НОВЫЙ БАКТЕРИОФАГ ЭНТЕРОИНВАЗИВНОЙ E. COLI ESC-COP-4 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЭНТЕРОИНВАЗИВНОЙ E. COLI
NEW BACTERIOPHAGE ENTEROINVASIVE ESCHERICHIA COLI ESC-COP-4 AND ITS APPLICATION FOR INHIBITING PROLIFERATION ENTEROINVASIVE ESCHERICHIA COLI

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Область изобретения
Настоящее изобретение относится к бактериофагу, выделенному из природы, инфицирующему и уничтожающему энтероинвазивную Е. coli, и способу предупреждения и лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с использованием композиции, содержащей бактериофаг в качестве активного ингредиента. В частности, настоящее изобретение относится к миовирусному бактериофагу Esc-COP-4, выделенному из природы и способному специфически уничтожать штаммы энтероинвазивной Е. coli, имеющему геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: KCTC 12663 ВР), и способу предупреждения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, и их последующего лечения с использованием композиции, содержащей указанный бактериофаг в качестве активного ингредиента.
2. Описание уровня техники Для Escherichia coli (E. coli) установлено более 9000 серотипов в соответствии с комбинацией поверхностного антигена (липополисахарид, О), флагеллярного антигена (флагеллин, Н) и капсулярного антигена (полисахарид, K). Е. coli также этиологически классифицируют на энтеротоксигенную Е. coli (ЕТЕС), энтероинвазивную Е. coli (EIEC), энтеропатогенную Е. coli (ЕРЕС) и энтероинвазивную Е. coli (ЕНЕС), в зависимости от патогенеза, токсинов и серотипов O:Н. Прежде всего, энтероинвазивная Е. coli (EIEC) проникает в эпителиальные клетки слизистой оболочки толстого кишечника, тем самым вызывая образование язв вследствие некроза клеток, и т.д., и вызывает бактериальную дизентерию, сопровождаемую кроваво-слизистой диареей.
Энтероинвазивная E.coli является важной патогенной бактерией, вызывающей диарею у свиней. Она снижает скорость роста инфицированных свиней, что приводит к смерти и большим экономическим потерям, поскольку лечение и предупреждение этой инфекции является дорогим. Учитывая существенный ущерб, наносимый такой Е. coli животноводческой отрасли, возникла острая потребность в разработке способа предупреждения и лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной E. coli. Для предупреждения или лечения таких инфекций, вызываемых энтероинвазивной E. coli, использовали различные антибиотики. Тем не менее, в связи с возрастающим в последнее время числом бактерий, устойчивых к антибиотикам, возникла острая потребность в эффективной альтернативе.
В последнее время внимание авторов привлекло применение бактериофагов в качестве нового способа лечения бактериальных инфекций. В частности, причиной повышенного интереса авторов к бактериофагам является то, что лечение, основанное на применении бактериофагов, является способом, дружественным к окружающей среде. Бактериофаги представляют собой чрезвычайно маленькие инфицирующие бактерии микроорганизмы, сокращенно называемые фагами. Как только бактериофаг инфицирует бактерию, бактериофаг пролиферирует внутри бактериальной клетки. После полной пролиферации потомки уничтожают бактериальную клеточную стенку, чтобы выйти из хозяина, что указывает на то, что бактериофаги обладают способностью уничтожать бактерии. Инфицирование бактериофагами характеризуется высокой специфичностью, так что конкретный бактериофаг инфицирует только определенную бактерию. То есть, число бактерий, которые могут быть инфицированы конкретным бактериофагом, ограничено, что указывает на то, что бактериофаг способен уничтожать только определенную бактерию, и не может нанести вред другим бактериям.
