ЦИТОЛОГИЧЕСКАЯ И ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ФИКСИРУЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ОКРАШИВАНИЯ
CYTOLOGICAL AND HISTOLOGICAL FIXING COMPOSITION AND STAINING METHOD

Настоящее изобретение относится к композиции для фиксации тканей, клеток или компонентов клеток на предметных стеклах в целях их окрашивания и анализа.
Изобретение относится также к способу получения этого фиксатора и к его применению в гистологии или цитологии. Особым применением настоящего изобретения является способ окрашивания тканей, клеток или компонентов клеток, в частности для крови и костного мозга, с использованием этого фиксатора.
Для идентификации тканей, клеток или частей клеток используют методы окрашивания клеток, комбинируемые с исследованием под микроскопом или с помощью систем анализа изображений.
Эти методы окрашивания необходимы во многих областях биологии, а также в фундаментальных исследованиях, например в медицинском или ветеринарном анализе для гистологической диагностики или цитодиагностики.
В частности, в гематологии уже очень много лет используют окрашивание, известное под названием МГГ (от Май-Грюнвальд/Гимза). Этот способ окрашивания состоит в:
- фиксации клеток, которые требуется окрасить, на предметном стекле раствором Май-Грюнвальда, состоящим из эозин-метиленового синего, растворенного в метаноле,
- контактировании предметного стекла с буферным раствором,
- затем в контактировании с раствором Гимза, состоящим из синего и азур II-эозина, растворенного в метаноле, с глицерином,
- и, наконец, в промывке предметного стекла и сушке.
В этом случае получают окрашивания, известные всем практикующим врачам, что делает этот метод стандартным и позволяет устанавливать надежное сравнение.
Однако окрашивание по МГГ имеет много недостатков. В частности, в нем используются токсичные и летучие растворители. Кроме того, присутствие глицерина также создает неудобства, так как он затрудняет промывку предметных стекол и может вызвать забивку фильтров при фильтрации.
Кроме того, чтобы получить хорошее окрашивание, важно, чтобы краситель был стабильным и не оставлял отложений красителей после промывки предметного стекла. Однако при использовании МГГ такие отложения могут появляться. Эти отложения мешают работе автоматических устройств окрашивания и систем распознавания клеток и затрудняют распознавание разных клеточных элементов и различение здоровых клеток и больных клеток в случае цитодиагностики.
Чтобы устранить эти недостатки, были попытки заменить МГГ другими способами окрашивания.
Однако большинство способов, разработанных для замены МГГ, не позволяют ни сохранить воспроизводимость, важнейшую для анализа, ни получить сравнимые результаты.
Кроме того, как и способ МГГ, они используют метанол как для получения самих красителей, так и раствора для фиксации клеток. Действительно, метанол имеет особые физические свойства, которые позволяют ему хорошо фиксировать клетки.
Однако метанол является токсичным и летучим продуктом, использование которого желательно ограничить, так как он может оказаться опасным для врача-практика.
Предлагались решения заменить метанол этанолом, но один этанол не дает удовлетворительных результатов, в частности, когда он применяется для фиксации.
Другие решения состоят в использовании в качестве фиксатора клеточных структур пикриновой кислоты, формальдегида, глутаральдегида или же осмиевой кислоты.
Однако хотя полученные результаты могут быть качественными, присутствие токсичных продуктов влечет опасность для людей, вынужденных обращаться с ними.
Кроме того, с созданием систем анализа изображений необходимо использовать окрашивающие автоматы, чтобы всегда обеспечивать идентичное протекание стадий окрашивания. Однако при современных реагентах и продуктах фиксации эти автоматы требуют сложного обслуживания, так как эти реагенты и продукты вызывают быстрое засорение схем и емкостей.
Наконец, известно, что исторически сложилось так, что в разных странах окрашивающие реактивы могут быть разными, даже в одной и той же области биологии. Это отражается в разных цветах и более или менее резкой визуализации того или иного типа клеточного элемента. В гематологии классически различают окрашивания, использующие комбинацию окрашивающих реагентов (как краситель МГГ, применяющийся в странах "европейской культуры"), и окрашивания, в которых применяется единственный окрашивающий реактив (как красители Райта и Лейшмана, использующиеся в странах "англосаксонской или азиатской культуры"). Однако применяющиеся в настоящее время фиксирующие растворы являются специфическими для данного способа окрашивания, и нельзя использовать один и тот же фиксатор для двух разных способов.
