Криогенное консервирование возбудителей кровепаразитарных болезней животных

Криогенное консервирование возбудителей кровепаразитарных болезней животных

УДК 619:616.993.1.616-076

В.Т. Заблоцкий, В.В. Белименко, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко

Ключевые слова: криоконсервация, кровепаразиты, протозойные болезни животных, жидкий азот Сокращения: ДМСО — диметилсульфоксид

Протозойные болезни широко распространены во всех странах земного шара и наносят значительный ущерб животноводству. Многие из них относятся к числу карантинных. Однако исследовательская работа с ними имеет некоторые трудности, обусловленные сезонностью большинства протозоозов, а также сложностью культивирования и длительного сохранения возбудителей.

В настоящее время специалисты научно-исследовательских учреждений и ветеринарных лабораторий при работе с возбудителями кровепаразитарных болезней животных (тейлерии, пироплазмы, анаплазмы и др.) могут длительное время сохранять их в исходном состоянии. Сохранить относительно длительное время жизнеспособность паразита в клеточном нативном или культуральном материале удается благодаря методу глубокого охлаждения (замораживания) до -79°С и -196°С.

Краткая история исследований по криоконсервированию кровепаразитов

Первые исследования по сохранению простейших в замороженном состоянии носили чисто познавательный характер. Их начали задолго до того, как был открыт криозащитный эффект глицерина и других веществ. В 1939 г. Coggeshall L. [8] сообщил о сохранении жизнеспособности и вирулентности малярийного плазмодия в крови обезьян, которая была заморожена в течение 19...70 дней (при -76°С). Размороженная при 37,5°С кровь после внутривенного введения обезьянам вызвала у них заболевание. Несмотря на то, что в процессе замораживания сохранилось лишь незначительное количество неразрушенных эритроцитов, инвазионность такой крови, по мнению автора, практически не отличалась от ин-вазионности свежей крови.

D. Weinman et al. [26] впервые установили, что медленное охлаждение культур или инвазирован-ной крови действует на простейшие менее разрушительно, чем быстрое замораживание. Например, трипаносомы четырех различных видов и лейшма-нии двух видов, замороженные медленно, оставались жизнеспособными в течение соответственно 19 и 24 мес хранения при -70°С.

Если при замораживании трипаносом можно было обойтись без глицерина, то при разработке методов

хранения других патогенных простеиших он, несомненно, принес большую пользу.

Первое сообщение об успешном воспроизведении теИлериоза возбудителем, который в течение 5 мес хранился при температуре -70°С, сделали Tsur I., Pipano E. [23]. В качестве криопротектора ими был использован 15%-И раствор глицерина.

Интересные исследования по выяснению влияния продолжительности хранения при -70°С различных штаммов тейлерий на их исходную вирулентность провели Hashemi-Fesharki R. et al. [12]. Они использовали инвазированную тейлериями кровь, клетки печени, селезенки, а также инвазированные гранатными телами лимфоидные клетки, выращенные in vitro. Перед замораживанием культуральные лимфоидные клетки концентрировали до 1...2 млн/мл среды Игла, содержащей 20 % дрожжевого экстракта гидролизата лактальбумина и 10 % сыворотки крови теленка. После добавления глицерина — 13,5%-го к нативному материалу и 10%-го к культу-ральному — образцы тщательно перемешивали, разливали по ампулам и помещали в холодильник при -70°С. В течение 3 лет авторы поставили биопробы на 85 восприимчивых телятах, которым вводили ин-вазированный материал, хранившийся при -70°С от 1 до 1095 дней. Температурная и паразитарная реакции у опытных животных были аналогичны реакции контрольных телят, которым инокулировали незамороженный материал. Таким образом, хранение различных штаммов тейлерий при -70°С в течение 400, 545 и 1095 дней не изменило их исходной вирулентности.

