КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЗАЩИТЫ СВИНЕЙ ОТ ИНФЕКЦИИ РРСС-ВИРУСА (ВАРИАНТЫ) И ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ УКАЗАННУЮ КОМПОЗИЦИЮ (ВАРИАНТЫ)
COMPOSITION FOR PIGS PROTECTION AGAINST PRRS-VIRUS INFECTION (VERSIONS) AND VACCINE CONTAINING SPECIFIED COMPOSITION (VERSIONS)

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему изобретению предложены генетически модифицированный вирус РРСС и кодирующие его полинуклеотиды. Также предложены вакцины, содержащие генетически модифицированный вирус и полинуклеотиды.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Респираторно-репродуктивный синдром свиней (РРСС) характеризуется абортами, мертворождениями и другими репродуктивными проблемами у свиноматок и подсвинков, также как и респираторным заболеванием у молодых свиней. Возбудителем является РРСС-вирус, член семейства Arteriviridae и порядка Nidovirales. Два отдельных генотипа вируса появились почти одновременно в Северной Америке и Европе в конце 1980-х гг. Вирус РРСС в настоящее время эндемичен почти во всех странах, производящих свинину, и признан одним из наиболее экономически важных заболеваний, влияющих на глобальную индустрию свинины.
В настоящее время коммерческие вакцины против РРСС включают модифицированные живые и убитые (инактивированные) вакцины. Убитые вакцины были подвержены критике из-за неспособности вызвать надежный иммунитет против гетерологичных штаммов РРСС-вируса. Модифицированные живые вакцины аттенуируют до потери вирулентности серией пассажей в клеточной культуре. Модифицированные живые вакцины вызывают более широкую защиту, чем убитые вакцины, но могут страдать от нескольких факторов опасности, включая остаточную вирулентность, распространение на невакцинированных свиней и генетическую реверсию вирулентности. Из-за антигенных изменений, происходящих в процессе аттенуирования, такие вакцины также могут терять часть способности защищать от вирулентных полевых штаммов РРСС-вируса. Следовательно, имеется насущная необходимость в новых и улучшенных модифицированных живых вакцинах для защиты от РРСС.
Краткое описание графических материалов
Фиг.1. (А) На графическом материале показано расположение и последовательность NLS мутации в белке нуклеокапсида Р129. (Б) Микрофотографии псевдоинфицированных, Р129-инфицированных и P129-GG-инфицированных клеток MARK-145. В верхнем ряду показаны типичные бляшки с применением фазовоконтрастной микроскопии, в то время как в нижнем ряду показано окрашивание флуоресцентными антителами инфицированных очагов с применением моноклонального антитела SDOW17, меченного флуоресцина изотиоцианатом (FITC). Следует отметить отсутствие окрашивания нуклеокапсида в ядрах и ядрышках Р129-СС-инфицированных клеток.
Фиг.2. (А) Количество свиней с вирусемией (7 свиней в группе) на 0-28 день после заражения по группам лечения. (Б) Средний титр вирусных частиц в сыворотке свиней на 0-28 день после заражения по группе лечения. (В) Средние уровни антител твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (S/P отношения) в сыворотке свиней на 0-28 день после заражения по группе лечения. (Г) Повторное титрование сыворотки, показанной на Фиг.2В, все образцы перед анализом были разбавлены 1:5 с целью лучшего выделения различий в образцах с высокими титрами. (Д) Средние сывороточные титры нейтрализующих антител у зараженных свиней в течение четырехнедельного исследования.
Краткое описание последовательностей
SEQ ID NO:1 41-47 остатки N-белка североамериканского изолята VR 2332 РРСС-вируса (РРССВ)
SEQ ID NO:2 Последовательность NoLS-области VR2332
SEQ ID NO:3 Последовательность NoLS-области Lelystad
SEQ ID NO:4 NES-область изолята VR2332
SEQ ID NO:5 NES-область изолята Lelystad
SEQ ID NO:6 Аминокислотная последовательность N-белка изолята Р129
SEQ ID NO:7 Нукпеотидная последовательность ORF 7 (кодирует N-белок) изолята Р129
SEQ ID NO:8 Праймер Р SHUTTLE FWD
SEQ ID NO:9 Праймер P-SHUTTLE-REV
SEQ ID NO:10 Мутагенный Праймер KK43/44GG-Fwd
SEQ ID NO:11 Мутагенный праймер KK43/44GG-REW
SEQ ID NO:12 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области дикого типа (wt) P129
SEQ ID NO:13 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области wt P129
SEQ ID NO:14 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-GG
SEQ ID NO:15 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-GG
SEQ ID NO:16 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-d43/44
SEQ ID NO:17 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-d43/44
SEQ ID NO:18 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-d43/44/46
SEQ ID NO:19 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-d43/44/46
SEQ ID NO:20 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-d44/46/47
SEQ ID NO:21 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-d44/46/47
SEQ ID NO:22 Таблица 8 делеционных мутантов. Аминокислотная последовательность NLS2-области P129-d46/47/48
SEQ ID NO:23 Таблица 8 делеционных мутантов. Нуклеотидная последовательность NLS2-области P129-d46/47/48
SEQ ID NO:24 P129-d43/44F
SEQ ID NO:25 P129-d43/44/46F
SEQ ID NO:26 P129-d44/46/47F
SEQ ID NO:27 P129-d46/47/48F
SEQ ID NO:28 P129-d43/44R
SEQ ID NO:29 P129-d43/44/46R
SEQ ID NO:30 P129-d44/46/47R
SEQ ID NO:31 P129-d46/47/48R
Цитированные ссылки
Doan D.N.P. and Dokland T. (2003). Structure of the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Structure 11(11), 1445-1451.
Lee С., Calvert J. G., Welch S.-K. W. and Yoo D. (2005). A DNA-launched reverse genetics system for porcine reproductive and respiratory syndrome virus reveals that homodimerization of the nucleocapsid protein is essential for virus infectivity. Virology 331, 47-62.
Rowland R.R., Kervin R., Kuckleburg C., Sperlich A. and Benfield D.A. (1999). The localization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus of infected cells and identification of a potential nucleolar localization signal sequence. Virus Research 64 (1), 1-12.
Rowland R.R.R., Schneider P., Fang Y., Wootton S., Yoo D. and Benfield D.A. (2003). Peptide domains involved in the localization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein to the nucleolus. Virology 316 (1), 135-145.
Rowland R.R.R.  and Yoo D. (2003). Nucleolar-cytoplasmic shuttling of PRRSV nucleocapsid protein: a simple case of molecular mimicry or the complex regulation by nuclear import, nucleolar localization and nuclear export signal sequences. Virus Research 95 (1-2), 23-33.
Wootton S.K., Rowland R.R.R. and Yoo D. (2002). Phosphorylation of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein. Journal of Virology 76 (20), 10569-10576.
Wootton S.K. and Yoo D. (2003). Homo-oligomerization of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus nucleocapsid protein and the role of disulfide linkages. Journal of Virology 77 (8), 4546-4557.
Yoo D., Wootton S.K., Li G., Song C. and Rowland R.R. (2003). Colocalization and interaction of the porcine arterivirus nucleocapsid protein with the small nucleolar RNA-associated protein fibrillarin. Journal of Virology 77 (22), 12173-12183.
Yoo D., Welch S.-K.W., Lee C. and Calvert J.G. (2004). Infectious clones of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and their potential as vaccine vectors. Veterinary Immunology and Immunopathology 102, 143-154.
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно изобретению предложен генетически модифицированный РРСС-вирус, который был модифицирован в пределах NLS-2-области, NoLS-области и/или NES-области белка нуклеокапсида (N-белка) так, что получившийся РРСС-вирус является аттенуированным. Согласно данному изобретению также предложена инфекционная молекула РНК, кодирующая генетически модифицированный вирус, и выделенная полинуклеотидная молекула, содержащая последовательность ДНК, кодирующую описанную выше инфекционную молекулу РНК.
Согласно изобретению также предложена биологически чистая культура описанных вирусов (то есть по существу свободная от других вирусов) и описан вирусный вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, кодирующую генетически модифицированный РРСС-вирус, описанный выше.
Согласно данному изобретению также предложена трасфицированная клетка-хозяин, содержащая любой из вирусов, инфекционных молекул РНК, выделенных полинуклеотидов или вирусных векторов, описанных выше.
Согласно данному изобретению также предложена вакцина для защиты свиньи от инфекции вируса РРСС, содержащая генетически модифицированный РРСС-вирус, описанный выше, инфекционную молекулу РНК, описанную выше, кодирующую генетически модифицированный РРСС-вирус, выделенную полинуклеотидную молекулу (возможно, в форме плазмиды), описанную выше, кодирующую генетически модифицированный РРСС-вирус, или описанный выше вирусный вектор, кодирующий генетически модифицированный РРСС-вирус, в количестве, эффективном для выработки иммунитета против инфекции вируса РРСС, и носитель, приемлемый для ветеринарного применения.
