ПРОТИВОРАКОВЫЕ ВАКЦИНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА MUC16, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTI-CANCER VACCINES TARGETING MUC16 AND THEIR USE

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка претендует на приоритет и преимущество относительно предварительной заявки на патент США Номер 62/598,314, поданной 13 декабря 2017 года, предварительной заявки на патент США Номер 62/599,513, поданной 15 декабря 2017 года, полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Данная заявка содержит Перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим полностью включен посредством ссылки. Указанная ASCII-копия, созданная 12 декабря 2018 года, называется l04409_000446_sequence_listing.txt и имеет размер 54 027 байт.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Настоящее изобретение относится к антигенам MUC16 и молекулам нуклеиновых кислот, которые их кодируют. Настоящее изобретение также относится к вакцинам, включающим антигены MUC16 и/или молекулы нуклеиновой кислоты. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам использования вакцин для индукции иммунных ответов и предотвращения и/или лечения субъектов, имеющих раковые клетки, которые экспрессируют MUC16.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Рак остается основной причиной смерти в США и во всем мире. Рынок противораковых вакцин быстро растет. Эффективные противоопухолевые вакцины могут быть полезны для предотвращения роста опухоли и/или могут быть полезны в качестве более эффективной, менее токсичной альтернативы стандартному лечению пациентов с запущенными формами рака. Антигеном, связанным с раком и, следовательно, мишенью для противоопухолевых вакцин является MUC16.
[0005] MUC16 является членом семейства муцинов, высокомолекулярных гликопротеинов. Муцины экспрессируются специализированными эпителиальными клетками, окружающими поверхность просвета различных органов респираторного, желудочно-кишечного и репродуктивного трактов. MUC16 играет прямую и косвенную роль в поддержании целостности эпителия, а также в любрикации и защите эпителиальных поверхностей.
[0006] Домен тандемного повтора MUC16 содержит повторяющийся пептидный эпитоп, CA125, который стал золотым стандартом биомаркера для множества клинических сценариев, возникающих при диагностике и лечении рака яичников, включая: 1) скрининг на раннее выявление, 2) проведение различия между доброкачественным и злокачественным заболеванием у женщин до и после менопаузы с образованиями в тазу, и 3) мониторинг реакции на терапию. Кроме того, функциональные исследования показали, что MUC16 способствует трансформации и метастазированию опухолей яичников.
[0007] Из-за его высокой экспрессии в большинстве случаев рака яичников, а также предполагаемой роли в потенцировании онкогенеза, MUC16 является привлекательной мишенью для противораковой терапевтической вакцины. Однако конструирование антигена затруднено его большим размером, сложным профилем гликозилирования и экспрессией в здоровой эпителиальной ткани.
[0008] Вакцины для лечения и профилактики рака представляют большой интерес. Существующие вакцины, нацеленные на антигены опухолевых клеток, часто ограничены слабой экспрессией антигена in vivo. Соответственно, в данной области остается потребность в разработке безопасных и эффективных вакцин, которые применимы к опухолям, экспрессирующим MUC16, обеспечивая тем самым лечение и способствуя выживанию субъектов, пораженных такими видами рака.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] В данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2.
[0002] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-4470 SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-4470 SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-4470 SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-4470 SEQ ID NO: 1.
[0003] В данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2.
[0004] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 1.
[0005] В данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4.
[0006] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-1926 SEQ ID NO: 3; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-1926 SEQ ID NO: 3; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-1926 SEQ ID NO: 3; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-1926 SEQ ID NO: 3.
[0007] В данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 4; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 4; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 4; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 4.
[0008] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 3; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 3; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 3; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 3.
[0009] В данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6.
[0010] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-2130 SEQ ID NO: 5; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-2130 SEQ ID NO: 5; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-2130 SEQ ID NO: 5; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-2130 SEQ ID NO: 5.
[0011] В данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 6; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 6; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 6; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 6.
[0012] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 5; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 5; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 5; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 5.
[0013] В данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8.
[0014] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7.
[0015] В данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8.
[0016] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-4023 SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-4023 SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-4023 SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-4023 SEQ ID NO: 7.
[0017] В данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 8.
[0018] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 7.
[0019] Одна или более молекул нуклеиновой кислоты, представленные в данном документе, могут быть включены в вектор, такой как плазмида или вирусный вектор. Одна или более молекул нуклеиновой кислоты, представленные в данном документе, могут быть включены в вектор, такой как плазмида или вирусный вектор. В некоторых вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2. В определенных вариантах воплощения вектор включает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-4470 SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-4470 SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-4470 SEQ ID NO: 1 ; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-4470 SEQ ID NO: 1. В дополнительных вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2. В еще других вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 1 ; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 1.
[0020] В дополнительных вариантах воплощения вектор содержит одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4. В определенных вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-1926 SEQ ID NO: 3; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-1926 SEQ ID NO: 3; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-1926 SEQ ID NO: 3; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-1926 SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 4; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 4; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 4; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 4. В дополнительных вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 3; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 3; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 3; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 3.
[0021] В некоторых вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6. В определенных вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-2130 SEQ ID NO: 5; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-2130 SEQ ID NO: 5; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-2130 SEQ ID NO: 5; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-2130 SEQ ID NO: 5. В дополнительных вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 6; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 6; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 6; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 6. В еще других вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 5; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 5; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 5; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 5.
[0022] В дополнительных вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8. В определенных вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7. В дополнительных вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8. В определенных вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: нуклеотидов 55-4023 SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-4023 SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-4023 SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-4023 SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения вектор содержит молекулы нуклеиновой кислоты, включающие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 7.
[0023] В некоторых вариантах воплощения, представленные в данном документе нуклеиновые кислоты функционально связаны с регуляторным элементом. В некоторых вариантах воплощения регуляторный элемент является промотором и/или сигналом полиаденилирования. В дополнительных вариантах воплощения промотор представляет собой немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (промотор hCMV). В других вариантах воплощения сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH poly A).
[0024] Также в данном документе предлагаются композиции, которые содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, как изложено в данном документе. В некоторых вариантах воплощения эти композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель.
[0025] Дополнительно предлагаются антигенные белки MUC16, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-1490 SEQ ID NO: 2; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2.
[0026] Дополнительно предлагаются антигенные белки MUC16, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 2; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 2; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2.
[0027] Дополнительно предлагаются антигенные белки MUC16, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-642 SEQ ID NO: 4; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4.
[0028] Дополнительно предлагаются антигенные белки MUC16, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 4; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 4; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 4; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах воплощения белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2.
[0029] Дополнительно предлагаются антигенные белки MUC16, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-710 SEQ ID NO: 6; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6.
[0030] Дополнительно предлагаются антигенные белки MUC16, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 6; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 6; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах воплощения белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6.
[0031] Дополнительно предлагаются антигенные белки MUC16, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8.
[0032] Дополнительно предлагаются антигенные белки MUC16, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-1341 SEQ ID NO: 8; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8.
[0033] Дополнительно предлагаются антигенные белки MUC16, содержащие аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 8; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 8; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 8; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8.
[0034] Также предлагаются вакцины, содержащие антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения антиген кодируется SEQ ID NO: 1.
[0035] Также предлагаются вакцины, содержащие антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах воплощения антиген кодируется SEQ ID NO: 3.
[0036] Также предлагаются вакцины, содержащие антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах воплощения антиген кодируется SEQ ID NO: 5.
[0037] Также предлагаются вакцины, содержащие антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения антиген кодируется SEQ ID NO: 7.
[0038] Дополнительно предлагаются вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 95% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 1. Дополнительно в данном документе предлагаются вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты кодирует антиген MUC16, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2.
[0039] Дополнительно предлагаются вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 95% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 3. Дополнительно в данном документе предлагаются вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты кодирует антиген MUC16, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4.
[0040] Дополнительно предлагаются вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 95% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 5. Дополнительно в данном документе предлагаются вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты кодирует антиген MUC16, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6.
[0041] Дополнительно предлагаются вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 95% идентичности по всей длине последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 7. Дополнительно в данном документе предлагаются вакцины, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, при этом молекула нуклеиновой кислоты кодирует антиген MUC16, включающий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере примерно 95% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8.
[0042] В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты может содержать экспрессионный вектор. Вакцины могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых вариантах воплощения вакцины могут дополнительно содержать адъювант. В определенных вариантах воплощения адъювант представляет собой IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
[0043] Также в данном документе предлагаются вакцины, включающие антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения антиген кодируется SEQ ID NO: 1.
[0044] Дополнительно предлагаются вакцины, содержащие пептид, при этом пептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 2.
[0045] Также в данном документе предлагаются вакцины, включающие антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах воплощения антиген кодируется SEQ ID NO: 3.
[0046] Дополнительно предлагаются вакцины, содержащие пептид, при этом пептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 4.
[0047] Также в данном документе предлагаются вакцины, включающие антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах воплощения антиген кодируется SEQ ID NO: 5.
[0048] Дополнительно предлагаются вакцины, содержащие пептид, при этом пептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 6.
[0049] Также в данном документе предлагаются вакцины, включающие антиген MUC16, при этом антиген содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения антиген кодируется SEQ ID NO: 7.
[0050] Дополнительно предлагаются вакцины, содержащие пептид, при этом пептид содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 90% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8.
[0051] Дополнительно предлагаются способы лечения субъекта с раковой клеткой, экспрессирующей MUC16, включающие введение терапевтически эффективного количества вакцины, описываемой в данном документе. В некоторых вариантах воплощения введение включает этап электропорации. В других вариантах воплощения введение происходит в одном или более участков на субъекте.
[0052] Также предлагаются способы вакцинации субъекта против раковой клетки, экспрессирующей MUC16. В некоторых вариантах воплощения введение включает этап электропорации. В других вариантах воплощения введение происходит в одном или более участков на субъекте.
[0053] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2 для использования в качестве лекарственного средства.
[0054] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 4; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 4; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 4; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 4 для использования в качестве лекарственного средства.
[0055] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 6; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 6; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 6; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 6 для использования в качестве лекарственного средства.
[0056] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 8 для использования в качестве лекарственного средства.
[0057] В некоторых вариантах воплощения, представленные в данном документе молекулы нуклеиновой кислоты предназначены для использования в качестве лекарственного средства в лечении рака. В некоторых вариантах воплощения, представленные в данном документе молекулы нуклеиновой кислоты предназначены для использования в приготовлении лекарственного средства. В некоторых вариантах воплощения, представленные в данном документе молекулы нуклеиновой кислоты предназначены для использования в приготовлении лекарственного средства для лечения рака.
[0058] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 1 для использования в качестве лекарственного средства.
[0059] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 3; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 3; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 3; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 3 для использования в качестве лекарственного средства.
[0060] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 5; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 5; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 5; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 5 для использования в качестве лекарственного средства.
[0061] Также в данном документе предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 7 для использования в качестве лекарственного средства.
[0062] В некоторых вариантах воплощения, представленные в данном документе молекулы нуклеиновой кислоты предназначены для использования в качестве лекарственного средства в лечении рака. В некоторых вариантах воплощения, представленные в данном документе молекулы нуклеиновой кислоты предназначены для использования в приготовлении лекарственного средства. В некоторых вариантах воплощения, представленные в данном документе молекулы нуклеиновой кислоты предназначены для использования в приготовлении лекарственного средства для лечения рака.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0063] ФИГ. 1 иллюстрирует структуру нативного MUC16 человека. Указаны области, на которые нацелены вакцинные конструкции MUC16.
[0064] ФИГ. 2 изображает филогенетический анализ нативных центральных тандемных повторов MUC16 человека.
[0065] ФИГ. 3 иллюстрирует отдельные повторные последовательности нативного MUC16, из которых был получен каждый микроконсенсусный повтор (RMC) MUC16, и процентную идентичность последовательностей между собой (GenBank: AAL65133.2).
[0066] ФИГ. 4 показывает аминокислотную последовательность карбокси-концевого домена MUC16. Подчеркнутая область (NFSPLARRVDR) представляет собой потенциальный сайт расщепления, жирная подчеркнутая область представляет собой трансмембранный домен, а цитоплазматический хвостовой сегмент обозначен двойным подчеркиванием. Неуказанная последовательность выше трансмембранного домена представляет собой внеклеточный эктодомен. Рамки обозначают потенциальные сайты фосфорилирования S/T/Y. Сайты N- и O-гликозилирования обозначены, соответственно, X и O.
[0067] ФИГ. 5 иллюстрирует выравнивание модифицированного консенсусного эктодомена и трансмембранного домена MUC16 и эктодомена и трансмембранного домена нативного человеческого MUC16. Изменения консенсуса обозначены серым цветом.
[0068] ФИГ. 6A-6B иллюстрируют стратегию сборки RMC, нативных повторов и синтетического консенсусного эктодомена и трансмембранного домена MUC16 для снижения вероятности появления нецелевых эпитопов. ФИГ. 6A показывает получение предварительного синтетического иммуногена MUC16 путем добавления стратегий конструирования центрального тандемного повтора и карбокси-концевого домена. Однако, когда слияние RMC4-R61 (последние 11 аминокислот RMC4 и первые 11 аминокислот нативного R61) было выровнено со всеми слияниями нативных повторов MUC16 (последние 11 аминокислот и начальные 11 аминокислот соседних нативных повторов), самая высокая идентичность последовательностей составила всего 76,2%, что позволяет предположить, что в этом слиянии могли быть введены нежелательные эпитопы. ФИГ. 6B показывает, что одной из стратегий, позволяющих избежать слияния RMC4-R61, было добавление нативного R59 между RMC4 и R61.
[0069] ФИГ. 7 представляет собой схематическое изображение четырех синтетических консенсусных иммуногенов MUC16, кодируемых плазмидами pGXl435, pGXl436, pGXl437, pGXl438 и pGXl439.
[0070] ФИГ. 8A-8C изображают оценку размера и сравнительное моделирование нативного и синтетического консенсусного домена центрального тандемного повтора IRC MUC16 человека. ФИГ. 8A является принципиальной схемой нативного MUC16 (на основе GenBank AAL65133.2) и IRC синтетического консенсусного MUC16. ФИГ. 8B показывает сравнительное моделирование для иллюстрации различий в размерах между нативным MUC16 (слева) и синтетическим консенсусным дизайном IRC MUC16 (справа). ФИГ. 8C является сравнительной моделью синтетической консенсусной области повтора IRC MUC16, показанной в формате cpk. Последовательности микроконсенсусного повтора от RMC1 до RMC4 обозначены светло-серым, спроектированный сайт расщепления фурином и нативные последовательности повтора от R61 до R63 обозначены темно-серым.
[0071] ФИГ. 9 является представлением в виде диаграммы модифицированного остова pVAXl (pGX0001).
[0072] ФИГ. 10 является представлением в виде диаграммы остова pGX0003.
[0073] ФИГ. 11 является представлением в виде диаграммы плазмиды pGXl435 и IRC+R59 синтетического консенсусного MUC16.
[0074] ФИГ. 12 является представлением в виде диаграммы плазмиды pGXl436 и RMC синтетического консенсусного MUC16.
[0075] ФИГ. 13 является представлением в виде диаграммы плазмиды pGXl437 и NRC синтетического консенсусного MUC16.
[0076] ФИГ. 14 является представлением в виде диаграммы плазмиды pGXl438 и RMC синтетического консенсусного MUC16 и NRC синтетического консенсусного MUC16.
[0077] ФИГ. 15 является представлением в виде диаграммы плазмиды pGXl439 и IRC синтетического консенсусного MUC16.
[0078] ФИГ. 16 иллюстрирует экспрессию конструкций синтетического консенсусного MUC16 методом иммуноблоттинга.
[0079] ФИГ. 17 является представлением в виде диаграммы пулов пептидов, содержащихся в пептидах, относящихся к белкам синтетического консенсусного антигена MUC16, используемых в вариантах воплощения данного изобретения.
[0080] ФИГ. 18A-18D иллюстрируют ответы IFNγ в ELISpot, полученные через 3 недели в результате 3-кратной иммунизации самок CB6F1 указанными количествами дозы синтетического консенсусного MUC16 (pGXl435 (ФИГ. 18A), pGXl438 (ФИГ. 18B) и pGXl439 (ФИГ. 18C), n=8/группу) или pGX0001 (пустой вектор, n=8). Также указаны выявляемые ответы на уникальный эпитоп R59 (пул пептидов 6), индуцированные pGXl435 (ФИГ. 18D).
[0081] ФИГ. 19A-19D иллюстрируют результаты, полученные через 3 недели после 3-кратной иммунизации самок CB6F1 указанными количествами дозы синтетического консенсусного MUC16 (pGXl436 (ФИГ. 19A) и pGXl437 (ФИГ. 19C), n=8 /группу) или pGX0001 (пустой вектор, n=8). Специфические ответы IFNγ в ELISpot на синтетический консенсусный MUC16 при указанных количествах дозы pGXl436 и pGXl437, а также сравнение иммунных ответов на полноразмерные конструкции (ФИГ. 19B и ФИГ. 19D).
[0082] ФИГ. 20 иллюстрирует стратегию гейтирования проточной цитометрии, используемую в вариантах воплощения данного изобретения.
+
[0083] ФИГ. 21A-21C иллюстрируют относительную частоту Т-клеток CD4, индуцированных полноразмерными конструкциями синтетического консенсусного MUC16 pGXl435 (ФИГ. 21A), pGXl438 (ФИГ. 21B) и pGXl439 (ФИГ. 21C).
+
[0084] ФИГ. 22A-22C иллюстрируют цитолитический потенциал Т-клеток CD4, специфических по отношению к синтетического консенсусному MUC16 и профиль цитокинов, индуцированных pGXl435 (ФИГ. 22A), PGX1438 (ФИГ. 22B) и pGXl439 (ФИГ. 22C).
+
[0085] ФИГ. 23A-23C иллюстрируют клеточные иммунные ответы, индуцированные pGXl435 (ФИГ. 23A), pGXl438 (ФИГ. 23B) и pGXl439 (ФИГ. 23C) в компартменте Т-клеток CD8.
+
[0086] ФИГ. 24A-24C иллюстрируют цитолитические иммунные ответы и профиль цитокинов, индуцированные pGXl435 (ФИГ. 24A), pGXl438 (ФИГ. 24B) и pGXl439 (ФИГ. 24C) в компартменте Т-клеток CD8.
+
+
[0087] ФИГ. 25A-25B иллюстрируют клеточные иммунные ответы, индуцированные pGXl436 в компартменте Т-клеток CD4 (ФИГ. 25A) и цитолитические иммунные ответы и профиль специфических ответов Т-клеток CD4 на конструкцию частичной длины pGXl436 (ФИГ. 25B).
+
+
[0088] ФИГ. 26A-26B иллюстрируют клеточные иммунные ответы, индуцированные pGXl437 в компартменте Т-клеток CD4 (ФИГ. 26A) и цитолитические иммунные ответы и профиль специфических ответов Т-клеток CD4 на конструкцию частичной длины pGXl437 (ФИГ. 26B).
+
+
[0089] ФИГ. 27A-27B иллюстрируют клеточные иммунные ответы, индуцированные pGXl436 в компартменте Т-клеток CD8 (ФИГ. 27A) и цитолитические иммунные ответы и профиль специфических ответов Т-клеток CD8 на конструкции частичной длины (ФИГ. 27B).
+
+
[0090] ФИГ. 28A-28B иллюстрируют клеточные иммунные ответы, индуцированные pGXl437 в компартменте Т-клеток CD8 (ФИГ. 28A) и цитолитические иммунные ответы и профиль специфических ответов Т-клеток CD8 на конструкции частичной длины (ФИГ. 28B).
+
+
+
+
[0091] ФИГ. 29A-29B иллюстрируют сравнение клеточных иммунных ответов, индуцированных pGXl436 (ФИГ. 29A) и pGXl437 (ФИГ. 29B) в отношении полноразмерных конструкций в компартментах Т-клеток CD4 и CD8 и профили цитокинов специфических клеточных ответов Т-клеток CD4 и CD8.
+
+
[0092] ФИГ. 30A-30C предоставляют итог данных по IFNγ (ФИГ. 30A) и клеточных данных по Т-клеткам CD4 (ФИГ. 30B) и CD8 (ФИГ. 30C) для раскрытых в данном документе полноразмерных конструкций.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0093] Настоящее изобретение относится к вакцинам, содержащим антиген MUC16. MUC16 экспрессируется во многих опухолях. Соответственно, вакцины обеспечивают лечение рака или опухоли, экспрессирующей MUC16. Вакцина по изобретению может обеспечить любую комбинацию конкретных раковых антигенов для конкретной профилактики или лечения рака у субъекта, который нуждается в лечении.
[0094] Одним из способов конструирования нуклеиновой кислоты и ее кодированной аминокислотной последовательности рекомбинантного ракового антигена является введение мутаций, которые изменяют конкретные аминокислоты в общей аминокислотной последовательности нативного ракового антигена. Введение мутаций не настолько сильно изменяет раковый антиген, что его нельзя универсально применять у субъекта-млекопитающего и предпочтительно у субъекта-человека или собаки, но изменяет его настолько, что полученная аминокислотная последовательность нарушает толерантность или считается чужеродным антигеном в организме, для того, чтобы генерировать иммунный ответ. Другим способом может быть создание консенсусного рекомбинантного ракового антигена, который имеет идентичность аминокислотной последовательности с соответствующим нативным антигеном рака по меньшей мере от 85% до 99%; предпочтительно по меньшей мере от 90% и до 98% идентичности последовательности; более предпочтительно по меньшей мере от 93% и до 98% идентичности последовательности; или даже более предпочтительно по меньшей мере от 95% и до 98% идентичности последовательности. В некоторых случаях рекомбинантный раковый антиген идентичен по аминокислотной последовательности на 95, 96, 97, 98 или 99% соответствующему нативному антигену рака. Нативный антиген рака является антигеном, обычно ассоциированным с конкретным раком или раковой опухолью. В зависимости от ракового антигена консенсусная последовательность ракового антигена может встречаться у разных видов млекопитающих или внутри подтипов вида, или среди вирусных штаммов или серотипов. Некоторые раковые антигены не сильно отличаются от аминокислотной последовательности дикого типа ракового антигена. Некоторые раковые антигены имеют последовательности нуклеиновых кислот/аминокислот, которые настолько различаются между видами, что консенсусная последовательность не может быть получена. В этих случаях генерируется рекомбинантный раковый антиген, который нарушает толерантность и генерирует иммунный ответ, который имеет идентичность аминокислотной последовательности по меньшей мере от 85% до 99% с соответствующим нативным антигеном рака; предпочтительно по меньшей мере от 90% и до 98% идентичности последовательности; более предпочтительно по меньшей мере от 93% и до 98% идентичности последовательности; или даже более предпочтительно по меньшей мере от 95% и до 98% идентичности последовательности. В некоторых случаях рекомбинантный раковый антиген идентичен по аминокислотной последовательности на 95, 96, 97, 98 или 99% своему соответствующему нативному антигену рака. Вышеупомянутые подходы могут быть объединены так, что конечный рекомбинантный раковый антиген имеет процентное сходство с аминокислотной последовательностью нативного ракового антигена, как обсуждалось выше.
[0095] Антиген mucin-16 («MUC16») может быть консенсусным антигеном MUC16, частично полученным из последовательностей MUC16 из разных видов или из разных изоформ в пределах вида, и, таким образом, консенсусный антиген MUC16 не является нативным.
[0096] Антиген MUC16 может также включать выбор последовательностей микроконсенсусных повторов (RMC) или нативных повторов (R), полученных из нативных последовательностей RMC или R. В некоторых вариантах воплощения предусмотрены конструкции нуклеиновых кислот, в которых две или более последовательности RMC и/или R связаны друг с другом сайтами протеолитического расщепления. Сайт протеолитического расщепления фурином является примером сайта протеолитического расщепления, который может связывать домены RMC и/или R в слитом белке, экспрессируемом конструкцией.
[0097] Дальнейшие модификации антигена MUC16 могут включать мутации остатков аспарагина в эктодоменах и трансмембранных доменах и добавление предшествующих лидерных последовательностей Козака и/или IgE к N-концу антигена MUC16.
[0098] Рекомбинантный MUC16 может индуцировать антигенспецифические Т-клетки и/или высокие титры антител, тем самым индуцируя или вызывая иммунный ответ, который направлен или реагирует на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может быть клеточным, гуморальным или как клеточным, так и гуморальным иммунным ответом. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (IFN-γ) и/или фактора некроза опухоли альфа (TNF-α). В других вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может уменьшать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, которые способствуют росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, без ограничений, факторы, которые подавляют презентацию MHC, факторы, которые повышают регуляцию антигенспецифических регуляторных Т-клеток (Tregs), PD-L1, FasL, цитокины, такие как IL-10 и TFG-β, ассоциированные с опухолью макрофаги, ассоциированные с опухолью фибробласты, растворимые факторы, продуцируемые иммуносупрессорными клетками, CTLA-4, PD-1, MDSCs, MCP-1 и молекула иммунной контрольной точки.
[0099] Вакцина может дополнительно комбинироваться с антителами к ингибиторам контрольной точки, таким как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 предотвращает подавление Т-клеточными и/или В-клеточными реакциями. В целом, проектирование антигенов рака, распознаваемых иммунной системой, помогает преодолеть другие формы иммуносупрессии опухолевыми клетками, и эти вакцины можно использовать в сочетании с терапией подавления или ингибирования (например, терапии при помощи антител к PD-1 и антител к PDL-1) для дальнейшего увеличения Т-клеточных и/или В-клеточных ответов.
Определения
[00100] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в данной области техники. В случае конфликта, регулирование будет осуществляться настоящим документом, включая определения. Предпочтительные способы и материалы описаны ниже, хотя на практике или при тестировании настоящего изобретения могут использоваться способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данном документе. Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые в данном документе, включены посредством ссылки во всей их полноте. Материалы, способы и примеры, раскрытые в данном документе, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Используемая в данном документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов воплощения и не предусматривает их ограничение.
[00101] Термины «включают(ет)», «содержат(ит)», «имеющий», «имеет», «может», «заключают(ет) в себе» и их варианты, в контексте данного документа, предназначены служить переходными фразами с открытым концом, терминами или словами, которые не исключают возможности дополнительных действий или структур. Формы единственного числа «a», «and» и «the» (англ.) включают множественные ссылки, если контекст явно не предписывает иное. В настоящем раскрытии также рассматриваются другие варианты воплощения, «содержащие», «состоящие из» и «состоящие по существу из» вариантов воплощения или элементов, представленных в данном документе, независимо от того, изложены они явно или нет.
[00102] Для перечисления числовых диапазонов в настоящем документе явным образом предусмотрено каждое промежуточное значение, имеющее ту же степень точности, что и минимум и максимум приведенного диапазона. Например, для диапазона 6-9 числа 7 и 8 рассматриваются в дополнение к 6 и 9, а для диапазона 6,0-7,0 числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0 предусмотрены явным образом.
[00103] Термин «адъювант», в контексте данного документа, означает любую молекулу, добавленную к вакцинам, описанным в настоящем документе, для усиления иммуногенности MUC16 антигенов и/или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих антигены, согласно настоящему описанию.
[00104] Термин «антитело», в контексте данного документа, означает антитело классов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE или их фрагменты или производные, включая Fab, F (ab') 2, Fd и одноцепочечные антитела, диатела, биспецифичные антитела, бифункциональные антитела и их производные. Антитело может представлять собой антитело, выделенное из образца сыворотки млекопитающего, поликлональное антитело, аффинное антитело или любую их смесь, которое проявляет достаточную специфичность связывания с желаемым эпитопом или полученной из него последовательностью.
[00105] «Антиген MUC16» относится к белкам, содержащим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: аминокислот 19-1490 SEQ ID NO: 2; аминокислот 19-642 SEQ ID NO: 4; аминокислот 19-710 SEQ ID NO: 6; аминокислот 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 8; их фрагментов указанной в данном документе длины, вариантов, то есть белков с последовательностями, имеющими идентичность с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8 как указано в данном документе, фрагментов вариантов, имеющих длины, указанные в данном документе в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8; их фрагментов указанной в данном документе длины, вариантов, то есть белков с последовательностями, имеющими идентичность с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8 как указано в данном документе, фрагментов вариантов, имеющих длины, указанные в данном документе и их комбинаций. Антигены могут необязательно включать сигнальные пептиды, такие как пептиды из других белков.
[00106] Термины «кодирующая последовательность» или «кодирующая нуклеиновая кислота», в контексте данного документа, означают нуклеиновые кислоты (молекулы РНК или ДНК), которые содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок. Кодирующая последовательность может дополнительно включать сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способный направлять экспрессию в клетках субъекта или млекопитающего, которым вводят нуклеиновую кислоту.
[00107] Термины «комплементарность» или «комплементарный», в контексте данного документа, означают, что нуклеиновая кислота может подразумевать спаривание оснований по Уотсону-Крику (например, A-T/U и C-G) или по Хугстину между нуклеотидами или нуклеотидными аналогами молекул нуклеиновой кислоты.
[00108] Термины «консенсусный» или «консенсусная последовательность», в контексте данного документа, означают полипептидную последовательность, основанную на анализе выравнивания множества последовательностей для одного и того же гена из разных организмов. Могут быть приготовлены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют консенсусную полипептидную последовательность. Вакцины, содержащие белки, которые содержат консенсусные последовательности, и/или молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют такие белки, могут быть использованы для индукции широкого иммунитета против антигена.
[00109] Используемый в данном документе термин «постоянный ток» описывает ток, который воспринимается или испытывается тканью или клетками, определяющими указанную ткань, в течение времени воздействия электрического импульса, доставляемого в ту же ткань. Электрический импульс подается от устройств электропорации, описанных в данном документе. Плотность тока остается постоянной в указанной ткани в течение времени воздействия электрического импульса, поскольку устройство электропорации, предложенное в настоящем документе, имеет элемент обратной связи, предпочтительно обладающий мгновенной обратной связью. Элемент обратной связи позволяет измерять сопротивление ткани (или клеток) на протяжении всего времени воздействия импульса и заставлять устройство электропорации изменять выходную электрическую мощность (например, увеличивать напряжение) таким образом, чтобы плотность тока в одной и той же ткани оставалась постоянной в течение всего времени воздействия электрического импульса (порядка микросекунд) и от импульса к импульсу. В некоторых вариантах воплощения элемент обратной связи содержит контроллер.
[00110] ] Термины «обратная связь по току» или «обратная связь», в контексте данного документа, могут использоваться взаимозаменяемо и могут означать активную реакцию предоставленных устройств электропорации, которая включает измерение тока в ткани между электродами и соответствующее изменение выходной мощности, доставляемой устройством ЭП, для поддержания плотности тока на постоянном уровне. Этот постоянный уровень задается пользователем перед инициацией воздействия последовательности импульсов или электротерапии. Обратная связь может обеспечиваться компонентом электропорации, например, контроллером устройства электропорации, поскольку электрическая цепь в нем способна непрерывно контролировать ток в ткани между электродами и сравнивать этот контролируемый ток (или ток в ткани) с заданным током и непрерывно производить регулировку выходной энергии для поддержания контролируемого тока на заданных уровнях. Цикл обратной связи может быть мгновенным, поскольку он является аналоговой замкнутой обратной связью.
[00111] Термин «децентрализованный ток», используемый в данном документе, может означать схему электрических токов, подаваемых из различных наборов игольчатых электродов устройств электропорации, описанных в данном документе, при этом схемы минимизируют или предпочтительно устраняют возникновение теплового напряжения, связанного с электропорацией, в любой области ткани, подвергающейся электропорации.