Бактериофаг был впервые обнаружен английским бактериологом Туортом в 1915 г., когда он заметил, что колонии Micrococcus под воздействием чего-то неизвестного стали плавиться и становиться прозрачными. В 1917 г. французский бактериолог Д'Эрелль обнаружил, что Shigella disentriae в фильтрате кала больного дизентерией расплавилась под воздействием чего-то, и впоследствии исследовал этот феномен. В результате он независимо обнаружил бактериофаг, и назвал его «бактериофагом», что означает «пожиратель бактерий». После этого были обнаружены бактериофаги, обладающие специфическим антибактериальным действием против таких патогенных бактерий, как Shigella, Salmonella Typhi и Vibrio cholerae.
По причине их уникальной способности уничтожать бактерии, бактериофаги исследовали и прогнозировали как способ лечения бактериальных инфекций. Однако после открытия пенициллина Флемингом исследования бактериофагов продолжились только в ряде западноевропейских стран и бывшем Советском Союзе по причине универсализации антибиотиков. После 2000 года достоинства общепринятых антибиотиков померкли по причине увеличения числа бактерий, устойчивых к антибиотикам. Таким образом, бактериофаги вновь оказались в центре внимания как новый антибактериальный агент, способный заменить общепринятые антибиотики.
Более того, недавнее регулирование использования антибиотиков поддерживается правительствами по всему миру. Интерес к бактериофагам все больше повышается, а также постоянно открываются их промышленные применения.
Таким образом, в настоящем изобретении реализована попытка разработать композицию, подходящую для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с помощью бактериофага, выделенного из природы и способного селективно уничтожать энтероинвазивную Е. coli, и дополнительно обеспечить способ предупреждения или лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с использованием композиции. В результате, авторы выделили бактериофаги, подходящее для этой цели, и установили нуклеотидную последовательность генома, позволяющую отличить бактериофаг по настоящему изобретению от других бактериофагов. Затем авторы разработали композицию, содержащую выделенный бактериофаг в качестве активного ингредиента, и подтвердили, что эта композиция может эффективно применяться для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной E. coli, что привело к созданию настоящего изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является обеспечение миовирусного бактериофага Esc-COP-4, выделенного из природы и способного специфически уничтожать клетки энтероинвазивной Е. coli, имеющего геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: KCTC 12663 ВР).
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение композиции, подходящей для предупреждения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, содержащей бактериофаг Esc-COP-4, способный инфицировать и уничтожать энтероинвазивную Е. coli, в качестве активного ингредиента, и способа предупреждения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с использованием указанной композиции.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение композиции, подходящей для лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, содержащей бактериофаг Esc-COP-4, способный инфицировать и уничтожать энтероинвазивную Е. coli, в качестве активного ингредиента, и способа лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с использованием указанной композиции.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение дезинфицирующего средства для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с использованием указанной композиции.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение добавки для питьевой воды для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с использованием указанной композиции.
Еще одной целью настоящего изобретения является обеспечение пищевой добавки, эффективной в сельском хозяйстве, для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с использованием указанной композиции.
Для достижения вышеуказанных целей в настоящем изобретении обеспечен миовирусный бактериофаг Esc-COP-4, выделенный из природы и способный специфически уничтожать энтероинвазивную Е. coli, имеющий геном, представленный нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 (регистрационный №: KCTC 12663 ВР), и способ предупреждения и лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с использованием композиции, содержащей бактериофаг в качестве активного ингредиента. Бактериофаг Esc-COP-4 был выделен авторами настоящего изобретения и затем депонирован в Корейской коллекции типовых культур Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии 21 августа 2014 г. (регистрационный №: KCTC 12663 ВР).
В настоящем изобретении также предложены дезинфицирующее средство, добавка для питьевой воды и пищевая добавка, подходящие для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, содержащие бактериофаг Esc-COP-4 в качестве активного ингредиента.
Поскольку бактериофаг Esc-COP-4, входящий в состав композиции по настоящему изобретению, эффективно уничтожает энтероинвазивную Е. coli, его следует считать эффективным для предупреждения или лечения диареи (инфекций) Е. coli, вызываемой энтероинвазивной Е. coli. Следовательно, композиция по настоящему изобретению может быть использована для предупреждения и лечения диареи Е. coli, вызванной энтероинвазивной Е. coli. В настоящем описании диарея Е. coli включает симптомы, вызываемые инфекциями Е. coli, сопровождаемыми лихорадкой, диареей и тому подобными.
