СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ГЕТЕРОКАРПИНА
METHOD FOR MAKING RECOMBINANT HETEROCARPINE

Изобретение относится к способу получения рекомбинантного гетерокарпина.
Гетерокарпин является белком с противораковыми свойствами, который впервые описан заявителем в заявке на патент РСТ WO 02/068461. Этот выделенный белок имеет молекулярную массу около 90,9 кДа, содержит фрагменты с пептидными последовательностями SEQ.ID.NO.1, SEQ.ID.NO.2 и SEQ.ID.NO.3 (см. в приложении список последовательностей) и может быть получен экстракцией из клеток растения Pilocarpus heterophyllus, культивированных in vitro в соответствии с описанием указанной выше заявки. Однако полная последовательность этого белка оставалась неизвестной до настоящего времени, поскольку его клонирование не было осуществлено.
В настоящей заявке описаны полинуклеотиды, которые могут служить затравкой для клонирования гетерокарпина, описана также ДНК, кодирующая гетерокарпин, мРНК, соответствующая гетерокарпину, векторы экспрессии, содержащие названную мРНК, клетки-хозяева, трансформированные или трансфицированные с помощью этих векторов и способ получения рекомбинантного гетерокарпина.
Следовательно, первым объектом изобретения является выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8. Предпочтительно указанный выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8.
Объектом изобретения является также антисмысловой полинуклеотид, включающий последовательность, комплементарную последовательности указанного выделенного полинуклеотида, содержащего полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8. Предпочтительно указанный антисмысловой полинуклеотид представлен последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.8.
Изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, содержащему полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из фрагментов этой последовательности, причем указанный полинуклеотид таков, что он кодирует полипептид, имеющий, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации. Предпочтительно указанный выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или одним из фрагментов этой последовательности.
На этом основании изобретение, в частности, относится к выделенному полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или к выделенному полинуклеотиду с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9.
Гетерокарпин, или, другими словами, белок с последовательностью SEQ.ID.NO.10, кодируется фрагментом полинуклеотида с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8, находящимся между основаниями в положениях 115 (инициирующий кодон ATG, кодирующий метионин) и 2437 (стоп-кодон UAA), т.е. полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9.
Изобретение относится также к вектору экспрессии, содержащему выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из фрагментов этой последовательности, или же последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.8 или одному из фрагментов этой последовательности, причем полипептид, кодируемый указанным выделенным полинуклеотидом, имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации. Предпочтительно указанный вектор экспрессии включает полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9.
Изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной или трансфицированной указанным вектором экспрессии.
Изобретение относится также к выделенному полипептиду, содержащему полипептид с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или один из ее фрагментов, причем выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации. Предпочтительно указанный выделенный полипептид представлен полипептидом с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов. В частности, указанный полипептид имеет последовательность SEQ.ID.NO.14.
Объектом изобретения является также моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, описанный выше, в частности объектом изобретения является моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает белок с последовательностью SEQ.ID.NO.14, но не связывает белок с последовательностью SEQ.ID.NO.10.
Изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, содержащему
- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из ее фрагментов, или
- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или один из ее фрагментов, в качестве лекарственного средства,
причем указанный выделенный полинуклеотид таков, что он кодирует выделенный полипептид, имеющий, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации.
Предпочтительно, выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или с одним из ее фрагментов, или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или с одним из ее фрагментов.
В частности, указанный выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9.
При этом указанный выделенный полинуклеотид, используемый в качестве лекарственного средства, предпочтительно находится в вирусном векторе, при этом вирусный вектор может быть выбран, например, из группы, состоящей из аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса и поксвируса.
Изобретение относится также к выделенному полипептиду, содержащему полипептид с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, в качестве лекарственного средства. Предпочтительно указанный выделенный полипептид представлен полипептидом с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов. В частности, указанный полипептид имеет последовательность SEQ.ID.NO.14.
Изобретение относится также к моноклональному антителу или к его фрагменту, осуществляющему связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, содержащий белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов, в качестве лекарственного средства, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием пролиферации клеток. Предпочтительно указанное моноклональное антитело или указанный его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, специфически связывает выделенный полипептид, который представлен белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов. Еще более предпочтительно указанное моноклональное антитело или указанный его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, специфически связывает выделенный полипептид, который представлен белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, белком с последовательностью SEQ.ID.NO.10).
Другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного начала выделенный полинуклеотид, содержащий
- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из ее фрагментов, или
- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или один из ее фрагментов,
причем указанный выделенный полинуклеотид таков, что он кодирует выделенный полипептид, имеющий, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации,
и фармацевтически приемлемый эксципиент или эксципиенты.
Предпочтительно выделенный полинуклеотид, являющийся активным началом, представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или с одним из ее фрагментов, или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или с одним из ее фрагментов.
В частности, выделенный полинуклеотид, являющийся активным началом, представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9.
Указанный выделенный полинуклеотид, введенный в фармацевтическую композицию согласно изобретению, предпочтительно находится в вирусном векторе, при этом вирусный вектор выбирают, например, из группы, состоящей из аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса и поксвируса.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей выделенный полипептид, содержащий полипептид с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка протеина, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации. Предпочтительно указанный выделенный полипептид представлен полипептидом с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов. В частности, указанный полипептид имеет последовательность SEQ.ID.NO.14.
Кроме того, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, содержащий по меньшей мере фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, при этом указанная композиция включает фармацевтически приемлемый эксципиент или эксципиенты. Предпочтительно указанная фармацевтическая композиция согласно изобретению является композицией, содержащей моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, представленный белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или ее фрагментом, или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов.
В частности, изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, белок с последовательностью SEQ.ID.NO.10), и фармацевтически приемлемый эксципиент или эксципиенты.
Другим объектом изобретения является применение выделенного полинуклеотида, содержащего
- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.8 или один из ее фрагментов, или
- полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или один из ее фрагментов,
причем указанный выделенный полинуклеотид таков, что он кодирует выделенный полипептид, имеющий, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для протеина, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации,
для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания.
Предпочтительно используемый выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или с одним из ее фрагментов или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или с одним из ее фрагментов.
В частности, используемый выделенный полинуклеотид представлен полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.8 или полинуклеотидом с полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9.
Указанный используемый выделенный полинуклеотид предпочтительно находится в вирусном векторе, причем вирусный вектор выбирают, например, из группы, состоящей из аденовируса, аденоассоциированного вируса, ретровируса и поксвируса.
Настоящее изобретение относится также к применению выделенного полипептида, содержащего полипептид с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов, причем выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания. Предпочтительно указанный выделенный полипептид представлен полипептидом с последовательностью SEQ.ID.NO.14 или с одним из ее фрагментов. В частности, указанный полипептид имеет последовательность SEQ.ID.NO.14.
В качестве альтернативного варианта согласно изобретению моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, содержащий белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, может быть использовано для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания. Предпочтительно указанное моноклональное антитело или указанный его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, специфически связывает полипептид, который представлен белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов.
В частности, моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, моноклональное антитело или его фрагмент, осуществляющий связывание с антигеном, которое специфически связывает белковую последовательность SEQ.ID.NO.10), может быть использовано для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения пролиферативного заболевания.
В соответствии с предпочтительными вышеуказанными вариантами применения пролиферативным заболеванием, которое подлежит лечению с помощью полипептида или полинуклеотида, описанных выше, является рак. В соответствии с более предпочтительными вариантами рак относится к группе, включающей рак простаты, рак грудной железы, рак легких (и в частности, мелкоклеточный рак легких) и рак прямой кишки. Еще более предпочтительно заболеванием является рак грудной железы и мелкоклеточный рак легких.
