ПРОИЗВОДНЫЕ 5-АМИНО-3-(2-АМИНОПРОПИЛ)-[1,2,4]ТИАДИАЗОЛА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОРАКОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ
5-AMINO-3-(2-AMINOPROPYL)-[1,2,4]THIADIAZOLE DERIVATIVES, POSSESSING ANTI-CANCER ACTIVITY

Изобретение относится к области синтеза физиологически активных соединений и может найти применение при изготовлении фармакологических препаратов для лечения онкологических заболеваний.
Злокачественные новообразования устойчиво занимают второе место в структуре заболеваемости и смертности человека. Значительные усилия и средства направляются во всем мире на разработку новых подходов к терапии новообразований и поиск эффективных лекарственных средств. Однако проблема создания адекватного фармакологического инструментария для борьбы с онкологическими заболеваниями далека от своего решения. Ежегодно выходящие на рынок препараты для терапии данного заболевания оказываются либо чересчур специфичными для какого-то одного типа рака, и только на определенной стадии, либо слишком токсичными для организма пациента в целом. При этом разработке высокоэффективных препаратов препятствует высокая гетерогенность раковых структур и обилие мутаций в тех частях клетки, которые могли бы быть потенциальными мишенями терапии.
Существует два принципиально различных подхода к поиску новых противораковых агентов: синтез соединений, направленных на определенную мишень в раковых клетках, способных подавить их рост, и поиск новых цитостатических и цитотоксических агентов среди библиотек органических соединений. При втором подходе механизм антиракового действия вещества чаще всего исследуется после доказательства его эффективности в клинических исследованиях. Учитывая гетерогенность раковых клеток, новые соединения должны быть мультифункциональными, что позволит воздействовать на различные мишени, которые могут быть по-разному доступны в различных раковых клетках.
Производные тиадиазолов обладают сильной ароматичностью циклической системы, что приводит к их высокой стабильности in vitro. У этих соединений, как правило, отсутствует токсичность для высших позвоночных, включая человека. Присоединение к тиадиазольному ядру различных функциональных групп, способных реагировать с различными рецепторами, позволяет получить физиологически активные соединения с превосходными фармакологическими свойствами. Эти вещества проявляют фунгицидную, противобактерицидную, инсектицидную, гербицидную, противовоспалительную, нейростимулирующую и антиконвульсивную активность [N. Siddiqui, P. Ahuja, W. Ahsan, S.N. Pandeya, M.S. Alam // «Thiadiazoles: Progress Report on Biological Activities» Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 2009, 1(1): 19-30]. Некоторые производные 1,2,4-тиадиазола могут быть основой препаратов для борьбы с болезнью Альцгеймера, заболеваниями сердечно-сосудистой системы [Gupta A., Mishra P., Pandeya S.N. et al. // Eur. J. Med. Chem. 2009. V.44. P.1100-1105]. Эти соединения обладают способностью связываться с рядом G-белоксопряженных рецепторов (опиодных, дофаминовых, аденозиновых) и могут выступать как противовоспалительные агенты [A. Castro, Т. Castano, A. Encinas. W. Porcal, С. Gil. Bioorg. Med. Chem. 2006, 14, 1644].
Авторам настоящего изобретения удалось обнаружить новые, ранее неизвестные физиологически активные свойства для производных 5-амино-3-(2-аминопропил)-[1,2,4]тиадиазола, а именно - высокую противораковую активность.
Изобретение направлено на решение задачи расширения арсенала средств, которые могут быть использованы в качестве новых и эффективных лекарств для лечения онкологических заболеваний.
Поставленная задача решается применением производных 5-амино-3-(2-аминопропил)-[1,2,4]тиадиазола общей формулы:
, где
1
2
R, R могут быть одинаковыми или различными и независимо означают водород, галоген, алкил;
3
R означает алкил, аралкил, гетероаралкил, циклоалкил;
в виде оснований или фармакологически приемлемых солей.
Термин "галоген" означает хлор, фтор, бром или йод.
