Набор для дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота и способ дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота
KIT FOR DIFFERENTIATING CATTLE PESTIVIRUSES AND METHOD FOR DIFFERENTIATING CATTLE PESTIVIRUSES

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано для выявления и генетического типирования трех видов пестивирусов крупного рогатого скота (Pestivirus А, В, Н) в образцах эмбриональных сывороток и пробах биоматериала, полученных от крупного рогатого скота.
Род Pestivirus семейства Flaviviridae включает 11 видов: вирус вирусной диареи крупного рогатого скота типа 1 (BVDV-1, Pestivirus А), типа 2 (BVDV-2, Pestivirus В), вирус классической чумы свиней (CSFV, Pestivirus С) и вирус пограничной болезни (BDV, Pestivirus D), HoBi-подобные пестивирусы (BVDV-3, Pestivirus Н), а также несколько других видов, таких как пестивирус жирафов (Pestivirus G), выделенные при вспышке у кенийских жирафов, атипичный пестивирус свиней (Pestivirus K), выделенный в стадах свиней в Австралии, где наблюдались мертворождение и гибель новорожденных, вирус антилоп (Pestivirus Е), выделенный из абортированного плода антилопы в США, а также другие виды, выделенные от крыс и летучих мышей (Smith et al., 2017. Proposed revision to the taxonomy of the genus Pestivirus, family Flaviviridae // J. Gen. Virol. 98, 2106-2112). Такой широкий спектр пестивирусов, заражающих различные виды животных, является доказательством генетической пластичности их геномов, и способности адаптации к различным хозяевам.
У крупного рогатого скота было выявлено заражение и клиническое заболевание, вызванное тремя видами пестивирусов А, В и Н, все они вызывают сходные клинические признаки и заболевание протекает в виде диареи, абортов, респираторного синдрома, персистентной инфекции. Встречаются также сообщения о выявлении у крупного рогатого скота пестивирусов С и D, но эпизоотологическая значимость этих возбудителей в заболеваемости КРС не определена.
В нашей стране были диагностированы заболевания крупного рогатого скота, вызванные пестивирусами А и В. Пестивирус Н выявляли только в эмбриональных сыворотках, культурах клеток и вирусных вакцинах, пестивирусы С и D у крупного рогатого скота не выявляли, что вероятно связано с незначительным объемом исследований на эти вирусы.
Таким образом, выявление и дифференциация пестивирусов, вызывающих патологию крупного рогатого скота, имеет значение для постановки диагноза и разработки противоэпизоотических мероприятий.
Для выявления пестивирусов предложены различные диагностические тесты, основанные на полимеразной цепной реакции, выделении вирусов в культуре клеток, а также иммунофлуоресцентный анализ и метод иммуногистохимии (Becher et al., 1999. Genetic diversity of pestiviruses: identification of novel groups and implications for classification. Virology, 262. 64-71).
В качестве основного метода дифференциации пестивирусов проводится секвенирование полного генома или отдельных фрагментов с последующим филогенетическим анализом (Liu L. et al., 2009. Phylogeny, classification and evolutionary insights into pestiviruses. Virology, 385, 351-357.; Zhu L. et al., 2016. Molecular Characterization of a Novel Bovine Viral Diarrhea Virus Isolate SD-15. PLoS ONE 11(10): e0165044.). Однако этот метод дорогостоящий и занимает много времени.
Известны способы применения различных вариантов ПЦР для выявления одновременно нескольких представителей семейства Pestivirus без их дифференциации на отдельные виды (Vilcek S. et al., 1994. Pestiviruses isolated from pigs, cattle and sheep can be allocated into at least three genogroups using polymerase chain reaction and restriction endonuclease analysis. Arch. Virol. 136, 309-323.; Nagai M. et al., 2004. Phylogenetic analysis of bovine viral diarrhea viruses using five different genetic regions. Virus Res. 99, 103-113).
