НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ "ОМ-СКРИН-СИБИРСКАЯ ЯЗВА-РВ"
KIT OF REAGENTS FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF DNA OF ANTHRAX AGENT BY REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION OM-SCREEN-SIBERIAN ULCER-RV

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской диагностике, и может быть использовано в учреждениях медицины и здравоохранения, в лабораториях Центров гигиены и эпидемиологии и противочумных учреждениях Роспотребнадзора, в эпидемиологических службах, а также в стационарных и мобильных лабораториях специализированных учреждений других министерств и ведомств, в том числе Министерства обороны, для качественного определения (скрининг, мониторинг) ДНК возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis) в биологическом материале - кровь, содержимое везикул, отделяемое карбункула или струпья, мокрота, спинномозговая жидкость, моча, испражнения, экссудаты, кусочки органов; в материале от животных; продовольственном сырье и продуктах животного происхождения; объектах окружающей среды - почва, трава, фураж, подстилка, вода и т.д., а также в культурах микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции с учетом результатов в режиме реального времени. Диагностическая роль набора реагентов заключается в возможности его использования в поддержке диагностики специфической патологии (сибирская язва) при исследовании материала от больного (подозрительного на заболевание) и индикации патогенных биологических агентов (ПБА) в объектах окружающей среды; как ускоренного предварительного теста при выполнении биологического метода исследования и индикации подозрительных культур; для эпидемиологического мониторинга.
Сибирская язва - особо опасное зооантропонозное заболевание, характеризующееся тяжестью течения и высокой летальностью. Уникальная способность В.anthracis длительно сохраняться в окружающей среде вследствие чрезвычайной резистентности спор к воздействию внешних факторов приводит к накоплению в природе естественных резервуаров возбудителя, десятки лет сохраняющих потенциальную опасность для человека и животных. В результате хозяйственной деятельности человека и природных катаклизмов горизонты почв часто оказываются вскрытыми, а содержащиеся в них споры выброшенными на поверхность и рассеянными в окружающей среде. В условиях недостаточности или отсутствия профилактических мероприятий на эндемичной территории сибиреязвенная инфекция может стать причиной массового заболевания людей и сельскохозяйственных животных [Бургасов П.Н., Черкасский Б.Л., Марчук Л.М., Щербак Ю.Ф. Сибирская язва. - М., 1970, - 127 с., Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. - М., 2002 - 384 с., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Буравцева Н.П. Современная ситуация по сибирской язве в России и мире. Основные тенденции и особенности Проблемы особо опасных инфекций. - 2017. - Вып. 1. - С. 65-71]. Ярким примером этому являются события лета 2016 г., когда вследствие эпизоотии сибирской язвы северных оленей за несколько недель был нанесен многомиллионный ущерб оленеводству, заболели люди, умер 12-летний подросток, пало свыше 2500 животных [Попова А.Ю., Демина Ю.В., Ежлова Е.Б., Куличенко А.Н., Рязанова А.Г., Малеев В.В., Плоскирева А.А., Дятлов И.А., Тимофеев И.С., Нечепуренко Л.А., Харьков В.В. Вспышка сибирской язвы в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 году, эпидемиологические особенности Проблемы особо опасных инфекций. - 2016 - Вып. 4. - С. 42-46, Демина, Ю.В., Нечепуренко Л.А., Познахарева С.А., Пашина Я.Е., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Малецкая О.В., Жилченко Е.Б., Харьков В.В., Косарева Л.Э., Эрдни-Горяева Г.В. Организация противоэпидемических мероприятий во время вспышки сибирской язвы в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 г./ Ю.В. Проблемы особо опасных инфекций. - 2017 - Вып. 1. - С. 49-53,]. Более того, в последние годы появилась реальная угроза применения биологических средств на основе возбудителя сибирской язвы со стороны террористических организаций. Как показал опыт ликвидации последствий биотеррористической атаки осенью 2001 года в США, именно В.anthracis в первую очередь представляет интерес для террористов в качестве биологического поражающего агента в связи с его относительной доступностью, исключительной стойкостью и высокой летальностью при легочных формах сибирской язвы, приближающейся к 100% [Сибирская язва: актуальные проблемы разработки и внедрения медицинских средств защиты / Под ред. д-ра мед. наук, профессора, академика РАН Онищенко Г.Г., д-ра мед. наук, профессора Дармова И.В., д-ра мед. наук, профессора, член-корр. РАН Борисевича С. В. 2-е изд., испр. и доп. С.-Посад - 2018 - 592 с.]. Поэтому своевременная и точная специфическая индикация В.anthracis имеет важное значение как в рамках лабораторной диагностики сибирской язвы, так и в ходе выполнения специальных мероприятий, проводимых для подтверждения факта использования возбудителя в качестве средства биотерроризма.
В настоящее время, по показателям чувствительности, специфичности и воспроизводимости наиболее эффективным методом экспресс-индикации В.anthracis является полимеразная цепная реакция (ПЦР) в различных модификациях.