Термин "алкил" означает незамещенную или замещенную алкильную группу с прямой или разветвленной цепью, содержащую от 1 до 12 атомов углерода. Заместителями в алкильной группе могут быть галогены, гидрокси- и алкоксигруппы (например, метокси, этокси и аналогичные), циано, нитро, тригалогенметильные (например, трифторметил и аналогичные), необязательно замещенные аминогруппы (например, амино, диметиламино, ацетиламино, N-пиперидино, N-морфолино и аналогичные), ацильные группы (например, формил, ацетил, бензоил и аналогичные), карбоксамидные (например, N,N-диэтилкарбоксамидная и аналогичные), карбоксигруппы, карбалкоксигруппы и аналогичные.
Термин "аралкил" означает алкильную группу с концевым необязательно замещенным арильным заместителем.
Термин "гетероаралкил" означает гетероарил, к которому присоединена алкильная группа, охарактеризованная выше. Примеры подходящих заместителей включают необязательно замещенные этилиндол-3-ил, пропил-3-имидазол-1-ил.
Термин "циклоалкил" означает насыщенную необязательно замещенную циклическую группу с 3-8 кольцевыми атомами углерода, необязательно включающую гетероатомы N и О в количестве от 1 до 2 (например, циклопропил, циклогексил, пиперазинил, морфолинил).
Синтез указанных соединений описан ранее [Прошин А.Н., Бачурин С.О. Патент РФ №2449997, "5-Амино-3-(2-аминопропил)-[1,2,4]тиадиазолы", от 10.05.2012; Прошин А.Н., Серков И.В., Бачурин С.О. "Новые бинарные соединения на основе 1,2,4-тиадиазола" ДАН, 2012, 446, №1, с.48-50; Proshin A.N.; Serkov I.V.; Bachurm S.O., "5-Amino-[1,2,4]thiadiazole derivatives", WO 2012050484, Pub. 19.04.2012, EP 2628734, Pub 21.08.2013].
Способность изученных соединений оказывать цитотоксическое действие подтверждена на культурах раковых клеток крысиной глиомы С6 и человеческой остеосаркомы HOS. Во всех экспериментах указанные соединения проявляли умеренную или сильную цитостатическую активность и вызывали гибель раковых клеток в концентрациях от 2 до 100 мкМ.
Таким образом, применение производных 5-амино-3-(2-аминопропил)-[1,2,4] тиадиазола решает задачу расширения номенклатуры веществ, обладающих способностью ингибировать раковые клетки, т.к. ранее противораковые свойства этих соединений не были известны.
Методика эксперимента
1. Культивирование клеток
2
Клетки глиомы С6 крысы (клеточный банк Российской коллекции клеточных культур. Институт цитологии РАН, СПб) культивировали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO в среде DMEM (ПанЭко, Россия), содержавшей 10% телячьей эмбриональной сыворотки (РАА Laboratories, США), 2 мМ глутамина, 25 мМ HEPES [6], 100 ед./мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептомицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина В (ПанЭко, Россия).
2
Клетки человеческой остеосаркомы HOS (клеточный банк Российской коллекции клеточных культур. Институт цитологии РАН, СПб) культивировали при температуре 37°C в атмосфере 5% CO в среде Игла MEM с солями Эрла (ПанЭко, Россия), содержавшей 10% телячьей эмбриональной сыворотки (РАА Laboratories, США), 2 мМ аланилглутамина, 1 мМ пирувата натрия, набор заменимых аминокислот для среды MEM (ПанЭко, Россия), 100 ед./мл пенициллина, 0.1 мг/мл стрептамицина и 0.25 мкг/мл амфотерицина В (ПанЭко, Россия).
Прикрепленные клетки снимали с помощью 0.25% раствора трипсина в 0.53 мМ ЭДТА с солями Хэнкса (ПанЭко, Россия). Подсчет клеток выполняли с помощью камеры Горяева.
