Способ получения эмбрионов от телок-доноров голштинской породы
METHOD FOR OBTAINING EMBRYOS FROM HEIFERS-DONORS OF HOLSTEIN BREED

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к молочному скотоводству.
Известен способ получения телят-трансплантатов разных генотипов по отцовской линии от коров-доноров эмбрионов (РФ, патент №2112368), включающий всю технологию трансплантации эмбрионов. Отбор проводят от не менее одной генетически ценной коровы-донора эмбрионов для гетероспермного осеменения смешанной спермой быков-улучшателей и в последующем производят иммуногенетический анализ происхождения телят-трансплантатов по группам крови родителей.
Недостатком данного способа является, невозможность использование способа в племенном животноводстве.
Из уровня техники известен способ получения эмбрионов КРС, включающий отбор телок-доноров клинически здоровых, имеющих хороший экстерьер, отличную родословную, продуктивность матери за наивысшую лактацию не менее 9000 кг, с содержанием жира в молоке не менее 3,9%, белка - 3,3%, индукцию суперовуляции по схеме, путем многократного введения в виде инъекций, путем много кратного введения в виде инъекций гормональных препаратов, содержащих фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны и гормональных препаратов для синхронизации половой охоты и регулирования воспроизводительной функции, многократное осеменение с интервалом, вымывание эмбрионов после осеменения и оценку качества эмбрионов (Руководство по получению и трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота / Д.В. Попов, А.В. Бригида, Г.Ю. Косовский. М.: КлабПринт, 2017. - 55 с., 4, 8-12 с.).
Наиболее близким техническим решением является (см. Нимбона К, и др., Получение эмбрионов от коров и телок- доноров, Научное обеспечение агропромышленного комплекса, Сборник статей по материалам 73-й научно-практической конференции студентов по итогам НИР за 2017, Краснодар, 25.04.2018, с. 312-314) - D1, включающий отбор телок-доноров голштинской породы в возрасте 13-15 месяцев клинически здоровых, имеющих хороший экстерьер, отличную родословную, продуктивность матери за наивысшую лактацию не менее 9000 кг, с содержанием жира в молоке не менее 3,9%, белка - 3,3%, индукцию суперовуляции, путем не однократного введения гормональных препаратов и осеменение, проводят стимуляцию суперовуляции, используя гормональные препараты, которые вводят 10 дней подряд в разной дозировке от 1 до 5 мл на 1 гол., многократное осеменения и вымывание эмбрионов.
Недостатком известного технического решения заключается в том, что для получения эмбрионов используются телки в возрасте 15 месяцев и старше, что не достаточно обеспечивает ускоренное получение эмбрионов и их качество.
Техническим результатом - является улучшения качества эмбрионов и увеличения их количества.
Технический результат достигается тем, что в способе получения эмбрионов от телок - доноров голштинской породы, включающем отбор телок-доноров голштинской породы в возрасте 13-15 месяцев клинически здоровых, имеющих хороший экстерьер, отличную родословную, продуктивность матери за наивысшую лактацию не менее 9000 кг, с содержанием жира в молоке не менее 3,9%, белка - 3,3%, индукцию суперовуляции по схеме, путем много кратного введения в виде инъекций гормональных препаратов, содержащих фолликулостимулирующий и лютеинизирующий гормоны и гормональных препаратов для синхронизации половой охоты и регулирования воспроизводительной функции, которые вводят в разной дозировке от 1 до 5 мл на 1 гол., многократное осеменение с интервалом, вымывание эмбрионов после осеменения и оценку качества эмбрионов согласно изобретению индукцию суперовуляции проводят по схеме: в 1-й день, утром вводят препарат «Эстрофантин» в дозе 3 мл, утром, на 2-й день вводят препараты: «СИДР» в дозе одной капсулы, «Каролин» в дозе 20 мл и «Седимин» - 10 мл, на 3-й и на 11-й день, также утром, в дозе 5 мл вводят препарат «Фертагил», затем на 6, 7, и 8 й день утром и вечером вводят препарат «Фоллигон» с ежедневно уменьшающейся соответственно дозой 1 мл; 0,7 мл и 0,5 мл, на 9-й день утром телкам вводят препараты: «Фоллигон» в дозе 0,4 мл, «Динолитик» - 5 мл и из влагалища телки-донора удаляют капсулу «СИДР», а вечером препараты: «Фоллигон» и «Динолитик» в тех же дозах, далее на 11-й день, утром после введения препарата «Фертагил» осуществляют первое осеменение в количестве 2-х доз и через 8-9 часов проводят второе осеменение одной дозой, затем на 18 - день, через 7 дней, после повторного осеменения, утром осуществляют вымывание эмбрионов и вводят телке-донору препарат «СИДР».
