СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ
METHODS FOR DETERMINATION OF ACTIVITY OF ADENO-ASSOCIATED VIRAL PREPARATIONS

Родственные заявки
По настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на патент США №62/467045, поданной 3 марта 2017 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой небольшой вирус без оболочки, который упаковывает геном в виде линейной одноцепочечной ДНК. AAV принадлежит к семейству Parvoviridae и роду Dependovirus, поскольку продуктивное заражение AAV происходит только в присутствии вируса-помощника, такого как, например, аденовирус или вирус герпеса. Даже в отсутствие вируса-помощника AAV (серотип 2) может достигать латентности путем интеграции в хромосому 19q13.4 генома человека-хозяина. Это единственный ДНК-вирус млекопитающих, о котором известно, что он способен к сайт-специфической интеграции (Daya and Berns, Clinical Microbiology Reviews, pages 583-593 (2008)).
Для безопасного применения AAV в клинике AAV был генетически модифицирован в нескольких положениях в своем геноме. Например, ген Rep, который необходим для репликации вируса, и элемент, необходимый для сайт-специфической интеграции, были удалены из генома AAV во многих вирусных векторах. Этот рекомбинантный AAV (rAAV) существует во внехромосомном состоянии и характеризуется очень низкой эффективностью интеграции в геномную ДНК. Таким образом, вероятность возникновения индуцированного rAAV случайного мутагенеза в клетке-хозяине снижается, если не устраняется полностью. Из-за этих свойств и отсутствия патогенности rAAV показал большой потенциал в качестве генотерапевтического вектора во многих аспектах доклинических и клинических применений. В клинике проходят испытания новые серотипы и самостоятельные векторы. Наряду с этими продолжающимися разработками векторов, постоянные усилия были сосредоточены на изменяемых производственных процессах, которые могут эффективно производить большие количества титра векторов rAAV с высокой чистотой и активностью.
Хотя усилия по разработке эффективных, широкомасштабных способов очистки продукта AAV, пригодного для введения человеку, продвинулись, все еще остается потребность в аналитических способах измерения качественных характеристик препаратов генотерапевтического вектора на основе рекомбинантного rAAV для выпуска продукта и точного клинического дозирования. Например, современные способы производства AAV в клеточной культуре приводят к образованию «пустых» капсидов, в которых отсутствует векторный геном, и было показано, что они приводят к опосредованным Т-клетками иммунным ответам. Кроме того, пустые капсиды не способны обеспечить терапевтическую пользу, связанную с производством трансгена, и существует потенциал для усиления врожденных или адаптивных иммунных ответов на вектор (например, опосредованный Т-клетками), что затем превращает пустые капсиды в проблему в контексте генной терапии. Wright, Molecular Therapy 22: 1-2 (2014).
Классически, применение количественной PCR (qPCR) является наиболее широко принятым и предпочтительным по сравнению со способом определения дозы препаратов AAV, потому что оно обеспечивает измерение векторных геномов (например, векторного генома (в.г.)/кг субъекта). Смотрите Halbert CL et al., J Virol 1997; 71:5932-5941; Samulski RJ et al., J Virol 1989; 63:3822-3828; Clark KR et al., Hum Gene Ther 1999; 10:1031-1039 и Wright JF, Hum Gene Ther 2011; 22:519-521. Однако применение qPCR ограничено тем фактом, что измеряется только общая ДНК, что может привести к значительным проблемам. Например, на считывание qPCR могут влиять такие проблемы, как применение неэффективных праймеров, проблемы со стандартами калибровки или третичные структуры ДНК (например, структуры шпилек, круговые или суперскрученные). Таким образом, применение qPCR может привести к неточному определению дозы и, в конечном итоге, активности конечного препарата AAV из-за включения в расчет дозы капсидов, содержащих более одной копии ДНК и/или разрушенных капсид. Это связано с тем, что активность препарата AAV состоит из двух частей: 1) способности капсида AAV трансдуцировать клетки и 2) способности ДНК в AAV производить желаемый продукт. Нефункционирующие капсиды, которые не были бы учтены с помощью qPCR, эффективно не трансдуцируют клетки. Кроме того, qPCR также ограничена из-за присущей ей изменчивости (т.е. высокой изменчивости до 0,5 шага по логарифмической шкале), которая может привести к неточному определению дозы конечного препарата AAV. Присущая изменчивость также может быть усугублена изменчивостью между анализами, наблюдаемой с помощью qPCR из-за подготовки образца, которая включает в себя несколько стадий, включая в себя расщепление капсидного белка, выделение ДНК и очистку ДНК. Если доза и/или активность не определены точно, пациенты могут получать неправильную дозу и/или широко варьирующиеся дозы от лечения к лечению. Таким образом, необходим точный инструмент для измерения дозы и, в конечном итоге, активности препаратов AAV, а также для мониторинга качества и активности генотерапевтического вектора.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
В настоящем документе представлены способы измерения количественных признаков препаратов генотерапевтических векторов. Согласно определенным вариантам осуществления препараты генотерапевтических векторов представляют собой препараты аденоассоциированного вируса (AAV). Раскрытые в настоящем документе способы могут быть использованы в любой точке очистки. Согласно некоторым вариантам осуществления способы могут быть использованы перед приготовлением или упаковкой капсидов AAV для применения. Раскрытые в настоящем документе способы могут быть использованы для улучшения определения концентрации, дозы и/или активности препарата AAV.
Особенность получения вектора AAV в клеточной культуре заключается в образовании избытка «пустых» капсидов, в которых отсутствует геном вектора. Согласно некоторым вариантам осуществления количество пустых капсидов оценивают для точного определения концентрации, дозы и/или активности препарата AAV. Пустые капсиды также могут рассматриваться как связанные с продуктом примеси, которые следует уменьшить во время очистки. Согласно определенным вариантам осуществления важно определить общее количество пустых капсидов, чтобы уменьшить врожденный и/или адаптивный иммунный ответ против капсидного антигена.
Классически, концентрация, доза и/или активность препарата AAV зависит от количественного определения с помощью количественной PCR (qPCR). Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что количественное определение препарата AAV может полагаться только на AAV-специфический твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), и его применение может улучшить измерение концентрации и/или дозы препарата AAV и, в конечном счете, активность. Способы по настоящему изобретению являются преимущественными по сравнению с известными в настоящей области техники, поскольку определение антигена с помощью ELISA обеспечивает очень надежные результаты, удивительно более точные, чем у qPCR. Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения концентрации, дозы и/или активности с помощью qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления концентрация, доза и/или активность могут быть определены посредством концентрации капсидов AAV в препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы, предусматривающие ELISA, приводят к получению препарата AAV, у которого по меньшей мере приблизительно на 10% меньшая вариабельность концентрации, дозы и/или активности по сравнению со способом, при котором используют qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы, предусматривающие ELISA, приводят к получению препарата AAV, у которого по меньшей мере приблизительно на 20% меньшая вариабельность концентрации, дозы и/или активности по сравнению со способом, при котором используют qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы, предусматривающие ELISA, приводят к получению препарата AAV, у которого приблизительно на 10-80% меньшая вариабельность концентрации, дозы и/или активности по сравнению со способом, при котором используют qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы, предусматривающие ELISA, приводят к получению препарата AAV, у которого приблизительно на 15-50% меньшая вариабельность концентрации, дозы и/или активности по сравнению со способом, при котором используют qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы, предусматривающие ELISA, приводят к получению препарата AAV, у которого приблизительно на 20-33% меньшая вариабельность концентрации, дозы и/или активности по сравнению со способом, при котором используют qPCR.
50
Согласно некоторым аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают количественную оценку дозы и/или активности препарата AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает исследование препарата AAV с помощью AAV-специфического анализа ELISA для количественного определения общего количества капсидов AAV в препарате AAV. Количество капсидов может затем использоваться для определения дозы для введения субъекту. Доза может быть использована для определения активности (т.е. дозы или концентрации, необходимой для достижения определенного эффекта (например, EC)). Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения дозы и/или активности с помощью qPCR.
Согласно некоторым аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают измерение концентрации капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает исследование фракции или препарата AAV с помощью AAV-специфического анализа ELISA для количественного определения общего количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения концентрации с помощью qPCR.
Согласно некоторым аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают измерение концентрации полных капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает исследование фракции или препарата AAV с помощью AAV-специфического анализа ELISA для количественного определения общего количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV и оценки процентного содержания полных и пустых капсидов AAV в препарате AAV (например, с использованием криогенной просвечивающей электронной микроскопии (CryoTEM)). Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения концентрации с помощью qPCR.
Согласно некоторым вариантам осуществления пустые капсиды удаляют из фракции или препарата AAV, что приводит к получению фракции или препарата AAV с определенной концентрацией полных капсидов и/или определенным соотношением полных:пустых капсидов. Согласно некоторым вариантам осуществления концентрация или соотношение между партиями является постоянными, так что AAV-специфический анализ ELISA является достаточным для определения концентрации, дозы и/или активности фракции или препарата AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения концентрации, дозы и/или активности с помощью qPCR.
Согласно некоторым аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают количественную оценку дозы и/или активности препарата AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает исследование препарата AAV с помощью AAV-специфического анализа ELISA в сочетании со способом, который оценивает или подтверждает процент или соотношение полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV в препарате AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения дозы и/или активности с помощью qPCR.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает измерение концентрации капсидов AAV во фракции или препарате AAV с помощью AAV-специфического анализа ELISA в сочетании со способом, который оценивает или подтверждает процент или соотношение полных:пустых капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения концентрации с помощью qPCR.
Согласно определенным вариантам осуществления способ количественного определения дозы и/или активности препарата AAV предусматривает подтверждение биологической активности препарата AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает подтверждение биологической активности препарата AAV с использованием способа in vitro. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает подтверждение биологической активности препарата AAV с использованием способа in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению не требуют подтверждения с использованием биологического анализа, если AAV-специфический анализ ELISA сочетается со способом подтверждения качества продукта (например, путем измерения соотношения полные: пустые). Например, согласно определенным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению не требуют подтверждения с использованием биологического анализа, если AAV-специфический анализ ELISA объединяют с CryoTEM. Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения дозы и/или активности с помощью qPCR.
Согласно определенным аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают получение препарата AAV, содержащего: (i) трансфекцию клеток-хозяев по меньшей мере одной плазмидой, содержащей представляющий интерес ген; (ii) сбор супернатанта или клеточной суспензии клеточной культуры, содержащей капсиды AAV, для создания фракции AAV; (iii) количественное определение общего количества капсидов AAV во фракции AAV с использованием AAV-специфического анализа ELISA и (iv) получение препарата AAV с желаемой концентрацией капсидов AAV на основе общего количества капсидов AAV, определенного на стадии (iii). Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает концентрирование фракции AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает удаление по меньшей мере части пустых капсидов из фракции AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере часть пустых капсидов удаляют для создания фракции или препарата AAV с определенной концентрацией полных капсидов и/или определенным соотношением полных:пустых капсидов. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает оценку или подтверждение процента или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения концентрации, дозы и/или активности с помощью qPCR. Согласно определенным вариантам осуществления способ дополнительно предусматривает лиофилизацию фракции или препарата AAV.
Согласно определенным аспектам способы настоящего изобретения предусматривают введение препарата AAV нуждающемуся в этом субъекту, предусматривая (i) получение очищенного препарата AAV; (ii) измерение концентрации капсидов AAV в очищенном препарате AAV с использованием AAV-специфического анализа ELISA; (iii) введение субъекту терапевтически эффективного количества очищенного препарата AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления препарат AAV на стадиях (i) и (ii) представляет собой фракцию AAV, которая может быть использована для получения конечного препарата AAV, в котором фракцию AAV очищают или разбавляют с образованием препарата AAV для стадий (i), (ii) и/или (iii). Согласно некоторым вариантам осуществления дозу и/или активность очищенной фракции или препарата AAV измеряют путем количественного определения общего количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает оценку или подтверждение процентного содержания или соотношения полных:пустых капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения концентрации, дозы и/или активности с помощью qPCR.
Согласно определенным аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают введение препарата AAV в конкретной дозе нуждающемуся в этом субъекту, предусматривая (i) получение очищенного препарата AAV; (ii) измерение концентрации капсидов AAV в очищенном препарате AAV с использованием AAV-специфического анализа ELISA; (iii) введение определенной дозы препарата AAV субъекту. Согласно некоторым вариантам осуществления препарат AAV на стадиях (i) и (ii) представляет собой фракцию AAV, которая может быть использована для получения конечного препарата AAV, в котором фракцию AAV очищают или разбавляют с образованием препарата AAV для стадий (i), (ii) и/или (iii). Согласно некоторым вариантам осуществления дозу очищенной фракции или препарата AAV измеряют путем количественного определения общего количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает оценку или подтверждение процентного содержания или соотношения полных:пустых капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения концентрации, дозы и/или активности с помощью qPCR.