Согласно изобретению также предложены резистентные к реверсии мутации NLS-2. Предпочтительные воплощения изобретения, особенно в целях вакцины, будут содержать дополнительные нуклеотидные замены и/или делеции, сконструированные с целью минимизации вероятности реверсии и минимизации вероятности мутации других фланкирующих остатков к исходным остаткам, таким как лизин и аргинин, и, таким образом, восстановления функционального NLS-фрагмента данной области.
Согласно данному изобретению также предложен способ защиты свиньи от инфекции РРСС-вируса, включающий вакцинирование животного указанной выше вакциной в количестве, эффективном для выработки иммунитета против инфекции РРСС-вируса.
Согласно изобретению предложен способ получения генетически модифицированного РРСС-вируса, включающий мутирование последовательности ДНК, кодирующей инфекционную молекулу РНК, которая кодирует описанный выше РРСС-вирус, и экспрессию генетически модифицированного РРСС-вируса с применением подходящей системы экспрессии.
РРСС-вирус, или дикого типа, или генетически модифицированный может быть экспрессирован с выделенной полинуклеотидной молекулы с применением подходящих систем экспрессии, в общем известных в уровне техники, примеры которых описаны в данной заявке. Например, выделенная полинуклеотидная молекула может быть в форме плазмиды, способной экспрессировать кодируемый вирус в подходящей клетке-хозяине in vitro, как более подробно описано ниже.
Другие признаки изобретения станут ясными после обзора.
Подробное описание изобретения
Здесь авторы изобретения раскрывают способ аттенуирования вирулентного РРСС-вируса посредством мутации или делеции NLS-2 области, NoLS-области или NES-области в нуклеокапсиде или N-белке (кодируемом ORF7) указанного вируса, иммуногенную композицию, содержащую указанный аттенуированнный вирус, и способ защиты свиней от РРСС посредством вакцинации указанными иммуногенными композициями. РРСС-вирусы, аттенуированные этим способом, должны сохранять антигенные характеристики вирулентного полевого штамма и, следовательно, обеспечивать более мощную защиту, чем вакцины на основе вирусов, аттенуированных в клеточной культуре.
Белок нуклеокапсида (N-белок) РРСС-вируса (РРССВ), кодируемый ORF7, представляет собой небольшой фосфорилированный основной белок (Wootton, Rowland, and Yoo, 2002) и формирует гомодимеры (Wootton and Yoo, 2003). Недавно была определена кристаллическая структура (Doan and Dokland, 2003). По-видимому, N-белок выполняет множество функций в инфицированной клетке. Кроме формирования сферической структуры капсида, в которую упакована геномная РНК, процесса, имеющего место в цитоплазме, часть N-белка транспортируется в ядро, а именно в ядрышко инфицированной клетки. Аминокислотная последовательность N-белка содержит два сигнала ядерной локализации (NLS), сигнал ядрышковой локализации (NoLS) и сигнал ядерного экспорта (NES), способствующие транспорту в ядро и ядрышко и экспорту из ядра соответственно (Rowland et al., 1999; Rowland et al., 2003; Rowland and Yoo, 2003). Находясь в ядрышке, N-белок взаимодействует с небольшим ядрышковым РНК-ассоциированным белком фибрилларином и может регулировать процессинг рРНК и биогенез рибосом в инфицированной клетке с целью поддержания репликации вируса (Yoo et al., 2003). В настоящем изобретении авторы изобретения показывают, что мутации и делеции в NLS-, NoLS- и NES-фрагментах N-белка могут приводить к образованию жизнеспособных вирусов с аберрантным ядерным транспортом, и что вирусы, содержащие такие мутации, полезны как вакцины против РРСС.
Вирусные мутации такого типа, сами по себе или в комбинации с другими аттенуирующими мутациями, ценны для разработки новых РРСС-вакцин.
Определения
«Эффективный иммунный ответ», «иммунитет» и подобные термины для целей настоящего изобретения обозначают иммунный ответ, направленный на один или более эпитопов патогена, для защиты вакцинируемого животного от инфекции, вызванной этим патогеном. В целях данного изобретения защита от инфекции, вызванной патогеном, включает не только абсолютное предупреждение инфекции, но также любое поддающееся обнаружению снижение степени или интенсивности инфекции, вызванной патогеном, или любое поддающееся обнаружению снижение тяжести заболевания или любого симптома или состояния, возникающего в результате инфекции, вызванной этим патогеном, у вакцинируемого животного в сравнении с невакцинированным зараженным животным. Эффективный иммунный ответ может быть вызван у животных, ранее не зараженных этим патогеном и/или не зараженных этим патогеном на момент вакцинации. Эффективный иммунный ответ может быть также вызван у животного, уже зараженного этим патогеном на момент вакцинации.
Генетически модифицированный РРСС-вирус является «аттенуированным», если он менее вирулентен, чем немодифицированный родительский штамм. Штамм «менее вирулентен», если он показывает статистически значимое снижение одного или более параметров, определяющих тяжесть заболевания. Такие параметры могут включать уровень вирусемии, лихорадку, тяжесть респираторного дистресс-синдрома, тяжесть репродуктивных симптомов или количество, или тяжесть поражений легких и так далее.
«Европейский РРСС-вирус» относится к любому штамму РРСС-вируса, имеющему генетические характеристики, ассоциированные с РРСС-вирусом, который был впервые выделен в Европе около 1991 г. (см., например, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13: 121-130). «Европейский РРСС-вирус» в данной области техники иногда также называют «Lelystad-вирус».
«Генетически модифицированный», при использовании здесь, если не указано иначе, обозначает здесь генетически мутировавший в результате вмешательства человека, «мутировавший» обозначает замену одной аминокислоты на другую или замену одного кодирующего нуклеотида другим (например, С на Т), то есть так называемую «замену», предпочтительно меняющую кодируемую аминокислоту, или любую другую мутацию, такую как «делеция» или «инсерция». Мутацию всегда осуществляют в кодирующей нуклеотидной последовательности.
«Клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию РРСС-вируса», обозначает клеточную линию, способную генерировать инфекционный РРСС, будучи зараженной вирусом по изобретению. Такие клетки включают альвеолярные макрофаги свиней и производные альвеолярных макрофагов свиней, клетки МА-104 и производные клеток МА-104, клетки MARC-145 и производные клеток MARC-145, и клетки, трансфицированные рецептором РРСС-вируса. Особо предпочтительными для демонстрации фенотипа небольших бляшек по изобретению являются клетки MARC-145. Термин «клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию РРСС-вируса», может также включать клетки живой свиньи.
«Иммунный ответ» для целей этого изобретения обозначает продукцию антител и/или клеток (таких как Т-лимфоциты), направленных против определенного эпитопа или определенных эпитопов, или способствующих их деструкции или ингибированию.
«Североамериканский РРСС-вирус» обозначает любой РРСС-вирус, имеющий генетические характеристики, ассоциированные с изолятом североамериканского РРСС-вируса, такого как РРСС-вирус, который был впервые выделен в Соединенных Штатах около начала 1990-х гг. (см., например, Collins, J.E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4: 117-126); изолят MN-1b североамериканского РРСС-вируса (Kwang J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6: 293-296); штамм Quebec IAF-exp91 PPCC (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140: 1405-1418); изолят VR 2385 североамериканского РРСС-вируса (Meng, X.-J. et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1795-1801), но не ограничивается ими. Генетические характеристики относятся к сходству геномных нуклеотидных последовательностей и сходству аминокислотных последовательностей, общих для штаммов североамериканского РРСС-вируса.
«Открытая рамка считывания», или "ORF", при использовании здесь обозначает здесь минимальную нуклеотидную последовательность, требующуюся для кодирования определенного белка РРСС-вируса без промежуточного стоп-кодона.
«Свиной» и «свинья» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к любому животному, являющемуся членом семейства Suidae, такому как, например, свинья. Термин «РРСС-вирус», при использовании здесь, если не указано иначе, обозначает любой штамм североамериканского или европейского РРСС-вируса.
«РРСС» включает симптомы заболевания, вызванного РРСС-вирусной инфекцией, у свиней. Примеры таких симптомов включают, но не ограничены лихорадкой, абортом у беременных самок, респираторным дистресс-синдромом, поражениями легких, потерей аппетита и падежом молодых свиней. При использовании здесь РРСС-вирус, который «неспособен вызвать РРСС», относится к вирусу, который может заразить свинью, но не вызывает каких-либо симптомов заболевания, обычно ассоциированных с РРСС-инфекцией у свиней.
