БЕЗОПАСНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГУМАНИЗИРОВАННЫЕ АНТИТЕЛА
SAFE AND FUNCTIONAL HUMANIZED ANTIBODIES

Настоящая заявка испрашивает преимущества приоритета предварительной заявки на патент США с номером 61/400650, поданной 30 июля 2010 г., которая включена сюда посредством ссылки в ее полном объеме.
1. Введение
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для безопасного и функционального лечения амилоидоза, группы нарушений и патологий, связанных с амилоидным белком, таких как болезнь Альцгеймера.
2. Предпосылки создания изобретения
Амилоидоз не является одной нозологической формой, а скорее представляет собой разнообразную группу прогрессирующих патологических процессов, характеризующихся экстраклеточными отложениями в тканях воскообразного, крахмалоподобного белка, называемого амилоидом, который накапливается в одном или нескольких органах или системах организма. По мере накопления амилоидных отложений они начинают препятствовать нормальному функционированию органа или системы организма. Существует по меньшей мере пятнадцать различных типов амилоидоза. Основными формами являются первичный амилоидоз без известного предшествующего заболевания, вторичный амилоидоз, возникающий после какого-либо другого заболевания, и наследственный амилоидоз.
Вторичный амилоидоз возникает во время хронического инфекционного или воспалительного заболевания, такого как туберкулез, бактериальной инфекции, которую называют семейной средиземноморской лихорадкой, костных инфекционных заболеваний (остеомиелита), ревматоидного артрита, воспаления тонкого кишечника (гранулематозного илеита), болезни Ходжкина и проказы.
Амилоидные отложения включают компонент, представляющий собой амилоид Р (пентагональный) (АР), гликопротеин, родственный обычному сывороточному амилоиду Р (амилоидному белку) (SAP), и сульфатированные гликозаминогликаны (GAG), сложные углеводы, присутствующие в соединительной ткани. Амилоидные белковые фибриллы, на долю которых приходится примерно 90% амилоидного материала, включают один из нескольких различных типов белков. Эти белки способны складываться в так называемые бета-складчато-листовые фибриллы, уникальную белковую конфигурацию, которая обладает сайтами связывания с красителем конго красным, что обусловливает уникальную способность амилоидного белка к окрашиванию.
Многие связанные с возрастом заболевания обусловлены или связаны с амилоидоподобными белками и характеризуются отчасти увеличением внеклеточных отложений амилоида или амилоидоподобного материала, которые вносят вклад в патогенез, а также в прогрессирование заболевания. Эти заболевания включают, но без ограничения, неврологические нарушения, такие как болезнь Альцгеймера (AD), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственное церебральное кровоизлияние, сопровождающееся амилоидозом (типа Дутча); сочетанная деменция Гуама-Паркинсона. Другими заболеваниями, которые обусловлены или связаны с амилоидоподобными белками, являются прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых; старческий сердечный амилоидоз; эндокринные опухоли и другие, включающие офтальмологические нарушения, такие как дегенерация желтого пятна.
Хотя патогенез этих заболеваний может быть различным, характерные для них отложения часто содержат множество сходных молекулярных компонентов. В значительной степени это объясняться местной активацией провоспалительных путей, приводя тем самым к одновременному отложению компонентов активированного комплемента, реактантов острой фазы, иммуномодуляторов и других медиаторов воспаления (McGeer et al., 1994).
Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой неврологическое нарушение, которое, как полагают, вызывается прежде всего амилоидными бляшками, накоплением анормальных отложений белков в головном мозге. Наиболее часто встречающийся тип амилоида, выявляемый в головном мозге пораженных заболеванием индивидуумов, в основном состоит из Aβ фибрилл. Научно доказано, что увеличение продукции и накопления бета-амилоидного белка в бляшках приводит к гибели нервных клеток, что способствует развитию и прогрессированию AD. В свою очередь, утрата нервных клеток в стратегически важных областях головного мозга приводит к уменьшению уровня нейромедиаторов и ухудшению памяти. Белки, которые в первую очередь ответственны за образование бляшки, включают амилоидный белок-предшественник (АРР) и два пресенилина (пресенилин I и пресенилин II). Последовательное расщепление амилоидного белка-предшественника (АРР), который конститутивно экспрессируется и катаболизируется в большинстве клеток под действием ферментов β- и γ-секретаз, приводит к высвобождению состоящего из 39-43 аминокислот Aβ пептида. Деградация АРР, вероятно, приводит к увеличению их склонности к агрегации с образованием бляшек. Особенно фрагмент Aβ1-42 обладает большей склонностью к образованию агрегатов вследствие наличия двух очень гидрофобных аминокислотных остатков на своем С-конце. Поэтому полагают, что прежде всего фрагмент Aβ1-42 участвует и ответственен за инициацию образования нейритной бляшки при AD и, следовательно, обладает высоким патологическим потенциалом.
Следовательно, существует необходимость в терапевтических средствах, которые предотвращают образование амилоидных бляшек и/или диффузных имеющихся бляшек у пациентов с AD. В частности, существует необходимость в агентах, способных препятствовать физиологическим проявлениям болезни, таким как образование бляшек, связанное с агрегацией волокон амилоида или амилоидоподобного пептида.
Пассивная иммунизация против бета-амилоида становится все более и более желательной стратегией в качестве терапевтического лечения по поводу AD. Эффективность пассивной иммунизации была продемонстрирована в моделях AD с использованием трансгенных животных, лечения которых антителами, как установлено, уменьшало массу бляшек и отменяло расстройства поведения. Несмотря на преодоление гиперактивации цитотоксичных T-клеток, риска, который несет активная иммунизация с использованием Ат, пассивная иммунизации все же несет риск опосредованной Fcγ-рецепторами сверхактивации глиальных макрофагов (микроглии) и активации комплемента, которые могут вносить вклад в несоответствующую провоспалительную реакцию и вазогенный отек.
Антитела против бета-амилоида были описаны, например, в заявке WO 2007/068412, опубликованной 21 июня 2007 г.; WO 2008/060364, опубликованной 22 мая 2008 г.; WO 2007/068412, опубликованной 21 июня 2007 г.; WO 2007/068412, опубликованной 21 июня 2007 г.; WO 2007/068412, опубликованной 21 июня 2007 г.; WO 2007/068412, опубликованной 21 июня 2007 г.; WO 2008/156621, опубликованной 24 декабря 2008 г.; WO 2008/156621, опубликованной 24 декабря 2008 г.; WO 2008/156621, опубликованной 24 декабря 2008 г. (смотрите таблицу 2).
Побочные эффекты, отмечаемые во время лечения пациентов с амилоидозом, таким как AD, антителами против бета-амилоида, включают воспалительные побочные эффекты, такие как менингит и менингоэнцефалит, и скопление жидкости в головном мозге (отек мозга). Необходимы терапии, которые уменьшают или исключают осложнения, связанные с амилоидозом.
3. Краткое изложение сущности изобретения
Новые композиции и способы настоящего изобретения обеспечивает альтернативное решение безопасного лечения - пассивной иммунизации по поводу амилоидоза, такого как болезнь Альцгеймера (AD). Настоящее изобретение основывается отчасти на обнаружении того, что антитело против Aβ, которое обладает эффективной нейтрализующей способностью, а также уменьшенной эффекторной функцией, уменьшает индуцируемую Aβ токсичность при избегании вредных побочных эффектов по сравнению с ранее известными терапиями с использованием моноклональных антител (мАт) против Aβ. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что гуманизированное моноклональное антитело (мАт) против Aβ изотипа IgG4, известное как MABT, как установлено, уменьшает риск опосредованной Fcγ-рецепторами сверхактивации глиальных макрофагов и аннулирует активацию комплемента. MABT связывается с высокой аффинностью с множеством форм Aβ1-42 и Aβ1-40, защищало от индуцируемой олигомерами Aβ1-42 цитотоксичности, опосредовало поглощение нейротоксичного Aβ глиальными макрофагами как in vitro, так и in vivo. По сравнению с Ат подкласса IgG1 человека дикого типа, содержащим те же антигенсвязывающие вариабельные домены и обладающим равной авидностью к Aβ, MABT продемонстрировало уменьшенную активацию стресс-активируемой, p38-митоген-активируемой протеинкиназы (p38 MAPK) в микроглии и вызывало меньший выброс провоспалительных медиаторов.
Настоящее изобретение также основывается отчасти на неожиданной роли активации p38 MAP-киназы в глиальных макрофагах в опосредуемой антителом против Аβ нейропротекции при AD. p38 MAP-киназная активность, как обычно считается, является провоспалительной и, как можно было бы полагать, вносит вклад в воспалительное состояние, относящееся к патогенезу амилоидоза, такого как AD. Однако как ни удивительно, промежуточная активация p38 MAP-киназы в глиальных макрофагах вносит вклад в опосредуемую антителом против Aβ нейропротекцию без вызова патогенетического воспалительного состояния.
Здесь предоставляются способы и композиции для безопасного лечения и/или предупреждения амилоидоза, в том числе, но без ограничения, болезни Альцгеймера. Амилоидоз включает, но без ограничения, неврологические нарушения, такие как болезнь Альцгеймера (AD), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственное церебральное кровоизлияние, сопровождающееся амилоидозом (типа Дутча), сочетанная деменция Гуама-Паркинсона, а также другие заболевания, которые обусловлены или связаны с амилоидоподобными белками, такие как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), диабет взрослых, старческий сердечный амилоидоз, эндокринные опухоли и другие, включающие офтальмологические нарушения, такие как дегенерация желтого пятна, поражения зрительной коры, глаукома, друзы зрительного нерва, невропатия зрительного нерва, неврит зрительного нерва, катаракта, амилоидоз глаза и решетчатая дистрофия.
В частности здесь предоставляются антитела против Aβ с эффекторными областями, которые были отобраны или подвергнуты модификации с целью инициации промежуточной активации p38 MAP-киназы в глиальных макрофагах. Кроме того, здесь предоставляются способы лечения и предупреждения амилоидоза, в том числе, но без ограничения, болезни Альцгеймера, в которых доза и/или схема введения выбираются из условия, чтобы p38 MAP-киназа активировалась на промежуточном уровне в глиальных макрофагах. В конкретных вариантах осуществления безопасное и функциональное антитело против Aβ имеет эффекторную область антитела изотипа IgG4. В некоторых более конкретных вариантах осуществления безопасное и функциональное антитело против Аβ имеет CH2-область антитела изотипа IgG4. В некоторых конкретных вариантах осуществления промежуточным уровнем активации p38 MAP-киназы является уровень, который выше уровня активации p38 MAP-киназы с помощью только токсичных олигомеров бета-амилоида, но ниже уровня активации p38 MAP-киназы с помощью антитела против Aβ изотипа IgG1 в сочетании с токсичными олигомерами бета-амилоида. В некоторых вариантах осуществления эффекторную область антитела против Аβ модифицируют так, чтобы его эффекторная функция уменьшалась. В некоторых вариантах осуществления модификацией может быть любое генетическое изменение, приводящее к замене и/или делеции аминокислоты.
Кроме того, здесь предоставляются способы увеличения безопасности антитела против Aβ. В одном варианте осуществления предоставляется способ увеличения безопасности не относящегося к изотипу IgG4 антитела против Aβ, включающий замену константной области указанного, не относящегося к изотипу IgG4 антитела против Aβ константной областью, происходящей из антитела изотипа IgG4. В другом варианте осуществления предоставляется способ увеличения безопасности не относящегося к изотипу IgG4 антитела против Aβ, включающий замену константной области указанного, не относящегося к изотипу IgG4 антитела константной областью, происходящей из не относящегося к изотипу IgG1 антитела. В конкретном варианте осуществления способ увеличения безопасности не относящегося к подклассу IgG4 антитела против бета-амилоида служит для увеличения безопасности антитела против Aβ изотипа IgG1.
Кроме того, здесь предоставляется система для анализа на основе культуры клеток для проверки безопасности и функциональности антител против Aβ для осуществления лечения и/или предупреждения амилоидоза, в том числе, но без ограничения, болезни Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления глиальные макрофаги инкубируют с токсичными олигомерами бета-амилоида и исследуемым антителом против Aβ. Опосредуемое антителом против Aβ поглощение бета-амилоида глиальными макрофагами указывает на функциональность антитела, например, в опосредовании очищения от бета-амилоида. Опосредуемая антителом против Aβ активация p38 MAP-киназы на промежуточных уровнях в глиальных макрофагах указывает на то, что антитело является и функциональным, и безопасным. В некоторых вариантах осуществления промежуточным уровнем активации p38 MAP-киназы является уровень, который выше уровня активации p38 MAP-киназы с помощью только токсичных олигомеров бета-амилоида, но ниже уровня активации p38 MAP-киназы с помощью антитела против Аβ изотипа IgG1 с уровнем эффекторной функции дикого типа (т.е. немодифицированной константной областью IgG1). Эта система для анализа на основе культуры клеток может использоваться для проверки способности антител против Aβ к защите нейронов от нейротоксических действий Аβ. Кроме того, эта система для анализа на основе культуры клеток может использоваться для проверки способности антител против Аβ к инициированию активации р38 МАР-киназы на промежуточных уровнях.
В некоторых вариантах осуществления система для анализа на основе культуры клеток, кроме того, включает нейроны. Степень выживания нейронов после совместной инкубации с токсичными олигомерами бета-амилоида, исследуемым антителом против Аβ и глиальными макрофагами указывает на функциональность исследуемого антитела против Аβ.
В некоторых вариантах осуществления системой для анализа на основе культуры клеток является первичная клеточная культура коркового слоя. Первичную клеточную культуру коркового слоя инкубируют с токсичными бета-амилоидными олигомерами и исследуемым антителом против Аβ. Опосредуемое антителом против Аβ поглощение бета-амилоида глиальными макрофагами указывает на функциональность антитела, например, в опосредовании очищения от бета-амилоида. Опосредуемая антителом против Аβ активация р38 МАР-киназы на промежуточных уровнях в глиальных макрофагах указывает и на функциональность, и на безопасность антитела.
Кроме того, здесь предоставляются безопасные и функциональные антитела для лечения и/или предупреждения амилоидоза, в том числе, но без ограничения, болезни Альцгеймера. В некоторых вариантах осуществления вариабельную область не относящегося к изотипу IgG4 гуманизированного антитела, которое связывается с Aβ, объединяют с константной областью антитела человека изотипа IgG4. В других вариантах осуществления вариабельную область гуманизированного антитела подкласса IgG1, которое связывается с Aβ, объединяют с константной областью антитела человека изотипа IgG4. В некоторых вариантах осуществления CH2-домен не относящегося к изотипу IgG4 гуманизированного антитела, которое связывается с Aβ, заменяют CH2-доменом антитела человека изотипа IgG4. В других вариантах осуществления CH2-домен гуманизированного антитела изотипа IgG1, которое связывается с Aβ, заменяют CH2-доменом антитела человека изотипа IgG4. В некоторых вариантах осуществления константная область происходит из антитела изотипа IgG1, причем константную область антитела изотипа IgG1 модифицируют из условия, чтобы модифицированная константная область обладала уменьшенной или исключенной эффекторной функцией.
В других вариантах осуществления предоставляются способы лечения и/или предупреждения амилоидоза, в том числе, но без ограничения, болезни Альцгеймера, в которых вводят антитело против Aβ изотипа IgG1 в сочетании с противовоспалительным средством из условия, чтобы p38 MAP-киназа активировалась на промежуточном уровне в глиальных макрофагах. В некоторых конкретных вариантах осуществления промежуточными уровнями активации p38 MAP-киназы являются уровни, которые выше уровней активации p38 MAP-киназы с помощью только токсичных олигомеров бета-амилоида, но ниже уровней активации p38 MAP-киназы с помощью антитела против Aβ изотипа IgG1 с обычным уровнем эффекторной функции в присутствии только олигомеров без противовоспалительного средства.
3.1 Терминология
Используемые здесь термины «полипептид», «пептид» и «белок» являются взаимозаменяемыми и, как установлено, означают биомолекулу, состоящую из аминокислот, связанных пептидной связью.
Используемые здесь термины «a», «an» и «the», как установлено, означают «один или более» и включают множественное число кроме случаев, когда контекст не допускает это.
Термин «амилоидоз» относится к группе заболеваний и нарушений, вызванных амилоидными или амилоидоподобными белками или связанных с ними, и включают, но без ограничения, заболевания и нарушения, вызванные присутствием или активностью амилоидоподобных белков в мономерном, фибриллярном или полимерном состоянии, или любой их комбинации, в том числе амилоидными бляшками. Такие заболевания включают, но без ограничения, вторичный амилоидоз и старческий амилоидоз, такой как заболевания, включающие, но без ограничения, неврологические нарушения, такие как болезнь Альцгеймера (AD), заболевания или состояния, характеризующиеся уменьшением способности к познанию и запоминанию, такие как, например, умеренное когнитивное нарушение (MCI), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственное церебральное кровоизлияние, сопровождающееся амилоидозом (типа Дутча), сочетанная деменция Гуама-Паркинсона и другие заболевания, которые обусловлены или связаны с амилоидоподобными белками, такие как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз, болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), миозит с тельцами включений (IBM), диабет взрослых, эндокринная опухоль и старческий сердечный амилоидоз, и различные заболевания глаз, включающие дегенерацию желтого пятна, связанную с друзами невропатию зрительного нерва и катаракту вследствие отложения бета-амилоида.
Используемые здесь термины «выявление (обнаружение)» или «выявленный (обнаруженный)» означают использование известных методов выявления биологических молекул, таких как иммунохимические или гистологические способы, и относятся к качественному или количественному определению присутствия или концентрации исследуемой биомолекулы.
«Амилоид β», «амилоид бета», «Aβ», «β-амилоид» или «бета-амилоид» является принятым в данной области техники термином и относится к β-амилоидным белкам и пептидам, а также их модификациям, фрагментам и любым функциональным эквивалентам, которые можно получить путем протеолитического расщепления амилоидного белка-предшественника (APP) и включают такие фрагменты APP, которые вовлечены в обусловленные амилоидом патологии или связаны с ними, в том числе, но без ограничения, Aβ1-38, Aβ1-39, Aβ1-40, Aβ1-41 Aβ1-42 и Aβ1-43.
Структура и последовательности вышеупомянутых β-амилоидных пептидов, упомянутых выше, хорошо известны специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, и способы получения указанных пептидов или извлечения их из головного мозга и других тканей описаны, например, в Glenner and Wong, Biochem Biophys Res Comm 129, 885-890 (1984). Кроме того, β-амилоидные пептиды в различных формах также имеются в продаже.
Термин «выделенный» означает биологическую молекулу без по меньшей мере некоторых из компонентов, с которыми она встречается в природе.
Используемые здесь термины «антитело» или «антитела» являются принятыми в данной области техники терминами и, как подразумевается, относятся к молекулам или активным фрагментам молекул, которые связываются с известными антигенами, и используются взаимозаменяемо с терминами «иммуноглобулин» или «молекулы иммуноглобулинов» и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов, т.е. части иммуноглобулина, которые содержат связывающий сайт, который специфически связывается с антигеном. Иммуноглобулин представляет собой белок, включающий один или более полипептидов, в основном кодируемыми генами константных областей каппа и лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю иммуноглобулинов, а также огромным количеством генов вариабельных областей иммуноглобулинов. Легкие цепи относят либо к каппа, либо к лямбда. Тяжелые цепи относят к гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, которые в свою очередь определяют классы иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Также известны подклассы тяжелой цепи. Например, тяжелые цепи IgG у людей могут быть любого из подклассов IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Как здесь используется, «специфически связывается» применительно к антителу означает, что антитело связывается с являющимся его мишенью антигеном с большей аффинностью, чем оно связывается со структурно отличным антигеном(ами).
Известно, что типичная структурная единица иммуноглобулина включает тетраметр. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара содержит одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-конец каждой цепи определяет вариабельную область из приблизительно 100-110 или более аминокислот, в основном ответственную за распознавание антигена. Термины «вариабельная область легкой цепи» (VL) и «вариабельная область тяжелой цепи» (VH) относятся к этим частям легкой и тяжелой цепей соответственно.
2
2
2
Антитела существуют в виде полноразмерных интактных антител или в виде ряда хорошо изученных фрагментов, получаемых в результате расщепления различными пептидазами или химическими веществами. Таким образом, например, пепсин расщепляет антитело ниже дисульфидных связей в шарнирной области с порождением F(ab'), димера Fab, который сам представляет собой легкую цепь, соединенную с VH-CH1 с помощью дисульфидной связи. F(ab') можно восстановить в мягких условиях для разрушения дисульфидной связи в шарнирной области, превращая тем самым F(ab')-димер в Fab'-мономер. Fab'-мономер по существу представляет собой Fab-фрагмент с частью шарнирной области (смотрите Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993) для более подробного описания других фрагментов антител). Хотя различные фрагменты антител определяют по расщеплению интактного антитела, специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники будет понятно, что любой из множества фрагментов антител можно синтезировать de novo либо химически, либо используя методологию рекомбинантных ДНК. Таким образом, используемый здесь термин «антитело» также включает фрагменты антител, или полученные в результате модификации полных антител, или синтезированные de novo, или антитела и фрагменты, полученные с использованием методологий рекомбинантных ДНК.
2
Термин «антитела» включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, химерные, одноцепочечные, биспецифические, подвергнутые включению элементов иммуноглобулинов обезьян, человеческие и гуманизированные антитела, а также их активные фрагменты. Примеры активных фрагментов молекул, которые связываются с известными антигенами, включают разделенные легкие и тяжелые цепи, Fab-, Fab/c-, Fv-, Fab'- и F(ab')-фрагменты, в том числе продукты библиотеки экспрессируемых иммуноглобулинов в виде Fab-фрагментов и эпитопсвязывающие фрагменты любого из антител и фрагментов, упомянутых выше. Эти активные фрагменты можно получить множеством методов. Например, моноклональные антитела можно расщепить с помощью фермента, такого как пепсин, и подвергнуть HPLC гель-фильтрации. Соответствующую фракцию, содержащую Fab-фрагменты, можно затем собрать и сконцентрировать с помощью мембранной фильтрации и т.п. Ради дальнейшего описания общих способов выделения активных фрагментов антител смотрите, например, Khaw, B.A. et al. J. Nucl. Med. 23: 1011-1019 (1982); Rousseaux et al. Methods Enzymology, 121: 663-669, Academic Press, 1986.
Рекомбинантно созданные антитела могут быть обычными полноразмерными антителами, активными фрагментами антител, известными в результате протеолитического расщепления, уникальными активными фрагментами антител, такими как Fv или одноцепочечный Fv (scFv), антитела с исключением домена и т.п. Антитело в виде Fv имеет размер, составляющий приблизительно 50 кДа, и включает вариабельные области легкой и тяжелой цепей. Полипептид в виде одноцепочечного Fv («scFv») представляет собой ковалентно связанный гетеродимер VH::VL, который может экспрессироваться с нуклеиновой кислоты, включающей кодирующие VH и VL последовательности, которые соединены либо напрямую, либо с помощью кодирующего пептид линкера. Смотрите Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883. Известен ряд структур для превращения агрегированных в природе, но химически разделенных легкой и тяжелой полипептидных цепей из V-области антитела в молекулу scFv, которая будет принимать трехмерную структуру, в значительной степени схожую со структурой антигенсвязывающего сайта. Смотрите, например, патенты США с № 5091513, 5132405 и 4956778.
