Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты)
AGENT FOR INDUCTION OF SPECIFIC IMMUNITY AGAINST SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS (SARS-COV-2) IN LIQUID FORM (VERSIONS)

Область техники.
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
Уровень техники.
Эпидемия коронавирусной инфекции COVID-19, которая началась в конце 2019 года в Китайской Народной Республике, за несколько месяцев распространилась по всему миру и бросила беспрецедентный вызов современной системе здравоохранения. В настоящее время число заболевших COVID-19 более106млн человек, а число погибших более 2,3 млн человек.
Возбудителем заболевания является одноцепочечный РНК-содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae к линии Beta-CoV.
Коронавирус передается от человека к человеку воздушно-капельным, воздушно-пылевым и контактным путями. Инкубационный период составляет в среднем 5-6 дней, после чего развиваются первые симптомы заболевания. Для COVID-19 характерными симптомами являются: повышение температуры тела, сухой кашель, отдышка, утомляемость. Реже встречаются - боль в горле, в суставах, насморк, головная боль. При этом тяжесть заболевания может варьироваться, от бессимптомной инфекции до тяжелого острого респираторного синдрома и смерти.
Быстрое распространение SARS-CoV-2 и высокий процент смертности создали острую необходимость в разработке эффективных средств профилактики заболеваний, вызываемых данным вирусом. Разработка безопасной и эффективной вакцины против SARS-CoV-2 в настоящее время является важнейшим глобальным приоритетом.
В течение года после начала пандемии различные фармацевтические компаний предложили свои варианты кандидатной вакцины против COVID-19.
Фармацевтическая компания Pfizer при сотрудничестве с биотехнологической компанией BioNTech разработала вакцину BNT162b2 (tozinameran). Данная вакцина представляет собой липидные наночастицы, внутрь которых инкапсулирована модифицированная мРНК, кодирующая мутантную форму S белка SARS-CoV-2. Схема вакцинации предполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 21 день (F.P. Polacketal. SafetyandEfficacyoftheBNT162b2 mRNACovid-19 Vaccine. NEnglJMed 2020; 383: 2603-2615).
Фармацевтическая компания Moderna в сотрудничестве с Национальным Институтом здоровья (США) разработала вакцину mRNA-1273. Активным компонентом данной вакцины является мРНК, кодирующая S белок SARS-CoV-2, которая окружена липидной оболочкой. Схема вакцинациипредполагает двукратную иммунизацию с интервалом в 28 дней (L. A. Jacksonetal. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 — Preliminary Report. NEnglJMed 2020; 383:1920-1931 ).
Оксфордский университет в сотрудничестве с фармацевтической компанией AstraZeneca разработал векторную вакцину ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222). Активным компонентном данной вакцины является аденовирус шимпанзе ChAdOx1, содержащий кодон-оптимизированную кодирующую последовательность полноразмерного S белка вируса SARS-CoV-2 (GenBank MN908947) с лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена. Схемавакцинациипредполагаетдвукратнуюиммунизациюсинтерваломв 28 дней (M. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. TheLancet. Vol. 397, Issue 10269, P99-111, 2021).
Компания CanSino разработала векторную вакцину против COVID-19, в основе которой репликативно-дефектный аденовирус человека 5 серотипа (Ad5), экспрессирующий полноразмерный S гликопротеин SARS-CoV-2. Схема вакцинации предусматривает однократную иммунизацию. (GenBankYP_009724390) (Feng-CaiZhuetal. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. TheLancet. Vol. 369, Issue 10249, P479-488, 2020).
Исследовательскиегруппы Johnson and Johnson и Janssen Pharmaceutical.всотрудничествесМедицинскимцентром Beth Israel Deaconess, спомощьютехнологии Janssen AdVac создалинесколькокандидатныхвакцин. После проведенных исследований безопасности и эффективности была выбрана кандидатная вакцина Ad26.COV2.S (Ad26COVS1). Активным компонентном данной вакцины является рекомбинантный аденовирусный вектор 26 серотипа с делецией Е1 и Е3 области, содержащий ген S белка SARS-CoV-2, с мутацией сайта расщепления фурина и с двумяпролин-стабилизирующими мутациями. В настоящий момент исследуются две схемы вакцинации: однократная и двукратная с интервалом 8 недель (J. Sadoff etal. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. NEnglJMed, 2021 Jan 13.DOI: 10.1056 / NEJMoa2034201).
Таким образом, можно отметить, что большая часть вакцин против COVID-19 предполагают двукратную вакцинацию.
Каждая из представленных вакцин имеет свои сильные стороны и недостатки. Так, вакцины на основе РНК обладают менее выраженными побочными эффектами, но по сравнению с векторными вакцинами обладают меньшей иммуногенностью. Кроме того, РНК более хрупкая, чувствительная к условиям хранения.
Вакцины, основанные на рекомбинантных вирусных векторах, обладают высокой иммуногенностью. Однако недостатком данного типа вакцин является возможность формирования иммунного ответа на векторную часть, что затрудняет ревакцинацию. Также за счет того, что аденовирусы циркулируют в популяции человека, часть населения может иметь предсуществующий иммунитет против данных вирусов. Экспрессионные векторы, основанные на аденовирусах других млекопитающих, позволяют решить проблему с предсуществующим иммунитетом, однако, такие векторы хуже проникают в клетки человека, а за счет этого снижается эффективность вакцин.
Техническое решение согласно патенту РФ №2731342 (опубликован 01.09.2020), выбрано авторами заявляемого изобретения за прототип. Из данного патента известны варианты фармацевтического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2:
- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
- содержащее компонент 1, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма simian adenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, а также содержащее компонент 2, представляющий собой средство в виде экспрессионного вектора на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3.
Кроме того, в данном патенте раскрыто применение указанных вариантов средств для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, включающее использование компонента 1 и 2 в эффективном количестве последовательно с интервалом не менее 1 недели.
Нужно отметить, что такой способ применения имеет ряд недостатков. Так, например, каждый из компонентов фармацевтического средства может вызывать побочные эффекты и аллергические реакции, следовательно при двукратной схеме вакцинации, количество таких явлений будет возрастать. Также такая схема иммунизации имеет ряд практических трудностей, заключающихся в том, что необходимо обеспечить явку пациентов с определенным интервалом времени. Кроме того, имеется ряд логистических трудностей, связанных со своевременной доставкой нужных компонентов   средства.
