НАНОЧАСТИЦЫ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ ЦИКЛОДЕКСТРИН И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНУЮ МОЛЕКУЛУ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NANOPARTICLES CONTAINING CYCLODEXTRIN AND BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULE, AND USING THEM

Область изобретения
Изобретение относится к наночастицам с биоадгезивными характеристиками, включающим биоразлагаемый полимер, циклодекстрин или его производное и биологически активную молекулу. Изобретение также относится к способу их получения, к композициям, содержащим указанные наночастицы, и их применениям.
Предшествующий уровень техники изобретения
В последние несколько лет было разработано применение биоразлагаемых полимерных наночастиц в качестве носителей для введения лекарственных средств, особенно пероральным путем. Наночастицы обычно определяют как коллоидные системы типа твердых частиц с размером менее чем один микрометр, образованные природными или синтетическими полимерами. В зависимости от способа, которому следуют при их получении, могут быть получены два типа структур: наносферы или нанокапсулы. Наносферы имеют структуру типа полимерной матрицы, в которой диспергирован активный ингредиент, тогда как нанокапсулы имеют сердцевину, содержащую активный ингредиент, окруженную оболочкой, такой как полимерная оболочка. Из-за высокоспецифичной поверхности таких систем активный ингредиент также может быть адсорбирован на поверхности системы наночастиц.
Пероральный путь является наиболее популярным и привлекательным путем для введения медицинских продуктов. Применение такого пути связано с существенным увеличением приемлемости препарата пациентом и с более низкими медицинскими затратами. Однако существенное количество лекарственных средств имеет очень низкую эффективность при введении посредством такого пути. Такой феномен может быть опосредован одним или несколькими следующими факторами, которые влияют на пероральную биодоступность лекарственного средства: (i) низкая протекающая способность активной молекулы для пересечения слизистых оболочек (обычно ассоциированная с гидрофильными лекарственными средствами), (ii) низкая стабильность в желудочно-кишечной среде (присутствие экстремальных значений рН, ферментов и др.), (iii) неполное высвобождение лекарственного средства из дозированной формы, (iv) низкая растворимость активного ингредиента в желудочно-кишечном окружении (ассоциированная с гидрофобными лекарственными средствами) и (v) пресистемный метаболизм.
В ряде случаев системы наночастиц позволяют существенно увеличить биодоступность биологически активной молекулы и, следовательно, допускают новые методики введения. Улучшение биодоступности, полученное с использованием таких носителей, может быть объяснено способностью полимерных наночастиц развивать биоадгезивные взаимодействия со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта. Следовательно, когда суспензию наночастиц вводит перорально, такие носители могут взаимодействовать и развивать адгезивные взаимодействия с несколькими компонентами слизистой оболочки. В зависимости от определенных физико-химических параметров (таких как природа полимера, размер, заряд поверхности или присутствие определенных оболочек или лигандов в носителе) биоадгезивные характеристики наночастиц могут варьироваться и позволяют в определенных случаях достичь поверхности энтероцитов и, возможно, развивать биоадгезивные взаимодействия во множестве специфических участков желудочно-кишечного тракта. Все такие феномены приводят к (i) увеличению времени прохождения дозированной формы в тесном контакте с поверхностью слизистой оболочки или к (ii) специфическому расположению носителя (с лекарственным веществом) в определенной области. Когда наночастицы прилипают к слизистой оболочке, они могут запускать абсорбцию несомого лекарственного средства и его доступ в большой круг кровообращения посредством нескольких механизмов.
Иллюстративные примеры лекарственных средств, пероральная биодоступность которых увеличивается посредством их инкапсулирования или ассоциации с наночастицами, включают кальцитонин лосося, фуросемид, аварол, дикумарол, нифедипин, фторпиримидины, плазмиды и др.
Гомо- и сополимеры молочной и гликолевой кислот (PLGA) являются особенно важными в качестве биоразлагаемых полимеров для производства систем частиц, так как они имеют хорошую тканевую совместимость, являются нетоксичными, используются в течение многих лет в качестве реабсорбируемых шовных материалов. Такие (со)полимеры являются растворимыми в органических растворителях, таких как хлороформ, дихлорметан, ацетон и этилацетат, и нерастворимыми в водной среде; однако они могут захватывать воду и в большей или меньшей степени разбухать в зависимости от их молекулярной массы и от их состава. Среди недостатков этих полимеров необходимо отметить, что PLGA могут быть более гидрофобными по сравнению с множеством антигенов, которые они несут. Более того, гидратирование и дегидратирование PLGA являются обязательными требованиями для высвобождения антигена в рамках фазы разрушения. Такое разрушение способствует скорее кислому микроокружению из-за накопления продуктов деградации полимеров, молочной и гликолевой кислот; рН может падать до порядка 2-3. В таких состояниях высвобождаемые белки подвергаются гидролизу и агрегации в подкисленной среде, и множество антигенов теряют свою антигенную способность. Наконец, их высокая стоимость может ограничивать их применение и способствует поиску других менее дорогих материалов.
В качестве альтернативы полиэфирам было доказано, что наночастицы, полученные с другими полимерами, подходят для перорального введения лекарственных средств. Одним из наиболее используемых полимеров является хитозан. Хитозан является полимером, сходным с целлюлозой, образующимся в результате деацетилирования хитина, основного компонента экзоскелета ракообразных. Хитозан может быть введен в наночастицы различных размеров, в которых заключено лекарственное средство. Частицы хитозана могут увеличивать абсорбцию белка на поверхности слизистой оболочки, индуцируя транзиторное открытие плотных соединений. Более того, хитозан может обладать иммуномодулирующим эффектом, стимулируя продукцию цитокинов in vitro и улучшая естественный баланс Th2/Th3 на уровне слизистой оболочки в отсутствие антигена.
Сополимер метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) [Gantrez] в последнее время был предложен в качестве биоразлагаемого материала для получения наночастиц (Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330). Такие сополимеры PVM/MA широко используются в качестве загустителей, стабилизаторов водных растворов, зубных адгезивных компонентов, кожных пластырей и в таблетках для перорального введения. Среди основных преимуществ таких полиангидридов должна быть отмечена их низкая стоимость, их низкая пероральная токсичность и доступность функциональных групп, которые могут легко реагировать с молекулами, содержащими гидроксильные или аминогруппы (Arbos et al., J. Control. Release, 89 (2003) 19-30). Следовательно, в водной среде ангидридная группа гидролизуется, давая две карбоксильные группы, и такая реакция способствует более легкому связыванию лигандов с полимерной цепью или с поверхностью полученных наночастиц.
Циклодекстрины (CD) представляют собой группу циклических олигосахаридов, полученных ферментативным разложением крахмала. Они формируются из единиц α-1,4-глюкопиранозы, связанных друг с другом, образуя структуру типа усеченного конуса с гидрофобной внутренней полостью. CD могут содержать более чем 15 единиц α-1,4-глюкопиранозы, хотя наиболее широко распространенные содержат 6 (α-CD), 7 (β-CD) или 8 (γ-CD) единиц α-1,4-глюкопиранозы. В фармацевтических применениях наиболее широко используемыми являются β-CD и его производные, особенно 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин (ОН-β-CD). Такой CD имеет высокую растворимость в воде, более низкую токсичность, а также более гидрофобную полость по сравнению с начальным соединением (β-CD). Комплексы, образованные посредством использования циклодекстринов, могут обеспечивать молекулу-носитель со стабильностью и увеличенной водной растворимостью, что может приводить к увеличению биодоступности такой молекулы (например, лекарственного средства) и/или снижению побочных эффектов. Более того, способность увеличивать нагрузочную способность липосом и микрочастиц описана в литературе. CD также могут модифицировать профиль высвобождения инкапсулированного лекарственного средства.
Ряд противоопухолевых средств вводят парентерально, что вызывает несколько проблем. Среди основных преимуществ, обусловленных пероральным введением противоопухолевых средств, должны быть отмечены улучшение качества жизни пациентов, а также снижение медицинских затрат. Такой путь введения допускает длительное воздействие на раковые клетки противоопухолевого средства в подходящем и непрерывном уровне концентрации, что может улучшить терапевтический индекс и снизить побочные эффекты. Однако большинство таких лекарственных средств (например, паклитаксел) имеют низкую биодоступность при пероральном введении.
Taxus brevifolia
Паклитаксел (Taxol, Bristol Myers Squibb Company) - продукт, экстрагированный из дерева , был впервые описан в 1971, и с 1993 он является наиболее используемым химиотерапевтическим средством против рака во всем мире. Паклитаксел действует на клеточном уровне, запуская полимеризацию тубулина. Микротрубочки, образующиеся в присутствии паклитаксела, следовательно, являются чрезвычайно стабильными и нефункциональными, таким образом, вызывая гибель клеток из-за динамической и функциональной неспособности микротрубочек для деления клеток. В Европе этот лекарственный препарат показан и в качестве единственного средства, и в комбинации с другой онкологической терапией для лечения рака яичника, рака молочной железы и немелкоклеточного рака легких, всех прогрессирующих и метастатических.
Основной недостаток такого лекарственного средства лежит в его плохой пероральной биодоступности из-за низкой растворимости в воде и преимущественно из-за эффекта метаболизма первого прохода. После перорального введения паклитаксел является субстратом Р-гликопротеина, а также других членов суперсемейства АВС (АТР-связывающая кассета), таких как BCPR и MRP2. Суперсемейство белковых переносчиков АВС играет центральную роль в защите организма от токсических соединений и от некоторых противораковых средств. Указанные белки (Р-гликопротеин, MRP2 и BCPR) расположены в апикальной области мембран кишечника, печени и почек, опосредуя подачу ксенобиотиков и токсинов в кишечный и желчный просвет и мочу. Более того, и Р-гликопротеин и MRP2 расположены объединенными вместе с CYP3A4, глютатион-S-трансферазой и UDP-глюкуронозилтрансферазой, которые оказывают синергическое действие в регуляции пероральной биодоступности вводимых лекарственных средств.
Из-за вышеуказанного паклитаксел в настоящее время включают в композицию для его применения в клинической практике посредством внутривенного пути в носителе, образованном Chremophor EL:этанолом (1:1). С целью предотвращения и минимизации токсических эффектов Chremophor EL для внутривенного введения и улучшения терапевтического индекса лекарственного средства в последнее время на рынке появилась новая композиция на основе инкапсулирования лекарственного средства в альбуминовых наночастицах, называемая Abraxane (Green et al., Annals of Oncology 17: 1263-1268, 2006).
Следовательно, необходимо разрабатывать системы введения лекарственных средств, которые могут увеличивать при пероральном введении биодоступность ряда активных ингредиентов, особенно лекарственных препаратов с липофильной природой и/или тех, которые являются субстратом Р-гликопротеина (например, паклитаксел). Преимущественно указанные системы введения должны обладать биоадгезивными свойствами, должны обладать способностью включать различные количества липофильных лекарственных средств и, в идеале, должны быть способны предотвращать действие Р-гликопротеина на транспортируемое лекарственное средство. Такие цели могут быть достигнуты с помощью наночастиц, предоставляемых настоящим изобретением.
Сущность изобретения
Достаточно неожиданно в настоящее время было обнаружено, что ассоциация наночастиц биоразлагаемого полимера, такого как сополимер метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA), с циклодекстринами, связанными с биологически активными молекулами, допускает получение наночастиц с физико-химическими характеристиками и характеристиками биоадгезии к слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, что делает их очень интересными системами в качестве транспортеров всех типов биологически активных молекул, особенно гидрофобных (липофильных) биологически активных молекул, таких как паклитаксел. Указанные наночастицы могут удлинять время нахождения в слизистой оболочке после их перорального введения. Более того, указанные наночастицы могут улучшить биодоступность биологически активных молекул, которые могут являться субстратами Р-гликопротеина. Аналогично, указанные наночастицы могут использоваться в качестве систем для введения лекарственных средств с высокой токсичностью (например, цитостатиков), так как они дают длительные и постоянные уровни биологически активной молекулы в плазме в течение периодов времени до 24 часов, что дает возможные варианты альтернативные лечению в больнице, способствуя снижению медицинских затрат на лечение такими видами лекарственных средств.
Следовательно, изобретение предлагает наночастицы со способностью связывать большие количества биологически активных молекул, особенно гидрофобной природы, для их эффективного введения через слизистые оболочки, особенно пероральным путем, из-за того факта, что они имеют подходящие биоадгезивные характеристики, обеспечивающие взаимодействие наночастиц (содержащих биологически активную молекулу) с поверхностью слизистой оболочки, они могут переносить широкий спектр биологически активных молекул, особенно липофильной природы, и, кроме этого, они могут высвобождать биологически активную молекулу, обеспечивая ее устойчивый и постоянный уровень в плазме при их введении перорально или через любые другие слизистые оболочки организма. Если транспортируемая биологически активная молекула представляет собой субстрат Р-гликопротеина, наночастицы по изобретению могут предотвращать действие этого белка на интересующую биологически активную молекулу.
Наночастицы, предлагаемые настоящим изобретением, включают биоразлагаемый полимер, циклодекстрин или его производное, и биологически активную молекулу. В частности, было обнаружено, что наночастицы, образованные сополимером поливинилметилового эфира и малеинового ангидрида и β-циклодекстрина (β-CD), 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина (ОН-β-CD) или 6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрина (NH-β-CD) легко получать и обеспечивать превосходные характеристики биоадгезии, размера и зета-потенциала, которые делают их подходящими для введения гидрофобных биологически активных молекул (например, паклитаксела). Более того, было обнаружено, что выбор типа циклодекстрина, используемого при их получении, допускает подходящую модуляцию характеристик таких наночастиц, которые могут преимущественно использоваться в соответствии с типом переносимых биологически активных молекул и/или способом введения фармацевтической композиции. Наконец, было обнаружено, что включение паклитаксела в такие наночастицы позволяет очень существенным образом увеличить их пероральную биодоступность, минимизируя эффект Р-гликопротеина на уровне слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.
Следовательно, в первом аспекте, изобретение относится к наночастицам, включающим биоразлагаемый полимер, циклодекстрин или его производное и биологически активную молекулу, применимым для переноса биологически активных молекул. В определенном варианте осуществления изобретения биоразлагаемый полимер представляет собой сополимер метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA). В другом определенном варианте осуществления изобретения циклодекстрин представляет собой β-CD, OH-β-CD или NH-β-CD.
В определенном варианте осуществления изобретения биологически активная молекула, присутствующая в наночастицах по изобретению, представляет собой паклитаксел. В таком случае наночастицы дают эффектное увеличение пероральной биодоступности паклитаксела, пероральное всасывание которого является фактически нулевым из-за его физико-химических характеристик (высокая липофильность) и из-за того факта, что он является субстратом Р-липопротеина, расположенного в желудочно-кишечном тракте.