[00112] «Электропорация», «электропермеабилизация» или «электрокинетическое усиление» («ЭП»), используемые в данном документе взаимозаменяемо, означают импульсное воздействие трансмембранного электрического поля для индукции микроскопических путей (пор) в биомембране; их присутствие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарственные средства, ионы и вода, проходить с одной стороны клеточной мембраны на другую.
[00113] В контексте данного документа, термин «фрагмент», касательно последовательностей нуклеиновой кислоты, означает последовательность нуклеиновой кислоты или ее часть, которая кодирует полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с антигеном, раскрытым в данном документе. Фрагменты могут представлять собой фрагменты молекулы нуклеиновой кислоты, выбранные по меньшей мере из одной из различных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют фрагменты белка, указанные ниже. Фрагменты могут содержать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% полной длины одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, за исключением добавления любого гетерологичного сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения фрагменты могут содержать по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% полной длины одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже, за исключением любого добавленного гетерологичного сигнального пептида.
[00114] В некоторых вариантах воплощения фрагменты могут быть по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичными одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, за исключением любого гетерологичного сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения фрагменты могут быть по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичными одной или более последовательностей нуклеиновых кислот, указанных ниже, за исключением любого добавленного гетерологичного сигнального пептида.
[00115] В дополнительных вариантах воплощения фрагменты могут дополнительно, необязательно, включать последовательность, кодирующую гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при расчете процента идентичности. Фрагменты также могут содержать кодирующие последовательности для сигнального пептида, такого как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид IgE или IgG. Кодирующая последовательность, кодирующая N-концевой метионин и/или сигнальный пептид, может быть связана с фрагментом кодирующей последовательности.
[00116] В некоторых вариантах воплощения фрагменты могут включать по меньшей мере 1700 нуклеотидов или более, 1750 нуклеотидов или более, 1800 нуклеотидов или более, 1850 нуклеотидов или более, 1900 нуклеотидов или более, 1950 нуклеотидов или более, 2000 нуклеотидов или более, 2050 нуклеотидов или более, 2100 нуклеотидов или более, 2150 нуклеотидов или более, 2200 нуклеотидов или более, 2250 нуклеотидов или более, 2300 нуклеотидов или более, 2350 нуклеотидов или более, 2400 нуклеотидов или более, 2450 нуклеотидов или более, 2500 нуклеотидов или более, 2550 нуклеотидов или более, 2600 нуклеотидов или более, 2650 нуклеотидов или более, 2700 нуклеотидов или более, 2750 нуклеотидов или более, 2800 нуклеотидов или более, 2850 нуклеотидов или более, 2900 нуклеотидов или более, 2950 нуклеотидов или более, 3000 нуклеотидов или более, 3050 нуклеотидов или более, 3100 нуклеотидов или более, 3150 нуклеотидов или более, 3200 нуклеотидов или более, 3250 нуклеотидов или более, 3300 нуклеотидов или более, 3350 нуклеотидов или более, 3400 нуклеотидов или более, 3450 нуклеотидов или более, 3500 нуклеотидов или более, 3550 нуклеотидов или более, 3600 нуклеотидов или более, 3650 нуклеотидов или более, 3700 нуклеотидов или более, 3750 нуклеотидов или более, 3800 нуклеотидов или более, 3850 нуклеотидов или более, 3900 нуклеотидов или более, 3950 нуклеотидов или более, 4000 нуклеотидов или более, 4050 нуклеотидов или более, 4100 нуклеотидов или более, 4150 нуклеотидов или более, 4200 нуклеотидов или более, 4250 нуклеотидов или более, 4300 нуклеотидов или более, 4350 нуклеотидов или более, 4400 нуклеотидов или более, 4450 нуклеотидов или более, 4500 по меньшей мере одной из последовательностей нуклеиновой кислоты, указанных ниже.
[00117] Термины «фрагмент» или «иммуногенный фрагмент», касательно полипептидных последовательностей, означают полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с антигеном, раскрытым в данном документе. Фрагменты могут быть полипептидными фрагментами, выбранными из по меньшей мере одной из различных аминокислотных последовательностей, описанных в данном документе. Фрагменты консенсусных белков могут включать по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% полной длины консенсусного белка, исключая любой добавленный гетерологичный сигнальный пептид. В некоторых вариантах воплощения изобретения фрагмент может содержать по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92,% по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% длины одной или более аминокислотных последовательностей, указанных ниже, за исключением любого добавленного гетерологичного сигнального пептида.
[00118] В некоторых вариантах воплощения фрагменты могут быть по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70% по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичны одной или более аминокислотным последовательностям, описанным в данном документе, за исключением любого гетерологического сигнального пептида. В некоторых вариантах воплощения фрагменты могут быть по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны одной или более аминокислотным последовательностям, указанным в данном документе, за исключением любого добавленного гетерологического сигнального пептида.
[00119] В дополнительных вариантах воплощения фрагменты могут дополнительно необязательно включать последовательность, кодирующую гетерологичный сигнальный пептид, который не учитывается при расчете процента идентичности. Фрагменты могут дополнительно содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, сигнальный пептид IgE или IgG.
[00120] В некоторых вариантах воплощения фрагменты консенсусных белков могут содержать 550 аминокислот или более, 600 аминокислот или более, 650 аминокислот или более, 700 аминокислот или более, 750 аминокислот или более, 800 аминокислот или более, 850 аминокислот или более, 900 аминокислот или более, 950 аминокислот или более, 1000 аминокислот или более, 1050 аминокислот или более, 1100 аминокислот или более, 1150 аминокислот или более, 1200 аминокислот или более, 1250 аминокислот или более, 1300 аминокислот или более, 1350 белковой последовательности, раскрытой в данном документе.
[00121] В контексте данного документа, термин «генетическая конструкция» относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок. Кодирующая последовательность включает сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая сигнал промотора и полиаденилирования, способный направлять экспрессию в клетках субъекта, которому вводят молекулу нуклеиновой кислоты. В контексте данного документа, термин «экспрессируемая форма» относится к генной конструкции, которая содержит необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей последовательностью, кодирующей белок, так что при наличии в клетке субъекта кодирующая последовательность будет экспрессироваться.
[00122] В контексте данного документа, термин «гомология» относится к степени комплементарности. Может существовать частичная гомология или полная гомология (то есть идентичность). Частично комплементарная последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует гибридизацию полностью комплементарной последовательности с нуклеиновой кислотой-мишенью, относится к использованию функционального термина «по существу гомологичный». При использовании в отношении последовательности двухцепочечной нуклеиновой кислоты, такой как кДНК или геномный клон термин «по существу гомологичный», используемый в данном документе, относится к зонду, который может гибридизироваться с цепью двухцепочечной последовательности нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости. При использовании в отношении последовательности одноцепочечной нуклеиновой кислоты термин «по существу гомологичный», в контексте данного документа, относится к зонду, который может гибридизироваться (то есть является комплементарным последовательности) с одноцепочечной матричной последовательностью нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости.
[00123] Термины «идентичный» или «идентичность», в контексте данного документа, относительно двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов, означают, что последовательности имеют определенный процент остатков, которые являются одинаковыми в указанной области. Процент может быть рассчитан путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в указанной области, определения количества позиций, в которых одинаковый остаток встречается в обеих последовательностях, для получения количества совпадающих позиций, деления количества совпавших позиций на общее количество позиций в указанной области и умножение результата на 100, чтобы получить процент идентичности последовательности. В тех случаях, когда две последовательности имеют разную длину или выравнивание приводит к одному или более ступенчатым концам и указанная область сравнения включает в себя только одну последовательность, остатки одной последовательности включаются в знаменатель, но не в числитель вычисления. При сравнении ДНК и РНК тимин (T) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентификация может быть выполнена вручную или с помощью компьютерного алгоритма последовательности, такого как BLAST или BLAST 2.0.
[00124] Термин «импеданс», в контексте данного документа, может использоваться при рассмотрении в деталях механизма обратной связи и может быть преобразован в текущее значение в соответствии с законом Ома, что позволяет проводить сравнение с заданным током.
[00125] Термин «иммунный ответ», в контексте данного документа, означает активацию иммунной системы хозяина, например, млекопитающего, в ответ на введение антигена. Иммунный ответ может быть в форме клеточного или гуморального ответа, или обоих.
[00126] Термины «нуклеиновая кислота» или «олигонуклеотид», или «полинуклеотид», в контексте данного документа, означают, что по меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связаны друг с другом. Описание одной цепи также определяет последовательность дополнительной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота также охватывает комплементарную цепь представленной единственной цепи. Многие варианты нуклеиновой кислоты могут быть использованы для той же цели, что и данная нуклеиновая кислота. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает по существу идентичные нуклеиновые кислоты и их дополнения. Одна цепь обеспечивает зонд, который может гибридизироваться с последовательностью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизируется в жестких условиях гибридизации.
[00127] Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными или могут содержать части как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может быть ДНК, как геномной, так и кДНК, РНК или гибридной нуклеиновой кислотой, при этом нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, изоцитозин и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены способами химического синтеза или рекомбинантными способами.
[00128] Термин «функционально связанный», в контексте данного документа, означает, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор может быть расположен 5 '(слева) или 3' (справа) от гена, находящегося под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть примерно таким же, как расстояние между этим промотором и геном, который он контролирует в гене, из которого происходит промотор. Как известно в данной области техники, изменение этого расстояния может быть адаптировано без утраты функции промотора.
[00129] В контексте данного документа, термины «пептид», «белок» или «полипептид» могут означать связанную последовательность аминокислот и могут быть природным, синтетическим или быть модификацией или комбинацией природного и синтетического.
[00130] Термин «промотор», в контексте данного документа, означает синтетическую молекулу или молекулу природного происхождения, которая способна придавать, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может содержать одну или более специфических регуляторных транскрипционных последовательностей для дополнительного усиления экспрессии и/или изменения пространственной экспрессии и/или временной экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор также может содержать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут находиться на расстоянии до нескольких тысяч пар оснований от сайта начала транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включая вирусные, бактериальные, грибковые, растительные, насекомые и животные. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно или дифференциально по отношению к клетке, ткани или органу, в котором происходит экспрессия, или относительно стадии развития, на которой происходит экспрессия, или в ответ на внешние раздражители, такие как физиологические стрессы, патогены, ионы металлов или индуцирующие агенты. Репрезентативные примеры промоторов включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага Т3, промотор SP6, оператор-промотор lac, промотор tac, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV IE, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40, промотор CMV IE и немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (hCMV). В определенных вариантах воплощения промотор представляет собой промотор hCMV.
[00131] Термины «сигнальный пептид» и «лидерная последовательность» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к аминокислотной последовательности, которая может быть связана на амино-конце белка, предложенного в данном документе. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности обычно направляют локализацию белка. Используемые в данном документе сигнальные пептиды/лидерные последовательности предпочтительно облегчают секрецию белка из клетки, в которой он продуцируется. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности часто отщепляются от остатка белка, часто называемого зрелым белком, при секреции из клетки. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности связаны на амино-конце (то есть на N-конце) белка.
[00132] Термин «жесткие условия гибридизации», в контексте данного документа, означает условия, при которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) будет гибридизироваться со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, мишенью), такой как сложная смесь нуклеиновых кислот. Жесткие условия зависят от последовательности и будут различными в разных обстоятельствах. Жесткие условия могут быть выбраны так, чтобы они были примерно на 5-10°С ниже, чем температура плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенном рН и ионной силе. Tm может быть температурой (при определенной ионной силе, pH и концентрации нуклеиновых кислот), при которой 50% зондов, комплементарных мишени, гибридизируются с последовательностью-мишенью в равновесии (так как последовательности мишени присутствуют в избытке, при Tm, 50% зондов заняты в равновесном состоянии). Жесткие условия могут быть такими, при которых концентрация соли составляет менее чем приблизительно 1,0 М иона натрия, например, концентрация приблизительно 0,01-1,0 М иона натрия (или других солей) при рН 7,0-8,3, и температура составляет по меньшей мере приблизительно 30°С для коротких зондов (например, приблизительно 10-50 нуклеотидов) и по меньшей мере приблизительно 60°С для длинных зондов (например, больше, чем приблизительно 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации положительный сигнал может по меньшей мере в 2-10 раз превышать фоновую гибридизацию. Примерные жесткие условия гибридизации включают следующие: 50% формамид, 5x SSC и 1% SDS, инкубирование при 42°C или 5x SSC, 1% SDS, инкубирование при 65°C, с промыванием в 0,2x SSC и 0,1% SDS при 65°С.
[00133] Термин «субъект», в контексте данного документа, может означать млекопитающее, который требует, хочет или нуждается в иммунизации представленными в данном документе вакцинами. Млекопитающее может быть человеком, шимпанзе, собакой, кошкой, лошадью, коровой, мышью или крысой.
[00134] «По существу комплементарный», в контексте данного документа, означает, что первая последовательность по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 , 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентична комплементарной цепи второй последовательности в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизируются в жестких условиях гибридизации.
[00135] «По существу идентичный», в контексте данного документа, означает, что первая и вторая последовательности по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% идентичны в области 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот или по отношению к нуклеиновым кислотам, если первая последовательность по существу комплементарна комплементу второй последовательности.
[00136] Термины «лечить», «лечение» или «лечащийся», в контексте данного документа, могут означать защиту животного от заболевания посредством средств предотвращения, подавления, сдерживания или полного устранения заболевания. Предотвращение заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному до начала заболевания. Подавление заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному после индукции заболевания, но до его клинического проявления. Сдерживание заболевания включает введение вакцины по настоящему изобретению животному после клинического проявления заболевания.
[00137] Термин «вариант», в контексте данного документа, касательно нуклеиновой кислоты, означает (i) часть или фрагмент указанной нуклеотидной последовательности; (ii) комплемент эталонной нуклеотидной последовательности или ее части; (iii) нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична указанной нуклеиновой кислоте или ее комплементу; или (iv) нуклеиновую кислоту, которая гибридизируется в жестких условиях с указанной нуклеиновой кислотой, ее комплементом или последовательностью, по существу идентичную ей.
[00138] Термин «вариант», в контексте данного документа, касательно пептида или полипептида, означает пептид или полипептид, который отличается по аминокислотной последовательности вставкой, делецией или консервативным замещением аминокислот, но сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Вариант также может означать белок с аминокислотной последовательностью, которая по существу идентична референтному белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет по меньшей мере одну биологическую активность. Консервативное замещение аминокислоты, то есть замена аминокислоты другой аминокислотой со схожими свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных областей), в данной области техники обычно признается незначительным изменением. Эти незначительные изменения могут быть идентифицированы, частично, с учетом индекса гидрофобности аминокислот, как понятно в данной области техники. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157: 105-132 (1982). Индекс гидрофобности аминокислоты основан на учете ее гидрофобности и заряда. В данной области техники известно, что аминокислоты с подобными индексами гидрофобности могут быть замещены и при этом сохранять функцию белка. В одном аспекте аминокислоты, имеющие индексы гидрофобности ± 2, являются замещенными. Гидрофильность аминокислот также может быть использована для выявления замен, которые приводят к тому, что белки сохраняют биологическую функцию. Рассмотрение гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет рассчитать наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, что является полезной мерой, которая, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4,554,101 включен в данный документ полностью посредством ссылки. Замена аминокислот, имеющих сходные значения гидрофильности, может привести к тому, что пептиды сохраняют биологическую активность, например иммуногенность, как понятно в данной области. Замены могут быть выполнены аминокислотами, имеющими значения гидрофильности с разницей в ±2. И индекс гидрофобности, и значение гидрофильности аминокислот зависят от конкретной боковой цепи этой аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением считается, что аминокислотные замены, которые совместимы с биологической функцией, зависят от относительного сходства аминокислот и, в частности, от боковых цепей этих аминокислот, что проявляется в гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и других свойствах.
[00139] ] Вариант может представлять собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая по существу идентична по всей длине полной последовательности гена или ее фрагмента. Последовательность нуклеиновой кислоты может составлять 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичности по всей длине генной последовательности или ее фрагмента. Вариант может представлять собой аминокислотную последовательность, которая по существу идентична по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента. Аминокислотная последовательность может составлять 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 95, 96, 97, 98, 99% или 100% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента.
[00140] Термин «вектор», в контексте данного документа, означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может представлять собой вирусный вектор, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может быть вектором ДНК или РНК. Вектор может быть самореплицирующимся внехромосомным вектором и предпочтительно представляет собой плазмиду ДНК. Вектор может содержать или включать одну или более гетерологичных последовательностей нуклеиновых кислот.
Вакцина
В данном документе предложены вакцины, содержащие антиген MUC16 или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген MUC16, согласно настоящему описанию. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют антиген MUC16, согласно настоящему описанию. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8.
[00141] В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают нуклеотиды 55-4470 SEQ ID NO: 1; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды 55-4470 SEQ ID NO: 1; фрагмент, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-4470 SEQ ID NO: 1; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-4470 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают нуклеотиды 55-1926 SEQ ID NO: 3; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды 55-1926 SEQ ID NO: 3; фрагмент, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-1926 SEQ ID NO: 3; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-1926 SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают нуклеотиды 55-2130 SEQ ID NO: 5; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды 55-2130 SEQ ID NO: 5; фрагмент, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-2130 SEQ ID NO: 5; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-2130 SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают нуклеотиды 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; фрагмент, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают нуклеотиды 55-4023 SEQ ID NO: 7; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотиды 55-4023 SEQ ID NO: 7; фрагмент, который по меньшей мере на 95% идентичен нуклеотидам 55-4023 SEQ ID NO: 7; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична нуклеотидам 55-4023 SEQ ID NO: 7.
[00142] В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO: 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO. 2; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO: 4; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO. 4; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 4; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO: 6; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO. 6; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 6; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую SEQ ID NO: 8; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO. 8; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 8; и/или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 8.
[00143] В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают SEQ ID NO: 1; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 1; фрагмент по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 1; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают SEQ ID NO: 3; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 3; фрагмент по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 3; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают SEQ ID NO: 5; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 5; фрагмент по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 5; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые включают SEQ ID NO: 7; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 7; фрагмент по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 7; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 7.
[00144] В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; белок по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2.
[00145] В некоторых вариантах воплощения вакцина содержит антиген MUC16, при этом антиген включает SEQ ID NO: 2; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO. 2; аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 2.
[00146] В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4.
[00147] В некоторых вариантах воплощения вакцина содержит антиген MUC16, при этом антиген включает SEQ ID NO: 4; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO. 4; аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 4; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 4.
[00148] В некоторых вариантах воплощения вакцины содержат антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; белок, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6.
[00149] В некоторых вариантах воплощения вакцина содержит антиген MUC16, при этом антиген включает SEQ ID NO: 6; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO. 6; аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 6; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 6.
[00150] В некоторых вариантах воплощения вакцина содержит антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8.
[00151] В некоторых вариантах воплощения вакцина содержит антиген MUC16, при этом антиген включает аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8.
[00152] В некоторых вариантах воплощения вакцина содержит антиген MUC16, при этом антиген включает SEQ ID NO: 8; фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% длины SEQ ID NO. 8; аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 8; и/или фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95% идентичен SEQ ID NO: 8.
[00153] Вакцины могут быть способны вызывать у субъекта иммунный ответ против антигена. Иммунный ответ может представлять собой терапевтический или профилактический иммунный ответ. Вакцины могут быть использованы для защиты от рака, например, рака или опухоли, экспрессирующей MUC16. Вакцины могут быть использованы для предотвращения и/или лечения опухоли, экспрессирующей MUC16, у субъекта, нуждающегося в этом. Вакцины могут индуцировать клеточные и/или антительные ответы против MUC16 и против опухолей, экспрессирующих MUC16. В одном варианте воплощения вакцины могут быть использованы для защиты от клеток рака яичника, экспрессирующих MUC16, для предотвращения и/или лечения или для индукции клеточного и/или антительного ответа против клеток рака яичника, экспрессирующих MUC16, конкретно, клеток эпителиального рака яичника, экспрессирующих MUC16, более конкретно, клеток серозного рака яичника, эеспрессирующих MUC16.
[00154] Разработка противораковой вакцины, согласно настоящему описанию, включает идентификацию ракового антигена, например, MUC16, который не распознается иммунной системой и является аберрантно экспрессируемым аутоантигеном. Идентифицированный раковый антиген изменяется в направлении от аутоантигена к чужеродному антигену для его распознавания иммунной системой. Изменение структуры нуклеиновой кислоты и аминокислотных последовательностей рекомбинантного ракового антигена в направлении от структуры «своего» к чужеродному антигену нарушает толерантность иммунной системы в отношении антигена. Для нарушения толерантности к антигену рака могут быть применены несколько мероприятий по изменению структуры, как описано ниже.
[00155] Рекомбинантный раковый антиген вакцины не распознается как собственный, тем самым нарушается толерантность. Нарушение толерантности может индуцировать антигенспецифические ответы Т-клеток и/или антител с высоким титром, тем самым индуцируя или вызывая иммунный ответ, который направлен против рака или опухоли или реагирует на рак или опухоль, экспрессирующую антиген. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может представлять собой клеточный, гуморальный или оба, и клеточный и гуморальный иммунные ответа. В некоторых вариантах воплощения индуцированный или вызванный клеточный иммунный ответ может включать индукцию или секрецию интерферона-гамма (IFN-γ) и/или фактора некроза опухолей-альфа (TNF-α). В других вариантах воплощения индуцированный или вызванный иммунный ответ может уменьшать или ингибировать один или более факторов иммуносупрессии, которые способствуют росту опухоли или рака, экспрессирующего антиген, например, но без ограничений, факторы, которые подавляют презентацию МНС, факторы, которые стимулируют антигенспецифичные регуляторные T-клетки (Tregs), PD-L1, FasL, цитокины, такие как IL-10 и TFG-β, связанные с опухолью макрофаги, связанные с опухолью фибробласты, растворимые факторы, продуцируемые иммуносупрессорными клетками, CTLA-4, PD-l, MDSCs, MCP-1 и молекула иммунной контрольной точки.
[00156] Вакцина может представлять собой ДНК-вакцину. ДНК-вакцины раскрываются в патентах США №№ 5,593,972, 5,739,118, 5,817,637, 5,830,876, 5,962,428, 5,981,505, 5,580,859, 5,703,055 и 5,676,594, которые полностью включены в данный документ посредством ссылки. ДНК-вакцина может дополнительно содержать элементы или реагенты, которые препятствуют ее интеграции в хромосому.
[00157] Вакцина может представлять собой РНК одного или более раковых антигенов. РНК-вакцина может быть введена в клетку.
[00158] Вакцина может представлять собой живую вакцину с ослабленным действием, вакцину, использующую рекомбинантные векторы для доставки антигена, субъединичные вакцины и гликопротеиновые вакцины, например, но без ограничения, вакцины, представленные в патентах США №№.: 4,510,245; 4,797,368; 4,722,848;4,790,987; 4,920,209; 5,017,487; 5,077,044; 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424; 5,225,336; 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548; 5,310,668; 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499; 5,453,3 64; 5,462,734; 5,470,734; 5,474,935; 5,482,713; 5,591,439; 5,643,579; 5,650,309; 5,698,202; 5,955,088; 6,034,298; 6,042,836; 6,156,319 и 6,589,529, которые полностью включены в данный документ посредством ссылки.
[00159] В некоторых вариантах воплощения вакцина может дополнительно содержать молекулярный адъювант, в некоторых случаях молекулярный адъювант может представлять собой IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES, а в некоторых случаях молекулярный адъювант является ингибитором контрольной точки, включая направленный против антигена 4 типа, ассоциированного с антицитотоксическим действием Т-лимфоцитов (CTLA-4), против рецептора программируемой смерти-1 (PD-1) и против гена активации лимфоцитов (LAG-3). Кодирующая последовательность для IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES может быть включена в одну или более молекул нуклеиновой кислоты, которые содержат кодирующую последовательность для одного или более антигенов. Кодирующая последовательность для IL-12, IL-15, IL-28, IL-31, IL-33 и/или RANTES может быть включена в отдельные молекулы нуклеиновой кислоты, такие как отдельная плазмида.
[00160] Вакцина по настоящему изобретению может обладать свойствами, необходимыми для эффективных вакцин, такими как безопасность, так что сама вакцина не вызывает заболевания или смерти; защищать от болезней; индуцируя нейтрализующие антитела; индуцируя защитные ответы Т-клеток; и обеспечивая простоту введения, обладает небольшим количеством побочных эффектов, биологической стабильностью и низкой стоимости на дозу. Вакцина может достигать некоторых или всех из этих характеристик путем содержания антигена рака, как обсуждается ниже.
[00161] Вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитора иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, которые предотвращают подавление любого компонента в иммунной системе, такого как презентация классами MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любого цитокина, хемокина или передачи сигналов для пролиферации и/или дифференцировки иммунных клеток. Как также более подробно описывается ниже, вакцина может дополнительно комбинироваться с антителами к ингибиторам контрольной точки, таким как PD-1 и PDL-1, для усиления стимуляции как клеточного, так и гуморального иммунного ответа. Использование антител против PD-1 или против PDL-1 предотвращает подавление Т-клеточными и/или В-клеточными реакциями PD-1 или PDL-1.
Антиген
[00162] Описанная выше вакцина может содержать антиген или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген. Антигеном может быть MUC16, его фрагмент, его вариант или их комбинация. MUC16 является членом семейства муцинов высокомолекулярных гликопротеинов. Муцины экспрессируются специализированными эпителиальными клетками, окружающими поверхность просвета различных органов дыхательного, желудочно-кишечного и репродуктивного трактов. Муцины играют прямую и косвенную роль в поддержании целостности эпителия, а также в смазывании и защите эпителиальных поверхностей.
[00163] MUC16 был связан с опухолью или образованием рака. Домен тандемного повтора MUC16 содержит повторяющийся пептидный эпитоп, CA125, который стал золотым стандартом биомаркера для множества клинических сценариев, возникающих при диагностике и лечении рака яичников, включая: 1) скрининг на раннее выявление, 2) проведения различия между доброкачественным и злокачественным заболеванием у женщин до и после менопаузы с образованием в области таза, и 3) мониторинг реакции на терапию. Кроме того, функциональные исследования показали, что MUC16 способствует трансформации и метастазированию опухолей яичников.
[00164] Соответственно, вакцина может быть использована для лечения субъектов, страдающих раком или опухолями, экспрессирующими MUC16. В некоторых вариантах воплощения рак представляет собой рак яичников. Антиген MUC16 может отличаться от нативного «нормального» MUC16 и, таким образом, обеспечивать терапию или профилактику в отношении опухоли, экспрессирующей антиген MUC16. Соответственно, в настоящем документе предложены последовательности антигена MUC16, которые отличаются от нативной последовательности MUC16, и молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие такие последовательности антигена MUC16 (т.е. рекомбинированные или мутированные гены или последовательности MUC16).
[00165] Предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие вышеописанные гетерологичные последовательности. Предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, состоящие из вышеописанных гетерологичных последовательностей. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) нуклеотидов 55-4470 SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды 55-4470 SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен нуклеотидам 55-4470 SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична нуклеотидам 55-4470 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 1; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины SEQ ID NO: 1; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 1; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 1.
[00166] В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) нуклеотидов 55-1926 SEQ ID NO: 3; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды 55-1926 SEQ ID NO: 3; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 9%, 96, 97, 98% или 99% идентичен нуклеотидам 55-1926 SEQ ID NO: 3; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична нуклеотидам 55-1926 SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 3; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины SEQ ID NO: 3; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 3; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 3. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 3.
[00167] В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) нуклеотидов 55-2130 SEQ ID NO: 5; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды 55-2130 SEQ ID NO: 5; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен нуклеотидам 55-2130 SEQ ID NO: 5; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична нуклеотидам 55-2130 SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 5; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины SEQ ID NO: 5; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 5; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 5.
[00168] В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) нуклеотидов 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен нуклеотидам 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична нуклеотидам 55-1926 и 1948-4023 SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) нуклеотидов 55-4023 SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99 полной длины молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотиды 55-4023 SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен нуклеотидам 55-4023 SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична нуклеотидам 55-4023 SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 7; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины SEQ ID NO: 7; (в) фрагмента, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 7; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины последовательности нуклеиновой кислоты, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах воплощения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, указанную в SEQ ID NO: 7.
[00169] В данном документе предлагаются последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антигены MUC16.В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 2; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины SEQ ID NO: 2; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 2; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 2.
[00170] В некоторых вариантах воплощения предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах воплощения предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 4; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины SEQ ID NO: 4; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 4; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 4.
[00171] В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраны из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах воплощения предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 6; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины SEQ ID NO: 6; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 6; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 6.
[00172] В некоторых вариантах воплощения предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранные из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94%, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения предлагаются молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из группы, состоящей из: (a) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID NO: 8; (б) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины SEQ ID NO: 8; (в) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 8; и (г) последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент, содержащий по меньшей мере 90% полной длины белка, который по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентичен SEQ ID NO: 8.
[00173] Изолированные молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие описанные выше гетерологичные последовательности, могут быть включены в векторы, такие как плазмиды, вирусные векторы и другие формы молекул нуклеиновых кислот, представленных ниже.
[00174] Предлагаются молекулы белка, содержащие описанные выше гетерологичные аминокислотные последовательности. Предлагаются молекулы белка, состоящие из описанных выше гетерологичных аминокислотных последовательностей. в данном документе предлагаются белки и полипептиды, имеющие вышеописанные последовательности. Белки и полипептид могут называться антигенами MUC16 и иммуногенами MUC16. Антигены MUC16 способны вызывать иммунный ответ против опухолей, экспрессирующих антиген MUC16. В некоторых вариантах воплощения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-1490 SEQ ID NO: 2; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1490 SEQ ID NO: 2; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-1490 SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 2; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 2; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 2; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах воплощения белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 2.
[00175] В некоторых вариантах воплощения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-642 SEQ ID NO: 4; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 SEQ ID NO: 4; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-642 SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах воплощения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 4; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 4; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 4; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах воплощения белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 4.
[00176] В некоторых вариантах воплощения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-710 SEQ ID NO: 6; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-710 SEQ ID NO: 6; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95,96, 97, 98% или 99% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-710 SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах воплощения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 6; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 6; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 6; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах воплощения белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6.
[00177] В некоторых вариантах воплощения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO:8; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-642 и 650-1341 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) аминокислот 19-1341 SEQ ID NO: 8; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины белка, включающего аминокислоты 19-1341 SEQ ID NO: 8; (в) аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8; и (г) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98% или 99% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична аминокислотам 19-1341 SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения, белки, содержащие аминокислотную последовательность, выбраны из группы, состоящей из: (a) SEQ ID NO: 8; (б) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины SEQ ID NO: 8; (в) аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95, 96, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 8; и (в) фрагмента, содержащего по меньшей мере 90% полной длины аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 95, 96%, 97, 98% или 99% идентична SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах воплощения белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 8.
[00178] В одном из аспектов изобретения, желательно, чтобы консенсусный антиген обеспечивал улучшенную транскрипцию и трансляцию, включая наличие одного или более из следующего: лидерная последовательность с низким содержанием GC для увеличения транскрипции; стабильность мРНК и оптимизация кодонов и устранение, насколько это возможно, мотивов цис-действующих последовательностей (т.е. внутренних TATA-боксов).
[00179] Антиген MUC16 может представлять собой консенсусную последовательность антигена (или иммуногена), полученную из двух или более видов. В некоторых вариантах воплощения консенсусный антиген может содержать эктодомен MUC16 и трансмембранный домен. Консенсусный антиген MUC16 может содержать одну или более мутаций в эктодомене и/или трансмембранном домене. Одна или более мутаций могут включать замену одной или более аминокислот, которые участвуют в N-гликозилировании. Одна или более мутаций могут включать замену аспарагина на аланин. Соответственно, в некоторых вариантах воплощения одна или более мутаций могут заменять 1, 2 или 3 аминокислоты в эктодомене и/или трансмембранном домене MUC16.
