ПРИМЕНЕНИЕ ВИРУСА МИКСОМЫ ДЛЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ РАКА И ХРОНИЧЕСКОЙ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ
APPLICATION OF MYXOMA VIRUS FOR THERAPEUTIC TREATMENT OF CANCER AND CHRONIC VIRUS INFECTION

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение в основном относится к терапевтическому применению вируса миксомы.
Предпосылки к созданию изобретения
Современные подходы к лечению различных типов раковых опухолей направлены на отравление или уничтожение раковых клеток. Те подходы лечения, которые являются токсичными для раковых клеток, также токсичны и для здоровых клеток. Более того, гетерогенная природа опухолей является одной из основных причин того, почему до сих пор не найден эффективный способ лечения рака. Основные подходы к лечению рака на настоящий момент, такие как химиотерапия и лучевая терапия, могут применяться в очень узких терапевтических рамках токсичности. Такие подходы к лечению считаются грубыми инструментами, применение которых ограничено из-за различия типов опухолевых клеток и ограниченных рамок, в которых эти виды лечения могут быть применены.
При разработке современных противораковых препаратов пытаются достичь селективной направленности в отношении опухолевых клеток, при этом уменьшить токсичность для здоровых клеток, тем самым увеличивая вероятность того, что здоровые клетки останутся неповрежденными.
Онколитическая вирусная терапия является одним из подходов, целью которых является использование клеточных различий между нормальными клетками и опухолевыми клетками. В этом подходе к лечению используют в качестве противораковых средств способные к репликации опухоле-селективные вирусные векторы. Онколитический вирус либо специфически нацелен на раковые клетки, либо с большей эффективностью репликцируется в раковых клетках, чем в здоровых клетках. Такие репликцирующиеся онколитические вирусы являются либо природными, либо полученными методами генной инженерии и являются высокоселективными и очень эффективными для воздействия на гетерогенную популяцию опухолей. Поскольку в нормальных (здоровых) клетках онколитические вирусы с селективной репликацией не могут эффективно реплицироваться, токсичность для пациента будет ниже, особенно по сравнению с обычными подходами к видам лечения, таким как химиотерапия и лучевая терапия.
Сообщалось о многочисленных исследованиях онколитической активности различных вирусных штаммов, среди которых наиболее перспективными онколитическими вирусами являются природные или генетически модифицированные варианты аденовируса, вируса простого герпеса 1 («HSV1»), реовируса, вируса коровьей оспы, вируса пузырькового (полостного) стоматита («VSV») или полиовируса. Модифицированные онколитические вирусы, исследуемые в настоящий момент в качестве противораковых агентов, включают в себя HSV, аденовирус, вирус болезни Ньюкастла («NDV»), реовирус и вирус коровьей оспы, вирус кори, VSV и полиовирус. Различные онколитические вирусы находятся в I и во II фазе клинических испытаний, и некоторые из них демонстрируют стабильную эффективность. Тем не менее, не известно, какие вирусы будут наиболее удовлетворять целям онколитической терапии, то есть длительной репликации, специфичности и высокой литической активности. Оптимальным кандидатом онколитического вирусного вектора мог бы стать вектор, у которого короткий жизненный цикл, который быстро образует зрелые вирусы, эффективно распространяется от клетки к клетке и имеет большой геном, доступный для осуществления вставок. Кроме того, экспериментальные данные показывают, что ингибирование природного раннего иммунного ответа и медленное развитие Th1 ответов очень важны для эффективной онколитической терапии. Очевидно, что вирусы человека являются высоко иммунногенными, что определяется высоким уровнем антител и Т-клеточными ответами, которые наблюдают в нормальной популяции многих вирусов, исследуемых для разработки онколитических вирусов.
Клиническое исследование показало, что современные онколитические вирусы являются действительно безопасными, но недостаточно эффективными в качестве препаратов монотерапии, то есть полностью клинически эффективными. Поскольку обычно не наблюдается достаточного или эффективного заражения опухолевых клеток, то современным направлением с целью повышения их эффективности является получение методами генетической инженерии кандидантных вирусов для экспрессии терапевтических трансгенов. Большинство из вышеупомянутых онколитических вирусов также исследовали в сочетании с другими общеизвестными онколитическими подходами к лечению.
J. Clin. Oncol.
Аденовирус может быть легко генетически изменен, и функция вирусных белков хорошо известна. Кроме того, он связан с заболеваниями легкой формы. Аденовирус человека ONYX-015 (Onyx Pharmaceuticals Inc.) является одним из наиболее изученных онколитических вирусов, которые были оптимизированы для клинического использования. Считается, что он предпочтительно реплицируется в р53-негативных опухолях и проявляет хороший потенциал в клинических испытаниях у пациентов с опухолями головы и шеи. Однако сообщалось, что только у 14% пациентов ONYX-015 демонстрирует требуемый клинический ответ. (Nemunaitis J, Khuri F, Ganly I, Arseneau J, Posner M, Vokes E, Kuhn J, McCarty T, Landers S, Blackburn A, Romel L, Randlev B, Kaye S, Kirn D.  2001 Jan 15;19(2):289-98).
В WO96/03997 и W097/26904 описаны мутантный онколитический вирус простого герпеса (HSV), который ингибирует рост опухолевых клеток и является специфичным в отношении нейрональных клеток. Дополнительными преимуществами HSV является то, что он может быть легко генетически изменен, и существуют лекарственные средства для прекращения любых нежелательных репликаций вируса. Однако применение таких общеизвестных патогенов человека ограничено, поскольку, вероятно, большая часть населения подвергалась воздействию этого вируса и приобрела иммунный ответ в отношении него, что снизило бы литический эффект этого вируса. HSV также может вызывать серьезные побочные эффекты и потенциально смертельные заболевания.
J. Virology
Реовирус типа III связан с относительно легкими формами заболеваний и функция его вирусного гена достаточно хорошо известна. В настоящее время фирмой Oncolytic Biotech разработан реовирус типа III как средство для лечения рака, которое демонстрирует повышенные репликативные свойства в клетках, экспрессирующих мутантный онкоген ras, и, предпочтительно, растет в клетках PKR -/- (Strong J.E. and P.W. Lee, , 1996. 70:612-616). Однако реовирус трудно поддается генетическим модификациям и его вирусную репликацию трудно остановить.
VSV связан с относительно легкими формами заболевания и функция вирусного гена также хорошо изучена. В WO99/04026 описано применение VSV в качестве вектора генной терапии для применения при лечении широкого круга. Однако применение VSV так же затруднено, как и применение реовируса, а именно из-за сложности проведения генетических модификаций и из-за того, что вирусная репликация не может быть быстро прекращена.
Другими кандидатами онколитических вирусов, описанных в данной области, являются вирус коровьей оспы и полиовирус, но они связаны с очень серьезными или потенциально смертельными заболеваниями.
В US 4806347 описано применение гамма интерферона и фрагмента IFNγ в отношении опухолевых клеток человека. В WO99/18799 описан способ лечения заболевания у млекопитающих, у которых больные клетки дефектны при интерферон-опосредованном антивирусном ответе, который заключается во введении млекопитающему терапевтически эффективного количества интерферон-чувствительного, способного к репликации клонального вируса. В частности, описано, что частицы VSV обладают токсичной активностью в отношении опухолевых клеток, но ослабляют цитотоксичность нормальных клеток под действием VSV в присутствии интерферона. В WO99/18799 также указано, что в клетках опухоли, обработанной интерфероном, наблюдалась NDV-стимулированная чувствительность, но добавление интерферона к нормальным клеткам делало эти клетки устойчивыми к NDV. Цель этого способа состоит в том, чтобы сделать клетки чувствительными к воздействию интерферона путем заражения их интерферон-чувствительными вирусами.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном из аспектов настоящее изобретения относится к способу ингибирования клетки с дефектным противовирусным ответом, который заключается во введении в клетку эффективного количества вируса миксомы.
