Тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
TEST SYSTEM FOR GENOME DETECTION OF ROTAVIRUS AGENT OF TYPE A IN AGRICULTURAL ANIMALS BY MEANS OF MULTIPLEX POLYMERASE CHAIN REACTION WITH FLUORESCENT DETECTION IN REAL TIME

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к средствам диагностики ротовирусной инфекции у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований.
Известна тест-система для обнаружения РНК вируса инфекционной болезни, путем проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя инфекции олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда и контрольных образцов (патент РФ №2515916, кл. C12N 15/11, 2014).
Также известна тест-система для обнаружения генома возбудителя ротовирусной инфекции с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с детекцией в режиме реального времени, включающий буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для ротавируса А, смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE и обратной транскриптазы MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE; буфер для разведения РНК в виде деионизованной воды, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, (патент РФ №2506317, C12Q 1/68, 2014 г. - прототип).
Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности диагностики ротовирусной инфекции у животных.
Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и получение достоверной диагностики с помощью ОТ - ПЦР в реальном времени.
3
Технический результат достигается тем, что в тест-системе для обнаружения генома возбудителя ротовируса типа А у сельскохозяйственных животных с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, включающей буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, праймеров и флуоресцентных зондов специфичные для ротавируса А, смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE и обратной транскриптазы MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE, буфер для разведения РНК в виде деионизованной воды, внутренний контрольный образец, отрицательный контрольный образец, положительный контрольный образец, согласно изобретению для внутреннего контрольного образца используют суспензию бактериофага MS2 с концентрацией 5×10/мл, а для положительного контрольного образца используют смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса RVA и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1, со следующими нуклеотидными последовательностями:
RVAF5 5'- ATTTCAGTTGATGAGACCA -3'; прямой праймер;
RVAR6 5'- CAATTCTAAGCGTGAGTCC -3' обратный праймер;
зонд RVAP FAM - 5'-AATATGACACCAGCGGTA-3'- BHQ1,
MS2F, 5'-TGGCACTACCCCTCTCCGTATTCAC-3'- прямой праймер;
MS2R, 5'-GTACGGGCGACCCCACGATGAC-3'- обратный праймер;
зонд MS2P, Су5 5'-CACATCGATAGATCAAGGTGCCTACAAGC-3' BHQ2.
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для получения достоверной диагностики ротовирусной инфекции животных используют тест-систему с использованием специфичных для участка генома ротавируса типа А олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда и разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со с специфическими к нему праймерами и зондом.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной вирусологии, а именно в качестве средств диагностики ротовирус А у животных, как в практике ветеринарной службы, так и для научных исследований, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Использование заявляемых олигонуклеотидных праймеров RVAF5, RVAR6 и флуоресцентно-меченного зонда RVAP обеспечивает специфическое выявление РНК ротавируса типа А у животных.
Использование разных видов контроля для которых используют различные формы материала бактериофага MS2: суспензия и фрагмент генома со специфическими к нему праймерами и зондом, бактериофага MS2 обусловлено тем, что это позволяет контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения РНК из образцов.
Для выбора последовательности и расчета первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов, был проведен сравнительный анализ доступных в базе данных GenBank нуклеотидных последовательности гена RVP6, кодирующего белок внутренней оболочки капсида вируса и являющегося важнейшим компонентом вириона (inner capsid protein gene) ротавирусов, входящих в семейство реовирусов. Как и другие представители этого семейства, ротавирусы обладают двунитевой фрагментированной РНК, размером порядка 18 500 пар нукдеотидов.
