Влияние диметпрамида на сократительную активность и проводящую систему изолированного сердца крысы

Д.С. Лаптев, С.Г. Петунов, Д.В. Бобков, Д.В. Криворотов, В.А. Кузнецов, А.С. Радилов, В.Р. Рембовский

Влияние диметпрамида на сократительную активность и проводящую систему изолированного сердца крысы

ФГУП «НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека» ФМБА России, г. Санкт-Петербург

D.S. Laptev, S.G. Petunov, D.V. Bobkov, D.V. Krivorotov, V.A. Kuznetsov, A.S. Radilov, V.R. Rembovskiy

Dimetpramide effects on cardiac contractility and conduction, in isolated rat heart

FSUE "Research Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology" FMBA,

St. Petersburg

Ключевые слова: изолированное сердце, диметпра-мид, дофаминовые рецепторы, ЭКГ.

Работа посвящена изучению влияния новой солевой формы — сукцината — эффективного противорвот-ного препарата диметпрамида (ДМПс) на функциональные показатели изолированного сердца крысы. Проведена оценка зависимости эффекта от действующей концентрации препарата. Показано, что в концентрации 1^10-4 М, соответствующей дозе, рекомендуемой для перорального применения, ДМПс обладает выраженным отрицательным хро-нотропным и дромотропным эффектом, оказывает умеренное вазоконстрикторное действие. Установлено, что механизм влияния ДМПс на изолированное сердце, в отличие от его центрального действия, лишь частично сопряжен с блокадой дофаминовых рецепторов. Эффект ДМПс в миокарде реализуется при участии потенциал-зависимых К+-каналов.

Разработка фармакологических препаратов, купирующих тошноту и рвоту (наиболее тяжелые первичные реакции при химическом и лучевом поражении), представляет собой актуальную задачу в целях эффективной реализации мероприятий по защите населения в случае возникновения аварийных ситуаций. Среди препаратов с выраженным противор-вотным и прокинетическим эффектом наиболее известны метоклопрамид и структурно близкий к нему диметпрамид, обладающий большим спектром фармакологической активности, позволяющий проводить работы в очаге

Key words: isolated heart, dimetpramide, dopamine receptors, ECG.

The research persue an understanding of the effects dimetpramide succinate (DMPs) — new salt form of dimetpramide (an antiemetic drug) has on the function of the isolated rat heart. We have assessed the dose/concentration-effect correlation. It was proven, that in Î^IO-4 M concentration, which corresponds with the dosage recommended for the oral administration, DMPs has strong negative chronotropic and dromotropic effect, along with a moderate vasoconstrictor effect. The mechanism of action DMPs has on an isolated heart differs from the central mode of action, only partially causes the dopamine receptors block. The effect DMPs has on the cardiac muscle carried out via the voltage gated K+-channels.

поражения. Проникая через гематоэнцефали-ческий барьер, они блокируют дофаминовые и серотониновые рецепторы триггерной зоны ствола мозга, повышая порог раздражения хе-морецепторной зоны рвотного центра [3].

На основе диметпрамида производился кластер радиопротекторов, применяемых при воздействии ионизирующего излучения, рецептуры на основе диметпрамида при дозах облучения 4—6 Гр в 40—100% случаев снимали рвоту и адинамию, а при дозах до 10 Гр существенно ослабляли тяжесть проявлений первичной реакции. Диметпрамид был разработан

в СССР, производился в Латвии, однако после распада страны промышленное производство активной фармацевтической субстанции было прекращено. На сегодняшний день в России не производятся лекарственные средства, которые могли бы заменить по эффективности и доступности линейку препаратов на основе ди-метпрамида. В целях восполнения этой ниши ФГУП «НИИ ГПЭЧ» ФМБА России проводится разработка современных технологий производства субстанции диметпрамида и создана новая солевая фармакологическая форма: 5-нитро-4-диметиламино-2-метокси^-(2-ди-этиламино-этил)-бензамида сукцинат (ДМПс). Янтарная кислота, являясь субстратом цикла Кребса, обладает выраженным антигипокси-ческим, метаболическим и антиоксидантным действием, важным для усиления терапевтического действия радиопротекторов. В итоге получена новая формула с модифицированными противорвотными, радиозащитными и адапто-генными свойствами.