Таким образом, существует потребность в продуктах, предназначенных для окрашивания тканей, клеток или компонентов клеток, нетоксичных, стабильных, недорогих, легких в обращении, позволяющих получать воспроизводимые результаты и подходящие для окрашивающих автоматов. В частности, существует потребность в продукте для фиксации тканей, клеток или клеточных элементов на предметных стеклах в целях их исследования под микроскопом, который отвечает этим требованиям и который подходит для разных способов окрашивания.
На эти потребности отвечает настоящее изобретение, предлагая использовать гистологическую или цитологическую фиксирующую композицию, ослабляющую недостатки предшествующего уровня, особенно хорошо подходящую в области гематологии.
С этой целью изобретение направлено на применение композиции, содержащей по меньшей мере:
- спирт,
- диметилсульфоксид,
- этиленгликоль,
- воду и
- хлорид натрия,
для фиксации тканей, клеток или компонентов клеток на предметном стекле в целях их окрашивания и их микроскопического исследования или исследования системой анализа изображений.
Изобретение относится также к используемой гистологической или цитологической фиксирующей композиции или фиксатору.
Предпочтительно такая фиксирующая композиция не содержит токсичных продуктов. Она позволяет эффективно удерживать клетки в целях их окрашивания, чтобы получить воспроизводимые и стабильные результаты, которые можно легко исследовать под микроскопом или системами анализа изображений.
Изобретение относится также к способу получения этой композиции.
Предпочтительно фиксирующая композиция содержит также по меньшей мере один синий краситель и по меньшей мере один красный краситель и может использоваться одновременно для фиксации и окрашивания клеток.
Наконец, изобретение относится также к способу окрашивания клеток или клеточных элементов, подходящему, в частности, для крови и костного мозга, с использованием этой фиксирующей композиции.
Предпочтительно способ согласно изобретению позволяет получить воспроизводимые результаты очень хорошего качества. Кроме того, он является экономичным, быстрым, надежным, легким в применении и требует лишь низкого содержания красителей.
Далее изобретение будет описано подробно в сочетании с приложенными фигурами, на которых:
- фиг.1a показывает мазок крови перед окрашиванием по способу МГГ,
- фиг.1b показывает мазок крови после окрашивания по способу МГГ с плохой фиксацией,
- фиг.1c показывает мазок крови после окрашивания по Райту,
- фиг.1d показывает мазок крови после окрашивания по Лейшману,
- фиг.2a показывает мазок крови после фиксации и окрашивания композицией согласно изобретению, в результате применения способа окрашивания по МГГ,
- фиг.2b показывает мазок крови после фиксации и окрашивания композицией согласно изобретению, в результате применения способа окрашивания по Райту/Лейшману,
- фиг.3a показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 1 минуты смесью 70°-ный этанол + 2% этиленгликоля,
- фиг.3b показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 1 минуты смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля,
- фиг.3c показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля,
- фиг.4 показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид,
- фиг.5a показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 5 мл воды,
- фиг.5b показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 10 мл воды,
- фиг.5c показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 20 мл воды,
- фиг.6a показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 5 мл воды + 0,1 г хлорида натрия,
- фиг.6b показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 5 мл воды + 0,3 г хлорида натрия, и
- фиг.6c показывает мазок крови после быстрого окрашивания согласно способу, содержащему этап предварительной фиксации в течение 5 минут смесью 99,9°-ный этанол + 2% этиленгликоля + диметилсульфоксид + 5 мл воды + 0,2 г хлорида натрия.
Изобретение относится к применению для осуществления фиксации тканей, и/или клеток, и/или клеточных структур на предметном стекле в целях их окрашивания и их микроскопического исследования или исследования с помощью системы анализа изображений, композиции, содержащей по меньшей мере один спирт, диметилсульфоксид, этиленгликоль, воду и хлорид натрия.
Предпочтительно, композицию используют для фиксации клеток и/или клеточных структур крови или костного мозга.
Композиция может также предпочтительно содержать один или несколько красителей и применяться для осуществления одновременной фиксации и окрашивания тканей, и/или клеток, и/или клеточных структур.
Изобретение относится также к особой гистологической или цитологической фиксирующей композиции, называемой также фиксатором.
Под фиксирующей композицией, или фиксатором, в контексте настоящего изобретения понимается реагент, позволяющий остановить процессы аутолиза клеток и тканей, чтобы сохранить их в виде, как можно более близком тому, какой они имели в живом состоянии. Таким образом, такой реагент позволяет не нарушать морфологию и иммобилизовать клетки и ткани в целях получения микроскопических препаратов, которые можно бы было хранить. Он должен также позволять проводить дополнительные обработки, такие как окрашивание, гистохимические или иммунологические реакции, чтобы выявить некоторые структурные, функциональные или генетические аспекты клеток и тканей.
