Средство для снижения патоморфологических проявлений посттоксического цирроза печени и его осложнений
AGENT FOR REDUCTION IN PATHOMORPHOLOGICAL MANIFESTATIONS OF POST-TOXIC LIVER CIRRHOSIS AND ITS COMPLICATIONS

Средство относится к экспериментальной биологии, фармакологии, медицине и может быть использовано при создании лекарственных препаратов, замедляющих прогрессирование цирроза печени токсической этиологии в дополнение к базисной терапии или самостоятельно.
При создании изобретения использовано оборудование ЦКП «Протеомный анализ», поддержанного финансированием Минобрнауки России (соглашение № 075-15-2021-691).
Печень обладает рядом функций, в числе которых - функция детоксикации ксенобиотиков. Это может быть сопряжено с развитием деструктивных процессов в гепатоцитах их метаболитами и, как следствие, с формированием цирроза печени. По данным ВОЗ около двух миллиардов людей контактируют с промышленными токсикантами и около семидесяти шести миллионов заболевают от употребления алкоголя. В 20% случаев это приводит к хронизации патологических процессов в печени, ее фиброзу и циррозу. За последние 20 лет смертность от токсических и алкогольных поражений печени достигла 59% (Shield K.D., Rylett М., Rehm J. Успехи и упущенные возможности общественного здравоохранения. Тенденции в потреблении алкоголя и смертности, относимой на счет алкоголя, в Европейском регионе ВОЗ, 1990-2014 гг. М: Европейский офис ВОЗ по профилактике неинфекционных заболеваний и борьбе с ними, 2016, - 81 с.).
Цирроз печени, согласно международной классификации болезней, является самостоятельной нозологической единицей (МКБ K74) и характеризуется необратимой перестройкой паренхимы печени с формированием характерных ложных долек и избыточным отложением коллагеновых волокон (фиброзной ткани) (Schuppan D, Afdhal NH. Liver cirrhosis // Lancet. 2008. Vol. 371. N. 9615. P. 838-851; Albanis E, Safadi R, Friedman SL. Treatment of hepatic fibrosis: almost there // Curr Gastroenterol Rep. 2003. Vol. 5. N. 1. P. 48-56). Ложные дольки - патологические структуры - группы хаотично расположенных гепатоцитов, окруженных коллагеновыми волокнами с нарушением архитектоники печеночных долек. Цирроз проявляется нарушениями структурной архитектоники печени: «извращенным» репаративным процессом, заключающемся в формировании так называемых ложных долек и многочисленных коллагеновых волокон, инициируя нарушение кровообращения и оттока желчи, что способствует вторичному повреждению гепатоцитов, поддерживая таким образом процессы прогрессирования избыточного отложения коллагеновых волокон, формирования «ложных долек» в печени и асцита.
В настоящее время нет лекарственных средств и методов полного излечения цирроза печени. Применяемые лекарственные средства и методы лечения цирроза печени ограничиваются препаратами с гепатопротективным и противовоспалительным эффектом. Это позволяет несколько предупреждать повреждения гепатоцитов и ограничивать проявления воспалительной реакции, возникающей в ответ на некроз гепатоцитов в период до формирования цирроза печени, что в части случаев предотвращает усиление осложнений и позволяет пациенту дождаться сложной и дорогостоящей операции трансплантации печени.
Согласно данным литературы, лечение пациентов, страдающих циррозом печени, направлено на коррекцию общего состояния, лечение и профилактику отдельных печеночных и внепеченочных осложнений уже сформированного заболевания (Ивашкин B.Т., Маевская М.В., Павлов Ч.С., Федосьина Е.А., Бессонова Е.Н., Пирогова И.Ю., Гарбузенко Д.В. Клинические рекомендации Российского общества по изучению печени и Российской гастроэнтерологической ассоциации по лечению осложнений цирроза печени // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2016. Т. 26. №4. C. 71-102; European Association for the Study of the Liver. EASL Clinical Practice Guidelines for the management of patients with decompensated cirrhosis // J. Hepatol. 2018. Vol. 69. N. 2. P. 406-460).
