СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОТЕКА РОГОВИЦЫ И ДРУГИХ ПРОЯВЛЕНИЙ РАННЕЙ БУЛЛЕЗНОЙ КЕРАТОПАТИИ
MEDICATION, METHOD OF OBTAINING MEDICATION, AND METHOD OF TREATMENT FOR CORNEA EDEMA AND OTHER EARLY BULLOUS KERATOPATHY MANIFESTATIONS

2
Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения отека роговицы и других проявлений буллезной кератопатии, развившихся в первые 3,5 месяца после воспалений, травм, и различных методов экстракции катаракты с имплантацией интраокулярной линзы, антиглаукоматозных операций на глазах с нормальным и сниженным (плотность 1000 кл/мм и ниже) количеством эндотелиальных клеток и их дисфункцией, а также с наличием признаков начальной компенсированной эндотелиальной дистрофии роговицы (cornea guttatae, дистрофии Фукса).
Уровень техники
Буллезная кератопатия (эндотелиально-эпителиальная дистрофия роговицы, отечная дистрофия роговицы) наряду с герпесвирусным кератитом является наиболее распространенной причиной корнеальной слепоты в России (Каспаров А.А. Офтальмогерпес. / М., Медицина, 1994, с.224). Буллезная кератопатия (БК) является полиэтиологичным заболеванием и может развиваться после различных воспалительных процессов и травм роговицы, однако наиболее частыми причинами ее возникновения являются внутриглазные оперативные вмешательства (Горгиладзе Т.У., Ивановская Е.В., Горгиладзе Л.Т. Причины, механизм развития и клинико-анатомическая классификация буллезной кератопатии. Одесса, Офтальмологический журнал, №3, 1992, стр.129-133). Пациенты предъявляют жалобы на резкое снижение остроты зрения, покраснение глаза, светобоязнь, слезотечение, чувство инородного тела в глазу, боли. Состояние роговой оболочки характеризуется наличием стойкого локального либо диффузного отека эндотелия, отложением на нем пигмента, выраженной складчатости десцеметовой оболочки, выраженным диффузным отеком стромы и вследствие нарушения барьерной функции эндотелия, прохождения внутриглазной жидкости кпереди вплоть до появления булл (пузырьков) в эпителии. С этим связано и название заболевания - буллезная отечная кератопатия. Подсчет эндотелиальных клеток (с помощью эндотелиального микроскопа) у большинства пациентов невозможен ввиду выраженного отека стромы, приводящего при дальнейшем прогрессировании заболевания к стойкому помутнению роговицы.
БК, развившаяся как осложнение хирургии катаракты, и реже - после антиглаукоматозных операций, расценивается как необратимый отек роговицы, возникающий вследствие повреждения эндотелиальных клеток (R.Narayanan at all. Pseudophakic Comeal Edema, Cornea, second edition, 2005, V-25, N 9, p.993-1001).
С усовершенствованием технологии экстракции катаракты, появлением вискоэластиков, эластичных ИОЛ, использованием хирургии «малых разрезов» доля осложнений после хирургии катаракты значительно снизилась (Mian S., Sugar A. Cornea, II-d edition. Surgical trauma: Pseudophakic and aphakic corneal edema. // Cornea, 2005, II-d edition, p.1263). Однако вопрос осложнений после хирургии катаракты все еще остается актуальным. Одним из основных осложнений экстракции катаракты и, в частности, факоэмульсификации (ФЭ) является развитие отечной дистрофии роговицы или буллезной кератопатии (БК) в послеоперационном периоде. Связь отека роговицы с потерей эндотелиальных клеток была широко признана лишь в 1960-е годы. (Stocker FW: The endothelium of the cornea and its clinical implications, Springfield, IL, 1971, Ch. Tomas, p.15). Буллезная кератопатия как осложнение хирургии катаракты является главной причиной низкого зрения в послеоперационном периоде и основным показанием к кератопластике.
В норме эндотелий роговицы представляет собой монослой, покрывающий заднюю поверхность десцеметовой мембраны и состоящий приблизительно из 350-500 тысяч гексональных клеток. Эндотелий участвует в синтезе протеинов, контролирует проникновение веществ из водянистой влаги в строму роговицы, выполняя барьерную функцию, и участвует в активном транспорте, обеспечивая нормальную гидратацию стромы (насосная функция), необходимую для поддержания ее прозрачности.
