Прогнозирование эффективности применения лучевой терапии
PREDICTION OF EFFICIENCY OF USING RADIATION THERAPY

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной и молекулярной диагностике, онкологии и лучевой терапии, и предназначено для прогнозирования эффективности лучевой терапии у детей с диффузно растущими глиомами ствола мозга. Способ прогнозирования эффективности лучевой терапии у пациентов с детскими диффузными срединными глиомами (ДГСМ), включает исследование периферической крови, в качестве «жидкостной биопсии», где по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК (цоДНК) оценивается концентрация мутантной формы BRAF(V600E) и ее изменение в процессе лечения. Повышение концентрации в жидкостной биопсии мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лечения коррелирует с лучшим прогнозом.
Наиболее частым патологическим процессом в области ствола мозга у детей являются опухоли (ОСГМ). Удельный вес этой патологии среди всех новообразований ЦНС в детском и подростковом возрасте составляет от 10 до 15%, но, в то же время, она является причиной смерти около 40% всех детей, заболевших опухолями головного мозга [Ostrom Q.T. et al., 2014]. Пик заболевания приходится на 7-8 лет, частота заболеваний примерно одинакова для лиц обоего пола [Щербенко О.И. и соваторы, 2014]. В 80% случаев ОСГМ локализуются в области моста и растут инфильтративно [Кит О.И. и соваторы, 2017]. Значительно реже, в 15-20% случаев, ОСГМ растут преимущественно экзофитно, обозначаясь как задние экзофитные цервико-медуллярные глиомы и очаговые тектальные глиомы. Инфильтративно растущие ОСГМ являются наиболее тяжелой формой патологии. Радикальное хирургическое лечение этих опухолей сопровождается риском тяжелой инвалидизации и даже смерти больного, так как они расположены близко к ядрам черепно-мозговых нервов и проводящим путям, находящимся в области ствола. Возможность получение биопсийного материала также крайне ограничена, а ребиопсия во время прогрессирования практически не возможна [Pfaff Е. et al., 2019; Щербенко О.И. и соваторы, 2019; Panditharatna Е., et al., 2018]. В связи с этим крайне актуальным/важным является поиск не инвазивных методов, позволяющих получить клинически важную информацию о генетическом статусе опухоли, таких метод «жидкостной биопсии».
Основным методом лечения ОСГМ в настоящее время являются лучевая и химиолучевая терапия, но у большинства больных достигаемый эффект имеет временный характер: через различные интервалы времени опухоль возобновляет рост и двухлетний срок переживают только 10-15% больных [Guillamo J.S. et al., 2001; Veldhuijzen van Zanten D.S.E.M. et al., 2017]. В ситуации, когда после короткого периода относительного благополучия, достигнутого в результате лучевой терапии, наступает ухудшение состояния ребенка, перед врачом встает сложная проблема оказания реальной помощи больному. Поиск наиболее рациональных и эффективных вариантов оказания помощи таким детям определяет актуальность исследования. Достигнутые в последние годы успехи в использовании молекулярно-генетических характеристик опухоли для диагностики и прогнозирования течения эмбриональных опухолей мозга [Kumar R. et al., 2018] дают надежду для достижения прогресса и при глиальных опухолях. Становится реальной перспектива использования информации о молекулярных особенностях глиом для прогнозирования течения, индивидуализации тактики и создания таргетных препаратов.
Проведенные в последние годы молекулярно-генетические исследования опухолей мозга позволили выявить ряд полезных для диагностики и планирования лечения маркеров при различных морфологических вариантах. Роль одного из важных молекулярных маркеров в нейроонкологии отводится гену BRAF. Протоонкоген BRAF - часть семейства сериновых/треониновых протеинкиназ, которые участвуют в MAPK/ERK сигнальном пути, регулируют клеточную дифференцировку, пролиферацию и миграцию [Roberts P.J. et al., 2007] и играют важнейшую роль в патогенезе различных видов рака. В нейроонкологии, наиболее диагностически ценными являются следующие мутации в гене BRAF: соматическая точечная мутация BRAF-V600E и соматическая fusion-мутация - генов KIAA1549-BRAF. Мутации BRAF-V600E чаще всего встречаются в плеоморфной ксантоастроцитоме, ганглиоглиоме, эпителиоидных глиобластомах и глиомах, диагностированных в более молодом возрасте. Мутация V600E присутствует у 15% диффузно инфильтративных педиатрических астроцитом II-IV степени злокачественности [Santiago-Dieppa D.R., et al, 2018]. Частота обнаружения мутации возрастает до 25% в педиатрических и взрослых ганглиоглиомах и достигает рекордного максимума - около 80% в плеоморфных ксантоастроцитомах [Veldhuijzen van Zanten S.E. et al., 2016]. Мутации BRAF-V600E, распространена в подмножестве глиом и может представлять собой потенциальный прогностический маркер. По данным мета- исследования [Нuу Gia Vuong et al., 2018], основанного на анализе 11 статей и 1308 пациентов с глиомой, было показано, что мутация V600E в гене BRAF связана с улучшением общей выживаемости (OS) у пациентов (HR=0,60; 95% CI=0,44-0,80). Результаты для выживаемости без прогрессирования (PFS), однако, не были статистически значимыми (HR=1.39; 95% CI=0.82-2.34). При разделение пациентов по группам, основанным на возрасте, наличие мутации V600E в гене BRAF ассоциировалось с улучшение выживаемости у детей и в группе молодых взрослых (до 35 лет), но не имело прогностического значения у пожилых пациентов. Кроме того, мутация V600E BRAF была связана только с благоприятным прогнозом при глиомах более низкой степени злокачественности. Проведенный мета-анализ свидетельствует о том, что мутация V600E в гене BRAF оказывает благоприятное прогностическое влияние на глиомы и ее прогностическая ценность может зависеть от возраста пациента и степени злокачественности опухоли.
