Незаряженный липид, композиция на его основе с поликатионным амфифилом и нейтральным фосфолипидом и способ ее получения для доставки нуклеиновых кислот in vitro
UNCHARGED LIPID, COMPOSITION BASED ON IT WITH POLYCATIONIC AMPHIPHILIC MOLECULE, AND NEUTRAL PHOSPHOLIPID, AND METHOD FOR ITS PREPARATION FOR DELIVERY OF NUCLEIC ACIDS IN VITRO

Изобретение относится к области химии, биотехнологии, медицины и химико-фармацевтической промышленности, и раскрывает незаряженный липид, композицию на его основе для транспорта нуклеиновых кислот в клетки в присутствии сыворотки крови в ростовой среде и способ получения такой композиции. Композиция включает незаряженный липид, поликатионный амфифил и нейтральный фосфолипид, и образует комплекс с нуклеиновой кислотой.
Несмотря на огромный потенциал использования генной терапии для лечения заболеваний, ранее считавшихся неизлечимыми (наследственных, онкологических заболеваний и т.д.), на сегодняшний день к клиническому применению в мире разрешено менее 10 геннотерапевтических препаратов [Мельникова Е.В. и др. Мировой опыт регистрации и применения препаратов для генной терапии в клинической практике / Антибиотики и химиотерапия, 2019, Т. 64, №1-2, с. 58-68]. В качестве вектора доставки нуклеиновых кислот (НК) в таких препаратах используются вирусные частицы - аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы простого герпеса, ретровирусы, обладающие высокой эффективностью трансдукции.
Однако их главным недостатком является иммуногенность и риск развития инсерционного мутагенеза, который приводит к злокачественному перерождению клеток [Nayak S. et al. Progress and prospects: immune responses to viral vectors / Gene Ther. Nature Publishing Group, 2010, V. 17, №3, pp. 295-304; Богословская Е.В. и др. Безопасность использования ретровирусных векторов в генной терапии / ВЕСТНИК РАМН, 2012, Т. 10, с. 55-61].
Для внедрения генной терапии в клиническую практику необходимо разрабатывать безопасные и эффективные системы доставки НК. Использование катионных липосом [Maslov М.А. et al. Novel cholesterol spermine conjugates provide efficient cellular delivery of plasmid DNA and small interfering RNA / J. Control. Release, 2012, V. 160, № 2, pp. 182-193; Markov O.O. et al. Novel cationic liposomes provide highly efficient delivery of DNA and RNA into dendritic cell progenitors and their immature offsets / J. Control. Release, 2012, V. 160, № 2, pp. 200-210] позволит решить проблемы, связанные с использованием вирусных векторов. Катионные липосомы должны быть нетоксичны, неиммуногенны, стабильны при хранении и обеспечивать высокую эффективность трансфекции НК.
Катионные липосомы содержат катионный амфифил, который связывает и компактизует НК при физиологических значения рН с образованием комплекса, получившего название липоплекс. Положительно заряженная группа катионного амфифила играет главную роль при формировании электростатического комплекса с отрицательно заряженными НК, при этом гидрофобные хвосты катионного амфифила взаимодействуют с неполярной областью плазматической мембраны клеток-мишеней [Dharmalingam P. et al. An anti-oxidant, α-lipoic acid conjugated oleoyl-sn-phosphatidylcholineas a helper lipid in cationic liposomal formulations / Colloids Surfaces В Biointerfaces, 2017, V. 152, pp. 133-142].
Для улучшения физико-химических свойств липоплексов и увеличения эффективности трансфекции НК в состав катионных липосом добавляют липиды-хелперы. Поглощаясь внутрь клетки, липоплексы попадают в эндосомы, где происходит закисление рН, которое оказывает разрушающее воздействие на молекулы НК. Так, в состав катионных липосом включают 1,2-ди-О-олеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), способный переходить из ламелярной фазы в инвертированную гексагональную, обеспечивая эффективный и своевременный выход НК из эндосом [Metwally А.А. et al. Quantitative Silencing of EGFP Reporter Gene by Self-Assembled siRNA Lipoplexes of LinOS and Cholesterol / Mol. Pharm., 2012, V. 9, №11, pp. 3384-3395]. Известно, что использование холестерина в качестве липида-хелпера приводит к улучшению стабильности липоплексов в присутствии сыворотки крови, а также способствуют слиянию с мембраной клетки-мишени [Cui S. et al. Cationic lioposomes with folic acid as targeting ligand for gene delivery / Bioorg. Med. Chem. Lett., 2016, V. 26, №16, pp. 4025-4029]. Для увеличения эффективности трансфекции в качестве липидов-хелперов также могут быть использованы фосфатидилхолин, ПЭГ-содержащие липиды, анионные липиды [Cheng X. et al. The role of helper lipids in lipid nanoparticles (LNPs) designed for oligonucleotide delivery / Adv. Drug Deliv. Rev., 2016, V. 99, pp. 129-137]. Создание новых липидов-хелперов и включение их в состав катионных липосом может привести к увеличению эффективности трансфекции.
