Индикация холерного токсина с помощью MALDI масс-спектрометрии

март №3

27

г-Ь

сравнительном анализе полученных данных нами не было выявлено существенных коррелятивных связей между их серогрупповой принадлежностью, УОТЯ- и ПЦР-генотипами. Однако вызванные ими заболевания характеризовались сходным клиническим течением. Продолжающаяся на протяжении нескольких десятилетий регистрация ОКИ, обусловленных вибрионами неО1/неО139 серогрупп, и постоянное выделение их из объектов окружающей среды позволяют сделать вывод о том, что на территории Ростовской области сложились благоприятные условия для циркуляции возбудителей и (в определенных случаях) проявления ими патогенных свойств. Не исключено, что этому способствует именно генетическая неоднородность популяции, в целом содержащей большой набор генов факторов патогенности и персистенции, многие из которых входят в состав мобильных элементов. Возможно, сохранение всех их в геноме одного штамма было бы невыгодно энергетически, тогда как «распределение» по геномам разных представителей данной группы допускает периодическое формирование наиболее жизнеспособных и обладающих выраженным патогенетическим потенциалом клонов за счет горизонтального переноса генов.

ЛИТЕРАТУРА

Водопьянов А.С. и др. Геоинформационная система «Холера. Штаммы—VNTR» (Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2007620389) / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, И.Ю. Сучков [и др.], 2007. Григоренко Л.В. и др. Холерные вибрионы неО1/неО139, выделенные в ходе мониторинга водоемов и стоков Ростова-на-Дону с 2009 по 2011 год / Л.В. Григоренко, В.Д. Кру-гликов, А.Б. Мазрухо [и др.] //Проблемы особо опасных инфекций. 2013. № 4. С. 48—50.

Кругликов В.Д. и др. Характеристика штаммов холерных вибрионов не О1/неО139 серогрупп, вызвавших заболевания людей в Ростовской области / В.Д. Кругликов, Е.В. Монахова, И.В. Архангельская [и др.] //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 5. С. 18—22. Семиотрочев В.Л и др. Классификация заболеваний, вызванных микроорганизмами рода Vibrio / В.Л. Семиотрочев, Ю.З. Ривкус //Здоровье населения и среда обитания. 2012. № 2. С. 32—36.

Шалу О.А.и др. Пандемичные штаммы Vibrio parahaemolyticus — этиологические агенты гастроэнтеритов на Дальнем Востоке Российской Федерации / О.А. Шалу, А.В. Алле-нов, Г.П. Мурначев [и др.] //Здоровье населения и среда обитания. 2010. № 12. С. 42—45.

Контактная информация: Contact information:

Водопьянов Алексей Сергеевич, Vodopyanov Alexey, тел.: 8 (903) 402-07-02, phone: 8 (903) 402-07-02,

e-mail: alexvod@gmail.com e-mail: alexvod@gmail.com

+>-

УДК 621.384.8:612.017.4 ^

ИНДИКАЦИЯ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА С ПОМОЩЬЮ MALDI МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

В.Г. Германчук, Д.В. Уткин, А.Н. Спицын, М.Н. Киреев, Н.Е. Щербакова ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»», г. Саратов, Россия Определен масс-спектр холерного токсина с помощью времяпролетной MALDI масс-спектрометрии (MALDI-TOFMS), выявлены специфические пики масс-спектров, изучена возможность определения холерного токсина в объектах окружающей среды (водопроводной воде). Ключевые слова: токсины, холерный токсин, масс-спектр, MALDI-TOF MS. V.G. Germanchuk, D.V. Utkin, A.N. Spitsyn, M.N. Kireyev, N.E. Scherbakova  INDICATION OF CHOLERA TOXIN FOR MALDI MASS SPECTROMETRY  FSHE «Russian Scientific Research Anti-Plague Institute «Microbe»», Saratov, Russia.

The mass spectrum of cholera toxin is defined by MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/ Ionization Time Of Flight Mass-Spectrometry), specific peaks of mass spectrums are revealed,

possibility of its definition in objects of environment (tap water) is studied. Key words: toxins, cholera toxin, mass spectrum, M iALDI-TOF MS.

