Моделирование иммунозависимого невынашивания беременности на мышах с использованием гликозида мурамилдипептида

Экспериментальная биология и медицина УДК 618.3-092.9

МОДЕЛИРОВАНИЕ ИММУНОЗАВИСИМОГО НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ НА МЫШАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЛИКОЗИДА МУРАМИЛДИПЕПТИДА

© Артемьева К.А., Болтовская М.Н., Калюжин О.В.

Лаборатория клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека РАМН, Москва; кафедра клинической иммунологии и аллергологии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, Москва

E-mail: kalyuzhin@list га

Целью работы было определение влияния р-гептилгликозида мурамилдипептида (С7МДП) на частоту резорбций эмбрионов in vivo с конечной задачей воспроизведения чувствительной модели иммунозависимого невынашивания беременности на мышах. При внутрибрюшинном введении С7МДП проявлял выраженную тенденцию к увеличению числа репродуктивных потерь в парах CBAxDBA/2, характеризующихся исходно высоким уровнем спонтанных абортов, и достоверно увеличивал частоту резорбций эмбрионов в фертильных парах CBAxBALB/c. Достигнутый, благодаря применению С7МДП, уровень резорбции эмбрионов (50% и 45,4% соответственно) представляется оптимальным для выявления и оценки разнонаправленных воздействий на иммуноопосредованные репродуктивные потери.

Ключевые слова: модель иммунозависимого невынашивания беременности, р-гептилгликозид мурамилдипептида, CBAxDBA/2, CBAxBALB/c.

MODELLING THE IMMUNE-DEPENDENT MISCARRIAGE IN MICE WITH THE USE OF A MURAMYL

DIPEPTIDE GLYCOSIDE Artemyeva К.А., Boltovskaya М-N., Kalyuzhin O. V.

Clinical Immunopathology & Biotechnology Laboratory of the RSI of Human Morphology RAMS, Moscow;

Clinical Immunology & Allergology Department of the I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow

The purpose of the paper was to study the influence of muramyl dipeptide P-heptylglycoside (C7MDP) on the level of embryo resorption in vivo with the final target to reproduce sensitive model of immune-dependent miscarriage. When injected intraperitoneally, C7MDP showed the tendency to increase the number of reproductive failures in abortion-prone pairs CBAxDBA/2 and significantly augmented embryo resorption in fertile pairs CBAxBALB/c. The level of embryo resorption (50% and 45.4%, respectively) achieved due to the use of C7MDP looks to be optimal for detecting and estimating oppositely directed responses to modulatory influences on immune-associated reproductive failures.

Keywords: model of immune-dependent miscarriage, muramyl dipeptide P-heptylglycoside, CBAxDBA/2,

CBAxBALB/c.

Вопрос о механизмах, позволяющих материнскому организму сохранять в себе полуаллоген-ный плод, остается во многих аспектах открытым. Беременность можно рассматривать как состояние иммунной толерантности к фетоплацентарному «трансплантату», реализующееся в разные сроки гестации через различные системные и локальные механизмы. Частота прерывания беременности сохраняется стабильно высокой (1520% в общей популяции), причем более чем в 40% случаев причина спонтанных абортов остается неустановленной. Если не выявлены генетические, анатомические, эндокринные и инфекционные причины репродуктивных потерь, как основную причину невынашивания беременности рассматривают нарушение иммунной толерантности. Сохранение и восстановление материнской иммунной толерантности представляют рацио-

нальную стратегию профилактики/терапии иммунозависимого невынашивания.

Для изучения патогенеза спонтанных абортов, разработки новых эффективных диагностических, профилактических и терапевтических мер, направленных на сохранение беременности, широко используют экспериментальные модели in vivo. При этом исследования часто выполняются на мышах, которые обладают типом строения плаценты и маточно-плацентарной области, характером материнского и плодного кровообращения, близкими к таковым у человека. Существуют многочисленные сингенные и аллогенные модели индуцированных абортов у мышей [26]. Пожалуй, наиболее адекватно привычное невынашивание беременности неустановленной этиологии воспроизводит мышиная модель, в условиях которой при скрещивании различающихся по антигенам главного комплекса гистосовместимости самок

линии CBA/J (H-2k) с самцами линии DBA/2 (H-2d) наблюдается высокая частота эмбриональных потерь (около 30%) в отсутствие экзогенных абортогенных факторов [13, 27, 29]. В качестве нормального фертильного контроля используют самок CBA/J, оплодотворенных самцами линии BALB/c с тем же гаплотипом (H-2d), что и DBA/2. При этой комбинации скрещиваемых мышей частота резорбции эмбрионов составляет около 10% [12, 19].

