СПОСОБ МОДИФИЦИРОВАНИЯ УГЛЕРОДНОГО ГЕМОСОРБЕНТА
METHOD OF MODIFYING CARBON HEMOSORBENT

Настоящее изобретение относится к технологии получения углеродных сорбентов с поверхностными функциональными группами определенной химической природы, формирующими селективный характер сорбции высокомолекулярных белковых соединений основного характера. Предназначено для применения в сорбционной терапии, биотехнологии.
К сорбентам, избирательно выводящим из организма высокомолекулярные токсические соединения белковой природы, проявляется значительный интерес на протяжении последних лет. Их применение позволяет управлять терапевтическим действием, индивидуализировать сорбционную терапию в каждом конкретном случае (Картель Н.Т. Изменение свойств углеродных сорбентов медицинского назначения как способ управления их терапевтическим действием // Эндогенные интоксикации: материалы Междунар. симпозиума «Эндогенные интоксикации», г.С-Петербург, 14-16 июня 1994 г.С-Петербург, 1994. С.141).
Разработан комплекс физических и химических способов повышения адсорбционной активности углеродных гемосорбентов и ее избирательности по отношению к белковым соединениям. Из физических наиболее известен и применим способ, направленный на изменение их пористой структуры, увеличение объема соразмерных молекулам белка крупных мезо- и макропор. Способ модифицирования не специфичен и не универсален, приводит к снижению прочности гранул и усилению пылевыделения в биологическую жидкость (Сигал В.Л. и др. Изменение пористой структуры активированных углей медицинского назначения при их обеззоливании // Журнал прикладной химии. 1991. №11. С.2349-2354).
Методы химического модифицирования углеродных сорбентов направлены на изменение химической природы поверхности путем закрепления на ней разнополярных поверхностных функциональных групп, белковых соединений, полимерных пленок (капсулирование) и др. (Streiko V.V., Malik D.J., Streat M. Characterisation of the surface of oxidised carbon adsorbents. // Carbon. 2002. V.40. P.95-104; патент РФ №2118898; Коваленко Г.А. Методы получения биоспецифических гемосорбентов // Химико-фармацевтический журнал. 1998. №3. С.36-40; Бакалинская О.Н., Сухаренко Н.В., Стрелко В.В Сорбционные свойства углеродных гемосорбентов с иммобилизованными белками // Украинский химический журнал, 1989, №12, С.1273-1276; Комов В.В. и др. Первый опыт применения отечественных покрытых сорбентов «ТЭТРА». // Актуальные проблемы очищения крови, нефрологии, гемафереза: материалы I Объединенного конгресса; г.Москва, 29-31 мая 2002 г. /. М.: Изд. НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, 2002. С.212).
Данные способы модифицирования повышают качество углеродных адсорбентов. Закрепленная при капсулировании на поверхности адсорбента модифицирующая пленка выравнивает ее рельеф, повышает прочность гранул и снижает выделение углеродной пыли в биологическую жидкость, повышает его биосовместимость. Основным недостатком модифицирования методом капсулирования является полное покрытие поверхности сорбента пленкой полимерного модификатора, которая значительно меняет исходную пористую структуру, ухудшает динамику процесса сорбции из биологических жидкостей за счет повышения диффузионной составляющей. Технологический процесс нанесения модификатора отличается многоступенчатостью, сложностью, разной прочностью закрепления на поверхности, допускающей десорбцию и переход в биологическую жидкость. Недостатком модифицирования сорбента окислением поверхности является неконтролируемое изменение его пористой структуры, отсутствие селективности при образовании и последующем закреплении на ней функциональных групп и гетероатомов (окислы марганца, азота и другие).
Известен способ модифицирования поверхности сорбента прозрачным покрытием из конформеров человеческого сывороточного альбумина (Николаев В.Г., Корнеева Л.Н., Сарнацкая В.В. и др. Биолизация поверхности высокоактивных углеродных сорбентов конформерами человеческого сывороточного альбумина // Эфферентная терапия. 2005.. №3. С.10-20). Прозрачное покрытие снижает влияние диффузионных процессов при прохождении адсорбируемых веществ к поверхности сорбента. Однако процесс модифицирования трудоемок и не гарантирует стабильности качества полученного продукта.
