Отличные от человека животные, имеющие гуманизированный локус фактора свертывания крови 12

F12,
F12
F12
.
1. Отличное от человека животное, имеющее в своем геноме гуманизированный эндогенный локус в котором сегмент эндогенного локуса  удален и заменен соответствующей последовательностью человека
F12
2. Отличное от человека животное по п. 1, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус кодирует белок, содержащий тяжелую цепь фактора свертывания крови XII человека.
F12
3. Отличное от человека животное по п. 1 или 2, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус  кодирует белок, содержащий легкую цепь фактора свертывания крови XII человека.
F12
4. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус кодирует белок, содержащий сигнальный пептид фактора свертывания крови XII человека.
F12,
F12
5. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что область эндогенного локуса содержащая как кодирующую последовательность, так и некодирующую последовательность, была удалена и заменена соответствующей последовательностью человека, содержащей как кодирующую последовательность, так и некодирующую последовательность.
F12
F12
F12
F12.
6. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус содержит эндогенный промотор , при этом последовательность  человека функционально связана с эндогенным промотором
F12
F12
.
7. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что по меньшей мере один интрон и по меньшей мере один экзон эндогенного локуса были удалены и заменены соответствующей последовательностью человека
F12
F12
F12
.
8. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что вся кодирующей последовательность эндогенного локуса была удалена и заменена соответствующей последовательностью человека
F12
F12
.
9. Отличное от человека животное по п. 8, отличающееся тем, что область эндогенного локуса  от стартового кодона до стоп-кодона была удалена и заменена соответствующей последовательностью человека
F12
F12
.
10. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что эндогенная 3'-нетранслируемая область  не была удалена и заменена соответствующей последовательностью человека
F12
F12
.
11. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что эндогенная 5'-нетранслируемая область  не была удалена и заменена соответствующей последовательностью человека
F12
F12
12. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что область эндогенного локуса от стартового кодона до стоп-кодона была удалена и заменена соответствующей последовательностью человека, и
F12
F12
.
где эндогенный промотор не был удален и заменен соответствующей последовательностью человека
13. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что
F12
F12
(i) последовательность человеческого  в гуманизированном эндогенном локусе содержит последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31 или 32; и/или
F12
(ii) гуманизированный эндогенный локус  кодирует белок, содержащий последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 5 или 46; и/или
F12
(iii) гуманизированный эндогенный локус содержит кодирующую последовательность, содержащую последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13 или 48; и/или
F12
(iv) гуманизированный эндогенный локус  содержит последовательность, которая на по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, указанной в SEQ ID NO: 17 или 18.
F12
F12
F12
14. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что гуманизированный эндогенный локус содержит селекционную кассету или репортерный ген в интроне соответствующей последовательности человека, или при этом гуманизированный эндогенный локус не содержит селекционную кассету или репортерный ген.
F12.
15. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное является гомозиготным по гуманизированному эндогенному локусу
F12
16. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное имеет гуманизированный эндогенный локус в своей зародышевой линии.
17. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное является млекопитающим.
18. Отличное от человека животное по п. 17, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное представляет собой крысу или мышь.
19. Отличное от человека животное по п. 18, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное представляет собой мышь.
20. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что у указанного отличного от человека животного в головном мозге экспрессируется короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека.
21. Отличное от человека животное по п. 20, отличающееся тем, что
F12,
F12
,
F12
(i) короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека кодируется мРНК  обнаруживаемой зондами против экзонов 11-14 человека но не зондами против экзонов 1-6 человека; и/или
297-596
(ii) короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека представляет собой FXII; и/или
(iii) короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека экспрессируется в нейронах головного мозга; и/или
(iv) короткая изоформа фактора свертывания крови XII человека может быть активирована калликреином плазмы и превращать про-ФРГ в активный ФРГ.
22. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что указанное отличное от человека животное имеет активированное частичное тромбопластиновое время (аЧТВ), которое существенно не отличается от аЧТВ у соответствующего отличного от человека животного и/или при этом у отличного от человека животного протромбиновое время (ПВ) существенно не отличается от ПВ у соответствующего отличного от человека животного дикого типа.
23. Отличное от человека животное по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что уровни фактора свертывания крови XII человека в плазме крови указанного отличного от человека животного составляют по меньшей мере около 5 мкг/мл.
F12,
F12
F12
.
24. Клетка отличного от человека животного, содержащая в своем геноме гуманизированный эндогенный локус в котором сегмент эндогенного локуса  удален и заменен соответствующей последовательностью человека
F12,
F12
F12
.