С помощью программы "BioEdit 7.0" выравнены нуклеотидные последовательности гена VP6 генома вирусов - представителей родов Ротавирусов (А-Н видов) и орбивирусов последовательностью гена VP6 генома ротавируса А изолята NCDV (Bovine rotavirus NCDV inner capsid protein VP6 mRNA (код доступа AF317127). В результате анализа построенного элайнмента
внутри гена капсидного белка VP6 выбран участок между 500 и 900 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности. С помощью программы "Oligo 6.0" рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд RVAP, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров RVAF5 и RVAR6. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
С помощью программы "Oligo 6.0" проанализирована нуклеотидная последовательность бактериофага MS2 (Enterobacteria phage MS2 isolate ST4, complete genome.ACCESSION EF204940). Бактериофаг MS2 содержит однонитевую позитивно ориентрованную РНК размером 3569 оснований. В результате анализа внутри гена белка `созревания` (maturation protein) выбран участок между 200 и 350 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд MS2P, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров MS2F и MS2R. Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
Пример применения тест- системы для выявления генома
возбудителя ротовируса типаА у животных
Для исследования используют следующий материал:
- фекалии весом 5 г. отбирают в стерильный пластиковый контейнер.
3
- из тканей кишечника вырезают кусочки размером 1 см и помещают в стерильный контейнер. Далее обрабатывают исследуемый материал.
Пробы тканей кишечника с содержимым (до 1 г) гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 9000 об/мин в течение 1 мин. Аликвоту надосадочной жидкости (0,1 мл) используют для экстракции РНК.
Из фекалий (1-5 г) готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе. Взвесь фекалий декантируют в течение 5-10 минут. Отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в чистую пробирку 1,5 мл, центрифугируют при 5000 об./мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf, в течение 5 мин. Экстракцию РНК из осветленного экстракта фекалий проводят по возможности, сразу. При необходимости хранения замораживают.
Анализ проводят с помощью набора реагентов (см. таблицу 1 и 2). «ПЦР-РОТАВИРУС-ФАКТОР» Технические условия ТУ 21.10.60-102-51062356-2015, ранее 9398-102-51062356-2015 «ПЦР-РОТАВИРУС-ФАКТОР, http://www.vetfaktor.ru/» набор реагентов для выявления РНК ротавируса типа А в клиническом материале методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Анализ состоит из трех этапов:
- экстракция НК;
- проведение ОТ-ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;
- учет результатов анализа.
Реакция ОТ-ПЦР РВ проводится в одной пробирке.
Экстракция (выделение) НК из исследуемых проб
Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для ОКО (отрицательный контрольный образец), по 10 мкл ВКО RVA (внутренний контрольный образец).
В набор не входят реактивы для экстракции НК. Выделение РНК может проводиться, например, с помощью наборов на основе сорбционного метода, в состав которых входит силика или микроцентрифужные колонки, наборов на основе фенол-хлороформной экстракции и т.п. Рекомендуется использовать набор «ДНК/РНК-С-ФАКТОР» http://www.vetfaktor.ru/ либо аналогичный.
Подготовка образцов к проведению ПЦР
Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем РНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием ПКО RV, ВКО RV и РНК буфера.
При формировании ПКО количество внесенных рекомбинантных плазмид составляет 5000 копий специфического фрагмента в 1 мкл.
Буфер для проведения ОТ-ПЦР, ПЦР буфер RV; состав: 2,5х ПЦР-буфер (хлорид калия, 100 мМ, Трис-HCl, рН 8,8 100 мМ, глицерол 1%, Tween-20 0.02%); хлорид магния, 5 мМ; деионизированная вода.
- Смесь для проведения ПЦР, ПЦР-смесь RV состав: эквимолярная смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ) в концентрации 0,25 мМ («Синтол», Россия); деионизированная вода, для ПКО: смесь праймеров и флуоресцентного зонда на ротавирус А (прямой и обратный праймеры RVF и RVR в концентрации 0,2 мкМ, зонд RVP-FAM в концентрации 0,1 мкМ, т.е. в соотношении 1:1:0,5), смесь праймеров и флуоресцентного зонда на (бактериофага MS2) (прямой и обратный праймеры MS2F и MS2R с концентрацией 0,2 мкМ, зонд MS2P -Су5 в концентрации 0,1 мкМ, в соотношении 1:1:0,5) («Синтол», Россия). Смесь праймеров и флуоресцентного зонда на ротавирус А и смесь праймеров и флуоресцентного зонда на бактериофага MS2 берется в соотношении 1:1.
