Средство для лечения и профилактики нематодозов и цестодозов у мелких домашних животных
AGENT FOR TREATING AND PREVENTING NEMATODOSIS AND CESTODIASIS IN SMALL DOMESTIC ANIMALS

Изобретение относится к области фармацевтики и может быть использовано для лечения и профилактики гельминтозов у мелких домашних животных (МДЖ), преимущественно - наиболее распростаненных нематодозов и цестодозов кошек и собак. Предложен таблетированный антигельминтный препарат, включающий комбинацию левовращающего оптического изомера празиквантела (R-празиквантела, R-ПР) с оксимом мильбемицина в качестве активного начала, а также нейтральные наполнители и вспомогательные добавки. Средство по изобретению характеризуется широким спектром действия (основные виды цестод и нематод, включая микрофиллярий), высокой эффективностью, которая обеспечивает 100%-ный эффект при однократном использовании в низких дозах, и повышенной в сравнении с аналогами безопасностью (меньшей токсичностью) для организма животного.
Введение
Гельминтозы относятся к числу самых распространенных паразитарных заболеваний мелких домашних животных, в частности кошек и собак, и являются результатом паразитирования в их организме различных видов гельминтов. Жизнедеятельность гельминтов в организме животного имеет следствием различные патологии желудочно-кишечного тракта, связанные как с механическими повреждениями кишечника, так и различными нарушениями обменных процессов вследствие выделения гельминтами токсичных для организма хозяина продуктов. Присутствие в организме животного гельминтов, которые являются чужеродными для него объектами, может приводить к развитию выраженных аллергических реакций, а также повышает вероятность возникновения инфекционных заболеваний как в результате прямого внесения гельминтами патогенной микрофлоры, так и в силу снижения иммунитета хозяина, зараженного гельминтами. Кроме того, что гельминтозы сопровождаются тяжелыми клиническими проявлениями у животного-хозяина, больные животные могут быть источником заражения человека.
Современные меры борьбы с гельминтозами домашних животных базируются на рациональном использовании эффективных антигельминтных препаратов. С учетом того, что во многих случаях у МДЖ обнаруживают одновременное паразитирование двух и более возбудителей, относящихся к разным классам гельминтов, предпочтительным специалистами признается одновременное использование в составе препаратов этого назначения нескольких антигельминтных субстанций. Это в свою очередь определяет в качестве приоритетного направления при создании новых антигельминтиков разработку комбинированных препаратов, основным преимуществом которых является широкий спектр противопаразитарного действия, позволяющий использовать их для уничтожения большинства из наиболее часто встречающихся у МДЖ видов гельминтов.
Уровень техники
Одной из хорошо зарекомендовавших себя в последние годы с точки зрения эффективности и спектра действия является комбинация празиквантела (ПР) с циклическим макролактоном - мильбемицина оксимом (МО).
Празиквантел (2-(циклогексилкарбонил)-1,2,3,6,7,11b-гексагидро-4Н-пиразино[2,1-а] изохинолин-4-он) известен как высоко эффективное антигельминтное средство, механизм действия которого состоит в повышении проницаемости мембран клеток гельминтов для ионов кальция, вызывающем генерализованное сокращение мускулатуры паразита, переходящее в стойкий паралич с последующей гибелью гельминта. Празиквантел известен как эффективный агент при лечении большинства цестодозов, цистицеркоза и нейроцистицеркоза, и таких трематодозов как клонорхоз, описторхоз, фасциолез, шистосомоз и др. По результатам многочисленных исследований празиквантел признается умеренно токсичным соединением.
Однако при всех неоспоримых достоинствах празиквантела, он имеет ряд недостатков, к которым относят: а) отсутствие необходимой активности в отношении класса круглых червей (нематод) и б) резко выраженный горький вкус, являющийся существенным препятствием при создании препаратов для орального приема.
Оксим мильбемицина - полусинтетическое производное природного макроциклического лактона (мильбемицина А3/А4 или D; US 4,547, 520), получаемого в результате ферментативной деятельности Streptomyces hygroscopicus var. Aureolacrimosus. Механизм действия мильбемицина обусловлен повышением проницаемости клеточных мембран гельминта для ионов хлора (Cl-), что приводит к сверхполяризации мембран клеток нервной и мышечной ткани, параличу и гибели паразита. МО отличает высокая нематоцидная активность в отношении большинства кишечных и многих внекишечных нематод, обеспечивающая возможность его использования в относительно низких дозах. Безусловным преимуществом многих представителей макролактонов, в том числе и МО, в сравнении с другими классами соединений с нематоцидной активностью, является их эффективность в отношении личиночных форм нематоды Dirofilaria immitis, определяющая возможность применения его для профилактики дирофиляриоза. Основной недостаток - достаточно высокая токсичность (II-III класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76) для теплокровных животных.