Данных недостатков лишен метод химического модифицирования углеродного сорбента с частичным покрытием поверхности, обеспечивающим прочное закрепление модификатора на отдельных ее участках. «Островковый» характер закрепления модификатора частично сохраняет исходную структуру сорбента и присущий углеродной поверхности механизм физический адсорбции веществ. Входящие в состав модификатора кислород- и азотсодержащие функциональные группы выполняют роль дополнительных специфических центров адсорбции белковых молекул, усиливают адсорбционную активность модифицированного углеродного гемосорбента и селективный характер адсорбции. Способ модифицирования с частичным покрытием поверхности модификатором наиболее приемлем для углеродных сорбентов высокого качества с преимущественным содержанием мезопор.
Наиболее близким к предлагаемому является способ модифицирования углеродного гемосорбента аминокапроновой кислотой. Осуществляется пропиткой гранул углеродного гемосорбента водным раствором аминокапроновой кислоты концентрацией 5-20% при соотношении гемосорбент: раствор аминокапроновой кислоты 1:10-1:20 при температуре 25-90°C в течение 2-4 ч. Гемосорбент выделяют из раствора фильтрованием с последующей сушкой, выдержкой при температуре 120-350°C в инертной среде в течение 0,25-6 ч, кипячением в дистиллированной воде в течение 1-3 ч и высушиванием полученного продукта на воздухе при комнатной температуре (патент РФ №2440844, прототип).
БЭТ
Модифицирование приводит к увеличению концентрации кислородсодержащих функциональных групп кислотной природы (в 2-3 раза), снижению величины удельной адсорбционной поверхности S, суммарного объема пор. Данные изменения повышают его адсорбционную способность по отношению к белковым соединениям фракции средних метаболитов, состоящих из пептидов, гликопептидов, полиаминов и других соединений с молекулярной массой до 150 кДа.
Углеродный гемосорбент, модифицированный полимером аминокапроновой кислоты, как и другими модификаторами кислотного характера, недостаточно активен по отношению к высокомолекулярным белковым соединениям основного характера.
Целью изобретения является повышение адсорбционной емкости углеродного гемосорбента по отношению к белковым соединениям основного характера.
2
-
Поставленная цель достигается нанесением на поверхность углеродного гемосорбента аминокислоты аргинина, имеющей в своем составе два центра основного характера (аминогруппа (NH-) в α-положении и гуанидиновая - в δ-положении) и кислотный центр в виде карбоксильной (СООН) группы. Гуанидиновая группа в боковой цепи молекулы аргинина придает ей сильно основный характер и определяет химическую природу поверхности модифицированного углеродного сорбента.
Предлагаемый способ модифицирования углеродного гемосорбента включает пропитку гранул водным раствором аминокислоты, фильтрование и сушку с последующей выдержкой в инертной среде и высушиванием полученного продукта и отличается тем, что в качестве модификатора аминокислоты используют аргинин в виде водного раствора с концентрацией 10-15%, пропитку, фильтрование и сушку гранул проводят дважды, при этом пропитку проводят при соотношении гемосорбент: раствор аргинина 1:2-5, температуре 20-25°С в течение 0,5-1,5 ч и постоянном перемешивании, а последующую выдержку в потоке инертного газа проводят при температуре 150-200°С в течение 0,25-0,5 ч.
2
3
В качестве исходного материала используют углеродный гемосорбент со следующими характеристиками: удельная адсорбционная поверхность 300-400 м/г, суммарный объем пор не менее 0,4 см/г, из них более 80% составляет объем мезопор; содержание на поверхности кислородных функциональных групп кислотного характера 0,060-0,070 мэкв/г, из них карбоксильных групп 0,051-0,058 мэкв/г, фенольных 0,009-0,012 мэкв/г, при отсутствии азотсодержащих групп.
Отличительными признаками данного изобретения являются:
1. Модифицирование поверхности гемосорбента мономером - нетоксичной аминокислотой аргинином.
2. Процесс модифицирования состоит из нескольких стадий:
- пропитка поверхности углеродного гемосорбента раствором аргинина концентрацией 10-15% при соотношении гемосорбент: раствор модификатора 1:2-5, температуре 20-25°C и непрерывном перемешивании в течение 0,5-1,5 ч с последующим отделением гемосорбента от пропитывающего раствора и высушиванием его при температуре 100-120°C до постоянной массы;
- вторичная пропитка поверхности высушенного углеродного гемосорбента раствором аргинина в тех же условиях;
- проведение процесса поликонденсации нанесенного на поверхность аргинина в инертной среде при температуре 150-200°C в течение 0,25-0,5 ч;
- высушивание модифицированного углеродного гемосорбента при температуре 100-120°C до постоянной массы.
