Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы
METHOD OF PRODUCING HUMAN RECOMBINANT FOLLICLE-STIMULATING HORMONE, PRODUCING CELL LINE AND PLASMID EXPRESSION VECTORS

Группа изобретений относится к биотехнологии и может быть использована для получения рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона.
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) представляет собой белок, состоящий из двух субъединиц - альфа (содержит 92 аминокислотных остатка) и бета (содержит 111 аминокислотных остатков), которые синтезируются в одной клетке, после чего подвергаются гликозилированию, протеолитическому удалению сигнальных пептидов, объединению в зрелый функционально активный белок и секреции. В ФСГ человека альфа- и бета-субъединица подвергаются N-гликозилированию по остаткам аспарагина в позициях альфа-52, альфа-78, бета-7, бета-24. При этом наблюдаются высокая степень гликозилирования ФСГ (до 35% углеводов в весовом соотношении) и гетерогенность гликозилирования, определяемая широким спектром углеводных структур, которые могут содержать би-, три- и тетра-разветвленные гликаны. Различия в гликозилировании влияют на биологическую активность, молекулярную массу и заряд молекул ФСГ [Mulders J.W. et al. Prediction of the in vivo Biological Activity of Human Recombinant Follicle Stimulating Hormone Using Quantitative Isoelectric Focusing // Biologicals, 1997, 25(3): 269-281; Horsman G. et al. A biological, immunological and physico-chemical comparison of the current clinical batches of the recombinant FSH preparations Gonal-F and Puregon // Hum Reprod., 2000, 15(9): 1898-1902; патенты RU 2502798 и RU 2560596].
ФСГ применяется в медицинской практике для лечения бесплодия и репродуктивных нарушений у пациентов женского и мужского пола.
Рекомбинантный человеческий фолликулостимулирующий гормон (рчФСГ) производят путем культивирования клеток яичников китайского хомячка (СНО), стабильно трансфицированных плазмидными векторами, кодирующими альфа- и бета-субъединицу данного белка. При этом некоторые из известных клеточных линий - продуцентов ФСГ были получены путем трансфекции клеток двумя плазмидными векторами, один из которых кодирует альфа-субъединицу, а другой - бета-субъединицу ФСГ [US 5240832, US 7939296, RU 2502798], другие клеточные линии были получены с помощью трансфекции клеток СНО одним плазмидным вектором, кодирующим как альфа-, так и бета-субъединицу ФСГ (US 2006223144, RU 2537268).
7
В US 7939296 раскрыто получение клеточной линии на основе клеток СНО-K1, трансфицированных плазмидными векторами, кодирующими альфа- и бета-субъединицу ФСГ. После селекции и адаптации к росту в бессывороточной среде, клетки данной линии за 7 суток суспензионного культивирования достигали плотности 1⋅10 клеток/мл, обеспечивая накопление 8-10 мкг/мл ФСГ человека в кондиционированной среде.
6
В RU 2502798 раскрыто получение клеточной линии huFSHIK, адаптированной к суспензионному росту к бессывороточной среде, которая обеспечивает накопление рчФСГ в культуральной жидкости в концентрации до 7 мкг/мл, удельная продуктивность клеточной линии составляет 1,5 мкг/10 клеток в день, или 1,5 пг на клетку в день.
В ЕА 022993 раскрыто получение плазмидной ДНК, содержащей оптимизированные последовательности кДНК, кодирующие альфа- и бета-субъединицу ФСГ человека, которую использовали для временной экспрессии рекомбинантного ФСГ человека, что не позволяет производить данный белок в промышленных масштабах.
6
В RU 2560596 раскрыто получение линии клеток C-P1.3-FSH-G4, продуцирующих рчФСГ человека. Клетки данной линии при суспензионном культивировании в бессывороточной среде обладают удельной продуктивностью более 10 пг ФСГ/клетка/день, что позволяет получать до 36,5 мкг/мл ФСГ в кондиционированной культуральной среде при концентрации клеток 1,55⋅10/мл.
Для удовлетворения растущих потребностей практической медицины в препаратах ФСГ требуется постоянное повышение продуктивности клеточных линий - продуцентов ФСГ человека.