Кроме того, изобретение относится к способу получения выделенного полипептида, содержащего белок, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, при этом указанный способ включает следующие последовательные стадии:
(а) культивирование, в условиях, подходящих для экспрессии указанного полипептида, клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором экспрессии, включающим выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13, последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 или же одному из фрагментов этих последовательностей, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, и
(б) выделение полипептида из культуры клеток-хозяев.
Предпочтительно указанный способ получения относится к получению выделенного полипептида, представленного белком, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или одним из ее фрагментов, или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или одному из ее фрагментов, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, при этом указанный способ включает следующие последовательные стадии:
(а) культивирование, в условиях, подходящих для экспрессии указанного полипептида, клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором экспрессии, включающим выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13, последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 или же одному из фрагментов этих последовательностей, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, и
(б) выделение полипептида из культуры клеток-хозяев.
В частности, указанный способ относится к получению выделенного полипептида, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 или же последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 (другими словами, к получению белковой последовательности SEQ.ID.NO.10).
Согласно еще более предпочтительному варианту указанного способа он относится к получению белковой последовательности SEQ.ID.NO.10 и включает следующие стадии:
(а) культивирование, в условиях, подходящих для экспрессии указанного полипептида, клетки-хозяина, трансформированной или трансфицированной вектором экспрессии, включающим выделенный полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 или последовательность, комплементарную полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13, причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, и
(б) выделение полипептида из культуры клеток-хозяев.
Настоящее изобретение относится также к способу идентификации соединений, способных связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию, причем способ включает следующие последовательные стадии:
(а) контактирование каждого тестируемого соединения в течение времени и в условиях, достаточных для связывания тестируемого соединения с полипептидом, с выделенным полипептидом, содержащим
- либо фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9,
- либо фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.13 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.13,
причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, и
(б) выявление связывания каждого тестируемого соединения с указанным полипептидом и идентификацию среди тестируемых соединений тех соединений, которые способны связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию.
В частности, указанный способ идентификации соединений, способных связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию, включает на стадии (а) контактирование каждого тестируемого соединения в течение времени и в условиях, достаточных для связывания тестируемого соединения с полипептидом, с выделенным полипептидом, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, с белковой последовательностью SEQ.ID.NO.10).
Альтернативный способ идентификации соединений, способных связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию, включает следующие последовательные стадии:
(а) контактирование каждого тестируемого соединения в течение времени и в условиях, достаточных для взаимодействия клетки с тестируемым соединением, с клеткой, способной экспрессировать выделенный полипептид, содержащий
- либо фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9,
- либо фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.13 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.13,
причем указанный выделенный полипептид имеет, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, и
(б) определение эффекта от воздействия каждого тестируемого соединения на концентрацию в клетке полипептида и идентификацию среди тестируемых соединений тех соединений, которые способны связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию.
В частности, указанный альтернативный вариант способа включает на стадии (а) контактирование каждого тестируемого соединения в течение времени и в условиях, достаточных для взаимодействия с клеткой тестируемого соединения, с клеткой, способной экспрессировать выделенный полипептид, кодируемый полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, с клеткой, способной экспрессировать белковую последовательность SEQ.ID.NO.10).
Согласно предпочтительным вариантам осуществления способов идентификации соединений, способных связывать GHRH человека и модулировать клеточную пролиферацию, описанных выше, тестируемые соединения получают из библиотек малых молекул, получаемых в результате применения программ комбинаторной химии.
Фармакологические свойства, присущие полинуклеотидам и полипептидам согласно изобретению, делают возможным их использование в фармацевтических целях. Так, выделенные полипептиды, включающие
- либо фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9,
- либо фрагмент белка, кодируемого полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.13 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.13,
и которые имеют, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека, и ассоциированную с модулированием клеточной пролиферации, а также полинуклеотиды, кодирующие указанные полипептиды, могут согласно изобретению вводиться раковым больным для замедления у них роста опухоли или для регрессии этих опухолей.
В описанных выше способах белок, связывающий GHRH человека и ассоциированный с модулированием клеточной пролиферации, может являться, в частности, выделенным полипептидом, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ.ID.NO.9 или последовательностью, комплементарной полинуклеотидной последовательности SEQ.ID.NO.9 (другими словами, белковой последовательностью SEQ.ID.NO.10).
Наконец, изобретение относится к полинуклеотидам с последовательностью SEQ.ID.NO.4, SEQ.ID.NO.5, SEQ.ID.NO.11 и SEQ.ID.NO.12, которые могут быть использованы, в частности, в качестве затравки в реакциях ПЦР при клонировании гетерокарпина.
Различные перечисленные выше характеристики станут очевидными для специалиста при чтении более подробного описания различных аспектов изобретения.
Подробное описание различных аспектов изобретения
Как указано выше, настоящее изобретение направлено в основном на продукты и способы, предназначенные для модулирования роста клеток и лечения рака. Настоящее изобретение основано, отчасти, на идентификации «последовательностей, ассоциированных с модулированием клеточной пролиферации», которые являются полипептидными и полинуклеотидными последовательностями, ассоциированными с модулированием клеточной пролиферации. Такие молекулы кДНК могут быть получены на основе препаратов РНК или мРНК с использованием стандартных методик, как например обратной транскрипцией. Аналогичным же образом белок или полипептид, ассоциированный с дифференцировкой, включает последовательность, кодируемую мРНК, ассоциированной с дифференцировкой клеток.
Описанные в настоящем изобретении фармацевтические композиции могут включать один или несколько полипептидов, последовательностей нуклеиновых кислот и/или антител. Полипептиды согласно изобретению содержат по меньшей мере часть белка или вариант белка, связывающего GHRH человека и ассоциированного с модулированием клеточной пролиферации. Последовательности нуклеиновых кислот согласно изобретению содержат последовательность ДНК или РНК, которая кодирует по меньшей мере часть такого полипептида или которая комплементарна этой кодирующей последовательности.
Антитела представляют собой белки иммунной системы или их фрагменты, осуществляющие связывание с антигеном, которые способны связывать часть полипептидов, описанных выше.
Полинуклеотиды, полипептиды и белки согласно изобретению
Настоящее изобретение относится более конкретно к полинуклеотидам с последовательностью SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13, а также к полипептиду или белку с последовательностью SEQ.ID.NO.14.
Изобретение включает также полинуклеотиды, содержащие полинуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90-95% являются гомологичными полинуклеотидным последовательностям, описанным выше, в частности последовательностям SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9 и SEQ.ID.NO.13. Это относится в равной мере к mutatis mutandis и к другим полинуклеотидам, полипептидам и белкам, составляющим часть изобретения, в частности к белку с последовательностью SEQ.ID.NO.14.
Степень гомологичности, выраженную в %, рассчитывают следующим образом:
100-100×(N'/N),
где N' означает число нуклеотидов или аминокислот, модифицированных по отношению к последовательности SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9, SEQ.ID.NO.10, SEQ.ID.NO.13 или SEQ.ID.NO.14, и N означает число нуклеотидов в последовательности SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9, SEQ.ID.NO.10, SEQ.ID.NO.13 или SEQ.ID.NO.14.
Согласно изобретению полинуклеотидные последовательности, которые кодируют полипептиды или белки согласно изобретению, а также фрагменты или слитые протеины этих полипептидов или белков могут быть использованы для получения молекул рекомбинантной ДНК, которые управляют экспрессией этих полипептидов или белков, или их активных фрагментов в соответствующих клетках-хозяевах. Как вариант, полинуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с фрагментами последовательностей полинуклеотидов согласно изобретению, могут быть также использованы в тестах гибридизации нуклеиновых кислот, таких как блоттинг по Саузерну, нозерн-блоттинг и т.д.
