Фенотипический и генетический анализ измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор

УДК 616.932

С.П.Заднова, А.В.Шашкова, Я.М.Краснов, Н.И.Смирнова

ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗМЕНЕННЫХ ВАРИАНТОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬТОР

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

В работе определена продукция холерного токсина у измененных вариантов эльтор вибрионов, содержащих ген ctxB классического типа, выделенных на территории России с 1993 по 2010 год, и изучены их генетические свойства, связанные с продукцией этого фактора патогенности. Установлено, что измененные варианты синтезируют в 10-20 раз больше холерного токсина по сравнению с типичными эльтор вибрионами. При этом не обнаружено изменений в промоторной области оперона ctxAB, но установлено, что в отличие от типичных штаммов, содержащих одну копию профага СТХф, 90 % изученных измененных вариантов имели в геноме две копии профага СТХф. Несмотря на повышенное количество копий профага СТХф, выявленные различия в синтезе холерного токсина в большей степени могут быть обусловлены изменением транскрипционной активности регуляторных генов, что приводит к активной продукции холерного токсина измененными вариантами в нетипичных для эльтор вибрионов условиях.

Ключевые слова: измененные варианты V. cholerae биовара эльтор, продукция холерного токсина, копийность генов ctxAB, секвенирование промоторной области.

S.P.Zadnova, A.V.Shashkova, Ya.M.Krasnov, N.LSmirnova

Phenotypic and Genetic Analysis of Altered Variants of Vibrio cholerae Biovar El Tor

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov

Determined is cholera toxin production by altered Vibrio cholerae O1 eltor strains, isolated on the territory of Russia in 1993— 2010, which contain classical type ctxB gene. Studied are their genetic characteristics related to the production of this virulence factor. Determined is that altered eltor variants yield 10 to 20 times more cholera toxin than typical eltor strains. Changes in promotor region of ctxAB operon are not detected but elucidated is that 90 % of studied altered strains contain two copies of CTXq> prophage in their genome whereas typical strains carry one copy of CTX9 prophage. Despite the higher copy number of CTX9 prophage, the identified differences in production of cholera toxin can be associated mostly with a change of transcriptional activity of regulatory genes. That causes the active production of cholera toxin by the altered variants of Vibrio cholerae eltor in non typical environment.

Key word: altered variants of V. cholerae biovar eltor, production of cholera toxin, copy number of ctxAB genes, sequencing of promoter region.

Эпидемически опасные штаммы Vibrio cholerae О1 серогруппы по ряду фенотипических и генетических свойств подразделяются на два биовара - классический и эльтор. Штаммы холерного вибриона классического биовара были, видимо, возбудителем первых шести пандемий холеры. Возбудителем текущей, 7-й, пандемии холеры являются токсигенные штаммы V. cholerae биовара эльтор [1, 9]. В ходе развития 7-й пандемии в эндемичных по холере районах начиная с 1991 г. появились генетически измененные токсигенные штаммы холерного вибриона биовара эльтор, получившие обозначение измененные варианты [14]. К настоящему времени измененные варианты V. cholerae биовара эльтор вытеснили типичные штаммы этого возбудителя во многих эндемичных по холере районах и начиная с 1993 г. стали причиной локальных вспышек или спорадических случаев холеры на территории Российской Федерации [5, 15].

Одним из основных факторов патогенности V. cholerae является холерный токсин (ХТ), кодируемый генами ctxAB, расположенными в профаге СТХф, интегрированным в хромосому. Холерные вибрионы классического биовара продуцируют ХТ

классического типа (ХТ1), в то время как типичные штаммы эльтор вибрионов синтезируют ХТ эльтор типа (ХТ2). Эти два типа токсинов различаются по аминокислотной последовательности их иммуно-генных В субъединиц и соответственно по нуклеотидной последовательности генов ctxB, кодирующих их биосинтез. В отличие от типичных штаммов измененные варианты продуцируют ХТ классического типа, что обусловлено присутствием в геноме их профага СТХф гена ctxB классического типа [14].