Согласно определенным вариантам осуществления анализ ELISA может представлять собой сэндвич-анализ ELISA, прямой ELISA, непрямой ELISA или конкурентный анализ ELISA. Согласно определенным вариантам осуществления для способов, раскрытых в настоящем документе, AAV-специфический анализ ELISA представляет собой сэндвич-анализ ELISA, специфический для антигена AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления антиген AAV представляет собой антиген AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 или химерный антиген AAV. Согласно определенным вариантам осуществления антиген AAV представляет собой антиген AAV8. Согласно определенным вариантам осуществления антиген AAV происходит из рекомбинантного AAV (rAAV). Согласно некоторым вариантам осуществления антиген AAV происходит из генетически сконструированного AAV или химически модифицированного AAV, или и того и другого.
Согласно определенным вариантам осуществления ELISA предусматривает антитело, специфическое к эпитопу AAV антигена. Согласно некоторым вариантам осуществления эпитоп AAV представляет собой конформационный эпитоп, присутствующий на собранных капсидах AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления эпитоп AAV представляет собой линейный эпитоп, присутствующий на собранных капсидах AAV. Примеры таких эпитопов включают в себя, без ограничения, капсидные белки вириона VP1, VP2 и/или VP3. Согласно некоторым вариантам осуществления AAV генетически сконструированы для экспрессии дополнительных белков вириона на поверхности капсида, и эти сконструированные белки могут быть использованы/обнаружены в анализе ELISA. Согласно некоторым вариантам осуществления AAV химически модифицированы для экспрессии вариантов белка вириона, который может быть использован/обнаружен в анализе ELISA (например, VP1', VP2', VP3' и т.д.). Согласно определенным вариантам осуществления антитела идентифицируют специфические к серотипу капсидные белки вириона.
Согласно некоторым вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов способ оценки или подтверждения процентного содержания или соотношения полных:пустых капсидов AAV во фракции или препарате AAV может представлять собой CryoTEM, ТЕМ с отрицательным окрашиванием, капиллярный электрофорез, аналитическое ультрацентрифугирование или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления способ оценки или подтверждения процентного содержания полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV во фракции или препарате AAV представляет собой CryoTEM. Согласно некоторым вариантам осуществления оценка предусматривает количественную оценку процента или соотношения полных:пустых капсидов AAV.
Согласно некоторым вариантам осуществления стадия CryoTEM предусматривает следующее: (i) погружение фракции или препарата AAV в субстрат в инертную подложку; (ii) мгновенное замораживание погруженной фракции или препарата AAV; (iii) визуализация погруженной фракции или препарата AAV с использованием криогенной просвечивающей электронной микроскопии и (iv) количественное определение процентного содержания полных капсидов AAV по сравнению с пустыми капсидами AAV во фракции или препарате AAV. Согласно определенным вариантам осуществления субстрат представляет собой аморфный некристаллический лед. Согласно определенным вариантам осуществления фракция или препарат AAV не содержат клеточного дебриса. Например, векторные образцы не содержат неопределенных частиц >2%, не содержат разбитых или олигомеризованных частиц >2%.
Использование CryoTEM в сочетании с AAV-специфическим анализом ELISA является преимущественным по сравнению с известными в настоящей области техники, поскольку CryoTEM обеспечивает прямое измерение полных:пустых капсидов, в отличие от количественной PCR (qPCR). Согласно определенным вариантам осуществления способ не предусматривает стадию измерения концентрации или дозы с помощью qPCR.
Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов анализ ELISA проводят перед количественным определением полных:пустых капсидов AAV. Согласно определенным вариантам осуществления анализ ELISA проводят до CryoTEM. Согласно некоторым вариантам осуществления анализ ELISA проводят для разбавления общего числа капсидов AAV до подтвержденного диапазона (например, диапазонов к.ч./мл, как описано в настоящем документе). Согласно некоторым вариантам осуществления анализ ELISA проводят после количественного определения полных: пустых капсидов AAV. Согласно определенным вариантам осуществления анализ ELISA проводят после CryoTEM. Согласно некоторым вариантам осуществления анализ ELISA проводят для разбавления общего числа полных капсидов AAV до подтвержденного диапазона. Согласно определенным вариантам осуществления количественное определение полные:пустые выполняется только один раз. Например, стадию CryoTEM можно использовать один раз, чтобы проверить, что партия характеризуется постоянным соотношением пустые:полные, как и в предыдущих партиях.
Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов использование как ELISA, так и CryoTEM приводит к способу, который можно применять для всех серотипов AAV, независимо от векторной ДНК. Это выгодно, поскольку позволяет проводить анализ на всех платформах.
Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов, фракций или препаратов процентное содержание полных капсидов AAV во фракции или препарате AAV по сравнению с пустыми капсидами составляет от приблизительно 40% до приблизительно 100%. Согласно определенному варианту осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 40% до приблизительно 95%, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 40% до приблизительно 85%, от приблизительно 40% до приблизительно 80%, от приблизительно 45% до приблизительно 75%, от приблизительно 50% до приблизительно 70% или от приблизительно 55% до приблизительно 65%. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 60% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы используются для получения фракций или препаратов AAV с постоянными количествами полных капсидов между партиями фракций или препаратов AAV.
10
20
11
19
12
18
13
17
14
16
12
15
13
15
12
13
14
14
14
14
14
15
Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов и препаратов концентрация препаратов AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл. Согласно некоторым вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов и препаратов концентрация препаратов AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл, от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10к.ч./мл, от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл или от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл. Согласно некоторым вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов и препаратов концентрация препаратов AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл, от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10к.ч./мл или от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно до 1×10 к.ч./мл. Согласно некоторым вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов и препаратов концентрация препаратов AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 5×10 к.ч./мл, от приблизительно 2×10 к.ч./мл до приблизительно 3×10к.ч./мл или от приблизительно 3,5×10 к.ч./мл до приблизительно 5×10 к.ч./мл. Согласно некоторым вариантам осуществления к.ч./мл могут представлять собой все капсиды на мл или полные капсиды на мл. Согласно некоторым вариантам осуществления к.ч./мл представляет собой все капсиды на мл.
5
25
10
20
10
16
Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов или препаратов доза препарата AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг. Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов, фракций или препаратов доза фракции или препарата AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг. Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов, фракций или препаратов доза фракции или препарата AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10к.ч./кг. Согласно некоторым вариантам осуществления к.ч./кг может представлять собой все капсиды на кг субъекта или полные капсиды на кг субъекта. Согласно определенным вариантам осуществления к.ч./кг представляет собой все капсиды на кг субъекта.
Согласно определенным вариантам осуществления для всех раскрытых в настоящем документе способов субъект представляет собой человека или отличное от человека животное (например, шимпанзе и другие виды обезьян; сельскохозяйственные животные, такие как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашние млекопитающие, такие как собаки и кошки; лабораторные животные, включая в себя грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птицы, включая в себя домашних, диких и промысловых птиц, таких как цыплята, индюки и другие куриные, утки или гуси). Согласно определенным вариантам осуществления субъект представляет собой человека.
Согласно некоторым вариантам осуществления для всех раскрытых в настоящем документе способов AAV представляет собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 или химерный вектор AAV. Согласно определенным вариантам осуществления AAV представляет собой AAV8. Согласно определенным вариантам осуществления AAV представляет собой AAV9. Согласно определенным вариантам осуществления AAV представляет собой рекомбинантный AAV (rAAV). Согласно определенным вариантам осуществления AAV является генетически сконструированным, химически модифицированным или и тем и другим.
Согласно определенным аспектам настоящее изобретение предусматривает фракцию или препарат AAV, причем концентрацию, дозу и/или активность фракции или препарата измеряют с помощью AAV-специфического анализа ELISA. Согласно определенным аспектам настоящее изобретение предусматривает фракцию или препарат AAV, причем концентрацию, дозу и/или активность фракции или препарата измеряют с помощью AAV-специфического анализа ELISA в сочетании с анализом, который измеряет процент или соотношение полных капсидов против пустых капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно определенным аспектам настоящее изобретение предусматривает фракцию или препарат AAV, причем концентрацию, дозу и/или активность фракции или препарата измеряют с помощью AAV-специфического анализа ELISA в сочетании с CryoTEM. Согласно некоторым вариантам осуществления концентрацию, дозу и/или активность препарата AAV не измеряют с помощью qPCR.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой график сравнения процента ошибок для измерения количества вектора AAV и содержания векторного генома с использованием антигена ELISA или qPCR, соответственно. ELISA AAV (QC («Контроль качества»)): n=60; ELISA AAV (R&D («Исследования и разработки»)): n=83; ITR-qPCR (R&D): n=64; FIX-qPCR (QC): n=40; FIX-qPCR (R&D): n=135.
10
Фиг. 2 представляет собой результат исследования электрофореза в агарозном геле, в котором изучается способность антигена ELISA и qPCR определять дозу капсидов AAV, погруженных в агарозный гель (2,0×10 капсидов/дорожка).
Фиг. 3 представляет собой график, подтверждающий применение антигена способа ELISA для определения дозы препарата AAV, вводимого при количественном анализе биологической активности in vivo с использованием мышиной модели (n=7).
Фиг. 4 представляет собой график сравнения вариации от партии к партии одноцепочечной ДНК FAVIII AAV8 с использованием AAV-специфического ELISA в сравнении с ITR-qPCR. AAV8: антиген - медиана: 3,03 к.ч./мл ± 0,66 к.ч./мл. ITR-qPCR -медиана: 9,11 в.г./мл ± 3,01 в.г./мл.
Фиг. 5А-5В: Фиг. 5А представляет собой график, демонстрирующий соотношение векторных геномов AAV (в.г.) на капсидные частицы ELISA антигена AAV8 (к.ч.). Фиг. 5В представляет собой график, демонстрирующий высокую консистенцию «полных» капсидов в препарате AAV (например, смотрите процесс, описанный в публикации международной заявки №PCT/US2017/059967, полностью включенной в настоящий документ для всех целей).
Фиг. 6А-6С: Фиг. 6А представляет собой изображение CryoTEM одного полного капсида AAV8 и одного пустого капсида AAV8. Фиг. 6В представляет собой изображение CryoTEM одного олигомеризованного капсида AAV8 (т.е. капсид AAV образует тримерную структуру, которая может быть пустой или полной). Фиг. 6С представляет собой изображение CryoTEM одного сломанного капсида AAV8.
Фиг. 7 представляет собой график анализа фракции AAV8 с использованием CryoTEM. Изображения CryoTEM получали при увеличении 38k и подвергали анализу внутренней плотности. Анализ основных компонентов для создания кластеров профиля радиальной плотности каждой частицы AAV выявил кластеры уровней упаковки: полный (слева), синий (справа), неопределенный (в середине) (более темные отметки указывают на перекрывающиеся точки данных); пунктирные кольца: доверительные интервалы 99%. 5 изображений проанализировано, 1568 частиц.
Фиг. 8 представляет собой график, подтверждающий использование CryoTEM для измерения процентного содержания полных векторных капсидов AAV8.
Фиг. 9 представляет собой график, демонстрирующий корреляцию векторных геномов с капсидными частицами с процентом полных капсидов.
Фиг. 10 представляет собой график, демонстрирующий влияние процентного содержания полных капсидных частиц AAV8 на активность in vivo в модели мыши с нокаутом по фактору IX. Образцы плазмы отбирали через 14 дней и измеряли свертываемость человеческого фактора IX.
Фиг. 11 представляет собой график, демонстрирующий влияние процентного содержания полных капсидных частиц AAV8 на биологическую активность in vitro. Биологическую активность измеряли в клеточном анализе, связанном с к.ч., и наносили на график в зависимости от процента полных частиц.
Фиг. 12 представляет собой график сравнения вариации от партии к партии одноцепочечной ДНК FAVIII AAV8 с использованием AAV-специфического ELISA в сравнении с ITR-qPCR для партий 17004-17013 (смотрите таблицу 7).
Фиг. 13 представляет собой график, демонстрирующий высокую консистенцию «полных» капсидов в препарате AAV (например, смотрите процесс, описанный в публикации международной заявки №PCT/US2017/059967) для партий 17004-17013 (смотрите таблицу 7).
Дополнительные прилагаемые фигуры предназначены только для дополнительного освещения настоящего раскрытия и не накладывают ограничения на объем настоящего раскрытия, если не указано иное.
Подробное описание настоящего изобретения
В настоящем документе представлены способы измерения качественных и/или количественных признаков препаратов генотерапевтического вектора. Согласно определенным вариантам осуществления препараты генотерапевтического вектора представляют собой препараты AAV, например, AAV8 или AAV9. Все раскрытые в настоящем документе способы могут быть использованы для получения препарата AAV.
