ИЗМЕНЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО ПРОФИЛЯ ПЛАЗМЫ ПУПОВИННОЙ КРОВИ И АМНИОТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ОТ МАТЕРЕЙ С COVID-19

ИЗМЕНЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО ПРОФИЛЯ ПЛАЗМЫ ПУПОВИННОЙ КРОВИ И АМНИОТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ОТ МАТЕРЕЙ С COVID-19

Н. А. Ломова В. В. Чаговец, Е. Л. Долгополова, А. В. Новоселова, У. Л. Петрова, Р. Г. Шмаков, В. Е. Франкевич Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова, Москва, Россия

Новорожденные от матерей с COVID-19 подвержены риску заражения, могут иметь высокий риск осложнений в раннем неонатальном периоде и отдаленные последствия для здоровья. Цель исследования — определить аминокислотный профиль пуповинной плазмы и амниотической жидкости пациентов с COVID-19 для анализа связи влияния перенесенного антенатально COVID-19 на изменения в метаболоме «внутриутробного пациента». Для оценки уровня 31 аминокислоты в образцах амниотической жидкости и пуповинной плазмы беременных с COVID-19, полученных при родоразрешении, применяли высокоэффективную жидкостную хроматографию с масс-спектрометрической детекцией. Основную группу составили 29 пациенток с подтвержденным диагнозом COVID-19; контрольную — 17 соматически здоровых женщин с беременностью без осложнений. Концентрации восьми аминокислот в амниотической жидкости статистически значимо p < 0,05) различались между исследуемыми группами. Разработаны модели логистической регрессии (чувствительность 0,84; специфичность — 1), позволяющие определять, что анализируемая амниотическая жидкость взята от пациенток, перенесших COVID-19. В плазме пуповинной крови значимые различия обнаружены для четырех аминокислот. Построенные модели позволяют выявлять принадлежность исследуемой пуповинной плазмы пациентам группы контроля или COVID-19 (чувствительность и специфичность — 1). Одновременно в двух точках (амниотическая жидкость и пуповинная плазма), комплексно отображающих метаболом плода, были выявлены и статистически значимо отличались при COVID-19 три аминокислоты. Воздействие вируса на организм приводит к выраженным изменениям в метаболоме амниотической жидкости и пуповинной плазмы плода, что может привести к нарушению программирования производства белковых молекул, но не проявляется при рождении.

Ключевые слова: аминокислотный анализ, плазма пуповинной крови, амниотическая жидкость, COVID-19, маркеры состояния новорожденного Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ грант рег № 20-04-60093.

Вклад авторов: Н. А. Ломова — анализ клинических данных, систематический анализ, написание рукописи; В. В. Чаговец — проведение метаболомного анализа методом масс-спектрометрии, статистический анализ полученных данных, редактирование рукописи; Е. Л. Долгополова — сбор и подготовка биологических сред в условиях «красной зоны», статистический анализ результатов; А. В. Новоселова — проведение метаболомного анализа методом масс-спектрометрии, обработка масс-спектрометрических данных; У. Л. Петрова — сбор и подготовка биологических сред в условиях «красной зоны»; Р. Г. Шмаков — анализ клинических данных в условиях «красной зоны», систематический анализ, редактирование рукописи; В. Е. Франкевич — подготовка исследования, систематический анализ, написание и редактирование рукописи.

Соблюдение этических стандартов: исследование одобрено этическим комитетом НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова (протокол № 13 от 10 декабря 2020 г), проведено в соответствии с требованиями Хельсинкской декларации, Международной конференции по гармонизации (ICF), Стандартов надлежащей клинической практики (GCP), ФЗ № З23-Ф3 от 21 ноября 2011 г. «Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации»; все пациентки подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании.

1^1 Для корреспонденции: Наталья Анатольевна Ломова

ул. Академика Опарина, д. 4, г. Москва, 117997; natasha-lomova@yandex.ru

Статья получена: 24.05.2021 Статья принята к печати: 18.06.2021 Опубликована онлайн: 29.06.2021 DOI: 10.24075/vrgmu.2021.032

CHANGES IN AMINO ACID PROFILE OF CORD BLOOD PLASMA AND AMNIOTIC FLUID OF MOTHERS WITH COVID-19

Lomova NA Chagovets VV, Dolgopolova EL, Novoselova AV, Petrova UL, Shmakov RG, Frankevich VE

National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V I. Kulakov, Moscow, Russia

Neonates born to mothers with COVID-19 are at risk for infection, they may have high risk of complications during the neonatal period, and long-term health consequences. The study was aimed to define the amino acid profile of blood plasma and amniotic fluid in patients with COVID-19 in order to assess the relationship between the COVID-19 infection during the antenatal period, and metabolomic alterations in the "intrauterine" patient. The levels of 31 amino acids in the samples of amniotic fluid and cord blood plasma of pregnant women with COVID-19, obtained during delivery, were assessed by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry. The index group included 29 patients with confirmed diagnosis of COVID-19, and the control group included 17 healthy women with uncomplicated pregnancies. There were significant (p < 0.05) differences in the concentrations of eight amino acids between the studied groups. Logistic regression models were developed (sensitivity 0.84; specificity 1) making it possible to define, whether the assessed amniotic fluid was obtained from COVID-19 patients. Significant differences in the concentrations of four amino acids were observed in the umbilical cord blood. The models developed made it possible to define whether the studied cord blood plasma belonged to controls or to COVID-19 patients (sensitivity and specificity 1). Three amino acids were detected, and their levels were significantly different in COVID-19 patients simultaneously in two points (amniotic fluid and cord blood plasma), depicting the fetal metabolome in a holistic manner. The impact of the virus on those infected results in pronounced metabolomic alterations in the amniotic fluid and the fetal cord blood plasma, which may lead to impaired programming of protein production, but never show up at birth.

Keywords: amino acid analysis, cord blood plasma, amniotic fluid, COVID-19, markers of neonatal condition

Funding: the study was supported by RFBR grant №. 20-04-60093.

Author contribution: Lomova NA — analysis of clinical data, systematic analysis, manuscript writing; Chagovets VV — mass spectrometry-based metabolome analysis, statistical analysis of the results, manuscript editing; Dolgopolova EL — collection and preparation of biological matrix samples in the red zone, statistical analysis of the results; Novoselova AV — mass spectrometry-based metabolome analysis, mass spectrometry data processing; Petrova UL — collection and preparation of biological matrix samples in the red zone; Shmakov RG — analysis of clinical data in the red zone, systematic analysis, manuscript editing; Frankevich VE — preparation of the study, systematic analysis, manuscript writing and editing.

Compliance with ethical standards: the study was approved by the Ethics Committee of the National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V I. Kulakov (protocol № 13 dated December 10, 2020); the study met the requirements of the Declaration of Helsinki, International Conference on Harmonization (ICF), Good Clinical Practice (GCP), and Federal Law No. 323-FZ "On the Basics of Protecting Citizens' Health in the Russian Federation" of November 21, 2011; the informed consent was submitted by all patients.

