МЕТАБИОТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ КОЛОНИЗАЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА
METABIOTIC COMPOSITION TO ENSURE COLONISATION RESISTANCE OF HUMAN INTESTINAL MICROBIOCENOSIS

Изобретение относится к области медицины и касается средства для обеспечения колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника человека при дисбиотических нарушениях, ассоциированных с воздействием антибиотиков, за счет благотворного влияния на составляющие индигенной микрофлоры биотопа, обеспечения антагонистического эффекта в отношении патогенов бактериальной и вирусной природы и неспецифической резистентности организма.
Актуальная проблема современной медицинской науки связана с изучением возможных нарушений микроэкологии человека, и в первую очередь, нарушений очень важной системы организма - микробиоценоза кишечника. Микроэкологические изменения в микрофлоре кишечника регистрируют практически у 90% населения [1] и многие исследователи наблюдаемое увеличение частоты и тяжести острых инфекционных заболеваний, торпидное течение и хронизацию воспалительных процессов объясняют развивающимися или уже имевшими место нарушениями микробиоты, сопровождающими основную болезнь. Представляя экстракорпоральный орган, микрофлора организма человека выполняет или регулирует многообразные функции по поддержанию нормального гомеостаза [2]. Изменения в составе нормальной микрофлоры ведут к развитию процессов, сказывающихся на состоянии здоровья людей [3-5].
Значение микрофлоры кишечника в жизнедеятельности организма человека связано с тем, что она оказывает непосредственное влияние на его состояние, выполняя ряд жизненно важных функций: обеспечение колонизационной резистентности, формирование иммунного ответа, переваривание пищи, регуляция моторной функции кишечника, дезинтоксикация.
Одной из важнейших функций нормальной микрофлоры является обеспечение колонизационной резистентности - совокупности механизмов, обеспечивающих способность микробиоты и макроорганизма, кооперативно взаимодействуя, защищать экосистему от воздействия патогенной микрофлоры, придающих стабильность нормальной микрофлоре, предотвращающих заселение организма посторонними микроорганизмами и обеспечивающих его противоинфекционную защиту [5-7].
Отсутствие колонизационной резистентности, обусловленное различными причинами, приводит к значительному ослаблению противоинфекционной защиты организма, увеличению численности и спектра патогенных и условно-патогенных микробов, их транслокации из мест первичной локализации, а, следовательно, к повышению восприимчивости организма к возникновению инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы [5, 8, 9], развитию эндогенных инфекций, суперинфекций различных локализаций [10-12]. Отсутствие колонизационной резистентности является одним из пусковых факторов возникновения различных заболеваний.
Колонизационная резистентность микробиоценоза кишечника определяется множеством факторов и, прежде всего, зависит от количества и качества нормальной микрофлоры, антагонистической активности составляющих ее микробов, условий их обитания, в том числе конкуренции за факторы питания и другие. К основным механизмам обеспечения колонизационной резистентности относится и активация иммунной системы [4].
Поэтому колонизационная резистентность микробиоценоза кишечника, главным образом, связана с состоянием микробиоценоза биотопа и механизмами местной неспецифической иммунологической резистентности организма [1, 9]. В свою очередь, нарушение механизмов иммунологического гомеостаза является одной из важных причин развития дисбиотических нарушений микробиоценоза кишечника. Защитные реакции против вирусных и бактериальных патогенов могут быть усилены путем активации иммунной системы [13], когда стимулирующий сигнал носит неспецифический характер, направленный не избирательно против вызвавшего инфекцию патогена, а повышающий общую иммунологическую резистентность.
Разнообразные неблагоприятные воздействия на организм человека вызывают изменения иммунного ответа и могут влиять на качественные и количественные характеристики нормальной микрофлоры кишечника. При дисбиотических нарушениях микробиоценоза кишечника возникают клинические состояния, связанные с отсутствием колонизационной резистентности, расстройствами пищеварения, нарушением детоксицирующей функции кишечной микрофлоры и изменениями иммунного ответа.
Развитию дисбактериоза кишечника способствуют разнообразные факторы экзогенного и эндогенного характера [4, 5, 15]. Достаточно распространенными в настоящее время являются: стресс и переутомление, физические и психоэмоциональные нагрузки, курение, несбалансированное питание, нарушение режима питания, переедание или перекусы на бегу, экологическое неблагополучие, многие хронические заболевания и ряд других патологических состояний. В подобных случаях, ввиду того, что микробиоценоз является эволюционно сложившейся и четко интегрированной системой, которая обеспечивает слаженную работу всех органов и систем и базируется до известной степени на принципе саморегуляции, возникающие изменения симбиотической микрофлоры в большинстве случаев восстанавливаются самопроизвольно.
Все складывается совершенно иначе после нерационального применения антибиотиков. В клинической практике подобная ситуация, при которой, прежде всего, и возникают дисбиотические нарушения микробиоценоза кишечника, в настоящее время является распространенной. Лечение с назначением антибиотиков зачастую является стандартным решением при самых различных заболеваниях, в том числе и таких распространенных, как ангина, бактериальные инфекции верхних и нижних дыхательных путей (тонзиллит, верхне-челюстной синусит (гайморит), фарингит, бронхит, пневмонии и другие), урогенитальные инфекции, острые кишечные инфекции и многие другие патологические состояния. На использовании антибиотиков основываются известные базовые схемы экстренной профилактики и лечения инфекционных заболеваний бактериальной природы [16-19].
При этом нельзя не отметить, что для достижения адекватного антибактериального эффекта подобные препараты, как правило, принимаются часто, длительно и в больших дозировках. Антибиотики, с одной стороны, позволяют эффективно ингибировать избыточный рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, но с другой, при обычно применяемых схемах их дозирования нередко становятся причиной развития целого ряда побочных явлений со стороны различных органов и систем организма. Прежде всего, они оказывают негативное влияние на состояние микробиоценоза кишечника человека ввиду отсутствия селективности их действия на микроорганизмы. Под воздействием антибиотиков, как правило, у 2/3 пациентов возникают относительно длительные (в течение 2-3 мес) нарушения кишечного микробиоценоза и, прежде всего, баланса качественного и количественного состава микрофлоры, вследствие чего появляются симптомы дисбактериоза.
Следует учитывать и то, что антибиотики токсичны, обладают неспецифичным бактерицидным действием и могут спровоцировать появление патогенных микроорганизмов, устойчивых к действию традиционно используемых антибактериальных средств, вследствие чего антибиотикотерапия требует в обязательном порядке последующее восстановление микробиоценоза кишечника (дисбаланса в системе «макроорганизм и нормальная микрофлора»).
Таким образом, практическая важность адекватной коррекции нарушений микробиоценоза кишечника у больных, получающих антибиотики, не вызывает сомнения. При коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника проводят комплекс мероприятий с учетом клинических проявлений основного заболевания и степени выраженности дисбиотических нарушений кишечного микробиоценоза, а также данных лабораторных исследований микрофлоры биотопа и состояния реактивности организма
Для обеспечения эффективной коррекции нарушений микробиоценоза кишечника человека выполняют такие мероприятия, как:
- селективная деконтаминация патогенной и условно-патогенной микрофлоры;
- нормализация индигенной микрофлоры кишечника;
- коррекция иммунологической реактивности организма.
Коррекцию дисбиотических нарушений проводят в соответствии с Отраслевым стандартом [20] и выполняют поэтапно (в 2 этапа) и в соответствии со степенью их выраженности. В случаях дисбактериоза 2 и 3 степени выраженности возникших нарушений коррекцию начинают с назначения на первом этапе средств, обладающих избирательной антибактериальной активностью и обеспечивающих селективную деконтаминацию патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Это различные бактериофаги - стафилококковый, клебсиеллезный, пиобактериофаг, интестибактериофаг, синегнойный и другие. При низкой чувствительности к бактериофагам используют антибактериальные препараты (фуразолидон, хлорофилипт, метронидазол, нифуроксазид, интетрикс и другие) и антигрибковые средства (кетоконазол, флюконазол, натамицин и другие). На втором же этапе в обязательном порядке рекомендуют проведение курса заместительной терапии для нормализации собственной индигенной микрофлоры кишечника. Значимую роль при этом играет дифференцированное применение различных иммунобиологических препаратов.
Спектр иммунобиологических препаратов, рекомендуемых в настоящее время для коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза кишечника достаточно широк. Из их числа наиболее широкое применение находят пробиотики, включающие специально отобранные штаммы живых микроорганизмов или специфические субстанции микробного, растительного или животного происхождения, которые проявляют антагонистическую активность в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, стимулируют репаративные процессы в слизистой оболочке кишечника и повышают иммунологическую реактивность организма за счет гфодукции кислот, антибиотических веществ, выделения различных ферментов, витаминов и других. Микроорганизмы, входящие в состав пробиотиков, способны синтезировать вещества, обладающие противомикробными свойствами, конкурировать с патогенными микроорганизмами за питательные вещества и участки микробной адгезии, модифицировать токсины или рецепторы токсинов. Определенные виды непатогенных для человека микроорганизмов и вещества микробного происхождения оказывают при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма через оптимизацию и стабилизацию его микроэкологического статуса [21]. К их числу относятся, прежде всего, бифидо- и лактосодержащие средства для регулирования равновесия кишечной микрофлоры.
Бифидо- и лактобактерии представляют основу кишечной микрофлоры и играют решающую роль в обеспечении нормального функционирования биотопа. Бифидобактерии, являясь сахаролитическими микробами, выделяют большое количество кислых продуктов. Образующиеся молочная и уксусная кислоты способствуют усилению всасывания ионов кальция, железа, витамина D. Продукция бифидобактериями лизоцима, бактериоцинов, спиртов и высокая антагонистическая активность в отношении различных патогенов препятствуют их проникновению в верхние отделы желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Бифидобактерии отличаются высокой способностью к синтезу аминокислот, белков, многих витаминов группы В, которые впоследствии всасываются в кишечнике. Поэтому при стойких, тяжелых нарушениях функций бифидобактерий может развиваться комплекс белково-витаминно-минеральной недостаточности. При снижении уровня бифидобактерий исчезает колонизационная резистентность микробиоценоза кишечника, происходит транслокация патогенов в верхние отделы кишечника и их избыточный рост.
