СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЗАРАЖЕНИЯ ОБРАЗЦА КРОВИ И ТКАНИ
METHOD AND DEVICE FOR DETECTION OF BACTERIAL CONTAMINATION OF BLOOD AND TISSUE SAMPLE

Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к скринингу крови или продуктов крови (включая цельную кровь, кроветворные (гемопоэтические) стволовые клетки, лейкоциты, плазму, сыворотку, эритроциты и тромбоциты), или донорской ткани на наличие клинически значимого (релевантного) количества инфицирующих бактерий в крови и продуктах крови или в донорских тканях, предназначенных для переливания или трансплантации.
Уровень техники
Переливание крови и продуктов крови является терапевтически важным аспектом помощи больным. Трансплантация донорских тканей также терапевтически важна. Отсутствие клинически значимых количеств (уровней) инфицирующих бактерий в донорской крови, донорском продукте крови или донорской ткани или органе является необходимым требованием для безопасного терапевтического применения этих донорских жидкостей и тканей для трансфузии или трансплантации. Например, бактериемия (инвазия бактерий в крови) может быть транзиторной, постоянной или прерывистой (перемежающейся). Wagner et al. (Chim. Microbiol. Rev. 7: 290-302 (1994)) и Goldman etai (Trans. Med. Revs. 5: 73-83 (1991)) пишут, что очень много различных видов бактерий было идентифицировано в инфицированной крови, перелитой больным, у которых после переливания развился сепсис (септицемия). Tadler et al. (J. Clin. Laboratory Analysis 2: 21-25 (1989)) пишет, что хотя транзиторная бактериемия обычно имеет незначительные последствия, постоянная или перемежающаяся бактериемия может представлять угрозу для жизни нескольких групп пациентов, в особенности пациентов с ослабленным иммунитетом, новорожденных и людей пожилого и старческого возраста. Следовательно, если кровь, инфицированную клинически значимым количеством бактерий, перелить больному-реципиенту, реципиент может получить осложнения, в особенности потому, что переливание крови и/или продуктов крови часто делают тогда, когда осуществляют обширное оперативное вмешательство, или же когда больной является уязвимым по какой-либо другой причине.
Аналогично, донорские ткани и органы предпочтительно не должны содержать микробов, чтобы замедлить и, предпочтительно, предотвратить отторжение реципиентом.
Несмотря на необходимость в безопасном "безмикробном" введении крови или продуктов крови, не существует быстрого эффективного обнаружения инфицирующих бактерий в крови или продуктах крови. Хотя существуют методы определения, инфицирована кровь бактериями или нет, большинство современных бактериальных анализов проводят на больных, предпочтительно, с инфицированной кровью, причем главной целью является точное определение микроорганизма, вызывающего инфекцию, с тем, чтобы можно было бы начать лечение соответствующим антибиотиком. В этих методах идентификации инфицирующих бактерий образец крови больного выращивают в культуральных средах, способствующих росту бактерий, в течение довольно продолжительного времени. В конце концов микроорганизмы амплифицируют до тех пор, пока не получат приемлемое их количество, которое можно обнаруживать.
Хотя эти методы анализа крови с помощью ее культур применимы для определения конкретного вида бактерий, инфицирующих кровь больного, длительное время, требуемое для осуществления этих методов делает непрактичным их использование для анализа донорской крови и продуктов крови или донорских органов. Это объясняется тем, что донорская кровь, продукты крови и органы часто требуются срочно для переливаний и трансплантаций. Следовательно, может не остаться времени для анализа донорской крови (или продукта крови) или органа с помощью культурального метода перед тем, как потребуется применить донорскую кровь или орган.
Кроме того, донорские органы, или кровь, или продукты крови имеют сравнительно короткий период хранения не только из-за утраты функции донорского материала, но также из-за увеличения количества любых присутствующих инфицирующих бактерий. Так как бактерии быстро размножаются, даже малое количество инфицирующих бактерий, присутствующих в донорской крови или в продуктах крови, быстро размножится со временем. Например, хотя донорские тромбоциты функционально жизнеспособны только 7 дней после взятия у донора, они редко используются более 5 дней после взятия из-за боязни инфицирования бактериями, которых в момент взятия у донора могло быть незначительное количество, но со временем могло увеличиться до клинически значимого количества. Кроме того, эти "культуральные" методы анализа крови слишком длительны для рутинного скрининга (анализа) тромбоцитов, которые имеют короткий период хранения (около 5 дней после взятия у донора), для переливания.
Brecher et al. (Transfusion 34(9): 750-755 (1994)) предлагает другой метод обнаружения конкретных инфицирующих бактерий в крови с применением меченых нуклеотидных зондов для гибридизации с генетическим материалом возможных примесей. Однако, зонды, используемые в этих исследованиях, ограничены числом микроорганизмов, которые можно обнаруживать, и, к сожалению, такая технология не может быть применена для серийных анализов. Из-за своей сложности этот метод слишком трудоемкий и требует слишком много времени, чтобы его использовать для обычного (рутинного) анализа крови или продуктов крови на бактериальное инфицирование.
Следовательно, необходим метод быстрого обнаружения присутствия клинически релевантного количества любых инфицирующих бактерий в донорской крови, или в продуктах крови, или в донорской ткани. В идеале можно было бы быстро и эффективно использовать метод связывания антигена. К сожалению, Wagner, S.J. (tot. J. Med. Microbiol. Virol Parasitol. Infect. Dis. 283(3): 253-257 (1996)) пишет, что не существует общего антигенного источника для универсального бактериального анализа. Следовательно, требуются методы, основанные на реакции связывания с антигеном, для обнаружения клинически значимых количеств инфицирующих бактерий в донорской крови, или в продуктах крови, или в донорских тканях.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение включает быстрые методы на основе реакции связывания антигена для обнаружения клинически релевантных количеств инфицирующих бактерий в донорской крови, или в продуктах крови, или в донорских тканях, особенно в донорской крови, или в продуктах крови, или в донорской ткани, предназначенных для переноса от одного человека другому.
Соответственно, в первом аспекте изобретение включает способ определения присутствия клинически релевантного количества бактерий в донорской крови, или в продукте донорской крови донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему, заключающийся в контактировании образца крови или продукта крови с набором связывающих агентов, причем набор связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и в обнаружении связывания набора связывающих агентов с образцом, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови, или в продукте донорской крови, а отсутствие связывания указывает на отсутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или в продукте донорской крови.
В некоторых вариантах первого аспекта изобретения образец обрабатывают перед или вместе с контактированием образца с набором связывающих агентов. Предпочтительно, при обработке экспонируют сайт связывания связывающего агента с грамотрицательным бактериальным антигеном или с грамположительным бактериальным антигеном. Предпочтительно, когда млекопитающее-донор и млекопитающее-реципиент относятся к одним и тем же видам. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид - связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, чтобы связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связывались с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с антигеном грамположительных бактерий, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ванкомицином или гентамицином. Предпочтительно, связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В различных вариантах первого аспекта изобретения связывающий агент, который специфически связывается с грамотрицательным бактериальным агентом, детектируемо метится первой молекулой-репортером, а связывающий агент, который специфически связывается с грамположительным бактериальным агентом, детектируемо метится второй молекулой-репортером. В некоторых вариантах изобретения первая и вторая молекулы-репортеры являются одной и той же молекулой. В другом варианте первая молекула-репортер и вторая молекул-репортер не являются одинаковыми. Предпочтительно, одна или обе молекулы-репортеры, первая и вторая, представляют собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
Во втором аспекте изобретение включает способ скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови или продукте крови донора-млекопитающего, вводимой реципиенту-млекопитающему, заключающийся в контактировании образца донорской крови или продукта крови с набором связывающих агентов, при этом набор связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и в обнаружении связывания набора связывающих агентов с образцом, причем связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови, или в продукте крови, а отсутствие связывания указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови или продукте крови.
В некоторых вариантах второго аспекта изобретения образец обрабатывают перед или одновременно с контактированием образца с набором связывающих агентов. Предпочтительно, обработка заключается в экспонировании сайта связывания в грамположительном бактериальном антигене со связывающим агентом. В некоторых вариантах изобретения кровь или продукт крови, в которой не обнаружено клинически релевантного количества грамположительных бактерий, вводят реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, млекопитающее-донор и млекопитающее-реципиент относятся к одним и тем же видам. В некоторых предпочтительных вариантах связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В различных вариантах второго аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным агентом, детектируемо метят молекулой-репортером. Предпочтительно, молекула-репортер представляет собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
По третьему аспекту изобретение включает способ скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской крови или продукте крови млекопитающего-донора для переливания млекопитающему-реципиенту, заключающийся в контактировании образца донорской крови или продукта крови с набором связывающих агентов, при этом набор связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и в обнаружении связывания набора связывающих агентов с образцом, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской крови, или в продукте крови, а отсутствие связывания указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской крови или продукте крови.
В некоторых вариантах третьего аспекта изобретения образец обрабатывают перед или одновременно с контактированием образца с набором связывающих агентов. Предпочтительно, при обработке экспонируют сайт связывания на грамотрицательном бактериальном антигене со связывающим агентом. В некоторых вариантах изобретения кровь или продукт крови, в которых отсутствует клинически релевантное количество грамотрицательных бактерий, переливают реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, млекопитающее-донор и млекопитающее-реципиент относятся к одному и тому же виду. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные (дериваты) антитела, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых предпочтительных вариантах связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид - связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий.
В различных вариантах третьего аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным агентом, детектируемо метят с помощью молекулы-репортера. Предпочтительно, когда молекула-репортер представляет собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
В соответствии с четвертым аспектом изобретение включает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или в продукте донорской крови от донора-млекопитающего для переливания реципиенту-млекопитающему, содержащий комплект связывающих агентов, и этот комплект связывающих агентов включает агенты, которые специфически связываются с грам-отрицательным бактериальным антигеном, и связывающие агенты, которые специфически связываются с грам-положительным бактериальным антигеном, и средства обнаружения связывания набора связывающих агентов с образцом донорской крови или продукта крови, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или продукте крови, а отсутствие связывания указывает на отсутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или продукте крови.
В некоторых вариантах четвертого аспекта изобретения набор дополнительно содержит средства для обработки образца, при этом обработка делает доступным сайт связывания на грамотрицательном бактериальном антигене или на грамположительном бактериальном антигене для связывающего агента. В некоторых вариантах четвертого аспекта изобретения донорская кровь или продукт крови, в которых в результате определения не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, вводится реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, когда донор-млекопитающее и второе млекопитающее относятся к одним и тем же видам. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные (дериваты) антитела, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых предпочтительных вариантах связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные (дериваты) антител, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В различных вариантах четвертого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо метят первой молекулой-репортером, а связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, детектируемо метят второй молекулой-репортером. В некоторых вариантах изобретения первая молекула-репортер и вторая молекула-репортер являются одной и той же молекулой. В другом варианте изобретения первая молекула-репортер и вторая молекула-репортер различны. Предпочтительно, когда обе, первая и вторая молекула-репортер, представляет собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
Согласно пятому аспекту изобретение включает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови или продукте донорской крови от донора-млекопитающего для передачи реципиенту-млекопитающему, содержащий комплект связывающих агентов, при этом комплект связывающих агентов, который специфически связывается с грамположительным бактериальным антигеном, и средства обнаружения связывания комплекта связывающих агентов с образцом крови или продукта крови, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови, а несвязывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови или продукте крови.
В некоторых вариантах пятого аспекта изобретения набор дополнительно содержит средства для обработки образца, причем обработкой экспонируют сайт связывания на грамположительном бактериальном антигене со связывающим агентом. В некоторых вариантах донорскую кровь или продукт крови, в которых не найдено клинически релевантного количества грамположительных бактерий, вводят реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, донор-млекопитающее и реципиент-млекопитающее относятся к одним и тем же видам. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В различных вариантах пятого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным агентом, детектируемо метят молекулой-репортером. Предпочтительно, чтобы молекула-репортер представляла собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
В шестом аспекте изобретение включает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской крови или в продукте донорской крови от донора-млекопитающего для переливания реципиенту-млекопитающему, содержащий комплект связывающих агентов, при этом комплект связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и средства для обнаружения связывания комплекта связывающих агентов с образцом крови или продукта крови, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в крови или продукте крови, а отсутствие связывания указывает на отсутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или продукте крови.
В некоторых вариантах шестого аспекта изобретения набор дополнительно содержит средства для обработки образца, причем при обработке экспонируют сайт связывания на грамотрицательном бактериальном антигене. В некоторых вариантах изобретения донорская кровь или продукт крови, в которых не обнаружено клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий, вводится реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, когда донор-млекопитающее и реципиент-млекопитающее относятся к одному и тому же виду. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные (дериваты) антитела, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых предпочтительных вариантах связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий.
