ИНГИБИТОРЫ КАЛИЕВЫХ КАНАЛОВ КАК ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА ПРИ ЛИМФОМАХ И ЛЕЙКОЗАХ
POTASSIUM CHANNEL INHIBITORS AS THERAPEUTIC AGENTS IN LYMPHOMA AND LEUKAEMIA

Изобретение относится к области молекулярной биологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицине, а также в сельском хозяйстве и в промышленной биотехнологии для разработки принципиально нового подхода в противолейкозной терапии с помощью низкомолекулярных соединений, направленных против специфических молекулярных мишеней, к которым относятся молекулы субъединиц потенциалзависимых калиевых каналов семейства Kv.
Известно использование циклоалкильных соединений в качестве ингибиторов функции калиевых каналов. Патент Российской Федерации №2343143, основные коды МПК: С07С 233/59, С07С 233/60, С07С 279/28, С07С 307/08, С07С 311/16, C07D 261/08, C07D 213/82, C07D 271/06, C07D 409/12, C07D 413/12, А61К 031/155, А61К 031/165, А61К 031/415, А61К 031/4427, А61К 031/4245.
Известно описание АТР-чувствительного калиевого канала человеческого или иного происхождения, его производных, а также перечень диагностических или терапевтических средств против заболеваний, связанных с изменением активности данного канала. Патент Российской Федерации №2190663, коды МПК: C12N 15/12, С07К 14/705, С07Н 21/04.
Таким образом, использование калиевых каналов в качестве терапевтических мишеней достаточно интенсивно исследуется в нашей стране. Однако в российском патентном пространстве в качестве мишеней описаны только сами калиевые каналы, а не их белковые ингибиторы, принадлежащие к семейству KCNRG. Примеров использования калиевых каналов в качестве биомаркеров заболеваний человека в российском патентном пространстве не обнаружено.
Техническим и медицинским результатом изобретения является создание ингибиторов калиевых каналов, использующихся в качестве средства для индукции апоптоза опухолевых клеток В-клеточного хронического лимфолейкоза.
Технический результат достигается тем, что с помощью низкомолекулярных соединений был смоделирован ингибирующий эффект белка KCNRG, который препятствует нормальной сборке белков калиевых каналов, связываясь с областью, отвечающей за их тетрамеризациию, и тем самым подавляя активности каналов, с целью дальнейшего их использования в качестве потенциальных лекарственных средств для больных В-клеточным хроническим лимфолейкозом, и на модели В-клеточной линии Raji определены диапазоны эффективных действующих концентраций этих соединений.
Хронический лимфолейкоз является практически неизлечимым, однако, медленно прогрессирующим заболеванием. В отличие от острого миелоидного лейкоза и хронического миелобластного лейкоза, радикальных методов терапии хронического лимфолейкоза на сегодняшний день не существует. Из-за системного характера заболевания радиотерапия при ХЛЛ не применяется. Стандартом терапии являются химиотерапевтические режимы с включением нуклеотидных аналогов, алкилирующих препаратов и моноклональных антител.
Сущность изобретения поясняется на фиг.2 и таблице 3.
Белковый продукт гена KCNRG содержит единственный домен Т1, являющийся N-концевым цитоплазматический доменом, ответственным за тетрамеризацию субъединиц калиевых каналов, открывающихся в зависимости от разности потенциалов на мембране клетки. Потенциалзависимые калиевые каналы (Kv) представляют собой чрезвычайно разнообразную группу. Однако при множественном выравнивании аминокислотных последовательностей каналов, Т1-домен показал высокую гомологию и консервативность, что продемонстрировано на фиг.1, где отображено множественное выравнивание последовательностей Т1-домена, выбранных для анализа потенциалзависимых калиевых каналов, полученное с помощью программного обеспечения ClustalX 1.83.
В таблице 1 приведен полный список ингибиторов/блокаторов и активатора калиевых каналов, включенных в настоящее исследование, а также оптимальные теоретические концентрации для ингибирования калиевых каналов для каждого ингибитора.
В качестве рабочих концентраций, помимо теоретических концентраций, на начальном этапе были выбраны также в 10 раз более и в 10 раз менее концентрированные растворы. Предварительные эксперименты по определению эффективных действующих концентраций были проведены на В-клеточной линии Raji. Культуры клеток, выделенных от больных В-ХЛЛ, обрабатывали выбранными концентрациями указанных соединений. В случае ингибирующего действия на калиевые каналы выбранных веществ, был сделан вывод о том, что эти вещества обладают KCNRG-подобным опухоль-супрессорным действием.
