СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОТИПА, СЕРОГРУППЫ И ТОКСИГЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ И НАБОР ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
METHOD DETECTION AND EVALUATION OF BIOTYPE, SEROGROUP AND TOXIGENICITY OF CHOLERA AGENT AND RELATED KIT

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинской диагностике, конкретно к способу и набору для обнаружения ДНК возбудителя холеры в материале от больных людей и из объектов окружающей среды, и может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях, региональных, областных службах санэпиднадзора.
В основе лабораторной диагностики холеры лежат культуральные методы исследования. Однако при определении серовара и биовара у выделяемых штаммов Vibrio cholerae возникают трудности, связанные с их фагорезистентностью к холерным диагностическим фагам (определяющим классический и эльтор биовар), а также с их пониженной агглютинабельностью холерными диагностическими сыворотками (определяющими серовар 01 или не 01). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) применяется в качестве ускоренного метода для детекции возбудителя, а также на этапе определения эпидемической значимости (токсигенности) выделенных культур.
В настоящее время одним из наиболее перспективных методов диагностики вирусных и бактериальных заболеваний человека и индикации их возбудителей, в частности индикации Vibrio cholerae, широко используется ПЦР-анализ, основанный на выявлении ДНК возбудителя.
Известен способ детекции возбудителя холеры, включающий выделение ДНК, проведение ПЦР, состоящего из первичной денатурации, цикла из денатурации отжига и синтеза, заключительного синтеза, а также соответствующий диагностический набор. Набор содержит реагенты для ПЦР, воду, дНТФ (дезоксинуклиотидтрифосфаты) фермент, контрольную ДНК, минеральное масло и праймеры ctx2, ctx3, обеспечивающие амплификацию фрагмента ctx А гена, кодирующего синтез А-субъединицы холерного токсина, размером 564 п.н. («ГенХол - Тест-система для выявления ДНК V. cholerae ctxA + методом полимеразной цепной реакции», ТУ 8895-006-01898109-2007).
Недостатком этого способа и набора является то, что с их помощью невозможно осуществить мультилокусный анализ одновременно нескольких генов, что замедляет процесс исследования материала. Кроме того, описанный способ и набор не позволяет выявлять штаммы холерных вибрионов, не содержащие ctx А ген, но которые могут иметь другие факторы вирулентности.
Известен набор для определения ДНК пародонтопатогенных микробов Prevotella intermedia sensu stricto, Bacteroides forsythus, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis при помощи мультилокусной полимеразной цепной реакции. Набор включает комплект реагентов для подготовки пробы, комплект для амплификации, содержащий праймеры, специфичные к ДНК Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Treponema denticola, Bacteroides forsythus, Prevotella intermedia sensu stricto, положительный и отрицательный контрольные образцы, и комплект для анализа продуктов ПЦР. Набор обеспечивает одновременное, быстрое, простое и точное обнаружение 5 видов пародонтопатогенов в одной пробе (Патент RU 2306341, 20.09.07). Однако описанный набор предназначен для выявления микроорганизмов не относящихся к семейству Vibrionocae и не предусматривает возможности детекции холерного вибриона.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению техническим решением является способ определения токсигенности и биовара холерных вибрионов с использованием набора праймеров, обеспечивающих одновременную амплификацию двух фрагментов гена ctx A2-B, кодирующего синтез холерного токсина V. cholerae и трех фрагментов hly А гена, кодирующего синтез гемолизина. Для амплификации двух фрагментов гена ctx А2-В используют две пары праймеров C2F-C2R и C4F-C4R, а для hly А гена используют три праймера - H4F, H3R и H3F. Описанные праймеры (C2F, C2R, C4F, C4R, H4F, H3R и H3F) в одной реакционной смеси обеспечивают одновременную амплификацию фрагментов генов ctxA 2-В и hly А при двухэтапной постановке реакции.
ctx A2-B
C2F - 5'-AGGTGTAAAATTCCTTGACGA-3',
C2R - 5'-TCCTCAGGGTATCCTTCATC-3',
C4F - 5'-ACTGATTTGTGTGCAGAATACCAC-3',
C4R - 5'-TGATAGCCATCTCTCTTTTTCCAG-3'.
hly А
H4F - 5'-GCAAACAGCGAAACFAATACC-3',
H3R - 5'-TCCACCCCACCAGTCACC-3',
H3F - 5'-GGGAGCCGGCATTCATCT-3'.
