Сопоставление состава флавоноидов, выделенных из меланинов чаги в ходе гидролиза и при растворении в водно-спиртовых растворах

УДК 615

М. А. Бурмасова, А. А. Буерашева, М. А. Сысоева

СОПОСТАВЛЕНИЕ СОСТАВА ФЛАВОНОИДОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МЕЛАНИНОВ ЧАГИ

В ХОДЕ ГИДРОЛИЗА И ПРИ РАСТВОРЕНИИ В ВОДНО-СПИРТОВЫХ РАСТВОРАХ

Ключевые слова: меланины чаги, гидролиз, водно-спиртовые экстракты, гликозиды и агликоны флавоноидов, хроматография.

Проведено исследование состава гидролизатов и водно-спиртовых экстрактов меланинов чаги. Анализ флавоноидов, выделяющихся в ходе эксперимента, проведен хроматографическим методом. В исследуемых объектах обнаружены гликозиды и агликоны флавоноидов, как показанные ранее, так и впервые, а именно 4 -оксифлавон, кверцетин-3,7-О-диглюкозид, робинин.

Keywords: fungal melanins, hydrolysis, aqueous-alcoholic extracts, glycosides and flavonoid aglycones, chromatography.

The study of the composition of hydrolysates and water-alcoholic extracts of melanin from the fungi I. obliquus was conducted. Analysis of flavonoids in samples was evaluated by chromatography. Glycosides and flavonoid aglycones were identified, as was shown earlier. 4-oxyflavone, quercetin-3,7-O-glucoside, robinin was detected in extracts of melanin from the fungi I. obliquus for the first time.

Введение

Меланины чаги представляют собой частицы, структурообразующими элементами которых являются агрегаты и субагрегаты. Частицы меланинов в водном извлечении (ВИ) чаги имеют размеры от 400 до 120 нм, а также могут присутствовать частицы с диаметром около 60 нм и менее [1]. Поскольку частицы меланинов относят к нанообъектам, то извлечь из них индивидуальные соединения чрезвычайно сложно. Ранее для их выделения применяли химический гидролиз в автоклаве при высокой температуре и давлении [2-4], проводили их отделение из водных извлечений, фильтратов и меланинов с помощью органических растворителей [5-6]. Особый интерес для исследования представляют фенольные соединения (ФС) чаги. Они обладают биологически активными свойствами, такими как: антибактериальные, противораковые, противовоспалительные, антиоксидантные. Качественный состав ФС, обнаруженных ранее в гидролизатах меланинов, представлен в таблице 1.

Таблица 1 - Качественный состав фенольных соединений, выделенных из меланинов чаги, по литературным данным

Метод исследования Фенольные соединения

гидролиз 10 % раствором соляной кислоты при 1,5 атм и температуре 180 °С ванилиновая, сиреневая, п-оксибензойная кислоты, протокатеховая, пи-рогалловая кислоты [2]

гидролиз 10 % раствором соляной кислоты в автоклаве при 1,5 атм и температуре 126 °С п-крезол, пирокатехин, а-нафтол, гидрохинон, резорцин, апигенин, нарин-генин, морин, кверцетин [3]

гидролиз разведенной соляной кислотой в автоклаве при 121,59 кПа в течение 2 часов кофейная кислота, апиге-нин, кверцетин [4]

Как видно из таблицы 1, применение гидролиза для изучения химического состава меланинов позволило выделить фенолкарбоновые кислоты, такие как протокатеховая, пирогалловая, кофейная, так как они являются продуктами распада лигнина, которые гриб использует в своём метаболизме. Кроме того, выделены простые фенолы: п-крезол, пирокатехин, а-нафтол, гидрохинон, резорцин, играющие важную роль в метаболизме гриба.

Наличие флавоноидов в чаге впервые было установлено Рыжовой [3], которая провела гидролиз меланинов щелочью при 1=126 °С и давлении 1,5 атм. Флавоноиды, выделенные ею, относятся к аг-ликонам: апигенин, нарингенин, морин, кверцетин.

Обработка водного извлечения, фильтрата и меланинов органическими растворителями позволила существенно расширить спектр выделенных соединений [5-6]. Были определены как агликоны мири-цетин, робинетин, кемпферол, апигенин, морин, нарингенин, госсипетин, гиперин, наренгин, изо-рамнетин, лютеолин, так и гликозиды 3-метокси-4,5-диоксифлаванон-7-О-неогесперидозид, лютеолин-7-О-рутинозид.

