СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ТКАНЕЙ НИЖНЕЙ КОНЕЧНОСТИ ПРИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ГАНГРЕНЕ
METHOD OF LOWER LIMB TISSUE ANALYSIS FOR VIABILITY IN DIABETIC GANGRENE

Изобретение относится к медицине, в частности патологической анатомии, может быть использовано для определения жизнеспособности тканей нижней конечности при диабетической гангрене.
Предлагаются разнообразные методы оценки состояния жизнеспособности тканей нижней конечности с гнойно-некротическими процессами при сахарном диабете. Для этого используются различные объективные методы исследования. Наиболее распространенными являются оценки состояния жизнеспособности тканей нижней конечности с использованием клинических данных, результатов лабораторных и инструментальных методов исследования.
В.Г.Санин и соавт. (В.Г.Санин, Б.А.Зелинский, В.И.Шевчук. Предампутационное лечение и послеоперационное ведение больных сахарным диабетом: Метод, рекомендации. - М., 1985. - 12 с.) наиболее информативным методом определения степени нарушения кровообращения в нижней конечности считают артериографию. В основу данного метода положены степень проходимости магистральных артерий нижней конечности (бедренная, передняя и задняя большеберцовые, малоберцовая), уровень окклюзии, наличие и выраженность развития коллатеральной сети.
Е.В.Кулешов и С.Е.Кулешов (Е.В.Кулешов, С.Е.Кулешов. Сахарный диабет и хирургические заболевания. - М.: Воскресенье, 1996. - 216 с.) для определения границ зоны клинически скрытого некроза тканей нижней конечности предлагают оценивать состояние микроциркуляции путем регистрации парциального напряжения кислорода.
Н.В.Степанов и соавт. (Н.В.Степанов, С.А.Дроздов, Н.А.Жильцова, Л.А.Зайцева. Определение уровня ампутации при гангрене нижней конечности методом ультразвуковой доплерометрии / Хирургия, 1988. - №12. - с.94-97) для оценки оптимального уровня ампутации предлагают использование ультразвуковой доплерографии с измерением регионального систолического давления (РСД) в зоне предполагаемой ампутации с последующим определением индекса регионального систолического давления (ИРСД) - отношение величины РСД в зоне предполагаемой ампутации к величине РСД в области бифуркации плечевой артерии. Заживление раны первичным натяжением наблюдается при ИРСД от 0,6 до 1,7.
Прототипом является способ определения жизнеспособности тканей нижней конечности, заключающийся в том, что проводят пункционную биопсию с последующим цитологическим, гистохимическим и электронномикроскопическим исследованием биоптата (А.С.Аметов, Э.Касаткина, М.Франц. Как научиться жить с диабетом. - М.: Интерпракс, 1991. - 112 с.). Данный способ является наиболее информативной методикой, позволяющей выявить ранние признаки нарушения микроциркуляции и проницаемости сосудов.
Использование известных методов исследования не всегда позволяет определить жизнеспособность тканей нижней конечности в условиях прогрессирования гнойно-некротического процесса в диабетической стопе из-за отсутствия в предлагаемых способах морфологических признаков, которые являются наиболее достоверными.
В определении жизнеспособности тканей нижней конечности при диабетической гангрене большое значение имеет комплексное морфологическое исследование органа, когда учитываются анатомо-функциональные, гистологические, морфометрические и гистоэнзиматические показатели.
Технический результат - повышение объективности и достоверности определения жизнеспособности тканей нижней конечности при сахарном диабете в условиях прогрессирования гнойно-некротического процесса.