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащий указанные наночастицы.
В другом аспекте изобретение относится к способу получения указанных наночастиц.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 представляет собой график, показывающий вариации количества циклодекстрина (CD), ассоциированного с наночастицами PMV/MA, в соответствии с типом используемого CD [β-CD: β-циклодекстрин, OH-β-CD: 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин; NH-β-CD: 6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрин] и временем инкубации последнего с сополимером метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) (100 мг) перед получением наночастиц. Результаты показывают среднее ± стандартное отклонение (n=8).
Фиг.2 представляет собой фотографию результатов, полученных при подвергании лиофилизированного образца наночастиц, основанных на PVM/MA с β-циклодекстрином (β-CD-NP), сканированию электронной микроскопией.
Фиг.3 представляет собой график, который показывает высвобождение RBITS из наночастиц, содержащих циклодекстрины (β-CD-NP: наночастицы на основе PVM/MA с β-CD; ОН-β-CD-NP: наночастицы на основе PVM/MA с ОН-β-CD; NH-β-CD-NP: наночастицы на основе PVM/MA с NH-β-CD) и из контрольных наночастиц (NP) после их инкубации в стимулированной желудочной среде (в течение первого часа:0-1 ч) и в стимулированной кишечной среде (1-24 ч) при 37±1ºС. Данные показывают среднее ± стандартное отклонение (n=3).
На фиг.4 показана столбчатая диаграмма, представляющая собой распределение (А) наночастиц на основе PVM/MA с гидроксипропил-β-CD (ОН-β-CD-NP); (В) наночастиц на основе PVM/MA с β-CD и (С) контрольных наночастиц (NP) в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта после перорального введения 10 мг наночастиц, флуоресцентно меченных RBITC. Ось Х представляет собой различные сегменты слизистой оболочки; ось y представляет собой фракцию наночастиц, прилипших к слизистой оболочке; и ось Z представляет собой время после введения.
Фиг.5 представляет собой график, показывающий кривые биоадгезии, полученные при представлении фракции наночастиц, прилипших по всему желудочно-кишечному тракту, в отношении времени. Представленные композиции представляют собой (●) ОН- β-CD-NP; ()β-CD-NP; и () контрольные NP. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение (n=3).
На фиг.6 представлена группа фотографий, показывающих вид флуоресцентной микроскопии контрольных наночастиц (А) и ОН-β-CD-NP (В,С), прилипших к подвздошной кишке крыс через 2 часа после перорального введения однократной дозы 10 мг.
Фиг.7 представляет собой график, показывающий изменение количества паклитаксела (PTX), инкапсулированного в различные композиции в соответствии с типом используемого циклодекстрина и исходно добавленным количеством лекарственного средства. Результаты показывают среднее ± стандартное отклонение (n=6). PTX-NP: обычные наночастицы PVM/MA с паклитакселом; PTX-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и β-CD с паклитакселом; PTX-ОН-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и ОН-β-CD с паклитакселом; и PTX-NH-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и NH-β-CD с паклитакселом.
Фиг.8 представляет собой группу графиков, представляющих концентрации паклитаксела в плазме (PTX) в соответствии со временем после введения различных композиций PTX лабораторным животным. Результаты показывают среднее ± стандартное отклонение (А). Внутривенный путь, доза: 10 мг/кг. Taxol: коммерческая композиция паклитаксела. (В) Пероральный путь, доза 10 мг/кг. Taxol: коммерческая композиция паклитаксела; PTX-β-CD: комплекс β-CD с паклитакселом; PTX-ОН-β-CD: комплекс ОН-β-CD с паклитакселом; PTX-NH-β-CD: комплекс NH-β-CD с паклитакселом. (С) Пероральный путь, доза: 10 мг/кг. PTX-NP: обычные наночастицы PVM/MA с паклитакселом; PTX-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и β-CD с паклитакселом; PTX-ОН-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и ОН-β-CD с паклитакселом; и PTX-NH-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и NH-β-CD с паклитакселом; Taxol: коммерческая композиция с паклитакселом. Значения, полученные для коммерческой композиции таксола и PTX-NP, перекрываются и указаны на оси Х (Таблица 9).
Подробное описание изобретения
Наночастицы
В одном аспекте изобретение относится к наночастицам, далее в настоящем описании наночастицам по изобретению, включающим биоразлагаемый полимер, циклодекстрин или его производное и биологически активную молекулу.
Наночастицы по изобретению имеют подходящие физико-химические характеристики, характеристики специфичности и биоадгезии к слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, что делает их потенциально применимыми системами для транспортировки биологически активных молекул, особенно липофильных биологически активных молекул (например, паклитаксела, и др.) и/или биологически активных молекул, которые являются субстратами Р-гликопротеина. Наночастицы по изобретению могут улучшить биодоступность биологически активных молекул в общем и, в частности, липофильных биологически активных молекул и/или биологически активных молекул, которые могут являться субстратом Р-гликопротеина. Действительно, наночастицы по изобретению могут удлинять время нахождения в слизистой оболочке после их перорального введения. Также наночастицы по изобретению могут быть использованы в качестве системы для транспортировки биологически активных молекул с высокой токсичностью, например цитостатиков, из-за того факта, что они дают устойчивые и постоянные уровни таких лекарственных препаратов в плазме в течение временных периодов до 24 часов, что позволяет создавать варианты, альтернативные лечению в больнице, приводя к снижению медицинских затрат на лечение с помощью таких видов лекарственных средств.
Как используется в настоящем описании, термин «наночастицы» относится к сферам или сходным формам со средним размером менее чем 1,0 микрометр (мкм). Наночастицы по изобретению обычно имеют средний размер частиц, составляющий между 1 и 999 нанометрами (нм), предпочтительно между 10 и 900 нм. В определенном варианте осуществления изобретения наночастицы по изобретению имеют средний размер частиц, составляющий между 100 и 400 нм.
«Средний размер» понимают как средний диаметр группы наночастиц, двигающихся совместно в водной среде. Средний размер таких систем может быть измерен стандартными методиками, известными специалистам в данной области, и которые описаны, в качестве иллюстрации, в экспериментальной части, сопровождающей описанные ниже примеры. На средний размер частиц могут влиять преимущественно количество и молекулярная масса биоразлагаемого полимера, природа и количество циклодекстрина или его производного, и природа и количество биологически активной молекулы, присутствующей в наночастицах по изобретению (обычно чем выше количество или молекулярная масса указанных компонентов, тем больше средний размер наночастиц), и некоторые параметры способа получения указанных наночастиц, такие как скорость перемешивания и др.
Биоразлагаемый полимер
Наночастицы по изобретению включают биоразлагаемый полимер. Как используется в настоящем описании, термин «биоразлагаемый» относится к полимерам, которые растворяются или разрушаются за период времени, который приемлем для желаемого применения, в данном случае in vivo терапии при воздействии на них физиологического раствора с рН, составляющем между 1 и 9, обычно между 4 и 9 при температуре, составляющей между 25°С и 40°С.
Фактически любой биоразлагаемый полимер, известный в области техники как дающий образование наночастиц, может быть использован для внедрения настоящего изобретения в практику. Иллюстративно, неограничивающие примеры указанных биоразлагаемых полимеров включают полигидроксикислоты, такие как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и др., и их сополимеры, например, поли(молочная-ко-гликолевая кислота) [PLGA], и др.; полиангидриды; полиэфиры; полисахариды, и др., хитозан, и др. Молекулярная масса указанных биоразлагаемых полимеров может варьироваться в широком диапазоне, с условием, что он соответствует установленным условиям формирования наночастиц и является биразлагаемым.
50
В определенном варианте осуществления изобретения используемым биоразлагаемым полимером является сополимер метилвинилового эфира и малеинового ангидрида в ангидридной форме (PVM/MA). В специфическом варианте осуществления изобретения может быть использован, например, сополимер PVM/MA, имеющийся на рынке под торговым наименованием Gantrez AN. В определенном варианте осуществления изобретения указанный сополимер PVM/MA имеет молекулярную массу, составляющую между 100 и 2400 кДа, предпочтительно между 200 и 2000 кДа, более предпочтительно между 180 и 250 кДа. Такой биоразлагаемый полимер (PVM/MA) является особенно преимущественным, так как он широко используется в фармакологической технологии из-за его низкой токсичности (LD=8-9 г/кг пероральным путем) и превосходной биосовместимости. Более того, его легко получать и из-за количества и из-за его стоимости. Такой биоразлагаемый полимер (PVM/MA) может реагировать с различными гидрофильными веществами из-за присутствия ангидридных групп, не прибегая к обычным органическим реагентам (глутаральдегид, производные карбодиимида, и др.), которые обладают существенной токсичностью. В водной среде сополимер PVM/MA является нерастворимым, но его ангидридные группы гидролизуются с формированием карбоксильных групп. Растворение медленное и зависит от условий, в которых оно возникает. Из-за доступности функциональных групп в PVM/MA при обычной инкубации в водной среде возникает ковалентная связь молекул с нуклеофильными группами, такими как гидроксид или амино.
Международная патентная заявка WO 02/069938, содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки, описывает наночастицы сополимера PVM/MA. В качестве иллюстрации, указанные наночастицы сополимера PVM/MA могут быть легко получены путем десольватации сополимера посредством добавления к его органическому раствору первого полярного растворителя (смешиваемого с раствором сополимера) и последующего добавления второй нерастворяющей жидкости, такой как водноспиртовой раствор. Необязательно, может быть добавлен сшивающий агент.
Циклодекстрин и его производные
Наночастицы по изобретению включают, в добавление к биоразлагаемому полимеру, циклодекстрин или его производное.
Как используется в настоящем описании, термин «циклодекстрин» включает любой циклический олигосахарид, образованный единицами глюкозы, связанными α-1,4 (α-1,4-глюкопираноза) глюкозидными связями. Такие мономеры образуются в результате реакции внутримолекулярного трансгликозилирования разложения крахмала ферментом циклодекстринглюканотрансферазой (CGTазы).
«Циклодекстрин» может содержать более чем 15 единиц α-1,4-глюкопиранозы, хотя наиболее обычные содержат 6, 7 или 8 единиц α-1,4-глюкопиранозы, образуя так называемые альфа-циклодекстрины (α-CD), бета-циклодекстрины (β-CD) или гамма-циклодекстрины (γ-CD) соответственно. Все из них имеют структуру типа усеченного конуса с гидрофобной внутренней полостью и гидрофильной наружной поверхностью. Это происходит из-за того факта, что гидроксильные группы ориентированы в направлении от циклодекстрина, т.е. в их гидрофобную внутреннюю полость, она покрыта водородами метиленовой группы, а также кислородами типа простого эфира. Следовательно, они действуют в качестве носителя посредством полного или частичного захвата инородной молекулы. В определенном варианте осуществления изобретения указанный циклодекстрин представляет собой альфа-циклодекстрин, бета-циклодекстрин или гамма-циклодекстрин.
1
8
1
8
1
8
1
8
1
2
1
4
Как используется в настоящем описании, термин «производное циклодекстрина» включает любой циклодекстрин, имеющий, по меньшей мере, одну модифицированную гидроксильную группу. Химическая модификация циклодекстринов может изменять их физико-химические свойства, улучшая растворимость, стабильность и регулируя химическую активность молекул, с которыми они связаны (инородные молекулы). Было описано включение алкила, арила, карбоксиалкила, цианоалкила, гидроксиалкила, сульфоалкила, амино, азидо, гетероциклической, ацетильной, бензоильной, сукциновой групп и других групп, содержащих фосфор, серу и др. посредством реакции ОН групп циклодекстринов (Robyt (1998) “Essentials of carbohydrate chemistry”, Ed. Charles R. Canto, Springer Advanced Text in Chemistry). В определенном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одна из указанных концевых гидроксильных групп модифицирована с заменой водорода линейной или разветвленной С-С алкильной группой, например метил, этил, пропил, и др.; три(С-С)алкилсилил, например т-бутилдиметилсилил, и др., С-Сгидроксиалкил, например 2-гидроксиэтил, 2-гидроксипропил, и др.; (С-С)алкилкарбонил, необязательно замещенный карбоксильной группой, например ацетил, сукцинил, и др.; арилкарбонил, например, бензоил, и др.; (С-С)цианоалкил, например, цианометил, цианоэтил; амино, необязательно замещенная; азидо; сульфо; (С-С)сульфоалкил; или сахаридный радикал, например глюкозил, маннозил, и др. В другом определенном варианте осуществления изобретения две или более концевых гидроксильных групп CD, например, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 концевых гидроксильных группы, присутствующие в β-CD, модифицированы любой из указанных групп.
Исходные циклодекстрины (т.е. без изменений), особенно β-CD, обладают ограниченной водной растворимостью по сравнению с ациклическими сахаридами, частично из-за сильных связей между молекулами циклодекстрина в кристаллическом состоянии. Более того, β-CD могут образовывать внутримолекулярные водородные связи между вторичными гидроксильными группами, таким образом давая неблагоприятные энтальпии раствора и, следовательно, низкую водную растворимость. Замещение любой из водородных связей гидрофобными группами, такими как метокси- или этокси-, приводит к увеличению водной растворимости. Например, водная растворимость β-CD составляет 1,85% (мас./об.) при комнатной температуре, но она может увеличиваться до 150 раз при увеличении степени метилирования (метил-β-CD). Другим особенно важным производным циклодекстрина является 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин (ОН-β-CD), полученный после обработки β-CD пропиленоксидом, который обладает водной растворимостью 60% (мас./об.). Аналогично, такие производные могут улучшить токсикологический профиль, способность инкапсулировать биологически активные молекулы и модулировать их профиль высвобождения. Основной проблемой исходных циклодекстринов является нефротоксичность после парентерального введения, преимущественно для β-CD, из-за его низкой водной растворимости. Следовательно, наиболее гидрофильные производные, такие как ОН- β-CD, уменьшают такие проблемы нефротоксичности, так как они могут легче выделяться. То же самое не имеет места для метилированных производных β-CD, которые, несмотря на то, что являются более растворимыми, чем β-CD, не исключают развития системной токсичности из-за их большей способности взаимодействовать с эндогенными липидами, что ограничивает их парентеральное применение. Наоборот, исследования токсичности, проводимые после перорального введения, показывают, что циклодекстрины, а также их производные, нетоксичны при таком пути введения.
