СПОСОБЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЭПИТОПОВ

1. Способ идентификации эпитопа, с которым может связываться антитело, на белке, причем указанный способ включает
(i) осуществление протеолитического расщепления указанного белка in silico одной или несколькими протеазами для идентификации сайтов на белке, которые согласно прогнозу разрезаются указанной одной или несколькими протеазами;
(ii) осуществление ограниченного или частичного протеолиза указанного белка in vitro одной или несколькими протеазами;
(iii) идентификацию пептидов, высвободившихся из указанного белка в результате протеолитического расщепления in vitro на этапе (ii), и посредством этого - идентификацию сайтов разрезания;
(iv) сравнение спрогнозированных in silico сайтов разрезания, идентифицированных на этапе (i), с сайтами разрезания, идентифицированными на этапе (iii);
(v) исследование одного или нескольких эпитопов в области белка, содержащей или фланкирующей сайт разрезания, который представляет собой сайт разрезания протеазой, спрогнозированный in silico, идентифицированный на этапе (i), но который не является сайтом разрезания, идентифицированным на этапе (iii) с помощью одного или нескольких антител; и
(vi) определение того, связывается или нет указанное одно или более антител с указанным одним или несколькими эпитопами, и посредством этого идентификацию эпитопа на белке, с которым может связываться антитело.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий осуществление моделирования белков по гомологии для прогнозирования, какие спрогнозированные in silico сайты разрезания протеазой, вероятно, являются экспонированными.
3. Способ по п. 1 или 2, дополнительно включающий осуществление докинга фрагментов антитела или протеаз in silico для прогнозирования, какие спрогнозированные in silico сайты разрезания, вероятно, будут разрезаны in vitro.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что применяют одну протеазу.
5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что применяют несколько протеаз.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанная протеаза выбрана из группы, состоящей из: трипсина, протеиназы Arg-C, эндопептидазы Asp-N, клострипаина, глутамилэндопептидазы, Lys-C, Lys-N, химотрипсина, протеиназы K, термолизина, пепсина, каспазы 1, каспазы 2, каспазы 3, каспазы 4, каспазы 5, каспазы 6, каспазы 7, каспазы 8, каспазы 9, каспазы 10, энтерокиназы, фактора Ха, гранзима В, нейтрофильной эластазы, пролинэндопептидазы, стафилококковой пептидазы I и тромбина.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что указанная протеаза выбрана из группы, состоящей из: трипсина, эндопептидазы Asp-N, химотрипсина, пепсина и протеиназы K.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что указанный белок представляет собой мембранный белок, который присутствует в протеолипосоме, полученной из клеток.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанная протеолипосома иммобилизована в проточной ячейке для создания неподвижной фазы мембранных белков.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что идентификацию пептидов, высвободившихся из указанного белка в результате протеолитического расщепления in vitro на этапе (ii), и посредством этого - идентификацию сайтов разрезания, осуществляют методом масс-спектрометрии.
11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает до этапа (v) этап создания одного или нескольких выделенных эпитопов, последовательности которых соответствуют одному или более эпитопам на указанном белке, которые расположены в области белка, содержащей или фланкирующей сайт разрезания, который представляет собой сайт разрезания протеазой, спрогнозированный in silico, идентифицированный на этапе (i), но который не является сайтом разрезания, идентифицированным на этапе (iii), и образования антител, которые связываются с указанными выделенными эпитопами, и применения указанных антител на этапе (v) для исследования указанного одного или нескольких эпитопов указанного белка.
12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что исследуют совокупность эпитопов.
13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанный эпитоп находится в пределах 20 аминокислот от указанного сайта разрезания, который представляет собой сайт разрезания протеазой, спрогнозированный in silico, идентифицированный на этапе (i), но который не является сайтом разрезания, идентифицированным на этапе (iii).
14. Способ по любому из пп. 1-13, отличающийся тем, что исследуют совокупность эпитопов, и что указанная совокупность эпитопов представляет собой множество (группу) эпитопов, причем последовательность каждого эпитопа во множестве смещена по сравнению с другим эпитопом во множестве на 1, 2 или 3 аминокислоты.
15. Способ идентификации эпитопа, с которым может связываться антитело, на белке, причем указанный способ включает:
(i) идентификацию сайтов, в которых одна или более протеаз разрезали указанный белок после того, как указанный белок подвергся воздействию ограниченного или частичного протеолиза указанной одной или несколькими протеазами; и
(ii) исследование совокупности эпитопов на указанном белке, которые расположены между сайтами разрезания, которые перекрываются с сайтом разрезания или которые расположены в области, фланкирующей сайт разрезания, с помощью антител, направленных против указанных эпитопов, посредством этого идентифицируя один или несколько эпитопов, с которыми может связываться антитело.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что применяют одну протеазу.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что применяют несколько протеаз.
18. Способ по любому из пп. 15-17, отличающийся тем, что указанная протеаза выбрана из группы, состоящей из: трипсина, протеиназы Arg-C, эндопептидазы Asp-N, клострипаина, глутамилэндопептидазы, Lys-C, Lys-N, химотрипсина, протеиназы K, термолизина, пепсина, каспазы 1, каспазы 2, каспазы 3, каспазы 4, каспазы 5, каспазы 6, каспазы 7, каспазы 8, каспазы 9, каспазы 10, энтерокиназы, фактора Ха, гранзима В, нейтрофильной эластазы, пролинэндопептидазы, стафилококковой пептидазы I и тромбина.
19. Способ по любому из пп. 15-18, отличающийся тем, что указанная протеаза выбрана из группы, состоящей из: трипсина, эндопептидазы Asp-N, химотрипсина, пепсина и протеиназы K.
20. Способ по любому из пп. 15-19, отличающийся тем, что указанный белок представляет собой мембранный белок, который присутствует в протеолипосоме, полученной из клеток.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что указанная протеолипосома иммобилизована в проточной ячейке для создания неподвижной фазы мембранных белков.
22. Способ по любому из пп. 15-21, отличающийся тем, что указанные сайты, в которых одна или более протеаз разрезали указанный белок, идентифицируют с применением масс-спектрометрии.
23. Способ по любому из пп. 15-22, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает до этапа (ii) этап создания совокупности выделенных эпитопов, последовательности которых соответствуют эпитопам на указанном белке, которые расположены между сайтами разрезания, которые перекрываются с сайтом разрезания или которые расположены в области, фланкирующей сайт разрезания, и образования антител, которые связываются с указанными выделенными эпитопами, и применения указанных антител на этапе (ii) для исследования указанной совокупности эпитопов на указанном белке.
24. Способ по любому из пп. 15-23, отличающийся тем, что указанный эпитоп находится в пределах 20 аминокислот от указанного сайта разрезания.
25. Способ по любому из пп. 15-24, отличающийся тем, что указанная совокупность эпитопов представляет собой множество (группу) эпитопов, причем последовательность каждого эпитопа во множестве смещена по сравнению с другим эпитопом во множестве на 1, 2 или 3 аминокислоты.
26. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает этап получения антитела против эпитопа, идентифицированного по любому из пп. 1-25.
27. Эпитоп, идентифицированный способом по любому из пп. 1-25.
28. Антитело, которое связывается с эпитопом по п. 27.