Сравнительное изучение противовирусной активности лютеолина и 7,3’-дисульфата лютеолина

Сравнительное изучение противовирусной активности лютеолина и 7,3’-дисульфата лютеолина

Н. В. КРЫЛОВА1, А. М. ПОПОВ2, Г. Н. ЛЕОНОВА1, А. А. АРТЮКОВ2, О. С. МАЙСТРОВСКАЯ1

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток

2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток

Comparative Study of Antiviral Activity of Luteolin and 7,3’-Disulfate Luteolin

N. V. KRYLOVA, A M. POPOV, G. N. LEONOVA, A A ARTYUKOV, O. S. MAISTROVSKAYA

Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Vladivostok Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far-East Branch of Russian Academy of Sciences, Vladivostok

На экспериментальной модели клещевого энцефалита (КЭ) in vivo и in vitro изучено противовирусное действие 7,3'-ди-сульфата лютеолина, полученного из морской травы Zosterci marina. Этот препарат повышает выживаемость мышей, инфицированных вирусом КЭ, и увеличивает продолжительность их жизни. На культуре клеток СПЭВ показано, что 7,3'-дисульфат лютеолина снижает накопление вируса на 2,0—4,0 lg ТЦИД50/мл.

Ключевые слова: лютеолш, дисульфат лютеолина, вирус клещевого энирфалита, противовирусная активность.

Antiviral activity of 7,3'-disulfate luteolin, extracted from Zostera marina was studied on an experimental model of tick-borne encephalitis (TBE) in vivo and in vitro. The drug increased the survival of the experimental mice infected with TBE virus and prolonged their lifespan. It was shown that 7,3'-disulfate luteolin reduced the virus accumulation in the SPEV cells by 2.0—4.0 lg TCID50/ml.

Keywords: luteolin, luteolin disulfate, tick-Ьоте encephalitis virus, antiviral activity.

Среди биофлавоноидов флавон лютеолин (ЛТ), входящий в состав растений различных семейств, характеризуется широким спектром биологической активности [1—4], включая противовирусное действие [5]. Водонерастворимый ЛТ, поступающий в организм человека с пищей, в эпителиальных клетках кишечника и печени модифицируется, превращаясь в водорастворимые производные — гликозиды и сульфаты [6].

Относительно биологической активности этих производных известно, что гликозилирован-ные и глюкоуронидные формы этого флавона характеризуются высокой биоусвояемостью эпителиальными клетками кишечника [7] и обладают выраженной биологической активностью [8, 9].

Сульфатирование — другой важный путь метаболизма ЛТ как в тканях растений, так и животных. Сульфаты ЛТ широко распространены в высших наземных растениях. Однако среди морских растений они обнаружены только в травах семейства 7о51егасгаг (Х.таппа и 2ш1аИоа) [10] и в морской траве Тка1а$51а testudinum [8]. В виде

© ^пле^ив aвтoрoв, 2011

Aдрec для кoррecпoндeнции: 11У105 Mocквa, Нагатин^ая ул., д. За. Редакция жyрнaлa «Aнтибиoтики и х^^терата»

сульфатированных производных ЛТ циркулирует в плазме крови и проникает в различные клетки тканей человеческого организма. По сравнению с ЛТ, сульфатированный ЛТ более эффективно всасывается клеточным эпителием [7]. В этой связи в лаборатории биотехнологии ТИБОХ ДВО РАН недавно разработан способ получения 7,3'-дисульфата лютеолина (ДСЛ) из морских трав семейства Тояіегасеае [11]. Однако экспериментальные данные относительно фармакологической активности сульфатированных производных ЛТ до настоящего времени отсутствуют. Поэтому проведение разносторонних исследований полезных свойств сульфатированных производных ЛТ представляется закономерным и оправданным. Ранее нами было показано [12], что препарат Люромарин, состоящий из розмариновой кислоты, лютеолина и других биофлавоноидов, способен эффективно подавлять продукцию вируса клещевого энцефалита (КЭ) на ранних стадиях развития инфекции.

В этой связи возникла необходимость провести исследования по сравнительному изучению противовирусных свойств известного препарата лютеолина и синтезированного нами — 7,3'-ди-

npenapa™ Дoзы пpeпapaтoв, мкг/мл Шдавление peпpoдукции виpуca, lg в пpиcутcтвии п|)еп;ф;п(>в

Лютeoлин 1 4+0,4

0,1 3,5+0,5

0,01 3+0,4

0,001 1+0,3

0,0001 0

Джульфат лютeoлинa 1 3,5+0,4

0,1 3,5+0,4

0,01 4+0,5

0,001 3+0,3*

0,0001 2+0,3*

Koнтрoль (без прeпaрaтoв) — У+0,5

Примечание. Здесь и в табл. 2: * — достоверные различия между группами (р<0,05).

cyльфaтa лютeoлинa (ДОЯ) из мoрcкиx трав ce-медотва Zosteraceae.

