МОДУЛЯТОРЫ ФАКТОРА В КОМПЛЕМЕНТА
MODULATORS OF COMPLEMENT FACTOR B

Перечень последовательностей
Настоящая заявка подана вместе с перечнем последовательностей в электронном формате. Указанный перечень последовательностей предоставлен в виде файла под названием BIOL0183WOSEQ_ST25.txt, созданного 11 сентября 2014 года, размер которого составляет 225 kb. Информация, содержащаяся в перечне последовательностей в электронном формате, включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
Область техники
В настоящих вариантах реализации предложены способы, соединения и композиции для лечения, предотвращения или облегчения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, путем введения субъекту ингибитора, специфичного в отношении фактора В комплемента (CFB).
Уровень техники
Система комплемента представляет собой часть врожденной иммунной системы хозяина, вовлеченную в лизис чужеродных клеток, усиление фагоцитоза антигенов, агрегацию антигеннесущих агентов и привлечение макрофагов и нейтрофилов. Система комплемента подразделяется на три пути активации - классический, лектиновый и альтернативный пути - которые сходятся к компоненту С3 с образованием ферментного комплекса, известного как С3-конвертаза, который расщепляет С3 на С3а и C3b. C3b связывается с С3-конвертазой, опосредуемой CFB, и приводит к образованию С5-конвертазы, которая расщепляет С5 на С5а и C5b, который инициирует путь формирования мембраноатакующего комплекса, приводящий к формированию мембраноатакующего комплекса (MAC), содержащего компоненты C5b, С6, С7, С8 и С9. Указанный мембраноатакующий комплекс (MAC) образует трансмембранные каналы и разрушает фосфолипидный бислой целевых клеток, приводя к их лизису.
В гомеостатическом состоянии альтернативный путь является непрерывно активированным на низком «холостом» уровне вследствие активации альтернативного пути спонтанным гидролизом С3 и образованием C3b, который генерирует С5-конвертазу.
Краткое описание изобретения
Система комплемента опосредует врожденный иммунитет и играет важную роль в нормальной воспалительной реакции на повреждение, но ее дисрегуляция может приводить к тяжелому повреждению. Активация альтернативного пути активации комплемента на уровне выше конститутивного «холостого» уровня может приводить к неограниченной гиперактивности и проявляться в виде заболеваний, связанных с дисрегуляцией комплемента.
Некоторые варианты реализации, представленные в настоящем документе, относятся к способам лечения, предотвращения или облегчения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, у субъекта путем введения ингибитора, специфичного в отношении фактора В комплемента (CFB). Некоторые варианты реализации, представленные в настоящем документе, относятся к способу ингибирования экспрессии CFB у субъекта, который страдает от или у которого присутствует риск развития заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, путем введения указанному субъекту CFB-специфичного ингибитора. В некоторых вариантах реализации способ уменьшения или ингибирования накопления отложений С3 в глазу субъекта, который страдает от или у которого присутствует риск развития заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, включает введение указанному субъекту CFB-специфичного ингибитора. В некоторых вариантах реализации способ уменьшения или ингибирования накопления отложений С3 в почке субъекта, который страдает от или у которого присутствует риск развития заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, включает введение указанному субъекту CFB-специфичного ингибитора.
Подробное описание изобретения
Следует понимать, что как вышеприведенное общее описание, так и следующее подробное описание носят лишь иллюстративный и поясняющий характер, и не ограничивают заявленное изобретение. В настоящем описании использование единственного числа включает множественное число, если специально не указано иное. В настоящем описании использование «или» означает «и/или», если не указано иное. Более того, употребление термина «включающий (содержащий)», а также других форм, таких как «включает (содержит)» и «включенный (содержащийся)», не является ограничивающим. Кроме того, такие термины, как «элемент» или «компонент», включают как элементы и компоненты, содержащие одну единицу, так и элементы и компоненты, содержащие больше одной субъединицы, если специально не указано иное.
В настоящем описании заголовки разделов приведены только для целей организации и не ограничивают описанный объект изобретения. Содержание всех документов или частей документов, приведенных в настоящей заявке, включая, но не ограничиваясь ими, патенты, заявки на патент, статьи, книги и монографии, явным образом включено в настоящее описание посредством ссылки в отношении частей, а также полного документа, рассмотренного в настоящем описании.
Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения:
2
2
3
Термин «2'-O-метоксиэтил» (также 2'-МОЕ и 2'-O(СН)-ОСН) относится к O-метоксиэтильной модификации в положении 2' фуранозного кольца. 2'-O-метоксиэтил-модифицированный сахар представляет собой модифицированный сахар.
Термин «2'-МОЕ-нуклеозид» (также 2'-O-метоксиэтилнуклеозид) означает нуклеозид, содержащий 2'-МОЕ-модифицированную сахарную группу.
Термин «2'-замещенный нуклеозид» означает нуклеозид, содержащий заместитель в 2'-положении фуранозильного кольца, отличный от Н или ОН. В некоторых вариантах реализации 2'-замещенные нуклеозиды включают нуклеозиды с модификациями бициклических сахаров.
Термин «3'-целевой сайт» относится к нуклеотиду целевой нуклеиновой кислоты, который комплементарен самому крайнему нуклеотиду с 3'-конца конкретного антисмыслового соединения.
Термин «5'-целевой сайт» относится к нуклеотиду целевой нуклеиновой кислоты, который комплементарен самому крайнему нуклеотиду с 5'-конца конкретного антисмыслового соединения.
Термин «5-метилцитозин» означает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в положении 5. 5-метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеотидное основание.
Термин «приблизительно» означает в пределах ±10% от значения. Например, если сказано, что «соединения осуществляли по меньшей мере приблизительно 70% ингибирование CFB», подразумевается, что ингибирование уровней CFB происходило в пределах диапазона от 60% до 80%.
Термин «введение» или «осуществление введения» относится к путям введения антисмыслового соединения, предложенного согласно настоящему изобретению, субъекту для выполнения предполагаемой функции. Пример пути введения, который может быть использован, включает, но не ограничивается им, парентеральное введение, такое как подкожная, внутривенная или внутримышечная инъекция или инфузия.
Термин «облегчение» относится к уменьшению по меньшей мере одного показателя, признака или симптома ассоциированного заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах реализации облегчение включает отсрочивание или замедление прогрессирования одного или более показателей состояния или заболевания. Тяжесть показателей может быть определена по субъективным или объективным критериям, которые известны специалисту в данной области техники.
Термин «животное» относится к животному, относящемуся к человеку или не относящемуся к человеку, включая, но не ограничиваясь ими, мышей, крыс, кроликов, собак, кошек, свиней и нечеловекообразных приматов, включая, но не ограничиваясь ими, обезьян и шимпанзе.
Термин «антисмысловая активность» означает любую детектируемую или измеримую активность, свойственную гибридизации антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах реализации антисмысловая активность представляет собой снижение количества или уровня экспрессии целевой нуклеиновой кислоты или белка, кодируемого такой целевой нуклеиновой кислотой.
Термин «антисмысловое соединение» означает олигомерное соединение, которое способно гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой путем образования водородных связей. Примеры антисмысловых соединений включают одноцепочечные и двухцепочечные соединения, такие как антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК (siPHK), короткие шпилечные РНК (shPHK), одноцепочечные РНК (ssPHK) и соединения на основе степени занятости (occupancy-based compound).
Термин «антисмысловое ингибирование» означает снижение уровней целевой нуклеиновой кислоты в присутствии антисмыслового соединения, комплементарного целевой нуклеиновой кислоте, по сравнению с уровнями целевой нуклеиновой кислоты в отсутствии указанного антисмыслового соединения.
«Антисмысловые механизмы» представляют собой те механизмы, в которые вовлечена гибридизация соединения с целевой нуклеиновой кислотой, при этом результатом или следствием гибридизации является либо распад цели, либо занятость цели с сопутствующей остановкой клеточного механизма, в который вовлечена, например, транскрипция или сплайсинг.
Термин «антисмысловой олигонуклеотид» означает одноцепочечный олигонуклеотид, содержащий последовательностью нуклеотидных оснований, которая обеспечивает гибридизацию с соответствующей областью или сегментом целевой нуклеиновой кислоты.
Термин «комплементарность оснований» относится к способности к точному спариванию нуклеотидных оснований антисмыслового олигонуклеотида с соответствующими нуклеотидными основаниями в целевой нуклеиновой кислоте (т.е. гибридизации), и опосредуется образованием водородных связей по Уотсону-Крику, хугстиновских или обратных хугстиновских водородных связей между соответствующими нуклеотидными основаниями.
Термин «бициклическая сахарная группа» означает модифицированную сахарную группу, содержащую 4-7-членное кольцо (включая, но не ограничиваясь им, фуранозил), содержащее мостик, соединяющий два атома указанного 4-7-членного кольца с образованием второго кольца, в результате чего образуется бициклическая структура. В некоторых вариантах реализации 4-7-членное кольцо представляет собой сахарное кольцо. В некоторых вариантах реализации 4-7-членное кольцо представляет собой фуранозил. В некоторых таких вариантах реализации указанный мостик соединяет 2'-углерод и 4'-углерод фуранозила.
2
2
2
2
2
2
Термин «бициклическая нуклеиновая кислота» или «BNA», или «нуклеозиды BNA» означает мономеры нуклеиновой кислоты, содержащие мостик, соединяющий два атома углерода в 4'- и 2'-положении сахарного звена нуклеозида, тем самым образуя бициклический сахар. Примеры такого бициклического сахара включают, но не ограничиваются ими, (А) α-L-метиленокси (4'-СН-O-2')-«закрытую» нуклеиновую кислоту (LNA), (В) β-D-метиленокси (4'-CH-O-2')-LNA, (С) этиленокси (4'-(СН)-O-2')-LNA, (D) аминоокси (4'-CH-O-N(R)-2')-LNA и (Е) оксиамино (4'-CH-N(R)-O-2')-LNA, изображенные ниже.
1
2
n
1
2
1
1
1
2
x
1
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
1
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
В настоящем описании LNA-соединения включают, но не ограничиваются ими, соединения, содержащие по меньшей мере один мостик между 4'- и 2'-положением сахара, при этом каждый из мостиков независимо содержит 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R)(R)]-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -C(=NR)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=O)- и -N(R)-; где: х равен 0, 1 или 2; n равен 1, 2, 3 или 4; каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C-C алкил, содержащий заместители C-C алкил, C-C алкенил, содержащий заместители C-C алкенил, C-C алкинил, содержащий заместители C-C алкинил, C-C арил, содержащий заместители С-С арил, гетероциклический радикал, содержащий заместители гетероциклический радикал, гетероарил, содержащий заместители гетероарил, C-C алициклический радикал, содержащий заместители С-С алициклический радикал, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацил (С(=O)-Н), содержащий заместители ацил, CN, сульфонил (S(=O)-J) или сульфоксил (S(=O)-J); и каждый J и J независимо представляет собой Н, C-C алкил, содержащий заместители C-C алкил, С-С алкенил, содержащий заместители C-C алкенил, C-C алкинил, содержащий заместители C-C алкинил, С-С арил, содержащий заместители C-C арил, ацил (С(=O)-Н), содержащий заместители ацил, гетероциклический радикал, содержащий заместители гетероциклический радикал, C-Саминоалкил, содержащий заместители C-C аминоалкил или защитную группу.
1
2
n
1
2
n
1
2
1
1
2
1
2
2
2
2
3
2
2
2
2
1
2
1
1
2
1
12
Примеры групп, образующих мостик 4'-2', включенных в определение LNA, включают, но не ограничиваются ими, одну из формул: -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-O- или -C(RR)-O-N(R)-. Кроме того, другие группы, образующие мостик, включенные в определение LNA, представляют собой мостики 4'-СН-2', 4'-(СН)-2', 4'-(СН)-2', 4'-СН-O-2', 4'-(СН)-O-2', 4'-CH-O-N(R)-2' и 4'-CH-N(R)-O-2', где каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу или C-C алкил.
2
2
2
2
2
2
2
В определение LNA согласно настоящему изобретению также включены LNA, в которых 2'-гидроксильная группа рибозильного сахарного кольца соединена с 4'-атомом углерода сахарного кольца, образуя таким образом метиленокси (4'-СН-O-2')-мостик с образованием бициклической сахарной группы. Мостик может также представлять собой метиленовую (-СН-) группу, соединяющую 2'-атом кислорода и 4'-атом углерода, при этом употребляется термин «метиленокси (4'-CH-O-2')-LNA». Более того, в случае бициклической сахарной группы, содержащей этиленовую мостиковую группу в данном положении, употребляется термин «этиленокси (4'-CHCH-O-2')-LNA». В настоящем описании α-L-метиленокси (4'-СН-O-2'), изомер метиленокси (4'-CH-O-2')-LNA, также включен в определение LNA.
Термин «кэп-структура» или «концевой кэп-фрагмент» означает химические модификации, которые были введены на любом конце антисмыслового соединения.
3
Термин «cEt» или «конформационно ограниченный этил» означает бициклическую сахарную группу, содержащую мостик, соединяющий 4'-углерод и 2'-углерод, при этом указанный мостик имеет формулу: 4'-СН(СН)-O-2'.
3
Термин «конформационно ограниченный этил-нуклеозид» (также cEt-нуклеозид) означает нуклеозид, содержащий бициклическую сахарную группу, содержащую мостик 4'-СН(СН)-O-2'.
Термин «фактор В комплемента (CFB)» означает любую нуклеиновую кислоту или белок CFB. Термин «нуклеиновая кислота CFB» означает любую нуклеиновую кислоту, кодирующую CFB. Например, в некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота CFB включает последовательность ДНК, кодирующую CFB, последовательность РНК, транскрибируемую из ДНК, кодирующей CFB (включая геномную ДНК, содержащую интроны и экзоны), включая не кодирующую белок (т.е. некодирующую) последовательность РНК и последовательность мРНК, кодирующую CFB. Термин «мРНК CFB» означает мРНК, кодирующую белок CFB.
Термин «CFB-специфичный ингибитор» относится к любому агенту, способному специфично ингибировать экспрессию или активность РНК CFB и/или белка CFB на молекулярном уровне. Например, CFB-специфичные ингибиторы включают нуклеиновые кислоты (в том числе антисмысловые соединения), пептиды, антитела, малые молекулы и другие агенты, способные ингибировать экспрессию РНК CFB и/или белка CFB.
Термин «химически отличающаяся область» относится к области антисмыслового соединения, которая в определенной степени химически отличается от другой области этого же антисмыслового соединения. Например, область, содержащая 2'-O-метоксиэтилнуклеотиды, химически отличается от области, содержащей нуклеотиды без 2'-O-метоксиэтильных модификаций.
Термин «химерные антисмысловые соединения» означает антисмысловые соединения, содержащие по меньшей мере две химически отличающихся области, при этом каждая позиция содержит множество субъединиц.
Термин «комплементарность» означает способность образовывать пары между нуклеотидными основаниями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты.
Очевидно, что термины «содержать (включать)», «содержит (включает)» и «содержащий (включающий)» предполагают включение указанного этапа или элемента, или группы этапов или элементов, но не исключение любого другого этапа или элемента, или группы этапов или элементов.
Термин «смежные нуклеотидные основания» означает нуклеотидные основания, непосредственно примыкающие друг к другу.
Термин «дезоксирибонуклеотид» означает нуклеотид, содержащий водород в положении 2' сахарной части нуклеотида. Дезоксирибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из различных заместителей.
Термин «получение» или «полученный для» относятся к способу получения олигомерного соединения, которое специфично гибридизуется с выбранной молекулой нуклеиновой кислоты.
Термин «эффективное количество» означает количество активного фармацевтического агента, достаточное для достижения желаемого физиологического исхода у индивидуума, нуждающегося в таком агенте. Эффективное количество может варьироваться среди индивидуумов в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, которого лечат, таксономической группы индивидуумов, которых лечат, состава композиции, оценки состояния у индивидуума и других соответствующих факторов.
Термин «эффективность» означает способность производить желаемый эффект.
Термин «экспрессия» включает все функции, посредством которых кодируемая геном информация превращается в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке. Такие структуры включают, но не ограничиваются ими, продукты транскрипции и трансляции.
Термин «полностью комплементарный» или «на 100% комплементарный» означает, что каждое нуклеотидное основание первой нуклеиновой кислоты имеет комплементарное нуклеотидное основание во второй нуклеиновой кислоте. В некоторых вариантах реализации первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, а целевая нуклеиновая кислота представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.
Термин «гэпмер (gapmer)» означает химерное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, содержащая множество нуклеозидов, обеспечивающих расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, содержащими один или более нуклеозидов, при этом нуклеозиды, составляющие внутреннюю область, химически отличаются от нуклеозида или нуклеозидов, составляющих внешние области. Внутренняя область может называться «гэпом», а внешние области могут называться «крыльями».
Термин «гибридизация» означает отжиг комплементарных молекул нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты включают, но не ограничиваются ими, антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень. В некоторых вариантах реализации комплементарные молекулы нуклеиновой кислоты включают, но не ограничиваются ими, антисмысловой олигонуклеотид и нуклеиновую кислоту-мишень.
Термин «идентификация животного, который страдает от или у которого присутствует риск развития заболевания, нарушения и/или состояния» означает идентификацию животного, у которого было диагностировано указанное заболевание, нарушение и/или состояние, или идентификацию животного, предрасположенного к развитию указанного заболевания, нарушения и/или состояния. Такая идентификация может быть осуществлена любым способом, включая оценку анамнеза индивидуума и стандартные клинические тесты или оценки.
Термин «непосредственно примыкающий» означает, что между непосредственно примыкающими элементами отсутствуют промежуточные элементы.
Термин «индивидуум» означает относящееся или не относящееся к человеку животное, которое было выбрано для лечения или терапии.
Термин «ингибирование экспрессии или активности» относится к снижению, блокаде экспрессии или активности и не обязательно указывает на полное устранение экспрессии или активности.
Термин «межнуклеозидная связь» относится к химической связи между нуклеозидами.
«Удлиненные» антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой те антисмысловые олигонуклеотиды, которые содержат один или более дополнительных нуклеозидов относительно антисмыслового олигонуклеотида, описанного в настоящем документе.
Термин «связанный дезоксинуклеозид» означает основание нуклеиновой кислоты (A, G, С, Т, U), содержащее в качестве заместителей дезоксирибозу, связанную фосфатным эфиром с образованием нуклеотида.
Термин «связанные нуклеозиды» означает примыкающие нуклеозиды, связанные друг с другом межнуклеозидной связью.
Термин «несоответствующее» или «некомплементарное нуклеотидное основание» относится к случаю, когда нуклеотидное основание первой нуклеиновой кислоты не способно к спариванию с соответствующим нуклеотидным основанием второй или целевой нуклеиновой кислоты.
Термин «модифицированная межнуклеозидная связь» относится к замещению или любому изменению относительно встречающейся в природе межнуклеозидной связи (т.е. фосфодиэфирной межнуклеозидной связи).
Термин «модифицированное нуклеотидное основание» означает любое нуклеотидное основание, отличное от аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. Термин «немодифицированное нуклеотидное основание» означает пуриновые основания - аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания - тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
Термин «модифицированный нуклеозид» означает нуклеозид, независимо содержащий модифицированную сахарную группу и/или модифицированное нуклеотидное основание.
Термин «модифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, независимо содержащий модифицированную сахарную группу, модифицированную межнуклеозидную связь или модифицированное нуклеотидное основание.
Термин «модифицированный олигонуклеотид» означает олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар и/или модифицированное нуклеотидное основание.
Термин «модифицированный сахар» означает замещение и/или любое изменение относительно природной сахарной группы.
Термин «модуляция» относится к изменению или коррекции признака в клетке, ткани, органе или организме. Например, модуляция мРНК CFB может означать повышение или понижение уровня мРНК CFB и/или белка CFB в клетке, ткани, органе или организме. «Модулятор» осуществляет изменение в клетке, ткани, органе или организме. Например, антисмысловое соединение для CFB может представлять собой модулятор, который уменьшает количество мРНК CFB и/или белка CFB в клетке, ткани, органе или организме.
Термин «мономер» относится к одному звену олигомера. Мономеры включают, но не ограничиваются ими, нуклеозиды и нуклеотиды, будь то встречающиеся в природе или модифицированные.
Термин «мотив» означает паттерн немодифицированных и модифицированных нуклеозидов в антисмысловом соединении.
Термин «природная сахарная группа» означает сахарную группу, встречающуюся в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).
Термин «встречающаяся в природе межнуклеозидная связь» означает 3'-5'-фосфодиэфирную связь.
Термин «некомплементарное нуклеотидное основание» относится к паре нуклеотидных оснований, которые не образуют водородные связи друг с другом или не обеспечивают гибридизацию иным образом.
Термин «нуклеиновая кислота» относится к молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. Термин «нуклеиновая кислота» включает, но не ограничивается ими, рибонуклеиновые кислоты (РНК), дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), одноцепочечные нуклеиновые кислоты и двухцепочечные нуклеиновые кислоты.
Термин «нуклеотидное основание» означает гетероциклическую молекулу, способную спариваться с основанием другой нуклеиновой кислоты.
Термин «комплементарность нуклеотидного основания» относится к нуклеотидному основанию, которое способно спариваться с другим нуклеотидным основанием. Например, в ДНК аденин (А) комплементарен тимину (Т). Например, в РНК аденин (А) комплементарен урацилу (U). В некоторых вариантах реализации термин «комплементарное нуклеотидное основание» относится к нуклеотидному основанию антисмыслового соединения, которое способно спариваться с нуклеотидным основанием целевой нуклеиновой кислоты. Например, если нуклеотидное основание в определенном положении антисмыслового соединения способно образовывать водородные связи с нуклеотидным основанием в определенном положении целевой нуклеиновой кислоты, то положение образования водородных связей между олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой считается комплементарным в данной паре нуклеотидных оснований.
Термин «последовательность нуклеотидных оснований» означает порядок расположения смежных нуклеотидных оснований независимо от какой-либо модификации сахаров, связей и/или нуклеотидных оснований.
Термин «нуклеозид» означает нуклеотидное основание, связанное с сахаром.
Термин «нуклеозидный миметик» включает те структуры, которые используют для замены сахара или сахара и основания, и не обязательно связи в одном или более положениях олигомерного соединения, такие как, например, нуклеозидные миметики, содержащие морфолино, циклогексенил, циклогексил, тетрагидропиранил, бициклические или трициклические миметики сахаров, например, нефуранозные сахарные звенья. Термин «нуклеотидный миметик» включает те структуры, которые используют для замены нуклеозида и связи в одном или более положениях олигомерного соединения, такие как, например, пептидные нуклеиновые кислоты или морфолиновые олигонуклеотиды (морфолиновые олигонуклеотиды, связанные -N(H)-C(=O)-O- или другой нефосфодиэфирной связью). Термин «заменитель сахара» пересекается с несколько более широким термином «нуклеозидный миметик», но указывает только на замену сахарного звена (фуранозного кольца). В настоящем описании тетрагидропиранильные кольца иллюстрируют пример заменителя сахара, в котором фуранозная сахарная группа была заменена тетрагидропиранильной кольцевой системой. Термин «миметик» относится к группам, которые заменяют сахар, нуклеотидное основание и/или межнуклеозидную связь. Как правило, миметик используют вместо сахара или комбинации сахар-межнуклеозидная связь, а нуклеотидное основание сохраняют для гибридизации с выбранной целью.
Термин «нуклеотид» означает нуклеозид, содержащий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.
Термин «олигомерное соединение» означает полимер из связанных мономерных субъединиц, способный гибридизоваться по меньшей мере с областью молекулы нуклеиновой кислоты.
Термин «олигонуклеозид» означает олигонуклеотид, в котором межнуклеозидные связи не содержат атом фосфора.
Термин «олигонуклеотид» означает полимер из связанных нуклеозидов, каждый из которых независимо друг от друга может быть модифицированным или немодифицированным.
Термин «парентеральное введение» означает введение посредством инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, интраперитонеальное введение или интракраниальное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.
Термин «фармацевтическая композиция» означает смесь веществ, подходящую для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать одно или более активных фармацевтических агентов и стерильный водный раствор.
Термин «фармацевтически приемлемые соли» означает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, т.е. соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного олигонуклеотида и не оказывают каких-либо нежелательных токсических эффектов.
Термин «фосфоротиоатная связь» означает связь между нуклеозидами, при этом фосфодиэфирная связь модифицирована путем замены одного из не образующих мостик атомов кислорода атомом серы. Фосфоротиоатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.
Термин «часть» означает определенное число смежных (т.е. связанных) нуклеотидных оснований нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации часть представляет собой определенное число смежных нуклеотидных оснований целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации часть представляет собой определенное число смежных нуклеотидных оснований антисмыслового соединения.
Термин «предотвращать» относится к отсрочиванию или предупреждению начала, развития или прогрессирования заболевания, нарушения или состояния на период времени от нескольких минут до неопределенного времени. Термин «предотвращать» также означает снижение риска развития заболевания, нарушения или состояния.
Термин «профилактически эффективное количество» относится к количеству фармацевтического агента, которое обеспечивает полезный профилактический или превентивный эффект для животного.
«Область» определяется как часть целевой нуклеиновой кислоты, имеющая по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику.
Термин «рибонуклеотид» означает нуклеотид, содержащий гидрокси в положении 2' сахарной части нуклеотида. Рибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из различных заместителей.
«Сегменты» определяются как меньшие части или подчасти областей в пределах целевой нуклеиновой кислоты.
Термин «побочные эффекты» означает физиологическое заболевание и/или состояния, связанные с лечением, отличные от желаемых эффектов. В некоторых вариантах реализации побочные эффекты включают реакции в месте инъекции, нарушения функции печени, выявляемые в результате исследования, нарушения функции почек, гепатотоксичность, нефротоксичность, нарушения центральной нервной системы, миопатии и недомогание. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени. Например, повышенный уровень билирубина может указывать на гепатотоксичность или нарушение функции печени.
В настоящем описании «сайты» определяются как уникальные положения нуклеотидных оснований в пределах целевой нуклеиновой кислоты.
Термин «замедляет прогрессирование» означает уменьшение развития указанного заболевания.
Термин «специфически гибридизуемый» относится к антисмысловому соединению, демонстрирующему степень комплементарности между антисмысловым олигонуклеотидом и целевой нуклеиновой кислотой, достаточную для индукции желаемого эффекта, при этом демонстрирующему минимальное действие или отсутствие действия на нецелевые нуклеиновые кислоты, в условиях, в которых специфическое связывание является желаемым, т.е. в физиологических условиях в случае анализов т vivo и терапевтического лечения. Термин «жесткие условия гибридизации» или «жесткие условия» относится к условиям, в которых олигомерное соединение будет гибридизоваться с целевой последовательностью, но с минимальным числом других последовательностей.
Термин «субъект» означает относящееся или не относящееся к человеку животное, которое было выбрано для лечения или терапии.
Термин «цель (мишень)» относится к белку, модуляция которого является желаемой.
Термин «целевой ген» относится к гену, кодирующему цель.
Термин «нацеливание» означает способ разработки и отбора антисмыслового соединения, которое будет специфически гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой и индуцировать желаемый эффект.
Все термины «целевая нуклеиновая кислота», «целевая РНК», «целевой РНК-транскрипт» и «нуклеиновая кислота-мишень» означают нуклеиновую кислоту, на которую могут быть нацелены антисмысловые соединения.
Термин «целевая область» означает часть целевой нуклеиновой кислоты, на которую нацелено одно или более антисмысловых соединений.
Термин «целевой сегмент» означает последовательность нуклеотидов целевой нуклеиновой кислоты, на которую нацелено антисмысловое соединение. Термин «5'-целевой сайт» относится к самому крайнему нуклеотиду целевого сегмента с 5'-конца. Термин «3'-целевой сайт» относится к самому крайнему нуклеотиду целевого сегмента с 3'-конца.
Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество фармацевтического агента, обеспечивающее полезный терапевтический эффект для индивидуума.
Термин «лечить» относится к введению фармацевтической композиции животному для изменения или ослабления заболевания, нарушения или состояния у указанного животного. В некоторых вариантах реализации животному может быть введена одна или более фармацевтических композиций.
Термин «немодифицированные» нуклеотидные основания означает пуриновые основания - аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания - тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
Термин «немодифицированный нуклеотид» означает нуклеотид, состоящий из встречающихся в природе нуклеотидных оснований, сахарных групп и межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации немодифицированный нуклеотид представляет собой нуклеотид РНК (т.е. β-D-рибонуклеозиды) или нуклеотид ДНК (т.е. β-D-дезоксирибонуклеозид).
Некоторые варианты реализации
В некоторых вариантах реализации предложены способы, соединения и композиции для ингибирования экспрессии фактора В комплемента (CFB).
В некоторых вариантах реализации предложены антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту CFB. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота CFB содержит последовательность, представленную под номером доступа в GENBANK NM_001710.5 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 1), номером доступа в GENBANK NT_007592.15, укороченную в пределах нуклеотидов 31852000-31861000 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 2), номером доступа в GENBANK NW_001116486.1, укороченную в пределах нуклеотидов 536000-545000 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 3), номером доступа в GENBANK XM_001113553.2 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 4) или номером доступа в GENBANK NM_008198.2 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 5).