В ряде вариантов шестого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо метят молекулой-репортером. Предпочтительно, молекула-репортер, представляет собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
В различных вариантах первого, второго, третьего, четвертого, пятого и шестого аспекта изобретения кровь или продукт крови представляют собой, предпочтительно, цельную кровь, лейкоциты, кроветворные стволовые клетки, тромбоциты, эритроциты, плазму или сыворотку.
В седьмом аспекте изобретение включает способ скрининга на наличие клинически релевантного количества бактерий в ткани млекопитающего, причем ткань хранится в жидкости, заключающийся в контактировании образца жидкости с набором связывающих агентов, при этом набор связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, в обнаружении связывания связывающих агентов с образцом, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской ткани.
В некоторых вариантах седьмого аспекта изобретения образец обрабатывают перед или одновременно с контактированием образца с набором связывающих агентов. Предпочтительно, при обработке экспонируют сайт связывания на грамотрицательном бактериальном антигене со связывающим агентом. В некоторых вариантах седьмого аспекта изобретения донорская ткань, в которой при анализе не обнаружено клинически релевантное количества бактерий, трансплантируют реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, млекопитающее-донор и млекопитающее-реципиент относятся к одному и тому же виду. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные (дериваты) антитела, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых предпочтительных вариантах связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные (дериваты) антитела, которые специфически связываются с их грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В различных вариантах седьмого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо метят первой молекулой-репортером, а связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, детектируемо метят второй молекулой-репортером. В некоторых вариантах изобретения первая молекула-репортер и вторая молекула-репортер являются одинаковыми. В другом варианте изобретения первая молекула-репортер и вторая молекула-репортер различны. Предпочтительно, когда одна или обе, первая и вторая молекула-репортер, представляет собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
В восьмом аспекте изобретение включает способ скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови от донора-млекопитающего для передачи реципиенту-млекопитающему, причем донорская ткань хранится в жидкости, заключающийся в контактировании образца жидкости с комплектом связывающих агентов, при этом комплект связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и в обнаружении связывания комплекта связывающих агентов с образцом, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской ткани.
В некоторых вариантах восьмого аспекта изобретения образец обрабатывают перед или одновременно с контактированием образца с набором связывающих агентов. Предпочтительно, при обработке экспонируют сайт связывания на грамположительном бактериальном антигене со связывающим агентом. В некоторых вариантах донорские ткани, в которых не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, вводят реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, млекопитающее-донор и млекопитающее-реципиент относятся к одному и тому же виду. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с их грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В различных вариантах восьмого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, детектируемо метят молекулой-репортером. Предпочтительно, молекула-репортер представляет собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
В девятом аспекте изобретение включает способ скрининга на наличие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани от донора-млекопитающего для передачи реципиенту-млекопитающему, причем донорская ткань хранится в жидкости, заключающийся в контактировании образца жидкости с набором связывающих агентов, при этом набор связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и в обнаружении связывания комплекта связывающих агентов с образцом, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани.
В некоторых вариантах девятого аспекта изобретения образец обрабатывают перед или одновременно с контактированием образца с набором связывающих агентов. Предпочтительно, при обработке экспонируют сайт связывания на грамотрицательном бактериальном антигене со связывающим агентом. В некоторых вариантах донорская ткань, в которой не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, переносится реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, когда млекопитающее-донор и млекопитающее-реципиент относятся к одному и тому же виду. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий.
В различных вариантах девятого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо метят молекулой-репортером. Предпочтительно, молекула-репортер, представляет собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
В десятом аспекте изобретение включает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской ткани от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему, причем ткань хранится в жидкости, содержащий набор связывающих агентов, при этом набор связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и средства для обнаружения связывания набора связывающих агентов с образцом жидкости, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской ткани, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской ткани.
В некоторых вариантах десятого аспекта изобретения набор дополнительно включает средство обработки образца, причем при обработке экспонируют сайт связывания со связывающим агентом на грамотрицательном бактериальном антигене и на грамположительном бактериальном антигене. В некоторых вариантах донорская ткань, в которой не обнаружено клинически релевантного количества бактерий. трансплантируют реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, когда млекопитающее-донор и млекопитающее-реципиент относятся к одному и тому же виду. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериями или их антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В различных вариантах десятого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо метят первой молекулой-репортером, а связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, детектируемо метят второй молекулой-репортером. В некоторых вариантах изобретения первая молекула-репортер и вторая молекула-репортер являются одинаковыми. В другом варианте изобретения первая молекула-репортер и вторая молекула-репортер различны. Предпочтительно, когда одна или обе, первая и вторая молекула-репортер, представляет собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
В одиннадцатом аспекте изобретение включает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской ткани от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему, причем донорская ткань хранится в жидкости, содержащий набор связывающих агентов, при этом набор связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и средства для обнаружения связывания комплекта связывающих агентов с образцом жидкости, и связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской ткани, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской ткани.
В некоторых вариантах одиннадцатого аспекта изобретения набор дополнительно содержит средства обработки образца, причем при обработке экспонируют сайт связывания на грамположительном бактериальном антигене со связывающим агентом.
В некоторых вариантах донорская ткань, в которой отсутствует клинически релевантное количество грамположительных бактерий, переносится (трансплантируется) реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, донор-млекопитающее и реципиент-млекопитающее относятся к одним и тем же видам. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В различных вариантах одиннадцатого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным агентом, детектируемо метят молекулой-репортером. Предпочтительно, чтобы молекула-репортер представляла собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
В двенадцатом аспекте изобретение включает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему, причем донорская ткань хранится в жидкости, содержащий набор связывающих агентов, при этом набор связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и средства для обнаружения связывания комплекта связывающих агентов с образцом жидкости, и связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани.
В некоторых вариантах двенадцатого аспекта изобретения набор дополнительно содержит средства обработки образца, причем при обработке экспонируют сайт связывания на грамотрицательном бактериальном антигене со связывающим агентом. В некоторых вариантах донорская ткань, в которой отсутствует клинически релевантное количество грамотрицательных бактерий, переносится реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, донор-млекопитающее и реципиент-млекопитающее относятся к одним и тем же видам. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий.
В различных вариантах двенадцатого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо метят молекулой-репортером. Предпочтительно, молекула-репортер, представляет собой молекулу с ферментативной активностью, молекулу с радиоактивной меткой, слитую молекулу, флуорогенную молекулу, коллоидный раствор (золь) металла, частицу, хроматическую молекулу или молекулу, которая специфически связана вторым связывающим агентом.
В различных вариантах седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого и двенадцатого аспектов изобретения донорские ткани предпочтительно представляют собой легкие, сердце, кожу, почку, поджелудочную железу, селезенку или костный мозг.
В некоторых предпочтительных вариантах всех вышеуказанных аспектов изобретения комплект (серия) связующих агентов иммобилизован на твердофазной подложке (например, титровальном микропланшете). В предпочтительных вариантах первого, второго, третьего, четвертого, пятого, шестого, седьмого, восьмого, девятого, десятого, одиннадцатого и двенадцатого аспектов изобретения донор- или реципиент-млекопитающее обозначает человека или домашнее животное-млекопитающее.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1 представляет собой схематическое изображение типичной мембраны грамположительной клеточной оболочки.
Фигура 2 представляет собой схематическое изображение структуры липополисахарида (LPS), обнаруженного в клеточной (стенке) оболочке грамотрицательных бактерий.
На Фигурах 3A-3D схематически изображено устройство по одному из вариантов изобретения. На Фигуре 3А изображено устройство (в отсутствие) без добавления образца крови или продукта крови или (в отсутствие) без добавления жидкости, в которой хранится донорская ткань. На Фигуре 3В показан прибор в момент добавления образца крови или продукта крови. На Фигуре 3С показан контакт образца жидкости из организма с устройством. На Фигуре 3D показан положительный результат, полученный с помощью прибора (устройства) по изобретению, указывающий на то, что испытуемый образец крови или продукта крови инфицирован микроорганизмом.
На Фигурах 4A-4D схематически изображен способ по изобретению. На Фигуре 4А показано прибавление образца крови, продукта крови или жидкости, в которой хранится донорская ткань, в прибор для испытания (анализа). На Фигуре 4В показано добавление гранул латекса, покрытых антибиотиками, которые специфически связываются как с грамотрицательными, так и с грамположительными бактериями, в прибор для испытания. На Фигуре 4С показано перемешивание образца с покрытыми антителами гранулами латекса в приборе для испытания (анализа). На Фигуре 4D показаны визуальные результаты отрицательного связывания (т.е. в образце нет бактерий; слева) и связывания (т.е. присутствие бактерий в образце; справа).
На Фигуре 5 графически изображено число различных (указанных) грамположительных бактерий, специфически связанных не-ограничивающим связывающим агентом по изобретению, антителом антилипотейхоевой кислоты.
На Фигуре 6 графически изображено число различных (указанных) грамотрицательных бактерий, специфически связываемых не-ограничивающим связывающим агентом по изобретению, антителом против липотейхоевой кислоты.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к обнаружению клинически релевантного количества инфицирующих бактерий в крови и продукте крови или донорской ткани, в частности, донорской крови или продукте крови или донорской ткани, которая передается от индивида-донора к индивиду-реципиенту. Изобретение включает быстрые способы на основе связывания с антигеном и наборы для обнаружения клинически релевантных количеств микроорганизмов в крови или продукте крови или в жидкости, в которой хранится донорская ткань. Изобретение исходит из признания того, что полная идентичность инфицирующих бактерий в донорской крови или продукте крови или донорской ткани, используемых для вливания или трансплантации, является необязательной. Соответственно, изобретение включает способы, использующие агенты, которые специфически связываются как с грамположительными, так и с грамотрицательными бактериями, для обнаружения любого связывания с образцом крови или продукта крови или с образцом жидкости, в которой хранится донорская ткань. Следовательно, если обнаружено любое связывание, то ясно, что кровь или продукт крови или донорской ткани инфицированы и, предпочтительно, не должны использоваться для введения другому индивидууму.
Опубликованные патенты и научная литература, на которую делаются ссылки в данном описании, дают сведения, пригодные для специалистов в данной области техники. Выданные патенты, заявки и ссылки, процитированные в данном описании, тем самым вводятся в данное описание в качестве ссылок в той степени, как если бы каждая, кокретно и индивидуально указанная, вводилась ссылкой. Любое несоотвествие между этими публикациями и данным описанием должно решаться в пользу данного описания.
В первом аспекте изобретение включает способ скрининга на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или в продукте донорской крови от донора-млекопитающего для передачи реципиенту-млекопитающему. Способ заключается в контактировании образца крови или продукта крови с серией связывающих агентов, причем серия связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и в обнаружении связывания серии связывающих агентов с образцом, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или в продукте крови, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или в продукте крови. В предпочтительных вариантах изобретения донор- или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным (например, кошкой, собакой, лошадью, свиньей).
Применяемое в данном описании выражение "кровь или продукт крови" включает любую клетку, обнаруженную в крови или костном мозге, а также любой продукт, образованный из крови или костного мозга, включая, без ограничения, цельную кровь, эритроциты, тромбоциты, сыворотку, плазму, гемопоэтические (кроветворные) стволовые клетки и лейкоциты (включая лимфоциты). Рядовой биолог поймет, что без добавления антикоагулянтов, таких как EDTA или гепарин, цельная кровь будет свертываться, что сделает большую часть клеток крови непригодными для переливания. Соответственно, выражение (термин) "кровь или продукт крови" подразумевает кровь, обработанную антикоагулянтом. Кроме того, в процессе выделения конкретных продуктов крови (например, тромбоцитов с помощью тромбафореза) в кровь могут добавляться не-компоненты крови, такие как физиологический раствор. Следовательно термин "кровь или продукт крови" также охватывает кровь, к которой добавлено любое биологически инертное вещество, такое как физиологический солевой раствор, вода или питательный раствор для хранения.
7
6
5
4
3
Употребляемый в данном описании термин "клинически релевантное (значимое) количество" применяется для обозначения количества бактериальной инфекции в крови или в продукте крови, которое равно или выше количества, которое, при наличии его в крови или в продукте крови, переливаемых типичному гемотрансфузионному реципиенту, вызывает, без ограничения, любой из следующих симптомов у гемотрансфузионного реципиента: лихорадку, озноб, гипотензию, тошноту/рвоту, головную боль, одышку, олигурию, диарею, боль в месте вливания, крапивницу, потоотделение, боль в грудной клетке, петехию и кровоподтек, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, септический шок, нарушение деятельности органов и смерть (См., например, Morduchowicz, G. et al., Reviews of Infectious Diseases 13: 307 (1991)). Из-за большой скорости деления бактерий количество бактерий в крови следует определять как можно ближе по времени к моменту переливания. Обычно во время трансфузии клинически релевантное количество больше 1×10 колониеобразующих единиц (CFU) на мл крови или продукта крови. Предпочтительно, когда в момент переливания клинически релевантное количество превышает 1×10 CFU/мл. Более предпочтительно, когда в момент переливания клинически релевантное количество выше 1×10 CFU/мл. Еще более предпочтительно, когда в момент переливания клинически релевантное количество больше 1×10 CFU/мл. Еще более предпочтительно, когда в момент переливания клинически релевантное количество выше 1×10 CFU/мл. Наиболее предпочтительно, когда в момент переливания клинически релевантное количество составляет более 1×10 CFU/мл. Конечно, рядовой специалист в области медицинской техники для переливания знает, что некоторые люди, такие как больные с очень ослабленным иммунитетом или новорожденные, обладают иммунной системой, которая не способна (очищать) выводить количество бактерий ниже клинически релевантного. Однако рядовой практикующий специалист поймет, что способы по изобретению достаточны для испытания (анализа) крови или продуктов крови для применения при переливании у подавляющего большинства больных.