В одном из аспектов изобретение относится к способу лечения заболевания, характеризующегося наличием клеток с дефектным противовирусным ответом, который заключается во введении пациенту эффективного количества вируса миксомы.
Настоящее изобретение также относится к применению эффективного количества вируса миксомы для ингибирования клеток с дефектным противовирусным ответом и для получения лекарственного средства для ингибирования клетки с дефектным противовирусным ответом.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к применению эффективного количества вируса миксомы для лечения заболевания у пациента, где заболевание характеризуется наличием клеток с дефектным противовирусным ответом, и для получения лекарственного средства для лечения этого заболевания у пациента.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вирус миксомы и фармацевтически приемлемый носитель, для ингибирования клетки с дефектным противовирусным ответом, а также для применения в лечении заболевания, характеризующегося наличием клеток с дефектным противовирусным ответом.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему вирус миксомы и инструкции по применению для ингибирования клеток с дефектным противовирусным ответом или для лечения заболевания, характеризующегося наличием клеток с дефектным противовирусным ответом. Такие заболевания включают в себя рак и хроническую вирусную инфекцию.
Настоящее изобретение, более того, относится к способу определения клеток с дефектным противовирусным ответом у пациента, который заключается во введении пациенту вируса миксомы, модифицированного для экспрессии выявляемого маркера; инфицировании вирусом клеток с дефектным противовирусным ответом у пациента и в выявлении клеток, экспрессирующих выявленный маркер у пациента.
Настоящее изобретение также относится к способу выявления в образце клеток с дефектным противовирусным ответом, который заключается в культивировании клеток; воздействии вируса миксомы на культивированные клетки и определении инфекционности заражения клетки вирусом миксомы.
in vivo
Настоящее изобретение основано на открытии, что вирус миксомы кроликов может селективно инфицировать клетки, включая опухолевые клетки человека, с дефектным противовирусным ответом, включая клетки, нечувствительные к интерферону. В данном контексте под термином «природный» понимают антиген-неспецифический иммунный ответ. Поскольку в нормальных клетках человека вирус миксомы реплицируется неэффективно, следовательно, он может быть использован для лечения различных заболеваний и болезненных состояний, которые характеризуются наличием клеток с дефектным противовирусным ответом, включая клетки, нечувствительные к интерферону, например в качестве онколитического средства для лечения рака. Также вирус может использоваться для идентификации клеток с дефектным противовирусным ответом и визуализации этих клеток .
Другие аспекты и существенные признаки настоящего изобретения станут очевидны специалисту в данной области из нижеследующего описания определенных вариантов осуществления настоящего изобретения, проиллюстрированных чертежами. Понятно, тем не менее, что подробное описание и конкретные примеры, представляющие предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения, приведены только для иллюстрации, так как различные изменения и модификации в рамках и объеме данного изобретения станут очевидны специалистам в данной области из подробного описания.
Краткое описание чертежей
Фигуры, иллюстрирующие варианты осуществления настоящего изобретения, приведены только в качестве примеров.
На фигуре 1 представлена схематическая диаграмма интерферон опосредованного противовирусного сигнального пути, индуцированного вирусным заражением клетки.
На фигуре 2 представлена фазово-контрастная микрофотография непермиссивных фибробластов мышиных эмбрионов дикого типа («MEF») после действия вируса миксомы, на которой видно, что MEF становятся пермиссивными после ингибирования интерферона α/β нейтрализирующим антителом.
На фигуре 3 представлен Вестерн-блоттинг, на котором видны фазы фосфорилирования (активации) STAT1 и STAT2 после заражения вирусом миксомы, что обозначает, что непермиссивное инфицирование клеток MEF связано с активацией STAT 1 и STAT 2;
На фигуре 4 представлен Вестерн-блоттинг, на котором видны фазы фосфорилирования (инактивации) STAT3, STAT4, STAT5 и STAT 6 после заражения вирусом миксомы, что указывает на то, что непермиссивное инфицирование клеток MEF не активировано ни одним из этих видов.
На фигуре 5 представлена фазово-контрастная микрофотография IFNα/β R-/- MEF и STAT1 -/- MEF, IFNα/β R-/- MEF и STAT1 -/- MEF после заражения вирусом миксомы, что указывает на то, что инактивация IFN/STAT/JAK передачи сигнала делает клетки пермиссивными для миксомной инфекции.
На фигуре 6 представлен Вестерн-блоттинг, на котором видны фазы фосфорилирования PKR в непермиссивных MEF дикого типа после заражения вирусом миксомы, что указывает на то что, что PKR не активируются в результате заражения вирусом миксомы.
На фигуре 7 представлен Вестерн-блоттинг, на котором видны фазы фосфорилирования PKR в MEF дикого типа, либо ложно инфицированных, либо предварительно инфицированных вирусом миксомы, что указывает на то, что вирус миксомы блокирует активацию PKR в клетках MEF;
На фигуре 8 представлен Вестерн-блоттинг, на котором видны фазы фосфорилирования PERK в MEF дикого типа после заражения вирусом миксомы, что указывает на то, что вирус миксомы блокирует активацию PERK в клетках MEF.
На фигуре 9 представлена фазово-контрастная микрофотография тройного нокаута PKR-/-, RNase L-/- и Mx1-/- после воздействия вируса миксомы, что указывает на то, что антивирусное состояние в клетках MEF опосредовано другим путем передачи сигнала.
На фигуре 10 представлена фазово-контрастная микрофотография тройного нокаута PKR-/-, RNase L-/- и Mx1-/- после воздействия вируса миксомы.
На фигуре 11 представлена фазово-контрастная микрофотография тройного нокаута PKR-/-, RNase L-/- и Mx1-/- после обработки нейтрализующим антителом к интерферону IFNα/β и после воздействия вируса миксомы.
На фигуре 12 представлен Вестерн-блоттинг, на котором видны уровни фосфорилирования eIF2α и PKR в непермиссивных MEF после обработки нейтрализирующим антителом к IFNα/β и после действия вируса миксомы, что указывает на то, что фосфорилирование eIF2α в непермиссивных клетках катализируется PKR-независимым путем.
На фигуре 13 представлен Вестерн-блоттинг, на котором видны фазы фосфорилирования STAT1 в результате тройного нокаута PKR-/-, RNase L-/- и Mx1-/- после заражения вирусом миксомы, указывая на нормальные IFN-индуцированные реакции передачи сигнала.
На фигуре 14 представлена фазово-контрастная микрофотография, иллюстрирующая субклеточную локализацию тирозин-фосфорилированного STAT1 в непермиссивных клетках PKR-/- + RNaseL-/- + Mx1 -/- через 12 часов после заражения, что указывает на то, что активированный STAT локализуется в ядре, как и было предположено для нормальных IFN/STAT реакций передачи сигнала.
На фигуре 15 представлено флуоресцентное изображение головного мозга «nude»-мышей с внутричерепными глиомами, ложно-инфицированных или инфицированных мертвыми или живыми вирусами миксомы, экспрессирующими GFP, что указывает на то, что клетки глиомы являются мишенью вируса миксомы.
На фигуре 16 представлено флуоресцентное изображение и фотография тонкого среза глиомы мыши, зараженной вирусом миксомы, экспрессирующей GFP, что указывает на то, что вирус миксомы реплицировался только в клетках опухоли.
На фигуре 17 представлена фазово-контрастная микрофотография опухолевых клеток человека HT29, окрашенных либо X-Gal, либо кристаллическим фиолетовым, после заражения вирусом миксомы, демонстрирующая пример непермиссивной инфекции клеток человека.
На фигуре 18 представлена фазово-контрастная микрофотография опухолевых клеток человека HOP92, окрашенных либо X-Gal, либо кристаллическим фиолетовым после заражения вирусом миксомы, демонстрирующая пример пермиссивной инфекции клеток человека.
