Адгезия штаммов бактерий рода Staphylococcus spp. К белкам человека, иммобилизованным на поверхности полистирола

УДК 539.61

Р. З. Хайруллин, Ю. А. Тюрин, Л. Т. Баязитова, Т. В. Григорьева

АДГЕЗИЯ ШТАММОВ БАКТЕРИЙ РОДА STAPHYLOCOCCUS SPP. К БЕЛКАМ ЧЕЛОВЕКА,

ИММОБИЛИЗОВАННЫМ НА ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИСТИРОЛА

Ключевые слова: атопический дерматит, адгезивная способность бактерий, полимеразная цепная реакция, S.aureus,

S. epidermidis, isdB, fnbA, fnbB.

Изучена адгезионная способность бактерий к белкам человека. Проведена детекция генов, кодирующих важнейшие адгезины. Установлено, что при атопическом дерматите штаммы S. aureus, колонизирующие кожу, дифференцируются на три адгезивных типа, при этом преобладают штаммы, относящиеся к высокоадгезивным типами Генотипирование штаммов, методом ПЦР, установило, что встречаемость двух генов адгезинов fnb A и fnb B характерна только, для изолятов S. aureus, относящихся к высокоадгезивному типу, а ген isdB был выявлен в геноме почти всех исследованных изолятов.

Key words: S.aureus, S. epidermidis, atopic dermatitis, adhesive bacteria, isdB, fnbA, fnbB, polymerase chain reaction.

Studied the adhesion ability of the bacteria to human proteins. Carried out the detection of the genes encoding the major adhesin. It is established that in atopic dermatitis strains of S. aureus colonises the skin, differentiate into the three adhesive types, while dominated by strains belonging to high adhesive types Genotyping of strains by PCR, found that the occurrence of two genes adhesins fnb A and fnb B characteristic only for isolates of S. aureus related to high adhesive type, and gene isdB was identified in the genome of almost all investigated isolates.

Адгезивный потенциал бактерий рода S. aureus обусловлен семейством белков, взаимодействующих с поверхностными

матриксными молекулами тканей макроорганизма, такими как фибронектин, ламинин, коллаген, эластин [1]. Адгезины стафилококков относят к семейству поверхностных белков, структура которых на молекулярном уровне хорошо изучена, как например, Fnbp A, B, (фибронектин-связывающий протеин, ClfA, B - рецепторы для фибриногена, коллаген, фибриноген, эластин связывающие белки [2].

Исследования в этой области показали, что данные адгезины играют важную роль в способности стафилококков колонизировать ткани организма человека и животных, а также участвуют во взаимодействии с интегриновыми рецепторами эукариотических клеток [3]. У таксона S. epidermidis адгезивный потенциал обусловлен

полисахаридными компонентами микробной клетки, а также некоторыми поверхностными белками, гомологичными белковым адгезинам золотистого стафилококка [4]. Штаммы S. aureus с мутациями в генах, кодирующих FnbpA, FnbpB адгезины, затрагивающие 40 аминокислотную

последовательность С-концевых участков этих белков, характеризуются низкой способностью к адгезии [5]. Важно отметить, что данная область FnbpA гомологична другим сайт-связывающим областям различных белков семейства адгезинов стафилококка, включая ClfA, ClfB.

Одним из существенных факторов, определяющих способность S. aureus к адгезии, является наличия железа в среде. Ключевую роль в связывании и извлечении гемового (Fe2+) железа из гемоглобина у S. aureus принадлежит IsdB белку, который активно экспрессируется на поверхности клетки, как рецептор, к гемоглобину и миоглобину [6]. Белки Isd и гомологичные им образуют систему

утилизации гемового железа у стафилококков и других бактерий. Необходимо отметить, что образование адгезинов как факторов патогенности является одной из его экологических стратегий в изменчивых условиях окружающей среды, которой для патогенных бактерий является внутренняя среда организма хозяина [7].

Нами была исследована адгезия различных клинических изолятов S. aureus и S. epidermidis, к полистирольной подложке с иммобилизованными белками - гемоглобином и фибронектином. Также была выполнена дифференцировка изолятов стафилококков, выделенных с «маркёрных» топографических зон кожи у больных с атопическим дерматитом и здоровых лиц, по способности адгезироваться к полистирольной поверхности с иммобилизованными белками - фибронектином и гемоглобином человека. На основании полученных результатов проведён анализ характера роста различных изолятов стафилококков в жидкой питательной среде как содержащей, так и не содержащей гемовое железо (Fe2+). Также у изолятов S. aureus с различной адгезивностью методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) была проведена детекция генов, кодирующих важнейшие адгезины (IsdB, FnbpA, FnbpB).