Снижение концентрации аргинина в модифицирующем растворе менее 10% не приводит к существенному изменению химической природы поверхности модифицированного образца углеродного гемосорбента.
Увеличение концентрации аргинина в модифицирующем растворе более 15% нецелесообразно, т.к. превышает его растворимость в воде. Это приводит к неполному растворению аргинина в воде, образованию осадка, влияющего на процесс поликонденсации.
Двойная пропитка углеродного гемосорбента раствором аргинина проводится с целью повышения концентрации функциональных групп основного характера на его поверхности.
Предлагаемый по заявке способ модифицирования изменяет пористую структуру исходного гемосорбента и химическую природу его поверхности. Результаты, иллюстрирующие параметры пористой структуры и химической природы поверхности модифицированного гемосорбента, а также адсорбционных свойств по отношению к белкам-маркерам по сравнению с прототипом, приведены в таблице 1.
Анализ изменений пористой структуры и химической природы поверхности модифицированного гемосорбента показал, что в процессе модифицирования практически полностью закрываются микропоры с размерами до 2 нм, не участвующие в процессе сорбции крупных белковых молекул. Применение растворов аргинина концентрацией 10-15% позволяет сохранить значительный объем мезопор исходного гемосорбента, по сравнению с прототипом, при снижении объема макропор в 3-10 раз. Концентрация кислородсодержащих групп кислотного характера на поверхности прототипа составляет 0,187 мэкв/г, у модифицированных аргинином образцов снижается до 0,057 мэкв/г.Повышается концентрация групп основного характера до 0,272 мэкв/г по сравнению с прототипом (0,008 мэкв/г), содержание азота до 3,74%.
Изменения пористой структуры и химической природы поверхности вносят свой вклад в механизм сорбции белковых молекул, усиливая специфичность процесса. При контакте поверхности углеродного гемосорбента с крупными молекулами белковой природы, имеющими большое число возможных центров связывания, характерную для углеродных сорбентов физическую сорбцию веществ существенно дополняет сорбция за счет специфического связывания активных функциональных групп поверхности сорбента и поверхности белка. Гуанидиновая группа закрепленного на поверхности сорбента полиаргинина в растворе с рН<10 переходит в протонированную катионную форму, при этом резонансная делокализация заряда внутри группы делает молекулу сильно основной (рКа 12,48). В растворе с рН<10 белковые молекулы с изоэлектрической точкой рI~10-11 приобретают положительный заряд и способны адсорбироваться на активных центрах модифицированного углеродного гемосорбента за счет специфического взаимодействия (ионного обмена, донорно-акцепторного, водородной связи и др.).
Повышение адсорбционной активности модифицированного предлагаемым способом углеродного гемосорбента по отношению к белкам основного характера доказывают примеры сорбции им из растворов маркеров белоксвязывающей способности - лизоцима и альбумина, приведенные в таблице 1.
Согласно данным таблицы, максимальная степень извлечения лизоцима (рI 10,2) из раствора поверхностью гемосорбента, модифицированной аргинином, составила 70%, альбумина (рI 5,8) - 54%. В этих же условиях гемосорбент, модифицированный аминокапроновой кислотой, извлекает из раствора 36% лизоцима и 78% альбумина.
Определения основных физико-химических характеристик образцов углеродного гемосорбента проводились стандартными методами, применяемыми при исследовании пористых материалов. Качественные изменения химической природы поверхности образцов углеродного гемосорбента - методом ИК-спектроскопии на Фурье-спектрометре “Nicolet 5700” фирмы Thermo Electron Corporation; количественное содержание кислородсодержащих групп - химическим методом (метод Boehm) по взаимодействию с химическими реагентами различной природы и потенциометрическим титрованием; азота - методом Кьельдаля. Основные текстурные характеристики - удельную адсорбционную поверхность, суммарный объем пор и распределение объема по размерам пор определяли расчетным путем по данным изотерм адсорбции-десорбции азота, полученным на приборе Gemini-2380, Micromeritics. Величину адсорбционной удельной поверхности рассчитывали по уравнению БЭТ. Определение сорбции белков-маркеров из растворов проводили спектрофотометрическим методом на спектрофотометре «SESIL-1021».
