Ассоциация полиморфного маркера g6230а гена сtla4 с сахарным диабетом 1-го типа у больных русского происхождения

Ассоциация полиморфного маркера G6230A гена CTLA4 с сахарным диабетом 1-го типа у больных русского происхождения

О.И. КОПЫЛОВА1, д.м.н. Т.Л. КУРАЕВА2, к.б.н. Е.Ю. ЛАВРИКОВА1, к.м.н. Е.В. ТИТОВИЧ2, к.б.н. А.Г. НИКИТИН1, к.м.н. Г.Е. СМИРНОВА2, член-корр. В.А. ПЕТЕРКОВА2, акад. И.И. ДЕДОВ2, д.б.н., проф. В.В. НОСИКОВ1*

Association of the polymorphous marker G6230A of the CTLA4 gene with type 1 diabetes mellitus in the patients of Russian descent

O.I. KOPYLOVA, T.L. KURAEVA, E.YU. LAVRIKOVA, E.V. TITOVICH, A.G. NIKITIN, G.E. SMIRNOVA, V.A. PETERKOVA, I.I. DEDOV, V.V. NOSIKOV

1Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН; 2 ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ, Москва

Проблема риска сахарного диабета 1-го типа (СД1) до настоящего времени остается актуальной, так как до конца не изучены вопросы этиологии, генетической предрасположенности и прогноза заболевания. В основе развития любого аутоиммунного процесса лежат нарушения тонких молекулярных механизмов регуляции иммунной системы, поэтому гены, кодирующие основные ее компоненты, являются потенциальными генами-кандидатами предрасположенности к СД1. Для изучения ассоциации с СД1 проведен сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера rs3087243 (G6230A) гена CTLA4, кодирующего антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов. В исследование были включены 257 больных СД1 и 526 здоровых лиц. Идентификацию генотипов проводили методом амплификации «в реальном времени». Генотип АА встречался реже в группе больных СД1, чем в контрольной группе (11,3 и 22,1% соответственно), а частота генотипа GG была выше у больных СД1, чем среди здоровых лиц (44,7 и 37,5% соответственно). Полученные результаты показывают, что полиморфный маркер rs3087243 гена CTLA4 высоко достоверно ассоциирован с предрасположенностью к развитию СД1 у больных русского происхождения.

Ключевые слова: сахарный диабет 1-го типа, полиморфный маркер rs3087243 (G6230A) гена CTLA4, ассоциация.

The risk of devolvement of type 1 diabetes mellitus (DM1) remains a challenging problem because neither etiology of the disease nor its prognosis and genetic predisposition to this condition are clearly understood. The development of any autoimmune process starts from the disturbance of subtle molecular mechanisms involved in the regulation of the immune system. Therefore, the genes controlling the function of its major components are at the same time the potential candidate genes encoding for the predisposition to DM1. Their association with the disease was studied by means of comparative analysis of the frequency distribution of alleles and genotypes of the polymorphous rs3087243 (G6230A) marker of the CTLA4 gene encoding for antigen-4 of cytotoxic T-lymphocytes. The present study included 257 patients presenting with type 1 diabetes mellitus and 526 healthy subjects. Genotypes were identified by the «real time» amplification technique. The AA genotype was found to occur less frequently in the diabetic patients than in the control group (11.3% and 22.1% respectively). In contrast, the frequency of the GG genotype was higher in the patients with DM1 than in the healthy subjects (44.7% and 37.5% respectively). It is concluded that the polymorphous rs3087243 marker of the CTLA4 gene is significantly associated with the predisposition to the development of type 1 diabetes mellitus in the patients of Russian descent.

Key words: type 1 diabetes mellitus, polymorphous rs3087243 (G6230A) marker of the CTLA4 gene, association.

Cахарный диабет 1-го типа (СД1) — широко распространенное, тяжелое заболевание, приводящее к ранней инвалидности и преждевременной смерти [1]. При СД1 происходит аутоиммунное разрушение Р-клеток островков Лангерганса поджелудочной железы, что приводит к полной зависимости больных от экзогенного инсулина, который необходим для регуляции уровня глюкозы в крови. Постоянное введение препаратов экзогенного инсулина продлевает жизнь, но не предотвращает развитие поздних осложнений, которые являются основной причиной ранней смертности больных. В целом средняя продолжительность жизни у заболевших СД1 в детстве на 20 лет меньше средней продолжительности жизни в общей популяции [1].