При осуществлении способа используют программу амплификации, включающую предварительную денатурацию при 95°С - 2 мин, 35 циклов (95°С - 60 с, 60°С - 90 с, 72°С - 90 с), завершающую элонгация - 10 мин при 72°С. Рассматриваемый способ определения генов ctxA и hlyA предусматривает выполнение исследований в два этапа, что занимает до 5 часов времени.
Недостатком способа и набора является то, что описанная выше смесь праймеров для детекции двух генов hlyA и ctx A-B не позволяет определять одновременно серогруппу возбудителя, что очень важно при индикации возбудителя холеры и оценке его эпидемической значимости. Кроме того, используемая программа амплификации не эффективна при одновременной детекции трех генов hlyA, ctxA и wbeN, обеспечивающего определение серогруппы возбудителя, а двухэтапная постановка реакции повышает риск возникновения контаминации проб ампликонами при переносе ПЦР - продукта первого этапа в реакционную смесь для второго этапа, усложняет постановку реакции и увеличивает затраты времени на получение результатов.
Задачей предлагаемого изобретения является создание высокоспецифичного, чувствительного, простого и быстрого в исполнении способа и соответствующего набора для детекции и идентификации холерного вибриона в материале от больных людей и объектов окружающей среды с использованием праймеров, позволяющих одновременно выявить и оценить возбудитель холеры - Vibrio cholerae по трем признакам: серогруппа, биовар, токсигенность (эпидемическая значимость).
Техническим результатом, достигаемым заявляемой группой изобретений, является высокоспецифичное и быстрое выявление возбудителя холеры с одновременным определением биовара, серогруппы, токсигенности.
Технический результат достигается способом для индикации и идентификации возбудителя холеры - Vibrio cholerae в материале от больных и из объектов окружающей среды, при котором для постановки одноэтапной ПЦР выбраны и синтезированы три пары праймеров:
к участку wbeN гена wbf кластера, кодирующего синтез 01 - антигена,
- wbeN1 - 5'-ATCAGTTTGCTTGCGCTTCTCC-3',
- wbeN2 - 5'-ATCTGGACATCGCATCGCAC-3',
обеспечивающие образование фрагмента размером 420 п.н.;
к участку ctx А гена, кодирующему синтез субъединицы А холерного энтеротоксина,
- ctx2 - 5'-GGAGCCGGCATTCATCTGAA-3',
- ctx3 - 5'-TTTCGGGCCATCTCCACTGA-3',
обеспечивающие образование фрагмента размером 564 п.н.;
к участку специфичного для холерных вибрионов биовара эльтор hly А гена, кодирующего синтез гемолизина,
hly1 - 5'-CGGGCAGATTCTAGACCTG-3',
hly2 - 5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3',
обеспечивающие образование фрагмента размером 264 п.н.;
амплифицирующиеся по программе для амплификаторов с регулированием температуре по матрице: предварительная денатурация 95°С - 5 мин, 5 циклов из 95°С - 40 с, 62°С - 40 с, 72°С - 40 с, 30 циклов из 95°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин, и для аплификаторов с активным регулированием температуры (по раствору в пробирке): 95°С - 5 мин, 5 циклов из 95°С - 10 с, 62°С - 10 с, 72°С - 10 с, 30 циклов из 95°С - 7 с, 60°С - 7 с, 72°С - 7 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин, с учетом результатов реакции по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК при сравнении с контрольными образцами.
Технический результат также достигается набором для детекции и идентификации возбудителя холеры, включающим компоненты для проведения ПЦР: 2-кратный буферный раствор с бромфеноловым синим и фиколлом 400, рН 8,5, минеральное масло, деионизированную стерильную воду, положительный контроль, фермент Taq-полимеразу, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, смесь олигонуклеотидных праймеров WbeN1 - WbeN2, ctx2-ctx3, hly1-hly2 в соотношении 1,5:1,2:1 соответственно, причем компоненты разделены слоем 20% парафина на две реакционные смеси, одна из которых содержит в 5 мкл раствор дНТФ и праймеры: wbeN1 5'-ATCAGTTTGCTTGCGCTTCTCC-3' и wbeN2 5'-ATCTGGACATCGCATCGCAC-3', hly1 5'-CGGGCAGATTCTAGACCTG-3' и hly2 5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3', ctx2 5'-GGAGCCGGCATTCATCTGAA-3' и ctx3 5'-TTTCGGGCCATCTCCACTGA-3', вторая смесь - 2 кратный буфер, в который ex tempore вводится фермент Taq-полимераза, находящийся в отдельной микропробирке, а также компоненты для выделения ДНК и анализа результатов диагностики.
