Иммунофармакологический эффект комплексных средств, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты

УДК 613.27.2.4:615.37

Г.П. Ламажапова, С.Д. Жамсаранова

иммунофармакологический эффект комплексных средств, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты

Восточно-Сибирский государственный технологический университет

В работе исследуется иммуномодулирующая активность комплексныхлипосомальных средств, полученных на основе липидов природного происхождения, на различных моделях иммунной супрессии. В экспериментах на лабораторных животных показано положительное влияние полиненасыщенных жирных кислот, жира байкальской нерпы, в составе комплексных лекарственных средств на показатели, иммунитета. Ключевые слова: липосомы, полиненасыщенные жирные кислоты, байкальская нерпа, иммунный статус

iMMuNEpHARMAcoLoGicAL EFFECT oF complex MEANS coNTAiNiNG polyunsaturated fatty AciDS

G.P. Lamazhapova, S.D. Zhamsaranova

East-Siberian State University of Technology

The article describes the results of investigation of immunemodulative activity of complex liposomal remedies received, on a basis of natural origin lipids at various models of immune suppression. In experiments on laboratory animals positive influence of polyunsaturated, fatty acids of the Baikal seal's fat as a part of complex means on immunity indicators is shown.

Key words: liposomes, polyunsaturated fatty acids, Baikal seal, immune status

Известно, что задача поддержания гомеостаза может быть решена воздействием многокомпонентных препаратов природного происхождения, содержащих эволюционно установившийся, гармонически сбалансированный состав биологически активных веществ, оказывающих комплексный положительный эффект на различные звенья обмена веществ организма. В настоящее время разработано и исследовано множество средств, способных стимулировать защитные силы организма и, тем самым, повышать его работоспособность и сопротивляемость внешним факторам. В результате действия биоактивных веществ, входящих в состав этих средств, активизируются функции различных органов и систем. К таким препаратам можно отнести «морские липиды», содержащие в своем составе эссенциаль-ные полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) ю-3 и ю-6 рядов. Исследованиями многих ученых доказана роль полиненасыщенных жирных кислот в поддержании функционирования клеточных мембран как обязательных компонентов клетки, а также в активации мембранных процессов при различных патологических состояниях [1, 3, 4, 5].

Целью исследований явилось изучение некоторых иммунологических показателей у экспериментальных животных под воздействием комплексных липосомальных средств, содержащих ПНЖК жира байкальской нерпы, в условиях иммунной супрессии, развивающейся при различных патологических состояниях.

материалы и методы исследований

Жир (подкожное сало) байкальской нерпы Р^а sibiricа Gmel. получен согласно ТУ 9281017-02069473-2001. В опытах были использованы 40 белых беспородных крыс обоего пола массой

170 — 250 г из питомника филиала № 5 ГНЦ «Институт биофизики федерального управления «Медбиоэкстрем» при Минздраве России (г. Ангарск) и 150 мышей-самцов линии СВА и линии Б1 (СВАхС57В1/6) массой 20 — 22 г из питомника «Столбовая» РАМН (г. Москва). Животные находились в стандартных условиях содержания вивария на обычном рационе в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденных приказами МЗ СССР № 1179 от 10.10.83 г. и № 755 от 12.08.77 г.

Фосфолипиды экстрагировали из печени нерпы по методу предложенному М. Кейтс [2]. Липо-сомальные структуры готовили из смеси фосфолипидов с добавлением жира нерпы в концентрации 60 % по методу, предложенному АЮ. Bangham согласно патенту [7].

Влияние исследуемых средств изучали в условиях иммунной супрессии, вызванной раневым повреждением и противотуберкулезной терапией.

Плоскостную кожно-мышечную рану воспроизводили под барбамиловым наркозом (70 мг/кг) путем иссечения в области спины животных кожно-фасциального лоскута площадью 400 мм2 на предварительно выстриженных участках [6].

Лечение ран производили гелем, содержащим смесь полиэтиленгликоля (ПЭГ) и липосом. Для этого полученные липосомальные суспензии подогревали до 40 °С и смешивали с предварительно сплавленными на водяной бане и охлажденными до 40 °С ПЭГ 1000 и 6000 (9:1) для получения необходимой консистенции, гомогенизировали до однородной массы. Лечение начинали в первые часы после нанесения кожно-мышечных ран, затем ежедневно на раневое повреждение наносили исследуемые лекарственные средства в дозе 7 мг в

день. В качестве контроля использовали животных, леченных смесью полэтиленгликоля с буфером.

