Лабораторная характеристика ослабленных вариантов отечественных штаммов вируса краснухи, адаптированных к культуре клеток Vera

9. Ларионов Г.М. Эпидемиология и профилактика сапа // Сап / Под ред. Н.Г. Тихонова. - Волгоград, 1995. С. 100 - 108.

10. Левчук Б.А., Кузнецов С.М., Бакулин М.К. и др. Выбор лабораторных животных для оценки средств специфической и неспецифической иммунопрофилактики сапа // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. - Саратов, 1993. С. 208, 209.

11. Пивень Н.Н., Авророва И.В., Жукова С.И. и др. Иммуногенность поверхностных и капсульных антигенов Burkholderia mallei // Журн. микро-биол. 2007. № 1. С. 47 - 52.

12. Пименов Е.В., Ковтун А.Л., Дармов И.В. и др. Антигенный препарат для профилактики сапа у людей и животных / Патент на изобретение № 2262949 с приоритетом от 8.09.2004 г.

13. Попов С.Ф. Ультраструктурно-функциональный анализ патогенных бурхолдерий и особенности их взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекционного процесса: Автореф. дис. ... докт. мед. наук. - Волгоград, 2004.

14. Программа Государственных испытаний вакцины сапной культуральной инактивированной адсорбированной жидкой. Утверждена руководителем Департамента государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники Минздрава России 21 марта 2003 г.

15. Программа испытания реактогенности, безопасности и специфической активности лабораторных серий вакцины сапной культуральной инактивированной адсорбированной жидкой на ограниченной группе людей. Утверждена председателем Комитета МИБП Минздрава России 23 февраля 2001 г.

16. Рыбкин В.С., Тихонов Н.Г., Жукова С.И. и др. Иммунология сапа // Сап / Под ред. Н.Г. Тихонова. - Волгоград, 1995. С. 73 - 84.

17. Справочник по лабораторным методам исследования / Под ред. Л.А. Даниловой. - СПб., 2003.

18. Супотницкий М.В., Кравец И.Д., Новикова О.Д. Специфическая профилактика экспериментального сапа порином Pseudomonas mallei // Ветеринария. 1995. № 3. С. 24 - 27.

19. Тихонов Н.Г., Липницкий А.В., Илюхин В.И. История открытия и изучения возбудителя сапа // Сап / Под ред. Н.Г. Тихонова. - Волгоград, 1995. С. 4 - 6.

20. Bomford R. Alluminum salts: perspectives in their use as adjuvant // Adjuvant and vaccines / Ed. G. Gregoriadis, A. Alligon, G. Postes. - N. Y.: Plenum Press, 1989. P. 35 - 41.

Лабораторная характеристика ослабленных вариантов отечественных штаммов вируса краснухи, адаптированных к культуре клеток Vero

В.В. Зверев, Р.Г. Десятскова, Н.В. Юминова, В.Д. Лотте, А.В. Степанов

ГУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва

До настоящего времени остается актуальной проблема краснухи, представляющей особую опасность для плода при заболевании беременных женщин, приводящей к эмбрио- и фетопатиям и возникновению врожденных дефектов развития.

Сероэпидемиологическими и вирусологическими исследованиями, осуществляемыми в России с 1964 года, установлено широкое распространение краснухи среди населения, определены восприимчивые контингенты среди женщин детородного возраста, на долю которых в разных регионах приходится от 1 до 31%. Выявлено распространение краснухи среди беременных в манифестной и первичной инаппарантной формах в соотношении 2,36:1 [5]. Получены прямые доказательства тератогенного действия вируса краснухи, циркулирующего среди населения страны в довакциналь-ный период. По данным разных исследователей, частота врожденных аномалий развития, вызванных этим вирусом, варьировала от 8,1 до 38,0% [5 - 7, 9]. Экономический ущерб от краснухи в Российской Федерации только в 2001 году составил 1,3 млрд рублей.

Наиболее эффективным путем защиты от приобретенной и врожденной краснухи признана иммунизация населения живыми аттенуированными вакцинами. В настоящее время вакцинопрофилак-тика краснухи осуществляется во многих странах мира, в том числе в 48 странах Европейского региона. Европейское бюро ВОЗ декларировало одной из целей программы «Здоровье для всех в XXI веке»

снизить к 2010 году частоту синдрома врожденной краснухи до уровня 1 случая на 100 тыс. живорожденных.

В Российской Федерации иммунизация против краснухи введена в календарь обязательных прививок в 1998 году. В стране ведется работа по созданию аттенуированной отечественной вакцины. Минздравсоцразвития России допускается применение краснушных вакцин зарубежного производства, лицензированных в установленном порядке. Вместе с тем очевидно, что осуществление широкомасштабной вакцинации, рассчитанной на повсеместное, регулярное и непрекращающееся проведение прививок, должно опираться на производство собственной отечественной вакцины.