Метод ПЦР позволяет осуществлять индикацию сибиреязвенных микробов по специфическим последовательностям нуклеиновых кислот и наряду с высокой разрешающей способностью исключает различные интерпретации, связанные с фенотипической изменчивостью бактерий. В геноме возбудителя сибирской язвы, помимо хромосомы, присутствуют две плазмиды - pXO1 и рХО2. Плазмидные гены детерминируют синтез основных факторов патогенности сибиреязвенного микроба. Наличие плазмид pXO1 и рХО2 является дифференциально-диагностическим признаком, отличающим В.anthracis от других представителей рода Bacillus. Практически все отечественные и зарубежные ПЦР-системы индикации возбудителя сибирской язвы основаны на выявлении последовательностей плазмидных генов.
+
Специалистами ФКУЗ «РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора разработан и реализован в коммерческом наборе реагентов «Тест-система для выявления ДНК В.anthracis рХО1 методом ПЦР» (ГенСиб) способ идентификации специфических нуклеотидных последовательностей плазмиды токсинообразования возбудителя сибирской язвы [Тучков И.В. Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы // Автореф. дис. канд. мед. наук. - Саратов, 2005. - 19 с.]. Набор содержит праймеры, комплементарные к фрагменту последовательностей гена pagA, расположенного на плазмиде pXO1. Недостатком данной тест-системы является отсутствие возможности идентификации моноплазмидньгх штаммов В.anthracis, содержащих только плазмиду рХО2, а также бесплазмидных вариантов сибиреязвенного микроба. Кроме того, с ее помощью невозможно дифференцировать вакцинные и аттенуированные штаммы от вирулентных.
На отечественном рынке реализуется «Тест-система для идентификации бактерий вида Bacillus anthracis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)», производства ООО «ВЕТБИОХИМ» (г. Москва). Согласно инструкции к тест-системе она предназначена для выявления и идентификации бактерий возбудителя сибирской язвы, содержащих ген капсулообразования (сарВ) и позволяет дифференцировать патогенные бактерии Bacillus anthracis от так называемых «атипичных», которые не вызывают заболевание у животных и человека. При этом визуализация результатов анализа производится методом электрофореза в агарозном геле. Недостатками данного набора реагентов является отсутствие возможности идентификации вакцинных, атоксигенных (лишенных плазмиды pXO1) и бесплазмидных сибиреязвенных изолятов.
Известен коммерческий набор реагентов для выявления ДНК Bacillus anthracis в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени «АмплиСенс Bacillus anthracis-FRT», совместно разработанный специалистами ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, ООО «ИнтерЛабСервис», ФКУЗ «РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора) [Абдрашитова А.С., Саяпина Л.В., Малахаева А.Н., Осина Н.А. Изучение эффективности наборов реагентов для детекции ДНК возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза и холеры методом ПЦР в режиме «реального времени» // Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера (Материалы XI Международной научно-практической конференции). Саратов. - 2012. - С. 13-15]. Использование набора реагентов позволяет выявлять фрагменты генов pagA и сарА, локализованных на плазмидах pXO1 и рХО2, соответственно. Между тем, данный набор не идентифицирует ДНК сибиреязвенных изолятов, лишенных плазмид токсино- и капсулообразования, однако присутствие последних в пробах из объектов окружающей среды может свидетельствовать о наличии в месте отбора проб высоковирулентных штаммов В.anthracis.
Известен комплект реагентов для выявления методом полимеразной цепной реакции в реальном времени ДНК возбудителя сибирской язвы производства ЗАО «НПФ «ДНК-Технология». Данный комплект представлен тест-системой, обеспечивающей «real-time» выявление ДНК В.anthracis по специфичным участкам генов pagA плазмиды pXOl и сарС плазмиды рХО2 в суспензиях микробных культур, а также в образцах клинического материала от экспериментальных животных [Д.Д. Абрамов, А.А. Воробьев, А.В. Кузнецовский, А.В. Савиных, Н.В. Онучина, И.В. Дармов, Д.Ю. Трофимов, С.Л. Кузнецов. Разработка и испытания молекулярно-биологической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - №3. - С. 46-50]. Разработчики тест-системы в ходе испытаний подтвердили высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов анализа с ее использованием. Недостатком данной тест-системы также является отсутствие возможности выявления бесплазмидных штаммов сибиреязвенного микроба.
Коллективом исследователей Ставропольского НИПЧИ Роспотребнадзора описана мультиплексная амплификационная тест-система, включающая праймеры на фрагменты плазмидных генов суа и сарС, а также хромосомного гена sap, кодирующего белок S-слоя [Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Рязанова A.Г., Цыганкова Е.А. Мультиплексная амплификационная тест-система для идентификации и дифференциации Bacillus anthracis II Журн. микробиол. -2005. - №3. - С. 69-74]. Между тем, по данным полногеномных сиквенсов, представленных в базах данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI), нуклеотидные последовательности гена sap у штаммов B. anthracis и отдельных представителей других видов бацилл идентичны [Кутырев В.В., Каштанова Т.Н., Попов Ю.А., Микшис Н.И. Способ дифференциации возбудителя сибирской язвы от других близкородственных видов рода Bacillus на основе определения различий в структуре хромосомных генов. Патент RU 2514663 С2].
