Возможности и перспективы клонального микроразмножения интродуцированных видов рододендрона

культур в Хакасии не более ста дней и проследить влияние фторидного загрязнения как, например, на многолетних растениях, не представляется возможным.

Климатические особенности Хакасско-Минусинской котловины: температура приземного слоя воздуха, атмосферные осадки, водный режим почв и грунтов, ветровая активность, особенности почвенного покрова, орография и в том числе территории окружающей САЗ, представляют мощный самоочищающий и нейтрализующий природный комплекс, способный длительное время переводить активные химические соединения в нерастворимые. Однако природный барьер не является вечным и неограниченным. Поэтому существует реальная необходимость соблюдения постоянного мониторинга окружающей среды, тщательного статистического анализа результатов исследований и интеграции данных наблюдений.

Литература

1. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов. - М.: Колос, 1983. - 336 с.

2. Методические указания по проведению комплексного мониторинга плодородия почв, земель сельскохозяйственного назначения / ВНИИА им. Д.Н. Прянишникова. - М., 2003. - 195с.

3. Методические указания по ионометрическому определению содержания фтора в растительной продукции, кормах и комбикормах: утв. Зам. министра сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации А.Г. Ефремовым, 14.04.1995. - М., 1995. - 9 с.

4. Танделов, Ю.П. Фтор в системе почва-растение / Ю.П. Танделов; под ред. акад. РАСХН В.Г. Минеева. -М.: Россельхозакадемия, 2004. - С. 6.

--------♦-----------

УДК 581.14.6:582.912 О.Г. Васильева

ВОЗМОЖНОСТИ И ПЕРСПЕКТИВЫ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ ВИДОВ РОДОДЕНДРОНА

В настоящей работе показана перспективность биотехнологических методов размножения представителей рода Rhododendron. Усовершенствована технология клонального микроразмножения некоторых интродуцированных видов и форм рододендрона. Данная методика позволит размножать в достаточном количестве многие высокодекоративные виды и формы. Создание банка этих культур in vitro позволит сохранять генофонд растительных ресурсов.

Род Rhododendron (L.) - самый крупный в семействе вересковых. Он насчитывает свыше 1300 дикорастущих видов и около 12000 сортов. Рододендроны - это вечнозеленые, полувечнозеленые или листопадные кустарники, кустарнички, реже деревья. Рододендроны являются лекарственными, эфиромасличными, дубильными и почвоукрепляющими растениями [1,2]. Однако самая большая ценность рододендронов в их высокой декоративности. По многообразию форм и окраске цветков и листьев, по сохранению декоративного вида в любое время года они не имеют себе равных среди красивоцветущих кустарников.

В отделе дендрологии ГБС РАН более 50 лет занимаются интродукцией рододендронов. Испытано 186 видов, в коллекции насчитывается 60 видов и сортов. По результатам многолетних наблюдений 42 наименования рододендрона рекомендованы как наиболее декоративные и вполне зимостойкие растения в условиях Нечерноземной зоны [1].

Рододендроны размножают как семенами, так и вегетативно. Семенное размножение весьма эффективно для видовых рододендронов, так как получается наиболее устойчивый к местным условиям материал с хорошо развитой корневой системой, отличающийся более высокой зимостойкостью [1-3]. Однако семенной способ размножения имеет существенный недостаток: сеянцы зацветают впервые позже, чем при вегетативном размножении - на 3-10 год в зависимости от вида. К тому же всхожесть семян рододендронов сохраняется при правильном хранении всего 1-2 года, а затем резко снижается [2].

При вегетативном же способе размножения цветение и зрелость саженцев наступает значительно раньше, чем при семенном. Также при вегетативном размножении молодые растения сохраняют все призна-

ки и свойства материнского растения, что очень важно для сохранения типичных признаков отдельных форм и сортов. Наряду с традиционными методами вегетативного размножения (черенками, прививкой, отводками, делением куста) существует и метод клонального микроразмножения растений.

В настоящее время преимущество клонального микроразмножения перед традиционными методами вегетативного и семенного размножения растений неоспоримо [4,5].