Основными из заселяющих ЖКТ лактобактерий являются Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum. Подавление гнилостных и гноеродных микробов и антагонистическая активность лактобактерий связаны с выработкой молочной кислоты, спирта и лизоцима, продуктов с высокой антибактериальной активностью, интерферонов, интерлейкина 1 и ряда других. Исчезновение лактобактерий приводит к сдвигу реакции среды в щелочную сторону и резкому ухудшению функционального состояния ЖКТ.
При возникновении дисбиотических состояний качественный и количественный состав анаэробных бифидо- и лактобактерий претерпевает нарушения в первую очередь. Поэтому препараты на их основе получили широкое распространение в практике врачей различных специальностей. Из их числа в ряде клинических ситуаций препаратами выбора являются пробиотические комплексы Линекс и Бифиформ [22, 23], действующим началом которых являются живые бактерии. Так, в состав Линекса, производимого фармацевтической фирмой «Лек» (Словения), включен сбалансированный комплекс молочнокислых бактерий: лактобактерий Lactobacillus acidophilus, бифидобактерии Bifidobacterium infantis и энтерококки Enterococcus faecium. В отличие от Линекса в состав Бифиформа, гфоизводимого датской фармацевтической компанией «Ферросан Интернейшнл А/С», помимо бифидобактерий Bifidobacterium longum (штамм АТСС 15707) и энтерококков Enterococcus faecium (штамм SF68) от микробиологической лаборатории «Кристиан Хансен» (Дания) включена особая питательная среда для их питания, роста и размножения. Кроме того, Бифиформ не содержит лактозу, вследствие чего показан пациентам с ее непереносимостью. Входящие в состав препаратов бактерии предназначены для регулирования физиологического равновесия кишечной микрофлоры путем продукции молочной кислоты, в меньшей степени уксусной и пропионовой кислот. Создаваемая в результате кислая среда является неблагоприятной для развития патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Полезные бактерии лиофильно высушены и расфасованы в специальные защитные капсулы, что обеспечивает их надежную защиту от разрушения под воздействием желудочного сока и позволяет донести в мало измененном виде непосредственно до кишечника и там высвободить.
Однако, помимо благоприятных эффектов препаратам Линекс и Бифиформ характерен ряд существенных недостатков, ограничивающих возможности их широкого применения в клинической практике. Прежде всего, нельзя считать, что входящие в их состав бактерии эквивалентны собственной индигенной микрофлоре и способны колонизировать и размножаться в пристеночном слое кишечника. Одной из основных причин этого является их недостаточная, вернее, непредсказуемая биосовместимость с резидентными бактериями кишечника человека. Индивидуальная биосовместимость микроорганизмов, вносимых в составе указанных препаратов, и их приживаемость не гарантированы. Соответственно, практически исключена вероятность выполнения указанными бактериями, внесенными в макроорганизм извне, своей основной функции (заместительной) и тем более за короткий промежуток времени.
Следует также учитывать, что механизм действия входящих в состав указанных препаратов микроорганизмов носит транзиторный характер, они не колонизируют в кишечнике, в связи с чем их благоприятный эффект продолжается практически только в период курсового приема. Поэтому, как правило, назначают их достаточно длительно (не менее 3-4 недель) и рекомендуют прием по 1-2 капсулы не реже 3 раз в день. А так как стоимость указанных коммерческих препаратов достаточно велика, то это также существенно ограничивает доступность Линекса и Бифиформа для широких слоев населения.
Линекс и Бифиформ рекомендуют для профилактики и лечения дисбактериозов различной этиологии. При этом используют их преимущественно в схемах коррекции дисбактериоза кишечника лишь на 2 этапе с целью заместительной терапии. В составы указанных препаратов включены штаммы бактерий с достаточно высоким уровнем антибиотикорезистентности и зачастую рекомендуют их применение одновременно с антибиотиками. Однако, опыт использования указанных средств в клинической практике с широким спектром антибиотиков при рекомендуемых схемах их назначения показал, что большая часть бактерий при таком сочетанном назначении гибнет, а активность попавших в кишечник в жизнеспособном состоянии чрезвычайно низка.
Вместе с тем, в настоящее время известно, что одним из перспективных направлений преодоления негативного воздействия антибиотиков на состав микробиоты кишечника является не самостоятельное их использование, а в комбинации с пробиотиками. При этом установлено, что в случае сочетанного назначения с антибиотиками приоритет следует отдавать таким пробиотикам, которые в своем составе содержат не живые микроорганизмы (Бифидобактерии, Лактобактерин, Споробактерин, Ламинолакт, Линекс, Бифиформ и другие), зачастую чужеродные для естественной индигенной микрофлоры ЖКТ человека, которые, к тому же, могут разрушаться антибиотиками, оказывая негативное воздействие на иммунную систему и макроорганизм в целом, а метаболиты пробиотических штаммов микроорганизмов - метабиотики [4, 24, 25].
Современным представителем таких метабиотических средств является композиция, которая по составу, механизму воздействия на организм и достигаемому благоприятному эффекту наиболее близка к заявляемой метабиотической композиции и принята в качестве композиции-прототипа [26].
Композиция-прототип представляет собой сбалансированный комплекс с выраженной антимикробной, антивирусной и иммуномодулирующей активностью, в состав которого включены метабиотический и пребиотический агенты, адсорбент-носитель и вспомогательная технологическая добавка при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:
стерилизованная культуральная жидкость, содержащая метаболиты
штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335
- 1,6-2,3;
цеолит
- 43,0-46,0;
комплекс полисахаридов (β-глюкан и маннан)
- 51,0-54,0;
стеарат кальция или аэросил
- 0,5-1,5.
В составе композиции-прототипа метабиотический агент представлен стерилизованной культуральной жидкостью (СКЖ), содержащей метаболиты, полученные в ходе культивирования и стерилизации бактерий вида Bacillus subtilis. Неотъемлемой составляющей композиции-прототипа, обеспечивающей ее лечебно-профилактические свойства, являются биологически активные вещества (БАВ), синтезируемые Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 при глубинном выращивании, в том числе различные природные антибактериальные субстанции (бактериоцины, лизоцим, катал азы), которые селективно подавляют рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике, не влияя при этом на симбионтную микрофлору. Микробы-продуценты синтезируют азотистые основания (пуриновые и пиримидиновые производные), которые представляют отдельную группу иммуномодулирующих веществ и содержатся в СКЖ в значительных количествах. Данное обстоятельство для композиции-прототипа имеет важное значение, так как азотистые основания и их производные восстанавливают функциональную активность единой макрофагальной системы организма и существенно повышают эффективность неспецифической и специфической защиты.
Основное предназначение цеолита, входящего в состав композиции-прототипа и выполняющего функции адсорбента и носителя метаболитов бацилл Bacillus subtilis, заключается в иммобилизации метаболитов, синтезируемых бациллами при культивировании и сконцентрированных в СКЖ, и доставке их в качестве носителя по всему протяжению кишечника. Постепенное высвобождение иммобилизованных на цеолите БАВ позволяет поддерживать высокий уровень активности композиции-прототипа.
В состав композиции-прототипа введен высокоактивный иммуномодулирующий агент, представляющий собой комплекс полисахаридов - продуктов ферментативного гидролиза полимеров внутреннего и внешнего слоев клеточной оболочки пивных дрожжей, а именно, β-глюкана и маннана. Действие данных легко усваиваемых в организме БАВ заключается, прежде всего, в том, что β-глюкан активизируют основные клетки иммунной системы - макрофаги.
Для улучшения технологичности процесса получения композиции-прототипа в твердой лекарственной форме для перорального введения в ее состав введена вспомогательная добавка - стеарат кальция или аэросил.
Важной особенностью композиции-прототипа является способность эффективно повышать неспецифическую и специфическую иммунную резистентность организма, которая реализуется посредством комплексного воздействия на иммунную систему всех входящих в ее состав компонентов, проявляющих иммуномодулирующую активность. Основным предназначением композиции-прототипа является поддержание оптимальных микроэкологических параметров в кишечнике путем введения в организм БАВ, сдерживающих развитие патогенов. Отсутствие в составе композиции-прототипа живых микроорганизмов позволяет применять его совместно с антибиотиками для улучшения микроэкологических условий, что способствует восстановлению качественных и количественных характеристик симбиотических микроорганизмов.
Вместе с тем, наряду с указанными благоприятными эффектами для композиции-прототипа характерен ряд недостатков:
- ограниченная биологическая активность, выражающаяся в недостаточных уровнях специфической антагонистической активности в отношении ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, что связано с использованием в его составе только одного вида микроорганизмов (Bacillus subtilis);
- обеспечение возможности эффективной коррекции нарушений только одной составляющей индигенной микрофлоры кишечника - лактобацилл;
-отсутствие сведений о возможности благоприятного воздействия на такую важную составляющую нормофлоры кишечника как бифидобактерии и стимулирования роста и размножения этих полезных микроорганизмов.
Отмеченные недостатки существенно ограничивают возможности широкого использования композиции-прототипа в клинической практике с целью коррекции колонизационной резистентности кишечника, сниженной вследствие дисбиотических нарушений микробиоценоза биотопа при назначении антибиотиков для осуществления терапии патологических состояний.
Целью изобретения явилось повышение эффективности коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза кишечника, обусловленных применением антибиотиков и приводящих к снижению колонизационной резистентности биотопа, за счет использования поликомпонентной метабиотической композиции на основе сбалансированного комплекса биологически активных веществ, обеспечивающих благоприятное влияние на основные составляющие индигенной микрофлоры кишечника, специфическую антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, неспецифическую иммунологическую резистентность организма за счет стимулирования функциональной активности иммунокомпетентаых клеток, не содержащей опасные для здоровья вещества, нетоксичной, не обладающей сенсибилизирующим действием, способностью к кумуляции, токсическим влиянием на репродуктивную функцию, мутагенным эффектом и отдаленными негативными последствиями, стабильной при хранении.
Достижение поставленной цели возможно за счет создания поликомпонентной метабиотической композиции, качественный и количественный состав которой позволит нормализовать микробиоценоз кишечника как за счет селективного стимулирования роста и размножения лактобацилл и бифидобактерий индигенной составляющей нормофлоры биотопа и обеспечения специфической антагонистической активности в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, так и путем стимулирующего влияния на систему неспецифической иммунологической резистентности и повышения неспецифической резистентности организма.