2
2
Проведено комплексное патологоанатомическое исследование 129 нижних конечностей с гнойно-некротическими процессами, развившимися на фоне сахарного диабета. Комплексное исследование включало определение анатомических, функциональных параметров (состояние кожных покровов, проходимость сосудов, выраженность атеросклероза, рентгенологические признаки); светооптическую микроскопию гистологических срезов кожной, мышечной, сосудистой и нервной тканей с использованием различных видов окраски (гематоксилин-эозином, пикрофуксином по ван Гизону, трехцветным методом Маллори, импрегнацией аргирофильных волокон по В.А.Жухину, PAS-реакция); морфометрическое исследование размеров сосудов; гистохимическое определение активности ферментов НАД·Н-дегидрогеназы (НАД·Н-ДГ), щелочной (ЩФ) и кислой (КФ) фосфатаз. Полученные данные позволили определить ряд объективных морфологических критериев, оценивающих степень жизнеспособности тканей нижней конечности в условиях прогрессирования гнойно-некротических осложнений сахарного диабета. В результате исследования предложены четыре группы качественных и количественных морфологических показателей: анатомические и функциональные, гистологические, морфометрические и гистоэнзиматические (табл.1).
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Определяют анатомические, функциональные показатели нижней конечности, а именно: состояние кожных покровов, проходимость сосудов магистрального русла, наличие поражения их атеросклеротическим процессом, наличие сужения просвета артерий, рентгенологических признаков поражения костной ткани. Проходимость магистральных сосудов изучают путем введения жидкого контраста (водного раствора бриллиантовой зелени) в их просвет. Предварительно сосудистую полость очищают от остатков крови, затем под стандартным давлением в просвет бедренной артерии, дистальнее отхождения a. profundis femoris, вводят контрастирующую жидкость, а выпускают на уровне дистального отрезка a. tibialis posterior. Одновременно рассчитывают скорость прохождения жидкости. Выраженность атеросклероза оценивают по Зайратьянц О.В. (О.В.Зайратьянц, Л.В.Кактурский, Г.Г.Автандилов. Правила построения патологоанатомического диагноза, оформления медицинского свидетельства о смерти, сопоставления клинического и патологоанатомического диагнозов в соответствии с требованиями МКБ-10. Метод, рекоменд. - М., 2001. - 143 с.). При поражении атеросклеротическим процессом до 25% площади интимы его степень оценивают как умеренную степень атеросклероза, до 50% - выраженную, более 50% - резко выраженную. Степень сужения просвета сосудов определяют по методике Зайратьянц О.В. Морфологические стадии атеросклероза соответствуют: I - долипидная, II - липоидоз. III - липосклероз, IV - атероматоз, V - осложненная, VI - кальциноз. При рентгенологическом исследовании используют классификацию Каланова Р.И. и соавт. (Р.Г.Каланов, И.Н.Астахова, А.Д.Салихов. Хирургическое лечение гангрены стопы у больных сахарным диабетом - Уфа: Издательство БГМУ, 2003. - 101 с.), которые выделяют 4 группы поражения костной ткани:
1) Атрофические процессы (спонтанные переломы, остеомиелитические поражения - «симптом тающего сахара», локальный и распространенный остеопороз);
2) Гипертрофические процессы (остеосклероз, экзостозы);
3) Суставные поражения (сужение или отсутствие суставной щели, подвывихи в суставах, остеопороз суставных поверхностей);
4) Поражения мягких тканей (обызвествление сосудов, отек и утолщение мягких тканей).
Затем определяют гистологические показатели жизнеспособности тканей нижней конечности при диабетической гангрене, а именно: состояние кожи, мышечной, сосудистой и нервной тканей. Определение данных параметров не требует применения сложных методов окраски. Общую архитектонику различных тканей оценивают на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Для определения состояния соединительнотканной стромы используют элективные методы окраски соединительной ткани (по ван Гизону, Маллори). Для обнаружения мукополисахаридов в стенке сосудов, строме прибегают к окрашиванию гистологических препаратов гистохимической PAS-реакцией. При уточнении состояния ретикулярной стромы и нервных волокон применяют импрегнацию срезов нитратом серебра по В.А.Жухину (В.А.Жухин. Патологоанатомические изменения у некоторых животных при общем воздействии на них ультракоротких волн // Труды Туркменского государственного медицинского института. - 1937. - т.2, вып.3-4, с.247-299). «Сорбционный» тип атеросклероза наблюдается при преобладании липоидных процессов, «фибропластический» - при доминировании процесса образования фиброзных бляшек, «деструктивный» - при преобладании изъязвлений и тромбообразования (Г.Г.Автандилов. Основы патологоанатомической практики. - М.: РМАПО, 1998. - 505 с).