«N-белок» РРСС-вируса (РРССВ) или «ORF7», при использовании здесь, обозначает полипептид, кодируемый ORF7 как европейского, так и североамериканского генотипов РРСС-вируса. На данный момент известны следующие примеры специфических изотипов N-белка: полипептид из 123 аминокислот изолята VR2322 североамериканского РРСС прототипа, представленный в Genbank под инвентарными номерами PRU87392, и N-белок из 128 остатков изолята Lelystad европейского прототипа РРСС, представленный в Genbank под инвентарным номером А26843.
«NLS-1-область N-белка РРССВ» или «NLS-1-область ORF РРССВ» относится к сигналу ядерной локализации "pat4" или "nuc1" (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003), содержащему четыре постоянные основные аминокислоты (лизин или аргинин), или три основных остатка и гистидин или пролин, расположенных в пределах приблизительно первых 15 нетерминальных остатков зрелого М-белка. В качестве примера последовательность NLS-1-области VR2332 представляет собой KRKK и занимает 9-12 остатки, в то время как у изолята Lelystad последовательность представляет собой КККК и занимает 10-13 остатки М-белка.
«NLS-2-область N-белка РРССВ» или «NLS-2-область ORF РРССВ» относится ко второму сигналу ядерной локализации в пределах N-белка, который может принимать одну из двух форм. У североамериканских РРСС-вирусов NLS-2 имеет структуру, которую авторы изобретения обозначили как фрагмент "pat8", который начинается с пролина и в пределах трех остатков сопровождается последовательностью из пяти остатков, содержащей по меньшей мере три основных остатка (К или R) из пяти (незначительная модификация фрагмента "pat7" или "nuc2", описанных Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). В качестве примера такая последовательность занимает 41-47 остатки N-белка изолята VR2332 североамериканского РРССВ и представлена последовательностью PGKKNKKK (SEQ ID NO:1). NLS-2 европейских РРСС-вирусов имеет фрагмент "pat4" или "nuc1", который представляет собой непрерывный участок из четырех основных аминокислот или трех основных остатков, ассоциированных с гистидином или пролином (Nakai & Kanehisa, 1992; Rowland & Yoo, 2003). NLS-2 изолята Leiystad европейских РРССВ занимает 47-50 остатки и представлен последовательностью KKKK.
«NoLS-область N-белка РРССВ» или «NoLS-область ORF РРССВ» относится к сигналу ядрышковой локализации, имеющему общую длину приблизительно 32 аминокислоты и включающему NLS-2-область вблизи его N-конца. В качестве примера NoLS-область VR2332 занимает остатки 41-72 и представлена последовательностью PGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSER (SEQ ID NO:2) (Rowland & Yoo, 2003), и соответствующая последовательность изолята Lelystad занимает 42-73 остатки и представлена последовательностью PRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTER (SEQ ID NO:3).
«NES-область N-белка РРССВ» или «NES-область ORF РРССВ» относится к сигналу ядерного экспорта, содержащему фрагмент LXL вблизи карбоксиконца N-белка. NES-фрагмент представляет собой X-R(2-5)-X-R2-X-R-Y, где Х представляет собой лейцин, изолейцин или валин, Y представляет собой лейцин, изолейцин, валин или аланин и R представляет собой любую аминокислоту. Как показано ниже, прототипные североамериканский и европейский изоляты соответствуют этой схеме, причем оба имеют спейсер из пяти остатков.
«Трансфицированная клетка-хозяин» обозначает практически любую клетку-хозяина, описанную в патенте США 5600662, которая, будучи трансфицированной РНК РРСС-вируса, способна продуцировать РРСС-вирионы первого цикла. При необходимости дальнейшего продуктивного заражения будет использована «клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию РРСС-вируса», как определено ниже.
Полинуклеотидные молекулы могут быть генетически мутированы с применением рекомбинантных технологий, известных специалистам в данной области, включая сайт-направленный мутагенез или неспецифический мутагенез, например воздействием химических мутагенов или радиацией, как известно в уровне техники. Указанные мутации могут быть осуществлены стандартными способами, известными в этой области техники, например сайт-направленным мутагенезом (см., например, Sambrook et at. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 (nd) ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) инфекционной копии, как описано (например, Meulenberg et al., Adv. Exp. Med. Biol, 1998, 440: 199-206).
В соответствии с этим, согласно данному изобретению, предложен способ получения генетически модифицированного североамериканского РРСС-вируса, включающий мутирование последовательности ДНК, кодирующей инфекционную молекулу РНК, кодирующую описанный выше РРСС-вирус, и экспрессию генетически модифицированного РРСС-вируса с применением подходящей системы экспрессии. Генетически модифицированный РРСС-вирус может быть экспрессирован с выделенной полинуклеотидной молекулой с применением подходящих систем экспрессии, в общем известных в уровне техники, примеры которых описаны в данной заявке. Например, выделенная полинуклеотидная молекула может быть представлена в форме плазмиды, способной экспрессировать кодируемый вирус в подходящей клетке-хозяине in vitro, как более подробно описано ниже.
Последовательности N-белка североамериканского РРССВ высококонсервативны и описанные последовательности имеют приблизительно 93-100% идентичность друг с другом. N-белки североамериканского и европейского РРССВ идентичны на приблизительно 57-59% и имеют общие структурные фрагменты.
В качестве примера последовательность NES-области VR2332 занимает 106-117 остатки и представлена последовательностью LPTHHTVRLIRV (SEQ ID NO:4) (Rowland & Yoo, 2003) и последовательность изолята Lelystad занимает 107-118 остатки и представлена последовательностью LPVAHTVRLIRV (SEQ ID NO:5).
Ниже, в консенсусе, включающем все последовательности в последовательностях североамериканского РРССВ в Genbank, положения, обозначенные (*), абсолютно консервативны. Альтернативные аминокислоты показаны под каждым положением.
LPTHHTVRLIRV (SEQ ID NO:4)
**VAQ******A
Q
V
G
Нумерация аминокислот, приведенная выше, соответствует упомянутым входным данным базы данных. Во всех других изолятах РРСС, которые могут быть пронумерованы по-другому, идентификацию нужных областей без труда осуществляли путем идентификации аминокислот с фиксированными характеристиками в интересующем штамме РРСС и их сопоставлении с эталонным штаммом. Задача данного изобретения состояла в том, чтобы модифицировать РРСС-вирус или кодирующие его нуклеиновые кислоты так, что одна или более чем одна консервативная область была элиминирована заменой, делецией или инсерцией, что привело бы к аттенуированному фенотипу.
Делеции, инсерции или замены, элиминирующие консервативный NLS-2-фрагмент, NoLS-фрагмент или NES-фрагмент, вводят модификацией полинуклеотидов в кодирующих вирусах по изобретению. В предпочтительном воплощении делеция или инсерция, включающая 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот, приводит к элиминации консервативного фрагмента и приводит к аттенуированному вирусу.
Аминокислоты могут быть классифицированы по физическим свойствам и вкладу во вторичную и третичную структуру белка. В уровне техники консервативной заменой признают замену одной аминокислоты на другую аминокислоту со схожими свойствами. Типичные консервативные замены представлены в таблице 1 непосредственно ниже (из WO 97/09433, стр.10, опубликованной 13 марта, 1997 (PCT/GB96/02197, поданной 9/6/96)).
Таблица 1.
Консервативные замены I
ХАРАКТЕРИСТИКА БОКОВОЙ ЦЕПИ
АМИНОКИСЛОТА
Алифатические
Неполярные
GAP
ILV
Полярные незаряженные
CSTM
NQ
Полярные заряженные
DE
KR
Ароматические
HFWY
Прочие
NQDE
Альтернативно, консервативные аминокислоты могут быть сгруппированы, как это описано в Lehninger [Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77], как представлено непосредственно ниже в таблице 2.
Таблица 2.
Консервативные замены II
БОКОВАЯ ЦЕПЬ
ХАРАКТЕРИСТИКА
АМИНОКИСЛОТА
Неполярные (гидрофобные)
А. Алифатические:
ALIVP
Б. Ароматические:
FW
В. Серосодержащие:
М
Г. Пограничные:
G
Незаряженные полярные
А. Гидроксильные:
STY
Б. Амидные:
NQ
В. Сульфгидрильные:
С
Г. Пограничные:
G
Положительно заряженные
KRH
(основные):
Отрицательно заряженные (кислые)
DE
В качестве еще одной альтернативы типичные консервативные замены представлены непосредственно ниже в таблице 3.
Таблица 3.