Изобретение иллюстрируется следующими примерами адсорбционной активности модифицированных образцов углеродного гемосорбента по отношению к белковым соединениям.
Пример 1 (по прототипу). Навеску гемосорбента пропитывают 10%-ным водным раствором аминокапроновой кислоты в соотношении 1:10 при температуре 25°C в течение 4 ч и постоянном перемешивании, затем отделяют гемосорбент фильтрованием, высушивают при температуре 105°C до постоянного веса, помещают навеску в реактор и при температуре 200°C в инертной среде в течение 2 ч проводят самокатализируемую гомополиконденсацию нанесенной аминокапроновой кислоты, далее часть аминокапроновой кислоты, не вступившей в реакцию поликонденсации, удаляют при кипячении гемосорбента в дистиллированной воде в течение 1 ч, после чего высушивают гемосорбент при комнатной температуре в течение 10 ч.
БЭТ
2
3
3
3
Навеску модифицированного углеродного гемосорбента (0,2 г) с текстурными показателями: S=145 м/г, суммарным объем пор 0,492 см/г, в т.ч. мезопор 0,445 см/г, макропор 0,047 см/г; концентрацией кислородсодержащих групп на поверхности гранул 0,187 мэкв/г, из них: карбоксильных 0,129 мэкв/г, фенольных 0,058 мэкв/г, основного характера 0,008 мэкв/г, азота 1,09%, заливают раствором альбумина (человеческий сывороточный альбумин производства филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Омское предприятие по производству бактериальных препаратов», г.Омск) концентрацией 2 мг/мл в буферном растворе рН 7,4 и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Концентрацию раствора альбумина до и после контакта с навеской гемосорбента измеряют на длине волны 280 нм спектрофотометра, расчетным путем определяют степень его извлечения, которая составила 78%.
Навеску модифицированного углеродного гемосорбента (0,2 г) с теми же текстурными характеристиками, концентрацией кислородсодержащих групп на поверхности и азота заливают раствором лизоцима (производство «Sigma-Aldrich», США) концентрацией 1,0 мг/мл в буферном растворе рН 7,4 и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Концентрацию раствора лизоцима до и после контакта с навеской гемосорбента измеряют на длине волны 280 нм, расчетным путем определяют степень извлечения, которая составила 36%.
БЭТ
2
3
3
3
Пример 2. Навеску углеродного гемосорбента пропитывают 15%-ным раствором аргинина рН 10,76 при соотношении гемосорбент: раствор модификатора 1:2 и перемешивании в течение 1,5 ч, отделяют гемосорбент от раствора, высушивают при температуре 110°C. Проводят повторную пропитку и сушку гемосорбента в тех же условиях. Проводят самокатализируемую гомополиконденсацию нанесенного на поверхность аргинина при температуре 200°C в инертной среде в течение 0,5 ч, сушат гемосорбент при температуре 110°C до постоянной массы. Полученный модифицированный гемосорбент характеризуется следующими характеристиками: удельная адсорбционная поверхность S=245 м/г, суммарным объем пор 0,462 см/г, в т.ч. мезопор 0,449 см/г, макропор 0,013 см/г; концентрацией кислородсодержащих групп 0,195 мэкв/г, из них: карбоксильных 0,114 мэкв/г, фенольных 0,081 мэкв/г, основных 0,239 мэкв/г, содержание азота 2,97%. Степень извлечения белковых молекул составила: альбумина 38%, лизоцима 55%.
БЭТ
2
3
3
3
Пример 3. Аналогично примеру 2, но для модифицирования применяют 10%-ный раствор аргинина при соотношении гемосорбент: раствор модификатора 1:2 и перемешивании в течение 0,75 ч, а поликонденсацию проводят при температуре 180°C в в течение 0,33 ч. Модифицированный гемосорбента характеризуется удельной адсорбционной поверхностью S=257 м/г, суммарным объем пор 0,575 см/г, в т.ч. мезопор 0,564 см/г, макропор 0,011 см/г; концентрацией кислородсодержащих групп 0,162 мэкв/г, из них: карбоксильных 0,086 мэкв/г, фенольных 0,076 мэкв/г, основных групп 0,258 мэкв/г, содержание азота 3,36%, степень извлечения белковых молекул: альбумина 44%, лизоцима 62%.