2
2
2
2
Общее число эндотелиальных клеток при рождении составляет около 1 миллиона, достигая 4000 кл на мм. В течение жизни плотность эндотелиальных клеток роговицы постепенно снижается: в молодом возрасте плотность эндотелиальных клеток составляет в среднем 3500 кл/мм, а в возрасте 60-ти лет - в среднем 2286 кл/мм (Teruo Nishida. Cornea, Cornea 2005, second edition, p.16-18; Bourne W.M., Kaufman H.E. Specular microscopy of corneal endothelium in vitro. Am. J. Ophtalmol. - 1976. - Vol.81. - P.319-323.). Снижение плотности эндотелиальных клеток до 1000 кл/мм и менее приводит к развитию эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговицы, что означает резкую потерю зрения и, вследствие этого, трудоспособности. Эндотелиальные клетки роговицы человека in vivo имеют минимальную пролиферативную активность. (R.Narayanan at all. Pseudophakic Corneal Edema, Cornea, second edition, 2005, V-25, N 9, p.993-1001).
Повреждение эндотелиальных клеток, возникающее после воспалений и травм, в том числе после хирургической травмы, увеличивает процент их потери и ведет к развитию хронического отека роговицы с последующим нарушением ее трофики, образованием стойких помутнений, снижением остроты зрения вплоть до слепоты и развитием болевого синдрома разной степени выраженности от ощущения инородного тела до сильной боли.
Одним из потенциальных факторов риска развития отечной дистрофии роговицы после ФЭ является предсуществующее нарушение функции и количества эндотелиальных клеток, т.е. наличие у пациента в предоперационном периоде заболеваний эндотелия. (Mian S., Sugar A.: Surgical trauma: Pseudophakic and aphakic corneal edema. // Cornea, II-d edition, p.1266-1267). К данным состояниям относятся: дистрофия Фукса, cornea guttatae и псевдоэксфолиативный синдром. Ishikawa к достоверным факторам риска развития послеоперационного отека роговицы относит наличие в анамнезе роговичных заболеваний, травм, закрытоугольной глаукомы, а также наличие плотного ядра хрусталика. (Ishikawa A. Cataract and refractive surg. 2002 Nov; 28 (II): p.1982-92). С другой стороны, развитие БК напрямую зависит от потери эндотелиальных клеток роговицы вследствие хирургических манипуляций при экстракции катаракты: механической травмы при контакте эндотелия с инструментами, интраокулярной линзы (ИОЛ), ядром хрусталика, ирригационной травмы при больших количествах, скорости потока ирригационных растворов и ультразвуковой травмы (Тахчиди Х.П., Егорова Э.В, Толчинская А.И. «Интраокулярная коррекция в хирургии осложненных катаракт». Монография, Москва-2004, с.129).
Известно, что чем плотнее ядро хрусталика, тем более длительное воздействие ультразвука, либо большая энергия ультразвука понадобится для его дробления. У пациентов пожилого возраста ядро хрусталика часто бывает плотным и увеличенным. В этих случаях удлиненное время выполнения факоэмульсификации для достижения дробления, большая мощность ультразвука, более длительное выполнение манипуляций может явиться причиной послеоперационных осложнений (L.Buratto Хирургия катаракты переход от экстракапсулярной экстракции катаракты к факоэмульсификации. Монография, 1999 г., с.200).
Радикальным методом лечения БК является сквозная кератопластика. Разработка эффективного терапевтического метода лечения БК явилась бы альтернативой сквозной пересадке роговицы.
Возможности консервативной терапии БК (применение гиперосмотических и витаминных средств, лечебные мягкие контактные линзы, выполняющие бандажные функции и гелий-неоновая лазерная стимуляция) ограничены и носят лишь паллиативный характер (Магден Ю. Оптимизация технологии и отдаленные результаты сквозной реконструктивной кератопластики при буллезной кератопатии. Дисс…канд. мед. наук., М. - 1998, с.4).
Известен способ лечения с помощью иммуностимуляторов ранних проявлений поствоспалительной буллезной кератопатии, развивающейся после экстракции катаракты с имплантацией искусственного хрусталика (ИОЛ), а также вследствие герпесвирусного эндотелиита. Способ состоит в применении пентоксила (перорально), гемодеза (внутривенно) или Полудана (субконъюнктивально, интракамерально) больным с БК в первые 2-3 месяца со дня появления признаков заболевания (Ершов Ф.И. Антивирусные препараты, М., Медицина, 1998, с.192; Каспаров А.А. Офтальмогерпес, М., Медицина, 1994 г., с.175). Однако известный способ у значительной части больных не купирует ранние признаки БК и заболевание неуклонно прогрессирует.
