о
Способ сохранения органов и тканей в составе целостного организма в жидкости при температурах ниже 0С под давлением в среде инертного газа
METHOD FOR PRESERVING ORGANS AND TISSUES AS PART OF INTEGRAL ORGANISM IN LIQUID AT TEMPERATURES BELOW 0°C UNDER PRESSURE IN INERT GAS

Изобретение относится к медицине, криобиологии, биотехнологии, ветеринарии и может быть использовано для сохранения органов и тканей в составе целостного организма при температурах ниже 0°С.
Из уровня техники известен способ криоконсервации биологических образцов под давлением и устройство для его осуществления, который включает насыщение раствором криопротектора, размещение образца при повышении гидравлического давления в объеме камеры до уровня 500-2100 атм и охлаждение до температур от 0°С до -100°С [1]. Недостатком этого способа является необходимость удаления органа из организма, отсутствие возможности сохранения органов в составе биологического объекта. Недостатком является видовая специфичность при применении способа для консервации целых органов. Недостатком также является сложность подготовки, создания и контроля подходящих условий (температура, давление) для осуществления способа.
Известен способ консервации биоматериала, который включает обработку биоматериала ксеноном 90-99,999% степенью чистоты с избыточным давлением до 7-9 атм и охлаждение до температуры не более +5°С, но не менее -10°С [2]. Недостатком этого способа является отсутствие возможности сохранения целых органов.
Известен способ криоконсервации яичниковой ткани, включающий замораживание образца в носителе в атмосфере ксенона 95-99,99% степени чистоты под давлением не менее 1,5 атм., не сбрасывая давления ксенона, выдерживают при отрицательной до -20°С температуре и погружают в жидкий азот [3]. Недостатком этого способа является отсутствие возможности сохранения целых органов.
Известен и выбран в качестве прототипа способ криоконсервации органов и тканей in situ который заключается в том, что биологический объект (сердце, почка и др.) охлаждают в воде до 0°С с одновременным насыщением смесью ксенона, криптона, аргона в соотношении 2,5:47,5:50 об. %, затем вытесняют воду указанной смесью газов и при давлении 1,5 атм понижают температуру до -43°С, далее снижают давление газовой среды до нормального и продолжают охлаждение до -196°С [4]. Этот способ позволяет осуществить криоконсервацию сердца животного в составе всего организма (in situ). Недостатками способа являются:
1. отсутствие самостоятельного дыхания биологического объекта и необходимость использования аппарата искусственной вентиляции легких на первых этапах, что усложняет способ;
2. сложность в создании газовой смеси, подходящей для осуществления способа;
3. подача газовой смеси, содержащей 10% кислорода, что способствует развитию состояния гипоксии биологического объекта;
4. низкая скорость охлаждения биологического объекта, что может привести к развитию состояния ацидоза.
Задачей настоящего изобретения является создание способа сохранения органов и тканей в составе целостного организма, и предотвращения их повреждений температурами ниже 0°С при длительном хранении.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение качества и надежности способа сохранения органов при температурах ниже 0°С.
Для достижения указанного технического результата биологический объект рассыщают от азота для увеличения насыщения медицинским кислородом и предотвращения развития декомпрессионной болезни при сбросе избыточного давления, насыщают кислородом для предотвращения развития состояния гипоксии, после чего к имеющейся газовой среде добавляют ксенон 99,9% чистоты до достижения избыточного давления 3 атм, затем биологический объект выдерживают в полученной газовой среде в течение 20 минут, далее, для ускорения процесса охлаждения и предотвращения развития состояния ацидоза охлаждают посредством прямого контакта с инертной к биологическим тканям жидкостью с температурой кристаллизации менее -80°С, предварительно насыщенной кислородом и охлажденной до -80°С, после чего биологический объект помещают на хранение при температуре окружающей среды -20°С. Предлагаемый способ осуществляют следующим образом: Схема осуществления способа представлена на иллюстрации (фиг. 1). Лабораторное животное (хомяк сирийский) 1 помещают в барокамеру 2, представляющую из себя полимерную колбу с прозрачными стенками с запорно-регулирующей арматурой первого разъема 3, запорно-регулирующей арматурой второго разъема 4 и манометром для контроля давления 5.
