СИНЕРГЕТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АРОМАТИЧЕСКИЕ ВЕЩЕСТВА И ОРГАНИЧЕСКИЕ КИСЛОТЫ, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
SYNERGETIC COMPOSITION CONTAINING FLAVOURING AGENTS AND ORGANIC ACIDS AND ITS APPLICATION

Данное изобретение касается композиции, содержащей синергетическую смесь ароматизаторов или ароматических веществ и органических кислот. Кроме того, настоящее изобретение касается применения указанных композиций в качестве консерванта для кормов и добавок для животных, предназначенных предпочтительно для животных с однокамерным желудком.
Известно, что значение pH в пищеварительных органах животных с однокамерным желудком является кислым. Значение pH варьируется в зависимости от конкретной части желудочно-кишечного тракта. Например, желудок имеет pH от 2 до 5, двенадцатиперстная кишка имеет pH от 4 до 6, тонкая кишка имеет pH от 6 до 7, слепая кишка имеет pH от 6 до 6,5, и, наконец, прямая кишка имеет pH от 6,5 до 7.
В желудочно-кишечной системе данная кислая среда обеспечивает защитное действие против пролиферации патогенов.
Известно, однако, что некоторые патогенные организмы способны развивать комплексную систему защиты, которая позволяет клеткам самих патогенов выживать даже при снижении значений pH до 3. Более того, некоторые бактерии, такие как Salmonella typhiniurium, могут развивать систему, способную выдерживать кислоты с pH 3 после предварительной обработки слабой кислотой с pH 5.
В EP 1391155 описана композиция, содержащая органические кислоты и ароматизирующие агенты. Композицию применяют для профилактики патогенных инфекций в желудочно-кишечном тракте животных с однокамерным желудком. Однако все еще сохраняется интерес в разработке новых композиций со способностью предотвращать или контролировать инфекции, вызванные присутствием и/или пролиферацией патогенов в желудочно-кишечном тракте. В частности, важно разработать композиции, имеющие улучшенную антибактериальную эффективность.
Настоящее изобретение предлагает композицию, имеющую признаки, перечисленные в формуле изобретения.
Предпочтительные варианты данного изобретения обладают характеристиками, описанными в зависимых пунктах формулы изобретения.
Для целей данного изобретения под композицией понимают композицию в твердой форме, например, гранулированная композиция или порошковая композиция.
Для целей данного изобретения применяются Council Directive 88/388/EEC от 22 июня 1988 в приближении к законодательству стран-членов, относящиеся к ароматизаторам для применения в кормах, и к сырью для их получения {опубликовано в Италии в Official Gazette, n. L 184 of 15/07/1988}. Указанная Директива применяется к «ароматизаторам», применяемым или предназначенным для применения в кормах для улучшения запаха и/или вкуса, и к сырью, применяемому для производства ароматизаторов.
Поэтому для целей данного изобретения: a) "ароматизатор" означает ароматические вещества, ароматические композиции, технологические ароматизаторы, ароматизаторы копчения или их смеси;
b) "ароматическое вещество" означает определенное химическое вещество с ароматическими свойствами, которые получают:
i) подходящими физическими процессами (включая дистилляцию и экстракцию растворителем) или ферментативными, или микробиологическими процессами из материалов растительного или животного происхождения либо в сыром состоянии, либо после обработки для потребления человеком с применением традиционных процессов приготовления пищи (включая сушку, поджаривание на огне и ферментацию);
ii) химическим синтезом или выделением химическими процессами, где вещество химически идентично веществу, присутствующему в природе в материале растительного или животного происхождения, как описано в i);
iii) химическим синтезом, где вещество не является химически идентичным веществу, присутствующему в природе в материале растительного или животного происхождения, как описано в i);
c) "ароматическая композиция" означает продукт, отличный от вещества, определенного в b) i), концентрированный или нет, с ароматическими свойствами, который получают подходящими физическими процессами (включая дистилляцию и экстракцию растворителем) или ферментативными, или микробиологическими процессами из материалов растительного или животного происхождения либо в сыром состоянии, либо после обработки для потребления человеком с применением традиционных процессов приготовления пищи (включая сушку, поджаривание на огне и ферментацию);
d) "технологический ароматизатор" означает продукт, который получают согласно известной практике производства нагреванием до температуры, не превышающей 180°С в течение времени, не превышающем 15 минут, смеси ингредиентов, которые сами по себе необязательно обладают ароматическими свойствами по меньшей мере один из которых содержит азот (амино), а другой является восстанавливающим сахаром;
e) "ароматизатор копчения" означает экстракт дыма, применяемого в традиционных процессах копчения пищи.