Материалы и методы исследования

Микрофлору кожи исследовали по методу бактериальных отпечатков с использованием стерильных пластиковых чашек площадью 10см2 с набором питательных сред (5% кровяной, желточно-солевой агары) [8]. Отпечатки забирали у больных с атопическим дерматозом и здоровых лиц с «маркёрных» топографических зон гладкой кожи: область лба, щёк, верхних конечностей - область локтевой ямки, нижних конечностей - область подколенной ямки, кожа кистей рук (ладонная, тыльная поверхность), кожа в области задней части

шеи, в области верхней трети грудины. Время аппликации составляло 5с. Учет колоний проводили спустя 24ч инкубации при температуре 37°С. В исследование были включены больные с экссудативной, эритематозно-сквамозная и лихеноидной формой в возрасте от 1 года до 45 лет (n=60). Контрольную группу составили здоровые добровольцы (n=42) - 25 детей в возрасте от 1 года до 17 лет, а также 17 взрослых от 19 до 43 лет без патологии кожи c информированным согласием на исследование.

Культивирование и идентификация штаммов. Идентификацию бактериальных культур выделенных с твердых агаровых сред, проводили по морфологическим, тинкториальным свойствам и плазмокоагулазной активности в соответствии с требованиями соответствующих нормативных документов. Видовую идентификацию штаммов осуществляли MALDI-TOF масс-спектрометрией (MALDI Biotyper, FLEX™, КФУ, Институт Фундаментальной медицины и биологии, с.н.с., к.б.н. А.А. Тойменцева).

Определение адгезии к гемоглобину и фибронектину. Культуры Staphylococcus spp. рассевали на чашки Петри с агаровой средой (Meat Pepton, Conda, Испания) культивировали 16ч при температуре 37°С. Затем производили пересев из изолированных колоний на пробирки со скошенным агаром, через 16ч культуры смывали стерильной питательной средой 199 (Россия). Для инокуляции в ячейки планшетов с иммобилизованными белками (гемоглобин, фибронектин) использовали концентрацию клеток 0,6 OD600.

Референс штаммы S. aureus ATCC 25923 и S. epidermidis ATCC 14990 (из коллекции лаборатории микробиологии ФБУН КНИИЭМ,

Роспотребнадзора). Индекс адгезии рассчитывали предложенными способами [9, 10].

Иммобилизацию белков человека гемоглобина и фибронектина (human fibronectin, Sigma, USA) осуществляли на полимерную поверхность 96-луночного плоскодонного планшета, изготовленного из полистирола (Microlon, сорбционная ёмкость 1,5-4,0нг/мм2) по методикам, изложенным в работе [11]. Гемоглобин человека (hHb) выделяли из эритроцитов донора. Эритроциты ресуспендировали в смеси, состоящей из 1,5 объема 10мМ Трис-HCl (pH 8,0) и 20% толуола (1:1, объем/объем) в течение 12ч при температуре 4°С. Гемоглобин гемолизата отделяли от клеточного дебриса центрифугированием (20000g в течение 60мин при температуре 4°С.). Полученный раствор фильтровали и очищали от примесей ионообменной хроматографией (колонка PRP-X500, Hamilton (4,6, 150, 7 мкм) по методу [12]. Полученный раствор гемоглобина сохраняли при температуре жидкого азота в сосуде Дьюара.

Генотипирование штаммов Staphylococcus spp. Гены isdB, fnbA, fnbB, кодирующие адгезины S. aureus, детектировали методом ПЦР, используя оригинальные подобранные праймеры: isdB-F: 3-TGCTTCGCTAGAACCTGCTG-5, isdB-R: 3-AAYYCCTGCTACAAAACCYAC-5; и специфичные

для гена yqiL (кодирует фермент фосфат-ацетилтрансферазу КФ 2.3.1.9, и является конститутивным) праймеры из работы [13]: yqiL-R: 5-CAGCATACAGGACACCTATTGGC-3, yqiL-F: 5-CGTTGAGGAATCGATACTGGAAC-3; праймеры для детекции генов fnb A, B из работы [14].

