Масс-спектрометрия и квантовохимическое исследование процессов самоассоциации молекул глицирризиновой кислоты

Химия растительного сырья. 2013. №2. С. 85-92.

DOI: 10.14258/jcprm.1321085

УДК 542.06.542.61.542.46.808.542.97.542.93

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ И КВАНТОВОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ САМОАССОЦИАЦИИ МОЛЕКУЛ ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ

© С.Н. Борисенко1, A.B. Лекарь2, A.A. Милое3, Е.В. Ветрова1, Н.И. Борисенко2

1НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, пр. Стачки, 194/2, Ростов-на-Дону, 344090

Метод масс-спектрометрии с ионизацией элекгрораспылением использован для изучения процессов формирования автоассоциатов глицирризиновой кислоты (ГК). Данные масс-спектрометрии доказывают наличие димеров и тримеров ГК для образцов 0,2%-ного раствора моноаммониевой соли глицирризиновой кислоты при pH 5,5 и 2. Полученные данные согласуются с квантово-химическими расчетами самоассоциатов глицирризиновой кислоты. Квантово-химическими расчетами показано, что для глицирризиновой кислоты возможно образование кластеров общего вида Xn со значением n от 1 до n=6. При этом как по данным масс-спектрометрии, так и по результатам квантово-химических расчетов наибольшей стабильностью обладают кластеры, построенные по принципу «голова-хвост». В ассоциате ГК, состоящем из двух молекул, присутствует полость, достаточная для включения соразмерных молекул-гостей.

Ключевые слова: самоассоциация, глицирризиновая кислота, масс-спектрометрия, ионизация элекгрораспыле-нием, квантовохимические расчеты, комплексообразование, супрамолекулярные комплексы.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 11-03-12141-офи-м-2011, грантов Президента РФ по поддержке ведущих научных школ НШ-927.2012.3, МК-4425.2011 и гос. задания вузам на 2012 год (проект 3.5193.2011).

Введение

Четкое понимание механизмов терапевтического действия лекарственных препаратов на молекулярном уровне является одной из важнейших задач биохимии и медицинской химии, поскольку понимание процессов связывания и диссоциации лиганд - рецепторных комплексов - позволяет выявить причину действия лекарства, разработать методы для контроля действия лекарства и минимизировать возможные побочные эффекты для организма. До настоящего времени такие процессы изучены недостаточно полно: отсутствуют четкие представления о механизмах связывания лекарства с рецептором, нет данных о дальнейшей трансформации комплекса на активном центре рецептора, ведущей к его диссоциации. Одним из классов биологически активных веществ, широко используемых в качестве адъювантных средств (adjuvants), являются сапонины, чья селективная способность к образованию ассоциатов с молекулами

* Автор, с которым следует вести переписку.

Борисенко Сергей Николаевич — кандидат химических наук, старший научный сотрудник, тел.: (863) 224-12-74, e-mail: sborisen@ipoc.rsu.ru Лекарь Анна Владимировна - старший лаборант, тел. (863) 224-12-74, e-mail: lekarann@mail.ru МиловАлексей Александрович - кандидат химических наук, научный сотрудник, тел.: 908 510-88-00, e-mail: c-si-ge@mail.ru Ветрова Елена Владимировна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, тел.: (863) 224-12-74, e-mail: firefuntik@mail.ru Борисенко Николай Иванович - директор, кандидат химическихнаук, доцент, тел.: (863)-224-12-74, e-mail: boni@ipoc.rsu.ru

других веществ известна давно [1]. Это свойство сапонинов применяется в настоящее время при направленном поиске новых лекарственных субстанций с заданными характеристиками на основе комплексов типа «хозяин-гость» [2]. Привлекательность такого подхода состоит в том, что в качестве базового фрагмента можно использовать композиции известных, клинически апробированных препаратов. Кроме того, применение уже испытанных препаратов позволяет значительно снизить затраты на доклинические исследования и клиническую апробацию новых композиций.