Техническим результатом заявленного изобретения является расширение арсенала средств для эффективной доставки нуклеиновых кислот в клетки в присутствии сыворотки в ростовой среде.
Технический результат достигается незаряженным липидом 1 следующего строения:
В структуру незаряженного липида 1 входят два остатка диглицерида, необходимых для закрепления в липосомальном бислое, полиэтиленгликольный (ПЭГ) спейсер, необходимые для дестабилизации липидного бислоя липосом, и карбамоильный линкер, который обеспечивает оптимальное сочетание стабильности и токсичности липида 1.
Технический результат также достигается предлагаемой композицией для доставки протяженных и коротких нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих, которая содержит: 1) незаряженный липид 1 в качестве липида-хелпера, 2) поликатионный амфифил 1,26-бис(холест-5ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан (2X3), необходимый для связывания и упаковки НК, 3) нейтральный фосфолипид 1,2-ди-О-олеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE) в качестве структурообразующего и промотирующего компонента.
В одном из вариантов осуществления изобретения композиция содержит (в мольных % от общего количества липидов композиции): поликатионный амфифил 1,26-бис(холест-5ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16,20-тетраазагексакозан в количестве от 45 до 49 мольных % от общего количества липидов в композиции, нейтральный фосфолипид 1,2-ди-О-олеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE) в количестве от 45 до 49 мольных % от общего количества липидов в композиции и незаряженный липид 1 в количестве от 2 до 10 мольных % от общего количества липидов композиции.
Технический результат также достигается способом получения композиции для доставки протяженных и коротких нуклеиновых кислот, в соответствии с которым липидную пленку, состоящую из трех компонентов - незаряженного липида 1, поликатионного амфифила 2X3 и нейтрального фосфолипида DOPE - гидратируют в воде, затем полученную эмульсионно-дисперсионную систему подвергают ультразвуковой обработке.
Исходным соединением в синтезе незаряженных липидов являлся rac-1-O-(4-нитрофенилоксикарбонил)-2,3-ди-O-тетрадецилглицерин, полученный согласно описанному ранее методу [Shmendel' Е.V. et al. Synthesis of neoglycolipids for the development of non-viral gene delivery systems / Russ. Chem. Bull, 2010, V. 59, №12, pp. 2281-2289]. К раствору O,O'-бис(2-аминоэтил)октадекаэтиленгликоля при перемешивании добавляли трехкратный избыток раствора rac-1-O-(4-нитрофенилоксикарбонил)-2,3-ди-O-тетрадецилглицерина в присутствии безводного триэтиламина и хлористого метилена, получая целевые незаряженные липиды.
Триэтиламин был получен от Aldrich; О,О'-бис(2-аминоэтил)октадекаэтиленгликоль получен от Fluka. Остальные растворители и реагенты были отечественного производства.
Хлористый метилен, триэтиламин кипятили над гидридом кальция и перегоняли перед реакцией.
254
3
3
H
C
3
1
13
1
13
Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках Kieselgel 60 F (Merck). Обнаружение пятен на хроматограммах проводили раствором фосформолибденовая кислота-церий (IV) сульфат с последующим прогреванием. Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле Kieselgel 60 (0.040-0.063 мм и 0.063-0.200 мм, Merck). Спектры ЯМР Н и С регистрировали на приборах Bruker DPX 300 с использованием CDCl в качестве растворителя, если не указано иное. Химические сдвиги ЯМР Н приведены относительно остаточного сигнала CHCl (δ 7.26 м.д.). Химические сдвиги ЯМР С приведены относительно центрального сигнала растворителя (δ 77.0 м.д. для растворов в CDCl). Масс-спектры регистрировали на спектрометре высокого разрешения Q-TOF G6550A (Agilent) с источником ионизации Dual-ESI-Jetstream и масс-спектрометре ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FT-ICR MS) ApexUltra (Bruker).
