Влияние аллогенных мезенхимальных стволовых клеток на чувствительность лейкемических клеток к противолейкемическим препаратам in vitro

ВЛИЯНИЕ АЛЛОГЕННЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЛЕЙКЕМИЧЕСКИХ КЛЕТОК К ПРОТИВОЛЕЙКЕМИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ IN VITRO

О.С. Татаринова, Е.Ю. Осипова, С.А. Румянцев

ФГУФедеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, Москва

Контакты: Елена Юрьевна Осипова e_ossipova@mail.ru

В настоящем исследовании изучено влияние аллогенных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга доноров на лейкемические клетки пациентов. В ходе работы исследовалось действие на чувствительность к противолейкемическим препаратам in vitro и способностьлейкемических клеток к спонтанному и индуцированному цитарабином апоптозу. Было показано, что МСК снижают чувствительность лейкемических клеток миелоидного ряда к даунорубицину. Однако МСК не оказывали статистически значимого влияния на уровни спонтанного и индуцированного цитарабином апоптоза лейкемических клеток.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, чувствительность к противолейкемическим препаратам, лейкемические клетки, спонтанный апоптоз, индуцированный цитарабином апоптоз

INFLUENCE OF ALLOGENEIC MESENCHYMAL STEM CELLS ON LEUKEMIC CELLS IN VITRO SENSITIVITY TO ANTILEUKEMIC DRUGS

O.S. Tatarinova, E.Yu. Osipova, S.A. Rumyantsev

Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, Moscow

In present study influence of allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells (MSC) on patients’ leukemic cells is investigated. Influence on in vitro sensitivity to antileukemic drugs and spontaneous and cytarabine-induced apoptosis of leukemic cells was studied. It has'been shown that MSC reduce myeloid leukemic cells sensitivity to daunorubicine. However, MSC did not statistically significant influence on spontaneous and cytarabine-induced apoptosis of leukemic cells.

Key words: mesenchymal stem cells, antileukemic drug sensitivity, leukemic cells, spontaneous apoptosis, cytarabine-induced apoptosis

Введение

Метод трансплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК), как аутологичных, так и аллоген-ных, в последние годы все чаще используется в клинической практике для ускорения приживления кроветворных предшественников при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), благодаря способности МСК продуцировать цитокины и ростовые факторы, необходимые для пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников [1, 2] и для профилактики и терапии иммунологических осложнений ТГСК, таких как реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ) и отторжение трансплантата [3]. Эффективность данного метода связана с тем, что МСК обладают иммуносупрессивными свойствами, способны оказывать антипролифератив-ное воздействие на лимфоциты, ингибировать активацию и ответ Т-клеток и клеток памяти [4, 5].

Согласно данным литературы, совместное культивирование стромальных клеток костного мозга и лей-кемических клеток различных культуральных линий, а также клеток доноров, может приводить к сниже-

нию пролиферации лейкемических клеток [6—11], увеличению количества лейкемических клеток в фазе G0/G1, уменьшению количества клеток в фазах Б [6, 7, 9] и G2/M [8]. В соответствии с результатами некоторых работ, стромальные клетки костного мозга, наоборот, могут способствовать пролиферации лейкемических клеток [12]. Однако мнения исследователей сходятся на том, что стромальные клетки костного мозга обладают способностью снижать уровни спонтанного (индуцированного бессывороточной средой) [12, 13] и индуцированного химиопрепаратами апоптоза [7—9, 13—15]. Механизм данного действия может быть связан с повышением экспрессии генов ан-тиапоптотических белков семейства Вс1-2 и Вс1-ХЬ в лейкемических клетках [8, 9, 13], снижением активности каспазы 3 типа в лейкемических клетках [9, 16], повышением активности фосфокиназы АЙ [17].

Таким образом, стромальные клетки костного мозга могут препятствовать спонтанному и индуцированному химиопрепаратами апоптозу лейкемиче-ских клеток, что может приводить к снижению чувствительности лейкемических клеток к химиопрепа-

4 ’201 0

4 ’201 0

ратам in vitro. Было показано, что чувствительность in vitro коррелирует с клиническим ответом на химиотерапию, безрецидивной и бессобытийной выживаемостью пациентов, больных лейкозом [18—21].