В настоящем описании термин «лечение» или «лечить» обозначает (i) подавление диареи, вызываемой энтероинвазивной Е. coli; и (и) облегчение диареи, вызываемой энтероинвазивной Е. coli.
В настоящем описании термин «выделение» или «выделенный» обозначает все действия для отделения бактериофага с помощью различных экспериментальных техник, и для определения характеристик, позволяющих отличить данный бактериофаг от других бактериофагов, и дополнительно включает действие пролиферации бактериофага посредством биоинженерных технологий с тем, чтобы сделать его полезным.
Фармацевтически приемлемый носитель, входящий в состав композиции по настоящему изобретению, представляет собой носитель, обычно используемый для получения фармацевтического состава, примерами которого являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, гуммиарабик, фосфат кальция, альгинат, желатин, силикат кальция, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, целлюлоза, вода, сироп, метилцеллюлоза, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло, но не всегда ограничиваясь перечисленным. Композиция по настоящему изобретению помимо вышеуказанных ингредиентов может дополнительно включать смазывающие вещества, смачивающие агенты, подсластители, вкусовые добавки, эмульгаторы, суспендирующие агенты и консерванты.
1
30
1
30
4
15
4
15
Бактериофаг Esc-COP-4 включен в состав композиции согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. При этом бактериофаг Esc-COP-4 включен в концентрации от 1×10 БОЕ/мл до 1×10БОЕ/мл, или от 1×10 БОЕ/г до 1×10 БОЕ/г, и предпочтительно в концентрации от 1×10 БОЕ/мл до 1×10 БОЕ/мл, или от 1×10 БОЕ/г до 1×10 БОЕ/г.
Композиция по настоящему изобретению может быть получена способом, осуществляемым специалистами в данной области, с использованием фармацевтически приемлемого носителя и/или эксципиента, в форме контейнера для однократной дозы или многократных доз. Состав может быть представлен в форме раствора, суспензии или эмульсии в масле или водорастворимой среде, экстракта, порошка, гранулы, таблетки или капсулы. При этом может быть дополнительно включен диспергирующий агент или стабилизатор.
Композиция по настоящему изобретению может быть изготовлена в виде дезинфицирующего средства, добавки для питьевой воды или пищевой добавки, в зависимости от цели использования, но не всегда ограничиваясь перечисленным.
ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ ЭФФЕКТ Способ предупреждения и лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, с использованием композиции, содержащей бактериофаг Esc-COP-4 в качестве активного ингредиента, обладает преимуществом высокой специфичности к энтероинвазивной Е. coli по сравнению с общепринятыми способами, основанными на химических веществах, включая общепринятые антибиотики. Это означает, что композиция по настоящему изобретению может специфически применяться для предупреждения или лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli, не оказывая воздействия на другие имеющиеся полезные бактерии, и, соответственно, имеет меньше побочных эффектов. В общем, при использовании химических веществ, таких как антибиотики, основные имеющиеся бактерии также повреждаются, что приводит к ослаблению иммунитета у животных с различными сопутствующими побочными эффектами. В то же время, в композиции по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента используется бактериофаг, выделенный из природы, что является очень дружественным к окружающей среде.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Применение предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения более понятно со ссылкой на прилагаемые фигуры, где:
Фиг. 1 представляет собой снимок, полученный при помощи электронного микроскопа, демонстрирующий морфологию бактериофага Esc-COP-4.
Фиг. 2 представляет собой фотографию, иллюстрирующую способность бактериофага Esc-COP-4 уничтожать энтероинвазивную Е. coli. Прозрачный участок на чашке представляет собой бляшки, образованные в результате лизиса бактериальных клеток.
ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Практические и предпочтительные в настоящий момент варианты осуществления настоящего изобретения являются иллюстративными, как показано в следующих Примерах.
Тем не менее, следует понимать, что специалисты в данной области с учетом настоящего описания могут создавать модификации и улучшения, оставаясь в рамках сущности и объема настоящего изобретения.
