СПОСОБ ВОССТАНОВЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ С ТОКСИЧЕСКИМ ГЕПАТИТОМ
METHOD FOR RECOVERING BIOCHEMICAL INDICES OF PERIPHERAL BLOOD OF LABORATORY ANIMALS WITH TOXIC HEPATITIS

Изобретение относится к области медицины и предназначено для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных.
Известен способ восстановления биохимических показателей крови лабораторных животных с токсическим гепатитом путем использования спиртового эктракта лавра благородного (Laurus nobilis). Токсическое повреждение печени моделировали путем внутрибрюшинного введения четыреххлористого углерода (CCl4). Экстракт лавра вводился в количестве 0,2 мл/100 г массы лабораторного животного (https://docplayer.ru/69619930-Biohimicheskie-pokazateli-krovi-krys-s-toksicheskim-gepatitom-pri-deystvii-spirtovogo-ekstrakta-lavra-blagorodnogo-laurus-nobilis.html). Недостатком данного подхода является то, что спиртовый экстракт лаврового листа нельзя употреблять пациентам с мочекаменной болезнью, при острой или хронической почечной недостаточности, при нефритах, тяжелой форме сахарного диабета. (Лавренов В.К., Лавренова Г.В. «Энциклопедия лекарственных растений народной медицины, Санкт-Петербург, Издательский дом «Нева», 2003 - 126 с.).
Наиболее близким техническим решением к заявляемому является способ восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных путем введения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) в количестве 4 млн кл./кг ММСК. (Изменение биохимических показателей крови лабораторных животных с токсическим гепатитом после введения ММСК // Сборник материалов VI Международной научно-практической конференции «Актуальные направления научных исследований: перспективы развития», Чебоксары 2018. С 44-46.) Недостатком данного подхода является использование высокой концентрации клеток в единице объема вводимой суспензии. Так, было суспендировано 4 млн кл./кг ММСК в 0,2 мл. 0,9% раствора NaCl. Эта концентрация клеток (ММСК) может вызвать эмболию, при этом отмечается достаточно высокая активность ферментов цитолиза гепатоцитов.
Задачей данного изобретения является расширение арсенала средств, способных приводить к восстановлению биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с токсическим гепатитом.
Технический результат, который будет получен от использования изобретения, заключается в исключении возможности развития эмболии трансплантированными клетками, а также в более существенном снижении уровня в крови показателей, характеризующих цитолиз гепатоцитов - аланинаминотрансфераза (ACT), аспартатаминотрансфераза (ACT), щелочной фосфатазы.
Технический результат достигается путем внутривенной сочетанной аллогенной трансплантации ММСК, полученных из хориона плаценты лабораторных животных в дозе 2 млн. клеток/кг и полученных из хориона плаценты лабораторных животных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в дозе 300 тыс. клеток/кг.
Способ позволяет обеспечить восстановление биохимических показателей периферической крови при циррозе печени и исключить возможность развития эмболии трансплантированными клетками.
Сущность изобретения обеспечена проведением сочетанной трансплантации лабораторным животным плацентарных ММСК и ГСК в количестве 4 млн клеток/кг и 330 тыс. клеток/кг соответственно.
Эффективность применения ММСК обусловлена тем, что они вырабатывают противовоспалительные цитокины (интерлейкин-10, трансформирущий фактор роста -β), факторы роста, необходимые для дифференцировки звездчатых клеток печени (клетки Ито) в гепатоциты. ММСК синтезируют компоненты матрикса, в том числе фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны. При этом ММСК способны дифференцироваться в клетки стромы, которая обеспечивает синтез экстрацеллюлярного матрикса, формирующего микроокружение, необходимое для пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. Способность ММСК в заявляемой дозировке оказывает иммуносупрессивное действие, обеспечивающее приживление аллогенного трансплантата.
ГСК способны дифференцироваться в гепатоциты. (Роль стволовых клеток в регенерации печени и перспективы их использования в лечении печеночной недостаточности / А.Н. Лызиков, А.Г. Скуратов, Е.В. Воропаев, А.А. Призенцов // Проблемы здоровья и экологии. - 2012, №2 (32). - С. 7-13.). В то же время известно, что ММСК способны вырабатывать хемоаттрактант для ГСК, обеспечивая их направленную миграцию (Стволовые клетки, их свойства, источники получения и роль в регенеративной медицине / А.П. Ястребов, Д.Ю. Гребнев, И.Ю. Маклакова. - Екатеринбург, 2016. - 282).
Заявляемая дозировка ММСК и ГСК подобрана эксперементальным путем и способствует активации регенерации печени и исключает возможность развития эмболии трансплантированными клетками.
Из анализа научно-технической и патентной литературы использования плацентарных ММСК и ГСК для восстановления биохимических показателей периферической крови лабораторных животных с циррозом печени не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Изобретение осуществляется следующим образом.
Эксперименты выполнены на 28 зрелых лабораторных мышах-самцах в возрасте 7-8 месяцев с массой 25-30 г. Животные содержались в стандартных условиях лабораторного вивария при естественном освещении и сбалансированном рационе.
Лабораторные животные были разделены на опытные и контрольные группы (по 7 животных в каждой группе). Лабораторным животным опытных групп внутривенно вводились ММСК и ГСК соответственно в дозе 2 млн. клеток/кг и 300 тыс. клеток/кг, суспендированные в 0,2 мл 0,9% NaCl. Животным контрольных групп вводили 0,2 мл 0,9% NaCl внутривенно. Токсический гепатит вызывали путем внутрибрюшинного введения CCl4 (четыреххлористый углерод) в дозе 50 мкг/кг. Трансплантация клеток осуществлялась в хвостовую вену через 1 час после введения четыреххлористого углерода однократно. Забой лабораторных животных осуществлялся на 3 и 7 сутки после трансплантации клеток.