Так, в настоящее время активно создаются лекарственные субстанции на основе известных базовых физиологически активных компонентов (фармаконов) и глицирризиновой кислоты (ГК) [3, 4]. При этом было обнаружено значительное количество примеров усиления действия ряда фармаконов в комплексах с ГК [5, 6], что позволяет уменьшить эффективные дозы лекарственных препаратов в 100-200 раз.

В процессах получения таких комплексов молекулы глицирризиновой кислоты выступают в роли полидентантных лигандов, образующих с базовыми фармаконами комплексы различной стехиометрии, которые и используются как низкодозные лекарственные субстанции. Изучение механизмов и процессов образования супрамолекулярных комплексов по типу «гость-хозяин», где сапонин, в качестве молекулы-«хозяина», может образовывать в гидрофильной среде эндолипофильную полость для молекулы гостя [7, 8], особенно важно для установления фундаментальных связей «структура-свойства».

При всей многочисленности примеров использования такого подхода [3-6] детали механизма процесса формирования низкодозных лекарственных комплексов глицирризиновой кислоты 1 с фармаконами в различных соотношениях (1 : 1, 1 : 2 и 1 : 4) до сих пор изучены недостаточно. Практически не известны данные по геометрии и свойствам самоассоциатов глицирризиновой кислоты, которые и определяют в значительной степени возможность образования полости внутри самоассоциатов глицирризиновой кислоты, так необходимой для размещения молекулы базового фармакона.

В этой связи целью данной работы стало доказательство формирования автоассоциатов ГК методами масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением и проведение квантово-химических расчётов для предсказания геометрии и свойств автоассоциатов глицирризиновой кислоты 1.

Экспериментальная часть

Съемки масс-спектров проведены с использованием масс-спектрометра «Bruker Daltonics micrOTOF-Q» с вводом пробы напрямую, ионизация электрораспылением, детектирование отрицательных и положительных ионов в интервале от 50 до 3000 Да с точностью не менее 1*10-2 Да. Напряжение на капилляре распылителя - ±4200 В, параметры газа-осушителя (азот «о.с.ч.», 5 л/мин, 200 °С) и энергия ионов на квад-руполе (5,0 эВ) оптимизированы для детектирования пиков псевдомолекулярных и ассоциатных ионов.

Для прямого ввода взяты растворы в ацетонитриле (фирма Merck, квалификация HPLC/MS) в концентрации до 0,2 мг/мл (10-7 ^ 10-6 М). Результаты масс-спектрометрии приведены в таблице 1.

Масс-спектры автоассоциатов глицирризиновой кислоты 1 получены для 0,2%-ного раствора моноаммониевой соли глицирризиновой кислоты при рН = 5,5 и 2 (добавка муравьиной кислоты).

Квантово-химические расчеты проводились при помощи пакета программ Gaussian-03 [9] полуэмпирическим методом PM3. Выбор этого приближения обусловлен размерами изучаемых ассоциатов, накладывающих ограничения на использование методов ab initio и теории функционала плотности [10]. Все

Масс-спектрометрия и квантовохимическое исследование

87

обсуждаемые далее структуры соответствуют минимумам на соответствующих поверхностях потенциальной энергии. Графические изображения молекулярных структур, представленные на рисунках, были получены с использованием программы СИешсгай [11], где в качестве исходных данных использовались результаты расчетов.

Обсуждениерезультатов

Для оценки возможностей масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением при доказательстве существования автоассоциатов ГК заключений сняты масс-спектры 0,2%-ного раствора моноаммониевой соли глицирризиновой кислоты при рН = 5,5 и 2 (добавка муравьиной кислоты)моноаммонийной КН4-соли глицирризиновой кислоты. Молекулярная масса глицирризиновой кислоты 1 С42И62016 составляет 822,370 Да. Типичный масс-спектр моноаммонийной МН4-соли глицирризиновой кислоты приведен на рисунке 1.