Новизна заявленного предложения обусловлено тем что, за счет сверхраннего осеменения телок - доноров, а именно в 13-15 месяцев, используя гормональную стимуляцию с определенными препаратами, обеспечивающую суперовуляцию, увеличиваются воспроизводительные способности телок, обеспечивающие интенсивное и продолжительное их использование и сокращаются количества осеменения, что влияет на экономическую целесообразность выращивания эмбрионов.
Способ получения эмбрионов от телок - доноров голштинской породы осуществляют следующим образом.
В хозяйстве из зоотехнической документации выбираются телки в возрасте 13-145 месяцев, происхождение (матери и отца голштинской породы), с живой массой 350 - 400 кг, удоем матерей более 7500 кг. У отобранных телок проводится оценка состояния половых органов. При ректальном исследовании матка расположена в тазовой полости, шейка матки четко выражена, длина рогов матки 20-35 см, без спаек и новообразований, яичники овальной формы и плотной консистенции, размером 2-1,5 см., продолжительность предыдущих циклов должна составлять 19-22 дня, активное желтое тело яичника 1-1,5 см, не используются животные, если есть одновременно желтое тело и фолликул. Клинически здоровые животные: упитанность животных 2,75-3,5 балла, животные без заболевания конечностей, желудочно-кишечного тракта, органов дыхания.
После оценки состояния здоровья телкам-донорам проводят в течение 10 дней по схеме индукцию суперовуляции, представленной в таблице 1.
Для проведения индукции суперовуляции используют следующие гормональные препараты:
Препарат «Эстрофантин» - ветеринарный препарат для лечения и регуляции воспроизводительной функции у самок сельскохозяйственных животных. Препарат обладает лютеолитическими свойствами, т.е. вызывает морфологическую регрессию желтого тела; снижает уровень прогестерона, что способствует выделению гонадотропных гормонов (ФСГ и ЛГ), развитию фолликулогенеза в яичниках у самок животных и вызывает полноценную течку и овуляцию; оказывает существенное влияние на преобразование про-лиферативного эндометрия в секреторный, тем самым увеличивая количество маточных желез, обладает утеротонической активностью; регулирует воспалительную реакцию за счет воздействия на тонус сосудов (https://veterinarka.ru/vetmedicaments/estrofantin.html).
СИДР - гестагенный препарат. При введении его во влагалище, прогестерон с постоянной скоростью выделяется из капсулы и проникает через слизистую влагалища в кровяное русло. Прогестерон ингибирует гипоталамо-гипофизарную систему, вследствие этого не происходит выделение гонадотропных гормонов - фолликулостимулирующего (ФСГ) и лютеинизирующего (ЛГ), и в результате не происходит созревание фолликулов и овуляция яйцеклеток. После извлечения препарата из влагалища, уровень прогестерона в крови снижается в течение 4-6 ч, в результате происходит созревание фолликулов и их овуляция.
В заявляемом способе препарат используют для синхронизации охоты крупного рогатого скота, для этого СИДР вводят во влагалище телок на срок от 7 до 12 дней. Сразу после извлечения препарата животному вводят Динолитик в дозе 5 мл. Животные приходят в охоту через 36-96 ч после извлечения СИДР, основная часть коров и телок приходит в охоту через 72 ч. (https://www.vidal.ru/veterinar/cidr-28048)
Препарат «Каролин» применяют для нормализации обмена веществ, профилактики задержания последа и послеродовых эндометритов, нормализации воспроизводительных функций. Препарат оказывает синергическое действие на организм животных, выражающееся в нормализации обмена веществ, профилактике гипо- и авитаминоза А, повышении воспроизводительных функций маточного поголовья с/х животных, снижении заболеваемости и падежа, повышении продуктивности новорожденного молодняка (https://ultravet.ru/karolin-inekcionnyy-100ml-20fl-upak).
