АНТИТЕЛА С ДВОЙНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ

1. Способ создания антитела с двойной специфичностью или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL), причем VH и VL антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом, при этом указанный способ включает стадии:
(a) предоставление антитела, которое содержит VH и VL, причем VH и VL соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который связывается с первым эпитопом, но не вторым эпитопом, и при этом указанное антитело содержит по меньшей мере одну аминокислоту в положении 32, 50 или 91 VL, которая является электростатической или гидрофобной;
(b) изменение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VH антитела из стадии (a), причем изменяется одна или более доступных растворителю аминокислот;
(c) экспрессия VL и измененного VH из стадии (b); и
(d) отбор антитела с двойной специфичностью или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего VL и измененный VH из стадии (c), причем VH и VL соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере две из аминокислот в положении 32, 50 или 91 являются электростатическими или гидрофобными.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что все три аминокислоты в положении 32, 50 и 91 являются электростатическими или гидрофобными.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что электростатический остаток представляет собой тирозин.
5. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что гидрофобный остаток представляет собой триптофан.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая VH, изменяется на основе разнообразия множества встречающихся в природе аминокислотных последовательностей тяжелой цепи.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что подверженное воздействию растворителя положение остатка является положением аминокислотного остатка, выбранным из группы, состоящей из положений 33, 34, 50-58 и 95-97 VH.
8. Способ по любому из пп. 1-7, дополнительно включающий изменение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей VL антитела из стадии (a), причем изменяются один или больше доступных растворителю аминокислотных остатков.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что подверженное воздействию растворителя положение остатка является положением аминокислотного остатка, выбранным из аминокислот 93-96 VL.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что измененный VH отображается на фаге с VL во время отбора на стадии (d).
11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что антитело из стадии (a) содержит определяющий комплементарность участок CDRL1 вариабельного участка легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9), CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10), и CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11).
12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что антитело из стадии (a) содержит определяющий комплементарность участок CDRH1 вариабельного участка тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность DYSMH (SEQ ID NO.: 13), CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность VWINTETGEPTYADDFK (SEQ ID NO.: 17), и CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).
13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что антигенсвязывающий сайт антитела с двойной специфичностью из стадии (d) связывает первый эпитоп и второй эпитоп исключительно совместно.
14. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что антигенсвязывающий сайт антитела с двойной специфичностью из стадии (d) связывает одновременно первый эпитоп и второй эпитоп.
15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что первый эпитоп походит из одной биологической молекулы и второй эпитоп походит из такой же биологической молекулы.
16. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что первый эпитоп походит из первой биологической молекулы, а второй эпитоп походит из второй биологической молекулы.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что первую биологическую молекулу и вторую биологическую молекулу выбирают из группы, состоящей из ИЛ4/ИЛ5, ИЛ4/ИЛ13.
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что первая биологическая молекула и вторая биологическая молекула представляют собой цитокины.
19. Способ по п. 16, отличающийся тем, что первая или вторая биологическая молекула представляет собой молекулу, которая может увеличить период полувыведения антитела с двойной специфичностью при связывании с антителом in vivo.
20. Способ по п. 16, отличающийся тем, что первая или вторая биологическая молекула представляет собой сывороточный альбумин или неонатальный Fc-рецептор (FcRn).
21. Способ по п. 16, отличающийся тем, что первая или вторая биологическая молекула представляет собой молекулу, которая может увеличить эффекторную функцию антитела с двойной специфичностью при связывании с антителом in vivo.
22. Способ по п. 16, отличающийся тем, что первая или вторая биологическая молекула связывается с белком клеточной поверхности на естественных клетках-киллерах или макрофагах.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что белок клеточной поверхности представляет собой Fc-рецептор или C1q.
24. Способ по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что VH и VL антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом или вторым эпитопом с KD 10-6 или ниже.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что VH и VL антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом или вторым эпитопом с KD 10-9 или ниже.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что VH и VL антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом или вторым эпитопом с KD 10-12 или ниже.
27. Способ по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что VH и VL антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом с KD 10-6 или ниже.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что VH и VL антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом с KD 10-9 или ниже.
