Средство разрезания ДНК на основе Cas9 белка из биотехнологически значимой бактерии Clostridium cellulolyticum
DNA POLYMER BASED ON Cas9 PROTEIN FROM BIOTECHNOLOGICALLY SIGNIFICANT BACTERIUM CLOSTRIDIUM CELLULOLYTICUM

Область техники
Изобретение относится к области молекулярной биологии и микробиологии, в частности, описывает новые бактериальные нуклеазы системы CRISPR-Cas. Изобретение может быть использовано в качестве инструмента для строго специфической модификации ДНК в различных организмах.
Уровень техники
in vitro
de novo
Изменение последовательности ДНК – одна из актуальных задач биотехнологии на сегодняшний день. Редактирование и изменение геномов эукариотических и прокариотических организмов, а также манипуляции с ДНК , требуют направленного внесения двунитевых разрывов в последовательности ДНК. Для решения этой задачи в настоящее время используют следующие методики: искусственные нуклеазные системы, содержащей домены типа «цинковые пальцы», TALEN-системы и бактериальные CRISPR-Cas системы. Первые два метода требуют трудозатратой оптимизации аминокислотной последовательности нуклеазы для узнавания конкретной последовательности ДНК. В отличие от них в случае CRISPR-Cas систем структурами, узнающими ДНК мишень, являются не белки, а короткие направляющие РНК. Разрезание конкретной ДНК мишени не требует синтеза нуклеазы или ее гена , а обеспечивается за счет использования направляющих РНК, комплементарных целевой последовательности. Это делает CRISPR-Cas системы удобными и эффективными инструментами разрезания различных ДНК-последовательностей. Методика позволяет осуществлять единовременное разрезание ДНК в нескольких участках при использовании направляющих РНК разной последовательностей. Такой подход используется в том числе для одновременного изменения нескольких генов в эукариотических организмах.
По своей природе CRISPR-Cas системы являются иммунными системами прокариот, способными высоко специфично вносить разрывы в генетический материал вирусов (Mojica F. J. M. et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements //Journal of molecular evolution. – 2005. – Т. 60. – №. 2. – С. 174-182).  Аббревиатура CRISPR-Cas расшифровывается как “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR associated genes” (Jansen R. et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes //Molecular microbiology. – 2002. – Т. 43. – №. 6. – С. 1565-1575), что переводе с английского обозначает “короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами, и aссоциированные с ними гены”. Все CRISPR-Cas системы состоят из CRISPR кассет и генов, кодирующих различные Cas белки (Jansen R. et al. , Molecular microbiology. – 2002. – Т. 43. – №. 6. – С. 1565-1575). CRISPR кассеты состоят из последовательностей-спейсеров, каждый из которых имеет уникальную нуклеотидную последовательность, и повторяющихся палиндромных повторов (Jansen R. et al. , Molecular microbiology. – 2002. – Т. 43. – №. 6. – С. 1565-1575). В результате транскрипции CRISPR кассет и их последующего процессинга образуются направляющие крРНК, которые вместе с Cas белками формируют эффекторный комплекс (Brouns S. J. J. et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes //Science. – 2008. – Т. 321. – №. 5891. – С. 960-964). За счет комплементарного спаривания крРНК с целевым участком ДНК, именуемым протоспейсером, Cas-нуклеаза узнает ДНК-мишень и высоко специфично вносит в нее разрыв.
CRISPR-Cas системы, представленными одиночным белком-эффектором, разделяют на шесть различных типов (от I до VI) в зависимости от Cas белков, входящих в состав систем. Система CRISPR-Cas9 II типа отличается простотой состава и механизма работы: для ее функционирования необходимо формирование эффекторного комплекса, состоящего лишь из одного белка Cas9 и двух коротких РНК: крРНК (crRNA) и трейсерной РНК (tracrRNA). Трейсерная РНК комплементарно спаривается с участком крРНК, проиcходящим из CRISPR повтора, образуя вторичную структуру, необходимую для связывания направляющих РНК с Cas эффектором. Эффекторный белок Cas9 является РНК-зависимой ДНК эндонуклеазой с двумя нуклеазными доменами (HNH и RuvC), вносящими разрывы в комплементарные нити целевой ДНК, таким образом образуя двунитевой разрыв ДНК (Deltcheva E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III //Nature. – 2011. – Т. 471. – №. 7340. – С. 602).
in vitro
На сегодняшний день известно несколько CRISPR-Cas нуклеаз, способных направлено и специфично вносить двунитевые разрывы в ДНК. Одной из основных характеристик, ограничивающих применение CRISPR-Cas систем является PAM последовательность, фланирующая ДНК-мишень с 3'-конца, наличие которой необходимо для правильного узнавания ДНК Cas9 нуклеазой. Различные CRISPR-Cas белки имеют разные PAM последовательности, которые ограничивают возможности применения нуклеаз на любых участках ДНК. Использование CRISPR-Cas белков с новыми разнообразными PAM последовательностями необходимо для обеспечения возможности изменения любого участка ДНК, как , так и в геноме живых организмов. Изменение эукариотических геномов также требует использования нуклеаз малого размера для обеспечения доставки CRISPR-Cas систем в клетки посредством AAV вирусов.
