Лекарственное средство на основе синтетического сополимера винилпиридинового ряда для лечения тканевых гельминтозов
MEDICINAL AGENT BASED ON SYNTHETIC COPOLYMER OF VINYLPYRIDINE ROW FOR TREATING TISSUE HELMINTHIASIS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к областям фармацевтики и медицины. Более конкретно, оно обеспечивает лекарственное средство на основе синтетического сополимера винилпиридинового ряда для лечения тканевых гельминтозов, таких как цистный и ларвальный эхинококкоз и альвеококкоз. Предлагаемое лекарственное средство может служить альтернативой применяемым сейчас антигельминтным средствам, например мебендазолу и альбендазолу, или же применяться совместно с ними.
Уровень техники
Альвеолярный эхинококкоз (альвеококкоз) и цистный эхинококкоз - хронически протекающие тканевые гельминтозы, вызываемые личинками цестод Echinococcos multilocularis и Echinococcos granulosus, относятся к наиболее тяжелым паразитарным болезням, характеризующимися длительным течением, первичным опухолевидным поражением печени, нередко с метастазами в мозг, легкие, другие органы и ткани и частым летальным исходом.
Для химиотерапии пациентов применяют карбаматбензимидазолы (мебендазол и албендазол), которые вызывают необратимое нарушение всасывания глюкозы паразитом и его гибель, а в случае инвазии человека Echinococcos multilocularis лишь сдерживают дальнейшее развитие кист.
Основными недостатками этих препаратов являются высокая токсичность, вызывающая угнетение костномозгового кроветворения, печеночную недостаточность, цирроз печени, низкая биодоступность (из ЖКТ абсорбируется менее 5%), необходимость длительных курсов химиотерапии (в некоторых случаях 3-5 лет и более, а при нерезектабельном альвеококкозе рекомендован пожизненный прием препарата), отсутствие гарантии излечения и возможность рецидивирования заболеваний. В связи с этим поиск новых препаратов для лечения эхинококкозов является актуальным и рассматривается авторами как техническая проблема, которую решает настоящее изобретение.
Гельминтозы вызывают характерные специфические изменения иммунного ответа в пораженном организме [O'Neill L.A. A guide to immunometabolism for immunologists. / O'Neill L.A., Kishton R.J., Rathmell J. // Nature Reviews Immunology. - 2016. - Sep; 6(9), P. 553-65. - doi: 10.1038/nri.2016.70. - Epub 2016 Jul 11. - PMID: 27396447]. Супрессия Т-системы иммунитета, возникающая вследствие развития эхинококкоза, обеспечивает дальнейший рост паразита и его метастазирование [Збарский А.И. Динамика иммунного ответа на специфический и эритроцитный антигены при экспериментальном многокамерном эхинококкозе линейный мышей. / Збарский А.И., Коваленко Ф.П., Цветков B.C. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 1985. - №2. - С. 16-21. - PMID: 2409438].
Th1-цитокины при паразитарных заболеваниях должны индуцировать защитные реакции организма, однако их концентрация снижается через 7 дней от момента заражения на фоне возрастающей концентрации Th2-цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-10). Было установлено, что активация Th2-цитокинов при эхинококкозе ассоциирована с повышенной биологической активностью кисты, а не с защитной реакцией иммунитета. Так, активные (растущие, увеличивающиеся в размерах и количестве) кисты вызывают повышение уровня ИЛ-4 в сыворотке крови пациентов, а цитокин ИЛ-10 играет решающую роль в сохранении паразита.
Повышенные уровни ИЛ-4, ИЛ-10 чаще регистрируют у больных с тяжелым течением заболевания. Имеются данные о решающей роли ИЛ-17 для абортивного течения заболевания, а экспериментальное применение ИНФ-гамма может остановить прогрессирование эхинококкоза у человека. У мышей применение ИНФ-гамма также ингибировало развитие заболевания и метастазирование [Wellinghausen N. Interleukin (IL)-4, IL-10 and IL-12 profile in serum of patients with alveolar echinococcosis. / Wellinghausen N., Gebert P., Kern P. // Acta Tropica. - 1999. - Vol. 73, No. 2. - P. 165-74. - PMID: 10465056; Jenne L. IL-5 expressed by CD4+lymphocytes from Echinococcus multilocularis-infected patients. / Jenne L., Kilwinski J., Scheffold W., Kern P. // Clinical and Experimental Immunology. - 1997. - Vol. 109 (1). - No. 1. - P. 90-7. PMID: 9218830; Lechner C.J. Parasite-specific IL-17-type cytokine responses and soluble IL-17 receptor levels in Alveolar Echinococcosis patients. / Lechner C.J., Gruner В., Huang X., Hoffmann W.H., Kern P., Soboslay P.T. // Clinical and developmental immunology. - 2012. - Vol. 2012, Article ID 735342,9 pages. - doi:10.1155/2012/735342. - PMID: 22969818].