29. Способ по п. 28, отличающийся тем, что VH и VL антитела с двойной специфичностью соединяются попарно вместе с образованием антигенсвязывающего сайта, который специфически связывается с первым эпитопом и вторым эпитопом с KD 10-12 или ниже.
30. Способ по любому из пп. 1-29, отличающийся тем, что первая биологическая молекула и вторая биологическая молекула не являются структурно сходными.
31. Способ по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что отбор на стадии (d) включает глубокое секвенирование.
32. Выделенное антитело с двойной специфичностью, или его антигенсвязывающий фрагмент, созданное процессом по п. 1.
33. Выделенное антитело с двойной специфичностью по п. 32, отличающееся тем, что антитело с двойной специфичностью представляет собой моноклональное антитело.
34. Выделенное антитело с двойной специфичностью по п. 32, отличающееся тем, что фрагмент представляет собой Fab или scFv.
35. Выделенное антитело с двойной специфичностью по п. 32, отличающееся тем, что антитело с двойной специфичностью представляет собой IgG.
36. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит аминокислотную последовательность любого из антител на фиг. 4A, 4B, 4C, 7A, 7C или 7D.
37. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее следующие шесть CDR:
(i)  CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9);
(ii)  CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10);
(iii)  CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11);
(iv)  CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYDIH (SEQ ID NO.: 14);
(v)  CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность VWINTETGEPTYADDFK (SEQ ID NO.: 17) и
(vi)  CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность EILFYGMDY (SEQ ID NO.: 21).
38. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее следующие шесть CDR:
(i)  CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9);
(ii)  CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10);
(iii)  CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11);
(iv)  CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYFIH (SEQ ID NO.: 15);
(v)  CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность AGIVYDATGFTTYADDFK (SEQ ID NO.: 18) и
(vi)  CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).
39. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее следующие шесть CDR:
(i)  CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9);
(ii)  CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10);
(iii)  CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTPFPLTF (SEQ ID NO.: 12);
(iv)  CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYLMH (SEQ ID NO.: 16);
(v)  CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность AVIVSITGRTYYADDFK (SEQ ID NO.: 19) и
(vi)  CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).
40. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее следующие шесть CDR:
(i)  CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9);
(ii)  CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10);
(iii)  CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11);
(iv)  CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYSMH (SEQ ID NO.: 13);
(v)  CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность GVIFQSGATYYADDFK (SEQ ID NO.: 22) и
(vi)  CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).
41. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее следующие шесть CDR:
(i)  CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9);
(ii)  CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10);
(iii)  CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTSPWTF (SEQ ID NO.: 11);
(iv)  CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYSMH (SEQ ID NO.: 13);
(v)  CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность GIIFYTGHTYYADDFK (SEQ ID NO.: 23) и
(vi)  CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).
42. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее следующие шесть CDR:
(i)  CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9);
(ii)  CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10);
(iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYX1X2PWTF (SEQ ID NO.: 24), где X1 представляет собой Thr, Ile, Leu или Lys, а X2 представляет собой Ser или His;
(iv)  CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYFIH (SEQ ID NO.: 15);
(v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность X1GIVYDATGFTX2YA X3X4FK (SEQ ID NO.: 25), где X1 представляет собой Ala или Gly, X2 представляет собой Thr, Ile, Val или Ala, X3 представляет собой Asp, Val или Glu и X4 представляет собой Asp, Glu, Asn, Ser, Ile, Leu, Thr, Ala или Phe, и
(vi)  CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).
43. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 41, содержащее следующие шесть CDR:
(i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9);
(ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10);
(iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYTHPWTF (SEQ ID NO.: 27);
(iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYFIH (SEQ ID NO.: 15);
(v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность GGIVYDATGFTTYAEEFK (SEQ ID NO.: 28) и
(vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).
44. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 41, содержащее следующие шесть CDR:
(i) CDRL1, содержащий аминокислотную последовательность KASQSVINDAA (SEQ ID NO.: 9);
(ii) CDRL2, содержащий аминокислотную последовательность YTSHRYT (SEQ ID NO.: 10);
(iii) CDRL3, содержащий аминокислотную последовательность QQDYKHPWTF (SEQ ID NO.: 31);
(iv) CDRH1, содержащий аминокислотную последовательность DYFIH (SEQ ID NO.: 15);
(v) CDRH2, содержащий аминокислотную последовательность AGIVYDATGFTTYADDFK (SEQ ID NO.: 32) и
(vi) CDRH3, содержащий аминокислотную последовательность GGIFYGMDY (SEQ ID NO.: 20).
45. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 42-44, дополнительно содержащее каркасный участок 3 (FR3), содержащий аминокислотную последовательность GRX1TITX2DX3STSTX4 (SEQ ID NO.: 26), где X1 представляет собой Val или Phe, X2 представляет собой Arg или Ile, X3 представляет собой Thr, Phe, Met или Pro и X4 представляет собой Ala или Val.
46. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельный участок легкой цепи, выбранный из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO.: 1, 5, 29 или 33, и вариабельный участок тяжелой цепи, выбранный из SEQ ID NO.: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 30 или 34.
47. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп. 38, 39, и 42-46, отличающееся тем, что указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывает ИЛ4 с Kd 500 нM или ниже и ИЛ5 с Kd около 900 нM или ниже.
48. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 38, 39, и 42-46, отличающееся тем, что указанное антитело связывает ИЛ4 с Kd 100 нM или ниже и ИЛ5 с Kd около 100 нM или ниже.
49. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент, по любому из пп. 38, 39, и 42-46, отличающееся тем, что указанное антитело связывает ИЛ4 с Kd 10 нM или ниже и ИЛ5 с Kd около 50 нM или ниже.
50. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 40, 41, и 46, отличающееся тем, что указанное антитело связывает ИЛ4 с Kd 500 нM или ниже и ИЛ13 с Kd около 900 нM или ниже.
51. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 40, 41, и 46, отличающееся тем, что указанное антитело связывает ИЛ4 с Kd 100 нM или ниже и ИЛ13 с Kd около 100 нM или ниже.
52. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 36-51, отличающееся тем, что указанное антитело ингибирует или блокирует связывание ИЛ4, ИЛ5 или ИЛ13 со своими рецепторами.
53. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 36-51, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
54. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 36-51, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой антитело IgG.
55. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 36-51, отличающееся тем, что указанный фрагмент представляет собой Fab-фрагмент или одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv).
56. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 36-51, отличающееся тем, что по меньшей мере часть каркасной последовательности представляет собой консенсусную каркасную последовательность человека.
57. Выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 32-51, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой химерное, гуманизированное или полностью человеческое антитело.
58. Фармацевтическая композиция, содержащая любое из антител по пп. 32-57.
59. Полинуклеотид, кодирующий выделенное антитело с двойной специфичностью или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 32-57.
60. Вектор, содержащий полинуклеотид по п. 59.
61. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п. 60.
62. Способ продуцирования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 32-57, причем указанный способ включает культивирование клетки-хозяина, которая содержит вектор по п. 60, и выделение указанного антитела.
63.  Способ лечения у субъекта астмы, причем указанный способ включает введение указанному субъекту антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 32-57, отличающийся тем, что указанное введение проводится в течение времени и в количестве, достаточном для лечения или предупреждения развития у указанного субъекта астмы.
64. Способ по п. 61, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает введение по меньшей мере одного дополнительного средства для лечения астмы, выбранного из группы, состоящей из антагониста IgE, антигистаминного средства, теофилина, сальбутамола, беклометазона дипропионата, натрия кромогликата, стероидного средства и противовоспалительных средств.
65. Способ по п. 63 или 64, отличающийся тем, что астма представляет собой аллергическую астму.
66. Способ лечения у субъекта пролиферативного нарушения, причем указанный способ включает введение указанному субъекту антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 32-57, отличающийся тем, что указанное введение проводится в течение времени и в количестве, достаточном для лечения или предупреждения развития у указанного субъекта пролиферативного нарушения.
67. Способ по п. 66, отличающийся тем, что указанное пролиферативное нарушение представляет собой рак.
68. Способ по п. 67, дополнительно включающий введение указанному субъекту дополнительного антипролиферативного средства, выбранного из группы, состоящей из химиотерапевтического средства, цитотоксического средства и антиангиогенного средства.