Генетическая дифференциация клонов Populus tremula L. с использованием ISSR-маркеров, полученных в культуре invitro

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

285

2017. Т. 27, вып. 3

УДК 58.085:575.22:632.911.2:632.915

Е.В. Луценко, В.А. Чохели, А.В. Верещагина, М.М. Середа

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КЛОНОВ POPULUS TREMULA L. С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR-МАРКЕРОВ, ПОЛУЧЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Рассмотрено состояние вопроса в области селекции вида Populus trémula L. в Ростовской области. Изложены результаты эксперимента по получению здоровых эксплантов осины методом клонального микроразмножения. Отмечено, что лучше всего стерилизовать образцы в растворе 70 % этанола, затем в 0,1 %-ом растворе сулемы (5 мин.) и последующая отмывка в дистиллированной воде 3 раза по 15 мин. Описана модификация технологии культуры ткани in vitro применительно к древесным видам. Было отмечено, что оптимальной средой для прямой регенерации осины из листовой пластины является среда WPM, содержащая 0,4 мг/л ТДЗ. Мультипликацию побегов производили на среде МС с добавлением 1 мг/л БАП. Укоренение побегов осуществлялось на среде Уайта. Исследована возможность применения ISSR-маркеров для оценки генетического родства клонов осины. Всего было детектировано 16 ISSR-фрагментов, из которых обнаружено 4 уникальных фрагмента, а 9 оказались полиморфными, что составляет 60,1 %.

Ключевые слова: Populus trémula L., культура in vitro, микроклональное размножение, экспланты, ISSR-маркеры, полиморфизм.

Осина - листопадное дерево первой величины с широкоцилидрической или яйцевидной ажурной кроной и светло-зеленовато-серой корой, образующее чистые или смешанные с другими породами древостои [1; 2]. Является ценным лекарственным видом, используется в деревообрабатывающей промышленности и является декоративным растением [2; 3]. Ее можно использовать в озеленении городов. Декоративна красивой кроной, стройным светлым стволом. Особенно привлекательна ранней весной в период цветения и осенью желтым или карминовым расцвечиванием листвы. Декоративная долговечность 30-40 лет [4-6].

Материалы и методы исследования

В качестве первичного экспланта для введения в культуру in vitro Populus trémula был взят фрагмент листвой пластинки (рис. 1) маточного растения из коллекции ботанического сада ЮФУ. Перед стерилизацией листовые пластинки помещались в дистиллированную воду с несколькими каплями TWIN и встряхивались на шейкере 15 мин., после чего промывались дистиллированной водой. Затем экспланты обрабатывались 70 %-ым раствором этанола, после чего стерилизовались 0,1 %-ым раствором сулемы и промывались дистиллированной водой 3 раза по 15 мин.

Рис. 1. Первичный эксплант Populus trémula

Для культивирования использовались среды МС (Мурасиге-Скуга) [7; 8], WPM (Woody Plant Medium) и Уайта с добавлением таких фитогормонов, как БАП (6-бензиламинопурин), НУК (a-нафтилуксусная кислота) и ТДЗ (тидиазурон) [1; 9]. В качестве гелеобразующего средства применялся агар-агар (6 г/л).

Стерилизация и высадка всех эксплантов на среду осуществлялась в ламинар-боксе. Стерилизация сред проводилась в автоклаве при температуре 121 °С в течение 20 мин. РН среды доводился до значения 5,7 с помощью 1 М КОН. Культуры помещались в условия 16-часового фотопериода при температуре 25 °С.

286

2017. Т. 27, вып. 3

Н.Н. Иванова, И.В. Митрофанова, Н.В. Зубкова

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

Для получения микроклонов использовалась среда для прямой регенерации. Экспланты помещались на среду WPM с добавлением ТДЗ 0,2 мг/л - 0,6 мг/л [10]. Тидиазурон является синтетическим фитогармоном, имеющим мутагенный эффект. Данный фитогормон способствует увеличению частоты спонтанного мутагенеза на этой стадии микроклонального размножения.

