СПОСОБ ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО АППЕНДИЦИТА
METHOD FOR PATHOMORPHOLOGICAL DIAGNOSIS OF CHRONIC APPENDECTOMY

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии.
Известно, что диагностика хронического аппендицита, а особенно дифференциальная диагностика его различных форм, представляет определенные трудности [Bittinger F., Brochhausen С, Köhler Н., Lehr Н.А., Otto М., Skarke С, Walgenbach S., Kirkpatrick C.J. Differential expression of cell adhesion molecules in inflamed appendix: correlation with clinical stage // J. Pathol. - 1998. - Vol. 186, N 4. - P. 422-428].
Известен способ дифференциальной диагностики хронического аппендицита, включающий подсчет плотности эозинофильной инфильтрации и количества тучных клеток в гистологическом препарате. Выявление тучных клеток на препарате проводят окрашиванием срезов 1%-ным толлуидиновым синим. При хроническом аппендиците количество эозинофилов во всех слоях аппендикса ниже, чем при остром аппендиците, а количество тучных клеток выше [Mysorekar V.V., Chanda S., Dandeka C.P. Mast cells in surgically resected appendices // Indian J. Pathol. Microbiol. - 2006. - Vol.; 49, N 2. - P. 229-233].
Недостатком известного способа является отсутствие четких критериев постановки диагноза "хронический аппендицит" при необходимости проведения трудоемких морфометрических исследований.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ диагностики хронического аппендицита путем фиксации образца ткани, изготовления срезов, инкубирования во влажной камере с реагентом и обработки проявляющим агентом, дегидратации и заключения в среду. Известный способ основан на оценке дифференциальной экспрессии молекул клеточной адгезии в воспаленном аппендиксе [Bittinger F., Brochhausen С, Köhler Н., Lehr Н.А., Otto М., Skarke С, Walgenbach S., Kirkpatrick С.J. Differential expression of cell adhesion molecules in inflamed appendix: correlation with clinical stage // J. Pathol. - 1998. - Vol. 186, N 4. - P. 422-428].
Известный способ осуществляют следующим образом. Криосрезы аппендикса, фиксированные 4% параформальдегидом, окрашивают имуногистохимическим методом с использованием в качестве первичных антител моноклональные мышинные антитела к ICAM-1 (молекула межклеточной адгезии 1) (в разведении 1:200), VCAM-1 (васкулярная молекула клеточной адгезии 1) (в разведении 1:50), E-selectin (эндотелиально-лейкоцитарная молекула адгезии 1) (в разведении 1:50) (Biermann, Bad Nauheim, Germany). Первичные антитела инкубируют на срезах в течение 16 часов при 4°С. В качестве вторичных антител применяют кроличьи антимышинные IgG. Затем на срезы наносят АРААР complex (меченные щелочной фосфатазой моноклональные антитела к щелочной фосфатазе) (Dako, Hamburg, Germany) и инкубируют в течение 15-30 минут с хромогенами. Для докрашивания ядер на срезах применяют гемалаун.
Экспрессию молекул клеточной адгезии оценивают полуколичественным методом с помощью световой микроскопии по интенсивности окраски клеток. При отсутствии окраски интенсивность экспрессии обозначают как 0, при слабой фокальной окраске менее 30% клеток - 1, при средней интенсивности фокальной окраски менее 30% клеток - 2, при выраженной окраске менее 30% клеток - 3, при выраженной окраске большинства клеток - 4.