Сегодня комбинация МО с ПР, представленным рацемической смесью двух оптических изомеров, достаточно широко используется в качестве основы при разработке различных лекарственных форм антигельминтных препаратов для МДЖ. Так, европейский патент ЕР 2219643 16.05.2012, Novartis AG, предоставляет правовую охрану водной суспензии в форме пасты для лечения гельминтозов животных, включающей празиквантел, макролактон, в частности мильбемицин оксим, циклодекстрин и вспомогательные компоненты; в патентах США US 8,541,019 (24.09.2013) и US 8,628,794 (14.01.2014), Novartis AG раскрываются составы для жевательной резинки с эндопаразитарным действием, включающей в качестве ДВ комбинацию мильбемицина оксима с празиквантелом, а в патенте РФ RU 2627420 С2 от 08.08.2017 (Байер Интеллектчуал проперти ГМБХ, DE) описана композиция МО с ПР в форме «мягких жевательных таблеток».
Комбинация МО+ПР(в виде рацемата) в традиционной таблетированной форме представлена в хорошо известном на ветеринарном рынке антигельминтном препарате Мильбемакс (MILBEMAX, Novartis AG), который может рассматриваться в качестве ближайшего аналога (прототипа) предлагаемого в настоящем изобретении антигельминтика.
Согласно Инструкции по применению (Видаль. Справочник лекарственных средств для ветеринарии, применяемых в России. М., 2013 стр. 215) препарат Мильбемакс ориентирован на дегельминтизацию кошек и собак при наиболее часто встречающихся у них цестодозах и нематодозах: он назначается кошкам - для лечения и профилактики цестодозов, вызванных гельминтами видов Dipylidium caninum, Taenia spp., Echinococcus multilocularis, и нематодозов, вызванных гельминтами видов Ancylostoma tubaeforme, Toxocara cati, Dirofilaria immitis (профилактика заболевания в течение 1 месяца), также смешанных нематодо-цестодозных инвазий;
собакам - для лечения и профилактики цестодозов, вызванных гельминтами видов Dipylidium caninum, Taenia spp., Echinococcus spp., Mesocestoides spp.; нематодозов, вызванных гельминтами видов Ancylostoma caninum, Toxocara canis, Toxascaris leonina, Trichuris vulpis, Thelazia callipaeda; Angiostrongylus vasorum (снижает интенсивность заражения), Crenosoma vulpis (снижает интенсивность заражения), Dirofilaria immitis (профилактика заболевания) а также смешанных нематодо-цестодозных инвазий.
Минимальная терапевтическая доза МО, рекомендуемая при применении препарата Мильбемакс для собак составляет 0,5 мг/кг, для кошек - 2 мг/кг; минимальная эффективная доза ПР в обоих случаях одинакова и равна 5 мг/кг. В качестве вспомогательных компонентов таблетки Мильбемакс для собак содержит традиционные наполнители для таблетирования: микрокристаллическую целлюлозу, кроскармеллозу, повидон, лактозу, коллоидный кремний и стеарат магния, тогда как таблетки для кошек включают ряд дополнительных компонентов, предназначенных для придания антигельминтику приемлемого вкуса.
Известно, что при лечении кошек оральное применение лекарств с неприятным вкусом и/или запахом является серьезной проблемой. Празиквантел входит в число соединений, плохо воспринимаемых животными, особенно кошками, в силу выраженного горького вкуса и неприятного запаха, что приводит к необходимости их маскировки в составе лекарственных препаратов, а в случае таблетированных форм - еще и максимально возможного уменьшения размера таблеток. В связи с этим, Мильбемакс для кошек представлен в виде небольших таблеток, покрытых оболочкой, содержащей искусственный заменитель мясного вкуса (Bernachon N, et al.2014, Vet Rec Open, 1:e000080).
Высокая эффективность препарата Мильбемакс в отношении различных видов гельминтов подтверждена многочисленными работами по изучению его действия на целевых животных (например, Motta В. Et al., 2012, Par. and Vect., 5, 1-6; Wolken S. et al., 2012, Par. Res., Ill, 2123-2127; Di Cesare A. et al., 2014, Par. and Vect, 7:347; Rinaldi L.et al., 2015, Par. and Vect., 8:30 и др.).
Вместе с тем, нельзя не отметить следующие слабые стороны прототипа: а) достаточно высокую токсичность, а именно отношение к III кл. опасности по ГОСТ 12.1.007-76; (Инструкция по применению препарата); б) относительно высокое содержание ПР, определяемое требующимися для лечения животных минимальными эффективными дозами (не менее 5 мг/кг) и в) необходимость применения в таблетках для кошек дополнительных компонентов для устранения или маскировки неприемлемого для этого вида животных вкуса ПР, в частности пленочного покрытия с вкусовыми добавками.
Целью настоящего изобретения была разработка таблетированной формы антигельминтика на основе комбинации ПР+МО, характеризующейся меньшей токсичностью, повышенной специфической цестодоцидной активностью (более низкими терапевтически эффективными дозами ПР) и улучшенными вкусовыми качествами в сравнении с прототипом.
Раскрытие изобретения
Поставленная задача была решена путем использования в предлагаемой таблетированной форме вместо рацемата ПР эффективного количества его левовращающего оптического изомера - R-празиквантела.
