Способность стафилококков различных видов к образованию биопленок и их воздействие на клетки человека

14. Kim Y.J., Kim J.H., Hur J., Lee J.H. Isolation of Escherichia coli from piglets in South Korea with diarrhea and characteristics of the virulence genes. Can. J. Vet. Res. 2010; 74 (1): 59-64.

Received 16.04.15

MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS OF MICROORGANISMS WITH INTRAEPITHELIAL INVASION ISOLATED FROM PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER

1 Nguyen N. T., 12Vafin R. R, 'Rzhanova I. V., 'Kolpakov A. I, 34 Gataullin I. G, 5Tyulkin S. V.,1 Sinyagina M. N., 'Grigoryeva T. V., 'Ilinskaya O. N.

1 Kazan (Volga region) Federal University, Ministry of Education

and Science of the Russian Federation, Kazan, Russia; 2 Tatar Research Institute of Agriculture, Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia; 3Tatarstan Regional Clinical Cancer Center, Ministry of Health of the Republic of Tatarstan, Kazan, Russia; 4 Kazan State Medical Academy, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Kazan, Russia; 5 Tatar Trans-regional Veterinarian Laboratory, Federal Service for Veterinary and Phytosanitary Surveillance (Rosselkhoznadzor), Kazan, Russia

The facultative aerobic bacteria isolated from the mucosa of rectum in patients with colorectal cancer in the zone of malignant tumor and neighboring normal mucosa was studied using molecular-genetic methods. The species attribution of bacteria was implemented using the cultural-morphological analysis and sequencing of the 16S rRNA locus. The microorganisms with the intraepithelial invasion to rectal mucosa isolated were identified as representatives of the adherent-invasive (AIEC) subgroup of Escherichia coli and species Klebsiella pneumonia. The molecular analysis by genetic determinants controlling adhesive, hemolytic, and toxigenic activity revealed that some bacterial isolates were able to produce toxins with potential can-cerogenic activity (e.g., colibactin and cytotoxic necrotic factor I). Certain bacterial species isolated from malignant and normal rectum epithelium of the same patient demonstrated no difference between analyzed factors of toxigenicity.

Key words: colorectal cancer, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, colibactin, cytotoxic necrotic factor I, identification, PCR, sequencing.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-13-18

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.861.2:579.22].083.1

Корниенко М.А.1, Копыльцов В.Н.1, Шевлягина Н.В.2, Диденко Л.В.2, Любасовская Л.А.

Припутневич Т.В.3, Ильина Е.Н.1

способность стафилококков различных видов к образованию

биопленок и их воздействие на клетки человека

'ФГБУН «НИИ физико-химической медицины» ФМБА России, Москва, 119435, Малая Пироговская, 1а; 2ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, 123098, Россия, Москва, ул. Гамалеи, д. 18; 3ФГУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава РФ, 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4

Актуальность изучения стафилококков обусловлена тем, что они вызывают тяжелые инфекционные заболевания: инфекции мягких тканей, эндокардит, сепсис, синдром токсического шока и пищевые отравления. Коагулазоположительный Staphylococcus aureus является основным возбудителем госпитальных инфекций. Он обладает большим количеством факторов патогенности, которые хорошо изучены. Среди коагулазо-отрицательных стафилококков (КОС) клиническое значение имеют S. haemolyticus и S. epidermidis, приводящие к инфекционным процессам у пациентов с ослабленной иммунной системой. Механизмы патогенности КОС изучены недостаточно.

Целью данной работы являлась оценка потенциальной патогенности клинических штаммов КОС по способности к образованию биопленок и характеру взаимодействия с клетками человека, на примере культуры НТ-29. В исследование включены: лабораторный штамм S. aureus АТСС 29213, и клинические штаммы S. haemolyticus SH39, S. epidermidis SE36-1, выделенные из аутопсийного материала новорожденных детей. В данной работе была проведена визуальная оценка образования биопленки каждым штаммом и проанализировано их воздействие на клеточную линию НТ-29. Оба вида КОС образовывали биопленки быстрее, чем S. aureus. При инкубации клеток НТ-29 с изучаемыми штаммами стафилококков через 2 ч наблюдали адгезию бактерий на поверхности клеток. Наиболее ярко выраженно адгезия проявлялась у S. aureus АТСС 29213 и S. haemolyticus SH39. Через 3 ч инкубации под воздействием S. aureus АТСС 29213 и S. haemolyticus SH39 происходила деструкция монослоя клеток НТ-29. Через 24 ч инкубации все три изучаемых штамма вызывали деструкцию монослоя клеток НТ-29. Максимальный токсический эффект на клетки НТ-29 оказывал штамм S. haemolyticus SH39. Совокупные данные свидетельствует о наличии у штамма S. haemolyticus SH39 факторов патогенности, молекулярная природа которых требует дальнейшего исследования.

