Экспериментальная модель диабетической нефропатии у крыс

незначительная их выраженность могут служить индикатором скрытой неудовлетворенности пациента проводимым лечением даже в том случае, если жалобы с его стороны на данный момент отсутствуют. Детальный анализ анкеты в сочетании с дополнительным обследованием пациента в данной ситуации помогает выявить «проблемную зону» ортодонтического лечения и скорректировать его тактику до снятия брекет-системы, уменьшив таким образом риск возникновения осложнений, а также претензий со стороны пациента после его окончания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мансур Ю. П., Казанцева И. А. Качество жизни взрослых пациентов с аномалиями окклюзии в ходе ортодонтического лечения // Современные проблемы науки и образования. — 2014. — № 4; URL: http:// www.science-education.ru/118-14062 (дата обращения: 23.07.2014).

2. Хорошилкина Ф. Я. Ортодонтия. Дефекты зубов, зубных рядов, аномалии прикуса, морфофункцинальные нарушения в челюстно-лицевой области и их комплексное лечение / Ф. Я. Хорошилкина. — М.: Мед. информ. агентство, 2006. — 544 с.

3. Kenealy P. M., Kingdon A., Richmond S., Shaw W. C. The Cardiff dental study: a 20-year critical evaluation of the psychological health gain from orthodontic treatment // Br J Health Psychol. — 2007. — Vol. 12. — P 17—49.

4. Kressin N., Spiro A., Bosse R., Garcia R., Kazis L. Assessing oral health-related quality of life: founding from the normative aging study. — Medical Care. — 1996. — Vol. 34. — P. 416—427.

Контактная информация

Мансур Юлия Петровна — ассистент курса стоматологии общей практики кафедры стоматологии ФУВ, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: juliam75-1@yandex.ru

УДК 615.015:616.379-008.64:616-092.9

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МОДЕЛЬ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ У КРЫС

А. А. Спасов, А. В. Смирнов, О. А. Соловьева, В. А. Кузнецова,

Н. Г. Паньшин, А. И. Мацевич

Волгоградский государственный медицинский университет,

Волгоградский медицинский научный центр, НИИ фармакологии, кафедра фармакологии, кафедра патологической анатомии

В настоящей работе представлены результаты, свидетельствующие о развитии ранних проявлений диабетической нефропатии при стрептозотоциновой интоксикации у крыс (повышение клиренса креатинина, микроальбуминурия, гипертрофия почек), что подтверждается данными морфологического и иммуногистохимического исследования ткани почек.

Ключевые слова: диабетическая нефропатия, стрептозотоцин, неферментативное гликозилирование.

EXPERIMENTAL MODEL OF DIABETIC NEPHROPATHY IN RATS

A. A. Spasov, A. V. Smirnov, O. A. Solovyova, V. A. Kuznetsova,

N. G. Panshin, A. I. Matsevich

This study provides the findings of the study of the development of the early symptoms of diabetic nephropathy in streptozotocin-induced models of diabetus mellitus in rats (increased creatinine clearance, microalbuminuria, renal hypertrophy) confirmed by morphological and immunohistochemical studies of kidney tissue.

Key words: diabetic nephropathy, streptozotocin, non-enzymatic glycation.

Ведущим метаболическим фактором, запускающим каскад патологических изменений в клетках клубочков и канальцев почек при сахарном диабете (СД), является гипергликемия. Она индуцирует неферментативное гликозилирование (гликирование) белков, окислительный стресс, активирует протеинкиназу С, мито-ген-активирующую протеинкиназу, действие факторов роста, цитокинов, вызывающих повреждение почек на уровне клетки [1,4]. Гликирование белков базальной мембраны почечных клубочков (коллаген IV типа, ламинин, гепарансульфат и др.) приводит к изменению их

структуры и свойств, утолщению базальной мембраны сосудов клубочка, расширению мезангиального матрикса, снижению уровня гломерулярной фильтрации, что предшествует таким необратимым процессам, как гло-мерулосклероз и тубулоинтерстициальный фиброз, которые характеризуют финальные стадии развития нефропатии [9].