В представленной работе приведены результаты исследования влияния ДМПс на сократительную функцию сердечной мышцы как одного из наиболее важных факторов, лимитирующих работоспособность в экстремальных ситуациях, в том числе связанных с лучевым воздействием.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования использовали изолированное сердце самцов нелинейных белых крыс (m = 300±50 г). Данная экспериментальная модель позволяет оценить функциональное состояние коронарного русла, проводящей системы и рабочего миокарда независимо от центральных регуляторных механизмов и действия гуморальных факторов. Все работы с животными выполняли с соблюдением правил биоэтики, утвержденных Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей.

Эвтаназию проводили методом цервикаль-ной дислокации. При выполнении широкого доступа применяли билатеральную трансабдоминальную торакотомию. Сразу после извлечения сердца из грудной полости его помещали в холодный (+4° С) физиологический раствор Кребса-Хензелейта (мМ): NaCl - 118,99; KCl - 4,69; NaHCO3 - 25; KH2PO4 - 1,18;

MgS04x7H20 - 1,17; CaCl2x2H2O - 2,5; EDTA -0,03; C6H12O6 — 5,5. Аорту фиксировали к канюле перфузионной установки Langendorff System (Panlab, Испания) зажимом типа «крокодил», а затем лигатурами. Перфузию сердца осуществляли через канюлю, закрепленную в аорте, при этом перфузат ретроградно поступал в левый желудочек. В качестве перфузата использовали подогретый до 37° С и насыщенный карбогеном раствор Кребса-Хензелейта. Перфузат подавали в режиме постоянного протока из расчета ~10 мл в минуту на 1 г сырого веса сердца. В качестве контроля адекватности перфузии служило давление (не менее 50 мм рт. ст.) в контуре «насос - аортальная канюля» [4]. Величину давления в левом желудочке определяли катетером с полиэтиленовым баллоном. Параметры сократительной активности сердца записывали с использованием системы PowerLab Data acquisition system 8/30 (ADInstruments, Новая Зеландия) с последующей обработкой в программе LabChartProUpgrade 7.0. Регистрировали объемную скорость коронарной перфузии (КП), давление перфузии (ДП), давление в левом желудочке, пульсовое давление (ПД), конечно-диастоли-ческое давление (КДД), частоту сердечных сокращений (ЧСС). Дополнительно рассчитывали интегральный показатель минутной производительности левого желудочка сердца (1М1мин) и индекс сократительной функции (ИСФ = = ПДхЧСС). Для определения влияния препарата на состояние проводящей системы изолированного сердца регистрировали ЭКГ. Для этого использовали атравматичные электроды: референтный закрепляли на металлической канюле установки, отрицательный - в области правого ушка, положительный - в области левого желудочка ближе к верхушке сердца.

Стабилизационный период, в течение которого происходила адаптация изолированного сердца к экспериментальным условиям, составлял 30 минут, после чего фиксировали показатели сократимости, которые принимали за фоновые, и добавляли в перфузат тестируемые вещества. В качестве контроля использовали параметры работы интактного сердца, перфузируемого раствором Кребса-Хензелейта.

Исследовали влияние ДМПс на параметры сократительной активности изолированного миокарда крысы в диапазоне концентраций

1х10-5-1х10-3М. Выбор действующих концентраций определяли исходя из доз диметпра-мида гидрохлорида, рекомендованных для применения у человека (20 мг/сут): концентрация 1х10-4 М соответствует дозе 2 мг/кг при биологической доступности 70%. Продолжительность воздействия на сердце каждой концентрации составляла 10 минут. Поскольку одним из наиболее вероятных механизмов действия диметпрамида является блокада Б2-рецепторов триггерной зоны рвотного центра головного мозга [3], для определения роли периферических дофаминовых рецепторов в реализации эффектов ДМПс на изолированном сердце мы использовали неселективный агонист дофамин (ДА) (Sigma Aldrich, США). ДА, обладающий большей аффинностью по отношению к Б2-рецепторам, использовали в концентрации 6,2 х 10-6 М, что соответствует ЕС50 для положительного инотропного эффекта [8]. Дофамин добавляли в перфузионный раствор после 10 минут экспозиции сердца с ДМПс, что определялось скоростью формирования сосудистых реакций на действие вазоактивной субстанции [6]. По истечении 20 минут воздействия вновь фиксировали регистрируемые показатели.