Композиция содержит по меньшей мере один спирт, диметилсульфоксид, этиленгликоль, воду и хлорид натрия.
Спирт может быть выбран из любых нетоксичных спиртов. Предпочтительно спирт является этанолом или изопропанолом.
Можно также использовать смесь спиртов.
Согласно одному особенно подходящему варианту осуществления, спирт является этанолом. Вода может быть деминерализованной водой или деионизованной водой.
Чтобы достичь лучшей эффективности композиции, вода и хлорид натрия должны присутствовать в особых пропорциях. Так, согласно одному особенно подходящему варианту осуществления, хлорид натрия содержится в количестве от 0,1 до 0,5% от полной массы композиции, а вода в количестве от 2 до 12%, предпочтительно от 2,6 до 8,0% от полной массы композиции. Еще более предпочтительно содержание хлорида натрия составляет от 0,2 до 0,3%, а воды от 3 до 6%. Также спирт составляет от 40 до 60% от полной массы композиции и этиленгликоль от 0,1 до 1% от полной массы композиции. Еще более предпочтительно, содержание спирта составляет от 50 до 60%, а этиленгликоля от 0,1 до 0,5%.
Кроме того, особенно интересные результаты получаются, когда содержание ДМСО составляет от 30 до 40% от полной массы композиции.
Сравнивая разные фиг.3a-6c, можно утверждать, что важно присутствие каждого из компонентов: спирта, этиленгликоля, диметилсульфоксида, хлорида натрия и воды. Именно смесь этих особых составляющих дает возможность композиции фиксировать клетки, которые позднее можно легко окрасить и исследовать.

На фиг.3a-6c клетки фиксированы композициями, содержащими все или часть компонентов композиции согласно изобретению, затем они окрашены методом быстрого окрашивания, какой используется в наборе RAL 555 (RAL): предметное стекло с зафиксированным веществом погружают в первый красный краситель на 5 секунд, затем в синий краситель на 5 секунд и, наконец, предметное стекло промывают и сушат. Полученные результаты лучше, когда в фиксирующей композиции присутствуют спирт, этиленгликоль, диметилсульфоксид, хлорид натрия и вода.
Композиция согласно изобретению может быть получена способом, включающим проведение по меньшей мере следующих стадий:
- смешение спирта и этиленгликоля, чтобы получить раствор 1,
- растворение хлорида натрия в воде, чтобы получить раствор 2,
- добавление раствора 2 в раствор 1 при перемешивании, затем добавление диметилсульфоксида и
- фильтрация.
В одном варианте фиксирующая композиция согласно изобретению содержит также по меньшей мере один синий краситель и по меньшей мере один красный краситель.
Синий краситель может быть выбран из метиленового синего, и/или азура I, и/или синего красителя, относящегося к группе тиазинов.
Красный краситель может быть выбран из эозина и/или эритрозина.
Предпочтительно, синий и красный красители растворяют в диметилсульфоксиде.
Согласно одному особенно подходящему варианту осуществления, композиция по изобретению содержит:
- диметилсульфоксид,
- спирт, например этанол или изопропанол, или смесь спиртов,
- этиленгликоль,
- воду,
- хлорид натрия,
- эозин-метиленовый синий,
- эозин-азур I,
- метиленовый синий,
- азур I метиленового синего и
- соединение группы тиазинов.
В частности, композиция согласно изобретению может содержать:
- около 32% (по объему) ДМСО,
- около 63% (по объему) спирта,
- около 0,1% (по объему) этиленгликоля,
- около 4,9% (по объему) воды,
- около 20% (в расчете на вес сухих веществ) эозин-метиленового синего,
- около 20% (в расчете на вес сухих веществ) азур I-эозина,
- около 8% (в расчете на вес сухих веществ) метиленового синего,
- около 8% (в расчете на вес сухих веществ) азур I метиленового синего,
- около 4% (в расчете на вес сухих веществ) соединения группы тиазинов и
- около 40% (в расчете на вес сухих веществ) хлорида натрия.
Предпочтительно такая композиция позволяет одновременно провести окрашивание и фиксацию тканей, клеток или компонентов клеток.
