Способ прогнозирования риска развития задержки роста плода
METHOD FOR PREDICTING THE RISK OF FETAL GROWTH RETARDATION

Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития задержки роста плода.
Плацентарная недостаточность является ключевой особенностью беременностей с задержкой роста плода (ЗРП). ЗРП определяется как патологическое торможение внутриутробного роста плода и неспособность плода достичь своего потенциала роста, при котором размеры плода ниже 10-го процентиля для данного гестационного возраста (Early onset fetal growth restriction / A. Dall'Asta, V. Brunelli, F. Prefumo [et al.]. – DOI: 10.1186/s40748-016-0041-x // Matern. Health Neonatol. Perinatol. – 2017. – Vol. 3. – Art. 2. – URL: https://mhnpjournal.biomedcentral.com/track/pdf/10.1186/s40748-016-0041-x.pdf).
Эмбриональный рост, как известно, является важным показателем исхода беременности и отражает взаимодействие физиологических и патологических факторов, влияющих на плод (Haram, K. Intrauterine growth restriction: effects of physiological fetal growth determinants on diagnosis / K. Haram, E. Søfteland, R. Bukowski. – DOI: 10.1155/2013/708126 // Obstet. Gynecol. Int. – 2013. – Vol. 2013. – Art. 708126. – URL: https://www.hindawi.com/journals/ogi/2013/708126/). Рост плода напрямую зависит от нормальной плацентации, так как плацента обеспечивает транспортную, трофическую, эндокринную и метаболическую функции. Необходимый уровень маточно-плацентарного кровообращения вместе с быстрым ангиогенезом ворсинок хориона являются ключевыми факторами, необходимыми для адекватного развития и функционирования плаценты и последующего роста плода. Нарушения развития плаценты могут возникать из-за неполного вторжения трофобласта, что приводит к неполному ремоделированию спиральных артерий и уменьшению маточно-плацентарного кровотока, и обычно связано с преэклампсией и задержкой роста плода (The placental basis of fetal growth restriction / R. L. Zur, J. C. Kingdom, W. T. Parks, S. R. Hobson // Obstet. Gynecol. Clin. North Am. – 2020. – Vol. 47, № 1. – P. 81-98.).
Преэклампсия занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной заболеваемости и смертности (Early-onset fetal growth restriction: a systematic review on mortality and morbidity / A. Pels, I. M. Beune, A. G. van Wassenaer-Leemhuis [et al.] // Acta Obstet. Gynecol. Scand. – 2020. – Vol. 99, № 2. – P. 153-166.), а также обусловливает в дальнейшем у детей отставание в физическом развитии, его дисгармоничность, задержку темпов психомоторного развития (Ярыгина, Т. А. Задержка (замедление) роста плода: все, что необходимо знать практикующему врачу / Т. А. Ярыгина, А. И. Гус // Акушерство и гинекология. – 2020. – № 12. – С. 14-24.). На территории РФ в настоящее время данная патология встречается в 5-18% случаев (Darendeliler, F. IUGR: genetic influences, metabolic problems, environmental associations/triggers, current and future management / F. Darendeliler // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. – 2019. – Vol. 33, № 3. – Art. 101260. – URL: https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1521690X1930003X).
Преэклампсия и задержка роста плода являются коморбидными осложнениями беременности, так как их развитие связано с аномальной плацентацией, развитием окислительного стресса, воспалительного процесса и формированием эндотелиальной дисфункции (Диагностическая значимость определения уровня внеклеточной фетальной ДНК у беременных с преэклампсией и задержкой роста плода / А. А. Садекова, З. В. Хачатрян, А. М. Красный [и др.] // Акушерство и гинекология. – 2019. – № 8. – С. 144-149.). Считается, что ранняя форма ЗРП регистрируется в 20-30% случаев и в том числе в 50% она связана с ранней ПЭ, тяжелой плацентарной недостаточностью и хронической гипоксией плода. На долю поздней формы приходится 70-80% всех случаев ЗРП и она значительно реже (лишь в 10% случаев) сочетается с ПЭ (Maršál, K. Preeclampsia and intrauterine growth restriction: placental disorders still not fully understood / K. Maršál // J. Perinat. Med. – 2017. – Vol. 45, № 7. – P. 775-777).