Синтез олигонуклеотидов выполняют фосфоамитидным методом. Например, на синтезаторе ДНК ASM-800 фирмы «Биосет».
Обоснование выбора праймеров.
Показана возможность биотипирования токсигенных штаммов холерных вибрионов по амплификации в ПЦР top А гена, нуклеотидная последовательность которого отличается у классического и эльтор биоваров (Keasler S.P., Hall R.H./ Lancet. - 1993. - Vol.341. - P.1661; Karaolis D.K.R. et al. PNAS. - 1998. - Vol.95. - P.3134-3139). Однако от вибрионосителей и из объектов окружающей среды часто выделяют штаммы V. cholerae, не содержащие ctx А и topA генов. Нами выбран hly А ген, который присутствует в геноме у всех холерных вибрионов, но у классического биовара в нем имеется делеция размером 11 п.н.
Для выявления O1 серогруппы Vibrio cholerae подобраны праймеры, обеспечивающие амплификацию участка wbeN гена размером 420 п.н.. По данным S. Yamasaki et al. [FEMS Microbiol. Letters. - 1999. - Vol.179. - P.115-121] указанный фрагмент входит в группу генов gmd-wbeO, которые встречаются только у холерных вибрионов 01 серогруппы.
На основании представленных в базе данных NCBI GenBank нуклеотидных последовательностей выбранных генов, с помощью программы Primer Premier-V5 (Premier Bio Soft International) и алгоритма BLAST подобранны олигонуклеотидные праймеры wbeN1 - wbeN2 на wbeN ген, входящий в кластер генов, отвечающих за синтез 01 антигена, а также праймеры hly1-hly2 на hly А ген, нуклеотидная последовательность которого специфична для холерных вибрионов биовара эльтор и холерных вибрионов не-01 серогруппы.
Для определения эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae использовали известные праймеры комплементарные ctxA гену, кодирующему А-субъединицу холерного токсина [Fields P.I. et al. J. Clin. Microbiol. - 1992. - P.2128-2121].
Специфичность праймеров оценивали методом множественного сравнения последовательностей, используя программное обеспечение, например BLAST (Lastaew для оценки полиморфизмов в сравниваемых последовательностях).
Праймеры wbeN1 - wbeN2 расположены на участке гена wbeN и инициирует амплификацию продукта 420 п.н. (фиг.1).
Праймеры hly1-hly2 расположены на участке гена hlyA и инициируют амплификацию продукта 264 п.н. (фиг.2).
Данные праймеры не образуют вторичных структур (шпилек) и димеров, способствует эффективному связыванию их с матричной ДНК.
Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для выполнения мультилокусной ПЦР. Подобранная концентрация праймеров wbeN1-wbeN2, ctx2-ctx3, hly1-hly2 - в соотношении 1,5:1,2:1 соответственно, фермента Tag - полимеразы в концентрации 1,25 ед. необходима и достаточна для обеспечения высокой специфичности и эффективности проведения реакции и позволяют получить легко детектируемые количества ампликонов.
При использовании режима регулирования температуры по матрице и по раствору в пробирке определен диапазон температур, время отжига праймеров, эффективное число циклов (таблица 1).
Аналитические характеристики.
Предварительная оценка аналитической специфичности используемых праймеров с помощью on-line сервера BLAST (blast) показала отсутствие гомологии выбранной последовательности с другими видами микроорганизмов при уровне значимости Е=10.
+
-
+
-
Экспериментальная оценка чувствительности и специфичности мультилокусной ПЦР проведена методом 10-кратных разведении следующих культур: 5 штаммов V.cholerae classica, 10 - V.cholerae eltor ctx A, 10 - V.cholerae eltor ctx A, 10 - V.cholerae O139 ctx A, 10 - V.cholerae O139 ctx A, 50 - V.cholerae non-01 non-O139, 7 - Escherichia coli, 6 - Shigella spp., 5 - Salmonella spp., 4 - Pseudomonas spp., 3 - Aeromonas spp., 3 - Alcaligenes faecalis, 3 - Comamonas spp., 3 - Corynebacterium diphteriae, 3 - Listeria monocitogenes, 3 - Plesiomonas shigelloides, 3 - Proteus vulgaris, 3 - Serracia marcescens, 2 - Enterococcus spp., 1 - Citrobacter freundii, 1 - Erysepelotrix rhusiopthiae, 1 - Lactobacillus casei, 1 - Sarcina aurantica (таблица 2).