Пример 1: Выделение бактериофага, способного уничтожать энтероинвазивную Е. coli
Образцы отбирали из природы для отбора бактериофага, способного уничтожать энтероинвазивную Е. coli. Энтероинвазивная E. coli, использованная здесь для выделения бактериофага, представляла собой Е. coli, выделенную авторами настоящего изобретения и ранее идентифицированную как энтероинвазивная Е. coli.
Процедура выделения бактериофага подробно описана далее. Собранный образец добавляли к TSB (триптиказо-соевый бульон) среде (панкреатический гидролизат казеина, 17 г/л; папаиновый гидролизат соевых бобов, 3 г/л; декстроза, 2,5 г/л; хлорид натрия, 5 г/л; дикалийфосфат, 2,5 г/л), инокулированной энтероинвазивной Е. coli в соотношении 1/1000, с последующим встряхиванием культуры при 37°С в течение от 3 до 4 часов. После завершения культивирования осуществляли центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут, и собирали супернатант. Собранный супернатант инокулировали культурой энтероинвазивной Е. coli в соотношении 1/1000 с последующим встряхиванием культуры при 37°С в течение от 3 до 4 часов. Когда образец содержал бактериофаг, для увеличения титра бактериофага вышеуказанную процедуру повторяли в общей сложности 5 раз. После повторения процедуры 5 раз культуральный раствор подвергали центрифугированию при 8000 об/мин в течение 20 минут и собирали полученный супернатант. Собранный супернатант фильтровали с использованием 0,45 мкм фильтра. Полученный фильтрат использовали в капельном анализе для определения того, содержался ли в нем бактериофаг, способный уничтожать энтероинвазивную E. coli.
600
Капельный анализ проводили следующим образом; среду TSB инокулировали энтероинвазивной Е. coli в соотношении 1/1000 с последующим встряхиванием культуры при 37°С в течение ночи. 3 мл (с OD, равной 1,5) культурального бульона энтероинвазивной Е. coli, полученного как описано выше, распределяли по пластинке с TSA (триптиказо-соевый агар; панкреатический гидролизат казеина, 17 г/л; папаиновый гидролизат соевых бобов, 3 г/л; хлорид натрия, 5 г/л; агар, 15 г/л). Пластинка находилась в камере в течение приблизительно 30 минут для высыхания. После высыхания 10 мкл полученного фильтрата точечно наносили непосредственно на поверхность газонов энтероинвазивной Е. coli и сушили в течение приблизительно 30 минут. После сушки планшет инкубировали при 37°С в течение суток, и затем исследовали образование прозрачных участков на поверхности газонов бактерий. Если прозрачный участок был образован в том месте, куда капали фильтрат, можно было сделать вывод, что в фильтрате содержался бактериофаг, способный уничтожать энтероинвазивную Е. coli. Фильтрат, содержащий бактериофаг, способный уничтожать энтероинвазивную Е. coli, можно получать посредством вышеуказанного способа.
После чего бактериофаг выделяли из фильтрата, для которого ранее было подтверждено, что он содержит бактериофаг, способный уничтожать энтероинвазивную Е. coli. Для выделения чистых бактериофагов использовали общепринятый анализ бляшкообразования. А именно, бляшки, образованные в ходе анализа бляшкообразования, собирали с использованием стерилизованного наконечника, и затем добавляли в культуральный раствор энтероинвазивной Е. coli, с последующим культивированием в течение от 4 до 5 часов. После завершения культивирования проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут с получением супренатанта. Собранный супернатант инокулировали культурой энтероинвазивной Е. coli в соотношении 1/50, с последующим культивированием в течение от 4 до 5 часов. Для увеличения титра бактериофага вышеуказанную процедуру повторяли по меньшей мере 5 раз. Затем проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут с получением супернатанта. С полученным супернатантом проводили анализ бляшкообразования. В общем, выделение чистого бактериофага не завершается однократной процедурой, поэтому вышеуказанную процедуру повторяли с использованием бляшек, образованных ранее. После повторения процедуры по меньшей мере 5 раз получали раствор, содержащий чистый бактериофаг. Процедуру выделения чистого бактериофага обычно повторяли до тех пор, пока образуемые бляшки не обладали схожими размерами и морфологиями. И последнее выделение чистого бактериофага подтверждали путем наблюдения при помощи электронного микроскопа. Вышеуказанную процедуру выполняли до тех пор, пока выделение чистого бактериофага не подтверждалось при помощи электронного микроскопа. Наблюдение при помощи электронного микроскопа проводили общепринятым способом. Вкратце, раствор, содержащий чистый бактериофаг, наносили на медную сетку с последующим негативным окрашиванием 2% уранилацетатом. После его сушки исследовали морфологию при помощи электронного микроскопа. Полученный при помощи электронного микроскопа снимок бактериофага, выделенного в настоящем изобретении, представлен на Фиг. 1. В результате морфологического исследования выделенный выше бактериофаг идентифицировали как принадлежащий к семейству миовирусов.
