Кооперативное взаимодействие сигнальных путей рецепторов tlr4, TLR9 и NOD2 в макрофагах мыши

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 612.112.95.014.467.083

Лебедева Е.С., Багаев А.В., Гараева А.Я., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И.

КООПЕРАТИВНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ РЕЦЕПТОРОВ TLR4, TLR9 И NOD2 В МАКРОФАГАХ МЫШИ

Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115478, Москва, Россия

Рецепторы, распознающие молекулярные образы патогенов (pattern recognition receptors, PRR), выполняют функцию первичных сенсоров инфекции. Большинство патогенов несут в своём составе множество агонистов различных типов PRR и потому индуцируют одновременную активацию не одного, а двух, трёх или более типов сенсорных рецепторов. Ранее мы сообщали о синергическом усилении ответа клеток врождённого иммунитета при их одновременной активации парными сочетаниями агонистов PRR, в частности TLR4+NOD2, TLR4+TLR9 или TLR9+NOD2 [1-3]. В этой работе мы усложнили внешний сигнал до комбинации трёх агонистов и сравнили ответы макрофагов на тройную активацию суммой агонистов TLR4+TLR9+NOD2 с ответами этих клеток на парные сочетания тех же агонистов.

Ответную реакцию макрофагов на воздействие агонистами оценивали по активации внутриклеточных сигнальных путей на уровне протеинкиназ и транскрипционных факторов: TAK1, IKKa/p, NF-kB (NF-kB-путь), ERK1/2, с-Fos (MAPK-путь) и TBK1 (IRF-путь). Наряду с амплитудой изучалась кинетика активации.

Наибольшую активацию макрофагов наблюдали после воздействия парными сочетаниями агонистов TLR4+TLR9, TLR4+NOD2 или тройной комбинацией LPS+CpG+MDP. По активации TAK1, IKKa/p, NF-kB, ERK1/2, с-Fos и TBK1 указанные комбинации превысили одиночное действие агонистов TLR4, TLR9 и NOD2. Сочетание агонистов TLR9+NOD2 проявило слабое или ингибирующее действие по сравнению с одиночным действием агонистов этих рецепторов. Тройное сочетание агонистов TLR4+TLR9+NOD2 индуцировало в макрофагах более интенсивную активацию IKKap, NF-kB и ERK1/2 по сравнению с двойными сочетаниями агонистов TLR4+TLR9 и TLR4+NOD2. Полученные результаты свидетельствуют о синергической кооперации внутриклеточных NF-kB- MAPK- и IRF-сигнальных каскадов при воздействии на макрофаги тройным и парными сочетаниями агонистов TLR4, TLR9 и NOD2. Результатом кооперации является возрастание в клетках концентрации активных факторов транскрипции NF-kB и AP-1 (с-Fos). Вероятно, повышенная транскрипционная активность этих факторов обеспечивает синерги-ческую продукцию провоспалительных цитокинов макрофагами, активированными сочетанием агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 [1, 2].

Ключевые слова: Toll-подобные рецепторы; NOD-подобные рецепторы; сигнальные пути; кооперация; NF-kB, MAP-киназа; ERK; IRF3.

Для цитирования: Лебедева Е.С., Багаев А.В., Гараева А.Я., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Кооперативное взаимодействие сигнальных путей рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 в макрофагах мыши. Иммунология. 2018; 39(1): 4-11. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11

LebedevaE.S., BagaevA.V., GaraevaA.Y., ChulkinaM.M., Pichugin A.V., AtaullakhanovR.I.

THE COOPERATIVE INTERACTION OF TLR4-, TLR9- AND NOD2-SIGNALING PATHWAYS IN MOUSE MACROPHAGES

National Research Center - «Institute of Immunology», Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115478, Moscow, Russia Pattern recognition receptors (PRR) recognize conserved pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and function as primary sensors of infection. As many pathogens carry multiple PAMPs, they are able to simultaneously activate not one but two, three or more types of sensory receptors. We reported previously a synergistic enhancement of response of innate immunity cells after their simultaneous activation with paired combinations of PRR agonists, in particular, TLR4+NOD2, TLR4+TLR9 or TLR9+NOD2 [1-3]. In this paper, we complicated the external signal up to three PRR-agonists. The responses of macrophages to triple activation with TLR4+TLR9+NOD2 agonists were compared with the ones to paired combinations or the same agonists used alone.

The response of macrophages to agonists was evaluated according to activation of intracellular signaling pathways. We tracked activation of cellular protein kinases and transcription factors (TAK1, IKKa/p, NF-kB (NF-kB pathway), ERK1/2, c-Fos (MAPK pathway) TBK1 (IRF -way)) in macrophages treated with different PRR agonistic compositions. Along with the amplitude, the activation kinetics was studied.

The highest activation response of macrophages was observed to paired TLR4+TLR9, and TLR4+NOD2 combinations of agonists or to TLR4+TLR9+NOD2 triple combination. These combinations exceeded the response to the TLR4, TLR9 or NOD2 agonists used alone according to the activation of TAK1, IKKa p, NF-kB, ERK1/2, c-Fos and TBK1. The combination of TLR9+NOD2 agonists showed weak or inhibitory effect compared to the same agonists used alone. The TLR4+TLR9+NOD2 triple combination of agonists induced more intensive activation of IKKap, NF-kB and ERK1/2 in macrophages as compared to the TLR4+TLR9 and TLR4+NOD2 double combinations.

Для корреспонденции: Атауллаханов Равшан Иноятович, д-р мед. наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com

ORIGINAL ARTICLE

Our results evidence for a synergistic cooperation of intracellular NF-kB, MAPK and IRF-signal cascades in macrophages upon exposure to triple and paired combinations of TLR4, TLR9 and NOD2 agonists. As a consequence of NF-kB, MAPK and IRF pathways' cooperation the concentration of active transcription factors NF-kB and AP-1 (c-Fos) is increased. Probably, the enhanced transcription activity of these factors provides synergistic production of pro-inflammatory cytokines in macrophages activated with the combination of TLR4, TLR9 and NOD2 agonists [1, 2].