Несмотря на известность ряда способов разрезания ДНК и изменения последовательности геномной ДНК, на сегодняшний день сохраняется потребность в новых эффективных инструментах для модификации ДНК в различных организмах и в строго определенных местах последовательности ДНК. Данное изобретение обладает рядом свойств, необходимых для решения этой задачи.
Clostridium cellulolyticum.
Clostridium cellulolyticum (C. cellulolyticum)
C. cellulolyticum
C. cellulolyticum
Clostridium cellulolyticum,
Основой изобретения является CRSIRP Cas система, найденная в бактериях Анаэробные бактерии способны осуществлять гидролиз лигноцеллулозы без добавления коммерческих целлулаз с образованием в качестве конечных продуктов лактата, ацетата и бутанола (Desvaux M. Clostridium cellulolyticum: model organism of mesophilic cellulolytic clostridia. FEMS Microbiol Rev. 2005 Sep;29(4):741-64). Такая способность данных микроорганизмов делает их перспективными кандидатами на роль продуцентов биотоплива. Использование бактерий продуцентов таких как  в биотехнологических производствах поможет эффективнее организовать цикл переработки сырья, повысить эффективность и, в конечном итоге, приведет к снижению нагрузки на все компоненты биосферы. С помощью методов генетической инженерии возможно существенно улучшить метаболические показатели микроорганизмов, и сместить баланс в сторону наработки большего количества бутанола вместо лактата и ацетата. Так, например, для двойного мутанта по генам лактатдегирогеназы и мальтатдегидрогеназы показано отсутствие образования лактата и увеличенная продукция бутанола (Li Y, et al., Combined inactivation of the Clostridium cellulolyticum lactate and malate dehydrogenase genes substantially increases ethanol yield from cellulose and switchgrass fermentations. Biotechnol Biofuels. 2012 Jan 4;5(1):2). До настоящего момента не удалось разработать эффективную процедуру получения штаммов  с мутациями в генах фосфотрансацетилазы и ацетаткиназы, что позволило бы снизить продукцию ацетата. Изобретение может использоваться для изменения генома как и  геномов других живых организмов.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание новых инструментов для изменения последовательности геномной ДНК одноклеточных или многоклеточных организмов на основе систем CRISPR-Cas9. Существующие в настоящее время системы имеют ограниченное применение из-за специфичной последовательности РАМ, которая должна присутствовать на 3'-конце участка ДНК, подвергающегося модификации. Поиск новых ферментов Cas9 с другими РАМ последовательностями позволит расширить арсенал имеющихся средств для образования двунитевого разрыва в необходимых, строго определенных местах в молекулах ДНК разных организмов.
C. cellulolyticum
о
Для решения этой задачи авторами была охарактеризована ранее предсказанная для  CRISPR нуклеаза II типа CcCas9, которая может быть применена для внесения направленных изменений в геном как этого, так и других организмов. Существенными признаками, отличающими настоящее изобретение, являются: (а) короткая, двухбуквенная, отличающаяся от других известных последовательность PAM; (б) малый размер охарактеризованного белка CcCas9 – 1030 аминокислотных остатков (а.о.), что на 23 а.о. меньше, чем размер известного фермента Cas9 из Staphylococcus aureus (SaCas9); (в) широкий рабочий диапазон температур нуклеазы CcCas9, которая активна при температурах от 37°С до 65°С с оптимумом при 45 С, что позволит использовать ее в организмах, имеющих различную температуру.
Указанная задача решается путем применения белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеет отличия по сравнению с SEQ ID NO: 1 только в неконсервативных аминокислотных остатках, для образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК, расположенного непосредственно перед нуклеотидной последовательностью 5’- NNNNGNA -3’ в указанной молекуле ДНК. Под N следует понимать любой из нуклеотидов (A, G, C, T). В некоторых вариантах изобретения данное применение характеризуется тем, что образование двунитевого разрыва в молекуле ДНК происходит при температуре от 37°С до 65°С. В предпочтительных вариантах изобретения данное применение характеризуется тем, что образование двунитевого разрыва в молекуле ДНК происходит при температуре от 37°С до 55°С.
Указанная задача также решается с помощью способа изменения последовательности геномной ДНК одноклеточного или многоклеточного организма, включающий введение в по меньшей мере одну клетку этого организма эффективного количества: а) либо белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, либо нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и б) либо направляющей РНК, содержащей последовательность, образующую дуплекс с нуклеотидной последовательностью участка геномной ДНК организма, непосредственно примыкающей к нуклеотидной последовательности 5’-NNNNGNA-3’, и взаимодействующей с указанным белком после образования дуплекса, либо последовательности ДНК, кодирующей указанную направляющую РНК; при этом взаимодействие указанного белка с направляющей РНК и нуклеотидной последовательностью 5’- NNNNGNA -3’  приводит к образованию двунитевого разрыва в последовательности геномной ДНК, непосредственно примыкающей к последовательности 5’- NNNNGNA -3’.