В настоящее время угроза возникновения чрезвычайных ситуаций различного характера является актуальной проблемой для всех государств мирового сообщества, не исключая Россию. Сохраняется потенциальная опасность применения патогенных биологических агентов в целях биотерроризма [5]. Еще в 1988 г. Министерством здравоохранения СССР был утвержден перечень агентов, в отношении которых необходимо создавать средства защиты и проводить защитные мероприятия. К их числу относят биологические токсины растительного и животного происхождения: ботулинические, столбнячный, сибиреязвенный, шигеллезный, холерный токсины, стафилококковые энтеротоксины, рицин, нейротоксины и др. Холероген входит в список токсинов, подлежащих экспортному контролю и в перечень агентов, выявляемых в лабораториях специализированных противоэпидемических бригад. Для выявления штаммов холерного вибриона, продуцирующих холерный токсин, используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [1, 2]. Тем

не менее, молекулярно-генетические методы не позволяют провести индикацию холерного токсина в нативном материале. В настоящее время для выявления холерного токсина в объектах окружающей среды рядом зарубежных и отечественных производителей выпускаются наборы для иммунохромато-графического анализа (BADD — Osborn Scientific, США; SMART-II - New Horizons Diagnostic, Inc., США; Prime Alert - GenPrime, Inc., США; УИХЭ - ФГУП ГосНИИБП ФМБА, Россия).

Холерный токсин, продуцируемый Vibrio choleraе, относится к группе токсинов, генерирующих образование вторичных мессенджеров, способных в значительной степени усиливать и искажать клеточную реакцию на различные сигналы. Холерный токсин обладает АДф-рибозилтрансферазной активностью по отношению к ГТФ-азе клеток млекопитающих. После АДФ-рибозилирования ГТФ-аза вызывает пролонгированную активацию аденилатциклазы и резкое увеличение цАМФ в энтероцитах. Увеличение концентрации цАМФ, в

28

ЗНиСО

март №3

Рис. 1. Масс-спектр коммерческого препарата холерного токсина Sigma (USA).

свою очередь, приводит к выведению ионов хлора, бикарбоната и воды из клеток, обусловливая тем самым потерю электролитов и обезвоживание. Известно, что холерный токсин представляет собой олигомерный белок, состоящий из шести субъединиц. Одна из этих субъединиц, обладающая каталитической активностью, относится к типу А, остальные пять, осуществляющих связывание холерного токсина с белком-рецептором на поверхности энтероцитов тонкого кишечника, — к типу В. Два домена, соединенных дисульфидной связью, выделяют в субъединице А: А1 (СТА1) — фермент, который присоединяет АДФ-рибозу к О-белкам, и А2 (СТА2), имеющий вид альфа-спирали, которая находится внутри пятичленного кольца, образованного субъединицами В [6].

Масс-спектрометрия является физико-химическим методом исследования, позволяющим проводить качественный и количественный анализ состава вещества. Принцип масс-спектрометрического анализа основан на предварительной ионизации атомов и молекул, входящих в состав пробы, дальнейшего

ц

разделения ионов исследуемого вещества в вакууме под действием электрических и магнитных полей и регистрации результатов в виде масс-спектра. Масс-спектр представляет собой зависимость интенсивности ионного тока молекулы от отношения ее массы к заряду и является характеристикой анализируемого вещества, отражающей особенности его строения. Масс-спектрометрию отличают высокая селективность, чувствительность (1—10 нг), экспрессность (1—5 мин — анализ одной пробы, 1,5 ч — 100 проб), информативность, точность, минимальный расход исследуемой пробы (1—10 мкл) [4].

Времяпролетная МАЬБ1 масс-спектрометрия (MALDI-TOF МБ) является новой технологией в лабораторной диагностике, позволяющей проводить идентификацию микроорганизмов и определять их таксономическое положение. Данный метод включает прямой масс-спектрометрический анализ белковой фракции лизата микробной клетки («прямое белковое профилирование»), предметом которого служат преимущественно рибосомальные белки, являющиеся консервативными в пределах

март №3

29

Ü

Рис. 2. Масс-спектр холерного токсина ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

вида микроорганизма. MALDI-TOF MS использовалась для идентификации ботулинического нейротоксина, столбнячного токсина, стафилококкового энтеротоксина [3] и шига-токсина E. coli O157 [7]. Для выявления холерного токсина, по имеющимся литературным данным, этот метод не использовался.

Цель работы: определение масс-спектра холерного токсина с помощью масс-спектрометрического анализа и возможность индикации его в объектах окружающей среды (водопроводной воде).

Материалы и методы. В работе использовали коммерческий препарат холерного токсина — «Cholera toxin from Vibrio спо1егае» (Sigma, USA) — и холерный токсин производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», полученный модифицированным методом. Для получения холерного токсина использовали бульонную культуру холерного вибриона штамма 569B (безмикробный центрифугат после стерилизующей мембранной фильтрации). Холерный токсин осаждали добавлением в фильтрат соляной кислоты до 18,5 % в присутствии гексаметафосфата натрия (рН = 4,3). Осаждение проводили при ком-

натной температуре и постоянном перемешивании в течение 2 ч. Затем фильтрат центрифугировали и полученный осадок растворяли в фосфатном буфере (рН = 7,0) и диализовали в течение суток против фосфатного буфера (рН = 7,0) при температуре 4 °С. Затем при помощи ионообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе отделяли холерный токсин от примесей. Фракции второго пика собирали, добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,02% и диализовали против 0,9 % раствора хлорида натрия. Холерный очищенный энтеротоксин, приготовленный описанным методом, обладает высокой антигенной и протективной активностью, используется для получения антитоксических сывороток, диагностикума, научных исследований.

Супернатант, содержащий холерный токсин в количестве 0,5 мкл, размещали на ячейке МБР-чипа, и после полного высыхания наслаивали 0,5 мкл матрицы. В качестве матрицы для МЛЬБ1-TOF-анализа использовали 10 мг/мл а-циано-4-гидроксикоричной кислоты в 50 % растворе ацетонитрила и 2,5 % растворе трифторуксусной кислоты. Для приготовления раствора матрицы ис-

30

ЗНиСО

март №3

Рис. 3. Масс-спектр водопроводной воды, контаминированной коммерческим препаратом холерного токсина Sigma

пользовали сухую порционную матрицу и стандартный растворитель, приготовленный в день проведения масс-спектрометрического исследования путем внесения 475 мкл ультрачистой деионизованной воды, 25 мкл 100 % трифторуксусной кислоты и 500 мкл ацетонитрила в микропробирку до конечного объема 1 мл. В программе flexControl™ проводили обстрел образцов в ручном режиме. Сбор спектров осуществляли на масс-спектрометре Microflex™ LT (Bruker Daltonics, Германия), оснащенном программным обеспечением для анализа масс-спектров BioTyper™ (Bruker Daltonik, Германия), содержащим более пяти тысяч спектров индивидуальных штаммов и обладающим возможностью создания собственных баз данных в диапазоне «масса/заряд» 2 000-20 000 Да.

Результаты и обсуждение. На основании полученных данных выделены биологические маркеры (спектральные пики с определенным значением, m/z), соответствующие коммерческому препарату холерного токсина Sigma (рис. 1), со значениями m/z: 2 899 ± 1; 3 868 ± 1; 5 803 ± 4; 7 738 ± 6; 11 603 ± 7, и

ц

холерному токсину ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (рис. 2), со значениями m/z: 2 466 ± 2; 3 870 ± 3; 5 806 ± 4; 6 846 ± 6; 11 610 ± 6.

Полученные спектральные пики с m/z, равным 5 803 ± 4 и 5 806 ± 4, предположительно соответствовали домену A2 A-субъединицы холерного токсина с молекулярной массой ~5,5 кДа, а 11 603 ± 7 и 11 610 ± 6 — мономеру В-субъединицы холерного токсина с молекулярной массой —11,6 кДа [8].

Для оценки возможности индикации холеро-гена в объектах окружающей среды использовали водопроводную воду, контаминированную коммерческим препаратом холерного токсина Sigma (USA) и холерным токсином ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» с последующим определением масс-спектра исследуемых образцов (рис. 3).

Спектральные пики с определенным значением m/z, соответствующие водопроводной воде, контаминированной коммерческим препаратом холерного токсина Sigma (значения m/z составили 2 899 ± 1; 3 868 ± 1; 5 803 ± 4; 7 739 ± 6 и 11 605 ± 7), совпадали с пиками, полученными при исследовании холер-

март №3

31

Г-Ь

ного токсина (наиболее характерны спектральные пики: 3 868 ± 1; 5 803 ± 4; 11 603 ± 7). Аналогичные совпадения отмечались и при исследовании водопроводной воды, контаминированной холерным токсином ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Метод MALDI-TOF MS позволил определить наличие холерного токсина в водопроводной воде в концентрации 0,01 мкг/мл (в то время как индикаторный иммунохроматографический элемент (производства ФГУП «ГосНИИБП», ФМБА, Россия) для выявления холерного токсина в пробах, взятых из объектов внешней среды, дает положительную реакцию в концентрации не менее 1 мкг/мл).

Выводы. В результате проведенного исследования определен масс-спектр холерного токсина с помощью MALDI-TOF MS, выявлены специфические пики масс-спектров, определена возможность индикации холерного токсина в водопроводной воде. Использовать данный метод можно для индикации токсинов в объектах окружающей среды при наработке базы данных токсинов биологического происхождения.