Keywords: Toll-like receptors; NOD-like receptors; signaling pathways; cooperation; NF-kB, MAP kinase; ERK; IRF3.

For citation: Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Garaeva A.Y., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. The cooperative interaction of TLR4-, TLR9- and NOD2-signaling pathways in mouse macrophages. Immunologiya. 2018; 39(1): 4-11. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11

For correspondence: Ravshan I. Ataullakhanov, MD, PhD, Prof., Head, Department of Immune Biotechnology, NRC Institute of Immunology FMBA, Russia, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgments. The work is executed at financial support of RGNF, grant 15-15-00102.

Received 15.07.17 Accepted 16.08.17

Введение

Клетки врождённого иммунитета распознают чужеродные агенты различной природы - вирусы, бактерии, грибы, простейшие - с помощью рецепторов, определяющих молекулярные образы патогенов (pattern recognition receptors, PRR). В соответствии со структурной организацией выделяют несколько семейств PRR: Toll-подобные (TLR), NOD-подобные (NLR), RIG-подобные рецепторы (RLR) и др. [4, 5].

TLR являются наиболее изученной группой PRR. Так, TLR1, TLR2, TLR4 и TLR5 встроены во внешнюю мембрану клеток, TLR3, TLR7/8 и TLR9 локализуются в мембранах внутриклеточных органелл - эндосом и фагосом. TLR распознают такие структурные компоненты бактерий, как ли-попротеин, липопептид, пептидогликан (TLR1, 2 и 6), липо-полисахарид (TLR4) и флагеллин (TLR5), или консенсусные структуры чужеродных нуклеиновых кислот dsRNA (TLR3), ssRNA (TLR7/8) и CpG-DNA (TLR9) [6]. NLR локализуются в цитозоле. Рецепторы этого типа NODl и NOD2 распознают компоненты пептидогликана клеточной стенки бактерий -диаминопимелиновую кислоту и мурамилдипептид соответственно [7]. Другие представители RLR, в частности MDA5 и LGP2, распознают молекулы двухцепочечной вирусной РНК и служат цитоплазматическими сенсорами вирусной инфекции [8]. Такая 3-уровневая компартментализация сенсорных рецепторов (внешняя мембрана, цитозоль, эндосома) обеспечивает надёжную детекцию клеткой вторгшихся возбудителей инфекции.

Несмотря на довольно большое разнообразие PRR и их агонистов, в активированной клетке задействуется ограниченное количество сигнальных путей, обеспечивающих передачу активационного сигнала и индукцию защитных реакций в ответ на инфекцию. В сигналинг с рецепторов PRR главным образом вовлечены 3 внутриклеточных сигнальных пути: MAPK-, NF-kB- и IRF-пути (рис. 1). Для трансдукции активационного сигнала в клетку TLR способны задействовать все 3 сигнальные оси. Связавшись со своим агонистом, TLR через TIR-домен активируют адапторные белки MyD88 или TRIF. В зависимости от задействованных адапторных молекул, TLR-сигнальные пути подразделяют на MyD88- и TRIF-зависимые. Большинство известных TLR активируют MyD88-зависимый путь, исключение составляют TLR3 и TLR4. TLR3 активирует ответ клетки через сигнальную ось TRIF ^ IRF, а TLR4 активирует одновременно MyD88- и TRIF-сигнальные пути. MyD88 через протеинкиназы IRAK передаёт сигнал на цитозольный адаптерный белок TRAF-6, способный к убиквитинилированию и активации киназы TAK1. ТАК1 определяет передачу сигнала на NF-kB-ось TLR-сигнального каскада в результате фосфорилирования комплекса IKKaPy. Фосфорилирование IKKaPy под действием TAK1 инициирует деградацию IkB, ингибитора

транскрипционного фактора NF-kB. Высвобожденный из ингибиторного комплекса NF-kB транслоцируется в ядро, где активирует подконтрольные гены. Помимо NF-kB-пути TAK1 передаёт сигнал на митоген-активируемые протеинкиназы (MAPK-путь) - p38, Erk1/2 и JNK, последние участвуют в активации транскрипционных факторов AP-1 и Elk-1. В случае TRIF-зависимого пути адапторный белок TRIF передаёт активационный сигнал на IKK-подобную киназу TBK1. TBK1 в результате фосфорилирования транскрипционных факторов семейства IRF активирует в клетках IRF-сигнальный путь, обеспечивающий интерфероновый ответ клетки на инфекцию. NLR (NOD1 и NOD2) подобно TLR через протеинкиназу TAK1 индуцируют NF-kB- и MAPK-сигнальные пути в клетке. RLR через TBK-1 стимулируют активацию IRF-пути [4-8].

Патогены содержат в своём составе множество молекул различной природы, которые распознаются рецепторами PRR как агонисты [9]. В условиях реальной инфекции разные PPR и связанные с ними внутриклеточные сигнальные пути активируются одновременно, приводя к индукции ответа клеток, адекватно вторгшейся в организм инфекции [4, 9]. Кооперация внутриклеточных сигнальных путей от нескольких PRR может вызывать синергическое усиление ответа клетки. Так, одновременное воздействие на клетки сочетанием нескольких агонистов PRR индуцировало синергическую активацию продукции клетками широкого спектра защитных субстанций и провоспалительных цитокинов [4, 9-12]. Имеются также сообщения, что перекрёстная активация нескольких PPR-путей в клетке может подавлять и ингибирование реакций врождённого иммунитета [13-15]. В целом можно отметить, что точные механизмы взаимодействия разных сигнальных путей исследованы недостаточно и не сформировано научное представление, где и каким образом в клетке формируются синергический или антагонистический ответы при активации двух или более агонистов PRR.