[00180] В некоторых вариантах воплощения антиген MUC16 дополнительно может включать любую комбинацию из одной или более последовательностей микроконсенсусного повтора (RMC), полученных из нативных последовательностей RMC, например, RMC1, RMC2, RMC3, и/или RMC4. В некоторых вариантах воплощения антиген MUC16 может включать любую комбинацию одной или более нативных последовательностей повтора (R), например, R59, R61, R62 и/или R63. В некоторых вариантах воплощения антиген MUC16 включает последовательности RMC1, RMC2, RMC3, RMC4, R61, R62 и R63. В некоторых вариантах воплощения антиген MUC16 включает последовательности RMC1, RMC2, RMC3, RMC4, R59, R61, R62 и R63. В некоторых вариантах воплощения антиген MUC16 включает последовательности RMC1, RMC2, RMC3 и RMC4. В некоторых вариантах воплощения антиген MUC16 включает последовательности R61, R62 и R63.
[00181] Антиген MUC16 может содержать модификации для улучшенной экспрессии. Модификация может включать оптимизацию кодонов, оптимизацию РНК, добавление последовательности Козака (например, GCC ACC) для увеличения инициации трансляции и/или добавление лидерной последовательности иммуноглобулина для повышения иммуногенности антигена MUC16. Антиген MUC16 может содержать сигнальный пептид, такой как сигнальный пептид иммуноглобулина, например, без ограничений, сигнальный пептид иммуноглобулина E (IgE) или иммуноглобулина G (IgG).
[00182] Антиген MUC16 может содержать модификации для оптимизации эпитопа. В некоторых вариантах воплощения может быть вставлен сайт расщепления между последовательностями RMC, между последовательностями R или на границе последовательностей RMC или R. Сайт расщепления может быть сайтом расщепления фурином. В определенных вариантах воплощения сайт расщепления фурином может быть вставлен между RMC4 и R61.
Вакцина в комбинации с ингибитором иммунной контрольной точки
[00183] Вакцина может дополнительно содержать один или более ингибиторов одной или более молекул иммунной контрольной точки (то есть ингибитора иммунной контрольной точки). Молекулы иммунной контрольной точки описаны ниже более подробно. Ингибитором иммунной контрольной точки является любая нуклеиновая кислота или белок, которые предотвращают подавление любого компонента в иммунной системе, такого как презентация классами MHC, презентация и/или дифференцировка Т-клеток, презентация и/или дифференцировка В-клеток, любого цитокина, хемокина или передачи сигналов для пролиферации и/или дифференцировки иммунной клетки.
[00184] Такой ингибитор может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, аминокислотной последовательностью, небольшой молекулой или их комбинацией. Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Нуклеиновая кислота может также включать дополнительные последовательности, которые кодируют последовательности линкера или метки, которые связаны с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малой молекулой может быть низкомолекулярное, например, менее 800 дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить субстратом фермента, лиганд (или его аналог), связанный с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятор биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.
[00185] В некоторых вариантах воплощения ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, его вариант, его фрагмент или их комбинацию. В других вариантах воплощения ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой антитело, его вариант, его фрагмент или их комбинацию.
a. Молекула иммунной контрольной точки
[00186] Молекула иммунной контрольной точки может быть последовательностью нуклеиновой кислоты, аминокислотной последовательностью, небольшой молекулой или их комбинацией. Последовательность нуклеиновой кислоты может представлять собой ДНК, РНК, кДНК, их вариант, их фрагмент или их комбинацию. Нуклеиновая кислота также может включать дополнительные последовательности, которые кодируют последовательности линкера или метки, которые связаны с ингибитором иммунной контрольной точки пептидной связью. Малой молекулой может быть низкомолекулярное, например, менее 800 дальтон, органическое или неорганическое соединение, которое может служить субстратом фермента, лиганд (или его аналог), связанный с белком или нуклеиновой кислотой, или регулятор биологического процесса. Аминокислотная последовательность может быть белком, пептидом, его вариантом, его фрагментом или их комбинацией.
(1) PD-1 и PD-L1
[00187] Молекулой иммунной контрольной точки может быть белок запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-1), лиганд запрограммированной клеточной смерти 1 (PD-L1), его фрагмент, его вариант или их комбинация. PD-1 представляет собой белок клеточной поверхности, кодируемый геном PDCDI. PD-1 является членом суперсемейства иммуноглобулинов и экспрессируется на Т-клетках и про-В-клетках и, таким образом, способствует участию и/или дифференцировке этих клеток. В частности, PD-1 является мембранным белком типа 1 семейства регуляторов Т-клеток CD28/CTLA-4 и отрицательно регулирует сигналы рецептора Т-клеток (TCR), тем самым отрицательно регулируя иммунные ответы. PD-1 может отрицательно регулировать ответы CD8+T-клеток и, таким образом, ингибировать цитотоксичность, опосредованную CD8, и усиливать рост.
[00188] PD-1 имеет два лиганда, PD-L1 и PD-L2, которые являются членами семейства B7. PD-L1 активируется на макрофагах и дендритных клетках (DC) в ответ на обработку LPS и GM-CSF, а также на T-клетках и B-клетках при передаче сигналов TCR и рецепторами B-клеток. PD-L1 экспрессируется многими опухолевыми клеточными линиями, включая миеломы, мастоцитомы и меланомы.
b. Антитело против молекулы иммунной контрольной точки
[00189] Описанный выше ингибитор иммунной контрольной точки может представлять собой антитело. Антитело может связываться или реагировать с антигеном (то есть молекулой иммунной контрольной точки, описанной выше). Соответственно, антитело может рассматриваться как антитело против иммунной контрольной молекулы или антитело против молекулы иммунной контрольной точки. Антитело может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащейся в данном документе.
[00190] Антитело может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи может включать вариабельную область тяжелой цепи (VH) и/или по меньшей мере одну константную область тяжелой цепи (CH). По меньшей мере, одна константная область тяжелой цепи может включать в себя константную область 1 тяжелой цепи (СН1), константную область 2 тяжелой цепи (СН2) и константную область 3 тяжелой цепи (СН3) и/или шарнирную область.
[00191] В некоторых вариантах воплощения полипептид тяжелой цепи может включать область VH и область CH1. В других вариантах воплощения полипептид тяжелой цепи может включать область VH, область CH1, шарнирную область, область CH2 и область CH3.
[00192] Полипептид тяжелой цепи может включать набор областей, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области VH. Исходя из N-конца полипептида тяжелой цепи, эти CDR обозначены, » соответственно, как «CDR1», «CDR2» и «CDR3». CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида тяжелой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.
[00193] Полипептид легкой цепи может включать область вариабельной легкой цепи (VL) и /или область константной легкой цепи (CL). Полипептид легкой цепи может включать набор областей, определяющих комплементарность («CDR»). Набор CDR может содержать три гипервариабельные области VL. Исходя из N-конца полипептида легкой цепи, эти CDR обозначены, соответственно, как «CDR1», «CDR2» и «CDR3». CDR1, CDR2 и CDR3 полипептида легкой цепи могут способствовать связыванию или распознаванию антигена.
[00194] Антитело может содержать набор областей, определяющих комплементарность («CDR») легкой цепи и тяжелой цепи, и, соответственно, помещаться между набором каркасной области тяжелой цепи и легкой цепи («FR»), которые обеспечивают поддержку CDR и определяют пространственную взаимосвязь разных CDR относительно друг друга. Набор CDR может содержать три гипервариабельных участка V-области тяжелой или легкой цепи. Исходя из N-конца тяжелой или легкой цепи, эти области обозначены как, соответственно, «CDR1», «CDR2» и «CDR3». Следовательно, антигенсвязывающий сайт может включать шесть CDR, включающих набор CDR из каждой V-области тяжелой и легкой цепи.
[00195] Антитело может представлять собой иммуноглобулин (Ig). Ig может быть, например, IgA, IgM, IgD, IgE и IgG. Иммуноглобулин может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи иммуноглобулина может включать область VH, область CH1, шарнирную область, область CH2 и область CH3. Полипептид легкой цепи иммуноглобулина может включать область VL и область CL.
[00196] Кроме того, протеолитический фермент папаин предпочтительно расщепляет молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, два из которых (фрагменты F (ab)) содержат ковалентный гетеродимер, который включает интактный антигенсвязывающий сайт. Фермент пепсин способен расщеплять молекулы IgG с образованием нескольких фрагментов, включая фрагмент F (ab') 2, который содержит оба антигенсвязывающих сайта. Соответственно, антитело может представлять собой Fab или F (ab') 2. Fab может включать полипептид тяжелой цепи и полипептид легкой цепи. Полипептид тяжелой цепи Fab может включать область VH и область CH1. Легкая цепь Fab может включать область VL и область CL.
[00197] Антитело может представлять собой поликлональное или моноклональное антитело. Антитело может быть химерным антителом, одноцепочечным антителом, антителом со зрелой аффинностью, человеческим антителом, гуманизированным антителом или полностью человеческим антителом. Гуманизированное антитело может быть антителом нечеловеческого вида, которое связывает желаемый антиген, имеющий одну или более областей, определяющих комплементарность (CDR) из нечеловеческого вида, и каркасных областей молекулы человеческого иммуноглобулина.
(1) Антитело PD-l
[00198] Антитело против иммунной контрольной точки может представлять собой антитело против PD-1 (также называемое в настоящем документе «антитело против PD-1»), его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Антитело к PD-1 может представлять собой ниволумаб. Антитело против PD-1 может ингибировать активность PD-1, таким образом индуцируя, вызывая или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.
(2) Антитело PD-L1
[00199] Антитело против иммунной контрольной точки может представлять собой антитело против PD- L1 (также называемое в настоящем документе «антитело против PD- L1»), его вариант, его фрагмент или их комбинацию. Антитело против PD- L1 может ингибировать активность PD- L1, посредством этого индуцируя, вызывая или усиливая иммунный ответ против опухоли или рака и уменьшая рост опухоли.
Вектор
[00200] Вакцина может содержать один или более векторов, которые включают гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген MUC16. Один или более векторов могут быть способны экспрессировать антиген в количестве, эффективном для вызывания иммунного ответа у млекопитающего. Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген. Вектор может иметь последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую источник репликации. Вектор может представлять собой плазмиду, бактериофаг, бактериальную искусственную хромосому или дрожжевую искусственную хромосому. Вектор может быть либо самовоспроизводящимся внехромосомным вектором, либо вектором, который интегрируется в геном хозяина.
[00201] Один или более векторов могут быть экспрессионной конструкцией, которая обычно представляет собой плазмиду, которая используется для введения специфического гена в клетку-мишень. Как только экспрессирующий вектор находится внутри клетки, белок, который кодируется геном, продуцируется рибосомными комплексами механизмов клеточной транскрипции и трансляции. Плазмиду часто конструируют так, чтобы она содержала регуляторные последовательности, которые действуют в области энхансера и промотора и приводят к эффективной транскрипции гена, переносимого на вектор экспрессии. Векторы по настоящему изобретению экспрессируют большие количества стабильной матричной РНК и, следовательно, белков.
[00202] Векторы могут иметь сигналы экспрессии, такие как сильный промотор, сильный кодон терминации, регулирование расстояния между промотором и клонированным геном и вставка последовательности терминации транскрипции и PTIS (портативная последовательность инициации трансляции).
[00203] Векторы могут содержать последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанные с регуляторным элементом, выбранным из промотора и сигнала полиаденилирования. В некоторых вариантах воплощения промотор представляет собой немедленный ранний промотор цитомегаловируса человека (промотор hCMV). В некоторых вариантах воплощения сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH poly A).
[00204] Вектор может представлять собой кольцевую плазмиду или линейную нуклеиновую кислоту. Кольцевая плазмида и линейная нуклеиновая кислота способны направлять экспрессию конкретной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке субъекта. Вектор может иметь промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей антиген, который может быть функционально связан с сигналами терминации. Вектор также может содержать последовательности, необходимые для правильной трансляции нуклеотидной последовательности, а также последовательности для клонирования и субклонирования вектора и его фрагментов. Вектор, содержащий искомую нуклеотидную последовательность, может быть химерным, что означает гетерелогичность по меньшей мере одного из его компонентов по отношению к по меньшей мере одному из его других компонентов. Экспрессия нуклеотидной последовательности в кассете экспрессии может находиться под контролем конститутивного промотора или индуцибельного промотора, который инициирует транскрипцию только тогда, когда на клетку-хозяина воздействует какой-то конкретный внешний стимул. В случае многоклеточного организма промотор также может быть специфичным для конкретной ткани или органа или стадии развития.
[00205] Вектор может представлять собой плазмиду. Плазмида может быть полезна для трансфекции клеток нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, которая культивируется и поддерживается в трансформированных клетках-хозяевах в условиях, при которых происходит экспрессия антигена.
[00206] Плазмида может включать нуклеиновую кислоту, которая кодирует один или более различных антигенов, описанных выше, включая кодирующие последовательности, которые кодируют синтетический консенсусный антиген, способный вызывать иммунный ответ против антигена, фрагменты таких белков, варианты таких белков, фрагменты вариантов или слитые белки, которые состоят из комбинаций консенсусных белков и/или фрагментов консенсусного белка и/или вариантов консенсусного белка и/или фрагментов вариантов консенсусных белков.
[00207] В некоторых вариантах воплощения плазмида может дополнительно содержать кодирующую последовательность, которая кодирует CCR20 отдельно или как часть одной из этих плазмид. Аналогично, плазмиды могут дополнительно содержать кодирующие последовательности для IL-12, IL-15 и/или IL-28.
[00208] Плазмида может дополнительно содержать инициирующий кодон, который может быть располагаться против хода транскрипции по отношению к кодирующей последовательности, и стоп-кодон, который может располагаться по ходу транскрипции по отношению к кодирующей последовательности. Кодон инициирования и терминации может находиться в рамке считывания с кодирующей последовательностью.
[00209] Плазмида также может содержать промотор, который функционально связан с кодирующей последовательностью. Промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью, может представлять собой промотор обезьяньего вируса 40 (SV40), промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV), промотор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), такой как промотор длинного терминального повтора (LTR) вируса иммунодефицита крупного рогатого скота (BIV), промотор вируса Молони, промотор вируса птичьего лейкоза (ALV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как немедленный ранний промотор CMV, промотор вируса Эпштейна-Барр (EBV) или промотор вируса саркомы Рауса (RSV). Промотор также может быть промотором человеческого гена, такого как человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или человеческий металлотионеин. Промотор также может представлять собой тканеспецифичный промотор, такой как мышечный или кожный специфический промотор, природный или синтетический. Примеры таких промоторов представлены в публикации заявки на патент США №. US 20040175727, содержание которой полностью включено в настоящий документ.
[00210] Плазмида также может содержать сигнал полиаденилирования, который может располагаться после кодирующей последовательности. Сигнал полиаденилирования может представлять собой сигнал полиаденилирования SV40, сигнал полиаденилирования LTR, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH), сигнал полиаденилирования человеческого гормона роста (hGH) или сигнал полиаденилирования β-глобина человека. Сигнал полиаденилирования SV40 может быть сигналом полиаденилирования от плазмиды pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA).
[00211] Плазмида также может содержать энхансер перед кодирующей последовательностью. Энхансером может быть человеческий актин, человеческий миозин, человеческий гемоглобин, человеческий мышечный креатин или вирусный усилитель, такой как усилитель CMV, FMDV, RSV или EBV. Усиления полинуклеотидной функции представлены в патентах США №№ 5,593,972, 5,962,428 и WO 94/016737, содержание каждого из которых полностью включено посредством ссылки.
[00212] Плазмида также может содержать источник репликации млекопитающего для поддержания внехромосомной плазмиды и получения множества копий плазмиды в клетке. Плазмида может представлять собой p V AXI, pCEP4 или pREP4 от Invitrogen (San Diego, CA), которая может включать в себя источник репликации вируса Эпштейна-Барр и кодирующую область ядерного антигена EBNA-1, которая может продуцировать эписомальную репликацию большого количества копий без интеграции. Основой плазмиды может быть pA V0242. Плазмида может быть дефектной по репликации плазмидой аденовируса типа 5 (Ad5).
[00213] Плазмида также может содержать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для экспрессии генов в клетке, в которую вводится плазмида. Кодирующая последовательность может содержать кодон, который может обеспечивать более эффективную транскрипцию кодирующей последовательности в клетке хозяина.
[00214] Кодирующая последовательность также может содержать лидерную последовательность Ig. Лидерная последовательность может быть последовательностью, кодирующей 5”. Консенсусные антигены, кодируемые этой последовательностью, могут содержать N-концевой лидерный Ig, за которым следует консенсусный антигенный белок. N-концевым лидерным Ig может быть IgE или IgG.
[00215] Плазмида может быть pSE420 (Invitrogen, San Diego, Калифорния), которая может использоваться для продуцирования белка в Escherichia coli (E.coli). Плазмида также может быть pYES2 (Invitrogen, San Diego, CA), которая может быть использована для продуцирования белка в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Плазмида также может иметь полную систему экспрессии бакуловируса MAXBAC™ (Invitrogen, San Diego, Калифорния), которая может быть использована для продуцирования белка в клетках насекомых. Плазмида также может представлять собой pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Калифорния), которые могут быть использованы для продуцирования белка в клетках млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (CHO). Плазмида также может представлять собой pGX001 (Inovio), модифицированную от pVAX1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
[00216] Вектор может представлять собой кольцевую плазмиду, которая может трансформировать клетку-мишень путем интеграции в клеточный геном или существовать внехромосомно (например, автономная реплицирующаяся плазмида с точкой начала репликации).
[00217] Вектором может быть pVAX, pcDNA3.0 или provax или любой другой вектор экспрессии, способный экспрессировать ДНК, кодирующую антиген, и позволяющий клетке транслировать последовательность в антиген, который распознается иммунной системой.
[00218] Также в данном документе предоставлена линейная вакцина на основе нуклеиновой кислоты или кассета с линейной экспрессией («LEC»), которая способна эффективно доставляться субъекту посредством электропорации и экспрессии одного или более желаемых антигенов. LEC может представлять собой любую линейную ДНК, лишенную какого-либо фосфатного остова. ДНК может кодировать один или более антигенов. LEC может содержать промотор, интрон, стоп-кодон и/или сигнал полиаденилирования. Экспрессия антигена может контролироваться промотором. LEC может не содержать генов устойчивости к антибиотикам и/или фосфатного остова. LEC может не содержать других последовательностей нуклеиновых кислот, не связанных с желаемой экспрессией гена антигена.
[00219] LEC может быть получена из любой плазмиды, способной к линеаризации. Плазмида может быть способной экспрессировать антиген. Плазмида может быть pNP (Puerto Rico/34) или pM2 (New Caledonia/99). Плазмида может быть WLV009, pVAX, pcDNA3.0 или provax или любым другим вектором экспрессии, способным экспрессировать ДНК, кодирующую антиген и позволяющую клетке транслировать последовательность в антиген, который распознается иммунной системой.
[00220] LEC может быть pcrM2. LEC может быть pcrNP. pcrNP и pcrMR могут быть получены из, соответственно, pNP (Puerto Rico/34) и pM2 (New Caledonia/99).
[00221] Вектор может иметь промотор. Промотор может быть любым промотором, который способен управлять экспрессией гена и регулировать экспрессию выделенной нуклеиновой кислоты. Такой промотор представляет собой цис-действующий элемент последовательности, необходимый для транскрипции через ДНК-зависимую РНК-полимеразу, которая транскрибирует последовательность антигена, согласно настоящему описанию. Выбор промотора, используемого для прямой экспрессии гетерологичной нуклеиновой кислоты, зависит от конкретного применения. Промотор может быть расположен приблизительно на том же расстоянии от начала транскрипции в векторе, что и от начального сайта транскрипции в его естественной обстановке. Тем не менее изменение этого расстояния может быть принято без потери функции промотора.
[00222] Промотор может быть функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген и сигналы, необходимые для эффективного полиаденилирования транскрипта, сайтов связывания рибосом и терминации трансляции.
[00223] Промотор может представлять собой промотор CMV, ранний промотор SV40, поздний промотор SV40, металлотионеиновый промотор, промотор вируса опухоли молочной железы мыши, промотор вируса саркомы Рауса, промотор полиэдрина или другой промотор, продемонстрировавший эффективность для экспрессии в эукариотических клетках.
[00224] Вектор может включать энхансер и интрон с функциональными донорными и акцепторными сайтами сплайсинга. Вектор может содержать область терминации транскрипции, расположенной против хода транскрипции структурного гена для обеспечения эффективной терминации. Терминальная область может быть получена из того же гена, что и последовательность промотора, или может быть получена из разных генов.
Способы получения вектора
[00225] В настоящем документе представляются способы получения вектора, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген MUC16, обсуждаемый в данном документе. Вектор, после заключительной стадии субклонирования в плазмиду экспрессии млекопитающего, может быть использован для инокуляции в культуры клеток в крупномасштабном ферментационном резервуаре с использованием известных в данной области способов.
[00226] Вектор для использования с устройствами ЭП, которые описаны ниже более подробно, может быть составлен или изготовлен с использованием комбинации известных устройств и технологий, но предпочтительно, чтобы они были изготовлены с использованием оптимизированной технологии изготовления плазмиды, которая описана в лицензированном документе, в одновременно находящейся на рассмотрении предварительной заявке США, серийный номер 60/939,792, поданной 23 мая 2007 года. В некоторых примерах плазмиды ДНК, используемые в этих исследованиях, могут быть приготовлены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии производства также включают или охватывают различные устройства и протоколы, которые обычно известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые представлены в заявке США, серийный номер США 60/939792, включая те, которые представлены в лицензированном патенте США № 7,238,522, выданном 3 июля 2007 года. Вышеупомянутая заявка и патент, соответственно, серийный номер США 60/939,792 и патент США № 7,238,522, полностью включены в настоящий документ.
Эксципиенты и другие компоненты вакцины
[00227] Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой функциональные молекулы, такие как наполнители, носители или разбавители. Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой агент, облегчающий трансфекцию, который может включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид A, мурамилпептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален и сквален, гиалуроновая кислота, липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы или другие известные агенты, облегчающие трансфекцию.
[00228] Агент, облегчающий трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая поли-L-глутамат (LGS), или липид. Средство, облегчающее трансфекцию, представляет собой поли-L-глутамат, и поли-L-глутамат может присутствовать в вакцине в концентрации менее 6 мг/мл. Агент, облегчающий трансфекцию, может также включать поверхностно-активные агенты, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален и сквален, и гиалуроновая кислота также могут быть использованы в сочетании с генетической конструкцией. ДНК-плазмидные вакцины могут также включать агент, облегчающий трансфекцию, такой как липиды, липосомы, включая лецитиновые липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, в виде смеси ДНК-липосомы (см., например, W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы или другие известные агенты, облегчающие трансфекцию. Агент, облегчающий трансфекцию, представляет собой полианион, поликатион, включая поли-L-глутамат (LGS), или липид. Концентрация агента трансфекции в вакцине составляет менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл, менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
[00229] Фармацевтически приемлемый наполнитель может представлять собой один или более адъювантов. Адъювант может представлять собой другие гены, которые экспрессируются в альтернативной плазмиде или доставляются в виде белков в комбинации с указанной выше плазмидой в вакцине. Один или более адъювантов могут быть выбраны из группы, включающей: CCL20, α-интерферон (IFN-α), β-интерферон (IFN-β), γ-интерферон, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFα, TNR β, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), кожный Т-клеточный хемокин (CTACK), эпителиальный тимус-экспрессированный хемокин (TECK), связанный со слизистой оболочкой эпителиальный хемокин (MEC), IL-12, IL-15, , IL-28, MHC, CD80, CD86, IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, MCP-l, MIP-la, MIP-1~, IL-8, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-l, MadCAM-l, LFA-l, VLA-l, Mac-l, pl50.95, PECAM, ICAM-l, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, мутантные формы IL-l 8, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, IL-7, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, рецептор TNF, Flt, Apo-l, p55, WSL-l, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DRS, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-l, Ap-l, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Неактивный NIK, SAP K, SAP-I, JNK, гены ответа на интерферон, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Оx40, Оx40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAPI, TAP2, IL-l 5, имеющие сигнальную последовательность или кодирующую последовательность, которая кодирует удаленную сигнальную последовательность, и необязательно включающую в себя другой сигнальный пептид, такой как из IgE, или кодирующую последовательность, которая кодирует другой сигнальный пептид, такой как из IgE, и их функциональные фрагменты или их комбинацию. Адъювант может представляет собой IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFα, TNFβ, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-l, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-l8 или их комбинацию.
[00230] В некоторых вариантах воплощения адъювант может представлять собой один или более белков и/или молекул нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, выбранных из группы, состоящей из: CCL-20, IL-12, IL-15, IL-28, CTACK, TECK, MEC или RANTES. Примеры конструкций и последовательностей IL-12 раскрыты в заявке PCT №. PCT/US1997/019502 и соответствующей заявке США, серийный номер 08/956,865, и в предварительной заявке США, серийный номер 61/569600, поданной 12 декабря 2011 г., каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Примеры конструкций и последовательностей IL-15 раскрыты в заявке PCT №. PCT/US04/18962 и соответствующей заявке США серийный номер 10/560,650, и в заявке PCT №. PCT/US07/00886 и соответствующей заявке США, серийный № 12/160,766, и в заявке PCT №. PCT/USI0/048827, каждая из которых включена сюда посредством ссылки. Примеры конструкций и последовательностей IL-28 раскрыты в заявке PCT №. PCT/US09/039648 и соответствующей заявке США, серийный номер 12/936,192, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT №. PCT/US 1999/004332 и соответствующей заявке США, серийный номер и 09/622452, каждая из которых включена в настоящий документ посредством ссылки. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT №. PCT/US 11/024098, которая включена сюда посредством ссылки. Примеры RANTES и других конструкций и последовательностей раскрыты в заявке PCT №. PCT/US1999/004332 и соответствующей заявке США, серийный номер 09/622452, каждая из которых включена сюда посредством ссылки. Другие примеры конструкций и последовательностей RANTES раскрыты в заявке PCT №. PCT/US11/024098, которая включена сюда посредством ссылки. Примеры хемокинов, конструкций и последовательностей CTACK, TECK и MEC раскрыты в заявке PCT №. PCT/US 2005/042231 и соответствующей заявке США, серийный № 11/719646, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Примеры Ох40 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 10/560653, которая включена в настоящее описание посредством ссылки. Примеры DR5 и других иммуномодуляторов раскрыты в заявке США № 09/622452, которая включена в настоящее описание посредством ссылки.
[00231] Другие гены, которые могут быть полезны в качестве адъювантов, включают гены, кодирующие: MCP-l, MIP-la, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-селектин, P-селектин, E-селектин, CD34, GlyCAM-l, MadCAM-l, LFA-l, VLA-l, Mac-l, pl50.95, PECAM, ICAM-l, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, фактор роста сосудов, фактор роста фибробластов, IL-7, IL-22, фактор роста нервов, фактор роста эндотелия сосудов, Fas, рецепор TNF, Flt, Apo-l, p55, WSL-l, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Каспазу ICE, Fos, c-jun, Sp-l, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Неактивный NIK, SAP K, SAP-l, JNK, гены ответа на интерферон, NFkB, Bax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Оx40, Оx40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.
[00232] Вакцина может дополнительно включать агент, стимулирующий генетическую вакцину, как представлено в заявке США, серийный номер 021 579, поданной 1 апреля 1994 г., которая полностью включена посредством ссылки.
[00233] Вакцина может содержать антиген и плазмиды в количестве от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграммов; от 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; или предпочтительно приблизительно от 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; или более предпочтительно от приблизительно 1 миллиграмма до приблизительно 2 миллиграммов. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина согласно настоящему изобретению содержит от приблизительно 5 нанограммов до приблизительно 1000 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 10 нанограммов до приблизительно 800 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать приблизительно от 1 до приблизительно 350 микрограммов ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения вакцина может содержать от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограммов, от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограммов, от приблизительно 1 нанограмма до 100 миллиграммов; от приблизительно 1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; от приблизительно 0,1 микрограмма до приблизительно 10 миллиграммов; от приблизительно 1 миллиграмма до приблизительно 2 миллиграммов, от приблизительно 5 нанограммов до приблизительно 1000 микрограммов, от приблизительно 10 нанограммов до приблизительно 800 микрограммов, от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограммов, от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограммов, от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограммов, от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограммов антигена или его плазмиды.
[00234] Вакцина может быть составлена в соответствии с применяемым способом введения. Фармацевтическая композиция для инъекционных вакцин может быть стерильной, апирогенной и не содержащей частиц. Можно использовать изотонический состав или раствор. Добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Вакцина может содержать вазоконстриктор. Изотонические растворы могут включать забуференный фосфатом физиологический раствор. Вакцина может дополнительно содержать стабилизаторы, включая желатин и альбумин. Стабилизаторы могут обеспечивать стабильность состава при комнатной температуре или температуре окружающей среды в течение продолжительных периодов времени, включая LGS или поликатионы или полианионы.
Фармацевтические композиции вакцины
[00235] Вакцина может быть в форме фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может содержать вакцину. Фармацевтические композиции могут содержать приблизительно от 5 нанограммов (нг) до приблизительно 10 миллиграммов (мг) молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат приблизительно от 25 нг до приблизительно 5 мг молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 50 нг до приблизительно 1 мг молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 1 до приблизительно 350 микрограммов нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 5 до приблизительно 250 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 10 до приблизительно 200 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 15 до приблизительно 150 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 20 до приблизительно 100 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 75 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 30 до приблизительно 50 микрограммов нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 35 до приблизительно 40 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 100 до приблизительно 200 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 10 микрограммов до приблизительно 100 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 20 микрограммов до приблизительно 80 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 25 микрограммов до приблизительно 60 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 30 нг до приблизительно 50 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 35 нг до приблизительно 45 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 0,1 до приблизительно 500 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 100 до приблизительно 200 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины.
[00236] В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 мг или более молекул нуклеиновой кислоты вакцины.
[00237] В других вариантах воплощения фармацевтическая композиция может включать до и включая 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нг молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция может включать до и включая 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины. В некоторых вариантах воплощения фармацевтическая композиция может включать до и включая 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5; 9; 9,5 или 10 миллиграммов молекул нуклеиновой кислоты вакцины.
[00238] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие агенты для целей включения в состав в соответствии с используемым способом введения. В тех случаях, когда фармацевтические композиции представляют собой фармацевтические композиции для инъекций, они являются стерильными, апирогенными и не содержат твердых частиц. Предпочтительно использовать изотонический состав. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях предпочтительными являются изотонические растворы, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах воплощения к препарату добавляют вазоконстриктор.
[00239] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый эксципиент, как указано выше. Например, фармацевтически приемлемый эксципиент может включать функциональные молекулы, наполнители, адъюванты, носители, разбавители или средства, облегчающие трансфекцию, как указано выше.