При формировании качественного и количественного состава заявляемой метабиотической композиции, предназначенной для обеспечения колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника человека, исходили из того, что основные ее компоненты должны:
- оказывать эффективное благоприятное влияние на основные составляющие индигенной микрофлоры кишечника - лакто- и бифидобактерии, способствуя их росту и размножению;
- обеспечивать колонизационную резистентность микробиоценоза биотопа, оказывая эффективное воздействие на микрофлору кишечника за счет проявления специфической антагонистической активности в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов бактериальной природы, с которыми, как правило, ассоциирована антибиотикотерапия, обеспечивая их селективную деконтаминацию;
- повышать противовирусную защиту организма за счет активации продукции в клетках макрофагальной системы такого цитокина, как интерферон;
- оказывать влияние на факторы неспецифической резистентности организма и стимулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток для устранения дисфункциональных изменений в иммунной системе, развивающихся под воздействием патогенов, а также вследствие назначения антибиотиков.
Для этого в состав заявляемой метабиотической композиции включены: метабиотическая составляющая, представляющая собой рациональную комбинацию метаболитов, продуцируемых пробиотическими штаммами четырех микроорганизмов, пребиотическая составляющая с иммуномодулирующей активностью, адсорбент-носитель и вспомогательная технологическая добавка.
В отличие от композиции-прототипа в обеспечении комплексного воздействия на состояние кишечного микробиоценоза кишечника как за счет благоприятного воздействия на индигенную составляющую микрофлоры биотопа, так и обеспечения специфического антагонистического эффекта по отношению к широкому спектру патогенов участвуют БАВ не одного вида микроорганизмов (Bacillus subtilis), а дополнительно еще трех - Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii и Lactobacillus fermentum. Метабиотическая составляющая представляет рациональную комбинацию метаболитов пробиотических штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335, Enterococcus faecium L-3, Lactobacillus delbrueckii TS1-06, Lactobacillus fermentum TS3-06.
При этом штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 введен в виде стерилизованной высушенной культуральной жидкости, так как именно в ней сконцентрирован уникальный набор БАВ, синтезируемых бациллами в процессе их выращивания. Из числа БАВ особую ценность представляют природные антибактериальные субстанции (бактериоцины, лизоцим и другие), которые селективно подавляют рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике, не влияя при этом на симбионтную микрофлору, а также вносят весомый вклад в способность заявляемой метабиотической композиции оказывать влияние на факторы неспецифической резистентности организма и стимулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток.
Способность Bacillus subtilis повышать фагоцитарную активность макрофагов и тем самым проявлять иммуномодулируюший эффект связана с синтезом при их глубинном выращивании азотистых оснований и их производных (аденин, гуанин, тимин, урацил, цитозин), которые представляют отдельную группу иммуномодулирующих веществ и содержатся в СКЖ в значительных количествах (таблица 1). Для заявляемой метабиотической композиции это имеет большое значение, так как указанные БАВ способствуют восстановлению функциональной активности единой макрофагальной системы организма, угнетенной вследствие воздействия патогенов и антибиотиков, и существенному повышению эффективности неспецифической защиты.
Особо значимо и то, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 представляют лактогенный фактор и проявляют лактогенный эффект, что выражается в стимулировании роста и размножения лактобацилл индигенной микрофлоры кишечника. Данное обусловливает благоприятные последствия за счет нормализации микрофлоры кишечника и способствует обеспечению колонизационной резистентности биотопа
Метаболиты пробиотического штамма энтерококков Enterococcus faecium L-3 включены в состав заявляемой метабиотической композиции в виде стерилизованной высушенной культуральной жидкости. В составе заявляемой метабиотической композиции метаболиты пробиотического штамма энтерококков Enterococcus faecium L-3 (энтероцины А и В) [27], представляют бифидогенный фактор и оказывают благоприятное воздействие на бифидобактерии индигенной микрофлоры кишечника, стимулируя их рост и размножение.
Пробиотические штаммы бактерий Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus fermentum TS3-06 при культивировании активно синтезируют метаболиты (бактериоцины) с протеиновым компонентом - лактоцин В [28, 29]. В состав заявляемой метабиотической композиции метаболиты введены в виде стерилизованных высушенных культуральных жидкостей и обусловливают существенный вклад в обеспечение специфической антагонистической активности заявляемой метабиотической композиции к широкому спектру патогенов.
В составе заявляемой метабиотической композиции пребиотическая составляющая представлена овсяными хлопьями и выполняет основное свое предназначение, заключающееся в обеспечении питательной потребности представителей индигенной микрофлоры кишечника, а также клеток макроорганизма, и проявляет иммуномодулирующую активность.
Овсяные хлопья способны оптимально обеспечить восстановление микрофлоры кишечника, так как доля пищевой клетчатки в них составляет 11%, которая, к тому же, содержит 35% очень ценных для человеческого организма β-глюканов. При коррекции дисбиотических состояний кишечника несомненна роль средств, отличающихся высоким содержанием пищевых волокон и позволяющих оптимизировать условия вегетирования симбионтов. Пищевые волокна (совокупность различных водорастворимых полисахаридов) не перевариваются (не расщепляются на моносахариды) эндогенными секретами ЖКТ человека и в неизмененном виде достигают толстой кишки, где метаболизируются анаэробной симбионтной микрофлорой до короткоцепочечных жирных кислот. В свою очередь, короткоцепочечные жирные кислоты (ацетат, пропионат, бутират, валерат) являются основным энергетическим субстратом для эпителиоцитов слизистой оболочки толстой кишки [30], стимулирующим пролиферацию, дифференциацию клеток и образование муциновой слизи. Помимо этого, пищевые волокна, фиксируя на своей обширной поверхности симбионтные микроорганизмы, способствуют резкому увеличению их содержания в единице внутрикишечного объема и возрастанию метаболической активности внутрикишечной среды.
Иммуномодулирующее действие β-глюкана, поступающего в организм в составе пребиотической составляющей, обусловлено тем, что он транспортируется через эпителиальный барьер клеток кишечного тракта в лимфу, в которой взаимодействует с ключевыми клетками иммунной системы (макрофагами) путем прикрепления к специфическим рецепторам, находящимся на их клеточных мембранах. Воздействуя на макрофаги, β-глюкан усиливает их фагоцитарную активность, а именно, подвижность и способность находить и устранять чужеродные, в том числе патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. Кроме того, β-глюкан стимулирует и такие клетки как нейтрофилы NK (натуральные клетки-киллеры) и LAK (лимфокиноактивированные клетки-киллеры), за счет чего дополнительно повышает антибактериальную активность заявляемой метабиотической композиции. Также β-глюкан позволяет активизировать продукцию в клетках макрофагальной системы такого цитокина, как интерферон, повышая тем самым противовирусную активность заявляемой метабиотической композиции.
Адсорбент в составе заявляемой метабиотической композиции предназначен, прежде всего, для иммобилизации метаболитов, продуцируемых Bacillus subtilis в процессе их культивирования и сконцентрированных в СКЖ. Целесообразность использования цеолита в качестве компонента заявляемой метабиотической композиции определена уникальным химическим строением его молекул, в результате чего цеолит обладает высокой сорбирующей активностью по отношению к метаболитам бактерий Bacillus subtilis. Возникают оптимальные условия для выполнения цеолитом основных функций - адсорбента и носителя метаболитов Bacillus subtilis. Не всасываясь в ЖКТ и проходя транзитом, цеолит выполняет транспортировку иммобилизованных на нем метаболитов по всему протяжению кишечника. Высвобождение метаболитов происходит постепенно и позволяет достаточно длительный промежуток времени (до 1 суток) поддерживать необходимый уровень активности заявляемой метабиотической композиции. Частицы используемого цеолита имеют размеры не более 500 мкм и овальную форму кристалла, что исключает образование микротравм в кишечнике и полностью безопасно [31-33].
Для улучшения технологичности процесса получения заявляемой метабиотической композиции в качестве вспомогательной технологической добавки используют СК или аэросил.
Действие заявляемой метабиотической композиции, выполненной в капсулированной форме, начинается уже в желудке, где происходит растворение защитной капсулы под воздействием желудочного сока Входящие в состав заявляемой метабиотической композиции метаболиты пробиотических штаммов бактерий, деградация которых в ходе транзита по ЖКТ практически исключена, попадают в кишечник, где и проявляется их благоприятное воздействие.
Как видно, ингредиенты подобраны таким образом, что заявляемая метабиотическая композиция включает сбалансированный комплекс БАВ, способствующих обеспечению колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника человека за счет эффективного благоприятного влияния на основные составляющие индигенной микрофлоры биотопа, обеспечения достаточного уровня антагонистической активности в отношении широкого спектра патогенов, а также неспецифической иммунобиологической резистентности организма, а количество их в одной капсуле составляет, масс.%:
стерилизованная высушенная культуральная жидкость,
содержащая метаболиты пробиотического штамма
бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335
- 1,9;
стерилизованная высушенная культуральная жидкость,
содержащая метаболиты пробиотического штамма
бактерий Enterococcus faecium L-3
- 4,5;
стерилизованная высушенная культуральная жидкость,
содержащая метаболиты пробиотического штамма
бактерий Lactobacillus delbrueckii TS1-06
- 4,5;
стерилизованная высушенная культуральная жидкость,
содержащая метаболиты пробиотического штамма
бактерий Lactobacillus fermentum TS3-06
- 4,5;
цеолит
- 64,3;
овсяные хлопья
- 20,0;
стеарат кальция или аэросил
- 0,3.
Возможность достижения цели изобретения подтверждается результатами проведенных исследований, представленными в следующих примерах.
Пример 1.
Получение заявляемой метабиотической композиции в виде капсулированной твердой дозированной формы для перорального введения.
Заявляемая метабиотическая композиция выполнена в виде капсулированной твердой дозированной формы для перорального введения, что не только существенно упрощает ее использование, но и обеспечивает надежную защиту входящих в ее состав БАВ от воздействия факторов, которые могут вызвать их деградацию.
Получают заявляемую метабиотическую композицию вначале в виде порошка, для чего выполняют следующий алгоритм действий. Выращивают микроорганизмы Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 методом глубинного культивирования в биологическом реакторе. После окончания процесса культивирования СКЖ с микроорганизмами подвергают центрифугированию для отделения и последующего удаления живых клеток микроорганизмов, а затем стерилизуют. Перед стерилизацией СКЖ смешивают с адсорбентом - цеолитом, предварительно измельченным до частиц размером не более 500 мкм. Полученную массу подвергают лиофилизации, при которой происходит иммобилизация биологически активных метаболитов продуцента на частицах цеолита. Далее в массу добавляют смесь, включающую овсяные хлопья и стерилизованные высушенные культуральные жидкости, содержащие метаболиты пробиотических штаммов бактерий Lactobacillus delbrueckii TS1-06, Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Enterococcus faecium L-3, затем добавляют CK или аэросил и помещают в резервуар установки для гранулирования с целью смешивания и досушивания. Затем массу просеивают на вибросите и передают на стадию капсулирования. Наполнение капсул осуществляют на автомате для наполнения капсул.