2
В силу вырожденности генетического кода другие последовательности ДНК, кодирующие, главным образом, полипептидную или белковую аминокислотную последовательность согласно изобретению, могут быть использованы для клонирования и экспрессии указанных полипептидов или белков. Эти последовательности ДНК включают последовательности, которые способны гибридизовать полинуклеотидные последовательности полинуклеотидов согласно изобретению в определенных жестких условиях, которые могут быть созданы различными способами. Например, в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно выдерживать температуру, при которой гибридизуются затравки с матрицей, или концентрации MgCl в реакционном буферном растворе. При использовании фрагментов ДНК с радиоактивными метками или олигонуклеотидов для зондирования мембран жесткие условия устанавливают путем регулирования ионной силы промывочных растворов или строго контролируя температуру промывки.
m
Предпочтительно указанная гомологическая нуклеотидная последовательность специфически гибридизуется с последовательностью, комплементарной последовательности SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13 в жестких условиях (или очень жестких условиях). Параметры, характеризующие жесткие условия, определяются температурой, при которой расходятся 50% спаренных нитей (Т).
m
Для последовательностей, содержащих более 30 оснований и в соответствии с Sambrook et coll. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Т определяют согласно уравнению
m
T=81,5+0,41×(% G+C)16,6×log[катион]-0,63×(% формамида)-(600/число оснований).
m
В соответствии с изобретением «очень» жесткими условиями являются условия, когда используемая температура гибридизации на 10°С ниже Т, а буфер гибридизации содержит 6-кратный раствор SSC (0,9 М раствор хлорида натрия и 0,09 М раствор цитрата натрия). При таких условиях полинуклеотиды с неспецифическими последовательностями не гибридизуются с полинуклеотидом, имеющим последовательность, комплементарную последовательности SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9 или SEQ.ID.NO.13.
Измененные последовательности ДНК, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают делеции, добавки или замены различных нуклеотидных остатков и приводят к последовательности, которая кодирует тот же генный продукт или его функциональный эквивалент. Генный продукт также может содержать делеции, добавки или замены аминокислотных остатков в белковых последовательностях согласно изобретению, которые приводят к так называемым молчащим изменениям и получают, таким образом, полипептиды и белки с эквивалентной функцией.
Такие замены аминокислотных остатков могут осуществляться на основе полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или с учетом амфипатической природы данного остатка.
Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, а положительно заряженные аминокислоты включают лизин и аргинин; аминокислоты с полярными группами, у которых близки значения гидрофобности, включают лейцин, изолейцин, валин; глицин, аланин; аспарагин, глутамин; серин, треонин; фенилаланин, тирозин.
По целому ряду причин последовательности ДНК согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы для изменения полинуклеотидных последовательностей согласно изобретению, включая изменения, но не ограничиваясь ими, которые модифицируют экспрессию генного продукта. Например, мутации могут быть осуществлены с использованием хорошо известных специалисту методов, например, используя направленный мутагенез, вставки новых сайтов рестрикции, изменения гликозилирования, фосфорилирования и т.д.
В частности, в некоторых системах экспрессии, как, например, дрожжи, клетка-хозяин может сверхгликозилировать генный продукт. В такой системе предпочитают изменять полинуклеотидные последовательности для того, чтобы устранить сайты гликозилирования. В объем настоящего изобретения входят также модифицированные полинуклеотидные последовательности, связанные с гетерологичными последовательностями, кодирующими слитый протеин. Слитый протеин (которым может быть, например, протеин с последовательностью SEQ.ID.NO.14) может быть модифицирован для установления сайта расщепления, локализированного между белковой последовательностью согласно изобретению (например, последовательностью SEQ.ID.NO.10) и гетерологичной белковой последовательностью, так чтобы белковая последовательность согласно изобретению могла бы быть отщеплена от гетерологичной части.
Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, ассоциированные с модулированием пролиферации клеток
Любой полинуклеотид, кодирующий полипептид или его часть или его вариант, который, как описано в настоящем изобретении, связывает GHRH человека и ассоциируется с модулированием клеточной пролиферации, входит в объем изобретения. Такие полинуклеотиды могут быть одноцепочечными (кодирующими или антисмысловыми) или двухцепочечными и могут представлять собой ДНК (геномную, кДНК или синтезированную) или молекулы РНК.
Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, связывающие GHRH человека и ассоциированные с модулированием клеточной пролиферации, могут быть получены с использованием любого способа, доступного специалисту. Например, такой полинуклеотид может быть амплифицирован посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), исходя из кДНК, полученной из клеток. Для этого специфические затравки могут быть заданы или синтезированы, или они должны быть коммерчески доступны; эти затравки базируются на последовательности указанного полинуклеотида. Амплифицированный участок может быть затем использован для выделения полного гена из банка геномных ДНК или из банка кДНК любой клетки или любой ткани с помощью известных специалисту способов, кратко изложенных ниже. В качестве варианта полный ген может быть сконструирован из нескольких фрагментов продукта ПЦР. Молекулы кДНК, кодирующие протеин, фиксирующий GHRH человека и ассоциированный с модулированием клеточной пролиферации, или его часть, могут быть получены также путем скрининга банка кДНК, полученного например, из мРНК клеток или ткани. Такие библиотеки коммерчески доступны или могут быть получены согласно классическим методам (см. Sambrook et coll., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Согласно альтернативному варианту могут быть также применены и другие методы скрининга, хорошо известные специалисту.
Молекула кДНК, кодирующая полипептид, фиксирующий GHRH человека и ассоциированный с модулированием клеточной пролиферации, может быть секвенирована классическими методами с использованием ферментов, как например: фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I, секвеназы Х (US Biochemical Corp., Cleveland, OH, Etats-Unis), Taq-полимеразы (Perkin Elmer, Foster City, CA, Etats-Unis), термостабильной полимеразы Т7 (Amersham, Chicago, IL, Etats-Unis), или комбинируя рекомбинантные полимеразы и экзонуклеазы, имеющие способность активировать повторное считывание, как, например, система амплификации Элонгаза (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, Etats-Unis). Система автоматического секвенирования может быть использована с помощью инструментов, имеющихся в продаже у поставщиков, таких как Perkin Elmer и Pharmacia.
Частичная последовательность кДНК может быть использована для идентификации полинуклеотидной последовательности, которая кодирует полный протеин, ассоциированный с модулированием клеточной пролиферации, с применением классических методов, хорошо известных специалисту. К таким методам относится метод скрининга библиотеки кДНК с использованием одного или нескольких полинуклеотидных зондов, использующих рекомбинантные свойства RecA (ClonCapture cDNA Selection Kit, Clontech Laboratories, Etats-Unis).
32
33
С целью гибридизации осуществляют радиоактивное мечение частичной последовательности (например, путем трансляции разрыва или путем мечения концов с использованием Р или Р) согласно классическим методам. Библиотеку бактерий или бактериофагов затем подвергают скринингу путем гибридизации на фильтрах, содержащих колонии денатурированных бактерий (или отпечатки, содержащие бляшки фагов) с меченым зондом (см. Sambrook et coll., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Положительные колонии или бляшки затем отбирают, амплифицируют и выделяют ДНК для будущих анализов.
Полную последовательность затем можно определить согласно стандартным методикам. Перекрывающиеся последовательности затем объединяют в одну непрерывную последовательность. Полная молекула кДНК может быть получена путем лигирования нужных фрагментов в соответствии с классическими методами.
В качестве альтернативных вариантов существует множество методик, основанных на амплификации, для получения полной кодирующей последовательности из частичной последовательности кДНК. К ним относится амплификация, осуществляемая как правило посредством ПЦР. Совокупность наборов, имеющихся в продаже, может быть использована для осуществления этапов амплификации. Затравки могут быть заданы с помощью, например, систем программного обеспечения, известных специалисту. Предпочтительно нуклеотидными затравками являются молекулы с 20-30 нуклеотидами, содержащими гуанидин и цитозин в количестве не менее 50% и которые гибридизуются с последовательностью-мишенью при температурах от 50 до 72°С. Амплифицированный участок может быть секвенирован, как описано выше, и перекрывающиеся последовательности объединяют в непрерывную последовательность.