Maтepиaл и методы

Bиpуc. B рaбoтe иcпoльзoвaли вирyc KЭ дaльнeвocтoчнo-гo cyGiHna, штамм Р-У3, выделенный из мoзгa чeлoвeкa, умер-шeгo ox KЭ c oчaгoвoй фoрмoй инфекции. Инфeкцнoнный титр этoгo штамма на пeрeвнвaeмoй культурє клexoк CПЭB (клетки пoчeк эмбртана cвнньн) был 10У TЦИД5o/0,2 мл.

Живoтныe. Неинбредные белые мыши ^амцы мaccoй 12—14 г) coдeржaлнcь в cтaндaртныx ycлoвняx вивария c co-блюдением правил и мeждyнaрoдныx реюмендаций Eврoпeй-cкoй кoнвeнцнн no защите пoзвoнoчныx живoxныx.

npenapara. У,3'-днcyльфaxa лютeoлинa — препарат, голу-ченный no oрнгннaльнoй xexнoлoгнн из мoрcкoй травы Zostera marina c иcпoльзoвaниeм мeтoдa выcoкoэффeкxнвнoй жидю-cxнoй xрoмaxoгрaфнн. Cтрyктyрa У,3'-днcyльфaxa люxeoлннa была пoдxвeрждeнa данными элементтого и ЯMР анализа (C13 и Н1), мacc-cпeкxрoмexрнeй, УФ и ИK-cпeктрocкoпиeй [11]. B кaчecxвe препарата cрaвнeния нcпoльзoвaлн кoммeрчecкий люxeoлнн прoизвoдcтвa фирмы «Sigma» (C0A).

Kультуpa клеток. Для анализа прoтивoвирycнoй активм-cти прeпaрaxoв нcпoльзoвaлн клетки пeрeвнвaeмoй линии CnBB, являющeйcя выcoкoчyвcxвнxeльнoй мoдeлью для ви-рyca KЭ. Хлетки кyльтивирoвaли в 24-лyнoчныx плacxнкoвыx панелях c нcпoльзoвaннeм рocxoвoй cрeды 199 и RPMI (в равных cooтнoшeнияx) c дoбaвлeннeм 10% cывoрoxки эмбр^той кoрoв и 100 ЕД/мл гентамицина. B экcпeрнмeнxe нcпoльзoвa-ли пoддeрживaющyю cрeдy c 1% cывoрoxки и reнтaмицинoм.

Оценка пpoтивoвиpуcнoгo дeйcтвия п|)еп;ф;пч>в на культуpe клeтoк. Moнocлoй культуры клexoк CПЭB заражали 10-кратными разведениями внрyca KЭ. Иccлeдyeмыe препараты в различных юнцентрациях (ox 1 мкг/мл дo 0,0001 мкг/мл) вта-cнлн через 1 чac norae ннфнцнрoвaння клexoк внрycoм. Планшеты инкyбирoвaли в CO2-ннкyбaxoрe в течение 5 cy!o^ Прoxнвoвнрycный эффект прeпaрaтoв рaccчнxывaлн no ch^ жению инфeкциoннoгo титра внрyca (А, lg).

Оценка пpoтeктивнoгo дeйcтвия пpeпapaтoв npH экcпepимeн-тaльнoм клeщeвoм энцефалите. Mышeй инфицирoвaли внрycoм KЭ (штамм Р-У3) no,n;mKHo в дoзe 100 LD50 в oбъёмe 0,2 мл (титр вирyca при пoдкoжнoм заражении cocxaвлял 6,5 lg LD50/ мл).

Препараты УД-дтеульфата люxeoлннa и люxeoлнн в дoзax 3,25, 6,25, 12,5 и 25 мг/кг ввoднлн живoxным ннxрaпeрнxoнe-альж> и пeрoрaльнo через 1 чac пocлe заражения внрycoм и в дальнейшем на прoтяжeнии 5 дней oдин раз в cyxки. Koh-xрoльнымн группами cлyжилн нeннфнцнрoвaнныe мыши, no-лучавшие нcпыxyeмыe препараты, а также инфицирoвaнныe внрycoм KЭ мыши, не случавшие препараты. B каждой группе бьгго no 10 живoтныx. За живoxнымн наблюдали 21 день.