Препарат «Седимин» при в/м введении всасывается и депонируется в печени и кроветворных органах, восполняя дефицит железа, йода и селена в организме. Применение Седимина устраняет недостаточность железа (стимулирует эритропоэз и синтез гемоглобина), недостаточность йода (предотвращает образование зоба) и селена, вызывающую беломышечную болезнь телят и дистрофию печени поросят; нормализует обменные процессы, ускоряет рост и развитие животных, повышает устойчивость организма к различным заболеваниям, улучшает общее состояние.
Кроме того, применение Седимина способствует повышению воспроизводительной способности матки животного и получению жизнеспособного приплода; нормализует и стимулирует внутриутробное развитие плода, обеспечивает профилактику послеродовой патологии и заболеваний (задержания последов, эндометриты); вызывает повышение общей резистентности организма сельскохозяйственных животных (https://www.vidal.ru/veterinar/sedimin-27638).
Препарат «Фертагил» - гормональное лекарственное средство, предназначенное для повышения воспроизводительной функции крупного рогатого скота и кроликов. Фармакологические свойства Фертагила связаны с совместным действием этих гормонов, которые оказывают непосредственное действие на яичники: ФСГ стимулирует рост и развитие фолликулов, синтез и секрецию эстрогенов, а ЛГ вызывает овуляцию и контролирует функцию желтого тела. После внутримышечного введения гонадорелин быстро всасывается с места инъекции, сохраняясь в плазме крови не более 20 минут. Гонадорелин метаболизируется до аминокислот, пептидов и углеводов. Гонадорелин выводится из организма с мочой и выдыхаемым воздухом. Препарат вводят в дозе 5 мл, которая является стандартной и рекомендована инструкцией препарата, кроме того, в отличие от инструкции, его вводят одновременно с первым осеменением (https://veterinarka.ru/vetmedicaments/fertagil.html)
Препарат «Фоллигон» содержит в качестве действующего вещества 1000 или 5000 ME гонадотропина из сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК), в качестве вспомогательных веществ: 5 мг маннитола, 0,315 мг гидрофосфата натрия дигидрата, 0,33 мг дигидрофосфата натрия дигидрата. Фармакологические свойства Фармакотерапевтическая группа лекарственного препарата: гормоны и их антагонисты. Сыворотка жеребых кобыл содержит гонадотропный гормон обладающий фолликулостимулирующей (ФСГ) и лютеинизирующей (ЛГ) активностью. При попадании в организм животного связывается с ЛГ и ФСГ рецепторами органов-мишеней. ФСГ вызывает рост и развитие фолликулов, ЛГ стимулирует овуляцию и образование желтого тела. При инъекционном введении максимальная концентрация гонадотропина достигается через 8 часов у свиней и овец и через 16 часов у крупного рогатого скота. Период полувыведения гормона из организма животных в зависимости от их вида составляет 34-150 часов.
Фоллигон применяют для повышения воспроизводительной функции как отдельно, так и в сочетании с гестагенами и простагландинами у самок крупного рогатого скота, для индукции и синхронизации половой охоты и для вызывания суперовуляции у коров-доноров эмбрионов (https://veterinarka.ru/vetmedicaments/folligon.html).
Dinolitik (динолитик) - гормональный препарат для синхронизации половой охоты и регулирования воспроизводительной функции, Этот препарат вводят одновременно с препаратом «Фоллигон» (доза 0.4 мл, также предназначена для поддержания суперовуляции) вечером 6-го дня и на 7-й день, утром в дозе 5 мл для формирования однородных групп животных, которые не надо контролировать ежедневно за состоянием их половой активности и осеменять их в короткие сроки, а также лучше планировать и контролировать производственные процессы. Доза 5 мл стандартная и рекомендована инструкцией препарата (https://www.vidal.ru/veterinar/dinolytic-28050)
В заявляемом способе, в качестве доноров использованы 13-15 месячные телки, которым в 1-й день, утром вводят препарат «Эстрофантин» в дозе 3 мл. Введение препарата способствует выделению гонадотропных гормонов (ФСГ и ЛГ), развитию фолликулогенеза в яичниках у телок и вызывает полноценную овуляцию. При дозе меньшей 3 мл выделение ганотропных будет медленней проходить, при большей дозе, может нарушиться гормональный фон.
