ГЕНОМНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

1. Способ изменения ДНК-мишени в клетке, включающий введение в клетку TALEN, утратившую последовательности повторов в 100 пар оснований или длиннее, где TALEN расщепляет ДНК-мишень, и клетка подвергается негомологичному соединению концов с получением измененной ДНК в клетке.
2. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 90 п.о. или длиннее.
3. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 80 п.о. или длиннее.
4. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 70 п.о. или длиннее.
5. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 60 п.о. или длиннее.
6. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 50 п.о. или длиннее.
7. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 40 п.о. или длиннее.
8. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 30 п.о. или длиннее.
9. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 20 п.о. или длиннее.
10. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 19 п.о. или длиннее.
11. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 18 п.о. или длиннее.
12. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 17 п.о. или длиннее.
13. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 16 п.о. или длиннее.
14. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 15 п.о. или длиннее.
15. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 14 п.о. или длиннее.
16. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 13 п.о. или длиннее.
17. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 12 п.о. или длиннее.
18. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 11 п.о. или длиннее.
19. Способ по п. 1, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 10 п.о. или длиннее.
20. Способ по п. 1, где клетка представляет собой эукариотическую клетку.
21. Способ по п. 1, в котором клетка представляет собой дрожжевую клетку, клетку растения или животную клетку.
22. Способ по п. 1, где клетка представляет собой соматическую клетку.
23. Способ по п. 1, где клетка представляет собой стволовую клетку.
24. Способ по п. 1, в котором клетка представляет собой стволовую клетку человека.
25. Способ по п. 1, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей TALEN, где TALEN экспрессируется, и где TALEN расщепляет целевую ДНК с получением измененной ДНК в клетке.
26. Способ по п. 1, включающий введение в клетку вируса, включающего первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую TALEN, где TALEN экспрессируется, и где TALEN расщепляет целевую ДНК с получением измененной ДНК в клетке.
27. Способ по п. 1, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей TALEN, имеющей TALE-последовательность
или последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность с TALE-последовательностью,
где TALEN экспрессируется, и
где TALEN расщепляет целевую ДНК с получением измененной ДНК в клетке.
28. Способ по п. 1, включающий
введение в клетку вируса, включающего первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую TALEN, имеющую TALE-последовательность
или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% TALE-последовательности,
где TALEN экспрессируется, и
где TALEN расщепляет целевую ДНК с получением измененной ДНК в клетке.
29. Способ изменения ДНК-мишени в клетке, включающий
объединение в пределах клетки TALEN, утратившей повторяющиеся последовательности в 100 п.о. или длиннее и донорной последовательности нуклеиновой кислоты, где TALEN расщепляет целевую ДНК, а донорная последовательность нуклеиновой кислоты встраивается в ДНК в клетке.
30. Способ по п. 29, где клетка подвергается негомологичному соединению концов для получения измененной ДНК в клетке.
31. Способ по п. 29, где клетка подвергается гомологичной рекомбинации с получением измененной ДНК в клетке.
32. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 90 п.о. или длиннее.
33. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 80 п.о. или длиннее.
34. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 70 п.о. или длиннее.
35. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 60 п.о. или длиннее.
36. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 50 п.о. или длиннее.
37. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 40 п.о. или длиннее.
38. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 30 п.о. или длиннее.
39. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 20 п.о. или длиннее.
40. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 19 п.о. или длиннее.
41. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 18 п.о. или длиннее.
42. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 17 п.о. или длиннее.
43. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 16 п.о. или длиннее.
44. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 15 п.о. или длиннее.
45. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 14 п.о. или длиннее.
46. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 13 п.о. или длиннее.
47. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 12 п.о. или длиннее.
48. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 11 п.о. или длиннее.
49. Способ по п. 29, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 10 п.о. или длиннее.
50. Способ по п. 29, где клетка представляет собой эукариотическую клетку.
51. Способ по п. 29, где клетка представляет собой дрожжевую клетку, клетку растения или животной клетки.
52. Способ по п. 29, где клетка представляет собой соматическую клетку.
53. Способ по п. 29, где клетка представляет собой стволовую клетку.
54. Способ по п. 29, где клетка представляет собой человеческую стволовую клетку.
55. Способ по п. 29, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей TALEN, где TALEN экспрессируется, и где TALEN расщепляет целевую ДНК с получением измененной ДНК в клетке.