Уровень резорбции при сингенных и аллоген-ных комбинациях указанных выше линий составлял для BALB/cxBALB/c 5,8% [27], CBA/J x CBA/J

- 8,9%; CBA/JxBALB/c - 8,2%; DBA/2xDBA/2 -8,5% [18], что отражает низкую частоту хромосомных аномалий у эмбрионов грызунов, не превышающую 6% [13, 15]. Иммуносупрессирующие препараты (ципрофлоксацин, циклоспорин А) снижали репродуктивные потери у мышей CBA/JxDBA/2 [17, 30], однако циклоспорин А не влиял на уровень резорбции у мышей CBAxBALB/c. Это доказывает, что низкая частота резорбций в фертильных комбинациях обусловлена элиминацией плодов с хромосомными аномалиями, тогда как спонтанные аборты у мышей CBA/JxDBA/2 имеют в большей степени иммунную этиологию [17].

Ранние репродуктивные потери связаны с локальной и/или системной дисфункцией иммунной сети, в том числе с нарушением сложного специфического цитокинового равновесия, в котором соотношение Th1- и гй2-цитокинов является одним из ведущих компонентов баланса [26]. Компонент пептидогликана клеточной стенки бактерий - мурамилдипептид (МДП) - и его производные известны как эффективные модификаторы биологических реакций [4], а Р-гликозидирование

- как один из доказанных вариантов увеличения иммуномодулирующей активности молекулы МДП [1, 3, 10]. Гликозиды МДП, в частности N-ацетил-Р-1 -О-гептилмурамил-Ь-аланил^-зоглу-тамин (С7МДП), обладают способностью направлять дифференцировку T-хелперов в сторону Th1-клеток и тем самым стимулировать клеточные иммунные реакции [9, 22] и продукцию провос-палительных цитокинов: интерферона у (ИФНу), фактора некроза опухоли (ФНО) и интелейкина-1 (ИЛ-1) [8, 11], обладающих абортогенным эффектом [13, 24]. МДП уже применяется для моделирования таких аутоиммунных заболеваний, как артрит [25] и увеоретинит [5]. Исходя из вышесказанного, мы выдвинули гипотезу о том, что С7МДП может потенцировать резорбцию эмбрионов и, следовательно, может быть использован для моделирования иммунозависимого невынашивания беременности.

Цель исследования - оценка влияния С7МДП на уровень эмбриональных потерь при аллоген-ной беременности у мышей с нормальной фертильностью (CBAxBALB/c) и высоким уровнем спонтанных абортов (CBAxDBA/2), а также определение принципиальной возможности использования этого вещества для моделирования иммуноопосредованного невынашивания. Кроме того, перед исследованием стояла задача определить частоту резорбции эмбрионов в указанных парах мышей, полученных из филиала «Столбовая» Научного центра биомедицинских технологий РАМН, так как при скрещивании самок CBA/J и самцов DBA/2, полученных из различных питомников, уровень резорбции существенно варьирует [14].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали 8-10-недельных мышей инбредных линий CBA, DBA/2, BALB/c с массой тела 23-25 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария НИИ морфологии человека РАМН. Эксперименты начинали после 2недельной адаптации мышей к условиям вивария и осуществляли в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными приказом Минздрава СССР № 577 от 12 августа 1977 года. Самок и самцов ссаживали в соотношении 3:1, день появления копулятивной пробки обозначали как 1-й день беременности. Высокий уровень спонтанных абортов воспроизводили при скрещивании самок CBA с самцами DBA/2; в качестве фертильного контроля использовали комбинацию мышей CBAxBALB/c [12, 13]. С7МДП синтезирован по методу [2] и представлен на испытания профессором А.Е. Земляковым (кафедра органической химии Таврического национального университета им. В.И. Вернадского, г. Симферополь, Украина). Гликопептид вводили внутрибрюшин-но на 5-е и 7-е сутки беременности в дозе 20 мкг в