Задачей, на решение которой направлена заявленная группа изобретений, является создание способа получения рекомбинантного человеческого ФСГ с высоким выходом, обеспечивающим содержание в культуральной жидкости не менее 75 мкг/мл рчФСГ.
Поставленная задача решается путем создания пары новых совместимых плазмидных экспрессионных векторов pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta, несущих гены альфа- и бета-субъединицы фолликуло-стимулирующего гормона соответственно, создание стабильной и высокопродуктивной клеточной линии CHO-FSH 91 на их основе и способа ее культивирования. Заявленная клеточная линия при культивировании в условиях, раскрываемых в заявленном способе, продуцирует в культуральную среду не менее 75 мкг/мл рчФСГ.
Технический результат заключается в высокой продуктивности клеточной линии CHO-FSH 91, превышающей продуктивность известных клеточных линий более чем в два раза при культивировании заявленным способом. Заявленная линия стабильно секретирует ФСГ в бессывороточную культуральную среду на протяжении не менее 20 пассажей в неселективных условиях культивирования. Перечисленные свойства делают ее экономически выгодной для широкого применения в биофармацевтическом производстве.
6
6
2
2
Технический результат достигается тем, что клетки линии CHO-FSH 91, трансфицированные плазмидами pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta, несущими гены альфа- и бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона соответственно, культивируют при следующих условиях. Клетки линии CHO-FSH 91 в концентрации 0,5⋅10-0,7⋅10 кл/мл помещают в среду, содержащую 5% гидролизата растительного белка, и выдерживают при 37°С, 5% CO и перемешивании в течение 4-х суток. После этого температуру понижают до 32°С, ежедневно вносят в культуральную среду 3% питательной добавки Cell Boost7a и 0,3% питательной добавки Cell Boost7b и выдерживают клетки при 32°С, 5% СО и перемешивании, ежедневно проверяя жизнеспособность клеток. Когда доля жизнеспособных клеток в культуре снижается до 85%, клетки удаляют, а культуральную жидкость используют для выделения рчФСГ.
Заявленная клеточная линия CHO-FSH 91 при культивировании в стандартных условиях позволяет получить 6 пг рчФСГ на клетку в сутки. Культивирование при 37°С в присутствии 5% гидролизата растительного белка в течение 4 суток позволяет максимально быстро увеличить клеточную массу. Дальнейшее культивирование при 32°С приводит к снижению темпа роста клеточной культуры, что позволяет увеличить время поддержания культуры клеток, активно продуцирующих целевой белок, и отдалить достижение клеточной культурой стадии отмирания. Добавление в культуральную среду 3% питательной добавки Cell Boost7a и 0,3% питательной добавки Cell Boost7b дополнительно приводит к увеличению продуктивности клеток линии CHO-FSH 91. Культивирование клеток заявленной линии до тех пор, пока доля жизнеспособных клеток составляет не менее 85% от общего числа клеток, позволяет повысить качество целевого белка, поскольку с уменьшением жизнеспособности клеток увеличивается гетерогенность синтезируемого ими белка и количество его изоформ. Таким образом, описанная в заявленном способе последовательность операций культивирования клеточной линии CHO-FSH 91, выбранные режимы и вещества, используемые при этом, обеспечивают решение поставленной задачи.
Линия клеток CHO-FSH 91 характеризуется следующими признаками:
Линия клеток яичников китайского хомячка Cricetulus griseus CHO-FSH 91 - продуцент рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека.
Родословная клеточной линии. Родительская клеточная линия СНО К-1, адаптированная к суспензионному росту. Котрансфекция плазмидами pTVK4p-FSHalpha, pTVK4n-FSHbeta с последующим последовательным отбором стабильного высокопродуктивного клона на селективной среде, содержащей антибиотики пуромицин и генетицин (G-418).
2
6
6
Культуральные свойства. Суспензионное культивирование в пробирках, колбах Эрленмейера на орбитальном шейкере с частотой вращения 130-180 об/мин, либо в биореакторе (ферментере), при температуре 37°С и 5% CO. Посевная доза 0,5⋅10-0,7⋅10 клеток/мл, пересев каждые 3-4 суток. Время удвоения 18-20 часов.