Она может быть получена способом, включающим проведение по меньшей мере следующих стадий:
- приготовление раствора 4, содержащего по меньшей мере диметилсульфоксид, синий краситель и красный краситель,
- смешение спирта и этиленгликоля, чтобы получить раствор 1,
- растворение хлорида натрия в воде, чтобы получить раствор 2,
- добавление раствора 2 в раствор 1 при перемешивании, чтобы получить раствор 3,
- добавление раствора 3 при перемешивании в раствор 4 и
- фильтрация.
Красители раствора 4 растворяют в ДМСО.
Спирт предпочтительно является этанолом.
Предпочтительно фиксатор согласно изобретению не содержит токсичных продуктов, позволяя одновременно хорошую фиксацию тканей, клеток и клеточных структур. Он особенно хорошо подходит для фиксации мазков крови и костномозгового вещества.
Согласно другому преимуществу, фиксирующая композиция может использоваться разными способами и применяться с разными способами окрашивания, как с теми, в которых используется комбинация окрашивающих реагентов, так и с теми, в которых используется единственный окрашивающий реактив.
Тем не менее, изобретение направлено на особые способы окрашивания, в которых применяется этот фиксатор. Речь идет о способах окрашивания клеток или клеточных структур, в частности для крови и костного мозга.
Эти способы включают по меньшей мере одну стадию, состоящую в контакте окрашиваемого препарата с фиксирующей композицией, являющейся объектом изобретения.
В первом варианте способ окрашивания включает по меньшей мере следующие стадии:
- контактирование окрашиваемого препарата, например, предметного стекла, на которое нанесены мазки крови или костномозгового вещества для анализа, с фиксирующей композицией согласно изобретению, предпочтительно в течение 5-10 минут;
- контактирование зафиксированного препарата с буферным раствором, pH которого составляет от 6,5 до 7, предпочтительно в течение 3-8 минут, чтобы запустить и управлять процессом окрашивания, подготовленным фиксатором по изобретению; на этой стадии может быть выгодным не удалять весь фиксатор при проведении в буферный раствор,
- контактирование, возможно при легком перемешивании, препарата с промывным раствором, предпочтительно в течение 5-20 секунд, функциями которого является остановить окрашивание, удаляя лишние красители, и улучшить окрашивание клеточных структур.
Этот способ соответствует окрашиванию типа "окрашивание по Райту/Лейшману".
Согласно второму варианту, способ окрашивания включает по меньшей мере следующие стадии:
- контактирование окрашиваемого препарата с фиксирующей композицией согласно изобретению, предпочтительно в течение 5-8 минут,
- контактирование связанного препарата с буферным раствором, pH которого составляет от 6,8 до 7,2, предпочтительно от 2 до 3 минут, чтобы запустить и управлять процессом окрашивания, подготовленным фиксатором по изобретению,
- контактирование, возможно при легком перемешивании, препарата с дополнительным окрашивающим реактивом, предпочтительно в течение 1-3 минут, который действует в буферной среде и позволяет улучшить окрашивание для определенных условий применения,
- контактирование препарата с промывным раствором, предпочтительно 5-20 секунд.
Этот способ соответствует окрашиванию по типу "Май-Грюнвальд/Гимза".
Буфер, используемый для осуществления способов по изобретению, может состоять из воды, динатрийфосфата, монокальцийфосфата, противомикробного средства и неионного ПАВа.
Дополнительный окрашивающий реактив может состоять из метиленового синего, азур I-метиленового синего и соединения группы тиазинов, растворенного в ДМСО, и динатрийфосфата и монокальцийфосфата, растворенного в воде.
Что касается промывочной жидкости, она может состоять из динатрийфосфата, монокальцийфосфата, противомикробного средства и изопропанола, растворенных в воде.
После сушки на воздухе предметное стекло готово для прямого наблюдения в микроскоп или для исследования системой анализа изображений.
Предпочтительно с используемыми продуктами, в частности с фиксатором согласно изобретению, можно гарантировать стандартизацию окрашивания и получить воспроизводимость цветов. Это связано с составами продуктов, в частности фиксатора, а также с тем, что это продукты, готовые к применению. Действительно, использование таких продуктов позволяет исключить человеческий фактор при приготовлении растворов, в частности, отменяя стадии разбавления и использования дополнительных продуктов переменного качества, которые ухудшают качество и воспроизводимость окрашивания.
Эта воспроизводимость представляет стабильную базу, на которую могут опираться системы анализа изображений. Эти системы, на которые возложены идентификация и классификация различных клеточных типов, при обнаружении случайных аномалий возможных признаков наличия патологии могут применяться, только если полученные результаты являются воспроизводимыми.