6
-1
7
-1
8
-1
9
-1
2
Применяемое в данном описании выражение "специфически связывается" означает, что связывающий агент (например, антитело) распознает конкретный лиганд (например, полипептид, углевод, липид или гликопротеин) и связывается с ним, но практически не распознает другие молекулы в образце, например, в биологическом образце, который естественно содержит много различных белков и не связывается с ними. Аналогично, о лиганде связываемо связывающим агентом, который специфически связывается с этим лигандом, говорят, что он "специфически связан" этим (с этим) связывающим агентом. Связь (ассоциация), образуемая между связывающим агентом и его лигандом, может быть ковалентной и, предпочтительно, нековалентной. Предпочтительно, когда связывающий агент, который специфически связывается с лигандом, образует связь с этим лигандем со сродством, по меньшей мере, 10 М, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 М, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 10 М, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 10 М либо в воде, в физиологических условиях, либо в условиях, которые приближаются по ионной силе к физиологическим условиям, например, 140 мМ Nad, 5 мМ MgCl.
Под используемым в данном описании термином "антиген" (например, грамотрицательный бактериальный антиген или грамположительный бактериальный антиген) понимают любую молекулу, за исключением молекул нуклеиновых кислот и пептидогликанов, в любой структурной конформации, которые могут специфически связываться связывающим агентом. Например, грамотрицательный бактериальный антиген представляет собой антиген, секретируется клеточной мембраной, клеточной стенкой или периплазматическим пространством грамотрицательных бактерий, находится внутри них или присутствует на них. Сайт на антигене, который связывается (со) связывающим агентом, называется "сайт связывания". Антиген может представлять собой, без ограничения, белок, гликопротеин, углевод или липид. Конкретно исключаются из определения антигена согласно данному изобретению пептидогликаны и молекулы нуклеиновых кислот, таких как ДНК и РНК.
Употребляемый в данном описании термин "грамположительные бактерии" означает штамм, тип, вид или род бактерий, которые, при экспонировании с краштелем по Граму, сохраняют цвет и, следовательно, окрашены в сине-фиолетовый цвет.
Употребляемый в данном описании термин "грамотрицательные бактерии" означает штамм, тип, вид или род бактерий, которые, при экспонировании с краштелем по Граму, не сохраняют цвет и, следовательно, не окрашены в сине-фиолетовый цвет. Рядовые практики, конечно, поймут, что в зависимости от концентрации красителя и продолжительности экспонирования, грамотрицательные бактерии могут "поймать" немного красителя Грама и окраситься в бледный сине-фиолетовый цвет. Однако, по сравнению с грамположительными бактериями, окрашиваемые тем же составом Грама в течение того же периода, грамотрицательные бактерии намного слабее окрашены в сине-фиолетовый цвет.
Стенка бактериальной клетки (клеточная стенка бактерии) представляет собой сложную полужесткую структуру, которая определяет форму (очертание) организма, окружает находящуюся под ней хрупкую цитоплазматическую мембрану и защищает бактериальную клетку от внешней окружающей среды. Стенка бактериальной клетки состоит из макромолекулярной сети, известной как пептидогликан, содержащий углеводы и полипептиды, которые образуют решетку вокруг бактериальной клетки. Стенка бактериальной клетки придает механическую устойчивость бактериальной клетке и предотвращает осмотический лизис. Наиболее значим для данного изобретния химический состав клеточной стенки, которая используется для дифференцировки основных видов бактерий.
Клеточные стенки различных видов бактерий могут значительно отличаться по толщине, структуре и составу. Однако существует два преобладающих типа бактериальной клеточной стенки, и то, имеет ли данный вид бактерий один или другой тип клеточной стенки, можно в общем определить по клеточной реакции на определенные красители. По-видимому, самым широко-распространенным красителем для окрашивания бактерий является краситель Грама. При окрашивании этим кристаллическим фиолетовым и иодом бактерии, которые сохраняют окрашивание, называются грамположительными, а те, которые не сохраняют, называются грамотрицательными.
x
Стенка грамположительной бактериальной клетки содержит сравнительно толстую оболочку из пептидоглицина. Эта структура организована в виде повторяющихся углеводных единиц N-ацетилглюкозаминовой (NAG) и N-ацетилмурамовой (NAM) кислоты, связанных р-1,4-гликозидными связями. Остатки N-ацетилмурамовой перекрестие связаны с прилегающими (NАМ-NАG)-цепями (где x обозначает любое число) с помощью тетрапептидов, где пептиды 2 и 3 могут проявлять некую вариабельность в природе пептида. Некоторые из перекрестных связей над и под плоскостью образуют полислои (множество слоев) пептидогликана. Эти полимеры окружают поверхность клетки, тем самым определяя форму организма.
В стенке грамположительной клетки локализовано липополимерное соединение, содержащей липотейхоевые кислоты (LTA), которые могут у некоторых видов составлять значительную массу клеточных стенок. Эти полимеры состоят главным образом из глицерин-(или рибит)-фосфата. На Фигуре 1 дано схематическое изображение типичной мембраны стенки грамположительной бактериальной клетки. Полагают, что из-за своей высокой полярности и положительного заряда решетки (сетки) структуры липотейхоевых кислот регулируют ток ионов и питательных веществ в бактериальную клетку и из нее. LTA-структуры являются высокоантигенными и могут создавать основу молекулярной специфичности, требующейся для универсального обнаружения этого класса бактерий. Из-за того, что липотейхоевые кислоты являются общими (обычными) для грамположительных бактерий, методики анализа по распознаванию этой структуры являются очень показательными для грамположительной бактериальной инфекции. Так как химическая структура полимеров липотейхоевой кислоты является довольно консервативной среди различных штаммов грамположительных бактерий, анализ на присутствие структуры этой клеточной стенки позволяет обнаруживать многие грамположительные бактерии.
Клеточная стенка бактерий грамотрицательного типа на вид представляет собой ряд четких слоев и значительно тоньше клеточной стенки грамположительных бактерий. Грамотрицательная бактериальная клеточная стенка сходна со стенкой грамположительной бактериальной клетки тем, что она построена на белке, содержащем липидный бислой; однако липиды, обращенные внутрь, представляют собой фосфолипиды, тогда как липиды, "смотрящие" наружу, включают макромолекулы, называемые липополисахаридами (LPS). Эта LPS-структура создает высокий отрицательный заряд на внешней поверхности клетки, который используется для распознавания и выживания организма. Эта LPS-структура также вызывает токсическое действие грамотрицательной инфекции и по этой причине называется также "эндотоксин".
Структура LPS-компонента описана во множестве исследований и показана на Фигуре 2. В общем, строение LPS-антигена можно описать как содержащую три отдельных области. Наиболее удаленная область, которая называется O-специфическая область и состоит из линейных или разветвленных цепей углеводов, является высоковариабельной и обычно отличается у отдельных видов. Серологические тесты используют это отличие для идентификации конкретных штаммов грамотрицательных бактерий. Наличие O-цепей создает при исследовании под микроскопом впечатление ровной (гладкой) поверхности. Напротив виды или мутанты без O-специфических боковых цепей по внешнему виду выглядят шероховатыми. Большинство штаммов дикого типа называются поэтому "гладкими" штаммами, тогда как мутанты, у которых отсутствует такая структура, называются "грубыми" штаммами.
Внутренняя относительно О-специфической области в LPS-структуре является центральной (сердцевинной, внутренней) полисахаридной областью, которая проявляет высокую степень гомологии между видами. Внутреннюю (центральную) область можно дополнительно разделить на две области: "внутреннее ядро" и "внешнее ядро". Внешнее ядро центральной области проявляет некоторую вариабельность, но имеет общие элементы и обычно содержит глюкозу, галактозу, N-ацетил-глюкозамин и другие углеводы. Внутреннее ядро центральной области всех LPS-экспрессирующих грамотрицательных бактерий содержит химически идентичные структуры. Внутреннее ядро состоит из остатков гептозы и 2-кето-3-дезоксиоктоната (KDO).
Самый внутренний компонент LPS-структуры представляет собой Lipid А - Липид А, который составляет химически наиболее однородную часть LPS. Липид А состоит из дисахарида β-глюкозаминил-(16)-α-глюкозамин, фосфорилированного по каждому из дистальных углеводных концов. Углеводный скелет ацилируется по каждому из 2,3-центров производными замещенной миристиновой кислоты. У боковых цепей жирных кислот наблюдается некоторая небольшая модификация в зависимости от вида, но эти жирные кислоты включаются в клеточную мембрану и не способны к иммунологическому распознаванию. Образование антитела, по-видимому, является результатом экспонирования с поверхностью структуры со скелетом дисахарида бисфосфорилглюкозамина, являющейся высококонсервативной.
Структурная вариабельность LPS уменьшается от экспонируемой с поверхностью О-специфической области к областям внутреннего и внешнего ядра и к производному дисахарида и к включенному в мембрану липидному А-компоненту. Причиной такого градиента вариабельности является, как полагают, эволюционное давление, проявляющееся по отношению к грамотрицательным бактериям. Понятно, что микробы со временем меняют свою экспонируемую с поверхностью структуру в ответ на это давление.
Так же как структура липотейхоевых кислот в грамположительных бактериях, консервативные липополисахаридные структуры внутри рода у грамотрицательных бактерий можно использовать для методологии универсального обнаружения. Эти уникальные мишени (липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий и липидная А или ядерные (центральные) области LPS-структуры грамотрицательных бактерий) являются основой методологии обнаружения класса микроорганизмов.
Употребляемый в данном описании термин "связывающий агент" представляет собой молекулу или макромолекулу, способную связываться с лигандом, за исключением того, что связывающий агент не является природным агентом, присутствующим в камчатском крабе (например, Limulus polyphemus), который связывается с эндоксином. Связывающий агент может представлять собой, без ограничения, антитело, антибиотик, белок, слитый белок (например, белок, содержащий остатки (участки) двух или более белков), или химический хелатообразователь (хелатирующее вещество). В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающий агент по изобретению является пептидом или пептидомиметиком. Для целей изобретения "пептид" представляет собой молекулу, состоящую из аминокислотных остатков, связанных друг с другом в линейный мотив пептидными связями. Такие пептиды по изобретению могут включать, примерно, от 3 до 50 аминокислот и могут дополнительно содержать вторичные, третичные или четвертичные структуры, а также межмолекулярные связи с другими пептидами или другими не-пептидными молекулами. Такие межмолекулярные связи могут осуществляться с помощью, без ограничения, ковалентного связывания (например, с помощью дисульфидных связей), или путем хелатирования, электрических взаимодействий, гидрофобных взаимодействий, водородных связей, ион-дипольных взаимодействий, диполь-дипольных взаимодействий или с помощью любой комбинации вышеуказанных взаимодействий.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения такой связывающий агент представляет собой гипервариабельный учаток (hv) (CDR) антитела, который связывается в физиологических условиях с антигенсодержащим эпитопом липополисахаридной (LPS) структуры грам-отрицательных бактерий или со структурой липотейхоевой кислоты (LTA) грамположительных бактерий, или пептидомиметик такого hv-участка. Для целей данного изобретения "гипервариабельный (hv) учаток антитела" представляет собой тот фрагмент антитела, который связывается в физиологических условиях с эпитопом, включая любые участки рамки считывания, необходимые для этого связывания, и который предпочтительно состоит из субпопуляции (подмножества) аминокислотных остатков, кодируемых областями V, D и J тяжелой цепи иммуноглобулина человека, областями V и J легкой цепи иммуноглобулина человека и/или их комбинациями. Примеры таких предпочтительных вариантов включают антитело или производное антитела, которое может, более предпочтительно, быть моноклональным антителом, человеческим антителом, "гуманизированным" антителом, одноцепочечным антителом, химерным антителом, или антигенсвязывающим фрагментом антитела.
Специалисты в данной области техники способны получить любые такие производные антитела, применяя стандартные известные в технике методы. Например, Jones, et al. (Nature 321: 522-525 (1986)) описывает замену CDR человеческого антитела на CDR антитела мыши. Marx (Science 229: 455-456 (1985)) обсуждает химерные антитела, содержащие мышиные вариабельные области и константные области человека. Rodwell (Nature 342: 99-100 (1989)) обсуждает сведения об элементах распознавания CDR антитела человека. Clackson (Br.J. Rheumatol. 3052: 36-39 (1991)) обсуждает полученные методом рекомбинантной ДНК моноклональные антитела, включая производные Fv фрагмента, одноцепочечные антитела, химерные антитела на основе слитых белков и "гумаризированные" антитела грызунов. Reichman et al. (Nature 332: 323-327 (1988)) описывает человеческое антитело с "трансплантированными" гипервариабельными участками мыши. Verhoeyen et al. (Science 239:1534-1536 (1988) описывает "пересадку" сайта связывания мышиного антигена на антитело человека.