R-празиквантел - один из двух оптических изомеров, составляющих рацемическую смесь, в виде которой данное соединение представлено во всех известных на сегодняшний день антигельминтных препаратах. В последние годы эта оптическая изоформа празиквантела стала предметом повышенного интереса фармакологов в связи с появлением целого ряда научно-исследовательских работ по изучению его свойств, в которых на различных модельных системах было показано, что именно R-празиквантел является основным активным компонентом рацемической смеси, отвечающим за 80-90% ее антигельминтной активности, что теоретически обосновывало возможность применения энантиомера в более низких дозах. При этом также было установлено, что S-празиквантел, практически будучи «балластом» в плане активности, является наиболее горькой частью рацемата (Meyer Т. et al., PLoS Negl. Trop.Dis., 2009, v.3, №l, e357; Olliaro P. et al., J.Antimicrob. Chemother., 2014, 69(4), 863-870 и др.), создающей определенные трудности при пероральном приеме содержащих его препаратов детьми, а также некоторыми видами животных. Число работ по изучению токсичности R-ПР крайне ограничено, а полученные результаты неоднозначны. Так, по данным экпериментов, выполненных на некоторых культурах клеток, R-празиквантел в отношении большинства из них демонстрирует меньшую цитотоксичность по сравнению с S-изомером, однако при этом для некоторых типов клеток существенно не отличается по этому показателю от рацемата (Sun Q. Et al., Drug Design, Development and Therapy 2016:10 2061-2068).
Особый интерес к проблеме практического использования R-празиквантела был проявлен медиками -педиатрами, специализирующими на лечении шистосомоза у детей, где применение празиквантела, являющегося единственным эффективным средством терапии, существенно ограничивается как высокими дозами, так и горьким вкусом ПР-рацемата. Результатом был запуск проекта ВОЗ, направленного на внедрение R-празиквантела в практику лечения заболевания. Однако до настоящего времени эта задача не решена.
Вместе с тем, описанные в литературе привлекательные свойства R-празиквантела послужили поводом для появления ссылок на возможность его применения в новых разработках по антигельминтикам на основе ПР. Следует, однако, отметить, что приводимые ссылки ограничиваются либо просто упоминанием о данном оптическом изомере (без раскрытия соответствующих композиций) как о предпочтительном «производном» ПР (WO 2009062939), либо относятся к некоторым конкретным составам, для которых не проведено никаких испытаний в отношении эффективности и где R-празиквантел «автоматически» заменяет рацемат в одних и тех же составах и используется в тех же дозах, т.е. никоим образом не проявляет никаких отличающих его от рацемической смеси позитивных характеристик (WO 2015071668).
Единственным на сегодняшний день примером комбинированного антигельминтика, содержащего в своем составе чистый активный энантиомер празиквантела (R-празиквантел) и предназначенного для лечения МДЖ, является запатентованная в РФ жидкая форма (суспензия) для лечения гельминтозов (RU 2613490 С2, 16.03.2017). На основе предложенного в данном патенте состава в последующем был разработан комбинированный (ДВ: R-ПР и пирантела памоат) препарат «Празител особый» для МДЖ, который до настоящего времени не имеет аналогов на мировом ветеринарном рынке. Главным достижением при создании этого препарата было существенное снижение эффективной дозы цистодоцидного компонента (энантиомера празиквантела) в сравнении с традиционно используемой для МДЖ и минимально возможной для рацемата ПР дозой, равной 5 мг/кг веса животного.
Важно, однако, отметить, что в составе жидкого антигельминтика R-ПР использован в комбинации с циклодекстрином, с которым он образует классический клатратный комплекс (Becket G. et al., Int J Pharm. 1999,179(1):65-71; de Jesus MB. et al., J Pharm Biomed Anal. 2006 Jun 16;41(4): 1428-32: Maragos S. etal., AAPS PharmSciTech., 2009;10(4): 1444-51). При этом известно, что формирование такого комплекса существенно повышает растворимость и биодоступность включенного в него агента и уже сам по себе этот феномен может обеспечивать эффект снижения концентрации рацемического празиквантела в составе водных антигельминтных композиций без изменения их терапевтической активности (de Jesus et al., J Drug Target., 2010 Jan; 18(l):21-26; CN 1557318 (A), 29.12.2004). Очевидно, что в данном случае, при условии нахождения в составе твердой формы, указанный механизм уменьшения терапевтической дозы ПР и повышения безопасности средства реализован быть не может.
Таким образом, до настоящего времени R-празиквантел в таблетированных антигельминтиках в ветеринарной практике МДЖ не применялся, поэтому все вопросы, связанные с токсичностью, биодоступностью, эффективностью действия в организме целевых животных и вкусовыми качествами таблеток на основе активного энантиомера получили свое разрешение только в процессе создания настоящего изобретения.
Практически разработка нового антигельминтика включала следующие этапы:
а) Приготовление составов, получение и применение таблетированных форм.
Для титрования эффективных доз ДВ и клинических испытаний использовали составы с различным содержанием МО и R-ПР, применявшиеся в виде таблеток массой 100 мг (таблицы 1а-в). Таблетки получали методом влажного гранулирования в нескольких вариантах, отличавшихся содержанием ДВ, ориентированным на массу тела животного (пример 1). При проведении экспериментов таблетки использовали в количестве, необходимом для достижения запланированных комбинаций доз R-ПР и МО.
б) Мониторинг терапевтически эффективных доз ДВ
Исследования проводились на кошках и собаках, без учета их возраста и пола. До начала проведения и через 10 дней после дегельминтизации определяли количество яиц гельминтов и рассчитывали средний по каждой опытной группе показатель, а также регистрировали число животных, полностью освободившихся от гельминтов.
