СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА ФОРМИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ИСТИННОЙ ЭКЗЕМЫ У ИНДИВИДУУМОВ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ НАЛИЧИЯ НАСЛЕДСТВЕННОЙ ОТЯГОЩЕННОСТИ
METHOD FOR PREDICTING RISK OF DEVELOPING CHRONIC TRUE ECZEMA IN INDIVIDUALS DEPENDING ON AVAILABILITY OF FAMILY HISTORY

Способ прогнозирования риска формирования хронической истинной экземы у индивидуумов в зависимости от наличия наследственной отягощенности
Истинная экзема - повсеместно встречающееся, рецидивирующее заболевание кожи, которое характеризуется полиморфизмом морфологических элементов и возникает в любом возрасте [Клиническая дерматовенерология: руководство для врачей: в 2-х т. /под ред. Ю. К. Скрипкина, Ю. С. Бутова. - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - Т. 2. - 921 с.]. Название данного заболевания можно объяснить свойством везикул быстро вскрываться, подобно пузырькам кипящей воды (по-гречески eczeo - вскипать). Важный признак острой экземы - наличие сгруппированных, многочисленных и быстро вскрывающихся мелких пузырьков, образующих серозные «колодцы», сходных с пузырьками на поверхности кипящей воды [Оспанова С.А. Совершенствование терапии экземы с учетом эндогенной интоксикации: автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.00.11 /С.А. Оспанова; Казах. науч.-исслед. кож.-венерол. ин-т М-ва здравоохранения Респ. Казахстан. - Алматы, 2008. - 21 с.].
На разных этапах развития учений об экземе важное значение в этиологии и патогенезе экземы придавали неврогенной и аллергической теориям, роли эндокринной системы, наследственным факторам.
По мнению большинства исследователей экзему следует относить к мультифакториальным заболеваниям с полигенным типом наследования с пороговым эффектом. При сочетании определенных генетических дефектов и средовых факторов достигается пороговое значение, при котором и появляется клиническая картина заболевания. Существует большое количество фенотипически здоровых людей с высоким риском формирования аллергических заболеваний в неблагоприятных условиях внешней среды.
При вовлеченности большого числа генов-кандидатов в подверженность к истинной экземе достаточно воздействия незначительных средовых факторов, чтобы очень быстро предрасположенность к развитию аллергического заболевания реализовалась в виде заболевания. И наоборот, агрессивные факторы внешней среды даже при минимальных генетических факторах подверженности могут привести к быстрому формированию экземы [Cytokines and chemokines orchestrate atopic skin inflammation /B. Homey, M. Steinhoff, T. Ruzicka [et al.] //J. Allergy. Clin. Immunol. - 2006. - Vol. 118, №1. - P. 178-189].
В современной литературе собрано большое количество наблюдений, указывающих на связь аллергических заболеваний у родителей или родственников больного с появлением каких-либо аллергических проявлений у детей. Если оба родителя ребенка страдают аллергическим заболеванием, то риск формирования экземы по разным данным составляет от 50% до 80%, если наследственность отягощена по материнской линии, то риск развития аллергического заболевания составляет от 30% до 50%.
У индивидуумов, c наследственной предрасположенностью, которая подтверждается положительной ассоциацией антигенов системы гистосовместимости (В22 и Cw1), усиливается синтез простагландина F2a, что вызывает стимуляцию выработки циклического гуанозинмонофосфата, активирующего синтез серотонина, гистамина и других медиаторов аллергии, что способствует развитию воспалительных и аллергических реакций и повышает проницаемость сосудов [Дегтяр Ю.С. Особенность гормонального статусаа у больных экземой и другими дерматозамии в условиях Севера /Ю.С. Дегтяр, Л.К. Добродеева //Вестник дерматологии и венерологии. - 2000. - №5. - С. 50-53]. Одновременно с увеличением образования простагландина F2a повышается синтез простагландина E1, но его концентрация значительно снижена по отношению к увеличивающейся концентрации простагландина F201. Недостаток содержания простагландина Е1, нарушение его соотношения с содержанием простагландина F2a приводит к недостаточной стимуляции синтеза циклического аденозинмонофосфата, подавляющего формирование аллергических и воспалительных реакций, выработку медиаторов аллергии [Дикова О.В. Состояние эндотоксикоза у больных экземой / О.В. Дикова, С.В. Селиванова, Е.Ю. Кочеткова //Вестник последипломного медицинского образования. - 2001. - №1. - С. 31. - (Новое в дерматовенерологии, андрологии и гинекологии: наука и практика: материалы VI междисциплинар. симп., Москва, 15-16 марта 2001 г.)].