0,1 мл 0,9% раствора NaCl на 1 животное (« 1 мг/кг). Выбранная доза С7МДП соответствует ED50, определенной в предварительной серии экспериментов на септических моделях in vivo [6, 7]. Беременным самкам контрольных групп внут-рибрюшинно вводили по 0,1 мл 0,9% раствора NaCl в том же режиме. Животных выводили из эксперимента на 14-е сутки беременности и определяли частоту резорбции эмбрионов по формуле: число резорбированных эмбрионов / (число ре-зорбированных + число живых эмбрионов) х 100% [17]. Кроме того, проводили взвешивание и гистологическое исследование плацент резобиро-ванных и жизнеспособных плодов. Результаты

представляли в виде среднего ± стандартное отклонение. Mежгрyпповые сравнения проводили с использованием z-критерия с коррекцией Йейтса, различия считали значимыми при р<0,05. Данные проанализированы с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе при внутрибрюшинном введении на 5-е и 7-е сутки беременности 0,9% раствора NaCl показатели резорбции эмбрионов на 14-й день гестации у самок CBA, оплодотворенных самцами DBA/2 (31,7±5,32%), и самок CBA, оплодотворенных самцами BALB/c (16,2±3,96%) (табл. 1), в целом были сходны с таковыми, описанными другими авторами: по литературным данным частота резорбции в усло-

виях модели СВА*БВА/2 варьировала от 11% до 41%, а в парах СВА^ВАЬВ/е составляла 7-13% [12, 18, 19, 20]. Это свидетельствует об отсутствии существенного влияния стресса, связанного с двумя внутрибрюшинными инъекциями, и введённого таким образом 0,9% раствора №С1 на показатели спонтанных фетальных потерь.

Уровень спонтанных абортов в комбинациях мышей СВА^БВА/2 вдвое превышал таковой при фертильном сочетании СВА*ВАЬВ/е (р=0,003).

Двукратное внутрибрюшинное введение С7МД11 увеличивало частоту резорбций эмбрионов в условиях фертильного контроля СВАхВАЬВ/е до 45,4±6,31% (р=0,017) (рис. 1). Этот факт представляет интерес с точки зрения возможности использования этой модели для оценки эффективности изучаемых методов и средств терапии и профилактики иммуноопосре-дованного невынашивания беременности.

Рис. 1. Maткa мыши CBA, оплодотворенной самцом Balb/c, 14-й день гестации.

А - внутрибрюшинное введение на 5-е и 7-е сутки беременности 0,1 мл 0,9% раствора NaCl (контроль); В - внутрибрюшинное введение на 5-е и 7-е сутки гестации 20 мкг C7MДП.

Стрелками обозначены резорбированные эмбрионы

Таблица 1

Влияние С7ИДП на число резорбций эмбрионов в фертильных комбинациях мышей

Группа Число резорбированных эмбрионов / общее число эмбрионов Частота резорбции, % M±m Достоверность различий

CBAxDBA/2 (n=6) 13/41 31,7±5,32 р1-2 = 0,17 р1-3 = 0,003

CBAxDBA/2 + C7M^P (n=6) 17/34 50,0±6,54

CBAxBALB/c (n=7) 6/37 16,2±3,96 р3-4 = 0,017

CBAxBALB/c + C7M^P (n=5) 15/33 45,4±6,31

Под влиянием иммуномодулирующего гликопептида доля резорбированных эмбрионов у мышей CBAxDBA/2 увеличивалась до 50,0±6,54% (табл. 1). Отсутствие статистически значимых различий с показателями контрольной группы (31,7±5,32%, р=0,17) обусловлено, по крайней мере, отчасти достаточно высоким уровнем спонтанной резорбции у мышей CBAxDBA/2, полученных из питомника «Столбовая», а также небольшим числом животных в группах. Тем не менее следует отметить, что достигнутый, благодаря применению С7МДП, уровень резорбции эмбрионов придал известной модели спонтанного аборта максимальную чувствительность для оценки разнонаправленных воздействий на иммунозави-симое невынашивание беременности. Это очень важно с позиции сокращения времени исследования и числа используемых экспериментальных животных для решения практических задач и проверки научных гипотез, связанных как с разработкой подходов к предотвращению/лечению спонтанных абортов, так и с изучением безопасности средств и методов, которые предполагается использовать при беременности.