Известные препараты и методы лечения цирроза печени представлены широким спектром средств и методов, оказывающих гепатопротективный эффект, а так же эффекты, опосредованные влиянием на ход воспалительной реакции, возникающей в ответ на повреждение гепатоцитов и приводящей к активации синтеза коллагена (Kockerling D, Nathwani R, Forlano R, Manousou P, Mullish BH, Dhar A. Current and future pharmacological therapies for managing cirrhosis and its complications // World J. Gastroenterol. 2019. Vol. 25. N. 8. P. 888-908. doi:10.3748/wjg.v25.i8.888; Ивашкин B.T., Маевская M.B., Павлов Ч.С., Федосьина Е.А., Бессонова Е.Н., Пирогова И.Ю., Гарбузенко Д.В. Клинические рекомендации Российского общества по изучению печени и Российской гастроэнтерологической ассоциации по лечению осложнений цирроза печени // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. 2016. Т. 26. №4. С. 71-102; European Association for the Study of the Liver. EASL Clinical Practice Guidelines for the management of patients with decompensated cirrhosis // J. Hepatol. 2018. Vol. 69. N. 2. P. 406-460).
Известно применение олтипраза для профилактики и лечения фиброза и цирроза печени (патент на изобретение РФ №2258509 «Применение олтипраза для профилактики и лечения фиброза и цирроза и фармацевтическая композици, содержащая олтипраз», опубл. 20.08.2005). Однако примеры конкретного выполнения изобретения ограничены демонстрацией антифибротичекого действия заявленного средства, но данных об эффективности при циррозе печени, в основе которого лежит нарушение гистологической структуры печени - образование ложных долек, не представлено. Кроме того, в литературе имеются сведения о застое желчи при применении олтипраза (Crowell J.A., Page J.G., Rodman L.E., Heath J.E., Goldenthal E.I., Hall L.B., Kelloff G.J. Chronic Toxicity Studies of 5-(2-Pyrazinyl)-4-methyl-1,2-dithiole-3-thione, a Potential Chemopreventive Agent // Fundamental And Applied Toxicology, 1997. N. 35. P. 9-21), что может дополнительно неблагоприятно влиять на нарушенный при циррозе печени отток желчи от ложных долек и способствовать прогрессированию цирроза печени.
Имеются сведения об антраниламидах, предлагаемых в качестве лекарственного препарата, способствующего ингибированию VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста). По мнению авторов изобретения антраниламиды могут применяться при различных заболеваниях, сопровождающихся патологическим ангиогенезом, в том числе при фиброзе и циррозе печени (патент на изобретение РФ №2263664 «Антраниламиды и их применение в качестве лекарственных средств», опубл. 10.11.2005). Однако пролиферация сосудов при циррозе и ряде других заболеваний является важной компенсаторной и приспособительной реакцией, обеспечивающей сосудистую трофику поврежденного органа. Таким образом, блокирование процесса ангиогенеза может привести к увеличению масштабов некрозов и прогрессированию склероза органов. Кроме того, указанное лекарственное средство не исследовано в отношении блокирования или замедления развития фиброза и цирроза печени.
Известны методы лечения цирроза печени, связанные с применением суспензии клеток печени плода человека (патент на изобретение РФ №2318526 «Способ лечения цирроза печени», опубл. 10.03.2008) и клеток пуповинной крови донора (патент на изобретение РФ №2295351 «Способ лечения хронического гепатита или цирроза печени», опубл. 20.03.2007). Недостатками указанных способов и средств лечения является сложность применения клеток плода человека или клеток пуповинной крови донора, связанная с проблемой поиска донора, высокой стоимостью процесса подготовки клеточных культур, потенциальной антигенной несовместимостью и вероятностью отторжения трансплантата, этическими аспектами применения подобных средств и методов.
Известен способ лечения цирроза печени с использованием мезенхимальных стромальных клеток (патент на изобретение РФ №2593007 «Способ лечения циррозов печени различной этиологии», опубл. 27.07.2016). Сложность указанного способа связана с высокой стоимостью, длительностью получения и выращивания клеточных культур. Кроме того, известно, что мезенхимальные клетки являются предшественниками клеток соединительной ткани, участвующих в процессах фиброзирования, склероза органов и развитии цирроза печени. Таким образом, применение данных клеток представляется сомнительным и рискованным у пациентов, страдающих циррозом печени.
