СПОСОБ ОЦЕНКИ ХАРАКТЕРА МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ
METHOD FOR EVALUATING PATTERN OF INTERMICROBIAL INTERACTIONS

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии.
Известен способ оценки взаимного влияния микроорганизмов методом совместного культивирования с контрольным высевом и определением численности тест-культуры и изучаемого штамма по количеству выросших колоний на плотной питательной среде (Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях. Дисс. к.м.н. Оренбург, 2009).
Недостатки прототипа: низкая производительность способа при высокой стоимости, связанная с трудоемкостью, продолжительностью во времени, необходимостью подбора оптимальных условий совместного культивирования для микроорганизмов различных таксономических групп.
Технический результат: повышение производительности за счет унификации пробоподготовки, использования 96-луночных полистироловых планшетов и автоматизированного учета результатов, снижение затратности.
Сущность метода заключается в оценке межмикробных взаимоотношений двух микробных штаммов путем сравнительного анализа массивности сформированных ими биопленок. Для этого в стандартных условиях in vitro формируют биопленки каждого штамма по отдельности и после их смешивания затем оценивают результат пленкообразования моно- и смешанными культурами на основе регистрации интенсивности поглощения ими красителя.
Способ осуществляется следующим образом: для формирования биопленок в лунки полистиролового планшета микропипеткой-дозатором вносят по 100 мкл 18-часовых бульонных культур микроорганизмов, выращенных на бульоне Луриа Бертани (LB-бульон), стандартизованных до 0,5 по стандарту МакФарланда, затем добавляют 100 мкл LB-бульона для формирования монопленок или 100 мкл другой тестируемой бульонной культуры для формирования смешанной биопленки. Контролем служат лунки с 200 мкл стерильного LB-бульона. Все эксперименты проводят не менее чем в трех повторностях.
580
Закрытые планшеты выдерживают в термостате при 37°С в течение 48 часов. Затем сформированные биопленки промывают дистиллированной водой и окрашивают 200 мкл 0,1%-ного водного раствора генцианвиолета в течение 45 минут в темноте. После тщательного трехкратного отмывания биопленок аналогичным образом и высушивания планшета определяют состояние биопленок по интенсивности их окрашивания. Для этого краситель элюируют 96%-ным спиртом и определяют показатель оптической плотности (ОП) элюата, который соответствует уровню пленкообразования (Шагинян, 2007). Количественным выражением степени образования биопленок служат значения ОП, измеряемые на планшетном спектрофотометре, например планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США), с интервалом измерения оптической плотности от 0,0 до 4,0.
mix
1
2
mix
1
2
mix
1
2
Затем сравнивают усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур. Если наблюдается аддитивный (суммарный) эффект, т.е. показатель смешанной биопленки (ОП) достоверно не отличается от суммы показателей каждого тестируемого штамма (ОП+ОП) - регистрируют нейтральный характер в межмикробном взаимодействии; если показатель ОП>ОП+ОП- - регистрируют синергический характер взаимодействия; если показатель ОП<ОП+ОП - регистрируют антагонистический характер взаимодействия. При этом сумма показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур не должна превышать 4. В противном случае, готовят разведение элюата 1:10 и вновь измеряют оптическую плотность.
Пример практического применения.
Пример 1. Оценено взаимное влияние микробных культур Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans, изолированных из мокроты больного К. 72 лет, находящегося на ИВЛ, с использованием предлагаемого способа. Для этого изоляты культивировали на LB-бульоне в лунках полистиролового планшета в виде смешанной и монокультур, после чего удаляли планктонные клетки и питательную среду, отмывали. Сформированные биопленки окрашивали 0,1%-ным раствором генцианвиолета, промывали, высушивали и краситель элюировали спиртом. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре, при этом показатель оптический плотности смешанной биопленки 2,209±0,669 превышал большее значение оптической плотности монокультур: 0,864±0,144 для Р.aeruginosa, что указывает на синергидный характер взаимоотношений тестируемых культур.