При гистологическом исследовании плаценты резорбированных эмбрионов как при спонтанных, так и при С7МДП-стимулированных абортах у мышей CBAxBALB/c и CBAxDBA/2 отмечали нарушения архитектоники плаценты, очаги некрозов, отложения фибрина. Средняя масса плаценты жизнеспособных плодов в контрольных группах CBAxBALB/c и CBAxDBA/2 не различалась (0,090±0,013 г и 0,107±0,013 г соответственно, р=0,571). Введение С7МДП достоверно уменьшало массу плаценты нерезорбированных плодов у мышей с высоким уровнем спонтанных абортов (0,070±0,003 г, р=0,049), но не влияло на массу плаценты у фертильных мышей.

Увеличение частоты резорбции эмбрионов при фертильном сочетании мышей CBAxBALB/c и выраженная тенденция к стимуляции фетальных потерь в парах CBAxDBA/2 с исходно высоким уровнем спонтанных абортов под влиянием гликозидного аналога МДП, очевидно, связаны с усилением клеточных иммунных реакций и продукции провоспалительных Thl-цитокинов [8, 9,

11, 22]. Одним из основных механизмов абортогенного действия Thl-цитокинов является стимуляция продукции протромбиназы fg12 эндотелием сосудов, приводящая к образованию тромбов, отложений фибрина и ишемии плаценты. Роль fg12 как медиатора резорбции эмбрионов доказана тем, что нейтрализующие антитела к мышиной протромбиназе fg12 уменьшали спонтанные репродуктивные потери у мышей CBAxDBA/2 с 38% до 4,5%, а ИФНу+ФНО-стимулированную резорбцию эмбрионов - с 87% до 13%. Механизм

гибели плода у мышей со спонтанными абортами сходен с механизмом развития ФНО-индуцированных ишемических некрозов в опухолях и отторжения аллогенных трансплантатов [13, 15, 28]. Повышение экспрессии fg 12 и ФНО в сочетании с массивными отложениями фибрина, выявляемое у мышей с высоким уровнем эмбриональных потерь, было обнаружено также в плацентах женщин с ранними спонтанными абортами и преэклампсией [23].

Модель спонтанных абортов CBA/JxDBA/2 за рубежом широко используется для поиска стратегических направлений иммунотерапии раннего невынашивания беременности, испытания потенциальных профилактических и терапевтических препаратов [17, 21, 29, 30]. В различных питомниках при скрещивании самок CBA/J и самцов DBA/2 репродуктивные потери варьируют от низких (10-15%, Berlin, Germany) до умеренных (<30%, Toronto, Canada) и высоких (30-40%, Clamart, France). Эти различия объясняют либо контактом с экзогенным липополисахаридом (ЛПС) во время спаривания, либо особенностями абсорбции эндогенного ЛПС, продуцируемого кишечной микрофлорой [14]. Для оценки эффективности средств и методов снижения репродуктивных потерь на модели in vivo зачастую требуется более высокий исходный уровень резорбций эмбрионов. Частота фетальных потерь у мышей CBA/JxDBA/2 может быть повышена до 50% и более введением ЛПС [16] или синтетической двухцепочечной РНК поли(I:C) [27], до уровня более 80% - TM-цитокинами ФНО и ИФНу или их комбинацией [13].

В настоящей работе мы впервые описали возможность использования производного мура-милдипептида для увеличения числа резорбций эмбрионов с целью воспроизведения чувствительной модели иммуноопосредованного невынашивания беременности.