В литературе также описан подход к индикации и внутривидовой дифференциации В.anthracis по плазмидному составу, основанные на комплексном использовании праймеров на фрагменты генов pag, суа, lef, локализованных на плазмиде pXO1, гена cap, расположенного на плазмиде рХО2, и хромосомной последовательности Ва813 [Patra G., Sylvestre P., Ramisse V., Therasse J., Guesdon J. Isolation of a specific chromosomic DNA sequence of Bacillus anthracis and its possible use in diagnosis // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 1996. - V. 15. -P. 223-231, Ramisse V., Patra G., Garrigue H., Guesdon J., Mock M. Identification and characterization of Bacillus anthracis bymultiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXOl and pXO2 and chromosomal DNA // FEMS Microbiol. Letters. - 1996. - V. 145. - Р. 9-16]. Однако в последующем уникальность маркера Ва813 в отношении сибиреявенного микроба была опровергнута ввиду обнаружения отдельных изолятов B.cereus и B.thuringiensis, содержащих нуклеотидную последовательность, идентичную Ва813 сибиреязвенного микроба [Patra G., Vaissaire J., Weber-Levy M., Le Doujet С, Mock M. Molecular characterization of Bacillus strains involved in outbreaks of anthrax in France in 1997 // J. Clin. Microbiol. - 1998. - V. 36. - Р. 3412-3414].
Qi Y. et al., сравнивая хромосомные последовательности штаммов бацилл, обнаружили у сибиреязвенного микроба синонимичную замену одного нуклеотида в гене rpoB, кодирующем β-субъединицу РНК полимеразы [Qi Y., Patra G., Liang X., Williams L., Rose S., Redkar R., DelVecchio V. Utilization of the rpoB gene as a specific chromosomal marker for real-time PCR detection of Bacillus anthracis II Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - V. 67(8). - Р. 3720-3727]. Исследователи экспериментально подтвердили возможность использования данного маркера для дифференциации В.anthracis от других филогенетически близких видов бацилл. Однако в последующем при тестировании 319 бациллярных штаммов был выявлен штамм B.cereus с последовательностью гена rpoB, идентичной аналогичной последовательности у сибиреязвенного микроба [Zasada A., Gierczynski R., Raddadi N., Daffonchio D., Jagielski M. Some Bacillus thuringiensis strains share rpoB nucleotide polymorphisms also present in Bacillus anthracis II J. Clin. Microbiol. - 2006. - V. 44. - Р. 1606-1607].
Agaisse H. et al. в процессе сравнительного анализа секвенированных геномов В.anthracis и B.cereus выявили полиморфизм единичного нуклеотида в хромосомном гене плейотропного регулятора plcR [Agaisse Н., Gominet М., Okstad О.,  Lereclus D. PlcR is a pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis // Mol Microbiol. - 1999. -V. 32. - P. 1043-1053]. Транскрипционный регулятор PlcR ответственен за различные функции клетки, имеющие отношение к патогенности микроорганизма и выживанию в условиях внешней среды. Нонсенс мутация в гене plcR относится к каноническим SNP (single nucleotide polymorphism) и используется при идентификации штаммов В. anthracis различного происхождения [Easterday R., Van Ert М., Simonson Т., Wagner D., Kenefic L., Allender C, Keim P. Use of single nucleotide polymorphisms in the plcR gene for specific identification of Bacillus anthracis II J. Clin. Microbiol. - 2005. - V. 43 (4). - P. 1995-1997].
Hurtle W. et al. выявили единичную синонимичную нуклеотидную замену у В. anthracis в хромосомном гене gyrA, позволяющую отличать сибиреязвенные бациллы от других представителей рода Bacillus [Hurtle W., Bode E., Kulesh D., Kaplan R., Garrison J., Bridge D., House M., Frye M., Loveless В., Norwood D. Detection of the Bacillus anthracis gyrA gene by using a minor groove binder probe. J.Clin. Microbiol. - 2004. - V. 42. - Р. 179-185]. На основе полиморфизма гена gyrA был создан зонд с флуоресцентной меткой. Между тем, в отношении использования единичных нуклеотидных замен для индикации В. anthracis ряд ученых настроен достаточно скептически ввиду возможных обратных реверсий.