Об успешном криоконсервировании возбудителей протозойных болезней при -75° и -196°С сообщали разные авторы, в частности, о хранеии B. bigem-ina — Barnett S. [7]; P. caballi и N. equi — Frerichs W. et al. [11]; B. rodhaini — Overdulve J. et al. [19]; Th. annu-lata — Vural A. et al. [25]; T. brucei, T. cruzi, T. lewisi, T. gambiense, T. equiperdum, T. evansi, T. congolense — Pellegrini D. et al. [20], Lapierre J. et al. [15]; A. marginale, A. centrale — Turner A. [24], Hruska J. et al. [13], Love J. et al. [16], Rees C.W. [21]; Р. vivax — Coggeshall L. [8], Saunders G. et al. [22].

Cunningham M. et al. [9] в своих исследованиях показали, что инвазионные частицы Th. parva, выделенные из клещей — переносчиков тейлериоза, сохраняют инвазионные свойства после 6 мес хранения в жидком азоте. В качестве криопротектора использовали 7,5%-й раствор глицерина. Метод сохранения в замороженном состоянии тейлерий, выделенных

х о

из слюнных желез клещей-переносчиков, в последнее время нашел широкое применение в специфической профилактике тейлериоза (так называемый метод «заражения—лечения»).

Теоретические основы замораживания

В охлажденных живых клетках биохимические процессы, связанные с дыханием, обменом веществ и всеми другими сторонами взаимодействия между цитоплазмой клеток и окружающей средой, замедляются. При охлаждении клеток примерно до -79°С, когда диоксид углерода и другие газы затвердевают или сжижаются, все химические реакции, замедляются во много раз или полностью прекращаются. В этом случае процесс старения, по-видимому подавляется, и клетки можно хранить при этой температуре бесконечно долго [4].

В настоящее время режимы глубокого холода стали доступными в лабораторных и производственных условиях. Оказалось, что клетки крови и костного мозга млекопитающих, спермы быков, многие возбудители болезней животных и другие объекты, существующие в условиях температурного гомеостаза, сохраняются в жизнеспособном состоянии в искусственных условиях после замораживания и длительного пребывания их при низких температурах.

Одна из причин повреждения клеток при замораживании — разрушение их кристаллами льда, образующимися внутри и вне клетки. По данным Ю. Итки-на, процесс кристаллизации в клеточных суспензиях происходит при температурах от -2 до -4°C. Между кристаллами располагалась сеть каналов, заполненных гиперконцентрированными солевыми растворами. В этих каналах находилось до 80 % клеток. По мере дальнейшего роста кристаллов льда нарушалась весьма чувствительная цитоплазматическая структура, что приводило к механическому повреждению клеток [2].

Теория о повреждении клетки в процессе замораживания концентрированными растворами солей, образующимися при вымерзании воды, создана Lovelock J., предложившим термин «осмотический шок» клетки. Изучая процессы, связанные с замораживанием эритроцитов, он установил, что обычно присутствующие в клетке соли натрия, калия, кальция и магния при повышении их концентрации разрушают биомембраны клетки. Кроме указанного, при дегидратации клеток в процессе замораживания наблюдают пространственное сближение молекул белков, при котором SH-группы ферментов превращаются в S-S-связи, что вызывает денатурацию белков.

[17, 18].

Криопротекторы

После выявления криозащитного действия глицерина, криопротекторные свойства были найдены более чем у 100 различных веществ, однако и сегодня в группу активных криопротекторов входит менее десяти химических соединений — глицерин, ДМСО, поливинилпирролидон, гексоэтиловый крах-

мал и другие. Остальные соединения либо не обеспечивают должной сохранности материала, либо токсичны.

Глицерин — наипростейший трехатомный спирт. Вызвать кристаллизацию глицерина очень трудно, ввиду большой устойчивости его к переохлаждению. При переохлаждении глицерина вязкость его возрастает адекватно падению температуры. Увеличение вязкости глицерина приводит к замедлению осмотических и диффузионных процессов, а, следовательно, к снижению скорости физико-химических процессов в биологических объектах при их охлаждении в средах, содержащих глицерин.

Молекула глицерина связывает воду, в результате чего вокруг нее образуется гидратная оболочка. Увеличение количества связанной воды, не замерзающей кристаллически, способствует ослаблению течения процесса кристаллизации и обусловленных им стрессовых воздействий на биоструктуры, подвергающиеся низкотемпературной консервации. Важность образования водородных связей между криопротек-тором и молекулами воды объясняется не только уменьшением количества свободной воды, но также пространственным расположением водородных связей в системе криопротектор — вода [3].

