Способ оценки реперфузионного повреждения сосудистой стенки в эксперименте
METHOD FOR ASSESSING REPERFUSION INJURY OF VASCULAR WALL IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и может быть использовано при лечении облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей (ОААНК).
Ишемическое и реперфузионное повреждения тканей – это ежедневная проблема в практике сосудистых хирургов [Основы ангиологии : учебное пособие / Р.Е Калинин [и др.]; под ред. Р.Е.Калинина. – М.: // ГЭОТАР-Медиа, 2018. – 112с.]. Реперфузия ткани, находящейся ранее в состоянии ишемии, хотя и является необходимой для предотвращения необратимых повреждений, вызывает ответную реакцию в микрососудах, которая очень сходна с процессом воспаления, то есть протекает на фоне окислительного стресса (ОС).
Известен способ  оценки реперфузионного повреждения сосудистой стенки  –  описание патоморфологической картины, которая при анализе аорт и подвздошных артерий животных показывает, что каскад патоморфологических изменений включает в себя несколько основных этапов и укладывается в традиционные представления о реактивности тканевых систем и не является специфическим для реперфузии. В этой связи для более тонкой дифференцировки различий патоморфогенеза при реперфузии применяются высокоразрешающие  биохимические методы исследования.
Несмотря на многолетнюю историю исследовательских работ в области реперфузионного повреждения тканей, на сегодняшний день патофизиология данного феномена  в хирургии магистральных артерий нижних конечностей остаётся не специфична. Многогранность патофизиологических процессов определяет важность проведения экспериментальных работ в изучении данного феномена с возможностью сопоставления биохимических  и морфологических   изменений.
Определение окисленных групп белков, как маркёров ОС, имеет ряд преимуществ [Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress/ I. Dalle – Donne [et al.] // Pubmed – 2003. –  URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12589963.]. Так, карбонильные группы являются химически стабильными соединениями, и циркулируют в крови более продолжительный промежуток времени, чем конечные продукты свободно-радикального окисления липидов, например, малоновый диальдегид.  Окисленные белки  подвергаются разрушению в течение часов и дней, в то время как продукты окисления липидов нейтрализуются за считанные минуты.
Одним из перспективных направлений в науке стало практическое исследование окислительно-модифицированных белков в биологическом материале при патологических состояниях [Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования / Л. Е. Муравлева [и др.] // Фундаментальные исследования – 2010 - №1 – С. 74-78.].
Техническим результатом настоящего изобретения является определение биохимического маркера реперфузионного повреждения сосудистой стенки в эксперименте после операций на аорте.
Способ заключается в следующем: на лабораторных животных (крысах линии Wistar массой тела 250-300)  создавалась модель реперфузии путем пережатия брюшного отдела аорты с последующим кондиционированием (на фиг.1 представлены основные этапы операции). Исследование выполнено на 40 лабораторных животных, которые содержались в стандартных условиях вивария, получали стандартный рацион питания и воду ad libitum, в соответствии с этическими нормами, изложенными в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986) и Приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Все операции осуществлялись под наркозом с использованием препаратов «Ксило» 1 мг/кг и «Золетил 50» 15 мг/кг. Вывод животных из эксперимента проводили передозировкой золетила (“Virbac Sante Animale”, Франция), вводимого внутримышечно в дозе 50мг/кг на 1, 3, 5, 7 сутки. Выделенный сосудистый ствол  фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина (фосфатный буфер, pH=7,2–7,4),  обезвоживали в серии этанолов возрастающей концентрации, с применением изопропанола, заливали в парафин.  Изготавливали тотальные серии срезов (10 мкм), которые окрашивали гематоксилином и эозином (“Biovitrum”, Россия). Гистологические срезы также окрашивали пикрофуксином по ван Гизону и по методу Маллори по общепринятой методике.
Морфологическое исследование проводили с помощью микроскопа Leica DMI 4000 B с видеозахватом камерой Leica.