После чего определяют морфометрические показатели сосудов, а именно толщину стенок и внутренний диаметр артериол по стандартной методике (Г.Г.Автандилов. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.) с использованием окуляр-микрометра МОВ-1 с предварительным определением цены деления. Измерение толщины сосудистой стенки осуществляют от внутренней поверхности сосуда до наружной поверхности адвентиции. Определение внутреннего диаметра артериол и венул проводят по меньшему размеру.
2
2
2
Для оценки степени нарушения метаболизма в мышцах и коже определяют гистоэнзиматические показатели, а именно активность ключевых ферментов - НАД·Н-дегидрогеназы, щелочной и кислой фосфатаз в дерме и мышцах. Эти показатели позволяют объективно оценить состояние аэробного метаболизма (НАД·Н-дегидрогеназа), трансмембранного транспорта (щелочная фосфатаза) и активации аутолитических процессов (кислая фосфатаза). Активность НАД·Н-дегидрогеназы определяют тетразолиевым методом с использованием нитросинего тетразолия по Берстону (Берстон М. Гистохимия ферментов. - М.: Мир, 1965. - 464 с.). Активность щелочной фосфатазы определяют реакцией азосочетания по Берстону (Берстон М. Гистохимия ферментов. - М.: Мир, 1965. - 464 с.) с использованием AS-BS-фосфат нафтола при рН инкубационной среды 7,4. Активность кислой фосфатазы также определяют реакцией азосочетания по Берстону (Берстон М. Гистохимия ферментов. - М.: Мир, 1965. - 464 с.) с AS-BS-фосфатом нафтола и хлоридом марганца при рН инкубационной среды 5,2. Для минимизации погрешностей при выполнении количественной оценки активности ферментов строго соблюдают установленные требования (Введение в количественную гистохимию ферментов. Под ред. Журавлевой Т.Б. и Прочуханова Р.А. - М.: Медицина, 1978. - 246 с.). Количественную оценку результатов гистоэнзиматических реакций осуществляют спектрофотометрическим методом (длина волны для дегидрогеназ - 554 нм, для фосфатаз - 537 нм). Абсолютную величину активности ферментов определяют в условных единицах оптической плотности.
Все полученные цифровые данные обрабатывают методами математической статистики с определением средних величин (М) (А.Е.Платонов. Статистический анализ в медицине и биологии: задачи, терминология, логика, компьютерные методы. - М.: Изд-во РАМН, 2000. - 51 с.). Для определения изменчивости наблюдаемой совокупности определяют среднее квадратичное отклонение (σ) и среднюю ошибку средней величины (m). Для определения достоверности различия статистических показателей между средними величинами используют критерий Стъюдента (t). При этом различие считается достоверным, если t>2,36, что соответствует безошибочному прогнозу с вероятностью 95% и более (p<0,05). Для обработки цифровых значений используют программу Excel в составе пакета прикладных программ Microsoft Office 2003 и Statistica 6.0 (StatSoft) для персональных IBM-совместимых компьютеров.
Полученные данные позволяют с помощью качественных и количественных морфологических показателей определить жизнеспособность тканей нижней конечности при гнойно-некротических процессах на фоне сахарного диабета.
2
Ткани нижней конечности определяют как жизнеспособные при целостных, влажных, бледно-розового цвета кожных покровах, сохраненной проходимости артерий магистрального русла, атеросклерозе II-III стадии морфогенеза с поражением до 25% площади интимы, отсутствия сужения просвета артерий, отсутствия рентгенологических признаков поражения костной ткани, при гистологическим исследовании - наличие четкой дифференцировки кожных покровов на эпидермис и дерму, не выраженного интерстициального отека мышечных волокон, «сорбционного» типа атеросклероза, плазматического пропитывания и утолщения базальных мембран артериол и капилляров, вакуольной дистрофии нервных клеток, отсутствия воспалительной реакции во всех тканях, толщины стенки артериол 17,8±1,2 мкм, внутреннего диаметра артериол 29,4±0,9 мкм, активности НАД·Н-ДГ в дерме 169,7±8,3 усл.ед., в мышце 339,4±7,4 усл.ед., активности ЩФ в дерме 116,3±7,8 усл.ед., в мышце 90,5±4,3 усл.ед., активности КФ в дерме 115,9±11,6 усл.ед., в мышце 68,6±3,5 усл.ед.