Статистический анализ. Различия средних значений оценивали с помощью T-теста (t-критерия Стьюдента) с разными дисперсиями, гетероскедастический, p<0,05. Проверка на нормальность распределения признака в выборках проведена по критериям Колмогорова-Смирнова/Лиллифорса, Шапиро-Уилка, Д'Агостино (асимметрия, эксцесс), Р=95%. Доверительный интервалы (95% ДИ) для частот рассчитывали по методу Уилсона с поправкой на непрерывность с помощью Web Site for Statistical Computation (vassarstats.net).

Обсуждение результатов

Были установлены показатели адгезии видовых референс-штаммов S. aureus ATCC 25923 и S. epidermidis ATCC 14990 к полистиролу с иммобилизованными белками - гемоглобином (Hb) и фибронектином (Fn) человека (табл. 1).

Таблица 1 - Показатели адгезии референс-штаммов стафилококков к гемоглобину и фибронектину

Показатель адгезии (ПА), усл.ед.

Референс-

штамм к к

полистиролу+Hb полистиролу+Fn

S. aureus ATCC25923 0,25+0,06* 0,34+0,06**

S. epidermidis ATCC14990 0,12+0,03 0,19+0,05

*p<0,01, T=3,8, t=2.1;

**p<0,01, T=4,8, t=2,1, Hb-гемоглобин; Fn- фибронектин

Таблица 2 - Рассчитанные показатели адгезии и их интервалы, характеризующие адгезивные типы штаммов бактерий Staphylococcus spp.

Значения и интервалы ПА

Staphylococcus Staphylococcus

aureus epidermidis

Адгезивные типы н и н и н и н и

штаммов ю о кт е ю о кт е

ог X о ог X о

ем р ю ем р ю

к к к к

Типичная Ы(ПА)-1 о>ПА<Ы(ПА)+1о 0,19>ПА <0,31 0,28>П А<0,4 0,09>П А<0,15 0,14>ПА <0,24

Высокая ПА>0,31 ПА>0, ПА > ПА>0,24

ПА>Ы(ПА)+1о 4 0,18

Низкая ПА<0,19 ПА<0, ПА<0, ПА<0,14

ПА<Ы(ПА)-1о 28 18

Выявлены видовые различия в адгезивной способности к гемоглобину и фибронектину для референс-штаммов. Так коагулазоотрицательный вид S. epidermidis, характеризуется в 1,7 раза меньшим показателем адгезии к полистиролу с иммобилизованным гемоглобином, чем S. aureus (p<0,001). Такая же закономерность, характерна и для адгезии референс-штаммов к полистиролу с иммобилизованным фибронектином, так S. aureus характеризуется в 1,6 раза большим показателем адгезии, чем S. epidermidis (р<0,001).

Используя средние значения показателя адгезии (ПА) для референс-штаммов Staphylococcus spp., определены интервалы значений данных показателей, характеризующих три типа адгезивности: типичную адгезивность, низкую и высокую (табл. 2).

Распределение адгезивных типов бактерий Staphylococcus spp., изолированных с «маркёрных» участков здоровой и поражённой кожи у больных атопическим дерматитом, имеет существенное значение. Установлено, что кожа «маркёрных» участков здоровых лиц преимущественно колонизирована штаммами S. aureus с типичными адгезивными свойствами, что характерно для всех возрастных групп (дети до 1 года, от 3 до 13 лет, старших подростков и взрослых от 20-47 лет). Частота штаммов с типичной адгезивностью к полистиролу с иммобилизованным гемоглобином составила 45,5% (95% ДИ 30,4-61,8) до 60,0% (95%ДИ 43,5-74,4) в зависимости от возрастной группы (табл. 3).

Таблица 3 - Частота распределения адгезивных типов Stapylococcus spp. к гемоглобину

Частота Возрастная группа

распределения

различных до 1 3-14 15-19 20-47

адгезивных типов, года лет лет лет

%

Staphylococcus aureus от здоровых лиц

Типичная 58,8 55,6 60 45,4

Низкая 5,9 11,1 10 9,1

Высокая 35,3 33,3 30 45,4

Staphylococcus aureus у больных АтД

Типичная 26 50 31 31

Высокая 64 35 67 37

Низкая 10 15 2 32

Staphylococcus epidermidis здоровых лиц

Типичная 41,6 28,5 25 25

Высокая 58,4 71,4 50 50

Низкая 0 0 0 25

Staphylococcus epidermidis от больных АтД

Высокая 10 25 42 25

Низкая 89 74 28 73

Типичная 1 1 30 2

АтД- атопический дерматит

При развитии патологии кожи (атопический дерматит) с «маркёрных» участков преимущественно выделяются штаммы,