К первому разъему 3 подключают шланг, соединенный через разветвитель 6 с баллоном медицинского кислорода 7 и баллоном ксенона 8 с чистотой ксенона 99,9%. Второй разъем 4 остается свободным и открытым. Осуществляют подачу медицинского кислорода в барокамеру 2 в течение 20 минут, при этом имеющаяся в барокамере 2 воздушная смесь, в т.ч. выдыхаемая лабораторным животным, удаляется из объема барокамеры, постоянно заменяясь медицинским кислородом. В процессе дыхания из лабораторного животного удаляется растворенный азот (рассыщение) и накапливается кислород.
Затем подачу медицинского кислорода прекращают и перекрывают второй разъем 4 барокамеры поворотом рукоятки запорно-регулирующей арматуры. В барокамеру плавно начинают подачу ксенона с увеличением давления со скоростью 3 атм/мин. При достижении избыточного давления 1 атм лабораторное животное теряет сознание, т.к. ксенон при такой концентрации обладает выраженным наркотическим эффектом. При достижении избыточного давления 3 атм подачу ксенона прекращают поворотом рукоятки запорно-регулирующей арматуры первого разъема 3 барокамеры 2. Самостоятельное дыхание лабораторного животного сохраняется.
Выдерживают лабораторное животное под этим давлением в течение 20 минут. По прошествии 20 минут отмечается значительное угнетающее влияние ксенона на дыхательную активность, выражающееся в сокращении частоты дыхательных движений лабораторного животного приблизительно в 3 и более раза, по сравнению с частотой дыхательных движений до подачи ксенона в барокамеру.
Через 20 минут от начала подачи в барокамеру ксенона ко второму разъему 4 барокамеры 2 подключают герметичную емкость 9, которая полностью заполнена инертной к биологическим тканям жидкостью с температурой кристаллизации менее -80°С, предварительно насыщенной кислородом и охлажденной до -80°С. Второй разъем 4 барокамеры 2 остается закрыт.Подключение осуществляют таким образом, чтобы при открытии второго разъема поворотом рукоятки запорно-регулирующей арматуры, жидкость заместила газовую среду барокамеры под действием силы тяжести. Открывают первый разъем 3 барокамеры 2 поворотом рукоятки запорно-регулирующей арматуры без изменения давления в барокамере. Затем открывают второй разъем 4 барокамеры, поворотом рукоятки запорно-регулирующей арматуры, сохраняя при этом избыточное давление в барокамере 3 атм. Открытие осуществляют плавно для того, чтобы избежать скачкообразного изменения давления из-за растворения газа в жидкости. После полного замещения газовой среды барокамеры жидкостью перекрывают оба разъема барокамеры поворотом рукояток запорно-регулирующей арматуры, отсоединяют шланг и герметичную емкость 9.
Барокамеру с лабораторным животным под избыточным давлением 3 атм и заполненную инертной к биологическим тканям жидкостью с температурой кристаллизации менее -80°С, предварительно насыщенной кислородом и охлажденной до -80°С помещают в морозильную камеру с температурой -20°С.
Пример.
Подготовка.
За несколько часов до эксперимента проводят подготовку перфторгексана, использующегося в дальнейшем в качестве инертной к биологическим тканям жидкости с температурой кристаллизации менее -80°С. Жидкость переливают в герметичную емкость, предназначенную для работы под избыточным давлением до 8 атм, оснащенную запорно-регулирующей арматурой. Осуществляют насыщение жидкости медицинским кислородом методом барботажа в течение 30 минут. Герметизируют емкость и помещают в морозильную камеру при температуре среды -80°С.
Начало эксперимента.
Лабораторное животное (хомяк сирийский) помещают в барокамеру с прозрачными стенками.
К одному разъему барокамеры подключают шланг, соединенный через разветвитель с баллоном медицинского кислорода и баллоном ксенона чистотой 99,9%. Другой разъем остается свободным. Проводят подачу медицинского кислорода в течение 20 минут с объемной скоростью потока 3-4 л/мин, при этом имеющаяся в барокамере воздушная смесь, в т.ч. выдыхаемая лабораторным животным, удаляется из объема барокамеры, постоянно заменяясь медицинским кислородом. В процессе дыхания происходит рассыщение лабораторного животного от азота и насыщение кислородом.
Затем подачу медицинского кислорода прекращают и перекрывают свободный разъем барокамеры, после чего плавно начинают подачу ксенона с увеличением давления со скоростью 3 атм/мин. При достижении давления 1 атм лабораторное животное теряет сознание, т.к. ксенон при такой концентрации обладает выраженным наркотическим эффектом. Дыхание становится редким и глубоким. При достижении избыточного давления 3 атм, подачу ксенона прекращают. При этом самостоятельное дыхание лабораторного животного сохраняется.
