Способ диагностики инфекции мочевыводящих путей у детей грудного и раннего возраста
METHOD FOR DIAGNOSING URINARY TRACT INFECTION IN INFANTS AND YOUNG CHILDREN

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и детской нефрологии, может быть использовано в качестве экспресс - диагностики ИМВП у детей грудного и раннего возраста.
Описан способ диагностики инфекции мочевыводящих путей (ИМВП) у детей грудного и раннего возраста. Способ включает исследование мочи на содержание белка зонулина (Zo), регулятора проницаемости кишечника. Zo имеет потенциальную ценность в определении механизма парацеллюлярного «шлюза» в кишечнике, образуя плотное соединение (TJ) в апикальной части эндотелия кишечника [1, 2]. Белок зонулин является одним из основных факторов, обеспечивающих адекватное действие механизма «ворот кишки», обратимо влияя на герметичность TJ. Экспериментальные исследования показали, что повышение концентрации Zo параллельно способствует увеличению проницаемости кишечника [1, 2]. В результате комплексного исследования была доказана связь между повышенной проницаемостью кишечника и биомаркерами воспалительных и эндотелиальных дисфункций [3]. При воздействии любых повреждающих агентов (бактерий, паразитов, вирусов, аллергенов) нарушается целостность кишечного барьера, возникает дисрегуляция в работе кишечника, размножается аутофлора, что способствует системному бактериальному воспалению, в том числе и почечной ткани [1, 2, 3, 4].
Известны различные способы диагностики ИМВП [5-8]. Известен способ диагностики пиелонефрита у детей [9], предлагающий всем детям с острым пиелонефритом исследовать среднюю порцию утренней мочи и в совокупности использовать стандартные лабораторные исследования: полимеразную цепную реакцию (ПНР) и микробиологический метод. С помощью ПЦР рекомендовано выявлять следующие патогены: ДНК герпесвирусных инфекций, хламидий, микоплазм и папилломовирусных инфекций. С помощью микробиологического метода - определять количественную и видовую характеристику уропатогенов. При обнаружении в моче вышеперечисленных патогенов, а также обсемененности мочи бактериями в количестве 100 тыс. КОЕ/мл, авторами метода предлагается диагностировать хронический пиелонефрит. Данный способ недостаточно информативен и специфичен, диагностический процесс может быть растянут во времени (согласно стандартам исследования, выполнение бактериологического исследования мочи в среднем занимает до 7-10 дней) и зачастую требует проведения дифференциальной диагностики с другими не воспалительными заболеваниями почек. Согласно клиническим рекомендациям Союза педиатров России, этиологическим агентом развития ИМВП у детей является бактериальная инфекция с преобладанием грамм-отрицательной флоры, а вирусная инфекция не относится к причинам развития ИМВП [5].
Известен способ диагностики острого пиелонефрита [10], основанный на определении активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в лейкоцитах крови пациента с инфекцией мочевыводящих путей. Авторы методики рекомендуют определять средний гистохимический коэффициент уровня ЩФ до и после инкубации пробы крови с почечным антигеном, при значении разницы полученного показателя в сравнении с исходным от 0,2 до 3,0 диагностируют острый пиелонефрит. Из недостатков данного метода стоит отметить, что у ряда лабораторий могут возникают сложности с постановкой реакций, ввиду отсутствия нужного объема оборудования для постановки исследований. Также данный метод рекомендован для диагностики пиелонефрита у лиц пожилого и старческого возраста и не может быть использован у детей грудного и раннего возраста.
Известен способ диагностики острого пиелонефрита у детей по уровню экспрессии молекул адгезии CD11β и CD54 лимфоцитами периферической крови [11]. С помощью метода непрямой иммунофлюоресценции определяют процентное соотношение моноклональных антител у детей с клиническими проявлениями пиелонефрита. Согласно исследованиям, при уровне CD11β более 26,34% и CD54 более 33,26% - диагностируют инфекцию мочевыводящих путей. Недостатком данного способа является то, что не всегда данный метод может быть использован в диагностике ИМВП у детей раннего возраста. В большинстве случаев, у детей до трех лет жизни отсутствуют признаки системной воспалительной реакции [5, 8]. Как правило, клинические симптомы у пациентов грудного и раннего возраста маловыраженные и не имеют типичной клинической симптоматики, характерной для детей более старшего возраста [5, 8]. Зачастую, диагностика ИМВП у детей раннего возраста затруднена, а изменения в анализах мочи могут выявляться случайно при профилактических осмотрах [5-8]. Кроме того, следует отметить, что способ относится к инвазивным методам диагностики и не всегда может быть проведен у детей грудного возраста в связи с необходимостью забора большого объема крови - 5 мл.
