Механизмы развития нежелательного иммунного ответа при применении биотехнологических препаратов

REVIEWS

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 615.373.06

Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Медуницын Н.В., Крючков Н.А.

МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ НЕЖЕЛАТЕЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ПРИМЕНЕНИИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, 127051, г Москва

Вещества белковой природы, в том числе биологические и биотехнологические препараты, обладают иммуно-генностью. Если эффективность вакцин и препаратов аллергенов основана на способности вызывать иммунный ответ, то для биотехнологических препаратов, которые применяются для лечения (биотерапевтические препараты), формирование иммунного ответа является нежелательной иммуногенностью. В работе проанализированы основные механизмы и факторы, влияющие на развитие иммунного ответа при применении терапевтических биологических и биотехнологических препаратов. Иммунный ответ на впервые вводимые биологические препараты обычно развивается по классическому механизму ответа за счёт присутствия чужеродных белков или низкой степени очистки препаратов. Предполагалось, что разработка технологии получения вы-сокоочищенных препаратов на основе полностью человеческого белка приведет к утрате их иммуногенного потенциала. Однако препараты на основе человеческого белка также обладают способностью инициировать развитие иммунного ответа. При этом обычно происходит развитие Т-независимого иммунного ответа или нарушение формирования иммунологической толерантности к эндогенному белку. Основными причинами развития иммунного ответа на биотерапевтические препараты являются особенности физико-химических свойств препарата, схемы лечения, патологического процесса, сопутствующей терапии и др. Выработка антител в ответ на введение биопрепаратов может привести не только к развитию тяжёлых аллергических, аутоиммунных и других побочных реакций, но и к нарушению фармакокинетики и в конечном итоге к снижению эффективности препарата.

Ключевые слова: биотехнологические препараты; биотерапевтические препараты; механизмы иммуноген-

ности; моноклональные антитела; иммунологическая толерантность. Для цитирования: Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Медуницын Н.В., Крючков Н.А. Механизмы развития нежелательного иммунного ответа при применении биотехнологических препаратов. Иммунология. 2017; 38 (5): 271-283. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2017-38-5-271-283

Soldatov A.A., Avdeeva Zh.I., Medunitsyn N.V., Kryuchkov N.A.

MECHANISMS OF DEVELOPMENT OF THE UNDESIRABLE IMMUNE RESPONSE AT USE OF BIOTECHNO-LOGICAL MEDICINES

Federal State Budgetary Institution «Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products» of the Ministry of Health of the Russian Federation, 127051, Moscow, Russian Federation

Substances of protein nature, including biological and biotechnological products, have immunogenicity. If the effectiveness of vaccines and medicines allergens is based on the ability to induce an immune response, then for biotechnological products, which are used for treatment (biotherapeutic products), the formation of an immune response is "undesirable" immunogenicity. The present article analyzes the main mechanisms and factors influencing the development of the immune response at use of therapeutic biological and biotechnological medicines. The immune response on for the first time the administered biological medicines usually develops on the classical mechanism of the response due to the presence of foreign proteins or low degree of purification of medicines. It was assumed that the development of technology of receiving high cleaning products on the basis of completely human protein will lead to loss of their immunogene potential. However, drugs based on human proteins also have the ability to initiate the development of an immune response. Usually the development of T-independent immune response or the disruption of the formation of immune tolerance to endogenous protein. The main reasons for the development of an immune response to the biotherapeutic medicines that are features of the physical and chemical properties of medicine, treatment regimens, pathologic process, the accompanying therapy, etc. Production of antibodies in response to the introduction of biological products can lead not only to severe allergic, autoimmune, and other adverse reactions, but also to the violation of pharmacokinetics and, finally, to decrease in effectiveness of the medicine.

Keywords: biotechnology medicines; biotherapeutic medicines; mechanisms of immunogenicity; monoclonal antibodies; immunological tolerance.

For citation: Soldatov A.A., Avdeeva Zh.I., Medunitsyn N.V., Kryuchkov N.A. Mechanisms of development of the undesirable immune response at use of biotechnological medicines. Immunologiya. 2017; 38 (5): 271-283. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2017-38-5-271-283

For correspondence: Soldatov Aleksandr Alekseevich, Dr.med. Sci, the main expert of Department of expertise, allergens, cytokines and other immunomodulators center of expertise and control, E-mail: Soldatov@expmed.ru

conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

Received 12.02.17 Accepted 14.04.17

Для корреспонденции: Солдатов Александр Алексеевич, д-р мед. наук, главный эксперт Управления экспертизы аллергенов, цито-кинов и других иммуномодуляторов Центра экспертизы и контроля МИБП, E-mail: soldatov@expmed.ru

ОБЗОРЫ

Открытие в 19 веке способности чужеродных белков вызывать гуморальный ответ организма послужило одним из стимулов, который привёл к появлению новой науки - иммунологии, а свойство макромолекул (белков или полисахаридов) вызывать выработку антител (Ат) при введении в организм является одним из фундаментальных понятий иммунологии, определяемое как иммуногенность.

Способность инфекционных или опухолевых антигенов (Аг) и аллергенов индуцировать выработку Ат, вызывающих гибель возбудителей инфекционных заболеваний (или опухолевых клеток) или нейтрализующих активность аллергенов, легла в основу разработки соответствующих лекарственных средств (вакцин, препаратов аллергенов и др.) для профилактики и лечения заболеваний. Данные препараты относятся к группе иммунобиологических, поскольку их эффективность напрямую связана с иммуногенностью [1].

С середины 19 века в течение длительного периода основными биологическими препаратами оставались иммунобиологические препараты, предназначенные для профилактики и лечения инфекционных и аллергических заболеваний. Первым биологическим препаратом для лечения (при длительном введении больным) стал инсулин, разработанный в 1920 г, - экстракт из клеток поджелудочной железы животных. Применение первых инсулинов продемонстрировало их высокую иммуногенность за счёт чужеродности белка и высокого уровня примесей, выступающих в качестве адъювантов. В 1980-х годах разработаны генно-инженерные технологии, позволяющие получать белки высокой степени очистки с заданными свойствами. Разработка технологии рекомбинантной ДНК для получения препаратов позволила за короткий период создать большое количество разнообразных биотехнологических препаратов для терапии многих тяжёлых наследственных, опухолевых, аутоиммунных и других заболеваний, однако не решило проблему нежелательной иммуногенности биотехнологических (биотерапевтических) препаратов.

Механизм действия биотерапевтических препаратов основан на взаимодействии с мишенью-рецептором, чем обусловило их таргетное действие, а механизм действия иммунобиологических препаратов - на стимуляции иммунного ответа. Однако гуморальный иммунный ответ развивается не только на иммунобиологические препараты, но и на любое вещество белковой природы, в том числе и на биотерапевтические препараты, используемые при лечении различных патологических состояний, как правило, длительно. Поэтому развитие иммунного ответа на введение биотерапевтических препаратов следует рассматривать как проявление их нежелательной иммуногенности. Пациент может отказаться от профилактической прививки, если имеются основания для возможного развития побочных реакций (ПР) на вакцину. А для больных, например, с наследственным или приобретенным дефицитом эндогенных белков (гормоны, факторы свертывания, факторы роста и др.), или онкологическими заболеваниями только прием соответствующих биотерапевтических препаратов позволяет поддерживать жизнеспособность организма. Развитие иммунного ответа и выработка Ат к действующему веществу препарата может привести не только к снижению его эффективности, но и развитию ПР в ряде случаев с необратимыми последствиями.

Иммуногенность биотехнологических (биотерапевтических) препаратов является одной из основных проблем, которая влияет на разработку препаратов данной группы. Совершенствование уже известных и разработка новых биотерапевтических препаратов привело к появлению новых проблем, связанных с их нежелательной иммуногенностью. Даже разработка лекарственных препаратов на основе ре-комбинантных полностью человеческих белков, имеющих высокую степень гомологии с эндогенными белками организма человека, не решило проблемы иммуногенности биопрепаратов. Исследования, посвящённые изучению причин и

механизмов развития иммунного ответа на биотерапевтические (биотехнологические) препараты нового поколения, позволили не только решить практические вопросы, связанные с проявлением иммуногенности конкретных биологических препаратов, но и значительно расширили фундаментальные представления о механизмах развития иммунного ответа и иммунологической толерантности.

Тем не менее, необходимо признать, что в настоящее время имеется больше вопросов, чем ответов, касающихся механизмов развития иммунного ответа на биотерапевтические препараты и роли Ат в развитии ПР и снижении эффективности биологических лекарственных препаратов. В работе представлен анализ эволюции представлений о механизмах развития иммунного ответа и проявления иммуногенных свойств биотехнологических/биологических препаратов при их клиническом применении.

Классический иммунный ответ

Эпидемиологические и клинические исследования им-муногенности биотерапевтических препаратов показали, что частота выработки Ат к препаратам варьирует в широком диапазоне (табл. 1). Она зависит не только от основных физико-химических и биологических свойств препарата, но и от таких факторов, как особенности патогенеза заболевания, сопутствующая терапия, доза, путь и схема введения лекарственного препарата и др.

Классический иммунный ответ на биотерапевтические препараты может развиваться по Т-зависимому (М) или Т-независимому (Т) пути, как и на любой белок с признаками чужеродности.

Классический Td-иммунный ответ развивается поэтапно и начинается с распознавания Аг-антигенпрезентирующими клетками (АПК), его процессирования и последующей презентации антигенного пептида (Т-клеточного эпитопа) в комплексе с продуктами генов главного комплекса гистосовме-стимости (ГКГ) II класса Т-хелперам.