Раствор, содержащий чистый бактериофаг, подтвержденный как описано выше, подвергали очистке. Культуральный бульон энтероинвазивной E. coli добавляли к раствору, содержащему чистый бактериофаг, в объемном соотношении 1/50 от общего объема раствора бактериофага, затем вновь культивировали в течение от 4 до 5 часов. После завершения культивирования проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 20 минут с получением супернатанта. Эту процедуру повторяли 5 раз до получения раствора, содержащего достаточное количество бактериофага. Супернатант, полученный после последнего центрифугирования, фильтровали через 0,45 мкм фильтр, с последующим общепринятым осаждением полиэтиленгликолем (ПЭГ). В частности, ПЭГ и NaCl добавляли к 100 мл фильтрата до достижения 10% ПЭГ 8000/0,5 M NaCl, который выдерживали при 4°С в течение от 2 до 3 часов. Затем проводили центрифугирование при 8000 об/мин в течение 30 минут с получением преципитата бактериофага. Полученный преципитат бактериофага ресуспендировали в 5 мл буфера (10 мМ Трис-HCI, 10 мМ MgSCM, 0,1% желатина, рН 8,0). Этот раствор называли суспензией бактериофага или раствором бактериофага.
В результате чистый бактериофаг, очищенный как описано выше, собирали, называли бактериофагом Esc-COP-4 и затем депонировали в Корейской коллекции типовых культур Корейского научно-исследовательского института биологических наук и биотехнологии 21 августа 2014 г. (регистрационный №: KCTC 12663 ВР).
Пример 2: Выделение и секвенирование генома бактериофага Esc-COP-4
Геном бактериофага Esc-COP-4 выделяли следующим образом. Геном выделяли из суспензии бактериофага, полученной в Примере 1. Сначала для того, чтобы устранить ДНК и РНК энтероинвазивной Е. coli, содержащихся в суспензии, добавляли ДНКазу I и РНКазу А по 200 Е каждая к 10 мл суспензии бактериофага, которую затем инкубировали при 37°С в течение 30 минут.30 минут спустя для удаления активности ДНКазы I и РНКазы А к ней добавляли 500 мкл 0,5 М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и затем ее инкубировали в течение 10 минут. Суспензию дополнительно инкубировали при 65°С в течение 10 минут, и затем к ней добавляли 100 мкл протеиназы К (20 мг/мл) для разрыва внешней стенки бактериофага, с последующим инкубированием при 37°С в течение 20 минут. Затем к ней добавляли 500 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия (SDS) с последующим инкубированием при 65°С в течение 1 часа. К ней добавляли 10 мл смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт в соотношении 25:24:1, затем хорошо перемешивали. Смесь центрифугировали при 13000 об/мин в течение 15 минут для разделения всех слоев. Получали верхний слой, к которому добавляли изопропиловый спирт в 1,5-кратном объеме по отношению к объему верхнего слоя с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут для осаждения генома бактериофага. После сбора преципитата к нему добавляли 70% этанол с последующим центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 минут для промывки преципитата. Промытый преципитат собирали, сушили в вакууме и затем растворяли в 100 мкл воды. Эту процедуру повторяли с получением достаточного количества генома бактериофага Esc-COP-4.