БЭТ
2
3
3
3
Пример 4. Аналогично примеру 2, но при модифицировании соотношение гемосорбент: раствор модификатора 1:5 и перемешивание в течение 1 ч, поликонденсация при температуре 160°C в течение 0,25 ч. Модифицированный гемосорбент характеризуется удельной адсорбционной поверхностью S=25 м/г, суммарным объем пор 0,439 см/г, в т.ч. мезопор 0,422 см/г, макропор 0,017 см/г; концентрацией кислородсодержащих групп 0,057 мэкв/г, в т.ч. карбоксильных 0,010 мэкв/г, фенольных 0,047 мэкв/г, основных 0,272 мэкв/г, содержание азота 3,74%, степень извлечения альбумина 54%, лизоцима 70%.
БЭТ
2
3
3
3
Пример 5. Аналогично примеру 3, но соотношение гемосорбент: раствор модификатора 1:5 и перемешивание в течение 0,5 ч, поликонденсация при температуре 170°C в течение 0,4 ч. Модифицированный гемосорбент характеризуется: удельной адсорбционной поверхностью S=240 м/г, суммарным объем пор 0,550 см/г, в т.ч. мезопор 0,543 см/г, макропор 0,007 см/г; концентрацией кислородсодержащих групп 0,083 мэкв/г, в т.ч. карбоксильных 0,031 мэкв/г, фенольных 0,052 мэкв/г, основных 0,247 мэкв/г, содержание азота 3,21%, степень извлечения альбумина 41%, лизоцима 58%.
2
3
3
3
2
Как следует из приведенных примеров, условия процесса модифицирования углеродного гемосорбента раствором аргинина оказывают значительное влияние на адсорбционные свойства конечного модифицированного продукта. Наибольшее влияние на процесс модифицирования и качество полученного продукта оказывает температура поликонденсации, определяющая возможность протекания параллельных реакций и получения полиаргинина с иной структурой и адсорбционной активностью. Модифицирование по предлагаемому способу и выбранных условиях (пример 4) создает условия для закрепления на поверхности гемосорбента максимального количества групп основного характера 0,272 мэкв/г и общего азота 3,74% при текстурных характеристиках: удельная адсорбционная поверхность 225 м/г, суммарный объем пор 0,439 см/г, в том числе мезопор 0,422 см/г, макропор 0,017 см/г. Образец, на поверхности которого поликонденсация аргинина проводилась при температуре 200°C, содержит групп основного характера 0,239 мэкв/г и общего азота 2,97% азота при удельной адсорбционной поверхности 245 м/г (пример 2).
Увеличение на поверхности модифицированного углеродного гемосорбента кислородных групп основного характера (более чем в 3 раза) и снижение концентрации групп кислотного характера (в 4 раза) способствует повышению его адсорбционной активности по отношению к белковым молекулам основного характера, т.е. усиливает селективный характер адсорбции. Это позволяет сделать вывод об эффективности данного способа модифицирования углеродных сорбентов.
Образец с максимальным содержанием групп основного характера (0,272 мэкв/г) и общего азота (3,74%) выбран для оценки адсорбционной активности в стендовых испытаниях, проведенных в Центральной научно-исследовательской лаборатории (ЦНИЛ) Омской государственной медицинской академии на плазме больных панкреатитом. Активность гемосорбента оценивалась по отношению к белку регуляторного типа - цитокину интерлейкин - 8 (IL 8), с изоэлектрической точкой рI 9,9 (таблица 2).
Содержание цитокинов существенно повышается при ряде заболеваний, например остром и хроническом эндотоксикозах. Их избыток ведет к снижению, а затем и подавлению чувствительности собственной системы детоксикации организма больного и определяет извращенный ответ на медикаментозную терапию при этих состояниях. Со снижением количества цитокинов ниже критического уровня связывают так называемый "деблокирующий" эффект методов экстракорпоральной гемокоррекции, в том числе и гемосорбции, на систему детоксикации организма.
По данным таблицы 2, модифицирование гемосорбента аргинином позволяет повысить его адсорбционную активность по отношению к белкам основной природы.
Таблица 2
Степень извлечения цитокина интерлейкин - 8 (IL 8) pi 9,9 из плазмы крови больных, %
Образец
По примеру 1 (прототип)
56±3
По примеру 4
85±2