Способы вакцинации
[00240] В настоящем документе предложены способы лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего MUC16, такого, без ограничений, как рак яичников, с использованием фармацевтических составов, описанных выше. Также в данном документе описаны способы применения фармацевтических составов, описанных выше, для лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего MUC16, такого, без ограничений, как рак яичников, у субъекта. В данном документе также представлены способы вакцинации субъекта. Также в данном документе представлены способы введения фармацевтических составов, представленных в данном документе, субъекту, нуждающемуся в этом. Представленные в данном документе способы, в совокупности называемые способами лечения с использованием фармацевтических составов, представленных в данном документе, могут включать введение одной или более вакцин, согласно настоящему описанию, субъекту, нуждающемуся в этом, для индукции терапевтического и/или профилактического иммунного ответа. Вакцина может быть введена субъекту для модуляции активности иммунной системы субъекта и усиления иммунного ответа. Введение вакцины может быть трансфекцией раковых антигенов, согласно настоящему описанию, в виде молекулы нуклеиновой кислоты, которая экспрессируется в клетке и доставляется на поверхность клетки, после чего иммунная система распознает их и индуцирует клеточный, гуморальный или клеточный и гуморальный ответ. Введение вакцины может быть использовано для того, чтобы индуцировать или вызывать иммунный ответ у субъектов против MUC16, согласно настоящему описанию, путем введения субъекту вакцины, как указано выше в данном документе.
[00241] Вакцина может быть введена субъекту для модуляции активности иммунной системы субъекта, тем самым усиливая иммунный ответ. В некоторых вариантах воплощения субъектом является млекопитающее. При введении вакцины млекопитающему и тем самым введении вектора в клетки млекопитающего трансфицированные клетки будут экспрессировать и секретировать один или более раковых антигенов, как указано в данном документе. Эти секретируемые белки или синтетические антигены будут распознаваться иммунной системой как чужеродные, что приведет к возникновению иммунного ответа, который может включать: антитела, выработанные против одного или более раковых антигенов, и специфический ответ Т-клеток против одного или более раковых антигенов. В некоторых примерах млекопитающее, вакцинированное вакцинами, обсуждаемыми в данном документе, будет иметь примированную иммунную систему, и при введении одного или более антигенов рака, согласно настоящему описанию, примированная иммунная система позволит быстро освободиться от последующих раковых антигенов, как указано в настоящем документе, независимо от того, будет ли это произведено через гуморальный, клеточный или через как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы.
[00242] Способы введения ДНК-вакцины представлены в патентах США №№ 4,945,050 и 5,036,006, оба из которых полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.
[00243] Вакцина может быть введена млекопитающему, чтобы вызвать иммунный ответ у млекопитающего. Млекопитающее может быть человеком, приматом, не являющимся человеком, коровой, свиньей, овцой, козой, антилопой, бизоном, водяным буйволом, быками, оленем, ежами, слонами, ламой, альпакой, мышами, крысами и предпочтительно человеком, коровой или свиньей. Чтобы вызвать иммунный ответ вакцину также можно вводить субъекту, не являющемуся млекопитающим, например курице.
[00244] Доза вакцины может составлять от 1 мкг до 10 мг активного компонента на килограмм (кг) веса тела во времени (компонент/кг веса тела/время) и может составлять от 20 микрограммов до 10 мг компонента/кг веса тела время. Вакцину можно вводить каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 дней или 31 день. Количество доз вакцины для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз.
Способы генерирования иммунного ответа при помощи вакцины
[00245] Вакцина может быть использована для генерирования иммунного ответа у субъекта млекопитающего или субъекта не являющегося млекопитающим, включая терапевтический или профилактический иммунный ответ. Иммунный ответ может генерировать антитела и/или Т-клетки-киллеры, которые направлены на один или более раковых антигенов, как указано в данном документе. Такие антитела и Т-клетки могут быть изолированы.
[00246] Некоторые варианты воплощения предлагают способы генерирования иммунных ответов против одного или более раковых антигенов, согласно настоящему описанию, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины субъекту. Некоторые варианты воплощения предлагают способы профилактической вакцинации субъекта против рака или опухоли, экспрессирующих один или более антигенов MUC16, как описано выше, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины. Некоторые варианты воплощения предлагают способы терапевтической вакцинации субъекта, который страдает от рака яичников или опухоли, экспрессирующей MUC16, причем эти варианты воплощения включают введение вакцины. Диагностика рака яичников или опухоли, экспрессирующей один или более антигенов MUC16, согласно настоящему описанию, до введения вакцины может проводиться обычным способом.
Способ лечения рака при помощи вакцины
[00247] Вакцина может использоваться для генерирования или индукции иммунного ответа у млекопитающего, который является реактивным или направленным на рак, экспрессирующий MUC16, такой как, без ограничений, рак яичника, более конкретно эпителиальный рак яичника, наиболее конкретно серозный рак яичника. Вызванный иммунный ответ может предотвратить рак яичников или рост опухоли.
[00248] Вызванный иммунный ответ может предотвращать и/или уменьшать метастазирование раковых или опухолевых клеток у субъекта с раком яичника. Соответственно, вакцина может быть использована в способе, который лечит и/или предотвращает рак или опухоли у млекопитающего или субъекта, больного раком, которому вводят вакцину.
[00249] В некоторых вариантах воплощения вводимая вакцина может опосредовать клиренс или предотвращать рост опухолевых клеток путем индуцирования (1) гуморального иммунитета посредством В-клеточных ответов для генерации антител, которые блокируют продукцию моноцитарного хемоаттрактантного белка-1 (МСР-1), тем самым задерживая клетки-супрессоры (MDSC), происходящие из миелоидных клеток, и вызывая подавление роста опухоли; (2) путем увеличения цитотоксических Т-лимфоцитов, таких как CD8 + (CTL), для атаки и уничтожения опухолевых клеток; (3) через увеличение ответов Т-хелперов; (4) и усиливая воспалительные реакции посредством IFN-γ и TFN-α или предпочтительно через все вышеупомянутое. Вакцина может увеличивать безопухолевую выживаемость на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44% и 45%. Вакцина после иммунизации может уменьшать опухолевую массу на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60%. Вакцина может предотвращать и блокировать повышение моноцитарного хемоаттрактантного белка 1 (МСР-1), цитокина, секретируемого клетками-супрессорами миелоидного происхождения. Вакцина может повышать выживаемость с опухолью на 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59% и 60%.
[00250] В некоторых вариантах воплощения иммунный ответ может генерировать гуморальный иммунный ответ и/или ответ антигенспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), который не вызывает повреждения или воспаления различных тканей или систем (например, мозга или неврологической системы и т. п.) у субъекта, которому вводили вакцину.
[00251] В некоторых вариантах воплощения вакцину можно вводить на периферию (как описано более подробно ниже) для установления антигенспецифического иммунного ответа, направленного на раковые или опухолевые клетки или ткань, чтобы освободиться от рака или опухоли или устранить рак или опухоль, экспрессирующую один или более видов раковых антигенов, не повреждая и не вызывая заболевание или смерть у субъекта, которому вводят вакцину.
[00252] ] Вводимая вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 5500 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 5000 раз, от приблизительно в 50 раз до приблизительно в 4500 раз, от приблизительно в 100 раз до приблизительно 6000 раз, от приблизительно в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 200 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 250 до приблизительно в 6000 раз или от приблизительно в 300 до приблизительно в 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вводимая вакцина может усиливать клеточный иммунный ответ у субъекта приблизительно в 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3 100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4l00, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или 6000 раз по сравнению с клеточным иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину.
[00253] Вводимая вакцина может повышать уровни интерферона гамма (IFN-γ) у субъекта приблизительно в 50 раз, приблизительно в 50 раз, приблизительно в 50 раз, приблизительно в 5000 раз, приблизительно в 50 раз, приблизительно в 4500 раз, от приблизительно в 100 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 150 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 200 раз до приблизительно в 6000 раз, от приблизительно в 250 раз до приблизительно в 6000 раз или от приблизительно в 300 раз до приблизительно в 6000 раз по сравнению на клеточный иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину. В некоторых вариантах воплощения вводимая вакцина может повышать уровни IFN-γ у субъекта приблизительно в 50, 100, l50, 200, 250, 300, 350 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, l200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 5100, 5200, 5300, 5400, 5500, 5600, 5700, 5800, 5900 раз или 6000 раз по сравнению на клеточный иммунным ответом у субъекта, которому не вводили вакцину.
[00254] Доза вакцины может составлять от 1 мкг до 10 мг активного компонента на килограмм (кг) массы тела в период времени (компонент/кг массы тела/время) и может составлять от 20 микрограммов до 10 мг компонента/кг массы тела/время. Вакцина может быть введена каждый 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или 31 день. Количество доз вакцины для эффективного лечения может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доз.
Пути введения
[00255] Вакцина или фармацевтическая композиция может вводиться различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, трансмукозальный, местный, посредством ингаляции, посредством буккального введения, внутриплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный, интратекальный и/или внутрисуставной, или их комбинации. Для ветеринарного применения композицию можно вводить в виде удобной приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить режим дозирования и путь введения, который наиболее подходит для конкретного животного. Вакцину можно вводить с помощью традиционных шприцев, безыгольных инъекционных устройств, «генных пушек с бомбардировкой микрочастицами» или других физических методов, таких как электропорация («ЭП»), «гидродинамический метод» или ультразвук.
[00256] Вектор вакцины может быть введен млекопитающему с помощью нескольких хорошо известных технологий, включая инъекцию ДНК (также называемую ДНК-вакцинацией) с электропорацией и без нее in vivo, трансфекцию, опосредованную липосомами, трансфекцию, стимулированную наночастицами, и использование рекомбинантных векторов, таких как рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный аденовирус-ассоциированный вирус и рекомбинантная вакцинация. Один или более раковых антигенов вакцины можно вводить путем инъекции ДНК вместе с электропорацией in vivo.
Электропорация
[00257] Вакцина или фармацевтическая композиция могут вводиться путем электропорации. Введение вакцины посредством электропорации может быть выполнено с использованием устройств электропорации, которые могут быть сконфигурированы для доставки в желаемую ткань млекопитающего импульса энергии, эффективного для образования обратимых пор в клеточных мембранах, и предпочтительно импульс энергии представляет собой постоянный ток, соответствующий входящему току, заданному пользователем. Устройство электропорации может содержать компонент электропорации и электродный узел или узел ручного управления. Компонент электропорации может включать и охватывать один или более различных элементов устройств электропорации, в том числе: контроллер, генератор сигналов тока, тестер импеданса, регистратор сигналов, элемент ввода, элемент сообщения о состоянии, порт связи, компонент памяти, источник питания и выключатель. Электропорацию для облегчения трансфекции клеток плазмидой можно проводить с использованием устройства электропорации in vivo, например, системы CELLECTRA EP (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) или электропоратора Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.).
[00258] Примеры устройств электропорации и способов электропорации, которые могут облегчать введение ДНК-вакцин по настоящему изобретению, включают те, которые представлены в Патенте США № 7,245,963 авторов Draghia-Akli, et al., Патенте США публикация 2005/0052630, поданная Smith, et al., содержание которых полностью включено в данный документ посредством ссылки. Другие устройства электропорации и способы электропорации, которые можно использовать для облегчения введения ДНК-вакцин, включают в себя устройства, представленные в одновременно находящейся на рассмотрении и находящейся в совместном владении заявке на патент США, серийный № 11/874072, поданной 17 октября 2007 г., в которой заявлено преимущество согласно 35 USC 119(e) к предварительных заявок США серийные № 60/852,149, поданной 17 октября 2006 года, и серийные № 60/978,982, поданной 10 октября 2007 года, и все они включены в настоящий документ в полном объеме.
[00259] Патент США №. 7,245,963 авторов Draghia-Akli, et al., описывает модульные электродные системы и их использование для облегчения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Модульные электродные системы могут содержать множество игольчатых электродов; иглу для подкожных инъекций; электрический разъем, который обеспечивает проводящую связь от программируемого импульсного контроллера постоянного тока к множеству игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может захватить множество игольчатых электродов, которые установлены на опорной конструкции, и плотно ввести их в выбранную ткань в теле или в растении. Затем биомолекулы вводят через подкожную иглу в выбранную ткань. Программируемый контроллер импульсов постоянного тока активируется, и электрический импульс постоянного тока подается на множество игольчатых электродов. Прилагаемый электрический импульс постоянного тока облегчает введение биомолекулы в ячейку между совокупностью электродов. Все содержание патента США № 7,245,963 полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.
[00260] Патентная публикация США 2005/0052630, поданная Smith, et al., описывает устройство электропорации, которое можно использовать для эффективного облегчения введения биомолекулы в клетки выбранной ткани организма или растения. Устройство электропорации содержит электрокинетическое устройство («устройство EKD»), работа которого задается внешним программным обеспечением или встроенным программным обеспечением. Устройство EKD создает серию программируемых последовательностей импульсов постоянного тока между электродами в матрице на основе пользовательского управления и ввода параметров импульсов и позволяет хранить и получать данные о форме сигнала тока. Устройство электропорации также содержит сменный электродный диск, имеющий ряд игольчатых электродов, центральный канал для инъекционной иглы и съемный направляющий диск. Все содержание патента США публикация 2005/0052630 полностью включено посредством ссылки.
[00261] Матрицы электродов и способы, представленные в патенте США № 7245963 и в патентной публикации США 2005/0052630, можно адаптировать для глубокого проникновения не только в такие ткани, как мышцы, но и в другие ткани или органы. Из-за конфигурации матрицы электродов инъекционная игла также полностью вводится в орган-мишень, и инъекция вводится перпендикулярно целевой проблеме, в области, которая предварительно очерчивается электродами. Электроды, представленные в патенте США № 7244563 и в патентной пуликации США 2005/005263, предпочтительно 20 мм длиной и 21 калибра.
[00262] Кроме того, в некоторых вариантах воплощения, которые включают устройства электропорации и их использование, существуют устройства электропорации, которые представлены в следующих патентах: патент США 5 273 525, выданный 28 декабря 1993 г., патенты США 6 110 161, выданный 29 августа 2000 г., 6 261 281, выданный 17 июля, 2001, и 6 958 060, выданный 25 октября 2005 г., и в патенте США 6 939 862, выданном 6 сентября 2005 г. Кроме того, в настоящем документе рассматриваются патенты, охватывающие предмет, предоставленный в патенте США 6 697 669, выданном 24 февраля 2004 г., который касается введения ДНК с использованием любого из множества устройств, и в патенте США 7 328 064, выданном 5 февраля 2008 г., который относится к способу введения ДНК. Вышеуказанные патенты включены посредством ссылки во всей их полноте.
Способы получения вакцины
[00263] В данном документе предложены способы получения плазмид ДНК, обсуждаемых в данном документе. ДНК-плазмиды после заключительной стадии субклонирования в плазмиду экспрессии млекопитающих могут быть использованы для инокуляции культуры клеток в крупномасштабном ферментационном резервуаре, используя известные в данной области техники способы.
[00264] ДНК-плазмиды для использования с ЭП-устройствами по настоящему изобретению могут быть составлены или изготовлены, применяя комбинации известных устройств и технологий, но предпочтительно они изготавливаются с использованием оптимизированной технологии получения плазмиды, которая представлена в опубликованной заявке США №. 20090004716, поданной 23 мая 2007. В некоторых примерах плазмиды ДНК, используемые в этих исследованиях, могут быть приготовлены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии производства также включают или охватывают различные устройства и протоколы, которые широко известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые представлены в заявке на патент США серийный № 60/939792, включая те, которые представлены в лицензированном патенте США № 7,238,522, выданном 3 июля 2007 года. Вышеупомянутая заявка и патент США, соответственно, серийный номер 60/939,792 и патент США № 7,238,522 полностью включены в настоящий документ.
[00265] Настоящее изобретение имеет множество аспектов, иллюстрируемых следующими неограничивающими примерами.
ПРИМЕРЫ
[00266] Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано в следующих примерах. Следует понимать, что эти примеры, хотя и указывают предпочтительные варианты воплощения изобретения, приведены только в качестве иллюстрации. Из приведенного выше обсуждения и этих примеров специалист в данной области техники может определить основные характеристики этого изобретения и, не отступая от его сущности и объема, может внести различные изменения и модификации изобретения, чтобы адаптировать его к различным применениям и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны в данном документе, будут очевидны для специалистов в данной области техники из предшествующего описания. Такие модификации также предназначены для попадания в объем прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1: Стратегия дизайна центрального домена тандемного повтора MUC16
[00267] Нативный человеческий MUC16 представляет собой большой, в значительной степени гликозилированный белок, длина которого составляет 22 152 аминокислоты. Он состоит из 3 доменов: N-концевой домен, центральный домен тандемного повтора и карбокси-концевой домен. Поскольку нативный N-концевой домен MUC16 человека очень большой (12 068 аминокислот) и у него отсутствуют повторяющиеся последовательности, целью явились только центральный домен тандемного повтора и карбокси-концевой домен (ФИГ. 1). Для домена тандемного повтора и карбокси-концевого домена использовались различные стратегии дизайна.
[00268] Центральный домен тандемного повтора нативного человеческого MUC16, длина которого составляет 9 799 аминокислот, представляет собой серию из 63 гомологичных повторов, каждый из которых состоит из 156 аминокислот, за исключением последнего повтора, который составляет всего 127 аминокислот. Из-за своей длины и отсутствия гомологии среди различных видов для того, чтобы потенциально индуцировать перекрестно-реактивные Т-клетки против большинства нативных повторов человека, последовательности микроконсенсусного повтора (RMC) были получены из множества последовательностей нативных повторов человека. Вкратце, после исключения низкокачественных последовательностей нативного повтора человека оставшиеся 34 последовательности нативного повтора человека были использованы для проведения филогенетического анализа (ФИГ. 2 и ФИГ. 3). Результат показал, что эти последовательности могут быть сгруппированы в четыре группы повторов, которые имеют идентичность более 80%. Основываясь на предыдущем опыте разработки вакцины на основе Т-клеток, каждая микроконсенсусная последовательность должна быть получена из последовательностей, которые имеют более 80% идентичности последовательностей одна с другой для того, чтобы выявлять перекрестно-реактивные ответы Т-клеток на нативные повторы, использованные для генерации этого микроконсенсуса. В результате были сгенерированы четыре последовательности RMC.
[00269] Среди тех повторов, которые не были сгруппированы ни в одну из этих четырех групп, только три других нативных повтора (R61-63) имели идентичность последовательностей менее 80% со всеми четырьмя сгенерированными последовательностями микроконсенсусного повтора (RMC) (таблица 1). Таблица 1 показывает процент идентичности последовательностей всех несгруппированных нативных последовательностей индивидуальных повторов MUC16 (R14, R1, R55, R56, R21, R58, R22, R59, R60, R61, R63 и R62) с RMC1-4. Жирный шрифт означает, что оставшиеся несгруппированные нативные повторяющиеся последовательности имеют идентичность более 80% по меньшей мере с одним RMC, за исключением R61, R62 и R63 (GenBank: AAL65133.2).
Таблица 1
<b>R14</b>
<b>R1</b>
<b>R55</b>
<b>R56</b>
<b>R21</b>
<b>R58</b>
<b>R22</b>
<b>R59</b>
<b>R60</b>
<b>R61</b>
<b>R63</b>
<b>R62</b>
<b>RMC № 1</b>
<b>87,2</b>
79,4
<b>85,2</b>
<b>80,6</b>
<b>81,8</b>
<b>80,6</b>
<b>83,1</b>
<b>83,9</b>
78,7
74,7
48,4
45,5
<b>RMC № 2</b>
<b>85,3</b>
<b>80,6</b>
<b>87,7</b>
<b>83,9</b>
<b>83,8</b>
<b>80,6</b>
<b>83,1</b>
<b>83,9</b>
<b>80,0</b>
76
50
45,5
<b>RMC № 3</b>
77,6
70,3
75,5
75,5
76,6
76,8
79,9
79,4
75,5
70,8
54,8
47
<b>RMC № 4</b>
77,6
74,8
<b>83,2</b>
79,4
<b>82,5</b>
<b>80,0</b>
<b>83,1</b>
<b>82,6</b>
78,7
77,9
51,6
47,7
[00270] Чтобы потенциально увеличить широту Т-клеточных ответов, вызванных вакциной, эти три повтора были включены в конструкцию центрального домена тандемного повтора MUC16 в качестве отдельных элементов. Остальные нативные повторы (R1, R14, R55, R56, R21, R58, R22, R59 и R60) имеют более 80% идентичности последовательностей по меньшей мере с один RMC, и должны покрываться по меньшей мере одной из четырех последовательностей RMC.
[00271] Подводя итог, подход синтеза синтетического консенсуса не был использован в отношении центрального домена тандемного повтора. Вместо этого были сгенерированы 4 последовательности RMC, полученные из множества последовательностей человеческого нативного повтора, чтобы потенциально индуцировать перекрестно-реактивные Т-клетки против большинства нативных повторов человека. Каждый RMC был получен из повторяющихся последовательностей, которые имеют более 80% идентичности последовательностей одна с другой. Нативные повторы R61, R62 и R63, все из которых имеют идентичность последовательности менее 80% со всеми 4 последовательностями RMC, также были включены в конструкцию центрального домена тандемного повтора MUC16 в качестве отдельных элементов, чтобы потенциально увеличить ширину Т-клеточных ответов, индуцируемых вакциной.
Пример 2: Стратегия дизайна карбокси-концевого домена MUC16
[00272] Карбокси-концевой домен нативного человеческого MUC16 имеет длину 284 аминокислоты и состоит из внеклеточного эктодомена, трансмембранного домена и короткого цитоплазматического хвоста. В отличие от центрального домена тандемного повтора карбокси-концевой домен хорошо сохраняется среди многих видов. Однако цитоплазматический хвост MUC16 содержит несколько потенциальных сайтов фосфорилирования S/T/Y, что свидетельствует об участии MUC16 в пути (путях) передачи сигнала. (ФИГ. 4). На ФИГ. 4 квадратами указаны потенциальные сайты фосфорилирования S/T/Y. Сайты N- и О-гликозилирования обозначены, соответственно, X и O. O'Brien, T. J. et al., Tumour biology: Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine 22, 348-366 (2001). Для предотвращения нежелательного запуска передачи сигналов по ходу трансляции цитоплазматический хвост (аминокислоты 254-284 нативного карбокси-терминального домена) не был включен ни в один из иммуногенов MUC16.
Генерация эктодомена и трансмембранного домена консенсусного MUC16
[00273] Карбокси-концевой домен консенсусный MUC16 человека был сконструирован без цитоплазматического хвоста с использованием последовательностей эктодомена и трансмембранного домена 21 MUC16 из GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Номера доступа GenBank этих последовательностей следующие: AAL65133.2, XP _004059993.1, XP _014197952.1, XP_0039l4869.1, XP_007993338. l, XP_0l 1739103.1, XP_011932759.1, XP_011810358.1, XP_015296314.1, XP_010387164.1, XP_0089854l7.l, XP_0l 0347904.1, XP_012291241.1, XP_011287799.1, CR_003354138.3, XP_014410271.1, XP_0l 5096370.1, XP_011373099.1, XP_011226599.1, XP_008703704. l, и XP_012496675.1.
[00274] Консенсусная последовательность была получена с использованием программного пакета DNASTAR Lasergene (версия 13.0.0.357). Последовательности эктодомена и трансмембранного домена MUC16 были импортированы в MegAlign и выровнены с использованием программы выравнивания множественных последовательностей ClustalW. Полученная последовательность эктодомена и трансмембранного домена MUC16 была определена как имеющая 96,0% - 96,4% идентичности с нативным эктодоменом и трансмембранным доменом MUC16 человека.
Обоснование введения мутаций в карбокси-концевом домене для отмены биологической функции MUC16
PloS one
[00275] После генерации эктодомена и трансмембранного домена консенсусного MUC16 были введены три мутации аспарагина (N) в аланин (A) (N -> A) для отмены биологической функции полученного белка эктодомена и трансмембранного домена консенсусного MUC16. Эти три мутации были введены по причине того, что карбокси-концевой эктодомен MUC16 участвует в развитии онкогенеза, инвазии опухоли и метастазировании. Rao, T. D. et al.,  10 (2015). Rao et al. показали, что введение этих трех мутаций N->A в эктодомене MUC16 для отмены N-гликозилирования резко снижает фосфорилирование ERK1/2 и AKT и рост опухоли in vivo у бестимусных голых мышей, которым трансплантировали трансфицированные клетки фибробластов 3T3. Отмена биологической функции после введения 3 N->A мутаций в конструкцию синтетического консенсусного MUC16 не оценивалась ни in vitro, ни in vivo.
Краткое описание дизайна карбокси-концевого домена MUC16
[00276] Были созданы эктодомен и трансмембранный домен консенсусного MUC16 и были введены три мутации (N->A) для отмены N-гликозилирования (ФИГ. 5). Модифицированные эктодомен и трансмембранный домен консенсусного MUC16 имеют 95,3% идентичность с эктодоменом и трансмембранным доменом нативного MUC16 человека. Таблица 2 показывает процент гомологии последовательностей сгенерированных эктодомена и трансмембранного домена MUC16 с эктодоменом и трансмембранным доменом нативного MUC16 человека.
Таблица 2
Процент идентичности
Дивергенция
<b>1</b>
<b>2</b>
<b>1</b>
\
95,3
<b>1</b>
<b>2</b>
4,9
\
<b>2</b>
<b>1</b>
<b>2</b>
1=Эктодомен и трансмембранный домен консенсусного MUC16;
2=Эктодомен и трансмембранный домен человеческого нативного MUC16.
Пример 3: Стратегия сборки RMC, нативных повторов и эктодомена и трансмембранного домена (CTD) синтетического консенсусного MUC16 для снижения вероятности введения нецелевых эпитопов
[00277] Элементы, которые следовало включить в дизайн MUC16, включали четыре RMC, три нативных повтора и эктодомен и трансмембранный домен (CTD) синтетического консенсусного MUC16. Первоначальной стратегией дизайна была генерация иммуногена MUC16 (предварительный синтетический иммуноген MUC16) путем включения элементов, как показано на ФИГ. 6A-6B. Однако, поскольку в этом иммуногене слияния RMC1-RMC2, RMC2-RMC3, RMC3-RMC4, RMC4-R61 и R63- эктодомен и трансмембранный домен синтетического консенсусного MUC16 не встречаются в нативной последовательности MUC16, вероятно потенциальное введение нерелевантных, нецелевых эпитопов в том случае, если эти слияния не имеют высокой идентичности последовательностей по меньшей мере с одним слиянием повтора нативного MUC16. Чтобы определить идентичность последовательностей слияний синтетического иммуногена со всеми слияниями нативных повторов MUCl6, последние 11 аминокислот и 11 аминокислот начала всех соседних нативных повторов были сопоставлены с последними 11 аминокислотами и 11 аминокислотами начала всех соседних синтетических иммуногенных слияний (RMC1-RMC2, RMC2-RMC3, RMC3-RMC4, RMC4-R61 и R63-синтетический консенсусный CTD). Результаты анализа показали, что все слияния синтетического иммуногена имели более 95,2% идентичности последовательностей по меньшей мере с одним слиянием с нативным повтором, за исключением слияния синтетического иммуногена RMC4-R61, которое имело только до 76,2% идентичности последовательностей со всеми нативными слияниями повторов (ФИГ. 6A).
[00278] Для уменьшения вероятности введения нецелевых эпитопов в последовательность слияния RMC4-R61 между RMC4 и R61 (синтетический консенсусный IRC+иммуноген R59) был вставлен нативный повтор MUC16 59 (R59) (ФИГ. 6B). Анализ последовательности показал, что слияния RMC4-R59 и R59-R61 имели более высокую идентичность с нативными слияниями повторов (85,7% и 90,9%, соответственно) по сравнению со слиянием RMC4-R61. Более того, предсказание эпитопа МНС класса I с использованием Immune Epitope Database Resource Analysis Resource (//tools.iedb.org/mhci/) спрогнозировало отсутствие сильных связующих у гаплотипа HLA-A*02:0l на слияниях RMC4-R59 и R59-R61.
[00279] Были также использованы дополнительные стратегии, позволяющие избежать введения слияния RMC4-R61, включая следующие: использование двух плазмид (одну для экспрессии иммуногена RMC1-RMC4, а другую для экспрессии иммуногена R61, R62, R63 и CTD синтетического консенсусного MUC16), добавление сайта расщепления фурином между RMC4 и нативным R61 предварительного синтетического иммунгена, и использование вектора экспрессии с двумя промоторами, одним промотором (hCMV), управляющим экспрессией иммуногена RMC1-RMC4, и другим промотором (sCMV), управляющим экспрессией R61, R62 , R63 и CTD синтетического консенсусного иммуногена MUC16. В результате было получено пять различных синтетических консенсусных ДНК-плазмид MUC16, как показано в таблице 3. Схематические представления синтетических консенсусных иммуногенов MUC16 показаны на ФИГ. 7.
Таблица 3
<b>ID плазмиды</b>
<b>Остов</b>
<b>Наименование иммуногена(ов)</b>
<b>Определения</b>
pGX1435
pGX0001
IRC+R59 синтетического консенсусного MUC16
<b></b><b><u>IRC+R59</u></b><b></b>: <u>I</u>ntegrated <u>R</u>epeats and <u>S</u>ynthetic Consensus <u>C</u>arboxy Terminal Domain (интегрированные повторы и синтетический консенсусный карбокси-концевой домен+Native <u>R</u>epeat (нативный повтор) <u>59 </u>
pGX1436
pGX0001
RMC синтетического консенсусного MUC16
<b></b><b><u>RMC:</u></b><b></b><u>R</u>epeat <u>M</u>icro-<u>c</u>onsensus (повторный микроконсенсус)
pGX1437
pGX0001
NRC синтетического консенсусного MUC16
<b></b><b><u>NRC:</u></b><b></b>Native <u>R</u>epeats (нативные повторы) и <u>S</u>ynthetic Consensus <u>C</u>arboxy Terminal Domain (синтетический консенсусный карбокси-концевой домен )
pGX1438
pGX0001
IRC синтетического консенсусного MUC16
<b></b><b><u>IRC</u></b><b></b>: <u>I</u>ntegrated <u>R</u>epeats and <u>S</u>ynthetic Consensus <u>C</u>arboxy Terminal Domain(интегрированные повторы и синтетический консенсусный карбокси-концевой домен)
pGX1439
pGX0003 (двойной промотор)
RMC синтетического консенсусного MUC16+NRC синтетического консенсусного MUC16
См. выше
[00280] Чтобы иметь более высокий уровень экспрессии, к N-концу всех четырех синтетических консенсусных иммуногенов MUC16 были добавлены против хода транскрипции последовательности Козака и IgE. Yang, J. S. et al., The Journal of infectious diseases 184, 809-816 (2001). Кроме того, использование кодонов последовательностей ДНК, кодирующих эти иммуногены, было адаптировано к смещению кодонов генов Homo sapiens. Andre, S. et al., Journal of virology 72, 1497-1503 (1998); Deml, L. et al. Journal of virology 75, 10991-11001 (2001).
[00281] Кроме того, также была проведена оптимизация РНК: области с очень высоким (>80%) или очень низким (<30%) содержанием GC, а также были исключены мотивы цис-действующих последовательностей, такие как внутренние боксы TATA, chi-сайты и рибосомные сайты входа. Schneider, R., et al., Journal of virology 71, 4892-4903 (1997); Muthumani, K. et al., Virology 314, 134-146 (2003). Синтезированные синтетические консенсусные иммуногены MUC16 расщеплялись при помощи BamHI и XhoI (pGXl435-pGXl438) либо PmeI и XhoI либо SalI и MluI (pGXl439), и клонировались в экспрессионный вектор Inovio pGX0001 (pGXl435-38) или вектор экспрессии с двойным промотором Inovio pGX0003 (pGXl439). Для всех синтетических плазмид консенсусного MUC16 было выполнено секвенирование по всей длине, а затем для проверки правильности оно было проанализировано и подтверждено двумя аналитиками.
