ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ СИЛИБИН И ЭКСТРАКТ КОРНЯ ПУЭРАРИИ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING SILYBIN AND RADIX PUERARIAE EXTRACT

Область техники
Настоящее изобретение относится к области лекарственных препаратов для применения в медицине, и в частности к фармацевтической композиции, которая содержит силибин, для лечения болезни печени.
Уровень техники
В 1960–1980-х годах фармацевты Западной Германии во главе с Г. Вагнером выделили активный ингредиент из плода расторопши пятнистой (Silybum marianum) из семейства Compositae, названный силимарином, который представляет собой новый класc флавоноидов с заместителями С-9, то есть флавонолигнаны, конденсированные с дигидрофлавонолом и производным фенилпропаноида. Силибин (силибинин) является одним из основных составляющих компонентов силимарина. Фармакологические и токсикологические исследования показали, что силибин оказывает защитное и стабилизирующее действие на мембрану гепатоцитов, способствуя восстановлению гепатоцитов и улучшая функцию печени. Силибин характеризуется разными уровнями защитного и лечебного эффектов в отношении разных типов повреждения печени, вызываемых «печеночными ядами», такими как тетрахлорид углерода, тиоацетамид, гидроксихолин, фаллоидин, мукронатин и т. д. Также силибин может использоваться для лечения острого и хронического гепатита, цирроза печени на ранней стадии, жировой дистрофии печени, токсической или медикаментозной гепатопатии.
Силибин плохо растворяется в воде и стандартных органических растворителях, плохо всасывается при пероральном применении, что является причиной его низкой биологической доступности и, таким образом, оказывает отрицательное влияние на его клиническую эффективность. Для улучшения его биологической доступности отечественные и иностранные фармацевты провели значительный объем работ. Способами улучшения всасывания плохо растворимых лекарственных средств обычно являются сверхтонкий помол, высаливание и добавление совместного растворителя и т.д. На протяжении последних лет исследования показали, что растворение и биологическая доступность в значительной степени улучшаются при использовании способов составления с включением соединения циклодекстрина, составления в твердую дисперсию, в синтетический фосфолипидный комплекс и составление в разные лекарственные формы.
С позиции твердого препарата фосфолипидный комплекс является более специфической твердой дисперсией, которая имеет постоянную точку плавления, представляющей собой молекулярное соединение (комплекс) с более стабильными химическими свойствами, и отличается от соединения лекарственного средства и фосфолипида, при этом такие соединения варьируются по типам фосфолипидов и соотношениям лекарственного средства и фосфолипида, а молекула фосфолипида может быть связана с разным количеством молекул лекарственного средства. На основе спектроскопических характеристик комплекса сделали заключение, что это лекарственное средство характеризуется сильным взаимодействием с полярными группами фосфолипида, что подавляет свободное вращение одиночных цепей в молекуле, тогда как две длинных цепи жирных кислот фосфолипида не принимают участия в реакции с образованием комплекса и могут сдвигать и обертывать полярные части фосфолипида с образованием липофильной поверхности, вследствие чего этот комплекс демонстрирует высокую растворимость в липидах. Этот комплекс изменяет физико-химические свойства лекарственного средства, и таким образом повышается растворимость лекарственных средств в липидах и уменьшается растворимость лекарственных средств в воде, что способствует связыванию молекул лекарственного средства с мембранами клеток с улучшением всасывания и повышением биологической доступности лекарственного средства.
Чай пуэр является уникальным и известным чаем из провинции Юньнань. Эта местность характеризуется умеренным климатом, обильными осадками и сильными туманами. Провинция Юньнань является местом выращивания крупнолистового чая пуэр, который классифицируют на две группы по его переработке: неферментированный чай пуэр, полученный путем прямой переработки в конечный продукт, и ферментированный чай пуэр, полученный путем переработки после искусственно ускоренной ферментации, при этом его классифицируют на рассыпной чай и прессованный чай; также в настоящее время для конечного продукта используют процесс естественного созревания, вследствие чего его уникальные качества улучшаются.
Чай пуэр представляет собой единственный постферментированный чай, в котором вещества, вредные для человеческого организма, такие как теофиллин, полифенолы чая, разрушаются в ходе длительного процесса ферментации, поэтому данный продукт мягкий, не оказывает стимулирующего действия на организм, а также может активизировать метаболизм, ускорять пищеварение и расщепление жиров и токсинов в организме. При проблемах в современном обществе, связанных с ожирением и высокими уровнями триглицеридов, чай пуэр может смягчать отрицательные последствия за счет выведения токсинов, придания чувства насыщения, оказания противовоспалительного эффекта, снижения уровня холестерина, выведения жиров и снижения избыточной массы тела. Современные технологии демонстрируют, что чай пуэр может корригировать инсулинорезистентность, регулировать уровни липидов и лептина в крови и т. д., и может блокировать накопление жира клетками паренхимы печени, которое до некоторой степени обусловлено инсулинорезистентностью.
Неалкогольная жировая дистрофия печени (NAFLD) представляет собой повреждение печение, индуцированное метаболическим стрессом, которое тесно связано с инсулинорезистентностью и генетической предрасположенностью, при этом патологические изменения при ней аналогичны изменениям при алкогольной жировой дистрофии печени. NAFLD представляет собой клинико-патологический синдром, который характеризуется гепатоцеллюлярным стеатозом и отложением жира в печеночных долях, но без указания о злоупотреблении алкоголем в анамнезе. NAFLD демонстрирует разные степени повреждения печени, от простой жировой дистрофии при отсутствии воспаления до тяжелой воспалительной реакции в виде сильного фиброза и даже цирроза, при этом преимущественно выделяют 3 типа: простую жировую дистрофию печени, стеатогепатит, жировой цирроз.
Лечение неалкогольной жировой дистрофии печени:
1. Предупреждение возникновения первичного заболевания или связанных с ним факторов риска.
