Тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
TEST SYSTEM FOR DETECTION OF SARS-CoV-2 OF OMICRON LINE BY SINGLE-STEP POLYMERASE CHAIN REACTION WITH REVERSE TRANSCRIPTION

Изобретение относится к области молекулярной биологии, вирусологии и биотехнологии, в частности, к диагностике инфекционных заболеваний, а именно к тест-системе для выявления SARS-CoV-2линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.
26 ноября 2021 Всемирная организация здравоохранения обозначила новую линию вируса SARS-CoV-2 – Омикрон (Классификация варианта «омикрон» (B.1.1.529) как варианта вируса SARS-CoV-2, вызывающего обеспокоенность. Сайт Всемирной организации здравоохранения, URL: https://www.who.int/ru/news/item/26-11-2021-classification-of-omicron-(b.1.1.529)-sars-cov-2-variant-of-concern, дата обращения – 28.12.2021 г.). Данный вариант нового коронавируса имеет большое количество мутаций, что объясняет повышенное внимание и беспокойство в отношении новой линии. По уже полученным данным отличиями новой линии Омикрон можно назвать высокий риск повторного заражения и относительно низкую эффективность существующих вакцин. Обеспечение возможности высокопроизводительного скрининга SARS-CoV-2 линии Омикрон является крайне важной и актуальной задачей, стоящей перед разработчиками тест-систем на сегодняшний день.
Известна тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 (Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: патент RU2756474, Российская Федерация, заявка RU2021114811, заявл. 24.05.2021, опубл. 30.09.2021), включающая ПЦР смесь, содержащую олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный зонд для амплификации и детекции участка гена N вируса SARS-CoV-2: прямой GGACCCCAAAATCAGCGAAA, обратный CTGGTTACTGCCAGTTGAATC, флуоресцентный зонд ROXCACCCCGCATTACGTTTGGTGGAC. Причем осуществляют реакцию ПЦР в режиме реального времени, состоящую из следующих этапов: обратная транскрипция 42°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термического циклирования при 95°С - 15 с, 55°С - 15 с; 72°С - 20 с - 40 циклов, образец считается положительным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct≤35, образец считается отрицательным на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, если значение Ct отсутствует/не регистрируется, однако в случае, если значение Ct для проб находится в пределах от 35 до 40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается сомнительным и подлежит повторному исследованию, при этом, если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается положительным; если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения РНК вируса SAPvS-CoV-2 считается отрицательным.
Также известен набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени (Набор для выявления вируса SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в реальном времени: патент RU2744198, Российская Федерация, заявка RU2020118246, заявл. 25.05.2020, опубл. 03.03.2021), включающий в себя олигонуклеотидные праймеры, ограничивающие фрагмент гена РНК зависимой РНК полимеразы, и олигонуклеотид, меченный флуоресцентной меткой (флуоресцентный зонд), имеющие следующую структуру:
CoV2-f
tca caa ttc aga agt agg acc tg;
CoV2-r
agc ctc caa agg caa tag tgc
CoV2-pr
R6G - tct tgc cga ata cca taa tga atc caa – BHQ1
Наиболее близким к заявляемому изобретению является тест-система для выявления SARS-CoV-2, Influenza virus A и Influenza virus B (Тест-системадлявыявления SARS-CoV-2, Influenza virus A, Influenza virus B методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией: патент RU2761481, РоссийскаяФедерация, заявка 2021126293, заявл. 07.09.2021, опубл. 08.12.2021), включающая олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды со следующей структурой: прямой праймер вируса гриппа В ATTCTTCAATgAAgAAggAAC; обратный праймер вируса гриппа В CTCCCAACACggTAgATA; флуоресцентный зонд вируса гриппа В (R6G)-TCCCATCATCATyCCAgg-(BHQ-1); прямой праймер вируса гриппа А CACCAAAyCATgArggAATA; обратный праймер вируса гриппа А gCTCATgTTgATTCCCAC; флуоресцентный зонд вируса гриппа А (ROX)-TgCAggTCCTrTAgAATCTrTCCACTC-(BHQ-2); прямой праймер SARS-CoV-2 AgAgCTATgAATTgCAgAC; обратный праймер SARS-CoV-2 gggAAATACAAAATTTggACA; флуоресцентный зонд SARS-CoV-2 (FAM)-AATTggCAAAgAAATTTgACACCTTCA-(BHQ-1).
На сегодняшний день неизвестны тест-системы, пригодные для эффективного выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон.
Технической проблемой является необходимость разработки эффективной и точной тест-системы для выявления SARS-CoV-2 Линии Омикрон – Ins214EPE.
Технический результат состоит в обеспечении возможности эффективного и точного выявления SARS-CoV-2 Линии Омикрон.
Технический результат достигается тем, что тест-система для выявления SARS-CoV-2 линии Омикрон методом одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией содержит олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентный зонд со следующей структурой:
прямой праймер Ins214EPESARS-CoV-2 – ATATTCTAAGCACACGCCTATT (SEQNO:1);
обратный праймер Ins214EPESARS-CoV-2 – GGCAAATCTACCAATGGTTCTA (SEQNO:2);
флоуресцентный зонд Ins214EPESARS-CoV-2 –
ROX-TGCGTGAGCCAGAAGATCTCCCT-BHQ-2 (SEQ NO:3).