Ароматизаторы могут содержать пищевые продукты и другие вещества.
Композиция, к которой относится данное изобретение, содержит смесь, состоящую из по меньшей мере одного вещества, выбранного из группы, определенной в a), b), c), d) и e) в сочетании с по меньшей мере одной органической кислотой и/или по меньшей мере солью органической кислоты.
В одном варианте указанное вещество может быть, например, ароматизатором или ароматическим веществом, без ограничений. Указанное вещество выбирают из группы, включающей тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, октановую кислоту, гептановую кислоту, диаллилдисульфид, камфору, лимонен, розмариновую кислоту, p-цимол, γ-терпинен, α-пинен, α-туйон, 1,8-цинеол. Например, p-цимол присутствует в Thymus vulgaris и Origanum vulgare; g-терпинен присутствует в Thymus vulgaris и Origanum vulgare; α-туйон присутствует в Salvia officinalis; α-пинен присутствует в Rosmarinus officinalis и Salvia officinalis; 1,8-цинеол присутствует в Rosmarinus officinalis и Salvia officinalis.
Органическую кислоту выбирают из группы, включающей молочную, яблочную, бензойную, фумаровую и сорбиновую кислоту или их соли. Для целей данного изобретения органическая кислота может присутствовать в виде соли, например, со щелочным или щелочноземельным металлом.
В предпочтительном варианте композиция дополнительно содержит лимонную кислоту или цитрат щелочного или щелочноземельного металла. Например, композиция может быть представлена лимонной кислотой, сорбиновой кислотой и тимолом.
Смесь может быть в твердой форме или в жидкой форме, например, в водном растворе.
В смеси в соответствии с данным изобретением молярное соотношение между указанным, по меньшей мере одним веществом, определенным выше в a), b), c), d) и e), и указанной по меньшей мере одной органической кислотой, составляет от 1:500 до 500:1, предпочтительно, от 1:300 до 300:1, и еще предпочтительнее, от 1:200 до 200:1. Предпочтительно, молярное соотношение составляет от 1:150 до 150:1, например, от 1:100 до 100:1 или от 1:50 до 50:1, или от 1:25 до 25:1.
Композиция и/или смесь в соответствии с данным изобретением также может содержать другие питательные компоненты, которые полезны и физиологически приемлемы для животных. Смесь в жидкой форме, например в водном растворе, может иметь pH от 6,5 до 7,5. Смесь может быть конвертирована в твердую форму с применением процесса кристаллизации, известного в данной области техники.
В предпочтительном варианте смесь содержит по меньшей мере две ароматизаторы или ароматические вещества, выбранные из группы, включающей тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, октановую кислоту, гептановую кислоту, диаллилдисульфид, камфору, лимонен, розмариновую кислоту, p-цимол, γ-терпинен, α-пинен, α-туйон, 1,8-цинеол и по меньшей мере две органические кислоты, выбранные из группы, включающей молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь, предпочтительно, содержит три ароматизаторы или ароматические вещества и по меньшей мере три органические кислоты. И еще предпочтительнее, смесь содержит четыре ароматизаторы или ароматические вещества и по меньшей мере четыре органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит карвакрол и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит карвакрол и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит тимол и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит тимол и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит коричный альдегид и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит коричный альдегид и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит ванилин и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит ванилин и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит камфору и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит камфору и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит гептановую кислоту и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит гептановую кислоту и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит октановую кислоту и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит октановую кислоту и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит лимонен и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит лимонен и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит диаллилдисульфид и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит диаллилдисульфид и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит розмариновую кислоту и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит розмариновую кислоту и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит α-пинен и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит α-пинен и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит α-туйон и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит α-туйон и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит цинеол и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит цинеол и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит γ-терпинен и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит γ-терпинен и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит р-цимол и по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, включающей лимонную кислоту, молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту. Смесь предпочтительно содержит р-цимол и по меньшей мере две органические кислоты; и еще предпочтительнее, три органические кислоты.
В предпочтительном варианте смесь содержит по меньшей мере один ароматизатор или ароматическое вещество, выбранное из группы, включающей тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, октановую кислоту, гептановую кислоту, диаллилдисульфид, камфору, лимонен, розмариновую кислоту, p-цимол, γ-терпинен, α-пинен, α-туйон, 1,8-цинеол и лимонную кислоту. Смесь, предпочтительно, содержит две ароматизаторы или ароматических вещества и лимонную кислоту; и еще предпочтительнее, три ароматизаторы или ароматических веществ.