При этом:
- в неизмененном аппендиксе отмечают легкую гомогенную окраску в сосудах на ICAM-1, в то же время на VCAM-1 и E-selectin окраска не регистрируется;
- в ранний период острого аппендицита регистрируют умеренно положительную окраску на ICAM-1, слабо положительный результат на VCAM-1 и слабо (менее 6 ч после начала клинических симптомов) или умеренно (более 6 ч) положительный результат на Е-селектин;
- при флегмонозном аппендиците окраска выявлялась от умеренной до сильной положительной на ICAM-1, слабоположительной на VCAM-1 и от умеренно до сильноположительной на Е-селектин;
- при подостром аппендиците - слабая экспрессия на ICAM-1, легкая на VCAM-1 и минимальная на Е-селектин;
- при хроническом аппендиците экспрессия ICAM-1 и VCAM-1 сильнее, чем при подостром аппендиците. В отличие от раннего острого аппендицита, наблюдается более интенсивное окрашивание на VCAM-1, аналогичное флегмонозному аппендициту, и умеренная экспрессия ICAM-1.
К недостаткам известного способа патоморфологической диагностики хронического аппендицита следует отнести недостаточную его точность, обусловленную полуколичественным анализом результатов.
Также к недостаткам данного способа следует отнести длительную инкубацию с первичными антителами - 16 часов, необходимость одновременного применения 3-х окрасок, а также и приготовление криосрезов. Все эти приемы существенно повышают трудоемкость и стоимость работ. При этом известный способ не может быть использован для анализа архивного материала, т.к. предполагает применение специального забора материала в операционной.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа патологоанатомической диагностики хронического аппендицита.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности патоморфологической диагностики хронического аппендицита, за счет специфической окраски субсерозного и мышечного слоев стенки аппендикса, а также снижение трудоемкости анализа и возможность исследования архивного материала.
Технический результат достигается тем, что способ патоморфологической диагностики хронического аппендицита включает в себя фиксацию образца ткани, изготовление срезов, инкубирование во влажной камере с реагентом и обработку проявляющим агентом.
Основным отличительным приемом заявляемого способа является то, что в качестве реагента используют антитела к р44 MAPK (Erk1) (MAPK3) (митогенактивируемая протеинкиназа 3) в разведении 1:100-1:250.
Отличительным приемом предлагаемого способа также является и то, что инкубацию с реагентом проводят при температуре 25°С и относительной влажности 100%. Длительность инкубации составляет 60 минут.
Отличие заявляемого способа заключаются и в том, что при микроскопическом выявлении в препарате свечения изумрудно-зеленой окраски в субсерозном и мышечном слоях стенки аппендикса диагностируют хронический аппендицит.
Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».
Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно обеспечение возможности диагностики хронического аппендицита, повышения точности и специфичности патоморфологического установления хронического аппендицита
Совокупность приемов заявляемого способа позволила авторам получить специфическое окрашивание субсерозного и мышечного слоев стенки аппендикса и по визуализации свечения флюорохромных меток в них четко дифференцировать хронический аппендицит от других форм патологии червеобразного отростка. Отсутствие такого свечения позволяет исключить данный диагноз.
Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами.
Вышеизложенное дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».
Сущность заявляемого способа поясняется примером конкретного выполнения. Приведенный ниже пример служит для иллюстрации, но не ограничивает данное изобретение.
Пример.
Объектом исследования явился интраоперационный материал 18-ти больных, оперированных по поводу различной аппендикулярной патологии. На основании клинико-морфологических данных в 12-ти случаях диагностировали острый флегмонозный аппендицит, в 2-х - острый гангренозный, в 3-х - хронический аппендицит, в 1-м - лимфофолликулярную гиперплазию слизистой червеобразного отростка. Протокол исследования одобрен Комитетом по биомедицинской этике Иркутского научного центра хирургии и травматологии.
Фрагменты дистальной части червеобразного отростка фиксировали в растворе FineFix (Milestone, Италия) и заливали в парафиновые блоки по общепринятой методике [Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - С. 13-15, 52-59].
Затем готовили срезы толщиной 5 мкм, которые монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Препараты депарафинировали вначале в толуоле - 5 минут, а затем последовательно, по 1 минуте, в спиртах 100°, 96°, 90°, 70° и 50°. После чего препараты выдерживали в дистиллированной воде в течение 10 минут.
