Определение молярных показателей поглощения основных производных гемоглобина по спектрам поглощения цельной крови

ХИМИЯ

Вестник Омского университета, 2002. №2. С. 38-40. © Омский государственный университет

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЯРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПОГЛОЩЕНИЯ ОСНОВНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЕМОГЛОБИНА ПО СПЕКТРАМ ПОГЛОЩЕНИЯ

ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ

Е.Ю. Мосур|, Е.В. Бескровная, А.А. Тютерев^

]Институт сенсорной микроэлектроники СО РАН, 644077, Омск, пр. Мира, 55A, \Омский государственный университет, кафедра ФТТ 644077, Омск, пр.Мира, 55A

Получена 22 февраля 2002 г.

The determination of molar extinction coefficients of oxyhemoglobin, deoxyhemoglobin, carboxyhemoglobin, and methemoglobin by absorption spectra of whole blood were made. The quantitative analysis of blood samples with different oxygenation levels was carried out by using present molar extinction coefficients.

Введение

цианметгемоглобинового метода [2].

Количественный анализ основных производных гемоглобина (оксигемоглобина (НЬО2), дезокси-гемоглобина (НЬ), карбоксигемоглобина (НЬСО) и метгемоглобина (ЫвЬНЬ)) позволяет проводить полноценную диагностику состояния сердечно-сосудистой системы человека. Самым распространенным методом анализа является спектро-фотометрия. Для корректного количественного спектрофотометрического анализа необходимо точное определение молярных показателей поглощения (м.п.п.) основных производных гемоглобина.

В настоящее время в гематологии стандартизовано только значение м.п.п. цианметгемогло-бина (СЫЫвЬНЬ) при длине волны Л =540 нм: £=11,0 л/(ммоль*см) [1]. Отсутствие стандартизованных значений молярных показателей поглощения основных производных гемоглобина вызывает необходимость их независимого определения.

Экспериментальная часть

Вычисление молярных показателей поглощения основных производных гемоглобина осуществлялось на основании выполнения для цельной крови закона Бугера и принципа аддитивности оптических плотностей. Общая концентрация гемоглобина определялась с помощью стандартного

Определение м.п.п. метгемоглобина

Исходная смесь основных производных гемоглобина посредством добавления феррицианида калия (КзРе(СN)б ) переводится в однокомпонент-ную смесь. Схематически это можно представить следующим образом:

HbO2,Hb, HbCO, MetHb)^+K3Fe(CN)«^(MetH^

По измеренному спектру поглощения метге-моглобина и значению общей концентрации гемоглобина можно вычислить м.п.п метгемоглобина:

A

MetHb

MetHb

CHbt

где АрМ[е1нЬ - оптическая плотность метгемоглобина при длине волны Л1; сны - общая концентрация гемоглобина.

Определение м.п.п. карбоксигемоглобина

Молярные показатели поглощения карбоксигемо-глобина определяются путем превращения окси-гемоглобина, дезоксигемоглобина и метгемогло-бина в карбоксигемоглобин посредством двух-шаговой процедуры: 1) добавление дитионита натрия (Na2S2O4) 2) насыщение получившейся смеси НЬ и НЬСО угарным газом СО . Схема процедуры:

л

А

Определение молярных показателей поглощения основных производных гемоглобина.

39

'НО2Н! НСО: МеН НСО ^ НСО

Используя значения измеренных оптических плотностей карбоксигемоглобина и общей концентрации гемоглобина, вычисляют м.п.п. кар-боксигемоглобина:

Г г —

ьИЪСО =

АШСо снъь

где АНъсо - оптическая плотность карбоксигемоглобина при длине волны ^.

Определение м.п.п. дезоксигемоглобина

При добавлении к исходному образцу дитионита натрия ((Ма2Б20А)) окси- и метгемоглобин переходят в дезоксигемоглобин:

ИЪ02:ИЪ: НЬСО, НЬСО

В образовавшейся двухкомпонентной смеси концентрация карбоксигемоглобина определяется методом Ишизавы [3]. Суть метода Ишизавы заключается в превращении гемоглобина в двух-компонентную смесь НЪ и НЬСО. Содержание карбоксигемоглобина [ НЪС0 ] рассчитывается по следующей формуле:

[НЬСО] =

где А419 - поглощение раствора при длине волны 419 нм (максимум поглощения НЪСО); А425,5 -поглощение раствора при длине волны 425,5 нм (изосбестическая точка спектров поглощения НЪ и НЪСО); а,Ъ - константы [3].

При вычислении м.п.п. дезоксигемоглобина учитывается содержание карбоксигемоглобина:

р 1 — ьнъ =

АНнъъ+нъъсо - [Н^СО}^нъсо °ть

Сны - [НЪСО]ены

где АНъ+нъсо - оптическая плотность смеси при длине волны Xi.