Таким образом, С7МДП проявлял выраженную тенденцию к увеличению репродуктивных потерь у мышей CBAxDBA/2 с исходно высоким уровнем спонтанных абортов и достоверно увеличивал частоту резорбций эмбрионов у мышей CBAxBALB/c с нормальной фертильностью. Два варианта аллогенного скрещивания мышей CBAxBALB/c и CBAxDBA/2 с введением на 5-е и 7-е сутки гестации гликозидного деривата МДП, усиливающего продукцию 'РЫ-цитокинов, можно рассматривать как новые высокочувствительные модели иммунозависимого невынашивания беременности.

Работа поддержана грантом Президента Российской Федерации по государственной поддержке ведущих научных школ (НШ-3482.2010.7).

ЛИТЕРАТУРА

1. Земляков А.Е., Цикалов В.В., Калюжин О.В. и др.

Гликозиды N-ацетилмурамоил-L-аланил-D-

изоглутамина. Влияние конфигурации гликозид-ного центра и природы агликона на биологическую активность // Биоорганическая химия. -2003. - Т. 29, № 3. - С. 316-322.

2. Земляков А.Е., Цикалов В.В., Калюжин О.В. и др. Синтез и исследование влияния конфигурации гликозидной связи и природы агликона на иммуностимулирующую активность гликозидов мура-моилдипептида // Физиологически активные вещества. - 2002. - № 1. - С. 35-38.

3. Калюжин О.В. Иммуномодулирующая активность гликозидных производных N-ацетилмурамил-L-аланил-Б-изоглутамина // Вестник новых медицинских технологий. - 2003. - Т.10, № 1-2. -С. 28-32.

4. Калюжин О.В. Производные мурамилдипептида в эксперименте и клинике // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1998. -№ 1. - С. 104-108.

5. Калюжин О.В., Дикинов З.Х., Евсегнеева И.В. Модели интраокулярного воспаления // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2011. -№ 2. - С. 14-19.

6. Калюжин О.В., Калина Н.Г., Баштаненко А.Ф. и др. Стимуляция резистентности мышей к бактериальной инфекции гликозидами мурамилдипептида // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т. 135, № 5. - С. 531-535.

7. Калюжин О.В., Калюжин В.В., Земляков А.Е. и др.

Стимуляция неспецифической резистентности мышей р-гептилгликозид-мурамилдипептидом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1999. - Т. 127, № 5. - С. 543-545.

8. Калюжин О.В., Нелюбов М.В., Калюжина Е.В. и

др. Влияние конфигурации гликозидной связи и структуры агликона гликозидов мурамилдипепти-да на их способность стимулировать продукцию интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли макрофагами // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - Т. 134, № 9. - С. 326328.

9. Калюжин О.В., Фукс Б.Б., Бовин Н.В. и др. Иммуномодулирующая активность новых производных мурамилдипептида in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1994. -Т. 117, № 5. - С. 510-513.

10. Караулов А.В. Калюжин О.В., Земляков А.Е. Биологическая активность гликозидных производных N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамина // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. -Т. 1, № 1. - С. 14-24.

11. Михайлова Л.П., Макарова О.В., Калюжин О.В. и др. Влияние глимурида на продукцию цитокинов спленоцитами мышей C57BL/6 и BALB/c // Иммунология. - 2004. - Т. 25, № 3. - С. 152-154.

12. Chaouat G., Menu E., Clark D.A. et al. Control of fetal survival in CBA x DBA/2 mice by lymphokine

therapy // J. Reprod. Fertil. - 1990. - Vol. 89, N 2. -P. 447-458.

13. Clark D.A., Chaouat G., Arck P.C. et al. Cutting Edge: Cytokine-dependent abortion in CBA x DBA/2 mice is mediated by the procoagulant fgl2 prothom-binase // J. Immunology. - 1998. - Vol. 160. -P. 545-549.

14. Clark D.A., Chaouat G., Banwatt D. et al. Ecology of danger-dependent cytokine-boosted spontaneous abortion in the CBA x DBA/2 mouse model: II. Fecal LPS levels in colonies with different basal abortion rates // Am. J. Reprod. Immunol. - 2008. - Vol. 60, N 6. -P. 529-933.

15. Clark D.A., Ding J.-W., Yu G. et al. Fgl2 prothrom-binase expression in mouse trophoblast and decidua triggers abortion but may be countered by OX-2 // Mol. Hum. Reprod. - 2001. - Vol. 7, N 2. - P. 185194.

