Способ оценки противопсориатического действия наружного препарата на лабораторной модели имиквимод-индуцированного псориаза
METHOD FOR EVALUATING THE ANTIPSORIATIC EFFECT OF AN EXTERNAL AGENT ON A LABORATORY MODEL OF IMIQUIMOD-INDUCED PSORIASIS

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может найти свое применение в медицинских целях для оценки противопсориатического действия изучаемых наружных препаратов на лабораторной модели псориаза.
При проведении доклинических исследований новых лекарственных веществ необходимо иметь критерии эффективности противопсориатического действия, которое включает противовоспалительный и антипролиферативный компоненты.
Применяемая для оценки острой фазы воспаления классическая модель «каррегининовый отек лап у крыс» осуществляется путем введения каррагенина в количестве 0,1 мл 1% раствора субплантарно. Через 3 часа проводят оценку выраженности воспалительной реакции по изменению объема лап (онкометрически), выражают в процентах к контролю [Winter С., Risley Е., Nuss G. // Proc. Soc. Exp.Biol. Med. - 1962. - Vol. 111. - Р. 544].
Недостатком данного метода является то, что в нем применяется оценка острой фазы развития воспалительной реакции, а при псориазе большее значение имеет оценка подавления хронического иммунного воспаления. Кроме того не определяется влияние препарата на пролиферативную активность клеток, имеющих ключевое значение в формировании псориатических высыпаний.
Описана модель «ватной гранулемы» для оценки антипролиферативного действия исследуемых препаратов. Белым крысам, находящимся под наркозом, выстригается шерсть в области спины с выполнением продольного разреза кожи и подкожно-жировой клетчатки длиной 1-2 см. Затем пинцетом в полость помещают ватный шарик массой 10 мг и зашивают рану. Исследуемый препарат вводят в виде водного раствора перорально ежедневно. На 8-ые сутки шарик извлекают и вычисляют его вес. Антипролиферативный эффект препарата оценивают по снижению веса шарика относительно контрольной группы [Оценка противовоспалительного и антиоксидантного действия супрамолекулярного комплекса рутина // Universum: химия и биология: электрон, научн. журн. Баратов К.Р. и др. 2020. №9(75)].
Недостатком метода является низкая точность измерений и неспецифичность повышения массы гранулемы, отсутствие роли кератиноцитов в формировании гранулемы и возможности наружного применения изучаемого препарата.
В зарубежной литературе описан способ оценки противопсориатического действия наружного препарата на основании оценки по PASI-модифицированному методу (mPASI) после формирования имиквимод-индуцированной модели псориаза на мышах нанесением имиквимода в течение 6 дней совместно с изучаемым препаратом. После индукции модели определяют показатели: эритема, индурация, шелушение по 5-ти бальной шкале от 0 до 4 и суммируют [van der Fits L, Mourits S, Voerman JS, Kant M, Boon L, Laman JD, Cornelissen F, Mus AM, Florencia E, Prens EP, Lubberts E. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 2009 May 1;182(9):5836-45].
Недостатком метода является субъективность при оценке клинических проявлений, а также низкий порог точности, не позволяющий стратифицировать эффективный препарат от неэффективного.
В основу нашего изобретения положена задача создания более точного и воспроизводимого способа оценки противопсориатического действия наружного препарата на лабораторной модели имиквимод-индуцированного псориаза. Целью работы стало изучение уровня экспрессии маркера Т-лимфоцитов (CD3) и пролиферативной активности клеток (Ki-67) в коже пациентов с бляшечным псориазом для определения противопсориатического действия топического препарата на имиквимод-индуцированной модели псориаза.
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе оценки противопсориатического действия наружного препарата на лабораторной модели имиквимод-индуцированного псориаза, включающем проведение иммуногистохимического исследования биоптата пораженного участка кожи, с помощью светового микроскопа определяют количество CD3+ и Ki-67+-клеток в пораженной коже; одновременное уменьшение количества CD3+ и Ki-67+-клеток в 2 раза и более по сравнению с контрольной группой является критерием эффективного противопсориатического действия препарата.
Технический результат заключается в повышении точности, достоверности, эффективности и воспроизводимости.
Проведение иммуногистохимического исследования кожи больных бляшечным псориазом с целью определения экспрессии маркера Т-лимфоцитов (CD3) и пролиферативной активности клеток (Ki-67) позволит наиболее точно оценить эффективность противопсориатического действия препарата.
Изобретение осуществляется следующим образом:
1. Формирование лабораторной модели псориаза при имиквимод-индуцированном воспалении у экспериментальных животных осуществляют согласно способу, предложенному в работе [Жуков А.С., Хайрутдинов В.Р., Самцов А.В. Сравнительное исследование противовоспалительной активности пиритиона цинка на лабораторной модели псориаза. 2020; 97 (2): 64-70]. Проводят нанесение изучаемого препарата согласно протоколу исследования. После окончания опыта выполняют эвтаназию с последующей биопсией кожи.
2. Образцы кожи вырезают так, чтобы в микроскопическом срезе сохранялись топографические соотношения, характерные для исследуемого материала.
3. Биоптат кожи помещают в емкость с фиксатором, объем фиксирующей жидкости превышал в 10-20 раз объем фиксируемого объекта. Если объект был разрезан на фрагменты толщиной более 5-6 мм, его оставляют в фиксаторе на 2-3 часа для уплотнения, после чего ткань рассекают на пластины толщиной 2-3 мм и помещают в свежий раствор фиксатора. Общее время фиксации при комнатной температуре (около 20°С) составляет от 18 до 24 часов. В повседневной работе в качестве фиксирующей жидкости используют 10% раствор формалина или цинк-формалин, который обеспечивает сохранение антигенных детерминант для проведения иммуногистохимических исследований.