О ранозаживляющем эффекте исследуемого лекарственного средства судили на основании наблюдения за животными, состоянием раны, сроков заживления ран. Показатели иммунного статуса экспериментальных животных при воспроизведении раневых повреждений оценивали по количеству клеток крови и популяций лимфоцитов при постановке непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции.

Иммунобиологическую активность липосо-мальной формы изониазида оценивали в экспериментах на лабораторных животных с помощью показателей реакций, характеризующих клеточное, гуморальное и макрофагальное звенья иммунитета на фоне иммунной супрессии, вызванной введением комплекса противотуберкулезных препаратов (ПТП): изониазид 5 мг/кг и 10 мг/кг, рифампицин 10 мг/кг, пиразинамид 25 мг/кг перорально, стрептомицин 15 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно в течение 3 недель. Опытным группам животным вводили, наряду с другими туберкулостатиками, изониазид в дозах 5 мг/кг и 10 мг/кг, включенный в липосомальные структуры. Данные дозировки антибактериальных препаратов используются в клинике фтизиатрии, соответствуют стандартным дозам для лечения больных туберкулезом, применяются в экспериментальных исследованиях.

Изониазид, включенный в липосомы, вводили перорально в объеме 0,2 мл / 20 г массы мыши 1 раз в сутки в течение 21 дня. Соответствующие контрольные группы животных в аналогичных условиях получали «свободный» изониазид, растворенный в дистиллированной воде, в эквивалентном объеме.

В работе были использованы липосомы, содержащие в своем составе жир байкальской нерпы

в концентрации 200 мкг/мл в пересчете на жир в опытах in vitro и в дозе 20 мг/кг массы животного в опытах in vivo, фосфолипиды яичного желтка в соотношении 6:4 (относительно жира) и антиоксидант а-токоферола ацетат в концентрации

0,05 %. Липосомы готовили из смеси яичных фосфолипидов с добавлением жира нерпы в концентрации 60 % относительно липидного компонента в липосомальных средствах [7].

Полученные цифровые данные обрабатывали статистически с применением параметрических (Стьюдента — с помощью компьютерной программы Jandel SigmaPlot32) критериев. Рассчитывали достоверность отличий данных в группах. Достоверными считались отличия с вероятностью p < 0,05.

результаты исследований

Показатели клеточного состава крови крыс при лечении раневого повреждения гелем, содержащим липосомальную суспензию, содержащую ПНЖК жира нерпы, с включением экстракта какалии копьевидной (ЭКК) представлены в таблице 1.

Как видно из представленных данных, во всех группах во все сроки эксперимента выражен лейкоцитоз (повышение уровня лейкоцитов от 2-х до

3,5 раза) по сравнению с интактной группой. По-видимому, это происходит за счет увеличения абсолютного числа лимфоцитов, особенно выраженное для Т-популяции подсчитанных клеток.

Абсолютное значение количества лимфоцитов (кол-во клеток в единице объема) во всех группах во все сроки эксперимента достоверно повышено по сравнению с интактом. Что касается относительного количества лимфоцитов (% от общего числа лимфоцитов), в контрольной группе на 14 сутки эксперимента наблюдается достоверное понижение данного показателя по сравнению с ин-

Таблица 1

Влияние липосомальной формы биогенных ПНЖК на показатели иммунитета белых крыс с кожно-мышечной