Использование генотерапевтических векторов зависит по меньшей мере от двух биологических активностей для его активности: 1) способности переносить последовательность ДНК в клетку и 2) биологического эффекта экспрессируемой генетической последовательности. Для достижения этих активностей требуется правильная концентрация или доза капсидов AAV, содержащих геномную последовательность. Это связано с тем, что «пустые» капсиды не способны обеспечить терапевтическую пользу, связанную с производством трансгена. Таким образом, важно точно измерить концентрацию или дозу препарата AAV, чтобы гарантировать доставку надлежащего и/или постоянного количества полных частиц вектора AAV. Это особенно верно, потому что для рекомбинантных белков соответствующий коэффициент дисперсии между партиями/дозировками составляет от ≤10% до 20%, при этом ≤10% является более идеальным. Правильное определение дозы важно для определения активности препарата AAV. Это связано с тем, что активность определяется градуированными или количественными кривыми доза-эффект. Если доза является неточной, неточность будет переведена в измеренную активность. Неточная активность может привести к недостаточному или чрезмерному лечению популяции пациентов.
Используемые в настоящем документе термины «капсид», «капсидная частица» и «частица» используются взаимозаменяемо и относятся к частице AAV, состоящей по меньшей мере из одной неповрежденной оболочки капсида AAV.
Используемый в настоящем документе термин «пустые» в отношении AAV или капсидов AAV относится к тем, у которых отсутствует полный векторный геном. Пустые AAV или пустые капсиды AAV, или пустые частицы AAV не могут обеспечить терапевтическую пользу. Используемый в настоящем документе термин «полные капсиды AAV» в отношении AAV или капсидов AAV, или частиц AAV относится к тем, которые содержат большую часть полного векторного генома. Полные капсиды AAV могут обеспечить терапевтическую пользу пациентам-реципиентам. Согласно некоторым вариантам осуществления «полные» могут также включать в себя «неполную векторную ДНК» или «усеченную векторную ДНК». Согласно определенным вариантам осуществления полная против неполной и/или усеченной векторной ДНК может быть дифференцирована с помощью дополнительных аналитических способов. Такие способы предусматривают, без ограничения, определение размера ДНК с помощью капиллярного электрофореза, AUC (аналитическое ультрацентрифугирование), % ДНК в агарозном геле (нативном или щелочном), саузерн-блот, дот-блот гибридизацию, УФ-спектрофотометрию, слабую анионообменную хроматографию и масс-спектрометрию (смотрите публикацию Resolving Adeno-Associated Viral Particle Diversity with Charge Detection Mass Spectrometry Elizabeth E. Piersonet.al Anal. Chem., 2016, 88 (13), pp 6718-6725, которая полностью включена в настоящий документ для всех целей).
В соответствии с руководящими принципами FDA, опубликованными в январе 2011 г. (Руководство для промышленности: исследование активности для продуктов клеточной и генной терапии), существует три способа измерения активности, такие как: 1) биологические анализы in vivo; 2) небиологические анализы in vitro и 3) множественные исследования. Биологические анализы, однако, приводят к большой вариабельности из-за вариабельности дозировки, анализа и считывания. Небиологические анализы также имеют проблемы. Например, количественная PCR (qPCR) измеряет только представляющий интерес ген. Таким образом, использование qPCR может привести к неточному определению активности конечного препарата AAV из-за включения нефункциональных капсидов, таких как олигомеризованные, разрушенные и/или содержащие более одной копии ДНК, в расчете дозы. Нефункциональные капсиды не могут эффективно трансдуцировать клетки. Кроме того, qPCR также ограничена из-за своей высокой внутренней вариабельности и вариабельности между анализами (т.е. высокой вариабельности до 0,5 шага по логарифмической шкале), что может привести к неточному определению активности. Если концентрация, доза и/или активность не определены точно, пациенты могут получать широко варьирующиеся дозы от партии к партии и/или от лечения к лечению. Переоценка дозы или активности может привести к неадекватному лечению заболевания и/или нарушения. Недостаточная оценка дозы или активности может привести к побочным эффектам (например, чрезмерной коррекции (например, сгусткам крови) или иммунному ответу, вызванному большим количеством капсидных частиц в организме).
Согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем изобретении представлены способы количественного определения концентрации, дозы и/или активности препарата AAV, предусматривающие количественное определение общего количества капсидов AAV в препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает а) количественную оценку общего количества капсидов AAV и, необязательно, b) оценку и/или подтверждение процента или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV в препарате AAV.
Согласно некоторым вариантам осуществления стадия количественного определения предусматривает определение общего количества капсидов AAV с помощью ELISA, SPR (поверхностного плазмонного резонанса), технологии дифференциальной сканирующей флуориметрии, способов иммунологического количественного определения или их комбинаций. Согласно определенным вариантам осуществления стадия количественного определения предусматривает определение общего количества капсидов AAV посредством AAV-специфического ELISA. Согласно некоторым вариантам осуществления анализ ELISA может представлять собой сэндвич-ELISA, прямой ELISA, непрямой ELISA или конкурентный анализ ELISA. Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов AAV-специфический анализ ELISA представляет собой сэндвич-анализ ELISA, специфический для антигена AAV.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ оценки или подтверждения процентного содержания или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV во фракции или препарате AAV может представлять собой криогенную просвечивающую электронную микроскопию (CryoTEM), ТЕМ с отрицательным окрашиванием, хроматографическое разделение полных и пустых капсидов (SEC, IEX, HIC и т.д.), капиллярный электрофорез, аналитическое ультрацентрифугирование или их комбинации. Согласно некоторым вариантам осуществления способ оценки или подтверждения процентного содержания или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV во фракции или препарате AAV может представлять собой CryoTEM. Согласно определенным вариантам осуществления способы включают в себя как AAV-специфический ELISA, так и CryoTEM.
Раскрытые в настоящем документе способы точно измеряют активность в этом узком диапазоне изменчивости. Согласно определенным вариантам осуществления раскрытые способы приводят к коэффициенту вариации от приблизительно 30% до приблизительно 1%, от приблизительно 27% до приблизительно 2%, от приблизительно 25% до приблизительно 5%, от приблизительно 22% до приблизительно 7%, от приблизительно 20% до приблизительно 10% или от приблизительно 17% до приблизительно 12%. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые способы приводят к тому, что коэффициент вариации составляет ≤ приблизительно 30%, ≤ приблизительно 29%, ≤ приблизительно 28%, ≤ приблизительно 27%, ≤ приблизительно 26%, ≤ приблизительно 25%, ≤ приблизительно 25%, ≤ приблизительно 24%, ≤ приблизительно 23%, ≤ приблизительно 22%, ≤ приблизительно 21%, ≤ приблизительно 20%, ≤ приблизительно 19%, ≤ приблизительно 18%, ≤ приблизительно 17%, ≤ приблизительно 16%, ≤ приблизительно 16%, ≤ приблизительно 15%, ≤ приблизительно 14%, ≤ приблизительно 14%, ≤ приблизительно 13%, ≤ приблизительно 12%, ≤ приблизительно 11%, ≤ приблизительно 10%, ≤ приблизительно 9%, ≤ приблизительно 8%, ≤ приблизительно 7%, ≤ приблизительно 6%, ≤ приблизительно 6%, ≤ приблизительно 5%, ≤ приблизительно 4%, ≤ приблизительно 4%, ≤ приблизительно 3%, ≤ приблизительно 2%, ≤ 1%, но во всех случаях ≥ 0.
Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы, включающие в себя ELISA, приводят к получению препарата AAV с вариабельностью концентрации, дозы и/или активности от приблизительно 10% до приблизительно 80%, по сравнению со способом, при котором используют qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы, включающие в себя ELISA, приводят к получению препарата AAV с меньшей вариабельностью концентрации, дозы и/или активности от приблизительно 10% до приблизительно 75%, от приблизительно 10% до приблизительно 70%, от приблизительно 10% до приблизительно 65%, от приблизительно 15% до приблизительно 60%, от приблизительно 15% до приблизительно 55%, от приблизительно 20% до приблизительно 50%, от приблизительно 20% до приблизительно 48%, от приблизительно 20% до приблизительно 46%, от приблизительно 20% до приблизительно 44%, от приблизительно 20% до приблизительно 42%, от приблизительно 20% до приблизительно 40%, от приблизительно 20% до приблизительно 38%, от приблизительно 20% до приблизительно 36%, от приблизительно 20% до приблизительно 34% или от приблизительно 20% до приблизительно 32%, по сравнению со способом, при котором используют qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы, включающие в себя ELISA, приводят к получению препарата AAV с вариабельностью концентрации, дозы и/или активности приблизительно на 20-33% меньше, по сравнению со способом, при котором используют qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы, включающие в себя ELISA, приводят к получению препарата AAV с меньшей вариабельностью концентрации, дозы и/или активности по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 11%, по меньшей мере приблизительно на 12%, по меньшей мере приблизительно на 13%, по меньшей мере приблизительно на 14%, по меньшей мере приблизительно на 15%, по меньшей мере приблизительно на 16%, по меньшей мере приблизительно на 17%, по меньшей мере приблизительно на 18%, по меньшей мере приблизительно на 19%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 21%, по меньшей мере приблизительно на 22%, по меньшей мере приблизительно на 23%, по меньшей мере приблизительно на 24%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 26%, по меньшей мере приблизительно на 27%, по меньшей мере приблизительно на 28%, по меньшей мере приблизительно на 29%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 31%, по меньшей мере приблизительно на 32%, по меньшей мере приблизительно на 33%, по меньшей мере приблизительно на 34%, по меньшей мере приблизительно на 35%, по меньшей мере приблизительно на 36%, по меньшей мере приблизительно на 37%, по меньшей мере приблизительно на 38%, по меньшей мере приблизительно на 39%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 41%, по меньшей мере приблизительно на 42%, по меньшей мере приблизительно на 43%, по меньшей мере приблизительно на 44%, по меньшей мере приблизительно на 45%, по меньшей мере приблизительно на 46%, по меньшей мере приблизительно на 47%, по меньшей мере приблизительно на 48%, по меньшей мере приблизительно на 49% или по меньшей мере приблизительно на 50%, по сравнению со способом, при котором используют qPCR.
Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают исследование препарата AAV с помощью AAV-специфического ELISA. Согласно некоторым вариантам осуществления AAV-специфический ELISA является достаточным для обеспечения репрезентативного считывания дозы или активности препарата AAV, поскольку большинство капсидов в препарате AAV представляют собой полные капсиды. Например, процент полных капсидов AAV составляет большинство от приблизительно 50% до приблизительно 100%. Согласно определенному варианту осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 50% до приблизительно 95%, от приблизительно 50% до приблизительно 90%, от приблизительно 50% до приблизительно 85%, от приблизительно 50% до приблизительно 80%, от приблизительно 55% до приблизительно 50%, от приблизительно 60% до приблизительно 80% или от приблизительно 65% до приблизительно 75%. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 60% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления AAV-специфический ELISA является достаточным для обеспечения репрезентативного считывания активности препарата AAV, потому что соотношение полных и пустых капсидов в препарате AAV является постоянным от партии к партии. Согласно некоторым вариантам осуществления термин «постоянный» относится к коэффициенту вариаций (CV) от приблизительно 0% до приблизительно 15%, от приблизительно 2% до приблизительно 12%, от приблизительно 5% до приблизительно 10%, от приблизительно 7% до приблизительно 9%. Согласно некоторым вариантам осуществления термин «постоянный» относится к CV приблизительно 15% или менее, приблизительно 12% или менее, приблизительно 10% или менее, приблизительно 9% или менее, приблизительно 8% или менее, приблизительно 7% или менее, приблизительно 6% или менее, приблизительно 5% или менее, приблизительно 4% или менее, приблизительно 3% или менее, приблизительно 2% или менее или приблизительно 1% или менее. Согласно определенным вариантам осуществления «постоянный» относится к CV приблизительно 1% или менее. Согласно некоторым вариантам осуществления AAV-специфический ELISA в сочетании с CryoTEM необходим для исследования активности препарата AAV.
Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают исследование фракции или препарата AAV с помощью CryoTEM. Согласно определенным вариантам осуществления CryoTEM является достаточным для обеспечения репрезентативного показания активности препарата AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления CryoTEM в сочетании с AAV-специфическим ELISA требуется для исследования активности препарата AAV.
