НАБОРЫ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ-ПРАЙМЕРОВ И ЗОНДОВ, БИОЛОГИЧЕСКИЙ МИКРОЧИП И ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ ВИРУСА ГРИППА А И В С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
SETS OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND PROBES, BIOLOGICAL MICROCHIP AND TEST SYSTEM FOR IDENTIFYING AND TYPING INFLUENZA A AND B VIRUS WITH USING THEM

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к наборам олигонуклеотидов-праймеров и зондов, биологическому микрочипу и тест-системе для идентификации и типирования вируса гриппа методом гибридизации с их использованием и может быть использовано в области молекулярной биологии, вирусологии и медицине.
Уровень техники
Вирусы гриппа (инфлюенцы) являются основной причиной респираторных заболеваний человека. В общей структуре инфекционных болезней в России и в мире на долю сезонного гриппа и острых вирусных инфекций дыхательных путей приходится от 75% до 92%. Вирусы гриппа, циркулирующие в природных резервуарах, вызывают ежегодные эпидемии и периодические пандемии.
Вирусы гриппа (ВГ) типов А, В и С являются основными представителями семейства ортомиксовирусов Orthomyxoviridae. Наибольшую эпидемиологическую опасность представляет вирус гриппа типа А (ВГА), поскольку он обладает широким кругом хозяев и способен вызывать не только локальные вспышки и сезонные эпидемии, но и глобальные пандемии, охватывающие весь земной шар. Вирусы гриппа В вызывают эпидемии с легким течением заболевания, вирусы гриппа типа С вызывают редкие спорадические вспышки респираторных болезней, преимущественно у детей.
Для осуществления эпидемиологического контроля и прогнозирования эпидемий необходимо иметь высокочувствительные и надежные методы идентификации и типирования вируса. Существующие в настоящее время методы можно разделить на две основные группы. К первой группе относятся методы, основанные на культивировании вируса и изучении влияния различных препаратов на репликацию вируса и на активность его белков. Ко второй группе методов относятся молекулярно-генетические методы, направленные на определение нуклеотидной последовательности РНК сегментов вируса (Wang R., Taubenberger J.K. Methods for molecular surveillance of influenza. Expert. Rev. Anti Infect. Ther., 2010, v. 8 (5), p. 517-527). В настоящее время “золотым стандартом” при определении вирусного подтипа является выделение вируса гриппа на развивающихся куриных эмбрионах или клеточных культурах с последующей идентификацией иммунологическими методами (иммуноферментный анализ, иммунофлуоресценция) (Stamboulian D., Bonvehi P. E., Nacinovich F. M., Cox N. Influenza Infect. Dis. Clin. North. Am., 2000, v. 14, p. 141-166). Недостатком метода является повышенная биологическая опасность, трудоемкость и длительное время, требуемое для культивирования (от 3 до 7 дней). Использующиеся культуры клеток поддерживают репликацию ограниченного количества клинически важных вирусов.
Ключевым элементом молекулярно-генетических методов является обратная транскрипция, во время которой на матрице РНК синтезируется кДНК, которую далее амплифицируют с использованием специфических праймеров. Визуализация продуктов амплификации осуществляется с помощью электрофореза, флуоресцентных красителей с детекцией в реальном времени, с использованием микроматриц или методом секвенирования (Gavin P. J., Thompson R. B. Jr. Review of rapid diagnostic tests for influenza. Clin. Appl. Immunol. Reviews, 2003, v. 4, p. 51-172). Широко используется детекция методом ПЦР в реальном времени (см., например, Stone B., Burrows J., Schepetiuk S., et al. Rapid detection and simultaneous subtype differentiation of influenza A viruses by real time PCR. J. Virol. Methods, 2004, v. 117, p. 103-112; Phipps L.P., Essen S.C., Brown I.H. Genetic subtyping of influenza A viruses using RT-PCR with a single set of primers based on conserved sequences within the HA2 coding region. J. Virol. Methods, 2004, v. 122 (1), p. 119-122). Данный метод требует постановки отдельных реакций для определения каждой мутации и дорог для рутинного анализа.
Методы анализа ВГ включают также полное или частичное секвенирование вирусных генов. Например, с помощью универсальной праймерной системы амплифицируются любые возможные типы ВГ, затем проводится секвенирование (Hoffmann E., Stech J., Guan Y., Webster R.G., Perez D.R. Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses. Arch. Virol., 2001, v. 146, p. 2275-2289). К недостаткам методов, основанных на секвенировании, относятся их трудоемкость, необходимость дорогостоящего оборудования (например, автоматический секвенатор), а также затрат времени и реагентов на дополнительную очистку продуктов амплификации перед проведением секвенирования.