В качестве альтернативных решений возможно получение последовательностей, пограничных с частичной последовательностью, путем амплификации с затравкой связующей последовательности и со специфической затравкой известного участка. Амплифицированные последовательности затем направляют на второй цикл амплификации.
Дополнительные способы включают ПЦР с захватом (Lagestrom et coll., PCT Methods Applic. (1991), 1, 111-19) и прогрессивную ПЦР (Parker et coll., Nucl. Acids. Res. (1991), 19, 3055-60). Могут быть применены и другие способы, использующие амплификацию, для получения полной последовательности кДНК.
Можно получить полную последовательность кДНК при анализе последовательностей, депонированных в общественные базы данных «Expressed Sequence Tags» (EST), находящиеся в Банке Генов (GenBank). Поиск перекрывающихся EST может быть осуществлен с использованием информационных программ, известных специалисту (например, NCBI BLAST), и такие EST могут быть использованы для выработки полной непрерывной последовательности.
В объем изобретения входят также варианты полинуклеотидных последовательностей, описанных выше (в частности, последовательностей SEQ.ID.NO.8, SEQ.ID.NO.9 и SEQ.ID.NO.13). Варианты полинуклеотидов могут содержать одну или несколько замен, делеций или вставок (см. также указанную выше главу под названием «Полинуклеотиды, полипептиды и протеины согласно изобретению»).
Часть последовательности, комплементарная кодирующей последовательности (т.е. антисмысловой полинуклеотид) может также быть использована в качестве зонда или модулятора экспрессии генов. Конструкции кДНК, которые могут транскрибироваться в антисмысловую РНК, могут быть введены в клетки или в ткани для облегчения продуцирования антисмысловой РНК. Как описано в настоящем изобретении, антисмысловой полинуклеотид может быть использован для ингибирования экспрессии гена, ассоциированного с модулированием клеточной пролиферации. Метод с антисмысловыми полинуклеотидами используется для регулирования экспрессии генов с образованием тройной спирали, которая снижает способность двойной спирали раскрываться в достаточной мере для связывания с полимеразами, факторами транскрипции или регуляторными молекулами (см. Gee et coll., Huber et Carr, Molecular and Immunologic Approaches (1994), Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY). Согласно альтернативному варианту антисмысловая молекула может быть использована для гибридизации с участком контроля гена (например, промотором или сайтом инициации транскрипции) и блокировки транскрипции гена или блокировки трансляции, ингибируя связывание рибосом с транскриптом.
Полинуклеотиды могут быть затем модифицированы для увеличения их стабильности in vivo. Возможные модификации включают (но ими не ограничиваются) добавление последовательностей к концам 5' и/или 3'; предпочтительное использование фосфоротиоата или 2'О-метила, а не связывание фосфодиэстеразы в скелете; и/или введение оснований, таких как инозин, кеозин и вибутозин, а также ацетиладенин, метилтиоаденин и другие модифицированные формы аденина, цитидин, гуанин, тимин и уридин.
Другие изменения полинуклеотидов согласно изобретению были описаны выше в главе под названием «Полинуклеотиды, полипептиды и протеины согласно изобретению».
Последовательности нуклеотидов, как описано в настоящем изобретении, могут присоединяться к другим нуклеотидным последовательностям при использовании известных методик с рекомбинантной ДНК. Например, полинуклеотид может быть клонирован в широком диапазоне векторов экспрессии, включая плазмиды, фагмиды, производные лямбда фагов и космиды. Векторы, представляющие особый интерес, включают векторы экспрессии, векторы репликации и векторы секвенирования. Обычно вектор содержит источник функциональной репликации, по меньшей мере, в организме, соответствующие сайты эндонуклеазной рестрикции и один или несколько маркеров селекции. Присутствие других элементов зависит от специфики использования, желаемого специалистом, который выбирает характеристики вектора экспрессии в зависимости от своих потребностей и имеющихся в его распоряжении средств.
Полинуклеотиды могут входить в состав композиций для введения в клетку и экспрессии соответствующего полипептида. Такие композиции особенно пригодны для терапевтических целей, как описано ниже.
Специалисты хорошо знают, что существует несколько методов для экспрессии полинуклеотида в клетке-мишени и что использована может быть любая адекватная технология. Например, полинуклеотид может вводиться в вирусный вектор, такой как аденовирус или ретровирус (но также и в другие). Технология введения ДНК в такие векторы хорошо известна специалисту. Ретровирусный вектор может переносить или вводить ген в маркер селекции и/или в элемент, служащий мишенью, как, например, ген, кодирующий лиганд специфического рецептора клетки-мишени, чтобы сделать вектор специфическим для мишени.
Другие композиции полинуклеотидов включают дисперсные коллоидные системы, как, например, макромолекулярные комплексы, нанокапсулы, микросферы, шарики, и системы, основанные на применении липидов, включающие эмульсии масло/вода, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой, используемой для доставки продукта in vitro и in vivo, является липосома (т.е. мембранная искусственная везикула).
Полипептиды, связывающие GHRH человека и модулирующие клеточную пролиферацию
В объем изобретения входят полипептиды, включающие по меньшей мере часть протеина, ассоциированного с модуляцией клеточной пролиферации, или его варианта, причем указанная часть является иммунологически и/или биологически активной. Такие полипептиды могут иметь любую длину, включая полный протеин, олигопептид (т.е. состоящий из относительно небольшого числа аминокислот, как, например, 8-10 остатков, соединенных пептидными связями) или пептид промежуточной длины. Полипептид может содержать дополнительные последовательности.
Аналогично полипептид является «биологически активным», если у него имеется одна или несколько структурных, регуляторных и/или биохимических функций, присущих нативному белку, ассоциированному со связыванием GHRH человека и с модулированием клеточной пролиферации.
50
Наличие биологической активности может быть определено согласно хорошо известным специалисту методам. Однако в соответствии с определением в рамках настоящего изобретения полипептид признается как «имеющий, по меньшей мере, иммунологическую и/или биологическую активность, характерную для белка, связывающего GHRH человека и ассоциированного с модулированием клеточной пролиферации», если его ингибирующая концентрация CI, измеренная в условиях, описанных в примере 6 настоящей заявки, будет ниже или равна 10 нМ (предпочтительно ниже или равна 1 нМ).
Например, сравнительные исследования последовательностей указывают конкретную биологическую активность белка. Опыты, направленные на измерение указанной активности, могут быть осуществлены на основе опытов, известных для данной области. Некоторые части и другие варианты этих белков также должны продемонстрировать эту активность в тесте in vitro или in vivo.
Как было уже сказано, полипептиды согласно настоящему изобретению могут содержать одну или несколько частей варианта эндогенного белка, в котором эта часть является иммунологически и/или биологически активной (т.е. часть имеет одну или несколько антигенных, иммуногенных и/или биологических характеристик полного протеина). Предпочтительно эта часть является, по меньшей мере, такой же активной, как весь белок, если опыт позволяет обнаружить эти свойства. «Вариантом» полипептида является полипептид, который отличается от нативного белка наличием замен, вставок, делеций и/или модификаций аминокислот. Некоторые варианты включают консервативные замены. «Консервативные замены» означают замену, при которой одна аминокислота заменена другой аминокислотой, имеющей такие же свойства, как те, которые определены специалистом, который не ожидает какого-либо изменения во вторичной структуре, а также в гидропатической природе полипептида. Замены аминокислот обычно осуществляют на основе сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Например, отрицательно заряженные аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; аминокислоты с положительным зарядом включают лизин и аргинин; незаряженные полярные аминокислоты, имеющие близкие значения гидрофобности, включают лейцин, изолейцин и валин; глицин и аланин; аспарагин и глутамин; серин, треонин, фенилаланин и тирозин. Другими группами аминокислот, которые могут означать консервативные замены, являются следующие: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His. Вариант может также содержать неконсервативные изменения.