В литературе имеются данные о положительном влиянии субконъюнктивальной трансплантации культивированных in vitro фетальных клеток роговицы (ФК) нескольким больным БК с длительностью заболевания от 2 недель до года (Ченцова Е.В. Применение фетальных клеток роговицы человека для лечения различной патологии органа зрения. Офтальмохирургия, M., 1999-3-9, №4.; Жаров В.В, Малов В.М., Перевозчиков П.А., Точилова Е.Р. Экспериментально-клиническое обоснование применения пласта фетальных клеток в комплексном лечении эндотелиально-эпителиальной дистрофии роговой оболочки. Новые технологии в лечении заболеваний роговицы, материалы научно-практической конференции Федоровские чтения - 2004, Москва, стр.439-442.). Механизм лечебного действия трансплантации авторы связывают с возможным наличием в ФК эмбриоспецифических ростовых факторов, усилением интерфероногенеза, а также с синтезом ИЛ-1, что усиливает процессы репарации и регенерации. Однако в настоящее время применение фетальных клеток в нашей стране в клинике ограничено законодательством РФ.
Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является метод того же назначения, включающий введение смеси аутологичной сыворотки крови и иммуномодулятора полиА:полиУ (Полудан, смесь полиаденил: полиуридиловых кислот) в переднюю камеру глаза больного (Каспаров А.А., Каспарова Евг.А., Павлюк А.С. Способ лечения поствоспалительной буллезной кератопатии, патент РФ №2165747 от 2001 г., с.2.; Каспаров А.А., Каспарова Евг.А., Павлюк А.С. Локальная экспресс-аутоцитокинотерапия (комплекс цитокинов) в лечении вирусных и невирусных поражений глаз // Вестн. Офтальмологии 2004, т.120, №1, с.29.). Недостатком данного метода является недостаточная эффективнось аутологичной сыворотки в связи с отсутствием в ней живых активированных полиА:полиУ клеток-продуцентов цитокинов и других биологически активных субстанций, в смеси, вводимой в переднюю камеру глаза. Вводимая смесь аутологичной сыворотки крови и иммуномодулятора полиА:полиУ содержит комплекс медиаторов иммунитета - цитокины, но не содержит клетки, продуцирующие эти цитокины. Соответственно, без постоянного «пополнения», т.е. без выработки цитокинов клетками в месте введения, цитокины, являющиеся короткоживущими белками, быстро разрушаются, и лечебная концентрация их в передней камере глаза снижается. Отсутствие клеток в смеси, применяющейся в ближайшем аналоге, не позволяет использовать их терапевтический потенциал, основанный в том числе на феноменах межклеточных контактных взаимодействий. Результаты большого числа научных исследований, выполненных в последние годы, свидетельствуют, что среди лейкоцитов периферической крови присутствует широкий спектр клеток-предшественников (прогениторов), способных дифференцироваться в различные типы специализированных клеток, при попадании в соответствующую тканевую нишу.