В последнее время интенсивно развивается технология ДНК-микроматриц (микрочипов), которая позволяет проводить многопараметрический анализ генетического материала. Микроматрицы представляют собой массивы иммобилизованных на твердой фазе олигонуклеотидов, способных специфично связываться с детектируемыми последовательностями. Для идентификации и типирования ВГ известны микроматрицы двух типов: ДНК-микроматрицы высокой плотности и специализированные олигонуклеотидные микроматрицы.
Варианты секвенирующей микроматрицы высокой плотности для анализа ВГ и других респираторных патогенов описаны в работе Lin B., Blaney K.M., Malanoski A.P., Ligler A. et al. Using a resequencing microarray as a multiple respiratory pathogen detection assay. J. Clin. Microbiol., 2007, v. 45, p. 443-452. Имеется патентная заявка на микроматрицу для анализа ряда патогенов в биологическом образце методом секвенирования: Agan B., Hanson E.H., Kruzelock R.P., et al. (США), Resequencing pathogen microarray, патентная заявка WO/2006/088493. Компанией CombiMatrix Corp., США запатентована микроматрица для идентификации ряда патогенов, включающих аденовирусы, энтеровирусы, вирусы гриппа А и В и др. (Microarray for pathogen identification, заявка на патент США № 20070092871). ДНК-зонды для идентификации респираторных патогенов выбраны из первых 500 нп с 5'-конца генов. К недостаткам микроматриц высокой плотности относятся их высокая стоимость, а также необходимость сложного компьютерного обсчета полученных результатов.
Существующие микроматрицы низкой плотности для типирования ВГ отличаются типом используемых олигонуклеотидных зондов, протоколами ПЦР-амплификации перед проведением гибридизации, типом детекции. В большинстве работ микроматрицы изготавливаются путем нанесения растворов олигонуклеотидов на стеклянную или пластиковую подложку, однако имеются примеры микроматриц других типов.
Известна международная заявка WO 2008/054830 (опубл. 2008 г.), а также заявка на патент США №20090124512 Университета шт. Колорадо (США), посвященная методам и инструментам для детекции и типирования ВГ на основе микроматриц низкой плотности (DNA array analysis as a diagnostic for current and emerging strains of influenza). Микроматрицы представляют собой массив ДНК-зондов на твердом носителе. Для их конструирования использовали олигонуклеотидные фрагменты М-сегмента ВГ.
Однако тест-система на основе таких микроматриц не описана.
Имеется несколько заявок на патенты Китая, касающиеся микроматриц низкой плотности на твердой подложке для идентификации и анализа ВГ:
- «Flu/human avian influenza virus detection gene chip and production method and use», заявка CN 101392302. Микроматрица содержит 102 ДНК-зонда для детекции вируса гриппа типа А и типа В, нескольких субтипов ВГА;
- «Detection of influenza A virus epidemic isolates, typing gene chip and using method», заявка CN 101487061. Микроматрица предназначена для детекции эпидемических штаммов гриппа А (всего 4 субтипа);
- «Gene chip for detecting influenza A virus and preparation method and application thereof», заявка CN 101701266. В качестве зондов использованы фрагменты генов НА, NA и белка М вируса.
Однако тест-системы на основе этих микроматриц также не описаны.
В связи с распространением птичьего гриппа сконструированы специализированные микроматрицы для обнаружения вируса этого типа (H1N1): Gall A., Hoffmann B., Harder T., Grund C., et al. Design and validation of a microarray for detection, hemagglutinin subtyping, and pathotyping of avian influenza viruses. J. Clin. Microbiol, 2009, v. 47, p. 327-334; Gall A., Hoffmann B., Harder T., Grund C. et al. Rapid haemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J. Virol. Methods, 2009, v. 160, p. 200-205). В качестве мишени для детекции вируса использовали сайт расщепления гемагглютинина.
Известна международная заявка №WO/2008/086094 (опубл. 2008 г.), касающаяся способа анализа на микроматрицах, а также композиций и реагентов для идентификации вирусов гриппа типа В (“Microarray-based lineage analysis as a diagnostic for current and emerging strains of indluenza B”).
Компанией GENOMICA S.A.U. (Испания) выпускается тест-система CLART PneumoVir для детекции и генотипирования ряда вирусов, вызывающих респираторные инфекции (аденовирусы, некоторые субтипы В, VSR-A, VSR-D и др.) на основе микроматриц низкой плотности, элементы которых располагают на дне пробирки или колодца стандартного иммунологического стрипа. Детекция осуществляется после проведения ОТ-ПЦР с образованием продуктов, меченных биотином, и основана на образовании нерастворимого осадка.
Многопараметрический анализ достигается также при использовании флуоресцентно-маркированных микросфер (мультиплексная технология xMAP, детекция с использованием технологии Luminex). Окрашивание микросфер смешанными в различных соотношениях флуорофорами позволяет получить множество типов микросфер с различными спектральными характеристиками. Олигонуклеотидные зонды расположены на поверхности микросфер. Известна международная заявка №WO/2008/143450 (опубл. 2008 г.), а также заявка на патент США №20090088331 американских исследователей, посвященная использованию данной технологии для одновременного субтипирования ВГА и детекции ряда респираторных патогенов (Multiplex detection of respiratory pathogens).