Стерилизованные высушенные культуральные жидкости, содержащие метаболиты пробиотических штаммов бактерий Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus delbrueckii TS1-06 вводят в виде высушенного продукта «Авена-Л» (ООО «Авена», Санкт-Петербург) [34].
Стерилизованную высушенную культуральную жидкость, содержащую метаболиты пробиотического штамма бактерий Enterococcus faecium L-3 вводят в виде высушенного продукта «Авена» (ООО «Авена», Санкт-Петербург) [35].
В состав заявляемой метабиотической композиции вводят овсяные хлопья, включающие пищевые волокна (11%), которые на 35% представлены β-глюканами [36].
В качестве адсорбента используют цеолит природный - натуральный микропористый силикатный минерал Холинского месторождения (Бурятия) (ООО «КРАФТ», Санкт-Петербург) [37, 38].
В качестве вспомогательной добавки используют СК [39] или аэросил [40].
Как видно, процесс получения заявляемой метабиотической композиции в капсулированной твердой дозированной форме для перорального введения отличается простотой, а используемые при этом ингредиенты выпускаются в промышленных условиях, доступны и недороги.
Пример 2.
Оценка безопасности заявляемой метабиотической композиции.
Безопасность заявляемой метабиотической композиции оценивали путем санитарно-химического анализа, микробиологических исследований, а также определения токсикологических характеристик, в том числе острой токсичности при внутрижелудочном введении, хронической токсичности и способности к кумуляции, раздражающего и сенсибилизирующего действия, возможных отдаленных последствий.
Санитарно-химический анализ.
Подготовку проб проводили по ГОСТ 26929-94 «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт». Свинец и кадмий определяли по ГОСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт». Мышьяк определяли согласно ГОСТ 26930-86 «Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка». Ртуть определяли согласно «Методическим указаниям по обнаружению и определению содержания общей ртути в пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции» (№5178-90).
Содержание хлорорганических пестицидов (токсикантов) определяли согласно «Методическим указаниям по определению остаточных количеств хлорорганических пестицидов» (№1766-77) и официальным методам анализа АО AC («Official methods of analysis of the AO АС», 1984, 14th ed., Chapter 29, P. 537-538).
Исследования проводили с использованием весов лабораторных ВЛР-500, газожидкостного хроматографа «Карло Эрба» (модель HRGC 5700), обменных клеток итальянской фирмы «Texnoplast».
Результаты проведенных измерений представлены в таблице 2 и свидетельствуют, что в заявляемой метабиотической композиции содержание токсикантов (хлорорганические пестициды ГХЦТ и ДЛТ) и опасных для здоровья веществ (свинец, кадмий, ртуть, мышьяк) не превышает допустимые уровни, установленные Техническим регламентом Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложение 3, раздел 10) [41]. Такие же пестициды как алдрин и гептахлор в заявляемой метабиотической композиции не обнаружены.
Микробиологические исследования.
Микробиологические исследования проводили в соответствии с требованиями методических указаний МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов» и МУК 2.3.2.721-98 «Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище», ГОСТ Р 52814-2007 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella», ГОСТ Р 52816-2007 «Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)», ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов», ГОСТ 30726-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli».
Проведена оценка стерильности и чистоты метаболитов пробиотических штаммов бактерий (Bacillus subtilis ВКПМ №В-23 35, Enterococcus faecium L3, Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus fermentum TS3-06), входящих в состав заявляемой метабиотической композиции. При оценке стерильности метаболитов культивирование осуществляли при температуре 37°С на жидкой и плотной питательных средах. Для этого по 1 г исходного материала разводили в 9 мл воды, фосфатного буфера или физиологического раствора хлорида натрия.
При исследовании стерильности метаболитов Bacillus subtilis осуществляли проверку наличия в них Bacillus subtilis. Проводили посев метаболитов Bacillus subtilis в жидкую питательную среду. Для этого 2 г порошка метаболитов вносили в 20 мл бульона и культивировали в течение 24 ч при температуре 37°С. Было отмечено помутнение бульона и возникновение осадка (от порошка). При высеве мутного бульона на триптозный агар бациллы не были обнаружены.
2
Осуществляли также проверку чистоты метаболитов Bacillus subtilis (допустимая общая обсемененность - менее 10 КОЕ/г). Навеску метаболитов Bacillus subtilis массой 10 г вносили в 90 мл стерильного физиологического раствора хлорида натрия, тщательно перемешивали в течение 5 мин. Надосадочную жидкость стерильно отбирали по 100 мкг, засевали на чашки Петри с мясопептонным агаром и инкубировали при температуре 30°С в течение 7 сут или при температуре 37°С в течение 24 ч. В обоих случаях рост посторонней микрофлоры не наблюдали.
2
Установлено, что метаболиты Bacillus subtilis, адсорбированные на цеолите, не содержат живых бацилл. Посторонняя микрофлора также не вырастала (менее 10 КОЕ/г).
При исследовании стерильности метаболитов Enterococcus faecium L3 осуществляли проверку наличия в них Enterococcus faecium L3. Для этого проводили посев метаболитов Enterococcus faecium L3 в жидкую питательную среду Luria broth. Для этого 2 г порошка метаболитов вносили в 20 мл бульона и культивировали в течение 24 ч при температуре 37°С. При высеве бульона на энтерококковый агар энтерококки не были обнаружены.
2
При проверке чистоты метаболитов Enterococcus faecium L3 (допустимая общая обсемененность - менее 10 КОЕ/г) навеску метаболитов Enterococcus faecium L3 массой 10 г вносили в 90 г стерильного физиологического раствора хлорида натрия, тщательно перемешивали в течение 5 мин. Надосадочную жидкость стерильно отбирали по 100 мкг, засевали на чашки Петри с мясопептонным агаром и инкубировали при температуре 30°С в течение 7 сут или в течение 24 ч при температуре 37°С. В обоих случаях рост посторонней микрофлоры не наблюдали.
2
Установлено, что метаболиты Enterococcus faecium L3 не содержат живых энтерококков. Рост посторонней микрофлоры также отсутствовал (менее 10 КОЕ/г).
При исследовании стерильности метаболитов Lactobacillus delbrueckii TS1-06 осуществляли проверку наличия в них Lactobacillus delbrueckii TS1-06. Для этого проводили посев метаболитов Lactobacillus delbrueckii TS1-06 в жидкую питательную среду Luria broth. Порошок метаболитов в количестве 2 г вносили в 20 мл бульона и культивировали в течение 24 ч при температуре 37°С. При высеве бульона на селективную плотную питательную среду живые лактобактерий Lactobacillus delbrueckii TS1-06 не были обнаружены.
2
При проверке чистоты метаболитов Lactobacillus delbrueckii TS1-06 (допустимая общая обсемененность - менее 10 КОЕ/г) навеску метаболитов Lactobacillus delbrueckii TS1-06 массой 10 г вносили в 90 г стерильного физиологического раствора хлорида натрия, тщательно перемешивали в течение 5 мин. Надосадочную жидкость стерильно отбирали по 100 мкг, засевали на чашки Петри с мясопептонным агаром и инкубировали при температуре 30°С в течение 7 сут или в течение 24 ч при температуре 37°С. Рост посторонней микрофлоры не наблюдали.
2
Установлено, что метаболиты Lactobacillus delbrueckii TS1-06 не содержат живых лактобактерий. Рост посторонней микрофлоры также отсутствовал (менее 10 КОЕ/г).
При исследовании стерильности метаболитов Lactobacillus fermentum TS3-06 осуществляли проверку наличия в них Lactobacillus fermentum TS3-06. Для этого проводили посев метаболитов Lactobacillus fermentum TS3-06 в жидкую питательную среду Luria broth, 2 г порошка метаболитов вносили в 20 мл бульона и культивировали в течение 24 ч при температуре 37°С. При высеве бульона на селективную плотную питательную среду живые лактобактерий Lactobacillus fermentum TS3-06 не были обнаружены.
2
При проверке чистоты метаболитов Lactobacillus fermentum TS3-06 (допустимая общая обсемененность - менее 10 КОЕ/г) навеску метаболитов Lactobacillus fermentum TS3-06 массой 10 г вносили в 90 г стерильного физиологического раствора хлорида натрия, тщательно перемешивали в течение 5 мин. Надосадочную жидкость стерильно отбирали по 100 мкг, засевали на чашки Петри с мясопептонным агаром и инкубировали при температуре 30°С в течение 7 сут или в течение 24 ч при температуре 37°С. Рост посторонней микрофлоры не наблюдали.
2
Установлено, что метаболиты Lactobacillus fermentum TS3-06 не содержат живых лактобактерий. Рост посторонней микрофлоры также отсутствовал (менее 10 КОЕ/г).
Таким образом, экспериментально установлено, что по микробиологическим показателям безопасности заявляемая метабиотическая композиция соответствует требованиям, установленным Техническим регламентом Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложения 1 и 2, раздел 1.9) (таблица 3).
Исследование острой токсичности.
Заявляемую метабиотическую композицию вводили здоровым беспородным белым крысам обоих полов массой тела 130-150 г и 180-200 г внутрижелудочно в виде водных суспензий через металлический атравматичный зонд, медленно погружая его до желудка. Исследования проводили с использованием пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону в модификации 3. Рота [42]. В ходе эксперимента были сформированы две группы по 10 животных в каждой: опытная (вводили заявляемую метабиотическую композицию два раза в день в максимально переносимой дозе, составляющей 15 г/кг) и контрольная (вводили эквивалентные объемы дистиллированной воды). Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по массе тела (±10%).
Наблюдение за подопытными животными осуществляли в течение 14 сут с регистрацией показателей: летальность, время гибели животных, симптоматика отравления, результаты ежедневного наблюдения общего состояния и поведения, взвешивания, результаты контроля потребления корма и воды, результаты вскрытия и макроскопического описания погибших и выживших животных в конце исследования (эвтаназия осуществлялась передозировкой эфира), результаты определения массовых коэффициентов (МК) внутренних органов.
