ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ КРЫС

1. Композиция для культивирования и поддержания плюрипотентности крысиной ЭС клетки, содержащая:
(a) питающий клеточный слой, не модифицированный для экспрессии фактора ингибирования лейкемии (LIF);
(b) среду, содержащую от около 50 Ед/мл до около 150 Ед/мл LIF и комбинацию ингибиторов, состоящую из ингибитора MEK и ингибитора GSK3; и
(c) популяцию из одной или более крысиных ЭС клеток, причем крысиные ЭС клетки содержат целевую генетическую модификацию и способны передавать целевую генетическую модификацию через зародышевую линию.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что питающий клеточный слой содержит монослой митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ).
3. Композиция по п. 1 или п. 2, отличающаяся тем, что среда содержит от около 75 Ед/мл до около 125 Ед/мл LIF, необязательно причем среда содержит от около 90 Ед/мл до около 110 Ед/мл LIF.
4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что среда содержит около 100 Ед/мл LIF.
5. Композиция по любому из пп. 1, 2 и 4, отличающаяся тем, что LIF в среде является мышиным LIF или имеет по меньшей мере 91% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 и активность LIF.
6. Композиция по любому из пп. 1, 2 и 4, отличающаяся тем, что ингибитор MEK представляет собой PD0325901 и/или что ингибитор GSK3 представляет собой CHIR99021.
7. Композиция по п. 6, отличающаяся тем, что ингибитор MEK представляет собой PD0325901 в концентрации от 0,8 мкM до около 1,2 мкM, а ингибитор GSK3 представляет собой CHIR99021 в концентрации от около 2,5 мкM до около 3 мкM или от 3 мкM до около 3,5 мкM,
необязательно причем концентрация ингибитора MEK составляет около 1 мкM, а концентрация ингибитора GSK3 составляет около 3 мкM.
8. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что концентрация LIF в среде составляет около 100 Ед/мл, ингибитор MEK представляет собой PD0325901 в концентрации около 1 мкM, а ингибитор GSK3 представляет собой CHIR99021 в концентрации около 3 мкM.
9. Композиция по любому из пп. 1, 2, 4, 7 и 8, отличающаяся тем, что среда дополнительно содержит базовую среду DMEM/F12 и среду Neurobasal.
10. Композиция по п. 8, отличающаяся тем, что среда содержит: 1x базовой среды DMEM/F12; 1x среды Neurobasal; 1% пенициллина/стрептомицина; 4 мM L-глутамина; 0,1 мM 2-меркаптоэтанола; 1x добавки N2; 1x добавки B27, 100 Ед/мл LIF, 1 мкM PD0325901; и 3 мкM CHIR99021.
11. Композиция по любому из пп. 1, 2, 4, 7, 8 и 10, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки:
(i) экспрессируют маркеры плюрипотентности и демонстрируют нормальный кариотип 42X,Y; и/или
(ii) образуют в культуре сфероподобные колонии.
12. Композиция по любому из пп. 1, 2, 4, 7, 8 и 10, отличающаяся тем, что целевая генетическая модификация представляет собой инсерцию, делецию, нокаут, нокин, точечную мутацию или их комбинацию.
13. Композиция по п. 12, отличающаяся тем, что целевая генетическая модификация представляет собой инсерцию гетерологичного полинуклеотида в геном крысиных ЭС клеток.
14. Композиция по п. 13, отличающаяся тем, что гетерологичный полинуклеотид содержит селективный маркер, и причем селективный маркер имеет одну или более из следующих характеристик:
(a) селективный маркер содержит неослабленный ген селективного маркера, функционально связанный с промотором;
(b) селективный маркер имеет повышенную активность по сравнению с селективным маркером дикого типа; и
(c) крысиные ЭС клетки содержат множество копий селективного маркера, введенных в геном.
15. Композиция по любому из пп. 1, 2, 4, 7, 8, 10, 13 и 14, отличающаяся тем, что:
(a) крысиные ЭС клетки получены от крысы линии ACI или получены от крысы линии Dark Agouti (DA); и/или
(b) крысиные ЭС клетки получены от эмбриона на стадии морулы или на стадии бластоцисты.
16. Композиция по любому из пп. 1, 2, 4, 7, 8, 10, 13 и 14, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки представляют собой мужские (XY) крысиные ЭС клетки или женские (XX) крысиные ЭС клетки.