2. Основное лечение: планирование подходящего потребления калорий и рациона, умеренные занятия физическими упражнениями в аэробном режиме, корригирование неправильного образа жизни и вредных привычек.
3. Исключение усугубления повреждения печени: предупреждение резкого снижения массы тела, злоупотребления лекарственными средствами и других факторов, которые могут индуцировать обострение болезни печени.
2
2
2
4. Снижение массы тела: требуется для всех пациентов с NAFLD, у которых имеется избыточная масса тела, висцеральное ожирение и быстрый набор массы за короткий период времени, с изменением образа жизни для контроля массы тела и уменьшения окружности талии. Основное лечение в течение 6 месяцев, снижение массы тела <0,45 кг в месяц или индекс массы тела (BMI) >27 кг/мв комбинации с отклонением от нормы более чем двух из таких показателей, как уровень липидов в крови, уровень глюкозы в крови, кровяное давления и другие, можно рассматривать как показание к добавлению сибутрамина или орлистата и других лекарственных средств для лечения ожирения, при этом снижение массы тела за неделю не должно превышать 1,2 кг (для детей не превышать 0,5 кг за неделю); а BMI 40 кг/м или BMI >35 кг/м в сочетании с синдромом апноэ во время сна и другими заболеваниями, связанными с ожирением, можно рассматривать как показание для процедуры шунтирования проксимальной части желудка для похудения (II-1, II-2, II-3, III).
5. Лекарственное средство, повышающее чувствительность к инсулину: в сочетании с диабетом 2-го типа, нарушенной толерантностью к глюкозе, повышенным уровнем глюкозы в плазме крови натощак и висцеральным ожирением можно рассматривать как показание к применению метформина и тиазолидиндионов с целью корригирования инсулинорезистентности и контроля уровня глюкозы в крови (II-1, II-2, II-3).
6. Гиполипидемические средства: дислипидемия в течение основного лечения и (или) применение лекарственных средств для снижения массы тела и гипогликемических фармацевтических средств на протяжении более 3-6 месяцев, что по-прежнему сочетается с гиперлипидемией или гиперлипидемией с более чем 2 факторами риска, следует рассматривать как показание к добавлению фибратов, статинов или пробукола и других гиполипидемических лекарственных средств (II-1, II-2, II-3).
7. Лекарственные средства для лечения болезни печени: при NAFLD, ассоциированной с нарушением функции печени, метаболический синдром, неэффективность 3-6-месячного основного лечения и биопсия печени, демонстрирующая NASH и постепенное прогрессирование заболевания, можно использовать вспомогательное медикаментозное лечение заболевания печени с использованием антиоксидантных, противовоспалительных, противофиброзных и родственных им лекарственных средств (II-1, II-2, II-3, III), таких как полиенфосфатидилхолин, витамин Е, силимарин и урсодезоксихолевая кислота, которые могут быть рационально подобраны в соответствии с эффективностью лекарственных средств, активностью заболевания и стадией заболевания, но при этом нельзя одновременно применять много лекарственных средств.
2
8. Пересадка печени: перед трансплантацией печени необходимо провести проверку в отношении наличия, главным образом, болезни печени в терминальной стадии, связанной с NASH, и криптогенного цирроза печени, а также метаболического состояния (III). BMI >40 кг/м является противопоказанием к пересадке печени (III).
Вышеуказанные виды лечения не использовали в сочетании, как например, комбинацию гипогликемических средств и средств для лечения болезней печени, или комбинацию гиполипидемических средств и средств для лечения болезней печени. Таким образом, необходим безотлагательный поиск фармацевтического средства с разнообразными лечебно-профилактическими свойствами.
Краткое описание изобретения
Для того, чтобы решить описанные выше технические задачи, настоящее изобретение предусматривает фармацевтическую композицию и препарат на основе нее, которые являются терапевтически эффективными при неалкогольной жировой дистрофии печени, при этом в ходе лечения неалкогольной жировой дистрофии печени комбинация из четырех компонентов также характеризуется синергическим эффектом.
Настоящее изобретение предусматривает способы получения фармацевтической композиции и препарата на основе нее.
Настоящее изобретение осуществляют с помощью следующих технических решений.
Фармацевтическая композиция получена из следующих видов лекарственного сырья при соотношении по массе:
8,75-60 частей силибина,
15-65 частей фосфолипида,
25-200 частей экстракта чая пуэр и
5-50 частей экстракта корня пуэрарии.
Предпочтительно фармацевтическую композицию получают из следующих видов лекарственного сырья при соотношении по массе:
25-40 частей силибина,
30-50 частей фосфолипида,
80-120 частей экстракта чая пуэр и
10-35 частей экстракта корня пуэрарии.
Наиболее предпочтительно фармацевтическую композицию получают из следующих видов лекарственного сырья при соотношении по массе:
35 частей силибина,
42 части фосфолипида,
100 частей экстракта чая пуэр и
20 частей экстракта корня пуэрарии.
Фосфолипид по настоящему изобретению представляет собой фосфолипид или лецитин, который главным образом имеет в составе фосфатидилхолин, предпочтительно соевый фосфолипид.
Функция фосфолипида в настоящем изобретении заключается в обеспечении растворения и всасывания фармацевтических средств, а поскольку силибин представляет собой фармацевтическое средство с низкой растворимостью и низкой проницаемостью, то фософолипид объединяют с cилибином с образованием фосфолипидного комплекса для того, чтобы улучшить растворимость силибина, с улучшением тем самым биологической доступности фармацевтических средств.
Оба описанные силибин и фосфолипид известны из предшествующего уровня техники или являются коммерчески доступными. С целью лучшего проявления эффективности настоящего изобретения силибин по настоящему изобретению предпочтительно получают путем растворения силимарина в 80% этаноле, фильтрования и трехкратного промывания осадка 95% этанолом с последующим сбором осадка. Осадок растворяют в безводном этаноле, фильтруют и в фильтрат добавляют некоторое количество воды для отделения осадка, при этом осадок собирают путем фильтрации, высушивают при пониженном давлении, измельчают в порошок и перемешивают.

