КОНТРОЛИРУЕМАЯ ПИЩЕВЫМ РАЦИОНОМ ЭКСПРЕССИЯ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩЕЙ НУКЛЕАЗУ CAS9, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
FOOD RATION-CONTROLLED EXPRESSION OF NUCLEIC ACID ENCODING Cas9 NUCLEASE, AND ITS APPLICATIONS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к нуклеиновой кислоте для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas9, у индивидуума.
В частности, экспрессия нуклеиновой кислоты может контролироваться при потреблении рациона с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Редактирование генома с помощью нацеливаемых нуклеаз представляет собой новую технологию точной модификации генома организмов от бактерий до растений и животных, включая людей. Его привлекательность заключается в том, что он может использоваться практически для всех организмов, в которых направленная модификация генома не была возможна при использовании других способов.
Последние методы направленной модификации генома с использованием, например, нуклеаз с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторных нуклеаз, подобных транскрипционному активатору (TALEN), и мегануклеаз позволили научному сообществу создавать перманентные мутации путем введения двухцепочечных разрывов для активации путей восстановления.
Способность сконструированных нуклеаз, таких как ZFN и TALEN, генерировать двухцепочечные разрывы в ДНК в желаемых позициях в геноме позволяет надеяться на возможность переноса локус-направленной геномной инженерии в клиническую практику. Однако эти подходы являются дорогостоящими и времязатратными для инженеров, что ограничивает их массовое применение, особенно для крупномасштабных исследований с высокой пропускной способностью.
Относительно недавно значительный интерес вызвал новый инструмент, основанный на совершенно отличной и специфической системе, а именно, бактериальной нуклеазе CRISPR-ассоциированный белок-9 (Cas9) из Streptococcus pyogenes.
В отличие от других методов редактирования генов он является дешевым, быстрым и простым в осуществлении, и он быстро стал известен лабораториям по всему миру. Достоинство этой системы заключается в выполнении целенаправленных, высокоэффективных изменений геномной последовательности и экспрессии генов, которые, без сомнения, трансформируют все отрасли биотехнологии и стимулируют разработку новых молекулярных терапевтических средств для лечения болезней человека.
После первоначальной демонстрации в 2012 году система CRISPR/Cas9 получила широкое распространение. Эта система уже была успешно использована в отношении важных генов во многих клеточных линиях и организмах, включая человека (Mali et al., 2013, Science, Vol. 339: 823-826), бактерий (Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop.Dis., Vol. 8: e2671), рыбу данио-рерио (Hwang et al., 2013, PLoS One, Vol. 8: e68708), нематоду С.elegans (Hai et al., 2014 Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11), растения (Mali et al., 2013, Science, Vol. 339: 823-826), тропическую шпорцевую лягушку Xenopus tropicalis (Guo et al., 2014, Development, Vol. 141: 707-714), дрожжи (DiCarlo et al., 2013, Nucleic Acids Res., Vol. 41: 4336-4343), дрозофилу (Gratz et al., 2014 Genetics, doi:10.1534/genetics.113.160713), обезьян (Niu et al., 2014, Cell, Vol. 156: 836-843), кроликов (Yang et al., 2014, J. Mol. Cell Biol., Vol. 6: 97-99), свиней (Hai et al, 2014, Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11), крыс (Ma et al., 2014, Cell Res., Vol. 24: 122-125) и мышей (Mashiko et al., 2014, Dev. Growth Differ. Vol. 56: 122-129).
Кроме того, редактирование генома было успешно применено для лечения ряда заболеваний на доклиническом уровне, а также в клинических испытаниях I фазы (см. обзор за авт. Сох et al., Nat Med. 2015 Feb; 21(2):121-31). При оценке возможности практической реализации терапии, основанной на редактировании генома, сначала необходимо четко установить терапевтический эффект желаемого генетического изменения. Впоследствии успех данной стратегии будет зависеть от легкости, с которой достигается «порог» терапевтической модификации - критерия, обусловленного пригодностью редактируемых клеток, пути восстановления DSB (двухцепочечных разрывов), используемого для редактирования генома, и эффективности доставки молекул для редактирования генома в целевые типы клеток.
Однако, несмотря на весь свой потенциал, технология CRISPR-Cas9 в настоящее время серьезно ограничена нецелевым действием, связанным с процессом редактирования (например, редактирование генома в нежелательном месте в геноме), и иммуногенностью бактериальной нуклеазы Cas9.
На сегодняшний день проблема нецелевого действия представляется присущей особенностям механизма, обуславливающим активности нуклеаз, как подчеркивает Porteus (Genome Biology, 2015, 16:286). Porteus считает, что «важным соображением при определении подходящей стратегии доставки является то, что редактирование генома, в отличие от стратегий увеличения гена, - это подход «удар-отход»». Кроме того, Porteus полагает, что «устойчивая экспрессия нуклеазы не только не является нужной, но ее следует избегать: продолжающаяся экспрессия нуклеазы увеличивает вероятность пагубной неустойчивости генома и может либо скомпрометировать пригодность отредактированной клетки, либо спровоцировать трансформацию подвергнутой воздействию клетки». Наконец, Porteus приходит к выводу, что «для терапевтических применений, требующих редактирования клеток in vivo, задача является еще более серьезной, и решение пока не найдено».
Простое средство для борьбы с нецелевым действием, которое может быть пагубным в некоторых областях применения, заключается в идентификации/разработке новых нуклеаз с большей специфичностью.
Следовательно, в данной области техники существует потребность в обеспечении новых точно настраиваемых систем контролируемой экспрессии для экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, в частности, нуклеазу Cas9, у индивидуума, в частности, для безопасных методов генной терапии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один из аспектов изобретения относится к нуклеиновой кислоте для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, у индивидуума, содержащей:
- регуляторный полинуклеотид, содержащий минимальный промотор и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту AARE (элемент отклика на аминокислоту), где указанный регуляторный полинуклеотид активируется у индивидуума при потреблении рациона с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты; и
- нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазу Cas, которая находится под контролем указанного регуляторного полинуклеотида.
Еще один аспект изобретения относится к нуклеиново-кислотному вектору для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, содержащему нуклеиновую кислоту, как определено в настоящем документе.
Еще один аспект изобретения относится к частице для доставки, содержащей нуклеиновую кислоту или нуклеиново-кислотный вектор, как определено в настоящем документе.
В еще одном аспекте изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей (I) нуклеиновую кислоту, или нуклеиново-кислотный вектор, или частицу для доставки, как определено в настоящем документе, и (II) фармацевтически приемлемый носитель.
В еще одном аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту или нуклеиново-кислотный вектор, как определено в настоящем документе.
Еще один аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе, для применения в качестве лекарственного средства.
В еще одном аспекте изобретение также относится к фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе, для применения в качестве активного агента для редактирования генома в по меньшей мере одной целевой клетке.
В одном из аспектов изобретение относится к способу редактирования генома в по меньшей мере одной целевой клетке, включающему по меньшей мере стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе.
В еще одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе, для применения в качестве активного агента для предупреждения и/или лечения заболевания.
Один аспект изобретения также относится к способу предупреждения и/или лечения заболевания, включающему по меньшей мере стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе.
Наконец, в еще одном аспекте изобретение относится к набору для лечения и/или предупреждения заболевания, содержащему:
- фармацевтическую композицию, как определено в настоящем документе, и
- фармацевтически активное соединение.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
ФИГ. 1: Схема, иллюстрирующая сигнальный путь GCN2-eIF2α-ATF4. В ответ на нехватку ЕАА активированная GCN2 фосфорилирует eIF2α, что приводит к повышающей регуляции фактора транскрипции ATF4 и его рекрутингу в последовательности AARE для индукции экспрессии целевого гена.
ФИГ. 2: Схема, иллюстрирующая изображение конструкции AARE-нуклеаза Cas: эта конструкция состоит из шести копий AARE из промотора Trb3 (черные пятна) и минимального промотора Tk.
ФИГ. 3: Схема, иллюстрирующая плазмиду pTrip-2XAARE-NLS-FLAG-CAS9. pTK обозначает положение минимального промотора TK; 2Х AARE обозначает положение нуклеиновых кислот AARE; стрелка «NLS-FLAG-CAS9» обозначает положение нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas9; стрелка «AmpR» обозначает нуклеиновую кислоту, кодирующую устойчивость к ампициллину.
ФИГ. 4: Схема, иллюстрирующая плазмиду pTRIP blast_U6 AAVS1_2xAARE-Cas9-Flag-RFP. Нижняя секция является продолжением верхней. Сайт рестрикции EcoRl в правом конце верхней секции относится к сайту рестрикции EcoRl в левом конце нижней секции.
ФИГ. 5: Графики, иллюстрирующие экспрессию Cas9 в клетках 293Т при индукции в момент Т0 с помощью безлейциновой среды (293Т-С9 Leu-; сплошная кривая), или среды, содержащей туникамицин (293Т-С9 TU; пунктирная кривая). Индукцию проводят в момент Т0 и прекращают через 24 ч. За экспрессией наблюдают через 24 ч и 48 ч после прекращения индукции, т.е. в моменты Т0+48 ч и Т0+72 ч, соответственно. На оси абсцисс отложено время (в часах), а на оси ординат - интенсивность полосы для нуклеазы Cas9, и, следовательно, она характеризует экспрессию Cas9. Максимальная экспрессия Cas9 наблюдается через 24 ч после индукции и условно представляет собой 100% экспрессию.
ФИГ. 6: Графики, иллюстрирующие интеграцию донорной ДНК (Do) в сайт AAVS1 генома клеток 293Т. Клетки 293Т трансфицировали плазмидой «pTRIP blast_U6 AAVSl_2xAARE-Cas9-flag-RFP» (С9), а также донорной плазмидой, содержащей кассету «место разреза AAVS1-GFP-р2а-пуромицин_место разреза AAVS1» (Do). Количество клеток, устойчивых к пуромицину (ось ординат), подсчитывали после индукции в присутствии туникамицина (293+Do+C9i Tu) или безлейциновой среды (293+Do+C9i Leu-). В качестве контроля анализировали клетки 293Т, трансфицированные обеими плазмидами (Do и С9), в отсутствие индукции (293+Do+C9 ni). Наконец, клетки 293Т без какой-либо копии плазмиды С9 трансфицировали донорной плазмидой (Do) и далее подсчитывали количество клеток, устойчивых к пуромицину.
ФИГ. 7: Графики, иллюстрирующие интеграцию донорной ДНК (Do) в сайт AAVS1 генома клеток 293Т, содержащих одну копию плазмиды С9 (клетки 293-С9), аналогично тому, как показано на фиг. 6. Клетки 293-С9 трансфицировали донорной плазмидой, содержащей кассету «место разреза AAVSl-GFP-p2a-пуромицин_место разреза AAVS1» (Do). Количество клеток, устойчивых к пуромицину (ось ординат), подсчитывали после индукции в присутствии туникамицина (293_C9+Doi Tu) или безлейциновой среды (293_C9+Doi Leu-). В качестве контроля анализировали клетки 293-С9, трансфицированные плазмидой Do в отсутствие индукции (293_C9+Do-ni). Наконец, далее подсчитывали количество клеток 293-С9, устойчивых к пуромицину, трансфицированных донорной плазмидой (Do), в отсутствие индукции.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Любой цитируемый источник, упомянутый в настоящем документе, включен посредством ссылки.
Авторы изобретения оценили исключительные особенности пути пищевой адаптации к рациону, лишенному одной незаменимой аминокислоты, с получением системы регуляции, идеально подходящей для генной терапии. Авторы изобретения обнаружили, что такая система, основанная на нехватке определенной аминокислоты в рационе, не требует ни экспрессии синтетических факторов транскрипции или регуляторных белков, ни введения фармакологических индукторов. Она является физиологичной, нетоксичной и пригодна для клинического применения. Эта новая система регуляции, основанная на рационе питания, является физиологичным подходом, позволяющим преодолеть одно из основных препятствий для генной терапии человека на сегодняшний день.
Не ограничиваясь какой-либо теорией, авторы изобретения считают, что раскрытая в настоящем документе система контролируемой экспрессии является особенно подходящей системой для точно настраиваемой экспрессии нуклеазы Cas (CPJSPR (кластеризованные, регулярно разделенные, короткие палиндромные повторы)-ассоциированного белка).
Следует отметить, что в документе WO 2013068096 раскрыта такая система контролируемой экспрессии для нескольких белков, и концепция была подтверждена на примере экспрессии белка люциферазы. Chaveroux и соавторы (Science Signaling, 2015, vol. 8(374), 1-10) воспользовались этой системой для характеристики сигнального пути eIF2α-ATF4.
Однако из-за ограничений в отношении экспрессии нуклеазы Cas в целевой клетке-хозяине, например, отсутствия утечки, нельзя было ожидать, что система регуляции, основанная на рационе питания, раскрытая в документах WO 2013068096 и Chaveroux et al., послужила бы подходящим инструментом для контролируемой экспрессии нуклеазы Cas.
Нуклеиновая кислота для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, как раскрыто в настоящем документе, позволяет ограничить нецелевые действия, которые обычно наблюдаются из-за отсутствия эффективно контролируемой системы экспрессии (называемые выражением «утечка»), или избежать их.
Нуклеиновая кислота для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas
Первый аспект изобретения относится к нуклеиновой кислоте для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, у индивидуума, содержащей:
- регуляторный полинуклеотид, содержащий минимальный промотор и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту AARE, где указанный регуляторный полинуклеотид активируется у индивидуума при потреблении рациона с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты; и
- нуклеиновую кислоту, кодирующей нуклеазу Cas, которая находится под контролем указанного регуляторного полинуклеотида.