В настоящее время в клинической практике нет препаратов, способных ингибировать образование конечных продуктов гликирования в организме, поэтому экспериментальное изучение веществ, которые могут

36

Выпуск 3 (55). 2015

оказывать патогенетическое действие на течение осложнений СД, является актуальным.

В настоящее время разработано достаточно большое количество экспериментальных моделей СД, которые могут быть индуцированы химическими диабетогенными веществами, диетическими или хирургическими манипуляциями или сочетанием этих способов, а также генетически обусловлеными [7].

Для воспроизведения СД чаще всего используются модели на взрослых крысах, индуцированные химическими цитотоксическими диабетогенными веществами — стрептозотоцином, аллоксаном, дек-саметазоном и др., а также нарушением характера питания (например, содержание животных на рационе с высоким содержанием жиров), либо сочетанным воздействием химических и диетических факторов: стрептозотоциновый диабет с одновременным или предварительным введением никотинамида; стреп-тозотоциновые модели на фоне высокожировой диеты и т. д. [3, 6].

Для скрининга и детального изучения веществ, оказывающих патогенетическое действие на лечение осложнений сахарного диабета наиболее подходящей является модель стрептозотоцин-индуци-рованного диабета [2, 5], вследствие способности стрептозотоцина накапливаться в р-клетках поджелудочной железы, что приводит к стойкой гипергликемии, необходимой для формирования диабетической нефропатии [10].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Воспроизведение экспериментальной модели диабетической нефропатии у крыс при длительной гипергликемии, вызванной стрептозотоциновой интоксикацией.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на 50 половозрелых беспородных крысах-самцах массой 200—230 г, которых содержали в условиях вивария ВолгГМУ с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной по содержанию питательных веществ диете для лабораторных животных, согласно ГОСТ Р50258-92. Исследования были одобрены Этическим комитетом ВолгГМУ (протокол № 191-2014 от 25 февраля 2014 г.).

Экспериментальный сахарный диабет моделировали путем однократного внутривенного введения стреп-тозотоцина («Sigma», США), растворенного в 0,1 М цит-ратном буфере с рН 4,5 в дозе 45 мг/кг [2]. Количественное определение глюкозы в крови проводили на 3-и сутки после введения цитотоксина и далее еженедельно, в утреннее время, натощак, в течение всего срока эксперимента длительностью 12 недель, с использованием глюкометра «Глюкокард» (Россия). В эксперимент брали животных с уровнем глюкозы натощак более 17 ммоль/л.

В случае превышения значения гликемии натощак уровня 20 ммоль/л животным вводили инсулин длительного действия «ЛантусСолоСтар», Франция (подкожно).

В ходе исследования оценивали массу тела всех экспериментальных животных—исходно и далее еженедельно. Каждые 4 недели крыс помещали на 24 часа в метаболические камеры для сбора мочи с целью исследования суточной экскреции альбумина (колориметрическим методом с бромфеноловым синим «Vital Diagnostics», (Россия). Креатинин сыворотки крови (с последующим расчетом клиренса креатинина) определяли методом Яффе с использованием набора «Pliva-Lachema» (Чехия); уровень гликированно-го гемоглобина определяли с использованием набора «Фосфосорб», (Россия).

Для проведения гистологического исследования материал, полученный из почек, фиксировали в течение 24 часов в 10%-м растворе нейтрального забуфе-ренного формалина (pH 7,4), обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой гистологической методике. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 3—5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином и по Массону.

Для проведения иммуногистохимического исследования (ИГХ) использовались моноклональные антитела к фибронектину (GeneTex, F14) и карбоксиметил-лизину (Abcam, CMS-10). Процедуры депарафинизации, демаскировки антигенов, визуализации, окрашивания гематоксилином проводили в соответствии с протоколами фирм производителей антител с последующим анализом иммунофенотипа.