Наибольший интерес представляет исследование флавоноидных гликозидов, так как они участвуют в окислительно-восстановительных реакциях в клетке и являются переносчиками сахаров.

Приведенные в литературе данные о веществах флавоноидной природы часто показаны на основе водного извлечения и меланинов, полученных способами экстракции, отличающимися условиями проведения процесса. Кроме того, природное сырье может существенно варьировать по составу компонентов, что объясняется многими факторами, в том числе и условиями произрастания гриба. Все это также осложняет задачу исследования веществ, входящих в состав меланинов, и в то же время делает актуальным разработку новых подходов по их выделению и идентификации.

Поскольку меланины - это сложно организованные частицы, то представляет интерес исследование постепенного высвобождения веществ флавоноид-ной природы в ходе гидролиза или растворения ме-

ланинов, что может расширить представление о компонентах, входящих в их состав.

Цель работы - изучение флавоноидов меланинов чаги, последовательно выделяющихся по ходу кислотного или щелочного гидролиза, а также при растворении их в водно-спиртовых растворах.

Экспериментальная часть

Водное извлечение чаги получали методом ре-перколяции [7]. Меланины осаждали из водного извлечения чаги 25 % раствором соляной кислоты. В качестве экстрагентов использовали воду, 95 % и 50 % растворы этилового спирта, а гидролизующих агентов - 5 % раствор едкого натра, 10 % раствор соляной кислоты. Пробы для анализа отбирали через 9,5 и 16,5 часов при растворении меланинов, а также через 3, 8, 10, 13, 15, 18, 20, 23, 25, 28 часов при проведении гидролиза. Ход растворения меланинов и гидролиза контролировали хроматографи-ческим методом в системе: н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5). В качестве проявителя применяли пары аммиака [8]. Идентификацию выделенных соединений проводили на основании литературных данных [9].

Обсуждение результатов

Гидролиз меланинов чаги проведен в мягких условиях при кипячении со слабым раствором щелочи и кислоты в атмосферных условиях для максимально меньшего разрушения сложно организованных флавоноидных соединений. Результаты приведены в таблице 2.

При проведении щелочного гидролиза из частиц меланинов высвобождение флавоноидов наблюдается на протяжении всего гидролиза. При этом обнаруживаются шесть веществ: с И=0,13 (кверцетин-3,7-О-диглюкозид), И=0,25 (3', 4', 5, 7-Тетраоксифлавонол - робинетин), И=0,29 (3 , 4', 5', 5, 7-Пентаоксифлавонол - мирицетин), Ш=0,10, 0,21, 0,32 - не идентифицированы.

Как кверцетин-3,7-О-диглюкозид, робинетин, так и мирицетин относятся к оксифлавонолам. Ранее робинетин и мирицетин обнаружен при обработке водных извлечений и фильтратов чаги, в то время как гликозид кверцетина выделен нами впервые. Оба соединения, по-видимому, не устойчивы в щелочной среде при нагреве, поскольку по ходу гидролиза на 15 часу наблюдается исчезновение кверце-тин-3,7-О-диглюкозида, а робинетина уже на 8 часу. Их появление в последующих пробах гидролизатов можно объяснить разрушением частиц меланинов и выделением их в раствор. Можно предположить, что соединение с И=0,10 относится к гликозидам флавоноидов. Его выделение из меланинов наблюдается с 8 часа по 15 час гидролиза, и далее в пробах не наблюдается. Можно предположить, что либо его мало содержится в меланинах, либо оно разрушается при длительной термической обработке меланинов в щелочной среде.

Таблица 2 - Результаты хроматографического анализа щелочного гидролизата

Время отбора проб, ч Соотнесение

3 0,13 0,25 0,32 Кверцетин-3,7-О-диглюкозид 3 , 4', 5, 7-Тетраоксифлавонол

8 0,10 -

0,13 0,32 Кверцетин-3,7-О-диглюкозид

10 0,10 -

0,13 0,32 Кверцетин-3,7-О-диглюкозид

13 0,10 -

0,13 0,25 Кверцетин-3,7-О-диглюкозид 3 , 4', 5, 7-Тетраоксифлавонол

15 0,10 -

0,21 -

0,25 3 , 4', 5, 7-Тетраоксифлавонол

18 0,21 -

0,32 -

20 0,13 0,25 Кверцетин-3,7-О-диглюкозид 3 , 4', 5, 7-Тетраоксифлавонол

23 0,21 -

0,32 -

25 0,13 0,29 Кверцетин-3,7-О-диглюкозид 3 , 4',5',5, 7-Пентаоксифлавонол

28 0,18 -

0,29 3 , 4',5',5, 7-Пентаоксифлавонол

В случае кислотного гидролиза из меланинов высвобождается 2 вещества. По ходу гидролиза с 3 до 18 часов высвобождается кемпферол-3-О-рабинозилил-7-О-рамнозид (робинин) с И=0,40, затем он разрушается и с 23-28 часов выделяется вещество с И=0,35. Очевидно, что кислый гидролиз менее продуктивен по извлечению флавоноидов по сравнению с щелочным гидролизом.