Irenge L. et al. была предложена двухэтапная ПЦР в реальном времени для поддержки диагноза сибиреязвенной инфекции [Irenge L., Durant J., Tomaso H., Pilo P. Olsen J., Ramisse V., Mahillon J., Gala J. Development and validation of a real-time quantitative PCR assay for rapid identification of Bacillus anthracis in environmental samples // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - V. 88. - P. 1179-1192]. Ha первом этапе проводится скрининг В.anthracis с помощью плазмидных генов сибиреязвенного микроба, на втором этапе - более специфичное исследование с использованием хромосомных последовательностей генов purA и ptsI. Однако диагностическое исследование, осуществляемое в два этапа, более продолжительно по времени и менее экономично.
Для быстрой идентификации Bacillus anthracis и других представителей группы Bacillus cereus K.Kim et al. предложен способ мультиплексного анализа по кривым плавления в режиме реального времени [Kijeong Kim, Juwon Seo, Katherinr Wheeler, Chulmin Park, Daewhan Kim, Seungjoon Park, Wonyong Kim, Sang-In Chung, Terrance Leighton. Rapid genotypic detection of Bacillus anthracis and the Bacillus cereus group by multiplex real-time PCR melting curve analysis // J. Clin. Microbiol. - 2005. - V. 43 (4). - P. 1995-1997]. Исследователи с использованием праймеров к последовательностям генов ssp, lef и сарС подобрали оптимальные условия ПЦР-анализа в присутствии красителя SYBR, обеспечивающие в режиме реального времени по различиям в температурах плавления соответствующих амплификатов эффективное выявление Bacillus anthracis с дифференциацией от других представителей группы Bacillus cereus. Эффективность данного способа подтверждается экспериментальными данными по идентификации 11 штаммов возбудителя сибирской язвы и 18 штаммов близкородственных бацилл. Не смотря на то, что авторы в своем исследовании предлагают использовать способ для анализа экологических и клинических изолятов, практическое его использование ограничено, так как для исследования требуется высоко очищенная ДНК.
В Российской Федерации в настоящее время выпускается несколько коммерческих наборов реагентов для выявления методом ПЦР ДНК разных производителей. Мишенями для амплификации ДНК с использованием реагентов из состава данных наборов служат специфические фрагменты протективного антигена (pag) и/или одного из структурных генов цистрона капсулообразования (сарАВС) сибиреязвенного микроба. Однако ни один из предлагаемых наборов не содержит олигонуклеотиды для амплификации специфичных для В.anthracis последовательностей ДНК хромосомной локализации.
Из числа запатентованных диагностических средств для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы, основанных на методе ПЦР, в открытых источниках описаны несколько наборов, в составе которых присутствуют специфические праймеры и зонды для детекции плазмидных генов pag, суа, lef, сарА, сарВ и сарС: WO 2004/070001 А2 «Assay And Compositions For Detection Of Bacillus Anthracis Nucleic Acid», WO 2005/094219 A2 «Unique Chromosomal Sequence Of Bacillus Anthracis And Methods Of Making And Using Thereof Including Real-time Pcr Assays», US 6472155 B1 «Species specific identification of spore-producing microbes using the gene sequence of small acid-soluble spore coat proteins for amplification based diagnostics», US 6878519 B1 «DNA probes for specific genes of anthrax», US 6811984 B1 «Nucleotide sequences for detection of Bacillus anthracis», US 7960106 B2 «Diagnostic method and products useful therein».
Также известен набор реагентов US 2012/0123108 A1 «Bcl Gene Primers For Detection And Fingerprinting Of Bacillus Anthracis)), имеющий в своем составе праймеры для амплификации консервативных областей аллелей гена bclB, кодирующих коллагеноподобные белки, синтезируемые сибиреязвенным микробом, в отличие от других близкородственных видов бацилл.
В Российской Федерации известен патент «Набор реагентов и способ для выявления ДНК возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов» (RU 2542395 С1), позволяющий позволяет быстро и высокоспецифично выявлять штаммы видов Y.pestis, В.anthracis и F.tularensis, независимо от их плазмидного профиля. В качестве мишени для выявления штаммов сибиреязвенного микроба используется участок гена ssp. Хромосомный ген ssp присутствует у всех спорообразующих видов бацилл, однако последовательность его имеет различия, достаточные для дифференциации сибиреязвенного микроба от представителей близкородственных видов группы B.cereus [Kim K, Seo J, Wheeler K, Park С,Kim D, Park S, Kim W, Chung SI, Leighton T:Rapid genotypic detection of Bacillus anthracis and the Bacillus cereus group bymultiplex real-time PCR melting curve analysis. FEMS Immunology and Medical Microbiology 2005, 43(2):301-310]. Продукт амплификации данного участка гена для В.anthracis имеет размер 102 п.н.