Экстракция ДНК образцов материнского растения проводилась из листьев, а для образцов 3-х поколений in vitro проводилась из молодых неодревесневевших побегов (стебель и листья). Выделение ДНК проводилось сорбентным методом при помощи комерческого набора «Сорб-ГМО-Б» (Син-тол). Концентрацию ДНК определяли на флюориметре Qubit 3.0 (Invitrogen) по стандартной методике с нашей модификацией. Все образцы разбавлялись до нужной концентрации в 5 нг/мкл деионизиро-ванной водой.

Для анализа ДНК выделенных образцов использовали метод межмикросателлитного анализа (ISSR-метод). Олигонуклеотидные праймеры подбирались из набора University of British Columbia Biotechnology Laboratory (UCB, Vancouver, Canada) [11], хорошо зарекомендовавших себя в исследованиях на других древесных растениях, в частности на дубе чрешчатом [12]. Характеристики маркеров представлены в табл. 2.

ПЦР-смесь готовили из расчёта на один образец: H2O (DD) - 14,25 мкл, раствор 10xdNTP (Ли-тех) - 2,5 мкл (25мМ), ПЦР буфер+MgCb (Евроген) - 2,5 мкл, Taq-полимераза (Синтол) - 0,25 мкл (5 ед/мкл), ДНК матрица - 2 мкл и праймер 1 мкл (10 мкМ/мкл). Общий объём смеси 25 мкл.

Амплификация проводилась на термоциклере T 100 Thermal Cycler (производства BIO-RAD). Протокол амплификации: 1. 94 °С - 1:00; 2. 94 °С - 0:30; 3. 52/53 °С - 0:45; 4. 72 °С - 2:00; 5. 34 цикла, начиная со второго пункта; 6. 72 °С - 5:00; 7. хранение при 12 °С.

Разделение фрагментов проводили электрофорезом в 1,5 % агарозном геле с использованием 1 xTBE-буфера (TRIS - Boric acid - EDTA), на мощности 70 В, 2 часа, источник питания Power Pac Basic (производства BIO-RAD).

Окрашивание ДНК производили интерколирующим красителем SYBR Green I из соотношения 1 мкл красителя на 6 мкл ДНК. Съёмку производили в гельдокументирующей системе GelDoc XR+ с программным обеспечением ImageLab версии 4.1.

Маркер длин ДНК фрагментов 100+bp (с дополнительной меткой на 1500 п.н.) и 1 kb (производства Евроген) смешивали с красителем SYBR Green I из соотношения 6 к 1, соответственно.

Компьютерную обработку полученных фореграмм проводили при помощи программы PyElph 1.4, с последующим представлением в виде матрицы бинарных данных. В ней наличие или отсутствие в спектре одинаковых по размеру фрагментов ДНК рассматривается как состояние 1 или 0, соответственно. При этом учитывали только воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты, изменчивость по интенсивности не учитывалась. Компьютерный анализ матриц проведен с помощью программы MSExcel. По матрице состояний с помощью компьютерной программы Winboot [13; 14] была составлена матрица сходства и генетической дистанции с использованием коэффициента Жаккарда.

Результаты и обсуждения

В работе было испробовано четыре режима стерилизации первичного экспланта Populus trémula, отличающихся по времени экспозиции, в 0,1 %-ом растворе сулемы. Для оценки эффективности поверхностной стерилизации помимо процента чистых культур (без гибкого или бактериального заражения) учитывался и процент выживших эксплантов. Из табл. 1 видно, что длительное время экспозиции (7 мин. и 10 мин.) делает эксплаты нежизнеспособными, а короткое - приводит к гибели от грибковых и бактериальных заражений. Наилучшая схема стерилизации следующая: 70 %-ый раствор этанола, 0,1 %-ый раствор сулемы (5 мин.) и дистиллированная вода 3 раза по 15 мин.