Распознавание представляемого комплекса осуществляется Т-клеточным рецептором (TCR), экспрессированным на мембране клеток, в комплексе с CD3. Вторым сигналом (костимулирующим), необходимым для активации наивных Т-хелперов, является взаимодействие рецепторов CD80/86, экспрессированных на АПК, с молекулой CD28 («маркер ранней активации»), представленной на Т-клетках. При отсутствии костимулирующего сигнала не происходит активации Т-хелперов, а включается механизм развития апоптоза с целью элиминации частично активированных Т-клеток.

Активированные Т-клетки передают информацию об Аг-наивных В-клеток в комплексе с ГКГ II класса. Второй сигнал В-клетки получают при взаимодействии CD40 и CD40L-лигандов. Дополнительный сигнал может быть получен от самого Аг, в котором могут быть распознаны В-клеточные эпитопы ^М и IgD-рецепторами на поверхности В-клетки (BCR). Активированные Т-клетки синтезируют цитокины, стимулирующие активацию, пролиферацию и дифференци-ровку В-клеток в плазматические и формирование В-клеток памяти. Наличие кофакторного сигнала (через CD40 и CD40L- лиганды) является обязательным условием для формирования плазматических клеток и выработки Ат.

При Т-зависимом иммунном ответе плазматические клетки начинают синтез ^М и IgD с последующим переключением на синтез Ат других изотипов (IgG, ^Е и ^А). Кроме того, в процессе развития Т-зависимого иммунного ответа формируются В-клетки памяти, которые при повторном контакте с Аг могут синтезировать специфические Ат без участия Т-клеток [1, 2].

Развитие Т-независимого классического иммунного ответа осуществляется без участия Т-клеток; описаны два типа Т-независимого иммунного ответа (рис. 1). Первый тип ответа начинается с распознавания В-клеточными рецепторами (^М и IgD), экспрессированными на поверхностной мембра-

REVIEWS

Таблица 1

Частота выработки антител при применении биотехнологических препаратов

Препарат

Действующее вещество

Мишень (для препаратов мАт) или аналоги эндогенных белков

Показания к применению препарата

Частота выработки Ат

Muronomab

Fab-фрагмент химерных мАт

CD3

GPIIb/IIIa

Профилактика и лечение реакции 25-86 отторжения трансплантата

Профилактика реакции отторжения 6-44 трансплантата

Rituximab (Rituxan) Химерные мАт СЭ20 Неходжкинская лимфома 11

Infliximab (Remicade) Химерные мАт ТОТа Ревматоидные заболевания/псориаз/ болезнь Крона 10-15

Adalimumab (Humira) Человеческие мАт ТОТа Ревматоидный артрит, болезнь Крона, болезнь Бехтерева, псориаз 1.0-26

Omalizumab (Xolair) Гуманизированные мАт № Бронхиальная астма < 0.1

Cetuximab (Erbitux) Химерные мАт EGFR Колоректальный рак 5

ReFacto Рекомбинантный белок VIII фактор свертывания крови Гемофилия А 30

Benefix Рекомбинантный белок IX фактор свертывания крови Гемофилия В 3

Cerezyme Рекомбинантный белок Р-гликоцереброзидаза Болезнь Гоше 15

IntronA Рекомбинантный белок ЮТ-а Лейкоз, саркома Капоши, гепатит В и С < 3-13

Betaseron Рекомбинантный белок ют-р Рассеянный склероз 16.5-25.2

Leukine Рекомбинантный белок GM-CSF Нейтропения 2.3

Neupogen (Filgrastim) Рекомбинантный белок G-CSF Нейтропения 3

Humatrope Рекомбинантный белок Гормон роста Гипофизарный нанизм 1.6

Procrit Рекомбинантный белок Эритропоэтин Анемия при дефиците эритропоэтина < 1

Proleukin Рекомбинантный белок ^-2 Онкологические заболевания < 1

Примечание. мАТ - моноклональные антитела.

не В-лимфоцитов, В-клеточных эпитопов белковой молекулы препарата. Второй сигнал поступает при стимуляции Аг Толл-рецепторов (TLR) В-клеток. Данные сигналы вызывают активацию В-клеток с последующей пролиферацией и диф-ференцировкой в плазматические антителосинтезирующие клетки. В случае развития иммунного ответа при применении биотерапевтических препаратов сигнал через TLR (сигнал «опасности») может быть обусловлен взаимодействием указанных рецепторов с примесями или продуктами деградации, содержащимися в препарате.

При Т-независимом типе иммунного ответа синтезируются ^М и IgD-антитела без последующего переключения на синтез IgG-, ^Е- и ^А-изотипов Ат и без формирования В-клеток памяти.

Эпитопы (антигенные детерминанты). Развитие классического иммунного ответа возможно в случае, если иммунокомпетентные клетки распознают в макромолекуле биологического препарата антигенные детерминанты как чужеродные. Наличие антигенных детерминант в биопрепарате связанно с двумя основными причинами: во-первых, они могут присутствовать в молекуле биопрепарата, например, если он разработан на основе белков животного происхождения и др. (рис. 2). Во-вторых, чужеродные эпитопы могут быть образованы в процессе нарушения структуры или целостности молекулы белкового препарата (деградация, денатурация, агрегация и др.). Среди различных нарушений структуры белка наибольшая вероятность появления антигенных эпитопов связана с агрегацией белка. В процессе агрегации возможно не только формирование нового эпитопа, но и появление скрытых и повторяющихся эпитопов. Кроме того, в организме человека компоненты препарата могут образовать комплексы с эндогенными белками, способные выступать в роли Аг.

Вероятность выработки Ат на биотехнологические/биологические лекарственные препараты, полученные из тканей животных или в системе клеток животных, или микроорганизмов, всегда высока (например, на такие препараты как стрептокиназа, стафиллокиназа, аспаргиназа, бычья адено-зиндезаминаза, лососевый кальцетонин, бычий или свиной инсулин, мышиные мАт (мурономаб) и др.).

Разработанные с использованием методов генной инженерии препараты (мАт) также обладают иммуногенным по-

ф В-кпеточный эпитоп

ф Участок молекулы белка, распознаваемый Толл рецепторами

>- Рецептор, распознающий В-клеточные эпитопы

У Рецептор, распознающий Толл область молекулы белка

^ Специфическое антитело

Рис. 1. Схема развития первого типа Т-независимого иммунного ответа.

Эпитопы биологических препаратов

Содержатся в составе молекулы:

— белки животного происхождения;

— химерные или гибридобные белки;

— человеческие белки.

"Новые" эпитопы. образованные в процессе связывания препарата с белками организма с образованием комплексов.

"Новые" эпитопы. образованные в процессе изменения структуры молекулы в процессе:

— нарушения производственного процесса;

— нарушения процессов хранения и транспортирования;

— агрегации;

— денатурации;

— деградации; .— ДР-

Рис. 2. Эпитопы биологических препаратов.

тенциалом. Препараты химерных и гуманизированных мАт содержат в своем составе участки молекулы белка животного происхождения, распознаваемые как чужеродные структуры. Но даже препараты на основе полностью человеческих мАт содержат в антигенраспознающей области Fab-фрагмента иммуноглобулина (CDR-регион) уникальные участки (являются «слепком» с молекулы мишени), которые иммуноком-петентными клетками могут быть распознаны как антигенные детерминанты.

Появление нового эпитопа возможно и при образовании комплекса белковый компонент препарата - мишень (или другой эндогенный белок). Описано появление Ат к комплексу инсулин-антитело при развитии инсулинрезистентности. При применении препарата абциксимаба, который представляет собой Fab-фрагмент химерных мАт, специфичных к гли-копротеину IIb/IIIa, наблюдали выработку Ат к шарнирному участку С-конца Fab-фрагмента, которые не оказывали влияние на эффективность препарата. Дальнейший мониторинг иммуногенности абциксимаба выявил прямую корреляционную зависимость между появлением Ат к препарату и развитием тромбоцитопении. При исследовании причин данного осложнения S. Lajus с соавт. [3] установили, что Ат вырабатываются не только к указанному участку молекулы иммуноглобулина, но и к новому эпитопу, который образуется при формировании комплекса абциксимаба с гликопротеиновым лигандом IIb (IIIa рецептора).

Аналогично, при применении препарата на основе низкомолекулярного гепарина, образование комплекса препарата гепарин с эндогенным тромбоцитарным фактором 4 (PF4) приводит к развитию иммунного ответа с выработкой Ат против данного комплекса и развитию тромбоэмболических осложнений1.

Изучение механизмов проявления иммуногенности биологических препаратов и развития иммунного ответа позволило установить, что антигенные детерминанты имеют не только белковую природу. Исследования, начатые при изучении возможности ксенотрансплантации органов свиньи человеку, выявили, что в составе белков животного происхождения определяются гликановые структуры, которые

'Guideline on non-clinical and clinical development of similar biological medicinal products containing low molecular-weight-heparins (EMEA/CHMP/BMWP/118264/2007 Rev. 1).

не встречаются в составе белков человека, и которые могут вызвать у него развитие иммунного ответа. Из них по крайней мере 4 гликановые структуры (гликоэпитопы) могут встречаться в составе биотехнологических препаратов: галактоза-а1,3-галактозы (a-Gal), N-гликолилнейраминовая кислота (Neu5Gc), Р1,2-ксилоза и а1,3-фукоза [4].