Консервативные замены III
Исходный остаток
Типичная замена
Ala (A)
Val, Leu, Ile
Arg (R)
Lys, Gln, Asn
Asn (N)
Gln, His, Lys, Arg
Asp (D)
Glu
Cys (С)
Ser
Gln (Q)
Asn
Glu (E)
Asp
His (H)
Asn, Gln, Lys, Arg
Ile (I)
Leu, Val, Met, Ala, Phe,
Leu (L)
Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys (K)
Arg, Gln, Asn
Met (M)
Leu, Phe, Ile
Phe (F)
Leu, Val, Ile, Ala
Pro (P)
Gly
Ser (S)
Thr
Thr (T)
Ser
Trp (W)
Tyr
Tyr (Y)
Trp, Phe, Thr, Ser
Val (V)
Ile, Leu, Met, Phe, Ala
Получение генетически модифицированного РРСС-вируса
Генная инженерия включает очень разнообразные и эффективные молекулярно-биологические способы, направленные на модификацию нуклеиновых кислот на уровне ДНК, и делает возможным анализ и модификацию геномов на молекулярном уровне. В связи с этим вирусы, такие как РРСС-вирус, ввиду малого размера их генома особенно легко поддаются такого рода манипуляциям. Тем не менее, генная инженерия не является непосредственно применимой к РНК-вирусам, не относящимся к ретровирусам, поскольку репликация этих вирусов не включает промежуточную ДНК-стадию. Для таких вирусов, перед тем как генную инженерию можно будет применить к их геному для создания модифицированного вируса, должны быть произведены инфекционные кДНК-клоны. Инфекционные клоны могут быть получены конструированием полноразмерной (длина генома) кДНК изучаемого вируса (здесь используют в широком смысле ДНК-копии РНК, а не только в узком смысле ДНК-копии мРНК), после чего инфекционный транскрипт синтезируется in vivo в клетках, трансфицированных полноразмерной кДНК, однако инфекционные транскрипты могут также быть получены транскрипцией in vitro из лигированных in vitro фрагментов кДНК неполной длины, содержащих полный вирусный геном. В любом случае, транскрибированная РНК несет все модификации, введенные в кДНК, и может быть использована для дальнейшего пассажа модифицированного таким образом вируса.
Получение инфекционного клона изолята европейского РРСС-вируса или вируса Lelystad описано в патенте США №6268199, который полностью включен посредством ссылки. Получение инфекционного кДНК-клона изолята североамериканского РРСС-вируса, обозначенного Р129 (Lee et al., 2005; Yoo et al., 2004), описано в патенте США 6500662, который полностью включен посредством ссылки. Последовательность кДНК Р129 раскрыта в Genbank под инвентарным номером AF 494042 и в патенте США 6500662. Ниже в работе авторов изобретения применяется инфекционный клон, который в виде плазмиды экспрессируется немедленно-ранним промотором CMV-вируса (цитомегаловируса) и был обозначен pCMV-S-P129, и также раскрыт в патенте США 6500662. Как описано в патенте США 6500662, существуют другие плазмиды и промоторы, подходящие для применения в данном изобретении.
Зная полноразмерную последовательность любой интересующей открытой рамки считывания и расположение интересующего аминокислотного остатка, любому специалисту в данной области требуется лишь обратиться к таблице кодонов, чтобы сконструировать изменения в конкретном желаемом положении.
Таблица аминокислот и их типичных аббревиатур, символов и кодонов представлена в следующей таблице 4.
Таблица 4
Аминокислота
Аббревиатура
Символ
Кодон(ы)
Аланин
Ala
A
GCA
GCC
GCG
GCU
Цистеин
Cys
С
UGC
UGU
Аспарагиновая кислота
Asp
D
GAC
GAU
Глутаминовая кислота
Glu
E
GAA
GAG
Фенилаланин
Phe
F
UUC
UUU
Глицин
Gly
G
GGA
GGC
GGG
GGU
Гистидин
His
H
CAC
CAU
Изолейцин
Ile
I
AUA
AUC
AUU
Лизин
Lys
K
AAA
AAG
Лейцин
Leu
L
UUA
UUG
CUA
CUC
CUG
CUU
Метионин
Met
M
AUG
Аспарагин
Asn
N
AAC
AAU
Пролин
Pro
P
CCA
CCC
CCG
CCU
Глутамин
Gln
Q
CAA
CAG
Аргинин
Arg
R
AGA
AGG
CGA
CGC
CGG
CGU
Серин
Ser
S
AGC
AGU
UCA
UCC
UCG
UCU
Треонин
Thr
Т
АСА
ACC
ACG
ACU
Валин
Val
V
GUA
GUC
GUG
GUU
Триптофан
Trp
W
UGG
Тирозин
Tyr
Y
UAC
UAU
Кодоны представляют собой триплетные последовательности нуклеотидов в мРНК и соответствующие им кДНК молекулы. Для кодонов характерно основание урацил (U), когда они присутствуют в молекуле мРНК, но когда они присутствуют в ДНК, для них характерно основание тимин (Т). Простое изменение в кодоне для одного и того же аминокислотного остатка в полинуклеотиде не изменит последовательность или структуру кодируемого полипептида. Очевидно, при утверждении, что последовательность из 3 конкретных нуклеотидов «кодирует» любую конкретную аминокислоту, специалист в данной области определит, что таблица, приведенная выше, предоставляет способ идентификации рассматриваемых конкретных нуклеотидов. В качестве примера, если последовательность из трех конкретных нуклеотидов кодирует лизин, то в приведенной выше таблице показано, что две возможные триплетные последовательности представляют собой ААА и AAG. Глицин кодируют GGA, GGC, GGT (GGU если в РНК) and GGG. Для замены в кодируемом белке остатка лизин на глицин можно заменить триплет ААА или AAG на любой из GGA и GGC, GGT или GGG в кодирующей нуклеиновой кислоте. Кодирующая последовательность N- или ORF7-белка изолята Р129 представлена ниже.
Конструирование полинуклеотидной последовательности мутантного N-белка с модифицированными NLS-2-областями продемонстрировано путем иллюстративного примера в Примере 1.
Следует понимать, что мутации в NLS-1-, NoLS- и NES-областях могут быть также выполнены похожими способами с похожими результатами.
Демонстрация того, что генетически модифицированный РРСС-вирус является аттенуированным
Для демонстрации того, что конкретный генетически модифицированный штамм является аттенуированным, может быть использован эксперимент, описанный ниже.
Группы по меньшей мере из 10 подсвинков, произведенных на ферме, не зараженной РРССВ, включены в каждое исследование. По результатам тестов сыворотка животных не содержит специфических антител против РРСС-вируса и животные РРССВ-негативны. Все животные, включенные в исследование, имеют общий источник и породу. Распределение животных по группам случайно.
5
50
Заражение проводили на 90 день беременности интраназальным нанесением 1 мл РРССВ 10 TCID (средняя цитопатогенная доза) в каждое носовое отверстие. В начале каждого теста было по меньшей мере три группы: одна группа для заражения Р129, одна тестируемая группа для заражения возможно аттенуированным вирусом и одна группа строгого контроля.
Исследование считают достоверным, если животные из группы строгого контроля оставались РРССВ-негативными в течение всего исследования, и в группе, зараженной Р129, рождается по меньшей мере на 25% меньше живых здоровых поросят, чем в группе строгого контроля.
Аттенуацию, или другими словами ослабление вирулентности, определяют как статистически значимое изменение одного или более параметров, определяющих репродуктивность или другую симптомологию.
Значимое снижение по меньшей мере одного из следующих параметров в тестируемой группе (возможно, аттенуированный вирус) в сравнении с группой, зараженной немодифицированным родительским штаммом, было свидетельством аттенуации:
а) частота мертворождений;
б) аборты в 112 день беременности или до него;
в) количество мумифицированных поросят;
г) количество менее активных и слабых поросят;
д) смертность до отъема.
Более того, предпочтительным является существенное повышение одного из следующих параметров в тестируемой группе в сравнении с группой, зараженной немодифицированным родительским штаммом:
а) количество поросят, отлученных от свиноматки;
б) количество живых здоровых поросят, рожденных свиноматкой.
В качестве альтернативы респираторные симптомы и другие симптомы РРССВ-инфекции могут быть изучены для оценки аттенуации, как описано ниже в Примере 3.
Вакцины
Аттенуированный штамм ценен для приготовления вакцин.