Введение заявляемой метабиотической композиции в максимально переносимых дозах не вызывало гибели подопытных животных. Не отмечали и какие-либо другие признаки негативного действия заявляемой метабиотической композиции. В частности, не отмечали какие-либо диспепсические явления. Во все дни наблюдения по общему состоянию и поведению животные опытной и контрольной групп не отличались.
Результаты изучения динамики изменения массы тела подопытных животных, получавших заявляемую метабиотическую композицию, в течение 14 сут наблюдения за ними позволили установить, что динамика массы тела животных опытной и контрольной групп практически не различалась (таблица 4).
Анализ величин МК органов белых крыс позволил установить, что острое введение им заявляемой метабиотической композиции в максимально переносимой дозе не вызывало какие-либо достоверные отличия по сравнению с контрольной группой животных, получавших дистиллированную воду (таблица 5).
Таким образом, результаты токсикометрии и данные наблюдений за подопытными животными на протяжении 14 сут после острого введения позволяют отнести заявляемую метабиотическую композицию к нетоксичным (относительно безвредным по С.Д. Заугольникову) и малоопасным (IV класс опасности по ГОСТ 12.1.007) веществам.
Исследование хронической токсичности и способности к кумуляции.
Исследования хронической токсичности проводили на белых нелинейных крысах-самцах массой 180-200 г при введении заявляемой метабиотической композиции внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд в течение 30 дней при суточной дозе 1,5 г/кг. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в аналогичном объеме.
Измерение основных физиологических показателей осуществляли через 30 дней хронического ежедневного введения заявляемой метабиотической композиции.
В течение всего периода наблюдения летальных эффектов не наблюдали. Общее состояние и поведение подопытных животных оставалось нормальным и не отличалось от показателей контрольной группы в течение всего эксперимента.
Результаты изучения интегральных показателей общей токсичности, представленные в таблицах 6 и 7, свидетельствуют, что ни по одному из анализируемых показателей не было выявлено статистически значимых различий с контрольной группой животных, получавших дистиллированную воду (р>0,05 при 95% уровне вероятности) или патологических отклонений за пределы варьирования физиологической нормы.
Вскрытие крыс, умерщвленных на следующий день после последнего введения заявляемой метабиотической композиции, показало, что размеры, форма и окраска их внутренних органов не имели макроскопических изменений по сравнению с контрольной группой. Слизистая оболочка желудка и тонкого кишечника были блестящими, бледно-розовыми, без признаков раздражения или воспаления.
При гистологическом исследовании препаратов легких, миокарда, печени, почек и слизистой желудка подопытных животных, получавших заявляемую метабиотическую композицию, дистрофические, воспалительные или некробиотические изменения органов не выявлены.
Следовательно, хроническое внутрижелудочное введение заявляемой метабиотической композиции в организм подопытных животных не вызывало дистрофических или деструктивных изменений паренхиматозных органов и не сопровождалось раздражением слизистых оболочек ЖКТ. Таким образом, по интегральному показателю кумуляции и показателям общей нелетальной токсичности заявляемая метабиотическая композиция не обладает способностью к кумуляции и нетоксична.
Исследование возможного местно-раздражающего действия.
Местно-раздражающее действие заявляемой метабиотической композиции оценивали на модели мерцательного эпителия пищевода лягушки. Цитотоксический эффект изучали на болотных лягушках Rana temporaria массой тела 25 г. После обездвиживания путем разрушения спинного мозга и фиксации животных на пробковом столе вскрывали грудную клетку, выделяли пищевод и рассекали в каудальном направлении. Над глоточной частью пищевода устанавливали две штанги. В ходе эксперимента регистрировали время прохождения пробковой крошкой участка пищевода длиной 10 мм, ограниченного штангами, до и после нанесения на слизистую оболочку пищевода дистиллированной воды или заявляемой метабиотической композиции в виде порошка в количестве 50 мг. Продолжительность воздействия составляла 1 мин.
Экспериментально установлено, что нанесение на слизистую оболочку пищевода заявляемой метабиотической композиции в виде порошка не влияет на двигательную функцию мерцательного эпителия пищевода лягушки (таблица 8). Таким образом, заявляемая метабиотическая композиция не оказывает местно-раздражающее действие.
Исследование действия на кожу и глаза
Действие на кожу и кожно-резорбтивное действие изучалось на белых крысах-самках массой тела 130-150 г. После помещения животных в специальные домики их хвосты на 2/3 помещали на 4 ч в кашицу, которую получали, смешивая заявляемую метабиотическую композицию в виде порошка с холодной водой в количествах, соответственно, 90% и 10%. Через 1 ч и 16 ч после окончания однократной аппликации не отмечалось эритемы или отека кожи хвостов (величина отека оценивалась путем измерения толщины хвоста в средней части при помощи толщинометра типа ТР-1-10). Установлено, что 20-кратная аппликация не вызывала гибели подопытных животных и не выявляла раздражающего действия на кожу в течение последующего 5-дневного срока наблюдения.
Морфологически кожа хвостов в месте нанесения порошка изменений не имела. Эпидермис и придатки кожи также были без изменений. Слои эпидермиса отчетливо выражены, базальная мембрана сохранена Эпителиальные клетки наружных и внутренних корневых влагалищ волосяных фолликулов и соединительно-тканная сумка были хорошо выражены.
Макроскопические и микроскопические изменения внутренних органов у подопытных животных отсутствовали.
Изучение морфологических, биохимических, гематологических и физиологических показателей белых крыс не выявило достоверных отличий от контрольной группы животных, хвосты которых помещали в воду.
Следовательно, заявляемая метабиотическая композиция не обладает раздражающим действием на кожу и кожно-резорбтивным действием, то есть, нетоксична при попадании на кожу или при контакте с ней.
Исследовали также раздражающее действие заявляемой метабиотической композиции на слизистую оболочку глаза кролика. В ходе эксперимента установлено, что через 1 мин после однократного внесения заявляемой метабиотической композиции в виде порошка в конъюнктивальный мешок глаза кролика в количестве 50 мг появились умеренная гиперемия и слезотечение, сопровождавшиеся непродолжительным блефароспазмом, что можно расценить как реакцию на индифферентное механическое инородное тело. Полнокровие сосудов сохранялось не более 20 мин, а через 40-45 мин все возникшие явления раздражения полностью прошли. Следовательно, заявляемая метабиотическая композиция обладает слабым раздражающим действием на слизистую оболочку глаза кролика, как любая механическая пыль.
Исследование ингаляционного воздействия
пылью.
3
Однократное динамическое ингаляционное воздействие заявляемой метабиотической композиции в виде порошка на белых крыс-самок массой тела 130-150 г производили в течение 2 ч в стандартных камерах Б.А. Курляндского объемом 200 л при температуре 20°С и скорости подачи воздуха 60 л/мин. Максимально возможные концентрации пыли, которые в ходе эксперимента определяли гравиметрическим методом, достигали с помощью пылевых распылителей. Пробы воздуха отбирали через каждые 30 мин. В ходе эксперимента средняя концентрация пыли составила 53,4±3,1 г/м.
Как в ходе воздействий, так и после них у подопытных животных не наблюдалось летальных исходов, а лишь признаки пылевого (механического) раздражения верхних дыхательных путей (чихание, груминг) и глаз (лакримация), а также беспокойство.
После вскрытия умерщвленных животных изменения не выявлены, кроме умеренного полнокровия внутренних органов. В дыхательных путях определялись частички порошка заявляемой метабиотической композиции.
Следовательно, острое ингаляционное воздействие пылью заявляемой метабиотической композиции не представляет опасности, так как не вызывает признаков отравления и как любая механическая пыль лишь незначительно раздражает верхние дыхательные пути и глаза.
Исследование сенсибилизирующего действия.
2
Изучение сенсибилизирующего действия заявляемой метабиотической композиции проводили на морских свинках. Для этого в кожу наружной поверхности уха животных туберкулиновым шприцем вводили однократно 0,02 мл водного разведения заявляемой метабиотической композиции в дозе 10 мг/кг, а через 10 дней на предварительно выстриженные участки кожи боковой поверхности спины размером 2×2 см наносили и фиксировали заявляемую метабиотическую композицию в виде порошка из расчета 20 мг/см. Забор крови у животных осуществляли через 3 ч после постановки кожных проб.
Результаты оценки влияния заявляемой метабиотической композиции на показатели сенсибилизирующего действия представлены в таблице 9 и свидетельствуют об отсутствии признаков сенсибилизации в периферической крови - эозинофилии или увеличения уровня лизиса в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) по сравнению с контролем. При осмотре кожи спины подопытных животных признаков раздражения не отмечалось. Следовательно, заявляемая метабиотическая композиция при эпикутанном контакте не обладает сенсибилширующим действием, то есть не провоцирует развитие аллергии.
Исследование возможных отдаленных последствий.
Изучение возможного гонадотоксического эффекта проводили в соответствии с методическими рекомендациями по показателям, обязательным при первичной оценке химических веществ [43,44]. Изучение мутагенной активности проводили по частоте образования микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга (из бедренной кости) белых мышей в соответствии с методическими рекомендациями [45, 46].
Результаты изучения возможных гонадотоксического и мутагенного эффектов заявляемой метабиотической композиции при введении ее в течение 10 дней в дозе 1 г/кг, проведенного через 15 дней после окончания ее введения, свидетельствуют об отсутствии достоверно значимых сдвигов показателей гонадотоксичности и мутагенности (таблица 10). Угнетения сперматогенеза или увеличения частоты мутаций также не наблюдалось.
Следовательно, заявляемая метабиотическая композиция не обладает токсическим влиянием на репродуктивную функцию и не оказывает мутагенного эффекта. Это свидетельствует о ее безопасности в плане развития отдаленных негативных последствий у человека.
Пример 3.
Оценка стабильности заявляемой метабиотической композиции в процессе хранения.
Исследовали возможность сохранения активности и безопасности заявляемой метабиотической композиции в виде порошка и устанавливали гарантированный срок годности в случае хранения при различных температурах и без использования специального оборудования.
В ходе эксперимента порошок закладывали в 100 потребительских упаковок в виде двойных полиэтиленовых пакетов и хранили их в течение 2,5 лет при температурах 5±2°С, 10±3°С, 25±5°С, 35±6°С (по 25 упаковок на каждый температурный режим хранения). Через каждые 6 мес хранения отбирали по 5 упаковок от соответствующего температурного режима и определяли характеристики порошка: влажность, амилолитическую и протеолитическую активности, антагонистическую активность и микробиологическую чистоту. Для оценки возможных изменений указанных характеристик при хранении определяли их значения в начале исследований.