2
Стандартные условия выращивания. Среда CDM4 СНО (HyClone, США) с добавлением 4 мМ аланилглутамина, 1 г/л сурфактанта Pluronic-F68 (Sigma, США), 2,2 г/л гидрокарбоната натрия, 10 мкг/мл пуромицина, 200 мкг/мл антибиотика G-418, 37°С, 5% CO.
Характеристика культивирования в организме животного. Культивирование в организме животного не применяется.
Характеристики полезного вещества, продуцируемого линией. Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека. Оценка с помощью иммуноферментного анализа, электрофореза в полиакриламидном геле, капиллярного изоэлектрического фокусирования, биологического теста на клеточной линии CHO-FSHR 11, экспрессирующей рецептор к фолликулостимулирующему гормону человека.
Характеристика биосинтеза полезных продуктов. Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека секретируется в культуральную среду в количестве около 6 пг на клетку в сутки. Стабильность культивирования - не менее 40 пассажей в среде с 10 мкг/мл пуромицина и 200 мкг/мл G-418 и не менее 20 пассажей в среде без селекционного давления.
6
6
Способ криоконсервирования. 45% свежей среды CDM4 СНО, 45% кондиционированной среды, 10% DMSO, 3⋅10-5⋅10 клеток/мл, заморозка до -70°С со скоростью 1°С/мин, далее помещение в жидкий азот, жизнеспособность после размораживания и отмывки от криоконсерванта 90% (окраска трипановым синим).
Группа изобретений иллюстрируется следующими графическими материалами:
На Фиг. 1 представлена карта плазмиды pTVK4p-FSHalpha, где:
CMV - промотор предранних белков цитомегаловируса;
FSH alpha - кодонно оптимизированный ген альфа-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека;
TK polyA - сайт терминации транскрипции и полиаденилирования РНК из гена тимидинкиназы;
SV40 - промотор ранних белков вируса SV40;
Puro - ген устойчивости к пуромицину;
SV40 PolyA - сайт полиаденилирования ранних белков вируса SV40;
pUC ori - точка начала репликации;
b-lactamase - ген бактериального фермента бета-лактамазы;
regulatory element - регуляторный элемент UCOE, усиливающий экспрессию целевого гена.
На Фиг. 2 представлена карта плазмиды pTVK4n-FSHbeta, где:
CMV - промотор предранних белков цитомегаловируса;
FSH beta - кодонно оптимизированный ген бета-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека;
TK polyA - сайт терминации транскрипции и полиаденилирования РНК из гена тимидинкиназы;
SV40 - промотор ранних белков вируса SV40;
Neo - ген устойчивости к неомицину;
SV40 PolyA - сайт полиаденилирования ранних белков вируса SV40;
pUC ori - точка начала репликации;
b-lactamase - ген бактериального фермента бета-лактамазы;
regulatory element - регуляторный элемент UCOE, усиливающий экспрессию целевого гена.
На Фиг. 3 представлены клоны, обладающие наибольшей волюметрической продуктивностью, после первого этапа селекции. КЖ - культуральная жидкость, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.
На Фиг. 4 представлена динамика роста клеток линии CHO-FSH 91 и концентрация рчФСГ в культуральной жидкости при культивировании при 37°С, начиная с 4 суток, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.
На Фиг. 5 представлена динамика роста клеток линии CHO-FSH 91 и концентрация рчФСГ в культуральной жидкости при культивировании при 32°С, начиная с 4 суток, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.
На Фиг. 6 представлена динамика роста клеток линии CHO-FSH 91 и концентрация рчФСГ в культуральной жидкости при культивировании при 32°С с питательными добавками, начиная с 4 суток, где КЖК - концентрация жизнеспособных клеток, рчФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон.
На Фиг. 7 представлен электрофорез в ПААГ рекомбинантного ФСГ, очищенного из культуральной жидкости линии-продуцента CHO-FSH 91, до и после обработки нейраминидазой, восстанавливающие условия.
М - маркеры молекулярного веса, кДа;
ФСГ - необработанный белок;
ФСГ+НА - белок, обработанный нейраминидазой;
НА - нейраминидаза
На Фиг. 8 представлено капиллярное изоэлектрическое фокусирование рчФСГ, очищенного из культуральной жидкости линии-продуцента CHO-FSH 91. Указаны значения pI главных изоформ рчФСГ.