Ключевые слова: Staphylococcus; биопленки; сканирующая электронная микроскопия; НТ-29.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-18-25

Введение

Стафилококки различных видов могут вызывать такие инфекционные процессы как поражение мягких тканей, эндокардит, остеомиелит, сепсис, пневмонию, синдром токсического шока и пищевые отравления [1, 2], что обусловливает важность их исследования. Общий показатель смертности от бактериемии, вызванной стафилококками, колеблется от 11 до 43% [3]. Среди представителей рода Staphylococcus коагулазоположительный Staphylococcus aureus является основным возбудителем инфекций. Эти бактерии обладают широким набором различных факторов вирулентности и патоген-ности, которые обеспечивают их адгезию и инвазию, формирование биопленок, продукцию токсинов, и способствуют подавлению иммунного ответа человека [4]. Частота послеоперационных осложнений, вызванных метициллин-устойчивыми S. aureus, достигает 33% [5]. Среди коагулазо-отрицательных стафилококков (КОС) клиническое значение имеют виды Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus haemolyticus, приводящие к инфекционным процессам у пациентов с ослабленной иммунной системой [6]. КОС выявляют у 30% пациентов хирургических стационаров, их обнаружение часто ассоциировано с длительным использованием катетеров [7, 8]. Наиболее подвержены КОС инфекциям новорожденные дети [8-12]. Однако по сравнению с S. ciureus о факторах вирулентности и патогенности КОС известно существенно меньше [13]. В этой связи целью настоящего исследования являлась оценка потенциальной вирулентности и патогенности клинических штаммов КОС, изолированных из аутопсийного материала новорожденных детей.

3

Материал и методы

Бактериальные штаммы. В исследование включены 3 штамма стафилококков: лабораторный штамм S. aureus АТСС 29213, полученный из американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, АТСС), клинические штаммы S. epidermidis SE36-1 и S. haemolyticus SH39, изолированные из аутопсийного материала новорожденных детей. Культивирование стафилококков проводили в триптон-соевом бульоне (Triptic soy Broth, Becton, Dickinson and Company) при 37°С в аэробных условиях. Для построения кривых роста в 7 мл триптон-соевого бульона вносили инокулят исследуемого бактериального штамма до конечной плотности суспензии 0,5 МР [14]. В качестве инокулята использовали ночную культуру. Последующие замеры оптической плотности (OD540) проводили на плашечном денситометре Multiskan Ascent (Thermo Electron corporation, Финляндия). Тестирование осуществляли в трех биологических повторах.

Культура клеток человека. Для модельных экспериментов использовали перевиваемую клеточную линию рака толстой кишки человека HT-29 (аденокарцинома человека), полученную из коллекции АТСС. Клетки выращивали в 1 мл среды в культу-ральных планшетах на 24 лунки (Greiner bio-one Ltd.). В каждую лунку предварительно помещали покровные стекла размером 0,5 х 0,5 см. Культивирование проводили в питательной среде DMEM (Gibco) c 10% сывороткой (Fetal Bovine Serum, Gibco) в 5% CO2 при 37оС до образования монослоя (24 ч).

Приготовление образцов для электронной микроскопии

Для изучения образования биопленок стафилококки культивировали в 1 мл триптон-соевого бульона в культуральных планшетах на 24 лунки (Greiner bio-one Ltd.), содержащих в каждой лунке покровные стекла размером 0,5 x 0,5 см. Инокулят вносили до конечной плотности бактериальной суспензии 0,5 MF. Инкубацию проводили при 37°С в аэробных условиях в течение 24 и 48 ч, после чего покровные стекла промывали двукратно стерильным раствором 0,9% NaCl и извлекали из планшета. Образцы фиксировали 10% раствором нейтрального формалина.

Визуальное наблюдение взаимодействия стафилококков и клеток НТ-29 осуществляли при их совместном культивировании. Клетки HT-29 выращивали в культуральном плашете с покровными стеклами, как описано выше, в течение 24 ч до образования монослоя. К выращенному на стеклах пласту клеток HT-29 в 1 мл среды культивирования добавляли 1 мл клеточной суспензии одного из следующих штаммов: S. aureus АТСС 29213, S. epidermidis SE36-1, S. haemolyticus SH39 (мутность суспензии 0,5 MF) в триптон-соевом бульоне. Препараты инкубировали в течение 1, 2, 3, 24 и 48 ч при 37°С и 5% СО2, после чего проводили фиксацию образца на покровных стеклах описанным выше способом.

Клетки HT-29, инкубированные с 1 мл триптон-соевого бульона, служили контролем.

Сканирующая электронная микроскопия

Фиксированные образцы монтировали на алюминиевые столики с помощью угольного скотча. Для создания электронопро-водящего слоя на поверхности образцов проводили напыление золотом толщиной 5 нм с помощью напылительной установки SPI-MODULE Sputter Coater (SPI Supplies, USA). Исследование проводили в двулучевом сканирующем ионно-электронном микроскопе Quanta 200 3D (FEI Company, USA) в режиме высокого вакуума при ускоряющем напряжении 10 кВ в диапазоне рабочего увеличения объектов от x 300 до x 30 000.

Генетическая характеристика факторов вирулентности и патогенности стафилококков. Для определения наличия генов токсинов (sea, seb, sed, see, sei, sej, seg, seh, hla, hlgA/hlgB/hlgC) и образования биопленок (clfA, clfB, fnbA, fnbB, icaA, icaB, icaC, icaD) использовали метод амплификации соответствующих генов посредством полимеразной цепной реакции [12].

Определение активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) Токсичность воздействия стафилококков на клетки НТ-29 оценивали по изменению активности ЛДГ. Ночную культуру бактериального штамма центрифугировали 10 мин при 1000g. На-досадок фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,20 мкм (Minisart, Sartorius stedim). Осадок двукратно отмывали в среде DMEM и получали суспензию бактериальных клеток в DMEM с оптической плотностью 0,5 при 540 нм (плотность суспензии

2 MF). К монослою клеток НТ-29 в питательной среде DMEM (1 мл) добавляли бактериальную суспензию (1 мл), либо супер-натант (1 мл). В качестве контроля вместо суспензии бактериальных клеток и супернатанта вносили либо 1 мл среды DMEM (первый контроль), либо 1 мл триптон-соевого бульона (второй контроль). Активность ЛДГ оценивали с помощью набора реагентов для определения общей активности ЛДГ в сыворотке (плазме) крови (Ольвекс Диагностикум, Россия) на спектрофотометре UV-1700 PharmaSpec (Shimadzu, Япония). Измерения проводили сразу после добавления тестируемых образцов к клеткам НТ-29 и затем через 2, 4, 6 и 24 ч. Оценку токсичности воздействия стафилококков на клетки НТ-29 осуществляли в трех биологических повторах.

