СПОСОБ РАННЕГО ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СЕПТИЧЕСКИХ ОСЛОЖНЕНИЙ У НОВОРОЖДЕННЫХ С РЕСПИРАТОРНОЙ ПАТОЛОГИЕЙ
METHOD OF EARLY PREDICTION OF SEPTIC COMPLICATIONS IN NEWBORNS WITH RESPIRATORY PATHOLOGY

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, и может быть использовано для раннего прогнозирования неонатального сепсиса у новорожденных детей с респираторной патологией и перинатальным поражением центральной нервной системы (ЦНС), находящихся на искусственной вентиляции легких (ИВЛ).
Широкое внедрение в неонатологию высокотехнологичных методов обследования и лечения, в том числе аппаратной искусственной вентиляции легких, обеспечивает возможность успешного выхаживания новорожденных с глубокими нарушениями функции дыхания. Однако в условиях незавершенности становления иммунной системы и развития механизмов местной неспецифической противоинфекционной защиты у новорожденных с респираторной патологией возможна повышенная микробная колонизация организма ребенка и, как следствие, развитие септических осложнений.
Проведенный анализ литературы показал, что вопрос прогнозирования развития бактериальных осложнений у новорожденных детей с тяжелой респираторной патологией и перинатальным поражением ЦНС недостаточно освещен, в связи с этим разработки в данном направлении весьма актуальны.
В настоящее время известны следующие способы прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных.
В последние годы большое внимание уделяется С-реактивному белку (СРБ). СРБ начинает синтезироваться в период 6-8 ч от начала инфекционного процесса или повреждения тканей. Как диагностический маркер у новорожденных СРБ более чувствительный и специфичный тест по сравнению с показателем лейкоцитов и степенью их незрелости. Однако уровень СРБ повышается очень медленно в начале септической инфекции, чувствительность теста в этот период едва достигает 60% (Ng Р.С., Cheng S.H., Chui K. et al. // Arch. Dis. Childh. - 1997. - Vol.77. - P.221-227). Наиболее информативен тест в режиме мониторирования в течение 24 или 48 ч, в этом случае чувствительность его достигает 84%. СРБ достаточно чувствительный, но поздний маркер септической инфекции новорожденных.
Несколько более высокие показатели чувствительности и специфичности тестов продемонстрировали такие маркеры, как уровень интерлейкина 1β (ИЛ1 β) и фактор некроза опухолей α (ФНО α) в сыворотке крови. Повышение уровня ИЛ1 β свыше 20 нг/л оказалось чувствительным тестом (92,3%), но не специфичным (34,5%). В то же время ФНО α продемонстрировал низкую чувствительность (60%) при хорошей специфичности (85,2%) (Т.В.Бирюкова, И.Г.Солдатова, Н.Н.Володин и др. "Сравнительная информативность определения уровней прокальцитонина, интерлейкина β и С-реактивного белка как критериев системного воспалительного ответа при раннем неонатальном сепсисе". / Педиатрия. 2007; 86 (4): 43-51; И.Г.Солдатова. "Роль провоспалительных цитокинов, рецепторного антагониста интерлейкина 1 в диагностике и лечении бактериальных инфекций у новорожденных детей". Автореф. … дисс. канд. мед. наук. М., 2003). Таким образом, стало очевидным, что эти тесты (СРБ, ИЛ1 β, ФНО α) не могут использоваться как маркеры сепсиса.
Прототипом предлагаемого изобретения выбран один из перспективных маркеров сепсиса прокальцитонин, который избирательно реагирует на системные и септические инфекционные процессы и может служить ранним критерием для их диагностики (А.Г.Антонов, Е.Н.Байбарина, Ю.В.Соколовская, Н.В.Евтеева. "Объективные диагностические критерии сепсиса у новорожденных". / Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. 2005, т.4, №5-6, с.113-115).
Недостатками прототипа являются: 1. Концентрация прокальцитонина широко варьирует в первые дни жизни ребенка (Chiesa С., Panero A., Rossi N. et al. // Clin. Infect. Dis. - 1998. - Vol.26. - Р.664-672). 2. Опубликованы работы, в которых приводятся очень высокие ложноположительные значения прокальцитонина у пациентов с респираторным дистресс-синдромом, острыми заболеваниями легких, гемодинамическими повреждениями, тяжелой травмой без бактериального инфицирования (Lapillone A., Basson Е., Monneret G. et al. // Lancet. - 1998. - Vol.351. - P.1211-1212). 3. Низкая специфичность (48%) (Turner D., Hammerman C., Rudenssky В., Schlesinger Y., Schimmel M.S. // Acta paediatr. 2006. Dec.; 95 (12); 1571-6).