Целью данной работы было определение влияния аллогенных МСК костного мозга доноров на чувствительность лейкемических клеток пациентов к проти-волейкемическим препаратам in vitro и способность лейкемических клеток пациентов к спонтанному и индуцированному цитарабином апоптозу.

Материалы и методы

Материал исследования

Лейкемические клетки. В работе были использованы лейкемические клетки, выделенные при помощи градиентного центрифугирования из образцов костного мозга пациентов в возрасте от 6 месяцев до 17 лет с впервые диагностированными нелечеными острыми лейкозами. В соответствии с диагнозом пациентов образцы костного мозга и выделенные из них лейкозные клетки были разделены на 3 основные группы (табл. 1).

Таблица 1. Количество исследованньа образцов костного мозга больньа различными вариантами острого лейкоза

Вариант лейкоза (группа) n, количество образцов

ВП-БШ олл 15

ОМЛ 9

Т-ОЛЛ 4

Первая — группа В-клеточных острых лимфобластных лейкозов (В-ОЛЛ), 2-я — группа острых миелоидных лейкозов (ОМЛ), 3-я — группа Т-клеточных острых лимфобластных лейкозов (Т-ОЛЛ).

Лейкемические клетки, использованные для определения уровней апоптоза, на группы не подразделяли.

МСК костного мозга. В работе были использованы МСК, выделенные из образцов костного мозга здоровых доноров. Культивирование МСК костного мозга проводили рутинным способом. Клетки высаживали на 24-луночные планшеты в концентрации 25 х 103 на лунку для эксперимента с определением чувствительности лейкемических клеток к противоопухолевым препаратам, а также во флаконы площадью 25 см2 в концентрации 200* 103 для определения уровней апоптоза лейкемических клеток.

Методы исследования

За основу метода для определения чувствительности лейкемических клеток к противолейкеми-ческим препаратам был взят МТТ-анализ по методике лаборатории онкогематологии и иммунологии госпиталя Свободного Университета Ам-

стердама [21, 22], в который были внесены изменения. В ходе эксперимента производили инкубацию бластных клеток костного мозга на подложке из МСК и без подложки из МСК с различными разведениями химиопрепаратов в течение 4 сут. В ходе исследования тестировали препараты, относящиеся к различным группам противоопухолевых препаратов, используемых для лечения злокачественных клональных заболеваний крови: ци-тарабин (цитозар), метилпреднизолон, даунору-бицин. В последующем определяли полулеталь-ную концентрацию (LC50) для каждого препарата и производили статистический анализ значений LC50. Для оценки средних значений LC50 использовалась медиана, для определения достоверности различий между двумя группами (при воздействии МСК и в отсутствии воздействия МСК) применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистическая компьютерная обработка полученного материала проводилась при помощи пакета программ Microsoft Excel и Statistica 8.0. Различия считались статистически значимыми при р < 0,05. Кроме того, производилась оценка выживаемости лейкозных клеток (определение доли живых клеток) в лунках платы с МСК без химиопрепаратов. В качестве контрольных лунок использовались лунки платы без МСК и без химиопрепаратов, в которых значение выживаемости клеток принимали за 1.

Для определения уровней спонтанного и индуцированного цитарабином апоптоза лейкемических клеток использовали окрашивание конъюгатом аннексина-V с флюорохромом (изоти-оцианатом флуоресцеина, FITC) и йодистым про-пидием (propidium iodide, PI) с последующим анализом при помощи проточной цитофлюориме-трии. Для индукции апоптоза лейкемические клетки инкубировали в течение 24 часов в следующих условиях:

— в среде RPMI-1640 — для определения уровня спонтанного апоптоза:

- на подложке из МСК,

- без подложки из МСК;

— в растворе цитозара с концентрацией 0,0025 мг/мл в среде RPMI-1640 — для определения уровня индуцированного апоптоза:

- на подложке из МСК,

- без подложки из МСК.