17. Композиция по любому из пп. 1, 2, 4, 7, 8, 10, 13 и 14, отличающаяся тем, что крысиные ЭС клетки имеют одну или более из следующих характеристик:
(a) крысиные ЭС клетки экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбранный из Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF-рецептора, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2 и Utf1;
(b) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более маркеров плюрипотентности, выбранных из c-Myc, Ecat1 и Rexo1;
(c) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более мезодермальных маркеров, выбранных из Brachyury и Bmpr2;
(d) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более эндодермальных маркеров, выбранных из Gata6, Sox17 и Sox7;
(e) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более нейронных маркеров, выбранных из Nestin и Pax6;
(f) крысиные ЭС клетки экспрессируют один или более маркеров плюрипотентности, выбранных из Oct-4, Sox2 и щелочной фосфатазы; и
(g) крысиные ЭС клетки экспрессируют один или более крысиных ЭСК-специфических генов, выбранных из белка 1, связанного с адгезионными контактами (Ajap1), клаудина 5 (Cldn5), фактора 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы IV (Camk4), эфрина-A1 (Efna1), EPH рецептора A4 (Epha4), белка бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белка 1, подобного белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpl1), интерлейкина 36 бета (Il1f8), рецептора альфа интерлейкина 28 (Il28ra), фактора 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептора фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептора 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейронального рецептора пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазы нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокса 2 каудального типа (Cdx2), повторных доменов 1 фибронектина III и анкирина (Fank1), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split c мотивом 2 YRPW (Hey2), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split c мотивом 2 YRPW (Hey2), фактора 1, связывающего лимфоидный энхансер (Lef1), гена 3, подобного Sal (дрозофила) (Sall3), гомеобокса 1 SATB (Satb1) и miR-632.
18. Способ получения целевой генетической модификации в крысиных эмбриональных стволовых (ЭС) клетках, включающий:
(a) культивирование популяции крысиных ЭС клеток в условиях, включающих слой питающих клеток, которые не модифицированы для экспрессии фактора ингибирования лейкемии (LIF), и среду, содержащую от около 50 Ед/мл до около 150 Ед/мл LIF и комбинацию ингибиторов, состоящую из ингибитора MEK и ингибитора GSK3; и
(b) модификацию крысиных ЭС клеток так, чтобы они содержали целевую генетическую модификацию, при этом крысиные ЭС клетки были способны передавать целевую генетическую модификацию через зародышевую линию.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что питающий клеточный слой содержит монослой митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ).
20. Способ по п. 18 или п. 19, отличающийся тем, что среда содержит от около 75 Ед/мл до около 125 Ед/мл LIF, необязательно причем среда содержит от около 90 Ед/мл до около 110 Ед/мл LIF.
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что среда содержит около 100 Ед/мл LIF.
22. Способ по любому из пп. 18, 19 и 21, отличающийся тем, что LIF в среде является мышиным LIF или имеет по меньшей мере 91% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 1 и активность LIF.
23. Способ по любому из пп. 18, 19 и 21, отличающийся тем, что ингибитор MEK представляет собой PD0325901 и/или что ингибитор GSK3 представляет собой CHIR99021.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что ингибитор MEK представляет собой PD0325901 в концентрации от 0,8 мкM до около 1,2 мкM, а ингибитор GSK3 представляет собой CHIR99021 в концентрации от около 2,5 мкM до около 3 мкM или от 3 мкM до около 3,5 мкM,
необязательно причем концентрация ингибитора MEK составляет около 1 мкM, а концентрация ингибитора GSK3 составляет около 3 мкM.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что концентрация LIF в среде составляет около 100 Ед/мл, ингибитор MEK представляет собой PD0325901 в концентрации около 1 мкM, а ингибитор GSK3 представляет собой CHIR99021 в концентрации около 3 мкM.
26. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24 и 25, отличающийся тем, что среда дополнительно содержит базовую среду DMEM/F12 и среду Neurobasal.
27. Способ по п. 25, отличающийся тем, что среда содержит: 1x базовой среды DMEM/F12; 1x среды Neurobasal; 1% пенициллина/стрептомицина; 4 мM L-глутамина; 0,1 мM 2-меркаптоэтанола; 1x добавки N2; 1x добавки B27, 100 Ед/мл LIF, 1 мкM PD0325901; и 3 мкM CHIR99021.
28. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25 и 27, отличающийся тем, что крысиные ЭС клетки:
(i) экспрессируют маркеры плюрипотентности и демонстрируют нормальный кариотип 42X,Y; и/или
(ii) образуют в культуре сфероподобные колонии.
29. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25 и 27, отличающийся тем, что целевая генетическая модификация представляет собой инсерцию, делецию, нокаут, нокин, точечную мутацию или их комбинацию.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что целевая генетическая модификация представляет собой инсерцию гетерологичного полинуклеотида в геном крысиных ЭС клеток.
31. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27 и 30, отличающийся тем, что стадия модификации включает:
(i) введение в крысиные ЭС клетки гетерологичного полинуклеотида, содержащего селективный маркер, функционально связанный с промотором, активным в крысиных ЭС клетках; и
in vitro
in vitro
(ii) культивирование   крысиных ЭС клеток попеременно в первой и второй культуральной среде, причем первая культуральная среда содержит эффективное количество селективного агента в течение первого периода времени, а вторая культуральная среда не содержит селективного агента, и причем условия культивирования  являются достаточными для сохранения плюрипотентности, тем самым обеспечивая отбор крысиных ЭС клеток, имеющих стабильно включенный в геном гетерологичный полинуклеотид.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что чередование первой и второй культуральной среды проводят каждые 24 часа, и причем селективный маркер придает устойчивость к антибиотику,
r
r
r
r
необязательно причем селективный маркер представляет собой одно или более из неомицинфосфотрансферазы (neo), гигромицин-B фосфотрансферазы (hyg), пуромицин-N-ацетилтрансферазы (puro) и бластицидин-S дезаминазы (bsr); и
необязательно причем антибиотик представляет собой G418.
33. Способ по п. 31, отличающийся тем, что селективный маркер имеет одну или более из следующих характеристик:
(a) селективный маркер содержит неослабленный ген селективного маркера, функционально связанный с промотором;
(b) селективный маркер имеет повышенную активность по сравнению с селективным маркером дикого типа; и
(c) крысиные ЭС клетки содержат множество копий селективного маркера, введенных в геном.
34. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27, 30, 32 и 33, отличающийся тем, что стадия модификации включает модификацию крысиных ЭС клеток так, чтобы они содержали две или более целевых модификаций, при этом крысиные ЭС клетки могли передавать две или более целевых генетических модификаций через зародышевую линию.
35. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27, 30, 32 и 33, отличающийся тем, что стадия модификации включает один или более циклов электропорации.
36. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27, 30, 32 и 33, отличающийся тем, что целевую генетическую модификацию создают посредством события гомологичной рекомбинации.
37. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27, 30, 32 и 33, отличающийся тем, что целевую генетическую модификацию создают с использованием нацеленного вектора, содержащего расположенные выше и ниже группы гомологий, которые фланкируют вставку полинуклеотида, причем группы гомологий соответствуют областям генома в целевом геномном локусе.
38. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27, 30, 32 и 33, отличающийся тем, что целевую генетическую модификацию создают с использованием нуклеазных агентов, которые создают разрыв одиночной или двойной цепи в целевом геномном локусе.
39. Способ по п. 38, отличающийся тем, что нуклеазный агент представляет собой эффекторную нуклеазу, подобную активаторам транскрипции (TALEN), нуклеазу белкового домена «цинковые пальцы» (ZFN), мегануклеазу или систему CRISPR/Cas.
40. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27, 30, 32, 33 и 39, отличающийся тем, что:
(a) крысиные ЭС клетки получены от крысы линии ACI или получены от крысы линии Dark Agouti (DA); и/или
(b) крысиные ЭС клетки получены от эмбриона на стадии морулы или на стадии бластоцисты.
41. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27, 30, 32, 33 и 39, отличающийся тем, что крысиные ЭС клетки представляют собой мужские (XY) крысиные ЭС клетки или женские (XX) крысиные ЭС клетки.
42. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27, 30, 32, 33 и 39, отличающийся тем, что крысиные ЭС клетки имеют одну или более из следующих характеристик:
(a) крысиные ЭС клетки экспрессируют по меньшей мере один маркер плюрипотентности, выбранный из Dnmt3L, Eras, Err-бета, Fbxo15, Fgf4, Gdf3, Klf4, Lef1, LIF-рецептора, Lin28, Nanog, Oct4, Sox15, Sox2 и Utf1;
(b) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более маркеров плюрипотентности, выбранных из c-Myc, Ecat1 и Rexo1;
(c) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более мезодермальных маркеров, выбранных из Brachyury и Bmpr2;
(d) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более эндодермальных маркеров, выбранных из Gata6, Sox17 и Sox7;
(e) крысиные ЭС клетки не экспрессируют один или более нейронных маркеров, выбранных из Nestin и Pax6;
(f) крысиные ЭС клетки экспрессируют один или более маркеров плюрипотентности, выбранных из Oct-4, Sox2 и щелочной фосфатазы; и
(g) крысиные ЭС клетки экспрессируют один или более крысиных ЭСК-специфических генов, выбранных из белка 1, связанного с адгезионными контактами (Ajap1), клаудина 5 (Cldn5), фактора 9 гуанин-нуклеотидного обмена Cdc42 (Arhgef9), кальций/калмодулин-зависимой протеинкиназы IV (Camk4), эфрина-A1 (Efna1), EPH рецептора A4 (Epha4), белка бета 5 межклеточных щелевых контактов (Gjb5), белка 1, подобного белку, связывающему инсулиноподобный фактор роста (Igfbpl1), интерлейкина 36 бета (Il1f8), рецептора альфа интерлейкина 28 (Il28ra), фактора 1 детерминации асимметрии (Lefty1), альфа-рецептора фактора ингибирования лейкемии (Lifr), рецептора 2 лизофосфатидной кислоты (Lpar2), нейронального рецептора пентраксина (Ntm), протеинтирозинфосфатазы нерецепторного типа 18 (Ptpn18), гомеобокса 2 каудального типа (Cdx2), повторных доменов 1 фибронектина III и анкирина (Fank1), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split c мотивом 2 YRPW (Hey2), гена forkhead box E1 (тироидный фактор транскрипции 2) (Foxe1), гена, родственного hairy/enhancer-of-split c мотивом 2 YRPW (Hey2), фактора 1, связывающего лимфоидный энхансер (Lef1), гена 3, подобного Sal (дрозофила) (Sall3), гомеобокса 1 SATB (Satb1) и miR-632.
43. Способ по любому из пп. 18, 19, 21, 24, 25, 27, 30, 32, 33 и 39, дополнительно включающий:
(e) введение по меньшей мере одной из модифицированных крысиных ЭС клеток со стадии (d) в крысиный эмбрион-хозяин для получения эмбриона F0;
(f) имплантацию эмбриона F0 суррогатной матери;
(g) созревание эмбриона F0 в организме суррогатной матери до срока; и
(h) идентификацию крысы F0, имеющей целевую генетическую модификацию.
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что модифицированная крысиная ЭС клетка, введенная в крысиный эмбрион-хозяин, получена из той же линии крыс, что и крысиный эмбрион-хозяин.
45. Способ по п. 43, отличающийся тем, что модифицированная крысиная ЭС клетка, введенная в крысиный эмбрион-хозяин, получена из линии крыс, отличной от той, к которой принадлежит крысиный эмбрион-хозяин.
46. Способ по п. 43, дополнительно включающий:
(i) скрещивание самца F0, содержащего целевую генетическую модификацию, с самкой крысы дикого типа с получением потомства F1, являющегося гетерозиготным по целевой генетической модификации; и необязательно
(j) скрещивание самца крысы потомства F1 с самкой крысы потомства F1 с получением потомства F2, являющегося гомозиготным по целевой генетической модификации.
47. Способ по п. 43, отличающийся тем, что по меньшей мере 3% крыс F0, имеющих целевую генетическую модификацию, передают эту целевую генетическую модификацию потомству F1,
необязательно причем по меньшей мере 10% крыс F0, имеющих целевую генетическую модификацию, передают эту целевую генетическую модификацию потомству F1, и
необязательно причем по меньшей мере 60% крыс F0, имеющих целевую генетическую модификацию, передают эту генетическую модификацию потомству F1.