Данные, представленные в таблице 11, свидетельствуют о том, что при выбранных для испытаний температурных режимах хранения (от 5 до 40°С) оцениваемые показатели практически не изменяются в течение 2,5 лет. Средние значения показателей составили: влажность - 6,8±0,1%, амилолитическая активность - 2,0±0,2 ед. АА/г, протеолитическая активность - 1,0±0,12 ед. ПА/г. Микробиологическая чистота заявляемой метабиотической композиции, оцениваемая отсутствием в ней патогенных микроорганизмов (Pseudomonas aeruginosa, Entero-bacteriaceae, Staphylococcus aureus и Bacillus cereus), сохранялась в течение 2,5 лет, то есть весь период исследований.
Таким образом, гарантированный срок хранения заявляемой метабиотической композиции, выполненной в твердой форме в виде порошка, составляет не менее 2,5 лет при температуре не выше 40°С при условии соблюдения сохранности упаковки. Особые температурные условия хранения или использование специального оборудования при этом не требуются.
Пример 4.
Исследование влияния метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 на рост и размножение пробиотических лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3.
В ходе эксперимента исследовали in vitro влияние метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 на рост лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3, близких нормальной составляющей индигенной микрофлоры кишечника человека
Исследования проводили с использованием:
- метода прямого антагонизма путем нанесения стерильных метаболитов штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 в лунки или на поверхность твердой питательной среды (агар МРС-4) сразу же после посева в нее лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 с последующей инкубацией в течение 24 ч при температуре 37°С;
- метода двухслойного агара [47], при котором в нижний слой твердой питательной среды (агар МРС-4) вносили суспензию метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335, а в верхний слой засевали лактобациллы.
Метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 вводили в концентрациях 1 г или 0,1 г в 10 мл агара.
Лактобациллы засевали в различных количествах, составляющих 7 lg КОЕ/мл -2 lg КОЕ/мл.
После нанесения стерильных метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 в лунки или на поверхность агара, засеянного лактобациллами Lactobacillus plantarum 8R-A3, экспериментально, с использованием метода прямого антагонизма установлено, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 не проявляют антагонистическую активность в отношении указанного штамма лактобацилл, зоны подавления роста лактобацилл отсутствуют.
Использование метода двухслойного агара подтвердило, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 при введении в указанной концентрации не оказывают ингабирующий эффект на рост лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3. При этом экспериментально установлено, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 стимулируют рост пробиотических лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 (таблица 12). В присутствии указанных метаболитов в принятых концентрациях вырастало большее количество лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 (в четыре и более раз).
Установлено также, что колонии лактобацилл при посеве 50 колоний на чашку Петри и росте в присутствии метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 были в 2 раза крупнее, их диаметр увеличивался с 1 мм до 2 мм по сравнению с контролем (без добавления метаболитов указанного штамма бактерий).
Таким образом, экспериментально установлен лактогенный эффект метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335, выражающийся в стимулировании роста и размножения пробиотических лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3. Данное свидетельствует о том, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 в составе заявляемой метабиотической композиции представляют лактогенный фактор, чем и обусловлен их положительный эффект при восстановлении нормофлоры кишечника.
Пример 5.
Исследование влияния метаболитов Enterococcus faecium L-3 на рост и размножение пробиотических бифидобактерий.
В ходе эксперимента исследовали in vitro влияние метаболитов Enterococcus faecium L-3 на рост и размножение пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium longum GT15, близких естественной составляющей индигенной микрофлоры кишечника.
Исследования проводили с использованием метода двухслойного агара, как описано в примере 4. Метаболиты Enterococcus faecium L-3 вводили в концентрациях 1 г или 0,1 г в 10 мл питательной среды для бифидобактерий. Индикаторные штаммы бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium longum GT15 засевали в различных количествах, составляющих 7 lg КОЕ/мл -2 lg КОЕ/мл.
Экспериментально, с использованием метода двухслойного агара установлено, что метаболиты пробиотического штамма бактерий Enterococcus faecium L-3 в указанных концентрациях не оказывают ингибирующий эффект в отношении бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium longum GT15 и даже стимулируют их рост и размножение (таблицы 13 и 14). В присутствии указанных метаболитов в принятых концентрациях вырастало большее количество бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 (в три и более раз) и Bifidobacterium longum GT15 (в четыре и более раз).
Таким образом, экспериментально установлен бифидогенный эффект заявляемой синбиотической композиции, в состав которой включены метаболиты Enterococcus faecium L-3, выражающийся в стимулировании роста и размножения пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium longum GT15.
Пример 6.
Исследование специфической антагонистической активности заявляемой метабиотической композиции и композиции-прототипа в отношении условно-патогенных микроорганизмов.
В ходе эксперимента проводили сравнительные исследования in vitro специфической антагонистической активности композиции-прототипа, включающей метаболиты пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335, и заявляемой метабиотической композиции, включающей комплекс метаболитов пробиотических штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335, Enterococcus faecium L-3, Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus fermentum TS3-06, в отношении условно-патогенных микроорганизмов.
В частном конкретном случае использовали композицию-прототип следующего состава: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ № В-2335 бактерий Bacillus subtilis (2,1 мас.%), цеолит (44,6 мас.%), комплекс полисахаридов (52,4 мас.%), стеарат кальция (0,9 мас.%).
В качестве индикаторных тест-культур использовали грамположительные (энтерококки, стафилококки, листерии) и грамотрицательные бактерии (эшерихии, клебсиеллы, псевдомонады) (таблица 15). Культуры микроорганизмов, используемых в качестве индикаторных, соответствуют тем, которые, как правило, выявляют при диагностике дисбиотических нарушений микробиоценоза ЖКТ.
Засевали индикаторные тест-культуры микроорганизмов в ходе эксперимента на питательной среде в различных количествах, составляющих 7 lg КОЕ/мл - 2 lg КОЕ/мл.
В качестве питательной среды использовали твердую агаризованную среду МРС-4.
Исследования предусматривали определение задержки роста индикаторных тест-культур условно-патогенных микроорганизмов при воздействии композиции-прототипа или заявляемой метабиотической композиции и проводились с использованием:
- метода прямого антагонизма путем прямого нанесения композиции-прототипа или заявляемой метабиотической композиции в лунки или на поверхность твердой питательной среды сразу же после посева индикаторных тест-культур с последующей инкубацией в течение 24 ч при температуре 37°С;
- метода двухслойного агара, при котором в нижний слой твердой питательной среды вносили композицию-прототип или заявляемую метабиотическую композицию, а в верхний слой засевали индикаторные тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов.
При использовании метода прямого антагонизма установлено, что композиция-прототип и заявляемая метабиотическая композиция проявляют специфический антагонистический эффект в отношении псевдомонад (таблица 16) и листерий (таблица 17). Причем, антагонистический эффект заявляемой метабиотической композиции в отношении псевдомонад и листерий более выражен, чем у композиции-прототипа
С использованием метода двухслойного агара оценивали антагонистическую активность как композиции-прототипа, так и заявляемой метабиотической композиции. Для этого в нижний слой агара вносили по 1 г композиции-прототипа или заявляемой метабиотической композиции. В верхний слой агара при этом вносили индикаторные тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов.
Также композиция-прототип и заявляемая метабиотическая композиция значимые антагонистических эффекты проявляют в отношении стафилококков и эшерихий (таблицы 18 и 19), рост указанных индикаторных тест-культур отсутствует при добавлении в нижний слой агара по 1 г каждой из исследуемых композиций. При этом экспериментально установлено, что антагонистическая активность заявляемой метабиотической композиции превосходит указанную характеристику композиции-прототипа.
Таким образом, экспериментально установлено, что заявляемая метабиотическая композиция обладает достаточным уровнем специфической антагонистической активности в отношении широкого спектра условно-патогенных микроорганизмов, что связано с высоким уровнем активности метаболитов бактерий Enterococcus faecium L-3 (бактериоцинов А и В), а также Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus fermentum TS3-06 (лактоцина В). Наиболее достоверно наблюдаемые эффекты продемонстрированы на примере тест-культур псевдомонад (частых возбудителей гаойно-воспалительных заболеваний) и листерий (возбудителей кишечных и урогенитальных инфекций).
Пример 7.
Исследование иммунотропных эффектов заявляемой метабиотической композиции и композиции-прототипа.
Так как существенную роль в поддержании колонизационной резистентности организма играет местный иммунитет, исследования предусматривали оценку способности композиции-прототипа и заявляемой метабиотической композиции оказывать влияние на факторы неспецифической резистентности организма. В числе местных неспецифических факторов противо-инфекционной защиты рассматривали фагоцитарную активность местных макрофагов, а также антибактериальные и антивирусные субстанции (лизоцим, интерферон).
Исследования выполнены на белых беспородных лабораторных мышах массой 18-23 г (питомник «Рапполово» РАМН). Всего использовали 150 животных (три группы по 50 особей в каждой: контрольную (получали изотонический раствор хлорида натрия) и две опытные, в которых животным вводили композицию-прототип или заявляемую метабиотическую композицию.
В частном конкретном случае использовали композицию-прототип следующего состава: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ № В-2335 бактерий Bacillus subtilis (2,1 мас.%), цеолит (44,6 мас.%), комплекс полисахаридов (52,4 мас.%), стеарат кальция (0,9 мас.%).
Композицию-прототип и заявляемую метабиотическую композицию вводили перорально 1 раз в сутки в дозе 150 мкг/мышь.
Вводили композицию-прототип и заявляемую метабиотическую композицию в течение 7 сут. Оценку эффекта их воздействия осуществляли через 1, 5 и 7 сут. Для этого до введения препаратов (контроль), а также спустя 1, 3 и 7 сут после введения у животных каждой из групп проводили забор крови для исследования. На каждом этапе исследования забор материала проводили от 10 животных из группы, индивидуально от каждой мыши после ее декапитации.
Динамика изменений факторов неспецифической резистентности оценивалась путем определения функционального состояния клеток фагоцитарной системы (переваривающей активности гранулярных лейкоцитов), а также концентрации в сыворотке крови лизоцима и миелопероксидазы, обладающих не только прямым бактерицидным действием, но и являющихся медиаторами межклеточного взаимодействия при развитии иммунного ответа на любое антигенное воздействие.