Согласно литературным данным измененные варианты холерного вибриона являются более вирулентными по сравнению с типичными изолятами [7, 15]. Причины повышенной вирулентности измененных вариантов пока не совсем ясны. В этой связи представлялось, в частности, интересным оценить продукцию ХТ измененными вариантами в условиях in vitro, а также определить копийность генов ctxAB, входящих в состав профага СТХф, и изучить структуру их оперона.

Цель данной работы состояла в проведении сравнительного анализа продукции ХТ типичными и измененными вариантами V. cholerae эльтор биовара, выделенными на территории России, и изучении их

генетических свойств, связанных с продукцией этого фактора вирулентности.

Материалы и методы

В работе было использовано 23 штамма измененных вариантов и 11 типичных штаммов V. cholerae эльтор биовара, хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий. Для культивирования бактерий использовали агар LB (рН 7,6). Определение биовароспецифических свойств осуществляли согласно МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры» [3].

Синтез холерного токсина изучали с помощью иммунофементного анализа GM1 ELISA [16]. Для детекции ХТ штаммы выращивали в двух разных условиях: оптимальных для продукции ХТ классическими вибрионами - бульон LB (рН 6,8) с 66 моль NaCl при температуре 30 °С с аэрацией [13] и эльтор вибрионами - бульон AKI (1,5 % Бакто пептона, 0,4 % дрожжевого экстракта, 0,5 % NaCl, 0,3% NaHCO3), рН 7,6, при температуре 37 °С [8].

Для изучения генетической организации сравниваемых штаммов использовали блот-гибридизацию по Саузерну, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенирование. Выделение ДНК, ДНК-ДНК гибридизацию осуществляли по методам, описанным в пособии по молекулярному клонированию [4]. Для определения количества гептапептидных последовательностей (TTTTGAT) в промоторной области ctxA проводили секвенирование на приборе «ABI RPISM 3100 GeneticAnalyzer» (США), получая предварительно ампликоны на приборе «Терцик» (Россия) с использованием рассчитанного в данной работе прямого р1-5'-TGCCTAACAAATCCCGTCTGAGTTC-3' и обратного р2-5'-ATGGGCGACAGGTCATCACATTTAC-3' праймеров. Температура отжига праймеров составляла 60 °С, размер получаемого ампикона - 578 п.н. Выравнивание и сравнение секвенированных нуклеотидных последовательностей осуществляли в программе «Mega4».

Результаты и обсуждение

На первом этапе работы был проведен фенотипический анализ изучаемых штаммов для определения их биовара. В результате установлено, что измененные варианты обладают всеми признаками, характерными для V. cholerae биовара эльтор - лизируются до ДРТ диагностическим холерным бактериофагом эль-тор, но не лизируются классическим, растут на агаре с добавлением 50 мкг/мл полимиксина B и образуют ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра.

Повышенная вирулентность измененных вариантов V. cholerae биовара эльтор, содержащих ген ctxB классических вибрионов, может быть обусловлена более высоким уровнем биосинтеза ими ХТ по сравнению с типичными штаммами этого возбудителя. В этой связи нами впервые был проведен срав-

нительный анализ продукции ХТ генетически измененными и типичными штаммами холерных эльтор вибрионов, выделенными на территории России с 1970 по 2010 год. Известно, что оптимальные условия для продукции ХТ токсигенными штаммами двух биоваров неодинаковы, что определяется различиями в регуляторных системах, контролирующих экспрессию структурных генов холерного токсина классических или эльтор вибрионов. Как известно, у холерных вибрионов двух биоваров основными регуляторными белками являются белки ToxR и ТохТ. Разница в регуляции синтеза этих белков заключается в том, что хотя холерные вибрионы обоих биоваров при культивировании их в стандартных лабораторных условиях ^В-бульон, 30 °С) образуют одинаковое количество регуляторного белка ToxR, непосредственно участвующего в активации транскрипции генов ctxAB, но только у классических вибрионов в этих условиях происходит синтез второго регуляторного белка ТохТ, являющегося транскрипционным регулятором многих генов, в том числе и генов холерного токсина [6]. Однако до сих пор нет полных сведений об уровне экспрессии гена ctxB классического типа в новом генетическом окружении, а именно, в клетках V. cholerae биовара эльтор. На этом основании мы определили уровень продукции ХТ изучаемыми штаммами (23 измененных вариантов и 11 типичных изолятов) при выращивании их в двух разных условиях: оптимальных для биосинтеза этого белка V. cholerae классического биовара ^В-бульон, рН 6,8, 30 °С, 18 ч с аэрацией) и оптимальных для продукции ХТ V. cholerae биовара эльтор (АК1 бульон, рН 7,6, 37 °С, 4 ч без аэрации, 16 ч с аэрацией).