Пионером в области использования метода культуры in vitro для промышленного размножения рододендронов является питомник Бриггса (США). Более 30 лет назад Бриггсом и Андерсоном были проведены совместные исследования по клональному размножению растений семейства Ericaceae. В результате была предложена питательная среда, наиболее подходящая для культивирования этих культур [4].

В настоящее время посредством размножения in vitro производится несколько сотен культиваров рододендрона [5]. Однако информация, касающаяся методик клонального микроразмножения в питомниках, является коммерческой тайной. Единичные публикации затрагивают лишь узкие вопросы и весьма противоречивы.

Остается актуальной разработка и совершенствование технологии клонального микроразмножения рододендронов, интродуцированных в ГБС РАН, что и явилось целью наших исследований.

В качестве объектов были выбраны рекомендованные отделом дендрологии наиболее перспективные вечнозеленые и листопадные, зимующие в условиях Москвы виды рододендроны: Rhododendron smirnowii Trautv., Rh. catawbiense Michx., Rh. brachycarpumn D.Don ex G. Don, Rh. maximum L., Rh. japonicum (A. Gray) Suring, Rh. ledebourii Pojark, Rh. roseum (Loisel.) Rehd., Rh. vaseyi A. Grey, Rh.canadense (L.) Torr и другие.

В качестве стерилизующих агентов использовали сулему (1% р-р HgCl2) и лизоформин-3000 (3% р-р) Для индукции культуры в качестве эксплантов использовали апикальные и латеральные почки побегов текущего года, а также сегменты стерильных проростков (семена рододендронов репродукции ГБС 1999-2000, 2006-2007 гг.).

Было установлено, что у исследуемых нами рододендронов более высоким регенерационным потенциалом обладали экспланты, вычлененные из ювенильных побегов. У зрелых эксплантов регенерационный потенциал был близок к нулю. С точки зрения регенерационной способности молодые экспланты с побегов текущего года занимали промежуточное положение по сравнению с эксплантами с одревесневших побегов.

Это может быть объяснено тем, что у ювенильных эксплантов по сравнению со зрелыми синтезируется большее количество эндогенных фитогормонов, способствующих дедифференциации клеточных структур, их активному делению и росту, приводящему к образованию новых побегов. С увеличением возраста экспланта и степени его зрелости синтез эндогенных гормонов в нем снижается, что служит затем препятствием дедифференциации клеточных структур, их активному делению и росту.

Лучшие результаты по времени взятия экспланта были получены после прохождения растениями периода органического и вынужденного покоя, а также в фазе начала активного роста побегов.

Для получения стерильной культуры рододендронов из проростков семян сезонность принципиального значения не имеет при строгом соблюдении условий культивирования.

Для индукции культуры рододендронов использовалась питательная среда, предложенная Андерсоном в 1984 году. Эту среду мы приняли за стандартную.

Наблюдения, проведенные в процессе микроразмножения, показали, что темпы развития эксплантов существенно меняются в процессе культивирования.

Так, на этапе введения в культуру in vitro и при первом субкультивировании коэффициент размножения (Кр) и длина образующихся побегов были значительно ниже, чем при последующих пассажах [6].

Основной метод, используемый нами - активация развития уже существующих в растении пазушных меристем, за счет снятия апикального доминирования.

Среди факторов, оказывающих наибольшее влияние на морфогенетические процессы на этапе размножения, в первую очередь необходимо выделить видовые особенности растений - доноров, что выражается в количестве дополнительно заложенных почек и побегов.

На гистограмме, представленной на рисунке, приведены коэффициенты размножения различных видов рододендрона, которые варьировали от 1,6 до 12.

14 п

1 2 3 4 5 6 7 8

Коэффициент размножения рододендронов в зависимости от генотипа на среде Андерсона с соотношением ИУК: 2иП 4:15:

1. Rh. smirnowii Trautv; 5. Rh. japonicum (AGray) Suring;

2. Rh. brachycarpum D.Don ex G.Don; 6. Rh. ledebourii Pojark

3. Rh. maximum L; 7. Rh. roseum (Loisel) Rehd;

4. Rh. catawbiense Michx; 8. Rh. vaseyi v. album Bean

Из анализа гистограммы следует, что наибольшей регенерационной способностью характеризовались Rh. ledebourii и Rh. roseum.