Паратоп (связывающий сайт) относится к части молекулы антитела, которая участвует в связывании антигена. Антигенсвязывающий сайт образуют аминокислотные остатки N-концевых вариабельных («V») областей тяжелой («H») и легкой («L») цепей. Вариабельные области антител включают три высокодивергентных участка, называемых «гипервариабельными участками» или «определяющими комплементарность участками» (CDR), которые помещены между более консервативными фланкирующими участками, известными как «каркасные области» (FR). В молекуле антитела три гипервариабельных участка легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) и три гипервариабельных участка тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) располагаются относительно друг друга в трехмерном пространстве с образованием антигенсвязывающей поверхности или кармана. Следовательно, паратоп антитела представляет собой аминокислоты, которые являются частью CDR антитела, и любые остатки каркасных областей, которые являются частью кармана в качестве связывающего сайта.
Идентификацию аминокислотных остатков в конкретном антителе, которые являются частью паратопа, можно осуществить, используя широко известные в данной области техники способы. Например, CDR антитела можно определить как гипервариабельные участки, первоначально определенные Kabat и др. (смотрите "Sequences of Proteins of Immunological Interest", E. Kabat et al., U.S. Department of Health and Human Services; Johnson, G and Wu, TT (2001) Kabat Database and its applications: future directions. Nucleic Acids Research, 29: 205-206; http://immuno.bme.nwa.edu). Положения CDR можно также определить как структурные петлевые структуры, первоначально описанные Chothia и другими (смотрите Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901 (1987), Chothia et al., Nature 342, 877 (1989) и Tramontano et al., J. Mol. Biol. 215, 175 (1990)). Другие способы включают «определение для IgM», которое является компромиссом между определениями по Kabat и Chothia и осуществляется с использованием программного обеспечения для моделирования IgM Oxford Molecular (сейчас Accelrys), или «определение путем анализа контактов» CDR по Macallum и др. ("Antibody-antigen interactions: contact analysis and binding site topography", J Mol Biol. 1996 Oct 11; 262(5): 732-745).
Химерные антитела являются антителами, которые содержат одну или более областей из антитела, происходящего от первого вида, и одну или более областей из антитела, происходящего от второго, отличного вида. В одном варианте осуществления химерным антителом является антитело, которое включает области из иммуноглобулина примата. Химерное антитело для клинического применения в случае человека, как обычно подразумевается, содержит вариабельные области из не являющегося человеком животного, например грызуна, вместе с константными областями из антитела человека. В отличие от этого в гуманизированном антителе используются CDR из нечеловеческого антитела с большей частью или всеми каркасными областями вариабельных областей и всеми константными областями из антитела человека. Человеческое химерное антитело, как обычно подразумевается, содержит вариабельные области из антитела грызуна. Типичное человеческое химерное антитело содержит константные области тяжелой цепи антитела человека и константные области легкой цепи антитела человека вместе с вариабельными областями и тяжелой, и легкой цепей, происходящими из антитела грызуна. Химерное антитело может включать некоторые изменения относительно встречающейся в природе аминокислотной последовательности константных областей человека и встречающейся в природе последовательности вариабельных областей грызуна. Химерные и гуманизированные антитела можно приготовить с помощью хорошо известных в данной области техники способов, включающих подходы к пересадке CDR (смотрите, например, патенты США с № 5843708, 6180370, 569376, 5585089, 5530101), стратегии перетасовки в цепях (смотрите, например, патент США с № 5565332; Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 8910-8915), стратегии молекулярного моделирования (патент США с № 5639641) и т.п.
«Гуманизированное антитело», как здесь используется в случае антитела с двумя или более цепями, является антителом, в котором по меньшей мере одна цепь является гуманизированной. Гуманизированная цепь антитела имеет вариабельную область, в которой одна или более каркасных областей является человеческой. Гуманизированное антитело, которое является одноцепочечным, является антителом, в котором цепь имеет вариабельную область, в которой одна или более каркасных областей является человеческой. Нечеловеческие части вариабельной области гуманизированной цепи антитела или ее фрагмента происходят из не являющегося человеком источника, в частности нечеловеческого антитела, обычно происходящего от грызуна. Вклад частей нечеловеческого происхождения в гуманизированное антитело обычно предоставлен в форме по меньшей мере одного CDR-участка, который расположен среди каркасных областей, происходящих из одного (или более) иммуноглобулина(ов) человека. Кроме того, могут быть измены остатки каркасных областей для сохранения аффинности связывания.
«Гуманизированное антитело» может, кроме того, включать константные области (например, по меньшей мере одну константную область или ее часть в случае легкой цепи и в некоторых вариантах осуществления три константных области в случае тяжелой цепи). Константные области гуманизированного антитела, в случае их присутствия, обычно являются человеческими по происхождению. Способы получения гуманизированных антител хорошо известны специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники (смотрите, например, Queen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86: 10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)). Гуманизированное антитело можно также получить с помощью нового способа генетической инженерии, который позволяет продуцировать поликлональные антитела с созревшей аффинностью, подобные человеческим антителам, в больших животных, таких как, например, кролики и мыши. Смотрите, например, патент США с № 6632976.
Используемый здесь термин «константная область» или сокращенно «CR» относится к генам константных областей иммуноглобулина. Гены константных областей кодируют часть молекулы антитела, которая придает эффекторные функции. В случае химерных человеческих антител и гуманизированных антител типично нечеловеческие (например, мышиные) константные области заменены константными областями человека. Константные области рассматриваемых химерных или гуманизированных антител типично происходят из иммуноглобулинов человека. Константная область тяжелой цепи может быть выбрана из любого из пяти изотипов: альфа, дельта, эпсилон, гамма или мю. Кроме того, тяжелые цепи различных подклассов (таких как подклассы тяжелых цепей IgG) ответственны за различные эффекторные функции, и, таким образом, посредством выбора желаемой константной области тяжелой цепи можно продуцировать антитела с желаемой эффекторной функцией. Константными областями, которые могут использоваться в пределах объема этого изобретения, являются гамма 1 (IgG1), в частности, Fc-область изотипа гамма 1 (IgG1), гамма 3 (IgG3) и особенно гамма 4 (IgG4). Типом константной области легкой цепи может быть каппа или лямбда, предпочтительно каппа. В одном варианте осуществления константной областью легкой цепи является константная область каппа человека (Heiter et al. (1980) Cell 22: 197-207), а константной областью тяжелой цепи является константная область IgG4 человека.
Термин «моноклональное антитело» также является принятым в данной области и относится к антителу, которое является продуктом одной клонированной, продуцирующей антитело клетки. Моноклональные антитела обычно создают посредством слияния обычно короткоживущей, продуцирующей антитело B-клетки с быстрорастущей клеткой, такой как раковая клетка (иногда называемой «иммортализованной» клеткой). Результирующая гибридная клетка, или гибридома, быстро размножается, создавая клон, который продуцирует антитело.
Должно быть понятно, что применительно к настоящему изобретению «моноклональное антитело» также включает антитела, которые продуцируются материнским клоном, который еще не достиг полной моноклональности.
Антителом в соответствии с настоящим изобретением может быть иммуноглобулин или антитело, в котором, как подразумевается, каждый из его связывающих сайтов является идентичным (в случае поливалентного антитела), или альтернативно которое может быть биспецифическим антителом или полиспецифическим антителом.
«Биспецифическое» или «бифункциональное антитело» представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжелая цепь/легкая цепь и два различных связывающих сайта. Биспецифические антитела можно создать с помощью ряда способов, включающих слияние гибридом или соединение Fab'-фрагментов. Смотрите, например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). «Полиспецифическое» или «полифункциональное антитело» представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее более чем две различные пары тяжелая цепь/легкая цепь и более чем два различных связывающих сайта. Полиспецифические антитела можно создать, используя тот же ряд способов, что и в случае биспецифических антител.
2
2
Термин «фрагмент» относится к части антитела или цепи антитела, включающей меньшее количество аминокислотных остатков, чем интактное или полное антитело или цепь антитела. Фрагменты можно получить благодаря химической или ферментативной обработке интактного или полного антитела или цепи антитела. Фрагмент можно также получить способом с использованием рекомбинантных ДНК. Приводимые в качестве примера фрагменты включают Fab-, Fab'-, F(ab')-, Fabc и/или Fv-фрагменты. Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который связывает антиген или конкурирует с интактным антителом (т.е. с интактным антителом, от которого он происходит) за связывание с антигеном (т.е. специфическое связывание). Связывающие фрагменты можно получить с помощью методов с использованием рекомбинантных ДНК или посредством ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab'), Fabc, Fv, отдельные цепи и одноцепочечные антитела.
«Фрагмент» также относится к пептиду или полипептиду, включающему аминокислотную последовательность из по меньшей мере 5 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 70 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 175 следующих друг за другом аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 следующих друг за другом аминокислотных остатков или по меньшей мере 250 следующих друг за другом аминокислотных остатков аминокислотной последовательности другого полипептида. В конкретном варианте осуществления фрагмент полипептида сохраняет по меньшей мере одну функцию полипептида.
Термин «антиген» относится к частице или ее фрагменту, который может связываться с антителом. Иммуноген относится к антигену, который может индуцировать иммунный ответ в организме, в частности, у животного, конкретнее у млекопитающего, в том числе человека. Термин «антиген» включает области, известные как антигенные детерминанты или эпитопы, которые относятся к частям антигена (которые являются контактирующими или которые играют важную роль в поддержании контактного остатка в антигене), ответственным за антигенность.
Используемый здесь термин «растворимый» означает способность к частичному или полному растворению в водном растворе.
Также, как здесь используется, термин «иммуногенные» относится к веществам, которые индуцируют продукцию антител, T-клеток и других реактивных иммуноцитов, направленных против антигена или иммуногена.
Используемый здесь термин «иммуногенность» относится к мере способности антигена к индукции иммунного ответа (гуморального или клеточного) после введения реципиенту. Иммунный ответ имеет место, когда индивидуум продуцирует достаточное количество антител, T-клеток и других реактивных иммуноцитов против введенных иммуногенных композиций настоящего изобретения для смягчения или ослабления подвергаемого лечению нарушения.
Гуманизированное антитело с «уменьшенной иммуногенностью» относится к гуманизированному антителу, демонстрирующему уменьшенную иммуногенность относительно родительского антитела, например, мышиного антитела.
Гуманизированное антитело, «по существу сохраняющее способности к связыванию родительского антитела», относится к гуманизированному антителу, которое сохраняет способность к специфическому связыванию с антигеном, распознаваемым родительским антителом, использованным для создания такого гуманизированного антитела. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело будет демонстрировать такую же или по существу такую же аффинность связывания с антигеном и авидность, что и родительское антитело. В некоторых вариантах осуществления аффинность антитела будет составлять не менее 10% аффинности родительского антитела, не менее приблизительно 30% аффинности родительского антитела или не менее 50% аффинности родительского антитела. Способы исследования аффинности связывания с антигеном хорошо известны в данной области техники и включают анализы полумаксимального связывания, анализы конкуренции и распределение Скэтчарда. Подходящие анализы связывания с антигенами описываются в этой заявке.
Как здесь используется, «консервативная замена» относится к изменениям, которые являются по существу конформационно или антигенно нейтральными, приводящими к очень маленьким изменениям в третичной структуре мутантных полипептидов или приводящими к очень маленьким изменениям в антигенных детерминантах мутантных полипептидов, соответственно, по сравнению с встречающимся в природе белком. При ссылке на антитела и фрагменты антител настоящего изобретения консервативная замена означает замену аминокислоты, которая не делает антитело неспособным к связыванию рассматриваемого рецептора. Специалисты со средним уровнем компетентности в данной области техники смогут предсказать, какие замены аминокислот могут быть осуществлены при сохранении высокой вероятности быть конформационно и антигенно нейтральными. Такое руководство предоставлено, например, в Berzofsky, (1985) Science 229: 932-940 и Bowie et al. (1990) Science 247: 1306-1310. Факторы, которые следует учитывать, которые оказывают влияние на вероятность сохранения конформационного и антигенного нейтралитета, включают, но без ограничения, то, что: (a) замена гидрофобных аминокислот с меньшей вероятностью будет влиять на антигенность, поскольку гидрофобные остатки скорее находятся во внутренней части белка; (b) замена физико-химически схожих аминокислот с меньшей вероятностью будет влиять на конформацию, поскольку замененная аминокислота будет структурно имитировать встречающуюся в природе аминокислоту; и (c) изменение эволюционно консервативных последовательностей будет, вероятно, оказывать вредное влияние на конформацию, поскольку такое сохранение подсказывает, что эти аминокислотные последовательности могут быть функционально важными. Специалист со средним уровнем компетентности в данной области техники сможет оценить изменения в конформации белка, используя широко известные анализы, такие как, но без ограничения, способы фиксации микрокомплемента (Wasserman et al. (1961) J. Immunol. 87: 290-295; Levine et al. (1967) Meth. Enzymol. 11: 928-936) и исследования связывания с использованием конформационно-зависимых моноклональных антител (Lewis et al. (1983) Biochem. 22: 948-954).
Термин «терапевтически функциональное количество» относится к количеству антитела, которое, после введения человеку или животному, является достаточным для вызова терапевтического эффекта у указанного человека или животного. Специалист со средним уровнем компетентности в данной области техники без труда определит функциональное количество, следуя обычным процедурам.
Используемые здесь термины «лечить», «предупреждать» и «предупреждение» относится к предупреждению повторения или возникновения одного или более симптомов нарушения у субъекта, являющемуся следствием введения профилактического или терапевтического средства.
Термин «безопасное и функциональное количество» применительно к антителу против бета-амилоида относится к такому количеству антитела против бета-амилоида, которое, после введения пациенту с болезнью Альцгеймера, уменьшает или предотвращает образование новых амилоидных бляшек у пациента, уменьшает массу амилоидных бляшек у пациента и/или уменьшает или предотвращает ухудшение когнитивных способностей пациента или увеличивает их, и при этом не отмечаются побочные эффекты, такие как воспалительные побочные эффекты, например, менингит и менингоэнцефалит, и скопление жидкости в головном мозге (оттек мозга), или при этом какие-либо побочные эффекты не являются настолько тяжелыми, чтобы было необходимо прерывать лечение пациента. В некоторых вариантах осуществления образование новых амилоидных бляшек уменьшается на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% относительно не подвергнутого лечению контроля. В некоторых вариантах осуществления масса амилоидных бляшек уменьшается на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% относительно не подвергнутого лечению контроля. В некоторых вариантах осуществления ухудшение когнитивных способностей пациента уменьшается на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% относительно не подвергнутого лечению контроля. В некоторых вариантах осуществления когнитивные способности пациента увеличиваются на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% относительно не подвергнутого лечению контроля.
Термин «не относящееся к изотипу IgG1 антитело» относится к антителу с какой-либо константной областью одного из следующих изотипов IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, однако же не относящееся к изотипу IgG1 антитело не содержит константную область IgG1, которая сохраняет эффекторную функцию IgG1 дикого типа. В конкретных вариантах осуществления не относящимся к изотипу IgG1 антителом является антитело изотипа IgG4. В других вариантах осуществления не относящееся к изотипу IgG1 антитело имеет константную область, происходящую из антитела изотипа IgG1, которая была мутирована из условия, чтобы эффекторная функция результирующего антитела была уменьшенной или исключенной относительно антитела изотипа IgG1 дикого типа.
d
Термин «промежуточные уровни» применительно к активации p38 MAP-киназы относится к уровням активации p38 MAP-киназы, которые выше уровня активации p38 MAP-киназы в отсутствие гуманизированного, не относящегося к изотипу IgG1 антитела против бета-амилоида, но ниже уровня активации p38 MAP-киназы в присутствии той же концентрации антитела против бета-амилоида изотипа IgG1, которое связывается с бета-амилоидом с той же K, что и гуманизированное, не относящееся к изотипу IgG1 антитело против бета-амилоида.
4. Описание фигур
Комплект материалов патента или заявки содержит по меньшей мере один рисунок, выполненный в цвете. Копии этой публикации патента или заявки на патент с цветными рисунками будут предоставлены Ведомством по первому требованию и после уплаты обязательной пошлины.
На фиг.1 представлены графики и иммуногистохимические изображения, соответствующие экспериментам, описанным в примере 6.1 и 6.2. Моноклональное антитело против Aβ MABT связывалось с различными Aβ пептидами с высокой аффинностью и обладает противоагрегационными свойствами. Специфический для Aβ ELISA использовали для сравнения связывания mMABT (A) и MABT (B) с человеческим и мышиным Aβ1-42 и человеческим Aβ1-40. Также проверяли связывание MABT с различными формами агрегации Aβ1-42 (C). MABT связывается с Aβ бляшками, присутствующими в срезах головного мозга APP-трансгенных мышей (D верхние панели) и срезах новой коры в височной доле человека с AD (D нижние панели). In vitro функциональность установлена по способности МАВТ препятствовать агрегации Aβ1-42 и разбивать на части ранее сформированные агрегаты Aβ1-42. Ингибирование агрегации Aβ1-42 и дезагрегация ранее сформированных агрегатов Aβ1-42 были продемонстрированы, используя молярное соотношение 10:1 (Aβ1-42 к моноклональному антителу) в анализе на основе ThT (Е). В качестве контроля было использовано моноклональное антитело против N-концевого эпитопа Аβ изотипа IgG. Результаты представлены в виде среднего значения (± среднеквадратическое отклонение) трех независимых экспериментов. *Р<0,05, **Р<0,01. МАВТ также проверяли в анализе самосборки Aβ1-42, который не основывается на ThT флуоресценции при связывании с мультимерными Аβ агрегатами, как описано в разделе «Материалы и методы» (F). Представлено среднее значение (± среднеквадратическое отклонение) двух анализов.
На фиг. 2 представлены графики и иммуноцитохимические изображения, соответствующие экспериментам, описанным в примере 6.3. МАВТ ингибирует цитотоксичность олигомеров Aβ1-42 по отношению к смешанным клеточным культурам коркового слоя. Смешанные клетки коркового слоя крыс PI подвергали обработке 2,5 или 5 мкМ олигомеров Aβ1-42 вместе со 100 мкг/мл МАВТ или без него или с контрольным моноклональным антителом IgG (А). Анализ МТТ использовали для определения жизнеспособности клеток, как описано в разделе «Материалы и методы». Представлены средние величины (± стандартная погрешность средней величины) пяти независимых экспериментов. *Р<0,05, **Р<0,01. В сравнимом анализе, но измеряя продукцию АТФ в качестве маркера метаболической активности, клетки подвергали обработке 10 мкМ олигомеров Аβ1-42 вместе с 200 мкг/мл МАВТ или без него (В). Результаты представлены в виде средней величины (± стандартная погрешность средней величины) двух независимых анализов. Нейротоксичность после длительной обработки олигомерами Aβ1-42 была проверена с помощью морфологических исследований (С). Указанные выше клетки подвергали обработке в течение 4 дней 10 мкМ олигомеров Aβ1-42, вместе с 50 мкг/мл МАВТ или без него, а затем окрашивали TuJ1 и DAPI.
На фиг. 3 представлены графики и иммуноцитохимические изображения, соответствующие экспериментам, описанным в примере 6.4. Моноклональное антитело против Аβ изотипа IgG4 уменьшало связывание олигомеров Aβ1-42 с аксонами. Смешанные клетки коркового слоя крыс PI подвергали обработке 2 мкМ олигомеров Aβ1-42 вместе со 100 мкг/мл МАВТ или без него или с контрольным IgG в течение 30 мин (представлено) или 18 ч (не представлено). На фигурах слева направо представлена: обработка буфером в качестве контроля, олигомерами Aβ1-42 и олигомерами Aβ1-42 вместе с МАВТ (А). DAPI использовали для мечения клеточных ядер; антитело против специфического для нейронов тубулина, TuJ1, использовали для мечения нейронов; и антитело против Аβ (клон 6Е10) использовали для мечения бета-амилоида. Нижний ряд демонстрирует все три маркера, в то время как верхний ряд демонстрирует только Aβ и DAPI. Две вставки иллюстрируют связывание олигомеров Аβ1-42 с аксонами (слева) и ингибирование этого связывания с помощью моноклонального антитела МАВТ (справа). Представлены результаты количественных определений флуоресценции после обработки в течение 30 мин и 18 ч (В). Представлены средние результаты (± стандартная погрешность средней величины) двух экспериментов. Эксперимент с использованием Aβ1-42, меченного HyLite Fluor-488, подтвердил, что МАВТ ингибирует связывание Аβ1-42 с аксонами. Культуры клеток коркового слоя крыс PI подвергали обработке, как описано для (А), за исключением использования Aβ1-42, меченного HyLite Fluor-488 (С). Aβ1-42-меченные образцы представлены на верхней панели, a DAPI-окрашенные образцы представлены на нижней панели. Представлен один репрезентативный эксперимент. Измеряли Aβ1-42-флуоресценцию, при этом представлено среднее значение (± среднеквадратическое отклонение) двух независимых экспериментов (D). Внутриклеточное накопление Aβ1-42 было исследовано в результате выполнения ELISA, специфического для Aβ1-42, на разъединенных с помощью трипсина клетках, как описано в разделе «Материалы и методы» (С). Представлены средние результаты (± стандартная погрешность средней величины) трех экспериментов. После обработки МАВТ олигомеры Aβ1-42, по-видимому, поглощались клетками, напоминающими глиальные макрофаги, как показано в (F). DAPI использовали для мечения клеточных ядер, а антитело против Аβ (клон 6Е10) использовали для мечения бета-амилоида.