Недостаточное ремоделирование спиральных артерий приводит к развитию острых атеротических изменений с накоплением пенных клеток и сужением их просвета. Недостаточность кровоснабжения плода в дальнейшем приводят к задержке его развития и снижению веса при рождении (Failure of physiologic transformation of spiral arteries, endothelial and trophoblast cell activation, and acute atherosis in the basal plate of the placenta / C. A. Labarrere, H. L. DiCarlo, E. Bammerlin [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2017. – Vol. 216, № 3. – Р. 287.e1-287.e16.).
Таким образом, окончательное ремоделирование плаценты происходит в конце первого/начале второго триместра беременности, когда плацента становится полностью гемохориальной. От нормального протекания данного процесса будет зависеть конечный размер плаценты и, следовательно, её функциональная способность. Эта подтверждается результатами исследований, свидетельствующими о том, что беременность, осложненная ЗРП, характеризуется меньшим объемом плаценты и более высоким индексом резистентности маточных артерий.
При многоплодной беременности риск возникновения ЗРП также выше, чем при одноплодной (до 20-30% при дихорионных и до 40% при монохорионных плацентах) (Townsend, R. Fetal growth restriction in twins / R. Townsend, A. Khalil // Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. – 2018. – Vol. 49. – P. 79-88.).
Низкий вес до беременности и низкий прирост веса во время беременности также приводят к увеличению риска развития ЗРП (Different risk factors for very low birth weight, term-small-for-gestational-age, or preterm birth in Japan / N. Tamura, T. Hanaoka, K. Ito [et al.]. – DOI: 10.3390/ijerph15020369 // Int. J. Environ. Res. Public. Health. – 2018. – Vol. 15, № 2. – Art. 369. – URL: https://www.mdpi.com/1660-4601/15/2/369).
Так как плацента принимает непосредственное участие в регуляции росто-весовых показателей плода путем обеспечения транспорта различных веществ, иммунной защиты и нейроэндокринных функций, то нарушения её нормальной структуры будет связано с развитием плацентарной недостаточности и сопутствующих осложнений беременности (Burton, G. J. What is the placenta? / G. J. Burton, E. Jauniaux // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2015. – Vol. 213, № 4, suppl. – P. S6-S8.). Учитывая вышесказанное, логичным является изучение экспрессии генов плацентарной ткани, влияющих на вес и рост плода, и развитие таких нарушений беременности, как плацентарная недостаточность с задержкой роста плода. Проведенные исследования транскриптома плаценты у беременных с ЗРП выявляют различия в экспрессии генов по всему геному. Процессы, связанные с изменением экспрессии плацентарных генов, включают: ангиогенез, иммунные реакции, энергетический обмен и регуляцию роста (Identification of placental genes linked to selective intrauterine growth restriction (IUGR) in dichorionic twin pregnancies: gene expression profiling study / L. Biesiada, A. Sakowicz, M. Grzesiak [et al.] // Hum. Genet. – 2019. – Vol. 138, № 6. – P. 649-659.). Так как вес и рост плода является одним из показателей его развития, перспективным является полногеномный поиск ассоциаций (GWAS), ассоциированных с весом и ростом при рождении плода и поэтому влияющих на развитие плацентарной недостаточности. Учитывая вышесказанное, логичным является изучение экспрессии генов плацентарной ткани, влияющих на вес и рост плода, и развитие таких нарушений беременности, как плацентарная недостаточность с задержкой роста плода.
Ген HK2 кодирует гексокиназу 2, которая катализирует первый этап метаболизма глюкозы – фосфорилирование с образованием глюкозо-6-фосфата (https://www.genecards.org/).
С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития ЗРП на основании исследованных полиморфных вариантов генов дифференциально экспрессирующихся в плаценте, а так же других возможных факторов риска с целью выявления беременных с развитием задержки роста плода.
В Российской Федерации исследования о вовлеченности полиморфного варианта гена rs3771787 HK2 в формирование предрасположенности к риску развития задержки роста плода у женщин отсутствуют.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2021 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития задержки развития плода в зависимости от полиморфного варианта гена rs3771787 HK2. Источники информации: сайты Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ЗРП на основе данных о полиморфном варианте гена HK2.