Переваривающую активность гранулярных лейкоцитов периферической крови подопытных животных оценивали по методу Зеленовой Е.Г. и Никифорова В.А. (1972). Сыворотку получали по стандартной методике, отделяя сгусток крови от жидкой фазы. Для оценки функционального состояния фагоцитирующих клеток кровь забирали в пробирки, предварительно обработанные силиконом (Serva, Германия) и содержащие раствор гепарина из расчета 20 ЕД на 1 мл крови.
Фагоцитарный индекс (Фи), представляющий отношение выраженности поглотительной и переваривающей функций фагоцитирующих клеток, определяли через 15 мин и 30 мин инкубации с тест-объектом фагоцитоза - тест-микробом (М.lysodeicticus), выращенном на мясопептонном агаре в термостате при температуре 37°С в течение 24 ч. В качестве оцениваемого показателя служил индекс переваривающей активности гранулярных лейкоцитов (ИП), представляющий отношение количества фагоцитирующих клеток в мазке через 30 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза к количеству фагоцитирующих клеток в мазке через 15 мин инкубации крови с тест-объектом фагоцитоза. Значения ИП определяли по формуле:
где А - количество фагоцитирующих клеток на 100 клеток, просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-микроб в течение 15 мин инкубации;
В - количество фагоцитирующих клеток на 100 клеток, просчитанных в мазке гранулярных лейкоцитов, поглотивших тест-микроб в течение 30 мин инкубации.
Величину ИП выражали в условных единицах (фиг. 1). Экспериментальные данные свидетельствуют, что применение заявляемой метабиотической композиции как и композиции-прототипа способствует существенному повышению функциональной активности гранулярных лейкоцитов периферической крови, так как значения ИП значительно превышают уровень показателя контрольной группы (различия с группой «контроль» достоверны при р<0,05). При этом эффект воздействия заявляемой метабиотической композиции выше чем у композиции-прототипа (различия с группой «композиция-прототип» достоверны при р<0,05).
Концентрацию лизоцима в сыворотке крови определяли по методу Бухарина О.В. с соавт. (1974). Для этого кровь подопытного животного собирали в центрифужную пробирку и получали сыворотку. Затем 0,1 мл сыворотки крови переносили в бактериологическую пробирку и добавляли 0,9 мл физиологического раствора. Полученную смесь перемешивали и добавляли к ней 1,5 мл суспензии тест-микроба, которую предварительно стандартизовали на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М до экстинкции 0,66.
Готовую суспензию, содержащую тест-микроб и исследуемую сыворотку, перемешивали и помещали в термостат на 30 мин при температуре 37°С. По истечении времени инкубации пробирки вынимали из термостата и определяли экстинкцию материала. Полученные величины экстинкций с помощью специальных таблиц переводили в значения, характеризующие концентрацию лизоцима в сыворотке крови, и выражали в мкг/мл.
Уровень миелопероксидазы (МПО) в сыворотке крови определяли по методу, разработанному на основании общепринятых подходов к выявлению этого субстрата в сыворотке крови и иммунокомпетентных клетках (Gell P.G.H. и др. (1968); Page R.C. и др. (1978)). Для определения концентрации МПО в сыворотке крови в 96-луночные планшеты для иммунологических реакций с плоским дном, начиная со второй лунки ряда А, разливали по 0,1 мл сывороток, взятых от подопытных животных. Затем в них добавляли по 0,1 мл реактива, представляющего собой смесь бензидина и 3% перекиси водорода. В первую лунку ряда А панели (контроль) вместо сыворотки наливали 0,1 мл физиологического раствора. После добавления реактива панели встряхивали, помещали в термостат и выдерживали при температуре 37°С в течение 60 мин. По прошествии времени инкубации панели вынимали из термостата и просматривали на вертикальном спектрофотометре «Dynatech» (Германия) при длине волны 495 нм. Концентрацию фермента в сыворотке крови получали в единицах экстинкции и выражали в условных единицах.
Как свидетельствуют представленные на фиг. 2-3 данные, иммунотропные эффекты композиции-прототипа и заявляемой метабиотической композиции проявляются на уровне клеток фагоцитарной системы крови и процессов, связанных с синтезом и секрецией в кровь ферментов лизоцима и миелопероксидазы. Динамика изменений значений факторов неспецифической резистентности подопытных животных экспериментальных групп, которым вводили композицию-прототип или заявляемую метабиотическую композицию, практически одинакова, о чем свидетельствует отсутствие статистически значимых различий (р>0,05). Выявленные эффекты, заключающиеся в достоверном повышении функциональной активности факторов неспецифического иммунитета, регистрировали уже через 1 сут после введения исследуемых композиций и длились они как минимум 7 сут от момента введения. То есть, стимулирующее действие как композиции-прототипа, так и заявляемой метабиотической композиции на механизмы иммунологической резистентности имело место уже после однократного их введения.
Введение как композиции-прототипа, так и заявляемой метабиотической композиции в течение 1, 3 и 7 сут приводит к достоверному повышению активности факторов неспецифической резистентности по сравнению с контролем. Проявляется это как в увеличении индекса переваривающей активности гранулярных лейкоцитов, так и в повышении концентрации лизоцима и миелопероксидазы. Достаточно существенное повышение функциональной активности указанных факторов наблюдается после однократного введения исследуемых композиций уже в течение первых суток. С одной стороны, это свидетельствует об активации факторов неспецифического иммунитета и возможности обеспечения быстрой неспецифической зашиты организма от патогенов. С другой стороны, это означает, что первичные механизмы действия исследуемых композиций связаны не только с прямым влиянием на микрофлору ЖКТ, но и с непосредственным воздействием на компоненты местного иммунитета, которые, в том числе, связаны с регуляцией баланса эндогенных цитокинов, усиливающих защитные реакции.
В случае использования заявляемой метабиотической композиции, содержащей как и композиция-прототип β-глюкан (в составе овсяных хлопьев), прослеживалась практически такая же эффективность в установленных эффектах в сравнении с композицией-прототипом. Так, заявляемая метабиотическая композиция оказывала аналогичное влияние на клетки фагоцитарной системы крови и их кислородзависимый бактерицидный механизм (повышалась концентрация миелопероксидазы в сыворотке крови). Вместе с тем, известно, что увеличение концентрации сывороточной миелопероксидазы свидетельствует не только об активации неспецифической иммунологической резистентности, но и повышении вероятности ее активирующего влияния на иммунокомпетентные клетки, поскольку на их мембране имеется соответствующий специфический рецептор.
Экспериментально установлено, что стимулирующее действие заявляемой метабиотической композиции на механизмы неспецифической резистентности практически такое же, как и у композиции-прототипа. Уровни концентраций лизоцима и миелопероксидазы в сыворотке крови подопытных животных, получавших заявляемую метабиотическую композицию, через 1 сут выросли, соответственно, в 3,9 и 1,9 раз в сравнении с контрольной группой животных, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия. В сравнении же с группой подопытных животных, получавших композицию-прототип, уровни концентраций лизоцима и миелопероксидазы через 1 сут выросли, соответственно, в 1,05 и 1,09 раз. Таким образом, заявляемая метабиотическая композиция проявляет практически такие же иммунотропные эффекты, как и композиция-прототип.
Пример 8.
Исследование интерфероногенных свойств композиции-прототипа и заявляемой метабиотической композиции.
Поскольку неспецифическая иммунологическая резистентность призвана оказывать защиту не только при бактериальных, но и вирусных инфекциях, то исследовали в какой степени композиция-прототип и заявляемая метабиотическая композиция способны оказывать влияние на интерфероногенез.
Исследования выполнены на белых беспородных лабораторных мышах (питомник «Рапполово» РАМН) массой 18-23 г.Экспериментальные группы животных формировали как описано в примере 7.
В частном конкретном случае использовали композицию-прототип следующего состава: СКЖ, содержащая метаболиты штамма ВКПМ № В-2335 бактерий Bacillus subtilis (2,1 мас.%), цеолит (44,6 мас.%), комплекс полисахаридов (52,4 мас.%), стеарат кальция (0,9 мас.%).
Для определения интерфероногенных свойств композиции-прототипа и заявляемой метабиотической композиции в динамике проводили забор крови у подопытных животных из ретроорбитального синуса, объединяя в одной пробе материал от трех животных. Полученную после центрифугирования при 1000 об./мин в течение 10 мин сыворотку отсасывали и хранили при температуре минус 20°С. Внутренние органы мышей растирали с добавлением физиологического раствора, гомогенат центрифугировали (4000 об./мин) в течение 20 мин и из супернатанта готовили 10% суспензию в физиологическом растворе.
5
2
50
Полученные таким образом пробы хранили при температуре минус 20°С. Титрование интерферона (ИФН) в полученных пробах проводили микрометодом в культуре клеток. Культуру клеток L-929, разведенную ростовой средой до необходимой концентрации (3-4·10 клеток/мл), вносили в лунки 96-луночных пластиковых панелей и инкубировали в термостате в течение 24 ч. На протяжении всего процесса титрования инкубация клеточных культур проходила при идентичных условиях: температура 37°С в атмосфере с 5% СО и 98% влажности. После образования на дне лунок клеточного монослоя ростовую среду из панели удаляли и вносили поддерживающую среду, в которой производили последовательные двукратные разведения тестируемых проб (в парных лунках). По окончании суточной инкубации тестируемые пробы удаляли и вносили тест-вирус энцефаломиокардита (ЕМС) в рабочем разведении, составляющем 100 ЦПД (цитопатогенная доза, при которой гибнет 50% клеток). Через сутки производили учет результатов с помощью инвертированного микроскопа. Титр ИФН - величина, обратная последнему разведению сыворотки или пробы гомогената органа, при котором наблюдается 50% защита от тест-вируса.
Экспериментально установлено, что однократное введение как композиции-прототипа, так и заявляемой метабиотической композиции в дозе 150 мкг/мышь каждого оказывает практически одинаковое достаточно выраженное интерфероногенное действие, так как уже спустя 1 сут после введения исследуемых композиций уровень сывороточного интерферона увеличивался, соответственно, до 158,4 ЕД/мл и 163,7 ЕД/мл, что в 49,5 раз (композиция-прототип) или 51,2 раз (заявляемая метабиотическая композиция) превосходит показатель контрольной группы животных (различия достоверны (р<0,05)). В дальнейшем наблюдали снижение уровня сывороточного интерферона, однако и на последующих сроках исследования оцениваемый показатель для исследуемых композиций достоверно превышал данные контрольной группы животных (р<0,05).
