СРЕДСТВО, ИНГИБИРУЮЩЕЕ Na+/H+-ОБМЕН, И ГАЛОГЕНИДЫ 1-ДИАЛКИЛАМИНОЭТИЛ-3-[ЗАМЕЩЕННЫЙ(ДИЗАМЕЩЕННЫЙ) ФЕНАЦИЛ]-2-АМИНОБЕНЗИМИДАЗОЛИЯ
MEDICATION, INHIBITING Na+/H+-EXCHANGE, AND HALOGENIDES OF 1-DIALKYLAMINOETHYL-3-[SUBSTITUTED(DISUBSTITUTED)PHENACYL]-2-AMINOBENZIMIDAZOLIUM

+
+
Изобретение относится к средствам, обладающим способностью ингибировать Na/H-обмен (ингибиторы NHE).
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Na/H обменники (NHE) составляют группу интегральных мембранных белков, экспрессируемых во всех тканях организма, которые осуществляют трансмембранный обмен ионов Na на ионы H. В настоящее время девять различных типов Na/H белков-обменников были клонированы из тканей млекопитающих, и эти изоформы обычно обозначают как NHE-1,2,3,4,5,6,7,8,9 соответственно. Они различаются по аминокислотному составу, тканевой специфичности, механизмам внутриклеточной регуляции. NHE-обменники вовлечены во множество сложных физиологических и патологических процессов, включающих регуляцию клеточного рН, клеточную миграцию, апоптоз, гипертрофию повреждений, связанных с ишемией и реперфузией, защиту клетки от закисления цитоплазмы, контроль клеточного объема [Malo ME, Fliegel L Physiological role and regulation of the Na/H exchanger./ Can. J. Physiol. Pharmacol. - 2006. - №84 (11). - p.1081-1095.], эндотелиальную дисфункцию, а также таких заболеваний, как сахарный диабет и его осложнения, сердечная недостаточность, нарушение мозгового кровообращения, развитие злокачественных опухолей [Fliegel L. Regulation of the Na()/H() exchanger in the healthy and diseased myocardium. / Expert. Opin. Ther. Targets. - 2009. - №13 (1). - p.55-68.; Karmazyn M, Kilic A., Javadov S. The role of NHE-1 in myocardial hypertrophy and remodeling. / J. Mol. Cell Cardiol. - 2008. - №44. - p.647-653.; Provost JJ, Wallert MA. Inside Out: Targeting NHE1 as an Intracellular and Extracellular Regulator of Cancer Progression. // Chem Biol Drug Des. - 2013. - №81(1). - p.85-101.].
Известны различные группы ингибиторов NHE: амилорид и его производные (DMA, EIPA, MIBA и НМА), бензоилгуанидиновые производные, такие как НОЕ-642 (карипорид), его производное НОЕ-694 и энипорид (EMD-85131), сабипорид (BIIB-722), бициклические производные гуанидина, содержащие хинолин (MS 31038), индол (SM 20220, SM 20550, SMP-300), бензоксазинон (КБ-R9032), дигидробензофуран (BMS 284640), тетрагидронафтален (Т-162559), циклогептапиридин (TY-12533) и другие [Masereel В., Pochet L., Laeckmann D. An overview of inhibitors of Na+/H+ exchanger. // Eur. J. Med. Chem. - 2003. - №38. - P.547-554].
+
+
+
+
Известны производные бензимидазола, содержащие нециклическую гуанидиновую группу (бензимидазол-2-ил и бензимидазол-2-илтиометил бензоилгуанидин), способные ингибировать Na/H обмен [Zhang R et al. Benzimidazol-2-yl or benzimidazol-2-ylthiomethyl benzoylguanidines as novel Na/H exchanger inhibitors, synthesis and protection against ischemic-reperfusion injury. / Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2007. - №17. - p.2430-2433.].
50
Наиболее близким по достигаемому результату является Зонипорид (СР-597396)-[1-(хинолин-5-ил)-5-циклопропил-1Н-пиразол-4-карбонил] гуанидина гидрохлорид моногидрат [A Guzman-Perez et al. Discovery of zoniporide: A potent and selective sodium-hydrogen exchanger type 1 (NHE-1) inhibitor with high aqueous solubility. / Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2001. - №11(6). - p.803-807]. В исследованиях in vitro на тромбоцитах кролика было показано, что данный препарат подавляет NHE-1 - зависимое набухание тромбоцитов (ЕС=56 нМ) [Tracey WR et al. Zoniporide: a potent and selective inhibitor of the human sodium-hydrogen exchanger isoform 1 (NHE-1) // Cardiovasc Drug Rev. - 2003. - №21. - p.17-32].