Ранее было показано, что поливинилпирролидон может активировать пул специфических Т-хелперов, что сопровождается повышением уровня ИЛ-1 и ИЛ-6 при отсутствии увеличения ФНО и ИЛ-2 [Braley-Mullen Н. B-cell-derived immunoglobulin for Th activation by the type 2 antigen polyvinylpyrrolidone. / Braley-Mullen H., Milligan G.N., Van Buskirk A.M. // International Immunology. - 1994. - Vol. 6. - P. 805-15. - PMID: 8086371]. Однако специалисту в данной области неочевидно, будут ли обладать подобным действием (а если будут, то в какой степени) сополимеры на основе N-винилпирролидона, содержащие звенья 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина (МВП), которые авторы настоящего изобретения рассматривают далее как наиболее релевантный уровень техники.
Патент RU 2415876 (опубл. 10.04.2011) раскрывает сополимеры на основе N-винилпирролидона, представленные общей формулой (I):
где мономерное звено М представляет фрагмент 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина (МВП):
μ
μ
μ
и содержание мономерных звеньев n составляет 25-90 мол. %, а средневязкостная молекулярная масса М сополимера зависит от природы М: когда М представляет МВТ M находится в интервале 100-250 кДа, а если М представляет МВП, то Мсоставляет 46-150 кДа. Сополимеры применимы в качестве адьювантов при производстве вакцин.
В патенте RU 2430932 (опубл. 10.10.2011) раскрыты сополимеры на основе N-винилпирролидона. Предложено применение сополимеров N-винилпирролидона, представленных общей формулой (I):
где мономерное звено М представляет фрагмент 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина (МВП)
μ
μ
μ
и содержание мономерных звеньев n составляет 25-50 мол. %, а средневязкостная молекулярная масса М сополимера зависит от природы М: если М представляет МВТ, то М находится в диапазоне 30-50 кДа, а если М представляет МВП, то Мравна 15-28 кДа в качестве активаторов продуцирования интерлейкина-1-альфа и интерейкина-1-бета, а также противораковых агентов. Раскрытие технического решения в описании изобретения к указанному патенту не предполагает наличия у сополимеров МВП свойств стимуляторов Т-клеточного иммунитета, а также активаторов фагоцитоза.
В патенте RU 2430933 (опубл. 10.10.2011) предложены сополимеры на основе N-винилпирролидона, представленные общей формулой (I),
где мономерное звено М представляет фрагмент 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина (МВП)
μ
μ
μ
и содержание мономерных звеньев т составляет 25-50 мол. %, а средневязкостная молекулярная масса М сополимера зависит от природы М: если М представляет МВТ, то М равна 30-50 кДа, если же М представляет МВП, то М находится в интервале 15-28 кДа, и их применение в качестве активаторов фагоцитоза. На основании описания изобретения к патенту RU 2430933 и общих знаний средний специалист в данной области не сможет предположить наличия у известных соединений свойств модулятора Т-клеточного иммунитета, а также способности воздействовать на уровни цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, ИНФ-гамма и ИЛ-17.
Патентом RU 2459838 (опубл. 27.08.2012) предоставляется правовая защита сополимеру на основе N-винилпирролидона общей формулы (I):
где мономерное звено M1 представлено фрагментом 2-метил-5-винилпиридина (МВП), а мономерное звено М2 представлено фрагментом 4-винилпиридина (ВП):
μ
содержание мономерных звеньев M1 и М2 (m+k) составляет 20-90 мол.%, при этом доля мономерных звеньев М2 (k) составляет 0,05(m+k)-0,30(m+k), а средневязкостная молекулярная масса М сополимера равна 15-250 кДа. Предложено также применение указанного сополимера в качестве активатора продуцирования интерлейкина-1-альфа, интерлейкина-1-бета, как агента против рака печени, почек, мочевого пузыря, костного мозга и молочной железы, как активатора фагоцитоза и как адъюванта при изготовлении вакцины против гриппа. Указанные соединения представляют собой трисополимеры и не являются непосредственными аналогами действующего вещества в соответствии с настоящим изобретением.