На фиг. 4 представлены графики и конфокальные изображения,
+
соответствующие экспериментам, описанным в примере 6.5. Олигомеры Aβ1-42 поглощались с помощью FcR-опосредованного механизма глиальными макрофагами после обработки МАВТ. Получение конфокальных изображений использовали для демонстрации того, что олигомеры Aβ1-42, образовавшие комплекс с МАВТ, поглощаются глиальными макрофагами. DAPI использовали для мечения клеточных ядер, чтобы выявить сами глиальные макрофаги, а антитело против Аβ использовали для мечения олигомеров Aβ1-42 (А). Апикальная дистальная часть была получена из трехмерного изображения, представленного исходя из набора изображений плоскостей на различных глубинах внутри образца. Получение конфокальных изображений выполняли на смешанных клетках коркового слоя, меченных на Аβ (периферия) и окрашенных DAPI (центр), как описано в разделе «Примеры» под заголовком «Материалы и методы». Глиальные макрофаги идентифицировали и сканировали в отношении максимальной интенсивности флуоресценции во всем ряде наборов конфокальных изображений, представляющих внутриклеточную локализацию (В), и определяли общую площадь флуоресцентного сигнала, превышающего минимальный порог (С). Каждая отметка на графике представляет собой общую площадь Аβ, окрашенного в одной клетке. В случае каждого условия обработки анализировали как минимум 20 клеток. Данные сравнивали, используя однофакторный дисперсионный анализ с последующими множественными сравнениями по полученным результатам с использованием критерия Тьюки. Представлены средние величины (± стандартная погрешность средней величины). Было подтверждено, что микроглия (Ibal) является типом клеток, поглощающих Aβ1-42, образовавший комплекс с МАВТ (D). Ibal использовали в качестве маркера микроглии, меченный HyLite Fluor-488 Aβ1-42 использовали для выявления Aβ1-42, a DAPI использовали для демонстрации клеточных ядер. Демонстрируется коллокализация Ibal и Aβ1-42. Интернализация олигомеров Aβ1-42 с помощью различных моноклональных антител IgG коррелирует со связыванием с FcγR. Дифференцированное связывание с FcγRIIIa-V158 было подтверждено в анализе связывания (Е). Для эффекта, состоящего в полной защите от токсичности олигомеров Aβ1-42, моноклонального антитела против Аβ требуется связыванием с FcγR. Смешанные клетки коркового слоя крыс PI подвергали обработке олигомерами Aβ1-42 вместе с МАВТ, МАВТ-IgG1-D265A, МАВТ-IgG1 или контрольным мАт IgG1 или без них (F). На графике представлен средний (± стандартная погрешность средней величины) % увеличения выживания клеток по сравнению с клетками, подвергнутыми обработке олигомерами Аβ1-42, исходя из 5 независимых экспериментов. Статистический анализ был выполнен с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями по полученным результатам с использованием критерия Тьюки.
На фиг. 5 представлены графики и иммуноцитохимические изображения, соответствующие экспериментам, описанным в примере 6.6. Добавление в комплексе с олигомерами Aβ1-42 IgG1 с остовом дикого типа значительно увеличивало активацию р38 по сравнению с таковой, отмечаемой в случае подвергнутых обработке олигомерами Aβ1-42 глиальных макрофагов. Смешанные клетки коркового слоя крыс PI подвергали обработке в течение 30 мин 10 мкМ олигомеров Aβ1-42 вместе с 100 мкг/мл МАВТ, МАВТ-IgG1-D2 65A или МАВТ-IgG1 дикого типа или без них. В качестве контроля использовали моноклональное антитело изотипа IgG1, не связывающееся с Аβ. Активность р38 MAPK измеряли с помощью фосфо-специфического ELISA, как описано в разделе «Материалы и методы» (А). Представлена средняя величина (± стандартная погрешность средней величины) 4 независимых экспериментов. Статистический анализ был выполнен с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями по полученным результатам с использованием критерия Тьюки. Активация р38 MAPK олигомерами Aβ1-42 в комплексе с моноклональным антителом была характерна для глиальных макрофагов (В). Клетки подвергали обработке, как описано выше, а затем окрашивали на фосфо-р38МАРК, с использованием Ibal (микроглия) и DAPI (клеточные ядра). На фигурах слева направо представлена: обработка буфером в качестве контроля, олигомерами Аβ1-42 и олигомерами Aβ1-42 вместе с МАВТ. В правой вставке демонстрируется коллокализация фосфо-р38МАРК и Iba1. Чистые глиальные макрофаги от мышей с заменой CX3CR1-GFP использовали для подтверждения характерной для глиальных макрофагов р38-активности (С). Окрашивание на только фосфо-р38 демонстрируется в верхней панели, a CX3CR1-GFP-сигнал (микроглия) вместе с фосфо-р38 демонстрируется в нижней панели. Для эффекта, состоящего в полной защите от токсичности олигомеров Aβ1-42, МАВТ требуется р38 MAPK-активность. Смешанные клетки коркового слоя крыс PI подвергали обработке 10 мкМ олигомеров Aβ1-42 отдельно или вместе со 100 мкг/мл МАВТ или MABT-IgG1-D265A, в присутствии или в отсутствие 1 мкМ SB239063, р38-специфического ингибитора (D). Анализ цитотоксичности, считывая данные о МТТ, выполняли спустя 24 ч. Представлена средняя величина (± стандартная погрешность средней величины) 4 независимых экспериментов. Статистический анализ был выполнен с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями по полученным результатам с использованием критерия Тьюки.
На фиг. 6 представлен график, соответствующий экспериментам, описанным в примере 6.6. Высокое сродство IgG1 к FcγR делает его менее эффективным в уменьшении Aβ1-42-опосредованного выброса провоспалительных цитокинов глиальными макрофагами. Выброс TNFα клетками, обогащенными глиальными макрофагами, измеряли после 24 ч обработки (смотрите раздел «Материалы и методы»). Представлена средняя величина (± стандартная погрешность средней величины) трех независимых экспериментов. Статистический анализ был выполнен с использованием однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями по полученным результатам с использованием критерия Тьюки.
На фиг. 7 представлены диаграммы, соответствующие экспериментам, описанным в примере 6.1., по уменьшению массы бляшек и улучшению непространственной памяти в модели на экспрессирующих АРР мышах. Процент массы бляшек (А) и среднее количество бляшек (B) у мышей с двумя трансгенами - APP/PS1 определяли после продолжающейся в течение длительного времени пассивной иммунизации с использованием mMABT, мышиного варианта моноклонального антитела MABT. Животным вводили PBS, служивший в качестве контролей (PBS). Тиофлавин-S (ThS) использовали для окрашивания плотных бляшек (смотрите раздел «Материалы и методы»). Функциональность была выявлена у мышей с одним трансгеном - мутантным hAPP после двух введений mMABT (C). Индекс распознания (RI), в качестве показателя вспоминания, изучали с использованием теста распознания нового объекта (смотрите раздел «Материалы и методы»). Животным вводили PBS, служивший в качестве контролей (PBS). Каждый кружок на диаграмме представляет отдельную мышь. Представлены средние значения (± среднеквадратическое отклонение), *P<0,01.
На фиг.8 представлен Вестерн-блоттинг, соответствующий экспериментам, описанным в примере 6.1. Нейротоксичный Aβ1-42 представляет собой смесь низко- и высокомолекулярных олигомеров. Нейротоксичные олигомеры Aβ1-42 были приготовлены (смотрите раздел «Материалы и методы») и использованы для vitro экспериментов, в которых исследуются эффекты обработки моноклональным антителом на опосредованную олигомерами Aβ1-42 нейротоксичность. Олигомеры Aβ1-42 были подвергнуты электрофорезу в 4-12% градиентном ПААГ/SDS, перенесены на нитроцеллюлозную мембрану и зондированы с использованием антитела против Aβ (клона 6E10).
На фиг.9 представлен график, соответствующий экспериментам, описанным в примере 6.2. Направленное против срединного домена MABT ингибирует взаимодействие Aβ1-42 с ApoE4. ELISA использовали для оценки эффекта моноклональных антител против N-конца (клоны 6E10 и W02), C-конца (клон G2-11) или срединного домена (MABT) Aβ на связывание Aβ1-42 с рекомбинантным ApoE4 человека. Представлен процент ингибирования сигнала по сравнению с контролем без моноклонального антитела IgG.
На фиг.10 представлены графики и иммуноцитохимические изображения, соответствующие экспериментам, описанным в примере 6.5. Сшитое моноклональное антитело MABT-IgG4 обладало уменьшенной активностью связывания по сравнению с IgG1 дикого типа. Сшитое антитело против Aβ-IgG1 дикого типа связывалось со всеми рецепторами FcγR с активностями, схожими с таковой не связывающегося с Aβ IgG1 в качестве положительного контроля. И MABT, и MABT-IgG1-D265A продемонстрировали значительно уменьшенное связывание со всеми FcγR по сравнению с MABT против αβ - IgG1 и не связывающимся с Aβ IgG1 в качестве положительного контроля. Эти данные соответствуют опубликованным данным для антител изотипа IgG4 человека (Gessner et al., 1998) и антител изотипа IgG1, несущим мутацию D265A (Shields et al, 2001).
На фиг.11 представлена in vivo визуализация Aβ бляшек у экспрессирующих APP/PS1 мышей, подвергнутых лечению антителом против бета-амилоида. Системное введение доз MABT изменяет индивидуальные амилоидные бляшки in vivo. Амилоидные бляшки у экспрессирующих APP/PS1 животных метили метокси-X04, вводимым внутрибрюшинно, визуализировали с помощью in vivo двухфотонной микроскопии и прослеживали в течение множества недель (A). Относительное изменение объема бляшки в зависимости от времени наносили на график в виде увеличения в разы по сравнению первоначальной процедурой получения изображений (B). В среднем размер индивидуальной бляшки уменьшался в объеме после системного введения доз MABT (x бляшек, 2 животных).
4.1 Описание последовательностей
SEQ ID NO:1: Аминокислотная последовательность (CDR1) вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:2: Аминокислотная последовательность (CDR2) вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:3: Аминокислотная последовательность (CDR3) вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:4: Аминокислотная последовательность (CDR1) вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:5: Аминокислотная последовательность (CDR2) вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:6: Аминокислотная последовательность (CDR3) вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:7: Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:8: Аминокислотная последовательность легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:9: Аминокислотная последовательность константной области легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:10: Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:11: Аминокислотная последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:12: Модифицированная аминокислотная последовательность константной области цепи IgG4
SEQ ID NO:13: Нуклеотидная последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:14: Нуклеотидная последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:15: Нуклеотидная последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:16: Нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:17: Нуклеотидная последовательность легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:18: Нуклеотидная последовательность константной области легкой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:19: Нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:20: Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:21: Нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи гуманизированного антитела MABT
SEQ ID NO:22: Типичная аминокислотная последовательность, предшествующая HCDR2
5. Подробное описание настоящего изобретения
Ниже описываются системы для анализа на основе клеток для проверки антител против бета-амилоида и способы контролирования и корректировки лечения пациента антителами против бета-амилоида. Ниже также описываются системы для анализа на основе клеток для проверки безопасности или эффективности нейропротективного средства и способы контролирования и корректировки лечения пациента нейропротективным средством. Кроме того, ниже описываются безопасные и функциональные антитела и способы применения таких безопасных и функциональных антител для лечения болезни Альцгеймера. Также описываются терапевтические препараты и способы введения.
5.1 Система для анализа на основе клеток
Здесь предоставляются in vitro системы для анализа на основе клеток для проверки безопасности и функциональности антител или других агентов для лечения амилоидоза. В некоторых вариантах осуществления клетки, которые поражаются амилоидозом («клетки-мишени»), амилоидный белок в его патологической форме и иммуноциты-эффекторы (например, клетки-природные киллеры, макрофаги, такие как глиальные макрофаги, нейтрофилы и тучные клетки) инкубируют в присутствии и в отсутствие исследуемого антитела. Параметры, которые можно определить для проверки безопасности и функциональности антитела, включают степень выживания клеток-мишеней, интернализацию амилоидного белка в иммуноциты-эффекторы и активацию пути с участием р38 МАР-киназы в иммуноцитах-эффекторах. В некоторых вариантах осуществления безопасное и функциональное антитело приводит к максимальной интернализации и промежуточной активации пути с участием р38 МАР-киназы.
В более конкретных вариантах осуществления амилоидозом является болезнь Альцгеймера, амилоидным белком является бета-амилоид, иммуноцитами-эффекторами являются глиальные макрофаги, а клетками-мишенями являются нейроны. В конкретных вариантах осуществления клетки получают из имеющихся линий клеток для создания смешанной культуры. В других вариантах осуществления смешанной культурой клеток является первичная клеточная культура коркового слоя (Meberg & Miller 2003, Methods Cell Biol 71: 111-127). В некоторых вариантах осуществления смешанной культурой клеток является первичная клеточная культура коркового слоя крысы, мыши или шимпанзе. В некоторых вариантах осуществления первичную клеточную культуру коркового слоя получают с помощью биопсии коры головного мозга или биопсии спинного мозга являющегося человеком пациента.
Смешанную культуру клеток, которая включает нейроны и глиальные макрофаги, инкубируют с бета-амилоидным белком. В одном варианте осуществления бета-амилоидный белок предоставляется в виде олигомера бета-амилоида. В этой системе для анализа можно определить следующие параметры: (1) степень выживания нейронов можно определить, например, по метаболизму, который можно определить, например, по окислению в митохондриях 3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) или выработке АТФ; (2) интернализацию олигомера бета-амилоида в глиальные макрофаги можно определить, например, с помощью иммуноцитохимического анализа в отношении бета-амилоидного белка или мечения и прямого определения и/или визуализации бета-амилоидного белка; и (3) активацию пути с участием p38 MAPK можно определить, например, с помощью ELISA в отношении фосфорилированной p38 MAPK («Фосфо-p38»).
В некоторых вариантах осуществления степень выживания нейронов в присутствии бета-амилоида и безопасного и функционального антитела увеличивается на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% или по меньшей мере 500% по сравнению со степенью выживания нейронов в отсутствие безопасного и функционального антитела.
В некоторых вариантах осуществления интернализация бета-амилоида в глиальные макрофаги в присутствии безопасного и функционального антитела увеличивается на по меньшей мере 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, 250%, 275%, 300%, 325%, 350%, 375%, 400%, 425%, 450%, 475% или по меньшей мере 500% по сравнению со степенью интернализации в отсутствие безопасного и функционального антитела.
В некоторых вариантах осуществления активация p38 MAP-киназы в глиальных макрофагах в присутствии бета-амилоида и безопасного и функционального антитела увеличивается на 5%-15%, 10%-20%, 15%-25%, 20%-30%, 35%-45%, 40%-50% или 45%-55% по сравнению с активацией p38 MAP-киназы в присутствии бета-амилоида, но в отсутствие безопасного и функционального антитела. В более конкретном варианте осуществления активация p38 MAP-киназы в глиальных макрофагах в присутствии бета-амилоида и безопасного и функционального антитела увеличивается на 10%-30% по сравнению с активацией p38 MAP-киназы в присутствии бета-амилоида, но в отсутствие безопасного и функционального антитела. Кроме того, активация p38 MAP-киназы в глиальных макрофагах в присутствии бета-амилоида и безопасного и функционального антитела увеличивается на 5%-15%, 10%-20%, 15%-25%, 20%-30%, 35%-45%, 40%-50% или 45%-55% меньше, чем активируется p38 MAP-киназа в присутствии антитела против бета-амилоида изотипа IgG1.
В некоторых вариантах осуществления патологическую форму бета-амилоида, например, олигомерный бета-амилоид, исследуемое антитело и глиальные макрофаги инкубируют для определения безопасности и функциональности антитела. В этой системе для анализа можно определить следующие параметры: (1) интернализацию олигомера бета-амилоида в глиальные макрофаги можно определить, например, с помощью иммуноцитохимического анализа в отношении бета-амилоидного белка или мечения бета-амилоидного белка; и (2) активацию пути с участием p38MAPK можно определить, например, с помощью ELISA в отношении фосфо-p38.
Для определения активации p38 MAP-киназы можно использовать любой способ, известный специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления ELISA Вестерн-блоттинг или иммуноцитохимический анализ с использованием антитела, которое специфически связывается с фосфорилированной p38 MAP-киназой, используют для определения уровней фосфорилированной, т.е. активированной, p38 MAP-киназы. В некоторых вариантах осуществления активацию p38 MAP-киназы определяют с помощью иммуноцитохимического анализа с использованием антитела, которое специфически связывается с p38 MAP-киназой, для определения степени локализации в ядре p38 MAP-киназы. Чем выше степень локализации в ядре p38 MAP-киназы, тем выше уровень активации p38 MAP-киназы.
В некоторых вариантах осуществления можно определить активацию других компонентов в пути передачи сигналов с участием p38 MAP-киназы. В некоторых вариантах осуществления можно определить уровни экспрессии мишени p38 MAP-киназы по ходу этого пути для определения активации p38 MAP-киназы у пациента. Такие мишени по ходу пути включают, но без ограничения, S6 киназу рибосомы с М.м. 90 кДа (pp90rsk); (RSK) семейство: RSK1, RSK2, MNK1/2 и MSK1/2; и факторы трансляции в ядре, такие как Elk-1, ATF2, STAT3 и CREB. Уровни экспрессии мишеней по ходу пути можно определить с помощью любого способа, известного специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, такого как, но без ограничения, блоттинг по Нозерну, Вестерн-блоттинг или полимеразная цепная реакция.
5.2 Контролирование и корректировка лечения
В некоторых вариантах осуществления контролируют активацию p38 MAP-киназы в иммуноцитах-эффекторах, таких как глиальные макрофаги, пациента, подвергаемого лечению безопасным и функциональным антителом, которое специфически связывается с амилоидным белком, таким как бета-амилоид. Иммуноциты-эффекторы можно получить от пациента с помощью любого способа, известного специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления глиальные макрофаги получают с помощью биопсии коры головного мозга или биопсии спинного мозга. Иммуноциты-эффекторы можно поддерживать в культуре с помощью любого способа, известного специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления контролируют активацию p38 MAP-киназы в иммуноцитах-эффекторах, таких как глиальные макрофаги, пациента, подвергаемого лечению агентом, таким как нейропротективное средство. В некоторых, более конкретных вариантах осуществления пациента подвергают лечению по поводу амилоидоза, такого как болезнь Альцгеймера. В некоторых, еще более конкретных вариантах осуществления пациента подвергают лечению такрином (COGNEX, Morris Plains, NJ), донепезилом (ARICEPT, Tokyo, JP), ривастигмином (EXELON, East Hanover, NJ), галантамином (REMINYL, New Brunswick, NJ) или мемантином (NAMENDA, New York, NY).
В некоторых вариантах осуществления корректируют дозу введения и/или схему введения пациенту из условия, чтобы активация p38 MAP-киназы в глиальных макрофагах находилась на промежуточных уровнях, т.е. выше, чем в отсутствие антитела, но ниже чем в присутствии антитела изотипа IgG1, которое специфически связывается с бета-амилоидом, в присутствии олигомера бета-амилоида. Если активация p38 MAP-киназы выше промежуточных уровней, уменьшают дозу и/или уменьшают частоту введения. Если активация p38 MAP-киназы ниже промежуточных уровней, увеличивают дозу и/или увеличивают частоту введения.
В некоторых вариантах осуществления модулятор пути передачи сигналов с участием p38 MAP-киназы вводят вместе с безопасным и функциональным антителом для корректировки активации p38 MAP-киназы до промежуточных уровней. Если активация p38 MAP-киназы выше промежуточных уровней, может вводиться совместно ингибитор пути передачи сигналов с участием p38 MAP-киназы. Если активация p38 MAP-киназы ниже промежуточных уровней, может вводиться совместно активатор пути передачи сигналов с участием p38 MAP-киназы.
Иллюстративные ингибиторы пути передачи сигналов с участием p38 MAP-киназы включают 4-[4-(4-фторфенил)-5-(4-пиридинил)-1-H-имидазол-2-ил]фенол («SB 202190»); 4-[5-(4-фторфенил)-2-[4-(метилсульфонил)фенил]-1H-имидазол-4-ил]пиридин («SB 203580») и транс-4-[4-(4-фторфенил)-5-(2-метокси-4-пиримидинил)-1-H-имидазол-1-ил]циклогексанол («SB 239063») и их фармацевтически подходящие производные.
Иллюстративные активаторы пути передачи сигналов с участием p38 MAP-киназы включают Анизомицин, MKK, Rac, Cdc42 и PAK1, IL-1, рецептор для IL-1, TNF, LPS, TRAF6 и TAB1/2.
В некоторых вариантах осуществления уровни промежуточной активации p38 MAP-киназы на 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50% или 45%-55% выше активации p38 MAP-киназы в глиальных макрофагах пациента в отсутствие безопасного и функционального антитела.
Для определения активации p38 MAP-киназы может использоваться любой способ, известный специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления ELISA вестерн-блоттинг или иммуноцитохимический анализ с использованием антитела, которое специфически связывается с фосфорилированной p38 MAP-киназой, используют для определения уровней фосфорилированной, т.е. активированной, p38 MAP-киназы. В некоторых вариантах осуществления активацию p38 MAP-киназы определяют с помощью иммуноцитохимического анализа с использованием антитела, которое специфически связывается с p38 MAP-киназой, для определения степени локализации в ядре p38 MAP-киназы. Чем выше степень локализации в ядре p38 MAP-киназы, тем выше уровень активации p38 MAP-киназы.
В некоторых вариантах осуществления можно определить активацию других компонентов в пути передачи сигналов с участием p38 MAP-киназы.
В некоторых вариантах осуществления можно определить уровни экспрессии мишени p38 MAP-киназы по ходу этого пути для определения активации p38 MAP-киназы у пациента. Такие мишени по ходу пути включают, но без ограничения, S6 киназу рибосомы с М.м. 90 кДа (pp90rsk); (RSK) семейство: RSK1, RSK2, MNK1/2 и MSK1/2; и факторы трансляции в ядре, такие как Elk-1, ATF2, STAT3 и CREB. Уровни экспрессии мишеней по ходу пути можно определить с помощью любого способа, известного специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, такого как, но без ограничения, блоттинг по Нозерну, Вестерн-блоттинг или выявление транскриптов с генов, с помощью, например, ОТ-ПЦР.
Кроме того, здесь предоставляется способ оценки безопасности и функциональности антитела против бета-амилоида для лечения болезни Альцгеймера у пациента. В некоторых вариантах осуществления глиальные макрофаги можно получить от пациента. В конкретном варианте осуществления глиальные макрофаги можно получить от пациента до начала лечения пациента антителом против бета-амилоида. Глиальные макрофаги от пациента можно поддерживать в культуре клеток, используя стандартные, известные в данной области техники методы.
В некоторых вариантах осуществления глиальные макрофаги от пациента инкубируют с антителом против бета-амилоида и олигомерами бета-амилоида. Могут определяться следующие параметры: связывание комплекса антитело-бета-амилоид с глиальными макрофагами; интернализация комплекса антитело-бета-амилоид в глиальные макрофаги и/или активация p38 MAP-киназы в глиальных макрофагах.
Контроли можно выполнить посредством инкубации глиальных макрофагов от пациента только с антителом против бета-амилоида (т.е. без олигомера бета-амилоида), и/или только с олигомерами бета-амилоида (т.е. без антитела), и/или с антителом против бета-амилоида изотипа IgG1 в присутствии олигомера бета-амилоида. В некоторых вариантах осуществления антитело против бета-амилоида является безопасным и функциональным, если активация p38 MAP-киназы на 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50% или 45%-55% выше активации p38 MAP-киназы в контрольных глиальных макрофагах пациента в присутствии олигомера бета-амилоида, но в отсутствие безопасного и функционального антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело против бета-амилоида является безопасным и функциональным, если интернализация бета-амилоида в глиальные макрофаги на 5%-15%; 10%-20%; 15%-25%; 20%-30%; 35%-45%; 40%-50% или 45%-55% выше или ниже таковой в случае моноклонального антитела MABT (смотрите раздел 6).
