Газохроматографическая методика совместного определения низших спиртов, ацетальдегида, ацетона и других летучих соединений в крови моно- и полигастричных млекопитающих

различия реакции / И. В. Майбородин, Д. Н. Струкин, В. И. Май-бородина // Морфология. - 2007. - Т. 132, № 5. - С. 68-73.

7. Blijlevens, N. M. Drospective avaluation of gut mucosal barrier injury following various myeloablative regimens for haematopoietic stem cell transplant / N. M. Blijlevens, J. P. Donnelly, B. E. Pauw // Bone Marrow Transplant. - 2005. - Vol. 35, № 7. - P. 707-711.

8. Blijlevens, N. M. Measuring mucosal damage induced by cytotoxic therapy / N. M. Blijlevens, B. Van't Land, J. P. Donnelly // Support Care Cancer. - 2004. - Vol. 12, № 4. - P. 227-233.

9. Сходство и различия реакции пейеровых бляшек и брыжеечных лимфатических узлов крыс на полихимиотерапию / И. В. Майбородин [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. -2005. - Т. 50, № 2-3. - С. 8-13.

10. Майбородина, В. И. Лимфатический регион тонкой и толстой кишки крыс после полихимиотерапии : дис. ... канд. мед. наук / В. И. Майбородина. — Новосибирск, 2003. — 224 с.

СИДЕНКО Надежда Ивановна, аспирантка кафедры анатомии человека.

ПУТАЛОВА Ирина Николаевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой анатомии человека.

Адрес для переписки: 644043, г. Омск, ул. Партизанская, 20.

Статья поступила в редакцию 18.08.2010 г. © Н. И. Сиденко, И. Н. Путалова

УДК 612.111+543.544.3:547.42+599

И. П. СТЕПАНОВА А. Г. ПАТЮКОВ Т. В. ПОСТНОВА Т. П. МИЦУЛЯ

Омская государственная медицинская академия

Экспертно-криминалистический центр Омской области

ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ МЕТОДИКА

СОВМЕСТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИЗШИХ СПИРТОВ, АЦЕТАЛЬДЕГИДА, АЦЕТОНА И ДРУГИХ ЛЕТУЧИХ СОЕДИНЕНИЙ В КРОВИ МОНО- И ПОЛИГАСТРИЧНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ_

Разработана газохроматографическая методика совместного определения этанола, ацетальдегида и других летучих компонентов в крови млекопитающих. Проведено сравнение содержания этанола и ацетальдегида в крови моно- и полигастричных млекопитающих. Показано, что в организме последних процессы гликолиза сопряжены с процессами спиртового брожения в преджелудках. Предложена математическая модель косвенного определения этанола на основе стандартных биохимических показателей (молочная кислота, глюкоза, аспартатаминотрансфераза, аланинамино-трансфераза, триацилглицерины).

Ключевые слова: газовая хроматография, этанол, ацетальдегид, кровь.

На сегодняшний день имеется потребность в разработке методики совместного определения содержания этанола и ацетальдегида в тканях млекопитающих, так как отсутствие единого мнения о содержании этих соединений не позволяет в полной мере установить их физиологическую роль и биологическое значение. Доказано, что этанол обладает, прежде всего, метаболической (регулятор проницаемости клеточных мембран, способствует тканевому дыханию, участвует в регуляции обмена нейромеди-аторов и гормонов) и энергетической функциями [1]. Данных по ацетальдегиду еще меньше. Именно ему, а не этанолу, приписывается роль одного из основных регуляторов работы дыхательной цепи клетки, при-

чем считается, что свое регуляторное действие он проявляет посредством изменения структурно-функционального состояния убихинона [2]. Нет данных о содержании этанола и ацетальдегида в крови поли-гастричных млекопитающих.

Этанол и ацетальдегид в основном определяют ферментативной фотоколориметрической методикой, которая является точной, воспроизводимой, достаточно простой в исполнении, однако не позволяет получать данные об уровне ацетальдегида, находящегося в связанном виде.