Смесь ферментов, RT PCR ENZ, состав: ДНК полимераза с антителами, ингибирующими активность фермента, TAQ POLYMERASE (5 ед/мкл) («Альфа-фермент», Россия), обратная транскриптаза MMLV REVERSE TRANSCRIPTASE (100 ед/мкл) («Альфа-фермент», Россия).
Буфер для разведения РНК, РНК буфер, состав: деионизованная вода.
3
Внутренний контрольный образец, ВКО RV; состав: суспензия бактериофага MS2 с концентрацией 5×10/мл.
- Отрицательный контрольный образец, ОКО (ТЕ буфер); состав: ТЕ буфер (10 мМ Tris-HCl, 0,5 мМ EDTA, рН 8,0)
- Положительный контрольный образец, ПКО RV; состав: смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса RVa А и фрагмент генома бактериофага MS2, взятых в соотношении 1:1.
В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета на каждую реакцию:
10 мкл ПЦР БУФЕР RV
5 мкл ПЦР СМЕСЬ RV
0,75 мкл RT PCR ENZ.
Перемешивают смесь на вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием. Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации НК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл РНК буфера;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл НК соответствующей пробы;
в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) 10 мкл ПКО RV.
Проводят реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией на приборах «Rotor-Gene Q», «ДТ-96» и «CFX96».
Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора и программируют прибор.
Синтез кДНК проводят при температуре 55°С в течение 15 мин, а затем терминируют реакцию 5-минутным прогреванием реакционной смеси при температуре 95°С. Далее следует стадия ПЦР.
Температурный режим для проведения ПЦР включает 40 циклов амплификации (95°С - 15 сек, 58°С - 30 сек, 72°С - 20 сек). Обе реакции проводятся в одной пробирке последовательно, без открывания пробирки и переноса материала.
Детекция продуктов амплификации осуществляется методом регистрации флуоресценции, накапливающейся в результате разрушения гибридизационного зонда, содержащего на 5'-конце флуорофор (FAM/Cy5), а на 3'-
конце - гаситель (BHQ1/BHQ2). В реакции используется два зонда одновременно, пара FAM -BHQ1 для мишени RV и пара Су5 - BHQ2 для MS2. В отсутствие мишени флуорофор и гаситель сближены и наблюдается лишь незначительная флуоресценция, так как гаситель поглощает испускаемое флуорофором излучение. В процессе ПЦР зонд гибридизуется на участок одной из нитей ампликона, при синтезе комплементарной нити ДНК Taq=полимераза приближается к флуорофору, что ведет к его разрушению за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. В результате флуорофор отделяется от гасителя и его излучение может быть детектировано. Таким образом, увеличение количества синтезированного ПЦР-продукта приводит к росту сигнала флуоресценции.
В результате ПЦР получают данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала, которые анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени».
Учет результатов ОТ-ПЦР проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца.
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции НК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции (ВК-) на канале FAM/Green и для отрицательного контроля этапа ПЦР (К-) на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.
Анализ результатов амплификации для канала Cy5/Red (ВКО) по графику (рис 2) показал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Образцы, для которых по каналу Cy5/Red значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (при этом по каналу FAM/ Green значение Ct также отсутствует) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале Cy5/Red указывает на присутствие ингибиторов в пробах или на ошибки при постановке реакции ОТ-ПЦР. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции НК.
Анализ результатов амплификации для канала FAM/Green (Ротавирус А) по графику (рис. 1) показал характерное экспоненциальное нарастание флуоресцентного сигнала. Образец считается положительным, РНК ротавируса А присутствует, т.к. наблюдается рост специфического сигнала на канале FAM/Green, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу FAM7 Green значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (наблюдается рост специфического сигнала на канале FAM/Green) - образец считается положительным.