Гистологические препараты фотографировали цифровой камерой Axiocam 105 color (Карл Цейс, Германия, 5 мегапикселей) на базе микроскопа Axiocam plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х10; х40 и окуляра х10. При морфологическом исследовании оценивали наличие изменений в почечных тельцах (капсула, капилляры, мезангий), изменений соединительной ткани, наличие воспалительной инфильтрации. С помощью морфометрического метода исследования (с использованием программы «ZEN Pro 2012», (Карл Цейс, Германия) определяли площадь почечного тельца (мкм2), площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце (мкм2) и относительную площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием табличного редактора Microsoft Excel 2007, программы «GraphPad Prism 5.0», программы STATISTICA 5.0 фирмы StatSoft, Inc., (США) для Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Уровень глюкозы в крови у крыс с СД на 3-й день после введения стрептозотоцина достоверно превос-

Выпуск 3 (55). 2015

37

ходил в 4,8 раза таковой у интактных животных. Развитие диабета сопровождалось полидипсией, полиурией, животные были вялы и апатичны.

На протяжении всего эксперимента уровень сахара в крови у крыс с диабетом оставался достоверно высоким, превосходя значения интактной группы животных (в 4 раза — 1-й месяц, в 6 раз — 2-й месяц, в 3,35 раза — 3-й месяц, р < 0,05) (рис. 1А). Полученные результаты подтверждались статистически значимым увеличением уровня гликированного гемоглобина у крыс со стрептозотоциновой интоксикацией длительностью 3 месяца относительно интактных (в 2 раза, р < 0,05, рис. 1Г). У крыс с патологией к концу исследования отмечали снижение массы тела на 20 % по сравнению с исходной.

Каждые 4 недели регистрировали достоверное повышение уровня белка в моче у животных с диабетом по сравнению со значениями интактной группы крыс (в 3 раза — 1 -й месяц, в 2,36 раза — 2-й месяц, в 2 ра-

за — 3-й месяц, р < 0,05) (рис. 1Б), что может быть связано с потерей отрицательной заряженности мембраны почечных клубочков вследствие нарушенного синтеза протеогликанов, входящих в структуру базальной мембраны капилляров [1]. Клиренс креатинина у крыс с сахарным диабетом недостоверно, но увеличивался по сравнению с таковым у интактных животных (в 2,4 ра-за — 1-й месяц, в 1,64 раза — 2-й месяц, в 2,06 раза — 3-й месяц) (рис. 1В), что может происходить в результате гиперфильтрации креатинина и свидетельствовать о развитии ранней стадии диабетической нефропатии.

Данное предположение подтверждается увеличением отношения массы почек к массе тела у животных со стрептозотоциновой интоксикацией длительностью 3 месяца на 36 %, по сравнению с интактными животными (рис. 2), что говорит о сопутствующей гипертрофии почек, имеющей место в ранней фазе диабетической нефропатии [8].

а1

Уровень глюкозы крови интактных крыс и животныхсо стрептозотоциновой интоксикацией

в

3 35

1

1 30 ш 25

О

а 20 Z

8 15

к

2 10 5

Л 5

S

№ „ CD 0 О Cl

_______________18,43'

ИСХОДНО

1 МССЯЦ

2 месяца

3 месяца

Длительность стрептозотоциновой интоксикации I Контроль интактный  стрептоэотоциновый диабет

Б

*Данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,05).

Рис. 1. Данные биохимических исследований крови и мочи интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией

38

Выпуск 3 (55). 2015

*Данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,05).

Рис. 2. Отношение массы почек к массе тела интактных крыс и у животных со стрептозотоциновой интоксикацией длительностью 3 месяца

Морфологическое исследование показало, что в группе животных с сахарным диабетом, по сравнению

с контрольной группой, определялось уменьшение размеров почечных телец с дистрофически измененными клетками наружной и внутренней стенок капсулы клубочка, отмечалось очаговое утолщение базальной мембраны капилляров клубочков, расширение мезангия. При проведении морфометрического исследования определялось достоверное уменьшение площади почечных телец на 39 % по сравнению с контрольной группой. Площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце достоверно уменьшается на 31 % пропорционально уменьшению площади почечного тельца. Относительная площадь соединительной ткани сосудистого клубочка у животных с сахарным диабетом достоверно увеличивалась на 6 % (табл. 1).