Также известны способы применения различных вариантов ПНР для дифференциации отдельных представителей семейства Pestivirus (Gilbert S.A. et al., 1999. Typing of bovine viral diarrhea viruses directly from blood of persistently infected cattle by multiplex PCR. // J. Clin. Microbiol. 37, 2020-2023.; Letellier C., Kerkhofs P., 2003. Real-time PCR for simultaneous detection and genotyping of bovine viral diarrhea virus. J. Virol. Methods 114, 21-27.; Baxi M. et al., 2006. A one-step multiplex real-time RT-PCR for detection and typing of bovine viral diarrhea viruses // Veterinary Microbiology. 116, 37-44.; La Rocca S.A., Sandvik Т., 2009. A short target real-time RT-PCR assay for detection of pestiviruses infecting cattle // J. of Virol. Methods, 16, 122-127; Синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления рнк вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с одновременной дифференциацией штаммов вируса на 1 и 2 генотип / Глотов А.Г., Глотова Т.И., Нефедченко А.В. // патент на изобретение RUS 2347812 06.06.2007).
К недостаткам данного способа можно отнести то, что они позволяют различать только 2 вида представителей семейства Pestivirus.
Известен способ типирования пестивирусов А, В и Н с помощью вложенной ПЦР (Decaro N. et al., 2012. A nested PCR approach for unambiguous typing of Pestiviruses infecting cattle. Mol. Cell. Probes 26 (1), 42-46). Однако этот способ проводится в два раунда и существует только в электрофоретическом варианте.
Наиболее приемлемым результатом, принятым за прототип является способ, основанный на Реал-Тайм ПЦР с применением общих олигонуклеотидных праймеров и зондов на ген Npro для выявления пестивирусов А, В и Н (Pesti-qF GATGCCATGTGGACGAGGGC, BVDgen-R TATGTTTTGTATAAAAGTTCA, BVDgen-Pb FAM-CTCTGCTGTACATGGCACATG-TAMRA), с последующей их дифференциацией с помощью олигонуклеотидных праймеров и зондов (Pesti-qF GATGCCATGTGGACGAGGGC, Pesti-qR CATGTGCCATGTACAGCAGAG, FAM-CAATACAGTGGGCCTCTGCAGCA-TAMRA, BVD2-Pb VIC-GTGGCGTTATGGACACAGCCTG-BHQ2, BVD3-Pb TexasRed-ATCAGGCTGTACTCCCAAAG-BHQ2) в мультиплексной ПЦР. (G. Lanave et al. Circulation of multiple subtypes of bovine viral diarrhoea virus type 1 with no evidence for HoBi-like pestivirus in cattle herds of southern Italy // Infection, Genetics and Evolution. 2017. 50: 1-6). К недостаткам данного способа можно отнести то, что общие олигонуклеотидные праймеры выявляют только три вида пестивирусов (пестивирус А, В и Н) и в варианте мультиплексной ПЦР возможны перекрестные реакции между отдельными видами.
Технической задачей изобретения являлась разработка высокоспецифичного и чувствительного способа на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени, позволяющего одновременно выявлять и дифференцировать пестивирусы крупного рогатого скота в культурах клеток, пробах биоматериала, эмбриональных сыворотках и других пробах.
Сущность изобретения заключается в том, что предложены синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды для дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота, согласно изобретению, синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды имеют нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO: 1-12.
Сущность изобретения заключается также в том, что в способе дифференциации пестивирусов крупного рогатого скота, включающем выделение РНК из проб образцов культур клеток, эмбриональных сывороток и проб биоматериала от крупного рогатого скота, проведение обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, согласно изобретению, используют синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды SEQ ID NO: 1-12, исследование каждой пробы проводят в двух реакциях, в первой реакции используют праймеры и зонды SEQ ID NO: 1-4, затем положительные пробы исследуют в трех независимых реакциях для дифференциации трех пестивирусов: с праймерами и зондом SEQ ID NO: 5-7 для дифференциации пестивируса A, SEQ ID NO: 8-10 для дифференциации пестивируса В и SEQ ID NO: 2, 11, 12 - для дифференциации пестивируса Н.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Подбор синтетических олигонуклеотидных праймеров.
На начальном этапе проводят анализ нуклеотидных последовательностей 5'-NTO области геномов всех видов рода Pestivirus из базы данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) и определяют наиболее консервативные участки, специфичные для всех видов, а также специфичные для каждого вида и подбирают специфичные олигонуклеотидные праймеры и зонды. Анализ свойств олигонуклеотидных праймеров проводят с использованием программы Vector NTI 9.0.0 (InforMax) (таблица 1).