Оказалось, что штаммы измененных вариантов, выделенные в разные годы и в разных регионах, продуцировали значительно больше ХТ (0,11,2 мкг/мл) по сравнению с типичными штаммами (0,01-0,03 мкг/мл). При этом установлено, что 13 изолятов из 23 изученных, или 57 % синтезировали больше ХТ в LB бульоне при 30 °С, т.е. в условиях оптимальных для продукции этого белка классическими штаммами (таблица). Можно предположить, что с приобретением нового гена ctxB классического типа у эльтор вибрионов появилась способность образовывать в стандартных лабораторных условиях белок ТохТ, независимо от экспрессии белка ToxR. Вместе с тем было обнаружено 6 штаммов - М1272 (Краснодар, 1993), М1270 (Татарстан, 1993), М1269 (Магнитогорск, 1994), М1295 (Дагестан, 1994), М1328 (Дагестан, 1998), Л4150 (Москва, 2010), продукция ХТ у которых не зависела от среды выращивания, а также 4 штамма - М1299 (Краснодар, 1993), М1275 (Дагестан, 1993), М1268 (Магнитогорск, 1994), Л3226 (Москва, 2010), которые в 4-10 раз более активно синтезировали ХТ при культивировании в среде АК1 по сравнению с LB бульоном (таблица). Причина таких различий в экспрессии генов ctxAB между изученными штаммами пока не известна.

Продукция холерного токсина и генетические свойства измененных и типичных штаммов V cholerae биовара эльтор

Штамм V cholerae Место и год выделения Продукция XT, мкг/мл Генетические свойства

