофилов -отношение молодых клеток псевдоэозинофильной группы (промиелоциты, миелоциты, метамиелоци-ты) к зрелым псевдоэозинофилам (палочкоядерные, сегментоядерные); костномозговой индекс созревания эозинофилов - соотношение молодых (промиелоциты, миелоциты, метамиелоциты) и зрелых (палочкоядерные, сегментоядерные) клеток эозинофильной группы; костномозговой индекс созревания эритронормобластов - отношение числа гемоглобинизированных форм нормоцитов (полихроматофильные нормоциты) к количеству всех клеток эритроидного ряда.

Цифровые данные обработаны статистически с использованием программы Microsoft Excel 2003.

Результаты исследований и их обсуждение. При гистологическом исследовании костного мозга 19-дневных эмбрионов установлено, что строма органа была образована соединительнотканными

трабекулами, отходящими от эндооста кости. В метафизарной области выявлялись также участки хрящевой ткаии. В эндотелиальной выстилке капилляров, а также среди элементов ретикулярной ткани локализовались макрофаги, содержащие гранулы железосодержащих пигментов. В петлях ретикулярной сети располагались молодые и зрелые гемопоэтические элементы. Развивающиеся диф-фероны кроветворных клеток располагались островками. При этом эритробластические островки часто формировались в непосредственной близости от макрофагов. Созревающие гранулоциты также лежали в виде островков. Клетки тромбоцитарного ряда (тромбобласты, протромбоциты и тромбоциты) локализовались, как правило, рядом с синусоидными капиллярами (рис. 1, 2).

Рис. 1. Структура костного мозга интактного эмбриона Рис. 2. Наличиегенераций эритроцитов и

19-дневного возраста. Микрофото. Гематоксилин-эозин. гранулоцитов в костном мозге интактного эмбриона

Биомед-6. Об. х 10, ок. х 10, бинок. х 1,25 19-дневного возраста. Микрофото. Гематоксилин-эозин.

Биомед-6. Об. х 40, ок. х 10, бинок. х 1,25

Вокруг кровеносных сосудов встречались также небольшие группы лимфоцитов и моноцитов. Среди клеток костного мозга преобладали малодифференцированные клетки. Желтый костный мозг выявлялся в диафизах трубчатой кости. Он состоял из ретикулярной ткани, которая местами была замещена скоплениями липоцитов.

При исследовании СПФ-цыплят разного возраста установлены сходные закономерности гистологического строения костного мозга (рис. 3, 4).

Рис. 3. Структура костного мозга 8-дневного цыпленка Рис. 4. Костный мозгинтактного цыпленка

контрольной группы. Микрофото. Гематоксилин-эозин. 15-дневного возраста без морфологических изменений.

Биомед-6. Об. х 40, ок. х 10, бинок. х 1,25 Микрофото. Гематоксилин-эозин. Биомед-6.

Об. х 100, ок. х 40, бинок. х 1,25

В миелограмме эмбрионов опытной группы мы отмечали достоверное уменьшение в 2,7 раза общего количества гранулоцитов по сравнению с контролем. Изменение данного показателя происходило в основном за счет клеток эозинофильного ряда. В миелограмме эмбрионов подопытной группы отмечено резкое уменьшение числа эозинофилов с 40,4±11,1 % (контроль) до 12,3±5,8%. Изменение данного показателя происходило за счет существенного (в 4,6-2,6 раза) снижения числа эозинофиль-ных метамиелоцитов, а также палочкоядерных и сегментоядерных эозинофилов. Данные показатели уменьшились по сравнению с контролем (Р>0,05). Количество базофильных клеток уменьшилось с 12,53±5,84 до 3,1±1,2 % (Р>0,05), что также повлияло на общее содержание клеток гранулоцитарного ряда (рис. 5).

Общее количество эритробластических клеток в миелограмме подопытных эмбрионов увеличилось с 0,2±0,01% (контроль) до 3,3±1,3 % (Р>0,05). Отмечалось уменьшение содержания полихрома-тофильных нормоцитов в 1,7 раза при одновременном уменьшении количества других видов нормо-цитов. При этом общее количество клеток эритроцитарного ряда уменьшилось с 6,4±1,6 % до 5,9±2,3 %, а число лимфоцитов увеличилось на 40 % (Р<0,05) (рис. 6).

Различия в показателях по тромбоцитарному и моноцитарному рядам клеток между 1 и 2 группами эмбрионов были недостоверными.

Рис. 5. Аплазия красного костного мозга 19-дневного эмбриона опытной группы. Микрофото. Гематоксилин-эозин. Биомед-6. Об. х 10, ок. х 10, бинок. х 1,25

Рис. 6. Преобладание генераций лимфоцитов в костном мозге эмбриона опытной группы на 19 день после заражения вирусом ИАЦ. Микрофото. Гематоксилин-эозин. Биомед-6. Об. х 100, ок. х 10, бинок. х 1,25

В костном мозге эмбрионов опытной группы отмечено незначительное уменьшение лейкоэрит-робластического индекса. Также в опыте отмечалось увеличение индекса созревания эритронормоб-ластов (0,01±0,08 % контроль) 0,4±0,2 %. При этом костномозговые индексы созревания эозинофилов и псевдоэозинофилов оставались практически на одном уровне.