Согласно определенным вариантам осуществления препарат AAV, полученный и/или измеренный с помощью способов настоящего изобретения, подходит для введения субъекту. Применимые векторы AAV более подробно описаны ниже. Согласно определенным вариантам осуществления препарат AAV, полученный способами по настоящему изобретению, является стерильным и/или класса надлежащей производственной практики (GMP). Согласно некоторым вариантам осуществления препарат AAV, полученный с помощью способов настоящего раскрытия, соответствует требованиям, изложенным в главе 1046 Фармакопеи США или Европейской фармакопее по лекарственным средствам для генной терапии, или как предписано Управлением по контролю за продуктами и лекарственными средствами США (USFDA) или Европейским агентством по лекарственным средствам (ЕМА).
Используемые в настоящем документе способы могут быть использованы для фракции AAV и/или препарата AAV. Термины «препарат» и «фракция» могут использоваться взаимозаменяемо в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам осуществления термин «фракция» может означать образец или партию AAV, которые можно использовать для создания конечного «препарата» AAV, который будет вводиться субъекту. Например, фракция AAV может подвергаться дополнительной обработке, очистке или регулировке объема перед формированием конечного препарата AAV. Количественные и/или качественные способы
Способы по настоящему изобретению предусматривают одну или несколько стадий контроля качества, например, стадии измерения концентрации, дозы и/или активности фракций или препаратов AAV, полученных после одной или нескольких стадий (например, после каждой стадии) процесса очистки, включая в себя заключительную стадию приготовления препарата для введения.
Способы по настоящему изобретению могут предусматривать анализ ELISA, специфический для AAV (например, антигена AAV), для количественного определения количества капсидов AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления анализ ELISA может включать в себя, без ограничения, иммуносорбентный анализ, прямой ELISA, непрямой ELISA, сэндвич-ELISA и/или конкурентный ELISA. Согласно определенным вариантам осуществления ELISA представляет собой сэндвич-ELISA. Неограничивающий пример анализа ELISA представлен в примере 1.
Согласно определенным вариантам осуществления антиген AAV представляет собой антиген AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 или химерный антиген AAV. Согласно определенным вариантам осуществления антиген AAV представляет собой антиген AAV8. Согласно определенным вариантам осуществления антиген AAV происходит из рекомбинантного AAV (rAAV). Согласно некоторым вариантам осуществления антиген AAV происходит из генетически сконструированного AAV или химически модифицированного AAV, или и того и другого.
Согласно определенным вариантам осуществления ELISA содержит антитело, специфическое к эпитопу AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления эпитоп AAV представляет собой конформационный эпитоп, присутствующий на собранных капсидах AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления эпитоп AAV представляет собой линейный эпитоп, присутствующий на собранных капсидах AAV. Примеры таких эпитопов включают в себя, без ограниченияи, капсидные белки вириона VP1, VP2 и/или VP3. Согласно некоторым вариантам осуществления AAV генетически сконструированы для экспрессии дополнительных белков вириона на поверхности капсида, и эти сконструированные белки могут быть использованы/обнаружены в анализе ELISA. Согласно некоторым вариантам осуществления AAV химически модифицированы для экспрессии вариантов белка вириона, который может быть использован/обнаружен в анализе ELISA (например, VP1', VP2', VP3' и т.д.). Согласно определенным вариантам осуществления антитела идентифицируют серотипоспецифические белки капсидного вириона.
ELISA может заменить qPCR в качестве способа определения дозы и/или активности фракции или препарата AAV. Как показано на фиг. 1, способ ELISA по настоящему изобретению обладает значительно меньшей вариабельностью, чем способ qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают оценку фракции или препарата AAV с помощью AAV-специфического ELISA. Согласно определенным вариантам осуществления все способы, раскрытые в настоящем документе, не предусматривают стадию qPCR.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после ультрацентрифугирования, с помощью AAV-специфического ELISA для определения количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после глубокой фильтрации, с помощью AAV-специфического ELISA для определения количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после концентрирования фракции или препарата AAV, с использованием системы ультра-/диафильтрации с помощью AAV-специфического ELISA для определения количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после стадии фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), с помощью AAV-специфического ELISA для определения количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после отрицательной анионообменной хроматографии с (АЕХ), с помощью AAV-специфического ELISA для определения количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после стадии окончательной очистки, с помощью AAV-специфического ELISA для определения количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование очищенного препарата AAV с помощью AAV-специфического ELISA для определения количества капсидов AAV в препарате AAV.
Дополнительные способы оличественного определения количества капсидов AAV включают в себя, без ограничения, поверхностный плазмонный резонанс (SPR) (например, BIACORE, OCTET), дифференциальную сканирующую флуориметрию (например, Prometheus NT48, Nanotemper), магнитный иммуноанализ (MIA) и иммуноанализ доноров клонированных ферментов (CEDIA). Эти способы могут использоваться в дополнение или вместо количественного анализа ELISA.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы настоящего раскрытия предусматривают измерение полных и пустых капсидов AAV (например, процентное соотношение полных и пустых капсидов AAV). Способ оценки или подтверждения процентного содержания или соотношения полных:пустых капсидов AAV во фракции или препарате AAV включает в себя, без ограничения, криогенную просвечивающую электронную микроскопию (CryoTEM), ТЕМ с отрицательным окрашиванием, капиллярный электрофорез, аналитическое ультрацентрифугирование или их комбинации.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ измерения полных и пустых капсидов AAV представляет собой СгуоТЕМ (смотрите фиг.6). Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает использование как СгуоТЕМ, так и AAV-специфического ELISA, как описано выше. Согласно определенным вариантам осуществления ELISA представляет собой сэндвич-ELISA. Согласно некоторым вариантам осуществления сэндвич-ELISA содержит антитело, специфическое к эпитопу AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления эпитоп AAV представляет собой конформационный эпитоп, присутствующий на собранных капсидах AAV. Неограничивающий способ измерения количества полных и пустых капсидов с помощью CryoTEM описан в настоящем документе как пример 2.
Одним из преимуществ использования CryoTEM является то, что нет необходимости в отрицательном окрашивании. CryoTEM также дает возможность количественно определять количество полных капсидов AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления использование CryoTEM приводит к отсутствию завышения количества полных капсидов AAV из-за ложного положительного сигнала.
Способы по настоящему раскрытию включают в себя способ, оценивающий количество или процентное содержание полных и пустых капсидов AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают CryoTEM. Согласно определенным вариантам осуществления способы предусматривают: (i) погружение фракции или препарата AAV в субстрат в инертную подложку; (ii) мгновенное замораживание погруженной фракции или препарата AAV; (iii) визуализацию погруженной фракции или препарата AAV с использованием криогенной просвечивающей электронной микроскопии и (iv) количественное определение процентного содержания полных капсидов AAV по сравнению с пустыми капсидами AAV.
Для стадии (i) примеры подходящих субстратов для применения в способе включают в себя, без ограничения, аморфный некристаллический лед. Примеры подходящей инертной подложки для применения в способе включают в себя, без ограничения, пленку из углерода, термопластичные смолы и поливинильные формали (например, полимеры, образованные из поливинилового спирта и формальдегида в качестве сополимеров с поливинилацетатом, такие как, без ограничения, Formvar или Vinylec, поливиниловый формальдегид, стабилизированный углеродом, монооксид кремния на поливиниловом формальдегиде, чистая углеродная пленка, углерод типа А: пленка из углеродного носителя (например, съемный поливиниловый формаль на противоположной стороне сетки), углерод типа В: поливиниловая формальная пленка (например, покрытая более тяжелым слоем углерода) и монооксид кремния на углероде типа А). Согласно некоторым вариантам осуществления стадия (i) выше предусматривает осаждение образца на тонкую поддерживающую пленку углерода в температуре (например, (-196°С) или ниже) и среде с контролируемой влажностью. Согласно определенным вариантам осуществления уровень влажности может представлять собой относительную влажность. На стадии (ii) образец может быть мгновенно заморожен. Согласно некоторым вариантам осуществления мгновенное замораживание может предусматривать применение жидкого этана, жидкого азота, жидкого пропана или гелия вблизи температуры жидкого азота. Например, емкость с жидким этаном, жидким азотом, жидким пропаном или гелием окружена жидким азотом.
Согласно некоторым вариантам осуществления фракцию или препарат AAV замораживают так быстро (например, при 104-106 К в секунду), что кристаллы льда не могут образовываться. Согласно некоторым вариантам осуществления аморфный лед получают либо путем быстрого охлаждения жидкой воды, либо путем сжатия обычного льда при низких температурах. Согласно некоторым вариантам осуществления после удаления избытка фракции или препарата AAV, оставляя прилипшие некоторые образцы, сетку остекловывают в жидком этане и затем хранят в жидком азоте. Для обсуждения дополнительных стадий по выполнению CryoTEM смотрите публикацию Cabra and Samso, J. Visualized Experiments, (2015) 95(e52311): 1-11, полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки для всех целей.
CryoTEM-анализ частиц AAV можно использовать для оценки общей морфологии образца, т.е. наличия различных морфологий AAV (как правило, включая сферические и деформированные частицы AAV, структуры субъединиц и более крупные структурно менее определенные морфологии). На фиг. 6А представлен пример того, как можно визуально отличить «полную» от «пустой» частицы AAV. Например, полный капсид отображает внутреннюю плотность без четкой границы между оболочкой и ядром. Капсиды AAV, имеющие различную четко выраженную оболочку и минимальную внутреннюю плотность, классифицируются как пустые капсиды.
CryoTEM также может быть использован для оценки неопределенных капсидов. На фиг. 6В и 6С приведены примеры деформированных/неопределенных капсидов, которые не будут включены в качестве полных капсидов. Например, CryoTEM может использоваться для подсчета «полных», «пустых» и «неопределенных» капсидов.
CryoTEM также можно использовать для определения уровня упаковки частиц путем классификации частиц вручную или с использованием методологии автоматического анализа изображений.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после ультрацентрифугирования с помощью CryoTEM, для определения количества и/или качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после глубокой фильтрации с помощью CryoTEM, для определения количества и/или качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после концентрирования фракции или препарата AAV с использованием системы ультра-/диафильтрации через CryoTEM, для определения количества и/или качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после стадии фильтрации с тангенциальным потоком (TFF), с помощью CryoTEM, чтобы определить количество и/или качество капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после отрицательной анионообменной хроматографии (АЕХ), с помощью CryoTEM, для определения количества и/или качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после стадии окончательной очистки с помощью CryoTEM, для определения количества и/или качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование очищенного препарата AAV с помощью CryoTEM для определения количества и/или качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после ультрацентрифугирования, с помощью AAV-специфического ELISA и CryoTEM для определения количества и качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после глубокой фильтрации, с помощью AAV-специфического ELISA и CryoTEM для определения количества и качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после концентрирования фракции или препарата AAV с использованием системы ультра-/диафильтрации, с помощью AAV-специфического ELISA и CryoTEM для определения количества и качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после стадии фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), с помощью AAV-специфического ELISA и CryoTEM для определения количества и качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после отрицательной анионообменной хроматографии (АЕХ), с помощью AAV-специфического ELISA и CryoTEM для определения количества и качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование фракции или препарата AAV, полученных после стадии окончательной очистки, с помощью AAV-специфического ELISA и CryoTEM для определения количества и качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают исследование очищенного препарата AAV с помощью AAV-специфического ELISA и CryoTEM для определения количества и качества капсидов AAV во фракции или препарате AAV.
Аналитическое ультрацентрифугирование (AUC) способно разделять белки в соответствии с коэффициентом седиментации. Для идентичных белков коэффициент седиментации можно соотнести с состоянием агрегации. Вкратце, образцы разбавляют соответствующим буфером для образцов, а затем переносят в ячейки со встроенными кварцевыми окнами и загружают в ротор, который затем вращается с постоянной скоростью. Молекулы белка разного размера мигрируют с разной скоростью осаждения к дну ячейки и непрерывно контролируются во время центрифугирования с помощью УФ-обнаружения при 280 нм. Набор собранных данных позволяет проводить вычислительный анализ, который приводит к деконволюции процессов седиментации и диффузии, что приводит к дифференциальному распределению коэффициента седиментации c(s). Это разрешает различные виды выборки и представляет их s-значения и популяции. Распределение коэффициентов седиментации является интегрированным, и относительные проценты площади, а также S-значения пиковых максимумов приведены в качестве результатов анализа.
