Способ получения специфического иммуномодулятора
METHOD FOR OBTAINING A SPECIFIC IMMUNOMODULATOR

Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и касается способа получения специфического иммуномодулятора.
Известен препарат - ЦП-БЦЖ, специфический иммуномодулятор, содержащий вытяжку из туберкулезных микобактерий вакцинного штамма БЦЖ, комплексированную с полиоксидонием - синтетическим иммуностимулятором в соотношении микобактериальный белок - полиоксидоний от 1:30 до 1:120. Препарат был предложен для лечения больных туберкулезом людей, особенно с выраженным вторичным иммунодефицитом, с целью повышения эффективности стандартной противотуберкулезной химиотерапии (патент RU №2112543, 10.06.1998 г. МПК А61К 39/04, А61К 47/48).
С целью профилактики и лечения туберкулеза животных химиотерапию не применяют и названный препарат может быть не эффективным.
В последние десятилетия все большее внимание исследователей привлекают природные биоактивные соединения. Одну из лидирующих позиций в ряду таких соединений занимает пентациклический тритерпеновый спирт - бетулин и его производные: бетулоновая и бетулиновая кислоты, которые широко исследуются в плане биологической активности [Толстиков Г.А., Флехтер О.Б., Шульц Э.Э., Балтина Л.А., Толстиков А.Г. // Химия в интересах устойчивого развития. 2005. №13. С. 1-30.]. Бетулин и его производные обладают разнообразной биологической активностью: гепатопротекторной, желчегонной, антилитогенной, антиоксидантной, противовоспалительной, противоопухолевой, противовирусной, иммуномодуляторной, гиполипидемической, гастропротекторной, антисептической, антимутагенной [Pisha Е., Chai Н., Lee I.S. etal. // Nature Medicine. 1995. V. 1. P. 1046-1051.]. Помимо наличия разнообразной биологической активности, бетулин и его производные не обладают аллергенным, канцерогенным, кожнораздражающим, кумулятивным, мутагенным, сенсибилизирующим и эмбриотоксическим действием, имеют очень низкую токсичность (сам бетулин относится к IV классу опасности веществ с ЛД50 = 9000 мг/кг).
Помимо этого, показана перспективность использования экстракта бересты, содержащего бетулин, в качестве адъюванта вакцинных препаратов, в том числе при моделировании мышиного туберкулеза. В частности, применение белков ESAT-6 / CFP-10 вместе с адъювантом на основе бетулина в несколько раз усиливало иммунный ответ [Красильников И.В. Исследование протективной активности рекомбинантных антигенов возбудителя туберкулеза на мышах / И.В. Красильников, С.А. Аракелов, С.В. Петровский и др. // Медицинский алфавит. - 2017. - Т. 1. - №8(305). - С. 24-29.]
Установлено, что адъювантирующие свойства экстракта бересты проявляются в маленьких концентрациях до 500 мкг, при этом уменьшение концентрации нанодисперсии в 10 раз (до 50 мкг) не оказывает влияния на иммуногенные свойства [Красильников И.В. Изучение возможности использования нанодисперсии экстракта бересты в качестве адъюванта вакцинных препаратов / И.В. Красильников, А.В. Иванов, A.M. Николаева, В.В. Машин // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - Т. 26. - №2-2. - С. 65-67.]
Наиболее близким техническим решением является способ получения специфического иммуномодулятора (патент RU 2478399, 10.04.2013 г. МПК А61К 39/04, А61К 47/48), который включает следующие стадии: культивирование вакцинного штамма БЦЖ, разрушение культуры ультразвуком, выделение антигенного комплекса, смешивание надосадочной жидкости с формалином, определяют содержание белка и конъюгацию реакционной смеси на полиэлектролитах: поливинилпирролидоне (ПВП) и полиэтиленгликоле (ПЭГ) на магнитной мешалке при комнатной температуре до получения гомогенной жидкости. Представленное изобретение позволяет получать препарат, который устраняет вторичные иммунодефициты, и изготавливать безвредные для животных средства, обладающие выраженными протективными свойствами. Однако при испытании препарата, полученного по предлагаемой технологии, выявлены недостатки, создающие сложность при введении препарата животным из-за повышенной вязкости жидкости.
