СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ МЕТАСТАТИЧЕСКИХ ВИДОВ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РЕЦЕПТОРОВ-ЛОВУШЕК AXL
METHODS FOR TREATMENT OF METASTATIC CANCER TYPES, USING AXL TRAP RECEPTORS

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ НА ПАТЕНТЫ
Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США №62/581671, поданной 4 ноября 2017 г., предварительной заявки на патент США №62/618916, поданной 18 января 2018 г., и предварительной заявки на патент США №62/681944, поданной 7 июня 2018 г., каждая из которых полностью включена сюда посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей в форме «бумажной копии» (файл PDF) и файл, содержащий соответствующие последовательности (SEQ ID NO: 1) в машиночитаемой форме (текстовый файл формата ST25), поданный вместе с ним. Перечень последовательностей показан с применением стандартного трехбуквенного кода аминокислот, как определено в части 1.822 раздела 37 Свода федеральных нормативных актов США (37 C.F.R. 1.822).
ЗАЯВЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНО ИССЛЕДОВАНИЙ ИЛИ РАЗРАБОТОК, ФИНАНСИРУЕМЫХ ИЗ ФЕДЕРАЛЬНОГО БЮДЖЕТА
Данная работа была поддержана Институтом профилактики и изучения рака штата Техас (Cancer Prevention & Research Institute of Texas), новый грант на разработку продукта для компаний (New Company Product Development Award) DP150127. Штат Техас, США, может обладать правами на любой патент, выданный по данной заявке.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Рак представляет собой группу заболеваний, включающих аномальный клеточный рост с возможностью распространения или инвазии в другие части тела. Варианты аномального роста, формирующие обособленную опухолевую массу, то есть не содержащую кист или жидких участков, определяют как солидные опухоли. Солидные опухоли могут быть доброкачественными (нераковыми) или злокачественными (раковыми). Различные типы солидных опухолей называют по типу образующих их клеток. Примерами солидных опухолей являются саркомы, карциномы и лимфомы. Виды рака, имеющие происхождение от какой-либо из двух линий клеток крови, миелоидной и лимфоидной, определяют как злокачественные опухоли крови. Такие злокачественные новообразования также называют раком крови или гемобластозами. Примеры гемобластозов включают множественную миелому, острые лейкозы (например, 11q23-положительный острый лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз, острый миелогенный лейкоз и миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный лейкоз и эритролейкоз), хронические лейкозы (например, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз, хронический миелогенный лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз), истинную полицитемию, лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому (индолентные и высокодифференцированные формы), макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелых цепей, миелодиспластический синдром, волосатоклеточный лейкоз и миелодисплазию.
Лечение, доступное пациентам с раком, сильно зависит от комбинированной терапии, включая хирургическое вмешательство, криодеструктивную терапию и цитотоксическую химиотерапию. К сожалению, несмотря на эффективность в некоторых случаях, побочные эффекты на нормальные ткани часто проявляются как явления дозолимитирующей токсичности и не позволяют обеспечить эрадикацию опухоли. И даже когда побочные эффекты этих различных видов терапии можно контролировать, достичь длительных ответов часто не удается, особенно при метастатических опухолях, не поддающихся терапии.
Для решения этих проблем и уменьшения побочных эффектов на нормальные ткани была разработана концепция таргетной терапии, то есть направленного воздействия на конкретную молекулу или сигнальный путь. Тем не менее, у большинства пациентов либо нет ответа на такую таргетную терапию, либо после ответа быстро развивается рецидив. Таким образом, есть потребность в более эффективных видах таргетной терапии, которые можно применять в сочетании с текущими стандартами лечения для метастатического и не поддающегося терапии заболевания.
Терапевтические усилия по предотвращению и лечению рака сосредоточены на уровне сигнальных путей или селективных белков-модуляторов. Активности протеинкиназ, кальциевый гомеостаз и активация онкобелков являются стимулирующими сигналами и поэтому могут быть ключевыми регуляторными точками для терапевтического вмешательства. Рецептор AXL и активирующий его лиганд, специфичный к блокировке роста - 6 (growth arrest-specific 6, GAS6) являются важными стимуляторами метастазирования и резистентности рака к терапии у человека. AXL принадлежит к семейству рецепторных тирозинкиназ ТАМ, включающему Tyro3 (или SKY), AXL и MER (O'Bryan, JR, Molecular and Cellular Biology, 5016-5031, 1991). GAS6 является общим лигандом для всех трех рецепторов. В отличие от других представителей семейства ТАМ, имеющих по несколько сигнальных лигандов, для AXL GAS6 является единственным известным лигандом (с очень высокой естественной аффинностью связывания). Было обнаружено что сверхэкспрессия и активация сигнального трансдукционного пути GAS6-AXL важны при широком спектре опухолей человека, включая рак почки, поджелудочной железы, молочной железы, легкого, яичника и предстательной железы (Rankin, EK, PNAS, 13373-13378, 2014). Сверхэкспрессия AXL при раке с высокой склонностью к метастазированию ассоциирована с неблагоприятным прогнозом, агрессивным поведением опухоли и резистентностью к терапии. Согласно исследованиям, при солидных опухолях активация сигнального пути GAS6-AXL способствует инвазии и метастазированию опухоли, а также развитию резистентности к широко применяемым химиотерапевтическим агентам. С учетом той критически важной роли, которую GAS6 и AXL играют при распространенном и не поддающемся лечению раке, этот сигнальный механизм является привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства. К сожалению, необычно высокая аффинность связывания GAS6 и AXL, составляющая приблизительно 30 пМ, существенно затруднила разработку конкурентных антагонистов.
Рецептор AXL содержит два отдельных эпитопа, связывающихся с GAS6: высокоаффинный сайт в его N-концевом иммуноглобулиноподобном (Ig) домене и низкоаффинный сайт во втором Ig-домене. Авторы настоящего изобретения сконструировали основной сайт Ig1 AXL с использованием методов рациональной и комбинаторной белковой инженерии, получив «рецепторы-ловушки» AXL с длительным периодом полувыведения, связывающиеся с GAS6 с более высокой аффинностью, чем эндогенный AXL, эффективно секвестрируя GAS6 и предотвращая передачу сигналов через AXL. Эти рецепторы-ловушки уменьшают инвазию/миграцию метастатических клеток in vitro и подавляют метастатическое заболевание в агрессивных доклинических моделях человеческого рака поджелудочной железы, почки, молочной железы и яичника, а также демонстрируют благоприятный профиль безопасности. При прямом сравнении в доклинических моделях с наиболее современными малыми молекулами против AXL, клиническое изучение которых проводится в настоящее время, рецепторы-ловушки позволили достичь более высокой противоопухолевой эффективности, не демонстрируя токсичности в фармакологических исследованиях. Также важно отметить, что, в то время как большинство агентов, предназначенных для применения в онкологии, требуют проведения клинических исследований в популяции пациентов с раком из-за значительной токсичности, ассоциированной с эффективными дозами, вызываемой как непосредственным действием на их мишени, так и нецелевыми эффектами, рецепторы-ловушки, сконструированные авторами настоящего изобретения, не являются цитотоксическим лекарственным средством.
Все идеи патентных документов 13/554954, 13/595936, 13/714875, 13/950111, 14/712731, 14/650852, 14/650854, 14/910565, US 2011/022125, US 2013/056435, US 2012/069841, US 2013/074809, US 2013/074786, US 2013/074796, US 2015/0315553 прямо включены сюда посредством ссылки.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложены способы лечения пролиферативного заболевания, например человеческого метастатического рака, включающие введение растворимого полипептида AXL в соответствии со схемой, которая определена как позволяющая достичь пролонгированной общей выживаемости по сравнению с контролем.
В некоторых воплощениях пролиферативное заболевание представляет собой рак, выбранный из группы, состоящей из: В-клеточной лимфомы; рака легкого (мелкоклеточного рака легкого и немелкоклеточного рака легкого); рака бронха; колоректального рака; рака предстательной железы; рака молочной железы; рака поджелудочной железы; рака желудка; рака яичника; рака мочевого пузыря; рака головного мозга или центральной нервной системы; рака периферической нервной системы; рака пищевода; рака шейки матки; меланомы; рака матки или эндометрия; рака полости рта или глотки; рака печени; рака почки; рака желчевыводящих путей; рака тонкой кишки или аппендикса; рака слюнной железы; рака щитовидной железы; рака надпочечника; остеосаркомы; хондросаркомы; липосаркомы; рака яичка; злокачественной фиброзной гистиоцитомы; рака кожи; рака головы и шеи; лимфом; сарком; множественной миеломы; и лейкозов. В некоторых воплощениях рак представляет собой рак яичника. В некоторых воплощениях рак представляет собой рак молочной железы.
В некоторых воплощениях рак представляет собой рак, сверхэкспрессирующий биомаркер GAS6 и/или AXL. В некоторых воплощениях рак представляет собой рецидивирующий рак. В некоторых воплощениях рак представляет собой человеческий метастатический рак, резистентный к стандартным терапиям. В некоторых воплощениях человеческий метастатический рак представляет собой химиорезистентный рак. В некоторых воплощениях человеческий метастатический рак представляет собой рак, резистентный к платине.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложены способы лечения человеческого метастатического рака, включающие введение растворимого полипептида AXL, не имеющего трансмембранного домена AXL и имеющего по меньшей мере одну мутацию относительно AXL дикого типа, повышающую аффинность связывания полипептида AXL с GAS6 по сравнению с AXL дикого типа, в комбинации со второй терапией, выбранной из группы, состоящей из таргетной терапии низкомолекулярными ингибиторами киназ, хирургического вмешательства, циторедуктивной терапии, цитотоксической химиотерапии и иммунотерапии.
В некоторых воплощениях вторая терапия представляет собой циторедуктивную терапию и комбинация может повышать терапевтический индекс циторедуктивной терапии. В некоторых воплощениях циторедуктивная терапия может действовать на путь репарации ДНК. В некоторых воплощениях циторедуктивная терапия представляет собой лучевую терапию. В некоторых воплощениях комбинация может быть синергической.
В некоторых воплощениях вторая терапия представляет собой химиотерапевтический агент, выбранный из группы, состоящей из даунорубицина, адриамицина (доксорубицина), эпирубицина, идарубицина, анамицина, MEN 10755, этопозида, тенипозида, винбластина, винкристина, винорелбина (NAVELBINE), виндезина, виндолина, винкамина, мехлорэтамина, циклофосфамида, мелфалана (L-сарколизина), кармустина (BCNU), ломустина (CCNU), семустина (метил-CCNU), стрептозоцина, хлорозотоцина, цитарабина (CYTOSAR-U), арабинозида цитозина, фторурацила (5-FU), флоксуридина (FUdR), тиогуанина (б-тиогуанина), меркаптопурина (6-МР), пентостатина, фторурацила (5-FU), метотрексата, 10-пропаргил-5,8-дидеазафолата (PDDF, СВ3717), 5,8-дидеазатетрагидрофолиевой кислоты (DDATHF), лейковорина, цисплатина (цис-DDP), карбоплатина, оксалиплатина, гидроксимочевины, гемцитабина и N-метилгидразина. В некоторых воплощениях комбинация может быть синергической.
В некоторых воплощениях вторая терапия будет включать иммунотерапию, выбранную, без ограничения, из: лечения с использованием истощающих антител к конкретным опухолевым антигенам; лечения с использованием конъюгатов «антитело - лекарственное средство»; лечения с использованием агонистических, антагонистических или блокирующих антител к костимулирующим или коингибирующим молекулам (иммунным контрольным точкам), таким как CTLA-4 (цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4), PD-1 (белок программируемой клеточной смерти 1), ОХ-40, CD 137, GITR (индуцированный глюкокортикоидами рецептор фактора некроза опухолей), LAG3 (ген активации лимфоцитов 3), TIM-3 (Т-клеточный иммуноглобулин и муцин-содержащий белок 3) и VISTA (V-доменный Ig-супрессор активации Т-клеток); лечения с использованием биспецифичных антител, привлекающих Т-клетки (BiTE), таких как блинатумомаб; лечения, включающего введение модификаторов биологического ответа, таких как IL-2 (интерлейкин 2), IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), IFN-α (интерферон-α), IFN-β и IFN-γ; лечения с использованием терапевтических вакцин, таких как сипулейцел-Т; лечения с использованием дендритноклеточных вакцин или вакцин на основе опухолевых антигенных пептидов; лечения с использованием Т-клеток с химерными антигенными рецепторами (CAR); лечения с использованием CAR-NK-клеток (натуральные клетки-киллеры); лечения с использованием опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL); лечения с использованием адоптивно перенесенных противоопухолевых Т-клеток (размноженных ex vivo и/или трансгенных по TCR (Т-клеточным рецепторам)); лечения с использованием клеток TALL-104; и лечения с использованием иммуностимулирующих агентов, таких как агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR) CpG и имихимод; где комбинированная терапия обеспечивает усиленное уничтожение опухолевых клеток эффекторными клетками, то есть при совместном введении существует синергия растворимого полипептида AXL и иммунотерапии.
В некоторых воплощениях вторая терапия будет включать введение ингибитора поли(ADP-рибоза)-полимеразы (PARP). В некоторых воплощениях ингибитор PARP выбран из группы, состоящей из АВТ-767, AZD 2461, BGB-290, BGP 15, СЕР 9722, Е7016, Е7449, флузопариба, INO1001, JPI 289, MP 124, нирапариба, олапариба, ONO2231, рукапариба, SC 101914, талазопариба, велипариба, WW 46 или их солей или производных, олапариба, рукапариба, нирапариба, талазопариба и велипариба. В некоторых воплощениях комбинация может быть синергической.
В некоторых воплощениях способ лечения будет включать введение растворимого варианта полипептида AXL в комбинации с пегилированным липосомальным доксорубицином (PLD). В некоторых воплощениях способ лечения будет включать введение растворимого варианта полипептида AXL в комбинации с паклитакселом. В некоторых воплощениях комбинация может быть синергической.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой растворимый вариант полипептида AXL, где указанный растворимый вариант полипептида AXL не имеет трансмембранного домена AXL, не имеет функционального фибронектинового (FN) домена, имеет один или более чем один домен Ig1, имеет один или более чем один домен Ig2, и где указанный вариант полипептида AXL демонстрирует повышенную аффинность связывания варианта полипептида AXL с GAS6 по сравнению с AXL дикого типа.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой растворимый вариант полипептида AXL, где указанный растворимый вариант полипептида AXL не имеет трансмембранного домена AXL, не имеет функционального фибронектинового (FN) домена, имеет один домен Ig1, не имеет функционального домена Ig2, и где указанный вариант полипептида AXL демонстрирует повышенную аффинность связывания варианта полипептида AXL с GAS6 по сравнению с AXL дикого типа.