Таким образом, в области техники существует потребность в расширении арсенала фармацевтических средств, способных индуцировать иммунный ответ против вируса SARS-CoV-2 у широких слоев населения.
Технической задачей заявленной группы изобретений является создание средств, содержащих один активный компонент, и при этом обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 у широких слоёв населения.
Раскрытие сущности изобретения
Решением технической задачи является вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из  SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
Также создан вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
Кроме того, заявлен вариант средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащего в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
При этом,частном случае его выполнения, буферный раствор средства для жидкой формы содержит, масс. %:
трис
от 0,1831 до 0,3432
хлорид натрия
от 0,3313 до 0,6212
сахароза
от 3,7821 до 7,0915
магния хлоридагексагидрат
от 0,0154 до 0,0289
ЭДТА
от 0,0029 до 0,0054
полисорбат-80
от 0,0378 до 0,0709
этанол 95%
от 0,0004 до 0,0007
вода
остальное
Каждый вариант средства применяют для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
При этом средство предназначено для применения интраназально или внутримышечно. Также средство может быть введено совместно и одновременно интраназально и внутримышечно.
Причем в частном случае выполнения средство интраназально вводят в дозе от 5*10 10 до 5*1011 вирусных частиц или внутримышечно в дозе от 5*10 10 до 5*1011 вирусных частиц. А совместное введение интраназально и внутримышечно осуществляют в дозе от 5*10 10 до 5*1011 вирусных частиц внутримышечно, в дозе от 5*10 10 до 5*1011вирусных частиц интраназально.
Совместное введение предусматривает интраназальное и внутримышечное введение в рамках одной процедуры вакцинации.
Технический результат заключается в разработке средства, обеспечивающего развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2  у широких слоёв населения.
Основная цель вакцинации - обеспечить эффективную и долгосрочную защиту от патогена. Одним из вариантов достижения этой цели является многократная вакцинация. Когда организм человека впервые встречает вакцинный антиген это приводит к активации двух основных компонентов адаптивного иммунного ответа: В-лимфоцитов и эффекторных Т-лимфоцитов. Активированные B-лимфоциты трансформируются в плазматические клетки, способные к продукции антител, а также превращаются в B-клетки памяти. Эффекторные Т-лимфоциты делятся на два основных типа: Т-хелперы (CD4+) и Т-киллеры (CD8+). Главной функцией Т-хелперов является поддержка в развитии гуморального или клеточного иммунного ответа. Основной функцией Т-киллеров является уничтожение повреждённых клеток собственного организма. Т-киллеры являются одним из главных компонентов антивирусного иммунитета. Однако через некоторое время после вакцинации, количество антиген-специфичных иммунных клеток в организме начинает уменьшаться, тогда вводят бустерную дозу вакцины, которая позволяет поддерживать количество антиген-специфичных Т- и В-клеток на должном уровне (обеспечивающем протекцию организма от патогена).
Разработка однокомпонентного средства, которое будет вызывать стойкий иммунный ответ после однократной иммунизации является сложной научно-практической задачей. При этом значимость такой разработки сложно переоценить. Однократное введение способно обеспечить более быстрые темпы массовой вакцинации, что в условиях пандемии имеет критическое значение.Также данное средство может быть полезно для экстренной вакцинации, для иммунизации мобильных групп граждан (кочевые народы и пр.) и др. Кроме того, можно отметить, что при однократном введении снижается неблагоприятное воздействие на человека: травматичность, количество побочных эффектов и аллергических реакций.
Краткое описание фигур.
На фиг. 1
представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного
средства по варианту 1,
Ось ординат – титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.
Ось абсцисс – дни.
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 14 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 21 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 28 день
Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р  по Т- критерию Вилкоксона.
На фиг. 2
представлены результаты оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV2 у добровольцев, иммунизированных жидкой формой разработанного  средства по варианту 2,
Ось ординат – титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2.
Ось абсцисс – дни.
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 14 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 21 день
титр IgG к RBD домену гликопротеина S вируса SARS-CoV-2 у каждого добровольца участвующего в исследовании, на 28 день
Среднее геометрическое значение титра антител представлено в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 14, 21 и 28 дней обозначена скобкой, над которой указано значение р по Т- критерию Вилкоксона.
На фиг.3 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанного  средства по варианту 1 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс – дни.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+ у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+  у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD8+  у каждого добровольца на 28 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+  у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+  у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD4+  у каждого добровольца на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, p<0,05;   **, p<0,01;   ****, p<0,001 по критерию Манна-Уитни.
На фиг.4 представлены результаты оценки эффективности иммунизации добровольцев жидкой формой разработанного  средства по варианту 2 по оценке доли пролиферирующих CD8+ (А) и CD4+ (Б) лимфоцитов, рестимулированных S антигеном SARS-CoV-2.
Ось ординат – количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс – дни.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+  у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD8+  у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD8+  у каждого добровольца на 28 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+  у каждого добровольца на 0 день.
- обозначена доля пролиферирующих CD4+  у каждого добровольца на 14 день
- обозначена доля пролиферирующих CD4+  у каждого добровольца на 28 день.
Медиана значений представлена в виде черной черты для каждой группы данных. Статистически достоверная разница между значениями 0, 14 и 28 дня обозначена скобкой и символами *, p<0,05;   **, p<0,01;   ****, p<0,001 по критерию Манна-Уитни.
Осуществление изобретения.
Активным компонентом разработанного   средства является экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма аденовируса, со встроенной экспрессионной кассетой, содержащей ген антигена вируса SARS-CoV-2.
Аденовирусные векторы способны проникать в различные типы клеток человека, обеспечивают высокие уровни экспрессии целевого антигена, приводят к индукции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. В ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России было разработано 3 варианта экспрессионных векторов на основе аденовирусов млекопитающих:
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области
- экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
В качестве антигена был выбран S белок SARS-CoV-2, который находится на поверхности вирусной частицы. Это один из наиболее перспективных антигенов, позволяющих индуцировать мощный и длительный иммунный ответ. Также было показано, что антитела к S белку SARS-CoV-2 являются вирус-нейтрализующими.