В качестве направляющей РНК может быть использована смесь из крРНК (crRNA) и трейсерной РНК (tracrRNA), способных образовать комплекс с участком таргетной ДНК и белком СсCas9. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве направляющей РНК может быть использована гибридная РНК, сконструированная на основе крРНК и трейсерной РНК. Методы конструирования гибридной направляющей РНК известны специалистам (Hsu PD, et al., DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):827-32).
Изобретение может быть использовано как для разрезания целевой ДНК in vitro, так и для модификации генома какого-либо живого организма. Модификация генома может проводиться прямым способом – разрезанием генома в соответствующем сайте, а также вставкой экзогенной последовательности ДНК за счет гомологичной репарации.
В качестве экзогенной последовательности ДНК может быть использован любой участок двунитевой или однонитевой ДНК из генома организма, отличного от организма, используемого при введении (или смесь таких участков между собой и с другими фрагментами ДНК), при этом этот участок (или смесь участков) предназначен для интеграции в место двуцепочечного разрыва в таргетной ДНК, образованного под действием нуклеазы СсCas9. В некоторых вариантах изобретения в качестве экзогенной последовательности ДНК может быть использован участок двуцепочечной ДНК из генома организма, используемого при введении белка СсCas9, но при этом измененный мутациями (заменой нуклеотидов), а также вставками или делециями одного или нескольких нуклеотидов.
Техническим результатом настоящего изобретения является повышение универсальности доступных систем CRISPR-Cas9, позволяющее использовать нуклеазу Cas9 для разрезания геномной или плазмидной ДНК в большем количестве специфических мест и при больших диапазонах температур.
Краткое описание рисунков
Clostridium celluloliticum
Фиг. 1.  Схема CRISPR локусов в
in vitro
Фиг. 2. Определение PAM    методами. Разработка системы порезки ДНК, ограниченной  NNNNGNA последовательностью.
Фиг. 3. Проверка значимости отдельных позиций PAM.
Фиг. 4. Проверка активности белка в разрезании различных ДНК мишеней.
Фиг. 5. Реакции in vitro разрезания ДНК фрагмента гена человека grin2b
Фиг. 6. Исследование температурного диапазона активности CcCas9.
Фиг. 7. Схема взаимодействия направляющей РНК с участком целевой ДНК.
Фиг. 8. Выравнивание последовательностей белков Cas9 из организмов Staphylococcus aureus (SaCas9), Campylobacter jejuni (CjCas9) и CcCas9. Подчеркнуты снизу неконсервативные участки последовательностей.
Подробное раскрытие изобретения
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.
Используемый здесь термин «процент гомологии двух последовательностей» эквивалентен термину «процент идентичности двух последовательностей». Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp. 403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями может быть использовано сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами. Процент идентичности двух последовательностей определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100.
Термин "специфически гибридизуется" относится к ассоциации между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот или в достаточной степени комплементарными последовательностями, что разрешает такую гибридизацию в предопределенных условиях, обычно использующихся в данной области.
непосредственно
Фраза "двунитевой разрыв, расположенный  перед нуклеотидной последовательностью РАМ" означает, что двунитевой разрыв в таргетной последовательности ДНК будет произведен на расстоянии от 0 до 25 нуклеотидов перед нуклеотидной последовательностью РАМ.
Под белком, содержащим определенную аминокислотную последовательность следует понимать белок, имеющий аминокислотную последовательность, составленную из указанной аминокислотной последовательности и, возможно, других последовательностей, соединённых пептидными связями с указанной аминокислотной последовательностью. Примером других последовательностей может служить последовательность сигнала ядерной локализации (NLS), или другие последовательности, обеспечивающие повышенную функциональность для указанной аминокислотной последовательности.
Под экзогенной последовательностью ДНК, вводимой одновременно с направляющей РНК, следует понимать последовательность ДНК, подготовленную специально для специфической модификации двуцепочечной целевой ДНК в месте разрыва, определяемого специфичностью направляющей РНК. Подобной модификацией может быть, например, вставка или делеция определенных нуклеотидов в месте разрыва целевой ДНК. Экзогенной ДНК может служить как участок ДНК из другого организма, так и участок ДНК из того же организма, что и целевая ДНК.
Под эффективным количеством вводимых в клетку белка и РНК следует понимать такое количество белка и РНК, которое при попадании в указанную клетку будет способно образовать функциональный комплекс, то есть комплекс, который будет специфически связываться с целевой ДНК и производить в ней двунитевой разрыв в месте, определяемом направляющей РНК и РАМ последовательностью на ДНК. Эффективность этого процесса может быть оценена при помощи анализа целевой ДНК, выделенной из указанной клетки с помощью стандартных методов, известных специалистам.
Доставка белка и РНК в клетку может быть осуществлена различными способами. Например, белок может быть доставлен в виде ДНК-плазмиды, которая кодирует ген этого белка, как мРНК для трансляции этого белка в цитоплазме клетки, или как рибонуклеопротеидный комплекс, включающий этот белок и направляющую РНК. Доставка может быть осуществлена различными методами, известными специалистам.