Кроме того, специалисты в данной области техники способны смодулировать и получить пептидомиметики, имеющие характеристики связывания, сходные или более высокие, с таким гипервариабельным участком (см., например, Horwell et al., Bioorg.Med. Chem. 4: 1573 (1996); Liskamp et al., Reel. Trav. Chim. Pays-Bas 1: 113 (1994); Gante et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:1699 (1994); Seebach et al., Helv. Chim. Acta 79: 913 (1996)). Соответственно, все такие производные антител и их пептидомиметики входят в объем данного изобретения. Композиции по изобретению могут дополнительно включать физиологически приемлемые разбавители, стабилизаторы, локализирующие агенты или буферы.
Кроме того, предпочтительные связывающие агенты по изобретению включают малые молекулы, которые можно идентифицировать методами скрининга или рационального моделирования (дизайна), как обсуждается ниже в данном описании.
Наиболее предпочтительно, когда связывающие агенты по данному описанию являются антителами, такими как поликлональные антитела или моноклональные антитела и/или производные (дериваты) антител. Получение моноклональных и поликлональных антител хорошо известно рядовому специалисту в данной области техники (см., например Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY, 1994). Ряд методик применимы для получения антител для заданных уникальных целевых антигенов. Традиционные методы иммунизации и сбора приводят к образованию поликлональных антител против общих дереминант целевых видов бактерий (LTA или LPS). Кроме того, можно применять методы гибридизации клеток для получения иммортализованных клеточных линий гибридомы, которые генерируют специфические моноклональные антитела к целевым видам.
Антитела для потенциального широкого применения с целью обнаружения грам-положительных бактерий включают антитела, описанные в Fischer et al., опубликованная заявка РСТ N WO 98/57994; Jackson, D.E. et al., Infection and Immunity 43:800 (1984); Hamada, S. et al., Microbiol. Immunol. 28:1009 (1984); Aasjord p. et al., Acta Path. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. C, 93: 245 (1985); McDaniel, L.S. et al., Microbial Pathogenesis 3: 249 (1987); Tadler, M.B. et al., Journal of Clinical Laboratory Analysis 3: 21 (1989); и Stuertz, K. et al., Journal of Clinical Microbiology 36: 2346 (1998).
Антитела для потенциального широкого применения с целью обнаружения грам-отрицательных бактерий включают антитела, описанные в Nelles, M.J. et al., Infect. Immun. 46: 677 (1984); Teng, N.N.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1790 (1985); Dunn, D.L. et al., Sugery 98: 283 (1985); De Jongh-Leuvenink, J. et al., Eur. J. Clin. Microbiol. 5: 148 (1986); Bogard, W.C. et al., Infect. Immun. 55: 899 (1987); Pollack. M. et al., Bacterial Endotoxins: Pathophysiological Effects, Clinical Significance, and Pharmacological Control, pp.327-338 Alan R. Liss, Inc. (1988); Priest, B.P. et al., Sugery 106:147 (1989); Tyier, J.W. et al., Journal of Immunological Methods 129: 221 (1990); Siegel, S.A. et al., Infect. Immun. 61: 512 (1993); Shelbume, C.E. et al., J. Periodont. Res. 28: 1 (1993); Di Pardova, F.E. et al., Infect. Immun. 61: 3863 (1993); и De Kievit. T.R. and Lam, J.S.J. Bacteriol. 176: 7129 (1994).
Отбор антител(а), которые(-ое) следует применять, можно осуществлять обычными классическими методами. Специфичность антитела, степень связывания и кинетика могут характеризоваться путем эмпирического тестирования каждого антитела в опытном (эмпирическом) формате. Форматы скрининга с помощью титрационного микропланшета хорошо документированы в литературе для целей характеристики специфического гуморального иммунного ответа в любом заданном формате иммуноанализа. Аналогично, активности детектируемо меченых антител можно охарактеризовать рядом химических (синтетических) методов и скринингом полученного продукта на оптимальные параметры режима. Иммобилизованное антитело и детектируемо меченое антитело можно подвергать скринингу в сравнении с клиническими изолятами бактерий из оставшихся образцов тромбицитов и эритроцитов для того, чтобы конечный анализ как можно ближе соответствовал конечному продукту. Этот эксперимент помогает выбрать и оптимизировать антительные реагенты для применения в различных форматах анализа, описанных ниже. Если идентифицируются связывающие агенты, которые эмпирически действуют лучше, чем альтернативные антитела, описанные или полученные, тогда их оценивают в том же эмпирическом формате, описанном для антител.
Моноклональные антитела, обладающие специфичностью относительно кросс-генных (перекрестие генных) мишеней на поверхности бактериальных клеток, используют для разработки аналитического формата для обнаружения класса. Если единичные клоны антител не позволяют получить заданный предел чувствительности обнаружения (как в случае с заменами в LTA-структуре), для каждого вида можно использовать смеси моноклональных антител. Дальнейшее расширение для LPS может включать создание поликлональных антисывороток с широким спектром специфичности в отношении различных грамотрицательных видов. Поликлональные антитела могут быть также заменены в каждом из описанных ниже аналитических форматов.
Еще одним типом связывающего агента по изобретению являются связывающие рецепторы, отличные от иммуноглобулинов.
Некоторые предпочтительные способы используют образование комплексов грам-отрицательных бактерий и таких не-ограничивающих видов, как Limulus анти-липополисахаридный фактор (LALF), полимиксины, кислый противомикробный белок (CAP 18), сывороточный милоид Р (Myloid P), магаинины, бактенецины, рецептор-ловушка 4 (TLR-4), липополисахарид-связывающий белок (LBP) и бактерицид/повышающий проницаемость белок (BPI), а также антибиотики, такие как бацитрацин и другие антибиотики. Некоторые предпочтительные способы используют образование комплексов грам-положительных бактерий с такими нелимитирующими видами, как маннозу-связывающий белок (МВР), рецептор-ловушка 2 (TLR-2), гистатины и антибиотики, причем антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. В некоторых предпочтительных способах используют комплексообразование как грам-отрицательных, так и грам-положительных бактерий с такими нелимитирующими видами, как CD 14, α-спиральные катионные пептиды, лактоферрицин В, тромбоцитарные микробные белки и пептиды нейтрофилов (дефензины, Defensins). Каждый из этих связывающих агентов обладает способностью связываться со многими генами бактерий и может использоваться вместе с реагентами для получения иммунного комплекса или вместо (как альтернатива) них.
Вышеуказанные антитела или связывающие агенты можно использовать, как описано, или модифицировать как необходимо для получения нужного иммунологического реагента.
Согласно первому аспекту изобретения наличие ли отсутствие связывания можно обнаруживать обычными методами, включая применение анализов (испытания) на связывание по изобретению, как описано ниже. В целом определение "связывание" (т.е. наличие клинически релевантного количества бактерий в крови или в продукте крови) обосновано, когда связывание образца от донора, по меньшей мере, в 0,5Х больше, чем фоновое связывание, при этом фоновое связывание наблюдается в образце крови или продукта крови, свободном от какой-либо бактериальной инфекции. Так, если фон составляет 0,1 единиц (например, определенный с помощью ридера титрационных микропланшетов), состояние определяют как "связывание", когда образец донорской крови или продукта крови составляет, по меньшей мере, 0,15 единиц. Более предпочтительно определение "связывание", когда образец от донора связывается, по меньшей мере, в 0.75Х фона. Еще более предпочтительно определение "связывание", когда образец от донора связывается, по меньшей мере, в 1.0Х выше, чем фон. Еще более предпочтительно определение "связывание", когда образец от донора связывается, по меньшей мере, в 1,25Х выше, чем фон. Наиболее предпочтительно определение "связывание", когда образец от донора связывается, по меньшей мере, в 1,5Х выше, чем фон.
В некоторых вариантах первого аспекта изобретения образец обрабатывают перед или одновременно с контактированием образца с набором связывающих агентов. Предпочтительно, при обработке экспонируют сайт связывания со связывающим агентом на грамотрицательном бактериальном антигене или на грамположительном бактериальном антигене. Сайт связывания на бактериальном антигене можно экспонировать, например, отщепляя антиген от клеточной стегнки или клеточной мембраны бактерии, тем самым экспонируя сайт связывания; индуцируя бактерии секретировать антиген, тем самым экспонировать сайт связывания; лизируя бактерии, тем самым высвобождая внутриклеточный бактериальный антиген и, следовательно, экспонируя сайт связывания на антигене; или индуцируя конформационное изменение бактериального антигена, тем самым экспонируя сайт связывания. Такая обработка включает механическое разрушение бактериальных клеток в образце физическими методами, включая, без ограничения, ультразвук, кипячение или гомогенизацию с применением, например, гомогенизатора Даунса. Обработка может также включать обработку химическими методами с помощью соединения или композиции, такой как детергент, основной раствор (для щелочного лизиса), кислый раствор (для кислотного лизиса), EDTA, EGTA, ион металла, анион, катион, поверхностно-активное вещество, хелатирующее вещество и/или фермент; при обработке экспонируют сайт связывания со связывающим агентом на грамотрицательном бактериальном антигене или на грамположительном бактериальном антигене.
В одном варианте первого аспекта изобретения донорскую кровь или продукт крови, в которых при определении не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, переносят реципиенту-млекопитающему. Под "переносом" понимают введение, вливание, трансплантацию или опосредованный перенос крови, продукта крови и/или ткани от донора-млекопитающего реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, донор-млекопитающее, от которого берут образец крови или продукта крови, и реципиент-млекопитающее относятся к одному виду. Согласно способам по данному изобретению можно проводить быстрый скрининг донорской крови или продукта донорской крови на наличие каких-либо инфицирующих бактерий, вне зависимости от штамма или типа инфицирующих бактерий. Понятно, что вследствие высокой скорости размножения бактерий в крови или в продукте крови предпочтительно переливать предполагаемому реципиенту донорскую кровь или продукт крови, не содержащие клинически релевантного количества бактерий, как оно определяется согласно изобретению, вскоре после анализа. Предпочтительно, клинически релевантное количество не содержащей бактерий крови или продукта крови вводят путем переливания больному не более чем через 42 дня после проведения испытания; более предпочтительно, не более чем через 30 дней после испытания; более предпочтительно, не более чем через 2 недели после испытания; более предпочтительно, не более чем через 7 дней после испытания; еще более предпочтительно, не более, чем через 3 дня после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 2 дня после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 24 часа после испытания; еще более предпочтительно, не более, чем через 12 часов после испытания; еще более предпочтительно, не более, чем через 6 часов после испытания; и наиболее предпочтительно, когда донорская кровь или продукт крови, в которых не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, переливается реципиенту в течение 3 часов после проведения испытания. Наиболее предпочтительно, когда кровь или продукт крови представляют собой цельную кровь, кроветворные стволовые клетки, лейкоциты, тромбоциты, эритроциты, плазму или сыворотку.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
Рядовой биолог поймет, что по изобретению можно применять любую комбинацию из одного или более различных связывающих агентов. Так, антибиотик, который специфически связывается с субпопуляцией грамположительных бактерий, может объединяться с антителом, которое специфически связывается с остальными грамположительными бактериями, и вторым антителом, которое специфически связывается с грамотрицательными бактериями.
В нескольких вариантах первого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо метят первой репортерной группой (молекулой-репортером), а связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, детектируемо метят второй репортерной группой. В одном варианте первая репортерная группа и вторая репортерная группа являются одинаковыми. В другом варианте изобретения первая репортерная группа и вторая репортерная группа не являются одинаковыми. Предпочтительно, когда одна или обе, первая и вторая репортерная группа, являются молекулой с ферментативной активностью, молекулой с радиоактивной меткой, слитой молекулой, флуорогенной молекулой, золем металла (например, золем (коллоидной частицей) золота или серебра), частицей, хроматической молекулой или молекулой, которая специфически связывается вторым ("вторичным") связывающим агентом. Под "вторым ("вторичным") связывающим агентом" понимают связывающий агент, который специфически связывается со связывающим агентом, который специфически связывается с грамотрицательными бактериями, грамположительными бактериями или с теми и другими. Например, если связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательными бактериями и грамположительными бактериями, все являются мышиными моноклональными антителами, второй ("вторичный") связывающий агент может быть антимышиным антителом.
Например, образец можно анализировать методом FACS с помощью связывающих агентов, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, детектируемо меченым FITC, и с помощью связывающих агентов, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо меченым родамином. Скринингом на окрашивание с помощью FITC и/или родамином можно определить, что в образце отсутствует грамположительная бактериальная инфекция (контаминация), но может быть обнаружено, что содержится клинически релевантное количество грамотрицательной бактериальной контаминации. Предпочтительно, если этот образец взят из "блока" донорской крови или продукта крови, не использовать этот "блок" для переливания.