В предпочтительном варианте смесь содержит по меньшей мере один ароматизатор или ароматическое вещество, выбранное из группы, включающей тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, октановую кислоту, гептановую кислоту, диаллилдисульфид, камфору, лимонен, розмариновую кислоту, p-цимол, γ-терпинен, α-пинен, α-туйон, 1,8-цинеол и молочную кислоту. Смесь, предпочтительно, содержит две ароматизаторы или ароматических вещества и молочную кислоту; и еще предпочтительнее, три ароматизаторы или ароматических вещества.
В предпочтительном варианте смесь содержит по меньшей мере один ароматизатор или ароматическое вещество, выбранное из группы, включающей тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, октановую кислоту, гептановую кислоту, диаллилдисульфид, камфору, лимонен, розмариновую кислоту, p-цимол, γ-терпинен, α-пинен, α-туйон, 1,8-цинеол и яблочную кислоту. Смесь, предпочтительно, содержит две ароматизаторы или ароматических вещества и яблочную кислоту; и еще предпочтительнее, три ароматизаторы или ароматических веществ.
В предпочтительном варианте смесь содержит по меньшей мере один ароматизатор или ароматическое вещество, выбранное из группы, включающей тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, октановую кислоту, гептановую кислоту, диаллилдисульфид, камфору, лимонен, розмариновую кислоту, p-цимол, γ-терпинен, α-пинен, α-туйон, 1,8-цинеол и бензойную кислоту. Смесь, предпочтительно, содержит две ароматизаторы или ароматических вещества и бензойную кислоту; и еще предпочтительнее, три ароматизаторы или ароматических веществ.
В предпочтительном варианте смесь содержит по меньшей мере один ароматизатор или ароматическое вещество, выбранное из группы, включающей тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, октановую кислоту, гептановую кислоту, диаллилдисульфид, камфору, лимонен, розмариновую кислоту, p-цимол, γ-терпинен, α-пинен, α-туйон, 1,8-цинеол и фумаровую кислоту. Смесь, предпочтительно, содержит две ароматизаторы или ароматических вещества и фумаровую кислоту; и еще предпочтительнее, три ароматизаторы или ароматических вещества.
В предпочтительном варианте смесь содержит по меньшей мере один ароматизатор или ароматическое вещество, выбранное из группы, включающей тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, октановую кислоту, гептановую кислоту, диаллилдисульфид, камфору, лимонен, розмариновую кислоту, p-цимол, γ-терпинен, α-пинен, α-туйон, 1,8-цинеол и сорбиновую кислоту. Смесь, предпочтительно, содержит две ароматизаторы или 2 ароматических вещества и сорбиновую кислоту; и еще предпочтительнее, три ароматизаторы или ароматических вещества.
Предпочтительно, молярное соотношение между по меньшей мере одной ароматизатором или ароматическим веществом и указанной по меньшей мере одной органической кислотой составляет от 1:300 до 1:5 для яблочной кислоты или молочной кислоты, соответственно; предпочтительно, от 1:100 до 1:10.
Предпочтительно, молярное соотношение между по меньшей мере одной ароматизатором или ароматическим веществом и указанной, по меньшей мере одной органической кислотой составляет от 1:250 до 1:5 для бензойной кислоты или лимонной кислоты, соответственно; предпочтительно, от 1:100 до 1:10.
Предпочтительно, молярное соотношение между по меньшей мере одной ароматизатором или ароматическим веществом и указанной, по меньшей мере одной органической кислотой составляет от 1:250 до 1:5 для фумаровой кислоты; предпочтительно, от 1:125 до 1:10.
Предпочтительно, молярное соотношение между по меньшей мере одной ароматизатором или ароматическим веществом и указанной, по меньшей мере одной органической кислотой составляет от 1:100 до 1:5 для сорбиновой кислоты; предпочтительно, от 1:50 до 1:10.
Предпочтительно, смесь содержащая тимол, карвакрол и коричный альдегид, обеспечивает хорошее антибактериальное действие и обеспечивает присутствие патогенов в значительно пониженном количестве или их отсутствие уже через 24 часа.
