СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНОМАЛИЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ МУЖСКОМ БЕСПЛОДИИ В СИСТЕМЕ.
METHOD FOR DIAGNOSIS OF ABNORMAL SPERM CELL DIFFERENTIATION IN MALE STERILITY IN SYSTEM

Изобретение относится к области репродуктивной медицины и предназначено для диагностики идиоматических (не выявляемым известными в настоящее время методами) патологий спермиогенеза.
Актуальность разработки эффективных методов диагностики причин бесплодия обусловлена сложной демографической ситуацией в стране и большим количеством бесплодных браков (15% супружеских пар), причем у половины этих пар бесплодие связано с мужским фактором. Бесплодие является полиэтиологичным заболеванием. Оно может быть вызвано множеством различных факторов как эндогенных (первичные, или генетически обусловленные заболевания мужчин и женщин), так и экзогенных (вторичные заболевания). Выявление причин бесплодия, в первую очередь, необходимо для выбора тактики лечения, в том числе и для определения возможности применения консервативного лечения или методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Особое значение имеет разработка методов прижизненной диагностики патологии сперматозоидов, так как она позволяет отбирать нормальные сперматозоиды в практике искусственного оплодотворения.
Известен (RU, патент 2118822, опубл. 10.09.1998) способ диагностики мужского бесплодия путем проточно-цитофлуориметрического анализа состояния хроматина сперматозоидов. Согласно известному способу состояние хроматина оценивают по интенсивности флуоресценции ядер клеток, окрашенных бромистым этидием до и после обработки гепарином, и при наличии образца спермы, в котором интенсивность флуоресценции повышена исходно более чем у 30% клеток либо она возрастает более чем в 2 раза у более 50% клеток после обработки гепарином, диагностируют мужское бесплодие.
Недостатком известного способа следует признать, что метод не является строго количественным и, как и при использовании для деконденсации гепарина, лишь косвенно отражает аномалии в упаковке хроматина. Кроме того, этот метод требует сложного и дорогостоящего оборудования и не может использоваться для широкого скрининга.
Известен (RU, патент 2426993 опубл. 20.08.2011) способ диагностики аномалий упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии. При реализации способа образец спермы очищают от сопутствующих соматических и недифференцированных клеток, очищенные сперматозоиды осаждают центрифугированием, промывают в буферном растворе с pH 7,6÷8,0, осадок ресуспендируют в буферном растворе с pH 7,8÷8,2 в присутствии 10÷15 мМ Трис-НСl, инкубируют при охлаждении, клетки осаждают центрифугированием с последующим промыванием осадка, промытый осадок ресуспендируют в растворе с рН 7,8÷8,2 в присутствии 8,0÷12 мМ Трис-HCl, к полученной суспензии добавляют микрококковую нуклеазу, образцы инкубируют при температуре от 10 до 40°C, останавливают гидролиз с последующей гомогенизацией и повторным центрифугированием образцов с получением осадка, содержащего нерастворимый хроматин, и супернатанта, содержащего растворимый хроматин, и по процентному содержанию растворимого хроматина не менее 18,4% и растворимого хроматина не выше 81,4% диагностируют наличие аномалии упаковки хроматина сперматозоидов при мужском бесплодии.
Недостатком известного способа следует признать его длительность, а также трудоемкость.
Одним из подходов к диагностики мужского бесплодия является количественное определение в сперматозоидах тиоловых групп, которыми обогащены белки-протамины.
Сульфгидрильные группы (тиоловые группы, меркаптогруппы)
- SH-группы органических соединений, обладающие высокой реакционной способностью. Сульфгидрильные группы входят в состав многих веществ биологического происхождения; участвуют в создании и поддержании нативного состояния белков, а также в образовании активных центров ферментов и др. Взаимодействием с сульфгидрильными группами обусловлено действие многих отравляющих веществ, ионизирующей радиации, ионов тяжелых металлов.
