Способ получения иммуностимулирующего средства из шрота ягод брусники обыкновенной
METHOD FOR OBTAINING AN IMMUNOSTIMULATORY AGENT FROM THE MEAL OF WHORTLEBERRY BERRIES

Изобретение относится к области фармацевтики, а именно, к способам получения средств из растительного сырья, обладающего иммуностимулирующим действием.
В настоящее время наблюдается ухудшение экологической обстановки, распространение респираторных заболеваний, увеличение информационной и нервно-эмоциональной нагрузки, снижение социальной защищенности широких слоев населения и многие факторы (злоупотребление лекарствами, табакокурением, алкоголем, нарушения в питании и др.) приводят к росту и тяжести иммунодефицитных состояний. Люди с пониженной активностью иммунной системы входят в группу риска по состоянию здоровья, отмечается снижение естественной резистентности иммунологической реактивности организма, связанное с ослаблением иммунных, детоксикационных и других адаптационно-приспособительных механизмов.
Известны различные композиции лечебно-профилактических средств из растительного сырья, имеющие широкий диапозон лечебно-оздоровительного действия.
Известен способ получения комплекса, обладающего противовоспалительным, иммуномодулирующим и антигипоксическим действием (см. RU №2123349, кл. А61К 35/78, опубл. 20.12.1998), полученный путем экстракции травы касатика молочно-белого 35-45% водным этанолом в течение 10-12 часов методом перколяции.
Композиция, состоящая из растительного материала (см. US №7964221, кл. А61К 36/00, А61К 36/866, А61К 36/28, А61К 36/45, опубл. 21.06.2011), включает корневища девясила, плод фенхеля, ягоды можжевельника, корень солодки, трава душицы, цветы календулы, плод шиповника, трава тимьяна, для чего, получают спиртовой экстракт путем смешивания восьми видов растительного сырья в присутствии 95% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент как 1:5, выдерживания в течение двух дней с периодическим перемешиванием и с последующей фильтрацией.
Недостатками известных способов являются длительность производства и низкий выход экстрактивных веществ, а также использование отдельных лекарственных растений не приводит к максимальному выходу групп биологически активных веществ.
Кроме того, известен способ получения фракции флавоноидов из корней софоры лисохвостной, обладающей иммуностимулирующим, гепатозащитным, противовоспалительным, детоксицирующим и антиоксидантым действием (см. Халилов P.M., Маматханов А.У., Сотимов Г.Б., Маматханова М.А. Разработка технологии получения фланорина из Pseudosophora alopecuroides // Химия растительного сырья. 2009. №2. С. 93-96), заключающийся в последовательной экстракции сырья водой и этанолом, с последующим концентрированием, нанесением на колонку с активированным углем водного остатка, элюированием колонки смесью хлороформ-изопропанол (1:1), концентрированием элюата, растворением последнего в растворе гидроксида натрия и осаждением флавоноидов раствором соляной кислоты.
Недостатками известного решения является длительность технологического процесса (один цикл - около 4 дней), использование в ходе выделения токсичных реагентов. При этом для производства препарата используется сырье софоры лисохвостной, имеющей ограниченные сырьевые запасы на территории России.
Известен способ получения средства, обладающего иммуностимулирующим действием (см. RU №2639132, кл. А61К 36/515, B01D 11/02, А61Р 37/04, опубл. 19.12.2017), заключающийся в экстрагировании надземной части горечавки холодной 70% этанолом, для чего, смесь подвергают ультразвуковой обработке, фильтруют и промывают на фильтре дополнительным объемом 70% этанола, далее, остаток растительного материала после этанольной экстракции смешивают с водой, подвергают смесь ультразвуковой обработке, фильтруют и промывают на фильтре дополнительным объемом воды, после чего, этанольное извлечение и водное извлечение концентрируют, сконцентрированные этанольное и водное извлечения объединяют, высушивают и измельчают при определенных условиях.
В известном способе в качестве растительного сырья используют горечавку холодную, характерной ограниченным ареалом произрастания и небольшой биомассой.
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в создании суммарного растительного препарата, содержащего антоцианы и полисахариды из шрота брусники обыкновенной после производства функциональных продуктов питания (безотходная, комплексная переработка ягод брусники), а также повышение иммуностимулирующей активности средства за счет высокого содержания действующих веществ.
