ПОИСК БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ С ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПО ЭНЕРГИИ СВЯЗЫВАНИЯ С ЦИКЛООКСИГЕНАЗАМИ 1 И 2
SEARCH FOR BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES WITH ANTI-INFLAMMATORY ACTION ON BINDING ENERGY WITH CYCLOOXYGENASES 1 AND 2

Изобретение относится к биологии и медицине и касается способа поиска биологически активных веществ с противовоспалительным действием по энергии связывания с циклооксигеназами 1 и 2.
Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ отбора противовоспалительных лекарственных средств [1], при котором исследуемое вещество растворяют в трихлориде мышьяка и регистрируют ПМР-спектр, затем рассчитывают величину химического сдвига протона группы NH, связанного с фенильным радикалом антраниловой кислоты, и по его величине осуществляют отбор противовоспалительных средств. Данный способ взят за прототип.
Предлагаемый способ позволяет расширить круг поиска веществ с противовоспалительным действием (ПВД) на основе взаимодействия с ферментами циклооксигеназа (ЦОГ) 1 и 2.
ЦОГ1
ЦОГ2
ЦОГ является одним из ключевых ферментов, принимающих участие в развитии воспаления, известны две ее изоформы: ЦОГ 1 и 2. Важным с фармакологической точки зрения отличием является то, что ЦОГ 1 в 523 положении содержит более гидрофобную аминокислоту - изолейцин (ЦОГ 2 в аналогичном положении содержит валин). Патентуемый способ предусматривает связь противовоспалительного действия веществ с энергиями связывания Be (Ве и Ве) по ферментам ЦОГ 1 и 2. Взаимодействие с ЦОГ 1 и 2 изучено методом молекулярной стыковки с помощью программы AutoDock 4, в качестве мишеней использовали кристаллографические копии ферментов, полученные рентгеноструктурным анализом и представленные в виде pdb - файлов, которые взяты из базы данных Brookhaven Protein Data Bank: ЦОГ 1 (PDB ID code: 3N8X [2]) и ЦОГ 2: (PDB ID code: 1PXX [3]).
Задача изобретения - поиск новых биологически активных веществ с противовоспалительным действием по энергии связывания с циклооксигеназами 1 и 2.
Патентуемый способ заключается в возможности отбора соединений на основе энергии связывания с циклооксигеназами 1 и 2 путем выявления интервалов биологически активных веществ, представленных по ЦОГ 1 (метод по ЦОГ 1) и ЦОГ 2 (метод по ЦОГ 2) отвечающих определенным требованиям, описанным в формуле изобретения.
Для достижения результата необходимо выполнить следующие действия:
I. Отобрать производные антраниловой кислоты в количестве 70 соединений (табл. 1 и 3).
эксп.,
II. Ввести экспериментальные данные (ПВД %), определенные на модели «каррагенинового отека» на крысах (табл. 1 и 3).
III. Рассчитать энергии связывания с ферментами ЦОГ 1 и 2 каждого соединения.
эксп.,
IV. Данные расчета по ЦОГ 1 и 2 внести в таблицы 1 и 3 по мере уменьшения величин энергий связывания с указанием структуры соединения и ПВД %.
V. Осуществить выбор интервалов биологически активных веществ, у которых ПВД превышает 30% (табл. 1 и 3).
VI. Провести проверку на выборке веществ, не включенных в состав 70 соединений (табл. 2 и 4).
Предлагаемая в способе последовательность действий и операций над химическими соединениями и лабораторными животными, позволяет получить технический результат - способ прогнозной оценки веществ по энергии связывания с циклооксигеназами 1 и 2, которые влияют на противовоспалительный эффект.
Для всех соединений было определено ПВД на беспородных белых крысах массой 180-220 г на модели «каррагенинового отека» лапы. Исследуемые соединения в дозе 50 мг/кг вводили внутрибрюшинно в виде взвеси в 2% крахмальной слизи за 1 ч до введения каррагенина. Величину воспалительной реакции оценивали онкометрически по изменению объема воспаленной конечности через 4 ч после введения 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина [4].
ЦОГ1
ЦОГ2
эксп.,
Предварительно проводится расчет энергий связывания Be (Ве и Ве) с ферментами ЦОГ 1 и 2, методом молекулярной стыковки с использованием программы AutoDock 4, и данные расчета внести в таблицы 1 и 3 по мере уменьшения величин энергий связывания с указанием структуры соединения и ПВД %.
На основе полученных данных составляют методы поиска по ферментам ЦОГ 1 (метод по ЦОГ 1) и ЦОГ 2 (метод по ЦОГ 2) с использованием энергии связывания (Be), которые приведены в таблице 5. Проводят прогноз соединений с ПВД отек торможения, которых свыше 30%.
Исследование соединений по энергии связывания с циклооксигеназой 1 (метод по ЦОГ 1)
ЦОГ1
ЦОГ1
Для расчета биологически активных веществ методом по энергии связывания с ЦОГ 1 (Ве) отобрано 70 соединений которые располагаются в таблице 1 в порядке уменьшения Ве и введением соответствующих каждому соединению значений ПВД экспериментального.