В патенте RU 2533113 (опубл. 20.11.2014) раскрыты биологически активные сополимеры, которые могут найти применение в медицине и ветеринарии. Сополимер на основе N-винилпирролидона в форме фармацевтически приемлемых аддитивных солей кислот представлен общей формулой (I):
μ
где R обозначает водород или метил; содержание мономерных звеньев n составляет 25-90 мол.%; X обозначает анион фармацевтически приемлемой неорганической или органической кислоты; k равно 1 или 2; m принимает значения от 0,1 до 1,0; и средневязкостная молекулярная масса сополимера М равна 15-150 кДа. Изобретение позволяет расширить арсенал биологически активных сополимеров, обладающих улучшенными характеристиками растворимости и проявляющих большую активность в качестве иммуностимулятора, пролонгатора действия антибиотиков, активатора продуцирования IL-1 и фагоцитоза по сравнению с соединениями, известными из публикации RU 2000004. Однако, перевод соответствующих оснований в солевые формы, раскрытые в описании изобретения к патенту RU 2533113, решает иную техническую задачу, чем настоящее изобретение.
В патенте RU 2550820 (опубл. 20.05.2015) раскрыты сополимеры на основе N-винилпирролидона, содержащие в качестве концевых фрагментов остаток циановалериановой кислоты и атом водорода, общей формулы (I)
где мономерное звено является фрагментом 4-винилпиридина (4-ВП), если X представляет
или фрагментом 2-метил-5-винилпиридина (2-М-5-ВП), если X представляет
μ
-3
в котором содержание мономерных звеньев, являющихся фрагментами 4-ВП или 2-М-5-ВП, составляет 20-90 мол.%, средневязкостная молекулярная масса М сополимеров равна 10-350 кДа, а кислотное число равно (0,1-5,6)⋅10 мг КОН/г. Предложено применение указанных сополимеров в качестве агента против пневмокониозов.
В патенте RU 2000004 (опубл. 15.02.1993) предложены сополимеры 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона формулы
где n=25-40 со средневязкостной молекулярной массой 29000-45000 Да, обладающие иммуностимулирующим действием. Данные соединения отличаются по молекулярной массе от действующего вещества лекарственной композиции в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, механизм иммуностимуляции в описании не раскрыт.
Патент RU 2015993 (опубл. 15.07.1994) относится к использованию в качестве противоопухолевого средства в медицине сополимера 2-метил-5-винилпиридина и N-винилпирролидона общей формулы
η
где среднестатическое значение n=35, со средневязкостной молекулярной массой М равной 40000 Да. Раскрытые соединения отличаются от действующего вещества предлагаемого лекарственного средства величиной молекулярной массы, а также областью применения, т.к. на моделях мышей и крыс была показана их эффективность против саркомы Иенсена, карциносаркомы Уокера, саркомы М-1, саркомы 35 и аденокарциономы толстого кишечника. Таким образом, рассматриваемый патент не относится к лечению опухолей, вызванных эхинококками или альвеококками.
Раскрытие сущности изобретения
В результате обширных исследований авторы настоящего изобретения установили, что технический результат, заключающийся в расширении арсенала средств для лечения эхинококкозов и альвеококкоза, достигается созданием лекарственных средств, альтернативных применяемым в настоящее время мебендазолу и альбендазолу и обладающих существенно меньшей токсичностью.