[X] Correspondence should be addressed: Natalia А. Lomova Oparina, 4, Moscow, 117997; natasha-lomova@yandex.ru

Received: 24.05.2021 Accepted: 18.06.2021 Published online: 29.06.2021

DOI: 10.24075/brsmu.2021.032

Вспышка тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 8АЯ8-СоУ-2, началась в Ухане (Китай) в 2019 г. и быстро привела к всемирной пандемии, которая поставила системы здравоохранения стран перед необходимостью оказания интенсивной терапии огромному числу пациентов. Из-за быстрого распространения число заболеваний во всем мире увеличивается каждый день. Только в России на сегодняшний день зарегистрировано более 4 700 000 подтвержденных случаев заражения СОУЮ-19. Беременные женщины представляют собой уязвимую группу населения, восприимчивую к инфекции СОУЮ-19 из-за физиологических изменений иммунологических показателей и показателей кровообращения. Дети от матерей, инфицированных СОУЮ-19, подвержены риску заражения, а также высокому риску осложнений в раннем неонатальном периоде и отдаленных последствий для здоровья. Непосредственно для СОУЮ-19 такие последствия еще не изучены, однако исследования, выполненные для вируса гриппа, позволяют предположить их потенциальную возможность [1, 2]. До сих пор мало известно о перинатальной и неонатальной инфекции СОУЮ-19, а текущая информация основана преимущественно на отчетах о единичных случаях. Одно из первых и самых крупных исследований касается 33 новорожденных от матерей с подтвержденным диагнозом СОУЮ-19 [3]. Было постулировано несколько путей передачи вируса, включая послеродовую передачу (горизонтальную), транс-плацентарную передачу, а также через околоплодные воды и грудное молоко [4-12]. Первое исследование, описывающее клинические характеристики и изучающее возможность вертикальной передачи 8АЯ8-СоУ-2 у девяти беременных с лабораторно подтвержденным СОУЮ-19, продемонстрировало отсутствие доказательств вертикальной передачи [11, 13]. Однако в последнее время в литературе появляются сообщения о единичных случаях вертикальной передачи вируса, а также о тяжелых заболеваниях в антенатальном периоде у беременных [14, 15]. Так, продемонстрирована трансплацентарная передача вируса, подтвержденная комплексными вирусологическими тестами на плаценте, а также симптомами и клиническими проявлениями у новорожденных [16].

По фундаментальным причинам метаболом является более чувствительным и динамичным индикатором биохимического статуса клетки и организма, чем протеом или транскриптом [17]. Метаболомный анализ образцов пациентов с инфекцией СОУЮ-19 дает возможность понять биохимические изменения, связанные с плохо изученными процессами, поскольку он показывает воздействие вируса на хозяина, а не просто присутствие инфекционного агента. Метаболомные исследования могут предоставить набор маркеров, потенциально имеющих важное значение для подтверждения инфекции 8АЯ8-СоУ-2, а также для определения тяжести заболевания и возможного исхода. Недавно показано, что 204 метаболита в плазме крови пациентов с СОУЮ-19 коррелируют с тяжестью заболевания [18]. Аминокислоты, являющиеся частью метаболома, незаменимы во всех процессах жизнедеятельности человека. Биологическая роль около трехсот аминокислот в нашем организме неоценима. Без необходимого количества аминокислот организм не может эффективно развиваться. Именно поэтому существуют оптимальные уровни аминокислот в организме, обеспечивающие сбалансированные обменные процессы. Отклонение концентрации

аминокислот от референсных значений может указывать на развитие конкретного заболевания. Так, концентрации аминокислот изменяются при инфицировании вирусом песчаной мухи [19], при пневмонии, вызванной вирусом гриппа И1Ы1 [20], при хронической обструктивной болезни легких [21]. Ряд неонатальных патологий выявляют путем анализа аминокислот в сухой капле крови [22]. Исследования низкомолекулярных промежуточных продуктов метаболизма в биологических системах приобретают все большее значение в последние годы, поскольку позволяют лучше понять взаимодействие и регуляцию метаболических путей человека. Связанные с заболеваниями изменения метаболических профилей физиологических жидкостей человеческого организма исследуют для выяснения патофизиологии сложных заболеваний. Например, метаболомный анализ показал, что изменение метаболизма аминокислот коррелирует с изменением гомеостаза кислорода у пациентов с СОУЮ-19 [23]. Еще в одном исследовании аминокислотных профилей у взрослых и детей с СОУЮ-19 выявлены изменения, которые могут быть связаны с эндотелиальной дисфункцией и нарушением регуляции Т-лимфоцитов [24]. Различные метаболические процессы могут быть охарактеризованы путем измерения концентраций аминокислот [25].

Таким образом, целью исследования было определить влияние СОУЮ-19 на аминокислотный состав амниотической жидкости и плазмы пуповинной крови для разработки диагностической панели и влияние возможных последствий на состояние новорожденного, к которым могут привести изменения метаболизма аминокислот.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В период с марта по май 2020 г. в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова была создана «красная зона», где проходили лечение и обследование пациенты с диагнозом СОУЮ-19, в том числе беременные женщины. Подготовлено 190 коек для лечения пациентов с СОУЮ-19 и 60 коек акушерского профиля.

В исследование были включены 46 беременных, которые поступили и были родоразрешены в НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова. Основную группу составили 29 пациенток с подтвержденным диагнозом СОУЮ-19; контрольную группу составили 17 соматически здоровых женщин с беременностью без осложнений. Диагноз СОУЮ-19 был подтвержден с помощью ПЦР-теста («ДНК-Технология»; Россия). Включение в группу происходило по мере обращения. Критерии включения в I группу: наличие СОУЮ-19, установленной по данным молекулярно-генетического обследования (ПЦР); критерии включения во II группу: отсутствие СОУЮ-19 по данным клинического обследования, результатам ПЦР-исследования. Критерии исключения: многоплодная беременность; отсутствие резус- и АВ0-изоиммунизации, хромосомных аномалий, генетических мутаций и врожденных пороков развития у плода. Для анализа были собраны пуповинная плазма и амниотическая жидкость.

Образцы биологических жидкостей собирали у всех пациентов на базе 1-го инфекционного отделения НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова «красная зона» с проведением предварительной подготовки и хранения образцов. Транспортировку и последующий анализ осуществляли на

территории НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова в помещениях, сертифицированных для работы с пробами 2-го класса опасности. В работе использовали стандартный набор и модифицированный протокол для приготовления и последующего анализа 31 аминокислоты в физиологических жидкостях (JASEM; Турция). Набор содержит две различных калибровочных смеси лиофилизированных аминокислот, смесь внутренних стандартов, лиофилизированную смесь для контроля качества анализа, подвижные фазы A и B, «Реагент 1» (кат. № JSM-CL-503), используемый при приготовлении образцов плазмы, а также колонку для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) аминокислот (кат. № JSM-CL-575).

В процессе подготовки к анализу 50 мкл образца смешивали с 50 мкл раствора внутренних стандартов, перемешивали в течение 5 с, добавляли 700 мкл Реагента-1, перемешивали повторно 15 с, центрифугировали 3 мин со скоростью 3000 об./мин, после чего переносили надосадочную жидкость в хроматографическую виалу. Подготовку и хранение анализируемых образцов и вспомогательных растворов производили в соответствии с руководством JASEM.

Анализ образцов осуществляли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе 1260 Infinity II (Agilent; США) с детектированием на масс-спектрометре 6460 Triple Quad (Agilent; США).

Транзитные переходы между родительскими ионами и дочерними фрагментами для анализируемых аминокислот, соответствующие им хроматографические времена удержания, концентрации внутренних стандартов, а также сведения о чувствительности и воспроизводимости анализа представлены в руководстве JASEM.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с помощью скриптов, написанных на языке R (R Core Team, Vienna, Austria, в Rstudio; R. RStudio, Inc.; Boston).

Статистический анализ проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Для описания количественных данных использовали медианы (Me) и квартили Q1 и Q3 в формате Me (Q1; Q3). Величину порогового уровня значимости p принимали равной 0,05. Если значение p было меньше 0,001, то p указывали в формате p < 0,001.