Ковалентная связь репортерной группы со связывающим агентом (таким как антитело или антибиотик) приводит к тому, что этот связывающий агент является детектируемо (т.е. его можно обнаружить, детектировать) меченным. Репортерная группа, преимущественно применяемая в настоящее время в большинстве форматов иммуноанализа, представляет собой молекулу с ферментативной активностью. Связывающие агенты обычно химически связываются с ферментами. Это приводит к образованию комплекса, который сохраняет способность к иммунологическому связыванию, но в то же время делает возможным повышение пределов обнаружения (детектирования) за счет использования способности пары фермент/субстрат к амплификации. Итак, более чем о 20 различных ферментах-метках для получения конъюгатов ферментов сообщалось в литературе. Пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и β-галактозидаза, несомненно, наиболее часто используются. Заданные характеристики для ферментативной метки включают высоко-специфическую активность, малый размер, продукты реакции легко определять (количественно), и стабильность комплекса. Пероксидаза хрена применяется с субстратом - перекисью водорода и следующими критериями: орто-фенилендиамин (OPD), тетраметилбензидин (ТМВ) и диаминобензидин (DAB). Щелочную фосфатазу применяют с пара-нитрофенилфосфатом (PNPP) и метилумбеллифероном. В случае β-галактозидазы используют в качестве сустрата О-нитрофенил-β-D-галактопиранозу (ONPG).
Когда репортерная группа представляет собой фермент, ферментативная активность зависит от способности ферментативно активного детектируемо меченого связывающего агента специфически связываться с целевым лигандом (например, LPA или LTA). Связывание фермента с антителом не должно значительно влиять на способность связывающего агента специфически связываться с его мишенью и не должно заметно влиять на каталитическую активность фермента. В типичных реакциях перекрестного связывания используются некоторые группы гетеро- или гомобифункциональных реагентов для того, чтобы одновременно связываться химически с обоими видами. В настоящее время промышленно выпускаются системы, которые могут легко применять не-специалисты.
Альтернативой ферменту в качестве репортерной группы являются частицы-метки. Они включают латексные частицы; пропитанные красителем латексные частицы и частицы металла, такого как золото или серебро. Конъюгаты частиц применимы для визуального определения граничной точки. Выпускаемые промышленностью частицы имеют размер в интервале от нанометров до микрометров. Размер частицы важен, так как он влияет на обнаружение граничной точки. Латексные частицы, а также частицы металла применяют с различными химически реакционноспособными фрагментами на поверхности. Производители получают их, так что можно применять альтернативные методы связывания.
Следовательно, связывающий агент по изобретению можно детектируемо метить репортерной группой путем межмолеклярной ассоциации, или же детектируемо метить с помощью интермедиатов (промежуточных молекул) репортерной группы путем межмолеклярной ассоциации. Такая межмолекулярная ассоциация может возникать за счет, без ограничения, ковалентного связывания (например, за счет дисульфидных связей), или за счет хелатирования, электростатических взаимодействий, гидрофобных взаимодействий, водородных связей, ион-дипольных взаимодействий, диполь-дипольных взаимодействий или любой комбинации вышеперечисленного. Предпочтительные репортерные молекулы (группы) включают, без ограничения, радиоизотопы, тяжелые металлы, флуоресцентные метки, хроматические метки, хемолюминесцентные метки, ферменты и субстраты ферментов. Предпочтительные биологические образцы включают кровь, сыворотку, плазму, эритроциты, тромбоциты и лейкоциты. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения способ согласно данному аспекту принимает форму обычного иммуноанализа, такого как ELISA или RIA. В другом предпочтительном варианте изобретения способ использует прямую или непрямую иммунофлуоресценцию.
В предпочтительном варианте первого аспекта изобретения набор связывающих агентов иммобилизован на твердофазной подложке (например, на титрационных микропланшетах).
Во втором аспекте изобретение охватывает способ скрининга на присутствие клинически релевантного количества грам-положительных бактерий в донорской крови или продукте крови от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему. Способ заключается в контактировании образца донорской крови или продукта крови с набором связывающих агентов, при этом набор связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и в установлении связывания набора связывающих агентов с образцом, причем связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови или в продукте крови, а не-связывание (отсутствие связывания) указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови или продукте крови. Предпочтительно, донор и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
В третьем аспекте данное изобретение охватывает способ скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской крови или продукте крови от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему. Способ согласно этому аспекту заключается в контактировании образца крови или продукта крови с серией связывающих агентов, причем серия связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и в определении (установлении) связывания набора (серии) связывающих агентов с образцом, при этом связывание указывает на наличие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской крови, или в продукте крови, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской крови или продукте крови. Предпочтительно, донор и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
В соответствии со вторым и третьим аспектами изобретения термины "связывание", "антиген", "кровь или продукт крови", "грамположительные бактерии", "грамотрицательные бактерии", "клинически релевантное количество", "специфически связывается", "связывающий агент" определяются выше. Следует отметить, что способы первого, второго и третьего аспектов изобретения можно осуществлять в момент проверки на АВО-совместимость, Rh-совместимость и/или МНС-совместимость донора и реципиента-млекопитающего.
В некоторых вариантах второго и третьего аспектов изобретения образец обрабатывают перед или одновременно с контактированием образца с набором связывающих агентов. Предпочтительно, при обработке экспонируют сайт связывания связывающего агента на грамположительном бактериальном антигене или на грамотрицательном бактериальном антигене. Способы обработки образца с целью экспонировать сайт связывания со связывающим агентом либо на грамположительном бактериальном антигене, либо на грамотрицательном бактериальном антигене описаны для первого аспекта изобретения.
В некоторых вариантах изобретения донорская кровь или продукт крови, в которых при анализе не обнаружено клинически релевантного количества грамположительных бактерий согласно способу второго аспекта изобретения, "переносят" реципиенту-млекопитающему. В некоторых вариантах изобретения донорская кровь или продукт крови, в которых при анализе не обнаружено клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий согласно способу третьего аспекта изобретения, переносятся реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, донор-млекопитающее и реципиент-млекопитающее относятся к одному виду.
В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий.
В четвертом аспекте изобретение охватывает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или в продукте донорской крови от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему, содержащий (серию) комплект связывающих агентов, и серия (комплект) связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и связывающие агенты, которые специфически связываются с грам-
положительным бактериальным антигеном, и средства обнаружения связывания комплекта (серии, ряда) связывающих агентов с образцом донорской крови или продукта крови, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или продукте крови, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или продукте крови. В предпочтительных вариантах изобретения донор и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
В соответствии с четвертым аспектом изобретения определение терминов "связывание", "антиген", "кровь или продукт крови", "грамположительные бактерии", "грамотрицательные бактерии", "клинически релевантное количество", "специфически связывается" и "связывающий агент" дано выше.
Употребляемое в данном описании выражение "средство (способ) обнаружения связывания" обозначает любой способ, известный из уровня техники, для обнаружения связывания связывающего агента с целевым лигандом (т.е. с LPS и LTA-структурами). Предпочтительные способы (средства) для обнаружения связывания включают иммунологические анализы, описанные ниже. Различные "средства (способы) обнаружения связывания" известны рядовому биологу и включают, без ограничения, латеральный проточный анализ, ELISA, RIA, FACScan анализ, вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, реакции агглютинации, латексный анализ, разделение и неразделение. Разделение - "гетерогенные" анализы - суть такие анализы, в ходе которых связанные и свободные меченые виды (частицы) разделяются. He-разделение - "гомогенные" анализы - суть такие анализы, в ходе которых связывание меченых частиц (видов) с комплементарным связующим модулирует свойство меченого, и, следовательно, связанный и свободный компоненты можно отличить без стадии разделения. Сепарационные (разделительные) анализы можно поделить на два основных формата - конкурентный анализ, при котором аналит и меченый аналит (конкурируют) соревнуются за ограниченное число сайтов связывания, и сэндвич-анализы ("экстракция"), в которых реагент, взятый в избытке, экстрагирует аналит из образца. Реагенты и образцы могут смешиваться одновременно или последовательно в зависимости от разработанного протокола. Для повышения чувствительности анализа один компонент может быть помечен веществом, которое может усиливать сигнал с целью обнаружения малого числа событий связывания; таковое (это вещество) может включать: радиоизотопы, флуоресцентные красители, ферменты, хемилюминесцентные соединения, атомы металлов, золи металлов или соединения металлов, стабильные свободные радикалы, вирусы или бактериофаги, кофакторы, подложки-латексные частицы, эритроциты, антитела, ингибиторы, апоферменты, электроактивные вещества, вуалирующие вещества, спектральные секнсибилизаторы, цветные красители, фосфоресцентные красители, липосомы и электрофоры.
Ясно, что для осуществления любого из этих способов обнаружения связывания и/или анализа результатов исследования можно применять автомат.
В некоторых вариантах четвертого аспекта изобретения набор дополнительно содержит средства для обработки образца, причем при этой обработке экспонируют сайт связывания связывающего агента (со связывающим агентом) на грамположительном бактериальном антигене или на грамотрицательном бактериальном антигене.
Под "средством для обработки" ("способами обработки") понимается любой способ обработки, при котором экспонируется сайт связывания связывающего агента на грамотрицательном или грамположительном бактериальном антигене к нему. Такие способы включают, без ограничения, физическую манипуляцию, включая гомогенизацию (например, с помощью гомогенизатора Даунса), ультразвуковое воздействие и кипячение. Другие "способы обработки" включают обработку образца химическими растворами или соединениями, включая, без ограничения, детергенты (например, SDS или тритон-Х), растворы для щелочного лизиса (например, раствор основания), растворы для кислотного лизиса (например, кислый раствор), EDTA, EGTA, поверхностно-активные вещества, ионы металлов, катионы, анионы, хелатирующие вещества и ферменты.
В одном варианте четвертого аспекта изобретения донорская кровь или продукт крови, в которых при анализе не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, переносят реципиенту-млекопитающему, причем донор-млекопитающее и рецепиент-млекопитающее относятся к одному виду. Предпочтительно, набор по изобретению хранится в месте (например, в больнице), где больному-реципиенту будут делать переливание крови или продукта крови. Применяя набор по изобретению, лечащий профессиональный медперсонал сможет быстро определить, содержит ли донорская кровь клинически релевантное количество инфицирующих бактерий. Когда такое определение произведено и обнаружено, что кровь или продукт крови не содержит клинически релевантного количества бактериальной инфекции, кровь или продукт крови можно перелить больному-реципиенту.
В предпочтительных вариантах четвертого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител (дериваты), которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых предпочтительных вариантах связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбираемую из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий. В одном предпочтительном варианте изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном к нему, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В нескольких вариантах четвертого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо метят первой репортерной группой (молекулой-репортером), а связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, детектируемо метят второй репортерной группой (молекулой-репортером). В одном варианте изобретения первая репортерная группа и вторая репортерная группа являются одинаковыми. В другом варианте изобретения первая репортерная группа и вторая репортерная группа не являются одинаковыми. Предпочтительно, одна или обе, первая репортерная группа и вторая репортерная группа, являются молекулой с ферментативной активностью, частицей (например, частицей золя золота (коллоидной системой) или латексной частицей), меченой радиоактивным изотопом молекулой, слитой молекулой, флуорогенной молекулой, хроматической молекулой или молекулой, которая специфически связана "вторичным" связывающим агентом. Такие детектируемо меченные связующие агенты набора по изобретению, как и описанные выше. Понятно, что если репортерная группа является детектируемой меткой для связывающего агента, представляет собой молекулу с ферментативной активностью, ферментный субстрат также входит в набор по изобретению.
В предпочтительном варианте четвертого аспекта по изобретению комплект (серия) связывающих агентов иммобилизован на твердофазной подложке (например, на титрационном микропланшете).
В пятом аспекте изобретение охватывает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови или продукте донорской крови от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему, содержащий серию (ряд) связывающих агентов, при этом серия связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и средства обнаружения связывания серии связывающих агентов с образцом крови или продукта крови, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови или продукте крови, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской крови или продукте крови. Предпочтительно, донор- и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним (млекопитающим) животным.
В шестом аспекте изобретение включает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской крови или в продукте донорской крови от донора-млекопитающего для передачи реципиенту-млекопитающему, содержащий серию (комплект) связывающих агентов, при этом комплект связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и средства для обнаружения связывания комплекта связывающих агентов с образцом крови или продукта крови, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в крови или продукте крови, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской крови или продукте крови. Предпочтительно, донор- и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
Согласно пятому и шестому аспектам изобретения определение терминов "средства для (способы) связывания", "связывание", "антиген", "кровь или продукт крови", "грамотрицательные бактерии", "грамположительные бактерии", "клинически релевантное количество", "специфически связывается" и "связывающий агент" дано выше.