Утром, на 2-й день телкам вводят композицию препаратов: «СИДР» в дозе одной капсулы, «Каролин» в дозе 20 мл и «Седимин» - 10 мл.
На 3-й и на 11-й день, также утром, в дозе 5 мл вводят препарат «Фертагил».
Затем на 6 й день утром и вечером вводят ударную дозу 1 мл для стимулирования роста и созревания фолликулов в яичниках у телок, усиления секреции эстрогенов, обеспечения овуляции и образования желтого тела, а также выделения стероидных гормонов, как в фолликулах, так и в клетках желтого тела. При меньшей дозе индукция суперовуляции будет медленней проходить, при большей дозе, может нарушиться гормональный фон.
На 7 и 8-й день препарат «Фоллигон» вводят с уменьшающейся соответственно дозой 0,7 мл и 0,5 мл для поддержания суперовуляции, при отклонении от дозы могут быть нарушения в процессе, для поддержания суперовуляции, при отклонении от дозы могут быть нарушения в процессе.
На 9-й день, утром телкам вводят препараты: «Фоллигон» в дозе 0,4 мл, «Динолитик» - 5 мл и удаляют из влагалища капсулу «СИДР», а вечером препараты: «Фоллигон» и «Динолитик» в тех же дозах, также для поддержания суперовуляции, при отклонении от дозы могут быть нарушения в процессе для формирования однородных групп животных, которые не надо контролировать ежедневно за состоянием их половой активности и осеменять их в короткие сроки, а также лучше планировать и контролировать производственные процессы. Доза препарата «Динолитик» 5 мл стандартная и рекомендована инструкцией препарата.
Далее на 11-й день, утром после введения препарата «Фертагил» осуществляют первое осеменение в количестве 2-х доз и через 8-9 часов проводят второе осеменение одной дозой. Препарат вводят в дозе 5 мл, которая является стандартной и рекомендована инструкцией препарата, кроме того, в отличие от инструкции, его вводят одновременно с первым осеменением
Затем на 18- день, через 7 дней, после повторного осеменения, утром 10.30 осуществляют вымывание эмбрионов жидкостью PBS, обогащенную 2% фетальной телячьей сывороткой, для каждого вымывания 0,5 литра при трехкратном повторении и вводят во влагалище препарат «СИДР».
Через 10 дней процесс индукции суперовуляции повторяют по предложенной схеме.
Подбор быка - производителя для осеменения доноров осуществляется индивидуально для каждого животного. Критерии при подборе быков: исключение инбридинга, должна быть первая племенная категория по удою и жирности молока, высокая продуктивность матери и матери отца быка, легкость отела по быкам 7% и менее для исключения осложнения при отеле.
Осеменение телок - доноров проводят двух-кратно 3-мя дозами. Первое осеменение в количестве 2-х доз на 8 день от начала гормональной схемы утром, второе осеменение одной дозой в этот же день вечером, с интервалом 8-9 часов. Использовали на каждое животное три дозы семени: семя быка для осеменения использовали, согласно индивидуального подбора.
Пример конкретного осуществления заявляемого способа получения эмбрионов от телок-доноров голштинской породы
Для доказательства эффекта заявленного способа получения эмбрионов от телок-доноров голштинской породы, были сформированы две группы телок-доноров голштинской породы: 1 контрольная и 2 опытная с высоким уровнем генетического потенциала (таблица 2).
У матерей телок-доноров (1 и 2 группы) разница показателей молочной продуктивности была незначительной: по удою 69 кг (0,7%), содержание жира и белка в молоке соответственно 0,07% и 0,03% (в абсолютной величине).
Рассчитана будущая продуктивность эмбрионов, полученных от отобранных телок и быков-производителей, сексированным семенем, которых осеменены доноры (таблица 3).