После 2-3 недель культивирования эксплантов наблюдалась прямая регенерация. Прямая регенерация отмечена, начиная с 0,3 мг/л ТДЗ. Поскольку целью было размножение с помощью прямой регенерации, то оценивалась ее эффективность на средах с разным содержание ТДЗ (рис. 2). Установлено, что наиболее оптимальной средой для прямой регенерации осины из листовой пластины является среда WPM, содержащая 0,4 мг/л ТДЗ (рис. 3).

_Генетическая дифференциация клонов Populus trémula L. ..._287

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ 2017. Т. 27, вып. 3

Таблица 1

Эффективность поверхностной стерилизации Populus trémula

Экспозиция, мин. Незараженные экспланты, % Погибшие экспланты, %

3 0 100

5 80 30

7 90 80

10 97 100

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Е

Прямая регенерация, % образцов Populus trémula

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Концентрация TDZ, мг/л Рис. 2. Эффективность прямой регенерации Populus trémula из листовой пластинки

Рис. 3. Прямая регенерация Populus trémula на среде WPM + 0,4 ТДЗ

Полученные регенераты пересаживали на среду МС с половинной концентрацией солей с добавлением 0,3 мг/л БАП и 0,05 мг/л НУК. После двух недель культивирования регенерантов их переносили на среду МС с добавлением 1 мг/л БАП (стадия мультипликации побегов). Для элонгации возникшие микропобеги пересаживались на среду МС с половинной концентрацией солей без добавления гормонов. Укоренение побегов осуществлялось на среде Уайта (укорененные растения-регенеранты 1-го поколения). После чего проводили повторный цикл микроразмножения, начиная со стадии регенерации из листовой пластинки.

Каждый ISSR-праймер был проанализирован индивидуально в ПЦР с геномной ДНК P. trémula. В результате этого анализа было выявлено 4 наиболее эффективных ISSR-праймера (табл. 2).

В основном все праймеры оказались с динуклеотидными повторами. Среднее число амплифи-цированных фрагментов на праймер равнялось 4, максимальное - 7 (праймер UBC 835), минимальное - 2 (праймер UBC 811) (рис. 4). Среднее число полиморфных фрагментов на праймер составило 2,25, максимальное - 4 (праймер UBC 835), минимальное - 1 (праймер UBC 857).

288_Н.Н. Иванова, И.В. Митрофанова, Н.В. Зубкова_

2017. Т. 27, вып. 3 БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

Таблица 2

Полиморфизм P. Tremula, выявленный с использованием ISSR-маркеров

Название Последовательность Ta, 0C Диапазон размера фрагментов T M %P U

UBC 811 (GA)8C 53 600-1350 2 0 100 0

UBC 835 (AG)sYC 52 700-2500 7 1 57,1 2

UBC 841 (GA)sYC 52 1200-3500 4 0 50 2

UBC 857 (AC)sYG 52 900-3000 3 2 33,3 0

Примечание. У - любой пиримидин, Т - общее число фрагментов ДНК, М - число мономорфных фрагментов, %Р — процент полиморфизма, и - количество уникальных фрагментов

IV! IV1P К1 К2 КЗ

Рис. 4. Фореграмма Populus tremula с ISSR-маркером UBC 811

Примечание: М - маркер размерности длин ДНК, МР - материнское растение, К1 - клон 1-го поколения, К2 - клон 2-го поколения, КЗ - клон 3-го поколения

Всего было детектировано 16 ISSR-фрагментов, из которых 9 оказались полиморфными, что составляет 60,1 %. Обнаружено 4 уникальных фрагмента, то есть те, которые встречаются только в одном образце. Поскольку все экспланты стерильные, то можно исключить контаминацию.

Для оценки генетического сходства был использован коэффициент Джакарта. На основе полученных фореграмм была построена бинарная матрица. Генетическое сходство для пар образцов осины представлено в табл. 3.