На фиг 3 представлены результаты специфичности мультиплексной ПЦР:
5
1. V.cholerae classica 569 В - 1×10 м.к./мл,
4
2. V.cholerae classica 16126 - 1×10 м.к./мл,
4
3. V.cholerae eltor P15243 (ctxA+)- 1×10 м.к./мл,
4
4. V.cholerae eltor M-1344 (ctxA+) - 1×10 м.к./мл,
4
5. V.cholerae eltor 1 (ctxA+) - 1×10 м.к./мл,
7
6. E.coli 0111-BH-3133 - 1×10 м.к./мл,
6
7. V.cholerae eltor M-1231 (ctxA-) - 1×10 м.к./мл,
6
8. V.cholerae eltor M-1246 (ctxA-) - 1×10 м.к./мл,
5
9. V.cholerae non-O1 P-9741 - 1×10 м.к./мл,
5
10. V.cholerae eltor KM-26 (ctxA-) - 1×10 м.к./мл,
6
11. V.cholerae O28 12630-62 (ctxA-) - 1×10 м.к./мл,,
12. К+ - ДНК V. cholerae eltor М-1289 в концентрации 1 нг/мкл,
13. Отрицательный контроль.
На фиг.4 представлены результаты чувствительности мультиплексной ПЦР:
с тремя парами праймеров на три ДНК-мишени: ctxA ген (фрагмент размером 564 п.н.), wbeN (фрагмент размером 420 п.н.), hlyA (фрагмент размером 264 п.н.) где:
1. К+ - ДНК V.cholerae eltor М-1289 в концентрации 1 нг/мкл,
5
2. V.cholerae eltor M-1289 - 1×10 м.к./мл,
4
3. V.cholerae eltor M-1289 (ctxA+) - 1×10 м.к./мл,
3
4. V.cholerae eltor M-1289 (ctxA+) - 1×10 м.к./мл,
5. Отрицательный контроль.
С двумя парами праймеров на wbeN и hlyA гены - для определения принадлежности к O1 серогруппе и биотипирования:
6. К+ - ДНК V.cholerae eltor M-128 9 в концентрации 1 нг/мкл,
5
7. V.cholerae eltor M-1289 (ctxA+) - 1×10 м.к./мл,
4
8. V.cholerae eltor M-1289 (ctxA+) - 1×10 м.к./мл,
3
9. V.cholerae eltor M-1289 (ctxA+) - 1×10 м.к./мл,
4 м
10. V.cholerae non-O1 P-9741 - 1×10.к./мл,
3
11. V.cholerae non-O1 P-9741 - 1×10 м.к./мл,
12. Отрицательный контроль.
n
n
Концентрация микробных клеток в бактериальных суспензиях по данным контрольного высева составила для V.cholerae eltor M-1289 - 0,7×10 м.к./мл, V.cholerae non-O1 P-9741 - 0,13×10 м.к./мл.
В результате проведенной оценки установлено, что выбранные праймеры для детекции и характеристики холерных вибрионов
wbeN1 -5'-ATCAGTTTGCTTGCGCTTCTCC-3',
wbeN2 - 5'-ATCTGGACATCGCATCGCAC-3',
hly1 - 5'-CGGGCAGATTCTAGACCTG-3',
hly2 - 5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3',
ctx2 - 5'-GGAGCCGGCATTCATCTGAA-3',
ctx3 - 5'-TTTCGGGCCATCTCCACTGA-3'
3
обладают высокой чувствительностью - 1×10 м.к/мл и специфичностью - 100%.