В миелограмме цыплят опытной группы во все сроки исследований отмечено достоверное уменьшение клеток гранулоцитарного ряда с 56,8±0,9 % до 41,6±1,9 %. Также во все сроки исследования мы отмечали достоверное уменьшение общего количества эозинофилов по сравнению с контролем. Так, на 4 сутки опыта количество эозинофилов достоверно уменьшилось в опытной группе (16,5±0,2 % контроль) 10,8±0,5 %. При этом в последующие сроки исследования на 8, 15 и 21 сутки опыта содержание общего количества эозинофилов в опытной группе была в 0,1-0,8 раз меньше, чем в контрольной группе (рис. 7). Общее количество эритробластических клеток в миелограмме подопытных птиц на 4, 8 и 15 сутки было достоверно больше, чем в контроле, ана 21 сутки наблюдалось незначительное уменьшение числа эритробластов в сравнении с контролем.

Во все сроки исследований наблюдалось достоверное уменьшение количества клеток лимфоидно-го ряда (рис. 8). Так, на 15 сутки опыта количество лимфоцитов уменьшилось с 24,7±0,4 % (контроль) до 14,5±0,03 % (P<0,05). На 4, 15, 21 сутки опыта выявлено значительное уменьшение общего количества клеток тромбоцитарного ряда с 21,00±0,1 % до 9,4±0,2 % (P<0,01), а на 8 сутки опыта, наоборот, отмечено увеличение данного показателя в 1,2 раза. Кроме того, на 4, 15, 21 сутки наблюдалось

увеличение количества моноцитов в опытной группе в пределах 3,3-5,3 раз в сравнении с контролем. Индекс созревания эритронормобластов у птиц опытной и контрольной групп на 4 сутки эксперимента достоверно не отличался. В дальнейшем на 8, 15, 21 день в костном мозге цыплят опытной группы отмечалось значительное снижение данного показателя. Кроме того, в костном мозге цыплят опытной группы в сравнении с контролем на 4 сутки отмечено недостоверное увеличение лейкоэритроб-ластческого индекса. На 8, 15 и 21 сутки опыта наблюдалось уменьшение данного показателя с 1,4±0,05 (контроль) до 0,3±0,003 % (Р<0,001).

Рис. 7. Аплазия и ожиреииекостиого мозга цыпленка Рис. 8. Единичныелимфоциты в костном мозге цыпленка опытной группы на 15 день опыта. Микрофото. на 15 сутки опыта. Микрофото. Гематоксилин-эозин.

Гематоксилин-эозин. Биомед-6. Об. х 10, ок. х 10, бинок. х 1,25 Биомед-6. Об. х 100, ок. х 10, бинок. х 1,25

Заключение. Полученные результаты исследований свидетельствуют о том, что при экспериментальном заражении эмбрионов цирковирусом в костном мозге выявлены глубокие структурные изменения, характеризующиеся угнетением миелоидного кроветворения, что подтверждается достовер -ным уменьшением количества клеток гранулоцитарного ряда, изменениями парциальных формул различных групп кроветворных клеток. Под действием вируса инфекционной анемии в костном мозге СПФ-цыплят также происходит выраженная структурная перестройка, характеризующаяся достоверным уменьшением числа клеток гранулоцитарного и эритробластического рядов, гиперплазией клеток лимфоцитарного ростка, а также изменением лейкоэритробластического индекса и индекса созревания эритронормобластов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Болотников, И. А. Гематология птиц / И. А. Болотников, Ю. В. Соловьев. - Ленинград: Наука, 1980. - 115 с.

2. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / Б. У. Кэлнек [и др.]; под ред. Б. У. Кэлнека, X. Джона Барнса, Чарльза У. Биерда и др.; пер. с англ. И. Григорьева [и др.]. - М.: АКВАРИУМ БУК, 2003. - С. 829-849.

3. Гусева, Е. В. Инфекционная анемия цыплят: Обзор литературы / Е. В. Гусева, Т. А.Сатина, Т. А. Фомина // ВНИ-ИЗЖ. - Владимир, 1997. - 72 с.

4. Инфекционная анемия цыплят / А. С. Алиев [и др.]. // Ветеринарная медицина. - 2011. - № 1. - С. 49-53.

5. Карпуть, И. М. Гематологический атлас сельскохозяйственных животных / И. М. Карпуть. - Минск: Ураджай, 1986. -183 с.

6. Коленкин, С. М. Основные правила исследования пунктата костного мозга / С. М. Коленкин, А. И. Михеева // Клиническая лабораторная диагностика. - 1999. - № 2. - С.41-43.

7. Лилли, Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лилли; под ред. В. В. Португалова; пер. с англ. И. Б. Краснов [и др.]. - М.: Мир, 1969. - С. 577-592.

8. Меркулов, Г. А. Курс патологогистологической техники / Г. А. Меркулов. - Ленинград: Медицина, 1969. - 432 с.

9. Микроскопическая техника: Руководство / Д. С. Саркисов [и др.]; под ред. Д. С. Саркисова, Ю. Л. Петрова. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.

10. Серологический мониторинг инфекционной анемии цыплят и молекулярно-биологическая характеристика изолятов вируса / В. А. Лобанов [и др.]. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2003. - № 2. - С. 66-69.

11 .Структурные измененния в костном мозге цыплят при инфекционной анемии / И. Н.Громов [и др.]. // Ученые записки УО ВГАВМ. - Витебск, 2011. - Т. 47. - Вып. 2. -Ч. 1. - С. 18-20.