O^My прoxнвoвнрycнoй эффeкxнвнocxн иcпoльзyeмыx прeпaрaxoв прoвoднлн coглacнo xрeбoвaнням, излoжeнным в рyкoвoдcxвe [13]. Ocнoвнымн критериями ее in vivo были no-

казатели защиты животных от гибели и средняя продолжительность жизни (СПЖ) животных в группе.

Все опыты повторяли трёхкратно. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ GeoStat и Biostatistics (Version 4.03). Различие двух сравниваемых величин считали достоверным, если вероятность их тождества была меньше 5% (р<0,05).

Результаты и обсуждение

Оценка влияния ЛТ и ДСЛ на начальные стадии взаимодействия вируса с клеткой показала, что эти препараты в разной степени защищали инфицированные клетки СПЭВ от цитопатичес-кого действия вируса КЭ. Данные по изучению влияния ЛТ и ДСЛ на репродукцию вируса КЭ, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что их применение приводит к значимому снижению показателей репликации вируса. Установлено, что в концентрациях от 1 до 0,01 мкг/мл ЛТ и ДСЛ снижали накопление вируса на 3,0—4,0 lg ТЦИД50/мл по сравнению с контролем. При более низких концентрациях препаратов (0,001 и 0,0001 мкг/мл) противовирусная активность ДСЛ была выше таковой по сравнению с лютеолином на 2 lg ТЦИД50/мл (р<0,05). Ранее было показано, что лютеолин in vitro эффективно ингибирует ци-топатическое действие вируса гриппа (H3N2) [5]. При этом его минимальная доза, защищающая клетки, составляла 2,06 мкг/мл. Кроме того, 7-рамнозид кверцитина также обладает выраженной противовирусной активностью in vitro в отношении эпидемического вируса, вызывающего диарею у свиней. По этой активности 7-рамно-зид кверцитина превосходил кверцитин и лютеолин более чем в 10 раз. Действие этого водорастворимого метаболита связано не с ингибированием абсорбции вируса свиной диареи, а подавлением ранних стадий его репликации [14].

Нами установлено, что вновь синтезируемый препарат ДСЛ более эффективно, чем ЛТ, подавлял in vitro репликацию высокопатогенного штамма вируса КЭ на ранних стадиях развития инфекции. Полученные результаты говорят о целесообразности дальнейшего изучения этого нового препарата уже на моделях in vivo.

Таблица 2. Выживаемость животных, инфицированных вирусом КЭ, при разных дозах и способах введения препаратов

npenapa™ Дoзы пpeпapaтoв, мг/кг Cnoco6 введения пpeпapaтoв 10-й день onbira защита CПЖ, oт гибели, % cjT" 21-й день oro^a защита CПЖ, oт гибели, % cjT"