Задачей изобретения является разработка более совершенного, высокочувствительного метода раннего прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных детей.
Поставленная задача решается тем, что в крови у новорожденных детей методом прямой иммунофлюоресценции на проточном цитометре определяют относительное содержание Аннексина V на моноцитах и при его значении, равном 17,4% и более, диагностируют септическое осложнение.
Наиболее чувствительным и патогенетически обоснованным лабораторным тестом, на основании которого возможна ранняя диагностика дисфункции иммунной системы еще до формирования нарушений в различных звеньях иммунореактивности и развития иммунной недостаточности, является оценка интенсивности процессов апоптоза. В частности, известно, что при сепсисе резко возрастает интенсивность гибели моноцитов механизмом апоптоза (В.А.Черешнев, Е.Ю.Гусев. "Иммунология воспаления: роль цитокинов" // Медицинская иммунология. - 2001. Т.3, №3. - С.361-368; Hotchkiss R.C., Swanson P.E., Freeman B.D. Apoptotic cell death in patients with sepsis, shock and multiple organ dysfunction // Crit. Care Med. - 1999. - Vol.27. - P.1230-1250). Возникает состояние иммунологической толерантности или «иммунопаралича», моноциты/макрофаги не в состоянии запускать иммунный ответ, т.е. продуцировать провоспалительные цитокины и экспрессировать HLA-DR. В этих условиях иммунная система не может выполнять свою главную функцию осуществления иммунологического надзора, что приводит к развитию тяжелых гнойно-септических осложнений и усугубляет синдром полиорганной недостаточности. У новорожденных с респираторной патологией развивается апоптогенное иммунодефицитное состояние.
2+
Утрачивание фосфолипидной асимметричности клеточной мембраны характерно для ранних стадий апоптоза. В жизнеспособных клетках фосфатидилсерин расположен на внутренней стороне цитоплазматической мембраны. В апоптотических клетках фосфатидилсерин переориентируется и локализуется на поверхности клеточной мембраны, становясь доступным для связывания с Аннексином V. Аннексин V - белок (35-36 kD), который при определенной концентрации солей и ионов Са обладает высокой аффинностью к фосфатидилсерину, являясь индикатором ранних стадий апоптоза. Для окрашивания клеточной ДНК в анализе используется пропидий иодид. Клетки, окрашенные только Аннексином V, конъюгированным с FITC (флуоресцеин), находятся на более ранней стадии апоптоза, чем окрашенные также и пропидий иодидом (PI), так как переориентация фосфатидилсерина наблюдается раньше, чем изменения ядра клетки, связанные с апоптозом. Одним из основных методов детекции процессов апоптоза с помощью проточной цитофлуориметрии является использование системы ANNEXIN V - FITC - kit. Различное насыщение клеток двумя красителями позволяет определить живые, некротические и апоптотические клетки - жизнеспособные клетки (неокрашенные), находящиеся в раннем апоптозе (положительные по Аннексину V), находящиеся в позднем апоптозе/некрозе (положительные и по Аннексину V, и по пропидий иодиду).
+
+
Нашими исследованиями установлено, что у новорожденных детей с септическими осложнениями относительное содержание Аннексина V на моноцитах значительно больше, чем у новорожденных без таковых, и мониторинговое определение относительного содержания Аннексина Vна моноцитах позволяет с высокой степенью вероятности диагностировать развитие неонатального сепсиса у новорожденных детей на доклинической стадии.
Работоспособность изобретения подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1
Ребенок У-ва, 1-х суток жизни, история болезни №112/34. Пациентка переведена в отделение реанимации из родильного дома на искусственной вентиляции легких (ИВЛ) с диагнозом гипоксия, впервые выявленная до родов, асфиксия в родах тяжелой степени, мекониально-аспирационный синдром. Клинически выражены симптомы угнетения ЦНС: резко снижена реакция на осмотр, мышечная гипотония, гипорефлексия, спонтанный горизонтальный нистагм; выражена бледность кожного покрова; аускультативно дыхание в легких с обеих сторон ослаблено, хрипы не выслушиваются. Клинические и лабораторные симптомы бактериального инфицирования отсутствуют: температура тела нормальная, гемодинамика стабильная, печень, селезенка не увеличены, общий анализ крови без особенностей, прокальцитонин крови меньше 0,5 нг/мл.