В предпочтительных вариантах пятого и шестого аспектов изобретения набор дополнительно содержит средства для (способы) обработки образца, при этом обработка заключается в экспонировании сайта связывания связывающего агента на грамотрицательном бактериальном антигене или на грамположительном бактериальном антигене. Определение выражения "средства для (способы) обработки" дано для четвертого аспекта изобретения.
Любой из наборов по четвертому, пятому и шестому аспектам изобретения можно использовать одновременно с пробами на АВО-совместимость, Rh-совместимость и МНС-совместимость донорской крови или продукта крови и предполагаемого (намеченного) реципиента. Предпочтительно, клинически релевантное количество не содержащей бактерий крови или продукта крови вводят путем переливания больному не более чем через 42 дня после проведения испытания; более предпочтительно, не более чем через 30 дней после испытания; более предпочтительно, не более чем через 2 недели после испытания; более предпочтительно, не более чем через 7 дней после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 3 дня после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 2 дня после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 24 часа после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 12 часов после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 6 часов после испытания; и наиболее предпочтительно, когда донорская кровь или продукт крови, в которых не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, переливается реципиенту в течение 3 часов после проведения анализа. Наиболее предпочтительно, когда кровь или продукт крови представляют собой цельную кровь, кроветворные стволовые клетки, лейкоциты, тромбоциты, эритроциты, плазму или сыворотку.
Изобретение также охватывает способы и наборы для скрининга на присутствие любых инфицирующих бактерий в донорской ткани или органе перед трансплантацией донорской ткани или органа реципиенту-млекопитающему, который, предпочтительно, относится к тому же виду, что и донор. Донорские ткани и органы обычно хранят, хотя в течение короткого времени в жидкости, такой как физиологический раствор или буфер для хранения питательных веществ. Наличие бактерий в жидкости для хранения указывает на присутствие инфицирующих бактерий в ткани. Такие инфицирующие бактерии могут ускорять отторжение трансплантированной ткани или органа организмом реципиента-млекопитающего. Соответственно в седьмом аспекте изобретение охватывает способ скрининга на присутствие клинически релевантного количества бактерий в ткани млекопитающего, причем ткань хранится в жидкости, заключающийся в контактировании образца жидкости с серией (комплектом) связывающих агентов, при этом комплект связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и в обнаружении связывания комплекта связывающих агентов с образцом, причем связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской ткани, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской ткани. Предпочтительно, донор- и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
Согласно седьмому аспекту изобретения определение терминов "связывание", "антиген", "грамотрицательные бактерии", "грамположительные бактерии", "клинически релевантное количество", "специфически связывается" и "связывающий агент" дано выше.
Термин "ткань" обозначает любую ткань или орган тела. Примеры тканей по изобретению включают, без ограничения, почку, печень, сердце, кожу, костный мозг, селезенку, тимус, поджелудочную железу, кишечник и нервную ткань.
В некоторых вариантах седьмого аспекта изобретения образец обрабатывают перед или одновременно с контактированием образца с комплектом связывающих агентов. В некоторых вариантах изобретения при обработке экспонируют сайт связывания связывающего агента на грамотрицательном бактериальном антигене или на грамположительном бактериальном антигене. Способы обработки, при которых экспонируют сайт связывания связывающего агента на грамотрицательном бактериальном антигене или на грамположительном бактериальном антигене, такие же, как описанные для первого аспекта изобретения. В некоторых вариантах седьмого аспекта изобретения донорскую ткань, в которой при анализе не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, переносят реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, донор-млекопитающее, от которого получают ткань, и реципиент-млекопитающее относятся к одному и тому же виду. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном. В некоторых предпочтительных вариантах связывающие агенты, которые специфически связываются с их грамотрицательным бактериальным антигеном, представляют собой молекулу, выбранную из группы, состоящей из Limulus анти-липополисахаридного фактора (LALF), липополисахарид-связывающего белка (LBP), бактерицидного/повышающего проницаемость белка (BPI) и антибиотика, такого как полимиксин или бацитрацин. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, специфически связываются с липополисахаридной структурой грамотрицательных бактерий. В некоторых предпочтительных вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антитела или производные антител, которые специфически связываются с их грамположительным бактериальным антигеном. В некоторых вариантах изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, представляют собой антибиотик, причем этот антибиотик не является ни ванкомицином, ни гентамицином. Предпочтительно, когда связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, специфически связываются со структурой липотейхоевой кислоты грамположительных бактерий.
В ряде вариантов седьмого аспекта изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, детектируемо метят первой репортерной группой, а связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, детектируемо метят второй репортерной группой. В некоторых вариантах изобретения первая репортерная группа и вторая репортерная группа являются одинаковыми. В другом варианте изобретения первая репортерная группа и вторая репортерная группа не являются одинаковыми. Предпочтительно, одна или обе, первая репортерная группа и вторая репортерная группа, являются молекулой с ферментативной активностью, молекулой, меченой радиоактивным изотопом, слитой молекулой, флуорогенной молекулой, золью металла, частицей (латексом), хроматической молекулой или молекулой, которая специфически связана со вторым ("вторичным") связывающим агентом.
В некоторых предпочтительных вариантах седьмого аспекта по изобретению комплект связывающих агентов иммобилизован на твердофазной подложке (например, на титрационном микропланшете).
В восьмом аспекте изобретение включает способ скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской ткани от донора-млекопитающего для передачи реципиенту-млекопитающему, при этом донорская ткань хранится в жидкости, заключающийся в контактировании образца жидкости с комплектом связывающих агентов, при этом комплект связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и в обнаружении связывания комплекта связывающих агентов с образцом, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской ткани. Предпочтительно, донор- и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
В девятом аспекте изобретение охватывает способ скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему, при этом донорская ткань хранится в жидкости, заключающийся в контактировании образца жидкости с комплектом связывающих агентов, при этом комплект связывающих агентов содержит связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и в обнаружении связывания комплекта связывающих агентов с образцом, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани. Предпочтительно, донор- и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
В соответствии с восьмым и девятым аспектами изобретения определение терминов "связывание", "антиген", "ткань", "грамотрицательные бактерии", "грамположительные бактерии", "клинически релевантное количество", "специфически связывается" и "связывающий агент" дано выше. Предпочтительно, любой из способов по седьмому, восьмому и девятому аспектам изобретения осуществляют, когда ткань проверяют на АВО-совместимость, Rh-совместимость и/или МНС-совместимость с намечаемым больным.
В некоторых вариантах восьмого и девятого аспектов изобретения образец обрабатывают перед или одновременно с контактированием образца с комплектом связывающих агентов. Способы обработки образца экспонированием сайта связывания связывающего агента либо на грамположительном бактериальном антигене, либо на грамотрицательном бактериальном антигене, такие же, как описанные для первого аспекта изобретения.
В некоторых вариантах восьмого и девятого аспектов по изобретению донорскую ткань, в которой при анализе не обнаружено клинически релевантного количества грамположительных бактерий или клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий, переносят реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, донор-млекопитающее, от которого получают ткань, и реципиент-млекопитающее относятся к одному и тому же виду.
В десятом аспекте изобретение включает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества бактерий в донорской ткани от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему, при этом донорская ткань хранится в жидкости, содержащий набор связывающих агентов, и этот набор связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и средства для (способы) обнаружения связывания набора связывающих агентов с образцом жидкости, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани. Предпочтительно, донор- и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
В одиннадцатом аспекте изобретение включает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской ткани от донора-млекопитающего для переноса реципиенту-млекопитающему, при этом донорская ткань хранится в жидкости, содержащий набор связывающих агентов, и этот комплект связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительным бактериальным антигеном, и средства для (способы) обнаружения связывания набора связывающих агентов с образцом жидкости, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской ткани, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в донорской ткани. Предпочтительно, донор- и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
В двенадцатом аспекте изобретение охватывает набор для скрининга на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани от донора-млекопитающего для передачи реципиенту-млекопитающему, при этом донорская ткань хранится в жидкости, содержащий комплект связывающих агентов, и этот комплект связывающих агентов включает связывающие агенты, которые специфически связываются с грамотрицательным бактериальным антигеном, и средства для (способы) обнаружения связывания набора связывающих агентов с образцом жидкости, при этом связывание указывает на присутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани, а не-связывание указывает на отсутствие клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий в донорской ткани. Предпочтительно, донор- и/или реципиент-млекопитающее является человеком или домашним животным.
В соответствии с десятым, одиннадцатым и двенадцатым аспектами изобретения определения терминов "средства для (способы) связывания", "связывание", "антиген", "ткань", "грамотрицательные бактерии", "грамположительные бактерии", "клинически релевантное количество", "специфически связывается" и "связывающий агент" даны выше. В предпочтительных вариантах одиннадцатого и двенадцатого аспектов изобретения набор дополнительно содержит средства для обработки образца, при этой обработке экспонируют сайт связывания связывающего агента на грамотрицательном бактериальном антигене или на грамположительном бактериальном антигене.
В некоторых вариантах десятого, одиннадцатого и двенадцатого аспектов изобретения набор дополнительно содержит средства для (способы) обработки образца, при этой обработке экспонируют сайт связывания связывающего агента на грамотрицательном бактериальном антигене или на грамположительном бактериальном антигене. Средства для (способы) обработки образца описаны для четвертого аспекта изобретения. В ряде вариантов изобретения донорскую ткань, в которой при анализе не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, переносят реципиенту-млекопитающему. Предпочтительно, донор-млекопитающее, от которого получают ткань, и реципиент-млекопитающее относятся к одному и тому же виду.
Предпочтительно, набор по изобретению хранят в том месте (например, в больнице), где больному реципиенту будут вводить донорскую ткань, например, трансплантацией или переливанием. Применяя набор по изобретению, лечащие медицинские работники-профессионалы смогут быстро обнаружить, не содержит ли донорская ткань клинически релевантного количества инфицирующих бактерий. Когда такой анализ сделан и найдено, что в донорской ткани не содержится клинически релевантного количества бактериальной контаминации, донорскую ткань трансплантируют реципиенту-больному.
Любой из способов по десятому, одиннадцатому и двенадцатому аспектам изобретения можно использовать одновременно с проверкой на АВО-совместимость, Rh-совместимость и/или МНС-совместимость донорской ткани и предполагаемого реципиента. Предпочтительно, ткань подвергают скринингу с использованием способов и наборов по седьмому, восьмому, девятому, десятому, одиннадцатому и двенадцатому аспектам изобретения сравнительно незадолго до трансплантации ткани. Предпочтительно, догорскую ткань трансплантируют больному не более, чем через 42 дня после проведения испытания; более предпочтительно, не более чем через 30 дней после испытания; более предпочтительно, не более чем через 2 недели после испытания; более предпочтительно, не более чем через 7 дней после испытания; еще более предпочтительно, не более, чем через 3 дня после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 2 дня после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 24 часа после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 12 часов после испытания; еще более предпочтительно, не более чем через 6 часов после испытания; и наиболее предпочтительно, донорскую ткань, в которой не обнаружено клинически релевантного количества бактерий, трансплантировать реципиенту в течение 3 часов после проведения теста.
Хотя не исчерпывающе, ряд возможных форматов иммунологического анализа описан в следующих примерах, которые, при использовании в сочетании с LTA- или LPS-специфическими связывающими агентами, могут предложить общий метод анализа для обнаружения класса микробов. Так, предполагается, что следующие примеры дополнительно проиллюстрируют некоторые особенно предпочтительные варианты изобретения, но они не претендуют на ограничение объема изобретения.
Пример I
Способ обнаружения бактерий по изобретению может осуществляться в соответствии с форматом обычного латекс-иммуноанализа. При этом способе связывающие агенты, которые специфически связываются с антигенной областью на бактериальной клеточной стенке, могут использоваться в качестве иммунологических мишеней и могут создавать основу для обнаружения бактерий в продуктах крови. Схематически устройство, использованное в этом примере, показано на Фигурах 3A-3D. В одном варианте изобретения связывающие агенты, которые специфически связываются с грамположительными бактериями, грамотрицательными бактериями, или с ними обоими, объединяют, а затем делят приблизительно так, что две популяции связывающих агентов, каждая, содержит смесь связывающих агентов. Одна популяция связывается с мембраной в основании устройства, изображенного на Фигурах 3A-3D. Вторую популяцию используют для покрытия ярко окрашенных латексных частиц (т.е. латексные частицы, покрытые связывающим агентом, пропитывают красителем так, чтобы они были интенсивно окрашены). В другом варианте изобретения один и тот же связывающий агент (т.е. все молекулы связывающего агента специфически распознают один и тот же антигенный эпитоп) делят на две популяции. И снова, одну популяцию связывают с мембраной в основании устройства, изображенного на Фигурах 3A-3D, тогда как вторую популяцию используют для покрытия ярко окрашенных латексных частиц. Тот же связывающий агент (т.е. молекулы, которые специфически связываются с тем же самым эпитоп) можно использовать, когда на бактериальной поверхности имеется много сайтов распознавания.
Гранулы, покрытые связывающим агентом, помещают в устройство (прибор) так, чтобы они не связывались с мембраной.