Техническим результатом является разработка технологии изготовления специфического иммуномодулятора, обладающего более эффективной противотуберкулезной защитой, а также не создающего трудности при введении препарата.
Указанный технический результат достигается путем культивирования микобактерий из штамма БЦЖ с последующим разрушением их ультразвуком, выделением антигенного комплекса (цитоплазматического и клеточных оболочек) при 15000 об/мин, надосадочную жидкость (антиген комплекс) смешивают с формалином, определяют содержание белка, реакционную смесь конъюгируют с бетулоновой кислотой при соотношении 1 мг/мл белка - 500 мкг при комнатной температуре до получения гомогенной жидкости.
Сущность изобретения поясняется на конкретных примерах выполнения способа.
Получение антигенного комплекса из вакцинного штамма БЦЖ.
Проводят посев вакцинного штамма БЦЖ на жидкую синтетическую среду Сотона. Вакцинный штамм культивируют в конических колбах емкостью 0,5-1,0 л при температуре 37°С в течение 2-3-х недель. Выросшую бактериальную массу собирают и трижды отмывают стерильным физиологическим раствором, центрифугируют в течение 20 минут при 3 тыс. об/мин. Отмытую бактериальную массу ресуспендируют в стерильном физиологическом растворе из расчета 1:5 (1,0 г бактериальной массы и 5 мл физиологического раствора). Флаконы с суспензией бактериальных клеток помещают на 24 часа на шуттель-аппарат при комнатной температуре.
2
Суспензию бактериальных клеток подвергают ультразвуковой дезинтеграции на аппарате УЗДН-1 (22-35 кГц, 60-70 Вт/см в течение 30 мин), полученную взвесь центрифугируют 30 мин при 15000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают и в ней определяют количество белка на полуавтоматическом программируемом фотометре 5010 V5 + (производство «Нитап» Германия).
В основе определения на приборе общего белка в жидкостях используется общеизвестный биуретовый метод. Ионы меди реагируют в щелочной среде, формируя фиолетовый комплекс. Оптическая плотность образованного комплекса пропорциональна концентрации белка в пробе.
Оптическую плотность определяли в сравнении со стандартом при длине волны 546 нм, при этом оптический путь составляет 1 см при температуре 20…25°С. Измерение осуществляется против холостой пробы по реагенту (одна холостая проба на серию).
В объем антигенного комплекса (99,3 мл) добавляют 37%-ного медицинского формальдегида 0,7 мл или 40%-ного - 0,6 мл. Реакционную смесь инкубируют в термостате при 37°С в течение 5-9 дней, конъюгируют с бетулоновой кислотой концентрацию которой доводят на 1 мг/мл белка - 500 мкг/мл.
Размешивают при комнатной температуре до получения гомогенной массы, измеряют содержание белка, доводят дозу по содержанию белка на животное. Реакционную смесь разливают во флаконы и стерилизуют на установке АСИС при 80°С в течение 30 мин и в стерильном боксе закрывают пробками.
Испытание препарата на лабораторных животных. Готовят описанным способом 2 серии иммуномодулирующего средства с содержанием производных бетулина на 1 мг/мл белка: 1-я серия - 500 мкг/мл бетулиновой кислоты; 2-я - 500 мкг/мл бетулоновой кислоты. В сравнительном аспекте с вакциной БЦЖ и иммуномодулятором КИМ-М2 (патент RU 2478399, МПК А61К 39/04, А61К 47/48) на 25 морских свинках изучают иммуногенные свойства препаратов, а также проводят гистологические исследования.
Результаты изучения иммуногенных свойств.
С целью изучения иммуногенности 5 морским свинкам вводят препарат 1-й серии подкожно в дозе 0,5 мг/мл белка (1-я группа), другим 5 морским свинкам аналогичным способом препарат 2-й серии (2-я группа), 5 - вводят иммуномодулятор КИМ-М2 в дозе 0,5 мг/мл белка (3-я группа), 5 - вводят внутрикожно вакцину БЦЖ в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора (4-я группа) и 5 интактных морских свинок используют в качестве контроля (5-я группа). Всех морских свинок (n=25) через 30 суток после иммунизации инфицируют вирулентной культурой штамм 8 М. bovis подкожно в дозе 0,001 мг/мл.