Разработка вакцинных препаратов для профилактики краснухи сопряжена с большими трудностями, что обусловлено рядом биологических особенностей вируса краснухи: его относительно невысокой репродуцирующей активностью, лабильностью, длительным периодом размножения, проблемами при его индикации и идентификации, а также отсутствием надежных маркеров аттенуации. Одним из главных технологических вопросов при изготовлении вакцины является вопрос выбора субстрата для аттенуации вируса и получения высокоактивного, безопасного препарата. Анализ данных, касающихся выделения и аттенуации 11-ти известных вакцинных штаммов вируса краснухи, показал, что наиболее используемыми субстратами были первичная культура клеток почек африканской зеленой мартышки и пер-

— 46

epid 4 (41).indd 46 Ф 9/1/08 11:52:32 AM

вичные клетки почки кролика, а также культуры диплоидных клеток человека (ДКЧ). В ряде стран осуществляется воспроизводимая промышленная технология приготовления вакцины против краснухи из аттенуированного штамма Wistar RA 27/3 в культуре ДКЧ. Эта вакцина оказалась высокоим-муногенной (особенно в отношении секреторных антител) и малореактогенной. В нашей стране на предприятии «Микроген» (Москва) внедряется промышленная технология изготовления вакцины из этого штамма в культуре ДКЧ. В Санкт-Петербургском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера проводится работа по усовершенствованию отечественного штамма «Орлов», выделенного и аттенуированного в первичной культуре клеток почек кролика и переведенного в культуру ДКЧ [8].

При использовании ДКЧ в производстве сталкиваются с определенными технологическими трудностями, обусловленными спецификой культивирования и контроля этих клеток, сравнительно низкой активностью получаемого вируссодержащего материала (ВСМ), что может определять большую себестоимость конечного продукта.

В качестве перспективного субстрата можно рассматривать перевиваемую линию клеток Vero WHO как более технологичную (доступность, простота ведения этих клеток, высокие «урожаи» вируса краснухи), чем культура ДКЧ. ВОЗ допускает использование линии клеток Vero в производстве вакцин. Существует положительный опыт применения этих клеток в производстве живой трехвалентной оральной вакцины Полио Сэбин Веро, инактивированной вакцины Имовакс Полио для профилактики полиомиелита и инактивированной вакцины Верораб для профилактики бешенства (каталог препаратов фирмы «Пастер Мерье» «Сыворотки и вакцины»).

В России живая оральная полиовирусная вакцина приготовлена на перевиваемой линии клеток Vero с помощью биореакторной технологии, а также получены экспериментальные гриппозные вакцины с высокими иммуногенными свойствами [1, 2, 12].

Цель настоящей работы - получение оригинальных ослабленных отечественных штаммов вируса краснухи в результате пассирования в культуре клеток Vero.

В задачи исследований входили характеристика испытуемых штаммов на разных пассажных уровнях по цитопатической, бляшкообразующей, гемаг-глютинирующей активности и антигенности (в иммунологическом маркерном тесте на животных), а также изучение их морфологии. На высоких пассажных уровнях оценивались подлинность и специфичность полученных вариантов вируса.

Материалы и методы

Вирусы. В работе использовали вирус краснухи - штаммы С-74 и С-77, выделенные нами из носоглоточного отделяемого больных манифестной

краснухой в очагах Москвы в 1997 и в 2001 году соответственно.

В качестве штаммов сравнения взяты два зарубежных штамма вируса краснухи:

• аттенуированный вакцинный штамм Wistar RA

27/3, США [17];

• штамм М-33 - международный референс-реа-

гент живого вируса краснухи ВОЗ. Представлен

Институтом сывороток, Копенгаген (Дания).

Культуры клеток. Vero - перевиваемая линия клеток почек африканской зеленой мартышки, получена в 1997 году из Европейской коллекции клеточных культур Центра прикладной микробиологии и исследований, Салсбери (Англия).

Другая линия клеток Vero из Европейской коллекции клеточных культур ВОЗ (Женева, Швейцария) была предоставлена для работы ФГУП «НПО «Микроген».

Эти клетки выращивали в питательной среде ДМЭМ, содержащей 7% прогретой фетальной сыворотки крупного рогатого скота (ФС КРС); зараженные вирусом клетки культивировали в поддерживающей среде с 1% ФС КРС.