По интенсивности пролиферации испытанные виды рододендроны были условно разделены на 2 группы: 1-я группа, Кр >6; 2-я группа, Кр <6.

К первой группе относятся листопадные рододендроны, а ко второй - вечнозеленые. Это, очевидно, объясняется биологическими особенностями развития данных видов.

Причем, у листопадных растений при последующих субкультивированиях коэффициент размножения увеличивался до 20-30, а у вечнозеленых оставался почти без изменений.

Необходимо отметить также, что потребность эксплантов в регуляторах роста может также меняться в зависимости от числа проведенных субкультивирований.

При длительном культивировании растительных тканей на питательных средах происходит накопление цитокининов выше необходимого уровня, что приводит к формированию растений с измененной морфологией, образованию витрифицированных побегов и, впоследствии, к снижению способности к укоренению.

Дальнейшие исследования были направлены на возможность повышения коэффициента размножения у некоторых видов рододендрона, что позволяло сократить число пассажей для получения необходимого количества материала.

Для поддержания устойчиво пролиферирующей культуры in vitro весьма существенным является правильный подбор и оптимальное соотношение стимуляторов роста (цитокининов и ауксинов).

С целью получения выровненных побегов листопадных рододендронов, способных к дальнейшему ризогенезу, был проведен опыт по применению препаратов группы цитокининов и их комбинации с ауксинами. В качестве цитокининов использовали Zeatin, Kinetin, 6-BAP в концентрациях 1 и 1,5 мг/л без ауксинов и с добавлением I IA в концентрации 1мг/л.

Продолжительность субкультивирования составила 60-70 дней. Учитывали следующие показатели: коэффициент размножения (КР), высоту растений-регенерантов и количество междоузлий (табл.).

На изученных средах у всех 3-х генотипов рододендрона более интенсивное размножение наблюдалось на среде Андерсона с добавлением Zeatin в концентрации 1 мг/л и на среде, содержащей 1мг/л Zeatin +1 мг/л I IA.

Наибольшим регенерационным потенциалом характеризовался Rh. ledebourii на всех модификациях питательных сред Кр=19,8. Расчетный коэффициент размножения у данного вида достигал 126,8 на среде с содержанием 1 мг/л Z и 1 мг/л I IA.

Влияние различных веществ с цитокиноиновой активностью на морфометрические показатели

некоторых видов рододендронов

Среда Коэффициент размножения Высота побега, см Количество междоузлий, шт. Количество микрочеренков, шт.

НЬ. ЫеЬоигп Ро]агк

1 18,8 1,1 5,23 104,9

2 16,1 0,92 5,02 75,9

3 19,8 1,24 6,14 126,8

4 12,9 1,2 5,34 112,5

5 1,9 1,77 9,99 18,0

6 1,9 1,36 7,63 14,2

7 1,8 1,17 6,05 10,5

8 1,2 1,87 8,94 10,0

9 1,7 1,82 9,99 11,5

10 2,5 1,84 9,2 22,5

11 1,6 1,63 7,0 10,8

12 1,7 2,6 11,03 17,6

НСР05 2,22 0,27 1,09 -

НЬ. іаропісит (A.Gray) Suring

1 16,2 1,8 7,59 97,3

2 14,4 1,79 7,2 105,7

3 9,9 1,59 8,68 110,7

4 13,3 1,5 9,04 85,4

5 9,3 1,46 8,34 97,2

6 8,7 1,48 8,38 84,3

7 7,4 1,23 7,57 79,4

8 7,0 1,51 7,75 68,2

9 8,6 1,63 10,3 81,6

10 11,3 1,64 9,14 98,1

11 7,6 1,05 9,71 86,7

12 7,0 1,02 8,22 82,5

НСР05 2,57 0,13 0,89 -

НЬ. roseum ^оівеї.) НеЬсі

1 11,1 1,85 Образование тонких побегов с большим количеством сближенных междоузлий

2 10,8 1,83

3 9,9 1,88

4 6,7 1,84

5 6,4 1,87

6 6,7 1,83

7 3,4 2,09

8 6,0 1,59

9 4,3 1,46

10 4,6 1,34

11 3,5 1,05

12 4,9 0,8

НСР05 1,41 0,22

На этой же среде у НЬ. ]аропюит также был отмечен высокий коэффициент размножения Кр=9,9, а расчетный достигал величины 110,7.