Гликан галактоза-а1,3-галактозы выявлен в области Fab-фрагмента препарата це-туксимаб, синтезируемого в системе клеток SP2/0 мыши. Данный препарат представляет собой мАт против эпидермального фактора роста (ЭФР) и разработан для лечения рака шеи, головы и прямой кишки [5]. Употребление в пищу мяса животных способствует сенсибилизации к a-Gal, и у здоровых лиц могут определяться в крови Ат против a-Gal, а у некоторых лиц наблюдается даже синтез аллерген-специфических IgE к a-Gal.

Поэтому введение цетуксимаба больным _ раком может сопровождаться развитием иммунной или аллергической реакции при наличии у больного аллерген-специфических IgE к a-Gal [4]. Согласно современным представлениям, при использовании системы клеток СНО для получения мАт гликозилирование белка происходит без образования a-Gal. Однако некоторые авторы считают, что даже и при синтезе белка в системе клеток СНО возможно появление в молекуле белка препарата гликана a-Gal [4, 6].

Клетки человека способны синтезировать белки, содержащие в своем составе N-ацетилнейраминовую сиаловую кислоту (neu5Ac), но, в отличие от клеток других млекопитающих, не способны синтезировать Neu5Gc. Наличие Neu5Gc в составе молекулы белка препарата может распознаваться иммунокомпетентными клетками как антигенная детерминанта. Gadheri D. и соавт. [6] изучали влияние антител к Neu5Gc на фармакокинетические свойства препаратов мАт. Введение мышам Ат против Neu5Gc с последующим введением цетуксимаба вызывало повышение клиренса препарата, что сопровождалось его быстрым выведением из организма мышей. Авторы предполагают, что антитела к Neu5Gc взаимодействуют с цетуксимабом с образованием иммунных комплексов и последующей активацией системы комплемента, усиливающей элиминацию препарата.

Так, Neu5Gc выявлены в препаратах мАт (цетуксимаб, гемтузумаб озогамицин и инфликсимаб), синтезируемых в системе клеток мышей и не определялись в препаратах, полученных в системе клеток СНО (тоцилизумаб, бевацизумаб и адалимумаб). Связывание гликана Neu5Gc с молекулой рекомбинантного белка возможно и после его секреции из клетки в среду, содержащую Neu5Gc, используемую для производства препарата [7].

Молекулы белков человека могут содержать участки аминокислотной последовательности, которые соответствуют аминокислотной последовательности антигенных эпитопов. В частности Yeung V.P. с соавт. [8] показали, что в молекуле интерферона бета (INF-p-1b) содержатся высокоантигенные эпитопы, распознаваемые Т-клетками, которые при введении мышам линии Balb/C вызывали развитие иммунного ответа. Удаление с помощью генно-инженерных методов данных эпитопов в молекуле препарата предотвращало развитие иммунного ответа мышей на препарат INF-p-1b.

В последние годы успехи в области биохимии и математического/компьютерного моделирования позволили на молекулярном уровне описать особенности эпитопов белковых молекул. Было установлено, что эпитопы, распознаваемые В-клеточными рецепторами (IgA, IgG и IgE), содержат разное количество и состав аминокислот. Более 55% рецепторов

REVIEWS

IgA на В-клетках распознают эпитопы, имеющие менее 10 аминокислотных остатков (4-10 аминокислот), а 45% IgE рецепторов распознают эпитопы, состоящие из 10-15 аминокислот. Эпитопы, распознаваемые IgG антителами на В-клетках, обычно содержат в начале эпитопа аминокислоты пролин, глицин и метионин, далее обычно располагаются пролин и аргинин. В эпитопах, распознаваемых IgE рецепторами В-клеток, преобладают глутамин, глутамат и цистеин, а эпитопов, распознаваемых IgA - содержатся глутамин и пролин [9].

При определении эпитопов на молекуле ин-фликсимаба Homann A. с соавт. [10] выявили 6 эпитопов, распознаваемых В-клетками. Из них 4 эпитопа определены в Fab-фрагменте и 2 эпитопа - в константной области (Fc-фрагменте) иммуноглобулина. Из 4 эпитопов в Fab-фрагменте 3 расположены в участке связывания с Аг (CDR).

При наличии нескольких эпитопов в биопрепарате возможно развитие феномена «расширение эпитопа» («epitope spreading», расширение, распространение, растекание, размывание эпитопа) [11]. При определении эпитопов в молекуле INF-P было установлено, что Ат чаще вырабатывались к следующим аминокислотным участкам молекулы: 1-12, 121-132, 151-162 [12]. В процессе применения указанного биотерапевтического препарата будет наблюдаться постоянная и длительная презентация Аг различной активности от доминантного до субдоминантного. Мониторинг динамики Ат к таким препаратам показал, что на ранних этапах применения препарата могут определяться низкоаффинные не-нейтрализующие (связывающие) Ат, а при длительном применении препарата появляются высокоаффинные нейтрализующие Ат. Таким образом, в начале лечения биопрепаратами иммунный ответ развивается на наиболее «активные» эпитопы, а в процессе длительного применения препарата происходит развитие иммунного ответа и на другие эпитопы. При лечении препаратами INF-P рассеянного склероза низкие концентрации нейтрализующих Ат к INF-P могут определяться уже после 6 мес лечения. Нейтрализующие Ат, снижающие эффективность лекарственного препарата, обычно, появляются в период 9-18 мес лечения INF-P и сохраняются в течение более 59 мес [13, 14]2.

Учитывая накопленные данные о структуре эпитопов и методы математического моделирования Strurmiolo T. с соавт. [15] разработан метод in silico (компьютерное моделирование) по определению потенциальных эпитопов белковых молекул, в том числе и биотерапевтических препаратов. В процессе презентации эпитопа АПК наивным Т-клеткам Аг представляется не один, а в комплексе с молекулой продукта генов ГКГ II класса. Koita O.A. с соавт. [16] дополнил данный метод in silico оценкой участка эпитопа, способного образовывать комплекс с молекулой ГКГ II класса, при его презентации Т-хелперам. Данные методы основаны на выявлении в молекуле белка участков аминокислотной цепочки, которые соответствуют аминокислотной последовательности эпито-пов, которые установлены в процессе лабораторных или экспериментальных исследований. По количеству выявленных эпитопов (антигенных аминокислотных участков) в молекуле препарата рассчитывается индекс «общей иммуногенно-сти» лекарственного препарата [18].Программы для оценки Т-клеточных и других эпитопов in silico доступны в следующих базах данных: EpiMatrix, Class l/class II binding prediction, SYFPEITHHI, МНС Thred, MHCPred, EpiJen, NetMHC,

2Guideline on similar biological medicinal products containing interferon beta (EMA/CHMP/BMWP/652000/2010).

Рис. 3. Индексы иммуногенности для некоторых биотехнологических препаратов согласно данным тестирования т silico с помощью программы ЕрШаМх [18]

NetCTL, nHLAPred, SVMHC, Bimas и др. Данные компьютерные экспертные системы первоначально разработаны для проектирования новых вакцин, но в последствие были распространены и для оценки иммуногенности белков биотерапевтических препаратов. Авторы системы EpiMatrix опубликовали результаты оценки иммуногенности некоторых биотехнологических препаратов. Согласно опубликованным данным (рис. 3), высоким иммуногенным потенциалом обладают следующие препараты: вацизумаб, ИЛ-11, интерферон бета, ритуксимаб, эфатизумаб, алемтузумаб, эпоэтин альфа, интерферон альфа, тромбопоэтин, даклизумаб и инфликси-маб. Низкая иммуногенность прогнозируется для препаратов альбумина, амилазы, Fc-фрагмента IgG, фибриногена альфа, инсулина и фолликулотропина бета [18].

Bryson C.J. с соавт. [19] провели анализ различных методов определения эпитопов и пришли к выводу, что методы определения in silico позволяют предсказать значительно большее количество потенциально иммуногенных эпитопов в молекулах белка, чем это может быть подтверждено лабораторными или экспериментальными исследованиями.

Согласно классическим представлениям, низкомолекулярные соединения самостоятельно не могут вызвать развитие иммунного ответа. Однако, связываясь с молекулами белка организма хозяина и образуя комплекс, они могут индуцировать развитие иммунного ответа. Данные низкомолекулярные вещества получили название гаптенов; известны три варианта участия гаптенов в иммунном ответе. В первом случае лекарственное вещество, являясь гаптеном, связывается с растворимыми белками или белками, фиксированными на поверхности клеток, и образует комплекс белок-гаптен. Комплекс взаимодействует с иммунокомпетентными клетками (ИКК) при непосредственном связывании с Аг ГКГ II класса на АПК, что приводит к развитию иммунного ответа (например, на пенициллин).

При втором варианте действующее вещество препарата самостоятельно не может вступить в контакт с ИКК. Однако в процессе метаболизма (при изменении структуры молекулы) оно может приобрести свойства гаптена, и дальше происходит развитие иммунного ответа, как и в первом случае. Такие макромолекулы препарата получили название прогап-тены, например, сульфаметоксазол (SMX), который в про-

ОБЗОРЫ

цессе метаболизма переходит в активную форму SMX-NO (цитохром Р450-зависимый метаболизм в печени).

W.J. Pichler [20] в лабораторных условиях показал, что макромолекулы компонентов препарата могут взаимодействовать непосредственно с рецепторами Т-клеток, в том числе и с рецепторами сигнала «опасности» (Toll-рецепторы). В данном случае нековалентное связывание с Т-клеточным рецептором сопровождается развитием иммунного ответа с участием Аг ГКГ. При этом не развивается сенсибилизация, однако происходит прямая стимуляция клеток памяти и формирование эффекторных Т-клеток аналогично тому, что наблюдается при взаимодействии с суперантигеном. Развитие иммунного ответа по данному механизму продемонстрировано в условиях in vitro для некоторых антибиотиков. Данная гипотеза получила название p-i-концепции, от слов pharmacology и immunology (фармакологическое взаимодействие с иммунным рецептором - pharmacological interaction with immune receptors (p-i concept).