Для достижения максимально эффективной индукции иммунных реакций авторы разработали различные варианты экспрессионных кассет, содержащих ген S белка.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CMV промотор – это промотор ранних генов цитомегаловируса, который обеспечивает конститутивную экспрессию во множестве типов клеток. Однако сила экспрессии гена-мишени, управляемая промотором CMV, варьируется в зависимости от типов клеток. Кроме того, было показано, что уровень экспрессии трансгена под контролем CMV-промотора уменьшается с увеличением времени культивирования клеток из-за подавления экспрессии генов, которое связано с метилированием ДНК [Wang W., Jia YL., Li YC., Jing CQ., Guo X., Shang XF., Zhao CP., Wang TY. Impact of different promoters, promoter mutation, and an enhancer on recombinant protein expression in CHO cells. // Scientific Reports – 2017. – Vol. 8. – P. 10416].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. CAG-промотор – синтетический промотор, который включает ранний энхансер промотора CMV, промотор β-актина курицы и химерный интрон (β-актина курицы и β-глобин кролика). Экспериментально показано, что транскрипционная активность промотора СAG выше, чем у промотора CMV. [Yang C.Q., Li X.Y., Li Q., Fu S.L., Li H., Guo Z.K., Lin J.T., Zhao S.T. Eval-uation of three different promoters driving gene expression in developing chicken embryo by using in vivo electroporation. // Genet. Mol. Res. – 2014. – Vol. 13. – P. 1270-1277].
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования. Промотор EF1 – промотор человеческого эукариотического фактора элонгации трансляции 1α (EF-1α). Промотор является конститутивно активным в широком диапазоне типов клеток [Wang X, Xu Z, Tian Z, Zhang X, Xu D, Li Q, Zhang J, Wang T. The EF-1α promoter maintains high-level transgene expression from episomal vectors in transfected CHO-K1 cells. J Cell Mol Med. 2017 Nov;21(11):3044-3054. doi: 10.1111/jcmm.13216. Epub 2017 May 30. PMID: 28557288; PMCID: PMC5661254.]. Ген EF-1α кодирует фактор элонгации-1α, который является одним из наиболее распространенных белков в эукариотических клетках и экспрессируется почти во всех типах клеток млекопитающих. Данный промотор EF-1α часто активен в клетках, в которых вирусные промоторы не способны экспрессировать контролируемые гены, и в клетках, в которых вирусные промоторы постепенно заглушаются.
Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Таким образом, в результате проведенной работы было разработано 3 варианта  средства.
1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3
2)  средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
3)  средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1 Получение активного компонента средствадля индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа.
На первом этапе работы был разработан дизайн 3 вариантов экспрессионных кассет:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России: плазмида pAd26-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа, и плазмида pAd26-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd26-Ends, были получены плазмиды pAd26-Ends-CMV-S-CoV2, pAd26-Ends-CAG-S-CoV2, pAd26-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pAd26-too-CMV-S-CoV2, pAd26-too-CAG-S-CoV2, pAd26-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы humanadenovirus 26-го серотипа: Ad26-too-CMV-S-CoV2, Ad26-too-CAG-S-CoV2, Ad26-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм humanadenovirus26-го серотипа:Ad26-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, был полученэкспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5  со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.
Пример 2. Получение активного компонента средствадля индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа.
В данной работе также использовали 3 варианта экспрессионных кассет:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:1 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России:
- плазмида pAd5-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа (одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 5-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок; второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4-области до конца генома)
- плазмида pAd5-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd5-Ends, были получены плазмиды pAd5-Ends-CMV-S-CoV2, pAd5-Ends-CAG-S-CoV2, pAd5-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pAd5-too-CMV-S-CoV2, pAd5-too-CAG-S-CoV2, pAd5-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы humanadenovirus5-го серотипа: Ad5-too-CMV-S-CoV2, Ad5-too-CAG-S-CoV2, Ad5-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм humanadenovirus5-го серотипа:Ad5-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, был полученэкспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного  средства.
Пример 3. Получение активного компонента средствадля индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа.
В данной работе использовали 3 варианта экспрессионных кассет:
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:4 состоит из CMV промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:2 состоит из CAG промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования;
- экспрессионная кассета SEQ ID NO:3 состоит из EF1 промотора, гена S белка вируса SARS-CoV-2 и сигнала полиаденилирования.
Синтез гена S белка вируса SARS-CoV-2осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России:
- плазмида pSim25-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса обезьян 25-го серотипа
- плазмида pSim25-null, несущая геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pSim25-Ends, были получены плазмидыp-Sim25-Ends-CMV-S-CoV2, p-Sim25-Ends-CAG-S-CoV2, p-Sim25-Ends-EF1-S-CoV2, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса обезьян25-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pSim25-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2, несущие геном рекомбинантного аденовируса обезьян 25-го с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pSim25-too-CMV-S-CoV2, pSim25-too-CAG-S-CoV2, pSim25-too-EF1-S-CoV2 гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы были получены рекомбинантные штаммы simianadenovirus25-го серотипа: simAd25-too-CMV-S-CoV2, simAd25-too-CAG-S-CoV2, simAd25-too-EF1-S-CoV2. По аналогичной схеме был получен контрольный штамм simianadenovirus25-го серотипа: simAd25-too, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2.
Таким образом, был полученэкспрессионный вектор, содержащий геном рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, который является активным компонентом разработанного средства.
Пример 4. Разработка буферного раствора.
Авторами изобретения был подобран буферный раствор на водной основе, обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц. Для поддержания рН раствора в буфер добавили Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис). Для достижения необходимой ионной силы и осмолярности был добавлен хлорид натрия. Для криопротекции в буфер добавили сахарозу. Магния хлорида гексагидрат добавили в качестве источника двухвалентных катионов, ЭДТА - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления, полисорбат-80 - в качестве поверхностно-активного вещества, этанол 95% - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для жидкой формы  средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 1). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из активных компонентов средства:
1. экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1 (Ad26-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).
2. экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1 (Ad5-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).
3. экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:4 (simAd25-CMV-S-CoV2, 1*1011 вирусных частиц).
Полученные средства хранили при температуре -18ºС и -70 ºС в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.