Для оценки возможности классификации пациентов по группам на основании исследуемых параметров были разработаны модели логистической регрессии. В качестве

Таблица 1. Клиническая характеристика беременных женщин c COVID-19

зависимых переменных в моделях рассматривали все возможные комбинации аминокислот. В качестве независимой переменной выступала принадлежность пациентки к группе. Из всех разработанных моделей выбирали четыре с наибольшей величиной площади под ЯОС-кривой (АиС). Для каждой модели были определены критерий Вальда, 95%-й доверительный интервал (ДИ), отношение шансов (ОШ) и его доверительный интервал. Качество разработанных моделей определяли путем построения ЯОС-кривой, определения площади под ЯОС-кривой, а также расчета чувствительности и специфичности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследование были включены 46 женщин, из которых 29 пациенток находились в стационаре с подтвержденным СОУЮ-19, и 17 женщин, не болевших данной вирусной инфекцией (группа контроля). Средний возраст пациентов составил 30,7 ± 4,9 года, в первой группе средний возраст пациенток 29,9 ± 5,03, в группе контроля 32,0 ± 5,03. Индекс массы тела в обеих группах значимо не отличался: в первой группе 27,85 ± 4,52, во второй 26,12 ± 3,16.

Основными клиническими симптомами были кашель (41,38%), потеря обоняния (24,14%) и гипертермия (41,38%) (табл. 1). Бессимптомное течение СОУЮ-19 зарегистрировано в 8 (28,59%) случаях. Легкие, средние и тяжелые случаи составили 22 (75,86%), 6 (20,69%) и 1 (3,45%) случаев соответственно.

По данным компьютерной томографии (КТ) в 25% случаев характерные признаки вирусной пневмонии отсутствовали (СТ-0). Высокая вероятность вирусной пневмонии с минимальным объемом пораженной легочной ткани была выявлена у 40% женщин (СТ-1). Высокая вероятность вирусной пневмонии с поражением 25-50% объема легочной ткани (СТ-2) отмечена у 10% женщин. Высокая вероятность вирусной пневмонии с поражением 50-75% объема легочной ткани (СТ-3) была выявлена у 10% пациенток, с критическим объемом пораженной легочной ткани > 75% (СТ-4) — в 15% случаев.

В группе пациенток с подтвержденным СОУЮ-19 срок родоразрешения 38 ± 1,52 недель беременности достоверно отличался, в сравнении с группой контроля 39,42 ± 1,14 недель (р = 0,001). Вероятно, это связано с тем, что в группе СОУЮ-19 в четырех случаях (13,8%) были преждевременные роды, однако причины досрочного родоразрешения не связаны с тяжестью вирусного заболевания СОУЮ-19. Причинами преждевременного

Клиническая характеристика COVID-19

Наличие симптомов 21

Повышенная температура

Потеря обоняния 7

Боль в горле 3

Одышка 4

Кашель 12

Утомляемость 4

Легкая степень тяжести 22

Средняя степень тяжести 6

Тяжелая степень тяжести 1

Таблица 2. Клиническая характеристика беременных женщин, включенных в исследование

COVID-19 (п= 29) Контроль (п = 17) P

Возраст, лет 29,9 (± 5,03) 32,0 (± 5,03) 0,16

Рост, см 166,62 (± 7,37) 165,76 (± 7,34) 0,71

Вес, кг 77,64 (± 11,58) 71,87 (± 9,75) 0,10

ИМТ 27.85 (± 4,52) 26.12 (± 3,16) 0,18

Срок родоразрешения, месяцы 38 (± 1,52) 39,42 (± 1,14) 0,001

Масса новорожденного, г 3332 (± 484) 3585 (± 424) 0,08

Рост новорожденного, см 52,4 (± 2,66) 53,1 (± 2,29) 0,35

Апгар на 1-й мин 8 (8;8) 9 (9;9) 0,69

Апгар на 5-й мин 8 (8;8) 9 (9;9) 0,83

родоразрешения послужили в одном случае неготовность мягких родовых путей и наличие рубца на матке, в другом — нарастание тяжести преэклампсии и еще в двух случаях — преждевременное излитие околоплодных вод и начало родовой деятельности. Кесарево сечение выполнено в 13 (44,8%) случаях (ОР: 0,9 [0,5;1,6]), вакуум-экстракция проведена в связи с дистрессом плода в одном (3,5%) случае, остальные роды протекали нормально через естественные родовые пути. В группе контроля было произведено 9 (52,9 %) операций кесарева сечения, в остальных случаях роды произошли через естественные родовые пути. Причинами для операции кесарева сечения послужили наличие одного или более рубца на матке, неправильное положение плода, анатомические особенности таза и заключение смежных специалистов (врача офтальмолога, ортопеда, невролога). В группе СОУЮ-19 средний вес при рождении составил 3332 ± 484 г, в группе контроля — 3585 ± 424 г, средняя длина новорожденных составила 52,4 ± 2,66 см и 53,1 ± 2,29 см соответственно. В обеих группах состояние новорожденных на первой минуте по шкале Апгар оценено в 8 (8; 8) баллов и на пятой минуте 9 (9; 9) баллов (табл. 2).

Случаев СОУЮ-19 у новорожденных не зарегистрировано. Новорожденные сразу после рождения были изолированы от их матерей. При получении двух отрицательных результатов 8АЯ8-СоУ-2 у матерей им разрешали грудное вскармливание. Все новорожденные были протестированы на 8АЯ8-СоУ-2 сразу после рождения, а также на 3-й и 10-й дни после рождения. Все новорожденные получили отрицательные результаты анализов, которые могут свидетельствовать об отсутствии вертикальной передачи инфекции. Случаев перинатальной смерти не зарегистрировано.

На лабораторном этапе работы был применен метод целевой метаболомики с использованием набора для количественного определения 31 аминокислоты методом ВЭЖХ-МС в образцах амниотической жидкости и плазмы пуповинной крови, собранных в Национальном медицинском исследовательском центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика Кулакова. Настоящее исследование было проведено для описания изменений уровня аминокислот новорожденных от матерей, у которых был положительный результат теста на инфекцию СОУЮ-19.

Амниотическая жидкость

При анализе амниотической жидкости была определена концентрация 31 аминокислоты. Статистический анализ полученных экспериментальных данных позволил выявить восемь аминокислот, содержание которых статистически

значимо отличалось при СОУЮ-19 (табл. 3; рис. 1): 1-метилгистидин, 3-метилгистидин, аргинин, цистатионин, цистин, глутамин, гистидин, транс-4-гидроксипролин.

С учетом полученных результатов ВЭЖХ-МС-анализа интерес представляло рассмотрение возможности разработки математической модели, позволяющей отличить амниотическую жидкость пациентов группы СОУЮ-19 от группы контроля. Для этого были построены модели логистической регрессии на базе аминокислот со статистически значимой разницей между исследуемыми группами. Для построения моделей использовали все возможные комбинации аминокислот. Для каждой из моделей был выполнен ЯОС-анализ и выбраны четыре модели с характерной наибольшей площадью под ЯОС-кривой (АиС). В табл. 4 представлены параметры полученных моделей, а на рис. 2 — соответствующие им ЯОС-кривые. Наибольшее значение АиС, равное 0,89, было у модели, построенной на базе аргинина, цистина, гистидина и транс-4-гидроксипролина (табл. 5). Эта модель характеризуется чувствительностью 0,84 и специфичностью 0,93. Несколько более высокие значения чувствительности и специфичности, 0,84 и 1 соответственно, были у модели, построенной на базе 1-метилгистидина, цистина, транс-4-гидроксипролина (табл. 5).

Пуповинная плазма

На следующем этапе работы был проведен анализ аминокислотного профиля пуповинной плазмы в двух группах. Статистический анализ полученных экспериментальных данных позволил выявить четыре аминокислоты, концентрации которых статистически значимо отличались при СОУЮ-19 (табл. 6; рис. 3): 1-метилгистидин, бета-аланин, цистин, гистидин.

Аналогично исследованию амниотической жидкости были построены модели логистической регрессии, позволяющие отличить пуповинную плазму пациентов группы СОУЮ-19 от группы контроля. Результаты разработки и анализа полученных моделей представлены на рис. 4 и в табл. 7, 8. Во все построенные модели вошел цистин, очевидно, как аминокислота наиболее различающаяся между группами. Все модели характеризуются АиС, равным 1, а также чувствительностью и специфичностью, равными 1 (табл. 8).