раной

Группы животных Интактные животные Контроль Липосомы

Показатели иммунного статуса 14 сутки 21 сутки 14 сутки 21 сутки

Лейкоциты в абс.ч. 4,0 ± 0,4 9,8 ± 1,4* 8,1 ± 1,1* 14.3 ± 2.2* 11.9 ± 2.1*

Лимфоциты % 65,0 ± 8,7 46,9 ± 5,6* 65,4 ± 7,2 56.6 ± 5.6 57.1 ± 4.7

абс. ч. 2,6 ± 0,4 4,6 ± 0,3* 5,3 ± 0,4* 8.1 ± 1.2* 6.8 ± 1.1*

CD3 % 46,2 ± 4,3 52,2 ± 4,1 41,5 ± 3,4 48.1 ± 6.3 50.0 ± 7.2

абс. ч. 1,2 ± 0,5 2,4 ± 0,3* 2,2 ± 0,4* 3.9 ± 0.4*,** 3.4 ± 0.6*,**

CD4 % 50,0 ± 5,2 30,4 ± 4,2* 52,8 ± 3,7 13.6 ± 2.9*,** 47.1 ± 2.5

абс. ч. 1,3 ± 0,2 1,4 ± 0,3 2,8 ± 0,4* 1.1 ± 0.3 3.2 ± 0.4*

CD8 % 15,4 ± 3,5 30,4 ± 3,2* 28,3 ± 2,8* 27.2 ± 3.1* 19.1 ± 2.4**

абс. ч. 0,4 ± 0,1 1,4 ± 0,5* 1,5 ± 0,7* 2.2 ± 0.3* 1.3 ± 0.2*

CD16 % 11,5 ± 1,8 15,2 ± 2,0 11,3 ± 0,9 13.6 ± 3.5 17.7 ± 1.9*,**

абс. ч. 0,3 ± 0,1 0,7 ± 0,2* 0,6 ± 0,2 1.1 ± 0.3* 1.2 ± 0.2*,**

ИРИ (CD4:CD8) 3,3 ± 0,3 1,0 ± 0,1* 1,9 ± 0,2* 0.5 ± 0.02* 2.5 ± 0.3**

примечание: * - достоверное отклонение значения в экспериментальной группе по отношению к интактной; ** - достоверное отклонение значения в экспериментальной группе по отношению к контрольной в соответствующие сроки эксперимента.

тактной на 27,5 %. Хотя на 21 сутки этот показатель достигает исходного уровня. В группах животных, которым производили лечение гелями, содержащими липосомы и липосомальный фитоэкстракт, этот показатель остается стабильным в течение всего эксперимента и находится в пределах стандартного отклонения значения у интактных животных.

Как уже упоминалось выше, абсолютное значение CD3-клеток (Т-популяции лимфоцитов) во всех группах во все сроки эксперимента достоверно повышено по сравнению с интактом (от 1,8 до 3,3 раза). Причем наибольшее увеличение отмечается в группе животных, леченных гелем с липосомами, как на 14-е, так и на 21-е сутки. При этом показатель относительного количества Т-лимфоцитов во всех группах существенно не меняется и в течение эксперимента остается на уровне интакта.

Данные иммунограммы показали, что во всех экспериментальных группах на 21 сутки эксперимента отмечается повышение абсолютного количества Т-хелперной популяции лимфоцитов до 2,5 раз по сравнению с интактом. Одновременно с этим, у животных опытных групп на 21-е сутки эксперимента относительное количество Т-супрессоров достоверно ниже по сравнению с группой контрольных животных. При этом на 14 сутки значения относительного количества Т-хелперов достоверно уменьшаются по сравнению с интактными на 20 — 37 %, а на 21 сутки этот показатель во всех группах восстанавливается до исходного уровня.

В ходе эксперимента выявлено, что в крови экспериментальных животных возрастает Т-супрессорная активность по сравнению с интакт-ными, что выражается в повышении значений абсолютного количества CD8-клеток в 3 — 5 раз, которое сохраняется во всех группах на одном уровне до 21

суток. В то же время расчеты относительного количества Т-супрессоров показывают, что у животных в группах липосом и ЛЭ на 21 сутки эксперимента числовые значения достоверно понижаются по сравнению с группой контрольных животных.

Таким образом, иммунорегуляторный коэффициент CD4/CD8 (соотношение основных субпопуляций Т-лимфоцитов) при раневом процессе достоверно понижается (в основном за счет возрастания количества CD8+ клеток) в течение первых 14 суток. В результате лечения ран исследуемыми средствами значения данного коэффициента возрастали до значений достоверно более высоких, чем в контроле, хотя и не достигали нормальных значений.