(3-7)
(50)
Настоящая вакцина эффективна, если она защищает свинью от инфекции, вызванной РРСС-вирусом. Вакцина защищает свинью от инфекции, вызванной РРСС-вирусом, если после введения вакцины одной или более незараженным свиньям последующее заражение биологически чистым изолятом вируса (например, VR 2385, VR 2386, Р129 и так далее) приводит к менее тяжелым макроскопическим или гистопатологическим изменениям (например, поражениям легких) и/или симптомам заболевания в сравнении с изменениями и симптомами, обычно вызываемыми этим изолятом у похожих свиней, не являющихся защищенными (то есть относительно соответствующего контроля). Конкретнее, эффективность данной вакцины может быть показана введением вакцины одной или более подходящим свиньям, нуждающимся в этом, и последующим заражением большой порцией (10 TCID) биологически чистого изолята РРССВ после соответствующего промежутка времени (например 3 недели). Затем через примерно одну неделю у зараженных свиней брали анализ крови и пытались выделить вирус из образца крови (например, см., пример процедуры выделения вируса приведен ниже в Эксперименте VIII). Выделение большого количества вируса представляет собой свидетельство того, что вакцина не может быть эффективной, в то время как выделение уменьшенных количеств вируса (или его отсутствие) представляет собой свидетельство того, что вакцина может быть эффективной.
Таким образом, эффективность настоящей вакцины может быть оценена количественно (то есть снижение процентного содержания уплотненной легочной ткани по сравнению с соответствующей контрольной группой) и качественно (например, выделение РРССВ из крови, обнаружение антигена РРССВ в образце ткани легкого, миндалины или лимфатического узла иммунологическим анализом). Симптомы респираторно-репродуктивного заболевания свиней могут быть оценены количественно (например, температура/лихорадка), полуколичественно (например, тяжесть респираторного дистресс-синдрома [объяснено ниже более подробно] или качественно (например, присутствие или отсутствие одного или более симптомов или снижение тяжести одного или более симптомов, таких как цианоз, пневмония, поражения легкого и так далее).
Незараженная свинья представляет собой свинью, которая не была подвержена воздействию инфекционного агента респираторно-репродуктивного заболевания свиней, или которая была подвержена воздействию инфекционного агента респираторно-репродуктивного заболевания свиней, но не демонстрирует симптомы этого заболевания. Зараженная свинья представляет собой свинью, которая демонстрирует симптомы РРСС и из которой может быть выделен РРССВ.
Вакцины по настоящему изобретению могут быть изготовлены по приемлемым правилам и включать носители, приемлемые для животных, включая людей (как подходит), такие как стандартные буферы, стабилизаторы, разбавители, консерванты и/или солюбилизаторы, и могут быть также изготовлены для облегчения длительного высвобождения. Разбавители включают воду, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобное. Добавки для изотоничности включают среди прочих натрия хлорид, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают среди прочих альбумин. Другие подходящие наполнители для вакцин и добавки, включая те, которые являются особенно полезными в изготовлении модифицированных живых вакцин, известны или очевидны специалистам. См., например, Remington's Pharmaceutical Science, 18 th ed., 1990, Mack Publishing, включенное сюда посредством ссылки.
Вакцины по настоящему изобретению могут также содержать один или более дополнительных иммуномодуляторных компонентов, таких как, например, среди прочих, адъювант или цитокин. Неограничивающие примеры адъювантов, которые могут быть использованы в вакцине по настоящему изобретению, включают адъювантную систему RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), квасцы, минеральные гели, такие как гель гидроксида алюминия, эмульсии типа «масло в воде», эмульсии типа «вода в масле», такие как, например, полный и неполный адъюванты Фрейнда, блок-сополимер (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN, сапонин, Quil А или другая фракция сапонина, монофосфориллипид А, липид-аминный адъювант Avridine. Неограничивающие примеры эмульсий типа «масло в воде», полезных в вакцине по изобретению, включают модифицированные композиции SEAM62 и SEAM 1/2. Модифицированная SEAM62 представляет собой эмульсию типа «масло в воде», содержащую 5% (об./об.) сквалена (Sigma), 1% (об./об.) детергента SPAN 85 (ICI Surfactants), 0,7% (об./об.) детергента TWEEN 80 (ICI Surfactants), 2,5% (об./об.) этанола, 200 пг/мл Quil A, 100 [мгр] г/мл холестерина и 0,5% (об./об.) лецитина. Модифицированная SEAM 1/2 представляет собой эмульсию типа «масло в воде», содержащую 5% (об./об.) сквалена, 1% (об./об.) детергента SPAN 85, 0,7% (об./об.) детергента Tween 80, 2,5% (об./об.) этанола, 100 мкг/мл Quil А и 50 мкг/мл холестерина. Другие иммуномодуляторные агенты, которые могут быть включены в вакцину, включают, например, один или более интерлейкинов, интерферонов или другие известные цитокины.
Вакцины по настоящему изобретению могут, возможно, быть изготовлены для длительного высвобождения вируса, инфекционной молекулы РНК, плазмиды или вирусного вектора по настоящему изобретению. Примеры таких композиций с длительным высвобождением включают вирус, инфекционную молекулу РНК, плазмиду или вирусный вектор в комбинации со смесью биосовместимых полимеров, таких как, например, поли(молочная кислота), сополимер молочной и гликолевой кислот, метилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, коллаген и тому подобное. Структура, выбор и применение разлагаемых полимеров в наполнителях для доставки лекарственных средств рассмотрены в нескольких публикациях, в том числе A. Domb et al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279-292, включенной сюда посредством ссылки. Дополнительные указания по выбору и применению полимеров в фармацевтических композициях могут быть найдены в руководствах, известных в уровне техники, например М. Chasin and R. Langer (eds), 1990, "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in: Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Vol.45, М. Dekker, N.Y., которое также включено сюда посредством ссылки. Альтернативно или дополнительно, вирус, плазмида или вирусный вектор может быть микроинкапсулирован для улучшения введения и эффективности. Способы микроинкапсуляции антигенов хорошо известны в уровне техники и включают методики, описанные, например, в патенте США №3137631, патенте США №3959457, патенте США №4205060, патенте США №4606940, патенте США №4744933, патенте США №5132117 и международной патентной публикации WO 95/28227, которые включены сюда посредством ссылки.
Для обеспечения длительного высвобождения вируса, плазмиды или вирусного вектора также могут быть использованы липосомы. Подробности, касающиеся изготовления и применения липосомных композиций, могут быть найдены, помимо прочего, в патенте США №4016100, патенте США №4452747, патенте США №4921706, патенте США №4927637, патенте США №4944948, патенте США №5008050 и патенте США №5009956, которые включены сюда посредством ссылки.
Эффективное количество любой из описанных выше вакцин может быть установлено обычными средствами, начиная с низкой дозы вируса, плазмиды или вирусного вектора и, затем, увеличением дозировки с одновременным мониторингом эффектов. Эффективное количество может быть достигнуто после одного введения вакцины или после нескольких введений вакцины. Известные факторы также могут быть приняты во внимание при установлении оптимальной дозы для животного. Они включают вид, размер, возраст и общее состояние животного, присутствие других лекарственных средств в организме животного и тому подобное. Фактическую дозировку предпочтительно выбирают после рассмотрения результатов исследований на других животных.
Один из способов выявления того, был ли достигнут адекватный иммунный ответ, заключается в установлении сероконверсии и титра антител у животного после вакцинации. Выбор момента вакцинации и количество повторных инъекций антигена, если они необходимы, предпочтительно определяют доктор или ветеринар на основе анализа значимых факторов, некоторые из которых описаны выше.
1
9
Эффективное количество дозы вируса, инфекционной молекулы РНК, плазмиды или вирусного вектора по настоящему изобретению может быть определено с применением известных методик с учетом факторов, которые могут быть установлены специалистом в данной области, таких как масса тела животного, подлежащего вакцинации. Количество дозы вируса по настоящему изобретению в вакцине по настоящему изобретению предпочтительно колеблется от примерно 10 до примерно 10 бляшкообразующих единиц (pfu), более предпочтительно от примерно
2
8
3
7
1
9
2
8
3
7
10 до примерно 10 pfu и наиболее предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 pfu. Количество дозы плазмиды по настоящему изобретению в вакцине по настоящему изобретению предпочтительно колеблется от примерно 0,1 мкг до примерно 100 мг, более предпочтительно от примерно 1 мкг до примерно 10 мг, даже более предпочтительно от примерно 10 мкг до 1 мг. Количество дозы инфекционной молекулы РНК по настоящему изобретению в вакцине по настоящему изобретению предпочтительно колеблется от примерно 0,1 до примерно 100 мг, более предпочтительно от примерно 1 мкг до примерно 10 мг, даже более предпочтительно от примерно 10 мкг до 1 мг. Количество дозы вирусного вектора по настоящему изобретению в вакцине по настоящему изобретению предпочтительно колеблется от примерно 10 pfu до примерно 10 pfu, более предпочтительно от примерно 10 pfu до примерно 10 pfu и наиболее предпочтительно от примерно 10 pfu до примерно 10 pfu. Подходящий размер дозировки колеблется от примерно 0,5 мл до примерно 10 мл и более предпочтительно от примерно 1 мл до примерно 5 мл.