Рис. 1. Масс-спектр моноаммонийной МН4-соли глицирризиновой кислоты при рН = 2

Масс-спектры моноаммонийной МИ4-соли глицирризиновой кислоты при pH = 2 (рис. 1) регистрируют, при выбранных экспериментальных условиях, как наличие однозарядных пиков, отвечающих как молекулярному иону глицирризиновой кислоты, так и однозарядных пиков, соответствующих самоассо-циатам кислоты.

Так, например, пик, регистрируемый с m/z 821,36 (67% интенсивности), отвечает мономерному аниону [М-Н]- кислоты 1.

Димерному (содержащему две молекулы глицерризиновой кислоты) однозарядному моноаниону [2М-Н]- однозначно отвечает пик (3% интенсивности) с массой 1643,723 Да.

На этом же спектре регистрируется в отрицательных ионах, наряду с пиками мономеров и димеров ГК, двухзарядный пик с m/z 1232,541 (12% интенсивности), который отвечает тримерному автоассоциату кислоты 1. Такой тример может иметь строение сэндвича [(М-Н)+М+(М-Н)]-2 или [М+(М-2Н)+М]-2 (табл.).

Так как глицирризиновая кислота 1 является трехосновной кислотой, ее масс-спектр содержит, соответственно, пики мономерных псевдомолекулярного трианиона [М-3Н]-3 с m/z 273,106 и изотопного трианиона [М-3Н+1]-3 с m/z 273,443 (рис. 2).

Интенсивность пика [М-3Н]-3 в 54 раза меньше интенсивности пика [М-2Н]-2 ив 36 раз меньше интенсивности пика [М-Н]-, следовательно, в условиях ионизации электрораспылением при рН=2 трехосновная кислота 1 диссоциирует, в основном, по первой и второй ступеням.

В масс-спектре наблюдается пик с m/z 547,218, который отвечает димерному трианиону [(М-Н)+(М-2Н)]-3. Тримерному трехзарядному аниону [3М-3Н)]-3 в таком случае в масс-спектре должен соответствовать пик с m/z 821,36. Такой пик, однако, достоверно в полученных масс-спектрах не фиксируется. Последнее может объясняться тем, что его интенсивность <102. Убывание интенсивности пиков в ряду трех-зарядных анионов [М-3Н]-3 (2,3x104), [2М-3Н]-3 (2,9x103) и ожидаемого [3М-3Н]-3 (<102) позволяет прогнозировать практическое отсутствие трехзарядных анионов со степенью ассоциации более 3, при выбранных условиях ионизации. Наблюдаемые зависимости напрямую связаны с возрастанием роли кулоновских взаимодействий в процессах ионизации тримерных и выше ассоциатов.

Кулоновским отталкиванием можно объяснить также отсутствие димерных тетраанионов [(М-2Н)+(М-2Н)]-4 и [(М-Н)+(М-3Н)]-4, что подтверждено отсутствием пиков с m/z 410,179 для иона [2М-4Н]-4.

Характерно, что с увеличением pH от 2 до 5,5 доля трехзарядного аниона [М-3Н]-3 с m/z 273,106 увеличивается на 65%, тогда как доли ди- и моноанионов кислоты 1 изменяются менее существенно.

Таким образом, данные масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением подтверждают, что глицирризиновая кислота 1 образует димерные автоассоциаты за счет свободных карбоксильных групп в углеводной цепи и при атоме С-28 агликона. Причем устойчивость этих комплексов достаточна для преодоления кулоновского отталкивания в трианионе. Наибольшее зарегистрированное значение коэффициента ассоциации составляет 3 (автоассоциат [3М-2Н]-2 с m/z 1232,541; см. табл.).