Пример 2. Выявление и дифференциация пестивирусов КРС с помощью синтетических олигонуклеотидных праймеров и зондов штаммов и изолятов, в образцах коммерческих эмбриональных сывороток и пробах биоматериала от крупного рогатого скота.
Способ осуществляется в несколько этапов.
Этап 1. Выделение РНК пестивирусов КРС.
Выделение РНК вируса осуществляют стандартным способом с использованием коммерческого набора «Рибо - сорб» производства ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Этап 2. Проведение реакции обратной транскрипции для получения кДНК.
Осуществляют стандартным способом с использованием коммерческого набора «Реверта-L» того же производителя.
2
В пробирку, содержащую 9,5 мкл реакционной смеси: буфер для ОТ (50 mM Tris-HCl [рН 8.3], 3 мМ MgCl, 75 mM KC1, 10 мМ DTT), 0,1 мМ dNTP, 0,1 мкг праймера для ОТ) и 0,5 мкл ревертазы из набора «Реверта-L», добавляют 10 мкл РНК-пробы, осторожно перемешивают и помещают в термостат 37°С на 30 минут. Затем добавляют 20 мкл ДНК-буфера, тщательно перемешивают и используют для постановки ПЦР.
Этап 3. Постановка полимеразной цепной реакции для выявления и дифференциации пестивирусов КРС
2
Полимеразная цепная реакция. Состав реакционной смеси: ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgCl, 25 mM KC1, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, по 0,2 мкг каждого праймера, по 0,1 мкг каждого зонда, 1.25 U Taq-ДНК-полимеразы, 5 мкл кДНК.
Для выявления пестивирусов при приготовлении реакционной смеси используют смесь праймеров и зонда SEQ ID NO: 1-4. Температурный режим проведения ПЦР: 95°С - 5 мин - 1 цикл; 95°С - 10 сек., 57°С - 15 сек., 72°С - 30 сек. - 45 циклов.
Для генотипирования при приготовлении реакционной смеси используют смесь праймеров и зонда отдельно для каждого пестивируса: SEQ ID NO: 5-7 (Pestivirus A), SEQ ID NO: 8-10 (Pestivirus B), SEQ ID NO: 2, 11, 12 (Pestivirus H).
Температурный режим проведения ПЦР: 95°С - 5 мин - 1 цикл; 95°С - 10 сек., 55°С - 15 сек., 72°С - 30 сек. - 45 циклов.
Измерение флуоресценции осуществляют при температуре 55 или 57°С на канале FAM.
Положительными считают образцы со значением Ct не превышающим 40.
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности ПЦР по заявленному способу.
Методом молекулярной трансформации компетентных бактериальных клеток Escherichia coli плазмидой pDrive, содержащей специфические ДНК вставки, для контроля амплификации получают положительные контрольные образцы (ПКО) отдельно для каждого анализа.
Концентрацию плазмидной ДНК определяют с использованием набора реагентов Quant-iT dsDNA, HS (Invitrogen, США) и флуориметра QUBIT (Invitrogen, США).
Для определения чувствительности реакции готовят 10-кратные разведения ПКО и каждое разведение подвергают исследованию в ПЦР.
За аналитическую чувствительность принимают последнее разведение ПКО, с которым результат ПЦР-анализа интерпретируется как положительный. Результаты определения аналитической чувствительности представлены в таблице 2.
Минимальное количество ПКО, выявляемое в реакциях составило 7,2×10 ГЭ на реакцию.
Результаты опытов по определению специфичности реакции представлены в таблице 3.
Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. С помощью разработанных праймеров и зондов можно выявлять штаммы и изоляты пяти видов пестивирусов и дифференцировать 3. Вирусы чумы свиней и пограничной болезни овец с помощью данного набора выявляются, но не генотипируются.
Пример 4. Выявление и дифференциация пестивирусов в образцах эмбриональных сывороток крупного рогатого скота и пробах биологического материала, полученного от больных и инфицированных животных.