4
Для проведения трансмиссионной электронной микроскопии, фрагменты сосудистой стенки фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида (“Fluka”, Швейцария) с постфиксацией в 1% растворе OsO (“Fluka”, Швейцария). Контрастирование проводили 2,5% спиртовым раствором (70є этиловый спирт) уранила ацетата (“Fluka”, Швейцария). Подготовленные кусочки заливали в смесь смол Эпона и Аралдита М (“Fluka”, Швейцария). Полутонкие срезы окрашивали азуром II и эозином. Ультратонкие срезы дополнительно контрастировали солями свинца и уранилацетатом  по Рейнольдсу (Уикли Б., 1975г.). Изучение препаратов проводили на трансмиссионном электронном микроскопе “Libra 120” с автоматическим сканированием изображений (“Carl Zeiss”, Германия).
Подсчет площади под кривой спектра поглощения продуктов окислительной модификации белков осуществляли по авторской методике [Патент на изобретение №2524667 РФ, МПК G01N33/52. / Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях / Фомина М.А. и др.; Ряз. гос. мед. ун-т им. И.П. Павлова. – 2013102618/15; заявл. 21.01.2013; опубл. 27.07.2014, Бюл. № 21. – 8 с.], полученное значение выражали в условных единицах/грамм белка.
общ
Для оценки доли первичных маркеров окислительной модификации белков подсчитывалась сумма альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ), для оценки вторичных – сумма кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ), и соотносилась с общим содержанием карбонильных производных белков (S).
Статистический анализ результатов исследования проводился с использованием программы Statistica 10.0. Проверку нормальности распределения данных осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилка (W-критерий). Результаты представлены в формате Ме [min; max], где Ме- медиана, min - минимальное и max - максимальное значение. Для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест). Для проверки равенства медиан нескольких выборок использовали критерий Краскела-Уоллиса. Для оценки ранговой корреляции использовали коэффициент Спирмена. Критический уровень значимости нулевой гипотезы (р) принимали равным 0,05.
При исследовании ультраструктуры сосудистой стенки после моделирования реперфузии обнаружены адаптивные и патологические изменения эндотелиальных клеток. Получены данные, свидетельствующие о значительном нарушении микрогемодинамики в тканях при реперфузии: отмечается повреждение (альтерация) основных компонентов сосудистой стенки. Эндотелиоциты под воздействием этого фактора реагируют неспецифическим образом изменяя свою синтетическую активность, что проявляется совокупностью морфологических изменений, захватывающих ядро, кариолемму, цитоплазму и плазмалемму. В некоторых клетках изменения приобретают необратимый характер, сопровождаются разрывом мембран митохондрий, органелл общего назначения, плазмалеммы. Такие эндотелиоциты погибают и десквамируются. Субэндотелиальные структуры подвергаются отеку, что закономерно в связи с учетом нарушения барьерной функции эндотелия и незначительно выраженного воспалительного компонента (на фиг. 2, 3 представлены описанные морфологические изменения).
С целью оценки степени повреждения белковых молекул проводился анализ доли первичных и вторичных маркеров окислительного стресса. Из приведенных результатов следует, что при моделировании ишемии-реперфузии преобладают вторичные маркеры (КДНФГ) на 3-и и 5-е сутки в сосудистой стенке, а в плазме еще и на 7-е сутки, что свидетельствует об усугублении окислительного стресса и переходе в позднюю стадию.
На фиг. 4 представлены значения доли (%) вторичных маркеров  окислительного стресса при реперфузии в сосудистой стенке и плазме (КДНФГ).
Полученные данные свидетельствуют о том, что при реперфузии активация свободно-радикальных процессов плазмы и сосудистой стенки стимулируется напряжением кислорода, что приводит к развитию окислительного стресса на 3-и, 5-е, 7-е сутки в сочетании с накоплением вторичных маркеров окислительного стресса (КДНФГ).
Необратимое окисление белков, то есть преобладание вторичных маркеров, свидетельствует об усугублении окислительного стресса, переходе его в позднюю стадию и приводит к утрате биологических свойств протеинов, а в дальнейшем к их агрегации или деградации, что наблюдается при моделировании реперфузии на 3-и, 5-е сутки в сосудистой стенке.
В ходе проведенного исследования доказано, что при экспериментальном моделировании реперфузии окислительный стресс развивается с 3-их суток в сосудистой стенке с  преобладанием вторичных маркеров. Данные биохимические изменения подтверждаются морфологическими изменениями ультраструктуры сосудистой стенки. Таким образом, КДНФГ является маркером реперфузионного поражения сосудистой стенке после оперативного вмешательства на магистральных артериях.