Особый интерес представляло сравнение аминокислот в амниотической жидкости и пуповинной плазме, которые статистически значимо различаются в группах контроля и СОУЮ-19. В двух точках (амниотическая жидкость и пуповинная плазма), комплексно отображающих метаболом плода, были выявлены и статистически

Таблица 3. Концентрация аминокислот (нмоль/мл) в амниотической жидкости в группах контроля и СОУЮ-19

Аминокислота Контроль СОУЮ-19 р-уа1ие

1-метил-1_-гистидин 9,52 (5,78; 23,54) 0 (0; 4,98) < 0,001

3-метил-1_-гистидин 1,32 (0,14; 2,56) 1,62 (0,48; 5,35) 0,258

3-аминоизомасляная кислота 7,44 (6,38; 9,22) 5,48 (4,4; 6,17) 0,002

01_-5-гидроксилизин 10,31 (9,98; 10,69) 10,28 (9,99; 10,5) 0,591

Этаноламин 45,69 (38,94; 67,65) 35,24 (24,53; 46,3) 0,096

1_-2-аминомасляная кислота 1,5 (1,27; 2,34) 1,27 (1; 2,62) 0,367

1_-2-аминоадипиновая кислота 7,21 (5,39; 10,59) 6,66 (5,24; 9,46) 0,615

1_-аланин 238,74 (179,29; 329,59) 187,36 (136,91; 257,72) 0,302

1_-аргинин 26,59 (22,42; 48,86) 16,25 (8,97; 23,61) 0,006

1_-аспарагин 29,36 (24,49; 40,74) 25,56 (19,32; 41,31) 0,391

1_-аспарагиновая кислота 13,82 (7,9; 29,75) 11,92 (6,64; 62,9) 0,784

1_-карнозин 4,58 (4,43; 5,21) 5,5 (4,54; 6,31) 0,107

1_-цитруллин 8,6 (6,93; 11,43) 7,57 (4,84; 14,52) 0,632

1_-цистатионин 0,96 (0,83; 1,16) 0,8 (0,56; 0,96) 0,036

1_-цистин 39,69 (30,93; 46,09) 15,92 (5,48; 35,06) 0,005

1_-глутаминовая кислота 176,3 (114,37; 215,51) 112,92 (67,26; 176,17) 0,15

1_-глутамин 392,48 (267,94; 450,24) 286,57 (177,62; 369,67) 0,044

1_-глицин 216,37 (189,39; 359,66) 219,92 (156,65; 260,22) 0,43

1_-гистидин 65,35 (34,72; 85,64) 7,9 (0; 30,68) 0,008

1_-лизин 153,56 (113,59; 169,06) 149,15 (105,52; 187,74) 0,973

1_-метионин 16,55 (10,59; 20,68) 11,21 (7,36; 19,59) 0,252

1_-орнитин 24,16 (15,39; 34,42) 42,8 (20,11; 69,65) 0,096

1_-фенилаланин 39,63 (24,82; 51,44) 32 (21,48; 55,77) 0,515

1_-пролин 118,37 (103,97; 154,61) 109,16 (72,85; 125,35) 0,137

1_-серин 65,52 (37,24; 89,78) 50,74 (32,72; 95,85) 0,681

1_-треонин 150,1 (101,89; 211,52) 136,31 (96,46; 172,32) 0,445

1_-триптофан 11,63 (7,7; 13,69) 7,49 (4,36; 14,33) 0,302

1_-тирозин 24,3 (17,75; 38,24) 18,23 (8,22; 47,62) 0,435

1_-валин 378,17 (286,06; 544,61) 412,5 (256,16; 570,82) 0,681

Таурин 12,6 (11,48; 14,32) 12,66 (11,54; 16,48) 0,958

7ранс-4-гидрокси-1_-пролин 18,03 (14,18; 20,08) 13,54 (11,05; 15,96) 0,019

значимо отличались при СОУЮ-19 три аминокислоты: 1-метилгистидин, цистин и гистидин (табл. 9).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Вирусные инфекции вызывают характерные изменения в метаболизме клеток-хозяев, чтобы обеспечить эффективную репликацию вируса [19]. Более того, результирующее метаболическое воздействие и клеточное перепрограммирование варьируют между вирусами (даже в пределах одного семейства) и типом клетки-хозяина.

Полученные данные свидетельствуют о статистически значимом различии концентраций восьми аминокислот в амниотической жидкости и четырех в пуповинной плазме между пациентками с СОУЮ-19 и группой контроля. Причем концентрации восьми аминокислот били снижены у пациенток с СОУЮ-19. Сходные изменения концентраций аминокислот были обнаружены при исследовании плазмы крови взрослых и детей с СОУЮ-19 [24]. Авторы этой работы искали подтверждение своей гипотезе о возможном снижении концентрации

аргинина при СОУЮ-19. Известно, что эндотелиальная дисфункция играет роль в развитии повреждения легких при СОУЮ-19 как у взрослых, так и у детей [27, 28], а низкая биодоступность аргинина связана с развитием эндотелиальной дисфункции и дисрегуляции Т-клеток [29, 30] и вносит вклад в патофизиологию множества заболеваний [31]. Действительно, у больных СОУЮ-19 было обнаружено ожидаемое снижение концентрации аргинина. Кроме того, были значимо снижены и концентрации цитруллина, глутамина, аланина, глицина, гистидина, пролина и нескольких других аминокислот, однако авторы статьи затрудняются объяснить механизмы такого эффекта [24]. Снижение концентрации аминокислот было выявлено и при некоторых других патологиях [19, 21-24, 32, 33].

Особый интерес в нашем исследовании представляло сравнение уровней аминокислот в амниотической жидкости и пуповинной плазме, которые статистически значимо различаются в группах контроля и СОУЮ-19. Одновременно в двух точках (амниотическая жидкость и пуповинная плазма), комплексно отображающих

А

§ 100

:a

о 75

S ^

к 50

s

zS

я

P- 25

œ

Группа E-3 Норма Ф COVID

Б

200

a

-- ——_____*_

Группа

Норма $ COVID

i - i Л ¿Ф

s J*

Аминокислота

В

f 3000 §

нм

Аминокислота

y

^x4

Группа

Норма Ö COVID

__ t^ ч z. — —

#

Аминокислота

Рис. 1. Концентрация аминокислот в амниотической жидкости в группах контроля и COVID-19. Границами бокса служат первый и третий квартили, линия в середине бокса — медиана; концы усов — разность первого квартиля и полуторной величины межквартильного расстояния, сумма третьего квартиля и полуторной величины межквартильного расстояния; * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001; 1-mHis — 1-метилгистидин; 3-mHis — 3-метилгистидин; BAIBA — 3-аминоизомасляная кислота; 5-OH-Lys — 5-гидроксилизин; MEA — этаноламин; ABA — 2-аминомасляная кислота; AAD — 2-аминоадипиновая кислота; Car — карнозин; Cit — цитруллин; Cyt — цистатионин; 4-OH-Pro — 4-гидроксипролин

метаболом плода, были выявлены и статистически значимо отличались при COVID-19 три аминокислоты: 1-метилгистидин, цистин и гистидин.

Одной из трех аминокислот, выявленных сразу в двух средах плода (амниотической жидкости и плазме пуповинной крови), обладающей высокой дифференцирующей значимостью, был L-цистин. Это некодируемая аминокислота, представляющая собой продукт окислительной димеризации цистеина. В ходе

посттрансляционной модификации белков она играет крайне важную роль в формировании и поддержании третичной структуры белков и пептидов и, соответственно, их биологической активности. Так, например, такие гормоны, как вазопрессин, окситоцин, инсулин и соматостатин, приобретают биологическую активность после образования внутримолекулярных дисульфидных мостиков.