Однако его свойства как ингибитора NHE остаются недостаточно эффективными.
+
+
Техническим результатом является повышение эффективности ингибиторов Na/H-обмена (ингибиторы NHE).
+
+
Технический результат достигается применением в качестве ингибиторов Na/H-обмена галогенидов 1,3-дизамещенных 2-амино-бензимидазолия, общей формулы I:
6
4
6
3
2
2
Ar=CHF-4, CH(OCH)-3,4
2
2
5
2
2
5
2
2
2
NR=N(CH), N(CH), N(CHCH)O
X=Cl, Br
в том числе,
6
4
2
2
5
Ia Ar=CHF-4; NR=N(CH), X=Br
6
4
2
2
2
2
Ib Ar=CHF-4; NR=N(CHCH)O, X=Br
6
4
2
2
2
2
Ic Ar=CHF-4; NR=N(CHCH)O, X=Cl
6
3
2
2
2
2
5
2
Id Ar=CH(OCH)-3,4; NR=N(CH), X=Br
+
+
+
+
Соединения могут применяться в том числе для изготовления средств, обладающих способностью ингибировать Na/H-обмен, а также для ингибирования Na/H-обмена в живых организмах.
Соединение Ia известно как обладающее геморологическими свойствами (патент РФ №2290404, МПК C07D 487/04, 2006 г.).
Соединение Ib известно как промежуточный продукт в синтезе соединения, проявляющего обезболивающее действие (патент РФ №2412187, МПК C07D 487/04, 2011 г.).
Соединения Ic и Id не описаны.
+
+
Техническим результатом являются также новые соединения в ряду галогенидов 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия, обладающие свойством ингибировать Na/H-обмен.
Технический результат достигается галогенидами 1-диалкиламиноэтил-3-[замещенный(дизамещенный) фенацил]-2-аминобенз-имидазолия общей формулы Ic, d:
6
4
6
3
2
2
Ar=CHF-4, CH(OCH)-3,
2
2
5
2
2
2
2
NR=N(CH), N(CHCH)O
X=Cl, Br, в том числе
6
4
2
2
2
2
Ic Ar=CHF-4; NR=N(CHCH)O, X=Cl
6
3
2
2
2
2
5
2
Id Ar=CH(OCH)-3,4; NR=N(CH), X=Br
Ниже приведены примеры получения соединений Ic и Id.
Пример 1. Синтез хлорида 1-морфолиноэтил-3-(4-фторфенацил)-2-аминобензимидазолия (Ic).
Смесь 1,23 г (5 ммоль) 1-морфолиноэтил-2-аминобензимидазола, 0,87 г (5 ммоль) ω-хлор-4-фторацетофенона и 15 мл сухого ацетонитрила кипятят до полного протекания реакции кватернизации (~8-10 часов, контроль - ТСХ). Затем ацетонитрил упаривают до небольшого объема, осадок которого представляет собой искомый хлорид, отфильтровывают и промывают ацетоном. Выход 92,5%. Т.пл. 198-199°C.
21
24
4
2
Найдено, %: С 60,15; Н 5,68; Cl 8,54; F 4,60; N 13,45. CHClFNO.
Вычислено, %: С 60,21; Н 5,77; Cl 8,46; F 4,54; N 13,37.
-1
+
2
ИК спектр, ν, см: 3206, 3168, 3022 (NH), 1693 (C=O), 1663 (C=N), 1599 (C=C); 1226 (C-N), 1118 (C-O).
1
+
6
2
2
2
2
2
2
2
Ar
Ar
2
Спектр ЯМР Н (ДМСО-d), δ, м.д. (J, Гц): 2.40-2.60 м [4Н, N(CH)], 2.67 т (2Н, J=5.7 Гц, NCH), 3.48 т [4Н, J=3.9 Гц, O(СН)], 4.39 т (2Н, J=5.7 Гц, NCH), 6,05 с (2Н, СН), 7.24-7.62 м (6Н, H), 8.14-8.21 м (2Н, H), 9.22 уш.с (2Н, NH).