Таблица 3

Генетическое различие исследуемых образцов

Параметры МР К1 К2 К3

МР 1.000000

К1 0.705882 1.000000

К2 0.789474 0.722222 1.000000

КЗ 0.700000 0.375000 0.650000 1.000000

На основании полученных данных наиболее далекими можно считать образцы клона 2 и материнского растения, а наиболее близкими можно считать образцы клона 1 и клона 3.

Таким образом, нами подтверждена успешная применимость ISSR-метода в генетических исследованиях клонов P. tremula, прошедших несколько пассажей. Этот метод информативен и позволяет выявить уникальные идентификационные фрагменты, определить уровень генетического разнообразия.

Заключение

В работе было испробовано четыре режима стерилизации первичного экспланта Populus tremula, отличающихся по времени экспозиции, в 0,1 %-ом растворе сулемы. Установлена наилучшая схема стерилизации: 70 %-ый раствор этанола, 0,1 %-ый раствор сулемы (5 мин.) и дистиллированная вода 3 раза по 15 мин.

Генетическая дифференциация клонов Populus trémula L.

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

289

2017. Т. 27, вып. 3

Наиболее оптимальной средой для прямой регенерации осины из листовой пластины является среда WPM, содержащая 0,4 мг/л ТДЗ. Полученные регенераты пересаживали на среду МС с половинной концентрацией солей с добавлением 0,3 мг/л БАП и 0,05 мг/л НУК. На стадии мультипликации побеги переносили на среду МС с добавлением 1 мг/л БАП. Укоренение побегов осуществлялось на среде Уайта.

Всего было детектировано 16 ISSR-фрагментов, из которых 9 оказались полиморфными, что составляет 60,1 %. Обнаружено 4 уникальных фрагмента, то есть те, которые встречаются только в одном образце. Наиболее далекими можно считать образцы клона 2 и материнского растения, а наиболее близкими можно считать образцы клона 1 и клона 3.

Благодарности

Исследование выполнено при финансовой поддержке Федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере». Использовано оборудование ЦКП «Биотехнология, биомедицина и экологический мониторинг», ЦКП «Высокие технологии», лаборатории клеточных и геномных технологий растений Ботанического сада Академии биологии и биотехнологии им. Д.И. Ивановского Южного федерального университета.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Козловский Б.Л., Огородникова Т.К., Куропятников М.В., Федоринова О.И. Ассортимент древесных растений для зеленого строительства в Ростовской области. Ростов-н/Д.: ЮФУ, 2009. 416 с.

2. Петрова Г.А. Получение здорового посадочного материала осины (Populus trémula L.) из каллусной ткани с целью оздоровления осинников Республики Татарстан // Учен. записки Казан. гос. акад. ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2011. №. 205. С. 169-173.

3. Плантариум / Открытый атлас сосудистых растений России и сопредельных стран. URL: http://www.plantarium.ru/ page/view/item/46458.html (дата обращения: 23.03.2015).

4. Луценко Е.В. Разработка технологии получения засухоустойчивой формы осины методами клеточной инженерии // Неделя науки, 2015. Ростов-н/Д.: ЮФУ, 2015. C. 8-10.

5. Луценко Е.В., Середа М.М., Лысенко О.Г. Оптимизация микроклонального размножения осины (Populus trémula L.) // Биотехнология. Взгляд в будущее: Сб. тр. 4 Междунар. науч. интернет-конф. 2015. C. 88-92.

6. Михайлов Л.Е. Осина. М.: Агропромиздат, 1985. 72 с.

7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiologiaplantarum. 1962. Vol. 15, N 3. P. 473-497.

8. Peternel S. et al. In vitro propagation of European aspen (Populus trémula L.) from axillary buds via organogenesis // Scientiahorticulturae. 2009. Vol. 121, N 1. P. 109-112.