Koнтрoль — — 0 8,2+0,81 0 8,2+0,81

Лютеалин 12,5 и/п 32,5+9,б 8,8+1,11 0 9,0+0,99

б,25 и/п 35,0+5,8 9,0+1,03 0 9,8+1,1

3,25 и/п 20,0+10,0 8,5+0,5б 0 8,У+0,У8

25 пeрoрaльнo 32,5+5,0 9,0+0,89 13,3+5,8 10,5+1,2У

12,5 пeрoрaльнo 2У,5+5,0 9,0+1,01 1б,У+5,8 11,4+1Д2

Днcyльфax люxeoлннa 12,5 и/п 1У,5+5,0 8,3+1,15 0 8,У+1,3

б,25 и/п 25,0+5,8 9,0+0,98 0 9,б+0,99

3,25 и/п 42,5+9,б* 9,0+1,0У 0 10,0+1,1

25 пeрoрaльнo 55,0+5,8* 9,4+0,8У 21,У+б,3* 12,б+0,95*

12,5 пeрoрaльнo 5У,5+5,0* 9,4+0,Уб 3б,У+5,8* 13,1+0,8б*

При o^rae прoтeктивнoгo действия различных дoз ДОЯ ^т 3,25 мг/кг дo 25 мг/кг) и cnoco-бoв eгo введения in vivo быго ycтaнoвлeнo (табл. 2), что препарат oкaзывaeт дoзoзaвнcнмoe защиттое дeйcтвнe и увеличивает cрeднюю прoдoлжитeль-нocть жизни ннфнцнрoвaнныx жнвoтныx. Ta^ в кoнтрoлънoй группе мышей, ннфнцнрoвaнныx внрycoм KЭ в дoзe 100 LD50, лeтaлънocтъ вставила 100% на 10 день наблюдения, CПЖ — 8,2+0,81 дня. B этот же cрoк cрeдн жнвoтныx, заражённых та^й же выcoкoй дoзoй внрyca и no-лучавших HT, нaнбoлъшнй прoцeнт выживших (35,0+5,8%) oтмeчaлcя в группе мышей при ин-трaпeрнтoнeaлънoм введении б,25 мг/кг препарата. Cрeди жнвoтныx, пoлyчaвшиx Д^, бoлъшe вceгo выживших (55,0+5,8% и 57,5+5,0%) на-блюдaлocъ при применении препарата пeрoрaль-ho в дoзax 25 и 12,5 мг/кг (cooтвeтcтвeннo). K кoнцy зaключнтeлънoгo cрoкa наблюдения (21 день) сделан вывoд o тoм, чтo препараты HT и ДСТ cпocoбcтвoвaлн увеличению cрeднeй ^o-дoлжнтeлънocтн жизни жнвoтныx. Taк, CПЖ у мышей, пoлyчaвшиx 12,5 мг/кг HT пeрoрaлънo, cocтaвнлa 11,4+1,12 дней, что yвeличивaлo CПЖ на 39% no cрaвнeнию c кoнтрoлънoй труптой (8,2+0,81 дня). B тo же время пeрoрaльнoe применение 12,5 мг/кг ДСТ зaщнщaлo oт гибели 3 б, У+5,8 % ннфнцнрoвaнныx жнвoтныx, CПЖ вставила 13,1+0,8б дней, чтo yвeлнчнвaлo их cрeднюю прoдoлжнтeлънocтъ жизни на б0% no cрaвнeнню c тaкoвoй в кoнтрoльнoй группе.

Нами ycтaнoвлeнo, что пeрoрaльнoe применение препарата ДЄЛ в дoзe 12,5 мг/кг эффективта зaщнщaлo oт гибели мышей, ннфнцнрoвaнныx выcoкoпaтoгeнным штaммoм внрyca KЭ. Шказа-ho, чтo ДCЛ no защиттому дeйcтвню прeвocxoднт препарат cрaвнeння лютeoлин. ^лученные в на-cтoящeй рaбoтe результаты прoтeктнвнoгo действия препарата джульфат лютeoлинa при эгопе-римем'яль^м KЭ пoзвoляют рeкoмeндoвaть eгo для дальнейших иcпытaний, ocoбeннo при там-биннрoвaннoй терапии клeщeвoгo энцефалита.

Наряду c прямым прoтнвoвнрycным действием cyщecтвyют и другие механизмы, oбъяcняющиe прoтивoвнрycный эффект бнoфлaвoнoндoв in vivo. B дoпoлнeниe к прямoй прoтивoвирycнoй актив-нocти oнн тoрмoзят актив^сть фeрмeнтoв, oтвeт-ственных за cинтeз эйкoзaнoндoв. Oпрeдeлeнныe флaвoнoнд;ы, главным oбрaзoм прoнзвoдныe фла-вoнoв, мoдyлнрyют экотретеию прoвocпaлнтeлъ-ных мoлeкyл, no крайней мере, частичто, через ингнбнрoвaннe активизации фaктoрoв трaнcкрип-ции гeнoв этих мoлeкyл [2]. При изучении различных флaвoнoидoв были oпрeдeлeны нaибoлee важные фрагменты cтрyктyры, oпрeдeляющиe их прoтивoвocпaлнтeлънyю aктнвнocть. Этo — C-2,3 двoйнaя cвязъ в ^льце C, 5,У-гндрoкcнлъныe группы в тальце A и 4'- или 3',4'-щдрoкcильныe группы в кoлъцe B. Гидрoкcильнaя группа в пoлo-жении C-3 у флaвoнoлoв имеет бoлъшoe влияние на ингнбнрoвaннe липoкcигeнaзы и для ^oi^o-вocпaлнтeлънoй aктивнoсти. Флaвoны (без C-3 группы гндрoкcнлa) oблaдaют бoлee cнлънoй cno-coбнoстъю пoнижaть э^^е^ию прoвocпaлн-телъных гeнoв. K ним oтнocятcя апигенин, лютeo-лин, кeмфeрoл и кверцитин [15].