Известен способ лечения цирроза печени, связанный с применением жидкой формы жизнеспособных клеток штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 путем парентерального введения в организм (патент на изобретение РФ №2643591 «Средство для стимуляции регенерации ткани печени при парентеральном введении и способ стимуляции регенерации ткани печени на его основе», опубл. 02.02.2018). Заявлено свойство указанного штамма бактерий обеспечивать повышение стимуляции пролиферации гепатоцитов с сохраненной гистологической структурой и замещение пораженной паренхимы печени на здоровую при лечении заболеваний печени, включая цирроз, за счет повышения накопления пробиотика Bacillus subtilis в печени, приводящее к усилению пролиферации клеток печени. В примерах конкретного выполнения по изучению гистологических срезов печени и селезенки подтверждено наличие процессов пролиферации клеток в дольках печени, а также увеличение диаметра гепатоцитов и появление многоядерных клеток и клеток в состоянии митоза, однако данные о влиянии указанного средства на развитие таких важных признаков цирроза печени, как формирование ложных долек отсутствуют.
Известны препараты и методы лечения цирроза печени растительного и животного происхождения, такие как панцирь черепахи (заявка на CN201310443782A «Liver cirrhosis softening pill for treating liver cirrhosis in compensatory stage», опубл. 2014-01-08), печень ягненка (заявка на изобретение CN201410632537A «Lamb liver soup for treating liver cirrhosis», опубл. 2015-03-25), экстракт Closena Excavata (заявка на изобретение KR20140019602A «Pharmaceutical composition for preventing or treating liver cirrhosis comprising extract of Clausena Excavata Burm, опубл. 2015-08-28). Указанные средства и методы лечения предполагают влияние на процессы выброса профибротических медиаторов при воспалении в печени, в процессе развития и формирования цирроза печени, обладая гепатопротективными свойствами. Однако в представленных примерах не содержится данных о патоморфологическом исследовании процесса лечения сформированного, необратимого цирроза печени. Кроме того, процесс выращивания сырья, получения указанных препаратов как животного, так и растительного происхождения для их изготовления - трудоемкий, требующий масштабных кадровых и экономических затрат, дополнительных методов очистки полученных препаратов.
Известен способ лечения хронического гепатита и цирроза печени отваром лекарственных растений, включающий плоды жостера, траву чистотела, шишки хмеля, семена фенхеля, корень одуванчика, траву чабреца, цветки ромашки и календулы, корень цикория, траву пастушьей сумки, цветки бессмертника песчаного, листы мяты перечной, траву зверобоя продырявленного, траву горца птичьего, листы березы, корень сушеницы, цветы тысячелистника (патент на изобретение РФ №2014842 «Способ лечения хронического гепатита и цирроза печени», опубл. 30.06.1994). Согласно описанию метода лечения прием указанных отваров способствует улучшению общего состояния пациентов, стабилизации уровня маркеров повреждения печени в крови пациентов, однако патоморфологических признаков, подтверждающих замедление поражения структуры печени при циррозе, в нем не содержится.
В качестве наиболее близкого к заявленному выбрано применение 5-гидрокси-2-деценоевой кислоты (5-hydroxy-2-decenoic acid) для изготовления лечебного средства при хронических болезнях печени, фиброзе и циррозе печени (заявка на изобретение CN110403927 «Application of 5-hydroxy-2-decenoic acid in preparation of drug for anti-liver fibrosis, chronic liver disease, liver cirrhosis and liver cancer», опубл. 2019-11-05). На модели тетрахлорметанового повреждения печени у крыс показано, что при индуцированном фиброзе и циррозе печени у мышей воздействие 5-гидрокси-2-деценовой кислоты может значительно улучшить аномальную функцию печени и снизить уровень аспартатаминотрансферазы, глутаматпируваттрансаминазы и общего билирубина в тканях печени, подавляет активацию звездчатых клеток печени, снижает экспрессию коллагена I типа и приводит к двукратному уменьшению объема коллагена в ткани печени. Однако снижение объема коллагена недостаточно велико, а влияние заявленного средства на такие ключевые показатели цирроза печени как количество ложных долек и отечный синдром в виде асцита, не показано.
Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является снижение патоморфологических проявлений посттоксического цирроза и его осложнений в виде отечного синдрома.