В некоторых воплощениях вариант полипептида AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен. В некоторых воплощениях вариант полипептида не имеет внутриклеточного домена AXL. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL также не имеет функционального фибронектинового (FN) домена, где указанный вариант полипептида демонстрирует повышенную аффинность связывания полипептида с GAS6. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию относительно последовательности AXL дикого типа.
В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в области, выбранной из группы состоящей из (1) 15-50, (2)60-120 и (3) 125-135 последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1).
В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию в положении 19, 23, 26, 27, 32, 33, 38, 44, 61, 65, 72, 74, 78, 79, 86, 87, 88, 90, 92, 97, 98, 105, 109, 112, 113, 116, 118 или 127 последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) или их комбинацию.
В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию, выбранную из группы, состоящей из (1)А19Т, (2)Т23М, (3)E26G, (4)E27G или Е27К 5)G32S, (6)N33S, (7)T38L (8)T44A, (9)H61Y, (10)D65N, (11)A72V, (12) S74N, (13)Q78E, (14)V79M, (15)Q86R, (16)D87G, (17)D88N, (18)I90M или I90V, (19)V92A, V92G или V92D, (20)I97R, (21)T98A или T98P, (22)T105M, (23)Q109R, (24)V112A, (25)F113L, (26)H116R, (27)T118A, (28) G127R или G127E, (29) G129E и их комбинации.
В некоторых воплощениях вариант полипептида AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO:1) в следующих положениях: (а) глицин 32; (б) аспарагиновая кислота 87; (в) валин 92; и (г) глицин 127.
В некоторых воплощениях вариант полипептида AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO:1) в следующих положениях: (а) аспарагиновая кислота 87 и (б) валин 92.
В некоторых воплощениях вариант полипептида AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO:1) в следующих положениях: (а) глицин 32; (б) аспарагиновая кислота 87; (в) валин 92; (г) глицин 127; и (д) аланин 72.
В некоторых воплощениях вариант полипептида AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO:1) в следующем положении: аланин 72.
В некоторых воплощениях остаток глицин 32 варианта полипептида AXL заменен остатком серина, остаток аспарагиновая кислота 87 заменен остатком глицина, остаток валин 92 заменен остатком аланина, или остаток глицин 127 заменен остатком аргинина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях остаток аспарагиновая кислота 87 варианта полипептида AXL заменен остатком глицина, или остаток валин 92 заменен остатком аланина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях остаток аланин 72 варианта полипептида AXL заменен остатком валина.
В некоторых воплощениях остаток глицин 32 варианта полипептида AXL заменен остатком серина, остаток аспарагиновая кислота 87 заменен остатком глицина, остаток валин 92 заменен остатком аланина, остаток глицин 127 заменен остатком аргинина, или остаток аланин 72 заменен остатком валина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях вариант AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) в следующих положениях: (а) глутаминовая кислота 26; (б) валин 79; (в) валин 92; и (г) глицин 127.
В некоторых воплощениях остаток глутаминовая кислота 26 варианта полипептида AXL заменен остатком глицина, остаток валин 79 заменен остатком метионина, остаток валин 92 заменен остатком аланина, или остаток глицин 127 заменен остатком аргинина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях вариант полипептида AXL содержит по меньшей мере аминокислотную область, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных областей 19-437, 130-437, 19-132, 21-121, 26-132, 26-121 и 1-437 полипептида AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1), и где в указанной аминокислотной области присутствует одна или более чем одна аминокислотная модификация.
В некоторых воплощениях вариант полипептида AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) в следующих положениях: (а) глицин 32; (б) аспарагиновая кислота 87; (в) аланин 72; и валин 92.
В некоторых воплощениях глицин 32 варианта полипептида AXL заменен остатком серина, аспарагиновая кислота 87 заменена остатком глицина, аланин 72 заменен остатком валина, и валин 92 заменен остатком аланина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, и где указанный вариант AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) в следующих положениях: (а) глицин 32; (б) аспарагиновая кислота 87; (в) аланин 72; и (г) валин 92.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, и где глицин 32 заменен остатком серина, аспарагиновая кислота 87 заменена остатком глицина, аланин 72 заменен остатком валина, и валин 92 заменен остатком аланина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, и где указанный вариант AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) в следующих положениях: (а) глицин 32; (б) аспарагиновая кислота 87; (в) аланин 72; (г) валин 92; и (д) глицин 127.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, и где глицин 32 заменен остатком серина, аспарагиновая кислота 87 заменена остатком глицина, аланин 72 заменен остатком валина, валин 92 заменен остатком аланина, и глицин 127 заменен остатком аргинина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, не имеет функционального FN-домена, и где указанный вариант AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) в следующих положениях: (а) глицин 32; (б) аспарагиновая кислота 87; (в) аланин 72; и (г) валин 92.
В некоторых воплощениях растворимый вариант AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, не имеет функционального FN-домена, и где глицин 32 заменен остатком серина, аспарагиновая кислота 87 заменена остатком глицина, аланин 72 заменен остатком валина, и валин 92 заменен остатком аланина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, не имеет функционального FN-домена, и где указанный вариант AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) в следующих положениях: (а) глицин 32; (б) аспарагиновая кислота 87; (в) аланин 72; (г) валин 92; и (д) глицин 127.
В некоторых воплощениях растворимый вариант AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, не имеет функционального FN-домена, и где глицин 32 заменен остатком серина, аспарагиновая кислота 87 заменена остатком глицина, аланин 72 заменен остатком валина, валин 92 заменен остатком аланина, и глицин 127 заменен остатком аргинина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, не имеет функционального FN-домена, не имеет домена Ig2, и где указанный вариант AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) в следующих положениях: (а) глицин 32; (б) аспарагиновая кислота 87; (в) аланин 72; и (г) валин 92.
В некоторых воплощениях растворимый вариант AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, не имеет функционального FN-домена, и где глицин 32 заменен остатком серина, аспарагиновая кислота 87 заменена остатком глицина, аланин 72 заменен остатком валина, и валин 92 заменен остатком аланина, или присутствует комбинация указанных замен.
В некоторых воплощениях растворимый полипептид AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, не имеет функционального FN-домена, не имеет домена Ig2, и где указанный вариант AXL содержит аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) в следующих положениях: (а) глицин 32; (б) аспарагиновая кислота 87; (в) аланин 72; (г) валин 92; и (д) глицин 127.
В некоторых воплощениях растворимый вариант AXL представляет собой слитый белок, содержащий Fc-домен, не имеет функционального FN-домена, не имеет домена Ig2, и где глицин 32 заменен остатком серина, аспарагиновая кислота 87 заменена остатком глицина, аланин 72 заменен остатком валина, валин 92 заменен остатком аланина, и глицин 127 заменен остатком аргинина, или присутствует комбинация указанных замен.
-8
-9
-10
-11
-12
В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL имеет аффинность по меньшей мере приблизительно 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М, 1×10 М или 1×10 М в отношении GAS6.
В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL демонстрирует аффинность в отношении GAS6, превышающую аффинность полипептида AXL дикого типа по меньшей мере приблизительно в 5 раз, по меньшей мере приблизительно в 10 раз или по меньшей мере приблизительно в 20 раз.
4
4
В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL дополнительно содержит линкер. В некоторых воплощениях линкер содержит одну или более чем одну единицу (GLY)SER. В некоторых воплощениях линкер содержит 1, 2, 3 или 5 единиц (GLY)SER.
В некоторых воплощениях доза растворимого варианта полипептида AXL, вводимая пациенту, выбрана из группы, состоящей из приблизительно 0,5, приблизительно 1,0, приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5, приблизительно 10,0 мг/кг, приблизительно 10,5, приблизительно 11,0, приблизительно 11,5, приблизительно 12,0, приблизительно 12,5, приблизительно 13,0, приблизительно 13,5, приблизительно 14,0, приблизительно 14,5, приблизительно 15,0, приблизительно 15,5, приблизительно 16,0, приблизительно 16,5, приблизительно 17,0, приблизительно 17,5, приблизительно 18,0, приблизительно 18,5, приблизительно 19,0 мг/кг, приблизительно 19,5 и приблизительно 20,0 мг/кг. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 10 мг/кг в неделю. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 5 мг/кг в неделю. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 2,5 мг/кг в неделю. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 1 мг/кг в неделю. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 20 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 10 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 5 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 2,5 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 1 мг/кг каждые 14 суток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
+
+
ФИГ. 1. Ингибирование инвазии/миграции, индуцированной GAS6, с использованием рецептора-ловушки AXL. (А) Растворимый рецептор-ловушку AXL (AVB-S6-500) и клетки MDA-MB-231 Ax1 TNBC в бессывороточной среде помещали в верхний отсек камеры Бойдена, покрытый матригелем. В нижний отсек камеры вносили среды с сывороткой в качестве хемоаттрактанта. Через 24 часа инкубации определяли число клеток, мигрировавших через матригель, и выражали его как долю инвазивных клеток относительно PBS (забуференный фосфатом физиологический раствор)-контроля. (б) AVB-S6-500, клетки рака яичника OVCAR8 Ах1, коллаген 1-го типа, 50 нг/мл GAS6 и питательный среды помещали в микролунки и инкубировали. В 6 сутки определяли число клеток, демонстрировавших инвазивный фенотип, и выражали его как долю инвазивных клеток относительно PBS-контроля. AVB-S6-500 в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкг/мл значимо ингибировал инвазию/миграцию, индуцированную GAS6.
ФИГ. 2. Типичные изображения, полученные в анализе инвазии клеток MDA-MB-231 с AVB-S6-500.
6
ФИГ. 3. Снижение метастатической опухолевой нагрузки с использованием рецептора-ловушки AXL. Мышам проводили внутрибрюшинное (в/б) введение опухолевых клеток рака яичника SKOV3.ip (1×10), рандомизировали их по группам и вводили AVB-S6-500 в дозе 5, 10 или 20 мг/кг через день (Q2D). Метастатическую опухолевую нагрузку оценивали через 24 дня дозирования, проводя подсчет всех видимых метастатических очагов в полости брюшины с иссечением и взвешиванием всей пораженной ткани для определения общей массы (А) и числа (В) метастазов. AVB-S6-500 значимо снижал метастатическую опухолевую нагрузку при его введении в дозах 10 и 20 мг/кг.
6
ФИГ. 4. Повышенная эффективность при использовании комбинации рецептора-ловушки AXL и доксорубицина. Мышам проводили внутрибрюшинное (в/б) введение опухолевых клеток рака яичника SKOV3.ip (1×10), рандомизировали их по группам и вводили AVB-S6-500 в дозе 20 мг/кг Q2D в отдельности или в комбинации с доксорубицином (DOX), 2 мг/кг два раза в неделю. Метастатическую опухолевую нагрузку оценивали через 24 дня дозирования. Сравнение общей массы (А) и числа (б) метастазов продемонстрировало значимое преимущество комбинированной терапии. Комбинация AVB-S6-500 и доксорубицина значимо уменьшала среднюю массу пораженной ткани и привела к излечению у 2 животных.
ФИГ. 5. Резкое снижение сывороточного GAS6 на протяжении приблизительно 1 недели у яванских макаков после однократного введения рецептора-ловушки AXL в дозе 5 мг/кг (эквивалентная доза для человека 1,7 мг/кг). У яванских макаков AVB-S6-500, 5 мг/кг, приводил к резкому снижению сывороточного GAS6 на протяжении по меньшей мере 168 часов, а в исследованиях с многократным введением один раз в неделю NOAEL (уровень, не вызывающий нежелательных эффектов) был определен как 150 мг/кг/сутки или более.
ФИГ. 6. Резкое снижение сывороточного GAS6 на протяжении приблизительно 1 недели у субъектов-людей после однократного введения рецептора-ловушки AXL в дозах 1 мг/кг (А) и 2,5 мг/кг (В).
ФИГ. 7. Резкое снижение сывороточного GAS6 на протяжении приблизительно 1 недели у людей после однократного введения рецептора-ловушки AXL в дозах 5 мг/кг (А) и 10 мг/кг (В).
ФИГ. 8. Линейный график, на котором показаны средние (плюс/минус) концентрации AVB-S6-500 после однократной в/в инфузии AVB-S6-500 у здоровых людей (N равно 6 на дозу).
ФИГ. 9. Линейный график, на котором показаны средние (плюс/минус) концентрации сывороточного GAS6 после однократной в/в инфузии AVB-S6-500 у здоровых людей (N равно 6 на дозу).
ВАРИАНТ(Ы) ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
th
Если здесь не определено иное, научные и технические термины, использованные в связи с настоящим изобретением, имеют значение, в котором их обычно понимают специалисты в данной области. Кроме того, если контекст не требует иного, формы единственного числа включают множественное число, и формы множественного числа включают единственное число. В целом, номенклатура, используемая в связи с культивированием клеток и тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой и химией и гибридизацией белков и нуклеиновых кислот, и соответствующие методики, описанные здесь, широко применяются и хорошо известны в данной области. Если не указано иное, способы и методики по настоящему изобретению обычно осуществляют в соответствии с традиционными методами, хорошо известными в данной области и описанными в различных общих и более специализированных источниках, цитируемых и обсуждаемых в настоящем описании. См., например, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012), включенную сюда посредством ссылки. Ферментативные реакции и методики очистки осуществляют в соответствии с описаниями изготовителя, как это обычно делают в данной области, или как это описано здесь. Номенклатура, использованная в связи с аналитической химией, синтетической органической химией и медицинской и фармацевтической химией, и соответствующие лабораторные процедуры и методики, описанные здесь, широко применяются и хорошо известны в данной области. Для химического синтеза, химического анализа, изготовления фармацевтических препаратов, композиций, их доставки и лечения субъектов применяют стандартные методики.
При использовании здесь термин «опухоль» относится ко всем видам неопластического клеточного роста и пролиферации, как злокачественным, так и доброкачественным, и ко всем предраковым и раковым клеткам и тканям.