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 9 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 10 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 11 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 12 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую последовательность нуклеотидных оснований любой из SEQ ID NO: 6-808.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из последовательности нуклеотидных оснований любой из SEQ ID NO: 6-808.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, комплементарных в пределах нуклеотидных оснований 30-49, 48-63, 150-169, 151-170, 152-171, 154-169, 154-173, 156-171, 156-175, 157-176, 158-173, 158-177, 480-499, 600-619, 638-657, 644-663, 738-757, 1089-1108, 1135-1154, 1141-1160, 1147-1166, 1150-1169, 1153-1172, 1159-1178, 1162-1181, 1165-1184, 1171-1186, 1171-1190, 1173-1188, 1173-1192, 1175-1190, 1175-1194, 1177-1196, 1183-1202, 1208-1227, 1235-1254, 1298-1317, 1304-1323, 1310-1329, 1316-1335, 1319-1338, 1322-1341, 1328-1347, 1349-1368, 1355-1374, 1393-1412, 1396-1415, 1399-1418, 1405-1424, 1421-1440, 1621-1640, 1646-1665, 1646-1665, 1647-1666, 1689-1708, 1749-1768, 1763-1782, 1912-1931, 2073-2092, 2085-2104, 2166-2185, 2172-2191, 2189-2208, 2191-2210, 2193-2212, 2195-2210, 2195-2214, 2196-2215, 2197-2212, 2197-2216, 2202-2221, 2223-2238, 2223-2242, 2225-2240, 2226-2245, 2227-2242, 2227-2246, 2238-2257, 2241-2260, 2267-2286, 2361-2380, 2388-2407, 2397-2416, 2448-2467, 2453-2472, 2455-2474, 2457-2472, 2457-2476, 2459-2474, 2459-2478, 2461-2476, 2461-2480, 2532-2551, 2550-2569, 2551-2566, 2551-2570, 2552-2568, 2552-2570, 2552-2571, 2553-2568, 2553-2570, 2553-2571, 2553-2572, 2554-2571, 2554-2572, 2554-2573, 2555-2570, 2555-2572, 2555-2574, 2556-2573, 2556-2574, 2556-2575, 2557-2573, 2557-2574, 2557-2575, 2557-2576, 2558-2575, 2558-2576, 2558-2577, 2559-2576, 2559-2577, 2559-2578, 2560-2577, 2560-2578, 2560-2579, 2561-2576, 2561-2578, 2561-2579, 2561-2580, 2562-2577, 2562-2579, 2562-2581, 2563-2578, 2563-2580, 2563-2582, 2564-2581, 2564-2583, 2565-2584, 2566-2583, 2566-2585, 2567-2582, 2567-2584, 2567-2586, 2568-2583, 2568-2585, 2568-2587, 2569-2586, 2569-2588, 2570-2585, 2570-2587, 2570-2589, 2571-2586, 2571-2588, 2571-2590, 2572-2589, 2572-2590, 2572-2591, 2573-2590, 2573-2592, 2574-2590, 2574-2591, 2574-2593, 2575-2590, 2575-2591, 2575-2592, 2575-2594, 2576-2593, 2576-2595, 2577-2594, 2577-2595, 2577-2596, 2578-2594, 2578-2596, 2578-2597, 2579-2598, 2580-2596, 2580-2597, 2580-2598, 2580-2599, 2581-2597, 2581-2598, 2581-2599, 2581-2600, 2582-2598, 2582-2599, 2582-2600, 2582-2601, 2583-2599, 2583-2600, 2583-2601, 2583-2602, 2584-2600, 2584-2601, 2584-2602, 2584-2603, 2585-2601, 2585-2603, 2585-2604, 2586-2601, 2586-2602, 2586-2604, 2586-2605, 2587-2602, 2587-2603, 2587-2605, 2587-2606, 2588-2603, 2588-2604, 2588-2605, 2588-2606, 2588-2607, 2589-2604, 2589-2605, 2589-2606, 2589-2607, 2589-2608, 2590-2605, 2590-2606, 2590-2607, 2590-2608, 2590-2609, 2590-2609, 2591-2607, 2591-2608, 2591-2609, 2591-2610, 2592-2607, 2592-2608, 2592-2609, 2592-2610, 2592-2611, 2593-2608, 2593-2609, 2593-2610, 2593-2612, 2594-2609, 2594-2610, 2594-2611, 2594-2612, 2594-2613, 2595-2610, 2595-2611, 2595-2612, 2595-2613, 2595-2614, 2596-2611, 2596-2612, 2596-2613, 2596-2614, 2596-2615, 2597-2612, 2597-2612, 2597-2613, 2597-2614, 2597-2615, 2597-2616, 2598-2613, 2598-2614, 2598-2615, 2598-2616, 2598-2617, 2599-2614, 2599-2615, 2599-2616, 2599-2617, 2599-2618, 2600-2615, 2600-2616, 2600-2617, 2600-2618, 2600-2619, 2601-2616, 2601-2617, 2601-2618, 2601-2619, 2601-2620, 2602-2617, 2602-2618, 2602-2619, 2602-2620, 2602-2621, 2603-2618, 2603-2619, 2603-2620, 2603-2621, 2603-2622, 2604-2619, 2604-2620, 2604-2621, 2604-2622, 2604-2623, 2605-2620, 2605-2621, 2605-2622, 2605-2623, 2605-2624, 2606-2621, 2606-2622, 2606-2623, 2606-2624, 2606-2625, 2607-2622, 2607-2623, 2607-2624, 2607-2625, 2607-2626, 2608-2623, 2608-2624, 2608-2625, 2608-2626, 2608-2627, 2609-2624, 2609-2625, 2609-2626, 2609-2627, 2609-2628, 2610-2625, 2610-2626, 2610-2627, 2610-2628, 2610-2629, 2611-2626, 2611-2627, 2611-2628, 2611-2629, 2611-2630, 2612-2627, 2612-2628, 2612-2629, 2612-2630, 2612-2631, 2613-2628, 2613-2629, 2613-2630, 2613-2631, 2614-2629, 2614-2630, 2614-2631, 2615-2630, 2615-2631 или 2616-2631 последовательности SEQ ID NO: 1, при этом указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарен SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую часть из по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований, комплементарную имеющей равную длину части из нуклеотидных оснований 30-49, 48-63, 150-169, 151-170, 152-171, 154-169, 154-173, 156-171, 156-175, 157-176, 158-173, 158-177, 480-499, 600-619, 638-657, 644-663, 738-757, 1089-1108, 1135-1154, 1141-1160, 1147-1166, 1150-1169, 1153-1172, 1159-1178, 1162-1181, 1165-1184, 1171-1186, 1171-1190, 1173-1188, 1173-1192, 1175-1190, 1175-1194, 1177-1196, 1183-1202, 1208-1227, 1235-1254, 1298-1317, 1304-1323, 1310-1329, 1316-1335, 1319-1338, 1322-1341, 1328-1347, 1349-1368, 1355-1374, 1393-1412, 1396-1415, 1399-1418, 1405-1424, 1421-1440, 1621-1640, 1646-1665, 1646-1665, 1647-1666, 1689-1708, 1749-1768, 1763-1782, 1912-1931, 2073-2092, 2085-2104, 2166-2185, 2172-2191, 2189-2208, 2191-2210, 2193-2212, 2195-2210, 2195-2214, 2196-2215, 2197-2212, 2197-2216, 2202-2221, 2223-2238, 2223-2242, 2225-2240, 2226-2245, 2227-2242, 2227-2246, 2238-2257, 2241-2260, 2267-2286, 2361-2380, 2388-2407, 2397-2416, 2448-2467, 2453-2472, 2455-2474, 2457-2472, 2457-2476, 2459-2474, 2459-2478, 2461-2476, 2461-2480, 2532-2551, 2550-2569, 2551-2566, 2551-2570, 2552-2568, 2552-2570, 2552-2571, 2553-2568, 2553-2570, 2553-2571, 2553-2572, 2554-2571, 2554-2572, 2554-2573, 2555-2570, 2555-2572, 2555-2574, 2556-2573, 2556-2574, 2556-2575, 2557-2573, 2557-2574, 2557-2575, 2557-2576, 2558-2575, 2558-2576, 2558-2577, 2559-2576, 2559-2577, 2559-2578, 2560-2577, 2560-2578, 2560-2579, 2561-2576, 2561-2578, 2561-2579, 2561-2580, 2562-2577, 2562-2579, 2562-2581, 2563-2578, 2563-2580, 2563-2582, 2564-2581, 2564-2583, 2565-2584, 2566-2583, 2566-2585, 2567-2582, 2567-2584, 2567-2586, 2568-2583, 2568-2585, 2568-2587, 2569-2586, 2569-2588, 2570-2585, 2570-2587, 2570-2589, 2571-2586, 2571-2588, 2571-2590, 2572-2589, 2572-2590, 2572-2591, 2573-2590, 2573-2592, 2574-2590, 2574-2591, 2574-2593, 2575-2590, 2575-2591, 2575-2592, 2575-2594, 2576-2593, 2576-2595, 2577-2594, 2577-2595, 2577-2596, 2578-2594, 2578-2596, 2578-2597, 2579-2598, 2580-2596, 2580-2597, 2580-2598, 2580-2599, 2581-2597, 2581-2598, 2581-2599, 2581-2600, 2582-2598, 2582-2599, 2582-2600, 2582-2601, 2583-2599, 2583-2600, 2583-2601, 2583-2602, 2584-2600, 2584-2601, 2584-2602, 2584-2603, 2585-2601, 2585-2603, 2585-2604, 2586-2601, 2586-2602, 2586-2604, 2586-2605, 2587-2602, 2587-2603, 2587-2605, 2587-2606, 2588-2603, 2588-2604, 2588-2605, 2588-2606, 2588-2607, 2589-2604, 2589-2605, 2589-2606, 2589-2607, 2589-2608, 2590-2605, 2590-2606, 2590-2607, 2590-2608, 2590-2609, 2590-2609, 2591-2607, 2591-2608, 2591-2609, 2591-2610, 2592-2607, 2592-2608, 2592-2609, 2592-2610, 2592-2611, 2593-2608, 2593-2609, 2593-2610, 2593-2612, 2594-2609, 2594-2610, 2594-2611, 2594-2612, 2594-2613, 2595-2610, 2595-2611, 2595-2612, 2595-2613, 2595-2614, 2596-2611, 2596-2612, 2596-2613, 2596-2614, 2596-2615, 2597-2612, 2597-2612, 2597-2613, 2597-2614, 2597-2615, 2597-2616, 2598-2613, 2598-2614, 2598-2615, 2598-2616, 2598-2617, 2599-2614, 2599-2615, 2599-2616, 2599-2617, 2599-2618, 2600-2615, 2600-2616, 2600-2617, 2600-2618, 2600-2619, 2601-2616, 2601-2617, 2601-2618, 2601-2619, 2601-2620, 2602-2617, 2602-2618, 2602-2619, 2602-2620, 2602-2621, 2603-2618, 2603-2619, 2603-2620, 2603-2621, 2603-2622, 2604-2619, 2604-2620, 2604-2621, 2604-2622, 2604-2623, 2605-2620, 2605-2621, 2605-2622, 2605-2623, 2605-2624, 2606-2621, 2606-2622, 2606-2623, 2606-2624, 2606-2625, 2607-2622, 2607-2623, 2607-2624, 2607-2625, 2607-2626, 2608-2623, 2608-2624, 2608-2625, 2608-2626, 2608-2627, 2609-2624, 2609-2625, 2609-2626, 2609-2627, 2609-2628, 2610-2625, 2610-2626, 2610-2627, 2610-2628, 2610-2629, 2611-2626, 2611-2627, 2611-2628, 2611-2629, 2611-2630, 2612-2627, 2612-2628, 2612-2629, 2612-2630, 2612-2631, 2613-2628, 2613-2629, 2613-2630, 2613-2631, 2614-2629, 2614-2630, 2614-2631, 2615-2630, 2615-2631 или 2616-2631 последовательности SEQ ID NO: 1, при этом указанная последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарна SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, комплементарных в пределах нуклеотидных оснований 1608-1627, 1685-1704, 1686-1705, 1751-1770, 1769-1784, 1871-1890, 1872-1891, 1873-1892, 1875-1890, 1875-1894, 1877-1892, 1877-1896, 1878-1897, 1879-1894, 1879-1898, 2288-2307, 2808-2827, 2846-2865, 2852-2871, 2946-2965, 3773-3792, 3819-3838, 3825-3844, 3831-3850, 3834-3853, 3837-3856, 3843-3862, 4151-4166, 4151-4170, 4153-4172, 4159-4178, 4184-4203, 4211-4230, 4609-4628, 4612-4631, 4615-4634, 4621-4640, 4642-4661, 4648-4667, 4686-4705, 4689-4708, 4692-4711, 4698-4717, 4714-4733, 5270-5289, 5295-5314, 5296-5315, 5830-5849, 5890-5909, 5904-5923, 6406-6425, 6662-6681, 6674-6693, 6954-6973, 6960-6979, 6977-6996, 6979-6998, 6981-7000, 6983-6998, 6983-7002, 6984-7003, 6985-7000, 6985-7004, 6990-7009, 7122-7141, 7125-7144, 7151-7170, 7353-7372, 7362-7381, 7683-7702, 7688-7707, 7690-7709, 7692-7707, 7692-7711, 7694-7709, 7694-7713, 7696-7711, 7696-7715, 7767-7786, 7785-7804, 7786-7801, 7787-7803, 7787-7805, 7787-7806, 7788-7803, 7788-7805, 7788-7806, 7788-7807, 7789-7806, 7789-7807, 7789-7808, 7790-7805, 7790-7807, 7790-7809, 7791-7808, 7791-7809, 7791-7810, 7792-7808, 7792-7809, 7792-7810, 7792-7811, 7793-7810, 7793-7811, 7793-7812, 7794-7811, 7794-7812, 7794-7813, 7795-7812, 7795-7813, 7795-7814, 7796-7811, 7796-7813, 7796-7814, 7796-7815, 7797-7812, 7797-7814, 7797-7816, 7798-7813, 7798-7815, 7798-7817, 7799-7816, 7799-7818, 7800-7819, 7801-7818, 7801-7820, 7802-7817, 7802-7819, 7802-7821, 7803-7818, 7803-7820, 7803-7822, 7804-7821, 7804-7823, 7805-7820, 7805-7822, 7805-7824, 7806-7821, 7806-7823, 7806-7825, 7807-7824, 7807-7825, 7807-7826, 7808-7825, 7808-7827, 7809-7825, 7809-7826, 7809-7828, 7810-7825, 7810-7826, 7810-7827, 7810-7829, 7811-7828, 7811-7830, 7812-7829, 7812-7830, 7812-7831, 7813-7829, 7813-7831, 7813-7832, 7814-7833, 7815-7831, 7815-7832, 7815-7833, 7815-7834, 7816-7832, 7816-7833, 7816-7834, 7816-7835, 7817-7833, 7817-7834, 7817-7835, 7817-7836, 7818-7834, 7818-7835, 7818-7836, 7818-7837, 7819-7835, 7819-7836, 7819-7837, 7819-7838, 7820-7836, 7820-7838, 7820-7839, 7821-7836, 7821-7837, 7821-7839, 7821-7840, 7822-7837, 7822-7838, 7822-7840, 7822-7841, 7823-7838, 7823-7839, 7823-7839, 7823-7840, 7823-7841, 7823-7842, 7824-7839, 7824-7840, 7824-7840, 7824-7841, 7824-7842, 7824-7843, 7825-7840, 7825-7841, 7825-7842, 7825-7843, 7825-7844, 7826-7842, 7826-7843, 7826-7844, 7826-7845, 7827-7842, 7827-7843, 7827-7844, 7827-7845, 7827-7846, 7828-7843, 7828-7844, 7828-7845, 7828-7847, 7829-7844, 7829-7845, 7829-7846, 7829-7847, 7829-7848, 7830-7845, 7830-7846, 7830-7847, 7830-7848, 7830-7849, 7831-7846, 7831-7847, 7831-7848, 7831-7849, 7831-7850, 7832-7847, 7832-7848, 7832-7849, 7832-7850, 7832-7851, 7833-7848, 7833-7849, 7833-7850, 7833-7851, 7833-7852, 7834-7849, 7834-7850, 7834-7851, 7834-7852, 7834-7853, 7835-7850, 7835-7851, 7835-7852, 7835-7853, 7835-7854, 7836-7851, 7836-7852, 7836-7853, 7836-7854, 7836-7855, 7837-7852, 7837-7853, 7837-7854, 7837-7855, 7837-7856, 7838-7853, 7838-7854, 7838-7855, 7838-7856, 7838-7857, 7839-7854, 7839-7855, 7839-7856, 7839-7857, 7839-7858, 7840-7855, 7840-7856, 7840-7857, 7840-7858, 7840-7859, 7841-7856, 7841-7857, 7841-7858, 7841-7859, 7841-7860, 7842-7857, 7842-7858, 7842-7859, 7842-7860, 7842-7861, 7843-7858, 7843-7859, 7843-7860, 7843-7861, 7843-7862, 7844-7859, 7844-7860, 7844-7861, 7844-7862, 7845-7860, 7845-7861, 7845-7862, 7846-7861 или 7846-7862 последовательности SEQ ID NO: 2, при этом указанный модифицированный олигонуклеотид по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарен SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах реализации предложено соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую часть из по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований, комплементарную имеющей равную длину части из нуклеотидных оснований 1608-1627, 1685-1704, 1686-1705, 1751-1770, 1769-1784, 1871-1890, 1872-1891, 1873-1892, 1875-1890, 1875-1894, 1877-1892, 1877-1896, 1878-1897, 1879-1894, 1879-1898, 2288-2307, 2808-2827, 2846-2865, 2852-2871, 2946-2965, 3773-3792, 3819-3838, 3825-3844, 3831-3850, 3834-3853, 3837-3856, 3843-3862, 4151-4166, 4151-4170, 4153-4172, 4159-4178, 4184-4203, 4211-4230, 4609-4628, 4612-4631, 4615-4634, 4621-4640, 4642-4661, 4648-4667, 4686-4705, 4689-4708, 4692-4711, 4698-4717, 4714-4733, 5270-5289, 5295-5314, 5296-5315, 5830-5849, 5890-5909, 5904-5923, 6406-6425, 6662-6681, 6674-6693, 6954-6973, 6960-6979, 6977-6996, 6979-6998, 6981-7000, 6983-6998, 6983-7002, 6984-7003, 6985-7000, 6985-7004, 6990-7009, 7122-7141, 7125-7144, 7151-7170, 7353-7372, 7362-7381, 7683-7702, 7688-7707, 7690-7709, 7692-7707, 7692-7711, 7694-7709, 7694-7713, 7696-7711, 7696-7715, 7767-7786, 7785-7804, 7786-7801, 7787-7803, 7787-7805, 7787-7806, 7788-7803, 7788-7805, 7788-7806, 7788-7807, 7789-7806, 7789-7807, 7789-7808, 7790-7805, 7790-7807, 7790-7809, 7791-7808, 7791-7809, 7791-7810, 7792-7808, 7792-7809, 7792-7810, 7792-7811, 7793-7810, 7793-7811, 7793-7812, 7794-7811, 7794-7812, 7794-7813, 7795-7812, 7795-7813, 7795-7814, 7796-7811, 7796-7813, 7796-7814, 7796-7815, 7797-7812, 7797-7814, 7797-7816, 7798-7813, 7798-7815, 7798-7817, 7799-7816, 7799-7818, 7800-7819, 7801-7818, 7801-7820, 7802-7817, 7802-7819, 7802-7821, 7803-7818, 7803-7820, 7803-7822, 7804-7821, 7804-7823, 7805-7820, 7805-7822, 7805-7824, 7806-7821, 7806-7823, 7806-7825, 7807-7824, 7807-7825, 7807-7826, 7808-7825, 7808-7827, 7809-7825, 7809-7826, 7809-7828, 7810-7825, 7810-7826, 7810-7827, 7810-7829, 7811-7828, 7811-7830, 7812-7829, 7812-7830, 7812-7831, 7813-7829, 7813-7831, 7813-7832, 7814-7833, 7815-7831, 7815-7832, 7815-7833, 7815-7834, 7816-7832, 7816-7833, 7816-7834, 7816-7835, 7817-7833, 7817-7834, 7817-7835, 7817-7836, 7818-7834, 7818-7835, 7818-7836, 7818-7837, 7819-7835, 7819-7836, 7819-7837, 7819-7838, 7820-7836, 7820-7838, 7820-7839, 7821-7836, 7821-7837, 7821-7839, 7821-7840, 7822-7837, 7822-7838, 7822-7840, 7822-7841, 7823-7838, 7823-7839, 7823-7839, 7823-7840, 7823-7841, 7823-7842, 7824-7839, 7824-7840, 7824-7840, 7824-7841, 7824-7842, 7824-7843, 7825-7840, 7825-7841, 7825-7842, 7825-7843, 7825-7844, 7826-7842, 7826-7843, 7826-7844, 7826-7845, 7827-7842, 7827-7843, 7827-7844, 7827-7845, 7827-7846, 7828-7843, 7828-7844, 7828-7845, 7828-7847, 7829-7844, 7829-7845, 7829-7846, 7829-7847, 7829-7848, 7830-7845, 7830-7846, 7830-7847, 7830-7848, 7830-7849, 7831-7846, 7831-7847, 7831-7848, 7831-7849, 7831-7850, 7832-7847, 7832-7848, 7832-7849, 7832-7850, 7832-7851, 7833-7848, 7833-7849, 7833-7850, 7833-7851, 7833-7852, 7834-7849, 7834-7850, 7834-7851, 7834-7852, 7834-7853, 7835-7850, 7835-7851, 7835-7852, 7835-7853, 7835-7854, 7836-7851, 7836-7852, 7836-7853, 7836-7854, 7836-7855, 7837-7852, 7837-7853, 7837-7854, 7837-7855, 7837-7856, 7838-7853, 7838-7854, 7838-7855, 7838-7856, 7838-7857, 7839-7854, 7839-7855, 7839-7856, 7839-7857, 7839-7858, 7840-7855, 7840-7856, 7840-7857, 7840-7858, 7840-7859, 7841-7856, 7841-7857, 7841-7858, 7841-7859, 7841-7860, 7842-7857, 7842-7858, 7842-7859, 7842-7860, 7842-7861, 7843-7858, 7843-7859, 7843-7860, 7843-7861, 7843-7862, 7844-7859, 7844-7860, 7844-7861, 7844-7862, 7845-7860, 7845-7861, 7845-7862, 7846-7861 и 7846-7862 последовательности SEQ ID NO: 2, при этом указанная последовательность нуклеотидных оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или на 100% комплементарна SEQ ID NO: 2.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB. В некоторых вариантах реализации такие соединения или олигонуклеотиды, нацеленные на область нуклеиновой кислоты CFB, содержат часть из смежных нуклеотидных оснований, которая комплементарна имеющей равную длину части из нуклеотидных оснований в указанной области. Например, указанная часть может представлять собой часть из по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеотидных оснований, комплементарную имеющей равную длину части области, указанной в настоящем описании. В некоторых вариантах реализации такие соединения или олигонуклеотид нацелены на следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 1: 30-49, 48-63, 150-169, 151-170, 152-171, 154-169, 154-173, 156-171, 156-175, 157-176, 158-173, 158-177, 480-499, 600-619, 638-657, 644-663, 738-757, 1089-1108, 1135-1154, 1141-1160, 1147-1166, 1150-1169, 1153-1172, 1159-1178, 1162-1181, 1165-1184, 1171-1186, 1171-1190, 1173-1188, 1173-1192, 1175-1190, 1175-1194, 1177-1196, 1183-1202, 1208-1227, 1235-1254, 1298-1317, 1304-1323, 1310-1329, 1316-1335, 1319-1338, 1322-1341, 1328-1347, 1349-1368, 1355-1374, 1393-1412, 1396-1415, 1399-1418, 1405-1424, 1421-1440, 1621-1640, 1646-1665, 1646-1665, 1647-1666, 1689-1708, 1749-1768, 1763-1782, 1912-1931, 2073-2092, 2085-2104, 2166-2185, 2172-2191, 2189-2208, 2191-2210, 2193-2212, 2195-2210, 2195-2214, 2196-2215, 2197-2212, 2197-2216, 2202-2221, 2223-2238, 2223-2242, 2225-2240, 2226-2245, 2227-2242, 2227-2246, 2238-2257, 2241-2260, 2267-2286, 2361-2380, 2388-2407, 2397-2416, 2448-2467, 2453-2472, 2455-2474, 2457-2472, 2457-2476, 2459-2474, 2459-2478, 2461-2476, 2461-2480, 2532-2551, 2550-2569, 2551-2566, 2551-2570, 2552-2568, 2552-2570, 2552-2571, 2553-2568, 2553-2570, 2553-2571, 2553-2572, 2554-2571, 2554-2572, 2554-2573, 2555-2570, 2555-2572, 2555-2574, 2556-2573, 2556-2574, 2556-2575, 2557-2573, 2557-2574, 2557-2575, 2557-2576, 2558-2575, 2558-2576, 2558-2577, 2559-2576, 2559-2577, 2559-2578, 2560-2577, 2560-2578, 2560-2579, 2561-2576, 2561-2578, 2561-2579, 2561-2580, 2562-2577, 2562-2579, 2562-2581, 2563-2578, 2563-2580, 2563-2582, 2564-2581, 2564-2583, 2565-2584, 2566-2583, 2566-2585, 2567-2582, 2567-2584, 2567-2586, 2568-2583, 2568-2585, 2568-2587, 2569-2586, 2569-2588, 2570-2585, 2570-2587, 2570-2589, 2571-2586, 2571-2588, 2571-2590, 2572-2589, 2572-2590, 2572-2591, 2573-2590, 2573-2592, 2574-2590, 2574-2591, 2574-2593, 2575-2590, 2575-2591, 2575-2592, 2575-2594, 2576-2593, 2576-2595, 2577-2594, 2577-2595, 2577-2596, 2578-2594, 2578-2596, 2578-2597, 2579-2598, 2580-2596, 2580-2597, 2580-2598, 2580-2599, 2581-2597, 2581-2598, 2581-2599, 2581-2600, 2582-2598, 2582-2599, 2582-2600, 2582-2601, 2583-2599, 2583-2600, 2583-2601, 2583-2602, 2584-2600, 2584-2601, 2584-2602, 2584-2603, 2585-2601, 2585-2603, 2585-2604, 2586-2601, 2586-2602, 2586-2604, 2586-2605, 2587-2602, 2587-2603, 2587-2605, 2587-2606, 2588-2603, 2588-2604, 2588-2605, 2588-2606, 2588-2607, 2589-2604, 2589-2605, 2589-2606, 2589-2607, 2589-2608, 2590-2605, 2590-2606, 2590-2607, 2590-2608, 2590-2609, 2590-2609, 2591-2607, 2591-2608, 2591-2609, 2591-2610, 2592-2607, 2592-2608, 2592-2609, 2592-2610, 2592-2611, 2593-2608, 2593-2609, 2593-2610, 2593-2612, 2594-2609, 2594-2610, 2594-2611, 2594-2612, 2594-2613, 2595-2610, 2595-2611, 2595-2612, 2595-2613, 2595-2614, 2596-2611, 2596-2612, 2596-2613, 2596-2614, 2596-2615, 2597-2612, 2597-2612, 2597-2613, 2597-2614, 2597-2615, 2597-2616, 2598-2613, 2598-2614, 2598-2615, 2598-2616, 2598-2617, 2599-2614, 2599-2615, 2599-2616, 2599-2617, 2599-2618, 2600-2615, 2600-2616, 2600-2617, 2600-2618, 2600-2619, 2601-2616, 2601-2617, 2601-2618, 2601-2619, 2601-2620, 2602-2617, 2602-2618, 2602-2619, 2602-2620, 2602-2621, 2603-2618, 2603-2619, 2603-2620, 2603-2621, 2603-2622, 2604-2619, 2604-2620, 2604-2621, 2604-2622, 2604-2623, 2605-2620, 2605-2621, 2605-2622, 2605-2623, 2605-2624, 2606-2621, 2606-2622, 2606-2623, 2606-2624, 2606-2625, 2607-2622, 2607-2623, 2607-2624, 2607-2625, 2607-2626, 2608-2623, 2608-2624, 2608-2625, 2608-2626, 2608-2627, 2609-2624, 2609-2625, 2609-2626, 2609-2627, 2609-2628, 2610-2625, 2610-2626, 2610-2627, 2610-2628, 2610-2629, 2611-2626, 2611-2627, 2611-2628, 2611-2629, 2611-2630, 2612-2627, 2612-2628, 2612-2629, 2612-2630, 2612-2631, 2613-2628, 2613-2629, 2613-2630, 2613-2631, 2614-2629, 2614-2630, 2614-2631, 2615-2630, 2615-2631 и 2616-2631.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB. В некоторых вариантах реализации такие соединения или олигонуклеотиды, нацеленные на область нуклеиновой кислоты CFB, содержат часть из смежных нуклеотидных оснований, которая комплементарна имеющей равную длину части из нуклеотидных оснований в указанной области. Например, указанная часть может представлять собой часть из по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеотидных оснований, комплементарную имеющей равную длину части области, указанной в настоящем описании. В некоторых вариантах реализации такие соединения или олигонуклеотид нацелены на следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 2: 1608-1627, 1685-1704, 1686-1705, 1751-1770, 1769-1784, 1871-1890, 1872-1891, 1873-1892, 1875-1890, 1875-1894, 1877-1892, 1877-1896, 1878-1897, 1879-1894, 1879-1898, 2288-2307, 2808-2827, 2846-2865, 2852-2871, 2946-2965, 3773-3792, 3819-3838, 3825-3844, 3831-3850, 3834-3853, 3837-3856, 3843-3862, 4151-4166, 4151-4170, 4153-4172, 4159-4178, 4184-4203, 4211-4230, 4609-4628, 4612-4631, 4615-4634, 4621-4640, 4642-4661, 4648-4667, 4686-4705, 4689-4708, 4692-4711, 4698-4717, 4714-4733, 5270-5289, 5295-5314, 5296-5315, 5830-5849, 5890-5909, 5904-5923, 6406-6425, 6662-6681, 6674-6693, 6954-6973, 6960-6979, 6977-6996, 6979-6998, 6981-7000, 6983-6998, 6983-7002, 6984-7003, 6985-7000, 6985-7004, 6990-7009, 7122-7141, 7125-7144, 7151-7170, 7353-7372, 7362-7381, 7683-7702, 7688-7707, 7690-7709, 7692-7707, 7692-7711, 7694-7709, 7694-7713, 7696-7711, 7696-7715, 7767-7786, 7785-7804, 7786-7801, 7787-7803, 7787-7805, 7787-7806, 7788-7803, 7788-7805, 7788-7806, 7788-7807, 7789-7806, 7789-7807, 7789-7808, 7790-7805, 7790-7807, 7790-7809, 7791-7808, 7791-7809, 7791-7810, 7792-7808, 7792-7809, 7792-7810, 7792-7811, 7793-7810, 7793-7811, 7793-7812, 7794-7811, 7794-7812, 7794-7813, 7795-7812, 7795-7813, 7795-7814, 7796-7811, 7796-7813, 7796-7814, 7796-7815, 7797-7812, 7797-7814, 7797-7816, 7798-7813, 7798-7815, 7798-7817, 7799-7816, 7799-7818, 7800-7819, 7801-7818, 7801-7820, 7802-7817, 7802-7819, 7802-7821, 7803-7818, 7803-7820, 7803-7822, 7804-7821, 7804-7823, 7805-7820, 7805-7822, 7805-7824, 7806-7821, 7806-7823, 7806-7825, 7807-7824, 7807-7825, 7807-7826, 7808-7825, 7808-7827, 7809-7825, 7809-7826, 7809-7828, 7810-7825, 7810-7826, 7810-7827, 7810-7829, 7811-7828, 7811-7830, 7812-7829, 7812-7830, 7812-7831, 7813-7829, 7813-7831, 7813-7832, 7814-7833, 7815-7831, 7815-7832, 7815-7833, 7815-7834, 7816-7832, 7816-7833, 7816-7834, 7816-7835, 7817-7833, 7817-7834, 7817-7835, 7817-7836, 7818-7834, 7818-7835, 7818-7836, 7818-7837, 7819-7835, 7819-7836, 7819-7837, 7819-7838, 7820-7836, 7820-7838, 7820-7839, 7821-7836, 7821-7837, 7821-7839, 7821-7840, 7822-7837, 7822-7838, 7822-7840, 7822-7841, 7823-7838, 7823-7839, 7823-7839, 7823-7840, 7823-7841, 7823-7842, 7824-7839, 7824-7840, 7824-7840, 7824-7841, 7824-7842, 7824-7843, 7825-7840, 7825-7841, 7825-7842, 7825-7843, 7825-7844, 7826-7842, 7826-7843, 7826-7844, 7826-7845, 7827-7842, 7827-7843, 7827-7844, 7827-7845, 7827-7846, 7828-7843, 7828-7844, 7828-7845, 7828-7847, 7829-7844, 7829-7845, 7829-7846, 7829-7847, 7829-7848, 7830-7845, 7830-7846, 7830-7847, 7830-7848, 7830-7849, 7831-7846, 7831-7847, 7831-7848, 7831-7849, 7831-7850, 7832-7847, 7832-7848, 7832-7849, 7832-7850, 7832-7851, 7833-7848, 7833-7849, 7833-7850, 7833-7851, 7833-7852, 7834-7849, 7834-7850, 7834-7851, 7834-7852, 7834-7853, 7835-7850, 7835-7851, 7835-7852, 7835-7853, 7835-7854, 7836-7851, 7836-7852, 7836-7853, 7836-7854, 7836-7855, 7837-7852, 7837-7853, 7837-7854, 7837-7855, 7837-7856, 7838-7853, 7838-7854, 7838-7855, 7838-7856, 7838-7857, 7839-7854, 7839-7855, 7839-7856, 7839-7857, 7839-7858, 7840-7855, 7840-7856, 7840-7857, 7840-7858, 7840-7859, 7841-7856, 7841-7857, 7841-7858, 7841-7859, 7841-7860, 7842-7857, 7842-7858, 7842-7859, 7842-7860, 7842-7861, 7843-7858, 7843-7859, 7843-7860, 7843-7861, 7843-7862, 7844-7859, 7844-7860, 7844-7861, 7844-7862, 7845-7860, 7845-7861, 7845-7862, 7846-7861 и 7846-7862.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на 3'-нетранслируемую область (3'UTR) нуклеиновой кислоты CFB. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на нуклеотиды 2574-2626 нуклеиновой кислоты CFB, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения или олигонуклеотиды содержат часть из по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеотидных оснований, комплементарную имеющей равную длину части в пределах нуклеотидов 2574-2626 нуклеиновой кислоты CFB, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB, имеющей последовательность нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 1, в пределах нуклеотидных оснований 2457-2631, 2457-2472, 2457-2474, 2457-2476, 2457-2566, 2457-2570, 2457-2571, 2457-2572, 2457-2573, 2457-2574, 2457-2575, 2457-2576, 2457-2577, 2457-2578, 2457-2579, 2457-2580, 2457-2581, 2457-2582, 2457-2583, 2457-2584, 2457-2585, 2457-2586, 2457-2587, 2457-2588, 2457-2589, 2457-2590, 2457-2591, 2457-2592, 2457-2593, 2457-2594, 2457-2595, 2457-2596, 2457-2597, 2457-2598, 2457-2599, 2457-2600, 2457-2601, 2457-2602, 2457-2603, 2457-2604, 2457-2605, 2457-2606, 2457-2607, 2457-2608, 2457-2609, 2457-2610, 2457-2611, 2457-2612, 2457-2613, 2457-2614, 2457-2615, 2457-2616, 2457-2617, 2457-2618, 2457-2619, 2457-2620, 2457-2621, 2457-2622, 2457-2623, 2457-2624, 2457-2625, 2457-2626, 2457-2627, 2457-2628, 2457-2629, 2457-2630, 2457-2631, 2459-2474, 2459-2476, 2459-2566, 2459-2570, 2459-2571, 2459-2572, 2459-2573, 2459-2574, 2459-2575, 2459-2576, 2459-2577, 2459-2578, 2459-2579, 2459-2580, 2459-2581, 2459-2582, 2459-2583, 2459-2584, 2459-2585, 2459-2586, 2459-2587, 2459-2588, 2459-2589, 2459-2590, 2459-2591, 2459-2592, 2459-2593, 2459-2594, 2459-2595, 2459-2596, 2459-2597, 2459-2598, 2459-2599, 2459-2600, 2459-2601, 2459-2602, 2459-2603, 2459-2604, 2459-2605, 2459-2606, 2459-2607, 2459-2608, 2459-2609, 2459-2610, 2459-2611, 2459-2612, 2459-2613, 2459-2614, 2459-2615, 2459-2616, 2459-2617, 2459-2618, 2459-2619, 2459-2620, 2459-2621, 2459-2622, 2459-2623, 2459-2624, 2459-2625, 2459-2626, 2459-2627, 2459-2628, 2459-2629, 2459-2630, 2459-2631, 2461-2476, 2461-2566, 2461-2570, 2461-2571, 2461-2572, 2461-2573, 2461-2574, 2461-2575, 2461-2576, 2461-2577, 2461-2578, 2461-2579, 2461-2580, 2461-2581, 2461-2582, 2461-2583, 2461-2584, 2461-2585, 2461-2586, 2461-2587, 2461-2588, 2461-2589, 2461-2590, 2461-2591, 2461-2592, 2461-2593, 2461-2594, 2461-2595, 2461-2596, 2461-2597, 2461-2598, 2461-2599, 2461-2600, 2461-2601, 2461-2602, 2461-2603, 2461-2604, 2461-2605, 2461-2606, 2461-2607, 2461-2608, 2461-2609, 2461-2610, 2461-2611, 2461-2612, 2461-2613, 2461-2614, 2461-2615, 2461-2616, 2461-2617, 2461-2618, 2461-2619, 2461-2620, 2461-2621, 2461-2622, 2461-2623, 2461-2624, 2461-2625, 2461-2626, 2461-2627, 2461-2628, 2461-2629, 2461-2630, 2461-2631, 2551-2566, 2551-2570, 2551-2571, 2551-2572, 2551-2573, 2551-2574, 2551-2575, 2551-2576, 2551-2577, 2551-2578, 2551-2579, 2551-2580, 2551-2581, 2551-2582, 2551-2583, 2551-2584, 2551-2585, 2551-2586, 2551-2587, 2551-2588, 2551-2589, 2551-2590, 2551-2591, 2551-2592, 2551-2593, 2551-2594, 2551-2595, 2551-2596, 2551-2597, 2551-2598, 2551-2599, 2551-2600, 2551-2601, 2551-2602, 2551-2603, 2551-2604, 2551-2605, 2551-2606, 2551-2607, 2551-2608, 2551-2609, 2551-2610, 2551-2611, 2551-2612, 2551-2613, 2551-2614, 2551-2615, 2551-2616, 2551-2617, 2551-2618, 2551-2619, 2551-2620, 2551-2621, 2551-2622, 2551-2623, 2551-2624, 2551-2625, 2551-2626, 2551-2627, 2551-2628, 2551-2629, 2551-2630, 2551-2631, 2553-2570, 2553-2571, 2553-2572, 2553-2573, 2553-2574, 2553-2575, 2553-2576, 2553-2577, 2553-2578, 2553-2579, 2553-2580, 2553-2581, 2553-2582, 2553-2583, 2553-2584, 2553-2585, 2553-2586, 2553-2587, 2553-2588, 2553-2589, 2553-2590, 2553-2591, 2553-2592, 2553-2593, 2553-2594, 2553-2595, 2553-2596, 2553-2597, 2553-2598, 2553-2599, 2553-2600, 2553-2601, 2553-2602, 2553-2603, 2553-2604, 2553-2605, 2553-2606, 2553-2607, 2553-2608, 2553-2609, 2553-2610, 2553-2611, 2553-2612, 2553-2613, 2553-2614, 2553-2615, 2553-2616, 2553-2617, 2553-2618, 2553-2619, 2553-2620, 2553-2621, 2553-2622, 2553-2623, 2553-2624, 2553-2625, 2553-2626, 2553-2627, 2553-2628, 2553-2629, 2553-2630, 2553-2631, 2554-2573, 2554-2574, 2554-2575, 2554-2576, 2554-2577, 2554-2578, 2554-2579, 2554-2580, 2554-2581, 2554-2582, 2554-2583, 2554-2584, 2554-2585, 2554-2586, 2554-2587, 2554-2588, 2554-2589, 2554-2590, 2554-2591, 2554-2592, 2554-2593, 2554-2594, 2554-2595, 2554-2596, 2554-2597, 2554-2598, 2554-2599, 2554-2600, 2554-2601, 2554-2602, 2554-2603, 2554-2604, 2554-2605, 2554-2606, 2554-2607, 2554-2608, 2554-2609, 2554-2610, 2554-2611, 2554-2612, 2554-2613, 2554-2614, 2554-2615, 2554-2616, 2554-2617, 2554-2618, 2554-2619, 2554-2620, 2554-2621, 2554-2622, 2554-2623, 2554-2624, 2554-2625, 2554-2626, 2554-2627, 2554-2628, 2554-2629, 2554-2630, 2554-2631, 2555-2572, 2555-2573, 2555-2574, 2555-2575, 2555-2576, 2555-2577, 2555-2578, 2555-2579, 2555-2580, 2555-2581, 2555-2582, 2555-2583, 2555-2584, 2555-2585, 2555-2586, 2555-2587, 2555-2588, 2555-2589, 2555-2590, 2555-2591, 2555-2592, 2555-2593, 2555-2594, 2555-2595, 2555-2596, 2555-2597, 2555-2598, 2555-2599, 2555-2600, 2555-2601, 2555-2602, 2555-2603, 2555-2604, 2555-2605, 2555-2606, 2555-2607, 2555-2608, 2555-2609, 2555-2610, 2555-2611, 2555-2612, 2555-2613, 2555-2614, 2555-2615, 2555-2616, 2555-2617, 2555-2618, 2555-2619, 2555-2620, 2555-2621, 2555-2622, 2555-2623, 2555-2624, 2555-2625, 2555-2626, 2555-2627, 2555-2628, 2555-2629, 2555-2630, 2555-2631, 2556-2573, 2556-2574, 2556-2575, 2556-2576, 2556-2577, 2556-2578, 2556-2579, 2556-2580, 2556-2581, 2556-2582, 2556-2583, 2556-2584, 2556-2585, 2556-2586, 2556-2587, 2556-2588, 2556-2589, 2556-2590, 2556-2591, 2556-2592, 2556-2593, 2556-2594, 2556-2595, 2556-2596, 2556-2597, 2556-2598, 2556-2599, 2556-2600, 2556-2601, 2556-2602, 2556-2603, 2556-2604, 2556-2605, 2556-2606, 2556-2607, 2556-2608, 2556-2609, 2556-2610, 2556-2611, 2556-2612, 2556-2613, 2556-2614, 2556-2615, 2556-2616, 2556-2617, 2556-2618, 2556-2619, 2556-2620, 2556-2621, 2556-2622, 2556-2623, 2556-2624, 2556-2625, 2556-2626, 2556-2627, 2556-2628, 2556-2629, 2556-2630, 2556-2631, 2557-2574, 2557-2575, 2557-2576, 2557-2577, 2557-2578, 2557-2579, 2557-2580, 2557-2581, 2557-2582, 2557-2583, 2557-2584, 2557-2585, 2557-2586, 2557-2587, 2557-2588, 2557-2589, 2557-2590, 2557-2591, 2557-2592, 2557-2593, 2557-2594, 2557-2595, 2557-2596, 2557-2597, 2557-2598, 2557-2599, 2557-2600, 2557-2601, 2557-2602, 2557-2603, 2557-2604, 2557-2605, 2557-2606, 2557-2607, 2557-2608, 2557-2609, 2557-2610, 2557-2611, 2557-2612, 2557-2613, 2557-2614, 2557-2615, 2557-2616, 2557-2617, 2557-2618, 2557-2619, 2557-2620, 2557-2621, 2557-2622, 2557-2623, 2557-2624, 2557-2625, 2557-2626, 2557-2627, 2557-2628, 2557-2629, 2557-2630, 2557-2631, 2558-2575, 2558-2576, 2558-2577, 2558-2578, 2558-2579, 2558-2580, 2558-2581, 2558-2582, 2558-2583, 2558-2584, 2558-2585, 2558-2586, 2558-2587, 2558-2588, 2558-2589, 2558-2590, 2558-2591, 2558-2592, 2558-2593, 2558-2594, 2558-2595, 2558-2596, 2558-2597, 2558-2598, 2558-2599, 2558-2600, 2558-2601, 2558-2602, 2558-2603, 2558-2604, 2558-2605, 2558-2606, 2558-2607, 2558-2608, 2558-2609, 2558-2610, 2558-2611, 2558-2612, 2558-2613, 2558-2614, 2558-2615, 2558-2616, 2558-2617, 2558-2618, 2558-2619, 2558-2620, 2558-2621, 2558-2622, 2558-2623, 2558-2624, 2558-2625, 2558-2626, 2558-2627, 2558-2628, 2558-2629, 2558-2630, 2558-2631, 2559-2576, 2559-2577, 2559-2578, 2559-2579, 2559-2580, 2559-2581, 2559-2582, 2559-2583, 2559-2584, 2559-2585, 2559-2586, 2559-2587, 2559-2588, 2559-2589, 2559-2590, 2559-2591, 2559-2592, 2559-2593, 2559-2594, 2559-2595, 2559-2596, 2559-2597, 2559-2598, 2559-2599, 2559-2600, 2559-2601, 2559-2602, 2559-2603, 2559-2604, 2559-2605, 2559-2606, 2559-2607, 2559-2608, 2559-2609, 2559-2610, 2559-2611, 2559-2612, 2559-2613, 2559-2614, 2559-2615, 2559-2616, 2559-2617, 2559-2618, 2559-2619, 2559-2620, 2559-2621, 2559-2622, 2559-2623, 2559-2624, 2559-2625, 2559-2626, 2559-2627, 2559-2628, 2559-2629, 2559-2630, 2559-2631, 2560-2577, 2560-2578, 2560-2579, 2560-2580, 2560-2581, 2560-2582, 2560-2583, 2560-2584, 2560-2585, 2560-2586, 2560-2587, 2560-2588, 2560-2589, 2560-2590, 2560-2591, 2560-2592, 2560-2593, 2560-2594, 2560-2595, 2560-2596, 2560-2597, 2560-2598, 2560-2599, 2560-2600, 2560-2601, 2560-2602, 2560-2603, 2560-2604, 2560-2605, 2560-2606, 2560-2607, 2560-2608, 2560-2609, 2560-2610, 