На Фиг. 9 представлено сравнение биологической активности рчФСГ, очищенного из культуральной жидкости линии-продуцента CHO-FSH 91, и коммерческого препарата рчФСГ «Гонал-Ф».
Группа изобретений поясняется следующими примерами:
Пример 1. Дизайн, синтез и сборка генетических конструкций.
Известные последовательности кДНК, кодирующих альфа- и бета-цепи рекомбинантного ФСГ человека, были проанализированы с помощью программных средств IDT (https://eu.idtdna.com/CodonOpt). В последовательности кДНК альфа-субъединицы ФСГ человека был обнаружен 71 кодон, редко встречающийся в генах китайского хомячка Cricetulus griseus, данные кодоны были заменены на часто встречающиеся в генах китайского хомячка синонимические кодоны, для чего потребовалось заменить 80 нуклеотидов. В кДНК бета-субъединицы было обнаружено 7 кодонов, редко встречающихся в генах китайского хомячка С. griseus, которые также были заменены на синонимические кодоны, часто встречающиеся в генах китайского хомячка. Полученные оптимизированные последовательности кДНК альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека представлены в SEQ ID No: 1 и SEQ ID No: 2 соответственно. Оптимизированные последовательности к ДНК альфа- и бета-субъединицы были синтезированы методом автоматизированного химического синтеза, при этом к этим последовательностям были добавлены последовательности Kozak (5'-gccacc-3') перед стартовыми кодонами, а также стоп-кодоны и фланкирующие сайты рестрикции: на 3'-конце кДНК - BglII, на 5'-конце кДНК - NotI.
Полученные фрагменты ДНК были вставлены в предварительно рестрицированные по этим сайтам плазмидные векторы серии pTVK4, которые содержат следующие элементы:
- промотор предранних белков цитомегаловируса (CMV promoter);
- сайт терминации транскрипции и полиаденилирования РНК ТК поли(А) (TK polyA);
- гены селекции в эукариотических клетках, транскрипция которых обеспечивается локальными промоторами (ген устойчивости к пуромицину (р) в плазмидном векторе pTVK4p и ген устойчивости к неомицину (n) в плазмидном векторе pTVK4n).
- точку начала репликации pUC ori
- ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину;
- элемент UCOE из генома мыши длиной 2990 нуклеотидов, обеспечивающий повышенную частоту интеграции плазмидного вектора в транскрипционно активные сайты хроматина. Интеграция в транскрипционно активные сайты хроматина, в свою очередь, приводит к высокому уровню продукции и повышенной стабильности продукции целевого белка, кодируемого плазмидным вектором [Betts Z, Dickson A.J. Ubiquitous Chromatin Opening Elements (UCOEs) effect on transgene position and expression stability in CHO cells following methotrexate (MTX) amplification. Biotechnol J. 2016; 11(4): 554-641].
В результате были получены плазмидные векторы:
pTVK4p-FSHalpha (Фиг. 1)
pTVK4n-FSHbeta (Фиг. 2)
В этих плазмидных векторах кДНК, кодирующие соответствующие цепи ФСГ человека, находятся между промотором CMV и сайтом терминации транскрипции и полиаденилирования ТК поли(А). Отсутствие ошибок в синтезе генов и сборке плазмидных векторов было подтверждено секвенированием.
Пример 2. Получение высокопродуктивной линии культивируемых клеток - продуцента ФСГ человека
2
Родительская линия клеток яичников китайского хомячка СНО-К1 была ранее адаптирована к суспензионному росту в бессывороточных средах по описанной методике (Sinacore M.S., Drapeau D., Adamson S.R. Adaptation of mammalian cells to growth in serum-free media. Mol Biotechnol, 2000; 15(3): 249-257). Альтернативно можно использовать коммерчески доступные суспензионные культуры СНО-К1. Клетки культивировали в 50-миллилитровых пробирках в среде CDM4CHO (HyClone, США), содержащей 4 мм аланилглутамина, 1 г/л Pluronic-F68 (Sigma, США), 2,2 г/л бикарбоната натрия (ПанЭко, Россия) при температуре 37°С и 5% CO. Перемешивание осуществляли с помощью орбитального шейкера с частотой вращения 180 об/мин.