На фигуре 19 представлена фазово-контрастная микрофотография опухолевых клеток человека OVCAR4, окрашенных либо X-Gal, либо кристаллическим фиолетовым после заражения вирусом миксомы, демонстрирующая пример пермиссивной инфекции клеток человека.
На фигуре 20 представлена фазово-контрастная микрофотография опухолевых клеток человека SK-MEL3, окрашенных либо X-Gal, либо кристаллическим фиолетовым после заражения вирусом миксомы, демонстрирующая пример пермиссивной инфекции клеток человека
На фигуре 21 представлена фазово-контрастная микрография опухолевых клеток человека SK-MEL28, окрашенных либо X-Gal, или кристаллическим фиолетовым после заражения вирусом миксомы, демонстрирующая пример полупермиссивной инфекции клеток человека;
На фигуре 22 представлена фазово-контрастная микрофотография клеток BGMK, окрашенных либо X-Gal, либо кристаллическим фиолетовым после заражения вирусом миксомы, демонстрирующая характерную пермиссивную контрольную инфекцию.
На фигуре 23 представлена фазово-контрастная микрофотография клеток позитивного контроля BGMK и клеточных линий U87, A172 и U373 опухоли человека, зараженных повышенными концентрациями вируса миксомы, экспрессирующего белок LacZ, окрашенный X-Gal, что указывает на то, что все эти клетки глиомы человека были пермиссивными для репликации вируса миксомы.
На фигуре 24 представлен график, отображающий уровень выживаемости клеток BGMK, U87, A172 и U373, зараженных вирусом миксомы, через 72 часа после инфицирования повышенный концентрацией вируса, демонстрирующий способность вируса миксомы уничтожать эти клетки.
На фигуре 25 представлена фазово-контрастная микрофотография и флуоресцентная микрофотография клеток астроцитомы SF04 1585, инфицированных вирусом миксомы GFP (MV GFP), демонстрирующая инфицирование первичных клеток глиомы человека;
На фигуре 26 представлена фазово-контрастная микрофотография клеток глиомы U373, инфицированных вирусом миксомы, экспрессирующим LacZ белок, и окрашенных X-Gal, показывающая инфицирование этих опухолевых клеток человека;
На фигуре 27 представлен график, отображающий уровень выживаемости клеток SF04 1585, инфицированных вирусом миксомы GFP через 48 часов после заражения, и показывающий уничтожение этих инфицированных опухолевых клеток человека.
На фигуре 28 представлена флуоресцентная микрофотография медуллобластомы линий Daoy и D384, инфицированных вирусом миксомы, экспрессирующим GFP, показывающая инфицирование клеток этой опухоли человека.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Авторы изобретения обнаружили, что вирус миксомы, вирус, который обычно поражает кроликов, может, в том числе выборочно, поражать и уничтожать клетки человека с дефектным противовирусным ответом, например клетки, которые нечувствительны к интерферону. С другой стороны, в нормальных клетках человека вирус миксомы реплицируется неэффективно. Поскольку многие заболевания и болезненные состояния характеризуются наличием клеток с дефектным противовирусным ответом, в том числе клеток, нечувствительных к интерферону, например раковых, вирус миксомы может быть использован для лечения таких заболеваний и состояний, включая рак, с низкой токсичностью для нормальных клеток. Вирус миксомы также может быть использован для воздействия на хронически инфицированные клетки, так как такие клетки имеют дефект противовирусного ответа. Например, многие вирусы кодируют генные продукты, действие которых направлено на подавление противовирусного интерферонового ответа клеток. Вирус миксомы может выборочно инфицировать эти клетки.
Leporipoxvirus
Poxviridae
Sylvilagus
Virology
Viral Immunology
Вирус миксомы («MV») является этиологическим агентом миксоматоза у кроликов. MV принадлежит к роду  семейства , крупнейших ДНК-вирусов. MV вызывает заболевания в легкой форме у его природного реципиента кролика  в Америке. Тем не менее, это вирулентный и хозяин-специфичный поксвирус, который вызывает смертельное заболевание у европейских кроликов, характеризующеееся системными поражениями и, в особенности, слизистых оболочек. (Cameron C, Hota-Mitchell S, Chen L, Barrett J, Cao JX, Macaulay C, Willer D, Evans D, McFadden G.  1999, 264(2): 298-318; Kerr P & McFadden G.  2002, 15(2): 229-246).
Virology
MV является крупным вирусом с геномом из двухцепочечной ДНК, состоящим из 163 т.п.н., который реплицируется в цитоплазме инфицированных клеток (B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, Eds.,  Lippincott Raven Press, New York, 2nd ed., 1996). Известно, что MV кодирует различные клеточно-ассоциированные и секретируемые белки, которые были вовлечены в регуляцию по типу обратной связи иммунного и воспалительного ответов организма-хозяина, и ингибирование апоптоза зараженных вирусом клеток. MV может проникать во все соматические клетки человека. Тем не менее, в отличие от нормальных соматических клеток кролика, когда клетки имеют нормальный природный противовирусный ответ, вирус не способен продуктивно инфицировать клетку, значит, вирус не может реплицироваться и вызвать гибель клетки.
Интерфероны («IFN») представляют собой семейство цитокинов, которые секретируются в ответ на различные раздражители. Интерфероны связываются с рецепторами на поверхности клетки, активируя сигнальный каскад, который приводит к множеству клеточных ответов, включая противовирусный ответ и индукцию ингибирования роста или/и сигналов апоптоза. Интерфероны разделяют на тип I и на тип II. К IFN типа I относятся IFN-α, -β, -τ и -ω, каждый из которых является мономером, лишь только IFN-γ является IFN типа II и димером. Двенадцать различных подтипов IFN-α продуцируются 14 генами, а все другие TFN являются моногенными (Arduini et al., 1999). TFN проявляют непосредственную противоопухолевую активность путем модуляции онкогенной экспрессии. Сверхэкспрессия стимулирующих рост онкогенов, или утрата онкогенов, супрессирующих опухоль, может приводить к злокачественному преобразованию. Некоторыми онкогенами, вовлеченными в возникновение рака, являются p53, Rb, PC, NF1, WT1, DCC.
Для репликации внутри клетки вирусу миксомы, так же как и другим онколитическим вирусам, таким как реовирус и вирус пузырькового стоматита (VSV), необходимо обойти противовирусную защиту в нормальных здоровых клетках. MV и другие онколитические вирусы индуцируют продукцию интерферона и обычно чувствительны к противовирусному действию пути IFN. Соответствующие белки, индуцированные под действием противовирусного ответа IFN, и которые, главным образом, влияют на размножение вируса, включают в себя PKR, синтазу OAS и нуклеазу RnaseL. PKR активирует eIF2α, что приводит к ингибированию трансляции и индукции апоптоза. На фиг.1 представлено схематическое изображение пути ответа IFN. В нормальных клетках на MV непосредственно воздействуют PKR и eIF2α.
Cancer Cell
J Biol Chem
Blood
Cancer Res.
Cancer Cell
В раковых клетках пути противовирусного ответа часто нарушены. Например, сниженный или дефектный ответ на IFN является генетическим дефектом, который часто возникает во время процесса трансформации и развития опухоли. Более 80% опухолевых клеточных линий не реагируют, или проявляют пониженный ответ на интерферон. (Stojdl et al.,  (2003) 4: 263-275 and references cited therein; Wong et al. . (1997) 272(45):28779-85; Sun et al. . (1998) 91(2):570-6; Matin et al.  (2001) 61(5):2261-6; Balachandran et al  (2004) 5(1):51-65). Авторы изобретения обнаружили, что MV может инфицировать и уничтожать раковые клетки, в том числе опухолевые клетки человека, и не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что MV может инфицировать такие клетки, поскольку они имеют дефект противовирусного ответа.