2560-2611, 2560-2612, 2560-2613, 2560-2614, 2560-2615, 2560-2616, 2560-2617, 2560-2618, 2560-2619, 2560-2620, 2560-2621, 2560-2622, 2560-2623, 2560-2624, 2560-2625, 2560-2626, 2560-2627, 2560-2628, 2560-2629, 2560-2630, 2560-2631, 2561-2578, 2561-2579, 2561-2580, 2561-2581, 2561-2582, 2561-2583, 2561-2584, 2561-2585, 2561-2586, 2561-2587, 2561-2588, 2561-2589, 2561-2590, 2561-2591, 2561-2592, 2561-2593, 2561-2594, 2561-2595, 2561-2596, 2561-2597, 2561-2598, 2561-2599, 2561-2600, 2561-2601, 2561-2602, 2561-2603, 2561-2604, 2561-2605, 2561-2606, 2561-2607, 2561-2608, 2561-2609, 2561-2610, 2561-2611, 2561-2612, 2561-2613, 2561-2614, 2561-2615, 2561-2616, 2561-2617, 2561-2618, 2561-2619, 2561-2620, 2561-2621, 2561-2622, 2561-2623, 2561-2624, 2561-2625, 2561-2626, 2561-2627, 2561-2628, 2561-2629, 2561-2630, 2561-2631, 2562-2577, 2562-2578, 2562-2579, 2562-2580, 2562-2581, 2562-2582, 2562-2583, 2562-2584, 2562-2585, 2562-2586, 2562-2587, 2562-2588, 2562-2589, 2562-2590, 2562-2591, 2562-2592, 2562-2593, 2562-2594, 2562-2595, 2562-2596, 2562-2597, 2562-2598, 2562-2599, 2562-2600, 2562-2601, 2562-2602, 2562-2603, 2562-2604, 2562-2605, 2562-2606, 2562-2607, 2562-2608, 2562-2609, 2562-2610, 2562-2611, 2562-2612, 2562-2613, 2562-2614, 2562-2615, 2562-2616, 2562-2617, 2562-2618, 2562-2619, 2562-2620, 2562-2621, 2562-2622, 2562-2623, 2562-2624, 2562-2625, 2562-2626, 2562-2627, 2562-2628, 2562-2629, 2562-2630, 2562-2631, 2563-2580, 2563-2581, 2563-2582, 2563-2583, 2563-2584, 2563-2585, 2563-2586, 2563-2587, 2563-2588, 2563-2589, 2563-2590, 2563-2591, 2563-2592, 2563-2593, 2563-2594, 2563-2595, 2563-2596, 2563-2597, 2563-2598, 2563-2599, 2563-2600, 2563-2601, 2563-2602, 2563-2603, 2563-2604, 2563-2605, 2563-2606, 2563-2607, 2563-2608, 2563-2609, 2563-2610, 2563-2611, 2563-2612, 2563-2613, 2563-2614, 2563-2615, 2563-2616, 2563-2617, 2563-2618, 2563-2619, 2563-2620, 2563-2621, 2563-2622, 2563-2623, 2563-2624, 2563-2625, 2563-2626, 2563-2627, 2563-2628, 2563-2629, 2563-2630, 2563-2631, 2564-2581, 2564-2582, 2564-2583, 2564-2584, 2564-2585, 2564-2586, 2564-2587, 2564-2588, 2564-2589, 2564-2590, 2564-2591, 2564-2592, 2564-2593, 2564-2594, 2564-2595, 2564-2596, 2564-2597, 2564-2598, 2564-2599, 2564-2600, 2564-2601, 2564-2602, 2564-2603, 2564-2604, 2564-2605, 2564-2606, 2564-2607, 2564-2608, 2564-2609, 2564-2610, 2564-2611, 2564-2612, 2564-2613, 2564-2614, 2564-2615, 2564-2616, 2564-2617, 2564-2618, 2564-2619, 2564-2620, 2564-2621, 2564-2622, 2564-2623, 2564-2624, 2564-2625, 2564-2626, 2564-2627, 2564-2628, 2564-2629, 2564-2630, 2564-2631, 2565-2584, 2565-2585, 2565-2586, 2565-2587, 2565-2588, 2565-2589, 2565-2590, 2565-2591, 2565-2592, 2565-2593, 2565-2594, 2565-2595, 2565-2596, 2565-2597, 2565-2598, 2565-2599, 2565-2600, 2565-2601, 2565-2602, 2565-2603, 2565-2604, 2565-2605, 2565-2606, 2565-2607, 2565-2608, 2565-2609, 2565-2610, 2565-2611, 2565-2612, 2565-2613, 2565-2614, 2565-2615, 2565-2616, 2565-2617, 2565-2618, 2565-2619, 2565-2620, 2565-2621, 2565-2622, 2565-2623, 2565-2624, 2565-2625, 2565-2626, 2565-2627, 2565-2628, 2565-2629, 2565-2630, 2565-2631, 2566-2583, 2566-2584, 2566-2585, 2566-2586, 2566-2587, 2566-2588, 2566-2589, 2566-2590, 2566-2591, 2566-2592, 2566-2593, 2566-2594, 2566-2595, 2566-2596, 2566-2597, 2566-2598, 2566-2599, 2566-2600, 2566-2601, 2566-2602, 2566-2603, 2566-2604, 2566-2605, 2566-2606, 2566-2607, 2566-2608, 2566-2609, 2566-2610, 2566-2611, 2566-2612, 2566-2613, 2566-2614, 2566-2615, 2566-2616, 2566-2617, 2566-2618, 2566-2619, 2566-2620, 2566-2621, 2566-2622, 2566-2623, 2566-2624, 2566-2625, 2566-2626, 2566-2627, 2566-2628, 2566-2629, 2566-2630, 2566-2631, 2567-2584, 2567-2585, 2567-2586, 2567-2587, 2567-2588, 2567-2589, 2567-2590, 2567-2591, 2567-2592, 2567-2593, 2567-2594, 2567-2595, 2567-2596, 2567-2597, 2567-2598, 2567-2599, 2567-2600, 2567-2601, 2567-2602, 2567-2603, 2567-2604, 2567-2605, 2567-2606, 2567-2607, 2567-2608, 2567-2609, 2567-2610, 2567-2611, 2567-2612, 2567-2613, 2567-2614, 2567-2615, 2567-2616, 2567-2617, 2567-2618, 2567-2619, 2567-2620, 2567-2621, 2567-2622, 2567-2623, 2567-2624, 2567-2625, 2567-2626, 2567-2627, 2567-2628, 2567-2629, 2567-2630, 2567-2631, 2568-2585, 2568-2586, 2568-2587, 2568-2588, 2568-2589, 2568-2590, 2568-2591, 2568-2592, 2568-2593, 2568-2594, 2568-2595, 2568-2596, 2568-2597, 2568-2598, 2568-2599, 2568-2600, 2568-2601, 2568-2602, 2568-2603, 2568-2604, 2568-2605, 2568-2606, 2568-2607, 2568-2608, 2568-2609, 2568-2610, 2568-2611, 2568-2612, 2568-2613, 2568-2614, 2568-2615, 2568-2616, 2568-2617, 2568-2618, 2568-2619, 2568-2620, 2568-2621, 2568-2622, 2568-2623, 2568-2624, 2568-2625, 2568-2626, 2568-2627, 2568-2628, 2568-2629, 2568-2630, 2568-2631, 2569-2586, 2569-2587, 2569-2588, 2569-2589, 2569-2590, 2569-2591, 2569-2592, 2569-2593, 2569-2594, 2569-2595, 2569-2596, 2569-2597, 2569-2598, 2569-2599, 2569-2600, 2569-2601, 2569-2602, 2569-2603, 2569-2604, 2569-2605, 2569-2606, 2569-2607, 2569-2608, 2569-2609, 2569-2610, 2569-2611, 2569-2612, 2569-2613, 2569-2614, 2569-2615, 2569-2616, 2569-2617, 2569-2618, 2569-2619, 2569-2620, 2569-2621, 2569-2622, 2569-2623, 2569-2624, 2569-2625, 2569-2626, 2569-2627, 2569-2628, 2569-2629, 2569-2630, 2569-2631, 2569-2586, 2569-2587, 2569-2588, 2569-2589, 2569-2590, 2569-2591, 2569-2592, 2569-2593, 2569-2594, 2569-2595, 2569-2596, 2569-2597, 2569-2598, 2569-2599, 2569-2600, 2569-2601, 2569-2602, 2569-2603, 2569-2604, 2569-2605, 2569-2606, 2569-2607, 2569-2608, 2569-2609, 2569-2610, 2569-2611, 2569-2612, 2569-2613, 2569-2614, 2569-2615, 2569-2616, 2569-2617, 2569-2618, 2569-2619, 2569-2620, 2569-2621, 2569-2622, 2569-2623, 2569-2624, 2569-2625, 2569-2626, 2569-2627, 2569-2628, 2569-2629, 2569-2630, 2569-2631, 2571-2588, 2571-2589, 2571-2590, 2571-2591, 2571-2592, 2571-2593, 2571-2594, 2571-2595, 2571-2596, 2571-2597, 2571-2598, 2571-2599, 2571-2600, 2571-2601, 2571-2602, 2571-2603, 2571-2604, 2571-2605, 2571-2606, 2571-2607, 2571-2608, 2571-2609, 2571-2610, 2571-2611, 2571-2612, 2571-2613, 2571-2614, 2571-2615, 2571-2616, 2571-2617, 2571-2618, 2571-2619, 2571-2620, 2571-2621, 2571-2622, 2571-2623, 2571-2624, 2571-2625, 2571-2626, 2571-2627, 2571-2628, 2571-2629, 2571-2630, 2571-2631, 2572-2589, 2572-2590, 2572-2591, 2572-2592, 2572-2593, 2572-2594, 2572-2595, 2572-2596, 2572-2597, 2572-2598, 2572-2599, 2572-2600, 2572-2601, 2572-2602, 2572-2603, 2572-2604, 2572-2605, 2572-2606, 2572-2607, 2572-2608, 2572-2609, 2572-2610, 2572-2611, 2572-2612, 2572-2613, 2572-2614, 2572-2615, 2572-2616, 2572-2617, 2572-2618, 2572-2619, 2572-2620, 2572-2621, 2572-2622, 2572-2623, 2572-2624, 2572-2625, 2572-2626, 2572-2627, 2572-2628, 2572-2629, 2572-2630, 2572-2631, 2573-2590, 2573-2591, 2573-2592, 2573-2593, 2573-2594, 2573-2595, 2573-2596, 2573-2597, 2573-2598, 2573-2599, 2573-2600, 2573-2601, 2573-2602, 2573-2603, 2573-2604, 2573-2605, 2573-2606, 2573-2607, 2573-2608, 2573-2609, 2573-2610, 2573-2611, 2573-2612, 2573-2613, 2573-2614, 2573-2615, 2573-2616, 2573-2617, 2573-2618, 2573-2619, 2573-2620, 2573-2621, 2573-2622, 2573-2623, 2573-2624, 2573-2625, 2573-2626, 2573-2627, 2573-2628, 2573-2629, 2573-2630, 2573-2631, 2574-2591, 2574-2592, 2574-2593, 2574-2594, 2574-2595, 2574-2596, 2574-2597, 2574-2598, 2574-2599, 2574-2600, 2574-2601, 2574-2602, 2574-2603, 2574-2604, 2574-2605, 2574-2606, 2574-2607, 2574-2608, 2574-2609, 2574-2610, 2574-2611, 2574-2612, 2574-2613, 2574-2614, 2574-2615, 2574-2616, 2574-2617, 2574-2618, 2574-2619, 2574-2620, 2574-2621, 2574-2622, 2574-2623, 2574-2624, 2574-2625, 2574-2626, 2574-2627, 2574-2628, 2574-2629, 2574-2630, 2574-2631, 2575-2592, 2575-2593, 2575-2594, 2575-2595, 2575-2596, 2575-2597, 2575-2598, 2575-2599, 2575-2600, 2575-2601, 2575-2602, 2575-2603, 2575-2604, 2575-2605, 2575-2606, 2575-2607, 2575-2608, 2575-2609, 2575-2610, 2575-2611, 2575-2612, 2575-2613, 2575-2614, 2575-2615, 2575-2616, 2575-2617, 2575-2618, 2575-2619, 2575-2620, 2575-2621, 2575-2622, 2575-2623, 2575-2624, 2575-2625, 2575-2626, 2575-2627, 2575-2628, 2575-2629, 2575-2630, 2575-2631, 2576-2593, 2576-2594, 2576-2595, 2576-2596, 2576-2597, 2576-2598, 2576-2599, 2576-2600, 2576-2601, 2576-2602, 2576-2603, 2576-2604, 2576-2605, 2576-2606, 2576-2607, 2576-2608, 2576-2609, 2576-2610, 2576-2611, 2576-2612, 2576-2613, 2576-2614, 2576-2615, 2576-2616, 2576-2617, 2576-2618, 2576-2619, 2576-2620, 2576-2621, 2576-2622, 2576-2623, 2576-2624, 2576-2625, 2576-2626, 2576-2627, 2576-2628, 2576-2629, 2576-2630, 2576-2631, 2577-2594, 2577-2595, 2577-2596, 2577-2597, 2577-2598, 2577-2599, 2577-2600, 2577-2601, 2577-2602, 2577-2603, 2577-2604, 2577-2605, 2577-2606, 2577-2607, 2577-2608, 2577-2609, 2577-2610, 2577-2611, 2577-2612, 2577-2613, 2577-2614, 2577-2615, 2577-2616, 2577-2617, 2577-2618, 2577-2619, 2577-2620, 2577-2621, 2577-2622, 2577-2623, 2577-2624, 2577-2625, 2577-2626, 2577-2627, 2577-2628, 2577-2629, 2577-2630, 2577-2631, 2578-2597, 2578-2598, 2578-2599, 2578-2600, 2578-2601, 2578-2602, 2578-2603, 2578-2604, 2578-2605, 2578-2606, 2578-2607, 2578-2608, 2578-2609, 2578-2610, 2578-2611, 2578-2612, 2578-2613, 2578-2614, 2578-2615, 2578-2616, 2578-2617, 2578-2618, 2578-2619, 2578-2620, 2578-2621, 2578-2622, 2578-2623, 2578-2624, 2578-2625, 2578-2626, 2578-2627, 2578-2628, 2578-2629, 2578-2630, 2578-2631, 2579-2598, 2579-2599, 2579-2600, 2579-2601, 2579-2602, 2579-2603, 2579-2604, 2579-2605, 2579-2606, 2579-2607, 2579-2608, 2579-2609, 2579-2610, 2579-2611, 2579-2612, 2579-2613, 2579-2614, 2579-2615, 2579-2616, 2579-2617, 2579-2618, 2579-2619, 2579-2620, 2579-2621, 2579-2622, 2579-2623, 2579-2624, 2579-2625, 2579-2626, 2579-2627, 2579-2628, 2579-2629, 2579-2630, 2579-2631, 2580-2598, 2580-2599, 2580-2600, 2580-2601, 2580-2602, 2580-2603, 2580-2604, 2580-2605, 2580-2606, 2580-2607, 2580-2608, 2580-2609, 2580-2610, 2580-2611, 2580-2612, 2580-2613, 2580-2614, 2580-2615, 2580-2616, 2580-2617, 2580-2618, 2580-2619, 2580-2620, 2580-2621, 2580-2622, 2580-2623, 2580-2624, 2580-2625, 2580-2626, 2580-2627, 2580-2628, 2580-2629, 2580-2630, 2580-2631, 2581-2597, 2581-2598, 2581-2599, 2581-2600, 2581-2601, 2581-2602, 2581-2603, 2581-2604, 2581-2605, 2581-2606, 2581-2607, 2581-2608, 2581-2609, 2581-2610, 2581-2611, 2581-2612, 2581-2613, 2581-2614, 2581-2615, 2581-2616, 2581-2617, 2581-2618, 2581-2619, 2581-2620, 2581-2621, 2581-2622, 2581-2623, 2581-2624, 2581-2625, 2581-2626, 2581-2627, 2581-2628, 2581-2629, 2581-2630, 2581-2631, 2582-2600, 2582-2601, 2582-2602, 2582-2603, 2582-2604, 2582-2605, 2582-2606, 2582-2607, 2582-2608, 2582-2609, 2582-2610, 2582-2611, 2582-2612, 2582-2613, 2582-2614, 2582-2615, 2582-2616, 2582-2617, 2582-2618, 2582-2619, 2582-2620, 2582-2621, 2582-2622, 2582-2623, 2582-2624, 2582-2625, 2582-2626, 2582-2627, 2582-2628, 2582-2629, 2582-2630, 2582-2631, 2583-2601, 2583-2602, 2583-2603, 2583-2604, 2583-2605, 2583-2606, 2583-2607, 2583-2608, 2583-2609, 2583-2610, 2583-2611, 2583-2612, 2583-2613, 2583-2614, 2583-2615, 2583-2616, 2583-2617, 2583-2618, 2583-2619, 2583-2620, 2583-2621, 2583-2622, 2583-2623, 2583-2624, 2583-2625, 2583-2626, 2583-2627, 2583-2628, 2583-2629, 2583-2630, 2583-2631, 2585-2603, 2585-2604, 2585-2605, 2585-2606, 2585-2607, 2585-2608, 2585-2609, 2585-2610, 2585-2611, 2585-2612, 2585-2613, 2585-2614, 2585-2615, 2585-2616, 2585-2617, 2585-2618, 2585-2619, 2585-2620, 2585-2621, 2585-2622, 2585-2623, 2585-2624, 2585-2625, 2585-2626, 2585-2627, 2585-2628, 2585-2629, 2585-2630, 2585-2631, 2586-2604, 2586-2605, 2586-2606, 2586-2607, 2586-2608, 2586-2609, 2586-2610, 2586-2611, 2586-2612, 2586-2613, 2586-2614, 2586-2615, 2586-2616, 2586-2617, 2586-2618, 2586-2619, 2586-2620, 2586-2621, 2586-2622, 2586-2623, 2586-2624, 2586-2625, 2586-2626, 2586-2627, 2586-2628, 2586-2629, 2586-2630, 2586-2631, 2587-2605, 2587-2606, 2587-2607, 2587-2608, 2587-2609, 2587-2610, 2587-2611, 2587-2612, 2587-2613, 2587-2614, 2587-2615, 2587-2616, 2587-2617, 2587-2618, 2587-2619, 2587-2620, 2587-2621, 2587-2622, 2587-2623, 2587-2624, 2587-2625, 2587-2626, 2587-2627, 2587-2628, 2587-2629, 2587-2630, 2587-2631, 2588-2606, 2588-2607, 2588-2608, 2588-2609, 2588-2610, 2588-2611, 2588-2612, 2588-2613, 2588-2614, 2588-2615, 2588-2616, 2588-2617, 2588-2618, 2588-2619, 2588-2620, 2588-2621, 2588-2622, 2588-2623, 2588-2624, 2588-2625, 2588-2626, 2588-2627, 2588-2628, 2588-2629, 2588-2630, 2588-2631, 2589-2607, 2589-2608, 2589-2609, 2589-2610, 2589-2611, 2589-2612, 2589-2613, 2589-2614, 2589-2615, 2589-2616, 2589-2617, 2589-2618, 2589-2619, 2589-2620, 2589-2621, 2589-2622, 2589-2623, 2589-2624, 2589-2625, 2589-2626, 2589-2627, 2589-2628, 2589-2629, 2589-2630, 2589-2631, 2590-2606, 2590-2607, 2590-2608, 2590-2609, 2590-2610, 2590-2611, 2590-2612, 2590-2613, 2590-2614, 2590-2615, 2590-2616, 2590-2617, 2590-2618, 2590-2619, 2590-2620, 2590-2621, 2590-2622, 2590-2623, 2590-2624, 2590-2625, 2590-2626, 2590-2627, 2590-2628, 2590-2629, 2590-2630, 2590-2631, 2591-2610, 2591-2611, 2591-2612, 2591-2613, 2591-2614, 2591-2615, 2591-2616, 2591-2617, 2591-2618, 2591-2619, 2591-2620, 2591-2621, 2591-2622, 2591-2623, 2591-2624, 2591-2625, 2591-2626, 2591-2627, 2591-2628, 2591-2629, 2591-2630, 2591-2631, 2592-2611, 2592-2612, 2592-2613, 2592-2614, 2592-2615, 2592-2616, 2592-2617, 2592-2618, 2592-2619, 2592-2620, 2592-2621, 2592-2622, 2592-2623, 2592-2624, 2592-2625, 2592-2626, 2592-2627, 2592-2628, 2592-2629, 2592-2630, 2592-2631, 2593-2608, 2593-2612, 2593-2613, 2593-2614, 2593-2615, 2593-2616, 2593-2617, 2593-2618, 2593-2619, 2593-2620, 2593-2621, 2593-2622, 2593-2623, 2593-2624, 2593-2625, 2593-2626, 2593-2627, 2593-2628, 2593-2629, 2593-2630, 2593-2631, 2594-2612, 2594-2613, 2594-2614, 2594-2615, 2594-2616, 2594-2617, 2594-2618, 2594-2619, 2594-2620, 2594-2621, 2594-2622, 2594-2623, 2594-2624, 2594-2625, 2594-2626, 2594-2627, 2594-2628, 2594-2629, 2594-2630, 2594-2631, 2595-2611, 2595-2612, 2595-2613, 2595-2614, 2595-2615, 2595-2616, 2595-2617, 2595-2618, 2595-2619, 2595-2620, 2595-2621, 2595-2622, 2595-2623, 2595-2624, 2595-2625, 2595-2626, 2595-2627, 2595-2628, 2595-2629, 2595-2630, 2595-2631, 2596-2614, 2596-2615, 2596-2616, 2596-2617, 2596-2618, 2596-2619, 2596-2620, 2596-2621, 2596-2622, 2596-2623, 2596-2624, 2596-2625, 2596-2626, 2596-2627, 2596-2628, 2596-2629, 2596-2630, 2596-2631, 2597-2612, 2597-2613, 2597-2614, 2597-2615, 2597-2616, 2597-2617, 2597-2618, 2597-2619, 2597-2620, 2597-2621, 2597-2622, 2597-2623, 2597-2624, 2597-2625, 2597-2626, 2597-2627, 2597-2628, 2597-2629, 2597-2630, 2597-2631, 2598-2613, 2598-2614, 2598-2615, 2598-2616, 2598-2617, 2598-2618, 2598-2619, 2598-2620, 2598-2621, 2598-2622, 2598-2623, 2598-2624, 2598-2625, 2598-2626, 2598-2627, 2598-2628, 2598-2629, 2598-2630, 2598-2631, 2599-2614, 2599-2615, 2599-2616, 2599-2617, 2599-2618, 2599-2619, 2599-2620, 2599-2621, 2599-2622, 2599-2623, 2599-2624, 2599-2625, 2599-2626, 2599-2627, 2599-2628, 2599-2629, 2599-2630, 2599-2631, 2600-2615, 2600-2616, 2600-2617, 2600-2618, 2600-2619, 2600-2620, 2600-2621, 2600-2622, 2600-2623, 2600-2624, 2600-2625, 2600-2626, 2600-2627, 2600-2628, 2600-2629, 2600-2630, 2600-2631, 2601-2616, 2601-2617, 2601-2618, 2601-2619, 2601-2620, 2601-2621, 2601-2622, 2601-2623, 2601-2624, 2601-2625, 2601-2626, 2601-2627, 2601-2628, 2601-2629, 2601-2630, 2601-2631, 2602-2618, 2602-2619, 2602-2620, 2602-2621, 2602-2622, 2602-2623, 2602-2624, 2602-2625, 2602-2626, 2602-2627, 2602-2628, 2602-2629, 2602-2630, 2602-2631, 2603-2620, 2603-2621, 2603-2622, 2603-2623, 2603-2624, 2603-2625, 2603-2626, 2603-2627, 2603-2628, 2603-2629, 2603-2630, 2603-2631, 2604-2619, 2604-2620, 2604-2621, 2604-2622, 2604-2623, 2604-2624, 2604-2625, 2604-2626, 2604-2627, 2604-2628, 2604-2629, 2604-2630, 2604-2631, 2605-2620, 2605-2621, 2605-2622, 2605-2623, 2605-2624, 2605-2625, 2605-2626, 2605-2627, 2605-2628, 2605-2629, 2605-2630, 2605-2631, 2606-2621, 2606-2622, 2606-2623, 2606-2624, 2606-2625, 2606-2626, 2606-2627, 2606-2628, 2606-2629, 2606-2630, 2606-2631, 2607-2622, 2607-2623, 2607-2624, 2607-2625, 2607-2626, 2607-2627, 2607-2628, 2607-2629, 2607-2630, 2607-2631, 2608-2623, 2608-2624, 2608-2625, 2608-2626, 2608-2627, 2608-2628, 2608-2629, 2608-2630, 2608-2631, 2609-2624, 2609-2625, 2609-2626, 2609-2627, 2609-2628, 2609-2629, 2609-2630, 2609-2631, 2610-2625, 2610-2626, 2610-2627, 2610-2628, 2610-2629, 2610-2630, 2610-2631, 2611-2626, 2611-2627, 2611-2628, 2611-2629, 2611-2630, 2611-2631, 2612-2627, 2612-2628, 2612-2629, 2612-2630, 2612-2631, 2613-2628, 2613-2629, 2613-2630, 2613-2631, 2614-2629, 2614-2630, 2614-2631, 2615-2630, 2615-2631 или 2616-2631. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены по меньшей мере на 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 смежных нуклеотидных оснований в пределах вышеупомянутых областей нуклеотидных оснований.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 1 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 50% ингибирование: 30-49, 48-63, 150-169, 151-170, 152-171, 154-169, 154-173, 156-171, 156-175, 157-176, 158-173, 158-177, 480-499, 600-619, 638-657, 644-663, 738-757, 1089-1108, 1135-1154, 1141-1160, 1147-1166, 1150-1169, 1153-1172, 1159-1178, 1162-1181, 1165-1184, 1171-1186,1171-1190,1173-1188, 1173-1192, 1175-1190, 1175-1194, 1177-1196, 1183-1202, 1208-1227, 1235-1254, 1298-1317, 1304-1323, 1310-1329, 1316-1335, 1319-1338, 1322-1341, 1328-1347, 1349-1368, 1355-1374, 1393-1412, 1396-1415, 1399-1418, 1405-1424, 1421-1440, 1621-1640, 1646-1665, 1646-1665, 1647-1666, 1689-1708, 1749-1768, 1763-1782, 1912-1931, 2073-2092, 2085-2104, 2166-2185, 2172-2191, 2189-2208, 2191-2210, 2193-2212, 2195-2210, 2195-2214, 2196-2215, 2197-2212, 2197-2216, 2202-2221, 2223-2238, 2223-2242, 2225-2240, 2226-2245, 2227-2242, 2227-2246, 2238-2257, 2241-2260, 2267-2286, 2361-2380, 2388-2407, 2397-2416, 2448-2467, 2453-2472, 2455-2474, 2457-2472, 2457-2476, 2459-2474, 2459-2478, 2461-2476, 2461-2480, 2532-2551, 2550-2569, 2551-2566, 2551-2570, 2552-2568, 2552-2570, 2552-2571, 2553-2568, 2553-2570, 2553-2571, 2553-2572, 2554-2571, 2554-2572, 2554-2573, 2555-2570, 2555-2572, 2555-2574, 2556-2573, 2556-2574, 2556-2575, 2557-2573, 2557-2574, 2557-2575, 2557-2576, 2558-2575, 2558-2576, 2558-2577, 2559-2576, 2559-2577, 2559-2578, 2560-2577, 2560-2578, 2560-2579, 2561-2576, 2561-2578, 2561-2579, 2561-2580, 2562-2577, 2562-2579, 2562-2581, 2563-2578, 2563-2580, 2563-2582, 2564-2581, 2564-2583, 2565-2584, 2566-2583, 2566-2585, 2567-2582, 2567-2584, 2567-2586, 2568-2583, 2568-2585, 2568-2587, 2569-2586, 2569-2588, 2570-2585, 2570-2587, 2570-2589, 2571-2586, 2571-2588, 2571-2590, 2572-2589, 2572-2590, 2572-2591, 2573-2590, 2573-2592, 2574-2590, 2574-2591, 2574-2593, 2575-2590, 2575-2591, 2575-2592, 2575-2594, 2576-2593, 2576-2595, 2577-2594, 2577-2595, 2577-2596, 2578-2594, 2578-2596, 2578-2597, 2579-2598, 2580-2596, 2580-2597, 2580-2598, 2580-2599, 2581-2597, 2581-2598, 2581-2599, 2581-2600, 2582-2598, 2582-2599, 2582-2600, 2582-2601, 2583-2599, 2583-2600, 2583-2601, 2583-2602, 2584-2600, 2584-2601, 2584-2602, 2584-2603, 2585-2601, 2585-2603, 2585-2604, 2586-2601, 2586-2602, 2586-2604, 2586-2605, 2587-2602, 2587-2603, 2587-2605, 2587-2606, 2588-2603, 2588-2604, 2588-2605, 2588-2606, 2588-2607, 2589-2604, 2589-2605, 2589-2606, 2589-2607, 2589-2608, 2590-2605, 2590-2606, 2590-2607, 2590-2608, 2590-2609, 2590-2609, 2591-2607, 2591-2608, 2591-2609, 2591-2610, 2592-2607, 2592-2608, 2592-2609, 2592-2610, 2592-2611, 2593-2608, 2593-2609, 2593-2610, 2593-2612, 2594-2609, 2594-2610, 2594-2611, 2594-2612, 2594-2613, 2595-2610, 2595-2611, 2595-2612, 2595-2613, 2595-2614, 2596-2611, 2596-2612, 2596-2613, 2596-2614, 2596-2615, 2597-2612, 2597-2612, 2597-2613, 2597-2614, 2597-2615, 2597-2616, 2598-2613, 2598-2614, 2598-2615, 2598-2616, 2598-2617, 2599-2614, 2599-2615, 2599-2616, 2599-2617, 2599-2618, 2600-2615, 2600-2616, 2600-2617, 2600-2618, 2600-2619, 2601-2616, 2601-2617, 2601-2618, 2601-2619, 2601-2620, 2602-2617, 2602-2618, 2602-2619, 2602-2620, 2602-2621, 2603-2618, 2603-2619, 2603-2620, 2603-2621, 2603-2622, 2604-2619, 2604-2620, 2604-2621, 2604-2622, 2604-2623, 2605-2620, 2605-2621, 2605-2622, 2605-2623, 2605-2624, 2606-2621, 2606-2622, 2606-2623, 2606-2624, 2606-2625, 2607-2622, 2607-2623, 2607-2624, 2607-2625, 2607-2626, 2608-2623, 2608-2624, 2608-2625, 2608-2626, 2608-2627, 2609-2624, 2609-2625, 2609-2626, 2609-2627, 2609-2628, 2610-2625, 2610-2626, 2610-2627, 2610-2628, 2610-2629, 2611-2626, 2611-2627, 2611-2628, 2611-2629, 2611-2630, 2612-2627, 2612-2628, 2612-2629, 2612-2630, 2612-2631, 2613-2628, 2613-2629, 2613-2630, 2613-2631, 2614-2629, 2614-2630, 2614-2631, 2615-2630, 2615-2631 и 2616-2631.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 2 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 50% ингибирование: 1608-1627, 1685-1704, 1686-1705, 1751-1770, 1769-1784, 1871-1890, 1872-1891, 1873-1892, 1875-1890, 1875-1894, 1877-1892, 1877-1896, 1878-1897, 1879-1894, 1879-1898, 2288-2307, 2808-2827, 2846-2865, 2852-2871, 2946-2965, 3773-3792, 3819-3838, 3825-3844, 3831-3850, 3834-3853, 3837-3856, 3843-3862, 4151-4166, 4151-4170, 4153-4172, 4159-4178, 4184-4203, 4211-4230, 4609-4628, 4612-4631, 4615-4634, 4621-4640, 4642-4661, 4648-4667, 4686-4705, 4689-4708, 4692-4711, 4698-4717, 4714-4733, 5270-5289, 5295-5314, 5296-5315, 5830-5849, 5890-5909, 5904-5923, 6406-6425, 6662-6681, 6674-6693, 6954-6973, 6960-6979, 6977-6996, 6979-6998, 6981-7000, 6983-6998, 6983-7002, 6984-7003, 6985-7000, 6985-7004, 6990-7009, 7122-7141, 7125-7144, 7151-7170, 7353-7372, 7362-7381, 7683-7702, 7688-7707, 7690-7709, 7692-7707, 7692-7711, 7694-7709, 7694-7713, 7696-7711, 7696-7715, 7767-7786, 7785-7804, 7786-7801, 7787-7803, 7787-7805, 7787-7806, 7788-7803, 7788-7805, 7788-7806, 7788-7807, 7789-7806, 7789-7807, 7789-7808, 7790-7805, 7790-7807, 7790-7809, 7791-7808, 7791-7809, 7791-7810, 7792-7808, 7792-7809, 7792-7810, 7792-7811, 7793-7810, 7793-7811, 7793-7812, 7794-7811, 7794-7812, 7794-7813, 7795-7812, 7795-7813, 7795-7814, 7796-7811, 7796-7813, 7796-7814, 7796-7815, 7797-7812, 7797-7814, 7797-7816, 7798-7813, 7798-7815, 7798-7817, 7799-7816, 7799-7818, 7800-7819, 7801-7818, 7801-7820, 7802-7817, 7802-7819, 7802-7821, 7803-7818, 7803-7820, 7803-7822, 7804-7821, 7804-7823, 7805-7820, 7805-7822, 7805-7824, 7806-7821, 7806-7823, 7806-7825, 7807-7824, 7807-7825, 7807-7826, 7808-7825, 7808-7827, 7809-7825, 7809-7826, 7809-7828, 7810-7825, 7810-7826, 7810-7827, 7810-7829, 7811-7828, 7811-7830, 7812-7829, 7812-7830, 7812-7831, 7813-7829, 7813-7831, 7813-7832, 7814-7833, 7815-7831, 7815-7832, 7815-7833, 7815-7834, 7816-7832, 7816-7833, 7816-7834, 7816-7835, 7817-7833, 7817-7834, 7817-7835, 7817-7836, 7818-7834, 7818-7835, 7818-7836, 7818-7837, 7819-7835, 7819-7836, 7819-7837, 7819-7838, 7820-7836, 7820-7838, 7820-7839, 7821-7836, 7821-7837, 7821-7839, 7821-7840, 7822-7837, 7822-7838, 7822-7840, 7822-7841, 7823-7838, 7823-7839, 7823-7839, 7823-7840, 7823-7841, 7823-7842, 7824-7839, 7824-7840, 7824-7840, 7824-7841, 7824-7842, 7824-7843, 7825-7840, 7825-7841, 7825-7842, 7825-7843, 7825-7844, 7826-7842, 7826-7843, 7826-7844, 7826-7845, 7827-7842, 7827-7843, 7827-7844, 7827-7845, 7827-7846, 7828-7843, 7828-7844, 7828-7845, 7828-7847, 7829-7844, 7829-7845, 7829-7846, 7829-7847, 7829-7848, 7830-7845, 7830-7846, 7830-7847, 7830-7848, 7830-7849, 7831-7846, 7831-7847, 7831-7848, 7831-7849, 7831-7850, 7832-7847, 7832-7848, 7832-7849, 7832-7850, 7832-7851, 7833-7848, 7833-7849, 7833-7850, 7833-7851, 7833-7852, 7834-7849, 7834-7850, 7834-7851, 7834-7852, 7834-7853, 7835-7850, 7835-7851, 7835-7852, 7835-7853, 7835-7854, 7836-7851, 7836-7852, 7836-7853, 7836-7854, 7836-7855, 7837-7852, 7837-7853, 7837-7854, 7837-7855, 7837-7856, 7838-7853, 7838-7854, 7838-7855, 7838-7856, 7838-7857, 7839-7854, 7839-7855, 7839-7856, 7839-7857, 7839-7858, 7840-7855, 7840-7856, 7840-7857, 7840-7858, 7840-7859, 7841-7856, 7841-7857, 7841-7858, 7841-7859, 7841-7860, 7842-7857, 7842-7858, 7842-7859, 7842-7860, 7842-7861, 7843-7858, 7843-7859, 7843-7860, 7843-7861, 7843-7862, 7844-7859, 7844-7860, 7844-7861, 7844-7862, 7845-7860, 7845-7861, 7845-7862, 7846-7861 и 7846-7862.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 1 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 60% ингибирование: 48-63, 150-169, 152-171, 154-169, 154-173, 156-171, 156-175, 158-173, 158-177, 600-619, 1135-1154, 1141-1160, 1147-1166, 1153-1172, 1171-1186, 1173-1188, 1175-1190, 1749-1768, 1763-1782, 1763-1782, 1912-1931, 2189-2208, 2191-2210, 2193-2212, 2195-2210, 2195-2214, 2197-2212, 2197-2216, 2223-2238, 2225-2240, 2227-2242, 2238-2257, 2448-2467, 2453-2472, 2455-2474, 2457-2472, 2457-2476, 2459-2474, 2459-2478, 2461-2476, 2461-2480, 2550-2569, 2551-2566, 2552-2571, 2553-2568, 2553-2570, 2553-2571, 2553-2572, 2554-2571, 2554-2572, 2554-2573, 2555-2572, 2555-2574, 2556-2573, 2556-2574, 2556-2575, 2557-2574, 2557-2575, 2557-2576, 2558-2575, 2558-2576, 2558-2577, 2559-2576, 2559-2577, 2559-2578, 2560-2577, 2560-2578, 2560-2579, 2561-2578, 2561-2579, 2561-2580, 2562-2577, 2562-2579, 2562-2581, 2563-2578, 2563-2580, 2563-2582, 2564-2581, 2564-2583, 2565-2584, 2566-2583, 2566-2585, 2567-2582, 2567-2584, 2567-2586, 2568-2583, 2568-2585, 2568-2587, 2569-2586, 2569-2588, 2570-2587, 2570-2589, 2571-2588, 2572-2590, 2572-2591, 2573-2590, 2573-2592, 2574-2591, 2574-2593, 2575-2590, 2575-2592, 2575-2594, 2576-2593, 2576-2595, 2577-2594, 2577-2595, 2577-2596, 2578-2594, 2578-2597, 2579-2598, 2580-2596, 2580-2597, 2580-2598, 2580-2599, 2581-2597, 2581-2598, 2581-2599, 2581-2600, 2582-2598, 2582-2599, 2582-2600, 2582-2601, 2583-2599, 2583-2600, 2583-2601, 2583-2602, 2584-2600, 2584-2602, 2584-2603, 2585-2601, 2585-2603, 2585-2604, 2586-2602, 2586-2604, 2586-2605, 2587-2603, 2587-2605, 2587-2606, 2588-2603, 2588-2604, 2588-2606, 2588-2607, 2589-2605, 2589-2606, 2589-2607, 2589-2608, 2590-2605, 2590-2606, 2590-2607, 2590-2608, 2590-2609, 2591-2607, 2591-2609, 2591-2610, 2592-2608, 2592-2609, 2592-2611, 2593-2608, 2593-2609, 2593-2612, 2594-2609, 2594-2610, 2594-2611, 2594-2612, 2594-2613, 2595-2610, 2595-2611, 2595-2612, 2595-2613, 2595-2614, 2596-2611, 2596-2612, 2596-2613, 2596-2614, 2596-2615, 2597-2612, 2597-2613, 2597-2614, 2597-2615, 2597-2616, 2598-2613, 2598-2614, 2598-2615, 2598-2616, 2598-2617, 2599-2614, 2599-2615, 2599-2616, 2599-2617, 2599-2618, 2600-2615, 2600-2616, 2600-2617, 2600-2618, 2600-2619, 2601-2616, 2601-2617, 2601-2618, 2601-2619, 2601-2620, 2602-2617, 2602-2618, 2602-2619, 2602-2620, 2602-2621, 2603-2618, 2603-2619, 2603-2620, 2603-2621, 2603-2622, 2604-2619, 2604-2620, 2604-2621, 2604-2622, 2604-2623, 2605-2620, 2605-2621, 2605-2622, 2605-2623, 2605-2624, 2606-2621, 2606-2622, 2606-2623, 2606-2624, 2606-2625, 2607-2622, 2607-2623, 2607-2624, 2607-2625, 2607-2626, 2608-2623, 2608-2624, 2608-2625, 2608-2625, 2608-2626, 2608-2627, 2609-2624, 2609-2625, 2609-2626, 2609-2627, 2609-2628, 2610-2625, 2610-2626, 2610-2627, 2610-2628, 2610-2629, 2611-2626, 2611-2626, 2611-2627, 2611-2628, 2611-2629, 2611-2630, 2612-2627, 2612-2628, 2612-2629, 2612-2630, 2612-2631, 2613-2628, 2613-2629, 2613-2630, 2613-2631, 2614-2629, 2614-2630, 2614-2631, 2615-2630, 2615-2630, 2615-2631, 2615-2631 и 2616-2631.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 2 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 60% ингибирование: 1685-1704, 1686-1705, 1769-1784, 1871-1890, 1873-1892, 1875-1890, 1875-1894, 1877-1892, 1877-1896, 1879-1894, 1879-1898, 2808-2827, 3819-3838, 3825-3844, 3831-3850, 3837-3856, 4151-4166, 5890-5909, 5904-5923, 5904-5923, 6406-6425, 6977-6996, 6979-6998, 6981-7000, 6983-6998, 6983-7002, 6985-7000, 6985-7004, 7122-7141, 7683-7702, 7688-7707, 7690-7709, 7692-7707, 7692-7711, 7694-7709, 7696-7711, 7696-7715, 7786-7801, 7787-7806, 7788-7803, 7788-7805, 7788-7806, 7788-7807, 7789-7806, 7789-7807, 7789-7808, 7790-7807, 7790-7809, 7791-7808, 7791-7809, 7791-7810, 7792-7809, 7792-7810, 7792-7811, 7793-7810, 7793-7811, 7793-7812, 7794-7811, 7794-7812, 7794-7813, 7795-7812, 7795-7813, 7795-7814, 7796-7813, 7796-7814, 7796-7815, 7797-7812, 7797-7814, 7797-7816, 7798-7813, 7798-7815, 7798-7817, 7799-7816, 7799-7818, 7800-7819, 7801-7818, 7801-7820, 7802-7817, 7802-7819, 7802-7821, 7803-7818, 7803-7820, 7803-7822, 7804-7821, 7804-7823, 7805-7822, 7805-7824, 7806-7823, 7806-7825, 7807-7824, 7807-7825, 7807-7826, 7808-7825, 7808-7827, 7809-7826, 7809-7828, 7810-7825, 7810-7827, 7810-7829, 7811-7828, 7811-7830, 7812-7829, 7812-7830, 7812-7831, 7813-7829, 7813-7832, 7814-7833, 7815-7831, 7815-7832, 7815-7833, 7815-7834, 7816-7832, 7816-7833, 7816-7834, 7816-7835, 7817-7833, 7817-7834, 7817-7835, 7817-7836, 7818-7834, 7818-7835, 7818-7836, 7818-7837, 7819-7835, 7819-7837, 7819-7838, 7820-7836, 7820-7838, 7820-7839, 7821-7837, 7821-7839, 7821-7840, 7822-7838, 7822-7840, 7822-7841, 7823-7838, 7823-7839, 7823-7841, 7823-7842, 7824-7840, 7824-7841, 7824-7842, 7824-7843, 7825-7840, 7825-7841, 7825-7842, 7825-7843, 7825-7844, 7826-7842, 7826-7844, 7826-7845, 7827-7843, 7827-7844, 7827-7846, 7828-7843, 7828-7844, 7828-7847, 7829-7844, 7829-7845, 7829-7846, 7829-7847, 7829-7848, 7830-7845, 7830-7846, 7830-7847, 7830-7848, 7830-7849, 7831-7846, 7831-7847, 7831-7848, 7831-7849, 7831-7850, 7832-7847, 7832-7848, 7832-7849, 7832-7850, 7832-7851, 7833-7848, 7833-7849, 7833-7850, 7833-7851, 7833-7852, 7834-7849, 7834-7850, 7834-7851, 7834-7852, 7834-7853, 7835-7850, 7835-7851, 7835-7852, 7835-7853, 7835-7854, 7836-7851, 7836-7852, 7836-7853, 7836-7854, 7836-7855, 7837-7852, 7837-7853, 7837-7854, 7837-7855, 7837-7856, 7838-7853, 7838-7854, 7838-7855, 7838-7856, 7838-7857, 7839-7854, 7839-7855, 7839-7856, 7839-7857, 7839-7858, 7840-7855, 7840-7856, 7840-7857, 7840-7858, 7840-7859, 7841-7856, 7841-7857, 7841-7858, 7841-7859, 7841-7860, 7842-7857, 7842-7858, 7842-7859, 7842-7860, 7842-7861, 7843-7858, 7843-7859, 7843-7860, 7843-7861, 7843-7862, 7844-7859, 7844-7860, 7844-7861, 7844-7862, 7845-7860, 7845-7861, 7845-7862, 7846-7861, 7846-7862 и 7847-7862.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 1 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 70% ингибирование: 48-63, 150-169, 152-171, 154-169, 154-173, 156-171, 156-175, 158-173, 158-177, 1135-1154, 1141-1160, 1147-1166, 1171-1186, 1173-1188, 1175-1190, 1749-1768, 1763-1782, 1912-1931, 2193-2212, 2195-2210, 2195-2214, 2197-2212, 2197-2216, 2223-2238, 2225-2240, 2227-2242, 2453-2472, 2455-2474, 2457-2472, 2457-2476, 2459-2474, 2461-2476, 2461-2480, 2550-2569, 2551-2566, 2552-2571, 2553-2570, 2553-2571, 2553-2572, 2554-2571, 2554-2572, 2554-2573, 2554-2573, 2555-2572, 2555-2574, 2555-2574, 2556-2573, 2556-2574, 2556-2575, 2557-2574, 2557-2576, 2558-2575, 2558-2576, 2558-2577, 2559-2576, 2559-2577, 2559-2578, 2560-2577, 2560-2578, 2560-2579, 2561-2578, 2561-2579, 2561-2580, 2562-2577, 2562-2579, 2562-2581, 2563-2578, 2563-2580, 2563-2582, 2564-2581, 2564-2583, 2565-2584, 2566-2583, 2566-2585, 2567-2582, 2567-2584, 2567-2586, 2568-2585, 2568-2587, 2569-2586, 2569-2588, 2570-2587, 2570-2589, 2571-2588, 2571-2590, 2572-2589, 2572-2591, 2573-2590, 2573-2592, 2574-2591, 2574-2593, 2575-2592, 2575-2594, 2576-2593, 2576-2595, 2577-2594, 2577-2596, 2578-2597, 2579-2598, 2580-2596, 2580-2598, 2580-2599, 2581-2597, 2581-2600, 2582-2598, 2582-2600, 2582-2601, 2583-2599, 2583-2601, 2583-2602, 2584-2600, 2584-2602, 2584-2603, 2585-2601, 2585-2603, 2585-2604, 2586-2605, 2587-2606, 2588-2604, 2588-2606, 2588-2607, 2589-2605, 2589-2606, 2589-2607, 2589-2608, 2590-2605, 2590-2606, 2590-2607, 2590-2609, 2591-2607, 2591-2610, 2592-2611, 2593-2608, 2593-2612, 2594-2609, 2594-2610, 2594-2612, 2594-2613, 2595-2610, 2595-2611, 2595-2612, 2595-2613, 2595-2614, 2596-2611, 2596-2614, 2596-2615, 2597-2612, 2597-2613, 2597-2614, 2597-2615, 2597-2616, 2598-2613, 2598-2614, 2598-2615, 2598-2616, 2598-2617, 2599-2614, 2599-2615, 2599-2616, 2599-2617, 2599-2618, 2600-2615, 2600-2616, 2600-2617, 2600-2618, 2600-2619, 2601-2616, 2601-2617, 2601-2618, 2601-2619, 2601-2620, 2602-2617, 2602-2618, 2602-2619, 2602-2620, 2602-2621, 2603-2619, 2603-2620, 2603-2621, 2603-2622, 2604-2619, 2604-2620, 2604-2621, 2604-2622, 2604-2623, 2605-2620, 2605-2621, 2605-2622, 2605-2623, 2605-2624, 2606-2621, 2606-2622, 2606-2623, 2606-2624, 2606-2625, 2607-2622, 2607-2623, 2607-2624, 2607-2625, 2607-2626, 2608-2623, 2608-2624, 2608-2625, 2608-2626, 2608-2627, 2609-2624, 2609-2625, 2609-2626, 2609-2627, 2609-2628, 2610-2625, 2610-2626, 2610-2627, 2610-2628, 2610-2629, 2611-2626, 2611-2627, 2611-2629, 2611-2630, 2612-2627, 2612-2628, 2612-2629, 2612-2630, 2612-2631, 2613-2628, 2613-2629, 2613-2630, 2613-2631, 2614-2629, 2614-2630, 2614-2631, 2615-2630, 2615-2630, 2615-2631 и 2616-2631.