Циклодекстрины являются водорастворимыми макромолекулами, которые одобрены для перорального, парентерального и местного введения лекарственных средств. Применение циклодекстринов при пероральном введении лекарственных средств происходит преимущественно из-за улучшения пероральной биодоступности лекарственного средства, из-за увеличения растворимости, увеличения стабильности лекарственного средства в желудочно-кишечном тракте и/или в композиции. Более того, для определенных лекарственных средств среди остальных интересна эффективность циклодекстринов в уменьшении местного раздражения, вызванного самим лекарственным препаратом, контроль за высвобождением лекарственного средства на протяжении желудочно-кишечного тракта или маскировка нежелательных органолептических характеристик. Таким является случай итраконазола, который имеется на рынке в Соединенных Штатах и Европе, ассоциированный с ОН-β-CD для перорального введения, существенно снижая раздражение в желудочно-кишечном тракте при отдельном введении.
Кроме того, циклодекстрины также используются из-за их способности увеличивать проникновение лекарственного средства через кожу и слизистые оболочки, что вызывает лучшее и более однородное всасывание лекарственного средства. Это приводит к увеличению активности лекарственного средства после его введения, такого как, например, комплекс, образованный между флутамидом и ОН-β-CD, существенно улучшая всасывание лекарственного средства после его перорального введения.
В определенном варианте осуществления изобретения указанным производным циклодекстрина является производное альфа-циклодекстрина или производное бета-циклодекстрина или производное гамма-циклодекстрина. Иллюстративно, неограничивающим примером производных циклодекстрина, которые могут использоваться для внесения настоящего изобретения в практику, являются этил-β-CD, гептакис(2,3,6-три-О-этил)-β-CD, 2-гидроксипропил-β-CD, 2-О-гидроксипропил-β-CD, 2-гидроксиэтил-β-CD, сукцинилированные производные β-CD, сукцинилированные производные 2-гидроксипропил-β-CD, бутил-β-CD, гептакис(2,6-ди-О-н-бутил)-β-CD, гептакис(2,6-ди-О-н-пентил)-β-CD, метил-β-CD, метил-β-CD, карбоксиметил-β-CD, карбоксиэтил-β-CD, гептакис(2,6-ди-О-метил)-β-CD, гептакис(2,3,6-три-О-метил)-β-CD, ацетил-β-CD, гептакис(3-О-ацетил-2,6-ди-О-н-пентил)-β-CD, гептакис(3-О-ацетил-2,6-ди-О-метил)-β-CD, сульфо-β-CD, сульфапропил-β-CD, н-бутил-β-CD, гептакис(3-О-н-бутирил-2,6-ди-О-пентил)-β-CD, 2-цианоэтил-β-CD, 6-монодезокси-6-моноазидо-β-CD, гептакис(2,3,6-три-О-бензил)-β-CD, гептакис(2,3,6-три-О-бензоил)-β-CD, 6-монодезокси-6-моноамино-β-CD, гептакис(2,6-ди-О-н-пентил-3-О-трифторацетил)-β-CD, гептакис(2,3,6-три-О-н-октил)-β-CD, гептакис(2,3-ди-О-ацетил-6-О-трет-бутилдиметилсилил)-β-CD, гептакис(6-О-трет-бутилдиметилсилил)-β-CD, гептакис(6-О-трет-бутилдиметилсилил-2,3-ди-О-метил)-β-CD, гептакис(2,6-ди-трет-бутилдиметилсилил)-β-CD, гептакис(2,3,6-три-О-трифторацетил)-β-CD, гептакис(2,6-ди-О-метил-3-О-н-пентил)-β-CD.
Массовое соотношение между циклодекстрином или его производными и биоразлагаемым полимером может варьироваться в широком диапазоне, в определенном варианте осуществления изобретения указанное массовое соотношение циклодекстрина (или его производного): биоразлагаемого полимера составляет 1:1-10, предпочтительно 1:1-5, более предпочтительно около 1:4. В определенном варианте осуществления изобретения указанным биоразлагаемым полимером является PVM/MA.
Как было упомянуто ранее, наиболее широко используемыми в фармацевтических применениях являются β-CD и его производные, особенно 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин (ОН-β-CD), так как он имеет высокую водную растворимость, низкую токсичность и более гидрофобную полость, чем таковая β-CD.
В определенном варианте осуществления изобретения циклодекстрин, присутствующий в наночастицах по изобретению, не имеет каких-либо замещенных гидроксильных групп. В специфическом варианте осуществления изобретения указанным циклодекстрином является бета-циклодекстрин (β-CD), содержащий 7 единиц α-1,4-глюкопиранозы. Хотя массовое соотношение β-CD:биоразлагаемый полимер составляет 1:1-10, предпочтительно 1:1-5, соотношение 1:4 дает хорошие результаты. В качестве иллюстрации приблизительно 0,25 мг β-CD/мг биоразлагаемого полимера дает эффективную ассоциацию. В таком случае количество β-CD, ассоциированое с наночастицами, составляет приблизительно 90 микрограмм/мг наночастиц. Такие наночастицы характеризуются обычно как имеющие сферическую форму и размер близкий к 150 нм.
В другом определенном варианте осуществления изобретения циклодекстрин, присутствующий в наночастицах по изобретению, является более гидрофильным производным β-CD, таким как гидроксилированное производное β-CD, включающее одну или более гидроксиалкильных групп (например, гидроксипропил). В предпочтительном определенном варианте осуществления изобретения используется 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин (ОН-β-CD). Массовое соотношение ОН-β-CD:биоразлагаемый полимер составляет 1:1-10, предпочтительно 1:1-5, хотя массовое соотношение 1:4 дает хорошие результаты. В качестве иллюстрации приблизительно 0,25 мг ОН-β-CD/мг биоразлагаемого полимера дает эффективную ассоциацию. В таком случае количество β-CD, ассоциированного с наночастицами, составляет приблизительно 65 микрограмм/мг наночастиц. Такие наночастицы характеризуются как имеющие обычно сферическую форму и размер, близкий к 150 нм.
1
4
2
В другом определенном варианте осуществления изобретения циклодекстрин, присутствующий в наночастицах по изобретению, представляет собой производное CD, имеющее одну или более концевых функциональных групп, отличных от гидроксила, например одну или более необязательно замещенных аминогрупп. Аминогруппы могут в свою очередь быть замещенными и иметь другие функциональные группы, например С-Салкил; иллюстративные примеры указанных замещенных аминогрупп включают метиламин, этиламин, диэтиламин, и др.). В предпочтительном определенном варианте осуществления изобретения указанная аминогруппа представляет собой свободную аминогруппу, без замещения (-NH). В некоторых проведенных анализах наблюдали, что при указанных группах наночастицы по изобретению, вводимые перорально, накапливаются в определенных сегментах кишечного тракта, что допускает специфическое введение. В специфическом варианте осуществления изобретения производное циклодекстрина, присутствующее в наночастицах по изобретению, представляет собой 6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрин (NH-β-CD). Массовое соотношение NH-β-CD:биоразлагаемый полимер составляет 1:1-10, предпочтительно 1:1-5, хотя соотношение 1:4 дает хорошие результаты. Такие наночастицы характеризуется как обычно имеющие сферическую форму и размер, близкий к 150 нм.
В определенном варианте осуществления изобретения циклодекстрин или его производное, присутствующее в наночастицах по изобретению, выбирают из группы, состоящей из β-циклодекстрина (β-CD), 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина (ОН-β-CD), 6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрина (NH-β-CD) и их смесей.
Несколько исследований, проводимых авторами изобретения, показали, что наночастицы, основанные на биоразлагаемом полимере, содержащем циклодекстрин, допускают образование непосредственных биоадгезивных взаимодействий между такими носителями (наночастицами) и компонентами поверхности желудочно-кишечного тракта. Такой тесный контакт интересен в отношении увеличения биодоступности биологически активных молекул, когда их вводят посредством любого пути, дающего доступ к слизистой оболочке (например, пероральным, ректальным, вагинальным, глазным или назальным путем).
Наночастицы, основанные на биоразлагаемом полимере (например, PVM/MA), содержащие циклодекстрин (пустые наночастицы, т.е. без биологически активных молекул) могут быть получены способом, основанным на методе замены растворителя, описанным, например, в международной патентной заявке WO 09/069938. В качестве иллюстрации, указанные пустые наночастицы, включающие биоразлагаемый полимер (например, PVM/MA) и циклодекстрин или его производное, могут быть получены двумя альтернативными способами, особенно посредством одновременной инкубации двух компонентов, биоразлагаемого полимера (например, PVM/MA) и циклодекстрина или его производного (например, β-CD, ОН-β-CD или NH-β-CD) в органической фазе [альтернатива 1] или посредством инкубации наночастиц биоразлагаемого полимера (например, PVM/MA) с водным раствором циклодекстрина или его производного (например, β-CD, ОН-β-CD или NH-β-CD) [альтернатива 2].
Биологически активные молекулы
Наночастицы по изобретению включают, в добавление к биоразлагаемому полимеру и циклодекстрину или его производному, биологически активные молекулы.
Как используется в настоящем описании, термин «биологически активная молекула» относится к любому веществу, которое вводят пациенту, предпочтительно человеку, с профилактическими или лечебными целями, т.е. любому веществу, которое может быть использовано в лечении, излечении, профилактике или диагностике заболевания или для улучшения физического или психического самочувствия людей и животных. Указанный термин «биологически активная молекула» обычно включает и лекарственные средства, и антигены и аллергены.
Наночастицы по изобретению могут включать одну или более биологически активных молекул, независимо от ее характеристик растворимости, хотя для указанных наночастиц было доказано, что они являются особенно применимыми системами для введения гидрофобных биологически активных молекул.
Наночастицы по изобретению допускают модификацию распределения биологически активных молекул, которые они содержат, при их введении любым путем, давая доступ к любой слизистой оболочке организма (например, пероральным, ректальным, назальным, вагинальным, глазным путем и др.).
Химическая природа биологически активных молекул может варьироваться в широком диапазоне, от небольших молекул до макромолекулярных соединений (пептиды, полинуклеотиды и др.)
В определенном варианте осуществления изобретения указанная биологически активная молекула представляет собой пептид или белок. Как используется в настоящем описании, термин «пептид» относится к соединению, образованному аминокислотами, связанными посредством пептидных связей, и включает олигопептиды (образованные 10 или менее аминокислотами) и полипептиды (образованные более чем 10 аминокислотами). Аналогично, как используется в настоящем описании, термин «белок» относится к макромолекулам с высокой молекулярной массой, образующим линейные цепи аминокислот, связанных посредством пептидных связей; белки могут быть образованы одной или несколькими пептидными цепями.
В другом определенном варианте осуществления изобретения указанная биологически активная молекула включает нуклеозид, нуклеотид, олигонуклеотид, полинуклеотид или нуклеиновую кислоту. Как используется в настоящем описании «олигонуклеотид» представляет собой полимер нуклеотидов, связанных посредством 5'-3' фосфодиэфирных связей с длиной, равной или меньшей чем 50 нуклеотидов, тогда как «полинуклеотид» представляет собой полимер нуклеотидов, связанных 5'-3' фосфодиэфирными связями с длиной больше чем 50 единиц. Аналогично, термин «нуклеиновая кислота» также относится к полимеру нуклеотидов, связанных 5'-3' фосфодиэфирными связями; в зависимости от того, являются ли они рибонуклеотидами или дезоксирибонуклеотидами, нуклеиновая кислота будет РНК или ДНК соответственно. Нуклеиновые кислоты имеют различные функции в клетках живых организмов, такие как хранение генетической информации и ее передача последующему поколению (ДНК) или экспрессия этой информации в рамках синтеза белка (мРНК и тРНК), они являются структурным компонентом органелл клеток, таких как рибосомы (рРНК), они катализируют определенные химические реакции (рибозимы) и участвуют в механизмах регуляции экспрессии генов (посредством комплементарных РНК мРНК или dsРНК в нарушениях РНК).
В другом определенном варианте осуществления указанная биологически активная молекула представляет собой небольшую (органическую или неорганическую) молекулу; обычно такие молекулы получают химическим синтезом, или полусинтетическими методами, или, альтернативно, их выделяют из их источников. В специфическом варианте осуществления изобретения указанные небольшие (органические или неорганические) молекулы имеют относительно низкую молекулярную массу, обычно равную или меньшую чем 5000, обычно равную или меньшую чем 2500, преимущественно равную или меньшую чем 1500. Ряд терапевтически активных ингредиентов обладает такими характеристиками и, следовательно, может использоваться для внедрения настоящего изобретения в практику.
Хотя биологически активная молекула, присутствующая в наночастицах по изобретению, может быть и гидрофильным веществом и гидрофобным веществом, в определенном варианте осуществления изобретения наночастицы по изобретению являются особенно применимыми для ведения гидрофобных биологически активных молекул. Следовательно, в определенном варианте осуществления изобретения биологически активная молекула, присутствующая в наночастицах по изобретению, представляет собой гидрофобное вещество. Как используется в настоящем описании, «гидрофобное вещество» представляет собой вещество, которое из-за его свойств или состава, является не очень растворимым в водной среде, обычно имея растворимость менее чем 1% (1 грамм активного ингредиента на 100 мл водного растворителя) при 20°С при рН, составляющим между 1-7,5, и атмосферном давлении.
Фактически любая биологически активная молекула может использоваться для внедрения настоящего изобретения в практику. Иллюстративные неограничивающие примеры гидрофобных биологически активных молекул, которые могут присутствовать в наночастицах по изобретению, включают противопаразитарные средства (например, альбендазол, мебендазол, празиквантел и др.); противогрибковые средства (например, клотримазол, итраконазол и др.), антибиотики (например, сульфаметизон, гентамицин, гризеофульвин, и др.), кардиотонические средства (например, дигоксин и др.), противоопухолевые средства (например, камптотекин, метотрексат, доцетаксел, фторурацил, паклитаксел, и др.), иммуносупрессанты (например, такролимус, циклоспорин), (глюко)кортикоиды (например, кортизон, дексаметазон, преднизолон, преднизон, триамцинолон и др.), и др.
В другом определенном варианте осуществления изобретения биологически активная молекула, присутствующая в наночастицах по изобретению, представляет собой вещество, которое является субстратом Р-гликопротеина. Действительно, важное применение наночастиц по изобретению лежит в их способности минимизировать отрицательные эффекты Р-гликопротеина на всасывание через слизистые оболочки определенных лекарственных средств.
