Новые подходы к регуляции противоопухолевого иммунитета

СЪЕЗДЫ, КОНФЕРЕНЦИИ 1 ’2007

НОВЫЕ ПОДХОДЫ К РЕГУЛЯЦИИ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ИММУНИТЕТА

З.Г. Кадагидзе

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

Ключевой проблемой в иммунологии является понимание того, как иммунная система отличает «свое» от «чужого» и, подавляя ответы на аутоантигены, обеспечивает эффективную защиту от патогенных микроорганизмов и чужеродных антигенов. К сожалению, несмотря на способность иммунной системы распознавать и отвечать на различные опу-хольассоциированные антигены, опухоль преодолевает защитные силы организма, растет и метастазирует.

К настоящему времени накоплен огромный материал, свидетельствующий о том, что различные субпопуляции регуляторных Т-кле-ток — CD4+, CD8+, а также NKT-клетки играют существенную роль в контроле аутоиммунных процессов, а также иммунного ответа на аллотрансплантаты, аллергены, инфекционные агенты и опухолевые клетки. Важно отметить, что различные субпопуляции Т-супрессо-ров экспрессируют разные рецепторы, используют разные эффекторные механизмы и функционируют на разных стадиях иммунного ответа. Регуляторные CD4+ Т-клетки включают в себя естественные «профессиональные», продуцируемые тимусом полностью дифференцированные супрессорные клетки CD25+CD4+ Трег (Трег) [1], и регуляторные Т-клетки, возникающие из наивных или покоящихся периферических CD4+ Т-клеток в процессе ответа на антиген: ^1- и ^3-клетки (супрессорная активность обусловлена продуцируемыми ими интерлейкином — ИЛ-10 и трансформирующим фактором роста-р соответственно).

Многочисленные исследования показывают, что решающую роль в обеспечении иммунологической аутотолерантности и негативном контроле как патологических, так и физиологических иммунных реакций играет популяция естественных CD25+CD4+Трег. Элиминация или инактивация этих клеток вызывает развитие тяжелых аутоиммунных заболеваний, а также приводит к усилению иммунного ответа на аллоантигены и опухолевые клетки. Трег продуцируются тимусом как функционально зрелая популяция, сохраняющая стабильную функцию на периферии. Они обнаруживаются в тимусе плода человека уже на 13-й неделе, а вне тимуса — начиная с 14-й недели беременности. C возрастом супрессорная активность CD25+CD4+Трег у человека снижается.

Трег периферической крови постоянно экспрессируют различные поверхностные молекулы, характерные для активированных клеток или клеток «памяти». Основными маркерами являются CD25 — рецептор ИЛ-2 (IL-2Ra), GITR (glucocorticoid-induced TNF receptor family-related gene), а также внутриклеточный CTLA-4 (CD152). Хотя практически ни один из этих маркеров не является уникальным для СD4+Трег, постоянный характер и уровень экспрессии дают возможность использовать их для характеристики, выделения и исследования этих клеток. Совершенно очевидно, что знание специфических маркеров регуляторных Т-клеток необходимо для разработки методов эффективной иммунотерапии опухолей. Наиболее характерным маркером естественных регуляторных CD4+CD25+ Т-клеток является ген Foxp3/FOXP3. У мышей Foxp3 экспрессируется только естественными регуляторными Т-клетками. У человека экспрессия этого маркера была обнаружена и в активированных Т-клетках, однако регуляторные клетки экспрессируют значительно более высокие уровни FOXP3, чем активированные Т-клетки. Гену Foxp3, который кодирует транскрипционный репрессор — белок Scurfin, отводится центральная роль в развитии и функционировании Трег.

CD25 является специфическим маркером естественных регуляторных Т-клеток, однако он экспрессируется также на любых Т-клетках после активации. По данным разных авторов, у человека около 30% CD4+ T-клеток экспрессируют CD25. В лаборатории клинической иммунологии показано, что большинство этих клеток имеют низкий или средний уровень экспрессии CD25 и только 1—3% — высокий. Исследования in vitro популяций CD25int и СD25high показали, что супрессорной активностью обладали главным образом CD4+ Т-клетки, имевшие высокую постоянную экспрессию СD25, что согласуется с зарубежными данными [2].

GITR. Эта молекула постоянно экспрессируется на Трег, но ее экспрессия, как и экспрессия других маркеров Трег, повышается на активированных нерегуляторных Т-клетках. Имеются сообщения как о блокаде ингибиторной активности Трег моноклональными анти-GITR антителами (анти-GITR мАТ), так и об отсутст-

вии их влияния на нее. Высказываются предположения, что антисупрессорный эффект анти-GITR мАТ обусловлен связыванием GITR на активированных клетках, а не на Трег, что делает первые резистентными к супрессии. GITRL (лиганд GITR) экспрессируется на антигенпре-зентирующих клетках (АПК) — дендритных клетках (ДК), макрофагах и В-клетках, его экспрессия снижается в процессе их созревания.