Для объяснения полученных экспериментальных результатов выполнены квантово-химические расчеты кластеров ГК общего вида Xn (n=1-6). Показано, что бимолекулярная система ГК (n=2) образует устойчивые структуры 2-4, которые стабилизируются системой водородных мостиковых O-H-O связей. Характеристики данных структур приведены рисунке 3, где, в частности, показаны наименьшие длины связи между молекулами ГК. Комплекс 2 относится к типу «голова-голова», а комплексы 3-4 имеют структуру «голова-хвост». Расчеты показывают, что наибольшей устойчивостью обладают ассоциаты 3-4, энергии комплексообразования которых составляют 15-16 ккал/моль, что согласуется с моделью стабилизации димерных ассоциатов ГК по типу «голова к хвосту». Необходимо отметить, что наиболее энергетически устойчивый бимолекулярный ассоциат 4 имеет внутреннюю полость, достаточную для включения соразмерных молекул-гостей.

Косвенным подтверждением расчетных данных об образовании димерных ассоциатов кислоты 1 по типу «голова-хвост» может служить отсутствие в масс-спектрах (рис. 1) пика, отвечающего тримерному ассоциату [М+(М-Н)+М]- с m/z 2466,10.

Таким образом, данные масс-спектрометрии и результаты квантово-химических расчетов подтверждают формирование автоассоциатов глицирризиновой кислоты, при этом наибольшей стабильностью обладают димерные кластеры ГК, построенные по принципу «голова-хвост». Димерные кластеры ГК, по данным расчета, имеют внутреннюю полость, достаточную для включения соразмерных молекул-гостей [7, 8].

Масс-спектрометрия и квантовохимическое исследование

89

Наличие и строение автоассоциатов глицирризиновой кислоты 1

Соотношение m/z Заряд z Строение иона Коэффициент Относительная

ассоциации доля иона

273,106 и 273,443 -3 [М-3НГ3 1 8

410,179 и 410,678 -2 [М-2Н]-2 1 429

547,218 и 547,560 -3 [(М-Н)... (М-2Н)]-3 или [М... (М-3Н)]-3 2 1

821,362 -1 [М-Н]- 1 286

1232,541 -2 [(М-Н).М.(М-Н)]-2 3 52

или [М...(М-2Н)...М]-2

1643,723 -1 [(М-Н).М]- 2 13

Рис. 2. Фрагменты масс-спектра анионов глицирризиновой кислоты 1: трианиона [М-3Н] 3 с m/z 273,106 и

изотопного трианиона ГМ-3Н+11 3 с m/z 273,443

"VSA

АЕ(компл)= 16.2 ккал/моль

Рис. 3. Геометрическое строение бимолекулярных комплексов глицирризиновой кислоты

Заключение

Масс-спектрометрия с ионизацией электрораспылением использована для изучения процессов фор -мирования автоассоциатов глицирризиновой кислоты (ГК). Данные масс-спектрометрии доказывают наличие димеров и тримеров ГК для образцов 0,2%-ного раствора моноаммониевой соли глицирризиновой кислоты при рН 5,5 и 2.

Данные, полученные методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением, согласуются с проведенными квантово-химическими расчетами самоассоциатов глицирризиновой кислоты. Квантово-химическими расчетами показано, что для глицирризиновой кислоты возможно образование кластеров общего вида Xn со значением n от 1 до n=6. В ассоциате ГК, состоящем из двух молекул, присутствует полость, достаточная для включения соразмерных молекул-гостей.

Данные масс-спектрометрии и результаты квантово-химических расчетов демонстрируют, что наибольшей стабильностью обладают кластеры, построенные по принципу «голова-хвост».

Список литературы

1. Samthein-Graf C., La Mesa C. Association of saponins in water and water-gelatine mixtures // Thermochimica Acta. 2004. Vol. 418, N1-2. Pp. 79-84.

2. Sidhu G.S., Oakenfull D.G. A mechanism for the hypocholesterolaemic activity of saponins // British Journal of Nutrition. 1986. Vol. 55, N3. Pp. 643-649.