5
Для трансфекции использовали клетки на третий день культивирования после третьего пассажа с жизнеспособностью не ниже, чем 95%. Клетки подсчитывали в камере Горяева, жизнеспособность культур оценивали по исключению трипанового синего. Клетки центрифугировали при 100 g в течение 1 мин. Супернатант удаляли, клетки ресуспензировали в среде DMEM-F12 (HyClone, США) и переносили в лунки 24-луночного планшета (Corning, США) из расчета 3⋅10 клеток на лунку. Готовили растворы плазмидных векторов pTVK4p-FSHalpha и pTVK4n-FSHbeta в среде DMEM-F12 в концентрации 50 мкг/мл. Для трансфекции клеток в одной лунке в каждую лунку помещали по 10 мкл раствора каждого плазмидного вектора. Трансфекцию осуществляли с помощью реагента Turbofect (Thermo Fisher, США) по инструкции изготовителя.
6
Через два дня после трансфекции клетки рассевали в плотности 0,7⋅10 кл/мл в среду CDM4CHO (HyClone, США), содержащую 10 мкг/мл пуромицина и 200 мкг/мл генетицина G-418 (селективная среда). В работе использовали антибиотик генетицин (G-418), который является аналогом неомицина, имеет сходный механизм действия и используется для селекции эукариотических клеток, трансфицированных плазмидными экспрессионными векторами, содержащими ген устойчивости к неомицину. Далее клетки адаптировали к селективным условиям, пересевая их каждые три дня. Концентрацию клеток подсчитывали в камере Горяева. Жизнеспособность культур оценивали по исключению красителя трипанового синего. После перевода на селективную среду в течение первых трех пассажей жизнеспособность клеток снизилась до 11,4%, затем начала повышаться и на шестом пассаже достигла 100%. Из полученного стабильного пула клеток, экспрессирующих рчФСГ, отбирали отдельные клоны с использованием метода лимитирующих разведений. Для этого клеточную суспензию в концентрации 5-10 клеток/мл переносили в лунки 96-луночного планшета в объеме 200 мкл в селективной среде, через две недели отбирали образцы культуральной жидкости (КЖ) из тех лунок, в которых было отмечено по одному клону. Через 14 суток было отобрано 12 клонов, концентрацию рчФСГ в культуральной жидкости для каждого клона определяли с помощью набора «Гонадотропин-ИФА ФСГ» (АлкорБио, Россия) (Фиг. 3).
6
Клоны, обладающие наибольшей продукцией белка, переносили в 48-луночные планшеты, содержащие по 500 мкл селективной среды. На третьи сутки культивирования отбирали образцы культуральной жидкости из каждой лунки и вновь выбирали клоны с наибольшей продукцией белка. Отобранные клоны переносили в 5 мл селективной среды в 50-миллилитровые пробирки и продолжали культивирование. Через 3 суток 4 клона с наибольшей продуктивностью и жизнеспособностью выше 90% переносили в 5 мл питательной среды CDM4CHO, не содержавшей антибиотиков, и культивировали в течение 6 суток, после чего определяли жизнеспособность клеток и продукцию рчФСГ (Таблица 1). На основании полученных результатов был отобран клон 91, названный CHO-FSH 91, обеспечивающий накопление в культуральной жидкости 10,8 мг/л рекомбинантного ФСГ человека на шестые сутки культивирования при концентрации клеток 6,2⋅10 кл/мл и жизнеспособности не менее 94,2%.
Пример 3. Оптимизация способа культивирования клона клеток СНО-FSH 91.
6
6
Стабильный клон клеток CHO-FSH 91, полученный в примере 2, использовали для дальнейшей оптимизации процесса культивирования с целью повышения продукции клетками рчФСГ. Клетки культивировали в 50-миллитровых пробирках в среде CDM4CHO без антибиотиков с 5% гидролизата растительного белка CD Hydrolysate Fusion (Sigma, США) при температуре 37°С и скорости вращения шейкера 180 об/мин. Начальная плотность культуры составляла 0,5⋅10-0,7⋅10 кл/мл. Ежедневно, начиная с 4 суток, отбирали аликвоты для оценки концентрации рчФСГ, содержания и жизнеспособности клеток.