В результате проведенных исследований было установлено, что при лечении гельминтозов эффективная доза R-празиквантела, обеспечивающая, как минимум, 80%-ный эффект при однократном применении, одинакова для кошек и собак и составляет не менее 2 мг/кг веса животного (табл. 2 и 5), тогда как минимальная терапевтическая доза для достижения 100%-ного результата в обоих случаях равна 2,5 мг/кг. Минимальная эффективная доза МО, обеспечивающая полное удаление нематод, для кошек составляет 2,0 мг/кг (табл. 3 и 4), а для собак - 0,5 мг/кг (табл. 6 и 7).
Определение эффективной дозы МО в составе антигельминтика по изобретению при профилактике дирофиляриоза у собак проводилось в регионах, не благополучных по данному заболеванию, в период лета комаров. Контроль эффективности осуществлялся ежемесячно путем исследования проб крови для обнаружения микрофилярий D. immitis. Установлено, что МО (в предлагаемом составе) демонстрирует полную защиту животных от заражения дирофиляриозом в интервале доз от 0,5 до 2,0 мг/кг.
в) Клинические исследования лечебного эффекта
Испытания и оценку лечебного эффекта в целом осуществляли согласно схеме, использованной при мониторинге эффективных доз ДВ, за исключением того, что а) в каждый опыт включали только животных с точно установленным ветеринарными врачами диагнозом; б) использовали препараты, обеспечивающие дозировки ДВ, определенные предварительно как минимально возможные или близкие к ним для получения максимального эффекта при однократном применении; в) оценку эффективности лечения проводили в сравнении с препаратом (К), аналогичным по содержанию ДВ и вспомогательных компонентов опытным образцам и отличающимся тем, что празиквантел был представлен рацемической смесью.
Анализ результатов лечения дипилидиоза у кошек и собак подтвердил возможность более, чем двукратного (в сравнении с прототипом) снижения дозировки цестодоцидного компонента (R-празиквантела) в составе нового антигельминтика с сохранением эффективности его действия: минимальная терапевтическая доза R-ПР, обеспечивающая при разовом применении препарата, как минимум, 80%-ную эффективность цестодоцидного действия, составляла 2,0 мг/кг веса, а полное освобождение животных от цестод при однократном применении наблюдалось при дозе 2,5 мг/кг веса (против 5 мг/кг рацемата празиквантела в прототипе). При лечении нематодозов (токсакароза и токсаскариоза) у кошек и собак подтверждены следующие минимальные терапевтические дозы для получения 100%-ного эффекта дегельминтизации: 0,5 мг/кг веса у собак и 2,0 мг/кг - у кошек. Таким образом, применение нового препарата (R-Пр /МО) в виде комбинации доз 2,5/2,0 мг/кг для кошек и 2,5/0,5 мг/кг для собак гарантирует полную дегельминтизацию животного в случае заражения как ленточными, так и круглыми гельминтами, при разовом применении.
г) Оценка (индивидуального) потребления препарата животными.
Для определения потребления предлагаемых таблетированных антигельминтных композиций кошками было проведено сравнительное исследование, предусматривающее введение животным одним и тем же методом средства по изобретению и препарата-прототипа (Мильбемакс, таблетки без покрытия) с регистрацией показателя слюноотделения после введения лекарственного средства. Показано, что количество животных с непроизвольным слюнотечением в случае применения средства-аналога было в 6 раз больше, чем при использовании антигельминтика по изобретению и составляло 40% от общего числа животных (против 6,7% для предлагаемых составов). Это позволило заключить, что главной причиной исследуемого побочного эффекта (непроизвольного слюнотечения) является реакция вкусовых рецепторов на горечь препарата, а улучшение вкусовых качеств (уменьшение горького вкуса) новой ветеринарной композиции связано с заменой рацемата празиквантела R-энантиомером.
д) Определение токсичности нового антигельминтика.
Оценку данного показателя проводили на мышах и крысах в соответствии с общепринятой схемой определения острой токсичности лекарственных средств (пример 5). В результате проведенных исследований признаков интоксикации у мышей и крыс опытных групп обнаружено не было: ни одна из тестируемых доз (от 7000 до 12000 мг/кг веса) не привела к гибели животных в течение 14 суток наблюдения. Расчет точного значения LD50 не представлялся возможным в связи со сложностью дальнейшего увеличения дозы при внутрижелудочном введении (LD50 препарата условно определили как составляющую «более 12000 мг/кг массы животного» или как относящуюся к интервалу 12000-15000 мг/кг), что однозначно позволяет отнести его к IV классу опасности согласно общепринятой гигиенической классификации (ГОСТ 12.1.007-76).
Таким образом, по совокупности полученных результатов может быть сделан вывод о получении нового таблетированного антигельминтика для МДЖ на основе комбинации мильбемицина оксима с оптическим изомером празиквантела (R-празиквантелом), который обеспечивает а) снижение интервала эффективных доз цестодоцидного компонента до 2-4 мг/кг и 100%-ное освобождение животных от гельминтов при однократном применении вдвое меньшей минимальной терапевтической дозы (2,5 мг/кг) в сравнении с прототипом (5 мг/кг) (технический результат), характеризуется значительно сниженным по сравнению с прототипом (с III до IV кл. опасности) уровнем токсичности (технический результат), а также существенным улучшением вкусовых качеств, позволяющим отказаться от необходимости использования специальных пленочных покрытий при производстве таблеток для кошек и, соответственно, упростить производство препарата (технический результат).