Также известен патент RU 2514663 С2 «Способ дифференциации возбудителя сибирской язвы от других близкородственных видов рода Bacillus на основе определения различий в структуре хромосомных генов». В качестве мишеней авторы используют участки генов fliC и hom2, имеющие хромосомную локализацию.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является RU 2542395 С1 «Набор реагентов и способ для выявления ДНК возбудителей чумы, сибирской язвы и туляремии методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов». Общим с данным подходом является использование хромосомного маркера ssp для идентификации сибиреязвенного микроба. Признаками, отличающими предлагаемое изобретение от данного аналога, является возможность идентификации и дифференциации моно- и биплазмидных вариантов сибиреязвенного микроба за счет использования в качестве генов-мишеней возбудителя сибирской язвы фрагментов нуклеотидных последовательностей детерминант патогенности lef и capA, кодирующих факторы патогенности сибиреязвенного микроба и локализованных на плазмидах pXO1 и pXO2, соответственно. Кроме того в состав набора включен положительный контрольный образец, содержащий в отличие от RU 2542395 С1 не ДНК Bacillus anthracis, а смесь четырех рекомбинантных плазмид pGem-T, три из которых в своем составе несут встроенные нуклеотидные специфические последовательности генов ssp, lef и сарА сибиреязвенного микроба, а четвертая - специфический фрагмент контрольной ДНК.
Задачей предполагаемого изобретения является разработка набора реагентов для выявления и идентификации методом полимеразной цепной реакции в реальном времени ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале, продовольственном сырье и продуктах животного происхождения, объектах окружающей среды, а также культурах микроорганизмов.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в повышении эффективности лабораторной диагностики сибирской язвы, за счет возможности использования набора реагентов в поддержке диагностики соответствующей патологии при исследовании материала от больного (подозрительного на заболевание), а также мероприятий специфической индикации, в связи с возможностью его использования как для обнаружения В.anthracis в объектах окружающей среды, так и в качестве ускоренного предварительного теста при выполнении биологического метода исследования (идентификации) подозрительных микробных культур.
Указанный технический результат достигается за счет включения в состав набора реагентов лиофилизированных олигонуклеотидных праймеров и специфических флуоресцентно-меченых зондов, позволяющих в реакции амплификации в режиме реального времени достоверно выявлять специфические нуклеотидные последовательности В.anthracis, и имеющих представленную ниже (и в приложении к заявке) структуру нуклеотидных последовательностей:
для индикации хромосомного маркера ssp:
SEQ ID NO 1 (прямой праймер ssp_up): agcaaacgcacaatcagaag;
SEQ ID NO 2 (обратный праймер ssp_low): acgtctgtttcagttgcaaattctgtacc;
SEQ ID NO 3 (флуоресцентно-меченый зонд ssp_Pr_up_R6G):
(R6G)-ctggtgctagcattcaaagcacaaatgct-(BH2);
для индикации маркера cap А плазмиды pXO2:
SEQ ID NO 4 (прямой праймер pXO2_up): tttcaccagcacccacatagtca;
SEQ ID NO 5 (обратный праймер pXO2_low): cagtaaaagaagccggatttaca;
SEQ ID NO 6 (флуоресцентно-меченый зонд pXO2_ROX):
(ROX)-tggcgaataaccatatga(C-LNA)ggattatg-(BHQ2);
для индикации маркера lef плазмиды pXO1:
SEQ ID NO 7 (прямой праймер Ba_up): ttactttgagtggtcccgtcttt;
SEQ ID NO 8 (обратный праймер Ba_low): tgctcttcctgtgttttatttcg;
SEQ ID NO 9 (флуоресцентно-меченый зонд Ba_Pr_up_FAM):
(FAM)-cgggcggtcatggtgatgtaggtatg-(RTQ1);
для внутреннего положительного контроля:
SEQ ID NO 10 (прямой праймер IPC_up4): agaactcgtagcgctagctgtag;
SEQ ID NO 11 (обратный праймер IPC_low2): cgtagaactagctgtagcgct;
SEQ ID NO 12 (флуоресцентный зонд IPC_up_Cy5):
(Cy5)-agcggctcctacttctgcagggg-(BHQ2).
Примечание - BH2, BHQ2, RTQ1 - присоединенные к 5'-концевому нуклео-тиду темновые гасители флуоресценции; FAM, R6G, ROX, Су5 флуоресцентные красители, присоединенные к 3'-концевому нуклеотиду, соответствующего флуоресцентно-меченного зонда; C-LNA - модифицированный нуклеотид.
Характеристика праймеров и нуклеотидных последовательностей ампли-фицируемой ДНК.
2+
Предлагаемые к патентованию в составе набора реагентов олигонуклео-тидные праймеры фланкируют уникальные участки хромосомной и плазмидной ДНК сибиреязвенного микроба. Праймеры для индикации хромосомного маркера комплементарны к фрагменту гена ssp, кодирующего кислоторастворимый споровый белок (фрагмент в 102 п.н. хромосомного гена ssp); праймеры к гену летального фактора (lef), кодирующему Zn-зависимую металлопротеазу, фланкируют участок на плазмиде pXO1 в 145 п.н.; праймеры к гену сарА, кодирующему один из пептидов, участвующих в синтезе γ-поли-D-глутаминовой капсулы В.anthracis, комплементарны уникальной нуклеотидной последовательности на плазмиде pXO2 в 132 п.н. Использование в комплекте с праймерами соответствующих флуоресцентно-меченных ДНК-зондов позволяет производить детекцию продуктов амплификации в режиме реального времени.