Таким образом, у больных экземой в результате повышения содержания F2a и нарушения соотношения ПГЕ1/ПГФ2а и цАМФ/цГМФ происходит преобладание простагландина F2a и циклического гуанозинмонофосфата, что является одной из причин развития заболевания [Мазитова Л.П. Современные аспекты патогенеза излечения аллергодерматозов у детей /Л.П. Мазитова //Русский медицинский журнал. - 2001. - Т. 9, №11. - С. 457-460].
В тромбоцитах периферической крови больных экземой установлено усиление синтеза и экскреции серотонина в кровяное русло. Реакция высвобождения тромбоцитов, в результате которой серотонин поступает в кровь, регулируется простагландинами. Простагландин Е1 ее подавляет, а простагландин F2a провоцирует [Емельянов А.В. Топические кортикостероиды в терапии аллергодерматозов: значения внегеномного эффекта /А. В. Емельянов, К. Н. Монахов //Вестник дерматологии и венерологии. - 2002. - №3. - С. 59-61]. Преобладание простагландина F2a обусловливает повышение содержания в крови серотонина, что усугубляет аллергические реакции. Гормон щитовидной железы тиреокальцитонин стимулирует активность аденилатциклазы - фермента, катализирующего синтез циклического аденозинмонофосфата из АТФ. Повышение содержания тиреокальцитонина у больных экземой, возможно, и есть проявление защитных реакций организма. Изменения иммунного статуса повышают аллергическую реактивность и наряду с циклическими нуклеотидами и простагландинами приводят к формированию экземы.
По современным представлениям, в развитии экземы главную роль играют Т-лимфоциты, которые несут на своей поверхности специфические рецепторы к антигену и выделяют ряд провоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО-α [Павлова О.В. Экзема: этиология, патогенез, клиника, диагностика и лечение /О.В. Павлова. - Москва: URSS Либроком, 2010. - 61 с.]. Выброс биологически активных веществ вызывает развитие тканевых реакций воспаления, что клинически проявляется аллергической реакцией в виде отека, гиперемии, зуда.
Провоспалительные цитокины вызывают индукцию экспрессии молекул адгезии на эндотелиальных клетках и лейкоцитах, вследствие чего путем трансэндотелиальной миграции усиливается приток в очаг воспаления лейкоцитов из сосудистого русла [Interleukin-16 stimulates the expression and production of pro-inflammatory cytokines by human monocytes /N. L. Mathy, W. Scheuer, M. Lanzendörfer [et al.] //Immunology. - 2000. - Vol. 100, №1. - P. 63-69]. Дальнейшее накопление и продвижение иммунокомпетентных клеток в очаге воспаления контролируют хемокины, которые продуцируются эндотелиальными клетками и макрофагами. Клеточный инфильтрат в очаге воспаления, состоящий из макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов, способствует развитию аллергического воспаления. Полиморфный инфильтрат в коже при экземе - результат действия образовавшихся провоспалительных цитокинов, в том числе ФНО-α.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2013 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска формирования хронической истинной экземы по генетическим данным в зависимости от наследственной отягощенности.
За прототип выбрана выявленная в научно-медицинской литературе статья Ассоциация полиморфизма лимфотоксина α (+250 A/G Ltα) с формированием хронической истинной экземы [Я. Е. Денисова, М. И. Чурносов //Современные проблемы науки и образования. - 2014. - №3. - Режим доступа: http://www.science-education.ru/117-13677]. Способ включает забор венозной крови, выделение геномной ДНК из периферической крови и анализ локуса  +250 A/G Ltα  методом полимеразной цепной реакции  (далее ПЦР)  синтеза ДНК. Установлены особенности ассоциаций генетического полиморфизма +250G Lt α  с формированием хронической истинной экземы (далее ХИЭ) в зависимости от наследственной отягощенности. В группе больных ХИЭ, без отягощенного семейного анамнеза, +250A/G Ltα вносит значимый вклад в подверженность к ХИЭ: факторами риска формирования ХИЭ являются генетические варианты +250G Ltα  и +250GG Ltα .
Недостатком известного способа является его ограниченность, т.к. для прогнозирования риска формирования хронической истинной экземы у индивидуумов в зависимости от наличия наследственной отягощенности рассматриваются только генетические полиморфизмы +250 A/G Ltα .