Более точные значения этих веществ можно получить с помощью газохроматографических методов. Однако используемый алкилнитритный метод

недостаточно специфичен, требует проведения калибровки прибора при его повторном включении, колонка обеспечивает хорошую воспроизводимость только при проведении на ней не более 30 анализов.

Цель исследований — разработка газохромато-графической методики совместного определения этанола, ацетальдегида и других летучих компонентов в крови млекопитающих и определение содержания этанола и ацетальдегида в крови млекопитающих с разным типом пищеварения.

Материал и методы исследования

Изучено содержание этанола и ацетальдегида в крови клинически здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 30 до 40 лет (n=10), у которых значения общепринятых биохимических показателей находились в пределах референтного интервала. Лица до обследования не употребляли алкоголь в течение 14 суток.

Обследованы группы клинически здорового крупного рогатого скота (n = 50) разного возраста (1, 3, 6, 9 и 12 месяцев), содержащихся в типовых животноводческих помещениях (рацион стандартный).

Содержание этанола и ацетальдегида определялось с помощью газового хроматографа фирмы «Хьюлетт Паккард» (США), модель 5890, серия 2, с пламенно-ионизационным детектором и системой электронного регулирования потока газа-носителя, колонка хроматографическая капиллярная HP-FFAP (база ЭКЦ УВД Омской области). Концентрации глюкозы, молочной кислоты, триацилглицеринов, активность ферментов аланинаминотрансферазы (К.Ф. 2.6.1.1.), аспартатаминотрансферазы (К.Ф. 2.6.1.2.), у-глутамил-аминотрансферазы (К.Ф. 2.3.2.4.) в крови изучались унифицированными методами на биохимическом анализаторе Screen Master производства Германия с помощью наборов реактивов фирм Hospitex (Швейцария, Италия) и Human (Германия).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием параметрических и непараметрических критериев [3].

Результаты и их обсуждение

Методика определения содержания этанола и ацетальдегида основана на газохроматографическом разделении исследуемых компонентов с использованием капиллярной колонки и последующим количественном определении этилового спирта и ацетальдегида в дистиллятах цельной крови.

Разделенные на хроматографической колонке компоненты смеси поочередно поступают в пламенно-ионизационный детектор, сигналы которого регистрируются в виде ряда хроматографических пиков. В основе детектирования лежит измерение различий электропроводности пламени чистого газа-носителя, поступающего в сравнительную камеру детектора, и смеси анализируемого вещества с газом-носителем, поступающей из хроматографической колонки в измерительную камеру детектора.

Установление подлинности веществ производится по времени их удерживания, которое исчисляется от момента введения анализируемого вещества в колонку до появления максимума пика.

Расчет концентрации этилового спирта и ацетальдегида производят с помощью внутреннего стандарта. Внутренний стандарт — 1,2-пропиленгликоль.

Подготовка пробы и анализ дистиллята включает следующие этапы.

Взвешивают от 10 до 50 г цельной крови в перегонную колбу вместимостью 500 см3, затем добавляют 50 см3 дистиллированной воды. Смесь перемешивают. Колбу со смесью присоединяют к дефлегматору с каплеуловителем и холодильником с прямой трубкой.

При осторожном нагревании (бурное вспенивание) смесь подвергают прямой дистилляции и собирают точно 25 см3 дистиллята в мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 25 см3. Ацет-альдегид и этиловый спирт отгоняются с первыми миллилитрами дистиллята. Приемную колбу необходимо дополнительно охлаждать.

В 25 см3 полученного дистиллята вносят 2 мм3 внутреннего стандарта. Смесь тщательно перемешивают и подвергают хроматографическому исследованию. Проводят два параллельных анализа образца.

Обработку результатов измерений выполняют, используя программное обеспечение входящего в комплект хроматографа персонального компьютера, в соответствии с инструкцией по их эксплуатации.

За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений, допускаемое расхождение между которыми не должно превышать нормативов оперативного контроля сходимости, воспроизводимости и погрешности.