Препарат AAV
Препарат AAV, полученный способом по настоящему изобретению, дополнительно представлен в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления способ получения препарата AAV предусматривает следующее: (i) трансфекция клеток-хозяев по меньшей мере одной плазмидой, содержащей представляющий интерес ген; (ii) сбор супернатанта или клеточной суспензии клеточной культуры, содержащей капсиды AAV, для создания фракции или препарата AAV; (iii) количественное определение общего количества капсидов AAV во фракции или препарате AAV с использованием AAV-специфического анализа ELISA и (iv) получение препарата AAV с желаемой концентрацией на основе общего количества капсидов AAV, определенного на стадии (iii). Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает концентрирование фракции AAV. Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает удаление по меньшей мере части пустых капсидов из фракции AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления количество пустых капсидов удаляют для создания фракции или препарата AAV с конкретной концентрацией полных капсидов и/или конкретным соотношением полных: пустых капсидов. Согласно определенному варианту осуществления фракцию или препарат AAV разбавляют подходящим буфером до желаемой дозы.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает оценку или подтверждение процента или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV во фракции или препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способ, предусматривающий оценку или подтверждение процента или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV при помощи CryoTEM. Согласно некоторым вариантам осуществления доза и/или активность не определяются с помощью qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 40% до приблизительно 100%. Согласно определенному варианту осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 40% до приблизительно 95%, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 40% до приблизительно 85%, от приблизительно 40% до приблизительно 80%, от приблизительно 45% до приблизительно 75%, от приблизительно 50% до приблизительно 70% или от приблизительно 55% до приблизительно 65%. Согласно некоторым вариантам осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 60% до приблизительно 80%. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 60% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления раскрытые в настоящем документе способы используются для получения фракций или препаратов AAV с постоянными количествами полных капсидов между фракциями или препаратом AAV.
Способ введения препарата AAV, полученного способом по настоящему изобретению, дополнительно представлен в настоящем документе. Согласно определенным вариантам осуществления способ введения препарата AAV нуждающемуся в этом субъекту предусматривает следующее: (i) получение очищенного препарата AAV; (ii) измерение концентрации капсидов AAV в очищенном препарате AAV с использованием AAV-специфического анализа ELISA; (iii) введение субъекту терапевтически эффективного количества очищенного препарата AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления препарат на стадиях (i) и (ii) представляет собой фракцию AAV, которую можно использовать для получения конечного препарата AAV, в котором фракцию AAV дополнительно очищают или разбавляют для образования препарата AAV для стадий (i), (ii) и/или (iii). Согласно некоторым вариантам осуществления концентрацию, дозу и/или потенциальную эффективность очищенного препарата AAV измеряют путем количественного определения общего количества капсидов AAV в препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает оценку или подтверждение процента или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV в препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способ, предусматривающий оценку или подтверждение процента или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV, представляет собой CryoTEM. Согласно некоторым вариантам осуществления концентрация, доза и/или активность не определяется с помощью qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 40% до приблизительно 100%. Согласно определенному варианту осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 40% до приблизительно 95%, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 40% до приблизительно 85%, от приблизительно 40% до приблизительно 80%, от приблизительно 45% до приблизительно 75%, от приблизительно 50% до приблизительно 70% или от приблизительно 55% до приблизительно 65%. Согласно некоторым вариантам осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 60% до приблизительно 80%. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 60% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV.
Способ введения препарата AAV, полученного способом по настоящему изобретению, дополнительно представлен в настоящем документе. Согласно определенным аспектам способы по настоящему изобретению предусматривают введение препарата AAV определенной дозы нуждающемуся в этом субъекту, предусматривая следующее: (i) получение очищенного препарата AAV; (ii) измерение концентрации капсидов AAV в очищенном препарате AAV с использованием AAV-специфического анализа ELISA; (iii) введение определенной дозы препарата AAV субъекту. Согласно некоторым вариантам осуществления препарат на стадиях (i) и (ii) представляет собой фракцию AAV, которую можно использовать для получения конечного препарата AAV, в котором фракцию AAV дополнительно очищают или разбавляют для образования препарата AAV для стадий (i), (ii) и/или (iii). Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает оценку или подтверждение процента или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV в препарате AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления способ, предусматривающий оценку или подтверждение процента или соотношения полных и пустых (полные:пустые) капсидов AAV, представляет собой CryoTEM. Согласно некоторым вариантам осуществления концентрация, доза и/или активность не определяется с помощью qPCR. Согласно некоторым вариантам осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 40% до приблизительно 100%. Согласно определенному варианту осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 40% до приблизительно 95%, от приблизительно 40% до приблизительно 90%, от приблизительно 40% до приблизительно 85%, от приблизительно 40% до приблизительно 80%, от приблизительно 45% до приблизительно 75%, от приблизительно 50% до приблизительно 70% или от приблизительно 55% до приблизительно 65%. Согласно некоторым вариантам осуществления процент полных капсидов AAV составляет от приблизительно 60% до приблизительно 80%. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 60% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 99% или по меньшей мере приблизительно 100% капсидов AAV представляют собой полные капсиды AAV.
Согласно определенным вариантам осуществления активность препарата AAV может быть дополнительно подтверждена с помощью количественного анализа биологической активности in vitro и/или in vivo. Например, стадии могут предусматривать: 1) определение содержания AAV в препарате (например, с помощью ELISA); 2) определение процента полных капсидов (например, с помощью CryoTEM) и 3) подтверждение биологической активности (например, с помощью количественного анализа биологической активности in vivo и/или in vitro).
10
20
11
19
12
18
13
17
14
16
12
15
13
15
12
13
14
14
14
14
14
15
Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов, фракций или препаратов концентрация препаратов AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл. Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов, фракций или препаратов концентрация препаратов AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл, от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10к.ч./мл, от приблизительно 1×10 к.ч./мл до 1×10 к.ч./мл или от 1×10 к.ч./мл до 1×10к.ч./мл. Согласно некоторым вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов и препаратов концентрация препарата AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл, от приблизительно 1×10к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл или от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 1×10 к.ч./мл. Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов и препаратов концентрация препарата AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./мл до приблизительно 5×10 к.ч./мл, от приблизительно 2×10 к.ч./мл до приблизительно 3×10 к.ч./мл или от приблизительно 3,5×10 к.ч./мл до приблизительно 5×10 к.ч./мл. Согласно некоторым вариантам осуществления к.ч./мл могут представлять собой все капсиды на мл или полные капсиды на мл. Согласно некоторым вариантам осуществления к.ч./мл представляет собой все капсиды на мл.
12
13
Согласно некоторым вариантам осуществления препарат AAV содержит по меньшей мере приблизительно 10 вирусных частиц (в.ч.), полученных из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры), или по меньшей мере приблизительно 10 вирусных частиц (б.ч.), полученных из приблизительно 1000 л исходного материала (например, клеточной культуры).
5
25
6
24
7
23
8
22
9
21
10
20
11
19
12
18
13
17
14
16
12
20
13
19
14
18
15
17
10
16
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов или препаратов доза препарата AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг. Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов или препаратов доза препарата AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10к.ч./кг, от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг, от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг, от приблизительно 1×10к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг, от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг, от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10к.ч./кг, от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг, от приблизительно 1х10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг или от приблизительно 1×10 к.ч./кг до 1×10 к.ч./кг. Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов и препаратов доза препарата AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг, от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг, от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг или от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг. Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов и препаратов доза препарата AAV составляет от приблизительно 1×10 к.ч./кг до приблизительно 1×10 к.ч./кг. Согласно определенным вариантам осуществления для раскрытых в настоящем документе способов и препаратов доза препарата AAV составляет по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг, по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг или по меньшей мере приблизительно 1×10 к.ч./кг. Согласно некоторым вариантам осуществления к.ч./мл могут представлять собой все капсиды на кг субъекта или полные капсиды на кг субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления к.ч./мл представляет собой все капсиды на кг субъекта.
Согласно определенным вариантам осуществления препарат AAV по настоящему изобретению является высокочистым, высокоэффективным и подходящим для клинического применения у субъекта. Согласно определенным вариантам осуществления препарат AAV содержит капсидные частицы AAV гомогенной популяции и высокой чистоты. Согласно определенным вариантам осуществления препарат AAV содержит полноразмерную векторную ДНК. Согласно иллюстративным вариантам осуществления препарат AAV по существу не содержит нежелательных загрязняющих веществ, включая в себя, без ограничения, капсидные частицы AAV, содержащие усеченную или неполную векторную ДНК, частицы AAV с неполной белковой композицией и олигомеризованными структурами или загрязняющие вирусы, например, не AAV, вирусы в липидной оболочке. Согласно иллюстративным вариантам осуществления препарат AAV содержит большое количество кодирующей кДНК представляющего интерес белка. Согласно определенным вариантам осуществления препарат AAV по настоящему изобретению подходит для введения субъекту. Согласно определенным вариантам осуществления препарат AAV является стерильным и/или класса надлежащей производственной практики (GMP). Согласно некоторым вариантам осуществления препарат AAV соответствует требованиям, изложенным в главе 1046 Фармакопеи США или Европейской фармакопее по лекарственным средствам для генной терапии, или соответствует требованиям Управления по контролю за продуктами и лекарственными средствами США (USFDA) или Европейского агентства по лекарственным средствам (ЕМА). Согласно определенным вариантам осуществления препарат AAV представляет собой готовый к применению препарат для непосредственного введения субъекту с минимальной обработкой или ее отсутствием.
Термины «пациент» и «субъект» используются взаимозаменяемо и используются в их общепринятом смысле для обозначения живого организма, страдающего от состояния или склонного к состоянию, которое можно предотвратить или лечить путем введения композиции по настоящему изобретению, и включают в себя как людей, так и отличных от людей животных. Примеры субъектов включают в себя, без ограничения, людей, шимпанзе и других видов обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних млекопитающих, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая в себя грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки; птиц, включая в себя домашних, диких и охотничьих, таких как куры, индюки и другие куриные, утки, гуси и т.п. Термин не обозначает конкретный возраст. Таким образом, интерес представляют взрослые, несовершеннолетние и новорожденные.
Источник AAV
Что касается способов по настоящему раскрытию, AAV может быть любого серотипа AAV. Согласно определенным вариантам осуществления описанный в настоящем документе AAV характеризуется серотипом AAV1, серотипом AAV2, серотипом AAV3, серотипом AAV4, серотипом AAV5, серотипом AAV6, серотипом AAV7, серотипом AAV8, серотипом AAV9, серотипом AAV10 или представляет собой химерные векторы AAV. Согласно определенным вариантам осуществления AAV представляет собой AAV дикого типа. Согласно определенным вариантам осуществления AAV представляет собой рекомбинантный AAV (rAAV). Согласно определенным вариантам осуществления AAV модифицируется генной инженерией и/или химически модифицируется. Согласно определенным вариантам осуществления AAV содержит модифицированный капсид, например, генетически сконструированный или химически модифицированный капсид AAV. Согласно определенным вариантам осуществления AAV характеризуется серотипом AAV8. Согласно определенным вариантам осуществления AAV характеризуется серотипом AAV9.
10
11
12
13
14
15
16
12
Что касается способов по настоящему изобретению, фракция AAV согласно иллюстративным аспектам представляет собой концентрированную фракцию AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления фракция AAV содержит по меньшей мере приблизительно 1×10, приблизительно 1×10, приблизительно 1×10, приблизительно 1×10, приблизительно 1×10, приблизительно 1×10 или приблизительно 1×10 всех капсидов AAV на мл. Согласно определенным вариантам осуществления фракция AAV содержит по меньшей мере приблизительно 1×10 всех капсидов AAV на мл. Капсиды AAV могут включать в себя пустые капсиды AAV и полные капсиды AAV.
Согласно определенным вариантам осуществления AAV представляет собой фракцию или препарат AAV, производимый трансфицированными клетками-хозяевами. Согласно некоторым вариантам осуществления фракция или препарат AAV представляет собой собранный супернатант или суспензию клеток из клеточной культуры, содержащей клетки-хозяева, трансфицированные тройной плазмидной системой, причем одна плазмида системы содержит представляющий интерес ген или кДНК, одна плазмида кодирует капсидный белок VP1, капсидный белок VP2 и/или капсидный белок VP3. Согласно некоторым вариантам осуществления VP1, VP2 и/или VP3 представляют собой VP1, VP2 и/или VP3 AAV8. Тройная плазмидная трансфекция с целью получения rAAV известна в настоящей области техники. Смотрите, например, Qu et al., 2015, выше, и Mizukami et al., "A Protocol for AAV vector production and purification." PhD dissertation, Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998 и Kotin et al., Hum Mol Genet 20(R1): R2-R6 (2011). Согласно некоторым вариантам осуществления трансфекция может быть осуществлена с использованием неорганических соединений, например, фосфата кальция, или органических соединений, полиэтиленимина (PEI) или нехимических средств, например, электропорации.
Согласно некоторым вариантам осуществления клетки-хозяева представляют собой адгезивные клетки. Согласно определенным вариантам осуществления клетки-хозяева представляют собой суспензионные клетки. Согласно некоторым вариантам осуществления клетки-хозяева представляют собой клетки HEK293 или клетки Sf9 (например, клетки Sf9, инфицированные бакуловирусом) или HeLa или BHK (система вируса герпеса). Согласно определенным вариантам осуществления клеточная культура содержит культуральную среду, которая не содержит сыворотки и белка. Согласно некоторым вариантам осуществления среда является химически определенной и не содержит компонентов животного происхождения, например, гидролизатов.