Изобретение обеспечивает лекарственное средство в твердой лекарственной форме, предназначенное для лечения тканевых гельминтозов, выбранных из эхинококкоза и альвеококкоза, содержащее в качестве действующего вещества 35-65 мас.% сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I)
где мономерное звено М представляет фрагмент 2-метил-5-винилпиридина формулы (II)
μ
с содержанием мономерных звеньев n в пределах 30-38 мол. % и средневязкостной молекулярной массой M в пределах 15-28 кДа, а также фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества:
а) 55-33,5 мас.% вещества, которое применяют в качестве наполнителя и связующего, выбранного из лактозы, микрокристаллической целлюлозы (МКЦ), кальция гидрофосфата безводного, двухосновного кальция фосфата дигидрата, магния карбоната, изомальта, глюкозы, сорбитола, изосорбита, мальтозы, маннита, сахарозы, крахмала картофельного, крахмала кукурузного, крахмала рисового, кальция полифосфата, декстранов, циклодекстранов, кальция карбоната основного, поливинилпирролидона; амилопектина, ультра-амилпектина, магния оксида, желатина, метилцеллюлозы (МЦ), прежелатинизированного крахмала, натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, алюмометасиликата магния, а также вещества, которое применяют в качестве связующего, выбранного из воды очищенной, спирта этилового, крахмального клейстера, сахарного сиропа, карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), оксиэтилцеллюлозы (ОЭЦ), оксипропилметилцеллюлозы (ОПМЦ); поливинилового спирта (ЛВС), поливинилпирролидона (ПВП), коповидона, альгиновой кислоты, натрия альгината, желатина, метилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы,
б) 10-1,5 мас.% скользящего, выбранного из кремния диоксида коллоидного, натрия стеарилфумарата, талька, кислоты стеариновой и ее фармацевтически приемлемых солей.
Предпочтительно твердая лекарственная форма является капсулой с порошком, имеющим массу 260 мг, который в качестве действующего вещества содержит 170 мг (65,4 мас.%) сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I), в качестве наполнителя и связующего содержит 26 мг (10,0 мас.%) МКЦ и 9 мг (3,5 мас.%) крахмала кукурузного, в качестве наполнителя содержит 51 мг (19,6 мас.%) лактозы моногидрата, в качестве скользящего содержит 3 мг (1,1 мас.%) талька и 1 мг (0,4 мас.%) натрия стеарилфумарата.
Также предпочтительно твердая лекарственная форма является саше с порошком, имеющим массу 350 мг, который в качестве действующего вещества содержит 170 мг (48,8 мас.%) сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I), в качестве наполнителя и связующего содержит 111,3 мг (31,7 мас.%) МКЦ и 9 мг (2,5 мас.%) крахмала кукурузного, в качестве наполнителя содержит 51 мг (14,5 мас.%) лактозы моногидрата, в качестве скользящего содержит 7 мг (2,0 мас.%) талька и 1,7 мг (0,5 мас.%) натрия стеарилфумарата.
Далее предпочтительно твердая лекарственная форма является таблеткой массой 800 мг, которая в качестве действующего вещества содержит 340 мг (42,5 мас.%) сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I), в качестве наполнителя и связующего содержит 300 мг (37,5 мас.%) МКЦ, в качестве наполнителя содержит 112 мг (14,0 мас.%) лактозы моногидрата, в качестве скользящего содержит 48 мг (6,0 мас.%) кремния диоксида коллоидного.
Лекарственные формы, приготовленные в соответствии с изобретением, следует заключать в первичную упаковку. Примерами такой первичной упаковки являются ячейковая или безъячейковая контурная упаковка, пластмассовая пробирка для лекарственных средств, банка круглого сечения для лекарственных средств, изготовленная из приемлемого полимерного материала или стекломассы и снабженная подходящей пробкой или крышкой, пакет для лекарственных средств, изготовленный из полимерных материалов, в частности - из полиэтилена, однодозовая контурная упаковка (саше).
Выбор подходящего вида упаковки находится в компетенции среднего специалиста в данной области. Например, капсулы и таблетки предпочтительно упаковывать в ячейковую контурную упаковку, а порошок - в однодозовую контурную упаковку (саше). Первичную упаковку следует маркировать указанием, в частности, торгового наименования и дозировки. Также предпочтительно помещать ее во вторичную упаковку, такую как пачка картонная с нанесенной на ее поверхность соответствующей маркировкой и снабжать инструкцией по медицинскому применению. Для удобства транспортировки вторичные упаковки предпочтительно заключать в групповую упаковку, например в коробку картонную.
Осуществление изобретения
Далее возможность осуществления изобретения во всех его вариантах с достижением технического результата будет показана на неограничивающих примерах.