3
6
При поступлении у ребенка из пупочного катетера набрали 1,5 мл венозной крови в пробирку, содержащую литиевую соль гепарина. Выделение моноцитарных клеток из цельной крови производили на градиенте плотности фиколл-урографина (1,082 г/см) с последующей отмывкой клеток фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2). Ресуспендировали клетки в связывающем буфере (концентрация клеток составляла 1-2×10 клеток/мл, жизнеспособность более 95%, примесь гранулоцитов не более 4%). Для диагностики использовали набор "ANNEXIN V - FITC - kit" фирмы Caltag Laboratories (США). Помещали 100 мкл клеточной суспензии в пробирку объемом 5 мл. Добавляли 5 мкл Аннексина V - FITC и 10 мкл раствора пропидиума йодида. Перемешивали на шейкере (1000 об/мин) в течение 3 секунд и инкубировали при комнатной температуре в темноте 20 минут. Затем добавляли в пробирку 400 мкл связывающего буфера. Анализировали образец на проточном цитометре фирмы Beckman Coulter Epics XL в течение 1 часа. Цитофлуориметрический метод оценки апоптоза клеток является очень чувствительным методом, позволяет проанализировать за короткий промежуток времени большое количество образцов и значительное количество клеток, что дает возможность получить достоверные сведения о состоянии клеток при различных патологических процессах.
В результате проведенного исследования были получены следующие результаты относительного содержания Аннексина V на моноцитах, находящихся в раннем апоптозе (Апоптоз моноцитов ранний, %) при поступлении - 21,4%.
Обнаружение цифр относительного содержания моноцитов, находящихся в раннем апоптозе 21,3%, свидетельствовало о высоком риске развития неонатального сепсиса. На 4-е сутки пребывания в отделении у пациентки отмечена гипертермия свыше 39°С, тахиаритмия свыше 160/мин, артериальная гипотония; в легких с обеих сторон выслушивались крепитирующие хрипы, наблюдалось увеличение размеров печени и селезенки; в гемограмме - нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом до юных, прокальцитонин крови - 10 нг/мл, гипокоагуляция. Бактериологический посев крови - обнаружен рост Ps. aeruginosa. Пациентке поставлен клинический диагноз: неонатальный сепсис. Благодаря своевременному усилению интенсивной и антибактериальной терапии, назначению иммуностимулирующих препаратов ребенок остался жив. На 10-е сутки при повторном исследовании относительное содержание Аннексина V на моноцитах, находящихся в раннем апоптозе, снизилось до 16%. На 16-е сутки ребенок был экстубирован и переведен на спонтанное дыхание и на 20-е сутки переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения. На момент перевода уровень относительного содержания Аннексина V на моноцитах, находящихся в раннем апоптозе, составил 15,4%.
Таким образом, из данного примера следует, что обнаружение уровня экспрессии Аннексина V на моноцитах выше 17,4% свидетельствовало о возможности развития у ребенка неонатального сепсиса в наиболее раннем сроке, до появления клинических и лабораторных признаков тяжелой бактериальной инфекции.
Пример 2
Ребенок И-ов, первых суток жизни, история №141/31. Поступил из родильного дома в отделение реанимации на ИВЛ в связи с нарастанием дыхательной недостаточности и неврологической симптоматики в возрасте 4 часов жизни с диагнозом тяжелая асфиксия в родах, респираторный дистресс-синдром, ателектазы легких. При поступлении реакция на осмотр отсутствует, зрачковая реакция на свет ослаблена, мышечная гипотония, гипорефлексия; отмечалась выраженная бледность кожного покрова, петехиальные кровоизлияния в кожу головы и лица, артериальная гипотония, тахиаритмия свыше 160/мин; в легких выслушивались крепитирующие хрипы с обеих сторон, печень +2 см, селезенка у края реберной дуги, в общем анализе крови анемия, тенденция к нейтропении, прокальцитонин крови 2 нг/мл. Уровень экспрессии Аннексина V на моноцитах составлял 17,3%, что несмотря на тяжелое состояние и неоднозначность клинических симптомов и лабораторных данных позволяло исключить развитие неонатального сепсиса. Несмотря на проводимую терапию на 3 сутки ребенок погиб. На паталогоанатомическом вскрытии поставлен диагноз родовой травмы. Признаков бактериального инфицирования не обнаружено. Таким образом, из данного примера следует, что обнаружение уровня экспрессии Аннексина V на моноцитах ниже 17,4% свидетельствовало об отсутствии у пациента неонатального сепсиса, что и подтвердилось в дальнейшем.