Известен способ прогнозирования задержки внутриутробного роста плода, отличающийся тем, что с ранних сроков беременности определяют относительное содержание CD3+CD16+56+-лимфоцитов, уровень С3-компонента комплемента и растворимого рецептора фактора некроза опухоли (sTNF-R) в венозной крови женщины, вычисляют прогностический индекс (PI) по формуле:
PI=-0,8911X1-0,0321X2-2,3669X3+11,0779,
где X1 - относительное содержание CD3+CD16+CD56+-лимфоцитов, %;
Х2 - концентрация С3-компонента комплемента, мг/дл;
Х3 - концентрация sTNF-R, нг/мл
и при PI менее 0 прогнозируют задержку внутриутробного роста плода во второй половине беременности, а при PI более 0 делают заключение о низком риске развития данного патологического состояния (патент РФ №2526178, от 20.08.2014). К недостаткам данного способа можно отнести многокомпонентность, сложный расчет, затрудняющий получение заключения о прогнозе,  отсутствие сведений о точности и особенно специфичности способа, поскольку изменение многих иммунологических параметров, в том числе используемых CD+-лимфоцитов, имеет место и при преэклампсии, не учитываются генетические факторы (патент РФ №2265221, 2005).
Из области техники известен патент №  2677335C1 «Способ  прогнозирования  риска формирования  суб-  и декомпенсированной плацентарной  недостаточности  с исходом  в  синдром  задержки роста плода на основе генетических особенностей энергетического обмена матери» по заявке № 2017138891, от 2017.11.08. Сущность способа: проводят определение наиболее информативных сочетаний патологических полиморфизмов генов энергетического обмена PPARD(-87C>T), PPARGC 1A(S482G G>A) и AMPD(Q12X G>A), а также исследование уровня липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и холестерина у матери. Затем вычисляют прогностический индекс D по формуле: D=0,19*Х1+0,39*Х2-0,71*Х3-1,04*Х4-0,68*Х5-1,86, где D - прогностический индекс, Х1 - уровень холестерина в ммоль/л в крови у женщины, Х2 - уровень липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в ммоль/л в крови женщины, Х3 - наличие у женщины генотипов, содержащих вариантный аллель - 87_Т полиморфного ДНК-локуса PPARD(-87C>T) в гомо- и гетерозиготном состоянии: если есть - 1, если нет - 0, Х4 - наличие у женщины генотипов, содержащих вариантный аллель S482 А полиморфного ДНК-локуса PPARGC 1 A(S482G G>A) в гомо- и гетерозиготном состоянии: если есть -1, если нет - 0, Х5 - наличие у женщины генотипов, содержащих вариантный аллель Q12X_A полиморфного ДНК-локуса AMPD(Q12X G>A) в гомо- и гетерозиготном состоянии: если есть - 1, если нет - 0, - 1,86 - CONST. Риск развития суб- и декомпенсированной плацентарной недостаточности с исходом в синдром задержки роста, оценивается в зависимости от величины показателя D: D<0 соответствует высокому риску, D≥0 - низкому.
Недостатком данного способа является низкий уровень специфичности решения: изменение данных показателей может наблюдаться у женщин с ожирением, нарушением липидного обмена, атеросклерозом, данный способ ограничен в применении ввиду сложности и длительности его выполнения, а также не учитываются другие генетические детерминанты.
9
Известен способ прогнозирования синдрома задержки роста плода (СЗРП) у женщин во втором триместре беременности, осложненной гестозом (патент № 2221253 C2 от 01.10.2004.). Для этого в периферической венозной крови определяют число тромбоцитов, активированное парциальное тромбопластиновое время, уровень фибриногена и вычисляют прогностический индекс S по формуле: S=AK1+BK2+CK3+const, где А - число тромбоцитов в 10/л; В - активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ): С - уровень фибриногена, г/л; K1, K2, К3 - коэффициенты, равные соответственно 0,02; 0,046; -0,06; const=-4.39, и если значение индекса S менее 0, то прогнозируют угрозу СЗРП, если значение S более 0, то прогнозируют пропорциональное развития плода.
Недостатками способа являются:  трудоемкость, так как требует определения трех показателей для вычисления прогностического критерия; в изобретении не указывается точный срок беременности, в котором следует проводить исследование и срок гестации, в котором прогнозируется развитие СЗРП;  сложность математической обработки результата по формуле;  не учитываются генетические факторы.