Как известно, Р-гликопротеин (PGY1; фермент ЕС 3.6.3.44) представляет собой белок, который у людей кодируется геном АВСВ1, также называемым геном MDR1 (множественной лекарственной устойчивости). Р-гликопротеин действует как трансмембранный переносчик или насос, который переносит свой субстрат (обычно лекарственные средства и другие ксенобиотики) из его внутриклеточного отдела в его внеклеточный отдел. В зависимости от его анатомического расположения Р-гликопротеин выполняет свою функцию 3 основными путями: (1) Р-гликопротеин ограничивает вход лекарственного вещества в организм после его перорального введения в результате его экспрессии в просветной мембране энтероцитов; (2) когда лекарственное средство достигает кровотока, Р-гликопротеин обеспечивает его выделение в желчь и в мочу в результате его экспрессии в каналикулярной мембране гепатоцитов и в просветной мембране клеток проксимальных канальцев почек; и (3) находясь в большом круге кровообращения, он ограничивает проникновение лекарственного средства в чувствительные ткани.
Следовательно, вещество субстрат Р-гликопротеина относится к веществу, например, ксенобиотику, со способностью связывать внутриклеточный домен Р-гликопротеина так, что посредством потребления АТФ, он может быть перенесен из клетки в соответствии со следующей реакцией:
2
АТФ+НО+ксенобиотик (внутри) = АДФ+фосфат+ксенобиотик (снаружи).
2+
1
Иллюстративно, неограничивающие примеры известных субстратов Р-гликопротеина, которые могут присутствовать в наночастицах по изобретению в качестве биологически активных молекул, включают, среди остальных (Fromm MF; Trends 2004; 25: 423-429), противоопухолевые средства (например, доцетаксел, этопозид, иматиниб, паклитаксел, тенипозид, винбластин, винкристин, антрациклины (например, доксорубицин, даунорубицин, эпирубицин, и др.); антагонисты β-адренорецепторов (например, бунитролол, карведилол, целипролол, талинолол и др.); блокаторы Са каналов (например, дилтиазем, мибефрадил, верапамил, и др.); кардиотонические лекарственные средства (например, дигитоксин, дигоксин, хинидин и др.), противовирусные средства (например, ампренавир, индинавир, нелфинавир, саквинавир, ритонавир, и др.); стероиды (например, дексаметазон, метилпреднизолон, и др.); иммуносупрессанты (например, циклоспорин А, сиролимус, такролимус и др.); противорвотные средства (домперидон, ондансетрон, и др.); антибиотики (например, эритромицин, левофлоксацин и др.); антилипидемические средства (например, аторвастатин, ловастатин, и др.); антагонисты рецепторов гистамина Н (например, фексофенадин, терфенадин, и др.); и лекарственные средства других терапевтических групп (например, амитриптилин, колхицин, дебрисоквин, итраконазол, лозартан, морфин, фенитоин, рифампин, актиномицин D, топотекан, эстрадиол, рапамицин, FK506 и др.).
В определенном варианте осуществления изобретения указанные биологически активные молекулы представляют собой гидрофобное вещество или вещество-субстрат фермента Р-гликопротеина, выбираемое из группы, состоящей из актиномицина D, альбендазола, амитриптилина, ампренавира, аторвастатина, бунитролола, камптотецина, карведилола, целипролола, циклоспорина, клотримазола, колхицина, кортизона, даунорубицина, дебризоквина, дексаметазона, дигитоксина, дигоксина, дилтиазема, доцетаксела, домперидона, доксорубицина, эпирубицина, эритромицина, эстрадиола, этопозида, фенитоина, фексофенадина, FK506, фторурацила, гентамицина, гризеофульвина, иматиниба, индинавира, итраконазола, левофлоксацина, лозартана, ловастатина, мебендазола, метилпреднизолона, метотрексата, мибефрадила, морфина, нелфинавира, ондансетрона, паклитаксела, празиквантела, преднизолона, преднизона, хинидина, рапамицина, рифампицина, саквинавира, сиролимуса, сульфметизола, ритонавира, такролимуса, талинолола, тенипозида, терфенадина, топотекана, триамцинолона, верапамила, винбластина, винкристина и их смесей.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения биологически активная молекула, присутствующая в наночастицах по изобретению, представляет собой паклитаксел.
2+
1
В определенном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция по изобретению включает наночастицы по изобретению, содержащие одно или более различных лекарственных средств. Иллюстративно, неограничивающие примеры указанных лекарственных средств включают средства, принадлежащие к различным терапевтическим группам, например противоопухолевые средства, антагонисты β-адренорецепторов, обезболивающие средства, блокаторы Са каналов, кардиотонические лекарственные средства, противовирусные средства, стероиды, иммуносупрессоры, противорвотные средства, антибиотики (например, антибактериальные, противогрибковые, противовирусные, противопаразитические средства и др.), антилипидемические средства, антагонисты рецепторов гистамина Н, противовоспалительные средства, нейропротекторы, противоаллергические средства, антиастматические средства, антибиотики, легочные поверхностно-активные вещества, и др.
Как может быть отмечено, некоторые биологически активные молекулы, которые являются субстратом Р-гликопротеина, имеют гидрофобную природу. Аналогично, системы для введения биологически активных молекул, обеспечиваемых настоящим изобретением, предусматривают возможность введения лекарственных средств ряда терапевтических групп.
В другом определенном варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиции по изобретению включает наночастицы по изобретению, содержащие один или больше различных антигенов для целей вакцинирования или один или больше различных аллергенов для иммунотерапевтических целей в качестве биологически активной молекулы.
Как используется в настоящем описании, термин «антиген» относится к любому веществу, которое может быть распознано иммунной системой пациента и/или может индуцировать у пациента гуморальный иммунный ответ или клеточный иммунный ответ, приводящий к активации В и/или Т клеток при его введении пациенту; в качестве иллюстрации, указанный термин включает любой природный или рекомбинантный иммуногенный продукт, полученный от высшего организма или из микроорганизма, например бактерии, вируса, паразита, простейшего, грибов и др., который содержит одну или больше антигенных детерминант, например структурные компоненты указанных организмов; токсины, например, экзотоксины и др. Фактически любой антиген может быть использован в получении наночастиц по изобретению, нагруженных антигеном. В качестве неограничивающей иллюстрации, термин «антиген» включает:
- «микробные» антигены, т.е. антигены микроорганизмов, включая, но не ограничиваясь, инфекционные вирусы, бактерии, грибы и паразиты; указанные антигены включают интактные микроорганизмы, а также их части, фрагменты и производные, природного или искусственного происхождения, а также синтетические или рекомбинантные продукты, которые идентичны или сходны с природными антигенами микроорганизма и вызывают специфический иммунный ответ для этого микроорганизма; в таком смысле соединение сходно с природным антигеном микроорганизма, если оно вызывает (гуморальный и/или клеточный) иммунный ответ, как таковой для природного антигена на этот микроорганизм; указанные антигены обычно используются специалистами в области техники; и
- «опухолевые» антигены, т.е. вещества, например пептиды, ассоциированные с опухолью или раком («опухолевый маркер»), которые могут вызывать иммунный ответ, особенно когда представлены в контексте молекулы МНС, например Her2 (рак молочной железы); GD2 (нейробластома); EGF-R (злокачественная глиобластома); СЕА (медуллярный рак щитовидной железы); CD52 (лейкемия); белок g100 человеческой меланомы; белок melan-A/MART-1 человеческой меланомы; белок MAGE-3; белок Р53; белок HPV16E7; антигенные фрагменты указанных антигенов и др.
Как используется в настоящем описании, термин «аллерген» относится к веществу, к которому пациент является чувствительным и которое вызывает иммунную реакцию, например экстракты аллергенов пыльцы, экстракты аллергенов насекомых, экстракты аллергенов пищи или пищевых продуктов, компоненты, присутствующие в слюне, клещах или жалах насекомых, индуцирующие реакции гиперчувствительности у пациента, компоненты, присутствующие в растениях, индуцирующие у пациента реакции гиперчувствительности, и др., например, экстракты белков пыльцы, такие как пыльца злаков, аллергенные экстракты Lolium perenne, аллергенные экстракты масел (оливковое) и др., экстракт белков насекомых, такие как из пылевых клещей и др., аллергенные экстракты пищевых компонентов и др. Фактически любой аллерген может использоваться при получении наночастиц, нагруженных аллергеном композиции по изобретению; тем не менее, в определенном варианте осуществления изобретения указанным аллергеном является яичный альбумин (OVA), белок, широко используемый в качестве экспериментальной модели аллергии.
Brucella sp., Salmonella sp
Иллюстративно, неограничивающие примеры указанных биологически активных молекул, которые могут содержать наночастицы по изобретению, включают бактериальные антигены: цитоплазматические, периплазматические антигены, антигены клеточной оболочки (например, белки внутренней мембраны, белки наружной мембраны, липополисахариды и смешанные комплексы, белки, ассоциированные с клеточной стенкой и др.) и др.; антигены поверхностных структур (например, фимбрии, гликокаликс, жгутики и др.), включая таковые внутриклеточных патогенов, такие как, например, ., и др.; и растворимые и поверхностные антигены эукариотических микроорганизмов; вирусные антигены, например матрикс, капсид, оболочка, внутренние (включая ферментные) антигены, аллергены видов животных (клещи и др.), растений (злаки и др.), и др.
Наночастицы по изобретению могут быть получены посредством способа, основанного на методе замены растворителя, описанного, например, в международной патентной заявке WO 02/069938, который включает (i) образование комплекса (циклодекстрин или его производное) - (биологически активные молекулы), далее комплекса [CD:BAM] и (ii) включение указанного комплекса [CD:BAM] в раствор биоразлагаемого полимера в органическом растворителе перед образованием наночастиц.
Коротко, образование указанного комплекса [CD:BAM] включает добавление раствора биологически активной молекулы (ВАМ) к органическому растворителю, такому как спирт, этанол, например к водному раствору циклодекстрина или его производного (CD). Смесь подвергают перемешиванию до достижения равновесия. Воду и органический растворитель (например, этанол) затем удаляют любым обычным методом, например выпариванием при пониженном (давлении) или любой другой системой для удаления растворителей.
Молярное соотношение CD:BAM, присутствующее в указанном комплексе [CD:BAM], может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от, среди других факторов, циклодекстрина или его производных (CD) и биологически активных молекул (ВАМ) присутствующих в указанном комплексе; тем не менее, в определенном варианте осуществления изобретения молярное соотношение CD:BAM, присутствующее в комплексе [CD:BAM] составляет 1:1-4, обычно 1:1-2. В специфическом варианте осуществления изобретения биологически активной молекулой является паклитаксел, молярное соотношение CD:BAM в указанном комплексе [CD:BAM] составляет 1:1.
Включение указанного комплекса [CD:BAM] в раствор биоразлагаемого полимера в органическом растворителе перед получением наночастиц может проводиться посредством добавления указанного комплекса к раствору биоразлагаемого полимера и впоследствии одновременной инкубации обоих компонентов, биоразлагаемого полимера (например, PVM/MA) и комплекса [CD:BAM] в органической фазе (например, ацетон), включающей биоразлагаемый полимер (например, PVM/MA) в течение подходящего периода времени, обычно составляющего между 10 и 60 минутами, при температуре, составляющей между 20°С и 30°С приблизительно (в определенном варианте осуществления изобретения, когда биологически активной молекулой является паклитаксел, инкубацию могут проводить в течение периода времени 30 минут при комнатной температуре (25°С)), при перемешивании, например, посредством использования ультразвуковой, магнитной или механической мешалки); путем такой операции обычно получают высокую степень ассоциации комплекса [CD:BAM] с биоразлагаемым полимером. Коротко, такая стадия включает одновременное растворение и/или диспергирование биоразлагаемого полимера и комплекса [CD:BAM] в органическом растворителе (например, ацетоне). Смесь инкубируют при перемешивании при комнатной температуре в течение определенного периода времени. Концентрация биоразлагаемого полимера предпочтительно составляет между 0,001% и 10% мас./об. и таковая комплекса [CD:BAM] между 0,001% и 5% мас./об. Необязательно, при необходимости, к указанному раствору добавляют определенный объем полярного растворителя, смешиваемого с раствором полимеров (например, этанол). Также, необязательно, при желании сшивающий агент может быть использован для улучшения стабильности наночастиц, как описано в WO 02/069938. Иллюстративные примеры сшивающих агентов, которые могут быть использованы, включают диаминированные молекулы (например, 1,3-диаминопропан, и др.), полисахариды или простые сахариды, белки и, в общем, любую молекулу, имеющую функциональные группы, которые могут реагировать с группами, присутствующими в биоразлагаемом полимере, например с ангидридными группами, присутствующими в PVM/MA. Тем не менее, обычно нет необходимости сшивать, так как это возникает одновременно из-за присутствия циклодекстрина или его производного. В случае, когда желательны сшивки, может быть добавлено небольшое количество любого из указанных продуктов.
Затем с целью получения наночастиц по изобретению к предшествующей смеси добавляют сходный объем второй жидкости не-растворителя, предпочтительно водно-спиртового раствора. В определенном варианте осуществления изобретения используется вода фармацевтического качества (очищенная вода или вода для инъекций (вди), в соответствии с применением). Соотношение органическая фаза:водно-спиртовой раствор предпочтительно включено в диапазон, составляющий между 1:1 и 1:10 по объему. Наночастицы непрерывно образуются в среде при появлении мутной суспензии. Органические растворители могут быть удалены любым подходящим способом, таким как выпаривание при пониженном давлении, наночастицы остаются в стабильной водной суспензии. При желании наночастицы вероятно могут быть очищены обычными средствами, такими как центрифугирование, ультрацентрифугирование, тангенциальная фильтрация или выпаривание, включая использование вакуума. Наконец, при желании, наночастицы могут быть лиофилизированы для их длительного хранения и консервации. Для облегчения лиофилизации могут быть использованы обычные криопротективные средства, такие как сахароза, лактоза или маннит, предпочтительно в концентрации между 0,1% и 10 мас.%.
Альтернативно, наночастицы, основанные на биоразлагаемом полимере, могут быть получены посредством способа, который включает инкубацию частиц биоразлагаемого полимера (например, PVM/MA) с водным раствором, включающим комплекс [CD:BAM]. Коротко, такая альтернатива включает растворение биоразлагаемого полимера в органическом растворителе, таком как ацетон. Впоследствии к полученному раствору добавляют определенный объем водно-спиртового раствора, такого как этанол, и, наконец, такой же объем воды. Наночастицы немедленно образуются в среде при появлении мутной суспензии. Органические растворители удаляют образом, сходным с таковым, описанным в предшествующем способе, например выпариванием при пониженном давлении, наночастицы остаются в стабильной водной суспензии. Наночастицы биоразлагаемого полимера затем инкубируют в водном растворе, включающем полученный ранее комплекс [CD:BAM]. Инкубация наночастиц из биоразлагаемого полимера с комплексом [CD:BAM] может проводиться при перемешивании (например, посредством использования ультразвуковой, магнитной или механической мешалки) в течение определенного периода времени при подходящей температуре в условиях, сходных с таковыми, упомянутыми в связи с предшествующим способом (например, в течение периода времени, обычно составляющего между 10 и 60 минутами, при температуре, составляющей между 20°С и 30°). Наночастицы впоследствии очищали обычными способами, центрифугированием например, и, наконец, их лиофилизировали, при желании следуя таким же описанным ранее способам.