Результаты

Особенности формирования биопленок стафилококками различных штаммов

Результаты сканирующей электронной микроскопии показали, что после первых 24 чкультивирования бактерии S. aureus АТСС 29213 не образовывали биопленок (рис. 1А). Участки образования экзополисахаридного (ЭПС) матрикса, покрывающего часть бактерий, зарегистрированы только после 48 ч культивирования (рис. 1B). Бактерии S. epidermidis SE36-1 уже через 24 ч параллельно с процессом адгезии начинали формирование биопленки (рис. 1C). Через 48 ч инкубации было отмечено формирование бактериями микроколоний, а также наблюдались обширные участки, покрытые ЭПС матриксом (рис. 1D). В случае S. haemolyticus SH39 бактерии, покрытые выраженным слоем ЭПС матрикса, наблюдали через 24 ч инкубации (рис. 1E). В то же время были участки, где ЭПС матрикс не наблюдался (рис. 1F). Через 48 ч инкубации принципиальных изменений не было обнаружено, количество ЭПС матрикса увеличилось, но оставались участки, не покрытые ЭПС матриксом.

Визуализация взаимодействия стафилококков с культурой клеток НТ-29

После совместной инкубации суспензии бактериальных клеток анализируемых штаммов стафилококков с монослоем клеток НТ-29 были подготовлены препараты для сканирующей электронной микроскопии. В контрольном препарате к клеткам НТ-29 добавлена среда для культивирования стафилококков.

При исследовании методом сканирующей электронной микроскопии, в контрольном препарате клеточная культура НТ-29 была представлена монослоем клеток с бугристой поверхностью, отростками и выступающими округлыми ядрами. Пространство между клетками было заполнено гомогенным веществом (межклеточным ма-триксом), с глобулярными и фибриллярными включениями. Клетки контактировали между собой посредством отростков (рис. 2).

В первые часы инкубации (1 и 2 ч) S. aureus АТСС 29213 с культурой клеток человека наблюдали адгезию бактерий на поверхности клеток НТ-29, при этом большинство бактерий располагались в межклеточном пространстве (рис. 3 A, B). Через 3 ч наблюдали колонизацию бактериальными клетками поверхности НТ-29. Кроме того через 3 ч была зарегистрирована начальная стадия деформации клеточного пласта (рис. 3С). Через 24 ч инкубации происходила полная дезорганизация клеточного пласта и деструкция клеток. Остатки клеточного пласта были колонизированы бактериями (рис. 3D). Через 48 ч инкубации выявлялись единичные участки, где можно было видеть остатки клеточного пласта, сплошь покрытого бактериями (рис. 3E).

Взаимодействие S. epidermidis SE36-1 с клетками НТ-29 на ранних этапах инкубации (1 и 2 ч) не отличалось по своему характеру от взаимодействия S. aureus АТСС

Рис. 1. Сканограммы: a, b - бактериальной культуры S. aureus АТСС 29213, ув. 4000 (срок инкубации: 24, 48 ч соответственно); c, d - бактериальной культуры S. epidermidis SE36-1, ув. 8000 и 4000 соответственно (срок инкубации: 24, 48 ч соответственно); e, f - бактериальной культуры S. haemolyticus SH39, ув. 8000 (срок инкубации 24 ч).

29213 с клетками НТ-29 (рис. 4А, В). Через 3 ч совместной инкубации со S. epidermidis SE36-1 происходила деформация клеточного пласта, но, в отличие от взаимодействия с клетками НТ-29 S. aureus АТСС 29213, изменения в архитектонике клеточного пласта носили ограниченный характер (рис. 4C, D). Через 24 чинкубации количество бактерий резко увеличивалось. Деформация клеточного пласта была более отчетливой, чем на сроке инкубации 3 ч. (рис. 4 E, F). Через 48 ч инкубации деформация клеточного пласта была максимальна, наблюдалась массовая деструкция клеток НТ-29, были выявлены остатки клеточного скелета ("тени" клеток) (рис. 4G, H, I).

На начальных сроках инкубации 1-3 ч взаимодействие S. haemolyticus SH39 с клетками клеток НТ-29 протекало аналогично описанному для штаммов S. aureus АТСС 29213 и S. epidermidis SE36-1. Отличия касались интенсивности колонизации поверхности клеток: бактерии S. haemolyticus SH39 были выявлены в большем количестве

Рис. 2. Сканограмма препарата клеточной культуры НТ-29 после 24 ч инкубации со средой культивирования стафилококков (контроль), ув. 1000.

по сравнению с количеством бактериями штамма S. epi-dermidis SE36-1 и в меньшем количестве по сравнению с количеством клеток S. aureus АТСС 29213. (рис. 5А, B, С). Через 24 ч инкубации происходила дезорганизация клеточного пласта с образованием конгломератов клеток. На поверхности конгломератов наблюдали прикрепленных стафилококков, практически полностью покрывавших поверхность клеток. В некоторых участках стафилококки были покрыты ЭПС (рис. 5D). Через 48 ч инкубации процесс дезорганизации клеточного пласта, инфицированного стафилококками, продолжался. Количество клеток НТ-29 существенно уменьшилось. Также можно было видеть скопления стафилококков, с фрагментарным покрытием ЭПС (рис. 5E).