Термины «рак», «новообразование» и «опухоль» использованы здесь взаимозаменяемо для обозначения клеток, демонстрирующих автономный нерегулируемый рост, таким образом, что они демонстрируют фенотип аберрантного роста, характеризующийся значительным снижением контроля над пролиферацией клеток. В целом, клетки, представляющие в настоящей заявке интерес с точки зрения их выявления, анализа, классификации или лечения, включают предраковые (например, доброкачественные), злокачественные, преметастатические и неметастатические клетки.
Термин «первичная опухоль» относится ко всем видам неопластического клеточного роста и пролиферации, как злокачественным, так и доброкачественным, и ко всем предраковым и раковым клеткам и тканям, расположенным в анатомической области, где начался автономный нерегулируемый рост клеток, например в органе исходной раковой опухоли. Первичные опухоли не включают метастазы.
«Патология» рака включает все явления, угрожающие благополучию пациента. Это включает, без ограничения, аномальный или неконтролируемый рост клеток, рост и формирование первичной опухоли, метастазирование, нарушение нормального функционирования соседних клеток, аномальные уровни высвобождения цитокинов или других секреторных продуктов, подавление или усугубление воспалительного или иммунологического ответа, новообразование, предрак, злокачественное новообразование, инвазию в окружающие или отдаленные ткани или органы, такие как лимфатические узлы, и так далее.
При использовании здесь термины «рецидив рака», «рецидив опухоли» и их грамматические варианты относятся к дальнейшему росту неопластических или раковых клеток после диагностики рака. В частности, рецидив может возникнуть, когда в раковой ткани происходит дальнейший рост раковых клеток. Сходным образом, распространение опухоли» происходит, когда клеток опухоли диссеминируют в местные или отдаленные ткани и органы; поэтому распространение опухоли включает метастазирование опухоли. «Инвазия опухоли» происходит при местном распространении опухоли с нарушением функции затронутых тканей посредством их сдавления, разрушения или предотвращения нормального функционирования органов.
При использовании здесь термин «метастаз/метастазирование» относится к росту раковой опухоли в органе или части тела, непосредственно не связанных с органом исходной раковой опухоли. Подразумевают, что метастаз/метастазирование включают микрометастаз/микрометастазирование, представляющие собой присутствие раковых клеток, в количестве, не поддающемся определению, в органе или части тела, непосредственно не связанных с органом исходной раковой опухоли (например, органом, содержащим первичную опухоль). Метастазирование может также быть определено как несколько стадий процесса, такие как выход раковых клеток из области исходной опухоли (например, области первичной опухоли) и миграция и/или инвазия раковых клеток в другие части тела.
У пациента получают подходящий образец, в зависимости от природы рака. При использовании здесь фраза «образец раковой ткани» относится к любым клеткам, полученным из раковой опухоли. В случае солидных опухолей, которые не метастазировали (например, первичной опухоли) будет обычно получен образец ткани из хирургически удаленной опухоли и подготовлен к анализу с использованием общепринятых методик.
Определение подходящего образца пациента включает кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, образцы солидных тканей, такие как биопсийный образец, или тканевые культуры, или клетки, имеющие происхождение от них, и их потомство. Определение включает кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, образцы солидных тканей, такие как биопсийный образец, или тканевые культуры, или клетки, имеющие происхождение от них, и их потомство. Определение также включает образцы, с которыми, после их получения, были проведены какие-либо манипуляции, такие как обработка реагентами, отмывка или обогащение определенными популяциями клеток, такими как раковые клетки. Определение также включает образец, который был обогащен молекулами определенных типов, например нуклеиновыми кислотами, полипептидами и так далее. Термин «биологический образец» включает клинический образец и также включает ткань, полученную посредством хирургической резекции, ткань, полученную посредством биопсии, клетки в культуре, клеточные супернатанты, клеточные лизаты, образцы тканей, органы, костный мозг, кровь, плазму, сыворотку и тому подобное. «Биологический образец» включает образец, полученный из раковой клетки пациента, например образец, содержащий полинуклеотиды и/или полипептиды, полученный из раковой клетки пациента (например, клеточный лизат или другой клеточный экстракт, содержащий полинуклеотиды и/или полипептиды), и образец, содержащий раковые клетки пациента. Биологический образец, содержащий раковую клетку пациента, может также содержать нераковые клетки.
Опухоли, представляющие интерес с точки зрения лечения способами по изобретению, включают солидные опухоли, например карциномы, глиомы, меланомы, саркомы и тому подобное. Особый интерес представляют рак яичника и рак молочной железы. Карциномы включают множество аденокарцином, например предстательной железы, легкого и так далее, карциному коры надпочечника, печеночноклеточную карциному, почечноклеточную карциному, карциному яичника, карциному in situ, протоковую карциному, карциному молочной железы, базальноклеточную карциному, плоскоклеточную карциному, переходноклеточную карциному, карциному толстой кишки, назофарингеальную карциному, мультилокулярную кистозную почечноклеточную карциному, овсяноклеточную карциному, крупноклеточную карциному легкого, мелкоклеточную карциному легкого и так далее. Карциномы могут быть обнаружены в предстательной железе, поджелудочной железе, толстой кишке, головном мозге (например, глиобластома), легком, молочной железе, коже и так далее. Определение опухолей мягких тканей включает неоплазии, имеющие происхождение от фибробластов, миофибробластов, гистиоцитов, клеток сосудов / эндотелиальных клеток и клеток периневрия. Опухоли соединительной ткани включают саркомы, гистиоцитомы, фибромы, скелетную хондросаркому, внескелетную миксоидную хондросаркому, светлоклеточную саркому, фибросаркомы и так далее. Гематологические виды рака включают лейкозы и лимфомы, например Т-клеточную лимфому кожи, острый миелоидный лейкоз (AML), хронический миелоидный лейкоз (CML), острый лимфобластный лейкоз (ALL), неходжкинскую лимфому (NHL) и так далее. В некоторых воплощениях рак представляет собой рак яичника. В некоторых воплощениях рак представляет собой рак, сверхэкспрессирующий биомаркер GAS6 и/или AXL. В некоторых воплощениях у пациента ранее был ответ на противораковую терапию, но после прекращения терапии развился рецидив (далее - «рецидивирующий рак»). В некоторых воплощениях рак резистентен к стандартным терапиям. В некоторых воплощениях рак представляет собой химиорезистентный рак. В некоторых воплощениях рак представляет собой резистентный к платине рак.
«В комбинации с», «комбинированная терапия» и «комбинированные продукты» относятся, в определенных воплощениях, к одновременному введению пациенту первого лекарственного средства и соединений, как использовано здесь. В некоторых воплощениях комбинированные продукты вводят неодновременно. При введении в комбинации компоненты можно вводить в одно и то же время или последовательно в любом порядке в разные моменты времени. Таким образом, компоненты можно вводить по отдельности, но в достаточной временной близости друг от друга для обеспечения желаемого терапевтического эффекта.
При использовании здесь фраза «выживаемость без признаков заболевания» относится к отсутствию таких рецидива и/или инвазии опухоли и летального исхода у пациента после постановки диагноза, связанного с влиянием рака на продолжительность жизни пациента. Фраза «общая выживаемость» относится к летальному исходу у пациента после постановки диагноза, несмотря на возможность того, что причина смерти пациента может не быть прямым следствием влияния рака. Фразы «вероятность выживаемости без признаков заболевания», «риск рецидива» и их варианты относятся к вероятности рецидива или распространения опухоли у пациента после диагностики рака, где вероятность определена в соответствии со способом по изобретению.
Для модуляции функции AXL/GAS6 соединения, имеющие желаемую фармакологическую активность, можно вводить реципиенту в физиологически приемлемом носителе. Терапевтические агенты можно вводить множеством способов, перорально, местно, парентерально, например внутривенно, подкожно, внутрибрюшинно, вирусной инфекцией, интраваскулярно и так далее. Особый интерес представляет внутривенная доставка. Соединения могут быть включены в различные композиции, в зависимости от способа введения. Концентрация терапевтически активного соединения в композиции может составлять приблизительно 0,1-100 мас.%.
Фармацевтические композиции могут быть изготовлены в различных формах, таких как гранулы, таблетки, пилюли, суппозитории, капсулы, суспензии, мази, лосьоны и тому подобное. Для изготовления композиций, содержащих терапевтически активные соединения, могут быть использованы органические или неорганические носители и/или разбавители фармацевтической степени чистоты, подходящие для перорального и местного применения. Разбавители, известные в данной области, включают водные среды, растительные и животные масла и жиры. В качестве вспомогательных агентов могут быть использованы стабилизирующие агенты, смачивающие и эмульгирующие агенты, соли для изменения осмотического давления, или буферы для обеспечения адекватного значения рН, и усилители чрескожного проникновения.
«Ингибиторы», «активаторы» и «модуляторы» AXL или его лиганда GAS6 использованы для обозначения ингибирующих, активирующих или модулирующих молекул, соответственно, идентифицированных с применением анализов связывания или сигнализации рецепторов или лигандов in vitro и in vivo, например лигандов, рецепторов, агонистов, антагонистов и их гомологов и миметиков.
Термины «полипептид», «пептид» и «белок» использованы здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из двух или более аминокислотных остатков. Данные термины применимы к аминокислотным полимерам, в которых один или более чем один аминокислотный остаток представляет собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, а также к встречающимся в природе аминокислотным полимерам, и не встречающимся в природе аминокислотным полимерам. Термины «антитело» и «антитела» использованы здесь взаимозаменяемо и относятся к полипептиду, способному к взаимодействию и/или связыванию с другой молекулой, часто называемой антигеном. Антитела могут включать, например, «антигенсвязывающие полипептиды» или «полипептиды, связывающиеся с молекулами-мишенями». Антигены по настоящему изобретению могут включать, например, любые полипептиды, описанные в настоящем изобретении.
Термин «аминокислота» относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, а также к аналогам аминокислот и миметикам аминокислот, функционирующим сходным с встречающимися в природе аминокислотами образом. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицируемые позднее, например гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, имеющим такую же основную химическую структуру, что и встречающиеся в природе аминокислоты, то есть α-углерод, связанный с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например гомосерин, норлейцин, метионинсульфоксид, метионинметилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные каркасы, но сохраняют такую же основную химическую структуру, как у встречающихся в природе аминокислот. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, имеющим структуру, отличающуюся от общей химической структуры аминокислот, но функционирующую сходным с встречающимися в природе аминокислотами образом. Все отдельные буквы, используемые в настоящем изобретении для обозначения аминокислот, использованы в соответствии с общепринятыми символами аминокислот, широко применяемых в данной области, например, А обозначает аланин, С обозначает цистеин и так далее. Аминокислота, представленная одной буквой до и после соответствующего положения, отражает изменение исходной аминокислоты (до положения) на измененную аминокислоту (после положения). Например, А19Т означает, что аминокислота аланин в положении 19 изменена на треонин.
Термины «субъект», «индивид» и «пациент» использованы здесь взаимозаменяемо для обозначения млекопитающего, оцениваемого для лечения и/или проведения лечения. В одном воплощении млекопитающее представляет собой человека. Таким образом, термины «субъект», «индивид» и «пациент» включают индивидов с раком, в том числе, без ограничения, с аденокарциномой яичника или предстательной железы, раком молочной железы, глиобластомой и так далее, включая тех, у которых была проведена резекция (хирургическое вмешательство) с удалением раковой ткани или тех, кто является кандидатом на проведение резекции (хирургического вмешательства) с удалением раковой ткани. Субъекты могут представлять собой людей, но также включают других млекопитающих, особенно тех млекопитающих, которых можно использовать в качестве лабораторных моделей человеческих заболеваний, например мышей, крыс и так далее.
Определение подходящего образца пациента включает кровь и другие жидкие образцы биологического происхождения, образцы солидных тканей, такие как биопсийный образец, или тканевые культуры, или клетки, имеющие происхождение от них, и их потомство. Определение также включает образцы, с которыми, после их получения, были проведены какие-либо манипуляции, такие как обработка реагентами, отмывка или обогащение определенными популяциями клеток, такими как клетки эндометрия, патологические клетки почки, патологические воспалительные клетки и/или клетки отторжения трансплантата (GvHD). Определение также включает образец, который был обогащен молекулами определенных типов, например нуклеиновыми кислотами, полипептидами и так далее. Термин «биологический образец» включает клинический образец и также включает ткань, полученную посредством хирургической резекции, ткань, полученную посредством биопсии, клетки в культуре, клеточные супернатанты, клеточные лизаты, образцы тканей, органы, костный мозг, кровь, плазму, сыворотку и тому подобное. «Биологический образец» включает образец, полученный из клетки образца от пациента, например образец, содержащий полинуклеотиды и/или полипептиды, полученный из клетки образца от пациента (например, клеточный лизат или другой клеточный экстракт, содержащий полинуклеотиды и/или полипептиды), и образец, содержащий клетки образца от пациента. Биологический образец, содержащий клетку образца от пациента, может также содержать нормальные, непатологические клетки.
Термин «диагностика» использован здесь для обозначения определения молекулярного или патологического состояния, заболевания или положения, такого как определение вирусной инфекции.
При использовании здесь термины «лечение», «лечить» и тому подобные относятся к введению агента или проведению процедуры для получения эффекта. Эффект может быть профилактическим в смысле полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим в смысле обеспечения частичного или полного излечения заболевания и/или симптомов заболевания. При использовании здесь «лечение» охватывает любое лечение любой вирусной инфекции или воздействия у млекопитающего, в частности у человека, и включает: (а) предотвращение инфекции; (б) подавление инфекции, то есть остановку ее развития; и (в) ослабление заболевания, то есть обеспечение обратного развития инфекции.
Лечение может относиться к любым признакам успешного лечения, уменьшения интенсивности или предотвращения рака, включая любой объективный или субъективный параметр, такой как уменьшение выраженности, ремиссия, уменьшение симптомов или повышение переносимости патологического состояния для пациента, уменьшение темпа деградации или ухудшения или уменьшение степени тяжести исхода деградации. Лечение или уменьшение интенсивности симптомов может быть основано на объективных или субъективных параметрах, включая результаты обследования, проводимого врачом. Соответственно, термин «лечение» включает введение соединений или агентов по настоящему изобретению для предотвращения, задержки, уменьшения выраженности или остановки или подавления развития симптомов или состояний. Термин «терапевтический эффект» относится к уменьшению, устранению или предотвращению заболевания, симптомов заболевания или побочных эффектов заболевания у субъекта.