[00282] Репрезентативная сравнительная модель центральной области тандемного повтора синтетических консенсусных иммуногенов MUC16, основанная на синтетической консенсусной последовательности IRC MUC16, показана на ФИГ. 8A-8C. ФИГ. 8A представляет собой схематическую диаграмму нативного MUC16 (на основе GenBank AAL65133.2) и IRC синтетического консенсусного MUC16. Между двумя молекулами существуют четкие различия в размерах, и нативная последовательность содержит дополнительные домены, которых нет в синтетической консенсусной версии. И нативный MUC16, и IRC синтетического консенсусного MUC16 содержат ряд повторов белка сперматозоидов морского ежа, энтерокиназы и агрино(SEA)-подобных повторов, а также трансмембранный домен. В IRC синтетического консенсусного MUC16 последовательности повторов основаны на протоколе микроконсенсусной последовательности, описанном в разделе Стратегия дизайна центрального домена тандемного повтора. Как показано на ФИГ. 8B, сравнительное моделирование иллюстрирует различия в размерах между нативным MUC16 и дизайном IRC синтетического консенсусного MUC16. SEA-подобные модули повторов были смоделированы как для нативного MUC16, так и для IRC синтетического консенсусного MUC16. Из-за размера нативной последовательности моделирование выполнялось только при низком разрешении и обеспечивало передачу относительной информации о размере. ФИГ. 8C демонстрирует сравнительную модель области повтора IRC синтетического консенсусного MUC16, показанную в формате cpk. Большая N-концевая область MUC16, а также С-концевая область не содержат последовательностей с надежными родительскими шаблонами, и поэтому они не поддаются моделированию.
[00283] Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 1) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) для IRC+R59 синтетического консенсусного MUC16 указаны, соответственно, в таблице 21 и таблице 22. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 3) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) для RMC синтетического консенсусного MUC16 представлены, соответственно, в таблице 23 и таблице 24. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 5) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 6) для NRC синтетического консенсусного MUC16 представлены, соответственно, в таблице 25 и таблице 26. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 7) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 8) для IRC синтетического консенсусного MUC16 представлены, соответственно, в таблице 27 и таблице 28. Аннотация элементов SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 8 и соответствующих аминокислотных положений представлена в таблице 4.
Таблица 4
<b>SEQ ID NO: 2 Аннотация (IRC+R59 синтетического консенсусного MUC16)</b>
Описание
Положение аминокислот
Лидерная последовательность IgE
1-18
Повторный микро-консенсус 1
19-174
Повторный микро-консенсус 2
175-330
Повторный микро-консенсус 3
331-486
Повторный микро-консенсус 4
487-642
Нативный повтор 59
643-798
Нативный повтор 61
799-954
Нативный повтор 62
955-1110
Нативный повтор 63
1111-1237
Мутации карбокси-концевого домена синтетического консенсусного MUC16 для отмены N-гликозилирования
1238-1490N1408АN1431АN1437А
<b>SEQ ID NO: 4 Аннотация (RMC синтетического консенсусного MUC16)</b>
Описание
Положение аминокислот
Лидерная последовательность IgE
1-18
Повторный микро-консенсус 1
19-174
Повторный микро-консенсус 2
175-330
Повторный микро-консенсус 3
331-486
Повторный микро-консенсус 4
487-642
<b>SEQ ID NO: 6 Аннотация (NRC синтетического консенсусного MUC16)</b>
Лидерная последовательность IgE
1-18
Нативный повтор 61
19-174
Нативный повтор 62
175-330
Нативный повтор 63
331-457
Мутации карбокси-концевого домена синтетического консенсусного MUC16 для отмены N-гликозилирования
458-710N628АN651АN657А
<b>SEQ ID NO: 8 Аннотация (IRC синтетического консенсусного MUC16)</b>
Лидерная последовательность IgE
1-18
Повторный микро-консенсус 1
19-174
Повторный микро-консенсус 2
175-330
Повторный микро-консенсус 3
331-486
Повторный микро-консенсус 4
487-642
Сайт расщепления фурином
643-649
Нативный повтор 61
650-805
Нативный повтор 62
806-961
Нативный повтор 63
962-1088
Мутации карбокси-концевого домена синтетического консенсусного MUC16 для отмены N-гликозилирования
1098-1341N1259АN1282АN1288А
[00284] Различия между синтетическими консенсусными иммуногенами MUC16 и нативными последовательностями суммированы в таблице 5. Поскольку размер центрального домена тандемного повтора домена среди видов варьирует (человек: 63 повтора, макака-резус: 4 повтора; мышь: 15 повторов), а также размеры отдельных повторов у разных видов сильно различаются, поэтому сложно выровнять точно полноразмерные синтетические иммуногенные последовательности MUC16 с видоспецифическими нативными последовательностями. Следовательно, для центрального домена тандемного повтора сравнивали только области доменов синтетического конструкта белка сперматозоидов морского ежа, энтерокиназы и агрина (SEA) с последовательностями нативного домена SEA человека, мыши и макаки-резуса, поскольку этот регион является наиболее консервативным регионом последовательности повтора.
Таблица 5
Характеристики
IRC+R59 синтететич. консенсусн. MUC16
RMCсинтетич. консенсусн.MUC16
NRCсинтетич. консенсусн. MUC16
IRCсинтетич. консенсусн. MUC16
Синтетич. консенсусн.MUC16 -домены SEARMC1-4
Синтетич. консенсусн.MUC16 -домены SEAR61-R63
Синтетич. консенсусн.MUC16 -карбокси-концевой домен
Идентичность нативному человеческому MUC16
/
/
/
/
51,5% - 100%
100%
95,3%
Идентичность нативному MUC16 макаки-резус
/
/
/
/
от 20,0% до 89,7%
от 17,4% до 93,9%
95,7%
Идентичность нативному мышиному MUC16
/
/
/
/
от 21.6% до 71,1%
от 15,1% до 71,3%
75,1%
Количество аминокислотных мутаций (по сравнению с нативным человеческим
/
/
/
/
0
12
Количество вставленных мутаций (не происходящих от консенсуса)
3
0
3
3
0
0
3
Молекулярный вес
1492 аминокислоты(164 кДа)
644 аминокислот(71 кДа)
712 аминокислот(78 кДа)
1343 аминокислоты(148 кДа)
/
/
/
Длина кодирующей последовательности (п.о.)
4476
1932
2136
4029
/
/
/
Пример 4: Конструкция и структура плазмиды
pGX0001
[00285] Остов вектора pGX0001 представляет собой модифицированный экспрессионный вектор pVAXl с 2998 п.о. под контролем немедленного раннего промотра цитомегаловируса человека (промотор hCMV). Оригинальный pVAXl был получен от Thermo Fisher Scientific. Остов pGX0001 включает ген резистентности к канамицину (KanR) и плазмидный источник репликации (pUC ori) для целей продукции. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках. Карта и описание модифицированного экспрессионного вектора pVAXl (pGX0001) показаны, соответственно, на ФИГ. 9 и в таблице 6.
Таблица 6
<b>Элементы:</b>
<b>Пары оснований:</b>
Промотор CMV:
137-724
Сайт промотора Т7/примирования
664-683
Сайт множественного клонирования
696-811
Сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (GH)
829-1053
Ген резистентности к канамицину
1226-2020
Источник репликации pUC origin
3219-2992
[00286] В pVAXl были введены модификации для создания pGX0001. Эти модификации перечислены в таблице 7, и не было обнаружено никаких проблем, касающихся амплификации плазмиды и транскрипции и трансляции антигена. Не наблюдалось никаких дальнейших изменений в последовательности pGX0001 ни в одном из плазмидных продуктов на платформе, использующей pGX0001 в качестве остова. Пары оснований 2, 3 и 4 изменяются с ACT на CTG в остове перед промотором CMV.
Таблица 7
<b>Модификация</b>
<b>Пара оснований</b>
<b>Описание</b>
C>G
241
в промоторе CMV
C>T
1158
остов, ниже сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста (bGН polyA)
A>-
2092
остов, ниже гена резистентности к канамицину
C>T
2493
в источнике репликации (pUC ori)
G>C
2969
в самом конце pUC Оri выше участка RNASeH
pGX0003
[00287] Остов вектора pGX0003 представляет собой экспрессионную плазмиду эукариот с 4596 п.о. с двумя сайтами множественного клонирования для вставок под контролем двух промоторов: промотора hCMV с поли А-сигналом SV40 и промотора sCMV с поли А-сигналом bGH. Этот остов также включает KanR и pUC ori. Карта и описание pGX0003 показаны, соответственно, на ФИГ. 10 и в таблице 8.
Таблица 8
<b>Элементы:</b>
<b>Пары оснований:</b>
Промотор hCMV:
3548-4373
Сигнал полиаденилирования вируса обезьян 40
4391-4596
Промотор Scmv
2558-3060
Сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста (GH)
2290-2528
Ген резистентности к канамицину
298-1059
Источник репликации pUC origin
1227-1900
pGX1435
[00288] pGXl435 получали путем клонирования ДНК последовательности синтетического консенсусного MUC16 (IRC+R59 синтетического консенсусного MUC16) в pGX0001 на сайтах BamHI и XhoI. Связанная с этим продукция мРНК управляется промотором CMV человека (промотор hCMV) и прекращается сигналом полиаденилирования 3'-конца бычьего гормона роста (bGH poly A). Остов pGX0001 включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и плазмидный источник репликации (pUC ori) для производственных целей. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках. Схематическая диаграмма pGXl435 и IRC+R59 синтетического консенсусного MUC16 представлена на ФИГ. 11, а элементы плазмиды и соответствующие пары оснований представлены в таблице 9.
Таблица 9
<b>Элементы:</b>
<b>Пары оснований:</b>
Промотор hCMV:
137-724
Кодирующая последовательность IRC+R59 синтетического консенсусного MUC16:
742-5217
bGH Poly A:
5261-5485
Резистентность к канамицину (KanR):
5658-6452
pUC Ori:
6751-7424
pGX1436
[00289] pGXl436 получали путем клонирования последовательности ДНК синтетического микроконсенсусного MUC16 (RMC синтетического консенсусного MUC16) в pGX0001 на сайтах BamHI и XhoI. Связанная с этим продукция мРНК управляется промотором CMV человека (промотор hCMV) и прекращается сигналом полиаденилирования 3'-конца бычьего гормона роста (bGH poly A). Остов pGX0001 включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и плазмидный источник репликации (pUC ori) для производственных целей. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках. Схематическая диаграмма pGXl436 и RMC синтетического консенсусного MUC16 представлена на ФИГ. 12, а элементы плазмиды и соответствующие пары оснований представлены в таблице 10.
Таблица 10
<b>Элементы:</b>
<b>Пары оснований:</b>
Промотор hCMV:
137-724
Кодирующая последовательность RMC синтетического консенсусного MUC16:
742-2673
bGH Poly A:
2717-2941
Резистентность к канамицину (KanR):
3114-3908
pUC Ori:
4207-4880
pGX1437
[00290] pGXl437 получали путем клонирования последовательности ДНК синтетического консенсусного MUC16 (NRC синтетического консенсусного MUC16) в pGX0001 на сайтах BamHI и XhoI. Связанная с этим продукция мРНК управляется промотором CMV человека (промотор hCMV) и прекращается сигналом полиаденилирования 3'-конца бычьего гормона роста (bGH poly A). Остов pGX0001 включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и плазмидный источник репликации (pUC ori) для производственных целей. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках. Схематическая диаграмма pGXl437 и NRC синтетического консенсусного MUC16 представлена на ФИГ. 13, а элементы плазмиды и соответствующие пары оснований представлены в таблице 11.
Таблица 11
<b>Элементы:</b>
<b>Пары оснований:</b>
Промотор hCMV:
137-724
Кодирующая последовательность NRC синтетического консенсусного MUC16:
742-2877
bGH Poly A:
2921-3145
Резистентность к канамицину (KanR):
3318-4112
pUC Ori:
4411-5084
pGX1438
[00291] pGXl438 получали путем клонирования последовательности ДНК синтетического консенсусного MUC16 (IRC синтетического консенсусного MUC16) в pGX0001 на сайтах BamHI и XhoI. Связанная с этим продукция мРНК управляется промотором CMV человека (промотор hCMV) и прекращается сигналом полиаденилирования 3'-конца бычьего гормона роста (bGH poly A). Остов pGX0001 включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и плазмидный источник репликации (pUC ori) для производственных целей. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках. Схематическая диаграмма pGXl438 и IRC синтетического консенсусного MUC16 представлена на ФИГ. 14, а элементы плазмиды и соответствующие пары оснований представлены в таблице 12.
Таблица 12
<b>Элементы:</b>
<b>Пары оснований:</b>
Промотор hCMV:
137-724
Кодирующая последовательность IRC синтетического консенсусного MUC16:
742-4770
bGH Poly A:
4814-5038
Резистентность к канамицину (KanR):
5211-6005
pUC Ori:
6304-6977
pGX1439
[00292] pGXl439 получали путем клонирования последовательности ДНК RMC синтетического консенсусного MUC16 в pGX0003 на сайтах SalI и MluI и последовательности ДНК NRC синтетического консенсусного MUC16 на сайтах PmeI и XhoI.
[00293] pGXl439 представляет собой ДНК-плазмиду с двумя промоторами, в которой RMC синтетического консенсусного MUC16, продуцирующего мРНК, управляется промотором CMV человека (промотор hCMV) и прекращается сигналом полиаденилирования обезьяньего вируса 40 (SV40 poly А), и в которой NRC синтетического консенсусного MUC16, продуцирующего мРНК, управляется промотором CMV обезьяны (sCMV Promoter) и прекращается сигналом полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH poly A). Остов pGX0003 включает ген устойчивости к канамицину (KanR) и плазмидный источник репликации (pUC ori) для производственных целей. Эти элементы не функционируют в эукариотических клетках.
[00294] Схематическая диаграмма pGXl439 и RMC синтетического консенсусного MUC16 и NRC синтетического консенсусного MUC16 представлена на ФИГ. 15, а элементы плазмиды и соответствующие пары оснований представлены в таблице 13.
Таблица 13
<b>Элементы:</b>
<b>Пары оснований:</b>
Промотор hCMV:
5682-6506
Кодирующая последовательность RMC синтетического консенсусного MUC16:
6524-8455
SV40 Poly A:
8457-8662
Резистентность к канамицину (KanR):
298-1059
pUC Ori:
1227-1900
Промотор sCMV
4703-5193
Кодирующая последовательность NRC синтетического консенсусного MUC16:
2557-4692
bGH Poly A
2290-2528
Пример 5: Экспрессия антигена
in vitro
2
[00295] Экспрессия белка антигена pGXl435, pGXl436, pGXl437, pGXl438 и pGXl439 была подтверждена вестерн-блоттингом. Клетки человеческой рабдомиосаркомы (RD) (ATCC, CCL-136), которые поддерживали в среде DMEM с 10% FBS (ThermoFisher), трансфицировали pGXl435, pGXl436, pGXl437, pGXl438, pGXl439 или pGX0001 (6 мкг/10 см/чашку) с использованием Turbofectin 8 (Origene). Через сорок восемь часов после трансфекции клетки лизировали с использованием буфера для лизиса клеток RIPA (ThermoFisher) и собирали лизат клеток. После анализа BCA (ThermoFisher) для определения концентрации общего белка 15 мкг клеточного лизата подвергали электрофорезу в 4-12% геле SDS-PAGE (ThermoFisher) и проводили детекцию с использованием моноклонального антитела против MUC16 (Abeam, клон EPSISR23-96, abl68360), затем визуализировали с помощью анти-кроличьего IgG, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (Santa Cruz Biotech #sc-2004), с использованием системы вестерн-блот анализа ECL (GE Amersham). В качестве контроля нагрузки блоты повторно исследовали на экспрессию актина с использованием моноклонального антитела анти-β-актина (Santa Cruz Biotech, клон, C4).
[00296] Была обнаружена белковая полоса ожидаемой молекулярной массы для конструкций синтетического консенсусного MUC16 (~162,5 кДа), а также белковые полосы для Участка 1 (~68,2 кДа) и Участка 2 (~77,2 кДа) (ФИГ. 16). В дорожке pGX0001 не были обнаружены белковые полосы, что указывает на то, что белковые полосы специфичны для синтетического консенсусного Mucl6. Анти-β-актиновые полосы были обнаружены с одинаковой интенсивностью, что указывает на то, что в каждой дорожке были загружены равные количества белка. Было обнаружено, что pGXl435 и pGXl438 экспрессируют соответствующие антигенные белки, а pGXl436, pGXl437 и pGXl439 экспрессируют свои соответствующие антигенные белковые участки.
Пример 6: Иммуногенность синтетических консенсусных вакцинных конструкций мезотелина
Животные и иммунизации
[00297] Самки 8-недельных мышей CB6F1 были приобретены в Jackson Laboratories. Все животные содержались в помещении с регулируемой температурой и световой цикличностью в BTS Research (San Diego, CA). Уход за животными осуществлялся в соответствии с руководящими принципами Национального института здравоохранения и предложением по уходу и использованию животных (ACUP) (BTS ACUP # 15-091). Мыши были разделены на шестнадцать групп, как показано в таблице 14.
Таблица 14
Группа
n
Конструкция
Доза конструкции (мкг)
Объем введения (мкл)
1
8
pGX0001
30
30
2
8
pGX1435
10
30
3
8
pGX1435
30
30
4
8
pGX1435
50
30
5
8
pGX1436
10
30
6
8
pGX1436
30
30
7
8
pGX1436
50
30
8
8
pGX1437
10
30
9
8
pGX1437
30
30
10
8
pGX1437
50
30
11
8
pGX1438
10
30
12
8
pGX1438
30
30
13
8
pGX1438
50
30
14
8
pGX1439
10
30
15
8
pGX1439
30
30
16
8
pGX1439
50
30
[00298] Мышей в группах иммунизации вакцинировали указанными дозами pGX0001 или pGXl435, pGXl436, pGXl437, pGXl438, pGXl439 в соответствии с SOP R20-003147 CELLECTRA 3P Mouse Treatment. Вкратце, плазмиды готовили в стерильной воде для инъекций (VetOne) так, чтобы указанная доза доставлялась путем внутримышечной инъекции в переднюю мышцу большеберцовой кости в объеме инъекции 30 мкл. За каждой внутримышечной инъекцией немедленно следовала электропорация (ЭП) с использованием адаптивного устройства электропорации постоянного тока CELLECTRA 2000 с матрицей 3P (Inovio Pharmaceuticals). Устройство было настроено на подачу двух импульсов по 0,1 А с шириной импульса 52 мс, разнесенных на 1 секунду. Из-за большого количества мышей и групп половина мышей в каждой группе получила 3 иммунизации с интервалом 3 недели. Этих мышей умерщвляли через неделю после последней иммунизации, а селезенки собирали для получения показателей клеточного иммунитета. Другая половина мышей в каждой группе получила 3 иммунизации с интервалом 3 недели. Мышей умерщвляли через неделю после последней иммунизации, а селезенки собирали для получения показателей клеточного иммунитета. Никакая другая ткань собрана не была.
Выделение лимфоцитов селезенки
[00299] Спленоциты выделяли асептически и помещали в 5 мл среды R10 (среда 1640 Rosewell Park Memorial Institute, дополненная 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% антибиотиком, антимикотическим средством). Спленоциты выделяли путем механического разрушения селезенки с использованием аппарата Stomacher (Seward Laboratory Systems Inc.), полученный продукт фильтровали с использованием сита для клеток на 40 мкм (BD Falcon). Полученный преперет центрифугировали, и осадок обрабатывали в течение 5 минут лизирующим буфером ACK (Lonza) для лизиса эритроцитов. Спленоциты затем центрифугировали, промывали в PBS, а затем ресуспендировали в среде R10 и сразу же использовали для дальнейшего анализа.
Определение IFN
методом иммуноферментных пятен (ELISpot)
γ
5
6
2
[00300] Анализ мышиного IFNγ в ELISpot для оценки антигенспецифических клеточных ответов проводили с использованием набора от MabTech (MabTech, # 3321-4APW-10). Планшеты на девяносто шесть лунок, предварительно покрытые антителами против мышиного IFNγ (mAb AN18), промывали в PBS и блокировали в течение 2 часов при комнатной температуре с помощью среды R10, и затем добавляли (в трех повторах) при количестве клеток на входе 2 × 10 клеток на лунку. Был синтезирован набор пептидов (GenScript), каждый из которых содержал 15 аминокислотных остатков с перекрыванием 11 аминокислот, представляющий полную белковую последовательность синтетического консенсусного MUC16 для каждой конструкции. Эти наборы пептидов ресуспендировали в DMSO (Sigma) и объединяли при концентрации пептида ~ 2 мкг/мл в шесть пептидных пулов. Эти пептидные пулы содержали пептиды, соответствующие белковому антигену синтетического консенсусного MUC16, как указано в схеме на ФИГ. 17. Конкавалин А (Sigma) в концентрации 5 мкг/мл использовали в качестве положительного контроля, а полную культуральную среду использовали в качестве отрицательного контроля. Планшеты инкубировали в течение 18 часов при 37°С в инкубаторе в атмосфере с 5% СО. Затем добавляли биотинилированное антитело против IFNγ мыши (MabTech, mAb R4-6A2), и планшеты инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Планшеты промывали и добавляли антитело к стрептавидину-ALP (MabTech), и планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Обнаружение пятна проводили с использованием субстрата BCIP/NBT в соответствии с инструкциями производителя набора (MabTech). Пятна на планшетах подсчитывали с использованием автоматического ридера ELISPOT (Cellular Technology). Для отображения данных среднее количество единиц, формирующих пятно (SFU), было приведено к 1×10 спленоцитов.
6
[00301] Антигенспецифические ответы в ELISpot по IFNγ, представленные как число единиц, формирующих пятно IFNγ (SFU) на 1×10 спленоцитов, превышают число SFU в контроле при инкубации с одной только средой.
[00302] Иммуногенность конструкции синтетического консенсусного MUC16 оценивали при трех дозах (10 мкг, 30 мкг и 50 мкг) с помощью определения IFNγ в ELISpot и проточной цитометрии (n=8/группу). Мышей иммунизировали пустым плазмидным остовом (pGX0001) в качестве отрицательного контроля (n=4/группа). Вакцинация полноразмерными конструкциями синтетического консенсусного MUC16 (pGXl435, pGXl438 и pGXl439) вызывала исключительно устойчивые клеточные иммунные ответы по сравнению с мышами, вакцинированными отрицательным контролем.
[00303] Интенсивность продукции IFNγ, специфической по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, индуцированная pGXl435, по данным анализа в ELISpot, была дозозависимой (ФИГ. 18A). Конкретно, количество SFU IFNγ в ответ на pGXl435 синтетического консенсусного MUC16 составило 1564 ± 661, 3858 ± 2767 и 5407 ± 1959 при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Ответы IFNγ синтетического консенсусного MUC16, индуцированные pGXl435, были значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами при дозах pGXl435 10 мкг (p=0,002), 30 мкг (p=0,028) и 50 мкг (p=0,001). Обнаруживаемые ответы на уникальный эпитоп R59 (пептидный пул 6), индуцированный pGXl435, также указаны на ФИГ. 18D.
[00304] Интенсивность продукции IFNγ, специфической по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, индуцированная конструкцией pGXl438, по данным анализа в ELISpot, была дозонезависимой, при этом болеe низкие дозы вызывали более устойчивый ответ (ФИГ. 18B). Конкретно, количество SFU IFNγ в ответ на pGXl438 синтетического консенсусного MUC16 составило 5628 ± 3144, 7668 ± 3371 и 6005 ± 3472 при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Ответы IFNγ синтетического консенсусного MUC16, индуцированные pGXl438, были значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами при дозах pGXl435 10 мкг (p=0,008), 30 мкг (p=0,002) и 50 мкг (p=0,009).
[00305] Интенсивность продукции IFNγ, специфической по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, индуцированная конструкцией pGXl439, по данным анализа в ELISpot, также была дозонезависимой, при этом болеe низкие дозы вызывали более устойчивый ответ (ФИГ. 18C). Конкретно, количество SFU IFNγ в ответ на pGXl439 синтетического консенсусного MUC16 составило 3180 ± 1377, 6138 ± 2696 и 4862 ± 2069 при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Ответы IFNγ синтетического консенсусного MUC16, индуцированные pGXl439, были значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами при дозах pGXl435 10 мкг (p=0,002), 30 мкг (p=0,002) и 50 мкг (p=0,002).
[00306] Ответы IFNγ для полноразмерных конструкций суммированы в таблице 15.
Таблица 15
Ответы IFNγ в ELISpot на слияние синтетического консенсусного MUC16 (pGX1435)
Код препарата
Группа
Количество дозы
Среднее кол-во SFU ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
7 ± 8
н/д
pGX1435
Иммунизированные
10 мкг
1564 ± 661
0,002
30 мкг
3858 ± 2767
0,028
50 мкг
5407 ± 1959
0,001
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Ответы IFNγ в ELISpot на расщепление фурином синтетического консенсусного MUC16 (pGX1438)
Код препарата
Группа
Количество дозы
Среднее кол-во SFU ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
7 ± 8
н/д
pGX1438
Иммунизированные
10 мкг
5628 ± 3144
0,008
30 мкг
7668 ± 3371
0,002
50 мкг
6005 ± 3472
0,009
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Ответы IFNγ в ELISpot на двойной промотор синтетического консенсусного MUC16 (pGX1439)
Код препарата
Группа
Количество дозы
Среднее кол-во SFU ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
7 ± 8
н/д
pGX1439
Иммунизированные
10 мкг
3180 ± 1377
0,002
30 мкг
6138 ± 2696
0,002
50 мкг
4862 ± 2069
0,002
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
[00307] Вакцинация конструкциями частичной длины синтетического консенсусного MUC16 (pGXl436 и pGXl437) также вызывала исключительно устойчивые клеточные иммунные ответы по сравнению с вакцинированными мышами отрицательного контроля.
[00308] Интенсивность продукции IFNγ, специфической по отношению к синтетическому консенсусному MUC16 в отношении Участка 1, индуцированной конструкцией pGXl436, по данным анализа ELISpot, была дозозависимой (ФИГ. 19A). Конкретно, количество SFU IFNγ в ответ на pGXl436 синтетического консенсусного MUC16 составило 3609 ± 1377, 4711 ± 2365 и 5565 ± 3496 при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Ответы IFNγ синтетического консенсусного MUC16, индуцированные pGXl436, были значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами при дозах pGXl436 10 мкг (p=0,001), 30 мкг (p=0,004) и 50 мкг (p=0,014). При сравнении ответов IFNγ на Участок 1, индуцированных всеми конструкциями MUC16, ответы, индуцированные pGXl435, были значимо более низкими по сравнению с pGXl438 (ФИГ. 19B).
[00309] Интенсивность продукции IFNγ, специфической по отношению к синтетическому консенсусному MUC16 в отношении Участка 2, индуцированной конструкцией pGXl437, по данным анализа ELISpot, также была дозозависимой (ФИГ. 19C). Конкретно, количество SFU IFNγ в ответ на pGXl437 синтетического консенсусного MUC16 составило 835 ± 428, 1893 ± 1291 и 2399 ± 1245 при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Ответы IFNγ синтетического консенсусного MUC16, индуцированные pGXl437, были значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами при дозах pGXl437 10 мкг (p=0,005), 30 мкг (p=0,022) и 50 мкг (p=0,005). Наблюдалась тенденция к более устойчивой продукции IFNγ в отношении Участка 2 с pGXl438 (ФИГ. 19D).
[00310] Ответы IFNγ на конструкции частичной длины суммированы в таблице 16.
Таблица 16
Ответы IFNγ в ELISpot на «Участок 1» синтетического консенсусного MUC16 (pGX1436)
Код препарата
Группа
Количество дозы
Среднее кол-во SFU ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
3 ± 5
н/д
pGX1436
Иммунизированные
10 мкг
3609 ± 1377
0,001
30 мкг
4711 ± 2365
0,004
50 мкг
5565 ± 3496
0,014
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Ответы IFNγ в ELISpot на «Участок 2» синтетического консенсусного MUC16 (pGX1437)
Код препарата
Группа
Количество дозы
Среднее кол-во SFU ± ст.откл.
Значение р
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
3 ± 5
н/д
pGX1437
Иммунизированные
10 мкг
835 ± 428
0,005
30 мкг
1893 ± 1291
0,022
50 мкг
2399 ± 1245
0,005
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Проточная цитометрия
6
[00311] Клеточные иммунные ответы, индуцированные синтетическим консенсусным MUC16, были дополнительно охарактеризованы методом проточной цитометрии. Спленоциты в количестве 2×10 от вакцинированных и не получавших вакцину мышей непосредственно после выделения стимулировали синтетическим консенсусным пептидом MUC16 в течение 6 часов в присутствии брефелдина A (BD Biosciences), монензина (BD Biosciences) и меченного FITC мышиного антитела против CD107a (BD Biosciences). После стимуляции пептидами спленоциты центрифугировали и ресуспендировали в 20 мкл на лунку в блокирующем растворе против Fc мыши BD Fc Block (BD Biosciences) мыши. Раствор Fc Block использовали при начальном разведении 1:40 в PBS и инкубации при 4°С в течение 5 минут.
[00312] После инкубации оставшиеся внеклеточные антитела (в PBS) добавляли в количестве 30 мкл на лунку и инкубировали при 4°С в течение 30 минут. После добавления внеклеточного красителя конечный объем в каждой лунке составляет 50 мкл, включая раствор Fc Block в конечном разведении 1: 100 и внеклеточные антитела в соответствующих рабочих разведениях. Затем клетки окрашивали красителем для оценки жизнеспособности (Vivid , Thermo-Fisher) и следующими внеклеточными антителами: PerCP-Cy5.5 против CD4 мыши (BD Biosciences, клон RM4-5) и APC против CD8a мыши (BD Biosciences, клон 63-6,7). Внутриклеточные цитокины затем окрашивали при помощи следующих антител: антитела BV605 против мышиного IFNγ, антитела APC-R700 против мышиного IL-2, и антитела PE против мышиного TNF-α (BD Biosciences). Клетки фиксировали и пермеабилизировали (BD Biosciences, # 554714) в течение 20 минут при 4°C. Внутриклеточное окрашивание затем останавливали следующими антителами: APC-Cy7 против мышиного CD3e (BD Biosciences, клон 145-2C11), BV605 против мышиного IFNγ (BD Biosciences, клон XMG1.2), APC-R700 против мышиного IL-2 (BD Biosciences, клон JEs6-5H4) и PE против мышиного TNF-α (BD Biosciences, клон MP6-XT22).
[00313] Данные внутриклеточного окрашивания получали на 10-цветном FACS CANTO (BD Biosciences), и анализ завершали с использованием программного обеспечения FlowJo. Стратегия гейтирования проточной цитометрии показана ниже на ФИГ. 20. Для того чтобы клетку можно было назвать антигенспецифичной с помощью проточной цитометрии, частота сообщаемого параметра должна превышать частоту контроля для одной только среды. Для того чтобы клетка была идентифицирована как продуцирующая антигенспецифичная CD107a, клетка также должна быть идентифицирована как позитивная по антигенспецифической продукции IFNγ, и/или IL-2, и/или TNFα по данным идентификации с булевским гейтированием.
+
+
[00314] Полноразмерные конструкции синтетического консенсусного MUC16 вызывали сильные ответы в компартменте Т-клеток CD4, при этом наиболее устойчивый ответ был вызван pGXl438 (ФИГ. 21A-21C). Синтетический консенсусный MUC16 индуцировал частоты антигенспецифических ответов Т-клеток CD4, которые были значимо более эффективными по сравнению с неиммунизированными мышами (0,29% ± 0,23%) в группах уровней доз 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг для pGXl435, pGXl438 и pGXl439 (ФИГ. 21A-21C).