Известен способ прогнозирования риска развития плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных, включающий забор периферической венозной крови, отличающийся тем, что после выделения ДНК проводят анализ полиморфизмов генов факторов коагуляции 20210G/A FII, 1691G/A FV, 10976G/A FVII и прогнозируют повышенный риск развития плацентарной недостаточности с синдромом задержки роста плода 2-3-ей степени у беременных в случае выявления аллеля 10976G FVII и генотипа 10976GG FVII, а низкий риск прогнозируют при наличии следующих комбинаций: генотипа 20210GG FII и аллеля 10976А FVII; аллелей 20210G FII, 10976А FVII с генотипом 1691GG FV; аллелей 20210G FII и 10976А FVII (патент РФ №2540928, от 10.02.2015). Недостатком данного способа в том, что не учитываются другие генетические полиморфизмы.
За прототип взят патент № 2646505 «Способ выявления наследственной предрасположенности к развитию задержки роста плода у курящих женщин» по заявке № 2017115003 от 27.04. 2017. Способ представляет собой исследование периферической венозной крови, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и анализ полиморфизма генов женщин, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфизма гена IL-10 G-1082A и при выявлении генотипов IL-10-1082А/А или IL-70-1082G/A делают вывод о наличии наследственной предрасположенности к задержке роста плода у курящих женщин. Недостатками указанного способа являются: 1. Использование в качестве маркера только одного генетического полиморфизма, что снижает статистическую мощность проведенного исследования; 2. Способ прогнозирования риска развития задержки роста плода может быть использован только у ограниченной группе, а именно, у курящих женщин.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала методов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития задержки роста плода на основе данных об аллеле Т полиморфного варианта гена rs3771787 HK2.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития задержки роста плода у беременных русской национальности, уроженок Центрально – Черноземного региона РФ, на основе данных о полиморфного варианта гена rs3771787 HK2.
Технический результат достигается тем, что в известный способ, включающий выделение ДНК, проведение полимеразной цепной реакции и анализ полиморфизма генов женщин, внесены следующие новые признаки:
- анализ полиморфного варианта гена rs3771787 HK2;
- прогнозирование высокого риска развития ЗРП у беременных при выявлении аллеля Т полиморфного варианта гена rs3771787 HK2.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза развития ЗРП у беременных на основе данных об аллеле Т полиморфного варианта гена rs3771787 HK2.
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции (Miller, S. A. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S. A. Miller, D. D. Dykes, H. F. Polesky // Nucleic. Acids. Res. – 1988. – Vol. 16, № 3. – P. 1215) в два этапа.
2
На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 часов.
0
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20С.
Генотипирование образцов ДНК было выполнено в Центре коллективного пользования «Медицинская геномика» Томского национального исследовательского медицинского центра РАН на базе НИИ медицинской генетики (использовался метод MALDI и масс-спектрометр MassARRAY Analyzer 4 (фирма производитель “Seqeunom”, страна производства США). Для генотипирования использовали образцы ДНК в концентрации 10-20 нг в микролитре общим обьемом 10 мкл. В процессе экспериментального анализа образцов выполняли следующие этапы: проведение мультиплексной ПЦР; осуществление SAP-реакции; выполнение iPLEX реакции с последующим обессоливанием и нанесением на SpectroCHIP; процедуры ионизации и анализа спектров с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF (Степанов, В. А. Мультиплексное генотипирование однонуклеотидных полиморфных маркеров методом масс-спектрометрии MALDI-TOF: частоты 56 SNP в генах иммунного ответа в популяциях человека / В. А. Степанов, Е. А. Трифонова // Молекулярная биология. – 2013. – Т. 47, № 6. – С. 976-986).