При использовании здесь термин «коррелирует» или «коррелирует с» и подобные термины относятся к статистической связи между наступлением двух событий, где события включают числа, наборы данных и тому подобное. Например, когда события включают числа, положительная корреляция (также называемая здесь «прямой корреляцией») означает, что по мере увеличения одного другое также увеличивается. Отрицательная корреляция (также называемая здесь «обратной корреляцией») означает, что по мере увеличения одного другое уменьшается.
«Единица дозы» относится к физически дискретным единицам, подходящим для использования в качестве единичных доз у конкретного индивида, подлежащего лечению. Каждая единица может содержать предопределенное количество активного соединения(ий), рассчитанное для оказания желаемого(ых) терапевтического(их) эффекта(ов), вместе с необходимым фармацевтическим носителем. Характеристики стандартных лекарственных форм могут быть продиктованы (а) уникальными характеристиками активного(ых) соединения(ий) и конкретного(ых) терапевтического(их) эффекта(ов), подлежащего(их) достижению, и (б) ограничений, свойственных методам изготовления такого(их) активного(ых) соединения(ий).
«Фармацевтически приемлемый эксципиент» обозначает эксципиент, полезный в изготовлении фармацевтической композиции, являющейся в целом безопасной, нетоксичной и желаемой, и включает эксципиенты, приемлемые для ветеринарного применения, а также для фармацевтического применения у человека. Такие эксципиенты могут быть твердыми, жидкими, полутвердыми или, в случае аэрозольной композиции, газообразными.
Термины «фармацевтически приемлемый», «физиологически переносимый» и их грамматические варианты, когда они относятся к композициям, носителям, разбавителям и реагентам, использованы взаимозаменяемо и отражают то, что вещества можно вводить человеку или применять у человека без развития нежелательных физиологических эффектов до степени выраженности, которая могла бы сделать введение или применение композиции невозможным.
«Терапевтически эффективное количество» относится к количеству соединения, которое, при введении субъекту для лечения рака молочной железы или рака яичника, достаточно для проведения такого лечения рака. «Терапевтически эффективное количество» может варьировать в зависимости, например, от выбранного растворимого варианта полипептида AXL, стадии рака, возраста, массы тела и/или состояния здоровья пациента и мнения лечащего врача. В каждом конкретном случае подходящее количество может быть легко определено специалистами в данной области или специалистами, способными определять его посредством рутинных экспериментов.
Фраза «определение эффективности лечения» и ее варианты могут включать любые методы определения того, что лечение приносит пользу субъекту. Термин «эффективность лечения» и его варианты обычно указывают на уменьшение выраженности одного или более чем одного признака или симптома, ассоциированного с заболеванием, и могут быть легко определены специалистом в данной области. «Эффективность лечения» может также относиться к предотвращению или уменьшению интенсивности признаков или симптомов токсичности, обычно связанных со стандартным или нестандартным лечением заболевания. Определение эффективности лечения обычно зависит от показаний к его проведению и заболевания, по поводу которого его проводят, и могут включать любые методы определения того, что лечение обеспечивает полезный эффект у пациента, известные или доступные в данной области. Например, признаки эффективности лечения могут включать, без ограничения, ремиссию заболевания или показания. Кроме того, эффективность лечения может также включать общие улучшения состояния здоровья субъекта в целом, такие как, без ограничения, повышение качества жизни пациента, увеличение предполагаемого показателя выживаемости у субъекта, уменьшение депрессии или уменьшение частоты рецидивов показания (увеличение времени ремиссии). (См., например, Physicians' Desk Reference (2010)).
При использовании здесь термин «выживаемость без прогрессирования» обозначает период времени, на протяжении которого субъект, имеющий заболевание (например, рак), выживает, без существенного ухудшения рассматриваемого болезненного состояния. Выживаемость без прогрессирования можно оценивать как период времени, на протяжении которого нет прогрессирования опухолевого роста и/или статус заболевания пациента не определяют как прогрессирующее заболевание. В некоторых воплощениях выживаемость без прогрессирования у субъекта с раком оценивают по размеру опухоли (очага), числу опухолей (очагов) и/или метастазированию.
При использовании здесь «частоту объективного ответа (ORR)» определяют как долю пациентов с уменьшением размера опухоли на предопределенное количество и на протяжении минимального периода времени. Продолжительность ответа обычно измеряют от времени первоначального ответа до документально подтвержденного прогрессирования опухоли. Обычно ORR может быть определена как сумма частичных ответов и полных ответов.
«Сопутствующее введение» известного лекарственного средства для лечения рака с фармацевтической композицией по настоящему изобретению обозначает введение лекарственного средства и варианта AXL в такое время, что терапевтический эффект будут оказывать как известное лекарственное средство, так и композиция по настоящему изобретению. Такое сопутствующее введение может включать одновременное (то есть в одно и то же время), предшествующее или последующее введение лекарственного средства относительно введения соединения по настоящему изобретению. Специалисту в данной области не составит труда определить подходящие время, последовательность и дозы для введения конкретных лекарственных средств и композиций по настоящему изобретению.
AXL, MER, Tyro3 и GAS6, а также связанные с ними сигнальные пути описаны в WO 2011/091305, а также в заявках на патенты Соединенных Штатов Америки №№13/554,954 и 13/595,936, все из которых полностью включены сюда посредством ссылки для любых задач.
Типичные воплощения
Способы по настоящему изобретению включают лечение, уменьшение или предотвращение метастазирования видов рака посредством введения растворимого варианта полипептида AXL, как описано здесь. В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложены способы лечения видов человеческого метастатического рака, включающие введение растворимого полипептида AXL, не имеющего трансмембранного домена AXL и имеющего по меньшей мере одну мутацию относительно AXL дикого типа, повышающую аффинность связывания полипептида AXL с GAS6 по сравнению с AXL дикого типа.
В некоторых воплощениях указанные способы продлевают выживаемость без прогрессирования по сравнению с контролем. В некоторых воплощениях указанные способы продлевают общую выживаемость по сравнению с контролем. В некоторых воплощениях указанные способы позволяют достичь улучшенной выживаемости без прогрессирования по сравнению с контролем. В некоторых воплощениях указанные способы позволяют достичь улучшенного интервала без химиотерапии по сравнению с контролем. В некоторых воплощениях указанные способы позволяют достичь улучшенного времени до первой последующей терапии по сравнению с контролем. В некоторых воплощениях указанные способы позволяют достичь улучшенного времени до второй последующей терапии по сравнению с контролем. В некоторых воплощениях определено, что указанные способы не оказывают отрицательного эффекта на качество жизни, оцениваемое посредством FOSI и/или EQ-5D-5L.
Виды рака, представляющие интерес, включают солидные опухоли и гематологические злокачественные новообразования. В различных воплощениях рак выбран из группы, состоящей из: В-клеточной лимфомы; рака легкого (мелкоклеточного рака легкого и немелкоклеточного рака легкого); рака бронха; колоректального рака; рака предстательной железы; рака молочной железы; рака поджелудочной железы; рака желудка; рака яичника; рака мочевого пузыря; рака головного мозга или центральной нервной системы; рака периферической нервной системы; рака пищевода; рака шейки матки; меланомы; рака матки или эндометрия; рака полости рта или глотки; рака печени; рака почки; рака желчевыводящих путей; рака тонкой кишки или аппендикса; рака слюнной железы; рака щитовидной железы; рака надпочечника; остеосаркомы; хондросаркомы; липосаркомы; рака яичка; злокачественной фиброзной гистиоцитомы; рака кожи; рака головы и шеи; лимфом; сарком; множественной миеломы; и лейкозов.
Рак яичника является 5-й причиной среди всех смертей от рака у женщин и составляет 5% от всех смертей от рака у женщин. Согласно оценкам, в 2014 г. будет 21980 новых случаев рака яичника и приблизительно 14270 женщин умрет от этого заболевания. Расчетная частота эпителиального рака яичника у женщин в Соединенных Штатах Америки в 2012 г. составляет приблизительно 22280 (15500 смертей), а в Европе - 65538 случаев (42704 смерти). Серозный рак яичника высокой степени является наиболее частым подтипом и демонстрирует широкую геномную нестабильность, что указывает на вероятный дефект гомологичной рекомбинации (Bowtell D D, Nat Rev Cancer 2010; 10: 803-8). На момент постановки диагноза у большинства женщин заболевание имеет распространенный характер, что приводит к высокой смертности. Начальная химиотерапия состоит из химиотерапии таксаном, или платиной, или их комбинацией. Несмотря на то, что приблизительно 75% пациентов отвечают на терапию первой линии, в течение 1-3 лет после нее у 70% таких пациентов развивается рецидив. Столь высокая частота рецидивов, несмотря на исходно высокую частоту ответа, приводит к существенной неудовлетворенной потребности. Попытки усовершенствовать стандартную двухкомпонентную химиотерапию (карбоплатин и паклитаксел) добавлением третьего цитотоксического лекарственного средства (топотекана, гемцитабина или доксила) были безуспешны (du Bois et al., 2006, и Pfisterer et al., 2006). Поддерживающая терапия после достижения ответа на начальную химиотерапию может быть способом обеспечения клинического полезного эффекта посредством задержки развития побочных эффектов прогрессирования заболевания, задержки возникновения необходимости токсичной химиотерапии и увеличения общей выживаемости. Тем не менее общепринятого стандарта поддерживающей терапии при раке яичника на данный момент не существует.
В некоторых воплощениях рак представляет собой рак яичника. В некоторых воплощениях рак яичника резистентен к стандартным терапиям. В некоторых воплощениях рецидивирующий и/или резистентный к платине рак представляет собой рак яичника. В некоторых воплощениях на момент начала терапии растворимым вариантом полипептида AXL рак яичника представляет собой рак яичника, резистентный к платине. В некоторых воплощениях на момент начала терапии растворимым вариантом полипептида AXL рак яичника представляет собой рецидивирующий рак яичника, резистентный к платине. В некоторых воплощениях рак яичника отвечал на самую недавнюю схему химиотерапии на основе платины до начала терапии растворимым вариантом полипептида AXL. В некоторых воплощениях ответ на самую недавнюю схему химиотерапии на основе платины представляет собой полный ответ. В некоторых воплощениях ответ на самую недавнюю схему химиотерапии на основе платины представляет собой частичный ответ. В некоторых воплощениях рак яичника отвечал на предпоследнюю схему химиотерапии на основе платины до начала терапии растворимым вариантом полипептида AXL.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложены способы лечения рака, включающие введение растворимого полипептида AXL, не имеющего трансмембранного домена AXL и имеющего по меньшей мере одну мутацию относительно AXL дикого типа, повышающую аффинность связывания полипептида AXL с GAS6 по сравнению с AXL дикого типа, в комбинации с второй терапией, выбранной из группы, состоящей из хирургического вмешательства, циторедуктивной терапии, цитотоксической химиотерапии и иммунотерапии. В некоторых воплощениях комбинация может быть синергической.
2
2
2
В некоторых воплощениях комбинированная терапия включает антипролиферативную или циторедуктивную терапию. Антипролиферативную или циторедуктивную терапию применяют терапевтически для устранения опухолевых клеток и других нежелательных клеток у реципиента, и она включает применение таких терапий, как доставка ионизирующего излучения и введение химиотерапевтических агентов. Например, ионизирующее излучение (IR) применяют для лечения приблизительно 60% пациентов с раком посредством приложения энергии, повреждающей или разрушающей клетки в области, в которой проводят лечение, и для задач настоящего изобретения IR можно доставлять в обычных дозах и схемах или в сниженных дозах. Радиационное повреждение клеток является неспецифичным, с комплексными эффектами в отношении ДНК. Эффективность терапии зависит от того, что повреждение клеток у раковых клеток выражено в большей степени, чем у нормальных клеток. Лучевая терапия может быть применена для лечения любого типа рака. Некоторые типы лучевой терапии включают фотоны, такие как рентгеновское излучение или гамма-излучение. Другой методикой доставки излучения к раковым клеткам является внутренняя лучевая терапия, при которой радиоактивные имплантаты помещают непосредственно в опухоль или полость тела, что позволяет сконцентрировать дозу излучения на небольшой области. Подходящая доза ионизирующего излучения может составлять от по меньшей мере приблизительно 2 Гр до не более чем приблизительно 10 Гр, обычно приблизительно 5 Гр. Подходящая доза ультрафиолетового излучения может составлять от по меньшей мере приблизительно 5 Дж/м до не более чем приблизительно 50 Дж/м, обычно приблизительно 10 Дж/м. Образец может быть получен от по меньшей мере приблизительно 4 до не более чем приблизительно 72 часов после ультрафиолетового облучения, обычно через приблизительно 4 часа.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Химиотерапевтические агенты хорошо известны в данной области, и их применяют обычных дозах и схемах или в сниженных дозах или схемах, включая, например, ингибиторы топоизомераз, такие как антрациклины, включая соединения даунорубицин, адриамицин (доксорубицин), эпирубицин, идарубицин, анамицин, MEN 10755 и тому подобные. Другие ингибиторы топоизомеразы включают аналоги подофиллотоксина этопозид и тенипозид, и антрацендионы, митоксантрон и амсакрин. Другие антипролиферативные агенты препятствуют сборке микротрубочек, например семейство алкалоидов барвинка. Примеры алкалоидов барвинка включают винбластин, винкристин, винорелбин (NAVELBINE), виндезин, виндолин, винкамин и так далее. Агенты, повреждающие ДНК, включают аналоги нуклеотидов, алкилирующие агенты и так далее. Алкилирующие агенты включают: азотистые иприты, например, мехлорэтамин, циклофосфамид, мелфалан (L-сарколизин) и так далее; и нитрозомочевины, например карму стин (BCNU), ломустин (CCNU), семустин (метил-CCNU), стрептозоцин, хлорозотоцин и так далее. Аналоги нуклеотидов включают: пиримидины, например цитарабин (CYTOSAR-U), арабинозид цитозина, фторурацил (5-FU), флоксуридин (FUdR) и так далее; пурины, например тиогуанин (6-тиогуанин), 6-меркаптопурин (6-МР), пентостатин, фторурацил (5-FU) и так далее; и аналоги фолиевой кислоты, например метотрексат, 10-пропаргил-5,8-дидеазафолат (PDDF, СВ3717), 5,8-дидеазатетрагидрофолиевую кислоту (DDATHF), лейковорин и так далее. Другие представляющие интерес химиотерапевтические агенты включают: комплексы металлов, например цисплатин (цис-DDP), карбоплатин, оксалиплатин и так далее; мочевины, например гидроксимочевину; гемцитабин; и гидразины, например N-метилгидразин. В различных воплощениях дозы таких химиотерапевтических агентов включают, без ограничения, любое из приблизительно 10 мг/м, 20 мг/м, 30 мг/м, 40 мг/м, 50 мг/м, 60 мг/м, 75 мг/м, 80 мг/м, 90 мг/м, 100 мг/м, 120 мг/м, 150 мг/м, 175 мг/м, 200 мг/м, 210 мг/м, 220 мг/м, 230 мг/м, 240 мг/м, 250 мг/м, 260 мг/м и 300 мг/м.