Наиболее близким к заявляемому является способ диагностики пиелонефрита [12], основанный на определении оптической плотности исследуемой мочи до и после инкубации с тест-микроорганизмом в термостате. Содержание бета-лизинов выявляют по степени лизиса тест-культуры сенной палочки. При повышении бета-лизинов по сравнению с нормой в два и более раз диагностируют латентную форму пиелонефрита. Преимущества данного метода - неинвазивность, простота в исполнении, возможно диагностировать латентные формы, рекомендуется использовать у пациентов с энурезами. Из недостатков - нет данных о возможности использования методики у детей до 3 лет, нельзя диагностировать острые формы заболевания.
Задачей заявленного способа является разработка неинвазивного способа экспресс-диагностики ИМВП, обеспечивающего раннюю и эффективную диагностику у детей первых трех лет жизни.
Сущность способа заключается в определении концентрации зонулина в утренней порции мочи, до назначения антибактериальной терапии, у детей грудного и раннего возраста с подозрением на ИМВП. Если в образцах мочи определяется уровень зонулина выше 0,4 нг/мл (р<0,05) у пациентов регистрируется ИМВП. Способ обеспечивает раннюю безопасную, неинвазивную экспресс-диагностику ИМВП у детей грудного и раннего возраста и позволяет своевременно определять тактику патогенетической терапии.
Технический результат от реализации предлагаемого способа заключается в том, что заявленный способ позволяет получить достоверные сведения о диагностике ИМВП у детей грудного и раннего возраста.
Технический результат от реализации предлагаемого способа:
- полная безопасность для здоровья пациента;
- возможность проведения исследования у детей грудного и раннего возраста;
- для исследования необходимо небольшое количество биологического материала (5 мл мочи);
- отсутствие реактогенности со стороны организма больного;
- забор материала не представляет никаких трудностей для родителей, может производиться в домашних условиях;
- позволяет диагностировать заболевание на ранней стадии.
Предложенный способ оценки технически прост, неинвазивен, информативен, его внедрение не требует больших экономических затрат. Заявляемый способ диагностики ИМВП у детей грудного и раннего возраста является новым и в общедоступной литературе не описан. Технический результат достигается в результате осуществления предлагаемого способа, сущность которого заключается в том, что исследуют мочу ребенка с определением содержания в ней белка зонулина методом энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA) на иммуноферментном автоматическом анализаторе с использованием реактивов фирмы Cloud-Clone Corp (ССС, USA). При уровне Zo выше 0,4 нг/мл у пациентов регистрируют ИМВП. Заявленные отличительные признаки являются новыми и у детей грудного и раннего возраста определение зонулина в моче ранее не использовалось. Зонулин является диагностическим маркером повреждения эндотелия кишечника [1, 4, 13, 15], следовательно, повышение данного маркера свидетельствует о повреждении гистогематического барьера под воздействием различных агентов [1, 2, 3, 13, 14, 15]. Использование в рутинной практике инвазивных методов диагностики у детей грудного и раннего возраста ограничивает и затягивает постановку диагноза, способствует формированию хронических форм заболеваний. В связи с этим, разработка и внедрение в клиническую практику неинвазивных методов диагностики, своевременное прогнозирование обострения заболевания и проведение предиктивной терапии особенно актуальны в педиатрической практике. Способ осуществляется следующим образом. Пациенту при подозрении на ИМВП проводят забор мочи в количестве 5 мл в стерильную пробирку. Забор материала проводят утром, после туалета половых органов, до назначения антибактериальной терапии. Биологический материал центрифугируют в течение 20 минут, после чего, материал разливают по эпиндорфам. Определение Zo проводят в моче методом энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA) на иммуноферментном автоматическом анализаторе с использованием реактивов фирмы Cloud-Clone Corp (ССС, USA). Через 3 часа оцениваются результаты исследования. Полученные значения сравнивают с нормативными показателями. При уровне Zo выше 0,4 нг/мл у пациентов регистрируется ИМВП.