После окрашивания Annexin V-FITC Kit (Bender MedSystems GmbH) производили анализ клеток при помощи проточного цитофлюориметра FACScan, оценивая интенсивность зеленой флюоресценции FITC-аннексина V (FL1, 530 нм) и красной флюоресценции йодистого пропидия (FL2, в интервале от 564 до 606 нм). В качестве «негативного контроля» использовали неокрашенные клетки. При помощи программы CellQuest Pro выстраивалась точечная

диаграмма распределения популяций клеток. Выделяли 4 кластера: жизнеспособные клетки AnV-/PI-(в левом нижнем квадранте), ранние апоптотиче-ские клетки AnV+/PI- (правый нижний квадрант), некротические или поздние апоптотические клетки

— последующая стадия апоптоза in vitro AnV+/PI+ (правый верхний квадрант) и некротические клетки AnV-/PI+ (левый верхний квадрант) (рис. 1).

As(amirovRPMI13.05 10.004

£ о і

3 — :

‘, „» 1 •* .лі * V •’ .' •

поздние апоптотичес-кие клетки

ранние апоптотичес-кие клетки

Иг

Ю1

І0£ annexin V

10J

ИГ

Рис. 1. Гистограмма распределения лейкемических клеток при окрашивании аннексином-V-FITCи йодистым пропидием

Группу сравнения для оценки результатов составили образцы лейкемических клеток до инкубации (0 часов). В каждой группе лейкемических

клеток с одинаковыми условиями инкубации рассчитывали общую долю апоптотических клеток (суммарное количество ранних и поздних апопто-тических клеток). Для оценки скорости и динамики накопления апоптотических клеток был разработан оригинальный показатель — коэффициент накопления апоптотических клеток (Капо). Показатели раннего и позднего спонтанного апоптоза в группе сравнения принимались за 1, в исследуемых группах коэффициент Капо рассчитывался как отношение доли апоптотических клеток после 24 часов инкубации в различных условиях к доле апоптотических клеток в группе сравнения. Для определения достоверности различий уровней спонтанного и индуцированного цитараби-ном апоптоза (раннего и суммарного) между двумя группами (при воздействии МСК и в отсутствии воздействия МСК) применяли критерий Вилкок-сона для парных сравнений. Статистическая компьютерная обработка полученного материала проводилась при помощи пакета программ Microsoft Excel и Statistica 8.0. Различия считались статистически значимыми при р < 0,05.

Результаты и обсуждение

Результаты статистической обработки данных чувствительности лейкемических клеток, полученных в группах В-ОЛЛ, ОМЛ и Т-ОЛЛ, представлены в таблице 2.

Таблица 2. Показатели выживаемости при культивировании лейкемических клеток с МСК и без них

Препарат Значения LC50 (медиана) p

- МСК + МСК

В-ОЛЛ

Цитозар 1,02 1,95 0,205

Даунорубицин 0,28 0,85 0,206

Метилпреднизолон 123,03 38,71 0,949

Выживаемость в контроле (медиана) 153,46% -

ОМЛ

Цитозар 0,60 0,59 0,895

Даунорубицин 0,31 1,42 0,009

Метилпреднизолон 166,04 250 0,212

Контроль (медиана) - 118,66% -

Т-ОЛЛ

Цитозар 6,85 1,03 0,375

Даунорубицин 0,58 0,66 0,663

Метилпреднизолон 125,09 167,02 0,767

Выживаемость в контроле (медиана) - 141,51% -

4 ’201 0

4 ’201 0

В нашем исследовании было выявлено увеличение медианы LC50 цитозара при инкубации с МСК клеток В-ОЛЛ приблизительно в 2 раза (следовательно, снижение чувствительности лейкозных клеток под действием МСК). Ввиду того, что в данном случаер > 0,05, эти результаты не являются статистически значимым. В группе ОМЛ было обнаружено незначительное снижение медианы LC50 ци-тозара при инкубации с МСК, данный результат не был статистически значимым. В группе Т-ОЛЛ было выявлено снижение концентрации цитараби-на при инкубации с МСК больше чем в 6 раз, а следовательно, повышение чувствительности лейкоз-ных клеток к цитарабину под действием МСК. Данный результат был статистически незначимым.

Наблюдалось увеличение медиан LC50 дауно-рубицина при инкубировании с МСК во всех группах лейкемических клеток. В группе ОМЛ результат был статистически значимым (р < 0,05).