Объектом данного изобретения является композиция, содержащая смесь, описанную выше, которая покрыта слоем агента доставки. Указанный агент доставки выбирают из агентов, которые могут доставлять и выделять компоненты указанной смеси в желудочно-кишечном тракте. Выделение в различных частях желудочно-кишечного тракта является функцией от времени, температуры, pH и бактериальной флоры и микроорганизмов, присутствующих в них.
Предпочтительно, смесь в соответствии с данным изобретением имеет внешнее покрытие, содержащее два отдельных слоя. Покрытие может выделять компоненты, присутствующие в смеси, в зависимости от времени, температуры, pH и бактериальной флоры и микроорганизмов, присутствующих в различных частях желудочно-кишечного тракта.
Смесь может быть покрыта одним или двумя слоями с применением методик, известных специалистам в данной области техники.
Альтернативно, агент доставки может быть смешан с указанной, по меньшей мере одной ароматизатором или ароматическим веществом и указанной, по меньшей мере одной органической кислотой. Смешивание компонентов может проводиться с применением методик, известных специалистам в данной области техники.
Одним примером методики для введения агента доставки, например, растительного триглицерида, является его добавление в контейнер, оборудованный нагревательным и смешивающим устройствами. Затем температуру контейнера доводят до температуры от 80 до 120°С, и матрицу перемешивают до плавления агента доставки. Необязательно в расплавленную матрицу затем могут быть добавлены добавки. Перемешивание и температуру сохраняют до получения массы агента доставки с гомогенным распределением добавок. Во время этой стадии в указанную массу могут быть добавлены эмульгаторы.
Композиция с покрытием или без может быть превращена в гранулы с применением методик, известных в данной области техники.
Агент доставки может содержать жидкое вещество, обладающее способностью модулировать замедленное выделение компонентов смеси.
Для компонентов смеси важно постепенное выделение в различных частях желудочно-кишечного тракта. Постепенное и специфичное выделение в различных частях желудочно-кишечного тракта служит для улучшения антибактериального действия композиции в соответствии с данным изобретением, так как достигается большая синергия между компонентами смеси.
Жировое вещество выбирают из гидрированных и/или не гидрированных триглицеридов. Триглицериды выбирают из триглицеридов растительного и/или животного происхождения.
Гидрированные растительные триглицериды выбирают из группы, включающей пальмовое масло, подсолнечное масло, кукурузное масло, рапсовое масло, арахисовое масло и соевое масло.
Триглицериды животного происхождения выбирают из бычьего жира и свиного сала.
Предпочтительно, композиция может содержать агента доставки в количестве от 40 до 70% массовых; например, в количестве от 45 до 55% массовых, и смесь в соответствии с данным изобретением в количестве от 1 до 50% массовых, например, в количестве от 5 до 40% массовых или от 15 до 30% массовых в отношении к общей массе композиции.
Матрица также может содержать конкретные добавки. Добавки выбирают из группы, включающей коллоидную двуокись кремния, стеарат кальция, стеарат магния и сульфат кальция. Эти добавки применяют для повышения вязкости самой матрицы и снижения ее проницаемости. Предпочтительно, агент доставки содержит различные добавки в количестве от 0,1 до 30% массовых по отношению к общей массе агента доставки; например, от 1 до 20% или от 5 до 10% массовых.
Композиция в соответствии с данным изобретением может применяться для профилактики и/или лечения бактериальных инфекций. Для целей данного изобретения бактериальные инфекции означают все ситуации, в которых присутствие и/или рост организмов прокариотов оказывает вредное действие на хозяина, например, вызывает заболевание.
Среди таких организмов прокариотов могут быть указаны организмы, принадлежащие к видам: Salmonella sp., S. aureus, E. faecalis, E. coli, K. Pneumoniae, P. mirabilis, P. aeruginosa, C. perfrigens, Carnbylobacter sp., S. pneumoniae, B. cereus, C. albicans, A, oryzae, P. funiculosum и F. moniliforme.
В более предпочтительных вариантах указанными организмами- прокариотами являются C. Perfrigens и Salmonella typhimurium. В другом предпочтительном варианте указанную смесь применяют для приготовления лекарственного средства для профилактики и/или лечения бактериальных инфекций, которые дополнительно включают агент доставки. В еще более предпочтительном варианте указанным агентом доставки является жировая матрица, такая как описана выше.
Лекарственное средство в данном варианте может применяться для профилактики и/или лечения бактериальных инфекций в желудочно-кишечной системе животных с однокамерным желудком.
Композиция в соответствии с данным изобретением находит применение в качестве консерванта для корма и добавок для животных.