56. Способ по п. 29, включающий введение в клетку вируса, включающего первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую TALEN, где TALEN экспрессируется, и где TALEN расщепляет целевую ДНК с получением измененной ДНК в клетке.
57. Способ по п. 29, включающий введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей TALEN, имеющую TALE-последовательность
или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% TALE-последовательности, где TALEN экспрессируется, и где TALEN расщепляет целевую ДНК с получением измененной ДНК в клетке.
58. Способ по п. 29, включающий введение в клетку вируса, включающего первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую TALEN, имеющую TALE-последовательность
или последовательность, идентичную, по меньшей мере, на 90% TALE-последовательности,
где TALEN экспрессируется, и
где TALEN расщепляет целевую ДНК с получением измененной ДНК в клетке.
59. Вирус, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую TALEN, утратившую повторяющиеся последовательности в 100 п.о. или длиннее.
60. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 90 п.о. или длиннее.
61. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 80 п.о. или длиннее.
62. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 70 п.о. или длиннее.
63. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 60 п.о. или длиннее.
64. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 50 п.о. или длиннее.
65. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 40 п.о. или длиннее.
66. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 30 п.о. или длиннее.
67. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 20 п.о. или длиннее.
68. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 19 п.о. или длиннее.
69. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 18 п.о. или длиннее.
70. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 17 п.о. или длиннее.
71. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 16 п.о. или длиннее.
72. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 15 п.о. или длиннее.
73. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 14 п.о. или длиннее.
74. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 13 п.о. или длиннее.
75. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 12 п.о. или длиннее.
76. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 11 п.о. или длиннее.
77. Вирус по п. 59, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 10 п.о. или длиннее.
78. Вирус по п. 59, являющийся лентивирусом.
79. Клетка, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую TALEN, утратившую повторяющиеся последовательности в 100 п.о. или длиннее.
80. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 90 п.о. или длиннее.
81. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 80 п.о. или длиннее.
82. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 70 п.о. или длиннее.
83. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 60 п.о. или длиннее.
84. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 50 п.о. или длиннее.
85. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 40 п.о. или длиннее.
86. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 30 п.о. или длиннее.
87. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в на 20 п.о. или длиннее.
88. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 19 п.о. или длиннее.
89. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 18 п.о. или длиннее.
90. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 17 п.о. или длиннее.
91. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 16 п.о. или длиннее.
92. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 15 п.о. или длиннее.
93. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 14 п.о. или длиннее.
94. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 13 п.о. или длиннее.
95. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 12 п.о. или длиннее.
96. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 11 п.о. или длиннее.
97. Клетка по п. 79, где TALEN утратила повторяющиеся последовательности в 10 п.о. или длиннее.
98. Клетка по п. 79, являющаяся эукариотической клеткой.
99. Клетка по п. 79, являющаяся дрожжевой клеткой, растительной клеткой или животной клеткой.
100. Клетка по п. 79, являющаяся соматической клеткой
101. Клетка по п. 79, являющаяся стволовой клеткой.
102. Клетка по п. 79, являющаяся человеческой стволовой клеткой.
103. Способ изготовления TALE, включающий
объединение эндонуклеазы, ДНК-полимеразы, ДНК-лигазы, экзонуклеазы, множества блоков нуклеотидных димеров, кодирующих повторяющиеся домены вариабельных двух остатков и каркасного вектора TALE-N/TF, включающего участок разрезания эндонуклеазой,
активацию разрезания эндонуклеазой каркасного вектора TALE-N/TF в участке разрезания эндонуклеазой для получения первого конца и второго конца,
активацию экзонуклеазы для создания 3' и 5' выступа на каркасном векторе TALE-N/TF и множестве блоков нуклеотидных димеров, и для гибридизации каркасного вектора TALE-N/TF и множества блоков нуклеотидных димеров в желаемом порядке,
активацию ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы для соединения каркасного вектора TALE-N/TF и множества блоков нуклеотидных димеров.