Расчет концентрации этилового спирта и ацет-альдегида в цельной крови проводится по формуле:

-3

a-V-10 1000-ш

-•100

где а — результат хроматографического исследования, мг/дм3;

V — объем дистиллята, см3; т — масса навески цельной крови, г.

При необходимости результат пересчитывают в мкмоль/л.

Для оценки правильности результатов измерений проводились исследования стандартных растворов этанола по новой методике и известной ранее [4] (табл. 1). Кроме того, правильность и воспроизводимость предлагаемой методики оценивалась методом добавок (табл. 2).

В ходе статистической обработки данных установлено, что различия средних значений достоверно незначимы с вероятностью 95 %. Это указывает на то, что разработанная методика газохроматографи-ческого определения эндогенного этанола в крови коров дает правильные и воспроизводимые результаты.

Хроматограмма дистиллята цельной крови человека представлена на рис. 1.

Отличительной особенностью методики является возможность определения в рамках одного исследования кроме ацетальдегида и этилового спирта, также таких соединений как метилацетат, этилацетат, ацетон, пропиловые, бутиловые и амиловые спирты и другие соединения.

Хроматограмма модельной смеси представлена на рис. 2.

У половозрелых особей моногастричных млекопитающих уровень этанола изменяется в пределах 25,3 — 73,7 мкмоль/л, ацетальдегида — в диапазоне 4,0—16,0 мкмоль/л. Содержание этанола в крови, полученное с помощью газохроматографической методики, соответствует литературным данным) [1], в то же время уровень ацетальдегида в крови выше, чем по сведеньям литературы (< 4,5 мкмоль/л). Это объясняется тем, что по новой методике опреде-

с

Оценка правильности методики определения

Таблица 1

Метод Концентрация этанола в стандартном растворе, % Найдено, % Абсолютная погрешность, %

ГЖХ, алкил-нитриты 0,01 0,0096 ± 0,0007 0,0003

ГЖХ 0,01 0,0098 ± 0,0003 0,0001

Таблица 2

Оценка правильности и воспроизводимости методики определения

Проба, п = 2 Найдено в пробе, мкг Добавка, мкг Найдено в пробе с добавкой, мкг Найдено в добавке, мкг Относительная ошибка, % Воспроизводимость, %

0,0001 % р-р этанола 24,88 5,0 29,79 4,95 0,7 5,2

0,0001 % р-р ацетальдегида 24,92 5,0 29,86 4,98 0,5 4,7

1, мин

5

10

15

20

25

30

Рис. 2. Хроматограмма модельной смеси 4,66 — диэтиловый эфир; 4,92 — ацетальдегид; 5,63 — ацетон; 6,30 — этилацетат; 6,74 — изопропиловый спирт; 9,98 — изобутиловый спирт; 11,00 — нормальный бутиловый спирт; 12,06 — изоамиловый спирт; 12,46 — нормальный амиловый спирт

ляется не только свободный, но и связанный ацет-альдегид.

Концентрация эндогенного этанола в крови поли-гастричных животных варьирует от 25 до 164 мкмоль/л, ацетальдегида — от 12 до 84 мкмоль/л. В постна-тальном онтогенезе уровень этанола возрастает с 6 до 12 месяцев (примерно в 2,5 — 3 раза). Это объясняется, по-видимому, усилением процессов брожения в рубце (в том числе и спиртового) по мере развития организма. Повышенное содержание этанола в пред-желудке приводит к увеличению уровня этого метаболита в крови. Концентрация ацетальдегида снижается с первого по третий месяцы постнатальной жизни (примерно в 2,0 — 2,5 раза) и до 12 месяцев практически не изменяется. Вероятно, значительное содержание ацетальдегида у одномесячных телят объясняется неразвитостью пищеварительной системы и несформированностью механизмов поддержания гомеостаза.

Более высокий уровень этанола и ацетальдегида в крови полигастричных млекопитающих указывает на сопряжение процессов гликолиза и спиртового брожения в преджелудках.