Выдерживают лабораторное животное под избыточным давлением 3 атм в течение 20 минут. Через 20 минут отмечается значительное угнетающее влияние ксенона на дыхательную активность, выражающееся в сокращении частоты дыхательных движений лабораторного животного в 3 и более раза, по сравнению с частотой дыхательных движений до подачи ксенона в барокамеру.
Через 20 минут от начала подачи в барокамеру ксенона к свободному разъему барокамеры подключают заранее подготовленную герметичную емкость, полностью заполненную жидкостью - перфторгексаном. Подключение осуществляют таким образом, чтобы жидкость заместила газовую среду барокамеры под действием силы тяжести. Затем плавно открывают запорно-регулирующую арматуру разъема между барокамерой и емкостью с жидкостью одновременно с дозированной подачей ксенона, следя за тем, чтобы не было скачкообразного изменения давления из-за растворения газа в жидкости. Жидкость начинает замещать газовую смесь барокамеры. Приблизительно через 5 минут происходит полное замещение газовой среды барокамеры жидкостью, затем перекрывают оба разъема барокамеры, отсоединяют шланг и пустую емкость. Наблюдаются дыхательные движения лабораторного животного в жидкости в течение 1 минуты. Снаружи, на металлических частях барокамеры образуется иней. По прошествии 1 минуты дыхательные движения прекращаются. В жидкости видны свободноплавающие единичные кристаллы водного льда. Визуально лабораторное животное остается гибким, при поворотах барокамеры отчетливо наблюдается подвижность лап и туловища относительно друг друга.
Барокамеру помещают в морозильную камеру при температуре окружающей среды -20°С на 60 минут.
Через 60 минут барокамеру извлекают из морозильной камеры и оставляют для отогревания при комнатной температуре. Дополнительный обогрев не используют. Приблизительно через 30 минут свободноплавающие кристаллы водного льда исчезают, что является одним из свидетельств того, что температура внутри барокамеры достигла значения выше 0°С. Затем начинают плавный сброс давления со скоростью 3 атм/мин. После сброса давления из барокамеры сливают жидкость и извлекают лабораторное животное. При визуальном и тактильном обследованиях лабораторное животное пластичное, ушные раковины мягкие, конечности подвижные во всех суставах, позвоночный столб гибкий на всем протяжении. Подключают электрокардиограф и измеряют ректальную температуру. При извлечении ректальная температура составляет 4°С. Через 30 минут после извлечения лабораторного животного из барокамеры ректальная температура составляет 16°С, на ЭКГ отмечаются ритмичные потенциалы в виде зубцов, что свидетельствует о сохранности электрической активности сердечной мышцы. Самостоятельное дыхание отсутствует. Через 45 минут после извлечения из барокамеры ректальная температура составляет 19°С. Проводят вскрытие лабораторного животного. Визуально наблюдаются ритмичные сокращения предсердий, органы и ткани без изменений, кровь не гемолизирована, свертков нет. Участки промерзания не обнаружены.
Эксперимент завершен.
Предлагаемый способ позволяет добиться сохранения органов и тканей в составе целостного организма при температурах ниже 0°С. При сохранении органов и тканей предлагаемым способом уменьшается риск развития состояния гипоксии, благодаря предварительному насыщению организма кислородом, снижается степень развития состояния ацидоза за счет быстрого охлаждения организма. Полностью восстанавливается адекватная сократительная активность сердца в организме, включающая правильный сердечный цикл, отсутствуют повреждения органов характерные для температур ниже 0°С.
Предлагаемый способ может быть использован для сохранения органов и тканей в составе целостного организма при температурах ниже 0°С.
1. Кобелев Алексей Владимирович. Способ криоконсервации биологических образцов под давлением и устройство для его осуществления. Патент RU 2688331 С1 (2018.04.02).
2. Пономарев Александр Игоревич. Способ консервации биоматериала. Патент RU 2577996 C2 (2014.07.04).
3. Грязнов Алексей Юрьевич. Способ криоконсервации яичниковой ткани. Заявка на патент 2012103061 (2012.01.31).
4. Щербаков Павел Васильевич. Способ криоконсервации органов и тканей in situ. Патент RU 2268590 C1 (2004.06.15).