Существует точка зрения, согласно которой, глицерин, образуя водородные связи с водой, стабилизирует гидратную структуру вокруг белков, предотвращая возможность белковой денатурации в процессе замораживания [10].

Одним из факторов, определяющим защитную роль глицерина, является повышение жесткости молекул белка и предохранение их от образования ле-вовращающих структур. Вода при вымораживании удаляется из белка, и глицерин, образуя водородные связи с гидрофильными участками белков, замещает воду и предотвращает белковую денатурацию, формируя защитную оболочку вокруг белковой молекулы.

Защитное действие глицерина при замораживании и оттаивании объясняется еще и тем, что, проникая внутрь клетки, он в период охлаждения ниже 0°С понижает точку замерзания воды и замедляет процесс ее кристаллизации. Благодаря чему кристаллы льда имеют меньшие размеры и поэтому не повреждают клетки. Кроме того, глицерин, оставаясь вязким, препятствует нарастанию концентрации солей по мере охлаждения, т. е. предохраняет клетки от так называемого осмотического шока. Находясь между кристалликами льда, где при охлаждении образуются концентрированные растворы солей, глицерин не допускает появления высоких концентраций солей калия внутри клетки и натрия вне ее, т. е. действует как противосолевой буфер. При понижении температуры от -20 до -80°С глицерин способствует образованию стекловидных структур [4].

Одно из объяснений криозащитного действия глицерина связано также с контрактацией объема его в водной среде. При охлаждении глицерин не уве-

Криогенное консервирование возбудителей кровепаразитарных болезней животных

личивается в объеме, а сжимается, что приводит к «гашению» давления водного и криогидратного льда, способствует большей сохранности ультраструктур клетки. Защитные свойства глицерина связаны также со способностью его витрифицироваться внутри клетки и вызывать переохлаждение внутриклеточной среды. В среде, содержащей глицерин, внутриклеточной кристаллизации не наблюдали при охлаждении клеток даже до -60°С [5].

Глицерин в дозах, применяемых при низкотемпературном консервировании биоструктур, способен оказывать на них токсическое действие, степень которого зависит от концентрации криопротектора и времени контакта его с клетками (эквилибрационный период).

Токсическое действие глицерина на клетки проявляется в изменении проницаемости мембран в первые часы эквилибрации, достигая максимума спустя 12.48 ч с момента контакта криопротектора с клетками. Этим объясняются рекомендации ограничить время инкубации клеток c глицерином перед замораживанием до 30 мин, либо начинать замораживать клетки немедленно после добавления к ним кри-опротектора [6].

В последнее время в разных областях биологии и, в частности, криобиологии, большой интерес вызвал ДМСО, характеризующийся широким спектром физиологического действия. Это органическое соединение, представлявшее собой прозрачную бесцветную жидкость, в чистом виде без запаха, со слегка горьковатым вкусом; смешивается в любой пропорции с большинством органических растворителей и жидкостей — водой, ацетоном, эфиром и др. Препарат гигроскопичен и во влажной атмосфере поглощает воду. ДМСО оказался эффективным криопро-тектором биологических систем при замораживании до низких и ультранизких температур. Установлено его повышенное сродство к воде. Как и другие кри-опротекторы, ДМСО хорошо проникает через мембраны, связываясь с ионными компонентами и молекулами воды, может образовывать комплексы разной природы, что в значительной мере изменяет действие возрастающей концентрации ионов и других соединений в среде на структуры клеток при их охлаждении.

Об успешном применении ДМСО в качестве кри-опротектора для замораживания биоматериалов впервые сообщили Lovelock J. et al. [17]. После этого ДМСО как консервант был широко использован для замораживания различных биологических объектов. Наиболее широкое применение ДМСО нашел при разработке методов низкотемпературного консервирования клеток крови и костного мозга человека [14].