относящиеся к высокоадгезивному типу. Частота штаммов S. aureus с высоким адгезивным типом к

полистиролу с иммобилизованным гемоглобином увеличивается в несколько для всех возрастных групп по сравнению со здоровыми лицами (табл. 3). Частота высокоадгезивных штаммов у больных детей в возрасте до 1 года составила - 64,0% (95% ДИ 55,2-72,0), что в 10,8 раз выше, чем в группе здоровых сверстников. В группе детей в возрасте от 3 до 14 лет, частота высокоадгезивных штаммов в 3 раза выше, чем в группе здоровых сверстников. В группе больных подростков в возрасте от 15 до 19 лет, частота высокоадгезивных штаммов в 6,7 раза выше, чем у здоровых сверстников. У взрослых больных в возрасте от 20 до 49 лет, частота встречаемости высокоадгезивных штаммов в 4,1 раза выше, чем у здоровых лиц (табл. 3). Таким образом установлено, что «маркёрные» топографические зоны кожи у больных с атопическим дерматитом, преимущественно колонизируется штаммами S. aureus c высокоадгезивными свойствами к полистиролу с иммобилизованным гемоглобином, а частота встречаемости данных штаммов на поражённой кожи в 3,0-10,0 раз выше, чем в группе здоровых лиц.

При сравнении встречаемости трёх адгезивных типов S. epidermidis выделенных с «маркёрных» зон кожи здоровых лиц, установлено, что частота штаммов с типичными адгезивными свойствами к полистиролу с иммобилизованным гемоглобином, составила для данного таксона от 28,5%(95% ДИ 18,3-40,0) до 41,6% (95% ДИ 30,354,4). Встречаемость высокоадгезивных штаммов этого вида у здоровых подростков и взрослых составила 50,0% (95%ДИ 38,9-62,5), а у детей от 1 года до 14 лет более 50% (58%-71,4%).

У больных атопическим дерматитом встречаемость высокоадгезивных типов S. epidermidis была высокой в группах детей до 1 года, 3-14 лет и у взрослых в возрасте от 20 до 49 лет (табл.4). У больных атопическим дерматитом частота штаммов S. epidermidis, относящихся к типичному адгезивному типу была в 4 раза меньше, только у больных детей в возрасте до года, по сравнению со здоровыми сверстниками. Таким образом, для здоровых лиц, а также больных с атопическим дерматитом характерно

преимущественная колонизация «маркёрных» зон кожи штаммами S. epidermidis относящимся к высокоадгезивным типам к полистиролу с иммобилизованным гемоглобином.

Анализ адгезии штаммов стафилококков к полистиролу с иммобилизованным фибронектином, т. е. белком, входящим в состав межклеточного матрикса тканей, в том числе и кожи, содержание которого в поражённой кожи при атопическом дерматите увеличивается, позволил

дифференцировать штаммы по данному свойству. Встречаемость высокоадгезивных типов S. aureus у здоровых детей в возрасте от 3 до 14 лет составляет 32,0% (95 % ДИ 22,2-44,3), в других возрастных группах от 17,0% (95 % ДИ 9,7-27,8) до 25,0% (95 % ДИ 15,7-36,3). У больных атопическим дерматитом установлено, что частота выделения

высокоадгезивных типов резко возрастает (более 50% всех штаммов) во всех возрастных группах от 67,0% (95% ДИ 58,2-74,1) до 98,0% (95%ДИ 93,399,2) у подростков (табл. 4). Необходимо отметить, что по сравнению со здоровыми лицами, частота выделения с «маркёрных» зон низкоадгезивных типов S. aureus у больных резко снижается. Анализ встречаемости адгезивных типов среди штаммов S. epidermidis, установил, что с «маркёрных» зон кожи у здоровых лиц частота выделения высокоадгезивных штаммов была незначительной и составляла от 8,0% (95% ДИ 3,0-17) до 12,0% (95% ДИ 6,2-23,6) у детей до 1 года (табл. 4).

Таблица 4 - Частота распределения адгезивных типов Stapylococcus spp. к фибронектину

темп роста, по сравнению, со штаммами, обладающими типичным и низким типом адгезии.