Генетические детерминанты факторов вирулентности стафилококков различных видов

О наличии генов токсинов (sea, seb, sed, see, sei, sej, seg, seh, hla, hlgA/hlgB/hlgC) и генов, ответственных за образование биопленки (clfA, clfB, fnbA, fnbB, icaA, icaB, icaC, icaD), в геноме исследуемых штаммов стафилококков судили по результатам полимеразной цепной реакции. Гены токсинов (sea, sei, seg, hla) и гены, кодирующие белковые компоненты формирования биопленки - ген клампинг фактора (clfA) и ген фибронектин-связывающего белка (fnbA), были обнаружены только у S. aureus АТСС 29213.

Гены ica оперона, ответственные за продукцию полисахаридов биопленки, были обнаружены у всех изученных штаммов стафилококков.

Токсическое воздействие стафилококков на культуру клеток человека НТ-29

Токсическое воздействие бактерий изучаемых штаммов (S. aureus АТСС 29213, S. haemolyticus SH39, S. epidermidis SE36-1) на культуру клеток человека НТ-29 оценивали посредством измерения активности ЛДГ, вырабатываемой клетками культуры. Кинетика измене-

Рис. 3. Сканограмма препаратов, отражающих взаимодействие S. aureus АТСС 29213 с культурой клеток человека НТ-29: a - срок инкубации 1 ч, ув. 4000; b - срок инкубации 2 ч, ув. 4000; c - срок инкубации 3 ч, ув. 1000; d- срок инкубации 3 ч, ув. 4000, e - срок

инкубации 24 ч, ув. 1000, f- срок инкубации 24 ч, ув. 4000.

ния активности ЛДГ клеток НТ-29 при добавлении суспензии бактерий, а также при добавлении супернатанта представлена на рис. 6А и В соответственно. В качестве контроля на этих же рисунках представлена кинетика

изменения ЛДГ под действием триптон-соевого бульона и при добавлении эквивалентного количества среды DMEM. Для сопоставления кинетики изменения активности ЛДГ клеток НТ-29 под действием изучаемых ста-

* М; «г- , . >

4 //> > • V I

в \

Рис. 4. Сканограмма взаимодействия культуры клеток человека НТ-29 с S. epidermidis 36-1: a - срок инкубации 1 ч, ув. 4000, b - срок инкубации 2 ч, ув. 4000, c - срок инкубации 3 ч, ув. 1000, d - срок инкубации 3 ч, ув. 4000, e - срок инкубации 24 ч, ув. 1000, f - срок

инкубации 24 ч, ув. 4000.

Рис. 5. Сканограмма взаимодействия культуры клеток человека НТ-29 с S.haemolyticus 39: а - срок инкубации 1 ч, ув.4000, Ь - срок инкубации 2 ч, ув. 4000, с - срок инкубации 3 ч, ув. 1000, d - срок инкубации 3 ч, ув. 4000, е - срок инкубации 24 ч, ув. 1000, / - срок инкубации 24 ч, ув. 4000, g - срок инкубации 48 ч, ув. 1000, к -срок инкубации 48 ч, ув. 4000.

б

10 20 Время, ч.

& Ьавто/уИсив 39 —Д— б. ер/с/егт/сйв 36-1 -ЭК— Триптон соевый бульон

Рис. 6. Кинетика изменения активности ЛДГ культуры клеток НТ-29. а - при добавлении суспензии клеток различных видов стафилококков, б - при добавлении супернатантов различных стафилококков. Графики построены по усредненным данным, полученным

в ходе трех экспериментов.

22

0,7-i

Время, ч.

—о— S. aureus 29213 —о— S. epidermidis 36,1

—о— S. haemolyticus 39

Рис. 7. Кривая роста изучаемых штаммов стафилококков.

филококков и стадии роста бактерий были получены кривые роста изучаемых штаммов стафилококков (рис. 7). Наиболее быстро достигает стационарной фазы роста S. aureus АТСС 29213 (7 ч), для S. haemolyticus SH39 и S. epidermidis SE36-1 стационарная фаза роста наступает через 9 и 10 ч соответственно.

Обсуждение

Род Staphylococcus на сегодняшний день объединяет более 70 видов, которые характеризуются разной степенью вирулентности. Наиболее патогенным для человека видом является S. aureus. Для S. aureus описано значительное количество факторов вирулентности и патогенности. Что касается клинически значимых КОС (S. haemolyticus и S. epidermidis), то эти виды чаще вызывают инфекции у пациентов с ослабленной иммунной системой, при этом о механизмах патогенности КОС известно крайне мало. Поэтому нам представлялось интересным сравнить особенности проявления свойств патогенности у стафилококков трех наиболее клинически значимых видов: S. aureus, S. haemolyticus, S. epidermidis. В исследование были включены по одному штамму из перечисленных видов: S. aureus АТСС 29213, S. haemolyticus SH39, S. epidermidis SE36-1. Важно отметить происхождение штаммов КОС. Они были выделены из аутопсийного материала новорожденных детей, что косвенно указывает на их вирулентность. Изучение возбудителей инфекционных болезней, в том числе и стафилококков, невозможно без исследования взаимодействия в системе патоген-хозяин. Поиск модели патоген-хозяин, наиболее адекватно описывающей поведение системы целом, является одной из важнейших задач медицинской микробиологии. В данной работе в качестве модели для изучения адгезии, колонизации и токсического эффекта стафилококков была выбрана клеточная линия рака толстой кишки человека НТ-29. Выбор клеточной линии НТ-29 связан с тем, что стафилококки часто являются причиной инфекционных поражений кишечника. Примером такой инфекции может служить формирования колоректальных свищей [15]. Отчасти наш выбор был также продиктован источником изоляции клинических штаммов КОС, выделенных из ЖКТ новорожденных. Кроме того, клетки линии НТ-29 представляют собой эпителиальные клетки, что также является важным фактором, позволяющим использовать эту клеточную линию в качестве модели для изучения па-тогенности стафилококка. Это связано с тем, что эпители-