16. Clark D.A. Manuel J. Lee L. et al. Ecology of danger-dependent cytokine-boosted spontaneous abortion in the CBA x DBA/2 mouse model. I. Synergistic effect of LPS and (TNF-alpha + IFN-gamma) on pregnancy loss // Am. J. Reprod. Immunol. - 2004. - Vol. 52, N 6. - P. 370-378.

17. Du M.-R., Dong L., Zhou W.-H. et al. Cyclosporin A improves pregnancy outcome by promoting functions of trophoblasts and inducing maternal tolerance to the allogeneic fetus in abortion-prone matings in the mouse // Biol. Reproduction. - 2007. - Vol. 76. -P. 906-914.

18. Girardi G., Yarilin D., Thurman J.M. et al. Complement activation induces dysregulation of angiogenic factors and causes fetal rejection and growth restriction // JEM. - 2006. - Vol. 203, N 9. - P. 21652175.

19. Imaizumi M., Pritsker A., Kita M. et al. Pregnancy and murine thyroiditis: thyroglobulin immunization leads to fetal loss in specific allogeneic pregnancies // Endocrinology. - 2001. - Vol. 142, N 2. - P. 823-829.

20. Jin L.P., Li D.J., Zhang J.P. et al. Adoptive transfer of paternal antigen-hyporesponsive T cells induces maternal tolerance to the allogeneic fetus in abortion-prone matings // Immunol. - 2004. - Vol. 173, N 6. -P. 3612-3619.

21. Junovich G., Dubinsky V., Gentile T. et al. Comparative immunological effect of anticoagulant and antioxidant therapy in the prevention of abortion in mice // Am. J. Reprod. Immunol. - 2011. - Vol. 65. - P. 104109.

22. Kalyuzhin O.V., Zemlyakov A.E., Fuchs B.B. Distinctive immunomodulating properties and interactivity with model membranes and cells of two homologous muramyl dipeptide derivatives // Int. J. Immunophar-macol. - 1996. - Vol. 18, N 11. - P. 651-659.

23. Knackstedt M., Ding J.W., Arck P.C. et al. Activation of the novel prothrombinase, fg12, as a basis for the pregnancy complications spontaneous abortion and pre-eclampsia // Am. J. Reprod. Immunol. - 2001. -Vol. 46, N 3. - P. 196-210.

24. Knackstedt M.K., Zenclussen A.C., Hertwig K. et al. Th1 cytokines and the prothrombinase fgl2 in stress-

triggered and inflammatory abortion // Am. J. Reprod. Immunol. - 2003. - Vol. 49, N 4. - P. 210-220.

25. Kohashi O., Aihara K., Ozawa A. et al. New model of a synthetic adjuvant, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine-induced arthritis: clinical and histologic studies in athymic nude and euthymic rats // Lab Invest. - 1982. - Vol. 47, N 1. - P. 27-36.

26. Kwak-Kim J., Park J. Ch., Kyong H. et al. Immunological modes of pregnancy loss // Am. J. Reprod. Immunol. - 2010. - Vol. 63, N 6. - P. 611-623.

27. Lin Y., Zeng Y., Di J. et al. Murine CD200+CK7+ trophoblasts in a poly (I:C)-induced embryo resorption model // Reproduction. - 2005. - Vol. 130. - P. 529537.

28. Ning Q., Sun Y., Han M. et al. Role of fibrinogen-like protein 2 prothrombinase/ fibroleukin in experimental and human allograft rejection // J. Immunol. - 2005. -Vol. 174, N 11. - P. 7403-7411.

29. Redecha P., van Rooijen N., Torry D.et al. Pravastatin prevents miscarriages in mice: role of tissue factor in placental and fetal injury // Blood. - 2009. - Vol. 113, N 17. - P. 4101-4109.

30. Savion S., BlankM., Shepshelovich J. et al. Ciprofloxacin affects pregnancy loss in CBA/JxDBA/2J mice possibly via elevation of interleukin-3 and granulocyte macrophage-colony stimulating factor production // Am. J. Reprod. Immunol. - 2000. - Vol. 44, N 5. -P. 293-298.