4. Обезвоживание и пропитывание парафином биоптатов кожи проводят вручную по восходящим спиртам (70%, 80%, 90% и 100%) в аппарате гистологической проводки тканей «Leica Peloris» («Leica Microsystems», Германия), заливают в парафин.
5. Срезы приготавливают толщиной 3-4 мкм. Используют микротом ротационный Accu-CutSRM™200.
6. После этого приступают к непрямому иммуногистохимическому исследованию. Для этого срезы наклеивали на стекла, обработанные полилизином, распарафинивают, блокируют эндогенную пероксидазу раствором перекиси водорода в метаноле и выполняют демаскировку антигенов путем нагревания в трис-ЭДТА или цитратном буфере в течение 30 мин при температуре 97°С на водяной бане. Для иммуногистохимической детекции Т-лимфоцитов (CD3) и пролиферативной активности (Ki-67) используют первичные антимышины антитела (Таблица 1). Время инкубации с первичными антителами составляет 18-20 часов при t°=+40°С.
Для детекции клеток используют полимерную систему визуализации Envision (Dako, Дания), где в качестве хромогена применяют диаминобензидин (ДАБ) (Dako, Швеция). Инкубацию проводят с системой визуализации - 30 мин при температуре +20°С для проявления результата реакции ДАБ наносится на срезы на 5 мин.
Выполняют подсчет количества клеток кожи окрашенных цветовой меткой при 200-кратном увеличении светового микроскопа в пяти полях зрения (размерами 720×530 мкм), выбранных с учетом наибольшего количества меченых участков. Полученные средние значения количества CD3+ и Ki-67+-клеток в изучаемой группе сравнивают с контрольной (без терапии). Одновременное уменьшение количества CD3+ и Ki-67+-клеток в 2 раза и более по сравнению с контрольной группой является критерием эффективного противопсориатического действия препарата.
Изобретение поясняется фиг. 1-3. На фиг. 1 показана клиническая картина сформированной имиквимод-индуцированной модели заболевания, на фиг. 2 - экспрессия CD3+-клеток при иммуногистохимическом исследовании, на фиг. 3 - экспрессия Ki67+-клеток при иммуногистохимическом исследовании. Слева - снимки без применения изучаемого препарата, справа - после применения препарата (для примера в данном случае использовали глюкокортикостероидный гормональный препарат - мометазона фуроат).
На фиг. 1 слева видны сформированные псориазиформные элементы: эритема, шелушение и индурация кожи, справа изменения слабо выражены. На фиг. 2 слева наблюдается высокий уровень экспрессии Т-лимфоцитов (CD3-клетки) в эпидермисе и дерме; справа отмечается выраженное снижение экспрессии данного маркера. При иммуногистохимическом исследовании (фиг. 3) слева в сформированной модели наблюдается резкое увеличение площади экспрессии Ki67+-клеток в эпидермисе, после терапии количество Ki67+-клеток значительно ниже.
Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами.
Пример 1.
Для оценки эффективности препарата, содержащего цинк-пиритион, в подавлении развития воспалительной реакции применена лабораторная модель имиквимод-индуцированного воспаления на мышах. После формирования модели в течение 5 дней изучаемой группе наносили препарат цинк-пиритион, в качестве отрицательного контроля - индифферентный крем.
2
2
Результаты: При клиническом наблюдении установлено, что при применении препарата цинка-пиритиона наблюдается разрешение элементов кожной сыпи: эритемы, индурации и шелушения. Для более точной оценки действия препарата была проведена биопсия кожи с последующим иммуногистохимическим исследованием с маркерами CD3 и Ki67. Установлено, что количество клеток, экспрессирующих маркер CD3 в контрольной и лечебной группах - 101 и 25/0,38 мм, a Ki67 - 316 и 73/0,38 мм. Количества определяемых клеток >2 раз ниже в группе изучаемого препарата, что соответствует критерию эффективности противопсориатического действия.
В приведенном примере использование данной методики подсчета позволило подтвердить и количество оценить противопсориатическое действие препарата.
Пример 2.
Для оценки действия нового топического препарата на основе ингибирования нейтрофильных эластаз применена лабораторная модель острого имиквимод-индуцированного воспаления.
2
2
Результаты: При проведении клинического исследования установлено, что в группе мышей, где применяли изучаемый препарат, обнаружено не выраженное снижение интенсивности эритемы, шелушения и утолщения кожи по сравнению с группой без терапии, что не позволяет однозначно трактовать клиническую эффективность препарата. Для более точной оценки действия препарата была проведена биопсия кожи с последующим иммуногистохимическим исследованием с маркерами CD3 и Ki67. Установлено, что количество клеток, экспрессирующих маркер CD3 в контрольной и лечебной группах - 110 ио 54/0,38 мм, a Ki67 - 332 и 109/0,38 мм. Количества определяемых клеток >2 раз ниже в группе изучаемого препарата, что соответствует критерию эффективности противопсориатического действия.
Таким образом, при клинически сходных результатах, результат иммуногистохимической оценки маркеров CD3 и Ki67 позволяет определить эффективность изучаемого препарата.
Из анализа научно-технической и патентной литературы не обнаружено сведений о способе оценки противопсориатической активности препарата путем определения одновременного снижения количества CD3+ и Ki-67+-клеток, что позволяет сделать выводы о соответствии заявляемого технического решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».