Техническим результатом изобретения является повышенное иммуностимулирующее действие средства из шрота ягод брусники, полученного заявленным способом. Кроме того, техническое решение позволяет выделить полисахариды и антоцианы из шрота наиболее распространенной ягоды - брусники обыкновенной.
Для решения поставленной задачи способ получения иммуностимулирующего средства из шрота ягод брусники обыкновенной включает экстрагирование растительного материала, для чего, высушенный и измельченный растительный материал (шрот ягод брусники) помещают в экстрактор, добавляют 60% этанол в соотношении сырье:экстрагент как 1:12 и подвергают смесь ультразвуковой обработке частотой 50 кГц при 70±1°С в течение 38-51 мин. Извлечение фильтруют в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре дополнительным объемом 60% этанола (15-16% от взятого на этанольную экстракцию). Экстракцию растительного сырья повторяют с водой в соотношении сырье:экстрагент как 1:12 при ультразвуковой обработке частотой 50 кГц при 70±1°С в течение 59-72 мин. Полученные водное и этанольное извлечения концентрируют в вакууме до 1/6-1/7 части от первоначального объема. Сконцентрированные этанольное и водное извлечения объединяют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта (сухого экстракта) составляет 36-38% от массы растительного сырья.
Заявленный технический результат позволяет получить сухой экстракт (далее - средство) в виде рассыпчатого негигроскопичного порошка красно-малинового цвета со сладковато-кислым вкусом и специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет до 5-7%.
Анализ признаков заявленного решения свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение иммуностимулирующего средства из шрота ягод брусники обыкновенной.
Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.
3
3
3
3
3
3
3
2
Пример 1. 5,1 кг шрота ягод брусники с влажностью 4,5% измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2-3 мм. Навеску 5,00±0,01 кг измельченного сырья загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 60,00±0,02 л 60% раствора этанола (плотность 0,881 г/см). Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме при температуре 70±1°С в течение 40±2 мин. После чего, удаляют ультразвуковой процессор и смесь фильтруют через сукно в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре 10,00±0,02 л 60% этанола. В результате получено 61,0 л этанольного экстракта с плотностью 0,895 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 10,00±0,02 л (плотность концентрата 1,045 г/см). Отгон этанола объемом 50,0 л (плотность 0,853 г/см) далее может быть повторно использован на стадии экстракции растительного сырья. Шрот растительного сырья после экстракции этанолом повторно загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 60,0 л воды очищенной. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и смесь обрабатывают ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме при температуре 70±1°С в течение 60±1 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и смесь фильтруют через сукно в сборник. В результате получено 60,0 л водного экстракта с плотностью 0,980 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 8,00±0,02 л (плотность концентрата 1,005 г/см). Шрот растительного сырья массой 9,64 кг и влажностью 71% далее не используют и отправляют в отвал. Полученные концентраты после водной и этанольной экстракций объединяют (объем объединенного концентрата 18,0 л, плотность 1,030 г/см), сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 55±1°С и давлении 0,1 кг/см в течение 10±0,05 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 1,86 кг готового продукта, что составляет 37,2% от массы растительного сырья. Средство представляет собой рассыпчатый негигроскопичный порошок, красно-малинового цвета, со сладковато-кислым вкусом и специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 5,2%.
3
3
3
3
3
3
3
2
Пример 2. 5,12 кг шрота ягод брусники с влажностью 4,9% измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2-3 мм. Навеску 5,00±0,01 кг измельченного сырья загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 60,00±0,02 л 60% этанола (плотность 0,881 г/см). Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме при температуре 70±1°С в течение 45±1 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и смесь фильтруют через сукно в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре 10,00±0,02 л 60% этанола. В результате получено 60,8 л этанольного экстракта с плотностью 0,892 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 10,00±0,02 л (плотность концентрата 1,042 г/см). Отгон этанола объемом 49,0 л (плотность 0,850 г/см) далее может быть повторно использован на стадии экстракции растительного сырья. Шрот растительного сырья после экстракции этанолом повторно загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 60,0 л воды очищенной. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме при температуре 70±1°С в течение 65 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и смесь фильтруют через сукно в сборник. В результате получено 60,2 л водного экстракта с плотностью 0,981 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 8,10±0,02 л (плотность концентрата 1,004 г/см). Шрот растительного сырья массой 9,60 кг и влажностью 70% далее не используют и отправляют в отвал. Полученные концентраты после водной и этанольной экстракций объединяют (объем объединенного концентрата 17,8 л, плотность 1,028 г/см), сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 55±1°С и давлении 0,1 кг/см в течение 10±0,05 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 1,88 кг готового продукта, что составляет 37,6% от массы растительного сырья. Средство представляет собой рассыпчатый негигроскопичный порошок, красно-малинового цвета, со сладковато-кислым вкусом и специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 5,7%.