Нуклеотидную последовательность генома бактериофага Esc-COP-4, полученного выше, анализировали по технологии Секвенирования нового поколения (NGS) с помощью устройства Mi-Seq от illumina в Национальном инструментальном центре Экологического управления Национального университета Сеула. В результате было предположено, что конечный геном бактериофага Esc-COP-4 имеет размер 168161 п.н., и нуклеотидная последовательность полного генома имеет SEQ ID NO: 1.
Схожесть геномной последовательности бактериофага Esc-COP-4, полученной выше, с ранее описанными геномными последовательностями бактериофагов была исследована с помощью BLAST, доступного из Интернет (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Результатами BLAST было подтверждено, что геномная последовательность бактериофага Esc-COP-4 имела высокую гомологичность с последовательностями бактериофага Shigella pSs-1 (регистрационный № в Genbank: КМ501444.1), бактериофага Е. coli RB10 (регистрационный № в Genbank: КМ606999.1), бактериофага Е. coli RB9 (регистрационный № в Genbank: КМ606998.1), бактериофага Е. coli RB7 (регистрационный № в Genbank: КМ606997.1) и бактериофага Е. coli RB6 (регистрационный № в Genbank: КМ606996.1) (98%, 95%, 95%, 95% и 95%). Тем не менее, размеры их геномов отличались друг от друга. А именно, было определено, что полный геном бактериофага Esc-COP-4 имел размер 168161 п.н., тогда как, в отличие от него, размер полного генома бактериофага Shigella pSs-1 составлял 164999 п.н., для бактериофага Е. coli RB10 он составлял 168401 п.н., для бактериофага Е. coli RB9 он составлял 168395 п.н., для бактериофага Е. coli RB7 он составлял 168395 п.н. и для бактериофага Е. coli RB6 он составлял 168394 п.н. Более того, установленное количество ORF (открытых рамок считывания) в геноме бактериофага Esc-COP-4 составило 267 ORF, тогда как, в отличие от него, число ORF в бактериофаге Shigella pSs-1 составило 266 ORF, для бактериофага Е. coli RB10 оно составило 272 ORF, для бактериофага Е. coli RB9 оно составило 272 ORF, для бактериофага Е. coli RB7 оно составило 272 ORF, и для бактериофага Е. coli RB6 оно составило 271 ORF.
На основании этого результата заключили, что бактериофаг Esc-COP-4 должен быть новым бактериофагом, не описанным ранее.
Пример 3: Исследование способности бактериофага Esc-COP-4 уничтожать энтероинвазивную Е. coli
Исследовали способность выделенного бактериофага Esc-COP-4 уничтожать энтероинвазивную Е. coli. Для этого наблюдали за образованием прозрачного участка посредством капельного анализа, таким же образом, как описано в Примере 1. Энтероинвазивная Е. coli, использованная для этого исследования, составляла 10 штаммов, ранее выделенных и идентифицированных авторами настоящего изобретения как энтероинвазивная Е. coli. Бактериофаг Esc-COP-4 демонстрировал способность уничтожать 9 штаммов энтероинвазивной Е. coli, использованных в данном эксперименте. Показательный результат исследования способности к уничтожению представлен на Фиг. 2. В то же время, также исследовали активность бактериофага Esc-COP-4 в отношении уничтожения Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus plantarum, Streptococcus uberis и Pseudomonas aeruginosa. В результате было решено, что бактериофаг Esc-COP-4 не обладал активностью в отношении уничтожения этих микроорганизмов.
Следовательно, было подтверждено, что бактериофаг Esc-COP-4 обладает специфической способностью уничтожать энтероинвазивную Е. coli и широким антибактериальным спектром против энтероинвазивной Е. coli, указывая на то, что бактериофаг Esc-COP-4 по настоящему изобретению мог бы применяться в качестве активного ингредиента композиции для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli.