Важную структурную и физиологическую роль тиоловые группы играют в формировании сперматозоидов человека. При дифференцировке сперматозоидов происходит процесс, который принято обозначать как ремоделирование хроматина. Суть процесса - замещение канонических белков - гистонов белками протаминами. Завершающий этап созревания сперматозоидов осуществляется в семенном протоке (эпидидимусе). Когда сперматозоиды выходят в эпидидимус, геном стабилизируется путем окисления тиоловых групп в цистеиновых остатках протаминов с образованием S-S связей. Показано, что у человека около 95% SH групп протаминов формирует S-S связи. Окисление тиоловых групп является конечным этапом стабилизации ДНК генома в зрелых сперматозоидах. Считается, что разрыв S-S связей в нуклеопротаминовом хроматине сперматозоидов может индуцироваться оксидативным стрессом, что впоследствии приводит к включению программы апоптоза.
Известен (Ramos L Incomplete nuclear transformation of human spermatozoa in oligo-astheno-teratospermia: characterization by indirect immunofluorescence of chromatin and thiol status. «Department of Obstetrics and Gynaecology, Radboud University Nijmegen Medical Centre, PO Box 9101, 6500 HB Nijmegen, The Netherlands.) способ диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии в системе in vitro, включающий количественное определение в ядрах сперматозоидах тиоловых групп и определение по измеренному значению качество спермы. Количественные показатели были определены путем определения тиоловых групп в сперматозоидах здоровых доноров и пациентов с выраженной олигоастенотератоспермией. В качестве индикатора использовали флуорохром монобромобиман. Показано, что у инфертильных пациентов значительно повышено количество свободных тиоловых групп, что коррелирует с нарушениями в ремоделлировании хроматина.
Существенным недостатком данной работы является использование фиксированных клеток, что исключает возможность прижизненной диагностики.
Указанный источник информации выбран в качестве ближайшего аналога.
Техническая задача, решаемая посредством разработанного способа, состоит в создании тест-системы диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии в системе in vivo.
Технический результат, достигаемый при реализации разработанного способа, состоит в доступности его для клиник, не обладающих уникальным оборудованием, обслуживаемым специально подготовленным персоналом, что дает возможность использовать разработанный способ для широкого скрининга населения, представленного группами риска и занятых профессиональной деятельностью на вредных производствах.
Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ диагностики аномалий дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии в системе in vivo. Согласно разработанному способу проводят количественное определение в ядрах сперматозоидах тиоловых групп и определение по измеренному значению качества спермы, причем определение тиоловых групп в сперматозоидах проводят путем обработки пробы спермы реагентом MitoTrackerRed, при этом диагностику проводят по количеству окрашенных ядер.
Предпочтительно количественное определение тиоловых групп проводят с использованием цитометрии.
Разработанный способ представляет собой новый метод выявления свободных тиоловых групп в хроматине сперматозоидов. Метод основан на использовании в качестве индикатора SH групп реагента MitoTrackerRed, который применяется для прижизненного окрашивания митохондрий. Установлено, что после проникновения в живые сперматозоиды MitoTrackerRed окисляется и в окисленном виде входит в митохондрии, при этом в митохондриях MitoTrackerRed связывается с тиоловыми группами белков митхондриального матрикса.
Установлено также, что в эякуляте инфертильных пациентов в части живых сперматозоидов MitoTrackerRed окрашивает ядра.
Объяснить этот феномен можно только наличием в ядрах некоторых сперматозоидов свободных тиоловых групп протаминов. Для проверки этого предположения были использованы сперматозоиды, в которых S-S связи были редуцированы с использованием дитиотрсйтола (ДТТ).
После обработки сперматозоидов ДТТ хроматин сперматозоидов декомпактизуется и окрашивается реагентом MitoTrackerRed. Это означает, что MitoTrackerRed, как и в матриксе митохондрий, связывается со свободными тиоловыми группами протаминов.
Суть предлагаемого подхода для создания биомедицинской тест-системы (БМТС) - выявление аномалий дифференцировки сперматозоидов по доступности хроматина для реагента, взаимодействующего со свободными тиоловыми группами протаминов.