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 2 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 70% ингибирование: 1685-1704, 1686-1705, 1769-1784, 1871-1890,1873-1892, 1875-1890, 1875-1894, 1877-1892, 1877-1896, 1879-1894, 1879-1898, 3819-3838, 3825-3844, 3831-3850, 4151-4166, 5890-5909, 5904-5923, 5904-5923, 6406-6425, 6983-6998, 6983-7002, 6985-7000, 6985-7004, 7688-7707, 7690-7709, 7692-7707, 7692-7711, 7694-7709, 7696-7711, 7696-7715, 7786-7801, 7787-7806, 7788-7805, 7788-7806, 7788-7807, 7789-7806, 7789-7807, 7789-7808, 7790-7807, 7790-7809, 7791-7808, 7791-7809, 7791-7810, 7792-7809, 7792-7811, 7793-7810, 7793-7811, 7793-7812, 7794-7811, 7794-7812, 7794-7813, 7795-7812, 7795-7813, 7795-7814, 7796-7813, 7796-7814, 7796-7815, 7797-7812, 7797-7814, 7797-7816, 7798-7813, 7798-7815, 7798-7817, 7799-7816, 7799-7818, 7800-7819, 7801-7818, 7801-7820, 7802-7817, 7802-7819, 7802-7821, 7803-7820, 7803-7822, 7804-7821, 7804-7823, 7805-7822, 7805-7824, 7806-7823, 7806-7825, 7807-7824, 7807-7826, 7808-7825, 7808-7827, 7809-7826, 7809-7828, 7810-7827, 7811-7828, 7811-7830, 7812-7829, 7812-7831, 7813-7832, 7814-7833, 7815-7831, 7815-7833, 7815-7834, 7816-7832, 7816-7835, 7817-7833, 7817-7835, 7817-7836, 7818-7834, 7818-7836, 7818-7837, 7819-7835, 7819-7837, 7819-7838, 7820-7836, 7820-7838, 7820-7839, 7821-7840, 7822-7841, 7823-7839, 7823-7841, 7823-7842, 7824-7840, 7824-7841, 7824-7842, 7824-7843, 7825-7840, 7825-7841, 7825-7842, 7825-7844, 7826-7842, 7826-7845, 7827-7846, 7828-7843, 7828-7847, 7829-7844, 7829-7845, 7829-7847, 7829-7848, 7830-7845, 7830-7846, 7830-7847, 7830-7848, 7830-7849, 7831-7846, 7831-7849, 7831-7850, 7832-7847, 7832-7848, 7832-7849, 7832-7850, 7832-7851, 7833-7848, 7833-7849, 7833-7850, 7833-7851, 7833-7852, 7834-7849, 7834-7850, 7834-7851, 7834-7852, 7834-7853, 7835-7850, 7835-7851, 7835-7852, 7835-7853, 7835-7854, 7836-7851, 7836-7852, 7836-7853, 7836-7854, 7836-7855, 7837-7852, 7837-7853, 7837-7854, 7837-7855, 7837-7856, 7838-7854, 7838-7855, 7838-7856, 7838-7857, 7839-7854, 7839-7855, 7839-7856, 7839-7857, 7839-7858, 7840-7855, 7840-7856, 7840-7857, 7840-7858, 7840-7859, 7841-7856, 7841-7857, 7841-7858, 7841-7859, 7841-7860, 7842-7857, 7842-7858, 7842-7859, 7842-7860, 7842-7861, 7843-7858, 7843-7859, 7843-7860, 7843-7861, 7843-7862, 7844-7859, 7844-7860, 7844-7861, 7844-7862, 7845-7860, 7845-7861, 7845-7862, 7846-7861, 7846-7862 и 7847-7862.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 1 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 80% ингибирование: 152-171, 154-169, 156-171, 158-173, 1135-1154, 1171-1186, 1173-1188, 1175-1190, 1763-1782, 1912-1931, 2197-2212, 2223-2238, 2225-2240, 2227-2242, 2457-2472, 2459-2474, 2461-2476, 2551-2566, 2553-2570, 2553-2571, 2553-2572, 2554-2573, 2555-2572, 2555-2574, 2556-2573, 2556-2574, 2556-2575, 2557-2574, 2557-2576, 2558-2575, 2558-2576, 2559-2577, 2559-2578, 2560-2577, 2560-2578, 2560-2579, 2561-2578, 2561-2579, 2561-2580, 2562-2577, 2562-2579, 2562-2581, 2563-2580, 2563-2582, 2564-2581, 2564-2583, 2565-2584, 2566-2583, 2567-2584, 2567-2586, 2568-2585, 2568-2587, 2569-2586, 2569-2588, 2570-2587, 2571-2588, 2571-2590, 2572-2589, 2572-2591, 2573-2590, 2573-2592, 2574-2591, 2574-2593, 2575-2592, 2576-2593, 2576-2595, 2577-2594, 2577-2596, 2578-2597, 2580-2598, 2580-2599, 2581-2597, 2581-2600, 2582-2601, 2583-2602, 2584-2603, 2585-2604, 2586-2605, 2587-2606, 2588-2607, 2589-2608, 2590-2606, 2590-2607, 2590-2609, 2591-2610, 2592-2611, 2593-2608, 2593-2612, 2594-2613, 2595-2611, 2595-2614, 2596-2615, 2597-2612, 2597-2613, 2597-2614, 2597-2615, 2597-2616, 2598-2613, 2598-2613, 2598-2614, 2598-2615, 2598-2616, 2598-2617, 2599-2614, 2599-2617, 2599-2618, 2600-2615, 2600-2617, 2600-2618, 2600-2619, 2601-2616, 2601-2617, 2601-2619, 2601-2620, 2602-2618, 2602-2621, 2603-2620, 2603-2621, 2603-2622, 2604-2619, 2604-2620, 2604-2621, 2604-2622, 2604-2623, 2605-2620, 2605-2621, 2605-2622, 2605-2623, 2605-2624, 2606-2621, 2606-2622, 2606-2623, 2606-2624, 2606-2625, 2607-2622, 2607-2623, 2607-2624, 2607-2625, 2607-2626, 2608-2623, 2608-2624, 2608-2625, 2608-2627, 2609-2624, 2609-2626, 2609-2627, 2609-2628, 2610-2625, 2610-2626, 2610-2628, 2610-2629, 2611-2626, 2611-2627, 2611-2629, 2611-2630, 2612-2627, 2612-2628, 2612-2630, 2612-2631, 2613-2628, 2613-2629, 2613-2631, 2614-2629, 2614-2630, 2614-2631, 2615-2630 и 2616-2631.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 2 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 80% ингибирование: 1685-1704, 1686-1705, 1873-1892, 1875-1890, 1877-1892, 1879-1894, 3819-3838, 4151-4166, 5904-5923, 6406-6425, 6985-7000, 7692-7707, 7694-7709, 7696-7711, 7786-7801, 7788-7805, 7788-7806, 7788-7807, 7789-7808, 7790-7807, 7790-7809, 7791-7808, 7791-7809, 7791-7810, 7792-7809, 7792-7811, 7793-7810, 7793-7811, 7794-7812, 7794-7813, 7795-7812, 7795-7813, 7795-7814, 7796-7813, 7796-7814, 7796-7815, 7797-7812, 7797-7814, 7797-7816, 7798-7815, 7798-7817, 7799-7816, 7799-7818, 7800-7819, 7801-7818, 7802-7819, 7802-7821, 7803-7820, 7803-7822, 7804-7821, 7804-7823, 7805-7822, 7806-7823, 7806-7825, 7807-7824, 7807-7826, 7808-7825, 7808-7827, 7809-7826, 7809-7828, 7810-7827, 7811-7828, 7812-7829, 7812-7831, 7813-7832, 7814-7833, 7815-7834, 7816-7832, 7816-7835, 7817-7836, 7818-7837, 7819-7838, 7820-7839, 7821-7840, 7822-7841, 7823-7842, 7824-7843, 7825-7841, 7825-7842, 7825-7844, 7826-7845, 7827-7846, 7828-7843, 7828-7847, 7829-7848, 7830-7846, 7830-7849, 7831-7850, 7832-7847, 7832-7848, 7832-7849, 7832-7850, 7832-7851, 7833-7848, 7833-7849, 7833-7850, 7833-7851, 7833-7852, 7834-7849, 7834-7852, 7834-7853, 7835-7850, 7835-7852, 7835-7853, 7835-7854, 7836-7851, 7836-7852, 7836-7854, 7836-7855, 7837-7853, 7837-7856, 7838-7855, 7838-7856, 7838-7857, 7839-7854, 7839-7855, 7839-7856, 7839-7857, 7839-7858, 7840-7855, 7840-7856, 7840-7857, 7840-7858, 7840-7859, 7841-7856, 7841-7857, 7841-7858, 7841-7859, 7841-7860, 7842-7857, 7842-7858, 7842-7859, 7842-7860, 7842-7861, 7843-7858, 7843-7859, 7843-7860, 7843-7862, 7844-7859, 7844-7861, 7844-7862, 7845-7860, 7845-7861, 7846-7862 и 7847-7862.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 1 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 90% ингибирование: 154-169, 156-171, 158-173, 1135-1154, 1171-1186, 1173-1188, 1763-1782, 1912-1931, 2223-2238, 2227-2242, 2459-2474, 2461-2476, 2554-2573, 2555-2574, 2560-2577, 2561-2578, 2561-2579, 2562-2581, 2563-2580, 2563-2582, 2564-2581, 2566-2583, 2567-2584, 2568-2585, 2568-2587, 2569-2586, 2570-2587, 2576-2593, 2577-2594, 2577-2596, 2578-2597, 2580-2599, 2581-2600, 2582-2601, 2583-2602, 2584-2603, 2586-2605, 2587-2605, 2587-2606, 2588-2607, 2589-2608, 2590-2607, 2590-2609, 2592-2611, 2595-2614, 2596-2615, 2597-2612, 2597-2613, 2597-2615, 2597-2616, 2598-2613, 2598-2613, 2598-2617, 2599-2614, 2599-2618, 2600-2615, 2600-2619, 2601-2617, 2601-2620, 2602-2621, 2603-2622, 2604-2623, 2605-2621, 2605-2622, 2605-2624, 2606-2625, 2607-2626, 2608-2623, 2608-2625, 2609-2628, 2611-2627, 2611-2630, 2612-2628, 2612-2631, 2613-2629, 2614-2629, 2615-2630 и 2616-2631.
В некоторых вариантах реализации следующие нуклеотидные области последовательности SEQ ID NO: 2 при нацеливании на них антисмысловых соединений или олигонуклеотидов демонстрируют по меньшей мере 90% ингибирование: 1685-1704, 1686-1705, 1875-1890, 1877-1892, 1879-1894, 3819-3838, 5904-5923, 6406-6425, 7694-7709, 7696-7711, 7789-7808, 7790-7809, 7795-7812, 7795-7813, 7796-7813, 7796-7814, 7797-7814, 7797-7816, 7798-7815, 7798-7817, 7799-7816, 7801-7818, 7802-7819, 7803-7820, 7803-7822, 7804-7821, 7805-7822, 7811-7828, 7812-7829, 7812-7831, 7813-7832, 7815-7834, 7818-7837, 7819-7838, 7821-7840, 7822-7840, 7822-7841, 7825-7842, 7832-7847, 7832-7848, 7832-7850, 7833-7848, 7833-7852, 7834-7849, 7834-7853, 7835-7850, 7836-7852, 7836-7855, 7837-7856, 7838-7856, 7839-7857, 7839-7858, 7840-7856, 7840-7857, 7840-7859, 7843-7858, 7843-7860 и 7846-7862.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 50% ингибирование мРНК CFB, №№ISIS: 516350, 532614, 532632, 532635, 532638, 532639, 532686, 532687, 532688, 532689, 532690, 532691, 532692, 532692, 532693, 532694, 532695, 532696, 532697, 532698, 532699, 532700, 532701, 532702, 532703, 532704, 532705, 532706, 532707, 532770, 532775, 532778, 532780, 532791, 532800, 532809, 532810, 532811, 532917, 532952, 588509, 588510, 588511, 588512, 588513, 588514, 588515, 588516, 588517, 588518, 588519, 588520, 588522, 588523, 588524, 588525, 588527, 588528, 588529, 588530, 588531, 588532, 588533, 588534, 588535, 588536, 588537, 588538, 588539, 588540, 588541, 588542, 588543, 588544, 588545, 588546, 588547, 588548, 588549, 588550, 588551, 588552, 588553, 588554, 588555, 588556, 588557, 588558, 588559, 588560, 588561, 588562, 588563, 588564, 588565, 588566, 588567, 588568, 588569, 588570, 588571, 588572, 588573, 588574, 588575, 588576, 588577, 588580, 588581, 588585, 588586, 588589, 588590, 588599, 588603, 588606, 588608, 588610, 588614, 588616, 588628, 588631, 588632, 588634, 588636, 588638, 588640, 588645, 588646, 588654, 588656, 588658, 588660, 588662, 588664, 588670, 588672, 588676, 588682, 588688, 588696, 588698, 588807, 588808, 588809, 588813, 588814, 588815, 588819, 588820, 588822, 588823, 588838, 588839, 588840, 588841, 588842, 588846, 588847, 588848, 588849, 588850, 588851, 588852, 588853, 588854, 588855, 588856, 588857, 588858, 588859, 588860, 588861, 588862, 588863, 588864, 588865, 588866, 588867, 588868, 588870, 588871, 588872, 588873, 588874, 588875, 588876, 588877, 588878, 588879, 588880, 588881, 588882, 588883, 588884, 598999, 599000, 599001, 599002, 599003, 599004, 599005, 599006, 599007, 599008, 599009, 599010, 599011, 599012, 599013, 599014, 599015, 599018, 599019, 599023, 599024, 599025, 599026, 599027, 599028, 599029, 599030, 599031, 599032, 599033, 599034, 599035, 599058, 599062, 599063, 599064, 599065, 599070, 599071, 599072, 599073, 599074, 599076, 599077, 599078, 599079, 599080, 599081, 599082, 599083, 599084, 599085, 599086, 599087, 599088, 599089, 599090, 599091, 599092, 599093, 599094, 599095, 599096, 599097, 599098, 599102, 599119, 599123, 599124, 599125, 599126, 599127, 599128, 599132, 599133, 599134, 599135, 599136, 599137, 599138, 599139, 599140, 599141, 599142, 599143, 599144, 599145, 599147, 599148, 599149, 599150, 599151, 599152, 599153, 599154, 599155, 599156, 599157, 599158, 599159, 599178, 599179, 599180, 599181, 599182, 599186, 599187, 599188, 599189, 599190, 599191, 599192, 599193, 599194, 599195, 599196, 599197, 599198, 599199, 599200, 599201, 599202, 599203, 599204, 599205, 599206, 599207, 599208, 599209, 599210, 599211, 599212, 599213, 599214, 599215, 599216, 599217, 599218, 599219, 599220, 599221, 599221, 599222, 599223, 599224, 599225, 599226, 599227, 599228, 599229, 599230, 599231, 599232, 599233, 599234, 599235, 599236, 599241, 599247, 599248, 599249, 599255, 599256, 599257, 599258, 599260, 599261, 599262, 599263, 599264, 599265, 599266, 599267, 599268, 599269, 599270, 599271, 599272, 599273, 599274, 599275, 599276, 599277, 599278, 599279, 599280, 599297, 599299, 599306, 599307, 599308, 599309, 599311, 599312, 599313, 599314, 599315, 599316, 599317, 599318, 599319, 599320, 599321, 599322, 599323, 599324, 599325, 599326, 599327, 599328, 599329, 599330, 599338, 599349, 599353, 599354, 599355, 599356, 599357, 599358, 599359, 599360, 599361, 599362, 599363, 599364, 599369, 599371, 599372, 599373, 599376, 599378, 599379, 599382, 599383, 599384, 599385, 599386, 599387, 599388, 599389, 599390, 599391, 599392, 599393, 599394, 599395, 599396, 599397, 599398, 599399, 599400, 599401, 599402, 599403, 599404, 599405, 599406, 599407, 599408, 599409, 599410, 599412, 599413, 599414, 599415, 599416, 599417, 599418, 599419, 599420, 599421, 599422, 599423, 599424, 599425, 599426, 599433, 599434, 599435, 599436, 599437, 599438, 599439, 599440, 599441, 599442, 599443, 599444, 599445, 599446, 599447, 599448, 599450, 599454, 599455, 599456, 599467, 599468, 599469, 599471, 599472, 599473, 599474, 599475, 599476, 599477, 599478, 599479, 599480, 599481, 599482, 599483, 599484, 599485, 599486, 599487, 599488, 599489, 599490, 599491, 599492, 599493, 599494, 599495, 599496, 599497, 599498, 599499, 599500, 599501, 599502, 599503, 599504, 599505, 599506, 599507, 599508, 599509, 599512, 599515, 599518, 599531, 599541, 599541, 599546, 599547, 599548, 599549, 599550, 599552, 599553, 599554, 599555, 599557, 599558, 599561, 599562, 599563, 599564, 599565, 599566, 599567, 599568, 599569, 599570, 599577, 599578, 599579, 599580, 599581, 599581, 599582, 599584, 599585, 599586, 599587, 599588, 599589, 599590, 599591, 599592, 599593, 599594, 599595, 601321, 601322, 601323, 601325, 601327, 601328, 601329, 601330, 601332, 601333, 601334, 601335, 601336, 601337, 601338, 601339, 601341, 601342, 601343, 601344, 601345, 601346, 601347, 601348, 601349, 601362, 601367, 601368, 601369, 601371, 601372, 601373, 601374, 601375, 601377, 601378, 601380, 601381, 601382, 601383, 601384, 601385, 601386, 601387 и 601388.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 50% ингибирование мРНК CFB, SEQ ID NO: 12, 30, 33, 36, 37, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 198, 203, 206, 208, 219, 228, 237, 238, 239, 317, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401,402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 468, 472, 473, 475, 478, 479, 488, 492, 494, 495, 498, 499, 500, 502, 503, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 517, 518, 522, 523, 524, 525, 529, 530, 531, 534, 535, 537, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 559, 563, 564, 565, 569, 570, 572, 573, 577, 588, 589, 590, 591, 592, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 623, 640, 641, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 700, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 758, 759, 760, 761, 762, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 813, 833, 834, 841, 846, 849, 850, 867 и 873.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 60% ингибирование мРНК CFB, №№ISIS: 516350, 532614, 532635, 532686, 532687, 532688, 532689, 532770, 532800, 532809, 532810, 532811, 532917, 532952, 588512, 588513, 588514, 588515, 588516, 588517, 588518, 588519, 588522, 588523, 588524, 588525, 588527, 588528, 588529, 588530, 588531, 588532, 588533, 588534, 588535, 588536, 588537, 588538, 588539, 588540, 588541, 588542, 588543, 588544, 588545, 588546, 588547, 588548, 588549, 588550, 588551, 588552, 588553, 588554, 588555, 588556, 588557, 588558, 588559, 588560, 588561, 588562, 588563, 588564, 588565, 588566, 588567, 588568, 588569, 588570, 588571, 588572, 588573, 588574, 588575, 588576, 588577, 588636, 588638, 588640, 588664, 588676, 588696, 588698, 588807, 588808, 588814, 588815, 588819, 588820, 588840, 588842, 588846, 588847, 588848, 588849, 588850, 588851, 588852, 588853, 588854, 588855, 588856, 588857, 588858, 588859, 588860, 588861, 588862, 588863, 588864, 588866, 588867, 588868, 588870, 588871, 588872, 588873, 588874, 588875, 588876, 588877, 588878, 588879, 588880, 588881, 588882, 588883, 588884, 598999, 599000, 599001, 599002, 599003, 599004, 599005, 599006, 599007, 599008, 599009, 599010, 599011, 599012, 599013, 599014, 599015, 599019, 599024, 599025, 599026, 599027, 599028, 599029, 599030, 599031, 599032, 599033, 599034, 599035, 599064, 599065, 599071, 599072, 599077, 599078, 599079, 599080, 599083, 599084, 599085, 599086, 599087, 599088, 599089, 599090, 599091, 599092, 599093, 599094, 599095, 599096, 599097, 599125, 599126, 599127, 599133, 599134, 599135, 599136, 599138, 599139, 599140, 599141, 599142, 599148, 599149, 599150, 599151, 599152, 599154, 599155, 599156, 599157, 599158, 599159, 599178, 599179, 599180, 599181, 599187, 599188, 599190, 599192, 599193, 599194, 599195, 599196, 599197, 599198, 599199, 599200, 599201, 599202, 599203, 599204, 599205, 599206, 599207, 599208, 599209, 599210, 599211, 599212, 599213, 599214, 599215, 599216, 599217, 599218, 599219, 599220, 599221, 599222, 599223, 599224, 599225, 599226, 599227, 599228, 599229, 599230, 599231, 599232, 599233, 599234, 599235, 599236, 599247, 599255, 599256, 599257, 599263, 599264, 599265, 599266, 599270, 599271, 599272, 599273, 599274, 599275, 599276, 599277, 599278, 599279, 599280, 599306, 599307, 599308, 599311, 599312, 599313, 599314, 599315, 599316, 599317, 599318, 599319, 599320, 599321, 599322, 599323, 599324, 599325, 599327, 599328, 599329, 599330, 599349, 599353, 599355, 599356, 599357, 599358, 599359, 599360, 599361, 599362, 599363, 599364, 599369, 599371, 599372, 599373, 599376, 599378, 599379, 599382, 599384, 599386, 599387, 599388, 599389, 599390, 599391, 599392, 599393, 599394, 599395, 599396, 599397, 599398, 599399, 599400, 599401, 599402, 599403, 599404, 599405, 599406, 599407, 599408, 599409, 599410, 599412, 599413, 599414, 599415, 599416, 599417, 599418, 599419, 599420, 599421, 599422, 599423, 599424, 599425, 599433, 599434, 599435, 599436, 599437, 599438, 599439, 599440, 599441, 599442, 599443, 599444, 599445, 599446, 599447, 599448, 599456, 599467, 599468, 599471, 599472, 599473, 599474, 599475, 599476, 599477, 599478, 599479, 599480, 599481, 599482, 599483, 599484, 599485, 599486, 599487, 599488, 599489, 599490, 599491, 599492, 599493, 599494, 599495, 599496, 599497, 599498, 599499, 599500, 599501, 599502, 599503, 599504, 599505, 599506, 599507, 599508, 599512, 599531, 599547, 599548, 599549, 599552, 599553, 599554, 599555, 599557, 599558, 599562, 599563, 599564, 599565, 599566, 599567, 599568, 599569, 599570, 599577, 599578, 599579, 599580, 599581, 599582, 599584, 599585, 599586, 599587, 599588, 599589, 599590, 599591, 599592, 599593, 599594, 599595, 601323, 601327, 601329, 601332, 601333, 601333, 601334, 601335, 601336, 601338, 601339, 601341, 601342, 601343, 601344, 601345, 601346, 601347, 601348, 601349, 601368, 601369, 601371, 601372, 601374, 601375, 601377, 601378, 601380, 601381, 601382, 601383, 601384, 601385, 601386, 601387 и 601388.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 60% ингибирование мРНК CFB, SEQ ID NO: 12, 33, 84, 85, 86, 87, 198, 228, 237, 238, 239, 317, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 472, 473, 513, 514, 515, 531, 537, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 558, 564, 565, 569, 570, 577, 590, 592, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 644, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 700, 704, 706, 707, 708, 709, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 758, 759, 760, 761, 767, 768, 770, 772, 773, 774, 775, 775, 776, 776, 777, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 783, 784, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 813, 833, 834, 841, 846, 849 и 850.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 70% ингибирование мРНК CFB, №№ISIS: 516350, 532614, 532686, 532687, 532688, 532770, 532800, 532809, 532810, 532811, 532917, 532952, 588512, 588513, 588514, 588515, 588516, 588517, 588518, 588524, 588529, 588530, 588531, 588532, 588533, 588534, 588535, 588536, 588537, 588538, 588539, 588540, 588541, 588542, 588543, 588544, 588545, 588546, 588547, 588548, 588549, 588550, 588551, 588552, 588553, 588554, 588555, 588556, 588557, 588558, 588559, 588560, 588561, 588562, 588563, 588564, 588565, 588568, 588569, 588570, 588571, 588572, 588573, 588574, 588575, 588577, 588636, 588638, 588640, 588696, 588698, 588807, 588814, 588815, 588819, 588842, 588847, 588848, 588849, 588850, 588851, 588852, 588853, 588856, 588857, 588858, 588859, 588860, 588861, 588862, 588863, 588866, 588867, 588870, 588871, 588872, 588873, 588874, 588875, 588876, 588877, 588878, 588879, 588880, 588881, 588882, 588883, 588884, 599000, 599001, 599003, 599004, 599005, 599008, 599009, 599010, 599011, 599014, 599015, 599024, 599025, 599027, 599028, 599029, 599030, 599031, 599032, 599033, 599034, 599072, 599077, 599080, 599085, 599086, 599087, 599088, 599089, 599090, 599091, 599093, 599094, 599095, 599096, 599097, 599125, 599126, 599134, 599138, 599139, 599148, 599149, 599150, 599151, 599152, 599154, 599155, 599156, 599157, 599158, 599187, 599188, 599193, 599195, 599196, 599197, 599198, 599199, 599200, 599201, 599202, 599203, 599204, 599205, 599206, 599207, 599208, 599210, 599211, 599212, 599213, 599214, 599215, 599216, 599217, 599218, 599219, 599220, 599221, 599222, 599223, 599224, 599225, 599226, 599227, 599228, 599229, 599230, 599231, 599232, 599233, 599234, 599235, 599236, 599266, 599272, 599272, 599273, 599274, 599275, 599277, 599278, 599279, 599280, 599280, 599306, 599311, 599312, 599313, 599314, 599315, 599316, 599317, 599318, 599319, 599320, 599321, 599322, 599323, 599325, 599327, 599328, 599329, 599330, 599355, 599357, 599358, 599359, 599360, 599361, 599362, 599363, 599364, 599369, 599371, 599372, 599373, 599378, 599379, 599382, 599384, 599386, 599387, 599388, 599389, 599390, 599391, 599392, 599393, 599394, 599395, 599396, 599397, 599398, 599399, 599400, 599401, 599402, 599403, 599404, 599405, 599406, 599407, 599408, 599409, 599410, 599413, 599414, 599415, 599416, 599417, 599418, 599419, 599420, 599421, 599422, 599423, 599424, 599433, 599434, 599435, 599436, 599437, 599438, 599439, 599440, 599441, 599442, 599443, 599445, 599446, 599447, 599448, 599472, 599473, 599474, 599475, 599476, 599477, 599478, 599479, 599480, 599481, 599482, 599483, 599484, 599485, 599486, 599487, 599488, 599489, 599490, 599491, 599492, 599493, 599494, 599495, 599496, 599497, 599498, 599499, 599500, 599501, 599502, 599503, 599504, 599505, 599506, 599507, 599508, 599512, 599547, 599548, 599552, 599553, 599554, 599555, 599558, 599562, 599563, 599564, 599566, 599567, 599568, 599569, 599570, 599577, 599578, 599579, 599580, 599581, 599582, 599585, 599586, 599587, 599588, 599589, 599590, 599591, 599592, 599593, 599594, 599595, 601332, 601335, 601341, 601343, 601344, 601345, 601346, 601347, 601348, 601349, 601371, 601372, 601380, 601382, 601383, 601384, 601385, 601386 и 601387.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 70% ингибирование мРНК CFB, SEQ ID NO: 12, 84, 85, 86, 198, 228, 237, 238, 239, 317, 395, 396, 397, 398, 399, 402, 403, 404, 405, 407, 408, 410, 411, 412, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 464, 465, 472, 473, 513, 514, 515, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 564, 565, 569, 592, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603, 604, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 645, 646, 647, 648, 649, 650, 653, 654, 655, 656, 659, 660, 662, 663, 664, 665, 666, 668, 669, 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 677, 678, 679, 680, 682, 683, 684, 686, 687, 688, 689, 706, 708, 709, 711, 712, 713, 714, 715, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 767, 768, 773, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 793, 794, 795, 797, 798, 799, 813, 833, 834, 841, 846, 849, 867 и 873.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 80% ингибирование мРНК CFB, №№ISIS: 532686, 532809, 532810, 532811, 532917, 532952, 588512, 588517, 588518, 588533, 588534, 588535, 588536, 588537, 588538, 588539, 588540, 588542, 588543, 588544, 588545, 588546, 588547, 588548, 588549, 588550, 588551, 588552, 588553, 588554, 588555, 588556, 588557, 588558, 588559, 588560, 588561, 588562, 588563, 588564, 588565, 588571, 588638, 588640, 588696, 588698, 588807, 588814, 588849, 588850, 588851, 588853, 588857, 588858, 588859, 588860, 588861, 588862, 588863, 588866, 588867, 588871, 588872, 588873, 588874, 588875, 588876, 588877, 588878, 588879, 588880, 588881, 588882, 588883, 599001, 599024, 599025, 599033, 599086, 599087, 599088, 599089, 599093, 599094, 599095, 599096, 599134, 599139, 599148, 599149, 599151, 599154, 599155, 599156, 599158, 599188, 599195, 599196, 599198, 599201, 599202, 599203, 599204, 599205, 599206, 599207, 599212, 599213, 599215, 599216, 599217, 599218, 599219, 599220, 599221, 599222, 599223, 599224, 599225, 599226, 599227, 599228, 599229, 599230, 599231, 599232, 599233, 599234, 599235, 599236, 599272, 599273, 599275, 599277, 599278, 599279, 599280, 599311, 599313, 599314, 599316, 599317, 599318, 599320, 599321, 599322, 599323, 599327, 599328, 599329, 599330, 599355, 599357, 599358, 599359, 599360, 599361, 599362, 599363, 599364, 599371, 599372, 599373, 599378, 599379, 599382, 599384, 599386, 599387, 599388, 599389, 599390, 599391, 599392, 599393, 599397, 599398, 599399, 599400, 599401, 599403, 599404, 599405, 599407, 599408, 599409, 599410, 599413, 599414, 599415, 599416, 599417, 599418, 599419, 599420, 599421, 599422, 599423, 599424, 599433, 599434, 599435, 599436, 599437, 599438, 599439, 599440, 599441, 599445, 599446, 599447, 599448, 599474, 599476, 599477, 599479, 599481, 599482, 599483, 599485, 599486, 599487, 599488, 599489, 599490, 599491, 599492, 599494, 599495, 599496, 599497, 599498, 599499, 599500, 599502, 599503, 599504, 599505, 599506, 599507, 599508, 599547, 599552, 599553, 599554, 599558, 599563, 599567, 599568, 599569, 599570, 599577, 599578, 599581, 599582, 599585, 599587, 599588, 599590, 599591, 599592, 599593, 599594, 601332, 601344, 601345, 601382, 601383 и 601385.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 80% ингибирование мРНК CFB, SEQ ID NO: 84, 237, 238, 239, 317, 395, 397, 411, 412, 413, 414, 415, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 425, 426, 427, 429, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 472, 473, 514, 515, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557, 564, 595, 599, 600, 601, 602, 603, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 646, 655, 660, 662, 663, 666, 669, 670, 671, 672, 673, 675, 676, 677, 678, 679, 682, 684, 686, 687, 688, 689, 706, 708, 709, 711, 712, 713, 714, 715, 720, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 729, 730, 731, 732, 733, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 768, 775, 776, 778, 781, 782, 783, 784, 785, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 799, 813, 833, 834, 841, 849, 867 и 873.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 90% ингибирование мРНК CFB, №№ISIS: 532686, 532811, 532917, 588536, 588537, 588538, 588539, 588544, 588545, 588546, 588548, 588551, 588552, 588553, 588554, 588555, 588556, 588557, 588558, 588559, 588560, 588561, 588562, 588564, 588638, 588640, 588696, 588698, 588849, 588850, 588851, 588860, 588866, 588867, 588872, 588873, 588874, 588876, 588877, 588878, 588879, 588881, 588883, 599149, 599188, 599203, 599206, 599220, 599221, 599222, 599223, 599224, 599225, 599226, 599227, 599228, 599229, 599235, 599236, 599279, 599280, 599314, 599321, 599362, 599378, 599390, 599391, 599398, 599399, 599404, 599413, 599414, 599416, 599419, 599420, 599422, 599435, 599437, 599438, 599441, 599483, 599494, 599508, 599552, 599553, 599554, 599568, 599570, 599577, 599581, 599591, 599592 и 599593.
В некоторых вариантах реализации следующие антисмысловые соединения или олигонуклеотиды нацелены на область нуклеиновой кислоты CFB и осуществляют по меньшей мере 90% ингибирование мРНК CFB, SEQ ID NO: 84, 238, 239, 317, 412, 413, 420, 421, 426, 434, 436, 437, 438, 439, 440, 442, 443, 444, 445, 446, 448, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 464, 465, 472, 473, 514, 515, 542, 543, 544, 545, 546, 551, 553, 555, 556, 599, 600, 601, 602, 610, 616, 617, 618, 662, 666, 670, 676, 677, 678, 688, 689, 713, 723, 729, 730, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 755, 756, 768, 783, 793, 833 и 867.
В некоторых вариантах реализации соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, комплементарных в пределах нуклеотидов 2193-2212, 2195-2210, 2457-2476, 2571-2590, 2584-2603, 2588-2607, 2592-2611, 2594-2613, 2597-2616, 2600-2619 или 2596-2611 последовательности SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах реализации соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющий последовательность нуклеотидных оснований, содержащую любую из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598.
В некоторых вариантах реализации соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеотидных оснований, состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598.
В некоторых вариантах реализации любое из вышеуказанных соединений или олигонуклеотидов содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, по меньшей мере один модифицированный сахар и/или по меньшей мере одно модифицированное нуклеотидное основание.
3
2
2
2
В некоторых вариантах реализации любое из вышеуказанных соединений или олигонуклеотидов содержит по меньшей мере один модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтильную группу. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар, такой как группа 4'-СН(СН)-O-2', группа 4'-СН-O-2' или группа 4'-(СН)-O-2'.
В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, такую как фосфоротиоатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах реализации любое из вышеуказанных соединений или олигонуклеотидов содержит по меньшей мере одно модифицированное нуклеотидное основание, такое как 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации любое из вышеуказанных соединений или олигонуклеотидов содержит:
гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5'-крыло, состоящий из связанных нуклеозидов; и
сегмент 3'-крыло, состоящий из связанных нуклеозидов,
при этом указанный гэп-сегмент расположен между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид состоит из 10-30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность нуклеотидных оснований, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 или 598.
В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеотидных оснований, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453 или 455, при этом указанный модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5'-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и
сегмент 3'-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов,
при этом указанный гэп-сегмент расположен между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом, при этом каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь, и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации соединение содержит или состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 20 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453 или 455, при этом указанный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5'-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и
сегмент 3'-крыло, состоящий из пяти связанных нуклеозидов,
при этом указанный гэп-сегмент расположен между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом, при этом каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь; и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации соединение содержит ISIS 588540. В некоторых вариантах реализации соединение состоит из ISIS 588540. В некоторых вариантах реализации ISIS 588540 имеет следующую химическую структуру:
В некоторых вариантах реализации соединение содержит или состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 16 связанных нуклеозидов, имеющего последовательность нуклеотидных оснований, состоящую из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 549, при этом указанный модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5'-крыло, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
сегмент 3'-крыло, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом указанный гэп-сегмент расположен между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом; при этом каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит cEt-сахар; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь; и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах реализации соединение содержит или состоит из одноцепочечного модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 16 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 598, при этом указанный модифицированный олигонуклеотид содержит:
гэп-сегмент, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов;
сегмент 5'-крыло, состоящий из трех связанных нуклеозидов; и
сегмент 3'-крыло, состоящий из трех связанных нуклеозидов;
при этом указанный гэп-сегмент расположен между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом; при этом сегмент 5'-крыло содержит 2'-O-метоксиэтил-сахар, 2'-O-метоксиэтил-сахар и cEt-caxap в 5'-3'-направлении; при этом сегмент 3'-крыло содержит cEt-caxap, cEt-caxap и 2'-O-метоксиэтил-сахар в 5'-3'-направлении; при этом каждая межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь; и при этом каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
В любом из вышеприведенных вариантов реализации соединение или олигонуклеотид может быть по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% комплементарен нуклеиновой кислоте, кодирующей CFB.
В любом из вышеприведенных вариантов реализации соединение или олигонуклеотид может быть одноцепочечным.