В качестве блокатора потенциал-зависимых К+-каналов использовали 4-аминопири-дин (4-АП) 3,1 х10-6 М (Sigma Aldrich, США), EC50 составляет 5,3х10-6 М [2]. ДМПс и 4-АП в перфузат вводили одномоментно после стабилизационного периода, время экспозиции составляло 10 минут.

При анализе результатов оценивали динамику параметров работы сердца по сравнению

с фоновыми значениями, а также проводили сравнение показателей сократимости интакт-ного миокарда на фоне действия блокаторов. Статистическую обработку проводили в программе GraphPad Prism 5.04. Для сравнения результатов при нормальном распределении данных использовали t-критерий Стьюдента, при распределении данных, отличном от нормального, применяли Т-критерий Вилкоксона для связанных выборок, а для выявления межгрупповых различий применяли U-критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Применение ДМПс приводит к снижению параметров сократительной активности миокарда. Действие препарата в концентрации 1 х 10-5 М сопровождается тенденцией к уменьшению ЧСС, ИСФ и минутной производительности сердца на 8,7, 4,9 и 4,2% соответственно (снижение всех показателей - достоверное в сравнении с фоном). В более высокой концентрации (1 х 10-4 М) применение ДМПс приводило к выраженным изменениям сократимости: зарегистрировано снижение ЧСС на 31% ( отрицательный хронотропный эффект), что на фоне стабильного показателя ПД приводит к значительному (на 34,6%, p < 0,05) снижению ИСФ. При этом инотропный эффект от применения ДМПс не выявлен. Установлено вазоконстрикторное действие ДМПс на коронарное русло, о чем свидетельствует статистически значимое в сравнении с контролем повышение ДП на 6,9% (табл. 1).

Таблица 1 Влияние ДМПс на функциональные показатели изолированного сердца крысы в зависимости от концентрации в сравнении с фоновыми значениями, %

Перфузат ДП Int (1 м) ЧСС ПД ИСФ кдд

Контроль 99,2±1,8 99,4±2,2 98,7±4,1 103,0±4,1 101,0±2,8 100,1±3,2

ДМПс 10-5 М 97,9±2,2" 95,8±0,9*" 91,3±2,7*" 103,0±1,7 95,1±1,6*" 106,6±2,6*

ДМПс 10-4 М 106,9±2,3*# 74,5±2,5*# 69,0±4,2*# 97,0±5,3 65,4±2,3*# 98,7±4,0

ДМПс 10-3 М - - - - - -

Примечание: * — достоверное отличие от фона, р < 0,05; # — достоверное отличие от контроля, р < 0,05 отличие эффекта ДМПс 1*10-4 М от 1*10-5 М, р < 0,05. " - достоверное

При этом наблюдаемое под влиянием ДМПс снижение ЧСС способствовало уменьшению потребности сердца в кислороде, указывая на возможный кардиопротекторный эффект. Увеличение концентрации препарата до 1х10-3 М вызывало остановку сердца уже в первые минуты эксперимента. В связи с этим установленным фактом последующие эксперименты по выявлению возможных механизмов периферического действия ДМПс проводили с применением его в концентрации 1 х 10-4 М.

Неселективный агонист дофаминовых рецепторов дофамин в концентрации 6,2 х 10-6 М обладает стимулирующим влиянием на сердечную мышцу. В наших экспериментах (табл. 2) показано значительное (на 51,9%) достоверное в сравнении с контролем увеличение ЧСС, приводящее к увеличению ИСФ и минутной производительности миокарда на 48,4 и 8,5% соответственно. При этом давление перфузии достоверно снижалось на 22% (р < 0,05), свидетельствуя об уменьшении тонуса коронарных сосудов и увеличении их перфузии. В присутствии ДМПс эффект дофамина, увеличивающий сердечную производительность и коронарный кровоток, сохранялся, но был выражен в несколько меньшей степени: отмечено снижение ДП на 10,6% и достоверное в сравнении с контролем увеличение ЧСС на 24,2% (р < 0,05).