^ЬЛ-4 (CD152) постоянно экспрессируется на высоком уровне внутри и на низком на поверхности CD25+CD4+Трег человека. После стимуляции TCR экспрессия этого маркера повышается и сохраняется на высоком уровне в течение длительного времени. Напротив, CD25"CD4+ Т-клетки экспрессируют CTLA-4 только после стимуляции и очень непродолжительное время.

В многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях установлено, что при большинстве злокачественных опухолей (рак легкого, желудка, яичников, молочной железы, пищевода и др.) увеличивается Трег популяция до 12—21% [1]. Однако необходимо отметить, что это увеличение более характерно для больных с распространенными заболеваниями, в то время как на ранних стадиях увеличение Трег незначительно. Так, например, при анализе количественного содержания Трег среди лимфоцитов, инфильтрирующих слизистую оболочку желудка в норме и при раке, практически не обнаружено различий в их содержании у больных с ранними стадиями рака и у людей с другими заболеваниями желудка. В то же время при распространении опухоли и появлении метастазов в периферических лимфатических узлах уровень Трег значительно повышается.

Особое значение исследование функции этой популяции клеток имеет при различных видах иммунотерапии опухолей. Отсутствие эффективного опухольспецифического иммунного ответа связывают с дефицитом функции АПК или толерантностью Т-клеток к ассоциированным с опухолью антигенам. Утверждается, что CD4+CD25+ клетки снижают эффективность противоопухолевых цитотоксиче-ских лимфоцитов, влияя в то же время и на аутоиммунные реакции. Полагают, что разрушение иммунологической толерантности может быть одним из эффективных путей индукции противоопухолевого иммунного ответа. В связи с этим был проведен ряд исследований по изучению влияния удаления этих клеток на противоопухолевый иммунный ответ. Показано, что уменьшение количества Трег приводит к активации молчащих CD8+ Т-клеток, а также неспецифических NК-подобных эффекторных клеток. Так было исследовано влияние анти-СD25, -СD4, -CD8 и -NK мАТ на индукцию

противоопухолевого иммунного ответа к опухолевым клеткам СТ26 (HLA-II — негативная опухоль толстого кишечника мышей). Оказалось, что иммунизация АН-1 (пептид из клеток СТ26) не защищала животных от развития опухоли, т.е. введение антигена не было достаточным для развития противоопухолевого иммунного ответа. В то же время после удаления CD4+ Т-клеток все иммунизированные животные были живы, а удаление CD8+ не оказывало влияния на выживаемость мышей. Чтобы подтвердить, что именно CD4+CD25+ клетки играют основную роль в развитии этого эффекта, части мышей за 4 дня до введения разрешающей дозы опухолевых клеток вводили анти-CD25 мАТ. Оказалось, что все животные этой группы были защищены от развития опухоли, причем даже те, кому иммунизация не проводилась. Для подтверждения ингибирующей роли CD25+ клеток авторы осуществили адоптивный перенос этой популяции клеток. Мышам, иммунизированным АН-1 и получившим анти-CD4 мАТ, вместе с разрешающей дозой опухолевых клеток вводили 5 х 106 CD25+ клеток. Оказалось, что адоптивный перенос СD25+ Т-клеток отменяет защитный эффект, наблюдаемый у иммунизированных мышей с удаленными CD4+ клетками. Таким образом, на этой модели было четко показано, что CD25+ T-клетки являются главными ингибиторами индукции противоопухолевого иммунитета [3]. Далее было показано, что если вводить мышам опухолевые клетки через 50 дней после удаления CD25+ клеток, все животные гибнут. Оказалось, что к этому времени количество CD25+ клеток в организме животных восстанавливается, т.е. защитный эффект проявляется в короткий промежуток времени сразу после удаления этой популяции клеток. Эти и аналогичные данные позволяют предположить, что ин-гибиция CD25+Трег может благотворно влиять на индукцию противоопухолевого иммунного ответа при комбинации с различными методами вакцинотерапии. В то же время удаление CD25+ Т-клеток на длительный срок опасно в связи с риском развития аутоиммунных процессов, к тому же это может приводить к уменьшению количества активированных лимфоцитов, в том числе неспецифических противоопухолевых CD4+ и CD8+ Т-клеток, что может способствовать опухолевому росту.

Большой интерес представляет динамика Трег при использовании цитокинов при лечении онкологических больных. Оказалось, что при введении ИЛ-2 в период лечения значительно повышается число Трег (CD4+CD25high FOXP3+), через 3 нед их число уменьшается, но остается выше исходного уровня [4]. Полагают, что именно активация Трег может ограничивать противоопухолевый эффект ИЛ-2.