Экстракт чая пуэр является коммерчески доступным, предпочтительно под названием «эссенция чая пуэр DEEPURE». Его также можно получить в соответствии с предшествующим уровнем техники. С целью лучшего проявления эффективности настоящего изобретения эссенцию чая пуэр или экстракт чая пуэр предпочтительно получают в соответствии со способами, изложенными в патентах (публикации №№ CN101961061A, CN101961061B, CN101961425A, CN101961425B, CN101961060A, CN101961059A, CN101961059B).
Например, указанную эссенцию чая пуэр получают следующим образом:
стадия 1: листья чая пуэр отваривают в 6-12-кратном объеме воды 2-4 раза, каждый раз по 0,5-2 часа; жидкий экстракт фильтруют и фильтрат концентрируют при пониженном давлении и при температуре ≤70°C до соотношения массы чайных листьев:объема концентрата = 1:2-1:3;
стадия 2: концентрат центрифугируют с помощью центрифуги, центрифугат концентрируют при пониженном давлении до плотности 1,1-1,25 при 45-65°С, концентрированную пасту подвергают высушиванию распылением или высушиванию под воздействием микроволнового излучения с получением конечного продукта.
Предпочтительно данные стадии осуществляют следующим образом:
стадия 1: листья чая пуэр отваривают в 6-12-кратном объеме бурно кипящей воды 3 раза, каждый раз по 0,5-2 часа; раствор экстракта фильтруют и фильтрат концентрируют при пониженном давлении и при температуре ≤70°C до соотношения массы чайных листьев:объема концентрата = 1:2-1:3;
стадия 2: концентрат центрифугируют с помощью трехколонной центрифуги периодического действия, полученный центрифугат центрифугируют на центрифуге с трубчатым ротором, а затем центрифугат концентрируют при пониженном давлении до плотности 1,1-1,25 при 45-65℃, концентрированную пасту подвергают высушиванию распылением или высушиванию под воздействием микроволнового излучения с получением конечного продукта;
при этом параметры для центрифуги с трубчатым ротором следующие: скорость центрифугирования: 15000-19000 об./мин; параметры высушивания распылением: температура на входе: 140-190°C, температура на выходе: 75-95°C.
Наиболее предпочтительно эти стадии осуществляют следующим образом:
листья чая пуэр отваривают в бурно кипящей воде 3 раза, первый раз кипятят в течение 1,5 ч, добавляют 10 объемов воды; второй раз кипятят в течение 1,5 ч, добавляют 8 объемов воды; третий раз кипятят в течение 1 ч, добавляют 8 объемов воды, раствор экстракта фильтруют и фильтрат концентрируют при пониженном давлении и при температуре ≤70°C до соотношения массы чайных листьев:объема концентрата = 1:2-1:3, с помощью трехколонной центрифуги периодического действия, полученный центрифугат центрифугируют на центрифуге с трубчатым ротором, а затем центрифугат концентрируют при пониженном давлении до плотности 1,1-1,25 при 45-65℃, концентрированную пасту подвергают высушиванию распылением или высушиванию под воздействием микроволнового излучения с получением конечного продукта;
при этом параметры для центрифуги с трубчатым ротором следующие: скорость центрифугирования: 15000-19000 об./мин; параметры высушивания распылением: температура на входе: 140-190°C, температура на выходе: 75-95°C.
Экстракт корня пуэрарии является коммерчески доступным в качестве пищевой добавки или для применения в фармакологии, и характеризуется тем, что содержание пуэрарина составляет не менее 80%.
Вышеупомянутые композиции получают при определенных соотношениях компонентов по массе, и эти значения можно увеличивать или уменьшать согласно соответствующим соотношениям в ходе производственных процессов, таких как крупномасштабное производство, при котором могут использоваться кг или т (тонна) в качестве единиц измерения; мелкомасштабное производство, при котором может использоваться г в качестве единицы измерения. Массу можно увеличивать или уменьшать, но соотношение по весу видов лекарственного сырья оставляют без изменения.
Вышеуказанные соотношения по массе получены с помощью научного скрининга для определенных пациентов, таких как пациенты с тяжелыми или умеренными симптомами, страдающие ожирением или худощавые пациенты, при этом соотношение количеств компонентов в композиции могут быть соответствующим образом откорректированы, увеличены или уменьшены не более чем на 10%, причем эффективность практически не изменяется.
Любые фармацевтически приемлемые лекарственные формы могут быть составлены в виде фармацевтического препарата, при этом лекарственные формы выбраны из таблетки, таблетки, покрытой сахарной оболочкой, таблетки, покрытой пленочной оболочкой, таблетки, покрытой кишечнорастворимой оболочкой, капсулы, твердой капсулы, мягкой капсулы, жидкости для перорального приема, средства для перорального приема, гранулы, пилюли, порошка, пасты, лиофилизированного препарата, суспензии, раствора, инъекционного раствора, суппозитория, мази, пластыря, крема, спрея, трансдермальной терапевтической системы. Предпочтительными являются препараты для перорального приема, а в оптимальном варианте предпочтительными являются таблетки, капсулы, гранулы.
