ПЕПТИДЫ И ПЕПТИДОМИМЕТИКИ ДЛЯ КОМБИНИРОВАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ В СУБПОПУЛЯЦИЯХ ПАЦИЕНТОВ С РАКОВЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
PEPTIDES AND PEPTIDOMIMETICS FOR COMBINED USE AND TREATMENT IN A SUBPOPULATION OF PATIENTS WITH CANCER DISEASES

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
В настоящей заявке заявляется приоритет на основании предварительной заявке на патент США № 61/838777, поданной 24 июня 2013 г. и полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к соединениям, включая пептиды и пептидомиметики, которые оказывают антипролиферативное действие на клетки, сами по себе и в комбинации с видами лечения, прямо или косвенно повреждающими нуклеиновые кислоты (например, ДНК). Соединения согласно настоящему изобретению, соответственно, подходят для ингибирования пролиферации клеток и, таким образом, для лечения нарушений клеточной пролиферации, в том числе раковых заболеваний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Клеточный цикл включает S-фазу (репликация ДНК), M-фазу (митоз) и две промежуточные фазы (фазы G1 и G2) между фазами S и M. Контрольные точки клеточного цикла (cell cycle checkpoints) обеспечивают точность его прохождения, например, отслеживание состояния целостности ДНК, репликации ДНК, размера клетки и окружающей среды (Maller, J.L. Curr. Opin. Cell Biol., 3:26 (1991)). Поддержание целостности генома особенно важно для многоклеточных организмов; и имеется несколько контрольных точек для мониторинга состояния генома. Среди них – контрольные точки в фазах G1 и G2, присутствующие перед репликацией ДНК и митозом, соответственно. Исправление повреждений ДНК до входа в S-фазу критически важно, поскольку репликация поврежденной ДНК зачастую приводит к возникновению мутаций (Hartwell, L. Cell, 71:543 (1992)). Прохождение через контрольные точки G1 и G2 без репарации значительно поврежденной ДНК индуцирует апоптоз и/или катастрофу.
INK4
ARF
У большинства раковых клеток присутствуют аномалии в белках, связанных с контрольной точкой G1, таких как p53, Rb, MDM-2, p16и p19 (Levine, A.J. Cell, 88:323 (1997)). В качестве альтернативы, мутации могут вызывать сверхэкспрессию и/или избыточную активацию онкогенных продуктов, например, Ras, MDM-2 и циклина D, уменьшающих “строгость” контрольной точки G1. Помимо указанных мутаций, избыточный опосредованный факторами роста сигналинг может быть обусловлен сверхэкспрессией факторов роста и может уменьшать «строгость» контрольной точки G1. Наряду с мутациями, приводящими к утрате/приобретению функции, постоянная активация рецепторов факторов роста или молекул, передающих сигнал внутрь клетки, может вызывать трансформацию клеток за счет подавления контрольной точки в G1. Устранение контрольной точки в G1 способствует более высоким уровеням мутаций и вносит вклад во многие мутации, наблюдаемые в раковых клетках. В результате, выживание большинства раковых клеток при значительно выраженном повреждении ДНК зависит от контрольной точки в G2 (O’Connor and Fan, Prog. Cell Cycle Res., 2:165 (1996)).
Механизм, который способствует остановке клеточного цикла в G2 после повреждения ДНК, предположительно является консервативным у различных видов, от дрожжей до человека. В присутствии поврежденной ДНК киназа Cdc2/циклин B остается неактивной за счет ингибирующего фосфорилирования остатков треонина-14 и тирозина-15 киназы Cdc2, или за счет того, что уровень белка циклина B снижен. При вступлении в митоз фосфатаза с двойной специфичностью Cdc25 удаляет указанные ингибирующие фосфаты, таким образом активируя киназу Cdc2/циклин B. Активация Cdc2/циклина B эквивалентна вступлению в M-фазу.
У делящихся дрожжей протеинкиназа Chk1 необходима для остановки клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК. Киназа Chk1 действует на стадиях, следующих за несколькими продуктами гена rad, и модифицируется фосфорилированием при повреждении ДНК. Известно, что киназы Rad53 почкующихся дрожжей и Cds1 делящихся дрожжей передают сигналы от нереплицированной ДНК. Предположительно, существует некоторая избыточность между Chk1 и Cds1, поскольку элиминация обеих киназ Chk1 и Cds1 заканчивалась устранением остановки в G2, индуцированной повреждением ДНК. Интересно, что и Chk1, и Cds1 фосфорилируют Cdc25 и способствуют связыванию Rad24 с Cdc25, которое обуславливает секвестрирование Cdc25 в цитозоль и предотвращает активацию Cdc2/циклина B. Соответственно, Cdc25 предположительно является общей мишенью указанных киназ, что подразумевает, что указанная молекула представляет собой незаменимый фактор контрольной точки в G2.
У человека и hChk1, гомолог Chk1 делящихся дрожжей у человека, и Chk2/HuCds1, гомолог Rad53 почкующихся дрожжей и Cds1 делящихся дрожжей у человека, фосфорилируют Cdc25C по серину 216, критически важному регуляторному сайту, в ответ на повреждение ДНК. Указанное фосфорилирование создает сайт связывания для малых кислых белков 14-3-3, гомологов Rad24 и Rad25 делящихся дрожжей у человека. Регуляторная роль указанного фосфорилирования была убедительно подтверждена тем фактом, что замена серина-216 на аланин в Cdc25C блокировала остановку клеточного цикла в G2 в клетках человека. Тем не менее, механизм контрольной точки в G2 понятен не полностью.
Микроокружение опухоли также играет роль в предотвращении или стимуляции роста, инвазии, метастазирования раковых клеток и противоопухолевого иммунитета, который влияет на прогноз для пациента. Было показано, что макрофаги, которые, как ранее предполагалось, противодействуют раковым клеткам, играют как ингибирующую, так и стимулирующую роли в развитии опухоли. Макрофаги, имеющие классический противоопухолевый фенотип и называемые M1, являются провоспалительными; макрофаги проопухолевых и противовоспалительных типов называются M2, и эта категория включает по меньшей мере три главных подтипа (Martinez and Gordon, F1000Prime Reports 6:13 (2014)).
Нейтрофильные внеклеточные ловушки (NET) представляют собой другой элемент микроокружения опухоли, наряду с лейкоцитами. Хотя образование NET полезно для борьбы нейтрофилов с инвазией микроорганизмов, они могут вносить вклад в тромбоз глубоких вен (ТГВ) (Martinnod and Wanger, Blood (2013)) и метастазирование опухолевых клеток (Cools-Lartigue, J., et al. J. Clin. Invest. (2013)) у пациентов с раковыми заболеваниями. Соответственно, NET могут нежелательным образом влиять на выживаемость пациентов. ТГВ представляет собой распространенное и потенциально летальное явление среди пациентов с раковыми заболеваниями, и лейкоцитоз (который обуславливает высокие уровни БКК) представляет собой основной фактор риска (Pabinger, I., et al. Blood 122:12 (2013); Blix, K., et al. PLOS One 4:8 (2013); Wang, T.F., et al. Thromb. Res. 133(1):25 (2014)).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с настоящим изобретением предложены способы и варианты применения пептидных соединений, которым свойственны один или несколько типов активности, ингибирующей пролиферацию клеток, стимулирующей апоптоз или катастрофу, нарушающих контрольную точку в фазе G2 клеточного цикла в клетке; или устраняющей нежелательную пролиферацию или выживаемость клеток, например, клеток, характеризующихся нарушением пролиферации. Например, в настоящем изобретении предложены способы и варианты применения для ингибирования пролиферации клеток; блокады контрольной точки в G2 клеточного цикла в клетке; повышения чувствительности клетки к повреждающему нуклеиновые кислоты агенту или лечению; увеличения повреждения нуклеиновых кислот в клетке.
4
2
4
2
Согласно одному варианту реализации способ или вариант применения для увеличения повреждения нуклеиновых кислот гиперпролиферирующей клетки, или для профилактики или лечения нарушения пролиферации клеток у млекопитающего (например, человека), число лейкоцитов в крови которого находится в пределах нормального диапазона, включает введение пептидного соединения, при этом указанное пептидное соединение содержит любую из следующих последовательностей: A) пептид, содержащий остатки, обозначенные как P1–P6, имеющий структуру P1, P2, P3, P4, P5, P6 или P6, P5, P4, P3, P2, P1; где P1 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи, или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой, хиназолиновой группой на боковой цепи; где P2 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, PheNO, аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи, или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой или хиназолиновой группой на боковой цепи; где P3, P4, P5 представляет собой любую аминокислоту, или где один или несколько из P3, P4, P5 представлены простой углеродной цепью, такой, что расстояние между P2 и P6 приблизительно равно расстоянию в том случае, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой; где P6 представляет собой Bpa, PheNO, одну любую аминокислоту и Tyr, одну любую аминокислоту и Phe, любую аминокислоту или отсутствует; B) или пептид согласно A), где аминокислота, содержащая простую углеродную цепь, представляет собой 11-аминоундекановую кислоту, 10-аминодекановую кислоту, 9-аминононановую кислоту, 8-аминокаприловую кислоту, 7-аминогептановую кислоту, 6-аминокапроновую кислоту или аналогичную структуру, содержащую одну или большее количество ненасыщенных углеродных связей, и/или где одна любая аминокислота представляет собой Ser и/или где P4 представляет собой Trp, и/или где аминокислота, которая имеет аналогичный объем боковой цепи, представляет собой Tyr или Phe; или пептид, содержащий остатки, обозначенные как P1–P12, имеющий любую из следующих структур:
4
2
4
2
P1, P2, P3, P4, P5, P6; P6, P5, P4, P3, P2, P1; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; где P1 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, PheNO, аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой или хиназолиновой группой на боковой цепи; где P2 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), или аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи, или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой, хиназолиновой группой на боковой цепи; где P3, P4, P5 представляет собой любую аминокислоту, или где один или несколько из P3, P4, P5 представлены простой углеродной цепью, такой, что расстояние между P2 и P6 приблизительно равно расстоянию в том случае, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой; где P6 представляет собой Bpa, PheNO, одну любую аминокислоту и Tyr, одну любую аминокислоту и Phe; и где по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 представляют собой основные аминокислоты, а остальные представлены любой аминокислотой или отсутствуют; или пептид согласно C), где аминокислота, содержащая простую углеродную цепь, представляет собой 11-аминоундекановую кислоту, 10-аминодекановую кислоту, 9-аминононановую кислоту, 8-аминокаприловую кислоту, 7-аминогептановую кислоту, 6-аминокапроновую кислоту или аналогичную структуру, содержащую одну или большее количество ненасыщенных углеродных связей, и/или, где одна любая аминокислота представляет собой Ser и/или где P4 представляет собой Trp, и/или, где аминокислота, которая имеет аналогичный объем боковой цепи, представляет собой Tyr или Phe; или пептид, содержащий остатки, обозначенные как P1–P12, имеющий любую из следующих структур:
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; где P1 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, PheNO, аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи, или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой или хиназолиновой группой на боковой цепи; где P2 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи, или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой, хиназолиновой группой на боковой цепи; где P3, P4, P5 представляет собой любую аминокислоту, или где один или несколько из P3, P4, P5 представлены простой углеродной цепью, такой, что расстояние между P2 и P6 приблизительно равно расстоянию в том случае, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой; где P6 представляет собой Bpa, PheNO, одну любую аминокислоту и Tyr, одну любую аминокислоту и Phe, любую аминокислоту или отсутствует; и где по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 представляют собой основные аминокислоты, а остальные представлены любой аминокислотой или отсутствуют; или пептид согласно E), где аминокислота, содержащая простую углеродную цепь, представляет собой аминоундекановую кислоту или 8-аминокаприловую кислоту, и/или где одна любая аминокислота представляет собой Ser, и/или где аминокислота, которая имеет аналогичный объем боковой цепи, представляет собой Tyr или Phe; или пептид, содержащий остатки, обозначенные как P1–P12, имеющий любую из следующих структур: P1, P2, P3, P4, P5, P6 или P6, P5, P4, P3, P2, P1, где P1 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, PheNO, Tyr или Phe; где P2 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, PheNO, Tyr или Phe; где P3 представляет собой Ser, Arg, Cys, Pro или Asn; где P4 представляет собой Trp; где P5 представляет собой Ser, Arg или Asn; или где P3, P4, P5 представляет собой одиночную аминоундекановую кислоту или одиночную 8-аминокаприловую кислоту; и где P6 представляет собой Bpa, PheNO, (Ser-Tyr) или (Ser-Phe); или
пептид, содержащий остатки, обозначенные как P1–P12, имеющий любую из следующих структур:
4
2
4
2
4
2
P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; где P1 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, PheNO, Tyr или Phe; где P2 представляет собой Cha, Nal(2), (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3), Bpa, PheNO, Tyr или Phe; где P3 представляет собой Ser, Arg, Cys, Pro или Asn; где P4 представляет собой Trp; где P5 представляет собой Ser, Arg или Asn; или где P3, P4, P5 представляет собой одиночную аминоундекановую кислоту или одиночную 8-аминокаприловую кислоту; где P6 представляет собой Bpa, PheNO, (d-Ser-d-Tyr) или (d-Ser-d-Phe); и где по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 представлены Arg или Lys, а остальные представлены любой аминокислотой или отсутствуют; или
пептид, содержащий остатки, обозначенные как P1–P12, имеющий любую из следующих структур:
4
2
P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; где P1 представляет собой Cha или Nal(2); где P2 представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F), (Phe-4CF3); где P3 представляет собой Ser; где P4 представляет собой Trp; где P5 представляет собой Ser или Asn; где P6 представляет собой Bpa, PheNO, (Ser-Tyr) или (Ser-Phe); и где по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 представлены Arg, а остальные представлены любой аминокислотой или отсутствуют; или пептид, содержащий остатки, обозначенные как P1–P12, имеющий любую из следующих структур: P1, P2, P3, P4, P5, P6 или P6, P5, P4, P3, P2, P1; где P1 представляет собой Cha или Nal(2); где P2 представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3); где P3 представляет собой Ser; где P4 представляет собой Trp; где P5 представляет собой Ser; и где P6 представляет собой Bpa, или (Ser-Tyr); или
пептид, содержащий остатки, обозначенные как P1–P12, имеющий любую из следующих структур:
P1, P2, P3, P4, P5, P6; P6, P5, P4, P3, P2, P1; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; где P1 представляет собой Cha или Nal(2); где P2 представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3); где P3 представляет собой любую аминокислоту; где P4 представляет собой d- или l-Trp; где P5 представляет собой любую аминокислоту; где P6 представляет собой Bpa или (Ser-Tyr); где P7 представляет собой Arg; где P8 представляет собой Arg; где P9 представляет собой Arg; где P10 представляет собой Gln или Arg; где P11 представляет собой Arg; и где P12 представляет собой d- или l-Arg, или
пептид согласно K), где указанная любая аминокислота представляет собой Ser, или Pro; или
пептид, содержащий остатки, обозначенные как P1–P12, имеющий любую из следующих структур:
P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12; P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1; P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1; или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12; где P1 представляет собой Cha или Nal(2); где P2 представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F); где P3 представляет собой Ser; где P4 представляет собой Trp; где P5 представляет собой Ser; где P6 представляет собой Bpa или (Ser-Tyr); где P7 представляет собой Arg; где P8 представляет собой Arg; где P9 представляет собой Arg; где P10 представляет собой Gln или Arg; где P11 представляет собой Arg; и где P12 представляет собой Arg; или
его пролекарства или его фармацевтически приемлемой соли млекопитающему, с усилением таким образом повреждения нуклеиновых кислот гиперпролиферирующей клетки или профилактики или лечения нарушения пролиферации клеток.
Согласно конкретным вариантам реализации способ или применение задействует пептидное соединение, включающее любые из следующих последовательностей: (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln)(d-Arg) (d-Arg);
(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha);
(d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg);
(d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha);
(d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln)(d-Arg) (d-Arg);
(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa);
(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg);
(d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Bpa);
(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser) (d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa);
(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser) (d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg);
(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha);
(d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg);
(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha);
(d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg)(d-Arg);
(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg)(d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha);
(d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg)(d-Trp) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg); (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa) (d-Arg)(d-Trp)(d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Trp)(d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg);
(d-Arg) (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha); или (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg).
Согласно дополнительным конкретным вариантам реализации способ или применение задействует пептидное соединение, включающее или состоящее из любых из следующих последовательностей: (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(SEQ ID NO:1); (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) или (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha).
Согласно дополнительным конкретным вариантам реализации способ или применение осуществляют у млекопитающего, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 11 000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающего, содержание лейкоцитов у которого составляет от приблизительно 4000 до приблизительно 11 000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающего, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 10000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающего, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 9000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающего, содержание лейкоцитов у которого составляет от приблизительно 4000 до приблизительно 9000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающего, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 8000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающего, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 7000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; или млекопитающего, содержание лейкоцитов у которого меньше верхнего значения нормального диапазона любых клинических лабораторных показателей содержания лейкоцитов на мкл (БКК/мкл) крови.
Способы и варианты применения включают пептидное соединение в фармацевтическом составе. Способы и варианты применения согласно настоящему изобретению также включают введение любым путем. Согласно конкретным вариантам реализации пептидное соединение вводят местно, регионарно или системно.
Способы и варианты применения включают фармацевтически приемлемую соль пептидного соединения. Согласно конкретным аспектам фармацевтически приемлемая соль представляет собой любую соль или комбинацию солей из перечисленных: ацетат, сульфонат, сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, фосфат, моногидрофосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, пропионат, деканоат, каприлат, акрилат, формат, изобутират, капроат, гептаноат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацат, фумарат, малеат, бутин-1,4-диоат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоаты, динитробензоаты, гидроксибензоаты, метоксибензоаты, фталаты, ксиленсульфонат, фенилацетат, фенилпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, γ-гидроксибутират, гликолат, тартрат, метан-сульфонат, пропансульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат и манделат.
Способы и варианты применения включают пептидное соединение, включающее или имеющее длину от 6 до 10, от 10 до 15, от 15 до 20, от 20 до 25, от 25 до 30, от 30 до 40, от 40 до 50, от 50 до 75, от 75 до 100, от 100 до 150, от 150 до 200, или от 200 до 300 остатков аминокислот.
Способы и варианты применения включают пептидное соединение, включающее или состоящее из проникающей в клетки молекулы, присоединенной или конъюгированной. Согласно конкретным неограничивающим аспектам проникающая в клетки молекула присоединена к пептидному соединению ковалентной связью, либо пептидным или непептидным линкером. Согласно дополнительным конкретным неограничивающим аспектам проникающий в клетки пептид содержит чередующиеся полярные/заряженные аминокислоты и неполярные е аминокислоты. Согласно другим дополнительным конкретным неограничивающим аспектам проникающий в клетки пептид содержит поликатионную или амфипатическую альфа-спиральную структуру. Согласно дальнейшим дополнительным конкретным неограничивающим аспектам проникающий в клетки пептид содержит последовательность полиаргинина (Arg) (например, пептид, включающий или состоящий из (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)).
Согласно дополнительным конкретным аспектам пептидное соединение и/или проникающий в клетки пептид включает или состоит из L- или D-изомеров аминокислот или смеси L- и D-изомеров аминокислот.
Согласно дополнительным конкретным вариантам реализации способ или применение также включает введение повреждающего нуклеиновые кислоты агента, повреждающее нуклеиновые кислоты лечение, введение антипролиферативного агента или антипролиферативное лечение. Неограничивающие повреждающие нуклеиновые кислоты агенты, повреждающее нуклеиновые кислоты лечение, антипролиферативные агенты или антипролиферативное лечение включает(ют) или состоит(ят) из хирургического удаления, радиационной терапии, терапии ионизирующим или химическим излучением, химиотерапии, иммунотерапии, местной или регионарной термотерапии (гипертермической терапии), вакцинации, алкилирующего агента, антиметаболита, растительного экстракта, растительного алкалоида, нитрозомочевины, гормона или нуклеозида либо аналога нуклеозида.
Согласно дополнительным конкретным вариантам реализации способ или применение также включает введение или состоит из введения пептидного соединения до, во время или после введения повреждающего нуклеиновые кислоты агента, повреждающего нуклеиновые кислоты лечения, введения антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения. Согласно конкретным аспектам пептидное соединение вводят менее чем за 48 часов до или менее чем через 48 часов после введения повреждающего нуклеиновые кислоты агента, повреждающего нуклеиновые кислоты лечения, введения антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение вводят менее чем за 24 часа до или менее чем через 24 часа после введения повреждающего нуклеиновые кислоты агента, повреждающего нуклеиновые кислоты лечения, введения антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение вводят менее чем за 12 часов до или менее чем через 12 часов после введения повреждающего нуклеиновые кислоты агента, повреждающего нуклеиновые кислоты лечения, введения антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение вводят менее чем за 6 часов до или менее чем через 6 часов после введения повреждающего нуклеиновые кислоты агента, повреждающего нуклеиновые кислоты лечения, введения антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение вводят менее чем за 4 часа до или менее чем через 4 часа после введения повреждающего нуклеиновые кислоты агента, повреждающего нуклеиновые кислоты лечения, введения антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение вводят менее чем за 2 часа до или менее чем через 2 часа после введения повреждающего нуклеиновые кислоты агента, повреждающего нуклеиновые кислоты лечения, введения антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения; пептидное соединение вводят менее чем за 1 час до или менее чем через 1 час после введения повреждающего нуклеиновые кислоты агента, повреждающего нуклеиновые кислоты лечения, введения антипролиферативного агента или антипролиферативного лечения.
Неограничивающие примеры повреждающих нуклеиновые кислоты агентов или антипролиферативных агентов включают лекарственные средства. Неограничивающие примеры повреждающих нуклеиновые кислоты агентов или антипролиферативных агентов включают содержащие платину лекарственные средства, такие как цисплатин, карбоплатин, недаплатин, митаплатин, сатраплатин, пикоплатин, триплатин, мириплатин или оксалиплатин.
цис-
131
125
89
153
90
177
В частности, способы и варианты применения включают или состоят из введения содержащего платину лекарственного средства, цисплатина, карбоплатина, оксалиплатина, пеметрекседа, гемцитабина, 5-фторурацила (5-FU), ребеккамицина, адриамицина (ADR), блеомицина (Bleo), пеплеомицина, цисплатина, цисплатины или диаминдихлорплатины (II) (CDDP), оксалиплатина или камптотецина (CPT), циклофосфамида, азатиоприна, циклоспорина A, преднизолона, мелфалана, хлорамбуцила, мехлорэтамина, бусульфана, метотрексата, 6-меркаптопурина, тиогуанина, 5-фторурацила, цитозинарабинозида, АЗТ, 5-азацитидина (5-AZC) или родственного 5-азацитидину соединения, актиномицина D, митрамицина, митомицина C, кармустина, ломустина, семустина, стрептозотоцина, гидроксимочевины, цисплатина, митотана, прокарбазина, дакарбазина, таксана, винбластина, винкристина, доксорубицина, дибромоманнита, излучения или введения радиоизотопа. Конкретные неограничивающие примеры излучения включают УФ-излучение, ИК-излучение, рентгеновское излучение, или альфа-, бета-, или гамма-излучение. Конкретные неограничивающие примеры радиоизотопов включают I, I, Sr, Sm, Y или Lu.
Способы и варианты применения согласно настоящему изобретению подходят для применения при расстройстве пролиферации клеток или гиперпролиферативном расстройстве, или нежелательной пролиферации клеток. Согласно конкретным вариантам реализации нарушение пролиферации клеток включает опухоль или раковое заболевание. Согласно частным вариантам реализации нарушение пролиферации клеток включает метастатическую опухоль или раковое заболевание.
Конкретные неограничивающие примеры опухоли или ракового заболевания включают опухоль или раковое заболевание легких, такое как мелкоклеточный или немелкоклеточный рак легкого, или аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома или крупноклеточная карцинома. Дополнительные конкретные неограничивающие примеры опухоли или ракового заболевания включают карциному, саркому, лимфому, лейкоз, аденому, аденокарциному, меланому, глиому, глиобластому, менингиому, нейробластому, ретинобластому, астроцитому, олигодентроцитому, мезотелиому, ретикулоэндотелиальную, лимфатическую или гемопоэтическую неоплазию, опухоль, раковое заболевание или злокачественное новообразование. Дополнительные конкретные неограничивающие примеры опухоли или ракового заболевания представлены неоплазией, опухолью или раковым заболеванием легких, щитовидной железы, головы или шеи, носоглотки, горла, носа или пазух носа, головного мозга, позвоночника, молочной железы, надпочечников, гипофиза, щитовидной железы, лимфатической системы, желудочно-кишечного тракта (рта, пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки, тощей кишки (тонкого кишечника), толстой кишки, прямой кишки), мочеполового тракта (матки, яичника, шейки матки, эндометрия, мочевого пузыря, яичка, полового члена, простаты), почек, поджелудочной железы, печени, кости, костного мозга, лимфатической системы, крови, мышц или кожи. Другие дополнительные конкретные неограничивающие примеры опухоли или ракового заболевания включают рак молочной железы, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак желудка, мезотелиому плевры, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак толстого кишечника, рак тонкого кишечника, рак пищевода, рак двенадцатиперстной кишки, рак языка, рак глотки, рак слюнной железы, опухоль головного мозга, шванному, рак печени, рак почки, рак желчных протоков, рак эндометрия, рак шейки матки, рак тела матки, рак яичников, рак мочевого пузыря, рак уретры, рак кожи, ангиому, злокачественную лимфому, злокачественную меланому, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак носа, рак придаточных пазух носа, рак органов слуха, карцинома дна ротовой полости, рак гортани, рак околоушной железы, рак подчелюстной железы, опухоль кости, ангиофиброму, саркому сетчатки, рак полового члена, опухоль яичка, солидный рак детского возраста, саркому Капоши, опухоль верхнечелюстной пазухи, фиброзную гистиоцитому, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, лимфому, множественную миелому или лейкоз.