Для того чтобы сопоставить вещества фла-воноидной природы, выделяющиеся в более мягких условиях из меланинов чаги по сравнению с гидролизом, применено растворение меланинов в воде, 50 % этаноле, 95 % этаноле при нагреве 70-80°С. Было показано, что наилучшей экстрагирующей способностью обладает 50 % этанол. В нем обнаружено 5 веществ. Кверцетин-3,7-О-диглюкозид и робинетин с И=0,13; 0,25 обнаружены при проведении щелочного гидролиза. Вещества с И=0,18 и 0,32 так же наблюдались в пробах щелочного гидролиза. Следовательно, в этом экстракте обнаружены практически все соединения, что и при их гидролизе, кроме лю-теолин-7-глюкозида (И=0,42).

При растворении меланинов в воде в экстрактах подтверждено присутствие кверцетин-3,7-О-диглюкозида и лютеолин-7-глюкозида.

Использование 95 % этанола позволило выделить два соединения: кверцетин-3-О-галактозид (гиперин) с И=0,43, обнаруженное ранее [5] и вещество с И=0,95 - 4-оксифлавон, обнаруженный впервые.

Выводы

1. Установлено, что проведение в мягких условиях щелочного гидролиза меланинов чаги более эффективно, по сравнению с кислым гидролизом, поскольку при этом выделено шесть соединений флавоноидной природы, из них кверцетин-3,7-О-диглюкозид выделен впервые.

2. Проведение гидролиза меланинов в кислой среде позволило впервые обнаружить робинин.

3. Показано, что растворение меланинов чаги в водно-спиртовых растворах позволило выделить те же вещества, что и при его гидролизе, а также гипе-рин и 4'-оксифлавон.

Литература

1 М.А. Сысоева. Автореф. дисс. д-ра хим. наук, Казань, 2009. 20 с.

2 Е.В. Ловягина, А.Н. Шиврина, Биохимия, 25, 4, 640-645 (1960);

3 Г.Л. Рыжова, С.С. Кравцова, С.А. Матасова, Н.В. Гри-бель, В.Г. Пашинский, К.А. Дычко, Хим.-фарм. журн., 10, 44-47 (1997);

4 Е.А. Калашникова. Автореф. дисс. канд. фарм. наук, Пятигорск, 2003. 20 с.

5 В.Р. Хабибрахманова. Автореф. дисс. канд. фарм. наук, Казань, 2008. - 18 с.

6 М.А. Бурмасова. Автореф. дисс. канд. хим. наук, Казань, 2013. 18 с.

7 М.А. Сысоева, О.Ю. Кузнецова, В.С. Гамаюрова, П.П. Суханов, Ф.Г. Халитов, Вестник Казан. Технол. ун-та, 2, 172-179 (2003);

8 И.М. Хайс, К.Мацек, Хроматография на бумаге. Ино-стран. лит-ра, Москва, 1962. 851 с.

9 В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук, Физико-химические методы анализа биологически активных веществ растительного происхождения. Наука, Новосибирск. 1990. 333 с.

© М. А. Бурмасова, канд. хим. наук, ассистент, кафедра пищевой биотехнологии КНИТУ, m-burmasowa@mail.ru; А. А. Буе-рашева, сотрудник ОАО «Казанский хлебозавод №3»; М. А. Сысоева, д-р хим. наук, профессор, зав. кафедрой кпищевой биотехнологии КНИТУ, oxygen1130@mail.ru.

© M. A. Burmasova, cand. of chem. sciences, associate professor, department of food biotechnology of the KNRTU, m-burmasowa@mail.ru; A. A. Buerasheva, fellow worker OJSC «Mechanized bakery .№3»; M. A. Sysoeva, doctor of chemical sciences, professor, head of the Department of food biotechnology of the KNRTU, oxygenl 130@mail.ru.