Варианты, являющиеся частью изобретения, включают также полипептиды, в которых первичная структура нативного белка модифицирована с образованием ковалентных или нековалентных конъюгатов с другими полипептидами или химическими структурами, такими как, например, липидные группы или гликозильные группы или ацетилфосфатные группы.
Настоящее изобретение включает также полипептиды, содержащие или не содержащие гликозилированные звенья. Полипептиды, экспрессированные в системе экспрессии дрожжей или в клетках млекопитающих, с точки зрения молекулярной массы или схемы гликозилирования, могут быть схожи или иметь слабые отличия от нативной молекулы в зависимости от использованной системы экспрессии.
Экспрессия ДНК у бактерии, такой как E. coli, приводит к негликозилированным молекулам. Сайты N-гликозилирования эукариотических белков характеризуются триплетом аминокислот Asn-A1-Z, где А1 означает любую аминокислоту, за исключением Pro, и Z означает серин или треонин.
Другие изменения полипептидов и белков по изобретению описаны выше в главе, названной «Полипептиды и полинуклеотиды согласно изобретению».
Для получения варианта полипептида могут быть использованы стандартные методики мутагенеза, такого как направленный мутагенез с использованием направляющего олигонуклеотида.
Обычно используют любой известный специалисту вектор экспрессии для экспрессирования рекомбинантных полипептидов согласно изобретению. Экспрессию можно осуществить в любой подходящей клетке-хозяине, которая трансформирована или трансфицирована вектором экспрессии, содержащим последовательность ДНК, которая кодирует рекомбинантный полипептид. Подходящие клетки-хозяева включают прокариотические клетки, высшие эукариотические клетки или клетки дрожжей. Предпочтительно используемыми клетками-хозяевами являются E. coli, клетки дрожжей или клетки млекопитающих, такие как COS, CHO, HEK-293, MCF7 (опухолевые клетки человека, выделенные из карциномы грудной железы) или DU 145 (опухолевые клетки человека, выделенные из раковой опухоли простаты).
Некоторые части и другие варианты могут быть получены методами синтеза, хорошо известными специалисту в данной области. Например, части и варианты, содержащие менее 500 аминокислот, предпочтительно менее 100 аминокислот, более предпочтительно менее 50 аминокислот можно синтезировать химическим путем. Полипептиды могут быть синтезированы с использованием методов твердофазного синтеза, коммерчески доступных, как, например, метод синтеза на смоле Меррифилда, в котором последовательно присоединяются аминокислоты к аминокислотной цепи в процессе синтеза (см. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. (1963), 85, 2146-2149). Существуют также многочисленные другие методы твердофазного синтеза (например, метод Roberge et coll., Science (1995), 269, 202-204). Оборудование для автоматического синтеза полипептидов поставляется на рынок таким поставщиком, как, например, Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, Etats-Unis); в этом случае синтез полипептидов осуществляют в соответствии с рекомендациями разработчика.
Выделенные полинуклеотиды или полипептиды.
Обычно описанные в настоящем изобретении полипептиды и полинуклеотиды выделяют. «Выделенный» полипептид или полинуклеотид представляет собой полинуклеотид или пептид, отделенный от своего первоначального окружения. Например, природный белок выделен, если он отделен от биологического материала, с которым он сосуществовал в природной системе. Полинуклеотид считается выделенным, если, например, он клонирован в векторе, который не относится к природной среде.
Антитела и их фрагменты
Настоящее изобретение предлагает агенты связывания, такие как антитела, которые специфически связывают белок, ассоциированный со связыванием GHRH человека и с модулированием клеточной пролиферации. Такой агент называют «специфически связывающимся» с белком модулирования клеточной пролиферации, если его взаимодействие с белком, ассоциированным с модулированием клеточной пролиферации, или с его частью, или его вариантом находится на уровне, достаточном для обнаружения (например, с помощью теста ELISA), и не обнаруживается его взаимодействие с другими белками. «Связывание» означает нековалентную связь между двумя отдельными молекулами, при которой образуется комплекс. Способность к связыванию может оцениваться, например, с помощью константы связывания для образования комплекса. Константа связывания означает величину, получаемую в результате деления величины концентрации комплекса на произведение значений концентраций компонентов. Обычно два продукта называют «связанными», если константа связывания достигает 103 1/моль. Константу связывания определяют методами, известными специалисту.
Любой агент, отвечающий указанным выше критериям, может рассматриваться как агент связывания.
В настоящем изобретении агентом связывания предпочтительно является антитело или его фрагмент. Антитела могут быть получены любым методом, имеющимся в распоряжении специалиста (см. Harlow et Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Обычно антитела получают по методу культивирования клеток, включающему выработку моноклональных антител, или посредством трансфекций генов антитела в клетках-хозяевах бактерий или млекопитающих для получения рекомбинантных антител.
Из числа других методов предпочитают использовать методы, описанные ниже. Иммуноген, содержащий полипептид, вводят группе млекопитающих (например, мышам, крысам, овцам или козам). На этой стадии полипептиды согласно изобретению могут выполнять роль иммуногенов без их модификации. В другом варианте, в частности, для пептидов малого размера наибольший иммунный ответ может быть инициирован, если полипептид присоединен к транспортному белку, такому как, например, сывороточный бычий альбумин или гемоцианин моллюска. Иммуноген вводится животному-хозяину предпочтительно в соответствии с вышеописанной схемой, и у животных периодически отбирают кровь. Специфические поликлональные полипептидные антитела могут быть очищены от антисывороточных элементов, например, путем аффинной хроматографии с использованием пептида, связанного с соответствующей твердой подложкой.
Для получения антитела, специфически связывающего белковую последовательность А, но не связывающего белковую последовательность В, белковую последовательность А вводят животному-хозяину, предпочтительно в соответствии с вышеописанной схемой, и у животных периодически отбирают кровь. Специфические поликлональные полипептидные антитела с последовательностью А могут быть также очищены от антисывороточных элементов, например, путем аффинной хроматографии с использованием белковой последовательности В, спаренной с соответствующей твердой подложкой. Соответствующий элюат содержит антитело, специфически связывающееся с белковой последовательностью А, но не связывающееся с белковой последовательностью В.
Слитые белки
Любой слитый ген может быть получен специалистом для определения субклеточной локализации белка согласно изобретению, в частности субклеточной локализации белка, имеющего последовательность SEQ.ID.NO.10. Коммерчески доступными являются многочисленные плазмидные конструкции, такие как белок Glutathione S Transférase (GST) или флуоресцирующие белки, такие как Green Fluorescent Protein (GFP) или же, но не ограничиваясь ею, метка полигистидин.

Эукариотические человеческие клетки-хозяева (например, НЕК-293) субкультивируют в течение 24 часов перед процедурой трансфекции, что обеспечивает нормальный метаболизм клеток и наилучшую эффективность трансфекции. Увеличивающиеся концентрации (1, 5 и 10 мкг) одного вектора, содержащего протеиновую метку (GFP, GST или Tag Histidine), или вектора, содержащего полинуклеотид с последовательностью SEQ.ID.NO.8 или полинуклеотид с последовательностью SEQ.ID.NO.9, слитый с белковой меткой, создают при использовании реактива Effecteneв соответствии с рекомендациями изготовителя (Qiagen).
Клетки затем анализируют под софокусным микроскопом, например, для определения локализации белка. Если предполагается, что белок, например, секретирован, то супернатанты собирают, лиофилизуют, помещают на акриламидный гель и анализируют методом вестерн-блоттинга с помощью антител, направленных против белковой метки.