На основе поликатионного амфифила 2X3 [Petukhov I.A. et al. Synthesis of polycationic lipids based on cholesterol and spermine / Russ. Chem. Bull., 2010, V. 59, pp. 260-268], нейтрального фосфолипида DOPE и незаряженного липида 1 были приготовлены композиции Р2-Р10 путем гидратирования липидной пленки, состоящей из поликатионного амфифила и DOPE, взятых в соотношении 1:1 (мольн.) и липида 1, взятого в количестве 2-10 мольн. %, с последующей ультразвуковой обработкой. В качестве контроля были приготовлены композиции Н2-Н10, О2-О10, содержащие липид 1a-b [Шмендель Е.В. и др. Получение нейтральных липидов на основе 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина с гидрофильными спейсерными группами, Сборник тезисов докладов Четверного Междисциплинарного симпозиума по медицинской, органической и биологической химии и фармацевтике, 2018, с. 196, С.А. Бахарева и др. Получение нейтральных липидов на основе 1,2-ди-О-тетрадецил-rac-глицерина с гидрофобными спейсерными группами Сборник тезисов докладов Четверного Междисциплинарного симпозиума по медицинской, органической и биологической химии и фармацевтике 2018, с. 103] в количестве 2-10 мольн. %, с последующей ультразвуковой обработкой.
Известно, что оптимальный размер катионных липосом должен быть не менее 30 нм и не более 200 нм для предотвращения их выведения почками и ретикуло-эндотелиальной системой [Cabral Н. et al. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size / Nat. Nanotechnol. Nature Publishing Group, 2011, V. 6, №12, pp. 815-823]. Положительный ζ-потенциал обеспечивает не только повышение эффективности загрузки плазмидной ДНК (пДНК), но также является одной из причин эффективного накопления в клетках-мишенях, а также влияет на стабильность липосом в процессе хранения. Положительные значения ζ-потенциала необходимы для обеспечения коллоидной стабильности за счет электростатического отталкивания между частицами [Elsana Н. et al. Evaluation of novel cationic gene based liposomes with cyclodextrin prepared by thin film hydration and microfluidic systems / Sci. Rep., 2019, V. 9, №1, pp. 1-17].
Для изучения размеров и ζ-потенциала полученных катионных липосом и их комплексов с плазмидной ДНК (pEGFP-C2, «Clontech» (Германия)) использовали метод динамического лазерного светорассеяния. Размеры всех полученных катионных липосом и их комплексов с плазмидной ДНК находились в оптимальном диапазоне, а ζ-потенциал был положительным.
Для изучения способности предлагаемой композиции переносить нуклеиновые кислоты в клетки млекопитающих использовали протяженную плазмидную ДНК (pEGFP-С2, «Clontech» (Германия)) и короткую 21-звенную двуцепочечную РНК (siPHК, ИХБФМ СО РАН) (последовательность смысловой цепи  антисмысловой цепи - ).
Формирование комплексов нуклеиновых кислот с предлагаемой композицией проводили путем инкубирования аликвот растворов нуклеиновых кислот и композиции, рассчитанные в соответствии с соотношением положительных зарядов аминогрупп к отрицательным зарядам фосфатных групп (соотношение N/P=6/1 и 8/1 в случае доставки плазмидной ДНК, соотношение N/P=8/1 в случае доставки siPHК).
Эффективность проникновения нуклеиновых кислот с использованием композиций Н2-Н10, О2-О10 и Р2-Р10 в клетки млекопитающих in vitro была исследована в экспериментах по трансфекции клеток плазмидной ДНК, кодирующей зеленый флуоресцирующий белок (EGFP) и короткой интерферирующей РНК, направленной на мРНК гена EGFP и подавляющей его экспрессию.
Сопоставительный анализ композиций Н2-Н10, О2-О10 и Р2-Р10 с известными и широко используемыми трансфектантами, такими как Lipofectamine3000 и композицией L (2X3:DOPE) [Maslov М.А. et al. Novel cholesterol spermine conjugates provide efficient cellular delivery of plasmid DNA and small interfering RNA / J. Control. Release, 2012, V. 160, pp. 182-193] показал, что предлагаемые соединения обладают следующими преимуществами:
1) Заявляемая композиция с высокой эффективностью доставляет в клетки млекопитающих короткие и протяженные нуклеиновые кислоты в присутствии сыворотки крови в ростовой среде, что позволяет рассматривать ее в качестве перспективного средства доставки терапевтических нуклеиновых кислот в эукариотические клетки.
2) Заявляемая композиция не требуют сложной процедуры приготовления, для получения рабочего раствора достаточно подвергнуть ультразвуковой обработке гидратированную липидную пленку, состоящую из поликатионного амфифила, нейтрального фосфолипида (например, DOPE) и незаряженного липида 1.
3) Заявляемая композиция стабильна при хранении как в сухом виде, так и в виде водных формуляций.
4) Заявляемая композиция превосходит известные аналоги по эффективности трансфекции в эукариотические клетки.