2
2
Мононуклеары периферической крови больных В-ХЛЛ выделяли с помощью стандартной методики Ficoll-Hipaque. После троекратной промывки стерильным PBS, клетки помещали в культуральный флакон со средой RPMI-1640, содержащей 2 мМ L-глутамина, 15 мкг/мл гентамицина и 10% бычью эмбриональную сыворотку, в концентрации 1-2 млн клеток/мл. Культура помещалась в СО-инкубатор при 37°C с атмосферой, насыщенной водяными парами и не менее чем 5% CO. С учетом специфики проводимых экспериментов (определение цитостатического действия низкомолекулярных соединений в отношении клеток В-ХЛЛ по высокочувствительному измерению активности каспаз 3 и 7), культуру считали «живой» в том случае, если количество живых клеток превышало 70% от исходного (оценивалось по окраске трипановым синим).
2
2
Все дальнейшие эксперименты проводили в 24-луночных планшетах. В лунку вносили 2 мл первичной культуры, различные концентрации растворов ингибиторов в конечном объеме 8 мкл, после чего планшет помещали в CO-инкубатор и инкубировали при 37°C, сильном увлажнении и не менее чем при 7% концентрации CO. Цитотоксичность ингибиторов оценивалась в случае, когда в положительном контроле (клетки без ингибиторов) оставалось более 70% живых клеток.
Первоначальную оценку цитотоксичности и выбор оптимального диапазона концентраций проводили при помощи визуального подсчета клеток после окраски трипановым синим на клеточной линии Raji, а затем подтвердили на первичных культурах клеток В-ХЛЛ, полученных от больных. Эти эксперименты позволили выделить группу из 10 соединений, действие которых на первичные культуры является наиболее заметным и стабильным. Для этих веществ был определен рабочий диапазон концентраций (см. табл.2).
Чувствительность лимфоцитов периферической крови к воздействиям ингибиторов определяли с помощью теста с МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) и наборов для определения каспазной активности. Показания считывали через 3 и 24 часа после начала инкубации с цитотоксическими веществами.
2
2
Клетки после инкубации с цитотоксическими веществами помещали в 96-луночные планшеты. В качестве контроля использовали интактные клетки. Для учета фоновой оптической плотности в лунки вносили ростовую среду без клеток. В каждую лунку вносили 20 мкл раствора МТТ в стандартном фосфатно-солевом буфере в концентрации 5 мкг/мл. Инкубировали в течение 4 часов (в CO-инкубаторе при 37°C с атмосферой, насыщенной водяными парами и не менее чем 7% CO), после чего образовавшиеся кристаллы формазана растворяли равным объемом кислого изопропанола, интенсивно перемешивая. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 540 нм на оптическом анализаторе Униплан-Пикон (Россия).
Для оценки воздействия выбранных химических ингибиторов на первичные культуры клеток использовался относительный индекс апоптоза I, рассчитываемый по следующей формуле:
,
0
culture
0
culture
где А - показание активности каспаз 3 и 7 в образце, А - фоновое показание активности каспаз 3 и 7 (без клеток), A - показание активности каспаз 3 и 7 в отрицательном контроле (без добавления блокаторов), МТТ - показание теста МТТ в образце, МТТ - фоновое показание теста МТТ (без клеток), MTT - показание теста МТТ в отрицательном контроле (без добавления блокаторов).
Если относительный показатель I>100 (например, 200), это означает, что воздействие вещества в данной концентрации приводит к увеличению апоптоза (в примере в два раза). Если индекс I=100, это значит, что вещество не действует на культуру, и интенсивность ее апоптоза не изменяется. Если I<100, это означает, что вещество приводит к уменьшению интенсивности ее апоптоза.
В исследовании участвовало 8 больных В-ХЛЛ и 4 здоровых доноров в качестве контроля. На фиг.2 представлены характеристики выборок индекса апоптоза I в зависимости от исследуемых ингибиторов при трех различных концентрациях.
Целью настоящего исследования был поиск таких ингибиторов, которые бы действовали на культуру клеток от здоровых доноров в меньшей степени (или не действовали вообще), чем на выборку больных. Для выявления подобной закономерности нами был проведен статистический анализ с использованием непараметрического U критерия Манна - Уитни - Уилкоксона для оценки различий между двумя выборками по уровню относительного индекса апоптоза I. Значения критерия Манна - Уитни приведены в таблице 3.
Нулевой гипотезой при анализе было предположение, что выборки больных и здоровых отвечали на воздействия одинаково. Альтернативной гипотезой служило предположение, что данные выборки отличаются друг от друга. Жирным в таблицах выделены ингибиторы, воздействие которых на культуры подтверждает альтернативную гипотезу с вероятностью р<0,05. Такие ингибиторы можно назвать перспективными, то есть приводящими к апоптозу преимущественно культуры клеток больных. Данные ингибиторы могут быть рекомендованы в качестве основы для разработки новых фармацевтических препаратов для лечения В-клеточного хронического лимфолейкоза. Выделенные курсивом потенциально перспективные ингибиторы удовлетворяют критерию Манна - Уитни не в полной мере (с вероятностью р<0,1), однако их показатели могут быть, вероятно, улучшены при увеличении выборок больных и здоровых.