Использование ДМСО для криоконсервирования эритроцитов было обусловлено тем, что мембраны не всех клеток хорошо проницаемы для глицерина. Lovelock J et al. [18] впервые использовали для замораживания эритроцитов человека (проницаемых для глицерина) и быка (малопроницаемых для глицерина) растворы ДМСО, проникающего в оба ти-

па указанных клеток. Несколько лучше ДМСО защищал эритроциты быка. Таким образом, защитное действие ДМСО в отношении разных клеток неодинаково.

Исследования лаборатории протозоологии ВИЭВ в области замораживания кровепаразитов

В настоящее время в лаборатории протозоологии ВИЭВ сохраняются и поддерживаются референтные штаммы 10 возбудителей протозойных болезней животных: Th. annulata (041293), Tr. equiperdum (Аль-форт, Гамбург, SVD, АнТат 4, Омск 40496), Tr. evan-si, A. ovis (310349), N. equi (150695), P. canis, B. rod-hani (131291), B. ovis, P. bigeminum, N. caninum.

Для замораживания и хранения кровепаразитов при низких температурах используют инвазированную кровь, а также суспензию клеток внутренних органов, полученных от больных животных.

Перед замораживанием кровь смешивают с равным объемом 30%-го раствора глицерина или ДМСО на солевых растворах Тироде, Эрла, Хэнкса или на среде № 199. В суспензию клеток из внутренних органов (концентрация клеток не более 2х108/мл) перед замораживанием добавляют также сыворотку крови крупного рогатого скота из расчета 15 % от общего объема.

Затем материал разливают в ампулы по 2.. .5 мл, которые запаивают и оставляют при комнатной температуре на 20.30 мин для проникновения криопро-тектора внутрь клеток.

Замораживают материал, хранят в жидком азоте и размораживают согласно «Рекомендациям по замораживанию и хранению возбудителей кровепара-зитарных болезней сельскохозяйственных животных при -79°С и -196°С» от 29 января 1972 г. В настоящее время работа значительно упрощается благодаря использованию низкотемпературных холодильников и аппаратов для программного замораживания компонентов крови.

Исследования, проведенные в лаборатории протозоологии, показали, что P. bigeminum сохраняет свои инвазионные свойства после 222 дней (срок наблюдения) хранения в жидком азоте при температуре -196°С. Toxoplasma gondii не теряет инвазионных свойств при хранении их при температуре -196°С в течение 300 дней (срок наблюдения). Tr. evansi и Tr. equiperdum оставались вирулентными после 425 дней хранения при -196°С. При этом они сохраняли жизнеспособность как после медленного, так и после быстрого охлаждения с криопротектором и без него. A. ovis и A. marginale сохраняют свои инфекционные свойства после глубокого замораживания до -196°С и хранения при этой температуре в течение 90.120 дней (срок наблюдения). Th. recondita и E. ovis выдержали глубокое замораживание в жидком азоте более четырех месяцев (срок наблюдения) и сохранили вирулентность для овец.

Особый интерес представляет следующий пример. В 2011 г. исследовали вирулентность B. rodhani, за-

мороженной в жидком азоте в 1972 г. (почти 30 лет назад). После нескольких пассажей через организм белых мышей вирулентные свойства возбудителя были полностью восстановлены.

Кроме того, глубокое замораживание нашло широкое применение при производстве культуральной жидкой вакцины ВИЭВ против тейлериоза крупного рогатого скота, которая сохраняется в жидком азоте [1].

Библиография

1. Заблоцкий В.Т. Специфическая профилактика тейлериоза крупного рогатого скота // Автореф. дис... д-ра биол. наук — Москва, 1985.

2. Иткин Ю.А. Исследование некоторых биофизических процессов, происходящих в клетках костного мозга при замораживании // Автореф. дис... канд. биол. наук — Харьков, 1972.

3. Медведев П.М., Фисанович Т.И. Роль криопротекторов как стабилизаторов воды в биологических средах // Успехи современной биологии, 1973, 75 (1): 46—61.

4. Михайлов В.Г. Консервация костного мозга. — М.: Медицина, 1979.

5. Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения. — М.: Медицина, 1963.