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска формирования ХИЭ у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья РФ в зависимости от наличия наследственной отягощенности по данным о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα и +1663A/G TNFR2 и их сочетаний, в том числе с +250A/G Ltα.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска формирования хронической истинной экземы в зависимости от наследственной отягощенности по данным о генетических полиморфизмах -308G/A TNFα и +1663A/G TNFR2 и их сочетаний с полиморфным вариантом +250A/G Ltα.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования ХИЭ у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья РФ, в зависимости от наследственной отягощенности, включающий:
- забор венозной крови,
- выделение геномной ДНК из периферической крови методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК,
- анализ локуса +250A/G Ltα,
в который внесены следующие новые признаки:
- анализ полиморфизмов генов фактора некроза опухоли α (-308G/A TNFα) и рецептора фактора некроза опухоли 2 типа (+1663A/G TNFR2);
- прогнозирование риска развития ХИЭ у индивидуумов с наследственной отягощенностью при наличии аллеля+1663G TNFR2 или сочетания аллеля +1663G TNFR2 с аллелем -308G TNFα;
- прогнозирование риска развития ХИЭ у индивидуумов без наследственной отягощенности при наличии аллеля -308А TNFα или сочетания аллеля +250G Ltα с аллелем +1663 G TNFR2 или сочетания аллеля -308 А TNFα с аллелем +250 G Ltα.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что впервые установлена вовлеченность генетических полиморфизмов фактора некроза опухоли α (-308 G/A TNF α) и рецептора фактора некроза опухоли 2-го типа (+1663А/G ТNFR2) и их сочетаний, в том числе с полиморфным вариантом +250A/G Ltα в формировании хронической истинной экземы у индивидуумов в зависимости от наличия наследственной отягощенности.
Способ осуществляют следующим образом.
2
Выделение геномной ДНК осуществляют стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. 1-ый этап: к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, который содержит 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х -100, 5 мМ MgCl и 10 мМ трис-НCl (pH=7,6).Полученную смесь при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут перемешивают и центрифугируют. После центрифугирования сливают надосадочную жидкость, к полученному осадку добавляют 4 мл раствора, с 25 мM ЭДТА (рН=7,8) и 75 мМ NaCl, затем ресуспензируют. После этого прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы K (10 мг/мл) и в течение 16 часов при 37ºС инкубируют образец.
0
На 2-м этапе в течение 10 минут при 4000 об/мин из полученного лизата последовательно экстрактируют ДНК равными частями фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием. Производят отбор водной фазы после каждого центрифугирования. Из раствора 2-мя объемами охлажденного 96% этанола осаждают ДНК. Полученную ДНК растворяют в деионизованной, бидистиллированной воде и хранят при t=-20 С. Выделенную ДНК используют для полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК.
Анализ -308G/А TNFα, +250G/A Ltα, +36A/G TNFR1, +1663A/G TNFR2 осуществлялся методами ПЦР синтеза ДНК на CFX 96 с системой ПЦР в режиме real time. Использовали ДНК-полимеразу Thermus aquaticus (производитель фирма «Силекс-М») и олигонуклеотидные праймеры и зонды (синтезированные фирмой «Синтол»).
2
2
Реакционная смесь (объем 25 мкл) включает: 67 мМ трис-НCl (pН=8,8), 2,5 мМ MgCl, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 5 пмоль каждого зонда, по 200 мкM dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. Для каждой пары праймеров рассчитывали оптимальный температурный и временной режим отжига и подбирали соответствующую концентрацию MgCl.
Генотипирование производят по методу Tag Man зондов на основании данных значений RFU (уровень относительной флуоресценции) для каждого зонда при проведении ПЦР в амплификаторе IQ5.
Изобретение характеризуется:
Фиг.1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин УОФ (далее уровень относительной флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе IQ5 c детектирующей системой в режиме реального времени локуса -308 G/A TNFα, где
○ -308АА TNFα,  -308GG TNFα, Δ -308GA TNFα, ◊ - контрольный образец.
Фиг.2. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин УОФ каждого зонда на амплификаторе IQ5 c детектирующей системой в режиме реального времени локуса +1663A/G TNFR2, где ○ - +1663GG TNFR2,  - +1663AA TNFR2, Δ -+1663AG TNFR2, ◊ - контрольный образец.
На фигурах 1-2 две полосы, вертикальная и горизонтальная, делят график на четыре секции: одна для каждого гомозиготного состояния, одна для гетерозиготного состояния и секция без реакции. Присвоение генотипов неизвестным образцам определяется вычерчиванием УОФ для одного флуорофора на оси x, относительно УОФ для другого флуорофора на оси y на диаграмме дискриминации аллелей. Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю A, зонд с красителем FAM - аллелю G.
Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и правее вертикальной полосы, генотип гетерозиготен (GA).
Если значения УОФ неизвестного образца находятся выше горизонтальной полосы и левее вертикальной полосы, генотип гомозиготен по аллелю A (УОФ аллеля A отложены по оси y).
Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и правее вертикальной, генотип гомозиготен по аллелю G (УОФ аллеля G отложены по оси x).