Конкретные неограничивающие примеры саркомы включают лимфосаркому, липосаркому, остеосаркому, хондросаркому, лейомиосаркому, рабдомиосаркому или фибросаркому. Конкретные неограничивающие примеры гемопоэтической опухоли, ракового заболевания или злокачественного новообразования включают миелому, лимфому или лейкоз.
Способы и варианты применения согласно настоящему изобретению включают введение количества пептидного соединения, эффективного для лечения опухоли или ракового заболевания. Согласно конкретным аспектам способ или применение ингибирует или уменьшает рецидив, рост, прогрессирование, ухудшение или метастазирование опухоли или ракового заболевания; обеспечивает частичное или полное уничтожение неопластической, опухолевой, раковой или злокачественной клеточной массы, объема, размера или количества клеток, стимуляцию, индуцирование или увеличение некроза, лизиса или апоптоза неопластических, опухолевых, раковых или злокачественных клеток, сокращение объема, клеточной массы неоплазии, опухоли, ракового заболевания или злокачественного новообразования, ингибирование или предотвращение прогрессирования или увеличение объема, массы, размера или количества клеток неоплазии, опухоли, ракового заболевания или злокачественного новообразования, или увеличение продолжительности жизни; обеспечивает уменьшение или снижение тяжести, продолжительности или частоты неблагоприятного симптома или осложнения, связанного с неоплазией, опухолью, раковым заболеванием или злокачественным новообразованием, или вызванного неоплазией, опухолью, раковым заболеванием или злокачественным новообразованием; или способ обеспечивает уменьшение или снижение боли, дискомфорта, тошноты, слабости или апатии, или обеспечивает повышенную энергичность, аппетит, улучшение подвижности или психологического благополучия.
Кроме того, предложены наборы, включающие пептидные соединения, необязательно в комбинации с повреждающим нуклеиновые кислоты лечением (например, повреждающим нуклеиновые кислоты агентом) или антипролиферативным агентом. Согласно одному варианту реализации набор включает пептидное соединение и инструкции по практическому применению способа согласно настоящему изобретению (например, введения млекопитающему, содержание лейкоцитов у которого находится в нормальном диапазоне, например, млекопитающему, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 11 000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающему, содержание лейкоцитов у которого составляет от приблизительно 4000 до приблизительно 11 000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающему, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 10000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающему, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 9000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающему, содержание лейкоцитов у которого составляет от приблизительно 4000 до приблизительно 9000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающему, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 8000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; млекопитающему, содержание лейкоцитов у которого составляет менее чем приблизительно 7000 лейкоцитов на микролитр (БКК/мкл) крови; или млекопитающему, содержание лейкоцитов у которого меньше верхнего значения нормального диапазона любых клинических лабораторных показателей содержания лейкоцитов на мкл (БКК/мкл) крови).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 приведена кривая зависимости «доза-эффект» для каждого соединения при применении против обработанных блеомицином клеток Jurkat. На оси Х указаны дозы, а на оси Y указан процент клеток в G2/M после обработки.
На фиг. 2 приведена кривая зависимости «доза-эффект» для каждого соединения при применении против обработанных колхицином клеток Jurkat. На оси Х указаны дозы, а на оси Y указан процент клеток в G2/M после обработки.
Фиг. 3A и 3B Клетки полученной из рака поджелудочной железы человека линии MIAPaCa2, обработанные (A) блеомицином (Bleo) или (B) адриамицином (ADR) с различными дозами соединений. Собранные клетки окрашивали на ДНК и анализировали с помощью проточной цитометрии. % популяции клеток в суб-G1 указан как погибшие клетки.
На фиг. 4A–4C приведено схематическое изображение зависимости активности от структуры блокирующего контрольную точку в G2 агента (l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(l-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln) (l-Arg) (l-Arg)(l-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr) (SEQ ID NO:78): (A) блокирующая контрольную точку в G2 активность при заменах аминокислот на l-Cha в обработанных блеомицином клетках Jurkat указаны в порядке, [l-Cha=l-Nal(2)]>[l-Ala(3-Bzt)=l-Nal(1)=l-Trp=l-Dph]>[l-Ala(tBu)=Cys(tBu)=Leu]; (B) Блокирующая контрольную точку в М-фазе и/или неспецифическая токсичность при заменах аминокислот на l-Cha в обработанных колхицином клетках Jurkat в порядке: [Ala(3-Bzt)=l-Nal(1)=l-Dph]>[l-Cha=l-Nal(2)]; (C) блокирующая контрольную точку в G2 активность замены аминокислоты для l-Phe-2,3,4,5,6-F указаны в порядке, l-(Phe-2,3,4,5,6-F)=l-(Phe-3,4,5-F)=l-(Phe-4CF3)]>[l-(Phe-3Br,4Cl,5Br)=l-(Phe-4Cl)=l-Tyr].
На фиг. 5 показана блокирующая контрольную точку в G2 активность различных богатых аргинином последовательностей. Определенные пептиды добавляли к клеткам Jurkat с блеомицином или без блеомицина. Процент клеток в G2/M указан на оси Y. Ось X выглядит следующим образом: 1. Только блеомицин; 2. 0,2мкг/мл; 3. 0,39 мкг/мл; 4. 0,78 мкг/мл; 5. 1,56 мкг/мл; 6. 3,125 мкг/мл; 7. 6,25 мкг/мл; 8. 12,5 мкг/мл; 9. 25 мкг/мл; и 10. 50 мкг/мл. Пептидные последовательности представлены следующими последовательностями: rrrqrrkkr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg) (d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg) (SEQ ID NO:79); CBP501, (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO:80); без TAT, (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEQ ID NO:81); rqrr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Gln)(d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO:82); rrqrr, (d-Bpa)(d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg)(d-Arg)(SEQ ID NO:83); rrrq, (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(SEQ ID NO:84); и rrrqr, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg)(SEQ ID NO:85).
На фиг. 6 показана блокирующая контроль в G2 активность различных пептидов без (d-Bpa). Определенные пептиды добавляли к клеткам Jurkat с блеомицином или без блеомицина. Процент клеток в G2/M указан на оси Y. Ось X выглядит следующим образом: 1. Только блеомицин; 2. 0,2мкг/мл; 3. 0,39мкг/мл; 4. 0,78мкг/мл; 5. 1,56мкг/мл; 6. 3,125мкг/мл; 7. 6,25мкг/мл; 8. 12,5мкг/мл; 9. 25мкг/мл; и 10. 50мкг/мл. Пептидные последовательности представлены следующими последовательностями: CBP0, (d-Arg)(d-Arg) (d-Arg)(d-Gln)(d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO:86); CBP451, (d-Tyr)(d-Ser)(d-Pro) (l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO:87); CBP452, (d-Tyr)(d-Ser)(l-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha)(d-Arg)(d-Arg) (d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO:88); и CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:80).
4
2
На фиг. 7 показана блокирующая контроль в G2 активность различных богатых аргинином и богатых лизином пептидные последовательности. Определенные пептиды добавляли к клеткам Jurkat согласно описанию выше, и рассчитывали процент клеток в G2/M (ось Y). Пептидные последовательности представлены следующими последовательностями: CBP603, (d-Bpa)(d-Ser) (d-Trp) (d-Ser)(d-PheNO)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO:89); CBP607, (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO:90); CBP608, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d -Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg)(SEQ ID NO91:); и CBP609, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d -Cha) (d-Lys) (d-Lys) (d-Lys) (d-Lys) (d-Lys) (d-Lys) (SEQ ID NO:92).
На фиг. 8 показано, что расположение богатой аргинином части последовательности может варьировать. Определенные пептиды добавляли к клеткам Jurkat согласно описанию выше, и рассчитывали процент клеток в G2/M (ось Y). Пептидные последовательности представлены следующими последовательностями: CBP501, (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:80); CBP510, (d-Arg)(d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)(d-Arg) (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser)(d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (SEQ ID NO:93); CBP511, (d-Arg)(d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg)(d-Arg) (d-Bpa)(d-Ser) (d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:94); и CBP512, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Bpa) (SEQ ID NO:95).
На фиг. 9 показана структура нескольких исследованных замещенных пептидных последовательностей. Блокирующая контроль в G2 активность повышалась при введении выделенных более светлым цветом замен (*), блокирующая контрольную точку M-фазы активность и/или неспецифическая токсичность повышалась при введении выделенных более темным цветом замен (**) и оставалась приблизительно на том же уровне при введении остальных замен.
На фиг. 10 показано ингибирование роста опухоли (карциномы поджелудочной железы человека) у ТКИН-мышей после лечения CBP501 и цисплатином. День 0 соответствует началу лечения. Средние размеры опухолей со стандартным отклонением для каждой экспериментальной группы указаны на оси Y и количество дней после начала лечения указаны на оси X.
На фиг. 11 показана блокирующая контроль в G2 активность пептидов содержащие ингибирующую киназу область последовательности и область последовательности на основе последовательности трансдукции HIV-Tat, согласно описанию выше. Процент клеток в G2/M указан на оси Y. Ось X выглядит следующим образом: 1. Только блеомицин; 2. 0,2мкг/мл; 3. 0,39 мкг/мл; 4. 0,78 мкг/мл; 5. 1,56 мкг/мл; 6. 3,125 мкг/мл; 7. 6,25 мкг/мл; 8. 12,5 мкг/мл; 9. 25 мкг/мл; и 10. 50 мкг/мл. Пептидные последовательности представлены следующими последовательностями: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:80); CBP700, (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEQ ID NO:96); CBP701, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg)(d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:97); CBP702, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg)(d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:98); CBP703, (d-Arg) (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:99).
На фиг. 12 приведено сравнение блокирующей контрольную точку в G2 активности и блокирующей контрольную точку M активности и/или неспецифической токсичности пептидов с блеомицином в анализе на блокирующую контрольную точку в G2, и колхицином на блокирующую контрольную точку M активность и/или неспецифическую токсичность. Определенные пептиды добавляли к клеткам Jurkat с блеомицином или колхицином. Процент клеток в G2/M указан на оси Y. Ось X выглядит следующим образом: 1. Только блеомицин или колхицин; 2. 0,2 мкг/мл; 3, 0,39 мкг/мл; 4. 0,78 мкг/мл; 5. 1,56 мкг/мл; 6. 3,125 мкг/мл; 7. 6,25 мкг/мл; 8. 12,5 мкг/мл; 9. 25 мкг/мл; и 10. 50 мкг/мл. Пептидная последовательность представлена следующей последовательностью: CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg).
На фиг. 13 приведена молекулярная структура CBP501, (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg).
На фиг. 14 представлен анализ общей выживаемости Каплана-Мейера у всех получавших лечение пациентов в зависимости от базового уровня БКК: кривые выживаемости Каплана-Мейера, медиана общей выживаемости и отношение рисков в зависимости от базового уровня БКК у всех получавших лечение пациентов. Отношение рисков улучшается при уменьшении порога отсечения и достигает пика при уровне лейкоцитов 8000/мкл в качестве порога отсечения.
На фиг. 15 представлен анализ общей выживаемости Каплана-Мейера у включенных в систему ICON пациентов в зависимости от базового уровня БКК: кривые выживаемости Каплана-Мейера, медиана общей выживаемости и отношение рисков в зависимости от базового уровня БКК у включенных в систему ICON пациентов. Отношение рисков улучшается при уменьшении порога отсечения и достигает пика при уровне лейкоцитов 8000/мкл в качестве порога отсечения, и разность между Группа A и Группа B была статистически значимой при пиковом значении.
На фиг. 16 приведены кривые выживаемости Каплана-Мейера, медиана общей выживаемости, число пациентов, отношение рисков и р-значения, полученные при помощи логарифмического рангового критерия (теста Мантеля-Кокса), в зависимости от БКК, >8000 или <8000, при скрининге во всех получавших лечение популяциях, разделенные по группам.
На фиг. 17 показано повышенное образование NET активированными нейтрофилами при обработке CBP501.
На фиг. 18 показано увеличение уровня комплексов тромбина/антитромбина под действием CBP501 in vivo.
На фиг. 19 показано, что CBP501 ингибировал фагоцитоз и M1, и M2 макрофагами in vitro.
На фиг. 20 показано подавление высвобождения ФНО в клеточной линии макрофагов мыши (RAW264.7).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложены соединения, в том числе пептиды и пептидомиметики, которые ингибируют пролиферацию клеток. Соединения согласно настоящему изобретению, соответственно, подходят для лечения нарушений клеточной пролиферации или физиологических условий, характеризующихся нежелательной или неблагоприятной пролиферацией клеток, таких как доброкачественные и злокачественные опухолевые клетки. Способность пептидов и пептидомиметиков согласно настоящему изобретению ингибировать пролиферацию клеток предположительно обусловлена, по меньшей мере частично, блокировкой контрольной точки клеточной цикла в G2. Поскольку контрольная точка G2 клеточного цикла в клетках может быть индуцирована в ответ на повреждение нуклеиновых кислот, что позволяет клетке устранить повреждение до репликации ДНК и клеточного деления, за счет ингибирования контрольной точки в G2 пептиды и пептидомиметики согласно настоящему изобретению сенситизируют клетки к повреждающим нуклеиновые кислоты агентами и протоколам обработки/лечения. Клетки, аккумулировавшие достаточно значительные повреждения нуклеиновых кислот, неспособны завершить репарацию поврежденной нуклеиновой кислоты, поскольку контрольная точка в G2 разрушена. Такие клетки демонстрируют сниженную пролиферацию (например, в результате мутации гена, критически важного для выживания, который не репарируется) и в конечном итоге подвергаются апоптозу.
Клетки с нормальной фазой G1 в меньшей степени подвержены аккумуляции поврежденных нуклеиновых кислот, поскольку репарация нуклеиновой кислоты может также происходить в G1. Соответственно, нормальные клетки менее чувствительны к эффектам соединений согласно настоящему изобретению. Тем не менее, клетки с поврежденной или разрушенной контрольной точкой в G1 клеточного цикла с большей вероятностью будут аккумулировать поврежденную нуклеиновую кислоту, поскольку контрольная точка в G1 повреждена или разрушена, что уменьшает вероятность полной репарации клетками поврежденной нуклеиновой кислоты. Соответственно, обработка клеток с нарушениями или повреждениями в фазе G1 пептидом или пептидомиметиком согласно настоящему изобретению, разрушающим контрольную точку в G2, дополнительно уменьшает вероятность того, что клетки будут способны полностью репарировать поврежденную нуклеиновую кислоту. Соответственно, к таким пептидами или пептидомиметикам согласно настоящему изобретению чувствительны, в частности, клетки с повреждениями или нарушениями в G1. Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению, в том числе пептиды и пептидомиметики, могут применяться для ингибирования или предотвращения пролиферации клеток в целом, и в частности для ингибирования пролиферация клеток с поврежденной или разрушенной контрольной точкой в G1.
Клетки с поврежденной или разрушенной контрольной точкой в G1 клеточного цикла включают, не ограничиваясь перечисленными, быстро пролиферирующие клетки. Нарушения клеточной пролиферации и физиологические состояния, характеризующиеся быстрым ростом клеток, нежелательным ростом клеток или выживанием клеток вместо их апоптоза часто включают повреждение или разрушение контрольной точки в G1 клеточного цикла. Соответственно, поскольку способность пептидов и пептидомиметиков согласно настоящему изобретению ингибировать пролиферацию или стимулировать апоптоз предположительно обусловлена, по меньшей мере отчасти, разрушением контрольной точки клеточного цикла в G2, клетки, быстро или нежелательно пролиферирующие в результате повреждения или разрушения контрольной точки в G1, в частности, представляют собой подходящую мишень.
CBP501 представляет собой пептид TAT-S216A, ингибирующий контрольную точку клеточного цикла в контрольной точке в G2 (Suganuma, M., et al. Cancer Res. 59:5887 (1999)). Для оптимизации TAT-S216A применяли метод скрининга на основе фенотипа клеточного цикла с целью уменьшения аккумуляции раковых клеток в фазе G2 клеточного цикла в ответ на повреждающие ДНК агенты без влияния на фенотип клеточного цикла нормальных клеток (Sha, S., et al. Mol. Cancer Ther. 6:147 (2007)). Было обнаружено, что CBP501 повышает концентрацию платины и стимулирует образование аддукта платина-ДНК в чувствительных к CBP501 опухолевых клетках, и способен, в альтернативном варианте или дополнительно, ингибировать/разрушать контрольную точку в G2 за счет ингибирования кальмодулина (Mine, N., et al. Mol. Cancer Ther. 10:1929 (2011)).
Соединения согласно настоящему изобретению, в том числе пептиды и пептидомиметики сами по себе способны подавлять пролиферацию клеток без дополнительной обработки, повреждающей нуклеиновую кислоту или обеспечивающей антипролиферативную активность, поскольку разрушение контрольной точки в G2 предположительно будет приводить к аккумулированию повреждений нуклеиновых кислот при делении клеток. Соответственно, клетки, для которых наблюдается аномальная или нежелательная пролиферация или выживание, могут быть обработаны соединением согласно настоящему изобретению, отдельно или в сочетании с повреждающей нуклеиновые кислоты обработкой (например, химическим агентом или протоколом обработки) для ингибирования или предотвращения пролиферации клеток, или для стимуляции апоптоза/катастрофы.
В отличие от стандартных антипролиферативных агентов, нацеленных на быстро пролиферирующие клетки независимо от того, являются ли указанные клетки нормальными или аномальными (например, раковыми), соединения согласно настоящему изобретению преимущественно нацелены на клетки с поврежденной или разрушенной контрольной точкой в фазе G1 клеточного цикла. Например, CBP501, в отличие от цисплатина, не влияет на рост клеток HUVEC (см., например, таблицу 3). Также CBP501 не влияет на остановку клеточного цикла в M-фазе клеточного цикла и/или неспецифическую токсичность, индуцируемую колхицином (см., например, фиг. 12). Как следствие, соединения согласно настоящему изобретению с меньшей вероятностью будут вызывать избыточные нежелательные побочные эффекты, связанные со стандартными антипролиферативными терапевтическими агентами, такие как подавление функций костного мозга, тошнота, потеря аппетита, диарея и выпадение волос. Кроме того, поскольку подавляющему большинству раковых клеток свойственно повреждение или разрушение контрольной точки в G1 клеточного цикла, раковые клетки проявляют повышенную чувствительность к соединениям согласно настоящему изобретению, которые останавливают клеточный цикл в контрольной точке в G2. Меньшая восприимчивость нормальных клеток также означает, что соединения согласно настоящему изобретению, в том числе пептиды и пептидомиметики, могут использоваться в больших количествах.
4
2
4
2
В соответствии с настоящим изобретением предложены соединения, в том числе пептиды и пептидомиметики, обладающие оказывающей антипролиферативное действие на клетки активностью и/или останавливающие клеточный цикл в контрольной точке G2. Указанные пептиды или пептидомиметики включают последовательности, ингибирующие пролиферацию клетки или стимулирующие апоптоз клетки. Указанные пептиды или пептидомиметики также включают последовательности, останавливающие клеточный цикл в контрольной точке в G2. Согласно одному варианту реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:1) или P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:2); где P1 представляет собой d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой группой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой, хиназолиновой группой на боковой цепи; P2 представляет собой d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой или хиназолиновой группой на боковой цепи; P3, P4, P5 представляют собой любую аминокислоту, или один или более из P3, P4, P5 представляют собой простую углеродную цепь, такую, что расстояние между P2 и P6 приблизительно равно расстоянию в том случае, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой (d- или l-Trp представляет собой пример на P4; P6 представляет собой d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, любую аминокислоту и d- или l-Tyr (например, d-Ser-d-Tyr), любую аминокислоту и d- или l-Phe (например, d-Ser-d-Phe), любую аминокислоту или отсутствует. Согласно различным аспектам аминокислота, содержащая простую углеродную цепь, представляет собой d- или l-11-аминоундекановую кислоту, d- или l-10-аминодекановую кислоту, d- или l-9-аминононановую кислоту, d- или l-8-аминокаприловую кислоту, d- или l-7-аминогептановую кислоту, d- или l- 6-аминокапроновую кислоту или аналогичную структуру, содержащую одну или большее количество ненасыщенных углеродных связей.
4
2
4
2
Согласно другому варианту реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:3); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:4); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:5); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:6); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:7); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:8); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:9); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:10); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:11); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:12); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:13); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:14); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:15); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:16); где P1 представляет собой d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи (например d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой или хиназолиновой группой на боковой цепи; P2 представляет собой d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l-(Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), или аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи (например d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой группой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой, хиназолиновой группой(ами) на боковой цепи; P3, P4, P5 представляют собой любую аминокислоту, или один или более из P3, P4, P5 представляют собой простую углеродную цепь, такую, что расстояние между P2 и P6 приблизительно равно расстоянию в том случае, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой (d- или l-Trp представляет собой пример на P4); P6 представляет собой d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, любую аминокислоту и d- или l-Tyr (например, d-Ser-d-Tyr), любую аминокислоту и d- или l-Phe (например, d-Ser-d-Phe), и по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 представляют собой основные аминокислоты, а остальные представлены любой аминокислотой или отсутствуют. Согласно различным аспектам аминокислота, содержащая простую углеродную цепь, представляет собой d- или l-11-аминоундекановую кислоту, d- или l-10-аминодекановую кислоту, d- или l-9-аминононановую кислоту, d- или l-8-аминокаприловую кислоту, d- или l-7-аминогептановую кислоту, d- или l- 6-аминокапроновую кислоту или аналогичную структуру с одной или большим количеством ненасыщенных углеродных связей.
4
2
4
2
Согласно дополнительному варианту реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:17); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:18); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:19); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:20); где P1 представляет собой d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l- (Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l- (Phe-3,4,5F), d- или l- (Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой или хиназолиновой группой на боковой цепи; P2 представляет собой d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l- (Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l- (Phe-3,4,5F), d- или l- (Phe-4CF3), аминокислоту, которая имеет аналогичный объем боковой цепи (например, d- или l-Tyr, d- или l-Phe), или любую аминокислоту с одной или двумя ароматическими, пиперидиновыми, пиразиновыми, пиримидиновыми, пиперазиновыми, морфолиновыми или пиримидиновыми группами, или одной индольной, пенталеновой, инденовой, нафталиновой, бензофурановой, бензотиофеновой, хинолиновой, индолиновой, хромановой, хиноксалиновой, хиназолиновой группой на боковой цепи; P3, P4, P5 представляют собой любую аминокислоту, или один или более из P3, P4, P5 представляют собой простую углеродную цепь, такую, что расстояние между P2 и P6 приблизительно равно расстоянию в том случае, когда каждый из P3, P4, P5 является аминокислотой (d- или l-Trp представляет собой пример на P4); P6 представляет собой d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, любую аминокислоту и d- или l-Tyr (например, d-Ser-d-Tyr), любую аминокислоту и d- или l-Phe (например, d-Ser-d-Phe), любую аминокислоту или отсутствует; и по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 представляют собой основные аминокислоты, а остальные представлены любой аминокислотой или отсутствуют. Согласно различным аспектам аминокислота, содержащая простую углеродную цепь, представляет собой d- или l-аминоундекановую кислоту или d- или l-8-аминокаприловую кислоту.
4
2
4
2
4
2
Согласно еще одному варианту реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:21) или P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:22); где P1 представляет собой d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l- (Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l- (Phe-3,4,5F), d- или l- (Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, d- или l-Tyr, или d- или l-Phe; P2 представляет собой d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l- (Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l- (Phe-3,4,5F), d- или l-(Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, d- или l-Tyr, или d- или l-Phe; P3 представляет собой d- или l-серин, d- или l-аргинин, d- или l-цистеин, d- или l-пролин, или d- или l-аспарагин; P4 представляет собой d- или l-триптофан; и P5 представляет собой d- или l-серин, d- или l-аргинин, или d- или l-аспарагин; или P3, P4, P5 представляет собой одиночную d- или l-аминоундекановую кислоту или одиночную d- или l-8-аминокаприловую кислоту; P6 представляет собой d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, (d-Ser-d-Tyr) или (d-Ser-d-Phe).
4
2
4
2
4
2
Согласно еще одному варианту реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:23); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:24); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:25); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:26); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:27); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:28); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:29); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:30); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:31); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:32); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:33); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:34); где P1 представляет собой d- или l-Cha, Nal(2), d- или l- (Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l- (Phe-3,4,5F), d- или l- (Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, d- или l-Tyr, или d- или l-Phe; P2 представляет собой d- или l-Cha, d- или l-Nal(2), d- или l- (Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l- (Phe-3,4,5F), d- или l- (Phe-4CF3), d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, d- или l-Tyr, или d- или l-Phe; P3 представляет собой d- или l-серин, d- или l-аргинин, d- или l-цистеин, d- или l-пролин, или d- или l-аспарагин; P4 представляет собой d- или l-триптофан; P5 представляет собой d- или l-серин, d- или l-аргинин, или d- или l-аспарагин; или P3, P4, P5 представляет собой одиночную d- или l-аминоундекановую кислоту или одиночную d- или l-8-аминокаприловую кислоту; P6 представляет собой d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, (d-Ser-d-Tyr) или (d-Ser-d-Phe); и по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 представляют собой d- или l-Arg, или d- или l-Lys, а остальные представлены любой аминокислотой или отсутствуют.