СЪЕЗДЫ, КОНФЕРЕНЦИИ 1 ’2007

СЪЕЗДЫ, КОНФЕРЕНЦИИ 1 ’2007

В ряде исследований показано, что у онкологических больных увеличенное количество CD4+CD25+ клеток сопровождается высокой экспрессией на них CTLA-4. Получение мАТ к CTLA-4 позволило проводить исследования по изучению влияния удаления этой популяции клеток на опухолевый рост как в эксперименте, так и в клинике. Введение мАТ к CTLA-4 в дозе 0,5 мг/кг больным метастатическим раком простаты приводило к снижению уровня простатического антигена у гор-монрезистентных больных. Введение мАТ MDX-100 в дозе 3 мг/кг больным метастатической меланомой до вакцинотерапии (антиген, выделенный из клеток меланомы с адъювантами) дало клинический эффект у 3 из 14 больных (2 полных ответа и 1 частичный). Однако у 6 больных было отмечено развитие аутоиммунных реакций. Необходимо отметить, что удаление CTLA-4+ клеток может быть недостаточно для отмены супрессорной активности Трег: в экспериментальных исследованиях было показано, что Трег «нокаутированных» по CTLA-4 мышей оставались способными подавлять иммунный ответ.

Другим подходом к ингибиции активности Трег является использование малых доз ци-клофосфамида (ЦФ). Еще в 1980-х годах было показано, что малые дозы ЦФ способны усиливать противоопухолевый иммунный ответ. Оказалось, что введение ЦФ в дозе 2 мг/мышь уменьшало количество CD4+CD25+ клеток в лимфатических узлах (ЛУ) и селезенке мышей. Снижение начиналось через 24 ч после введения (на 14%) и достигало максимума на 4-й день (50%), а затем число Трег постепенно восстанавливалось и к 10-му дню их количество возвращалось к исходному уровню. Кроме того, среди CD4+CD25+ Т-клеток после введения ЦФ снижалось количество клеток, экспрессирующих GITR и CTLA-4. Трег от мышей, леченных ЦФ, в значительно меньшей степени ингибировали пролиферативный ответ CD8+и CD25-CD4+ клеток и были более чувствительны к индукции апоптоза in vitro и in vivo [5]. Таким образом, перспективным для применения вакцинотерапии является период с 4-го по 10-й день после введения ЦФ.

Экспериментальные исследования с использованием CD4-дефицитных мышей показали, что адоптивный перенос CD25-CD4+ совместно со специфическими противоопухолевыми CD8+ Т-клетками и вакциной (мела-номный антиген gp100) приводил к развитию аутоиммунных реакций и регрессии развившейся меланомы. Перенос CD4+ T-клеток, которые включали в себя смесь CD25+CD4+ и CD25-CD4+ Т-клеток, или только Трег подавлял эффект адоптивной иммунотерапии. Эти данные указывают на то, что Т-хелперы могут способствовать снятию толерантности к персистирующим антигенам и разрушению уже развившейся опухоли, но эффект проявляется только при одновременном отсутствии Трег. Данные о повышении количества Трег у больных меланомой, иммунизированных различными вакцинами, в том числе и gp100, еще раз указывают на необходимость подавления функции этой популяции в процессе вакцинотерапии. В этом убеждают также данные, полученные S.J. Prasad и соавт. [6], исследовавшими эффективность различных вакцин на основе дендритных клеток в зависимости от присутствия Трег. Вакцинация проводилась ДК; клетками меланомы, обработанными тепловым шоком и у-облучением; ДК, нагруженными этими клетками. Часть мышей в день 0 получала введение 100 мкг мАТ PC61 против CD25+ клеток. Удаление CD25+ клеток способствовало торможению опухолевого роста, особенно в группе мышей, получивших классический вариант дендритной вакцины: ДК+клетки меланомы. Следует отметить, что повторное введение через 90 дней интактных опухолевых клеток животным, у которых опухоли не развились, выявило сохранение противоопухолевого эффекта, что, возможно, связано с развитием Т-клеток памяти. По некоторым данным, фактор некроза опухоли обладает способностью подавлять активность Трег, что позволяет исследовать возможности влияния различных цитокинов на функцию Трег. Таким образом, удаление иммунорегуля-торных Т-клеток можно рассматривать как одно из перспективных направлений повышения эффективности вакцинотерапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Sakaguchi S. Nat Immunol 2005;6(4):345—52.

2. Baecher-Allan C., Brown J.A., Freeman G.J., Hafler

D.A. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood. J Immunol 2001;167(3):1245—53.

3. Casares N., Arribillaga L., Sarobe P. et al. CD4+/CD25+ regulatory cells inhibit activation of tumor-primed CD4+ T cells with IFN-gamma-

dependent antiangiogenic activity, as well as long-lasting tumor immunity elicited by peptide vaccination. J Immunol 2003;171(11):5931—9.

4. Ahmadzaden M., Rosenberg

5.A. IL-2 administration increases CD4+ CD25(hi) Foxp3+ regulatory T cells in cancer patients. Blood 2006;107(6):2409—14.

5. Lutsiak M.E, Semnani R.T, De Pascalis R. et al. Inhibition of

CD4(+)25+ T regulatory cell function implicated in enhanced immune response by low-dose cyclophosphamide. Blood 2005;105(7):2862—8.

6. Prasad S.J., Farrand K. J.,

Matthews S.A. et al. Dendritic cells loaded with stressed tumor cells elicit long-lasting protective tumor immunity in mice depleted of CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol 2005;174(1):90—8.