Экспериментальная часть
Пример 1 – Оценка противомикробного действия, оказываемого органическими кислотами и ароматизаторами или ароматическими веществами на Clostridium perfringens через 24 часа инкубирования в титровальных микропланшетах с применением метода оптической плотности.
В сущности, антибактериальную силу смесей в соответствии с данным изобретением определяют с применением метода разведений и измерений оптической плотности {Smith-Palmer et al.; 1998).
Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) вещества или смеси может быть определена как наименьшая концентрация этого вещества или смеси, которая позволяет ингибировать рост организмов, применяемых в конкретной инфицирующей дозе после определенного периода времени (Karapinar and Aktug, 1987; Onawunmi, 1989; Hammer et al., 1999; Delaquis et al., 2002).
C. perfringens, хранившиеся в приготовленном мясе при комнатной температуре, инокулируют в культуральную жидкость (Oxoid), содержащую УКС (усиленную клостридийную среду) и инкубируют при 37°C в течение 24 часов в условиях анаэробиоза. Перед применением законсервированные штаммы C. perfringens культивируют дважды - каждый раз в течение 24 часов.
Следующие ароматизаторы или ароматические вещества тестируют: тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, гептановую кислоту, октановую кислоту, камфару, лимонен, диаллилдисульфид, розмариновую кислоту, α-пинен, α-туйон, цинеол, γ-терпинен и p-цимол.
Тестируют следующие органические кислоты: лимонную кислоту, сорбиновую кислоту, яблочную кислоту, фумаровую кислоту, бензойную кислоту и молочную кислоту.
Маточные растворы каждого из перечисленных выше веществ (ароматизаторы/ароматические вещества и органические кислоты) получают растворением указанных веществ в деионизированной воде. pH раствора корректируют до 6,5, и раствор затем фильтруют в стерильных условиях (диаметр пор 0,22 мкм).
Рабочие растворы, содержащие органические кислоты, получают двукратным серийным разведением каждого маточного раствора с применением культуральной жидкости, полученной, как описано выше, с pH 6,5, с получением минимальных тестируемых концентраций в соответствии с типом кислоты.
Маточные растворы ароматизаторов получают разведением растворов в этиловом спирте (75%) с получением 7,28 мМ, но маточные растворы для ванилина, лимонена и камфары получают в деионизированной воде.
pH всех растворов доводят до около 6,5. Все растворы стерилизуют фильтрацией через поры диаметром 0,22 мкм.
Рабочие растворы, содержащие культуральную жидкость и ароматизаторы или ароматические вещества, получают разведением последних в культуральной жидкости УКС при pH 6,5 (маточный раствор, содержащий ароматизаторы или ароматические вещества: УКС жидкость = 3:1). Другие концентрации, вплоть до 1,96 мМ, получают тем же методом.
4
5
5
Ингибирование Clostridium perfringens анализируют при концентрации 1×10 КОЕ на лунку. Каждую из 96 лунок наполняют 100 мкл бактериальной посевной культуры (1×10 КОЕ/мл) и 100 мкл каждого раствора. Лунки с отрицательным контролем засевают таким же образом 100 мкл культуры (1×10 КОЕ/мл) и 100 мкл культуральной жидкости (pH 6,5) без добавления какого-либо вещества (органической кислоты или ароматического вещества). Каждое вещество тестируют дважды на планшет.
Планшеты с Clostridium perfringens инкубируют при 37°C в анаэробных условиях.
Мутность культур применяют в качестве показателя роста бактерий и оценивают через измерение абсорбции при 630 нм (Tecan Spectra Classic). Абсорбцию измеряют через 24 часа после инкубирования.
Результаты
Анализ графиков, на которых изображен рост Clostridium perfringens, определенный на основе измерений абсорбции, показывает улучшенное/повышенное антибактериальное действие для перечисленных ниже смесей по сравнению с активностью каждой органической кислоты или ароматического вещества, присущей им самим. Смеси, демонстрирующие синергетический эффект между органической кислотой и ароматическим веществом, по сравнению с органическим веществом, рассматриваемым отдельно, или ароматическим веществом, рассматриваемым отдельно, перечислены ниже:
1. карвакрол 0,98-0,49 + лимонная кислота 31,25-7,82. Следовательно, карвакрол и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:65.
2. карвакрол 0,98-0,49 + сорбиновая кислота 50-3,13.
Следовательно, карвакрол и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:3 до 1:110.
3. карвакрол 0,98-0,49 + яблочная кислота 125-15,63. Следовательно, карвакрол и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:260.