Заявляемый набор компонентов для детекции и характеристики возбудителя холеры методом мультилокусной ПЦР разделен на 3 комплекта:
комплект №1 содержит компоненты для выделения ДНК, упакованных в шесть пластиковых флаконов, содержащих раствор 1 (6М раствор гуанидинтиоционата), раствор 2 (4M раствор гуанидинтиоционата), раствор 3 (спиртосолевой раствор), ацетон, элюент для ДНК (ТЕ- буфер), 2 пластиковые пробирки с нуклеосорбентом;
комплект №2 содержит компоненты для проведения ПЦР, включающий 100 пластиковых пробирок с реакционной смесью 1 (праймеры и нуклеотиды под слоем парафина), 1 пластиковую пробирку с реакционной смесью 2 (буфер и деонизованная вода), 1 пластиковую пробирку, содержащую Taq-полимеразу, 3 пластиковых пробирки с минеральным маслом, 1 пластиковую пробирку с ТЕ-буфером, 1 пластиковую пробирку, содержащую контрольный положительный образец;
комплект №3 содержит компоненты для анализа результатов анализа и включает 1 пластиковый флакон, содержащий 50хТАЕ с бромидом этидия и 2 флакона с агарозой для электрофореза.
Предлагаемый набор компонентов укомплектован 10 пластиковыми флаконами и 109 пластиковыми пробирками.
Набор предназначен для выявления ДНК возбудителя холеры (Vibrio cholerae) в пробах биологического материала и объектов окружающей среды, определения его серогруппы, биовара и эпидемической значимости методом мультилокусной полимеразной цепной реакции. Набор рассчитан на проведение 100 определений, включая контрольные образцы.
Заявляемый способ детекции возбудителя холеры включает следующие этапы.
а) Выделение ДНК (комплект №1).
в) Проведение ПЦР (комплект №2).
ПЦР проводят в один этап с использованием принципа «горячего старта», достигая его разделением двух реакционных смесей слоем 20% парафина по следующей программе для амплификаторов с регулированием температуре по матрице: предварительная денатурация 95°С - 5 мин, 5 циклов из 95°С - 40 с, 62°С - 40 с, 72°С - 40 с, 30 циклов из 95°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин, и для аплификаторов с активным регулированием температуры (по раствору в пробирке): 95°С - 5 мин, 5 циклов из 95°С - 10 с, 62°С - 10 с, 72°С - 10 с, 30 циклов из 95°С - 7 с, 60°С - 7 с, 72°С - 7 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин, что значительно сокращает время исследования.
с) Анализ результатов (комплект 3).
Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР осуществляют методом горизонтального гельэлектрофореза в 2% агарозе. Учет результатов ПЦР-анализа проводят по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК при сравнении с контрольными образцами (положительный и отрицательный). В качестве положительного контрольного образца использована ДНК штамма Vibrio cholerae, содержащего гены hlyA, cthA и wbeN. Оценка получаемых данных представлена в таблице 3.
Способ детекции возбудителя холеры с использованием заявляемого набора выполняют следующим образом.
1. Выделение ДНК осуществляют с использованием комплекта №1.
- Комплект для выделения ДНК извлекают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре. Все реагенты комплекта добавляют отдельными наконечниками с помощью автоматических микропипеток.
- Раствор 1 прогревают при температуре 60-65°С до полного растворения кристаллов, после чего добавляют к обеззараженным пробам в объеме 300 мкл. Пробы тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхиватиле и инкубируют при температуре 65°С.
- Сорбент тщательно ресуспендируют на микроцентрифуге/встряхиватиле. В каждую пробирку вносят 25 мкл подготовленного сорбента, перемешивают на микроцентрифуге/встряхиватиле 30 с и оставляют в штативе на 2 минуты. Процедуру повторяют дважды. Затем пробирки центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 с, супернатант удаляют.
- К осадку добавляют 300 мкл раствора 2. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 с, супернатант удаляют.
- К осадку добавляют 500 мкл раствора 3. Содержимое пробирки перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе до гомогенного состояния и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 с. Супернатант удаляют, отмывку раствором 3 повторяют.
- К осадку добавляют 400 мкл ацетона. Содержимое перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе, затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 с, супернатант удаляют.
- Осадок высушивают при температуре 65°С в течение 5-7 мин.
- К осадку добавляют 50 мкл ТЕ-буфера и выдерживают при температуре 65°С в течение 10 мин, встряхивая на микроцентрифуге/встряхивателе 2-3 раза. По окончании взвесь центрифугируют при 1200 об/мин в течение 1 мин. Супернатант содержит очищенную ДНК.
2. Проведение ПЦР-амплификации ДНК (комплект 2).
- Извлекают из холодильника необходимое количество микропробирок с реакционной смесью 1, соответствующее числу исследуемых проб, а также для положительного и отрицательного контроля.