Поиск по источникам научно-технической и патентной литературы показал, что заявляемое соединение, композиция на его основе и способ ее получения в известных из уровня техники источниках не описаны.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Синтез незаряженного липида 1
Получение 1,59-ди[rac-2,3-ди(тетрадецилокси)пропил-1-оксикарбониламино]-O,O'-бис(2-аминоэтил)октадекаэтиленгликоля (1)
2
2
3
2
2
104
208
2
27
3
3
2
11
2
2
2
2
2
2
3
1
13
Н
H
К раствору О,О'-бис(2-аминоэтил)октадекаэтиленгликоля (47.3 мг, 0.038 ммоль) в безводном CHCl (2 мл) при перемешивании добавили раствор 1-O-(4-нитрофенилоксикарбонил)-2,3-ди-O-тетрадецилглицерина [Shmendel' E.V. et al. Synthesis of neoglycolipids for the development of non-viral gene delivery systems / Russ. Chem. Bull, 2010, V. 59, №12, pp. 2281-2289] (110.2 мг, 0.169 ммоль) и безводного EtN (0.2 мл) в безводном CHCl (3 мл). Реакционную смесь перемешивали 5 ч при 24°С, нейтрализовали 3%-ным водным раствором HCl (0.1 мл), растворители удаляли в вакууме. Продукт выделили колоночной хроматографией, элюируя системой хлороформ-метанол (100:1). Получили 48.2 мг (65%) соединения 1 в виде кристаллизуемого масла белого цвета. Найдено (%): С, 65.09; Н, 10.88; N, 1.58. CHNO. Вычислено (%): С, 65.10; Н, 10.93; N, 1.46. Спектр ЯМР Н (300 МГц, CDCl): 0.86 (т, J=6.7 Гц, 12Н, 4 СН); 1.15-1.40 (м, 88Н, 4 (СН),); 1.43-1.69 (м, 8Н, 4 ОСНС); 3.28-3.37 (м, 4Н, 2 NHC); 3.39-3.89 (м, 90Н, 42 ОСН, 2 ОСНСН); 4.08 (дд, J=11.4 Гц, J=5.4 Гц, 2Н) и 4.18 (дд, J=11.4 Гц, J=4.4 Гц, 2Н, 2 СНОС(O)); 5.00-5.40 (м, 2Н, 2 NH). Спектр ЯМР С ЯМР (60 МГц, CDCl): 14.08, 14.30, 22.43, 22.66, 22.87, 25.79, 26.04, 26.10, 26.30, 29.33, 29.49, 29.61, 29.63, 29.67, 30.02, 31.67, 31.90, 32.13, 40.91, 46.04, 64.34, 69.32, 70.07, 70.34, 70.48, 70.53, 70.58, 71.11, 71.60, 71.76, 156.41.
Пример 2. Получение композиций L, Н2-Н10, О2-О10, Р2-Р10
Катионный амфифил 2X3 [Petukhov I.A. et al. Synthesis of polycationic lipids based on cholesterol and spermine // Russ. Chem. Bull., 2010, V. 59, pp. 260-268], нейтральный фосфолипид DOPE и незаряженный липид 1 в смеси органических растворителей упаривали до образования липидной пленки. Образовавшуюся липидную пленку сушили 4 ч в вакууме масляного насоса (0.01 Торр), гидратировали в необходимом количестве воды для инъекций в течение 12 ч, а затем озвучивали на ультразвуковой бане до получения однородной композиции. В результате получили композиции Р2 (2X3-DOPE-1, 49:49:2 мольн.), Р5 (2X3-DOPE-1, 47.5:47.5:5 мольн.), Р10 (2X3-DOPE-1, 45:45:10 мольн.).
Также были приготовлены контрольные композиции: L (2X3-DOPE, 50:50 мольн.), Н2 (2X3-DOPE-1a, 49:49:2 мольн.), Н5 (2X3-DOPE-1a, 47.5:47.5:5 мольн.), Н10 (2X3-DOPE-1a, 45:45:10 мольн.), O2 (2X3-DOPE-1b, 49:49:2 мольн.), O5 (2X3-DOPE-1b, 47.5:47.5:5 мольн.), О10 (2X3-DOPE-1b, 45:45:10 мольн.),
Пример 3. Определение размеров катионных липосом и их комплексов с плазмидной ДНК
Гидродинамический диаметр и ζ-потенциал катионных липосом и их комплексов с плазмидной ДНК измеряли с помощью метода динамического лазерного светорассеяния на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, Великобритания) при температуре 25°C в трех повторах. Измерения катионных липосом проводили при концентрации 0.05 мМ. Для изучения размеров комплексов растворы катионных липосом (100 мкл) и нуклеиновых кислот (100 мкл) в концентрациях, соответствующих необходимым соотношениям N/P, смешивали в деионизированной воде (MilliQ, США) и инкубировали 2 ч при 24°С, затем доводили объем деионизированной водой до 1 мл.