Кол-во копий профага CTXф Число повторов TTTTGAT*

AKI LB

569В классического биовара Индия, 1950 2,0 9,0 2 8

Измененные варианты эльтор биовара

М1264 Краснодар, 1993 0,03 0,6 н/о 4

М1272** Краснодар, 1993 0,2 0,3 2 н/о

М1297 Дагестан,1993 0,01 0,4 н/о н/о

М1266 Пермь,1994 0,03 0,5 н/о 4

М1293 Дагестан, 1994 0,02 0,1 2 4

М1268** Магнитогорск, 1994 0,04 0,01 2 н/о

Р17644 Ачинск, 1997 0,03 0,4 н/о 3

Р17647 Ачинск, 1997 0,01 0,1 н/о 3

М1326 Дагестан, 1998 0,04 0,8 н/о н/о

М1344 Казань, 2001 0,1 0,8 н/о 4

М1345 Казань, 2001 0,04 1,2 2 4

М1349 Казань, 2001 <0,01 0,9 н/о 4

М1429 Башкирия, 2004 0,01 0,5 2 4

М1430 Тверь, 2005 0,1 1,3 2 4

Р18899 Мурманск, 2006 0,01 0,8 1 4

Л3226 Москва, 2010 0,4 0,1 2 з

Л4150 Москва, 2010 0,4 0,3 2 з

Типичные штаммы эльтор биовара

М818 Саратов, 1970 0,03 0,02 1 4

М736 Пермь, 1970 0,03 0,02 н/о 4

М738 Пермь, 1970 0,03 0,03 н/о 4

М887 Астрахань, 1970 <0,01 <0,01 1 н/о

М888 Астрахань, 1970 <0,01 <0,01 1 н/о

M890 Астрахань, 1970 0,1 0,01 1 н/о

М1011 Башкирия, 1972 0,03 0,02 н/о 4

М1013 Башкирия, 1972 0,02 0,02 н/о 4

М641 Астрахань, 1975 0,1 0,02 1 н/о

C402 Ставрополь, 1990 0,03 0,01 н/о 4

C447 Ставрополь, 1990 <0,01 <0,01 н/о 4

* Число тандемных повторов TTTTGAT в промоторной области оперона СхАВ, участвующих в регуляции синтеза холерного токсина. ** Другие штаммы с аналогичными свойствами не приведены; н/о - не определяли.

Можно лишь предположить, что более эффективный синтез ХТ рядом штаммов измененных вариантов в среде AKI может быть следствием дополнительных изменений в нуклеотидной последовательности гена ctxB. Так, известно, что в нуклеотидной последовательности гена ctxB штаммов (Л3226, Л4150), изолированных в 2010 г. в Москве, помимо 2 известных однонуклеотидных замен в положении 115 (Т/С) и 203 (Т/С), характерных для классических вибрионов, присутствует новая мутация, а именно, в положении 58 цитозин заменен на аденини (С/А) [5]. В целом полученные нами результаты о повышенном синтезе ХТ измененными вариантами, по сравнению с типичными штаммами, согласуются с данными зарубежных исследователей [7].

Итак, анализируя полученные эксперименталь-

ные данные можно предположить, что различия в продукции ХТ между типичными и генетически измененными штаммами могут быть обусловлены разной регуляцией синтеза этого фактора вирулентности, которая, как известно, осуществляется за счет нескольких механизмов. Во-первых, количество вырабатываемого ХТ зависит от копийности оперона ctxAB, локализованного в геноме профага СТХф. Известно, что холерные вибрионы эльтор характеризуются большим разнообразием относительно числа копий оперона ctxAB. По данным литературы, более 70 % изученных типичных штаммов содержали в хромосоме одну копию этого оперона, а при увеличении числа копий оперона ctxAB продукция ХТ возрастала [11]. Референс-штамм V cholerae N16961 эльтор биовара также содержит одну копию профага СТХф. Во-вторых, большая роль

2,30- 1,96-

М 1234567 8 9 10 11 12

Рис. 1. Блот-гибридизация хромосомной ДНК генетически измененных вариантов Vibrio cholerae биовара эльтор с СТ-зондом:

М - HindlII - рестрикты ДНК фага X, взятые в качестве маркеров.

Измененные варианты V. cholerae: 2 - М1272; 3 - Л4150; 4 - М1270;

5 - М1429; 6 - М1268; 7 - Л3226; 9 - М1345; 10 - М1430; 11 - М1293;

12 - Р18899. Контроли: 1 - V cholerae 569В классического биовара;

8 - V cholerae М818 эльтор биовара

в регуляции синтеза ХТ принадлежит тандемно повторяющимся последовательностям TTTTGAT, расположенным на расстоянии 76 п.н. от начала транскрипции гена ctxA. В разных штаммах количество этих повторов изменяется от 3 до 8. При этом 8 раз эта последовательность повторена перед обеими копиями ctxAB оперона в хромосоме только высокотоксиген-ного штамма классического биовара V. cholerae 569В [11]. В-третьих, имеются дополнительные регуляторные гены, продукты которых также влияют на уровень биосинтеза ХТ.