Нуклеиновая кислота, кодирующая компоненты системы, может быть введена в клетку, непосредственно или опосредованно: за счет трансфекции или трансформации клеток известными специалистам способами, за счет использования рекомбинатного вируса, за счет манипуляций с клеткой, таких как микроинъекция ДНК и т.п.
Доставка рибонуклеинового комплекса, состоящего из нуклеазы и направляющих РНК и экзогенной ДНК (при необходимости) может осуществляться путем трансфекции комплексов в клетку или за счет механического введения комплекса внутрь клетки, например, микроинъекции.
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, который необходимо ввести в клетку, может быть интегрирована в хромосому или может представлять собой внехромосомно реплицирующуюся ДНК. В некоторых вариантах для обеспечения эффективной экспрессии гена белка с вводимой в клетку ДНК необходимо изменить последовательность этой ДНК в соответствии с типом клетки в целях оптимизации кодонов при экспрессии, обусловленное неравномерностью частот встречаемости синонимичных кодонов в кодирующих областях генома различных организмов. Оптимизация кодонов необходима для увеличения экспрессии в клетках животных, растений, грибов или микроорганизмов.
Для функционирования белка, имеющего последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в эукариотической клетке необходимо, чтобы этот белок оказался в ядре этой клетки. Поэтому, в некоторых вариантах изобретения, для образования двунитевых разрывов в целевой ДНК используют белок, имеющий последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и который дополнительно модифицирован с одного или с обоих концов добавлением одного или нескольких сигналов ядерной локализации. Например, может быть использован сигнал ядерной локализации из вируса SV40. Для эффективной доставки в ядро сигнал ядерной локализации может быть отделен от основной последовательности белка спейсерной последовательностью, например, описанной в Shen B, et al. "Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting", Cell Res. 2013 May;23(5):720-3. Также, в других вариантах осуществления, может быть использован другой сигнал ядерной локализации, или альтернативный метод доставки указанного белка в ядро клетки.
C. cellulolyticum)
Настоящее изобретение охватывает применение белка из организма Clostridium cellulolyticum (, гомологичного ранее охарактеризованным белкам Cas9, для внесения двуцепочечных разрывов в молекулы ДНК в строго определенных положениях.
C. cellulolyticum
Редактирование генома  для метаболической инженерии – сложная задача из-за отсутствия эффективных инструментов редактирования. Методы направленного редактирования генома - такие как рекомбинация, ретротранспрессия интрона II группы и обмен аллелями - имеют ряд существенных ограничений. Например, процедура рекомбинационного-зависимого обмена аллелями достаточно продолжительная и обладает низкой эффективностью (Heap J. T. et al. Integration of DNA into bacterial chromosomes from plasmids without a counter-selection marker //Nucleic acids research. – 2012. – Т. 40. – №. 8. – С. e59-e59). Вставка протяженных фрагментов ДНК (для, например, переноса метаболических путей) трудно осуществима при помощи имеющихся инструментов для изменения генома, которые требуют существующих сайтов рекомбинации и / или рекомбиназ (Esvelt K. M., Wang H. H. Genome-scale engineering for systems and synthetic biology //Molecular systems biology. – 2013. – Т. 9. – №. 1. – С. 641). Для успешного манипулирования геномом микроорганизмов и получения мутантов с заданными свойствами, необходима простая и эффективная методика.
Использование CRISPR нуклеаз для внесения направленных изменений в геном имеет ряд преимуществ. Во-первых, специфичность действия системы определяется последовательностью крРНК, что позволяет использовать один тип нуклеазы для всех локусов-мишеней. Во-вторых, методика позволяет доставить в клетку сразу несколько направляющих РНК, комплементарных разным генам-мишеням, что позволяет осуществлять единовременное изменение сразу нескольких генов.
C. cellulolyticum
Кроме того, использование нативной системы CRISPR-Cas9 из бактерии позволитсделать систему редактирования генома этого организма проще и эффективней: процедура не будет требовать внесения в клетки чужеродных генов, их поддержание и экспрессию. Вместо этого возможно разработать процедуру внесения направляющих РНК, направленных на целевые гены, в бактерию: благодаря им хозяйская внутриклеточная CRISPR-Cas9 система сможет распознавать соответствующие ДНК-мишени биотехнологически значимой бактерии и вносить в них двунитевые разрывы.