альные клетки следует рассматривать как первый барьер для бактериальных клеток, с которыми они находятся в постоянном контакте [16].

При изучении взаимодействия штаммов стафилококков с культурой клеток человека НТ-29 очень важно учитывать способность бактерий к образованию биопленок. Образование биопленок может определять течение инфекционного процесса. Это связано с тем, что бактерии в составе биопленки часто имеют характеристики отличные от таковых у бактерий в планктонном состоянии. Данные отличия обычно касаются устойчивости к эффекторам иммунной системы и устойчивости к различным антибактериальным препаратам. На сегодняшний день довольно много работ, посвященных формированию биопленок бактериями видов S. aureus, S. epidermidis [17-19], но вопрос об образовании биопленки видом S. haemolyticus изучен не достаточно. В качестве метода регистрации биопленок [20, 21] мы использовали сканирующую электронную микроскопию, поскольку этот метод наиболее достоверно и наглядно отражает стадии формирования ЭПС матрикса. Образование биопленок изучали непосредственно в планшете на стекле, а также в планшете на стекле, покрытом монослоем клеток НТ29.

Представляется значимым тот факт, что при культивировании в питательной среде наиболее активно за 24 ч биопленки образует S. haemolyticus SH39, в то время как S. aureus АТСС 29213 только к 48 ч начинает продуцировать ЭПС. При этом при культивировании на монослое клеток НТ-29 за 24 ч изучаемые штаммы стафилококков не образовывали биопленки. Начало образования биопленок на монослое клеток НТ-29 зарегистрировано только через 48 ч инкубации со штаммом S. haemolyticus SH39. Эти данные свидетельствуют о том, что различия в условиях культивирования могут повлиять на факт формирование биопленки, образуемой стафилококками.

Образования биопленок изучаемыми штаммами было подтверждено на генетическом уровне. Так как формирование биопленок у стафилококков связано с поверхностными белками и межклеточным полисахаридным адгезином PIA (polysaccharide intercellular adhesion), то в исследование было включено определение соответствующих генов. Синтез PIA регулируется icaADBC оперо-ном, включающим гены: icaA, icaB, icaC, icaD. К белковым факторам образования биопленок стафилококка относят клампинг фактор, кодируемый генами clfA и clfB, коллагенсвязывающий белок (ген cna), а также фибро-нектин связывающий белок (гены fnbA; fnbB) [15-17]. Присутствие генов icaADBC оперона подтвердило способность к образованию этими штаммами биопленок, обнаруженных с помощью сканирующей микроскопии. Исследуемые белковые факторы, ответственные за образования биопленки, были найдены только у S. aureus АТСС 29213, что хорошо согласуется с литературными данными. Видимо, в образовании биопленок КОС принимают участия белки, отличные от белков S. aureus.

Помимо вопроса об образовании стафилококками биопленок, сканирующая электронная микроскопия позволила выявить характерные особенности взаимодействия различных стафилококков (S. aureus АТСС 29213, S. haemolyticus SH39, S. epidermidis SE36-1) с культурой клеток человека НТ-29. Инфицирование клеточного пласта выбранными штаммами стафилококка на первом этапе (1-2 ч) характеризуется адгезией бактерий к межклеточному матриксу культуры клеток НТ29. Наиболее ярко адгезивность проявлялась у золотистого и гемолитического стафилококков (S. aureus АТСС 29213, S. haemolyticus SH39), у эпидермального стафилококка (S. epidermidis SE36-1) она была менее выражена. В процес-

се взаимодействия с культурой клеток у стафилококков всех изученных штаммов происходило изменение архитектоники клеточного пласта с последующим его разрушением. Несмотря на различную способность к адгезии у изучаемых штаммов, отчетливые признаки деструкции клеточного пласта НТ-29 наблюдали через 24 ч инкубации под действием любого из этих штаммов.

В ходе работы была выявлена очень интересная особенность взаимодействия штамма S. epidermidis SE36-1 с культурой клеток человека НТ-29. В результате цитолити-ческого действия S. epidermidis SE36-1 на клетки НТ-29 в течение 48 ч на поверхности стекла наблюдались «тени» клеток. Эти структуры, очевидно, представляют собой неразрушенный цитоскелет клеток НТ-29. Подобная картина не наблюдалась при изучении образцов клеточной культуры, инфицированной золотистым и гемолитическим стафилококками. Возможная причина этого явления - наличие у эпидермального стафилококка факторов, разрушающих, в первую очередь, матрикс, синтезируемый эукариотическими клетками культуры НТ-29, и менее выраженный цитолитический потенциал по сравнению с золотистым и гемолитическим стафилококками.