Некоторые фармацевтические приемлемые носители могут быть добавлены в композиции по настоящему изобретению, если в этом существует необходимость, при этом фармацевтические препараты могут быть получены с использованием общепринятых методик составления галеновых лекарственных форм, таких как смешивание фармацевтически активного вещества с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтически приемлемые носители выбраны из маннита, сорбита, сорбиновой кислоты или ее калиевой соли, метабисульфита натрия, бисульфита натрия, тиосульфата натрия, гидрохлорида цистеина, меркаптоуксусной кислоты, метионина, витамина А, витамина С, витамина Е, витамина D, азона, динатриевой соли EDTA, динатрий-кальциевой соли EDTA, карбоната, ацетата, фосфата одновалентного щелочного металла или их водного раствора, хлористоводородной кислоты, уксусной кислоты, серной кислоты, фосфорной кислоты, аминокислоты, хлорида натрия, хлорида калия, лактата натрия, ксилита, мальтозы, глюкозы, фруктозы, декстрана, глицина, крахмала, сахарозы, лактозы, маннита, производного диоксида кремния, целлюлозы и ее производного, альгината, желатина, поливинилпирролидона, глицерина, пропиленгликоля, этанола, Tween 60-80, Span-80, пчелиного воска, ланолина, вазелинового масла, цетилового спирта, сложных эфиров галловой кислоты, агара, триэтаноламина, основной аминокислоты, мочевины, аллантоина, карбоната кальция, бикарбоната кальция, поверхностно-активного вещества, полиэтиленгликоля, циклодекстрина, бета-циклодекстрина, фосфолипидного соединения, каолина, талька, стеарата кальция, стеарата магния и т. д. Предпочтительными являются носители, выбранные из одного или более из микрокристаллической целлюлозы, лактозы, крахмала, натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы с низкой степенью замещения, талька.
При составлении композиции по настоящему изобретению в лекарственный препарат единичная доза этого лекарственного препарата может содержать 0,1-1000 мг фармацевтически активного вещества по настоящему изобретению, а остальными составляющими компонентами являются фармацевтически приемлемые носители. Фармацевтически приемлемые носители могут составлять 0-99,9% по массе от общей массы препарата. Предпочтительно фармацевтически приемлемые носители могут составлять 40-70% по массе от общей массы препарата.
Частоту применения и дозировку композиций или препаратов традиционной Китайской медицины по настоящему изобретению определяют в соответствии с состоянием пациентов в ходе применения.
Совокупная скорость растворения препаратов, содержащих фармацевтическую композицию по настоящему изобретению, таких как таблетки, капсулы, гранулы и т. д., составляет не менее 80% при растворении in vitro в течение 2 ч, при этом условия растворения следующие: суспензионный способ, скорость вращения 100 об./мин. и температура 37°С, средой высвобождения является: 1000 мл раствора хлористоводородной кислоты с показателем pH 1,2, дозировка: 1 капсула/1 таблетка/1 пакет гранул.
Cпособ получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению предусматривает следующие стадии:
1) отбор заданного количества сырья для последующего применения;
2) получение раствора комплекса на основе силибина: отвешивают заданное количество силибина и фосфолипида и их растворяют в безводном этаноле, нагревают с обратным холодильником для осветления раствора и продолжают нагревать в течение некоторого периода времени, затем прозрачный раствор концентрируют при пониженном давлении до определенного объема с получением раствора комплекса на основе силибина для последующего применения;
3) грануляция: отвешивают заданное количество экстракта чая пуэр в качестве исходного материала, отбирают раствор комплекса на основе силибина, полученный на стадии 2, в качестве подаваемой жидкости, получают гранулы для последующего применения с помощью способа грануляции распылением в псевдоожиженном слое и последующего высушивания после полного распыления раствора комплекса;
4) конечное составление смеси: осуществляют однородное смешивание заданного количества экстракта корня пуэрарии и гранул, полученных на стадии 3, при постепенном добавлении соответствующего количества компонентов, с получением фармацевтической композиции;
Настоящее изобретение также включает стадию получения 5, предусматривающую отбор фармацевтической композиции, полученной на стадии 4, и фармацевтически приемлемых носителей, при этом фармацевтически приемлемые лекарственные формы получают в соответствии со стандартным способом получения.
Кроме того, предпочтительно способ получения фармацевтической композиции по настоящему изобретению предусматривает следующие стадии:
1) отбор заданного количества сырья для последующего применения;
2) получение раствора комплекса на основе силибина: отвешивают заданное количество силибина и фосфолипида и их растворяют в безводном этаноле, нагревают с обратным холодильником для осветления раствора и продолжают нагревать в течение некоторого периода времени, затем прозрачный раствор концентрируют при пониженном давлении до определенного объема с получением раствора комплекса на основе силибина для последующего применения;
3) грануляция: отвешивают заданное количество экстракта чая пуэр в качестве исходного материала, отбирают раствор комплекса на основе силибина, полученный на стадии 2, в качестве подаваемой жидкости, получают гранулы для последующего применения с помощью способа грануляции распылением в псевдоожиженном слое и последующего высушивания после полного распыления раствора комплекса;
4) конечное составление смеси: осуществляют однородное смешивание заданного количества экстракта корня пуэрарии и гранул, полученных на стадии 3, при постепенном добавлении соответствующего количества компонентов, с получением фармацевтической композиции;
5) получение: отбор фармацевтической композиции и фармацевтически приемлемых носителей с получением фармацевтически приемлемых лекарственных форм.
При этом время нагревания, описанное для стадии 2, составляет 0,5-1,5 часа, объем концентрированного раствора составляет 5% - 20% от исходного объема, а температура концентрирования при пониженном давлении составляет 60-80°C.
При этом параметры для псевдоожиженного слоя на стадии 3 являются следующими: температура материалов составляет 40-65°C, и такие параметры, как частота вращения вентилятора, температура воздуха на впуске и частота подачи, регулируют с тем, чтоб поддерживать материалы в надлежащем ожиженном состоянии в ходе осуществления способа грануляции.
После завершения грануляции гранулы сушат в течение 10-60 минут, а температура высушивания составляет 55-65°C.
Чай пуэр может корригировать инсулинорезистентность, регулировать уровни липидов и лептина в крови и оказывать другие эффекты, он может блокировать накопление жира в клетках паренхимы печени, которое до некоторой степени обусловлено инсулинорезистентностью, в сочетании с высокой способностью силибина к захвату свободных радикалов и к предупреждению оксидативного стресса, при этом оба данных компонента предпочтительно обладают лечебно-профилактическим эффектом в отношении NAFLD (неалкогольной жировой дистрофии печени).
