Оптимизация результатов трансплантации клеток в сетчатку, поврежденную лазерным излучением на модели эксплантационной культуры

областных целевых программ (приоритетных направлений) и их коммерческой реализации путем создания малых предприятий и (или) частно-государственного партнерства с помощью целевых программ по развитию инновационной деятельности.

А.Б. Селькина, В.И. Шепитько, Г.А. Ерошенко,

О.Д. Лисаченко

Влияние трансплантации криоконсервированной плаценты на местный иммунный статус слизистой оболочки полости рта

ВГУЗ Украины «Украинская медицинская стоматологическая академия», Полтава, Украина gala_umsa@mail.ru

А.В. Sel’kina, V.l. Shepitko, G.A. Yeroshenko, O.D. Lisachenko Influence of kryopreserved placenta transplantation on the oral cavity mucosa’s local immune status

Местные защитные реакции в слизистой оболочке полости рта обеспечиваются иммунокомпетентными клетками как в составе эпителиальной пластинки (клетки Лангерганса, макрофаги, лимфоциты), так и в собственной пластинке (макрофаги, лимфоциты, плазматические клетки, тканевые базофилы). Изменение их количества и соотношения дает представление о напряженности местного защитного барьера.

Целью работы было определение клеточного состава «иммуноцитов» в собственной пластинке слизистой оболочки дорсальной поверхности языка (ДПЯ) крыс после трансплантации криоконсервированной плаценты (ККП).

Исследование выполнено на 30 крысах линии Ви-стар, 5 из которых составили контрольную группу, а 25 одноразово провели трансплантацию ККП объемом 0,125 см3 под кожу на плече. Выведение животных из эксперимента осуществляли на 2, 7, 14, 21 и 30 сут. Фрагменты слизистой оболочки ДПЯ заключали в эпон-812 по общепринятой методике, изготавливали полутонкие срезы, которые окрашивали полихромным красителем. Количество макрофагов, лимфоцитов, плазмоцитов и тканевых базофилов определяли методом стандартных площадей в 10 полях зрения. Статистическую обработку полученных цифровых данных провели при помощи программы Excel.

У животных контрольной группы в собственной пластинке ДПЯ определялись лимфоциты (0,9±,23 в п/з), макрофаги (1,0+0,29 в п/з), плазматические клетки (0,4+0,22 в гУз) и тканевые базофилы (1,2+0,29 в п/з).

На 2-е сут. после трансплантации ККП количество всех изученных клеток, особенно макрофагов (в 6 раз) и плазмоцитов (в 9 раз) статистические достоверно увеличилось, что может служить морфологическим подтверждением формирования иммунного ответа в слизистой оболочке языка в ответ на введение плацентарной ткани. Количество лимфоцитов и тканевых

+

3,2+0,18 в п/з соответственно (р<0,05).

На 7-е сут. эксперимента количество лимфоцитов соответствовало показателям в контрольной группе животных. Нормализация количества тканевых базофилов определялась до 14 сут. наблюдения. К 21 сут. эксперимента количество всех изученных клеток не отличалось от значений в контрольной группе.

Таким образом, трансплантация ККП вызывает изменение количества и соотношения «иммуноцитов» в собственной пластинке ДПЯ. Однако наличие в ККП

биологически активных веществ способствует быстрой реализации иммунного ответа и восстановлению морфофункционального состояния слизистой оболочки ДПЯ до 14 сут. наблюдения.