2
2
Ткани нижней конечности определяют как нежизнеспособные при пастозных, плотных, темно-вишневого и черного цвета кожных покровах с глубокими дефектами кожи (100-200 см и более) и ихорозным запахом, не проходимых артериях магистрального русла с атеросклерозом III-VI стадии морфогенеза, поражающим свыше 50% площади интимы, тяжелой степени сужения просвета артерий, при рентгенологическом исследовании - диффузного остеопороза, остеолиза, краевых остеофитах, сужения и деформации суставов, при гистологическом исследовании - атрофических процессов эпидермиса и дермы, язвенных дефектов кожи с клеточной реакцией и очагами некроза, выраженного интерстициального отека мышечных волокон с мезенхимальной реакцией, миолизе и очаговом фиброзе, «деструктивном» типе атеросклероза, сужения просвета сосудов микроциркуляторного русла за счет циркулярного гиалиноза вплоть до их облитерации, дистрофических изменениях нервных клеток, диссоциации и демиелинизации нервных волокон, диффузной лейкоцитарной и макрофагальной инфильтрации, гистолизе, толщины стенки артериол более 31,6±0,9 мкм, внутреннего диаметра артериол менее 11,2±0,7 мкм, активности НАД·Н-ДГ в дерме менее 109,5±6,9 усл.ед., в мышце менее 273,6±8,4 усл.ед., активности ЩФ в дерме менее 99,4±4,2 усл.ед., в мышце менее 69,2±9,3 усл.ед., активности КФ в дерме более 144,8±6,5 усл.ед., в мышце более 111,2±7,6 усл.ед.
Применение предлагаемого способа позволяет по четырем группам качественных и количественных морфологических показателей определить жизнеспособность тканей нижней конечности при гнойно-некротических процессах на фоне сахарного диабета. Объективное определение жизнеспособности тканей нижней конечности позволит оптимизировать уровень ампутации при диабетической гангрене. Предлагаемый способ оценки жизнеспособности тканей нижней конечности при сахарном диабете, осложненном гнойно-некротическим процессом, может быть использован для определения уровня жизнеспособных тканей путем дооперационной толстоигольной биопсии с последующим гистологическим и гистохимическим исследованием.
2
2
2
Предлагаемый способ иллюстрируется следующим примером. Больная П., 58 лет (ист. бол. №1267), поступила 11.12.06 в ГКБ №21 г.Уфы с жалобами на покраснение и боли в области язвенного дефекта правой стопы, нарастание отека стопы и голени. В анамнезе сахарный диабет на протяжении последних 15 лет. Уровень глюкозы крови в день госпитализации составил 15,4 ммоль/л. Пульсация на правой бедренной артерии удовлетворительная, на подколенной и задней большеберцовой - резко снижена, а на артериях тыла стопы не определялась. По данным УЗДГ выявлены стеноз артерий подвздошно-бедренного сегмента слева и артерий надлодыжечного сегмента справа (около 55%). При этом кровообращение в дистальном отделе правой нижней конечности признано компенсированным. Ампутация бедра выполнена 12.12.06 г. В интраоперационном периоде был произведен забор кусочков кожи и мышц на стандартных участках для гистологического и гистохимического исследования. Стопа резко увеличена в объеме, на тыльной поверхности плюсневых костей определялся дефект кожи неправильной формы (11×7-9 см), грязно-зеленого цвета с налетом фибрина, издающий неприятный запах. При этом глубина дефекта достигала 2 см. Обнаружено гнойное расплавление окружающих тканей и кости. Зона отека и гиперемия распространялась до голени. Кожные покровы в нижней трети голени и выше были бледно-розовой окраски, несколько