6
Согласно определенным вариантам осуществления фракция, содержащая частицы rAAV, представляет собой фракцию, содержащую клетки HEK293, трансфицированные тройной плазмидной системой. Согласно некоторым вариантам осуществления фракция, содержащая частицы AAV, представляет собой фракцию сбора через приблизительно 2-7 дней после трансфекции клеток HEK293 или когда клеточная культура характеризуется плотностью клеток более чем или приблизительно 5×10 клеток/мл и характеризуется жизнеспособность клеток более чем или приблизительно 50%.
Согласно некоторым вариантам осуществления AAV получают путем тройной плазмидной трансфекции с последующим сбором через 1-7 дней. Согласно определенным вариантам осуществления AAV получают из разрушения клеток.
6
6
6
6
6
Согласно некоторым вариантам осуществления AAV получают следующим образом: клетки HEK293 являются адгезивными и выращиваются в коммерчески доступной культуральной среде, которая может представлять собой химически определенную и может не содержать компонентов животного происхождения, например, сыворотку и белки. Клетки культивируют до плотности клеток от приблизительно 3×10 до приблизительно 12×10 клеток/мл, например, от приблизительно 6×10 до приблизительно 10×10клеток/мл. Затем клетки разбавляют в соотношении приблизительно 1:2, так что плотность клеток составляет приблизительно 3-5×10 клеток/мл. После этого клетки могут быть трансфицированы тремя плазмидами, которые включают в себя (1) плазмиду-помощника, способную обеспечить одну или несколько функций вирусного помощника, необходимых для производства AAV, (2) плазмиду, которая кодирует один или несколько генов, участвующих в производстве капсида, репликации и упаковке вируса, и (3) плазмиду, содержащую представляющий интерес ген (GOI), которая должна быть упакована в полученную частицу rAAV. Например, GOI может представлять собой векторную ДНК, содержащую человеческий фактор свертывания крови IX Падуя в одноцепочечной самокомплементарной форме с векторной ДНК. В качестве другого примера, GOI может представлять собой векторную ДНК, содержащую человеческий фактор свертывания крови IX Падуя в двухцепочечной самокомплементарной форме, причем векторная ДНК имеет полную длину 4,8 т.п.н. В качестве другого примера, GOI может представлять собой векторную ДНК, содержащую фактор VIII свертывания крови человека с удаленным В-доменом в одноцепочечной самокомплементарной форме, причем векторная ДНК имеет полную длину 4,8 т.п.н. Могут быть использованы другие GOI. Трансфекция может быть осуществлена переходным способом, например, с использованием катионных полимеров. Перед элюированием клеточную линию HEK293 можно культивировать в течение по меньшей мере приблизительно 1 дня, например, 3-5 дней, до сбора.
Согласно некоторым вариантам осуществления фракция, содержащая частицы AAV, описана в предварительной заявке США №62/417775 и публикации международной заявки №PCT/US2017/059967, каждая из которых полностью включена в настоящий документ.
Стадии очистки
Способы по настоящему раскрытию предусматривают любую комбинацию стадий, раскрытых в настоящем документе, и могут необязательно комбинироваться с одной или несколькими дополнительными стадиями.
Согласно иллюстративным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают стадию ультрацентрифугирования, во время которой формируется градиент плотности. Без ограничения какой-либо теорией полагают, что стадия ультрацентрифугирования позволяет отделить полные капсиды AAV от пустых капсидов AAV. Примеры протоколов ультрацентрифугирования можно найти, например, в публикации международной заявки WO 2008135229 и публикации PCT/US17/59967, каждая из которых полностью включен в настоящий документ для всех целей.
Способы по настоящему изобретению могут предусматривать еще другие дополнительные стадии, которые могут дополнительно повысить чистоту AAV и удалить другие нежелательные компоненты и/или сконцентрировать фракцию и/или подготовить фракцию для последующей стадии.
2
Согласно определенным вариантам осуществления способ предусматривает стадию глубокой фильтрации. Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает подвергание фракции супернатанта трансфицированной клеточной культуры НЕK293 глубокой фильтрации с использованием фильтра, содержащего целлюлозу и перлиты и имеющего минимальную проницаемость приблизительно 500 л/м. Согласно определенным вариантам осуществления способ дополнительно предусматривает применение фильтра с минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм. Согласно некоторым вариантам осуществления глубинная фильтрация сопровождается фильтрацией через фильтр с минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм. Согласно некоторым вариантам осуществления один или оба из глубинного фильтра и фильтра с минимальным размером пор приблизительно 0,2 мкм промывают и промывки собирают. Согласно некоторым вариантам осуществления промывки объединяют вместе и объединяют с фильтратом, полученным при глубокой фильтрации и фильтрации с фильтром, имеющим минимальный размер пор приблизительно 0,2 мкм. Согласно определенным вариантам осуществления стадия глубокой фильтрации и другая стадия фильтрации происходят до стадии ультрацентрифугирования, описанной в настоящем документе.
Согласно определенным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают одну или несколько стадий хроматографии. Согласно некоторым вариантам осуществления способы предусматривают стадию отрицательной хроматографии, при которой нежелательные компоненты связываются с хроматографической смолой, а желаемый AAV не связывается с хроматографической смолой. Согласно некоторым вариантам осуществления способы предусматривают стадию отрицательной анионообменной хроматографии (АЕХ) или стадию хроматографии АЕХ в «режиме без связывания». Преимущества «режима без связывания» включают в себя относительную легкость проведения процедуры и проведения последующего анализа. Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления способы очистки частиц AAV предусматривают выполнение отрицательной анионообменной хроматографии (АЕХ) на фракции, содержащей частицы AAV, путем нанесения фракции на хроматографическую колонку АЕХ или мембрану в условиях, которые позволяют AAV проходить через хроматографическую колонку или мембрану АЕХ, и сбор частиц AAV. Согласно некоторым вариантам осуществления фракцию наносят на хроматографическую колонку или мембрану АЕХ с загрузочным буфером, содержащим от приблизительно 100 мМ до приблизительно 150 мМ соли, например, NaCl, необязательно, причем рН загрузочного буфера составляет от приблизительно 8 до приблизительно 9. Согласно некоторым вариантам осуществления загрузочный буфер содержит от приблизительно 115 мМ до приблизительно 130 мМ соли, например, NaCl, необязательно, причем загрузочный буфер содержит от приблизительно 120 мМ до приблизительно 125 мМ соли, например, NaCl. Согласно определенным вариантам осуществления стадия отрицательной АЕХ происходит до стадии ультрацентрифугирования, описанной в настоящем документе.
Согласно определенным вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию предусматривают концентрирование фракции AAV с использованием системы ультра/диафильтрации. Согласно определенным вариантам осуществления способы по настоящему раскрытию предусматривают одну или больше стадий фильтрации в тангенциальном потоке (TFF). Согласно определенным вариантам осуществления фракция AAV подвергается ультра-/диафильтрации. Согласно некоторым вариантам осуществления фракцию AAV концентрируют в системе ультра/диафильтрации перед стадией, предусматривающей выполнение отрицательной АЕХ-хроматографии, после стадии, предусматривающей выполнение отрицательной АЕХ-хроматографии, или до и после выполнения отрицательной АЕХ-хроматографии.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают обработку фракции, содержащей частицы AAV, растворимым детергентом для инактивации вирусов, содержащих липидную оболочку.
Согласно определенным вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают фильтрацию фракции, содержащей частицы rAAV, для удаления вирусов большего размера, чем частицы rAAV во фракции. Согласно некоторым вариантам осуществления способ по настоящему изобретению предусматривает фильтрацию фракции, содержащей AAV, для удаления вирусов размером 35 нм или более. Согласно некоторым вариантам осуществления размер пор фильтра находится в нанометровом диапазоне, а согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает нанофильтрацию. Согласно некоторым вариантам осуществления способ по настоящему изобретению предусматривает применение нанофильтра с размером пор в диапазоне 35 нм ± 2 нм, как определено способом потока воды. Классификация типа фильтра зависит от структуры мембраны, материала и поставщика.
Согласно определенным вариантам осуществления во время стадии фильтрации поддерживается разность давлений на фильтре. Согласно некоторым вариантам осуществления давление (перепад давления на фильтре) составляет от приблизительно 0,02 МПа до приблизительно 0,1 МПа. Согласно некоторым вариантам осуществления давление (например, перепад давления на фильтре) составляет от приблизительно 0,02 МПа до приблизительно 0,08 МПа. В случае, если фильтр работает в тупиковом режиме, на перепад давления может влиять давление подачи подаваемого образца (т.е. путем настройки насоса на определенный поток, который влияет на давление подачи).
Согласно определенным вариантам осуществления стадия фильтрации для удаления вирусов, больших, чем частицы rAAV, происходит один раз во время процесса по настоящему изобретению. Согласно определенным вариантам осуществления стадия фильтрации происходит дважды во время процесса. Согласно определенным вариантам осуществления стадия фильтрации для удаления вирусов, больших, чем частицы rAAV, происходит после стадии ультрацентрифугирования, описанной в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам осуществления стадия фильтрации для удаления вирусов, больших, чем частицы rAAV, происходит после стадии окончательной очистки.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы по настоящему изобретению предусматривают стадию окончательной очистки, предусматривающей выполнение хроматографии на АЕХ, необязательно с колонкой, содержащей гель типа «щупальца».
Все ссылки, включая в себя публикации, патентные заявки и патенты, процитированные в настоящем документе, тем самым включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально и конкретно указана для включения посредством ссылки и была полностью изложена в настоящем документе.
Использование в единственном числе и аналогичных ссылок в контексте описания настоящего раскрытия (особенно в контексте следующей формулы изобретения) должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в настоящем документе или явно не противоречит контексту. Термины «содержащий», «имеющий» и «включающий в себя» следует истолковывать как открытые термины (т.е. означающие «включающий в себя, без ограничения»), если не указано иное.
Перечисление диапазонов значений в настоящем документе просто предназначено для того, чтобы служить кратким способом индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон, и каждую конечную точку, если в настоящем документе не указано иное, и каждое отдельное значение и конечная точка включены в описание как если бы это было индивидуально указано в настоящем документе.
Все описанные в настоящем документе способы могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если иное не указано в настоящем документе или иное явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративных формулировок (например, «таких как»), представленных в настоящем документе, предназначено просто для лучшего освещения настоящего раскрытия и не налагает ограничений на объем настоящего раскрытия, если не заявлено иное. Ни одно упоминание в описании не должно быть истолковано как указывающее на любой не заявленный элемент как существенный для практики настоящего раскрытия.
Варианты осуществления настоящего раскрытия описаны в настоящем документе. Изменения этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в настоящей области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы настоящего изобретения ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы настоящего изобретения предполагают, что настоящее раскрытие будет осуществляться на практике иначе, чем конкретно описано в настоящем документе. Соответственно, настоящее раскрытие включает в себя все модификации и эквиваленты предмета, изложенного в прилагаемой формуле настоящего изобретения, как это разрешено применимым законодательством. Кроме того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных их вариациях охватывается настоящим раскрытием, если иное не указано в настоящем документе или иное явно не противоречит контексту.
Следующие примеры даны просто для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения его объема.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Этот пример демонстрирует AAV-специфический ELISA. ELISA определяет количество частиц AAV8, присутствующих в исследуемой фракции или препарате.
AAV-специфический ELISA проводили для идентификации AAV-содержащих фракций. Конформационно-специфическое моноклональное антитело используют для обнаружения эпитопа, неоднократно экспрессируемого на собранных частицах AAV-8.
ELISA для AAV8 проводили с помощью набора для ELISA для титрования AAV-8 (арт. номер PRAAV8; Progen (Heidelberg, Germany)) на системе TECAN Roboter. Вкратце, моноклональное антитело, специфическое к конформационному эпитопу на собранных капсидах AAV8 (ADK8), наносили на полоски для микротитрования и использовали для захвата частиц AAV8 из фракции AAV. Захват частиц AAV8 обнаруживали в две стадии. На первой стадии биотин-конъюгированное моноклональное антитело, специфическое к антителу ADK8, связывалось с иммунным комплексом (ADK8 и антитела ADK8). Конъюгаты стрептавидинпероксидазы добавляли к иммунным комплексам, связанным с биотин-конъюгированным моноклональным антителом, и конъюгаты стрептавидинпероксидазы реагировали с биотином. В качестве стандарта использовали препарат для частиц AAV2/8, WL217S, содержащий меченые частицы AAV-8 в заданных концентрациях. Добавляли раствор субстрата пероксидазы, что приводило к цветной реакции, пропорциональной количеству связанных капсидных частиц AAV. Цветную реакцию измеряли фотометрически при 450 нм.