perm
perm
adj
adj
adj
adj
Ассоциации SNPs генов-кандидатов c формированием преэклампсии и задержки роста плода оценивали при помощи логистической регрессии с включением в расчеты трех моделей – аддитивной (модель 1), рецессивной (модель 2) и доминантной (модель 3), и поправкой на ковариаты (выявленные в работе средовые факторы риска) и множественные сравнения (использовались адаптивные пермутационные процедуры с расчетом показателя p). Финальную оценку статистической значимости выявленных ассоциаций выполняли с учетом дополнительно введенной поправки на множественные сравнения – поправки Бонферрони, равной 3, учитывающей число тестируемых генетических моделей (модели 1, 2 и 3). В конечном итоге, при рассмотрении самостоятельных эффектов SNPs показатель p<0,017 принимался за статистически значимый. Для оценки направленности ассоциации использовался показатель отношения шансов (ОR) и его 95% доверительный интервал (95%CI). При показателе ОR большем единице связь оценивали как положительную (рассматриваемый генетический маркер является рисковым), а значение ОR меньшее единицы указывало на отрицательную ассоциацию (изучаемый маркер выполняет «протективную роль»). Анализ ассоциаций осуществлялся с помощью программы gPLINK v2.050 (PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses / S. Purcell, B. Neale, K. Todd-Brown [et al.] // Am. J. Hum. Genet. – 2007. – Vol. 81, № 3. – Р. 559-575).
Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития ЗРП у беременных подтверждает анализ результатов наблюдений 904 пациенток, из них  женщины с изолированной задержкой роста плода (n=194) и беременные с сочетанием задержки роста плода с преэклампсией (n=79) и 631 женщин контрольной группы. Основные медико-биологические и клинико-анамнестические характеристики беременных с задержкой роста плода и женщин группы контроля отражены в таблице 1.
В выборку для исследования вошли женщины с преэклампсией и/или задержкой роста плода и женщины контрольной группы (с физиологическим течением беременности), давшие свое информированное согласие на участие в данной исследовательской работе и соответствующие ряду критериев: русский этнос, место рождения и проживания – регион Центрального Черноземья России. Основаниями для исключения женщин из исследовательской выборки были отказ от участия в данной работе, наличие родства между ними различной степени, выявление тяжелых хр. заболеваний, проводящих к декомпенсации, нерусский этнос и иные (нежели Центральное Черноземье России) места рождения и/или проживания.
Клиническое, клинико-лабораторное, клинико-инструментальное обследование беременных и новорожденных детей, верификация диагноза осложнений беременности – ПЭ, ЗРП (или их отсутствие), сбор медико-биологической информации, результатов клинического, клинико-лабораторного, клинико-инструментального обследования беременных и новорожденных детей в специально разработанные анкеты и формирование электронной базы данных проводилось сертифицированными врачами профильных отделений перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
adj
perm
adj
perm
При расчете частот аллелей и анализе их ассоциаций  у индивидуумов установлена связь полиморфного варианта гена rs3771787 HK2 с формированием задержки роста плода. Аллель Т полиморфного варианта гена rs3771787 HK2 связан с развитием ЗРП в рамках аддитивной (OR=1,34, р=0,038) и рецессивной моделей (OR=2,45, р=0,021).
В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено обследование русских пациенток, уроженок Центрально-Черноземного региона РФ и не являющихся родственницами между собой:  проведено генетическое исследование по полиморфного варианта гена rs3771787 HK2.
1. У женщины Д., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья  на ранних сроках беременности была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен аллель Т рамках аддитивной и рецессивной моделей полиморфного варианта гена rs3771787 HK2, что позволило отнести ее в группу беременных с высоким риском развития ЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов, были выявлены признаки ЗРП.
2. У женщины Л., при прегравидарной подготовке, была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен аллель Т рамках аддитивной и рецессивной моделей полиморфного варианта гена rs3771787 HK2, что позволило отнести ее в группу беременных с повышенным риском развития ЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение. При возникновении беременности у нее на сроке 27 недель был диагностирован синдром задержки роста плода.
3. У беременной Е., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, на ранних сроках беременности была взята венозная кровь, при генотипировании ДНК-маркеров был выявлен аллель G в рамках аддитивной и рецессивной моделей полиморфного варианта гена rs3771787 HK2, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском развития ЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено признаков ЗРП.
4. У женщины И., русской национальности, уроженки Центрального Черноземья, при прегравидарной подготовке была взята венозная кровь. При генотипировании ДНК-маркеров был выявлен аллель G в рамках аддитивной и рецессивной моделей полиморфного варианта гена rs3771787 HK2, что позволило отнести ее в группу беременных с пониженным риском развития ЗРП. Это подтвердило дальнейшее наблюдение: в течение беременности и после родов не было выявлено признаков ЗРП.
Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди пациенток группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития ЗРП.