Известны также несколько заявок на патенты Китая:
- CN 101392298 (Method for detecting flu and H5N1 avian influenza virus by using liquid chip);
- CN 101717830 (Method for detecting influenza virus by liquid phase chip).
Для детекции результатов используется проточный флуориметр.
К недостаткам метода относится сложность и высокая стоимость синтеза меченых микросфер.
Компанией InDevR, Inc. (США) разрабатываются микроматрицы для субтипирования ВГ, использующие метод колориметрической детекции результатов гибридизации (Moulton K.R., Taylor A.W., Rowlen K.L., Dawson E.D. AmpliPHOX colorimetric detection on a DNA microarray for influenza. J. Vis. Exp., 2011, e-pub: June 9; (52), pii: 2682). Детекция основана на взаимодействии микроматрицы с исследуемой биотинилированной ДНК, которая связывается с содержащим стрептавидин конъюгатом (ampliTAG). Далее в ячейках, содержащих ampliTAG, происходит полимеризация под действием света и окрашивание (визуализация). Чувствительность детекции уступает флуоресцентному методу.
В Институте молекулярной биологии РАН (Россия) разработан метод молекулярного типирования ВГА, в основе которого лежит биологический микрочип с трехмерными гелевыми элементами, содержащими набор дискриминирующих олигонуклеотидных зондов (Fesenko E.E., Kireyev D.E., Gryadunov D.A., Mikhailovich V.M., et al. Oligonucleotide microchip for subtyping of influenza A virus. Influenza Other Respi Viruses, 2007, v. 1 (3), p. 121-129). Процедура анализа включает двухстадийную амплификацию фрагментов генов НА и NA с последующей гибридизацией на микрочипе и флуоресцентной детекцией.
Однако тест-система на основе гидрогелевых микрочипов не описана.
Наиболее близким аналогом (прототипом) являются олигонуклеотидные микрочипы для субтипирования ВГА, которые создают в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и получают путем нанесения растворов олигонуклеотидов на стеклянный слайд (Рябинин В.А., Костина Е.В., Неверов А.А., Максакова Г.А., Синяков А.Н. Типирование гемагглютинина вируса гриппа А с использованием гибридизационного микрочипа. Биоорг. хим., 2010, т. 36 (6), с. 688-699; Ryabinin V.A., Kostina E.V., Maksakova G.A., Neverov A.A., Chumakov K.M., Sinyakov A.N. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One, 2011, v.6 (4), e17529). В 2012 г. получен патент РФ №2470076 «Способ выбора ДНК-зондов для микрочиповой диагностики, биочип и способ типирования гена нейраминидазы и гемагглютинина вируса гриппа А». Способ выбора ДНК-зондов на основе белковых последовательностей вируса и метод определения 9 субтипов гена нейраминидазы ВГА заключается в проведении двухэтапной ПЦР кДНК вируса с последующей гибридизацией полученных флуоресцентно-меченых ампликонов с ДНК-микрочипом.
Однако данный способ касается только определения субтипов нейраминидазы ВГА, а тест-система на основе данного биочипа не описана.
Анализ опубликованной патентной и научно-технической информации по данной теме показал, что, несмотря на широкое использование молекулярно-генетических методов для детекции и типирования ВГ, включая использование в биочипах микроматриц различного типа, не известны тест-системы, которые позволяли бы проводить все стадии анализа биологического (клинического) образца и использовали бы доступный и простой способ проведения анализа, обладающего высокой специфичностью и низкой стоимостью.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом заявляемого изобретения является создание тест-системы для идентификации и типирования вируса гриппа с использованием оригинальных наборов олигонуклеотидов-праймеров и зондов и биологического микрочипа, обеспечивающей более доступный и простой метод анализа с высокой специфичностью и низкой стоимостью.
Указанный технический результат достигается созданием:
- набора олигонуклеотидов-праймеров, используемых в тест-системе для идентификации и типирования вируса гриппа, нуклеотидные последовательности Seq 1 - Seq 8 которых приведены в таблице 1 и в приложении;
- набора олигонуклеотидных зондов, используемых для изготовления биологического микрочипа, входящего в состав тест-системы для идентификации и типирования вируса гриппа, нуклеотидные последовательности Seq 9 - Seq 14 которых приведены в таблице 1 и в приложении;
- биологического микрочипа (биочипа), используемого в тест-системе для идентификации и типирования вируса гриппа, представляющего собой пластинку-носитель, на поверхности которой сформирована микроматрица с отдельными иммобилизованными элементами, содержащими олигонуклеотидные зонды, нуклеотидные последовательности которых охарактеризованы в п.2 формулы;
- тест-системы для идентификации и типирования вируса гриппа методом гибридизации на микроматрице биочипа, охарактеризованного в п.3 формулы, содержащей элементы с олигонуклеотидными зондами, включающей наборы реагентов для последовательного проведения всех стадий анализа биологического материала человека (отделяемое носоглотки, мазки из зева и полости носа) от выделения РНК вируса гриппа до регистрации результатов анализа, а именно:
а) выделение геномной РНК вируса гриппа из биологического материала человека: отделяемое носоглотки, мазки из зева и полости носа;
б) ПЦР-амплификация, совмещенная с обратной транскрипцией, с использованием специфических праймеров, с образованием флуоресцентно-меченных фрагментов генома вируса гриппа;
в) гибридизация фрагментов ДНК, полученных на стадии (б), на микроматрице, содержащей элементы с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, последовательности которых комплементарны последовательностям вирусов гриппа А и В, позволяющим идентифицировать вирус гриппа и определить его тип.