Кроме того, в состав набора реагентов включены: разбавитель, положительный контрольный образец, отрицательный контрольный образец, внутренний положительный контроль выделения.
Состав заявляемого набора реагентов приведен в таблице 1.
Реакционная смесь в стрипованных микропробирках (лиофилизованная), РС-СЯ, расфасована в сорок восемь микропробирок (шесть стрипов) объемом 0,2 мл и упакована в непрозрачный полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 9x12 см. Состав реакционной смеси: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов, восемь олигонукледотидных праймеров, четыре флуресцентно-меченых зонда, фермент Taq ДНК-полимераза, синтетическая ДНК внутреннего положительного контроля (ВПК), трегалоза.
Разбавитель, РБ, расфасован пробирку из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: ПЦР-буфер, хлорид магния, глицерол, вода для ПЦР.
Положительный контрольный образец (лиофилизованный), ПКО-СЯ, расфасован в три пробирки из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчивающимися крышками, упакованных в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 6x7 см, состав: смесь четырех рекомбинантных плазмид pGem-T, три из которых содержат встроенные специфические последовательности ДНК возбудителя сибирской язвы: фрагмент хромосомного локуса ssp или фрагмент гена lef или фрагмент гена сарА сибиреязвенного микроба, а четвертая - специфический фрагмент контрольной ДНК.
Раствор для разбавления ПКО, ОКО, расфасован в пробирку из полипропилена объемом 1,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4x7 см, состав: ТЕ буфер.
Внутренний положительный контроль выделения, ВПК-В (лиофилизованный), расфасован в пробирку из полипропилена объемом 0,5 мл с завинчивающейся крышкой, упакованную в полиэтиленовый пакет Zip-Lock размером 4×7 см, состав: рекомбинантная плазмида pGem-T со встроенным специфическим фрагментом ДНК.
Методика получения положительных контрольных образцов.
Положительный контрольный образец был получен методом клонирования. Компетентные клетки E.coli линии ТОР 10 (Invitrogen, США) были трансформированы рекомбинантными плазмидами pGem-T (Invitrogen, США), несущими встроенные фрагменты генов lef (плазмида pXO1), capA (плазмида pXO2), ssp (специфический хромосомный локус).
Конструирование внутреннего контрольного образца.
Внутренний контрольный образец был получен методом клонирования. Компетентные клетки E.coli линии ТОР 10 (Invitrogen, США) были трансформированы рекомбинантной плазмидой pGem-T со специфическим фрагментом контрольной ДНК.
Апробация набора реагентов.
Апробация набора реагентов была осуществлена на базе филиала ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России (г.Киров) с использованием водных суспензий агаровых культур штаммов возбудителя сибирской язвы из Государственной коллекции микроорганизмов I-II групп патогенности. Постановку ПЦР-РВ проводили в соответствии с разработанной инструкцией по применению набора реагентов на приборе АНК-32М производства ИАП РАН (г.Санкт-Петербург, Россия).
Использование бактериальных культур коллекционных штаммов В.anthracis в экспериментах по подтверждению основных характеристик по назначению набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» обосновано тем, что провести испытание с участием человека невозможно, поскольку популяция заболевших сибиреязвенной инфекцией недостаточна.
Инактивация материала.
Обеззараживание материала проводили согласно методическим указаниям по организации работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности (МУ 1.3.2569-09). Выделение ДНК.
Для выделения ДНК из инактивированных бактериальных суспензий использовали набор для выделения ДНК «М-Сорб» (ООО «Синтол», Россия). Полученные препараты ДНК использовали для проведения анализа.
Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Количество микропробирок в каждом эксперименте рассчитывали исходя из числа исследуемых образцов с учетом трех дополнительных микропробирок под контроли (отрицательного и положительного контрольных образцов, ОКО и ПКО, соответственно, а также отрицательного контроля выделения, ОКО-В).
К каждой реакционной смеси из состава набора реагентов добавляли 15 мкл разбавителя (10×ПЦР-буфер; хлорид магния, 25 мМ; глицерол, 50%; азид натрия 0,01%; вода для ПЦР). После чего в микропробирки для исследуемых образцов вносили по 20 мкл соответствующего исследуемого образца, а в контрольные микропробирки вносили по 20 мкл ОКО, ПКО и ОКО-В.
Постановку ПЦР осуществляли с использованием амплификатора АНК-32М в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора. Оптимальный температурно-временной режим проведения ПЦР с учетом термодинамических характеристик праймеров и ДНК-зондов из состава набора реагентов для АНК-32М представлен в таблице 2.
макс.
возб.
макс.эм.