Перевиваемую линию клеток почек кролика RK-13, используемую для изучения инфекционной активности вируса краснухи, культивировали в питательной или поддерживающей среде RPMI-1640, содержащей 7 или 1% прогретой ФС КРС соответственно. Во все среды добавляли гентамицин в концентрации 50 мкг/мл. Культуры выращивали при 35 оС.

Пассирование вируса краснухи. Вирус пассировали в культурах клеток, взятых на 3 - 4-й день роста. Слой клеток перед заражением трижды ополаскивали раствором Хэнкса рН 7,5. Адсорбцию вируса проводили при 35 оС в течение 2-х часов. Затем во флаконы с инфицированными клетками вносили поддерживающую среду и инкубировали при 35 оС. ВСМ из зараженных культур пассировали через 5 - 9 дней.

Титрование вируса. ВСМ титровали в культуре клеток RK-13 методом бляшек под агаровой средой в нашей модификации [4]. Культуру, выращенную во флаконах объемом 50 мл, заражали на

3 - 4-е сутки после засева, когда был сформирован однородный по плотности слой клеток. Десятикратные разведения ВСМ в поддерживающей среде вносили по 1 мл на флакон. После адсорбции в течение 2-х часов при 35 оС жидкость из флаконов удаляли и пласт клеток покрывали средой, приготовленной на растворе Эрла, содержащей 1,5% агара Дифко, 0,22 г соды, 2,8% аминопептида и 0,6 мг/мл протаминсульфата. На 5 - 7-е сутки инкубации при 35 оС клетки окрашивали, наслаивая агаровую среду такого же состава, но содержащую 0,005% нейтрального красного. Результаты учитывали на 6 - 10-е сутки после заражения.

47

epid 4 (41).indd 47 Ф 9/1/08 11:52:32 AM

Титры вируса определяли по цитопатическому действию на клетки RK-13. Пробирки со сплошным слоем клеток на 3 - 4-й день роста ополаскивали раствором Хэнкса и заражали десятикратными разведениями ВСМ, которые вносили по 1,0 мл на пробирку (четыре пробирки на разведение). Культуры инкубировали при 35 оС. Результаты учитывали на 9-й и 15-й день после заражения.

Реакцию нейтрализации испытанных штаммов вируса краснухи ставили с использованием метода бляшек. Вируссодержащую жидкость (доза вируса 200 - 350 БОЕ/мл) смешивали в равных объемах с иммунной сывороткой, разведенной 1:8 и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Затем по 1 мл этой смеси вносили в культуру клеток RK-13. После 2-х часов инкубации при 35 оС инокулят удаляли и клетки покрывали агаровой средой. Учет бляшек проводили ежедневно в течение недели после окрашивания. Одномоментно ставили опыты с заведомо известным вирусом краснухи, а также с неимунной сывороткой и контролировали испытуемые сыворотки на цитотоксичность.

Реакцию гемагглютинации (РГА) и реакцию торможения гемагглютинации антигена вируса краснухи осуществляли макрометодом в объеме 0,6 мл при использовании глюкозо-желатиново-верона-лового буферного раствора с 0,1% сывороточным альбумином КРС (V фракция), гемагглютинирующе-го антигена в дозе, равной 4 гемагглютинирующим единицам (ГЕ), и эритроцитов голубей по методике, описанной ранее [18, 3].

Антигенные свойства разных штаммов вируса краснухи изучали в иммунологическом маркерном тесте на кроликах [13]. Иммунизировали самок кроликов породы «шиншилла» весом 1,5 - 2,0 кг.

Каждый штамм, полученный на разных пассажных уровнях в культуре клеток Vero, испытывался на двух группах кроликов, каждая из которых насчитывала трех животных. Одной группе ВСМ вводили однократно по 1,0 мл внутривенно, другой - по 0,5 мл в каждую ноздрю (всего 1,0 мл на животное). Пробы крови брали перед иммунизацией, через каждую неделю в течение первого месяца и через две - четыре недели в последующие второй и третий месяцы. Сыворотки крови исследовали в РТГА с антигеном вируса краснухи.

Испытание на общую безопасность адаптированных вариантов штаммов проводили на самках белых мышей весом 15 - 20 г. На пул вируса брали по 20 животных. ВСМ вводили по 1,0 мл внутрибрюшинно. Период наблюдения составлял 21 день. В опытах на самках морских свинок весом 350 - 400 г ВСМ вводили по 5,0 мл внутрибрюшинно. На пул вируса брали по пять голов. Период наблюдения - 42 дня.

Электронная микроскопия. Культуральную вируссодержащую жидкость исследовали под электронным микроскопом JEM-100 SX

методом негативного контрастирования. В качестве контрастирующего агента применяли 2% раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,0). Препараты просматривали и фотографировали при инструментальном увеличении х58 000-100 000 и ускоряющем напряжении 80 кВ.