Для демаскирования антигенов препараты помещали в цитратный буфер (pH=6.0) и нагревали 8 минут в микроволновой печи мощностью 800 W при 100% мощности, а затем 10 минут при 60% мощности. После чего препараты охлаждали до 25°C в цитратном буфере (pH=6.0), промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (pH=7.6) 2 раза по 5 минут, обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002).
На препарат наносили Image-iT FX signal enhancer (Invitrogen. Cat. N 136933, Lot 681688) и инкубировали во влажной камере при температуре 25°C 30 минут.
Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (pH=7.6) 2 раза по 5 минут.
Наносили 2% раствор нормальной сыворотки козы (Normal goat serum, Invitrogen, REF PCN 5000, Lot 757418А), инкубировали при температуре 25°C 30 минут.
Наносили первичные антитела р44 МАРК (Erkl) (МАРК3) Rabbit Monoclonal Antibody (Epitomics, Clone ID: EP4967, Cat. N 3739-1, Lot YH111626 в рабочем разведении (1:100 - 1:250), инкубировали во влажной камере при температуре 25°C 60 минут.
Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (pH=7.6) 2 раза по 5 минут.
Наносили вторичные антитела Alexa fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) (Invitrogen, Cat. N 11034, Lot 870976), рабочее разведение 1:300, инкубировали во влажной камере при температуре 25°C 30 минут.
Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут.
Для окрашивания ядер наносили Hoechst, рабочее разведение 1:200, инкубировали 10 минут.
Промывали в фосфатно-солевом буфере с твином (рН=7.6) 2 раза по 5 минут.
Заключали в среду Fluoromount (Diagnostic Biosystems, REF K024, Lot P 939-B).
Визуализацию специфического свечения флюорохромных меток - изумрудно-зеленой окраски, проводили на исследовательском микроскопе Nikon Eclipse 80i с приставкой для эпифлюоресценции DIH-M. В качестве фильтров для выделения требуемых диапазонов флюоресценции использовали Nikon DAPI (возбуждение 325-375 нм, дихроичное зеркало 400 LP, эмиссия 435-485 нм), Nikon В-2А (возбуждение 450-490 нм, дихроичное зеркало 505 LP, эмиссия ≥515 нм). В качестве регистратора использовали камеру Nikon DS-Filc, подключенную к контроллеру Nikon DS-U2, с использованием программного обеспечения Nikon Elements.
Авторами установлено, что при хроническом аппендиците регистрируется яркое специфическое свечение изумрудно-зеленой окраски в субсерозном и мышечном слоях стенки аппендикса. Так, на фиг. 1 представлено специфическое свечение в субсерозном (позиция А) и мышечном (фиг. 2, позиция В) слоях при хроническом аппендиците. Специфическое свечение имеет изумрудно-зеленую окраску. Ядра клеток - синяя окраска (окрашены Hoechst).
При других формах патологии червеобразного отростка специфическое свечение не зарегистрировано. На фиг. 3 и фиг. 4 показано отсутствие специфического свечения при остром флегмонозном аппендиците, соответственно, в субсерозном и мышечном слоях стенки аппендикса. Ядра клеток окрашены Hoechst (синяя окраска).
Авторы отмечают хорошую воспроизводимость предлагаемого способа - при окрашивании серийных срезов в разных партиях достигнуты идентичные результаты окрашивания.
Таким образом, предлагаемый способ патоморфологической диагностики хронического аппендицита позволяет: четко верифицировать диагноз хронический аппендицит при патоморфологическом исследовании; снизить длительность инкубации с первичными антителами с 16 часов (в прототипе) до 1 часа, а общее время окрашивания - до 4 часов; применять для диагностики окраску с единственным первичным антителом, что снижает трудоемкость и стоимость работ. При этом предлагаемый способ обеспечивает возможность анализа архивного материала.
Данный способ может быть использован в медицине, а именно в патологической анатомии для дифференциальной диагностики хронического аппендицита.