C. cellulolyticum
H10
Для биохимической характеризации белка Cas9 из локус CRISPR, кодирующий основные компоненты системы (гены белков СсCas9, cas1, cas2, а также CRISPR кассету и направляющие РНК), был клонирован в малокопийный бактериальный вектор pACYC184. Эффекторному рибонуклеиновому комплексу, состоящему из Cas9 и дуплекса крРНК (crRNA) и трейсерной РНК (tracrRNA), для распознавания и последующего гидролиза ДНК помимо комплементарного соответствия спейсера крРНК и протоспейсера необходимо присутствие PAM (от англ. “PAM” - protospacer adjusted motif) на ДНК мишени (Mojica F. J. M. et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system //Microbiology. – 2009. – Т. 155. – №. 3. – С. 733-740). PAM представляет собой строго определенную последовательность из нескольких нуклеотидов, расположенных в системах типа II вплотную либо в нескольких нуклеотидах от 3’-конца протоспейсера на нетаргетной цепи. При отсутствии PAM гидролиза связей в ДНК с образованием двунитевого разрыва не происходит. Необходимость присутствия PAM последовательности на мишени повышает специфичность узнавания, но в то же время накладывает ограничение в выборе целевых участков ДНК, в которые необходимо внести разрыв.
E.coli
Фиг. 1
Для определения последовательностей направляющий РНК системы CRISPR-Cas9 было проведено РНК-секвенирование бактерий   DH5alpha, несущих созданную конструкцию pACYC184_CcCas9. Секвенирование показало, что CRISPR кассета системы активно транскрибируется, также как и трейсерная РНК (). Анализ последовательности crRNA и tracrRNA позволил предположить возможное формирование ими вторичных структур, распознаваемых CcCas9 нуклеазой.
E.coli
Далее авторами было произведено определение PAM последовательности белка CcCas9 при помощи бактериального PAM скрининга. Для определения PAM последовательности белка СсCas9 клетки  DH5alpha, несущие плазмиду  pACYC184_CcCas9, были трансформированы библиотекой плазмид, содержащих последовательность  спейсера 5’-TAAAAAATAAGCAAGCGATGATATGAATGC-3’ CRISPR кассеты CcCas9 системы, фланкированной рандомизированной семибуквенной последовательностью с 5’ или 3’ конца. Плазмиды, несущие последовательность, соответствующую последовательности PAM системы CcCas9, подвергались деградации под действием функционирующей CRISPR-Cas системы, в то время как остальные плазмиды библиотеки эффективно трансформировались в клетки, придавая им устойчивость к антибиотику ампициллину. После трансформации и инкубации клеток на чашках с антибиотиком колонии смывались с поверхности агара и из них экстрагировали ДНК с помощью набора Qiagen Plasmid Purification Midi. Из выделенного пула плазмид амплифицировали при помощи ПЦР участки, включающие рандомизированную PAM последовательность, которые затем подвергали высокоэффективному секвенированию на платформе Illumina. Полученные прочтения анализировали: сравнивали эффективность трансформации плазмид с уникальными PAM, входящими в библиотеку, в клетки, несущие pACYC184_CcCas9 или в контрольные клетки, несущие пустой вектор pacyc184. Полученные результаты анализировали методами биоинформатики. В результате удалось выявить PAM системы CcCas9 – двубуквенную последовательность NNNNGNA  (Фиг. 2).
in vitro
in vitro
in vitro
Далее было произведено дополнительное определение PAM последовательности при помощи воссоздания реакции разрезания . Для определения PAM последовательности белка CcCas9 использовали  порезку двунитевых PAM библиотек. Для этого было необходимо получить все компоненты CcCas9 эффекторного комплекса: направляющие РНК и нуклеазу в рекомбинантной форме. Определение РНК-секвенированием последовательности направляющих РНК позволило синтезировать  молекулы crRNA и tracrRNA.  Синтез осуществляли с помощью набора NEB HiScribe T7 RNA synthesis. Двунитевые ДНК библиотеки представляли собой фрагменты  размером 374 п.н, содержащие последовательность протоспейсера, фланкированную рандомизированными семью нуклеотидами (5’ NNNNNNN 3’) c 3’ конца:
NNNNNN
5’cccggggtaccacggagagatggtggaaatcatctttctcgtgggcatccttgatggccacctcgtcggaagtgcccacgaggatgacagcaatgccaatgctgggggggctcttctgagaacgagctctgctgcctgacacggccaggacggccaacaccaaccagaacttgggagaacagcactccgctctgggcttcatcttcaactcgtcgactccctgcaaacacaaagaaagagcatgttaaaataggatctacatcacgtaacctgtcttagaagaggctagatactgcaattcaaggaccttatctcctttcattgagcacNaactccatctaccagcctactctcttatctctggtatt -3’
Для разрезания этой мишени использовали направляющие РНК следующей последовательности:
tracrRNA:
5’AUUAUGGCAUAUCGGAGCCUGAAUUGUUGCUAUAAUAAGGUGCUGGGUUUAGCCCAGACCGCCAAGUUAACCCCGGCAUUUAUUGCUGGGGUAUCUUGUUUU
и crRNA:
uaucuccuuucauugagcac
5’GUUAUAGCUCCAAUUCAGGCUCCGAUAU
Жирным шрифтом выделена последовательность crRNA, комплементарная протоспейсеру (целевой ДНК последовательности).
in vitro
Для получения рекомбинантного белка CcCas9 его ген был заклонирован в плазмиду pET21a. Клетки E.coli Rosetta были трансформированы полученной плазмидой CcCas9_pET21a. Клетки, несущие плазмиду, наращивали до оптической плотности OD_600=0.6, далее проводили индукцию экспрессии гена CcCas9 добавлением  IPTG до концентрации 1mM. Клетки инкубировали в течение 4 часов на 25°С, после чего проводили их лизис. Очистку рекомбинантного белка проводили двумя этапами: с помощью аффинной хроматографии (NiNTA) и разделением белков по размерам на колонке Superdex 200. Полученный белок концентрировали c помощью фильтров Amicon с размером пор 30кДа. После этого белок замораживали на минус 80°С и использовали для проведения  реакций.
