Модуляция противоопухолевого иммунного ответа аутологичными активированными дендритными клетками при раке яичника in vitro

МОДУЛЯЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУННОГО ОТВЕТА АУТОЛОГИЧНЫМИ АКТИВИРОВАННЫМИ ДЕНДРИТНЫМИ КЛЕТКАМИ ПРИ РАКЕ ЯИЧНИКА IN VITRO

О.П. Хрипко1, Ю.А. Шевченко1, И.А. Облеухова1, М.А. Гончаров2, Е.В. Якушенко1, С.В. Сенников1, Н.В. Пронкина1, Г.И. Бровкина2, В.С. Кожевников1, В.А. Козлов1

ГУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН, г. Новосибирск1 Городская клиническая больница №1, г. Новосибирск2

Актуальность. Несмотря на огромное количество разрабатываемых и используемых методов лечения онкологических заболеваний эта проблема до сих пор остается практически не решенной. Уже более 100 лет повышенный интерес вызывает вопрос об эффективности иммунного ответа на опухоль у человека. Одной из гипотез возникновения злокачественного процесса является несостоятельность иммунной системы. В последнее время стало ясно, что в процессе опухолевой прогрессии важную роль играют дендритные клетки (ДК). Установлено, что по причине отсутствия ДК в опухоли или слабой экспрессии молекул МНС 1-го и 2-го классов, а также CD80 и CD86 костимули-рующих молекул на ДК, инфильтрирующих опухоль, не создается устойчивый антигенспе-цифический Т-клеточный ответ. По мнению ряда авторов, это может быть следствием продукции злокачественной опухолью факторов (ИЛ-10, ТФР-бета, фактор роста эндотелия и др), угнетающих дифференцировку, созревание и функциональную активность периферических ДК. В последнее время ДК рассматривают в качестве основного адъюванта при создании вакцин для лечения рака, а также при микробных инфекциях, аутоиммунных заболеваниях, трансплантации.

В связи с этим цель исследования - разработать протокол модуляции специфического противоопухолевого иммунного ответа с использованием аутологичных дендритных клеток, презентирующих антигены опухолевого лизата, и оценить их эффективность in vitro.

Материал и методы. Объект исследования ДК и мононуклеарные клетки периферической

крови (МНК) больных раком яичника (12 человек) для разработки и оптимизации протоколов их получения и изучения возможностей иммунокоррекции. Из них 7 человек имели папиллярно-железистый рак яичника, 1 - солидно-железистый рак, 1 - мезонефроидный рак, 1 - эндометриодный рак, 1 - недифференцированную карциному, 1 - умереннодифференцированную аденокарциному. Приготовление лизата опухолевой ткани: опухоль гомогенизировали в забуференном физиологическом растворе, полученный раствор замораживался при температуре -70°С и проводился через 3 цикла быстрого оттаивания на водяной бане +37°С и быстрой заморозки. Полученный гомогенат центрифугировали при 12000G 15 мин, супернатант собирали, измеряли концентрацию белка и замораживали до дальнейшего использования при -20°С. Получение ДК. МНК выделялись методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина (р=1,082). Популяция, используемая для получения ДК, выделялась методом адгезии на пластике (Nunc, Denmark) из МНК. Полученные клетки культивировались в присутствии GM-CSF (50 нг /мл) и IL-4 (100 нг/мл) в течение 24 часов. Инкубация с лизатом опухоли (100 мкг/мл) продолжалась 16-18 часов, а созревание в присутствии ТОТб (25 нг/мл) - 24 часа. Проточная цитофлуорометрия. Для идентификации популяции ДК использовалась оценка способности незрелых ДК к эндоцитозу декстрана (Sigma, USA) и экспрессия маркеров CD83, Cd86 (Becton Dickinson, USA) и hLA-DR(Сорбент, Москва) зрелыми ДК. Анализ проводился на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). Пролиферация оценивалась на

72 ч по включению 3Н-тимидина. МНК стимулировали ДК и оценивали пролиферативный ответ в присутствии или отсутствии лизата опухоли и ИЛ-18. ELISpot применялся для количественной оценки IFN-г-продуцирующих клеток в ответ на опухолевые антигены через 72 ч культивирования согласно инструкции фирмы производителя (R&Dsystems, USA). Статистическая обработка проводилась с помощью программы Statistica 6.0 с использованием критерия Wilcoxon.

Результаты. Функциональная активность незрелых ДК определялась по захвату декстрана. Признаком функциональной зрелости считали повышение уровня экспрессии маркеров CD83, CD86, HLA-DR. Применение антиген-активиро-ванных ДК для обучения МНК распознаванию специфического антигена приводит к увеличению количества IFN-г-продуцирующих клеток в ответ на лизат опухолевой ткани, с 18,1 ± 4,9 клеток на 1х105 исходной популяции до 32,4 ± 6,8 для «обученных» МНК. Также в ответ на антигены опухоли, представленные лизатом, увеличивается уровень пролиферации «обученных» МНК с 380,1 ± 115,5 имп/мин в исходной

популяции до 1437,7 ± 201,9 имп/мин для «обученных» МНК (ртакохоп=0,04). Применение ИЛ-18 при совместном культивировании ДК с МНК периферической крови больных раком яичника приводит к увеличению секреции ГКК-г без выраженной стимуляции пролиферативной реакции МНК.

Выводы. В результате проведенных исследований разработан протокол получения функционально активных зрелых ДК, презентирующих антигены опухолевых лизатов. Полученные зрелые ДК способны активировать неспецифическую и специфическую функциональную активность МНК периферической крови онкологических больных, в частности, усиливать пролиферативный ответ и стимулировать продукцию ИФНг. Использование рекомбинантного интерлейкина-18 при совместном культивировании мононуклеарных и дендритных клеток приводит к увеличению количества клеток, продуцирующих ИФНг, который является важным фактором противоопухолевой защиты и продуцируется цитотоксическими лимфоцитами и натуральными киллерными клетками.

ЭФФЕКТЫ РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМОВ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ В ОТНОШЕНИИ КОСТНОМОЗГОВОГО РЕЗЕРВА НЕЙТРОФИЛОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Т.Ю. Хричкова1, В.А. Шаталова2

ГУ «НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН», г. Томск1 ГУ «НИИ онкологии ТНЦ Со РАМН», г. Томск2

Актуальность. На сегодняшний день достоверно подтверждена выраженная эффективность сочетания адриабластин/таксотер в сравнении с классическим режимом CAF, что позволяет считать вышеназванную комбинацию новым стандартом химиотерапии распространенных форм рака молочной железы (РМЖ). Однако возможности химиотерапии лимитируются выраженными побочными эффектами цитостатиков в отношении системы крови. Учитывая также, что при химиотерапии критическим оказывается состояние белого ростка кроветворения, оценка именно его резервных возможностей приобретает особое значение.

Одним из внении с таковыми при лечении по схеме CAF.

Материал и методы. В ходе работы было обследовано 87 больных РМЖ ГГГ-ГУ стадии, из которых 40 человек получали противоопухолевую химиотерапию по схеме САБ (циклофосфан, адриамицин, 5-фторурацил) и 47 - по схеме, включающей адриамицин с таксотером. Показатели периферической крови исследовали стандартными гематологическими методами. По данным предни-золоновых проб оценивали состояние костномозгового резерва нейтрофильных гранулоцитов.

Результаты. Проведенные исследования показали, что общее количество лейкоцитов