Осуществление изобретения.
Осуществление изобретения с достижением технических результатов подтверждается нижеследующими конкретными примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.
Пример 1. Составы, получение и применение таблетированных форм
В качестве ДВ использовали коммерческую субстанцию МО фирмы Hubei Honch Pharm. Co.Ltd., (CN) и R(-)-празиквантел, полученный нами с помощью собственной модификации метода (ноу-хау компании), описанного Woelfle М. et al. в PLoS, 2011, v. 5, №9, el260. Очищенная субстанция R-ПР представляла собой белый кристаллический порошок с Тплав.=109-111°С, характеризующийся высокой гигроскопичностью, растворимостью в органических растворителях и низкой растворимостью в воде.
Для проведения экспериментов по титрованию эффективных доз и последующих клинических испытаний использовали твердые составы, различавшиеся содержанием МО и R-ПР, которые при применении обеспечивали 6 основных комбинации доз ДВ (таб. 1а)
Твердые формы (таблетки) получали методом влажного гранулирования, описанным в патенте РФ 2456992, используя для таблетирования следующие вспомогательные компоненты: лактозу (моногидрат), микрокристаллическую целлюлозу, (коллоидный) диоксид кремния, кроскармеллозу, стеарат магния, а также (необязательно) вкусовую добавку. В одной из опытных партий таблеток, предназначенных для кошек и дополнительно покрытых пленочной оболочкой, указанную вкусовую добавку включали в состав покрытия.
С целью удобства применения готовили несколько модификаций таблеток (с одной риской) с различным, ориентированным на вид и массу тела животного, содержанием ДВ (таблица 16), которые при проведении экспериментов использовали в количестве, необходимом для достижения запланированных комбинаций доз.
Приведенные в таблице 16 концентрации вспомогательных компонентов (МКЦ, кроскармеллоза, диоксид кремния, лактоза) были отобраны в ходе предварительных экспериментов как оптимальные по совокупности таких показателей качества таблетки, как скорость распадаемости, процент истираемости, прочность на раздавливание (таб. 1в).
Пример 2. Мониторинг терапевтически эффективных доз ДВ
Оценка зависимости эффективности действия нового антигельминтика от доз ДВ проводилась на кошках и собаках, содержащихся в приютах для бездомных животных.
Таблетки с различными комбинациями ДВ задавали животным до утреннего кормления, после взвешивания, однократно, перорально (с помощью таблеткодавателя кошкам, собакам - в импровизированном паштетном болюсе). Специальной диеты при дегельминтизации не назначали.
Животных в опыт подбирали после предварительных копроскопических исследований, в ходе которых пробы фекалий исследовали методом флотации с использованием в качестве флотационного агента раствора Бреза и проводили подсчет количества яиц гельминтов в грамме фекалий животных с помощью счетной камеры МакМастера. Тем же методом определяли количество яиц через 10 дней после дегельминтизации и рассчитывали средний по каждой опытной группе показатель, а также регистрировали число животных, полностью освободившихся от гельминтов. Все полученные данные подвергались статистической обработке.
Кошки.
а) Для определения терапевтически эффективных доз R-празиквантела при лечении цестодозов проводились испытания на кошках, спонтанно инвазированных цестодой Dipylidium caninum. В опыт было отобрано 36 кошек разного пола и пород, которые затем были случайным образом разделены на 6 опытных групп, каждая из которых получала одну из указанных выше комбинаций ДВ.
Результаты исследований представлены в таблице 2.
Из приведенных данных следует, что все животные, получавшие титруемые составы №№1, 2, 4 и 5, полностью освободились от дипилидиумов, а комбинации доз ДВ №№3 и 6 продемонстрировали цестодоцидную активность немногим более 83%. На этом основании был сделан вывод, что в случае дипилидиоза у кошек для обеспечения 100%-ной эффективности при разовом применении необходимы дозы R-празиквантела, равные или превышающие 2,5 мг/кг. При этом указанный результат достигается при различных (как низкой - 0,5 мг/кг, так и высокой - 2 мг/кг) дозах МО в составе испытуемой комбинации. Было отмечено, что титруемые составы не вызвали ни у одной из кошек признаков токсикоза или других побочных действий ни в процессе, ни после обработки.
б) Для установления терапевтически эффективной дозы мильбемицина оксима при лечении нематодозов были проведены исследования по лечению токсокароза и токсаскариоза. В первый опыт было отобрано 36 кошек разного пола и породы, спонтанно инвазированных Toxocara cati, которые были разделены на 6 групп для испытания составов №№1-6.
Полученные результаты (таблица 3) показывают, что все животные, получавшие составы №№4-6 полностью освободились от токсокар, тогда как при применении комбинаций ДВ №№1-3, препарат был неэффективен. Из этого следует, что при токсокарозе кошек мильбемицин оксим при однократном использовании в дозе 2,0 мг/кг обеспечивает полное освобождение животных от токсокар, а доза МО 0,5 мг/кг (вне зависимости от дозы R-ПР) оказывается неэффективной. Признаков токсикоза или других побочных действий во время и после обработки ни у одного животного не наблюдалось.