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
[00315] Интенсивность Т-клеток CD4, специфическая по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, вызванная конструкцией pGXl435, была дозозависимой (ФИГ. 21A). Конкретно, Т-клетки CD4при введении конструкции pGXl435 синтетического консенсусного MUC16 составили 1,34% ± 0,45%, 2,27% ± 1,38% и 3,12% ± 1, 45% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Количество Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl435 синтетического консенсусного MUC16 было значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами при количествах дозы pGXl435 10 мкг (p<0,001), 30 мкг (p=0,020) и 50 мкг (p=0.004). Специфические ответы Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl435 синтетического консенсусного MUC16 состояли, в основном, из Т-клеток CD4, продуцирующих IFNγIL-2TNFα, IFNγIL-2TNFα или IFNγIL-2TNFα.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
[00316] Интенсивность Т-клеток CD4, специфическая по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, вызванная конструкцией pGXl438, также была дозозависимой (ФИГ. 21В). Конкретно, Т-клетки CD4при введении конструкции pGXl438 синтетического консенсусного MUC16 составили 3,12% ± 1,19%, 3,73% ± 1,48% и 4,06% ± 1,87% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Количество Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl438 синтетического консенсусного MUC16 было значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами при количествах дозы pGXl438 10 мкг (p=0,001), 30 мкг (p=0,001) и 50 мкг (p=0,003). Специфические ответы Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl438 синтетического консенсусного MUC16 состояли, в основном, из Т-клеток CD4, продуцирующих IFNγIL-2TNFα, IFNγIL-2-TNFα или IFNγIL-2TNFα.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
[00317] Интенсивность Т-клеток CD4, специфическая по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, вызванная конструкцией pGXl439, была дозозависимой (ФИГ. 21С). Конкретно, Т-клетки CD4при введении конструкции pGXl439 синтетического консенсусного MUC16 составили 1,99% ± 0,99%, 2,71% ± 0,51% и 3,25% ± 1,29% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Количество Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl439 синтетического консенсусного MUC16 было значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами при количествах дозы pGXl439 10 мкг (p=0,007), 30 мкг (p< 0,001) и 50 мкг (p=0,001). Специфические ответы Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl439 синтетического консенсусного MUC16 состояли, в основном, из Т-клеток CD4, продуцирующих IFNγIL-2TNFα, IFNγIL-2-TNFα или IFNγIL-2TNFα. Частота антигенспецифических Т-клеток CD4 далее указана в деталях в таблице 17.
+
+
[00318] Все количества дозы полноразмерных конструкций синтетического консенсусного MUC16 индуцировали более высокую интенсивность Т-клеток CD4CD107a по сравнению с неиммунизированными мышами (0,08% ± 0,04%), однако только конструкция pGXl438 была значимо более устойчивой при всех дозах.
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
[00319] Конкретно, частота антигенспецифических Т-клеток CD4CD107a при введении конструкции pGXl435 составила 0,27% ± 0,14%, 0,32% ± 0,37% и 0,64% ± 0, 34% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг (р=0,011), 30 мкг (р=0,297) и 50 мкг (р=0,008) (ФИГ. 21A). Профиль цитокинов Т-клеток CD4CD107aпри введении конструкции pGXl435 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 22A).
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
[00320] Частота антигенспецифических Т-клеток CD4CD107a при введении конструкции pGXl438 составила 0,40% ± 0,18%, 0,54% ± 0,36% и 0,53% ± 0,25% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг (р=0,004), 30 мкг (р=0,029) и 50 мкг (р=0,004) (ФИГ. 21В). Профиль цитокинов Т-клеток CD4CD107aпри введении конструкции pGXl438 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 22В)
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
[00321] Частота антигенспецифических Т-клеток CD4CD107a при введении конструкции pGXl439 составила 0,26% ± 0,18%, 0,36% ± 0,18% и 0,50% ± 0,25% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг (р=0,069), 30 мкг (р=0,008) и 50 мкг (р=0,006) (ФИГ. 22С). Профиль цитокинов Т-клеток CD4CD107aпри введении конструкции pGXl439 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 22С). Частота антигенспецифических Т-клеток CD4с цитолитическим потенциалом далее показана в деталях в таблице 17.
Таблица 17
Ответы Т-клеток CD4<sup>+</sup> и CD4<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на слияние синтетического консенсусного MUC16 (pGX1435)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD4<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup>
% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,29 ± 0,23
н/д
0,08±0,04
н/д
pGX1435
Иммунизированные
10 мкг
1,34 ± 0,45
<0,001
0,27±0,14
0,011
30 мкг
2,27 ± 1,38
0,020
0,32±0,37
0,297
50 мкг
3,12 ± 1,45
0,004
0,64±0,34
0,008
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Ответы Т-клеток CD4<sup>+</sup> и CD4<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на расщепление фурином синтетического консенсусного MUC16 (pGX1438)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD4<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup>
% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,29 ± 0,23
н/д
0,08±0,04
н/д
pGX1438
Иммунизированные
10 мкг
3,12 ± 1,19
0,001
0,40±0,18
0,004
30 мкг
3,73 ± 1,48
0,001
0,54±0,36
0,029
50 мкг
4,06 ± 1,87
0,003
0,53±0,25
0,004
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Ответы Т-клеток CD4<sup>+</sup> и CD4<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на двойной промотор синтетического консенсусного MUC16 (pGX1439)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD4<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup>
% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,29 ± 0,23
н/д
0,08±0,04
н/д
pGX1439
Иммунизированные
10 мкг
1,99 ± 0,99
0,007
0,26±0,18
0,069
30 мкг
2,71 ± 0,51
<0,001
0,36±0,18
0,008
50 мкг
3,25 ± 1,29
0,001
0,50±0,25
0,006
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
[00322] Частота антигенспецифических ответов Т-клеток CD8, индуцированных полноразмерными конструкциями синтетического консенсусного MUC16 была повышена по сравнению с контролем (0,13% ± 0,15%) во всех дозовых группах для всех конструкций (ФИГ. 23A-23C). Конкретно, частота антигенспецифических ответов Т-клеток CD8 во всех группах, иммунизированных 10 мкг (0,65% ± 0,28%, p=0,007), 30 мкг (0,82% ± 0,46%, p=0,022) и 50 мкг (1,60 ± 1,08%, p=0,034) pGXl435 была значительно более устойчивой по сравнению с неиммунизированными мышами. Ответы Т-клеток CD8 на введение pGXl435 синтетического консенсусного MUC16 были дозозависимыми и состояли, в основном, из T-клеток CD8, продуцирующих IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 23A).
+
+
+
+
-
-
+
-
+
[00323] Частота антигенспецифических ответов Т-клеток CD8 в группах, иммунизированных 10 мкг (1,30% ± 0,79%, p=0,024), 30 мкг (1,33% ± 0,87%, p=0,034) и 50 мкг (1,36% ± 0,71%, р=0,010) pGXl438 также была значимо более устойчивой по сравнению с неиммунизированными мышами. Ответы Т-клеток CD8 на введение pGXl438 синтетического консенсусного MUC16 были дозонезависимыми, с очень небольшой разницей между дозами, и состояли, в основном, из T-клеток CD8, продуцирующих IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα(ФИГ. 23B).
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
[00324] Частота антигенспецифических ответов Т-клеток CD8 в группах, иммунизированных 10 мкг (1,36% ± 0,62%, p=0,004), 30 мкг (2,07% ± 1,77%, p=0,089) и 50 мкг (1,19% ± 0,69%, p=0,020) pGXl439 также была значимо более устойчивой по сравнению с неиммунизированными мышами. Ответы Т-клеток CD8 на введение pGXl439 синтетического консенсусного MUC16 были дозонезависимыми и состояли, в основном, из T-клеток CD8, продуцирующих IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα(ФИГ. 23C). Частота антигенспецифических Т-клеток CD8 далее представлена в деталях в таблице 18.
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
[00325] Подобно картине с антигенспецифическими Т-клетками CD8, полноразмерные конструкции синтетического консенсусного MUC16 индуцировали значимое изменение в частоте Т-клеток CD8CD107a во всех группах по сравнению с неиммунизированными мышами (0,05% ± 0,04%) за исключением pGXl439 при количестве дозы 30 мкг (ФИГ. 24A-24C). Конкретно, частота антигенспецифических Т-клеток CD8CD107a составила 0,47 ± 0,23%, 0,59 ± 0,34% и 1,19 ± 0,90%, соответственно, в группах количества дозы pGXl435 10 мкг (p=0,005), 30 мкг (р=0,013) и 50 мкг (p=0,043) (ФИГ. 24A). Профиль цитокинов Т-клеток CD8CD107aпри введении конструкции pGXl435 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 23А).
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
[00326] Частота антигенспецифических Т-клеток CD8CD107a составила 0,80% ± 0,48%, 1,05% ± 0,77% и 1,05% ± 0,65%, соответственно, в группах количества дозы pGXl438 10 мкг (р=0,016), 30 мкг (p=0,039) и 50 мкг (р=0,016) (ФИГ. 23B). Профиль цитокинов Т-клеток CD8CD107aпри введении конструкции pGXl438 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 24B).
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
[00327] Частота антигенспецифических Т-клеток CD8CD107a составила 1,04% ± 0,65%, 1,68% ± 1,54% и 0,93% ± 0,68%, соответственно, в группах количества дозы pGXl439 10 мкг (р=0,018), 30 мкг (p=0,094) и 50 мкг (p=0,038) (ФИГ. 23C). Профиль цитокинов Т-клеток CD8CD107aпри введении конструкции pGXl439 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 24C). Частота антигенспецифических Т-клеток CD8 с цитолитическим потенциалом далее представлена в деталях в таблице 18.
Таблица 18
Ответы Т-клеток CD8<sup>+</sup> и CD8<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на слияние синтетического консенсусного MUC16 (pGX1435)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD8<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup>
% CD8<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,13 ± 0,15
н/д
0,05±0,04
н/д
pGX1435
Иммунизированные
10 мкг
0,65 ± 0,28
0,007
0,47±0,23
0,005
30 мкг
0,82 ± 0,46
0,022
0,59±0,34
0,013
50 мкг
1,60 ± 1,08
0,034
1,19±0,90
0,043
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Ответы Т-клеток CD8<sup>+</sup> и CD8<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на расщепление фурином синтетического консенсусного MUC16 (pGX1438)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD8<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup>
% CD8<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,13 ± 0,15
н/д
0,05±0,04
н/д
pGX1438
Иммунизированные
10 мкг
1,30 ± 0,79
0,024
0,80±0,48
0,016
30 мкг
1,33 ± 0,87
0,034
1,05±0,77
0,039
50 мкг
1,36 ± 0,71
0,010
1,05±0,65
0,016
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Ответы Т-клеток CD8<sup>+</sup> и CD8<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на двойной промотор синтетического консенсусного MUC16 (pGX1439)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD8<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup>
% CD8<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,13 ± 0,15
н/д
0,05±0,04
н/д
pGX1439
Иммунизированные
10 мкг
1,36 ± 0,62
0,004
1,04±0,65
0,018
30 мкг
2,07 ± 1,77
0,089
1,68±1,54
0,094
50 мкг
1,19± 0,69
0,020
0,93±0,68
0,038
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
[00328] Конструкции частичной длины синтетического консенсусного MUC16 вызывали сильные ответы в компартменте Т-клеток CD4 (ФИГ. 25A-25B и ФИГ. 26A-26B). Интенсивность Т-клеток CD4, специфическая по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, вызванная конструкцией pGXl436, была дозонезависимой (ФИГ. 25 A). Конкретно, Т-клетки CD4при введении конструкции pGXl436 синтетического консенсусного MUC16 составили 1,74% ± 0,79%, 2,18% ± 1,15% и 1,32% ± 1,74% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Количество Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl436 синтетического консенсусного MUC16 было значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами (0,17% ± 0,10%) при количествах дозы pGXl436 10 мкг (p=0,003) и 30 мкг (p=0,007), но не 50 мкг (p=0,359). Специфические ответы Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl436 синтетического консенсусного MUC16 состояли, в основном, из Т-клеток CD4, продуцирующих IFNγIL-2TNFα, IFNγIL-2TNFα или IFNγIL-2TNFα. Частота антигенспецифических Т-клеток CD4CD107a составила 0,45% ± 0,28%, 0,31% ± 0,26% и 0,23% ± 0,30%, соответственно, в группах количества дозы pGXl436 10 мкг (p=0,020), 30 мкг (p=0,080) и 50 мкг (p=0,369) (ФИГ. 25B). Профиль цитокинов Т-клеток CD4CD107aпри введении конструкции pGXl436 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 25B). Частота антигенспецифических Т-клеток CD4 с цитолитическим потенциалом далее представлена в деталях в таблице 19.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
[00329] Интенсивность Т-клеток CD4, специфическая по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, вызванная конструкцией pGXl437, была дозозависимой (ФИГ. 26A). Конкретно, Т-клетки CD4при введении конструкции pGXl437 синтетического консенсусного MUC16 составили 0,56% ± 0,38%, 1,14% ± 0,36% и 1,87% ± 1,05% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Количество Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl437 синтетического консенсусного MUC16 было значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами (0,21% ± 0,14%) при количествах дозы pGXl437 30 мкг (p<0,001) и 50 мкг (p=0,011), но не 10 мкг (p=0,063). Специфические ответы Т-клеток CD4, при введении конструкции pGXl437 синтетического консенсусного MUC16 состояли, в основном, из Т-клеток CD4, продуцирующих IFNγIL-2TNFα, IFNγIL-2TNFα или IFNγIL-2TNFα. Частота антигенспецифических Т-клеток CD4CD107a составила 0,09% ± 0,09%, 0,21% ± 0,05% и 0,36% ± 0,21%, соответственно, в группах количества дозы pGXl437 10 мкг (p=0,335), 30 мкг (p<0,001) и 50 мкг (р=0,016) (ФИГ. 26B). Профиль цитокинов Т-клеток CD4CD107aпри введении конструкции pGXl437 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 26B). Частота антигенспецифических Т-клеток CD4 с цитолитическим потенциалом далее представлена в деталях в таблице 19.
Таблица 19
Ответы Т-клеток CD4<sup>+</sup> и CD4<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на «Участок 1» синтетического консенсусного MUC16 (pGX1436)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD4<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup>
% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,17 ± 0,10
н/д
0,04±0,03
н/д
pGX1436
Иммунизированные
10 мкг
1,74 ± 0,79
0,003
0,45±0,28
0,020
30 мкг
2,18 ± 1,15
0,007
0,31±0,26
0,080
50 мкг
1,32 ± 1,74
0,359
0,23±0,30
0,369
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Ответы Т-клеток CD4<sup>+</sup> и CD4<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на «Участок 2» синтетического консенсусного MUC16 (pGX1437)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD4<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup>
% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD4<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,21±0,14
н/д
0,02±0,02
н/д
pGX1437
Иммунизированные
10 мкг
0,56 ± 0,38
0,063
0,09±0,09
0,335
30 мкг
1,14 ± 0,36
<0,001
0,21±0,05
<0,001
50 мкг
1.87 ± 1,05
0,011
0,36±0,21
0,016
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
[00330] Конструкции частичной длины синтетического консенсусного MUC16 вызывали сильные ответы в компартменте Т-клеток CD8 (ФИГ. 27A-27B и ФИГ. 28A-28B). Интенсивность Т-клеток CD8, специфическая по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, вызванная конструкцией pGXl436, была дозонезависимой (ФИГ. 27 A). Конкретно, Т-клетки CD8при введении конструкции pGXl436 синтетического консенсусного MUC16 составили 1,76% ± 0,73%, 2,17% ± 0,81% и 1,92% ± 2,13% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Количество Т-клеток CD8, при введении конструкции pGXl436 синтетического консенсусного MUC16 было значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами (0,06% ± 0,08%) при количествах дозы pGXl436 10 мкг (p=0,002) и 30 мкг (p=0,001), но не 50 мкг (p=0,192). Специфические ответы Т-клеток CD8, при введении конструкции pGXl436 синтетического консенсусного MUC16 состояли, в основном, из Т-клеток CD8, продуцирующих IFNγIL-2TNFα или IFNγIL-2TNFα. Частота антигенспецифических Т-клеток CD8CD107a составила 1,55% ± 0,64%, 1,86% ± 0,73% и 1,72% ± 1,95% соответственно, в группах количества дозы pGXl436 10 мкг (p=0,001), 30 мкг (p=0,001) и 50 мкг (p=0,193) (ФИГ. 26B). Профиль цитокинов Т-клеток CD8CD107aпри введении конструкции pGXl436 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα или IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 27B). В целом, ответы Т-клеток CD8 на Участок 1, индуцированные pGXl435, значимо ниже по сравнению с pGXl436 (ФИГ. 29 A). Частота антигенспецифических Т-клеток CD8 с цитолитическим потенциалом далее указана в деталях в таблице 20.
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
+
[00331] Интенсивность Т-клеток CD8, специфическая по отношению к синтетическому консенсусному MUC16, вызванная конструкцией pGXl437, была дозозависимой (ФИГ. 28A). Конкретно, Т-клетки CD8при введении конструкции pGXl437 синтетического консенсусного MUC16 составили 0,26% ± 0,14%, 0,77% ± 0,47% и 0,89% ± 0,37% при количествах дозы, соответственно, 10 мкг, 30 мкг и 50 мкг. Количество Т-клеток CD8, при введении конструкции pGXl437 синтетического консенсусного MUC16 было значимо выше по сравнению с неиммунизированными мышами (0,07% ± 0,07%) при количествах дозы pGXl437 30 мкг (p=0,025) и 50 мкг (p=0,001), но не 10 мкг (p=0,069). Специфические ответы Т-клеток CD8, при введении конструкции pGXl437 синтетического консенсусного MUC16 состояли, в основном, из Т-клеток CD8, продуцирующих IFNγIL-2TNFα или IFNγIL-2TNFα. Частота антигенспецифических Т-клеток CD8CD107a составила 0,16% ± 0,10%, 0,58% ± 0,40% и 0,89% ± 0,37%, соответственно, в группах количества дозы pGXl437 10 мкг (p=0,022), 30 мкг (p=0,030) и 50 мкг (p=0,002) (Фигура 28B). Профиль цитокинов Т-клеток CD8CD107aпри введении конструкции pGXl437 был схожим по группам количества дозы и состоял, в основном, из клеток IFNγIL-2TNFα и IFNγIL-2TNFα (ФИГ. 28B). В целом, ответы Т-клеток CD8 на Участок 2, индуцированные pGXl435 и pGXl438, значимо ниже по сравнению с pGXl437 (ФИГ. 29 В). Частота антигенспецифических Т-клеток CD8 с цитолитическим потенциалом далее указана в деталях в таблице 20.
Таблица 20
Ответы Т-клеток CD8<sup>+</sup> и CD8<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на «Участок 1» синтетического консенсусного MUC16 (pGX1436)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD8<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup>
% CD8<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,06 ± 0,08
н/д
0,03±0,03
н/д
pGX1436
Иммунизированные
10 мкг
1,76 ± 0,73
0,002
1,55±0,64
0,001
30 мкг
2,17 ± 0,81
0,001
1,86±0,73
0,001
50 мкг
1,92 ± 2,13
0,192
1,72±1,95
0,193
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Ответы Т-клеток CD8<sup>+</sup> и CD8<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup> на «Участок 2» синтетического консенсусного MUC16 (pGX1437)
Код препарата
Группа
Количество дозы
% CD8<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup>
% CD8<sup>+</sup>CD107a<sup>+</sup>±ст.откл.
Значение р% CD8<sup>+</sup> CD107a<sup>+</sup>
pGX0001
Неиммунизированные
30 мкг
0,07 ± 0,07
н/д
0,03±0,02
н/д
pGX1437
Иммунизированные
10 мкг
0,26 ± 0,14
0,069
0,16±0,10
0,022
30 мкг
0,77 ± 0,47
0,025
0,58±0,40
0,030
50 мкг
0,89 ± 0,37
0,001
0,89±0,37
0,002
Статистическая значимость присваивалась при р≤0,05. Указаны значения р по отношению к неиммунизированным мышам (иммунизированным при помощи pGX0001)
Статистический анализ
[00332] Статистический анализ был выполнен с использованием IBM SPSS Statistics 22 (IBM Corporation). Анализ различий между группами был выполнен с использованием ANOVA с использованием апостериорного теста Тьюки Honest Significant Difference (HSD) для того, чтобы скорректировать множественные сравнения. Однородность дисперсии была подтверждена с использованием F-статистики перед множественными сравнениями. Для всего статистического анализа значение р 0,050 считалось значимым.
Вывод
+
+
[00333] В целом, полноразмерные конструкции pGXl438 (расщепление фурином) и pGXl439 (двойной промотор) MUC16 вызывали более устойчивые иммунные ответы по сравнению с pGXl435 (слияние) (ФИГ. 30A-C). По сравнению с pGXl435, pGXl438 индуцировал значимо более устойчивые ответы по данным IFNγ в ELISpot при количествах дозы 10 мкг и 30 мкг. Также в компартменте Т-клеток CD4 pGXl438 вызывал значимо более устойчивые иммунные ответы по сравнению с pGXl435 при количестве дозы 10 мкг. Не было отмечено других значимых различий в интенсивности ответа, индуцированного тремя полноразмерными конструкциями MUC16, однако существовала тенденция в пользу более устойчивых ответов Т-клеток CD8, индуцированных pGXl438 и pGXl439.
+
+
[00334] Помимо этого, pGXl438 и pGXl439 индуцировали ответы на Участок 1, эквивалентные pGXl436, и индуцировали ответы на Участок 2, эквивалентные pGXl437 по данным определения IFNγ в ELISpot компартмента Т-клеток CD4. Ответы, эквивалентные pGXl437 в компартменте Т-клеток CD8 были индуцированы только pGXl439.
[00335] Понятно, что вышеприведенное подробное описание и сопровождающие примеры являются просто иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничения объема изобретения, который определяется исключительно прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
[00336] Различные изменения и модификации раскрытых вариантов воплощения будут очевидны для специалистов в данной области техники. Такие изменения и модификации к раскрытым вариантам воплощения, включая без ограничения изменения, относящиеся к химическим структурам, заместителям, производным, промежуточным соединениям, синтезам, композициям, составам или способам применения изобретения, могут быть сделаны без отклонения от его сущности и объема.
Таблица 21: Кодирующая последовательность ДНК IRC+R59 синтетического консенсусного MUC16
SEQIDNO.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
1
atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa cccgcgtgca ctccacagca gcaggacctc tgctggtgcc attcaccctg aactttacca tcacaaatct gcagtacgag gaggatatgc accacccagg cagcagaaag ttcaacacca cagagagggt gctgcagggc ctgctgggac caatgtttaa gaataccagc gtgggcctgc tgtattccgg atgcaggctg acactgctgc gctccgagaa ggacggagca gcaaccggcg tggatgccat ctgtacacac aggctggacc ccaagagccc tggcctggat cgggagcagc tgtactggga gctgtcccag ctgaccaacg gcatcaagga gctgggcccc tacacactgg accgcaacag cctgtatgtg aatggcttta cccaccggag ctccgtgcca aataccagca cacccggcac ctccacagtg gatctgggca cctccggcac accatctagc ctgccttctc caaccgcagc aggaccactg ctggtgcctt tcacactgaa ctttaccatt accaatctgc agtatgaaga ggacatgagg catcctggca gcagaaagtt caacacgaca gagagagtgc tgcaaggcct gctgaagcca ctgtttaaga atacctctgt gggccccctg tatagtggct gtagactgac actgctgcgc cccgaaaaag atggcgccgc cactggagtc gacgccatct gtacacacag actggacccc aagtctcccg gcctgaacag agaacagctg tattgggaac tgagcaagct gaccaatggc atcacagagc tgggccctta caccctggac agaaactctc tgtatgtgaa tggcttcacc cacaggacat ctgtgcctac cacaagcacc ccaggcacct ccaccgtcga tctgggcacc agcggcacac cttttagcct gccatcccct accaccgccg gaccactgct ggtgcccttc accctgaact ttaccataac caatctgcag tatgaggagg acatgcaccg gcccggcagc agaaagttca acactacaga gagagtgctg cagggcctgt tatcccctat ctttaagaat tcctctgtgg gcccactgta cagcggatgc aggctgacct ctctgcggcc cgaaaaagac ggagcagcaa caggaatgga tgccgtgtgc ctgtaccacc caaaccccaa gaggccaggc ctggatcgcg agcagctgta ttgggagctg agccagctga cccacaatat cacagagctg ggcccctact ctctggacag ggatagcctg tatgtgaacg gcttcaccca ccagaattccgtgcccacca catctacacc tggcaccagc acagtgtact gggccaccac aggcacccct agctcctttc caggacacac agcacctgga ccactgctga tcccattcac cctgaacttt accattacaa atctgcacta tgaggagaac atgcagcacc ccggcagccg caagttcaat accacagagc gggtgctgca aggcctgctg aagccgctgt ttaagaacac cagcgtggga cctctgtact ctggctgtcg cctgacactg ctgcggcccg agaagcatgg cgcagcaacc ggcgtggacg ctatttgcac ccacagactg gaccctaagg gcccaggcct ggatagggag cgcctgtatt gggaactgtc tcagctgacc aattctatca cagagctggg accatacacc ctggacaggg attctctgta cgtgaacggc ttcaatccac ggtctagcgt gcccaccaca agcacccctg gcacctccac agtgcacctg gccacctctg gcacaccctc ctctctgcct ggacacaccg caagccccct gctggtgctg ttcacaatca actttaccat tactaatctg agatacgagg agaacatgca ccaccctggc tccagaaagt tcaatactac cgaaagggtg ctgcaaggcc tgctgcgccc agtgtttaag aacacttccg tgggccccct gtatagcggc tgtaggctga cactgctgcg ccccaagaag gatggcgcag caaccaaggt cgacgctatc tgtacataca ggcccgaccc taaatcccca ggcctggacc gggagcagct gtattgggag ctgtctcagc tgacccactc cattaccgaa ctgggaccct acaccctgga cagagattcc ctgtacgtga atggcttcac acagaggagc tccgtgccta ccacatccat cccaggaacc cctacagtgg acctgggcac ctccggaacc ccagtgtcta agccaggacc atctgccgca agccacctgc tgatcctgtt caccctgaac tttaccataa cgaatctgcg gtacgaggag aacatgtggc caggctcccg gaagttcaat actaccgaga gagtgctgca aggcctgctg aggcctctgt ttaagaacac tagcgtgggc ccactgtatt ccggctctcg gctgaccctg ctgcggcccg aaaaagatgg agaggccaca ggcgtggatg ccatctgcac ccacagacct gacccaacag gacctggcct ggacagggag cagctgtacc tggagctgtc acagctgact cactccatta ccgagctggg cccctatact ctggatagag actccctgta cgtcaacggc ttcacccacc ggtctagcgt gccaaccaca tctacaggcg tggtgagcga ggaacccttc accctgaact tcaccatcaa caatctgagg tacatggcag acatgggaca gccaggctct ctgaagttca acatcaccga taatgtgatg aagcacctgc tgagccctct gtttcagcgg agcagcctgg gagcaaggta caccggatgc cgcgtgatcg ccctgcggtc cgtgaagaac ggagcagaga cacgggtgga cctgctgtgc acatatctgc agcctctgag cggaccaggc ctgcccatca agcaggtgtt ccacgagctg tctcagcaga cccacggaat cacaaggctg ggaccctact ccctggacaa ggattctctg tacctgaacg gctataatga gcctggcctg gacgagcccc ctaccacacc caagcctgcc accacatttc tgccacccct gagcgaggca accacagcaa tgggatacca cctgaagacc ctgacactga acttcaccat cagcaatctg cagtattccc ccgatatggg caagggctct gccaccttta acagcacaga gggcgtgctg cagcacctgc tgcggcccct gttccagaag agctccatgg gcccttttta cctgggctgc cagctgatct ccctgaggcc tgaaaaagat ggagcagcaa ccggagtgga taccacatgt acataccacc cagaccccgt gggaccaggc ctggatatcc agcagctgta ctgggaactg tcccagctga ctcacggcgt gacacagctg ggcttctacg tgctggaccg cgattccctg tttatcaacg gctacgcccc tcagaatctg tctatccggg gcgagtatca gatcaacttc cacatcgtga actggaatct gagcaatcct gacccaacct ctagcgagta catcgccctg ctgcgcgaca tccaggataa ggtgaccaca ctgtataagg gctcccagct gcacgacacc ttccggtttt gcctggtgac caacctgaca atggattcta tgctggtgac agtgaaggcc ctgttctcct ctaacctgga ccccagcctg gtggagcagg tgtttctgga taagaccctg aatgccagct cccactggct gggctccacc taccagctgg tggacatcca cgtgacagag atggagccaa gcgtgtacca gcccacctct agctcctcta cacagcactt ctacctgaac tttaccataa ctaatctgcc ctatagccag gatatcgccc agcctggcac cacaaactac cagcggaaca agagaaatat cgaggacgcc ctgaaccagc tgttcagaaa tagctccatc aagtcctatt tctctgattg ccaggtgagc acctttaggt ccgtgcctaa ttctcaccac acaggcgtgg actccctgtg cgccttttct ccactggcaa ggagagtgga tagggtggca atctacgagg agttcctgag gatgacccgc gccggaacac agctgcaggc ctttaccctg gacagatcta gcgtgctggt ggatggctat agccctaaca ggaatgagcc actgaccggc aactccgacc tgcccttctg ggccatcatc ctgatctgtc tggcaggcct gctgggcctg atcacctgcc tgatctgtgg ctttctggtg tgataa
Таблица 22: Последовательность белка IRC+R59 синтетического консенсусного MUC 16
SEQIDNO.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
2
MDWTWILFLVAAATRVHSTAAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHHPGSRKFNTTERVLQGLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSVPNTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTAAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLNREQLYWELSKLTNGITELGPYTLDRNSLYVNGFTHRTSVPTTSTPGTSTVDLGTSGTPFSLPSPTTAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQGLLSPIFKNSSVGPLYSGCRLTSLRPEKDGAATGMDAVCLYHPNPKRPGLDREQLYWELSQLTHNITELGPYSLDRDSLYVNGFTHQNSVPTTSTPGTSTVYWATTGTPSSFPGHTAPGPLLIPFTLNFTITNLHYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKHGAATGVDAICTHRLDPKGPGLDRERLYWELSQLTNSITELGPYTLDRDSLYVNGFNPRSSVPTTSTPGTSTVHLATSGTPSSLPGHTASPLLVLFTINFTITNLRYEENMHHPGSRKFNTTERVLQGLLRPVFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPKKDGAATKVDAICTYRPDPKSPGLDREQLYWELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTQRSSVPTTSIPGTPTVDLGTSGTPVSKPGPSAASHLLILFTLNFTITNLRYEENMWPGSRKFNTTERVLQGLLRPLFKNTSVGPLYSGSRLTLLRPEKDGEATGVDAICTHRPDPTGPGLDREQLYLELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTHRSSVPTTSTGVVSEEPFTLNFTINNLRYMADMGQPGSLKFNITDNVMKHLLSPLFQRSSLGARYTGCRVIALRSVKNGAETRVDLLCTYLQPLSGPGLPIKQVFHELSQQTHGITRLGPYSLDKDSLYLNGYNEPGLDEPPTTPKPATTFLPPLSEATTAMGYHLKTLTLNFTISNLQYSPDMGKGSATFNSTEGVLQHLLRPLFQKSSMGPFYLGCQLISLRPEKDGAATGVDTTCTYHPDPVGPGLDIQQLYWELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNWNLSNPDPTSSEYIALLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSMLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASSHWLGSTYQLVDIHVTEMEPSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDIAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNSHHTGVDSLCAFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRAGTQLQAFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAIILICLAG LLGLITCLICGFLV
Таблица 23: Кодирующая последовательность ДНК RMC синтетического консенсусного MUC16
SEQIDNO.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
3