Для того чтобы использовать устройство (прибор), изображенное на Фигурах 3A-3D, для обнаружения клинически релевантного количества бактерий в крови или в продукте крови, осуществляют следующие стадии. Сначала образец экстрагируют в стерильных условиях из донорской крови или продукта донорской крови. Или же образец можно экстрагировать из жидкости, в которой хранится донорский орган или ткань (например, питательная жидкость для хранения, в которой хранят донорскую почку).
Далее, для питательного прибора (устройства) берут соответствующий объем образца, как показано на Фигурах 3A-3D. Образец можно анализировать непосредственно (т.е. неразбавленный или необработанный) или же его можно разбавить буферизующим/ экстрагирующим реагентом, или его можно обработать физическими или химическими способами, при этой обработке экспонируют сайт связывания связывающего агента на бактериях (или их антигене), имеющихся в образце. Например, обработка может привести к разрушению бактериальной клеточной стенки. В другом примере обработка может привести к отщеплению антигена от клеточной стенки, и тем самым экспонируется сайт связывания на антигене.
Образец проходит определенный путь в приборе вследствие впитывающего эффекта абсорбирующей мембраны. Бактерии, присутствующие в образце, связываются с частицами через связывающий агент-меченый латекс.
Образец смешивается с частицами связывающий агент-меченый латекс и мигрирует вдоль впитывающего абсорбента к определенному участку, где иммобилизованы антибактериальные антитела. Иммобилизованные связывающие агенты захватывают комплексы в виде покрытых бактериями-антибактериями окрашенных гранул латекса, и окрашенное пятно указывает на положительный результат.
Пример II
В другом варианте способа, описанного в Примере I, связанные с латексом связывающие агенты являются связывающими агентами, которые специфически распознают либо грамотрицательные бактерии, либо грамположительные бактерии, либо те и другие. Однако, каждый из этих антибактериальных связывающих агентов имеет эпитоп, общий для всех связывающих агентов. В данном примере все антибактериальные связывающие агенты суть мышиные антитела. Мембраносвязанные связывающие агенты не связываются специфически с бактериями; скорее, они специфически связываются с мышиными детерминантами на константном участке мышиных антибактериальных антител. Эти антимышиные связывающие агенты называют "вторичными" связывающими агентами, так как они не специфически связываются с бактериями, а скорее, специфически связывают связывающий агент, который специфически связан с бактерией.
Пример III
Реакция агглютинации является еще одним методом обнаружения клинически релевантных количеств бактерий в крови, в продукте крови или в жидкости с донорской тканью. В этом примере реакции агглютинации используют лактексные частицы, покрытые связывающими агентами, которые специфически связываются с образцами бактерий. Эти латексные частицы агглютинируют в присутствии клинически релевантных количеств бактерий. Положительная реакция видна при появлении агглютинированной структуры. При отрицательной реакции латекс не агглютинирует и молочная консистенция остается практически неизменной.
При этом способе используется устройство, такое как показано на Фигурах 4A-4D. Образец, экстрагированный в стерильных условиях из донорской крови или продукта крови, помещают в прибор для испытания. Или же образец, экстрагированный из жидкости, в которой хранится донорский орган или ткань, можно поместить в прибор для анализа (испытания). Образец можно анализировать непосредственно (т.е., неразбавленным или необработанным), разбавлять буферизующим/экстрагирующим реагентом, или обрабатывать так, что при обработке экспонируется сайт связывания связывающего агента на любой бактерии (или ее антигене), имеющейся в образце. Далее, гранулы латекса, покрытые связывающими агентами, которые специфически связываются с бактериями, добавляют в биологический образец в приборе для анализа. Содержимое перемешивают, чтобы обеспечить гомогенность смеси.
Бактерии в биологических образцах специфически связываются с антибактериальными антителами на лактексных гранулах. Благодаря множеству антигенных сайтов на поверхности бактерий покрытые антителом латексные частицы образуют мостик между прилегающими бактериальными клетками. В присутствии клинически релевантных количеств бактериальных клеток в биологическом образце образуется сшитая матрица (основа). При превышении определенного заранее клинически релевантного количества бактерий в образце (как определено выше) матрица растет, так что становится видимой как "агглютинированная" ("скелетная") структура в лунке для анализа. После роста в течение определенного времени результаты "читаются" визуально, присутствие бактериального антигена приводит к образованию структуры, показанной на Фигуре 4D.
Пример IV
Еще один способ обнаружения присутствия клинически релевантного количества бактерий в крови или в продукте крови применяет стандартный формат твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Форматы титрационного микропланшета (т.е. 96-луночного) ELISA используют множество отдельных реакционных лунок, причем каждая образует отдельную контрольную идентификационную среду. Форматы титрационного микропланшета позволяют повысить "производительную способность" испытания, применять автоматизацию работы с образцом, добавления реагента, обнаружения реакции и количественной расшифровки результатов. Титрационные микропланшеты ELISA хорошо известны и применяются на практике. Для обнаружения видов (бактерий) с большой молекулярной массой со многими сайтами связывания, как антигены бактериальной поверхности, предпочтительным форматом является многослойный иммуносэндвич. Сэндвич-иммуноанализы проводят, помещая - пассивно или ковалентно-связанным - связывающий агент, который специфически связывается либо с грамотрицательными, либо с грамположительными бактериями (либо с теми и другими), на поверхность лунки титрационного микропланшета из полистирола (или других материалов), так что связывающий агент прилипает (адгезия) к лунке титрационного микропланшета. Иммунологическое обнаружение происходит следующим образом.
Сначала образец (препарат) экстрагируют в стерильных условиях либо из донорской крови, либо из продукта донорской крови, или из жидкости, в которой хранят донорский орган или ткань. Образец может быть разбавленным или неразбавленным, или он может быть обработан так, что при обработке экспонируется сайт связывающего агента на любой бактерии (или ее антигене), присутствующей в образце. В лунку для анализа помещают соответствующий объем препарата (образца). Бактерии в биологическом препарате будут специфически комплексоваться со связанными с поверхностью антибактериальными связывающими агентами на поверхности лунки титрационного микропланшета. Затем лунку отсасывают (или выгружают), удаляя несвязанный препарат из лунки. Специально приготовленный промывающий раствор добавляют в лунку, чтобы отмыть неспецифически связанные бактерии (и другие составляющие препарата) от поверхности лунки титрационного микропланшета.
Далее, раствор, содержащий связывающий агент, детектируемо меченный молекулой-репортером, добавляют в реакционную лунку. Детектируемо меченный связывающий агент в этом растворе связывается с антигеном, который определяет тип бактерий, находящихся в биологическом препарате, и может быть отличным от связанного с поверхностью связывающего агента, или тем же самым. Детектируемо меченный связывающий агент химически соединяется с молекулой-репортером (молекула-репортер с ферментативной активностью, в конкретном случае с ELISA), которая применяется, чтобы выявить наличие или отсутствие бактерий в образце. Следует отметить, что молекула-репортер может быть "создана" из ряда видов и выбирается с целью минимизировать влияние на реакцию связывания антитела. В твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) используют преимущественно ферменты, но можно также использовать другие молекулы-репортеры, включая, без ограничения, хромофоры, флуорофоры, радиоизотопы, хемилюминесцентные соединения, электрохимически активные соединения, металлы, частицы (латексы), магнитные частицы и вторичные метки, такие как биотин/авидин или им подобные. Детектируемо меченный связывающий агент, получающийся химическим взаимодействием специфического связывающего агента с репортерной группой, дает комплекс с комплексом антибактериальный связывающий агент/бактерия, образуя "сэндвич": антибактериальный связывающий агент/бактерия/антибактериальный детектируемо меченный связывающий агент.
Через определенное время раствор детектируемо меченного связывающего агента удаляют из лунки. Лунку можно отмыть специально приготовленным промывающим раствором, чтобы отделить связанный конъюгат от несвязанного конъюгата в лунке титрационного микропланшета.
Специфически связанный детектируемо меченный связывающий агент в лунке титрационного микропланшета можно обнаружить соответствующими способами. Эти способы включают непосредственные измерения в случае флуорофоров, хромофоров, хемилюминесцентных, электроактивных меток и непрямое измерение (опосредованное) в случае таких меток, как ферменты. Число специфически связанных детектируемо меченных связывающих агентов прямо пропорционально числу бактерий в биологическом образце. Эта пропорциональность есть основа методологии количественного расчета, которую можно использовать для конкретного определения количества бактерий в образце. Стандартную (эталонную) кривую отклика можно построить, определяя отклик (реакцию) специфически связанного детектируемо меченного связывающего агента как функцию известных количеств бактерий в калибровочных образцах. Интерполяцией результатов стандартной кривой отклика получают концентрацию бактерий в неизвестном биологическом образце.
Пример V
Еще один способ скрининга на наличие клинически релевантного количества бактерий в крови, в продукте крови или жидкости, в которой хранится ткань, использует формат конкуретного иммуноанализа. Действительно, для обнаружения видов (бактерий) с малой молекулярной массой с единичными сайтами связывания, таких как секретируемые липополисахаридные структуры грамотрицательных бактерий, формат конкуретного иммуноанализа является предпочтительным форматом. Конкуретный иммуноанализ проводят, помещая - пассивно или ковалентно-связанный - связывающий агент, который специфически связывается либо с секретируемой LPS-структурой (как, например, связывание с участком липида A LPS-структуры), на полистирольную (или из другого материала) поверхность лунки титрационного микропланшета, так что связывающий агент прилипает к поверхности лунки титрационного микропланшета.
В одном примере такого формата конкуретного иммуноанализа для обнаружения присутствия клинически релевантного количества грамотрицательных бактерий иммунологическое обнаружение проводят следующим образом. Сначала образец (препарат) экстрагируют в стерильных условиях из донорской крови или продукта крови, или из жидкости, в которой хранят донорский орган или ткань. Образец может быть разбавленным или неразбавленным, или он может быть обработан так, что сайт связывания связывающего агента на грамотрицательных бактериях (или их антигене) экспонируется, как сайт связывания липидного А-компонента LPS. Соответствующий объем препарата помещают в лунку для анализа, которая содержит связывающий агент, специфически связывающийся с LPS. Детектируемо меченные молекулы LPS в этом растворе специфически связываются со связывающим агентом в тест-лунке. Детектируемо меченная молекула LPS химически соединяется с молекулой-репортером (такой как молекула-репортер с ферментативной активностью, в конкретном случае ELISA), которую используют для доказательства наличия или отсутствия бактерий в образце. Следует отметить, что молекулу-репортер можно получить (создать) из многих видов и ее выбирают с целью минимизировать влияние на реакцию связывания антитела. В твердофазном иммуноферментном анализе (ELISA) используют преимущественно ферменты, но можно также использовать другие репортерные группы, включая, без ограничения, хромофоры, флуорофоры, радиоизотопы, хемилюминесцентные соединения, электрохимически активные соединения, металлы, частицы (латексы), магнитные частицы и вторичные метки, такие как биотин/авидин или другие подобные частицы. Детектируемо меченная молекула LPS образует комплекс с иммобилизованным связывающим агентом в присутствии LPS из клеточной стенки, при этом устанавливается равновесное связывание. Предпочтительно, тест-лунка (лунка для пробы) есть лунка в титрационном микропланшете.
Через определенное время раствор (молекул) детектируемо меченного LPS/LPS из инфицирующей бактериальной клетки удаляют из тест-лунки. Лунку можно отмыть с помощью специально приготовленного промывающего раствора для отделения связанного конъюгата от несвязанного конъюгата в лунке титрационного микропланшета. В отсутствие клинически релевантного количества каких-либо инфицирующих грамотрицательных бактерий в препарате и, следовательно, в отсутствие клеточного LPS, детектируемо меченная молекула LPS дает комплекс со связанным с поверхностью связывающим агентом. При повышенных концентрациях бактерий и, следовательно, при повышенных уровнях бактериального клеточного LPS, связывание с поверхностно-связанным связывающим агентом распределяется между двумя видами LPS в зависимости от концентрации. При низких концентрациях LPS из инфицирующих бактериальных клеток основная часть связывания связывающего агента дает комплекс с детектируемо меченной молекулой LPS, и наблюдается усиление сигнала репортера. При высоких значениях (уровнях) бактериального клеточного LPS основная часть сайтов связывания связывающего агента дает комплекс с бактериальным клеточным LPS, и наблюдается слабый сигнал репортера. Следовательно, число специфически связанных детектируемо меченных молекул LPS обратно пропорционально числу инфицирующих грамотрицательных бактерий в биологическом препарате (образце). Эталонную кривую отклика можно построить, определяя (измеряя) отклик детектируемо меченной молекулы LPS как функцию известных количеств бактерий в калибровочных образцах. Интерполяцией результатов на эталонной кривой отклика получают концентрацию грамотрицательных бактерий в неизвестном биологическом образце (препарате).
Пример VI
Еще один способ обнаружения присутствия клинически релевантного количества бактерий в крови или в продукте крови использует формат гомогенного иммуноанализа. Гомогенный иммуноанализ характеризуется тем, что можно одновременно измерять связанный и свободный компоненты реакции комплексообразования связующее-лиганд. Свойства метки так изменяются при связывании комплементарного реагента, что разделение связанного и несвязанного не требуется.
