ПЛАНШЕТ

Полезная модель относится к области биотехнологии, а именно, к оборудованию для иммуноферментного анализа.
Известно использование для иммуноферментного анализа полистироловых пробирок или планшетов, например, фирмы Polypast , Хальберштадт,Германия (1,2).
Планшеты представляют собой снабженную бортиками поверхность, на которой выполнены лунки.Внутренняя поверхность лунок покрыта дополнительным слоем,содержащим антигены или антитела.
Известны планшеты для связывания антител к вирусу инфекционного бронхита кур (ИБК).Процесс проводят методом реакции непрямой гемагглютинации.
Для анализа используют планшет для иммуноферментного анализа, на поверхности лунок которого наносятся обработанные акролеином и танином бараньи эритроциты с адсорбированными на них неинактивированным вырусами ИБК (3).
Недостатком данного планшета является длительность и трудоемкость получения вирусосодержащего слоя, опасность работы с активным вирусом.
Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание более простого по технологии получения и безопасного в эксплуатации планшета, с тем, чтобы, обеспечивая высокзш селективность анализа , избежать работы с активным вирусом и заменить покрытие с
МКЛ. COIN 15/00 Планшет
использованием вирусосодержащих эритроцитов.
Задача решалась выполнением внутреннего слоя лзшок планшета из слоя очищенного вакцинного вируса ИБК серотипа Массачузетс.
Слой состоит из указанных вирусов, сорбированных на активных центрах пластиковых лунок, или из их смеси с неактивным в реакции антиген-антитело ИБК белком, например, альбумином, что обеспечивает более стабильное покрытие.
Общий вид планшета приведен на фиг.1.Планшет состоит из горизонтальной поверхности (пластины) (1) с бортиками (2). На пластине выпохшены лунки (3), внутренняя поверхность которых покрыта вирусосодержащим слоем (4).Для фиксации лунок на поверхности (1) нанесены координаты (буквы и цифры).
Получение и использование планшета осуществляют следующим образом.
В луккк (3) планшета вносят по 0,1 см кубическому очищенного антигена вируса ИБК, выдерживают 16-18 часов при 2-4С Затем содержимое лунок планшета удаляют резким встряхиванием, троекратно промывают дистиллированной водой и просушивают по внешней стороне лунки (3) уложив поверхность (1) на фильтровальную бумагу.
Затем анализируют сыворотки крови,полученные у кур.
Образцы исследуемых проб сывороток крови разводят 1:100 раствором N1 ( М фосфатно-буферный раствором с 0.15 М хлоридом натрия рН 7.2-7.4 с твин-20 или тритоном Х-10О) до конечной концентрации 0.05%.С этой целью к 0.1 куб.см сыворотки крови кур добавляют 9.9 куб.см раствора N1 и перемешивают.
0.1 куб.CM положительной сыворотки крови (положительный контроль),а в три следующие лунки Д1,Е1,F1 вносят по О.1 куб.см отрицательной сыворотки крови (отрицательный контроль), лунки G1,H1 служат для контроля раствора конъюгата и субстрактноиндикаторной смеси, в которые вносят по 0.1 куб.см раствора N1.
В остальные луки рядов В2-12...Н2-12 вносят по 0.1 куб.см раствора Nl,a в лунки горизонтального ряда А2-12 вносят по 0.2 куб.см исследуемых проб сывороток крови, разведенных раствором N1 в 100 раз, и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная от разведения 1:100 до 1:12800.
С этой целью из лунок А2-12 отбирают по 0.1 куб.см разведенных исследуемых сывороток крови и переносят в лунки В2-12 соответствующего ряда,пипетируют и проводят двухкратные разведения переносом по 0.1 куб.см в очередную лунку вертикального ряда, удаляя из последних лунок Н2-12 по 0.1 куб.см.
При обнаружении высоких титров антител в испытуемых пробах сыворотки крови проводят раститровку по горизонтальным рядам планшета.
Планшет осторожно вытряхивают для перемешивания содержимого, закрывают крышкой и переносят в термостат (37+0.5С) на 30 мин.Затем лунки планшета освобождают от содержимого путем вытряхивания, троекратно промывают раствором N1 и подсушивают путем постукивания по фильтровальной бумаге.
Готовят раствор N2 (антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против IgG кур в растворе N1, разведение 1:21 ) и вносят во все лунки планшета по 0.1 куб.см ,затем помещают в термостат на 30 минут.После этого конъюгат удаляют, лунки троекратно
промывают и подсушивают путем постукивания перевернутым планшетом по фильтровальной бумаге.
Готовят раствор N3 (субстратно-индикаторная смесь-20мг 5-аминосалициловой кислоты в 20 куб.см раствора N1)встряхивают до полного растворения и добавляют 0.1 куб.см раствора гидроперита ( 1 таблетка гидроперита растворена в 45 куб. см дистиллированной воды).
Во все лунки планшета вносят по 0.1 куб.см субстратноиндикаторной смеси и оставляют при комнатной температуре в темном месте на 10-15 мин.
Выявление специфических антител в сыворотках крови иммуноферментным методом можно проводить и без растировки испытуемых сывроток. В этом случае во все лунки планшета А2-12...Н2-12 вносят по 0.1 куб.см исследуемых проб сывороток крови кур в разведении 1:100, используя по одной лунке на каждую пробу.Остальные этапы постановки анализа проводят аналогично вышеописанному.
При спектрофотометрическом учете результатов проводят остановку реакции внесением в лунки планшета 0.1 куб.см 0.1М раствора серной кислоты.
Учет результатов анализа проводят через 10-15 мин. одним из способов;визуально-по интенсивности окрашивания содержимого лунок планшета или инструменально -с помощью спектрофотометра с вертикальным лучем света, при длине волны 450 нм.
При раститровке парных проб сывороток крови кур обнаружение нарастания титра специфических антител в четыре и более раз не менее чем в 50% исследованных проб дает основание для постановки диагноза-инфекционный бронхит птиц.При этом
необходимо учитывать эпизоотическую ситуацию в хозяйстве и провести анализ показателей продуктивности птиц (прирост массы тела у цыплят и яйценосности у кур).
При обнаружении нарастания титра антител в исследумых пробах сывороток крови не достигающего 4-кратного увеличения или выявлении нарастания титра у менее 50% испытуемых сывороток проводят вирусологические исследования.
Обнарз жение специфических антител титра 1:100 у 50% и более исследованных птиц свидетельствует о циркуляции вируса инфекционного бронхита кур в хозяйстве.Положительные сыворотки раститровывают и при выявлении титров антител 1:800 и выше проводят выделение вируса инфекционного бронхита кур и постановку биопробы.
1.Иммунологические методы. ред.Фримеля Г., М., Медицина, 1987, с.166.
2.La,systeme Product Catalogue, p.13-18. 3.М.А.Романова и др. Ветеринария, 1987, Ы8, с.112.
Литература