atggattgga cttggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctcgggtgca ttctactgct gctgggccac tgctggtgcc ttttacactg aacttcacca tcacaaatct gcagtacgag gaggacatgc accaccctgg ctctcggaag ttcaacacca cagagagagt gctgcagggc ctgctgggcc caatgtttaa gaataccagc gtgggcctgc tgtattccgg atgccggctg acactgctga gatccgagaa ggacggagca gcaaccggag tggatgccat ctgtacacac aggctggacc caaagtcccc aggcctggat agagagcagc tgtactggga gctgtctcag ctgaccaacg gcatcaagga gctgggcccc tacacactgg accggaacag cctgtatgtg aatggcttta cccacagaag ctccgtgcca aataccagca cacccggcac ctccacagtg gatctgggca cctctggcac accttctagc ctgccaagcc ctaccgcagc aggaccactg ctggtgccct tcacactgaa ctttaccatt accaatctgc agtatgaaga ggacatgagg cacccaggct cccgcaagtt caacactacc gagcgggtgc tgcaaggcct gctgaagcct ctgtttaaga atacctctgt gggcccactg tatagtggct gccggctgac actgctgcgg cccgaaaaag acggagcagc aaccggcgtg gatgctattt gcacccacag gctggacccc aagagcccag gcctgaaccg cgaacagctg tattgggagc tgtccaagct gaccaatggc atcacagagc tgggccccta caccctggac agaaattccc tgtacgtgaa tggcttcacc caccgcacat ctgtgcctac cacaagcacc ccaggcacct ccacagtgga tctgggcacc tccggcacac ccttttccct gccatctcca accacagcag gacctctgct ggtgccattc accctgaact ttaccattac taatctgcag tatgaagaag acatgcacag gcctggctct cgcaagttca acactactga gagggtgctg cagggcctgt taagcccaat ctttaagaat tcctctgtgg gccctctgta ttccggatgc aggctgacct ctctgcgccc agaaaaagat ggagcagcaa caggaatgga tgccgtgtgc ctgtaccacc ctaacccaaa gcggcccggc ctggacaggg agcagctgta ttgggaactg agccagctga cccacaatat cacagagctg ggcccttact ctctggaccg cgatagcctg tatgtgaacg gcttcaccca ccagaattcc gtgcccacca catctacacc tggcaccagc acagtgtact gggccaccac aggcaccccc agctcctttc ctggacacac agcaccagga cctctgctga tccccttcac cctgaacttt accataacaa atctgcacta tgaggagaac atgcagcacc ctggcagcag gaagttcaat accacagagc gcgtgctgca aggcctgctg aagccgctgt ttaagaacac cagcgtggga ccactgtaca gcggctgcag gctgaccctg ctgcgccctg agaagcatgg cgccgccacc ggcgtggatg ctatctgcac acatagactg gaccccaagg gacctggcct ggatagggag agactgtact gggaactgtc ccagctgacc aactcaatta cagagctggg cccatacacc ctggaccggg attctctgta cgtgaacggc ttcaatccaa gatctagcgt ccctaccaca tctacccctg ggacaagtac cgtgcatctg gctacaagcg gaactccttc aagtctgcct ggacactgat
Таблица 24: Последовательность белка RMC синтетического консенсусного MUC16
SEQIDNO.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
4
MDWTWILFLVAAATRVHSTAAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHHPGSRKFNTTERVLQGLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSVPNTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTAAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLNREQLYWELSKLTNGITELGPYTLDRNSLYVNGFTHRTSVPTTSTPGTSTVDLGTSGTPFSLPSPTTAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQGLLSPIFKNSSVGPLYSGCRLTSLRPEKDGAATGMDAVCLYHPNPKRPGLDREQLYWELSQLTHNITELGPYSLDRDSLYVNGFTHQNSVPTTSTPGTSTVYWATTGTPSSFPGHTAPGPLLIPFTLNFTITNLHYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKHGAATGVDAICTHRLDPKGPGLDRERLYWELSQLTNSITELGPYTLDRDSLYVNGFNPRSSVPTTSTPGTSTVHLATSGTPSSLPGH
Таблица 25: Кодирующая последовательность ДНК NRC синтетического консенсусного MUC16
SEQIDNO.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
5
atggactgga cttggattct gttcctggtc gctgccgcca cccgcgtgca tagtgccgca tctcacctgc tgattctgtt caccctgaac ttcaccatca caaatctgcg gtacgaggag aacatgtggc caggcagccg caagttcaat accacagagc gggtgctgca gggcctgctg cggcccctgt ttaagaacac ctccgtgggc cccctgtatt ctggcagcag gctgaccctg ctgcgcccag agaaggacgg agaggcaaca ggcgtggatg ccatctgcac ccacaggcct gacccaacag gaccaggcct ggatagggag cagctgtacc tggagctgag ccagctgacc cactccatca cagagctggg accatacacc ctggacaggg attccctgta tgtgaacggc tttacccaca gaagctccgt gcccaccaca tctacaggcg tggtgagcga ggagcccttc accctgaact tcaccatcaa caatctgagg tacatggcag acatgggaca gccaggcagc ctgaagttca acatcaccga taatgtgatg aagcacctgc tgtcccctct gtttcagcgg tctagcctgg gagcaaggta caccggctgc agagtgatcg ccctgaggtc cgtgaagaac ggagcagaga cacgggtgga cctgctgtgc acatatctgc agcctctgag cggaccaggc ctgcctatca agcaggtgtt ccacgagctg tctcagcaga cccacggaat cacacgcctg ggaccttact ccctggacaa ggattctctg tacctgaacg gctataatga gccaggcctg gacgagcccc ctaccacacc caagcctgcc accacatttc tgccacccct gagcgaggca accacagcaa tgggatacca cctgaagacc ctgacactga acttcaccat cagcaatctg cagtattccc ccgatatggg caagggctct gccaccttta atagcacaga gggcgtgctg cagcacctgc tgaggcctct gttccagaag tcctctatgg gccccttcta cctgggatgc cagctgatct ccctgcgccc tgagaaggac ggagcagcaa ccggagtgga taccacatgt acataccacc cagaccccgt gggaccaggc ctggatatcc agcagctgta ttgggaactg tcccagctga cccacggcgt gacacagctg ggcttctatg tgctggaccg ggattctctg tttatcaacg gctacgcccc tcagaatctg agcatcagag gcgagtatca gatcaacttc cacatcgtga actggaatct gtctaatcct gatccaacca gctccgagta catcgccctg ctgcgggaca tccaggataa ggtgaccaca ctgtataagg gcagccagct gcacgacacc ttcagatttt gtctggtgac caacctgaca atggattcca tgctggtgac agtgaaggcc ctgttctcta gcaacctgga cccttctctg gtggagcagg tgtttctgga taagaccctg aatgcctcct ctcactggct gggctctacc taccagctgg tggacatcca cgtgacagag atggagccaa gcgtgtatca gcccaccagc tcctctagca cacagcactt ctacctgaac tttaccatca caaatctgcc ctatagccag gatatcgccc agcctggcac cacaaactac cagaggaaca agcgcaatat cgaggacgcc ctgaaccagc tgttcaggaa ttcctctatc aagtcctatt tctctgattg ccaggtgagc acctttcgct ccgtgccaaa ttctcaccac acaggcgtgg actccctgtg cgccttttct cccctggcac ggagagtgga tagggtggca atctacgagg agttcctgcg gatgaccaga gccggcacac agctgcaggc ctttaccctg gacaggagct ccgtgctggt ggatggctat agccctaacc gcaatgagcc actgacaggc aattccgacc tgcccttctg ggccatcatc ctgatttgcc tggctggact gctggggctg attacctgtc tgatttgtgg gttcctggtg tgataa
Таблица 26: Последовательность белка NRC синтетического консенсусного MUC 16
SEQIDNO.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
6
MDWTWILFLVAAATRVHSTAAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHHPGSRKFNTTERVLQGLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSVPNTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTAAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLNREQLYWELSKLTNGITELGPYTLDRNSLYVNGFTHRTSVPTTSTPGTSTVDLGTSGTPFSLPSPTTAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQGLLSPIFKNSSVGPLYSGCRLTSLRPEKDGAATGMDAVCLYHPNPKRPGLDREQLYWELSQLTHNITELGPYSLDRDSLYVNGFTHQNSVPTTSTPGTSTVYWATTGTPSSFPGHTAPGPLLIPFTLNFTITNLHYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKHGAATGVDAICTHRLDPKGPGLDRERLYWELSQLTNSITELGPYTLDRDSLYVNGFNPRSSVPTTSTPGTSTVHLATSGTPSSLPGH
Таблица 27: Кодирующая последовательность ДНК IRC синтетического консенсусного MUC16
SEQIDNO.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
7
atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa ccagggtgca ctccacagca gcaggacctc tgctggtgcc attcaccctg aactttacca tcacaaatct gcagtacgag gaggatatgc accaccccgg cagccgcaag ttcaacacca cagagcgggt gctgcagggc ctgctgggac ctatgtttaa gaataccagc gtgggcctgc tgtattccgg atgcaggctg acactgctgc gctccgagaa ggacggagca gcaaccggcg tggatgccat ctgtacacac aggctggacc caaagtctcc cggcctggat cgcgagcagc tgtactggga gctgagccag ctgaccaacg gcatcaagga gctgggcccc tacacactgg accggaacag cctgtatgtg aatggcttca cccacagaag ctccgtgcca aatacctcca cacccggcac ctctacagtg gatctgggca cctctggcac accctctagc ctgcctagcc caaccgcagc aggaccactg ctggtgcctt tcacactgaa ctttaccatt accaatctgc agtatgaaga ggacatgcgg caccctggca gcagaaagtt caacactacc gagcgcgtgc tgcaaggcct gctgaagcca ctgtttaaga atacctctgt gggccccctg tatagtggct gtagactgac actgctgcgc cctgaaaaag atggcgccgc cactggagtc gacgctattt gcacccacag gctggacccc aagtccccag gcctgaacag agaacagctg tattgggagc tgtctaagct gaccaatggc atcacagagc tgggcccata caccctggac aggaactctc tgtacgtcaa tggcttcacc caccgcacaa gcgtgcctac cacatccacc ccaggcacct ctaccgtcga tctgggcacc agcggcacac cattttccct gccatctcct accaccgccg gaccactgct ggtgcccttc accctgaact ttaccataac caatctgcag tatgaggagg acatgcaccg gcccggctct agaaagttca acactactga acgggtgctg caaggcctgt taagccctat ctttaagaat tcctctgtgg gcccactgta cagcggatgc aggctgacct ctctgcggcc cgaaaaagac ggagcagcaa caggaatgga tgccgtgtgc ctgtaccacc caaaccccaa gaggcctggc ctggacagag agcagctgta ttgggaactg tcccagctga cccacaatat cacagagctg ggcccctaca gcctggacag agattccctg tatgtgaacg gcttcaccca ccagaattct gtgcccacca caagcacacc tggcacctcc acagtgtact gggccaccac aggcacccct agctcctttc caggacacac agcacctgga ccactgctga tccctttcac cctgaacttt accattacaa atctgcacta tgaggagaac atgcagcacc caggcagcag aaagttcaat accacagaga gggtgctgca aggcctgctg aagccgctgt ttaagaacac cagcgtggga cctctgtact ctggctgtcg cctgacactg ctgcggcccg agaagcatgg cgcagcaacc ggcgtggacg ctatttgcac tcatagactg gaccccaagg gacctggcct ggatagggag agactgtact gggaactgtc tcagctgacc aattccatta cagagctggg cccttacacc ctggaccggg acagcctgta cgtcaacggc ttcaatccaa gatctagcgt gcccaccaca tccacccctg gcacctctac agtgcacctg gccaccagcg gaacaccctc ctctctgcct ggacacaggg gaaggaagcg gagaagcgcc gcatcccacc tgctgatcct gttcaccctg aactttacca taacgaatct gagatacgag gagaacatgt ggcctggctc ccgcaagttc aatactaccg aacgggtgct gcagggcctg ctgcggcccc tgtttaagaa cacttccgtg ggccccctgt attctggcag caggctgacc ctgctgcgcc cagagaagga cggagaggca acaggcgtgg atgccatctg cacccacagg cccgacccta caggaccagg cctggatagg gagcagctgt acctggagct gtcccagctg actcactcaa ttaccgaact gggaccttac accctggaca gggatagtct gtacgtgaat ggcttcaccc atcgcagctc cgtgccaacc acatctacag gcgtggtgag cgaggaaccc ttcaccctga acttcaccat caacaatctg aggtacatgg ccgacatggg ccagccaggc tccctgaagt tcaacatcac cgataatgtg atgaagcacc tgctgtctcc cctgtttcag aggtctagcc tgggagcaag gtacaccgga tgcagagtga tcgccctgag gtccgtgaag aacggagcag agacacgggt ggacctgctg tgcacatatc tgcagcctct gagcggacca ggcctgccca tcaagcaggt gttccacgag ctgtcccagc agacccacgg aatcacaagg ctgggacctt actccctgga caaggattct ctgtacctga acggctataa tgagccaggc ctggacgagc cccctaccac accaaagccc gccaccacat ttctgccacc cctgagcgag gcaaccacag caatgggata ccacctgaag accctgacac tgaacttcac catcagcaat ctgcagtatt cccccgatat gggcaagggc tctgccacct ttaacagcac agagggcgtg ctgcagcacc tgctgcggcc tctgttccag aagtcctcta tgggcccctt ctacctggga tgccagctga tctccctgcg gcccgaaaag gatggagcag caaccggagt ggataccaca tgtacatacc accctgaccc agtgggacca ggcctggata tccagcaatt atattgggaa ctgagtcagc tgacccacgg cgtgacacag ctgggcttct atgtgctgga cagggatagc ctgtttatca acggctacgc cccacagaat ctgtccatcc gcggcgagta tcagatcaac ttccacatcg tgaactggaa tctgagcaat cccgacccta ccagctccga gtacatcgcc ctgctgaggg acatccagga taaggtgacc acactgtata agggctccca gctgcacgac accttccgct tttgcctggt gaccaacctg acaatggatt ctatgctggt gacagtgaag gccctgttct ctagcaacct ggaccccagc ctggtggagc aggtgtttct ggataagacc ctgaatgcct cctctcactg gctgggcagc acctaccagc tggtggacat ccacgtgaca gagatggagc catccgtgta tcagcccacc agctcctcta gcacacagca cttctacctg aactttacca taactaatct gccctatagc caggatatcg cccagcctgg caccacaaac taccagcgga acaagagaaa tatcgaggac gccctgaacc agctgttccg gaattcctct atcaagtctt atttcagcga ttgccaggtg tccaccttta gatctgtgcc aaatagccac cacacaggcg tggactccct gtgcgccttt tctcccctgg caaggagggt ggatagggtg gcaatctacg aggagttcct gaggatgacc cgcgccggaa cacagctgca ggcctttacc ctggaccgga gctccgtgct ggtggatggc tattccccta acagaaatga gccactgaca ggcaactctg acctgccctt ctgggccatc atcctgatct gtctggcagg cctgctgggc ctgatcacct gcctgatctg tggctttctg gtgtgataa
Таблица 28: Последовательность белка IRC синтетического консенсусного MUC16
SEQIDNO.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
8
MDWTWILFLVAAATRVHSTAAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHHPGSRKFNTTERVLQGLLGPMFKNTSVGLLYSGCRLTLLRSEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLDREQLYWELSQLTNGIKELGPYTLDRNSLYVNGFTHRSSVPNTSTPGTSTVDLGTSGTPSSLPSPTAAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMRHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKDGAATGVDAICTHRLDPKSPGLNREQLYWELSKLTNGITELGPYTLDRNSLYVNGFTHRTSVPTTSTPGTSTVDLGTSGTPFSLPSPTTAGPLLVPFTLNFTITNLQYEEDMHRPGSRKFNTTERVLQGLLSPIFKNSSVGPLYSGCRLTSLRPEKDGAATGMDAVCLYHPNPKRPGLDREQLYWELSQLTHNITELGPYSLDRDSLYVNGFTHQNSVPTTSTPGTSTVYWATTGTPSSFPGHTAPGPLLIPFTLNFTITNLHYEENMQHPGSRKFNTTERVLQGLLKPLFKNTSVGPLYSGCRLTLLRPEKHGAATGVDAICTHRLDPKGPGLDRERLYWELSQLTNSITELGPYTLDRDSLYVNGFNPRSSVPTTSTPGTSTVHLATSGTPSSLPGHRGRKRRSAASHLLILFTLNFTITNLRYEENMWPGSRKFNTTERVLQGLLRPLFKNTSVGPLYSGSRLTLLRPEKDGEATGVDAICTHRPDPTGPGLDREQLYLELSQLTHSITELGPYTLDRDSLYVNGFTHRSSVPTTSTGVVSEEPFTLNFTINNLRYMADMGQPGSLKFNITDNVMKHLLSPLFQRSSLGARYTGCRVIALRSVKNGAETRVDLLCTYLQPLSGPGLPIKQVFHELSQQTHGITRLGPYSLDKDSLYLNGYNEPGLDEPPTTPKPATTFLPPLSEATTAMGYHLKTLTLNFTISNLQYSPDMGKGSATFNSTEGVLQHLLRPLFQKSSMGPFYLGCQLISLRPEKDGAATGVDTTCTYHPDPVGPGLDIQQLYWELSQLTHGVTQLGFYVLDRDSLFINGYAPQNLSIRGEYQINFHIVNWNLSNPDPTSSEYIALLRDIQDKVTTLYKGSQLHDTFRFCLVTNLTMDSMLVTVKALFSSNLDPSLVEQVFLDKTLNASSHWLGSTYQLVDIHVTEMEPSVYQPTSSSSTQHFYLNFTITNLPYSQDIAQPGTTNYQRNKRNIEDALNQLFRNSSIKSYFSDCQVSTFRSVPNSHHTGVDSLCAFSPLARRVDRVAIYEEFLRMTRAGTQLQAFTLDRSSVLVDGYSPNRNEPLTGNSDLPFWAIILICLAGLLGLITCLICGFLV
--->
ЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
ПЕРЕ
<110>  INOVIO PHARMACEUTICALS, INC
YAN, Jian
SLAGER, Anna
GARMAN, Bradley
COOCH, Neil
<120>  ПРОТИВОРАКОВЫЕ ВАКЦИНЫ, НАПРАВЛЕННЫЕ НА MUC16, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  I1005 US PRO
<160>  8
<170>  Патентная версия 3.5
<210>  1
<211>  4476
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  Микросенсусный повтор MUC16  + повторы 59, 61, 62, 63
+  синтетический концевой усеченный  карбокси-концевой
домен  аминокислотной последовательности, кодирующей  белок pGX1435
<400>  1
atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa cccgcgtgca ctccacagca       60
gcaggacctc tgctggtgcc attcaccctg aactttacca tcacaaatct gcagtacgag      120
gaggatatgc accacccagg cagcagaaag ttcaacacca cagagagggt gctgcagggc      180
ctgctgggac caatgtttaa gaataccagc gtgggcctgc tgtattccgg atgcaggctg      240
acactgctgc gctccgagaa ggacggagca gcaaccggcg tggatgccat ctgtacacac      300
aggctggacc ccaagagccc tggcctggat cgggagcagc tgtactggga gctgtcccag      360
ctgaccaacg gcatcaagga gctgggcccc tacacactgg accgcaacag cctgtatgtg      420
aatggcttta cccaccggag ctccgtgcca aataccagca cacccggcac ctccacagtg      480
gatctgggca cctccggcac accatctagc ctgccttctc caaccgcagc aggaccactg      540
ctggtgcctt tcacactgaa ctttaccatt accaatctgc agtatgaaga ggacatgagg      600
catcctggca gcagaaagtt caacacgaca gagagagtgc tgcaaggcct gctgaagcca      660
ctgtttaaga atacctctgt gggccccctg tatagtggct gtagactgac actgctgcgc      720
cccgaaaaag atggcgccgc cactggagtc gacgccatct gtacacacag actggacccc      780
aagtctcccg gcctgaacag agaacagctg tattgggaac tgagcaagct gaccaatggc      840
atcacagagc tgggccctta caccctggac agaaactctc tgtatgtgaa tggcttcacc      900
cacaggacat ctgtgcctac cacaagcacc ccaggcacct ccaccgtcga tctgggcacc      960
agcggcacac cttttagcct gccatcccct accaccgccg gaccactgct ggtgcccttc     1020
accctgaact ttaccataac caatctgcag tatgaggagg acatgcaccg gcccggcagc     1080
agaaagttca acactacaga gagagtgctg cagggcctgt tatcccctat ctttaagaat     1140
tcctctgtgg gcccactgta cagcggatgc aggctgacct ctctgcggcc cgaaaaagac     1200
ggagcagcaa caggaatgga tgccgtgtgc ctgtaccacc caaaccccaa gaggccaggc     1260
ctggatcgcg agcagctgta ttgggagctg agccagctga cccacaatat cacagagctg     1320
ggcccctact ctctggacag ggatagcctg tatgtgaacg gcttcaccca ccagaattcc     1380
gtgcccacca catctacacc tggcaccagc acagtgtact gggccaccac aggcacccct     1440
agctcctttc caggacacac agcacctgga ccactgctga tcccattcac cctgaacttt     1500
accattacaa atctgcacta tgaggagaac atgcagcacc ccggcagccg caagttcaat     1560
accacagagc gggtgctgca aggcctgctg aagccgctgt ttaagaacac cagcgtggga     1620
cctctgtact ctggctgtcg cctgacactg ctgcggcccg agaagcatgg cgcagcaacc     1680
ggcgtggacg ctatttgcac ccacagactg gaccctaagg gcccaggcct ggatagggag     1740
cgcctgtatt gggaactgtc tcagctgacc aattctatca cagagctggg accatacacc     1800
ctggacaggg attctctgta cgtgaacggc ttcaatccac ggtctagcgt gcccaccaca     1860
agcacccctg gcacctccac agtgcacctg gccacctctg gcacaccctc ctctctgcct     1920
ggacacaccg caagccccct gctggtgctg ttcacaatca actttaccat tactaatctg     1980
agatacgagg agaacatgca ccaccctggc tccagaaagt tcaatactac cgaaagggtg     2040
ctgcaaggcc tgctgcgccc agtgtttaag aacacttccg tgggccccct gtatagcggc     2100
tgtaggctga cactgctgcg ccccaagaag gatggcgcag caaccaaggt cgacgctatc     2160
tgtacataca ggcccgaccc taaatcccca ggcctggacc gggagcagct gtattgggag     2220
ctgtctcagc tgacccactc cattaccgaa ctgggaccct acaccctgga cagagattcc     2280
ctgtacgtga atggcttcac acagaggagc tccgtgccta ccacatccat cccaggaacc     2340
cctacagtgg acctgggcac ctccggaacc ccagtgtcta agccaggacc atctgccgca     2400
agccacctgc tgatcctgtt caccctgaac tttaccataa cgaatctgcg gtacgaggag     2460
aacatgtggc caggctcccg gaagttcaat actaccgaga gagtgctgca aggcctgctg     2520
aggcctctgt ttaagaacac tagcgtgggc ccactgtatt ccggctctcg gctgaccctg     2580
ctgcggcccg aaaaagatgg agaggccaca ggcgtggatg ccatctgcac ccacagacct     2640
gacccaacag gacctggcct ggacagggag cagctgtacc tggagctgtc acagctgact     2700
cactccatta ccgagctggg cccctatact ctggatagag actccctgta cgtcaacggc     2760
ttcacccacc ggtctagcgt gccaaccaca tctacaggcg tggtgagcga ggaacccttc     2820
accctgaact tcaccatcaa caatctgagg tacatggcag acatgggaca gccaggctct     2880
ctgaagttca acatcaccga taatgtgatg aagcacctgc tgagccctct gtttcagcgg     2940
agcagcctgg gagcaaggta caccggatgc cgcgtgatcg ccctgcggtc cgtgaagaac     3000
ggagcagaga cacgggtgga cctgctgtgc acatatctgc agcctctgag cggaccaggc     3060
ctgcccatca agcaggtgtt ccacgagctg tctcagcaga cccacggaat cacaaggctg     3120
ggaccctact ccctggacaa ggattctctg tacctgaacg gctataatga gcctggcctg     3180
gacgagcccc ctaccacacc caagcctgcc accacatttc tgccacccct gagcgaggca     3240
accacagcaa tgggatacca cctgaagacc ctgacactga acttcaccat cagcaatctg     3300
cagtattccc ccgatatggg caagggctct gccaccttta acagcacaga gggcgtgctg     3360
cagcacctgc tgcggcccct gttccagaag agctccatgg gcccttttta cctgggctgc     3420
cagctgatct ccctgaggcc tgaaaaagat ggagcagcaa ccggagtgga taccacatgt     3480
acataccacc cagaccccgt gggaccaggc ctggatatcc agcagctgta ctgggaactg     3540
tcccagctga ctcacggcgt gacacagctg ggcttctacg tgctggaccg cgattccctg     3600
tttatcaacg gctacgcccc tcagaatctg tctatccggg gcgagtatca gatcaacttc     3660
cacatcgtga actggaatct gagcaatcct gacccaacct ctagcgagta catcgccctg     3720
ctgcgcgaca tccaggataa ggtgaccaca ctgtataagg gctcccagct gcacgacacc     3780
ttccggtttt gcctggtgac caacctgaca atggattcta tgctggtgac agtgaaggcc     3840
ctgttctcct ctaacctgga ccccagcctg gtggagcagg tgtttctgga taagaccctg     3900
aatgccagct cccactggct gggctccacc taccagctgg tggacatcca cgtgacagag     3960
atggagccaa gcgtgtacca gcccacctct agctcctcta cacagcactt ctacctgaac     4020
tttaccataa ctaatctgcc ctatagccag gatatcgccc agcctggcac cacaaactac     4080
cagcggaaca agagaaatat cgaggacgcc ctgaaccagc tgttcagaaa tagctccatc     4140
aagtcctatt tctctgattg ccaggtgagc acctttaggt ccgtgcctaa ttctcaccac     4200
acaggcgtgg actccctgtg cgccttttct ccactggcaa ggagagtgga tagggtggca     4260
atctacgagg agttcctgag gatgacccgc gccggaacac agctgcaggc ctttaccctg     4320
gacagatcta gcgtgctggt ggatggctat agccctaaca ggaatgagcc actgaccggc     4380
aactccgacc tgcccttctg ggccatcatc ctgatctgtc tggcaggcct gctgggcctg     4440
atcacctgcc tgatctgtgg ctttctggtg tgataa                               4476
<210>  2
<211>  1490
<212> Белок
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  Микросенсусный повтор MUC16  + повторы 59, 61, 62, 63
+ синтетический консенсусный карбокси-концевой домена
аминокислотной последовательности, кодирующей белок   pGX1435
<400>  2
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Thr Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
20                  25                  30
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His His Pro Gly Ser
35                  40                  45
Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro
50                  55                  60
Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
65                  70                  75                  80
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala
85                  90                  95
Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu
100                 105                 110
Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu
115                 120                 125
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
130                 135                 140
His Arg Ser Ser Val Pro Asn Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
145                 150                 155                 160
Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Ala
165                 170                 175
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn
180                 185                 190
Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn
195                 200                 205
Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn
210                 215                 220
Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
225                 230                 235                 240
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
245                 250                 255
Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp
260                 265                 270
Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr
275                 280                 285
Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser
290                 295                 300
Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr
305                 310                 315                 320
Ser Gly Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
325                 330                 335
Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu
340                 345                 350
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg
355                 360                 365
Val Leu Gln Gly Leu Leu Ser Pro Ile Phe Lys Asn Ser Ser Val Gly
370                 375                 380
Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Val Cys Leu Tyr His Pro Asn Pro
405                 410                 415
Lys Arg Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln
420                 425                 430
Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ser Leu Asp Arg Asp
435                 440                 445
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln Asn Ser Val Pro Thr Thr
450                 455                 460
Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Tyr Trp Ala Thr Thr Gly Thr Pro
465                 470                 475                 480
Ser Ser Phe Pro Gly His Thr Ala Pro Gly Pro Leu Leu Ile Pro Phe
485                 490                 495
Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu His Tyr Glu Glu Asn Met Gln
500                 505                 510
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly
515                 520                 525
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser
530                 535                 540
Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys His Gly Ala Ala Thr
545                 550                 555                 560
Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Gly Pro Gly
565                 570                 575
Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Ser
580                 585                 590
Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
595                 600                 605
Asn Gly Phe Asn Pro Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly
610                 615                 620
Thr Ser Thr Val His Leu Ala Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro
625                 630                 635                 640
Gly His Thr Ala Ser Pro Leu Leu Val Leu Phe Thr Ile Asn Phe Thr
645                 650                 655
Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met His His Pro Gly Ser Arg
660                 665                 670
Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Val
675                 680                 685
Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr
690                 695                 700
Leu Leu Arg Pro Lys Lys Asp Gly Ala Ala Thr Lys Val Asp Ala Ile
705                 710                 715                 720
Cys Thr Tyr Arg Pro Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln
725                 730                 735
Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly
740                 745                 750
Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr Gln
755                 760                 765
Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Ile Pro Gly Thr Pro Thr Val Asp
770                 775                 780
Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Val Ser Lys Pro Gly Pro Ser Ala Ala
785                 790                 795                 800
Ser His Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu
805                 810                 815
Arg Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr
820                 825                 830
Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser
835                 840                 845
Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu
850                 855                 860
Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro
865                 870                 875                 880
Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Leu Glu Leu
885                 890                 895
Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp
900                 905                 910
Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val Pro
915                 920                 925
Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe
930                 935                 940
Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser
945                 950                 955                 960
Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp Asn Val Met Lys His Leu Leu Ser Pro
965                 970                 975
Leu Phe Gln Arg Ser Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val
980                 985                 990
Ile Ala Leu Arg Ser Val Lys Asn  Gly Ala Glu Thr Arg  Val Asp Leu
995                 1000                 1005
Leu Cys  Thr Tyr Leu Gln Pro  Leu Ser Gly Pro Gly  Leu Pro Ile
1010                 1015                 1020
Lys Gln  Val Phe His Glu Leu  Ser Gln Gln Thr His  Gly Ile Thr
1025                 1030                 1035
Arg Leu  Gly Pro Tyr Ser Leu  Asp Lys Asp Ser Leu  Tyr Leu Asn
1040                 1045                 1050
Gly Tyr  Asn Glu Pro Gly Leu  Asp Glu Pro Pro Thr  Thr Pro Lys
1055                 1060                 1065
Pro Ala  Thr Thr Phe Leu Pro  Pro Leu Ser Glu Ala  Thr Thr Ala
1070                 1075                 1080
Met Gly  Tyr His Leu Lys Thr  Leu Thr Leu Asn Phe  Thr Ile Ser
1085                 1090                 1095
Asn Leu  Gln Tyr Ser Pro Asp  Met Gly Lys Gly Ser  Ala Thr Phe
1100                 1105                 1110
Asn Ser  Thr Glu Gly Val Leu  Gln His Leu Leu Arg  Pro Leu Phe
1115                 1120                 1125
Gln Lys  Ser Ser Met Gly Pro  Phe Tyr Leu Gly Cys  Gln Leu Ile
1130                 1135                 1140
Ser Leu  Arg Pro Glu Lys Asp  Gly Ala Ala Thr Gly  Val Asp Thr
1145                 1150                 1155
Thr Cys  Thr Tyr His Pro Asp  Pro Val Gly Pro Gly  Leu Asp Ile
1160                 1165                 1170
Gln Gln  Leu Tyr Trp Glu Leu  Ser Gln Leu Thr His  Gly Val Thr
1175                 1180                 1185
Gln Leu  Gly Phe Tyr Val Leu  Asp Arg Asp Ser Leu  Phe Ile Asn
1190                 1195                 1200
Gly Tyr  Ala Pro Gln Asn Leu  Ser Ile Arg Gly Glu  Tyr Gln Ile
1205                 1210                 1215
Asn Phe  His Ile Val Asn Trp  Asn Leu Ser Asn Pro  Asp Pro Thr
1220                 1225                 1230
Ser Ser  Glu Tyr Ile Ala Leu  Leu Arg Asp Ile Gln  Asp Lys Val
1235                 1240                 1245
Thr Thr  Leu Tyr Lys Gly Ser  Gln Leu His Asp Thr  Phe Arg Phe
1250                 1255                 1260
Cys Leu  Val Thr Asn Leu Thr  Met Asp Ser Met Leu  Val Thr Val
1265                 1270                 1275
Lys Ala  Leu Phe Ser Ser Asn  Leu Asp Pro Ser Leu  Val Glu Gln
1280                 1285                 1290
Val Phe  Leu Asp Lys Thr Leu  Asn Ala Ser Ser His  Trp Leu Gly
1295                 1300                 1305
Ser Thr  Tyr Gln Leu Val Asp  Ile His Val Thr Glu  Met Glu Pro
1310                 1315                 1320
Ser Val  Tyr Gln Pro Thr Ser  Ser Ser Ser Thr Gln  His Phe Tyr
1325                 1330                 1335
Leu Asn  Phe Thr Ile Thr Asn  Leu Pro Tyr Ser Gln  Asp Ile Ala
1340                 1345                 1350
Gln Pro  Gly Thr Thr Asn Tyr  Gln Arg Asn Lys Arg  Asn Ile Glu
1355                 1360                 1365
Asp Ala  Leu Asn Gln Leu Phe  Arg Asn Ser Ser Ile  Lys Ser Tyr
1370                 1375                 1380
Phe Ser  Asp Cys Gln Val Ser  Thr Phe Arg Ser Val  Pro Asn Ser
1385                 1390                 1395
His His  Thr Gly Val Asp Ser  Leu Cys Ala Phe Ser  Pro Leu Ala
1400                 1405                 1410
Arg Arg  Val Asp Arg Val Ala  Ile Tyr Glu Glu Phe  Leu Arg Met
1415                 1420                 1425
Thr Arg  Ala Gly Thr Gln Leu  Gln Ala Phe Thr Leu  Asp Arg Ser
1430                 1435                 1440
Ser Val  Leu Val Asp Gly Tyr  Ser Pro Asn Arg Asn  Glu Pro Leu
1445                 1450                 1455
Thr Gly  Asn Ser Asp Leu Pro  Phe Trp Ala Ile Ile  Leu Ile Cys
1460                 1465                 1470
Leu Ala  Gly Leu Leu Gly Leu  Ile Thr Cys Leu Ile  Cys Gly Phe
1475                 1480                 1485
Leu Val
1490
<210>  3
<211>  1932
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  MUC16 микроконсенсусный  повтор аминокислотной последовательности,
кодирующей белок  pGX1436
<400>  3
atggattgga cttggattct gttcctggtc gccgccgcaa ctcgggtgca ttctactgct       60
gctgggccac tgctggtgcc ttttacactg aacttcacca tcacaaatct gcagtacgag      120
gaggacatgc accaccctgg ctctcggaag ttcaacacca cagagagagt gctgcagggc      180
ctgctgggcc caatgtttaa gaataccagc gtgggcctgc tgtattccgg atgccggctg      240
acactgctga gatccgagaa ggacggagca gcaaccggag tggatgccat ctgtacacac      300
aggctggacc caaagtcccc aggcctggat agagagcagc tgtactggga gctgtctcag      360
ctgaccaacg gcatcaagga gctgggcccc tacacactgg accggaacag cctgtatgtg      420
aatggcttta cccacagaag ctccgtgcca aataccagca cacccggcac ctccacagtg      480
gatctgggca cctctggcac accttctagc ctgccaagcc ctaccgcagc aggaccactg      540
ctggtgccct tcacactgaa ctttaccatt accaatctgc agtatgaaga ggacatgagg      600
cacccaggct cccgcaagtt caacactacc gagcgggtgc tgcaaggcct gctgaagcct      660
ctgtttaaga atacctctgt gggcccactg tatagtggct gccggctgac actgctgcgg      720