Частота возраст

распределения

различных до 1 3-14 15-19 20-47

адгезивных типов, года лет лет лет

%

Staphylococcus aureus здоровых лиц

Низкая 32 34,7 27 35

Высокая 23 32 17 25

Типичная 45 33,3 56 40

Staphylococcus aureus от больных АтД

Низкая 2 9 1 17

Высокая 68 87 98 67

Типичная 12 4 1 16

Staphylococcus epidermidis здоровых людей^=56)

Низкая 21 22 13 36

Высокая 12 10 9 8

Типичная 67 68 78 56

Staphylococcus epidermidis от больных АтД

Низкая 13 2 4 1

Высокая 13 23 40 23

Типичная 74 75 56 76

АтД- атопический дерматит

У больных атопическим дерматитом частота встречаемости высокоадгезивных типов составила от 13,0% (95% ДИ 6,0-23,0) до 40,0% (95% ДИ 27,6-53,8) у старших подростков. Таким образом, «маркёрные» зоны кожи как здоровых, так и больных лиц, колонизируются штаммами S. epidermidis относящимися в основном к низкоадгезивным типам. Выделенным штаммам S. epidermidis с кожи больных и здоровых лиц была свойственна низкая адгезивная способность к полистиролу с иммобилизованным фибронектином, что возможно обусловлено отсутствием у данного таксона специальных фибронектин-связывающих белков адгезинов, таких как у таксона S. aureus.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что рост штаммов в ячейках полистиролового планшета в жидкой питательной среде зависит от источников гемового железа (рис.1).

Присутствие гемопротеинов ускоряет рост, штаммов, а изоляты S. aureus, относящиеся к высокоадгезивным типам к полистиролу с иммобилизованным гемоглобином, имеют высокий

1

0,8 § °,6

а

О 0,4 0,2 0

S.aureus 54 S.aureus 23 S.aureus 14 S.aureus 112 S.aureus 78 S.aureus 11 S.aureus 116 S.aureus 231 S.aureus 45

12 3 4 время инкубации, ч

Рис. 1 - Кривые роста изолятов S. aureus в жидкой питательной среде

Заключение

Таким образом, в ходе проведенных экспериментов нами установлено, что при атопическом дерматите штаммы S. aureus, колонизирующие кожу дифференцируются на три адгезивных типа. У больных различных возрастных групп, гладкая кожа «маркёрных» топографических зон, в основном колонизируется

высокоадгезивными типами штаммов (с высокими показателями адгезии к полистиролу с иммобилизованными белками фибронектином и гемоглобином). Данная закономерность, возможно, обусловлена большим содержанием в коже больных атопическим дерматитом фибронектина,

фибриногена и других белков плазмы, которые входят в состав воспалительного экссудата, что приводит к глубокому проникновению и связыванию бактерий с сайтами матриксных белков и белков плазмы, которые содержаться в составе воспалительного экссудата [15].

Генотипирование штаммов установило следующие особенности: встречаемость двух генов адгезинов fnb A и fnb B в геноме изолятов S. aureus, относящихся к высокоадгезивному типу составило 89,5% (95% ДИ 84,2-92,9), по сравнению с низкоадгезивными типами, где два гена детектировались в геноме, только в 14,5% (95% ДИ 10,0-19,7). Ген isdB был выявлен в геноме 93,8% (95% ДИ 89,0-96,1), у всех адгезивных типов. Колонизация кожи здоровых лиц, штаммами S. aureus, происходит преимущественно

низкоадгезивными типом, характеризующимся низкими показателями адгезии к полистиролу с иммобилизованным фибронектином. Для обычного колонизата кожи, S. epidermidis, колонизирующего кожные покровы человека в норме, характерно преобладание штаммов с низкой адгезией к полистиролу с иммобилизованным фибронектином.

0

Литература

1. Herrmann, M. Fibronectin, fibrinogen, and laminin act as mediators of adherence of clinical staphylococcal isolates to foreign material/ M.Herrmann, P.E.Vaudaux, Pittet et al.// J. Infect Dis. -1988. -№158. -Р.693-701.