ЦОГ1
Результат исследований связи экспериментально определенного противовоспалительного действия с энергией связывания по ЦОГ 1 (Ве) способствовал выявлению областей биологически активных веществ (торможение отека свыше 30%): (-1,31)÷(-1,67); (-3,87)÷(-5,34); (-6,12)÷(-9,12) (табл. 5).
Из 70 соединений использованных нами (табл. 1), 42 - попали в интервал биологически активной области энергии связывания, это составило 60%.
Это послужило основанием для отбора биологически активных веществ методом по ЦОГ 1, с использованием рассчитанной величины энергии связывания с ЦОГ 1, попадающей в определенные интервалы.
Выполнена проверка метода по ЦОГ 1 на примере 12 соединений, в список которых включен аналог по структуре мефенамовая кислоты и производное ряда фенилуксусной кислоты (ортофен) [5]. Предварительно рассчитаны значения энергии связывания с ферментом ЦОГ 1 (табл. 2).
ЦОГ1
Пример 1. Циклогексиламид N-(2-фураноил) 5-бромантраниловой кислоты (71). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-9,08.
Противовоспалительное действие изучали на модели «каррагенинового отека» лапы. Исследуемые соединения в дозе 50 мг/кг вводили внутрибрюшинно в виде взвеси в 2% крахмальной слизи за 1 ч до введения каррагенина. Величину воспалительной реакции оценивали онкометрически по изменению объема воспаленной конечности через 4 ч после введения 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина [4].
Торможение отека соединения составило 63,65%.
ЦОГ1
Пример 2. 3-Метилфениламид N-аллил-N-хлорацетил антраниловой кислоты (72). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-4,79. Торможение отека соединения составило 58,40%.
ЦОГ1
Пример 3. N-Этоксиоксалил антраниловая кислота (73). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-5,42. Торможение отека соединения составило 11,00%.
ЦОГ1
Пример 4. 4-Хлорфениламид N-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты (74). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-1,53. Торможение отека соединения составило 27,60%.
ЦОГ1
Пример 5. 4-Метоксифениламид N-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты (75). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-3,89. Торможение отека соединения составило 38,80%.
ЦОГ1
Пример 6. Гидразид N-ацетил-3,5-дибромантраниловой кислоты (76). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-6,68. Торможение отека соединения составило 56,50%.
ЦОГ1
Пример 7. Амид N-(3-хлорпропионил)-5-бромантраниловой кислоты (77). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-6,31. Торможение отека соединения составило 42,35%.
ЦОГ1
Пример 8. N-Фенилацетил антраниловая кислота (78). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-5,63. Торможение отека соединения составило 24,90%.
ЦОГ1
Пример 9. Метиламид N-(2-фураноил) 5-йод антраниловой кислоты (79). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-6,69. Торможение отека соединения составило 36,15%.
ЦОГ1
Пример 10. N-(4-метилбензоил)-5-йодантраниловая кислота (80). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-8,00. Торможение отека соединения составило 30,80%.
ЦОГ1
Пример 11. N-(2,3-диметилфенил)антраниловая кислота (мефенамовая кислота) (81). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-6,36. Торможение отека соединения составило 46,20%.
ЦОГ1
Пример 12. Натриевая соль 2,6-дихлорфенилуксусной кислоты (ортофен) (82). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 1, рассчитали энергию связывания Ве=-6,20. Торможение отека соединения составило 56,30%.
Из 12 соединений, использованных нами, 10 - попали в интервал биологически активной области энергии связывания (табл. 5), это составило 83,3%. Из этих 10 соединений 9 проявили в эксперименте противовоспалительную активность, что составило 90% (табл. 2).
ЦОГ1
Сравнение данных таблиц 1 и 2 показывает, что проведение анализа по предлагаемому способу расширяет круг анализируемых веществ за счет использования энергии связывания по ферменту ЦОГ 1 (Ве).
Исследование соединений по энергии связывания с циклооксигеназой 2 (метод по ЦОГ 2)
ЦОГ2
ЦОГ2
Для расчета биологически активных веществ методом по энергии связывания с ЦОГ 2 (Ве) отобрано 70 соединений которые располагаются в таблице 3 в порядке уменьшения Ве и введением соответствующих каждому соединению значений ПВД экспериментального.
ЦОГ2
Результат исследований связи экспериментально определенного противовоспалительного действия с энергией связывания по ЦОГ 2 (Ве) способствовал выявлению областей биологически активных веществ (торможение отека свыше 30%): (-5,78)÷(-6,11); (-6,19)÷(-9,45) (табл. 5).
Из 70 соединений использованных нами (табл. 3), 50 - попали в интервал биологически активной области энергии связывания, это составило 71,4%.
Это послужило основанием для отбора биологически активных веществ методом по ЦОГ 2, с использованием рассчитанной величины энергии связывания с ЦОГ 2, попадающей в определенные интервалы.