Фармацевтическая композиция
В соответствии с некоторыми аспектами изобретения такие продукты, как полипептиды, антитела и/или нуклеиновые кислоты могут вводиться в фармацевтические композиции или вакцины. Фармацевтические композиции содержат один или несколько таких продуктов и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов (носителей). Некоторые фармацевтические композиции, возможно, используемые в качестве вакцин, могут включать один или несколько полипептидов и активатор иммунного ответа, такой как адъювант или липосому (в которые введен продукт). Фармацевтическая композиция и вакцины могут дополнительно содержать систему для введения, такую как, например, биоразлагаемые микросферы (и, например, микросферы, состоящие из сополимеров молочной и гликолевой кислоты или PLGA). Фармацевтические композиции и вакцины, входящие в объем изобретения, могут также содержать другие продукты, которые могут быть биологически активными или неактивными.
Фармацевтическая композиция или вакцина может содержать ДНК, кодирующую один или несколько полипептидов, как это описано выше, так чтобы полипептид вырабатывался in situ. Как отмечено выше, ДНК может находиться в любой форме, пригодной для введения в организм и известной специалисту, включая системы экспрессии нуклеиновых кислот, бактерийные или вирусные системы. Подходящие системы экспрессии нуклеиновых кислот содержат последовательности ДНК, необходимые для экспрессии у пациентов.
Системы введения на основе бактерии требуют введения бактерии (как Bacillus-Calmette-Guerrin), которая экспрессирует иммуногенную часть полипептида на своей поверхности. Предпочтительно ДНК может быть введена в форме вирусной системы экспрессии (например, с использованием поксвируса, ретровируса или аденовируса), требующей использования непатогенных агентов (дефектных).
Хотя может быть использован любой носитель, известный специалисту, в фармацевтической композиции согласно изобретению, тип носителя выбирают в зависимости от метода введения. Композиция согласно изобретению может быть составлена для каждого соответствующего метода введения, включая, например, топический, назальный, внутривенный, внутричерепной, интраперитонеальный, подкожный и внутримышечный путь.
При парентеральном введении, таком как подкожная инъекция, носитель предпочтительно содержит воду, соль, спирт, жир, парафин или буфер. При пероральном введении может быть использован любой носитель, указанный выше, или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. В фармацевтических композициях согласно изобретению в качестве носителя могут быть также использованы биоразлагаемые микросферы. При некоторых видах топического нанесения предпочитают составы в виде кремов или лосьонов.
Такие композиции могут также содержать буферы (например, солевые растворы, содержащие нейтральные или фосфатные буферы), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как, например, глицин, антиоксиданты, хелатирующие агенты, такие как, например, ЕДТУ или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия) и/или защитные агенты. Согласно альтернативному варианту композиции согласно изобретению могут находиться в форме лиофилизата. Продукты могут быть также инкапсулированы в липосомах с использованием классических технологий.
Согласно изобретению может быть использован любой из множества адъювантов в вакцинах для индукции иммунного ответа. Большинство адъювантов содержит вещество, защищающее антиген от быстрого катаболизма, такое как, например, гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунных ответов, такой как, например, липид А, протеины, являющиеся производными Bordetella Pertussis или Mycobacterium tyberculosis. Аналогичные адъюванты имеются в продаже, как например: адъювант Фрейнда и полный адъювант (Difco Laboratories, Detroit, MIY, Etats-Unis; Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ, Etat-Unis)), биоразлагаемые микросферы; монофосфорильный липид А; и цитокины, как, например, GM-CSF или интерлейкин-2, -7 или -12.
Описанные выше композиции могут вводиться также в форме композиций замедленного действия (т.е. композиции в виде капсулы или губки, которые начинают медленно высвобождать продукт после его приема). Такие композиции обычно получают с применением хорошо известной специалистам технологии и вводятся, например, пероральным, ректальным путем или путем подкожной имплантации или имплантацией на желаемом участке. Композиции замедленного действия могут содержать полипептид, полинуклеотид или антитело, диспергированное в несущей матрице и/или содержащееся в емкости, защищенной диффузной мембраной. Носители, используемые в таких композициях, являются биосовместимыми и должны быть, кроме того, биоразлагаемыми. Предпочтительно композиция создает относительно постоянный уровень высвобождения активного компонента. Количество активного вещества, содержащееся в композиции замедленного действия, зависит от места имплантирования.
Противораковая терапия
Согласно другим аспектам изобретения описанные продукты могут использоваться в противораковой терапии. В частности, полинуклеотиды или полипептиды, ассоциированные с фиксацией GHRH человека и с модулированием клеточной пролиферации, могут использоваться для ингибирования роста и модулирования клеточной пролиферации в специфических опухолях грудной железы, простаты или рака легких.
Эти полипептиды или полинуклеотиды могут также использоваться в терапии многочисленных карцином, включая меланомы, множественные формы глиобластом, карцином легкого, а также раковых опухолей прямой кишки. Агенты, которые активируют экспрессию этих полипептидов или полинуклеотидов, могут также использоваться в рамках указанной терапии.
Согласно этим аспектам изобретения продукты (которыми могут быть полипептиды или нуклеиновые кислоты) предпочтительно вводят в фармацевтические композиции, указанные выше.
Больными, которые могут пользоваться данной терапией, являются все теплокровные животные, предпочтительно люди. Больной, направляемый на прохождение терапии согласно изобретению, может быть продиагностирован как пациент, заболевший раком. Другими словами, фармацевтические композиции, описанные выше, могут быть использованы для ингибирования развития рака на разных стадиях этого заболевания (как для профилактики появления рака, так и для лечения пациента, заболевшего раком).
Фармацевтические композиции согласно изобретению вводят в соответствии со способом, соответствующим каждому специфическому случаю рака, подлежащему лечению.
Путь, продолжительность и частота введения определяются с учетом состояния пациента, типа и серьезности заболевания, а также способа введения. Пути и частота введения могут варьировать от одного больного к другому. Обычно фармацевтические композиции и вакцины могут вводиться путем инъекции (например, внутрикожным, внутривенным, внутримышечным или подкожным путем), назальным путем (например, ингаляцией) или через рот. Предпочтительно от 1 до 10 доз могут вводиться в течение 52 недель. Альтернативные методы приема могут устанавливаться индивидуально для каждого пациента.
Обычно соответствующие дозы и схема лечения включают количество активного продукта, достаточное для того, чтобы добиться терапевтического и/или профилактического успеха. Такой ответ может быть получен в результате установления улучшенного клинического состояния (например, более частая ремиссия, продление срока жизни в отсутствие полного, частичного или более продолжительного заболевания) у лечившегося пациента по сравнению с пациентами, не лечившимися или лечившимися меньшими дозами.
Согласно другим аспектам настоящего изобретения полипептид может вводиться в дозах от 100 мкг до 5 мг. Молекулы ДНК, кодирующие эти полипептиды, можно, как правило, вводить в количестве, достаточном для выработки полипептидов на сравнимом уровне. Необходимые дозы обычно определяют на экспериментальных моделях и/или при клинических испытаниях. Обычно предпочитают использовать минимальную дозу, достаточную для достижения терапевтического эффекта. Как правило, для оценки эффективности лечения за больными наблюдают с использованием тестов, соответствующих условиям лечения или профилактики, которые представляются хорошо известными специалисту.
Если нет иных определений, то все технические и научные термины, использованные в настоящем описании, имеют такое же значение, которое широко признается обычным специалистом данной области, к которой относится изобретение. Кроме того, все указанные здесь публикации, заявки на патент, все патенты и все другие ссылки включены в настоящую заявку путем ссылки.
Следующие примеры представлены для иллюстрации описанных выше процедур и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: клонирование кДНК, кодирующей гетерокарпин
1.1) Экстракция РНК из клеток Pilocarpus Heterophyllus
Культивируемые клетки хранят при -80°С перед стадиями экстракции всех РНК. Экстракцию всех РНК осуществляют на основании метода, описанного в научной литературе (Chomczynski et Sacchi, Anal. Biochem. (1987), 162, 156) при помощи реактива Тризол (Gibco/BRL). Количество экстрагированных РНК анализируют на 1%-м агарозном геле в присутствии бромида этидия.