Особенностью №. говеит. являлось образование тонких побегов с большим количеством сближенных междоузлий, что сделало невозможным подсчет междоузлий. Поэтому расчетный коэффициент раз-

множения для данного вида в таблице не представлен. Была отмечена еще одна особенность этого вида: при горизонтальном расположении микрочеренка, состоящего из 5-7 сильно сближенных междоузлий, и при соприкосновении узлов со средой, через 4-5 недель культивирования наблюдалось образование пучков ак-силлярных побегов по 3-5 штук в каждом узле, что приводило к многократному увеличению Кр.

При интенсивном размножении Rh. vaseyi. образовывались конгломераты, состоящие в основном из укороченных побегов. Но для успешного укоренения и последующего развития растений наиболее пригодны побеги длиной больше 10 мм [7,8].

Добиться элонгации побегов можно путем культивирования эксплантов на специальных средах. Такой средой является среда Андерсона с пониженным содержанием цитокинина (соотношение I IA : 2iP = 1:5) [6].

Важным моментом при получении растений-регенерантов является укоренение микропобегов.

На этапе укоренения нами было изучено 2 способа аппликации ауксина, влияющего на формирование корневой системы [9]:

1) непосредственное культивирование микропобегов на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (1 мг/л);

2) обработка базальной части побегов ауксинами в более высокой концентрации (30-50 мг/л) в течение 3-6 часов с последующим культивированием на средах, свободных от регуляторов роста.

Результаты исследований показали, что наибольший процент укоренившихся растений наблюдался при замачивании микрочеренков в спиртовом растворе IBA в концентрации 30 мг/л.

В этом варианте выход укоренившихся растений Rh. ledebourii составил 100%, у Rh. smirnowii - 66%. В контроле Rh. ledebourii - 75-80 %, а у Rh. smirnowii не превышала 50%. Причем положительное влияние кратковременных обработок появлялось не только в увеличении процента укоренившихся растений, но и в качестве развивающихся корней. Формирование корней проходило без образования каллусной ткани.

Очевидно, действие ауксинов для индукции ризогенеза необходимо только на первых этапах. Как показали наши исследования, дальнейший контакт развивающихся корней с этими веществами бесполезен и даже нежелателен.

Использование второго способа аппликации ауксина приводило к сокращению времени укоренения с 2,5-3 месяцев до 1-1,5.

Повышение частоты укоренения побегов возможно связано с процессами оздоровления культивируемых эксплантов - с одной стороны, а с другой - с реювенилизацией, увеличением в эксплантах доли молодых клеток, изменениями биохимического состава и подготовленностью тканей к регенерации.

Для успешной адаптации растений-регенерантов рододендронов к условиям in vivo мы использовали субстрат, состоящий из смеси верхового торфа и песка в соотношении 1:1, с добавлением хвойной земли (полуразложившейся подстилки соснового леса).

При соблюдении известных условий адаптации можно добиться 90-98%-й приживаемости регенеран-тов рододендронов.

При замедлении роста в первый год после высадки саженцев в открытый грунт в почвенную смесь, названную выше, отмечено хорошее их жизненное состояние. Через год наблюдается активный рост побегов, а в последующие годы и более раннее заложение цветочных почек.

Растения-регенеранты, прошедшие цикл культивирования in vitro, могут быть использованы в дальнейшем как маточный материал для «зеленого черенкования», так как имеют более высокую способность к ризогенезу по сравнению с коллекционными маточными растениями.

В результате проведенных исследований:

^ Усовершенствована технология клонального микроразмножения некоторых видов рододендронов.

т Показано, что морфогенез в культуре in vitro испытанных растений тесно связан с их генетическими особенностями, определяющими потенциальную возможность к регенерации.

т Установлено, что экспланты стерильных проростков легче регенерируют in vitro, по сравнению с другими эксплантами, обнаруживают большую способность к образованию дополнительных побегов.

т Показана возможность увеличения коэффициента размножения различных видов, посредством введения в среду менее распространенных для вересковых растений веществ с цитокининовой активностью.