Роль иммунологической толерантности

Наиболее мало изученным является вопрос, связанный с развитием иммунного ответа на введение препаратов, созданных на основе белков, характеризующихся высокой степенью гомологии с эндогенными белками человека. Так, препарат инфликсимаб на основе химерных мАт, содержащий аминокислотные последовательности иммуноглобулина мыши в Fab-фрагменте иммуноглобулина человека, блокирующий фактор некроза опухоли альфа (TNF-a), при лечении больных ревматоидным артритом (РА) вызывал выработку Ат в 20-60% случаев [21]. Разработка препарата адалимума-ба (полностью человеческие мАт, блокирующие TNF-a) не привело к снижению его иммуногенности, Ат к адалимумабу определялись у 20% больных, а в некоторых клинических исследованиях Ат к адалимумаба определялись ещё чаще - до 89% случаев (см. табл. 1). При этом Ат, индуцированные введением анти-ТОТ-препаратов, вызывали не только снижение эффективности и изменение фармакокинетики, но и развитие анафилактических реакций [22].

При появлении первых препаратов для лечения гемофилии на основе VIII и IX факторов свёртывании крови, получаемых из крови доноров, было установлено, что при применении VIII фактора у 25% больных вырабатываются нейтрализующие Ат к препарату, несмотря на то что белки являются полностью человеческими. Данные препараты вводятся для остановки кровотечений (в первую очередь, кровотечение в суставную полость), которые обычно сопровождаются развитием воспалительной реакции. Кроме того, препараты вводят через постоянный катетер, который, проходя через ткани организма, вызывает развитие местной воспалительной реакции. Учитывая высокую вероятность воспалительного процесса при применении препаратов VIII фактора свертывания крови, высказано предположение о том, что элементы воспалительной реакции выступают в качестве сигнала опасности, воспринимаемого иммунокомпетентными клетками и запускающего развитие иммунного ответа.

Исследования влияния цитокинов не подтвердили ключевой роли воспалительной реакции в развитии иммунного ответа на препараты VIII фактора свёртывания крови. В частности, Oliveira C.A. с соавт. [23] провели сравнительный анализ профиля цитокинов в сыворотке крови больных гемофилией, у которых определялись Ат к VIII фактору свертывания (ингибиторы), и у больных без Ат. У больных без наличия ингибиторов, как и в группе здоровых лиц, преобладали цитокины INF-y, TNF-a, IL-2 и IL-5, т. е. преобладал профиль провоспа-лительных цитокинов. А в группе больных, у которых в крови наблюдали высокий уровень Ат к VIII фактору свёртывания, определялся высокий уровень противовоспалительных и ре-гуляторных цитокинов, таких как IL-4 и IL-10.

Развитие иммунного ответа на биотерапевтические препараты на основе белков, гомологичных эндогенным белкам,

способствовало началу исследований, посвящённых роли толерантности в развитии иммунного ответа на биопрепараты. Известно, что основная роль системы иммунитета заключается в защите организма от экзогенных агентов с признаками генетической чужеродности или собственных изменённых белков (аутоантигенов). Однако организм человека вынужден контактировать с белками, которые несут признаки чужеродности, но необходимы для его жизнедеятельности, например, пищевые продукты. Контакт системы иммунитета с веществами, которые не несут признаков опасности или имеют малую молекулярную массу (например, пыльца растений и др.), сопровождается формированием механизма иммунологической толерантности. Признаки чужеродности могут появиться у клеток тканей или эндогенных белков организма (аутоантигены), что может инициировать развитие иммунного ответа против собственных белков организма. В норме, если появляются Т-клетки с аутореактивной активностью к собственным белкам, они подвергаются апоптозу. Регуляторные нарушения в иммунной системе и нарушение механизмов иммунологической толерантности к аутоантиге-нам лежат в основе развития аутоиммунных заболеваний.

Существует насколько механизмов нарушения иммунологической толерантности. Наиболее изученным нарушением иммунологической толерантности при применении биопрепаратов является механизм развития Т-независимого иммунного ответа II типа. В 1993 г M.F. Bachmann и R.M. Zinkernagel [24] изучали влияние сложных белков на поверхности вируса (VCP - viral coat protein) на иммунологическую толерантность мышей и установили, что плохо организованные VCP вызывали Т-зависимый иммунный ответ, а хорошо организованные - Т-независимый ответ. Авторы предложили гипотезу, согласно которой распознавание рецепторами В-клеток повторяющихся В-клеточных антигенных детерминант, расположенных на расстоянии 5-10 нм друг от друга, способно вызвать развитие Т-независимого иммунного ответа. Недавно Charckerian В. с соавт. [25] показали, что высокая плотность вирусных частиц (Virus particles VLPs) на поверхности вируса вызывает выработку высоких титров IgG, в то время как меньшая плотность не вызывала выработки высоких тиров Ат. Авторы считают, что повторяющиеся, плотные и располагающиеся на расстоянии 5-10 нм эпитопы могут вызывать Т-независимый иммунный ответ.

Таким образом, при получении сигнала (распознавании) В-клеточными рецепторами (BCR) сразу от нескольких одинаковых полимерных повторов В-клеточных эпитопов может произойти активация В-клеток с формированием плазматических клеток (рис. 4). Данный процесс может быть усилен C3d-компонентом системы комплемента, который усиливает иммунный ответ и снижает порог активации В-клеток. R.Z. Dintzis с соавт. [26] показали, что Т-независимый иммунный ответ развивается за счёт стимуляции не менее 10 рецепторов на поверхности В-клеток, а область В-клеток, в которой BCRs связываются с эпитопом, предложили назвать «имму-нон». В природе полимерные повторы эпитопов встречаются в составе полисахаридов и липидных соединений.

Многочисленные исследования показали, что полимерные повторы эпитопов в биотехнологических препаратах могут быть образованы при формировании агрегатов белка препарата. Если агрегация приводит к появлению нового эпитопа, распознаваемого Т-клетками, то возможно развитие Т-зависимого иммунного ответа. А если в агрегате присутствует много повторяющихся эпитопов, распознаваемых IgM и IgD-рецепторами В-клеток, то может развиться нарушение толерантности В-клеток с появлением плазматических анти-телопродуцирующих клеток, синтезирующих Ат.

Экспериментально продемонстрировано участие агрегированных форм биологических препаратов в развитии Т-независимого механизма иммунного ответа. Введение агрегированных форм INF-ß сопровождалось развитием им-

REVIEWS

ф В-клеточный эпитоп

>- Рецептор, распознающий В-клеточные эпитопы Специфическое антитело

Рис. 4. Схема развития II типа Т-независимого иммунного ответа.

мунного ответа с синтезом IgM и IgD Ат без переключения на синтез Ат других изотипов и без формирования иммунологической памяти (В-клеток памяти) [27]. Данные выводы подтверждены в процессе клинических исследований [28].

В исследованиях S. Hermeling с соавт. [29] различные виды агрегатов препарата INF-ß получены путем использования катализируемого металлом окисления, окисления перок-сидом водорода, сшивкой глутаральдегидом и термообработкой. При введении таких препаратов INF-ß с индуцированной агрегацией установлено, что только агрегаты, полученные при окислении, катализируемом металлом, вызывали нарушение толерантности у трансгенных мышей. По-видимому, именно в процессе окисления белка происходит формирование агрегатов с образованием повторяющихся эпитопов, вызывающих нарушение иммунологической толерантности.

В некоторых работах показана возможность синтеза IgG по Т-независимому пути (без участия Т-хелперов) в ответ на введение препарата, однако механизм переключения с синтеза IgM на IgG неизвестен. В то же время некоторые авторы считают, что переключение на синтез Ат IgG-изотипа свидетельствует о подключении Т-зависимого иммунного процесса.

Изучение роли нарушения иммунологической толерантности в развитии иммунного ответа при применении биотерапевтических препаратов привело к появлению понятия «адаптивная толерантность». Данная гипотеза основана на том, что при появлении эффекторных Т-клеток с высоким сродством к собственным белкам, эти клетки удаляются из организма посредством апоптоза. В то же время, Т-клетки с невысоким сродством к собственным белкам могут быть «перепрограммированы» в естественные регуляторные Т-клетки (T-regulatory - Treg) [30].

Таким образом, при введении в организм веществ белковой природы дендритные клетки в процессе презентации определяют путь дифференцирования Т-клеток. В зависимости от ряда условий (гомологичный или чужеродный белок, уровень цитокинов др.) Т-клетки могут дифференцироваться в Т-эффекторные (с развитием иммунного ответа) или в Treg («адаптивные» клетки Treg-фенотипа). Процесс формирования клеток периферической толерантности (Treg) развивается с участием цитокинов ИЛ-10 и TGF-ß. Механизм формирования Treg до конца не изучен. Анализ механизмов иммуногенности биотерапевтических препаратов позволил выдвинуть гипотезу о том, что молекулы белка (в том числе и биопрепаратов) могут содержать в своем составе эпитопы, распознаваемые Treg-клетками.