Для решения задачи детекции варианта Омикрон были обработаны геномы всех вариантов SARS-CoV-2 в базе данных GISAID (https://www.gisaid.org) с целью поиска уникальных инделов, которые бы встречались бы в большинстве геномов варианта Омикрон и не встречались бы никогда у других вариантов SARS-CoV-2. Заявляемая тест-система была получена путем конструирования диагностических праймеров и зонда для детекции линии Омикрон SARS-CoV-2 с помощью подбора флюоресцентно-меченного гидролизующегося зонда высокоспецифичного к уникальной последовательности инсерции Ins214EPE. Данная инсерция не встречается более ни у одного варианта SARS-CoV-2, но присутствует в большинстве геномов линии B.1.1.529 BA.1.
Для оптимизации работы тест-системы была проведена серия экспериментов по подбору рабочей концентрации праймеров и поставлен эксперимент с градиентом температуры отжига праймеров для подбора оптимального значения в условиях мультиплексной реакции. По результатам экспериментов оптимальная концентрация праймеров и зондов составила 400 нМ, оптимальная температура отжига 61°С.
Анализ результатов был произведён с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Результаты интерпретировали на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла Ct, причем результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную сигмовидную форму и пересекала пороговую линию.
Заявляемое изобретение поясняется примером
Проверка эффективности тест-системы.
Тест был валидирован на РНК варианта Omicron, любезно предоставленной Лабораторией изменчивости патогенных микроорганизмов (д-р Владимир Гущин, Институт Гамалеи, Москва, Россия), и РНК из коллекции НИИ гриппа им. Смородинцева.
Таблица 1 – образцы вируса, используемые при валидации теста
№ п/п
Наименование вируса
Номер в глобальном европейском вирусном архиве (GISAIDIsolateID)
1
hCoV-19/Russia/MOW-Moscow_PMVL-O11/2021
EPI_ISL_7263932
2
hCoV-19/Russia/MOW-Moscow_PMVL-O16/2021
EPI_ISL_7263933
3
hCoV-19/Russia/SPE-RII-MH44356S/2021
EPI_ISL_7717296
В результате образцы 1, 2 и 3 были положительными в анализе, как и ожидалось. Отрицательные контрольные образцы (не отражены в таблице 1) были признаны отрицательными. Для оценки эффективности амплификации анализа ins214EPE использовали 10-кратные серийные разведения РНК Omicron. Эффективность составила 98,9% (R2 = 0,99). Данныеоб эффективности амплификации представлены на фиг.1, а кривая амплификации представлена на фиг. 2.
Разработаннаятест-система демонстрирует высокую специфичность. Он был протестирован на 26 клинических образцах (РНК, выделенных из мазков из ротоглотки) с ранее охарактеризованными вирусами, принадлежащими 8 различным линиям SARS-CoV-2 (включая DeltaB.1.617.2 + AY. *). Специфический сигнал был обнаружен только в образцах с SARS-CoV-2 РНК линии Omicron (подтверждено полногеномным секвенированием). Специфичность была дополнительно проверена на клинических образцах, положительных на другие респираторные вирусы из коллекции НИИ гриппа им. Смородинцева - гриппа, парагриппа, сезонных коронавирусов человека (OC43, NL63, 229E, HKU1), hRSV, риновирусов, бокавирусов, метапневмовирусов (всего 33) – без ложноположительных результатов. Аналитическая специфичность теста была проверена на 26 образцах 8 различных линий SARS-CoV-2 (таблица 2).
Таблица 2 – результаты проверки аналитической специфичности теста
№ п/п
Образцы
Анализ рекомбинантного белка,значение Ct
Анализ гена HKU SARS-CoV-2 N, значение Ct
Анализ гена ins214EPE, значение Ct
1
hRV
32,85
2
hRV
33,76
3
hRV
27,75
4
hRSV B
31,49
5
hRSV B
30,98
6
hRSV B
32,33
7
hRSV A
28,76
8
hRSV A
30,56
9
hRSV A
27,7
10
hPIV4
23,9
11
hPIV3
27,01
12
hPIV2
24,72
13
hPIV1
28,63
14
hCoV OC43
30,34
15
hCoV OC43
30,69
16
hCoV OC43
28,64
17
hCoV NL63
32,2
18
hCoV NL63
30,42
19
hCoV NL63
24,95
20
hMPV
30,12
21
hCoV HKU1
30,06
22
hCoV HKU1
28,3
23
hCoV HKU1
30,73
24
Human influenza A (H3N2)
28,16
39,06
25
Human influenza A (H3N2)
29,13
26
Human influenza A (H3N2)
28,45
27
SARS-CoV-2 B.1.1.529
34,15
26,61
28,44
28
hBoV
32,26
29
hBoV
30,75
30
hBoV
27,25
31
hAdV
29,47
32
hCoV 229E
29,11
33
hCoV 229E
32,52
34
hCoV 229E
29,37
--->
Перечень последовательностей
<110>  ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
"НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА ИМЕНИ А.А.
СМОРОДИНЦЕВА" МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
<120>Тест-система для выявления в SARS-CoV-2 линии Омикрон методом
одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
<130>Тест-система для выявления в SARS-CoV-2 линии Омикрон методом
одношаговой полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией
<160>3
<170>PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>21
<212>  DNA
<213>SARS-CoV-2
<400>  1
atattctaagcacacgcctatt                                                22
<210>  2
<211>22
<212>  DNA
<213>SARS-CoV-2
<400>  2
ggcaaatctaccaatggttc ta                                                22
<210>  3
<211>  23
<212>  DNA
<213>SARS-CoV-2
<400>3
tgcgtgagccagaagatctccct                                                23
<---