9. Cavusoglu A. et al. Direct and indirect plant regeneration from various explants of eastern cottonwood clones (Populus deltoides Bartram ex Marsh.) with tissue culture // African Journal of Biotechnology. 2013. Vol. 10, N 16. P. 3216-3221.

10. Tullus Hardi, Tullus Arvo, Soo Tea, Vares Aivo Hybrid aspen (Populus trémula L. x P. tremuloides Michx.) complex study programme in hemiboreal Estonia // The 23rd Session of IPC. Estonian University of Life Sciences. 2008. P. 183.

11. Lopez-Aljorna A., Bueno M.A., Aguinagalde I., Martrin J.P. Fingerprinting and genetic variability in cork oak (Quercus suber L.) elite trees using ISSR and SSR markers // Ann. For. Sci. 2007. Vol. 64. P. 773-779.

12. Chokheli V., Kozlovsky B., Sereda M., Lysenko V., Fesenko I., Varduny T., Kapralova O., Bondarenko E. Preliminary Comparative Analysis of Phenological Varieties of Quercus robur by ISSR-Markers // J. of Botany. Vol. 2016. Article ID 7910451. 7 pages. 2016. doi:10.1155/2016/7910451.

13. Nei M., Li W.-H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proct. Natl Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76, N 10. P. 5269-5273.

14. Yap I.V., Nelson R.J. WinBoot A program for performing bootstrap analysis of binary data to determine the confidence limits of UPGMA-based dendrograms - International Rice Research Institute Fhilippines. 1996. 22 p.

Поступила в редакцию 03.07.17

E.V. Lutsenko, V.A. Chokheli, A.V. Vereschagina, M.M. Sereda

GENETIC DIFFERENTIATION OF CLONES OF POPULUS TREMULA L. USING ISSR MARKERS GROWN IN VITRO

The state-of-the-art in the field of plant breeding of the species Populus trémula L. in the Rostov region is discussed. The results of the experiment to obtain healthy explants of aspen by the method of clonal micropropagation are present-

290

2017. Т. 27, вып. 3

Н.Н. Иванова, И.В. Митрофанова, Н.В. Зубкова

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

ed. It is noted that it is best to sterilize samples in a solution of 70 % ethanol, then in 0.1 % solution of mercuric chloride (5 minutes) with subsequent washing in distilled water 3 times for 15 minutes. A modified technology of tissue culture in vitro in relation to woody species is described. It was observed that the optimal medium for direct regeneration of aspen from lamina is the medium WPM containing 0.4 mg/l TDZ. Multiplication of shoots was produced on MS medium supplemented with 1 mg/l BAP. Rooting of shoots was carried out on White's medium. The possibility of using ISSR markers for evaluation of genetic relatedness of aspen clones was investigated. 16 ISSR-fragments were detected in total, 4 of which were unique fragments, and 9 were polymorphic, accounting for 60.1 %.

Keywords: Populus tremula L., in vitro culture, micropropagation, explants, ISSR-markers, polymorphism.

REFERENCE

1. Kozlovskij B.L., Ogorodnikova T.K., Kuropjatnikov M.V. and Fedorinova O.I. Assortiment drevesnyh rastenij dlja zelenogo stroitel'stva v Rostovskoj oblasti [Assortment of woody plants for green building in the Rostov region], Rostov-na-Donu: JuFU, 2009, 416 p. (in Russ.).

2. Petrova G.A. [Obtaining a healthy planting material of aspen (Populus tremula L.) from callus tissue for the purpose of healing aspen in the Republic of Tatarstan], in Uchenye zapiski Kazanskoj gosudarstvennoj akade-mii veterinarnoj mediciny im. N.E. Baumana, 2011, no 205, pp. 169-173 (in Russ.).