Жизнеспособность сохранялась выше 85% в течение девяти суток. За это время концентрация рчФСГ в культуральной жидкости достигала 13 мкг/мл (Фиг. 4). Уменьшение количества клеток после 6 суток культивирования было связано с агрегацией части клеток.
Для увеличения времени культивирования и количества синтезированного белка, начиная с 4 суток, температуру культивирования снижали до 32°С, в результате чего концентрация рчФСГ в культуральной жидкости повысилась и на 12-й день составила 30 мкг/мл (Фиг. 5). Жизнеспособность сохранялась выше 85% в течение 12 суток. Ежедневное, начиная с 4 суток культивирования, внесение питательных добавок (HyClone, США): Cell Boost7a (3% объема питательной среды) и Cell Boost7b (0,3% объема питательной среды) позволило достигнуть концентрации рчФСГ в культуральной жидкости на 12-й день культивирования равной 75 мкг/мл (Фиг. 6). Жизнеспособность сохранялась выше 85% в течение 12 суток. Уменьшение количества клеток после 8 суток культивирования было связано с агрегацией части клеток.
Клетки клона CHO-FSH 91, выращенные при температуре 37°С, криоконсервировали и поместили в клеточный банк ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» под названием «Клеточная линия CHO-FSH 91 - продуцент рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека»
Пример 4. Очистка рекомбинантного ФСГ человека
6
Культивирование клеток линии CHO-FSH 91 при температуре 32°С проводили в 8 колбах объемом 500 мл каждая, содержавших по 100 мл питательной среды, при начальной плотности культуры 0,5⋅10 кл/мл в условиях, описанных в примере 3. После 12 суток культивирования было получено 800 мл культуральной жидкости.
Культуральную жидкость осветляли путем последовательной фильтрации через фильтры с размером пор 0,8 мкм и 0,2 мкм (Sartorius, Германия). Далее рекомбинантный ФСГ человека очищали из осветленной культуральной жидкости следующим образом:
Этап I. Концентрирование и замена буферного раствора методом тангенциальной фильтрации на мембране Sartocon Slice 50, (Sartorius, Германия) с размером пор 10 кДа, материал мембраны Hydrostat. Скорость циркуляции ретентата составила 50 мл/мин, скорость трансмембранного потока составила 4 мл/мин. В результате объем культуральной жидкости уменьшили до 160 мл с заменой буфера на 20 мМ трис-гидрохлорид, рН 7,5.
Этап 2. Анионообменная хроматография на колонке HiPrep 16/10 Q-Sepharose FF 16×100 мм (GE-Healthcare, США), уравновешенной 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5. После промывки колонки связавшийся материал элюировали 100 мл элюирующего буфера (100 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, рН 7,5). Было получено 40 мл элюата.
4
2
4
4
2
4
Этап 3. Гидрофобная хроматография на колонке HiTrap Phenyl HP (GE-Healthcare, США) объемом 1 мл. Элюат, полученный после проведения этапа 2, смешивали с буфером для разведения (3,6 М аммония сульфат, 20 мМ трис гидрохлорид, рН 7,5) в соотношении 1:1 и наносили на колонку, уравновешенную 1,8 М (NH)SO, 20 мМ трис-HCl, рН 7,5. После нанесения и промывки колонки проводили элюцию линейным градиентом 1,8 М - 0 М (NH)SO в 20 мМ трис-HCl, рН 7,5, объем градиента 20 мл. Собирали фракции, элюированные в диапазоне проводимости от 150 до 80 мСм/см. Объем собранных фракций составил 12 мл.
Этап 4. Замена буферного раствора путем гель-фильтрации на колонке BioScale Mini Bio-Gel Р6 (Bio-Rad, США) объемом 50 мл. Колонку уравновешивали 100 мл фосфатного буфера (10 мМ натрия фосфат, рН 6,8) и вносили в нее материал, полученный на этапе 3. Элюировали 10 мМ Na-фосфатным буфером, рН 6,8. Объем фракций, включающих в себя целевой белок, составил 20 мл.