В еще одном аспекте изобретение также относится к нуклеиновой кислоте для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas по меньшей мере в одной целевой клетке у индивидуума, содержащей:
- регуляторный полинуклеотид, содержащий минимальный промотор и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту AARE, где указанный регуляторный полинуклеотид активируется у индивидуума при потреблении рациона с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты; и
- нуклеиновую кислоту, кодирующей нуклеазу Cas, которая находится под контролем указанного регуляторного полинуклеотида.
В объеме настоящего изобретения под выражением «контролируемая экспрессия» подразумевается, что экспрессия индуцируется или «включается» и прекращается или «выключается» точным образом, применительно к моменту индукции, продолжительности индукции.
В некоторых вариантах осуществления нуклеаза Cas выбрана из группы, содержащей нуклеазу Cas I класса, нуклеазу Cas II класса и нуклеазу Cas III класса.
Для получения дополнительной информации белках Cas I типа, II типа или III типа квалифицированный специалист в данной области техники может обратиться к источникам Chylinski et al. (2014, Nucleic Acids Research, Vol. 42(10): 6091-6105); Sinkunas et al. (2011, The EMBO Journal, Vol. 30(7): 1335-1342); Aliyari et al. (2009, Immunological Reviews, Vol. 227(1): 176-188); Cass et al. (Biosci Rep, doi: 10.1042/BSR20150043), Makarova et al. (2011, Biology Direct, Vol. 6: 38); Gasiunas et al. (2012, Proc Natl Acad Sci USA, Vol. 109(39): E2579-E2586); Heler et al. (2015, Nature, Vol. 519(7542): 199-202); Esvelt et al. (2013, Nat Methods, Vol. 10(11): doi:10.138/nmeth.2681), Zetsche et al. (Cell. 2015 Oct 22;163(3):759-71) или Chylinski et al. (2013, Biology, Vol. 10(5): 726-737).
В некоторых вариантах осуществления нуклеаза Cas I класса выбрана из группы, содержащей Cas3, Cas8a, Cas8b, Cas8c, CaslOd, Csel и Csyl.
В некоторых вариантах осуществления нуклеаза Cas II класса выбрана из группы, содержащей Cas9, Cpf1, Csn2 и Cas4.
В некоторых вариантах осуществления нуклеаза Cas III класса выбрана из группы, содержащей Cas 10, Csm2 и Cmr5.
В некоторых вариантах осуществления нуклеаза Cas представляет собой нуклеазу Cas9.
В некоторых вариантах осуществления нуклеаза Cas9 может происходить из бактерии, в частности, бактерии, выбранной из группы, содержащей Acaryochloris marina, Actinomyces naeslundii, Alcanivorax dieselolei, Belliella baltica, Campylobacter jejuni, Corynebacterium diphtheriae, Coriobacterium glomerans, Corynebacterium ulcerans, Desulfomonile tiedjei, Dickeya dadantii, Escherichia coli, Francisella tularensis, Lactobacillus kefiranofaciens, Listeria innocua, Methylobacterium extorquens, Micrococcus luteus, Myxococcus fulvus, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Prevotella intermedia, Prochlorococcus marinus, Psychroflexus torquis, Sphaerobacter thermophilus, Sphingobacterium sp., Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus и Streptomyces bingchenggensis.
В некоторых вариантах осуществления нуклеаза Cas9 происходить от археабактерии, такой как, например, Methanoculleus bourgensis.
Без каких-либо ограничений раскрытая в настоящем документе нуклеаза Cas9 охватывает гомологи, паралоги и ортологи, и варианты нуклеаз Cas9 природного происхождения.
В некоторых вариантах осуществления варианты Cas9 могут включать SpCas9-HFl (Kleinstiver et al.; Nature. 2016 Jan 28; 529(7587):490-5), fCas9, представляющую собой слитый белок каталитически неактивной Cas9 и нуклеазы FokI (Guilinger et al.; Nat, Biotechnol. 2014: 32(6): 577-582), и любые рационально сконструированные нуклеазы Cas9 с улучшенной специфичностью, как описано Slaymaker et al. (Science. 2016 Jan l; 351(6268):84-8).
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая нуклеазу Cas9 и/или векторы, кодирующие нуклеазу Cas9, могут быть коммерчески доступны, например, от компании SIGMA-ALDRICH.
В некоторых других вариантах осуществления нуклеазы Cas могут быть идентифицированы с помощью способов направленной эволюции белков (Packer и Liu (Nat Rev Genet. 2015 Jul; 16(7):379-94)).
В некоторых вариантах осуществления нуклеаза Cas представляет собой ДНК- или РНК-управляемую нуклеазу Cas.
В объеме настоящего изобретения под выражением «ДНК- или РНК-управляемая» подразумевается, что в присутствии гидовых ДНК или РНК нуклеаза Cas нацелена на нуклеиновую кислоту, последовательность которой комплементарна гидовым ДНК и РНК. В некоторых вариантах осуществления экспрессия нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, может быть измерена любым подходящим способом, доступным в данной области техники, включая измерение экспрессии мРНК в результате транскрипции нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, и/или измерение экспрессии нуклеазы Cas.
В некоторых вариантах осуществления измерение экспрессии нуклеазы Cas может быть выполнено путем измерения экспрессии нуклеазы Cas с помощью антител, которые специфично связываются с указанной нуклеазой Cas.
В объеме настоящего изобретения индуцированная экспрессия может быть выражена как кратность увеличения в зависимости от времени по сравнению с базовой, неиндуцированной экспрессией.
В некоторых вариантах осуществления индуцированная экспрессия может превышать базовую экспрессию в от 2 до 10000 раз, предпочтительно от 4 до 500 раз, более предпочтительно от 8 до 250 раз, наиболее предпочтительно от 10 до 100 раз.
В контексте изобретения увеличение в 2-10000 раз включает в 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз, 30 раз, 35 раз, 40 раз, 45 раз, 50 раз, 75 раз, 100 раз, 150 раз, 200 раз, 250 раз, 300 раз, 350 раз, 400 раз, 450 раз, 500 раз, 550 раз, 600 раз, 750 раз, 800 раз, 850 раз, 900 раз, 950 раз, 1000 раз, 2000 раз, 3000 раз, 4000 раз, 5000 раз, 6000 раз, 7000 раз, 8000 раз и 9000 раз.
В объеме настоящего изобретения под выражением «минимальный промотор» подразумевается промотор, включающий все необходимые элементы, чтобы должным образом инициировать транскрипцию интересующего нижерасположенного гена. В объеме настоящего изобретения выражения «минимальный промотор» и «базальный промотор» считаются эквивалентными. Специалисту в данной области техники ясно, что «минимальный промотор» включает по меньшей мере сайт начала транскрипции, сайт связывания РНК-полимеразы и сайт связывания общих факторов транскрипции (ТАТА-бокс).
Подходящие минимальные промоторы известны специалисту в данной области техники.
В некоторых вариантах осуществления минимальный промотор, подходящий для осуществления изобретения, может быть выбран из группы, содержащей промотор тимидинкиназы, промотор β-глобина, промотор цитомегаловируса (CMV), промотор SV40 и тому подобные.
В некоторых вариантах осуществления индивидуум представляет собой человека или млекопитающее, не являющееся человеком, предпочтительно человека.
В некоторых вариантах осуществления млекопитающее, не являющееся человеком, выбрано из группы, содержащей домашнее животное, такое как собака, кошка, одомашненная свинья, кролик, хорек, хомяк, мышь, крыса и тому подобное; примата, такого как шимпанзе, обезьяна и тому подобного; экономически важного животного, такого как крупный рогатый скот, свинья, кролик, лошадь, овца, коза, мышь, крыса.
В объеме настоящего изобретения под термином «целевая клетка» подразумевается клетка от указанного индивидуума, для которой была бы полезной экспрессия нуклеазы Cas.
В объеме настоящего изобретения выражение «незаменимая аминокислота» включает гистидин (His, Н), изолейцин (Не, I), лейцин (Leu, L), лизин (Lys, K), метионин (Met, М), фенилаланин (Phe, F), треонин (Thr, Т), триптофан (Trp, W) и валин (Val, V).
В объеме настоящего изобретения подразумевается, что выражение «по меньшей мере одна незаменимая аминокислота» означает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 незаменимых аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления рацион с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты может быть введен индивидууму в течение периода времени от 5 мин до 12 ч, включая 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 1 ч 30 мин, 2 ч, 2 ч 30 мин, 3 ч, 3 ч 30 мин, 4 ч, 4 ч 30 мин, 5 ч, 5 ч 30 мин, 6 ч, 6 ч 30 мин, 7 ч, 7 ч 30 мин, 8 ч, 8 ч 30 мин, 9 ч, 9 ч 30 мин, 10 ч, 10 ч 30 мин, 11 ч, 11 ч 30 мин.
В некоторых вариантах осуществления рацион с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты может быть введен индивидууму один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз или большее число раз в сутки.
В некоторых вариантах осуществления рацион с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты может быть введен индивидууму один или два раза в сутки.
В некоторых вариантах осуществления рацион с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты может быть введен индивидууму рано утром, например, на завтрак, а затем индивидуум может употреблять обычный рацион на обед и ужин.
В контексте настоящего изобретения под выражением «обычный рацион» подразумевается рацион, не имеющий дефицита какой-либо незаменимой аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления рацион с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты может быть введен индивидууму каждый день, через день, раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю.
В некоторых вариантах осуществления рацион с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты может быть введен индивидууму в течение половины дня, 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней, 15 дней, 16 дней, 17 дней, 18 дней, 19 дней 20 дней или более.
В некоторых вариантах осуществления рацион с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты может повторяться каждую неделю, через неделю, каждый месяц, каждый месяц или более.
В некоторых вариантах осуществления рацион с недостатком по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты может быть предоставлен в виде порошкового пищевого продукта, не содержащего изолейцин, лейцин и валин, коммерчески доступного от компании NUTRICA METABOLICS под названием MILUPA. Этот рацион адаптирован для индивидуума с болезнью мочи с запахом кленового сиропа, которая, по-видимому, влияет на метаболизм аминокислот с разветвленной цепью.
В одном из вариантов осуществления рацион, не содержащий лейцин, изолейцин или валин может быть получен путем смешивания порошка, не содержащего изолейцин, лейцин и валин, с внешним источником 2 оставшихся аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления рацион, не содержащий фенилаланин, может быть предоставлен в виде порошка, не содержащего фенилаланин, коммерчески доступного от компании MEAD JOHNSON. Этот рацион адаптирован для индивидуума, имеющего фенилкетонурию.
На практике порошок смешивают с адаптированным жидким или пастообразным пищевым продуктом, не содержащим желаемую незаменимую аминокислоту.
В одном из вариантов осуществления нехватка аминокислот может быть имитирована введением галофугинона или этого же препарата под любым другим названием, соответствующего молекуле «4(3Н)-хиназолинон,7-бром-6-хлор-3-[3-(3-гидрокси-2-пиперидинил)-2-оксопропил]-,транс-(±)-, или доступного на рынке, например, под названием Halocur, Stenorol, Flavomycin, Lincomix, Stafac.
В одном из вариантов осуществления нуклеиновая кислота элемента отклика на аминокислоту (AARE) выбрана из группы, содержащей нуклеиновую кислоту с последовательностью SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.
В объеме настоящего изобретения выражение «по меньшей мере одна нуклеиновая кислота AARE» включает по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 и по меньшей мере 5 нуклеиновых кислот AARE. Таким образом, выражение «по меньшей мере одна нуклеиновая кислота AARE» включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16,17, 18, 19 и 20 нуклеиновых кислот AARE.
В некоторых вариантах осуществления регуляторный полинуклеотид содержит по меньшей мере две нуклеиновые кислоты AARE,
В других вариантах осуществления регуляторный полинуклеотид содержит от одной до двадцати нуклеиновых кислот AARE, предпочтительно от двух до десяти нуклеиновых кислот AARE.
В некоторых вариантах осуществления регуляторный полинуклеотид содержит от двух до шести нуклеиновых кислот AARE.
В некоторых вариантах осуществления регуляторный полинуклеотид содержит две нуклеиновые кислоты AARE, выбранные из группы, содержащей нуклеиновую кислоту с последовательностью SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления регуляторный полинуклеотид содержит шесть нуклеиновых кислот AARE с последовательностью SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления две нуклеиновые кислоты AARE или, в качестве альтернативы, по меньшей мере две нуклеиновые кислоты AARE могут быть одинаковыми или разными.
В некоторых вариантах осуществления регуляторный полинуклеотид, содержащийся в нуклеиновой кислоте для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, также может быть активирован при введении индивидууму галофугинона, туникамицина и тому подобного, то есть соединений, которые, как известно, обладают свойствами активации нуклеиновых кислот AARE.
Нуклеиново-кислотный вектор
В еще одном аспекте изобретение также относится к нуклеиново-кислотному вектору для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, содержащему нуклеиновую кислоту для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, как определено в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, согласно изобретению включена в вектор, подходящий для генной терапии.
В объеме настоящего изобретения под выражением «вектор, подходящий для генной терапии» подразумевается, что вектор содержит необходимые элементы для достижения экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, в целевой клетке.
В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирусный вектор.
В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор выбран из группы, содержащей аденовирус, аденоассоциированный вирус (AAV), альфавирус, герпесвирус, лентивирус, неинтегрирующийся лентивирус, ретровирус, вирус осповакцины и бакуловирус.
Частица для доставки
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотный вектор, как определено в настоящем документе, могут содержаться в частице, в частности, совместно с другими соединениями, такими как, например, липиды, белок, пептиды или полимеры.
В объеме настоящего изобретения указанная частица или «частица для доставки» предназначена для обеспечения или «доставки» в целевые клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотного вектора, содержащего указанную нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазу Cas.
В еще одном аспекте изобретение также относится к частице для доставки, содержащей нуклеиновую кислоту для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотный вектор, как определено в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления частица для доставки может иметь форму липоплекса, содержащего катионные липиды; липидной наноэмульсии; твердой липидной наночастицы; частицы на основе пептида; частицы на основе полимера, в частности, содержащей природные и/или синтетические полимеры.