4
2
Согласно дополнительному варианту реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:35); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:36); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1(SEQ ID NO:37); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:38); где P1 представляет собой d- или l-Cha, или d- или l-Nal(2); P2 представляет собой d- или l- (Phe-2,3,4,5,6-F), d- или l- (Phe-3,4,5F), d- или l- (Phe-4CF3); и по меньшей мере три из P7, P8, P9, P10, P11, P12 представляют собой d- или l-Arg, а остальные представлены любой аминокислотой или отсутствуют; P3 представляет собой d- или l-серин; P4 представляет собой d- или l-триптофан; P5 представляет собой d- или l-серин или d- или l-аспарагин; P6 представляет собой d- или l-Bpa, d- или l-PheNO, (d- или l-Ser-d- или l-Tyr) или (d- или l-Ser-d- или l-Phe).
Согласно еще одному дополнительному варианту реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:39) или P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:40); где P1 представляет собой d- или l-Cha, или d- или l-Nal(2); P2 представляет собой (d- или l-Phe-2,3,4,5,6-F), (d- или l-Phe-3,4,5F) или (d- или l-Phe-4CF3); P3 представляет собой d- или l-Ser; P4 представляет собой d- или l-Trp; P5 представляет собой d- или l-Ser; P6 представляет собой d- или l-Bpa, или (d- или l-Ser-d- или l-Tyr).
Согласно дополнительному варианту реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:41); P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:42); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:43); P1, P2, P3, P4, P5, P6, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:44); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:45); P6, P5, P4, P3, P2, P1, P12, P11, P10, P9, P8, P7 (SEQ ID NO:46); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:47); P7, P8, P9, P10, P11, P12, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:48); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P1, P2, P3, P4, P5, P6 (SEQ ID NO:49); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:50); P12, P11, P6, P9, P8, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:51); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:52); P1, P2, P7, P8, P9, P6, P11, P12 (SEQ ID NO:53); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:54); где P1 представляет собой d- или l-Cha, или d- или l-Nal(2); P2 представляет собой (d- или l-Phe-2,3,4,5,6-F), (d- или l-Phe-3,4,5F) или (d- или l-Phe-4CF3); P3 представляет собой любую аминокислоту (например, d- или l-Ser, или d- или l-Pro); P4 представляет собой d- или l-Trp; P5 представляет собой любую аминокислоту (например, d- или l-Ser); P7 представляет собой d- или l-Arg; P8 представляет собой d- или l-Arg; P9 представляет собой d- или l-Arg; P10 представляет собой d- или l-Gln или d- или l-Arg; P11 представляет собой d- или l-Arg; P12 представляет собой d- или l-Arg; P6 представляет собой d- или l-Bpa или (d- или l-Ser-d- или l-Tyr).
Согласно еще одному варианту реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:55); P12, P11, P10, P9, P8, P7, P6, P5, P4, P3, P2, P1 (SEQ ID NO:56); P12, P11, P10, P6, P9, P4, P7, P2, P1 (SEQ ID NO:57); или P1, P2, P7, P4, P9, P6, P10, P11, P12 (SEQ ID NO:58); где P1 представляет собой d- или l-Cha или d- или l-Nal(2); P2 представляет собой (d- или l-Phe-2,3,4,5,6-F); P3 представляет собой d- или l-Ser; P4 представляет собой d- или l-Trp; P5 представляет собой d- или l-Ser; P7 представляет собой d- или l-Arg; P8 представляет собой d- или l-Arg; P9 представляет собой d- или l-Arg; P10 представляет собой d- или l-Gln или d- или l-Arg; P11 представляет собой d- или l-Arg; P12 представляет собой d- или l-Arg; P6 представляет собой d- или l-Bpa или (d- или l-Ser-d- или l-Tyr).
Согласно другим дополнительным вариантам реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln)(d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:99); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln)(d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEQ ID NO:100); (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:59); (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEQ ID NO:60); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln)(d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:61); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln)(d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Bpa) (SEQ ID NO:62); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:63); (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Bpa) (SEQ ID NO:64); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser) (d-Trp)(d-Ser) (d-Bpa) (SEQ ID NO:65); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:66); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:67); (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:68); (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:69); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:70); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg)(d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:71); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg)(d-Trp) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:72); (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg)(d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:73); (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg)(d-Trp) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:74); (d-Arg) (d-Arg)(d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg)(d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:75); или (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:76).
Согласно другим дополнительным вариантам реализации непрерывная последовательность пептида или пептидомиметика включает следующую структуру: (d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:77).
Пептиды и пептидомиметики согласно настоящему изобретению необязательно содержат последовательность полилизина или полиаргинина для облегчения прохождения через клеточную мембрану. Поскольку другие последовательности аминокислот (например, HIV-Tat, лиганды рецепторов/белков клеточной поверхности и т.п.) способны проникать через мембрану, и другие молекулы могут применяться для облегчения проникновения в клетки блокирующих контрольную точку в G2 пептидов и пептидомиметиков (например, липосомы, мицеллы и другие липидные молекулы, вирусные и другие векторы, электропорация и т.п.), включение полилизиновых и/или полиаргининовых последовательностей является необязательным. Соответственно, согласно дополнительным вариантам реализации указанные пептиды и пептидомиметики не содержат полилизиновой и/или полиаргининовой последовательности, способствующей проникновению в клетку. Например, согласно двум конкретным вариантам реализации, минимальная последовательность без поли-Lys/Arg последовательности, способствующей прохождению через клеточную мембрану, включает P6, P5, P4, P3, P2, P1, например, d-Bpa, d-Ser, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha (SEQ ID NO:101); и d-Tyr, d-Ser, d-Pro, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha (SEQ ID NO:102). Согласно двум дополнительные конкретным вариантам реализации минимальная последовательность без поли-Lys/Arg последовательности, способствующей прохождению через клеточную мембрану, включает, например, d-Bpa, d-Cys, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha, d-Cys (SEQ ID NO:103); и d-Tyr, d-Cys, d-Pro, d-Trp, d-Ser, d-Phe-2,3,4,5,6F, d-Cha, d-Cys (SEQ ID NO:104); остатки Cys необязательно циклизованы.
Как обсуждалось выше, соединения согласно настоящему изобретению сами по себе обладают оказывающей антипролиферативное действие на клетки активностью или блокирующей контроль в G2 активностью. Оказывающая антипролиферативное действие на клетки активность может быть усилена путем комбинирования таких соединений согласно настоящему изобретению с лечением, прямо или непрямо вызывающим повреждение нуклеиновых кислот. Оказывающая антипролиферативное действие на клетки активность также может быть усилена путем комбинирования таких соединений согласно настоящему изобретению с вариантами лечения, ингибирующими пролиферацию клеток, при этом повреждающими или не повреждающими нуклеиновую кислоту. Соответственно, в настоящем изобретении предложены также композиции, содержащие соединение согласно настоящему изобретению (например, последовательность пептида или пептидомиметика) и повреждающий нуклеиновые кислоты агент, и композиции, содержащие соединение согласно настоящему изобретению (например, последовательность пептида или пептидомиметика) и антипролиферативный агент.
В настоящем документе термины «блокировать контрольную точку в фазе G2 клеточного цикла», «разрушать контрольную точку в фазе G2 клеточного цикла», «нарушать клеточный цикл в контрольной точке в G2» и их грамматические варианты означают ингибирование остановки клеточного цикла в контрольной точке в G2. В клетке, в которой блокирована контрольная точка фазы G2 клеточного цикла, наблюдается уменьшение продолжительности нахождения в контрольной точке G2, варьирующее от полного отсутствия контрольной точки в G2 до уменьшения продолжительности нахождения в контрольной точке в G2 на протяжении минут, часов, дней, недель или большего периода времени в подходящих условиях. Соответственно, в клетке при приведении в контакт с соединением согласно настоящему изобретению наблюдается меньшая продолжительность нахождения в контрольной точке в G2, чем обычно наблюдаемая в указанной клетке в отсутствие указанного соединения. Например, уменьшение продолжительности нахождения в контрольной точке в G2 будет означать, что клетка, находящаяся в G2 на протяжении определенного времени, например, 4 часа, при приведении в контакт с соединением согласно настоящему изобретению, находится в G2 на протяжении менее чем 4 часов, например, 3,5, 3, 2,5, 2, 1 или менее часов.
В настоящем документе термин «апоптоз» относится к запрограммированной смерти клеток и связанным с ней изменениями в физиологии клеток, например, фрагментацией нуклеиновых кислот, активации каспаз и т.п., как известно в данной области техники. Термин «катастрофа» означает клеточную смерть, обусловленную ошибкой в процессе митоза. При катастрофе наблюдается меньше признаков, характерных для апоптоза, например, активация каспаз, конденсация хромосом и т.п.
например
В настоящем документе термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и относятся к двум или более аминокислотам, ковалентно связанным амидной связью или ее неамидным эквивалентом. Пептиды согласно настоящему изобретению могут иметь любую длину. Например, длина указанных пептидов может составлять от приблизительно 5 до 100 или более остатков, например, от 5 до 12, от 12 от 15, от 15 до 18, от 18 до 25, от 25 до 50, от 50 до 75, от 75 до 100 или более остатков. Пептиды согласно настоящему изобретению включают l- и d-изомеры, и комбинации l- и d-изомеров. Пептиды могут включать модификации, как правило, связаны с посттрансляционным процессингом белков, например, циклизацией (, с помощью дисульфидной или амидной связи), фосфорилированием, гликозилированием, карбоксилированием, убиквитинированием, миристилированием или липидированием.
Пептиды, описанные в настоящем документе, также включают соединения, содержащие структурные или функциональные аналоги аминокислот, например, пептидомиметики, содержащие синтетические или не встречающиеся в природе аминокислоты или аналоги аминокислот, при условии, что указанный миметик обладает одной или большим количеством функций или типов активности. Соединения согласно настоящему изобретению, соответственно, включают формы «миметик» и «пептидомиметик».
В настоящем документе термины «миметик» и «пептидомиметик» относятся к синтетическому химическому соединению, которое обладает по существу такими же структурными и/или функциональными характеристиками, что и пептиды согласно настоящему изобретению. Миметик может полностью состоять из синтетических не встречающихся в природе аналогов аминокислот, или может представлять собой гибридную молекулу, содержащую одну или большее количество природных пептидных аминокислот и одну или большее количество не встречающихся в природе аналогов аминокислот. Миметик может также включать любое число консервативных замен природных аминокислот, при условии, что такие замены не устраняют активность указанного миметика. Как и в случае с полипептидами согласно настоящему изобретению, представляющими собой консервативные варианты, рутинное тестирование может применяться для определения того, обладает ли миметик требуемой активностью, например, обладает ли он детектируемой блокирующей контрольную точку в G2 клеточного цикла активностью. Миметик, который при введении субъекту или приведении в контакт с клеткой, детектируемым образом разрушает клеточный цикл в контрольной точке G2, соответственно, обладает и блокирующей контрольную точку в G2 активностью.
2
2
2
2
4
Chemistry and Biochemistry of Amino acids, Peptides and Proteins
Композиций с пептидомиметиками могут содержать любую комбинацию не встречающихся в природе структурных компонентов, которые, как правило, относятся к трем структурным группам: a) связывающие остатки группы, не представленные природной амидной связью («пептидная связь»); b) не встречающиеся в природе остатки вместо встречающихся в природе остатков аминокислот; или c) остатки, которые индуцируют мимикрия вторичной структуры, т.е. индуцируют или стабилизируют вторичную структуру, например, бета-спираль, гамма-спираль, бета-лист, альфа-спиральная конформация и т.п. Например, полипептид может быть охарактеризован как миметик, если один или большее количество остатков объединены химическими способами, отличными от амидной связи. Индивидуальные остатки пептидомиметика могут быть объединены амидными связями, не встречающимися в природе и неамидными химическими связями, другими химическими связями или способами связи, включая, например, глутаральдегид, сложные N-гидроксисукцинимидные эфиры, бифункциональные малеимиды, N,N’-дициклогексилкарбодиимид (DCC) или N,N’-диизопропилкарбодиимид (DIC). Связывающие группы, представляющие альтернативу амидной связи, включают, например, кетометилен (например, -C(=O)-CH- для -C(=O)-NH-), аминометилен (CH-NH), этилен, олефин (CH=CH), простой эфир (CH-O), тиоэфир (CH-S), тетразол (CN-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см., например, Spatola (1983), , Vol. 7, pp 267-357, “Peptide and Backbone Modifications,” Marcel Decker, NY).
Как обсуждалось выше, пептид может быть охарактеризован как миметик при содержании одного или большего количества не встречающихся в природе остатков вместо встречающегося в природе остатка аминокислоты. Не встречающиеся в природе остатки известны в данной области техники. Конкретные неограничивающие примеры не встречающихся в природе остатков, подходящих в качестве миметиков природных остатков аминокислот, представленные миметиками ароматических аминокислот, включают, например, D- или L-нафтилаланин; D- или L-фенилглицин; D- или L-2-тиенилаланин; D- или L-1-, 2-, 3- или 4-пиренилаланин; D- или L-3 тиенилаланин; D- или L-(2-пиридинил)-аланин; D- или L-(3-пиридинил)-аланин; D- или L-(2-пиразинил)-аланин; D- или L-(4-изопропил)-фенилглицин; D-(трифторметил)-фенилглицин; D-(трифторметил)-фенилаланин; D-п-фтор-фенилаланин; D- или L-п-бифенилфенилаланин; K- или L-п-метокси-бифенилфенилаланин; D- или L-2-индол(алкил)аланины; и D- или L-алкиламины, где алкил может представлять собой замещенный или замещенный метил, этил, пропил, гексил, бутил, пентил, изопропил, изобутил, втор-изотил, изопентил или некислотную аминокислоту. Ароматические кольца не встречающейся в природе аминокислоты, которые могут использоваться вместо природных ароматических колец, включают, например, тиазолильные, тиофенильные, пиразолильные, бензимидазолильные, нафтильные, фуранильные, пирролильные и пиридильные ароматические кольца.
Миметики кислых аминокислот могут быть получены путем замены на некарбоксилатные аминокислоты при сохранении отрицательного заряда; (фосфоно)аланин; и сульфатированный треонин. Карбоксильные боковые группы (например, аспартил или глутамил) могут также быть избирательно модифицированы путем проведения реакции с карбодиимидами (R’-N-C-N-R’), включая, например, 1-циклогексил-3(2-морфолинил-(4-этил) карбодиимид или 1-этил-3(4-азония-4,4-диметолпентил) карбодиимид. Аспартильные или глутамильные группы могут быть также преобразованы в аспарагинильные и глутаминильные группы путем проведения реакции с ионами аммония.
Миметики основных аминокислот могут быть получены путем замещения, например, помимо лизина и аргинина, аминокислотами орнитином, цитруллином или (гуанидино)-уксусной кислотой, или (гуанидино)алкилуксусной кислотой, где алкил может быть замещенным или незамещенным метилом, этилом, пропилом, гексилом, бутилом, пентилом, изопропилом, изобутилом, втор-изотил, изопентилом или некислотной аминокислотой. Производное нитрила (например, содержащее CN-фрагмент вместо COOH) может быть заменено на аспарагин или глутамин. Остатки аспарагинила и глутаминила могут быть дезаминированы до соответствующих остатков аспартила или глутамила.
Миметики аргинина могут быть получены путем проведения реакции аргинила с одним или большим количеством реагентов, включая, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, необязательно в щелочной среде. Миметики остатка тирозина могут быть получены путем проведения реакции тирозила с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. N-ацетилимидазол и тетранитрометан могут применяться для получения O-ацетилтирозильных веществ и 3-нитропроизводных, соответственно.
Миметики лизина могут быть получены (и аминоконцевые остатки могут быть изменены) путем проведения реакции лизинила с ангидридами янтарной или другой карбоновой кислоты. Миметики лизина и другие содержащие альфа-аминогруппы остатки может также быть получен путем проведения реакции со сложными имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензенсульфоновая кислота, O-метилизомочевина, 2,4, пентандион, и катализируемых трансамидазой реакций с глиоксилатом.
Миметики метионина могут быть получены путем проведения реакции с метионинсульфоксидом. Миметики пролина включают, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин и 3,3,-диметилпролин. Миметики гистидина могут быть получены путем проведения реакции гистидила с диэтилпирокарбонатом или парабромфенацилбромидом. Другие миметики включают, например, полученные путем гидроксилирования пролина и лизина; фосфорилирования гидроксильных групп остатков серила или треонила; метилирования альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилирования N-концевого амина; метилирования остатков амида основной цепи или замещения N-метиламинокислотами; или амидирования C-концевых карбоксильных групп.
Один или большее количество остатков могут также быть заменены на аминокислоту (или остаток пептидомиметика) противоположной хиральности. Соответственно, любая аминокислота, встречающаяся в природе в L-конфигурации (которая дополнительно может называться «R» или «S», в зависимости от структуры химического объекта), может быть заменена на ту же аминокислоту или миметик, но противоположной хиральности, называемую(ый) D-аминокислотой, которая(ый) при этом дополнительно может называться R- или S-формой.
Пептиды и пептидомиметики согласно настоящему изобретению также включают модифицированные формы представленных в настоящем документе последовательностей, при условии, что указанная модифицированная форма сохраняет, по меньшей мере частично, функцию немодифицированного или референсного пептида или пептидомиметика. Например, модифицированный пептид или пептидомиметик сохраняет по меньшей мере частично ингибирующую пролиферацию клеток или блокирующую контроль в G2 активность, но может обладать повышенной или пониженной ингибирующей пролиферацию клеток или блокирующей контроль в G2 активностью относительно референсного пептида или пептидомиметика.
Модифицированные пептиды и пептидомиметики могут включать один или большее количество остатков аминокислот, замененных на другой остаток, добавленных к последовательности или удаленных из последовательности. Согласно одному варианту реализации модифицированный пептид или пептидомиметик включает одну или большее количество замен аминокислот, добавлений или удалений (например, 1–3, 3–5, 5–10 или более). Согласно одному аспекту происходит замена на аминокислоту или миметик, боковая цепь которой(ого) занимает то же положение, что и в референсной(ом) аминокислоте или миметике (аминокислоте или миметике, в которую(ый) вводится замена). Согласно другому аспекту происходит замена на не принадлежащую человеку аминокислоту, структурно аналогичную остатку аминокислоты человека. Согласно конкретному аспекту указанная замена представляет собой консервативную замену аминокислоты.
В настоящем документе термин «аналогичный объем» означает, что химический фрагмент занимает в трехмерном пространстве объем, аналогичный по размеру занимаемому референсным фрагментом объему. Как правило, фрагмент, занимающий такой же объем, аналогичен по размеру референсному фрагменту. Аминокислота или миметик, которая(ый) «имеет аналогичный объем боковой цепи» содержит боковую цепь, которая занимает в трехмерном пространстве объем, аналогичный по размеру занимаемому референсной(ым) аминокислотой или миметиком. Конкретные примеры для d-(Phe-2,3,4,5,6-F), l-(Phe-2,3,4,5,6-F), d-(Phe-3,4,5F), l-(Phe-3,4,5F), d-(Phe-4CF3) или l-(Phe-4CF3) представлены (l или d-Phe-2R1,3R2,4R3,5R4,6R5), где R1, R2, R3, R4, R5 может представлять собой хлорид, бромид, фторид, йодид, водород, оксид водорода или отсутствовать. Для малых молекул, например, фторида, который имеет размер приблизительно 1 ангстрем, «аналогичный объем» может представлять собой отсутствие фрагмента.
Термин «консервативная замена» означает замещение одной аминокислоты на биологически, химически или структурно аналогичный остаток. «Биологически аналогичный» означает, что указанная замена совместима с биологической активностью, например, антипролиферативной или блокирующей контроль в G2 активностью. «Структурно аналогичный» означает, что указанные аминокислоты содержат боковые цепи аналогичной длины, например, аланин, глицин и серин, или имеющие аналогичный размер. «Химически аналогичный» означает, что остатки имеют одинаковый заряд, или что оба остатка являются гидрофильными или гидрофобными. Конкретные примеры включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой, или замену одного полярного остатка на другой, например, замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин, серина на треонин, и т.п.
Пептиды и пептидомиметики согласно настоящему изобретению соответственно включают пептиды и пептидомиметики, содержащие последовательность, неидентичную последовательностям пептидов и пептидомиметиков, приведенным в таблице 1. Согласно одному варианту реализации пептид или пептидомиметик содержит последовательность, на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или более идентичную последовательности, приведенной в таблице 1. Согласно одному аспекту идентичность относится к определенной области последовательности, например, к 3–5 аминоконцевым или карбоксиконцевым остаткам.
Соединения согласно настоящему изобретению, в том числе пептиды и пептидомиметики могут быть получены и выделены с применением любого метода, известного в данной области техники. Пептиды могут быть синтезированы, полностью или частично, с применением химических методов, известных в данной области техники (см., например, Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215-223; Horn (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 225-232; и Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems (1995) Technomic Publishing Co., Lancaster, PA). Пептидный синтез может выполняться с применением различных твердофазных техник (см., например, Roberge (1995) Science 269:202; Merrifield (1997) Methods Enzymol. 289:3-13), и автоматизированный синтез может осуществляться, например, с применением синтезатора пептидов ABI 431A (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Индивидуальные синтетические остатки и полипептиды, в том числе миметики, могут быть синтезированы с применением различные процедур и методик, известных в данной области техники (см., например, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman, et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY). Пептиды и пептидомиметики могут также быть синтезированы с применением комбинаторных методик. Техники получения библиотек пептидов и пептидомиметиков хорошо известны, и включают, например, пиновую технологию (Multipin), технику «чайных пакетиков» и технику расщепления-сочетания-смешивания (split-couple-mix) (см., например, al-Obeidi (1998) Mol. Biotechnol. 9:205-223; Hruby (1997) Curr. Opin. Chem. Biol. 1:114-119; Ostergaard (1997) Mol. Divers. 3:17-27; и Ostresh (1996) Methods Enzymol. 267:220-234). Модифицированные пептиды могут также быть получены с помощью методов химической модификации (см., например, Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; и Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896).
Пептиды могут также быть синтезированы и экспрессированы в виде гибридных белков с присоединенным одним или большим количеством дополнительных доменов для получения более иммуногенного пептида, более простого выделения синтезированного рекомбинантным методом пептида или для идентификации и выделения антител или экспрессирующих антитела B-клеток. Домены, облегчающие детекцию и очищение, включают, например, металл-хелатирующие пептиды, такие как полигистидиновые участки и гистидин-триптофановые модули, которые позволяют проводить очищение на иммобилизованных металлах; домены белка A, которые позволяют проводить очищение на иммобилизованном иммуноглобулине; и домен, используемый в системе удлинения/аффинной очистки FLAGS (Immunex Corp, Сиэтл, Вашингтон). Включение расщепляемой линкерной последовательности, такой как фактор Ха или энтерокиназа (Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния), между доменом для очищения и пептидом, может применяться для облегчения очищения пептида. Например, экспрессионный вектор может включать кодирующую пептид последовательность нуклеиновой кислоты, соединенную с 6 остатками гистидина, за которыми следует тиоредоксин и сайт расщепления энтерокиназы (см., например, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-14). Остатки гистидина облегчают детекцию и очищение гибридного белка, а сайт расщепления энтерокиназы обеспечивает способ очищения пептида от остальной части гибридного белка. Технология, задействующая векторы, кодирующие гибридные белки, и применение гибридных белков известны в данной области техники (см., например, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53).
В настоящем изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды согласно настоящему изобретению. Согласно конкретным вариантам реализации нуклеиновая кислота кодирует пептидные последовательности согласно настоящему изобретению, длина которых составляет приблизительно от 8 до 12, от 12 до 15, от 15 до 18, от 15 до 20, от 18 до 25, от 20 до 25, от 25 до 35, от 25 до 50 или от 50 до 100 аминокислот или более.
например
Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения всех форм нуклеиновой кислоты, в том числе дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и рибонуклеиновой кислоты (РНК). Нуклеиновые кислоты могут быть двуцепочечными, одноцепочечными, или триплексными, линейными или кольцевыми. Нуклеиновые кислоты включают геномную ДНК, кДНК и антисмысловую НК. РНК может представлять собой сплайсированную или несплайсированную мРНК, рРНК, тРНК или антисмысловую НК (, РНК-интерференцию). Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению включают встречающиеся в природе, синтетические, а также аналоги и производные нуклеотидов. Такие измененные или модифицированные полинуклеотиды включают аналоги, например, обеспечивающие устойчивость к нуклеазам. Длина нуклеиновых кислот также может быть меньше, чем в приведенным примерах пептидных последовательностей. Например, субпоследовательность любой из пептидных последовательностей могут кодировать пептид, обладающий антипролиферативной или блокирующей контрольную точку в G2 активностью.
Нуклеиновая кислота может быть получена с помощью любых из ряда хорошо известных стандартных методов клонирования и химического синтеза, и может быть целенаправленно изменена посредством сайт-специфического мутагенеза или других рекомбинантных техник, известных специалистам в данной области техники. Чистота полинуклеотидов может быть определена с помощью секвенирования, гель-электрофореза и т.п.