Полученные данные дают основание полагать, что действие ДМПс приводит к неполной блокаде дофаминовых рецепторов сердца. Однако приведенные в таблице 2 показатели (ДМПс+ДА) получены на фоне 10-минутного ингибирующего воздействия ДМПс, учитывая которые, можно говорить о сохранении общей динамики реактивности сердца на действие ДА.

Данный эффект может объясняться высокой аффинностью дофамина к адренорецептив-ным структурам. Согласно литературным данным низкие (5—20 мкМ) концентрации ДА способствуют увеличению проницаемости медленных Са2+-каналов ^-типа) посредством воздействия на Р-адренорецепторы миокарда (в большей степени — предсердий) [12], а также обеспечивают увеличение выделения нора-дреналина из симпатических терминалей [7], обусловливая развитие положительного хро-но- и инотропного эффекта. Кроме того, возможна прямая стимуляция сигнальной функции D1- и D2-рецепторов, которая вызывает увеличение мобилизации ионов кальция из инозитол-3-фосфатзависимых внутриклеточных депо, усиливая сократительную активность миокарда. Схожий механизм модуляции уровня внутриклеточного кальция обнаружен в различных структурах мозга [5]. Выявленное в наших экспериментах снижение под влиянием ДМПс показателей сократимости миокарда может объясняться угнетением данного сигнального пути.

При оценке влияния ДМПс на процессы возбудимости и проводимости сердца установлено, что применение ДМПс в течение 30 минут приводит к увеличению продолжительности сердечного цикла в среднем на 52%, при этом отмечено удлинение интервалов РЯ и QT на 29% (р < 0,05) и 23% (р < 0,05) соответственно ( табл. 3) , тогда как продолжительность периода общей паузы увеличилась более чем на 67%.

Полученные результаты, в частности более выраженное в сравнении с динамикой остальных показателей ЭКГ увеличение продолжи-

Влияние дофамина (ДА) на изолированное сердце крысы в присутствии ДМПс в сравнении с фоновыми значениями, % (п = 10, M±SE) Таблица 2

Перфузат ДП Int (1 м) ЧСС ПД ИСФ КДД

Контроль 99,8±1,8 94,5±2,9 91,6±3,4* 101,5±3,4 92,8±3,0* 107,1±9,2

ДМПс 10-4 М 109,6±2,6*#" 69,7±2,4*#" 67,6±3,9*#" 93,7±3,8" 62,5±2,7*#" 110,7±8,6

ДМПс 10-4 М + ДА 10-6 М 89,4±4,3* 83,2±2,0*# 124,2±4,6*# 78,6±3,1*# 96,8±2,9 109,4±15,8

ДА 10-6 М 78,0±7,3#* 108,5±4,8# 151,9±5,1#* 95,2±5,6 148,4±5,9#* 83,3±7,7

Примечание: * — достоверное отличие от фона, р < 0,05; # — достоверное отличие от контроля, р < 0,05; " отличие от ДМПс+ДА, р < 0,05. — достоверное

тельности общей диастолы сердца, указывают на снижение под действием ДМПс скорости медленной деполяризации в клетках водителя ритма и предсердий. Это влияние может быть обусловлено как уменьшением К-тока, активируемого гиперполяризацией мембраны и обеспечивающего поступление положительных ионов и К+ в клетку (сходный эффект наблюдается при усилении парасимпатических влияний на сердце) [1], так и активацией аце-тилхолин-чувствительных К+-каналов внутреннего выпрямления (К^-каналов, 0ШК4) [9].

Данный тип каналов представлен в большей степени в предсердиях и проводящей системе сердца [10]. Следствия увеличения проницаемости К.г-каналов — замедление активации натриевых каналов, увеличение продолжительности гиперполяризации, уменьшение скорости проведения возбуждения и снижение ЧСС. Установленные в наших экспериментах увеличение продолжительности интервала РЯ на 29% (р < 0,05), уменьшение ЧСС (на 32,4%) при существенно меньшем изменении ПД (на 6,3%, р > 0,05) и КДД (на 10,7%, р > 0,05) свидетельствуют в пользу того, что клетками-мишенями для ДМПс являются в большей степени структуры проводящей системы сердца.