С.А. Сергеев 1, Н.В. Кошелева 1 а, И.Н. Сабурина а,

М.Л. Семенова 1

Оптимизация результатов трансплантации клеток в сетчатку, поврежденную лазерным излучением на модели эксплантационной культуры

1 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

2 Институт общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва, Россия

embryossa@gmail.com

S.A. Sergeev, N.V. Kosheleva, I.N. Saburina, M.L. Semenova Cells transplantation results optimization using the explantation retina culture model damaged by laser émission

Применение клеточных технологий, a именно, трансплантация нейрональных стволовых/прогениторных клеток (НСПК) и клеток пигментного эпителия (ПЗ), в современной офтальмологии дало возможность восстанавливать утраченное зрение после необратимых повреждений сетчатки. Однако полученные как в клинике, так и в эксперименте данные наблюдения за репарацией дефектов сетчатки после клеточной трансплантации часто носят противоречивый характер и не позволяют добиться желаемого результата. Остается бесспорной решающая роль нового микроокружения на судьбу трансплантированных клеток, однако наглядно продемонстрировать зависимость активности участия введенных в организм клеток от места и способа инъекции удается при сравнении экспериментов in vivo и in vitro с применением модели органотипического эксплантационного культивирования.

Нами были предложены модели трансплантации GFP+ НСПК 4-го пассажа и клеток ПЗ 6-го пассажа мышей линии C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP)/0sb/J в эксплан-тационную культуру сетчатки (37°С, 5%С02 DMEM/F12, + глутамин, -t-dFGFn EGF (Юнг/мл), В27, N2 и 10% Fêtai clone) и их инъекции интравитриально (10 ООО кл./2 мкл), ретробульбарно (300 ООО кл/10 мкп) и супрахориоидально (300 ООО кл./2 мкл) крысам линии Campbell в возрасте 14 сут. с последующим иммуногистохимическим анализом экспресии p-lll-тубу-лина и GFAP.

После трансплантации in vivo на основании ЗРГ установлено, что клетки ПЗ как при интравитриальной, так и при ретробульбарной трансплантации через 4 и 6 сут. оказывают слабоположительное влияние на функциональное состояние сетчатки крыс Campbell возраста 25 сут. и позволяет сохранить функциональную активность сетчатки у крыс до 36 сут. Статистически достоверно увеличивается толщина ONL у опытных животных возраста 27 и 43 сут. При супрахориоидаль-ной трансплантации клеток ПЗ отмечено выраженное стабилизирующее влияние трансплантации на процессы дегенерации, развивающиеся в ONL у крыс Campbell и сохранение высокого уровня функциональной активности сетчатки. При супрахориоидальной трансплантации НСПК функциональная активность сетчатки животных была в 3 раза ниже, чем при аналогичной трансплантации клеток ПЗ, несмотря на статистически неразличимые морфологические данные толщины ONL.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 3, 2010

При супрахориоидальной инъекции НСПК попадали в новое микроокружение, в то время как клетки ПЭ занимали свойственное им расположение над слоем нейросетчатки.

Аналогичные результаты были получены и при нанесении агрегатов НСПК и ПЭ на поверхность эксплантата сетчатки. НСПК оставались в составе агрегата на протяжении всего времени эксперимента (14 сут.) и оставались негативными к маркерам нейральной и глиальной дифференцировки. Для ПЭ была характерна активная миграция, начинающаяся уже через 10 мин после нанесения на эксплантат, и пролиферация, приводящая к покрытию всего эксплантата сетчатки клетками ПЭ к 3-м сут. сокультивирования.

Противоположные результаты оценки клеточной миграции и пролиферации были получены при инъекции НСПК и ПЭ непосредственно в нейросетчатку — в среднюю зону края разрастания эксплантата. Клетки ПЭ оставались неподвижными и слабо пролиферировали на протяжении всего времени сокультивирования, в то время как НСПК активно мигрировали по направлению к зоне повреждения, начиная с первых минут после инъекции, образовывали длинные филоподиаль-ные и нейритоподобные отростки, по которым шло передвижение тел нейронов и соседних нейрональных клеток к области дефекта. Перемещение НСПК и их потомков в составе эксплантата сетчатки происходило наиболее активно в первые сут. после трансплантации, GFP+ клетки детектировали через сут. в зоне повреждения, удаленной от места инъекции на 100 мкм, через 3-е сут. на 1000 мкм и через 7 сут. в области повреждения, находящейся на расстоянии 3000 мкм от зоны инъекции. Инъецированные в нейросетчатку НСПК образовывали длинные разветвленные нейриты, взаимодействующие как с другими GFP+ клетками донора, так и с нейронами сетчатки реципиента. Начиная с 3-х сут. после трансплантации, они имели все морфологические признаки биполярных и муль-типолярных нейронов и экспрессировали p-lll-тубулин.