Детекцию интенсивности флуоресценции проводили по каналам, соответствующим красителям FAM, R6G, ROX, Су5 (либо их спектральным аналогам) со следующими характеристиками - λ./λ (№1 - 490 нм /520 нм, №2 - 525 нм /550 нм, №3 - 550 нм /580 нм, №4 - 630 нм /665 нм). Результаты оценивали по наличию (отсутствию) флуоресценции.
Оценка полученных результатов.
Интерпретацию результатов проводили согласно таблице 3.
Изображение иллюстрируется следующими графическими материалами (табл. 1-5, фиг. 1-20) и примерами (1-3).
Таблица 1 - Состав набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ»;
Таблица 2 - Температурно-временной режим амплификации;
Таблица 3 - Интерпретация результатов анализа с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ»;
Таблица 4 - Результаты оценки аналитической специфичности набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» с использованием коллекционных тест-штаммов микроорганизмов;
Таблица 5 - Результаты оценки воспроизводимости результатов анализа с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ»;
4
-3
Фигура 1. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналам флуоресценции FAM, R6G, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препаратов ДНК, выделенных из бактериальной суспензии тест-штамма 4-7 В.anthracis в концентрации 1⋅10 КОЕ⋅см.
3
-3
Фигура 2. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналам флуоресценции FAM, R6G, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препаратов ДНК, выделенных из бактериальной суспензии тест-штамма 4-7 В.anthracis в концентрации 1⋅10 КОЕ⋅см.
2
-3
Фигура 3. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналам флуоресценции FAM, R6G, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препаратов ДНК, выделенных из бактериальной суспензии тест-штамма 4-7 В.anthracis в концентрации 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 4. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии тест-штамма Ч-7 В.anthracis с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 5. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии тест-штамма 81/1 В. anthracis с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 6. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии тест-штамма Второй вакцины Ценковского В.anthracis с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 7. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии тест-штамма СТИ-1 В. anthracis с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 8. Кинетические кривые ПНР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма В. thuringiensis var. Pasteur с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 9. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма В. thuringiensis var. finitimus с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 10. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма 2 B.megaterium с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 11. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма 36 B.subtilis с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 12. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма 8 B.cereus с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 13. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма 96 B.cereus с концентрацией 1⋅10 КОЕ⋅см.
5
-3
Фигура 14. Кинетические кривые ПНР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма 231 Y.pestis с концентрацией 1⋅10 м.к.⋅см.
5
-3
Фигура 15. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма 5584 В.mallei с концентрацией 1⋅10 м.к.⋅см.
5
-3
Фигура 16. Кинетические кривые ПНР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма Dalat B.pseudomallei с концентрацией 1⋅10 м.к.⋅см.
5
-3
Фигура 17. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма 680 V.cholerae с концентрацией 1⋅10 м.к.⋅см.
5
-3
Фигура 18. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма 19 ВА В.abortus с концентрацией 1⋅10 м.к.⋅см.
5
-3
Фигура 19. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма Rev-1 B.melitensis с концентрацией 1⋅10 м.к.⋅см.
5
-3
Фигура 20. Кинетические кривые ПЦР в реальном времени по каналу флуоресценции R6G, FAM, ROX, Су5 с использованием набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» и препарата ДНК, выделенного из бактериальной суспензии штамма 803 E.coli с концентрацией 1⋅10 м.к.⋅см.
Пример 1
+
+
4
3
2
-3
В эксперименте по оценке аналитической чувствительности (предела обнаружения) набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» были исследованы препараты ДНК, выделенные из водных суспензий агаровой культуры тест-штамма В.anthracis Ч-7 (pXO1, pXO2) в концентрации 1⋅10, 1⋅10, 5 10 КОЕ⋅см. В ПЦР анализировали аликвоты объемом 20 мкл из каждого разведения. Результаты эксперимента представлены на фиг. 1-3.
2
-3
В результате проведенной оценки установлено, что аналитическая чувствительность набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» составляет 10 КОЕ⋅см.
Пример 2
5
-3
Для экспериментального исследования аналитической специфичности набора реагентов использовали препараты ДНК, выделенные из водных суспензий агаровых культур штаммов В.anthracis, а также близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов в концентрации 10 КОЕ см.
Критерием специфичности служило наличие флуоресцентного сигнала по каналам FAM, R6G и ROX при анализе препаратов ДНК Bacillus anthracis и отсутствие сигнала по данным каналам при анализе ДНК близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов.
Результат считали истинно положительным в случае обнаружения аналита во всех трех пробирках с ДНК Bacillus anthracis по каналам FAM, R6G и ROX.
Результат считали ложноотрицательным в случае отсутствия обнаружения аналита в любой из трех пробирок с ДНК Bacillus anthracis по каналам FAM, R6G и ROX.
Результат считали истинно отрицательным в случае отсутствия обнаружения аналита во всех трех пробирках с ДНК близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов по каналам FAM, R6G и ROX.