Результаты исследований показывают, что ингибирование раннего природного иммунного ответа и замедление развития Th1 ответа являются очень важными факторами для эффективной онколитической терапии. Хотя вирус миксомы является вирулентным, он хозяин-специфичный и имеет очень ограниченный круг хозяев; он не поражает человека или мышей. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, вероятно, что, так как вирус миксомы не поражает человека, на него не должен влиять предшествующий иммунный ответ у человека. Более того, его потенциал как онколитического вируса будет менее подвержен риску, и вирус миксомы должен будет обеспечить более сильное инфицирование пермиссивных опухолевых клеток по сравнению с нативными вирусами человека, что, таким образом, может обеспечить эффективное онколитическое лечение рака.
Таким образом, один из вариантов осуществления изобретение относится к методу ингибирования клеток с дефектным противовирусным ответом, который заключается во введении в клетки эффективного количества вируса миксомы. В одном из воплощений клетка является нечувствительной к интерферону.
В конкретных вариантах осуществления клетка представляет собой раковую клетку млекопитающих. В одном из вариантов осуществления клетка представляет собой раковую клетку человека, в том числе клетку солидной опухоли человека.
Еще в одном варианте осуществления клетка хронически инфицирована вирусом.
Термин «клетка с дефектным противовирусным ответом», используемый здесь, относится к клетке, которая при воздействии вируса или при проникновении вируса не вызывает противовирусный защитный механизм, который включает в себя ингибирование вирусной репликации, продукцию интерферона, индуцирование пути ответа интерферона и апоптоз, опосредованный интерфероном или нет, и, таким образом, инфицируется вирусом миксомы. Термин включает в себя клетку, которая имеет пониженный или дефектный врожденный противовирусный ответ на воздействие или инфицирование вирусом по сравнению с нормальными клетками, например неинфицированными или нераковыми клетками. В том числе, этот термин относится к клетке, которая является нечувствительной к воздействию интерферона, и к клетке, имеющей пониженный или дефектный апоптотический ответ или индукцию метаболического пути. Дефицит может быть вызван различными причинами, в том числе инфекцией, внешним воздействием или может быть генетическим дефектом. Тем не менее, понятно, что когда дефицит возникает вследствие предшествующей инфекции, сферхинфицирование вирусом миксомы может быть исключено и специалист в данной области может легко идентифицировать такие случаи. Специалист в данной области может с легкостью определить, не проводя чрезмерные экспериментальные исследования, имеет ли данный тип клетки дефект противовирусного ответа и, следовательно, может ли инфицироваться вирусом миксомы. Например, VSV обычно используется для измерения противовирусного ответа клеткой.
in
vitro
Для оценки, имеет ли данный тип клеток, например данный вид раковых клеток, дефект противовирусного ответа, специалист в данной области может взять образец, вырастить некоторое количество клеток и оценить инфицирующую способность VSV или альтернативно, вирусом миксомы .
Термин «клетка, нечувствительная к интерферону», используемый в данном описании, обозначает клетку, которая не реагирует на активность интерферона, например на противовирусную или противоопухолевую активность интерферона, или клетку, которая имеет аномальный ответ на воздействие интерферона, например пониженный или неэффективный ответ на воздействие интерферона, или патологический путь передачи сигнала интерферона, оцениваемый, например, фосфорилированием или активацией сигнальных молекул, таких как факторы транскрипции, например STAT1. Например, без каких-либо ограничений, если клетка подвергается воздействию достаточного количества интерферона для индукции ответа в клетке, чувствительной к действию интерферона, то пролиферация клетки может не ингиброваться или клетка может быть не уничтожена. Клетка, нечувствительная к интерферону, может иметь дефект внутриклеточного сигнального пути или метаболических путей, которые в норме активированы в чувствительных к интерферону клетках. Обычно, чувствительность к инфицированию VSV определяется невосприимчивостью к действию интерферона, и специалист в данной области может с легкостью определить, является ли конкретная клетка нечувствительной к интерферону, или имеет дефект ингибирования инфекции, вызываемой VSV, в присутствии интерферона; или, используя другие маркеры активности интерферона, известные в данной области, например, уровень экспрессии IFN-стимулируемых генов, таких как PKR, STAT, OAS, MX.
Термин «способный к репликации», используемый в описании, относится к вирусу, способному инфицировать клетку организма-хозяина и реплицироваться в ней.
in vitro
in vivo
Термин «клетка», используемый здесь, включает в себя как единичную клетку, так и множество клеток или клеточную популяцию. Введение агента в клетку включает в себя как , так и  введение.
Понятие «эффективное количество», используемое здесь, означает количество, эффективное при дозах и в период времени, необходимое для достижения желаемого результата.
Термин «животное», используемое здесь, включает в себя всех членов животного царства, в том числе и человека.
Термин «ингибирование» клетки, которая имеет дефект противовирусного ответа, включает в себя клеточную гибель в результате апоптоза или других механизмов клеточной гибели наряду с ингибированием роста и деления клетки.
Вирус миксомы может быть любым вирусом, который принадлежит к роду Leporipoxvirus поксвирусов, способным к репликации. Вирус миксомы может быть вирусом дикого типа, или генетически модифицированным.
rd
Virology
Геном вируса миксомы может быть легко модифицирован для экспрессии одного или нескольких терапевтических трансгенов, используя стандартные методики молекулярной биологии, известные специалисту в данной области и описанные, например в Sambrook et al. ((2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3 ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press). Специалист в данной области легко определит, какую часть генома вируса миксомы можно удалить, чтобы при этом вирус оставался способен к продуктивному заражению. Например, необязательные области вирусного генома, которые могут быть удалены, могут быть определены при сравнении опубликованной последовательности вирусного генома с геномами других хорошо изученных вирусов (для примера см. C. Cameron, S. Hota-Mitchell, L. Chen, J. Barrett, J.-X. Cao, C. Macaulay, D. Willer, D. Evans, и G. McFadden,  (1999) 264: 298-318)).
Термин «терапевтический ген» или «терапевтический трансген», используемый в настоящем изобретении, широко применяется для описания любого гена, экспрессия которого влияет на ожидаемый результат, например на противораковый эффект. Например, вирус может быть модифицирован и, таким образом нести ген, который будет усиливать противораковый эффект лечения вирусом. Таким геном может быть ген, вовлеченный в запуск апоптоза, или вовлеченный в нацеленное разрушение зараженных клеток под воздействием иммунного ответа, например ген, который восстанавливает неполный ответ на действие интерферона, или который приводит к экспрессии маркеров на поверхности клетки, которые стимулируют антительный ответ, как, например антиген на поверхности бактериальной клетки. Вирус также может быть модифицирован и экспрессировать гены, вовлеченные в ингибирование пролиферации и роста опухолевых или раковых клеток, тем самым предупреждая их деление. Так же вирус может быть модифицирован и таким образом иметь в своем составе терапевтические гены, такие как гены, вовлеченные в синтез химиотерапевтических средств, или вирус может быть модифицирован и таким образом иметь повышенный уровень репликации в клетках определенных типов, от которых происходят клетки, подлежащие ингибированию или уничтожению, например клетки человека. Конкретные примеры генов, которые могут быть введены в вирус миксомы для повышения его противоракового эффекта, включают ген человека белка TRAK или ген аденовируса, который кодирует полипептид E4 или f4, которые вовлечены в процесс уничтожения опухолевых клеток человека.
Понятно, что терапевтический эффект вируса миксомы может быть достигнут в результате лизиса клетки вирусом или в результате доставки терапевтических продуктов.
Virology
Вирус может быть получен с помощью стандартных способов, известных в данной области. Например, вирус может быть получен путем заражения клеточных культур кролика штаммом вируса миксомы, прогрессирования инфекции с тем, чтобы вирус реплицировался в клеточной культуре, и выделения стандартными способами, известными в данной области, для разрушения клеточной стенки и, таким образом, получения частиц вируса. После полученный титр вируса может быть определен путем заражения конфлюэнтного слоя клеток кролика и проведения анализа бляшкообразования (см. Mossman et al. (1996)  215:17-30).
