СПОСОБ УВЕЛИЧЕНИЯ СРОКА ГОДНОСТИ БИОУДОБРЕНИЯ НА ОСНОВЕ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ
METHOD FOR EXTENDING SHELF LIFE OF BIOFERTILIZER BASED ON NODULE BACTERIA

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве для повышения урожайности бобовых культур.
Способ увеличения срока годности биоудобрения на основе клубеньковых бактерий основан на использовании технологии лиофилизации бактериальных культур и их последующей регенерации и размножении на специализированных питательных средах непосредственно перед обработкой ими посевного материала.
Применение препаратов на основе ризобий, в симбиозе с которыми бобовые растения обретают способность усваивать и использовать для своего питания атмосферный азот - обязательный элемент в технологии возделывания бобовых культур, позволяющий отказаться от использования минеральных азотных удобрений и способствующий существенному увеличению содержания белка в семенах и зеленой массе.
Представленные на рынке препараты клубеньковых бактерий, предназначенные для предпосевной обработки семян бобовых культур или же инокуляции, имеют различные препаративные формы, то есть отличаются по субстрату, который используется в качестве «носителя», в котором ризобии не теряют жизнеспособность в течение достаточно продолжительного срока. В основном представлены 2 основных вида носителя - сухие и жидкие. Наиболее широко используемым субстратом является стерильный торф (обеззараженный посредством гамма-облучения). Гарантированный срок сохранности жизнеспособности бактерий при использовании данного носителя - от шести месяцев до 2-х лет. Но применение торфа не всегда технологично: практически невозможно использовать для инокуляции протравительные машины; частицы торфа часто засоряют высевающие аппараты у современных сеялок. Однако попытки создания надежных жидких препаративных форм до недавнего времени успеха не имели, поскольку аэробные ризобии быстро теряют жизнеспособность в жидкой среде. Жидкие инокулянты, производимые в районных или зональных биофабриках, имеют срок годности лишь несколько суток.
Сегодня препараты на основе клубеньковых бактерий, представленные на российском рынке, имеют следующие формы.
Ризоторфин (защищен Патентами РФ: №2025471. 1994, №2025472. 1994; №2025484. 1994; №2066875. 1996) - отечественный торфяной инокулянт. До недавнего времени этот препарат был единственным широко используемым инокулянтом в РФ. Срок годности препарата 6 месяцев.
Нитрофикс С - украинский торфяной инокулянт срок годности препарата 12 месяцев.
Нитрофикс Ж -жидкий инокулянт украинского производства. Срок годности препарата 1 месяц.
Ноктин А - аргентинский жидкий инокулянт. Срок годности препарата до 2 лет.
Оптимайз - препарат производства США. Жидкий двухкомпонентный инокулянт, в состав которого входит липохитоолигосахарид, который является естественным стимулятором образования клубеньков и выделяется бактериями рода ризобиум. Срок годности препарата 2 года. Имеет высокую стоимость (Щегольков и Махонин, 2011).
Таким образом, все вышеперечисленные препараты представляют собой заранее размноженные бактерии на различных носителях, что негативно сказывается на продолжительности их срока годности. Предлагаемый нами способ увеличения срока годности препаратов на основе клубеньковых бактерий предполагает хранение культуры микроорганизмов в составе наборов биоудобоений в лиофилизированной форме с возможностью последующей ее регенерации и размножения в специализированной стерильной питательной среде непосредственно перед их применением, что дает возможность значительно повысить срок годности предлагаемого препарата. Лиофилизированные препараты бактерий могут сохраняться длительное время; они малочувствительны к колебаниям температуры в процессе хранения, легко регенерируются после введения питательной среды.
Лиофилизация состоит из предварительного замораживания и сублимационного высушивания. Консервирование препарата осуществляется при замораживании с отвердением жидкой фазы (среды); практически приостанавливаются все биохимические, химические и физические процессы. Для микробиологических препаратов среду подбирают таким образом, чтобы предотвратить возможное разрушение отдельных клеток при отвердевании раствора и образовании льда. Подобные среды обычно состоят из комбинации кристаллоида и коллоида. При использовании данного метода многие физиологически разнородные виды бактерий удается сохранять в жизнеспособном состоянии 30 лет и более (Бекер, 1987; Герна, 1983; Сидякина, 1985; Malik, 1987; Morgan, 2006
На чертеже 1 показан один из возможных вариантов составов набора на основе лиофилизированной культуры клубеньковых бактерий. Он может состоять из самого препарата лиофилизированных бактерий во флаконе (1), 125 мл стерильной регенерационной среды в банке на 0,5 л с резиновой самогерметизирующейся пробкой (2), одноразового шприца (3) и стерильной воды в ампуле (4). Безусловным преимуществом предлагаемой формы бактериального препарата является срок хранения и удобство транспортировки.