В связи с этим нам представилось целесообразным при помощи метода «жидкостной биопсии» по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК (цоДНК) изучить выявление и динамику концентрации в процессе лучевой терапии мутантной формы BRAF(V600E) при ДГСМ и других локализациях глиом мозга у детей.
Метод разработан в ФГБУ «Российский научный центр Рентгенорадиологии» Минздрава России и основана на оценке изменения уровня концентрации мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лучевой терапии методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR) в материале жидкостной биопсии.
Задачей изобретения является создание метода, позволяющего прогнозировать эффективность лучевой терапии у пациентов детского возраста с диффузными опухолями ствола головного мозга.
Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования эффективности лучевой терапии у пациентов детского возраста с диффузными опухолями ствола головного мозга проводится забор периферической венозной крови в объеме не менее 2,5 мл четыре раза за период лечения. Образцы получают до начала курса лучевой терапии (ЛТ); на 3-5-й день; 14-18 день после начала ЛТ и после окончания ЛТ. Подготовка плазмы и выделение циркулирующей ДНК проводятся в максимально короткие сроки после получения образцов крови, не более 30 минут после забора крови. Скрининг мутации BRAF (V600E) проводится методом цифровой капельной ПЦР (Digital Droplet PCR, ddPCR). Анализ и обработка результатов осуществляется с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Оценивается динамика изменения концентрации мутантной формы BRAF(V600E) в процессе лучевой терапии, увеличение концентрации BRAF(V600E) в процессе лучевой терапии коррелирует с положительным прогнозом лечения.
Способ осуществляют следующим образом.
Были исследованы 146 образцов плазмы периферической крови, полученные от 60 пациентов, из них у 31 был установлен диагноз ДГСМ и у 29 другие глиальные опухоли головного мозга. Образцы получали до начала курса ЛТ; на 3-5-й; 14-18 день после начала ЛТ и после окончания ЛТ. По результатам проведенной лучевой терапии, пациенты были разделены на две группы: 1-я - наступление рецидива опухоли менее, чем через 6 месяцев после окончания курса ЛТ; 2 - стабилизация процесса, отсутствие рецидива, в течение 6 и более месяцев после окончания курса ЛТ.
Подготовки качественной плазмы проводилась сразу после получения образца крови, время от забора до подготовки составляло не более 30 минут. Подготовку плазмы и последующее выделение циркулирующей ДНК проводили согласно протоколу фирмы производителя, использовали наборы фирмы Sileks на основе частиц SileksMagNA-Direct (избирательное связывание нуклеиновых кислот).
Высокочувствительный скрининг мутации BRAF (V600E) проводили методом Digital Droplet PCR (ddPCR) с использованием наборов BRAF V600E Screening Kit (Bio-Rad, USA) и системы QX100™ Droplet Digital™ PCR System (Bio-Rad, США). Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2013 (Microsoft Corporation, США) и Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США).
При сравнении результатов исследования мутационного статуса по плазме крови 11 больных различными локализациями глиом методом ddPCR и их же гистологических препаратов, полученных в результате операции, методом NGS установлено полное совпадение как положительных, так и отрицательных данных. Это дало основание для использования метода ddPCR при оценке мутационного статуса опухоли по циркулирующей в плазме крови опухолевой ДНК.
В целях выявления возможности прогнозирования течения заболевания, по молекулярно-генетическим признакам нами было проведено исследование динамики содержания опухолевой ДНК в плазме крови больных ДГСМ в процессе лучевой терапии и после ее окончания. Для этого был проведен дискриминантный анализ, в котором в качестве переменных использованы данные о концентрации циркулирующих в плазме крови, как мутантных, так и молекул дикого типа опухолевой ДНК (цоДНК), а также ряд клинических данных. Было установлено, что соотношение концентрация ДНК гена BRAF с мутацией V600E у больных с более благоприятным течением опухоли увеличивается в начале курса радиотерапии и снижается к концу ее. У больных с ранним рецидивом опухоли к концу курса лечения концентрация этого мутантного гена, напротив, не изменяется или возрастает (рис. 1)
Рис. 1. Динамика содержания мутантных форм ДНК гена BRAF в процессе лучевой терапии в зависимости от наличия или отсутствия прогрессирования опухоли.
Полученные данные свидетельствуют, что с помощью метода «жидкостной биопсии» можно определить наличие в плазме крови цоДНК специфичных для глиальных опухолей молекулярно-генетических маркеров и проследить их динамику в процессе лучевой терапии с возможным использованием полученных данных в прогнозировании течения заболевания. Различия в динамике содержания маркеров в процессе лучевой терапии у больных глиомами и ДГСМ могут быть также объяснены большей гетерогенностью структуры ДГСМ. Среди которых присутствуют опухоли лучше поддающиеся ионизирующей радиации, в результате чего на первом этапе концентрация мутировавшей ДНК в плазме крови повышается, а по мере девитализации основной популяции клеток опухоли к концу курса лечения она снижается.
1. Относительная концентрация мутаций BRAF (V600E), в плазме крови больных диффузно растущими опухолями ствола мозга выше, чем при глиомах других локализаций.
2. Повышение концентрации в плазме крови мутантной формы BRAF(V600E) коррелирует с лучшим прогнозом.
3. Динамический контроль концентрации опухолевой ДНК содержащей мутацию BRAFV600E в плазме крови у детей с опухолями головного мозга в процессе лучевой терапии может быть использован для прогноза эффективности ЛТ. На основании анализа динамики уровней концентрации мутантной цоДНК в процессе лечения, возможно предсказание рецидива опухоли после лучевой терапии с достоверностью 96%.