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способу лечения заболевания, характеризующегося наличием клеток с дефектным противовирусным ответом, у пациентов при необходимости такого лечения, который включает в себя введение пациенту эффективного количества вируса миксомы. Пациентом может быть любое животное, включая млекопитающее и, в частности, человека.
Использующая здесь фраза «заболевание, характеризующееся наличием клеток с дефектным противовирусным ответом», относится к любому заболеванию, расстройству или болезненному состоянию, связанному или характеризующемуся наличием клеток с дефектным противовирусным ответом, и заболеванию, расстройству или состоянию или симптомам, которые, таким образом, могут быть излечены путем уничтожения таких клеток. Примером такого заболевания может быть рак. Такие заболевания могут также включать в себя хронические вирусные инфекции.
Термин «лечение» заболевания относится к подходу для лечебного или желаемого эффекта, в том числе клинических результатов. Благоприятные или желательные результаты могут включать, но ими не ограничиваться, облегчение или улучшение одного или нескольких симптомов или состояний, минимизирование продолжительности заболевания, стабилизацию статуса заболевания, профилактику развития заболевания, профилактику распространения заболевания, отсрочку или замедление прогрессирования заболевания, приостановку или замедление начала заболевания, уменьшение симптомов или временное ослабление заболевания, или ремиссию заболевания (частичную или полную) либо определяемые, либо нет. «Лечение» также может означать продление времени жизни пациента по сравнению с тем временем, которое предполагалось без лечения. Также термин «лечение» может означать ингибирование прогрессирования заболевания, временное замедление прогрессирования заболевания, хотя, более предпочтительно, он обозначает полное постоянное прекращение прогрессирование заболевания. Специалисту в данной области понятно, что результаты могут быть неблагоприятными или неожидаемыми, если, несмотря на улучшение конкретного заболевания, лечение оказывает отрицательное воздействие на пациента, сводя на нет любые благоприятные или ожидаемые эффекты лечения.
В одном из вариантов осуществления заболеванием является рак. Рак может быть раком любого типа, при котором по меньшей мере некоторые клетки, хотя необязательно, все клетки имеют дефект противовирусного ответа. В одном из вариантов осуществления раком может быть рак, при котором по крайней мере некоторая часть клеток является нечувствительной к действию интерферона. Термины «опухоль», «опухолевые клетки», «рак», «раковые клетки», используемые здесь (употребляемые взаимозаменяемо), относятся к клеткам, которые демонстрируют патологический рост, характеризуются значительной потерей над клеточной пролиферацией, или к клеткам, которые были иммортализованы. Термины «рак» или «опухоль» включают в себя злокачественные новообразования или опухоли, дающие или не дающие метастазы. Термин «новообразование», используемый здесь, главным образом относится к клетке или клеткам, пролиферация которых проходит без контроля нормальных механизмов ингибирования роста и, кроме рака, включают доброкачественные опухоли, а так же диспластические или гиперпластические клетки.
Рак может быть диагностирован на основании общепринятых в данной области критериев, включая наличие злокачественной опухоли.
Типы рака, на которые может быть направлено лечение по данному изобретению, включают в себя, но ими не ограничиваются, рак гемопоэтических клеток, в том числе лейкемию и лимфому, рак толстой кишки, рак легких, рак почек, рак поджелудочной железы, рак эндометрия, рак щитовидной железы, рак ротовой полости, рак яичника, рак гортани, печеночно-клеточный рак, рак желчных протоков, плоскоклеточная карцинома, рак предстательной железы, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, меланома и другие опухоли. Солидные опухоли, такие как саркома и карцинома, включают, но ими не ограничиваются, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеобластическую саркому и другие саркомы, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, лимфолейкоз, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника, рак предстательной железы, печеночно-клеточный рак, плоскоклеточный рак, базально-клеточный рак, аденокарциному, карциному потовых желез, сосочковый рак, сосочковую аденокарциному, медуллярный рак, бронхогенный рак, рак почки, гепатому, карциному желчного протока, хориокарциному, опухоль Вильямса, рак шейки матки, опухоль яичка, опухоль мочевого пузыря; и опухоли центральной нервной системы (такие как глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, аденома шишковидного тела, гемангиобластома, акустическая невринома, олигодендроглиома, менангиома, меланома, нейробластома и ретинобластома).
В еще одном варианте осуществления заболевание представляет собой хроническую вирусную инфекцию.
Хронически инфицирующим вирусом может быть любой вирус, который инфицирует и реплицируется в клетках животных постоянным образом в течение длительного периода времени, что приводит к патологическому состоянию. Хронически инфицирующим вирусом может быть вирус, который связан с развитием рака.
Хроническая вирусная инфекция может быть диагностирована с помощью стандартных методов, известных в данной области. Например, хроническая вирусная инфекция может быть определена на основании наличия у пациента антивирусных антител или на основании положительного теста на присутствие вирусной РНК или ДНК в клетках пациента.
Вирус может быть введен в организм пациента с помощью стандартных способов введения. В одном из вариантов осуществления вирус может быть введен системно. Еще в одном варианте осуществления вирус может быть введен путем инъекции в очаг заболевания. В частности, когда заболевание представляет собой плотную однородную опухоль, тогда вирус вводят в организм пациента путем инъекции в очаг опухоли. В конкретном варианте осуществления вирус может быть введен перорально или парэнтерально или с помощью любых стандартных методов, известных в данной области.
При введении пациенту эффективным количеством вируса является количество необходимой дозы с адекватной длительностью действия для облегчения (смягчения), выздоровления (улучшения), снижения, улучшения, стабилизации, предотвращения распространения, замедления или откладывания прогрессирования болезни или полного выздоровления. Например, такое количество может быть количеством, достаточным для достижения эффекта снижения числа или разрушения раковых или неопластических клеток или уменьшения числа или разрушения клеток, хронически инфицированных вирусом, или ингибирования роста и/или пролиферации таких клеток.
Эффективное количество для введения пациенту может зависеть от многих факторов, таких как фармакодинамические свойства вируса, способ введения, возраст, состояние здоровья и масса пациента, природа и степень тяжести заболевания, частота лечения и тип сопутствующей терапии, если таковая осуществляется, а также вирулентности и титра вируса.
Специалист в данной области может определить соответствующее количество на основании вышеизложенных факторов. Изначально вирус может быть введен в подходящем количестве, которое затем может быть увеличено или уменьшено, если необходимо, в зависимости от клинического ответа пациента. Эффективное количество вируса может быть определено эмпирически и зависит от максимального количества вируса, введение которого  безопасно для пациента, и минимального количества вируса, при котором достигается желаемый результат.
В случае системного введения вируса для получения такого же клинического эффекта, как и при инъекции вируса в очаг заболевания, может потребоваться введение значительно более высоких доз вируса. Тем не менее, соответствующая доза должна составлять минимальное количество, при котором можно достигнуть желаемого результата.
Концентрация вводимого вируса будет изменяться в зависимости от вирулентности конкретного штамма вируса миксомы, который вводят в организм, и от природы клеток-мишеней.
9
2
9
2
7
3
6
4
5
В одном из вариантов осуществления пациенту вводят дозу, менее чем 10бляшкообразующих единиц (pfu). В различных вариантах осуществления в качестве единичной дозы может вводиться 10-10 pfu, 10-10 pfu, 10-10 pfu, 10-10 pfu.
Эффективное количество вируса может вводиться повторно, в зависимости от эффекта начальной схемы лечения. Введение обычно осуществляют периодически, наблюдая за любой реакцией. Специалисту в данной области будет понятно, что могут вводиться более низкие или более высокие дозы вируса, чем указано выше, в соответствии с графиком и выбранным путем введения.