Несмотря на отсутствие системных представлений, имеются полезные фактические сведения о молекулярных процессах в клетке при воздействии сочетанием TLR-агонистов [10]. Комбинация агонистов TLR3+TLR8 приводит к усиленной продукции IL-12, как считают авторы, в результате взаимодействия NF-kB-, IRF-, MAPK-, PI3K- и STAT- сигнальных путей [16]. Ингибирование NF-B-, JNK-, p38-, cJun- и ERK-путей в клетке отменяет синергическую продукцию провоспалительных цитокинов [16-19]. При этом вклад каждого пути в синергическую продукцию конкретного цитокина неравнозначен. JNK- и ERK-пути главным образом регулируют синергическую продукцию TNF, IL6 и IL12, а p38 - продукцию IL12 [16, 20-22]. В ряде работ обнаружено соответствие уровня активации транскрипционных факторов и отдельных компонентов PRR-сигнальных путей c синергическим ответом

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

клеток на сочетанное действие агонистов PRR. Так, показано, что синергическое действие агонистов TLR3+TLR7 сопровождается повышенным уровнем фосфорилирования ERK в клетках [19], а снижение активности JNK отменяет синерги-ческую продукцию TNF по действием TLR4+TLR9 [22]. Показано участие транскрипционного фактора IRF5 в синергиче-ской продукции провоспалительных цитокинов в макрофагах, активированных TLR3+TLR9 [10]. Действие TLR4+TLR7 и TLR3+TLR7 вместе с синергической активацией клеток вызывает в них усиление и пролонгирование синтеза мРНК IBZ -регулятора экспрессии ряда цитокинов [17].

Ранее нами исследовано действие двойных сочетаний агонистов TLR, NOD2, TLR9 на макрофаги мыши [1, 2, 23]. Усиленная макрофагами продукция провоспалительных цитокинов и противомикробных субстанций под влиянием парных сочетаний агонистов TLR4+NOD2, TLR9+NOD2, TLR4+NOD2, TLR4+TLR9 [1, 2] сопровождалась возрастанием активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках [2], что указывало на возможность интеграции двух PRR-сигнальных путей на уровне активации NF-kB-пути. В настоящей работе мы исследовали взаимодействие PRR-сигналов на уровне отдельных компонентов NF-kB-, MAPK- и IRF-путей при действии на клетки тройной комбинацией агонистов TLR4+NOD2+TLR9 в сравнении с воздействием одиночными агонистами этих же рецепторов и их парными сочетаниями.

Материал и методы

Реактивы и антитела

В работе использованы агонисты Toll-подобных рецепторов: липополисахарид из E. coli серотип 055:B5 (LPS, аго-нист TLR4, Sigma, L-2880), ODN CpG-1826 (CpG, агонист TLR9, Invitrogen), L18-MDP (MDP, агонист NOD2-рецептора, Invitrogen).

В работе также применяли моноклональные антитела к следующим белкам: Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (T202/204) (Cell signaling, 4370), Phospho-NF-KB p65 (Ser536), (Cell signaling, 3033S), р-актин (Cell signaling, 4967S), c-Fos (Ser32) (D82C12) (Cell signaling, 5348), NF-kB p65 (Ser536) (Cell signaling, 3033S), Phospho-TAK1(T184/187) (Cell signaling, 4508S), Phospho-IKK-alpha/beta (S176/180) (Cell signaling, 2697S), Phospho-TBK1/NAK (Ser172) (D52C2) (Cell signaling, 5483S), Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (T202/204) (Cell signalling, 4370), Phospho IRF-3 (S396) (Cell signaling, 29047S), p-actin (Cell signaling, 4970S) и GAPDH (Abcam, ab22555).

Животные

Мышей линии BALB/c в возрасте 8-10 нед, полученных из питомника «Столбовая», содержали на стандартной диете в стандартных условиях вивария ГНЦ «Института иммунологии» ФМБА России.

Культуры клеток

Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM с 25 мМ HEPES, дополненной коктейлем заменимых аминокислот, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мM L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ p-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы фирмы «ПанЭко») при 37оС в увлажнённой атмосфере с 5% CO2.

Костномозговые макрофаги получали in vitro диф-ференцировкой клеток костного мозга мышей BALB/c в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестиму-лирующего фактора (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony stimulating factor, Sigma). Костный мозг вымывали из бедренных и больших берцовых костей мыши, эритроциты удаляли осмотическим лизисом, ядросодержащие клетки дважды отмывали PBS, после чего культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл GM-CSF (Sigma) в течение 7 дней. К окончанию этого срока адгезионная культура клеток была на 95% представлена макрофагами. Монослой адгезионных клеток промывали (PBS, 0,5%

Рис. 1. Взаимодействие TLR4-, NOD2- и TLR9-сигнальных путей в клетке.

Серым выделены компоненты сигнальных путей, исследованные в настоящей работе.

BSA), выдерживали в растворе Версена (ПанЭко) в течение 1 ч при 37°С и смывали (PBS, 0,5% BSA) тщательным пипетирова-нием. Полученную культуру макрофагальных клеток использовали в дальнейших экспериментах.