2
4
2
4
2
Предварительно покрытый планшет заполняли буфером для разведения 100 мкл/лунку. Затем серии разведений для стандарта анализа, контроля анализа и образцы готовили непосредственно на планшете. Растворенный стандарт анализа разводили в дубликатах шесть раз 1+1 непосредственно на планшете, смешивая 100 мкл с буфером для разведения в объеме 100 мкл, уже присутствующим в лунках, в то время как контроль анализа разводили 1/200 до того, как шесть серийных разведений были приготовлены непосредственно на планшете. Для образцов готовили два серийных разведения в независимых дубликатах. Затем планшет инкубировали в течение 60±10 минут при температуре +37°С (заданное значение) на шейкере для микропланшетов, поворачивая планшет на 180° через 30±5 минут. После стадии промывки (промывочный буфер: физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) с Tween 20, 0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,02% KHPO, 0,126% NaHPO×2HO, 0,05% Tween 20, pH нейтрален (проверено индикаторной бумагой)) добавляли 100 мкл/лунку обнаруживающего антитела и планшет инкубировали через 30±5 мин после добавления. Эту инкубацию прекращали стадией промывки. Затем добавляли 100 мкл/лунку тетраметилбензидинового субстрата. Цветной реакции давали протекать при комнатной температуре в течение 25±5 минут, прежде чем она была остановлена добавлением останавливающего раствора. Планшет измеряли в течение 30 минут с использованием ридера ELISA при 450 нм и 620 нм в качестве эталонной длины волны. Затем получали калибровочную кривую после дважды логарифмической подгонки.
Пример 2
Этот пример демонстрирует криогенную просвечивающую электронную микроскопию (CryoTEM).
CryoTEM обеспечивает визуализацию наноразмерных частиц, таких как AAV. Техника предусматривает нанесение препарата AAV на тонкую несущую пленку углерода в контролируемой температуре и влажности. После удаления избытка препарата AAV, оставляя некоторое количество адгезированного препарата AAV, сетку витрифицировали в жидком этане, а затем хранили в жидком азоте. CryoTEM-анализ капсидных частиц AAV использовали для оценки общей морфологии образца, т.е. наличия различных морфологий AAV (как правило, включая в себя сферические и деформированные частицы AAV, структуры субъединиц и более крупные структурно менее определенные морфологии), и уровня упаковки частиц с помощью методологи автоматического анализа изображений.
Фракцию или препарат AAV сохраняли близко к их исходному состоянию, погружая их в аморфный некристаллический лед на инертной подложке путем мгновенного замораживания в криогенных условиях. Анализ изображений проводили с использованием автоматизированного объективного способа анализа с использованием программного обеспечения Vironova Analyzer (VAS).
Капсидные частицы AAV, демонстрирующие внутреннюю плотность без четкой границы между оболочкой и ядром, классифицируют как заполненные частицы (фиг. 6А). Частицы капсида AAV, имеющие четкую внешнюю оболочку и минимальную внутреннюю плотность, классифицируются как пустые частицы (фиг. 6А). Неопределенные частицы включают в себя капсиды AAV в форме тримерной структуры (фиг. 6В), которые могут быть пустыми или полными, и разрушенные капсиды AAV (фиг. 6С).
CryoTEM определяет количество полностью полных и пустых капсидов в препаратах AAV.
Пример 3
Этот пример демонстрирует, что использование AAV-специфического ELISA приводит к меньшей вариабельности, чем использование способа qPCR.
ELISA AAV8: Общий титр капсидных частиц AAV8 измеряли с использованием коммерческого набора (Progen), откалиброванного по эталонному стандартному материалу AAV8 АТСС для концентраций капсидных частиц (к.ч.), как описано в примере 1.
qPCR: Количественный PCR-анализ, основанный на химии Taqman, разрабатывали для измерения концентрации копий векторной геномной трансгенной ДНК. Для ITR-qPCR для FVIII титр векторного генома (в.г.) на миллилитр (мл) определяли, используя qPCR на основе TaqMan с праймерами и флуоресцентно меченный зонд, обнаруживающий последовательность в последовательностях ITR векторного генома. Для выявления ITR-специфической последовательности в частице AAV образцы обрабатывали ДНКазой I и после последующей стадии протеиназы К из капсида высвобождали геном scAAV. Наконец, для расщепления Т-образных структур AAV ITR выполняли расщепление рестриктазой.
Плазмиду, используемую в качестве эталона, линеаризовали производящей один разрез рестриктазой и дополнительно очищали из агарозного геля. УФ-поглощение А260 экстрагированной гелем ДНК трижды измеряли на УФ-спектрофотометре, а среднее значение концентрации ДНК рассчитывали в мкг на мл.
Чтобы определить количество копий на мл для линеаризованной стандартной плазмиды, молекулярную массу двухцепочечной ДНК рассчитывали в граммах на моль с учетом точной массы для каждого отдельного нуклеотида основной последовательности.
Титр векторного генома в исследуемом изделии (в векторных геномах на мл) рассчитывали с помощью подбора стандартной кривой плазмиды с линейной регрессией.
CryoTEM: образцы сохраняли близко к их исходному состоянию путем погружения их в аморфный некристаллический лед на инертной подложке посредством мгновенного замораживания в криогенных условиях, как описано в примере 2.
Гель-электрофорез: электрофорез проводили, как описано (Fagone et al., 2012). Вкратце, образцы AAV обрабатывали в течение 10 минут при температуре 75°С в присутствии 0,5% ДСН (додецилсульфата натрия) и затем охлаждали до комнатной температуры. Образцы (приблизительно 1,5Е10 векторных геномов (в.г.)/дорожка) затем загружали в 1% 1-кратный ТАЕ-агарозный гель и разделяли в электрическом поле (60 мин при 7 В/см длины геля). Затем гель окрашивали в 2-кратном GelRed (Biotium) растворе и визуализировали с помощью ChemiDocTMMP (Biorad).
11
12
Биологическая активность in vivo: AAV-специфический количественный анализ биологической активности in vivo проводили с использованием препарата AAV8, оцененного с использованием анализа антигена ELISA, для определения капсидных частиц на мл - к.ч./мл. Образцы отправляли в испытательную установку (заморожены, ≤-60°С), оттаивали и разбавляли буфером для препаратов до 4×10 к.ч./мл. Количественное исследование биологической активности in vivo включает в себя до восьми мышей-самцов, нокаутированных по FVIII, на группу ((В6; 129S4-F8 tm2Kaz); Charles River GmbH, Sulzfeld, Germany). Животные получали однократную внутривенную болюсную инъекцию 4×10к.ч./кг исследуемых или контрольных образцов вскоре после оттаивания образцов. Исследуемые образцы представляли собой генотерапевтические векторы AAV8-FVIII. Собранную цитратную плазму мыши используют для оценки активности FVIII с использованием анализа активности FVIII. Анализ активности FVIII проводят в присутствии ионов кальция и фосфолипидов. Фактор X активируется в фактор Ха с помощью фактора IXa. Эта активация стимулируется фактором VIII, который действует как кофактор в этой реакции. При использовании оптимальных количеств Са2+, фосфолипида и фактора IXa и избытка фактора X скорость активации фактора X линейно связана с количеством фактора VIII. Фактор Ха гидролизует хромогенный субстрат, освобождая хромофорную группу. Затем цвет считывается фотометрически при 405 нм. Производимый фактор Ха и, следовательно, интенсивность цвета пропорциональны активности фактора VIII в образце.
Биологическая активность in vitro: AAV-специфический количественный анализ биологической активности in vitro проводили с использованием препарата AAV8, оцениваемого с использованием анализа антигена ELISA, для определения капсидных частиц на мл - к.ч./мл. Вирусный вектор AAV8, содержащий представляющего интерес ген (GOI) фактора VIII (FVIII), инфицировал печеночную клеточную линию-мишень, которая впоследствии секретировала функциональный и измеряемый белок FVIII в среду для культивирования клеток. Активность фактора VIII супернатанта клеточной культуры непосредственно измеряли с помощью хромогенного анализа FVIII. Измерение образца AAV8-FVIII приведено в процентах относительно контрольного материала. Способ позволяет количественно оценить биологическую функцию генотерапевтического вектора AAV8-FVIII. Тот же самый анализ использовали, как описано выше для биологической активности in vivo.
Как показано на фиг. 1, использование способов qPCR привело к большей изменчивости по сравнению со способом AAV-специфического ELISA. Например, способ qPCR на основе ITR позволил получить коэффициент дисперсии ≤43%, в то время как коэффициент дисперсии для AAV8-специфического ELISA составил ≤10%. Способ ELISA был менее изменчивым на 20-33%, чем способ qPCR. Это удивительное различие позволяет определять дозу фракции AAV только с помощью AAV-специфического анализа ELISA. Этот подход не только обеспечивает более точный способ дозирования фракции AAV, но и является более экономичным и эффективным по времени.
10
Чтобы исследовать, приводит ли способ ELISA или способ qPCR к точному способу измерения содержания капсида в препарате AAV, препараты AAV получали и оценивали с использованием ELISA и отдельно qPCR. Результаты этих измерений использовали для подготовки образца для загрузки в каждую дорожку (2,0×10 капсиды/дорожка). Как показано на фиг. 2, образцы, оцененные с помощью ELISA, были неизменно менее вариабельными, чем образцы, оцененные с помощью qPCR, поскольку сигнал для образцов, ассоциированных с ELISA, был более последовательным по сравнению с сигналами, связанными с результатами qPCR, даже если препараты были из тех же партий, по обоим типам анализов. Таким образом, дозирование с помощью ELISA было более надежным, чем дозирование, связанное с qPCR.
Все результаты, полученные в результате исследования высвобождения доклинических и GMP нерасфасованных лекарственных веществ (BDS) и серий конечных лекарственных продуктов (FDP) с помощью ELISA и ITR-qPCR капсидов AAV8, показаны (таблицы 1-4), а также соотношения геномов векторов на общее количество капсидных частиц (таблица 5). Для сравнения также показаны значения ELISA для AAV8, нанесенные на график против значений ITR-qPCR (фиг. 4). На фиг. 5 оценивается соотношение векторных геномов AAV (в.г.) к капсидным частицам (к.ч.) ELISA антигена AAV8. На фиг. 5А показана вариабельность способа qPCR на основе соотношения векторных геномов на антиген AAV. На фиг. 5В показана высокое постоянное процентное содержание полного AAV, полученного в процессе производства в соответствии с ультрацентрифугированием PCT/US2017/059967 с использованием способа 50-55-60. Процесс ультрацентрифугирования обеспечивает постоянный профиль полных к пустым капсидам от партии к партии. Как таковая, вариабельность между анализами должна быть согласованной (например, фиг. 5В). Когда qPCR, однако, используется для расчета дозы, существует высокая вариабельность между партиями (например, фиг. 5А).
Затем мышам вводили препарат AAV в количественном анализе биологической активности in vivo с использованием способа ELISA для измерения активности. На фиг. 3 подтверждается использование способа антигена ELISA для определения активности препарата AAV с использованием количественного анализа биологической активности in vivo с использованием мышиной модели. Как показано на фиг. 3, биологический анализ подтвердил, что во всех партиях была биологическая активность и что активности партий была сопоставимой и последовательной. Как указано выше, количественный анализ биологической активности in vivo оценивает как способность AAV трансдуцировать клетки, так и производить представляющий интерес белок или ген.
Таблица 1: партии нерасфасованных лекарственных веществ (BDS): общие титры капсидных частиц AAV8, измеренные с помощью ELISA, и титры векторных геномов, измеренные с помощью ITR-qPCR, и их соотношения. Средние значения, стандартные отклонения, коэффициенты вариаций (CV) и 3 предела стандартных отклонений соотношений также показаны. Соотношение ITR-qPCR/ELISA AAV8 обеспечивает «специфическую активность» препарата AAV. Соотношение или «специфическая активность» может предоставить информацию/количество полных капсидов, но вариация очень велика, поскольку она обусловлена как qPCR, так и ELISA. Различия происходят в основном от qPCR, которая демонстрирует, почему способ AAV-ELISA или AAV-ELISA/TEM превосходит способ qPCR.
Таблица 2: Надлежащие производственные практики (GMP) партий BDS: общие титры капсидных частиц AAV8, измеренные с помощью ELISA, и титры векторных геномов, измеренные с помощью ITR-qPCR, и их соотношения. Средние значения, стандартные отклонения, коэффициенты вариаций (CV) и 3 предела стандартных отклонений соотношений также показаны.