Двумя другими аминокислотами со статистически значимой разницей, выявленной в амниотической

Таблица 4. Параметры моделей логистической регрессии, позволяющие дифференцировать пациенток с COVID-19 и без по концентрации аминокислот в амниотической жидкости

№ модели Коэффициент Величина коэффициента Критерий Вальда p-value ДИ ОШ ОШ

2,50% 97,50% 2,50% 97,50%

1 Свободный член 5,8782 2,3394 0,019 1,8187 11,8835 357,17 6,1637 144864

1_-аргинин 0,0091 0,3735 0,709 -0,042 0,0565 1,0091 0,9588 1,0582

1_-цистин -0,0842 -2,2358 0,025 -0,1747 -0,0208 0,9192 0,8397 0,9794

1_-гистидин 0,0129 1,1644 0,244 -0,0063 0,0386 1,013 0,9937 1,0394

7р>анс-4-гидрокси-1_-пролин -0,2534 -1,7891 0,074 -0,574 -0,0041 0,7762 0,5633 0,9959

2 Свободный член 2,7692 1,7238 0,085 -0,1116 6,3699 15,9456 0,8944 583,996

1-метил-1_-гистидин -0,0336 -1,271 0,204 -0,1107 0,0073 0,9669 0,8952 1,0073

1_-цистин -0,0123 -0,5235 0,601 -0,0621 0,0328 0,9878 0,9398 1,0333

7р>анс-4-гидрокси-1_-пролин -0,1114 -1,0398 0,298 -0,3392 0,0951 0,8946 0,7123 1,0998

3 Свободный член 2,7231 1,6899 0,091 -0,152 6,3672 15,2278 0,859 582,4

1-метил-1_-гистидин -0,0339 -1,2824 0,2 -0,1109 0,0071 0,9667 0,895 1,0071

1_-цистин -0,0156 -0,5326 0,594 -0,0792 0,0395 0,9845 0,9239 1,0402

1_-глутамин 7,00E-04 0,1925 0,847 -0,0066 0,0082 1,0007 0,9934 1,0082

7ранс-4-гидрокси-1_-пролин -0,116 -1,0585 0,29 -0,3503 0,0978 0,8905 0,7045 1,1027

4 Свободный член 5,1861 2,146 0,032 1,2261 11,0587 178,765 3,408 63495,7

1-метил-1_-гистидин -0,0272 -0,8762 0,381 -0,1263 0,0193 0,9731 0,8813 1,0195

1_-цистин -0,0633 -1,6706 0,095 -0,1559 8,00E-04 0,9387 0,8557 1,0008

1_-гистидин 0,0146 2,199 0,028 0,0032 0,0312 1,0147 1,0032 1,0317

7ранс-4-гидрокси 1_-пролин -0,2185 -1,5539 0,12 -0,5408 0,0346 0,8038 0,5823 1,0352

Таблица 5. Характеристики моделей логистической регрессии, позволяющих дифференцировать пациенток с COVID-19 и без по концентрации аминокислот в амниотической жидкости

Аминокислота AUC Пороговое значение Чувствительность Специфичность Положительная предсказательная ценность

L-аргинин, L-цистин, L-гистидин, транс-4-гидрокси-1_-пролин 0,89 0,46 0,84

1-метил-1_-гистидин, L-цистин, транс-4-гидрокси-_-пролин 0,88 0,68 0,84

1-метил-_-гистидин, L-цистин, L-глутамин, транМ-гидрокси^-пролин 0,88 0,67 0,82

^метил^-гистидин, L-цистин, L-гистидин, гранМ-гидрокси^-пролин 0,88 0,65 0,79

Таблица 6. Концентрация аминокислот (нмоль/мл) в пуповинной плазме в группах контроля и COVID-19

Аминокислота Контроль COVID-19 p-value

^метил^-гистидин 0 (0; 1,95) 0 (0; 0) 0,041

3-метил-L-гистидин 3,02 (2,82; 3,46) 3,2 (2,56; 3,68) 0,759

Бета-аланин 1,19 (0,82; 1,61) 2,9 (1,8; 4,35) 0,014

DL-5-гидроксилизин 6,69 (6,48; 6,77) 6,67 (6,56; 6,87) 0,608

Этаноламин 18,77 (14,52; 21,97) 14,75 (13,43; 16,43) 0,104

L-2-аминомасляная кислота 5,97 (1,97; 7,96) 7,04 (3,45; 10,51) 0,255

L-аланин 498,14 (451,48; 554,51) 426,72 (390,15; 530,81) 0,134

L-аргинин 55,2 (42,7; 73,97) 69,1 (51,71; 81,33) 0,23

L-аспарагин 46,5 (43,4; 51) 51,33 (45,72; 53,85) 0,404

L-аспарагиновая кислота 21,69 (12,05; 28,9) 16,66 (11,6; 26,76) 0,753

L-карнозин 2,14 (1,93; 2,3) 2,01 (1,64; 2,33) 0,274

L-цитруллин 11,92 (10,83; 13,47) 11,96 (10,46; 15,18) 0,357

L-цистатионин 0,32 (0,17; 0,46) 0,2 (0,16; 0,42) 0,593

L-цистин 28,93 (26,49; 33,43) 2,55 (1,44; 3,81) < 0,001

L-глутаминовая кислота 138,44 (41,01; 189,32) 92,68 (60,31; 109,28) 0,187

L-глутамин 617,36 (576,47; 725,84) 625,09 (559,72; 689,24) 0,736

L-глицин 277,25 (255,67; 303,25) 259,22 (235,34; 293,13) 0,43

L-гистидин 175,97 (138,84; 206,4) 141,92 (103,55; 175,91) 0,04

L-лизин 410,97 (388,38; 448,61) 451,73 (389,8; 488,91) 0,531

L-метионин 33,11 (27,86; 39) 30,61 (25,81; 39,05) 0,753

L-орнитин 119,5 (100,28; 131,19) 100,77 (83,6; 124,42) 0,123

L-фенилаланин 79,88 (76,47; 94,87) 80,5 (75,99; 88,11) 0,982

L-пролин 159,61 (153,75; 177,18) 158,5 (143,86; 176,18) 0,417

L-серин 132,49 (125,85; 148,56) 143,03 (128,45; 154,13) 0,558

L-треонин 293,9 (231,79; 339,82) 319,48 (276,25; 352,53) 0,23

L-триптофан 77,59 (66,69; 84,57) 73,72 (68,93; 78,29) 0,309

L-тирозин 70,65 (57,22; 78,07) 63,8 (57,51; 77,25) 0,685

Таурин 38,01 (31,1; 49,77) 37,28 (30,51; 46,92) 0,928

Транс-4-гидрокси-L-пролин 20,95 (17,68; 26,64) 20,56 (19,28; 23,57) 0,893

жидкости и плазме пуповинной крови новорожденных от матерей с СОУЮ-19, были 1_-гистидин и его производное 1-метилгистидин.

_-гистидин — гетероциклическая альфа-аминокислота, одна из 20 протеиногенных аминокислот и одна из двух условно-незаменимых аминокислот (наряду с аргинином). Первоначально считалось, что незаменима она только для детей. Остаток гистидина входит в состав активных центров множества ферментов. Гистидин является предшественником в биосинтезе гистамина. Гистамин

играет важную роль в развитии воспаления и некоторых аллергических реакций. Гистидин, одна из незаменимых аминокислот, способствует росту и восстановлению тканей, участвует в синтезе эритроцитов и лейкоцитов, а также в формировании миелиновых оболочек нервных клеток. Нехватка гистидина может вызвать ослабление слуха, дегенеративные заболевания, такие как болезни Паркинсона и Альцгеймера.