Витамин E добавляют для дополнительного повышения эффективности продукта как косметического средства, а L-карнитин добавляют для усиления действия продукта в плане снижения уровня жиров и снижения массы тела.
Далее полезные эффекты настоящего изобретения будут описаны с помощью экспериментальных примеров.
Экспериментальный пример 1. Эксперимент по исследованию растворения in vitro
Растворение композиций на основе силибина-фосфолипида-чая пуэр-экстракта корня пуэрарии, полученных в вариантах осуществления 16-20, определяли в следующих условиях: выбор способов растворения основывался на свойствах основного компонента силибина в данных композициях, который в качестве лекарственного препарата обладает низкой растворимостью и низкой проницаемостью, при этом он относится к четвертой категории согласно биофармацевтической классификации лекарственных средств (BCS), а его растворение и всасывание являются стадиями, лимитирующими скорость процесса. Таким образом, каждая из этих стадий должна быть одновременно улучшена с целью повышения биологической доступности фармацевтических препаратов. Cтадия растворения силибина в основном осуществляется в желудке, стадия всасывания в основном осуществляется в тонком кишечнике. Таким образом, определение растворения этого фармацевтического препарата in vitro способствует обеспечению улучшения биологической доступности фармацевтических препаратов. Как результат, следующий способ растворения выбирали для оценки данной композиции: суспензионный способ, скорость вращения 100 об./мин. при температуре 37°C, а среда для высвобождения представляет собой 1000 мл раствора хлористоводородной кислоты с показателем pH 1,2, дозировка: 1 капсула/1 таблетка/1 пакет гранул. Моменты времени отбора образцов: 15, 30, 45, 60, 90, 120 мин. Определяли совокупную растворимость. Результаты показаны в таблице 1 ниже.
Таблица 1
Осуществляли определение растворения эталонного препарата (препарата, представляющего собой комплекс силибин-фосфолипид, полученный в лаборатории), и сравнивали этот показатель с показателем для композиций на основе силибина-фосфолипида-чая пуэр-экстракта корня пуэрарии, полученных согласно вариантам осуществления 16-20, при этом результаты показаны на фиг. 1. Из данных, приведенных в таблице 1 и на графике на фигуре 1, можно увидеть, что
высвобождение in vitro композиции на основе силибина-фосфолипида-чая пуэр-экстракта корня пуэрарии, полученной с помощью способа получения по настоящему изобретению, является значительно лучшим, чем высвобождение эталонного препарата, который представляет собой комплекс силибин-фосфолипид, при этом, как ни странно, совокупное растворение этой композиции в растворе хлористоводородной кислоты с показателем pH 1,2 через 2 часа достигало более 80%, то есть это свидетельствует о практически полном растворении, что в два раза превышает растворение эталонного состава, при этом решаются проблемы низкой растворимости и низкой биологической доступности силибина, которые всегда существовали, что дает основание для проведения в будущем исследований с подбором дозы и безопасности и эффективности композиции на основе силибина in vivo.
Объединенные данные теста растворения in vitro и фармакологические исследования in vivo демонстрируют, что настоящее изобретение дополнительно улучшает растворимость этого фармацевтического средства за счет объединения комплекса силибин-фосфолипид с чаем пуэр и экстрактом корня пуэрарии, продолжая улучшать всасывание данного фармацевтического средства путем улучшения совместимости данного фармацевтического средства и биологической мембраны как результат комбинации силибина и фосфолипида, при улучшении двух аспектов в виде растворимости и всасывания улучшается биологическая доступность основного компонента, представляющего собой силибин.
Экспериментальный пример 2. Оценка фармакодинамики in vivo
1. Экспериментальные животные
80 мышей класса SPF (свободных от патогенной микрофлоры) и самцов 6-недельного возраста C57 BL/6J, дефицитных по лептину (ob/ob), 10 мышей класса SPF и 6-недельных самцов C57 BL/6J (ob/m), предоставленных Beijing Huafukang Bioscience Co., Inc., содержали в барьерном отделении для животных центра фармакологических и токсикологических исследований института Tasly при температуре 20°C - 25°C, относительной влажности 60%, по 5 мышей в каждой клетке, при освещении продолжительностью 12 часов, при регулярном и достаточном кормлении, причем мышам ob/ob скармливали рацион с высоким содержанием жиров (HFD, D12492), мышам C57 BL/6J скармливали стандартный рацион, при этом оба типа рационов были предоставлены компанией Beijing Huafukang Bioscience Co., Inc., и со свободным доступом к воде, ежедневной заменой подстилки.
2. Тестируемые вещества
Комплекс силибин-фосфолипид был предоставлен компанией Tasly Pharmaceutical Co., Ltd., номер партии 500902031. Экстракт чая пуэр, коричневый порошок, был предоставлен компанией Tasly Pharmaceutical Co., Ltd., номер партии Z001 PE(2014)C06(H); экстракт корня пуэрарии был предоставлен компанией Shanxi Yongyuan Bio-Tech Co., Ltd., номер партии YYP140717; при этом указанные выше тестируемые вещества для защиты от света хранили при комнатной температуре в шкафу для образцов в комнате для проведения испытаний Института фармакологии.