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут быть встроены в содержащую нуклеиновую кислоту конструкцию, в которой на экспрессию указанной нуклеиновой кислоты влияет или регулирует ее «элемент контроля экспрессии»; указанная комбинация называется «экспрессионной кассетой». Термин «элемент контроля экспрессии» относится к одному или большему количеству элементов последовательности, регулирующих или влияющих на экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, с которыми они функционально связаны. Элемент контроля экспрессии, функционально связанный с последовательностью нуклеиновой кислоты, контролирует транскрипцию и, при необходимости, трансляцию последовательности нуклеиновой кислоты.
Термин «функционально связанный» относится к функциональному сочетанию, при котором взаимодействие описываемых указанным термином компонентов обеспечивает выполнение их функций надлежащим образом. Как правило, элементы контроля экспрессии расположены рядом с 5’ или 3’-концом гена, однако могут быть и интронными. Промоторы обычно расположены в 5’-направлении от кодирующей последовательности. «Промотор» означает элемент с минимальной последовательностью, достаточной для управления транскрипцией.
например
т.е.
т.е.
Элементы контроля экспрессии включают промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, сайленсеры генов, стартовый кодон (, ATG) перед кодирующим белок геном. Элементы контроля экспрессии активируют конститутивную транскрипцию, индуцируемую транскрипцию ( требуется внешний сигнал для активации) или дерепрессируют транскрипцию ( сигнал выключает транскрипцию; удаление сигнала активирует транскрипцию). Экспрессионные кассеты могут также включать контрольные элементы достаточные для придания экспрессии генов статуса контролируемой экспрессии в конкретных типах клеток или тканей (т.е. тканеспецифические контрольные элементы).
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут быть встроены в плазмиду для размножения в клетке-хозяине и последующих генетических манипуляций. Плазмида представляет собой нуклеиновую кислоту, которая способна стабильно размножаться в клетке-хозяине; плазмиды необязательно содержат элементы контроля экспрессии для управления экспрессией нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид в указанной клетке-хозяине. Термин «вектор» используется в данном документе в качестве синонима плазмиды и могут также включать элемент контроля экспрессии для экспрессирования в клетке-хозяине. Плазмиды и векторы обычно содержат по меньшей мере точку начала репликации для размножения в клетке и промотор. Таким образом, плазмиды и векторы подходят, например, для генетических манипуляций с пептидом, кодирующим нуклеиновые кислоты, для получения пептидов и для экспрессирования указанных пептидов в клетках-хозяевах или целых организмах.
Current Protocols in Molecular Biology
Methods in Enzymology
Methods in Enzymology
The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces
DNA Cloning, Practical Approach
in vivo
Соответственно, пептиды могут быть экспрессированы в бактериальных системах с применением конститутивных промоторов, таких как T7, или индуцируемых промоторов, таких как pL бактериофага λ, plac, ptrp, ptac (гибридный промотор ptrp-lac); в дрожжевых системах с применением конститутивных промоторов, таких как ADH или LEU2, или индуцируемого промотора, такого как GAL (см., например, Ausubel et al., In: , Vol. 2, Ch. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. , 153:516 (1987), eds. Wu & Grossman; Bitter , 152:673 (1987), eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y.; и Strathern et al.,  (1982) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I, II; R. Rothstein, в: , Vol.11, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986); в системах на основе клеток насекомых с применением конститутивных или индуцируемых промоторов, таких как экдизон; и в системах клеток млекопитающих с применением конститутивных промоторов, таких как SV40, RSV, или индуцируемых промоторов, происходящих из генома клеток млекопитающих, таких как промотор металлотионеина IIA, промотор белка теплового шока или промотор, происходящий из вируса млекопитающих, такой как поздний аденовирусный промотор или длинный концевой повтор индуцируемого вируса опухоли молочной железы мыши. Системы для экспрессии пептидов также включают векторы, сконструированные для применения , в том числе аденовирусные векторы (патенты США №№ 5700470 и 5731172), аденоассоциированные векторы (патент США №5604090), векторы на основе вируса простого герпеса (патент США № 5501979) и ретровирусные векторы (патенты США №№ 5624820, 5693508 и 5674703 и публикации WIPO WO92/05266 и WO92/14829). Вирус папилломы крупного рогатого скота (BPV) также применялся в генной терапии (патент США № 5719054). Такие векторы для генной терапии также включают векторы на основе ЦМВ (патент США № 5561063).
например
Соответственно, в настоящем изобретении также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды согласно настоящему изобретению, встроенные в клетки-хозяева. Согласно одному варианту реализации указанная клетка-хозяин представляет собой прокариотическую клетку. Согласно другому варианту реализации указанная клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку. Согласно различным аспектам указанная эукариотическая клетка представляет собой дрожжи или клетку млекопитающего (, человека, примата и т.п.).
В настоящем документе «клетка-хозяин» представляет собой клетку, в которую вводят нуклеиновую кислоту, которая может быть размножена, транскрибирована, или с которой может быть экспрессирован кодируемый белок. Указанный термин также включает любое потомство заявленной клетки-хозяина.
например
например
например
например
Клетки-хозяева включают, не ограничиваясь перечисленными, микроорганизмы, такие как бактерии или дрожжи; клетки растений, насекомых и млекопитающих. Например, предложены бактерии, трансформированные нуклеиновой кислотой рекомбинантного бактериофага, нуклеиновой кислотой плазмидных или космидных экспрессионных векторов; дрожжи, трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессионными векторами; системы на основе растительных клеток, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус табачной мозаики, TMV) или трансформированные рекомбинантными плазмидными экспрессионными векторами (, плазмидой Ti); системы на основе клеток насекомых, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (, бакуловирусными); или системы на основе клеток животных, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (, ретровирусами, аденовирусами, вирус осповакцины), или трансформированные системы на основе клеток животных, сконструированных для стабильной экспрессии.
например
dhfr
gpt
неомициновому
гигромициновому
_
_
Current Communications in Molecular Biology
Экспрессионный вектор также может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую селектируемый маркер, придающий устойчивость к селективному давлению, или идентифицируемый маркер (, β-галактозидазу), что обеспечивает возможность идентифицирования, культивирования и размножения содержащих такой вектор клеток. Как вариант, селектируемый маркер может находиться на втором векторе, которым трансфицируют клетку-хозяина совместно с первым вектором, содержащим полинуклеотид согласно настоящему изобретению. Может применяться ряд систем селекции, включая, но не ограничиваясь перечисленными, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), ген гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы(Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026 (1962)) и гены аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)), для клеток tk-, hgprt или aprt, соответственно. Устойчивость к антиметаболитам может использоваться в качестве основы для селекции по , который придает устойчивость к метотрексату (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); гену , который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981));  гену, который придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1(1981)); и  гену, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Дополнительные селектируемые гены включают trpB, который позволяет клеткам использовать индол вместо триптофана; hisD, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047 (1988)); и ODC (орнитиндекарбоксилаза), который придает устойчивость к ингибитору орнитиндекарбоксилазы, 2-(дифторметил)-DL-орнитину, DFMO (McConlogue (1987) In: , Cold Spring Harbor Laboratory).
В настоящем документе термины «повреждающее нуклеиновые кислоты лечение» и «повреждающий нуклеиновые кислоты агент» означает любую схему лечения, которое прямо или непрямо повреждает нуклеиновую кислоту (например, ДНК, кДНК, геномную ДНК, мРНК, тРНК или рРНК). Специфические примеры таких агентов включают алкилирующие агенты, нитрозомочевины, антиметаболиты, растительные алкалоиды, растительные экстракты и радиоизотопы. Специфические примеры агентов также включают повреждающие нуклеиновые кислоты лекарственные средства, например, 5-фторурацил (5-FU), капецитабин, S-1 (Тегафур, 5-хлор-2,4-дигидроксипиридин и оксоновая кислота), 5-этинилурацил, арабинозилцитозин (ара-C), 5-азацитидин (5-AC), 2’,2’-дифтор-2’-дезоксицитидин (dFdC), пуриновые антиметаболиты (меркаптопурин, азатиопурин, тиогуанин), гидрохлорид гемцитабина (Гемзар), пентостатин, аллопуринол, 2-фтор-арабинозил-аденин(2F-ара-A), гидроксимочевину, сернистый иприт (бисхлорэтилсульфид), мехлорэтамин, мелфалан, хлорамбуцил, циклофосфамид, ифосфамид, тиотепа, AZQ, митомицин C, диангидрогалактит, дибромодульцит, алкилсульфонат (бусульфан), нитрозомочевины (BCNU, CCNU, 4-метил CCNU или ACNU), прокарбазин, декарбазин, ребеккамицин, антрациклины, такие как доксорубицин (адриамицин; ADR), даунорубицин (Церубицин), идарубицин (Идамицин) и эпирубицин (Элленс), аналоги антракциклинов, такие как митоксантрон, актиномицин D, неинтеркалирующие ингибиторы топоизомеразы, такие как эпиподофиллотоксины (этопозид=VP16, тенипозид=VM-26), подофиллотоксин, блеомицин (Bleo), пеплеомицин, соединения, которые образуют аддукты с нуклеиновой кислотой, в том числе производные платины (например, цисплатин (CDDP), транс-аналог цисплатина, карбоплатина, ипроплатин, тетраплатин и оксалиплатин), камптотецин, топотекан, иринотекан (CPT-11) и SN-38. Специфические примеры повреждающего нуклеиновые кислоты лечения включают излучение (например, ультрафиолетовое (УФ), инфракрасное (ИК), или альфа-, бета- или гамма-излучение) и экологический шок (например, гипертермия).
в том числе
В настоящем документе термины «антипролиферативное лечение» и «антипролиферативный агент» означает любую схему лечения, которое прямо или непрямо ингибируют пролиферацию клетки, вируса, бактерий или другого одноклеточного или многоклеточного организма независимо от того, повреждает ли указанное(ый) лечение или агент нуклеиновую кислоту. Конкретные примеры антипролиферативных агентов представлены противоопухолевыми и противовирусными лекарственными средствами, которые ингибируют пролиферацию клеток, или пролиферацию или репликацию вируса. Специфические примеры включают, , циклофосфамид, азатиоприн, циклоспорин A, преднизолон, мелфалан, хлорамбуцил, мехлорэтамин, бусульфан, метотрексат, 6-меркаптопурин, тиогуанин, цитозинарабинозид, таксол, винбластин, винкристин, доксорубицин, актиномицин D, митрамицин, кармустин, ломустин, семустин, стрептозотоцин, гидроксимочевина, цисплатин, митотан, прокарбазин, дакарбазин и дибромоманнит. Антипролиферативные агенты, которые вызывают ошибки репликации нуклеиновой кислоты или ингибируют репликацию нуклеиновой кислоты, такие как аналоги нуклеозидов и нуклеотидов (например, АЗТ или 5- АЗТ).
Пептиды и пептидомиметики согласно настоящему изобретению могут также усиливать антипролиферативную активность в отношении клеток стабилизирующих или дестабилизирующих микротрубочки агентов, таких как алкалоиды барвинка (винбластин=VLB, винкристин=VCR, винорелбин=VRLB, винфлунин=VFL) и таксаны (паклитаксел и доцетаксел=таксотер). Соответственно, такие агенты могут быть дополнительно включены в композиции согласно настоящему изобретению и применяться в способах согласно настоящему изобретению.
Клетки, обработку которых можно проводить с применением соединений согласно настоящему изобретению, включают любые клетки, пролиферацию которых желательно ингибировать или предотвращать in vitro, ex vivo или in vivo. Конкретные целевые клетки демонстрируют более короткую по сравнению с нормальной длительность нахождения в контрольной точке в G1 клеточного цикла или повреждение контрольной точки в G1 клеточного цикла таким образом, что клетки выходят из контрольной точки в G1 до окончания периода времени, достаточного для завершения репарации нуклеиновой кислоты. Кандидатные клетки, соответственно, включают клетки, которые быстро пролиферируют, нормальные или аномальные. Конкретные примеры представлены доброкачественными или опухолевыми, метастатическими или неметастатическими клетками. Дополнительные кандидатные клетки могут быть идентифицированы путем измерения скорости пролиферации или продолжительности нахождения клеток в фазе G1. Кандидатные клетки могут также быть идентифицированы путем приведения в контакт экспериментальной клетки с соединением согласно настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с повреждающим нуклеиновые кислоты лечением, и определения того, наблюдается ли в указанной приведенной в контакт клетке снижение пролиферации или стимуляция клеточной смерти или апоптоза/катастрофы.
ex vivo
in vivo
Соединения согласно настоящему изобретению, соответственно, подходят для ингибирования пролиферации клеток in vitro,  и . Таким образом, субъекты, у которых имеется расстройство или физиологическое состояние, характеризующееся аномальной, нежелательной или неблагоприятной пролиферацией клеток или выживанием клеток, или аномальной или неполноценной дифференцировкой клеток, или имеется риск такого расстройства или физиологического состояния, могут получать лечение соединением согласно настоящему изобретению, отдельно или в комбинации с лечением, которое прямо или непрямо вызывает повреждение нуклеиновых кислот, или антипролиферативным лечением.
in vitro
ex vivo
in vivo
Соответственно, в соответствии с настоящим изобретением, предложены способы ингибирования пролиферации клеток, способы увеличения чувствительности клеток к повреждающему нуклеиновые кислоты агенту или лечению, и способы увеличения повреждения нуклеиновых кислот в клетке ,  и . Согласно одному варианту реализации способ включает приведение клетки в контакт (например, культивированной клетки или клетки, присутствующей у субъекта) с количеством пептида или пептидомиметика согласно настоящему изобретению, достаточным для ингибирования пролиферации клетки. Согласно другому варианту реализации способ включает приведение указанной клетки в контакт с количеством пептида или пептидомиметика согласно настоящему изобретению, достаточным для повышения чувствительности клетки к повреждающему нуклеиновые кислоты агенту или лечению. Согласно еще одному варианту реализации способ включает приведение клетки в контакт с количеством пептида или пептидомиметика согласно настоящему изобретению, достаточным для увеличения повреждения нуклеиновых кислот в клетке. Согласно различным аспектам способ также включает приведение указанной клетки в контакт с повреждающим нуклеиновые кислоты агентом или воздействие на клетку повреждающей нуклеиновые кислоты обработкой.
Также предложены способы лечения нарушения пролиферации или дифференцировки клеток у субъекта, в том числе состояний, характеризующихся нежелательными или неблагоприятными пролиферацией клеток или выживанием клеток, состояний, характеризующихся неполноценным или аберрантным апоптозом, состояний, характеризующихся аберрантной или неполноценным выживанием клеток, а также состояний, характеризующихся аберрантной или неполноценной дифференцировкой клеток. Согласно одному варианту реализации способ включает введение субъекту, у которого имеется нарушение пролиферации клеток или имеется риск развития нарушения пролиферации клеток, количества пептида или пептидомиметика согласно настоящему изобретению, эффективного для лечения указанного нарушения пролиферации клеток. Согласно одному аспекту указанное количество является достаточным для улучшения состояния указанных субъектов. Согласно конкретным аспектам указанное улучшение включает, по меньшей мере в некоторых целевых клетках (например, аномально пролиферирующих клетках), уменьшение пролиферации клеток, уменьшение числа клеток, ингибирование увеличения числа клеток, усиление апоптоза или уменьшение выживаемости. Согласно еще одному аспекту субъекту вводят соединение согласно настоящему изобретению до проведения, одновременно с проведением или после проведения лечения, ингибирующего пролиферацию клеток. Согласно дополнительным конкретным аспектам по меньшей мере часть клеток с нарушениями пролиферации находится в крови, молочной железе, легких, щитовидной железе, голове или шее, головном мозге, лимфе, желудочно-кишечном тракте, мочеполовом тракте, почке, поджелудочной железе, печени, костях, мышцах или коже.
Согласно другому варианту реализации способ включает введение определенного количества соединения субъекту для лечения солидной опухоли. Согласно еще одному варианту реализации способ включает введение определение количества соединения субъекту для лечения гемобластоза. Согласно различным аспектам субъекту, у которого имеется опухоль, вводят соединение согласно настоящему изобретению до проведения, одновременно с проведением или после проведения другой противоопухолевой терапии.
например
В настоящем документе термины «пролиферативное расстройство» и «пролиферативное состояние» означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или нежелательной пролиферации (например, клетки, вируса, бактерий, гриба и т.п.). Термины «нарушение пролиферации клеток» и «клеточно- пролиферативное состояние» означают любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или нежелательной пролиферацией клеток, а также включает состояния, характеризующееся нежелательными или неблагоприятными пролиферацией клеток или выживанием клеток (, в результате неполноценного апоптоза), состояния, характеризующиеся неполноценным или аберрантным апоптозом, а также состояния, характеризующиеся аберрантным, нежелательным или неблагоприятным выживанием клеток. Термин «нарушение дифференцировки» означает любое патологическое или непатологическое физиологическое состояние, характеризующееся аберрантной или неполноценной дифференцировкой.
т.е.
Пролиферативные расстройства или нарушения дифференцировки, которые поддаются лечению, включают заболевания и непатологические физиологические состояния, как доброкачественные, так и неопластические, характеризующееся аномальным или нежелательным количеством клеток, ростом клеток или выживанием клеток. Такие расстройства или состояния могут, соответственно, представлять собой болезненное состояние, и включают все типы злокачественных образований или онкогенных процессов, метастатических тканей или злокачественно трансформированных клеток, тканей или органов, или могут быть непатологическими,  представлять собой отклонение от нормы, но, как правило, не связанное с заболеванием. Конкретным примером непатологического состояния, лечение которого может проводиться в соответствии с настоящим изобретением, является разрастание ткани при заживлении раны, что приводит к образованию рубцов.
Клетки, характеризующиеся нарушением пролиферации или дифференцировки, могут быть объединены в клеточную массу или быть разрозненными. Термин «солидная опухоль» относится к неоплазиям или метастазам, которые, как правило, объединяются и образуют массу. Конкретные примеры включают висцеральные опухоли, например, рак желудка или толстой кишки, гепатомы, венозные карциномы, опухоли/раковые заболевания легких и головного мозга. «Гемобластоз/жидкая опухоль» относится к неоплазиям гемопоэтической системы, таким как лимфомы, миеломы и лейкозы, или неоплазиям, диффузным по своей природе, поскольку они, как правило, не образуют солидную массу. Конкретные примеры лейкозов включают острую и хроническую лимфобластную, миелобластную и множественную миелому.
например
Такие расстройства включают неоплазии или раковые заболевания, которые могут поражать клетки или ткани практически любого типа, , карциному, саркому, меланому, метастатические расстройства или гемопоэтические неопластические расстройства. Метастатическая опухоль может возникать из первичных опухолей множества типов, в том числе, но не ограничиваясь перечисленными, молочной железы, легкого, щитовидной железы, головы и шеи, головного мозга, лимфоидной системы, желудочно-кишечного тракта (рта, пищевода, желудка, малого кишечника, прямой кишки, прямой кишки), мочеполового тракта (матки, яичников, шейки матки, мочевого пузыря, яичек, полового члена, предстательной железы), почки, поджелудочной железы, печени, кости, мышц, кожи и т.п.
например
Карциномы относятся к злокачественным новообразованиям эпителиальной или эндокринной ткани, и включают карциномы дыхательной системы, карциномы желудочно-кишечного тракта, карциномы мочеполовой системы, карциномы яичка, карциномы молочной железы, карциномы предстательной железы, карциномы эндокринной системы и меланомы. Примеры карцином включают образующиеся из тканей шейки матки, легкого, предстательной железы, молочной железы, головы и шеи, прямой кишки, печени и яичника. Термин также включает карциносаркомы, , включающие злокачественные опухоли, состоящие из карциноматозных и саркоматозных тканей. Аденокарцинома включает карциному железистой ткани, или опухоль, образующую железоподобную структуру.
Саркомы относятся к злокачественным опухолям из клеток мезенхимального происхождения. Примеры сарком включают, например, лимфосаркому, липосаркому, остеосаркому и фибросаркому.
например
например
В настоящем документе термин «гемопоэтическое пролиферативное расстройство» означает заболевание, включающее гиперпластические/неопластические клетки гемопоэтического происхождения, , возникающие из миелоидных, лимфоидных или эритроидных линий, или их клеток-предшественников. Как правило, заболевания возникают в результате низкодифференцированных острых лейкозов, , эритробластический лейкоз и острый мегакариобластный лейкоз. Дополнительные примеры миелоидных расстройств включают, не ограничиваясь перечисленными, острый промиелоцитарный лейкоз (ОПМЛ), острый миелогенный лейкоз (ОМЛ) и хронический миелогенный лейкоз (ХМЛ); лимфоидные злокачественные новообразования включают, не ограничиваясь перечисленными, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), который включает B-клеточный ОЛЛ и T-клеточный ОЛЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), пролимфоцитарный лейкоз (ПЛЛ), лейкоз ворсистых клеток (HLL) и макроглобулинемию Вальденстрема (WM). Дополнительные злокачественные лимфомы включают, не ограничиваясь перечисленными, неходжкинскую лимфому и ее варианты, периферические Т-клеточные лимфомы, Т-клеточный лейкоз/лимфома взрослых (ATL), кожная Т-клеточная лимфома (КТКЛ), лейкоз больших зернистых лимфоцитов (БЗЛ), болезнь Ходжкина и болезнь Рида-Штернберга.
например
Лечение для применения в комбинации с соединениями согласно настоящему изобретению включает любое антипролиферативное, повреждающее нуклеиновые кислоты или противоопухолевое лечение согласно описанию в настоящем документе или известное в данной области техники. Например, антипролиферативное или противоопухолевое лечение может включать лучевую терапию или хирургическое удаление, необязательно в комбинации с лекарственным лечением. Лечение может включать введение химического вещества, такого как радиоизотоп, лекарственного средства, такого как химиотерапевтический агент, или проведение генной терапии, например, введение антионкогена (, Rb, DCC, p53 и т.п.), доминантно-негативного онкогена или антисмысловой относительно онкогена последовательности. Указанные соединения могут вводиться до, одновременно или после других протоколов лечения. Например, субъекту-кандидату для антипролиферативной терапии (например, лучевой терапии, химиотерапии, генной терапии, хирургического удаления и т.п.) может вводиться соединение согласно настоящему изобретению до начала антипролиферативной терапии. Соответственно, предложены способы профилактического лечения.
Термин «субъект» относится к животным, как правило, млекопитающим, таким как приматы (человек, высшие обезьяны, гиббоны, орангутанги, шимпанзе, макаки), домашние животные (собаки и кошки), домашний скот (лошади, крупный рогатый скот, козы, овцы, свиньи) и экспериментальные животные (мышь, крыса, кролик, морская свинка). Субъекты включают животных в моделях заболеваний (например, опухоленесущих мышей).
Rb
Субъекты, которым подходит лечение, включают субъектов, в текущее время проходящих лечение нарушений пролиферации или дифференцировки, или являющихся кандидатами для такого лечения (например, противоопухолевой терапии). Дополнительно субъекты-кандидаты включают, например, субъектов, у которых имеется риск развития нарушения пролиферации клеток. Способы согласно настоящему изобретению, соответственно, подходят для лечения субъекта, у которого имеется риск развития нарушения пролиферации клеток, но еще не наблюдаются явные симптомы указанного расстройства. Субъекты из группы риска могут быть идентифицированы на основании генетической предрасположенности или семейной истории развития нарушений пролиферации клеток. Например, кандидатами являются субъекты, у которых имеется активированный онкоген, либо мутация или делеция гена супрессора опухоли. Субъекты из группы риска могут быть, соответственно, идентифицированы с применением рутинного генетического скрининга на присутствие генетического нарушения, или анализа семейного анамнеза для определения риска развития расстройства. Конкретным примером субъекта из группы риска является субъект, семейная история которого или другая генетическая характеристика указывает на предрасположенность к раковому заболеванию, при котором неопластические или лекарственно-устойчивые неопластические клетки экспрессируют CD40. Конкретным специфическим примером генетического заболевания является ретинобластома, обусловленная дефектом гена-супрессора опухоли .
например
например
Вводимые количества, как правило, представляют собой «эффективное количество» или «достаточное количество», то есть количество, достаточное для достижения требуемого эффекта. Эффективные количества, соответственно, предусматривают что-либо одно или более из: уменьшения пролиферации клеток, уменьшение количества клеток, ингибирования повышенной пролиферации, ингибирования увеличения числа клеток, усиления апоптоза или уменьшения выживания по меньшей мере части клеток, включающих пролиферирующие клетки (например, по меньшей мере некоторых целевых клеток). Соответственно, например, если требуется ингибирование пролиферации клеток, эффективное количество будет представлено количеством, которое детектируемо уменьшает пролиферацию клеток или число пролиферирующих клеток, усиливает клеточный апоптоз или уменьшает выживаемость клеток. Указанное количество может, соответственно, быть достаточным для уменьшения количества целевых клеток, стабилизации количества целевых клеток или ингибирования увеличения количества целевых клеток. Например, если указанное расстройство включает солидную опухоль, уменьшение размера опухоли, стабилизация размера опухоли или предотвращение дальнейшего роста опухоли, по меньшей мере для части опухоли (, ингибирование роста 5–10% или 10–20% составляющих опухолевую массу клеток или более), представляет собой удовлетворительный клинический результат. Если указанное расстройство включает гемобластоз, уменьшение числа опухолевых клеток, стабилизация числа опухолевых клеток или ингибирование дальнейшего увеличения числа опухолевых клеток, по меньшей мере для субпопуляции опухолевых клеток (, ингибирование роста 5–10% клеток, или 10–20% клеток или более) представляет собой удовлетворительный клинический результат.