Проведена проверка метода по ЦОГ 2 на примере 12 соединений, в список которых включен аналог по структуре мефенамовая кислоты и производное ряда фенилуксусной кислоты (ортофен) [5]. Предварительно рассчитаны значения энергии связывания с ферментом ЦОГ 2 (табл. 4).
ЦОГ2
Пример 13. Циклогексиламид N-(2-фураноил) 5-бромантраниловой кислоты (71). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-9,00.
Противовоспалительное действие изучали на модели «каррагенинового отека» лапы. Исследуемые соединения в дозе 50 мг/кг вводили внутрибрюшинно в виде взвеси в 2% крахмальной слизи за 1 ч до введения каррагенина. Величину воспалительной реакции оценивали онкометрически по изменению объема воспаленной конечности через 4 ч после введения 0,1 мл 1% водного раствора каррагенина [4].
Торможение отека соединения составило 63,65%.
ЦОГ2
Пример 14. 3-Метилфениламид N-аллил-N-хлорацетил антраниловой кислоты (72). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-8,02. Торможение отека соединения составило 58,40%.
ЦОГ2
Пример 15. N-Этоксиоксалил антраниловая кислота (73). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-4,69. Торможение отека соединения составило 11,00%.
ЦОГ2
Пример 16. 4-Хлорфениламид N-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты (74). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-7,60. Торможение отека соединения составило 27,60%.
ЦОГ2
Пример 17. 4-Метоксифениламид N-(3'-хлорбутен-2'-ил) антраниловой кислоты (75). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-7,17. Торможение отека соединения составило 38,80%.
ЦОГ2
Пример 18. Гидразид N-ацетил-3,5-дибромантраниловой кислоты (76). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-6,30. Торможение отека соединения составило 56,50%.
ЦОГ2
Пример 19. Амид N-(3-хлорпропионил)-5-бромантраниловой кислоты (77). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-6,53. Торможение отека соединения составило 42,35%.
ЦОГ2
Пример 20. N-Фенилацетил антраниловая кислота (78). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-4,99. Торможение отека соединения составило 24,90%.
ЦОГ2
Пример 21. Метиламид N-(2-фураноил) 5-йодантраниловой кислоты (79). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-6,11. Торможение отека соединения составило 36,15%.
ЦОГ2
Пример 22. N-(4-метилбензоил)-5-йодантраниловая кислота (80). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-7,52. Торможение отека соединения составило 30,80%.
ЦОГ2
Пример 23. N-(2,3-диметилфенил)антраниловая кислота (мефенамовая кислота) (81). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-6,62. Торможение отека соединения составило 46,20%.
ЦОГ2
Пример 24. Натриевая соль 2,6-дихлорфенилуксусной кислоты (ортофен) (82). Выполнили молекулярный докинг по ферменту ЦОГ 2, рассчитали энергию связывания Ве=-7,87. Торможение отека соединения составило 56,30%.
Из 12 соединений, использованных нами, 10 - попали в интервал биологически активной области энергии связывания (табл. 5), это составило 83,3%. Из этих 10 соединений 9 проявили в эксперименте противовоспалительную активность, что составило 90% (табл. 4).
ЦОГ2
Сравнение данных таблиц 3 и 4 показывает, что проведение анализа по предлагаемому способу расширяет круг анализируемых веществ за счет использования энергии связывания по ферменту ЦОГ 2 (Ве).
ЦОГ1
ЦОГ2
Предлагаемый способ экономически выгоден и прост, так как позволяет по структурной формуле рассчитать энергии связывания с ферментами циклооксигеназ 1 и 2 и с достаточно высокой точностью выполнить поиск биологически активных соединений в отличие от патента [1], где проведены экспериментальные исследования над анализируемыми соединениями. При проведении контроля на проверочной выборке (12 соединений) процент точности прогноза по ЦОГ 1 и 2 составляет 90%, против 88,3% указанных в патенте [1]. Описанный принцип отбора противовоспалительных средств можно использовать и для других рядов химических соединений. Патентуемый способ предназначен для поиска веществ с противовоспалительной активностью на основе связи Ве и Ве с противовоспалительным действием.
Литература
1. Патент 2043621. Рос. Федерация. Способ отбора противовоспалительных средств / Коркодинова Л.М., Марданова Л.Г. №5062070/25; заявл. 10.09.1992; опубл. 10.09.1995.
2. Sidhu R.S., Lee, J.Y., Yuan С.. Comparison of Cyclooxygenase-1 Crystal Structures: Cross-Talk between Monomers Comprising Cyclooxygenase-1 Homodimers. // Journal Biochemistry., 49: 7069-7079 (2010).
3. Rowlinson S.W., Kiefer J.R.. A Novel Mechanism of Cyclooxygenase-2 Inhibition Involving Interactions with Ser-530 and Tyr-385. // Journal Biol. Chem., 278: 45763-5769 (2003).
4. Тринус Ф.П., Клебанов Б.М., Кондратюк В.И. Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению нестероидных противовоспалительных фармакологических веществ. М., Минздрав СССР, с. 16 (1983).
5. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 16-е изд., перераб., испр. и доп. - М.: Новая волна, с. 175-176, 180, (2012).