Таким образом, данные об адгезии и колонизации стафилококков, а также деструкции пласта клеток НТ-29 под их воздействием, свидетельствуют о токсическом эффекте всех изученных стафилококков на культуру клеток НТ-29.

Для количественной характеристики токсического эффекта каждого из изучаемых штаммов стафилококка на культуру клеток человека НТ-29 было проведено измерение активности ЛДГ. ЛДГ - фермент, участвующий в реакции превращения лактозы в пируват с образованием HADH+ в ходе гликолиза. Тест на измерение активности этого фермента широко используется в клинических лабораториях как показатель стресса или гибели клеток [22, 23]. Рост активности ЛДГ при стрессе связан с потребностью клеток в быстром получении энергии, при этом происходит активация ферментов гликолиза. В данной работе изменение активности ЛДГ культуры клеток НТ-29 оценивали под действием супернатанта или отмытых от среды бактериальных клеток. Изменение активности ЛДГ под действием супернатанта позволило охарактеризовать токсическое воздействие секретируемых стафилококком веществ. Как при изучении токсичности суперна-танта стафилококков на культуру клеток НТ-29, так и при изучении токсического воздействия отмытых бактерий наибольшее изменение активности ЛДГ было вызвано штаммом S. haemolyticus SH39. Максимальная активность ЛДГ под действием супернатанта S. haemolyticus SH39 наблюдалась через 4 ч инкубации (рис. 6б). Что касается отмытых бактерий S. haemolyticus SH39, то их токсическое воздействие на культуру клеток НТ-29 возрастало по мере роста количества бактерий в среде культивирования (рис. 6а, рис. 7), а также накопления в среде токсических агентов. Характер токсического воздействия супернатанта и клеток S. epidermidis SE36-1 аналогичен S. haemolyticus SH39, но выражен очень слабо. Изменение активности ЛДГ культуры клеток НТ-29 под воздействием супернатанта и отмытых бактерий S. aureus АТСС 29213 имели свои особенности: на протяжении первых 4 ч после добавления супернатанта или клеток S. aureus АТСС 29213 происходило снижение уровня активности ЛДГ. Максимальный рост активности ЛДГ и следовательно максимальный токсический эффект супернатанта S. aureus АТСС 29213 наблюдался через 6 ч инкубации. При инкубации монослоя клеток НТ-29 с отмытыми бактериями S. aureus АТСС 29213 рост активности ЛДГ наблюдается через 4 ч инкубации. В последнем случае рост

токсического эффекта только через 4 ч инкубации может быть связан с тем, что в первые часы культивирования для стафилококков не характерна продукция токсинов. Как было показано ранее для S. aureus, в первые часы культивирования бактерии S. aureus, продуцируют вещества, связанные с образование биопленок, основная часть токсинов продуцируется после фазы активного деления (логарифмической фазы роста) [24]. Наличие генов эн-теротоксинов А, I, G, а так же а-гемолизина у S. aureus АТСС 29213 было подтверждено с помощью полимераз-ной цепной реакции. Экспрессия токсинов с обнаруженных у S. aureus АТСС 29213 генов может обусловливать эффект роста ЛДГ клеток НТ-29 под действием этого штамма. У S. haemolyticus SH39, S. epidermidis SE36-1 генов известных токсинов выявлено не было, но при этом наблюдаемый рост активности ЛДГ клеток НТ-29 под действием S. haemolyticus SH39 свидетельствует о сильном токсическом эффекте, вызываемом этим штаммом. В дальнейшем мы планируем более подробное изучение компонентов супернатанта штамма S. haemolyticus SH39.

Полученные данные свидетельствуют о высокой вирулентности исследуемого штамма гемолитического стафилококка, однако молекулярная природа реализуемых им факторов патогенности требует дальнейшей расшифровки, в том числе с привлечением методов про-теомного и геномного тестирования.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Смирнову Г.Б. и Ла-гарьковой М.А. за участие в обсуждении результатов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Pottinger P.S. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections. Med Clin. N. Am. 2013; 97 (4): 601-19.

2. Power Coombs M.R., Kronforst K., Levy O. Neonatal Host Defense against Staphylococcal Infections. Clin. Dev. Immunol. 2013; 826303. DOI: 10.1155/2013/826303

3. Lowy F.D. Staphylococcus aureus infections. N. Engl. J. Med. 1998; 339 (8): 520-32.

4. Plata K., Rosato A.E., Wegrzyn G. Staphylococcus aureus as an infectious agent: overview of biochemisrtry and molecular genetics of its pathogenicity. Acta Biochim. Pol. 2009; 56 (4): 597-612.

5. Gurusamy K.S., Koti R., Toon C.D., Wilson P., Davidson B.R. Antibiotic therapy for the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infections in surgicalwounds. Cochrane Database Syst. Rev. 2013; doi: 10.1002/14651858. CD009726.pub2.

6. Davidson L.E., Boucher H.W. Infections in immunocompromised patients. In: Staphylococci in Human Disease / Eds Crossley K.B., Jefferson K.K., Archer G., Fowler V.G. Jr. 2nd Ed. Oxford: Blackwell Publishing; 2009: 505-20.

7. Lepelletier D., Bourigault C., Roussel J.C., Lasserre C., Leclere B., Corvec S. et al. Epidemiology and prevention of surgical site infections after cardiac surgery. Med. Mal. Infect. 2013; 43 (10): 403-9.

8. Rahman A., Hosaain M.A., Mahmud C., Paul S.K., Sultana S., Haque N. et al. Species distribution of coagulase negative staphylococci isolated from different clinical specimens. Mymensingh Med. J. 2012; 21 (2): 195-9.