Кроме того, количества, которые можно рассматривать как эффективные, могут предотвращать или ингибировать прогрессирование состояния или расстройства. Например, некоторые опухоли по мере прогрессирования становятся все более агрессивными, в том числе прогрессируют в метастатические формы. Соответственно, количества, которые приводят к уменьшению или предотвращению повышения агрессивности или метастазирования опухоли, также считаются эффективными. Соответственно, ингибирование или предотвращение усугубления расстройства или состояния, т.е. стабилизация состояния, также представляет собой удовлетворительный клинический результат.
например
например
Путем исследования биологического образца с гемобластозом (, образца крови или ткани) можно установить, произошло ли уменьшение числа клеток или размеров опухолевой массы, или ингибирование пролиферации опухолевых клеток. В случае солидной опухоли уменьшение размеров опухоли или ингибирование увеличения размеров опухоли может быть подтверждено с помощью инвазивных и неинвазивных способов визуализации. Уменьшение содержания рецепторов рецептороположительной опухоли может быть использовано для оценки уменьшения или ингибирования пролиферации опухолевых клеток. Оценка уменьшения или ингибирования пролиферации опухоли может быть основана на количестве гормонов в случае гормонпродуцирующей опухоли, , рака молочной железы, яичка или яичника.
Эффективные количества могут также объективно или субъективно уменьшать или снижать тяжесть или частоту проявления симптомов, связанных с расстройством или состоянием. Например, количество соединения согласно настоящему изобретению, уменьшающее боль, тошноту или другие неприятные ощущения, или улучшает аппетит или субъективное благополучие, обеспечивает удовлетворительный клинический результат.
Эффективные количества также включают количества, уменьшающие количество (например, дозировку) или частоту лечения согласно другому протоколу, что считается удовлетворительным клиническим результатом. Например, страдающему раковым заболеванием пациенту, получающему лечение соединением согласно настоящему изобретению, может в меньшей степени требоваться повреждающее нуклеиновые кислоты лечение для ингибирования пролиферации раковых клеток. В данном примере эффективное количество включает количество, которое уменьшает частоту дозирования или количество повреждающего нуклеиновые кислоты агента, который вводится субъекту, по сравнению с частотой дозирования или количеством, вводимыми в отсутствие лечения соединением согласно настоящему изобретению.
Способы согласно настоящему изобретению могут обеспечивать улучшение состояния субъекта или благоприятный терапевтический эффект на протяжении относительного краткого периода времени, например, улучшение может продолжаться несколько часов, дней или недель, или распространяться на более длительный период времени, например, месяцы или годы. Эффективное количество необязательно обеспечивает полное устранение любого или всех симптомов состояния или расстройства. Соответственно, удовлетворительный клинический результат для эффективного количества достигнут, если происходит субъективное или объективное улучшение состояния субъекта по оценке на основании любых из вышеуказанных критериев или других критериев, известных в данной области техники, подходящих для определения статуса расстройства или состояния, на протяжении короткого или длительного периода времени. Количество, эффективное для достижения одного или нескольких благоприятных эффектов согласно описанию в настоящем документе, или известных в данной области техники, называют «улучшением» состояния субъекта или «благоприятным терапевтическим эффектом» для субъекта.
Эффективное количество соединения согласно настоящему изобретению может быть определено на основании исследований на животных или, необязательно, в клинических испытаниях на людях. Специалисту в данной области техники известны различные факторы, способные влиять на дозировку и распределение во времени, необходимые для лечения конкретного субъекта, включая, например, общее состояние здоровья, возраст или пол субъекта, тяжесть или стадию расстройства или состояния, предшествующее лечение, подверженность нежелательным побочным эффектам, требуемый клинический исход и наличие других расстройств или состояний. Такие факторы могут влиять на дозировку и распределение во времени, необходимые для обеспечения достаточного для благоприятного терапевтического эффекта количества. Режим дозирования также учитывает фармакокинетику, т.е. скорость абсорбции фармацевтической композиции, биодоступность, метаболизм и клиренс (см., например, Egleton (1997) “Bioavailability and transport of peptides and peptide drugs into the brain” Peptides 18:1431-1439; и Langer (1990) Science 249:1527-1533). Кроме того, дозировки или протоколы лечения могут быть специально разработаны для субъекта или модифицированы на основании фармакогеномных данных.
Соединения согласно настоящему изобретению могут, соответственно, вводиться отдельно или в виде фармацевтической композиции системно, регионарно (например, направленное введение в орган или ткань, например, путем инъекции в воротную вену для лечения нарушения пролиферации клеток печени), или локально (например, непосредственно в опухолевую массу), в соответствии с любым протоколом или маршрутом, обеспечивающим требуемый эффект. Соединения и фармацевтические композиции могут вводиться в виде одной дозы или нескольких доз ежедневно (например, в низкой дозе) или периодически (например, 1 раз в сутки, 1 раз в неделю и т.п., в более высокой дозе). Соединения и фармацевтические композиции могут вводиться путем ингаляции (например, интратрахеально), перорально, внутривенно, внутриартериально, внутривенно, интратекально, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, внутриполостным путем, трансдермально (например, местно), трансмукозально (например, буккально, внутрь мочевого пузыря, вагинально, внутрь матки, прямой кишки, или назально), путем многократного введения, замедленного высвобождения (например, постепенной перфузии в течение некоторого времени) или в виде одного болюса. Имплантируемые устройства, в том числе микротехнологические устройства, для введения лекарственных средств хорошо известны и также подходят для доставки соединений согласно настоящему изобретению у субъекта.
Соединения для внутривенного введения (В/В) вводят со скоростью от приблизительно 0,01 мг/ч до приблизительно 1,0 мг/ч на протяжении нескольких часов (как правило, 1, 3 или 6 часов); такое введение может повторяться в течение одной или нескольких недель в виде периодических циклов. Могут использоваться значительно более высокие дозы (например, до приблизительно 10 мг/мл), в частности, когда лекарственное средство вводят в обособленную область, а не в кровоток, например, в полость тела или в просвет органа, например, в спинномозговую жидкость (СМЖ).
in vivo
ex vivo
Соответственно, в настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции. Такие фармацевтические композиции подходят, например, для введения субъекту  или , и для лечения субъекта соединениями согласно настоящему изобретению.
В настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый» и «физиологически приемлемый» включает растворители (водные или неводные), растворы, эмульсии, дисперсионные среды, покрытия, способствующие изотоничности и абсорбции или задерживающие абсорбцию агенты, совместимые с фармацевтическим введением. «Фармацевтическая композиция» или «фармацевтический состав» соответственно относится к композиции, подходящей для фармацевтического применения у субъекта. Фармацевтические композиции и составы включают количество соединения согласно настоящему изобретению, например, эффективное количество пептида или пептидомиметика, кодирующей его нуклеиновой кислоты, вектора или клеток согласно настоящему изобретению, и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель.
Фармацевтические композиции могут быть введены в состав, совместимый с конкретным способом введения, системного или местного. Соответственно, фармацевтические композиции включают носители, разбавители или вспомогательные вещества, подходящие для введения различными способами.
Составы для энтерального (перорального) введения могут входить в состав таблеток (с покрытием или без покрытия), капсул (твердые или мягкие), микросфер, эмульсии, порошка, гранул, кристаллов, суспензии, сиропа или эликсира. Стандартные нетоксичные твердые носители, которые включают, например, маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния фармацевтических категорий, могут применяться для приготовления твердых составов. Дополнительные активные соединения (например, консерванты, антибактериальные, противовирусные и фунгицидные агенты) могут также быть включены в указанные составы. Для энтерального введения могут также применяться жидкий состав. Носитель может быть выбран из различных масел, включая нефтяное масло, масло животного происхождения, растительное или синтетическое масло, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают, например, крахмал, целлюлозу, тальк, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат магния, стеарат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол.
Фармацевтические композиции для энтерального, парентерального или трансмукозального введения включают, например, воду, физиологический раствор, забуференный фосфатом солевой раствор, раствор Хэнка, раствор Рингера, декстрозный/ солевой раствор и раствор глюкозы. Указанные составы могут содержать вспомогательные вещества для приближения к физиологическим условиям, такие как буферные агенты, регулирующие тоничность агенты, смачивающие агенты, поверхностно-активные вещества и т.п. Добавки могут также включать дополнительные активные ингредиенты, такие как бактерицидные агенты или стабилизаторы. Например, указанный раствор может содержать ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, сорбитанмонолаурат или триэтаноламинолеат. Дополнительные способы и составы для парентерального применения описаны в источниках: Bai (1997) J. Neuroimmunol. 80:65-75; Warren (1997) J. Neurol. Sci. 152:31-38; и Tonegawa (1997) J. Exp. Med. 186:507-515. Состав для парентерального введения может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозные флаконы, изготовленные из стекла или пластика.
Фармацевтические композиции для внутрикожного или подкожного введения могут включать стерильный разбавитель, такой как вода, солевой раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, глутатион или бисульфит натрия; хелатирующие агенты такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для коррекции тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза.
Фармацевтические композиции для инъекций включают водные растворы (при условии растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального приготовления стерильных растворов для инъекций или дисперсий. Подходящие для внутривенного введения носители включают физиологический солевой раствор, бактериостатическую воду, Кремофор EL™ (BASF, Парсиппани, Нью-Джерси) или забуференный фосфатом солевой раствор (ФСБ). Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль, и т.п.), и их подходящие смеси. Текучесть может обеспечиваться, например, путем применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем применения поверхностно-активных веществ. Антибактериальные и фунгицидные агенты включают, например, парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту и тимеросал. В композицию могут быть включены изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, и хлорид натрия. Полученные растворы могут быть упакованы для непосредственного применения, или лиофилизированы, и лиофилизированный состав впоследствии может быть объединен со стерильным раствором перед введением.
Фармацевтически приемлемые носители могут содержать соединение, которое стабилизирует, увеличивает или задерживают абсорбцию или выведение. Такие соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза, или декстраны; низкомолекулярные белки; композиции, которые уменьшают выведение или гидролиз пептидов; или вспомогательные вещества или другие стабилизаторы и/или буферы. Агенты, которые замедляют абсорбцию, включают, например, моностеарат алюминия и желатин. Для стабилизации, или для увеличения или уменьшения абсорбции фармацевтической композиции, в том числе липосомных носителей, могут также применяться поверхностно-активные вещества. Для защиты от расщепления указанное соединение может быть введено в комплекс с композицией, придающей устойчивость к кислотному и ферментативному гидролизу, или указанное соединение может входить в комплекс с подходящим устойчивым носителем, например, липосомой. Способы защиты соединений от расщепления известны в данной области техники (см., например, Fix (1996) Pharm Res. 13:1760-1764; Samanen (1996) J. Pharm. Pharmacol. 48:119-135; и патент США 5391377, где описаны липидные композиции для пероральной доставки терапевтических агентов).
В состав для трансмукозального или трансдермального введения входят проникающие вещества, подходящие для проникновения через заданный барьер. Такие проникающие вещества хорошо известны в данной области техники, и включают, например, в случае трансмукозального введения, поверхностно-активные вещества, соли желчных кислот и производные фузидовой кислоты. Трансмукозальное введение может быть реализовано путем применения назальных спреев или суппозиториев (см., например, Sayani (1996) “Systemic delivery of peptides and proteins across absorptive mucosae” Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13:85-184). Для трансдермального введения активное соединение может быть введено в состав мазей, бальзамов, гелей или кремов, как хорошо известно в данной области техники. Трансдермальные системы доставки могут быть реализованы также в виде пластырей.
В случае введения ингаляционным путем, фармацевтический состав может вводиться в форме аэрозоля или беспропеллентного аэрозоля. В случае введения аэрозоля указанный состав может поставляться в тонкодисперсной форме вместе с поверхностно-активным веществом и пропеллент. Согласно другому варианту реализации предложено устройство для доставки состава в респираторную ткань, где указанный состав испаряется. Другие известные в данной области техники системы доставки включают аэрозоли сухих порошков, системы доставки жидкостей, ингаляторы, пневматические распылители и пропеллентные системы (см., например, Patton (1998) Biotechniques 16:141-143; Dura Pharmaceuticals, Сан-Диего, Калифорния; Aradigm, Хейворд, Калифорния; Aerogen, Санта-Клара, Калифорния; и Inhale Therapeutic Systems, Сан-Карлос, Калифорния).
Могут использоваться биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких составов известны специалистам в данной области техники. Указанные материалы могут также быть приобретены у Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Липосомные суспензии (включающие липосомы, нацеленные на клетки или ткани с помощью антител или белков вирусной оболочки) могут также применяться в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии с известными в данной области техники способами, например, согласно описанию в патентах США №№ 4235871; 4501728; 4522811; 4837028; 6110490; 6096716; 5283185; 5279833; Akimaru (1995) Cytokines Mol. Ther. 1:197-210; Alving (1995) Immunol. Rev. 145:5-31; и Szoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467). Биоразлагаемые микросферы или капсулы, или другие биоразлагаемые конфигурации полимеров, способные обеспечивать доставку с длительным высвобождением малых молекул, в том числе пептидов, известны в данной области техники (см., например, Putney (1998) Nat. Biotechnol. 16:153-157). Соединения согласно настоящему изобретению могут быть включены в мицеллы (см., например, Suntres (1994) J. Pharm. Pharmacol. 46:23-28; Woodle (1992) Pharm. Res. 9:260-265). Пептиды могут быть присоединены к поверхности липидного монослоя или бислоя. Например, пептиды могут быть присоединены к содержащим гидразид-ПЭГ-(дистеароилфосфатидил)этаноламин липосомам (см., например, Zalipsky (1995) Bioconjug. Chem. 6:705-708). Как вариант, может использоваться любая форма липидной мембраны, такая как плоская липидная мембрана или клеточная мембрана интактной клетки, например, эритроцита. Липосомные и содержащие липиды составы могут доставляться любыми способами, включая, например, внутривенное, трансдермальное (см., например, Vutla (1996) J. Pharm. Sci. 85:5-8), трансмукозальное или пероральное введение.
Фармацевтически приемлемый состав может включать приблизительно от 1% до 99,9% активного ингредиента (например, пептида или пептидомиметика). Фармацевтические композиции могут быть стерилизованы обычными хорошо известными способами стерилизации, или могут быть стерилизованы фильтрацией.
Remington’s Pharmaceutical Sciences
The Merck Index
Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms
Drug Delivery Systems
Дополнительные фармацевтические составы и системы доставки известны в данной области техники и подходят для применения в способах и композициях согласно настоящему изобретению (см., например,  (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA;  (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; , Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); и Poznansky et al., , R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315).
Указанные фармацевтические составы могут быть упакованы в виде единичной лекарственной формы для облегчения введения и обеспечения однородности дозирования. «Единичная лекарственная форма» в настоящем документе относится к физически дискретным унитарным дозам для введения субъекту, подлежащему лечению; каждая единица содержит заданное количество соединения, обеспечивающего требуемый эффект в комбинации с фармацевтическим носителем или вспомогательным веществом.
Ниже приведены используемые в настоящем документе сокращенные обозначения:
Cha: циклогексил-аланин
Phe-2,3,4,5,6-F: Фториды находятся в положении 2, 3, 4, 5, 6 в остатке фенила фенилаланина
F: Фторид
Bpa: Бензоил-фенилаланин
Nal(2): 2-Нафтил-аланил
Ala(3-Bzt): (3-Бензотиенил)-Аланин
Nal(1): 1-Нафтил-аланил
Dph: Дифенил-Аланин
Ala(tBu): трет-Бутил-аланил
Cys(tBu): трет-Бутил-цистеин
Phe-3,4,5-F: Фториды находятся в положении 3,4,5 в фениле фенилаланина
Phe-4CF3: CF3 находится в положении 4 в остатке фенила фенилаланина
Phe-3Br,4Cl,5Br: Бромид находится в положении 3, хлорид находится в положении 4 и бромид находится в положении 5 в фениле фенилаланина
Phe-4Cl: Хлорид находится в положении 4 в фениле фенилаланина
P1, P2, P3, P4, P5, P6 и т.п., и (P1, P2, P3, P4, P5, P6 и т.п.); и P7, P8, P9, P10, P11, P12 и т.п., и (P7, P8, P9, P10, P11, P12 и т.п.): непрерывная последовательность из P1, P2, P3, P4, P5, P6 и т.п.; и P7, P8, P9, P10, P11, P12, соответственно.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значение, обычно подразумеваемое специалистом в области техники, к которой принадлежит указанное изобретение. Хотя при реализации или тестировании настоящего изобретения могут применяться способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, в настоящем описании приводятся подходящие способы и материалы.
Все публикации, патенты и другие источники, цитируемые в настоящем документе, включены в него посредством ссылки полностью. В случае возникновения противоречий настоящее описание, включая определения, имеет преимущественную силу.
В настоящем документе формы единственного числа, в том числе используемые с определением «указанный», включают соответствующие им термины во множественном числе, если из контекста не очевидно иное. Соответственно, например, ссылка на «соединение» подразумевает включение совокупности соединений, а ссылка на «остаток» или «аминокислоту» включает ссылку на один или большее количество остатков и аминокислот.
Описан ряд вариантов реализации настоящего изобретения. Тем не менее, следует понимать, что могут быть выполнены различные модификации без отступления от объема и существа настоящего изобретения. Соответственно, приводимые ниже примеры предназначены для иллюстрации, и не ограничивают объем настоящего изобретения, описанного формулой изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
В настоящем примере описаны материалы и некоторые способы. В настоящем примере также описаны последовательности анализируемых пептидов/пептидомиметиков.
Химические вещества и реагенты
2
Блеомицин приобретали у Wako Pure Chemical Co. (Осака, Япония) и растворяли в дистиллированной HO до концентрации 10 мг/мл. Йодид пропидия (PI) и адриамицин приобретали у Sigma (Сент-Луис, Миссури).
Клеточная культура
o
o
2
2
Клетки происходящей из T-клеточного лейкоза человека клеточной линии Jurkat культивировали на RPMI 1640 (Sigma) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (IBL: Immuno-Biological Laboratories, Гумма, Япония) при 37C/5% CO. Клетки происходящей из рака поджелудочной железы человека клеточной линии MIAPaCa2 культивировали на DMEM с 10% фетальной бычьей сыворотки при 37C/5% CO.
Анализ клеточного цикла
o
Статус клеточного цикла в клетках, которые обрабатывали блеомицином или адриамицином, анализировали с помощью проточной цитометрии согласно описанию у Kawabe (1997) Nature 385:454-458. Вкратце, 2 млн клеток ресуспендировали и инкубировали в 200 мкл раствора Кришана (0,1% цитрата натрия, 50 мкг/мл йодида пропидия, 20 мкг/мл РНКазы A и 0,5% NP-40) в течение 1 часа при 4C и анализировали с помощью проточной цитометрии FACScan™ (Beckton Dickinson, Маунтин Вью, Калифорния) с применением программы CELLQuest™ (Beckton Dickinson).
<b>Таблица 1</b><b>Последовательности и соответствующие кодовые названия примеров пептидов/пептидомиметиков</b>
(l-Tyr)(l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(l-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(l-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr) (SEQ ID NO:105)
BP413
(l-Tyr)(l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(l-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(l-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr) (SEQ ID NO:106)
BP420
(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(l-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr) (SEQ ID NO:107)
BP430
(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(l-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Arg)(l-Ser)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr)(l-Tyr) (SEQ ID NO:108)
BP431
(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(l-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Ser)(d-Trp)(l-Pro)(l-Ser)(l-Tyr) (SEQ ID NO:109)
BP432
(l-Tyr)(l-Gly)(l-Arg)(l-Lys)(l-Lys)(l-Arg)(l-Arg)(l-Gln)(l-Arg)(l-Arg)(l-Arg)(l-Cha)(l-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-аминоундекановая кислота)(l-Tyr)(l-Tyr) (SEQ ID NO:110)
BP440
(d-Tyr)(d-Tyr)(d-Ser)(l-Gly)(d-Ser)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg)(d-Lys)(d-Lys)(d-Arg)(l-Gly)(d-Tyr) (SEQ ID NO:111)
BP450
(d-Tyr)(d-Ser)(d-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:87)
BP451
(d-Tyr)(d-Ser)(l-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:88)
BP452
(d-Tyr)(d-Ser)(d-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Pro) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (d-Gln) (d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:112)
BP454
(d-Tyr)(d-Ser)(l-Pro)(l-Trp)(l-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(l-Pro) (d-Arg)(d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:113)
BP455
(l-Tyr)(l-Tyr)(l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg)(d-Arg) (d-Lys)(d-Lys)(d-Arg) (l-Gly)(d-Tyr) (SEQ ID NO:114)
BP460
(l-Tyr)(l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha)(d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (d-Lys)(d-Lys)(d-Arg) (l-Gly)(d-Tyr) (SEQ ID NO:115)
BP461
(l-Tyr)(l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:116)
BP462
(l-аминоундекановая кислота) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Lys)(d-Lys)(d-Arg) (l-Gly)(d-Tyr) (SEQ ID NO:117)
BP463
(l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:118)
BP464
(l-аминоундекановая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:119)
BP465
(l-8-аминокаприловую кислоту)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:120)
BP466
(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:121)
BP470
(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln)(d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:122)
BP471
(d-Tyr)(d-Ser)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg) (d-Gln) (d-Arg)(d-Arg) (SEQ ID NO:123)
BP481
(d-Tyr)(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg)(d-Arg)(d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:124)
BP500
(d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:80)
BP501
(d-Bpa)(l-8-аминокаприловая кислота)(d-Cha)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:125)
BP502
(d-Bpa)(l-8-аминокаприловая кислота)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:126)
BP503
(d-Asp) (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:127)
BP504
(d-Bpa) (d-Asp) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:128)
BP505
(d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Asp) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:129)
BP506
(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (SEQ ID NO:93)
BP510
(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEQ ID NO:94)
BP511
(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Cha) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Bpa) (SEQ ID NO:95)
BP512
(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Bpa)(d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:130)
BP601
(d-Bpa)(l-8-аминокаприловая кислота) (d-Bpa) (d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:131)
BP602
(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser)(d-Phe<sub>4</sub>NO<sub>2</sub>)(d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:89)
BP603
(d-Bpa)(d-Pro)(d-Trp)(d-Pro)(d-Phe<sub>4</sub>NO<sub>2</sub>)(d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:132)
BP604
(d-Bpa)(d-Pro)(d-Trp)(d-Pro)(d-Phe<sub>4</sub>NO<sub>2</sub>)(d-Nal2)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:133)
BP605
(d-Phe<sub>4</sub>NO<sub>2</sub>)(d-Pro)(d-Trp)(d-Pro)(d-Phe<sub>4</sub>NO<sub>2</sub>)(d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:134)
BP606
(d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:90)
BP607
(d-Bpa) (d-Ser) (d-Trp) (d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:91)
BP608
(d-Bpa)(d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Lys)(d-Lys)(d-Lys)(d-Lys) (d-Lys) (d-Lys) (SEQ ID NO:92)
BP609
(d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:96)
BP700
(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:97)
BP701
(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:98)
BP702
(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:99)
BP703
(d-Bpa)(d-Cys)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6F)(d-Cha)(d-Cys) (SEQ ID NO:135)
BP524
(d-Tyr)(d-Cys)(d-Pro)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6F)(d-Cha)(d-Cys) (SEQ ID NO:136)
BP721
Пример 2
В указанном примере описаны данные, указывающие на блокирующую контроль в G2 активность различных пептидов и эффект различных пермутаций последовательностей на активность, в том числе – эффект уменьшения длины последовательности.
Анализ остановка контрольной точки в G2 с помощью проточной цитометрии выполняли с использованием клеточной линии Jurkat, происходящей из клеток лейкоза человека. Вкратце, культивированные клетки обрабатывали различными дозами пептида/пептидомиметика и 40 мкг/мл блеомицина в течение 24 ч. ДНК клеток окрашивали йодидом пропидия и анализировали с помощью проточной цитометрии. Указанные результаты обобщены в таблице 2.
Кривые зависимости «доза-эффект» для каждого пептида/пептидомиметика при применении против обработанных блеомицином клеток Jurkat приведены на фигурах 1, 5, 6, 7, 8, 11 и 12; на оси Y указан % клеток Jurkat в G2/M через 24 часа после обработки.
Анализ блокады контрольной точки в M-фазе указанными соединениями с помощью проточной цитометрии выполняли на клетках линии T-клеточного лейкоза человека Jurkat, обработанных колхицином (5 мкг/мл или 0,5 мкг/мл) с применением различных доз пептида/пептидомиметика, в течение 24 ч (фиг. 12). ДНК клеток окрашивали и анализировали с помощью проточной цитометрии согласно описанию выше. Указанные результаты также обобщены в таблице 2.
Кривые зависимости «доза-эффект» для каждого пептида/пептидомиметика при применении против обработанных колхицином клеток Jurkat приведены на фигурах 2 и 14; на оси Y указан % клеток Jurkat в G2/M через 24 часа после обработки.