Раскрытие изобретения
2
Задачей изобретения является разработка средства, способа его получения и способа лечения отека роговицы и других проявлений буллезной кератопатии, развившихся в первые 3,5 месяцев после воспалений, травм, и различных методов экстракции катаракты с имплантацией ИОЛ, антиглаукоматозных операций на глазах с нормальным и сниженным (плотность 1000 кл/мм и ниже) количеством эндотелиальных клеток и их дисфункцией, а также с наличием признаков начальной компенсированной эндотелиальной дистрофии роговицы (cornea guttatae, дистрофии Фукса) и/либо при катаракте с плотным ядром, который позволяет устранить недостатки ближайшего аналога в виде введения в переднюю камеру глаза сконцентрированной взвеси предварительно активированных в условиях in vitro комплексом полиА:полиУ аутологичных лейкоцитов периферической крови (в т.ч. мононуклеарных клеток) в аутологичной сыворотке крови.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности лечения отека роговицы и других проявлений ранней буллезной кератопатии с использованием заявленного средства. Эффективность лечения проявляется: устранением роговичного синдрома, перикорнеальной инъекции и болей, исчезновением булл, значительным снижением, либо полным купированием отека роговицы и, соответственно, уменьшением толщины роговицы, расправлением и резким уменьшением количества складок десцеметовой оболочки, повышением прозрачности роговицы и повышением остроты зрения в пределах от 0,05 до 1,0. Технический результат достигается за счет:
- создания локального депо в «органе-мишени» - передней камере глаза сконцентрированных живых аутологичных клеток, активированных полиА:полиУ in vitro;
- создания условий, обеспечивающих прямые межклеточные контакты между активированными лейкоцитами крови с эндотелиальными клетками и десцеметовой мембраной роговицы;
- наличия во вводимой в переднюю камеру клеточной суспензии в аутологичной сыворотке синтезированных за время инкубации in vitro цитокинов, в т.ч. факторов роста и других биологически активных веществ, и продолжающимся после введения синтезом их in vivo, преактивированными in vitro клетками;
- формирования т.н. «клеточной ниши» - пространственно-организованного компартмента ткани, включающего межклеточную строму и клеточные элементы, поддерживающего эндотелиальные клетки роговицы в особом состоянии (фаза клеточного цикла, продукция специфических веществ), что обеспечивает осуществление физиологических функций всей ткани).
- восстановления барьерной функции эндотелия и десцеметовой мембраны;
- стимулирующего и противовоспалительного воздействия биологически активных веществ (интерферонов-α, β, γ, интерлейкина-2 и интерлекина-8, трансформирующего фактора роста TGF-beta2, фибробластического фактора роста b-FGF), синтезируемых введенными аутологичными лейкоцитарными клетками, непосредственно на пораженный эндотелий роговицы;
- защитой клеток эндотелия от апоптоза и активации исходно супрессированной пролиферации.
Суть аутоклеточной технологии заключается во введении в переднюю камеру глаза пациента, т.е. непосредственно к органу-мишени - пораженному эндотелию, активированных полиА:полиУ (Полуданом) аутологичных лейкоцитарных клеток (в том числе и мононуклеарных клеток) в аутологичной сыворотке крови. Следует отметить, что мононуклеарные клетки крови являются основными продуцентами цитокинов (Войтенок Ю.Ф., Каспаров А.А., Павлюк А.С., Каспарова Евг.А. ПолиА:полиУ стимулирует выработку ИЛ-8, но не ФНО-α мононуклеарами крови in vitro. Материалы VII съезда иммунологов и аллергологов СНГ, Сочи, Россия, октябрь 2000, опублик. в журн. "Аллергология и иммунология", М., 2000, т.1, №2, с.129), а аутологичная сыворотка крови обладает наиболее близким составом к камерной влаге (Волобуева Т.М. Влияние влагозамещающих растворов на задний эпителий роговицы. Автореф. дисс…канд. мед. наук., М. - 1998, с.12).
Теоретической предпосылкой изобретения была идея создания локального депо аутологичных живых, активированных клеток в передней камере глаза. Эффект клеточной терапии опосредован как наличием во вводимом в переднюю камеру клеточном препарате синтезированных за время инкубации in vitro цитокинов и других биологически активных веществ, так и продолжающимся после введения синтезом их in vivo активированными клетками.
Для активации клеток используется - полиА:полиУ (комплекс полиадениловой: полиуридиловой кислот, Полудан), являющийся лигандом Toll-like рецепторов 3-го типа. Toll-like рецепторы (TLR) являются ключевым механизмом врожденного иммунитета, играют важную роль в активации различных типов клеток в том числе и прогениторов (клеток-предшественников), запуская их дифференцировку в направлении специализированных клеточных типов. С их помощью распознаются инфекционные патогены (вирусные, микробные) и активируются иммунные процессы, направленные на элиминацию этих патогенов. Связывание лигандов (полиА:полиУ, полиИ:полиЦ, вирусной дсРНК) с TLR приводит к активации клеток и синтезу интерферона-альфа и бета (IFN-α, β), а также ряда других цитокинов. Результаты экспериментальных исследований in vitro и in vivo свидетельствуют о том, что при активации периферической крови комплексом полиА:полиУ клетки становятся способными вырабатывать широкий спектр аутологичных цитокинов, в том числе  β, γ, ИЛ-2, -8. ПолиА:полиУ (Полудан) применяется в офтальмологии более 20 лет и зарекомендовал себя как высокоактивный и нетоксичный индуктор цитокинов: под действием полиА:полиУ происходит каскадное усиление продукции ИФН и ИЛ, в частности, ИЛ-8 в цельной крови и лейкоцитах в 3-5 раз, при этом продукция ключевого медиатора воспаления ФНО-α не увеличивается. Иммуномодулирующее действие полиА:полиУ в значительной степени реализуется через стимуляцию продукции ИЛ-8, основного хемотаксического цитокина, вызывающего хемотаксис и активацию нейтрофилов, стимуляцию ангиогенеза и регенерации, реализуемых с помощью факторов роста.