Наши результаты показали, что вирус может вызывать выраженные изменения в метаболоме амниотической

- L-аргинин, L-цистин, L-гистидин, Транс-4-гидрокси-L-пролин; AUC = 0,888

---1-метил^-гистидин, L-цистин, L-глутамин, Транс-4-гидрокси-L-пролин; AUC = 0,884

--- 1-метил-L-гистидин, L-цистин, L-глутамин, Транс-4-гидрокси-L-пролин; AUC = 0,881 ---- 1-метил-L-гистидин, L-цистин, L-гистидин, Транс-4-гидрокси^-пролин; AUC = 0,881

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Специфичность

Рис. 2. 1ПОС-кривые моделей логистической регрессии, разработанных на основании концентраций аминокислот в амниотической жидкости для классификации пациенток контрольной группы и группы СОУЮ-19

жидкости и плазме пуповиннои крови, что чревато риском нарушения программирования производства белковых молекул. При этом СОУЮ-19 может никак не проявлять себя при рождении. Изменения метаболических процессов путем нарушения необходимого соотношения аминокислот на территории плода, могут быть связаны с репликацией вируса, воспалительной реакцией хозяина и изменениями энергетического метаболизма. Вероятно, данные нарушения метаболома могут проявиться и на момент родоразрешения, но не были зафиксированы в нашем исследовании, ввиду критериев включения в основную группу. Все роженицы болели СОУЮ-19 на момент родоразрешения. И, возможно, именно данный факт не позволил вирусу реализовать на территории плода все свои негативные потенции.

ВЫВОДЫ

В данном исследовании мы использовали методы целевой метаболомики для обнаружения изменений концентрации аминокислот беременных, инфицированных СОУЮ-19, в момент госпитализации. Такие изменения были выявлены. Было обнаружено, что концентрации восьми аминокислот в амниотической жидкости (1-метилгистидин, 3-метилгистидин, аргинин, цистатионин, цистин, глутамин, гистидин, транс-4-гидроксипролин) и четырех аминокислот в пуповинной плазме (1-метилгистидин, бета-аланин, цистин, гистидин) статистически значимо различаются между группой пациентов, инфицированных СОУЮ-19, и контрольной группой. Наша цель состояла в том, чтобы не только найти маркеры заболевания, но и

А

40

20

Группа Е-3 Норма Ó COVID

Б

* a_ . —b *

/

¿г

400-

300-

200-

1000-

^ O^

Группа Норма COVID

Аминокислота

В

§ 2000 м

к

§ 1000

Аминокислота

Группа

Норма Ф COVID

^ ____

&

С*?

Аминокислота

Рис. 3. Концентрация аминокислот в пуповинной плазме в группах контроля и COVID-19. Границами бокса служат первый и третий квартили, линия в середине бокса — медиана; концы усов — разность первого квартиля и полуторной величины межквартильного расстояния, сумма третьего квартиля и полуторной величины межквартильного расстояния; * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001. 1-mHis — 1-метилгистидин; 3-mHis — 3-метилгистидин; bAla — бета-аланин; BAIBA — 3-аминоизомасляная кислота; 5-OH-Lys — 5-гидроксилизин; MEA — этаноламин; ABA - 2-аминомасляная кислота; AD - 2-аминоадипиновая кислота; Car — карнозин; Cit — цитруллин; Cyt — цистатионин; 4-OH-Pro — 4-гидроксипролин

--L-цистин; AUC = 1

" " 1-метил-L-гистидин, L-цистин; AUC = 1

..........Бета-аланин, L-цистин; AUC = 1

--------L-цистин, L-гистидин; AUC = 1

0.6 0.4

Специфичность

0.2

0.0

Рис. 4. ROC-кривые моделей логистической регрессии, разработанных на основании концентраций аминокислот в пуповинной плазме для классификации пациенток контрольной группы и группы с COVID-19

понять, какое влияние инфекция СОУЮ-19 оказывает на метаболом плода. Оказалось, что нарушение метаболизма выявленных аминокислот проявляется при ряде серьезных патологий, таких как острый респираторный дистресс-синдром у пациентов с тяжелым сепсисом, пневмония при гриппе Н1 N1, бактериальная пневмония, серповидноклеточная анемия, талассемия, малярия,

острая астма, муковисцидоз, легочная гипертензия, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые виды рака и др. Эти результаты могут быть использованы для выбора направления дальнейших исследований возможных последствий для здоровья новорожденных от матерей, перенесших СОУЮ-19, и определения требований к лечению и медицинской помощи беременным женщинам и

Таблица 7. Параметры моделей логистической регрессии, позволяющих дифференцировать пациенток с COVID-19 и без по концентрации аминокислот в пуповинной плазме

№ модели Коэффициент Величина коэффициента Критерий Вальда p-value

1 Свободный член 79,204 0,001 0,9992

1_-цистин -5,3827 -0,001 0,9992

2 Свободный член 79,4804 0,001 0,9992

1-метил-_-гистидин 3,1115 3,00E-04 0,9998

_-цистин -5,4032 -0,001 0,9992

3 Свободный член 77,8123 9,00E-04 0,9992

Бета-аланин -1,4597 -2,00E-04 0,9998

_-цистин -5,099 -0,001 0,9992

4 Свободный член 78,9156 9,00E-04 0,9993

_-цистин -5,3946 -0,001 0,9992

_-гистидин 0,0027 0 1

Таблица 8. Характеристики моделей логистической регрессии, позволяющих дифференцировать пациенток с COVID-19 и без по концентрации аминокислот в пуповинной плазме

Аминокислоты AUC Пороговое значение Чувствительность Специфичность Положительная предсказательная ценность

L-цистин 1 0,5 1

1-метил^-гистидин, L-цистин 1 0,5 1

Бета-аланин, L-цистин 1 0,5 1

L-цистин, L-гистидин 1 0,5 1

Таблица 9. Концентрации аминокислот (нмоль/мл) в амниотической жидкости и пуповинной плазме, которые статистически значимо различаются в группах контроля и COVID-19

Образец Аминокислота Контроль COVID-i9 p-value

Амниотическая жидкость ^метил^-гистидин 9,52 (5,78; 23,54) 0 (0; 4,98) < 0,00i

3-метил^-гистидин 7,44 (6,38; 9,22) 5,48 (4,4; 6,i7) 0,002

L-аргинин 26,59 (22,42; 48,86) i6,25 (8,97; 23,6i) 0,006

L-цистатионин 0,96 (0,83; i,i6) 0,8 (0,56; 0,96) 0,036

L-цистин 39,69 (30,93; 46,09) i5,92 (5,48; 35,06) 0,005

L-глутамин 392,48 (267,94; 450,24) 286,57 (i77,62; 369,67) 0,044

L-гистидин 65,35 (34,72; 85,64) 7,9 (0; 30,68) 0,008

7ранс-4-гидрокси^-пролин i8,03 (i4,i8; 20,08) i3,54 (ii,05; i5,96) 0,0i9

Пуповинная плазма ^метил^-гистидин 0 (0; i,95) 0 (0; 0) 0,04i

Бета-аланин i,i9 (0,82; i,6i) 2,9 (i,8; 4,35) 0,0i4

L-цистин 28,93 (26,49; 33,43) 2,55 (i,44; 3,8i) < 0,00i

L-гистидин i75,97 (i38,84; 206,4) i4i,92 (i03,55; i75,9i) 0,04

новорожденным после постановки диагноза СОУЮ-19, так как отдаленные последствия для здоровья данной когорты новорожденных могут включать в себя эндокринные,

нервные и аллергические расстройства, обусловленные метаболомными нарушениями программирования производства белковых молекул в антенатальном периоде.

Литература

1. Mendez-Figueroa H, Raker C, Anderson BL. Neonatal characteristics and outcomes of pregnancies complicated by influenza infection during the 2009 pandemic. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 2011; 204 (6 SUPPL.): 58.

2. Song JY, Park KV, Han SW, Choi MJ, Noh JY, Cheong HJ, et al. Paradoxical long-term impact of maternal influenza infection on neonates and infants. BMC Infect Dis. 2020; 20 (1): 1-8.