Установлено, что у животных при воспроизведении плоскостных ран повышается содержание клеток, несущих маркер естественных киллеров (CD16 + ) как в абсолютных значениях, так и в относительных. В результате лечения их содержание при всех сроках эксперимента остается повышенным по сравнению с нормальными значениями.

Одним из общепринятых методов, отражающих состояние клеточно-опосредованного иммунного ответа, является реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Результаты исследования влияния противотуберкулезных средств на животных в реакции ГЗТ представлены в таблице 2.

По данным проведенного исследования введение туберкулостатиков угнетало развитие ГЗТ, что проявлялось в достоверном снижении индекса реакции ГЗТ на 73,3 % и 65,3 % в случаях введения «свободного» изониазида в дозах 5 мг/кг и 10 мг/кг соответственно по сравнению с данными в интактной группе. Как видно из таблицы 1, при использовании липосомального изониазида в комплексе с другими противотуберкулезными препаратами наблюдали

Таблица 2

Изменение индекса реакции ГЗТ под воздействием противотуберкулезных препаратов (ПТП) и липосомального

изониазида

Группы животных Индекс реакции, %

Интактные животные 42,12 ± 3,06

ПТП (Изониазид, 5 мг/кг) 30,88 ± 1,27*1

ПТП (Изониазид, 10 мг/кг) 27,50 ± 2,85*1

ПТП (Липосомальный изониазид, 5 мг/кг) 40,60 ± 2,64*2

ПТП (Липосомальный изониазид, 10 мг/кг) 34,87 ± 1,82*3

Примечание (к таблицам 2-5): *n - достоверное отклонение показателя по сравнению со значением в сравниваемой группе (p < 0,05); n - номер группы.

Таблица 3

Изменение показателя реакции «Трансплантат против хозяина» у мышей, получавших липосомальный изониазид в комплексе с противотуберкулезными препаратами

Группы животных Индекс увеличения лимфоузлов

Интактные животные 2,70 ± 0,29

ПТП (Изониазид, 5 мг/кг) 1,33 ± 0,07*1

ПТП (Изониазид, 10 мг/кг) 1,35 ± 0,17*1

ПТП (Липосомальный изониазид, 5 мг/кг) 2,07 ± 0,14*2

ПТП (Липосомальный изониазид, 10 мг/кг) 1,92 ± 0,19*3

достоверное повышение индекса реакции ГЗТ на

31,5 % и на 26,8 % по сравнению с данными в группах животных, получавших изониазид в чистом виде в дозировках 5 мг/кг и 10 мг/кг соответственно. При этом уровень развития реакции у мышей, получавших изониазид в дозе 5 мг/кг в липосомальной форме, находился на таковом у интактных животных.

Состояние клеточного иммунитета оценивали также по локальной реакции «Трансплантат против хозяина» (РТПХ). Среди способов экспериментального воспроизведения РТПХ модель с мышами-гибридами Б1 занимает особое место. В соответствии с законом генетики такие гибриды не дают иммунного ответа на трансплантаты ткани от родительской линии, и это позволяет обойтись без иммунодепрессивной обработки реципиентов.

Данные об изменении индекса РТПХ у животных, получавших различные формы изониазида, представлены в таблице 3.

Как видно из таблицы 3, введение противотуберкулезных препаратов угнетало данную клеточно-опосредованную реакцию, что проявлялось в уменьшении соотношения клеточного содержания лимфоузлов контрольной и опытной лапок по сравнению с данными в интактной группе на 50,7 % и 50 % в случаях введения изониазида в дозах 5 мг/кг и 10 мг/кг соответственно.

Оценивая результаты эксперимента можно заключить, что при использовании липосомальной формы изониазида в комплексе с другими ПТП наблюдали достоверное повышение индекса увеличения лимфатических узлов на 55,6 % и 42,2 % (в случаях применения изониазида в дозах 5 мг/кг и 10 мг/кг соответственно) по сравнению с соответствующими группами при введении «свободного» изониазида.

Таким образом, изучение иммуномодулирующих свойств липосомальной формы изониазида позволило выявить Т-лимфотропный эффект, проявляющийся в активации реакции ГЗТ, подтвержденный результатами изучения влияния исследуемого средства на другую Т-клеточно-опосредованную реакцию — РТПХ.