Патогенез БК связан, как говорилось выше, с повреждением и/или дисфункцией эндотелиальных клеток роговицы. Эти клетки обладают низкой способностью к делению. Объяснением этого может являться специфическая комбинация ростовых факторов в микроокружении клеток эндотелия (тканевой нише). Показано, что в водянистой влаге передней камеры концентрация TGF-beta2, способствующего ингибированию митозов, в 10 раз выше, чем в сыворотке крови (Dekaris I., Gabric N. Et all "Profile of cytokines in aqueous humor from corneal graft recipients" // Croat. Med. J. - 2001 Dec. - 42-46. - 650-6). Однако при определенных условиях in vitro клетки эндотелия человека способны к делению. Так, совместное добавление ростовых факторов TGF и b-FGF в культуру эндотелиальных клеток роговицы приводит к стимуляции их пролиферации и выработке эндогенного b-FGF (Rieck P., Oliver L., Engelmann К. Et all "The role of exogenous|endogenous basis fibroblast growth factor (FGF2) and transforming growth factor beta (TGF beta-1) on human corneal endothelial cells proliferation in vitro" / Exp. Cell. Res. - 1995 Sep. - 220 (1). - 36-46/). Показано также, что стимуляция клеток через TLR влияет на продукцию TGF-beta.
Высокие концентрации трансформирующего фактора роста - бета (TGF-beta2) и фибробластического фактора роста (b-FGF) в клеточном препарате аутологичных лейкоцитарных клеток позволяют предположить, что у больных наблюдается такой же эффект, как и в культуре эндотелиоцитов, то есть совместное действие b-FGF и TGF-beta не только защищает клетки эндотелия от апоптоза, но и приводит к активации пролиферации, которая исходно супрессирована собственным микроокружением, а также стимулирует выработку коллагена, что укрепляет физические свойства базальной мембраны и препятствует дальнейшему прогрессированию заболевания (А.С.Павлюк, А.А.Каспаров, Евг.А.Каспарова, A.M.Попкова Механизмы терапевтического действия клеточных препаратов на основе аутологичных лецкоцитов периферической крови при лечении заболеваний роговицы: репрограммирование иммуноцитокиновой доминанты Th1/Th2 и продукция факторов роста TGF-β1, TGF-β2, и b-FGF. Сборник научных статей по материалам научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры», М., 28-29 сентября, 2007 г., стр.220; Rieck PW, Gigon М, Jaroszewski J, Pleyer U, Hartmann C. Increased endothelial survival of organ-cultured corneas stored in FGF-2-supplemented serum-free medium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003 Sep; 44 (9): 3826-32; Kay EP, Gu X, Ninomiya Y, Smith RE Invest Ophthalmol Vis Sci. 1993 Mar; 34 (3): 663-72. Corneal endothelial modulation: a factor released by leukocytes; Ко MK, Kay EP Invest Ophthalmology Vis. Sci. 2005 Dec; 46 (12): 4495-503. Regulatory role of FGF-2 on type I collagen expression during endothelial mesenchymal transformation).
Результаты проведенных нами исследований по определению концентраций TGF-β1, TGF-β2, b-FGF в клеточных препаратах аутологичных лейкоцитов периферической крови, стимулированных иммуномодулятором полиА:полиУ, показали, что в клеточных препаратах концентрация TGF-β2 более чем в 40 раз, а b-FGF - в 20 раз превышала концентрацию этих факторов в референс-сыворотках (т.е. в контрольных образцах сыворотки здоровых доноров без добавления полиА:полиУ). Полученные нами данные по концентрации ключевых факторов роста согласуются с наблюдаемым клиническим эффектом - восстановлением барьерной функции эндотелия и десцеметовой мембраны (А.С.Павлюк, А.А.Каспаров, Евг.А.Каспарова, A.M. Попкова Механизмы терапевтического действия клеточных препаратов на основе аутологичных лецкоцитов периферической крови при лечении заболеваний роговицы: репрограммирование иммуноцитокиновой доминанты Th1/Th2 и продукция факторов роста TGF-β1, TGF-β2, и b-FGF. Сборник научных статей по материалам научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры», М., 28-29 сентября, 2007 г., стр.220).