Вестерн-блот

Клетки трижды промывали охлаждённым фосфатно-соле-вым буфером и подвергали лизису (Invitrogen, Cell Extraction Buffer, FNN0011) в присутствии ингибиторов протеаз (Sigma, P2714-1BTL) 30 мин при 4°C. Клеточные лизаты осветляли центрифугированием (14,000 • g; 10 мин; 4 °C), после чего в них измеряли концентрацию клеточных белков (Pierce, Protein Assay Reagent, 23225). Полученную смесь белков (10-40 мкг) разделяли в 8% SDS-ПААГ и переносили на PVDF-мембрану (Amersham, Hybond-P). Для детекции целевых белков мембрану последовательно в течение 1 ч инкубировали с первичными антителами к Phospho-NF-KB p65 (Ser536) (Cell signaling, 3033S), Phospho-TAK1(T184/187) (Cell signaling, 4508S), Phospho-IKK-alpha/beta (S176/180) (Cell signaling, 2697S), Phospho-TBK1/NAK (Ser172) (D52C2) (Cell signaling, 5483S), Phospho-p44/42 MAPK (ERK1/2) (T202/204) (Cell signalling, 4370), Phospho IRF-3(S396) (Cell signaling, 29047S), c-Fos (Ser32) (Cell Signaling, 5348), p-actin (Cell signaling, 4970S), и GAPDH (Abcam, ab22555) в разведении 1:1000 и со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1:1 000 000 (Sigma, A0545-1ML). Визуализацию результатов осуществляли методом хемилюминесценции (Pierce, SuperSignal West Femto Maximum sensitivity, 34095). Интенсивность белковых пятен анализировали с помощью программы «ImageJ», для количественной оценки результатов интенсивность окраски пятен целевых белков нормировали на значения интенсивности пятен GAPDH и делили на значение в контроле (точка «0 минут»).

Анализ внутриклеточного содержания фосфорилиро-ванного транскрипционного фактора c-Fos в макрофагах методом проточной цитометрии

Клетки фиксировали раствором 4% параформальдегида в течение 10 мин при 37°С, отмывали и пермеабилизировали холодным (-20°С) метанолом в течение суток при -20°С. По-

ORIGINAL ARTICLE

a

IKKa/ß 60 Омин 10

LPS

MDP

CpG

MDP+CPG

LPS+MDP

LPS+ CpG

LPS+MDP +CPG

д

iC

CD

5 <

12

£ 9

ca

eg.

ro 5 "8

Щ 3 CL

_I P-NFkB

GAPDH

P-NFkB

GAPDH

P-NFkB

GAPDH

P-NFkB GAPDH

МИН

10

30

60

10

30

60

LPS+MDP+ CpG

Время инкубации, мин

Время инкуации, мин

Время инкубации, мин

. Рис. 2. Кинетика активации NF-kB-сигнального пути в макрофагах мыши при комбинированном воздействии на 3 рецептора врождённого иммунитета.

TLR4, TLR9 и NOD2. Клетки инкубировали 0 - 60 мин. в присутствии LPS 5 нг/мл, MDP 200 нг/мл, CpG 200 нг/мл и их различных комбинаций. В клеточных лизатах анализировали активность P-TAK1 (а, г), P-IKKaP (б, д), P-NFkB (в, е) методом вестерн-блота с использованием специфических антител к целевым белкам, GAPDH и в-актин использовали в качестве нормировочных белков. Визуализацию результатов осуществляли методом хемилюминесцентции (а - в). Интенсивность белковых пятен анализировали с помощью программы «ImageJ», для количественной оценки результатов интенсивность окраски пятен целевых белков нормировали на значения интенсивности пятен GAPDH и делили на значение в контроле (точка «0 минут») (г, д, е).

сле этого клетки промывали, окрашивали первичными антителами, специфичными к фосфорилированному c-Fos (Cell Signaling, Ser32), затем вторичными anti-Rabbit-Ig AF488 (Invitrogen). Анализ флуоресценции меченых клеток проводили на проточном цитофлуориметре BD FACS Aria II.

Результаты и обсуждение

Активация NF-кВ-сигнального пути в макрофагах мыши под действием агонистов TLR4, TLR9 и NOD2

NF-kB-сигнальный путь объединяет последовательность реакций, обеспечивающих активацию транскрипционного

фактора NF-kB в клетке (рис. 1). В отсутствии инфекции NF-kB локализуется в цитоплазме клетки в комплексе со своим ингибитором IkB. Диссоциация IkB - необходимое условие для высвобождения транскрипционно-активной формы NF-kB. Сигнальные каскады, инициированные взаимодействием агонистов с PRR, обеспечивают диссоциацию от NF-kB и деградацию IkB. Ключевую роль в этом играет 1кВ-киназный (IKK) комплекс. IKK - гетеродимер, состоящий из субъединиц IKKa, IKKß и IKKy. Две субъединицы - IKKa и IKKß - обладают каталитической активностью, а IKKy является регуляторной субъединицей комплекса. Аго-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

LPS

MDP

CPG

MDP+CPG

LPS+MDP

LPS+CPG

LPS+MDP

+CPG

P-ERK1/2 GAPDH

P-ERK1/2 GAPDH

б

мин10 п

8 H

О

CL <

0

í ш

01

6

4  2 О

LPS MDP

0 10 30 60 Время инкубации, мин

C-Fos

со о

0

01

3 i

2

Рис. 3. Кинетика активации MAPK-сигнального пути в макрофагах мыши при комбинированном воздействии на 3 рецептора врождённого иммунитета.

TLR4, TLR9 и NOD2. Клетки инкубировали 0 - 60 мин в присутствии LPS 5 нг/мл, MDP 200 нг/мл, CpG 200 нг/мл и их различных комбинаций. В клеточных лизатах анализировали активность P-Erk1/2 (а, б) и Р-с-Fos (в). P-Erk1/2 (а, б) детектировали методом вестерн-блота с использованием специфических антител к белкам, GAPDH использовали в качестве нормировочного белка. Визуализацию результатов осуществляли методом хе-милюминесцентции (а). Интенсивность белковых пятен анализировали с помощью программы «ImageJ», для количественной оценки результатов интенсивность окраски пятен целевых белков нормировали на значения интенсивности пятен GAPDH и делили на значение в контроле (точка «0 минут») (б). Активность P^-Fos (в) детектировали методом внутриклеточного окрашивания белков с последующим анализом флуоресценции клеток на проточном цитофлуориметре BD FACS Aria II. Приведены средние значения и стандартные отклонения по двум культуральным параллелям, нормированные на значение в контроле без активации.