3. Plantarium / Otkrytyj atlas sosudistyh rastenij Rossii i sopredel'nyh stran [Plantarium / An open atlas of vascular plants in Russia and neighboring countries], URL: http://www.plantarium.ru/page/view/item/46458.html (accessed: 23.03.2015) (in Russ.).

4. Lucenko E.V. [Development of technology for obtaining drought-resistant aspen shape by the methods of cellular engineering], in Nedelja nauki - 2015, Rosto-na-Donu: JuFU, 2015, pp. 8-10 (in Russ.).

5. Lucenko E.V., Sereda M.M. and Lysenko O.G. [Optimization of microclonal propagation of aspen (Populus tremula L.)], in Sb. tr. 4Mezhdunar. nauchn. Internetkonf. "Biotehnologija. Vzgljadv buduschee", 2015, pp. 88-92 (in Russ.).

6. Mihajlov L.E. Osina [Aspen], M.: Agropromizdat, 1985, 72 p. (in Russ.).

7. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures, in Physiologiaplantarum, 1962, vol. 15, no 3, pp. 473-497.

8. Peternel S. et al. In vitro propagation of European aspen (Populus tremula L.) from axillary buds via organogenesis, in Scientiahorticulturae, 2009, vol. 121, no 1, pp. 109-112.

9. Cavusoglu A. et al. Direct and indirect plant regeneration from various explants of eastern cottonwood clones (Populus deltoides Bartram ex Marsh.) with tissue culture, in African Journal of Biotechnology, 2013, vol. 10, no 16, pp. 3216-3221.

10. Tullus Hardi, Tullus Arvo, Soo Tea and Vares Aivo. Hybrid aspen (Populus tremula L. x P. tremuloides Michx.) complex study programme in hemiboreal Estonia, in The 23rd Session of IPC. Estonian University of Life Sciences, Beijing, October 26-30, 2008, pp. 183.

11. Lopez-Aljorna A., Bueno M.A., Aguinagalde I. and Martrin J.P. Fingerprinting and genetic variability in cork oak (Quercus suber L.) elite trees using ISSR and SSR markers, in Ann. For. Sci., 2007, vol. 64, pp. 773-779.

12. Chokheli V., Kozlovsky B., Sereda M., Lysenko V., Fesenko I., Varduny T., Kapralova O. and Bondarenko E. Preliminary Comparative Analysis of Phenological Varieties of Quercus robur by ISSR-Markers, in Journal of Botany, vol. 2016, Article ID 7910451, 7 pages, 2016, doi:10.1155/2016/7910451.

13. Nei M. and Li W.-H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases, in Proct. Natl Acad. Sci. USA, 1979, vol. 76, no 10, pp. 5269-5273.

14. Yap I.V. and Nelson R.J. WinBoot: A program for performing bootstrap analysis of binary data to determine the confidence limits of UPGMA-based dendrograms - International Rice Research Institute Fhilippines, 1996, 22 p.

Луценко Елена Витальевна, бакалавр E-mail: lev-1311@yandex.ru

Чохели Василий Александрович, аспирант, младший научный сотрудник E-mail: vachokheli@sfedu.ru

Верещагина Алена Вадимовна, бакалавр E-mail: knh2009alyonka@yandex.ru

Середа Михаил Михайлович,

кандидат биологических наук, доцент, заведующий кафедрой ботаники E-mail: seredam@yandex.ru

ФГАОУ ВО «Южный федеральный университет» 344041, Россия, г. Ростов-на-Дону, пер. Ботанический спуск, 7

Lutsenko E.V., Bachelor E-mail: lev-1311@yandex.ru

Chokheli V.A.,

postgraduate, junior researcher E-mail: vachokheli@sfedu.ru

Vereshchagina A.V., Bachelor E-mail: knh2009alyonka@yandex.ru

Sereda M.M.

Candidate of Biology, Associate Professor, Head of the Department of Botany E-mail: seredam@yandex.ru

Southern Federal University

344041, Russia, Rostov-on-Don, per. Botanical descent, 7