Важнейшим терапевтическим механизмом является способность полиА:полиУ защищать клетки от апоптоза: под его влиянием в культурах лимфоцитов отмечаются 2 дозозависимых эффекта: усиление пролиферации лимфоцитов и снижение уровня активационно-индуцированного апоптоза лимфоцитов, в присутствии широко применяющегося апоптогена дексаметазона (Ковальчук Л.В., Павлюк А.С., Каспаров А.А., Каспарова Евг.А., Щигленко Н.А., Синюхин В.Н., Чирун Н.В. Анализ фармакологических средств на модели апоптоза лимфоцитов человека in vitro в норме и при иммунопатологии. // Аллергология и иммунология", т.1, №1, апрель 2000, М.).
3
3
При исследовании клеточной взвеси, отобранной из пробирки, на границе между фибриновым сгустком и плазмой крови, было выявлено, что содержание в ней лейкоцитарных клеток составляет в среднем - 1200-1500·10 клеток в 1 мл, из них 400-570·10 клеток в 1 мл взвеси составляют мононуклеары. Таким образом, содержание мононуклеарных клеток в суспензии аутологичных лейкоцитов, которую после предварительной активации в культуре in vitro вводят в переднюю камеру глаза, составляет 25-45% от общего числа лейкоцитов, что соответствует нормальному содержанию мононуклеарных клеток в периферической крови человека, и, следовательно, данная методика не приводит к селективным потерям монкуклеаров.
Терапевтический эффект данной клеточной технологии мы во многом связываем с формированием т.н. «клеточной ниши» - пространственно-организованного компартмента ткани, включающего межклеточную строму и клеточные элементы, поддерживающего эндотелиальные клетки роговицы в особом состоянии (фаза клеточного цикла, продукция специфических веществ), что обеспечивает нормализацию осуществления физиологических функций всей ткани.
Эту идею подтверждают наши клинические наблюдения. При лечении пациентов с ранней (т.е. развившейся спустя 1-3,5 месяцев после операции травмы или воспаления) послеоперационной и поствоспалительной БК методом введения взвеси аутологичных лейкоцитарных клеток, активированных в культуре in vitro полиА:полиуУ в переднюю камеру глаза, отек роговицы и другие признаки (соответствующие 1-3 стадиям БК по классификации Горгиладзе) БК купировались.
Осуществление изобретения
Способ получения средства включает: забор крови у пациента предварительно производится с соблюдением правил асептики и антисептики. Из локтевой вены в стерильную одноразовую систему для забора крови «Вакутайнер» набирается 5 мл крови. Свежезабранная кровь сразу же смешивается с предварительно ex tempory приготовленным раствором полиА:полиУ и помещается в пробирку для суспензионных культур с вентилируемой крышкой. 200 ЕД полиА:полиУ (Полудана) растворяют в 2,0 мл воды для инъекций, и, используя одноразовый стерильный шприц, водный раствор полиА:полиУ (Полудан) переносят в пробирку для суспензионных культур с вентилируемой крышкой, содержащую свежезабранную кровь. Содержимое пробирки тщательно перемешивают. Далее, пробирку помещают в термостат на 4-8 часов при температуре от +18 до +41. Основную часть времени культивирование проводится при +37 °С, периодически повышая ее до +41 °С.
Увеличение времени и температуры инкубации позволяет достичь более высокого уровня активации клеток и усиления синтеза цитокинов и других биологически активных веществ клетками, в том числе синтеза эндогенных лигандов TLR, таких как белки теплового шока. Именно при таких временном и температурном режиме культивирования усиленная выработка цитокинов, факторов роста и других биологически активных соединений.