Наборы реагентов заявляемой тест-системы для последовательного проведения всех стадий анализа биологического материала человека включают:
- набор реагентов для выделения РНК вируса гриппа из биологического материала человека на стадии (а); набор содержит раствор для лизиса вирусных частиц, реагент для осаждения (преципитации) нуклеиновых кислот, буферные растворы для промывки, буферный раствор для растворения нуклеиновых кислот;
- набор реагентов для проведения ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (стадия (б)), с образованием флуоресцентно-меченных фрагментов генома вируса гриппа, содержащий олигонуклеотиды-праймеры, нуклеотидные последовательности которых охарактеризованы в п.1 формулы; растворы ферментов для проведения обратной транскрипции и амплификации, раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, раствор дезоксинуклеозидтрифосфата, содержащего флуоресцентную метку, буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции, буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции, и, при необходимости, минеральное масло. В результате ПЦР образуются флуоресцентно-меченные фрагменты ДНК, которые далее используются для проведения гибридизации;
- набор реагентов для проведения гибридизации на стадии (в), включающий биочип по п.3 формулы, имеющий микроматрицу, содержащую элементы с олигонуклеотидными зондами, нуклеотидные последовательности которых охарактеризованы в п.2 формулы и которые комплементарны специфическим последовательностям вирусов гриппа А и В, позволяющим идентифицировать вирус гриппа и определить тип вируса, и раствор для проведения гибридизации;
- при необходимости, тест-система включает положительный контрольный образец (образцы) - РНК штамма вируса гриппа А и/или В, отрицательный контрольный образец, не содержащий РНК вируса гриппа.
Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров и зондов, использованных в тест-системе для идентификации и типирования вируса гриппа
№
Праймер*/зонд**
Последовательность
Seq 1
праймер
5'-CTTCTAACCGAGGT(C/Т)GAAACGTA(C/Т)GTTCT(C/Т)TCTAT-3'
Seq 2
праймер
5'-CTTCTAACCGAGGT(C/Т)GAAA-3'
Seq 3
праймер
5'-TCCATGAATGG(А/G)AATGG(А/G/Т)GA(C/Т)CC(А/G)AA(C/Т)AA-3'
Seq 4
праймер
5'-TCCATGAATGG(А/G)AATGG(А/G/Т)-3'
Seq 5
праймер
5'-TTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTT-3'
Seq 6
праймер
5'-TTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTT-3'
Seq 7
праймер
5'-AAGCATATAGA(А/G)GC(А/G)CCAATTAGTGCTTT-3'
Seq 8
праймер
5'-AAGCATATAGA(А/G)GC(А/G)CCA-3'
Seq 9
зонд
5'-ATGGA(А/G)TGGHTAAAGACAAGAC-3'
Seq 10
зонд
5'-CACCTCTGACTAA(А/G)GG(А/G)AT(C/Т)TT-3'
Seq 11
зонд
5'-GG(А/G)TTTGT(А/G)TT(C/Т)ACGCTCAC-3'
Seq 12
зонд
5'-TGACCTAGACTCTGCCTTG-3'
Seq 13
зонд
5'-CAGAAGATGGAGAAGGCAAA-3'
Seq 14
зонд
5'-CAGAACTAGCAGAAAAATTACACTG-3'
Примечание:
* в составе набора реагентов для проведения ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией;
** закреплены в элементах микроматрицы, входящей в состав набора реагентов для проведения гибридизации.
Заявляемая в данном техническом решении тест-система содержит реагенты для проведения всех стадий анализа биологического материала от выделения РНК вируса гриппа до регистрации результатов анализа. В тест-системе используются уникальные, ранее не описанные олигонуклеотидные зонды и праймеры, которые обеспечивают высокую чувствительность и специфичность анализа. Идентификация и типирование ВГ осуществляются методом гибридизации на микроматрице, содержащей элементы с олигонуклеотидными зондами.