9. Venkatesh M.P., Placencia F., Weisman L.E. Coagulase-negative staphylococcal infections in the neonate and child: An update. Semin. Pediatr. Infect. Dis. 2006; 17 (3): 120-7.

10. Lemaire X., Morena M., Leray-Moragues H., Henriet-Viprey D., Chenine L., Defez-Fougeron C., Canaud B. Analysis of risk factors for catheter-related bacteremia in 2000 permanent dual catheters for hemodialysis. BloodPurif 2009; 28 (1): 21-8.

11. Maldini B., Antolic S., Sakic-Zdravcevic K., Karaman-Ilic M., Jankovic S. Evaluation of bacteremia in a pediatric intensive care unit: epidemiology, microbiology, sources sites and risk factors. Coll. Antropol. 2007; 31 (4): 1083-8.

12. Любасовская Л.А., Корниенко М.А., Припутневич Т.В., Ильина Е.Н., Щеголев А.И. Микробиологическая и молекулярно-генетическая характеристика коагулазонегативных стафилококков, выделенных у новорожденных отделения реанимации и интенсивной терапии. Антибиотики и химиотерапия. 2013; 58: 3-4.

13. Otto M. Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections. Semin. Immunopathol. 2012; 34 (2): 201-14.

14. McFarland J. Nephelometer; an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J. A. M. A. 1907; 14: 1176-8.

15. al-Salem A.H., Qaisaruddin S., Qureshi S.S. Perianal abscess and fistula in ano in infancy and childhood: a clinicopathological study. Pediatr. Pathol. Lab. Med. 1996; 16 (5): 755-64.

16. Grice E.A., Kong H.H., Conlan S., Deming C.B., Davis J., Young

A.C. et al. Topographical and temporal diversity of the human skin microbiome. Science. 2009; 324: 1190-2.

17. Otto M. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2008; 322: 207-28.

18. Fey P.D., Olson M.E. Current concepts in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Future Microbiol. 2010; 5 (6): 917-33.

19. Patel J.D., Colton E., Ebert M., Anderson J.M. Gene expression during S. epidermidis biofilm formation on biomaterials. J. Biomed. Mater. Res. A. 2012; 100 (11): 2863-9.

20. Christensen G.D., Simpson W.A., Younger J.J., Baddour L.M., Barrett F.F., Melton D.M., Beachey E.H. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for theadherence of staphylococci to medical devices. J. Clin. Microbiol. 1985; 22 (6): 996-1006.

21. Freeman D.J., Falkiner F.R., Keane C.T. New method for detecting slime production by coagulase-negative staphylococci. J. Clin. Pathol. 1989; 42: 872-4.

22. Chan F.K., Moriwaki K., De Rosa M.J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Meth. Mol. Biol. 2013; 979: 65-70.

23. Koukourakis M.I., Giatromanolaki A., Sivridis E., Gatter K.C., Trarbach T., Folprecht G. et al. Prognostic and predictive role of lactate dehydrogenase 5 expression in colorectal cancer patients treated with PTK787/ZK 222584 (vatalanib) antiangiogenic therapy. Clin. Cancer Res. 2011; 17 (14): 4892-900.

24. Vuong C., Gotz F., Otto M. Construction and characterization of an agr deletion mutant of Staphylococcus epidermidis. Infect. and Immun., 2000, 68: 1048-53.

Поступила 07.11.14

REFERENCES

1. Pottinger P.S. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections. Med Clin. N. Am. 2013; 97 (4): 601-19.

2. Power Coombs M.R., Kronforst K., Levy O. Neonatal Host Defense against Staphylococcal Infections. Clin. Dev. Immunol. 2013; 826303. DOI: 10.1155/2013/826303

3. Lowy F.D. Staphylococcus aureus infections. N. Engl. J. Med. 1998; 339 (8): 520-32.

4. Plata K., Rosato A.E., Wegrzyn G. Staphylococcus aureus as an infectious agent: overview of biochemisrtry and molecular genetics of its pathogenicity. Acta Biochim. Pol. 2009; 56 (4): 597-612.

5. Gurusamy K.S., Koti R., Toon C.D., Wilson P., Davidson B.R. Antibiotic therapy for the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infections in surgicalwounds. Cochrane Database Syst. Rev. 2013; doi: 10.1002/14651858. CD009726.pub2.

6. Davidson L.E., Boucher H.W. Infections in immunocompromised patients. In: Staphylococci in Human Disease / Eds Crossley K.B., Jefferson K.K., Archer G., Fowler V.G. Jr. 2nd Ed. Oxford: Blackwell Publishing; 2009: 505-20.

7. Lepelletier D., Bourigault C., Roussel J.C., Lasserre C., Leclere

B., Corvec S. et al. Epidemiology and prevention of surgical site infections after cardiac surgery. Med. Mal. Infect. 2013; 43 (10): 403-9.

8. Rahman A., Hosaain M.A., Mahmud C., Paul S.K., Sultana S., Haque N. et al. Species distribution of coagulase negative staphylococci isolated from different clinical specimens. Mymensingh Med. J. 2012; 21 (2): 195-9.

9. Venkatesh M.P., Placencia F., Weisman L.E. Coagulase-negative staphylococcal infections in the neonate and child: An update. Semin. Pediatr. Infect. Dis. 2006; 17 (3): 120-7.

10. Lemaire X., Morena M., Leray-Moragues H., Henriet-Viprey D., Chenine L., Defez-Fougeron C., Canaud B. Analysis of risk factors for catheter-related bacteremia in 2000 permanent dual catheters for hemodialysis. BloodPurif. 2009; 28 (1): 21-8.