50
В некоторых вариантах реализации соединения или композиции, описанные в настоящем документе, эффективны в соответствии с по меньшей мере одной из IC in vitro, составляющей менее 250 нМ, менее 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ, менее 90 нМ, менее 80 нМ, менее 70 нМ, менее 65 нМ, менее 60 нМ, менее 55 нМ, менее 50 нМ, менее 45 нМ, менее 40 нМ, менее 35 нМ, менее 30 нМ, менее 25 нМ или менее 20 нМ.
В некоторых вариантах реализации соединения или композиции, описанные в настоящем документе, являются в высшей степени переносимыми, о чем свидетельствует по меньшей мере одно из: повышения значения аланинтрансаминазы (АЛТ) или аспартаттрансаминазы (ACT) не более чем в 4 раза, в 3 раза или в 2 раза по сравнению с животными, получавшими лечение физиологическим раствором, или увеличения массы печени, селезенки или почки не более чем на 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 5% или 2%. В некоторых вариантах реализации соединения или композиции, описанные в настоящем документе, являются в высшей степени переносимыми, о чем свидетельствует отсутствие повышения уровня АЛТ или ACT по сравнению с животными, получавшими лечение физиологическим раствором. В некоторых вариантах реализации соединения или композиции, описанные в настоящем документе, являются в высшей степени переносимыми, о чем свидетельствует отсутствие увеличения массы печени, селезенки или почки по сравнению с животными, получавшими лечение физиологическим раствором.
В некоторых вариантах реализации предложена композиция, содержащая соединение согласно любому из вышеупомянутых вариантов реализации или его соль и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В некоторых вариантах реализации указанная композиция имеет вязкость менее приблизительно 40 сантипуаз (сП), менее приблизительно 30 сантипуаз (сП), менее приблизительно 20 сантипуаз (сП), менее приблизительно 15 сантипуаз (сП) или менее приблизительно 10 сантипуаз (сП). В некоторых вариантах реализации композиция, имеющая любое из вышеупомянутых значений вязкости, содержит соединение, предложенное согласно настоящему изобретению, в концентрации приблизительно 100 мг/мл, приблизительно 125 мг/мл, приблизительно 150 мг/мл, приблизительно 175 мг/мл, приблизительно 200 мг/мл, приблизительно 225 мг/мл, приблизительно 250 мг/мл, приблизительно 275 мг/мл или приблизительно 300 мг/мл. В некоторых вариантах реализации композиция, имеющая любое из вышеупомянутых значений вязкости и/или концентрации соединения, имеет температуру, представляющую собой комнатную температуру, или приблизительно 20°С, приблизительно 21°С, приблизительно 22°С, приблизительно 23°С, приблизительно 24°С, приблизительно 25°С, приблизительно 26°С, приблизительно 27°С, приблизительно 28°С, приблизительно 29°С или приблизительно 30°С.
В некоторых вариантах реализации способ лечения, предотвращения или облегчения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, у субъекта включает введение указанному субъекту специфичного ингибитора фактора В комплемента (CFB), что таким образом позволяет лечить, предотвращать или облегчать указанное заболевание. В некоторых вариантах реализации альтернативный путь активации комплемента активируется на уровне, выше нормального. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой антисмысловое соединение, нацеленное на CFB, такое как антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на CFB. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 или 594430. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из ISIS 588540, который имеет следующую химическую структуру:
В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна, такую как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), которая может представлять собой влажную форму AMD или сухую форму AMD. В некоторых вариантах реализации сухая форма AMD может представлять собой географическую атрофию. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой заболевание почек, такое как волчаночный нефрит, системная красная волчанка (SLE), болезнь плотного осадка (DDD), С3-гломерулонефрит (C3GN), CFHR5-нефропатия или атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), или любая комбинация указанных заболеваний.
В некоторых вариантах реализации способ лечения, предотвращения или облегчения дегенерации желтого пятна, такой как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), у субъекта включает введение указанному субъекту CFB-специфичного ингибитора, что таким образом позволяет лечить, предотвращать или облегчать AMD, такую как влажная форма AMD и сухая форма AMD. В некоторых вариантах реализации сухая форма AMD может представлять собой географическую атрофию. Географическая атрофия считается запущенной сухой формой AMD, в которую вовлечена дегенерация сетчатки. В некоторых вариантах реализации субъект демонстрирует альтернативный путь активации комплемента, который активируется на уровне, выше нормального. В некоторых вариантах реализации введение антисмыслового соединения уменьшает или ингибирует накопление уровней С3 в глазу, таких как уровни белка С3. В некоторых вариантах реализации введение антисмыслового соединения снижает уровень отложений С3 в глазу или ингибирует накопление отложений С3 в глазу. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой антисмысловое соединение, нацеленное на CFB, такое как антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на CFB. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 или 594430. В некоторых вариантах реализации соединение вводят субъекту парентерально.
В некоторых вариантах реализации способ лечения, предотвращения или облегчения заболевания почек, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, у субъекта включает введение указанному субъекту специфичного ингибитора фактора В комплемента (CFB), что таким образом позволяет лечить, предотвращать или облегчать указанное заболевание почек. В некоторых вариантах реализации альтернативный путь активации комплемента активируется на уровне, выше нормального. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой антисмысловое соединение, нацеленное на CFB, такое как антисмысловой олигонуклеотид, нацеленный на CFB. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 или 594430. В некоторых вариантах реализации соединение вводят субъекту парентерально. В некоторых вариантах реализации заболевание почек представляет собой волчаночный нефрит, системную красную волчанку (SLE), болезнь плотного осадка (DDD), С3-гломерулонефрит (C3GN), CFHR5-нефропатию или атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), или любую комбинацию указанных заболеваний. В некоторых вариантах реализации заболевание почек связано с отложениями С3, такими как отложения С3 в клубочке. В некоторых вариантах реализации заболевание почек связано с уровнями циркулирующего С3, которые ниже нормальных, такими как уровни С3 в сыворотке или плазме. В некоторых вариантах реализации введение соединения снижает или ингибирует накопление уровней С3 в почке, таких как уровни белка С3. В некоторых вариантах реализации введение соединения снижает уровень отложений С3 в почке или ингибирует накопление отложений С3 в почке, таких как уровни С3 в клубочке. В некоторых вариантах реализации присутствие или риск развития заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, у субъекта определяют, например, путем детектирования уровней комплемента или уровней мембраноатакующего комплекса в крови субъекта и/или путем выполнения генетического теста на предмет генных мутаций факторов комплемента, связанных с указанным заболеванием.
В некоторых вариантах реализации способ ингибирования экспрессии фактора В комплемента (CFB) у субъекта, который страдает от или у которого присутствует риск развития заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, включает введение указанному субъекту ингибитора, специфичного в отношении фактора В комплемента (CFB), что таким образом позволяет ингибировать экспрессию CFB у субъекта. В некоторых вариантах реализации введение ингибитора позволяет ингибировать экспрессию CFB в глазу. В некоторых вариантах реализации субъект страдает от или у него присутствует риск развития возрастной дегенерации желтого пятна (AMD), такой как влажная форма AMD и сухая форма AMD. В некоторых вариантах реализации сухая форма AMD может представлять собой географическую атрофию. В некоторых вариантах реализации введение ингибитора позволяет ингибировать экспрессию CFB в почке, например, в клубочке. В некоторых вариантах реализации субъект страдает от или у него присутствует риск развития волчаночного нефрита, системной красной волчанки (SLE), болезни плотного осадка (DDD), С3-гломерулонефрита (C3GN), CFHR5-нефропатии или атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS), или любой комбинации указанных заболеваний. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 или 594430. В некоторых вариантах реализации соединение вводят субъекту парентерально.
В некоторых вариантах реализации способ уменьшения или ингибирования накопления отложений С3 в глазу субъекта, который страдает от или у которого присутствует риск развития заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, включает введение указанному субъекту ингибитора, специфичного в отношении фактора В комплемента (CFB), что таким образом позволяет уменьшать или ингибировать накопление отложений С3 в глазу субъекта. В некоторых вариантах реализации субъект имеет или подвержен риску развития возрастной дегенерации желтого пятна (AMD), такой как влажная форма AMD и сухая форма AMD. В некоторых вариантах реализации сухая форма AMD может представлять собой географическую атрофию. В некоторых вариантах реализации ингибитор представляет собой антисмысловое соединение, нацеленное на CFB. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 или 594430. В некоторых вариантах реализации соединение вводят субъекту парентерально.
В некоторых вариантах реализации способ уменьшения или ингибирования накопления отложений С3 в почке субъекта, который страдает от или у которого присутствует риск развития заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, включает введение указанному субъекту ингибитора, специфичного в отношении фактора В комплемента (CFB), что таким образом позволяет уменьшать или ингибировать накопление отложений С3 в почке субъекта. В некоторых вариантах реализации субъект страдает от или у него присутствует риск развития волчаночного нефрита, системной красной волчанки (SLE), болезни плотного осадка (DDD), С3-гломерулонефрита (C3GN), CFHR5-нефропатии или атипичного гемолитико-уремического синдрома (aHUS), или любой комбинации указанных заболеваний. В некоторых вариантах реализации ингибитор представляет собой антисмысловое соединение, нацеленное на CFB. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 6-808. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598. В некоторых вариантах реализации CFB-специфичный ингибитор представляет собой соединение, содержащее или состоящее из ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 или 594430. В некоторых вариантах реализации соединение вводят субъекту парентерально.
Некоторые варианты реализации относятся к соединению или композиции, описанной в настоящем документе, для применения в терапии. Некоторые варианты реализации относятся к соединению, содержащему или состоящему из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808, для применения в терапии. Некоторые варианты реализации относятся к соединению, содержащему или состоящему из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 6-808, для применения в терапии. Некоторые варианты реализации относятся к соединению, содержащему или состоящему из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598, для применения в терапии. Некоторые варианты реализации относятся к соединению, содержащему или состоящему из ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 или 594430, для применения в терапии.
Некоторые варианты реализации относятся к соединению или композиции, описанной в настоящем документе, для применения для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. Некоторые варианты реализации относятся к соединению, содержащему или состоящему из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808, для применения для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. Некоторые варианты реализации относятся к соединению, содержащему или состоящему из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 6-808, для применения для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. Некоторые варианты реализации относятся к соединению, содержащему или состоящему из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598, для применения для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. Некоторые варианты реализации относятся к соединению, содержащему или состоящему из ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 или 594430, для применения для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. В некоторых вариантах реализации альтернативный путь активации комплемента активируется на уровне, выше нормального. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна, такую как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), которая может представлять собой влажную форму AMD или сухую форму AMD. В некоторых вариантах реализации сухая форма AMD может представлять собой географическую атрофию. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой заболевание почек, такое как волчаночный нефрит, системная красная волчанка (SLE), болезнь плотного осадка (DDD), С3-гломерулонефрит (C3GN), CFHR5-нефропатия или атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), или любая комбинация указанных заболеваний.
Некоторые варианты реализации относятся к соединению, содержащему или состоящему из ISIS 588540, который имеет следующую химическую структуру:
для применения для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. В некоторых вариантах реализации альтернативный путь активации комплемента активируется на уровне, выше нормального. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна, такую как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), которая может представлять собой влажную форму AMD или сухую форму AMD. В некоторых вариантах реализации сухая форма AMD может представлять собой географическую атрофию. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой заболевание почек, такое как волчаночный нефрит, системная красная волчанка (SLE), болезнь плотного осадка (DDD), С3-гломерулонефрит (C3GN), CFHR5-нефропатия или атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), или любая комбинация указанных заболеваний.
Некоторые варианты реализации относятся к применению соединения или композиции, описанной в настоящем документе, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. Некоторые варианты реализации относятся к применению соединения, содержащего или состоящего из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов и имеющего последовательность нуклеотидных оснований, содержащую по меньшей мере 8 смежных нуклеотидных оснований любой из последовательностей нуклеотидных оснований SEQ ID NO: 6-808, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. Некоторые варианты реализации относятся к применению соединения, содержащего или состоящего из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 6-808, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. Некоторые варианты реализации относятся к применению соединения, содержащего или состоящего из модифицированного олигонуклеотида, состоящего из 10-30 связанных нуклеозидов, имеющих последовательность нуклеотидных оснований, содержащую или состоящую из любой из SEQ ID NO: 198, 228, 237, 440, 444, 448, 450, 453, 455, 549 и 598, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. Некоторые варианты реализации относятся к применению соединения, содержащего или состоящего из ISIS 532770, 532800, 532809, 588540, 588544, 588548, 588550, 588553, 588555, 588848 или 594430, для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. В некоторых вариантах реализации альтернативный путь активации комплемента активируется на уровне, выше нормального. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна, такую как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), которая может представлять собой влажную форму AMD или сухую форму AMD. В некоторых вариантах реализации сухая форма AMD может представлять собой географическую атрофию. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой заболевание почек, такое как волчаночный нефрит, системная красная волчанка (SLE), болезнь плотного осадка (DDD), С3-гломерулонефрит (C3GN), CFHR5-нефропатия или атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), или любая комбинация указанных заболеваний.
Некоторые варианты реализации относятся к применению соединения, содержащего или состоящего из ISIS 588540, который имеет следующую химическую структуру:
для изготовления лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента. В некоторых вариантах реализации альтернативный путь активации комплемента активируется на уровне, выше нормального. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой дегенерацию желтого пятна, такую как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), которая может представлять собой влажную форму AMD или сухую форму AMD. В некоторых вариантах реализации сухая форма AMD может представлять собой географическую атрофию. В некоторых вариантах реализации заболевание представляет собой заболевание почек, такое как волчаночный нефрит, системная красная волчанка (SLE), болезнь плотного осадка (DDD), С3-гломерулонефрит (C3GN), CFHR5-нефропатия или атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), или любая комбинация указанных заболеваний.
В любом из вышеприведенных вариантов реализации CFB-специфичный ингибитор может представлять собой антисмысловое соединение, нацеленное на CFB. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит антисмысловой олигонуклеотид, например, антисмысловой олигонуклеотид, состоящий из 8-80 связанных нуклеозидов, 12-30 связанных нуклеозидов или 20 связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95% или 100% комплементарен любой из последовательностей нуклеотидных оснований, представленных в SEQ ID NO: 1-5. В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, по меньшей мере один модифицированный сахар и/или по меньшей мере одно модифицированное нуклеотидное основание. В некоторых вариантах реализации модифицированная межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь, модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар или 2'-O-метоксиэтил-сахар, и модифицированное нуклеотидное основание представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых вариантах реализации модифицированный олигонуклеотид содержит гэп-сегмент, состоящий из связанных дезоксинуклеозидов; сегмент 5'-крыло, состоящий из связанных нуклеозидов; и сегмент 3'-крыло, состоящий из связанных нуклеозидов; при этом указанный гэп-сегмент непосредственно примыкает и расположен между 5'-сегментом-крылом и 3'-сегментом-крылом, и при этом каждый нуклеозид каждого сегмента-крыла содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид вводят парентерально. Например, в некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид может быть введен посредством инъекции или инфузии. Парентеральное введение включает подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, интраперитонеальное введение или интракраниальное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение.
Антисмысловые соединения
Олигомерные соединения включают, но не ограничиваются ими, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды и siPHK. Олигомерное соединение может быть «антисмысловым» по отношению к целевой нуклеиновой кислоте, т.е. оно способно гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой путем образования водородных связей.
В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение содержит последовательность нуклеотидных оснований, которая при записи в 5'-3'-направлении содержит обратно-комплементарную последовательность целевого сегмента целевой нуклеиновой кислоты, на которую она нацелена.
В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 10 до 30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 12 до 30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 12 до 22 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 14 до 30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 14 до 20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 15 до 30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 15 до 20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 16 до 30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 16 до 20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 17 до 30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 17 до 20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 18 до 30 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 18 до 21 субъединицы. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 18 до 20 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет от 20 до 30 субъединиц. Другими словами, такие антисмысловые соединения представляют собой от 12 до 30 связанных субъединиц, от 14 до 30 связанных субъединиц, от 14 до 20 субъединиц, от 15 до 30 субъединиц, от 15 до 20 субъединиц, от 16 до 30 субъединиц, от 16 до 20 субъединиц, от 17 до 30 субъединиц, от 17 до 20 субъединиц, от 18 до 30 субъединиц, от 18 до 20 субъединиц, от 18 до 21 субъединицы, от 20 до 30 субъединиц или от 12 до 22 связанных субъединиц соответственно. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет 14 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет 16 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет 17 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет 18 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет 19 субъединиц. В некоторых вариантах реализации длина антисмыслового соединения составляет 20 субъединиц. В других вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой от 8 до 80, от 12 до 50, от 13 до 30, от 13 до 50, от 14 до 30, от 14 до 50, от 15 до 30, от 15 до 50, от 16 до 30, от 16 до 50, от 17 до 30, от 17 до 50, от 18 до 22, от 18 до 24, от 18 до 30, от 18 до 50, от 19 до 22, от 19 до 30, от 19 до 50 или от 20 до 30 связанных субъединиц. В некоторых таких вариантах реализации длина антисмысловых соединений составляет 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных субъединиц, или характеризуется диапазоном, определяемым любыми двумя из значений, указанных выше. В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, а связанные субъединицы представляют собой нуклеотиды.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды могут быть усеченными или укороченными. Например, одна субъединица может быть делегирована с 5'-конца (5'-укорачивание) или, в качестве альтернативы, с 3'-конца (3'-укорачивание). Усеченное или укороченное антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту CFB, может содержать делецию двух субъединиц с 5'-конца или, в качестве альтернативы, может содержать делецию двух субъединиц с 3'-конца антисмыслового соединения. В качестве альтернативы, делегируемые нуклеозиды могут быть распределены по всему антисмысловому соединению, например, в антисмысловом соединении, содержащем делецию одного нуклеозида с 5'-конца и делецию одного нуклеозида с 3'-конца.
В случае, когда в удлиненном антисмысловом соединении присутствует одна дополнительная субъединица, указанная дополнительная субъединица может быть расположена на 5'- или 3'-конце антисмыслового соединения. В случае, когда присутствуют две или более дополнительных субъединиц, указанные присоединяемые субъединицы могут примыкать друг с другом, например, в антисмысловом соединении, содержащем две субъединицы, присоединенные к 5'-концу (5'-присоединение) или, в качестве альтернативы, к 3'-концу (3'-присоединение) указанного антисмыслового соединения. В качестве альтернативы, присоединяемые субъединицы могут быть распределены по всему антисмысловому соединению, например, в антисмысловом соединении, содержащем одну субъединицу, присоединенную к 5'-концу, и одну субъединицу, присоединенную к 3'-концу.
Можно увеличивать или уменьшать длину антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид, и/или вводить в него несоответствующие основания без устранения активности. Например, в Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89: 7305-7309, 1992) тестировали серию антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13-25 нуклеотидных оснований на способность индуцировать расщепление целевой РНК в модели с инъекцией ооцитов. Антисмысловые олигонуклеотиды длиной 25 нуклеотидных оснований с 8 или 11 несоответствующими основаниями возле концов указанных антисмысловых олигонуклеотидов были способны направлять специфичное расщепление целевой мРНК, хотя и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, не содержащие таких несоответствий. Подобным образом, специфичного в отношении цели расщепления достигали с использованием антисмысловых олигонуклеотидов длиной 13 нуклеотидных оснований, в том числе тех, которые содержали 1 или 3 несоответствия.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93: 463-471, March 2001) продемонстрировали способность олигонуклеотида, на 100% комплементарного мРНК bcl-2 и содержащего 3 несоответствия мРНК bcl-xL, уменьшать экспрессию как bcl-2, так и bcl-xL in vitro и in vivo. Более того, данный олигонуклеотид демонстрировал сильную противоопухолевую активность in vivo.
Maher и Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16: 3341-3358, 1988) тестировали серию тандемных антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеотидных оснований и антисмысловых олигонуклеотидов длиной 28 и 42 нуклеотидных основания, состоящих из последовательности двух или трех тандемных антисмысловых олигонуклеотидов соответственно, на способность останавливать трансляцию дигидрофолатредуктазы (DHFR) человека в анализе с ретикулоцитами кролика. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов длиной 14 нуклеотидных оснований сам по себе мог ингибировать трансляцию, хотя и на более умеренном уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды длиной 28 или 42 нуклеотидных основания.
Некоторые мотивы и механизмы антисмысловых соединений
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат химически модифицированные субъединицы, организованные в паттерны или мотивы для придания указанным антисмысловым соединениям таких свойств, как повышенная ингибирующая активность, повышенная аффинность связывания в отношении целевой нуклеиновой кислоты или устойчивость к распаду под действием нуклеаз in vivo.
Химерные антисмысловые соединения, как правило, содержат по меньшей мере одну область, модифицированную для придания повышенной устойчивости к распаду под действием нуклеаз, повышенной способности к поглощению клетками, повышенной аффинности связывания в отношении целевой нуклеиновой кислоты и/или повышенной ингибирующей активности. Вторая область химерного антисмыслового соединения может придавать другое желаемое свойство, например, служить в качестве субстрата для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет РНК-цепь дуплекса РНК:ДНК.
Антисмысловая активность может являться результатом любого механизма, в который вовлечена гибридизация антисмыслового соединения (например, олигонуклеотида) с целевой нуклеиновой кислотой, при этом гибридизация, в конечном счете, обуславливает биологический эффект. В некоторых вариантах реализации модулируют количество и/или активность целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации уменьшают количество и/или активность целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации гибридизация антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой, в конечном счете, приводит к распаду целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации гибридизация антисмыслового соединения с целевой нуклеиновой кислотой не приводит к распаду целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых таких вариантах реализации присутствие антисмыслового соединения, гибридизованного с целевой нуклеиновой кислотой (занятость), приводит к модуляции антисмысловой активности. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, содержащие конкретный химический мотив или паттерн химических модификаций, особенно подходят для использования одного или более механизмов. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения функционируют больше чем по одному механизму и/или по механизмам, которые не были объяснены. Соответственно, антисмысловые соединения, описанные в настоящем документе, не ограничиваются конкретным механизмом.
Антисмысловые механизмы включают, без ограничения, антисмысловой механизм, опосредуемый РНКазой Н; механизмы РНК-интерференции (PHКi), которые используют путь индуцируемого РНК комплекса сайленсинга (RISC) и включают, без ограничения, механизмы siPHК, ssPHК и микроРНК; и механизмы на основе степени занятости. Некоторые антисмысловые соединения могут действовать больше чем по одному такому механизму и/или по дополнительным механизмам.
Антисмысловой механизм, опосредуемый РНКазой Н
В некоторых вариантах реализации антисмысловая активность по меньшей мере отчасти является следствием распада целевой РНК под действием РНКазы Н. РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет РНК-цепь дуплекса РНК:ДНК. В данной области техники известно, что одноцепочечные антисмысловые соединения, которые являются «ДНК-подобными», вызывают активность РНКазы Н в клетках млекопитающих. Соответственно, антисмысловые соединения, содержащие по меньшей мере часть нуклеозидов ДНК или ДНК-подобных нуклеозидов, могут активировать РНКазу Н, что приводит к расщеплению целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, которые используют РНКазу Н, содержат один или более модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации такие антисмысловые соединения содержат по меньшей мере один блок из 1-8 модифицированных нуклеозидов. В некоторых таких вариантах реализации указанные модифицированные нуклеозиды не обеспечивают активность РНКазы Н. В некоторых вариантах реализации такие антисмысловые соединения представляют собой гэпмеры, описанные в настоящем документе. В некоторых таких вариантах реализации гэп гэпмера содержит нуклеозиды ДНК. В некоторых таких вариантах реализации гэп гэпмера содержит ДНК-подобные нуклеозиды. В некоторых таких вариантах реализации гэп гэпмера содержит нуклеозиды ДНК и ДНК-подобные нуклеозиды.
3
Некоторые антисмысловые соединения, содержащие гэпмерный мотив, считаются химерными антисмысловыми соединениями. В гэпмере внутренняя область, содержащая множество нуклеотидов, обеспечивающих расщепление РНКазой Н, расположена между внешними областями, содержащими множество нуклеотидов, которые химически отличаются от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, содержащего гэпмерный мотив, гэп-сегмент, как правило, служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, тогда как сегменты-крылья содержат модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации области гэпмера отличаются типами сахарных групп, составляющих каждую отличающуюся область. Типы сахарных групп, которые используют для дифференцировки областей гэпмера, в некоторых вариантах реализации могут включать β-D-рибонуклеозиды, β-D-дезоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (такие 2'-модифицированные нуклеозиды могут включать 2'-МОЕ и 2'-O-СН в числе прочих) и нуклеозиды, модифицированные бициклическим сахаром (такие нуклеозиды, модифицированные бициклическим сахаром, могут включать те, которые содержат конформационно ограниченный этил). В некоторых вариантах реализации нуклеозиды в «крыльях» могут содержать несколько модифицированных сахарных групп, включая, например, 2'-МОЕ, и бициклических сахарных групп, таких как конформационно ограниченный этил или LNA. В некоторых вариантах реализации «крылья» могут содержать несколько модифицированных и немодифицированных сахарных групп. В некоторых вариантах реализации «крылья» могут содержать различные комбинации 2'-МОЕ-нуклеозидов, бициклических сахарных групп, таких как конформационно ограниченные этил-нуклеозиды или LNA-нуклеозиды, и 2'-дезоксинуклеозидов.
Каждая отличающаяся область может содержать одинаковые сахарные группы, вариантные или чередующиеся группы. Мотив «крыло-гэп-крыло» часто описывается как «X-Y-Z», где «X» представляет длину 5'-крыла, «Y» представляет длину гэпа, и «Z» представляет длину 3'-«крыла». «X» и «Z» могут содержать одинаковые, вариантные или чередующиеся сахарные группы. В некоторых вариантах реализации «X» и «Y» могут содержать один или более 2'-дезоксинуклеозидов. «Y» может содержать 2'-дезоксинуклеозиды. В настоящем описании гэпмер, описываемый как «X-Y-Z», имеет такую конфигурацию, при которой гэп непосредственно примыкает к каждому из 5'-«крыла» и 3'-«крыла». Таким образом, между 5'-«крылом» и гэпом или гэпом и 3'-«крылом» отсутствуют промежуточные нуклеотиды. Любое из антисмысловых соединений, описанных в настоящем документе, может содержать гэпмерный мотив. В некоторых вариантах реализации «X» и «Z» являются одинаковыми; в других вариантах реализации они отличаются. В некоторых вариантах реализации «Y» составляет от 8 до 15 нуклеозидов. X, Y или Z могут составлять любое число из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 или более нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации антисмысловое соединение, нацеленное на нуклеиновую кислоту CFB, содержит гэпмерный мотив, в котором гэп состоит из 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 связанных нуклеозидов.
m
n
p
r
t
g
v
w
x
y
z
В некоторых вариантах реализации антисмысловой олигонуклеотид содержит сахарный мотив, описываемый формулой А следующим образом: (J)-(B)-(J)-(B)-(A)-(D)-(A)-(B)-(J)-(B)-(J),
где:
каждый А независимо представляет собой 2'-замещенный нуклеозид;
каждый В независимо представляет собой бициклический нуклеозид;
каждый J независимо представляет собой либо 2'-замещенный нуклеозид, либо 2'-дезоксинуклеозид;
каждый D представляет собой 2'-дезоксинуклеозид;
m равен 0-4; n равен 0-2; р равен 0-2; r равен 0-2; t равен 0-2; v равен 0-2; w равен 0-4; х равен 0-2; у равен 0-2; z равен 0-4; g равен 6-14;
при этом:
по меньшей мере один из: m, n и r отличен от 0;
по меньшей мере один из: w и у отличен от 0;
сумма m, n, р, r и t составляет от 2 до 5; и
сумма v, w, х, у и z составляет от 2 до 5.
Соединения PHКi
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения представляют собой интерферирующие РНК-соединения (PHКi), которые включают двухцепочечные РНК-соединения (также называемые короткой интерферирующей РНК или siPHК) и одноцепочечные соединения PHКi (или ssPHК). Такие соединения действуют по меньшей мере отчасти по пути RISC с разложением и/или секвестированием целевой нуклеиновой кислоты (таким образом, включают микроРНК/соединения-имитаторы микроРНК). В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат модификации, которые делают их особенно подходящими для таких механизмов.
i. Соединения, представляющие собой ssPHК
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, в том числе те соединения, которые особенно подходят для применения в качестве одноцепочечных соединений PHКi (ssPHК), содержат модифицированную 5'-концевую область. В некоторых таких вариантах реализации указанная 5'-концевая область содержит модифицированную фосфатную группу. В некоторых вариантах реализации такой модифицированный фосфат стабилизирован (например, устойчив к распаду/расщеплению по сравнению с немодифицированным 5'-фосфатом). В некоторых вариантах реализации такие 5'-концевые нуклеозиды стабилизируют 5'-фосфорную группу. Некоторые модифицированные 5'-концевые нуклеозиды можно встретить в данной области техники, например, в WO/2011/139702.
В некоторых вариантах реализации 5'-нуклеозид соединения, представляющего собой ssPHКЙ, имеет формулу IIc:
где:
1
T представляет собой возможно защищенную фосфорную группу;
2
Т представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, которая связывает соединение формулы IIc с олигомерным соединением;
А имеет одну из формул:
1
2
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
3
4
Q и Q каждый независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, C-С алкокси, содержащий заместители C-С алкокси, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, С-С алкинил, содержащий заместители С-С алкинил или N(R)(R);
3
5
6
7
Q представляет собой О, S, N(R) или С(R)(R);
3
4
5
6
7
1
6
1
6
1
6
каждый R, R R, R и R независимо представляет собой Н, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил или C-С алкокси;
3
14
15
16
15
16
17
18
15
17
15
16
15
2
М представляет собой О, S, NR, C(R)(R), C(R)(R)C(R)(R), C(R)=C(R), OC(R)(R) или OC(R)(Bx);
14
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
R представляет собой Н, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, C-С алкокси, содержащий заместители C-С алкокси, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, С-С алкинил или содержащий заместители С-С алкинил;
15
16
17
18
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
R, R, R и R каждый независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, C-С алкокси, содержащий заместители C-С алкокси, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, С-С алкинил или содержащий заместители С-С алкинил;
1
Bx представляет собой гетероциклическое основание;
2
2
1
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
или, если присутствует Вх, то Вх представляет собой гетероциклическое основание, а Bx представляет собой Н, галоген, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, C-С алкокси, содержащий заместители C-С алкокси, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, С-С алкинил или содержащий заместители С-С алкинил;
4
5
6
7
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
J, J, J и J каждый независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, C-С алкокси, содержащий заместители C-С алкокси, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, С-С алкинил или содержащий заместители С-С алкинил;
4
5
7
19
20
21
20
21
20
21
5
6
7
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
или J образует мостик с одним из: J или J, при этом указанный мостик содержит от 1 до 3 связанных бирадикальных групп, выбранных из О, S, NR, C(R)(R), C(R)=C(R), C[=C(R)(R)] и С(=O), а другие два из: J, J и J каждый независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, C-С алкокси, содержащий заместители C-С алкокси, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, С-С алкинил или содержащий заместители С-С алкинил;
19
20
21
1
6
1
6
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
каждый R, R и R независимо представляет собой Н, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, C-С алкокси, содержащий заместители C-С алкокси, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, С-С алкинил или содержащий заместители С-С алкинил;
8
9
n
m
1
j
G представляет собой Н, ОН, галоген или O-[C(R)(R)]-[(C=O)-X]-Z;
8
9
1
6
1
6
каждый R и R независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил или содержащий заместители C-С алкил;
1
1
X представляет собой О, S или N(E);
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
2
3
Z представляет собой Н, галоген, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, С-С алкинил, содержащий заместители С-С алкинил или N(Е)(Е);
1
2
3
1
6
1
6
E, E и Е каждый независимо представляет собой Н, C-С алкил или содержащий заместители C-С алкил;
n равен от 1 до приблизительно 6;
m равен 0 или 1;
j равен 0 или 1;
1
1
2
1
1
3
2
1
2
1
2
2
1
2
каждая содержащая заместители группа содержит одну или более возможно защищенных замещающих групп, независимо выбранных из галогена, OJ, N(J)(J),=NJ, SJ, N, CN, OC(=X)J, OC(=X)N(J)(J) и C(=X)N(J)(J);
2
3
Х представляет собой О, S или NJ;
1
2
3
1
6
каждый J, J и J независимо представляет собой H или C-С алкил;
2
3
когда j равен 1, Z отличен от галогена или N(Е)(Е); и
при этом указанное олигомерное соединение содержит от 8 до 40 мономерных субъединиц и способно гибридизоваться по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты.
3
2
2
3
В некоторых вариантах реализации М представляет собой О, СН=СН, ОСН или ОС(Н)(Вх). В некоторых вариантах реализации М представляет собой О.
4
5
6
7
4
5
7
В некоторых вариантах реализации J, J, J и J каждый представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации J образует мостик с одним из: J или J.
В некоторых вариантах реализации А имеет одну из формул:
где:
1
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
2
1
2
1
2
1
2
3
3
Q и Q каждый независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, C-С алкокси или содержащий заместители C-С алкокси. В некоторых вариантах реализации Q и Q каждый представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации Q и Q каждый независимо представляет собой Н или галоген. В некоторых вариантах реализации Q и Q представляет собой Н, а другой из: Q и Q представляет собой F, СН или ОСН.
1
В некоторых вариантах реализации T имеет формулу:
где:
a
c
1
6
1
6
1
6
1
6
R и R каждый независимо представляет собой защищенный гидроксил, защищенный тиол, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, C-С алкокси, содержащий заместители C-С алкокси, защищенную аминогруппу или содержащую заместители аминогруппу; и
b
b
a
c
3
2
3
3
2
R представляет собой О или S. В некоторых вариантах реализации R представляет собой О, и R и R каждый независимо представляет собой ОСН, ОСНСН или СН(СН).
3
2
2
3
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
2
3
10
11
2
2
10
11
2
2
2
2
10
11
2
10
11
2
12
2
2
10
11
2
2
12
13
10
11
10
11
12
13
1
6
3
3
2
3
2
3
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
2
3
2
2
2
3
2
2
3
2
2
3
В некоторых вариантах реализации G представляет собой галоген, ОСН, OCHF, OCHF, OCF, ОСНСН, O(CH)F, OCHCHF, OCHCF, ОСН-СН=СН, O(СН)-ОСН, O(СН)-SCH, O(СН)-OCF, O(СН)-N(R)(R), O(CH)-ON(R)(R), O(CH)-O(CH)-N(R)(R), OCHC(=O)-N(R)(R), OCHC(=O)-N(R)-(CH)-N(R)(R) или O(CH)-N(R)-C(=NR)[N(R)(R)], где R, R, R и R каждый независимо представляет собой Н или C-С алкил. В некоторых вариантах реализации G представляет собой галоген, ОСН, OCF, ОСНСН, OCHCF, ОСН-СН=СН, O(СН)-ОСН, O(СН)-O(СН)-N(СН), OCHC(=O)-N(H)CH, OCHC(=O)-N(H)-(CH)-N(CH) или ОСН-N(H)-C(=NH)NH. В некоторых вариантах реализации G представляет собой F, ОСН или O(СН)-ОСН. В некоторых вариантах реализации G представляет собой O(СН)-ОСН.
В некоторых вариантах реализации 5'-концевой нуклеозид имеет формулу IIe:
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, в том числе те соединения, которые особенно подходят в качестве ssPHК, содержат один или более типов модифицированных сахарных групп и/или встречающихся в природе сахарных групп, расположенных по всему олигонуклеотиду или его области в определенном паттерне или мотиве модификаций сахаров. Такие мотивы могут включать любую из модификаций сахаров, рассмотренных в настоящем описании, и/или другие известные модификации сахаров.
В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат или состоят из области, содержащей одинаковые модификации сахаров. В некоторых таких вариантах реализации каждый нуклеозид указанной области содержит одну и ту же модификацию РНК-подобного сахара. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид области представляет собой 2'-F-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид области представляет собой 2'-ОМе-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид области представляет собой 2'-МОЕ-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид области представляет собой cEt-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации каждый нуклеозид области представляет собой LNA-нуклеозид. В некоторых вариантах реализации одинаковая область составляет весь или по существу весь олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации указанная область составляет весь олигонуклеотид за исключением 1-4 концевых нуклеозидов.
В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат одну или более областей с чередующимися модификациями сахаров, при этом нуклеозиды чередуются между нуклеотидами, содержащими модификацию сахара первого типа, и нуклеотидами, содержащими модификацию сахара второго типа. В некоторых вариантах реализации нуклеозиды обоих типов представляют собой РНК-подобные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации чередующиеся нуклеозиды выбраны из: 2'-ОМе, 2'-F, 2'-МОЕ, LNA и cEt. В некоторых вариантах реализации чередующиеся модификации представляют собой 2'-F и 2'-ОМе. Такие области могут быть смежными или могут прерываться по-разному модифицированными нуклеозидами или сопряженными нуклеозидами.
х
у
В некоторых вариантах реализации каждая чередующаяся область с чередующимися модификациями состоит из одного нуклеозида (т.е. паттерн представляет собой (АВ)А, где А представляет собой нуклеозид, содержащий модификацию сахара первого типа, и В представляет собой нуклеозид, содержащий модификацию сахара второго типа; х равен 1-20, и у равен 0 или 1). В некоторых вариантах реализации одна или более чередующихся областей в чередующемся мотиве содержит более одного нуклеозида определенного типа. Например, олигонуклеотиды могут содержать одну или более областей с любым из следующих мотивов нуклеозидов:
ААВВАА;
АВВАВВ;
ААВААВ;
АВВАВААВВ;
АВАВАА;
ААВАВАВ;
АВАВАА;
АВВААВВАВАВАА;
ВАВВААВВАВАВАА; или
АВАВВААВВАВАВАА;
где А представляет собой нуклеозид первого типа, а В представляет собой нуклеозид второго типа. В некоторых вариантах реализации А и В каждый выбран из 2'-F, 2'-ОМе, BNA и МОЕ.
В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды, содержащие такой чередующийся мотив, также содержат модифицированный 5'-концевой нуклеозид, такой как нуклеозиды формулы IIc или IIe.
В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат область, содержащую мотив 2-2-3. Такие области содержат следующий мотив:
2
x
2
у
3
-(А)-(В)-(А)-(С)-(А)-,
где: А представляет собой первый тип модифицированного нуклеозида;
В и С представляют собой нуклеозиды, модифицированные иначе, чем А, однако В и С могут содержать одинаковые или разные модификации относительно друг друга;
х и у равны от 1 до 15.
В некоторых вариантах реализации А представляет собой 2'-ОМе-модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах реализации В и С оба представляют собой 2'-F-модифицированные нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации А представляет собой 2'-ОМе-модифицированный нуклеозид, а В и С оба представляют собой 2'-F-модифицированные нуклеозиды.
В некоторых вариантах реализации олигонуклеозиды содержат следующий сахарный мотив:
x
y
z
5'-(Q)-(AB)A-(D),
где:
Q представляет собой нуклеозид, содержащий стабилизированную фосфатную группу. В некоторых вариантах реализации Q представляет собой нуклеозид, имеющий формулу IIc или IIe;
А представляет собой первый тип модифицированного нуклеозида;
В представляет собой второй тип модифицированного нуклеозида;
D представляет собой модифицированный нуклеозид, содержащий модификацию, отличную от нуклеозида, примыкающего к нему. Таким образом, если у равен 0, то D должен быть модифицирован иначе, чем В, и если у равен 1, то D должен быть модифицирован иначе, чем А. В некоторых вариантах реализации D отличается как от А, так и от В.
Х равен 5-15;
Y равен 0 или 1;
Z равен 0-4.
В некоторых вариантах реализации олигонуклеозиды содержат следующий сахарный мотив:
x
z
5'-(Q)-(A)-(D),
где:
Q представляет собой нуклеозид, содержащий стабилизированную фосфатную группу. В некоторых вариантах реализации Q представляет собой нуклеозид, имеющий формулу IIc или IIe;
А представляет собой первый тип модифицированного нуклеозида;
D представляет собой модифицированный нуклеозид, содержащий модификацию, отличную от А.
Х равен 11-30;
Z равен 0-4.