Краткое описание фигур
Фигура 1 представляет структуру биочипа с микроматрицей, содержащей элементы с олигонуклеотидными зондами, для проведения гибридизации при идентификации вируса гриппа и определении его типа.
Фигура 2 представляет флуоресцентные изображения микроматрицы биочипа, содержащей элементы с олигонуклеотидными зондами, показанной на Фиг. 1, после проведения всех стадий анализа с использованием тест-системы:
а) идентифицирован вирус гриппа А;
б) идентифицирован вирус гриппа В;
в) вирус гриппа отсутствует.
Осуществление изобретения
Изобретение касается наборов олигонуклеотидных праймеров и зондов, биологического микрочипа и на их основе тест-системы для идентификации и типирования вируса гриппа в биологическом материале человека: отделяемое носоглотки, мазки из зева и полости носа. Тест-система содержит наборы реагентов для последовательного осуществления всех стадий анализа от выделения РНК вируса гриппа из биологического материала до флуоресцентной регистрации результатов анализа:
а) выделение геномной РНК вируса гриппа;
б) ПЦР-амплификация, совмещенная с обратной транскрипцией, с использованием специфических праймеров, с образованием флуоресцентно-меченных фрагментов генома вируса гриппа;
в) гибридизация фрагментов ДНК, полученных на стадии (б), на микроматрице, содержащей элементы с иммобилизованными олигонуклеотидными зондами, последовательности которых комплементарны последовательностям вирусов гриппа А и В, позволяющим идентифицировать вирус гриппа и определить его тип вируса.
Набор реагентов для выделения РНК вируса гриппа из биологического материала человека на стадии (а) может включать раствор для лизиса вирусных частиц, реагент для осаждения (преципитации) нуклеиновых кислот, буферные растворы для промывки, буферный раствор для растворения нуклеиновых кислот. В состав раствора для лизиса входят реагенты для разрушения оболочки вирусных частиц, например, хаотропный агент (гуанидинхлорид, гуанидинтиоцианат и др.), детергент (Triton X-100, N-лаурилсаркозил и др., но не ограничиваясь ими), компоненты, регулирующие рН раствора. Реагент для осаждения нуклеиновых кислот может включать, например, изопропанол, этанол, но не ограничиваясь ими, а также соосадитель (например, линейный полиакриламид). В растворах для промывки используются этанол, ацетон, но не ограничиваясь ими.
Набор реагентов для проведения ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (стадия (б)), включает раствор праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности Seq 1 -Seq 8 (Таблица 1 и приложение), а также может включать:
- растворы ферментов для проведения обратной транскрипции и амплификации (фермент обратная транскриптаза из различных источников, а также другие ферменты, обладающие аналогичной активностью, фермент ДНК-полимераза или ее аналоги, например термостабильная Taq-полимераза, Pfu-полимераза и другие);
- раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ;
- раствор дезоксинуклеозидтрифосфа, содержащего флуоресцентную метку; в качестве метки используется любое соединение, позволяющее осуществлять флуоресцентную детекцию (цианиновые красители Cy3, Cy5, Cy7, Техасский красный, флуоресцеин и др.);
- буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции;
при необходимости, минеральное масло; минеральное масло добавляется для предохранения реакционной смеси от испарения при амплификации, если для проведения ПЦР используется ДНК-амплификатор без подогрева крышки.
В результате ПЦР образуются флуоресцентно-меченные фрагменты ДНК, которые далее используются для проведения гибридизации.
Набор для проведения стадии гибридизации (стадия (в)) фрагментов ДНК, полученных на стадии (б), включает
- биочип с микроматрицей, содержащей элементы с олигонуклеотидными зондами, имеющие нуклеотидные последовательности Seq 9 - Seq 14 (Таблица 1 и приложение), комплементарные специфическим последовательностям вирусов гриппа А и В, позволяющим идентифицировать вирус гриппа и определить его тип;
- раствор для проведения гибридизации.
Конструкция биочипа с микроматрицей представлена на фиг. 1. В качестве микроматрицы используются стеклянные или пластиковые подложки, на которых закреплены олигонуклеотидные зонды. Олигонуклеотиды могут быть закреплены в элементах микроматрицы любым способом: адсорбированы, путем образования ковалентных связей, связаны через гиброфобные взаимодействия, через комплексообразование и т.д. Один из способов получение микроматриц, входящих в состав тест-системы, приведен в Примере 1.
Зонды, закрепленные в элементах микроматрицы (фиг. 1), имеют следующую нуклеотидную последовательность:
для идентификации гриппа А:
1
А - 5'-ATGGA(А/G)TGGHTAAAGACAAGAC-3' (Seq 9),
2
А - 5'-CACCTCTGACTAA(А/G)GG(А/G)AT(C/Т)TT-3' (Seq 10),
3
А -5'-GG(А/G)TTTGT(А/G)TT(C/Т)ACGCTCAC-3' (Seq 11),
для идентификации гриппа В:
1
B -5'-TGACCTAGACTCTGCCTTG-3' (Seq 12),
2
B -5'-CAGAAGATGGAGAAGGCAAA-3' (Seq 13),
3
B -5'-CAGAACTAGCAGAAAAATTACACTG-3' (Seq 14),
К - контрольные элементы, содержащие флуоресцентную метку (Cy 5).