пастозные. Мышечная ткань на голени умеренно пастозная, с очагами жирового перерождения (ложная гипертрофия). Магистральные сосуды проходимы до стопы, интима поражена атеросклеротическим процессом до 25% на верхней трети голени и бедра, до 50% - на нижней трети голени. Вокруг язвенного дефекта определялась лейкоцитарная инфильтрация с примесью лимфоцитов и гистиоцитов, выявлены колонии микроорганизмов, очаги некроза и кровоизлияний. Дерма утолщена за счет сосочкового слоя, с фрагментацией эластических волокон и мелкими очагами некроза. В сосочковом слое придатков мало, многие сосуды редуцированы. В мышечной ткани наблюдался выраженный интерстициальный отек, очаги миолиза, перемежающиеся с участками склероза, диффузная клеточная реакция. Просвет сосудов микроциркуляторного русла был сужен за счет циркулярного гиалиноза, местами подвергался облитерации. Сосудистая сеть была полнокровной, местами с явлениями стаза, тромбоза. В нервных клетках наблюдались дистрофические изменения, диссоциация и демиелинизация нервных волокон. Толщина стенки артериол составляла 30,2±0,4 мкм, а их внутренний диаметр - 12,7±0,3 мкм. В коже нижней трети голени атрофические процессы проявлялись в виде выраженной сглаженности сосочкового слоя, явлений склероза, сочетающиеся с утолщением дермы, очаговой фрагментацией эластических волокон, атрофией и исчезновением придатков, редукцией сосудов. В мышечной ткани наблюдался умеренный интерстициальный отек, очаги фиброза, в отдельных миоцитах - некробиотические и некротические изменения, очаговая межуточная инфильтрация лейкоцитами, гистиоцитами. В артериях магистрального русла атеросклероз носил преимущественно «деструктивный» тип. В большинстве артериол и капилляров отмечалось утолщение и прерывистость базальных мембран, выраженное плазматическое пропитывание, пролиферация эндотелиоцитов и перицитов, сужение просвета части сосудов за счет сегментарного гиалиноза. Толщина стенки артериол равнялась 28,5±0,3 мкм, а их внутренний диаметр - 17,7±0,4 мкм. В коже средней трети голени количество коллагеновых волокон увеличилось, во всех слоях наблюдались дистрофические процессы, эпидермис истончен, количество потовых желез уменьшено. В мышечной ткани наблюдался интерстициальный отек и очаговый фиброз, некробиотические изменения в отдельных миоцитах сочетались с очаговой межуточной инфильтрацией лимфоцитами, гистиоцитами. В стенке сосудов микроциркуляторного русла отмечались вышеобозначенные структурные сдвиги. В нервных волокнах можно было заметить периневральный отек, очаговые дистрофические и атрофические изменения нервных клеток. Толщина стенки артериол составляла 23,8±0,5 мкм, внутренний диаметр - 21,2±0,4 мкм. В коже верхней трети голени изменялось соотношение эластических и коллагеновых волокон в сторону увеличения последних. Эпидермис был истончен, во всех слоях дермы и эпидермиса наблюдались дистрофические изменения. В базальной мембране выводных протоков потовых желез наблюдался гиалиноз, а также некоторое снижение их количества в поле зрения. В мышечной ткани наблюдались морфологические признаки межуточного отека. Атеросклероз сосудов носил преимущественно «сорбционный» тип. Умеренное сужение просвета сосудов микроциркуляторного русла было обусловлено плазматическим пропитыванием и гиалинозом их стенки. При этом толщина стенки равнялась 20,1±0,5 мкм, а их внутренний диаметр достигал 25,1±0,4 мкм. В кожных покровах бедра выявлялись атрофические изменения умеренной степени выраженности, в мышечной ткани - незначительный интерстициальный отек, в артериях - «сорбционный» тип атеросклероза, в отдельных сосудах микроциркуляторного русла - плазматическое пропитывание, пролиферация эндотелия и перителия. Толщина стенки артериол составила 19,8±0,3 мкм, а внутренний диаметр - 26,1±0,3 мкм. При гистохимическом исследовании на бедре, верхней и средней трети голени активность ферментов соответственно составила: НАД·Н-ДГ в коже - 164,6±0,2 усл.