5.3 Безопасные и функциональные антитела
В некоторых вариантах осуществления константная область антитела, которое специфически связывается с амилоидным белком, вызывающим амилоидоз, подвергаемый лечению, можно модифицировать или заменить для обеспечения безопасного и функционального антитела. В некоторых вариантах осуществления константная область результирующего антитела связывается с промежуточной активностью с Fc-рецептором на поверхности иммуноцитов-эффекторов, таких как клетки-природные киллеры, макрофаги, нейтрофилы и тучные клетки. В некоторых вариантах осуществления результирующе антитело активирует путь с участием p38 MAPK в иммуноците-эффекторе на промежуточных уровнях, т.е. выше активации p38 MAP-киназы в отсутствие антитела, но ниже активации p38 MAP-киназы в присутствии той же концентрации антитела изотипа IgG1 с той же специфичностью связывания. В некоторых вариантах осуществления вариабельные области вне определяющих комплементарность участков («CDR») можно также модифицировать для обеспечения безопасного и функционального антитела. Также здесь предоставляются способы создания такого антитела и фармацевтические композиции, включающие такое антитело.
Специфичность связывания с антигеном обеспечивают определяющие комплементарность участки («CDR»), которые встроены в вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи антитела соответственно. Константные области антитела и каркасные области, окружающие CDR, которые могут использоваться для конструирования безопасных и функциональных антител, предоставляемых здесь, включает те, которые описаны в разделе 5.3.1. В некоторых вариантах осуществления CDR или вариабельные области, которые могут использоваться для конструирования безопасных и функциональных антител, могут происходить из антител, которые изложены в таблице 2.
В некоторых вариантах осуществления CDR известного антитела, которое специфически связывается с бета-амилоидом человека (смотрите таблицу 2 ниже), объединяют с константной областью IgG4 человека, а каркасные области между CDR антитела заменяют каркасными областями IgG человека, такого как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления вариабельные области известного гуманизированного антитела против бета-амилоида, например, Бапинеузумаба или Соланезумаба, объединяют с константной областью IgG4 человека.
5.3.1 Константные области
Константные области антитела для создания безопасных и функциональных антител, предоставляемых здесь, могут происходить от любого изотипа, в том числе IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В некоторых вариантах осуществления константные области антитела для создания безопасных и функциональных антител, предоставляемых здесь, могут происходить от подтипа IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
Аналогично каркасные области вариабельных областей тяжелой цепи антитела для создания безопасных и функциональных антител, предоставляемых здесь, могут происходить от любого изотипа, в том числе IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. В некоторых вариантах осуществления каркасные области антитела для создания безопасных и функциональных антител, предоставляемых здесь, могут происходить от подтипа IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
В конкретном варианте осуществления константная область для создания безопасного и функционального антитела, предоставляемого здесь, может происходить от изотипа IgG. В еще более конкретном варианте осуществления константная область для создания безопасного и функционального антитела, предоставляемого здесь, может происходить от изотипа IgG4.
В конкретном варианте осуществления каркасные области для создания безопасного и функционального антитела, предоставляемого здесь, могут происходить от изотипа IgG. В еще более конкретном варианте осуществления каркасные области для создания безопасного и функционального антитела, предоставляемого здесь, могут происходить от изотипа IgG4.
В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи безопасного и функционального антитела является химерной константной областью за счет различных изотипов или подтипов. В конкретном варианте осуществления константная область тяжелой цепи является химерой между той частью константной области тяжелой цепи IgG4, которая ответственна за эффекторную функцию IgG4, и отличным подтипом IgG. В конкретном варианте осуществления константная область тяжелой цепи является химерой между CH2-доменом константной области тяжелой цепи IgG4 человека и отличным подтипом IgG.
В некоторых вариантах осуществления химерная константная область обладает промежуточной активностью связывания с FcγR, описываемой ниже. В некоторых вариантах осуществления химерная константная область опосредует интернализацию в иммуноциты-эффекторы, такие как глиальные макрофаги, так, что активность пути с участием p38 MAP-киназы находится на промежуточном уровне, как определено с помощью системы для анализа на основе клеток, описанной в разделе 5.1.
В некоторых вариантах осуществления константную область подвергают оптимизации путем введения мутаций. Мутации можно ввести в константную область, используя технологию рекомбинантных ДНК. В некоторых вариантах осуществления результирующие антитела поддерживают интернализацию бета-амилоида в глиальные макрофаги на высоких уровнях, в то время как активация p38 MAP-киназы находится на промежуточных уровнях. Степень интернализации и активации p38 MAP-киназы можно определить, используя систему для анализа на основе клеток, описанную в разделе 5.1. В некоторых вариантах осуществления антитело с мутированной константной областью обладает промежуточной активностью связывания с Fc-рецептором, описываемой ниже.
В некоторых вариантах осуществления константную область подвергают оптимизации путем изменения профиля гликозилирования. Профиль гликозилирования можно изменить посредством экспрессионной системы, в которой синтезируется антитело, и/или мутирования аминокислоты, которая подвергается гликозилированию (например, Asn297). В некоторых вариантах осуществления результирующие антитела поддерживают интернализацию бета-амилоида в глиальные макрофаги на высоких уровнях, в то время как активация p38 MAP-киназы находится на промежуточных уровнях. Степень интернализации и активации p38 MAP-киназы можно определить, используя систему для анализа на основе клеток, описанную в разделе 5.1. В некоторых вариантах осуществления антитело, имеющее константную область с измененным профилем гликозилирования, обладает промежуточной активностью связывания с Fc-рецептором, описываемой ниже.
В некоторых вариантах осуществления константная область обладает промежуточной активностью связывания со своим Fc-рецептором. В таблице 1 изложены иллюстративные Fc-рецепторы и соответствующий им основной лиганд-антитело. Активность связывания между лигандом-антителом и Fc-рецептором можно определить, используя любой способ, известный специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники. Приводимые в качестве примера способы определения сродства включают, но без ограничения, анализы ELISA и анализы с использованием BIACORE. В некоторых, более конкретных вариантах осуществления Fc-рецептором является Fc-рецептор, который опосредует интернализацию комплекса антитело-антиген в иммуноцит-эффектор. В некоторых, еще более конкретных вариантах осуществления Fc-рецептором является Fcγ-рецептор, который экспрессируется в глиальных макрофагах.
В некоторых вариантах осуществления константная область антитела является таковой изотипа IgG, а Fc-рецептором является Fcγ-рецептор. Константная область для создания безопасного и функционального антитела обладает активностью связывания с Fcγ-рецептором, которая находится между 10% и 30%, между 20% и 40%, между 30% и 50%, между 40% и 60%, между 50% и 70%, между 60% и 80% или между 70% и 90% от активности связывания IgG1 с Fcγ-рецептором. В конкретном варианте осуществления активность связывания константной области для создания безопасного и функционального антитела для лечения болезни Альцгеймера составляет 15%-25% или конкретнее приблизительно 20% активности связывания IgG1 с Fcγ.
В некоторых вариантах осуществления область с эффекторной функцией антитела против Аβ подвергают модификации из условия, чтобы эффекторная функция антитела уменьшалась или исключалась. Модификацией может быть любое генетическое изменение, приводящее к замене и/или делеции аминокислоты. В более конкретных вариантах осуществления константной областью является модифицированная константная область IgG1 с уменьшенной или исключенной эффекторной функцией. Такие модификации можно осуществить, как описано, например, в международной заявке на патент с № WO 00/42072, опубликованной 20 июля 2000 г., которая включена сюда в ее полном объеме. В некоторых вариантах осуществления способность антитела с модифицированной константной областью к связыванию со своим Fc-рецептором является уменьшенной по сравнению с таковой немодифицированной константной области. В других вариантах осуществления связывание между константной областью и ее Fc-рецептором не является измененным, но эффекторные функции, такие как цитотоксичность в присутствии клеток-эффекторов, являются уменьшенными по сравнению с таковыми немодифицированной константной области.
5.3.2 Вариабельные области
В некоторых вариантах осуществления вариабельные области антитела, которое, как известно, специфически связывается с бета-амилоидом и/или его патологической формой(ами), могут использоваться для создания безопасного и функционального антитела. В некоторых, более конкретных вариантах осуществления вариабельные области гуманизированного антитела, которое, как известно, специфически связывается с бета-амилоидом и/или его патологической формой(ами), могут использоваться для создания безопасного и функционального антитела. В некоторых вариантах осуществления вариабельные области получают из не относящегося к изотипу IgG4 гуманизированного антитела. В конкретном варианте осуществления вариабельные области получают из не относящегося к изотипу IgG4 гуманизированного антитела, а в качестве константной области используют константную область IgG4.
CDR антител, которые, как известно, связываются с представляющим интерес амилоидным белком, могут использоваться для создания безопасного и функционального антитела, применимого в описываемых здесь способах. В некоторых вариантах осуществления CDR антитела, которое, как известно, специфически связывается с бета-амилоидом и/или его патологической формой(ами), могут использоваться для создания такого безопасного и функционального антитела.
Иллюстративные антитела, CDR или вариабельные области которых могут использоваться, включают, но без ограничения, те, которые изложены в таблице 2.
В конкретном варианте осуществления CDR безопасного и функционального антитела настоящего изобретения являются следующими: CDR1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В другом конкретном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи безопасного и функционального антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В более конкретном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи безопасного и функционального антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на 100%аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7.
В другом конкретном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи безопасного и функционального антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. В более конкретном варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи безопасного и функционального антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
В еще более конкретном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи безопасного и функционального антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, а вариабельная область тяжелой цепи безопасного и функционального антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
В одном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи безопасного и функционального антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, а вариабельная область тяжелой цепи безопасного и функционального антитела настоящего изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая идентична на 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
Последовательность CDRL2 («KVSNRFS» (SEQ ID NO: 5)) антитела mMABT может быть подвергнута небольшой модификации без оказания вредного влияния на активность антитела. Консервативные замены можно осуществить через замену К на R в положении 50 и N на S в положении 53. Двумя альтернативными последовательностями CDRL2, следовательно, являются «RVSNRFS» и «KVSSRFS» соответственно. Их включают в последовательность VK мыши без других изменений, в виде VK-R mMABT и VK-S mMABT соответственно.
5.3.3 Конструирование антител
В некоторых вариантах осуществления CDR антитела, которое специфически связывается с амилоидным белком или его патологической формой, такой как бета-амилоид, встраивают в антитело с константными областями, в соответствии с безопасным и функциональным антителом настоящего изобретения (раздел 5.3.1). В некоторых вариантах осуществления вариабельные области антитела, которое специфически связывается с амилоидным белком или его патологической формой, такой как бета-амилоид, объединяют с константными областями в соответствии с безопасным и функциональным антителом настоящего изобретения (раздел 5.3.1).
Способы конструирования гуманизированных антител хорошо известны в данной области техники. Например, способы создания гуманизированных антител описываются в международной заявке на патент с № PCT/US2007/073504, опубликованной как WO 2008/011348, которая включена сюда посредством ссылки в ее полном объеме.
5.3.4 Проверки на безопасность
Побочные эффекты, отмечаемые во время лечения болезни Альцгеймера антителами против бета-амилоида, включают воспалительные побочные эффекты, такие как менингит и менингоэнцефалит, и скопление жидкости в головном мозге (отек мозга). Другие побочные эффекты включают побочную иммунную реакцию, т.е. иммунную реакцию пациента против введенного антитела против бета-амилоида.
5.3.4.1 Побочная иммунная реакция
Одним побочным эффектом, который можно контролировать у пациента, который получил антитело против бета-амилоида, является гуморальный иммунный ответ на это антитело. Любой метод, известный специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, для выявления, контролирования или определения степени такой побочной реакции может использоваться. Такой гуморальный иммунный ответ проявляется, когда антитело связывается с антителом против бета-амилоида. Когда растворимые антигены вступают в соединение с антителами в васкулярном компартменте, они могут образовывать циркулирующие иммунные комплексы, которые неспецифически захватываются в сосудистых ложах различных органов, вызывая так называемые болезни иммунных комплексов, такие как сывороточная болезнь, васкулит, нефрит, системная красная волчанка с васкулитом или гломерулонефрит.
Болезнь иммунных комплексов можно выявить и/или контролировать, используя любой способ, известный в данной области техники. Например, тест на иммунные комплексы может использоваться для доказательства наличия циркулирующих иммунных комплексов в крови для оценки тяжести болезни иммунных комплексов. Тест на иммунные комплексы может быть выполнен с помощью любого способа, известного специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники. В частности, тест на иммунные комплексы может быть выполнен, используя любой один или более способов, описанных в патенте США с № 4141965, патенте США с № 4210622, патенте США с № 4210622, патенте США с № 4331649, патенте США с № 4544640, патенте США с № 4753893 и патенте США с № 5888834, каждый из которых включен сюда посредством ссылки в его полном объеме.
Другим способом является использование иммуноанализа, такого как иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA), для выявления антиидиотипических антител против антитела. Смотрите Gerostamoulos, J. et. al. (2001). The Use Of Elisa (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Screening In Postmortem Blood. TIAFT, The International Association of Forensic Toxicologists; Clarke, W. and Dufour, D.R., Editors (2006). Contemporary Practice in Clinical Chemistry, AACC Press, Washington, DC. Harris, N. and Winter, W; Presta патент США с № 6737056; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612); WO96/13590 и WO96/29605.
5.3.4.2 Отек
Одним побочным эффектом, который можно контролировать у пациента, который получил антитело против бета-амилоида, является отек, в частности, отек мозга, который можно оценить, например, с помощью изображения, полученного при магнитно-резонансной томографии (МРТ), МРТ с динамическим контрастированием, позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) и/или компьютерной томографии (КТ). Любой метод, известный специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, для выявления, контролирования или определения степени отека может использоваться. Отек можно также определить в модели отека на животном. В таких способах рассчитываются размеры отека (преобладание размера ипсилатерального полушария над размером контралатерального полушария).
На компьютерной томограмме и T1-средневзвешеннной МР-томограмме отек мозга можно визуализировать как очаг с пониженной плотностью или гиперинтенсивный очаг. Отек мозга и другие структуры с высоким содержанием воды, такие как спинномозговая жидкость, являются гиперинтенсивными на Т2-средневзвешеннной МР-томограмме. МР-томограммы, полученные с использованием инверсии-восстановления с подавлением сигнала от жидкости, дают дополнительную информацию, поскольку отек мозга ясно обнаруживается как гиперинтенсивный очаг на изо- или гиперинтенсивном фоне.
5.3.4.3 Менингит
Одним побочным эффектом, который можно контролировать у пациента, который получил антитело против бета-амилоида, является менингит. Любой метод, известный специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники, для выявления, контролирования или определения степени менингита может использоваться. Может также проводиться неврологическое исследование, включающее ряд тестов, предназначенных для оценки двигательной и сенсорной функции; нервной функции; слуха и речи; зрения; координации и равновесия; психического состояния и изменений настроения или поведения. Функцию нервной системы можно оценить благодаря тестам на силу и чувствительность с помощью таких предметов как камертон, маломощное освещение, молоточек для исследования рефлексов и булавки.
Анализируя спинномозговую жидкость, которая окружает и защищает головной мозг и спинной мозг, можно выявить острое и хроническое воспаление. В случае процедуры, известной как спинномозговая пункция (или люмбальная пункция), извлекают небольшое количество спинномозговой жидкости с помощью специальной иглы, которую вводят в нижний отдел спины. Вызывают онемение кожи с помощью местного анестетика до взятия образца. Жидкость, которая являются совершенно прозрачной у здоровых людей, исследуют для выявления присутствия бактерий или крови, а также для определения уровней глюкозы (низкий уровень глюкозы является признаком бактериального или грибкового менингита) и лейкоцитов (повышенные количества лейкоцитов также являются признаком инфекции). Процедуру обычно проводят в больнице, и она занимает приблизительно 45 минут.
Неинвазивные способы визуализации обычно используются для диагностирования менингита. Такая осуществляемая с помощью ЭВМ визуализация может обнаружить признаки воспаления головного мозга, внутреннее кровотечение или кровоизлияние и другие патологии головного мозга, которые могут быть связаны с менингитом. В компьютерной томографии, также известной как КТ-исследование, объединены рентгеновские лучи и компьютерная технология для получения быстрых, четких, двумерных изображений костей, органов и тканей. Иногда в кровоток вводят контрастное вещество для выделения различных тканей в головном мозге и для выявления воспаления при менингите. В случае магнитно-резонансной томографии (МРТ) используются электронно-генерированные радиоволны и сильный электромагнит для получения детальных изображений структур тела, в том числе тканей, органов, костей и нервов. Контрастное вещество может вводиться до исследования для выявления большого количества деталей. Другим методом визуализации, используемым для помощи в диагностировании менингита, является ультразвук.
С помощью электроэнцефалографии, или ЭЭГ, можно идентифицировать анормальные электроэнцефалограммы, связанные с менингитом, посредством слежения за электрической активностью головного мозга сквозь череп. ЭЭГ используется для помощи в диагностировании воспаления головного мозга.
5.3.5 Тесты на функциональность
5.3.5.1 Нейропсихологические исследования
Функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя одно или более нейропсихологических исследований. Приводимые в качестве примера нейропсихологические исследования описаны ниже и включают, без ограничения, те, которые разработаны Консорциумом по разработке диагностических критериев болезни Альцгеймера («CERAD»; смотрите, например, Morris JC, Mohs RC, Rogers H, Fillenbaum G, Heyman A. Consortium to establish a registry for Alzheimer's disease (CERAD) clinical and neuropsychological assessment of Alzheimer's disease. Psychopharmacol Bull. 1988; 24(4): 641-652; Morris JC, Heyman A, Mohs RC, Hughes JP, van Belle G, Fillenbaum G, Mellits ED, Clark C. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part I. Clinical and neuropsychological assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 1989 Sep; 39(9): 1159-1165; и Welsh K, Butters N, Hughes J, Mohs R, Heyman A. Detection of abnormal memory decline in mild cases of Alzheimer's disease using CERAD neuropsychological measures. Arch Neurol. 1991 Mar; 48(3): 278-281).
В одном варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя исследование когнитивных способностей по шкале оценки болезни Альцгеймера («ADAS-Cog»; смотрите, например, Rosen WG, Mohs RC, Davis L. A new rating scale for Alzheimer's disease. Am J Psychiatry. 1984 Nov; 141(11): 1356-1364; Ihl R, Brinkmeyer J, Janner M, Kerdar MS. A comparison of ADAS and EEG in the discrimination of patients with dementia of the Alzheimer type from healthy controls. Neuropsychobiology. 2000 Jan; 41(2): 102-107; и Weyer G, Erzigkeit H, Kanowski S, Ihl R, Hadler D. Alzheimer's Disease Assessment Scale: reliability and validity in a multicenter clinical trial. Int Psychogeriatr. 1997 Jun; 9(2): 123-138).
В другом варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя поведенческие расстройства по шкале оценки болезни Альцгеймера («BEHAVE-AD»; смотрите, например, Reisberg B, Borenstein J, Salob SP, Ferris SH, Franssen E, Georgotas A. Behavioral symptoms in Alzheimer's disease: phenomenology and treatment. J Clin Psychiatry. 1987 May; 48 Suppl: 9-15).
В другом варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя тест на информацию-память-концентрацию по шкале деменции Блесседа (смотрите, например, Blessed G, Tomlinson BE, Roth M. The association between quantitative measures of dementia and of senile change in the cerebral grey matter of elderly subjects. Br J Psychiatry. 1968 Jul; 114(512): 797-811).
В другом варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя Кембриджскую автоматизированную батарею нейропсихологических тестов («CANTAB»; смотрите, например, Swainson R, Hodges JR, Galton CJ, Semple J, Michael A, Dunn BD, Iddon JL, Robbins TW, Sahakian BJ. Early detection and differential diagnosis of Alzheimer's disease and depression with neuropsychological tasks. Dement Geriatr Cogn Disord. 2001; 12: 265-280; Fray PJ, Robbins TW. CANTAB battery: proposed utility in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 1996 Jul-Aug; 18(4): 499-504; и Robbins TW, James M, Owen AM, Sahakian BJ, McInnes L, Rabbitt P. Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery (CANTAB): a factor analytic study of a large sample of normal elderly volunteers. Dementia. 1994 Sep-Oct; 5(5): 266-281).
В другом варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя тест «рисования часов» (смотрите, например, Sunderland T, Hill JL, Mellow AM, Lawlor BA, Gundersheimer J, Newhouse PA, Grafman JH. Clock drawing in Alzheimer's disease. A novel measure of dementia severity. J Am Geriatr Soc. 1989 Aug; 37(8): 725-729; и Lee H, Swanwick GR, Coen RF, Lawlor BA. Use of the clock drawing task in the diagnosis of mild and very mild Alzheimer's disease. Int Psychogeriatr. 1996 Fall; 8(3): 469-476).
В другом варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя шкалу Корнелла для оценки депрессии при деменции («CSDD»; Alexopoulos GS, Abrams RC, Young RC, Shamoian CA. Cornell Scale for Depression in Dementia. Biol Psychiatry. 1988 Feb 1; 23(3): 271-284).
В другом варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя гериатрическую шкалу депрессии («GDS»; смотрите, например, Burke WJ, Roccaforte WH, Wengel SP. The short form of the Geriatric Depression Scale: a comparison with the 30-item form. J Geriatr Psychiatry Neurol. 1991 Jul-Sep; 4(3): 173-178).
В другом варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя краткую шкалу оценки психического состояния («MMSE»; смотрите, например, Folstein MF, Folstein SE, and McHugh PR. "Mini-Mental State": a practical method for grading the cognitive state of patients for the clinician. J Psychiatr Res. 1975; 12: 189-198; и Cockrell JR, and Folstein MF. Mini-Mental State Examination (MMSE). Psychopharm Bull. 1988; 24(4): 689-692).
В другом варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя опросник для оценки нейропсихиатрического состояния («NPI»; Cummings JL, Mega M, Gray K, Rosenberg-Thompson S, Carusi DA, Gornbein J. The Neuropsychiatric Inventory: comprehensive assessment of psychopathology in dementia. Neurology. 1994 Dec; 44(12): 2308-2314; Cummings JL. The Neuropsychiatric Inventory: assessing psychopathology in dementia patients. Neurology. 1997 May; 48(5 Suppl 6): S10-6).
В другом варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя 7-минутную проверку (смотрите, например, Solomon PR, Pendlebury WW. Recognition of Alzheimer's disease: the 7 Minute Screen. Fam Med. 1998 Apr; 30(4): 265-271; и Solomon PR, Hirschoff A, Kelly B, Relin M, Brush M, DeVeaux RD, Pendlebury WW. A 7 minute neurocognitive screening battery highly sensitive to Alzheimer's disease. Arch Neurol. 1998 Mar; 55(3): 349-355).