Результаты и обсуждение

Штаммы С-77 и С-74 были выделены и пассированы в течение длительного периода времени в культуре клеток Vero. Штамм С-77 прошел 34 пассажа при температуре 35 оС и дополнительно 14 пассажей при 33 оС; штамм С-74 - 44 пассажа при 35 оС и 16 пассажей при 33 оС. В процессе культивирования штаммов отмечено, что на ранних пассажах они не вызывали дегенерации клеток Vero и RK-13, тогда как аттенуированный штамм RA 27/3, взятый в виде вакцины без предварительной адаптации, проявлял четкое цитопатическое действие на клетки RK-13. В этой культуре цитопа-тическая активность выделенных штаммов начала выявляться в низких титрах (1,0 - 3,6 lg ТЦД50/мл) на 5-м, 6-м, 9-м пассажах. По мере пассирования цитопатическая активность вирусов повышалась и на 21 - 30-м пассажах достигала 5,5 lg ТЦД50/мл (табл. 1).

Таким образом, в процессе адаптации в культуре клеток Vero штаммы приобрели свойство вызывать четкую дегенерацию клеток RK-13 и по этому признаку проявили сходство с вакцинным штаммом RA 27/3. Ряд исследователей связывают указанный признак с аттенуацией вируса краснухи [10, 16, 17].

Изучение способности образовывать бляшки в культуре RK-13 под агаровым покрытием показало, что это свойство выявилось на 5-м и 6-м пассажах адаптации штаммов к клеткам Vero. Было установлено, что в последующих пассажах выделенные штаммы, а также RA 27/3 и М-33 обладали бляшкообразующей активностью в титрах, которые варьировали от 4,7 х 104 до 2,2 х 106 БОЕ/мл. Отмечено, что штаммы С-77 и С-74 формировали бляшки размером 2,0 - 3,0 мм в диаметре, которые проявлялись на 6 - 10-е сутки после заражения. Бляшки, образованные штаммом RA 27/3, были таких же размеров, но характеризовались большей прозрачностью и четкостью. У штамма М-33 размеры бляшек были не более 1,5 - 2,0 мм в диаметре.

При изучении гемагглютинирующих свойств штаммов, выделенных и культивируемых в клетках Vero, отмечено, что гемагглютинирующая активность выявлялась ранее, чем бляшкообразующая и цитопатическая. Гемагглютинирующая активность начала обнаруживаться уже на 1-м, 6-м пассажах. Титры гемагглютинирующей активности штамма С-77, пассированного при 35 оС, варьировали от 8 до 32 ГЕ/0,2 мл, штамма С-74 - от 4 до 16 ГЕ/0,2 мл. У штаммов, пассированных при 33 оС, гемагглютинин определялся в титрах, равных

— 48

epid 4 (41).indd 48 Ф 9/1/08 11:52:32 AM

Таблица 1.

Инфекционная и гемагглютинирующая активность вируса краснухи

(штаммы С-77, С-74, вакцинный RA 27/3 и референс-штамм М-33) на разных пассажных уровнях

Вирус (пассажи - п) Активность

БОЕ/мл lg ТЦД50/мл ГЕ/0,2 мл

С-77 1 0 Н.д. 2

2 0 0 4

3 0 0 16

4 0 0 16

5 2,1 х 104 1,0 16

6 Н.д. 0 8

9 0 1,0 8

21 8,0 х 105 5,0 32

32 2,2 х 106 5,5 8

44 п (34 п при 35 оС и 10 п при 33 оС) 1,2 х 106 5,0 4

48 п (34 п при 35 оС и 14 п при 33 оС) 1,2 х 106 5,5 4

С-74 6 3,7 х105 3,6 8

7 1,6 х106 3,5 16

22 4,5 х 105 4,5 4

29 4,0 х105 Н.д. 4

30 2,2 х106 5,5 8

43 4,5 х 105 4,0 8

54 п (44 п при 35 оС и 10 п при 33 оС) 3,7 х105 5,0 2

60 п (44 п при 35 оС и 16 п при 33 оС) 5,0 2

RA 27/3 вакцина Serum Institute, Индия 4,7 х 104 4.0

RA 27/3 2 п (Vero) 2,0 х 106 5,5 8

М-33 6 п (Vero) 4,8 х 104 Н.д. 8

4 и 2 ГЕ/0,2 мл соответственно. Установлено, что на одну ГЕ приходилось от 5,0 х 102 до 6,0 х 104 БОЕ (штамм С-77) и от 1,1 х 104 до 9,1 х 104 БОЕ

(штамм С-74).