Так, по нашим данным, интерферонообразование во фракциях крови 20 доноров и больных герпесом начинается сразу же после введения водного раствора полиА:полиУ (200 ЕД), достигая максимума через 6-24 часа (Каспарова Евг.А., Фадеева Л.Л.., Павлюк А.С., Переверзина O.K., Каспаров А.А. «К вопросу о теоретическом обосновании методики локальной экспресс-аутоцитокинотерапии». // Вестн. офтальмологии, 2002, №3). Из трех фракций крови (плазма, плазма + лейкомасса, лейкомасса) наибольшие титры интерферонов α и γ отмечены в двух последних фракциях (α-640-1280 МЕ/мл) и (γ-40-160 МЕ/мл).
В процессе культивирования пробирки периодически подвергаются механическому воздействию, с использованием вибрационнго шейкера. Встряхивание пробирки с использованием шейкера приводит к неожиданным результатам: вибрация активизирует обменные процессы в культуре клеток и стимулирует выработку ИЛ-8 (R.Takenchi et all "Effects of vibration and hyaluronic acid on activation of three-dimenisional cultured chondrocytes" Arthritis and rheumatism, Vol.6, June 2006, p.1897-1905; Puig F, Ryco F et all. "Vibration enchases IL-8 release in a cell model of snoring-induced airway inflammation" Sleep, 2005 Oct. 1; 28 (10); 1312-6.) После окончания времени инкубации пробирку со свернувшейся кровью уравновешивают и в течение 8-12 минут центрифугируют при ускорении 100-400 G. Изменение параметров времени и ускорения и оборотов центрифугирования позволяет сконцентрировать клетки на границе кровяного сгустка, избежать «ухода» клеток под кровяной сгусток и получить максимально возможное их количество в виде суспензии в аутологичной сыворотке из этой же пробирки. Полученная после центрифугирования пробирки клеточная суспензия в аутологичной сыворотке помещается в стерильную пробирку и передается для последующего использования для проведения клеточной терапии.
Эта пробирка с клетками в аутологичной сыворотке может храниться до использования в медицинском рефрижераторе, при температуре +2 -+4 °С, в течение 1-2 часов.
Полученная взвесь клеток, собранных на границе сыворотки и сгустка свернувшейся крови, представляет собой средство для лечения БК. Режимы способа дают возможность получить неповрежденные и максимально активизированные аутологичные клетки, что позволяет с оптимальным эффектом использовать их в лечении.
Способ лечения осуществляют следующим образом: после местной ретробульбарной анестезии раствором 2,0 мл лидокаина и акинезии 7,0 мл лидокаина, верхнюю прямую мышцу прошивают швом-держалкой. Лезвием производится парацентез роговицы вблизи лимба размером 2-3 мм. В случае наличия преципитатов или «наложений» на эндотелии (при герпетических кератоиридоциклитах) переднюю камеру предварительно промывают сбалансированным физиологическим раствором для их эвакуации.
Далее, в переднюю камеру постепенно осуществляют инфузию заранее приготовленной ранее суспензии аутологичных клеток крови в аутологичной сыворотке в количестве 0,5-2,0 мл, до полного замещения ею жидкости передней камеры. В случае выраженных дистрофических изменений стромы роговицы дополнительно данную взвесь вводят интракорнеально. При необходимости накладывают супрамидный шов в зоне парацентеза роговицы. Избыток клеточной суспензии (1,0-2,0 мл) вводят под конъюнктиву паралимбально. Парабульбарно вводят 0,5 мл раствора антибиотика. Глаз заклеивают. Сразу после операции больной должен принять положение лицом вниз и лежать таким образом в течение 1-2 часов, чтобы введенная взвесь клеток контактировала с задней поверхностью роговицы. Сеансы клеточной терапии проводят с интервалом 3-7 дней, число их колеблется от 1 до 4 в зависимости от клинической динамики.