Схема 1. М. п. п. основных производных гемоглобина: 1 -оксигемоглобина; 2 - дезоксигемоглобина; 3 -карбоксигемоглобина; 4 - метгемоглобина

лежит принцип дифференциальной спектрофо-тометрии. Расчет концентрации метгемоглобина производится по формуле:

С

МеШЪ = "6зо

с,

А<р0 — А230

МвЬНъ

— >

-630 '

"С N Меьнъ

где гМешъ и Меьнъ - молярные показатели

поглощения MetHЪ и СЫМе1НЬ при длине волны 630 нм; А130 и А630 - оптические плотности

растворов при длине волны 630 нм до и после добавления ацетонциангидрина.

М.п.п. оксигемоглобина вычисляются с учетом концентраций дисгемоглобинов:

нъо 2

Атх — ^^НъсоСНСО — ^МелЬМН

Снъь — Снъсо — СМеЬНъ

где А^х - оптическая плотность смеси НЪО2, НЪСО и Ме1НЪ при длине волны Xi; снъсо = [НЪСО]снъь - концентрация карбоксигемоглоби-на в образце крови.

Определение м.п.п. оксигемоглобина

При сатурации образца крови дезоксигемоглобин переходит в оксигемоглобин:

НЪО2:НЪ: НЪСО, МеШЪ) НЪО2:НЪСО, МеШЪ

Концентрации карбокси- и метгемоглобина в полученном образце определяются независимыми методами Ишизавы и Эвелина-Маллоя [4] соответственно. В основе метода Эвелина-Маллоя

Результаты и обсуждение

Экспериментальные образцы крови готовились следующим образом. Цельная гепаринизирован-ная кровь, взятая из локтевой вены человека, гемолизировалась перемораживанием в течение 1 часа при температуре -180 С. Регистрация спектров поглощения производилась на универсальном спектрофотометре СФ-56 в диапазоне 510650 нм; оптическая длина пути: 0,01 см (для цельной крови) и 1 см (для растворов крови).

40

Е.Ю. Мосур, Е.В. Бескровная, А.А. Тютерев

Схема 2. Спектры поглощения цельной крови и ее раствора

Схема 3. Зависимость спектров поглощения цельной крови от степени оксигенации

По вышеприведенным методикам были определены молярные показатели поглощения основных дериватов гемоглобина. На рис.1 показаны м.п.п. основных дериватов гемоглобина, полученные в ходе исследования, в сравнении с литературными данными [5].

Проведен сравнительный анализ спектров поглощения цельной крови и ее растворов (рис.2). Количественный анализ спектров показал большее содержание кислорода в растворе, чем в цельной крови, что, по-видимому, объясняется дополнительным насыщением крови кислородом при ее растворении буферным раствором. В данной работе исследовались спектры поглощения цельной крови, поскольку они позволяют определить реальную концентрацию оксигемоглобина в крови. На рис.3 показаны спектры поглощения образцов крови с различной степенью оксигена-ции. По спектрам поглощения рассчитаны концентрации основных производных гемоглобина.

Количественный спектрофотометрической анализ основных производных гемоглобина выполнен с помощью компьютерной программы ИешоЯре^г [6].

Выводы

В интервале длин волн 510 - 650 нм получены молярные показатели поглощения основных производных гемоглобина, согласующиеся с известными литературными данными.

Сравнительный количественный анализ спектров поглощения цельной крови и ее растворов показал, что реальное кислородное насыщение крови можно оценить по спектрам цельной кро-

ви.

Получена зависимость спектров поглощения основных дериватов гемоглобина от степени ок-сигенации.

[1] Zwart A., Buursma A., van Kampen E.J., Zijlstra W.G. Multicomponent analysis of hemoglobin derivatives with a reversed-optics spectrophotometr. // J. Clin. Chem. 1984. N.30/3. P.373-379.

[2] International Committee for Standardization in Haemotology. Recommendations for reference method for haemoglobinometry in human blood (ICSH standard 1986) and specifications for international haemoglobinocyanide reference preparation. 3rd ed. // J. Clin. Lab. Haemotol. 1987. N.9. P.73-79.

[3] Ishizawa F. A study on the spectrophotometric determination of carboxyhemoglobin in blood -"isobestic point"method. // Jpn. J. Legal. Med. 1981. N.35(3). P.191-200.

[4] Evelyn K.A., Malloy H.T. Microdetermination of oxyhemoglobin, methemoglobin and sulfhemogobin in a single sample of blood. // J. Biol. Chem. 1938. N.126. P.655-662.

[5] Zijlstra W.G., Buursma A., Meeuwsen-van der Roest W.P. Absorption spectra of human fetal and adult oxyhemoglobin, de-oxyhemoglobin, carboxyhemoglobin, and methemoglobin. // Clin. Chem. 1991. N.37. P.1633-1638.

[6] Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ "HemoSpectr"№2001610571, Мосур Е.Ю. (Россия); Омский государственный университет (Россия). Заявка №2001610305 от 19.03.2001; Зарегистрировано в Реестре программ для ЭВМ 17.05.2001.