Пример 1. Приготовление капсул, содержащих 170 мг сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I)
Готовят 100 твердых желатиновых капсул, каждая из которых заполнена 260 мг лекарственного средства в соответствии с изобретением. Берут точную навеску 17,000 г сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I) и просеивают ее через сито с диаметром отверстий 0,5 мм. Берут точную навеску 100 мг натрия стеарилфумарата и просеивают ее через сито с диаметром отверстий 0,3 мм. Навески объединяют и смешивают в барабанном смесителе с перемешивающими элементами в течение 15 минут при скорости вращения 40 об/мин.
Берут точные навески 300 мг талька, 2,600 г МКЦ, 5,100 г лактозы моногидрата и 900 мг крахмала кукурузного, каждую навеску просеивают через сито с диаметром отверстий 0,5 мм. В барабанный смеситель с перемешивающими элементами, где находится смесь сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I) и натрия стеарилфумарата загружают просеянные навески и перемешивают в течение 15 минут при скорости вращения 40 об/мин. Готовой смесью для инкапсулирования стандартным способом заполняют твердые желатиновые капсулы размера 1. Каждая капсула имеет следующий качественный и количественный состав:
Пример 2. Приготовление порошка, упакованного в саше и содержащего 170 мг сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина
В соответствии с изобретением готовят твердую лекарственную форму в виде порошка для наполнения 100 саше размером 6×6 см вместимостью 1-2 мл. Берут точную навеску 17,000 г сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I) и просеивают ее через сито с диаметром отверстий 0,5 мм. Берут точную навеску 170 мг натрия стеарилфумарата и просеивают ее через сито с диаметром отверстий 0,3 мм. Навески объединяют и смешивают в барабанном смесителе с перемешивающими элементами в течение 15 минут при скорости вращения 40 об/мин.
Берут точные навески 700 мг талька, 11,300 г МКЦ, 5,100 г лактозы моногидрата и 900 мг крахмала кукурузного, каждую навеску просеивают через сито с диаметром отверстий 0,5 мм. В барабанный смеситель с перемешивающими элементами, где находится смесь сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I) и натрия стеарилфумарата загружают просеянные навески и перемешивают в течение 15 минут при скорости вращения 40 об/мин. Готовой смесью стандартным способом (штучный дозатор) заполняют саше, после чего их запаивают сварным швом. Каждая упаковка саше содержит порошок лекарственного средства, имеющий следующий качественный и количественный состав:
Пример 3. Приготовление таблеток, содержащих 340 мг сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I)
Готовят 100 таблеток массой 800 мг каждая, для чего берут точную навеску 34,000 г (42,5 мас.%) сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I), 11,200 г (14,0 мас.%) лактозы моногидрата, 30,000 г (37,5 мас.%) микрокристаллической целлюлозы и 4,800 г (6,0 мас.%) кремния диоксида коллоидного. Навески объединяют в барабанном смесителе с перемешивающими элементами и смешивают в течение 20 минут при скорости вращения 40 об/мин.
Из готовой таблеточной смеси методом прямого прессования на таблеточном прессе готовят плоскоцилиндрические таблетки с фаской диаметром 14 мм от белого до светло-желтого цвета. Каждая таблетка имеет следующий качественный и количественный состав:
Пример 4. Сравнительное исследование антигельминтной эффективности сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I) и препарата Немозол (МНН - альбендазол) in vivo
А. Отбор модельных животных
В исследовании используют хлопковых крыс (всего 110 особей) и белых мышей (всего 70 особей). Производитель животных - Филиал «Электрогорский» НЦБМТ РАМН (Московская область).
Перед началом исследования необходимое количество животных, отвечающих критериям включения в исследование, распределяют по группам методом рандомизации по массе тела. В исследовании используют животных, разброс по массе которых не превышает 10%.
Каждому животному присваивают индивидуальный номер. Клетки снабжают этикетками с указанием исследования, вида, пола и группы животных, сроков эксперимента.
Животных содержат в клетках не более, чем по 5 особей. Животным предоставляют свободный доступ к стандартному комбикорму гранулированному полнорационному (ООО «Лабораторкорм», Россия), помещаемому в кормовое углубление клетки и к водопроводной воде в стандартных поилках 600 мл.
Животные пребывают в контролируемых условиях окружающей среды: температура воздуха 16-22°С и относительная влажность 30-70%, параметры контролируют в каждой экспериментальной комнате ежедневно и документируют вручную. Освещение в комнатах - естественно-искусственное (день / ночь 12 часов / 12 часов).