Результат считали ложноположительным в случае обнаружения аналита в любой из трех пробирок с ДНК близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов по каналам FAM, R6G и ROX.
Критерий, согласно которому набор реагентов считали выдержавшим испытания на аналитическую специфичность: истинно положительный результат в отношении ДНК Bacillus anthracis при истинно отрицательном результате в отношении всех остальных аналитов.
Кинетические кривые ПЦР в реальном времени, полученные в ходе экспериментального исследования аналитической специфичности набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» представлены на фиг. 4-20, значения порогового цикла по каждому каналу флуоресценции обобщены в таблице 4. Полученные результаты свидетельствуют, что испытываемый набор реагентов обладает видовой специфичностью в отношении возбудителя сибирской язвы. Аналиты похожей структуры не выявляются.
Пример 3
3
3
Оценку воспроизводимости результатов ПЦР-РВ с использованием исследуемого набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» проводили с препаратами ДНК штаммов Ч-7, 81/1, 71/12 В.anthracis, содержащих 1⋅10 специфических фрагментов ДНК в см (20 копий на реакционный объем).
Расчет воспроизводимости результата
ПЦР-РВ производили на основании анализа 100 проб. Результаты оценки воспроизводимости набора реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» представлены в таблице 5.
Данные, представленные в таблице 5, свидетельствуют, что набор реагентов «ОМ-Скрин-Сибирская язва-РВ» позволяет надежно выявлять ДНК В.anthracis с воспроизводимостью не менее 98%.
Таким образом, из вышеизложенного следует, что достигнут заявляемый технический результат, а именно: разработан набор реагентов, включающий олигонуклеотидные праймеры и флюоресцентно-меченые ДНК-зонды, позволяющий достоверно выявлять специфические нуклеотидные последовательности штаммов возбудителя сибирской язвы в образцах различного происхождения методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Borisevich, C.V.
<120> НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ «ОМ-СКРИН-СИБИРСКАЯ ЯЗВА-РВ»
<140> 2019145239/20(087272)
<141> 25.12.2019
<160> 12
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
ssp Bacillus anthracis.
<223> Synthetic oligonucleotide (Forward Primer) for RT-PCR detection of the chromosomal marker
<400> 1
agcaaacgca caatcagaag 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
ssp Bacillus anthracis.
<223> Synthetic oligonucleotide (Reverse Primer) for RT-PCR detection of the chromosomal marker
<400> 2
acgtctgttt cagttgcaaa ttctgtacc 29
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> 1 – (R6G)-c, 29 – t-(BH2)
ssp Bacillus anthracis.
<223> Synthetic oligonucleotide (Probe) for RT-PCR detection of the chromosomal marker
<400> 3
ntggtgctag cattcaaagc acaaatgcn 29
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
capA Bacillus anthracis.
<223> Synthetic oligonucleotide (Forward Primer) for RT-PCR detection of the gene
<400> 4
tttcaccagc acccacatag tca 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
capA Bacillus anthracis.
<223> Synthetic oligonucleotide (Reverse Primer) for RT-PCR detection of the gene
<400> 5
cagtaaaaga agccggattt aca 23
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> 1 – (ROX)-t, 19 – (c-LNA), 27 – g-(BHQ2)
capA Bacillus anthracis.
<223> Synthetic oligonucleotide (Probe) for RT-PCR detection of the gene
<400> 6
nggcgaataa ccatatgang gattatn 27
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
lef Bacillus anthracis.
<223> Synthetic oligonucleotide (Forward Primer) for RT-PCR detection of the gene
<400> 7
ttactttgag tggtcccgtc ttt 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
lef Bacillus anthracis.
<223> Synthetic oligonucleotide (Reverse Primer) for RT-PCR detection of the gene
<400> 8
tgctcttcct gtgttttatt tcg 23
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> 1 – (FAM)-c, 26 – g-(RTQ1)
lef Bacillus anthracis.
<223> Synthetic oligonucleotide (Probe) for RT-PCR detection of the gene
<400> 9
ngggcggtca tggtgatgta ggtatn 26
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide (Forward Primer) for internal control in a multiplex RT-PCR.
<400> 10
agaactcgta gcgctagctg tag 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide (Reverse Primer) for internal control in a multiplex RT-PCR.
<400> 11
cgtagaacta gctgtagcgc t 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> primer_bind
<222> 1 – (Cy5)-a, 23 – g-(BHQ2)
<223> Synthetic oligonucleotide (Probe) for internal control in a multiplex RT-PCR.
<400> 12
ngcggctcct acttctgcag ggn 23
<---
Примечание – BH2, BHQ2, RTQ1 – присоединенные к 5'-концевому нуклеотиду темновые гасители флуоресценции; FAM, R6G, ROX, Cy5 флуоресцентные красители, присоединенные к 3'-концевому нуклеотиду, соответствующего флуоресцентно-меченного зонда; C-LNA – модифицированный нуклеотид.