- В отдельной микропробирке объемом 0,6 мл объединяют на каждую пробу по 10 мкл реакционной смеси 2 и по 0,25 мкл Taq-полимеразы, полученную смесь перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и переносят по 10 мкл в подготовленные микропробирки с реакционной смесью 1, не повреждая слой парафина.
- В пробирки в реакционную смесь 1 вносят по 10 мкл ДНК из исследуемых проб и контролей, не повреждая слой парафина.
- Микропробирки переносят в термоциклер, предварительно нагретый до температуры 95°С, и проводят амплификацию по соответствующей программе для каждого типа регулировки температуры.
Время проведения ПЦР составляет 1 ч 30 мин.
3. Анализ результатов диагностики (комплект 3).
- Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР проводят методом горизонтального гельэлектрофореза в 2% агарозе.
- Для подготовки 50 мл 2% агарозного геля к 1 г агарозы добавляют 50 мл 1×TAE буфера с бромидом этидия. Смесь помещают в термостойкую колбу и нагревают на кипящей водяной бане до полного расплавления агарозы, после чего охлаждают до температуры 50°С и выливают на подготовленный столик для заливки геля.
- Учет результатов ПЦР-анализа проводят по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК. Оценка полученных данных представлена в таблице 3.
Время проведения анализа составляет 2,5 ч.
Пример конкретного исполнения.
3
Материалом для исследования служили 2 пробы испражнения массой 1 г: один образец интактный, а второй - контаминированный возбудителем холеры биовара эльтор до конечной концентрации 1×10 м.к./г, и 2 пробы воды открытых водоемов из различных источников, каждая объемом 0,5 л.
К пробам испражнений добавили 9 мл физиологического раствора и тщательно перемешали. Полученную суспензию перенесли в центрифужные пробирки объемом 15 мл и центрифугировали в течение 2-3 мин при 5000 об/мин для удаления крупных частиц. Надосадочную жидкость центрифугировали в течение 15 мин при 10000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 100 мкл физиологического раствора.
Пробы воды дробно центрифугировали: первоначально в течение 2-3 мин при 5000 об/мин, затем супернатант центрифугировали в течение 15 мин при 10000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 0,1 мл физиологического раствора.
К подготовленным, таким образом, пробам добавляли 300 мкл раствора 1 из комплекта 1 (раствор перед началом исследования прогревали на водяной бане до полного растворения кристаллов). Пробы инкубировали в течение 10 мин при 65°С, после добавляли 25 мкл сорбента из комплекта 1. Тщательно перемешивали на микроцентрифуге/встряхивателе и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Перемешивания сорбента осуществляли каждые 2 мин. После чего пробы центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 с, супернатант удаляли.
Затем осадок отмывали однократно раствором 2 из комплекта 1, двукратно раствором 3 из комплекта 1 и однократно ацетоном из комплекта 1. После последней отмывки ацетоном супернатант удаляли наиболее тщательно. Осадок высушивали при температуре 65°С в течение 5-7 мин.
Затем к осадку добавляли 50 мкл ТЕ-буфера и выдерживали при температуре 65°С в течение 10 мин, встряхивая на микроцентрифуге/встряхивателе 2-3 раза. По окончании взвесь центрифугировали при 1200 об/мин в течение 1 мин. С полученным раствором выделенного и очищенного препарата ДНК проводили ПЦР, используя комплект 2.
Для этого из холодильной камеры достали 6 микропробирок с готовой реакционной смесью 1:4 пробирки для исследуемых проб и 2 для положительного и отрицательного контроля.
В отдельную микропробирку объемом 0,6 мл внесли 60 мкл раствора реакционной смеси 2 из комплекта 2 (из расчета 10 мкл на одну пробирку) и 1,5 мкл Taq-полимеразы (которую достали из морозильной камеры). Полученную смесь перемешивали на микроцентрифуге/встряхивателе и переносили по 10 мкл в подготовленные микропробирки с реакционной смесью 1, не повреждая слой парафина.
После чего в пробирки вносили по 10 мкл по 10 мкл ДНК из исследуемых проб, ДНК положительного контроля и 10 мкл ТЕ-буфера, не повреждая слой парафина.