Пример 4: Эффект бактериофага Esc-COP-4 в отношении предупреждения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli
8
600
100 мкл раствора бактериофага Esc-COP-4 в концентрации 3*10 БОЕ/мл добавляли в пробирку, содержащую 9 мл TSB. В другую пробирку, содержащую 9 мл TSB, добавляли такой же объем только TSB. Затем в каждую пробирку добавляли культуру энтероинвазивной Е. coli с получением бактериальной суспензии с OD, равной 0,5. После чего пробирки переносили в инкубатор при 37°С с последующим встряхиванием культуры, во время которого наблюдали рост энтероинвазивной Е. coli. Как представлено в Таблице 1, рост энтероинвазивной Е. coli ингибировался в пробирке, в которую был добавлен раствор бактериофага Esc-COP-4, тогда как в пробирке, не содержащей раствор бактериофага Esc-COP-4, рост энтероинвазивной Е. coli не ингибировался.
Вышеприведенные результаты указывают на то, что бактериофаг Esc-COP-4 не только ингибировал рост энтероинвазивной Е. coli, но также мог ее уничтожать. Следовательно, бактериофаг Esc-COP-4 может применяться в качестве активного ингредиента в композиции для предупреждения инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli.
Пример 5: Терапевтический эффект бактериофага Esc-COP-4 в отношении инфекций, вызываемых энтероинвазивной Е. coli
9
9
Исследовали терапевтический эффект бактериофага Esc-COP-4 на животных, пораженных энтероинвазивной Е. coli. 4 поросенка-отъемыша в возрасте 25 дней группировали; всего 2 группы поросят выращивали в свинарнике (1,1 м × 1,0 м) в течение 14 дней. Была оборудована нагревательная система и проводился контроль за окружающей средой. Контролировали температуру и влажность в свинарнике и ежедневно производили уборку пола. На 7-й день эксперимента всем животным перорально вводили 1 мл суспензии энтероинвазивной Е. coli с помощью питательного зонда. Суспензию энтероинвазивной Е. coli, вводимую как описано выше, получали следующим образом: энтероинвазивную Е. coli культивировали в среде TSB (триптиказо-соевый бульон) при 37°С в течение 18 часов и собирали бактериальные клетки центрифугированием. К бактериальной клеточной массе добавляли физиологический раствор (рН 7,2) с получением суспензии клеток с концентрацией 10 КОЕ/мл. Начиная со следующего дня после введения энтероинвазивной Е. coli, экспериментальной группе (свиньи, подвергавшиеся обработке раствором бактериофага) перорально вводили бактериофаг Esc-COP-4 (10 БОЕ/особь) тем же способом введения, как описано выше, дважды в сутки. Контрольную группу (свиньи, не подвергавшиеся обработке раствором бактериофага) не подвергали какой-либо обработке. Корма и питьевую воду одинаково предоставляли обеим группам. После введения энтероинвазивной Е. coli за всеми животными наблюдали ежесуточно, вне зависимости от того, наблюдалась ли у них диарея. Наблюдение производили путем измерения показателя диареи. Были установлены следующие показатели диареи в соответствии со шкалой консистенции кала (FC) (нормальный: 0, жидкий стул: 1, умеренная диарея: 2, и тяжелая диарея: 3). Результаты представлены в Таблице 2.
Исходя из вышеприведенных результатов было подтверждено, что бактериофаг Esc-COP-4 по настоящему изобретению мог бы быть очень эффективным в лечении инфекционных заболеваний, вызываемых энтероинвазивной Е. coli.
Пример 6: Получение кормовых добавок и кормов
8
4
Кормовую добавку, содержащую бактериофаг Esc-COP-4 в концентрации 1×10 БОЕ/г, получали, используя раствор бактериофага Esc-COP-4. Способ ее получения представлял собой следующий: мальтодекстрин (40%, w/v) добавляли к раствору бактериофага, и затем добавляли трегалозу до достижения конечной концентрации 10%. После хорошего перемешивания смесь лиофилизировали. Наконец, лиофилизированную смесь размалывали в мелкие порошки. Вышеуказанный процесс лиофилизации может быть заменен сушкой в вакууме, сушкой при повышенной температуре или сушкой при комнатной температуре. Для получения контрольной кормовой добавки для сравнения получали кормовую добавку, не содержавшую бактериофаг, а содержавшую только буфер (10 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgSO, 0,1% желатина, рН 8,0).