Приведенный выше анализ был проделан на данных, полученных после культивирования культур клеток в присутствии блокаторов калиевых каналов в течение суток.
Таблица 1
№ п/п
Название
Теоретически рассчитанные концентрации
1
хлорид тетраэтиламмония
560 mM
2
4-аминопиридин
290 µМ
3
ацетат флекаинида
217 µМ
4
нифедипин
96 µМ
5
гидрохлорид дилтиазема
187 µМ
6
дигидрат гидрохлорида налтрексона
2 nM
7
анандамид (арахидонилэтаноламид)
2.7 µМ
8
хинин
14 µМ
9
гидрохлорид верапамила
6 µМ
10
рилузол
70 µМ
11
хинидин
1 <b>mM</b>
12
гидрохлорид никардипина
0.8 µМ
13
гидрохлорид бипувакаина
4.1 µМ
14
гидрохлорид амиодарона
35 µМ
15
кетоконазол
500 <b>nM</b>
16
пимозид
300 <b>nM</b>
17
галотан (2-бром-2-хлор-1,1,1 -трифторэтан)
200 М
18
3-изобутил-1-метилксантин
100 µМ
19
арахидоновая кислота
2 µМ
20
никотин
40 µМ
21
линолевая кислота
280 М
22
капсаицин
45 µМ
23
хлорид бария
5 <b>mM</b>
24
фосфат флудабарина
Нет данных
25
орлистат
Нет данных
Таблица 2
№ п/п
Название
Экспериментально определенный диапазон рабочих концентраций
4
нифедипин
30-960 µМ
5
гидрохлорид дилтиазема
6-600 µМ
7
анандамид (арахидонилэтаноламид)
0,27-27 µМ
9
гидрохлорид верапамила
6-600 µМ
10
рилузол
70-700 µМ
14
гидрохлорид амиодарона
3,5-35 µМ
17
галотан (2-бром-2-хлор-1,1,1-трифторэтан)
2-20 М
21
линолевая кислота
50-140 М
22
капсаицин
20-200 µМ
25
орлистат
0,5-5 mg/1
Таблица 3
<b>(3.1)</b> Значения критерия Манна-Уитни при концентрации 10х
Ингибитор
U
z
p-level
nifedipine
15,00
0,17
0,87
<i>diltiazem hydrochloride</i>
<i>5,00</i>
<i>1,87</i>
<i>0,06</i>
<b>anandamide</b>
<b>1,00</b>
<b>2,55</b>
<b>0,01</b>
verapamil hydrochloride
12,00
0,68
0,50
riluzole
14,00
0,34
0,73
amiodarone hydrochloride
12,00
0,68
0,50
linoleic acid
9,00
1,39
0,16
capsaicin
8,00
1,36
0,17
<i>fludarabine phosphate</i>
<i>4,00</i>
<i>1,89</i>
<i>0,06</i>
<b>orlistat</b>
<b>3,00</b>
<b>2,08</b>
<b>0,04</b>
<b>(3.2</b>) 3начения критерия Манна-Уитни при концентрации 1х
Ингибитор
U
Z
p-level
nifedipine
9,00
1,19
0,23
<b>diltiazem hydrochloride</b>
<b>1,00</b>
<b>2,55</b>
<b>0,01</b>
anandamide
16,00
0,00
1,00
<b>verapamil hydrochloride</b>
<b>2,00</b>
<b>2,38</b>
<b>0,02</b>
<i>riluzole</i>
<i>6,00</i>
<i>1,70</i>
<i>0,09</i>
amiodarone hydrochloride
12,00
0,68
0,50
linoleic acid
10,00
0,76
0,45
capsaicin
14,00
0,00
1,00
fludarabine phosphate
12,00
-0,38
0,71
<i>orlistat</i>
<i>4,00</i>
<i>1,89</i>
<i>0,06</i>
<b>(3.3)</b> Значения критерия Манна-Уитни при концентрации 0,1х
Ингибитор
и
Z
p-level
nifedipine
5,00
1,87
0,06
<b>diltiazem hydrochloride</b>
<b>4,00</b>
<b>2,04</b>
<b>0,04</b>
anandamide
9,00
1,19
0,23
<b>verapamil hydrochloride</b>
<b>4,00</b>
<b>2,04</b>
<b>0,04</b>
riluzole
13,00
0,51
0,61
<i>amiodarone hydrochloride</i>
<i>6,00</i>
<i>1,70</i>
<i>0,09</i>
<b>linoleic acid</b>
<b>4,00</b>
<b>2,04</b>
<b>0,04</b>
capsaicin
14,00
0,00
1,00
fludarabine phosphate
12,00
0,38
0,71
<i>orlistat</i>
<i>4,00</i>
<i>1,89</i>
<i>0,06</i>