Технический результат применения заявленного изобретения - снижение содержания коллагеновых волокон, количества ложных долек в печени и объема асцитической жидкости в брюшной полости.
Решение поставленной задачи достигается путем использования 5% водного раствора окисленного декстрана с молекулярной массой 40 кДа.
Раскрытие сущности изобретения
Средство для снижения патоморфологических проявлений посттоксического цирроза печени и его осложнений включает окисленный декстран с молекулярной массой 40 кДа, в виде водного раствора с концентрацией 5,0 мас.%
В качестве фармацевтически приемлемого растворителя использована вода для инъекций.
Окисленный декстран представляет собой декстран, содержащий карбонильные группы. Он может быть получен любым из известных способов на основе химического окисления декстрана. В частности, окисленный декстран может быть получен путем окисления декстрана с молекулярной массой 40 кДа водным раствором перекиси водорода (патент на изобретение РФ №2618341 «Способ получения окисленного декстрана», опубл. 03.05.2017) или путем окисления декстрана ("Fluka", Швейцария) периодатом натрия и осаждения окисленного декстрана этанолом (патент на изобретение РФ №2125451 «Способ получения конъюгата изониазид-декстран», дата публикации 27.01.1999). Окисленный декстран может быть также получен путем окисления декстрана перманганатом калия в кислой среде при нагревании 80-100°С и осаждения окисленного декстрана этанолом (Евразийский патент на изобретение №011718 «Способ получения диальдегиддекстрана», опубл. 28.04.2009).
Эффективность заявленного средства изучали на модели повреждения печени у крыс породы Wistar с массой тела 280-320 граммов четыреххлористым углеродом и этиловьм спиртом (токсиканты) в течение 60 суток с кратностью введения 3 раза в неделю до развития цирроза печени.
Для проведения испытаний использовали окисленный декстран, полученный путем окисления декстрана с молекулярной массой 40 кДА водным раствором перекиси водорода (патент на изобретение РФ №2618341 «Способ получения окисленного декстрана», опубл. 03.05.2017).
Признаки цирроза печение проявлялись на 56 сутки в виде выраженного фиброза, обусловленного отложением коллагеновых волокон, образования ложных долек и появления асцитической жидкости в брюшной полости. Одной группе крыс (контрольные животные, не получавшие лечения, n=10) введение токсикантов прекращали на 60-е сутки и содержали со свободным доступом к воде и пище еще 30 суток. Для гистологического исследования забирали печень. Другой группе крыс - на 60-е сутки введение токсических веществ прекращали, но после 60-х суток 30 суток интраперитонеально вводили по 2 мл 5% водного раствора окисленного декстрана с молекулярной массой 40 кДа, с периодичностью один раз в каждые 4 суток, в течение 30 суток (до 90-х суток эксперимента). Затем крыс вводили в состояние наркоза (смесь препаратов тилетамина и золазепама), проводили декапитацию. Объем жидкости в брюшной полости измеряли при помощи шприца. Полученную от животных печень подвергали стандартной гистологической обработке, срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по методу Ван Гизон. Производили морфологическое исследование с использованием методов морфометрии, исследовали объемную плотность коллагена, подсчитывали численную плотность ложных долек, определяли объем асцитической жидкости в брюшной полости.
В результате проведенных исследований печени выявили высокую эффективность заявленного средства для снижения патоморфологических проявлений посттоксического цирроза печени и его осложнения в виде отечного синдрома. При макроскопическом исследовании печени у крыс контрольной группы без воздействия заявленным средством выявлены грубые патоморфологические проявления цирроза печени: печень была мелкобугристой, уплотненной (фиг. 1А) со сформированными ложными дольками, в брюшной полости содержалась асцитическая жидкость у всех контрольных животных, объем накопленной в брюшной полости асцитической жидкости, в среднем составил 7,2 мл. (Таблица 1). При макроскопическом исследовании печени опытной группы крыс, получавших заявленное средство, указанные патоморфологические проявления цирроза печени не выявлены: ложные дольки видны не были, печень была с гладкой капсулой и однородной плотноэластической паренхимой (фиг. 1Б), объем асцитической жидкости в брюшной полости составил в среднем 0,15 мл. Отсутствие мелкобугристого вида печени в опытной группе обусловлено значительным уменьшением объема накапливаемого коллагена, разграничивающего ложные дольки друг от друга и придающего печени бугристый вид. При микроскопическом исследовании печени контрольной и опытной групп крыс выявлены те же закономерности (Фиг. 1В, 1Г), при этом обнаружены ложные дольки у крыс, получавших заявленное средство, но в существенно меньшем количестве (Фиг. 1Г), что подтверждено в дальнейшем по оценке численной плотности ложных долек.