Таблица 1 – Состав экспериментальных буферных растворов для жидкой формы  средства.
Таблица 1.
№группы
Состав буферного раствора
Трис (мг)
Хлорид натрия (мг)
Сахароза (мг)
Магния хлорида гексагидрат (мг)
ЭДТА (мг)
Полисорбат-80 (мг)
Этанол 95% (мг)
Вода
1
0,968
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
2
1,815
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
3
1,21
1,752
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
4
1,21
3,285
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
5
1,21
2,19
20
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
6
1,21
2,19
37,5
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
7
1,21
2,19
25
0,0816
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
8
1,21
2,19
25
0,153
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
9
1,21
2,19
25
0,102
0,0152
0,25
0,0025
до 0,5 мл
10
1,21
2,19
25
0,102
0,0285
0,25
0,0025
до 0,5 мл
11
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,2
0,0025
до 0,5 мл
12
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,375
0,0025
до 0,5 мл
13
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,002
до 0,5 мл
14
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,00375
до 0,5 мл
15
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для жидкой формы  средства при температурах -18ºС и -70 ºС в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для жидкой формы  средства обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного  средства в следующем диапазоне действующих веществ (масс %):
Трис: от 0,1831 масс. % до 0,3432 масс. %;
Хлорид натрия: от 0,3313 масс. % до 0,6212 масс. %;
Сахароза: от 3,7821 масс. % до 7,0915 масс. %;
Магния хлорида гексагидрат: от 0,0154 масс. % до 0,0289 масс. %;
ЭДТА: от 0,0029 масс. % до 0,0054 масс. %;
Полисорбат-80: от 0,0378 масс. % до 0,0709 масс. %;
Этанол 95%: от 0,0004 масс. % до 0,0007 масс. %;
Растворитель: остальное.
Пример 5. Получение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме.
Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 1 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3 в буферном растворе.
Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 2 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3 в буферном растворе.
Разработанное средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме по варианту 3 содержит экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus 25-го серотипа, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3 в буферном растворе.
Активный компонент смешивается с компонентами буферного раствора во время технологического процесса. Фармацевтическое средство разливается в стерильные флаконы. Хранение производят в защищенном от света месте, при температуре не выше минус 18°С. Перед использованием необходимо достать из холодильной камеры и выдержать при комнатной температуре до полного размораживания не более 30 минут; перед применением перемешать, осторожно покачивая флакон (ампулу). Не допускается резко встряхивать препарат. Не допускается повторная заморозка.
Пример 6. Токсичность разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при внутривенном и внутримышечном введении.
В данном исследовании оценивали острую токсичность:
- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:1, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
- средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме, содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма simianadenovirus25-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой, выбранной из SEQIDNO:4, SEQIDNO:2, SEQIDNO:3.
В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.
Расчет дозы средства проводили исходя из иммунизирующей дозы (108в.ч.), полученной в предварительном эксперименте на чувствительном виде животных – сирийских хомячках. Расчет доз для мышей проводили исходя из массы тела. Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 108в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.
В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы   средства:
108в.ч. – близкая к эффективной дозе(ЭД) для мышей;
109в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 20 раз;
1010в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;
1011в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;
Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:
1) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;
2) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;
3) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;
4) Ad26-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;
5) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;
6) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;
7) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;
8) Ad5-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;
9) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*108 в.ч., 20 мышей;
10) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*109 в.ч., 20 мышей;
11) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*1010 в.ч., 20 мышей;
12) simAd25-too-CMV-S-CoV2, 1*1011 в.ч., 20 мышей;
13) плацебо (буферныйраствор), 20 мышей.
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.
Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных:активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей.Физиологические функции:дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.
На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.
Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.
При макроскопическом исследовании не обнаруженовлияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Cтатистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.
Пример 7.
Определение эффективности иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответа.
Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител. В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против SARS-CoV-2 через 21 день после введения средства лабораторным животным.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на 13 групп по 5 животных, которым внутримышечно вводили варианты разработанного средства в жидкой форме в дозе 5*1010вирусных частиц/200мкл.
Были получены следующие группы животных:
1) Ad26-too-CMV-S-CoV2,
2) Ad26-too-CAG-S-CoV2,
3)  Ad26-too-EF1-S-CoV2
4) Ad26-too
5) Ad5-too-CMV-S-CoV2,
6) Ad5-too-CAG-S-CoV2,
7)  Ad5-too-EF1-S-CoV2
8) Ad5-too
9) simAd25-too-CMV-S-CoV2,
10) simAd25-too-CAG-S-CoV2,
11)  simAd25-too-EF1-S-CoV2
12) simAd25-too
13) плацебо (буфер)
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5 % молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5)  Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 2.
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-too-CMV-S-CoV2,
2425
2
Ad26-too-CAG-S-CoV2,
2111
3
Ad26-too-EF1-S-CoV2
2786
4
Ad26-too
0
5
Ad5-too-CMV-S-CoV2,
38802
6
Ad5-too-CAG-S-CoV2,
29407
7
Ad5-too-EF1-S-CoV2
33779
8
Ad5-too
0
9
simAd25-too-CMV-S-CoV2,
14703
10
simAd25-too-CAG-S-CoV2,
16890
11
simAd25-too-EF1-S-CoV2
12800
12
simAd25-too
0
13
плацебо (буфер)
0
Таким образом, результаты эксперимента показывают, что все разработанные средства вызывают гуморальный иммунный ответ против SARS-CoV-2.
Пример 8. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки гуморального иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации
Цель данного эксперимента заключалась в определении напряженности иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев в различные сроки после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.
В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет.  Все участники исследования были разделены на несколько групп.
1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формесодержащее в качестве единственного активного компонентаэкспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формесодержащее в качестве единственного активного компонентаэкспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек
Добровольцы были однократно внутримышечно иммунизированы соответствующим средством. Перед иммунизацией, а также через 14, 21, 28 и 42 дней, у пациентов отбирали образцы крови. Из полученных образцов выделяли сыворотку крови, которую в дальнейшем использовали для определения титра антител к S антигену вируса SARS-CoV-2.
Титр антител определяли с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа, разработанной в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России (РЗН 2020/10393 2020-05-18), которая позволяет определять титр IgG к RBD домену S антигена вируса SARS-CoV-2.