Б. Воспроизведение модели ларвального эхинококкоза
Моделями ларвального эхинококкоза служат подкожный эхинококкоз у хлопковых крыс и внутрибрюшинный - у белых мышей, вызываемые путем подкожного и внутрибрюшинного введения протосколексов и ацефалоцист.
В качестве инвазионного материала используют протосколексы и ацефалоцисты, выделенные из ларвоцист Е. multilocularis. Материал получен от 9 экспериментально зараженных хлопковых крыс-доноров.
Инокулят для заражения лабораторных животных готовят следующим образом. Донорские ларвоцисты, выделенные от экспериментально зараженных хлопковых крыс-доноров, измельчают ножницами; полученные фрагменты смешивают с физиологическим раствором и протирают через сито с диаметром ячеек 0,9 мм, пропуская одновременно стерильный физиологический раствор (0,9% хлорид натрия). Полученный фильтрат собирают в мерную колбу объемом 1 л и после 2-5 минут отстаивания удаляют надосадочную жидкость и заменяют ее свежим физиологическим раствором.
С целью очистки инокулята от фрагментов оболочек донорских ларвоцист и гидатидной жидкости содержимое колбы взбалтывают и после 2-5 минут отстаивания повторно удаляют надосадочную жидкость. Эту операцию повторяют до тех пор, пока надосадочная жидкость не становится прозрачной, в инокулят добавляют пенициллин (4000 ЕД/мл) и гентамицин (1 мг/мл) для предотвращения бактериального загрязнения.
Инокулят перемешивают, забирают из него по 100 мкл, тотчас наносят на предметные стекла по 3-4 капель инокулята и при малом увеличении микроскопа подсчитывают в каждой капле число живых паразитов и рассчитывают концентрацию в единице объема.
При заражении хлопковым крысам в область задней трети правой или левой половины живота вводят по 0,3 мл постоянно перемешиваемого инокулята, белым мышам внутрибрюшинно вводят по 0,2 мл. Доза заражения для хлопковых крыс составляет 1550±100 зрелых протосколексов Е. multilocularis, для белых мышей 1000±70 на животное.
В. Изучение специфической фармакологической активности
Растворы испытуемой лекарственной субстанции вводят в желудок через канюлю в суточной дозе 100 мг/кг, 1 раз в день курсом в 20 дней. Растворы готовят ежедневно непосредственно перед применением.
Изучение специфической фармакологической активности вещества на ранней стадии инвазии на модели подкожного эхинококкоза проводят у 60 хлопковых крыс и внутрибрюшинного - у 30 белых мышей. Лечение начинают через 21 день и 1 месяц соответственно. Животные из испытуемых групп получают в течение 20 дней по 100 мг/кг сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I) или препарат сравнения (альбендазол) по 200 мг/кг.
Характеристика опытных и контрольных групп хлопковых крыс с экспериментальным ларвальным эхинококкозом на ранней стадии инвазии приведена в таблице 1.
Характеристика опытных и контрольных групп белых мышей с экспериментальным ларвальным эхинококкозом на ранней стадии инвазии приведена в таблице 2.
Изучение специфической фармакологической активности вещества на поздней стадии инвазии проводят на модели подкожного эхинококкоза у 30 хлопковых крыс и внутрибрюшинного - у 30 белых мышей через 3 месяца от момента заражения. Животные в течение 7 дней получают по 100 мг/кг кг сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I) или препарат сравнения (альбендазол) по 200 мг/кг.
Характеристика опытных и контрольных групп хлопковых крыс с экспериментальным ларвальным эхинококкозом на поздней стадии инвазии приведена в таблице 3.
Характеристика опытных и контрольных групп белых мышей с экспериментальным ларвальным эхинококкозом на поздней стадии инвазии приведена в таблице 4.
Химиотерапевтическую активность соединений оценивают с помощью индекса торможения роста ларвоцист (ИТРЛ) по Миронову и индексу ингибирования и патоморфологическому заключению контрольных и леченых групп. Об эффективности действия субстанции судят по выраженности и стабильности снижения массы тела животного за счет прекращения роста ларвоцист и их деструкции и патоморфологическому заключению контрольных и леченых групп.