Описаны эпитопы инсулина и GAD-65, распознаваемые Treg-клетками. В препаратах на основе мАт эпитопы, распознаваемые Treg-клетками, расположены в Fc-фрагменте (Treg-эпитопы), а Т-клеточные эпитопы - в Fab-фрагменте. АПК, поглощая и процессируя мАт, презентируют Аг наивным Т-клеткам. Если АПК представляет Treg-эпитоп препарата наивным T-клеткам (например, эпитоп Fc-фрагмента мАт) и отсутствуют эпитопы, связывающие Аг ГКГ, наивные

Т-клетки дифференцируются в специфические Treg-клетки с развитием иммунологической толерантности к конкретному белку [31]. Treg-клетки начинают секретировать провоспали-тельные цитокины толерантности (ИЛ-10 и TGF-P), которые подавляют активность аутореактивных Т-клеток, причем происходит подавление Th1- и ТЬ2-путей иммунного ответа на конкретный Treg-эпитоп. Предполагается, что подавление активности аутореактивных Т-клеток может происходить и при их непосредственном контакте с Treg-клетками [18].

Вероятно, дифференцировка Т-клеток в Treg связана с передачей АПК-ко-стимулирующего сигнала для подавления активации Т-клеток через CTLA-4-рецептор («маркер поздней активации»). Препарат модифицированных мАт -абатацепт (содержит CTLA-4 и Fc-фрагмент иммуноглобулина), используемый для лечения системных аутоиммунных заболеваний, в частности, ревматоидного артрита, подавляет чрезмерную активацию лимфоцитов. Препарат ипилимумаб (мАт, специфичные к CTLA-4), используемый в онкологии для лечения рака лёгкого и простаты, вызывает блокирование CTLA-4-рецептора на Т-клетках и активацию Т-клеток и формирование цитотоксических Т-лимфоцитов. Однако его применение часто приводит к развитию осложнений за счет чрезмерной активации иммунной системы, что сопровождается иммуноопосредованными тяжёлыми поражениями желудочно-кишечного тракта, печени, кожи, нервной, эндокринной систем или других органов [30].

Treg-клетки представлены двумя группами: клетки центральной (nTreg) и периферической (iTreg) толерантности. Основная функция клеток центральной толерантности - удаление (ликвидация) клона аутореактивных лимфоцитов в процессе их развития в костном мозге и тимусе. При повышении количества nTreg у мышей развивается раковое лимфопроли-феративное заболевание (так называемое «scurfy») [32].

Индуцированные или периферические iTreg приобретают супрессорные свойства в процессе активации CD4+ Т-клеток в ответ на стимуляцию Аг Существует два подмножества периферических Treg - Tr1 и Th3. Ш-клетки обязательно продуцируют ИЛ-10, а также TGF-p. Th3-клетки секретируют преимущественно TGF-p.

Супрессорные (регуляторные) функции Treg осуществляются посредством супрессорных цитокинов. Основными супрессорными медиаторами Treg-клеток являются ИЛ-10 и TGF-p. У здоровых лиц в крови определяется высокий уровень аллергенспецифических Т-клеток различной специфичности, секретирующих ИЛ-10 и TGF-p, превышающий количество Т-клеток, секретирующих ИЛ-4 (Th2-клетки) и ИНФ-у (ГЫ-клетки) [33].

Таким образом, при наличии в молекуле участков чуже-родности иммунный ответ на биотерапевтический препарат развивается по механизму классического Т-зависимого ответа. Если препарат состоит из белка, гомологичного эндогенным белкам человека, то развитие иммунного ответа связано с нарушением механизмов иммунологической толерантности, что можно проиллюстрировать на примере лекарственных препаратов мАт.

Факторы, влияющие на иммуногенность биотехнологических препаратов. Основные факторы, которые могут выступить в роли пускового механизма или факторов, усиливающих (способствующих) развитие иммунного ответа, можно объединить в 3 группы (рис. 5). К первой группе относятся факторы, связанные с препаратом (степень гомологии, уровень и характер примесей, состав вспомогательных веществ и др.). Вторая группа факторов определяется особенностями патологического процесса, при котором применяется препарат (подавление системы иммунитета, сопутствующая терапия и др.). К третьей группе относятся факторы, связанные с особенностью терапевтического курса применения препарата (схема введения, доза, путь введения и др.).

Среди факторов, влияющих на иммуногенные свойства

биотерапевтических препаратов, следует выделить способность некоторых препаратов на основе цитокинов или ростовых факторов усиливать иммунный ответ. Введение данных препаратов усиливает иммунный ответ на белковый компонент препарата. Такая способность усиливать иммунный ответ установлена при применении препаратов INF-ß, INF-a, гранулоцитарно-макрофагального колоние-стимулирующего фактора (GM-CSF) и мАт к TNF-a.

Rini B. с соавт. [34] показали, что реком-бинантный GM-CSF может стимулировать иммунный ответ при введении в комплексе с вакциной за счёт индукции активации АПК. Предполагается, что он влияет на созревание и миграцию АПК, выступая в качестве адъюван-та для вакцин. В то же время близкий к GM-CSF цитокин - гранулоцитарный колониести-мулирующий фактор (G-CSF) не влияет на интенсивность иммунного ответа. В исследованиях по изучению иммуногенности INF-a-2a человека установлено, что его одновременное введение мышам с препаратом INF-мыши приводило к усилению иммунного ответа [35].

Большое влияние на иммуногенные свойства биотерапевтических препаратов оказывают их физико-химические и биологические свойства. Даже один и тот же биотехнологический препарат, но полученный на разных производственных платформах, будет иметь разный иммуногенный потенциал, что обусловлено особенностью системы экспрессии белка, состава вспомогательных веществ и др. Например, INF-ß-1b (Betaseron), полученный в системе клеток E.coli, отличается от человеческого интерферона тем, что он не гликозилирован, цистеин в 17-м положении молекулы белка заменён на серин, отсутствует N-концевой метионин. Гликозилирование ЮТ^-1а (Avonex и Rebif), полученного в системе клеток СНО, не обязательно будет идентично профилю гликозилирования INF, синтезируемого клетками человека.

Клинические исследования выявили, что эффективность INF-ß-1b ниже, чем Г№^-1а, в связи с этим INF-ß-1b вводится в значительно более высоких дозах, чем INF-ß-1a. При лечении INF-ß-1b значительно быстрее образуются Ат к препарату, чем при применении INF-ß-1a. При этом отмечено, что указанные Ат могут через определённое время не выявляться. Ат чаще вырабатываются при подкожном введении, чем при внутримышечном, причём, чем чаще вводится препарат, тем определяется более высокий титр Ат к INF. Частота выработки Ат к препаратам INF-ß установлена при внутримышечном введении препарата Avonex в 2-6% случаев, подкожном введении Rebif в 12-28% и Betaseron в 28-47% [36].

С другой стороны Betaseron обладает плохой растворимостью и имеет склонность к агрегации, которая, как было установлено в исследованиях с удалением стабилизатора (альбумина) из препаратов интерферонов бета, активно влияет на иммуногенную активность препаратов [37].

В данном случае сложно установить, что является доминирующим фактором «нежелательной» иммуногенности препаратов INF-ß: профиль гликозилирования, состав препарата, путь введения, частота введения или др. Тем не менее, установлена чёткая закономерность зависимости иммуноген-ности от уровня агрегации белка препарата. В эксперименте на трансгенных мышах установлено, что введение препарата INF-a, содержащего агрегаты, сопровождалось выработкой Ат к INF-a. В то же время введение неагрегированных (мономерных) форм препарата не вызывало выработки Ат.

Исследование роли агрегации белка в механизмах развития иммунного ответа показало, что в процессе агрегации мо-

Факторы, влияющие на иммуногенность биологических препаратов

Связанные с препаратом:

а) физико-химические и биологические свойства:

— степень гомологии;

— влияние на иммунитет;

— структура молекулы белка;

— размер молекулы;

— модификации молекулы;

— контаминация и примеси;

— состав препарата;

— "рецептор-мишень";

— перекрестная активность;

— агрегация белка.

б) связанные с производственным процессом, условиями хранения . и транспортирования >

г

Связанные с пациентом:

— генетические особенности;

— особенности патогенеза заболевания;

— состояние системы Иммунитета;

— сопутствующая терапия;

— другие.

Связанные с лечением:

— доза препарата;

— путь введения;

— длительность курса;

— частота и периодичность введения.

Рис. 5. Основные факторы, влияющие на иммуногенность биологических/биотехнологических препаратов.

гут быть образованы не только новые эпитопы, но и выявиться скрытые и повторяющиеся эпитопы, с которыми связано нарушение толерантности и развитие Т-независимого иммунного ответа на биотерапевтические препараты (см. рис. 5).

С целью повышения эффективности и/или снижения нежелательной иммуногенности очень часто используются различные виды модификаций биотерапевтических препаратов. Наиболее распространёнными формами модификации являются гликозилирование и пегелирование, которые приводят к снижению иммуногенности за счёт экранирования потенциальных антигенных детерминант в молекуле препарата, повышения растворимости действующего вещества или предотвращения агрегации. Исследование гликозилированных препаратов GM-CSF и INF-ß-1b показало, что они обладают более низкой иммуногенностью, чем их негликозилирован-ные нативные формы. Предполагается, что в процессе глико-зилирования происходит экранирование эпитопов, что было продемонстрировано при применении препаратов рекомби-нантного GM-CSF-человека, полученных в разных системах экспрессии. Ат, индуцированные введением препаратов GM-CSF человека, полученных в системе клеток дрожжей или E. coli (негликозилированная форма белка препарата), перекрёстно реагировали между собой. Но данные Ат не реагировали с Ат, полученными в ответ на введение GM-CSF, синтезированного в системе клеток яичника китайского хомячка (СНО), который содержит гликаны в О-области [38, 39].