В некоторых воплощениях комбинированная терапия будет включать иммунотерапию. При использовании здесь термин «иммунотерапия» относится к лечению рака, включающему, без ограничения: лечение с использованием истощающих антител к конкретным опухолевым антигенам (см., например, обзоры Blattman and Greenberg, Science, 305:200, 2004; Adams and Weiner, Nat Biotech, 23:1147, 2005; Vogal et al. J Clin Oncology, 20:719, 2002; Colombat et al., Blood, 97:101, 2001); лечение с использованием конъюгатов «антитело - лекарственное средство» (см., например, Ducry, Laurent (Ed.) Antibody Drug Conjugates. In: Methods in Molecular Biology. Book 1045. New York (NY), Humana Press, 2013; Nature Reviews Drug Discovery 12, 259-260, April 2013); лечение с использованием агонистических, антагонистических или блокирующих антител к костимулирующим или коингибирующим молекулам (иммунным контрольным точкам), таким как CTLA-4 (ипилимумаб), PD-1 (ниволумаб, пембролизумаб, пидилизумаб (pidilizumab)) и PD-L1 (BMS-936559, MPLD3280A, MEDI4736, MSB0010718C) (см., например, Philips and Atkins, International Immunology, 27(1); 39-46, Oct 2014), OX-40, CD137, GITR, LAG3, TIM-3 и VISTA (см., например, Sharon et al., Chin J Cancer., 33(9): 434-444, Sep 2014; Hodi et al., N Engl J Med, 2010; Topalian et al., N Engl J Med, 366:2443- 54, 2012); лечение с использованием биспецифичных антител, привлекающих Т-клетки (BiTE), таких как блинатумомаб (см., например, патент США №9260522; заявку на патент США №20140302037); лечение, включающее введение модификаторов биологического ответа, таких как IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, GM-CSF, IFN-α, HN-β и IFN-γ (см., например, Sutlu Т et al., Journ of Internal Medicine, 266(2): 154-181, 2009; Joshi S PNAS USA, 106(29):12097-12102, 2009; Li Y et al., Journal of Translational Medicine, 7:11, 2009); лечение с использованием терапевтических вакцин, таких как сипулейцел-Т (см., например, KantoffPW New England Journal of Medicine, 363(5):411-422, 2010; Schlom J., Journal of the National Cancer Institutes, 104(8):599-613, 2012); лечение с использованием дендритно-клеточных вакцин или вакцин на основе опухолевых антигенных пептидов; лечение с использованием Т-клеток с химерными антигенными рецепторами (CAR-T-клеток) (см., например, Rosenberg SA Nature Reviews Cancer, 8(4):299-308, 2008; Porter DL et al., New England Journal of Medicine, 365(8):725-733, 2011; Grupp SA et al., New England Journal of Medicine, 368(16): 1509-151, 2013; патент США №9102761; патент США №9101584); лечение с использованием CAR-NK-клеток (см., например, Glienke et al., Front Pharmacol, 6(21): 1-7, Feb 2015); лечение с использованием опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL) (см., например, Wu et al, Cancer J., 18(2): 160-175, 2012); лечение с использованием адоптивно перенесенных противоопухолевых Т-клеток (культивированных ex vivo и/или трансгенных по TCR) (см., например, Wrzesinski et al., J Immunother, 33(1): 1-7, 2010); лечение с использованием клеток TALL-104; и лечение с использованием иммуностимулирующих агентов, таких как агонисты Toll-подобных рецепторов (TLR) CpG и имихимод (см., например, Krieg, Oncogene, 27:161-167, 2008; Lu, Front Immunol, 5(83): 1-4, March 2014).
В проведенных исследованиях иммунотерапия, сосредоточенная на использовании истощающих антител к конкретным опухолевым антигенам, была весьма успешной (см., например, обзоры Blattman and Greenberg, Science, 305:200, 2004; Adams and Weiner, Nat Biotech, 23:1147, 2005). Некоторыми из примеров таких истощающих антител, специфичных в отношении опухолевых антигенов, являются HERCEPTIN (mAb против Her2/neu) (Baselga et al., J Clin Oncology, Vol 14:737, 1996; Baselga et al., Cancer Research, 58:2825, 1998; Shak, Semin. Oncology, 26 (Suppll2):71, 1999; Vogal et al. J Clin Oncology, 20:719, 2002); и RITUXAN (mAb против CD20) (Colombat et al., Blood, 97:101, 2001). К сожалению, несмотря на свое несомненное значение в лечении онкологических заболеваний, в виде монотерапии они обычно эффективны лишь у приблизительно 30% индивидов и лишь с частичным ответом. Более того, после лечения с применением этих схем, включающих антитела, у многих индивидов в конечном счете развиваются рефрактерность или рецидивы.
Лечение с использованием агонистических, антагонистических или блокирующих антител к костимулирующим или коингибирующим молекулам (иммунным контрольным точкам) является предметом активного изучения и клинических исследований. В нормальных физиологических условиях иммунные контрольные точки являются ключевыми для поддержания самотолерантности (то есть для предотвращения аутоиммунитета) и защиты тканей от повреждения при ответе иммунной системы на патогенную инфекцию. В настоящее время также ясно, что опухоли привлекают пути определенных иммунных контрольных точек как важный механизм иммунной резистентности, в частности к Т-клеткам, специфичным в отношении опухолевых антигенов (Pardoll DM., Nat Rev Cancer, 12:252-64, 2012). Соответственно, лечение с использованием антител к молекулам иммунных контрольных точек, включая, например, CTLA-4 (ипилимумаб), PD-1 (ниволумаб, пембролизумаб, пидилизумаб (pidilizumab)) и PD-L1 (BMS-936559; MPLD3280A; MEDI4736; MSB0010718C) (см., например, Philips and Atkins, International Immunology, 27(1); 39-46, Oct 2014), и OX-40, CD137, GITR, LAG3, TIM-3 и VISTA (см., например, Sharon et al., Chin J Cancer., 33(9): 434-444, Sep 2014; Hodi et al., N Engl J Med, 2010; Topalian et al., N Engl J Med, 366:2443-54), изучается как новые альтернативные виды иммунотерапии для лечения пациентов с пролиферативными заболеваниями, такими как рак, и, в частности, пациентов с рефрактерным и/или рецидивирующим раком.
Лечение с применением терапии Т-клетками с химерными антигенными рецепторами (CAR) представляет собой иммунотерапию, при которой собственные Т-клетки пациента выделяют в лаборатории, меняют их направленность посредством синтетического рецептора для распознавания определенного антигена или белка и осуществляют их реинфузию пациенту. CAR представляют собой синтетические молекулы, содержащие по меньшей мере (1) антигенсвязывающую область, обычно имеющую происхождение от антитела, (2) трансмембранный домен для заякоривания CAR на Т-клетках и (3) 1 или более чем один внутриклеточный Т-клеточный сигнальный домен. CAR перенаправляет специфичность Т-клетки к антигену независимым от человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) образом и позволяет преодолеть проблемы, связанные с Т-клеточной толерантностью (Kalos М and June СН, Immunity, 39(1):49-60, 2013). За последние 5 лет было опубликовано по меньшей мере 15 клинических исследований CAR-T-клеточной терапии. Новая волна интереса к CAR-T-клеточной терапии возникла в августе 2011 г., когда исследователи из Пенсильванского университета (Penn) опубликовали отчет о 3 пациентах с рефрактерным хроническим лимфоцитарным лейкозом (CLL), у которых после однократной дозы CAR-T-клеток, направленных на CD 19, была получена длительная ремиссия (Porter DL, et al., N Engl J Med., 365(8):725-733, 2011).
Известно, что, в отличие от донорских Т-клеток, натуральные клетки-киллеры (NK-клетки) опосредуют противораковые эффекты без риска индуцирования реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD). Соответственно, аллореактивные NK-клетки сейчас также в центре внимания как подходящие и эффективные эффекторные клетки для клеточной терапии рака. Были разработаны несколько линий человеческих NK-клеток, например NK-92, HANK-1, KHYG-1, NK-YS, NKG, YT, YTS, NKL и NK3.3 (Kornbluth, J., et al., J. Immunol. 134, 728-735, 1985; Cheng, M. et al., Front.Med. 6:56, 2012), и получены различные NK-клетки, экспрессирующие CAR (CAR-NK-клетки). Иммунотерапия NK-клетками, экспрессирующими CAR (CAR-NK-клетками), является предметом активного изучения и клинических исследований (см., например, Glienke et al., Front Pharmacol, 6(21):l-7, Feb 2015).
Биспецифичные молекулы, привлекающие Т-клетки (BiTE), составляют класс биспецифичных одноцепочечных антител для поликлональной активации цитотоксических Т-клеток и их перенаправления против патогенных клеток-мишеней. BiTE биспецифичны в отношении поверхностного антигена-мишени на раковых клетках и в отношении CD3 на Т-клетках. BiTE способны соединить цитотоксическую Т-клетку любого типа с раковой клеткой, независимо от специфичности рецепторов Т-клетки, костимуляции или представления пептидного антигена. Уникальный набор свойств, а именно очень высокая активность и эффективность против клеток-мишеней при малых количествах Т-клеток в отсутствие необходимости костимуляции Т-клеток, пока не обнаружен ни у одного другого типа биспецифичных конструкций на основе антител (Baeuerle et al., Cancer Res, 69(12):4941-4, 2009). На данный момент сконструированы BiTE-антитела к более чем 10 различным антигенам-мишеням, включая CD19, ЕрСАМ, Her2/neu, EGFR, CD66e (или СЕА, СЕАСАМ5), CD33, EphA2 и MCSP (или HMW-MAA) (Id.). Лечение с использованием антител BiTE, таких как блинатумомаб (Nagorsen, D. et al., Leukemia & Lymphoma 50(6): 886-891, 2009) и солитомаб (solitomab) (Amann et al., Journal of Immunotherapy 32(5): 452-464, 2009) проходит клинические испытания.
В некоторых воплощениях вторая терапия будет включать введение ингибитора PARP. Поли(ADP-рибоза)-полимеразы (PARP) представляют собой семейство ферментов, вовлеченных в различные активности в ответ на повреждение ДНК. PARP-1 является ключевым ферментом репарации ДНК, опосредующим репарацию одноцепочечных разрывов (SSB) путем эксцизионной репарации оснований (BER). Было продемонстрировано, что ингибиторы PARP селективно уничтожают опухолевые клетки с мутациями BRCA1 и BRCA2. Кроме того, согласно доклиническим и предварительным клиническим данным, ингибиторы PARP проявляют селективную цитотоксичность в отношении опухолей с дефицитом гомологичной рекомбинационной репарации, вызванным дисфункцией генов, отличных от BRCA1 или BRCA2. В некоторых воплощениях ингибитор PARP выбран из группы, состоящей из АВТ-767, AZD 2461, BGB-290, BGP 15, СЕР 9722, Е7016, Е7449, флузопариба, INO1001, JPI 289, MP 124, нирапариба, олапариба, ONO2231, рукапариба, SC 101914, талазопариба, велипариба, WW 46 или их солей или производных. В некоторых воплощениях анти-PARP терапию вводят в дозе, эквивалентной приблизительно 100 мг, приблизительно 200 мг или приблизительно 300 мг нирапариба или его соли или производного. В некоторых воплощениях анти-PARP терапию вводят в дозе, эквивалентной приблизительно 100 мг нирапариба или его соли или производного. В некоторых воплощениях анти-PARP терапию вводят в дозе, эквивалентной приблизительно 200 мг нирапариба или его соли или производного. В определенных воплощениях анти-PARP терапию вводят в дозе, эквивалентной приблизительно 300 мг нирапариба или его соли или производного.
Вариант AXL может быть введен до, одновременно с или после второй терапии, обычно в пределах по меньшей мере приблизительно 1 недели, по меньшей мере приблизительно 5 суток, по меньшей мере приблизительно 3 суток, по меньшей мере приблизительно 1 суток. Вариант AXL может быть доставлен посредством в виде одной дозы или может быть разделен на несколько доз, например доставка за некоторый период времени, в том числе один раз в сутки, один раз в двое суток, два раза в неделю, один раз в неделю и так далее. Эффективная доза будет варьировать в зависимости от пути введения, конкретного агента, дозы циторедуктивного агента и тому подобного и может быть эмпирически определена специалистом в данной области. Для полипептидов, вводимых внутривенно, полезный диапазон может быть определен эмпирически, например по меньшей мере приблизительно 0,1 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 0,5 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 1 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 2,5 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 5 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг массы тела, по меньшей мере приблизительно 20 мг/кг массы тела или более. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в недельной дозе 10 мг/кг. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в недельной дозе 5 мг/кг. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в недельной дозе 2,5 мг/кг. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в недельной дозе 1 мг/кг. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 20 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 10 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 5 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 2,5 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 1 мг/кг каждые 14 суток.
В некоторых других воплощениях терапевтические средства по настоящему изобретению часто вводят в форме фармацевтических композиций, то есть композиций, содержащих активный терапевтический агент и множество других фармацевтически приемлемых компонентов (См. Remington's Pharmaceutical Science, 15.sup.th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980). Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Композиции могут также содержать, в зависимости от желаемого состава, фармацевтически приемлемые нетоксичные носители или разбавители, которые определяют как наполнители, обычно используемые для приготовления фармацевтических композиций для введения животным или человеку. Разбавитель выбирают таким образом, чтобы он не влиял на биологическую активность комбинации. Примерами таких разбавителей являются дистиллированная вода, забуференный фосфатом физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка. Кроме того, фармацевтическая композиция или состав может также содержать другие носители, адъюванты или нетоксичные нетерапевтические неиммуногенные стабилизаторы и тому подобное.
В некоторых других воплощениях фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также содержать крупные медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, такие как хитозан, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты и сополимеры (такие как сефароза (Sepharose™), функционализированная латексом, агароза, целлюлоза и тому подобное), полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и липидные агрегаты (такие как капельки масла и липосомы). Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимулирующие агенты (то есть адъюванты).