2. Mazmanian, S. K. Staphylococcus aureus sortase, an enzyme that anchors surface proteins to the cell wall/ S.K.Mazmanian, G.Liu, H.Ton-That, O. Schneewind// Science.-1999. Jul 30.285(5428):760-3

3. Sinha, B. Fibronectin-binding protein acts as Staphylococcus aureus invasin via fibronectin bridging to integrin alpha5beta1/ B. Sinha, P.Franjois, Nüsse O. et al.// Cell Microbiol. -1999. -№1(2)/ -P.101-17

4. Nilsson, M. A fibrinogen-binding protein of Staphylococcus epidermidis/ M. Nilsson, L.Frykberg, et al.// Infect Immun. -1998, Jun;66(6):2666-73.

5 Тюрин, Ю. А. Роль факторов патогенности золотистых стафилококков в развитии атопического дерматита// Ю.А.Тюрин, Д.А. Долбин//Журн. Микробиол. -2008. -№4. -С.105-110

6. Torres, V.J. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization/ V.J.Torres, G.Pishchany, M.Humayun et al.//J. Bacteriol. -2006. -№188(24).-P.8421-8429.

7. Foster, T. J. Surface protein adhesins of Staphylococcus aureus/ T.J.Foster, M.Höök/Trends Microbiol. -1998 Dec;6(12):484-8.

8. Баязитова, Л.Т. Вирулентные свойства стафилококовой микрофлоры кожи при атопическом дерматите: автореф. дис. ... канд.мед.наук/ Л.Т. Баязитова -Уфа, 2009. -24 с.

9. Пат. 2490329 РФ. Способ определения адгезии Staphylococcus spp к фибронектину и фибриногену/ Ю.А.Тюрин, Р.С.Фассахов; заявитель и

патентообладатель ФБУН «КНИИЭМ»

Роспотребнадзора. -№2012106638/10; заявл. 22.02.2012; опубл. 20.08.2013.

10. Пат. 2393229 РФ. Способ определения адгезии Staphylococcus spp. к гемопротеинам/ Ю.А.Тюрин, И.Г.Мустафин, Р.С.Фассахов; заявитель и патентообладатель ФБУН «КНИИЭМ» Роспотребнадзора, ГОУ ВПО «КГМУ» -№2008152652/13; заявл. 29.12.2008; опубл. 27.06.2010.

11.Долбин, Д.А. Получение и иммунохимические свойства комплексного аскаридозного антигена/ Д.А. Долбин, Ю.А. Тюрин, Р.З. Хайруллин// Вестник Казанского технологического университета. -2014. -Т.17. -№13. -С.266-269

12. Christensen, S. M. Preparation of human hemoglobin Ao for possible use as a blood substitute/ S.M.Christensen, F.Medina, R.W.Winslow et al.// J Biochem Biophys Methods. -1988. -№17(2):143-54.

13. Nei, M. A simple method for estimating average number of nucleotide substitutions within and between populations from restriction data/ M.Nei, J.C.Miller// Genetics. -1990. -№125(4):873-9.

14. Хисматуллина, З.Н. Заболевания, связанные с воздействием химических факторов окружающей среды/ З. Н.Хисматуллина// Вестник Казанского технологического университета. -2013. -Т.16. -№20. -С.170-178.

15. Cho, S. H. Preferential binding of Staphylococcus aureus to skin sites of Th2-mediated inflammation in a murine model/ S.H. Cho, I. Strickland, A.Tomkinson et al// J.Invest Dermatol. -2001.-№5:658-63

© Р. З. Хайруллин - к.б.н., ст. преп. каф. промышленной безопасности КНИТУ, khayrullinrz@gmail.com; Ю. А. Тюрин -к.м.н, вед. научн. сотр., зав. лаб. иммунологии и разработки аллергенов ФБУН КНИИЭМ; преподаватель каф. биологической химии Казанского государственного медицинского университета, immunolab@yandex.ru; Л. Т. Баязитова- к.м.н., вед. научн. сотр., зав. лаб. микробиологии ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора; Т. В. Григорьева - мл. научн. сотр. лаб. иммунологии и разработки аллергенов ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора.

© R.Z. Khayrullin, Cand. Biol. Sci., Senior Lecturer, Industrial Safety Department, Kazan National Research Technological University, khayrullinrz@gmail.com; Y. A. Tyurin , Cand. Med. Sci., leading researcher, head of laboratory of immunology and the development of allergen of Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; lecturer of Department biological chemistry, Kazan state medical University, immunolab@yandex.ru; L. T. Bayazitova - Cand. Med. Sci., leading researcher, head of laboratory of Microbiology of of Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology; T. V. Grigor'eva - Junior researcher of the laboratory of immunology and the development of allergen of Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology.