СПОСОБ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ДЛЯ РАЗЛИЧЕНИЯ ЗДОРОВОЙ ТКАНИ И ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ
VISUALISATION TECHNIQUE TO DISTINGUISH HEALTHY TISSUE FROM TUMOR TISSUE

13
Данное изобретение относится к способу визуализация опухоли с использованием гиперполяризованного С-пирувата в качестве МР визуализирующего агента, позволяющего различать опухолевую ткань и здоровую ткань.
Магнитно-резонансная (МР) визуализация (МРВ) представляет собой метод визуализации, который стал особенно привлекательным для врачей, поскольку он позволяет получать изображения организма пациента или его частей неинвазивным способом, не подвергая пациента и медицинский персонал воздействию потенциально опасного излучения, такого как рентгеновское излучение. Благодаря высокому качеству изображений МРВ является предпочтительным методом визуализации мягких тканей и органов, который позволяет различать нормальную ткань и больную ткань, например опухоли, и патологические изменения.
МР визуализацию опухоли можно осуществлять с использованием или без использования МР контрастных агентов. На МР изображении, полученном без использования контрастного агента, довольно четко будут видны опухоли размером от примерно 1-2 сантиметров и больше. Однако МРВ с контрастным усилением обеспечивает обнаружение гораздо меньших изменений ткани, то есть гораздо меньших опухолей, что делает МР визуализацию с контрастным усилением мощным инструментом обнаружения опухолей на ранних стадиях и обнаружения метастазов.
В МР визуализации опухолей используется несколько типов контрастных агентов. Водорастворимые хелаты парамагнитных металлов, например хелаты гадолиния, такие как Omniscan™ (Amersham Health), широко используются в качестве МР контрастных агентов. При введении в сосудистую сеть, благодаря своей низкой молекулярной массе они быстро распределяются во внеклеточное пространство (то есть в кровь и интерстиций). Они также относительно быстро выводятся из организма. Было обнаружено, что хелаты гадолиния особенно полезны для увеличения процента обнаружения метастазов и небольших опухолей и для улучшения классификации опухолей, причем последнее обеспечивается дифференцированием витальной опухолевой ткани (высокая степень перфузиии и/или нарушение гематоэнцефалического барьера) от центрального некроза и от окружающего отека или макроскопически незатронутой ткани (см., например, С.Claussen et al., Neuroradiology 1985; 27:164-171).
С другой стороны, МР контрастные агенты кровяного пула, например частицы суперпарамагнитного оксида железа, остаются в сосудистой сети в течение длительного времени. Оказалось, что они чрезвычайно полезны для усиления контраста в печени, а также для обнаружения аномалий проницаемости капилляров, например "имеющих течь" стенок капилляров в опухолях, например, в результате ангиогенеза.
Несмотря на бесспорно превосходные свойства указанных контрастных агентов, их использование не лишено риска. Хотя хелатные комплексы парамагнитных металлов обычно имеют высокие константы стабильности, возможно, что ионы токсичных металлов высвобождаются в организм после введения. Кроме того, контрастные агенты этого типа демонстрируют плохую специфичность.
1
1
1
1
13
15
13
15
13
15
В WO-A-99/35508 раскрыт способ МР исследования пациента с использованием гиперполяризованного раствора агента с высоким T в качестве МР визуализирующего агента. Термин "гиперполяризация" означает усиление ядерной поляризации ЯМР активных ядер, присутствующих в агенте с высоким Т, то есть ядер с ненулевым ядерным спином, предпочтительно ядер С или N. При усилении ядерной поляризации ЯМР активных ядер разница между населенностями возбужденного и основного ядерных спиновых состояниях этих ядер значительно увеличивается, и в силу этого интенсивность МР сигнала усиливается в сто раз и более. При использовании гиперполяризованного С- и/или N-обогащенного агента с высоким T помехи от фоновых сигналов практически отсутствуют, поскольку распространенность С и/или N в природе пренебрежимо мала и поэтому контрастность изображения будет преимущественно высокой. Раскрыт целый ряд возможных агентов с высоким T, подходящих для гиперполяризации и последующего использования в качестве МР визуализирующих агентов, включая, но не ограничивая ими, неэндогенные и эндогенные соединения, такие как ацетат, пируват, оксалат или глюконат, сахара, такие как глюкоза или фруктоза, мочевина, амиды, аминокислоты, такие как глутамат, глицин, цистеин или аспартат, нуклеотиды, витамины, такие как аскорбиновая кислота, производные пенициллина и сульфонамиды. Установлено также, что промежуточные соединения в нормальных метаболических циклах, таких как цикл лимонной кислоты, такие как фумаровая кислота и пировиноградная кислота, являются предпочтительными визуализирующими агентами для визуализации метаболической активности.
1
Необходимо подчеркнуть, что сигнал от гиперполяризованного визуализирующего агента ослабевает из-за релаксации и после введения в организм пациента из-за разбавления. Следовательно, значение Т визуализирующих агентов в биологических жидкостях (например, в крови) должно быть достаточно высоким, чтобы обеспечить распределение агента в сайт-мишень в организме пациента в высокогиперполяризованном состоянии.
13
Теперь авторы изобретения неожиданно нашли способ МР визуализации опухоли, позволяющий различать опухолевую ткань и здоровую ткань, где в качестве визуализирующего агента используют гиперполяризованный С-пируват.
Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ различения здоровой ткани и опухолевой ткани, включающий
13
13
13
13
а) получение прямых С-МР изображений С-пирувата и его С-содержащих метаболитов аланина, лактата и, возможно, бикарбоната у субъекта, которому предварительно введена композиция, содержащая гиперполяризованный С-пируват;
б) возможно корректирование лактатного сигнала в отношении количества пирувата и/или аланина с получением взвешенного лактатного относительно пируватного и/или лактатного относительно аланинового изображения,
13
при этом на опухолевую ткань в указанных С-изображениях указывает самый высокий лактатный сигнал и/или в случае проведения корректирования на стадии (б) высокий взвешенный лактатный относительно пируватного и/или лактатный относительно аланинового сигнал.
13
13
13
13
13
13
Гиперполяризация ЯМР активных С-ядер может быть достигнута различными методами (например, методами, описанными в WO-A-99/35508). Предпочтительными методами являются перенос поляризации от благородного газа, "метод грубой силы", замораживание спинов и ДПЯ (динамическая поляризация ядер). Предпочтительно для получения гиперполяризованного С-пирувата либо поляризуют непосредственно сам С-пируват либо поляризуют С-пировиноградную кислоту и превращают поляризованную С-пировиноградную кислоту в поляризованный С-пируват, например, нейтрализацией основанием.
13
13
3
129
13
13
Предпочтительным методом получения гиперполяризованного С-пирувата является перенос поляризации от гиперполяризованного благородного газа. Благородные газы, имеющие ненулевой ядерный спин, могут быть гиперполяризованы, то есть их поляризация может быть повышена относительно равновесной поляризации, например, использованием поляризованного вкруговую света. Для осуществления гиперполяризации С-ядер можно использовать гиперполяризованный благородный газ, предпочтительно Не или Хе, или смесь таких газов. Гиперполяризация может быть достигнута также с использованием обогащенного изотопом гиперполяризованного благородного газа, предпочтительно He или Хе. Гиперполяризованный газ может находиться в газовой фазе, он может быть растворенным в жидкости/растворителе, или гиперполяризованный газ сам может служить в качестве растворителя. Альтернативно этот газ можно конденсировать на охлажденную твердую поверхность и использовать в этой форме или дать ему возможность сублимироваться. Тщательное перемешивание гиперполяризованного газа с соединением, которое должно быть поляризовано, является предпочтительным. Следовательно, если поляризуют С-пировиноградную кислоту, которая при комнатной температуре является жидкостью, гиперполяризованный газ предпочтительно растворен в жидкости/растворителе или служит в качестве растворителя. Если поляризуют С-пируват, гиперполяризованный газ предпочтительно растворен в жидкости/растворителе, которая(ый) растворяет также и пируват.
13
Другой предпочтительный метод получения гиперполяризованного С-пирувата заключается в передаче поляризации ЯМР активным ядрам термодинамическим уравновешиванием при очень низкой температуре и в очень сильном поле. Гиперполяризацию осуществляют, используя очень сильное поле и очень низкую температуру (метод грубой силы) по сравнению с рабочими полем и температурой ЯМР спектрометра. Напряженность используемого магнитного поля должна быть как можно более высокой, приемлемо выше 1 Тл, предпочтительно выше 5 Тл, более предпочтительно 15 Тл или выше и особенно предпочтительно 20 Тл или выше. Температура должна быть очень низкой, например 4,2 К или ниже, предпочтительно 1,5 К или ниже, более предпочтительно 1,0 К или ниже, особенно предпочтительно 0,1 К или ниже.
13
2+
Другим предпочтительным методом получения гиперполяризованного С-пирувата является метод замораживания спинов. Этот метод включает поляризацию спина твердого соединения или системы путем поляризации замораживанием спина. В систему вводят подходящие парамагнитные вещества или систему смешивают до гомогенного состояния с подходящими парамагнитными веществами, такими как Ni, ионы лантанидов или актинидов, в кристаллической форме с осью симметрии третьего или более порядка. Аппаратура проще, чем требуется для ДПЯ, не требуется однородное магнитное поле, поскольку поле резонансного возбуждения не прикладывается. Этот процесс осуществляют физическим вращением образца вокруг оси, перпендикулярной направлению магнитного поля. Предварительным условием для этого метода является то, что парамагнитные вещества должны иметь высокоанизотропный g-фактор. В результате вращения образца электронный парамагнитный резонанс входит в контакт с ядерными спинами, что приводит к уменьшению температуры ядерного спина. Вращение образца выполняют до тех пор, пока поляризация ядерного спина не достигает нового равновесия.
13
13
13
13
В более предпочтительном воплощении для получения гиперполяризованного С-пирувата используют метод динамической поляризации ядер (ДПЯ). Поляризацию осуществляют парамагнитным соединением, так называемым парамагнитным агентом или ДПЯ агентом. Во время осуществления процесса ДПЯ подводят энергию, обычно в форме микроволнового излучения, которая первоначально возбуждает парамагнитный агент. При угасании до исходного состояния происходит перенос поляризации от неспаренного электрона парамагнитного агента к ЯМР активным ядрам образца. Обычно в процессе ДПЯ используют умеренное или сильное магнитное поле и очень низкую температуру, например проводят процесс ДПЯ в жидком гелии и в магнитном поле около 1 Тл или выше. Альтернативно можно использовать умеренное магнитное поле и любую температуру, при которой достигается достаточное усиление поляризации. Методика ДПЯ описана, например, в международных публикациях WO-A-98/58272 и в WO-A-01/96895, которые обе включены в данное описание изобретения ссылкой на них. Для получения гиперполяризованного С-пирувата методом ДПЯ в качестве поляризуемого соединения используют либо С-пируват либо С-пировиноградную кислоту.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
В зависимости в основном от используемого в процессе ДПЯ парамагнитного агента используют С-пировиноградную кислоту и/или С-пируват. Если парамагнитный агент растворим в С-пировиноградной кислоте, то предпочтительно используют С-пировиноградную кислоту и образуют жидкую смесь, предпочтительно жидкий раствор парамагнитного агента и С-пировиноградной кислоты. Если парамагнитный агент не растворяется в С-пировиноградной кислоте, то используют С-пируват и/или С-пировиноградную кислоту и по меньшей мере один сорастворитель для образования жидкой смеси, предпочтительно жидкого раствора. Было установлено, что успешное осуществление ДПЯ и, следовательно, уровень поляризации зависит от нахождения поляризуемого соединения и парамагнитного агента в тесном контакте друг с другом. Следовательно, сорастворителем предпочтительно является сорастворитель или смесь сорастворителей, который(ая) растворяет как парамагнитный агент, так и С-пировиноградную кислоту и/или С-пируват. Для С-пирувата в качестве сорастворителя предпочтительно используют воду.
13
13
13
13
Было также обнаружено, что более высокие уровни поляризации достигаются методом ДПЯ, когда образец-смесь при охлаждении/замораживании образует стекло, а не кристаллизованный образец. Опять же, образование стекла обеспечивает более тесный контакт парамагнитного агента и подвергаемого поляризации соединения. С-пировиноградная кислота является хорошим стеклообразующим веществом и поэтому предпочтительно ее используют в процессе ДПЯ, когда парамагнитный агент растворим в С-пировиноградной кислоте. С-пируват представляет собой соль и при замораживании жидкой смеси водного раствора С-пирувата и парамагнитного агента будет образовываться кристаллизованный образец. Чтобы предотвратить это, предпочтительно добавлять также сорастворители, которые являются хорошими стеклообразующими веществами, такие как глицерин, пропандиол или гликоль.
13
13
13
Следовательно, в одном воплощении С-пируват растворяют в воде с получением водного раствора и добавляют парамагнитный агент, глицерин и, возможно, также сорастворитель с образованием жидкой смеси. В предпочтительном воплощении С-пировиноградную кислоту, парамагнитный агент и сорастворитель объединяют с образованием жидкой смеси. В наиболее предпочтительном воплощении С-пировиноградную кислоту и парамагнитный агент объединяют с образованием жидкой смеси. Смешивание соединений до гомогенного состояния может быть достигнуто несколькими способами, известными в данной области, такими как перемешивание, вортексирование или обработка ультразвуком.
Жидкую смесь затем замораживают, после чего проводят процесс ДПЯ. Охлаждение/замораживание жидкой смеси может быть достигнуто способами, известными в данной области, например замораживанием жидкой смеси в жидком азоте или просто помещением ее в поляризатор, где образец будет заморожен жидким гелием.
Как указано выше, динамическая поляризация ядер (ДПЯ) представляет собой метод поляризации, заключающийся в том, что поляризацию соединения, которое поляризуют, осуществляют агентом ДПЯ, то есть парамагнитным агентом/соединением.
В качестве агентов ДПЯ могут быть использованы многие известные парамагнитные соединения, например переходные металлы, такие как ионы хрома (V), органические свободные радикалы, такие как нитроксидные радикалы, тритильные радикалы или магнитные частицы. Такие агенты ДПЯ описаны, например, в WO-A-99/35508, WO-A-88/10419, WO-A-90/00904, WO-A-91/12024, WO-A-93/02711 или WO-A-96/39367.
13
В предпочтительном воплощении в качестве парамагнитного агента для получения С-пирувата способом ДПЯ используют тритильный радикал формулы (I)
где М представляет собой водород или один эквивалент катиона; и
1
6
2
n
R1, которые являются одинаковыми или разными, каждый представляет собой, возможно, гидроксилированную C-С-алкильную группу с прямой или разветвленной цепью или группу -(CH)-X-R2, где n равно 1, 2 или 3;
X представляет собой О или S; и
1
4
R2 представляет собой, возможно, гидроксилированную С-С-алкильную группу с прямой или разветвленной цепью.
В предпочтительном воплощении М представляет собой водород или один эквивалент физиологически переносимого катиона. Термин "физиологически переносимый катион" означает катион, который переносим живым организмом человека или животного, не являющегося человеком. Предпочтительно М представляет собой водород или катион щелочного металла, ион аммония или ион органического амина, например меглумина. Наиболее предпочтительно М представляет собой водород или натрий.
1
4
В еще одном предпочтительном воплощении R1 одинаковые или разные, предпочтительно одинаковые, и каждый представляет собой возможно гидроксилированную С-С-алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, наиболее предпочтительно метил, этил, изопропил, гидроксиметил или гидроксиэтил.
2
1
3
2
2
3
1
3
3
2
1
3
2
2
3
1
3
3
2
3
2
2
5
2
2
4
2
2
3
2
3
2
2
5
2
2
4
2
2
3
2
2
3
В еще одном предпочтительном воплощении R1 одинаковые или разные, предпочтительно одинаковые, и каждый представляет собой -СН-O-(С-С-алкил), -(СН)-O-СН, -(С-С-алкил)-O-СН, -СН-S-(С-С-алкил), -(СH)-S-СН, -(С-С-алкил)-S-СН, -СН-O-СН, -СН-O-СН, -СН-O-СНOН, -СН-СН-O-СН, -СН-S-СН, -CH-S-CH, -CH-S-CHOH или -СН-СН-S-СН, наиболее предпочтительно -СН-СН-O-СН.
2
2
3
В более предпочтительном воплощении М представляет собой водород или натрий, и R1 одинаковые и каждый представляет собой -СН-СН-O-СН.
Тритильные радикалы формулы (I) могут быть синтезированы способами, которые подробно описаны в WO-A-91/12024, WO-A-96/39367, WO 97/09633 и WO-A-98/39277. Коротко, радикалы могут быть синтезированы путем взаимодействия трех мольных эквивалентов металлированного мономерного арильного соединения с одним мольным эквивалентом соответствующим образом защищенного производного карбоновой кислоты с образованием тримерного промежуточного соединения. Это промежуточное соединение металлируют и затем подвергают взаимодействию, например, с диоксидом углерода с получением трикарбокситритилкарбинола, который на следующей стадии обрабатывают сильной кислотой с образованием триарилметильного катиона. Этот катион затем восстанавливают с образованием стабильного тритильного радикала.
13
13
Жидкая смесь, содержащая С-пируват и/или С-пировиноградную кислоту и, возможно, растворитель, предпочтительно содержит от 5 до 100 мМ тритильных радикалов формулы (I), более предпочтительно от 10 до 20 мМ, особенно предпочтительно от 12 до 18 мМ и наиболее предпочтительно от 13 до 17 мМ. Было обнаружено, что время нарастания для поляризации в процессе ДПЯ короче при использовании большего количества радикала, однако достигается более низкий уровень поляризации. Следовательно, эти два эффекта должны быть сбалансированы один относительно другого.
13
13
13
Методика ДПЯ описана, например, в международных публикациях WO-A-98/58272 и в WO-A-01/96895, которые обе включены в данное описание ссылкой на них. Обычно в процессе ДПЯ используют умеренное или сильное магнитное поле и очень низкую температуру, например проводят процесс ДПЯ в жидком гелии и в магнитном поле примерно 1 Тл или выше. Альтернативно можно использовать умеренное магнитное поле и любую температуру, при которой достигается достаточное усиление поляризации. В предпочтительном воплощении способа по изобретению процесс ДПЯ проводят в жидком гелии и в магнитном поле примерно 1 Тл или выше. Подходящие установки для поляризации описаны, например, в WO-A-02/37132. В предпочтительном воплощении установка для поляризации содержит криостат и поляризующее устройство, например микроволновую камеру, соединенную волноводом с источником микроволнового излучения, в центральном канале, окруженном создающим магнитное поле устройством, таким как сверхпроводящий магнит. Канал тянется вертикально вниз до по меньшей мере уровня области Р рядом со сверхпроводящим магнитом, где сила магнитного поля достаточно высока, например от 1 до 25 Тл, для осуществления поляризации С-ядер. Канал для образца предпочтительно выполнен с возможностью герметизации и его можно откачивать до низких давлений, например давлений порядка 1 мбар (100 Па) или менее. Внутрь этого канала может быть помещено устройство для ввода образца (например смеси, содержащей парамагнитный агент и С-пируват или С-пировиноградную кислоту), например извлекаемая транспортирующая образец трубка, и эта трубка может быть вставлена в канал сверху вниз до позиции внутри микроволновой камеры в области Р. Область Р охлаждают жидким гелием до температуры, достаточно низкой, для того, чтобы происходила поляризация, предпочтительно до температуры порядка 0,1-100 К, более предпочтительно 0,5-10 К, наиболее предпочтительно 1-5 К. Устройство для ввода образца предпочтительно выполнено с возможностью герметизации на его верхнем конце любым подходящим способом для сохранения частичного вакуума в канале. В нижнем конце устройства для ввода образца может быть установлен с возможностью извлечения удерживающий образец контейнер, например удерживающий образец стакан. Удерживающий образец контейнер предпочтительно изготовлен из легкого по массе материала с низкой удельной теплоемкостью и хорошими криогенными свойствами, такого как, например, KelF (полихлортрифторэтилен) или PEEK (полиэфирэфиркетон). Контейнер для образца может вмещать в себя один или более чем один подлежащий поляризации образец.
13
13
13
Образец вставляют в удерживающий образец контейнер, погружают в жидкий гелий и подвергают микроволновому облучению, предпочтительно при частоте примерно 94 ГГц при 200 мВт. Мониторинг уровня поляризации можно выполнять путем получения С-ЯМР сигналов от образца в твердом состоянии во время микроволнового облучения, поэтому на стадии (б) предпочтительно используют установку для поляризации, содержащую устройство для получения С-ЯМР спектров в твердом состоянии. Обычно получают кривую насыщения на графике зависимости С-ЯМР сигнала от времени. Следовательно, можно определить, когда достигается оптимальный уровень поляризации.
Если гиперполяризацию осуществляют методом, который требует, чтобы образец был в твердом состоянии, например методом ДПЯ, то для использования в способе по изобретению твердый образец должен быть переведен в жидкое состояние. Твердую поляризованную смесь либо растворяют подобно тому, как описано, например, в WO-A-02/37132, либо расплавляют, как описано, например, в WO-A-02/36005. Предпочтительным является растворение твердого гиперполяризованного образца, более предпочтительно растворение в буфере, предпочтительно в физиологически переносимом буфере с получением жидкой композиции. Термин "буфер" в контексте данной заявки означает один или более буферов, то есть также смеси буферов.
2
4
2
4
Предпочтительными буферами являются физиологически переносимые буферы, более предпочтительно буферы, которые обеспечивают рН в пределах примерно от 7 до 8, такие как, например, фосфатный буфер (KHPO/NaHPO), ACES, PIPES, имидазол/HCl, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS или TRICIN. Более предпочтительными буферами являются фосфатный буфер и TRIS, наиболее предпочтительным является TRIS. В еще одном воплощении используют более чем один из вышеуказанных предпочтительных буферов, то есть смесь буферов.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
2
3
3
Когда в качестве соединения, подлежащего поляризации, используют С-пировиноградную кислоту, растворение также включает превращение С-пировиноградной кислоты в С-пируват. Чтобы достичь этого, С-пировиноградную кислоту подвергают взаимодействию с основанием. В одном воплощении С-пировиноградную кислоту подвергают взаимодействию с основанием с превращением ее в С-пируват, а затем добавляют буфер. В другом предпочтительном воплощении буфер и основание объединяют в одном растворе, и этот раствор добавляют к С-пировиноградной кислоте, при этом она растворяется и превращается в С-пируват одновременно. В предпочтительном воплощении основание представляет собой водный раствор NaOH, NаСО или NаНСО, и наиболее предпочтительным основанием является NaOH. В особенно предпочтительном воплощении для растворения С-пировиноградной кислоты и ее превращения в натриевую соль С-пирувата используют раствор буфера TRIS, содержащий NaOH.
1
В другом предпочтительном воплощении буфер или, где это применимо, объединенный раствор буфер/основание дополнительно содержит одно или более соединений, которые способны связывать свободные парамагнитные ионы или образовывать с ними комплексы, например хелатирующие агенты, такие как DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота) или EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Было обнаружено, что свободные парамагнитные ионы могут вызывать уменьшение T гиперполяризованного соединения и этого предпочтительно избегают.
Растворение может быть осуществлено предпочтительно с использованием методов и/или устройств, раскрытых в WO-A-02/37132. Если гиперполяризацию проводят методом ДПЯ, то может быть использована установка для растворения, которая либо физически отделена от поляризатора либо является частью аппарата, который содержит поляризатор и установку для растворения. В предпочтительном воплощении растворение осуществляют при повышенном магнитном поле для улучшения релаксации и сохранения максимума гиперполяризации. Узлов магнитного поля следует избегать, и, несмотря на вышеуказанные меры, слабое поле может приводить к усилению релаксации.
13
Если гиперполяризацию проводят методом ДПЯ, то парамагнитный агент и/или его реакционные продукты предпочтительно удаляют из раствора, содержащего С-пируват. Парамагнитный агент и/или реакционные продукты могут быть удалены частично, в значительной степени или в идеале полностью, причем полное удаление является предпочтительным. Реакционными продуктами, например, тритильных радикалов формулы (I) могут быть сложные эфиры, которые могут образовываться в результате реакции пировиноградной кислоты с радикалами формулы (I), содержащими гидроксильные группы. Способы, используемые для удаления парамагнитного агента и/или его реакционных продуктов, известны в данной области. Как правило, выбор способа зависит от природы парамагнитного агента и/или его реакционных продуктов. При растворении твердого образца после поляризации радикал может осаждаться и его легко можно выделить из жидкой композиции фильтрованием. Если в качестве парамагнитных агентов используют магнитные частицы, то эти частицы также без труда удаляют фильтрованием. Если осаждение не происходит, парамагнитный агент может быть удален хроматографическими методами разделения, например жидкостной хроматографией, такой как хроматография с обращенными фазами, прямофазная или ионообменная хроматография, или экстракцией.
Так как тритильный радикал формулы (I) имеет характеристический спектр поглощения в УФ/видимой области, можно использовать измерение поглощения в УФ/видимой области в качестве метода проверки его присутствия в жидкой композиции после его удаления. Для получения количественных результатов, то есть концентрации радикала, присутствующего в растворенном гиперполяризованном образце, оптический спектрометр может быть откалиброван таким образом, что поглощение при конкретной длине волны для образца дает соответствующую концентрацию радикала в образце.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
1
1
2
2
3
3
1,2
1,3
2,3
2,3
2,3
2,3
1,2,3
1,2,3
Изотопное обогащение С-пирувата, используемого в способе по изобретению, и/или С-пировиноградной кислоты, которую предпочтительно используют для получения гиперполяризованного С-пирувата методом ДПЯ, предпочтительно составляет по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80% и особенно предпочтительно по меньшей мере 90%, причем изотопное обогащение свыше 90% является наиболее предпочтительным. В идеале обогащение составляет 100%. С-пировиноградная кислота и/или С-пируват могут быть обогащены изотопом в положении С1 (что ниже обозначено как С-пировиноградная кислота и С-пируват), в положении С2 (что ниже обозначено как С-пировиноградная кислота и C-пиpyвaт), в положении С3 (что ниже обозначено как С-пировиноградная кислота и С-пируват), в положениях С1 и С2 (что ниже обозначено как С-пировиноградная кислота и С-пируват), в положениях С1 и С3 (что ниже обозначено как С-пировиноградная кислота и С-пируват), в положениях С2 и С3 (что ниже обозначено как C-пировиноградная кислота и C-пиpyвaт) или в положениях С1, С2 и С3 (что ниже обозначено как С-пировиноградная кислота и С-пируват), причем положение С1 является предпочтительным.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
1
2
1
2
1,2
В данной области известно несколько способов синтеза C-пировиноградной кислоты. Коротко, в Seebach et al., Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231-237, описан путь синтеза, основанный на защите и активации карбонилсодержащего исходного вещества в виде S,S-ацеталя, например 1,3-дитиана или 2-метил-1,3-дитиана. Дитиан металлируют и подвергают взаимодействию с метилсодержащим соединением и/или СО. С использованием соответствующего обогащенного изотопом C-компонента, как описано в этой ссылке, может быть получен С-пируват, C-пиpyвaт или С-пируват. Карбонильную функциональную группировку затем высвобождают общепринятыми способами, описанными в литературе. Другие пути синтеза начинаются с уксусной кислоты, которую сначала превращают в ацетилбромид, а затем подвергают взаимодействию с CuCN. Полученный нитрил превращают в пировиноградную кислоту через амид (см., например, S.H.Anker et al., J. Biol. Chem. 176 (1948), 1333 или J.E.Thirkettle, Chem Commun. (1997), 1025). С-пировиноградная кислота может быть получена также протонированием коммерчески доступного С-пирувата натрия, например способом, описанным в патенте США 6232497.
13
Для использования в способе по изобретению гиперполяризованный С-пируват предоставляется в виде композиции, которая подходит для введения в живой организм человека или животного, не являющегося человеком. Композиция предпочтительно содержит буфер или смесь буферов, как описано выше. Композиция может дополнительно содержать традиционные фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты и вспомогательные вещества, используемые для приготовления препаратов. Так, композиция может содержать, например, стабилизаторы, агенты, регулирующие осмотическое давление, солюбилизирующие агенты и тому подобное.
Пируват является эндогенным соединением, которое организм человека переносит очень хорошо даже в высоких концентрациях. В качестве предшественника в цикле лимонной кислоты пируват играет важную метаболическую роль в организме человека. Пируват превращается в разные соединения: в результате его трансаминирования образуется аланин, в результате окислительного декарбоксилирования пируват превращается в ацетил-KoA и бикарбонат, в результате восстановления пирувата образуется лактат, а в результате его карбоксилирования образуется оксалоацетат.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
1,2
1,2,3
1
1
Теперь обнаружено, что превращение гиперполяризованного С-пирувата в гиперполяризованный С-лактат, гиперполяризованный С-бикарбонат (только в случае С-гпирувата, С-пирувата или С-пирувата) и гиперполяризованный С-аланин может быть использовано для различения опухолевой ткани и здоровой ткани с использованием МР визуализации in vivo. Это неожиданно, поскольку известно, что T гиперполяризованных соединений снижается из-за релаксации и разбавления. В цельной крови человека при 37°С С-пируват имеет релаксацию T примерно 42 сек, однако было обнаружено, что превращение гиперполяризованного С-пирувата в гиперполяризованный С-лактат, гиперполяризованный С-бикарбонат и гиперполяризованный С-аланин является достаточно быстрым, чтобы иметь возможность детектировать сигнал от С-пируватного исходного соединения и его метаболитов. Количество аланина, бикарбоната и лактата зависит от метаболического статуса исследуемой ткани. Интенсивность МР сигнала гиперполяризованного С-лактата, гиперполяризованного С-бикарбоната и гиперполяризованного С-аланина связана с количеством этих соединений и степенью поляризации, оставшейся к моменту детектирования. Следовательно, мониторинг превращения гиперполяризованного С-пирувата в гиперполяризованный С-лактат, гиперполяризованный С-бикарбонат и гиперполяризованный С-аланин дает возможность исследовать метаболические процессы in vivo в организме человека или животного, не являющегося человеком, с использованием неинвазивной МР визуализации.
13
Было обнаружено, что амплитуды МР сигналов от разных метаболитов пирувата меняются в зависимости от типа ткани. Уникальная картина метаболических пиков, образуемая аланином, лактатом, бикарбонатом и пируватом, может быть использована в качестве характерного признака для метаболического состояния исследуемой ткани и, следовательно, обеспечивает различение здоровой ткани и опухолевой ткани. Это делает композицию, содержащую С-пируват, превосходным агентом для МР визуализации опухоли in vivo.
13
Субъекта, которого подвергают исследованию, например пациента или животное, обычно помещают в МР магнит. Специально предназначенные С-МР радиочастотные катушки расположены так, что они охватывают интересующую область.
13
13
13
13
13
13
13
13
Композицию, содержащую С-пируват, вводят парентерально, предпочтительно внутривенно, внутриартериально или непосредственно в интересующую область или орган. Дозировка и концентрация композиции по изобретению зависят от целого ряда факторов, таких как токсичность, способность направленно доставляться в орган и путь введения. Обычно композицию вводят в концентрации вплоть до 1 ммоль пирувата на 1 кг массы тела, предпочтительно от 0,01 до 0,5 ммоль/кг, более предпочтительно от 0,1 до 0,3 ммоль/кг. Скорость введения составляет предпочтительно менее 10 мл/сек, более предпочтительно менее 6 мл/сек и наиболее предпочтительно от 5 мл/сек до 0,1 мл/сек. Через менее чем 400 сек после введения, предпочтительно менее чем 120 сек, более предпочтительно менее чем 60 сек после введения, особенно предпочтительно через 20-50 сек после введения и наиболее предпочтительно через 30-40 сек после введения применяют последовательность МР визуализации, которая кодирует интересующий объем объединенным избирательным по частоте и пространственным характеристикам способом. Это приводит к получению метаболических изображений С-лактата, С-аланина и С-пирувата и, более предпочтительно, метаболических изображений С-лактата, С-аланина, С-бикарбоната и С-пирувата. В тот же самый период времени может быть получено протонное изображение с протонным МРВ контрастным агентом или без него с получением анатомической и/или перфузионной информации.
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
13
Кодирование интересующего объема может быть достигнуто с использованием так называемой последовательности спектроскопической визуализации, как описано, например, в T.R.Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3523-3526 (1982); A.A.Maudsley, et al., J. Magn. Res 51, 147-152 (1983). Данные спектроскопического изображения содержат множество элементов объема, при этом каждый элемент содержит полный С-МР спектр. С-пируват и его С-метаболиты все имеют свою уникальную позицию в С-МР спектре, и их резонансная частота может быть использована для их идентификации. Интеграл от пика при его резонансной частоте прямо связан с количеством С-пирувата и его С-метаболитов соответственно. Когда количество С-пирувата и каждого С-метаболита оценивают с использованием, например, рутинных методов выравнивания во временной области, как описано, например, в L.Vanhamme et al., J. Magn. Reson. 129, 35-43 (1997), можно генерировать изображения для С-пирувата и каждого С-метаболита, в которых цветовое кодирование или яркостное кодирование является характерным для измеряемого количества С-пирувата и каждого С-метаболита.
1
31
23
13
13
Хотя методы спектроскопической визуализации доказали свою ценность в создании метаболических изображений с использованием всех видов МР ядер, например Н, P, Na, количество повторов, необходимых для полного кодирования спектроскопического изображения, делает этот подход менее подходящим для гиперполяризованного С. Необходимо обеспечивать наличие сигнала от гиперполяризованного С в течение всего периода получения МР данных. Этого можно достичь за счет снижения отношения сигнал/шум в результате уменьшения угла РЧ-импульса, что применяют в каждой фазе стадии кодирования. Чем выше размеры матрицы, тем больше фаз стадий кодирования и более длительные периоды времени сканирования требуются.
13
13
13
13
Способы визуализации, основанные на пионерской работе Р.С.Lauterbur (Nature, 242, 190-191 (1973) и P.Mansfield (J. Phys. C.6, L422-L426 (1973)), предусматривающие использование градиента считывания в процессе сбора данных, должны обеспечить получение изображений с более высоким отношением сигнал/шум или, что эквивалентно, изображений с более высоким пространственным разрешением. Однако эти способы визуализации в их основной форме способны продуцировать не отдельные изображения для С-пирувата и его С-метаболитов, а изображение, содержащее сигналы от С-пирувата и всех его С-метаболитов, то есть идентификация конкретных метаболитов невозможна.
1
13
13
13
13
13
13
13
13
В предпочтительном воплощении применяют последовательности визуализации с использованием множественного эха для кодирования в отношении частотной информации. Последовательности, которые могут продуцировать отдельные H-изображения воды и жира, описаны, например, в G.Glover, J. Magn. Reson. Visualization 1991:1:521-530 и S.В.Reeder et al., MRM 51 35-45 (2004). Поскольку подлежащие обнаружению метаболиты и, по существу, их МР частоты известны, подход, рассмотренный в указанных ссылках, можно применять к получению прямых изображений C-пирувата, C-аланина и C-лактата и, предпочтительно, C-пирувата, C-аланина, C-лактата и С-бикарбоната. Этот метод делает более эффективным использование гиперполяризованного С-МР сигнала, обеспечивая по сравнению с классической спектроскопической методикой визуализации лучшее качество сигнала, более высокое пространственное разрешение и более короткое время обнаружения.
13
13
13
13
Опухолевая ткань часто характеризуется увеличенной перфузией и более высокой метаболической активностью. Процесс увеличения сосудистого русла, ангиогенез, индуцируется клетками, которые из-за их более высоких метаболических потребностей и/или их большего расстояния от капилляра не способны получать достаточно веществ, которые могут давать энергию, необходимую для поддержания энергетического гомеостаза. Именно в этой области, где клетки имеют проблемы с продуцированием достаточной энергии, ожидается заметное изменение метаболического паттерна. Ткань с проблемами поддержания энергетического гомеостаза меняет свой энергетический метаболизм, что приводит, в частности, к повышенной продукции лактата. Неожиданно оказалось возможным сделать это изменение метаболизма видимым с использованием гиперполяризованного C-пирувата в пределах короткого доступного временного окна МР визуализации, то есть за счет использования высокого сигнала от C-лактата в области опухоли, чтобы отличить опухоль от здоровой ткани. Так как перфузия в опухолевой ткани неоднородна, предпочтительно корректировать C-лактатный сигнал в отношении количества пирувата (C-пируватный сигнал), имеющегося в той же области. В результате этого корректирования получают взвешенное лактатное относительно пируватного изображение. Это обеспечивает выделение областей в ткани с относительно высоким лактатным сигналом относительно пируватного сигнала и таким образом лучшее различение опухолевой ткани и здоровой ткани.
Для корректирования в отношении пируватного сигнала как лактатное, так и пируватное изображения нормализуют по отношению к максимальному значению для каждого отдельного изображения. Во-первых, нормализованное лактатное изображение умножают на инвертированное пируватное изображение, например максимальный пируватный сигнал в изображении минус пируватный уровень для каждого пиксела. И на последней стадии промежуточный результат, полученный в вышеуказанной операции, умножают на исходное лактатное изображение.
13
13
13
Для выделения областей с измененным метаболизмом высокий C-лактатный сигнал в связи со пониженным C-аланиновым сигналом может быть использован в операции, аналогичной той, которая описана в приведенном выше абзаце, посредством чего получают взвешенное лактатное относительно пируватного изображение. Неожиданно идентификация опухолевой области, то есть различение опухолевой ткани и здоровой ткани тоже улучшается за счет этого корректирования. Для корректирования в отношении аланинового сигнала как лактатное, так и аланиновое изображения нормализуют по отношению к максимальному значению для каждого отдельного изображения. Во-вторых, нормализованное лактатное изображение умножают на инвертированное аланиновое изображение, например максимальный аланиновый сигнал в изображении минус аланиновый уровень для каждого пиксела. И на последней стадии промежуточный результат, полученный в вышеуказанной операции, умножают на исходное лактатное изображение. Подобным образом в анализ также может быть включен C-бикарбонатный сигнал. Кроме того, протонное изображение, полученное с или без протонного МРВ контрастного агента, может быть включено в анализ для получения анатомической и/или перфузионной информации.
13
В другом предпочтительном воплощении композицию, содержащую гиперполяризованный C-пируват, вводят повторно, обеспечивая таким образом возможность проведения динамических исследований. Это является дополнительным преимуществом способа по изобретению по сравнению с другими способами МР визуализации опухоли с использованием других МР визуализирующих агентов, которые из-за их относительно длительной циркуляции в организме пациента не дают возможность проводить такие динамические исследования.
Способ по изобретению может быть использован также для МР стадирования опухоли in vivo. Те же метаболические изображения и/или метаболические взвешенные изображения, которые описаны в предыдущих абзацах, могут быть использованы для этой цели с соответствующими категориями отсечки, определенными в зависимости от размера и метаболической активности опухоли.
Способ по изобретению может быть также использован для МР мониторинга лечения опухоли in vivo, например мониторингом прямых изменений в паттерне метаболизма опухолей при лечении терапевтическими противоопухолевыми агентами и/или лечении облучением или в связи с любым типом процедур вмешательства с абляцией любого вида или без нее, то есть химической абляцией в сочетании с радиочастотами, микроволнами или ультразвуком.
На МР визуализацию опухоли согласно способу по изобретению можно влиять и можно улучшать ее путем подготовки пациента или животного таким способом, который обычно изменяет белковый метаболизм, липидный метаболизм или энергетический метаболизм. Пути достижения этого известны в данной области, например голодание (например в течение ночи), инфузия глюкозы и тому подобное.
В предпочтительном воплощении способ по изобретению используют для МР визуализации опухоли in vivo, мониторинга лечения опухоли и стадирования опухоли при опухолях мозга, опухолях молочной железы, опухолях ободочной и прямой кишки, опухолях легкого, опухолях почки, опухолях в области головы и шеи, опухолях мышцы, опухолях желудка, опухолях пищевода, опухолях яичника, опухолях поджелудочной железы и опухолях простаты. Было также обнаружено, что способ по изобретению особенно полезен для МР визуализации опухоли простаты in vivo, то есть для диагностики опухоли простаты, и/или стадирования опухоли простаты, и/или мониторинга лечения опухоли простаты.
Когда мужчина обращается к доктору с симптомами боли или дискомфорта при мочеиспускании, предполагают рак простаты. Если мужчине больше 50 лет, делают тест на специфический антиген простаты (PSA). Рак простаты предполагают на основании повышенного PSA и/или аномального цифрового ректального обследования (ORE). Если тест на PSA является положительным, пациента направляют к специалисту (урологу) для постановки диагноза с использованием наведенной ультразвуком биопсии. При двух миллионах процедур биопсии в год, проводимых в США и Европе, 5 из 6 и 2 из 3 соответственно являются отрицательными. При обнаружении на ранней стадии пятилетняя выживаемость у этих пациентов равна 100%. Поскольку рак простаты является самым распространенным видом рака и второй лидирующей причиной смерти от рака у мужчин, имеется высокая медицинская потребность в способе диагностики опухолей простаты, который способен обнаруживать опухоли простаты на ранней стадии и который может способствовать снижению числа процедур биопсии.
13
13
13
13
13
1
13
Для С-визуализации простаты требуется приемо-передающая объемная C-PЧ-катушка. Предпочтительно используют передающую объемную C-PЧ-катушку в комбинации только с МР приемной эндоректальной PЧ-катушкой, и более предпочтительно используют приемо-передающую объемную C-PЧ-катушку с фазированной антенной решеткой в комбинации только с МР приемной эндоректальной С-РЧ катушкой. Особенно предпочтительными являются катушки, которые обеспечивают получение H-изображения простаты после С-визуализации.
Примеры
Пример 1: Синтез натриевой соли трис(8-карбокси-2,2,6,6-(тетра(метоксиэтил)бенз-[1,2-4,5']бис-(1,3)дитиол-4-ил)-метила
В 280 мл диметилацетамида в атмосфере аргона суспендировали 10 г (70 ммоль) натриевой соли
2
4
2
4
трис(8-карбокси-2,2,6,6-(тетра(гидроксиэтил)бенз-[1,2-4,5']-бис-(1,3)-дитиол-4-ил)-метила, которую синтезировали в соответствии с Примером 7 WO-A1-98/39277. Добавляли гидрид натрия (2,75 г), а затем метилйодид (5,2 мл), и реакции, которая слегка экзотермическая, давали возможность протекать в течение 1 ч на водяной бане при 34°С в течение 60 мин. Добавление гидрида натрия и метилйодида повторяли дважды с такими же количествами каждого соединения, и после последнего добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 68 ч и затем вливали в 500 мл воды. Затем рН доводили до рН>13, используя 40 мл 1М NaOH (водн.), и смесь перемешивали при температуре окружающей среды в течение 15 ч для гидролиза образовавшихся метиловых эфиров. Затем смесь подкисляли 50 мл 2М HCl (водн.) до рН примерно 2 и экстрагировали 3 раза этилацетатом (500 мл и 2×200 мл). Объединенную органическую фазу сушили над NaSO и затем упаривали досуха. Неочищенный продукт (24 г) очищали препаративной ВЭЖХ с использованием ацетонитрила/воды в качестве элюентов. Собранные фракции упаривали для удаления ацетонитрила. Оставшуюся водную фазу экстрагировали этилацетатом, и органическую фазу сушили над NaSO и затем упаривали досуха. К остатку добавляли воду (200 мл), и рН осторожно доводили до рН 7, используя 0,1М NaOH (водн.), и во время этого процесса остаток медленно растворялся. После нейтрализации водный раствор подвергали сублимационной сушке.
13
13
Пример 2: Получение композиции, содержащей гиперполяризованный C-пируват, методом ДПЯ с использованием C-пировиноградной кислоты и тритильного радикала Примера 1
13
1
Растворением 5,0 мг радикала Примера 1 в C-пировиноградной кислоте (164 мкл) получали 20 мМ раствор. Образец перемешивали до гомогенного состояния и аликвоту раствора (41 мг) помещали в кювету для образца и вставляли в ДПЯ-поляризатор.
13
13
13
1
Образец поляризовали в условиях ДПЯ при 1,2 К в магнитном поле 3,35 Тл под воздействием микроволнового излучения (93,950 ГГц). Через 2 часа поляризацию прекращали и образец растворяли, используя установку для растворения в соответствии с WO-A-02/37132, в водном растворе гидроксида натрия и трис(гидроксиметил)аминометана (TRIS) с получением нейтрального раствора гиперполяризованного С-пирувата натрия. Растворенный образец быстро анализировали методом С-ЯМР для оценки поляризации и получили С поляризацию 19,0%.
13
13
Пример 3: Получение композиции, содержащей гиперполяризованный C-пируват, методом ДПЯ с использованием C-пировиноградной кислоты и тритильного радикала Примера 1
13
1
Растворением радикала Примера 1 (209,1 мг) в смеси C-пировиноградной кислоты (553 мг) и немеченой пировиноградной кислоты (10,505 г) получали 15 мМ раствор. Образец перемешивали до гомогенного состояния и аликвоту раствора (2,015 г) помещали в кювету для образца и вставляли в ДПЯ-поляризатор.
13
13
13
1
Образец поляризовали в условиях ДПЯ при 1,2 К в магнитном поле 3,35 Тл под воздействием микроволнового излучения (93,950 ГГц). Через 4 ч поляризацию прекращали и образец растворяли, используя установку для растворения в соответствии с WO-A-02/37132, в водном растворе гидроксида натрия и трис(гидроксиметил)аминометана (TRIS) с получением нейтрального раствора гиперполяризованного C-пирувата натрия с суммарной концентрацией пирувата 0,5 М в 100 мМ TRIS-буфере. Хроматографическую колонку последовательно соединяли с установкой для растворения. Колонка состоит из картриджа (диаметр = 38 мм; высота = 10 мм), содержащего гидрофобный наполнитель (Bondesil-C18, 40UM Part #:12213012), поставляемый фирмой Varian. Растворенный образец прокачивали через колонку, которая селективно адсорбировала радикал. Фильтрованный раствор быстро анализировали методом С-ЯМР для оценки поляризации и получили С поляризацию 16,5%. Затем концентрацию остаточного радикала анализировали на УФ-спектрофотометре при 469 нм и определили, что она ниже предела детектирования 0,1 мкМ.
13
13
Пример 4: Получение гиперполяризованного C-пирувата методом ДПЯ с использованием C-пировиноградной кислоты и натриевой соли трис(8-карбокси-2,2,6,6-тетра(гидроксиэтокси)метил-бенз[1,2-d:4,5-d']бис(1,3)дитиол-4-ил)-метила
Натриевую соль трис(8-карбокси-2,2,6,6-тетра(гидроксиэтокси)метил-бенз[1,2-d:4,5-d']-бис-(1,3)-дитиол-4-ил)-метила синтезировали как описано в Примере 29 в WO-A-97/09633.
13
13
13
13
1
Растворением натриевой соли трис(8-карбокси-2,2,6,6-тетра(гидроксиэтокси)метил-бенз[1,2-d:4,5-d']-бис-(1,3)-дитиол-4-ил)-метила в C-пировиноградной кислоте (83,1 мг) получали 20 мМ раствор. Образец перемешивали до гомогенного состояния, помещали в кювету для образца и вставляли в ДПЯ-поляризатор. Образец поляризовали в условиях ДПЯ при 1,2 К в магнитном поле 3,35 Тл под воздействием микроволнового излучения (93,950 ГГц). С-ЯМР сигнал от образца затем получали, используя ЯМР спектрометр Varian Inova-200. Усиление ДПЯ вычисляли исходя из результатов измерения С-ЯМР сигнала при тепловом равновесии и усиленного ЯМР сигнала. Получили С поляризацию 16%.
13
Пример 5: Визуализация опухоли с использованием композиции, содержащей гиперполяризованный C-пируват в качестве визуализирующего агента
5.1 Животная модель опухоли и подготовка опухоли
2
6
2
R3230AC представляет собой аденокарциному молочной железы крысы, которую можно поддерживать у самок крыс Fischer 344. Для создания животной модели опухоли замороженную пробирку с клетками R32030, содержащую RPMI 1640, 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 10% DMSO (диметилсульфоксид), быстро оттаивали при 37°С. После этого раствор с клетками переносили в FBS и добавляли возрастающие объемы RPMI 1640. В конце клеточную суспензию переносили в культуральный флакон 25 см и ставили в инкубатор при 37°С, 5% СO. Ростовую среду меняли через день. В день инфицирования крыс клетки извлекали либо механически либо с помощью трипсина. Клетки промывали фосфатным буфером без кальция и магния. Трипсин (0,05% трипсин в 0,02% EDTA) добавляли в течение 2-5 мин. Затем добавляли 5 мл FBS и клетки переносили в химический стакан, содержащий RPMI 1640 с FCS (фетальная телячья сыворотка) и антибиотики (100 м.е./мл пенициллина, 100 м.е./мл стрептомицина, 2,5 мкг/мл амфотерицина В). Раствор с клетками центрифугировали и клеточный осадок ресуспендировали в 20 мл RPMI с FBS и антибиотиками, центрифугирование и ресуспендирование повторяли. Затем отбирали аликвоты клеток в пробирки, содержащие 4×10 клеток/мл RPMI 1640. Для получения донорских опухолей самок крыс Fischer 344 (Charles River, 180-200 г) анестезировали и делали им подкожные инъекции 0,3 мл клеточной суспензии в бедренную область с обеих сторон. Через 15 дней и 22 дня получили кусочки опухоли, как описано в F.A.Burgener et al., Invest Radiol 22/6 (1987), 472-478; S.Saini et al., J. Magn. Reson. 129/1 (1997), 35-43). В брюшной области живота реципиентов-самок крыс Fischer делали два разреза. Кусочек опухоли вставляли в каждый карман и разрезы зашивали. Крыс транспортировали на визуализацию в дни 12-14 после вживления опухоли.
5.2 Подготовка крыс и протонная МР визуализация
1
13
Взвешенным крысам делали анестезию изофлураном (2-3%) и оставляли их на столе с подогревом для поддержания температуры тела примерно 37°С. В хвостовую вену и в левую общую сонную артерию вводили катетер. Крыс транспортировали в МР аппарат и размещали на специальной подстилке, которую нагревали до приблизительно 37°С посредством циркулирующего Fluorinert FC-104. Эта жидкость не должна создавать фоновые сигналы при H- и С-МР визуализации. Анестезию поддерживали 1-2%-ным изофлураном, доставляемым через длинную трубку в открытую дыхательную систему со скоростью 0,4 л/мин. Артериальный катетер соединяли через Т-образную трубку с самопишущим манометром и насосом, доставляющим физиологический раствор (скорость 0,15 л/мин), для предотвращения закупорки катетера. Крыс помещали в МР катушку для крыс (Rapid Biomedicals, Германия) и проводили визуализацию с использованием стандартной последовательности протонной МР визуализации для получения анатомической информации и для определения местоположения опухоли.