В качестве примера вакцины могут быть доставлены перорально, парентерально, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, интраназально или внутривенно. Пероральная доставка может включать, например, добавление композиций к пище и питью животных. Факторы, влияющие на дозировку вакцины, включают, например, массу тела и возраст свиньи.
Согласно настоящему изобретению предложен способ приготовления вакцины, содержащей описанные здесь РРСС-вирус, инфекционную молекулу РНК, плазмиду или вирусный вектор, включающий объединение эффективного количества одного из РРСС-вируса, инфекционной молекулы РНК, плазмиды или вирусного вектора по настоящему изобретению с носителем, приемлемым для фармацевтического или ветеринарного применения.
Кроме того, живая аттенуированная вакцина по настоящему изобретению может быть модифицирована, как описано в патенте США 6500662, с применением известных рекомбинантных методик таким образом, чтобы она кодировала гетерологичный эпитоп, включенный в РРСС-вирусный геном. Эпитопы, полезные в качестве гетерологичных эпитопов по настоящему изобретению, включают эпитопы свиного патогена, отличного от РРСС-вируса, которые включают эпитоп свиного патогена, выбранный из группы, состоящей из свиного парвовируса, свиного цирковируса, свиного ротавируса, свиного гриппа, вируса псевдобешенства, вируса трансмиссивного гастроэнтерита, свиного респираторного коронавируса, вируса классической чумы свиней, вируса африканской чумы свиней, вируса энцефаломиокардита, свиного парамиксовируса, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Bacillus anthraci, Bordetella bronchiseptica, Clostridium haemolyticum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Escherichia coli, Erysipelothdix rhusiopathiae, Haemophilus parasuis, Leptospira spp., Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynovia, Pasteurella multocida, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Streptococcus equismilis и Streptococcus suis, но не ограничены ими. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эпитопы вышеупомянутых свиных патогенов, известны в уровне техники и могут быть получены из общедоступных генных баз данных, таких как Gen Bank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Genbank/index.html), предоставленная NCBI.
Дополнительные признаки и варианты данного изобретения будут ясны специалистам в данной области из всей данной заявки, включая подробное описание, и все эти признаки рассматриваются как аспекты данного изобретения. Аналогично, признаки данного изобретения, описанные здесь, могут быть рекомбинированы в дополнительных воплощениях, которые также рассматриваются как аспекты данного изобретения, независимо от того, является ли комбинация признаков, специально упомянутая выше, как аспект или воплощение данного изобретения. Также, только те признаки, которые описаны здесь как существенные для данного изобретения, следует рассматривать как таковые; варианты изобретения, не имеющие признаки, которые не были описаны здесь как существенные, рассматриваются как аспекты данного изобретения. Ясно, что изобретение может быть применено иначе, чем описано в вышеизложенном описании и примерах.
В свете вышеупомянутых идей возможны многочисленные модификации и варианты настоящего изобретения, которые, следовательно, входят в объем данного изобретения.
Настоящее изобретение далее проиллюстрировано, но не ограничено, следующими примерами.
Пример 1. Конструирование челночной плазмиды pTB-shuttIe-PRRSV-3997
4
2
4
4
Челночная плазмида была сконструирована с целью облегчить включение специфических модификаций в полноразмерный геномный кДНК-клон РРСС-вируса. Фрагмент из 3997 пар оснований (bp), представляющий собой 3'-конец вирусного генома (положения нуклеотидов с 11504 до 15416, включая полиаденозиновый хвост длиной в 21 остаток), и 84 bp векторных последовательностей в прямом направлении были амплифицированы с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР включала 5 нг ДНК плазмиды pCMV-S-P129 (США 6500662 В1), 300 нг прямого праймера P-shuttle-Fwd (5'-ACTCAGTCTAAGTGCTGGAAAGTTATG-3') (SEQ ID NO:8): положения с 11504 по 11530), 300 нг обратного праймера P-shuttle-Rev primers (5'-ATCTTATCATGTCTGGATCCCCGCGGC-3') (SEQ ID NO:9): положения с 15500 по 15475), 1 мМ каждого из дезоксицитидинтрифосфата (dCTP), дезоксигуанозинтрифосфата (dGTP), дезоксиаденозинтрифосфата (dATP), дезокситимидинтрифосфата (dTTP), 1× ПЦР-буфер [10 мМ KCl, 10 мМ (NH)SO, 20 мМ трис-HCl (рН 8,8), 2 мМ MgSO, 0,1% Triton X-100] и 2,5 ед Pfu ДНК-полимеразы (Stratagene) с применением GeneAmp PCR system 2400 (Perkin Elmer). Реакционную массу нагревали при 95°С в течение 5 минут и подвергали 35 циклам амплификации в следующих условиях: денатурация при 95°С в течение 30 секунд, отжиг праймера при 55°С в течение 1 минуты и удлинение при 72°С в течение 3 минут. Продукт ПЦР был клонирован в pTrueBlue-вектор с применением TrueBlue MicroCartridge™ PCR Cloning Kit XL (Genomics One; Buffalo, New York) для создания pTB-shuttle-PRRSV-3997.
Пример 2. Модификация NLS-2-последовательности для генерации Р129-GG-вируса
GGGGGAAAT
ATTTCCCCCT
4
2
4
4
Сайт-направленный мутагенез, основанный на ПЦР, использовали для модификации фрагмента сигнала ядерной локализации 2 (NLS-2-фрагмента), расположенного в аминокислотных положениях с 41 по 47 белка нуклеокапсида (N-белка). Среди североамериканских генотипов РРСС-вирусов этот NLS-фрагмент обычно представляет собой PGKKNKK (как в прототипном изоляте VR-2332 или в канадском изоляте РА-8) или ее производное, такое как PGKKSKK (обнаружен в изолятах Р129 и 93-47324). Считается, что присутствие множественных положительно заряженных остатков лизина (K) или аргинина (R) важно для полностью функционального NLS-сигнала. Остатки лизина в положениях 43 и 44 N (положения нуклеотидов 14999-15004 генома Р129) были заменены остатками глицина с использованием челночной плазмиды и мутагенной пары праймеров KK43/44GG-Fwd (5'-GGCAAGGGACCGGGAAAGAAGAAAAAC-3') (SEQ ID NO:10)-: геномные положения с 14984 по 15019) и KK43/44GG-Rev (5'-GTTTTTCTTCTTCCCGGTCCCTTGCC-3') (SEQ ID NO:11)-: геномные положения с 14984 по 15019), где подчеркивание указывает изменения кодонов для аминокислотных замен KKS на GGN. ПЦР-амплификации проводили с использованием 5 нг ДНК плазмиды pTB-shuttle-PRRSV-3997, 300 нг каждого из прямого и обратного праймеров, 1 мМ концентрации каждого из dCTP, dGTP, dATP и dTTP, 1× ПЦР-буфер [10 мМ KCl, 10 мМ (NH)SO, 20 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 2 мМ MgSO, 0,1% Triton Х-100] и 2,5 ед Pfu ДНК-полимеразы (Stratagene). Образцы подвергали 16 циклам амплификации в следующих условиях: денатурация при 94°С в течение 30 секунд, отжиг праймера при 55°С в течение 1 минуты и удлинение праймера при 68°С в течение 12 минут 30 секунд. После циклов ПЦР ПЦР-продукт гидролизовали 10 ед DpnI для удаления метилированной матрицы ДНК плазмиды. Клетки E.coli XL1-Blue трансформировали с использованием теплового шока 4 мкл ПЦР-DpnI гидролизованной реакционной массы, содержащей мутантные плазмиды, и высевали на чашки с агаром Луриа-Бертани (LB), содержащим ампициллин. Колонии отобрали случайно и культивировали в течение ночи. ДНК плазмиды приготавливали с применением QIAprep spin miniprep kit (Qiagen). Присутствие желаемой мутации (PGGGNKK) верифицировали секвенированием нуклеотида, и полученную плазмиду назвали pTB-shuttle-N-GG.
И челночная плазмида, несущая GG-мутацию (pTB-shuttle-N-GG), и полноразмерный геномный клон дикого типа (pCMV-S-P129) имеют уникальные сайты BsrG I и Spe I (в положениях 1192 и 3963 и положениях 12692 и 15463 соответственно). После гидролиза этими двумя ферментами фрагмент BsrG I - Spe I 2772 bp был подвергнут очистке в геле от pTB-shuttle-N-GG, и фрагмент BsrG I - Spe I 16120 bp был подвергнут очистке в геле от pCMV-S-P129. Эти два фрагмента были лигированы с применением Т4 ДНК-лигазы (Invitrogen) для конструирования GGN-модифицированного полноразмерного геномного кДНК-клона. Штамм DH5-α E.coli был трансформирован 10 мкл лигазной реакционной массы. Бактериальные колонии были отобраны из LB-чашек, содержащих ампициллин, и были приготовлены ДНК плазмиды. Основываясь на Xma I способах гидролиза были выбраны полноразмерные клоны. Выбранные клоны были секвенированы для подтверждения присутствия модификации GGN в полноразмерном геномном кДНК-клоне. Одна из полученных плазмид была обозначена pCMV-S-P129-GG.