В некоторых вариантах осуществления частицы на основе полимера могут содержать белок; пептид; полисахарид, в частности, хитозан.
В некоторых вариантах осуществления частица на основе полимера может содержать синтетический полимер, в частности, полиэтиленимин (PEI), дендример, поли(D,L-лактид) (PLA), поли(D,L-лактид-ко-гликозид) (PLGA), полиметакрилат и сложные полифосфоэфиры,
В некоторых вариантах осуществления частица для доставки дополнительно содержит на своей поверхности один или более лигандов, подходящих для связывания с целевым рецептором, экспонируемым на мембране целевой клетки.
Фармацевтическая композиция
Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей (I) нуклеиновую кислоту для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотный вектор, или частицу для доставки, как определено в настоящем документе, и (II) фармацевтически приемлемый носитель.
Разработка состава фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению хорошо известна специалистам в данной области техники.
Как указано в настоящем документе, нуклеиновая кислота для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотный вектор, или частица для доставки, как определено в настоящем описании, может представлять собой активный агент.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать нуклеиновую кислоту для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотный вектор, или частицу для доставки, как определено в настоящем описании, в качестве единственного активного агента.
В некоторых вариантах осуществления подходящий фармацевтически приемлемый носитель согласно изобретению включает любые возможные общепринятые растворители, дисперсионные среды, наполнители, твердые носители, водные растворы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, и тому подобное.
В некоторых вариантах осуществления подходящие фармацевтически приемлемые носители могут включать воду, физиологический раствор, натрий-фосфатный буфер, декстрозу, глицерин, этанол и их смесь.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок годности или эффективность клеток. Получение и применение фармацевтически приемлемых носителей хорошо известно в данной области техники.
Предусмотрено применение любых общепринятых сред или агентов в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, за исключением случаев, когда они несовместимы с активным ингредиентом.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть введена индивидууму, нуждающемуся в этом, любым способом, то есть с помощью перорального введения, местного введения или парентерального введения, например, путем инъекции, включая подкожное введение, внутривенное введение, артериальное введение, внутримышечное введение, внутриглазное введение и интрааурикулярное введение.
В некоторых вариантах осуществления введение фармацевтической композиции путем инъекции может быть осуществлено непосредственно в целевой ткани, представляющей интерес, в частности, чтобы избежать распространения нуклеиновой кислоты или нуклеиново-кислотного вектора, содержащихся в указанной фармацевтической композиции.
Авторы изобретения считают, что это особенно важно, когда целевой тканью является ткань головного мозга. Инфузии нуклеиново-кислотного вектора могут быть проведены с высокой точностью в определенных частях ткани головного мозга, например, с помощью томографа, в частности, с использованием бескаркасных стереотаксических нацеливающих устройств. Применение МРТ контроля и новых стереотаксических нацеливающих устройств обеспечило создание прочной основы для неврологической генной терапии, ставшей признанной процедурой в оперативной неврологии.
Другие способы введения включают ингаляционные препараты, суппозитории и трансдермальные применения.
В некоторых вариантах осуществления пероральный препарат согласно изобретению включает обычные эксципиенты, такие как, например, фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и тому подобного.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество указанного соединения вводят указанному индивидууму, нуждающемуся в этом.
В объеме настоящего изобретения «эффективное количество» относится к количеству указанного соединения, которое само по себе вызывает желаемый результат, то есть облегчает или устраняет симптомы заболевания, входящего в объем настоящего изобретения, в частности, генетического заболевания,
Определение эффективного количества нуклеиновой кислоты для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотного вектора, или частицы для доставки, необходимого для достижения желаемого результата, находится в рамках общих знаний специалиста в данной области техники.
В объеме настоящего изобретения эффективное количество соединения, подлежащее введению, может быть определено врачом или уполномоченным специалистом в данной области техники, и может быть соответствующим образом скорректировано в ходе лечения.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество, подлежащее введению, может зависеть от множества параметров, включая вещество, выбранное для введения, планируется ли введение одной или нескольких доз, а также параметры индивидуума, включая возраст, физическое состояние, рост, массу тела, пол и тяжесть заболевания, подлежащего лечению.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество активного агента может включать от приблизительно 0,001 мг до приблизительно 3000 мг на единицу дозирования, предпочтительно от приблизительно 0,05 мг до приблизительно 100 мг на единицу дозирования.
В объеме настоящего изобретения количество от приблизительно 0,001 мг до приблизительно 3000 мг включает от приблизительно 0,002 мг, 0,003 мг, 0,004 мг, 0,005 мг, 0,006 мг, 0,007 мг, 0,008 мг, 0,009 мг, 0,01 мг, 0,02 мг, 0,03 мг, 0,04 мг, 0,05 мг, 0,06 мг, 0,07 мг, 0,08 мг, 0,09 мг, 0,1 мг, 0,2 мг, 0,3 мг, 0,4 мг, 0,5 мг, 0,6 мг, 0,7 мг, 0,8 мг, 0,9 мг, 1 мг, 2 мг, 3 мг, 4 мг, 5 мг, 6 мг, 7 мг, 8 мг, 9 мг, 10 мг, 20 мг, 30 мг, 40 мг, 50 мг, 60 мг, 70 мг, 80 мг, 90 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг, 350 мг, 400 мг, 450 мг, 500 мг, 550 мг, 600 мг, 650 мг, 700 мг, 750 мг, 800 мг, 850 мг, 900 мг, 950 мг, 1000 мг, 1100 мг, 1150 мг, 1200 мг, 1250 мг, 1300 мг, 1350 мг, 1400 мг, 1450 мг, 1500 мг, 1550 мг, 1600 мг, 1650 мг, 1700 мг, 1750 мг, 1800 мг, 1850 мг, 1900 мг, 1950 мг, 2000 мг, 2100 мг, 2150 мг, 2200 мг, 2250 мг, 2300 мг, 2350 мг, 2400 мг, 2450 мг, 2500 мг, 2550 мг, 2600 мг, 2650 мг, 2700 мг, 2750 мг, 2800 мг, 2850 мг, 2900 мг и 2950 мг на единицу дозирования.
В некоторых вариантах осуществления активный агент может присутствовать в дозах, достаточных для доставки от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 40 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг и более предпочтительно от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг массы тела субъекта в сутки.
5
15
В некоторых конкретных вариантах осуществления эффективное количество активного агента может содержать от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 копий нуклеиновой кислоты для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотного вектора, или частицы для доставки, как определено в настоящем описании, на единицу дозирования.
5
15
5
5
5
5
5
5
5
5
б
6
6
6
6
6
6
6
6
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
8
8
8
8
9
9
9
9
9
9
9
9
9
10
10
10
10
10
10
10
10
10
11
11
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
12
12
13
13
13
13
13
13
13
13
13
14
14
14
14
14
14
14
14
14
В объеме настоящего изобретения от приблизительно 1x10 до приблизительно 1×10 копий включает 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10, 1×10, 2×10, 3×10, 4×10, 5×10, 6×10, 7×10, 8×10, 9×10 копий на единицу дозирования.
Целевая клетка и клетка-хозяин
В еще одном аспекте изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотный вектор, как определено в настоящем документе.
Целевая клетка и/или клетка-хозяин может быть выбрана из прокариотической клетки или эукариотической клетки.
В объеме изобретения термин «прокариотическая клетка» охватывает клетку бактерии и клетку архебактерии.
В некоторых вариантах осуществления целевая клетка и/или клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.
В контексте изобретения термин «эукариотическая клетка» охватывает дрожжи, клетку водорослей, клетку растения, клетку животного, предпочтительно клетку млекопитающего и более предпочтительно клетку человека.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, предпочтительно клетку человека.
В некоторых вариантах осуществления целевая клетка и/или клетка-хозяин согласно настоящему изобретению могут включать, не ограничиваясь перечисленным, клетку центральной нервной системы, эпителиальную клетку, мышечную клетку, эмбриональную клетку, зародышевую клетку, стволовую клетку, прогениторную клетку, гемопоэтическую стволовую клетку, гемопоэтическую прогениторную клетку, индуцированную полипотентную стволовую клетку (iPSC).
В некоторых частных вариантах осуществления целевая клетка и/или клетка-хозяин не представляет собой стволовую клетку, прогениторную клетку, зародышевую клетку или эмбриональную клетку.
В некоторых вариантах осуществления целевая клетка и/или клетка-хозяин могут принадлежать ткани, выбранной из группы, содержащей мышечную ткань, нервную ткань, соединительную ткань и эпителиальную ткань.
В некоторых вариантах осуществления целевая клетка и/или клетка-хозяин могут принадлежать органу, выбранному из группы, содержащей мочевой пузырь, кость, головной мозг, молочную железу, центральную нервную систему, шейку матки, толстую кишку, эндометрий, почку, гортань, печень, легкое, пищевод, яичник, поджелудочную железу, плевру, предстательную железу, прямую кишку, сетчатку, слюнную железу, кожу, тонкий кишечник, мягкую ткань, желудок, семенник, щитовидную железу, матку, влагалище.
Применения
Еще один аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей нуклеиновую кислоту для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотный вектор, или частицу для доставки, как определено в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в качестве лекарственного средства.
В одном из аспектов изобретение также относится к применению нуклеиновой кислоты для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, как определено в настоящем документе, для получения или изготовления лекарственного средства.
В еще одном аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей нуклеиновую кислоту для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотный вектор, или частицу для доставки, как определено в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в качестве активного агента для редактирования генома в по меньшей мере одной целевой клетке.
Еще один аспект изобретения дополнительно относится к применению нуклеиновой кислоты для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, как определено в настоящем документе, в качестве активного агента для редактирования генома в по меньшей мере одной целевой клетке.
В некоторых вариантах осуществления редактирование генома может быть проведено in vivo, in vitro или ex vivo.
В некоторых вариантах осуществления редактирование генома может быть проведено, как описано в источнике Komor et al. Nature; 2016 Apr 20; 533(7603):420-4.
В одном из вариантов осуществления целевая клетка имеет по меньшей мере генетическую мутацию.
В некоторых вариантах осуществления генетическая мутация присутствует в гене, выбранном из группы, содержащей МТТР; CNGB3; SLC39A4; TRMU; АСОХ1; ADA; ABCD1; SAMHD1; MAN2B1; НВА; ATRX; COL4A3; COL4A4; COL4A5; ALMS1; SLC12A6; ASL; CYP19A1; SLC35A3; ASNS; AGA; ТТРА; ATM; SACS; BBS10; BBS1; BBS2, BBS12; CIITA; BSND; GP1BA; HSD3B2; ACAT1; GPR56; BTD; BLM; ASPA; CPS1; CPT1A; CPT2; RAB23; RMRP; SLC6A8; GAMT; CYP27A1; NDRG1; PRPS1; GJB1; VPS13A; CHM; CYBA; CYBB; SLC25A13; ASS1; VPS13B; ACSF3; GFM1; TSFM; PROP1; LHX3; PSAP; CYP17A1; MPL; PMM2; MPI; ALG6; NTRK1; CHRNE; RAPSN; HAX1; VPS45; SLC4A11; CYP11B2; CFTR; CTNS; HSD17B4; LOXHD1; DMD; RTEL1; COL7A1; ADAMTS2; EVC; EMD; NR2E3; ETHE1; GLA; F9; F11; IKBKAP; LDLR; LDLRAP1; ABCC8; KCNJ11; MEFV; FANCA; FANCC; FANCG; FMR1; FH; GALK1; GALT; GBA; SLC12A3; GCDH; ETFA; ETFDH; AMT; GLDC; G6PC; SLC37A4; GAA; AGL; GBE1; PYGM; PFKM; BCS1L; HFE2; TFR2; ALDOB; TECPR2; HPS1; HPS3; HMGCL; HLCS; CBS; MTHFR; MTRR; HYLS1; SLC25A15; EDA; ALPL; GNE; MED17; IVD; TMEM216; RGPRIP1L; LAMA3; LAMB3; LAMC2; GALC; TGM1; CEP290; RDH12; RPE65; LCA5; CRB1; LRPPRC; GLE1; EIF2B5; CAPN3; DYSF; SGCG; SGCA; SGCB; FKRP; DLD; STAR; LPL; HADHA; SLC7A7; BCKDHA; BCKDHB; MKS1; ACADM; MLC1; ATP7A; ARSA; MCCC1; MCCC2; OPA3; MMAA; MMAB; MUT; MMACHC; VSX2; ACAD9; NDUFAF5; NDUFS6; MPV17; PUS1; GNPTAG; MCOLN1; IDUA; IDS; NAGLU; HGSNAT; GNS; GLB1; HYAL1; ARSB; SUMF1; POMGNT1; TYMP; MTM1; NAGS; NEB; AQP2; NPHS1; NPHS2; CLN3; CLN5; CLN6; CLN8; MFSD8; PPT1; TPP1; SMPD1; NPC1; NPC2; NBN; GJB2; WNT10A; RAG2; DCLRE1C; OAT; OTC; TCIRG1; SLC26A4; PAH; PHGDH; PKHD1; AIRE; VRK1; RARS2; SLC22A5; DNAI1; DNAH5; DNAI2; AGXT; GRHPR; H0GA1; SEPSECS; ABCB11; PCCA; PCCB; CTSK; PDHA1; PDHB; PTS; ATP6V1B1; EYS; CERKL; FAM161A; DHDDS; PEX7; AGPS; ESC02; SLC17A5; HEXB; SMARCAL1; TH; ALDH3A2; DHCR7; SMN1; MESP2; COL27A1; LIFR; SLC26A2; HEXA; FAH; MY07A; USH1C; CDH23; PCDH15; USH2A; CLRN1; ACADVL; FKTN; ATP7B; LIP A; RSI; IL2RG; PEX1; PEX2; PEX6 и PEX10.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей нуклеиновую кислоту для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотный вектор, или частицу для доставки, как определено в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, для применения в качестве активного агента для лечения и/или предупреждения заболевания,
В некоторых вариантах осуществления заболевание выбрано из группы, содержащей генетическое заболевание, инфекционное заболевание и рак.