Эмбрионы промывали в соответствии с рекомендациями Международного общества по технологиям эмбрионов (IETS).
На 18 день у телок-доноров проводили вымывание и оценку эмбрионов, для этого вводили в матку баллонный катетер и вымывали эмбрионы, используя жидкость PBS, обогащенную 2% фетальной телячьей сывороткой, для каждого вымывания 0,5 литра при трехкратном повторении. В процессе вымывания проводили трансректальный массаж, позволяющий вводимой жидкости диффундировать в два рога матки. В течение 15 минут колбы с вымытой средой от каждой телки-донора размещали в лаборатории, температура окружающей среды 25°С.
Оценивали эмбрионы под микроскопом при увеличении в 100; 60 раз, учитывая стадии развития бластоцитов: стадии морулы - 5 дней; компактной стадии - 6 дней; молодого этапа бластоциты - 7 дней; стадии бластоциты - 7 дней, - 8 дней и затитрованные стадии бластоциты 9 дней.
На оценку эмбриона влияли следующие показатели: количество, развитие, цвет и компактность клеток; размер перивителлинового пространства; количество вырожденных клеток.
В процессе исследований качества эмбрионов ранжировали по 4 классам.
I класс - присваивали оценку отлично, если идеальный эмбрион для его срока вымывания, сферической формы, симметричный с ячейками, одинаковыми по размеру, цвету и текстуре, или эмбрион немного позднего развития.
II класс - хорошее развитие эмбриона, если выглядят моложе на 1-2 дня, или имеют дефекты - экранированные клетки в перивителлическом пространстве, бластомеры различного развития, встречаются некоторые выроженные клетки и отдельные везикулы.
III класс - оценка неудовлетворительная, если четко видные аномалии и много дефектов, клетки эвакуированные, вырожденные, разных размеров, а также большие и многочисленные везикулы.
IV класс - брак, погибшие или дегенерированные, тяжелые аномалии, задержка роста на ранней стадии с вырожденными клетками.
Для доказательства эффективности способа, были созданы 2 группы аналогов по 6 телок: 1 группа - с суперовуляцией яичников по прототипу, 2 группа - с суперовуляции яичников по заявляемому способу.
В таблице 4 представлены данные по количеству и качеству вымытых эмбрионов от телок-доноров:
Таким образом, анализируя данные таблицы, можно утверждать, что заявляемый способ получения эмбрионов эффективнее, чем прототип на 3-4%.
Более детально результаты эксперимента приведены в таблице 5. Полученные эмбрионы в различных группах отличаются по количеству и качеству:
- Первая группа - количество от 3 до 28 эмбрионов, в среднем - 9,17 на 1 голову, из них 45 эмбрионов пересаживали, в среднем 7,50 эмбрионов на 1 голову.
- Вторая группа - от 1 до 16 эмбрионов, в среднем - 8,33 на 1 голову, из них 36 (6 эмбрионов на гол.) пересажемых эмбрионов
- Третья группа - от 3 до 35 эмбрионов (21,5 эмбрионов на гол.) и них 113 эмбриона (18,83 первого класса)
- Четвертая группа - от 3 до 19 эмбрионов (10,33 в среднем) из них 6,67 эмбрионо первого класса
- Пятая группа - от 13 до 42 эмбриона, в среденем 20,17 эмбрионов из 12 пересажеваемых эмбрионов
В таблице 5 представлены данные по количеству и качеству вымытых эмбрионов от телок-доноров:
Таким образом, анализируя данные таблицы 5, можно утверждать, что использование заявляемого способа получения эмбрионов позволило получить от 1 до 42 эмбрионов от каждой коровы-донора. От одной коровы получено 35 эмбрионов первого класса, а у других 33, 26, 18 соответственно первого класса.
Решение данной проблемы возможно при внедрении новых биотехнологических методов в скотоводстве, в том числе получение и трансплантацию эмбрионов от высокопродуктивных животных. В связи с повышением молочной продуктивности коров лактационная доминанта подавляет воспроизводительные функции у животных, что затрудняет ежегодное получение телят от высокопродуктивных животных, проведение эффективной селекции в стадах в стадах молочного скота и достигнуть расширенного воспроизводства.