Развитие СД1 более чем наполовину связано с генетическими факторами. Актуальность изучения молекулярной генетики СД1 обусловлена главным образом возможностью идентификации генов, предрасполагающих к СД1, что существенно для понимания того, какие именно механизмы определяют этот процесс [2].

Ассоциация хромосомной области 2q33 с СД1 впервые была установлена в 1996 г. [3] при анализе сцепления с СД1 группы полиморфных маркеров, расположенных около генов СТЬА4 и СБ28. Эти гены рассматривались в качестве кандидатов, так как, во-первых, структурная организация данной области генома человека подобна области хромосомы 1 мыши, содержащей локус idd5, который вовле-

© Коллектив авторов, 2012

*e-mail: nosikov@genetika.ru

чен в развитие СД у мышей линии NOD. Во-вторых, гены CTLA4 и CD28 кодируют поверхностные рецепторы Т-клеток и играют важную роль в пролиферации этих клеток.

Как известно, активация Т-клетки происходит после связывания с ней комплекса антигена с молекулой HLA вследствие последовательного фосфорили-рования гидроксигрупп остатков тирозина нескольких белковых факторов, обеспечивающих передачу сигнала в ядро клетки [4, 5]. Внутриклеточная часть белка CTLA-4 обладает фосфатазной активностью, и CTLA-4, дефосфорилируя соответствующие белковые факторы, понижает эффективность передачи такого сигнала [6], играя таким образом важную роль в формировании «разумного» иммунного ответа.

Ассоциация гена CTLA4 с СД1 установлена с точностью до блока неравновесия по сцеплению, содержащего весь ген. Кроме того, разные уровни ассоциации были обнаружены в случае полиморфного микросателлита (АТ)п, расположенного в 3'-некодирующей области гена, а также в случае однонуклеотидных полиморфных маркеров A49G и C(-318)T.

Расположенному в экзоне 1 полиморфизму A49G соответствует аминокислотный полиморфизм аланин/треонин в сигнальном пептиде молекулы CTLA-4 [7, 8]. Исследования in vitro показали, что у носителей аллеля Ala имеет место пониженный уровень гликозилирования молекулы CTLA-4 в эн-доплазматическом ретикулуме, что в свою очередь приводит к снижению содержания молекул CTLA-4 на поверхности клеток [9].

Аллель T полиморфного маркера C(—318)T ассоциирован с более высокой активностью промотора и, следовательно, с повышенным уровнем экспрессии гена CLTA4 [8, 10], что приводит к снижению уровня активации Т-клеток. Таким образом, носительство аллеля T понижает риск развития аутоиммунных заболеваний.

Полный геномный анализ позволил обнаружить еще один маркер гена CTLA4 [11], ассоциированный с рядом аутоиммунных заболеваний (rs3087243— G6230A) в наибольшей степени с тиреоидитом. В недавнем исследовании, проведенном на японской популяции, утверждалось, что полиморфный маркер rs3087243 ассоциирован исключительно с аутоиммунным тиреоидитом, при этом аллель G не имеет прямого влияния на предрасположенность к СД1 [12]. Позднее в трех других исследованиях было доказано, что данный полиморфный маркер ассоциирован с совместным развитием СД1 и аутоиммунного тиреоидита [13—15]. Таким образом, роль полиморфизма rs3087243 в целом пока еще неясна и к тому же до сих пор не исследовалась у больных СД1 русского происхождения.

Ранее у больных русского происхождения с использованием семей с конкордантными и дис-

конкордантными сибсами были обнаружены сцепление и ассоциация с СД1 полиморфного микросателлита (АТ)п, расположенного в 3'-некодирую-щей области гена, и полиморфного маркера A49G [16].

Цель настоящей работы — изучение ассоциации полиморфного маркера rs3087243 (G6230A) гена CTLA4 с СД1 методом «случай—контроль» на больших группах больных СД1 и здоровых лиц русского происхождения.