Известно, что при созревании сперматозоидов происходит глобальное ремоделирование хроматина, при котором гистоны в комплексе с ДИК практически полностью замещаются протаминами.
Экспериментально было установлено, что в некоторых сперматозоидах инфертильных пациентов наличие свободных тиоловых групп легко тестируется с использованием реагента MitoTrackerRed, который используется для прижизненного окрашивания митохондрий, при этом ядра сперматозоидов, полученных от здоровых доноров, практически не окрашиваются этим реагентом. Разработан метод окрашивания ядер на препаратах живых сперматозоидов и количественное определение доли окрашенных ядер методом цитометрии.
Разработанный способ был реализован следующим образом.
Свежеполученный эякулят инкубировали для разжижения 30 минут при 37°C. Имеющийся объем эякулята (3-5 мл) разбавляли PBS до 10 мл и осаждали сперматозоиды. Здесь и далее для осаждения нефиксированных сперматозоидов использовали центрифугирование при 400g в течение 2 минут. Удаляли супернатант, ресуспендировали осадок в 10 мл PBS и повторно осаждали сперматозоиды.
Удаляли супернатант и ресуспендировали осадок в 1 мл PBS, содержащем 200 нМ Mitotrackcr Red CMXRos (Cat. No. M7512, Invitrogen, США). Инкубировали сперматозоиды в красящем растворе 30 минут при 37°C. Отмывали сперматозоиды от красящего раствора двумя сменами PBS по 5 минут каждая.
Во второй смене PBS сперматозоиды осаждали, удаляли супернатант и ресуспендировали в минимальном объеме PBS (менее 100 мкл). С использованием автоматической пипетки на предметное стекло, покрытое полилизином (Menzel-Glaser, Германия), наносили 10 мкл суспензии сперматозоидов и равномерно распределяли их с использованием мазка. Мазку давали подсохнуть в течение примерно 1 минуты при комнатной температуре (до исчезновения слоя жидкости на стекле).
Стекло с мазком помещали в вертикальные полиэтиленовые контейнеры и инкубировали в 4% растворе формальдегида на PBS в течение 20 минут. Отмывали от фиксатора двумя сменами PBS по 5 минут каждая.
Стекло с мазком извлекали из контейнера и удаляли лишний PBS промакиванием о фильтровальную бумагу. На область мазка наносили 50 мкл синтетической монтировочной среды Mowiol (Calbiochem, США) с добавлением 50 мг/мл Dabco (Sigma, США). Каплю среды накрывали покровным стеклом 24x24 мм (Menzel-Glaser, Германия). Для затвердения монтировочной среды препараты оставляли на ночь при комнатной температуре и в дальнейшем хранили про 14°C в защищенном от света месте.
Контроль окрашенных ядер проводили с использованием микроскопа Zeiss Axiovert 200М, оснащенного флуоресцентной приставкой и камерой Hamamatsu Отса-II HRG-2 (размер пиксела 6,45×6,45 мкм), управляемой программным комплексом AxioVision v 4.3. Съемку на большом увеличении производили с использованием объектива Plan-Apochromat ×100/1.4 (Zeiss, Германия). Диагностируют наличие аномалии дифференцировки сперматозоидов при мужском бесплодии, если флуоресценция MitoTrackerRed регистрируют в 25-30% ядер живых сперматозоидов.
Разработанный способ может быть использован в центрах репродукции человека как для увеличения частоты наступления беременности, так и при установлении причины бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения и гомологичной инсеминации за счет отбраковки образцов спермы, содержащих клетки с нарушенной упаковкой ДНК. Низкая себестоимость метода и его доступность для клиник, не обладающих уникальным оборудованием, обслуживаемым специально подготовленным персоналом, дает возможность использовать тест-систему для широкого скрининга населения РФ, представленного группами риска и занятых профессиональной деятельностью на вредных производствах (нефтедобывающем, горнорудном, химическом, металлургическом и т.д.).