Планшеты с предварительно адсорбированным RBD (100 нг/лунку) промывали 5 раз
промывочным буфером. Далее в лунки планшета вносили в 2 повторах по 100 мкл положительного контроля, а также в 2 повторах по 100 мкл отрицательного контроля.В остальные лунки планшета добавляли серию двукратных разведений исследуемых образцов (по два повтора на каждый образец).Планшет заклеивали пленкой и инкубировали в течение 1 ч при температуре +37 °С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту.Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку добавляли по 100 мкл рабочего раствора конъюгатамоноклональных антител, планшет закрывали липкой пленкой и инкубировали в течение 1 часа при температуре +37 °С при перемешивании со скоростью 300 об/минуту. Далее лунки промывали 5 раз рабочим раствором буфера для промывания. Затем в каждую лунку вносили по 100 мкл хромоген-субстратного раствора и инкубировали в течение 15 минут в темном месте при температуре от +20°С. После этого останавливали реакцию добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (1М раствор серной кислоты). Результат учитывали в течение 10 мин после остановки реакции путем измерения на спектрофотометре оптической плотности при длине волны450 нм.
Титр IgG определяли как максимальное разведение сыворотки, при котором значение OD450 сыворотки иммунизированного участника превышаетзначение контрольной сыворотки (сыворотка участника до иммунизации) более чем в 2 раза.
Результаты анализа титра антител к антигену вируса SARS-CoV-2 в сыворотке крови добровольцев после введения различных вариантов разработанного средства представлены на фиг.1,2.
Как видно из представленных данных, иммунизация добровольцев обоими вариантами разработанного средства позволяет сформировать выраженный (статистически достоверно отличимый от показателей контрольной не иммунизированной группы добровольцев) гуморальный иммунитет, характеризующийся повышением титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. При этом рост напряженности гуморального иммунного ответа отмечается с увеличением дней после иммунизации.
Пример 9. Изучение иммуногенности разработанного средства путем оценки клеточного иммунного ответа к антигену вируса SARS-CoV-2 в крови добровольцев в различные сроки после вакцинации.
Цель данного эксперимента заключалась определении напряженности клеточного иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.
В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет.  Все участники исследования были разделены на несколько групп.
1) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1,  1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
2) Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме содержащее в качестве единственного активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма humanadenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQIDNO:1, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
Добровольцы были однократно внутримышечно иммунизированы соответствующим средством. Перед иммунизацией, а также через 14 и 28 дней, у пациентов отбирали образцы крови, из которых выделяли мононуклеарные клетки методом центрифугирования в градиенте плотности раствора фиколла (1,077 g/mL; ПанЭко). Далее выделенные клетки окрашивали флуоресцентным красителем CFSE (Invivogen, США) и высевали на лунки 96л планшета (2*105 кл/лунку). Затем проводили повторную стимуляцию лимфоцитов в условиях in vitro добавлением в культуральную среду S белка коронавируса (конечная концентрация белка 1мкг/мл). В качестве отрицательного контроля использовали интактные клетки, к которым не добавляли антиген. Через 72 часа после добавления антигена проводили измерение % пролиферирующих клеток, а культуральную среду отбирали для измерения количества гамма-интерферона.
Для определения % пролиферирующих клеток проводили их окрашивание антителами против маркерных молекул Т лимфоцитов CD3, CD4, CD8 (anti-CD3 Pe-Cy7 (BDBiosciences, клон SK7), anti-CD4 APC (BDBiosciences, клон SK3), anti-CD8 PerCP-Cy5.5 (BDBiosciences, клон SK1)). Пролиферирующие (с меньшим количеством красителя CFSE клеток) CD4+ и CD8+ Т лимфоциты определяли в клеточной смеси с использованием проточного цитофлюориметра BD FACS AriaIII (BDBiosciences, США). Результирующий процент пролиферирующих клеток в каждом образце определяли путем вычитания результата, полученного при анализе интактных клеток их результата, полученного при анализе клеток рестимулированных антигеном S коронавируса. Полученные результаты представлены на Фиг.3,4.
Результаты проведенного исследования показали, что рост напряженности клеточного иммунитета, вызванного иммунизацией добровольцев различными вариантами средства, согласно медиане значений пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, отмечается с увеличением дней после иммунизации. Во всех группах максимальные значения, пролиферирующих как CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов наблюдаются на 28 день после иммунизации. Между 0 и 28 днем исследования наблюдается максимальная статистически достоверная разница в значениях, пролиферирующих CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов - p<0,001.
Таким образом, исходя из приведенных данных можно заключить, что иммунизация разработанным средством способна вызвать формирование напряженного антиген-специфического клеточного звена противоинфекционного иммунитета, что подтверждается высокой степенью статистической достоверности в измеряемых параметрах до и после иммунизации.
Пример 10. Оценка нежелательных явлений у добровольцев после однократной и двукратной иммунизации вариантами разработанного   средства.
Цельданного эксперимента заключалась определении побочных эффектов у добровольцев после их иммунизации различными вариантами разработанного средства.
В исследование включили здоровых добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет.  Все участники исследования были разделены на несколько групп.
1) Однократноевнутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
2) Однократное внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 1011 вирусных частиц/дозу, 9 человек.
3) Двукратная схема иммунизации, при которой вначале вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме 1011 вирусных частиц/дозу, а через 21 день вводят средство на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме 1011 вирусных частиц/дозу, 20 человек.
В таблице 3включены данные об основных нежелательных явлениях, зарегистрированных с момента начала исследования и вплоть до визита (телефонного контакта) 180-го дня в рамках исследования.