В других воплощениях способы по настоящему изобретению включают введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества или эффективной дозы терапевтического средства (например, ингибирующего агента) по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях эффективные дозы терапевтического средства по настоящему изобретению, например, для лечения первичного или метастатического рака, описанного здесь, варьируют в зависимости от многих различных факторов, включая способ введения, целевую область, физиологическое состояние пациента, то, является ли пациент человеком или животным, введение других лекарственных средств и то, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно пациент представляет собой человека, но также возможно лечение млекопитающих, не являющихся людьми, включая трансгенных млекопитающих. Дозы, применяемые при лечении, необходимо титровать для оптимизации безопасности и эффективности.
В некоторых воплощениях доза может составлять от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг и чаще от 0,01 до 5 мг/кг по массе тела реципиента. Например, дозы могут составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или быть в диапазоне 1-10 мг/кг. В некоторых воплощениях доза растворимого варианта полипептида AXL, вводимая пациенту, выбрана из группы, состоящей из приблизительно 0,5, приблизительно 1,0, приблизительно 1,5, приблизительно 2,0, приблизительно 2,5, приблизительно 3,0, приблизительно 3,5, приблизительно 4,0, приблизительно 4,5, приблизительно 5,0, приблизительно 5,5, приблизительно 6,0, приблизительно 6,5, приблизительно 7,0, приблизительно 7,5, приблизительно 8,0, приблизительно 8,5, приблизительно 9,0, приблизительно 9,5, приблизительно 10,0 мг/кг, приблизительно 10,5, приблизительно 11,0, приблизительно 11,5, приблизительно 12,0, приблизительно 12,5, приблизительно 13,0, приблизительно 13,5, приблизительно 14,0, приблизительно 14,5, приблизительно 15,0, приблизительно 15,5, приблизительно 16,0, приблизительно 16,5, приблизительно 17,0, приблизительно 17,5, приблизительно 18,0, приблизительно 18,5, приблизительно 19,0 мг/кг, приблизительно 19,5 и приблизительно 20,0 мг/кг. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в недельной дозе 10 мг/кг. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в недельной дозе 5 мг/кг. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в недельной дозе 2,5 мг/кг. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в недельной дозе 1 мг/кг.В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 20 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 10 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 5 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 2,5 мг/кг каждые 14 суток. В некоторых воплощениях растворимый вариант полипептида AXL будут вводить в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 1 мг/кг каждые 14 суток.
В некоторых воплощениях схема лечения предусматривает введение один раз в две недели, или один раз в месяц, или один раз в 3-6 месяцев. Терапевтические средства по настоящему изобретению обычно вводят многократно. Интервалы между отдельными введениями могут составлять неделю, месяц или год. Кроме того, интервалы могут быть нерегулярными и зависеть от измерения уровней терапевтического средства в крови пациента. Альтернативно, терапевтические средства по настоящему изобретению можно вводить в форме композиции с замедленным высвобождением, в случае чего необходимо менее частое введение. Доза и частота варьируют в зависимости от периода полувыведения полипептида у пациента.
При профилактическом применении вводят относительно низкую дозу с относительно нечастыми интервалами на протяжении длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение до конца жизни. При терапевтическом применении иногда требуется относительно высокая доза с относительно короткими интервалами до уменьшения или прекращения прогрессирования заболевания и предпочтительно до частичного или полного уменьшения интенсивности симптомов заболевания. После этого введение пациенту можно осуществлять по профилактической схеме.
В других воплощениях способы по настоящему изобретению включают лечение, уменьшение или предотвращение формирования первичной опухоли, или метастазирования опухоли, или инвазии опухоли при AML, раке яичника, раке молочной железы, раке легкого, раке печени, раке толстой кишки, раке желчного пузыря, раке поджелудочной железы, раке предстательной железы и/или глиобластоме.
В некоторых других воплощениях, для профилактического применения, фармацевтические композиции или лекарственные средства вводят пациенту, имеющему восприимчивость или иной риск развития заболевания или состояния, в количестве, достаточном для устранения или снижения указанного риска, уменьшения тяжести или задержки начала заболевания, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы заболевания, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, возникающие в процессе развития заболевания.
В некоторых других воплощениях, для терапевтического применения, терапевтические средства по настоящему изобретению вводят пациенту с подозрением на такое заболевание или уже страдающему таким заболеванием в количестве, достаточном для излечения или по меньшей мере частичного уменьшения симптомов заболевания (биохимических, гистологических и/или поведенческих), включая его осложнения и промежуточные патологические фенотипы при развитии заболевания. Количество, адекватное для проведения терапевтического или профилактического лечения, определяют как терапевтически или профилактически эффективную дозу. Как в профилактических, так и в терапевтических схемах агенты обычно вводят несколько раз до достижения достаточного ответа. Обычно проводят мониторинг ответа с повторными дозами в случае рецидива рака.
Согласно настоящему изобретению, композиции для лечения первичного или метастатического рака можно вводить парентеральным, местным, внутривенным, внутриопухолевым, пероральным, подкожным, внутриартериальным, интракраниальным, внутрибрюшинным, интраназальным или внутримышечным способом. Наиболее типичным путем введения является внутривенный или внутриопухолевый, однако другие пути могут быть столь же эффективны.
Для парентерального введения композиции по изобретению можно вводить в форме инъецируемых доз раствора или суспензии вещества в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем, который может представлять собой стерильную жидкость, такую как вода, масла, физиологический раствор, глицерин или этанол. Кроме того, в композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие агенты или эмульгаторы, поверхностно-активные вещества, рН-буферные вещества и тому подобное. Другие компоненты фармацевтических композиций представляют собой компоненты нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое масло, соевое масло и минеральное масло. Предпочтительными жидкими носителями, особенно для растворов для инъекций, обычно являются гликоли, такие как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль. Антитела и/или полипептиды можно вводить в форме депо-инъекции или имплантата, который может быть изготовлен таким образом, чтобы обеспечить замедленное высвобождение активного ингредиента. В некоторых воплощениях композиция содержит полипептид в концентрации 1 мг/мл, приготовленный в водном буфере, состоящем из 10 мМ трис, 210 мМ сахарозы, 51 мМ L-аргинина, 0,01% полисорбата 20 с коррекцией рН до 7,4 с использованием HCl или NaOH.
Обычно композиции изготавливают в формах для инъекционного введения в виде жидких растворов или суспензий; могут также быть изготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких наполнителях перед инъекцией. Препарат может также быть эмульгирован или инкапсулирован в липосомы или микрочастицы, такие как полилактид, полигликолид или сополимер, для усиления адъювантного эффекта, как обсуждено выше. Langer, Science 249: 1527, 1990; и Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997. Агенты по данному изобретению можно вводить в форме депо-инъекции или имплантата, который может быть изготовлен таким образом, чтобы обеспечить замедленное или пульсирующее высвобождение активного ингредиента.
Дополнительные композиции, подходящие для других способов введения, включают композиции для перорального, интраназального и легочного введения, суппозитории и композиции для чрескожного применения.
Для суппозиториев связывающие агенты и носители включают, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в количестве от 0,5% до 10%, предпочтительно 1-2%. Композиции для перорального введения содержат эксципиенты, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза и карбонат магния фармацевтической степени чистоты. Эти композиции имеют форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций с замедленным высвобождением или порошков и содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%.
Местное применение может приводить к чрескожной или внутрикожной доставке.
Местному введению может способствовать совместное введение агента с холерным токсином или его детоксифицированными производными или субъединицами или с другими сходными бактериальными токсинами. Glenn et al., Nature 391: 851, 1998. Совместное введение может быть осуществлено с использованием компонентов в форме смеси или в форме связанных молекул, полученных химическим перекрестным связыванием или экспрессией в виде слитого белка. Альтернативно, чрескожная доставка может быть осуществлена с использованием кожного пластыря или с использованием трансферосом. Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521-24, 1995; Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998.
Фармацевтические композиции обычно изготавливают стерильными, по существу изотоническими и в полном соответствии с требованиями Надлежащей производственной практики (GMP) Управления по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами США. Предпочтительно, терапевтически эффективная доза полипептидных композиций, описанных здесь, будет обеспечивать полезный терапевтический эффект, не вызывая существенной токсичности.
100
Токсичность белков, описанных здесь, может быть определена стандартными фармацевтическими методиками в клеточных культурах или у экспериментальных животных, например посредством определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) или LD (дозы, летальной для 100% популяции). Отношение доз, оказывающих токсическое и терапевтическое действие, представляет собой терапевтический индекс. Данные, полученные при таком анализе клеточных культур или в исследованиях у животных, могут быть использованы для определения диапазона доз, которые не являются токсичными при применении у человека. Доза белков, описанных здесь, предпочтительно входит в диапазон концентраций в циркулирующей крови, включающий малотоксичную или нетоксичную эффективную дозу. Доза может варьировать в пределах этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и применяемого пути введения. Конкретную композицию, путь введения и дозу будет выбирать лечащий врач, исходя из состояния пациента (См., например, Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1).
Объем изобретения также включает наборы, содержащие композиции по изобретению и инструкции по применению. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный реагент, например циторедуктивное лекарственное средство. Композиции могут быть представлены в стандартной лекарственной форме.
Наборы обычно содержат этикетку с указаниями по применению содержимого набора. Термин «этикетка» включает любой письменный или записанный материал, поставляемый на наборе или с набором или сопровождающий набор иным образом.
Все публикации и патенты, процитированные в данном описании, включены сюда посредством ссылки так, как если бы было конкретно и по отдельности указано, что каждая отдельная публикация или патент включены посредством ссылки, и включены сюда посредством ссылки для раскрытия и описания способов и/или веществ, в связи с которыми эти публикации процитированы. Цитирование любой публикации обусловлено ее раскрытием до даты подачи данной заявки, и это не следует трактовать как признание того, что настоящее изобретение не может предшествовать такой публикации посредством более раннего изобретения. Кроме того, приведенные даты публикаций могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.
Как будет ясно специалистам в данной области по прочтении данного описания, каждое из отдельных воплощений, описанных и проиллюстрированных здесь, имеет дискретные компоненты и признаки, которые можно легко отделить от него или сочетать с признаками любого из ряда других воплощений без выхода за рамки объема или сущности настоящего изобретения. Любой указанный способ можно осуществить в указанном порядке или любом другом логически возможном порядке. Следует также понимать, что терминология, использованная здесь, предназначена для описания конкретных воплощений.
Несмотря на то, что для ясности понимания изобретение было подробно описано выше посредством пояснений и примеров, специалисту в данной области будет ясно, что, в свете идей данной изобретения, возможны определенные изменения и модификации изобретения без выхода за рамки его сущности, и что это не ограничивает объем настоящего изобретения, который будет ограничен только приложенной формулой изобретения.
Специалистам в данной области будет ясно, или они смогут убедиться, применяя не более чем рутинные эксперименты, что существует множество эквивалентов конкретных воплощений изобретения, описанных здесь. Подразумевают, что такие эквиваленты охвачены приложенной формулой изобретения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Пример 1
Ингибирование инвазии/миграции, индуцированной GAS6, с использованием рецептора-ловушки AXL
Ингибирование инвазии/миграции, индуцированной GAS6, оценивали в моделях тройного отрицательного рака молочной железы (MDA-MB-231) и рака яичника (OVCAR8) с применением анализа инвазии с Corning Matrigel или коллагеном, соответственно, и с использованием рецептора-ловушки AXL, содержащего растворимый вариант полипептида AXL, содержащий аминокислотные изменения относительно последовательности AXL дикого типа (SEQ ID NO: 1) в следующих положениях: (а) глицин 32, (б) аспарагиновая кислота 87, (в) аланин 72, (г) валин 92 и (д) глицин 127, не имеющий трансмембранного домена AXL, не имеющий функционального FN-домена и содержащий Fc-домен, связанный с растворимым вариантом полипептида AXL пептидным линкером (называемый далее AVB-S6-500).
+
+
AVB-S6-500 и клетки MDA-MB-231 Ах1TNBC в бессывороточной среде помещали в верхний отсек камеры Бойдена, покрытый матригелем. В нижний отсек камеры вносили среды с сывороткой в качестве хемоаттрактанта. Через 24 часа инкубации определяли число клеток, мигрировавших через матригель, и выражали его как долю инвазивных клеток относительно PBS-контроля (ФИГ. 1А). AVB-S6-500, клетки рака яичника OVCAR8 Ах1, коллаген 1-го типа, 50 нг/мл GAS6 и питательные среды помещали в микролунки и инкубировали. В 6 сутки определяли число клеток, демонстрировавших инвазивный фенотип, и выражали его как долю инвазивных клеток относительно PBS-контроля (ФИГ. 1B). AVB-S6-500 в диапазоне от 1 до 100 мкг/мл значимо ингибировал инвазию/миграцию, индуцированную GAS6.
Пример 2
50
50
50
Определение значений IC и сравнение рецептора-ловушки AXL с ингибитором тирозинкиназ в анализе инвазии клеток MDA-MB-231 Значения IC AVB-S6-500 определяли в анализе инвазии клеток MDA-MB-231 с и без 50 нМ GAS6 и анализе жизнеспособности клеток и сравнивали их с IC бозутиниба, утвержденного ингибитора тирозинкиназ. Типичные изображения клеток MDA-MB-231, обработанных AVB-S6-500, показаны на ФИГ. 2. Как показано в Таблице 1, AVB-S6-500 ингибировал инвазию клеток приблизительно в 100 раз сильнее, чем бозутиниб, и не влиял на жизнеспособность клеток при использовании панели из клеточных линий 8 разных видов рака (рака толстой кишки, рака молочной железы, AML, рака яичника, рака поджелудочной железы и NSCLC (немелкоклеточный рак легкого)) в сравнении с семью стандартными цитотоксическими/химиотерапевтическими лекарственными средствами (SOC).
Пример 3
Снижение метастатической опухолевой нагрузки с использованием рецептора-ловушки AXL
6
Мышам проводили внутрибрюшинное (в/б) введение опухолевых клеток рака яичника SKOVS.ip (1×10), рандомизировали их по группам и вводили AVB-S6-500 в дозе 5, 10 или 20 мг/кг через день (Q2D). Метастатическую опухолевую нагрузку оценивали через 24 дня дозирования AVB-S6-500, проводя подсчет всех видимых метастатических очагов в полости брюшины с иссечением и взвешиванием всей пораженной ткани для определения общей массы (ФИГ. 3А) и числа (ФИГ. 3В) метастазов. AVB-S6-500 значимо снижал метастатическую опухолевую нагрузку при его введении в дозах 10 и 20 мг/кг. В ксенотрансплантационной модели SKOV3.IP у мышей монотерапия AVB-S6-500 в дозах 10 и 20 мг/кг Q2D (эквивалентно 2,5-5 мг/кг в неделю у человека) значимо уменьшала среднее число и массу макроскопических метастатических очагов и резко снижала уровни свободного GAS6 в сыворотке.