6. Терентьева Э.И., Киселев А.Е., Федотенков А.Г. Электронно-микроскопическое изучение клеток костного мозга в процессе замораживания. I. Влияние глицерина и ДМСО на субмикроскопическое строение клеток // Пробл. гематологии и переливания крови, 1968; 13 (2): 2—16.

7. Barnett S. The preservation of Babesia bigemina, Anaplasma centrale u A. Marginale by deep freezing // Vet. Rec., 1964; 76 (1): 4—8.

8. Coggeshall L. Preservation of viable malaria, parasites in the frozen state // Proc. Soc. exp, Biol., N.Y., 1939; 42:499—501.

9. Cunningham M., Brown C., Purnell R., Branagan D. The preservation at low temperature of infective particles of Theileria parva // Proc. 2nd Int. congr. parasit., Washington, 1970; 4: 60.

10. Doebbler C.F., Rinfret A. Rapid freezing of human blood // Cry-obiology, 1965; 1 (1): 205—207.

11. Frerichs W.M., Johnson A.J. Holbrook A. Storage of Babesia caballi and Babesia equi in liquid nitrogen // J. Parasitol., 1968; 54 (3): 451.

12. Hashemi-Fesharki R., Shad-Del F. Long term maintenance of Theileria annulata strains by freezing at -70°C // Arch. Inst. Razi., 1973; 25: 89—91.

13. Hruska J.C., Brock W.E. Cryogenic preservation of Anaplasma marginale // Am. J. Vet. Res., 1966; 27 (121): 1547.

14. Huggins C. Frozen blood // Ann. Surg., 1964; 160 (6): 643— 649.

15. Lepierre J., Tran T. Possibilite. offertes par la congelation aux basses temperatures pour la conservation des trypanosomes // Corapt. rend. Soc. bid., 1968; 162 (3): 622—625.

16. Love J.N., Valentine B.L., Scales J.W. Effect temperature end time on the infectivity of Anaplasma marginale after treatment with protective additives // Am. J. Vet. Res., 1967; 28: 51—54.

17. Lovelock J. The haemolysis of human red blood-cells by freezing and thawing // Biochim. biophys. Acta, 1953; 10: 414—426.

18. Lovelock J., Bishop M. Prevention of freezing damage to living cells by dimethyl sulphoxide // Nature, 1959; 183:1394—1395.

19. Overdulve J.P., Antonisse H.W. Measurement of the effect of low temperature on protozoa by titration. II. Titration of Babesia rod-haini, using prepatent period and survival time, before and after storage at -76°C // Exp. Parasitol., 1970; 2:323—341.

20. Pellegrini D., Baldelli B., Pressure T. Conservatione di un ceppo Trypanosoma brucei con 1e basse temperature // Atti Soc. Ital. Sci. veterin., 1963; 2: 17.

21. Rees C.W. The effects of exposure to different degrees of temperature on the etiological agents of bovine anaplasmosis // J. Parasitol., 1937; 23: 175—182.

22. Saunders G., Scott V. Preservation of Plasmodium vivax by freezing // Science, 1947; 106: 300—301.

23. Tsur I., Pipano E. The successful infection of cattle with Theileria annulata parasites preserved in the frozen state // Refuoh Vet., 1962; 19:110.

24. Turner A.W. The successful preservation of Anaplasma centrale at temperature of solid carbon dioxide // Austral. Vet. J., 1944; 20: 295—298.

25. Vural A., Ozkoc U., Onar E. Virulence end maintenance of some local Theileria annulate strains isolated in Turkey // Pendik vet. bakteriyoloji vc serolojl enstitusu dergisl, 1976; 10 (1): 68—78.

26. Weinman D., McAllister J. Prolonged storage of human pathogenic protozoa with conservation of virulence observation on the storage of helmints end leptospiros // Amer. J. Hyg., 1947; 45:102—121.

Summary

V.T. Zablotskiy, W.V. Belimenko. Cryogenic preservation of animal blood parasites. The cryogenic preservation at low temperature (-75 and -196°C) is one of the main methods for storage the blood and other protozoan diseases agents. This method helps preserve the blood parasites in the liquid nitrogen during a long time and successful use it after. In this article the main aspects of freezing and review have been describe.