Два вышеуказанных типа кормовых добавок смешивали с 1000-кратным объемом корма для свиноводства, соответственно, с получением двух типов конечных кормов.
8
8
Пример 7: Получение добавок для питьевой воды и дезинфицирующих средств Добавка для питьевой воды и дезинфицирующее средство различаются по своему назначению, однако имеют аналогичный состав, поэтому их получали аналогичным образом. Добавку для питьевой воды (или дезинфицирующее средство), содержащую бактериофаг Esc-COP-4 в концентрации 1×10 БОЕ/мл, получали, используя раствор бактериофага Esc-COP-4. В частности, для получения добавки для питьевой воды (или дезинфицирующего средства), раствор бактериофага Esc-COP-4 добавляли к буферному раствору до достижения концентрации 1×10 БОЕ/мл, который хорошо перемешивали. Для сравнения, вышеуказанный буферный раствор сам по себе использовали в качестве добавки для питьевой воды (или дезинфицирующего средства), не содержащей бактериофаг.
Полученные два типа добавок для питьевой воды (или дезинфицирующих средств) разбавляли водой в соотношении 1:1000, и затем использовали как питьевую воду или дезинфицирующее средство.
Пример 8: Эффект в свиноводстве
Исследовали эффект кормов, питьевой воды и дезинфицирующего средства, полученных в Примере 6 и Примере 7, в свиноводстве. В частности, исследование фокусировалось на состоянии диареи, оцененном с помощью шкалы консистенции кала, использованной в Примере 5. Всего 30 поросят делили на три группы, и в каждой группе было по 10 поросят (группа А: группа исследования корма, группа В: группа исследования питьевой воды; и группа С: группа исследования дезинфицирующего средства). Исследование проводили в течение 2 недель. Каждую группу делили на две подгруппы по 5 поросят в каждой. Подгруппы делили в соответствии с тем, проводили ли лечение бактериофагом Esc-COP-4, или нет (подгруппа-: подвергалась лечению бактериофагом Esc-COP-4; и подгруппа-: не подвергалась лечению бактериофагом Esc-COP-4). Поросята, использованные в данном эксперименте, представляли собой поросят-отъемышей в возрасте 20 дней, и их выращивали в отдельных комнатах, расположенных на достаточном расстоянии друг от друга. Каждую подгруппу делили и называли, как показано в Таблице 3.
Корма обеспечивали в соответствии с общепринятым способом кормления, как представлено в Таблице 3, с кормами, полученными в Примере 6. Питьевую воду предоставляли в соответствии с традиционным способом снабжения водой, как представлено в Таблице 3, с питьевой водой, полученной в Примере 7. Обработку дезинфицирующим средством проводили трижды в неделю, по очереди с общепринятым дезинфицирующим средством. То есть, в день, когда распыляли дезинфицирующее средство по настоящему изобретению, не производили обработку общепринятым дезинфицирующим средством. Результаты представлены в Таблице 4.
Вышеприведенные результаты подтвердили, что корма, питьевая вода и дезинфицирующее средство, полученные согласно настоящему изобретению, были эффективны в снижении диареи у животных. Следовательно, можно сделать вывод, что композиция по настоящему изобретению может эффективно применяться для улучшения продуктивности животноводства.
Специалистам в данной области понятно, что концепции и конкретные варианты осуществления, раскрытые в вышеизложенном описании, могут быть без труда использованы в качестве основы для модификации или разработки других вариантов осуществления для достижения тех же целей, которые достигаются в настоящем изобретении. Специалистам в данной области также понятно, что такие эквивалентные варианты осуществления не отступают от сущности и объема настоящего изобретения, как представлено в прилагаемой формуле изобретения.