Пример 4
Повышенная эффективность при использовании комбинации рецептора-ловушки AXL и доксорубицина
6
Мышам проводили внутрибрюшинное (в/б) введение опухолевых клеток рака яичника SKOV3.ip (1×10), рандомизировали их по группам и вводили AVB-S6-500 в дозе 20 мг/кг Q2D сам по себе или в комбинации с доксорубицином (DOX), 2 мг/кг два раза в неделю. Метастатическую опухолевую нагрузку оценивали через 24 дня дозирования. Сравнение общей массы (ФИГ. 4А) и числа (ФИГ. 4В) метастазов продемонстрировало значимое преимущество комбинированной терапии. Комбинация AVB-S6-500 и доксорубицина значимо уменьшала среднюю массу пораженной ткани и привела к излечению у 2 животных.
Пример 5
PK(фармакокинетические)-исследования
В исследованиях у мышей была установлена связь между снижением sGAS6 (мишень лекарственного средства) и антиметастатическим эффектом. Дозы, которые были эффективны в исследованиях у мышей, были ассоциированы с резким снижением уровней GAS6 в сыворотке мышей и соответствовали 0,5-1,7 мг/кг для человека. В PK-исследованиях у яванских макаков AVB-S6-500 продемонстрировал резкое снижение GAS6 в сыворотке яванских макаков продолжительностью приблизительно 1 неделю после однократной дозы 5 мг/кг (эквивалентная доза для человека 1,7 мг/кг), что является желаемым профилем для введения человеку посредством в/в инфузии один раз в неделю.
Ввиду отмеченной доклинической связи между снижением сывороточного GAS6 (sGAS6) и антиметастатической активностью, sGAS6 был определен как полезный биомаркер при фармакодинамическом (PD) анализе для оценки уровней sGAS6 во всех доклинических исследованиях, включая GLP-токсикологию. В проведенных исследованиях было отмечено выраженное постоянство PK/PD.
Пример 6
Исследования безопасности
Мыши и обезьяны хорошо переносили однократное и многократное дозирование AVB-S6-500 в дозах, значительно превышавших необходимые для желаемого биологического эффекта. После медленных болюсных внутривенных (в/в) инъекций, однократно или два раза в неделю в дозах 25, 50 и 100 мг/кг (50, 100 и 200 мг/кг в неделю), у самцов и самок мышей CD-1 или после четырех в/в инфузий продолжительностью 30 минут в дозах 30, 100 и 150 мг/кг у обезьян не было отмечено летальных исходов или нежелательных эффектов, связанных с лечением. Все дозы приводили к полному снижению уровней сывороточного GAS6 на протяжении всего периода исследования. Уровни, не вызывающие нежелательных эффектов (NOAEL), были определены как 200 мг/кг в неделю (наивысшая доза) у мышей и 150 мг/кг в неделю у обезьян, соответственно. Согласно прогнозам, основанным на фармакокинетическом/фармакодинамическом моделировании, а также на экстраполяции эффективных доз, определенных у мышей, доза AVB-S6-500, составляющая 1,5-5 мг/кг, может быть эффективна для человека. В доклинических исследованиях с использованием sGAS6 в качестве биомаркера было отмечено выраженное постоянство PK/PD.
Было показано, что AVB-S6-500 был эффективен в снижении метастатической раковой нагрузки в ксенотрансплантационных моделях человеческого рака молочной железы и яичника и безопасен у яванских макаков и мышей в намного более высоких дозах. Эти результаты сходны с результатами, полученными для предшествующих рецепторов-ловушек, демонстрируя эффективность и безопасность во многих онкологических моделях и обосновывая безопасное применение AVB-S6-500 у здоровых добровольцев.
Моделирование PK/PD у животных было применено для того, чтобы руководить дозированием в исследованиях у человека с учетом повышенного sGAS6, наблюдаемого у пациентов с раком. Конкретно, токсикологический профиль позволил осуществлять дозирование здоровым добровольцам, a GLP-токсикологические исследования комбинировали с выбором доз на основании PD для первого исследования у человека. Влияние GAS6 на клиренс AVB-S6-500 было включено в модель мишень-опосредованного распределения лекарственного средства (TMDD), предусматривавшую параллельный линейный и нелинейный клиренс AVB-S6. Имитацию подавления человеческим GAS6 проводили при уровнях дозы 1, 2,5, 5 и 10 мг/кг с использованием данных, полученных у обезьян. С учетом потенциально более высоких уровней sGAS6 у пациентов с раком и комбинированных химиотерапевтических схем введения, были смоделированы различные схемы введения AVB-S6 для прогнозирования воздействия на мишень при дозах, которые предполагалось применять в онкологических исследованиях. При применении модели мишень-опосредованного распределения препарата (TMDD) доза для человека, которая, по расчетам, является эффективной, составляла от 1,5 мг/кг (для обеспечения сохранения GAS6 на уровне по меньшей мере на 50% ниже исходного) до 5 мг/кг (для обеспечения 97%-го снижения свободного GAS6 и возможного 3-кратного повышения уровней GAS6 относительно нормальных уровней).
Пример 7
Слепое, рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование I фазы по изучению безопасности и переносимости AVB-S6-500 у здоровых субъектов при его однократном внутривенном введении в возрастающей дозе и многократном внутривенном введении
Оценивают безопасность и переносимость однократного внутривенного введения AVB-S6-500 в возрастающей дозе (SAD) и многократного внутривенного введения AVB-S6-500 в единственной дозе (5 мг/кг) (RD) при в общей сложности четырех введениях, проводимых один раз в неделю, у здоровых пациентов. Охарактеризована фармакокинетика (РК) и фармакодинамика (PD) при SAD и RD.
Субъектов, соответствовавших критериям отбора, случайным образом распределяли в отношении 3:1 для введения AVB-S6-500 или плацебо в дозах, указанных в Таблице 2 и Таблице 3; субъекты не знали, какой препарат им вводили.
Для каждого субъекта исследование состояло из 3 периодов: периода до лечения (включая скрининговый визит, проводимый не более чем за 28 суток до суток 1), период лечения и период последующего наблюдения (визит окончания исследования / досрочного прекращения участия в исследовании). По завершении визита окончания исследования (EOS) / досрочного прекращения участия в исследовании (EW) в каждой группе спонсор, медицинский монитор (ММ) и исследователь проводят анализ доступных данных по безопасности, полученных при всех дозах, для определения того, продолжать ли изучение AVB-S6-500 в следующей, более высокой дозе.
Субъектам, включенным в группы однократного введения в возрастающей дозе, проводили однократное введение AVB-S6-500 или плацебо в соответствии со схемой рандомизации; в группе многократного введения субъектам проводили по четыре введения AVB-S6-500 или плацебо (один раз в неделю на протяжении 4 недель) в соответствии со схемой рандомизации. RD-субъекты возвращались в клинику для каждого введения препарата в рамках исследования в сутки 1 недель 2 и 3 и продолжали приходить на амбулаторные визиты после каждого еженедельного введения дозы. Субъекты поступали в CRU в сутки 1 недели 4 и оставались в CRU на протяжении 24 часов после введения на неделе 4 для облегчения забора крови для оценки PK/PD. В сутки 2 недели 4 субъектов выписывали из CRU после завершения всех обследований, запланированных на эти сутки, и они продолжали приходить на визиты амбулаторно вплоть до EOS/EW-визита.
Все дозы исследуемого лекарственного средства готовили в форме растворов для инфузии в 150 мл разбавителя (в мешках объемом 250 мл) для введения внутривенной инфузией на протяжении 1 часа. Все введения проводились медицинским персоналом в условиях клиники. Исследуемое лекарственное средство поставлялось во флаконах, содержавших по 10 мл AVB-S6-500 (концентрация 20 мг/мл; общее содержание AVB-S6-500 200 мг на флакон). AVB-S6-500 не был упакован в соответствии с индивидуальными номерами субъектов. Подготовку исследуемого лекарственного средства для внутривенного введения проводил фармацевт или квалифицированный специалист, исполнявший его обязанности, на основании рандомизационных кодов. Раствор AVB-S6-500 для инфузий упаковывали и маркировали в соответствии с действующими требованиями надлежащей производственной практики и поставляли в клинику во флаконах объемом 20 мл (по 10 мл в каждом флаконе).
Образцы крови (сыворотки) для анализа концентрации AVB-S6-500 и уровней GAS6 (включая фармакодинамический маркер) у субъектов, включенных в группы однократного введения в возрастающей дозе, получали в следующих временных точках относительно введения: в течение 45 минут до введения (0 часов) и приблизительно через 1, 2, 4, 6, 8, 24, 72, 120, 168 и 336 часов после введения. У субъектов, включенных в группу многократного введения, образцы сыворотки для анализа AVB-S6-500 и GAS6 получали в следующих временных точках: неделя 1 исследования - в течение 45 минут до введения (перед введением) и приблизительно через 1, 2, 4, 6, 8, 24, 72 и 120 часов после введения; неделя 2 исследования - перед введением (в течение 45 минут до введения; также соответствует временной точке 168 ч для недели 1); неделя 3 исследования - перед введением (в течение 45 минут до введения); неделя 4 исследования - в течение 45 минут до введения (перед введением) и приблизительно через 1, 2, 4, 6, 8, 24, 72, 120, 168, 504, 528 и 696 часов после введения.
Для фармакокинетического и фармакодинамического анализа образцы крови (4 мл) помещают в пробирки для выделения сыворотки и обрабатывали, как описано в лабораторном руководстве по анализу PK/PD/ADA. Образцы сыворотки для фармакокинетической оценки AVB-S6-500 и фармакодинамической оценки уровней GAS6 отправляют в SNBL. Один набор образцов сыворотки от каждого субъекта отправляют на постоянной основе, осуществляя по несколько отправок для каждой группы (график отправки определен в руководстве по анализу PK/PD в рамках исследования). Оставшиеся вторые или третьи экземпляры образцов хранят в CRU в качестве резерва. Образцы крови (4 мл), полученные в ряде временных точек для анализа РК и PD, анализируют на предмет присутствия противолекарственных антител (ADA). Фармакокинетические данные будут учитывать при повышении дозы до 10 мг/кг. Конкретно, получали PK-данные по предшествующим группам введения и сравнивали их с текущими расчетными PK-показателями для человека, масштабируя данные, полученные в доклинических исследованиях. Затем, по мере необходимости, эти данные использовали для повторной оценки приблизительных резервов безопасности последующих доз.
Переносимость AVB-S6-500 была хорошей во всех дозах. Серьезных нежелательных явлений не было. При физикальном обследовании и оценке показателей жизненно важных функций изменений, связанных с лечением, отмечено не было. Ни одно из АЕ (нежелательных явлений), основанных на лабораторных показателях, не было признано клинически значимым, ни одно из них не требовало лечения, и все были бессимптомными. Согласно протоколу, все лабораторные показатели, которые соответствовали критериям СТСАЕ v4.03 для субъектов, получающих активное лекарственное средство, рассматривались как возможно связанные. Ни один из них не был признан вероятно или определенно связанным.
max
max
trough
После однократных в/в инфузий РК AVB-S6-500 продемонстрировала характеристики, сходные с другими белковыми лекарственными средствами, такими как моноклональные антитела, которые обычно демонстрируют малые объемы распределения и двухфазное выведение. Максимальная концентрация AVB-S6-500 в сыворотке (C) и площадь под кривой зависимости концентрации от времени (AUC) возрастали по мере повышения дозы. В изученном диапазоне доз рост C был приблизительно пропорционален дозе, в то время как рост AUC несколько превышал пропорциональный дозе, указывая на нелинейную кинетику выведения, что характерно для TMDD. При многократном введении один раз в неделю последняя измеренная концентрация, определенная непосредственно перед последующей инфузией (C), после 4-го введения была приблизительно в 2 раза выше, чем после 1-го введения, указывая на умеренное накопление, что соответствует периоду полувыведения после однократного введения, составляющему 59 часов. Ни у одного из субъектов из всех групп однократного и многократного введения не было положительных результатов анализа на антитела против AVB-S6. Кроме того, отражением отсутствия субъектов с положительными результатами анализа на антитела против AVB-S6 было продолжительное снижение сывороточного GAS6 при многократном введении AVB-S6.
Как показано на ФИГ. 6 и 7, уровни сывороточного GAS6 были снижены через одну неделю после введения в дозе 1 мг/кг (отмечено у 4 из 6 субъектов) (ФИГ. 6А), через одну неделю после введения в дозе 2,5 мг/кг (отмечено у 6 из 6 субъектов) (ФИГ. 6 В), через две недели после введения в дозе 5 мг/кг (отмечено у 6 из 6 субъектов) (ФИГ. 7А), через две недели после введения в дозе 10 мг/кг (отмечено у 6 из 6 субъектов) и через три недели после введения в дозе 10 мг/кг (отмечено у 3 из 6 субъектов).
Как показано на ФИГ. 8 и 9, уровни AVB-S6-500 демонстрируют дозозависимость и наименьшая доза AVB-S6-500 (1 мг/кг) является фармакологически активной. Средние уровни сывороточного GAS6 у субъектов составляли 15,7 плюс/минус 3,9 нг/мл. Однократная инфузия AVB-S6 в дозах 1, 2,5, 5 или 10 мг/кг здоровым субъектам приводила к немедленному максимальному снижению концентраций циркулирующего сывороточного GAS6 до уровней BLQ (ниже предела количественного определения) (2 нг/мл). После инфузий AVB-S6-500 в дозах 1 и 2,5 мг/кг снижение GAS6 сохранялось на протяжении 7 суток. После инфузий в дозах 5 и 10 мг/кг снижение сывороточного GAS6 ниже поддающихся определению уровней сохранялось на протяжении 22 и 29 суток, соответственно. Инфузии AVB-S6-500 здоровым субъектам в дозе 5 мг/кг один раз в неделю приводили к немедленному и продолжительному максимальному снижению концентраций циркулирующего сывороточного GAS6 до уровней BLQ. Снижение GAS6 до уровней BLQ сохранялось у всех субъектов до 504 часов после последней инфузии, когда GAS6 поддавался измерению и был выше LLOQ (нижнего предела количественного определения) у 2 из 6 субъектов, не возвращаясь, тем не менее, к исходным уровням. У всех других субъектов (4 из 6) концентрации GAS6 оставались BLQ. Таким образом, PK/PD-моделирование подтвердило выбор схем введения для онкологических исследований, которые позволят снизить (снижение более чем на 90%) sGAS6 и будут сопоставимы с химиотерапевтическими схемами введения.