В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой генетическое заболевание.
В некоторых вариантах осуществления генетическое заболевание выбрано из неограничивающей группы, содержащей абеталипопротеинемию; ахроматопсию; энтеропатический акродерматит; острую печеночную недостаточность у младенцев; дефицит ацил-СоА-оксидазы I; дефицит аденозиндеаминазы; Х-сцепленную адренолейкодистрофию, синдром Айкарди-Гутьерес; альфа-маннозидоз; альфа-талассемию; синдром альфа-таласемии и умственной отсталости; синдром Альпорта; синдром Альстрома; синдром Андерманна; аргининосукцинатную ацидурию; дефицит ароматазы; артрогрипоз, умственную отсталость и судороги; дефицит аспарагинсинтетазы; аспартилглюкозаминурию; атаксию, обусловленную изолированным дефицитом витамина Е; атаксию телеангиэктазию; аутосомно-рецессивную спастическую атаксию Шарлевуа-Сагене; синдром Барде-Бидля; синдром голых лимфоцитов II типа; синдром Барттера, тип 4А; синдром Бернара-Сулье, тип А1; гемоглобинопатию, связанную с бета-глобином; дефицит 3-бета-гидроксистероид дегидрогеназы II типа; дефицит бета-кетотиолазы; двустороннюю фронтопариетальную полимикрогирию; дефицит биотинидазы; синдром Блума; болезнь Кэнэвэн; дефицит карбамоилфосфат синтетазы I; дефицит карнитин-пальмитоилтрансферазы IA; Дефицит карнитин-пальмитоилтрансферазы II; синдром Карпентера; гипоплазию хрящей и волос; синдром Дефицит церебрального креатина 1; синдром Дефицит церебрального креатина 2; церебротендинальный ксантоматоз; болезнь Шарко-Мари-Тута типа 4D; болезнь Шарко-Мари-Тута типа 5/синдром Артса; Х-сцепленную форму болезни Шарко-Мари-Тута; хорея акантоцитоз; хороидеремию; хроническую гранулематозную болезнь; хроническую гранулематозную болезнь; дефицит цитрина; цитруллинемию 1 типа; синдром Кохена; объединенную малоновую и метилмалоновую ацидурию; комбинированную недостаточность окислительного фосфорилирования 1 типа; комбинированную недостаточность окислительного фосфорилирования 3 типа; комбинированный дефицит гипофизарного гормона 2; комбинированный дефицит гипофизарного гормона 3; комбинированный дефицит SAP; врожденную гиперплазию коры надпочечников вследствие дефицита 17-альфа-гидроксилазы; врожденную амегакариоцитарную тромбоцитопению; врожденное нарушение гликозилирования, тип Ia; врожденное нарушение гликозилирования, тип Ib; врожденное нарушение гликозилирования, тип Ic; врожденную нечувствительность к боли с ангидрозом; врожденный миастенический синдром; врожденный миастенический синдром; врожденную нейтропению; дистрофию роговицы и перцептивную глухоту; дефицит кортикостерон метилоксидазы; кистозный фиброз; цистиноз; дефицит D-бифункционального белка; аутосомно-рецессивнуюглухоту 77; мышечную дистрофию Дюшенна/Беккера; врожденный дискератоз; дистрофический буллезный эпидермолиз; синдром Элерса-Данлоса, тип VIIC; синдром Эллиса-Ван-Кревельда; мышечную дистрофию Эмери-Дрейфуса 1; синдром усиленного ответа S-колбочек; этилмалоновую энцефалопатию; болезнь Фабри; дефицит фактора IX; дефицит фактора XI; семейную вегето-сосудистую дистонию; семейную гиперхолестеринемию; аутосомно-рецессивную семейную гиперхолестеринемию; семейный гиперинсулинизм; семейную средиземноморскую лихорадку; анемию Фанкони, группа А; анемию Фанкони, группа С; анемию Фанкони, группа G; синдром ломкой Х-хромосомы; дефицит фумаразы; дефицит галактокиназы; галактоземию; болезнь Гоше; синдром Гительмана; глутаровую ацидемию I типа; глутаровую ацидемию IIa типа; глутаровую ацидемию IIc типа; глициновую энцефалопатию; гликогеноз Ia типа; гликогеноз Ib типа; гликогеноз II типа; гликогеноз III типа; гликогеноз IV типа/болезнь с полиглюкозановыми тельцами у взрослых; гликогеноз V типа; гликогеноз VII типа; GRACILE-синдром и другие расстройства, связанные с BCS1L; гемохроматоз типа 2А; гемохроматоз типа 3; наследственную непереносимость фруктозы; наследственный спастический парапарез 49; синдром Германски-Пудлака тип 1; синдром Германски-Пудлака тип 3; дефицит ГМГ-КоА-лиазы; дефицит синтетазы голокарбоксилазы; гомоцистинурию; гомоцистинурию, обусловленную дефицитом MTHFR; гомоцистинурию, тип cblE; гидролетальный синдром; синдром гипераммониемия-гиперорнитинемия-гомоцитруллинемия; гипогидротическую эктодермальную дисплазию 1; гипофосфатазию; миопатию с включенными тельцами 2 типа; инфантильную церебральную и церебеллярную атрофию; изовалериановую ацидемию; синдром Жубер тип 2; синдром Жубер тип 7/синдром Меккеля 5/синдром COACH; узловой буллезный эпидермолиз; болезнь Краббе; ламеллярный ихтиоз 1 типа; врожденный амавроз Лебера 10 и другие цилиопатии, связанные с СЕР290; врожденный амавроз Лебера 13; врожденный амавроз Лебера 2/пигментный ретинит 20; врожденный амавроз Лебера 5; врожденный амавроз Лебера 8/пигментный ретинит 12/пигментную паравенозную ретинохориоидальную атрофию; синдром Ли, французско-канадский тип; летальный синдром врожденных контрактур 1/летальный артрогрипоз с поражением клеток переднего рога спинного мозга; лейкоэнцефалопатию с исчезающим белым веществом; конечностно-поясную мышечную дистрофию типа 2А; конечностно-поясную мышечную дистрофию типа 2 В; конечностно-поясную мышечную дистрофию типа 2С; конечностно-поясную мышечную дистрофию типа 2D; конечностно-поясную мышечную дистрофию типа 2Е; конечностно-поясную мышечную дистрофию типа 21; дефицит липоамид-дегидрогеназы; липоидную гиперплазию надпочечников; дефицит липопротеинлипазы; дефицит ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот с очень длинной цепью; лизинурическую непереносимость белка; болезнь мочи с запахом кленового сиропа типа 1а; болезнь мочи с запахом кленового сиропа типа lb; синдром Меккеля 1/синдром Барде-Бидля 13; дефицит среднецепочечной ацил-коа-дегидрогеназы; мегаленцефалическую лейкоэнцефалопатию с подкорковыми кистами; болезнь Менкеса; метахроматическую лейкодистрофию; дефицит 3-метилкротонил-КоА-карбоксилазы; 3-метилглутаконовую ацидурию III типа/атрофия зрительного нерва 3 с катарактой; метилмалоновую ацидемию; витамин В12-зависимую метилмалоновую ацидурию и гомоцистинурию, тип С; микрофтальмию/анофтальмию; дефицит митохондриального комплекса I; синдром истощения митохондриальной ДНК 6/нейрогепатопатию навахо; митохондриальную миопатию и сидеробластную анемию 1; муколипидоз II/IIIA; муколипидоз III-гамма; муколипидоз IV; мукополисахаридоз I типа; мукополисахаридоз II типа; мукополисахаридоз IIIB типа; мукополисахаридоз IIIC типа; мукополисахаридоз IIID типа; мукополисахаридоз IVb типа/GM1-ганглиозидоз; мукополисахаридоз, Type IX; мукополисахаридоз VI типа; множественную сульфатазную недостаточность; мышечно-глазо-мозговую болезнь и другие связанные с POMGNT1 врожденные мышечные дистрофии-дистрогликанопатии; мионейрогастроинтестинальную энцефалопатию;миотубулярную миопатию 1; дефицит N-ацетилглутаматсинтазы; немалиновую миопатию 2; почечный несахарный диабет II типа; нефротический синдром/врожденный нефротический синдром финского типа; нефротический синдром/стероид-устойчивый нефротический синдром; нейрональный цероидный липофусциноз; нейрональный цероидный липофусциноз; болезнь Нимана-Пика, тип А/В; болезнь Нимана-Пика, тип С; синдром Ниймеген; внесиндромное снижение слуха; одонто-онихо-дермальную дисплазию/синдром Шопа-Шульца-Пассаржа; синдром Оменна; синдром Оменна/атапаскский тяжелый комбинированный иммунодефицит; дефицит орнитинаминотрансферазы; дефицит орнитинкарбамоилтрансферазы; остеопороз 1 типа; синдром Пендреда; дефицит фенилаланингидроксилазы; дефицит 3-фосфоглицератдегидрогеназы; аутосомно-доминантный поликистоз почек; аутоиммунный полигландулярный синдром 1 типа; мостомозжечковую гипоплазию 1А типа; мостомозжечковую гипоплазию 6 типа; первичный дефицит карнитина; первичную цилиарную дискинезию; первичную гипероксалурию, тип 1; первичную гипероксалурию, тип 2; первичную гипероксалурию, тип 3; прогрессирующую спиноцеребеллярную атаксию; прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз, тип 2; пропионовая ацидемия; пропионовая ацидемия; пикнодизостоз; дефицит Е1-альфа субъединицы пируватдегидрогеназного комплекса; дефицит El-бета субъединицы пируватдегидрогеназного комплекса; дефицит 6-пирувил-тетрагидроптерин синтазы; почечный канальцевый ацидоз с глухотой; пигментный ретинит 25; пигментный ретинит 26; пигментный ретинит 28; пигментный ретинит 59; точечную дисплазию ризомелического типа, тип 1; точечную дисплазию ризомелического типа, тип 3; синдром Робертса; болезнь Салла; синдром Сандхоффа; иммунокостную дисплазию Шимке; синдром Сегавы; синдром Шегрена-Ларссона; синдром Смита-Лемли-Опица; спинальная мышечная атрофия; спондилокостальный дизостоз; стальной синдром; синдром Стува-Видеманна; остеохондродисплазию, связанную с переносчиками сульфат-ионов; болезнь Тея-Сакса; тирозинемию I типа; синдром Ушера IB типа; синдром Ушера IC типа; синдром Ушера ID типа; синдром Ушера IF типа; синдром Ушера IIA типв; синдром Ушера III типа; Дефицит ацил-КоА дегидрогеназы жирных кислот с очень длинной цепью; синдром Уолкера-Варбург и другие дистрофии, связанные с FKTN; болезнь Уилсона; болезнь Вольмана/болезнь накопления эфиров холестерина; Х-сцепленный ювенильный ретиношизис; Х-сцепленный тяжелый комбинированный иммунодефицит и синдром Цельвегера.
В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой инфекционное заболевание.
В некоторых вариантах осуществления инфекционное заболевание выбрано из неограничивающей группы, содержащей анаплазмоз; сибирскую язву; бабезиоз; ботулизм; бруцеллез; инфекцию Burkholderia mallei (сап); инфекцию Burkholderia pseudomallei (мелиоидоз); кампилобактериоз; устойчивую к карбапенемам инфекцию Enterobacteriaceae (CRE); мягкий шанкр; инфекцию Chikungunya; хламидийную инфекцию; сигуатеру; инфекцию Clostridium difficile; инфекцию Clostridium perfringens (Epsilon Toxin); грибковую инфекцию кокцидиоидомикоз (калифорнийскую лихорадку); болезнь Крейтцфельдта-Якоба, заразную губчатую энцефалопатию (CJD); криптоспоридиоз; циклоспороз; лихорадку денге; дифтерию; инфекцию Е. Coli; восточный энцефалит лошадей (ЕЕЕ); геморрагическую лихорадку Эбола (Эбола); эрлихиоз; арбовирусный или параинфекционный энцефалит; энтеровирусную неполиомиелитную инфекцию; инфекцию энтеровируса D68 (EV-D68); лямблиоз; гонококковую инфекцию (гонорею); паховую гранулему; гемофилический грипп типа Б (Hib или H-flu); Хантавирусный легочный синдром (HPS); гемолитический уремический синдром (HUS); гепатит А (геп А); гепатит В (геп В); гепатит С (геп С); гепатит D (геп D); гепатит Е (геп Е); герпес; опоясывающий лишай, вирус ветряной оспы VZV (лишай); гистоплазмоз; вирус иммунодефицита человека/СПИД (ВИЧ/СПИД); вирус папилломы человека (HPV); грипп (грипп); отравление свинцом; легионеллез (болезнь легионеров); лепру (болезнь Хансенса); лептоспироз; листериоз; болезнь Лайма; венерическую лимфогранулему (LVG); малярию; цистицеркоз; вирусный менингит; менингококковую инфекцию; коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV); эпидемический паротит; норовирус; паралитическое отравление моллюсками; педикулез (вши, головные и платяные вши); воспаление тазовых органов (PID); коклюш; бубонную, первично-септическую или легочную чуму; пневмококковую инфекцию; полиомиелит (Polio); орнитоз; фтириаз (лобковые вши; лобковый педикулез); заболевания, сопровождающиеся пустулезной сыпью (черная оспа, оспа обезьян, коровья оспа); Ку-лихорадку; бешенство; отравление рицином; риккетсиоз (пятнистая лихорадка Скалистых гор); краснуха, включая врожденную краснуху (коревую краснуху); гастроэнтерит, вызванный инфекцией сальмонеллы; чесотку; скомброидное отравление; тяжелый острый респираторный синдром (SARS); бактериальная дизентерия; черную оспу; инфекцию метициллин-резистентного стафилококка (MRSA); стафилококковое пищевое отравление; инфекцию стафилококка, обладающего промежуточной чувствительностью к ванкомицину (VISA); инфекцию ванкомицин-резистентного стафилококка (VRSA); стрептококковую инфекцию группы А; стрептококковую инфекцию группы В; стрептококковый синдром токсического шока (STSS); первичный, вторичный, ранний скрытый, поздний скрытый или врожденный сифилис; столбнячную инфекцию (блокировку челюсти); трихинеллез; туберкулез (ТВ); латентную туберкулезную инфекцию (LTBI); туляремию (заячью болезнь); брюшной тиф, группа D; сыпной тиф; вагиноз; ветряную оспу (ветрянку); инфицирование холерным вибрионом (холера); вибриоз (Vibrio); вирусную геморрагическую лихорадку (лихорадка Эбола, лихорадка Ласса, лихорадка Марбург); лихорадку Западного Нила; желтую лихорадку; иерсиниоз и лихорадку Зика.