При гистологическом исследовании печени контрольных животных широкие фиброзные септы окружали ложные дольки из хаотично-расположенных в них дистрофически-измененных гепатоцитов (Фиг. 1В). Обнаруживали наличие микрофибротических локусов в толще ложных долек. Наибольшим содержание коллагена было в перипортальных пространствах. У крыс, получавших в течение 30 дней заявленное средство, численная плотность ложных долек была на 30% меньше (Фиг. 2). При этом объемная плотность коллагена была в 4 раза меньшей, в сравнении с таковой у животных, не получавших заявленного средства (таблица 2). Этот результат был в два раза лучшим в сравнении с двукратным уменьшением объема коллагена, полученного при использовании 5-гидрокси-2-деценоевой кислоты (5-hydroxy-2-decenoic acid) по данным, изложенным в патенте CN110403927 (прототип).
Таким образом, применение заявленного средства при экспериментальном посттоксическом циррозе печени способствует значительному уменьшению содержания коллагена в печени, уменьшению численной плотности ложных долек и содержания асцитической жидкости в брюшной полости. При этом полученный эффект был существенно более выраженным при использовании заявленного средства в сравнении со средством, выбранным в качестве прототипа, т.к. эффект последнего был ограничен менее выраженным уменьшением содержания коллагена.
Применение окисленного декстрана с молекулярной массой 40 кДа, в виде водного раствора с концентрацией 5,0 мас.% известно для профилактики вирусного гриппа (патент на изобретение РФ №2572332 «Фармацевтическая композиция для профилактики гриппа», опубл. 10.01.2016), для профилактики интерстициальной пневмонии (патент на изобретение РФ №2747550 «Средство для профилактики интерстициальной пневмонии», опубл. 24.11.2020). Применение окисленного декстрана для профилактики вирусного гриппа и интерстициальной пневмонии не означает, что в указанных патентах эффекты окисленного декстрана с очевидностью указывают на возможность его использования для лечения посттоксического цирроза печени. Поскольку этиология и патогенез вышеуказанных патологических состояний не имеют этиологического и патогенетического сходства с этиологией и патогенезом посттоксического цирроза печени, который является самостоятельным заболеванием, что верифицировано в МКБ 10, есть основания рассматривать применение заявленного средства при посттоксическом циррозе печени как применение по новому назначению.
Перечень фигур
Фиг. 1. Влияние заявленного средства на структуру печени крыс с экспериментальным циррозом.
Примечание: А - макроскопический вид печени крысы с экспериментальным циррозом, не получавшей заявленное средство, Б - макроскопический вид печени крысы с экспериментальным циррозом, получавшей заявленное средство, В - микроскопический вид печени крысы с экспериментальным циррозом, не получавшей заявленное средство, Г - микроскопический вид печени крысы с экспериментальным циррозом, получавшей заявленное средство. Увеличение x200, окраска Ван Гизон.
Фиг. 2. Влияние заявленного средства на численную плотность ложных долек в печени крыс с экспериментальным циррозом.
Примечание: по вертикали Nai - численность ложных долек, А - контроль, Б - опытная группа крыс, получавшая заявленное средство.
Осуществление изобретения
Заявленное техническое решение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения.
Окисленный декстран с м.М. 40 кДа растворяют в воде для инъекций в соотношениях, указанных в таблице 3, и полученный раствор стерилизуют фильтрацией через микропористые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, затем разливают в стерильные флаконы или ампулы в атмосфере азота. Для снижения патоморфологических проявлений посттоксического цирроза печени полученный раствор вводят субъекту, нуждающемуся в этом, интраперитонеально в виде 5% водного раствора окисленного декстрана с молекулярной массой 40 кДа.