Вирус может вводиться самостоятельно, так и в сочетании с другими видами лечения, в том числе химиотерапией, лучевой терапией или другими противовирусными подходами к лечению. Например, вирус может вводиться перед или после хирургического удаления первичной опухоли; перед, одновременно или после проведения таких методов лечения как радиотерапия или введения обычно применяемых химиотерапевтических препаратов. В одном из вариантов осуществления вирус можно вводить в сочетании или последовательно с другими онколитическими вирусами, которые специфичны в отношении различных типов опухолевых клеток.
Для облегчения введения вирус может быть компонентом фармацевтической композиции. Таким образом, еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вирус миксомы и фармацевтически приемлемый разбавитель. Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для ингибирования клеток с дефектным противовирусным ответом или для лечения заболевания, характеризующегося наличием клеток с дефектным противовирусным ответом. Композиции, в соответствии со стандартной методикой, могут содержать приемлемую концентрацию соли, буферных веществ, консервантов и различных подходящих носителей. Для всех видов доставки рекомбинантный вирус может находиться в смеси с физиологическим солевым раствором.
Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать другие терапевтические средства, такие как противораковые средства. В одном из вариантов воплощения композиции включают в себя химиотерапевтическое средство. Химиотерапевтическим средством, по существу, например, может быть любое вещество, которое обладает онколитическим действием в отношении раковых клеток или неопластических клеток пациента и которое не ингибирует или не снижает способность вируса убивать опухолевые клетки. Например, химиотерапевтическим веществом, без ограничения перечисленным, могут быть антрациклины, алкилирующий агент, алкил сульфонат, азиридин, этиленимин, метилмеламин, азотистый иприт, нитрозомочевина, антибиотик, антиметаболит, аналог фолиевой кислоты, аналог пурина, аналог пиримидина, фермент, подофиллотоксин, платина-содержащее вещество или цитокин. Предпочтительно, химиотерапевтическим веществом является вещество, которое эффективно в отношении, как известно, конкретного типа клеток, раковых или неопластических.
Количественное соотношение и идентичность фармакологически приемлемых разбавителей определяется выбранным путем введения, совместимостью живого вируса и стандартных фармакологических подходов. Обычно, фармацевтическую композицию получают таким образом, чтобы компоненты композиции существенно не снижали биологические свойства живого вируса.
Фармацевтическая композиция может быть получена известными способами получения фармацевтически приемлемых композиций, подходящих для введения пациенту, так, что эффективное количество активного вещества было бы объединено в смесь с фармацевтически приемлемыми носителем. Подходящие носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985). На этом основании композиции включают в себя, не ограничиваясь ими, растворы вируса в ассоциации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и разбавителями, и находятся в буферных растворах с соответствующим pH и изоосмотичными с физиологическими жидкостями.
Фармацевтическая композиция может вводиться пациенту в различных формах, в зависимости от выбранного пути введения, что понятно специалисту в данной области. Композиция по настоящему изобретению может быть введена пациенту как перорально, так и парентерально. Парентеральное введение включает в себя внутривенный, внутрибрюшной, подкожный, внутримышечный, чрескожный, назальный, внутрилегочный, подоболочечный, ректальный и местный пути введения. Парентеральное введение может осуществляться инфузией в течение выбранного промежутка времени.
Фармацевтическая композиция может вводиться перорально, например вместе с инертным разбавителем, или с усвояемым носителем, или она может находиться в твердой или мягкой желатиновой капсуле, или может быть спрессована в виде таблеток. Для перорального терапевтического введения вирус может быть объединен с инертным наполнителем и может использоваться в виде перевариваемых таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, элексиров, суспензий, сиропов, облаток и тому подобного.
Растворы вируса могут быть получены в физиологически подходящем буфере. Для нормальных условий хранения и использования эти препараты содержат консерванты, препятствующие росту микроорганизмов, но которые не инактивируют живой вирус. Специалист в данной области знает, как получить подходящие фармацевтические композиции. Общепринятые методы и выбираемые ингредиенты, и получение подходящих фармацевтических композиций, описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences и в The United States Pharmacopeia: The National Formulary (USP 24 NF19), опубликованного в 1999 году.
В других вариантах осуществления композицию вводят путем инъекции (подкожной, внутривенной, внутримышечной и тому подобного) прямо в очаг заболевания, например в опухоль, или пероральным путем, альтернативно - чрескожным путем введения.
Формы фармацевтической композиции, подходящей для инъекций, включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий, где термин «стерильный» не относится к самому вирусу миксомы, который предназначен для введения пациенту. Во всех случаях фармацевтическая форма должна быть стерильной и должна быть достаточно жидкостной для простоты введения шприцом.
Доза используемой фармацевтической композиции зависит от конкретного заболевания, на которое направлено лечение, тяжести заболевания, индивидуальных показателей пациента, в том числе, возраста, физического состояния, роста и массы, продолжительности лечения, вида сопутствующей терапии (если есть), конкретного пути введения и других подобных факторов, на основании знаний и компетентности врача. Эти факторы известны специалисту в данной области и могут быть отнесены при минимальном экспериментальном исследовании.
Вирус миксомы или фармацевтические композиции, содержащие вирус миксомы, также могут быть упакованы в виде набора, содержащего инструкции по применению вируса, включая применение вируса миксомы для ингибирования клеток с дефектным противовирусным ответом, или применения вируса миксомы при лечении заболевания, характеризующегося наличием клеток с дефектным противовирусным ответом, у пациентов при необходимости такого лечения. Заболеванием может быть рак или хроническая вирусная инфекция.
Настоящее изобретение также относится к применению вируса миксомы для ингибирования клеток с дефектным противовирусным ответом. В одном из вариантов осуществления изобретения клетка является нечувствительной к действию интерферона. Изобретение также относится к использованию вируса миксомы для лечения заболевания, характеризующегося наличием клеток с дефектным противовирусным ответом у пациентов, при необходимости такого лечения. В одном из вариантов воплощения заболевание представляет собой рак. Также изобретение относится к применению вируса миксомы для получения фармацевтических композиций для ингибирования клеток с дефектным противовирусным ответом или для лечения заболевания, характеризующегося наличием клеток с дефектным противовирусным ответом.
Способность вируса миксомы (MV) селективно инфицировать клетки с дефектным противовирусным ответом у животных, которые не являются природными хозяевами вируса (кроликов), обеспечивает применение MV для выявления у животных клеток с дефектным противовирусным ответом, в том числе, клеток, нечувствительных к действию интерферона. Такие клетки могут не определяться другими способами, например некоторые раковые клетки, которые еще не достигли размеров пальпируемой опухоли или пока еще не индуцировали заметные симптомы заболевания у животного.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу определения клеток с дефектным противовирусным ответом у пациента, заключающемуся во введении пациенту вируса миксомы, модифицированного и таким образом экспрессирующего определяемый маркер, инфицировании вирусам клеток с дефектным противовирусным ответом и определении клеточной экспрессии определяемого маркера у пациента.
Инфицированные клетки могут быть определены любым обычным способом для визуализации диагностических изображений. Способ определения будет зависеть от конкретного используемого определяемого маркера. Например, клетки, инфицированные вирусом миксомы, генетически измененные и, таким образом, экспрессирующие флюоресцирующий белок, могут быть выявлены с помощью флуоресцентной цифровой микроскопии. Другие способы включают в себя компьютерную томографию (КТ), сканирование всего тела, например позиционную эмиссионную томографию, магнитно-резонансную томографию (МРТ), и сонографию. Специалист может определить подходящий метод детекции конкретного определяемого маркера.