В некоторых вариантах реализации А, В, С и D в приведенных выше мотивах выбраны из: 2'-ОМе, 2'-F, 2'-МОЕ, LNA и cEt. В некоторых вариантах реализации D представляет собой концевые нуклеозиды. В некоторых вариантах реализации такие концевые нуклеозиды не предназначены для гибридизации с целевой нуклеиновой кислотой (хотя один или более могут гибридизоваться случайно). В некоторых вариантах реализации нуклеотидное основание каждого нуклеозида D представляет собой аденин, независимо от идентичности нуклеотидного основания в соответствующем положении целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации нуклеотидное основание каждого нуклеозида D представляет собой тимин.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, в том числе те соединения, которые особенно подходят для применения в качестве ssPHK, содержат модифицированные межнуклеозидные связи, расположенные по всему олигонуклеотиду или его области в определенном паттерне или мотиве модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат область, содержащую мотив чередующихся межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотиды содержат область одинаково модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации олигонуклеотид содержит область, которая одинаково связана фосфоротиоатными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид одинаково связан фосфоротиоатными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах реализации каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфирной и фосфоротиоатной. В некоторых вариантах реализации каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида выбрана из фосфодиэфирной и фосфоротиоатной, и по меньшей мере одна межнуклеозидная связь представляет собой фосфоротиоатную связь.
В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 6 фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 8 фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере 10 фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок из по меньшей мере 6 последовательных фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок из по меньшей мере 8 последовательных фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок из по меньшей мере 10 последовательных фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит по меньшей мере один блок из по меньшей мере 12 последовательных фосфоротиоатных межнуклеозидных связей. В некоторых таких вариантах реализации по меньшей мере один такой блок расположен на 3'-конце олигонуклеотида. В некоторых таких вариантах реализации по меньшей мере один такой блок расположен в пределах 3 нуклеозидов 3'-конца олигонуклеотида.
Олигонуклеотиды, содержащие любой из различных сахарных мотивов, описанных в настоящем документе, могут содержать любой мотив связей. Например, олигонуклеотиды, включая, но не ограничиваясь ими, те, которые описаны выше, могут содержать мотив связей, выбранный из неограничивающей таблицы ниже:
ii. Соединения, представляющие собой siPHК
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения представляют собой двухцепочечные соединения PHКi (siPHК). В таких вариантах реализации одна или обе цепи могут содержать любой мотив модификаций, описанный выше для ssPHК. В некоторых вариантах реализации соединения, представляющие собой ssPHК, могут представлять собой немодифицированную РНК. В некоторых вариантах реализации соединения, представляющие собой siPHК, могут содержать немодифицированные нуклеозиды РНК, но модифицированные межнуклеозидные связи.
Некоторые варианты реализации относятся к двухцепочечным композициям, в которых каждая цепь содержит мотив, определяемый расположением одного или более модифицированных или немодифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации предложены композиции, содержащие первое и второе олигомерное соединение, которые полностью или по меньшей мере частично гибридизованы с образованием области-дуплекса, и дополнительно содержащие область, которая комплементарна и гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью. Подходящим является содержание такой композицией первого олигомерного соединения, которое представляет собой антисмысловую цепь, полностью или частично комплементарную нуклеиновой кислоте-мишени, и второго олигомерного соединения, которое представляет собой смысловую цепь, содержащую одну или более областей комплементарности и образующую по меньшей мере одну область-дуплекс с первым олигомерным соединением.
Композиции в некоторых вариантах реализации модулируют экспрессию генов путем гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, приводящей к потере ее обычной функции. В некоторых вариантах реализации распад целевого CFB облегчает активированный комплекс RISC, который образуется с помощью композиций согласно настоящему изобретению.
Некоторые варианты реализации относятся к двухцепочечным композициям, в которых одна из цепей подходит, например, для влияния на предпочтительную загрузку противоположной цепи в комплекс RISC (или расщепление). Композиции подходят для нацеливания на выбранные молекулы нуклеиновой кислоты и модуляции экспрессии одного или более генов. В некоторых вариантах реализации композиции согласно настоящему изобретению гибридизуются с частью целевой РНК, что приводит к потере обычной функции указанной целевой РНК.
Некоторые варианты реализации относятся к двухцепочечным композициям, в которых обе цепи содержат гемимерный (hemimer) мотив, полностью модифицированный мотив, позиционно модифицированный мотив или чередующийся мотив. Каждая цепь композиций согласно настоящему изобретению может быть модифицирована для выполнения конкретной роли, например, в пути siPHК. Использование отличного мотива в каждой цепи или одного и того же мотива с различными химическими модификациями в каждой цепи позволяет нацеливать антисмысловую цепь на комплекс RISC наряду с ингибированием включения смысловой цепи. В рамках данной модели каждую цепь можно независимо модифицировать так, чтобы усилить ее конкретную роль. Антисмысловая цепь может быть модифицирована на 5'-конце для усиления роли в одной из областей RISC, тогда как 3'-конец может быть модифицирован по-другому для усиления роли в другой области RISC.
Двухцепочечные молекулы олигонуклеотида могут представлять собой двухцепочечную молекулу полинуклеотида, содержащую самокомплементарные смысловую и антисмысловую области, при этом указанная антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в целевой молекуле нуклеиновой кислоты или ее части, а указанная смысловая область содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части. Двухцепочечные молекулы олигонуклеотида могут быть собраны из двух отдельных олигонуклеотидов, при этом одна цепь представляет собой смысловую цепь, а другая представляет собой антисмысловую цепь, при этом антисмысловая и смысловая цепи являются самокомплементарными (т.е. каждая цепь содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в другой цепи; при этом, например, антисмысловая цепь и смысловая цепь образуют дуплекс или двухцепочечную структуру, например, в которой двухцепочечная область представляет собой от приблизительно 15 до приблизительно 30, например, приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 пар оснований; антисмысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в целевой молекуле нуклеиновой кислоты или ее части, и смысловая цепь содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части (например, от приблизительно 15 до приблизительно 25 или более нуклеотидов в двухцепочечной молекуле олигонуклеотида комплементарны целевой нуклеиновой кислоте или ее части). В качестве альтернативы, двухцепочечный олигонуклеотид собран из одного олигонуклеотида, в котором самокомплементарные смысловая и антисмысловая области siPHК связаны линкером (линкерами) на основе нуклеиновой кислоты или не на основе нуклеиновой кислоты.
Двухцепочечный олигонуклеотид может представлять собой полинуклеотид с дуплексной, асимметричной дуплексной, шпилечной или асимметричной шпилечной вторичной структурой, содержащий самокомплементарные смысловую и антисмысловую области, при этом указанная антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в отдельной молекуле целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и указанная смысловая область содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части. Двухцепочечный олигонуклеотид может представлять собой кольцевой одноцепочечный полинуклеотид, содержащий две или более петлевых структур и «стебель», содержащий самокомплементарные смысловую и антисмысловую области, при этом указанная антисмысловая область содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности в целевой молекуле нуклеиновой кислоты или ее части, и указанная смысловая область содержит нуклеотидную последовательность, соответствующую последовательности целевой нуклеиновой кислоты или ее части, и при этом указанный кольцевой полинуклеотид может быть процессирован либо in vivo, либо in vitro с образованием активной молекулы siPHК, способной опосредовать PHКi.
В некоторых вариантах реализации двухцепочечный олигонуклеотид содержит отдельные смысловые и антисмысловые последовательности или области, при этом указанные смысловые и антисмысловые области ковалентно связаны нуклеотидными или ненуклеотидными линкерными молекулами, известными в данной области техники, или поочередно нековалентно связаны путем ионных взаимодействий, образования водородных связей, ван-дер-ваальсовых взаимодействий, гидрофобных взаимодействий и/или стэкинг-взаимодействий. В некоторых вариантах реализации двухцепочечный олигонуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности целевого гена. В другом варианте реализации двухцепочечный олигонуклеотид взаимодействует с нуклеотидной последовательностью целевого гена таким образом, что вызывает ингибирование экспрессии указанного целевого гена.
В настоящем описании двухцепочечные олигонуклеотиды необязательно ограничиваются теми молекулами, которые содержат только РНК, но также включают химически модифицированные нуклеотиды и ненуклеотиды. В некоторых вариантах реализации молекулы малой интерферирующей нуклеиновой кислоты не содержат нуклеотиды, содержащие 2'-гидрокси (2'-ОН). В некоторых вариантах реализации малые интерферирующие нуклеиновые кислоты возможно не содержат какие-либо рибонуклеотиды (например, нуклеотиды, содержащие группу 2'-ОН). Такие двухцепочечные олигонуклеотиды, для которых не требуется присутствие рибонуклеотидов в молекуле для обеспечения PHКi, могут однако содержать присоединенный линкер или линкеры, или другие присоединенные или ассоциированные группы, фрагменты или цепи, содержащие один или более нуклеотидов с группами 2'-ОН. Двухцепочечные олигонуклеотиды могут содержать рибонуклеотиды приблизительно в 5, 10, 20, 30, 40 или 50% от всех положений нуклеотидов. В настоящем описании термин «siPHК» эквивалентен другим терминам, употребляемым для описания молекул нуклеиновой кислоты, которые способны опосредовать специфичную в отношении последовательности PHКi, например, терминам «малая интерферирующая РНК (siPHК)», «двухцепочечная РНК (dsPHК)», «микроРНК (миРНК)», «короткая шпилечная РНК (shPHК)», «малый интерферирующий олигонуклеотид», «малая интерферирующая нуклеиновая кислота», «малый интерферирующий модифицированный олигонуклеотид», «химически модифицированная siPHК», «РНК посттранскрипционного сайленсинга гена (ptgsPHК)» и другим. Кроме того, в настоящем описании термин «PHКi» эквивалентен другим терминам, употребляемым для описания специфичной в отношении последовательности РНК-интерференции, таким как «посттранскрипционный сайленсинг гена», «ингибирование транскрипции» или «эпигенетика». Например, двухцепочечные олигонуклеотиды можно использовать для эпигенетического сайленсинга генов как на посттранскрипционном уровне, так и на претранскрипционном уровне. В не ограничивающем примере эпигенетическая регуляция экспрессии генов молекулами siPHК согласно настоящему изобретению может являться следствием siPHК-опосредуемой модификации структуры хроматина или паттерна метилирования для изменения экспрессии генов (см., например, Verdel et al., 2004, Science, 303, 672-676; Pal-Bhadra et al., 2004, Science, 303, 669-672; Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819; Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837; Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218; и Hall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237).
Предполагается, что соединения и композиции в некоторых вариантах реализации, приведенных в настоящем документе, могут прицельно воздействовать на CFB путем dsPHК-опосредуемого сайленсинга генов или по механизму PHКi, включая, например, «шпилечные» или двухцепочечные эффекторные молекулы РНК со структурой «стебель-петля», в которых одна цепь РНК с самокомплементарными последовательностями способна принимать двухцепочечную конформацию, или дуплексные эффекторные молекулы dsPHК, содержащие две отдельные цепи РНК. В различных вариантах реализации dsPHК полностью состоит из рибонуклеотидов или состоит из смеси рибонуклеотидов и дезоксинуклеотидов, как, например, гибриды РНК/ДНК, описанные, например, в WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 года, или U.S. No. 60/130377, поданной 21 апреля 1999 года. dsPHК или эффекторная молекула dsPHК может представлять собой одну молекулу с областью самокомплементарности такой, что нуклеотиды в одном из сегментов молекулы образуют пары оснований с нуклеотидами в другом сегменте молекулы. В различных вариантах реализации dsPHК, которая состоит из одной молекулы, полностью состоит из рибонуклеотидов или включает область рибонуклеотидов, комплементарную области дезоксирибонуклеотидов. В качестве альтернативы, dsPHК может содержать две различные цепи, содержащие область комплементарности друг другу.
В различных вариантах реализации обе цепи полностью состоят из рибонуклеотидов, одна цепь полностью состоит из рибонуклеотидов, и одна цепь полностью состоит из дезоксирибонуклеотидов, или одна или обе цепи содержат смесь рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. В некоторых вариантах реализации области комплементарности по меньшей мере на 70, 80, 90, 95, 98 или 100% комплементарны друг другу и последовательности целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации область dsPHK, которая присутствует в двухцепочечной конформации, содержит по меньшей мере 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 50, 75, 100, 200, 500, 1000, 2000 или 5000 нуклеотидов, или содержит все нуклеотиды в кДНК или последовательности другой целевой нуклеиновой кислоты, представленной в dsPHК. В некоторых вариантах реализации dsPHК не содержит никаких одноцепочечных областей, таких как одноцепочечные концы, или dsPHК представляет собой «шпильку». В других вариантах реализации dsPHK содержит одну или более одноцепочечных областей или липких концов. В некоторых вариантах реализации гибриды РНК/ДНК содержат цепь или область ДНК, которая представляет собой антисмысловую цепь или область (например, демонстрирует по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 98 или 100% комплементарность целевой нуклеиновой кислоте), и цепь или область РНК, которая представляет собой смысловую цепь или область (например, демонстрирует по меньшей мере 70, 80, 90, 95, 98 или 100% идентичность целевой нуклеиновой кислоте), и наоборот.
В различных вариантах реализации гибрид РНК/ДНК получают in vitro с применением способов ферментативного или химического синтеза, таких как те, которые описаны в настоящем документе, или те, которые описаны в WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 года, или U.S. No. 60/130377, поданной 21 апреля 1999 года. В других вариантах реализации цепь ДНК, синтезированную in vitro, связывают в комплекс с цепью РНК, полученной in vivo или in vitro, до, после или одновременно с трансформацией цепи ДНК в клетку. В других вариантах реализации dsPHК представляет собой одну кольцевую нуклеиновую кислоту, содержащую смысловую и антисмысловую область, или dsPHК содержит кольцевую нуклеиновую кислоту и либо вторую кольцевую нуклеиновую кислоту, либо линейную нуклеиновую кислоту (см., например, WO 00/63364, поданную 19 апреля 2000 года, или U.S. No. 60/130377, поданную 21 апреля 1999 года). Типичные кольцевые нуклеиновые кислоты включают структуры типа «лассо», в которых свободная 5'-фосфорильная группа нуклеотида становится связанной с 2'-гидроксильной группой другого нуклеотида путем «закольцовывания».
В других вариантах реализации dsPHК содержит один или более модифицированных нуклеотидов, в которых положение 2' в сахаре содержит галоген (такой как фторгруппа) или содержит алкоксигруппу (такую как метоксигруппа), которая увеличивает время полужизни dsPHК in vitro или in vivo по сравнению с соответствующей dsPHК, в которой соответствующее положение 2' содержит водород или гидроксильную группу. В других вариантах реализации dsPHК содержит одну или более связей между примыкающими нуклеотидами, отличных от встречающейся в природе фосфодиэфирной связи. Примеры таких связей включают фосфорамидные, фосфоротиоатные и фосфородитиоатные связи. dsPHК могут также представлять собой химически модифицированные молекулы нуклеиновой кислоты, указанные в патенте США №6673661. В других вариантах реализации dsPHК содержит одну или две кэппированные цепи, описанные, например, в WO 00/63364, поданной 19 апреля 2000 года, или U.S. No. 60/130377, поданной 21 апреля 1999 года.
В других вариантах реализации dsPHK может представлять собой любую из по меньшей мере частично молекул dsPHК, описанных в WO 00/63364, а также любую из молекул dsPHК, описанных в предварительной заявке США 60/399998; и предварительной заявке США 60/419532, и PCT/US 2003/033466, содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки. Любая из dsPHK может быть экспрессирована in vitro или in vivo с применением способов, описанных в настоящем документе, или стандартных способов, таких как те, которые описаны в WO 00/63364.
Занятость
В некоторых вариантах реализации не предполагается, что антисмысловые соединения приводят к расщеплению целевой нуклеиновой кислоты через РНКазу Н или приводят к расщеплению или секвестрации по пути RISC. В некоторых таких вариантах реализации антисмысловая активность может быть обусловлена занятостью, при этом присутствие гибридизованного антисмыслового соединения нарушает активность целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых таких вариантах реализации антисмысловое соединение может быть одинаково модифицировано или может содержать смесь модификаций и/или модифицированных и немодифицированных нуклеозидов.
Целевые нуклеиновые кислоты, целевые области и нуклеотидные последовательности
Нуклеотидные последовательности, кодирующие фактор В комплемента (CFB), включают, без ограничения, следующие последовательности: номер доступа в GENBANK NM_001710.5 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 1), номер доступа в GENBANK NT_007592.15, укороченную в пределах нуклеотидов 31852000-31861000 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 2), номер доступа в GENBANK NW_001116486.1, укороченную в пределах нуклеотидов 536000-545000 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 3), номер доступа в GENBANK XM_001113553.2 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 4) или номер доступа в GENBANK NM_008198.2 (включенную в настоящее описание как SEQ ID NO: 5).
Гибридизация
В некоторых вариантах реализации гибридизация происходит между антисмысловым соединением, описанным в настоящем документе, и нуклеиновой кислотой CFB. Наиболее распространенный механизм гибридизации включает образование водородных связей (например, образование водородных связей по Уотсону-Крику, хугстиновских или обратных хугстиновских водородных связей) между комплементарными нуклеотидными основаниями молекул нуклеиновой кислоты.
Гибридизация может происходить в различных условиях. Жесткие условия зависят от последовательностей и определяются природой и составом гибридизуемых молекул нуклеиновой кислоты.
Способы определения способности последовательности специфично гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, предложенные согласно настоящему изобретению, способны специфично гибридизоваться с нуклеиновой кислотой CFB.
Комплементарностъ
Антисмысловое соединение и целевая нуклеиновая кислота комплементарны друг другу в случае, когда достаточное число нуклеотидных оснований указанного антисмыслового соединения могут образовывать водородные связи с соответствующими нуклеотидными основаниями указанной целевой нуклеиновой кислоты, в результате чего будет достигаться желаемый эффект (например, антисмысловое ингибирование целевой нуклеиновой кислоты, такой как нуклеиновая кислота CFB).
Может допускаться присутствие некомплементарных нуклеотидных оснований между антисмысловым соединением и нуклеиновой кислотой CFB при условии сохранения у указанного антисмыслового соединения способности специфично гибридизоваться с целевой нуклеиновой кислотой. Более того, антисмысловое соединение может гибридизоваться по одному или более сегментам нуклеиновой кислоты CFB так, что промежуточные или примыкающие сегменты не вовлекаются в явление гибридизации (например, петлевая структура, структура с несоответствиями или шпилечная структура).
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, предложенные согласно настоящему изобретению, или их конкретная часть на или по меньшей мере на 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарны нуклеиновой кислоте CFB, ее целевой области, целевому сегменту или конкретной части. Процент комплементарности антисмыслового соединения целевой нуклеиновой кислоте может быть определен с использованием обычных способов.
Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидных оснований указанного антисмыслового соединения комплементарны целевой области и, следовательно, будут специфично гибридизоваться, будет представлять соединение с 90% комплементарностью. В данном примере остальные некомплементарные нуклеотидные основания могут быть сгруппированы или могут перемежаться с комплементарными нуклеотидными основаниями, и необязательно должны быть смежными друг с другом или с комплементарными нуклеотидными основаниями. Соответственно, антисмысловое соединение длиной 18 нуклеотидных оснований, содержащее четыре некомплементарных нуклеотидных основания, фланкированных двумя областями полной комплементарности целевой нуклеиновой кислоте, будет демонстрировать общую 77,8% комплементарность целевой нуклеиновой кислоте и, таким образом, входит в объем настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения по отношению к области целевой нуклеиновой кислоты может быть определен обычным способом с использованием программ BLAST (основные средства поиска, основанные на локальных выравниваниях) и программ PowerBLAST, известных в данной области техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичности или комплементарности последовательностей может быть определен, например, программой Gap (Висконсинский пакет программ для анализа последовательностей (Wisconsin Sequence Analysis Package), версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) с использованием установок параметров по умолчанию, в которой используется алгоритм Смита (Smith) и Уотермана (Waterman) (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, предложенные согласно настоящему изобретению, или их конкретные части полностью комплементарны (т.е. на 100% комплементарны) целевой нуклеиновой кислоте или ее конкретной части. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарно нуклеиновой кислоте CFB или ее целевой области, или целевому сегменту или целевой последовательности. В настоящем описании термин «полностью комплементарный» означает, что каждое нуклеотидное основание антисмыслового соединения способно к точному спариванию с соответствующими нуклеотидными основаниями целевой нуклеиновой кислоты. Например, антисмысловое соединение из 20 нуклеотидных оснований полностью комплементарно целевой последовательности длиной 400 нуклеотидных оснований, если присутствует соответствующая часть целевой нуклеиновой кислоты из 20 нуклеотидных оснований, которая полностью комплементарна указанному антисмысловому соединению. Термин «полностью комплементарный» может также употребляться по отношению к конкретной части первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, часть из 20 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения длиной 30 нуклеотидных оснований может быть «полностью комплементарна» целевой последовательности, длина которой составляет 400 нуклеотидных оснований. Часть из 20 нуклеотидных оснований олигонуклеотида длиной 30 нуклеотидных оснований полностью комплементарна целевой последовательности, если целевая последовательность содержит соответствующую часть из 20 нуклеотидных оснований, в которой каждое нуклеотидное основание комплементарно части из 20 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения. В то же время, все антисмысловое соединение из 30 нуклеотидных оснований может быть или может не быть полностью комплементарным целевой последовательности в зависимости от того, являются ли остальные 10 нуклеотидных оснований антисмыслового соединения также комплементарными целевой последовательности.
Некомплементарное нуклеотидное основание может быть расположено на 5'-конце или 3'-конце антисмыслового соединения. В качестве альтернативы, некомплементарное нуклеотидное основание или нуклеотидные основания могут находиться во внутреннем положении антисмыслового соединения. В случае, когда присутствуют два или более некомплементарных нуклеотидных оснований, они могут быть смежными (т.е. связанными) или несмежными. В одном из вариантов реализации некомплементарное нуклеотидное основание расположено в сегменте-крыле антисмыслового гэпмерного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, длина которых составляет или составляет до 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидных оснований, содержат не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 нуклеотидного основания, которое является некомплементарным по отношению к целевой нуклеиновой кислоте, такой как нуклеиновая кислота CFB или ее конкретная часть.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, длина которых составляет или составляет до 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидных оснований, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 нуклеотидного основания, которое является некомплементарным по отношению к целевой нуклеиновой кислоте, такой как нуклеиновая кислота CFB или ее конкретная часть.
Предложенные антисмысловые соединения также включают те соединения, которые комплементарны части целевой нуклеиновой кислоты. В настоящем описании термин «часть» относится к определенному числу смежных (т.е. связанных) нуклеотидных оснований в области или сегменте целевой нуклеиновой кислоты. Термин «часть» может также относиться к определенному числу смежных нуклеотидных оснований антисмыслового соединения. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 8 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 9 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 10 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 11 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 12 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 13 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 14 нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 15 нуклеотидных оснований. Также предусмотрены антисмысловые соединения, которые комплементарны части целевого сегмента по меньшей мере из 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеотидных оснований или из диапазона, определяемого любыми двумя из данных значений.
Идентичность
Антисмысловые соединения, предложенные согласно настоящему изобретению, могут также демонстрировать определенный процент идентичности конкретной нуклеотидной последовательности, SEQ ID NO, или соединению, представленному конкретным номером Isis, или его части. В настоящем описании антисмысловое соединение является идентичным последовательности, описанной в настоящем документе, если оно обладает такой же способностью к спариванию нуклеотидных оснований. Например, РНК, которая содержит урацил вместо тимидина в описанной последовательности ДНК, будет считаться идентичной указанной последовательности ДНК, поскольку как урацил, так и тимидин образуют пару с аденином. Также предусмотрены укороченные и удлиненные варианты антисмысловых соединений, описанных в настоящем документе, а также соединения, содержащие неидентичные основания относительно антисмысловых соединений, предложенных согласно настоящему изобретению. Неидентичные основания могут примыкать друг к другу или могут быть распределены по всему антисмысловому соединению. Процент идентичности антисмыслового соединения рассчитывают по числу оснований, которые демонстрируют спаривание, идентичное по отношению к последовательности, с которой его сравнивают.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения или их части на или по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны одному или более антисмысловым соединениям или SEQ ID NO, или их части, описанной в настоящем документе.
В некоторых вариантах реализации часть антисмыслового соединения сравнивают с имеющей равную длину частью целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации часть из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных оснований сравнивают с имеющей равную длину частью целевой нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах реализации часть антисмыслового олигонуклеотида сравнивают с имеющей равную длину частью целевой нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах реализации часть из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 нуклеотидных оснований сравнивают с имеющей равную длину частью целевой нуклеиновой кислоты.
Модификации
Нуклеозид представляет собой комбинацию основание-сахар. Частью нуклеозида, представляющей собой нуклеотидное основание (также известное как основание), обычно является гетероциклическое основание. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, дополнительно содержащие фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. Для тех нуклеозидов, которые содержат пентофуранозильный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2'-, 3'- или 5'-гидроксильной группой сахара. Олигонуклеотиды образуются путем ковалентного связывания примыкающих нуклеозидов друг с другом с образованием линейного полимерного олигонуклеотида. В олигонуклеотидной структуре фосфатные группы обычно называются образующими межнуклеозидные связи олигонуклеотида.
Модификации антисмысловых соединений включают замещения или замены в межнуклеозидных связях, сахарных группах или нуклеотидных основаниях. Модифицированные антисмысловые соединения часто являются предпочтительными по сравнению с нативными формами благодаря желаемым свойствам, таким как, например, повышенная способность к поглощению клетками, повышенная аффинность в отношении нуклеиновой кислоты-мишени, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или повышенная ингибирующая активность.
Химически модифицированные нуклеозиды можно также применять для повышения аффинности связывания усеченного или укороченного антисмыслового олигонуклеотида в отношении целевой нуклеиновой кислоты. Следовательно, сопоставимые результаты часто могут быть получены в случае более коротких антисмысловых соединений, содержащих такие химически модифицированные нуклеозиды.
Модифицированные межнуклеозидные связи
Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь в РНК и ДНК представляет собой З'-5'-фосфодиэфирную связь. Антисмысловые соединения, содержащие одну или более модифицированных, т.е. не встречающихся в природе межнуклеозидных связей, часто выбирают по сравнению с антисмысловыми соединениями, содержащими встречающиеся в природе межнуклеозидные связи, из-за желаемых свойств, таких как, например, повышенная способность к поглощению клетками, повышенная аффинность в отношении целевых нуклеиновых кислот и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды, содержащие модифицированные межнуклеозидные связи, содержат межнуклеозидные связи, в которых сохраняется атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, не содержащие атом фосфора. Типичные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи включают, но не ограничиваются ими, фосфодиэфирные, фосфотриэфирные, метилфосфонатные, фосфорамидатные и фосфоротиоатные. Способы получения фосфорсодержащих и не содержащих фосфор связей хорошо известны.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту CFB, содержат одну или более модифицированных межнуклеозидных связей. В некоторых вариантах реализации модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой фосфоротиоатные связи. В некоторых вариантах реализации каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.
Модифицированные сахарные группы
1
2
1
2
1
12
Антисмысловые соединения могут содержать один или более нуклеозидов, в которых сахарная группа была модифицирована. Такие нуклеозиды с модифицированным сахаром могут придавать антисмысловым соединениям повышенную устойчивость к нуклеазам, повышенную аффинность связывания или какое-либо другое полезное биологическое свойство. В некоторых вариантах реализации нуклеозиды содержат группы, представляющие собой химически модифицированные рибофуранозные кольца. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец включают, без ограничения, присоединение замещающих групп (включая 5'- и 2'-замещающие группы, образование мостиковых связей негеминальных кольцевых атомов с образованием бициклических нуклеиновых кислот (BNA), замену атома кислорода рибозильного кольца на S, N(R) или C(R)(R) (R, R и R каждый независимо представляет собой Н, C-C алкил или защитную группу) и их комбинации. Примеры химически модифицированных сахаров включают 2'-F-5'-метил-замещенный нуклеозид (другие описанные 5',2'-бис-замещенные нуклеозиды см. в международной заявке РСТ WO 2008/101157, опубликованной 8/21/08) или замену атома кислорода рибозильного кольца на S с дополнительным замещением в 2'-положении (см. опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) или, в качестве альтернативы, 5'-замещение BNA (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, в которой LNA содержит в качестве заместителей, например, 5'-метильную или 5'-винильную группу).
3
2
3
2
2
2
2
3
1
10
3
2
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
2
1
2
2
m
n
1
m
n
1
10
Примеры нуклеозидов, содержащих модифицированные сахарные группы, включают, без ограничения, нуклеозиды, содержащие 5'-винильную, 5'-метильную (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН, 2'-ОСНСН, 2'-OCHCHF и 2'-O(СН)OCH замещающие группы. Заместитель в положении 2' может также быть выбран из аллила, амино, азидо, тио, O-аллила, O-C-Салкила, OCF, OCHF, O(СН)SCH, O(CH)-O-N(R)(R), O-СН-С(=O)-N(R)(R) и O-CH-C(=O)-N(R)-(CH)-N(R)(R), где каждый R, R и R независимо представляют собой Н или содержащий заместители, или не содержащий заместители C-Салкил.
2
2
2
2
3
2
3
3
3
2
3
2
3
2
1
12
2
3
2
2
В настоящем описании термин «бициклические нуклеозиды» относится к модифицированным нуклеозидам, содержащим бициклическую сахарную группу. Примеры бициклических нуклеозидов включают, без ограничения, нуклеозиды, содержащие мостик между 4'- и 2'-атомами рибозильного кольца. В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, предложенные согласно настоящему изобретению, содержат один или более бициклических нуклеозидов, содержащих мостик 4'-2'. Примеры таких бициклических нуклеозидов с мостиком 4'-2' включают, но не ограничиваются ими, одну из формул: 4'-(СН)-O-2' (LNA); 4'-(CH)-S-2'; 4'-(СН)-O-2' (ENA); 4'-СН(СН)-O-2' (также называется конформационно ограниченным этилом или cEt) и 4'-СН(CHOCH)-O-2' (и аналоги, см. патент США 7399845, выданный 15 июля 2008 года); 4'-С(СН)(СН)-O-2' (и аналоги, см. опубликованную международную заявку WO/2009/006478, опубликованную 8 января 2009 года); 4'-CH-N(OCH)-2' (и аналоги, см. опубликованную международную заявку WO/2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008 года); 4'-СН-O-N(СН)-2' (см. опубликованную заявку на патент США US 2004-0171570, опубликованную 2 сентября 2004 года); 4'-CH-N(R)-O-2', где R представляет собой Н, C-C алкил или защитную группу (см. патент США 7427672, выданный 23 сентября 2008 года); 4'-СН-С(Н)(СН)-2' (см. Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-СН-С(=СН)-2' (и аналоги, см. опубликованную международную заявку WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008 года).
Дополнительные сообщения, относящиеся к бициклическим нуклеозидами, могут быть также найдены в опубликованной литературе (см., например: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; и Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №6268490; 6525191; 6670461; 6770748; 6794499; 7034133; 7053207; 7399845; 7547684; и 7696345; публикацию патента США №US 2008-0039618; US 2009-0012281; патенты США серийный №60/989574; 61/026995; 61/026998; 61/056564; 61/086231; 61/097787; и 61/099844; опубликованные международные заявки РСТ WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; и WO 2009/006478. Каждый из вышеупомянутых бициклических нуклеозидов может быть получен с одной или более стереохимическими конфигурациями сахара, включая, например, α-L-рибофуранозу и β-D-рибофуранозу (см. международную заявку PCT/DK 98/00393, опубликованную 25 марта 1999 года как WO 99/14226).
a
b
n
a
b
a
a
a
2
x
a
В некоторых вариантах реализации бициклические сахарные группы нуклеозидов BNA включают, но не ограничиваются ими, соединения, содержащие по меньшей мере один мостик между 4'- и 2'-положением пентофуранозильной сахарной группы, при этом такие мостики независимо содержат 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R)(R)]-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -C(=O)-, -C(=NR)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=O)- и -N(R)-;
где:
x равен 0, 1 или 2;
n равен 1, 2, 3 или 4;
a
b
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
1
каждый R и R независимо представляет собой Н, защитную группу, гидроксил, C-C алкил, содержащий заместители C-C алкил, C-C алкенил, содержащий заместители C-C алкенил, C-C алкинил, содержащий заместители C-C алкинил, C-С арил, содержащий заместители С-С арил, гетероциклический радикал, содержащий заместители гетероциклический радикал, гетероарил, содержащий заместители гетероарил, C-C алициклический радикал, содержащий заместители C-C алициклический радикал, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацил (С(=O)-Н), содержащий заместители ацил, CN, сульфонил (S(=O)-J) или сульфоксил (S(=O)-J); и
1
2
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
каждый J и J независимо представляет собой Н, C-C алкил, содержащий заместители C-C алкил, C-C алкенил, содержащий заместители C-C алкенил, C-C алкинил, содержащий заместители C-C алкинил, C-C арил, содержащий заместители С-С арил, ацил (С(=O)-Н), содержащий заместители ацил, гетероциклический радикал, содержащий заместители гетероциклический радикал, C-C аминоалкил, содержащий заместители С-С аминоалкил или защитную группу.
a
b
n
a
b
n
a
b
a
b
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
1
12
В некоторых вариантах реализации мостик в бициклической сахарной группе представляет собой -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-O- или -C(RR)-O-N(R)-. В некоторых вариантах реализации мостик представляет собой 4'-СН-2', 4'-(СН)-2', 4'-(СН)-2', 4'-СН-O-2', 4'-(СН)-O-2', 4'-CH-O-N(R)-2' и 4'-CH-N(R)-O-2'-, где каждый R независимо представляет собой Н, защитную группу или C-C алкил.
2
В некоторых вариантах реализации бициклические нуклеозиды также определяются изомерной конфигурацией. Например, нуклеозид, содержащий 4'-2'-метиленокси-мостик, может находиться в α-L-конфигурации или в β-D-конфигурации. Ранее BNA, содержащие α-L-метиленокси (4'-СН-O-2'), включали в антисмысловые олигонуклеотиды, которые демонстрировали антисмысловую активность (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
3
В некоторых вариантах реализации бициклические нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, (А) α-L-метиленокси (4'-CH-O-2')-BNA, (В) β-D-метиленокси (4'-СН-O-2')-BNA, (С) этиленокси (4'-(CH)-O-2')-BNA, (D) аминоокси (4'-CH-O-N(R)-2')-BNA, (Е) оксиамино (4'-CH-N(R)-O-2')-BNA и (F) метил(метиленокси) (4'-СН(СН)-O-2')-BNA, (G) метилентио (4'-CH-S-2')-BNA, (Н) метиленамино (4'-CH-N(R)-2')-BNA, (I) метилкарбоциклическую (4'-СН-СН(СН)-2') BNA, (J) пропиленкарбоциклическую (4'-(СН)-2') BNA и (K) винил-BNA, изображенные ниже.
1
12
1
12
где Вх представляет собой основание, и R независимо представляет собой Н, защитную группу, C-C алкил или C-C алкокси.
В некоторых вариантах реализации предложены бициклические нуклеозиды, имеющие формулу I:
где:
Вх представляет собой гетероциклическое основание;
a
b
c
2
c
2
c
2
2
c
2
c
c
2
-Q-Q-Q- представляет собой -CH-N(R)-CH-, -C(=O)-N(R)-CH-, -CH-O-N(R)-, -CH-N(R)-O- или -N(R)-O-CH;
c
1
12
R представляет собой C-C алкил или защитную группу амина; и
а
b
Т и T каждый независимо представляет собой Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к субстрату.
В некоторых вариантах реализации предложены бициклические нуклеозиды, имеющие формулу II:
где:
Вх представляет собой гетероциклическое основание;
а
b
Т и T каждый независимо представляет собой Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к субстрату;
a
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
Z представляет собой C-С алкил, С-С алкенил, С-С алкинил, содержащий заместители C-С алкил, содержащий заместители С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкинил, ацил, содержащий заместители ацил, содержащий заместители амид, тиол или содержащую заместители тиогруппу.
c
c
d
c
3
c
e
c
d
c
d
e
1
6
1
6
c
В одном из вариантов реализации каждая из групп, содержащих заместители, независимо моно- или поли-замещена замещающими группами, независимо выбранными из галогена, оксо, гидроксила, OJ, NJJ, SJ, N, OC(=X)J и NJC(=X)NJJ, где каждый J, J и J независимо представляет собой Н, C-Салкил или содержащий заместители C-С алкил, и Х представляет собой О или NJ.
В некоторых вариантах реализации предложены бициклические нуклеозиды, имеющие формулу III:
где:
Вх представляет собой гетероциклическое основание;
а
b
Т и T каждый независимо представляет собой Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к субстрату;
b
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
Z представляет собой C-С алкил, С-С алкенил, C-С алкинил, содержащий заместители C-С алкил, содержащий заместители С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкинил или содержащий заместители ацил (C(=О)-).
В некоторых вариантах реализации предложены бициклические нуклеозиды, имеющие формулу IV:
где:
Вх представляет собой гетероциклическое основание;
а
b
Т и T каждый независимо представляет собой Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к субстрату;
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
R представляет собой C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, C-С алкинил или содержащий заместители C-С алкинил;
a
b
c
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
1
6
1
6
1
6
1
6
каждый q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, С-С алкенил, содержащий заместители C-С алкенил, С-С алкинил или содержащий заместители С-С алкинил, C-С алкоксил, содержащий заместители C-С алкоксил, ацил, содержащий заместители ацил, C-С аминоалкил или содержащий заместители C-С аминоалкил.
В некоторых вариантах реализации предложены бициклические нуклеозиды, имеющие формулу V:
где:
Вх представляет собой гетероциклическое основание;
а
b
Т и T каждый независимо представляет собой Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к субстрату;
a
b
e
f
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
q, q, q и q каждый независимо представляет собой водород, галоген, C-C алкил, содержащий заместители C-C алкил, С-С алкенил, содержащий заместители C-C алкенил, С-С алкинил, содержащий заместители C-C алкинил, C-C алкокси, содержащую заместители C-C алкоксигруппу, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ;
e
f
g
h
или q и q вместе представляют собой =C(q)(q);
g
h
1
12
1
12
q и q каждый независимо представляет собой Н, галоген, C-C алкил или содержащий заместители C-C алкил.
2
Был описан синтез и получение мономеров метиленокси (4'-CH-O-2')-BNA аденина, цитозина, гуанина, 5-метилцитозина, тимина и урацила наряду с их олигомеризацией и свойствами распознавания нуклеиновых кислот (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNA и их получение также описано в WO 98/39352 и WO 99/14226.
2
Были также получены аналоги метиленокси (4'-CH-O-2')-BNA и 2'-тио-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Было также описано получение «закрытых» аналогов нуклеозидов, содержащих олигодезоксирибонуклеотидные дуплексы, в качестве субстратов для полимераз нуклеиновых кислот (Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области техники был описан синтез 2'-амино-ВНА, нового конформационно ограниченного аналога олигонуклеотида с высокой аффинностью (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, были получены 2'-амино- и 2'-метиламино-BNA и ранее была описана термическая стабильность их дуплексов с комплементарными цепями РНК и ДНК.
В некоторых вариантах реализации предложены бициклические нуклеозиды, имеющие формулу VI:
где:
Вх представляет собой гетероциклическое основание;
а
b
Т и T каждый независимо представляет собой Н, защитную группу гидроксила, конъюгированную группу, реакционноспособную фосфорную группу, фосфорный фрагмент или ковалентное присоединение к субстрату;
i
j
k
l
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
каждый q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, C-C алкил, содержащий заместители C-C алкил, C-C алкенил, содержащий заместители C-C алкенил, C-C алкинил, содержащий заместители С-С алкинил, C-C алкоксил, содержащий заместители C-C алкоксил, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ; и
i
j
l
k
g
h
g
h
1
12
1
12
q и q или q и q вместе представляют собой =C(q)(q), где q и q каждый независимо представляет собой Н, галоген, C-C алкил или содержащий заместители C-C алкил.
2
3
2
Был описан один из карбоциклических бициклических нуклеозидов, содержащий мостик 4'-(СН)-2', и аналоговый алкенильный мостик 4'-СН=СН-СН-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et at, J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Также был описан синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов наряду с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26), 8362-8379).
В настоящем описании термин «4'-2'-бициклический нуклеозид» относится к бициклическому нуклеозиду, содержащему фуранозное кольцо, содержащее мостик, соединяющий два атома углерода указанного фуранозного кольца, соединяющий атом углерода 2' и атом углерода 4' сахарного кольца.