Через 2 месяца после инфицирования морских свинок всех групп подвергают убою с целью изучения патологического процесса. Определяют показатель интенсивности поражений и индекс защиты, используя схему С.И. Гельберг, Е.А. Финкель [Гельберг С.И. К методике экспериментального изучения иммуногенных свойств противотуберкулезных вакцин и эффективность методов их применения / С.И. Гельберг, Е.А. Финкель // Пробл. туберкулеза. - 1959. - №2. - С. 80-84].
Результаты исследований представлены в таблице 1. Важно отметить, что аллергическая реакция на введение ППД-туберкулина на 30-е сутки после обработки противотуберкулезными препаратами развивалась только у морских свинок, привитых вакциной БЦЖ.
Патологоанатомическим исследованием морских свинок, убитых через 60 дней после заражения, установлено достоверное снижение степени пораженности органов у животных всех опытных групп, тем не менее, самая низкая степень пораженности отмечалась у животных, сенсибилизированных препаратом 2-й серии (индекс защиты - 73%), что было сопоставимое живой вакциной БЦЖ (индекс защиты 76%). В то же время препарат 1-й серии и иммуномодулятор КИМ-М2 показали менее низкую способность животных противостоять экспериментальному заражению.
Результаты гистологического исследования.
В регионарныхлимфоузлах морских свинок, сенсибилизированных как препаратом 1-й серии, так и иммуномодулятором КИМ-М2, ярко выражены специфические изменения. Большая часть поверхности среза занята обширными полями из эпителиоидных клеток. Среди них обнаруживаются различного размера очаги некроза. Некротические массы представляют собой продукты распада (рексиса) клеток и их ядер, а также апоптозные тельца.
В легких отмечена интенсивная пролиферация эпителиоидных клеток, что является специфичным для туберкулеза. Отмечена также пролиферация лимфоидной ткани.
В регионарных лимфоузлах морских свинок, сенсибилизированных препаратом 2-й серии, отмечаются признаки снижения лимфоцито- и плазмоцитопоэза, а также преимущественно диффузная пролиферация эпителиоидных макрофагов. Очагов некроза не обнаружено.
В легких туберкулезных очагов не обнаружено. Слабо выражены процессы пролиферации эпителиоидных макрофагов в стенках альвеол, в периваскулярной и перибронхиальной ткани. Также слабо выражена пролиферация лимфоцитов в названных структурах.
У морских свинок, привитых вакциной БЦЖ, при гистологическом исследовании пахового лимфоузла обнаружено, что в корковом веществе лимфоциты образуют сплошные поля, в которых обнаруживаются немногочисленные лимфатические фолликулы с центром размножения. В центрах размножения, кроме дендритных ретикулоцитов и бластных форм лимфоцитов, находится большое количество макрофагов со светлым круглым ядром и оксифильной цитоплазмой (эпителиоидные клетки). В краевых синусах лимфоциты расположены редко. Среди них встречаются немногочисленные плазмоциты и гранулоциты. Мозговые тяжи относительно узкие, лимфоциты в них расположены компактно. В мозговых синусах среди ретикулоцитов обнаруживается небольшое количество лимфоцитов. Плазмоциты в мозговых тяжах и синусах встречаются в небольшом количестве.
При гистологическом исследовании легких установлено, что в органе возникает иммунный ответ на генерализацию возбудителя, заключающийся в пролиферации вокруг кровеносных сосудов лимфоцитов и образованием лимфатических фолликулов, в которых нет выраженных признаков лимфо- и плазмоцитопоэза. Признаков формирования специфических гранулем не обнаружено.
Таким образом, у морских свинок, зараженных культурой микобактерий бычьего типа как после вакцинации вакциной БЦЖ, так и после обработки препаратом на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой, были слабее выражены специфические изменения, чем у морских свинок других групп.У них также отмечаются морфологические признаки усиления лимфоцито- и плазмоцитопоэза.
По результатам проведенных исследований для дальнейшего изучения взят препарат 2-й серии.
Результаты изучения иммуногенных свойств препарата с различным содержанием бетулоновой кислоты.
С целью изучения иммуногенности препарата на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой в зависимости от дозы готовят 3 серии иммуномодулирующего средства с различным содержанием бетулоновой кислоты на 1 мг/мл белка: 1-я серия - 250 мкг/мл бетулоновой кислоты; 2-я серия - 500 мкг/мл и 3-я - 1000 мкг/мл.