Применительно к модели: культура клеток Vero + вирус краснухи - удобными и достаточно быстрыми методами индикации и идентификации вируса оказались РГА и РТГА. Уже на 2 - 3-м пассажах выделенный вирус был идентифицирован в перекрестной РТГА при использовании при-

готовленных штаммовоспецифических антигенов и иммунных сывороток. Согласно данным, представленным в таблице 2, штаммовоспецифичес-кие сыворотки в одинаковой степени подавляли активность гемагглютинирующих антигенов как гомологичного, так и гетерологичных штаммов, взятых в дозе, равной 4 ГЕ. При этом с разными антигенами титры вирус-специфических антител в каждой сыворотке были сходными или различались не более чем в два раза.

Таблица 2.

Идентификация гемагглютинирующих антигенов свежевыделенных

и лабораторных штаммов вируса краснухи в перекрестной РТГА со штаммовоспецифическими сыворотками

Сыворотки Титры антител к вирусу краснухи в штаммовоспецифических иммунных сыворотках

Антигены RA 27/3 М-33 C-77 К

RA 27/3 твин-80 эфирный 128 64 512 < 8

М-33 6 пас. нативный 128 64 1024 < 8

С-77 2 пас. нативный 128 64 512 < 8

С-77 3 пас. нативный 128 64 512 < 8

С-74 21 пас. нативный 128 64 512 < 8

С-44, сер. 18 (твин-80 эфирный) 128 64 512 < 8

со

о

о

Подлинность и специфичность высокоадаптированных штаммов исследованы в перекрестной РТГА и в реакции нейтрализации.

В РТГА были использованы штаммовоспеци-фические сыворотки, полученные к С-77 и С-74, взятым на высоких пассажных уровнях, гиперим-мунные кроличьи сыворотки к вакцинному штамму RA 27/3 и Международному референс-штамму М-33, международный стандарт краснушных антител 67/182, лабораторный стандартный образец краснушных антител - человеческая донорская сыворотка, а также гемагглютинирующие антигены штаммов С-77, С-74, RA 27/3 и антиген авторского штамма С-44 (табл. 3).

Испытанные штаммы индуцировали образование антител, тормозящих гемагглютинирующую активность как гомологичного, так и других штаммов. В реакциях с антигенами авторских штаммов и вакцинного выявились сходные уровни антител в сыворотках к референс-штамму М-33, а также в реакции с международным стандартом краснуш-ных антител и лабораторным.

В РН установлено, что кроличья гипериммунная сыворотка к вирусу краснухи, штамм RA 27/3, в разведении 1:8 нейтрализовала 115 бляшек этого вируса и штамма С-77, испытанного на 32-м и 48-м пассажах, взятых в сходных бляшкообразующих единицах (128 и 120 БОЕ), и штамма С-74 на

43-м и 60-м пассажах, взятых в количествах, равных 77 и 160 БОЕ соответственно.

Таким образом, серологически подтверждена идентичность выделенных высокоадаптированных штаммов, вакцинного, а также референс-штамма

по гемагглютинирующему антигену, являющемуся основным иммуногеном вируса краснухи, индуцирующим образование антител, тормозящих гемагглютинирующую активность и нейтрализующих инфекционность вируса краснухи.

Выделенные штаммы на высоких пассажных уровнях изучали в электронном микроскопе. Во всех препаратах были обнаружены вирионы, имевшие структуру, типичную для вируса краснухи. Они были шаровидной формы с диаметром 50 - 80 нм. На поверхности вирионов отчетливо выявлялись гемагглютинины (рис. 1).

Антигенные свойства штаммов в иммунологическом маркерном тесте на кроликах изучены в процессе адаптации вируса в культуре клеток на разных пассажных уровнях.

Штамм С-77 исследован на 5-м, 21-м, 32-м пассажах, культивируемых при 35 оС, а также на

44-м пассаже (34 пассажа при 35 оС и 10 пассажей при 33 оС) и на 48-м пассаже (34 пассажа при 35 оС и 14 пассажей при 33 оС). Штамм С-74 изучен на 7-м, 30-м, 43-м пассажах (35 оС), на 54-м пассаже (44 пассажа при 35оС и 10 пассажей при 33 оС) и 60-м пассаже (44 пассажа при 35 оС и 16 пассажей при 33 оС).

Штаммы исследованы в иммунологическом маркерном тесте на кроликах в модификации Ыппетапп et а1. (1974 г.). Авторы предложили этот тест для дифференциации «диких» изолятов вируса краснухи и аттенуированного вакцинного штамма RA 27/3 при внутривенном введении. Нами изучены антигенные свойства штаммов как при внутривенном, так и при интраназальном методе

Таблица 3.