13
5.3 С-МР визуализация
13
1
Исходя из протонной частоты, найденной МР системой, вычисляли МР частоту для С-аланина по следующему уравнению:
13
1
Частота С-аланина = 0,25144 × [(системная протонная частота × 1,00021)-0,000397708].
13
13
13
13
13
13
2
3
13
13
1
1
1
1
1
Вычисленная частота позиционировала МР сигнал от С-аланина на резонанс с С-лактатным слева и с С-пируватным, резонирующим справа от С-аланина. Выполняли последовательность нелокализованной МР спектроскопии, чтобы убедиться в том, что С-МР катушка и системная МР частота установлены правильно. Локализацию С-изображения позиционировали так, чтобы охватить опухоль (толщина среза 10 мм, размер пиксела в одной плоскости 5×5 мм). В фазе реконструкции видеоданные заполняли нулями, чтобы в результате иметь разрешение 2,5×2,5×10 мм. С-пируват в TRIS-буфере (90 мМ) инъецировали в дозе 10 мл/кг за период времени 12 сек с минимальным объемом 2 мл в хвостовую вену, и через 30 сек после начала инъекции (то есть через 18 сек после окончания инъекции) начинали С-МР последовательность химических сдвигов.
5.4 Анализ данных МР визуализации
13
МР визуализация дала матрицу, содержащую 16×6 элементов, где каждый элемент или воксел/пиксел содержит С-МР спектр. В фазе реконструкции матрицу заполняли нулями до 32×32, что является математической операцией, которая помогает улучшить пространственное разрешение. Набор данных, подлежащий анализу, содержал 1024 спектра при экспорте в формат Dicom (DICOM является зарегистрированным товарным знаком National Electrical Manufactures Association для ее стандартов публикаций, относящихся к передаче цифровой медицинской информации) для последующего анализа. Примерно половина этих спектров не содержит МР сигналов, поскольку позиция этих вокселов была вне животного. Локализация в пределах животного выявила вокселы с высокими пируватными сигналами и пренебрежимо малым лактатным и аланиновым сигналом (кровяной пул), тогда как другие вокселы показали пируватный, аланиновый и лактатный с примерно равной интенсивностью.
Амплитуды для пирувата, аланина и лактата оценивали с использованием методов выравнивания данных во временной области, которые включали следующее: фаза нулевого порядка является постоянной по набору данных, фаза первого порядка составляет 1,4 мс, допускается варьирование ширины линии или затухания во временной области от 0,5 до 3-кратной средней ширины линии всего набора данных для каждого метаболита независимо, и допускается варьирование частоты с 20 Гц в обоих направлениях относительно средней частоты, найденной по всему набору данных для самого высокого пика, который должен быть идентифицирован пользователем.
13
13
Амплитуды для лактата, аланина и пирувата в матрице переупорядочивали в матрице и делали повторную выборку для подбора разрешения протонного анатомического МР изображения. С-МР изображения проецировали на анатомические изображения с использованием автоматизированной методики с получением не зависящего от оператора результата. Эти результаты отображали множеством изображений, содержащих анатомическое протонное изображение опухоли у крысы, метаболическое С-изображение для пирувата, лактата и аланина, спроецированное на анатомическое изображение, причем изображения показывали для каждого пиксела
норм
макс
норм
а) ([лактат]×([пируват]-[пируват]))×[лактат] и
норм
макс
норм
б) ([лактат]×([аланин]-[аланин]))×[лактат]
норм
где термин "[…]" означает нормализованную амплитуду, то есть масштабированную по отношению к ее наивысшему значению в метаболическом изображении, и "[лактат]" означает вычисленную амплитуду.
13
Успешный результат различения опухолевой ткани и здоровой ткани на метаболическом С-МР изображении определяли как самый высокий лактатный сигнал в области опухоли или высокое взвешенное соотношение лактатного относительно пируватного в области опухоли и высокое взвешенное соотношение лактатного относительно аланинового в одной и той же пиксельной локализации.
5.5 Биологический анализ
Места локализации опухолей были исследованы визуально для выявления признаков кровотечения. Опухоли извлекали из тел крыс, взвешивали и разрезали пополам. Внутреннюю часть опухоли исследовали визуально, оценивая однородность, некроз и кровотечение. Опухолевые ткани хранили в 4% формалине.
Крысу с опухолью считали подходящей для оценки, если имело место соответствие следующим критериям; масса опухоли >100 мг, отсутствие видимого некроза или кист во внутренней части опухоли, во время МР исследования температура тела выше 35°С и среднее артериальное давление крови выше 60 мм рт.ст.
5.6 Результаты
13
1
В сумме 30 разных опухолей были визуализированы у 18 крыс. Биологическим критериям, описанным в предыдущем разделе 5.5, не соответствовали 1 крыса и 3 опухоли. Остальные 26 опухолей у 17 крыс были гомогенными и имели массивную не некротическую внутреннюю часть. Средняя поляризация С-пирувата в момент инъекции составила 21,2±2,9% (среднее ± стандартное отклонение) и значение рН было 8,08±0,14 (среднее ± стандартное отклонение).
13
13
13
13
13
13
13
На Фиг.1 представлена типичная совокупность изображений одной визуализированной крысы с (1) протонным изображением сравнения, где стрелки указывают на местоположения опухолей, (2) С-пируватным изображением, (3) С-лактатным изображением, (4) С-аланинновым изображением, (5) С-лактатным изображением, скорректированным в отношении С-пируватного, и (6) С-лактатным изображением, скорректированным в отношении C-аланинового. Изображения (2)-(6) объединены с протонным изображением сравнения.
На Фиг.2 представлена та же совокупность изображений, однако с изображениями (2)-(6), которые не объединены с анатомическим протонным изображением.
В результате на местоположение опухоли указывает высокий пируватный сигнал (2) вследствие высокой метаболической активности. Однако лактатный сигнал (3) в конечном счете идентифицирует точное местоположение опухоли. Аланиновый виден в скелетной мышце и отсутствует в опухолевой ткани (4). Скорректированные в отношении пирувата и аланина лактатные изображения (5) и (6) тоже дают превосходный контраст для опухоли.
Таким образом, продемонстрировано, что на местоположение опухоли на метаболических изображениях указывает высокий лактатный сигнал, высокий лактатный сигнал, скорректированный в отношении пирувата, и высокий лактатный сигнал, скорректированный в отношении аланина.
13
Анализ метаболических С-МР изображений выявил метаболический контраст в области опухоли в
- 24 из 26 опухолей для лактатного сигнала,
- 26 из 26 опухолей для лактатного сигнала, скорректированного в отношении пирувата (5.5, а)),
- 26 из 26 опухолей для лактатного сигнала, скорректированного в отношении аланина 5.5, б)).
Общая степень успеха для этого исследования составила 26 из 26 или 100%.
13
1
Это исследование продемонстрировало, что опухоли могут быть идентифицированы с использованием гиперполяризованного С-пирувата, который достигает интересующую область (опухоль) за период времени, который дает возможность визуализировать соединение и его метаболиты.