Определяемый маркер включает в себя, но ими не ограничивается, любой маркер, гены которого, экспрессирующие или синтезирующие его, могут быть введены в геном вируса миксомы, что таким образом, приводит к экспрессии или синтезу этого маркера в клетке, инфицированной модифицированным вирусом. Например, в одном из вариантов осуществления определяемый маркер может представлять собой флуоресцентный белок. Инфицированные клетки могут быть выявлены в соответствующем временном интервале после введения модифицированного вируса пациенту, так, чтобы дать возможность вирусу инфицировать любые клетки с дефектным противовирусным ответом и экспрессировать детектируемый маркер в таких клетках на уровне, возможном для определения. Например, определение можно осуществлять в любой день между 2 и 20 после введения пациенту вируса, генетически модифицированного и поэтому экспрессирующего флуоресцентный белок.
Способ определения можно проводить у пациента повторно с перерывами для контроля наличия у пациента клеток с дефектным противовирусным ответом. Например, способ выявления таких клеток с помощью вируса миксомы можно проводить у пациента с интервалами в 6 месяцев, 1 год или 2 года, если необходимо, в зависимости от природы клеток с дефектным противовирусным ответом и природы заболевания, вызванного наличием таких клеток у пациента. Повторение данного способа на протяжении определенного периода времени позволяет контролировать прогрессирование или ремиссию заболевания, или распространение заболевания в организме пациента.
Вирус миксомы способен селективно инфицировать клетки с дефектным противовирусным ответом и может использоваться в качестве индикатора такого дефицита в клетках. Таким образом, клетки, взятые у пациента, могут быть исследованы на наличие дефекта противовирусного ответа с помощью способа по настоящему изобретению. Такое определение может показать, в комбинации с другими индикаторами, что пациент может страдать от конкретного заболевания, например рака.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к способу определения в образце клеток с дефектным противовирусным ответом, заключающемуся в культивировании клеток, инфицировании культивируемых клеток вирусом миксомы и определении эффективности заражения клеток вирусом миксомы.
Клетки могут быть взяты у пациента, в том числе у человека, известными способами биопсии. Метод биопсии будет зависеть от локализации и типа исследуемых клеток.
Клетки культивируют в соответствии с известными способами культивирования и подвергают воздействию MV, добавляя живой вирус в культуральную среду. Множественность заражения (MOI) может различаться для определения оптимального MOI для интересующего типа клеток, плотности и способа культивирования, с использованием в качестве положительного контроля клеточную культуру, которая, как известно, инфицирована MV.
Эффективность заражения клеточных культур вирусом миксомы может быть определена различными способами, известными специалисту в данной области, в том числе на основании способности вируса миксомы вызывать гибель клеток. Так же можно использовать добавление реактивов в клеточную культуру для завершения ферментативной или химической реакции с продуктом вирусной экспрессии. Продукт вирусной экспрессии может быть экспрессирован из репортерного гена, введенного в геном MV.
В одном из вариантов осуществления вирус миксомы может быть модифицирован для улучшения определения степени заражения. Например, MV может быть генетически модифицирован и, таким образом, экспрессировать маркер, который легко определяется фазово-контрастной микроскопией, флуоресцентной микроскопией или радиологической визуализацией. Маркер может быть экспрессируемым флуоресцентным белком или экспрессируемым ферментом, который может быть использован в колометрической реакции или реакции радиоактивного мечения. В другом варианте осуществления маркер может быть генетическим продуктом, который нарушает или ингибирует конкретную функцию исследуемой клетки.
Все приведенные здесь ссылки включены сюда в полном объеме.
ПРИМЕРЫ
Вирусные штаммы.
Использованные штаммы вирусов включают дикий тип вируса миксомы, модифицированный вирус миксомы, экспрессирующий либо зеленый флуоресцентный белок (“GFP”) либо β-галактозидазу (“LacZ”), либо инактивированный вирус миксомы. Вирусы были получены и оттитрованы стандартными методиками.
Клеточные штаммы.
Эксперименты на мышах осуществляли с использованием мышиных эмбриональных фибробластов, полученных у мышей дикого типа и нижеприведенных нокаут-мышей: гомозигот с нокаутом рецепторов IFNα/β, гомозигот с нокаутом STAT 1, гетерозигот PKR, гетерозигот с нокаутом Rnазы L; гетерозигот с нокаутом Мх1; гомозигот с тройным нокаутом PKR/RNазаL/Mx1.
Cancer Cell
Эксперименты с клетками человека осуществляли на контрольных клетках BGMK и опухолевых клеточных линиях человека: HT29, HOP92, OVCAR4, OVCAR5, SK-MEL3, SK-MEL28, M14, SKOV3, PC3, DU145, CAKI-1, 786-0, T47D, MDAMB 435, SF04, U87, A172, U373, Daoy и D384, как описано Stojdl et al., (2003) 4: 263-275.
Методы
Virology
J Virology
Как правило, исследования и эксперименты осуществляли как описано Lalani et al.  (1999) 256: 233-245 and Johnston et al.  (2003) 77(13): 7682-7688.
6
Для in vivo исследований мышей “nude-мышам” имплантировали клетки глиомы U87 человеком. Через 15 дней после имплантации мышам внутрь опухоли вводили инъекцией живой или инактивированный вирус миксомы линии GFP с титром 5×10 или ложно-инфицировали. Через 72 часа после заражения животных умерщвляли и извлекали головной мозг, который затем помещали в ОСТ (состав с оптимальной температурой для проведения срезов), и делали срезы замороженного образца. Миксому-GFP визуализировали во всех срезах мозга с помощью флуоресцентной микроскопии. Затем срезы фиксировали и окрашивали гемотоксилин-эозином для визуализации опухоли.
Для анализа опухолевых клеток человека сразу после хирургического удаления опухоли немедленно трипсонизировали и помещали в чашки, а на следующий день инфицировали вирусом с MOI 0.1, 1.0 или 10. Полученные результаты оценивали с точки зрения цитотоксичности и вирусной экспрессии, используя фазовую микроскопию и флуоресцентную микроскопию, соответственно, через 24 и 48 часов после заражения. Проводили анализы с использованием соли желтого тетразолия МТТ для подсчета процента выживших клеток (как процента выживаемости клеток после ложного инфицирования) через 48, 72 или 96 часов после заражения.
Клеточные линии детской медуллобластомы человека, Daoy и D384 инфицировали 10 M.O.I. миксомой-GFP. Через 72 часа после заражения жизнеспособность клеток измеряли с использованием МТТ.
Заражение мышиных клеточных линий.
Предыдущее исследование показало, что некоторые клоны клеток мышей линии 3Т3, трансфектированные рецепторами хемокинов, были способны к инфицированию вирусом миксомы, тогда как другие клоны не были инфицированы. Для изучения того, зависит ли тропизм вируса миксомы в отношении других мышиных клетках от каких-либо конкретных рецепторов, авторы изобретения использовали первичные фибробласты мышиных эмбрионов (MEF) мышей дикого типа и линий мышей с различными нокаут-генами.
Так как IFN играют ключевую роль в развитии противовирусных ответов, авторы изобретения предположили, что ограниченный фенотип связан с «противовирусным состоянием», опосредованным IFN. Разрыв цепи событий системы IFN, нейтрализация циркулирующего IFN антителами или получение мышей без рецепторов IFN или мышей с делетированными генами внутриклеточного метаболического пути передачи сигнала будет серьезно нарушать устойчивость организма-хозяина к вирусу миксомы, который обычно не инфицирует нормальные клетки мышей.
Для проверки этой гипотезы авторам было необходимо продемонстрировать неэффективность вируса миксомы в непермиссивных клетках при противовирусном действии интерферонов. Различные клетки MEF типов клеток с нокаутированным одним или несколькими белками, вовлеченными во внутриклеточный сигнальный ответ IFN, тестировали для определения эффекта инфекции MV в пути IFN.