2
2
2
3
3
4
5
MARC-145-клетки культивировали на модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 8% сывороткой плода коровы (FBS; Gibco BRL), пенициллином (100 ЕД/мл) и стрептомицином (50 мкг/мл), при 37°C с 5% CO. Клетки высевали в чашки диаметром 35 мм и культивировали до 70% конфлюэнтности. Клетки трансфицировали в течение 24 часов 2 мкг ДНК плазмиды pCMV-S-P129-GG с применением Lipofectin (Invitrogen). Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С на DMEM, дополненной 8% FBS, в течение 5 дней. РРССВ-специфический цитопатический эффект (СРЕ) наблюдали с 3 дня после трансфекции, и дальнейшее распространение на соседние клетки наблюдали до 5 дня после трансфекции. Специфичность СРЕ подтверждали иммунофлуоресцентным окрашиванием клеток с применением кроличьей антисыворотки к неструктурным белкам nsp2 и nsp3, и N-специфичного MAb SDOW17 (см. Фиг.1). Плавающие на поверхности культуры из трансфицированных клеток собрали на 5 день после трансфекции и обозначили «P129-GG пассаж 1» (Р1). Вирус пассажа 1 был использован для заражения свежих Marc-145-клеток, и урожай 5 дня был обозначен «пассаж-2» (Р2). Вирус «пассажа-3» (Р3) был приготовлен так же, как Р2. Каждый пассаж вируса до использования хранили в 1 мл аликвотах при -80°С. Каждый пассаж Р129-GG-вируса титровали анализом бляшкообразования, и были определены титры 1×10, 5×10 и 5×10 pfu/мл для пассажей 1, 2 и 3 соответственно. Вирус Р129 дикого типа генерировали из pCMV-S-P129 и титровали в параллельных уступающих титрах 1×10, 1×10 и 5×10 pfu/мл для пассажей 1, 2 и 3 соответственно.
Пример 3. Заражение свиней Р129-GG-вирусом и родительским р129-вирусом (Демонстрация того, что Р129-GG-вирус является аттенуированным)
4
4
Здоровые гибридные свиньи, не перенесшие заболевания, вызванного РРССВ и Mycoplasma hyopneumoniae или вакцинацией против РРССВ и Mycoplasma hyopneumoniae, в количестве двадцати одной были случайно включены в состав 3 групп лечения по 7 свиней в каждой. В возрасте примерно 6 недель Т01-свиньи получали плацебо, в то время как Т02- и Т03-свиньи получали интраназальное заражение 2,0 мл вирусного раствора, разведенного до 2,5×10 pfu/мл (5,0×10 pfu в дозе), генетически модифицированного Р129-GG-вируса (генерированного из плазмиды pCMV-S-P129-GG) или родительского РРСС-вируса Р129 (генерированного из плазмиды pCMV-S-Р129) соответственно. У всех свиней ежедневно наблюдали за клиническими признаками, включая общее состояние, депрессию, потерю аппетита, чихание, кашель, респираторный дистресс-синдром. Записывали ректальные температуры и массы тела. Образцы крови для выделения РРССВ и серологии брали на 0, 4, 7, 10, 14, 21 и 28 дни. Аутопсии производили на дни 14 (2 свиньи из группы) и 28 (5 свиней из группы) и получали образцы тканей (легкое и миндалина). Производили оценку тяжести поражения легких и процент консолидации каждой доли легкого. Свиньи в группах Т02 и Т03 обнаруживали признаки легкой РРСС-вирусной инфекции, содержали вирус в сыворотке, были подвержены сероконверсии. Незараженные контрольные свиньи (Т01) оставались негативными в отношении вирусемии и антител к РРСС-вирусу в сыворотке.
В сравнении со свиньями, зараженными родительским Р129-вирусом (Т03), свиньи, зараженные Р129-GG-вирусом (Т02), содержали меньше вируса в сыворотке (Фиг.2а и 2б) и вырабатывали большие уровни ELISA-антител к РРСС-вирусу (Фиг.2В и 2Г) и нейтрализующих антител (Фиг.2д).
Таблица 6.
Уровни ELISA-антител (S/P)
0 день
4 день
7 день
10 день
14 день
21 день
28 день
P129-wt
свинья 28
0,000
0,000
0,061
0,283
0,527
0,689
1,025
свинья 30
0,006
0,000
0,044
0,178
0,527
0,731
0,672
свинья 35
0,000
0,000
0,000
0,027
0,157
0,241
0,197
свинья 40
0,004
0,021
0,030
0,208
0,575
0,723
0,890
свинья 43
0,000
0,000
0,049
0,354
0,419
1,760
2,006
среднее
0,002
0,004
0,037
0,210
0,441
0,829
0,958
P129-GG
свинья 33
0,000
0,000
0,000
0,356
0,873
1,377
1,705
свинья 36
0,000
0,000
0,019
0,383
1,038
1,536
1,604
свинья 38
0,000
0,000
0,034
0,248
0,383
0,723
1,398
свинья 45
0,004
0,000
0,090
0,288
0,416
0,371
0,386
свинья 46
0,000
0,000
0,066
0,627
1,154
1,438
1,676
среднее
0,001
0,000
0,042
0,380
0,773
1,089
1,354
Средние
0
4
7
10
14
21
28
P129-wt
0,002
0,004
0,037
0,210
0,441
0,829
0,958
P129-GG
0,001
0,000
0,042
0,380
0,773
1,089
1,354
Сывороточные титры нейтрализующих антител определяли и в Т02-, и в Т03-группе на 7, 14, 21 и 28 дни после заражения. Титры нейтрализующих антител определяли с применением TCID50 на планшетах с 96 лунками в двух параллелях. В каждой лунке 200 pfu Р129-вируса дикого типа в объеме 100 мкл объединяли с 100 мкл двукратного серийного разведения сывороток (предварительно инактивированных нагреванием в течение 30 минут при 56°С). Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37°С, после чего инфицировали клетки. Инфицированные клетки инкубировали в течение 5 дней и определяли СРЕ. Данные представлены ниже, и они показывают, что свиньи, зараженные мутантным вирусом, обнаруживали большие средние титры нейтрализующих антител, чем свиньи, зараженные родительским вирусом дикого типа.
Таблица 7.
Титры нейтрализующих антител в течение четырех недель инфекции (параллельные значения)
P129-wt
7 день
14 день
21 день
28 день
Свинья 28
<2, <2
<2, <2
4,4
3,5
Свинья 30
<2, <2
2,8
2,2
4
Свинья 35
<2, <2
4,4
8,4
7,5
Свинья 40
<2, <2
4,4
2,8
8
Свинья 43
<2, <2
2,4
<2,8
3,5
Среднее
<b><2</b>
<b>3,2</b>
<b>4,2</b>
<b>5,3</b>
P129-GG
Свинья 33
<2, <2
4,8
8,16
16
Свинья 36
<2, <2
2,2
16,16
16
Свинья 38
<2, <2
8,4
8,4
36
Свинья 45
<2, <2
2,2
4,4
6
Свинья 46
<2, <2
8,8
16,16
48
Среднее
<b><2</b>
<b>4,8</b>
<b>10,8</b>
<b>24,4</b>
Одним из критериев РРССВ-инфекции является персистенция вируса в миндалинах. Таким образом, в конце исследования (4 недели после заражения) были получены миндалины от всех зараженных свиней и двух псевдозараженных контрольных свиней и изучены на предмет персистенции вируса с применением полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). N-ген был выявлен с использованием RT-PCR у всех свиней, зараженных или GG-вирусом, или Р129-вирусом, в то время как миндалины псевдозараженных свиней оставались негативными. Это указывает на то, что все зараженные свиньи содержали вирус спустя 4 недели после заражения. С целью изучения возможных мутаций в NLS N-гена ПЦР-продукты из миндалин были секвенированы.
Было обнаружено, что у всех пяти свиней GG-вирус, персистирующий в миндалинах, имел мутацию в NLS-2-последовательности, полученную путем введения аргинина в 43 или 44 положение. Р129-вирус дикого типа из миндалин не мутировал и сохранял NLS-2-последовательность дикого типа.