Для проведения ПЦР и закрепления (иммобилизации) на микроматрице используются уникальные, ранее не описанные олигонуклеотидные праймеры и зонды (соответственно), которые обеспечивают высокую чувствительность и специфичность идентификации и типирования ВГ.
В качестве раствора для гибридизации используется любой раствор, пригодный для проведения гибридизации ДНК: раствор, содержащий формамид, раствор Денхардта и др. (см., например, J. Sambrook and D.W. Russell, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. 2001, Appendix 1).
При необходимости, для проверки работоспособности тест-системы в ее состав включают положительный и отрицательный контрольные образцы. В качестве положительного контрольного образца используют РНК любого штамма вируса гриппа А или любого штамма вируса гриппа В; отрицательный контрольный образец не содержит РНК вируса гриппа.
Конкретный пример тест-системы для идентификации и типирования ВГ приведен в Примере 2. Процедура идентификации и типирования ВГ с использованием тест-системы, описанной в Примере 1, приведена в Примере 3. Пример 4 и Фиг. 2 иллюстрируют результаты анализа с использованием заявляемой тест-системы.
Примеры
Пример 1. Получение биочипа с микроматрицей, содержащей элементы с олигонуклеотидными зондами, используемого в тест-системе для идентификации и типирования вируса гриппа
Структура биочипа с микроматрицей для проведения гибридизации при идентификации вируса гриппа и определении его типа приведена на Фиг. 1.
1
3
1
3
Олигонуклеотиды для нанесения на микроматрицу, содержащие 3'-концевую аминогруппу, синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA (Applied Biosystems, США), спейсер С-7 Amino-Modifier C7 CPG 500 (Glen Research, США) и очищали с помощью HPLC на Supelco LC-18 колонке. Растворы олигонуклеотидных зондов А - А (Seq 9 - Seq 11), B - B (Seq 12 - Seq 14) (Таблица 1) помещали в лунки 384-луночного планшета. Стеклянные слайды (Corning 2947 Micro Slides, Corning Glass Works, Corning, NY) обрабатывали раствором 5% Bind Silane (Amersham Biosciences) в толуоле, промывали в этиловом спирте, воде и высушивали в беспылевых условиях. Растворы из лунок планшета наносили по 1 нл на поверхность обработанных слайдов с помощью робота QArray (“Genetix”, Великобритания). После нанесения слайды инкубировали при комнатной температуре в течение ночи и промывали дистиллированной водой. Избыток воды удаляли центрифугированием при 128 g в течение 3 мин. Получали микроматрицы с элементами диаметром около 75 мкм, расстояние между центрами элементов - 250 мкм.
Пример 2. Тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа
Тест-система включает следующие компоненты:
а) набор реагентов для выделения геномной РНК вируса гриппа из биологического материала человека:
- раствор для лизиса (150 мМ натрий-ацетатный буфер, рН 5,2, 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ ЭДТА, 5% Triton X-100, 0,1 М b-MeEtOH, 0,05% линейный полиакриламид) - 1 флакон (20 мл);
- реагент для осаждения нуклеиновых кислот (150 мМ натрий-ацетатный буфер, рН 5,2, 90 % изопропанол) - 1 флакон (25 мл);
- промывочный раствор 1 (70% этанол) - 1 флакон (30 мл);
- промывочный раствор 2 (70% ацетон) - 1 флакон (20 мл);
- буфер для растворения нуклеиновых кислот (150 мМ натрий-ацетатный буфер, рН 7,0) - 1 пробирка (5 мл);
б) набор реагентов для проведения ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией:
- водный раствор праймеров с нуклеотидными последовательностями Seq 1 - Seq 8 (Таблица 1) с концентрацией 1 пмоль/мкл каждый - 1 пробирка (0,06 мл);
- водный раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ с концентрацией 2 мМ каждый - 1 пробирка (1,0 мл);
- раствор флуоресцентного субстрата (конъюгат дезоксиуридинтрифосфата с цианиновым 5 (дУТФ-Cy 5)) - 1 пробирка (0,03 мл);
- раствор обратной транскриптазы с активностью 100 ед./мкл в буфере для хранения (10 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,5, 0,1 мМ EDTA, 0,2 М NaCl; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 40 % глицерин) - 1 пробирка (0,04 мл);
- раствор термостабильной ДНК-полимеразы Thermus aquaticus с активностью 5 ед./мкл в буфере для хранения (20 мМ трис-HCl, рН 8,0, 100 мМ KCl, 1 мМ дитиотреитол, 0,1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин-20, 50 % глицерин) - 1 пробирка (0,15 мл);
4
2
4
2