В этой связи, на первом этапе работы с помощью блот-гибридизации по Саузерну впервые было определено количество копий оперона ctxAB в хромосоме 10 штаммов измененных вариантов. В качестве зонда использовали полученный с помощью ПЦР ампли-кон гена ctxA размером 564 п.н. Этот зонд, меченный дигоксигенином, был обозначен как СТ. Хромосома изучаемых штаммов фрагментировалась с помощью эндонуклеазы рестрикции PstI. В результате установлено, что в хромосоме 9 штаммов присутствовало две копии оперона ctxAB. Поскольку каждая копия оперона ctxAB локализована в геноме одного профага СТХф, то полученные данные свидетельствуют о том, что указанные штаммы содержат по две копии этого профага. При этом было обнаружено две группы штаммов, различающиеся величиной Pst1-фрагментов, гибридизующихся с СТ-зондом. Первая группа состояла из 4 штаммов (М1272, М1270, М1268, М1293), выделенных до 2001 г., обе копии профага СТХф у которых входили в состав двух фрагментов размером 9,0 т.п.н. и 7,0 т.п.н. (рис. 1, дорожки 2, 4,

6, 11). Это означает, что одна из копий профага этих штаммов расположена в том же хромосомном фрагменте размером 9,0 т.п.н., что и одна из двух копий профага СТХф у штамма 569В классического биовара (рис. 1, дорожка 1). Возможно, у названных штаммов измененных вариантов данная копия профага СТХф локализована также на малой хромосоме, как и у холерных вибрионов классического биовара. Хотя это предположение нуждается в дальнейшем экспериментальном подтверждении, местоположение двух

копий профага СТХф на 2 разных хромосомах у ряда штаммов измененных вариантов уже доказано рядом зарубежных исследователей [10]. Что касается второй группы, то она состояла из 5 штаммов (М1345, М1429, М1430, Л3226, Л4150), у которых две копии профага СТХф локализованы на Pst1-хромосомных фрагментах размером 7,0 т.п.н. и 5,4 т.п.н. (рис. 1, дорожки 3, 5, 7, 9, 10). Такое местоположение СТХф характерно для ряда типичных холерных вибрионов эльтор, у которых обе копии профага расположены на большой хромосоме в непосредственной близости друг от друга [2, 11]. В то же время штамм V. ^окг-ae Р18899, выделенный в 2006 г. в Мурманске, имел одну копию оперона ^АВ с молекулярной массой 5,4 т.п.н. (рис. 1, дорожка 12).

Таким образом, на основе анализа данных блот-гибридизации с СТ зондом установлено, что в отличие от типичных штаммов холерных вибрионов эль-тор, штаммы измененных вариантов в 90 % случаях содержали в геноме две копии профага СТХф, что, возможно, способствует повышению биосинтеза ХТ. Однако, учитывая обнаружение штаммов, продуцирующих повышенное количество ХТ, но содержащих одну копию СТХф (V cholerae Р18899), вполне вероятно, что существуют иные механизмы, участвующие в данном процессе.

Второе возможное объяснение повышенной продукции ХТ у измененных вариантов могло состоять в том, что внедрение в их хромосому гена ^В классического типа сопровождалось увеличением числа копий тандемных повторов ТТТГСАТ в про-моторной области оперона ctxАВ. Для проверки этого предположения нами была секвенирована промо-торная область оперона Ох.АВ, находящаяся между генами zot и А, у 13 измененных и 7 типичных штаммов. Как известно, холерные вибрионы классического биовара содержат в промоторной области от шести до восьми копий гептаповторов (ТТТГСАТ). которые расположены в тандемном порядке и являются сайтами связывания с регуляторным белом ToxR, увеличивающим сродство промотора с РНК-полимеразой. В то же время эльтор вибрионы имеют от трех до четырех данных копий. Повышенное содержание гептаповторов в геноме классических вибрионов является одной из причин более эффективного синтеза ХТ по сравнению с вибрионами эль-тор [12]. В результате было установлено, что у большинства штаммов (9 из 13 изученных) в промотор-ной области оперона ^х.АВ содержится четыре копии гептаповторов (рис. 2, таблица). Это означает, что исследованные штаммы измененных вариантов не отличались по этому свойству от типичных штаммов, включая референс-штамм V. cholerae N16961. Лишь два штамма, выделенные в Ачинске в 1997 г., содержали три таких повтора. В то же время следует особо отметить тот факт, что в отличие от всех других изученных нами и описанных другими исследователями штаммов V. cholerae биовара эльтор, два штамма измененных вариантов, выделенные в 2010 г., несли 5