<b>Таблица 2</b><b>Дозы соединений, индуцирующих блокаду контрольной точки или побочный эффект в контрольной точке G2</b>
Появление побочного эффекта при применении отдельной дозы
Доза для блокады контрольной точки в G2
Появление побочного эффекта при применении с колхицином
Кодовое название
(мкМ)
(мкМ)
(мкМ)
CBP441
>50
>50
>50
CBP462
>50
>50
>50
CBP464
>50
>50
>50
CBP470
>50
>50
>50
CBP430
>50
50
>50
CBP481
>50
>6,25
>12,5
CBP431
>50
≥3,125
>50
CBP420
>50
≥1,56
≥50
CBP440
>12,5
≥1,56
>3,125
CBP413
>25
≥1,56
>25
CBP450
>6,25
≥0,78
>6,25
CBP460
>3,125
≥0,39
>3,125
CBP461
>6,25
≥0,39
>6,25
CBP463
>6,25
≥0,39
>6,25
CBP500
>50
≥0,39
>12,5
CBP501
>50
≥0,39
>25
«Появление побочного эффекта при применении по отдельности» соответствует дозе пептида/пептидомиметика, обеспечивавшей нарушение клеточного цикла в клетках Jurkat, т.е. появление значимых количеств клеток SubG1 (мертвых клеток) или клеток, содержание ДНК в которых варьирует сильнее обычного. Например, клетки в G1 обычно демонстрируют в FACS-анализе резко выраженный пик, однако после обработки при нарушении клеточного цикла пик становится шире и ниже, что указывает на некорректное прохождение клеточного цикла или начало клеточной смерти. «Блокирующая контроль в G2 доза» соответствует дозе пептида/пептидомиметика с 40 мкг/мл блеомицина, обеспечивавшей детектируемую блокирующую контрольную точку в G2 активность после обработки в течение 24 часов. «Появление побочного эффекта при применении с колхицином» соответствует дозе пептида/пептидомиметика с 5 мкг/мл колхицина, обеспечивавшей нарушение клеточного цикла в клетках Jurkat после обработки в течение 24 часов.
2
Блокирующая контрольную точку в G2 активность CBP501 при комбинировании с цисплатином исследовали в различных клеточных линиях. Вкратце, цисплатин (3 мкг/мл) и CBP501 (0,4, 2 и 10 мкМ) одновременно добавляли в клеточную культуру, которую инкубировали в течение 3 часов при 37°C 5% CO. Среду удаляли аспирацией, добавляли свежую среду без указанных соединений и клетки инкубировали в течение дополнительных 45 ч. Клетки, в том числе неприкрепленные, собирали с применением раствора трипсина-EDTA, инкубировали с раствором Кришана и анализировали содержание ДНК с помощью проточной цитометрии согласно приведенному ранее описанию. Указанные результаты обобщены в таблице 3. Цветом выделены, кроме клеток HUVEC, клеточные линии, демонстрирующие значимое уменьшение популяции G2 и увеличении популяции суб-G1, что указывает на блокаду контрольной точки в G2 и сенситизацию к цисплатину, обусловленные CBP501. Наблюдение, заключающееся в том, что клетки HUVEC, представляющие собой клетки с нормальной контрольной точкой в G1, не были сенситизированы, по меньшей мере при концентрациях CBP501 до 50 мкМ, указывает на специфичность CBP501 в отношении контрольной точки в G2, а не отсутствие специфичности.
Исследовали блокирующую контрольную точку в G2 активность различных соединений в разных дозах на клетки происходящей из рака поджелудочной железы человека линии MIAPaCa2, обработанные блеомицином (Bleo) или адриамицином (ADR). Вкратце, клетки инкубировали с указанными соединениями и блеомицином (10мкг/мл) или адриамицином (1 мкг/мл) в течение 3 часов. Среду заменяли и инкубировали в течение дополнительных 21 часов. Собранные клетки окрашивали на ДНК йодидом пропидия и анализировали с помощью проточной цитометрии согласно приведенному ранее описанию. Процент (%) популяции суб-G1 клеток указан на фиг. 3 как погибшие клетки. Эти результаты указывают на то, что CBP501 сенситизировал клетки MIAPaCa2 к воздействию как блеомицина, так и адриамицина дозозависимым образом.
На фиг. 4A и 4C приведен обзор блокирующей контрольную точку в G2 активности, обеспечиваемой парами пептидов, в которых один остаток аминокислоты отличается от другого. Блокирующую контрольную точку в G2 активность указанных пептидов анализировали с использованием обработанных блеомицином клеток Jurkat согласно описанию выше. На фиг. 4B обобщены данные анализов на блокирующую контрольную точку M активность и/или неспецифическую токсичность, выполненных с применением пар пептидов, в которых один остаток аминокислоты отличается от другого. Блокирующую контрольную точку M активность и/или неспецифическую токсичность указанных пептидов анализировали с применением обработанных колхицином клеток Jurkat согласно описанию выше.
Исследовали блокирующую контрольную точку в G2 активность различных богатых аргинином последовательностей в разных дозах в отношении клеток, которые обрабатывали блеомицином. Вкратце, пептиды добавляли в культуральную среду клеток Jurkat с блеомицином (40 мкг/мл) в концентрации 0,2 мкг/мл, 0,39 мкг/мл, 0,78 мкг/мл, 1,56 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 25 мкг/мл и 50 мкг/мл. Затем через 24 часа клетки собирали, окрашивали раствором Кришана и анализировали с помощью проточной цитометрии согласно приведенному ранее описанию. На фиг. 5 приведен график зависимости процента клеток в G2/M (ось Y) от доз пептидов (ось X). Эти данные свидетельствуют о том, что богатая основными остатками последовательность «(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg)(d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:137)» является лучшей последовательностью, чем последовательности с меньшим или бόльшим числом остатков.
Исследовали блокирующую контрольную точку в G2 активность пептидов без (D-Bpa) в разных дозах в отношении клеток, которые обрабатывали блеомицином. Вкратце, пептиды добавляли в культуральную среду клеток Jurkat с блеомицином (40мкг/мл) в концентрации 0,2мкг/мл, 0,39 мкг/мл, 0,78 мкг/мл, 1,56 мкг/мл, 3,125 мкг/мл, 6,25 мкг/мл, 12,5 мкг/мл, 25 мкг/мл и 50 мкг/мл. Затем клетки собирали и анализировали с помощью проточной цитометрии согласно приведенному ранее описанию. На фиг. 6 приведен график зависимости процента клеток в G2/M (ось Y) от доз пептида (ось X). Данный результат показывает, что последовательность (Tyr)(Ser)(Pro)(Trp)(Ser) (Phe-2,3,4,5,6F)(Cha) (SEQ ID NO:138) обладаем сопоставимой с последовательностью (Bpa)(Ser)(Trp)(Ser)(Phe-2,3,4,5,6F)(Cha) (SEQ ID NO:139) блокирующей контрольную точку в G2 активностью.
Исследовали блокирующую контрольную точку в G2 активность богатых аргинином и богатых лизином последовательностей в разных дозах в отношении клеток, которые обрабатывали блеомицином. Вкратце, пептиды добавляли в культуральную среду клеток Jurkat с блеомицином (40мкг/мл) в заданной дозе (ось X). Затем клетки собирали и анализировали с помощью проточной цитометрии согласно приведенному ранее описанию. На фиг. 7 приведен график зависимости процента клеток в G2/M (ось Y) от доз пептида. Эти результаты указывают на то, что последовательности, богатые Arg, по-видимому, обеспечивают лучшую, чем последовательности, богатые Lys, активность богатой основными аминокислотами последовательности, и что Gln не является критически важным для функции указанной последовательности.
Исследовали блокирующую контрольную точку в G2 активность последовательностей, расположение богатой аргинином области в которых варьирует. Вкратце, пептиды добавляли в культуральную среду клеток Jurkat с блеомицином (40 мкг/мл) в заданной дозе (ось X) в течение 24 часов. Затем клетки собирали и анализировали с помощью проточной цитометрии согласно приведенному ранее описанию. на фиг. 8 приведен график зависимости процента клеток в G2/M (ось Y) от доз пептида.
Эти данные свидетельствуют о том, что блокирующая контроль в G2 активность пептидов значимо не изменяется при изменении расположения богатой аргинином области. Кроме того, CBP501 был водорастворим, а CBP511 – нет. Указанное отличие может быть полезным для конкретных систем доставки лекарственных средств, поскольку для некоторых систем водонерастворимые в воде соединения являются предпочтительными.
На фиг. 9 приведены обобщенные данные анализа, выполненного для разных пептидных пар, различающихся только одним остатком аминокислоты. Блокирующую контрольную точку в G2 активность указанных пептидов анализировали с использованием обработанных блеомицином клеток Jurkat согласно описанию.
Размер, заряд и гидрофобность каждой аминокислоты определяют, насколько эффективно последовательность встраивается в целевую молекулу. Боковая цепь пептида или пептидомиметика обладает свободой перемещения, таким образом, даже при наличии одной или двух неблагоприятных боковых цепей указанный пептид или пептидомиметик способен заполнять «карман» или борозду на целевой молекуле. Сводная информация свидетельствует о наличии предпочтительных размеров для каждой боковой цепи, которые указывают на предполагаемые размеры связывающей области («кармана» или борозды) целевого белка для каждой боковой цепи. Например, боковые цепи с кольцевой структурой, такие как бензен, индол и циклогексан, определяют выраженность блокады контрольной точки в G2 или блокады контрольной точки в M, и/или неспецифическую токсичность; см. фиг. 9 и 4, где более чем 5-членные кольцевые структуры мешают блокирующей контроль в G2 активности (средний размер в P1 и P2 повышает блокирующую контроль в G2 активность, тогда как слишком большой размер структуры (P1, P5 и P6) стимулирует остановку в M и/или повышает неспецифическую токсичность.
Боковые цепи без кольцевой структуры, по-видимому, являются нейтральными. Таким образом, для достижения лучшей активности желательно получение кольцевой структуры подходящего размера в P1, P2, P4 и P6, и либо отсутствие кольцевой структуры в P3 и P5, либо наличие кольцевой структуры, содержащей менее чем 6 членов. Подходящим кольцом для P1, P2 и P6 является 1–6-членное кольцо, полученное путем конденсации двух 5- или 6-членных колец. Кольцо подходящего размера для P4 представляет собой два сочлененных кольца, каждое из которых является 5- или 6-членным. Соответственно, для P1 оптимальными предположительно являются Cha или Nal(2); для P2 оптимальными предположительно являются Phe-2,3,4,5,6F, Phe-3,4,5F или Phe-CF3. Такие размеры боковых цепей указывают на наличие либо двух «карманов», либо одного «кармана» большего размера на участке целевой молекулы, с которой взаимодействует указанная область. Для P3 и P5 приемлема небольшая боковая цепь, например, Ser или Pro, и также приемлема боковая цепь большего размера, например, Arg, что указывает на отсутствие «кармана» в указанной области целевой молекулы, соответственно, боковые цепи могут просто располагаться напротив мишени. Тем не менее, возможно, что кольцевая структура может приводить к взаимодействию пептида или пептидомиметика с другой молекулой (т.е. не целевой молекулой), что, в свою очередь, может усиливать побочный эффект. Для P6 Bpa или Ser-Tyr предположительно подходят лучше, чем только Tyr или боковая цепь меньшего размера, что указывает на наличие более глубокой борозды, горизонтально расположенной на мишени. Также на мишени может присутствовать неглубокий и более широкий «карман» для P4, судя по размерам остатков для P4.
Следующие пептиды анализировали с применением клеток Jurkat и блеомицина согласно приведенному описанию. Последовательности пептидов представлены следующими: CBP501, (d-Bpa) (d-Ser)(d-Trp)(d-Ser) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Gln) (d-Arg) (d-Arg) (SEQ ID NO:80); CBP700, (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEQ ID NO:96); CBP701, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp) (d-Arg) (d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:97); CBP702, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg) (d-Bpa)(d-Arg)(d-Trp)(d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F)(d-Cha) (SEQ ID NO:98); и CBP703, (d-Arg) (d-Arg) (d-Arg)(d-Bpa)(d-Arg) (d-Arg) (d-Arg)(d-Phe-2,3,4,5,6-F) (d-Cha) (SEQ ID NO:99). Эти результаты указывают на то, что CBP700, 701, 702, 703, хотя их длина меньше, чем длина других приведенных примеров пептидов, сохраняют блокирующую контрольную точку в G2 активность, сопоставимую с другими пептидами, обладающими значимой блокирующей контрольную точку в G2 активностью (фиг. 11).
Проводили сравнение блокирующей контрольную точку в G2 активности и неспецифической токсичности (блокады контрольной точки в M) CB501. Вкратце, клетки Jurkat обрабатывали 40 мкг/мл блеомицина или 0,5 мкг/мл колхицина для блокирующей контрольную точку в G2 активности и неспецифической токсичности, соответственно. Количество ДНК в каждой из обработанных клеток анализировали с помощью проточной цитометрии согласно приведенному ранее описанию. Полученные данные свидетельствуют о том, что блокада контрольной точки в G2 под действием CBP501 происходила дозозависимым образом, а неспецифическая токсичность отсутствовала при применении концентраций пептида до 50 мкМ, по оценке на основании отсутствия изменения процента останавливающихся в M-фазе клеток (фиг. 12).
Пример 3
В настоящем примере описан анализ ингибирующей киназы активности и стабильности в сыворотке пептида/пептидомиметика для различных пептидов.
(R)
Так как две киназы, Chk1 и Chk2, важны для механизма контрольной точки в G2, проводили анализ ингибирования киназ для обоих ферментов. Анализ ингибирования киназ in vitro выполняли с применением наборов для нерадиоактивного анализа протеинкиназ PepTagот Promega в соответствии с протоколом компании, за исключением того, что вместо протеинкиназы С (PKC) использовали очищенную киназу CHK2. Очищенную PKC приобретали у Upstate Biotechnology, Inc. Полученные результаты представлены в таблице 4A.
<b>Таблица 4A</b><b>Анализ ингибирования киназ соединениями</b>
IC<sub>50</sub> в мкМ
PKA
CHK2
CBP450
>400
10
CBP440
180
8
2
Анализ ингибирования киназ in vitro выполняли в CycLex, Co. Ltd., Нагано, Япония. Вкратце, в качестве киназ использовали бакуловирусную рекомбинантную полноразмерную Chk1 человека с гистидиновой меткой или происходящую из E. coli рекомбинантную полноразмерную Chk2 человека, соединенную с глутатион-S-трансферазой (GST). Происходящую из E. coli рекомбинантную GST-Cdc25C (аминокислоты 167–267) использовали в качестве субстрата. Условия реакции: 20 мМ Hepes-KOH (pH7,5), 1мМ ДТТ, 80 мкг/мл БСА, 10 мМ MgCl и 50 мМ АТФ при 30° в течение 60 мин. Фосфорилирование серина в положении 216 на GST-Cdc25C детектировали с применением антитела против Cdc25C, фосфорилированного по S216, с помощью иммуноферментного анализа. Полученные результаты представлены в таблице 4B.
<b>Таблица 4B</b><b>Анализ ингибирования киназ пептидами</b>
CHK1
CHK2
P500
5,6
8
P501
7,9
18,6
P505
63,4
>100
P506
37,6
67
P603
15,5
18,1
50
Эти данные свидетельствуют о том, что ингибирование и киназы Chk1, и киназы Chk2 происходит при использовании доз, превышающих блокирующую контрольную точку в G2 дозу (концентрации IC для блокады контрольной точки G2 с помощью CBP500, 501, 505, 506, 603 составляют во всех случаях менее чем 1 мкМ). Полученные результаты предполагают, что указанные пептиды обладают дополнительным механизмом действия помимо ингибирования молекул Chk1/2. Как вариант, указанные пептиды, возможно, аккумулируются внутри клеток, так что их концентрация выше внутри клеток, чем в окружающей среде.
Для определения стабильности пептидов в сыворотке мыши и человека выполняли анализ сыворотки. Вкратце, пептиды (10 мМ или 2,5 мМ) инкубировали со свежеполученной сывороткой человека 37° в течение 1 ч. CBP501 (10 мМ) инкубировали со свежеполученной сывороткой мыши в течение 1 ч при 37°. Клетки Jurkat обрабатывали сывороткой с пептидами или без пептидов и блеомицином (40мкг/мл) и инкубировали в течение 24 ч. Популяцию клеток в G2-фазе определяли с помощью проточной цитометрии согласно приведенному ранее описанию. Остаточную блокирующую контрольную точку в G2 активность обработанных сывороткой пептидов определяли путем сравнения % клеток в G2 в обработанной сыворотке и стандартной кривой для обработанных средой пептидов, блеомицина и клеток Jurkat (таблица 5A). Остаточное количество CBP501 определяли с помощью ВЭЖХ после депротеинизации этанолом (таблица 5B). Эти данные свидетельствуют о том, что пептиды с аминокислотами d-типа, такие как CBP501 и CBP603, более стабильны в сыворотке, чем пептиды с аминокислотами l-типа, такие как CBP413.
<b>Таблица 5A</b><b>Анализ с обработанной сывороткой человека</b>
Остаточная активность пептида после 1 ч обработки сыворотки крови человека
CBP413
<0,4% от исходной
CBP501
>50% от исходной
CBP603
>50% от исходной
<b>Таблица 5B</b><b>Анализ с обработанной сывороткой мыши</b>
О статочный пептид после 1 ч обработки сыворотки крови человека
CBP501
>90%
Пример 4
in vivo
В настоящем примере описана оказывающая антипролиферативное действие на культивируемые клетки активность CBP501. В настоящем примере также описаны данные, демонстрирующие  активность пептидов/пептидомиметиков.
Для демонстрации оказывающей антипролиферативное действие на клетки активности соединений, культивированные клетки MIAPaCa2 карциномы поджелудочной железы человека обрабатывали CBP501 (10мкмМ), цисплатином (1, 3 или 9 мкг/мл) и оксалиплатином (1, 3 или 9 мкг/мл) по отдельности и в комбинации. Вкратце, клетки высевали с плотностью 300 клеток на лунку в 6-луночные планшеты, инкубировали в течение ночи и обрабатывали соединениями в течение трех часов. Среду заменяли и культивировали клетки в течение дополнительных 10 дней. Затем клетки фиксировали 70% метанолом, окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым и визуализировали. Результаты анализа колониеобразования показали, что CBP501 повышал цитотоксическую активность в отношении клеток MIAPaCa2 как цисплатина, так и оксалиплатина.
Аналогичные исследования проводили с применением нормальных эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). Поскольку нормальные клетки не образуют колоний, их высевали с плотностью 3000 клеток на лунку, а не 300 клеток на лунку. Полученные результаты показывают, что пептид сам по себе не нарушает рост нормальных клеток, а также не увеличивает цитотоксическую активность цисплатина и оксалиплатина в отношении клетки. Соответственно, указанные пептиды, по-видимому, не проявляют значимой блокирующей контроль в G2 активности в отношении нормальных клеток, подвергающихся повреждающей нуклеиновые кислоты обработке, в отличие от гиперпролиферирующих клеток, таких как раковые клетки, в которых происходит сенситизация к повреждающей нуклеиновые кислоты обработке. Результаты указывают на специфичность пептида в отношении сенситизации пролиферирующих клеток, но не нормальных клеток, к повреждающей нуклеиновые кислоты обработке.
<b>Таблица 6</b><b>Анализ ингибирования роста MIAPaCa2 с применением аламарового синего</b>
IC<sub>50</sub>
24 ч
48 ч
72 ч
Цисплатин
16 мкМ
31 мкМ
46 мкМ
CBP501
6 мкМ
10 мкМ
13 мкМ
CBP501 с 10 мкМ цисплатином
0,6 мкМ
1 мкМ
6 мкМ
50
Анализ с аламаровым синим выполняли для оценки ингибирующей рост активности CBP501 с цисплатином и без цисплатина. Вкратце, клетки MIAPaCa2 подвергали воздействию 1, 3, 10, 30, 100 мкМ цисплатина или 0,22, 0,67, 2, 6 и 18 мкМ CBP501 с 10 мкМ цисплатином или без цисплатина в течение трех часов в 96-луночных планшетах в плотностью 2500 клеток на лунку в двух повторностях. Среду заменяли и инкубировали в течение дополнительных 24, 48 или 72 часов. После инкубирования в каждую лунку добавляли по 20 мкл 90% реагента аламаровый синий еще на 6 часов для детекции жизнеспособности клеток на основании интенсивности флуоресценции. Интенсивность флуоресценции измеряли с применением планшет-ридера Spectrafluor Plus с возбуждением на 530 нм и эмиссией на 590 нм. Вычисляли IC (Таблица 6).
50
Результаты данного исследования показывают, что CBP501 по отдельности ингибирует рост клеток лучше, чем цисплатин в молярной дозе. CBP501 подавлял рост клеток в значительно более низкой дозе при комбинировании с 10 мкМ цисплатина, что приблизительно соответствует дозе цисплатина, используется для лечения раковых заболеваний. Кроме того, подавляющая рост активность CBP501 отличалась большей продолжительностью, чем цисплатин; показатели IC через 72 часа были значительно лучше при использовании CBP501 по сравнению с цисплатином.
in vivo
Период полужизни CBP501 определяли путем количественного определения CBP501 в сыворотке мыши через 1, 3 и 6 ч после интраперитонеальной инъекции CBP501 (40 мг/кг). Остаточное количество интактного CBP501 определяли с помощью ВЭЖХ после депротеинизации этанолом сыворотки, извлеченной из получавших инъекции мышей (таблица 7).
<b>Таблица 7</b><b>Период полужизни CBP501 </b><b><i>in vivo</i></b>
Период полужизни после интраперитонеальной инъекции 40 мг/кг
CBP501
3 ч
Для определения толерантности к пептидам мышам в группах из десяти мышей инъецировали CBP501 однократно внутривенно (5, 8 или 10 мг/кг) или однократно интраперитонеально (50, 80 или 100 мг/кг). Выживаемость получивших инъекции мышей отслеживали в течение недели (таблица 8).
<b>Таблица 8</b><b>Максимально переносимая доза у мышей при однократной инъекции</b>
МПД (в/в)
МПД (и/п)
CBP413
14 мг/кг
146,7 мг/кг
CBP501
10 мг/кг
98,8 мг/кг
in vivo
3
Для исследования эффективности соединений клетки MIAPaCa2 карциномы поджелудочной железы человека имплантировали подкожно мышам ТКИН. Лечение начинали, когда размер первичной опухоли достигал 0,1 см (День 0) или более, например, 7 или 8 мм в диаметре. CDDP (3 мг/кг) и CBP501 (10 или 40 мг/ кг) вводили интраперитонеально, по отдельности или в комбинации. Размеры опухолей определяли с применением калипера три раза в неделю, объем вычисляли по формуле: масса (мг)=[ширина (мм)2×длина (мм)]/2. Строили график зависимости среднего размера опухолей для каждой экспериментальной группы (n=4) от количества дней после начала лечения (фиг. 10).
in vivo
Полученные результаты показывают, что лечение отдельно CBP501 подавляет рост клеток рака поджелудочной железы человека . Указанные результаты также показывают, что CBP501 повышал противоопухолевую активность цисплатина.
Пример 5
Указанный пример включает описание рака легких и исследований с применением CBP501.
Рак легких является ведущей причиной смерти от рака среди взрослого населения в западных странах. В США в 2009 г. было диагностировано 219440 новых случаев заболевания, и 159390 летальных исходов было обусловлено указанным заболеванием, являющегося причиной приблизительно 29% от всех случаев смерти от рака (см., например, отчет Американского онкологического общества (American cancer society, Cancer Facts & Figures 2009)). Восемьдесят семь процентов (87%) всех новых случаев рака легких гистологически представлены немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ), разделяемым на три основных типа: аденокарцинома, плоскоклеточная (эпидермоидная) карцинома и крупноклеточная карцинома (American cancer society, Cancer Facts & Figures 2009). Несмотря на усовершенствование хирургических техник и комбинированных методов лечения, прогноз для пациентов с диагнозом НМРЛ остается неблагоприятным. Показатель пятилетней выживаемости составляет 47% для случаев, детектированных на ранней стадии, когда заболевание еще является локализованным, однако у большинства пациентов НМРЛ (68%) (см., например, руководство по стадированию рака Американского объединенного онкологического комитета (AJCC Cancer Staging Manual, в: Fleming ID, editor. Philadelphia: Lippincott-Raven; 2002) диагностируют распространенный рак (стадия III) или метастатический рак (стадия IV), при котором необходима химиотерапия. Показатели пятилетней выживаемости составляют 8,4% для пациентов с заболеванием на стадии III и 1,6% для стадии IV, при этом большинство пациентов с распространенным НМРЛ умирает в результате указанного заболевания в течение 2 лет (см., например, American cancer society, Cancer Facts & Figures 2009; руководство по стадированию рака AJCC (AJCC Cancer Staging Manual. In: Fleming ID, editor. Philadelphia: Lippincott-Raven; 2002)). Существует нереализованная потребность во внедрении новых терапевтических средств, способных обеспечить значительное повышение выживаемости пациентов и улучшение качества жизни.
У пациентов с распространенным (стадии IIIb или IV) НМРЛ, у которых наблюдается хорошее общее состояние, химиотерапия может давать благоприятные результаты (см., например, Souquet, PJ., et al., Lancet 342:19-21, 1993; Marino, P., et al., Chest 106:861-865, 1994; Marino, P., et al., Cancer 76:593-601, 1995; Helsing, M., et al., Eur J Cancer 34:1036-1044, 1998; Cullen, MH., et al., J Clin Oncol 17:3188-3194, 1999; Pfister, DG., et al., J Clin Oncol 22:330-353, 2004). Химиотерапия на основе двух препаратов, как было показано, улучшает выживаемость по сравнению с применением агентов по отдельности или с отсутствием химиотерапии (см., например, Bunn, PA., et al., J Clin Oncol 20:23S-33S, 2002). Рекомендуемые в настоящее время схемы химиотерапии первой линии при распространенном НМРЛ включают соединения платины (цисплатин [CDDP] или карбоплатин) в комбинации с гемцитабином, винорелбином или таксанами (паклитаксел или доцетаксел), иринотеканом, этопозидом, винбластином и/или пеметрекседом в качестве эталонных схем (Pfister, DG., et al., J Clin Oncol 22:330-353, 2004).