Таким образом, при помощи модели эксплантаци-онной культуры развивающейся нейросетчатки, поврежденной лазерным излучением, удалось показать решающую роль способа введения клеток на дальнейшую судьбу трансплантата и эффективность репарации повреждений сетчатки, проследить миграцию, дифференцировку и взаимодействие индивидуальных клеток донора и реципиента на различных сроках после инъекции. Полученные данные подтверждаются экспериментальными наблюдениями in vivo, что позволяет не только говорить об адекватности используемой модели эксплантационного культивирования, но и оптимизировать имеющиеся протоколы трансплантации НСПК и ПЭ в клинике.

Работа выполнена при реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.

Е.И. Слынько, И.В. Прудников Результаты применения стволовых клеток костного мозга при травматических повреждениях спинного мозга

ГУ «Институт нейрохирургии им. акад. АЛ. Ромоданова»

АМН Украины, Киев

Институт физиологии им. акад. А.А. Богомольца,

Киев, Украина

E.I. Slynko, I.V. Prudnikov

The results of using bone marrow stem cells to cure spinal cord traumas

Данное исследование проведено с целью изучить эффективность метода трансплантации стволовых клеток костного мозга при травме спинного мозга в отдаленном периоде.

Материал и методы. За период с 2005 по 2010 г. у 16 больных применен метод трансплантации стволовых клеток костного мозга. У всех больных были травматические повреждения позвонков и спинного мозга грудного отдела. У всех больных на момент операции отмечена нижняя параплегия, анестезия ниже уровня повреждения, рефлекторная функция тазовых органов — полный функциональный перерыв мозга. Срок от момента травмы до оперативного вмешательства варьировал от 6 мес. до 27 мес. Перед операцией всем больным проводилась рентгенография и МРТ-графия интересующего отдела. В послеоперационном периоде МРТ-графия выполнялась через 1—3 мес. Всем 16 больным выполнены трансплантации стволовых клеток костного мозга с помощью оперативных вмешательств. Случаи, где операции дополнялись декомпрессией мозга, стабилизацией, менингиолизом исключены из данного исследования.

Результаты. Применяли методику открытой хирургической трансплантации стволовых нейрогенных клеток в зону повреждения спинного мозга. Использовали стволовые клетки, выделенные из костного мозга больного и культивированные в течение 2—3 мес. Клетки пересаживали в фибриновом клее в качестве матрикса, приготовленном из крови самого больного. При наличии интрамедуллярной кисты вследствие ми-еломаляции проводили миелотомию по REZ зоне (зона входа задних корешков). Кисту аспирировали, полость наполняли стволовыми нейрогенными клетками в фибриновом клее, спинной мозг ушивали за пиальную оболочку. При отсутствии кисты миеломаляции проводили миелотомию в зоне наибольшего повреждения мозга по данным MPT-графии. Микропинцетом волокна проводящих путей разводили в стороны, в центральные отделы проводили трансплантацию, мозг ушивали за пиальную оболочку. Для трансплантации использовали 2—4 млн стволовых нейрогенных клеток.

Отдаленные результаты оценивали через 10—12 мес. после операции. У 15 больных отмечено снижение уровня чувствительных расстройств на 1—3 сегмента. У 5 больных появились императивные позывы к мочеиспусканию. У 9 больных появилось ощущение тепла в нижних конечностях. Эти изменения не специфические, связанные отчасти со вскрытием интрамедуллярной кисты, внутренней декомпрессией спинного мозга.

Отдаленные результаты прослежены от 2 до 4 лет у 9 больных. У 4 больных отмечено дополнительное снижение уровня сенсорных нарушений на 1—2 сегмента, у 2 больных появились элементы глубокой чувствительности в нижних конечностях, у 3 больных отмечено

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, 1У< 3, 2010