5.3.5.2 In vivo визуализация
Функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя визуализацию in vivo у субъектов.
Реагенты для визуализации можно вводить посредством внутривенной инъекции в тело пациента или непосредственно в головной мозг посредством внутричерепной инъекции или посредством просверливания отверстия через череп. Доза реагента должна находиться в тех же диапазонах, что и в случае способов лечения. Обычно реагент является меченым, хотя в некоторых способах первый реагент со сродством является немеченым, и используется второй агент для мечения, который связывается с первым реагентом. Выбор метки зависит от способа выявления. Например, флуоресцентная метка подходит для обнаружения оптическими методами. Применение парамагнитных меток подходит для томографического выявления без хирургического вмешательства. Радиоактивные метки можно также детектировать, используя позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) или однофотонную эмиссионную компьютерную томографию (ОФЭКТ).
Функциональность лечения можно оценить посредством сравнения числа, размера и/или интенсивности меченых очагов с соответствующими значениями базовой линии. Значения базовой линии могут представлять собой средние уровни в популяции индивидуумов, не страдающих болезнью Альцгеймера. Альтернативно значения базовой линии могут представлять собой первоначальные уровни, определенные у того же пациента. Например, значения базовой линии можно определить у пациента до начала лечения, и значения, определенные впоследствии, сравнить со значениями базовой линии. Уменьшение значений относительно базовой линии может означать положительную ответную реакцию на лечение.
Антитела против бета-амилоида также применимы для определения того, присутствуют ли усеченные формы Aβ в спинномозговой жидкости или других тканях или жидкостях организма. Присутствие таких форм на уменьшенных уровнях у пациента относительно базовой линии может означать положительную ответную реакцию на лечение.
(1) Позитронно-эмиссионная томография
11
18
18
18
11
18
18
В одном варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить посредством использования меченных радиоактивными изотопами веществ в качестве зондов вместе с позитронно-эмиссионной томографией (ПЭТ) для контролирования патофизиологии болезни Альцгеймера (смотрите, например, Nagren et al. 2009, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging, Radiopharmaceuticals for positron emission tomography investigations of Alzheimer's disease, с публикацией в Internet 22 декабря 2009.) Например, меченное С Питтсбурское соединение B можно использовать в качестве радиоактивного индикатора вместе с ПЭТ для визуализации массы амилоидных бляшек (смотрите, например, Rinne 2010 г., Lancet Neurology 9: 363-372). Другие меченые вещества для визуализации с помощью ПЭТ массы амилоидных бляшек включают меченные F Стилбены и Стирилпиридины (смотрите, например, Kung et al. 2010, Journal of Medicinal Chemistry 53: 933-941); меченное F производное бензотиазола (BTA) 3'-FFPIB; меченный C и F вариант производного Конго красного SB-13 и производное аминонафтилового FFDDNP (смотрите, например, Henriksen et al. 2008, European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Suppl 1: S75-81).
(2) Магнитно-резонансная томография
В одном варианте осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить посредством использования магнитно-резонансной томографии (МРТ). МРТ может использоваться для оценки изменений размеров в центральной нервной системе (смотрите, например, Fagan et al. 2009, Annals of Neurology 65: 176-183) и количественного определения вазогенного отека (смотрите, например, Black et al. 2010, Alzheimer Disease and Associated Disorders 24: 198-203).
5.3.5.3 Модели на животных
В некоторых вариантах осуществления функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно проверить in vivo, используя модель болезни Альцгеймера. Такие модели болезни Альцгеймера на животных хорошо известны в данной области техники и включают, без ограничения, модели с использованием мышей, крыс и приматов.
Приводимая в качестве примера модель болезни Альцгеймера на мышах включает мышей TgCRND8 (смотрите, например, Chishti, M. A. et al., Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenic mice expressing a double mutant form of amyloid precursor protein 695. J. Biol Chem 276, 21562-21570 (2001); Janus, C. et al., Aβ peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408, 979-982 (2000)). Мыши TgCRND8 экспрессируют трансген амилоидного белка-предшественника человека (APP695), содержащего две миссенс-мутации, которые, как известно, вызывают болезнь Альцгеймера у людей (M670/671NL и V717F). В возрасте приблизительно трех месяцев эти мыши демонстрируют прогрессирующие нехватки способности к пространственному обучению, которые сопровождаются как увеличением церебральных уровней Aβ, так и увеличением количеств церебральных экстраклеточных амилоидных бляшек. К шестимесячному возрасту уровни Aβ и морфология, плотность и распределение амилоидных бляшек в головном мозге мышей TgCRNDS схожи с таковыми, отмечаемыми в головном мозге людей с твердоустановившейся болезнью Альцгеймера. Как и в случае являющихся людьми пациентов с болезнью Альцгеймера, биохимические, поведенческие и нейропатологические признаки модели на мыши сопровождаются ускоренной смертностью. В данной области техники известны другие примерные модели болезни Альцгеймера на мышах, и такие мыши имеются в продаже (смотрите, например, Ресурсы в виде моделей болезни Альцгеймера на мышах, имеющиеся на Web-сайте The Jackson Laboratory).
Модели болезни Альцгеймера на приматах также известны в данной области техники (смотрите, например, Wenk, 1993, Behavioural Brain Research 57(2): 117-122; и Fainman et al., 2007, American Journal of Medical Genetics 144B(6): 818-819).
После лечения такой болезни Альцгеймера в случае моделей на животных функциональность лечения можно оценить, используя известные в данной области техники способы, в том числе, без ограничения, те, которые описаны ниже.
(1) Сбор сведений о выживании
Вероятность выживания мышей можно оценить с использованием метода Каплана-Майера, оценивая вероятность выживания в каждом случае гибели, делая ее тем самым подходящей для небольших размеров выборки. Для анализов выживания мышей можно разделить на группы: контрольную группу и группу(ы) лечения, и сравнение между группами можно осуществить, используя, например, критерий Тарона-Уэйра.
(2) Тест водного лабиринта Морриса
Тест водного лабиринта Морриса можно выполнить, как ранее описывалось (смотрите, например, Morris, R. Development of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J. Neurosci Methods 11, 47-60 (1984)). В случае этого способа мышь можно поместить в круглый бассейн, наполненный водой, со спасательной платформой, погруженной чуть ниже поверхности воды. Видимую отметку можно установить на платформе, чтобы животное могло найти ее, передвигаясь к ближайшему видимому знаку. (Альтернативно, мышей можно подвергнуть более сложной форме теста, в случае которой нет формальных знаков, указывающих на место платформы. В случае этой формы мыши должны узнать место платформы относительно удаленных видимых знаков.) Период времени, в течение которого мыши остаются в воде, обратно пропорционален когнитивной способности.
Приводимым в качестве примера тестом является тест, указанный далее: мыши начинают тест водного лабиринта Морриса с использованием скрытой платформы в день 1 без предварительного обучения. Мышей можно тестировать в течение 3 дней с использованием шести испытаний в день. На четвертый день платформу можно удалить из бассейна и каждой мыши дать одну 30-секундную пробную попытку плавать. В последний день мышей можно подвергнуть тесту с использованием знаков для оценки их способности к плаванию, зрения и общей познавательной способности. Тест с использованием знаков может быть составлен с использованием платформы, помещаемой в четверть круга, отличную от той, которая используется для тестирования и может быть снабжена флажком. Животным можно дать возможность отыскать платформу в течение 60 секунд. Животные, которые не найдут платформу, не используются в завершающих анализах пространственной памяти. Данные, касающиеся поведения, можно анализировать, используя смешанную модель факторного дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием лекарственного средства или генотипа и тренировки в качестве факторов повторных измерений.
(3) Двигательная активность
Двигательную активность можно оценить, используя известные подходы, например, используя вращающийся барабан (San Diego Instruments, San Diego, Calif.). Например, мышей можно анализировать в течение 2 дней на вращающемся барабане, как описывалось ранее (смотрите, например, Masliah, et al. (2000)). В случае такого анализа мышей в первый день можно тренировать в течение 5 испытаний: первого испытания при 10 оборотах/мин, второго - при 20 оборотах/мин и третьего-пятого - при 40 оборотах/мин. Во второй день мышей можно тестировать в течение 7 испытаний при 40 оборотах/мин каждое. Во время испытаний мышей можно помещать по одному на барабан, и скорость вращения увеличивают до соответствующей скорости в течение некоторого периода времени. Период времени, в течение которого мыши остаются на барабане (задержку падения), можно регистрировать и использовать в качестве показателя двигательной функции.
(4) Содержание амилоида в головном мозге
Содержание амилоида в головном мозге можно исследовать следующим образом: головной мозг исследуемых животных можно извлечь, и одно полушарие можно зафиксировать в 4%-ном параформальдегиде и залить парафином в срединной, сагиттальной плоскости. Для получения рядов системных, одинаковых, сделанных наугад срезов можно собрать последовательные срезы толщиной 5 микрометров по всему полушарию. Ряды срезов с 50-мкм интервалами можно использовать для анализов (10-14 срезов/ряд). Бляшки можно идентифицировать после демаскировки антигенов с помощью муравьиной кислоты и инкубации с первым антителом против бета-амилоида (например, Dako M-0872), а затем вторым антителом (например, Dako StreptABCcomplex/horseradish kit). Конечные продукты можно визуализировать с помощью диаминобензидина (DAB) и можно подвергнуть контрастирующему окрашиванию с использованием, например, люксола быстрого голубого. Массу амилоидных бляшек можно оценить, используя, например, программное обеспечение для анализа изображений Leco IA-3001, связанного с микроскопом Leica и видеокамерой Hitachi KP-M1U CCD. Программное обеспечение для получения изображений Openlab (Improvision, Lexington, Mass.) можно затем использовать для превращения микроснимков в двухуровневые изображения для определений числа бляшек и площадей бляшек.
(5) Бета-амилоид в плазме и головном мозге
Уровни бета-амилоида можно определить в плазме и головном мозге следующим образом: образцы полушарий можно гомогенизировать в забуференном растворе сахарозы, а затем с использованием либо 0,4% диэтиламина/100 мМ NaCl для определения уровней растворимого бета-амилоида, либо холодной муравьиной кислоты для выделения всего Aβ. После нейтрализации образцы можно подвергнуть разбавлению и анализу на предмет Aβ, используя имеющиеся в продаже наборы (например, те, которые предоставляются BIOSOURCE International). Анализы с использованием Вестерн-блоттинга можно выполнить на всех фракциях, используя гели с мочевиной для вида Aβ (смотрите, например, Wiltfang, J. et al., Highly conserved and disease-specific patterns of carboxyterminally truncated Abeta peptides 1-37/38/39 in addition to 1-40/42 in Alzheimer's disease and in patients with chronic neuroinflammation J Neurochem 81, 481-496 (2002)). Бета-амилоид можно выявить, используя, например, 6E10 (BIOSOURCE International) и усиленную хемилюминесценцию (Amersham).
(6) Анализ APP в головном мозге
APP можно выявить в головном мозге следующим образом: образцы полушарий мыши можно гомогенизировать и подвергнуть центрифугированию при 109000×g, в 20 мМ Трис (pH 7,4), 0,25M сахарозе, 1 мМ EDTA и 1 мМ EGTA и смеси ингибиторов протеаз, смешанных с использованием 0,4% DEA (диэтиламина)/100 мМ NaCl. Супернатанты можно подвергнуть анализу на предмет уровней APP с помощью Вестерн-блоттинга с использованием моноклонального антитела, тогда как осадки можно подвергнуть анализу на предмет простого белка APP с использованием, например, моноклонального антитела C1/6.1, как описывалось ранее (смотрите, например, Chishti, M.A. et al., Early-onset amyloid deposition and cognitive deficits in transgenic mice expressing a double mutant form of amyloid precursor protein 695. J. Biol Chem 276, 21562-21570 (2001); и Janus, C. et al, A.beta, peptide immunization reduces behavioural impairment and plaques in a model of Alzheimer's disease. Nature 408, 979-982 (2000)).
(7) Долговременная потенциация
Потенциалы поля можно зарегистрировать в отделе CA1 гиппокампа мыши, используя стандартные процедуры (смотрите, например, Sarvey, J M, Burgard E C & Decker G. Long-term potentiation: studies in the hippocampal slice. J Neurosci Methods 28, 109-124 (1989); и Stanton, P K & Sarvey J M. Norepinephrine regulates long-term potentiation of both the population spike and dendritic EPSP in hippocampal dentate gyrus. Brain Res Bull. 18, 115-119 (1987)). Головной мозг мышей можно извлечь, и из каждого полушария можно изолировать гиппокамп, из которого можно приготовить срезы (например, можно сделать 350 мкм корональные срезы). Срезы можно перенести в камеру хранения, содержащую NaCl-CSF, и дать возможность восстановится в течение более чем 1 часа. После помещения в камеру можно непрерывно осуществлять перфузию срезов с помощью замкнутой системы, содержащей 15 мл ACSF, для сохранения олигомерного Aβ. Через 20 минут после установления неизменяемой базовой линии в перфузионную систему можно добавить 1 мл 15X-сконцентрированной, кондиционированной с использованием 7PA2 среды. Биполярный стимулирующий электрод (например, те, которые предоставляются World Precision Inst.) можно разместить в коллатералях Шеффера для передачи стимулов базовой линии и тетанических стимулов. Отводящий электрод из боросиликатного стекла, содержащий ACSF, можно установить на расстоянии приблизительно 75-200 мкм от стимулирующего электрода. Интенсивность стимула (типично 10-20 мкампер) можно установить для получения 25-40% от максимального ответа в виде потенциала поля. Исследуемые стимулы в 0,05 Гц могут передаваться. Для индукции долговременной потенциации 4 тетанических стимула (100 Гц в течение 1 секунд) могут передаваться с интервалом в 5 минут. Ответы в виде потенциала поля можно увеличить в 10 раз, используя, например, Axopatch 200B. Данные можно собирать при 10 кГц и фильтровать при 2 кГц. Записи можно анализировать, используя, например, pClamp 9.2. Падение потенциала поля можно установить, используя приблизительно 10-60% полного ответа.
(8) Количественное определение синаптофизина
2
2
Иммуногистохимическое окрашивание синаптофизина можно выполнить на 3 расположенных с равными интервалами сагиттальных срезах фиксированных в параформальдегиде, подвергнутых лечению и контролю мышей. Срезы можно подвергнуть иммуномечению на синаптофизин с помощью, например, IgG против синаптофизина (1:40; Roche, Laval, PQ). Цифровые изображения можно зафиксировать и проанализировать. Внутри каждого среза могут быть подсчитаны синаптофизин-реактивные клеточные тела и окончания нейронов в трех случайно выбранных 100 мкм областях отдела CA1 гиппокампа. Результаты могут быть представлены в виде среднего значения количества реактивных тел и окончаний нейронов в 100 мкм (смотрите, например, Chen, F. et al. Carboxyl-terminal fragments of Alzheimer beta-amyloid precursor protein accumulate in restricted and unpredicted intracellular compartments in presenilin 1-deficient cells. J. Biol. Chem. 275, 36794-36802 (2002); Phinney, A. et al, No hippocampal neuron or synaptic bouton loss in learning-impaired aged β-amyloid precursor protein-null mice. Neuroscience 90, 1207-1216 (1999)).
(9) Условно-рефлекторное неприятие вкуса
Условно-рефлекторное неприятие вкуса (CTA) представляет собой чувствительный, широко известный стандартный тест, используемый для проверки когнитивной функции животных до и после назначения лечения. CTA используется для проверки способности животных к обучению ассоциировать страдание с новыми стимулами, такими как вкус, так что животные избегают новое вкусовое ощущение при последующем повторном подвергании воздействию новых стимулов. В CTA вовлекается головной мозг на множестве кортикальных и субкортикальных уровнях. Ассоциацию, которая связывает вместе информацию восходящего и нисходящего потоков, вызывая поведение неприятия, можно или ослабить, или усилить с помощью изменений, влияя на любую из взаимосоединяемых единиц. В качестве формы ассоциативного обучения силу CTA определяют с использованием большого количества переменных, включающих новизну стимула в ротовой полости (например, не являющиеся новыми стимулы не могут привести к выработке условно-рефлекторного неприятия), степень вызванного страдания (токсичность), число повторений (обучений), противодействующие стимулы (такие как жажда), среди прочих. Хотя широкое множество химических и физических агентов могут вызывать CTA дозозависимым образом, хлорид лития с большой долей вероятности вызывает недомогание и анорексию. Как и в случае встречающего в природе страдания, литий приводит к CTA в результате стимуляции описанных выше путей, включающих выброс цитокинов.
(10) Лабиринт Барнса
Лабиринт Барнса состоит из круглого стола с круглыми отверстиями по окружности стола. Под каждым отверстием находится люк для коробки, называемой коробкой-убежищем. Целью животного в лабиринте является достижение коробки-убежища, которая представляет собой коробку с открытым верхом и в которую можно попасть через одно из отверстий в верхней части стола. Оставление на поверхности стола служит в качестве негативного подкрепления, мотивируя исследуемого субъекта искать убежище. Единственным имеющимся убежищем является коробка-убежище, в которую исследуемое животное должно убегать. Чтобы приучить исследуемое животное к лабиринту, его направляют в коробку-убежище защищающей рукой. Через четыре-пять испытаний нормальный исследуемый субъект может быстро наметить точку нахождения люка. Неподвижные видимые знаки, установленные по платформе, служат для ориентации грызуна во время испытаний.
Выполнение обычно оценивают по количеству ошибок, которые делает субъект, т.е. числу раз, когда он сует свой нос в круглое отверстие, которое не содержит коробки-убежища, или склоняет свою голову над ним. Степень уменьшения количества ошибок/испытание определяют для совокупности субъектов. Могут также осуществляться другие оценки выполнения, например, используемая каждым грызуном стратегия может оцениваться как беспорядочная (беспорядочная проверка каждого отверстия), систематическая (проверка каждого отверстия по системе) или пространственная (прямое движение к отверстию с коробкой-убежищем).
(11) Отсроченный выбор по образцу
Процедуру отсроченного выбора по образцу (DMTS) обычно используют для оценки пространственной памяти и опознания у лабораторных животных. В приводимом в качестве примера протоколе субъекта помещают в камеру, снабженную двумя убираемыми рычагами и дозатором пищевых шариков. Спустя некоторый период времени предоставляется рычаг-образец, и субъект должен нажать на рычаг, чтобы получить пищу. Затем рычаг убирается, и спустя период времени задержки различной длительности снова предоставляются оба рычага, и требуется, чтобы субъект сделал выбор. В условиях соответствия правильным ответом могло бы быть нажатие на рычаг, который предоставлялся ранее, и он вознаграждается подачей пищевого шарика. Неправильный ответ сопровождается наказанием - 5-секундным периодом перерыва, во время которого выключают свет в жилище. Кратковременную память определяют посредством анализа количества правильных и неправильных ответов субъекта.
(12) Активация глиальных макрофагов
Активация глиальных макрофагов может играть полезную роль при лечении болезни Альцгеймера. Таким образом, функциональность описываемого здесь лечения болезни Альцгеймера можно оценить, используя известные способы определения активации глиальных макрофагов (смотрите, например, Higuchi, 2009, Current Alzheimer Research 6: 137-143). В таких способах используются методы визуализации, такие как те, которые описаны выше, в том числе ПЭТ, для определения уровней активации глиальных макрофагов подвергнутых лечению субъектов по сравнению с таковым контрольных субъектов.
5.4 Способы лечения
Здесь предоставляются способы безопасного и функционального лечения амилоидоза, в том числе, но без ограничения, болезни Альцгеймера, используя безопасные и функциональные антитела. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение не относящегося к изотипу IgG1 антитела, которое специфически связывается с амилоидным белком и/или его патологической формой, такой как агрегаты, используя дозу и/или схему введения из условия, чтобы p38 MAP-киназа активировалась на промежуточных уровнях в иммуноцитах-эффекторах. Используемый в этом разделе термин «промежуточные уровни» применительно к активации p38 MAP-киназы означает уровни, которые выше, чем в отсутствие антитела, но ниже, чем в присутствии антитела с той же специфичностью связывания, но с константной областью антитела изотипа IgG1. Уровни активации p38 MAP-киназы можно определить, как изложено в разделе 5.1.
В некоторых вариантах осуществления не относящееся к изотипу IgG1 антитело, которое специфически связывается с амилоидным белком и/или его патологической формой, такой как агрегаты, вводят, используя дозу и/или схему введения, которая приводит к максимальной интернализации антигена-мишени, такого как бета-амилоидный белок, в иммуноциты-эффекторы, такие как глиальные макрофаги, и активации p38 MAP-киназы на промежуточных уровнях. В некоторых вариантах осуществления антитело вводят в комбинации с модулятором пути с участием p38 MAP-киназы так, чтобы p38 MAP-киназа активировалась на промежуточных уровнях.
В некоторых вариантах осуществления не относящимся к изотипу IgG1 антителом, используемым в способах здесь, является антитело с константной областью антитела - IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления не относящееся к изотипу IgG1 антитело имеет константную область антитела - IgG с CH2-доменом антитела - IgG4 человека. В некоторых вариантах осуществления CDR известного негуманизированного антитела, которое специфически связывается с бета-амилоидом человека (смотрите таблицу 2 ниже), объединяют с константной областью антитела - IgG4 человека, а каркасные области между CDR антитела заменяют каркасными областями антитела - IgG человека, такого как IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления вариабельные области известного гуманизированного антитела против бета-амилоида, например, Бапинеузумаба или Соланезумаба, объединяют с константной областью антитела - IgG4 человека.
Интернализацию бета-амилоида в глиальные макрофаги и активацию p38 MAP-киназы можно определить, используя любой метод, известный специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления дозу безопасного и функционального антитела настоящего изобретения, используемого при лечении амилоидоза, в том числе, но без ограничения, болезни Альцгеймера, определяют, используя описанную в разделе 5.1 систему для анализа на основе клеток. В частности, дозу корректируют из условия максимизации интернализации бета-амилоида в глиальные макрофаги при активации пути с участием p38 MAP-киназы, которая меньше на 5%-15%, 10%-20%, 15%-25%, 20%-30%, 35%-45%, 40%-50% или 45%-55% таковой в присутствии антитела против бета-амилоида изотипа IgG1.
В некоторых вариантах осуществления схему введения безопасного и функционального антитела настоящего изобретения, используемого при лечении амилоидоза, в том числе, но без ограничения, болезни Альцгеймера, определяют, используя описанную в разделе 5.1 систему для анализа на основе клеток. В частности, дозу корректируют из условия максимизации интернализации бета-амилоида в глиальные макрофаги при активации пути с участием p38 MAP-киназы, которая меньше на 5%-15%, 10%-20%, 15%-25%, 20%-30%, 35%-45%, 40%-50% или 45%-55% таковой в присутствии антитела против бета-амилоида изотипа IgG1.