В то же время описаны три случая, когда пегилирование рекомбинантных препаратов сопровождалось усилением их нежелательной иммуногенности. Пегилированные препараты фактора роста мегакариоцитов (PEG-rhMGDF), TNF и INF-a вызывали более активный иммунный ответ, по сравнению с немодифицированными формами препаратов. При этом разработчики препаратов считают, что в данном случае развитие иммунного ответа связано с более длительным периодом циркуляции препаратов в организме и соответственно более длительным контактом с иммунокомпетентными клетками больных [40]. Кроме того, применение препаратов пегилированного Г№^-1а сопровождается выработкой Ат не только к INF, но и молекуле полиэтиленгликоля.

Развитие иммунного ответа на препарат во многом зависит от особенностей патологического процесса заболевания и его влияния на систему иммунитета больного. При неход-

REVIEWS

Новый ЭПИТОП

Агрегация

Агрегация \ у J J Денатурация

Скрытые эпитопы

Повторяющиеся эпитопы — аминокислоты, формирующие эпитопы препаратов

Рис. 6. Схема возможных вариантов появления «новых» эпитопов в процессе денатурации и агрегации биотерапевтических препаратов (новые, скрытые и повторяющиеся эпитопы).

жкинской лимфоме маркер CD20 встречается не только на опухолевых, но и на здоровых зрелых В-клетках. Применение препарата ритуксимаб (мАт, специфичные к CD20) для лечения лимфомы приводит к снижению числа В-клеток в организме больного. Поэтому у больных с лимфомой не вырабатываются Ат к лекарственным препаратам, специфически блокирующим CD20. А при других заболеваниях (например при РА) введение данного препарата может привести к развитию иммунного ответа и формированию Ат к компонентам препарата.

В ряде исследований показано, что применение ритукси-маба не вызывало развитие иммунного ответа у больных с нарушением/подавлением иммунной системы при хроническом лимфолейкозе, но вызывало выработку Ат при аутоиммунной патологии (у 27% больных синдромом Шегрена и у 65% - системной красной волчанкой). Аналогично в процессе проведения клинических исследований препарата алемту-зумаб (мАт против CD52), который является иммуносупрес-сором, установлено, что при лечении больных ревматоидным артритом Ат к препарату вырабатывались в 63% случаев, а у больных рассеянным склерозом - в 23% случаев [41, 42].

Особенности патологического процесса и сопутствующей терапии влияют не только на частоту выработки Ат, но и на характер иммунного ответа. Например, начало лечения больных гемофилией А препаратом VIII фактора может вызвать активацию №2- пути иммунного ответа, сопровождающегося образованием IgG4 Ат, направленных против VIII фактора. Указанные Ат обладают нейтрализующей активностью и получили название ингибиторы. В связи с тем, что ингибиторы блокируют биологическую активность пре-

паратов VIII фактора свёртывания крови, в состав терапии включают иммуносупрессоры для подавления иммунного ответа на препарат VIII фактора. Введение препаратов VIII фактора на фоне иммуносупрессии вызывает активацию уже Thl-пути иммунного ответа с выработкой IgG1 и IgG2 Ат к VIII фактору. Причем эффективность препаратов VIII фактора при наличии ингибиторов у больных гемофилией выше, если ингибиторами являются IgG1 и IgG2, а при выработке IgG4 наблюдается подавление клинической эффективности препаратов VIII фактора.

Появление Ат к биотерапевтическим препаратам может привести к изменению фармакокинетики, снижению эффективности и развитию ПР на препарат (рис. 6). В некоторых случаях появление Ат к препарату вызывает прямое развитие эффекта, например, ускорение выведения препарата из организма или подавление эффективности за счёт нейтрализации биологического действия препарата. В других ситуациях Ат не прямо, а опосредованно, вызывают развитие тех или иных эффектов. Например, Ат могут не обладать нейтрализующей активностью, но, ускоряя выведение препарата из организма, снижают его эффективность.

В работе Carrascosa J.M. [43] показано, что эффективность инфликсимаба при тяжёлом псориазе у больных с наличием Ат в сыворотке крови к препарату отмечена только в 39% случаев, а у больных без Ат - в 81% случаев. Описано снижение эффективности терапии при появлении Ат к препаратам инфликсимаб - при лечении анкилозирующего спондилита, адалимумаб - при лечении ревматоидного артрита, натализумаб (мАт против а4-интегрина), факторов свертывания крови, INF и др.

Рис. 7. Последствия появления антител к биотерапевтическим препаратам.

В последнее время показано, что снижение эффективности биотерапевтических препаратов связано с нарушением фармакокинетических свойств препарата. Очень редко Ат могут увеличивать период полувыведения лекарственного препарата, чаще всего Ат увеличивают клиренс препарата, что сопровождается потерей его эффективности (рис. 7). Установлено, что Ат к инфликсимабу и адалимумабу оказывают влияние на клиренс и эффективность препаратов.

Ат, влияющие на клиренс инфликсимаба и адалимумаба, обычно определяются в период 8-16-й недели после начала лечения. Ат к натализумабу появляются через 12 нед после начала лечения, высокие постоянные уровни Ат коррелируют со снижением количества препарата, определяемого в сыворотке крови больных, и снижением его эффективности. При лечении пациентов болезнью Помпе препаратом Myo-zyme (аглюкозидаза-а) отмечено, что при появлении Ат с титром 1:12 800 наблюдалось повышение клиренса препарата на 50% (5-90%) в период от 1 до 12 нед лечения, которое сопровождалось снижением эффективности препарата.

При изучении фармакокинетики биотерапевтического препарата определяемое снижение концентрации препарата в сыворотке крови пациента еще не означает, что его количество в организме действительно снизилось. Во-первых, препарат может быть связан с Ат, что приводит к блокированию его связывания с Ат в тест-системе для определения концентрации препарата. Во-вторых, препараты на основе мАт могут связываться с FcRn-рецептором и поступать в клетки, не покидая организм.

Следует отметить, что уровень Ат, синтезируемых в ответ на введение препарата, может без всякого вмешательства спонтанно снизиться или Ат могут исчезнуть (так называемые транзиторные Ат). Одной из причин данного явления, возможно, является формирование иммунологической толерантности на введение препарата.

Синтез Ат к препарату не всегда сопровождается снижением эффективности препарата. Описаны случаи, когда появление Ат к препаратам мАт, предназначенных для лечения опухолевых заболеваний, вызывает усиление терапевтического эффекта. Установлено повышение эффективности препаратов мАт, используемых для лечения неходжкинской лимфомы. При лечении препаратом Lym-1 (мышиные мАт для лечения лимфомы) определялись высокие титры Ат к препарату, кото-

рые коррелировали с показателями выживаемости больных. Авторы предполагают, что вырабатываемые в ответ на введение Lym-1 Ат относятся к антиидиотипическим и усиливают цитотоксические свойства противоопухолевых мАт.

Влияние иммуногенности на эффективность и безопасность. Первые исследования, посвященные иммуногенности биологических препаратов, касались в основном вопросов определения Ат и оценки их нейтрализующей активности. Позже появились исследования, которые продемонстрировали, что появление Ат может сопровождаться развитием реакций гиперчувствительности. Описано развитие реакций гиперчувствительности с участием Ат к препаратам VIII и IX факторов свёртывания крови, INF, натализу-маб, инфликсимаб, омализумаб и др.

Кроме развития реакций гиперчувствительности, в том числе и немедленных аллергических реакций, появление Ат к препарату (особенно нейтрализующих) может привести к развитию иммунотоксичности типа иммунокомплексных реакций (осаждение иммунных комплексов в органах и тканях, например, в почках), аутоиммунных процессов, неконтролируемый выброс цитокинов (реакции типа «цитокинового шторма»), перекрёстных реакций с эндогенным белком и др.

У 68% больных с ревматоидными заболеваниями, которые принимали адалимумаб, было обнаружено образование Ат к препарату, однако данные Ат не влияли на развитие ПР, но приводили к снижению эффективности препарата, но в редких случаях (у больных болезнью Крона) эти Ат вызывали развитие тяжёлой формы сывороточной болезни, васкули-та и нефрита [44].

К наиболее тяжёлым последствиям синтеза Ат против биологических препаратов является перекрёстное связывание Ат эндогенных белков, которые являются аналогами белка препарата. Данные побочные эффекты зарегистрированы при лечении препаратами рекомбинантных эритропоэтинов с развитием парциальной красноклеточной аплазии и PEG-MGDF (пегилированный фактор роста мегакариоцитов), применение которого вызывало развитие аутоиммунной тромбоцитопе-нии. При введении PEG rhMGDF 35 здоровым добровольцам у 13 человек после 2-го или 3-го введения развивалась стойкая тромбоцитопения, которая также была зарегистрирована у 4 из 650 больных с опухолевыми заболеваниями [45].