- раствор для проведения ПЦР (650 мМ трис-HCl, pH 8,8, 200 мМ (NH)SO, 20 мМ MgCl, 0,2% Твин 20)) - 1 пробирка (1,0 мл);
- вода деионизованная, очищенная от ДНК-аз - 1 флакон (5,0 мл);
- минеральное вазелиновое масло - 1 флакон (15 мл);
в) набор реагентов для проведения гибридизации:
- биочип с микроматрицей, содержащей элементы с олигонуклеотидными зондами, имеющие нуклеотидные последовательности Seq 9 - Seq 14 (Таблица 1), полученные, как описано в Примере 1, - 50 штук для проведения 50 анализов;
- раствор для проведения гибридизации (15 мМ натрий-цитратный буфер, pH 7,0, 150 мМ NaCl, 0,04% поливинилпиролидон, 0,04% фиколл тип 400, 0,04 % бычий сывороточный альбумин, 600 мкг/мл ДНК спермы лосося, 0, 1% Твин 20);
г) контрольные материалы:
- лиофильно высушенная РНК вируса гриппа А, штамм A/Vladivostok/01/2009 (H1N1-пандемический) (положительный контрольный образец) - 1 пробирка (1 нг);
- лиофильно высушенная РНК вируса гриппа В, штамм B/Brisbane/60/2008 (положительный контрольный образец) - 1 пробирка (1 нг);
- лиофильно высушенная тотальная РНК клеток МДСК, перевиваемая культура клеток почки собаки (отрицательный контрольный образец) - 1 пробирка (1 нг);
д) инструкция для пользователя.
Пример 3. Процедура идентификации и типирования ВГ с использованием тест-системы, описанной в примере 2
1. Выделение геномной РНК из образцов биологического материал
1.1. В пробирки вместимостью 1,5 мл поместить по 300 мкл раствора для лизиса и добавить по 100 мкл анализируемых образцов.
1.2. Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе в течение 3-5 с и прогреть 15 мин при температуре + 65°С в термостате.
1.3. Осадить конденсат центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 с. В каждую пробирку добавить 400 мкл реагента для осаждения нуклеиновых кислот и перемешать пробы на вортексе в течение 3-5 с.
1.4. Центрифугировать пробирки при 14000 об/мин в течение 15 мин.
1.5. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки). Добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора 1, плотно закрыть крышки и 3-5 раз аккуратно перевернуть пробирки.
1.6. Центрифугировать пробирки при 14000 об/мин в течение 5 мин.
1.7. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки). Добавить к осадку 300 мкл промывочного раствора 2, плотно закрыть крышки и 3-5 раз аккуратно перевернуть пробирки.
1.8. Центрифугировать пробирки при 14000 об/мин в течение 5 мин.
1.9. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость (отдельным наконечником из каждой пробирки).
1.10. Открыть крышки пробирок и высушить осадки при температуре + 65°С в течение 5 мин.
1.11. Добавить в пробирки по 50 мкл буфера для растворения нуклеиновых кислот и прогреть пробы при температуре +65°С в течение 10 мин.
1.12. Осадить капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в течение 3-5 с. Полученные препараты РНК использовать для постановки реакции обратной транскрипции.
2. Проведение ПЦР-амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией
2.1. Подготовить контрольные материалы. В пробирки с лиофильно высушенными контрольными материалами добавить по 100 мкл раствора деионизованной воды. Полученные растворы перемешать на вортексе, осадить капли кратковременным центрифугированием.
2.2. Приготовить реакционную смесь для проведения ОТ-ПЦР. В стерильную пробирку вместимостью 0,5-1,5 мл (в зависимости от числа анализируемых образцов N) внести следующие компоненты набора в указанных ниже последовательности и количестве:
вода деионизованная
15,3х(N+1) мкл
раствор для проведения ПЦР
3,0х(N+1) мкл
раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов
3,0х(N+1) мкл
раствор праймеров
1,0х(N+1) мкл
раствор обратной транскриптазы
1,0х(N+1) мкл
раствор флуоресцентного субстрата
0,2х(N+1) мкл
раствор ДНК-полимеразы
1,5х(N+1) мкл
Общий объем
25х(N+1) мкл
2.3. Тщательно перемешать полученную реакционную смесь и внести по 25 мкл в пробирки, подготовленные для проведения ПЦР. Если используется амплификатор без подогрева крышки, в каждую пробирку внести по 30 мкл минерального масла для предохранения реакционной смеси от испарения при амплификации.
2.4. Внести по 5 мкл анализируемых образцов кДНК в пробирки с реакционной смесью. Удалить со стенок пробирок капли смеси центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 с при 1000 g.
2.5. Поместить пробирки в ДНК-амплификатор и провести ОТ-ПЦР по программе, указанной в Таблице 2.