С учетом полученных в эксперименте с токсокарозом результатов, при оценке эффективности разных дозировок МО в лечении токсаскариоза в число испытуемых комбинаций ДВ были включены использовавшиеся ранее основные составы №2 (R-ПР/МО=2,5 мг/0,5 мг) и №5 (R-ПР/МО=2,5 мг/2,0 мг), а также дополнительная комбинация (№7), где R-ПР/МО=2,5 мг/1 мг, которая позволяла оценить эффект МО в интервале доз между 0,5 и 2,0 мг/кг., и №8 - с увеличением дозы МО до 2,5 мг/кг. В опыте использовали 20 кошек разного пола и пород, спонтанно инвазированных Toxascaris leonina (4 группы по 5 животных).
Представленные в таблице 4 данные свидетельствуют о том, что, как и в случае токсокароза, в испытуемом интервале только 2 комбинации с дозой МО, равной или превышающей 2,0 мг/кг, показывают в отношении нематод 100%-ную эффективность. При дозе МО 1,0 мг/кг (дополнительный состав №7) эффективность дегельминтизации при однократном применении составила 40%.
Собаки
а) Установление эффективной терапевтической дозы R-празиквантела при лечении цестодозов у собак проводилось в рамках эксперимента по лечению эхинококкоза. В опыт было включено 30 собак различного пола и пород, спонтанно инвазированных Echinococcus spp., которые были разделены на 6 групп (по 5 в каждой) для испытания составов №1-№6.
В таблице 5 представлены полученные результаты, из которых следует, что все животные, получавшие составы №№2,3,5,6 (доза R-ПР 2,5-4,0 мг/кг) полностью освободились от эхинококков, тогда как доза R-ПР 2,0 мг/кг обеспечивала 80%-ный эффект. Таким образом, как и в испытаниях, проведенных на кошках, минимальная дозировка R-празиквантела, необходимая для проявления препаратом 100%-ной эффективности в уничтожении цестод при однократном применении, составляла 2,5 мг/кг. Признаков токсикоза или других побочных эффектов после обработки тестируемыми препаратами ни у одного животного не наблюдали.
б) Оценка терапевтической эффективной дозы мильбемицина оксима в составе препарата при лечении нематодозов у собак проводилась на примерах токсокароза и токсаскариоза.
В первом опыте участвовали 30 собак разного возраста и пород, спонтанно инвазированных Toxocara canis (6 групп по 5 животных). Полученные данные приведены в
Исходя из полученных результатов, можно заключить, что мильбемицина оксим демонстрирует 100%-ную эффективность при токсокарозе собак во всем испытанном интервале доз (0,5-2,0 мг/кг), причем независимо от содержания в комбинации R-ПР. Соответственно, в рамках данного интервала минимальной эффективной дозой МО при лечении токсокароза являлась доза 0,5 мг/кг. Для проверки возможности уменьшения дозы МО ниже указанной границы в следующем эксперименте (таблица 7) по лечению нематодоза собак был испытан дополнительный состав (№9), в котором доза МО составляла 0,25 мг/кг.
Во втором опыте по титрации дозы МО при лечении нематодоза у собак дегельминтизации подвергали 15 собак разного возраста и пород, спонтанно инвазированных Toxascaris leonina (3 группы по 5 животных). При этом проверяли действие комбинаций ДВ №2 (R-ПР/МО = 2,5 мг / 0,5 мг) и №5 (R-ПР/МО = 2,5 мг/ 2,0 мг), показавших 100%-ный результат при лечении токсокароза, а также дополнительного состава (№9) с R-ПР/МО = 4,0 мг/0, 25 мг.
В таблице 7 представлены полученные результаты, из которых с очевидностью следует, что при токсаскариозе собак, как и при лечении токсокароза, минимальная терапевически эффективная доза МО, обеспечивающая 100%-ный эффект при однократном применении, соответствует 0,5 мг/кг. При использовании МО в дозе 0,25 мг/кг его эффективность составляет 40%
в) При установлении терапевтически эффективной дозы мильбемицина оксима в составе антигельминтика по изобретению для профилактики дирофиляриоза использовали 18 собак (3 группы по 6 животных) старше года, разных пород, свободных от микрофилярий D. immitis. Исследования проводили в течение 2017 года в Волгоградской области, как регионе, не благополучном по этому заболеванию.
Использовали комбинации доз ДВ №№2, 5 и 7, которые применяли один раз в месяц, первый раз - за месяц до начала сезона, затем ежемесячно в сезон максимальной активности комаров - промежуточных хозяев дирофилярий, и через месяц после окончания лета насекомых. Всего обработку животных вели в течение девяти месяцев (с марта по ноябрь). Контроль эффективности применения составов с целью профилактики дирофиляриоза осуществлялся ежемесячно путем исследования проб крови для обнаружения микрофилярий D. immitis по методу Кнотта.