<b>Кол-во субъектов (%) Кол-во событий</b>
<b>Группа 1</b><b>(Ad26-too-CMV-S-CoV2)</b>
<b>Группа 2</b><b>(Ad5-too-CMV-S-CoV2)</b>
<b>Группа 3</b><b>(Ad26-too-CMV-S-CoV2+ Ad5-too-CMV-S-CoV2)</b>
<b>Лабораторные и инструментальные данные</b>
Повышение числа Т-лимфоцитов
3 (33.33%) 3
6 (66.67%) 6
7 (35.00%) 7
Снижение числа естественных клеток-киллеров
5 (55.56%) 5
4 (44.44%) 4
7 (35.00%) 8
Повышение числа B-лимфоцитов
3 (33.33%) 3
5 (55.56%) 5
5 (25.00%) 5
Повышение числа моноцитов
5 (55.56%) 5
0 (0.00%) 0
1 (5.00%) 1
Увеличение количества CD4-лимфоцитов
2 (22.22%) 2
2 (22.22%) 2
6 (30.00%) 6
Уменьшение процентного содержания лимфоцитов CD8
4 (44.44%) 4
0 (0.00%) 0
5 (25.00%) 5
Повышение количества CD8-лимфоцитов
1 (11.11%) 1
2 (22.22%) 2
4 (20.00%) 4
Повышение уровня иммуноглобулина Е (IgE) в крови
1 (11.11%) 1
2 (22.22%) 2
3 (15.00%) 3
Повышение скорости оседания эритроцитов
1 (11.11%) 1
1 (11.11%) 1
2 (10.00%) 2
Повышение числа естественных клеток-киллеров
0 (0.00%) 0
2 (22.22%) 2
4 (20.00%) 4
Уменьшение соотношения CD4/CD8
1 (11.11%) 1
1 (11.11%) 1
4 (20.00%) 4
Повышение числа лейкоцитов
1 (11.11%) 1
0 (0.00%) 0
1 (5.00%) 1
Повышение числа тромбоцитов
1 (11.11%) 1
0 (0.00%) 0
1 (5.00%) 1
Снижение количества CD4-лимфоцитов
1 (11.11%) 1
0 (0.00%) 0
2(10.00%) 2
Увеличение процентного содержания лимфоцитов
1 (11.11%) 1
0 (0.00%) 0
7(35.00%) 7
Увеличение соотношения CD4/CD8
0 (0.00%) 0
1 (11.11%) 1
2 (10.0%) 2
<b>Общие нарушения и реакции в месте введения</b>
Боль в месте вакцинации
7 (77.78%) 7
5 (55.56%) 5
8 (40.00%) 10
Гипертермия
8 (88.89%) 9
2 (22.22%) 2
19 (55.00%) 35
Астения
3 (33.33%) 3
3 (33.33%) 3
11 (55.00%) 13
Боль
3 (33.33%) 4
2 (22.22%) 2
4 (20.00%) 7
Снижение аппетита
2 (22.22%) 2
0 (0.00%) 0
1 (5.00%) 1
Пирексия
0 (0.00%) 0
1 (11.11%) 1
1 (5.00%) 1
<b>Нарушения со стороны нервной системы</b>
Головная боль
6 (66.67%) 6
3 (33.33%) 3
11 (55.00%) 15
<b>Нарушения со стороны дыхательной системы, органов грудной клетки и средостения</b>
Боль в ротоглотке (орофарингеальная)
0 (0.00%) 0
1 (11.11%) 1
1 (5.00%) 1
Ринорея
0 (0.00%) 0
0 (0.00%) 0
4 (20.00%) 4
Першение в горле
0 (0.00%) 0
0 (0.00%) 0
2(10.00%) 2
Заложенность носа
0 (0.00%) 0
0 (0.00%) 0
1 (5.00%) 1
Чихание
0 (0.00%) 0
0 (0.00%) 0
1 (5.00%) 1
Вирусная инфекция верхних дыхательных путей
1 (11.11%) 1
0 (0.00%) 0
0 (0.00%) 0
<b>Желудочно-кишечные нарушения</b>
Диарея
1 (11.11%) 1
0 (0.00%) 0
3(15.00) 3
<b>Нарушения со стороны иммунной системы</b>
Крапивница
1 (11.11%) 1
0 (0.00%) 0
0 (0.00%) 0
Как видно из представленных данных однократная схема иммунизации разработанным средством для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой формевызывает существенно меньше побочных эффектов, по сравнению с двукратной схемой иммунизации.
Пример 11. Определение эффективности интраназальной иммунизации разработанным средством по оценке гуморального иммунного ответа.
Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного  средства при интраназальном введении.
В эксперименте использованы мыши линии C57/Bl6, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:
1) Однократное интраназальноевведение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
2) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
3) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
4) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу.
5) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
6) Однократноеинтраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
7) Однократное интраназальное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 %  молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.
Таблица 4 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
Группа животных
Титр антител
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозу
919
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозу
8445
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозу
6400
Ad26-too-CMV-S-CoV2,5*10<sup>11</sup>вч/дозу
1838
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозу
19401
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозу
12800
Буферный раствор
0
Как видно из полученных результатов интраназальная иммунизация животных разработанным средством приводила к повышению титра антител к S белку вируса SARS-CoV-2. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме путем его интраназальноговведения.
Пример 12. Оценка иммуногенности разработанного средства при совместной внутримышечной и интраназальной иммунизации.
Целю данного исследования является проверка эффективности разработанного  средства при совместном интраназальном введении и внутримышечном введении.
В эксперименте использованы мыши линии C57/Bl6, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:
1) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
2) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу
3) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
4) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
5) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
6) Внутримышечное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
7) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу.
8) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу
9) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1010 вирусных частиц/дозу
10) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011 вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
11) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу
12) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа (Ad26-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
13) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
14) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
15) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа (Ad5-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
16) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу и одновременно внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
17) Интраназальное введение средства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
18) Внутримышечное введениесредства на основе рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа (simAd25-too-CMV-S-CoV2) в жидкой форме, 5*1011  вирусных частиц/дозу.
19) Интраназальное введение буферного раствора и одновременно внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
20) Интраназальное введение буферного раствора(отрицательный контроль).
21) Внутримышечное введение буферного раствора (отрицательный контроль).
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре +4ºС.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5 %  молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37oС на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37ºС.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.