Микропробирки перенесли в термоциклер РТС-100 «MJ Research», предварительно нагретый до температуры 95°С и провели амплификацию по соответствующей программе для амплификаторов с регулировкой температуры по матрице: предварительная денатурация 95°С - 5 мин, 5 циклов из 95°С - 40 с, 62°С - 40 с, 72°С - 40 с, 30 циклов из 95°С - 30 с, 60°С - 30 с, 72°С - 30 с, заключительная достройка цепи 72°С - 5 мин.
После окончания термоциклирования пробы нанесли на агарозный гель и проводили электрофорез в течение 20 мин при 200 В. Агарозный гель готовили на 1×TAE с бромидом этидия, камеру для электрофореза заполняли аналогичным буфером. После окончания процесса гель промывали в проточной воде и помещали на УФ-трансиллюминатор. Учет и документирование результатов осуществляли на гель-документирующей системе GelDoc (BioRad).
На электрофореграмме (фиг.5) были зафиксированы следующие фрагменты.
1. Проба 1. Интактные испражнения - фрагментов нет.
2. Проба 2. Испражнения, искусственно инфицированные возбудителем холеры биовара эльтор - три фрагмента, соответствующие по размеру фрагментам положительного контроля: 564, 420 и 264 п.н.
3. Проба 3. Вода открытых водоемов 1 - два фрагмента, соответствующих по размеру фрагментам положительного контроля 420 и 264 п.н.
4. Проба 4. Вода открытых водоемов 2 - один фрагмент, соответствующий по размеру фрагменту положительного контроля 264 п.н.
5. Проба положительного контроля - три фрагмента размером 564, 420 и 264 п.н.
6. Проба отрицательного контроля - фрагментов нет.
Интерпретацию результатов проводили в соответствии с идентификационной таблицей 3.
В отрицательном контроле фрагментов не выявлено - результаты реакции можно учитывать.
В положительном контроле - выявляются три фрагмента размером 564, 420 и 264 п.н. - результаты реакции можно учитывать.
Проба 1. Интактные испражнения - результат отрицательный - ДНК холерных вибрионов не обнаружена.
Проба 2. Испражнения, искусственно инфицированные возбудителем холеры биовара эльтор - результат положительный - выявлена ДНК токсигенных (эпидемически опасных) холерных вибрионов O1 серогруппы биовара Эльтор.
Проба 3. Вода открытых водоемов 1 - результат положительный - выявлена ДНК нетоксигенных (эпидемически не опасных) холерных вибрионов O1 серогруппы биовара Эльтор.
Проба 4. Вода открытых водоемов 2 - результат положительный - выявлена ДНК нетоксигенных (эпидемически не опасных) холерных вибрионов не-O1 серогруппы.
Преимуществом заявляемой группы изобретения является то, что реакцию проводят в один этап, что облегчает проведение анализа, сокращает время получения результатов в два раза и снижает риск контаминации проб ампликонами, повышает информативность ПЦР-анализа. Кроме того, модификация состава буфера уменьшает трудозатраты на этапе учета результатов. Подобранные высокоспецифичные праймеры позволяют выявлять возбудителя холеры, определять биовар, серогруппу и токсигенность.
Таким образом, предлагаемые способ и набор обладают новизной: подобраны специфичные праймеры для ограничения участков генома Vibrio cholerae: фрагмента wbeN гена, отвечающего за синтез 01 антигена, фрагмента hlyA гена, характерного только для холерных вибрионов биовара эльтор, ctxA гена кодирующего А-субъединицу холерного токсина; оптимальный состав реакционной смеси для выполнения мультилокусной ПЦР; оптимальные условия отжига, что позволяет одновременно выявлять возбудителя холеры, определять биовар, серогруппу и токсигенность, а также значительно сокращать время анализа, достигать высокого уровня чувствительности и специфичности.
Способ и набор для детекции и характеристики возбудителя холеры методом мультилокусной полимеразной цепной реакции
Таблица 1
Программа амплификации
Амплификаторы с регулированием по матрице: типа "MJ Reseachr"
Амплификаторы с активным регулированием (по пробиркам): типа "Терцик"
Температура, °С
Время
Циклов
Температура, °С
Время
Циклов
Т
95
Пауза
95
Пауза
2
95
5 мин
1
95
5 мин
1
Т
95
40 с
5
95
10 с
5
т
62
40 с
62
10 с
5
72
40 с
72
10 с
6
95
30 с
30
95
7 с
30
60
30 с
60
7 с
72
30 с
72
7 с
72
5 мин
1
72
5 мин
1
4
10
Хранение
10
Хранение