нисты TLR и NOD2-рецепторов через киназу ТАК1 индуцируют активацию IKK-комплекса. Для активации ТАК1 агонисты TLR инициируют TRAF6 (E3 убиквитин лигаза), а агонисты NOD2 действуют через адапторный белок RIP2. Активированный TAK1 передаёт сигнал на IKK-комплекс, и каталитические субъединицы IKK-комплекса фосфорили-руют IkB. Фосфорилированная форма IkB отсоединяется от NF-kB, подвергается убиквитинилированию и последующей протеосомной деградации. Освободившийся NF-kB транспортируется в ядро, где активирует экспрессию генов, которые регулируются этим транскрипционным фактором [1-5].

На рис. 2 представлены результаты исследования активности компонентов NF-kB-пути в макрофагах, активированных тройной комбинацией агонистов TLR4+NOD2+TLR9 в сравнении с активацией отдельными агонистами TLR4, NOD2 и TLR9 или их парными сочетаниями TLR4+NOD2, TLR4+TLR9, TLR9+NOD2. Для этого клетки инкубировали в течение 0, 10, 30 или 60 мин в присутствии одиночных агонистов LPS (5 нг/мл, TLR4), MDP (200 нг/мл, NOD2) и CpG (2,5 мкг/мл, TLR9) или их сочетаний по 2 и 3. Уровень активности компонентов PRR-путей в клеточных экстрактах анализировали методом вестерн-блоттинга с использованием специфических антител к интересующим белкам. Результаты наших экспериментов по активации ключевых белков

NF-kB-пути представлены как активация TAK1 (см. рис. 2, а, г), IKKa, IKKß (см. рис. 2, б, д), NF-kB (см. рис. 2, в, е).

Об активации киназы TAK1 в клетке свидетельствует её фосфорилирование в положении Thr184/187 (P-TAK1). На рис. 2, a, г видно, что все исследуемые агонисты PRR индуцировали накопление (P-TAK1) через 10 мин после воздействия на клетки. CpG индуцировал наибольший уровень P-TAK1 в клетках по сравнению с агонистами TLR4 и NOD2. После активации макрофагов CpG уровень P-TAK1 в клетках максимально сохранялся в течение 10-60 мин. Агонисты TLR4 и NOD2 проявили схожую активность в отношении фосфорилирования TAK1. Уровень P-TAK1 в клетках, активированных LPS и MDP, постепенно нарастал и достигал максимума на 60-й минуте. Сочетание 2 агонистов MDP+ CpG вызывало более высокий уровень P-TAK1 в клетках по сравнению с одиночным действием CpG и MDP. Активация макрофагов сочетанием LPS+MDP, LPS+CpG, напротив, приводила к снижению уровня P-TAK1 относительно действия CpG, LPS и MDP.

Таким образом, из всех исследованных нами парных сочетаний агонистов лишь комбинация агонистов TLR9+NOD2 привела к усилению активности TAK1, остальные парные сочетания агонистов PRR имели отрицательный эффект на активность TAK1 в клетках. Интересно, что одновременная

активация в клетках всех трёх исследуемых сигнальных PRR-путей (TLR9, TLR4, NOD2) индуцировала промежуточной уровень активности Р-TAKL Действие комбинации из тройного сочетания агонистов CpG+LPS+MDP превысило стимулирующую активность LPS, MDP, CpG, LPS+MDP, LPS+CPG, но оказалось менее эффективным относительно действия GPG+MDP на активацию TAK1.

В составе NF-kB-сигнального каскада TAK1 передаёт ак-тивационный сигнал на киназный комплекс IKKa/p. Об уровне активности IKKa/p в клетках свидетельствует его фосфо-рилирование в положении Ser176/180 (Р-IKKa/p). В наших экспериментах максимальная активность IKKa/p детектировалась через 60 мин после воздействия PRR-агонистами и их сочетаниями (см. рис. 2, б, д). Одиночные агонисты CpG, LPS, MDP проявили слабую активность в отношении индукции фосфорилирования IKKa/p-комплекса. Уровень активности IKKa/p в клетках, активированных двойными сочетаниями агонистов CpG+MDP LPS+MDP, LPS+CpG превысил одиночное действие каждого из них, Максимальный уровень активности IKKa/p-комплекса обнаружен при действии на клетки тройным сочетанием агонистов LPS+MDP+CpGP-IKKa/p-комплекс обеспечивает деградацию IkB и активацию NF-kB. Транскрипционно-активный NF-kB фосфорилирован в положении Ser536 в составе p65 субъединицы (P-NF-kB). Все исследуемые агонисты PRR стимулировали активацию NF-kB, однако кинетика активации NF-kB в клетках, активированных разными агонистами PRR, заметно различалась (см. рис. 2, в, е). После активации LPS активная форма NF-kB детектировалась в клетках через 10 мин. Уровень P-NF-kB, индуцированный LPS, сохранялся на протяжении всего времени наблюдения (10-60 мин). NF-kB также был активирован через 10 мин после активации макрофагов CpG, но через 60 мин уровень P-NF-kB в клетках резко снижался. MDP стимулировал фосфорилирование NF-kB через 30 мин после активации, сохраняя его активность до 60 мин наблюдения. Ответ клеток на сочетания двух агонистов LPS+MDP или LPS+CpG был более интенсивным, чем на одиночные агонисты LPS, MDP и CpG, при этом наблюдалась более ранняя кинетика активации NF-kB. При действии на клетки сочетанием MDP+CpG усиления активации NF-kB не обнаружено, в клетках детектировалась поздняя кинетика активации NF-kB, характерная для MDP. Тройная комбинация LPS+MDP+CpG значительно превысила одиночное действие каждого агониста и сочетания двух агонистов LPS+MDP, однако совпадало по уровню с ответом на двойное сочетание LPS+CpG. Таким образом, практически все исследованные двойные и тройные сочетания агонистов PRR, за исключением MDP+CpG, синергически активировали NF-kB в клетках, и возрастание уровня P-NF-kB в клетках сопровождалось ускоренной кинетикой активации этого транскрипционного фактора.