In vitro
реакцию порезки линейных PAM библиотек проводили в следующих условиях:
1xCutSmart буфер
400 нM СсCas9
100 нM  ДНК библиотека
2 мкM crRNA
2 мкM tracrRNA
Общий объем реакции 20 мкл.
Clostridium cellulolyticum H10
обитает вкомпостах и имеет оптимальную температуру деления 45°С, в связи с этим реакции проводили на этой температуре в течение 30 минут.
В результате порезки часть фрагментов библиотеки распадалась на две части длиной около 50 пар нуклеотидов (п.н.) и 324 п.н. В качестве контрольного образца использовали реакции без добавления crRNA, обязательного компонента эффекторного Cas комплекса.
Продукты реакции наносили на 1.5% агарозный гель и подвергали электрофорезу. Непорезанные фрагменты ДНК длиной 374 п.н. экстрагировали из геля и подготавливали для высокоэффективного секвенирования с помощью набора NEB NextUltra II. Образцы секвенировали на платформе Illumina и далее проводили анализ последовательностей биоформатическими методами: определяли разницу в представленности нуклеотидов в отдельных позициях PAM (NNNNNNN)  в сравнении с контрольным образцом (Фиг. 3).
in vitro
В результате авторам удалось определить PAM последовательность СсCas9  методами: NNNNGNA, что полностью повторило результат, полученный в экспериментах с бактериями.
Далее была произведена проверка значимости отдельных позиций последовательность PAM. Для этого in vitro проводили реакции in vitro порезки ДНК фрагмента, содержащего ДНК-мишень 5’- gtgctcaatgaaaggagata-3’, фланкированную PAM последовательностью GAGAGTA:
GAGAGTA
5’cccggggtaccacggagagatggtggaaatcatctttctcgtgggcatccttgatggccacctcgtcggaagtgcccacgaggatgacagcaatgccaatgctgggggggctcttctgagaacgagctctgctgcctgacacggccaggacggccaacaccaaccagaacttgggagaacagcactccgctctgggcttcatcttcaactcgtcgactccctgcaaacacaaagaaagagcatgttaaaataggatctacatcacgtaacctgtcttagaagaggctagatactgcaattcaaggaccttatctcctttcattgagcac  aactccatctaccagcctactctcttatctctggtatt 3’
Реакцию проводили в следующих условиях:
1xCutSmart буфер
400 нM СсCas9
20 нM  ДНК
2 мкM crRNA
2 мкM tracrRNA
Время инкубации 30 минут, температура проведения реакции 45 °С.
Результаты эксперимента подтвердили последовательность PAM для СсCas9 как NNNNGNA -3’. Наиболее консервативной оказалась позиция G в пятом положении (см. Фиг. 4).
Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.
Пример 1
. Тестирование активности белка СсCas9 в разрезании различных ДНК мишеней.
in vitro
Для того, чтобы проверить способность CcCas9 узнавать различные  последовательности ДНК, фланкированные NNNNGNA 3’ последовательностью, были проведены эксперименты по  разрезанию ДНК-мишеней  из  последовательности гена  grin2b человека (см. таблицу 1 ниже).
Таблица 1. ДНК-мишени, выделенные из гена  grin2b человека.
ДНК-мишень
PAM
ctacatcacgtaacctgtct
tagaAgA
gaacgagctctgctgcctga
cacgGcc
agaacgagctctgctgcctg
acacGgc
acggccaacaccaaccagaa
cttgGgA
tccgctctgggcttcatctt
caactcg
cgactccctgcaaacacaaa
gaaagag
atctacatcacgtaacctgt
cttaGaA
tatctcctttcattgagcac
caaaccc
Реакции in vitro разрезания ДНК проводили в условиях аналогичных описанным выше экспериментам. В качестве ДНК-мишени использовался фрагмент гена человека grin2b размером около 500 н.п:
ttgtctctgcctgtagctgccaatgactatagcaatagcaccttttattgccttgttcaaggatttctgaggcttttgaaagtttcattttctctcattctgcagagcaaataccagagataagagagtaggctggtagatggagttgggtttggtgctcaatgaaaggagataaggtccttgaattgcagtatctagcctcttctaagacaggttacgtgatgtagatcctattttaacatgctctttctttgtgtttgcagggagtcgacgagttgaagatgaagcccagagcggagtgctgttctcccaagttctggttggtgttggccgtcctggccgtgtcaggcagcagagctcgttctcagaagagcccccccagcattggcattgctgtcatcctcgtgggcacttccgacgaggtggccatcaaggatgcccacgagaaagatgatttccaccatctctccgtggtaccccggg
Результаты эксперимента показывают, что СсCas9 в комплексе с направляющими РНК способен распознавать различные ДНК мишени, содержащие последовательность PAM NNNNNGNA (Фиг. 5). В случаях некоторых мишеней СсCas9 толерантен к заменам в 7 положении последовательности PAM.