2. Определение ингибирующей активности веществ
2
2
50
Для анализа цитотоксичности исследуемых веществ культуры клеток рассеивали в 96-луночные планшеты в количестве 1.25×104 клеток/см и растили в течение трех дней до плотности 105 клеток/см (половина максимальной плотности клеток). Серийные разведения испытуемых веществ в диапазоне 0.1-100 мкМ (финальная концентрация после добавления к клеткам) готовили в ДМСО и растворяли в среде культивирования, после чего добавляли к культуре клеток (три повтора для каждой концентрации) и инкубировали 18 часов. Время инкубации выбирали, исходя из критерия наибольших различий между веществами. Финальная концентрация ДМСО составила 0.5%. К контролю добавляли только ДМСО в финальной концентрации 0.5%. Отдельно был поставлен контроль без ДМСО (нет различий с контролем с 0.5% ДМСО). Для оценки жизнеспособности клеток под действием исследуемых веществ использовали МТТ-тест (оценка восстановления красителя МТТ митохондриями живых клеток) [Mosmann Т. (1983) J. Immunol. Methods, 65, 55-63.]. После удаления среды с исследуемыми веществами клетки инкубировали 1.5 ч с 0.5 мг/мл раствором МТТ (ПанЭко, Россия) в растворе Хэнкса (ПанЭко, Россия). После этого раствор удаляли, растворяли клетки в ДМСО и оценивали количество восстановленного красителя фотометрически при длинах волн 574 и 620 нм с помощью аппарата Эфос 9505 (МЗ Сапфир, Россия). Дополнительно перед проведением МТТ-теста состояние клеток оценивали микроскопически. Каждый эксперимент повторяли три раза. Кривые для вычисления LD строили с помощью программы GraphPad Prism 5.0, в ней же проводили дисперсионный анализ данных с применением теста Тьюкея (Tukey). Достоверными считали отличия с p<0.05.
Ниже приведены результаты определения цитотоксической активности производных 5-амино-3-(2-аминопропил)-[1,2,4]тиадиазола и их солей на клетках глиомы С6 крысы (табл.1) и на клетках остеосаркомы человека HOS (табл.2), которые иллюстрируют, но не исчерпывают данное изобретение.
Таблица 1
Результаты определения цитотоксической активности производных 5-амино-3-(2-аминопропил)-[1,2,4]тиадиазола и их солей на клетках глиомы С6 крысы.
№
R<sup>1</sup>
R<sup>2</sup>
R<sup>3</sup>
HCl
LD<sub>50</sub>, мкМ
1
Cl
Cl
<img file="00000002.tif" he="23" wi="26" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
6±5
2
Cl
Cl
<img file="00000003.tif" he="11" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
94±9
3
F
Cl
<img file="00000004.tif" he="23" wi="27" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
11±1
4
Br
H
<img file="00000005.tif" he="23" wi="27" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
20±2
5
Me
H
<img file="00000006.tif" he="23" wi="26" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
79±9
6
Me
Cl
<img file="00000007.tif" he="11" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
15.9±0.3
7
F
Cl
<img file="00000007.tif" he="11" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
9±11
8
Cl
Cl
<img file="00000007.tif" he="11" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
6±5
9
Me
Cl
<img file="00000007.tif" he="11" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
HCl
18±8
10
Cl
Cl
<img file="00000008.tif" he="12" wi="28" img-content="undefined" img-format="tif" />
2HCl
10±4
11
H
Cl
<img file="00000007.tif" he="11" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
HCl
21±4
12
H
Cl
<img file="00000009.tif" he="23" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
14±4
13
Н
Cl
<img file="00000010.tif" he="25" wi="26" img-content="undefined" img-format="tif" />
HCl
21±8
14
Cl
Cl
<img file="00000011.tif" he="16" wi="35" img-content="undefined" img-format="tif" />
HCl
2.9±0.6
15
Cl
Cl
Me
-
15.4±0.3
16
CH(OH)Me
H
<img file="00000012.tif" he="24" wi="35" img-content="undefined" img-format="tif" />
-
14±2
17
H
Cl
<img file="00000013.tif" he="23" wi="26" img-content="undefined" img-format="tif" />
2HCl
10±4
Как видно из этой таблицы, большинство соединений проявляет активность при концентрациях от 2 до 20 мкМ.
Таблица 2
Цитотоксическая активность производных 5-амино-3-(2-аминопропил)-[1,2,4]тиадиазола и их солей на клетках остеосаркомы человека HOS (шифр соединений соответствует структурам в табл.1).
№
LD<sub>50</sub>, мкМ
1
20±6
7
51±3
8
26.5±0.7
10
28±6
17
20±7
На данной линии клеток активность соединений находилась в пределах 13-50 мкМ.