Массовое соотношение ВАМ:биоразлагаемого полимера, присутствующих в наночастицах по изобретению, может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от, среди других факторов, биоразлагаемого полимера (например, PVM/MA) и от биологически активной молекулы (ВАМ), присутствующих в указанных наночастицах; тем не менее, в определенном варианте осуществления изобретения массовое соотношение ВАМ:биоразлагаемый полимер, присутствующих в указанных наночастицах по изобретению, составляет 1:4-20, предпочтительно 1:10.
Соотношение комплекса [CD:BAM]:биоразлагаемый полимер, присутствующих в наночастицах по изобретению, может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от, среди других факторов, биоразлагаемого полимера (например, PVM/MA), циклодекстрина или его производного и биологически активной молекулы (ВАМ), присутствующих в указанных наночастицах; тем не менее, в определенном варианте осуществления изобретения массовое соотношение комплекса [CD:BAM]:биоразлагаемый полимер, присутствующих в указанных наночастицах по изобретению составляет 1:1-20, преимущественно, 1:2-20, предпочтительно, 3:10 (приблизительно 1:3,3) по массе.
В определенном варианте осуществления изобретения биоразлагаемый полимер представляет собой PVM/MA.
В другом определенном варианте осуществления изобретения биологически активной молекулой является паклитаксел.
В другом определенном варианте осуществления изобретения производным циклодекстрина является β-циклодекстрин (β-CD), 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин (ОН-β-CD) или 6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрин (NH-β-CD).
В другом определенном варианте осуществления изобретения биологически активной молекулой является паклитаксел и молярное соотношение (циклодекстрин или его производное):паклитаксел составляет 1:1.
В специфическом варианте осуществления изобретения комплекс [CD:BAM] представляет собой комплекс β-CD:паклитаксел, в молярном соотношении 1:1, и массовое соотношение паклитаксела:биоразлагаемого полимера (например, PVM/MA) составляет 1:4-20, хотя соотношения, близкие к 1:10, дают хорошие результаты. В качестве иллюстрации, приблизительно 0,25 мг паклитаксела в комплексе β-CD:паклитаксел, в молярном соотношении 1:1, на мг полимера дает эффективную ассоциацию. В таком случае количество лекарственного средства, ассоциированного с наночастицами, составляет приблизительно 40 микрограмм паклитаксела/мг наночастиц. Такие наночастицы характеризуются как имеющие сферическую форму и размер, близкий к 300 нм.
В другом специфическом варианте осуществления изобретения комплекс [CD:BAM] представляет собой комплекс ОН-β-CD в молярном соотношении 1:1 и массовое соотношение паклитаксел:биоразлагаемый полимер (например, PVM/MA) составляет 1:4-20, хотя соотношения, близкие к 1:10, дают хорошие результаты. В качестве иллюстрации, приблизительно 0,25 мг паклитаксела в комплексе ОН-β-CD:паклитаксел, в молярном соотношении 1:1, на мг полимера дает эффективную ассоциацию. В таком случае количество лекарственного средства, ассоциированного с наночастицами, составляет приблизительно 170 микрограмм паклитаксела/мг наночастиц. Такие наночастицы характеризуются как имеющие сферическую форму и размер, близкий к 300 нм.
В другом специфическом варианте осуществления изобретения комплекс [CD:BAM] представляет собой комплекс NH-β-CD в молярном соотношении 1:1 и массовое соотношение паклитаксел:биоразлагаемый полимер (например, PVM/MA) составляет 1:4-20, хотя соотношения, близкие к 1:10, дают хорошие результаты. В качестве иллюстрации приблизительно 0,25 мг паклитаксела в комплексе ОН-β-CD:паклитаксел, в молярном соотношении 1:1, на мг полимера дает эффективную ассоциацию. В таком случае количество лекарственного средства, ассоциированного с наночастицами, составляет приблизительно 100 микрограмм паклитаксела/мг наночастиц. Такие наночастицы характеризуются как имеющие сферическую форму и размер, близкий к 300 нм.
В определенном варианте осуществления изобретения когда дозу 10 мг/г паклитаксела, рецептированного в наночастицах по изобретению с β-CD, вводят перорально, постоянный и устойчивый уровень в плазме получают в течение по меньшей мере 24 часов, после достижения максимальной концентрации в плазме (Cmax) в момент времени приблизительно 5 часов. Максимальная концентрация в плазме (Cmax) сходна с таковой, полученной после внутривенного введения коммерческой композиции. Площадь под кривой концентрации в плазме (AUC) паклитаксела, полученная с такой композицией, приблизительно в 5 раз больше, чем полученная при внутривенном введении коммерческого медицинского продукта, вводимого в той же дозе. Такая композиция характеризуется развитием среднего времени нахождения (MRT) лекарственного средства в организме, приблизительно в 4 раза больше, чем таковое, полученное после внутривенного введения коммерческой композиции.
В другом определенном варианте осуществления изобретения, когда дозу 10 мг/кг паклитаксела, рецептированного в наночастицах по изобретению с ОН-β-CD, вводят перорально, постоянный и устойчивый уровень в плазме получают в течение, по меньшей мере, 24 часов, после достижения максимальной концентрации в плазме (Cmax) в момент времени приблизительно 6 часов. Максимальная концентрация в плазме составляет в 2 раза больше, чем полученная после внутривенного введения коммерческой композиции. Площадь под кривой концентрации в плазме (AUC) паклитаксела, полученной для такой композиции, приблизительно в 5 раз больше, чем полученная при внутривенном введении коммерческого медикамента, вводимого в той же дозе. Такая композиция характеризуется развитием среднего времени нахождения (MRT) лекарственного средства в организме приблизительно в 3,5 раза больше, чем полученное после внутривенного введения коммерческой композиции.
В другом определенном варианте осуществления изобретения, когда дозу 10 мг/кг паклитаксела, рецептированного в наночастицах по изобретению с NH-β-C, вводят перорально, постоянный и устойчивый уровень в плазме получают в течение, по меньшей мере, 24 часов после достижения максимальной концентрации в плазме (Cmax) в момент времени приблизительно 4,7 часов. Максимальная концентрация в плазме составляет приблизительно половину той, которая получена после внутривенного введения коммерческой композиции. Площадь под кривой концентрации в плазме (AUC) паклитаксела, полученной для этой композиции, приблизительно равна таковой, полученной при внутривенном введении коммерческого медицинского продукта, вводимого в той же дозе. Такая композиция характеризуется развитием среднего времени нахождения (MRT) лекарственного средства в организме приблизительно в 3 раза выше, чем полученное после внутривенного введения коммерческой композиции.
Фармацевтические композиции
В другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей, по меньшей мере, наночастицы по изобретению и фармацевтические приемлемый эксципиент, носитель или адъювант.
Указанная биологически активная молекула обычно образует комплекс с циклодекстрином или его производным, и указанный комплекс будет преимущественно находиться внутри наночастиц по изобретению; тем не менее, может так случиться, что относительная доля указанного комплекса, содержащего биологически активную молекулу, также связывается с поверхностью наночастиц, хотя большая его часть находится внутри (например, инкапсулированная) наночастиц по изобретению.
Наночастицы по изобретению могут использоваться для модификации распределения ассоциированных биологически активных молекул, когда их вводят путем, дающим доступ к любой слизистой оболочке организма (включая пероральный, ректальный, назальный, вагинальный или глазной путь). Кроме того, их также можно вводить парентерально.
Примеры фармацевтических композиций включают любую жидкую композицию (суспензию или дисперсию наночастиц) для перорального, буккального, сублингвального, местного, глазного, назального, вагинального или парентерального введения; любую композицию в форме геля, мази, крема или бальзама для его местного, глазного, назального или вагинального введения; или любую твердую композицию (таблетки, капсулы) для его перорального введения. В определенном варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию вводят перорально. В другом определенном варианте осуществления изобретения указанную фармацевтическую композицию вводят парентерально.
th
Описанная фармацевтическая композиция будет включать подходящие эксципиенты для каждой композиции. Например, в случае пероральных композиций в форме таблеток или капсул, если необходимо, будут включены связующие средства, дезинтегрирующие вещества, лубриканты, наполнители, средства для покрытия кишечно-растворимой оболочкой. Пероральные твердые композиции обычно получают смешиванием, влажной или сухой грануляцией и включением наночастиц по изобретению. Фармацевтические композиции также могут быть адаптированы для парентерального введения в форме, например, стерильных растворов, суспензий или лиофилизированных продуктов, в подходящей дозированной форме; в таком случае, указанные фармацевтические композиции будут включать подходящие эксципиенты, такие как буферы, поверхностно-активные вещества и др. В любом случае эксципиенты будут выбраны в соответствии с выбранной дозированной формой. Обзор различных фармацевтических дозированных форм лекарственных препаратов и их получения может быть обнаружен в книге “Tratado de Farmacia Galenica”, Fauli I Trillo, 10 Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones.
Доля биологически активных молекул, включенных в наночастицы по изобретению, может варьировать в широком диапазоне, например, она может составлять до 25 мас.% в отношении общей массы наночастиц. Тем не менее, подходящая доля будет в каждом случае зависеть от включенной биологически активной молекулы.
Вводимая доза наночастиц по изобретению может варьироваться в широком диапазоне, например, между приблизительно 0,01 и приблизительно 10 мг на кг массы тела, предпочтительно между 0,1 и 2 мг на кг массы тела.
Изобретение описано ниже посредством нескольких примеров, которые не ограничивают, но скорее иллюстрируют изобретение.
Примеры
Следующие примеры описывают получение и характеристики наночастиц на основе биоразлагаемого полимера (PVM/MA), включающих циклодекстрин (Примеры 1-5), и наночастиц на основе биоразлагаемого полимера (PVM/MA), включающих циклодекстрин и биологически активные молекулы (Примеры 6 и 7), которые ассоциированы с циклодекстрином и/или биоразлагаемым полимером (PVM/MA), образующим матрицу указанных наночастиц. Указанные примеры показывают способность указанных наночастиц формировать биоадгезивные взаимодействия со слизистой оболочкой и обеспечивать пероральное всасывание биологически активной молекулы, такой как паклитаксел. Как можно отметить в указанных примерах, когда паклитаксел используют в качестве биологически активной молекулы, его включение в указанные наночастицы, основанные на PVM/MA, включающие циклодекстрин, особенно 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин, позволяет получать постоянный и устойчивый уровень указанного лекарственного вещества в плазме в течение, по меньшей мере, 24 часов.
Общие способы, используемые для получения и характеристики указанных наночастиц, описаны ниже.
А. Получение наночастиц, содержащих циклодекстрины и, необязательно, биологически активную молекулу
Способ для получения наночастиц на основе биоразлагаемого полимера (PVM/MA), включающих циклодекстрин и, необязательно, биологически активную молекулу, представляет собой модификацию ранее описанного общего процесса на основе контролируемой десольватации полимера [Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330]. Для этого сополимер метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) и определенное количество циклодекстрина, или, альтернативно, комплекса циклодекстрин:биологически активная молекула, полученного обычными методами (например, Hamada et al., J Biosci Bioeng 102(4): 369-71, 2006) в ацетоне при магнитном перемешивании. После инкубации смешиваемый органический растворитель (этанол) и такой же объем деионизированной воды добавляют к этой фазе и при магнитном перемешивании, давая наночастицы при образовании мутной суспензии. Органические растворители (этанол и ацетон) затем удаляют посредством выпаривания при пониженном давлении, частицы остаются в стабильной водной суспензии. Образующиеся наночастицы могут необязательно быть покрыты оболочкой из водорастворимой биологически активной молекулы или лиганда, которые могут обладать специфическими нацеливающими свойствами для полученных наночастиц. После возможности суспензии наночастиц гомогенизироваться, ее выпаривают при пониженном давлении, например, посредством роторного испарителя, такого как роторный испаритель Buchi R144 (Швейцария), до удаления обоих органических растворителей. Впоследствии суспензию подвергают очистке ультрацентрифугированием (Sigma 3k30, № ротора 12150, Германия) или посредством тангенциальной фильтрации, и наночастицы могут вероятно быть заморожены при -80°С для их последующей лиофилизации и длительной консервации (Virtis Genesis, New York, United States).
В. Физико-химическая характеристика наночастиц
Характеристика наночастиц повлекла за собой несколько исследований, которые описаны ниже. Среди физико-химических исследований определяли размер частиц и заряд поверхности наночастиц, последний посредством измерения зета-потенциала. Оба параметра получали фотонной корреляционной спектроскопией с использованием Zetasizer nano Z-S (Malvern Instruments/Optilas, Spain).
Выход способа рассчитывали двумя способами. В первом способе выход рассчитывали гравиметрически с использованием массы лиофилизированных образцов без цитопротективного агента в соответствии с Уравнением 1:
Выход = (масса лиофилизата/исходная масса)×100
[Уравнение 1]
где
исходная масса представляет собой массу биоразлагаемого полимера (например, PVM/MA) и циклодекстрина, добавленного к композиции; и
масса лиофилизата представляет собой массу композиций после процесса лиофилизации.
Второй метод основан на количественной оценке посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), совмещенной с ELSD детектором типа (испарительное определение рассеяния света) (Agueros et al., J. Pharm. And Biomed. Anal., 39 (2005) 495-502) посредством способа, описанного ниже, который позволяет количественную оценку циклодекстринов и сополимера PVM/MA. В таком случае выход рассчитывали в соответствии с Уравнением 2:
исходное
PVM/MA
Выход = (Q-Q)×100
[Уравнение 2]
где
исходное
Qпредставляет собой исходное добавленное количество PVM/MA; и
PVM/MA
Qпредставляет собой количество PVM/MA, определенное в надосадочной жидкости.
Морфологию наночастиц наблюдали сканирующей электронной микроскопией (Zeiss, DSM 940A Germany). Для этого лиофилизированные наночастицы покрывали молекулярным слоем золота около 9 нм (Emitech K550 Equipment, Sputter Coater, United Kingdom) и получали фотографии с помощью микроскопа Zeiss, DSM 940A (United States).