Таблица 3: партии готового лекарственного продукта (FDP): общие титры капсидных частиц AAV8, измеренные с помощью ELISA, и титры векторных геномов, измеренные с помощью ITR-qPCR, и их соотношения. Средние значения, стандартные отклонения, коэффициенты вариаций (CV) и 3 предела стандартных отклонений соотношений также показаны.
Таблица 4: партии GMP FDP: общие титры капсидных частиц AAV8, измеренные с помощью ELISA, и титры векторных геномов, измеренные с помощью ITR-qPCR, и их соотношения. Средние значения, стандартные отклонения, коэффициенты вариаций (CV) и 3 предела стандартных отклонений соотношений также показаны.
Таблица 5: Соотношение векторных геномов к капсидным частицам для всех показанных партий BDS и FDP.
Таблица 6: Данные биологической активности in vitro и in vivo производственных партий AAV8, содержащих векторную ДНК В-домена с удаленным FVIII. Дозирование AAV8 основывалось на ELISA антигене AAV8, и % полных капсидов определяли с помощью CryoTEM. Консистенция от партии к партии в пересчете на % полных капсидов продемонстрирована с CV 2,7%.
На фиг. 12 и 13 показаны результаты ELISA, qPCR и СгуоТЕМ для партий 17004-17014. Партии 17004-17013 (таблица 6) имеют одинаковый размер партии, что составляет от 2-кратных партий по 500 л. Эти десять партий содержат сопоставимое количество капсидов AAV8 в конечном продукте. Анализ партий 17004-17013 представлен в Таблице 7.
Таблица 7: Данные по биологической активности in vitro и in vivo производственных партий AAV8, содержащих векторную ДНК В-домена с удаленным FVIII для партий 17004-17013.
Пример 4
Этот пример проверяет CryoTEM как инструмент для измерения количества полных и пустых капсидов в препарате AAV.
Комбинация надежных аналитических способов требуется для измерения качественных признаков векторных препаратов генной терапии на основе рекомбинантного AAV8 (rAAV8), чтобы обеспечить высвобождение продукта и точное клиническое дозирование. CryoTEM создавали для количественной оценки полных, содержащих векторный геном, и пустых векторных частиц в векторных препаратах для генной терапии AAV8, и для определения значимости этого параметра для активности с использованием ортогональных способов.
CryoTEM исследовали на количественное определение полных/пустых, используя векторные препараты rAAV8, кодирующие фактор свертывания крови человека IX (FIX) с содержанием полных частиц 40-80%, полученных путем смешивания векторных препаратов или путем селективного обогащения векторных фракций ультрацентрифугированием. Валидация приводила к промежуточной точности и точности результатов разных анализов ниже относительного стандартного отклонения 1%. Линейность шести независимых экспериментов была достигнута с каждым r2 выше 0,996. Векторные препараты, полученные из одной и той же массы векторов, показали корреляцию соотношения полных к пустым с измеренной активностью в анализе на основе клеток in vitro и в модели in vivo.
Способы и материалы
CryoTEM: векторные образцы сохраняли близко к их исходному состоянию путем погружения их в аморфный некристаллический лед на инертной подложке путем мгновенного замораживания в криогенных условиях. Анализ изображений выполняли с использованием автоматического, объективного способа анализа с использованием программного обеспечения Vironova Analyzer (VAS), как описано в примере 2.
ELISA AAV8: Общий титр капсидных частиц AAV8 измеряли с использованием коммерческого набора (Progen), откалиброванного по эталонному стандартному материалу AAV8 АТСС для концентраций капсидных частиц (к.ч.), как описано в примере 1.
Биологическая активность in vitro: Хромогенную активность FIX в супернатанте клеток HepG2, инфицированных FTX-AAV8, измеряли как произвольную единицу биологической активности относительно эталонного препарата и нормировали на частицы капсида. В анализе биологической активности in vitro вирусный вектор AAV8 инфицировал печеночную клеточную линию-мишень, которая впоследствии секретировала функциональный, измеряемый кодируемый белок в среду. На первой стадии клетки-мишени HepG2 трансдуцируют инфицированными посредством AAV8. Во время инкубации кодированный белок высвобождался в супернатант. На второй стадии активность закодированного белка, секретируемого в супернатант, непосредственно измеряли с помощью анализа активности (для анализа биологической активности in vitro использовали ферментативный анализ - ROX FIX (Rossix)). Измерение образца AAV8 приведено в процентах относительно эталонного материала. Способ позволяет количественно оценить биологическую функцию генотерапевтического вектора AAV8. Эталоном является стандарт ВОЗ или стандартный препарат, откалиброванный по стандарту ВОЗ для FIX человека.
2
Биологическая активность in vivo: человеческие FIX, кодирующие частицы AAV8, вводили внутривенно восьми мышам, нокаутированным по FIX (Charles River Germany (CRO в Sulzfeld, Germany)). Препарат AAV8 оценивали с помощью антигена ELISA для определения капсидных частиц на мл - к.ч./мл. Образцы отправляли на испытательную установку (замороженные, ≤-60°С), оттаивали и разбавляли буфером для препаратов до 4,95Е+10 к.ч./мл. Животные получали однократную внутривенную болюсную инъекцию 2,47Е+11 к.ч./кг исследуемых или контрольных образцов вскоре после оттаивания образцов. Активность FIX в плазме регулярно контролировали с помощью активности FIX-свертывания, измеренной одностадийным анализом свертывания АРТТ по стандарту человеческой плазмы, калиброванному по международному стандарту. Образец, содержащий FIX, разбавляли до диапазона в пределах калибровочной кривой в имидазольном буфере+1% альбумин. 50 мкл разбавленного образца добавляют к 50 мкл плазмы с дефицитом FIX и приводят в контакт с 50 мкл фосфолипидной суспензии (Pathromtin SL, Siemens) после 240-секундной инкубации, коагуляцию начинают, добавляя 50 мкл 25 мМ раствора CaCl, время для образования сгустка измеряют на станции BCS ХР (Siemens) или ACL 500 (Werfen).
qPCR: Количественный PCR-анализ, основанный на химии Taqman, разрабатывали для измерения концентрации копий векторной генома в трансгенной ДНК. Для ДНК-вектора FIX использовали два специфических для FIX способа qPCR: один для вектора AAV с двухцепочечной ДНК и другой для вектора AAV с одноцепочечной ДНК.
Титр векторного генома (в.г.) на миллилитр (мл) определяли с использованием qPCR на основе TaqMan с праймерами и флуоресцентно меченного зонда, обнаруживающего последовательность в последовательности FIX и сигнал полиаденилирования. Для выявления FIX-специфической последовательности обрабатывали ДНКазой I и после последующей стадии протеиназы К геном scAAV высвобождали из капсида. Наконец, осуществляли расщепление с помощью рестриктазы для отделения AAV ITR Т-образных структур.
Плазмиду, используемую в качестве эталонного материала, линеаризовали с помощью производящей один разрез рестриктазы и дополнительно очищали от агарозного геля. УФ-поглощение А260 ДНК, экстрагированной гелем, измеряли три раза в УФ-спектрофотометре и рассчитывали среднее значение концентрации ДНК в мкг на мл.
Для определения количества копий на мл для линеаризованной стандартной плазмиды молекулярную массу двухцепочечной ДНК рассчитывали в граммах на моль с учетом точной массы для каждого отдельного нуклеотида основной последовательности.
Титр векторного генома в исследуемом изделии (в векторных геномах на мл) рассчитывали с помощью нанесения стандартной кривой плазмиды с линейной регрессией.
Результаты
На фиг. 6 показано, что CryoTEM может использоваться для изображения полных и пустых капсидов. Фиг. 7 представляет собой пример анализа образца. Изображения СгуоТЕМ, полученные при увеличении 38k, подвергали анализу внутренней плотности. Анализ основных компонентов каждого профиля радиальной плотности частиц AAV выявил кластеры уровней упаковки: полный (красный; слева), синий (пустой; справа), неопределенный (зеленый; середина); пунктирные кольца: доверительные интервалы 99%. Смотрите таблицу 8 для краткого изложения результатов.
Таблица 8: Данные, полученные из 5 изображений, анализирующих в общей сложности 1568 частиц.
Фиг. 8 представляет собой валидацию CryoTEM согласно ICH Q2 (R1) (т.е. Международная конференция по гармонизации технических требований для регистрации фармацевтических препаратов для использования человеком), включая в себя специфичность, повторяемость, промежуточную точность, линейность, точность разбавления и надежность. Представлены результаты линейности из шести независимых экспериментов. На фиг. 8 показана разница между теоретическим и измеренным содержанием полных частиц AAV8. Препараты rAAV8, содержащие почти 80% полных капсидов, и другой препарат с пустыми капсидами в основной своей массе смешивали для получения 4 образцов с процентным содержанием полных капсидов от 40 до 80%. Эти препараты измеряли на двух сетках каждый, причем ось X представляет теоретический процент «полных» капсидов, а ось Y представляет измеренные значения с помощью CryoTEM. Одна точка данных отражает среднее из двух повторов. Все продемонстрировали хорошую корреляцию теоретических и экспериментальных значений с коэффициентами корреляции выше 0,996.
На фиг. 9 рассматриваются препараты с увеличивающимися степенями полных капсидов, которые были очищены от фракций ультрацентрифугирования (смотрите публикацию международной заявки PCT/US2017/059967). В частности, на фиг. 9 показано увеличение титра qPCR в зависимости от процентного содержания «полных» капсидов. Ось X представляет собой процент «полных» капсидов, измеренных CryoTEM, а ось Y представляет собой измеренное значение qPCR. Чем выше процент «полных» капсидов, тем выше титр qPCR. Соотношение qPCR на антиген AAV8 на фиг. 9 демонстрирует, как это соотношение увеличивается с количеством «полных» частиц - чем выше процент полных капсидов, тем выше соотношение qPCR к антигенам AAV8 [Y: отношение в.г./к.ч. на X: процентное содержание полных капсидов (CryoTEM)]. При более высоком проценте полных капсидов вариабельность qPCR выше, что делает его менее точным. Это особенно важно, учитывая, что продукт, предоставленный субъекту, будет находиться в более высоком диапазоне полных капсидов. Векторные геномы на титры капсидных частиц рассчитывали из результатов qPCR и ELISA капсидных частиц AAV8 и коррелировали с данными CryoTEM.
На фиг. 10 и 11 показано влияние % полных капсидных частиц FIX-AAV8 на биологическую активность in vivo и in vitro. На фиг. 10 тот же препарат вектора AAV, который использовался на фиг. 8, вводили внутривенно нокаутированным по фактору IX мышам (n=8). Образцы плазмы отбирали через 14 дней и измеряли активность свертывания huFIX. Для фиг. 11 препараты с различной степенью полных капсидов (такие же, как на фиг. 9) готовили путем выделения фракций ультрацентрифугирования и последующей очистки. Биологическую активность измеряли в клеточном анализе, связанном с к.ч., и наносили на график в зависимости от % полных частиц. Биологическая активность in vitro возрастает с увеличением степени полных капсидов.
% полных капсидов измеряли с использованием CryoTEM. В этом случае использовали AAV8, содержащий двухцепочечную ДНК, кодирующую FIX Падуя. Для результатов этого эксперимента in vivo образцы с различным содержанием полных и пустых частиц готовили путем смешивания содержащего полные капсиды продукта BDS с продуктом BDS с пустыми капсидами, как показано на фиг. 10. Животные получали однократную внутривенную инъекцию болюса в день 0 и кровь собирали в дни 7, 14 и 28. Активность FIX анализировали на стадии FIX анализа свертывания (факторный анализ на основе АРТТ широко используется для измерения факторов VIII, IX, XI и XI). Образец приводили в контакт с плазмой и фосфолипидами, дефицитными по фактору IX, инкубировали, и коагуляцию начинали с раствора хлорида кальция и измеряли время коагуляции. Время коагуляции имеет четкую математическую связь с концентрацией факторов коагуляции.
Выводы
CryoTEM представляет собой ценный инструмент для количественной оценки активности препарата AAV, который позволит высвобождать препарат генотерапевтического вектора для терапевтического применения. Он может служить в качестве ортогонального способа для измерения количества полных и пустых капсидных частиц или титра векторного генома для количественного определения векторов. Преимущество CryoTEM состоит в том, что он позволяет контролировать качество и активность генотерапевтического вектора.
CryoTEM превосходит другие способы, основанные на электронной микроскопии, поскольку принцип подготовки образца в значительной степени сохраняет исходное состояние образца. Более того, нет необходимости полагаться на окрашивающие средства.
Различные модификации настоящего изобретения, в дополнение к описанным в настоящем документе, будут очевидны для специалистов в настоящей области техники из предшествующего описания. Такие модификации также должны попадать в объем прилагаемой формулы изобретения. Каждая ссылка, цитируемая в настоящей заявке, включая все патенты, патентные заявки и непатентную литературу, полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.