3. Экспериментальные способы
3.1 Экспериментальный подбор доз и разделение на группы
Комплекс силибин-фосфолипид вводили экспериментальным животным в дозе из расчета в соответствии с суточной дозой для человека, составляющей 3 г (содержит силибина 420 мг, соевого фосфолипида 504 мг); экстракт чая пуэр вводили экспериментальным животным из расчета в соответствии с суточной дозой для человека, составляющей 1,2 г. В таблице 2 показаны пять композиций, отличающихся по соотношению составляющих компонентов, и подобранные экспериментальные дозы, причем доза для экспериментальных животных установлена на уровне клинически эквивалентной дозы соответствующих тестируемых веществ согласно следующей формуле для расчета:
экспериментальная доза для животного = рекомендованная доза для человека/60кг*12,3
Таблица 2. Доза различных композиций
3.2 Введение тестируемых веществ
После 1-недельного периода кормления с целью адаптации 80 мышей ob/ob 6-недельного возраста случайным образом разделяли на 8 групп: модельная группа, группа c назначением комплекса силибин-фосфолипид, группа c назначением экстракта чая пуэр, группа c назначением комбинации 1, группа c назначением комбинации 2, группа c назначением комбинации 3, группа c назначением комбинации 4 и группа c назначением комбинации 5, по 10 мышей в каждой группе. Еще 10 мышей C57BL/6J 6-недельного возраста составляли нормальную группу. Нормальной группе мышей скармливали стандартный рацион, а модельной группе и группе с введением препарата скармливали рацион с высоким содержанием жиров (HFD, D12492). Кроме того, мышам в разных группах введения лекарственных средств давали соответствующие дозы лекарственных средств путем внутрижелудочного введения, при этом дозы пяти композиций показаны в таблице 2, а нормальной группе и модельной группе давали такое же количество дистиллированной воды, путем внутрижелудочного введения на протяжении 6 недель.
Мыши имели свободный доступ к пище и воде на протяжении эксперимента, при этом каждую неделю их взвешивали и дозы корригировали в соответствии с массой тела. После последнего введения мышей подвергали голоданию на протяжении 12 часов, но сохраняли доступ к воде, измеряли массу тела, извлекали глазные яблоки мышей для забора крови, а затем их убивали путем перелома шеи и быстро отбирали печень, промывали ее физиологическим раствором, промокали фильтровальной бумагой и после взвешивания хранили в морозильной камере при -20°C.
3.3 Определение показателей и способы
3.3.1 Общее наблюдение
Показатели массы тела мышей в каждой группе измеряли еженедельно в ходе эксперимента.
3.3.2 Расчет печеночного индекса и общая оценка морфологии печени
После окончания эксперимента печень взвешивали и рассчитывали печеночный индекс, печеночный индекс (%) = масса сырой печени/масса тела*100%.
3.3.3 Определение биохимических показателей сыворотки крови
Кровь отбирали у всех мышей путем извлечения глазных яблок и центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 15 минут, сыворотку крови отделяли и переносили в пробирки эппендорф и хранили в морозилке при -20°C для последующего использования. Содержание глютамино-щавелевоуксусной трансаминазы (AST), глутамат-пируватной трансаминазы (ALT), общего холестерина (TC), холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-C) в сыворотке крови измеряли с помощью автоматического биохимического анализатора 7020.
3.3.4 Индекс инсулинорезистентности
Уровень инсулина натощак (FINS) в сыворотке крови определяли с использованием набора для ИФА и индекс инсулинорезистентности рассчитывали по следующей формуле.
Homa-IR (индекс инсулинорезистентности)=
3.3.5 Гистопатологическое исследование печени
Замороженные срезы получали из замороженных тканей печени, и степень стеатоза печени определяли путем окрашивания масляным красным (oil red O). Стадии процесса окрашивания c использованием масляного красного O: получали замороженные срезы → промывали достаточным объемом дистиллированной воды → окрашивали разведенным раствором масляного красного O в темноте на протяжении 10-15 минут → удаляли 6 мл насыщенного раствора масляного красного O, добавляли 4 мл дистиллированной воды, оставляли на 5-10 минут и удаляли с помощью фильтровальной бумаги для последующего использования → просветляли ткани в 60% этаноле → промывали водой →ядра клеток окрашивали гематоксилином → промывали водой → покрывали нейтральной средой для микроскопии → проводили микроскопическое исследование.
3.4 Обработка данных
Для анализа использовали статистическое программное обеспечение SPSS 15.0, при этом данные выражали в виде среднего значения ± стандартное отклонение, а t-критерий использовали для анализа присутствия или отсутствия различия между двумя группами до и после обработки, причем различие является статистически значимым при P<0,05.
4. Результаты экспериментов
4.1 Эффекты каждого тестируемого вещества в отношении массы тела
Массу тела мышей в каждой группе измеряли один раз в неделю в ходе эксперимента и оценивали эффекты каждого тестируемого лекарственного препарата в каждой группе в отношении массы тела мышей с неалкогольной жировой дистрофией печени. Как показано в таблице 3, масса тела мышей в нормальной группе увеличивалась медленно, а масса тела мышей в модельной группе увеличивалась быстрее. После 6 недель введения, за исключением группы с назначением комплекса силибин-фосфолипид, в остальных группах введения прибавка в массе тела мышей подавлялась в разной степени (P<0,05), a эффект в результате применения комбинации из комплекса силибин-фосфолипид, экстракта чая пуэр и экстракта корня пуэрарии значительно превосходил эффект, обусловленный применением только комплекса на основе силибина.
Таблица 3. Эффекты каждого тестируемого вещества в отношении массы тела мышей (г, n=10, ±S)
4.2 Эффекты каждого тестируемого вещества в отношении печеночного индекса
Как показано в таблице 4, масса тела, масса сырой печени и печеночный индекс у мышей в модельной группе значимо увеличивались по сравнению с нормальной группой (P<0,01), при этом комплекс силибин-фосфолипид мог обеспечивать уменьшение массы сырой печени (P<0,05), но не оказывал значимого эффекта в отношении массы тела мышей (P>0,05); при этом все пять композиций на основе комплекса силибин-фосфолипид, экстракта чая пуэр и экстракта корня пуэрарии могли обеспечивать значимое снижение сырой массы печени и печеночного индекса у мышей (P<0,05), при этом эффект в результате комбинированного применения трех компонентов является значительно лучше эффекта, обусловленного применением только комплекса силибин-фосфолипид.