3
3
3
3
3
3
3
2
Пример 3. 5,09 кг шрота ягод брусники с влажностью 4,0% измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2-3 мм. Навеску 5,00±0,01 кг измельченного сырья загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 60,00±0,02 л 60% этанола (плотность 0,881 г/см). Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме при температуре 70±1°С в течение 50±1 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и смесь фильтруют через сукно в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре 10,00±0,02 л 60% этанола. В результате получено 61,1 л этанольного экстракта с плотностью 0,893 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 9,90±0,02 л (плотность концентрата 1,044 г/см). Отгон этанола объемом 50,2 л (плотность 0,851 г/см) далее может быть повторно использован на стадии экстракции растительного сырья. Шрот растительного сырья после экстракции этанолом повторно загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 60,00±0,02 л воды очищенной. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме при температуре 70±1°С в течение 70±2 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и смесь фильтруют через сукно в сборник. В результате получено 60,0 л водного экстракта с плотностью 0,983 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 8,00±0,02 л (плотность концентрата 1,007 г/см). Шрот растительного сырья массой 9,8 кг и влажностью 72% далее не используют и отправляют в отвал. Полученные концентраты после водной и этанольной экстракций объединяют (объем объединенного концентрата 18,1 л, плотность 1,026 г/см), сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 55±1°С и давлении 0,1 кг/см в течение 10±0,02 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 1,9 кг готового продукта, что составляет 38% от массы растительного сырья. Средство представляет собой рассыпчатый негигроскопичный порошок, красно-малинового цвета, со сладковато-кислым вкусом и специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 6,8%.
Количественный анализ и показатели качества средства.
Для осуществления химической стандартизации средства разработаны методика количественного анализа суммарного содержания антоцианов методом УФ-спектроскопии и методика количественного анализа суммарного содержания полисахаридов методом спектроскопии в видимой области.
Методика количественного анализа суммарного содержания антоцианов методом УФ-спектроскопии. 0,5 г (точная навеска) средства помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой и прибавляют 30 мл 1,0% кислоты хлористоводородной в 96% этиловом спирте. Экстракцию проводят при комнатной температуре в течение 15 мин при постоянном перемешивании. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой в мерную колбу вместимостью 50 мл, которую доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки 1,0% кислотой хлористоводородной в 96% спирте этиловом и перемешивают (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 530 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 1,0% кислоту хлористоводородную в 96% спирте этиловом. Суммарное содержание антоцианов в пересчете на цианидина-3-О-глюкозид в средстве в процентах (Х) вычисляют по формуле:
1 см
1%
X=(A⋅100⋅25⋅100) / (A⋅m⋅1⋅(100-W)),
1 см
1%
О
где А - оптическая плотность раствора Б; m - навеска сырья, г; A- удельный показатель поглощения цианидин-3--глюкозида при длине волны 530 нм, равный 718; W - влажность средства, %.