5 морским свинкам вводят препарат 1-й серии подкожно в дозе 0,5 мг/мл белка (1-я группа), другим 5 морским свинкам аналогичным способом препарат 2-й серии (2-я группа) и еще 5 - 3-й серии (3-я группа). 5 интактных морских свинок используют в качестве контроля (4-я группа). Всех морских свинок (n=20) через 30 суток после иммунизации инфицируют вирулентной культурой штамм 8 М. bovis подкожно в дозе 0,001 мг/мл. Через 2 месяца после инфицирования морских свинок всех групп подвергают убою с целью изучения патологического процесса. Определяют показатель интенсивности поражений и индекс защиты, используя схему С.И. Гельберг, Е.А. Финкель.
Результаты исследований представлены в таблице 2.
Патологоанатомическим исследованием морских свинок, убитых через 60 дней после заражения, установлено достоверное снижение степени пораженности органов у животных всех опытных групп. Наиболее низкая степень пораженности отмечалась у животных, подвергнутых обработке препаратом 2-й серии (индекс защиты - 70%), несколько выше у животных, иммунизированных препаратом 1-й серии.
Увеличение количества бетулоновой кислоты в препарате до 1000 мкг/мл (серия 3) способствовало увеличению степени пораженности органов и, как следствие, снижению индекса защиты до 50%.
Результаты изучения иммунного статуса. С целью изучения иммунного статуса отбирают 15 морских свинок. Пять интактных морских свинок служат контролем. Из остальных формируют 2 опытные группы: животным I группы (n=5) подкожно вводят препарат на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой в дозе 0,5 мг/мли II группы (n=5) - внутрикожно вакцину БЦЖ в дозе 0,1 мг в 0,1 мл физиологического раствора. Через 30 суток после иммунизации животных контрольной и опытных групп инфицируют вирулентной культурой М. bovis (штамм 8), подкожно в дозе 0,001 мг/мл.
На 30-е сутки после введения препаратов, а также на 30-сутки после инокуляции вирулентной культуры микобактерий у всех животных производят отбор проб крови.
Результаты представлены в таблице 3.
Анализ параметров иммунной системы на 30-е сутки после введения противотуберкулезных препаратов показал, что у морских свинок опытных групп наблюдается достоверное увеличение числа лейкоцитов. Так, относительно контрольной группы концентрация белых клеток крови у животных, вакцинированных БЦЖ, возросла на 80%, а после обработки комплексом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой на 28,2%.
9
9
Идентичная траектория показателей отмечена в абсолютном содержании лимфоцитов. Средние значения этого параметра у животных опытных групп составили от 6,45 до 6,87 10/л, тогда как в контроле существенно ниже - 4,14 10/л (р<0,05).
Рост числа лимфоидных клеток происходил за счет всех популяций. Так, по сравнению с контролем в группе животных, подвергнутых обработке препаратами на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой, концентрация Т-лимфоцитов возросла с высокой степенью достоверности в 3,1, В-лимфоцитов - в 1,7 и цитотоксических Т-лимфоцитов - в 3,8 раза. Вакцинация БЦЖ также способствовала пролиферации иммунокомпетентных клеток, особенно это касалось Т-лимфоцитов и цитотоксических Т-лимфоцитов.
Действие специфических иммунобиологических средств на генерацию активных форм кислорода, в том числе перекиси водорода, носило преимущественно стимулирующий характер, хотя оно не оказывало статистически значимого влияния на показатели тетразолиевой (НСТ-тест) и пероксидазной активности (СЦК МПО), за исключением особей, сенсибилизированных конъюгатом антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой, у которых отмечалось достоверное снижение спонтанной до 0,59±0,05 против 0,73±0,03 ед. оп.пл. и повышение индуцированной НСТ-активности до 1,11±0,03 против 0,95±0,02 ед. оп.пл. в контрольной группе. Вследствие таких изменений у животных этой группы также был существенно увеличен функциональный резерв нейтрофилов, отражающий эффекторный потенциал системы фагоцитоза. В то же время у морских свинок, иммунизированных БЦЖ, резервная активность нейтрофилов находилась приблизительно на одном уровне.