Для подтверждения присутствия циклодекстринов, ассоциированных с наночастицами (метод количественного определения описан ниже), проводили элементный анализ различных композиций наночастиц с использованием элементного анализатора модель LECO CHN-900 (LECO Corporation, United States).
Количественное определение количества циклодекстрина, ассоциированного с наночастицами
Для определения количества неаминированного циклодекстрина [(например, β-циклодекстрина (β-CD) и 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина (ОН-β-CD)], ассоциированного с наночастицами, использовали способ ВЭЖХ, связанный с детектором типа ELSD. Анализ проводили в хроматографе модели LC серии 1100 (Agilent, Waldbornn, Germany) и данные анализировали на компьютере Hewlett-Packard с помощью программы Chem-Station G2171 (Aqueros et al., J. Pharm. and Biomed. Anal., 39 (2005) 495-502).
Для анализа образцов надосадочные жидкости, полученные после процесса очистки наночастиц, разводили до 10 мл очищенной водой. После добавления внутреннего стандарта (PEG6000) 1 мл аликвоты надосадочной жидкости получали в качестве образцов. Образцы анализировали с использованием колонки Zorbax Eclipse XDB-Phenyl (Agilent 150 мм ×2,1 мм) и смеси воды/ацетонитрила в градиенте (см. Таблицу 1) в качестве подвижной фазы с током 0,25 мл/мин.
Таблица 1
Градиентные условия для подвижной фазы (А: ацетонитрил; В: вода)
Время (мин)
А (%)
В (%)
0
0
100
2
0
100
9
60
40
11
71
29
12
0
100
Условия детектора (ELSD) оптимизировали до достижения максимальной чувствительности в соответствии с градиентом, используемым в подвижной фазе (температура небулайзера: 115°С; ток азота: 3,2 мл/мин). Хроматографическое разделение различных циклодекстринов, PVM/MA и внутреннего стандарта (PEG 6000) проводили в течение менее чем 15 минут.
Время удерживания составило:
1,08±0,05 минут для PVM/MA;
4,58±0,07 минут для β-CD;
10,27±0,06 минут для OH-β-CD;
13,60±0,04 минуты для внутреннего стандарта.
Предел количественного определения составил 0,2 мг/мл для циклодекстринов и 0,05 мг/мл для полимера (PVM/MA). Точность не превосходила предел 7%.
H2
В случае количественного анализа аминированного циклодекстрина [например, 6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрин (NH-β-CD)], ассоциированного с наночастицами, вариант вышеописанного способа использовали для предотвращения наложения пиков циклодекстрина и полимера. Следовательно, образцы анализировали с использованием колонки N-Zorbax (Agilent 4,6×150 мм, 5 мкм), нагревания до 40°С и смеси метанол/вода (80/20 об/об) в качестве подвижной фазы со скоростью потока 1 мл/мин). Условия детектора (ELSD) были следующими: температура небулайзера: 71ºС и ток азота: 1,9 мл/мин. Хроматографическое разделение 6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрина проводили в течение менее чем 7 минут. Время удерживания составило 3,8±0,07 минут.
Наконец, количество циклодекстрина (CD), ассоциированного с наночастицами, рассчитывали как различие между количеством исходно добавленного CD и количеством CD, определяемым в надосадочной жидкости.
Количественное определение RBITC
Количество изотиоцианата родамина В (RBITC), включенного в наночастицы, определяли колориметрией при длине волны 540 нм (Labsystems iEMS Reader MF, Finland). Для такого количественного определения использовали калибровочные кривые RBITC в 0,1 Н NaOH в диапазоне 5-50 мкг/мл; r=0,999.
Количество RBITC оценивали как разницу между исходным добавленным количеством и количеством, обнаруженным после полного гидролиза определенного количества наночастиц в 0,1 Н NaOH (24 ч, 37°С).
Высвобождение RBITC
Кинетику высвобождения RBITC из наночастиц проводили в диализных пробирках Vivaspin 100000 MWCO (VIVASPIN, Hannover, Germany). Для этого 10 мг наночастиц диспергировали в 1 мл стимулированной желудочной среды (0-1 ч) или стимулированной кишечной среды (1-24 ч) (USP XXIII) при 37±1°С. В определенные моменты времени суспензии наночастиц центрифугировали (5000×g, 15 мин) и количество RBITC в фильтратах оценивали количественно колориметрией (λ=540 нм).
Количественное определение паклитаксела
Количество паклитаксела, инкапсулированное в наночастицах, определяли ВЭЖХ. Анализ проводили в хроматографе LC модели серии 1100 (Agilent, Waldbornn, Germany), соединенном с системой определения диодно-лучевого УФ. Данные анализировали на компьютере Hewlett-Packard с помощью программы Chem-Station G2171. Для отделения паклитаксела использовали колонку с обращенной фазой Phenomenex Gemini C18 (150 мм ×3 мм; 5 мкм), нагретую до 30°С. Подвижную фазу образовывали смесью фосфатного регулирующего раствора (рН 2; 0,01М) и ацетонитрила (в соотношении 50/50 по объему) и прокачивали со скоростью 0,5 мл/мин. Определение проводили при 228 нм.
Для анализа свежего образца получали 100 мкл водной суспензии наночастиц и заполняли 100 мкл ацетонитрила. Растворители выпаривали (центрифужный испаритель) и образец восстанавливали в используемой подвижной фазе. 100 мкл аликвоты вводили в колонку ВЭЖХ для анализа.
Исследования биоадгезии
С.
Исследования биоадгезии проводили с использованием ранее описанного протокола (Arbos et al., Int. J. Pharm., 242 (2002) 129-136), в соответствии с правилами Этического Комитета Университета Наварры и Европейского законодательства по экспериментальным животным (86/609/EU).
ex
em
Для этого самцов крыс Wistar со средней массой 225 г (Harlan, Spain) содержали в обычных условиях без пищи и воды. 1 мл водной суспензии, содержащей 10 мг наночастиц, меченных RBITC, вводили животным перорально. Животных умерщвляли в различные моменты времени (0,5, 1, и 3 и 8 часов) посредством вывиха шеи. Брюшную полость открывали, желудочно-кишечный тракт удаляли и делили на шесть анатомических участков: желудок (Sto), тонкая кишка (I1, I2, I3 и I4) и слепая кишка (Се). Каждый сегмент слизистой оболочки открывали продольно и промывали PBS (рН 7,4). Каждую часть в свою очередь нарезали на пять одинаковых частей и ткань разрушали с помощью 1 мл 3 М NaOH в течение 24 часов. 2 мл метанола использовали для экстракции родамина, смесь перемешивали в течение 1 минуты с помощью вортекса и затем центрифугировали при 2000×g в течение 10 минут (центрифуга 5804R, ротор А-4-44, Germany). 1 мл аликвоты полученной надосадочной жидкости разводили водой (3 мл) и анализировали спектрофлуорометрией при λ 540 нм и λ 580 нм (GENios, Austria) для оценки фракции наночастиц, прилипших к слизистой оболочке. Калибровочные кривые получали посредством добавления растворов RBITC в 3 М NaOH (0,5-10 мкг/мл) к контрольным сегментам ткани, которые подвергали тем же стадиям экстракции (r>0,996).
max
adh
max
adh
adh
max
adh
adh
adh
С целью сравнения различных композиций исследовали кинетику и кривые биоадгезии. Для этого фракцию прилипших наночастиц наносили на график относительно времени, таким образом получая кривые биоадгезии. На основании последнего и использования компьютерного приложения WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, United Stetes) определяли следующие параметры кинетики биоадгезии: Q, AUC, T, MRT и K (Arbos et al., J. Control. Release, 89 (2003) 19-30). Q (мг) представляет собой исходную максимальную способность наночастиц прилипать к слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта и связана с их способностью развивать биоадгезивные взаимодействия. AUC(мг.ч) представляет собой площадь под кривой прилипшей фракции наночастиц и представляет собой интенсивность биоадгезии. MRT (ч) представляет собой оцененное среднее время, в течение которого композиции остаются прилипшими к слизистой оболочке. K определяют как скорость удаления фракции, прилипшей к слизистой оболочке. Все такие параметры оценивали между 0 и 8 часами. Расчет проводили с использованием программы WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, USA).
D. Визуализация наночастиц, прилипших к слизистой оболочке
TM
Визуальное изображение наночастиц, содержащих циклодекстрины и, необязательно, биологически активную молекулу, в желудочно-кишечной оболочке наблюдали посредством флуоресцентной микроскопии. Для этого использовали композиции, содержащие RBITS. Указанные композиции (10 мг наночастиц) перорально вводили лабораторным животным (самцам крыс Wistar), которых умерщвляли через два часа. После умерщвления желудочно-кишечный тракт извлекали, получая различные части тонкой кишки, которые промывали фосфатным буферным раствором (рН 7,4, 0,15 М), как было описано ранее для исследований биоадгезии. Различные сечения кишечника обрабатывали O.C.T. (Sakura, Netherlands) и замораживали в жидком азоте. Образцы тканей впоследствии нарезали на сечения толщиной 5 мкм в криостате (2800 Frigocut E, Reichert-Jung, Germany) и фиксировали к подложке для их визуализации посредством флуоресцентной микроскопии.
Е. Исследования фармакокинетики
Исследования фармакокинетики проводили в соответствии с правилами Этического Комитета Университета Наварры, а также Европейским законодательством по экспериментальным животным (86/609/EU). Для этого самцов крыс Wistar со средней массой 225 г (Harlan, Spain) изолировали в метаболические клетки за 12 часов до введения композиции, без доступа к пище, позволяя им свободный доступ к питьевой воде.
Животных делили на 8 групп лечения (по 6 животных в группе) и лечили однократными дозами 10 мг/кг (2,25 мг) паклитаксела, включенного в любую из следующих композиций:
(i) в/в раствор Taxol (Bristol-Myers Squibb, Madrid, Spain);
(ii) пероральный раствор Taxol;
(iii) комплекс паклитаксел (PTX)-2-гидроксипропил-β-циклодекстрин (ОН-β-CD) [PTX-OH-β-CD];
(iv) комплекс паклитаксел (PTX)-β-циклодекстрин (β-CD) [PTX-β-CD];
(v) комплекс паклитаксел (PTX)-6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрин (NH-β-CD) [PTX-NH-β-CD];
(vi) комплекс паклитаксел (PTX)-2-гидроксипропил-β-циклодекстрин (ОН-β-CD)-наночастицы, основанные на PVM/MA (NP) [PTX-OH-β-CD-NP];
(vii) комплекс паклитаксел (PTX)-β-циклодекстрин (β-CD)-наночастицы, основанные на PVM/MA (NP) [PTX-β-CD-NP]; и
(viii) комплекс паклитаксел (PTX)-6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрин-наночастицы, основанные на PVM/MA (NP) [PTX-NH-β-CD-NP].
1 мл различных композиций, растворенных или диспергированных в воде, вводили животным, за исключением случая в/в раствора (коммерческая композиция), который вводили в хвостовую вену (0,3 мл).
После введения отбирали объем крови приблизительно 300 мкл в различные моменты времени с использованием этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в качестве антикоагулянта и восстанавливая объем крови животного (крысы) эквивалентным объемом физиологического раствора внутрибрюшинным (в/б) путем. Кровь центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 минут, и надосадочную жидкость (плазму) замораживали при температуре -80°С. Исследование проводили соответствии с принципами, включенными в международные руководства для экспериментов на животных (WHO Chronicle, 39 (2): 51-56, 1985; A CIOMS Ethical Code for Animal Experimentation), с помощью протокола, одобренного Этическим Комитетом по экспериментам на животных Университета Наварры.
Предварительная обработка образцов
Экстракцию паклитаксела из плазмы проводили посредством процесса жидкость-жидкостной экстракции с использованием т-бутилметилового эфира в качестве экстракционного растворителя. Для этого получали аликвоты плазмы (0,1 мл), доводили до объема 1 мл водой и добавляли к ним 0,2 мкг доцетаксела в качестве внутреннего стандарта. Затем добавляли 4 мл трет-бутилметилового эфира и их перемешивали в течение 1 минуты. Затем образец центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут и надосадочную жидкость (органическую фазу) собирали и выпаривали в центрифужном испарителе (Savant, Barcelona, Spain). Полученный таким образом экстракт восстанавливали в 200 мкл смеси (50/50 об/об) ацетонитрила и фосфатного регулирующего раствора (рН 2; 0,01 М) посредством перемешивания с помощью вортекса в течение 1 минуты. Полученный раствор переносили в инъекционный флакон.
Аналитический метод: ВЭЖХ
Количественное определение паклитаксела проводили высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) с определением видимого ультрафиолета. Доцетаксел использовали в качестве внутреннего стандарта. Анализ проводили в хроматографе модели LC серии 1100 (Agilent, Waldbornn, Germany). Данные анализировали на компьютере Hewlett-Packard с помощью программы Chem-Station G2171. Для отделения паклитаксела использовали колонку с обращенной фазой Gemini C18 (Phenomenex) 150 мм × 3 мм; 5 мкм, нагретую до 30°С. Подвижную фазу образовывали смесью фосфатного регулирующего раствора (рН 2; 0,01 М) и ацетонитрила (в объемном соотношении 50/50) и пропускали через колонку с током 0,5 мл/мин. Определение проводили при 228 нм.
Используемый аналитический метод был утвержденным, было подтверждено линейное взаимоотношение между ответом детектора и концентрациями паклитаксела в плазме на всем протяжении подтвержденного диапазона концентраций, составляющих между 40 и 3200 нг/мл.
Фармакокинетический анализ
Фармакокинетический анализ данных концентрации в плазме, полученных после введения паклитаксела, проводили с использованием некомпартментного процесса корректировки фармакокинетической стабилизационной программы WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, United States).
max
1/2z
Рассчитывали следующие фармакокинетические параметры: максимальная концентрация (Cmax); время, в которое достигалась Cmax (t); площадь под кривой уровня в плазме (AUC0-inf); среднее время нахождения (MRT) и биологический период полужизни в конечной стадии элиминации (t), клиренс (Cl) и объем стабильного распределения.
Среднее время нахождения (MRT) рассчитывали посредством соотношения между значением AUMC (площадь под кривой в первый момент концентрации в плазме) и таковым AUC. Клиренс (Cl) рассчитывали как Доза × Биодоступность/AUC, и объем стабильного распределения (Vss) рассчитывали как соотношение между клиренсом и константой конечной элиминации (k), рассчитанной как 1/MRT.
F. Статистический анализ
Для исследований биоадгезии и фармакокинетики композиции анализировали с использованием непараметрического критерия «Манна-Уитни». Значения р<0,05 расценивали статистически значимыми. Все расчеты проводили с использованием статистического программного обеспечения SPSS (SPSS, Microsoft, United States).