Следует заметить, что возрастание уровня активности NF-kB в клетках (см. рис. 2, в, е), активированных сочетаниями агонистов LPS+MDP, LPS+CpG, LPS+MDP+CpG, хорошо согласуется с повышенным уровнем активности IKKa/p-комплекса в этих же клетках (см. рис. 2, б, д). Поэтому можно предположить, что активационные сигналы от TLR3, TLR9 и NOD2 кооперируют на уровне IKKa/p-комплекса. Вероятно, возрастание активности комплекса IKKa/p при активации макрофагов сочетаниями агонистов LPS+MDP, LPS+CpG или LPS+MDP+CpG обеспечивает повышенное содержание в клетках Р-NF-kB. При этом уровень активности P-TAK1 (см. рис. 2, а, г) в активированных клетках не повышается в согласии с содержанием P-NF-kB (см. рис. 2, в, е) в этих же клетках. Следовательно, TAK-1 не является ни лимитирующим, ни ключевым звеном при активации макрофагов сочетанием двух агонистов LPS+MDP или LPS+CpG. Минимального количества активной формы TAK1 достаточно для усиления активности P-NF-kB в клетке под влиянием

ORIGINAL ARTICLE

LPS+MDP и LPS+CpG. Возможно, P-TAK1 не играет критической роли в синергической интеграции TLR4-, TLR9- и NOD2-путей на уровне NF-kB-сигнального каскада.

Известно, что активационный сигнал от PRR-рецепторов с P-TAK1 в клетке перераспределяется между NF-kB- и MAPK-сигнальными каскадами. Это может объяснить несоответствие уровня активности NF-kB и TAK1 в исследуемых клетках. Поэтому мы исследовали эффективность активации MAPK-сигнального пути при воздействии на макрофаги тройной комбинацией TLR4+TLR9+NOD2 в сравнении с активацией отдельными агонистами и их парными сочетаниями.

Активация MAPK-сигнального пути в макрофагах мыши под действием агонистов TLR4, TLR9 и NOD2, и их сочетаний

MAPK-сигнальный путь передаёт активационный сигнал с PRR на три MAPK-киназы: ERK1/2, p38 и JNK. Эти МАРК-киназы задействованы в активации траскрипционного фактора AP-1. AP-1 - гетеродимер, состоящий из двух субъединиц c-Jun и c-Fos [3, 8].

Мы исследовали уровень активности MAPK-киназы ERK1/2 и субъединицы c-Fos транскрипционного фактора AP-1 при воздействии на костномозговые макрофаги одиночными агонистами TLR4, TLR9 и NOD2, их парными сочетаниями или тройной комбинацией TLR4+TLR9+NOD2 (рис. 3). Об активности ERK1/2 в клетках судили по фосфорилиро-ванию p42/p44-субъединиц белка в положении Thr202/Tyr204 (F-ERK1/2). TLR4-агонист LPS вызывал наибольшую активацию ERK1/2 киназы в макрофагах (см. рис. 3, а, б). Активация ERK1/2 (F-ERK1/2) в макрофагах достигала максимума через 10 мин после их активации LPS, к 60-й минуте наблюдения уровень Р-ERK1/2 в клетках постепенно снижался. По активации ERK1/2 CpG оказывал меньший эффект по сравнению LPS, а MDP практически не активировал накопления Р-ERK1/2 в клетках. Совместное действие MDP+CpG приводило к ингибиро-ванию активации ERK1/2 относительно одиночного действия CpG. В то же время сочетания агонистов LPS+MDP и LPS+CpG индуцировали значительный прирост количества Р-ERK1/2 в клетках по сравнению с действием LPS, CpG и CpG+MDP. Наибольший эффект в усилении активности ERK1/2 оказало тройное сочетание агонистов LPS+MDP+CpG.

Р-ERK1/2 передаёт активационный сигал на с-Fos, субъединицу транскрипционного фактора AP-1. Для детекции активности с-Fos в клетках использовали внутриклеточное окрашивание с последующим анализом флуоресценции окрашенных клеток методом проточной цитометрии. Признак активации с-Fos в клетке - наличие в его составе фосфо-эпитопа в положении Ser32 (P^-Fos). Из рис. 3, в видно, что LPS по сравнению с CPG и MDP индуцировал наибольший уровень активации с-Fos в клетках. Активационное действие сочетания двух LPS+MDP или LPS+CPG или комбинации трёх агонистов LPS+MDP+CPG превысило одиночное действие каждого агониста в отдельности. Сочетание MDP+CPG не индуцировало усиленного накопления P^-Fos в клетках.

Следует заметить, что уровень активности с-Fos (см. рис. 3, в), индуцированный отдельными агонистами TLR4, TLR9 и NOD2 или их сочетаниями коррелирует с содержанием активной формы ERK1/2 в этих же клетках (см. рис. 3, а, б). Однако уровень P-TAK (см. рис. 2, а, г) не соответствовал уровню активных форм исследованных компонентов МАРК-пути (с-Fos и ERK1/2) в этих же клетках. В частности, при воздействии LPS+MDP и LPS+CPG наблюдался минимальный уровень P-TAK, но максимальная активация Р-с-Fos и Р-ERK1/2 в этих же клетках. Напротив, при активации макрофагов MDP+CPG максимальный уровень P-TAK1 сопровождался низким уровнем активности ERK1/2 и отсутствием активации P^-Fos.

Таким образом, на уровне активации сигнальной оси ERK1/2 ^ Р-с-Fos MAPK-сигнального пути нами обнаружена синерги-

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Рис. 4. Кинетика активации IRF-сигнального пути в макрофагах мыши при комбинированном воздействии на 3 рецептора врождённого иммунитета.