Изучение механизмов развития аллергических реакций в

REVIEWS

Таблица 2

Модифицированная классификация повреждения тканей при аллергических реакциях W. Л. KcЫer с соавт. [46]

Тип I Тип II Тип III Тип IV

Тип !Уа Тип ГУЬ Тип ГУе Тип IVd

Активные ¡ВЕ IgG ДО ИНФ-у, ФНОа ИЛ-5, ИЛ-4, ИЛ-13 Гранзим В, перфо- CXCL-8, ИЛ-

молекулы (цитокины ТЫ (цитокины ТЬ2 рин (С^) 17, ГМ-КСФ,

или клетки пути) пути)

Антиген Раство- Антиген, Растворимый Антиген пред- Антигены, ассоции- Растворимый

римый ассоцииро- антиген ставляется АПК рованы с клеткой антиген пред-

антиген ванный с или происходит или происходит ставляется АПК

клеткой или прямая стимуля- прямая стимуляция или происходит

матриксом ция Т-клеток Т-клеток прямая стимуля-

ция Т-клеток

Эффекторы Активация FcR+-клетки FcR+-клетки, Активированные Эозинофилы Т-клетки Нейтрофилы

тучных (фагоциты, комплемент макрофаги

клеток NK-клетки)

Примеры Аллер- Аллергия на Сывороточ- Туберкулиновая Хроническая астма Контактный или AGEP, болезнь

реакций ги- гический препараты ная болезнь, реакция, контакт- или/и аллергиче- буллезный дер- Бехчета

перчувстви- ринит, (например реакция ный дерматит ский ринит, макуло- матит, макулопа-

тельности астма, ана- на пеницил- Артюса папулёзная сыпь с пулёзная сыпь,

филаксия лин) эозинофилией гепатит

Примечание. AGEP - острый генерализованный экзентемагозный пустулез.

ответ на применение биопрепаратов позволило описать особенности развития некоторых типов аллергических реакций и расширить представление о замедленных аллергических реакциях. IV тип повреждения тканей при аллергических реакциях (классификация Джейл и Кумбса) развивается при появлении сенсибилизированных Т-клеток, при этом в развитии воспаления участвуют различные эффекторные клетки (эозинофилы, моноциты или нейтрофилы). Учитывая вклад отдельных популяций лейкоцитов в развитие лекарственной аллергической реакции замедленного типа, W.J. Pichler с соавт. [46] среди аллергических реакций IV типа выделили следующие 4 подтипа: подтип А (IVa), обусловленные активностью моноцитов; подтип В (IVb) - эозинофилов; подтип С (ГУс) - клеток фенотипа СД4+ или СД8+ и подтип D (IVd) - нейтрофилов (табл. 2).

Реакции IVa типа развиваются при активации Thl-пути иммунного ответа, в процессе которого происходит активация макрофагов. Это сопровождается увеличением продукции INF-y и продукцией комплементсвязывающих Ат (IgG1 и IgG3), что является ко-стимулирующим сигналом для продукции про-воспалительных цитокинов (TNF, IL-12) и СД8+ Т-клеточного ответа. Развитие данного типа аллергической реакции может происходить одновременно с аллергическими реакциями II или III типа. Клиническим проявлением данного типа реакций является развитие лекарственного контактного дерматита.

Развитие IVb типа реакции происходит при непосредственном участии Th2-клеток. Активация Th2-клеток сопровождается продукцией противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-13, IL-5), которые запускают продукцию В-клетками IgE и IgG4. В развитии данного типа реакции могут принимать участие аллергические реакции I типа. При этом цито-кины подавляют активность макрофагов, но активируют тучные клетки и эозинофилы. Высокий уровень IL-5 запускает развитие эозинофильного воспаления, которое проявляется макулопапулезной сыпью, ринитом и бронхиальной астмой.

При аллергических реакциях ГУс типа в качестве эффек-торных клеток выступают Т-клетки, которые эмигрируют в ткани, вызывая их повреждение. Гибель клеток (гепатоцитов и кератоцитов) происходит за счёт секреции перфорина, гран-зима В, гранулолизина и активации апоптоза (через FasL ли-ганд). Данный тип реакции может доминировать при развитии буллёзных повреждений кожи, гепатите и нефрите [47].

Если указанные выше три подтипа обсуждались в течение продолжительного периода времени, то IVd тип описан недавно Britschgi M. с соав. [48]. Авторы считают, что Т-клетки могут координировать асептическое нейтрофильное воспаление. При этом Т-клетки продуцируют GM-CSF, фактор хемотаксиса и активации нейтрофилов (CXCL8). Данный тип реакций принимает участие в развитии болезни Бехчета и псориаза.

Основной проблемой практического применения данных 4 подтипов аллергической реакции IV типа является отсутствие чётких клинических критериев, характеризующих данные подтипы, и диагностических маркеров, на основании которых можно установить к какому подтипу относится ПР.

В заключение следует отметить, что количество биологических, особенно биотехнологических, препаратов неуклонно увеличивается. По мере появления и активного применения в клинической практике новых биотерапевтических препаратов появляются и новые проблемы, связанные с проявлением их нежелательной иммуногенности. Например, появление лекарственных препаратов на основе крупных молекул мАт потребовало особых подходов для оценки иммуногенности данной группы препаратов [49]. Были зарегистрированы случаи выработки Ат после замены оригинальных (эритропоэтинов и инсулинов) на неоригинальные препараты. Случаи развития ПР, связанных с проявлением иммуногенности указанных препаратов, зарегистрированы в развивающихся странах с низким уровнем фармаконадзо-ра. В частности в работе García-Nares H. с соавт. [50] показано, что после 9 лет применения оригинального препарата инсулина гларгин на неоригинальный у больной произошло развитие анафилаксии. При тестировании нескольких серий оригинальных и неоригинальных препаратов инсулина in vitro было показано, что в тесте дегрануляции базофилов положительная реакция определялась только на некоторые (но не все) серии неоригинального препарата. При этом реакция на все серии оригинального препарата была отрицательной. Данный пример может свидетельствовать о нестабильном производстве неоригинальных препаратов.

Несмотря на успехи в области изучения иммуногенности биотехнологических препаратов, имеются пробелы, в первую очередь касающиеся механизма развития иммунного ответа при нарушении иммунологической толерантности при применении препаратов на основе гомологичных белков. Открытым остаёт-

ОБЗОРЫ

ся вопрос о запуске (или переключении) синтеза конкретного изотипа иммуноглобулинов. Анализ литературы показал, что многие механизмы развития иммунного ответа на биотерапевтические препараты пока находится ещё на уровне гипотез.

Среди факторов, которые тормозят дальнейшие исследования в данном направлении, необходимо выделить отсутствие единого стандартного подхода для оценки иммуногенности биотерапевтических и биотехнологических препаратов. Несмотря на то что имеются методические рекомендации для оценки биотерапевтических белков, в рекомендациях для оценки конкретных биопрепаратов предлагаются собственные подходы. Например, для оценки иммуногенности при клинических исследованиях препаратов на основе факторов свёртывания крови рекомендации ограничены только оценкой нейтрализующей активности Ат, что не позволяет охарактеризовать другие важные особенности Ат, такие как класс иммуноглобулинов, влияние на фармакокинетические свойства лекарственного препарата и др.

Представленные данные свидетельствуют о необходимости дальнейшего исследования в данном направлении, что позволит не только раскрыть механизмы иммуногенно-сти биологических препаратов, но и разработать препараты нового поколения со сниженной иммуногенностью. С другой стороны, исследование иммуногенности биологических препаратов может помочь и при разработке иммунобиологических препаратов, механизм действия которых основан на иммуногенности, таких как вакцины и аллергены. Кроме того, изучение механизмов иммуногенности необходимо для разработки соответствующих мероприятий при применении биотерапевтических препаратов, направленных на предотвращение и снижение последствий, вызванных развитием нежелательной иммуногенности, что позволит снизить развитие побочных реакций и повысить эффективность применения биопрепаратов.

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Медуницын Н.В., Миронов А.Н., Мовсесянц А.А. Теория и практика вакцинологии. М.: «РЕМЕДИУМ»; 2015.

2. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2010.

14. Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Медуницын Н.В., Киселевский М.В., Лысикова С.Л. и др. Проблемы регистрации биологических неоригинальных лекарственных препаратов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2014; (4): 25-38.

33. Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Медуницын Н.В. Механизмы аллергической реакции немедленного типа, препараты и методы специфической иммунотерапии. Иммунология. 2016; 37 (1): 52-61. 49. Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Солдатов А.А., Бондарев В.П., Мосягин В.Д., Медуницын Н.В. Безопасность лекарственных препаратов моноклональных антител, связанная с проявлением их иммуногенности. Иммунология. 2015; 36 (4): 247-56.

REFERENcES

1. Medunitsyn N.V., Mironov A.N., Movsesyants A.A. Theory and practice of vaccinology.[Teoriya i praktika vaktsinologii]. Moscow: "REMEDIUM"; 2015.

2. Yarilin A.A. Immunology. [Immunologiya]. Moscow: GEOTAR-Media; 2010.

3. Lajus S., Clofent-Sanchez G., Jais C., Coste P., Nurden P., Nurden A. Thrombocytopenia after abciximab useresults from different mechanisms. Thromb Haemost. 2010; 103: 651-61; PMID: 20076853. http://dx.doi.org/10.! 160/TH09-08-0603.

4. Van Beers M.M.C., Bardor M. Minimizing immunogenicity of bio-pharmaceuticals by controlling critical quality attributes of proteins. Biotechnology Journal. 2012; 7 (12): 1473-84.

5. Xu X., Nagarajan H., Lewis N.E., Pan S., Cai Z., Liu X. et al. The genomic sequence of the Chinese hamster ovary (CHO)-K1 cell line. Nature Biotechnology. 2011; 29 (8): 735-41.

6. Ghaderi D., Taylor R.E., Padler-Karavani V., Diaz S., Varki A. Implications of the presence of N-glycolylneuraminic acid in recombinant therapeutic glycoproteins. Nature Biotechnology. 2010; 28 (8): 863-7.

7. Maeda E., Kita S., Kinoshita M., Urakami K., Hayakawa T., Kakehi K. Analysis of nonhuman N-glycans as the minor constituents in recombinant monoclonal antibody pharmaceuticals. Analytical Chemistry. 2012; 84 (5): 2373-9.