104. Способ изменения ДНК-мишени в стволовой клетке, экспрессирующий фермент, который формирует комплекс колокализации с РНК, комплементарной ДНК-мишени и который расщепляет ДНК-мишень сайт-специфическим образом, включающий
(а) введение в стволовую клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, которая кодирует РНК, комплементарную ДНК-мишени и которая направляет фермент на ДНК-мишень, где РНК и фермент являются членами комплекса колокализации на ДНК-мишени,
введение в стволовую клетку второй чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей донорную последовательность нуклеиновой кислоты,
где РНК и донорные нуклеотидные последовательности экспрессируются,
где РНК и фермент колокализуются с ДНК-мишенью, фермент расщепляет ДНК-мишень и донорная нуклеиновая кислота встраивается в ДНК-мишень, с получением измененной ДНК в стволовой клетке.
105. Способ по п. 104, где фермент представляет собой РНК-направляемый ДНК-связывающий белок.
106. Способ по п. 104, где фермент представляет собой РНК-направляемый ДНК-связывающий белок системы CRISPR II типа.
107. Способ по п. 104, где фермент представляет собой Cas9.
108. Способ по п. 104, где длина РНК составляет от около 10 до около 500 нуклеотидов.
109. Способ по п. 104, где длина РНК составляет от около 20 до около 100 нуклеотидов.
110. Способ по п. 104, где РНК представляет собой направляющую РНК.
111. Способ по п. 104, где РНК представляет собой химеру tracrRNA-crRNA.
112. Способ по п. 104, где ДНК представляет собой геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.
113. Способ по п. 104, где донорная последовательность нуклеиновой кислоты встраиваются в результате рекомбинации.
114. Способ по п. 104, где донорная последовательность нуклеиновой кислоты встраивается путем гомологичной рекомбинации.
115. Способ по п. 104, где донорная последовательность нуклеиновой кислоты встраивается негомологичным соединением концов.
116. Способ по п. 104, где РНК и донорные нуклеотидные последовательности присутствуют в одной или нескольких плазмидах.
117. Способ по п. 104, дополнительно включающий повторение стадии (а) несколько раз для того, чтобы осуществить множество изменений в ДНК в клетке.
118. Способ по п. 104, где после введения измененной ДНК в стволовую клетку, нуклеиновая кислота, кодирующая фермент, который формирует комплекс колокализации с РНК, комплементарной ДНК-мишени, и который расщепляет ДНК-мишень сайт-специфическим образом, удаляется из генома стволовой клетки.
119. Способ по п. 104, где РНК и донорные нуклеотидные последовательности экспрессируются как связанная последовательность нуклеиновой кислоты.
120. Стволовая клетка, включающая первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который образует комплекс колокализации с РНК, комплементарной ДНК-мишени и который расщепляет ДНК-мишень сайт-специфическим образом.
121. Стволовая клетка по п. 120, дополнительно включающая вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую РНК, комплементарную ДНК-мишени и которая направляет фермент к ДНК-мишени, где РНК и фермент являются членами комплекса колокализации на ДНК-мишени.
122. Стволовая клетка по п. 121, дополнительно включающая третью чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую донорную последовательность нуклеиновой кислоты.
123. Стволовая клетка по п. 120, дополнительно включающая индуцируемый промотор для стимуляции экспрессии фермента.
124. Стволовая клетка по п. 120, отличающаяся тем, что первая чужеродная нуклеиновая кислота удаляется из геномной ДНК клетки с помощью транспозазы.
125. Стволовая клетка по п. 120, отличающаяся тем, что фермент представляет собой РНК-направляемый ДНК-связывающий белок.
126. Стволовая клетка по п. 120, отличающаяся тем, что фермент представляет собой РНК-направляемый ДНК-связывающий белок системы CRISPR типа II.
127. Стволовая клетка по п. 120, отличающаяся тем, что фермент является Cas9.
128. Стволовая клетка по п. 120, отличающаяся тем, что длина РНК составляет от около 10 до около 500 нуклеотидов.
129. Стволовая клетка по п. 120, отличающаяся тем, что длина РНК составляет от около 20 до около 100 нуклеотидов.
130. Стволовая клетка по п. 120, отличающаяся тем, что РНК представляет собой направляющую РНК.
131. Стволовая клетка по п. 120, отличающаяся тем, что РНК представляет собой химеру tracrRNA-crRNA.
132. Клетка по п. 120, отличающаяся тем, что ДНК-мишень представляет собой геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.
133. Клетка включает первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который образует комплекс колокализации с РНК, комплементарной ДНК-мишени, и который расщепляет ДНК-мишень сайт-специфическим образом, и включает индуцируемый промотор для содействия экспрессии фермента.