Чувствительность лейкемических клеток из группы В-ОЛЛ к метилпреднизолону под действием МСК повышалась. В группах ОМЛ и Т-ОЛЛ наблюдалось незначительное превышение медианы при инкубировании с МСК. Во всех случаях результаты были статистически незначимыми (р > 0,05).

При оценке лейкозных клеток в контроле при культивировании с МСК было выявлено повышение выживаемости в сравнении с контролем без МСК во всех 3 группах (рис. 2).

Таблица 3. Уровни спонтанного и индуцированного цитарабином апоптоза лейкозных клеток

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0

МСК+

1,53 МСК+ 1,42

1,19

МСК- МСК- М о К

=

В-ОЛЛ

ОМЛ

Т-ОЛЛ

Рис. 2. Изменение выживаемости лейкозных клеток в лунках без проти-волейкемических препаратов под действием МСК

Результаты, полученные при определении уровней спонтанного и индуцированного цитараби-ном апоптоза при инкубации лейкемических клеток в различных условиях, представлены в таблице 3, гистограммы — на рисунках 3 и 4.

На основании представленных в таблице 3 результатов можно сделать выводы о том, что при определении уровней суммарного спонтанного и индуцированного цитарабином апоптоза отмечалось снижение доли апоптотических клеток под действием МСК, в сравнении с клетками, инкубированными без подложки из МСК. Это подтверж-

Условия Медиана, % Капо Р

ЯРМ1

- МСК 24 часа 5,33 1,0

ранний апоптоз

ЯРМ1

+ МСК 24 часа 5,63 1,0

ранний апоптоз

КРМ1

- МСК 24 часа 28,79 2,09 0,67

суммарный апоптоз

КРМ1

+ МСК 24 часа 38,11 2,02 0,67

суммарный апоптоз

Цитарабин

- МСК 24 часа 7,55 0,14

ранний апоптоз

Цитарабин

+ МСК 24 часа 8,64 0,14

ранний апоптоз

Цитарабин

- МСК 24 часа 57,60 3,02 0,22

суммарный апоптоз

Цитарабин

+ МСК 24 часа 55,48 2,71 0,22

суммарный апоптоз

Группа сравнения 0 часов 8,50 1

1

дают значения Капо. Данные наблюдения иллюстрируют рисунки 5 и 6.

При определении статистической значимости различий уровней спонтанного и индуцированного цитарабином апоптоза (раннего и суммарного) между двумя группами (при воздействии МСК и в отсутствии воздействия МСК) при помощи критерия Вилкоксона для парных сравнений не было получено статистически значимых различий.

Рис. 3. Гистограммы распределения лейкемических клеток после инкубирования в течение 24 часов в среде RPMI без подложки из MCK (слева) и на подложке из MCK (справа). В левом нижнем квадранте — жизнеспособные клетки AnV-/PI-, в правом нижнем квадранте — ранние апоптотические клетки AnV+/PI-, в правом верхнем квадранте — некротические или поздние апоптотические клетки, последующая стадия апоптоза in vitro AnV+/PI+,

в левом верхнем квадранте — некротические клетки AnV-/PI+

Рис. 4. Гистограмма распределения лейкемических клеток после инкубирования в течение 24 часов в растворе цитарабина без подложки из МСК

Рис. 5. Коэффициенты спонтанного апоптоза; крайний левый столбец — группа сравнения

Рис. б. Kdэффициенты индуцированного цитарабином апоптоза

4 ’201 о

4 ’ 2 о 1 о

Заключение

В ходе проведенного нами исследования было показано, что MCК костного мозга доноров могут оказывать влияние на чувствительность лейкемических клеток пациентов к противолейкемическим препаратам in vitro: статистически значимо снижают чувствительность лей-кемических клеток миелоидного ряда к даунорубици-ну и способствуют выживаемости всех групп лейкеми-ческих клеток. Однако в нашем исследовании аллоген-ные MCК костного мозга не оказывали статистически

значимого влияния на уровни спонтанного и индуцированного цитарабином апоптоза лейкемических клеток, что расходится с данными других исследователей [7—9, 12—15]. Несомненно, что все более широкое применение трансплантации МСК в клинической практике, особенно у онкогематологических пациентов, диктует необходимость проведения широкомасштабных исследований для дальнейшего изучения механизмов влияния МСК на кроветворные клетки, в частности, на лей-кемические клетки.