ЛИТЕРАТУРА

1. Абдрашитова А.С. и др. Оценка диагностической эффективности наборов реагентов для выявления ДНК возбудителей сибирской язвы, бруцеллеза и холеры методом ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени» / А.С. Абдрашитова, Л.В. Саяпина, А.Н. Малахаева [и др.] //Здоровье населения и среда обитания. 2013. № 1 (238). С. 32—34.

Водопьянов С.О. и др. Испытание метода ПЦР в работе индикационной лаборатории мобильного комплекса СПЭБ при исследовании экспериментальных проб на холеру / С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, И.П. Олейников [и др.] //Здоровье населения и среда обитания. 2011. № 8. С. 43—45.

Дубровский Я.А. и др. Определение токсинов пептидной природы методом MALDI-MS /Я.А. Дубровский, Е.П. Подольская //Научное приборостроение. 2010. Т. 20. № 4. С. 21—35.

Лебедев А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии. М.: «БИНОМ. Лаборатория знаний», 2003. 493 с. ОнищенкоГ.Г. и др. Биологическая безопасность / Г.Г. Они-щенко, М.А. Пальцев, В.В. Зверев [и др.]. М.: «Медицина», 2006. 304 с.

De Haan L. at al. Cholera toxin: a paradigm for multi-functional engagement of cellular mechanisms (Review). //Mol. Membr. Biol. 2004. V. 21 (2). P. 77—92.

Fagerquist C.K. at al. Top-Down Proteomic Identification of Furin-Cleaved a-Subunit of Shiga Toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 Using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. //Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010. V. 2010. 11 p. Williams J.P. at al. Gas Phase Characterization of the Noncovalent Quaternary Structure of Cholera Toxin and the Cholera Toxin B Subunit Pentamer //Biophysical Journal. 2006. V. 90. № 9. P. 3246—3254.

Контактная информация:

Германчук Валерий Геннадьевич, тел.: (8452) 51-52-11, e-mail: rusrapi@microbe.ru

Contakt information:

Germanchuk Valery, phone: (8452) 51-52-11, е-mail: rusrapi@microbe.ru

УДК: 549.843.1:579.26:57.083.13

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФОРМИРОВАНИЯ ХОЛЕРНЫМИ ВИБРИОНАМИ БИОПЛЕНОК НА АБИОТИЧЕСКИХ ПОВЕРХНОСТЯХ В РАЗНЫХ

УСЛОВИЯХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

С.В. Титова, Е.В. Кушнарева ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора,

г. Ростов-на-Дону, Россия

Определен оптимальный твердый субстрат (покровные стекла) и среды культивирования (водопроводная, речная вода, PBS, солевая среда) для моделирования нативных биопленок холерными вибрионами в лабораторных условиях. На примере двух нетоксигенных штаммов V.cholerae показано, что применение данной модели позволяет проследить стадии данного процесса — от адгезии отдельных клеток до образования стабильной многослойной структуры. Ключевые слова: штаммы холерных вибрионов, концентрация, биопленка, покровные стекла, твердый субстрат, среда культивирования.

Titova S.V, Kushnaryova E.V.  EXPERIMENTAL STUDY OF FORMATION OF BIOFILM BY VIBRIO CHOLERAE ON ABIOTIC SURFACES UNDER DIFFERENT CULTURE CONDITIONS  FSHE «Rostov-on-Don Anti-Plague Institute» of the Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Rostov-on-Don, Russia.

The results of investigations made it possible to determine optimal solid substrate (cover-glasses) and culture media (tap, river water, PBS, saline medium) for modeling the formation of native biofilms by Vibrio cholerae under laboratory conditions. With the use of two atoxigenic V. cholerae strains it was demonstrated that this model allows us to follow different stages of biofilm formation — from adhesion of single cells to the development of stable multilayer structure.

Key words: Vibrio cholerae strains, concentration, biofilm, cover-glass, a solid substrate, culture medium.

На территории России из объектов окружающей среды (ООС) ежегодно выделяется значительное количество штаммов Vibrio cholerae, большей частью атоксигенных, хотя периодически имеют место и заносы эпидемически опасных штаммов [1]. Возможность сохранения и персистенции холерных вибрионов в ООС обусловлена их способностью к образованию биопленок, которая зависит как от целого ряда внешних факторов, так и от исходно-

го количества клеток в популяции. В последние годы число публикаций, касающихся биопленок холерных вибрионов постепенно увеличивается. В работах отечественных ученых нашли отражение вопросы, касающиеся изучения способности сахаров ингибировать пленкообразование, и установлена роль определенных лектиновых рецепторов в этом процессе [3]. Показана вариабельность свойств, характеризующих способность к выживанию хо-