Приводим клинические примеры:
1) Пример №1. Больной X. поступил в клинику 25.02.2000 г. с диагнозом: эндотелиально-эпителиальная дистрофия роговицы, артифакия левого глаза; незрелая начальная катаракта правого глаза. При поступлении: левый глаз: умеренная смешанная инъекция глазного яблока, буллезные изменения роговицы, эпителий и строма роговицы отечны, оптический срез роговицы резко утолщен, складки десцеметовой оболочки, подсчет эндотелиальных клеток невозможен ввиду буллезных изменений роговицы, пахиметрия роговицы - 720 мкм, острота зрения правого глаза 0,01 (не корригируется). 1 месяц назад пациенту на левом глазу была проведена экстракция катаракты с имплантацией заднекамерной ИОЛ. С первых дней после операции пациент отмечал низкое зрение и предъявлял жалобы на слезотечение и светобоязнь. Лечился стероидными и нестероидными противовоспалительными средствами, получал инстилляции гиперосмотического раствора глюкозы, а также альбуцид и баларпан. В связи с отсутствием эффекта и нарастанием признаков отека роговицы, пациент был направлен на проведение лечения методом локальной экспресс-аутоцитокинотерапии на левом глазу. Внутриглазное давление обоих глаз - норма. Правый глаз спокоен, роговица прозрачна, блестяща. Больному в течение 15 дней было проведено 3 сеанса интракамеральной локальной экспресс-аутоцитокинотерапии (введения смеси аутоплазмы и полудана в переднюю камеру глаза) с интервалом в 6 дней на левом глазу. Через 3 недели после начала лечения явления буллезной кератопатии уменьшились, острота зрения повысилась до 0,04, отмечалось уменьшение отека стромы роговицы, и, соответственно, уменьшение оптического среза роговицы, повысилась ее прозрачность, пахиметрия роговицы левого глаза составила 680 мкм. В течение последующего месяца острота зрения левого глаза возросла до 0,2, однако остаточный отек стромы и складки десцеметовой оболочки сохранялись. Безусловно, отмечалась положительная динамика в состоянии роговицы левого глаза, однако сохранение остаточного отека роговицы и складок десцеметовой оболочки мы можем связать с недостаточной эффективностью вводимой в переднюю камеру глаза смеси аутоплазмы и полудана за счет отсутствия в этой смеси живых активированных клеток, что, соответственно, приводит к снижению терапевтического эффекта данной методики.
2) Пример №2. Пациентка Г., 1938 г.р., поступила 30.05.2006 г. в клинику с диагнозом: правый глаз: Эндотелиально-эпителиальная дистрофия роговицы, артифакия. Левый глаз - артифакия, частичная амблиопия, центральная хориоретинальная дистрофия сетчатки. Месяц назад пациентка перенесла операцию экстракции катаракты методом факоэмульсификации с имплантацией заднекамерной ИОЛ в другом лечебном учреждении. Лечилась стеродными и нестероидными противовоспалительными препаратами, местно применяла инстилляции гиперосмотического раствора глюкозы, витаминные капли, солкосерил-гель, однако явления буллезной кератопатии роговицы нарастали. При поступлении: пациентка предъявляла жалобы на выраженный блефароспазм, светобоязнь, слезотечение, боли и резкое снижение зрения на правом глазу. Правый глаз несколько раздражен, роговица отечна, диффузный отек эпителия и стромы роговицы, буллезные изменения эпителия, выраженное утолщение оптического среза роговицы, преципитаты на эндотелии, крупные грубые складки десцеметовой оболочки, глазное дно не офтальмоскопируется. Острота зрения правого глаза при поступлении составила 0,03-0,04, не корригировалась. Левый глаз - конъюнктива бледно-розовая, роговица прозрачная, блестящая, поверхность ее гладкая, артифакия, острота зрения левого глаза составила 0,2-0,3 (в связи с частичной амблиопией левого глаза и наличием дистрофических изменений в макулярной области на сетчатке). Во время пребывания в стационаре пациентка получила (с интервалом в 6-7 дней) 3 сеанса введения в переднюю камеру правого глаза сконцентрированной взвеси предварительно активированных в условиях in vitro комплексом полиА:полиУ аутологичных лейкоцитарных клеток периферической крови в аутологичной сыворотке крови. Уже через 2,5 недели после начала лечения явления буллезной кератопатии правого глаза значительно уменьшились: отмечали устранение роговичного синдрома, перикорнеальной инъекции и болей, исчезновение булл, значительное снижение отека роговицы и уменьшение толщины роговицы, расправление количества складок десцеметовой оболочки, повышение прозрачности роговицы и повышение остроты зрения до 0,3. Через месяц после выписки острота зрения правого глаза повысилась до 0,7, складки десцеметовой оболочки полностью расправились, прозрачность роговицы восстановилась. Таким образом, создание депо живых активированных аутологичных лейкоцитарных клеток в аутологичной сыворотке в передней камере глаза позволяет повысить эффективность лечения больных с ранней буллезной кератопатией.