ОЧИСТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ФАКТОРА, СПОСОБСТВУЮЩЕГО ЗАЖИВЛЕНИЮ РАН

1. Способ получения композиции, содержащей очищенный фактор, способствующий заживлению ран, выбранный из группы, включающей фактор роста гепатоцитов (HGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста эпидермиса (EGF), трансформирующий фактор роста α (TGF-α), трансформирующий фактор роста β (TGF-β), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1) и фактор роста фибробластов (FGF), из источников, таких как кровь, содержащих фактор, способствующий заживлению ран, включающий стадии очистки, которые осуществляют в присутствии антитромбина III (АТ-III).
2. Способ по п.1, включающий стадии:
(i) размораживание замороженной крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта,
(ii) приведение супернатанта в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе, необходимом для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение pH, близкое к нейтральному,
(iii) отделение носителя для анионообменной хроматографии с получением раствора,
(iv) приведение раствора в контакт с носителем для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина,
(v) отделение раствора и обработка носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина десорбционным буфером с ионном силой, достаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии на основе иммобилизованного гепарина,
(vi) сбор десорбционного буфера, содержащего факторы, способствующие заживлению ран, АТ-III и HRGP.
3. Способ по п.1, включающий стадии:
(i) размораживание замороженной плазмы крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта,
(ii) добавление неорганического адсорбирующего вещества, такого как диатомовая земля, силикагель или глинозем и инкубация в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей,
1
4
(iii) добавление низшего алифатического спирта, такого как С-С спирт, с получением фракции Кона I,
(iv) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества,
(v) пропускание супернатанта фракции Кона I через носитель для аффинной хроматографии, при котором фактор, способствующий заживлению ран, АТ-III и HRGP (HAH) связываются с носителем, тогда как другие белки плазмы остаются не связанными с носителем и удаляются,
(vi) элюирование и сбор фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии.
4. Способ по п.1, включающий стадии:
(i) размораживание замороженной плазмы крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта;
(ii) приведение супернатанта в контакт с носителем для анионообменной хроматографии в буферном растворе, необходимом для анионообменной хроматографии, причем буферный раствор содержит соли в концентрациях, сравнимых с физиологическими, и имеет значение pH, близкое к нейтральному, при этом основная часть белков является несвязанной (включая фактор, способствующий заживлению ран, АТ-III, HRGP, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и др.), а специфические белки и протеазы связываются анионной смолой (например протромбин, фактор X, фактор IX и др.);
(iii) отделение носителя для анионообменной хроматографии с получением раствора (содержащего фактор, способствующий заживлению ран, АТ-III, HRGP, альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и др.);
(iv) добавление неорганического адсорбирующего вещества, такого как диатомовая земля, силикагель или глинозем, и инкубация в течение достаточного времени для связывания нежелательных примесей, например, фактора XII, активатора прекалликреина и т.д.;
1
4
(v) добавление низшего алифатического спирта, такого как С-С спирт, с получением фракции Кона I;
(vi) удаление осадка, если таковой имеется, и неорганического адсорбирующего вещества;
(vii) пропускание супернатанта фракции Кона I через носитель для аффинной хроматографии, при котором фактор, способствующий заживлению ран, АТ-III и HRGP (HAH) связываются с носителем, в то время как основная масса других белков плазмы (например альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и т.д.) остаются несвязанными и удаляются;
(viii) элюирование и сбор фактора, способствующего заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии (необязательно, обработка аффинной смолы промывочным буфером перед десорбцией фактора, способствующего заживлению ран, причем промывочный раствор обладает повышенной ионной силой, достаточной для десорбции примесных белков, но недостаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран).
5. Способ по п.1, включающий стадии:
(i) размораживание замороженной плазмы крови, необязательное удаление осадка и дальнейшая обработка супернатанта;
(ii) пропускание супернатанта через носитель для аффинной хроматографии, при котором фактор, способствующий заживлению ран, АТ-III и HRGP (HAH) связываются с носителем, а основная часть других белков плазмы (например альбумин, IgG, трансферин, гаптоглобулин и т.д.) остается несвязанной и удаляется.
(iii) элюирование и сбор материала, содержащего фактор, способствующий заживлению ран, с носителя для аффинной хроматографии (необязательно, обработка аффинной смолы промывочным буфером перед десорбцией фактора, способствующего заживлению ран, причем промывочный раствор обладает повышенной ионной силой, достаточной для десорбции примесных белков (например кофактора гепарина II), но недостаточной для десорбции фактора, способствующего заживлению ран).
6. Способ по пп.2-5, в котором собранные фракции концентрируют и/или подвергают диафильтрации с получением концентрированного раствора.
7. Способ по любому из пп.2-5, в котором осуществляют инактивацию вирусов, в частности, после стадии (vi).
8. Способ по любому из пп.2-5, в котором после стадии инактивации вируса осуществляют анионообменную хроматографию.
9. Способ по любому из пп.2-5, в котором осуществляют катионообменную хроматографию, в частности, после анионообменной хроматографии.
10. Способ по любому из пп.2-5, в котором осуществляют хроматографию на фосфате целлюлозы.