Растворы после ПЦР использовать для проведения гибридизации на микроматрицах, содержащих элементы с олигонуклеотидными зондами.
3. Проведение гибридизации на микроматрицах, содержащих элементы с олигонуклеотидными зондами. Использовать микроматрицы, полученные по Примеру 1.
3.1. В пробирки вместимостью 0,5 мл поместить по 10 мкл растворов после проведения ПЦР. Если при амплификации использовалось вазелиновое масло ММ, следует избегать его попадания в наконечник пипетки.
Таблица 2. Режим проведения ОТ-ПЦР
№
Наименование операции
Температура, <sup>о</sup>С
Время инкубации
Количество циклов
1
Обратная транскрипция
37
30 мин
1
2
Предварительная денатурация ДНК
94
5 мин
1
3
Денатурация ДНК
94
20 с
44
Отжиг праймеров
50
30 с
Удлинение праймеров
72
30 с
4
Завершающая инкубация
72
3 мин
1
3.2. Добавить по 10 мкл раствора для проведения гибридизации и перемешать на вортексе в течение 5 с. Удалить со стенок пробирок капли смеси центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 с при 1000 g.
3.3. Смеси из пробирок нанести на микроматрицы и инкубировать в закрытом суховоздушном термостате при температуре +37°С в течение 1-1,5 ч.
3.4. По окончании гибридизации тщательно промыть микроматрицы дистиллированной водой.
3.5. Высушить микроматрицы в струе воздуха и использовать для учета результатов гибридизации.
Пример 4. Результаты анализа с использованием биочипа и тест-системы для идентификации и типирования вируса гриппа
С использованием тест-системы было проанализировано 200 образцов биологического материала, в которых независимым методом было установлено наличие или отсутствие ВГ. Результаты гибридизации регистрировали с использованием флуоресцентного микроскопа, снабженного CCD камерой и компьютером с соответствующим программным обеспечением. Сигналы от красителя цианинового 5 получали, используя фильтры 649/670 нм (возбуждение/флуоресценция). Флуоресцентные изображения микроматриц, содержащих элементы с олигонуклеотидными зондами, после проведения всех стадий анализа с использованием тест-системы по Примеру 3, показаны на Фиг. 2. Общее время проведения анализа с учетом всех стадий составило не более 5 час.
Диагностическая специфичность идентификации вируса гриппа и определения его типа (грипп А или грипп В), рассчитанная по формуле (1), составила 100%:
Диагностическая чувствительность идентификации вируса гриппа и определения его типа (грипп А или грипп В), рассчитанная по формуле (2), составила 98,5%:
Аналитическую чувствительность метода с использованием тест-системы по Примеру 2 - минимальное количество РНК вируса гриппа в образце, при котором определяется тип вируса - определяли методом последовательных разбавлений контрольных образцов, содержащих РНК вирусов гриппа А и В. Аналитическая чувствительность составила 500 геном-экв. для определения ВГ типа А и 500 геном-экв. для определения ВГ типа В.
Приложение
<110> Закрытое акционерное общество «ИмДи».
<120> Наборы олигонуклеотидов-праймеров и зондов, биологический микрочип и тест-система для идентификации и типирования вируса гриппа с их использованием
<210> 3
<223> Последовательности олигонуклеотидов специфические к вирусу гриппа
<400> 1
Олигонуклеотиды-праймеры 5`→3`
5'-CTTCTAACCGAGGT(C/Т)GAAACGTA(C/Т)GTTCT(C/Т)TCTAT-3' 32 н
5'-CTTCTAACCGAGGT(C/Т)GAAA-3' 18 н
5'-TCCATGAATGG(А/G)AATGG(А/G/Т)GA(C/Т)CC(А/G)AA(C/Т)AA-3' 24 н
5'-TCCATGAATGG(А/G)AATGG(А/G/Т)-3' 16 н
5'-TTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTT-3' 27 н
5'-TTGGAGACACAATTGCCTACCTGCTTT-3' 27 н
5'-AAGCATATAGA(А/G)GC(А/G)CCAATTAGTGCTTT-3' 27 н
5'-AAGCATATAGA(А/G)GC(А/G)CCA-3' 16 н
<400> 2
Олигонуклеотиды -зонды для идентификации гриппа типа А 5`→3:
5'-ATGGA(А/G)TGGHTAAAGACAAGAC-3' 21 н
5'-CACCTCTGACTAA(А/G)GG(А/G)AT(C/Т)TT-3' 19 н
5'-GG(А/G)TTTGT(А/G)TT(C/Т)ACGCTCAC-3' 17 н
<400> 3
Олигонуклеотиды -зонды для идентификации гриппа типа В 5`→3:
5'-TGACCTAGACTCTGCCTTG-3' 19 н
5'-CAGAAGATGGAGAAGGCAAA-3' 20 н
5'-CAGAACTAGCAGAAAAATTACACTG-3' 25 н