1.2) Синтез кДНК путем обратной транскрипции
Осуществляют ретротранскрипцию всех ДНК согласно двум разным рабочим методикам для того, чтобы разъединить обратные транскрипции и благоприятствовать обратным транскрипциям частей 5' и 3' всех РНК с помощью набора SMART™ RACE cDNA Amplification Kit (Clontech).
1.3) Конструкция и синтез затравок для полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Амплификацию 2 специфических последовательностей кДНК гетерокарпина осуществляют путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) продуктов обратной транскрипции, используя затравку Rev1 для продуктов, специфичных в отношении 5'кДНК, и затравку Fwd1 для продуктов, специфичных в отношении 3'кДНК, имеющих последовательности соответственно SEQ.ID.NO.4 и SEQ.ID.NO.5.
Последовательности SEQ.ID.NO.4 и SEQ.ID.NO.5 являются следующими:
- SEQ.ID.NO.4:
5'-TCC AAG GAG CAA AAA CTA GTG ACC CAG GGG CCA TTA TAT CT-3'
- SEQ.ID.NO.5:
5'-CGG TAT GGA CGC GGC TAT TGC TAT TGC TGA TGG TGT TGA TGT AA-3'
1.4) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее результаты
2
Условия реакции включают 0,2 мкМ Fwd1 для продуктов, специфичных в отношении 3'кДНК и 0,2 мкМ Rev1 для продуктов, специфичных в отношении 5'кДНК, 200 мкМ dNTP, 40 мМ Tricine-КОН (рН 8,7), 15 мМ КОАс, 3,5 мМ Mg(OAc), 3,75 мкг/мл BSA, 0,005% Tween-20, 0,005% Nonidet-P40 и 0,5 Ед Taq ДНК-полимеразы в конечном объеме 50 мкл. Реакции ПЦР осуществляют на термоциклическом устройстве Perkin-Elmer 9700 при следующих параметрах термических циклов: 5 циклов, включающих денатурацию при 94°С в течение 5 секунд, гибридизацию затравок при 72°С, 5 циклов, включающих денатурацию при 94°С в течение 5 секунд, гибридизацию затравок при 70°С в течение 10 секунд и продолжение полимеризации при 72°С в течение 3 минут и наконец 25 циклов, включающих денатурацию при 94°С в течение 5 секунд, гибридизацию затравок при 68°С в течение 10 секунд и продолжение полимеризации при 72°С в течение 3 минут.
Продукты, полученные в результате ПЦР, разделяют на 1%-м агарозном геле и оценивают визуально благодаря окрашиванию бромидом этидия.
Последовательности нуклеиновых кислот в продуктах ПЦР, специфичных в отношении 5'кДНК и 3'кДНК, определяют при помощи автоматического секвенсора. Речь идет соответственно о последовательностях SEQ.ID.NO.6 и SEQ.ID.NO.7, представленных ниже:
Перекрывающиеся последовательности SEQ.ID.NO.6 и SEQ.ID.NO.7 позволяют вычленить полную последовательность кДНК с последовательностью SEQ.ID.NO.8, кодирующей гетерокарпин. Последовательность SEQ.ID.NO.8 представлена ниже:
В последовательности SEQ.ID.NO.8 наблюдается открытая рамка считывания в присутствии кодона инициации (ATG), кодирующего инициирующий метионин в положении 115, и стоп-кодона (UAA) в положении 2437. Полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую гетерокарпин, соответствует последовательности SEQ.ID.NO.9, представленной ниже:
Этому транслированному полинуклеотиду соответствует белковая последовательность SEQ.ID.NO.10, состоящая из 774 аминокислот и представленная ниже:
Пример 2. Получение полной кДНК, кодирующей гетерокарпин, для продуцирования рекомбинантного гетерокарпина
2.1) Получение РНК из культуры клеток Pilocarpus Heterophyllus
Культивируемые клетки хранят при -80°С перед стадией экстракции всех РНК. Экстракцию всех РНК осуществляют на основании метода, описанного в научной литературе (Chomczynski et Sacchi, Anal. Biochem. (1987), 162, 156) при помощи реактива Тризол (Gibco/BRL). Количество экстрагированных РНК анализируют на 1%-м агарозном геле в присутствии бромида этидия.
2.2) Обратная транскрипция РНК

Все РНК подвергают обратной транскрипции с помощью затравок Oligo (dT) с использованием обратной транскриптазы Superscript как описано в инструкции изготовителя (Gibco/BRL).
2.3) Полимеразная цепная реакция (ПЦР) продуктов, полученных после обратной транскрипции
Амплификацию кДНК гетерокарпина осуществляют путем полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с продуктами обратной транскрипции с использованием затравок Fwd2 и Rev2 последовательностей соответственно SEQ.ID.NO.11 и SEQ.ID.NO.12.
Последовательности SEQ.ID.NO.11 и SEQ.ID.NO.12 являются следующими:
SEQ.ID.NO.11:
5'-GGG GGA TCC GAG GTC TAG GAA TGG TGT TCT TCA-3'
SEQ.ID.NO.12:
5'-GGG CTC GAG TTG TGT ACC CAT AAA CAC AAA GTT ACT CAT GG-3'
Затравка Fwd2 соответствует нуклеотидам 118-140 последовательности SEQ.ID.NO.8 и включает сайт BamH1 (подчеркнут) и три дополнительных нуклеотида в области 5' для облегчения клонирования. Затравка Rev2 соответствует последовательности, комплементарной участку, содержащему нуклеотиды 2405-2436 последовательности SEQ.ID.NO.8 и включает сайт Xho1 (подчеркнут) и три дополнительных нуклеотида в области 5' для облегчения клонирования.
2
Условия реакции включают 50 нг кДНК, полученных в результате реакции обратной транскрипции, описанной выше, 0,2 мкМ Fwd2 (SEQ.ID.NO.11) и Rev2 (SEQ.ID.NO.12), 200 мкМ dNTP, 40 мМ Tricine-KOH (рН 8,7), 15 мМ КОАс, 3,5 мМ Mg(OAc), 3,75 мкг/мл BSA, 0,005% Tween-20, 0,005% Nonidet-P40 и 0,5 Ед Taq ДНК-полимеразы в конечном объеме 50 мкл. Реакции ПЦР осуществляют на термоциклическом устройстве Perkin-Elmer 9700 при следующих параметрах термических циклов: 5 циклов, включающих денатурацию при 94°С в течение 5 секунд, гибридизацию затравок при 72°С, 5 циклов, включающих денатурацию при 94°С в течение 5 секунд, гибридизацию затравок при 70°С в течение 10 секунд и продолжение полимеризации при 72°С в течение 3 минут, и наконец 25 циклов, включающих денатурацию при 94°С в течение 5 секунд, гибридизацию затравок при 68°С в течение 10 секунд и продолжение полимеризации при 72°С в течение 3 минут.
Продукты, полученные в результате ПЦР разделяют на 1%-м агарозном геле и оценивают визуально благодаря окрашиванию бромидом этидия. Получают полосу около 2,3 кб.
Последовательность нуклеиновых кислот продукта ПЦР определяют при помощи автоматического секвенсора, она соответствует последовательности SEQ.ID.NO.9 после проведения искусственной делеции инициирующего кодона ATG для осуществления экспрессии рекомбинантного гетерокарпина с помощью вектора pQE-TriSystem (Qiagen) в фазе с сайтом BamH1, а также делеции стоп-кодона для сохранения трансляции в фазе протеина и, таким образом, осуществить синтез последовательности 8×His на С-концевом участке гетерокарпина. Эта последовательность соответствует последовательности SEQ.ID.NO.13, представленной ниже:
Эта последовательность кодирует белок с последовательностью SEQ.ID.NO.14, представленной ниже:
Пример 3. Продуцирование рекомбинантного гетерокарпина бактериями
Часть кДНК, кодирующую гетерокарпин, встраивают в сайты BamH1/Xho1 вектора экспрессии pQE-TriSystem (Qiagen) и экспрессируют с использованием бактерий E. coli M15, в качестве бактерий-хозяев. Инокулируют 20 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина, и бактерии встряхивают при 37°С в течение 12 часов. На основе этой культуры инокулируют 1 литр среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл канамицина, и бактерии встряхивают при 37°С до достижения оптической плотности при 600 нм, равной 0,6.