Кроме того, фиксатор и реагенты, используемые согласно изобретению, могут применяться в окрашивающих автоматах, так как их применение ограничивает осаждение, таким образом значительно снижая эксплуатационные расходы на эти автоматы.
Другим преимуществом является то, что изобретение позволяет получить отличный визуальный контраст, позволяющий точную идентификацию разных клеточных типов, причем без отложений красителя, являющихся источниками различных артефактов. Из фиг.2a и 2b установлено, в частности, что полученная контрастность лучше, чем получаемая с продуктами уровня техники (фиг.1a, 1b, 1c и 1d).
Далее изобретение иллюстрируется неограничивающим примером, применимым в гематологии.
Материал
Фиксирующая композиция (продукт 1)
Фиксирующую композицию готовят, как описано ниже.
Для получения 1 л продукта:
- готовят раствор A, растворяя в 280-380 мл ДМСО следующие красители: метиленовый синий - эозин, азур I - эозин, метиленовый синий, азур I метиленового синего, соединение группы тиазинов,
- готовят раствор B, смешивая от 550 до 680 мл этанола с примерно 1 мл этиленгликоля,
- готовят раствор C, растворяя от 1 до 4 г хлорида натрия в 40-60 мл воды,
- готовят раствор D, добавляя раствор C при перемешивании к раствору B,
- добавляют при перемешивании раствор A к раствору D и
- смесь фильтруют.
Буфер (продукт 2)
Буфер готовят, применяя описываемый ниже протокол.
Для получения 1 л продукта в примерно 1 л воды растворяют от 0,189 до 0,530 г динатрийфосфата, от 0,399 до 0,726 г монокальцийфосфата, около 1 г противомикробного агента и около 1 г неионного ПАВа. Затем все это фильтруют.
Дополнительный окрашивающий реактив (продукт 3)
Дополнительный окрашивающий реактив готовят следующим образом.
Для получения 1 л продукта:
- готовят первый раствор, растворяя в 10-15 мл ДМСО следующие красители: метиленовый синий, азур I метиленового синего и соединение группы тиазинов,
- готовят второй раствор, растворяя в 985-990 мл воды от 5 до 8 г динатрийфосфата и от 1,5 до 3 г монокальцийфосфата,
- при перемешивании добавляют первый раствор ко второму раствору, и
- смесь фильтруют.
Промывочная жидкость (продукт 4)
Для получения 1 л промывочной жидкости растворяют в примерно 940 мл воды от 0,3 до 0,5 г динатрийфосфата, от 0,3 до 0,5 г монокальцийфосфата, около 0,1 г противомикробного средства и от 45 до 50 г спирта (предпочтительно изопропанола). Затем все это фильтруют.
Пример способа окрашивания: результаты типа "окрашивание по Май-Грюнвальду/Гимзе"
Для получения результатов, признаваемых специалистами как окрашивание по "Май-Грюнвальду/Гимзе", можно осуществить последовательность следующих этапов:
- контактирование в течение 5-8 минут предметного стекла, на которое нанесен мазок крови или костномозгового вещества для анализа, с продуктом 1,
- контактирование в течение 2-3 минут предметного стекла с продуктом 2,
- контактирование в течение 1-3 минут предметного стекла с продуктом 3 и
- контактирование в течение 5-20 секунд, возможно при легком перемешивании, предметного стекла с продуктом 4.
После сушки на воздухе предметное стекло готово для прямого наблюдения в микроскоп или для исследования системой анализа изображений.
Полученные результаты представлены на фиг.2a.
Пример способа окрашивания: результаты типа "окрашивание по  Райту/Лейшману"
Чтобы получить результаты, признаваемые специалистами в данной области как "окрашивание по Райту/Лейшману", можно осуществить последовательность следующих стадий:
- контактирование в течение 5-10 минут предметного стекла, на которое нанесен мазок крови или костномозгового вещества для анализа, с продуктом 1,
- контактирование в течение 3-8 минут предметного стекла с продуктом 2, и
- контактирование в течение 5-20 секунд, возможно при легком помешивании, предметного стекла с продуктом 4.
После сушки на воздухе предметное стекло готово для прямого наблюдения в микроскоп или для исследования системой анализа изображений.
Полученные результаты представлены на фиг.2b.
Само собой разумеется, изобретение не ограничено представленным и описанным выше вариантом осуществления, но, напротив, оно охватывает все варианты.