Материал и методы

В работе использовали образцы крови больных СД1 (257 человек) и здоровых лиц (526 человек) русского происхождения, любезно предоставленные сотрудниками ЭНЦ. Использовали термостабильную ДНК-полимеразу Taq производства ЗАО «Диалат» (Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» (Москва). Флюоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез» (Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [17].

Амплификацию полиморфного участка гена проводили с помощью полимеразной цепной реакции «в реальном времени» на термоциклере ABI 7500 Fast («Applied Biosystems») в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01% Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 300 нМ прай-меров, 150 нМ зондов,1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50—100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95 °C/2 мин — 1-й цикл; 94 °C/10 с, 56 °C/60 — 40 циклов для полиморфного маркера rs3087243 гена CTLA4. Размер продукта амплификации 102 п.н. Анализ продуктов амплификации проводился методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

Статистический анализ распределения частот и генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия %2. Достоверными считали различия при ^<0,05. Для описания относительного риска развития заболевания рассчитывали отношение шансов (OR). Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях «случай—контроль» [18].

Результаты и обсуждение

В нашем исследовании аллель G полиморфного маркера G6230А гена CTLA4 был преобладающим в группах больных и здоровых лиц. Однако частота

Частоты аллелей и генотипов полиморфного маркера ^3087243 ^6230А) гена СТМ4 в группах «СД1+» и «СД1-»

Частота аллеля и генотипа 0

Аллель и генотиД СД1 + (п=257) СД1-(п=526) х2_р_™_95% ДИ

Аллель А 0,333 0,423 ппЛ/; 0,68 0,55—0,85

Аллель G 0,667 0,577 11,80 0,0006 1,47 1,18—1,83

Генотип АА 0,113 0,221 0,45 0,29—0,70

Генотип AG 0,440 0,405 13,62 0,001 1,15 0,85—1,56

Генотип GG_0,447_0,375_1,35_1,00—1,83

аллеля А у здоровых лиц существенно превышала частоту аллеля А в группе больных (см. таблицу).

Генотип АА встречался реже в группе больных СД1, чем в контрольной группе (11,3 и 22,1% соответственно), а частота генотипа GG была выше у больных СД1 (44,7 и 37,5% соответственно). Можно сделать вывод, что носители аллеля G и генотипа GG имеют повышенный риск развития СД1, тогда как носители аллеля А и генотипа АА — пониженный риск развития этого заболевания.

Полученные результаты показывают, что полиморфный маркер rs3087243 гена CTLA4 тесно ассоциирован с предрасположенностью к СД1 у больных русского происхождения. Однако трудно решить, какой из четырех изученных к настоящему времени маркеров (полиморфный микросателлит (АТ)п, A49G, C(-318)T и G6230А) гена CTLA4 вносит наибольший вклад в развитие СД1.

Все эти маркеры тесно ассоциированы с СД1 и в то же время не сцеплены между собой. Для маркеров A49G и C(-318)T показана функциональная значимость. У носителей аллеля A (Ala) полиморфного маркера A49G снижено содержание молекул CTLA-4 на поверхности клеток [9]. У носителей аллеля T полиморфного маркера C(—318)T имеет ме-

сто повышенная активность промотора гена СТЬА4 [8, 10], что приводит к снижению уровня активации Т-клеток.

Для двух других маркеров (полиморфный микросателлит (АТ)п и G6230А) функциональная значимость до настоящего времени не обнаружена. Однако это не означает, что они не оказывают влияния на реализацию функций молекул С^А-4. В данной ситуации при расчете риска развития СД1, по-видимому, следует учитывать совокупное влияние всех изученных маркеров.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Г. Никитин, В.В. Носиков, И.И. Дедов, О.И. Копылова

Сбор и обработка материала — Т.Л. Кураева, Г.Е. Смирнова, В.А. Петеркова, Е.Ю. Лаврикова, О.И. Копылова

Статистическая обработка данных — А.Г. Никитин, О.И. Копылова

Написание текста — А.Г. Никитин, О.И. Копы-лова, В.В. Носиков

Редактирование — В.В. Носиков

ЛИТЕРАТУРА

1. Дедов И.И., Шестакова М.В. Сахарный диабет. Руководство для врачей. М: Универсум Паблишинг 2003.