В настоящем описании термин «моноциклические нуклеозиды» относится к нуклеозидам, содержащим модифицированные сахарные группы, которые не являются бициклическими сахарными группами. В некоторых вариантах реализации сахарная группа или аналог сахарной группы в нуклеозиде может быть модифицирован или содержать заместители в любом положении.
2
n
m
3
2
n
2
2
n
3
2
n
2
n
2
2
3
2
n
2
n
3
2
1
12
3
3
3
3
2
3
2
2
3
2
В настоящем описании термин «2'-модифицированный сахар» означает фуранозильный сахар, модифицированный в положении 2'. В некоторых вариантах реализации такие модификации включают заместители, выбранные из: галогенида, включая, но не ограничиваясь ими, содержащий заместители и не содержащий заместители алкокси, содержащий заместители и не содержащий заместители тиоалкил, содержащий заместители и не содержащий заместители аминоалкил, содержащий заместители и не содержащий заместители алкил, содержащий заместители и не содержащий заместители аллил и содержащий заместители и не содержащий заместители алкинил. В некоторых вариантах реализации 2'-модификации выбраны из заместителей, включая, но не ограничиваясь ими: O[(СН)O]CH, O(CH)NH, O(СН)CH, O(CH)F, O(CH)ONH, ОСНС(=O)N(Н)СН и O(CH)ON[(CH)CH], где n и m равны от 1 до приблизительно 10. Другие 2'-замещающие группы могут быть также выбраны из: C-C алкила, содержащего заместители алкила, алкенила, алкинила, алкарила, аралкила, O-алкарила или O-аралкила, SH, SCH, OCN, Cl, Br, CN, F, CF, OCF, SOCH, SOCH, ONO, NO, N, NH, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкиламино, полиалкиламино, содержащего заместители силила, РНК-расщепляющей группы, репортерной группы, интеркалятора, группы для улучшения фармакокинетических свойств или группы для улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения и других заместителей, обладающих схожими свойствами. В некоторых вариантах реализации модифицированные нуклеозиды содержат боковую цепь 2'-МОЕ (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Было описано, что такое замещение 2'-МОЕ демонстрирует улучшенную аффинность связывания по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и с другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'-O-метил, O-пропил и O-аминопропил. Также было показано, что олигонуклеотиды, содержащие заместитель 2'-МОЕ, являются антисмысловыми ингибиторами экспрессии генов с перспективными характеристиками для применения in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
В настоящем описании термин «модифицированный тетрагидропирановый нуклеозид» или «модифицированный ТНР-нуклеозид» означает нуклеозид, содержащий шестичленный тетрагидропирановый «сахар», который заменяет пентофуранозильный остаток в обычных нуклеозидах (заменитель сахара). Модифицированные ТНР-нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, те соединения, которые называются в данной области техники гекситолнуклеиновой кислотой (HNA), анитолнуклеиновой кислотой (AHA), маннитолнуклеиновой кислотой (MNA) (см. Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854) или фтор-HNA (F-HNA), содержащей тетрагидропирановую кольцевую систему, проиллюстрированную ниже:
В некоторых вариантах реализации выбраны заменители сахара, имеющие формулу VII:
где независимо для каждого из указанного по меньшей мере одного тетрагидропиранового аналога нуклеозида формулы VII:
Вх представляет собой гетероциклическое основание;
a
b
a
b
a
b
T и T каждый независимо представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый аналог нуклеозида с антисмысловым соединением, или один из T и T представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый аналог нуклеозида с антисмысловым соединением, а другой из T и T представляет собой Н, защитную группу гидроксила, связанную конъюгированную группу или 5'- или 3'-концевую группу;
1
2
3
4
5
6
7
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
1
2
1
2
1
3
1
1
2
3
1
2
1
1
2
3
1
6
q, q, q, q, q, q и q каждый независимо представляет собой Н, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, С-С алкенил, содержащий заместители С-С алкенил, C-C алкинил или содержащий заместители С-С алкинил; и каждый из R и R выбран из водорода, гидроксила, галогена, содержащего заместители или не содержащего заместители алкокси, NJJ, SJ, N, OC(=X)J, OC(=X)NJJ, NJC(=X)NJJ и CN, где Х представляет собой О, S или NJ, и каждый J, J и J независимо представляет собой Н или C-С алкил.
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
1
2
1
2
1
2
В некоторых вариантах реализации предложены модифицированные ТНР-нуклеозиды формулы VII, в которых q, q, q, q, q, q и q каждый представляет собой Н. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из: q, q, q, q, q, q и q отличен от Н. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из: q, q, q, q, q, q и q представляет собой метил. В некоторых вариантах реализации предложены ТНР-нуклеозиды формулы VII, в которых один из: R и R представляет собой фтор. В некоторых вариантах реализации R представляет собой фтор, и R представляет собой Н; R представляет собой метокси, и R представляет собой Н; и R представляет собой метоксиэтокси, и R представляет собой Н.
В некоторых вариантах реализации заменители сахара содержат кольца, содержащие более 5 атомов и более одного гетероатома. Например, существуют данные о нуклеозидах, содержащих морфолиновые сахарные группы, и их применении в олигомерных соединениях (см., например: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41, 4503-4510; и патенты США 5698685; 5166315; 5185444; и 5034506). В настоящем описании термин «морфолиновая группа» означает заменитель сахара, имеющий следующую формулу:
В некоторых вариантах реализации морфолиновые группы могут быть модифицированы, например, путем присоединения или изменения различных замещающих групп из приведенной выше структуры морфолиновой группы. В настоящем описании такие заменители сахара называются «модифицированными морфолиновыми группами».
2
Также предложены, без ограничения, комбинации модификаций, такие как 2'-F-5'-метил-замещенные нуклеозиды (другие описанные 5',2'-бис-замещенные нуклеозиды см. в международной заявке РСТ WO 2008/101157, опубликованной 8/21/08) и замена атома кислорода рибозильного кольца на S и дополнительное замещение в 2'-положении (см. опубликованную заявку на патент США US 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 года) или, в качестве альтернативы, 5'-замещение в бициклической нуклеиновой кислоте (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, в которой 4'-СН-O-2'-бициклический нуклеозид дополнительно содержит в качестве заместителей 5'-метильную или 5'-винильную группу в положении 5'). Также был описан синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов наряду с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (см., например, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат один или более модифицированных циклогексенильных нуклеозидов, которые представляют собой нуклеозиды, содержащие шестичленный циклогексенил вместо пентофуранозильного остатка во встречающихся в природе нуклеозидах. Модифицированные циклогексенильные нуклеозиды включают, но не ограничиваются ими, те, которые описаны в данной области техники (см., например, совместную опубликованную заявку РСТ WO 2010/036696, опубликованную 10 апреля 2010 года, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008, 130(6), 1979-1984;  et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001, 29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001, 66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, 20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 722, 8595-8602; опубликованную заявку РСТ, WO 06/047842; и опубликованную заявку РСТ WO 01/049687; полное содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки). Некоторые модифицированные циклогексенильные нуклеозиды имеют формулу X:
где независимо для каждого из указанного по меньшей мере одного циклогексенильного аналога нуклеозида формулы X:
Вх представляет собой гетероциклическое основание;
3
4
3
4
3
4
Т и Т каждый независимо представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую циклогексенильный аналог нуклеозида с антисмысловым соединением, или один из Т и Т представляет собой межнуклеозидную связывающую группу, связывающую тетрагидропирановый аналог нуклеозида с антисмысловым соединением, а другой из Т и Т представляет собой Н, защитную группу гидроксила, связанную конъюгированную группу или 5'- или 3'-концевую группу; и
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
q, q, q, q, q, q, q, q и q каждый независимо представляет собой Н, C-С алкил, содержащий заместители C-С алкил, С-С алкенил, содержащий заместители C-С алкенил, С-С алкинил, содержащий заместители С-С алкинил или другую замещающую группу для сахара.
1
10
3
2
2
3
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
m
n
1
10
В настоящем описании термин «2'-модифицированный» или «2'-замещенный» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий заместитель в положении 2', отличный от Н или ОН. 2'-модифицированные нуклеозиды, включают, но не ограничиваются ими, бициклические нуклеозиды, в которых мостик, соединяющий два атома углерода сахарного кольца, соединяет 2'-углерод и другой углерод сахарного кольца; и нуклеозиды с не образующими мостик 2'-заместителями, такими как аллил, амино, азидо, тио, O-аллил, O-C-Салкил, -OCF, O-(СН)-O-СН, 2'-O(СН)SCH, O-(СН)-O-N(R)(R) или O-CH-C(=O)-N(R)(R), где каждый R и R независимо представляет собой Н или содержащий заместители или не содержащий заместители C-С алкил. 2'-модифицированные нуклеозиды могут дополнительно содержать другие модификации, например, в других положениях сахара и/или в нуклеотидном основании.
В настоящем описании термин «2'-F» относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий фторгруппу в положении 2' сахарного кольца.
3
3
В настоящем описании термины «2'-ОМе» или «2'-ОСН», или «2'-O-метил» каждый относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -ОСН в положении 2' сахарного кольца.
2
2
3
2
2
3
В настоящем описании термины «МОЕ» или «2'-МОЕ», или «2'-OCHCHOCH», или «2'-O-метоксиэтил» каждый относится к нуклеозиду, содержащему сахар, содержащий группу -OCHCHOCH в положении 2' сахарного кольца.
В настоящем описании термин «олигонуклеотид» относится к соединению, содержащему множество связанных нуклеозидов. В некоторых вариантах реализации один или более из указанного множества нуклеозидов являются модифицированными. В некоторых вариантах реализации олигонуклеотид содержит один или более рибонуклеозидов (РНК) и/или дезоксирибонуклеозидов (ДНК).
В данной области техники также известны многие другие бициклические и трициклические кольцевые системы, являющиеся заменителями сахара, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов для включения в антисмысловые соединения (см., например, обзорную статью: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Такие кольцевые системы могут быть подвергнуты различным дополнительным замещениям для повышения активности.
Способы получения модифицированных сахаров хорошо известны специалисту в данной области техники. Некоторые типичные патенты США, которые описывают получение таких модифицированных сахаров, включают, без ограничения, U.S.: 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5670633; 5700920; 5792847 и 6600032, и международную заявку PCT/US 2005/019219, поданную 2 июня 2005 года и опубликованную как WO 2005/121371 22 декабря 2005 года, полное содержание каждой из которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
В нуклеотидах, содержащих модифицированные сахарные группы, нуклеотидные основания (природные, модифицированные или их комбинацию) сохраняют для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.
3
3
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения содержат один или более нуклеозидов, содержащих модифицированные сахарные группы. В некоторых вариантах реализации модифицированная сахарная группа представляет собой 2'-МОЕ. В некоторых вариантах реализации 2'-МОЕ-модифицированные нуклеозиды расположены в гэпмерном мотиве. В некоторых вариантах реализации модифицированная сахарная группа представляет собой бициклический нуклеозид, содержащий мостиковую группу (4'-СН(СН)-O-2'). В некоторых вариантах реализации (4'-СН(СН)-O-2')-модифицированные нуклеозиды расположены по всем «крыльям» гэпмерного мотива.
Модифицированные нуклеотидные основания
Модификации или замещения в нуклеотидном основании (или основании) структурно отличаются от встречающихся в природе или синтетических немодифицированных нуклеотидных оснований, хотя по функциям равнозначны им. Как природные, так и модифицированные нуклеотидные основания способны участвовать в образовании водородных связей. Такие модификации нуклеотидного основания могут придавать антисмысловым соединениям устойчивость к нуклеазам, аффинность связывания или какое-либо другое полезное биологическое свойство. Модифицированные нуклеотидные основания включают синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как, например, 5-метилцитозин (5-me-С). Некоторые замещения в нуклеотидных основаниях, включая 5-метилцитозиновые замещения, особенно подходят для повышения аффинности связывания антисмыслового соединения в отношении целевой нуклеиновой кислоты. Например, было показано, что 5-метилцитозиновые замещения повышают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, В., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278).
Дополнительные модифицированные нуклеотидные основания включают 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропильные и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил (-С≡С-СН3)-урацил и цитозин, и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азо-урацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности, 5-бром-, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-F-аденин, 2-аминоаденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
Группы, представляющие собой гетероциклические основания, могут также включать те, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменено другими гетероциклами, например, 7-деазааденином, 7-деазагуанозином, 2-аминопиридином и 2-пиридоном. Нуклеотидные основания, которые особенно подходят для повышения аффинности связывания антисмысловых соединений, включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2-, N-6- и O-6-замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, нацеленные на нуклеиновую кислоту CFB, содержат одно или более модифицированных нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигонуклеотиды, укороченные или с расширенным гэпом, нацеленные на нуклеиновую кислоту CFB, содержат одно или более модифицированных нуклеотидных оснований. В некоторых вариантах реализации модифицированное нуклеотидное основание представляет собой 5-метилцитозин. В некоторых вариантах реализации каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
Конъюгированные антисмысловые соединения
Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связаны с одной или более группами или конъюгатами, которые повышают активность, распределение в клетках или поглощение клетками полученных антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные конъюгированные группы включают холестериновые группы и липидные группы. Дополнительные конъюгированные группы включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.
Антисмысловые соединения можно также модифицировать так, чтобы они содержали одну или более стабилизирующих групп, которые, как правило, присоединяют к одному или обоим концам антисмысловых соединений для усиления свойств, таких как, например, устойчивость к нуклеазам. Стабилизирующие группы включают кэп-структуры. Данные концевые модификации защищают антисмысловое соединение с концевой нуклеиновой кислотой от распада под действием экзонуклеазы и могут облегчать доставку и/или его локализацию в клетке. Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп) или на 3'-конце (3'-кэп), или может присутствовать на обоих концах. Кэп-структуры хорошо известны в данной области техники и включают, например, инвертированные дезокси-кэпы, лишенные азотистых оснований. Дополнительные 3'- и 5'-стабилизирующие группы, которые могут быть использованы для кэпирования одного или обоих концов антисмыслового соединения для придания ему устойчивости к нуклеазам, включают те группы, которые описаны в WO 03/004602, опубликованной 16 января 2003 года.
В некоторых вариантах реализации антисмысловые соединения, включая, но не ограничиваясь ими, соединения, которые особенно подходят для применения в качестве ssPHK, модифицируют путем присоединения одной или более конъюгированных групп. В целом, конъюгированные группы модифицируют одно или более свойств присоединяемого олигонуклеотида, включая, но не ограничиваясь ими, фармакодинамику, фармакокинетику, стабильность, связывание, абсорбцию, распределение в клетках, поглощение клетками, заряд и клиренс. Конъюгированные группы, которые обычно используют в области химии, связывают напрямую или через возможный конъюгат-связывающий фрагмент или конъюгат-связывающую группу с исходным соединением, таким как олигонуклеотид. Конъюгированные группы включают, без ограничения, интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, простые тиоэфиры, простые полиэфиры, холестерины, тиохолестерины, молекулы холевой кислоты, фолат, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фенантридин, антрахинон, адамантан, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. Некоторые конъюгированные группы были описаны ранее, например: молекула холестерина (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), холевая кислота (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), простой тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), алифатическая цепь, например, додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или триэтиламмония 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), полиамин или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), или адамантан-уксусная кислота (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), пальмитиловая группа (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237) или октадециламин- или гексиламинокарбонилоксихолестериновая группа (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
Дополнительные конъюгаты, включая те, которые подходят для ssPHК, и их расположение в антисмысловых соединениях см., например, в заявке США №61/583963.
Тестирование антисмысловых олигонуклеотидов in vitro
В настоящем документе описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть модифицированы соответствующим образом для обработки другими антисмысловыми соединениями.
Клетки могут быть обработаны антисмысловыми олигонуклеотидами по достижении указанными клетками приблизительно 60-80% конфлюэнтности в культуре.
Один из реагентов, обычно используемых для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, включает катионный липидный реагент для трансфекции ЛИПОФЕКТИН (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с ЛИПОФЕКТИНОМ в OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с достижением желаемой конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации ЛИПОФЕКТИНА, которая может находиться в диапазоне от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, включает ЛИПОФЕКТАМИН (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с ЛИПОФЕКТАМИНОМ в среде OPTI-MEM 1 с пониженным содержанием сыворотки (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) с достижением желаемой концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации ЛИПОФЕКТАМИНА, которая может находиться в диапазоне от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другая технология, используемая для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, включает электропорацию.
Еще одна технология, используемая для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивированные клетки, включает свободное поглощение олигонуклеотидов клетками.
Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами обычными способами. Клетки могут быть собраны через 16-24 часа после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, и в это время измеряют уровни РНК или белка, кодируемого целевой нуклеиновой кислотой, способами, известными в данной области техники и описанными в настоящем документе. Как правило, в случае, когда обработку осуществляют в нескольких повторностях, данные представляют в виде среднего значения для повторных обработок.
Концентрация применяемого антисмыслового олигонуклеотида варьируется между линиями клеток. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для конкретной линии клеток хорошо известны в данной области техники. Антисмысловые олигонуклеотиды, как правило, применяют в концентрациях в диапазоне от 1 нМ до 300 нМ при трансфекции с использованием ЛИПОФЕКТАМИНА. При трансфекции с использованием электропорации антисмысловые олигонуклеотиды применяют в более высоких концентрациях в диапазоне от 625 до 20000 нМ.
Выделение РНК
Анализ РНК может быть выполнен на тотальной клеточной РНК или poly(А)+мРНК. Способы выделения РНК хорошо известны в данной области техники. РНК получают с использованием способов, хорошо известных в данной области техники, например, с использованием реагента TRIZOL (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в соответствии с протоколами, рекомендованными производителем.
Некоторые показания
Некоторые варианты реализации, представленные в настоящем документе, относятся к способам лечения, предотвращения или облегчения заболевания, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, у субъекта путем введения CFB-специфичного ингибитора, такого как антисмысловое соединение, нацеленное на CFB.
Примеры заболеваний почек, связанных с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, которые можно лечить, предотвращать и/или облегчать способами, предложенными согласно настоящему изобретению, включают С3-гломерулопатию, атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), болезнь плотного осадка (DDD; также известную как мембранопролиферативный гломерулонефрит (MPGN) II типа или C3Neph) и CFHR5-нефропатию.
Дополнительные заболевания почек, связанные с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, которые можно лечить, предотвращать и/или облегчать способами, предложенными согласно настоящему изобретению, включают IgA-нефропатию; мезангиокапиллярный (мембранопролиферативный) гломерулонефрит (MPGN); аутоиммунные нарушения, включая волчаночный нефрит и системную красную волчанку (SLE); индуцированный инфекцией гломерулонефрит (также известный как постинфекционный гломерулонефрит); и ишемически-реперфузионное повреждение почек, например, посттрансплантационное ишемически-реперфузионное повреждение почек.
Примеры непочечных нарушений, связанных с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, которые можно лечить и/или предотвращать способами, предложенными согласно настоящему изобретению, включают заболевания глаз, такие как дегенерация желтого пятна, например, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), включая влажную форму AMD и сухую форму AMD, такую как географическая атрофия; оптиконевромиелит; заболевание роговицы, такое как воспаление роговицы;  аутоиммунный увеит; и диабетическая ретинопатия. Существуют данные о том, что система комплемента вовлечена в заболевания глаз. Jha P, et al., Mol Immunol (2007) 44(16): 3901-3908. Дополнительные примеры непочечных нарушений, связанных с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, которые можно лечить и/или предотвращать способами, предложенными согласно настоящему изобретению, включают васкулит, связанный с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA), антифосфолипидный синдром (также известный как синдром антифосфолипидных антител (APS)), астму, ревматоидный артрит, миастению гравис и рассеянный склероз.
Некоторые варианты реализации, представленные в настоящем описании, относятся к способам лечения, предотвращения или облегчения заболевания почек, связанного с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, у субъекта путем введения CFB-специфичного ингибитора, такого как антисмысловое соединение, нацеленное на CFB. В некоторых вариантах реализации заболевание почек представляет собой волчаночный нефрит, системную красную волчанку (SLE), болезнь плотного осадка (DDD), С3-гломерулонефрит (C3GN), CFHR5-нефропатию или атипичный гемолитико-уремический синдром (aHUS), или любую комбинацию указанных заболеваний.
Некоторые варианты реализации, представленные в настоящем описании, относятся к способам лечения, предотвращения или облегчения дегенерации желтого пятна, такой как возрастная дегенерация желтого пятна (AMD), у субъекта путем введения CFB-специфичного ингибитора, такого как антисмысловое соединение, нацеленное на CFB. В некоторых вариантах реализации AMD представляет собой влажную форму AMD или сухую форму AMD. В некоторых вариантах реализации сухая форма AMD может представлять собой географическую атрофию. Исследования показали связь дисрегуляции альтернативного пути активации комплемента и AMD. Компоненты комплемента являются частыми составляющими глазных друз, внеклеточного вещества, которое накапливается в желтом пятне у пациентов с AMD. Кроме того, существуют данные о том, что варианты CFH и CFB являются причиной почти 75% случаев AMD в Северной Европе и Северной Америке. Также было обнаружено, что специфический полиморфизм CFB обеспечивает защиту от AMD. Patel, N. et al., Eye (2008) 22(6): 768-76. Кроме того, мыши, гомозиготные по нулевому гену CFB, демонстрируют более низкую активность пути активации комплемента, демонстрируют меньшее поражение глаз и неоваскуляризацию хориоидеи (CNV) после лазерной фотокоагуляции. Rohrer, В. et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2009) 50(7): 3056-64. Кроме того, лечение siPHК CFB защищает мышей от CNV, индуцируемой лазером. Bora, NS et al., J Immunol. (2006) 177(3): 1872-8. Исследования также показали, что почки и глаза имеют общие пути развития и особенности структуры, включая композицию протомеров коллагена IV базальной мембраны и васкулярность. Savige et al., J Am Soc Nephrol. (2011) 22(8): 1403-15. Существует подтверждение того, что путь активации комплемента вовлечен в заболевания почек и глаз. Например, наследственный дефицит белка-регулятора комплемента является причиной предрасположенности к атипичному гемолитико-уремическому синдрому и AMD. Richards A et al., Adv Immunol. (2007) 96: 141-77. Кроме того, хроническая болезнь почек была связана с AMD. Nitsch, D. et al., Ophthalmic Epidemiol. (2009) 16(3): 181-6; Choi, J. et al, Ophthalmic Epidemiol. (2011) 18(6): 259-63. Болезнь плотного осадка (DDD), заболевание почек, связанное с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, характеризуется острым нефритическим синдромом и глазными друзами. Cruz and Smith, GeneReviews (2007) Jul 20. Более того, мыши с генетической делецией компонента альтернативного пути активации комплемента демонстрируют сосуществующие фенотипы заболеваний почек и глаз. Существуют данные о том, что у мышей, гомозиготных по нулевому гену CFH, развивается DDD и присутствуют аномалии сетчатки и дисфункция зрения. Pickering et al., Nat Genet. (2002) 31(4): 424-8. Модели заболеваний почек, связанных с дисрегуляцией альтернативного пути активации комплемента, у мышей также приняты в качестве моделей AMD. Pennesi ME et al., Mol Apects Med (2012) 33: 487-509. Мыши с нулевым геном CFH, например, представляют собой общепринятую модель заболеваний почек, таких как DDD, и AMD. Кроме того, существуют данные о том, что AMD связана с системным источником факторов комплемента, которые накапливаются локально в глазу для управления альтернативным путем активации комплемента. Loyet et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. (2012) 53(10): 6628-37.
ПРИМЕРЫ
Неограничивающее описание и включение посредством ссылки
Тогда как некоторые соединения, композиции и способы, описанные в настоящем документе, были специально описаны в соответствии с некоторыми вариантами реализации, следующие примеры служат исключительно для иллюстрации соединений, описанных в настоящем документе, и не ограничивают их. Полное содержание каждого из документов, приведенных в настоящей заявке, включено в настоящее описание посредством ссылки.
Очевидно, что последовательность, представленная в каждой SEQ ID NO в примерах, приведенных в настоящем описании, не зависит от какой-либо модификации сахарной группы, межнуклеозидной связи или нуклеотидного основания. Соответственно, антисмысловые соединения, определяемые SEQ ID NO, могут независимо содержать одну или более модификаций сахарной группы, межнуклеозидной связи или нуклеотидного основания. Антисмысловые соединения, описываемые номером Isis (Isis No), показывают комбинацию последовательности нуклеотидных оснований и мотива.
Пример 1: антисмысловое ингибирование фактора В комплемента (CFB) человека в клетках HepG2 МОЕ-гэпмерами
Получали антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора В комплемента (CFB) человека, и тестировали их на предмет действия на мРНК CFB in vitro. Указанные антисмысловые олигонуклеотиды тестировали в серии экспериментов со схожими условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Культивированные клетки HepG2 с плотностью 20000 клеток на лунку трансфицировали 4500 нМ антисмыслового олигонуклеотида с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 (прямая последовательность AGTCTCTGTGGCATGGTTTGG, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 810; обратная последовательность GGGCGAATGACTGAGATCTTG, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 811; последовательность зонда TACCGATTACCACAAGCAACCATGGCA, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 812) использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
Вновь полученные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в таблицах ниже получали в виде МОЕ-гэпмеров 5-10-5. Длина указанных МОЕ-гэпмеров 5-10-5 составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеозид в 3'-сегменте-крыле содержал 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидные связи на протяжении каждого гэпмера представляли собой фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина на протяжении каждого гэпмера представляли собой 5-метилцитозины. «Сайт инициации» означает самый крайний нуклеозид с 5'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. «Стоп-сайт» означает самый крайний нуклеозид с 3'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. Каждый гэпмер, перечисленный в таблицах ниже, нацелен либо на мРНК CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 1 (номер доступа в GENBANK NM_001710.5), либо на геномную последовательность CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 2 (номер доступа в GENBANK NT_007592.15, укороченная в пределах нуклеотидов 31852000-31861000), либо на обе. «n/а» означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на данную конкретную последовательность гена со 100% комплементарностью.
Пример 2: антисмысловое ингибирование фактора В комплемента (CFB) человека в клетках HepG2 МОЕ-гэпмерами
Получали дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора В комплемента (CFB) человека, и тестировали их на предмет действия на мРНК CFB in vitro. Культивированные клетки HepG2 с плотностью 20000 клеток на лунку трансфицировали 4500 нМ антисмыслового олигонуклеотида с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3460_MGB (прямая последовательность CGAAGCAGCTCAATGAAATCAA, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 813; обратная последовательность TGCCTGGAGGGCCTTCTT, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 814; последовательность зонда AGACCACAAGTTGAAGTC, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 815) использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
Вновь полученные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в таблицах ниже получали в виде МОЕ-гэпмеров 5-10-5. Длина указанных МОЕ-гэпмеров 5-10-5 составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеозид в 3'-сегменте-крыле содержал 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидные связи на протяжении каждого гэпмера представляли собой фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина на протяжении каждого гэпмера представляли собой 5-метилцитозины. «Сайт инициации» означает самый крайний нуклеозид с 5'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. «Стоп-сайт» означает самый крайний нуклеозид с 3'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. Каждый гэпмер, перечисленный в таблицах ниже, нацелен либо на мРНК CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 1 (номер доступа в GENBANK NM_001710.5), либо на геномную последовательность CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 2 (номер доступа в GENBANK NT_007592.15, укороченная в пределах нуклеотидов 31852000-31861000), либо на обе. «n/а» означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на данную конкретную последовательность гена со 100% комплементарностью.
Пример 3: антисмысловое ингибирование фактора В комплемента (CFB) человека в клетках HepG2 МОЕ-гэпмерами
Получали дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора В комплемента (CFB) человека, и тестировали их на предмет действия на мРНК CFB in vitro. Указанные антисмысловые олигонуклеотиды тестировали в серии экспериментов со схожими условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Культивированные клетки HepG2 с плотностью 20000 клеток на лунку трансфицировали 5000 нМ антисмыслового олигонуклеотида с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
Вновь полученные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в таблицах ниже получали в виде МОЕ-гэпмеров 5-10-5. Длина указанных гэпмеров составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеозид в 3'-сегменте-крыле содержал 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидные связи на протяжении каждого гэпмера представляли собой фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина на протяжении каждого гэпмера представляли собой 5-метилцитозины. «Сайт инициации» означает самый крайний нуклеозид с 5'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. «Стоп-сайт» означает самый крайний нуклеозид с 3'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. Каждый гэпмер, перечисленный в таблицах ниже, нацелен либо на мРНК CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 1 (номер доступа в GENBANK NM_001710.5), либо на геномную последовательность CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 2 (номер доступа в GENBANK NT_007592.15, укороченная в пределах нуклеотидов 31852000-31861000), либо на обе. «n/а» означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на данную конкретную последовательность гена со 100% комплементарностью. В случае, когда выравнивание последовательностей для целевого гена в конкретной таблице не показано, очевидно, что ни один из олигонуклеотидов, представленных в данной таблице, не выравнивается со 100% комплементарностью с данным целевым геном.
Пример 4: антисмысловое ингибирование фактора В комплемента (CFB) человека в клетках HepG2 МОЕ-гэпмерами
Получали антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора В комплемента (CFB) человека, и тестировали их на предмет действия на мРНК CFB in vitro. Указанные антисмысловые олигонуклеотиды тестировали в серии экспериментов со схожими условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Культивированные клетки HepG2 с плотностью 20000 клеток на лунку трансфицировали 3000 нМ антисмыслового олигонуклеотида с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
Вновь полученные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в таблицах ниже получали в виде МОЕ-гэпмеров 4-8-5, МОЕ-гэпмеров 5-9-5, МОЕ-гэпмеров 5-10-5, МОЕ-гэпмеров 3-10-4, МОЕ-гэпмеров 3-10-7, МОЕ-гэпмеров 6-7-6, МОЕ-гэпмеров 6-8-6 или МОЕ-гэпмеров 5-7-5, или в виде дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов.
Длина МОЕ-гэпмеров 4-8-5 составляла 17 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал восемь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, содержащими четыре и пять нуклеозидов соответственно. Длина МОЕ-гэпмеров 5-9-5 составляла 19 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал девять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 5-10-5 составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 5-7-5 составляла 17 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал семь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 3-10-4 составляла 17 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, содержащими три и четыре нуклеозида соответственно. Длина МОЕ-гэпмеров 3-10-7 составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, содержащими три и семь нуклеозидов соответственно. Длина МОЕ-гэпмеров 6-7-6 составляла 19 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал семь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал шесть нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 6-8-6 составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал восемь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал шесть нуклеозидов. Межнуклеозидные связи на протяжении каждого гэпмера представляли собой фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина на протяжении каждого гэпмера представляли собой 5-метилцитозины.
Длина дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов составляла 16 нуклеозидов, при этом указанные нуклеозиды содержали либо МОЕ-модификацию сахара, либо cEt-модификацию сахара, либо дезокси-модификацию. В колонке «химическая структура» описаны модификации сахаров в каждом олигонуклеотиде. «k» означает cEt-модификацию сахара; «d» означает дезоксирибозу; и «е» означает МОЕ-модификацию.
«Сайт инициации» означает самый крайний нуклеозид с 5'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. «Стоп-сайт» означает самый крайний нуклеозид с 3'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. Каждый гэпмер, перечисленный в таблицах ниже, нацелен либо на мРНК CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 1 (номер доступа в GENBANK NM_001710.5), либо на геномную последовательность CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 2 (номер доступа в GENBANK NT_007592.15, укороченная в пределах нуклеотидов 31852000-31861000), либо на обе. «п/а» означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на данную конкретную последовательность гена со 100% комплементарностью.
Пример 5: антисмысловое ингибирование фактора В комплемента (CFB) человека в клетках HepG2 МОЕ-гэпмерами
Получали дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора В комплемента (CFB) человека, и тестировали их на предмет действия на мРНК CFB in vitro. Указанные антисмысловые олигонуклеотиды тестировали в серии экспериментов со схожими условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Культивированные клетки HepG2 с плотностью 20000 клеток на лунку трансфицировали 2000 нМ антисмыслового олигонуклеотида с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
Вновь полученные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в таблицах ниже получали в виде МОЕ-гэпмеров 4-8-5, МОЕ-гэпмеров 5-8-5, МОЕ-гэпмеров 5-9-5, МОЕ-гэпмеров 5-10-5, МОЕ-гэпмеров 6-7-6, МОЕ-гэпмеров 3-10-5 или МОЕ-гэпмеров 6-8-6.
Длина МОЕ-гэпмеров 4-8-5 составляла 17 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал восемь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, содержащими четыре и пять нуклеозидов соответственно. Длина МОЕ-гэпмеров 5-8-5 составляла 18 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал восемь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 5-9-5 составляла 19 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал девять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 5-10-5 составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 3-10-5 составляла 18 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, содержащими три и пять нуклеозидов соответственно. Длина МОЕ-гэпмеров 6-7-6 составляла 19 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал семь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал шесть нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 6-8-6 составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал восемь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал шесть нуклеозидов. Каждый нуклеозид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеозид в 3'-сегменте-крыле содержал 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидные связи на протяжении каждого гэпмера представляли собой фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина на протяжении каждого гэпмера представляли собой 5-метилцитозины.
«Сайт инициации» означает самый крайний нуклеозид с 5'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. «Стоп-сайт» означает самый крайний нуклеозид с 3'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. Каждый гэпмер, перечисленный в таблицах ниже, нацелен либо на мРНК CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 1 (номер доступа в GENBANK NM_001710.5), либо на геномную последовательность CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 2 (номер доступа в GENBANK NT_007592.15, укороченная в пределах нуклеотидов 31852000-31861000), либо на обе. «n/а» означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на данную конкретную последовательность гена со 100% комплементарностью.
Пример 6: антисмысловое ингибирование фактора В комплемента (CFB) человека в клетках HepG2
Получали дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора В комплемента (CFB) человека, и тестировали их на предмет действия на мРНК CFB in vitro. Культивированные клетки HepG2 с плотностью 20000 клеток на лунку трансфицировали 1000 нМ антисмыслового олигонуклеотида с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
Вновь полученные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в таблицах ниже получали в виде дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов. Длина дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов составляла 16 нуклеозидов, при этом указанные нуклеозиды содержали либо МОЕ-модификацию сахара, либо cEt-модификацию сахара, либо дезокси-модификацию. В колонке «химическая структура» описаны модификации сахаров в каждом олигонуклеотиде. «k» означает cEt-модификацию сахара; «d» означает дезоксирибозу; и «е» означает МОЕ-модификацию.
«Сайт инициации» означает самый крайний нуклеозид с 5'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. «Стоп-сайт» означает самый крайний нуклеозид с 3'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. Каждый гэпмер, перечисленный в таблицах ниже, нацелен либо на мРНК CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 1 (номер доступа в GENBANK NM_001710.5), либо на геномную последовательность CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 2 (номер доступа в GENBANK NT_007592.15, укороченная в пределах нуклеотидов 31852000-31861000), либо на обе. «n/а» означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на данную конкретную последовательность гена со 100% комплементарностью.
Пример 7: антисмысловое ингибирование фактора В комплемента (CFB) человека в клетках HepG2
Получали дополнительные антисмысловые олигонуклеотиды, нацеленные на нуклеиновую кислоту фактора В комплемента (CFB) человека, и тестировали их на предмет действия на мРНК CFB in vitro. Указанные антисмысловые олигонуклеотиды тестировали в серии экспериментов со схожими условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Культивированные клетки HepG2 с плотностью 20000 клеток на лунку трансфицировали 500 нМ антисмыслового олигонуклеотида с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 24 часа, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
Вновь полученные химерные антисмысловые олигонуклеотиды в таблицах ниже получали в виде дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов или в виде МОЕ-гэпмеров 5-8-5, МОЕ-гэпмеров 5-9-5, МОЕ-гэпмеров 5-10-5, МОЕ-гэпмеров 6-7-6, МОЕ-гэпмеров 3-10-5 или МОЕ-гэпмеров 6-8-6.
Длина дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов составляла 16 нуклеозидов, при этом указанные нуклеозиды содержали либо МОЕ-модификацию сахара, либо cEt-модификацию сахара, либо дезокси-модификацию. В колонке «химическая структура» описаны модификации сахаров в каждом олигонуклеотиде. «k» означает cEt-модификацию сахара; «d» означает дезоксирибозу; и «е» означает МОЕ-модификацию.
Длина МОЕ-гэпмеров 5-8-5 составляла 18 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал восемь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 5-9-5 составляла 19 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал девять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 5-10-5 составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал пять нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 3-10-5 составляла 18 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал десять 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, содержащими три и пять нуклеозидов соответственно. Длина МОЕ-гэпмеров 6-7-6 составляла 19 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал семь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал шесть нуклеозидов. Длина МОЕ-гэпмеров 6-8-6 составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал восемь 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован сегментами-крыльями в 5'-направлении и 3'-направлении, каждый из которых содержал шесть нуклеозидов. Каждый нуклеозид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеозид в 3'-сегменте-крыле содержал 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидные связи на протяжении каждого гэпмера представляли собой фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина на протяжении каждого гэпмера представляли собой 5-метилцитозины.
Сайт инициации» означает самый крайний нуклеозид с 5'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. «Стоп-сайт» означает самый крайний нуклеозид с 3'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена человека. Каждый гэпмер, перечисленный в таблицах ниже, нацелен либо на мРНК CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 1 (номер доступа в GENBANK NM_001710.5), либо на геномную последовательность CFB человека, обозначаемую в настоящем описании SEQ ID NO: 2 (номер доступа в GENBANK NT_007592.15, укороченная в пределах нуклеотидов 31852000 - 31861000), либо на обе. «n/а» означает, что антисмысловой олигонуклеотид не нацелен на данную конкретную последовательность гена со 100% комплементарностью.
Пример 8: дозозависимое антисмысловое ингибирование CFB человека в клетках HepG2 МОЕ-гэпмерами 5-10-5
Отбирали гэпмеры из описанных выше исследований, демонстрирующие ингибирование мРНК CFB in vitro, и тестировали их в различных дозах в клетках HepG2. Клетки высевали с плотностью 20000 клеток на лунку и трансфицировали 0,313 мкМ, 0,625 мкМ, 1,25 мкМ, 2,50 мкМ, 5,00 мкМ или 10,00 мкМ концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, указанными в таблице ниже, с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. Уровни мРНК CFB снижались дозозависимым образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 9: дозозависимое антисмысловое ингибирование CFB человека в клетках HepG2
Отбирали гэпмеры из описанных выше исследований, демонстрирующие ингибирование мРНК CFB in vitro, и тестировали их в различных дозах в клетках HepG2. Антисмысловые олигонуклеотиды тестировали в ряде экспериментов со схожими условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Клетки высевали с плотностью 20000 клеток на лунку и трансфицировали 0,08 мкМ, 0,25 мкМ, 0,74 мкМ, 2,22 мкМ, 6,67 мкМ и 20,00 мкМ концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, указанными в таблице ниже, с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. Уровни мРНК CFB снижались дозозависимым образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 10: дозозависимое антисмысловое ингибирование CFB человека в клетках HepG2
Отбирали гэпмеры из описанных выше исследований, демонстрирующие ингибирование мРНК CFB in vitro, и тестировали их в различных дозах в клетках HepG2. Антисмысловые олигонуклеотиды тестировали в ряде экспериментов со схожими условиями культивирования. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Клетки высевали с плотностью 20000 клеток на лунку и трансфицировали 0,06 мкМ, 0,25 мкМ, 1,00 мкМ и 4,00 мкМ концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, указанными в таблице ниже, с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. Уровни мРНК CFB снижались дозозависимым образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 11: дозозависимое антисмысловое ингибирование CFB человека в клетках HepG2
Отбирали гэпмеры из описанных выше исследований, демонстрирующие ингибирование мРНК CFB in vitro, и тестировали их в различных дозах в клетках HepG2. Кроме того, получали дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотид, ISIS 594430, с такой же последовательностью (CTCCTTCCGAGTCAGC, SEQ ID NO: 549) и целевой областью (целевой сайт инициации 2195 последовательности SEQ ID NO: 1 и целевой сайт инициации 6983 последовательности SED ID NO: 2), что и у ISIS 588870, другого дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотида. ISIS 594430 представлял собой cEt-гэпмер 3-10-3.