Пример 4. Резистентные к реверсии мутации NLS-2
Р129-СС-мутация, описанная в Примере 2, была создана изменением шести нуклеотидов. Как видно из Примера 3, этот вирус способен к частичной или полной реверсии и может вновь приобрести NLS-негативный родительский фенотип с относительно высокой частотой благодаря случайной мутации и естественному отбору. Предпочтительные воплощения изобретения, особенно в целях вакцины, будут содержать дополнительные нуклеотидные замены и/или делеции, сконструированные с целью минимизировать вероятность реверсии и минимизировать вероятность мутации других фланкирующих остатков к исходным остаткам, таким как лизин и аргинин, и, таким образом, восстановления функционального NLS-фрагмента данной области. Кодоны, которым необходимо две или три отдельные нуклеотидные замены для того, чтобы мутировать к кодонам, кодирующим исходный остаток, предпочтительны среди тех, которым необходима только одна замена. Реверсия делеционных мутаций крайне маловероятна, поскольку часть области удалена. Альтернативные кодоны могут быть выбраны для фланкирующих аминокислот с целью уменьшения вероятности восстановления pat7, pat4 или другого NLS-фрагмента в результате мутации. Примеры таких «резистентных к реверсии» мутаций показаны в таблице 6, и их рассматривают как репрезентативные, а не лимитирующие. Учитывая эту информацию, специалист может предвидеть другие примеры резистентных к реверсии мутаций.
В таблице 8 мутантный вирус P129-d43/44 представляет собой делецию аминокислот 43 и 44. Более того, кодон серина AGT в 45 положении изменён на ТСТ для уменьшения вероятности его мутации к кодону лизина или аргинина. Также кодон аспарагина в 49 положении (ААС) изменён на кодон серина (ТСС) по той же причине. Серин в 49 положении был обнаружен у некоторых встречающихся в природе полевых изолятов, поэтому он должен быть хорошо переносимым. Минимальный pat 7 NLS-фрагмента (PGSKKKS) оставлен у этого мутанта и может иметь частичную NLS-активность. Предсказывают, что вирусы с частичной NLS-активностью имеют промежуточные фенотипы между вирусом дикого типа (родительским) и мутантами, полностью лишёнными NLS-фрагмента. Такие вирусы могут быть особенно полезны как вакцины.
Другие три мутанта, показанные в таблице 8 (P129-d43/44/46, Р129-d44/46/47 и P129-d46/47/48), представляют собой делеции трех аминокислот и имеют замены кодонов в 45 и 49 положениях, обсуждаемых выше. В этих мутациях нет NLS-фрагмента, и предсказывают, что они полностью лишены NLS-активности. Предполагают, что эти вирусы являются аттенурованными в отношении свиней и особенно полезны как вакцины.
Прямые и обратные праймеры для мутаций, описанных в таблице 8, представляют собой следующие:
Прямые праймеры (5'-3')
P129-d43/44F (SEQ ID NO:24)
GTCCAGAGGCAAGGGACCGGGATCTAAGAAGAAATCCCCGGAG
P129-d43/44/46F (SEQ ID NO:25)
GTCCAGAGGCAAGGGACCGGGATCTAAGAAATCCCCGGAG
P129-d44/46/47F (SEQ ID NO:26)
GCAAGGGACCGGGAAAGTCTAAATCCCCGGAGAAGCCCC
P129-d46/47/48F (SEQ ID NO:27)
GCAAGGGACCGGGAAAGAAATCTTCCCCGGAGAAGCCCC
Обратные праймеры (5'-3')
P129-d43/44R (SEQ ID NO:28)
CTCCGGGGATTTCTTCTTAGATCCCGGTCCCTTGCCTCTGGAC
P129-d43/44/46R (SEQ ID NO:29)
CTCCGGGGATTTCTTAGATCCCGGTCCCTTGCCTCTGGAC
P129-d44/46/47R (SEQ ID NO:30)
GGGGCTTCTCCGGGGATTTAGACTTTCCCGGTCCCTTGC
P129-d46/47/48R (SEQ ID NO:31)
GGGGCTTCTCCGGGGAAGATTTCTTTCCCGGTCCCTTGC
Вышеизложенные описания и примеры демонстрируют, что NLS-2-последовательность не требуется для размножения вируса, но является важным фактором вирулентности РРССВ, как продемонстрировано тем фактом, что мутировал единственный вирус, персистирующий в миндалинах. Авторы также демонстрируют, что NLS в N-белке РРССВ положительно коррелирован с более высокими нейтрализующими антителами и более высокими ELISA-титрами. Таким образом, авторы изобретения установили, что мутации, элиминирующие последовательность NLS-2-фрагмента, приводят к аттенуированному штамму РРССВ.
Перечень объектов изобретения
1. Композиция, содержащая инфекционный агент РРСС, выбранный из группы, состоящей из: а) генетически модифицированного РРСС-вируса, содержащего N-белок, который был модифицирован по меньшей мере в одной консервативной области, выбранной из группы, состоящей из NLS-2-области, NoLS-области и NES-области, так, что консервативная область была элиминирована, и где генетически модифицированный РРСС-вирус является аттенуированным; б) инфекционной молекулы РНК, кодирующей генетически модифицированный РРСС-вирус, указанный в (а); и в) выделенной полинуклеотидной молекулы, содержащей последовательность ДНК, кодирующую инфекционную молекулу РНК, указанную в (б).
2. Композиция по п.1, которая была также дополнительно модифицирована так, что консервативная NLS-1-область была элиминирована.
3. Композиция по п.1, где консервативная область была элиминирована введением неконсервативной аминокислотной замены.
4. Композиция по п.п.1 и 2, где консервативная область была по меньшей мере частично удалена.
5. Композиция по п.1, где консервативная область представляет собой NoLS-область.
6. Композиция по п.1, где консервативная область представляет собой NLS-2-область.
7. Композиция по п.1, где консервативная область представляет собой NES-область.
8. Композиция по п.1, где РРСС-вирус представляет собой североамериканский РРСС-вирус.
9. Композиция по п.1, где РРСС-вирус представляет собой европейский РРСС-вирус.
10. Композиция по п.8, где консервативная область представляет собой NLS-2-область.
11. Композиция по п.10, где 42 и 43 остатки N-белка представляют собой глицин.
12. Композиция по п.10, где 42 и 43 остатки N-белка представляют собой глицин, и 44 остаток представляет собой аспарагин.
13. Композиция по п.10, где NLS-2-область была по меньшей мере частично удалена.
14. Композиция по п.13, где по меньшей мере один из остатков N-белка с 43 по 48 был удален.
15. Композиция по п.14, где были удалены и 43, и 44 остатки N-белка.
17. Композиция по п.14, где были удалены 43, 44 и 46 остатки N-белка.
18. Композиция по п.14, где были удалены 44, 46 и 47 остатки N-белка.
19. Композиция по п.14, где были удалены 46, 47 и 48 остатки N-белка.
20. Композиция по п.п.1-19, которая содержит дополнительную нуклеотидную мутацию, замены и/или делеции, сконструированные с целью минимизировать вероятность реверсии.
21. Вакцина для защиты свиньи от инфекции РРСС-вируса, содержащая композицию по любому из п.п.1-20 в количестве, эффективном для выработки иммунитета против инфекции РРСС-вируса, и носитель, приемлемый для ветеринарного применения.
22. Способ защиты свиньи от инфекции РРСС-вируса, включающий вакцинацию животного вакциной по п.20 в количестве, эффективном для выработки иммунитета против инфекции РРСС-вируса.
23. Трансфицированная клетка-хозяин, содержащая композицию по любому из п.п.1-20.
24. Способ получения генетически модифицированного и аттенуированного РРСС-вируса, включающий: а) мутирование последовательности ДНК, кодирующей инфекционную молекулу РНК, кодирующую РРСС-вирус, с целью получения генетически модифицированного РРСС-вируса, содержащего N-белок, который был модифицирован по меньшей мере в одной консервативной области, выбранной из группы, состоящей из NLS-2-области, NoLS-области и NES-области, так, что консервативная область была элиминирована; б) введение генетически модифицированного РРСС-вируса в клетку-хозяина, способную поддерживать репликацию РРСС.
25. Способ по п.24, где генетически модифицированный РРСС-вирус представляет собой североамериканский РРСС-вирус.
26. Способ по п.24, где генетически модифицированный РРСС-вирус представляет собой европейский РРСС-вирус.
27. Способ по п.24, где клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию РРСС, представляет собой клетку MARC-145.
28. Способ по п.24, где клетка-хозяин, способная поддерживать репликацию РРСС, содержится в живой свинье.
29. Любое изобретение, описанное здесь, или любая комбинация пунктов, описанных выше.