11. Способ по любому из пп.2-5, в котором осуществляют нанофильтрацию.
12. Способ по любому из пп.2-5, в котором фракцию, полученную на стадии (vi) по п.2 или 3, стадии (viii) по п.4 или стадии (iii) по п.5, подвергают инактивации вирусов с помощью химических веществ, инактивирующих вирусы.
13. Способ по п.12, в котором фракцию, обработанную химическими веществами, инактивирующими вирусы, подвергают хроматографии на фосфате целлюлозы.
14. Способ по п.12, в котором фракцию, обработанную химическими веществами, инактивирующими вирусы, подвергают анионообменной хроматографии и с последующей катионообменной хроматографией.
15. Способ по п.8, в котором катионообменный носитель обрабатывают буфером с ионной силой для элюции фракции А1, содержащей в основном (>90%) АТ-III, и далее обрабатывают буфером с большей ионной силой для преимущественной элюции фактора, способствующего заживлению ран и HRGP, которые затем собирают.
16. Способ по п.14, в котором катионообменный носитель обрабатывают буфером с ионной силой для элюции фракции А1, содержащей в основном (>90%) АТ-III, и далее обрабатывают буфером с большей ионной силой для преимущественной элюции фактора, способствующего заживлению ран и HRGP, которые затем собирают.
17. Способ по п.15, в котором фактор, способствующий заживлению ран, и HRGP концентрируют или подвергают диафильтрации с получением фракции А2.
18. Способ по любому из пп.2-5, в котором к концентрату добавляют осаждающий буфер, осуществляют фильтрацию, и осадок обрабатывается буфером для выделения фактора, способствующего заживлению ран, и АТ-III.
19. Способ по любому из пп.2-5, в котором полученный концентрат фактора, способствующего заживлению ран, обрабатывают с целью снижения содержания патогенов, с помощью по меньшей мере одного из следующих методов:
(i) инактивация вирусов с помощью раствора детергента в растворителе;
(ii) инактивация вирусов с помощью облучения светом (например UVC), или радиоактивного облучения;
(iii) инактивация вирусов путем тепловой обработки;
(iv) удаление вирусов с помощью вирусных фильтров.
20. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что полученный концентрат фактора, способствующего заживлению ран, подвергают дальнейшей очистке с использованием катионообменной смолы, при которой фактор, способствующий заживлению ран, и HRGP связываются со смолой, и которая включает одну из следующих стадий:
(i) фракцию фактора, способствующего заживлению ран/HRGP, элюируют с катионообменной смолы буфером, обладающим проводимостью 10-450 мСм/см при комнатной температуре, более предпочтительно 20-200 мСм/см, наиболее предпочтительно 30-100 мСм/см;
(ii) при проведении хроматографии pH поддерживают на уровне 6-9, более предпочтительно 6,5-8, наиболее предпочтительно 6,75-7,25;
(iii) заряженные группы катионообменной смолы присоединяют к смоле с помощью слабогидрофобных полимерных углеродных цепей, состоящих примерно из 10-100 мономерных звеньев.
21. Способ по любому из пп.2-5, отличающийся тем, что полученный концентрат фактора, способствующего заживлению ран, подвергают дальнейшей очистке путем высаливания, при котором HRGP осаждается, следующим образом:
(i) используют соль в соответствии с рядом Гофмейстера, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из сульфата натрия, фосфата натрия, цитрата натрия, сульфата аммония и их комбинаций;
(ii) концентрацию соли выбирают в интервале 0,3-3 М, в частности, 0,5-2 М или 0,75-1,5 М;
(iii) рН раствора выбирают в интервале 4-10, в частности, 6-9 или 7-8;
(iv) полученный осадок удаляют путем фильтрации или центрифугирования.
22. Композиция, полученная способом по любому из вышеперечисленных пунктов, содержащая активированную и/или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, или их комбинацию.
23. Композиция по п.22, которая содержит активированную и/или неактивированную формы фактора, способствующего заживлению ран, а также АТ-III для повышения стабильности фактора, способствующего заживлению ран, in vivo и in vitro.
24. Композиция по п.22 и/или 23, которая содержит активированную и/или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, а также в ее состав включен HRGP для повышения стабильности природного фактора, способствующего заживлению ран, in vivo и in vitro.
25. Композиция по п.22, в которой дополнительно присутствуют химические стабилизаторы, выбранные из группы, состоящей из полиолов, сахаридов и/или аминокислот.
26. Фармацевтическая композиция, содержащая композицию по любому из пп.22-25.
27. Фармацевтическая композиция по п.26, которая содержит активированную и/или неактивированную форму фактора, способствующего заживлению ран, в жидкой или лиофизированной форме, которую наносят с помощью геля или спрея.
28. Лекарственная форма, в которой композиция по п.27 находится в форме геля, мази или спрея.
29. Фракция, обогащенная HRGP, полученная способом по пп.1-21.
30. Фракция по п.29, полученная способом, в котором после аффинной хроматографии на гепариновом носителе и инактивации вирусов полученную смесь подвергают обработке фосфатом целлюлозы.