Другим возможным механизмом реализации обсуждаемых эффектов ДМПс может быть модулирование потенциал-зависимых калиевых каналов. Так, 4-АП в микромолярной концентрации позволяет заблокировать ультрабыструю часть выходящих реполяризационных калиевых токов 1Киг [2], что приводит к увеличению длительности потенциала действия

в предсердиях [11]. При проверке данной гипотезы мы установили (табл. 4), что применение ДМПс на фоне 4-АП приводило к менее выраженному снижению ЧСС (на 22,3% против 31%), интегрального показателя сократимости за 1 минуту (на 17,3% против 25,5%) и статистически значимо менее выраженному уменьшению индекса сократимости миокарда (на 24,6% против 34,6%, р < 0,05).

Установленные различия свидетельствуют в пользу предположения о действии ДМПс при участии потенциал-зависимых К+-каналов. Вместе с тем эффект ДМПс на фоне 4-АП нивелировался не полностью, т.е. каналы, формирующие токи I , являются лишь одной из возможных мишеней при действии ДМПс на изолированное сердце.

При анализе динамики ПД установлено, что применение ДМПс приводит к снижению выраженности положительного инотропного эффекта дофамина в первые минуты действия, а также к более выраженному снижению показателя к 20-й минуте, достигающему 17,1% в сравнении с контролем (р < 0,05) (рисунок).

Механизм усиления угнетающего ПД влияния при действии дофамина на фоне ДМПс остается неясным. Вероятным в данных условиях представляется уменьшение продолжительности плато потенциала действия кардио-миоцитов желудочков вследствие повышения проницаемости калиевых каналов под влиянием ДМПс. Известно, что стимулирующее сократимость желудочков влияние дофамина, опосредованное активацией Р-адренорецепто-

Таблица 3 Влияние ДМПс 10-4 М на ЭКГ изолированного сердца крысы, интервалы в секундах

Перфузат ИИ Шегуа1 РИ Шегуа1 Р Duration QRS 1п1егуа1 QT 1п!егуа1

Физ. раствор (фон) 0,269±0,010 0,053±0,002 0,015±0,001 0,020±0,001 0,090±0,007

Физ. раствор 30 мин 0,275±0,010 0,051±0,003 0,015±0,001 0,018±0,001 0,090±0,010

Отношение к фону (средн) 1,02 0,97 0,95 0,91 0,99

ДМПс фон 0,251±0,010 0,046±0,003 0,012±0,001 0,022±0,002 0,093±0,004

ДМПс 30 мин 0,381±0,022 0,059±0,004 0,013±0,001 0,021±0,002 0,114±0,012

Отношение к фону ДМПс (средн) 1,52*# 1,29*# 1,11 0,94 1,23*#

Примечание: * — достоверное отличие от фона, принятого за 100%, р < 0,05; # — достоверное отличие от контроля с физ. раствором, р < 0,05.

Влияние ДМПс на потенциал-зависимые К+-каналы изолированного сердца крысы в сравнении с фоновыми значениями, % (п = 10, M±SE) Таблица 4

Перфузат ДП Int (1 м) ЧСС ПД ИСФ

Физ. раствор 99,3±1,8 99,4±2,2 98,7±4,1 103,0±4,1 101,0±2,8

ДМПс 10-4 М 106,9±2,3*# 74,5±2,5*# 69,0±4,2*# 97,0±5,3 65,4±2,3*#"

4-АП 10-6 М 100,3±1,9 100,6±2,1 94,8±2,9 107,5±3,2* 101,4±2,5

4-АП 10-6 М + ДМПс 10-4 М 107,6±1,7# 82,7±3,8#* 77,7±1,5#* 93,0±4,9# 75,4±3,8#*

Примечание: * — достоверное отличие от фона, р < 0,05; # — достоверное отличие от контроля, р < 0,05; " — достоверное отличие от 4-АП+ДМПс, р < 0,05.