Проведенные исследования показали, что заявляемая метабиотическая композиция, как и композиция-прототип, помимо активации механизмов бактериальной защиты существенно активирует интерфероногенез, представляющий ключевой механизм противовирусной защиты. Достаточно быстрая продукция эндогенного интерферона позволяет уже на ранней стадии обеспечить колонизационную резистентность микробиоценоза кишечника человека и надежную защиту организма от патогенов вирусной природы.
Таким образом, проведенные исследования показали, что заявляемая метабиотическая композиция, представляющая сбалансированный комплекс биологически активных веществ:
- обладает достаточным уровнем антагонистического эффекта в отношении широкого спектра патогенов. Наблюдаемый эффект обусловлен благоприятным суммарным воздействием метаболитов лактобацилл Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus fermentum TS3-06, а также метаболитов пробиотического штамма бактерий Enterococcus faecium L-3. Наиболее достоверно эти эффекты проявляются в отношении псевдомонад (частых возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний) и листерий (возбудителей кишечных и урогенитальных инфекций).
- проявляет лактогенный эффект. Экспериментально показано, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 в составе заявляемой метабиотической композиции представляют лактогенный фактор и стимулируют рост и размножение лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3, близких индигенной составляющей микрофлоры кишечника человека;
- проявляет бифидогенный эффект. Экспериментально показано, что метаболиты Enterococcus faecium L-3 обусловливают бифидогенный эффект и стимулируют рост и размножение пробиотических бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 1 и Bifidobacterium longum GT15, близких естественной составляющей индигенной микрофлоры кишечника человека;
- оказывает эффективное стимулирующее действие на иммунокомпетентные клетки и способствует повышению неспецифической резистентности организма;
- способствует достаточно быстрой продукции эндогенного интерферона, что позволяет уже на ранней стадии обеспечить колонизационную резистентность и надежную защиту организма от патогенов вирусной природы.
Кроме того, заявляемая метабиотическая композиция не содержит токсичные и опасные для здоровья компоненты в количествах, превышающих допустимые уровни, относится к малоопасным веществам, не обладает сенсибилизирующим действием и способностью к кумуляции, нежелательными побочными эффектами, в том числе токсическим влиянием на репродуктивную функцию, мутагенным эффектом и отдаленными негативными последствиями, стабильна при хранении в течение 2,5 лет.
Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна»
, так как впервые для обеспечения колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника человека предлагается использовать метабиотическую композицию, выполненную в твердой капсулированной дозированной форме для перорального введения и представляющую сбалансированный комплекс биологически активных веществ, совместно обеспечивающих достаточный уровень антагонистического эффекта в отношении широкого спектра патогенов, лактогенный и бифидогенный эффекты в отношении индигенной составляющей микрофлоры кишечника, способствующих повышению неспецифической резистентности организма.
Заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень»
, так как из доступной информации не представлялась очевидной целесообразность включения в состав заявляемой метабиотической композиции метаболитов пробиотических штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ № В-2335 и Enterococcus faecium L-3 и возможность обеспечения ими, соответственно, лактогенного и бифидогенного эффектов, а также возможность достижения достаточного уровня антагонистического эффекта в отношении патогенов бактериальной и вирусной природы за счет воздействия смеси метаболитов лактобацилл Lactobacillus delbrueckii TS1-06 и Lactobacillus fermentum TS3-06 и продукции эндогенного интерферона.
Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для применения»
подтверждается приведенными примерами, показавшими несложную технологию получения заявляемой метабиотической композиции в твердой капсулированной дозированной форме для перорального введения, ингредиенты которой выпускаются в промышленных условиях, доступны и недороги, а заявляемая метабиотическая композиция обладает высокой стойкостью при хранении, а также результатами многочисленных исследований, подтвердивших безопасность заявляемой метабиотической композиции и ее эффективность в обеспечении колонизационной резистентности микробиоценоза кишечника человека.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы актуальная проблема медицины // Вестн. РАМН. - 1997. - №3. - С. 4-7.
2. Шендеров Б.А. Нормальная микрофлора и ее роль в поддержании здоровья человека. // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - №1. - С. 61-65.
3. Шендеров Б.А. Роль анаэробных неспорообразующих бактерий в поддержании здоровья человека // Вестн. РАМН. - 1996. - №2. - С. 811.
4. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т. / Б.А. Шендеров. - Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции. - М.: ГРАНТЪ, 1998. - 288 с.
5. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. М.: КМК. - 2003. - 224 с.
6. Шендеров Б.А. Антимикробные препараты и нормальная микрофлора Проблемы и возможные пути их решения. //Антибиотики и химиотерапия. 1988. - Т. 33. - №12. - С. 921-926.
7. Воробьев А.А., Несвижский Ю.В. Микрофлора человека и иммунитет: единство и противоположность // Сборник трудов «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии». Москва. - 1997. - С. 137-141.
8. Петровская В.Г. Общие закономерности взаимодействия в системе паразит-хозяин и проблема смешанных инфекций // Журн. микробиол. - 1982. - №8. - С. 24-31.
9. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина - 1999. - 364 с.
10. Бондаренко В.М., Петровская В.Г. Ранние этапы развития инфекционного процесса и двойственная роль нормальной микрофлоры // Вестник РАМН. -1997. - №3. - С. 7-10.
11. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П. Актуальные проблемы микроэкологии человека // Аутофлора человека в норме и патологии и ее коррекция. Горький, 1988. - С. 10-14.
12. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. Лактофлора и колонизационная резистентность // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1987. - №3. - С. 173-179.
13. Иммунокорректоры: Руководство для врачей и провизоров / В.В. Юшков и др. -Екатеринбург: ООО «ИРА УТК», 2002. - 255 с.
14. Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В. Дисбактериоз кишечника.// Рос.мед. журнал. - 1999. - №3. - С. 40-45.
15. Крамарь Л.В. Микроэкология кишечника здоровых людей в условиях техногенного воздействия крупного промышленного города // Вестн. РАМН. - 2002. - №8. - С. 37-40.
16. Кузьмин М.Н., Шунько А.Н., Макаров М.В. Экстренная и специфическая профилактика в системе мер по защите войск и населения от биологического оружия, перспективы развития. Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: Мат.научной конф. ЦВТП БЗ НИИ Микробиологии МО РФ, Екатеринбург, 30 апреля-1 июня 1999. ЦВТПБЗ НИИМ МО РФ. - 1999. - С. 117-118.
17. Противодействие биологическому терроризму. Практическое руководство по противоэпидемическому обеспечению / Под ред. академика РАМН проф. Г.Г. Онищенко. - М., 2003. - С. 301.
18. Рациональная антимикробная фармакотерапия: руководство для практических врачей / Под ред. В.П. Яковлева, С.В. Яковлева. - М.: 2003. II: 1008.
19. Rushak J.M., Kortepeter M.G., Aldis J., Boudreau E. Experience in the medical manage-ment of potential laboratory exposures to agents of bioterrorism on the basis of risk assessment at the United States Army Medical Research Institute of Tnfletions Dislases (USAMRIID). J. Occup Environ Med. 2004: 46: 801-811.
20. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». Москва, 2003.
21. Воробейчиков Е.В., Василенко А.Ж., Синица А.В и др. Методологические аспекты применения пробиотиков и антибиотиков для экстренной профилактики инфекционных заболеваний // Сб. научн. тр. III съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - М: МаксПресс, 2005. - С. 35-36.
22. Регистрационное удостоверение № П N012084/01 от 06.08.2007.
23. Регистрационное удостоверение №013677/01 от 01.12.2006.
24. Волков М.Ю., Тухбатов И.А. Влияние нового пробиотика на обменные процессы и показатели иммунитета // Нива Урала, 2006. - №7. - С. 14-15.
25. Shenderov В.А. Metabiotics: novel idea or natural development of probiotic conception. Microbial Ecology in Health & Disease 2013, 24: 20399.
26. RU 2476205 C1, 27.02.2013.
27. RU 220199 C1, 27.12.2003.
28. RU 2391393 C1, 10.06.2010.
29. RU 2391395 C1, 10.06.2010.
30. Andoh A., Tsujikawa Т., Fujiyama Y. Role of dietary fiber and short-chain fatty acids in the colon. Curr. Pharm. Des. 2003; 9(4): 347-358.
31. Авраменко B.A., Василевский B.A. Новые сорбенты на основе модифицированных цеолитов и их применение в экологии, сельском хозяйстве и медицине // Цеолиты Приморья. Тезисы докладов научно-практической конференции. Владивосток, 1994, - С. 16-19.
32. Паничев А.М., Гульков А.Н. Природные минералы и причинная медицина будущего. Владивосток: Издательство ДВГТУ, 2001, - 216 с.
33. Пылев Л.Н., Васильева Л.А., Валамина И.Е. Анализ биологической агрессивности цеолитов различных месторождений Российской Федерации // Природные минералы на службе человека. Материалы научно-практической конференции. Новосибирск, 1999, - С. 68-70.
34. ТУ 9229-006-57935236-10. Технические условия «Закваска кисломолочная «Авена-Л»».
35. ТУ 9229-001-57935236-03. Технические условия «Закваска кисломолочная «Авена» для производства продуктов лечебного питания»
36. ГОСТ 21149-93 «Хлопья овсяные. Технические условия».
37. ТУ 9197-001-56264254-11. Технические условия «Цеолит природный молотый - сырье для производства биологически активных добавок к пище».
38. Пылев Л.Н., Заключение Комиссии по канцерогенным факторам при М3 РФ, 1998.
39. ТУ 6-09-4233-76. Технические условия «Кальций стеариновокислый, 1-водный (кальций стеарат)».
40. ГОСТ 14922-77 «Аэросил. Технические условия».
41. Технический регламент Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложения 1 и 2, раздел 1.9, приложение 3, раздел 10). - 242 с.
42. Гланц Э. Медико-биологическая статистика. - М.. 1999.
43. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию. Методические рекомендации. - М., 1969. - 25 с.
44. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования. Методические рекомендации 1744-77. - М., 1978. - 35 с.
45. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом. Методические рекомендации 28/10. - М., 1984. - 21 с.
46. Критерии оценки и методы прогнозирования отдаленных последствий действия на организм вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Информационное письмо. НИИ гиг. тр. и проф. забол. - М., 1985. - 15 с.
47. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пунгкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл. // Журн. микробиол., эпидем., иммунобиол. - 2004. - №5. - С. 94-98.