Изучение влияния препаратов на гуморальный иммунный ответ является важным этапом при исследовании иммунотропных свойств различных соединений. Спектр указанной активности определяется характером действия данных веществ на процессы антителообразования.

В таблице 4 представлены результаты исследования влияния липосомальной формы изониазида на процесс антителообразования клетками селезенки мышей линии СВА в ответ на введение эритроцитов барана.

Как видно из таблицы 4, введение изониазида в свободной форме в комплексе с другими препаратами с противотуберкулезной активностью приводило к достоверному снижению абсолютного числа АОК на 28,7 % и 17,7 % соответственно дозам изониазида 5 мг/кг и 10 мг/кг, относительного числа АОК — на 39,7 % и 14,8 % соответственно исследуемым дозам.

Анализ приведенных данных показывает, что при введении животным липосомального изониазида наблюдается повышение количества АОК как в абсолютных значениях, так и в относительных. При этом первый показатель повышался в 1,3 и в 1,1 раза, а второй — в 1,5 раза и на 2,2 % по сравнению с показателями в соответствующих исследуемым дозировкам группах животных, получавших «свободный» изониазид. Однако показатели количества АОК как на селезенку, так и на 106 спленоцитов у мышей, получавших изониазид в обеих дозировках в липосомальной форме, находились на одном уровне.

Уровень активности моноцитарно-макрофагальной системы во многом определяет исход заболевания, что связано с такими важными функциями фагоцитирующих клеток как фагоцитоз, представление антигена, инициация иммунного ответа, киллинг внутриклеточно локализованного возбудителя. Поскольку характерными чертами туберкулезной инфекции является недостаточность данного звена иммунного ответа, представлялось важным изучение влияния противотуберкулезных препаратов на функциональное состояние фагоцитирующих клеток.

В реакции фагоцитоза Staphylococcus aureus перитонеальными макрофагами мышей in vitro подсчитывали два показателя: активность фагоцитоза (процент фагоцитирующих клеток от общего числа сосчитанных макрофагов) и интенсивность фагоцитоза (среднее количество микроорганизмов, поглощенное одной клеткой). Изучали функции макрофагов под влиянием введения в культуру клеток смеси противотуберкулезных препаратов: изониазид в свободной и липосомальной формах концентрациях 5 мкг/мл и 10 мкг/мл, рифампи-

Таблица4

Количество антителообразующих клеток (АОК) селезенки мышей под влиянием липосомальной формы

изониазида в комплексе с ПТП

Группы животных Количество АОК

на селезенку на106 спленоцитов

Интактные животные 131470 ± 965 1275,40 ± 83,52

ПТП (Изониазид, 5 мг/кг) 93750 ± 6923*1 768,58 ± 77,21*1

ПТП (Изониазид, 10 мг/кг) 108210 ± 4808*1 1086,43 ± 44,29*1

ПТП (Липосомальный изониазид, 5 мг/кг) 119533 ± 7500*2 1160,80 ± 86,51 *2

ПТП (Липосомальный изониазид, 10 мг/кг) 120250 ± 2258*3 1109,94 ± 69,30

Таблица 5

Показатели фагоцитоза Staphylococcus aureus перитонеальными макрофагами мышей in vitro при воздействии липосомальной формы изониазида в комплексе с ПТП

Группы животных Активность фагоцитоза Интенсивность фагоцитоза

Интактные животные 64,1 ± 5,6 16,8 ± 1,8

ПТП (Изониазид, 5 мкг/мл) 46,6 ± 4,2*1 10,7 ± 0,6*1

ПТП (Изониазид, 10 мкг/мл) 37,3 ± 6,3*1 8,5 ± 1,9*1

ПТП (Липосомальный изониазид, 5 мкг/мл) 59,3 ± 4,8*2 15,3 ± 1,9*2

ПТП (Липосомальный изониазид, 10 мкг/мл) 48,6 ± 6,2 13,4 ± 1,5*3

цин в концентрации 10 мкг/мл, пиразинамид — 25 мкг/мл, стрептомицин — 15 мкг/мл.