Неодинаковую траекторию изменений наблюдали при исследовании другого важного компонента микробицидной системы лейкоцитов - катионных белков. В частности, с помощью цитохимического коэффициента выявлены следующие отличия: введение вакцины БЦЖ сопровождалось незначительным снижением активности катионных белков, тогда как конъюгата на основе антигенов БЦЖ с бетулоновой кислотой - существенным увеличением относительно контроля. Так, их уровень вырос соответственно до 1,53±0,04 против 1,08±0,07 в группе интактных животных.
Таким образом, введение морским свинкам изучаемого препарата оказывало иммуностимулирующее действие, которое проявлялось увеличением числа иммунокомпетентных клеток, а также усилением функциональной активности нейтрофилов.
Иммунологическая перестройка на 30-е сутки после инокуляции вирулентной культуры Mucobacterium bovis морским свинкам, иммунизированных препаратом на основе антигенов вакцинного штамма с бетулоновой кислотой, сопровождалась снижением числа лейкоцитов на 35,6% (р<0,001), лимфоцитов на 39,8% (р<0,001) и нейтрофилов на 14,3% (р<0,01 Относительно соответствующих значений инфицированных животных (контроль). Следует отметить, что введение М. bovis особям, вакцинированным БЦЖ, не оказывало статистически значимого влияния на указанные показатели, хотя и прослеживалась тенденция к их повышению.
Результаты представлены в таблице 4.
Снижение концентрации лимфоидных клеток после экспериментального заражения морских свинок, обработанных препаратом на основе антигенов вакцинного штамма с бетулоновой кислотой, происходило за счет популяции цитотоксических Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Так, по сравнению с контрольной группой зарегистрировано уменьшение числа эффекторных клеток на 62,1% (р<0,01), а В-клеток на 33% (р<0,01). В то же время инфицирование особей, которым предварительно вводили конъюгат с бетулоновой кислотой, индуцировало существенное увеличение концентрации Т-лимфоцитов на 72,7% (р<0,05). Последнее изменение также было характерно для животных, привитых БЦЖ, у которых пролиферация Т-клеток носила более выраженный характер (2,69±0,31; 0,99±0,06, р<0,01).
Изменения показателей кислородзависимой бактерицидной активности нейтрофилов по результатам исследований в НСТ-тесте в анализируемых группах были однонаправленными. При отсутствии значимых отличий был отмечен рост стимулированной и снижение спонтанной тетразолиевой активности. Помимо этого, средние значения функционального резерва нейтрофилов у морских свинок опытных групп составили от 0,92 до 0,94, тогда как в контроле этот параметр снижался до 0,78 (р<0,05).
Одинаковой траекторией изменений цитохимических показателей кислороднезависимой (СЦК ЛКБ) и кислородзависимой (СЦК МПО) бактерицидной активности нейтрофилов при разной степени выраженности характеризовались значения животных, иммунизированных вакциной БЦЖ и конъюгатом, при этом только у последних наблюдалось статистически значимое повышение показателей.
Известно, что при туберкулезе возникает выраженный дефицит Т-системы иммунитета, углубление степени которого происходит по мере прогрессирования заболевания. Помимо этого, ведущую роль в формировании противотуберкулезного иммунитета играет функциональное состояние фагоцитирующих клеток, особенно их бактерицидных систем. После экспериментального инфицирования вирулентным штаммом микобактерий указанные ключевые параметры иммунной системы у морских свинок, иммунизированных БЦЖ и конъюгатом, были существенно выше по сравнению с животными контрольной группы, что свидетельствовало об их более высокой противотуберкулезной эффективности.
Следовательно, конъюгат антигенов вакцинного штамма с бетулоновой кислотой индуцировал наиболее высокую противотуберкулезную устойчивость, сопоставимую с вакциной БЦЖ, о чем свидетельствовали реакции клеточного иммунитета после инокуляции вирулентного штамма Mucobacterium bovis, а также результаты патологоанатомических и гистологических исследований.
Таким образом, полученный специфический иммуномодулятор обладает иммуностимулирующими свойствами, способен эффективно корректировать иммунный статус животных при туберкулезном процессе, обладает выраженными протективными свойствами, безвреден для животных. При этом введение препарата животным не вызывает трудности за счет незначительного содержания в нем бетулоновой кислоты (500 мкг/мл). Последнее обстоятельство также позволяет уменьшить себестоимость средства.