Пример 2
. Температурный диапазон активности CcCas9.
Для уточнения температурного диапазона работы белка СсCas9 были проведены эксперименты по in vitro разрезанию ДНК-мишени в различных температурных условиях.
Для этого ДНК-мишень, фланкированную последовательностью PAM GAGAGTA, подвергали разрезанию эффекторным комплексом CcCas9 с соответствующими направляющими РНК при разных температурах (Фиг. 6).
Оказалось, что белок CcCas9 обладает широким температурным диапазоном работы. Максимум нуклеазной активности достигается при температуре в 45 °С, в то время как белок достаточно активен в диапазоне от 37 °С до 55 °С. Таким образом, CcCas9  в комплексе с направляющими РНК является новым инструментом разрезания (образования двунитевых разрывов) в молекуле ДНК, ограниченной последовательностью 3’- NNNNNGNA -5’, с температурным диапазоном работы от 37 °С до 55 °С. Схема комплекса таргетной ДНК с крРНК (crRNA)  и трейсерной РНК (tracrRNA), вместе образующей направляющую РНК, изображена на Фиг. 7.
Пример 3
.
Clostridium.
Белки Cas9 из близкородственных организмов, относящихся к
Clostridium perfringens
. Front Microbiol.
На сегодняшний день в клостридиях была найдена всего одна CRISPR Cas система второго класса –Cas9 CRISPR Cas система из (Maikova A, et al., New Insights Into Functions and Possible Applications of Clostridium difficile CRISPR-Cas System2018 Jul 31;9:1740).
Clostridium perfringens
Staphylococcus aureus
Cas9 белок из этой бактерии  идентичен на 36% белку СсCas9 (степень идентичности была рассчитана по программе BLASTp, default parameters). Сравнимый по размерам белок Cas9 из идентичен СсCas9 на 28% (BLASTp, default parameters).
Таким образом, белок СсCas9 существенно отличается по аминокислотной последовательности от других Cas9 белков, изученных на сегодняшний день, в том числе белков, найденных в родственных организмах.
Специалисту в области генетической инженерии очевидно, что полученный и охарактеризованный Заявителем вариант последовательности белка CcCas9 может быть изменен без изменения функции самого белка (например, направленным мутагенезом аминокислотных остатков, напрямую не влияющих на функциональную активность (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108)). В частности, специалисту известно, что могут быть изменены неконсервативные аминокислотные остатки, не затрагивающие остатки, определяющие функциональность белка (определяющие его функцию или структуру). Примерами таких изменений могут служить замены неконсервативных аминокислотных остатков на гомологичные. Некоторые из участков, содержащих неконсервативные аминокислотные остатки, приведены на Фиг. 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения возможно использование белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеет отличия по сравнению с SEQ ID NO: 1 только в неконсервативных аминокислотных остатках, для образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК, расположенного непосредственно перед нуклеотидной последовательностью 5’- NNNNGNA -3’ в указанной молекуле ДНК. Гомологичные белки могут быть получены путем мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) соответствующих молекул нуклеиновых кислот с последующим тестированием кодируемого модифицированного белка Cas9 на сохранение его функций в соответствии с описанными здесь функциональными анализами.
Пример 4
. Описанная в настоящем изобретении система CcCas9 в комплексе с направляющими РНК может быть использована для изменения последовательности геномной ДНК многоклеточного организма, в том числе эукариотического. Для введения система CcCas9 в комплексе с направляющими РНК в клетки этого организма (во все клетки или в часть клеток) могут быть применены различные подходы, известные специалистам. Например, методы доставки CRISPR-Cas9 систем в клетки организмов раскрыты в источниках (Liu C et al., Delivery strategies of the CRISPR-Cas9 gene-editing system for therapeutic applications. J Control Release. 2017 Nov 28;266:17-26; Lino CA et al., Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches. Drug Deliv. 2018 Nov;25(1):1234-1257), и в источниках, раскрытых внутри этих источников.
Для эффективной экспрессии нуклеазы CcCas9 в эукариотических клетках будет желательно провести оптимизацию кодонов для аминокислотной последовательности белка CcCas9 методами, известными специалистам (например, IDT codon optimization tool).
Для эффективной работы нуклеазы CcCas9 в эукариотических клетках необходимо обеспечить импорт этого белка внутрь ядра эукариотической клетки. Для этого можно использовать сигнал ядерной локализации из Т-антигена вируса SV40 (Lanford et al., Cell, 1986, 46: 575–582), соединённый с последовательностью CcCas9 с помощью спейсерной последовательности, описанной в Shen B, et al. "Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting", Cell Res. 2013 May;23(5):720-3 или без нее. Таким образом, полная аминокислотная последовательность нуклеазы транспортируемой внутрь ядра эукариотической клетки будет представлять собой следующую последовательность: MAPKKKRKVGIHGVPAA-CcCas9-KRPAATKKAGQAKKKK (далее СсCas9 NLS). Для доставки белка с приведенной выше аминокислотной последовательностью, могут быть использованы по меньшей мере два подхода.