Пример 2. Бромид 1-диэтиламиноэтил-2-амино-3-(3,4-метиленди-оксифенацил)бензимидазолия (Id).
В горячий раствор 1,16 г (5 ммоль) 1-морфолиноэтил-2-аминобензимидазола в ацетоне вносят 1,22 г (5 ммоль) 4-фторфенацилбромида, смесь перемешивают и оставляют на 3-4 часа при 20-25°C. Выпавший осадок бромида отделяют и промывают ацетоном. Выход 97,3%. Т.пл. 235-236°C (разложение).
-1
ИК спектр (твердое состояние), ν, см: 3310, 3236, 3090, 1681, 1652, 1449, 1255, 1033,751.
1
+
6
3
2
2
2
2
Ar
Ar
Ar
2
Спектр ЯМР Н (ДМСО-d), δ, м.д.: 0.81 т (6Н, J 6.9 Гц, 2СН); 2.73 т (2Н, J 6.2 Гц, СН); 4.29 т (2Н, J 6.2 Гц, CH); 5.88 с (2Н, СНСО); 6.20 с (2Н, OCHO); 7.15-7.40 м (3Н, H), 7.48-7.65 м (3Н, H), 7.75 д (1Н, J 8.1 Гц, H), NH в обмене.
+
+
Ниже приведены результаты испытаний свойств соединений I как ингибиторов Na/H обмена.
1. Материалы и методы.
1.1. Схема исследования.
+
+
50
1 этап - изучение влияния соединений на активность Na/H-обменника тромбоцитов кролика. Расчет IC.
2 этап - изучение острой токсичности.
1.2. Материалы.
Соединения Ia-d, зонипорид (SIGMA, США).
2
2
2
2
6
12
6
2
4
4
2
3
Реактивы: натрия пропионат (МР Biomedicals, Inc., Франция), HEPES (GERBU, Германия), кальций хлористый 2-водный (дигидрат) CaCI·2HO (ООО «АГАТ-МЕД», Россия), магний хлористый 6-водный «ч» MgCI·6HO (ЗАО «УНИХИМ», Россия), D-глюкоза (безводная) кристаллическая «ч» CHO (ООО «АГАТ-МЕД», Россия), натрий хлористый «ХЧ» NaCl (ЗАО «НПО ЭКРОС», Россия), калий хлористый «ЧДА» KCl (ООО «РЕАХИМ», Россия), калий фосфорнокислый однозамещенный KHPO «ЧДА» (ОАО «Петербургский Красный химик», Россия), магний сернистокислый 7-водный MgSO·7HO (000 «РЕАХИМ», Россия), гидрокарбонат натрия NaHCO (ООО «РЕАХИМ», Россия), этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (МР Biomedicals, Inc., Франция).
1.3. Животные.
В экспериментах были использованы кролики-самцы, весом 2,5-3,5 кг, которые содержались в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной диете лабораторных животных в соответствии с ГОСТ Р 50258-92 [1993]. Исследование проводили в соответствии с применимыми требованиями ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009, ГОСТ Р ИСО 5725-2002 и «Правил лабораторной практики», утвержденных приказом Минздравсоцразвития РФ от 23 августа 2010 №708н, с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22 September 2010 on the protection of animals used for scientific purposes Official Journal L 276, 20.10.2010 p.33-79 (revising Directive 86/609/EEC)].
Методы.
+
+
+
+
+
+
Изучение влияния соединений на активность Na/H-обменника тромбоцитов кролика проведено in vitro на тромбоцитах кролика (по методу Rosskopf D. et. al. Rapid determination of the elevated Na/H exchanger in platelets of patients with essential hypertension using an optical swelling assay // Journal of Hypertension. - 1991. - №9. - p.231-238; Kusumoto К. et al.. In vitro and in vivo pharmacology of a structurally novel Na/H exchanger inhibitor, T-162559 // British Journal of Pharmacology. - 2002. - №135. - p.1995-2003).
В качестве материала исследования выбраны тромбоциты кролика, на мембране которых активно экспрессируют NHE-1. В основу метода были положены подходы, основанные на изменении светопропускания при изменении формы тромбоцита.