25. Геном отличного от человека животного, содержащий гуманизированный эндогенный локус в котором сегмент эндогенного локуса удален и заменен соответствующей последовательностью человека
F12,
F12
F12
F12
F12,
F12.
26. Нацеленный вектор для создания гуманизированного эндогенного локуса  в котором сегмент эндогенного локуса  удален и заменен соответствующей последовательностью человека, причем нацеленный вектор содержит вставку нуклеиновой кислоты, содержащую соответствующую последовательность человека, фланкированную 5'-плечом гомологии, нацеленным на 5'-последовательность-мишень в эндогенном локусе и 3'-плечом гомологии, нацеленным на 3'-последовательность-мишень в эндогенном локусе
F12
F12
F12
.
27. Гуманизированный ген  отличного от человека животного, в котором сегмент эндогенного локуса  удален и заменен соответствующей последовательностью человека
in vivo
28. Способ оценки активности реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, , включающий
а) введение реагента, нацеленного фактор свертывания крови XII человека, отличному от человека животному по любому из пп. 1-23; и
(б) оценку активности реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, у отличного от человека животного.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что введение включает опосредованную аденоассоциированным вирусом (AAV) доставку, опосредованную липидными наночастицами (ЛНЧ) доставку, гидродинамическую доставку (HDD - англ.: hydrodynamic delivery) или инъекцию.
30. Способ по п. 28 или п. 29, отличающийся тем, что стадия (b) включает выделение плазмы отличного от человека животного и оценку активности реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, в плазме.
31. Способ по любому из пп. 28-30, отличающийся тем, что стадия (b) включает оценку активности реагента, нацеленного на фактор свертывания XII человека, в печени или головном мозге отличного от человека животного.
32. Способ по любому из пп. 28-31, отличающийся тем, что стадия (b) включает оценку свертывания крови или образования тромбина.
33. Способ по любому из пп. 28-32, отличающийся тем, что стадия (b) включает оценку сигналинга ФРГ-Met.
F12,
F12.
34. Способ по любому из пп. 28-33, отличающийся тем, что стадия (b) включает измерение экспрессии матричной РНК кодируемой гуманизированным эндогенным локусом
35. Способ по любому из пп. 28-34, отличающийся тем, что стадия (b) включает измерение экспрессии белка-фактора свертывания крови XII, кодируемого гуманизированным эндогенным локусом фактора свертывания крови XII.
F12.
36. Способ по любому из пп. 28-35, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, представляет собой агент для редактирования генома, и стадия (b) включает оценку модификации гуманизированного эндогенного локуса
F12.
37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что стадия (b) включает измерение частоты вставок или делеций в гуманизированном эндогенном локусе
F12
38. Способ по любому из пп. 28-37, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, содержит нуклеазный агент, предназначенный для нацеливания на область гена человека.
F12
39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что нуклеазный агент содержит белок Cas и направляющую РНК, предназначенную для нацеливания на последовательность-мишень направляющей РНК в гене человека.
40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.
F12
41. Способ по любому из пп. 28-40, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, содержит экзогенную донорную нуклеиновую кислоту, где экзогенная донорная нуклеиновая кислота предназначена для нацеливания на ген  человека, и, необязательно, при этом экзогенную донорную нуклеиновую кислоту доставляют через AAV.
42. Способ по любому из пп. 28-35, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, представляет собой агент РНКи или антисмысловой олигонуклеотид.
43. Способ по любому из пп. 28-35, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, представляет собой антигенсвязывающий белок.
44. Способ по любому из пп. 28-35, отличающийся тем, что реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, представляет собой небольшую молекулу.
in vivo
45. Способ оптимизации активности реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, , включающий
F12
(I) выполнение способа по любому из пп. 28-44 в первый раз на первом отличном от человека животном, имеющем в своем геноме гуманизированный эндогенный локус ;
F12
(II) изменение переменной и выполнение способа стадии (I) второй раз с измененной переменной на втором отличном от человека животном, имеющем в своем геноме гуманизированный эндогенный локус ; и
(III) сравнение активности реагента, нацеленного на фактор XII человека, на стадии (I) с активностью реагента, нацеленного на фактор XII человека, на стадии (II), и выбор способа, обеспечивающего более высокую активность.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ доставки, в котором реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, вводят отличному от человека животному.
47. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой способ введения реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, отличному от человека животному.
48. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой концентрацию или количество реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, введенного отличному от человека животному.
49. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой форму реагента, нацеленного на фактор свертывания крови XII человека, введенного отличному от человека животному.
50. Способ по п. 45, отличающийся тем, что измененная переменная на стадии (II) представляет собой реагент, нацеленный на фактор свертывания крови XII человека, введенный отличному от человека животному.
51. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-23, включающий
F12,
F12
F12
(а) введение в эмбрион отличного от человека животного-хозяина, генетически модифицированной эмбриональной стволовой (ЭС) клетки отличного от человека животного, содержащей в своем геноме гуманизированный эндогенный локус в котором сегмент эндогенного локуса был удален и заменен соответствующей последовательностью  человека; и
F12.
(b) вынашивание эмбриона отличного от человека животного-хозяина суррогатной матерью, причем суррогатная мать производит генетически модифицированное отличное от человека животное потомства F0, имеющее гуманизированный эндогенный локус
52. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-23, включающий:
F12
F12,
F12,
(а) введение в эмбриональную стволовую (ЭС) клетку отличного от человека животного нацеленного вектора, содержащего вставку нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность человека, фланкированную 5’-плечом гомологии, соответствующим 5'-последовательности-мишени в эндогенном локусе  и 3’-плечом гомологии, соответствующим 3’-последовательности-мишени в эндогенном локусе
F12
F12,
F12
где нацеленный вектор рекомбинирует с эндогенным локусом с образованием генетически модифицированной ЭС клетки отличного от человека животного, содержащей в своем геноме гуманизированный эндогенный локус  содержащий последовательность человека;
(b) введение генетически модифицированной ЭС клетки отличного от человека животного в эмбрион отличного от человека животного-хозяина;
F12,
F12
.
(c) вынашивание эмбриона отличного от человека животного-хозяина суррогатной матерью, при этом суррогатная мать производит модифицированное отличное от человека животное потомства F0, имеющее в своем геноме гуманизированный эндогенный локус  содержащий последовательность человека
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что нацеленный вектор представляет собой большой нацеленный вектор длиной по меньшей мере 10 т.п.н. или в котором сумма длин 5'- и 3'-плеч гомологии составляет по меньшей мере 10 т.п.н.
54. Способ получения отличного от человека животного по любому из пп. 1-23, включающий
F12
F12,
F12,
а) введение в эмбрион отличного от человека животного на одноклеточной стадии нацеленного вектора, содержащего вставку нуклеиновой кислоты, содержащую последовательность человека, фланкированную 5’-плечом гомологии, соответствующим 5'-последовательности-мишени в эндогенном локусе  и 3’-плечом гомологии, соответствующим 3’-последовательности-мишени в эндогенном локусе
F12
F12,
F12
при этом нацеленный вектор рекомбинирует с эндогенным локусом с образованием генетически модифицированного нечеловеческого эмбриона на одноклеточной стадии, имеющего в своем геноме гуманизированный эндогенный локус  содержащий последовательность  человека;
,
F12
.
(b) вынашивание генетически модифицированного эмбриона отличного от человека животного на одноклеточной стадии суррогатной матерью для получения генетически модифицированного отличного от человека животного поколения F0, имеющего в своем геноме гуманизированный эндогенный локусF12 содержащий последовательность человека
F12.
55. Способ по любому из пп. 52-54, отличающийся тем, что стадия (а) дополнительно включает введение нуклеазного агента или нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазный агент, при этом нуклеазный агент нацелен на последовательность-мишень в эндогенном локусе
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что нуклеазный агент содержит белок Cas и направляющую РНК.
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что указанный белок Cas представляет собой белок Cas9.
F12.
58. Способ по п. 56 или 57, отличающийся тем, что стадия (а) дополнительно включает введение второй направляющей РНК, которая нацелена на вторую последовательность-мишень в эндогенном локусе
59. Способ по любому из пп. 51-58, отличающийся тем, что отличное от человека животное представляет собой мышь или крысу.
60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что указанное отличное от человека животное представляет собой мышь.
F12
61. Способ оценки экспрессии короткой изоформы мРНК в биологическом образце, включающий
F12;
(a) обнаружение и количественную оценку РНК-транскриптов с использованием праймеров и/или зондов против одного или более экзонов 9-14 гена
F12,
(b) обнаружение и количественную оценку РНК-транскриптов с использованием праймеров и/или зондов против одного или более экзонов 1-6 гена
при этом короткая изоформа выявляется праймерами и/или зондами против экзонов 9-14, но не праймерами и/или зондами против экзонов 1-6.