Этап 5. Хроматография на колонке с гидроксиапатитом. Хроматографию проводили на колонке Foresight СНТ Type I (Bio-Rad, США) объемом 1 мл. Колонку уравновешивали стартовым буфером (20 мМ натрия фосфат, рН 6,8), после чего вносили материал, полученный на этапе 4. Промывали колонку 5 мл стартового буфера и собирали белок, прошедший через колонку при нанесении и промывке с оптической плотностью на длине волны 280 нм более 25 mAU. Объем фракции, содержащей очищенный ФСГ, составил 23 мл.
Этап 6. Диализ. Диализ белка проводили против раствора, содержащего 137 мМ хлорида натрия, 2,7 мМ хлорида калия, 10 мМ гидрофосфата калия, 1,75 мМ дигидрофосфата калия, с рН 7,3 в диализном мешке MFPI CelluSep RC Т2 с пределом отсечения 6-8 кДа. Степень чистоты белка определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (Табл. 2). Выход очищенного рчФСГ составил 50,5%. Баланс процесса очистки рчФСГ представлен в Таблице 2.
Пример 5. Обработка нейраминидазой и электрофорез белка в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Полученный в примере 4 белок обрабатывали ферментом нейраминидазой (NEB, США), отщепляющей концевые остатки сиаловой кислоты, по методике производителя. Затем осуществляли электрофорез нативного и обработанного ферментом рчФСГ в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) на установке Mini-PROTEAN II TETRA CELL (Bio-Rad, США). В качестве маркеров молекулярной массы использовали Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific, США). Перед нанесением на гель образцы белка прогревали при температуре 70°С в течение 10 минут в растворе, содержащем 0,05% бромфенолового синего, 2% SDS, 10% глицерина, 0,0625 М трис-HCl (рН 6,8), 400 мМ β-меркаптоэтанола. Электрофорез белков проводили при напряжении 180 V в течение 1 часа. После промывки геля в дистиллированной воде проводили окрашивание раствором Optiblot Blue Gel Stain (Abcam, США) в течение 15 минут. Затем производили трехкратную отмывку геля в дистиллированной воде в течение 10 минут.
На электрофореграмме обнаруживались полосы, соответствующие альфа- и бета-субъединице гетеродимера рчФСГ (Фиг. 7). Увеличение молекулярной массы белка на электрофорезе в ПААГ по сравнению с теоретически рассчитанной связано с наличием гликанов в составе гликопротеина. Гидрофильные гликаны уменьшают гидрофобные взаимодействия между белком и додецилсульфатом натрия (ДСН), препятствуя связыванию белка с ДСН, в результате чего кажущаяся молекулярная масса белка увеличивается [Stoyanov A.V. The proteome revisited: theory and practice of all relevant electrophoretic steps. 2001. Elsevier]. В случае необработанного нейраминидазой рчФСГ молекулярная масса альфа- и бета- субъединиц находилась в диапазоне 32-36 кДа, в случае обработанного нейраминидазой - 28-32 кДа. Такое снижение молекулярной массы субъединиц согласуется с данными о молекулярной массе рчФСГ, полученными в работе Heum K., Kim S.C., Seo K.S., Lee S.H., Kim W.B., Lee K.C. Purification and characterization of recombinant human follicle stimulating hormone produced by Chinese hamster ovary cells // J Microbiol Biotechnol., 2005, 15(2):395-402.
Пример 6. Определение изоэлектрической точки рчФСГ методом капиллярного изоэлектрического фокусирования.
РчФСГ, полученный в примере 4, был сконцентрирован с помощью ультрафильтрационных спин-колонок Amicon Ultra-0.5 («Merck Millipore», Германия) до конечной концентрации 10 мг/мл по инструкции производителя.
Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (кИЭФ) проводили в капилляре длиной 45 см и внутренним диаметром 50 мкм, в 3 М мочевине с амфолитами «Pharmalyte 3-10» («GE-Healthare», США), с помощью системы капиллярного электрофореза «Капель-105М» («Люмэкс», Россия).