Образцы крови забирали из краевой вены уха кролика в пробирку, содержащую 3,8% цитрата натрия, в соотношении 1:10. Для получения плазмы богатой тромбоцитами (ПБогТ) кровь центрифугировали при 1000 оборотах/минуту в течение 12 минут.
2
4
4
3
2
Для проведения калибровки использовали ПБогТ с ЭДТА и раствор Кребса (NaCl - 120 мМ, KCl - 4,8 мМ, КНРО- 1,2 мМ, MgSO- 2,5 мМ, NaHCO- 25 мМ, CaCl- 2,6 мМ, глюкоза - 5,4 мМ, рН 7,4).
2
2
+
+
+
В контрольной серии экспериментов к 200 мкл ПБогТ для снижения внутриклеточного рН добавляли 600 мкл раствора пропионата натрия (в ммоль/л: Na пропионат 135, HEPES 20, CaCl 1, MgCl 1, глюкоза 10; рН 6.7; t=37°C). При этом происходила активация Na/H-обменника, увеличение притока натрия, связанное с выделением цитозольного H, ведущее к отеку (сферуляции) тромбоцита в результате аккумуляции воды в цитоплазме. При этом наблюдалось облегчение светопропускания. Для контроля изменения светопропускания в условиях физиологических рН использовали раствор Кребса.
Изменения формы тромбоцитов регистрировали по изменению уровня светопропускания с помощью лазерного агрегометра «БИОЛА-220 ЛА», Россия.
При изучении новых соединений и препарата сравнения зонипорида (10 мкл) вещества добавляли в кювету с ПБогТ (200 мкл) за 3-5 минут до добавления раствора пропионата натрия, инкубировали при температуре 37°C и постоянном перемешивании с помощью магнитной мешалки (1000 оборотов в минуту).
-10
-5
Исследования проводились в диапазоне концентраций 10-10 М.
50
+
+
Рассчитывали IC - концентрацию соединения, блокирующую Na/H-обменник тромбоцитов кролика на 50%.
1.4. Изучение острой токсичности
50
Для вычисления широты терапевтического действия соединения определяли острую токсичность на 50 мышах-самцах при внутрибрюшинном введении. Расчет величины ЛД проводили графически по Миллеру и Тейтнеру [Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. - Л., 1963. - 152 с.].
1.5. Методы статистической обработки
50
Для исследуемого препарата и препарата сравнения экспериментально определены величины IC с использованием метода регрессионного анализа зависимости между lg концентрации и процентом ингибирования активности обменника в программе Microsoft Excel (пакет Office XP, Microsoft, США).
2. Результаты исследования
+
+
50
При изучении влияния новых соединений и зонипорида на активность Na/H-обменника кролика было показано дозозависимое увеличение ингибирующего эффекта. Рассчитаны IC, которые представлены в таблице 1.
50
При изучении острой токсичности при внутрибрюшинном введении мышам рассчитана ЛД. Для оценки широты терапевтического действия на изолированных органах рассчитан терапевтический индекс (таблица 1).
50
50
Показано, что по NHE-ингибирующему эффекту соединения Ic, Ia, Ib оказались активнее зонипорида и превосходили его как по величине IC в 50, 41, 6 раз, так и по терапевтическому индексу в 52; 46; 10,5 раза соответственно. Соединение РУ-1183 оказалось активнее зонипорида по величине IC в 1,5 раза при одинаковых терапевтических индексах.
Таблица 1
Расчет терапевтического индекса наиболее активных ингибиторов Na<sup>+</sup>/H<sup>+</sup>-обмена среди 1,3-дизамещенных 2-аминобензимидазолия
Ингибирование NHE
Вещество
ED<sub>50</sub>, мг/л (кг)
ЛД<sub>50</sub>, мг/кг
Терапевтический индекс
IC<sub>50</sub>, М
Ic
5,42×10<sup>-10</sup>
0,0002
342,7
1509400,39
Ia
6,56×10<sup>10</sup>
0,0003
401,8
1327769,35
Ib
4,56×10<sup>-9</sup>
0,002
643,3
304499,38
Id
1,76×10<sup>-8</sup>
0,008
240,0
28690,01
Зонипорид
2,7×l0<sup>-8</sup>
0,009
250,0
28903,57