TLR4, TLR9 и NOD2. Клетки инкубировали 0 - 60 мин в присутствии LPS 5 нг/мл, MDP 200 нг/ мл, CpG 200 нг/мл и их различных комбинаций. В клеточных лизатах анализировали активность P-TBK1 (а, в), P-IRF3 (б, г), методом вестерн-блота с использованием специфических антител к целевым белкам, GAPDH использовали в качестве нормировочных белков. Визуализацию результатов осуществляли методом хемилюминесцентции (а, б). Интенсивность белковых пятен анализировали с помощью программы «ImageJ», для количественной оценки результатов интенсивность окраски пятен целевых белков нормировали на значения интенсивности пятен GAPDH и делили на значение в контроле (точка «0 минут») (в, г).

ческая кооперация при воздействии на макрофаги сочетаниями агонистов TLR4+TLR9, TLR4+NOD2 и TLR4+TLR9+NOD2. При этом активность компонентов оси ERK1/2 ^ Р-с-Fos не зависит от активности P-TAK1. Однако нами исследована активность лишь одной из трёх MAPK-киназ, активируемых агонистами PRR, и не следует исключать возможности неравномерного распределения сигнала с P-TAK между MAPK-киназами ERK1/2, р38 и JNK. Влияние сочетанного действия агонистов TLR4, TLR9, и NOD2 на активность ERK1/2, р38 и JNK послужит предметом дальнейшего исследования.

Активация IRF-сигнального пути в макрофагах под действием агонистов TLR4, TLR9 и NOD2

IRF-сигнальные пути получили своё название от активируемых ими транскрипционных факторов - регулятор-

ных факторов интерферонов (Interferon regulatory factors, IRF). Активация IRF обеспечивает интерфероновый ответ клетки на инфекцию. В результате PRR-сигнальных каскадов происходит фос-форилирование IRF (P-IRF), молекулы P-IRF димеризуются и транслоцируются в клеточное ядро, где активируют гены, транскрипция которых контролируется этими транскрипционными факторами. Многие агонисты PRR способны к активации IRF в клетке [3, 8], задействуя для этого разные адапторные белки. Одним из белков, способных передавать актива-ционный сигнал от PRR на IRF, является киназа TBK1. TBK1 передаёт активаци-онный сигнал на IRF3, используя белки сигнальной оси TRIF^IRF, в частности TRIF, TRAM и TRAF3.

Для того чтобы проследить возможность интеграции PRR-сигнальных каскадов на уровне IRF-пути, мы исследовали активность TBK1 и IRF3 в макрофагах, активированных тройной комбинацией TLR4+TLR9+NOD2 в сравнении с активацией отдельными агонистами и их парными сочетаниями. На рис. 4, а и б представлены результаты измерения активности TBK1 в активированных клетках. Об активности TBK1 в клетках судили по его фосфорилированию в положении Ser172 (P-TBK1). Через 30 мин после воздействия LPS можно было наблюдать слабую активацию TBK1 в макрофагах. CPG, MDP и их сочетание CPG+MDP не индуцировали накопления Р-TBKF Известно, что роль адаптора для передачи сигнала от PRR на TBK1 выполняет TRIF [4, 9]. Среди исследуемых агонистов PRR лишь LPS использует TRIF для передачи сигнала от TLR4 на TBK1. По-видимому, это объясняет, почему мы наблюдали накопление Р-TBK! при активации клеток LPS, но не MDP, CPG или CPG+MDP. Интересно, что сочетания LPS+MDP, LPS+CPG, LPS+MDP+CPG были более эффективны в активации TBK1, чем LPS, хотя MDP, CPG и MDP+CPG не влияли на активность TBK1 в макрофагах.

Субстратом для Р-TBK! является транскрипционный фактор IRF3. Об активации IRF3 свидетельствует его фос-форилирование в положении Ser396 - (P-IRF3). На рис 4, б, г видно, что накопление P-IRF3 детектировалось в клетках через 30 мин после воздействия LPS. CPG, MDP и CPG+MDP не активировали IRF3, что соответствует уровню активности TBK1 в этих же клетках (см. рис. 3, а, в). Однако в отличие от TBK1, сочетания агонистов LPS+MDP, LPS+CPG, LPS+MDP+CPG не стимулировали повышенного накопления P-IRF3 в клетках. Известно, что активационный сигнал с TBK1 может перераспределяться на IKKaPy-комплекс, обеспечивая TRIF-зависимую активацию NF-kB [4, 9]. Возрастание накопления P-NF-kB под действием сочетаний агонистов LPS+MDP, LPS+CPG и LPS+MDP+CPG (см. рис. 2, в, е) соответствует повышенному уровню TBK1 в этих же клетках (см. рис. 4, а, в). Поэтому можно предположить, что TBK1 усиливает активность NF-kB в результате кооперации TLR4-, NOD2- и TLR9-сигнальных путей в клетках.

Таким образом, интеграция TLR4-, TLR9- и NOD2-сигнальных путей приводит к повышенной активности TBK1 в клетках. Однако возрастание активности TBK1 не сопровождается усилением транскрипционной активности IRF3. По-видимому, IRF3 не принимает участие в интеграции TLR4-, TLR9- и NOD2 в клетке

Заключение

Мы исследовали взаимодействие TLR4-, TLR9- и NOD2-сигнальных путей в макрофагах костномозгового происхождения, активированных одиночными агонистами LPS, MDP и CPG, их парными сочетаниями или тройной комбинацией. Интеграция сигнальных путей, идущих от TLR4, TLR9 и NOD2-рецепторов, приводит к возрастанию активности протеинкиназ TAK1, IKKa/p, ERK1/2 и TBK1, являющихся звеньями NF-kB-, MAPK- и IRF-сигнальных осей. Усиление активационного сигнала в результате кооперации компонент NF-kB-, MAPK- и IRF-сигнальных путей индуцирует повышенный уровень транскрипционно-активных форм NF-kB и AP-1, но не влияет на уровень активности IRF3. Вероятно, повышенная активность указанных транскрипционных факторов обеспечивает синергическую продукцию провоспали-тельных цитокинов при активации макрофагов сочетанием агонистов TLR4, TLR9 и NOD2 [1, 3].