4. карвакрол 0,98 + фумаровая кислота 62,5-7,82. Следовательно, карвакрол и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:65.
5. карвакрол 0,98 + бензойная кислота 62,5-31,25. Следовательно, карвакрол и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:75.
6. карвакрол 0,98-0,73 + молочная кислота 125-62,5. Следовательно, карвакрол и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:60 до 1:180.
7. тимол 1,46-0,49 + лимонная кислота 31,25-15,63. Следовательно, тимол и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:75.
8. тимол 0,98 + сорбиновая кислота 25-6,25. Следовательно, тимол и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:30.
9. тимол 0,98-0,73 + яблочная кислота 125-31,25. Следовательно, тимол и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:180.
10. тимол 1,82-0,98 + фумаровая кислота 125-31,25. Следовательно, тимол и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:150.
11. тимол 0,98-0,73 + бензойная кислота 62,5-15,63. Следовательно, тимол и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:90.
12. тимол 0,98 + молочная кислота 500. Следовательно, тимол и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:450 до 1:550.
13. коричный альдегид 0,98-0,49 + лимонная кислота 15,63-7,82. Следовательно, коричный альдегид и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:35.
14. коричный альдегид 1,46-0,49 + сорбиновая кислота 50-3,13. Следовательно, коричный альдегид и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:2 до 1:110.
15. коричный альдегид 0,49 + яблочная кислота 62,5-15,63. Следовательно, коричный альдегид и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:135.
16. коричный альдегид 0,98 + фумаровая кислота 62,5-15,63. Следовательно, коричный альдегид и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:65.
17. коричный альдегид 0,98-0,73 + бензойная кислота 31,25 – 7,62. Следовательно, коричный альдегид и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:50.
18. коричный альдегид 1,46-0,98 + молочная кислота 125-62,5. Следовательно, коричный альдегид и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:40 до 1:135.
19. ванилин 1,82-0,49 + лимонная кислота 31,25. Следовательно, ванилин и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:70.
20. ванилин 1,82-0,98 + сорбиновая кислота 50-25. Следовательно, ванилин и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:60.
21. ванилин 1,46 + яблочная кислота 125. Следовательно, ванилин и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:80 до 1:100.
22. ванилин 1,82-0,73 + фумаровая кислота 31,25-3,91. Следовательно, ванилин и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:2 до 1:50.
23. ванилин 0,73-0,49 + бензойная кислота 62,5. Следовательно, ванилин и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:80 до 1:130.
24. ванилин 1,82-0,98 + молочная кислота 500-250. Следовательно, ванилин и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:100 до 1:600.
25. камфора 0,98-0,49 + лимонная кислота 31,25. Следовательно, камфору и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:70.
26. камфора 0,98 + сорбиновая кислота 25. Следовательно, камфору и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:20 до 1:40.
27. камфора 1,46 + яблочная кислота 250. Следовательно, камфору и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:150 до 1:200.
28. камфора 1,82-1,46 + фумаровая кислота 125-62,5. Следовательно, камфору и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:100.
29. камфора 1,82 + бензойная кислота 62.5. Следовательно, камфору и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:40.
30. камфора 1,82-0,98 + молочная кислота 500. Следовательно, камфору и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:250 до 1:600.
31. гептановая кислота 1,82-0,49 + лимонная кислота 31,25-7,82. Следовательно, гептановую кислоту и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:70.
32. гептановая кислота 1,82-0,73 + сорбиновая кислота 50-3,13. Следовательно, гептановую кислоту и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:1 до 1:70.
33. гептановая кислота 1,82-0,73 + бензойная кислота 62,5-7,82. Следовательно, гептановую кислоту и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:100.
34. гептановая кислота 1,82-0,73 + молочная кислота 250-31,25. Следовательно, гептановую кислоту и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:400.
35. октановая кислота 1,82-0,49 + лимонная кислота 31,25. Следовательно, октановую кислоту и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:70.
36. октановая кислота 1,82-0,49 + сорбиновая кислота 50. Следовательно, октановую кислоту и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:20 до 1:120.
37. октановая кислота 1,82-1,46 + яблочная кислота 250. Следовательно, октановую кислоту и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:100 до 1:200.
38. октановая кислота 0,73 + фумаровая кислота 7,82. Следовательно, октановую кислоту и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:15.
39. октановая кислота 1,82-0,73 + бензойная кислота 62,5. Следовательно, октановую кислоту и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:200.