Обработку данных проводили в программе «Эльфоран» («Люмэкс», Россия). Расчет изоэлектрических точек белковых фракций осуществляли по уравнению, полученному методом линейной регрессии по пептидным маркерам с известными значениями pI.
Результаты, представленные на Фиг. 8, показывают, что очищенный рчФСГ состоит из фракций, pI которых располагаются в диапазоне от 3,83 до 5,01, что соответствует диапазону значений pI для изоформ биологически активного рчФСГ [US 7939296; Driebergen R., Baer G. Quantification of follicle stimulating hormone (follitropin alfa): is in vivo bioassay still relevant in the recombinant age? // Curr Med Res Opin., 2003, 19(1):41-46; Mulders J.W., Derksen M., Swolfs A., Maris F. Prediction of the in vivo biological activity of human recombinant follicle stimulating hormone using quantitative isoelectric focusing // Biologicals, 1997, 25(3):269-281].
Пример 7. Оценка биологической активности рчФСГ, продуцируемого линией культивируемых клеток CHO-FSH 91.
Для определения биологической активности рчФСГ, полученного в примере 4, использовали методику, основанную на определении концентрации циклического АМФ в клетках, экспрессирующих FSHR - рецептор ФСГ (RU 2193599; Minegishi Т., Igarashi S., Nakamura K., Nakamura М., Tano М., Shinozaki Н., Miyamoto K., Ibuki Y. Functional expression of the recombinant human FSH receptor // J Endocrinol., 1994, 141(2): 369-375).
dhƒr-
5
2
2
Линия клеток CHO-FSHR 11 была получена трансфекцией клеток линии CHO, дефицитных по гену дегидрофолатредуктазы, вектором, содержащим последовательность FSHR - рецептора фолликулостимулирующего гормона, и отбором наиболее хорошо растущего клона, экспрессирующего FSHR. Альтернативно можно использовать любую клеточную культуру, экспрессирующую рецептор ФСГ. Клетки культивировали в ростовой среде DMEM/F12 (HyClone, США), содержащей 10% сыворотки (HyClone, США). За день до проведения эксперимента клетки засевали в лунки 24-луночного планшета (Jet Biofil, Китай) в 1 мл ростовой среды в плотности 4⋅10 кл/мл. Через сутки кондиционированную среду в лунках заменяли на 950 мкл среды DMEM/F12 без сыворотки, содержащей 3-изобутил-1-метилксантин (Sigma, США) в конечной концентрации 0,1 мМ. Планшет инкубировали в CO-инкубаторе при 37°С в течение 15 минут, после чего к клеткам добавляли образцы рчФСГ. Активность полученного в примере 4 рчФСГ сравнивали с активностью препарата «Гонал-Ф» (Merck Serono, Италия). Образец рчФСГ, полученного в примере 4, и препарат Гонал-Ф разводили средой DMEM/F12 без сыворотки до концентрации 17 нг/мл, что составляет 0,23 МЕ/мл для препарата Гонал-Ф. Далее готовили 4 последовательных разведения образца рчФСГ и препарата Гонал-Ф с шагом 1:3. Затем полученные разведения вносили в лунки планшета с подготовленными клетками CHO-FSHR 11 по 50 мкл на каждую лунку, после чего проводили инкубацию планшета в СО-инкубаторе при 37°С в течение 30 минут. Среду удаляли, промывали лунки планшета фосфатно-солевым буфером и вносили по 200 мкл однократного лизирующего буфера Cell Lysis Buffer 5 из набора Parameter cAMP Assay kit (R&D Systems, США), Концентрацию цАМФ в полученных лизатах определяли с помощью набора Parameter cAMP Assay kit (R&D Systems, США). Затем строили график зависимости концентрации цАМФ в лизатах от концентрации образцов рчФСГ. Результаты, представленные на Фиг. 9, показывают, что препарат Гонал-Ф и рчФСГ, полученный в примере 4, одинаково стимулируют продукцию цАМФ клетками CHO-FSHR 11 в исследованном диапазоне концентрации, при этом 50% повышение уровня цАМФ наступает при одинаковой концентрации рчФСГ и Гонал-Ф, равной 4 нг/мл, что указывает на одинаковую активность сравниваемых препаратов.