В таблице 8 представлены результаты исследований, которые показывают, что все животные, получавшие титруемые составы, в течение всего периода исследования оставались свободными от микрофилярий. Это свидетельствует об отсутствии спонтанного заражения собак дирофиляриями во время применения препарата. На этом основании был сделан вывод, что дозировка мильбемицина оксима в интервале 0,5-2,0 мг/кг демонстрирует 100%-ную эффективность при профилактике дирофиляриоза собак. Длительное ежемесячное использование тестируемых составов не вызывало у животных признаков токсикоза или других побочных действий в период обработки.
На основании проведенных исследований по титрации эффективных доз ДВ в составе антигельминтика по изобретению было сделано заключение, что а) минимальной терапевтически эффективной дозой R-празиквантела, обеспечивающей в составе предлагаемых таблетированных композиций не менее, чем 80%-ную эффективность препарата в отношении цестод, является доза, равная 2,0 мг/кг веса; б) 100%-ное освобождение животных от инвазии цестодами при однократном использовании обеспечивает доза 2,5 мг/кг массы тела животного; в) доза мильбемицина оксима, необходимая для полной дегельминтизация при разовом применении в отношении нематод, достигается, начиная с дозы 2,0 мг/кг для кошек и 0,5 мг/кг для собак; в) при использовании для профилактики дирофиляриоза у собак минимальная эффективная доза мильбемицина оксима в предлагаемом средстве составляет 0,5 мг/кг.
Пример 3. Клинические исследования лечебного эффекта и их результаты.
Клинические испытания предлагаемых в настоящем изобретении таблетированных антигельминтных композиций проводили на базе трех ветеринарных клиник г. Москвы.
Исследования и оценку результатов в целом осуществляли согласно схеме, описанной в примере 2, за исключением того, что а) в каждый опыт включали животных с точно установленным ветеринарными врачами диагнозом; б) использовали препараты обеспечивающие дозировки ДВ, определенные предварительно как минимально возможные или близкие к ним для получения максимального эффекта при однократном применении; в) оценку эффективности лечения проводили в сравнении с контрольным препаратом (К1 или К2), аналогичным по содержанию ДВ и вспомогательных компонентов с опытными образцами и отличающимся тем, что празиквантел был представлен рацемической смесью; в) дополнительно проводили исследования по индивидуальному потреблению («поедаемости») препаратов животными (кошками).
Результаты проведенных испытаний по лечению гельминтозов у кошек и собак приведены в таблицах 9-11.
Анализ результатов клинических исследований, как в случае лечения кошек, так и в случае лечения собак, подтверждает возможность, как минимум, двукратного (в сравнении с прототипом) снижения дозировки цестодоцидного компонента в составе нового антигельминтика с сохранением эффективности его действия. При этом минимальная терапевтическая доза R-ПР, обеспечивающая полное освобождение животных от цестод при однократном применении, и для кошек, и для собак одинакова и составляет 2,5 мг/кг веса животного (против 5 мг/кг рацемата празиквантела в прототипе). Предлагаемый препарат обеспечивает 100%-ный результат при разовом применении в лечении нематодозов при минимальных дозах МО 0,5 мг/кг для собак и 2,0 мг/кг для кошек.
Пример 4. Оценка (индивидуального) потребления препарата животными.
При проведении клинических исследований Для определения потребления животными предлагаемых таблетированных антигельминтных композиций в ходе клинических испытаний дополнительно вели наблюдение за поведением кошек (30) во время и после введения им состава №5 (доза 11-ПР/МО=2,5 мг/2,0 мг на кг веса животного). При этом у двух животных было отмечено кратковременное (1-1,5 мин. после приема препарата) и умеренное по интенсивности непроизвольное слюноотделение. С тем, чтобы установить его причину, которой, в частности, могло быть неудачное применение таблеткодавателя, было проведено исследование, предусматривающее дачу 30 кошкам тем же методом препарата-прототипа (без покрытия) с регистрацией показателя слюноотделения после введения лекарственного средства.
Результаты испытания по сравнительному определению потребления кошками новой таблетированной антигельминтной композиции и средства-аналога представлены в таблице 12.
При наблюдении за потреблением кошками таблетированного препарата-прототипа(без оболочки) было установлено, что при одном и том же способе введения препарата (с помощью таблеткодавателя) количество животных с непроизвольным и при этом в большинстве случаев достаточно обильным слюнотечением было в 6 раз больше, чем в случае потребления средства по изобретению и составляло 40% от общего числа животных. Это позволило заключить, что главной причиной исследуемого побочного эффекта (непроизвольного слюнотечения) является реакция вкусовых рецепторов на вкус препарата, а улучшение вкусовых качеств (уменьшение горького вкуса) предлагаемой композиции связано с заменой рацемата празиквантела R-энантиомером, которая позволила исключить из его состава наиболее горькую составляющую - S(+)-празиквантел.
Дополнительная серия опытов, проведенная на 10 кошках, которым предлагались таблетки по изобретению, покрытые пленочной оболочкой с включенной в нее вкусовой добавкой (см. пример 1), в дозировке R-ПР/МО = 2,5/2,0 мг/кг показала возможность полного исключения побочного эффекта. Препарат задавали кошкам по 1 таблетке без таблеткодавателя, непосредственно на корень языка; при этом ни в одном случае не наблюдалось случаев отторжения кошками лекарства и/или непроизвольного слюнотечения. Следует, однако, отметить, что процедура покрытия, которая существенно усложняет и удорожает производство антигельминтика, в случае средства по изобретению не является необходимым условием при получении препарата для кошек и может рассматриваться, главным образом, как предоставляющая владельцам животных возможность выбора наиболее приемлемого для них способа введения лекарственного средства.