В некоторых вариантах осуществления заболевание представляет собой рак.
В некоторых вариантах осуществления рак выбран из неограничивающей группы, содержащей рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга, рак молочной железы, рак центральной нервной системы, рак шейки матки, рак дыхательных путей и верхних отделов желудочно-кишечного тракта, рак толстой и прямой кишки, рак эндометрия, герминогенный рак, глиобластому, лимфому Ходжкина, рак почки, рак гортани, лейкоз, рак печени, рак легкого, миелому, нефробластому (опухоль Вильмса), нейробластому, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, остеосаркому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак плевры, рак предстательной железы, ретинобластому, рак кожи (включая меланому), рак тонкой кишки, саркому мягких тканей, рак желудка, рак яичка и рак щитовидной железы.
В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области техники может понять, что процедуры и/или терапия, проводимые ex vivo, могут быть включены в объем настоящего изобретения, который будет включать стволовые клетки и прогениторные клетки, гемопоэтические стволовые клетки и прогениторные клетки, индуцированную полипотентную стволовую клетку (iPSC) и взрослые клетки от разных видов. Не ограничиваться какой-либо теорией, авторы изобретения считают, что это представляет особый интерес, когда специалист в данной области техники занимается регенеративной медициной.
В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты и нуклеиново-кислотные векторы, входящие в объем настоящего изобретения, могут быть использованы для конструирования моделей на животных или растениях, например, моделей на животных для доклинических исследований, с учетом основополагающих этических принципов.
Способы
Способы, раскрытые в настоящем документе, могут быть осуществлены in vitro, in vivo или ex vivo.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу редактирования генома по меньшей мере в одной целевой клетке, включающему по меньшей мере стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе.
Один из аспектов изобретения также относится к способу предупреждения и/или лечения заболевания, включающему по меньшей мере стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления вышеописанные способы дополнительно включают стадию обеспечения индивидууму рациона с дефицитом по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты, в частности, аминокислоты, выбранной из группы, содержащей гистидин (His, Н), изолейцин (Ile, I), лейцин (Leu, L), лизин (Lys, K), метионин (Met, М), фенилаланин (Phe, F), треонин (Thr, Т), триптофан (Trp, W) и валин (Val, V).
В некоторых вариантах осуществления вышеописанные способы в качестве альтернативы включают стадию введения соединения, которое, как известного, активирует нуклеиновую кислоту AARE, содержащуюся в регуляторном полинуклеотиде, в частности, соединения, выбранного из группы, содержащей галофугинон, туникамицин и тому подобное.
В некоторых вариантах осуществления заболевание выбрано из группы, содержащей генетическое заболевание, инфекционное заболевание и рак.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть введена индивидууму, нуждающемуся в этом, любым способом, то есть с помощью перорального введения, местного введения или парентерального введения, например, путем инъекции, включая подкожное введение, внутривенное введение, артериальное введение, внутримышечное введение, внутриглазное введение и интрааурикулярное введение.
Другие способы введения включают ингаляционные препараты, суппозитории и трансдермальные применения.
В некоторых вариантах осуществления пероральный препарат согласно изобретению включает обычные эксципиенты, такие как, например, фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарината натрия, целлюлозы, карбоната магния и тому подобного.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество указанного соединения вводят указанному индивидууму, нуждающемуся в этом.
В объеме настоящего изобретения «эффективное количество» относится к количеству указанного соединения, которое само по себе вызывает желаемый результат, то есть облегчает или устраняет симптомы заболевания, входящего в объем настоящего изобретения, в частности, генетического заболевания.
Определение эффективного количества нуклеиновой кислоты, содержащегося в фармацевтической композиции, как определено в настоящем документе, для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, или нуклеиново-кислотного вектора, или частицы для доставки, необходимого для достижения желаемого результата, находится в рамках общих знаний специалиста в данной области техники.
В объеме настоящего изобретения эффективное количество соединения, подлежащее введению, может быть определено врачом или уполномоченным специалистом в данной области техники, и может быть соответствующим образом скорректировано в ходе лечения.
В некоторых вариантах осуществления эффективное количество, подлежащее введению, может зависеть от множества параметров, включая вещество, выбранное для введения, то, планируется ли введение одной или нескольких доз, а также параметры индивидуума, включая возраст, физическое состояние, рост, массу тела, пол и тяжесть заболевания, подлежащего лечению.
Еще один аспект изобретения также относится к способу редактирования генома в по меньшей мере одной целевой клетке, включающему стадии:
- обеспечения целевой клетке:
нуклеиновой кислоты для контролируемой экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, как раскрыто в настоящем документе;
гидовых ДНК или РНК, специфичной для целевой геномной нуклеиновой кислоты, подлежащей редактированию;
донорной нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеиновую кислоту, предназначенную для замены целевой геномной нуклеиновой кислоты;
- индукции экспрессии нуклеазы Cas.
После индукции нуклеазы Cas, нуклеаза Cas будет способствовать одноцепочечному или двухцепочечному разрыву(ам) в целевой геномной нуклеиновой кислоте с помощью гидовых ДНК или РНК и на донорной нуклеиновой кислоте. Затем нуклеиновая кислота из донорной нуклеиновой кислоты может быть интегрирована в геном вместо целевой геномной нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления индукция экспрессии нуклеазы Cas может быть осуществлена путем обеспечения целевой клетке среды, не содержащей по меньшей мере одной незаменимой аминокислоты, или среды, содержащей галофугинон и/или туникамицин.
В определенном варианте осуществления целевая нуклеиновая кислота имеет генетическую мутацию.
Набор
В дополнительном аспекте изобретение относится к набору для лечения и/или предупреждения заболевания, содержащему:
- фармацевтическую композицию, как определено в настоящем документе, и
- фармацевтически активное соединение.
В некоторых вариантах осуществления заболевание выбрано из группы, включающей генетическое заболевание, инфекционное заболевание и рак.
В объеме настоящего изобретения под выражением «фармацевтически активное соединение» подразумевается соединение, обладающее положительным действием в отношении предупреждении и/или лечении данного заболевания.
Специалист в данной области техники понимает термин «положительное действие» как оказание положительного действия для уменьшения или облегчения по меньшей мере одного симптома, связанного с данным заболеванием. Под «положительным действием» специалист в данной области техники также понимает, что прогрессирование данного заболевания может быть замедлено или остановлено.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтически активное соединение представляет собой противомикробное соединение, которое может быть подходящим образом выбрано специалистом в данной области из соединений, обычно используемых для борьбы с инфекционным заболеванием, в частности бактериальной, грибковой или вирусной инфекцией.
В некоторых вариантах осуществления противомикробное соединение представляет собой антибиотик, выбранный из группы, содержащей пенициллин, в частности, пенициллин и амоксициллин; карбапенем, в частности, имипенем; цефалоспорин, в частности, цефалексин; аминогликозид, в частности, гентамицин и тобрамицин; тетрациклин, в частности, тетрациклин и доксициклин; макролид, в частности, эритромицин и кларитромицин; хинолон, в частности, ципрофлоксацин и левофлоксацин; и сульфонамид, в частности, сульфаметизол и сульфаметоксазол.
В некоторых вариантах осуществления противомикробное соединение представляет собой противовирусное средство, выбранное из неограничивающей группы, включающей ингибитор нейраминидазы; нуклеозидный аналог гуанина; нуклеозидный аналог тимидина; нуклеотидный ингибитор обратной транскриптазы и ингибитор протеазы.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтически активное соединение представляет собой противораковое соединение, которое может быть подходящим образом выбрано специалистом в данной области из соединений, обычно используемых в химиотерапии.
В некоторых вариантах осуществления противораковое соединение может быть выбрано из группы, содержащей алкилирующий агент, аналог пурина, аналог пиримидина, антрациклин, блеомицин, митомицин, ингибитор топоизомеразы 1, ингибитор топоизомеразы 2, таксан, моноклональное антитело, цитокин, ингибитор протеинкиназы и тому подобное.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Индукция экспрессии CAS9 с помощью нехватки незаменимых аминокислот
На фиг. 1 показан сигнальный путь GCN2-eIF2α-ATF4. В ответ на нехватку ЕАА активированная GCN2 фосфорилирует eIF2α, что приводит к повышающей регуляции фактора транскрипции ATF4 и его рекрутингу в последовательности AARE для индукции экспрессии целевого гена.
На фиг. 2 показана общая стратегия конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу Cas, под контролем минимального промотора Tk, и шести копий нуклеиновой кислоты AARE из Trb3 (черные пятна).
GFP
Для рассмотрения активности CAS9 используется клеточная модель, полученная из клеток HEK 293Т с одной копией трансгена GFP (клеточная линия 293T).
Эту клеточную линию котрансдуцировали 2 различными лентивирусными векторами.
Первый из них экспрессирует меченую FLAG версию CAS9 (Shen et al Cell Res. 2013 Apr 2. doi: 10.1038/cr.2013,46; SEQ ID NO: 8) под контролем регуляторного промотора 2Х AARE-TK (SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7).
GFP
Второй вектор экспрессирует гидовую РНК, специфически нацеленную на репортерный ген GFP (гPHK) под контролем промотора U6 РНК-полимеразы III (Ma, Н et al. Mol Ther Nucleic Acids 2014 doi: 10.1038/mtna.2014.12).
Оба лентивирусных вектора были сконструированы в лентивирусном остове pTRIP (Zennou et al., 2000; Cell 101, 173-185).
Нуклеиновая кислота плазмиды pTrip-2XAARE-NLS-FLAG-CAS9 (SEQ ID NO: 9) представлена на фиг. 3.
В качестве контроля генерируется третий лентивирусный вектор, экспрессирующий FLAG-CAS9 под контролем убиквитарного промотора EF1a.
Трансдуцированные клетки размножали в культуре. В отсутствие индукции клетки 2XAARE-CAS9 и клетки EF1a-CAS9 лизировали и наблюдали за экспрессией CAS9 с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией и величины экспрессии белка CAS9 с последующим детектированием метки FLAG с помощью вестерн-блоттинга. В таких условиях обнаруживается и количественно определяется только убиквитарно экспрессируемая СА9.
Затем трансдуцированные клетки помещали в культуру в определенную среду, не содержащую Leu или Thr. За индукцией экспрессии CAS9 в клетках 2XAARE-CAS9 с течением времени наблюдали на уровне как мРНК, так и белка. Таким образом определяли оптимальный период обработки.
GFP
GFP
Наконец, когда клетки 293T экспрессировали как CAS9, так и гPHK, экспрессия GFP в этих клетках снижалась, и, следовательно, процент GFP-положительных клеток, измеренный с помощью проточной цитометрии, является точным средством для оценки эффективности CAS9 в подавлении экспрессии GFP.
GFP
Таким образом, без аминокислотного голодания процент GFP-положительных клеток в клетках 293T, трансдуцированных FLAG-CAS9, остается постоянным в культуре. После оптимальной индукции в культуре с не содержащей аминокислот средой доля GFP-положительных клеток резко снижается. Общая эффективность сравнивается с непрерывной экспрессией CAS9 в клетках, трансдуцированных EFla-CAS9.
ПРИМЕР 2: Индукция экспрессии CAS9 с помощью нехватки незаменимых аминокислот
Промотор 2xAARE содержит 6 связывающих последовательностей для транскрипционного фактора ATF4, который быстро индуцируется в условиях нехватки незаменимых аминокислот (ЕАА) или другого клеточного стресса, такого как стресс, вызываемый в эндоплазматическом ретикулуме туникамицином (Tu).
Чтобы оценить, можно ли регулировать экспрессию бактериальной нуклеазы Cas9 с помощью промотора 2xAARE, ген Cas9 из Streptococcus pyogenes (spCas9), слитый с меткой flag, саморасщепляющийся пептид Р2А и красный флуоресцентный белок (RFP) клонировали под контролем энхансера 2xAARE, содержащего 4 сайта связывания ATF4, и минимального промотора гена тимидинкиназы (TKm), полученного из вируса простого герпеса (HSV; фиг. 4).
Этот лентивирусный вектор, происходящий из ВИЧ, обеспечивает стабильную экспрессию гена устойчивости к бластицидину для отбора случаев интеграции вектора. Вторая кассета содержит промотор U6 и гидовую РНК AAVS1 (SEQ ID NO: 10) и CRTSPR-ассоциированную РНК-матрицу, позволяющую делать разрез ниже ATG человеческого гена PPP1R12C. Третья кассета экспрессии содержит ген spCas9-flag-RFP под контролем промотора 2xAARE-TKm.