40. октановая кислота 1,82 + молочная кислота 250. Следовательно, октановую кислоту и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:100 до 1:150.
41. лимонен 1,82-0,73 + лимонная кислота 31,25. Следовательно, лимоненовую кислоту и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:50.
42. лимонен 1,82-0,98 + сорбиновая кислота 50. Следовательно, лимоненовую кислоту и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:20 до 1:60.
43. лимонен 1,82-0,49 + яблочная кислота 250. Следовательно, лимоненовую кислоту и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:100 до 1:600.
44. лимонен 1,82-1,46 + бензойная кислота 62,5. Следовательно, лимоненовую кислоту и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:50.
45. лимонен 1,82 + молочная кислота 500. Следовательно, лимоненовую кислоту и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:250 до 1:300.
46. диаллилдисульфид 1,82-0,49 + лимонная кислота 31,25-7,82. Следовательно, диаллилдисульфид и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:70.
47. диаллилдисульфид 1,82-0,73 + сорбиновая кислота 50-3,13. Следовательно, диаллилдисульфид и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:1 до 1:70.
48. диаллилдисульфид 1,82-0,98 + яблочная кислота 250-62,5. Следовательно, диаллилдисульфид и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:270.
49. диаллилдисульфид 1,82-0,98 + бензойная кислота 62,5-15,63. Следовательно, диаллилдисульфид и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:70.
50. диаллилдисульфид 1,82-0,73 + молочная кислота 500-15,63. Следовательно, диаллилдисульфид и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:700.
51. розмариновая кислота 0,98 + лимонная кислота 31,25. Следовательно, розмариновую кислоту и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:40.
52. розмариновая кислота 1,46 + сорбиновая кислота 12,5. Следовательно, розмариновую кислоту и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:15.
53. розмариновая кислота 0,98 + яблочная кислота 62,5. Следовательно, розмариновую кислоту и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:50 до 1:100.
54. розмариновая кислота 1,82-0,98 + фумаровая кислота 62,5. Следовательно, розмариновую кислоту и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:80.
55. розмариновая кислота 1,82-0,73 + бензойная кислота 15,63. Следовательно, розмариновую кислоту и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:30.
56. розмариновая кислота 1,82-0,49 + молочная кислота 125-62,5. Следовательно, розмариновую кислоту и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:300.
57. α-пинен 1,46-0,73 + лимонная кислота 31,25-7,82. Следовательно, α-пинен и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:50.
58. α-пинен 0,98-0,73 + сорбиновая кислота 50-1,56. Следовательно, α-пинен и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:1 до 1:80.
59. α-пинен 1,46-0,49 + яблочная кислота 250-15,63. Следовательно, α-пинен и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:600.
60. α-пинен 1,46-0,49 + фумаровая кислота 125-3,91. Следовательно, α-пинен и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:2 до 1:300.
61. α-пинен 1,46-0,49 + бензойная кислота 62,5-7,82. Следовательно, α-пинен и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:150.
62. α-пинен 1,46-0,49 + молочная кислота 500-15,63. Следовательно, α-пинен и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:1200.
63. α-туйон 1,82-0,73 + лимонная кислота 31,25-7,82. Следовательно, α-туйон и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:50.
64. α-туйон 1,82-0,49 + сорбиновая кислота 50-3,13. Следовательно, α-туйон и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:1 до 1:120.
65. α-туйон 1,82-0,73 + яблочная кислота 250-15,63. Следовательно, α-туйон и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:400.
66. α-туйон 1,82-0,98 + фумаровая кислота 125-3,91. Следовательно, α-туйон и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:2 до 1:150.
67. α-туйон 1,46-0,49 + бензойная кислота 62,5-15,63. Следовательно, α-туйон и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:10 до 1:150.
68. α-туйон 1,46-0,49 + молочная кислота 500-31,25. Следовательно, α-туйон и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:20 до 1:1200.
69. цинеол 1,82-0,98 + лимонная кислота 31,25-7,82. Следовательно, цинеол и лимонную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:40.
70. цинеол 1,82-0,73 + сорбиновая кислота 50-1,56. Следовательно, цинеол и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:0,5 до 1:70.
71. цинеол 1,82-0,98 + яблочная кислота 250-15,63. Следовательно, цинеол и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:300.
72. цинеол 1,82-1,46 + фумаровая кислота 62,5-7,82. Следовательно, цинеол и фумаровую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:50.
73. цинеол 1,82-0,49 + бензойная кислота 62,5-7,82. Следовательно, цинеол и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:150.