N16961 TTGCAGCGCA80 AGCGCTGTGG5 ю GTAGAAGTGA100 AACGGGGTTT 1,0 ACCGATAAAA1 20 ACAGAAAATG ,3a ATAAAAAAGG 140

569В TTGCAGCGCA AGCGCTGTGG GTAGAAGTGA AACGGGGTTT ACCGATAAAA ACAGAAAATG ATAAAAAAGG

Р18899 TTGCAGCGCA AGCGCTGTGG GTAGAAGTGA AACGGGGTTT ACCGATAAAA ACAGAAAATG ATAAAAAAGG

Р17647 TTGCAGCGCA AGCGCTGTGG GTAGAAGTGA AACGGGGTTT ACCGATAAAA ACAGAAAATG ATAAAAAAGG

L3226 TTGCAGCGCA AGCGCTGTGG GTAGAAGTGA AACGGGGTTT ACCGATAAAA ACAGAAAATG ATAAAAAAGG

, R. ... R R R R R R R

N16961 ACTAAATAGT 150 1 1 ATA 10 . 1 H » II Il II -TTTTGATTT 190 II „ TTGATTTTTG 200 11 1 „0 ATTTTTGATT210

569В ACTAAATAGT ATATTTTGAT TTTTGATTTT TGATTTTTGA TTTTTGATTT TTGATTTTTG ATTTTTGATT

Р18899 ACTAAATAGT ATA -TTTTGATTT TTGATTTTTG ATTTTTGATT

Р17647 ACTAAATAGT ATA TT TTGATTTTTG ATTTTTGATT

L3226 ACTAAATAGT ATA TTTTGA TTTTTGATTT TTGATTTTTG ATTTTTGATT

N16961 TCAAATAATA 220 CAAATTTATT r 10 TACTTATTTA240 ATTGTTTTGA250 TCAATTATTT26t ’ TTCTGTTAAA270 CAAAGGGAGC280

569В TCAAATAATA CAAATTTATT TACTTATTTA ATTGTTTTGA TCAATTATTT TTCTGTTAAA CAAAGGGAGC

Р18899 TCAAATAATA CAAATTTATT TACTTATTTA ATTGTTTTGA TCAATTATTT TTCTGTTAAA CAAAGGGAGC

Р17647 TCAAATAATA CAAATTTATT TACTTATTTA ATTGTTTTGA TCAATTATTT TTCTGTTAAA CAAAGGGAGC

L3226 TCAAATAATA CAAATTTATT V. TACTTATTTA J ATTGTTTTGA TCAATTATTT TTCTGTTAAA CAAAGGGAGC

ГТ/х4 Y 35 область -10 область

N16961 ATTATATGGT 290 AAAGATAATA: ,°° TTTGTGTTTT зю TTATT

569В ATTATATGGT AAAGATAATA TTTGTGTTTT TTATT

Р18899 ATTATATGGT AAAGATAATA TTTGTGTTTT TTATT

Р17647 ATTATATGGT AAAGATAATA TTTGTGTTTT TTATT

L3226 ATTATATGGT AAAGATAATA TTTGTGTTTT TTATT ...

Рис. 2. Hуклеотидные последовательности промоторной области штаммов V. cholerae:

Ш рисунке обозначены TTTTGAT повторы (R), являющиеся сайтами связывания с регуляторным белком ToxR, а также -10 и -35 области. N16961 - референс-штамм эльтор биовара (последовательность взята из GenBank); 569В - штамм V cholerae классического биовара; Р18899 и L3226 - измененные варианты эльтор биовара

копий нуклеотидной последовательности TTTTGAT Однако такая структурная организация промоторной области оперона ctxAB не влияла на уровень синтеза ХТ этими изолятами, у которых продукция этого белка не отличалась от других измененных вариантов (рис. 2, таблица). Следовательно, маловероятно, что повышенная продукция ХТ измененными вариантами V. cholerae биовара эльтор связана с копийностью изучаемых регуляторных элементов.