Идентификация гемагглютинирующих антигенов высокоадаптированных и лабораторных штаммов вируса краснухи в перекрестной РТГА при использовании иммунных штаммовоспецифических сывороток и стандартов краснушных антител

Сыворотки к штаммам Титры антител

антигены гемагглютинирующих штаммов

С-77 нативный С-74 нативный RA 27/3 твин-80 эфир. С-44 18 сер.**** твин-80 эфир.

С-77 32 пас.* 256 256 256 256

С-77 48 пас.** 256 256 256 256

С-74 43 пас.* 128 128 128 128

С-74 60 пас.** 128 Н.д. 128 128

RA 27/3*** 1024 512 1024 1024

Референс-штамм М-33*** 128 128 128 256

Международный стандарт краснушных антител 67/182 64 64 64 64

Лабораторный стандарт краснушных антител, человеческая донорская 46-я сер. 256 256 256 256

Неиммунная сыворотка кролика < 8 < 8 < 8 < 8

* Иммунные сыворотки кроликов, полученные после однократной иммунизации внутривенно на 50-й день ** Иммунные сыворотки кроликов, полученные после однократной иммунизации внутривенно на 42-й день *** Гипериммунная кроличья сыворотка после трех иммунизаций

**** Антиген вируса краснухи, авторский штамм С-44, сер. 18, апробирован в ГИСК им. Л.А. Тарасевича

50

еріи 4 (41).і^ 50 Ф 9/1/08 11:52:32 АМ

Рисунок 1.

Вирионы вируса краснухи, штамм С-77, 48-й пассаж, в культуре клеток Vero

введения животным (табл. 4). Испытанные на 5-м и 7-м пассажах штаммы индуцировали образование антител к вирусу краснухи при обоих методах иммунизации. Антитела появлялись через 2 - 4 недели, достигали максимальных титров через

4 - 8 недель после введения ВСМ и персистирова-ли в течение 12 недель (срок наблюдения).

Более высокие уровни антител выявлены при внутривенной иммунизации. Отмечено, что большей антигенной активностью обладал штамм С-77. Определено влияние длительности пассирования на иммунологическую активность штаммов. В опытах со штаммом С-77, взятым на 5-м и 21-м пассажах при внутривенной иммунизации, титры антител достигали максимального уровня через 8 недель и составляли 8192 и 277,3 соответственно. При интраназальном введении антитела

в максимальных титрах (234,7 и 184) определялись через 4 и 8 недель.

Штамм С-74 характеризовался меньшей антигенной активностью. Этот вирус, испытанный на 7-м пассаже, вызывал образование антител, которые при иммунизации внутривенно достигали титра 149,3, а при интраназальном введении - 74,6. Вирус 30-го пассажа индуцировал образование антител в титре 53,3 только при внутривенном введении.

Но в опытах с этим штаммом, испытанным на 43-м пассаже, при внутривенном введении титры антител оказались выше и отмечен, хотя и невысокий, иммунологический ответ при интраназальном введении.

Низкие показатели уровней антител получены с вариантами обоих штаммов, которые допол-

Таблица 4.

Титры антител, тормозящих гемагглютинацию антигена вируса краснухи в сыворотках крови кроликов, иммунизированных внутривенно или интраназально разными штаммами этого вируса

Вирус, пассаж Иммунизир. доза Метод введения Антитела к вирусу краснухи*

БОЕ/мл ГЕ/мл сроки определения

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12

С-77 5 пас. 2,1 х 104 40 в/в** <8 597,3 597,3 853,3 1024,0 2048,0 6144,0 8192,0 7509,3 4437,3 4906,6

и/н*** <8 192 117,3 234,7 149,3 234,7 80,0 160,0 144,0 272,0 264,0

С-77 21 пас. 8,0x10s 160 в/в <8 234,6 298,6 192,0 192,0 192,0 192,0 277,3 149,3 77,0

и/н <8 <8 10,7 21,3 37,3 98,7 101,3 184,0 101,3 58,7

77 32 пас. 2,2x10s 40 в/в <4 96 170,6 426,6 426,6

и/н <4 16 88 66,6 69,3

С-77 44 пас. (34 п. -35 °С) (10 п. -33°С) 1,2 х 106 20 в/в <8 <8 149,3 128 170,7 107 85,3 106,7

и/н <8 <8 13,3 18,7 18,7 10,7 8,0 5,3

С-77 48 пас. (34 п. - 35 °С) (14 п. -33°С) 1,2 х 106 20 в/в <8 <8 128,0 90,7 149,3 170,7 192 362,7