11. Maldini B., Antolic S., Sakic-Zdravcevic K., Karaman-Ilic M., Jankovic S. Evaluation of bacteremia in a pediatric intensive care unit: epidemiology, microbiology, sources sites and risk factors. Coll. Antropol. 2007; 31 (4): 1083-8.

12. Lyubasovskaya L.A., Kornienko M.A., Priputnevich T.V., Il'ina E.N., Shchegolev A.I. Microbiological and molecular genetic characteristics of coagulase-negative staphylococci isolated from neonatal resuscitation and intensive care. Antibiotiki i khimioterapiya. 2013; 58: 3-4.

13. Otto M. Molecular basis of Staphylococcus epidermidis infections. Semin. Immunopathol. 2012; 34 (2): 201-14.

14. McFarland J. Nephelometer; an instrument for estimating the number of bacteria in suspensions used for calculating the opsonic index and for vaccines. J. A. M. A. 1907; 14: 1176-8.

15. al-Salem A.H., Qaisaruddin S., Qureshi S.S. Perianal abscess and fistula in ano in infancy and childhood: a clinicopathological study. Pediatr. Pathol. Lab. Med. 1996; 16 (5): 755-64.

16. Grice E.A., Kong H.H., Conlan S., Deming C.B., Davis J., Young A.C. et al. Topographical and temporal diversity of the human skin microbiome. Science. 2009; 324: 1190-2.

17. Otto M. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2008; 322: 207-28.

18. Fey P.D., Olson M.E. Current concepts in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Future Microbiol. 2010; 5 (6): 917-33.

19. Patel J.D., Colton E., Ebert M., Anderson J.M. Gene expression during S. epidermidis biofilm formation on biomaterials. J. Biomed. Mater. Res. A. 2012; 100 (11): 2863-9.

20. Christensen G.D., Simpson W.A., Younger J.J., Baddour L.M., Barrett F.F., Melton D.M., Beachey E.H. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for theadherence of staphylococci to medical devices. J. Clin. Microbiol. 1985; 22 (6): 996-1006.

21. Freeman D.J., Falkiner F.R., Keane C.T. New method for detecting slime production by coagulase-negative staphylococci. J. Clin. Pathol. 1989; 42: 872-4.

22. Chan F.K., Moriwaki K., De Rosa M.J. Detection of necrosis by release of lactate dehydrogenase activity. Meth. Mol. Biol. 2013; 979: 65-70.

23. Koukourakis M.I., Giatromanolaki A., Sivridis E., Gatter K.C., Trarbach T., Folprecht G. et al. Prognostic and predictive role of lactate dehydrogenase 5 expression in colorectal cancer patients treated with PTK787/ZK 222584 (vatalanib) antiangiogenic therapy. Clin. Cancer Res. 2011; 17 (14): 4892-900.

24. Vuong C., Gotz F., Otto M. Construction and characterization of an agr deletion mutant of Staphylococcus epidermidis. Infect. and Immun., 2000, 68: 1048-53.

Received 07.11.14

ABILITY OF STAPHYLOCOCCUS OF VARIOUS STRAINS TO CREATE BIOFILMS AND THEIR EFFECT ON HUMAN BODY CELLS

'Kornienko M. A, 'Kopyltsov V. N, 2Shevlyagina N. V., fDidenko L. V,, 3Lyubasovskaya L. A.,3Priputnevich T. V., 'IlinaE. N.

1 Research Institute for Physical-Chemical Medicine, Moscow, Russia; 2 Research Institute for Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia ; 3 Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology, Moscow, Russia

The urgency of the staphylococcus research is due to its ability to cause severe infections: soft tissue infections, endocarditis, sepsis, toxic shock syndrome, and food poisoning. Coagulase-positive Staphylococcus aureus is the main infection agent of intrahospital infections. This agent has many factors of pathogenicity, which are well known. Among the coagulase-negative staphylococcus (CNS) strains, S. haemolyticus and S. epidermidis are clinically important, because they cause infections in patients with weak immune system. The mechanisms of the CNS pathogenicity are insufficiently understood.

The goal of this work was to evaluate the potential pathogenicity of clinical strains of CNS from their capacity to create biofilms and the character of their interaction with human body cells by the example of the НТ-29 cell culture. The research was carried out in laboratory strain S. aureus АТСС 29213 and clinical strains S. haemolyticus SH39, S. epidermidis SE36-1 isolated from the neonatal autopsy materials. The visual tests of biofilm formation by each strain and testing of the impact of the strains on the cell culture НТ-29 was carried out in this work. The two species of CNS form biofilms at a higher rate than S. aureus. Upon incubation for 2 h of НТ-29 cells with staphylo-coccus strains tested in this work, adhesion of bacteria on cell surface was observed. The adhesion was most pronounced in case of S. aureus АТСС 29213 and S. haemolyticus SH39. Upon 3 h of incubation with S. aureus АТСС 29213 and S. haemolyticus SH39, destruction of cell НТ-29 monolayer was observed. The incubation for 24 h with the 3 strains tested in this work caused complete destruction of cell НТ-29 monolayer. The maximal toxic effect on НТ-29 cells was inherent in the strain S. haemolyticus SH39. The aggregate of the results obtained in this work indicates the presence of the pathogenicity factors in the strains S. haemolyticus SH39, which require additional research. Key words: Staphylococcus, biofilms, scanning electron microscopy, НТ-29

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-18-25