В рандомизированных исследованиях было показано, что различные двойные комбинации с платиной обладают аналогичной эффективностью, хотя схемы немного отличаются с точки зрения токсичности, стоимости и удобства. Результаты указывают на частоту общего ответа (ORR) от 17% до 32%, медиану продолжительности выживания от 7 до 10 месяцев, и однолетнюю выживаемость от 30 до 45% (см., например, Scagliotti, G., et al., Semin Oncol 32:S5-S8, 2005; Schiller, JH., et al., N Engl J Med 346:92-98, 2002; Scagliotti, G., et al., J Clin Oncol 20:4285-4291, 2002; Kelly, K., et al., J Clin Oncol 19:3210-3218, 2001; Fossella, F., et al., J Clin Oncol 21:3016-3024, 2003).
В большинстве случаев тройная химиотерапия до сих пор не приводила к дальнейшему увеличению выживаемости, при этом повышая токсичность. В недавнем исследовании комбинации карбоплатин + паклитаксел + бевацизумаб, тем не менее, было продемонстрировано некоторое улучшение выживаемости (см., например, Sandler, A., et al., N Engl J Med 355:2542-2550, 2006), свидетельствующее, что добавление агента направленного действия с неперекрывающейся токсичностью может улучшать показатели двойной терапии. Предпринимаются активные попытки оптимизации благоприятных эффектов химиотерапии за счет применения молекулярных маркеров, отражающих противоопухолевую активность. Появляются данные о генах с прогностическими свойствами относительно эффективности химиотерапии при НМРЛ (см., например, Bepler, G., et al., ASCO Educational Book :350-352, 2008; Sommers, K., et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26 2008). Среди них заслуживают упоминания такие маркеры, как ERCC1, BRCA1/2, RRM1 и TS (Таблица 9).
<b>Таблица 9</b><b>Молекулярные маркеры с прогностическими</b><b>свойствами в отношении эффективности химиотерапии при НМРЛ</b>
Маркер
Экспрессия
Чувствительность
Устойчивость
ERCC1
↑
Агенты с платиной
↓
Агенты с платиной
BRCA1/2
↓
Агенты с платиной
Таксан
RRM1
↑
Гемцитабин
↓
Гемцитабин
TS
↑
Пеметрексед или 5-FU
↓
Пеметрексед или 5-FU
Пример 6
Указанный пример включает описание данных, указывающих на положительные результаты применения комбинаций пептидов и химиотерапевтических (повреждающих нуклеиновые кислоты) агентов в определенных субпопуляциях пациентов-людей. Неожиданным образом, полученные данные показывают, что в подгруппе популяции пациентов в клиническом исследовании неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого НМРЛ), где содержание ББК составляло менее чем 10 000 белых клеток крови (БКК) на кубический миллиметр крови до лечения CBP501, наблюдались положительные результаты при введении CBP501.
CBP501 представляет собой синтетический додекапептид, который состоит полностью из D-аминокислот (фиг. 13). Он представляет собой усовершенствованный вариант TAT-S216A, который был оптимизирован в отношении активности, направленной на уменьшение аккумуляции клеток в фазе G2 (4N) в ответ на обработку повреждающими ДНК агентами, согласно анализу на содержание ДНК на основе проточной цитометрии.
Было проведена два исследования фазы I с подбором дозы и исследованием фармакокинетики, для изучения CBP501 всего на 78 пациентах: исследование монотерапии CBP501, вводимого в виде 60-минутной в/в инфузии на 1, 8 и 15 день, с повторением каждые 4 недели, и исследование комбинированной терапии с цисплатином, с введением раз в 3 недели (см., например, Shapiro, GI., et al., Clin Cancer Res. May 15;17(10):3431-42, 2011).
Исследование однокомпонентной терапии фазы I (CBP04-01): исследование представляло собой исследование фазы I первого применения у человека однокомпонентной терапии с эскалацией дозы, с тестированием схемы, включающей три инъекции (дни 1-8-15), вводимые каждые 28 дней, в популяции пациентов с распространенными солидными опухолями. Всего было проведено 68 циклов, среднее количество циклов на одного пациента составило 2 (диапазон: 1–8). Два пациента, у одного из которых был диагностирован рак поджелудочной железы и у другого – рак яичников, прошли 7 циклов лечения при стабильном заболевании. Большинство пациентов (87%) досрочно выбыли из исследования ввиду прогрессирования заболевания. Выбывшие досрочно из-за токсичности пациенты отсутствовали (см., например, Shapiro, GI., et al., Clin Cancer Res. May 15;17(10):3431-42, 2011).
Исследование фазы I CBP501 в комбинации с цисплатином (CBP06-01): Основной целью указанного исследования фазы I было определение МПД и РД CBP501 и цисплатина при введении в комбинации, однократно каждый 21 день. Сначала вводили CBP501 в виде 1-часовой инфузии, а затем, через 2 часа после начала лечения, вводили цисплатин. Пациенты также получали профилактическое лечение аллергических реакций в соответствии с этой же схемой, разработанное для однокомпонентного исследования фазы I (лоратадин, дексаметазон, ранитидин и дифенгидрамин).
2
2
2
2
2
2
Всего 48 пациентов получали лечение в трех центрах в США, было проведено всего 182 цикла, среднее количество циклов на одного пациента составило 4 (диапазон: 1–13). CBP501 был исследован в диапазоне доз от 3,6 мг/м до 36,4 мг/м. Максимальная исследованная величина дозы составила 36,4 мг/м для CBP501 и 75 мг/м для цисплатина. При указанной величине дозы у 2 из 6 пациентов наблюдались аллергические реакции, которые исследователи сочли дозолимитирующими (3 степень). МПД была определена как величина дозы, непосредственно предшествующая указанной, что составляло для CBP501 24,3 мг/м и для цисплатина 75 мг/м. Признаки активности были зарегистрированы у нескольких пациентов (см., например, Shapiro, GI., et al., Clin Cancer Res. May 15;17(10):3431-42, 2011).
Цисплатин (цис-диаминодихлорплатина), органический координационный комплекс с платиной, вступает в реакцию с остатками гуанина и аденина ДНК преимущественно в положении N7, с образованием различных монофункциональных и бифункциональных аддуктов. Указанные аддукты вносят вклад в цитотоксичность лекарственного средства, препятствуя различным клеточным процессам, которые требуют разделения обеих нитей ДНК, например, репликации и транскрипции.
Активность цисплатина в отношении различных опухолей клинически оценивалась ввиду его выраженной противоопухолевой активности против рака яичка и рака яичников. С момента утверждения цисплатин был важнейшим химиотерапевтическим агентом и широко использовался по отдельности или в комбинации с другими противоопухолевыми агентами. Также известно, что цисплатин обеспечивает существенный паллиативный эффект у пациентов с другими типами опухолей, например, раком легких, карциномой мочевого пузыря, карциномой головы и шеи, и его включают в большинство схем химиотерапии, используемых при указанных заболеваниях.
Пеметрексед динатрия представляет собой структурно новый антифолат, содержащий уникальное 6-5-конденсированное пирроло[2,3-d]пиримидиновое ядро, и ингибирующий функцию зависимых от фолиевой кислоты ферментов, участвующих в синтезе субстратов, необходимых для роста и деления клеток, таких как тимидилатсинтаза, дигидрофолатредуктаза и глицинамидрибонуклеотидформилтрансфераза (см., например, Taylor, EC., et al., J Med Chem 35:4450-4454, 1992; Schultz, RM., et al., Anticancer Res 19:437-443, 1999).
Пеметрексед продемонстрировал активность в клинических испытаниях для широкого спектра типов опухолей, в том числе опухолей легких, молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, плевры, желудка, мочевого пузыря, головы и шеи, и шейки матки. Пеметрексед в комбинации с цисплатином был одобрен FDA 4 февраля 2004 года для лечения пациентов с MPM, либо имеющих неоперабельное заболевание, либо по другим причинам не подходящих в качестве кандидатов для хирургического лечения.
В исследованиях фазы II на ранее не получавших химиотерапию пациентов с НМРЛ пеметрексед в комбинации с цисплатином или карбоплатином давал результаты, сопоставимые по эффективности с другими вариантами двойной терапии с платиной (см., например, Scagliotti, G., et al., Clin Cancer Res 11:690-696, 2005; Zinner R., et al., Cancer 104:2449-2456, 2005; Manegold, C., et al., Ann Oncol 11:435-440, 2000; Shepherd, FA., et al., Cancer 92:595-600, 2001). Кроме того, пеметрексед имеет отличный профиль безопасности и удобный режим применения.
В недавнем рандомизированном исследовании фазы III проводилось сравнение, в исследовании отсутствия меньшей эффективности, общей выживаемости (OS) среди 1725 ранее не получавших химиотерапию пациентов с НМРЛ III или IV стадии при лечении цисплатином в сочетании с гемцитабином, или цисплатином в сочетании с пеметрекседом, каждые три недели, с проведением до 6 циклов лечения (см., например, Scagliotti, G., et al., J Clin Oncol 26:3543-3551, 2008; Pimentel, F., et al., Proc Am Soc Clin Oncol 26 (Part I of II):448s, 2008, (Suppl. 15S) (abstr) #448s). Показатель OS для цисплатина в сочетании с пеметрекседом был не ниже, чем для цисплатина в сочетании с гемцитабином (медиана выживаемости 10,3 месяца для обоих вариантов лечения). Показатель OS был статистически выше для цисплатина в сочетании с пеметрекседом по сравнению с цисплатином/гемцитабином у пациентов с гистологически определяемой аденокарциномой (n=847; 12,6 месяцев и 10,9 месяцев, соответственно) и крупноклеточной карциномой (n=153; 10,4 месяца и 6,7 месяца, соответственно). Для цисплатина в сочетании с пеметрекседом показатели 3-й и 4-й степени нейтропении, анемии и тромбоцитопении; фебрильной нейтропении; и алопеции были значительно ниже, чем в группе, получавшей цисплатин/гемцитабин, тогда как тошнота 3-й и 4-й степени наблюдалась чаще.
ПАЦИЕНТЫ И СПОСОБЫ:
Дизайн клинического исследования: Открытое многоцентровое рандомизированное двухгрупповое сравнительное исследование фазы II. Протокол для оценки полной дозы цисплатина и пеметрекседа с CBP501 или без CBP501. Пациенты были рандомизированы в соотношении 1:1 в группу, получавшую пеметрексед, цисплатин и CBP501 (Группа A) или группу, получавшую пеметрексед и цисплатин (Группа B). Рандомизация была стратифицирована по исходной стадии заболевания (IIIb или IV), наличию метастазов в головной мозг и адекватности терапии бевацизумабом для тех или иных пациентов.
Местонахождение исследователей/место проведения исследования: приблизительно 40 центров в США, России, Канаде, Бразилии, Аргентине и Перу.
Цели исследования:
Первичные: Сравнение эффективности действия на выживаемость без прогрессирования цисплатина и пеметрекседа с CBP501 или без CBP501 у пациентов с локально распространенным (стадия IIIB со злокачественным плевральным или перикардиальным выпотом) или метастатическим (стадия IV) неплоскоклеточным НМРЛ.
Вторичные: Описание профиля безопасности режима исследования и других параметров эффективности помимо выживаемости без прогрессирования, таких как общая выживаемость.
Исследуемая популяция:
Критерии включения:
1. Подписанное информированное согласие, полученное до начала каких-либо связанных с исследованием процедур
2. Гистологически или цитологически подтвержденный диагноз неплоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), не подлежащего радикальной резекции, стадия IIIB с плевральным или перикардиальным выпотом, или стадия IV, не получавшие ранее химиотерапии или другого системного лечения
3. По меньшей мере один одномерно измеримый очаг поражения в соответствии с критериями оценки ответа солидных опухолей (RECIST)
4. Пациенты мужского или женского пола возрастом по меньшей мере 18 лет
5. Показатель общего функционального состояния (PS) по шкале ECOG: 0–1
6. Ожидаемая продолжительность жизни>3 месяцев
7. Допустима локальная радиационная терапия, если она была завершена ≥3 недели до введения первой дозы исследуемого медикамента
8. Допускается сопутствующая паллиативная радиационная терапия существующего костного очага поражения для контроля болевого синдрома
9. Допускается предшествующая операция, если она была проведена по меньшей мере за 4 недели до введения первой дозы исследуемого медикамента, и пациент полностью восстановился
10. Адекватное функционирование органов, в том числе:
9
9
9
- Костного мозга: содержание лейкоцитов (ББК)≥4×10/л, абсолютное содержание нейтрофилов (ANC)≥1,5×10/л, содержание тромбоцитов ≥100×10/л, гемоглобин ≥9 г/дл
Печени: Билирубин ≤1,5× верхняя граница нормы (ВГН), аспартаттрансаминазы (AST/SGOT) и аланинтрансаминазы (ALT/SGPT) ≤2,5×ВГН (или ≤5×ВГН, если присутствуют метастазы в печень), INR≤1,5×ВГН, альбумин ≤3,0 г/дл
- Почек: Креатинин сыворотки ≤1,5 мг/дл, или клиренс креатинина ≥45 мл/мин (вычисляется по формуле Кокрофта-Голта)
11. У пациентов женского пола, обладающих детородным потенциалом, должен наблюдаться отрицательный результат теста на беременность, и они должны использовать по меньшей мере один из одобренных исследователем типов контрацепции на протяжении 4 недель до начала исследования и в течение 4 месяцев после получения последней дозы исследуемого лекарственного средства. Для целей указанного исследования обладающие детородным потенциалом пациенты определены как: «все пациенты женского пола, за исключением вступивших в постклимактерический период по меньшей мере 1 год назад или прошедших хирургическую стерилизацию»
12. Пациенты мужского пола должны использовать одобренную исследователем форму барьерной контрацепции на протяжении исследования и в течение 4 месяцев после получения последней дозы исследуемого лекарственного средства
13. Способность к сотрудничеству в ходе лечения и последующего наблюдения
Критерии исключения:
1. Лучевая терапия более чем 30% костного мозга до включения в исследование
2. Наличие нейроэндокринных признаков в образце опухоли
3. Предшествующее лечение с применением химиотерапии, новых методов биологической терапии (малых молекул, антител), иммунотерапии
4. Отсутствие измеримых очагов поражения
5. Продолжающаяся или активная инфекция, симптоматическая застойная сердечная недостаточность, нестабильная стенокардия, симптоматическая или плохо контролируемая сердечная аритмия, неконтролируемое тромботическое или геморрагическое расстройство, или любое другое серьезное неконтролируемое медицинское расстройство с точки зрения исследователя
6. Любое другое предшествующее злокачественное новообразование в анамнезе в течение 5 лет до включения в исследование (кроме излеченной базальной карциномы кожи или излеченной местной карциномы шейки матки)
7. Наличие каких-либо значительных расстройств центральной нервной системы (ЦНС) или психиатрического(их) расстройств(а), препятствующих комплаентности пациента
8. Признаки периферической невропатии >1 степени в соответствии с NCI-CTCAE, версия 3
9. Лечение любым другим экспериментальным агентом, или участие в другом клиническом испытании в течение 28 дней до включения в исследование
10. Беременные или кормящие пациенты, или любой пациент с детородным потенциалом, не использующий адекватные средства контрацепции
11. Установленная инфекция ВИЧ, ВГВ, ВГС
12. Наличие симптоматических метастазов в головной мозг. Пациенты с метастазами в головной мозг должны:
- Иметь стабильный неврологический статус после местной терапии (хирургической или лучевой) на протяжении по меньшей мере 2 недель после завершения радикальной терапии и прекратить применение кортикостероидов в течение 1 недели до включения в исследование.
- Не иметь неврологических дисфункций, которые могли бы исказить оценку неврологических и других НЯ
13. Невозможность или нежелание принимать фолиевую кислоту, витамин В12 или кортикостероиды
14. Невозможность прервать прием аспирина или других нестероидных противовоспалительных агентов, за исключением дозы аспирина ≤1,3 г в сутки, на период продолжительностью 5 дней (8 дней для агентов длительного действия, например, пироксикама)
15. Значительная потеря веса (≥10% массы тела в течение предшествующих 6 недель)
16. Наличие клинически значимого (по результатам физического осмотра) интерстициального скопления жидкости, например, асцита или плеврального выпота, который не поддается контролю с помощью дренажа или других процедур, до включения в исследование
Число пациентов:
Всего 195 пациентов получали лечение, при этом 97 пациентов получали лечение CBP501, цисплатином и пеметрекседом (Группа A), и 98 пациентов получали лечение пеметрекседом и цисплатином (Группа B).
Исследуемое лекарственное средство:
Состав: CBP501 для инъекций находился в однодозных флаконах (20 мг) со стерильным лиофилизированным порошком, содержащим ацетатную соль пептида CBP501 (базовые пептидные единицы). Для введения содержимое флакона восстанавливали в 5% растворе декстрозы, USP, и добавляли в пакет для внутривенного введения объемом 100 мл с 5% декстрозой для инъекций, USP.
Пеметрексед: Использовали коммерческий состав с пеметрекседом, с восстановлением в 20 мл 0,9% раствора хлорида натрия для инъекций и последующим разведением до 100 м.
Цисплатин: Использовали коммерческий состав с цисплатином и разбавляли в 250 мл нормального солевого раствора для введения.
Режим дозирования и способ введения:
CBP501, пеметрексед и цисплатин вводили в один день (День 1), каждые 3 недели, на протяжении максимум 6 циклов. Цикл приравнивали к 3 неделям (21 дню).
Группа A
2
1. CBP501 25 мг/м вводили в виде в/в инфузии в течение 1 часа.
2
2. Пеметрексед 500 мг/м вводили в виде в/в инфузии в течение 10 минут, непосредственно после инфузии CBP501.
2
3. Цисплатин 75 мг/м вводили в виде 1-часовой в/в инфузии непосредственно после инфузии пеметрекседа.
Группа B
2
1. Пеметрексед 500 мг/м вводили в виде в/в инфузии в течение 10 минут.
2
2. Цисплатин 75 мг/м вводили в виде 1-часовой в/в инфузии непосредственно после инфузии пеметрекседа.
Каждую комбинацию вводили через центральный или периферический венозный доступ.
Профилактическое лечение:
Все зарегистрированные пациенты получали:
1. Витамины: все пациенты получили указание принимать низкодозовый пероральный состав с фолиевой кислотой или поливитамины с фолиевой кислотой на ежедневной основе. По меньшей мере 5 ежедневных доз фолиевой кислоты должны быть приняты в течение 7-дневного периода, предшествующего введению первой дозы пеметрекседа, и дозирование следует продолжать в течение всего курса терапии и в течение 21 дня после введения последней дозы пеметрекседа. Рекомендуемая доза фолиевой кислоты находилась в диапазоне 350-1000 мкг. Пациенты должны быть также получить одну (1) внутримышечную инъекцию витамина В12 в течение недели, предшествовавшей введению первой дозы пеметрекседа, затем повторяемую через каждые 3 цикла. Последующие инъекции витамина B12 могли быть получены в один день с пеметрекседом. Доза витамина В12 составляла 1000 мкг.
2. Дексаметазон 4 мг перорально, два раза в сутки, за 1 день до введения лечения, в день введения лечения и через день после введения лечения.
3. Профилактическое противорвотное лечение: состоящее из антагонистов 5HT3 + стероиды в соответствии с стандартными протоколами терапевтического центра. В случае необходимости пациенты дополнительно получали противорвотные средства для перорального применения.
- Для пациентов без сердечно-сосудистых нарушений был предложен следующий протокол восполнения жидкости. Могли быть реализованы и аналогичные протоколы, рутинные для исследовательских центров:
4
1. Пациенты получали всего 1,5–2,0 л жидкости (5% декстрозы или 1/2 нормального солевого раствора) с 20 мЭкв KCl/ литр и 1 г MgSO/литр, со скоростью 500 мл/с.
2. После введения пациенту жидкости путем инфузии в течение 1 ч В/В струйно вводили 12,5 г маннита.
3. Затем в течение 1 часа вливали инфузионный состав с цисплатином (смешанный с нормальным солевым растворов в концентрации 1 мг/мл), при продолжении инфузии для восполнения жидкости.
4. Дополнительно вводили маннит (12,5–50,0 г В/В струйно), при необходимости поддержания мочевыделения на уровне 250 мл/час на протяжении восполнения жидкости.
- Для пациентов, получавших лечение CBP501 (Группа A), рекомендовано применение следующей профилактической схемы для уменьшения вероятности возникновения и тяжести симптомов, обусловленных высвобождением гистамина:
1. Дифенгидрамин (DPH) 50 мг В/В и ранитидин 50 мг В/В (или другой H2-антагонист гистамина) перед каждой инфузией CBP501.
2. Лоратадин (10 мг) п/о за день до введения CBP501 (день -1), в день введения CBP501 (день 0) и через день после введения CBP501 (день 1).
Продолжительность периода исследования для одного пациента:
Пациенты получают максимум 6 циклов исследуемого лечения, если ранее не наблюдалось что-либо из следующего:
- прогрессирование заболевания
- неприемлемая токсичность
- отзыв согласия
- серьезное нарушение протокола
- задержка лечения >2 недель (за исключением случаев потенциального или установленного благоприятного эффекта для пациента)
После прекращения лечения проводится наблюдение за пациентами каждые 8 недель до прогрессирования заболевания или начала дальнейшей системной противораковой терапии, и затем каждые 6 месяцев пожизненно.
Информированное согласие
Исследователь подробно объяснял пациенту цель и методы исследования, а также описывал любые ожидаемые результаты и неблагоприятные реакции до проведения каких-либо связанных с исследованием процедур скрининга. Пациенту выдавали информационный лист и предоставляли достаточное время и возможность задать вопросы относительно подробностей исследования, и принять решение об участии или неучастии. Пациент и специалист, с которым обсуждалось информированное согласие, подписывали и датировали форму о согласии.
Исследователь объяснял, что пациент имеет полное право отказаться вступать в исследование или выйти из него в любое время и по любой причине. Аналогичным образом, исследователь и/или заказчик имели полное право исключить пациента в любое время по соображениям безопасности или административным причинам. Были разъяснены все прочие требования, необходимые для защиты прав человека пациента в соответствии с действующей редакцией CFR (21, части 312D, 50 и 56), руководящими принципами надлежащей клинической практики (GCP) Международной конференции по гармонизации (ICH E6 1997), и Хельсинкской декларацией 1964 г. (уточненной в Токио в 2004 году).
Назначение номеров пациентов
Рандомизация пациентов и распределение по экспериментальным группам проводились централизованно.
Статистический анализ:
Применяли модель пропорциональных рисков Кокса для сравнения отношения рисков (HR) для выживаемости без прогрессирования (PFS) в двух экспериментальных группах. Модель включала экспериментальную группу в качестве фактора, а также факторы рандомизации стратификации. Исследовались следующие ковариаты: возраст, пол, раса (европеоид/не европеоид), предоперационный период/период до проведения процедур (да/нет), период до проведения радиационной терапии (да/нет), интерпретация рентгенограммы (нормальная/ аномальная), интерпретация ЭКГ (нормальная/аномальная), остеосцинтиграфия (нормальная/ аномальная) и время от постановки диагноза. Любые непрерывные переменные, такие как возраст и время от постановки диагноза до лечения, могли быть перед проведением лечения преобразованы в категориальные переменные, с указанием 2 или нескольких классов значений, если это обеспечивало лучшую подгонку модели. Поисковые переменные вводили с применением алгоритма ступенчатой регрессии, используя следующие критерии: переменная должна быть значимой на уровне 0,25 для введения в модель и значимой на уровне 0,15, чтобы оставаться в модели. В окончательной модели точечная оценка показателей отношения рисков приведена вместе с 95% ДИ.
Субгрупповой анализ проводился для пациентов с содержанием БКК при скрининге <10000 мкл. Дополнительный субгрупповой анализ выполняли с применением программного обеспечения GraphPad Prism 5 с анализом необработанных данных по каждому пациенту.
Полученные показатели эффективности
:
Анализ с применением модели пропорциональных рисков Кокса без изучения эффекта других ковариат на выживаемость без прогрессирования (PFS) показал, что в Группе A (группа с CBP501) наблюдался более высокий риск, чем в Группе B (HR=1,20 [0,88, 1,65]), однако указанный результат не был статистически значимым (P=0,25). Исследование других ковариат с применением той же модели также показало, что в Группе A наблюдался более высокий риск, чем в Группе B (HR=1,21 [0,85, 1,73]), однако указанный результат не был статистически значимым (P=0,30).
Для пациентов с содержанием БКК<10000/мкл при скрининге анализ с применением модели пропорциональных рисков Кокса без изучения других ковариат показал, что в Группе А наблюдается более высокий риск, чем в группе B (HR=1,04 [0,73, 1,49]), однако указанный результат не был статистически значимым (P=0,81). Исследование других ковариат с применением той же модели также показало, что в Группе A наблюдался более высокий риск, чем в Группе B (HR=1,06 [0,71, 1,59]), однако указанный результат не был статистически значимым (P=0,78).