Клетки высевали с плотностью 20000 клеток на лунку и трансфицировали 0,01 мкМ, 0,04 мкМ, 0,12 мкМ, 0,37 мкМ, 1,11 мкМ, 3,33 мкМ и 10,00 мкМ концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, указанными в таблице ниже, с использованием электропорации. После периода обработки, составляющего приблизительно 16 часов, из клеток выделяли РНК и измеряли уровни мРНК CFB путем количественной ПЦР в режиме реального времени. Набор праймер-зонд человека RTS3459 использовали для измерения уровней мРНК. Уровни мРНК CFB корректировали в соответствии с общим содержанием РНК, измеренным с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно необработанных контрольных клеток.
50
Также представлена полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC) каждого олигонуклеотида. Уровни мРНК CFB снижались дозозависимым образом в клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом.
Пример 12: переносимость МОЕ-гэпмеров, нацеленных на CFB, у мышей CD1
Мыши CD1 (Charles River, MA) представляют собой многоцелевую модель у мышей, часто используемую для тестирования безопасности и эффективности. Мышей лечили антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, отобранными из исследований, описанных выше, и оценивали на предмет изменений уровней различных химических маркеров плазмы.
Исследование 1 (с МОЕ-гэпмерами 5-10-5)
Группам семинедельных самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг олигонуклеотида ISIS один раз в неделю в течение 6 недель. Группе самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции фосфатно-буферный раствор (ФБР) один раз в неделю в течение 6 недель. Одной группе мышей подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг контрольного олигонуклеотида ISIS 141923 (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC, обозначаемый в настоящем описании SEQ ID NO: 809, МОЕ-гэпмер 5-10-5 без известной мишени у мышей) один раз в неделю в течение 6 недель. Мышей подвергали эвтаназии через 48 часов после последней дозы, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Химические маркеры плазмы
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровни трансаминаз и азота мочевины крови (АМК) в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции печени или почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Массу тела мышей измеряли в 40 день перед умерщвлением мышей. Также измеряли массу органов, печени, почки и селезенки после умерщвления мышей. Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения массы за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 2 (с МОЕ-гэпмерами 5-10-5)
Группам 6-8-недельных самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг олигонуклеотида ISIS один раз в неделю в течение 6 недель. Двум группам самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Одной группе мышей подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг контрольного олигонуклеотида ISIS 141923 один раз в неделю в течение 6 недель. Мышей подвергали эвтаназии через 48 часов после последней дозы, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Химические маркеры плазмы
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровни трансаминаз, альбумина и АМК в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции печени или почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Массу тела мышей измеряли в 42 день. Также измеряли массу органов, печени, почки и селезенки после умерщвления мышей в 45 день. Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения массы за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 3 (с МОЕ-гэпмерами 5-10-5)
Группам 6-8-недельных самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг олигонуклеотида ISIS один раз в неделю в течение 6 недель. Двум группам самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Мышей подвергали эвтаназии через 48 часов после последней дозы, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Химические маркеры плазмы
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровни трансаминаз, альбумина и АМК в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции печени или почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Массу тела мышей измеряли в 42 день. Также измеряли массу органов, печени, почки и селезенки после умерщвления мышей в 42 день. Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения массы за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 4 (с (S) cEt-гэпмерами и дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидами)
Группам десятинедельных самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции 50 мг/кг олигонуклеотида ISIS из описанных выше исследований один раз в неделю в течение 6 недель. Кроме того, два олигонуклеотида, ISIS 594431 и ISIS 594432, получали в виде cEt-гэпмеров 3-10-3 и также тестировали в данном исследовании. ISIS 594431 (ACCTCCTTCCGAGTCA, SEQ ID NO: 550) нацелен на ту же область, что и ISIS 588871, дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмер (целевой сайт инициации 2197 последовательности SEQ ID NO: 1 и целевой сайт инициации 6985 последовательности SEQ ID NO: 2). ISIS 594432 (TGGTCACATTCCCTTC, SEQ ID NO: 542) нацелен на ту же область, что и ISIS 588872, дезокси-, МОЕ- и cEt-гэпмер (целевой сайт инициации 154 последовательности SEQ ID NO: 1 и целевой сайт инициации 1875 последовательности SEQ ID NO: 2).
Двум группам самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Мышей подвергали эвтаназии через 48 часов после последней дозы, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Химические маркеры плазмы
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровни трансаминаз, альбумина, креатинина и АМК в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции печени или почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Массу тела мышей измеряли в 39 день. Также измеряли массу органов, печени, почки и селезенки после умерщвления мышей в 42 день. Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения массы за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 5 (с МОЕ-гэпмерами, (S) cEt-гэпмерами и дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидами)
Группам 8-9-недельных самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции 50 мг/кг олигонуклеотида ISIS один раз в неделю в течение 6 недель. Двум группам самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Мышей подвергали эвтаназии через 48 часов после последней дозы, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Химические маркеры плазмы
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровни трансаминаз, альбумина, креатинина и АМК в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции печени или почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Массу тела мышей измеряли в 40 день. Также измеряли массу органов, печени, почки и селезенки после умерщвления мышей в 42 день. Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения массы за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 6 (с дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидами)
Группам 8-9-недельных самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции 50 мг/кг дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов один раз в неделю в течение 6 недель. Двум группам самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Мышей подвергали эвтаназии через 48 часов после последней дозы, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Химические маркеры плазмы
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровни трансаминаз, альбумина, креатинина, билирубина и АМК в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции печени или почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Массу тела мышей измеряли в 40 день. Также измеряли массу органов, печени, почки и селезенки после умерщвления мышей в 45 день. Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения массы за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 7 (с МОЕ-гэпмерами и дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидами)
Группам 8-9-недельных самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг олигонуклеотидов ISIS один раз в неделю в течение 6 недель. Одной группе самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Мышей подвергали эвтаназии через 48 часов после последней дозы, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Химические маркеры плазмы
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровни трансаминаз, альбумина, креатинина и АМК в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции печени или почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Массу тела мышей измеряли в 44 день. Также измеряли массу органов, печени, почки и селезенки после умерщвления мышей в 49 день. Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения массы за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 8 (с МОЕ-гэпмерами, дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидами, и cEt-гэпмерами)
Группам 8-9-недельных самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг МОЕ-гэпмеров или 50 мг/кг дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов или cEt-гэпмеров один раз в неделю в течение 6 недель. Одной группе самцов мышей CD1 подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Мышей подвергали эвтаназии через 48 часов после последней дозы, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Химические маркеры плазмы
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени и почек измеряли уровни трансаминаз, альбумина, креатинина и АМК в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты представлены в таблице ниже.
Значения массы
Массу тела мышей измеряли в 36 день. Также измеряли массу органов, печени, почки и селезенки после умерщвления мышей в 43 день. Результаты для массы органов выражали в виде отношения к массе тела и приводили к соотношению для контроля ФБР.
Анализы для определения уровней цитокинов
Кровь, полученную от всех групп мышей, отправляли в Antech Diagnostics для измерения уровней различных цитокинов, таких как IL-6, MDC, MIP1β, IP-10, MCP1, MIP-1α и RANTES. Результаты представлены в таблице 54.
Гематологические анализы
Кровь, полученную от всех групп мышей, отправляли в Antech Diagnostics для измерения гематокрита (НСТ), а также различных клеток крови, таких как лейкоциты (WBC), эритроциты (RBC) и тромбоциты, и общего содержания гемоглобина (Hb). Результаты представлены в таблице 55.
Пример 13: переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на CFB человека, у крыс линии Sprague-Dawley
Крысы линии Sprague-Dawley представляют собой многоцелевую модель, используемую для оценки безопасности и эффективности. Крыс лечили антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS из исследований, описанных в примерах выше, и оценивали на предмет изменений уровней различных химических маркеров плазмы.
Исследование 1 (с МОЕ-гэпмерами 5-10-5)
7-8-недельных самцов крыс линии Sprague-Dawley содержали в условиях 12-часового цикла свет/темнота и кормили без ограничения обычным кормом для крыс Purina, рацион 5001. Группам из 4 крыс линии Sprague-Dawley каждая подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг МОЕ-гэпмеров 5-10-5 один раз в неделю в течение 6 недель. Одной контрольной группе из 6 крыс подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Через сорок восемь часов после последней дозы крыс подвергали эвтаназии, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли уровни трансаминаз в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Измеряли уровни АЛТ (аланинтрансаминазы) и ACT (аспартаттрансаминазы) в плазме, и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любых маркеров функции печени за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Функция почек
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли уровни азота мочевины крови (АМК) и креатинина в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты, выраженные в мг/дл, представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Измерение массы тела производили в 39 день. Массу печени, сердца, селезенки и почки измеряли в конце исследования в 42 день, и результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали любые изменения массы органов за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 2 (с дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидами)
9-10-недельных самцов крыс линии Sprague-Dawley содержали в условиях 12-часового цикла свет/темнота и кормили без ограничения обычным кормом для крыс Purina, рацион 5001. Группам из 4 крыс линии Sprague-Dawley каждая подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов один раз в неделю в течение 6 недель. Двум контрольным группам из 3 крыс каждая подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Через сорок восемь часов после последней дозы крыс подвергали эвтаназии, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли уровни трансаминаз в плазме в 42 день с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Измеряли уровни АЛТ (аланинтрансаминазы) и ACT (аспартаттрансаминазы), и альбумина в плазме, и результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любых маркеров функции печени за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Функция почек
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли уровни азота мочевины крови (АМК) и креатинина в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты, выраженные в мг/дл, представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Измерение массы тела производили в 39 день. Массу печени, сердца, селезенки и почки измеряли в конце исследования в 42 день, и результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали любые изменения массы органов за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 3 (с МОЕ-гэпмерами)
9-10-недельных самцов крыс линии Sprague-Dawley содержали в условиях 12-часового цикла свет/темнота и кормили без ограничения обычным кормом для крыс Purina, рацион 5001. Группам из 4 крыс линии Sprague-Dawley каждая подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг МОЕ-гэпмеров один раз в неделю в течение 6 недель. Одной контрольной группе из 6 крыс подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Через сорок восемь часов после последней дозы крыс подвергали эвтаназии, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли уровни трансаминаз в плазме в 43 день с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Измеряли уровни АЛТ (аланинтрансаминазы) и ACT (аспартаттрансаминазы) в плазме, и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любых маркеров функции печени за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Функция почек
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли уровни азота мочевины крови (АМК) и креатинина в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты, выраженные в мг/дл, представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Измерение массы тела производили в 39 день. Массу печени, сердца, селезенки и почки измеряли в конце исследования в 42 день, и результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали любые изменения массы органов за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 4 (с МОЕ-гэпмерами)
9-10-недельных самцов крыс линии Sprague-Dawley содержали в условиях 12-часового цикла свет/темнота и кормили без ограничения обычным кормом для крыс Purina, рацион 5001. Группам из 4 крыс линии Sprague-Dawley каждая подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг МОЕ-гэпмеров один раз в неделю в течение 6 недель. Одной контрольной группе из 6 крыс подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Через сорок восемь часов после последней дозы крыс подвергали эвтаназии, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли уровни трансаминаз в плазме в 42 день с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Измеряли уровни АЛТ (аланинтрансаминазы) и ACT (аспартаттрансаминазы) в плазме, и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любых маркеров функции печени за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Функция почек
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли уровни азота мочевины крови (АМК) и креатинина в плазме с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты, выраженные в мг/дл, представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Измерение массы тела производили в 39 день. Массу печени, сердца, селезенки и почки измеряли в конце исследования в 42 день, и результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали любые изменения массы органов за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 5 (с МОЕ-гэпмерами и дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидами)
9-10-недельных самцов крыс линии Sprague-Dawley содержали в условиях 12-часового цикла свет/темнота и кормили без ограничения обычным кормом для крыс Purina, рацион 5001. Группам из 4 крыс линии Sprague-Dawley каждая подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг МОЕ-гэпмера или 50 мг/кг дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидов один раз в неделю в течение 6 недель. Одной контрольной группе из 4 крыс подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Через сорок восемь часов после последней дозы крыс подвергали эвтаназии, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли уровни трансаминаз в плазме в 42 день с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Измеряли уровни АЛТ (аланинтрансаминазы) и ACT (аспартаттрансаминазы) в плазме, и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любых маркеров функции печени за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Функция почек
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли уровни азота мочевины крови (АМК) и креатинина в плазме и моче с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты, выраженные в мг/дл, представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Измерение массы тела производили в 39 день. Массу печени, сердца, селезенки и почки измеряли в конце исследования в 42 день, и результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали любые изменения массы органов за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Исследование 6 (с МОЕ-гэпмерами, дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотидами. и cEt-гэпмерами)
Самцов крыс содержали в условиях 12-часового цикла свет/темнота и кормили без ограничения обычным кормом для крыс Purina, рацион 5001. Группам из 4 крыс каждая подкожно вводили путем инъекции 100 мг/кг МОЕ-гэпмеров или 50 мг/кг дезокси-, МОЕ- и cEt-олигонуклеотида или cEt-гэпмера один раз в неделю в течение 6 недель. Одной контрольной группе из 4 крыс подкожно вводили путем инъекции ФБР один раз в неделю в течение 6 недель. Через сорок восемь часов после последней дозы крыс подвергали эвтаназии, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени измеряли уровни трансаминаз в плазме в 42 день с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Измеряли уровни АЛТ (аланинтрансаминазы) и ACT (аспартаттрансаминазы) в плазме, и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в таблице ниже.
Функция почек
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек измеряли уровни общего белка и креатинина в моче с использованием автоматического анализатора для клинической биохимии (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилл, Нью-Йорк). Результаты представлены в таблице ниже. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывали изменения уровней любого из маркеров функции почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов, исключали из дальнейших исследований.
Значения массы
Измерение массы тела производили в 39 день. Массу печени, сердца, селезенки и почки измеряли в конце исследования в 42 день, и результаты представлены в таблице ниже. Результаты для массы органов выражали в виде отношения к массе тела и приводили к соотношению для контроля ФБР.
Пример 14: эффективность антисмысловых олигонуклеотидов в отношении мРНК CFB у трансгенных по hCFB мышей
Отобранные соединения тестировали на предмет эффективности у трансгенных по CFB человека мышей, линия-основатель #6. Ген CFB человека расположен на хромосоме 6: положение 31913721-31919861. Для получения трансгенных мышей, экспрессирующих ген CFB человека, выбирали фосмиду (Fosmid) (ABC14-50933200C23), содержащую последовательность CFB. Рестрикционные ферменты Cla I (31926612) и Age I (31926815) использовали для получения фрагмента длиной 22127 пар оснований, содержащего ген CFB, для пронуклеарной инъекции. ДНК подтверждали путем анализа с рестрикционными ферментами с использованием Pvu I. Фрагмент ДНК длиной 22127 пар оснований вводили путем инъекции эмбрионам C57BL/6NTac. Выводили 6 положительных основателей. Основатель #6 экспрессировал мРНК CFB печени человека и его скрещивали с 3-им поколением. Потомство мышей 3-го поколения использовали для оценки антисмысловых олигонуклеотидов (ASO) CFB человека на предмет уменьшения мРНК CFB человека.
Лечение
Группам из 3 мышей каждая подкожно вводили путем инъекции 50 мг/кг олигонуклеотидов ISIS два раза в неделю в течение первой недели с последующим введением 50 мг/кг олигонуклеотидов ISIS один раз в неделю в течение еще трех недель. Одной контрольной группе из 4 мышей подкожно вводили путем инъекции ФБР два раза в неделю в течение 2 недель в течение первой недели в течение еще трех недель. Через сорок восемь часов после последней дозы крыс подвергали эвтаназии, и брали органы и плазму для дальнейшего анализа.
Анализ РНК
В конце периода введения доз РНК экстрагировали из печени и почки для анализа уровней мРНК CFB методом ПЦР в режиме реального времени. Уровни мРНК CFB человека измеряли с использованием набора праймер-зонд человека RTS3459. Уровни мРНК CFB приводили к RIBOGREEN, а также к гену «домашнего хозяйства», Циклофилину. Результаты рассчитывали в виде процента ингибирования экспрессии мРНК CFB по сравнению с контролем. Все антисмысловые олигонуклеотиды осуществляли ингибирование уровней мРНК CFB человека в печени.
Пример 15: антисмысловое ингибирование CFB мыши in vivo
Получали несколько антисмысловых олигонуклеотидов, нацеленных на мРНК CFB мыши (номер доступа в GENBANK NM_008198.2, включенный в настоящее описание как SEQ ID NO: 5). Целевые сайты инициации и последовательности каждого олигонуклеотида описаны в таблице ниже. Химерные антисмысловые олигонуклеотиды в таблице ниже получали в виде МОЕ-гэпмеров 5-10-5. Длина указанных гэпмеров составляла 20 нуклеозидов, при этом центральный гэп-сегмент содержал 10 2'-дезоксинуклеозидов и был фланкирован по обеим сторонам (в 5'- и 3'-направлениях) «крыльями», каждое из которых содержало 5 нуклеозидов. Каждый нуклеозид в 5'-сегменте-крыле и каждый нуклеозид в 3'-сегменте-крыле содержал 2'-МОЕ-модификацию. Межнуклеозидные связи на протяжении каждого гэпмера представляли собой фосфоротиоатные (P=S) связи. Все остатки цитозина на протяжении каждого гэпмера представляли собой 5-метилцитозины.
Лечение
Группам из четырех мышей C57BL/6 каждая вводили путем инъекции 50 мг/кг ISIS 516269, ISIS 516272, ISIS 516323, ISIS 516330 или ISIS 516341 каждую неделю в течение 3 недель. Контрольной группе мышей вводили фосфатный буферный раствор (ФБР) каждую неделю в течение 3 недель.
Анализ РНК CFB
В конце исследования РНК экстрагировали из ткани печени для анализа CFB методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора праймер-зонд RTS3430 (прямая последовательность GGGCAAACAGCAATTTGTGA, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 816; обратная последовательность TGGCTACCCACCTTCCTTGT, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 817; последовательность зонда CTGGATACTGTCCCAATCCCGGTATTCCX, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 818). Уровни мРНК нормализовали с использованием RIBOGREEN. Как показано в таблице ниже, некоторые антисмысловые олигонуклеотиды обеспечивали уменьшение CFB мыши относительно контроля ФБР. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно контроля.
Анализ белка
Измеряли уровни белка CFB в почке, печени, плазме и в глазу путем вестерн-блоттинга с использованием антитела козы анти-CFB (Sigma Aldrich). Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно контроля ФБР. «n/а» означает, что для данного образца не произведены измерения. Как показано в таблице ниже, антисмысловое ингибирование CFB олигонуклеотидами ISIS приводило к уменьшению белка CFB в различных тканях. Как показано в таблице ниже, системное введение олигонуклеотидов ISIS эффективно снижало уровни CFB в глазу.
Пример 16: дозозависимое антисмысловое ингибирование CFB мыши
Группам из четырех мышей C57BL/6 каждая вводили путем инъекции 25 мг/кг, 50 мг/кг или 100 мг/кг ISIS 516272 и ISIS 516323 каждую неделю в течение 6 недель. Другим двум группам мышей вводили путем инъекции 100 мг/кг ISIS 516330 или ISIS 516341 каждую неделю в течение 6 недель. Двум контрольным группам мышей вводили путем инъекции фосфатный буферный раствор (ФБР) каждую неделю в течение 6 недель.
Анализ РНК CFB
РНК экстрагировали из тканей печени и почки для анализа CFB методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора праймер-зонд RTS3430. Уровни мРНК нормализовали с использованием RIBOGREEN. Как показано в таблице ниже, антисмысловые олигонуклеотиды обеспечивали дозозависимое уменьшение CFB мыши относительно контроля ФБР. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно контроля.
Анализ белка
Измеряли уровни белка CFB в плазме путем вестерн-блоттинга с использованием антитела козы анти-CFB (Sigma Aldrich). Как показано в таблице ниже, антисмысловое ингибирование CFB олигонуклеотидами ISIS приводило к уменьшению белка CFB. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно контроля ФБР. «n/а» означает, что для данного образца не произведены измерения.
Уровни белка CFB также измеряли в глазу путем вестерн-блоттинга. Все группы лечения демонстрировали 95% ингибирование CFB, при этом измерения для некоторых образцов были ниже уровней детектирования для указанного анализа.
Пример 17: влияние антисмыслового ингибирования CFB в модели у мышей NZB/W F1
NZB/W F1 представляет собой старейшую классическую модель волчанки, когда у мышей развиваются тяжелые волчаночноподобные фенотипы, сопоставимые с фенотипами у пациентов с волчанкой (Theofilopoulos, A.N. and Dixon, F.J. Advances in Immunology, vol. 37, pp. 269-390, 1985). Данные волчаночноподобные фенотипы включают лимфаденопатию, спленомегалию, повышенный уровень антиядерных аутоантител (ANA) в сыворотке, включая IgG к двухцепочечной ДНК (dsДНК), большинство из которых представляют собой IgG2a и IgG3, и опосредуемый иммунными комплексами гломерулонефрит (GN), который обнаруживается в возрасте 5-6 месяцев и приводит к почечной недостаточности и смерти в возрасте 10-12 месяцев.
Исследование 1
Проводили исследование для демонстрации того, что лечение антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на CFB, уменьшит патологию почек в модели у мышей. 17-недельных самок мышей NZB/W F1 приобретали у Jackson Laboratories. Группы из 16 мышей каждая получали дозы, составляющие 100 мкг/кг/неделя ISIS 516272 или ISIS 516323 ISIS, в течение 20 недель. Другая группа из 16 мышей получала дозы, составляющие 100 мкг/кг/неделя контрольного олигонуклеотида ISIS 141923, в течение 20 недель. Другая группа из 10 мышей получала дозы ФБР в течение 20 недель и служила в качестве контрольной группы, с которой сравнивали остальные группы. Терминальные конечные точки собирали через 48 часов после введения путем инъекции последней дозы.
Анализ РНК CFB
РНК экстрагировали из ткани печени и почки для анализа CFB методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора праймер-зонд RTS3430. Уровни мРНК нормализовали с использованием RIBOGREEN. Как показано в таблице ниже, некоторые антисмысловые олигонуклеотиды обеспечивали уменьшение CFB мыши относительно контроля ФБР. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно контроля.
Протеинурия
Протеинурию ожидали у 60% животных в данной модели у мышей. Кумулятивную частоту возникновения тяжелой протеинурии измеряли путем вычисления соотношения общего белка и креатинина с использованием клинического анализатора. Результаты представлены в таблице ниже и показывают, что лечение антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на CFB, обеспечивало уменьшение протеинурии у мышей по сравнению с контролем ФБР и мышами, получавшими лечение контрольным олигонуклеотидом.
Выживаемость
Выживаемость мышей контролировали путем ведения подсчета мышей в начале лечения и затем снова на 20 неделе. Результаты представлены в таблице ниже и показывают, что лечение антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на CFB, увеличивало выживаемость мышей по сравнению с контролем ФБР и мышами, получавшими лечение контрольным олигонуклеотидом.
Отложение в клубочках
Количество отложений С3, а также отложений IgG в клубочках почек измеряли путем иммуногистохимического анализа с использованием антитела анти-С3. Результаты представлены в таблице ниже и показывают, что лечение антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на CFB, обеспечивало уменьшение отложений как С3, так и IgG в клубочках почек по сравнению с контролем ФБР и мышами, получавшими лечение контрольным олигонуклеотидом.
Исследование 2
16-недельных самок мышей NZB/W F1 приобретали у Jackson Laboratories. Группа из 10 мышей получала дозы, составляющие 100 мкг/кг/неделя ISIS 516323, в течение 12 недель. Другая группа из 10 мышей получала дозы, составляющие 100 мкг/кг/неделя контрольного олигонуклеотида ISIS 141923, в течение 12 недель. Другая группа из 10 мышей получала дозы ФБР в течение 12 недель и служила в качестве контрольной группы, с которой сравнивали остальные группы. Терминальные конечные точки собирали через 48 часов после введения путем инъекции последней дозы.
Анализ РНК CFB
РНК экстрагировали из ткани печени и почки для анализа CFB методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора праймер-зонд RTS3430. Как показано в таблице ниже, лечение ISIS 516323 обеспечивало уменьшение CFB мыши относительно контроля ФБР. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно контроля.
Протеинурия
Кумулятивную частоту возникновения тяжелой протеинурии оценивали путем измерения соотношения общего белка и креатинина в моче, а также путем измерения общих уровней микроальбумина. Результаты представлены в таблице ниже и показывают, что лечение антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на CFB, уменьшало протеинурию у мышей по сравнению с контролем ФБР и мышами, получавшими лечение контрольным олигонуклеотидом.
Выживаемость
Выживаемость мышей контролировали путем ведения подсчета мышей в начале лечения и затем снова на 12 неделе. Результаты представлены в таблице ниже и показывают, что лечение антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на CFB, увеличивало выживаемость мышей по сравнению с контролем ФБР и мышами, получавшими лечение контрольным олигонуклеотидом.
Пример 18: влияние антисмыслового ингибирования CFB в модели у мышей MRL
-
+
В модели волчаночного нефрита у мышей MRL/lpr развивается SLE-подобный фенотип, характеризующийся лимфаденопатией вследствие накопления двойных отрицательных (CD4 CD8) и B220 Т-клеток. У данных мышей наблюдается ускоренная смертность. Кроме того, указанные мыши демонстрируют высокие концентрации циркулирующих иммуноглобулинов, которые включают повышенные уровни аутоантител, таких как ANA, антитела к одноцепочечной ДНК (ssДНК), анти-dsДНК, анти-Sm и ревматоидные факторы, что приводит к образованию большого количества иммунных комплексов (Andrews, В. et al., J. Exp. Med. 148: 1198-1215, 1978).
Лечение
Проводили исследование для изучения того, вызовет ли лечение антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на CFB, регрессию патологии почек в указанной модели у мышей. 14-недельных самок мышей MRL/lpr приобретали у Jackson Laboratories. Группа из 10 мышей получала дозы, составляющие 50 мкг/кг/неделя ISIS 516323, в течение 7 недель. Другая группа из 10 мышей получала дозы, составляющие 50 мкг/кг/неделя контрольного олигонуклеотида ISIS 141923, в течение 7 недель. Другая группа из 10 мышей получала дозы ФБР в течение 7 недель и служила в качестве контрольной группы, с которой сравнивали остальные группы. Терминальные конечные точки собирали через 48 часов после введения путем инъекции последней дозы.
Анализ РНК CFB
РНК экстрагировали из ткани печени для анализа CFB методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора праймер-зонд RTS3430. Как показано в таблице ниже, ISIS 516323 уменьшал CFB относительно контроля ФБР. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно контроля.
Патология почек
Патологию почек оценивали двумя способами. Гистологические срезы почки окрашивали гематоксилином и эозином. Контроль ФБР демонстрировал присутствие мультигломерулярных полумесяцев, канальцевых цилиндров, что является симптомом гломерулосклероза. Срезы у мышей, которых лечили ISIS 516323, напротив, демонстрировали отсутствие полумесяцев, канальцевых цилиндров с минимальными фиброзными изменениями капсулы Боумена, сегментарный рост мезангиальных клеток от умеренного до сильного и утолщение клубочковой базальной мембраны.
Накопление С3 в почке также оценивали путем иммуногистохимического анализа с использованием антител анти-С3. Показатель интенсивности иммуногистохимической окраски С3 для всей почки рассчитывали по системе оценки интенсивности, которую вычисляли путем фиксации 10 клубочков на почку и расчета интенсивности положительного окрашивания С3. Результаты представлены в таблице ниже и показывают, что лечение ISIS 516323 уменьшало накопление С3 в почках по сравнению с контрольными группами.
Уровни С3 в плазме
Уменьшение CFB ингибирует активацию альтернативного пути активации комплемента, что предотвращает расход С3 и приводит к явному повышению уровней С3 в плазме. Уровни С3 в плазме, полученной в результате последнего кровопускания, измеряли с помощью клинического анализатора. Результаты представлены в таблице ниже и показывают, что лечение ISIS 516323 повышало уровни С3 (р<0,001) в плазме по сравнению с контрольными группами.
Данные результаты показывают, что лечение антисмысловыми олигонуклеотидами, нацеленными на CFB, вызывает регрессию патологии почек в модели волчанки у мышей.
Пример 19: влияние антисмыслового ингибирования CFB в модели у мышей CFH Het
+/-
Модель гетерозиготных по CFH (CFH Het, CFH) мышей экспрессирует белок, представляющий собой мутантный фактор Н, в комбинации с полноразмерным белком мыши (Pickering, M.C. et al., J. Exp.Med. 2007. 204: 1249-56). У данных мышей гистология почек остается нормальной до возраста шести месяцев.
Исследование 1
+/-
Группы из 8 шестинедельных CFH-мышей каждая получали дозы, составляющие 75 мг/кг/неделя ISIS 516323 или ISIS 516341, в течение 6 недель. Другая группа из 8 мышей получала дозы, составляющие 75 мг/кг/неделя контрольного олигонуклеотида ISIS 141923, в течение 6 недель. Другая группа из 8 мышей получала дозы ФБР в течение 6 недель и служила в качестве контрольной группы, с которой сравнивали остальные группы. Терминальные конечные точки собирали через 48 часов после введения путем инъекции последней дозы.
Анализ РНК CFB
РНК экстрагировали из ткани печени и почки для анализа CFB методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора праймер-зонд RTS3430. Как показано в таблице ниже, антисмысловые олигонуклеотиды уменьшали CFB относительно контроля ФБР. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно контроля.
Уровни С3 в плазме
Уменьшение CFB ингибирует активацию альтернативного пути активации комплемента, что предотвращает расход С3 и приводит к явному повышению уровней С3 в плазме. Уровни С3 в плазме, полученной в результате последнего забора плазмы, измеряли с помощью клинического анализатора. Результаты представлены в таблице ниже и показывают, что лечение ISIS 516323 повышало уровни С3 в плазме до нормальных уровней.
Исследование 2
+/-
Группы из 5 CFH-мышей каждая получали дозы, составляющие 12,5 мг/кг/неделя, 25 мг/кг/неделя, 50 мг/кг/неделя, 75 мг/кг/неделя или 100 мг/кг/неделя ISIS 516323 или ISIS 516341, в течение 6 недель. Другая группа из 5 мышей получала дозы, составляющие 75 мкг/кг/неделя контрольного олигонуклеотида ISIS 141923, в течение 6 недель. Другая группа из 5 мышей получала дозы ФБР в течение 6 недель и служила в качестве контрольной группы, с которой сравнивали остальные группы. Терминальные конечные точки собирали через 48 часов после введения путем инъекции последней дозы.
Анализ РНК CFB
РНК экстрагировали из ткани печени и почки для анализа CFB методом ПЦР в режиме реального времени с использованием набора праймер-зонд RTS3430. Как показано в таблице ниже, антисмысловые олигонуклеотиды уменьшали CFB относительно контроля ФБР дозозависимым образом. Результаты представлены в виде процента ингибирования CFB относительно контроля.
Уровни С3 в плазме
Уменьшение CFB ингибирует активацию альтернативного пути активации комплемента, что предотвращает расход С3 и приводит к явному повышению уровней С3 в плазме. Уровни С3 в плазме, полученной в результате последнего забора плазмы, измеряли с помощью клинического анализатора. Результаты представлены в таблице ниже и показывают, что лечение олигонуклеотидами ISIS, нацеленными на CFB, повышало уровни С3 в плазме.
Пример 20: влияние антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, нацеленных на CFB человека, у яванских макак
Яванских макак лечили антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, отобранными из исследований, описанных в примерах выше. Оценивали эффективность и переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, а также их фармакокинетический профиль в печени и почках.
В момент проведения данного исследования геномная последовательность яванских макак была недоступна в базе данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI); поэтому перекрестная реактивность с последовательностью гена яванских макак не могла быть подтверждена. Вместо этого, последовательности антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, применяемых у яванских макак, сравнивали с последовательностью макака-резус на предмет гомологии. Антисмысловые олигонуклеотиды человека, тестируемые ниже, являются перекрестно-реагирующими (с 0 или 1 несоответствием) с геномной последовательностью макака-резус (номер доступа в GENBANK No. NW_001116486.1, укороченная в пределах нуклеотидов 536000-545000, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 3). Сайты инициации и стоп-сайты каждого олигонуклеотида, нацеленного на SEQ ID NO: 3, представлены в таблице ниже. «Сайт инициации» означает самый крайний нуклеотид с 5'-конца, на который нацелен гэпмер, в последовательности гена макака-резус. «Несоответствия» означают число нуклеотидных оснований в олигонуклеотиде человека, которые не соответствуют геномной последовательности макака-резус.
Лечение
Перед исследованием обезьян выдерживали в карантине в течение по меньшей мере 30-дневного периода, во время которого животных ежедневно наблюдали на предмет общего состояния здоровья. Обезьяны были в возрасте 2-4 лет, и их масса составляла от 2 до 4 кг. Одиннадцати группам из 4-6 случайным образом разделенных самцов яванских макак каждая подкожно вводили путем инъекции олигонуклеотид ISIS или ФБР в четырех участках на спине по часовой стрелке (т.е. слева, сверху, справа и снизу), один участок на дозу. Обезьянам вводили четыре нагрузочных дозы ФБР или 40 мг/кг ISIS 532800, ISIS 532809, ISIS 588540, ISIS 588544, ISIS 588548, ISIS 588550, ISIS 588553, ISIS 588555, ISIS 588848 или ISIS 594430 в течение первой недели (1, 3, 5 и 7 дни), а затем вводили дозы ФБР или 40 мг/кг олигонуклеотида ISIS один раз в неделю в течение 12 недель (14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77 и 84 дни). ISIS 532770 тестировали в отдельном исследовании со схожими условиями с двумя самцами и двумя самками яванских макак в группе.
Целевое уменьшение CFB в печени
Анализ РНК
В 86 день брали образцы печени и почек в двух экземплярах (каждый приблизительно 250 мг) для анализа мРНК CFB. Образцы подвергали мгновенному замораживанию в жидком азоте после аутопсии в течение приблизительно 10 минут после умерщвления.
РНК экстрагировали из печени и почки для анализа методом ПЦР в режиме реального времени для измерения экспрессии мРНК CFB. Результаты представлены в виде процента изменения мРНК относительно контроля ФБР, нормализованного с использованием RIBOGREEN. Уровни РНК также нормализовали с использованием гена «домашнего хозяйства», Циклофилина А. Уровни РНК измеряли с помощью наборов праймер-зонд RTS3459, описанного выше, или RTS4445_MGB (прямая последовательность CGAAGAAGCTCAGTGAAATCAA, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 819; обратная последовательность TGCCTGGAGGGCCCTCTT, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 820; последовательность зонда AGACCACAAGTTGAAGTC, обозначаемая в настоящем описании SEQ ID NO: 815).
Как показано в таблицах ниже, лечение антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS приводило к уменьшению мРНК CFB по сравнению с контролем ФБР. Анализ уровней мРНК CFB показал, что некоторые олигонуклеотиды ISIS снижали уровни CFB в печени и/или почке. Здесь «0» означает, что ингибирование уровней экспрессии не происходило. «*» означает, что указанный олигонуклеотид тестировали в отдельном исследовании со схожими условиями.
Анализ белка
У всех имеющихся животных забирали приблизительно 1 мл крови в 85 день и помещали в пробирки, содержащие калиевую соль EDTA. Образцы крови сразу помещали в мокрый лед или Kryorack, и центрифугировали (3000 об/мин в течение 10 минут при 4°С) с получением плазмы (приблизительно 0,4 мл) в течение 60 минут после забора. Измеряли уровни CFB в плазме путем радиальной иммунодиффузии (RID) с использованием поликлонального антитела к фактору В. Результаты представлены в таблице ниже. ISIS 532770 тестировали в отдельном исследовании и уровни белка в плазме измеряли в 91 или 92 день у данной группы.
Анализ CFB в плазме показал, что некоторые олигонуклеотиды ISIS снижали уровни белка непрерывным образом. ISIS 532770, который тестировали в отдельном исследовании, снижал уровни белка CFB в 91/92 день на 50% по сравнению с исходными значениями. Снижение уровней белка CFB в плазме хорошо коррелирует со снижением уровня мРНК CFB в печени в соответствующих группах животных.
Исследования переносимости
Измерения массы тела
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на общее состояние здоровья животных измеряли массу тела и органов, и результаты представлены в таблице ниже. «*» означает, что указанный олигонуклеотид тестировали в отдельном исследовании со схожими условиями и является средним значением для измерений у самцов и самок обезьян. Данные результаты показывают, что влияние лечения антисмысловыми олигонуклеотидами на массу тела и органов находилось в пределах диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов.
Функция печени
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию печени брали образцы крови у всех групп исследования. Образцы крови брали из головной, подкожной или бедренной вены через 48 часов после введения доз. Обезьянам не давали есть в течение ночи перед забором крови. Кровь (1,5 мл) собирали в пробирки без антикоагулянта для отделения сыворотки. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение как минимум 90 минут, а затем центрифугировали (приблизительно 3000 об/мин в течение 10 минут) с получением сыворотки. Измеряли уровни различных маркеров функции печени с использованием химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония).
Измеряли уровни АЛТ и ACT в плазме, и результаты, выраженные в МЕ/л, представлены в таблице ниже. Аналогичным образом измеряли уровень билирубина, маркера функции печени, и результаты, выраженные в мг/дл, представлены в таблице ниже. «*» означает, что указанный олигонуклеотид тестировали в отдельном исследовании со схожими условиями и является средним значением для измерений у самцов и самок обезьян. Данные результаты показывают, что большинство антисмысловых олигонуклеотидов не влияли на функцию печени за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов.
Функция почек
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS на функцию почек брали образцы крови у всех групп исследования. Образцы крови брали из головной, подкожной или бедренной вены через 48 часов после введения доз. Обезьянам не давали есть в течение ночи перед забором крови. Кровь собирали в пробирки без антикоагулянта для отделения сыворотки. Пробирки выдерживали при комнатной температуре в течение как минимум 90 минут, а затем центрифугировали (приблизительно 3000 об/мин в течение 10 минут) с получением сыворотки. Измеряли уровни АМК и креатинина с использованием химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). Результаты, выраженные в мг/дл, представлены в таблице ниже. «*» означает, что указанный олигонуклеотид тестировали в отдельном исследовании со схожими условиями и является средним значением для измерений у самцов и самок обезьян.
Для анализа мочи свежую мочу у всех животных собирали утром с использованием чистого поддона для клетки на мокром льду. Еду убирали на ночь за день до сбора мочи, но обеспечивали водой. Анализировали образцы мочи (приблизительно 1 мл) для определения соотношения белка и креатинина (белок/креатинин) с использованием автоматического химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). «n.d.» означает, что уровень белка в моче был ниже предела детектирования для указанного анализатора.
Данные химического состава плазмы и мочи показывают, что большинство олигонуклеотидов ISIS не оказывали никакого влияния на функцию почек за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов.
Гематология
2
Для оценки какого-либо влияния олигонуклеотидов ISIS у яванских макак на гематологические параметры брали образцы крови, представляющие собой приблизительно 0,5 мл крови, у каждого из имеющихся животных исследования в пробирки, содержащие K-EDTA. Анализировали образцы для определения количества эритроцитов (RBC), количества лейкоцитов (WBC), количества отдельных лейкоцитов, например, моноцитов, нейтрофилов, лимфоцитов, а также количества тромбоцитов, содержания гемоглобина и гематокрита с использованием гематологического анализатора ADVIA 120 (Bayer, США). Данные представлены в таблицах ниже. «*» означает, что указанный олигонуклеотид тестировали в отдельном исследовании со схожими условиями и является средним значением для измерений у самцов и самок обезьян.
Указанные данные показывают, что олигонуклеотиды не вызывали никаких изменений гематологических параметров за пределами диапазона, ожидаемого для антисмысловых олигонуклеотидов в данной дозе.
Измерение концентрации олигонуклеотидов
Концентрацию полноразмерного олигонуклеотида измеряли в тканях почки и печени. Используемый способ представлял собой модификацию ранее опубликованных способов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), состоящих из экстракции смесью фенол-хлороформ (жидкость-жидкость) с последующей твердофазной экстракцией. Концентрации в образцах тканей рассчитывали с использованием калибровочных кривых с нижним пределом количественного определения (LLOQ), составляющим приблизительно 1,14 мкг/г. Результаты, выраженные в мкг/г ткани печени или почки, представлены в таблице ниже.