и/н <8 <8 5,3 10,7 16,0 21,3 2,7 < 8

С-74 7 пас. 1,6 х 106 80 в/в <8 43,7 96,0 149,3 106,6 117,3 74,6 74,6 64,0

и/н <8 <8 <8 32 42,7 74,6 74,6 74,6 58,7

С-74 30 пас. 2,2 х 106 40 в/в <8 29,3 37,3 26,7 37,3 53,3 48 48 21,3 21,3

и/н <8 <8 <8 <8 <8 < 8 <8 <8 <8 <8

С-74 43 пас. 4,5x10s 40 в/в <4 10,7 53,3 149,3 256

и/н <4 <4 <8 2,7 16

С-74 54 пас. (44 п. -35 °С) (10 п. -33°С) 9,1x10s 10 в/в <8 <8 <8 18,7 192 202,7 202,6 117,3

и/н <8 <8 <8 2,7 8 32 42,7 21,3

С-74 60 пас. (44 п. - 35 °С) (16 п. -33°С) 3,7 х 105 10 в/в <8 <8 <8 10,7 34,7 58,7 42,7 29,3

и/н <8 <8 <8 <8 2,7 < 8 <8 2,7

RA 27/3 вакцина Serum Institute, Индия 4,7 х 104 в/в <8 <8 5,3 <8 <8 <8 5,3 <8 <8 <8 <8 < 8

и/н <8 <8 <8 <8 <8 <8 <8 <8 <8 <8 <8 <8

ГО:

СИ

т:

J=

х

і

О

=1

TD

О

-Є-І

х

ь

СИ

си

' Титры антител к вирусу краснухи указаны в средних арифметических величинах; ' 'в/в - внутривенно; ' "и/н - интраназально.

нительно были культивированы в 10 - 14-ти и 10 - 16-ти пассажах при 33 оС. Штамм С-77, взятый на 44-м и 48-м пассажах, при внутривенном введении индуцировал антитела в средних, а при интраназальном методе - в низких титрах, выявленных через 2 недели после иммунизации.

При внутривенном введении штамма С-74, взятого на 54-м и 60-м пассажах, низкие уровни антител выявлялись через 3 недели после иммунизации. У 50% кроликов, иммунизированных интраназально вирусом 54 пассажей, сероконверсия не выявлена. Среди животных, получивших вирус 60-го пассажа, только у одного отмечено кратковременное появление антител в титре, равном 8.

По иммунологическому маркерному тесту штаммы, высокоадаптированные к культуре клеток, отличались от «диких» штаммов на ранних пассажах. Четко определилась тенденция к снижению антигенной активности для кроликов при внутривенной и интраназальной иммунизации. Высокоадаптированные варианты оказались более сходными по этому признаку с вакцинным штаммом RA 27/3. Как показали наши исследования, при внутривенном введении краснушной живой вакцины (штамм RA 27/3) у двух кроликов отмечено однократное (через 2 и 6 недель после иммунизации) быстро проходящее появление антител к вирусу краснухи в низких концентрациях (1:16). У животных, иммунизированных интраназально, вирус-специфических антител не обнаружено.

Представленные результаты полностью согласуются и подтверждают данные, имеющиеся в литературе, о низкой иммунологической активности вакцинного штамма и высокой антигенности «диких» штаммов на ранних пассажах в маркерном тесте на животных [11, 13 - 15, 19].

При испытании на животных на общую безопасность пулов, приготовленных из высокоадаптированных ослабленных отечественных штаммов вируса краснухи, определена 100%-ная выжива-

емость белых мышей (80 голов) и морских свинок (20 голов), что свидетельствовало об отсутствии токсичности вируссодержащих пулов.

Выводы

В процессе адаптации вируса краснухи к линии клеток Vero, сочетавшейся с культивированием при пониженной температуре, получены варианты отечественных штаммов, которые характеризовались стабильной репродукцией вируса, достигавшего титров, равных 105 - 106 БОЕ/мл, и обладавшего гемагглютинирующей активностью, варьировавшей от 2 до 32 ГЕ/0,2 мл.

Отмечено на животных изменение свойств этих штаммов в сторону повышения цитопатической, бляшкообразующей активности и снижения антигенности. Методом электронной микроскопии в препаратах штаммов выявлены типичные для вируса краснухи вирионы. Серологическими тестами (РТГА и РН) подтверждены подлинность и специфичность адаптированных штаммов на высоких пассажных уровнях. Тестами на общую безопасность на лабораторных животных определено отсутствие токсичности вируссодержащих пулов.