Таблица 4. Эффекты каждого тестируемого вещества в отношении печеночного индекса у мышей
Таблица 4.3. Эффекты каждого тестируемого вещества в отношении уровня липидов в крови, функции печени и индексов инсулинорезистентности у мышей
Как показано в таблице 5, уровни сывороточных TC, LDL, ALT, AST и индекс инсулинорезистентности значимо увеличены в мышиной модели неалкогольной жировой дистрофии печени по сравнению с нормальной группой (P<0,05); значимое улучшение в отношении патологически повышенных показателей при использовании комплекса силибин-фосфолипид отсутствовало (P>0,05); композиции на основе группы из фармацевтически совместимых комплекса силибин-фосфолипид, экстракта чая пуэр и экстракта корня пуэрарии в разных пропорциях могут значимо снижать TC, LDL-C, ALT, AST и индексы инсулинорезистентности (P<0,05), при этом данный эффект выражен лучше, чем при использовании комплекса силибин-фосфолипид отдельно.
Таблица 5. Эффекты каждого тестируемого вещества в отношении уровня липидов в крови, функции печени и индексов инсулинорезистентности у мышей
4.4 Эффекты каждого испытуемого вещества в отношении патологического состояния печени у мышей
Окрашивание с помощью масляного красного O: при исследовании с помощью световой микроскопии замороженных срезов из тканей печени, окрашенных масляным красным О, в соответствии с размером и количеством красных частиц в гепатоцитах патологическое состояние печени классифицировали на легкий, умеренный и тяжелый типы. Легкий означает, что 1/3-2/3 красных гранул выявляют на единицу площади под световым микроскопом, что оценивают в 1 балл; умеренный означает, что более 2/3 гепатоцитов содержат красные частицы, что оценивают в 2 балла; тяжелый означает, что практически все гепатоциты содержат красные частицы, что оценивают в 3 балла; отсутствие стеатоза оценивают в 0 баллов.
Как показано в таблице 6, стеатоз встречается практически во всех гепатоцитах тканей печени модельной группы и баллы показателя патологического состояния печени значимо увеличены по сравнению с нормальной группой (P<0,01); при этом отсутствовало значимое улучшение в баллах показателя патологического состояния печени при использовании комплекса силибин-фосфолипид или экстракта чая пуэр по отдельности (P>0,05); комбинация разных пропорций экстракта чая пуэр, комплекса силибин-фосфолипид и экстракта корня пуэрарии может значимо улучшать течение стеатоза печени, снижать показатели патологического состояния (P<0,05), причем данный эффект лучше эффекта, наблюдаемого при использовании комплекса силибин-фосфолипид и экстракта чая пуэр по отдельности.
Таблица 6. Эффекты каждого тестируемого вещества в отношении патологического состояния печени у мышей
5. Выводы, полученные на основе экспериментов
Вышеприведенные результаты экспериментов демонстрируют, что масса тела, печеночный индекс, уровни липидов в крови, ALT, AST и индекс инсулинорезистентности значимо увеличены у мышей модельной группы с неалкогольной жировой дистрофией печени по сравнению с мышами контрольной группы, и в тканях печени наблюдался тяжелый стеатоз. Чай пуэр может корригировать инсулинорезистентность, регулировать уровни липидов, корень пуэрарии оказывает липидорегулирующие и противовоспалительные эффекты, а также может улучшать детоксикационную функцию печени и восстанавливать поврежденные клетки печени, тогда как силибин обладает высокой способностью к захвату свободных радикалов и к предупреждению оксидативного стресса, при этом применение в комбинации этих трех компонентов в значительной степени улучшает течение стеатоза печени и оказывает профилактический и терапевтический эффект в отношении неалкогольной жировой дистрофии печени.
Краткое описание графических материалов
На фигуре 1 представлена кривая высвобождения in vitro, где каждый образец представляет собой следующее: эталонный препарат Shui Lin Jia, Shui Lin Jia без чая пуэр и композиции на основе силибина-фосфолипида-чая пуэр, полученные в вариантах осуществления 16-20.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими конкретными вариантами осуществления, но не предназначено для ограничения настоящего изобретения.
Вариант осуществления 1
Отбирали 26,25 г силибина, 45 г соевого фосфолипида, 75 г экстракта чая пуэр и 15 г экстракта корня пуэрарии.
1) Получали раствор комплекса на основе силибина: отвешивали заданное количество силибина и соевого фосфолипида и их растворяли в безводном этаноле, нагревали с обратным холодильником для осветления раствора и продолжали нагревать в течение 1 ч., затем концентрировали при пониженном давлении и повторно извлекали с помощью этанола с получением 15% от исходного объема для последующего применения;
2) грануляция: отвешивали заданное количество экстракта чая пуэр в качестве исходного материала, отбирали раствор комплекса на основе силибина, полученный на стадии 1, в качестве подаваемой жидкости, получали гранулы с помощью способа грануляции распылением в псевдоожиженном слое, устанавливали температуру материалов на уровне 40°C, высушивали при 60°C в течение 20 мин. с получением гранул после полного распыления раствора комплекса для последующего применения;
3) осуществляли однородное смешивание заданного количества экстракта корня пуэрарии и гранул, полученных на стадии 2, при постепенном добавлении соответствующего количества компонентов, гранулы расфасовывали в пакеты с получением 1000 пакетов с гранулами.
Вариант осуществления 2
Отбирали 180 г силибина, 195 г соевого фосфолипида, 600 г экстракта чая пуэр и 150 г экстракта корня пуэрарии.