Масс-спектрометрия и квантовохимическое исследование

91

3. Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Шульц Э.Э. Покровский А.Г. Глицирризиновая кислота // Биоорганическая химия. 1997. Т. 23, №9. C. 691-703.

4. Толстикова Т.Г., Толстиков А.Г., Толстиков Г.А. На пути к низкодозным лекарствам // Вестник Российской академии наук. 2007. Т. 77, №10. C. 867-874.

5. Стоник В.А., Толстиков Г.А. Природные соединения и создание отечественных лекарственных препаратов // Вестник Российской академии наук. 2008. Т. 78, №8. C. 675-682.

6. Толстикова Т.Г., Сорокина И.В., Брызгалов А.О., Лифшиц Г.И., Хвостов М.В. Использование подхода ком-плексообразования с глицирризиновой кислотой для создания новых кардиотропных средств // Биомедицина. 2006. №4. C. 115-117.

7. Vögtle F., Weber E. Multidentate acyclic neutral ligands and their complexation // Angewandte Chemie Int. Ed. 1979. Vol. 18, N10. P. 753-776.

8. Weber E., Vögtle F. Classification and nomenclature of coronands, cryptands, podands, and of their complexes // Inorg. Chim. Acta. 1980. Vol. 45, N2. P. 65-67.

9. Frisch M.J., Trucks G.W., Schlegel H.B., Scuseria G.E., Robb M.A., Cheeseman J.R., Zakrzewski V.G., Montgomery J.A. Jr., Stratmann R.E., Burant J.C., Dapprich S., Millam J.M., Daniels A.D., Kudin K.N., Strain M.C., Farkas O., Tomasi J., Barone V., Cossi M., Cammi R., Mennucci B., Pomelli C., Adamo C., Clifford S., Ochterski J., Peters-son G.A., Ayala P.Y., Cui Q., Morokuma K., Salvador P., Dannenberg J.J., Malick D.K., Rabuck A.D., Raghava-chari K., Foresman J.B., Cioslowski J., Ortiz J.V., Baboul A.G., Stefanov B.B., Liu G., Liashenko A., Piskorz P., Komaromi I., Gomperts R., Martin R.L., Fox D.J., Keith T., Al-Laham M.A., Peng C.Y., Nanayakkara A., Challa-combe M., Gill P.M.W., Johnson B., Chen W., Wong M.W., Andres J.L., Gonzalez C., Head-Gordon M., Re-plogle E.S., Pople J.A. Gaussian 98. Revision A.9. Gaussian, Inc., Pittsburgh PA. 1998.

10. Стариков А.Г., Миняев P.M., Старикова A.A., Минкин В.И. Механизм аддуктообразования пиридина с ß-ди-кетонатами Zn(II) и Cu(II) // Вестник ЮНЦ РАН. 2011. Т. 7, №2. С. 27-34.

11. Chemcraft. URL: www.chemcraftprog.com. Version 1.6 (build 304).

Поступило в редакцию 21 мая 2012 г.

После переработки 23 октября 2012 г.

Borisenko S.N.1, Lekar A.V.2, Milov A.A.3, Vetrova E.V.1, Borisenko N.I.2* MASS-SPECTROMETRY AND QUANTUM-CHEMICAL STUDY ^A SELF-ASSOCIATION PROCESSES OF GLYCYRRHIZINIC ACID MOLECULES institute of Physical and Organic Chemistry, Southern Federal University, Stachka Ave, 194/2, Rostov-on-Don, 344090

2Ecological and Analytical Center, Southern Federal University,Zorge Str., 7, Rostov-on-Don, 344090 (Russia), e-mail: boni@ipoc.rsu.ru

3Southern Scientific Center of Russian Academy of Sciences, st. Chehova, 41, Rostov-on-Don, 344006