Заключение

Taким oбрaзoм, нами впервые на экотеримен-тaлънoй мoдeлн внрycнoгo клeщeвoгo энцефалита in vitro и in vivo ^казато, что препарат д^^фат люте-oлинa, ^лученный из мoрcкoй травы Z.marina, o6-ладает внрycингибнрyющeй aктивнocтью и прoтeк-тивным действием. Эффектив^ать днcyлъфaтa лютeoлинa прeвocxoднx действие кoммeрчecкoгo препарата лютeoлннa. Moжнo прeдпoлoжнIъ, что ДCЛ — это прнрoднaя вoдoрaствoримaя фoрмa HT, cпocoбнaя прoникaть в плазму крoви жнвoтныx и че-лoвeкa через кишечник, минуя стадии мoдификaции клетками кишечника и печени, т. е. ДСТ oблaдaeт бoльшeй бнoycвoяeмoстью. Это пoзвoляeт coздaвaть навыкшую кoнцeнIрaцню HT в крoвн, твишая эффeкxнвнoстъ eгo фнзнoлoгнчecкoгo действия. B cвязи c этим рaзрaбoткa прoтивoвирycныx и других

лечебно-профилактических средств на основе ДСЛ представляется более перспективной, чем на основе

ЛИТЕРАТУРА

1. Кривошапко О. Н, Попов А. М., Артюков А. А. Здоровье. Медицинская экология. Наука 2009; 85—88.

2. Dirscherl К., Karlstetter М., Ebert S. et al. Luteolin triggers global changes in the microglial transcriptome leading to a unique antiinflammatory and neuroprotective phenotype. J Neuroinflammation 2010; 7: 3: 1—16.

3. Lin Y, Shi R, WangX., Shen H-A. Luteolin, a flavonoid with potentials for cancer prevention and therapy. Curr Cancer Drug 2008; 8: 7: 634—646.

4. Ueda H, Yamazaki C., Yamazaki M. Luteolin as an anti-inflammatory and anti-allergic constituent of Perilla frutescens. Biol Pharm Bull 2002; 25: 9: 1197—1202.

5. Liu A. L, Liu B, Qin H. L. et al. Anti-influenza virus activities of flavonoids from the medicinal plant Elsholtzia rugulosa. Planta Med 2008; 74: 8: 847-851.

6. Gradolatto A., Canivenc-Lavier M. C., Basly J. P. et al. Metabolism of apigenin by rat liver phase I and phase II enzymes and by isolated perfused rat liver. Drug, Metabolism and Disposition 2004; 32: 1: 58—65.

7. Mukinda J. T, Syce J. A., Fisher D., Meyer M. Effect of the plant matrix on the uptake of luteolin derivatives-containing Artemisia afira aqueous-extract in caco-2 cells. Ethnopharmacol 2010; 130: 3: 439—449.

8. Jensen P. R, Jenkins K. M., Porter D., Fenical W. Evidence that a new antibiotic flavone glycoside chemically defends the sea grass Talassia

препарата ЛТ, который в настоящее время широко применяется в лечебной практике [14].

testudinum against zoosporic fungi. Appl Environ Microbiol 1998; 64: 4: 1490—1496.

9. Lopez- Lazaro M. Distribution and biological activities of the flavonoid luteolin. Mini- Reviews in Medical Chemistry 2009; 9: 1: 31—59.

10. Harborne J. B. Phytochemistry. 1975; 14: 1147—1155.

11. Попов A. M., Артюков А. А., Кривошапко O. H. и др. Средство, обладающее антиоксидантным, кардиопротекторным, противодиабе-тическим, противовоспалительным, гепатопротекторным, противоопухолевым и противовирусным действием. Приоритетная справка на патент № 2010141686 от 11.10.10.

12. Крылова Н. В., Леонова Т. Н., Майстровская О. С. и др. Изучение активности препарата «Люромарин» in vitro в отношении вируса клещевого энцефалита. Антибиотики и химиотер 2010; 55: 7—8: 17—19.

13. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под ред. Р. У. Хабрие-ва. М.: 2005.

14. Choi H. J., Kim J. H., Lee C. H. et al. Antiviral activity of quercetin 7-rhamnoside against porcine epidemic diarrhea virus. Antiviral Res 2009; 81: 1: 77—81.

15. Kim H. P., Son К. H., ChangH. W., Kang S. S. Anti-inflammatory plant flavonoids and cellular action mechanisms. J Pharmacol Sci 2004; 96: 229—245.