Эксперименты, проведенные на первичных MEF, показали, что MEF дикого типа не подвержены инфицированию вирусом миксомы. MEF были полностью подвержены заражению вирусом миксомы при блокировании пути IFN нейтрализующими антителами к IFNα/β (фигура 2). Тем не менее, MEF, подверженные воздействию нейтрализующими антителами к IFNγ, оставались непермиссивными. Этот факт указывает на важность IFNα/β, но не IFNγ в создании пермиссивной окружающей среды для заражения MEF in vitro. Различные внутриклеточные сигнальные пути IFNα/β и IFNγ описаны в литературе. Однако и IFNα/β и IFNγ видимо играют важную роль в инфицировании хозяев, в отличие от культур фибробластов. Авторы утверждают, что дефицит либо пути IFNα/β, либо IFNγ в опухолях человека будут чувствительны к инфицированию вирусом миксомы in vivo.
Авторы определили активность STAT1 и STAT2 в непермиссивных MEF дикого типа, которые были инфицированы MV. Результаты, представленные на фигуре 3, демонстрируют, что STAT1 и STAT2 были активированы. Дальнейшие изучения показали, что STAT3, STAT4 и STAT5 активизированы не были (фигура 4).
Для того чтобы подтвердить важность внутриклеточного метаболического пути (IFNα/β) в поддержании непермиссивного состояния MEF, были проведены исследования генетической делеции для обеспечения нарушения в рецепторах IFNα/β и внутриклеточном каскаде. Проводилась генетическая делеция рецепторов IFN или JAK1 или STAT1. Вирус миксомы использовался для инфицирования MEF дикого типа, IFNα/β R-/- MEF и STAT1 -/- MEF. IFNα/β R-/- MEF и STAT1 -/- MEF были пермиссивными для MV, что доказывает, что сигнальные каскады IFNα/β STAT1 являются критичными для инфекции вирусом миксомы (фигура 5).
Протеинкиназа R (PKR) представляет собой фермент, индуцируемый IFNα/β в разнообразных клетках. Эта киназа в присутствии двухцепочечной РНК подвергается аутофосфорилированию и затем фосфорилирует несколько клеточных белков, включая эукариотический белок, синтезирующий фактор инициации (eIF-2α), фосфориляция которого может индуцировать ингибирование трансляции белков и апоптоз. Также отмечено участие PKR в активации RNaseL. Авторы проверяли активацию PKR в непермиссивных MEF после инфицирования MV. PKR не фосфорилируется в непермиссивных MEF, в которых известен противовирусный статус (фигура 6). Более того, инфицирование вирусом миксомы ингибирует фосфориляцию PKR (фигура 7). Кроме того, PERK (PRK-подобная, ER киназа) не фосфорилируется в первичных MEF дикого типа после инфицирования вирусом миксомы (фигура 8).
Для заражения MEF с единичным накаутированным геном PKR, RNaseL или Mx1 использовали MV (фигура 9). Было обнаружено, что PKR, RNaseL или Mx1 являются необязательными для поддержания непермиссивновности для инфицирования вирусом миксомы. Для дополнительного подтверждения второстепенной роли PKR, RNaseL и Mx1 проводили тройной нокаунт генов в MEF MEF: PKR-/-, RNase L-/- и Mx1-/-. Тройное выключение генов PKR-/-, RNase L-/- и Mx1-/- не поддерживает инфицирование вирусом миксомы (фигура 10), однако MEF с тройным нокаутом генов PKR, RnaseL и Mx1, обработанные нейтрализирующими интерферон α/β антителами, становились пермиссивными для инфицирования вирусом миксомы (сравнение фигур 10 и 11). Эти эксперименты демонстрируют, что PKR, RNaseL и Mx1 не являются необходимыми для обеспечения непермиссивности MEF к MV.
Для изучения активации eIF-2α и PKR в непермиссивных MEF дикого типа осуществляли дополнительные исследования пермиссивности IFNα/β R-/- MEF и STAT1 -/-MEF после инфицирования вирусом миксомы. После инфицирования вирусом миксомы eIF-2α фосфорилируется в непермиссивных и пермиссивных MEF, хотя фосфорилирование PKR бывает не в любом случае (фигура 12). Это демонстрирует, что без вовлечения PKR и PERK противовирусный статус опосредован другим путем, который является причиной фосфориляции eIF2α.
STAT1 является и серин- и тирозин фосфорилированным после инфицирований вирусами миксомы в непермессивных MEF с тройным нокаутом генов PKR, RNaseL и Mx1 (фигура 13). Так же показана субклеточная локализация тирозин-фосфорилированного STAT1 в непермиссивных PKR-/- + RNaseL-/- + Mx1 -/- MEF после инфицирования вирусом миксомы (фигура 14).
В заключение, необходимо отметить, что результаты показывают, что параллельный, PKR/PERK-независимый противовирусный метаболический путь, вовлекающий IFN/STAT1, является критичным для тропизма вирусов оспы (поксвирусов). Более того, фосфориляция elF2α является лучшим маркером противовирусного действия интерферона.
Исследования опухоли человека
Авторы изучали in vivo способность вируса миксомы инфицировать опухолевые клетки человека. “Nude-мышам” вводили инъекции клеток глиомы человека. Живой вирус был способен инфицировать эти опухолевые клетки человека, но не инфицировал окружающие клетки (фигура 15). Локализация флуоресцентного сигнала от GFP к опухоли показана на фигуре 16.
Принимая во внимание, что многие опухоли человека являются нечувствительными к интерферону и что опухолевые клетки не имеют нормального сигнального каскада интерферона в сравнение с найденным в нормальных клетках человека, были проведены исследования для изучения эффекта вируса миксомы на опухоли человека. Результаты суммированы ниже.
Исходно, вирус миксомы использовался для изучения инфекционных свойств и цитолитического эффекта в различных контрольных и опухолевых клеточных линиях человека: BGMK, HT29, HOP92, OVCAR4, SK-MEL3, и SK-MEL28. Вирус миксомы демонстрировал различные инфекционные свойства и цитолитические результаты: HT29 (фигура 17) HOP92 (фигура 18), OVCAR4 (фигура 19) SK-MEL3 (фигура 20), SK-MEL28 (фигура 21) и BGMK (фигура 22).
Кроме того, были исследованы опухолевые клетки и в таблице 1 представлена классификация различных исследованных типов опухоли как непермиссивные, пермиссивные и полупермиссивные. Полупермиссивные обозначают, что вирус миксомы имел среднюю инфекционную способность по сравнению с пермиссивными клеточными линиями.
Таблица 1Тропизм вируса миксомы для опухолевых клеток человека
Клетка
Тип
Непермиссивные
Пермиссивные
Полупермиссивные
HT29
Кишечник
X
HOP92
Легкие
X
M14
Меланома
X
SK-MEL3
Меланома
X
SK-MEL28
Меланома
X
OVCAR4
Яичники
X
OVCAR5
Яичники
X
SKOV3
Яичники
X
PC3
Простата
X
DU145
Простата
X
CAKI-1
Почки
X
786-0
Почки
X
T47D
Молочная железа
X
MDAMB 435
Молочная железа
X
Различные линии опухолей человека демонстрируют различную ответную реакцию на инфекцию повышенных концентраций вируса миксомы-LacZ. Например, клетки линии U373 нуждаются в повышенном титре вируса для достижения уровня клеточной гибели, достигаемого более низким титром вируса в клеточной линии U87 (фигура 23 и фигура 24). Миксома эффективно инфицирует клетки астроцитомы (фигура 25) и клетки глиомы (фигура 26). Миксома была эффективна через 48 часов после заражения для уничтожения (убийства) клеток астроцитомы человека и клеток детской медуллобластомы (фигура 27 и 28).
Специалисту в данной области понятно, что возможны и другие модификации описанных здесь вариантов осуществления, приведенных в качестве примеров. Настоящее изобретение охватывает все такие модификации в объеме, определенном формулой изобретения.