2. Pociot F., McDermott M.F. Genetics of type 1 diabetes mellitus. Genes Immun 2002; 3: 235—249.

3. Nistico L., Buzzetti R., PritchardL.E., Van der Auwera B., Giovan-nini C., Bosi E., Martinez L.M.T., Serrano R.M., Chow C.C., Cockram C.S. The CTLA-4 Gene Region of Chromosome 2q33 Is Linked to, and Associated with, Type 1 Diabetes. Human Mol Genet 1996; 5: 1075—1080.

4. Nistico L., Cascino I., BuzzettiR., PozzillP. CTLA-4 in Type 1 Diabetes Mellitus Landes Bioscience. Austin 2000.

5. Kavvoura F.K., Ioannidis J.P.A. CTLA-4 Gene Polymorphisms and Susceptibility to Type 1 Diabetes Mellitus: A HuGE Review and Meta-Analysis. Am J Epidemiol 2005; 162: 3—16.

6. Teft W.A., Kirchhof M.G., Madrenas J. A molecular perspective of CTLA-4 function. Ann Rev Immunol 2006; 24: 65—97.

7. Anjos S., Polychronakos C. Mechanisms of genetic susceptibility to type I diabetes: beyond HLA. Mol Genet Metab 2004; 81: 187— 195.

8. Anjos S.M., Tessier M.-C., Polychronakos C. Association of the Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4 Gene with Type 1 Diabetes: Evidence for Independent Effects of Two Polymorphisms on the Same Haplotype Block. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 6257—6265.

9. Anjos S., Nguyen A., Ounissi-Benkalha H., Tessier M.-C., Polychronakos C. A common autoimmunity predisposing signal peptide variant of the cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 results in inefficient glycosylation of the susceptibility allele. J Biol Chem 2002; 277: 46478—46486.

10. Wang X.B., Zhao X., Giscombe R., Lefvert A.K. A CTLA-4 gene polymorphism at position -318 in the promoter region affects the expression of protein. Genes Immun 2002; 3: 233—234.

11. Anjos S.M., Shao W., MarchandL., Polychronakos C. Allelic effects on gene regulation at the autoimmunity-predisposing CTLA4 locus: a re-evaluation of the 3[prime] +6230G>A polymorphism. Genes Immun 2005; 6: 305—311.

12. Awata T., KawasakiE., Tanaka S., Ikegami H., Maruyama T., Shi-mada A., Nakanishi K., Kobayashi T., Iizuka H., Uga M. et al. Association of type 1 diabetes with two Loci on 12q13 and 16p13 and

the influence coexisting thyroid autoimmunity in Japanese. J Clin Endocrinol Metab 2009; 94: 231—235.

13. Djilali-Saiah I., LargerE., Harfouch-HammoudE., Timsit J., Clerc J., Bertin E., Assan R., Boitard C., Bach J.F., Caillat-Zucman S. No major role for the CTLA-4 gene in the association of autoimmune thyroid disease with IDDM. Diabetes 1998; 47: 125—127.

14. Golden B., Levin L., Ban Y., Concepcion E., Greenberg D.A., Tomer Y. Genetic analysis of families with autoimmune diabetes and thyroiditis: evidence for common and unique genes. J Clin Endocrinol Metab 2005; 90: 4904—4911.

15. Takara M., Komiya I., Kinjo Y., Tomoyose T., Yamashiro S., Akamine H., Masuda M., Takasu N. Association of CTLA-4 gene A/G polymorphism in Japanese type 1 diabetic patients with younger

age of onset and autoimmune thyroid disease. Diabetes Care 2000; 23: 975—978.

16. ChistyakovD.A., Savost'anovK.V., Nosikov V.V. CTLA4 gene polymorphisms are associated with, and linked to, insulin-dependent diabetes mellitus in a Russian population. BMC Genetics 2001; 2: 1: 6.

17. Johns M.B., Paulus-Thomas J.E. Purification of human genomic DNA from whole blood using sodium perchlorate in place of phenol. Anal Biochem 1989; 180: 276—278.

18. Никитин А. Калькулятор для расчета статистики в исследованиях «случай—контроль». Available at: http://test.tapotili.ru/ calculator_or.php 2009.