ед., в мышце - 331,2±0,3 усл.ед., КФ в коже - 115,4±0,4 усл.ед., в мышце - 70,1±0,6 усл.ед., ЩФ в коже - 116,1±0,4 усл.ед., в мышце - 89,7±0,6 усл.ед.; НАД·Н-ДГ в коже - 158,7±0,4 усл.ед., в мышце - 327,4±0,3 усл.ед., КФ в коже - 120,1±0,3 усл.ед., в мышце - 74,6±0,4 усл.ед., ЩФ в коже - 109,9±0,5 усл.ед., в мышце - 87,3±0,7 усл.ед.; НАД·Н-ДГ в коже - 131,8±0,4 усл.ед., в мышце - 292,1±0,5 усл.ед., КФ в коже - 139,2±0,5 усл.ед., в мышце - 94,6±0,3 усл.ед., ЩФ в коже - 99,8±0,6 усл.ед., в мышце - 74,1±0,3 усл.ед. Результаты макро-, микроскопического исследования операционного материала с учетом уровня метаболизма свидетельствуют о жизнеспособности тканей в пределах верхней трети голени (табл.1).
Таблица 1
Морфологическая и гистохимическая оценка жизнеспособности тканей ампутированной нижней конечности при диабетической гангрене
Показатели
Степень жизнеспособности тканей
Жизнеспособные ткани
Нежизнеспособные ткани
Анатомо-функциональные показатели
Кожные покровы
бледно-розовые, влажные
темно-вишневого и черного цвета, пастозные, плотные, глубокие дефекты (100-200 см<sup>2</sup> и более) с некротическими массами и ихорозным запахом
Проходимость сосудов и выраженность атеросклероза
сохранена + атеросклероз II-III стадии (до 25% площади интимы)
не проходимы + атеросклероз III-VI стадии (свыше 50% площади интимы).
Степень сужения просвета артерий
часто отсутствует
тяжелая (свыше 50%)
Рентгенологические признаки
часто не выявляются
диффузный остеопороз, остеолиз, остеофиты, сужение и деформация суставов
Гистологическая характеристика тканей
Кожные покровы
четкая дифференцировка на эпидермис и дерму
атрофические процессы эпидермиса и дермы, язвы и выраженная клеточная реакция, очаги некроза
Мышечная ткань
не выраженный интерстициальный отек
выраженный интерстициальный отек, мезенхимальная реакция стромы, миолиз и очаги фиброза
Артерии среднего калибра (тип атеросклероза)
часто «сорбционный»
преимущественно «деструктивный»
Сосуды микроциркуляторного русла
утолщение базальных мембран + плазматическое пропитывание
просвет сосудов сужен за счет циркулярного гиалиноза вплоть до их облитерации
Нервные волокна
дистрофические изменения
диссоциация и некробиотические изменения, очаги демиелинизации
Воспалительная реакция
отсутствует
диффузная лейкоцитарная и макрофагальная инфильтрация, гистолиз
Морфометрические показатели сосудов
Толщина стенки артериол (мкм)
17,8±1,2
31,6±0,9***
Внутренний диаметр артериол (мкм)
29,4±0,9
11,2±0,7***
Гистоэнзиматические показатели
дерма (усл.ед.)
мышца (усл.ед.)
дерма (усл.ед.)
мышца (усл.ед.)
НАД·Н<sub>2</sub>-дегидрогеназа
169,7±8,3
339,4±7,4
менее 109,5***±6,9
менее 273,6***±8,4
Щелочная фосфатаза
116,3±7,8
90,5±4,3
менее 99,4**±4,2
менее 69,2**±9,3
Кислая фосфатаза
115,9±11,6
68,6±3,5
более 144,8***±6,5
более 111,2***±7,6
Примечание: достоверность (р) по отношению к жизнеспособным тканям * - <b><</b>0,05, ** - <0,01, *** - <b><</b>0,001