Таким образом, нами впервые получены данные о продукции ХТ измененными вариантами V. chol-erae биовара эльтор, выделенными на территории России, количестве копий профага СТХф, а также о нуклеотидной последовательности промоторной области их ctxAB-оперонов. Обнаружено, что измененные варианты действительно продуцируют заметно больше ХТ, чем типичные штаммы возбудителя холеры эльтор. При этом внедрение нового гена ctxB в геном профага СТХф у большинства клонов сопровождается, видимо, изменением транскрипционной активности регуляторных генов, что приводит к активной продукции ХТ в нетипичных для холерных вибрионов эльтор условиях культивирования.

Работа выполнена по государственному контракту № 70-Д от 25.07.2011 г. в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)» и гранту РФФИ № 09-04-00217-а.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. М.: Медицина; 1971. 256 с.

2. Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л., Шагинян И.А., Вертиев Ю.В., Смирнов Г.Б. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV79. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1984; 9:12-8.

3. Лабораторная диагностика холеры. Методические указания МУК 4.2.2218-07. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2007. 87 с.

4. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир;, 1984. 480 с.

5. Смирнова НИ, Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Лозовский Ю.В., Кутырев В.В. Генетическая характеристика клинических штаммов Vibrio cholerae, завезенных на территорию Российской Федерации в современный период. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2011; 3:11-8.

6. DiRita VJ., Neely M., Taylor R.K., Bruss P.M. Differential expression of the ToxR regulon in classical and El Tor biotypes of

Vibrio cholerae is due to biotype-specific control over toxT expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93(15):7991-5.

7. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H. et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283-6.

8. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N., Ichinose Y., Nakasone N., Tanabe M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 1986; 30(11):1075-83.

9. Kaper J.B., Morris J., Levin M. Cholera. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8(1):48-89.

10. Lee J.H., Choi S.Y., Jeon Y-S., Lee H.R., Kim E.J., Nguyen B.M. et al. Classification of hybrid and altered Vibrio cholerae strains by CTX prophage and RS1 element structure. J. Microbiology. 2009.

47(6):783-8.

11. Mekalanos J.J. Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae. Cell. 1983 ; 35(1):253—63.

12. Mekalanos, J.J., Swartz D.J., Pearson G.D.N., Harford N., Groyne F., de Wilde M. Cholera toxin genes: nucleotide sequence. deletion analysis and vaccine development. Nature. 1983; 306:551-7.

13. Miller V.L., Mekalanos J.J. A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol. 1988; 170(6):2575-83.

14. Nair G. B., Qadri F., Holmgren J., Svennerholm A.M., Safa A., Bhuiyan N.A. et at Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006. 44:4211-3.

15. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46-54.

16. Svennerholm A.M., Wiklund G. Rapid GM1-enzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin. J. Clin. Microbiol. 1983; 17(4):596-600.

References

1. Baroyan O.V. [Cholera El Tor]. M.: Meditsina; 1971. P. 256.

2. Gintsburg A.L., Yanishevsky, N.V., MotinV.L., Shaginyan I.A., Vertiev Yu.V, Smirnov G.B. [Arrangement and cloning of Vibrio cholerae El Tor RV79 structure genes of enterotoxin]. Mol. Genet. Microbiol. Virusol. 1984; 9:12-8.

3. Laboratory diagnostics of cholera. MUK 4.2.2218-07. M.; 2007.

87 p.

4. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. [Molecular Cloning: A Laboratory Manual]. M.: Mir; 1984. 480 p.

5. Smirnova N.I., Goryaev A.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Lozovskiy Yu.V., KutyrevVV [Genetic characterization of Vibrio cholerae strains emerging in Russian Federation during 7th cholera pandemic]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2011; 3:8-11.

Authors:

Zadnova S.P., Shashkova A.V., Krasnov Ya.M., Smirnova N.I. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. Universitetskaya St., 46, Saratov, 410005, Russia. E-mail: rusrapi@microbe.ru

Об авторах:

Заднова С.П., Шашкова А.В., Краснов Я.М., Смирнова Н.И. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru

Поступила 01.09.11.