8. Yeung V.P., Chang J., Miller J., Barnett C., Stickler M., Harding F.A. Elimination of an immunodominant CD4+ T cell epitope in human IFNbeta does not result in an in vivo response directed at the subdominant epitope. J. Immunol. 2004; 172: 6658-65.

9. Gupta S., Ansari H.R., Gautam A. Identification of B-cell epitopes in an antigen for inducing specific class of antibodies. Biology Direct. 2013; 8: 27.

10. Homann A., RockendorfN., Kromminga A., Frey A., Jappe U. B cell epitopes on infliximab identified by oligopeptide microarray with unprocessed patient sera. J. Transl. Med. 2015; 13:339: 1465-79.

11. Tuohy V.K., Kinkel R.P. Epitope spreading: a mechanism for progression of autoimmune disease. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2000; 48 (5): 347-51.

12. Gneiss C., Reindl M., Berger T., Lutterotti A., Ehling R., Egg R. et al. Epitope specificity of neutralizing antibodies against IFN-beta. J. Interferon Cytokine Res. 2004; 24: 283-90.

13. Petersen B., Bendtzen K., Koch-Henriksen N., Ravnborg M., Ross C., Sorensen P.S. Persistence of neutralizing antibodies after discontinuation of IFNbeta therapy in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult. Scler. 2006; 12: 247-52.

14. Soldatov A.A., Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A., Medunitsyn N.V., Kiselevskiy M.V., Lysikova S.L. et al. Problems of registration of non-original biological medicines. BIOpreparaty. Profilaktika, diag-nostika, lechenie. 2014;

15. Sturniolo T., Bono E., Ding J., Raddrizzani L., Tuereci O., Sahin U. et al. Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databases using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 1999; 17: 555-61.

16. Koita O.A., Dabitao D., Mahamadou I., Tall M., Dao S., Tounkara A. et al. Confirmation of immunogenic consensus sequence HIV-1 T-cell epitopes in Bamako, Mali and Providence. Rhode Island. Hum. Vaccin. 2006; 2: 119-28.

17. Singh S.K., Cousens L.P., Alvarez D., Mahajan P.B. Determinants of immunogenic response to protein therapeutics. Biologicals. 2012; 40: 364-8.

18. De Groot A.S., Moise L. Prediction of immunogenicity for therapeutic proteins: State of the art. Curr. Opin. Drug Disc. Develop. 2007; 10 (3): 332-40.

19. Bryson C.J., Jones T.D., Baker M.P. Prediction of immunogenicity of therapeutic proteins: validity of computational tools. BioDrugs. 2010; 24 (1): 1-8.

20. Pichler W.J. Pharmacological interacti on of drugs with antigen-specific immune receptors: the p-i concept. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2002; 2: 301-5.

21. Baert F., Noman M., Vermeire S., Van Assche G., Carbonez A., Rut-geerts P. Influence of immunogenicity on the long-term efficacy of infliximab in Crohn's disease. N. Engl. J. Med. 2003; 348: 601-8.

22. West R.L., Zelinkova Z., Wolbink G.J., Kuipers E.J., Stokkers P.C. Immunogenicity negatively influences the outcome of adalimumab treatment in Crohn;s disease. Aliment Pharmacol. Ther. 2008; 28: 1122-6.

23. Oliveira C.A., Velloso-Rodrigues C., Machado F.C., Carvalho B.N., Gentz S.H., Martins-Filho O.A., Chaves D.G. Cytokine profile and FVIII inhibitors development in haemophilia A. Haemophilia. 2013; 19 (3): 139-42.

24. Bachmann M. F., Zinkernagel R. M. Neutralizing antiviral B cell responses. Annu. Rev. Immunol. 1997; 15: 235-70.

25. Chackerian B., Lenz P., Lowy D.R., Schiller J.T. Determinants of autoantibody induction by conjugated papillomavirus virus-like particles. J. Immunol. 2002; 169: 6120-6.

26. Dintzis R.Z., Okajima M., Middleton M.H., Greene G., Dintzis H.M. The immunogenicity of soluble haptenated polymers is determined by molecular mass and hapten valence. J. Immunol. 1989; 143: 1239-44.

27. Karpusas M., Whitty A., Runkel L., Hochman P. The structure of human interferon-beta: implications for activity. Cell Mol. Life Sci. 1998; 54: 1203-16.

28. Hermeling S., Crommelin D. J., Schellekens H., Jiskoot W. Struc-ture-immunogenicity relationships of therapeutic proteins. Pharm. Res. 2004; 21: 897-903.

29. Hermeling S., Jiskoot W., Crommelin D., Bornaes C., Schellekens H. Development of a transgenic mouse model immune tolerant for human interferon Beta. Pharm. Res. 2005; 22: 847-51.

30. De Groot A.S., Terry F., Cousens L., Martin W. Beyond humaniza-tion and de-immunization: tolerization as a method for reducing the immunogenicity of biologics. Expert Rev. Clin. Pharmacol. 2013; 6 (6): 651-62.

31. Oling V., Marttila J., Ilonen J., Kwok W.W., Nepom G., Knip M. et al. GAD65- and proinsulin-specific CD4. T-cells detected by MHC class II tetramers in peripheral blood of type 1 diabetes patients and at-risk subjects. J. Autoimmun. 2006; 27 (1): 69.

32. McCaughtry T.M., Hogquist K.A. Central tolerance: what have we learned from mice? Semin. Immunopathol. 2008; 30: 399-409.

33. Soldatov A.A., Avdeeva Zh.I., Medunitsyn N.V. The mechanisms of allergic reactions of immediate type, medicines and methods of im-munotherapy. Immunologiya. 2016; 37

34. Rini B., Wadhwa M., Bird C., Small E., Gaines-Das R., Thorpe R. Kinetics of development and characteristics of antibodies induced in cancer patients against yeast expressed rDNA derived granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF). Cytokine. 2005; 29: 56-66.

35. Braun A., Kwee L., Labow M.A., Alsenz J. Protein aggregates seem to play a key role among the parameters influencing the antigenic-ity of interferon alpha (IFNalpha) in normal and transgenic mice. Pharm. Res. 1997; 14: 1472-8.

36. Bertolotto A., Sala A., Malucchi S., Marnetto F., Caldano M., Di Sa-pio A. et al. Biological activity of interferon betas in patients with multiple sclerosis is affected by treatment regimen and neutralising antibodies. J. Neurol. NeurosurgPsychiatry. 2004; 75: 1294-9.

37. Rosenberg A.S. Effects of Protein Aggregates: An Immunologic Perspective. AAPS J. 2006; 8 (3) Article 59: E501-8.

38. Wadhwa M., Skog A.H., Bird C., Ragnhammar P., Lilljefors M., Gaines-Das R. et al. Immunogenicity of granulocyte-macrophage

REVIEWS

colony-stimulating factor [GMCSF] products in patients undergoing combination therapy with GM-CSF. Clin. Cancer Res. 1999; 5: 1353-61.

39. van Beers M.M.C., Jiskoot W., Schellekens H. On the role of aggregates in the immunogenicity of recombinant human interferon beta in patients with multiple sclerosis. J. Interferon Cytokine Res. 2010; 30: 767-75.

40. Hermeling S., Crommelin D.J.A., Schellekens H., Jiskoot W. 40 Structure-immunogenicity relationships of therapeutic proteins. Pharm. Res. 2006; 21: 897-903.

41. Davis T.A., Grillo-Lo'pez A.J., White C.A. et al. Rituximab anti-CD20 monoclonal antibody therapy in non-Hodgkin's lymphoma: safety and efficacy of re-treatment. J. Clin. Oncol. 2000; 18 (17): 3135-43.

42. Pijpe J., van Imhoff G.W., Spijkervet F.K. et al. Rituximab treatment in patients with primary Sjogren's syndrome: an open-label phase II study. Arthritis Rheum. 2005; 52 (9): 2740-50.

43. Carrascosa J.M. Immunogenicity in Biologic Therapy: Implications for Dermatology. ActasDermosifiliogr. 2013; 104 (6): 471-9.

44. Wolbink G.J., Vis M., Lems W., Voskuyl A.E., de Groot E., Nur-mohamed M.T. et al. Development of antiinfliximab antibodies and relationship to clinical response in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 2006; 54: 711-5.

45. Li J., Yang C., Xia Y., Bertino A., Glaspy J., Roberts M., Kuter D.J. Thrombocytopenia caused by the development of antibodies to thrombopoietin. Blood. 2001; 98: 3241-8.

46. Pichler W.J., Adam J., Daubner B., Gentinetta T., Keller M., Yerly

D. Drug Hypersensitivity Reactions: Pathomechanism and Clinical Symptoms. Med. Clin. N. Am. 2010; 94: 645-64.

47. Nassif A., Bensussan A., Dorothee G. et al. Drug specific cytotoxic T-cells in the skin lesions of a patient with toxic epidermal necroly-sis. J. Invest. Dermatol. 2002; 118: 728-33.

48. Britschgi M., Steiner U.C., Schmid S. et al. T-cell involvement in drug-induced acute generalized exanthematous pustulosis. J. Clin. Invest. 2001; 107: 1433-41.

49. Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A., Soldatov A.A., Bondarev V.P., Mos-yagin V.D., Medunitsyn N.V. The safety of medicinal products monoclonal antibodies, associated with the manifestation of their immunogenicity. Immunologiya. 2015; 36

50. García-Nares H., Leyva-Carmona M.I., Pérez-Xochipa N., Chiquete

E. Hypersensitivity reaction to a biosimilar insulin glargine. J. Diabetes. 2014; 7: 155-7.

Поступила 12.02.17 Принята в печать 14.04.17