Работоспособность способа доказана путем клинико-лабораторного обследования 44 пациентов Краевой детской клинической больницы №1 г. Владивостока, в возрасте на момент участия в исследовании с 29 дня жизни и до 2 лет 11 месяцев и 29 дней включительно, которым в результате комплексного обследования поставлен диагноз: инфекция мочевыводящих путей. Диагностика заболевания осуществлялась в соответствии со стандартами Федеральных клинических рекомендаций союза Педиатров России (2018) [5]. В группу контроля включили 20 относительно здоровых детей, сопоставимых по возрасту и полу, не имеющие в анамнезе и на момент исследования заболеваний почек и изменений в анализах мочи. Группы обследованных детей не отличались между собой по возрастному и масса - ростовому показателям (р<0,05). Всем детям в моче определяли уровень белка зонулина (Zo), регулятора проницаемости кишечника, методом энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA) на иммуноферментном автоматическом анализаторе с использованием реактивов фирмы Cloud-Clone Corp (ССС, USA). Средние концентрации Zo в моче у детей грудного и раннего возраста с ИМВП и у детей из группы сравнения (контрольная группа) составили 2,86±0,09 нг/мл и 0,16±0,01 нг/мл, соответственно (р<0,05). Таким образом, предлагаемый информативный способ обеспечивает эффективную, безопасную и раннюю экспресс-диагностику ИМВП у детей и позволяет своевременно определить тактику персонифицированной терапии. Примеры:
Клинический пример 1. Больная Д., 2 года 3 месяца поступила с жалобами на появление неприятного запаха мочи, отказ от еды. Со слов мамы данные жалобы беспокоят в течение недели. Самостоятельно сдали общий анализ мочи, в котором выявлены следующие изменения: лейкоцитурия до 170 в поле зрения, бактериурия+++. Учитывая жалобы и результаты анализов, пациентку госпитализировали в нефрологическое отделение. Из анамнеза жизни: ребенок от первой беременности, первых родов, росла и развивалась согласно возрасту. Находилась на грудном вскармливании до года, прикормы введены по возрасту. Аллергологический анамнез: пищевая аллергия на цитрусовые в виде сыпи и зуда. Состоит на диспансерном учете у гастроэнтеролога с рождения с синдромом запоров. После проведенного комплексного обследования ребенку был выставлен диагноз: ИМВП. Пациенту проведено обследование на уровень зонулина в моче следующим способом: до назначения антибактериальной терапии, утром, после туалета половых органов, в стерильную пробирку набрали 5 мл мочи, далее биологический материал был центрифугирован в течение 20 минут, после чего, материал разлили по эпиндорфам. Определение Zo проводили в моче методом энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA) на иммуноферментном автоматическом анализаторе с использованием реактивов фирмы Cloud-Clone Corp (ССС, USA). Через 3 часа оценили результаты исследования - уровень зонулина у данного пациента составил 0,76 нг/мл. Результаты проведенного теста подтвердили наличие ИМВП.
Клинический пример 2. Больная К. 2 г. 1 месяц обратилась с жалобами на боли в животе, повышение температуры до 39°С, вялость, снижение аппетита. Анамнез заболевания: при профилактическом обследовании в возрасте 1 года по данным УЗИ отмечалось расширение чашечно-лоханочной системы обеих почек до 0,7 мм. В последующем по этому поводу не обследовалась. В течение последнего года отмечались эпизоды субфебрилитета без катаральных явлений. Больна в течение 4 дней, когда появились вышеперечисленные жалобы. Из анамнеза жизни известно, что девочка от второй беременности, вторых родов. Росла и развивалась согласно возрастным нормам. Из анамнеза: мама ребенка и бабушка по материнской линии страдают пиелонефритом. Девочка в возрасте 1 года 3 месяцев перенесла кишечную инфекцию (получала Амоксициллин), после чего появилась склонность к задержке стула до 3-4 дней. Проведено комплексное клинико-диагностическое обследование, а также определение содержания в моче зонулина по предлагаемому способу. В результате получено следующее значение: 2,61 нг/мл. Согласно изобретению, выставлен диагноз: ИМВП. Результаты проведенных провокационных тестов подтвердили диагноз ИМВП.