Доставка в виде гена осуществляется путем создания плазмиды, несущей ген CcCas9 NLS под регуляцией промотора (например, CMV промотора) и последовательности, кодирующей направляющие РНК под регуляцией U6 промотора. В качестве ДНК- мишеней используются ДНК последовательности фланкированные 5’-NNNGNA-3’, например, последовательности гена grin2b человека:
acggccaacaccaaccagaa
cgactccctgcaaacacaaa
Таким образом, кассета для экспрессии крРНК выглядит следующим образом:
Gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacc
- acggccaacaccaaccagaa -GTTATAGCTCCAATTCAGGCTCCGATATttttt
Жирным шрифтом выделена последовательность U6 промотора, далее последовательность, необходимая для узнавания целевой ДНК, а последовательность прямого повтора выделена заглавными буквами.
Кассета для экспрессии трейсерной РНК выглядит следующим образом:
Gagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacc
ATTATGGCATATCGGAGCCTGAATTGTTGCTATAATAAGGTGCTGGGTTTAGCCCAGACCGCCAAGTTAACCCCGGCATTTATTGCTGGGGTATCTTTGtttt
Жирным шрифтом выделена последовательность U6 промотора, далее последовательность, кодирующая трейсерную РНК.
Плазмидную ДНК очищают и трансфицируют в клетки человека HEK293 c помощью реагента Lipofectamine2000 (Thermo Fisher Scientific). Клетки инкубируют в течение 72 часов, после чего из них выделяется геномная ДНК с помощью колонок для очистки геномной ДНК (Thermo Fisher Scientific). Целевой ДНК сайт анализируется с помощью секвенирования на платформе Illumina с целью определения числа вставок-делеций в ДНК, происходящих в целевом сайте по причине направленного двунитевого разрыва и последующей его репарации.
Для амплификации целевых фрагментов используют праймеры, фланкирующие предположительное место внесения разрыва, например для указанных выше сайтов гена grin2b:
5’-GACTATAGCAATAGCAC-3’
5’TCAACTCGTCGACTCCCTG-3’
После амплификации пробы готовятся по протоколу реагента Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB) для подготовки образцов к высокопроизводительному секвенированию. Затем проводится секвенирование на платформе Illumina 300cycles, прямое прочтение. Результаты секвенирования анализируются биоинформатическими методами. В качестве детекции разрезания принимается вставка или делеция нескольких нуклеотидов в целевой последовательности ДНК.
Доставка в виде рибонуклеинового комплекса осуществляется путем инкубации рекомбинантной формы CcCas9 NLS c направляющими РНК в CutSmart буфере (NEB). Рекомбинантный белок получают из бактериальных клеток-продуцентов, очищая его с помощью аффинной хроматографии (NiNTA, Qiagen) разделением по размеру (Superdex 200).
Белок смешивают с РНК в соотношении 1:2:2 (CcCas9 NLS : crRNA :tracrRNA), инкубируют в течение 10 минут на комнатной температуре, затем смесь трансфицируют в клетки.
Далее проводится анализ экстрагированной из них ДНК на предмет вставок-делеций в целевом ДНК сайте (как описано выше).
Clostridium cellulolyticum
Охарактеризованная в настоящем изобретении CcCas9 нуклеаза из бактерии имеет ряд преимуществ относительно ранее охарактеризованных Cas9 белков.
in vitro
CcCas9 обладает коротким, двухбуквенным, отличным от других известных PAM Cas нуклеаз, необходимый для функционирования системы. Авторами было показано, что для СсCas9 достаточен короткий PAM GNA, распложенный в 4 нуклеотидах от протоспейсера. При этом G в +5 позиции является строгой, в то время как +7 позиция имеет меньшую значимость, и  гидролиз был детектирован не только в присутствии А или Т, но и в присутствии С в +7 позиции, хоть и с несколько меньшей эффективностью.
Известные на сегодняшний день большинство Cas нуклеаз, способных вносить двунитевые разрывы в ДНК, имеют сложные многобуквенные PAM последовательности, ограничивающие выбор последовательности, пригодных для разрезания. Среди изученных Cas нуклеаз, распознающих короткие PAM, только CcCas9 может распознавать последовательности, ограниченные GNA нуклеотидами.
Второе преимущество CcCas9 – малый размер белка (1030 а.о., что на 23 а.о. меньше, чем размер SaCas9). На сегодняшний день это единственный изученный малоразмерный белок, обладающий двухбуквенной PAM последовательностью.
Третье преимущество CcCas9 системы - широкий рабочий диапазон температур: нуклеаза активна при температурах от 37°С до 65°С с оптимумом 45°С.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.