ров, проявляется в более высоких его концентрациях (20—100 мкМ), чем в предсердиях [12]. Очевидно, повышение проницаемости калиевых каналов приводит к укорочению периода поступления в клетку ионов кальция и уменьшению продолжительности систолы. Об уменьшении роли Р-адренорецепторов в этих условиях косвенно свидетельствует отсутствие динамики КДД, тенденция к снижению которого установлена при действии дофамина (на 16,7%, р = 0,059).

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что механизм влияния ДМПс на изолированное сердце, в отличие от его центрального действия, лишь частично сопряжен с блокадой дофаминовых рецепторов. Отрицательный хронотропный эффект ДМПс в миокарде реализуется при участии потенциал-зависимых К+-каналов. Вероятным представляется увеличение под влиянием ДМПс

проницаемости калиевых каналов внутреннего выпрямления. Снижение производительности миокарда под действием ДМПс связано со снижением возбудимости и проводимости атипичных кардиомиоцитов, а также со снижением реактивности клеток к действию катехолами-нов. Установленные эффекты ДМПс, приводящие к снижению возбудимости и сократимости кардиомиоцитов, могут свидетельствовать о наличии кардиопротективного эффекта препарата вследствие уменьшения потребности миокарда в кислороде.

Литература

1. Асташкин Е.И., Глезер М.Г. Пейсмекер-ные ^каналы миоцитов синусового узла, как новая терапевтическая мишень для снижения частоты сердечных сокращений // Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2007. № 6 (8). С. 106-115.

2. Кодиров С.А., Журавлев В.Л., Сафонова Т.А. и др. Суперсемейство потенциалза-висимых К+-каналов: структура, функции и патология // Цитология. 2010. № 52 (9). С. 697-714.

3. Легеза В.И., Камынина М.Ф., Марковская И.В. и др. Влияние диметпрамида и метоклопрамида на скорость оборота кате-холаминов в подкорково-стволовых структурах головного мозга крыс // Фармакология и токсикология. 1986. № 49 (4). С. 25-27.

4. Минасян С.М., Галагудза М.М., Сонин Д.Л. и др. Методика перфузии изолированного сердца крысы // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2009. № 32 (4). С. 54-59.

5. Шабанов П. Д. Структура и функции рецепторов дофамина // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2002. № 1 (1). С. 2-18.

6. Barron B.A. Opioid peptides and the heart // Cardiovascular Research. 1999. Vol. 43. P. 13-16.

7. Habuchi Y., Tanaka H., Nishio M. et al. Dopamine stimulation of cardiac beta-adreno-ceptors: the involvement of sympathetic amine transporters and the effect of SKF38393 // British Journal of Pharmacology. 1997. Vol. 122 (8). P. 1669-1678.

8. Juan-Fita M.J., Vargas M.L., Hernández J. Diazepam enhances inotropic responses to

dopamine in rat ventricular myocardium // Anesthesia & Analgesia. 2006. Vol. 102 (3). P. 676-681.

9. Liang B., Nissen J., Laursen M. et al. G-pro-tein-coupled inward rectifier potassium current contributes to ventricular repolarization // Cardiovascular Research. 2014. Vol. 101. P. 175-184.

10. Mesirca P., Alig J., Torrente A.G. et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation // Nature Communications. 2014. Vol. 5. P. 4664.

11. Yue L., Feng J., Li G.R., Nattel S. Characterization of an ultrarapid delayed ectifier potassium channel involved in canine atrial re-polarization // The Journal of Physiology. 1996. Vol. 496. P. 646-662.

12. Zhao M., Matsuoka S., Fujioka Y., Noma A. Effects of dopamine on L-type Ca2+ current in single atrial and ventricular myocytes of the rat // British Journal of Pharmacology. 1997. Vol. 121. P. 1247-1254.

Контакты:

Лаптев Денис Сергеевич,

старший научный сотрудник лаборатории

экстремальной физиологии ФГУП «НИИ гигиены,

профпатологии и экологии человека» ФМБА России,

кандидат биологических наук.

Тел. моб: +7 (911) 133-36-26.

E-mail: lapden@mail.ru