Пример 3
Ребенок С-в, 3-х суток жизни, история болезни №211/63. Перевод в отделение реанимации на ИВЛ обусловлен нарастанием дыхательной недостаточности при отсутствии клинических симптомов бактериальной инфекции (акро - и периоральный цианоз, дыхание с участием вспомогательной мускулатуры, втяжением межреберий, одышка свыше 80/мин, с ослаблением аускультативного дыхания в легких с обеих сторон; симптомы угнетения ЦНС; печень, селезенка не увеличены, общий анализ крови без особенностей; прокальцитонин крови 0,4 нг/мл).
В результате проведенного исследования были получены следующие результаты относительного содержания Аннексина V на моноцитах: Аннексин V на моноцитах при поступлении - 17,5%.
Обнаружение цифр относительного содержания Аннексина V на моноцитах 17,5% у новорожденного свидетельствовало о высоком риске развития неонатального сепсиса. На 4-е сутки терапии у ребенка появились признаки системной воспалительной реакции: повышение температуры тела до 39,3°С, тахиаритмия свыше 160/мин, в легких с обеих сторон выслушивались крепитирующие хрипы, наблюдалось увеличение размеров печени и селезенки, в общем анализе крови - нейтрофильный лейкоцитоз со сдвигом до юных, прокальцитонин крови - 12 нг/мл, что в сочетании с обнаружением роста в крови Ps. Aeruginosa позволило поставить клинический диагноз неонатального сепсиса. Благодаря своевременному усилению интенсивной и антибактериальной терапии, назначению иммуностимулирующих препаратов пациенту удалось сохранить жизнь. На фоне проводимой интенсивной терапии на 11-е сутки при повторном исследовании относительное содержание Аннексина V на моноцитах понизилось до 16,2%. На 16-е сутки ребенок был экстубирован и на 20-е сутки переведен в отделение патологии новорожденных для дальнейшего наблюдения и лечения. На момент перевода уровень относительного содержания Аннексина V на моноцитах составил 12,3%.
Предлагаемым способом было обследовано 80 новорожденных с синдромом дыхательных расстройств и перинатальным поражением ЦНС, находящихся на ИВЛ, получавших терапию в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных. У 28 детей уровень относительного содержания Аннексина V на моноцитах был выше 17,4%. У этих пациентов в дальнейшем был диагностирован неонатальный сепсис, подтвержденный клинико-лабораторным и бактериологическим обследованием. Благодаря ранней диагностике развития этого заболевания и своевременного усиления проводимой антибактериальной и интенсивной терапии лишь у 2-х пациентов зарегистрирован летальный исход. При паталогоанатомическом исследовании у всех погибших детей имел место неонатальный сепсис.
У 68 детей уровень относительного содержания Аннексина V на моноцитах был ниже 17,4%. Течение основного заболевания у этих пациентов развитием неонатального сепсиса не осложнилось.
Таким образом, исследование относительного содержания Аннексина V на моноцитах крови у новорожденных с респираторной патологией и перинатальным поражением ЦНС, находящихся на ИВЛ, позволяет говорить о том, что чувствительность заявляемого способа составляет 90,91%, а специфичность - 89,55%.
Исходя из вышеизложенного заявляемый способ прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных по сравнению с существующими методами имеет следующие преимущества:
1. Способ прогнозирует развитие неонатального сепсиса в наиболее ранние сроки, до развития тяжелого симптомокомплекса и полиорганной недостаточности, позволяя своевременно усилить проводимую антибактериальную и интенсивную терапию.
2. Способ относится к экспресс-диагностике (время выполнения 2 часа).
3. Предлагаемый способ является высокотехнологичной методикой, обладает высокой точностью и специфичностью и найдет широкое применение не только в отделениях реанимации, но и в других педиатрических стационарах.
Предлагаемый способ прогнозирования развития неонатального сепсиса у новорожденных с дыхательными расстройствами и перинатальным поражением ЦНС может использоваться в неонатологии, педиатрии и реаниматологии, дополняя известные методы лабораторной диагностики, позволяя своевременно и обоснованно назначать патогенетическую терапию, способствуя повышению выживаемости новорожденных и сокращая продолжительность терапии.