Экспрессию рекомбинантного гетерокарпина осуществляют путем добавления IPTG до конечной концентрации 1 мМ в течение времени от 4 до 5 часов. Бактерии затем отделяют центрифугированием при скорости 4000×g в течение 20 минут, затем замораживают в жидком азоте. Осадок затем размораживают на льду в течение 15 минут и суспензируют на льду в лизирующем буфере с рН 8,0, состоящем из 50 мМ
2
4
2
4
2
4
NaHPO, 300 мМ NaCl и 10 мМ имидазола, в присутствии 1 мг/мл лизозима в течение 30 минут. После завершения лизиса осуществляют стадию ультразвуковой обработки и отходы удаляют центрифугированием. Осветленный лизат (4 мл) смешивают с 1 мл суспензии никелевой матрицы и втряхивают при 4°С в течение 60 минут. Реакционную среду переносят в колонку, промывают в присутствии 50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl и 20 мМ имидазола. В заключение гетерокарпин элюируют при помощи 4×0,5 мл буфера, состоящего из 50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазола.
Пример 4. Продуцирование рекомбинантного гетерокарпина клетками насекомых, инфицированных бакуловирусом
2
4
2
4
2
4
Часть кДНК, кодирующую гетерокарпин, встраивают в сайты BamH1/Xho1 вектора экспрессии pQE-TriSystem (Qiagen). Вектор pQE-TriSystem содержит последовательности вируса Autographa california nuclear polyhedrosis virus (AcNPV), создающие гомологическую рекомбинацию. Рекомбинантный бакуловирус, содержащий последовательность гетерокарпина, получают путем сотрансфекции вектора pQE-TriSystem с геномной линеаризованной ДНК бакуловируса в клетках насекомого sf9 или sf21, взятых из ткани яичника личинки Spodoptera frugiperda. Трансфицированные клетки промывают фосфатным буфером и отделяют центрифугированием при скорости 1000×g в течение 5 минут. Осадок затем суспензируют в лизирующем буфере с рН 8,0, состоящем из 50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl и 10 мМ имидазола. После завершения лизиса осуществляют стадию ультразвуковой обработки и отходы удаляют центрифугированием. Осветленный лизат (4 мл) смешивают с 200 мкл суспензии никелевой матрицы и встряхивают при 4°С в течение 60 минут. Реакционную среду переносят в колонку, промывают в присутствии 50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl и 20 мМ имидазола. В заключение гетерокарпин элюируют при помощи 4×0,5 мл буфера, состоящего из 50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазола.
Пример 5. Продуцирование рекомбинантного гетерокарпина клетками млекопитающего

Часть кДНК, кодирующую гетерокарпин, встраивают в сайты BamH1/Xho1 вектора экспрессии pQE-TriSystem (Qiagen). Вектор pQE-TriSystem содержит активирующие последовательности цитомегаловируса (CMV), слитые с промотором бета-актин цыпленка, позволяющие осуществить очень важный этап гетерологичной экспрессии. Клетки почки человеческого эмбриона (НЕК-293) культивируют в среде DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко), содержащей 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина, дополненной 10%-ной околоплодной телячьей сывороткой. Клетки субкультивируют 24 часа перед проведением трансфекции, чтобы осуществить нормальный метаболизм и высокую эффективность трансфекции. Трансфекцию 1 мкг вектора pQE-TriSystem, содержащего кДНК, кодирующую гетерокарпин, осуществляют с использованием реактива Effectene в соответствии с рекоментациями изготовителя (Qiagen).
2
4
2
4
2
4

Трансфицированные клетки промывают фосфатным буфером и отделяют центрифугированием при скорости 1000×g в течение 5 минут. Осадок суспензируют в лизирующем буфере с рН 8,0, состоящем из 50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl и 10 мМ имидазола в присутствии 0,05% Tween20. После завершения лизиса осуществляют стадию ультразвуковой обработки и отходы удаляют центрифугированием. Осветленный лизат (4 мл) смешивают с 200 мкл суспензии никелевой матрицы и встряхивают при 4°С в течение 60 минут. Реакционную среду переносят в колонку, промывают в присутствии 50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl и 20 мМ имидазола. В заключение гетерокарпин элюируют при помощи 4×0,5 мл буфера, состоящего из 50 мМ NaHPO, 300 мМ NaCl и 250 мМ имидазола.
Пример 6. Измерение связи с рецептором человека к GHRH
Стабильные трансфекции рецептора человека GHRH (hGHRH-R)
Клетки почки человеческого эмбриона, НЕК-293 (линия клеток, разработанная Dr. Stuart Sealfon, Mount Sinai Medical School, New York), стабильно экспрессирующие рецептор GHRH человека, были получены Dr. Kelly Mayo (Northwestern University, Chicago, IL).
Культура клеток и мембранный препарат
2
Клетки НЕК-293, стабильно трансфицированные рецептором GHRH человека, описанные выше, культивируют в среде DMEM (среда Игла, модифицированная Дульбекко, с высоким содержанием глюкозы; поставляется фирмой Life technologies), дополненной 0,4 мМ G418 (Life technologies), в присутствии 10%-ной околоплодной телячьей сыворотки и 4 мМ L-глутамина (Life technologies). Клетки гомогенизируют в буфере А, содержащем 50 мМ HEPES (рН 7,4), 5 мМ хлорида магния (MgCl), 2 мМ этиленгликоль-бис-(2-аминоэтил)-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (EGTA) и 50 мкг/мл бацитрацина, затем подвергают ультразвуковой обработке в том же буфере А. Гомогенизированные таким образом клетки центрифугируют при 4°С со скоростью 39000×g в течение 10 минут, суспендируют в буфере А и снова центрифугируют при 4°С со скоростью 40000×g в течение 10 минут. Общее содержание мембранных белков определяется по методу Бредфорда. Мембранные осадки хранят при -80°С для дальнейшего использования.
Тест на конкурентное связывание с рецептором hGHRH-R
2
125
Мембраны клеток НЕК-293, стабильно трансфицированные рецептором GHRH человека, разбавляют до концентрации 100 мкг/мл в реакционном буфере, содержащем 50 мМ HEPES (рН 7,4), 5 мМ MgCl, 2 мМ EGTA, 50 мкг/мл бацитрацина и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Мембраны инкубируют с помощью 0,05 нМ [I]GHRH(1-44 амида) (Amersham) в конечном объеме 200 мкл с увеличивающимися концентрациями гетерокарпина в течение 2 часов при 23°С. Реакцию останавливают быстрой фильтрацией на 96-луночных фильтрах GF/C, предварительно заполненных 0,1% полиэтиленамином. Фильтры затем промывают три раза при 4°С промывочным буфером, содержащим 50 мМ Tris (pH 7,4) с использованием фильтрующей установки Packard с 96 лунками. Высушенные фильтры погружают в 20 мкл сцинциллирующей смеси (Microscint O, Packard) и осуществляют подсчет с помощью счетчика Topcount (Packard). Неспецифическую активность определяют в присутствии 100 нМ hGHRH. Вычерчивают кривую доза-ответ для hGHRH (0,001 нМ - 100 нМ) и определяют по ней ингибирующую концентрацию
50
CIбелка/полипептида, при которой 50% GHRH человека не связалось с рецептором к GHRH человека.