Эту плазмиду использовали для получения лентивирусных частиц в соответствии со стандартным протоколом котрансфекции векторной плазмиды, +плазмиду, кодирующую конверт VSV (pVSV), +плазмиду, кодирующую ген ВИЧ Rev (pRev), +плазмиду, кодирующую гены Gag и Pol ВИЧ (р8.9) в клетках 293Т. Через 48 ч клеточные супернатанты собирали, подвергали ультрацентрифугированию для концентрирования и хранили при -80°С до использования. Исходные векторы были подвергнуты количественной ПЦР в реальном времени для измерения вирусных копий РНК геномов/мл (Saeed et al.; Mol Ther Nucleic Acids. 2014 Dec 2; 3:e213).
Чтобы оценить, может ли экспрессия spCas9-flag-RFP модулироваться посредством нехватки ЕАА (безлейциновая среда, Leu-) или посредством туникамицина (Sigma-Aldrich), клетки 293Т трансдуцировали с помощью 100 вирусных копий РНК на клетку и затем отбирали с помощью бластицидина в концентрации 2 мкг/мл (Sigma-Aldrich). Все нетрансдуцированные клетки 293Т погибли, в то время как трансдуцированные клетки демонстрировали нормальный рост, что указывает на то, что все они содержали по меньшей мере одну копию вектора pTRIP blast_U6 AAVSl_2xAARE-Cas9-flag-RFP.
Эта популяция, названная 293-С9, была размножена и использована для дальнейших экспериментов. Клетки высевали в 24-луночные планшеты (105 клеток/лунка) и индуцировали экспрессию гена Cas9-flag-RFP с помощью безлейциновой культуральной среды с 10% сыворотки (DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекком) Leu-), с помощью туникамицина в концентрации 0,5 мкг/мл (полная DMEM+Tu) или контрольной среды (полная DMEM).
Клетки собирали в несколько моментов времени после индукции (4 ч, 8 ч, 24 ч), а также через 24 ч (т.е. через 48 ч после индукции) и 48 ч (т.е. через 72 ч после индукции) после удаления индуцирующей среды и ее замены на полную среду. Клетки, собранные в разные моменты времени, осаждали центрифугированием и лизировали для очистки белка (Tris-HCl 0,05 М, SDS 0,5%, 1 мМ DTT (1итиотреитол), рН 8,0 с антипротеазами).
Измеряли концентрацию белков методом Бредфорда и загружали на 10% полиакриламидный гель для гель-электрофореза в денатурирующих условиях 30 мкг лизата, смешанного с загрузочным буфером и бета-меркаптоэтанолом, и нагревали при 95°С в течение 5 минут. Белки разделяли электрофорезом. За миграцией наблюдали с помощью набора окрашенных маркерных белков.
Белки на геле переносили на нитроцеллюлозную мембрану полусухим переносом и использовали мембрану для иммуноблотинга с использованием моноклональных антител анти-FLAG М2 (Sigma-Aldrich), затем детектировали вторичным антимышиным антителом, связанным с HRP (пероксидаза хрена). Активность пероксидазы выявляли с помощью хемилюминесцентного HRP субстрата (Luminata crescendo -Millipore), получая изображение с помощью хемилюминесцентного детектора Fusion FX7 (Vilber).
Плотность обнаруженных полос SPCas9-Flag-RFP массой 193 кДа количественно определяли с помощью программного обеспечения детектора Fusion FX7 (Vilber). Уровень бета-актина в каждом образце также измеряли таким же образом, но использовали первичное антитело против бета-актина. Плотность полос, соответствующих Cas9-flag-RFP, была нормализована к плотности бета-актина. Поскольку эти эксперименты проводились на разных гелях и для обеспечения однородности данных, полосу с наибольшей плотностью (в обоих случаях после 24-часовой индукции) рассматривали как 100% экспрессии, а значения других полос меньшей плотности сравнивались как процент от самой интенсивной полосы в каждом геле.
Как можно видеть на фиг. 5, на уровне базовой, неиндуцированной экспрессии 2xAARE-Tkm слитый белок Cas9-fiag-RFP остается недетектируемым. Однако экспрессия слитого белка быстро индуцируется при добавлении к клеткам среды Leu- (сплошная линия) или при добавлении полной среды, содержащей Tu (пунктирная линия). После удаления индуцирующей среды (через 24 ч) и ее замены на полную среду экспрессия белка Cas9-RFP-RFP неуклонно снижалась (см. при 48 ч и 72 ч). Это указывает на то, что промотор 2xAARE-Tkm позволяет контролировать экспрессию Cas9 посредством недостатка ЕАА или путем индукции стресса ER (эндоплазматическом ретикулуме). Чтобы оценить, позволяет ли индукция белка Cas9-RFP-RFP осуществлять разрезы (т.е. создавать двухцепочечные разрывы) в локусе AAVS1 в геноме, клетки 293-С9 культивировали в течение 24 ч в полной DMEM или в DMEM Leu-. Клетки собирали через 24 ч, осаждали центрифугированием и очищали геномную ДНК с помощью набора DNA easy Kit (Quiagen). Проводили ПЦР с использованием праймеров, гибридизующихся на 5' (SEQ ID NO: 11) и 3' (SEQ ID NO: 12) концах места разреза AAVS1. Продукт ПЦР размером 540 пар оснований очищали и секвенировали, и было подтверждено, что он представляет собой целевой продукт.
Чтобы дополнительно оценить, был ли осуществлен разрез с помощью Cas9, авторы провели тест с нуклеазой Т7 (New England Biolabs). Продукты ПЦР, амплифицирующие полосу AAVS1, из очищенной геномной ДНК 293-С9, не индуцированные и индуцированные, денатурировали и медленно повторно гибридизировали в соответствии с рекомендациями поставщика (https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i).
Индуцированные Cas9 двухцепочечные разрывы восстанавливаются посредством клеточных механизмов и приводят к появлению инсерций и делеций (вставки) в месте разреза, таким образом, в результате повторной гибридизации полос ПЦР, полученных из популяции клеток, содержащих смесь различных вставок, получают фрагменты ДНК, содержащие несоответствия. Они разрезаются нуклеазой Т7, высвобождающей меньшие полосы ДНК.
Можно было заметить, что индукция экспрессии Cas9-flag-RFP с помощью DMEM Leu- в течение 24 ч в клетках 293-С9 приводит к появлению меньших полос размером 250 пар оснований, соответствующих месту разреза AAVS1, помещенных в центр полосы ПЦР, что составляет приблизительно 20% от всей ДНК. В неиндуцированных клетках 293-С9 такие полосы не наблюдаются, что указывает на то, что сайт AAVS1 остается неразрезанным до индукции гена Cas9-flag-RFP.
Следовательно, система контролируемой экспрессии Cas9 в режиме ВКЛ/ВЫКЛ, как раскрыто в настоящем документе, представляет собой инструмент для безопасного редактирования генома. Безусловно, в отсутствие индукции отсутствие какой-либо обнаруживаемой утечки в системе экспрессии представляет собой средство безопасности для предотвращения любого нежелательного редактирования генома.
Напротив, при наличии индукции быстрая экспрессия может быть отключена при остановке индукции.
Затем были проведены два функциональных теста для интеграции донорной ДНК (Do) в сайт AAVS1.
2+
В первом из них клетки 293Т трансфицировали (методом Са фосфата) плазмидой «pTPJP blast_U6 AAVS1_2xAARE-Cas9-flag-RFP», а также донорной плазмидой, содержащей кассету «место разреза AAVS1-GFP-p2a-пуромицин_место разреза AAVS1», принимая разрезы с помощью Cas9+gRNA AAVS1 на 5' и 3' концах гена GFP-p2a-пуромицин.
Выбранный сайт AAVS1 в геноме клеток 293Т, на который была нацелена гидовая РНК, включает инициирующий ATG-кодон гена PPP1R12C. При использовании в качестве мишени он позволит осуществлять инсерцию высвобожденной кассеты GFP-p2a-пуромицин вместо экзона 1 гена PPP1R12C и затем экспрессию с помощью промотора PPP1R12C. В этом случае рекомбинантные клетки экспрессируют GFP и становятся устойчивыми к пуромицину, что позволяет проводить их отбор и подсчитывать клоны, соответствующие случаям интеграции.
Как показано на фиг. 6, донорная конструкция дает устойчивые к пуромицину клоны только при обеспечении плазмиды «pTRIP blast_U6 AAVS1_2xAARE-Cas9-flag-RFP» (С9) и донора «место разреза pAAVSl-GFP-p2a-пуромицин_место разреза AAVS1» (Do) одновременно с индукцией 2xAARE (i) с помощью безлейциновой среды (i Leu-) или содержащей туникамицин среды (i Tu), но не с помощью полной среды (ni). Это указывает на то, что активность Cas9 для направленной интеграции требует индукции промотора 2xAARE.
Этот эксперимент воспроизводили в клетках 293-С9, трансфицированных донорной плазмидой, содержащей -GFP-р2а-пуромицин с двумя местами разреза AAVS1 по бокам (Do). В такой плазмиде направленная pAAVSl активность Cas9 будет приводить к высвобождению последовательности GFP-p2a-пуромицин.
Как можно видеть на фиг. 5, когда клетки 293-С9 трансфицированы донорной плазмидой (Do), в отсутствие индукции (ni) не образуются устойчивые к пуромицину колонии. Напротив, когда клетки 293-С9 трансфицированы донорной плазмидой (Do) и индуцированы в присутствии туникамицина или безлейциновой среды, они производили резистентные к пуромицину колонии в обоих условиях.
Это еще раз подтверждает, что после индукции экспрессии Cas9 нуклеаза Cas9, направленная на места разреза AAVS1, эффективна для генерации двухцепочечных разрывов, как в (1) донорной плазмиде, приводя к высвобождению донорной кассеты, так и (2) в сайте AAVS 1 в геномной ДНК, приводя к интеграции донорной кассеты.
***
Приведенные выше примеры содержат убедительные экспериментальные данные, показывающие, что система контролируемой экспрессии нуклеазы Cas9, экспрессия которой основана на AARE, может быть точно настроена с помощью различных условий индукции.
Действительно, в отсутствие индукции не наблюдается заметной экспрессии, что означает, что утечки не наблюдается.
Кроме того, редактирование генома может наблюдаться только при индукции и может быть быстро отключено после удаления условий индукции.
Таким образом, поскольку эта система может быть включена и выключена очень точно, она представляет собой безопасный инструмент для осуществления редактирования генома и, следовательно, генной терапии у лиц, нуждающихся в этом.