Для регенерации лиофилизированной бактериальной культуры требуется развести препарат микроорганизмов стерильной водой и перенести получившуюся суспензию в емкость, на четверть заполненную специализированной стерильной регенерационной питательной средой. Эту процедуру удобно проводить с помощью одноразового шприца, если в качестве емкости для питательной среды используется посуда с самозакупоривающейся резиновой пробкой. Дать бактериям подрасти в течение 2-8 дней (в зависимости от штамма бактерий) при температуре 22-28°C, после чего их можно использовать для инокуляции семян. Срок годности жидкой культуры при этом составляет один месяц. Инкубацию необходимо проводить в помещении без доступа прямых солнечных лучей с интенсивным перемешиванием в течение нескольких секунд 1-2 раза в сутки. При этом 125 мл вновь наращенной культуры будет достаточно для обработки 20-25 кг посевного материала.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Аграрное предприятие готовится к посеву козлятника восточного. Для данной культуры в средней полосе России обязательным является привнесение в почву различными доступными способами культур симбиотических клубеньковых бактерий Rhizobium galegae, специфично взаимодействующих только с данным видом растений. В средней полосе в почве подобные бактерии отсутствуют.
Для этого берут заблаговременно приобретенные препараты на основе специфических к данной культуре штаммов клубеньковых бактерий. Одноразовым шприцем забирают из ампулы стерильную воду и этой водой разводят лиофилизированную культуру клубеньковых бактерий Rhizobium galegae, после чего этим же шприцем через резиновую пробку вводят суспензию бактерий в емкость, на 0,5 л на четверть заполненную стерильной специализированной питательной средой. Тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 3-е суток с интенсивным перемешиванием раз в сутки. После прохождения данного времени среда значительно мутнеет, что свидетельствует о размножении бактерий, и соответственно она становится готовой к применению. Полученной культуры достаточно для предпосевной обработки 20-25 кг семян козлятника, что примерно соответствует количеству семян, необходимых для засева одного гектара пашни. Непосредственно перед использованием культура, для удобства, разбавляется обычной водой.
Пример 2.
Берут лиофилизированные препараты клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum в запаянных ампулах, полученных А - один год назад, Б - три года назад, В - пять лет назад. Вышеуказанным способом каждый препарат переносят в отдельные емкости со стерильной питательной средой и инкубируют трое суток при комнатной температуре. Через каждые сутки производят замер плотности клеток в каждой из емкостей. Результаты замеров приведены в таблице.
650
Во всех вариантах независимо от возраста исходного лиофилизированного препарата клубеньковых бактерий нарастает достаточное количество бактериальных клеток (OD>0,60) для их дальнейшего применения в качестве биоудобрений. Таким образом, срок годности препаратов на основе лиофилизированных культур клубеньковых бактерий составляет как минимум 5 лет.
Использованная литература
1. Бекер М.Е., Рапопорт А.И., Калакуцкий Л.В. и др. Торможение жизнедеятельности клеток / - Рига: Зинатне, 1987. - 240 с.
2. Герна Р. Хранение микроорганизмов // Методы общей бактериологии: пер. с англ. / Р. Герна; под ред. Ф. Герхардта и др. - М.: Мир, 1983. - С. 512-534.
3. Сидякина Т.М. Консервация микроорганизмов / - Пущино: ОН-ТО НЦБИ, 1985. - 63 с.
4. Щегольков А.В., Махонин В.Л. Оценка инокулянтов при возделывании сои в рисовых севооборотах Краснодарского края. Материалы VI международной конференции молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 2011 г, С. 370-373.
5. Malik K.A., Claus D. Bacterial culture collection: Their importance to biotechnology and microbiology // Biotech, and Genetic Engenering Rev. - 1987. - V. 5. - P. 137-197.
6. Morgan C.A., Herman N., White P.A., Vesey G. Preservation of microorganisms by drying: A review // Journal of Microbiological Methods. - 2006. - V. 66. - №2. - P. 183-193.