Установлено, что адаптированные варианты отечественных штаммов приобрели различия со свежевыделенными «дикими» штаммами и сходство с аттенуированным вакцинным штаммов Wistar RA 27/3. Представлены экспериментальные доказательства получения ослабленных вариантов отечественных штаммов (повышение цитопатической активности в культуре клеток RK-13 и снижение антигенности для лабораторных животных - иммунологический маркер).

Получение ослабленных вариантов вируса краснухи на основе авторских отечественных штаммов открывает возможности их использования при конструировании медико-биологических препаратов для профилактики краснухи, а также при изготовлении диагностикумов. ш

Литература

Гендон Ю.З., Хапчаев Ю.Х., Клеблеева Т.Д. и др. Успехи в разработке культуральных гриппозных вакцин // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2002. № 51. С. 25 - 30.

Грачев В.П. Оценка экспериментальных серий живой вакцины против полиомиелита, изготовленных на перевиваемой линии клеток Vero с использованием биореакторной технологии // Биотехнология. 2001. № 1. С. 44 - 47. Десятскова РГ. Сравнительное изучение гемагглютинирующей активности различных штаммов вируса краснухи // Вопросы вирусологии. 1974. № 4. С. 459 - 463.

Десятскова Р.Г. Сравнительное изучение бляшкообразующих свойств свежевыделенных и лабораторных штаммов вируса краснухи // Вопросы вирусологии. 1977. № 2. С. 178 - 183.

Десятскова РІГ., Мальцева Н.Н. Сероэпидемиологический надзор за пост-натальной и врожденной краснухой // Биопрепараты. 2001. № 2. С. 2 - 5. Канторович Ра., Володина, Э.А. Телешевская и др. Врожденная краснуха в СССР // Бюл. ВОЗ. 1979. 57 (3). С. 445 - 452.

Канторович Р.А., Телешевская Э.А., Каражас Н.В. и др. Применение комплексного эпидемиологического и вирусолого-морфологического анализа краснушной инфекции в целях эпидемиологического надзора за врожденной краснухой // Вопросы вирусологии. 1981. № 3. С. 327 - 332.

Лаврентьева И.Н., Сухобаевская Л.П. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-Д» и способ получения вакцины против краснухи / Патент на изобретение РФ № 2173344 от 28.06.1999 г.

Нисевич Л.Л,. Бахмут Е.В., Талалаев А.Г. и др. Врожденная краснуха и ее роль в развитии внутриутробной патологии // Краснуха. Синдром врожденной краснухи. Инф. сборник. 1997. С. 31-39.

10. Fogel A., Plotkin S.A. Markere of rubella virus strain in RK-13 cell // J. Virol. 1969. № 3. P 157 - 163.

11. Gill S.D., Furesz J. Genetic stability in humans of the rabbit immunogenic marker of Cendehill rubella vaccine virus // Arch. ges. Virus for sch. 1973. 43. 1 - 2. P. 135 - 143.

12. Kistner O., Barrett P, Mundt W. et al Development of a mammalian cell (Vero) derived candidate influenza virus vaccine // Vaccine. 1998. V. 16. P 960 - 968.

13. Linnemann C.C., Hutchinson L., Rotte T.C. et al. Stability of the rabbit immunogenic marker of RA 27/3 rubella vaccine virus after human passage // Infection and Immunity. 1974. 9. 3. P. 547 - 549.

14. London W.T., Fuccillo D.A., Ley A. et al Antibody response of various strains of rubella virus when inoculated into rabbits // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1971. 137. 3. P. 925 - 927.

15. Oxford J.S., Potter C.W. An immunologic marker technique for the Cen-dehill vaccine strain of rubella virus // J. Immunol. 1970. 105. 4. P. 818 - 823.

16. Parkman P.D., Meyer H.M., Kirschstein R.J., Hopps H.E. Attenuated rubella virus. Development and laboratory characterization // New Engl. J. Med. 1966. 275. P. 569 - 574.

17. Plotkin S.A., Katz M., Buser F. Attenuation of RA 27/3 rubella virus in Wi-38 Human diploid cells // Amer. J. Dis. Chill. 1969. 118. 2. P. 178 - 185.

18. Stewat G. L., Parkman P.D., Hopps H.E. et al. Rubella - virus he-magglutination-inhibition test // New Engl. J. Med. 1967. 10. 276. P. 554-557.

19. Zygraich N., Peetermans J., Huygelen C. In vivo properties of attenuated rubella virus «Cendehill» strain // Arch. Ges. Virusforsch. 1971. 33. 3-4. P. 225-233.20.

53

epid 4 (41).indd SS 9/1/08 11:52:34 AM

1