МУЛЬТИПЛЕКСНОЕ ДЕТЕКТИРОВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Способ количественного определения первой хромосомы или хромосомного локуса относительно второй хромосомы или хромосомного локуса в образце нуклеиновой кислоты, включающий
контактирование образца с первым и вторым набором зондов, причем каждый из зондов первого набора специфически распознает особую целевую последовательность в пределах первой хромосомы или хромосомного локуса, и при этом каждый из зондов второго набора специфически распознает особую целевую последовательность в пределах второй хромосомы или хромосомного локуса,
обеспечение условий, при которых целевые последовательности в первой и второй хромосоме или хромосомном локусе являются по меньшей мере частично одноцепочечными,
обеспечение условий для отжига и лигирования, при которых зонды гибридизируются с их целевыми последовательностями и генерируют продукты лигирования, при этом каждый продукт лигирования является кольцом нуклеиновой кислоты, содержащим соединение лигирования,
обеспечение условий для репликации колец нуклеиновой кислоты по типу катящегося кольца,
подсчет количества первых продуктов репликации по типу катящегося кольца, где первые продукты репликации по типу катящегося кольца амплифицированы из продуктов лигирования, полученных с помощью зондов первого набора для обеспечения первого подсчета,
подсчет количества вторых продуктов репликации по типу катящегося кольца, где вторые продукты репликации по типу катящегося кольца амплифицированы из продуктов лигирования, полученных с помощью зондов второго набора для обеспечения первого подсчета, и, и
сравнение первого и второго подсчитанных количеств, с определением, таким образом, относительных количеств первого и второго типа нуклеиновых кислот в образце.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первая хромосома является хромосомой 21, а вторая хромосома выбрана из хромосомы 13 и хромосомы 18.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что набор зондов включает по меньшей мере 1000 зондов, каждый из которых специфически распознает отдельную целевую последовательность.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что набор зондов включает по меньшей мере 10000 зондов, каждый из которых специфически распознает отдельную целевую последовательность.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что продукты лигирования являются продуктами двойного лигирования, каждый из которых содержит первый и второй стыки лигирования.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что стадии подсчета завершаются отделением индивидуальных молекул продукта репликации по типу катящегося кольца друг от друга, и подсчетом количества индивидуальных молекул продукта репликации по типу катящегося кольца в определенной площади или объеме.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что стадия подсчета завершается:
i. гибридизацией меченного олигонуклеотида с молекулами продукта RCA, где меченный олигонуклеотид гибридизуется с поверхностью, которая повторяется в продукте RCA, посредством чего получается множество комплексов, каждый из которых содержит одиночный продукт RCA и множество меченных олигонуклеотидов, которые гибридизуются с продуктом RCA; и
ii. подсчетом количества меченных комплексов.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что стадия подсчета завершается:
(a) получением субстрата, включающего меченные комплексы, распределенные на поверхности субстрата; и
(b) подсчетом количества продуктов RCA, которые присутствуют на первой площади субстрата.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что продукты репликации по типу катящегося кольца индивидуально подсчитываются:
(a) получением субстрата, включающего множество комплексов, распределенных на поверхности субстрата, где каждый из комплексов включает одиночный продукт RCA и множество меченных олигонуклеотидных зондов, которые гибридизуются с продуктом RCA, и где комплексы, соответствующие первым продуктам амплификации по типу катящегося кольца и комплексы, соответствующие вторым продуктам амплификации по по типу катящегося кольца, отличимо помечены; и
(b) подсчетом количества первых продуктов RCA и, независимо, подсчетом количества вторых продуктов RCA, которые присутствуют в области субстрата.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что продукты лигирования являются кольцами нуклеиновой кислоты, содержащими целевые последовательности.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хромосома или хромосомный локус являются фрагментированной хромосомой или хромосомным локусом.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что целевые последовательности являются последовательностями фрагментов хромосомы или хромосомного локуса.
13. Способ по п. 11, отличающийся тем, что образец является рестриктом нуклеиновой кислоты, а целевая последовательность является фрагментом рестрикции.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что каждый зонд содержит
нацеливающий олигонуклеотид, который длиннее, чем целевой фрагмент и содержит внутреннюю целевую комплементарную последовательность, таким образом, что гибридизация между нацеливающим олигонуклеотидом и целевым фрагментом формирует двухцепочечную последовательность, расположенную между вышележащими и нижележащими фланкирующими последовательностями нацеливающего олигонуклеотида, и
последовательности, находящиеся в начале и в конце, имеющие свободные 5'- и 3'-концы соответственно, причем последовательности, находящиеся в начале и в конце, являются комплементарными вышележащим и нижележащим фланкирующим последовательностями, соответственно, при этом
в условиях отжига и лигирования, последовательности начала и конца гибридизируются с фланкирующими последовательностями, а целевой фрагмент, если он присутствует, гибридизуется с целевой комплементарной последовательностью, таким образом, позиционируя концы целевого фрагмента в соприкасании с 5'-концом последовательности начала и 3'-концом последовательности конца, причем 3'-конец целевого фрагмента лигирован с 5'-концом последовательности начала с образованием первого стыка лигирования, и 5'-конец целевого фрагмента лигируется с 3'-концом последовательности конца с образованием второго стыка лигирования, производя продукт двойного лигирования, включающий непрерывную цепь нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности начала и конца и целевой фрагмент, причем непрерывная цепь является кольцом.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что образец является образцом крови или ткани.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что образец содержит смесь фетальной и материнской ДНК из крови беременной женщины.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, детектируемая и количественно определяемая хромосома или хромосомный локус является ассоциированной с опухолью ДНК.