Результаты измерений гидродинамического диаметра и ζ-потенциала катионных липосом и их комплексов с плазмидной ДНК pEGFP-C2 представлены на фиг. 1(А, Б).
Пример 4. Трансфекция клеток HEK 293 плазмидной ДНК с использованием композиций Н2-Н10, О2-О10 или Р2-Р10
5
2
2
2
Изучение доставки плазмидной ДНК проводили с помощью проточной флуоциториметрии на клетках HEK 293. Эффективность трансфекции оценивали по количеству клеток, содержащих зеленый флуоресцентный белок (EGFP) от общего количества клеток в образце. Клетки HEK 293 высаживали в 24-луночные планшеты (1.2×10 клеток на лунку в 500 мкл среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой) и культивировали в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО. В день проведения трансфекции среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Композицию Н2-Н10, О2-О10 или Р2-Р10 в 25 мкл среды OptiMEM смешивали с раствором pEGFP-C2 (2 мкг/мл) в 25 мкл этой же среды в оптимальном соотношении N/P=6/1 и 8/1 и инкубировали 20 мин при 25°С. Полученную смесь добавляли к клеткам и выдерживали в течение 4 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО, затем заменяли среду на 500 мкл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Через 48 ч клетки промывали фосфатно-солевым буфером (300 мкл), добавляли 50 мкл раствора трипсина и инкубировали 2 мин (37°С, 5% СО). По окончании инкубации в лунки добавляли 200 мкл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой, клетки суспендировали и переносили в пробирки. Полученную клеточную суспензию центрифугировали при 1200 об/мин, отбирали среду и промывали 400 мкл фосфатно-солевого буфера. Затем клетки фиксировали 600 мкл 2% раствора формальдегида в фосфатно-солевом буфере. Анализ уровня трансфекции клеток проводили на флуоцитометре ACEA NovoCyte™ 3000 (Bioscience Inc., USA). В этих экспериментах определяли количество клеток, экспрессирующих белок EGFP, и средний уровень флуоресценции клеток при длине волны возбуждения 488 нм. В качестве объекта сравнения был выбран коммерчески доступный препарат - Lipofectamine 3000 и липосомы L.
Результаты трансфекции клеток плазмидной ДНК pEGFP-C2 в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки в ростовой среде представлены на фиг. 2(А, Б).
Пример 5. Трансфекция клеток BHK IR780 короткой интерферирующей РНК с использованием композиций Н2-Н10, О2-О10 или Р2-Р10
Исследование проникновения siPHК, направленной на подавление синтеза зеленого флуоресцирующего белка EGFP, проводили на клетках линии BHK IR780, стабильно экспрессирующих данный белок. В качестве мишени была выбрана мРНК, кодирующая белок EGFP, таким образом по уменьшению флуоресценции клеток, определяемой этим белком, можно судить об эффективности доставки siPHК в цитоплазму клетки.
5
2
2
Клетки BHK IR780 высаживали в 24-луночные планшеты (0.13×10 клеток на лунку в 500 мкл среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой) и культивировали в течение суток при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО. Перед проведением трансфекции для экспериментов в присутствии сыворотки среду в лунках заменяли на 200 мкл среды DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Композицию Н2-Н10, О2-О10 или Р2-Р10 в 25 мкл среды OptiMEM смешивали с раствором siPHК (с конечной концентрацией siPHК 50 нМ) в 25 мкл этой же среды при оптимальном соотношении N/P=6/1 и выдерживали 20 мин при 25°С. Полученную смесь добавляли к клеткам и выдерживали в течение 4 ч при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО, затем заменяли среду на 500 мкл DMEM с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Через 72 ч клетки обрабатывали, как описано в примере 4. В качестве объекта сравнения был выбран коммерчески доступный препарат - Lipofectamine 3000 и липосомы L. Результаты по трансфекции клеток короткой интерферирующей РНК с композициями в присутствии сыворотки в ростовой среде, определенные по уровню снижения экспрессии белка EGFP представлены в таблице 1.
Таким образом, приведенные примеры однозначно указывают на способность предлагаемой композиции, состоящей из поликатионного амфифила. нейтрального фосфолипида и незаряженного липида, эффективно способствовать проникновению коротких и протяженных нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих в присутствии сыворотки крови, что позволяет использовать их в качестве агентов для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих в условиях in vitro.