3. Zeng L, Xia S, Yuan W, Yan K, Xiao F, Shao J, et al. Neonatal Early-Onset Infection with SARS-CoV-2 in 33 Neonates Born to Mothers with COVID-19 in Wuhan, China. JAMA Pediatr. 2020; 174 (7): 722-5.

4. Yu N, Li W, Kang Q, Zeng W, Feng L, Wu J. No SARS-CoV-2 detected in amniotic fluid in mid-pregnancy. Lancet Infect Dis. 2020. DOI: 10.1016/S1473-3099(20)30320-0.

5. Chen H, Guo J, Wang C, Luo F, Yu X, Zhang W, et al. Clinical characteristics and intrauterine vertical transmission potential of COVID-19 infection in nine pregnant women: a retrospective review of medical records. Lancet. 2020; 395 (10226): 809-15.

6. Zamaniyan M, Ebadi A, Aghajanpoor S, Rahmani Z, Haghshenas M, Azizi S. Preterm delivery, maternal death, and vertical transmission in a pregnant woman with COVID-19 infection. Prenat Diagn. 2020; 40 (13): 1759-61.

7. Sisman J, Jaleel MA, Moreno W, Rajaram V Collins RRJ, Savani RC, et al. Intrauterine Transmission of SARS-COV-2 Infection in a Preterm Infant. Pediatr Infect Dis J. 2020; 265-7.

8. Costa S, Posteraro B, Marchetti S, Tamburrini E, Carducci B, Lanzone A, et al. Excretion of SARS-CoV-2 in human breast milk. Clin Microbiol Infect. 2020; 26 (10): 1430-2.

9. Buonsenso D, Costa S, Sanguinetti M, Cattani P, Posteraro B, Marchetti S, et al. Neonatal Late Onset Infection with Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Am J Perinatol. 2020; 37 (8): 869-72.

10. Qiancheng X, Jian S, Lingling P, Lei H, Xiaogan J, Weihua L, et al. Coronavirus disease 2019 in pregnancy. Int J Infect Dis. 2020; 95: 376-83.

11. Dong L, Tian J, He S, Zhu C, Wang J, Liu C, et al. Possible Vertical Transmission of SARS-CoV-2 from an Infected Mother to Her Newborn. JAMA. 2020; 323 (18): 1846-8.

12. Zhu H, Wang L, Fang C, Peng S, Zhang L, Chang G, et al. Clinical analysis of 10 neonates born to mothers with 2019-nCoV pneumonia. Transl Pediatr. 2020; 9 (1): 51-60.

13. Zeng H, Xu C, Fan J, Tang Y, Deng Q, Zhang W, et al. Antibodies in Infants Born to Mothers with COVID-19 Pneumonia. JAMA.

2020; 323 (18):1848-9.

14. Sukhikh G, Petrova U, Prikhodko A, Starodubtseva N, Chingin K, Chen H, et al. Vertical Transmission of SARS-CoV-2 in Second Trimester Associated with Severe Neonatal Pathology. Viruses. 2021; 13 (3). DOI: 10.3390/v13030447.

15. Ellington S, Strid P Tong VT, Woodworth K, Galang RR, Zambrano LD, et al. Characteristics of women of reproductive age with laboratory-confirmed SARS-COV-2 infection by pregnancy status — United States, January 22-June 7, 2020. Morb Mortal Wkly Rep. 2020; 69 (25): 769-75.

16. Vivanti AJ, Vauloup-Fellous C, Prevot S, Zupan V, Suffee C, Do Cao J, et al. Transplacental transmission of SARS-CoV-2 infection. Nat Commun. 2020; 11 (1). DOI: 10.1038/s41467-020-17436-6.

17. Kell DB, Oliver SG. The metabolome 18 years on: a concept comes of age. Metabolomics. 2016; 12 (10). DOI: 10.1007/ s11306-016-1108-4.

18. Shen B, Yi X, Sun Y, Bi X, Du J, Zhang C, et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-19 Patient Sera. Cell. 2020; 182 (1): 59-72.e15.

19. Wannemacher RW, Pekarek RS, Bartelloni PJ, Vollmer RT, Beisel WR. Changes in individual plasma amino acids following experimentally induced sand fly fever virus infection. Metabolism. 1972; 21 (1): 67-76.

20. Banoei MM, Vogel HJ, Weljie AM, Kumar A, Yende S, Angus DC, et al. Plasma metabolomics for the diagnosis and prognosis of H1N1 influenza pneumonia. 2017; 1-15. DOI: 10.1186/s13054-017-1672-7

21. Inoue S, Ikeda H. Differences in plasma amino acid levels in patients with and without bacterial infection during the early stage of acute exacerbation of COPD. Int J COPD. 2019; 14: 575-83.

22. Moat SJ, George RS, Carling RS. Use of Dried Blood Spot Specimens to Monitor Patients with Inherited Metabolic Disorders. Int J Neonatal Screen. 2020; 6 (2): 1-17.

23. Páez-Franco JC, Torres-Ruiz J, Sosa-Hernández VA, Cervantes-Díaz R, Romero-Ramírez S, Pérez-Fragoso A, et al. Metabolomics analysis reveals a modified amino acid metabolism that correlates with altered oxygen homeostasis in COVID-19 patients. Sci Rep. 2021; 11 (1). DOI: 10.1038/s41598-021-85788-0.

24. Rees CA, Rostad CA, Mantus G, Anderson EJ, Chahroudi A, Jaggi P. Altered amino acid profile in patients with SARS-CoV-2 infection. 2021; 118 (25): 4-6.

25. Hirschel J, Vogel M, Baber R, Garten A, Beuchel C, Dietz Y, et al. Relation of whole blood amino acid and acylcarnitine metabolome

to age, sex, BMI, puberty, and metabolic markers in children and adolescents. Metabolites. 2020; 10 (4). DOI: 10.3390/ metabo10040149.

26. Thaker SK, Chng J, Christofk HR. Viral hijacking of cellular metabolism. BMC Biol. 2019; 17 (1): 59.

27. Diorio C, McNerney KO, Lambert M, Paessler M, Anderson EM, Henrickson SE, et al. Evidence of thrombotic microangiopathy in children with SARS-CoV-2 across the spectrum of clinical presentations. Blood Adv. 2020; 4 (23): 6051-63.

28. Tay MZ, Poh CM, Renia L, MacAry PA, Ng LFP. The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention. Nature Reviews Immunology. 2020; 20 (6): 363-74.

29. Gambardella J, Khondkar W, Morelli MB, Wang X, Santulli G, Trimarco V. Arginine and endothelial function. Biomedicines. 2020; 8 (8): 277.

References

1. Mendez-Figueroa H, Raker C, Anderson BL. Neonatal characteristics and outcomes of pregnancies complicated by influenza infection during the 2009 pandemic. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 2011; 204 (6 SUPPL.): 58.

2. Song JY, Park KV, Han SW, Choi MJ, Noh JY, Cheong HJ, et al. Paradoxical long-term impact of maternal influenza infection on neonates and infants. BMC Infect Dis. 2020; 20 (1): 1-8.

3. Zeng L, Xia S, Yuan W, Yan K, Xiao F, Shao J, et al. Neonatal Early-Onset Infection with SARS-CoV-2 in 33 Neonates Born to Mothers with COVID-19 in Wuhan, China. JAMA Pediatr. 2020; 174 (7): 722-5.

4. Yu N, Li W, Kang Q, Zeng W, Feng L, Wu J. No SARS-CoV-2 detected in amniotic fluid in mid-pregnancy. Lancet Infect Dis. 2020. DOI: 10.1016/S1473-3099(20)30320-0.

5. Chen H, Guo J, Wang C, Luo F, Yu X, Zhang W, et al. Clinical characteristics and intrauterine vertical transmission potential of COVID-19 infection in nine pregnant women: a retrospective review of medical records. Lancet. 2020; 395 (10226): 809-15.