Если значения УОФ неизвестного образца находятся ниже горизонтальной полосы и левее вертикальной, определение генотипа невозможно: в данном случае неопределенный образец - отрицательный контроль.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития хронической истинной экземы в зависимости от наследственной отягощенности подтверждает анализ результатов обследования 552 индивидуумов: отягощенный семейный анамнез по заболеванию был выявлен у 80 больных (34,78%), 150 больных ХИЭ (65,22%) не имели наследственной отягощенности и 322 человек контрольной группы.
В исследуемые группы включались лица русской национальности, которые являлись уроженцами Центрального Черноземья Российской Федерации и не имели родства между собой. Клиническое и клинико-лабораторное обследование больных проводили на базе поликлинического отделения ОГБУЗ «Кожно-венерологический диспансер».
Средний возраст больных хронической истинной экземой составил 45,91±2,68 (варьировал от 18 лет до 86 лет), контрольной выборки - 43,62±3,46 (варьировал от 20 до 76 лет) (р>0,05). Следовательно, группа больных не отличалась от группы контроля по возрасту, месту рождения и национальности.
cor
cor
реrm
С целью решения проблемы множественных сравнений, связанной с получением ложноположительных результатов (ошибка 1-го рода), вводили поправку Бонферрони, т.е. производили перерасчет уровня значимости р для множественных парных сравнений по формуле: р=р·n, где р - полученный уровень статистической значимости, n - количество парных сравнений. За статистически значимый уровень принимали р≤0,05. Анализ ассоциаций сочетаний генетических вариантов с ХИЭ проведен с помощью программного обеспечения APSampler (http://sources.redhat.com/cygwin/), использующий метод Монте-Карло марковских цепей и байесовскую непараметрическую статистику. Уровень р, полученный после пермутационного теста р≤0,05 (выполнено 100 пермутаций), принимали за статистически значимый.
2
В группе больных ХИЭ, без отягощенного семейного анамнеза, значимый вклад в подверженность к ХИЭ вносит генетический полиморфизм -308G/A TNFα. В этой группе пациентов концентрации генетического варианта -308A TNFα (15,44%) достоверно выше, чем в контрольной группе, где этот показатель составил 10,47% (χ=4,03, р=0,04, OR=1,56, 95% CI 1,01-2,41).
2
Среди больных ХИЭ, имеющих наследственную отягощенность, предрасположенность к ХИЭ связана с генетическим полиморфизмом +1663A/G TNFR2: частота генетического варианта +1663G TNFR2 в группе больных (66,67%) в 1,2 раза превышает аналогичный показатель контрольной группы (55,95%, χ=5,08, р=0,025, OR=1,58, 95% CI 1,06-2,35).
perm
В формировании значимых комбинаций генетических вариантов, отличающих больных ХИЭ с отягощенным семейным анамнезом от контрольной группы, участвуют полиморфные маркеры: -308G/A TNFα и +1663A/G TNFR2. Сочетание генетических вариант -308G TNFα с +1663 G TNFR2 (78,75%) у больных ХИЭ с отягощенным семейным анамнезом встречается чаще, чем в контрольной группе (74,84%). Отношение шансов равно - 2,54 (95% CI 1,11-5,80), при р=0,04.
Выявлены достоверные различия в концентрациях сочетания аллелей +250 G Ltα с+1663 G TNFR2 между больными ХИЭ с неотягощенным семейным анамнезом (40,00%) и контролем (32,30%, OR=1,68, 95%CI 1,11-2,55).
perm
Наряду с этим, зарегистрированы различия в распределении сочетания двух генетических маркеров -308A TNFα с +250G Ltα между больными ХИЭ без наследственной отягощенности (25,33%) и контрольной группой (18,01%, OR=1,77, 95%CI 1,11-2,83). Данные комбинации полиморфных вариантов генов-кандидатов являются факторами риска развития ХИЭ у больных без отягощенного семейного анамнеза (р=0,04 для обоих сочетаний).
Примеры, подтверждающие осуществимость предложенного изобретения у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья РФ.
1. У пациента А. с неотягощенным семейным анамнезом выявлен аллель -308А TNFα. При дальнейшем наблюдении у данного пациента возникла хроническая истинная экзема.
2. У пациента Ж. с неотягощенным семейным анамнезом выявлена комбинация +250G Ltα с +1663G TNFR2. При дальнейшем наблюдении у данного пациента возникла хроническая истинная экзема.
3. У пациента З. с неотягощенным семейным анамнезом выявлена комбинация -308А TNFα с +250G Ltα. При дальнейшем наблюдении у данного пациента возникла хроническая истинная экзема.
4. У пациента И. с отягощенным семейным анамнезом выявлен генотип +1663G TNFR2. При дальнейшем наблюдении у данного пациента возникла хроническая истинная экзема.
5. У пациента Ф. с отягощенным семейным анамнезом выявлена комбинация +1663G TNFR2 с -308G TNFα. При дальнейшем наблюдении у данного пациента возникла хроническая истинная экзема.