Клеточные культуры
Получение клеточной культуры ММСК и ГСК производилось из хориона плаценты лабораторных животных. При этом мононуклеарная фракция клеток была получена путем последовательной механической и ферментативной (раствор аккутазы (Millipore, США)) обработки ткани плаценты.
Выделение ГСК осуществлялось методом позитивной иммуномагнитной сепарации по антигенам SCA-1 (StemCell Technologies, США) и CD 117 (StemCell Technologies, США) (X. Muniraetal., 2009).
Проточная цитометрия была проведена на цитометре FACS Calibur (BD Bioscienses, США). В суспензии трансплантируемых клеток оценивалось содержание ГСК с иммунофенотипом положительных по CD117, Sca-1 и отрицательных по Lin- (CD45, C3e, Ly-6G, M1/70, Ter-119).
В качестве изотипического контроля для антител при проведении позитивной иммуномагнитной сепарации по SCA-1 и CD117 были использованы антитела РЕ labeled Rat IgG2a, kappa isotype control (BD Bioscienses). С целью определения Lin антигенов на поверхности клеток был использован набор антител - FITC anti-mouse Lineage Coctail with isotype control (Biolegend, США).
Проведенные исследования позволили установить, что содержание клеток после иммуномагнитной сепарации с иммунофенотипом CD117+ (рис. 1), Sca-1+, Lin- составило 70-93%.
Тест колониеобразования. С целью определения функциональной способности клеток, выделенных с помощью позитивной иммуномагнитной сепарации (Sca1+, CD 117+, Lin-) был проведен стандартный тест колониеобразования в метилцеллюлозной среде MethoCult (StemCell Technologies, Канада). Данный тест позволяет установить способность полученных клеток формировать различные типы гемопоэтических колоний. Образование колоний было зарегистрировано под инвертированным микроскопом Unico (США).
6
2
2
Культура ММСК. С целью получения первичной культуры ММСК осуществлялся пассаж мононуклеарной фракции клеток, выделенной из ткани плаценты, в специализированной среде для культивирования ММСК в чашки Петри в концентрации 1×10 клеток на 1 см. Культивирование ММСК проводилось в условиях CO-инкубатора при температуре 37°С с содержанием углекислого газа 5% и влажностью 90%. Через 24-48 часов инкубации не прикрепленные к дну чашки Петри клетки аспирировали. Среду для культивирования ММСК добавляли к прикрепленным к пластику клеткам. Замена среды проводилась каждые 3-4 сутки до достижения клетками 70-80% конфлюэнтности. При формировании соответствующего монослоя осуществлялся пересев клеток.
При трансплантации лабораторным животным была использована культура ММСК третьего пассажа.
Иммуноцитохимия. Для подтверждения принадлежности культуры к ММСК производилась окраска клеток с помощью набора антител Mesenchymal Stem Cell Characterization Kit (Millipore, США), содержащего позитивные (антитела к integrin β1, CD 54, collagentypeI и fibronectin) и негативные маркеры (антитела к CD 14, CD 45).
Производилась дифференцировка полученной культуры в адипоцитарном и остеогенном направлениях. Состав среды, индуцирующей дифференцировку: MesenCult™ Osteogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) / MesenCult™ Adipogenic Stimulatory Supplement («StemCell Technologies», Канада) и MesenCult™ MSC Basal Medium (Mouse) («StemCell Technologies», Канада) в соотношении 1:4, 2 ммоль раствора L-глутамина («StemCell Technologies», Канада). Факт остеогенной дифференцировки подтвержден гистохимическим методом регистрации увеличения экспрессии щелочной фосфатазы, а также с помощью окраски vonKossa, выявляющей наличие минерализованного фосфата кальция. Способность клеток дифференцироваться в адипоцитарном направлении подтверждена гистохимическим методом регистрации липидных вакуолей, окрашивающихся красителем Oil Red О (J.J. Minguelletal., 2004).
Подсчет и определение жизнеспособности клеток. Жизнеспособность клеток была определена с помощью суправитальной окраски раствором трипанового синего. Подсчет клеток производился в 5 больших квадратах камеры Горяева (или ≥100 клеток). Жизнеспособность выделенных клеток перед трансплантацией составляла 95-97%.
Производилась оценка биохимических показателей периферической крови на автоматическом биохимическом и иммуноферментном анализаторе Chem Well 2910 (Combi) на 3 и 7 сутки после трансплантации клеток. Изучались следующие биохимические показатели: альбумин, мочевина, глюкоза, общий билирубин, аспартатаминотрансфераза (ACT), аланинаминотрансфераза (АЛТ), щелочная фосфатаза.
Достоверность отличий в сравниваемых выборках проведено с применением непараметрического (рангового) метода Манна-Уитни. Статистическая обработка данных проведена с помощью программного пакета SPSS Statistics (версия 17,0).
Сравнительные данные показателей приведены в таблицах 1 и 2.
Как видно из таблицы 1 и 2, на 3 и 7 сутки по заявляемому способу биохимические показатели периферической крови, отражающие степень выраженности цитолиза гепатоцитов существенно ниже, чем в прототипе. Таким образом, выявлено, что сочетанная аллогенная трансплантация плацентарных ММСК и ГСК (заявляемый способ) влияет на восстановление биохимических показателей в существенно большей степени, чем прототип. Заявляемое изобретение исключает возможность развития эмболии трансплантированными клетками.