***
НУКЛЕОТИДНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, РАСКРЫТЫЕ В ИЗОБРЕТЕНИИ
В таблице 1 ниже раскрыты нуклеотидные последовательности, использованные в настоящем документе:
Последовательность AARE гена TRIB3: SEQ ID NO: 1
cggtttgcatcacccg
Последовательность AARE гена CHOP: SEQ ID NO: 2 aacattgcatcatccc
Последовательность AARE гена ASNS: SEQ ID NO: 3 gaagtttcatcatgcc
Последовательность AARE гена ATF3: SEQ ID NO: 4 agcgttgcatcacccc
Последовательность AARE гена SNAT2: SEQ ID NO: 5 gatattgcatcagttt
Нуклеиновая кислота тимидинкиназного минимального промотора: SEQ ID NO: 6
Нуклеиновая кислота 2XAARE: SEQ ID NO: 7
Нуклеиновая кислота NLS-FLAG CAS9: SEQ ID NO: 8
Нуклеиновая кислота плазмиды pTrip-2XAARE-NLS-FLAG-CAS9: SEQ ID NO: 9
гидовая РНК AASV1: SEQ ID NO: 10
5'-праймер: SEQ ID NO: 11
3'-праймер: SEQ ID NO: 12
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>ЭНСЭРМ (ЭНСТИТЮ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛА САНТЕ Э ДЕ ЛА РЕШЕРШ МЕДИКАЛЬ)
ИСМ (ЭНСТИТЮ ДЮ СЕРВО Э ДЕ ЛА МОЭЛЬ ЭПИНЬЕР) САНТР НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛА
РЕШЕРШ СЬЯНТИФИК (СНРС) СОРБОНН ЮНИВЕРСИТЕ
КОМИССАРЬЯ А Л'ЭНЕРЖИ АТОМИК Э 03 ЭНЕРЖИ АЛЬТЕРНАТИВ (СЕА) АССИСТАНС
ПЮВЛИК - ОПИТО ДЕ ПАРИ
<120>КОНТРОЛИРУЕМАЯ ПИЩЕВЫМ РАЦИОНОМ ЭКСПРЕССИЯ НУКЛЕИНОВОЙ
КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩЕЙ НУКЛЕАЗУ CAS9, И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
<130>PR77982
<150>ЕР16172964<151>2016-06-03
<160>12
<170>BiSSAP 1.3.6
<210>1<211>16<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Последовательность AARE гена TRIB3<400>1
cggtttgcat cacccg 16
<210>2<211>16<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Последовательность AARE гена CHOP<400>2
aacattgcat catccc 16
<210>3<211>16<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Последовательность AARE гена ASNS
<400>3
gaagtttcat catgcc
<210>4<211>16<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Последовательность AARE гена ATF3<400>4
agcgttgcat cacccc
<210>5<2U>16<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Последовательность AARE гена SNAT2<400>5
gatattgcat cagttt
<210>б<211>94<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Нуклеиновая кислота тимидинкинаэного минимального промотора
<400>6
cgaggtccac ttcgcatatt aaggtgacgc gtgtggcctc gaacaccgag cgaccctgca
gcgacccgct taacagcgtc aacagcgtgc cgca
<210>7<211>215<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Нуклеиновая кислота 2XAARE
<400>7
gattagctcc ggtttgcatc acccggaccg ggggattago tccggtttgc atcacccgga
60
ccgggggatt agctccggtt tgcatcaccc ggaccggggg ccgggcgcgt gctagcgatt
120
agctccggtt tgcatcaccc ggaccggggg attagctccg gtttgcatca cccggaccgg
180
gggattagct ccggtttgca tcacccggac cgggg
215
<210>8<211>4212<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Нуклеиновая кислота NLS-FLAG CAS9<400>8
atgggaccta agaaaaagag gaaggtgcct aagaaaaaga ggaaggtgcc taagaaaaag 60
aggaaggtgg cggccgctga ctacaaggat gacgacgata aatctagaga caagaaatac 120
tctattggac tggatatcgg gacaaactcc gttggctggg ccgtcataac cgacgagtat 180
aaggtgccaa gcaagaaatt caaggtgctg ggtaatactg accgccattc aatcaagaag 240
aacctgatcg gagcactcct cttcgactcc ggtgaaaccg ctgaagctac tcggctgaag 300
cggaccgcaa ggcggagata cacccgccgc aagaatcgga tatgttatct gcaagagatc 360
tttagcaacg aaatggctaa ggtggacgac tccttctttc accgcctgga agagagcttt 420
ctggtggagg aggataagaa acacgagagg caccctatat tcggaaatat cgtggatgag 480
gtggcttacc atgaaaagta tcctacaatc taccatctga ggaagaagct ggtggacagc 540
accgataaag cagacctgag gctcatctat ctggccctgg ctcatatgat aaagtttaga 600
ggacactttc tgatcgaggg cgacctgaat cccgataatt ccgatgtgga taaactcttc 660
attcaactgg tgcagacata taaccaactg ttcgaggaga atcccataaa cgcttctggt 720
gtggatgcca aggctattct gtccgctcgg ctgtccaagt cacgcagact ggagaatctg 780
attgcccaac tgccaggaga aaagaagaac ggcctgtttg ggaacctcat cgccctgagc 840
ctgggcctga cacctaactt caagtccaat tttgatctgg ccgaagatgc taaactccag 900
ctctccaagg acacctatga cgatgatctg gacaacctgc tcgcacagat aggcgaccag 960
tacgccgatc tctttctggc tgctaagaat ctctccgacg ccattctgct gagcgacata 1020
ctccgggtca acactgagat caccaaagca cctctgagcg cctccatgat aaaacgctat 1080
gatgaacacc atcaagacct gactctgctc aaagccctcg tgaggcaaca gctgccagag 1140
aagtacaaag agatattctt cgaccagagc aagaatggat atgccggata catcgatggc 1200
ggagcatcac aggaagaatt ttacaagttc atcaaaccaa tcctcgagaa gatggacggt 1260
actgaagagc tgotggtgaa gctgaacagg gaggacctgc tgaggaagca gaggaccttt 1320
gataatggct ocattccaca tcagatacac otgggagagc tgcatgcaat cctccgcagg 1380
caggaggatt tctatccttt cotgaaggat aaccgggaga agatagagaa gatcctgacc 1440
ttcaggatcc cttattacgt cggccotctg gctagaggca actcccgctt cgcttggatg 1500
accaggaaat ctgaggagac aattactcct tggaacttcg aagaggtcgt ggataagggc 1560
gcaagcgccc agtcattcat cgaacggatg accaatttcg ataagaacct gcccaacgag 1620
aaggtcctgc ccaaacattc actcctgtac gagtatttca ccgtctataa cgagctgact 1680
aaagtgaagt acgtgaccga gggcatgagg aagcctgcct tcctgtccgg agagcagaag 1740
aaggctatcg ttgatctgct cttcaagact aatagaaagg tgacagtgaa gcagctcaag 1800
gaggattact ttaagaagat cgaatgcttt gactcagtgg aaatctctgg cgtggaggac I860
cgctttaatg ccagcctggg cacttaccat gatctgctga agataatoaa agacaaagat 1920
ttcctcgata atgaggagaa cgaggacatc ctggaagata tcgtgctgac cctgactctg 1980
ttcgaggata gagagatgat cgaagagcgc ctgaagacct atgcccatct gtttgacgat 2040
aaagtcatga aacagctcaa gcggcggcgc tacactgggt ggggtagact ctccaggaaa 2100
ctcataaacg gcatccgcga caaacagagc ggaaagacca tcctggattt cctgaaatcc 2160
gacggattcg ctaacaggaa cttcatgcaa ctgattcacg atgactctct gacatttaaa 2220
gaggacatcc agaaggcaca ggtgagcggt caaggcgaca gcctgcacga gcacatcgcc 2280
aacctcgctg gatcacccgc cataaagaag ggaatactgc agacagtcaa ggtcgtggac 2340
gaactcgtca aagtgatggg tcggcacaag ccagagaata tcflttatcga aatggcaagg 2400
gagaaccaaa ccacccagaa gggccagaag aactctcggg aacggatgaa aagaatcgaa 2460
gagggaatta aggagctggg atctcagata ctgaaggagc accctgtgga gaatacacag 2520
ctccagaacg agaaactcta cctgtactac ctccagaacg ggcgggacat gtacgttgac 2580
caggaactcg acatcaaccg gctgtccgat tatgacgtgg accatattgt tccacagtcc 2640
ttcctcaaag atgactccat tgacaacaag gtgctgacca gatccgataa gaatcgcggt 2700
aagtctgaca atgttccatc agaagaggtg gtcaagaaga tgaagaatta ctggcggcag 2760
ctcctcaacg ccaaactgat cacccagcgg aagtttgaca atctgactaa ggcagaaaga 2820
ggaggtctga gcgaactcga caaggcoggc tttattaaga ggcaactggt cgaaacacgc 2880
cagattacca aacacgtggc acaaatcctc gactctagga tgaacactaa gtacgatgag 2940
aacgataagc tgatcaggga agtgaaagtg ataactctga agagcaagct ggtgtctgac 3000
ttccggaagg actttcaatt ctacaaagtt cgcgaaataa acaattacca tcatgctcac 3060
gatgcctatc tcaatgctgt cgttggcacc gccctgatca agaaataccc taaactggag 3120
tctgagttcg tgtacggtga otataaagtc tacgatgtga ggaagatgat agcaaagtct 3180
gagcaagaga ttggoaaagc caccgocaag tacttcttct actctaatat catgaatttc 3240
tttaagactg agataaccct ggctaacggc gaaatccgga agcgcccact gatcgaaaca 3300
aacggagaaa caggagaaat cgtgtgggat aaaggcaggg acttcgcaac tgtgcggaag 3360
gtgctgtcca tgccacaagt caatatcgtg aagaagaccg aagtgcagac cggcggattc 3420
tcaaaggaga gcatcctgcc aaagcggaac tctgacaagc tgatcgccag gaagaaagat 3480
tgggacccaa agaagtatgg cggtttcgat tcccctacag tggcttattc cgttctggtc 3540
gtggcaaaag tggagaaagg caagtccaag aaactcaagt ctgttaagga gctgctcgga 3600
attactatta tggagagatc cagcttcgag aagaatccaa tcgatttcct ggaagctaag 3660
ggctataaag aagtgaagaa agatctcatc atcaaactgc coaagtactc tctctttgag 3720
ctggagaatg gtaggaagcg gatgctggcc tccgccggag agctgcagaa aggaaacgag 3780
ctggctctgc cctccaaata cgtgaacttc ctgtatctgg cctcccacta cgagaaactc 3840
aaaggtagcc ctgaagacaa tgagcagaag caactctttg ttgagcaaca taaacactac 3900
ctggacgaaa tcattgaaca gattagcgag ttcagcaagc gggttattct ggccgatgca 3960
aacctcgata aagtgctgag cgcatataat aagcacaggg acaagccaat tcgcgaacaa 4020
gcagagaata ttatccacct ctttactctg actaatctgg gcgctcctgc tgccttcaag 4080
tatttcgata caactattga caggaagcgg tacacctcta ccaaagaagt tctcgatgcc 4140
accctgatac accagtcaat taccggactg tacgagactc gcatcgacct gtctcagctc 4200
ggcggcgact ag 4212
<210>9<211>13650<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Нуклеиновая кислота плазмиды pTRIP 2XAARE- NLS-FLAG CAS9<400>9
ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc 60
tggcgcctat atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat 120
gagcgcttgt ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc 180
catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact 240
gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgaatggtgc actctcagta 300
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 360
cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 420
ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt catcaccgaa acgcgcgaga cgaaagggcc 480
tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat aatggtttct tagacgtcag 540
gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt 600
caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa 660
ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt 720
gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt 780
tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt 840
ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg 900
tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga 960
atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa 1020
gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga 1080
caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa 1140
ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca 1200
ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta 1260
ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac 1320
ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc 1380
gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag 1440
ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga 1500
taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt 1560
agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata 1620
atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag 1680
aaaagatcaa aggatcttct tgagatoctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa 1740
caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt 1800
ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgo agataccaaa tactgtcctt ctagtgtago I860
cgtagttagg ccaccactto aagaactctg tagcaocgcc tacatacctc gctctgctaa 1920
tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaocggg ttggactcaa 1980
gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc 2040
ccagcttgga gcgaacgacc tacacogaac tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa 2100
gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggo agggtcggaa 2160
caggagagcg cacgagggag cttocagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg 2220
ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc 2280
tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg 2340
ctcacatgtt ctttcctgcg ttatccoctg attetgtgga taaccgtatt accgcctttg 2400
agtgagctga taocgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg 2460
aagcggaaga gcgccoaata cgcaaacogc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat 2520
gcagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag 2580
aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc 2640
cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc 2700
cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttco gcccattctc cgccccatgg 2760
ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg agctattcca 2820
gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg gacacaagac 2880
aggcttgcga gatatgtttg agaataccac tttatcccgc gtcagggaga ggoagtgcgt 2940
aaaaagacgc ggactcatgt gaaatactgg tttttagtgc gccagatctc tataatctcg 3000
cgcaacctat tttcccctcg aacacttttt aagccgtaga taaacaggct gggacacttc 3060
acatgagcga aaaatacatc gtcacctggg acatgttgca gatccatgca cgtaaactcg 3120
caagccgact gatgccttct gaacaatgga aaggcattat tgccgtaagc cgtggcggtc 3180
tgtaccgggt gcgttactgg cgcgtgaact gggtattcgt catgtcgata ccgtttgtat 3240
ttccagctac.gatcacgaca accagcgcga gcttaaagtg ctgaaacgcg cagaaggcga 3300
tggcgaaggc ttcatcgtta ttgatgacct ggtggatacc ggtggtactg cggttgcgat 3360
tcgtgaaatg tatccaaaag cgcactttgt caccatcttc gcaaaaccgg ctggtcgtce 3420
gctggttgat gactatgttg ttgatatccc gcaagataco tggattgaac agccgtggga 3480
tatgggcgtc gtattcgtcc cgccaatctc cggtcgctaa tcttttcaac gcctggcact 3540
gccgggcgtt gttcttttta acttcaggcg ggttacaata gtttccagta agtattctgg 3600
aggctgcato catgacacag gcaaacctga gcgaaaccct gttcaaaccc cgctttaaac 3660
atcctgaaac ctogacgcta gtccgocgct ttaatcacgg cgcacaaccg cctgtgcagt 3720
cggcccttga tggtaaaaoc atccctcact ggtatcgcat gattaaccgt ctgatgtgga 3780
tctggcgcgg cattgaccca cgcgaaatcc tcgacgtcca ggcacgtatt gtgatgagcg 3840