Пример 1
Оптимизация процесса ассоциации между биоразлагаемым полимером (PVM/MA) и циклодекстрином для получения наночастиц
Наночастицы получали путем контролируемой десольватации после модификации ранее описанного способа [Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330]. Для этого сополимер метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) и определенное количество β-циклодекстрина (β-CD), 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина (ОН-β-CD) или 6-монодезокси-6-моноамино-β-циклодекстрина (NH-β-CD) инкубировали в ацетоне при магнитном перемешивании. После инкубации смешиваемый органический растворитель (этанол) и такой же объем деионизированной воды добавляли к этой фазе и при магнитном перемешивании, давая образование наночастиц при возникновении мутной суспензии. После возможности суспензии наночастиц гомогенизироваться ее выпаривали при пониженном давлении (роторный испаритель Buchi R-144, Switzerland) до устранения обоих органических растворителей. Суспензию впоследствии очищали ультрацентрифугированием (Sigma 3k30, rotor No. -12150, Germany). Часть полученных наночастиц замораживали при -80°С для их последующей лиофилизации и длительного консервирования (Virtis Genesis, New York, United States).
На фиг.1 показано количество циклодекстрина, ассоциированное с наночастицами, в соответствии со временем инкубации с биоразлагаемым полимером (PVM/MA) при получении наночастиц. Во всех случаях наблюдали оптимальное время инкубации между CD и полимером. Такое время инкубации составило 30 минут. Наконец, необходимо отметить, что β-CD ассоциируется с наночастицами PVM/MA более эффективно, чем его гидроксилированное (ОН-β-CD) или аминированное (NH-β-CD) производное.
В соответствии с полученными результатами для последующих исследований были выбраны следующие экспериментальные условия:
- соотношение циклодекстрин:сополимер PVM/MA (1:4);
- время инкубации 30 минут.
Пример 2
Получение наночастиц, содержащих циклодекстрины
2.1 Получение наночастиц, содержащих циклодекстрины
TM
Наночастицы получали контролируемой десольватацией после модификации ранее описанного способа [Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330]. Для этого 25 мг β-CD, ОН-β-CD или NH-β-CD диспергировали в 2 мл ацетона с помощью ультразвука (Microson или ультразвуковая баня в течение 1 минуты при охлаждении). Такую суспензию добавляли к раствору 100 мг сополимера метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) (Gantrez AN 119) в 3 мл ацетона и смеси позволяли инкубироваться в течение 30 минут. Впоследствии добавляли 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды к этой фазе и при магнитном перемешивании. Полученной смеси позволяли гомогенизироваться в течение 5 минут. Суспензию наночастиц затем выпаривали при пониженном давлении (Buchi R-144, Switzerland) до удаления обоих органических растворителей, и конечный объем доводили водой до 10 мл. Суспензию впоследствии подвергали очистке ультрацентрифугированием (20 минут при 27000×g) (Sigma 3k30, rotor No. -12150, Germany). Надосадочные жидкости элиминировали, и остаток ресуспендировали в воде или в 5% водном растворе сахарозы. Возможно, часть полученных наночастиц замораживали при -80°С для их последующей лиофилизации и длительного хранения (Virtis Genesis, New York, United States).
2.2 Физико-химическая характеристика различных полученных наночастиц на основе PVM/MA, содержащих циклодекстрины
Определение физико-химических характеристик позволило подтвердить что, независимо от используемого CD, наночастицы имели сходные размеры и поверхностный заряд. Более того, такой заряд был аналогичен таковому необработанных наночастиц, следовательно, может расцениваться, что большая часть CD расположена внутри наночастиц и не абсорбирована на их поверхности. В таблице 2 суммированы основанные физико-химические характеристики анализируемых наночастиц.
Таблица 2
Физико-химические характеристики различных композиций наночастиц, основанных на PVM/MA, содержащих циклодекстрины
Композиция
Размер (нм)
Зета потенциал (мВ)
Выход (%)
Ассоциированный CD (мкг/мг)
Ассоциированная эффективность (%)
NP
179±2
-48,1±0,8
91,3±3,1
-
-
β-CD
144±6
-51,1±8,8
94,4±5,3
88,4±9,9
30,2±7,8
ОН-β-CD
140±7
-52,1±3,7
91,1±4,1
68,4±4,3
22,8±4,7
NH-β-CD
151±7
-49,3±2,4
86,2±3,9
71,2±8,4
25,4±5,4
Данные показывают среднее±стандартное отклонение (SD) (n=12).
Условия эксперимента: PVM/MA: 100 мг; циклодекстрин: 25 мг; время инкубации: 30 мин. Данные показывают среднее±стандартное отклонение (SD) (n=12). NP: наночастицы на основе PVM/MA без циклодекстрина.
Как может быть видно из Таблицы 2, независимо от используемого циклодекстрина наночастицы имеют такой же размер и поверхностный заряд. Более того, такой заряд сходен с таковым необработанных наночастиц, следовательно, может быть расценено так, что большая часть циклодекстрина располагается внутри наночастиц и не адсорбирована на их поверхности. Ассоциация между циклодекстринами и наночастицами, основанными на PVM/MA, позволяет получать наночастицы размера, меньшего чем обычные наночастицы (NP). Как показано в таблице 2, наночастицы на основе PVM/MA, содержащие циклодекстрины, имеют размер близкий к 150 нм. Такое уменьшение размера может быть ассоциировано с высоким выходом способа для получения наночастиц. Такой выход получают посредством определения их массы в конце процесса и после их лиофилизации. Выход производства выражается в процентах, рассчитанных на основании исходной массы сополимера PVM/MA и циклодекстрина.
Количество циклодекстрина, ассоциированного с наночастицами, варьирует в соответствии с типом используемого олигосахарида, составляя около 90 мкг/мг для β-CD и 70 мкг/мг для ОН-β-CD и NH-β-CD. Подтверждение присутствия CD, ассоциированного с наночастицами на основе PVM/MA, проводили после элементного анализа различных композиций. Полученные результаты (Таблица 3) подтверждают присутствие CD из-за существенного увеличения доли кислорода в композициях, имеющих ассоциированный CD, а также снижение процента углерода по сравнению с контрольными наночастицами.
Таблица 3
Результаты элементного анализа контрольных (NP) композиций и композиций наночастиц, основанных на PVM/MA, ассоциированных с CD
Композиция
С (%)
Н (%)
О (%)
N (%)
NP
52,52
5,09
42,46
-0,07
β-CD-NP
42,37
5,94
51,61
0,08
ОН-β-CD-NP
41,27
5,92
52,84
-0,04
NH-β-CD-NP
43,12
5,78
51,17
-0,07
NP: контрольные наночастицы на основе PVM/MA без CD (пустые); β-CD-NP: наночастицы на основе PVM/MA с β-CD; ОН-β-CD-NP: наночастицы на основе PVM/MA с OH-β-CD; NH-β-CD-NP: наночастицы на основе PVM/MA с NH-β-CD.
Морфологию наночастиц оценивали сканирующей электронной микроскопией (Zeiss, Germany), в результате чего наблюдали типичную сферическую форму наночастиц, однородность и размер, составляющий между 80 и 200 нм. На фиг.2 показаны результаты проведения сканирующей электронной микроскопии лиофилизированного образца наночастиц на основе PVM/MA с β-CD (β-CD-NP).
Пример 3
Получение наночастиц, содержащих циклодекстрины и RBITC
TM
Наночастицы получали контролируемой десольватацией после модификации ранее описанного процесса [Arbos et al., J. Control. Release, 83 (2002) 321-330]. Для этого 25 мг β-CD, OH-β-CD или NH-β-CD диспергировали в 2 мл ацетона с помощью ультразвука (Microson или в ультразвуковой бане в течение 1 минуты при охлаждении). Полученную суспензию добавляли к раствору 100 мг сополимера метилвинилового эфира и малеинового альдегида (PVM/MA) [Gantrez AN 119] в 3 мл ацетона, и смеси позволяли инкубироваться в течение 30 минут. Впоследствии добавляли 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды к этой фазе и при магнитном перемешивании. Полученной смеси позволяли гомогенизироваться в течение 5 минут. Суспензию наночастиц затем выпаривали при пониженном давлении (Buchi R-144, Switzerland) до удаления обоих органических растворителей, и конечный объем доводили водой до 10 мл. Затем к наночастицам добавляли водный раствор изотиоцианата родамин В (RBITC) и позволяли инкубироваться в течение 5 минут при комнатной температуре и при магнитном перемешивании. Суспензию впоследствии подвергали очистке ультрацентрифугированием (20 минут при 27000×g) (Sigma 3k30, rotor No. - 12150, Germany). Надосадочные жидкости удаляли, и осадок ресуспендировали в воде или в 5% водном растворе сахарозы. Возможно, часть полученных наночастиц замораживали при -80°С для их последующей лиофилизации и длительной консервации (Virtis Genesis, New York, United States).
Количество RBITC оценивали как разницу между исходным добавленным количеством и количеством, обнаруженным после полного гидролиза определенного количества наночастиц в 0,1 Н NaOH (24 ч, 37°С). В таблице 4 показаны значения RBITC (мкг RBITC/мг наночастиц) для различных оцениваемых композиций.
Таблица 4
RBITC (мкг/мг), ассоциированный с наночастицами
Композиция
Размер (нм)
RBITC (мкг/мг)
NP
179±2
10,9±0,3
β-CD-NP
144±6
13,3±2,1
ОН-β-CD-NP
140±7
12,4±1,3
NH-β-CD-NP
151±7
11,8±0,7
Данные показывают среднее±SD (n=8). Условия эксперимента: PVM/M: 100 мг; циклодекстрин: 25 мг; время инкубации: 30 мин. NP: контрольные наночастицы на основе PVM/MA без CD (пустые); β-CD-NP: наночастицы на основе PVM/MA с β-CD; ОН-β-CD-NP - наночастицы на основе PVM/MA с OH-β-CD; NH-β-CD-NP наночастицы на основе PVM/MA с NH-β-CD.
На фиг.3 показана кинетика высвобождения RBITC из наночастиц в стимулированной желудочной среде (0-1 ч) и в стимулированной кишечной среде (1-24 ч) при 37±1°С. Во всех случаях подтверждали, что процент RBITC, высвобождаемый после 24 часов инкубации, всегда был меньше чем 10% количества, ассоциированного с наночастицами. Следовательно, может быть предположено, что результаты, полученные в последующих исследованиях биоадгезии, а также флуоресцентной микроскопии, интенсивность флуоресценции соответствует RBITC, ассоциированному с наночастицами.
Пример 4
Оценка биоадгезивных характеристик наночастиц, содержащих циклодекстрины, в желудочно-кишечном тракте крыс
На фиг.4 показан профиль биоадгезии оцениваемых композиций, представляющих собой прилипшую фракцию наночастиц в различных сегментах желудочно-кишечного тракта (желудок; тонкая кишка: I1-I4; слепая кишка) через 30 минут, 1 ч, 3 ч и 8 ч после перорального введения в соответствии с ранее описанной методологией. Как может быть отмечено на указанном чертеже, наночастицы, ассоциированные с циклодекстринами, показывают профиль биоадгезии, отличающийся от такового контрольных наночастиц. В недавних работах было доказано, что биоадгезивный потенциал сополимера PVM/MA существенно выше при включении в наночастицы, чем когда его вводят в форме простого водного раствора (Arbos et al., J. Control. Release, 89 (2003) 19-30). Этот факт согласуется с предыдущими работами, которые предполагают, что форма наночастиц облегчит и исходный контакт и адгезивные взаимодействия с компонентами слизистой оболочки.
Через тридцать минут после введения все оцениваемые композиции показали максимум биоадгезии в желудке и в тощей кишке (часть I2 на фиг.4). В любом случае, вероятно, наблюдают взаимодействия с наночастицами, ассоциированными с ОН-β-CD. Следовательно, через 30 минут после введения может быть установлено, что около 12-20% вводимой дозы композиций прилипает в желудке и приблизительно между 14-22% в тонкой кишке. Указанные значения существенно отличались от таковых, обнаруженных для обычных наночастиц (на основе PVM/MA) без CD, в которых менее чем 10% и не более чем 12% вводимой дозы прилипало в желудке и тонкой кишке, соответственно.
Через один час после введения можно наблюдать как фракция наночастиц с циклодекстринами, прилипшая к слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, уменьшалась и продвигалась к дистальной части тракта. В любом случае можно наблюдать, что указанное распределение является гомогенным и ни одна из композиций не проявляет специфичности к какой-либо области желудочно-кишечного тракта.
max
adh
max
adh
adh
С целью сравнения адгезивного потенциала различных композиций исследовали кинетику и кривые биоадгезии. Для этого фракцию прилипших наночастиц наносили на график относительно времени, получая таким образом кривые биоадгезии. Такие кривые показаны на фиг.5. На основании последнего и с использованием компьютерного приложения WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, United States) определяли следующие параметры кинетики биоадгезии: Q, AUC, T, MRT и K (Arbos et al., J.Control. Release, 89 (2003) 19-30). В таблице 5 показаны такие параметры.
Таблица 5
Параметры биоадгезии для различных композиций наночастиц
Q<sub>max </sub>(мг)
AUC<sub>adh </sub>(мг.ч)
K<sub>adh </sub>(ч<sup>-1</sup>)
MRT<sub>adh</sub> (ч)
ОН-β-CD-NP
3,5±0,5**
18,16±4,47*
0,098±0,084**
3,4±0,41*
β-CD-NP
2,3±0,3
13,86±1,03
0,077±0,029**
3,5±0,10*
NP
2,1±0,2
10,49±2,10
0,292±0,03
2,7±0,23
max
adh
adh
adh
-1
Результаты указаны как среднее±SD (n=3). * p<0,05 ОН-β-CD-NP и β-CD-NP vs NP. ** p<0,01 ОН-β-CD-NP и β-CD-NP vs NP. Q(мг): максимальное количество наночастиц, прилипших к слизистой оболочке. AUC(мг.ч): площадь под кривой биоадгезии. K(ч): скорость элиминации прилипшей фракции. MRT (ч): среднее время удержания прилипшей фракции наночастиц. ОН-β-CD-NP: наночастицы на основе PVM/MA с ОН-β-CD. β-CD-NP наночастицы на основе PVM/MA с β-CD. NP: Контрольные наночастицы на основе PVM/MA без CD (пустые).
adh
adh
adh
Как может быть видно, наночастицы, ассоциированные с ОН-β-CD, характеризуются AUC(параметром, измеряющим интенсивность биоадгезивных взаимодействий), которая в 1,5 раза выше, чем наблюдаемая для контрольных наночастиц (NP). Аналогично, прилипшая фракция композиций, ассоциированных с циклодекстринами, показала скорость элиминации (K) существенно ниже, чем таковая контрольных NP (p<0,01), и среднее время удержания (MRT) приблизительно 3,5 часа. Такие результаты позволили предположить, что присутствие циклодекстринов (особенно, ОН-CD) может облегчить взаимодействия со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта и развивать адгезивные взаимодействия с компонентами слизистой оболочки сильнее чем NP.