При морфометрическом исследовании иммуногистохимических препаратов животных с сахарным диабетом было выявлено увеличение доли фибронектина и карбоксиметиллизина в почечных клубочках (рис. 3, 4) на 33,5 и 14 % соответственно по сравнению с контрольной группой животных (табл. 2).

Таблица 1

Морфометрические показатели почечных клубочков

Г руппы Показатели

площадь почечного тельца, мкм2 площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце, мкм2 относительная площадь соединительной ткани сосудистого клубочка

Контрольные животные 6267,4 ± 217,3 2979,7 ± 123,8* 47,5

Животные с сахарным диабетом 3842,7 ± 144,0 2055,364 ± 79,700* 53,5**

*Данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,001); **данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,01).

Таблица 2

Морфометрические показатели почечных клубочков при иммуногистохимическом исследовании

Группы Показатели, мкм2

площадь иммунореактивного материала в почечном тельце контрольных животных площадь иммунореактивного материала в почечном тельце животных с сахарным диабетом

Фибронектин 1251,8 ± 95,6 1879,8 ± 145,1*

Карбоксиметиллизин 791,4 ± 171,4 916,7 ± 157,1

*Данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,001).

Контрольная группа

Группа с сахарным диабетом

Рис. 3. Экспрессия иммунореактивного материала с антителами к фибронектину окраска гематоксилин-эозином. Ув. х 400

Выпуск 3 (55). 2015

39

Контрольная группа Группа с сахарным диабетом

Рис. 4. Экспрессия иммунореактивного материала с антителами к карбоксиметиллизину окраска гематоксилин-эозином. Ув. х 400

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что при длительном течении стрептозотоцино-вой интоксикации у крыс формируются ранние проявления диабетической нефропатии. Воспроизведенная экспериментальная модель может быть использована для углубленного фармакологического изучения потенциальных средств профилактики диабетической нефропатии*.

ЛИТЕРАТУРА

1. Дедов И. И., Шестакова М. В. и др. Сахарный диабет. Острые и хронические осложнения / Под ред. академика РАН и РАМН И. И. Дедова, профессора М. В. Шестаковой. — М.: «МИА», 2011. — 480 с.

2. Спасов А. А. и др. Методические рекомендации по доклиническому изучению пероральных лекарственных средств для лечения сахарного диабета // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Часть первая, под ред. А. Н. Миронова. — М., 2012. — С. 670—684.

3. Спасов А. А., Воронкова М. П., Снигур Г. Л. и др. // Биомедицина. — 2011. — № 3.— C. 12—18.

4. Chilelli N. C., Burlina S., Lapolla A. // Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases. — 2013. — Vol. 23 (10). — P 913—910.

5. Etuk E. U. // Agric Biol J N Am. — 2010. — Vol. 1 (2). — P 130—134.

6. Islam M. S, Wilson R. D. // Methods Mol Biol. — 2012. — Vol. 933. — P 161—174.

7. Kumar S., Singh R., Vasudeva N., et al. // Cardiovascular Diabetology. — 2012. — Jun. — Vol. 19. — P 11—19.

8. Vallon V. and Komers R. // Comprehensive Physiology — 2011. — Jul. — Vol. 1(3). — P. 1175—1232.

9. Vallon V, Thomson S. C. // Annu Rev Physiol. — 2012. — Vol. 74. — P. 351—375.

10. Ventura-Sobrevilla J., Boone-Villa V. D., Aguilar C. N., et al. // Proc West Pharmacol Soc. — 2011. — Vol. 54. — P 5—9.

Контактная информация

Кузнецова Валентина Андреевна — к. м. н.,

ассистент кафедры фармакологии, научный сотрудник лаборатории лекарственной безопасности НИИ фармакологии, Волгоградский государственный медицинский университет, e-mail: sysoeva_va@mail.ru

*Работа выполнена за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 14-25-00139).

: 40 ------Выпуск 3 (55). 2015