atgccgaacg taccgacgat gatttatacg atacggtgat tggctaccgt ggcggcaact 3900
ggatttatga gtgggccccg gatctttgtg aaggaacctt acttctgtgg tgtgacataa 3960
ttggacaaac tacctacaga gatttaaagc tctaaggtaa atataaaatt tttaagtgta 4020
taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tgtgtatttt agattccaac ctatggaact 4080
gatgaatggg agcagtggtg gaatgccttt aatgaggaaa acctgttttg ctcagaagaa 4140
atgccatcta gtgatgatga ggctactgct gactctcaac attotactcc tccaaaaaag 4200
aagagaaagg tagaagaccc caaggacttt ccttcagaat tgctaagttt tttgagtcat 4260
gctgtgttta gtaatagaac tcttgcttgc tttgctattt acaccacaaa ggaaaaagct 4320
gcactgctat aoaagaaaat tatggaaaaa tattctgtaa cctttataag taggcataac 4380
agttataatc ataacatact gttttttctt actccacaca ggcatagagt gtctgctatt 4440
aataactatg ctcaaaaatt gtgtacottt agctttttaa tttgtaaagg ggttaataag 4500
gaatatttga tgtatagtgc cttgactaga gatcataatc agccatacca catttgtaga 4560
ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa 4620
tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgo agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 4680
catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat totagttgtg gtttgtccaa 4740
actcatcaat gtatcttatc atgtctggat caactggata actcaagcta accaaaatca 4800
tcccaaactt cccaccccat accctattac cactgccaat tacctagtgg tttcatttac 4860
tctaaacctg tgattcctct gaattatttt cattttaaag aaattgtatt tgttaaatat 4920
gtactacaaa cttagtagtt ggaagggcta attcactccc aaagaagaca agatatcctt 4980
gatctgtgga tctaccacac acaaggctac ttccctgatt agcagaacta cacaccaggg 5040
ccaggggtca gatatccact gacctttgga tggtgctaca agctagtacc agttgagcca 5100
gataaggtag aagaggccaa taaaggagag aacaccagct tgttaoaccc tgtgagcctg 5160
catgggatgg atgacocgga gagagaagtg ttagagtgga ggtttgacag ccgcctagca 5220
tttcatcacg tggcccgaga gctgcatccg gagtacttca agaactgctg atatcgagct 5280
tgctacaagg gactttccgc tggggacttt ccagggaggc gtggoctggg cgggactggg 5340
gagtggcgag ccctcagatc ctgcatataa gcagctgctt tttgcctgta ctgggtctct 5400
ctggttagac cagatctgag cctgggagct ctctggctaa ctagggaacc cactgcttaa 5460
gcctcaataa agcttgcctt gagtgcttca agtagtgtgt gcccgtctgt tgtgtgactc 5520
tggtaactag agatccctca gaccctttta gtcagtgtgg aaaatctcta gcagtggcgc 5580
ccgaacaggg acttgaaagc gaaagggaaa ccagaggagc tctctcgacg caggactcgg 5640
cttgctgaag cgcgcacggc aagaggcgag gggcggcgac tggtgagtac gccaaaaatt 5700
ttgactagcg gaggctagaa ggagagagat gggtgcgaga gcgtcagtat taagcggggg 5760
agaattagat cgcgatggga aaaaattcgg ttaaggccag ggggaaagaa aaaatataaa 5820
ttaaaacata tagtatgggc aagcagggag otagaacgat tcgcagttaa tcctggcctg 5880
ttagaaacat cagaaggctg tagacaaata ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca 5940
ggatcagaag aacttagatc attatataat acagtagcaa ccctctattg tgtgcatcaa 6000
aggatagaga taaaagacac caaggaagct ttagacaaga tagaggaaga gcaaaaoaaa 6060
agtaagacca ccgcacagca agcggccgct gatcttcaga cctggaggag gagatatgag 6120
ggacaattgg agaagtgaat tatataaata taaagtagta aaaattgaac cattaggagt 6180
agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg 6240
agctttgttc cttgggttct tgggagcagc aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac 6300
gctgacggta caggccagac aattattgtc tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct 6360
gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct 6420
ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata cctaaaggat caacagctcc tggggatttg 6480
gggttgctct ggaaaactqa tttgcaccac tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa 6540
taaatctctg gaacagattt ggaatcacac gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa 6600
caattacaca agcttaatac actccttaat tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa 6660
tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac 6720
aaattggctg tggtatataa aattattcat aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag 6780
aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa tagagttagg cagggatatt caccattatc 6840
gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg acocgacagg cccgaaggaa tagaagaaga 6900
aggtggagag agagacagag acagatccat tcgattagtg aacggatctc gacggtatcg 6960
ccgaattcac aaatggcagt attcatccac aattttaaaa gaaaaggggg gattgggggg 7020
tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag acatacaaac taaagaatta 7080
caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt cgggtttatt acagggacag cagagatcca 7140
ctttggctga tacgcggatc tacgcgtcaa gtttgtacaa aaaagcaggc tccgcggccg 7200
cccccttcac cggtaccgat tagctocggt ttgcatcacc cggaccgggg gattagctcc 7260
ggtttgcatc acccggaccg ggggattagc tccggtttgc atcacccgga ccgggggccg 7320
ggcgcgtgct agcgattagc tccggtttgc atcacccgga ccgggggatt agctccggtt 7380
tgcatcaccc ggaccggggg attagctccg gtttgcatca cccggaccgg ggactcgagg 7440
tccacttcgc atattaaggt gacgcgtgtg gcctcgaaca ccgagcgacc ctgcagcgac 7500
ccgcttaaca gcgtcaacag cgtgccgcaa gcttgaattc tgatcagcat tccggtactg 7560
ttggtaaagc caccatggga cctaagaaaa agaggaaggt gcctaagaaa aagaggaagg 7620
tgcctaagaa aaagaggaag gtggcggccg ctgactacaa ggatgacgac gataaatcta 7680
gagacaagaa atactctatt ggactggata tcgggacaaa ctccgttggc tgggccgtca 7740
taaccgacga gtataaggtg ccaagcaaga aattcaaggt gctgggtaat actgaccgcc 7800
attcaatcaa gaagaacctg atcggagcac tcctcttcga ctccggtgaa accgctgaag 7860
ctactcggct gaagcggacc gcaaggcgga gatacacccg ccgcaagaat cggatatgtt 7920
atctgcaaga gatctttagc aacgaaatgg ctaaggtgga cgactccttc tttcaccgcc 7980
tggaagagag ctttctggtg gaggaggata agaaacacga gaggcaccct atattcggaa 8040
atatcgtgga tgaggtggct taccatgaaa agtatcctac aatctaccat ctgaggaaga 8100
agctggtgga cagcaccgat aaagcagacc tgaggctcat ctatctggcc ctggctcata 8160
tgataaagtt tagaggacac tttctgatcg agggcgacct gaatcccgat aattccgatg 8220
tggataaact cttcattcaa ctggtgcaga catataacca actgttcgag gagaatccca 8280
taaacgcttc tggtgtggat gccaaggcta ttctgtccgc tcggctgtcc aagtcacgca 8340
gactggagaa tctgattgcc caactgccag gagaaaagaa gaaoggcctg tttgggaacc 8400
tcatcgccct gagcctgggc ctgacaocta acttcaagtc caattttgat ctggccgaag 8460
atgctaaact ccagctctcc aaggacaoct atgacgatga tctggacaac ctgctcgcac 8520
agataggcga ccagtacgcc gatctctttc tggctgctaa gaatctctcc gacgccattc 8580
tgctgagcga catactccgg gtcaacactg agatcaccaa agcacctctg agcgcctcca 8640
tgataaaacg ctatgatgaa caccatcaag acotgactct gctcaaagcc ctcgtgaggc 8700
aacagctgcc agagaagtac aaagagatat tcttcgacca gagcaagaat ggatatgccg 8760
gatacatcga tggcggagca tcacaggaag aattttacaa gttcatcaaa ccaatcctcg 8820
agaagatgga cggtactgaa gagctgctgg tgaagctgaa cagggaggac ctgctgagga 8880
agcagaggac ctttgataat ggctccattc cacatcagat acacctggga gagotgcatg 8940
caatcctccg caggcaggag gatttctatc ctttcctgaa ggataaccgg gagaagatag 9000
agaagatcct gaccttcagg atcccttatt acgtcggccc totggctaga ggcaactccc 9060
gcttcgcttg gatgaccagg aaatctgagg agacaattac tccttggaac ttcgaagagg 9120
tcgtggataa gggcgcaagc gcccagtcat tcatcgaacg gatgaccaat ttcgataaga 9180
acctgcccaa cgagaaggtc ctgcccaaac attcactcct gtacgagtat ttcaccgtct 9240
ataacgagct gactaaagtg aagtacgtga ocgagggcat gaggaagcct gccttcctgt 9300
ccggagagca gaagaaggct atcgttgatc tgctcttcaa gactaataga aaggtgacag 9360
tgaagcagct caaggaggat tactttaaga agatcgaatg ctttgactca gtggaaatct 9420
ctggcgtgga ggaccgcttt aatgccagcc tgggcactta coatgatctg ctgaagataa 9480
tcaaagacaa agatttcctc gataatgagg agaacgagga catcctggaa gatatcgtgc 9540
tgaccctgac tctgttcgag gatagagaga tgatcgaaga gcgcctgaag acctatgccc 9600
atctgtttga cgataaagtc atgaaacagc tcaagcggcg gcgctacact gggtggggta 9660
gactctccag gaaactcata aacggcatcc gcgacaaaca gagcggaaag accatcctgg 9720
atttcctgaa atccgacgga ttcgctaaca ggaacttcat gcaactgatt cacgatgact 9780
ctctgacatt taaagaggac atccagaagg cacaggtgag cggtcaaggc gacagcctgc 9840
acgagcacat cgccaacctc gctggatcac ccgccataaa gaagggaata ctgcagacag 9900
tcaaggtcgt ggacgaactc gtcaaagtga tgggtcggca caagccagag aatatcgtta 9960
tcgaaatggc aagggagaac caaaccaccc agaagggcca gaagaactct cgggaacgga 10020
tgaaaagaat cgaagaggga attaaggagc tgggatctca gatactgaag gagcaccctg 10080
tggagaatac acagctccag aacgagaaac tctacctgta ctacctccag aacgggcggg 10140
acatgtacgt tgaccaggaa ctcgacatca accggctgtc cgattatgac gtggaccata 10200
ttgttccaca gtccttcctc aaagatgact ccattgacaa caaggtgctg accagatccg 10260
ataagaatcg cggtaagtct gacaatgttc catcagaaga ggtggtcaag aagatgaaga 10320
attactggcg gcagctcctc aacgccaaac tgatcaccca gcggaagttt gacaatctga 10380
ctaaggcaga aagaggaggt ctgagcgaac togacaaggc cggctttatt aagaggcaac 10440
tggtcgaaac acgccagatt accaaacacg tggcacaaat cctcgactct aggatgaaca 10500
ctaagtacga tgagaaogat aagctgatca gggaagtgaa agtgataact ctgaagagca 10560
agctggtgtc tgacttccgg aaggactttc aattctacaa agttcgcgaa ataaacaatt 10620
accatcatgc tcacgatgcc tatctcaatg ctgtcgttgg caccgccctg atcaagaaat 10680
accctaaact ggagtctgag ttcgtgtacg gtgactataa agtctacgat gtgaggaaga 10740
tgatagcaaa gtctgagcaa gagattggca aagccaccgc caagtacttc ttctactcta 10800
atatcatgaa tttctttaag actgagataa ccctggctaa cggogaaatc cggaagcgcc 10860
cactgatcga aacaaacgga gaaacaggag aaatcgtgtg ggataaaggc agggacttcg 10920
caactgtgcg gaaggtgctg tccatgccac aagtcaatat cgtgaagaag accgaagtgc 10980
agaccggcgg attctcaaag gagagcatcc tgccaaagcg gaactctgac aagctgatcg 11040
ccaggaagaa agattgggac ccaaagaagt atggcggttt cgattcccct acagtggctt 11100
attccgttct ggtcgtggca aaagtggaga aaggcaagtc caagaaactc aagtctgtta 11160
aggagctgct cggaattact attatggaga gatccagctt cgagaagaat ccaatcgatt 11220
tcctggaagc taagggctat aaagaagtga agaaagatct catcatcaaa ctgcccaagt 11280
actctctctt tgagctggag aatggtagga agcggatgct ggcctccgcc ggagagctgc 11340
agaaaggaaa cgagctggct ctgccctcca aatacgtgaa cttcctgtat ctggcctccc 11400
actacgagaa aotcaaaggt agccctgaag acaatgagca gaagoaactc tttgttgagc 11460
aacataaaca ctacctggac gaaatcattg aacagattag cgagttcagc aagcgggtta 11520
ttctggccga tgcaaacctc gataaagtgc tgagcgcata taataagcac agggacaagc 11580
caattcgcga acaagcagag aatattatcc acctctttac tctgactaat ctgggcgctc 11640
ctgctgcctt caagtatttc gatacaacta ttgacaggaa gcggtacacc tctaccaaag 11700
aagttctcga tgccaccctg atacaccagt oaattaccgg actgtacgag actcgcatcg 11760
acctgtctca gctcggcggc gactagtaaa gcggccgggo tcgagtctag aaagggtggg 11820
cgcgccgacc cagctttctt gtacaaagtg gctcgacggt aoctttaaga ccaatgactt 11880
acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa 11940
ttcactccca acgaagacaa aatcgtcgag agatgctgca tataagcagc tgctttttgc 12000
ttgtactggg tctctctggt tagaocagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg 12060
gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg 12120
tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat 12180
ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat tattcagtat ttataacttg caaagaaatg 12240
aatatcagag agtgagaggc cttgacatta taatagattt agcaggaatt gaactaggag 12300
tggagcacac aggcaaagct gcagaagtac ttggaagaag ccaccagaga tactcacgat 12360
tctgcacata cctggctaat cccagatcct aaggattaca ttaagtttac taacatttat 12420
ataatgattt atagtttaaa gtataaactt atctaattta ctattctgac agatattaat 12480
taatcctcaa atatcataag agatgattac tattatcccc atttaacaca agaggaaact 12540
gagagggaaa gatgttgaag taattttccc acaattacag catccgttag ttacgactct 12600
atgatcttct gacacaaatt ccatttactc ctcaccctat gactcagtcg aatatatcaa 12660
agttatggac attatgctaa gtaacaaatt acccttttat atagtaaata ctgagtagat 12720
tgagagaaga aattgtttgc aaacctgaat agcttcaaga agaagagaag tgaggataag 12780
aataacagtt gtcatttaac aagttttaac aagtaacttg gttagaaagg gattcaaatg 12840
cataaagcaa gggataaatt tttctggcaa caagactata caatataacc ttaaatatga 12900
cttcaaataa ttgttggaac ttgataaaac taattaaata ttattgaaga ttatcaatat 12960
tataaatgta atttactttt aaaaagggaa catagaaatg tgtatcatta gagtagaaaa 13020
caatccttat tatcacaatt tgtcaaaaoa agtttgttat taacacaagt agaatactgc 13080
attcaattaa gttgactgca gattttgtgt tttgttaaaa ttagaaagag ataacaacaa 13140
tttgaattat tgaaagtaac atgtaaatag ttctacatac gttcttttga catcttgttc 13200
aatcattgat cgaagttctt tatcttggaa gaatttgttc caaagactct gaaataagga 13260
aaacaatcta ttatatagtc tcacaccttt gttttacttt tagtgatttc aatttaataa 13320
tgtaaatggt taaaatttat tcttctctga gatcatttca cattgcagat agaaaacctg 13380
agactggggt aatttttatt aaaatctaat ttaatctcag aaacacatct ttattctaac 13440
atcaattttt ccagtttgat attatcatat aaagtcagcc ttcctcatct gcaggttcca 13500
caacaaaaat ccaaccaact gtggatcaaa aatattggga aaaaattaaa aatagcaata 13560
caacaataaa aaaatacaaa tcagaaaaac agcacagtat aacaacttta tttagcattt 13620
acaatctatt aggtattata agtaatctag 13650
<210>10<211>22<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>гидовая РНК AASV1<400>10
ggggcgggcg gtgcgatgtc gt
22
<210>11<211>20<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>5'-праймер<400>11
agggccactt ctgctaatgg
20
<210>12<211>19<212>ДНК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>З'-праймер
<400>12
gataccgtcg gcgttggtg
19
<---