Клинический пример 3. Больной В., 1 год. При прохождении плановой медицинской комиссии выявлены изменения в анализе мочи в виде лейкоцитурии 50-60 в поле зрения. Из анамнеза: рос и развивался по возрасту. В 1 месяц на УЗИ почек выявлена пиелоэктазия справа 0,6 мм. Далее УЗИ почек не повторяли. У матери ребенка гидронефроз справа, бабушка по линии отца страдает мочекаменной болезнью. Больному проведено комплексное клинико-лабораторное обследование и определен уровень зонулина по предлагаемому способу, описанному в первом примере. В результате получено следующее значение: 1,2 нг/мл. Согласно изобретению, выставлен диагноз: ИМВП.
Источники информации:
1. Lukaszyk Е, Lukaszyk М, Koc-Zorawska Е, Bodzenta-Lukaszyk А, Malyszko J. Zonulin, inflammation and iron status in patients with early stages of chronic kidney disease. Int Urol Nephrol. 2018; 50(1):121-125. doi: 10.1007/s11255-017-1741-5
2. Fasano A. Zonulin, regulation of tight junctions, and autoimmune diseases. Ann N Y Acad Sci. 2012; 1258(1):25-33. doi: 10.1111/j.1749-6632.2012.06538.
3. Guerrant RL, Leite AM, Pinkerton R, et al. Biomarkers of Environmental Enteropathy, Inflammation, Stunting, and Impaired Growth in Children in Northeast Brazil. PLoS One. 2016; 11(9): e0158772. Published 2016 Sep 30. doi: 10.1371/journal.pone.0158772
4. Ficek J, Wyskida K, Ficek R, et al. Relationship between plasma levels of zonulin, bacterial lipopolysaccharides, D-lactate and markers of inflammation in haemodialysis patients. Int Urol Nephrol.2017; 49(4):717-725. doi: 10.1007/s11255-016-1495-5
5. Федеральные клинические рекомендации по оказанию медицинской помощи детям с инфекцией мочевыводящих путей [Электронный ресурс] М.: Союз педиатров России, 2018. http://www.pediatr-russia.ru/sites/default/files/file/kr_imvp2018.pdf (Accessed Apr 20, 2020)
6. Вялкова А.А., Гриценко В.А., Зыкова Л.С. Гордиенко Л.М. Инфекция мочевой системы у детей в XXI веке. Оренбургский медицинский вестник. 2016; 2(14):49-56
7. Stein R., Dogan H.S., Hoebeke P., Kocvara R., Nijman R.J., Radmayr C, Tekgiil S. Urinary tract infections in children: EAU/ESPU guidelines. European urology.2015; 67(3): 546-558. doi: 10.1016/j.eururo.2014.11.007
8. Захарова И.Н., Османов И.М., Мумладзе Э.Б., Свинцицкая В.И., Бекмурзаева Г.Б. Инфекция мочевых путей у детей: что нужно знать педиатру и нефрологу. Медицинский совет. 2015; 14
9. Патент RU 2192010 С1, 27.10.2002. «Способ диагностики пиелонефрита у детей»
10. Патент SU 1334090 А1, 1987.08.30 «Способ диагностики острого пиелонефрита»
11. Патент RU 2314040 С1 (ГОУ ВПО Смоленская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию), 10.01.2008 «Способ диагностики острого пиелонефрита у детей»
12. Патент SU 1337777 А1, 1987.09.15 «Способ диагностики пиелонефрита»
13. Sturgeon С, Fasano A. Zonulin, a regulator of epithelial and endothelial barrier functions, and its involvement in chronic inflammatory diseases. Tissue Barriers. 2016; 4(4):e1251384. doi: 10.1080/21688370.2016.1251384
14. Tajik N, Freeh M, Schulz O, et al. Targeting zonulin and intestinal epithelial barrier function to prevent onset of arthritis. Nat Commun. 2020; 11(1): 1995. doi: 10.1038/s41467-020-15831-7
15. Tripathi A, Lammers KM, Goldblum S, et al. Identification of human zonulin, a physiological modulator of tight junctions, as prehaptoglobin-2. Proc Natl Acad Sci USA. 2009; 106(39): 16799-16804. doi: 10.1073/pnas.0906773106