В некоторых вариантах осуществления дозу безопасного и функционального антитела настоящего изобретения корректируют из условия максимизации интернализации бета-амилоида в глиальные макрофаги при активации пути с участием p38 MAP-киназы, которая больше на 5%-15%, 10%-20%, 15%-25%, 20%-30%, 35%-45%, 40%-50% или 45%-55% уровней активации p38 MAP-киназы в отсутствие антитела.
В некоторых вариантах осуществления схему введения безопасного и функционального антитела настоящего изобретения, используемого при лечении амилоидоза, в том числе, но без ограничения, болезни Альцгеймера, определяют, используя описанную в разделе 5.1 систему для анализа на основе клеток. В частности, дозу корректируют из условия максимизации интернализации бета-амилоида в глиальные макрофаги при активации пути с участием p38 MAP-киназы, которая больше на 5%-15%, 10%-20%, 15%-25%, 20%-30%, 35%-45%, 40%-50% или 45%-55% уровней активации p38 MAP-киназы в отсутствие антитела.
В конкретных вариантах осуществления амилоидозом является болезнь Альцгеймера, амилоидным белком является бета-амилоид, а иммуноцитами-эффекторами являются глиальные макрофаги. Хотя способы и композиции изложены более детально специально для болезни Альцгеймера, эти способы и композиции в целом применимы для лечения и предупреждения амилоидозов, включающих, но без ограничения, вторичный амилоидоз и старческий амилоидоз, такой как заболевания, включающие, но без ограничения, неврологические нарушения, такие как болезнь Альцгеймера (AD), в том числе заболевания или состояния, характеризующиеся уменьшением способности к познанию и запоминанию, такие как, например, умеренное когнитивное нарушение (MCI), деменция, связанная с тельцами Леви, синдром Дауна, наследственное церебральное кровоизлияние, сопровождающееся амилоидозом (типа Дутча), сочетанная деменция Гуама-Паркинсона, а также другие заболевания, которые обусловлены или связаны с амилоидоподобными белками, такие как прогрессирующий надъядерный паралич, рассеянный склероз; болезнь Крейцфельдта-Якоба, болезнь Паркинсона, связанная с ВИЧ деменция, ALS (амиотрофический боковой склероз), миозит с тельцами включений (IBM), диабет взрослых, эндокринные опухоли и старческий сердечный амилоидоз и различные заболевания глаз, включающие дегенерацию желтого пятна, связанную с друзами невропатию зрительного нерва и катаракту вследствие отложения бета-амилоида. В конкретных вариантах осуществления амилоидозом является болезнь Альцгеймера, а пациентом является человек.
В некоторых вариантах осуществления лечение болезни Альцгеймера осуществляют, используя комбинацию безопасного и функционального антитела, предоставляемого здесь, и одного или более из следующих лекарственных средств, используемых в настоящее время для лечения болезни Альцгеймера, таких как такрин (COGNEX, Morris Plains, NJ), донепезил (ARICEPT, Tokyo, JP), ривастигмин (EXELON, East Hanover, NJ), галантамин (REMINYL, New Brunswick, NJ) и мемантин (NAMENDA, New York, NY).
5.5 Фармацевтический препарат и введение
Используя известные методы, безопасное и функциональное антитело, предоставляемое здесь (раздел 5.2), можно приготовить в физиологически приемлемой рецептуре, и оно может включать фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или наполнитель. Например, безопасное и функциональное антитело, описываемое здесь, объединяют с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или наполнителем для образования терапевтической композиции. Подходящие фармацевтические носители, разбавители и/или наполнители хорошо известны в данной области техники и включают, например, забуференные фосфатом солевые растворы, воду, эмульсии, такие как эмульсии типа «масло-в-воде», различные типы смачивающих веществ, стерильные растворы и т.д.
Приготовление фармацевтических композиций, предоставляемых здесь, можно выполнить в соответствии со стандартными методологиями, известными специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники.
Предоставляемая здесь фармацевтическая композиция может вводиться субъекту в твердой форме, в форме жидкости или аэрозоля в подходящей, фармацевтически функциональной дозе. Примеры твердых композиций включают таблетки, кремы и имплантируемые единицы дозирования. Таблетки могут назначаться орально. Терапевтические кремы могут применяться место. Имплантируемые единицы дозирования могут вводиться в определенное место, например, в опухолевый очаг, или могут имплантироваться для системного высвобождения терапевтической композиции, например, подкожно. Примеры жидких композиций включают препараты, подходящие для инъекции внутримышечно, подкожно, внутривенно, внутриартериально, и препараты для местного применения и внутриглазного введения. Примеры аэрозольных препаратов включают препараты-ингаляторы для введения в легкие.
Композиции могут вводиться с использованием стандартных путей введения. В общем, композиция может назначаться местно, вводиться через оральный, ректальный, назальный, чрескожный, внутрибрюшинный или парентеральный (например, внутривенный, подкожный или внутримышечный) пути. Кроме того, композиция может быть включена в матрицы для замедленного высвобождения, такие как биодеградируемые полимеры, полимеры, имплантируемые вблизи места, в которое доставка желательна, например, в опухолевый очаг. Способ включает введение однократной дозы, введение многократных доз с заранее заданными интервалами времени и непрерывное введение в течение заранее заданного периода времени.
Как здесь используется, матрица для замедленного высвобождения представляет собой матрицу, изготовленную из материалов, обычно полимеров, которые подвергаются деградации в результате ферментативного гидролиза или гидролиза в кислой/щелочной среде или в результате растворения. После введения в организм на матрицу воздействуют ферменты и жидкости организма. Желательно, когда матрицу для замедленного высвобождения выбирают в соответствии с биосовместимыми материалами, такими как липосомы, полилактиды (полилактидная кислота), полигликолиды (полимер гликолевой кислоты), сополимер полилактид-гликолид (сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты), полиангидриды, поли(орто)эфиры, полипептиды, гиалуроновая кислота, коллаген, хондроитина сульфат, карбоновые кислоты, жирные кислоты, фосфолипиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты, полиаминокислоты, аминокислоты, такие как фенилаланин, тирозин изолейцин, полинуклеотиды, поливинилпропилен, поливинилпирролидон и силикон. Широко применяемые биодеградируемые матрицы для целей настоящего изобретения включают, но без ограничения, матрицу из или полилактида, полигликолида, или сополимера полилактид-гликолид (сополимеров молочной кислоты и гликолевой кислоты).
Специалисту со средним уровнем компетентности в данной области техники хорошо известно, что доза композиции будет зависеть от различных факторов, таких как, например, подвергаемое лечение заболевание, конкретная используемая композиция и другие клинические факторы, такие как вес, размер, пол и общее состояние здоровья, площадь поверхности тела, конкретное вводимое соединение или композиция, другие лекарственные средства, вводимые одновременно, и путь введения.
Композиция может вводиться в комбинации с другими композициями, включающими биологически активное вещество или соединение, в частности, по меньшей мере одно соединение, выбираемое из группы, состоящей из соединений против окислительного стресса, противоапоптозных соединений, металлохелаторов, ингибиторов репарации ДНК, таких как пирензепин и метаболиты, 3-амино-1-пропансульфокислоты (3APS), 1,3-пропандисульфоната (1,3PDS), активаторов α-секретазы, ингибиторов β- и γ-секретаз, тау-белков, нейромедиаторов, разрушающих β-складчатую структуру агентов, аттрактантов для клеточных компонентов, очищающих от бета-амилоида/уменьшающих его, ингибиторов N-концевого усеченного бета-амилоида, в том числе Аβ3-42 с пироглютаматом, противовоспалительных молекул, нетипичных антипсихотических средств, таких как, например, клозапин, зипрасидон, рисперидон, арипипразол или оланзапин, или ингибиторы холинэстеразы (ChEI), такие как такрин, ривастигмин, донепезил и/или галантамин, агонистов M1 и других лекарственных средств, включающих любое лекарственное средство, модифицирующее амилоид или тау-белок, и питательных добавок, таких как, например, витамин B12, цистеин, предшественник ацетилхолина, лецитин, холин, гинкго билоба, ацетил-L-карнитин, идебенон, пропентофиллин или производное ксантина, вместе с антителом в соответствии с настоящим изобретением и необязательно фармацевтически приемлемым носителем и/или разбавителем и/или наполнителем и процедурами для лечения заболеваний.
Введение будет, как правило, осуществляться парентерально, например, внутривенно. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Неводные растворители включают, но без ограничения, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные растворители можно выбрать из группы, состоящей из воды, спиртовых/водных растворов, эмульсий или суспензий, включающих солевой раствор и забуференные среды. Носители для парентерального введения включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, раствор Рингера с лактатом или нелетучие масла. Носители для внутривенного введения включают пополнители жидкостей и питательных веществ, пополнители электролитов (такие как те, которые основаны на декстрозе Рингера) и другие. Также могут присутствовать консерванты, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатные добавки, инертные газы и т.д.
Фармацевтическая композиция может, кроме того, включать белковые носители, такие как, например, сывороточный альбумин или иммуноглобулин, в частности, человеческого происхождения. В фармацевтической композиции настоящего изобретения могут присутствовать дополнительные биологически активные агенты в зависимости от ее намеченного применения.
Когда мишень для связывания находится в головном мозге, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело или его активный фрагмент, которое пересекает гематоэнцефалический барьер. Некоторые нейродегенеративные заболевания сопровождаются увеличением проницаемости гематоэнцефалического барьера, так что антитело или его активный фрагмент может быть легко введен в головной мозг. Когда гематоэнцефалический барьер остается неповрежденным, существует несколько известных в данной области техники подходов для переноса молекул через него, включающих, но без ограничения, физические способы, способы на основе липидов и способы на основе рецепторов или каналов.
TM
Физические способы переноса антитела или его активного фрагмента через гематоэнцефалический барьер включают, но без ограничения, обход полностью гематоэнцефалического барьера или с помощью создания отверстий в гематоэнцефалическом барьере. Способы обхода включают, но без ограничения, прямое введение в головной мозг (смотрите, например, Papanastassiou et al, Gene Therapy 9: 398-406 (2002)) и имплантацию в головной мозг устройства для доставки (смотрите, например, Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003); и Gliadel Wafers, Guildford Pharmaceutical). Способы создания отверстий в барьере включают, но без ограничения, ультразвук (смотрите, например, публикацию заявки на патент с № 2002/0038086), осмотическое давление (например, посредством введения гипертонического раствора маннита (Neuwelt, E.A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989))), пермеабилизацию с помощью, например, брадикинина или пермеабилизатора A-7 (смотрите, например, патенты США с № 5112596, 5268164, 5506206 и 5686416) и трансфекцию нейронов, которые охватывают гематоэнцефалический барьер, векторами, содержащими гены, кодирующие антитело или антигенсвязывающий фрагмент (смотрите, например, публикацию заявки на патент США с № 2003/0083299).
Основанные на липидах способы переноса антитела или его активного фрагмента через гематоэнцефалический барьер включают, но без ограничения, включение антитела или его активного фрагмента в липосомы, которые соединяют со связывающими фрагментами антитела, которые связываются с рецепторами в эндотелии сосудов гематоэнцефалического барьера (смотрите, например, публикацию заявки на патент США с № 20020025313), и покрытие антитела или его активного фрагмента частицами липопротеинов низкой плотности (смотрите, например, публикацию заявки на патент США с № 20040204354) или аполипротеином E (смотрите, например, публикацию заявки на патент США с № 20040131692).
Основанные на рецепторах и каналах способы переноса антитела или его активного фрагмента через гематоэнцефалический барьер включают, но без ограничения, использование блокаторов рецепторов глюкокортикоидов для увеличения проницаемости гематоэнцефалического барьера (смотрите, например, публикации заявок на патенты США с № 2002/0065259, 2003/0162695 и 2005/0124533); активацию калиевых каналов (смотрите, например, публикацию заявки на патент США с № 2005/0089473), ингибирование ABC-транспортеров лекарственных средств (смотрите, например, публикацию заявки на патент США с № 2003/0073713); покрытие антител трансферрином и модулирование активности одного или более рецепторов трансферрина (смотрите, например, публикацию заявки на патент США с № 2003/0129186) и катионизацию антител (смотрите, например, патент США с № 5004697).
Специалист со средним уровнем компетентности в данной области техники определит или будет способен определить, используя не более чем обычное экспериментирование, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных здесь. Такие эквиваленты, как предполагается, охватываются следующей формулой изобретения.
Все ссылочные документы, приведенные здесь, включены сюда посредством ссылки в их полном объеме и для всех целей в той же степени, как если бы было специально и отдельно указано, что каждая отдельная публикация или патент или заявка на патент включена посредством ссылки в ее полном объеме для всех целей.
Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными здесь. В самом деле, различные модификации настоящего изобретения, помимо тех, которые здесь описаны, станут очевидными для специалиста со средним уровнем компетентности в данной области техники, исходя из вышеприведенного описания и сопроводительных фигур. Такие модификации, как предполагается, попадают в объем прилагаемой формулы изобретения.
6. ПРИМЕРЫ
6.1 Идентификация гуманизированного антитела изотипа IgG4, которое связывается одинаково с множеством конформаций Aβ
Мышиные моноклональные антитела против Aβ были порождены посредством иммунизации мышей антигеном в виде Aβ пептида, используя липосомный вакцинный препарат, как описывалось ранее (Muhs et al., 2007). Для отбора антител-кандидатов использовали несколько критериев, включающих способность к связыванию с множеством разновидностей Aβ и к ингибированию сборки Aβ1-42 в небольшие цитотоксичные агрегаты пептидов. Мышиное моноклональное антитело мАт с остовом IgG2b (mMABT) было выбрано для исследований функциональности in vivo, используя обе модели болезни Альцгеймера на мышах с одним трансгеном - мутантным APP человека или двумя трансгенами - мутантным APP/PS1 человека. Лечение mMABT улучшало память и уменьшало массу бляшек (смотрите фиг.7). mMABT было в дальнейшем подвергнуто созреванию аффинности и гуманизации к остову IgG4 человека (результирующее антитело также называют «MABT»). Для проверки связывания MABT с Aβ in vitro был приготовлен и охарактеризован ряд различных препаратов Aβ1-42. Они изменялись от фракций мономерного и олигомерного Aβ1-42, выделенных с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), зрелых Aβ1-42 волокон, до более сложной смеси в высокой степени нейротоксичных агрегатов олигомеров Aβ1-42, размер которых колеблется от димеров и тримеров до более высокомолекулярных мультимеров (смотрите фиг.8). Связывание MABT с различными препаратами пептида Aβ1-42 определяли с помощью ELISA, и, как и в случае с mMABT, было установлено, что оно является весьма сопоставимым среди различных форм сборки Aβ1-42 (фиг.1A-C).
Впоследствии проверяли связывание MABT с Aβ бляшками в головном мозге трансгенных мышей, экспрессирующих амилодный белок-предшественник человека (hAPP), и с амилоидными бляшками в срезах головного мозга человека с AD. Амилоидные бляшки и у hAPP-трансгенных мышей (фиг.1D наверху), и головном мозге человека с AD (фиг.1D внизу) были имммунопомечены моноклональным антителом MABT. Взятые вместе, эти данные прочно подтверждают связывание MABT и с растворимыми нейротоксичными олигомерами Aβ, и с агрегатами Aβ, присутствующими в головном мозге больных AD.
6.2 Ингибирование патологической сборки Aβ и дезагрегация ранее образованных протофибриллярных Aβ1-42 пептидов
In vitro данные показали, что антитела против Aβ после объединения с Aβ могут предотвращать образование патологических агрегатов Aβ более высокого порядка и аннулировать ранее образованные агрегаты Aβ (Legleiter et al., 2004; Solomon et al., 1997). Эпитоп, связывающийся с моноклональным антителом MABT, был поставлен в соответствии с аминокислотами 14-23 Aβ1-42 и, следовательно, перекрывается с основным гидрофобным катионным сегментом Aβ1-42, ответственным за самоассоциацию, последующую олигомеризацию и основу сборки в β-складчатую структуру Aβ1-42 (Pike et al., 1993; Esler et al., 1996; Haass and Selkoe, 2007). Эффекты MABT на in vitro агрегацию Aβ1-42 проверяли, используя тиофлавин-T (ThT), краситель, который не мешает сборке амилоида, но флуоресцируют после связывания с небольшими агрегатами амилоида с большим количеством β-складчатых структур (Levine, III, 1993). По сравнению с контрольным моноклональным антителом против Aβ, направленным против N-конца Aβ1-42 (и, соответственно, без перекрывания с основными аминокислотами, которые образуют домен самосборки), MABT продемонстрировало сильный ингибиторный эффект в отношении агрегации Aβ1-42 (фиг.1E левая панель) и рассеивание ранее агрегированного пептида Aβ1-42 (фиг.1E правая панель). Контрольное моноклональное антитело, направленное против N-конца Aβ, обладало приблизительно половиной ингибиторной активности моноклонального антитела против срединного домена MABT в обоих анализах. Схожие результаты были получены, когда MABT было подвергнуто сравнению с моноклональным антителом против C-конца Aβ (не представлено). Эти in vitro анализы основываются на способности ThT к связыванию с растянутыми β-складчатыми структурами пептида Aβ1-42 (Levine, 111, 1993). Поэтому для подтверждения того, что это не было артефактом вследствие возможного, опосредуемого моноклональным антителом вытеснения связывания ThT с Aβ1-42, богатым β-складчатыми структурами, был выполнен анализ, который не основывается на флуоресценции ThT, а точнее основывается на способности меченого Aβ1-42 к агрегации или самоагрегации к иммобилизованному немеченому Aβ1-42. В этом анализе были получены сравнимые результаты, а именно, что MABT предотвращало самоагрегацию Aβ1-42 дозозависимым образом (фиг.1F). Эти результаты показывают, что антитело, направленное против срединного домена Aβ, такое как MABT оказывает самый сильный ингибиторный эффект в отношении удлинения Aβ1-42 фибрил и/или агрегации по сравнению с антителами, мишенями которых служат другие домены Aβ, в этом анализе.
Было установлено, что способность растворимых олигомеров Aβ1-42 к связыванию с другими белками, как растворимыми, так и связанными с мембраной, вносит вклад в их токсичность (Strittmatter et al., 1993; Liu et al., 2009). В месте взаимодействия ApoE4 с Aβ1-42 требуются аминокислоты 18-28 (Strittmatter et al., 1993). Эффект MABT на связывание Aβ1-42 с рекомбинантным ApoE4 человека исследовали in vitro и сравнили с моноклональными антителами, специфическими для N- или C-конца Aβ1-42. В условиях использования концентраций насыщения ApoE4 и Aβ1-42 MABT ингибировало взаимодействие Aβ1-42 и ApoE4 на более 80%, больше чем при использовании любого из других исследованных моноклональных антител (смотрите фиг.9). В итоге, эти данные указывают на то, что MABT предотвращает дальнейшую олигомеризацию Aβ1-42 в токсичные, биологически активные агрегированные формы и рассеивает уже агрегированные или связанные с бляшками Aβ1-42. Кроме того, MABT против расположенного в центральной части эпитопа может конкурировать за взаимодействие Aβ пептидов с другими белками, такими как ApoE, блокируя тем самым взаимодействия с Aβ, для которых требуются аминокислоты в центральном домене Aβ, в том числе самоассоциацию.
6.3 MABT-опосредованная нейтрализация нейротоксических эффектов олигомеров Aβ1-42 in vitro
Учитывая и биохимические данные, и in vivo данные по функциональности, указывающие на терапевтическую функциональность моноклонального антитела MABT, были исследованы эффекты моноклонального антитела МАВТ в модели первичной клеточной культуры, используя цитотоксичные олигомеры Aβ1-42. Первичные клеточные культуры коркового слоя крыс Р1 наращивали и обрабатывали только олигомерами Aβ1-42 или олигомерами в комплексе с МАВТ. Во всех экспериментах в качестве контроля использовали неспецифическое антитело IgG. Обработка культур клеток коркового слоя 2,5 или 5 мкМ олигомеров Aβ1-42 в течение 24 ч приводила к уменьшению метаболизма, как определено по окислению МТТ в митохондриях (фиг.2А), в качестве показателя жизнеспособности клеток. Полную отмену токсичности отмечали в случае концентрации олигомера Aβ1-42 вплоть до 5 мкМ в присутствии МАВТ (молярное соотношение МАВТ : олигомер Aβ1-42 = 1:7,5). Для подтверждения этих результатов была измерена выработка АТФ, используя люминесцентный анализ, и она также указывала на аналогичные цитопротективные эффекты МАВТ (фиг. 2В). Для дальнейшей оценки эффекта МАВТ на Aβ1-42-опосредованную гибель нейронов нейроны коркового слоя эмбриона мыши поддерживали в культуре в течение шести дней и обрабатывали Aβ1-42 вместе с МАВТ или без него в течение четырех дней. Контрольные культуры продемонстрировали морфологию здоровых клеток (фиг.2С, крайняя слева панель). Обработка Aβ1-42 в течение четырех дней приводила к дегенерации аксонов и вызывала уменьшение общего количества аксонов (фиг.2С, центральная панель). Клетки, обработанные комбинацией Aβ1-42 и МАВТ, выглядели похожими на контрольные клетки (фиг.2С, крайняя справа панель). Эти результаты показывают, что моноклональное антитело против Аβ МАВТ было способно защищать и культуры клеток коркового слоя крысы от резкого, опосредуемого олигомерами Aβ1-42 уменьшения жизнеспособности, и нейроны коркового слоя эмбриона мыши от Aβ1-42-индуцируемой дегенерации.
6.4 мАт против Аβ МАВТ ингибирует взаимодействие олигомеров Aβ1-42 с клеточными мембранами
Известно, что Аβ пептиды, особенно промежуточные продукты агрегации (Bateman et al., 2007), соединяются с различными липидами и белками, присутствующими в клеточных мембранах. Было проверено, проявляет ли МАВТ свои нейропротективные эффекты в результате уменьшения или даже блокирования связывания олигомеров Aβ1-42 с нейронами. Было выполнено иммунофлуоресцентное окрашивание связанного с мембраной Аβ. Олигомеры Aβ1-42 применяли к смешанным культурам клеток коркового слоя в течение 30 мин или 18 ч, после чего культуры окрашивали на предмет обнаружения Аβ и с использованием антитела против специфического для нейронов β-тубулина класса III, TuJ1. Обработка нейронов коркового слоя олигомерами Aβ1-42 приводила к сильному соединению Аβ с нейронами, в частности, с аксонами (фиг.3А, панели в середине и вставки). Совместная обработка МАВТ блокировала взаимодействие олигомеров Aβ1-42 с нейронами, особенно связывание с аксонами. Этот эффект был очевидно выражен уже через 30 мин (фиг.3А и 3В) и сохранялся в течение по меньшей мере 18 ч обработки (фиг.3В). Хотя мАт против N-конца Аβ (клон 6Е10) использовалось в этом анализе для окрашивания олигомеров Aβ1-42 (фиг. 3А), уменьшая тем самым вероятность конфликта между МАВТ и моноклональным антителом для выявления, используемым для окрашивания, эти результаты подтвердили, используя флуоресцентно меченный HiLyte Fluor-488 Aβ1-42. Обработка культур клеток коркового слоя этим непосредственно меченным Aβ1-42 пептидом послужила дополнительным подтверждением вывода о том, что МАВТ уменьшает связывание Aβ1-42 с аксонами в первичных клеточных культурах коркового слоя (фиг. 3С и 3D).