PK/PD-профиль, определенный у людей, соответствовал данным, полученным в доклинических исследованиях и при моделировании.
Пример 8
Исследование фазы Ib/II по изучению AVB-S6-500 в комбинации с пегилированным липосомальным доксорубицином (PLD) или паклитакселом у пациентов с рецидивирующим раком яичника, резистентным к платине
Анализ уровней sGAS6 у 48 пациентов с раком яичника позволил предположить, что эти уровни были в 2 раза выше тех, что были определены в исследовании у здоровых добровольцев. Исходя из данных, полученных при PK/PD-моделировании у обезьян, исследовании I фазы у здоровых добровольцев и имитации повышения уровней sGAS6, схемы введения в дозе 5 мг/кг один раз в неделю или 10 мг/кг один раз в две недели будут приводить к резкому снижению уровней sGAS6 у пациентов с раком. PK/PD-моделирование позволило подтвердить выбор дозы для исследования у пациентов с раком яичника, которая приведет к снижению уровня мишени более чем у 90% пациентов, определить несколько схем введения, которые будут сопоставимы с химиотерапевтическими схемами введения, и ограничить число визитов пациентов. Применение собственного PD-анализа в сочетании с определением профиля безопасности и PK/PD у здоровых добровольцев позволило рационализировать клиническую программу и легло в основу выбора доз для онкологических исследований.
Фаза Ib
В разделе фазы Ib будет проведено открытое изучение безопасности и переносимости AVB-S6-500 в комбинации с пегилированным липосомальным доксорубицином (PLD) или паклитакселом у пациентов с рецидивирующим раком яичника, резистентным к препаратам платины.
2
Пациентам группы AVB-S6-500 плюс PLD будут вводить AVB-S6-500 в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 10 мг/кг в комбинации с PLD, вводимым в/в инфузией на протяжении 60 минут в дозе 40 мг/м в сутки 1 1-го цикла терапии. Затем AVB-S6-500 будут вводить в дозе 10 мг/кг каждые 14 суток, начиная с суток 15 1-го цикла. В случае плохой переносимости AVB-S6-500 в дозе 10 мг/кг каждые 2 недели (q2w) в комбинации с PLD, доза AVB-S6-500 будет снижена до 5 мг/кг один раз в неделю. В эту новую группу будут включены шесть новых пациентов.
2
Пациентам группы AVB-S6-500 плюс паклитаксел будут вводить AVB-S6-500 один раз в неделю в/в инфузией на протяжении 30 или 60 минут в дозе 10 мг/кг в комбинации с паклитакселом, вводимым один раз в неделю в/в инфузией на протяжении 60 минут в дозе 80 мг/м в сутки 1, 8, 15 и 22 каждого цикла терапии продолжительностью 28 суток. В каждой группе каждая схема комбинированной химиотерапии будет сначала применена у шести пациентов для оценки безопасности комбинации. В случае плохой переносимости AVB-S6-500 в дозе 10 мг/кг в комбинации с паклитакселом, доза AVB-S6-500 будет снижена до 5 мг/кг один раз в неделю. В эту новую группу будут включены шесть новых пациентов. При хорошей переносимости дозы 5 мг/кг в комбинации с паклитакселом эта схема будет применена у дополнительных 6 пациентов.
RP2D будет дозой / схемой введения AVB-S6-500, которая признана безопасной/переносимой в комбинации с соответствующей основной схемой химиотерапии и, исходя из анализа PK/PD на протяжении 1 месяца в исследовании фазы lb, позволяет достичь уровней AVB-S6-500 в сыворотке выше 3720 нг/мл и снизить сывороточный GAS6 у всех пациентов BLQ на всем протяжении интервала введения. Введение лекарственных средств в рамках исследования будет продолжено до исчезновения остаточной опухоли (применительно к химиотерапевтическому агенту; введение AVB-S6-500 следует продолжать на протяжении по меньшей мере одного года после полного ответа) или до прогрессирования заболевания, смерти, отзыва информированного согласия или неприемлемой токсичности.
Фаза II
2
2
После определения RP2D для AVB-S6-500 и переносимой дозы комбинации, оказывающей желаемый эффект резкого снижения сывороточного GAS6, в разделе фазы II будет проведено рандомизированное двойное слепое сравнение выживаемости без прогрессирования (PFS) у пациентов с рецидивирующим раком яичника, резистентным к платине, получающих терапию по схеме AVB-S6-500 плюс PLD в сравнении с плацебо плюс PLD или AVB-S6-500 плюс паклитаксел в сравнении с плацебо плюс паклитаксел. В качестве 2-й конечной точки может также быть проанализирована частота объективного ответа (ORR). AVB-S6-500 будут вводить в/в инфузией на протяжении 60 минут по схеме RP2D, начиная с суток 1, при продолжительности цикла терапии 28 суток. Выбор врача относительно химиотерапии включает следующие варианты: (1) паклитаксел, вводимый один раз в неделю в/в инфузией на протяжении 60 минут в дозе 80 мг/м при продолжительности цикла терапии 28 суток; или (2) PLD, вводимый в/в инфузией на протяжении 60 минут в дозе 40 мг/м в сутки 1 цикла терапии продолжительностью 28 суток. Введение лекарственных средств в рамках исследования будет продолжено до исчезновения остаточной опухоли (применительно к химиотерапевтическому агенту; введение AVB-S6-500 следует продолжать на протяжении по меньшей мере одного года после полного ответа) или до прогрессирования заболевания, смерти, отзыва информированного согласия или неприемлемой токсичности.
Пациентов будут включать и рандомизировать 2:1 в одну из двух больших групп лечения: группы A (AVB-S6-500 плюс химиотерапия по выбору врача) и группы В (плацебо плюс химиотерапия по выбору врача). В каждой большой группе будет по две группы: одна группа комбинированной схемы с PLD и одна группа комбинированной схемы с паклитакселом.
В свете настоящего описания, все изделия и способы, раскрытые и заявленные здесь, могут быть изготовлены и осуществлены без чрезмерного экспериментирования. Несмотря на то, что изделия и способы по данному изобретению были описаны посредством предпочтительных воплощений, специалистам в данной области будет ясно, что к указанным изделиям и способам могут быть применены вариации без выхода за рамки сущности и объема изобретения. Подразумевается, что все такие вариации и эквиваленты, очевидные специалистам в данной области, существовавшие на момент подачи данной заявки или разработанные позднее, включены в сущность и объем изобретения, определенные приложенной формулой изобретения. Все патенты, заявки на патенты и публикации, упомянутые в данном описании, указывают на уровень специалистов в области, к которой относится данное изобретение. Все патенты, заявки на патенты и публикации полностью включены сюда посредством ссылки для любых задач и в такой же степени, как если бы было конкретно и по отдельности указано, что каждая отдельная публикация полностью включена посредством ссылки для любых задач. Изобретение, наглядно описанное здесь, может быть подходящим образом применено в отсутствие любого(ых) элемента(ов), не раскрытого(ых) здесь конкретно. Таким образом, следует понимать, что, несмотря на то, что настоящее изобретение было конкретно раскрыто посредством предпочтительных воплощений и возможных признаков, специалисты в данной области могут прибегнуть к модификациям и вариациям концепций, раскрытых здесь, и что такие модификации и варианты рассматриваются как входящие в объем данного изобретения, определенный приложенной формулой изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, приведенные в приложенном перечне последовательностей, показаны с применением стандартных буквенных сокращений нуклеотидных оснований и трехбуквенного кода аминокислот, как определено в части 1.822 раздела 37 Свода федеральных нормативных актов США (37 C.F.R. 1.822).
SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность человеческого полипептида AXL.
SEQ ID NO: 1 - Аминокислотная последовательность человеческого полипептида AXL
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQUENCE LISTING
<110>  Aravive Biologics, Inc
<120>  METHODS OF TREATING METASTATIC CANCERS USING AXL DECOY RECEPTORS
<130>  CACAB1.0009WO
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  887
<212>  PRT
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Gly Arg Val Pro Leu Ala Trp Cys Leu Ala Leu Cys Gly Trp Ala
1               5                   10                  15
Cys Met Ala Pro Arg Gly Thr Gln Ala Glu Glu Ser Pro Phe Val Gly
20                  25                  30
Asn Pro Gly Asn Ile Thr Gly Ala Arg Gly Leu Thr Gly Thr Leu Arg
35                  40                  45
Cys Gln Leu Gln Val Gln Gly Glu Pro Pro Glu Val His Trp Leu Arg
50                  55                  60
Asp Gly Gln Ile Leu Glu Leu Ala Asp Ser Thr Gln Thr Gln Val Pro
65                  70                  75                  80
Leu Gly Glu Asp Glu Gln Asp Asp Trp Ile Val Val Ser Gln Leu Arg
85                  90                  95
Ile Thr Ser Leu Gln Leu Ser Asp Thr Gly Gln Tyr Gln Cys Leu Val
100                 105                 110
Phe Leu Gly His Gln Thr Phe Val Ser Gln Pro Gly Tyr Val Gly Leu
115                 120                 125
Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala
130                 135                 140
Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Pro Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gln Asp Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala
165                 170                 175
Pro Gly His Gly Pro Gln Arg Ser Leu His Val Pro Gly Leu Asn Lys
180                 185                 190
Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr
195                 200                 205
Ser Arg Thr Ala Thr Ile Thr Val Leu Pro Gln Gln Pro Arg Asn Leu
210                 215                 220
His Leu Val Ser Arg Gln Pro Thr Glu Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro
225                 230                 235                 240
Gly Leu Ser Gly Ile Tyr Pro Leu Thr His Cys Thr Leu Gln Ala Val
245                 250                 255
Leu Ser Asn Asp Gly Met Gly Ile Gln Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro
260                 265                 270
Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gln Ala Ser Val Pro Pro His Gln Leu Arg
275                 280                 285
Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro Tyr His Ile Arg Val Ala Cys
290                 295                 300
Thr Ser Ser Gln Gly Pro Ser Ser Trp Thr His Trp Leu Pro Val Glu
305                 310                 315                 320
Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly Pro Pro Glu Asn Ile Ser Ala Thr
325                 330                 335
Arg Asn Gly Ser Gln Ala Phe Val His Trp Gln Glu Pro Arg Ala Pro
340                 345                 350
Leu Gln Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg Leu Ala Tyr Gln Gly Gln Asp
355                 360                 365
Thr Pro Glu Val Leu Met Asp Ile Gly Leu Arg Gln Glu Val Thr Leu
370                 375                 380
Glu Leu Gln Gly Asp Gly Ser Val Ser Asn Leu Thr Val Cys Val Ala
385                 390                 395                 400
Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu
405                 410                 415
Glu Ala Trp Arg Pro Gly Gln Ala Gln Pro Val His Gln Leu Val Lys
420                 425                 430
Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu
435                 440                 445
Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val Leu Ile Leu Ala Leu Phe Leu
450                 455                 460
Val His Arg Arg Lys Lys Glu Thr Arg Tyr Gly Glu Val Phe Glu Pro
465                 470                 475                 480
Thr Val Glu Arg Gly Glu Leu Val Val Arg Tyr Arg Val Arg Lys Ser
485                 490                 495
Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr Leu Asn Ser Leu Gly Ile Ser
500                 505                 510
Glu Glu Leu Lys Glu Lys Leu Arg Asp Val Met Val Asp Arg His Lys
515                 520                 525
Val Ala Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ala Val Met
530                 535                 540
Glu Gly Gln Leu Asn Gln Asp Asp Ser Ile Leu Lys Val Ala Val Lys
545                 550                 555                 560
Thr Met Lys Ile Ala Ile Cys Thr Arg Ser Glu Leu Glu Asp Phe Leu
565                 570                 575
Ser Glu Ala Val Cys Met Lys Glu Phe Asp His Pro Asn Val Met Arg
580                 585                 590
Leu Ile Gly Val Cys Phe Gln Gly Ser Glu Arg Glu Ser Phe Pro Ala
595                 600                 605
Pro Val Val Ile Leu Pro Phe Met Lys His Gly Asp Leu His Ser Phe
610                 615                 620
Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Gly Asp Gln Pro Val Tyr Leu Pro Thr Gln
625                 630                 635                 640
Met Leu Val Lys Phe Met Ala Asp Ile Ala Ser Gly Met Glu Tyr Leu
645                 650                 655
Ser Thr Lys Arg Phe Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met
660                 665                 670
Leu Asn Glu Asn Met Ser Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys
675                 680                 685
Lys Ile Tyr Asn Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met
690                 695                 700
Pro Val Lys Trp Ile Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr
705                 710                 715                 720
Ser Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Ala
725                 730                 735
Thr Arg Gly Gln Thr Pro Tyr Pro Gly Val Glu Asn Ser Glu Ile Tyr
740                 745                 750
Asp Tyr Leu Arg Gln Gly Asn Arg Leu Lys Gln Pro Ala Asp Cys Leu
755                 760                 765
Asp Gly Leu Tyr Ala Leu Met Ser Arg Cys Trp Glu Leu Asn Pro Gln
770                 775                 780
Asp Arg Pro Ser Phe Thr Glu Leu Arg Glu Asp Leu Glu Asn Thr Leu
785                 790                 795                 800
Lys Ala Leu Pro Pro Ala Gln Glu Pro Asp Glu Ile Leu Tyr Val Asn
805                 810                 815
Met Asp Glu Gly Gly Gly Tyr Pro Glu Pro Pro Gly Ala Ala Gly Gly
820                 825                 830
Ala Asp Pro Pro Thr Gln Pro Asp Pro Lys Asp Ser Cys Ser Cys Leu
835                 840                 845
Thr Ala Ala Glu Val His Pro Ala Gly Arg Tyr Val Leu Cys Pro Ser
850                 855                 860
Thr Thr Pro Ser Pro Ala Gln Pro Ala Asp Arg Gly Ser Pro Ala Ala
865                 870                 875                 880
Pro Gly Gln Glu Asp Gly Ala
885
<---