Было отмечено, что отношение рисков для PFS улучшается для Группа A в обоих анализах при ограничении анализа пациентами, имевшими содержание БКК <10000/мкл при скрининге (таблицы A, B).
<b>Таблица A</b><b>Анализ Кокса эффекта ковариат на PFS без изучения эффекта других ковариат</b>
PFS с независимым радиологическим обследованием
Анализ ковариат Кокса без изучения других ковариат
Отношение рисков
P-значение
Лечение ОЛЛ
1,20
0,25
БКК<10000
1,04
0,81
<b>Таблица B</b><b>Анализ Кокса эффекта ковариат на PFS с исследованием других ковариат</b>
Исследование других ковариат
отношение рисков
P-значение
Лечение ОЛЛ
1,21
0,30
БКК<10000
1,06
0,78
Анализ общей выживаемости (OS) с применением модели пропорциональных рисков Кокса для всей экспериментальной популяции
В Группе A наблюдался меньший риск, чем в Группе B при исследовании или без исследования других ковариат (HR=0,96 и 0.77). Различие не было статистически значимым (P=0,82 и 0,25).
Анализ OS с применением модели пропорциональных рисков Кокса для пациентов с содержанием БКК < 10000/мкл при скрининге
При анализе OS для пациентов из экспериментальной популяции с содержанием БКК<10000/мкл при скрининге в Группе A наблюдался меньший риск, чем в Группе B, при исследовании или без исследования других ковариат (HR=0,80 и 0,69); различие не было статистически значимым (P=0,32 и 0,16).
Было отмечено, что отношение рисков для OS улучшается для Группы A при ограничении анализа пациентами с содержанием БКК <10000/мкл при скрининге во всех анализах (таблицы C, D).
<b>Таблица C</b><b>Анализ эффекта ковариат Кокса на OS без изучения других ковариат</b>
Анализ эффекта ковариат Кокса на общую выживаемость
Без изучения других ковариат
отношение рисков
P-значение
Лечение ОЛЛ
0,96
0,82
БКК<10000
0,80
0,32
<b>Таблица D</b><b>Анализ эффекта ковариат Кокса на OS с исследованием других ковариат</b>
Исследование других ковариат
Отношение рисков
P-значение
Лечение ОЛЛ
0,77
0,25
БКК<10000
0,69
0,16
На фиг. 14 приведены кривые выживаемости Каплана-Мейера, медиана общей выживаемости и отношение рисков в зависимости от содержания БКК при скрининге (исходном) у всех получавших лечение пациентов. Отношение рисков улучшается при снижении порога отсечения и достигает пика при уровне лейкоцитов 8000/мкл в качестве порога отсечения.
6
На фиг. 17: Нейтрофилы очищали с применением набора для обогащения нейтрофилами EasySep (Stemcell Technol.) из периферической крови человека после удаления эритроцитов с использованием Hetasep (Stemcell Technol.). Очищенные нейтрофилы (1×10 клеток на лунку, 24-луночные планшеты) культивировали с 1 мкМ CBP501 или без CBP501 в течение 15 минут (реакцию останавливали добавлением EDTA) и дополнительно в течение 4 часов с 1 нМ ФМА, 3 или 10 мкМ A23187, или 100 или 1000 нг/мл ЛПС. Лунки двукратно промывали и инкубировали с ДНКазой в течение 15 минут, супернатанты собирали, инкубировали с субстратом эластазы в течение 2 часов, а затем анализировали для детекции эластазной активности.
На фиг. 18: Мышам C57BL/6 возрастом 8 недель вводили внутривенные инъекции с 2,5, 5 или 10 мкг/мл ЛПС или без ЛПС за 30 минут до инъецирования дифенгидрамина. CBP501 (7,5 мг/кг) инъецировали через 30 минут после инъекции дифенгидрамина. Методом ИФА ELISA количественно определяли комплекс тромбин/антитромбин в плазме, выделенный из крови, извлеченной через 3 часа после инъекции CBP501 или ложной инъекции. Данные получали для каждого варианта состояния у четырех животных.
На фиг. 19: макрофаги получали стимуляцией мононуклеарных клеток периферической крови человека 0,32 мкМ ФМА и извлечением всех суспензированных клеток через 48 ч после стимуляции ФМА. Клетки дополнительно инкубировали с 50 нг/мл ИФН-гамма, 10 нг/мл ЛПС для получения фенотипа M1, и с 20 нг/мл ИЛ-4 для получения макрофагов M2. В обоих вариантах обработки использовали или не использовали CBP501. Фагоцитарную активность отслеживали с применением флуоресцентно меченых гранул и проточной цитометрии.
На фиг. 20: Макрофаги клеточной линии RAW264.7 инкубировали с 0,1 или 1 мкМ CBP501 или без CBP501 в течение 3–6 часов, и затем дополнительно инкубировали с 10 или 1000 нг/мл ЛПС или без ЛПС в течение 4 часов. Высвободившийся ФНО измеряли методом ИФА ELISA.
например,
CBP501 продемонстрировал потенциал эффективного противоопухолевого агента в доклинических (Sha, S., et al. Mol. Cancer Ther. 6:147 (2007)) и клинических исследованиях фазы I (Shapiro, G.I., et al. Clin. Cancer Res. (2011)). CBP501 может действовать за счет двух механизмов,  за счет блокады контрольной точки в фазе G2 (Sha, S., et al. Mol. Cancer Ther. 6:147 (2007)) и концентрации платины в опухолевых клетках, или за счет ингибирования кальмодулина (Mine, N., et al. Mol. Cancer Ther. 10:1929 (2011)).
Как показано в настоящем документе, в клиническом исследовании фазы II при субгрупповом анализе в популяции пациентов с неплоскоклеточным немелкоклеточным раком легкого было неожиданным образом обнаружено статистически значимое различие (p<0,0001) выживания между группами пациентов, отличающихся высоким содержанием лейкоцитов (БКК) при скрининге, и пациентов, отличающихся нормальным или низким содержанием БКК.
Далее, как следует из представленных здесь результатов, CBP501, помимо непосредственного действия на опухолевые клетки, может также действовать на микроокружение опухоли, например, на макрофаги, за счет ингибирования кальмодулина и стимуляции формирования нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET), когда у пациентов наблюдается воспаление, обусловленное уменьшением выведения/фагоцитоза NET макрофагами. Это может повышать вероятность возникновения тромбоза глубоких вен (ТГВ) и метастазов, и таким образом потенциально отрицательно влиять на выживаемость пациентов. С другой стороны, ингибирование макрофагов М2-типа у пациентов может предотвратить положительное действие макрофагов на рост, ангиогенез, метастазирование опухоли и ускользание опухоли от иммунологического надзора, которые способствуют метастазированию опухоли, что может сокращать продолжительность выживания пациентов.
В соответствии с указанным наблюдением, было продемонстрировано стимуляция формирования NET активированными нейтрофилами при обработке CBP501 in vitro и стимуляция образования комплекса тромбина с антитромбином у стимулированных ЛПС мышей. Также было отмечено ингибирование CBP501 секреции цитокинов и фагоцитоза макрофагами как М1-, так и М2-типа.
Помимо того, что клинические исследования показали, что CBP501 действует за счет усиления цитотоксичности цисплатина в отношении опухолевых клеток, представленные здесь результаты демонстрируют, что, как было неожиданно обнаружено в результате субгруппового анализа пациентов в исследовании неплоскоклеточного НМРЛ Фазы II, продолжительность выживания при ответе на схему с CBP501 в группах пациентов с высоким содержанием лейкоцитов (БКК) при скрининге в клиническом исследовании была меньше, а в других группах пациентов, с нормальными или низкими уровнями БКК, продолжительность выживания была больше, и указанное различие было весьма значительным статистически при p-значении, рассчитанном по кривым общей выживаемости Каплана-Мейера, полученным при помощи логарифмического рангового критерия (теста Мантеля-Кокса), составляющем менее чем 0,0001.
Таким образом, было неожиданно обнаружено, что на пациентов с нормальными или низкими уровнями БКК до лечения лечение CBP501 оказывало благоприятный эффект, тогда как на пациентов с высокими уровнями лейкоцитов такое же лечение могло оказывать неблагоприятное воздействие. Ингибирующая активность CBP501 в отношении кальмодулина предполагает, что эффект на различные клетки микроокружения, такие как макрофаги, лейкоциты и лимфоциты, мог ингибировать или модулировать их активность, что могло способствовать получению двунаправленных результатов, поскольку, например, только при ингибировании макрофагов, если бы он подавлял макрофаги M1-типа, это могло бы повлиять отрицательно на выживаемость пациентов, а если бы он подавлял макрофаги M2, это повышало бы выживаемость пациентов.
Сообщалось, что ингибиторы кальмодулина ингибируют ряд функций макрофагов (Horwitz, S.B., et al. J. Cell Biol. 91:798 (1981); Takenawa, T., et al. Biochem J. 15:208 (1982); Westra, J., et al. BMC Musculoskelet. Disord. 30:11 (2010)), лейкоцитов (Naccache, P.H., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 97(1):62 (1980); Takeshige, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99(2):484 (1981); Jones, H.P., et al. Biochem Biophys. Acta. 714(1):152 (1982); Jones, H.P., et al. Methods Enzymol. 015:389 (1984); Verploegen, S., et al. Eur. J. Biochem. 269(18) 4625 (2002)) и лимфоцитов (Salisbury, J.L., et al. Nature 12:294 (1981); Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012)). У пациентов с высокими уровнями лейкоцитов наблюдается тенденция к присутствию макрофагов M1, поскольку они относятся к провоспалительному типу, а у пациентов с опухолью и нормальными или низкими уровнями лейкоцитов наблюдается тенденция к присутствию макрофагов M2 (Hao, N., et al. Clin. Dev. Immunol. (2012)). Также известно, что пациенты с высокими уровнями лейкоцитов более подвержены развитию тромбоза глубоких вен (ТГВ) (Pabinger, I., et al. Blood 122:12 (2013); Blix, K., et al. PLOS One 4:8 (2013); Wang, T.F., et al. Thromb. Res. 133(1):25 (2014)), который является причиной смерти значительного числа пациентов с раковыми заболеваниями. У таких пациентов наблюдается тенденция к присутствию большего количества NET, а NET способствуют метастазированию опухолей (Cools-Lartigue, J., et al. J. Clin. Invest. (2013)) что является одной из причин неблагоприятного прогноза продолжительности жизни для многих пациентов с раковыми заболеваниями, в том числе раком легких.
В настоящем примере не наблюдалось статистически значимого улучшения выживаемости, детектируемого при добавлении CBP501 в стандартную схему, пеметрексед плюс цисплатин, при анализе во всех получавших лечение популяциях. Тем не менее, при субгрупповом анализе неожиданным образом было обнаружено, что добавление CBP501 обеспечивало благоприятный эффект в группе людей, у которых наблюдалось нормальное или низкое содержание лейкоцитов (БКК) при скрининге для клинического исследования. Нормальные показатели БКК в разных областях и странах варьируют. Верхняя граница нормы содержания БКК может составлять от 8000/мкл до 11000/мкл.
Неожиданным образом, на пациентов с содержанием БКК в нормальном диапазоне CBP501 оказывал благоприятное действие, а пациенты с высокими уровнями лейкоцитов при скрининге оказывали худшие результаты, чем пациенты, получавшие лечение цисплатином и пеметрекседом, хотя в обоих случаях отличия не были статистически значимыми по сравнению с контрольной группой, получавшей лечение цисплатином и пеметрекседом популяцией.
Хотя точная причина указанного потенциально двунаправленного действия CBP501 неочевидна, ингибирующее действие CBP501 на кальмодулин показывает, что ингибирование кальмодулина в различных клетках микроокружения, таких как макрофаги, лейкоциты и лимфоциты, могло ингибировать или модулировать их активность, что стимулировало указанный двунаправленный результат, поскольку, например, если бы он подавлял макрофаги M1-типа, это влияло бы отрицательно на выживаемость пациентов за счет ингибирования противоопухолевой активности макрофагов и/или ингибирования выведения NET, так как NET способствует тромбогенезу и метастазам, а если бы он подавлял проопухолевые M2-макрофаги, это повышало бы выживаемость пациентов. Кроме того, известно, что цисплатин способствует переходу макрофагов от M1-типа к M2-типу (Dijkgraaf, E.M., et al. Cancer Res. 15:73(8):2480 (2013)), и известно, что химиотерапия сама по себе способствует метастазированию опухолей (Haas, M.J. SciBX 1-3 (2011)), таким образом, присутствие CBP501 во время химиотерапии может оказывать значимое влияние на метастазирование опухоли. Известно, что ингибиторы кальмодулина способны ингибировать ряд функций макрофагов (Horwitz, S.B., et al. J. Cell Biol. 91:798 (1981); Takenawa, T., et al. Biochem J. 15:208 (1982); Westra, J., et al. BMC Musculoskelet. Disord. 30:11 (2010)), лейкоцитов (Naccache, P.H., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 97(1):62 (1980); Takeshige, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99(2):484 (1981); Jones, H.P., et al. Biochem Biophys. Acta. 714(1):152 (1982); Jones, H.P., et al. Methods Enzymol. 015:389 (1984); Verploegen, S., et al. Eur. J. Biochem. 269(18) 4625 (2002)) и лимфоцитов (Salisbury, J.L., et al. Nature 12:294 (1981); Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012)). У пациентов с высокими уровнями лейкоцитов наблюдается тенденция к большему содержанию M1-макрофагов, поскольку они являются провоспалительными, а у пациентов с нормальным или низким содержанием БКК с опухолью наблюдается тенденция к присутствию M2-макрофагов (Hao, N., et al. Clin. Dev. Immunol. (2012)). Также у пациентов с высокими уровнями лейкоцитов наблюдается тенденция к большему содержанию NET. В случаях, когда фагоцитоз NET предотвращается CBP501, у пациентов имеется больший риск развития ТГВ и метастазов; и первое, и второе уменьшает продолжительность выживания.
Как вариант, поскольку кальмодулин вовлечен в нормальное функционирование лейкоцитов (Horwitz, S.B., et al. J. Cell Biol. 91:798 (1981); Takenawa, T., et al. Biochem J. 15:208 (1982); Westra, J., et al. BMC Musculoskelet. Disord. 30:11 (2010); Naccache, P.H., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 97(1):62 (1980); Takeshige, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 99(2):484 (1981); Jones, H.P., et al. Biochem Biophys. Acta. 714(1):152 (1982); Jones, H.P., et al. Methods Enzymol. 015:389 (1984); Verploegen, S., et al. Eur. J. Biochem. 269(18) 4625 (2002); Salisbury, J.L., et al. Nature 12:294 (1981); Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012); Hao, N., et al. Clin. Dev. Immunol. (2012)). CBP501 может взаимодействовать с ним и запускать его активность, благоприятную для общей выживаемости, за счет потенциального пагубного действия на функцию БКК в случаях, когда требуется их значительное количество, например, в ситуации, когда пациенты страдают острой инфекцией, повышающей содержание лейкоцитов.
Ингибирование кальмодулина может также влиять на противораковый иммунитет за счет действия на лимфоциты, поскольку было высказано предположение, что кальмодулин может индуцировать анергию T-клеток (Boubali, S., et al. Mol. Immunol. 52(2):51 (2012)).
Содержание до лечения или базовый уровень БКК, как было показано, представляет собой прогностический фактор у пациентов с НМРЛ, получавших лечение на основе платины (Teramukai, S., et al. Eur. J. Cancer (45(11:1950 (2009); Kim, J.W., et al. Cancer Res. Trest. 45:4):325 (2013)) CBP501 может усиливать указанный эффект за счет модуляции активности цисплатина. Поскольку лабораторный анализ содержания ББК проводится для каждого пациента в качестве универсальной утвержденной стандартной процедуры перед проведением лечения, возможно проведение выбора пациентов на основании содержания БКК.
Ингибирование кальмодулина CBP501 может также прямо ингибировать миграцию и метастазирование опухоли, независимо от концентрации платины, поскольку было показано, что кальмодулин играет в миграции важную роль (Wang, H., et al. Nat. Commun. 4:1354 (2013)).
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Кэнбас Ко., Лтд.
КАВАБЕ, ТАКУМЕ
МИНЕ, НАОКИ
САЙТО, НАОЯ
САКАКИБАРА, КЕЙИЧИ
САТО, ТАКУДЖИ
<120>  ПЕПТИДЫ И ПЕТИДОМИМЕТИКИ ДЛЯ КОМБИНИРОВАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ В
СУБПОПУЛЯЦИИ ПАЦИЕНТОВ С РАКОВЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ
<130>  087533-0432881
<140>  14/313,264
<141>  2014-06-24
<150>  61/838,777
<151>  2013-06-24
<160>  139
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<400>  1
000
<210>  2
<400>  2
000
<210>  3
<400>  3
000
<210>  4
<400>  4
000
<210>  5
<400>  5
000
<210>  6
<400>  6
000
<210>  7
<400>  7
000
<210>  8
<400>  8
000
<210>  9
<400>  9
000
<210>  10
<400>  10
000
<210>  11
<400>  11
000
<210>  12
<400>  12
000
<210>  13
<400>  13
000
<210>  14
<400>  14
000
<210>  15
<400>  15
000
<210>  16
<400>  16
000
<210>  17
<400>  17
000
<210>  18
<400>  18
000
<210>  19
<400>  19
000
<210>  20
<400>  20
000
<210>  21
<400>  21
000
<210>  22
<400>  22
000
<210>  23
<400>  23
000
<210>  24
<400>  24
000
<210>  25
<400>  25
000
<210>  26
<400>  26
000
<210>  27
<400>  27
000
<210>  28
<400>  28
000
<210>  29
<400>  29
000
<210>  30
<400>  30
000
<210>  31
<400>  31
000
<210>  32
<400>  32
000
<210>  33
<400>  33
000
<210>  34
<400>  34
000
<210>  35
<400>  35
000
<210>  36
<400>  36
000
<210>  37
<400>  37
000
<210>  38
<400>  38
000
<210>  39
<400>  39
000
<210>  40
<400>  40
000
<210>  41
<400>  41
000
<210>  42
<400>  42
000
<210>  43
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<400>  43
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  44
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<400>  44
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  45
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<400>  45
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Xaa
1               5                   10
<210>  46
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<400>  46
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  47
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<400>  47
Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>  48
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<400>  48
Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>  49
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<400>  49
Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>  50
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой любую аминокислоту
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<400>  50
Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>  51
<211>  8
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<400>  51
Xaa Arg Xaa Arg Arg Arg Xaa Xaa
1               5
<210>  52
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Trp
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<400>  52
Xaa Arg Arg Xaa Arg Xaa Arg Xaa Xaa
1               5
<210>  53
<211>  8
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<400>  53
Xaa Xaa Arg Arg Arg Xaa Arg Xaa
1               5
<210>  54
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой (Phe-2,3,4,5,6-F), (Phe-3,4,5F) или (Phe-4CF3)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой d- или l-Arg
<400>  54
Xaa Xaa Arg Trp Arg Xaa Arg Arg Xaa
1               5
<210>  55
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой Phe-2,3,4,5,6-F
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой Gln или Arg
<400>  55
Xaa Xaa Ser Trp Ser Xaa Arg Arg Arg Xaa Arg Arg
1               5                   10
<210>  56
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой Gln или Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой Phe-2,3,4,5,6-F
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<400>  56
Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Xaa Xaa
1               5                   10
<210>  57
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой Gln или Arg
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Phe-2,3,4,5,6-F
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<400>  57
Arg Arg Xaa Xaa Arg Trp Arg Xaa Xaa
1               5
<210>  58
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой Cha или Nal(2)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой Phe-2,3,4,5,6-F
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Bpa или (Ser-Tyr)
<220>
<221>  MOD_RES
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Gln или Arg
<400>  58
Xaa Xaa Arg Trp Arg Xaa Xaa Arg Arg
1               5
<210>  59
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  59
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  60
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  60
Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa
1               5                   10
<210>  61
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  61
Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  62
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  62
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa
1               5                   10
<210>  63
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  63
Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  64
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  64
Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa
1               5                   10
<210>  65
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  65
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa
1               5                   10
<210>  66
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  66
Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  67
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  67
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa
1               5                   10
<210>  68
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  68
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  69
<211>  8
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  69
Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Phe Xaa
1               5
<210>  70
<211>  8
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  70
Xaa Phe Arg Arg Arg Xaa Arg Arg
1               5
<210>  71
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  71
Arg Arg Arg Xaa Arg Trp Arg Phe Xaa
1               5
<210>  72
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  72
Xaa Phe Arg Trp Arg Xaa Arg Arg Arg
1               5
<210>  73
<211>  10
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  73
Arg Arg Arg Arg Xaa Arg Trp Arg Phe Xaa
1               5                   10
<210>  74
<211>  10
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  74
Xaa Phe Arg Trp Arg Xaa Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  75
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  75
Arg Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Phe Xaa
1               5
<210>  76
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  76
Xaa Phe Arg Arg Arg Xaa Arg Arg Arg
1               5
<210>  77
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  77
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  78
<211>  17
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  78
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro Ser Tyr
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  79
<211>  15
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  79
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg
1               5                   10                  15
<210>  80
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  80
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  81
<211>  6
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  81
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa
1               5
<210>  82
<211>  10
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  82
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  83
<211>  11
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  83
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  84
<211>  10
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  84
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln
1               5                   10
<210>  85
<211>  11
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  85
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg
1               5                   10
<210>  86
<211>  6
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<400>  86
Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5
<210>  87
<211>  13
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  87
Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  88
<211>  13
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  88
Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  89
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  89
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  90
<211>  11
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  90
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  91
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  91
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  92
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  92
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1               5                   10
<210>  93
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  93
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa
1               5                   10
<210>  94
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  94
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa
1               5                   10
<210>  95
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  95
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Ser Xaa
1               5                   10
<210>  96
<211>  8
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  96
Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Phe Xaa
1               5
<210>  97
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  97
Arg Arg Arg Xaa Arg Trp Arg Phe Xaa
1               5
<210>  98
<211>  10
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  98
Arg Arg Arg Arg Xaa Arg Trp Arg Phe Xaa
1               5                   10
<210>  99
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  99
Arg Arg Arg Xaa Arg Arg Arg Phe Xaa
1               5
<210>  100
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  100
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa
1               5                   10
<210>  101
<211>  6
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  101
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa
1               5
<210>  102
<211>  7
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  102
Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Xaa
1               5
<210>  103
<211>  7
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  103
Xaa Cys Trp Ser Phe Xaa Cys
1               5
<210>  104
<211>  8
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  104
Tyr Cys Pro Trp Ser Phe Xaa Cys
1               5
<210>  105
<211>  19
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  105
Tyr Gln Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro
1               5                   10                  15
Ser Tyr Tyr
<210>  106
<211>  18
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  106
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro
1               5                   10                  15
Ser Tyr
<210>  107
<211>  11
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  107
Arg Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro Ser Tyr Tyr
1               5                   10
<210>  108
<211>  14
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  108
Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Arg Ser Pro Ser Tyr Tyr
1               5                   10
<210>  109
<211>  13
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  109
Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Ser Trp Pro Ser Tyr
1               5                   10
<210>  110
<211>  16
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту
<400>  110
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Xaa Phe Xaa Tyr Tyr
1               5                   10                  15
<210>  111
<211>  19
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  111
Tyr Tyr Ser Gly Ser Arg Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys
1               5                   10                  15
Arg Gly Tyr
<210>  112
<211>  13
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<400>  112
Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  113
<211>  14
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<400>  113
Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>  114
<211>  16
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  114
Tyr Tyr Xaa Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr
1               5                   10                  15
<210>  115
<211>  15
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  115
Tyr Xaa Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr
1               5                   10                  15
<210>  116
<400>  116
000
<210>  117
<211>  14
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  117
Xaa Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Tyr
1               5                   10
<210>  118
<400>  118
000
<210>  119
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  119
Xaa Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5
<210>  120
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  120
Xaa Xaa Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5
<210>  121
<400>  121
000
<210>  122
<211>  8
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  122
Xaa Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5
<210>  123
<211>  13
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  123
Tyr Ser Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  124
<211>  13
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  124
Tyr Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  125
<211>  10
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  125
Xaa Xaa Xaa Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  126
<211>  9
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту
<400>  126
Xaa Xaa Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5
<210>  127
<211>  13
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  127
Asp Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  128
<211>  13
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  128
Xaa Asp Ser Trp Ser Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  129
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<400>  129
Xaa Ser Trp Ser Asp Phe Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  130
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  130
Xaa Ser Trp Ser Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  131
<211>  10
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (2)..(2)
<223>  Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе аминокислоту
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  131
Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  132
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  132
Xaa Pro Trp Pro Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  133
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой 2-Naphthyl-alanyl
<400>  133
Xaa Pro Trp Pro Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  134
<211>  12
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  134
Phe Pro Trp Pro Phe Xaa Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5                   10
<210>  135
<211>  7
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  135
Xaa Cys Trp Arg Phe Xaa Cys
1               5
<210>  136
<211>  8
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  136
Tyr Cys Pro Trp Arg Phe Xaa Cys
1               5
<210>  137
<211>  6
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<400>  137
Arg Arg Arg Gln Arg Arg
1               5
<210>  138
<211>  7
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  138
Tyr Ser Pro Trp Ser Phe Xaa
1               5
<210>  139
<211>  6
<212>  Протеин
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Описание искусственной последовательности: Синтетическая пептидная последовательность
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  Xaa представляет собой бензоил-фенилаланин
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой циклогексил-аланин
<400>  139
Xaa Ser Trp Ser Phe Xaa
1               5
<---