Пример 5
Визуализация наночастиц, содержащих циклодекстрины, в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта
Вид распределения наночастиц, ассоциированных с циклодестринами, в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии. Для этого различные композиции, меченные RBITC, вводили лабораторным животным. Через два часа после введения животных умерщвляли и изучали различные части тонкой кишки. На фиг.6 показаны несколько фотографий, которые позволяют наблюдать распределение наночастиц в образце подвздошной кишки.
В соответствии с исследованиями биоадгезии in vivo наночастицы, ассоциированные с гидроксипропил-β-циклодекстрином, обладали большей способностью устанавливать биоадгезивные взаимодействия со слизистой оболочкой, чем контрольные наночастицы. Обычные наночастицы не были способны достигать энтероцитов, несмотря на их способность проникать в слой слизи, выстилающий слизистую оболочку. Наоборот, наночастицы, ассоциированные с циклодекстринами, значительно прилипали к энтероцитам тонкой кишки.
Пример 6
Наночастицы с циклодекстрином, включающие паклитаксел
Способ для получения наночастиц, включающих циклодекстрин с паклитакселом, делили на две различные стадии:
1) получение комплекса паклитаксел-циклодекстрин, включая и образование и очистку образованного комплекса; и
2) получение наночастиц, содержащих комплекс паклитаксел-циклодекстрин.
Получение комплекса паклитаксел-циклодекстрин
Для этой цели получали водный раствор циклодекстрина (β-CD, OH-β-CD или NH-β-CD), который добавляли к спиртовому раствору лекарственного средства паклитаксела (PTX) в соотношении 80:20 (об:об) и с молярным соотношением лекарственное средство:циклодекстрин (1:1). Смесь выдерживали при магнитном перемешивании (300 об/мин) в темноте и при комнатной температуре до достижения равновесия (по меньшей мере 72 часа). Затем этанол удаляли при выпаривании при пониженном давлении и суспензию фильтровали (0,45 мкм) для устранения нерастворившихся кристаллов лекарственного средства. Наконец, воду полностью устраняли из окончательного водного раствора путем выпаривания при пониженном давлении, комплекс паклитаксел-циклодекстрин оставался при появлении белого порошка.
Получение наночастиц, включающих комплекс паклитаксел-циклодекстрин
Наночастицы получали контролируемой десольватацией после модификации ранее описанного способа (Arbos et al., 2002, упомянутый выше). Для этого определенное количество комплекса, образованного ранее между паклитакселом и циклодекстрином (β-CD, OH-β-CD или NH-β-CD), диспергировали в 2 мл ацетона. Такую суспензию добавляли к раствору 100 мг сополимера метилвинилового эфира и малеинового ангидрида (PVM/MA) [Gantrez AN 119] в 3 мл ацетона и смеси позволяли инкубироваться в течение 30 минут. Впоследствии 10 мл этанола и 10 мл деионизированной воды добавляли к этой фазе и при магнитном перемешивании. Полученной смеси позволяли гомогенизироваться в течение 5 минут. Затем суспензию наночастиц выпаривали при пониженном давлении (Buchi R-144, Switzerland) до удаления обоих органических растворителей и конечный объем доводили водой до 10 мл. Впоследствии суспензию подвергали очистке ультрацентрифугированием (20 минут 27000×g) (Sigma 3k30, rotor No. -12150, Germany). Надосадочные жидкости устраняли, и остаток ресуспендировали в воде или в 5% водном растворе сахарозы. Часть полученных наночастиц замораживали при -80°С для их последующей лиофилизации и длительной консервации (Virtis Genesis, New York, United States).
Оптимизация способа для инкапсулирования комплекса паклитаксел-циклодекстрин в наночастицах
На фиг.7 показано изменение содержания PTX в наночастицах, содержащих циклодекстрины и PTX, в соответствии с количеством и типом используемого циклодекстрина. Сначала необходимо отметить, что PTX как таковой, т.е. без образования комплекса с CD, не может быть включен в наночастицы, удаляясь в процессе очистки наночастиц фильтрацией. Следовательно, необходимо образовывать комплекс паклитаксел-циклодекстрина (PTX-CD). Для различных используемых циклодекстринов наблюдали, что наилучшую эффективность инкапсуляции получали, когда PTX образовывал комплекс с OH-β-CD с последующим t-NH-β-CD и β-CD без замещения.
Аналогично, также оценивали различные количества PTX (5, 7,5, 10 и 25 мг), всегда сохраняя молярное соотношение 1:1 с соответствующим циклодекстрином и наблюдали, что для количеств, более высоких чем 10 мг PTX [PTX:PVM/MA (1:10)] не получали больших количеств инкапсулированного лекарственного средства и, следовательно, наблюдали снижение эффективности инкапсуляции комплекса PTX-CD в NP. После таких исследований было определено, что в оцениваемых условиях оптимальное количество PTX для включения в различные композиции составило 10 мг, таким образом, давая наилучший выход. В таблице 7 показано количество инкапсулированного PTX, когда исходно добавляли 10 мг в соответствии с различными циклодекстринами, используемыми для образования комплекса.
Таблица 7
Количество PTX, ассоциированного с различными композициями наночастиц в соответствии с типом используемого циклодекстрина (исходное количество добавленного паклитаксела: 10 мг)
Композиция
Размер (нм)
PTX (мкг/мг)
PTX-NP
204±4
0,29±0,13
PTX-β-CD-NP
298±6
40,5±5,12
PTX-OH-β-CD-NP
307±7
171,01±13,41
PTX-NH-β-CD-NP
310±6
99,26±10,13
Результаты выражены как среднее ± SD (n=6). PTX-NP: обычные наночастицы PVM/MA с паклитакселом; PTX-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и β-CD с паклитакселом; PTX-OH-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и OH-β-CD с паклитакселом; и PTX-NH-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и NH-β-CD с паклитакселом.
Пример 7
Фармакокинетическое исследование после перорального введения различных композиций паклитаксела
Паклитаксел представляет собой лекарственное средство, которое характеризуется как имеющее дозозависимый фармакокинетический профиль. Следовательно, ранее было необходимо определить фармакокинетический профиль после перорального или внутривенного введения коммерческой композиции паклитаксела в выбранной дозе для его композиции в наночастицах (10 мг/кг).
Фармакокинетические исследования проводили в соответствии с правилами Этического Комитета Университета Наварры, а также Европейским Законодательством по экспериментальным животным (86/609/EU). Для этого самцов крыс Wistar со средней массой 225 г (Harlan, Spain) изолировали в метаболических клетках за 12 часов до введения композиций, без доступа к пище, но допуская свободный доступ к питьевой воде.
Таблица 8
Физико-химические характеристики различных композиций комплекса паклитаксела-циклодекстрина, используемых в фармакокинетических исследованиях
Композиция
Размер (нм)
PDI
Зета-потенциал (мВ)
Выход (%)
PTX (мкг/мг)
PTX-NP
204±4
0,07
-38,3±2,1
51,2±6,6
0,29±0,13
PTX-β-CD-NP
298±6
0,21
-39,3±5,2
63,3±2,9
40,5±5,12
PTX-OH-β-CD-NP
307±7
0,24
-42,1±1,4
68,6±4,4
171,01±13,41
PTX-NH-β-CD-NP
310±6
0,18
-34,5±3,9
59,5±4,6
99,26±10,13
Результаты выражены как среднее ±SD (n=8). PTX-NP: обычные наночастицы PVM/MA с паклитакселом; PTX-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и β-CD с паклитакселом; PTX-OH-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и OH-β-CD с паклитакселом; и PTX-NH-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и NH-β-CD с паклитакселом.
В таблице 8 суммированы основные физико-химические характеристики наночастиц, оцениваемых в фармакокинетическом исследовании. Контрольные наночастицы (PTX-NP) показывают размер, близкий к 200 нм с отрицательным поверхностным зарядом -38 мВ. Кроме того, наночастицы, содержащие инкапсулированный комплекс PTX-CD, были существенно крупнее (близко к 300 нм) и показывали такой же зета-потенциал во всех случаях. Наконец, необходимо отметить, что присутствие комплекса PTX-CD не оказывает какого-либо эффекта на выход при производстве наночастиц, который варьируется между 50-60%.
Фармакокинетическое исследование делили на три фазы. В первом исследовании 10 мг/кг коммерческой композиции паклитаксела (Taxol) вводили внутривенно (в/в) и перорально двум группам самцов крыс Wistar (n=6). Вторая группа состояла из перорально вводимых растворов паклитаксела (10 мг/кг) с (i) β-CD, (ii) ОН-β-CD или (iii) NH-β-CD группам крыс, составленным из 6 животных. Наконец, для фармакокинетического исследования различных композиций различные композиции наночастиц (i) PTX-OH-β-CD-NP, (ii) PTX-β-CD-NP, (iii) PTX-NH-β-CD-NP или (iv) PTX-NP вводили перорально различным группам животных. Выбранная доза паклитаксела составила 10 мг/кг.
После введения объем крови приблизительно 300 мкл отбирали в различные моменты времени (0, 10, 30, 60, 90, 180, 360, 480 минут, 24 и 30 часов) с использованием ЭДТА в качестве антикоагулянта и восстанавливали объем крови животного (крысы) эквивалентным объемом физиологического солевого раствора внутрибрюшинным путем (i.p.). Фармакокинетический анализ результатов, полученных после введения паклитаксела, проводили с использованием некомпартментного процесса регулирования фармакокинетической стабилизационной программы WinNonlin 1.5 (Pharsight Corporation, Mountain View, United States).
Полученные результаты показаны на фиг.8. Как можно отметить, в/в введение обычной композиции (коммерческого таксола) показало пик концентрации паклитаксела в плазме в первом полученном образце с последующим двухфазным снижением с течением времени. Указанный профиль сходен с таковым, описанным другими авторами (Yeh et al., Pharm. Res. 22(6):867-74, 2005). Когда указанную коммерческую композицию вводили перорально (фиг.8В), уровень паклитаксела в плазме был нулевым. Подобные результаты получены при введении комплексов PTX:CD, ни один из них не позволил определить, или количественно оценить значительные уровни паклитакстела с течением времени. Наоборот, когда композиции паклитаксела в наночастицах, содержащих циклодекстрины и паклитаксел, вводили перорально, было доказано, что такие композиции давали постоянные уровни в плазме с течением времени в течение, по меньшей мере, 24 часов. В период времени, составляющий от 4 часов до 24 часов после введения указанных наночастиц, для трех композиций можно было наблюдать плато концентрации в плазме, типичное для композиций, которые высвобождают лекарственное средство с кинетикой 0 порядка. В любом случае композиции PTX-β-CD-NP и PTX-OH-β-CD-NP позволяли получать уровни в плазме, которые существенно выше (3-4 раза), чем полученные с композицией PTX-NH-β-CD-NP. Также интересно отметить, что введение паклитаксела в обычных наночастицах не дает абсорбции лекарственного средства.
В таблице 9 показаны значения фармакокинетических параметров, полученных после проведения некомпартментного анализа экспериментальных данных, полученных после введения различных композиций паклитаксела в наночастицах. Как может быть отмечено в указанной таблице, значения AUC и MRT подвергаются существенным вариациям в соответствиями с типом используемого в композиции циклодекстрина. В случае пероральных композиций PTX-OH-β-CD-NP и PTX-β-CD-NP были получены сходные значения AUC. В обеих пероральных композициях (PTX-OH-β-CD-NP и PTX-β-CD-NP) максимальная достигнутая концентрация была существенно выше, чем достигнутая в оставшихся композициях в период времени 6 и 5 часов соответственно. Среднее время удержания (MRT) лекарственного средства в организме было сходно для трех композиций с циклодекстринами. Такие значения составили от 3 до 5 раз выше, чем достигнутые после перорального введения коммерческой композиции (Taxol).
1/2z
Аналогично, период полувыведения лекарственного средства в терминальной фазе (Т) был сходен для композиций наночастиц, содержащих циклодекстрин и паклитаксел, и, в любом случае, меньше чем полученный для вводимой внутривенно коммерческой композиции (Taxol).
Таблица 9
Фармакокинетические параметры различных оцениваемых композиций
Композиция
Путь введ.
AUC (нг.ч/мл)
C<sub>max</sub> (нг)
T<sub>max</sub> (ч)
MRT (ч)
T<sub>1/2z</sub> (ч-1)
Cl/F (1/ч)
Vss/F (L)
Taxol
в\в
11,26
2,541
0,22
3,00
3,71
0,23
0,68
Taxol
пероральный
0
0
0
0
0
0
0
PTX-OH-β-CD-NP
пероральный
67,127*
5,679
6,17
11,09*
1,32
0,05
0,51
PTX-β-CD-NP
пероральный
65,965*
3,171
4,90
13,72*
1,48
0,04
0,59
PTX-NH-β-CD-NP
пероральный
14,612
1,470
4,66
9,97*
0,89
0,20
1,75
PTX-NP
пероральный
0
0
0
0
0
0
0
Комплекс PTX-OH-β-CD
пероральный
0
0
0
0
0
0
0
Комплекс PTX-β-CD
пероральный
0
0
0
0
0
0
0
Комплекс PTX-NH-β-CD
пероральный
0
0
0
0
0
0
0
* p<0,05 PTX-OH-β-CD-NP, PTX-β-CD-NP и PTX-NH-β-CD-NP vs коммерческая композиция (Taxol). Критерий Манна-Уитни.
0-inf
max
max
max
1/2z
2
AUC: площадь под кривой уровня в плазме; C: максимальная концентрация; T: время, при котором достигается C; MRT: среднее время нахождения; T: биологический период полужизни в терминальной фазе элиминации. Cl/F: клиренс (Cl = доза биодоступность/AUC); Vss: объем стабильного распределения (Vss = доза х AUMC/AUC). Значения клиренса и объема распределения стандартизированы в отношении значения пероральной биодоступности каждой композиции
PTX-OH-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и OH-β-CD с паклитакселом; PTX-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и β-CD с паклитакселом; PTX-NH-β-CD-NP: наночастицы PVM/MA и NH-β-CD с паклитакселом; и PTX-NP: обычные наночастицы PVM/MA с паклитакселом.