cccgaaaaag acggagcagc aaccggcgtg gatgctattt gcacccacag gctggacccc      780
aagagcccag gcctgaaccg cgaacagctg tattgggagc tgtccaagct gaccaatggc      840
atcacagagc tgggccccta caccctggac agaaattccc tgtacgtgaa tggcttcacc      900
caccgcacat ctgtgcctac cacaagcacc ccaggcacct ccacagtgga tctgggcacc      960
tccggcacac ccttttccct gccatctcca accacagcag gacctctgct ggtgccattc     1020
accctgaact ttaccattac taatctgcag tatgaagaag acatgcacag gcctggctct     1080
cgcaagttca acactactga gagggtgctg cagggcctgt taagcccaat ctttaagaat     1140
tcctctgtgg gccctctgta ttccggatgc aggctgacct ctctgcgccc agaaaaagat     1200
ggagcagcaa caggaatgga tgccgtgtgc ctgtaccacc ctaacccaaa gcggcccggc     1260
ctggacaggg agcagctgta ttgggaactg agccagctga cccacaatat cacagagctg     1320
ggcccttact ctctggaccg cgatagcctg tatgtgaacg gcttcaccca ccagaattcc     1380
gtgcccacca catctacacc tggcaccagc acagtgtact gggccaccac aggcaccccc     1440
agctcctttc ctggacacac agcaccagga cctctgctga tccccttcac cctgaacttt     1500
accataacaa atctgcacta tgaggagaac atgcagcacc ctggcagcag gaagttcaat     1560
accacagagc gcgtgctgca aggcctgctg aagccgctgt ttaagaacac cagcgtggga     1620
ccactgtaca gcggctgcag gctgaccctg ctgcgccctg agaagcatgg cgccgccacc     1680
ggcgtggatg ctatctgcac acatagactg gaccccaagg gacctggcct ggatagggag     1740
agactgtact gggaactgtc ccagctgacc aactcaatta cagagctggg cccatacacc     1800
ctggaccggg attctctgta cgtgaacggc ttcaatccaa gatctagcgt ccctaccaca     1860
tctacccctg ggacaagtac cgtgcatctg gctacaagcg gaactccttc aagtctgcct     1920
ggacactgat aa                                                         1932
<210>  4
<211>  642
<212> Белок
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>   MUC16  консенсусный повтор  аминокислотной последовательности,
кодирующей белок  pGX1436
<400>  4
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Thr Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
20                  25                  30
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His His Pro Gly Ser
35                  40                  45
Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro
50                  55                  60
Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
65                  70                  75                  80
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala
85                  90                  95
Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu
100                 105                 110
Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu
115                 120                 125
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
130                 135                 140
His Arg Ser Ser Val Pro Asn Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
145                 150                 155                 160
Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Ala
165                 170                 175
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn
180                 185                 190
Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn
195                 200                 205
Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn
210                 215                 220
Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
225                 230                 235                 240
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
245                 250                 255
Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp
260                 265                 270
Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr
275                 280                 285
Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser
290                 295                 300
Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr
305                 310                 315                 320
Ser Gly Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
325                 330                 335
Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu
340                 345                 350
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg
355                 360                 365
Val Leu Gln Gly Leu Leu Ser Pro Ile Phe Lys Asn Ser Ser Val Gly
370                 375                 380
Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Val Cys Leu Tyr His Pro Asn Pro
405                 410                 415
Lys Arg Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln
420                 425                 430
Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ser Leu Asp Arg Asp
435                 440                 445
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln Asn Ser Val Pro Thr Thr
450                 455                 460
Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Tyr Trp Ala Thr Thr Gly Thr Pro
465                 470                 475                 480
Ser Ser Phe Pro Gly His Thr Ala Pro Gly Pro Leu Leu Ile Pro Phe
485                 490                 495
Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu His Tyr Glu Glu Asn Met Gln
500                 505                 510
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly
515                 520                 525
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser
530                 535                 540
Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys His Gly Ala Ala Thr
545                 550                 555                 560
Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Gly Pro Gly
565                 570                 575
Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Ser
580                 585                 590
Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
595                 600                 605
Asn Gly Phe Asn Pro Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly
610                 615                 620
Thr Ser Thr Val His Leu Ala Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro
625                 630                 635                 640
Gly His
<210>  5
<211>  2136
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  MUC16 повторы 61, 62, 63 + синтетический консенснсный карбокси-концевой
домен  аминокислотной последовательности, кодирующей белок  pGX 1437
<400>  5
atggactgga cttggattct gttcctggtc gctgccgcca cccgcgtgca tagtgccgca       60
tctcacctgc tgattctgtt caccctgaac ttcaccatca caaatctgcg gtacgaggag      120
aacatgtggc caggcagccg caagttcaat accacagagc gggtgctgca gggcctgctg      180
cggcccctgt ttaagaacac ctccgtgggc cccctgtatt ctggcagcag gctgaccctg      240
ctgcgcccag agaaggacgg agaggcaaca ggcgtggatg ccatctgcac ccacaggcct      300
gacccaacag gaccaggcct ggatagggag cagctgtacc tggagctgag ccagctgacc      360
cactccatca cagagctggg accatacacc ctggacaggg attccctgta tgtgaacggc      420
tttacccaca gaagctccgt gcccaccaca tctacaggcg tggtgagcga ggagcccttc      480
accctgaact tcaccatcaa caatctgagg tacatggcag acatgggaca gccaggcagc      540
ctgaagttca acatcaccga taatgtgatg aagcacctgc tgtcccctct gtttcagcgg      600
tctagcctgg gagcaaggta caccggctgc agagtgatcg ccctgaggtc cgtgaagaac      660
ggagcagaga cacgggtgga cctgctgtgc acatatctgc agcctctgag cggaccaggc      720
ctgcctatca agcaggtgtt ccacgagctg tctcagcaga cccacggaat cacacgcctg      780
ggaccttact ccctggacaa ggattctctg tacctgaacg gctataatga gccaggcctg      840
gacgagcccc ctaccacacc caagcctgcc accacatttc tgccacccct gagcgaggca      900
accacagcaa tgggatacca cctgaagacc ctgacactga acttcaccat cagcaatctg      960
cagtattccc ccgatatggg caagggctct gccaccttta atagcacaga gggcgtgctg     1020
cagcacctgc tgaggcctct gttccagaag tcctctatgg gccccttcta cctgggatgc     1080
cagctgatct ccctgcgccc tgagaaggac ggagcagcaa ccggagtgga taccacatgt     1140
acataccacc cagaccccgt gggaccaggc ctggatatcc agcagctgta ttgggaactg     1200
tcccagctga cccacggcgt gacacagctg ggcttctatg tgctggaccg ggattctctg     1260
tttatcaacg gctacgcccc tcagaatctg agcatcagag gcgagtatca gatcaacttc     1320
cacatcgtga actggaatct gtctaatcct gatccaacca gctccgagta catcgccctg     1380
ctgcgggaca tccaggataa ggtgaccaca ctgtataagg gcagccagct gcacgacacc     1440
ttcagatttt gtctggtgac caacctgaca atggattcca tgctggtgac agtgaaggcc     1500
ctgttctcta gcaacctgga cccttctctg gtggagcagg tgtttctgga taagaccctg     1560
aatgcctcct ctcactggct gggctctacc taccagctgg tggacatcca cgtgacagag     1620
atggagccaa gcgtgtatca gcccaccagc tcctctagca cacagcactt ctacctgaac     1680
tttaccatca caaatctgcc ctatagccag gatatcgccc agcctggcac cacaaactac     1740
cagaggaaca agcgcaatat cgaggacgcc ctgaaccagc tgttcaggaa ttcctctatc     1800
aagtcctatt tctctgattg ccaggtgagc acctttcgct ccgtgccaaa ttctcaccac     1860
acaggcgtgg actccctgtg cgccttttct cccctggcac ggagagtgga tagggtggca     1920
atctacgagg agttcctgcg gatgaccaga gccggcacac agctgcaggc ctttaccctg     1980
gacaggagct ccgtgctggt ggatggctat agccctaacc gcaatgagcc actgacaggc     2040
aattccgacc tgcccttctg ggccatcatc ctgatttgcc tggctggact gctggggctg     2100
attacctgtc tgatttgtgg gttcctggtg tgataa                               2136
<210>  6
<211>  710
<212> Белок
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  MUC16 повторы 61, 62, 63 + синтетический консенсусный усеченный карбокси-концевой
домен  аминокислотной последовательности, кодирующей белок pGX 1437
<400>  6
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Ala Ala Ser His Leu Leu Ile Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr
20                  25                  30
Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys
35                  40                  45
Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe
50                  55                  60
Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Leu Thr Leu
65                  70                  75                  80
Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys
85                  90                  95
Thr His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu
100                 105                 110
Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro
115                 120                 125
Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg
130                 135                 140
Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly Val Val Ser Glu Glu Pro Phe
145                 150                 155                 160
Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu Arg Tyr Met Ala Asp Met Gly
165                 170                 175
Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile Thr Asp Asn Val Met Lys His
180                 185                 190
Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Thr
195                 200                 205
Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr
210                 215                 220
Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly
225                 230                 235                 240
Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly
245                 250                 255
Ile Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu
260                 265                 270
Asn Gly Tyr Asn Glu Pro Gly Leu Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys
275                 280                 285
Pro Ala Thr Thr Phe Leu Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met
290                 295                 300
Gly Tyr His Leu Lys Thr Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu
305                 310                 315                 320
Gln Tyr Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr
325                 330                 335
Glu Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser
340                 345                 350
Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro Glu
355                 360                 365
Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr His Pro
370                 375                 380
Asp Pro Val Gly Pro Gly Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu
385                 390                 395                 400
Ser Gln Leu Thr His Gly Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr Val Leu Asp
405                 410                 415
Arg Asp Ser Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Ala Pro Gln Asn Leu Ser Ile
420                 425                 430
Arg Gly Glu Tyr Gln Ile Asn Phe His Ile Val Asn Trp Asn Leu Ser
435                 440                 445
Asn Pro Asp Pro Thr Ser Ser Glu Tyr Ile Ala Leu Leu Arg Asp Ile
450                 455                 460
Gln Asp Lys Val Thr Thr Leu Tyr Lys Gly Ser Gln Leu His Asp Thr
465                 470                 475                 480
Phe Arg Phe Cys Leu Val Thr Asn Leu Thr Met Asp Ser Met Leu Val
485                 490                 495
Thr Val Lys Ala Leu Phe Ser Ser Asn Leu Asp Pro Ser Leu Val Glu
500                 505                 510
Gln Val Phe Leu Asp Lys Thr Leu Asn Ala Ser Ser His Trp Leu Gly
515                 520                 525
Ser Thr Tyr Gln Leu Val Asp Ile His Val Thr Glu Met Glu Pro Ser
530                 535                 540
Val Tyr Gln Pro Thr Ser Ser Ser Ser Thr Gln His Phe Tyr Leu Asn
545                 550                 555                 560
Phe Thr Ile Thr Asn Leu Pro Tyr Ser Gln Asp Ile Ala Gln Pro Gly
565                 570                 575
Thr Thr Asn Tyr Gln Arg Asn Lys Arg Asn Ile Glu Asp Ala Leu Asn
580                 585                 590
Gln Leu Phe Arg Asn Ser Ser Ile Lys Ser Tyr Phe Ser Asp Cys Gln
595                 600                 605
Val Ser Thr Phe Arg Ser Val Pro Asn Ser His His Thr Gly Val Asp
610                 615                 620
Ser Leu Cys Ala Phe Ser Pro Leu Ala Arg Arg Val Asp Arg Val Ala
625                 630                 635                 640
Ile Tyr Glu Glu Phe Leu Arg Met Thr Arg Ala Gly Thr Gln Leu Gln
645                 650                 655
Ala Phe Thr Leu Asp Arg Ser Ser Val Leu Val Asp Gly Tyr Ser Pro
660                 665                 670
Asn Arg Asn Glu Pro Leu Thr Gly Asn Ser Asp Leu Pro Phe Trp Ala
675                 680                 685
Ile Ile Leu Ile Cys Leu Ala Gly Leu Leu Gly Leu Ile Thr Cys Leu
690                 695                 700
Ile Cys Gly Phe Leu Val
705                 710
<210>  7
<211>  4029
<212>  ДНК
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  MUC16 микросенсунсные повторы с сайтом расщепления перед повторами
61, 62, 63  + синтетический  консенсунсный  карбокси-концевой
домен  аминокислотной последовательности, кодирующей белок pGX1438
<400>  7
atggactgga cctggattct gttcctggtg gcagcagcaa ccagggtgca ctccacagca       60
gcaggacctc tgctggtgcc attcaccctg aactttacca tcacaaatct gcagtacgag      120
gaggatatgc accaccccgg cagccgcaag ttcaacacca cagagcgggt gctgcagggc      180
ctgctgggac ctatgtttaa gaataccagc gtgggcctgc tgtattccgg atgcaggctg      240
acactgctgc gctccgagaa ggacggagca gcaaccggcg tggatgccat ctgtacacac      300
aggctggacc caaagtctcc cggcctggat cgcgagcagc tgtactggga gctgagccag      360
ctgaccaacg gcatcaagga gctgggcccc tacacactgg accggaacag cctgtatgtg      420
aatggcttca cccacagaag ctccgtgcca aatacctcca cacccggcac ctctacagtg      480
gatctgggca cctctggcac accctctagc ctgcctagcc caaccgcagc aggaccactg      540
ctggtgcctt tcacactgaa ctttaccatt accaatctgc agtatgaaga ggacatgcgg      600
caccctggca gcagaaagtt caacactacc gagcgcgtgc tgcaaggcct gctgaagcca      660
ctgtttaaga atacctctgt gggccccctg tatagtggct gtagactgac actgctgcgc      720
cctgaaaaag atggcgccgc cactggagtc gacgctattt gcacccacag gctggacccc      780
aagtccccag gcctgaacag agaacagctg tattgggagc tgtctaagct gaccaatggc      840
atcacagagc tgggcccata caccctggac aggaactctc tgtacgtcaa tggcttcacc      900
caccgcacaa gcgtgcctac cacatccacc ccaggcacct ctaccgtcga tctgggcacc      960
agcggcacac cattttccct gccatctcct accaccgccg gaccactgct ggtgcccttc     1020
accctgaact ttaccataac caatctgcag tatgaggagg acatgcaccg gcccggctct     1080
agaaagttca acactactga acgggtgctg caaggcctgt taagccctat ctttaagaat     1140
tcctctgtgg gcccactgta cagcggatgc aggctgacct ctctgcggcc cgaaaaagac     1200
ggagcagcaa caggaatgga tgccgtgtgc ctgtaccacc caaaccccaa gaggcctggc     1260
ctggacagag agcagctgta ttgggaactg tcccagctga cccacaatat cacagagctg     1320
ggcccctaca gcctggacag agattccctg tatgtgaacg gcttcaccca ccagaattct     1380
gtgcccacca caagcacacc tggcacctcc acagtgtact gggccaccac aggcacccct     1440
agctcctttc caggacacac agcacctgga ccactgctga tccctttcac cctgaacttt     1500
accattacaa atctgcacta tgaggagaac atgcagcacc caggcagcag aaagttcaat     1560
accacagaga gggtgctgca aggcctgctg aagccgctgt ttaagaacac cagcgtggga     1620
cctctgtact ctggctgtcg cctgacactg ctgcggcccg agaagcatgg cgcagcaacc     1680
ggcgtggacg ctatttgcac tcatagactg gaccccaagg gacctggcct ggatagggag     1740
agactgtact gggaactgtc tcagctgacc aattccatta cagagctggg cccttacacc     1800
ctggaccggg acagcctgta cgtcaacggc ttcaatccaa gatctagcgt gcccaccaca     1860
tccacccctg gcacctctac agtgcacctg gccaccagcg gaacaccctc ctctctgcct     1920
ggacacaggg gaaggaagcg gagaagcgcc gcatcccacc tgctgatcct gttcaccctg     1980
aactttacca taacgaatct gagatacgag gagaacatgt ggcctggctc ccgcaagttc     2040
aatactaccg aacgggtgct gcagggcctg ctgcggcccc tgtttaagaa cacttccgtg     2100
ggccccctgt attctggcag caggctgacc ctgctgcgcc cagagaagga cggagaggca     2160
acaggcgtgg atgccatctg cacccacagg cccgacccta caggaccagg cctggatagg     2220
gagcagctgt acctggagct gtcccagctg actcactcaa ttaccgaact gggaccttac     2280
accctggaca gggatagtct gtacgtgaat ggcttcaccc atcgcagctc cgtgccaacc     2340
acatctacag gcgtggtgag cgaggaaccc ttcaccctga acttcaccat caacaatctg     2400
aggtacatgg ccgacatggg ccagccaggc tccctgaagt tcaacatcac cgataatgtg     2460
atgaagcacc tgctgtctcc cctgtttcag aggtctagcc tgggagcaag gtacaccgga     2520
tgcagagtga tcgccctgag gtccgtgaag aacggagcag agacacgggt ggacctgctg     2580
tgcacatatc tgcagcctct gagcggacca ggcctgccca tcaagcaggt gttccacgag     2640
ctgtcccagc agacccacgg aatcacaagg ctgggacctt actccctgga caaggattct     2700
ctgtacctga acggctataa tgagccaggc ctggacgagc cccctaccac accaaagccc     2760
gccaccacat ttctgccacc cctgagcgag gcaaccacag caatgggata ccacctgaag     2820
accctgacac tgaacttcac catcagcaat ctgcagtatt cccccgatat gggcaagggc     2880
tctgccacct ttaacagcac agagggcgtg ctgcagcacc tgctgcggcc tctgttccag     2940
aagtcctcta tgggcccctt ctacctggga tgccagctga tctccctgcg gcccgaaaag     3000
gatggagcag caaccggagt ggataccaca tgtacatacc accctgaccc agtgggacca     3060
ggcctggata tccagcaatt atattgggaa ctgagtcagc tgacccacgg cgtgacacag     3120
ctgggcttct atgtgctgga cagggatagc ctgtttatca acggctacgc cccacagaat     3180
ctgtccatcc gcggcgagta tcagatcaac ttccacatcg tgaactggaa tctgagcaat     3240
cccgacccta ccagctccga gtacatcgcc ctgctgaggg acatccagga taaggtgacc     3300
acactgtata agggctccca gctgcacgac accttccgct tttgcctggt gaccaacctg     3360
acaatggatt ctatgctggt gacagtgaag gccctgttct ctagcaacct ggaccccagc     3420
ctggtggagc aggtgtttct ggataagacc ctgaatgcct cctctcactg gctgggcagc     3480
acctaccagc tggtggacat ccacgtgaca gagatggagc catccgtgta tcagcccacc     3540
agctcctcta gcacacagca cttctacctg aactttacca taactaatct gccctatagc     3600
caggatatcg cccagcctgg caccacaaac taccagcgga acaagagaaa tatcgaggac     3660
gccctgaacc agctgttccg gaattcctct atcaagtctt atttcagcga ttgccaggtg     3720
tccaccttta gatctgtgcc aaatagccac cacacaggcg tggactccct gtgcgccttt     3780
tctcccctgg caaggagggt ggatagggtg gcaatctacg aggagttcct gaggatgacc     3840
cgcgccggaa cacagctgca ggcctttacc ctggaccgga gctccgtgct ggtggatggc     3900
tattccccta acagaaatga gccactgaca ggcaactctg acctgccctt ctgggccatc     3960
atcctgatct gtctggcagg cctgctgggc ctgatcacct gcctgatctg tggctttctg     4020
gtgtgataa                                                             4029
<210>  8
<211>  1341
<212> Белок
<213>  искусственная последовательность
<220>
<223>  MUC16 микросенсунсные повторы с сайтом расщепления перед повторами
61, 62, 63 + синтетический  консенсусный карбокси-концевой
домен  аминокислотной последовательности, кодирующей белок  pGX1438
<400>  8
Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val
1. 5                   10                  15
His Ser Thr Ala Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe
20                  25                  30
Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met His His Pro Gly Ser
35                  40                  45
Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Gly Pro
50                  55                  60
Met Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Leu Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu
65                  70                  75                  80
Thr Leu Leu Arg Ser Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala
85                  90                  95
Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asp Arg Glu
100                 105                 110
Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Gly Ile Lys Glu Leu
115                 120                 125
Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr
130                 135                 140
His Arg Ser Ser Val Pro Asn Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val
145                 150                 155                 160
Asp Leu Gly Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro Ser Pro Thr Ala
165                 170                 175
Ala Gly Pro Leu Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn
180                 185                 190
Leu Gln Tyr Glu Glu Asp Met Arg His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn
195                 200                 205
Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn
210                 215                 220
Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg
225                 230                 235                 240
Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His
245                 250                 255
Arg Leu Asp Pro Lys Ser Pro Gly Leu Asn Arg Glu Gln Leu Tyr Trp
260                 265                 270
Glu Leu Ser Lys Leu Thr Asn Gly Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr
275                 280                 285
Leu Asp Arg Asn Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Thr Ser
290                 295                 300
Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Asp Leu Gly Thr
305                 310                 315                 320
Ser Gly Thr Pro Phe Ser Leu Pro Ser Pro Thr Thr Ala Gly Pro Leu
325                 330                 335
Leu Val Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Gln Tyr Glu
340                 345                 350
Glu Asp Met His Arg Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg
355                 360                 365
Val Leu Gln Gly Leu Leu Ser Pro Ile Phe Lys Asn Ser Ser Val Gly
370                 375                 380
Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ala Ala Thr Gly Met Asp Ala Val Cys Leu Tyr His Pro Asn Pro
405                 410                 415
Lys Arg Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln
420                 425                 430
Leu Thr His Asn Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Ser Leu Asp Arg Asp
435                 440                 445
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Gln Asn Ser Val Pro Thr Thr
450                 455                 460
Ser Thr Pro Gly Thr Ser Thr Val Tyr Trp Ala Thr Thr Gly Thr Pro
465                 470                 475                 480
Ser Ser Phe Pro Gly His Thr Ala Pro Gly Pro Leu Leu Ile Pro Phe
485                 490                 495
Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu His Tyr Glu Glu Asn Met Gln
500                 505                 510
His Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln Gly
515                 520                 525
Leu Leu Lys Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr Ser
530                 535                 540
Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys His Gly Ala Ala Thr
545                 550                 555                 560
Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Leu Asp Pro Lys Gly Pro Gly
565                 570                 575
Leu Asp Arg Glu Arg Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr Asn Ser
580                 585                 590
Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr Val
595                 600                 605
Asn Gly Phe Asn Pro Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Pro Gly
610                 615                 620
Thr Ser Thr Val His Leu Ala Thr Ser Gly Thr Pro Ser Ser Leu Pro
625                 630                 635                 640
Gly His Arg Gly Arg Lys Arg Arg Ser Ala Ala Ser His Leu Leu Ile
645                 650                 655
Leu Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Thr Asn Leu Arg Tyr Glu Glu Asn
660                 665                 670
Met Trp Pro Gly Ser Arg Lys Phe Asn Thr Thr Glu Arg Val Leu Gln
675                 680                 685
Gly Leu Leu Arg Pro Leu Phe Lys Asn Thr Ser Val Gly Pro Leu Tyr
690                 695                 700
Ser Gly Ser Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Glu Ala
705                 710                 715                 720
Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro Thr Gly Pro
725                 730                 735
Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Leu Glu Leu Ser Gln Leu Thr His
740                 745                 750
Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp Ser Leu Tyr
755                 760                 765
Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr Ser Thr Gly
770                 775                 780
Val Val Ser Glu Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile Asn Asn Leu
785                 790                 795                 800
Arg Tyr Met Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys Phe Asn Ile
805                 810                 815
Thr Asp Asn Val Met Lys His Leu Leu Ser Pro Leu Phe Gln Arg Ser
820                 825                 830
Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala Leu Arg Ser
835                 840                 845
Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys Thr Tyr Leu
850                 855                 860
Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val Phe His Glu
865                 870                 875                 880
Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro Tyr Ser Leu
885                 890                 895
Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu Pro Gly Leu Asp
900                 905                 910
Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr Phe Leu Pro Pro Leu
915                 920                 925
Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met Gly Tyr His Leu Lys Thr Leu Thr Leu
930                 935                 940
Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr Ser Pro Asp Met Gly Lys Gly
945                 950                 955                 960
Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu Gly Val Leu Gln His Leu Leu Arg
965                 970                 975
Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser Met Gly Pro Phe Tyr Leu Gly Cys Gln
980                 985                 990
Leu Ile Ser Leu Arg Pro Glu Lys  Asp Gly Ala Ala Thr  Gly Val Asp
995                 1000                 1005
Thr Thr  Cys Thr Tyr His Pro  Asp Pro Val Gly Pro  Gly Leu Asp
1010                 1015                 1020
Ile Gln  Gln Leu Tyr Trp Glu  Leu Ser Gln Leu Thr  His Gly Val
1025                 1030                 1035
Thr Gln  Leu Gly Phe Tyr Val  Leu Asp Arg Asp Ser  Leu Phe Ile
1040                 1045                 1050
Asn Gly  Tyr Ala Pro Gln Asn  Leu Ser Ile Arg Gly  Glu Tyr Gln
1055                 1060                 1065
Ile Asn  Phe His Ile Val Asn  Trp Asn Leu Ser Asn  Pro Asp Pro
1070                 1075                 1080
Thr Ser  Ser Glu Tyr Ile Ala  Leu Leu Arg Asp Ile  Gln Asp Lys
1085                 1090                 1095
Val Thr  Thr Leu Tyr Lys Gly  Ser Gln Leu His Asp  Thr Phe Arg
1100                 1105                 1110
Phe Cys  Leu Val Thr Asn Leu  Thr Met Asp Ser Met  Leu Val Thr
1115                 1120                 1125
Val Lys  Ala Leu Phe Ser Ser  Asn Leu Asp Pro Ser  Leu Val Glu
1130                 1135                 1140
Gln Val  Phe Leu Asp Lys Thr  Leu Asn Ala Ser Ser  His Trp Leu
1145                 1150                 1155
Gly Ser  Thr Tyr Gln Leu Val  Asp Ile His Val Thr  Glu Met Glu
1160                 1165                 1170
Pro Ser  Val Tyr Gln Pro Thr  Ser Ser Ser Ser Thr  Gln His Phe
1175                 1180                 1185
Tyr Leu  Asn Phe Thr Ile Thr  Asn Leu Pro Tyr Ser  Gln Asp Ile
1190                 1195                 1200
Ala Gln  Pro Gly Thr Thr Asn  Tyr Gln Arg Asn Lys  Arg Asn Ile
1205                 1210                 1215
Glu Asp  Ala Leu Asn Gln Leu  Phe Arg Asn Ser Ser  Ile Lys Ser
1220                 1225                 1230
Tyr Phe  Ser Asp Cys Gln Val  Ser Thr Phe Arg Ser  Val Pro Asn
1235                 1240                 1245
Ser His  His Thr Gly Val Asp  Ser Leu Cys Ala Phe  Ser Pro Leu
1250                 1255                 1260
Ala Arg  Arg Val Asp Arg Val  Ala Ile Tyr Glu Glu  Phe Leu Arg
1265                 1270                 1275
Met Thr  Arg Ala Gly Thr Gln  Leu Gln Ala Phe Thr  Leu Asp Arg
1280                 1285                 1290
Ser Ser  Val Leu Val Asp Gly  Tyr Ser Pro Asn Arg  Asn Glu Pro
1295                 1300                 1305
Leu Thr  Gly Asn Ser Asp Leu  Pro Phe Trp Ala Ile  Ile Leu Ile
1310                 1315                 1320
Cys Leu  Ala Gly Leu Leu Gly  Leu Ile Thr Cys Leu  Ile Cys Gly
1325                 1330                 1335
Phe Leu  Val
1340
<---