С возрастом происходит изменение соотношения этанол / ацетальдегид: от 0,7 у одномесячных животных до 5,6 у 12-месячных (по медиане). Изменение соотношения этанол / ацетальдегид объясняется, очевидно, формированием физиологических систем организма, в том числе пищеварительной системы, изменением обмена веществ в период полового созревания животных, сменой рациона, условий содержания.

В случае отсутствия современного газохромато-графического анализа весьма полезным может явиться косвенная оценка уровня этанола по формулам, в качестве факторов включающих показатели углеводного, азотистого и липидного обмена.

Для объединенной группы телят от одного месяца до полугода модель имеет вид:

Y=-0,187 + 0,300X1 + 0,263 Х2 --0,14 Х3-0,02 Х4 +0,605 Х5,

Для группы телят от 9 до12 месяцев пятифактор-ной линейной моделью является следующая функция:

Y=-0,394 + 0,442 Х1 + 0,585 Х2 --0,06Х3-0,18 Х4 + 0,26 Х5,

метилацетат, этилацетат, ацетон, пропиловый, бутиловый, амиловый спирты и другие соединения). Причем данная методика позволяет определять не только свободный, но и связанный ацетальдегид. Обнаруженные с помощью современного газохроматогра-фического оборудования более высокие концентрации ацетальдегида, по сравнению с данными литературы, прежде всего свидетельствуют, что этому соединению, возможно, присущ более широкий спектр физиологических функций, чем предполагалось до сих пор.

Методика количественного определения этанола и ацетальдегида может быть рекомендована для проведения научных исследований, а также в судебной медицине для анализа спиртсодержащих объектов.

Полученные данные могут быть использованы при изучении особенностей метаболизма моно- и полигастричных млекопитающих. Для последних, по данным проведенного исследования, сформированы представления об использовании в организме глюкозы по пути гликолиза, сочетанного с брожением. Полученные материалы могут лечь в основу выработки нормативов допустимого содержания в тканях млекопитающих.

Библиографический список

1. Прокопьева, В. Д. Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на клеточные мембраны туИго и тууо [Рукопись] : автореф. дис. ... д-ра биол. наук / В. Д. Прокопьева. — Томск : Изд-во ТГПУ, 2003. - 46 с.

2. Корнеев, А. А. О биологическом значении ацетальдегида как клеточного регулятора дыхательной цепи митохондрий / А. А. Корнеев, И. А. Комиссарова // Успехи соврем. биологии. -1994. - Т. 114, вып. 2. - С. 212-220.

3. Гланц, С. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. / С. Гланц. - М. : Практика, 1998. - 459 с.

4. Об обнаружении и определении этилового алкоголя в крови и моче методом газожидкостной хроматографии : Методическое письмо от 22 апреля 1968 г. № 10-95/14-32.

где Х1 — содержание глюкозы (ммоль/л);

Х2 — содержание молочной кислоты (ммоль/л);

Х3 — активность ГГТ (МЕ\л);

Х4 — активность АсАТ (МЕ\л);

Х5 — концентрация триацилглицеринов (ммоль/л).

Заключение

Разработанная методика является правильной, воспроизводимой, позволяет совместно определять целый ряд летучих соединений (этанол, ацетальдегид,

СТЕПАНОВА Ирина Петровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая кафедрой общей и биоорганической химии Омской государственной медицинской академии.

ПАТЮКОВ Александр Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, проректор по учебной работе, заведующий кафедрой нормальной физиологии Омской государственной медицинской академии. ПОСТНОВА Татьяна Вячеславовна, эксперт Экс-пертно-криминалистического центра Омской области УВД Омской области.

МИЦУЛЯ Татьяна Петровна, старший преподаватель кафедры общей и биоорганической химии Омской государственной медицинской академии. Адрес для переписки: е-шай: stepanova_ip@mail.ru

Статья поступила в редакцию 18.08.2010 г.

© И. П. Степанова, А. Г. Патюков, Т. В. Постнова, Т. П. Мицуля