Исследованию подвергают образцы коммерческих эмбриональных сывороток КРС, используемых для культивирования культур клеток и производства биопрепаратов в ветеринарии, и пробы сывороток крови, лимфатических узлов, селезенки, легких от КРС с подозрениями на инфицирование пестивирусами.
3
Пробы сывороток крови отбирают в объеме не менее 1 мл, из органов и тканей вырезают кусочки размером 1×1×1 см.
Образцы эмбриональных сывороток и сывороток крови от больных животных используют для выделения РНК без предварительной подготовки.
3
Пробы органов и тканей перед исследованием растирают в отдельных фарфоровых ступках со стерильным песком пестиком, добавляют 5-10 мл стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивают. Смесь переносят в пластиковые пробирки емкостью 1,5 мл, центрифугируют при 10×10 об/мин в течение 5 минут. Для выделения РНК используют 100 мкл осветленной надосадочной жидкости.
Дальнейшую процедуру проводят согласно примеру 2.
Всего предлагаемым способом было исследовано 18 образцов эмбриональных сывороток, 450 проб сыворотки крови и 234 проб внутренних органов КРС.
Результаты опытов по определению эффективности реакции по заявленному способу представлены в таблице 4.
Для подтверждения специфичности полученных результатов определяли нуклеотидную последовательность ампликонов с использованием набора BigDye 3.1 (Applied Biosystems, США) с последующей очисткой на сефадексе G-50 superfine. Секвенирование ПЦР-фрагментов проводили по обеим цепям ДНК. Расшифровку первичных данных секвенирования (хроматограмм) проводили с помощью программы Sequencher v.4.0.5 (Gene Codes Corporation, США).
Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов проводили методами выравнивания с опубликованными последовательностями штаммов пестивирусов с помощью программы ClustalW (Thompson et al., 1994).
В результате исследований в пробах органов больных животных и сыворотках крови КРС выявлен и генотипирован только Pestivirus А, а в пробах эмбриональных сывороток - Pestivirus В и Pestivirus Н. Негенотипируемые пестивирусы в данных образцах не выявлены.
Таким образом, предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью, специфичностью и эффективностью при выявлении и дифференциации в образцах эмбриональных сывороток, сыворотке крови и пробах органов крупного рогатого скота.
--->
Перечень последовательностей
<110>
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН)
<120>
Синтетические олигонуклеотидные праймеры и зонды,  и  способ дифференциации   пестивирусов крупного рогатого скота
<130>
<160>
13
<210>
1
<211>
22
<212>
RNA
<213>
Pestivirus spр.
<400>
ccatgccctа agtaggacta gc
22
<210>
2
<211>
22
<212>
RNA
<213>
Pestivirus spр.
<400>
ccatacctаc agtaggacga gc
22
<210>
3
<211>
21
<212>
RNA
<213>
Pestivirus spр.
<400>
tcaactccat gtgcgatgta c
21
<210>
4
<211>
23
<212>
RNA
<213>
Pestivirus spр.
<400>
ctcgagatgc catgtggacg agg
23
<210>
5
<211>
20
<212>
RNA
<213>
Pestivirus A
<400>
ggtagcaaca gtggtgagtt
20
<210>
6
<211>
17
<212>
RNA
<213>
Pestivirus A
<400>
cgtccacgtg gcatctc
17
<210>
7
<211>
23
<212>
RNA
<213>
Pestivirus A
<400>
tagtcgtcag tggttcgacg cct
23
<210>
8
<211>
19
<212>
RNA
<213>
Pestivirus B
<400>
ctagcgatgc ccttagtag
19
<210>
9
<211>
19
<212>
RNA
<213>
Pestivirus B
<400>
cgtcgaagca ttgacgact
19
<210>
10
<211>
30
<212>
RNA
<213>
Pestivirus B
<400>
tagcggtagc agtgagttca ttggatggcc
30
<210>
11
<211>
19
<212>
RNA
<213>
Pestivirus H
<400>
tccttgatgc gtcgaacca
19
<210>
12
<211>
26
<212>
RNA
<213>
Pestivirus A
<400>
tagtggtagc agtgagctcc ttggat
26
<210>
13
<400>
13
<---