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ, грант 15-15-00102.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М.М., Атауллаханов Р.И. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов разлилчных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38(1): 83-9.

2. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. NF-kB-, но не MAPK-сигнальный путь определяет синергический ответ макрофагов на одновременную активацию двух типов рецепторов TLR4 + NOD2 или TLR9 + NOD2. Иммунология. 2017; 38(2): 76-82.

3. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Ата-уллаханов Р.И. Синергическое усиление транскрипции генов интерферонов 1-го типа и цитокинов при активации макрофагов и дендритных клеток сочетанием двух агонистов PRR. Иммунология. 2017; 38(1): 76-83.

REFERENCES

1. Pichugin A.V., Bagaev A.V., Lebedeva E.S., Chulkina M.M., Ataullakhanov R.I. Synergistic cytokine production by murine dendritic cells in response to their simulteneous ctivation with pairs of agonists of innate immune receptors. Immunologiya. 2017; 38

2. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. NF-kB-, but not MAPK-signaling pathway determines synergistic response of macrophages to the simultaneous activation of two types receptors TLR4 + NOD2 or TLR9 + NOD2. Immunologiya. 2017; 38

3. Lebedeva E.S., Bagaev A.V., Chulkina M.M., Pichugin A.V., Ataullakhanov R.I. Synergistic activation of gene transcription encoding type I interferons and cytokines in macrophages and dendritic cells by the combinations of two PRR-agonists. Immunologiya. 2017; 38

4. Thaiss C.A., Levy M., Itav S., Elinav E. Integration of Innate Immune Signaling. Trends Immunol. 2016; 37(2): 84-101.

ORIGINAL ARTICLE

5. Janeway C.A. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1989; 54(1): 1-13.

6. Medzhitov R., Janeway C. The Toll receptor family and microbial recognition. Trends Microbiol. 2000; 8(10): 452-6.

7. Kim Y.K., Shin J.S., Nahm M.H. NOD-like receptors in infection, immunity, and diseases. YonseiMed. J. 2016; 57(1): 5-14.

8. Loo Y.M., Gale M. Immune Signaling by RIG-I-like Receptors. Immunity. 2011; 34(5): 680-92.

9. Trinchieri G., Sher A. Cooperation of Toll-like receptor signals in innate immune defence. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7(3): 179-90.

10. Ouyang X., Negishi H., Takeda R., Fujita Y., Taniguchi T., Honda K. Cooperation between MyD88 and TRIF pathways in TLR synergy via IRF5 activation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007; 354(4): 1045-51.

11. Krummen M., Balkow S., Shen L., Heinz S., Loquai C., Probst H.C. et al. "Release of IL-12 by dendritic cells activated by TLR ligation is dependent on MyD88 signaling, whereas TRIF signaling is indispensable for TLR synergy. J. Leukoc. Biol. 2010; 88(1): 189-99.

12. He H., Genovese K.J., Nisbet D.J., Kogut M.H. Synergy of CpG oligodeoxynucleotide and double-stranded RNA (poly I:C) on nitric oxide induction in chicken peripheral blood monocytes. Mol. Immunol. 2007; 44(12): 3234-42.

13. Re F., Strominger J.L. IL-10 Released by Concomitant TLR2 Stimulation Blocks the Induction of a Subset of Th1 Cytokines That Are Specifically Induced by TLR4 or TLR3 in Human Dendritic Cells. J. Immunol. 2004; 173(12): 7548-55.

14. Thaiss C.A., Elinav E. NF-kB B Regulation by NLRs: T Cells Join the Club. Immunity. 2015; 42(4): 595-7.

15. Sato S., Nomura F., Kawai T., Takeuchi O., Muhlradt P.F., Takeda K. et al. Synergy and Cross-Tolerance Between Toll-Like Receptor (TLR) 2- and TLR4-Mediated Signaling Pathways. J. Immunol. 2000; 165(12):7096-101.

16. Makela S.M., Strengell M., Pietila T.E., Osterlund P., Julkunen I. Multiple signaling pathways contribute to synergistic TLR ligand-dependent cytokine gene expression in human monocyte-derived macrophages and dendritic cells. J. Leukoc. Biol. 2009; 85(4): 66472.

17. Napolitani G., Rinaldi A., Bertoni F., Sallusto F. Selected TLR agonist combinations synergistically trigger a TH 1 polarizing program in dendritic cells. Nat. Immunol. 2005; 6(8): 2166-217.

18. Zhu Q., Egelston C., Vivekanandhan A., Uematsu S., Akira S., Klinman D.M. et al. Toll-like receptor ligands synergize through distinct dendritic cell pathways to induce T cell responses: implications for vaccines. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2008; 105(42): 16260-5.

19. Tukhvatulin A.I., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheblyakov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova I.V. et al. Powerful complex immunoadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive immune responses. PLoS One. 2016; 11(5): 1-24.

20. Bohnenkamp H.R., Papazisis K.T., Burchell J.M., Taylor-Papadimitriou J. Synergism of Toll-like receptor-induced interleukin-12p70 secretion by monocyte-derived dendritic cells is mediated through p38 MAPK and lowers the threshold of T-helper cell type I responses. Cell. Immunol. 2007; 247(2): 72-84.

21. Mitchell D., Yong M., Schroder W., Black M., Tirrell M., Olive C. Dual stimulation of MyD88-dependent Toll-like receptors induces synergistically enhanced production of inflammatory cytokines in murine bone marrow-derived dendritic cells. J. Infect. Dis. 2010; 202(2): 318-29.

23. De Nardo D., De Nardo C.M., Nguyen T., Hamilton J.A., Scholz G.M. Signaling Crosstalk during Sequential TLR4 and TLR9 Activation Amplifies the Inflammatory Response of Mouse Macrophages. J. Immunol. 2009; 183(12): 8110-8.

Поступила 15.07.17 Принята в печать 16.08.17