The mass spectrometry with electrospray ionization has used to study the processes of the formation the self-association complexes Glycyrrhizinic acid (GA). The data of mass spectrometry have proved the presence of dimers and trimers of GA for samples of 0,2% Monoammonium salt of GA at pH 5,5 and pH 2. These data are consistent with the quantum-chemical calculations of self-associates of glycyrrhizic acid. The quantum-chemical calculations predict the formation of clusters of the general form Xn with a value of n from 1 to n = 6. The data of mass spectrometry and the results of quantum chemical calculations demonstrated that the most stable clusters have built on the principle of «head - tail». Self-associated complex of GA composed of two molecules of GA create a cavity between them, with the size which is enough to include guest molecules with the similar size.

Keywords: self-association, glycyrrhizinic acid, mass-spectrometry, electrospray ionization, quantum-chemical research, complexation, supramolecular complex.

References

1. Sarnthein-Graf C., La Mesa C. Thermochimica Acta, 2004, vol. 418, no. 1-2, pp. 79-84.

2. Sidhu G.S., Oakenfull D.G. British Journal of Nutrition, 1986, vol. 55, no. 3, pp. 643-649.

3. Tolstikov G.A., Baltina L.A., Shul'ts E.E. Pokrovskii A.G. Bioorganicheskaia khimiia, 1997, vol. 23, no. 9, pp. 691-703. (in Russ.).

4. Tolstikova T.G., Tolstikov A.G., Tolstikov G.A. Vestnik Rossiiskoi akademii nauk, 2007, vol. 77, no. 10, pp. 867-874. (in Russ.).

5. Stonik V.A., Tolstikov G.A. Vestnik Rossiiskoi akademii nauk, 2008, vol. 78, no. 8, pp. 675-682. (in Russ.).

6. Tolstikova T.G., Sorokina I.V., Bryzgalov A.O., Lifshits G.I., Khvostov M.V. Biomeditsina, 2006, no. 4, pp. 115-117. (in Russ.).

7. Vogtle F., Weber E. Angewandte Chemie Int. Ed., 1979, vol. 18, no. 10. pp. 753-776.

8. Weber E., Vogtle F. Inorg. Chim. Acta., 1980, vol. 45, no. 2, pp. 65-67.

9. Frisch M.J., Trucks G.W., Schlegel H.B., Scuseria G.E., Robb M.A., Cheeseman J.R., Zakrzewski V.G., Montgomery J.A. Jr., Stratmann R.E., Burant J.C., Dapprich S., Millam J.M., Daniels A.D., Kudin K.N., Strain M.C., Far-kas O., Tomasi J., Barone V., Cossi M., Cammi R., Mennucci B., Pomelli C., Adamo C., Clifford S., Ochterski J., Pe-tersson G.A., Ayala P.Y., Cui Q., Morokuma K., Salvador P., Dannenberg J.J., Malick D.K., Rabuck A.D., Raghava-chari K., Foresman J.B., Cioslowski J., Ortiz J.V., Baboul A.G., Stefanov B.B., Liu G., Liashenko A., Piskorz P., Komaromi I., Gomperts R., Martin R.L., Fox D.J., Keith T., Al-Laham M.A., Peng C.Y., Nanayakkara A., Challa-combe M., P.M.W. Gill, Johnson B., Chen W., Wong M.W., Andres J.L., Gonzalez C., Head-Gordon M., Re-plogle E.S., Pople J.A. Gaussian 98. Revision A.9. Gaussian, Inc., Pittsburgh PA. 1998.

10. Starikov A.G., Miniaev R.M., Starikova A.A., Minkin V.I. Vestnik Iuzhnogo nauchnogo tsentra RAN, 2011, vol. 7, no. 2, pp. 27-34. (in Russ.).

11. Chemcraft. URL: www.chemcraftprog.com. Version 1.6 (build 304).

Received May 21, 2012 Revised October 23, 2012

* Corresponding author.