Сначала образец (препарат) экстрагируют в стерильных условиях из донорской крови или продукта крови, или из жидкости, в которой хранят донорский орган или ткань. Соответствующий объем испытуемого препарата смешивают с реагентом для предварительной обработки, так что образуются малые фрагменты структуры клеточных стенок. Такой реагент может включать (но без ограничения) поверхностно-активные вещества, комплексоны и ферменты для разрушения нативной антигенной структуры на субкомпоненты меньшей молекулярной массы. Кроме того, механическую фрагментацию (такую, как под воздействием ультразвука) или кинетическую энергию (например, кипячение) можно использовать для разрушения клеточной стенки до субкомпонентов. В данном примере обработкой экспонируют сайт связывания связывающего агента на грамотрицательных бактериях или их антигене, вызывая выделение и деградацию липополисахаридной структуры в грамотрицательных бактериях до его липидных А или ядерных единиц.
Препарат фрагментов разрушенных клеточных стенок смешивают с реагентом, содержащим липидный А (или ядерный) антиген, который химически связывается с флуоресцентной меткой. Известное количество антилипидного А (или антиядерного) связывающего агента добавляют в реакционную смесь. У антигенов, которые связываются со связывающим агентом, наблюдается пониженный уровень молекулярного вращения, в то время, как у несвязанных наблюдается повышенный уровень молекулярного вращения. В поле поляризованного света поляризованный свет предпочтительно возбуждает те молекулы, которые параллельны плоскости падающего света. Ориентация излучающих частиц определяет степень поляризации излучаемого света. Если положение молекул излучающих частиц ("видов") относительно стабильно, флуоресценция будет частично поляризованной. Если вместо фиксированного состояния молекулы находятся в состоянии быстрого колебания (осцилляции), молекулярное движение понижает степень поляризации. У флуоресцетного излучения реакционной смеси антигена липидного А (или ядерного) фрагмента клеточной стенки любых грамотрицательных бактерий в образце, флуоресцентно меченого липида А (или ядра) и связывающего агента наблюдается высокая степень поляризации света при низких уровнях (низком содержании) липидного А (или ядерного) фрагмента клеточных стенок (т.е. при низких уровнях бактериальной контаминации в образце) и низкая степень поляризации света при высоких уровнях липидного А (или ядерного) фрагмента клеточной стенки (т.е. высоком содержании грамотрицательной бактериальной контаминации в образце), по сравнению со смесью связывающий агент + флуоресцентно меченый липид А (или ядро) без какого-либо образца. Такой ответ различных уровней поляризации света как функция липидного А (или ядерного) фрагмента клеточных стенок может быть использован как основа анализа связывания для определения неизвестных концентраций липида А (или ядра) и, в конечном счете, для обнаружения наличия или отсутствия грамотрицательных бактерий в образце.
Использующие антитело в качестве связывающего агента вышеописанные методы хорошо известны в области флуоресцентного поляризационного иммуноанализа; родственные методы включают иммуноанализ с тушением флуоресценции, флуоресцентный иммуноанализ с разрушением во времени (time resolved), иммуноанализ с флуоресцентным усилением, иммуноанализ с переносом возбужденной флуоресценции и иммуноанализ с выделением флуорофора. Или же можно также использовать модуляцию ферментной активности как функцию образования комплекса связывающим агентом в качестве альтернативного формата гомогенного иммуноанализа для обнаружения составляющих бактериальной клеточной стенки меньшего размера (и, следовательно, обнаружения наличия или отсутствия бактериальной инфекции). Каждый из этих способов хорошо документирован и хорошо известен людям, знакомым с данной областью техники.
Пример VII
Модификация способа, описанного в Примере VI, позволяет проводить скрининг на наличие клинически релевантного количества грамположительных бактерий в препарате донорской крови, продукта донорской крови и/или жидкости, в которой хранится донорская ткань. В этом примере образец экстрагируют в стерильных условиях из донорской крови, продукта крови или жидкости, в которой хранят донорскую ткань. Соответствующий объем испытуемого препарата смешивают с агентом для предварительной обработки, так что образуются малые фрагменты структуры клеточных стенок. Эта обработка, приводящая к экспонированию сайта связывания связывающего агента на грамположительных бактериях (или их антигене), может быть обработкой химическим реагентом, таким как поверхностно-активное вещество, комплексен и/или фермент для разрушения нативной антигенной структуры на субкомпоненты меньшей молекулярной массы. Обработку можно также вести механическими способами, используя механическую фрагментацию (например, ультразвуковую) или кинетическую энергию (например, кипячение) для разрушения клеточной стенки до ее субкомпонентов, тем самым экспонируя сайт связывания связывающего агента на антигенном компоненте LTA-структуры. Конкретным примером может служить выделение полиглицерофосфатной цепи из структуры липотейхоевой кислоты. Другие структуры стенки грамположительных клеток могут легко представить те, кто хорошо осведомлен в данной области техники.
Далее, образец фрагментов разрушенной клеточной стенки смешивают с реагентом, содержащим полиглицерофосфатный антиген, который химически соединен с ферментной меткой, образуя конъюгат фермента. Конъюгацию фермента проводят в такой форме, что при образовании комплекса со связывающим агентом ферментативная активность конъюгата модулируется. Либо маскированием активного сайта, либо за счет конформационной модификации фермента, но когда связывающий агент дает комплекс с конъюгатом фермента, активность фермента понижается; без образования комплекса связывающего агента с ферментным конъюгатом активность фермента сохраняется. Такая модуляция ферментной активности лежит в основе общепринятого формата гомогенного анализа.
Далее, известное количество анти-полиглицерофосфат-связывающего агента добавляют в реакционную смесь, которая содержит фиксированное количество связывающего агента и конъюгат фермента. Кроме того, добавляют известный объем крови (или продукта крови, или тканевой жидкости), обработанной с целью разрушения составляющих бактериальных клеточных стенок. Если бактерии не присутствуют в крови, продукте крови или жидкости с образцом донорской ткани, тогда (соответствующие) доступные сайты связывания на связывающем агенте будут образовывать комплекс с ферментным конъюгатом. Ферментный конъюгат будет проявлять пониженную ферментативную активность в связанном состоянии, и будет происходить минимальная конверсия субстрата. При высоких уровнях антигена клеточных стенок, достигаемых тогда, когда в образце велико содержание (уровень) инфицирующих грамположительных бактерий, основная часть сайтов связывания на связывающем агенте будет занята нативным антигеном клеточной стенки (например, полиглицерофосфатным), что, тем самым, вынуждает конъюгат фермента существовать в незакомплексованном виде. В таком незакомплексованном состоянии активность фермента сохраняется и наблюдаются повышенные уровни превращения субстрата.
Небольшая модификация метода включает использование фрагментов фермента, один из которых мечен фрагментом антигена. В присутствии связывающего агента фрагмент фермента не может дать комплекс с нужным дополнительным фрагментом для получения целого функционального фермента. Когда связующее дает комплекс с антигеном клеточной стенки инфицирующих грамположительных бактерий, присутствующих в образце, он не может давать комплекс с фрагментами фермента, тем самым позволяя им соединяться и образовывать активный фермент. Модификации этих способов хорошо известны и понятны специалистам в области ферментного анализа с модуляцией связующего.
Пример VIII
Модификации анализов, описанных в Примерах IV, V, VI и VII, включают применение автоматизированного аналитического оборудования для проведения анализа и вычисления результатов. Автоматизация позволяет применять технологию в формате с лучшей воспроизводимостью, что совершенствует проведение анализа, а также снижает уровень определяемой бактериальной инфекции. Ряд систем для полного иммунного анализа выпускаются промышленностью и применяются для иммунодиагностических исследований в центральной лаборатории больниц. Применение вышеописанной технологии можно легко представить как часть любой из этих автоматизированных систем. Применение альтернативных методологий разделения (отделение твердой фазы, жидкой фазы, магнитных частиц, разделение по электрическому заряду) можно также предвосхитить в этом описании. Аналогично, можно также предвидеть, что альтернативные методы обнаружения (такие как хромогенный, флуорогенный, электрохимический, хемилюминесцентный или радиометрический) можно соответствующим образом модифицировать для способа обнаружения систем детектируемо меченных связывающих агентов, так же, как соответствующие изменения системы детектирования автоматической системы иммуноанализа.
Пример IX
Общеродовая специфичность двух репрезентативных неограничивающих связывающих агентов по изобретению оценивается при исследовании структур антигенов поверхности как на грамположительных, так и на грамотрицательных бактериях. Связывающий агент, который специфически связывается с грамположительным бактериальным антигеном, а именно, с липотейхоевой кислотой, суть моноклональное антитело клона 96-110 (IgGI) (описанное в Fischer et al. Международная заявка РСТ WO 98/57994). Связывающим агентом, который специфически связывается с грамотрицательнным бактериальным антигеном, а именно, липидом А, является моноклональное антитело клон 26-5 (IgG2b) (промышленно выпускается Biodesign International, Saco, Maine, номер в каталоге С61212М).
Четырнадцать видов бактерий выбирают для определения характеристик связывания: семь видов грамположительных бактерий и семь (видов) грамотрицательных бактерий (см. Фигуры 5 и 6, соответственно). Эти бактерии выбирают из-за того, что они представляют виды бактерий, которые были идентифицированы в ходе трех основных национальных исследований реакцией на переливание (включая BаCоn-исследование в США, исследование Hemovigilance во Франции и исследование SHOT в Вликобритании).
8
Для характеристики связывания грамположительных бактерий и грамотрицательных бактерий с моноклональным антителом против липотейхоевой кислоты и моноклональным антителом против липида А, соответственно, делают посев бактериальных видов из клинических изолятов штрихом на пластинках с 5% овечьим кровяным агаром (BBL) и выращивают в течение ночи при 37°С. Образующиеся колонии засевают в триптиказо-соевый бульон (30 мг/мл, Sigma) в PBS и перемешивают (вращение) при 37°С. Число бактерий определяют с помощью турбидиметра при 620 нм. Цельноклеточные бактерии центрифугируют при 5000 об/мин в течение пятнадцати минут. Дебрис (пеллеты) бактерий снова взвешивают (суспендируют) в PBS до достижения, примерно, 10 колониеобразующих единиц (CFU)/Mn физиологического раствора с фосфатным буфером. 10 мкл бактериальной суспензии добавляют в каждую лунку одного ряда 96-луночных титрационных микропланшетов. Эту операцию повторяют для каждого из семи (видов) грамположительных бактерий и каждого из семи (видов) грамотрицательных бактерий. Планшеты инкубируют один час при 37°С и затем хранят при 4°С.Затем планшеты отмывают пять раз 200 мкл/лунка 0,05% Tween-20 и хранят в сухом виде при -20°С до момента применения.
Для минимизации неспецифического связывания планшеты с нанесенными бактериями блокируют с помощью 300 мкл/лунка 5% сухого молока/0,05% Tween-20 в PBS. Планшеты блокируют в течение ночи при комнатной температуре, а затем отмывают 3Х PBS/Tween. Связывающие агенты (т.е. моноклональное антитело против липотейхоевой кислоты и моноклональное антитело против липида А) разбавляют до 5 мкг/мл раствором PBS, содержащим 4% BSA и 0,05% Tween-20. Растворы перемешивают и фильтруют через фильтры 0,22 мкм. 100 мкл раствора добавляют в каждую лунку и связывающие агенты реагируют один час при 37°С. Планшеты отмывают 5 раз 0,05% Tween-20. Промышленное "вторичное (второе)" антитело, конъюгат антитела козы к мышиному IgG (тяжелая и легкая цепи) HRP разводят 1:5000 в PBS/1,5% BSA и 0,05% Tween-20. 200 мкл раствора "вторичного" антитела добавляют в каждую лунку и "вторичное" антитело связывается один час при 37°С. Планшеты последовательно отмывают: один раз PBS/0,05% Tween-20 и еще три раза одним PBS. Для количественного анализа бактериального связывания в каждую лунку добавляют 200 мкл Peroxidase ТМВ субстрата (Sigma). Поглощение (OD 370 нм) прочитывают в кинетическом формате на ридере титрационных микропланшетов Dynax.
Как показано на Фигурах 5 и 6, соответственно, каждый из семи грамположительных бактерий и семи грамотрицательных (видов) бактерий специфически распознаются моноклональным антителом против липотейхоевой кислоты (грамположительные; Фигура 5) и моноклональным антителом против липида А (грамотрицательные; Фигура 6). (Средние результаты трехкратного измерения наносят на графике как функцию каждой распознаваемой бактерии). Как показано на Фигурах 5 и 6, степень (предел) распознавания отличается в разных видах бактерий, но во всех случаях превышает фон, по меньшей мере, в два раза. Эти данные ясно указывают на возможность использования общего связывающего агента для общеродового распознавания как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Эти бактерии представляют специфический интерес, так как они являются точными видами бактерий, определяемых как возбудители (причинные факторы) реакций на переливание.