Ризогенез микропобегов рододендронов, как и у других представителей семейства Ericaceae (эрика, голубика, брусника и др.), можно осуществлять путем изменения способа аппликации индуктора корнеобразования.

-г Создан банк стерильных культур 11 видов рододендронов, который служит одним из способов сохранения биоразнообразия растений ex situ.

Литература

1. Александрова, М.С. Рододендроны / М.С. Александрова. - М.: Фитон. - 192 с.

2. Кондратович, Р.Я. Рододендроны в Латвийской ССР / Р.Я. Кондратович. - Рига: Зинанте, 1981. - 332 с.

3. Ботяновский, И.Е. Культура рододендронов в Белоруссии / И.Е. Ботяновский. - Минск. Наука и техника, 1981. - 96 с.

4. Anderson, W.C. (1984) A revised tissue cultured medium for shoot multiplication of rhododendron. J Am Soc Hortic Sci 109:343-347.

5. Norton M.E., Norton C.R. (1986) Shoot proliferation in vitro in twenty Ericaceous plants. Plant Propagator 32(2): 2-5.

6. Стахеева, Т.С. Особенности микроклонального размножения малораспространенных ягодных культур семейства Vacciniaceae / Т.С. Стахеева, В.М. Митрошенкова, Ю.Н. Горбунов // Мат-лы междунар. на-уч.-метод. конф. - Мичуринск, 2003. - С. 76-80.

7. Высоцкий, В.А. Клональное микроразмножение растений / В.А. Высоцкий // Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука, 1986. - С. 91-102.

8. 8. Кутас, Е.Н. Научные основы клонального микроразмножения растений на примере интродуцирован-ных сортов голубики высокой и брусники обыкновенной: автореф. дис. ... д-ра биол. наук / Е.Н. Кутас. -М., 1997. - 40 с.

9. Высоцкий, В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровительного посадочного материала и селекцию плодовых и ягодных растений: автореф. дис. ... д-ра с.-х. наук / В.А. Высоцкий. - М., 1997. - 44 с.

---------♦-----------

УДК 581.48:57.086.13 Н.М. Воронкова, А.Б. Холина

ХРАНЕНИЕ СЕМЯН: ПОПУЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ СЕМЯН НА ГЛУБОКОЕ ЗАМОРАЖИВАНИЕ

В работе изучена популяционная изменчивость ответной реакции семян некоторых представителей флоры п-ова Камчатка, Курильских о-вов, о-вов Сахалин и Монерон на криоконсервацию. Анализ жизнеспособности семян, оцененной по лабораторной всхожести, показал, что глубокое замораживание в жидком азоте (-196°С) не приводит к их гибели и может быть рекомендовано для семян изученных видов. Результаты по популяционной изменчивости необходимо учитывать при создании репрезентативной коллекции семян в генном банке для сохранения богатства генофонда конкретных видов.

Одним из приоритетных направлений при изучении вопросов охраны ресурсов растительного покрова земли является создание банков семян. Проблема длительного хранения семян, как культурных, так и дикорастущих видов, в настоящее время решается путем замораживания их при сверхнизких температурах [1-2]. Замораживание семян в жидком азоте при температуре 196°С вызывает прекращение метаболизма, в результате семена остаются живыми в состоянии анабиоза. Отмечая перспективность данного метода, большинство исследователей считают, что перед проведением криоконсервации необходимо оценить влияние сверхнизкой температуры на жизнеспособность семян, и, прежде всего, на их прорастание, ход онтогенеза, развитие растений следующих поколений [3]. Контроль жизнеспособности семян во время хранения проводится по определению их всхожести.

В более ранней нашей работе по криоконсервации семян было показано, что семена даже систематически близких видов неодинаково реагируют на замораживание, т.е. их реакция на глубокое замораживание видоспецифична [4]. Однако толерантность семян при глубоком замораживании не только имеет видовую специфику, но и обладает популяционной изменчивостью.

Целью исследования является сравнительный анализ популяционной изменчивости ответной реакции семян некоторых представителей дальневосточной флоры на криоконсервацию. На данном этапе изучали влияние глубокого замораживания на жизнеспособность семян.