134. Клетка по п. 133, дополнительно включающая вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую РНК, комплементарную ДНК-мишени, которая направляет фермент к ДНК-мишени, где РНК и фермент являются членами комплекса колокализации на ДНК-мишени.
135. Стволовая клетка по п. 134 дополнительно включает третью чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую донорную последовательность нуклеиновой кислоты.
136. Клетка, включающая первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который образует комплекс колокализации с РНК, комплементарной ДНК-мишени и который расщепляет ДНК-мишень сайт-специфическим образом, где первая чужеродная нуклеиновая кислота может быть удалена из геномной ДНК клетки с помощью транспозазы.
137. Клетка по п. 136, дополнительно включающая вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую РНК, комплементарную ДНК-мишени, которая направляет фермент на ДНК-мишень, где РНК и фермент являются членами комплекса колокализации на ДНК-мишени.
138. Стволовая клетка по п. 137 дополнительно включает третью чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую донорную последовательность нуклеиновой кислоты.
139. Клетка включает первую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент, который образует комплекс колокализации с РНК, комплементарной ДНК-мишени и который расщепляет ДНК-мишень сайт-специфическим образом, где первая чужеродная нуклеиновая кислота обратимо встраивается в геномную ДНК клетки.
140. Клетка по п. 139, дополнительно включающая вторую чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую РНК, комплементарную ДНК-мишени и которая направляет фермент на ДНК-мишень, где РНК и фермент являются членами комплекса колокализации на ДНК-мишени.
141. Стволовая клетка по п. 140 дополнительно включает третью чужеродную нуклеиновую кислоту, кодирующую донорную последовательность нуклеиновой кислоты.
142. Способ изменения ДНК-мишени в клетке, экспрессирующей фермент, который формирует комплекс колокализации с РНК, комплементарной ДНК-мишени и который расщепляет ДНК-мишень сайт-специфическим образом, включающий
(а) введение в клетку первой чужеродной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность донорной нуклеиновой кислоты, введение в клетку из среды, окружающей клетку, РНК, комплементарной ДНК-мишени, которая направляет фермент к ДНК-мишени, где РНК и фермент являются членами комплекса колокализации на ДНК-мишени,
где донорная последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется,
где РНК и фермент колокализуются с ДНК-мишенью, фермент расщепляет ДНК-мишень и донорная нуклеиновая кислота встраивается в ДНК-мишень, что приводит к получению измененной ДНК в клетке.
143. Способ по п. 142, в котором РНК включает структуру 5' Сар.
144. Способ по п. 142, где РНК утратила фосфатные группы.
145. Способ по п. 142, где фермент представляет собой РНК-направляемый ДНК-связывающий белок.
146. Способ по п. 142, где фермент представляет собой РНК-направляемый ДНК-связывающий белок системы CRISPR II типа.
147. Способ по п. 142, где фермент является Cas9.
148. Способ по п. 142, где длина РНК составляет от около 10 до около 500 нуклеотидов.
149. Способ по п. 142, где длина РНК составляет от около 20 до около 100 нуклеотидов.
150. Способ по п. 142, где РНК представляет собой направляющую РНК.
151. Способ по п. 142, где РНК представляет собой химеру tracrRNA-crRNA.
152. Способ по п. 142, где ДНК представляет собой геномную ДНК, митохондриальную ДНК, вирусную ДНК или экзогенную ДНК.
153. Способ по п. 142, где донорная последовательность нуклеиновой кислоты встраивается в результате рекомбинации.
154. Способ по п. 142, где донорная последовательность нуклеиновой кислоты встраивается путем гомологичной рекомбинации.
155. Способ по п. 142, где донорная последовательность нуклеиновой кислоты встраивается негомологичным соединением концов.
156. Способ по п. 142, дополнительно включающий повторение стадии (а) несколько раз, для того, чтобы получить множество изменений в ДНК клетки.
157. Способ по п. 142, где после получения измененной ДНК в клетке, нуклеиновая кислота, кодирующая фермент, который формирует комплекс колокализации с РНК, комплементарной ДНК-мишени, и который расщепляет ДНК-мишень сайт-специфическим образом, удаляется из генома клетки.
158. Способ по п. 142, где РНК и донорные нуклеотидные последовательности экспрессируются в виде связанной последовательности нуклеиновой кислоты.