Было установлено, что накопление Aβ1-42 внутри нейронов вносит значительный вклад в дисфункцию нейронов (Casas et al., 2004; Wirths et al., 2001; Cleary et al., 2005; Oddo et al., 2003). Внутриклеточное накопление Aβ1-42 определяли в разъединенных с помощью трипсина клетках, используя анализ ELISA. Это анализ показал, что МАВТ уменьшало интернализацию олигомеров Aβ1-42 на более чем 60% (фиг. 3Е). Неожиданно данные иммунофлуоресцентных анализов также указали на то, что в присутствии МАВТ отмечается сдвиг соединения олигомеров Aβ1-42 от аксонов к клеточным контурам, напоминающим глиальные макрофаги (фиг. 3F).
6.5 Поглощение олигомеров Aβ1-42 глиальными макрофагами
Была изучена связь между образованием комплекса MABT/Aβ1-42 и поглощением Aβ1-42 глиальными макрофагами. Для подтверждения того, что олигомеры Aβ1-42, образовавшие комплекс с МАВТ, поглощаются микроглией, было получено конфокальное изображение подвергнутых обработке смешанных культур нейронов. Было установлено, что по сравнению с клетками, подвергнутыми обработке только олигомерами Aβ1-42, MABT опосредовало быстрое поглощение олигомеров Aβ1-42 клеточными контурами, вероятно, микроглией (фиг.4A). Это было очевидно выражено уже через 30 минут после начала обработки. Глиальные макрофаги играют важную роль в поглощении и деградации Aβ, функцию, которая подорвана у экспрессирующих APP мышей (Hickman et al, 2008). В связи с иммунотерапией с использованием антител против Aβ было выдвинуто предположение, что один возможный механизм, с помощью которого Aβ бляшки рассеиваются, осуществляется благодаря FcγR-связывающим способностям антитела против Aβ, связанного с Aβ (Koenigsknecht-Talboo et al., 2008). Однако поглощение комплексов антитело против Aβ/Aβ микроглией и активация FcγR могут инициировать становление этих клеток активированными.
Помимо преодоления непосредственной цитотоксичности олигомеров Aβ1-42 по отношению к нейронам терапевтическое антитело против Aβ в идеале, возможно, будет вызывать значительно уменьшенную провоспалительную реакцию со значительным уменьшением отрицательных последствий, являющихся следствием такой провоспалительной реакции. Поэтому MABT сравнили с антителами, содержащими те же антигенсвязывающие последовательности, но отличные остовы IgG с переменным сродством к FcγR и, следовательно, различным потенциалом активации микроглии. Эти антитела включали остов IgG1 человека дикого типа с полной способностью к связыванию с FcγR (MABT-IgG1) и остов IgG1 человека, несущий мутацию D265A (МАВТ-IgG1-D265A), которая значительно уменьшает связывание с FcγR (Shields et al, 2001). Все варианты остовов, которые были исследованы, связывались со схожими аффинностями с Аβ1-42, что подтверждено с использованием поверхностного плазмонного резонанса.
+
Способность этих различных остовов моноклональных антител к интернализации олигомеров Aβ1-42 в микроглию затем сравнивали, используя конфокальное изображение подвергнутых обработке олигомерами Аβ1-42 первичных глиальных макрофагов коркового слоя. Было установлено, что интернализация олигомеров Aβ1-42 находится в хорошем соответствии со связыванием с FcγR, при этом МАВТ-IgG1>МАВТ>МАВТ-IgG1-D265A (фиг. 4В и 4С). Для подтверждения того, что глиальные макрофаги действительно являются клетками, поглощающими Aβ1-42, образовавшим комплекс с моноклональными антителами, исследование повторяли, используя меченный HiLyte Fluor-488 Aβ1-42, и осуществляли совместное окрашивание на предмет обнаружения маркера глиальных макрофагов Ibal. После связывания с моноклональным антителом или МАВТ, или МАВТ-IgG1 меченый Aβ1-42 увеличивался в количестве в Ibal микроглии (фиг. 4D). В культурах клеток, подвергнутых обработке Aβ1-42 в комбинации с моноклональным антителом МАВТ-IgG1, глиальные макрофаги имели более плотные ядра и более яркое окрашивание Ibal, признаки, означающие большую опосредованную комплексом антиген/антитело активацию глиальных макрофагов. Для подтверждения различий в связывании с FcγR определяли связывание различных сшитых мАт-IgG с FcγRIIIa-V158 с низким сродством, и была установлена иерархия связывания МАВТ-IgG1>МАВТ>МАВТ-IgG1-D265A (фиг. 4Е). Связывание с другими членами семейства FcγR представлено на фиг. 10.
Была исследована способность различных IgG остовов моноклональных антител к отмене опосредованной олигомерами Aβ1-42 токсичности в смешанных первичных клеток коркового слоя. Для полной отмены опосредованной олигомерами Aβ1-42 токсичности требовалась функциональная активность связывания с FcγR, присутствующая в случае моноклональных антител и МАВТ, и МАВТ-IgG1 (фиг. 4F). Моноклональное антитело МАВТ-IgG1-D265A, у которого отсутствует функция связывания с FcγR, продемонстрировало лишь незначительную тенденцию к отмене опосредованной олигомерами Аβ1-42 токсичности. Неожиданно моноклональное антитело МАВТ-IgG1 дикого типа, которое обладает большим сродством к FcγR по сравнению с моноклональным антителом MABT-IgG4, имело тенденцию к меньшему протективному эффекту по сравнению с МАВТ. Таким образом, хотя связывание с микроглиальными FcγR необходимо для полного избавления, увеличенное связывание остова МАВТ-IgG1 с FcγR по сравнению с МАВТ может привести к нежелательной активации микроглии, которая может переводиться в уменьшение общей защиты от опосредованной олигомерами Аβ1-42 нейротоксичности.
6.6 Остов МАВТ-IgG1 дикого типа приводит к провоспалительной реакции микроглии
Пытаясь идентифицировать следующие за олигомерами Aβ1-42 медиаторы индуцируемой олигомерами Aβ1-42 токсичности, состояния активации которых изменяются под действием моноклональных антител против Аβ, было исследовано несколько возможных путей передачи сигналов. Роль р38 MAPK в содействии нейротоксичности и активации глиальных макрофагов была подтверждена в большом количестве документов (Li et al., 2004; Wang et al., 2004). Активацию p38 MAPK исследовали в смешанных первичных клеточных культурах коркового слоя, подвергнутых обработке только олигомерами Aβ1-42 или в комбинации с мАт против Аβ МАВТ, МАВТ-IgG1, МАВТ-IgG1-D265A, или контролем-IgG1, который не связывается с олигомерами Aβ1-42. В случае обработки клеток олигомерами Aβ1-42 активация р38 MAPK происходила в пределах 15 мин (не представлено) и достигала максимума через 30 мин. После комбинации с различными моноклональными антителами лишь МАВТ-IgG1, имеющее остов IgG1 дикого типа и обладающее наибольшим сродством к FcγR, увеличивало еще больше индуцируемую олигомерами Aβ1-42 активность р38 MAPK, что показано с помощью специфического для фосфо-p38MAPK ELISA (фиг. 5А). Поскольку различные антитела против Аβ связываются с Aβ1-42 со схожими аффинностями, моноклональное антитело МАВТ-IgG1 должно нейтрализовать токсичные олигомеры Aβ1-42 в той же степени, что и МАВТ. Однако большее сродство к FcγR остова IgG1 может привести к активации микроглии, которая может быть вредной для клеток, которые в высокой степени чувствительны к действиям олигомеров Aβ1-42, таких как нейроны. Моноклональное антитело MABT в комплексе с олигомерами Aβ1-42 не уменьшало индуцированную олигомерами Aβ1-42 активность p38 MAPK, а скорее продемонстрировало тенденцию к большей активности, что является отражением частичной активации FcγR этим антителом.
+
Поскольку в этих первоначальных анализах определялась общая активность p38 MAPK в смешанных культурах клеток коры, включающих как нейроны, так и глиальные макрофаги, проверили, является ли активность p38 MAPK, выявляемая после обработки клеток комбинацией олигомеров Aβ1-42 и MABT, специфической для глиальных макрофагов. Клетки обрабатывали, как и раньше, но в этот раз исследовали активность фосфо-p38MAPK с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания вместе с маркером глиальных макрофагов Iba1. После обработки олигомерами Aβ1-42 в комплексе с моноклональными антителами MABT или MABT-IgG1 приблизительно 93% клеток, которые были фосфо-p38MAP-положительными при окрашивании, были Ibal (фиг.5B). Для подтверждения активации p38 MAPK в глиальных макрофагах очищенные глиальные макрофаги обрабатывали таким же образом. В этих условиях опосредуемая комплексом Aβ1-42/IgG активация p38 MAPK была без труда определена (фиг.5C).
Для изучения вклада активации p38 MAPK в опосредованную олигомерами Aβ1-42 нейротоксичность клетки обрабатывали специфическим для p38 MAPK ингибитором второго поколения, а затем олигомерами Аβ1-42 отдельно или в комбинации с моноклональным антителом или МАВТ, или МАВТ-IgG1-D265A с низким сродством к FcγR. Неожиданно МАВТ-опосредованное увеличение сигнала МТТ было уменьшено до уровня в случае MABT-IgG1-D265A в присутствии ингибитора р38 MAPK, что указывает на уменьшение МАВТ-опосредованной функции избавления после ингибирования р38 MAPK (фиг. 5D). Ингибирование р38 MAPK не оказывало эффект на клетки, обработанные олигомерами Aβ1-42 в комплексе с моноклональным антителом MABT-IgG1-D265A. Эти результаты указывают на то, что, хотя моноклональное антитело МАВТ не стимулировало значительно уровни р38 MAPK по сравнению с теми, которые отмечались при использовании только олигомеров Aβ1-42, активация р38 MAPK действительно играет роль в МАВТ-опосредованной нейропротекции. Без ограничения какой-либо теорией клеточными мишенями этой активности в системе смешанной культуры являются глиальные макрофаги.
+
Для установления более прямой связи увеличения активности глиальных макрофагов с величиной последующей провоспалительной реакции измеряли выброс TNFα первичными клеточными культурами, обогащенными глиальными макрофагами (>61% Ibal, не представлено). Выброс провоспалительного TNFα обогащенными глиальными макрофагами после обработки олигомерами Aβ1-42 был уменьшенным в присутствии всех исследованных моноклональных антител против Аβ (фиг. 6). Однако наибольший эффект отмечался в присутствии МАВТ. Таким образом, моноклональное антитело против Аβ изотипа IgG4 может иметь более желательный профиль по сравнению с моноклональным антителом против Аβ изотипа IgG1, объединяя нейропротективные эффекты и способность к активации поглощения Аβ глиальными макрофагами с ограниченной активацией глиальных макрофагов.
6.7 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
6.7.1 Приготовление культуры клеток
2
2
2
2
4
4
Первичные клеточные культуры коркового слоя крысы были приготовлены, исходя из крыс Sprague-Dawley (Charles River Laboratories L'Arbresle, France) в день 1 после рождения, как описано Meberg и Miller (Meberg and Miller, 2003). Мозжечок и мозговые оболочки удаляли, а корковые слои разрезали на маленькие кусочки и подвергали диссоциации с помощью ферментативного расщепления при 37°С в буфере для диссоциации (папаин, CaCl, EDTA и HEPES; все от Invitrogen, Carlsbad, СА). ДНКазу (Invitrogen) добавляли на 10 мин. После диссоциации рассредоточенные кортикальные нейроны высевали в покрытые поли-L-лизином (0,01%; М.м. 150000-300000; Sigma) 6-луночные, 24-луночные или 96-луночные планшеты для культивирования тканей. Для иммуноцитохимического анализа клетки выращивали на покрытых покровных стеклах, в 24-луночных планшетах. Клетки поддерживали в среде Neurobasal (Invitrogen) без фенолового красного, с добавлением L-глютамина (2 мМ; Sigma), добавки В27 (Invitrogen) и пенициллина/стрептомицина (Sigma) во влажной камере при 37°С и CO. Спустя 1 ч и 30 мин в культуре среду заменяли кондиционированной в отношении астроцитов средой. Спустя еще 4 дня, в культуре пролиферацию клеток блокировали обработкой цитозин-арабинозидом (Ara-С) в концентрации 2,5 мкМ (Invitrogen). В этих условиях культивирования 20% клеток было идентифицировано как нейроны по окрашиванию NeuN/DAPI (не представлено). Эксперименты с использованием смешанных клеточных культур коркового слоя проводились, как правило, в день in-vitro («DIV») 6, кроме особо оговоренных случаев. Обогащенные глиальными макрофагами клетки, приготовляемые из коркового слоя и гиппокампа, получали, как описано выше, для культур клеток коркового слоя. Корковый слой и гиппокамп помещали в DMEM с высоким содержанием глюкозы и гомогенизировали пипетированием с использованием 10-мл пипетки, а затем с использованием шприца. Гомогенат центрифугировали в течение 3 мин при 1000×g, а затем осадок ресуспендировали в предварительно нагретой среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% FCS и пенициллин/стрептомицин (среде для глиальных макрофагов). Суспензию клеток затем переносили в матрас для культивирования тканей Т75 и сохраняли во влажной камере при 37°С и CO в течение 1 недели. Матрас встряхивали для отделения глиальных макрофагов от присоединенных клеток и собирали и промывали в DMEM. Результирующие клетки ресуспендировали в 1 мл среды для глиальных макрофагов, подсчитывали и засевали в количестве 5×10 клеток/лунку. Для подтверждения обогащения глиальными макрофагами клетки окрашивали с использованием маркеров астроцитов и глиальных макрофагов GFAP и Iba1 соответственно. Более 60% клеток были Iba1-положительными при окрашивании, без окрашивания клеток как на GFAP, так и на Iba1. Чистые глиальные макрофаги были приготовлены, исходя из мышей с заменой CX3CR1-GFP (Jackson Laboratories) в день 3 после рождения. Корковый слой и гиппокамп иссекали и измельчали в DMEM с высоким содержанием глюкозы, используя 10-мл пипетку, а затем иглу размером 18. Гомогенат центрифугировали в течение 3 мин при 1000×g, а затем осадок ресуспендировали в предварительно нагретой среде DMEM с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% FCS и пенициллин/стрептомицин (среде для глиальных макрофагов). Суспензию клеток затем переносили в матрас для культивирования тканей T75 и сохраняли во влажной камере при 37ºC и CO в течение 7-10 дней. Глиальные макрофаги отделяли посредством встряхивания, собирали и промывали в DMEM. Результирующие клетки ресуспендировали в 1 мл среды для глиальных макрофагов, подсчитывали и засевали на обработанные предметные стекла с камерами для культивирования тканей в количестве 5×10клеток/лунку для использования в экспериментах.
6.7.2 Создание антител против Aβ
Моноклональное антитело против Aβ изотипа IgG4 - MABT является гуманизированной формой мышиного моноклонального антитела - IgG2b (mMABT), созданного в результате иммунизации мышей вакциной, приготовленной, как описывалось ранее (Muhs et al., 2007).
6.7.3 Связывание с FcγR
2
2
2
3
4
Связывание исследуемых антител с набором Fcγ-рецепторов человека (FcγR) измеряли, используя иммуноферментный твердофазный анализ (ELISA). FcγR человека (Genentech, Inc., CA) представляют собой гибридные белки, содержащие экстраклеточный домен γ-цепи рецептора вместе с меткой в виде полипептида Gly/6xHis/глютатион-S-трансфераза (GST) на C-конце. Моноклональное антитело с остовом IgG1 человека использовали в качестве положительного контроля (IgG1-контроля) в этом эксперименте. Планшеты покрывали мышиным моноклональным антителом против GST (Genentech, Inc.) в 0,05M натрийкарбонатном буфере (pH 9,6) в течение ночи при 4ºC. После блокирования буфером для анализа, содержащим забуференный фосфатом солевой раствор (PBS), 0,5% BSA и 0,05% Tween-20, планшеты инкубировали с FcγR при комнатной температуре в течение 1 ч. FcγR человека подвергались иммобилизации к планшету благодаря взаимодействию со слоем антитела против GST. Готовили последовательные разведения моноклональных антител против Aβ MABT, MABT-IgG1, MABT-IgG1-D26A или IgG1-контроля в буфере для анализа, содержащем 10% казеина в качестве блокатора в PBS (Pierce; Rockford, IL). Использовали разведенные образцы в виде мономерных форм для рецептора с высоким сродством (FcγRIa), или мультимерных форм для рецепторов с низким сродством (FcγRIIa, FcγRIIb и FcγRIIIa). Мультимерные формы исследуемых антител создавали сшиванием F(ab')-фрагмента козьего антитела против κ-цепи человека (MP Biomedicals, Solon, OH) с исследуемым моноклональным антителом в приблизительном молярном соотношении 3:1. Планшеты инкубировали с FcγR при комнатной температуре в течение 2 ч. Планшеты промывали трижды буфером для промывки, содержащим PBS и 0,05% Tween-20, после каждой стадии инкубации. Антитела, связанные с FcγR, выявляли с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) F(ab')-фрагмента козьего антитела против F(ab') человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories; West Grove, PA). Тетраметилбензидин (TMB; Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) служил в качестве субстрата. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 15-20 мин для допуска формирования цвета. Реакцию останавливали с помощью 1M HPO, и в считывающем устройстве для планшетов (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) измеряли оптическую плотность при 450 нм по отношению к таковой при 650 нм. Графики связывания вычерчивали посредством нанесения на них средних значений оптической плотности, исходя из двух повторов разведений образца, в зависимости от соответствующего разведения образца.
6.7.4 Исследования функциональности in vivo
Было выполнено два исследования для оценок функциональности in vivo. Для измерения вспоминания 12 мышей, экспрессирующих мутантный APP человека, в каждой группе получали две внутрибрюшинные инъекции моноклонального антитела MABT или носителя в качестве контроля (PBS). Через день после второй инъекции вспоминание исследовали, используя задачу распознания нового объекта (ORT), как описано (Dewachter et al., 2002). Индекс распознания (RI) определяли как отношение времени, затраченного на изучение нового объекта, ко времени, затраченному на изучение как нового объекта, так и объекта, наблюдаемого тремя часами ранее, показатель непространственной памяти, в которую вовлечен гиппокамп. В отдельном исследовании использовались положительные по амилоидным бляшкам мыши с двумя трансгенами - мутантным APP/PS1 человека для определения эффекта введения моноклонального антитела на массу бляшек в коре головного мозга. Мышам вводили внутрибрюшинно еженедельно 500 мкг моноклонального антитела MABT в течение 16-недельного периода, после чего определяли массу бляшек в горе головного мозга. Головные мозги иссекали, и правое полушарие мозга подвергали иммерсионной фиксации в 4% параформальдегиде в PBS в течение ночи, и сагиттальные вибратомные срезы (40 мкм) делали для инкубаций со свободным плаванием и хранили при 4°C в PBS с 0,1% азида натрия до окрашивания. Пять срезов на разных уровнях окрашивали для выявления плотных бляшек тиофлавином-S. Срезы подвергали рандомизации для окрашивания и слепого количественного определения. Изображения получали с использованием микроскопа Leica DMR, снабженного фотокамерой Sony DXC-9100P, и анализировали с использованием ЭВМ, используя программное обеспечение Leica Q-Win. На протяжении всего процесса получения изображений установки интенсивности света и конденсатора для микроскопа сохраняли неизмененными. Область опорной структуры выбирали для автоматического количественного определения амилоидной массы при окрашивании тиофлавином-S.
6.7.5 Приготовление токсичных олигомеров Aβ1-42
2
4
Aβl-42 пептид (Bachem) растворяли в HFIP, подвергали воздействию ультразвука и встряхивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем аликвоты сушили в потоке аргона, подвергали вакуумной сушке и хранили при -80ºC в виде тонкого слоя мономерного Aβ1-42 пептида до использования. 165-мкг аликвоту тонкого слоя пептида ресуспендировали в 7 мкл DMSO, 85 мкл PBS и 9 мкл 2% SDS и инкубировали в течение 6 ч при 37°С. Затем добавляли 300 мкл воды, и после инкубации в течение ночи при 37°С олигомеры Aβ1-42 осаждали с использованием 900 мкл раствора, содержащего 33% метанола и 4% уксусной кислоты, в течение 1 ч при 4°С, центрифугировали при 16200×g в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, и олигомеры Aβ1-42 высушивали до ресуспендирования в растворе NaHPO/NaCl до конечной концентрации 1 мкг/мкл.
6.7.6 Исследования цитотоксичности Аβ1-42
Цитотоксичность олигомеров Aβ1-42 проверяли на смешанных культурах клеток коркового слоя в DIV 5. Все антитела в конечной концентрации, составляющей 100 мкг/мл, инкубировали вместе с олигомерами Аβ1-42 в течение 30 мин в бессывороточной среде для культивирования клеток при 37°С до обработки клеток. В случае некоторых экспериментов смешанные культуры клеток коркового слоя предварительно обрабатывали в течение 1 ч 1 мкМ SB239063 сильным ингибитором р38 второго поколения перед обработкой олигомерами Aβ1-42. Для оценки жизнеспособности клеток в ответ на различные обработки выполняли стандартные анализы восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) (Promega, Madison, WI, США), следуя инструкциям производителя. Вкратце в течение последних 3 ч обработки клетки, выращиваемые в 96-луночных планшетах (Costar), инкубировали с раствором красителя МТТ и измеряли образование голубого продукта формазанового ряда посредством снятия показаний - оптической плотности при 570 и 690 нм, используя считывающее устройство для планшетов (Tecan). Результаты представляли в виде процента увеличения выживанию по сравнению с обработанными олигомерами Аβ1-42 клетками. Способность моноклонального антитела МАВТ к защите нейронов от индуцируемой олигомерами Aβ1-42 дегенерации также определяли в in vitro анализе, используя иммунофлуоресценцию. Нейроны коркового слоя эмбриона мыши в день 17,5 выделяли, подвергали диссоциации и культивировали in vitro в среде Neurobasal с добавкой В27. Aβ1-42 был приготовлен, как описано выше, для тонкого слоя мономерного Aβ1-42 пептида, после чего добавляли 10 мкл DMSO для растворения пептида. Затем добавляли 78,6 мкл среды Ham's-F12, и раствор Aβ1-42 пептида в концентрации 25 мкМ инкубировали при 4°С в течение 48 ч до обработки клеток. Клетки наращивали всего в течение девяти дней и подпитывали в день 3 и в день обработки. Для обработки Aβ1-42 в концентрации 2 мкМ с МАВТ в концентрации 50 мкг/мл или без него добавляли в день 5 или день 6, при этом только DMS0-F12 в том же объеме использовали в качестве контроля в виде носителя. В день 9, после 3 или 4 дней обработки, нейроны фиксировали и окрашивали TuJ1 антителом против β-тубулина. FITC-меченное второе антитело использовали для визуализации микротрубочек, используя флуоресцентный микроскоп.