Полученные данные представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5, введение изониазида в свободной форме в обеих изучаемых концентрациях в комплексе с другими противотуберкулезными препаратами вызывало достоверное снижение показателей активности и интенсивности фагоцитоза на 27,3 % и 36,3 % соответственно концентрациям 5 мкг/ мл и 10 мкг/мл по отношению к интактной группе.

Анализ результатов показал, что введение ли-посомального изониазида в комплексе с другими ПТП в культуральную среду с перитонеальными макрофагами повышало уровень как активности, так и интенсивности фагоцитоза в обоих случаях, при этом, в группе с использованием изониазида в концентрации 5 мкг/мл, включенного в липосомы, исследуемые показатели достигали уровня интакта.

заключение

По результатам проведенного исследования установлено, что ПНЖК в липосомальной форме оказывают положительное влияние на восстановление показателей иммунного статуса организма. Показано, что исследуемое средство нейтрализует проявления иммунной супрессии у животных с раневым повреждением. Установлено иммуномодулирующее действие липосомальной формы туберкулостатика в отношении макрофагального, клеточного и гуморального звеньев иммунного ответа на фоне введения в организм комплекса противотуберкулезных препаратов.

Указанные реакции, по-видимому, неспецифичны для изученных процессов, а являются характерными признаками общего адаптационного синдрома. По-видимому, изменения в клеточном звене иммунитета происходят за счет перестройки плазматических мембран и активации рецепторного аппарата иммунных клеток эссенциальными фосфолипидами печени нерпы и высокоактивными жирными кислотами, входящими в состав жира нерпы. Кроме того, оптимальное соотношение ю-6 : ю-3 ПНЖК, характерное для жира нерпы, благотворно

влияет и на обменные процессы в организме при развитии патологических состояний. В жире нерпы присутствует большое количество ю-3 ПНЖК, которые подавляют выработку провоспалительных эйкозаноидов из ю-6 жирных кислот, что позволяет соблюдать физиологический баланс организма при ответе на воздействия повреждающих факторов.

литература

1. Горелова Ж.Ю. Характеристика и перспективы использования биологически активных добавок к пище / Ж.Ю. Горелова // Медицинская помощь. — 2002. — № 5. — С. 46 — 49.

2. Кейтс М. Техника липидологии / М. Кейтс. — М., 1975. - 322 с.

3. Красильникова Е.И. Полиненасыщенные w-3 жирные кислоты и их роль в первичной и вторичной профилактике атеросклероза / Е.И. Красильникова, Е.Г. Сергеева, Е.В. Шляхто // Человек и лекарство. — 2006. — Т. 14, № 4. — С. 234-240.

4. Лебедев В.В. Супероксидные основы патогенеза и терапии иммунных расстройств / В.В. Лебедев // В кн. «Проблемы патогенеза и терапии иммунных расстройств» под ред. В.В. Лебедева. — М., 2002. — Т. 1. — С. 6 — 35.

5. Опыт применения ПНЖК w-3 у детей с атопическим дерматитом / А.Н. Пампура [и др.] // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. — 2001. — № 5. — С. 54 — 57.

6. Пономарева-АстраханцеваЛ.З. Метод экспериментального получения ран и язв / Л.З. Пономарева-Астраханцева // Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевтических исследований. — М., 1954. — С. 66 — 73.

7. Способ получения липосом, обладающих иммунокорригирующим и гепатопротекторным действием : пат. 2308940 РФ МПК А61 К9/127 К39/10 К35/12 / Ламажапова Г.П., Жамсаранова С.Д., Цыренжапов А.В., Николаев С.М.; заявитель и патентообладатель Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Восточно-Сибирский государственный технологический университет. — 2006116831/15; заявл. 16.05.2006; опубл. 27.10.2007, Бюл. № 30 — 1 с.

Сведения об авторах:

Ламажапова Галина Петровна - старший преподаватель, кандидат биологических наук. 670034, г. Улан-Удэ, пр. 50-летия Октября, д. 20, кв. 32. Тел 8 (3012) 46-18-07, 8-914-840-44-09.

Жамсаранова Сэсэгма Дашиевна - профессор, зав. кафедрой «Биоорганическая и пищевая химия», доктор биологических наук, профессор. 670013, г. Улан-Удэ, ул. Жердева, д. 35, кв. 41.