1) Получали раствор комплекса на основе силибина: отвешивали заданное количество силибина и соевого фосфолипида и их растворяли в безводном этаноле, нагревали с обратным холодильником для осветления раствора и продолжали нагревать в течение 1,5 ч., затем концентрировали при пониженном давлении и повторно извлекали с помощью этанола с получением 20% от исходного объема для последующего применения;
2) грануляция: отвешивали заданное количество экстракта чая пуэр в качестве исходного материала, отбирали раствор комплекса на основе силибина, полученный на стадии 1, в качестве подаваемой жидкости, получали гранулы с помощью способа грануляции распылением в псевдоожиженном слое, устанавливали температуру материалов на уровне 65°C, высушивали при 65°C в течение 60 мин. с получением гранул после полного распыления раствора комплекса для последующего применения;
3) осуществляли однородное смешивание заданного количества экстракта корня пуэрарии и гранул, полученных на стадии 2, при постепенном добавлении соответствующего количества компонентов, гранулы расфасовывали в пакеты с получением 1000 пакетов с гранулами.
Вариант осуществления 3
Отбирали 26,25 г силибина, 195 г фосфолипида, 600 г экстракта чая пуэр и 15 г экстракта корня пуэрарии.
1) Получали раствор комплекса на основе силибина: отвешивали заданное количество силибина и соевого фосфолипида и их растворяли в безводном этаноле, нагревали с обратным холодильником для осветления раствора и продолжали нагревать в течение 0,5 ч., затем концентрировали при пониженном давлении и повторно извлекали с помощью этанола с получением 5% от исходного объема для последующего применения;
2) грануляция: отвешивали заданное количество экстракта чая пуэр в качестве исходного материала, отбирали раствор комплекса на основе силибина, полученный на стадии 1, в качестве подаваемой жидкости, получали гранулы с помощью способа грануляции распылением в псевдоожиженном слое, устанавливали температуру материала на уровне 50°C, высушивали при 55°C в течение 10 мин. с получением гранул после полного распыления раствора комплекса для последующего применения;
3) осуществляли однородное смешивание заданного количества экстракта корня пуэрарии и гранул, полученных на стадии 2, при постепенном добавлении соответствующего количества компонентов, гранулы расфасовывали в пакеты с получением 1000 пакетов с гранулами.
Вариант осуществления 4
Отбирали 26,25 г силибина, 195 г фосфолипида, 75 г экстракта чая пуэр и 150 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 5
Отбирали 180 г силибина, 45 г фосфолипида, 75 г экстракта чая пуэр и 15 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 6
Отбирали 180 г силибина, 45 г фосфолипида, 600 г экстракта чая пуэр и 150 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 7
Отбирали 180 г силибина, 195 г фосфолипида, 75 г экстракта чая пуэр и 150 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 8
Отбирали 26,25 г силибина, 48,75 г фосфолипида, 75 г экстракта чая пуэр и 30 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 9
Отбирали 26,25 г силибина, 48,75 г фосфолипида, 300 г экстракта чая пуэр и 30 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 10
Отбирали 52,5 г силибина, 97,5 г фосфолипида, 300 г экстракта чая пуэр и 7,5 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 11
Отбирали 75 г силибина, 90 г фосфолипида, 240 г экстракта чая пуэр и 36 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 12. Получение композиции
Отбирали 90 г силибина, 108 г фосфолипида, 270 г экстракта чая пуэр и 90 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 13. Получение композиции
Отбирали 105 г силибина, 126 г фосфолипида, 300 г экстракта чая пуэр и 60 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 14. Получение композиции
Отбирали 105 г силибина, 126 г фосфолипида, 300 г экстракта чая пуэр и 60 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 15. Получение композиции
Отбирали 120 г силибина, 150 г фосфолипида, 360 г экстракта чая пуэр и 105 г экстракта корня пуэрарии и получали 1000 пакетов с гранулами согласно способу варианта осуществления 1.
Вариант осуществления 16
Отбирали гранулы, полученные в варианте осуществления 8, добавляли 556 г микрокристаллической целлюлозы и 64 г натриевой соли карбоксиметилкрахмала, равномерно перемешивали, заключали в капсулы с получением 1000 капсул.
Вариант осуществления 17
Отбирали гранулы, полученные в варианте осуществления 9, добавляли 331 г микрокристаллической целлюлозы и 64 г натриевой соли карбоксиметилкрахмала, равномерно перемешивали, заключали в капсулы с получением 1000 капсул.
Вариант осуществления 18
Отбирали гранулы, полученные в варианте осуществления 10, добавляли 311 г микрокристаллической целлюлозы и 32 г натриевой соли карбоксиметилкрахмала, равномерно перемешивали, заключали в капсулы c получением 1000 капсул.
Вариант осуществления 19
Отбирали гранулы, полученные в варианте осуществления 13, добавляли 145 г микрокристаллической целлюлозы и 64 г натриевой соли карбоксиметилкрахмала, равномерно перемешивали, заключали в капсулы с получением 1000 капсул.
Вариант осуществления 20
Отбирали гранулы, полученные в варианте осуществления 14, добавляли 76 г микрокристаллической целлюлозы и 64 г натриевой соли карбоксиметилкрахмала, равномерно перемешивали, заключали в капсулы с получением 1000 капсул.
Вариант осуществления 21
Отбирали композицию, полученную в варианте осуществления 8, добавляли 400 г лактозы, 156 г крахмала и 64 г натриевой соли карбоксиметилкрахмала, равномерно перемешивали, заключали в капсулы с получением 1000 капсул.
Вариант осуществления 22
Отбирали композицию, полученную в варианте осуществления 13, добавляли 115 г лактозы, 10 г тальковой пудры и 84 г гидроксипропилцеллюлозы с низкой степенью замещения, равномерно перемешивали, заключали в капсулы c получением 1000 капсул.
Вариант осуществления 23
Отбирали композицию, полученную в варианте осуществления 13, добавляли 145 г микрокристаллической целлюлозы и 64 г натриевой соли карбоксиметилкрахмала, равномерно перемешивали, заключали в капсулы № 0 с получением 1000 капсул.