6.7.7 Иммуногистохимический анализ
Для иммуногистохимического окрашивания использовали заделанные в парафин срезы височной доли головного мозга (20 мкм) от больных AD и от подобранных по возрасту контролей без AD (Tissue Solutions, Clydebank, UK). Подвергнутые депарафинизации срезы подвергали демаскировке антигена, используя муравьиную кислоту, а затем метили 50 мкг/мл МАВТ в качестве первого антитела. В качестве второго антитела использовали козье биотинированное антитело против IgG человека. Окрашивание осуществляли с использованием диаминобензидина (Dako, Glostrup, Дания) и крепления, используя среду для крепления Eukitt. Изображения получали на инвертированном микроскопе LSM 700 от Zeiss.
6.7.8 Специфический для Aβ1-42 ELISA
Для измерения внутриклеточного накопления Aβ1-42 с помощью ELISA первичные клеточные культуры коркового слоя обрабатывали в 6-луночных планшетах для культивирования клеток (Costar), после чего их промывали и разъединяли с помощью трипсина (Bateman et al., 2007) до лизиса в буфере для лизиса клеток, состоящем из 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ натрия ортованадата, 1% Triton Х-100 и содержащем смесь ингибиторов протеаз и фосфатаз. Концентрацию белка определяли с помощью анализа ВСА (Pierce). Специфический для Aβ1-42 ELISA с высокой чувствительностью (The Genetics Company, Inc., Zurich, Швейцария) использовали для измерения Aβ1-42 в клеточных лизатах в соответствии с инструкциями производителя.
6.7.9 Иммуноцитохимический анализ и получение конфокальных изображений
Клетки выращивали на покровных стеклах. После обработки клетки быстро промывали PBS, а затем фиксировали с использованием 4% параформальдегида в течение 20 мин. После тщательных промывок клетки погружали в 100% метанол на 10 мин при -20°С. Затем их снова промывали и инкубировали в растворе для блокирования, PBS, содержащем 10% нормальной козьей сыворотки, в течение 1 ч при комнатной температуре. После инкубации в течение ночи с первым антителом клетки промывали и инкубировали в течение 2 ч со вторым антителом, затем промывали и крепили на предметных стеклах, используя реагент против расплывания ProLong Gold (Invitrogen). Эпифлуоресцентные и конфокальные изображения получали на инвертированном микроскопе LSM 700 от Zeiss, используя 63х линзы. Интенсивность флуоресценции измеряли в клеточных телах, намеченных с помощью насыщенных эпифлуоресцентных изображений. Набор изображений плоскостей на различных глубинах внутри образца представляли в трехмерном изображении, используя ImageJ 1.42 (National Institutes of Health, Freeware), исходя из которого получали апикальную-дистальную часть, содержащую меченые белки. Клетки, обработанные меченным HyLite Fluor-488 Aβ1-42, обрабатывали таким же образом за исключением того, что первое или второе антитело не использовали для мечения Aβ1-42.
6.7.10 Специфический для фосфо-р38 ELISA
Культуры клеток коркового слоя крысы засевали в покрытые поли-L-лизином 6-луночные планшеты для культивирования клеток (Costar, Cambridge, MA, США) и использовали в DIV 5. Кроме особо оговоренных случаев, клетки обрабатывали 2 мкМ олигомеров Aβ1-42 вместе с моноклональным антителом в концентрации 100 мкг/мл или без него в течение 30 мин. В некоторых анализах клетки предварительно обрабатывали в течение 1 ч ингибитором р38 второго поколения SB239063. Анизомицин использовали в качестве положительного контроля. Обработки прекращали помещением клеток на лед и отсасыванием среды. Клетки промывали холодным как лед PBS, собирали, используя скребок для клеток, и лизировали в буфере для лизиса клеток, состоящем из 50 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ натрия ортованадата, 1% Triton X-100 и содержащем смесь ингибиторов протеаз и фосфатаз. Концентрацию белка определяли с помощью анализа ВСА (Pierce, Rockford, IL, США). Для полуколичественного показателя активации р38 MAPK использовали набор для специфического для фосфо-p38MAPK крысы колориметрического ELISA (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, США), следуя инструкциям производителя. Планшеты считывали на спектрофотометрическом считывающем устройстве для планшетов (Tecan) при 370 нм. В случае некоторых экспериментов фосфо-р38 исследовали, используя иммуноцитохимический анализ.
6.7.11 Выброс TNFα
+
+
Культуры клеток коркового слоя крыс, обогащенные глиальными макрофагами (>60% Iba от всех DAPI клеток), обрабатывали 10 мкМ олигомеров Aβ1-42 со 100 мкг/мл антител или без них в течение 6 ч и 24 ч. В качестве положительного контрольного стимула использовали LPS (Sigma) в концентрации 1 мкг/мл. Супернатанты клеток отбирали в указанные моменты времени, пропускали через 0,2 мкм фильтр, и проверяли на TNFα с использованием крысиного TNFα/TNFSF1A Quantikine (R&D Systems), следуя инструкциям производителя. Кроме того, культуры чистых глиальных макрофагов от детенышей с заменой CX3CR1-GFP Р3 обрабатывали 1 мкг/мл LPS, 10 мкМ олигомеров Aβ1-42 отдельно или в комбинации со 100 мкг/мл антител против Аβ МАВТ, МАВТ-IgG1, МАВТ-IgG1-D265A, контроля-IgG1, или только антителами в течение 24 часов. Супернатанты клеток отбирали, пропускали через 0,2 мкм фильтр и использовали для выполнения анализа для 23 мышиных цитокинов Bio-Plex (Bio-Rad, Hercules, CA, США).
6.7.12 Статистический анализ
Все статистические анализы выполняли, используя программное обеспечение GraphPad Prism версии 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, США). Данные представляли в виде средних величин ± среднеквадратическое отклонение (SD) или стандартная погрешность средней величины (SEM), как указано. Данные анализировали с использованием критерия Стьюдента, однофакторного дисперсионного анализа с последующими множественными сравнениями по полученным результатам с использованием критерия Тьюки или непараметрического критерия суммы рангов Уилкоксона в соответствующих случаях. Р-значение <0,05, как считали, указывает на статистически значимое различие.
6.7.13 In vivo визуализация амилоидных бляшек
Краниальные «окна» имплантировали выше соматосенсорной коры мышей, экспрессирующих hAPP(V717I)/PS1, возрастом 10 месяцев, как ранее описывалось (Trachtenberg et al 2002, Holtmaat et al 2009), за две 2 недели до первоначальной процедуры получения изображений. За двадцать четыре часа до каждой процедуры получения изображений животным вводили внутривенно 10 мг/кг метокси-X04 для визуализации отдельных амилоидных бляшек (Klunk et al 2002) и непосредственно перед получением изображений внутривенно вводили AngioSense680 (VisEn Medical) для визуализации кровеносных сосудов. В случае каждой процедуры получения изображений животных анестезировали с помощью смеси изофлуран-кислород и крепили к микроскопу, используя подпорку для головы. Изображения получали с помощью двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа (Ultima in vivo; Prairie Technologies), используя лазер на титан:сапфире (MaiTai DeepSee; Spectra Physics), настроенный на 820 нм, доставляя ~30 мВт на заднюю фокальную плоскость 40x NA 0,8 линз объектива (Olympus). Рисунок сосудистой сети использовали для воспроизводимого размещения мыши относительно объектива день за днем, делая возможным получение изображений индивидуальных амилоидных бляшек на протяжении множества недель. Объемы индивидуальных бляшек оценивали, суммируя количество пикселей выше фона в представляющей интерес области, очерченной вокруг конкретной бляшки. Фон определяют как среднюю интенсивность в пикселях плюс два среднеквадратических отклонения в представляющей интерес области, очерченной рядом с амилоидной бляшкой. После четвертой и восьмой процедуры получения изображений животным вводили внутрибрюшинную дозу - 60 мг/кг MABT.
Список литературы
Bandyopadhyay S, Hartley DM, Cahill CM, Lahiri DK, Chattopadhyay N, Rogers JT (2006) Interleukin-1 alpha stimulates non-amyloidogenic pathway by alpha-secretase (ADAM-10 and ADAM-17) cleavage of APP in human astrocytic cells involving p38 MAP kinase. J Neurosci Res 84:106-118.
Bateman DA, McLaurin J, Chakrabartty A (2007) Requirement of aggregation propensity of Alzheimer amyloid peptides for neuronal cell surface binding. BMC Neurosci 8:29.
Bitan G, Kirkitadze MD, Lomakin A, Vollers SS, Benedek GB, Teplow DB (2003) Amyloid beta -protein (Abeta) assembly: Abeta 40 and Abeta 42 oligomerize through distinct pathways Proc Natl Acad Sci USA 100:330-335.
Casas C, Sergeant N, Itier JM, Blanchard V, Wirths O, van der KN, Vingtdeux V, van de SE, 1 G, Canton T, Drobecq H, Clark A, Bonici B, Delacourte A, Benavides J, Schmitz C, Tremp G, Bayer TA, Benoit P, Pradier L (2004) Massive CA1/2 neuronal loss with intraneuronal and N-terminal truncated Abeta42 accumulation in a novel Alzheimer transgenic model. Am J Pathol 165:1289-1300.
Clark MR (1997) IgG effector mechanisms. Chem Immunol 65:88-110.
Cleary JP, Walsh DM, Hofmeister JJ, Shankar GM, Kuskowski MA, Selkoe DJ, Ashe KH (2C Natural oligomers of the amyloid-beta protein specifically disrupt cognitive function. Nat Neurosci 8:79-84.
Dewachter I, Reverse D, Caluwaerts N, Ris L, Kuiperi C, Van den HC, Spittaels K, Umans L, Serneels L, Thiry E, Moechars D, Mercken M, Godaux E, Van LF (2002) Neuronal deficiency presenilin 1 inhibits amyloid plaque formation and corrects hippocampal long-term potentiatio: but not a cognitive defect of amyloid precursor protein [V717I] transgenic mice. J Neurosci 22:3445-3453.
Doyle SE, O'Connell RM, Miranda GA, Vaidya SA, Chow EK, Liu PT, Suzuki S, Suzuki N, Modlin RL, Yeh WC, Lane TF, Cheng G (2004) Toll-like receptors induce a phagocytic gene program through p38. J Exp Med 199:81-90.
Esler WP, Stimson ER, Ghilardi JR, Lu YA, Felix AM, Vinters HV, Manryh PW, Lee JP, Maggio JE (1996) Point substitution in the central hydrophobic cluster of a human beta-amyloi congener disrupts peptide folding and abolishes plaque competence. Biochemistry 35:13914-13921.
Gallagher TF, et al. (1997) Regulation of stress-induced cytokine production by pyridinylimidazoles; inhibition of CSBP kinase. Bioorg Med Chem 5:49-64.
Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE (1998) The IgG Fc receptor family. Ann Hemato 76:231-248.
Gouras GK, Tsai J, Naslund J, Vincent B, Edgar M, Checler F, Greenfield JP, Haroutunian V, Buxbaum JD, Xu H, Greengard P, Relkin NR (2000) Intraneuronal Abeta42 accumulation in human brain. Am J Pathol 156:15-20.
Haass C, Selkoe DJ (2007) Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer's amyloid beta-peptide. pp 101-112.
Hickman SE, Allison EK, El KJ (2008) Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci 28:8354-8360.
Holmes C, Boche D, Wilkinson D, Yadegarfar G, Hopkins V, Bayer A, Jones RW, Bullock R, Love S, Neal JW, Zotova E, Nicoll JA (2008) Long-term effects of Abeta42 immunisation in Alzheimer's disease: follow-up of a randomised, placebo-controlled phase I trial. Lancet 372:216-223.
Kayed R, Head E, Thompson JL, Mclntire TM, Milton SC, Cotman CW, Glabe CG (2003) Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis. Science 300:486-489.
Koenigsknecht-Talboo J, Meyer-Luehmann M, Parsadanian M, Garcia-Alloza M, Finn MB, Hyman BT, Bacskai BJ, Holtzman DM (2008) Rapid Microglial Response Around Amyloid Pathology after Systemic Anti-A{beta} Antibody Administration in PDAPP Mice. J Neurosci 28:14156-14164.
Lambert MP, Barlow AK, Chromy BA, Edwards C, Freed R, Liosatos M, Morgan TE, Rozovsky I, Trommer B, Viola KL, Wals P, Zhang C, Finch CE, Krafft GA, Klein WL (1998) Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abetal-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A 95:6448-6453.
Lee EB, Leng LZ, Lee VM, Trojanowski JQ (2005) Meningoencephalitis associated with passive immunization of a transgenic murine model of Alzheimer's amyloidosis. FEBS Lett 579:2564-2568.
Lee EB, Leng LZ, Zhang B, Kwong L, Trojanowski JQ, Abel T, Lee VM (2006) Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice. J Biol Chem 281:4292-4299.
Lee JC, Laydon JT, McDonnell PC, Gallagher TF, Kumar S, Green D, McNulty D, Blumenthal MJ, Heys JR, Landvatter SW (1994) A protein kinase involved in the regulation of inflammatory cytokine biosynthesis. Nature 372:739-746.
Lee YB, Schrader JW, Kim SU (2000) p38 map kinase regulates TNF-alpha production in human astrocytes and microglia by multiple mechanisms. Cytokine 12:874-880.
Legleiter J, Czilli DL, Gitter B, DeMattos RB, Holtzman DM, Kowalewski T (2004) Effect of different anti-Abeta antibodies on Abeta fibrillogenesis as assessed by atomic force microscopy. JMoIBiol 335:997-1006.
Levine H, III (1993) Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease beta-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution. Protein Sci 2:404-410.
Li R, Yang L, Lindholm K, Konishi Y, Yue X, Hampel H, Zhang D, Shen Y (2004) Tumor necrosis factor death receptor signaling cascade is required for amyloid-beta protein-induced neuron death. J Neurosci 24:1760-1771.
Ling Y, Morgan K, Kalsheker N (2003) Amyloid precursor protein (APP) and the biology of proteolytic processing: relevance to Alzheimer's disease. Int J Biochem Cell Biol 35:1505-1535.
Liu Q, Huang Y, Xue F, Simard A, DeChon J, Li G, Zhang J, Lucero L, Wang M, Sierks M, Hu G, Chang Y, Lukas RJ, Wu J (2009) A novel nicotinic acetylcholine receptor subtype in basal forebrain cholinergic neurons with high sensitivity to amyloid peptides. J Neurosci 29:918-929.
Meberg PJ, Miller MW (2003) Culturing hippocampal and cortical neurons. Methods Cell Biol 71:111-127.
Muhs A, Hickman DT, Pihlgren M, Chuard N, Giriens V, Meerschman C, Van dA, I, Van LF, Sugawara M, Weingertner MC, Bechinger B, Greferath R, Kolonko N, Nagel-Steger L, Riesner D, Brady RO, Pfeifer A, Nicolau C (2007) Liposomal vaccines with conformation-specific amyloid peptide antigens define immune response and efficacy in APP transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A 104:9810-9815.
Nimmerjahn F, Ravetch JV (2006) Fcgamma receptors: old friends and new family members. Immunity 24:19-28.
Oddo S, Caccamo A, Shepherd JD, Murphy MP, Golde TE, Kayed R, Metherate R, Mattson MP, Akbari Y, Laferla FM (2003) Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron 39:409-421.
Orgogozo JM, Gilman S, Dartigues JF, Laurent B, Puel M, Kirby LC, Jouanny P, Dubois B, Eisner L, Flitman S, Michel BF, Boada M, Frank A, Hock C (2003) Subacute meningoencephalitis in a subset of patients with AD after Abeta42 immunization. Neurology 61:46-54.
Perry RT, Collins JS, Wiener H, Acton R, Go RC (2001) The role of TNF and its receptors in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging 22:873-883.
Pike CJ, Burdick D, Walencewicz AJ, Glabe CG, Cotman CW (1993) Neurodegeneration induced by beta-amyloid peptides in vitro: the role of peptide assembly state. J Neurosci 13:1676-1687.
Poduslo JF, Giiles EJ, Ramakrishnan M, Howell KG, Wengenack TM, Curran GL, Kandimalla KK (2010) HH domain of Alzheimer's disease Abeta provides structural basis for neuronal binding in PC12 and mouse cortical/hippocampal neurons. PLoS One 5:e8813.
Poling A, Morgan-Paisley K, Panos JJ, Kim EM, O'Hare E, Cleary JP, Lesne S, Ashe KH, Porritt M, Baker LE (2008) Oligomers of the amyloid-beta protein disrupt working memory: confirmation with two behavioral procedures. Behav Brain Res 193:230-234.
Ransohoff RM, Perry VH (2009) Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol 27:119-145.
Salloway S, Sperling R, Gilman S, Fox NC, Blennow K, Raskind M, Sabbagh M, Honig LS, Doody R, van Dyck CH, Mulnard R, Barakos J, Gregg KM, Liu E, Lieberburg I, Schenk D, Black R, Grundman M (2009) A phase 2 multiple ascending dose trial of bapineuzumab in mild to moderate Alzheimer disease. Neurology 73:2061-2070.
Selkoe DJ (2002) Alzheimer's disease is a synaptic failure. Science 298(5594):789-791.
Shankar GM, Bloodgood BL, Townsend M, Walsh DM, Selkoe DJ, Sabatini BL (2007) Natural oligomers of the Alzheimer amyloid-beta protein induce reversible synapse loss by modulating an NMDA-type glutamate receptor-dependent signaling pathway. J Neurosci 27:2866-2875.
Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, Fox JA, Presta LG (2001) High resolution mapping of the binding site on human IgGl for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG 1 variants with improved binding to the Fc gamma R. J Biol Chem 276:6591-6604.
Simon PL, Laydon JT, Lee JC (1985) A modified assay for interleukin-1 (IL-1). J Immunol Methods 84:85-94.
Solomon B, Koppel R, Frankel D, Hanan-Aharon E (1997) Disaggregation of Alzheimer beta-amyloid by site-directed mAb. Proc Natl Acad Sci U S A 94:4109-4112.
Spires-Jones TL, Mielke ML, Rozkalne A, Meyer-Luehmann M, de CA, Bacskai BJ, Schenk D, Hyman BT (2009) Passive immunotherapy rapidly increases structural plasticity in a mouse model of Alzheimer disease. Neurobiol Dis 33:213-220.
Strittmatter WJ, Saunders AM, Schmechel D, Pericak-Vance M, Enghild J, Salvesen GS, Roses AD (1993) Apolipoprotein E: high-avidity binding to beta-amyloid and increased frequency of type 4 allele in late-onset familial Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci USA 90:1977-1981.
The International Federation of Alzheimer's Disease and Related Disorders Societies I (2009) World Alzeheimer Report - 2009 Executive Summary. (Prince M, Jackson J, eds), pp 1-21. Illinois, USA: Alzheimer's Disease International: The International Federation of Alzheimer's Disease and Related Disorders Societies, Inc.
Townsend M, Shankar GM, Mehta T, Walsh DM, Selkoe DJ (2006) Effects of secreted oligomers of amyloid beta-protein on hippocampal synaptic plasticity: a potent role for trimers. J Physiol 572:477-492.
Vellas B, Black R, Thai LJ, Fox NC, Daniels M, McLennan G, Tompkins C, Leibman C, Pomfret M, Grundman M (2009) Long-term follow-up of patients immunized with AN1792: reduced functional decline in antibody responders. Curr Alzheimer Res 6:144-151.
Walsh DM, Klyubin I, Fadeeva JV, Cullen WK, Anwyl R, Wolfe MS, Rowan MJ, Selkoe DJ (2002) Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416:535-539.
Walsh DM, Klyubin I, Shankar GM, Townsend M, Fadeeva JV, Betts V, Podlisny MB, Cleary JP, Ashe KH, Rowan MJ, Selkoe DJ (2005) The role of cell-derived oligomers of Abeta in Alzheimer's disease and avenues for therapeutic intervention. Biochem Soc Trans 33:1087-1090.
Wang Q, Walsh DM, Rowan MJ, Selkoe DJ, Anwyl R (2004) Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24:3370-3378.
Wirths O, Multhaup G, Czech C, Blanchard V, Moussaoui S, Tremp G, Pradier L, Beyreuther K, Bayer TA (2001) Intraneuronal Abeta accumulation precedes plaque formation in beta-amyloid precursor protein and presenilin-1 double-transgenic mice. Neurosci Lett 306:116-120.
Barghorn S, Nimmrich V, Striebinger A, Krantz C, Keller P, Janson B, Bahr M, Schmidt M, Bitner RS, Harlan J, Barlow E, Ebert U, Hillen H (2005) Globular amyloid beta-peptide oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease. J Neurochem 95:834-847.
Blond and Goldberg, 1987, PNAS March 1, 1987 Vol. 84 | no. 5 | 1147-1151
Cox JPL, Tomlinson IM and Winter G. Eur. J. Immunol. 1994; 24: 827-836. A directory of human germ-line V kappa segments reveals a strong bias in their usage.
Hieter PA, Max EE, Seidman JG, Maizel JV Jr, Leder P. Cloned human and mouse kappa immunoglobulin constant and J region genes conserve homology in functional segments.Cell. 1980Nov; 22(l Pt 1): 197-207.
Kabat EA, Wu TT, Perry HM, Gottesman KS, Foeller C. Sequences of proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, 1991.
Klein WL (2002) Abeta toxicity in Alzheimer's disease: globular soluble polymeric amyloid beta (ADDLs) as new vaccine and drug targets. Neurochem Int 41(5):345-352.
Langdon SD, Inaioki M, Kelsoe G. and Tedder TF. Immunogenetics 2000; 51: 241-245. Germline sequences of V(H)7183 gene family members in C57BL/6 mice demonstrate natural selection of particular sequences during recent evolution.
Mulligan RC and Berg P. Science 1980; 209: 1422-1427. Expression of a bacterial gene in mammalian cells.
Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G, Nature 1988; 332: 323-327. Reshaping human antibodies for therapy.
Schable KF, Thiebe R, Bensch A, Brensing-Kueppers J, Heim V, Kirschbaum T, Lamm R, Ohnrich M, Pourrajabi S, Roschenthaler F, Schwendinger J, Wichelhaus D, Zocher I and Zachau HG. Eur. J. Immunol. 1999; 29: 2082-2086. Characteristics of the immunoglobulin V kappa genes, pseudogenes, relics and orphons in the mouse genome.
Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB and Winter G. J. Mol. Biol. 1992; 227: 776-798. The repertoire of human germline VH sequences reveals about 50 groups of VH segments with different hypervariable loops.