Пример 4. Оценка токсичности нового антигельминтика.
В исследованиях использовали препарат в форме таблеток массой 100 мг с содержанием R-ПР - 25 мг, МО - 5 мг (модификация для взрослых собак из расчета 1 таб/10 кг).
Для изучения острой токсичности препарата в форме таблеток при введении в желудок было сформировано 5 групп мышей, каждая из которых состояла из 10 беспородных белых самцов массой 20 г, и 5 групп крыс, каждая группа состояла из 10 беспородных белых самцов массой 200 г. Масса указана на время введения препарата. Подготовку к исследованию мышей проводили следующим образом: необходимую навеску препарата (1400; 1600; 2000 и 2400 мг) суспендировали в 5 мл 1% крахмального геля. Полученную суспензию вводили однократно в желудок с помощью специального зонда в дозе 0,5 мл на 20 г, что соответствует дозам 7000; 8000; 10000 и 12000 мг/кг. Пятая группа животных служила контролем, мышам соответственно вводили 1% крахмальный гель. Подготовку к исследованию крыс проводили так: навеску препарата (1400; 1600; 2000 и 2400 мг) суспендировали в 5 мл 1% крахмального геля. Суспензию вводили однократно в желудок с помощью специального зонда в дозе 5 мл на 200 г, что соответствовало дозам первой группе - 7000 мг/кг; второй - 8000 мг/кг; третьей - 10000 мг/кг, четвертой - 12000 мг/кг. Пятая группа животных была контролем, этим крысам вводили 1% крахмальный гель.
Все опытные и контрольные животные содержались в одинаковых условиях, получали одинаковый рацион. Кормление мышей и крыс осуществляли через 2 часа после введения препарата. В течение 14 суток проводили наблюдение за общим состоянием и поведением животных, возможной гибелью, проявлением симптомов интоксикации, приемом корма, воды и так далее.
В результате проведенных исследований было установлено, что картина интоксикации у мышей и крыс опытных групп отсутствовала. Ни одна из тестируемых доз не привела к гибели животных в течение 14 суток наблюдения. Результаты перорального введения суспензии белым беспородным мышам и крысам обобщены в таблице 13.
50
В связи с тем, что доза, которая вызывает гибель животных, не была достигнута, а введение дозы, превышающей 12000 мг/кг, создает сложности при внутрижелудочном введении мышам и крысам, расчет точного значения LD50 не представлялся возможным. В связи с этим, величину LD препарата при пероральном введении мышам и крысам определили как составляющую «более 12000 мг/кг массы животного» или как относящуюся к интервалу 12000-15000 мг/кг, что является достаточным условием для отнесения препарата по изобретению к 4 классу опасности согласно общепринятой гигиенической классификации (ГОСТ 12.1.007-76).
Следует отметить, что столь значительное снижение токсичности нового антигельминтика в сравнении с прототипом является неожиданным с точки зрения имеющихся сведений о токсичности входящих в эти препараты ДВ. Учитывая то, что концентрации МО и ПР в составе препарата Мильбемакс сопоставимы, а острая токсичность (например, при применении п. о. мышам) для МО (LD50=300 мг/кг, https://dommedika.com/farmakology/42.html) более, чем в 8 раз, превышает таковую ПР (LD50=2454 мг/кг, https://parasitipedia.net/index.php?option=com_content&view=article&id=2673&Itemid=3005), очевидным является факт, что токсичность препарата должна определяться, главным образом, содержанием макролактона, а оно в новом и известном препарате одинаково.
Заключение.
Таким образом, в результате реализации настоящего изобретения разработан новый таблетированный антигельминтик для МДЖ, включающий в качестве ДВ комбинацию мильбемицина оксима с активным оптическим изомером празиквантела - R(-)-празиквантелом, который обеспечивает, как минимум, 80%-ное освобождение кошек и собак от цестод при однократном применении, где эффективная доза R-празиквантела является равной или превышающей 2,0 мг/кг веса животного, и демонстрирует 100%-ную цестодоцидную активность - при использовании минимальной терапевтической дозы цестодоцидного компонента, составляющей 2,5 мг/кг. Полное освобождение животных от цестод и нематод достигается при разовом применении таблетированного антигельминтика по изобретению, где минимальная терапевтическая доза R-ПР составляет 2,5 мг/кг и для кошек, и для собак, а минимальная терапевтическая доза МО, соответственно, 2,0 мг/кг и 0,5 мг/кг.
При этом, помимо, по крайней мере, двукратного снижения эффективной дозы цестодоцидного компонента, достигаемого в данном случае исключительно за счет замены применяемого во всех известных аналогах рацемата ПР его энантиомером, использование R-ПР в составе нового препарата имело результатом значительное снижение токсичности нового препарата в сравнении с прототипом (IV класс против III у препарата «Мильбемакс»), а также существенное улучшение его вкусовых качеств, что позволяет отказаться от необходимости использования дополнительных средств для устранения или маскировки вкуса (в частности пленочных покрытий и вкусовых добавок) при изготовлении таблеток для кошек и, соответственно, упростить производство препарата.