После лечения проводят эвтаназию животных всех экспериментальных групп с последующим взятием образцов паразитарных кист для гистологических исследований. С целью сравнения эффекта определяют массу, жизнеспособность и степень зрелости всех выявленных конгломератов ларвоцист у каждого животного. Дополнительно перед каждым экспериментом проводят вскрытие 5 животных, оценивают развитие патологического процесса перед началом лечения, данные используют для расчета ИТРЛ.
Г. Результаты экспериментальной химиотерапии на ранней стадии инвазии При химиотерапии хлопковых крыс с экспериментальным подкожным ларвальным эхинококкозом на ранней стадии отмечался падеж животных, получавших альбендазол, и в контрольной нелеченой группе (5 и 3 животных соответственно) в отличие от хлопковых крыс, получавших сополимер N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина. Уровень ингибирования кист и индекс торможения роста ларвоцист в группе животных, подвергнутых лечению сополимером N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина, превышает данные показатели в контрольной группе животных, получавших альбендазол (AZB). Результаты представлены в таблице 5.
При визуальном ежедневном осмотре хлопковых крыс и инструментальном измерении опухолей наиболее значимое уменьшение кист отмечено в группе животных, получавших сополимер N-винил-пирролидона и 2-метил-5-винилпиридина. (Таблица 6).
У животных, получавших сополимер N-винил-пирролидона и 2-метил-5-винилпиридина, не наблюдали нарушения целостности паренхимы оболочки ларвоцисты, в отличие от контрольных леченых групп животных. При гистологическом исследовании патологического материала, взятого у 10 хлопковых крыс с инвазией эхинококком на ранней стадии развития, при микроскопировании содержимого кисты были обнаружены протосколексы, при этом у 6 из них -нежизнеспособные (вывернутые, или корона крючьев отсутствовала).
Анализ результатов экспериментальной химиотерапии белых мышей с внутрибрюшинным ларвальным эхинококкозом на ранней стадии инвазии показывает, что наибольший индекс ингибирования кист наблюдался в группе животных, получавших сополимер N-винил-пирролидона и 2-метил-5-винилпиридина (58,3%) и данное значение превышает таковое в контрольной леченой группе (альбендазол). В группе, получавших сополимер, значение ИТРЛ превышает 100% (составило 116%), что объясняется снижением массы ларвоцист по отношению к их массе до начала лечения. В этой же группе не отмечено гибели животных (таблица 7).
Д. Результаты экспериментальной химиотерапии на поздней стадии инвазии
Анализ результатов экспериментальной химиотерапии хлопковых крыс с подкожным ларвальным эхинококкозом на поздней стадии инвазии показвывает, что наибольшее снижение веса животных (16,6%) отмечается в группе 2, получавшей сополимер N-винил-пирролидона и 2-метил-5-винилпиридина в течение 7 дней. Это объясняется снижением массы ларвоцист в сравнении с таковой до начала лечения за счет прекращения их роста и их деструкции. В этой же группе не отмечено гибели хлопковых крыс, в то время как в каждой из контрольных групп отмечен падеж 50% животных (таблица 8).
Сходные результаты получены и при химиотерапии белых мышей с внутрибрюшинным ларвальным эхинококкозом. Наибольшее снижение веса животных (14,48%) отмечалось в группе 2, получавшей сополимер в течение 7 дней. В группе животных, получавших сополимер, падежа не отмечалось (таблица 9).
У человека первичному поражению эхинококками чаще всего подвергается печень, однако инвазия может наблюдаться и в других органах. Поэтому исследования проводят на двух моделях: внутрибрюшинном и подкожном эхинококкозах.
Полученные результаты исследования дают основание считать, что сополимер N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I) в суточной дозе 100 мг/кг обладает выраженной противоэхинококковой активностью в экспериментах in vivo. С учетом этого авторы настоящего изобретения полагают, что эффективное лечение эхинококкозов человека (массу тела принимают равной 80 кг) достижимо при курсовом применении лекарственных средств в соответствии с настоящим изобретением по схеме 340 мг четыре раза в сутки в течение 20 дней.
Без ограничения какой-либо теорией авторы настоящего изобретения также полагают, что наиболее вероятным механизмом действия сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина формулы (I) является снижение уровней цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10 и повышение уровней ИНФ-гамма и ИЛ-17. Таким образом, предлагаемое лекарственное средство имеет механизм терапевтического действия, принципиально отличный от механизма действия мебендазола и альбендазола.