Таблица 5 - Титр антител к белку S в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
Группа животных
Титр антител
1
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н,Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м
3200
2
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н
1056
3
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м
2111
4
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н,Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м,
38802
5
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н
8445
6
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м
33779
7
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н,simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м
22286
8
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н
6400
9
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м
16890
10
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н,Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м
44572
11
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н,Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м
44572
12
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10 </sup>вч/дозуи/н,simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м
51200
13
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н,Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10 </sup>вч/дозув/м
51200
14
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup> вч/дозу и/н,simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозув/м
19401
15
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10</sup>вч/дозуи/н,Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>10 </sup>вч/дозу в/м
22286
16
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н,Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
3676
17
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н,
1213
18
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
2425
19
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н,Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
44572
20
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н
9701
21
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
33779
22
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н,simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
25600
23
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н
7352
24
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
19401
25
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н,Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
51200
26
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н,Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
51200
27
Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11 </sup>вч/дозуи/н,simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
51200
28
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н,Ad5-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11 </sup>вч/дозув/м
58813
29
Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup> вч/дозу и/н,simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозув/м
22286
30
simAd25-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11</sup>вч/дозуи/н,Ad26-too-CMV-S-CoV2, 5*10<sup>11 </sup>вч/дозу в/м
25600
31
Буферный раствор и/нБуферный раствор в/м
0
32
Буферный раствор и/н
0
33
Буферный раствор в/м
0
Как видно из полученных результатов совместная интраназальная и внутримышечная иммунизация животных разработанным средством приводила к более мощному гуморальному иммунному ответу, по сравнению с иммунизацией только одним способом. Таким образом, результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем совместного и одновременного внутримышечного и интраназальноговведения.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность фармацевтических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и промышленную применимость.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный
исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного
академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации
<120>Средство для индукции специфического иммунитета против вируса
тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме
(варианты).
<160>7
<170>BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 4711
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 1
atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata       60
acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat      120
aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga      180
gtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc      240
ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt      300
atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat      360
gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag      420
tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc      480
aaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggga      540
ggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagagatctggtaccgt      600
cgacgcggccgctcgagcctaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccac      660
tagtctctagtcagtgtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacacca      720
acagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcact      780
ctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacg      840
tgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacgggg      900
tgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacac      960
tggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaag     1020
tgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaaca     1080
agagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagt     1140
acgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgc     1200
gcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacaccccta     1260
tcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgc     1320
ccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctga     1380
cacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacc     1440
tgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtgg     1500
attgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaa     1560
agggcatctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttcc     1620
ccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctg     1680
tgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtaca     1740
actccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacc     1800
tgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcaga     1860
ttgcccctggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttca     1920
ccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactaca     1980
attacctgtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctcca     2040
ccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctact     2100
tcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagag     2160
tggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaa     2220
gcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccg     2280
gcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattg     2340
ccgataccacagacgccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcacccctt     2400
gcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcag     2460
tgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctga     2520
cacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtc     2580
tgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggca     2640
tctgtgccagctaccagacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagcc     2700
agagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaaca     2760
actctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgt     2820
ccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgct     2880
ccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacaggga     2940
tcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctaca     3000
agacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatccta     3060
gcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccg     3120
acgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctga     3180
tttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatga     3240
tcgcccagtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggag     3300
ctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcg     3360
gagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcg     3420
ccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcagg     3480
acgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaact     3540
tcggcgccatcagctctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccg     3600
aggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttaccc     3660
agcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgt     3720
ctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctga     3780
tgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccg     3840
ctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttc     3900
ctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttct     3960
acgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtga     4020
tcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaag     4080
aggaactggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatca     4140
gcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtgg     4200
ccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtaca     4260
tcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatgg     4320
tcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagct     4380
gtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaat     4440
tacattacacataagatatccgatccaccggatctagataactgatcataatcagccata     4500
ccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctga     4560
aacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttaca     4620
aataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagtt     4680
gtggtttgtccaaactcatcaatgtatctt a                                 4711
<210> 2
<211> 5984
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CAG-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 2
gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcc       60
catatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgccca      120
acgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaataggga      180
ctttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatc      240
aagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcct      300
ggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtat      360
tagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatct      420
ccccccctcccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatg      480
ggggcggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcgggg      540
cgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttcctttta      600
tggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcg      660
ctgcgcgctgccttcgccccgtgccccgctccgccgccgcctcgcgccgcccgccccggc      720
tctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggct      780
gtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttg      840
aggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtg      900
tgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggc      960
gcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtg     1020
ccccgcggtgcgggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtggg     1080
gggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccc     1140
cgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcgggg     1200
ctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcct     1260
cgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcga     1320
ggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggactt     1380
cctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcaccccctctagc     1440
gggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgt     1500
gcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggac     1560
ggctgccttcggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggct     1620
ctagaaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccactagtctctagtcagt     1680
gtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagag     1740
gcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgt     1800
tcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatg     1860
gcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagca     1920
ccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagaccc     1980
agagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagt     2040
tctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaa     2100
gcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctt     2160
tcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttca     2220
agaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcggg     2280
atctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaaca     2340
tcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagca     2400
gcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaacct     2460
tcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatc     2520
ctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccaga     2580
ccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatc     2640
tgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaacc     2700
ggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttca     2760
gcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacg     2820
tgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacaga     2880
caggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattg     2940
cctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggc     3000
tgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcagg     3060
ccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcct     3120
acggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagct     3180
tcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtga     3240
agaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagaga     3300
gcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgccgataccacagacg     3360
ccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggag     3420
tgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacg     3480
tgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcggg     3540
tgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagc     3600
acgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctacc     3660
agacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcct     3720
acacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatcc     3780
ccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagacca     3840
gcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgc     3900
agtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacagg     3960
acaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatca     4020
aggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagc     4080
ggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatca     4140
agcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagt     4200
ttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacat     4260
ctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgc     4320
agatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatg     4380
tgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatcc     4440
aggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccaga     4500
atgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagct     4560
ctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgaca     4620
gactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagag     4680
ccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgg     4740
gccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagt     4800
ctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatt     4860
tcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgt     4920
tcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatca     4980
tcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaaca     5040
ataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagt     5100
actttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgcca     5160
gcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacg     5220
agagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggt     5280
acatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgt     5340
gttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgca     5400
agttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacacataat     5460
tcactcctcaggtgcaggctgcctatcagaaggtggtggctggtgtggccaatgccctgg     5520
ctcacaaataccactgagatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagc     5580
cccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgtt     5640
ggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatc     5700
agaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatgaaca     5760
aaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttat     5820
tccatagaaaagccttgacttgaggttagatttttttatattttgttttgtgttattttt     5880
tctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcc     5940
tgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatc                     5984
<210> 3
<211> 5314
<212>DNA
<213>ArtificialSequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая EF1-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 3
ggtgaggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagt       60
tggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactggg      120
aaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataa      180
gtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaa      240
gtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgcctt      300
gaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtg      360
ggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgagg      420
cctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcg      480
ctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttt      540
tctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttg      600
gggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcc      660
tgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctgg      720
tgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcgg      780
caccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaat      840
ggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcct      900
ttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacc      960
tcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatg     1020
cgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttga     1080
tgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctc     1140
agacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggaattagcttggtac     1200
taatacgactcacaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccactagtctc     1260
tagtcagtgtgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctt     1320
taccagaggcgtgtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctaccca     1380
ggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttccacgccatccacgtgtccgg     1440
caccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactt     1500
tgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacag     1560
caagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcga     1620
gttccagttctgcaacgaccccttcctgggcgtctactatcacaagaacaacaagagctg     1680
gatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtc     1740
ccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagtt     1800
cgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacct     1860
cgtgcgggatctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcgg     1920
catcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgacacctgg     1980
cgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcc     2040
tagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgc     2100
tctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcat     2160
ctaccagaccagcaacttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatat     2220
caccaatctgtgccccttcggcgaggtgttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgc     2280
ctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtgctgtacaactccgc     2340
cagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgctt     2400
cacaaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccc     2460
tggacagacaggcaagatcgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctg     2520
tgtgattgcctggaacagcaacaacctggactccaaagtcggcggcaactacaattacct     2580
gtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatctccaccgagat     2640
ctatcaggccggcagcaccccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccact     2700
gcagtcctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggt     2760
gctgagcttcgaactgctgcatgcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaa     2820
tctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgct     2880
gacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgccgatac     2940
cacagacgccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagctt     3000
cggcggagtgtctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgta     3060
ccaggacgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgccgatcagctgacacctac     3120
atggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcgg     3180
agccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgc     3240
cagctaccagacacagacaaacagccccagacgggccagatctgtggccagccagagcat     3300
cattgcctacacaatgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctat     3360
cgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgac     3420
caagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacct     3480
gctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgt     3540
ggaacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccc     3600
tcctatcaaggacttcggcggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcc     3660
cagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactggccgacgccgg     3720
cttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgc     3780
ccagaagtttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgccca     3840
gtacacatctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgc     3900
cgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgac     3960
ccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcgg     4020
caagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggt     4080
caaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgc     4140
catcagctctgtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccgaggtgca     4200
gatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagacctacgttacccagcagct     4260
gatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtg     4320
tgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagctt     4380
ccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaaga     4440
gaagaatttcaccaccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagaga     4500
aggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcggaacttctacgagcc     4560
ccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcat     4620
tgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaact     4680
ggataagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaat     4740
caatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaa     4800
tctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagtacatcaagtg     4860
gccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaat     4920
catgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcag     4980
ctgctgcaagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacatta     5040
cacataagatctagagtcggggcggccggccgctcgctgatcagcctcgactgtgccttc     5100
tagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgc     5160
cactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtg     5220
tcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaa     5280
tagcaggcatgctggggatccgagtgtcgataag                               5314
<210> 4
<211> 4678
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,
оптимизированную последовательность S белка SARS-CoV-2 и сигнал
полиаденилирования
<400> 4
atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata       60
acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat      120
aatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtgga      180
gtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgcc      240
ccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgacctt      300
atgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgat      360
gcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag      420
tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttcc      480
aaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtggga      540
ggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagagatctggtaccat      600
gtttgtgttccttgtgttattgccactagtctctagtcagtgtgtgaacctgaccacaag      660
aacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgacaa      720
ggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaa      780
cgtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaa      840
ccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcat      900
cagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctgatcgtgaa      960
caacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcct     1020
gggcgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacag     1080
cagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaagg     1140
caagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatcgacggctactt     1200
caagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggatctgcctcagggcttctc     1260
tgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacact     1320
gctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctgg     1380
tgccgccgcttactatgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacga     1440
gaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctgagcgagacaaagtg     1500
caccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttccgggtgca     1560
gcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggt     1620
gttcaatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattg     1680
cgtggccgactactccgtgctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacgg     1740
cgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttcacaaacgtgtacgccgacagcttcgt     1800
gatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagatcgccgacta     1860
caactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacct     1920
ggactccaaagtcggcggcaactacaattacctgtaccggctgttccggaagtccaatct     1980
gaagcccttcgagcgggacatctccaccgagatctatcaggccggcagcaccccttgtaa     2040
cggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtcctacggctttcagcccacaaa     2100
tggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcatgcccc     2160
tgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaactt     2220
caacttcaacggcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgcc     2280
attccagcagtttggccgggatattgccgataccacagacgccgtacgagatccccagac     2340
actggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctgg     2400
caccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccaggacgtgaactgtaccgaagtgcc     2460
cgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaa     2520
tgtgtttcagaccagagccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacga     2580
gtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccagacacagacaaacagccc     2640
cagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgc     2700
cgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcag     2760
cgtgaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgta     2820
catctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcac     2880
ccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacacccaagaggt     2940
gttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaaggacttcggcggcttcaa     3000
tttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacct     3060
gctgttcaacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtct     3120
gggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgct     3180
gccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggccggcac     3240
aatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgca     3300
gatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaa     3360
gctgatcgccaaccagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcac     3420
agcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacac     3480
cctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctctgtgctgaacgacatcct     3540
gagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggct     3600
gcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctc     3660
tgccaatctggccgccaccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtgga     3720
cttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgcccctcacggcgtggt     3780
gtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccat     3840
ctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcaccca     3900
ttggttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacacctt     3960
cgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctct     4020
gcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaaccacacaag     4080
ccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaa     4140
agagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgca     4200
agaactggggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggctttat     4260
cgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctg     4320
tagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaggacgattc     4380
tgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacacataagatatcgcggccgctcgagt     4440
ctagataactgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaa     4500
acctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaact     4560
tgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaata     4620
aagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctta       4678
<---