Методика количественного анализа суммарного содержания полисахаридов методом спектроскопии в видимой области. 0,5 г (точная навеска) средства помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой и прибавляют 50 мл воды очищенной. Экстракцию проводят на кипящей водяной бане в течение 1 ч при постоянном перемешивании. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр с красной полосой в мерную колбу вместимостью 50 мл, которую доводят до метки тем же растворителем (раствор А). 2 мл раствора А переносят в центрифужную пробирку, приливают 4 мл 95% спирта этилового, перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения содержимое пробирки центрифугируют в течение 10 мин со скоростью вращения 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют с 5 мл 95% спирта этилового и повторно центрифугируют в тех же условиях. Надосадочную жидкость сливают, осадок продувают в пробирке горячим воздухом до удаления следов этанола. К осадку приливают 4 мл 0,2% раствора антрона в кислоте серной концентрированной, нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Содержимое пробирки после охлаждения переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл 95% спиртом этиловым и доводят до метки тем же растворителем (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 424 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 4 мл 0,2% раствора антрона в кислоте серной концентрированной, выдержанные в тех же условиях, что и опытная смесь. Суммарное содержание полисахаридов в пересчете на галактуроновую кислоту в средстве в процентах (Х) вычисляют по формуле:
1 см
1%
X=(A⋅50⋅25⋅0,91⋅100)/(A⋅m⋅2⋅(100-W)),
1 см
1%
где А - оптическая плотность раствора Б; m - навеска сырья, г; A- удельный показатель поглощения цветного комплекса при длине волны 424 нм, равный 214; W - влажность средства, %.
Метрологический анализ разработанных методик показал, что относительная ошибка определения не превышает 2%, что свидетельствует об удовлетворительных валидационных параметрах методик и указывает на возможность их использования в практике фармакопейного анализа для определения показателей качества разработанного средства. По данным проведенных исследований определены общие показатели качества средства, обобщенные в таблице.
Предлагаемый способ, по сравнению с известным, позволяет получить препарат постоянного состава с выраженной активностью за счет высокого содержания антоцианов и полисахаридов. Вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному и безотходному использованию растительного сырья и определяют перспективность внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.
Влияние средства на иммунную систему.
6
6
Эксперименты проведены на мышах самцах линии СВА массой 18-20 г. Действие средства было изучено на животных, находящихся в состоянии иммунодепрессии, вызванной цитостатиком азатиоприном, который вводили контрольной группе животных в дозе 50 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 5 дней (см. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. М., 1985. 256 с.). Состояние гуморального иммунитета оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза по методу A.J. Cunningham (см.Cunningham A.J. A method of increased sensitivity for detecting single antibody forming cells // Nature. 1965. Vol.207. №5001. P. 1106-1107.). Действие средства на состояние клеточного звена иммунного ответа оценивали в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (см. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. МЗ РФ. Департамент контроля качества, эффективности и безопасности фармакологических средств. Фармакологический комитет МЗ РФ. 2 изд., перераб. и доп. М., 2005. С. 138-145). При исследовании влияния средства на процессы антителообразования установлено, что оно восстанавливает показатели гуморального иммунного ответа в условиях азатиоприновой иммуносупрессии. Введение азатиоприна приводило к снижению как абсолютного числа АОК, так и числа АОК на 10 спленоцитов на 42 и 44% соответственно по сравнению с теми же показателями в контрольной группе. При введении средства на фоне иммуносупрессии наблюдали достоверное увеличение количества АОК как в абсолютных значениях, так и при расчете на 10 спленоцитов; при этом первый показатель превышал уровень азатиоприновой супрессии в 1,9 раза, а второй - 2,2 раза, соответственно.
Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что средство оказывает иммуностимулирующее действие в условиях экспериментальной иммуносупрессии.
ТаблицаПоказатели качества средства
Показатель
Метод
Норма
Описание, внешние признаки
Визуальный,органолептический
Рассыпчатый негигроскопичный порошок, цвет от красного до красно-малинового, запах специфический, вкус 1,0% водного раствора - сладковато-кислый
Подлинность:- антоцианы
Визуальный
Реакция 1,0% натрия гидроксидом (синее окрашивание)
Потеря в массе при высушивании
Гравиметрический
Не более 7%
Зола сульфатная
Гравиметрический
Не более 0,1%
Тяжелые металлы
Спектро-фотометрический
Не более 0,01%
Количественноеопределение:- антоцианы;- полисахариды
Спектро-фотометрическийСпектро-фотометрический
Не менее 0,6%Не менее 5%
Микробиологическая чистота
Бактериологический
Категория 3Б
Хранение
В защищенном от света месте при температуре 12-15°С
Срок годности
5 лет