6. Zamaniyan M, Ebadi A, Aghajanpoor S, Rahmani Z, Haghshenas M, Azizi S. Preterm delivery, maternal death, and vertical transmission in a pregnant woman with COVID-19 infection. Prenat Diagn. 2020; 40 (13): 1759-61.

7. Sisman J, Jaleel MA, Moreno W, Rajaram V Collins RRJ, Savani RC, et al. Intrauterine Transmission of SARS-COV-2 Infection in a Preterm Infant. Pediatr Infect Dis J. 2020; 265-7.

8. Costa S, Posteraro B, Marchetti S, Tamburrini E, Carducci B, Lanzone A, et al. Excretion of SARS-CoV-2 in human breast milk. Clin Microbiol Infect. 2020; 26 (10): 1430-2.

9. Buonsenso D, Costa S, Sanguinetti M, Cattani P, Posteraro B, Marchetti S, et al. Neonatal Late Onset Infection with Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Am J Perinatol. 2020; 37 (8): 869-72.

10. Qiancheng X, Jian S, Lingling P, Lei H, Xiaogan J, Weihua L, et al. Coronavirus disease 2019 in pregnancy. Int J Infect Dis. 2020; 95: 376-83.

11. Dong L, Tian J, He S, Zhu C, Wang J, Liu C, et al. Possible Vertical Transmission of SARS-CoV-2 from an Infected Mother to Her Newborn. JAMA. 2020; 323 (18): 1846-8.

12. Zhu H, Wang L, Fang C, Peng S, Zhang L, Chang G, et al. Clinical analysis of 10 neonates born to mothers with 2019-nCoV pneumonia. Transl Pediatr. 2020; 9 (1): 51-60.

13. Zeng H, Xu C, Fan J, Tang Y, Deng Q, Zhang W, et al. Antibodies in Infants Born to Mothers with COVID-19 Pneumonia. JAMA. 2020; 323 (18):1848-9.

14. Sukhikh G, Petrova U, Prikhodko A, Starodubtseva N, Chingin K, Chen H, et al. Vertical Transmission of SARS-CoV-2 in Second Trimester Associated with Severe Neonatal Pathology. Viruses. 2021; 13 (3). DOI: 10.3390/v13030447.

15. Ellington S, Strid P Tong VT, Woodworth K, Galang RR, Zambrano LD, et al. Characteristics of women of reproductive age with laboratory-confirmed SARS-COV-2 infection by pregnancy status — United States, January 22-June 7, 2020. Morb Mortal Wkly Rep. 2020; 69 (25): 769-75.

30. Rodriguez PC, Ochoa AC. Arginine regulation by myeloid derived suppressor cells and tolerance in cancer: Mechanisms and therapeutic perspectives. Immunological Reviews. 2008; 222 (1): 180-91.

31. Morris CR, Hamilton-Reeves J, Martindale RG, Sarav M, Ochoa Gautier JB. Acquired Amino Acid Deficiencies: A Focus on Arginine and Glutamine. In: Nutrition in Clinical Practice. SAGE Publications Inc.: 2017; 30S-47S.

32. IKEDA H. Plasma amino acid levels in individuals with bacterial pneumonia and healthy controls. 2020; 1-17. DOI: 10.21203/ rs.3.rs-18796/v1.

33. Ware LB, Magarik JA, Wickersham N, Cunningham G, Rice TW, Christman BW, et al. Low plasma citrulline levels are associated with acute respiratory distress syndrome in patients with severe sepsis. Crit Care. 2013; 17 (1): 1-8.

16. Vivanti AJ, Vauloup-Fellous C, Prevot S, Zupan V, Suffee C, Do Cao J, et al. Transplacental transmission of SARS-CoV-2 infection. Nat Commun. 2020; 11 (1). DOI: 10.1038/s41467-020-17436-6.

17. Kell DB, Oliver SG. The metabolome 18 years on: a concept comes of age. Metabolomics. 2016; 12 (10). DOI: 10.1007/ s11306-016-1108-4.

18. Shen B, Yi X, Sun Y, Bi X, Du J, Zhang C, et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of COVID-19 Patient Sera. Cell. 2020; 182 (1): 59-72.e15.

19. Wannemacher RW, Pekarek RS, Bartelloni PJ, Vollmer RT, Beisel WR. Changes in individual plasma amino acids following experimentally induced sand fly fever virus infection. Metabolism. 1972; 21 (1): 67-76.

20. Banoei MM, Vogel HJ, Weljie AM, Kumar A, Yende S, Angus DC, et al. Plasma metabolomics for the diagnosis and prognosis of H1N1 influenza pneumonia. 2017; 1-15. DOI: 10.1186/s13054-017-1672-7

21. Inoue S, Ikeda H. Differences in plasma amino acid levels in patients with and without bacterial infection during the early stage of acute exacerbation of COPD. Int J COPD. 2019; 14: 575-83.

22. Moat SJ, George RS, Carling RS. Use of Dried Blood Spot Specimens to Monitor Patients with Inherited Metabolic Disorders. Int J Neonatal Screen. 2020; 6 (2): 1-17.

23. Páez-Franco JC, Torres-Ruiz J, Sosa-Hernández VA, Cervantes-Díaz R, Romero-Ramírez S, Pérez-Fragoso A, et al. Metabolomics analysis reveals a modified amino acid metabolism that correlates with altered oxygen homeostasis in COVID-19 patients. Sci Rep. 2021; 11 (1). DOI: 10.1038/s41598-021-85788-0.

24. Rees CA, Rostad CA, Mantus G, Anderson EJ, Chahroudi A, Jaggi P. Altered amino acid profile in patients with SARS-CoV-2 infection. 2021; 118 (25): 4-6.

25. Hirschel J, Vogel M, Baber R, Garten A, Beuchel C, Dietz Y, et al. Relation of whole blood amino acid and acylcarnitine metabolome to age, sex, BMI, puberty, and metabolic markers in children and adolescents. Metabolites. 2020; 10 (4). DOI: 10.3390/ metabo10040149.

26. Thaker SK, Chng J, Christofk HR. Viral hijacking of cellular metabolism. BMC Biol. 2019; 17 (1): 59.

27. Diorio C, McNerney KO, Lambert M, Paessler M, Anderson EM, Henrickson SE, et al. Evidence of thrombotic microangiopathy in children with SARS-CoV-2 across the spectrum of clinical presentations. Blood Adv. 2020; 4 (23): 6051-63.

28. Tay MZ, Poh CM, Rénia L, MacAry PA, Ng LFP. The trinity of COVID-19: immunity, inflammation and intervention. Nature Reviews Immunology. 2020; 20 (6): 363-74.

29. Gambardella J, Khondkar W, Morelli MB, Wang X, Santulli G, Trimarco V. Arginine and endothelial function. Biomedicines. 2020; 8 (8): 277.

30. Rodríguez PC, Ochoa AC. Arginine regulation by myeloid derived suppressor cells and tolerance in cancer: Mechanisms and therapeutic perspectives. Immunological Reviews. 2008; 222 (1): 180-91.

31. Morris CR, Hamilton-Reeves J, Martindale RG, Sarav M,

Ochoa Gautier JB. Acquired Amino Acid Deficiencies: A Focus on Arginine and Glutamine. In: Nutrition in Clinical Practice. SAGE 33. Publications Inc.: 2017; 30S-47S. 32. IKEDA H. Plasma amino acid levels in individuals with bacterial pneumonia and healthy controls. 2020; 1-17. DOI: 10.21203/

rs.3.rs-18796/v1.

Ware LB, Magarik JA, Wickersham N, Cunningham G, Rice TW, Christman BW, et al. Low plasma citrulline levels are associated with acute respiratory distress syndrome in patients with severe sepsis. Crit Care. 2013; 17 (1): 1-8.