74. цинеол 1,82-0,73 + молочная кислота 250-7,82. Следовательно, цинеол и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:350.
75. γ-терпинен 1,82-0,49 + сорбиновая кислота 50-6,25. Следовательно, γ-терпинен и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:2 до 1:120.
76. γ-терпинен 1,82-1,46 + яблочная кислота 250-62,5. Следовательно, γ-терпинен и яблочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:30 до 1:200.
77. γ-терпинен 1,82-0,49 + бензойная кислота 62,5-7,82. Следовательно, γ-терпинен и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:150.
78. γ-терпинен 1,82-0,73 + молочная кислота 500-15,63. Следовательно, γ-терпинен и молочную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:700.
79. p-цимол 1,82-0,49 + сорбиновая кислота 50-12,5. Следовательно, p-цимол и сорбиновую кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:120.
80. p-цимол 1,82-0,49 + бензойная кислота 62,5-7,82. Следовательно, p-цимол и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:4 до 1:130.
81. p-цимол 1,82-0,49 + молочная кислота 500-15,63. Следовательно, p-цимол и бензойную кислоту предпочтительно применяют в молярном соотношении от около 1:5 до 1:1150.
Ниже приведены некоторые предпочтительные варианты изобретения:
1. Композиция, содержащая смесь из:
- по меньшей мере одного ароматического соединения, выбранного из группы, включающей тимол, ванилин, карвакрол, коричный альдегид, октановую кислоту, гептановую кислоту, диаллилдисульфид, камфору, лимонен, розмариновую кислоту, p-цимол, γ-терпинен, α-пинен, α-туйон, 1,8-цинеол; и
- по меньшей мере одну органическую кислоту, выбранную из группы, содержащей молочную кислоту, яблочную кислоту, бензойную кислоту, фумаровую кислоту и сорбиновую кислоту, или их соли с щелочным или щелочноземельным металлом.
2. Композиция по 1, в которой дополнительно присутствует лимонная кислота или цитрат щелочной или щелочноземельной соли.
3. Композиция по 1 или 2, содержащая тимол, сорбиновую кислоту или ее соль с щелочным или щелочноземельным металлом, и лимонную кислоту или ее соль с щелочным или щелочноземельным металлом.
4. Композиция по любому из 1-3, в которой ароматическое вещество выбрано из группы, включающей тимол, карвакрол и коричный альдегид.
5. Композиция по любому из 1-4, в которой молярное соотношение между указанным по меньшей мере одним ароматизатором или ароматическим соединением и указанной по меньшей мере одной органической кислотой или ее солью с щелочным или щелочноземельным металлом составляет от 1:500 до 500:1, предпочтительно от 1:300 до 300:1, еще предпочтительнее от 1:200 до 200:1.
6. Композиция по 5, в которой указанное молярное соотношение составляет от 1:150 до 150:1, предпочтительно от 1:100 до 100:1.
7. Композиция по 5 и 6, в которой, для яблочной кислоты или молочной кислоты, указанное молярное соотношение составляет от 1:300 до 1:5, предпочтительно от 1:100 до 1:10.
8. Композиция по 5 или 6, в которой, для бензойной кислоты или лимонной кислоты, указанное молярное соотношение составляет от 1:250 до 1:5, предпочтительно от 1:100 до 1:10.
9. Композиция по 5 или 6, в которой, для фумаровой кислоты, указанное молярное соотношение составляет от 1:250 до 1:5, предпочтительно от 1:120 до 1:10.
10. Композиция по 5 или 6, в которой, для сорбиновой кислоты, указанное молярное соотношение составляет от 1:100 до 1:5, предпочтительно от 1:50 до 1:10.
11. Композиция по любому из 1-10, содержащая агент доставки.
12. Композиция по 11, в которой агент доставки содержит гидрогенированные и/или негидрогенированные триглицериды животного и/или растительного происхождения.
13. Способ получения композиции по любому из 1-12, включающий по меньшей мере одну стадию, на которой ароматизатор и органическую кислоту добавляют к агенту доставки в расплавленном состоянии.
14. Применение композиции по любому из 1-12 для снижения или предотвращения развития и/или пролиферации патогенных бактерий и грибов в кормах и/или премиксах для кормления животных с однокамерным желудком.
15. Применение композиции по любому из 1-12 для получения кормового продукта для использования в области зоотехники и ветеринарии для снижения или предотвращения развития и/или пролиферации патогенных бактерий и грибов в желудочно-кишечной системе животных.