1. Haynesworth S.E., Baber M.A.,

Caplan A.I. Cytokine expression by human marrow-derived mesenchymal progenitor cells in vitro: effects of dexamethasone and IL-1 alpha. J Cell Physiol 1996;166:585-92.

2. Cheng L., Qasba P., Vanguri P.,

Thiede M.A. Human mesenchymal stem cells support megakaryocyte and pro-platelet formation from CD34+ hematopoietic progenitor cells. J Cell Physiol 2000;184:58-69.

3. Le Blanc K., Rasmusson I., Sundberg B., Gotherstrom C., Hassan M., Uzunel M., Ringden O. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells. Lancet 2004;363:1439-41.

4. Rasmusson I., Ringden O., Sundberg B., Le Blanc K. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cytotoxic T lymphocytes or natural killer cells. Transplantation 2003;76:1208-13.

5. Le Blanc K., Rasmusson I., Gotherstrom C., Seidel C., Sundberg B., Sundin M., Rosendahl K., Tammik C., Ringden O. Mesenchymal stem cells inhibit the expression of CD25 (interleukin-2 receptor) and CD38 on phytohaemagglutinin-activated lymphocytes. Scand J Immunol 2004;60:307-15.

6. Liang R., Huang G.S., Chen X.Q.,

Wang Z., Feng J.L., Zhang W.P., Guo Y., Yang G.Y. Effects of human fibroblastoid stromal cell line on proliferation of HL-60 cells and expression of VEGF. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2003;11(5):476-9.

7. Lin Y.M., Bu L.M., Yang S.J., Gao S., Zhang G.Z. Influence of human mesenchymal stem cells on cell proliferation and chemo-sensitivity of K562 cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2006;14(2):308-12.

8. Lin Y.M., Zhang G.Z., Leng Z.X.,

Lu Z.X., Bu L.S., Gao S., Yang S.J. Study on the bone marrow mesenchymal stem

Литература

cells induced drug resistance in the U937 cells and its mechanism. Chin Med J (Engl) 2006;119(11):905—10.

9. Liang R., Huang G.S., Wang Z., Chen X.Q., Bai Q.X., Zhang Y.Q., Dong B.X.,

Wang W. Q. Effects of human bone marrow stromal cell line (HFCL) on the proliferation, differentiation and apoptosis of acute myeloid leukemia cell lines U937, HL-60 and HL-60/VCR. Int J Hematol 2008;87(2):152-66.

10. Zhu Y., Sun Z., Han Q., Liao L.,

Wang J., Bian C., Li J., Yan X., Liu Y.,

Shao C., Zhao R.C. Human mesenchymal stem cells inhibit cancer cell proliferation by secreting DKK-1. Leukemia 2009. Jan 15. doi: 10.1038/leu.2008.384.

11. Ding Y., Lu H., Lu S.F., Lu R.N.,

Liu P., Wu YJ., Li J.Y. Effects of human bone marrow mesenchymal stem cells on proliferation and apoptosis of k562 cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi 2009;17(1):137-40.

12. Manabe A., Coustan-Smith E., Behm F.G., Raimondi S.C., Campana D. Bone marrow-derived stromal cells prevent apoptotic cell death in B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Blood 1992;79(9):2370-7.

13. Konopleva M., Konoplev S., Hu W., Zaritskey A.Y., Afanasiev B.V., Andreeff M. Stromal cells prevent apoptosis of AML cells by up-regulation of anti-apoptotic proteins. Leukemia 2002;16(9):1713-24.

14. Mudry R.E., Fortney J.E., York T.,

Hall B.M., Gibson L.F. Stromal cells regulate survival of B-lineage leukemic cells during chemotherapy. Blood 2000;96(5):1926-32.

15. Garrido S.M., Appelbaum F.R., Willman C.L., Banker D.E. Acute myeloid leukemia cells are protected from spontaneous and drug-induced apoptosis by direct contact with a human bone marrow stromal cell line (HS-5). Exp Hematol 2001;29(4):448-57.

16. Fortney J.E., Zhao W., Wenger S.L., Gibson L.F. Bone marrow stromal cells regulate caspase 3 activity in leukemic cells during chemotherapy. Leuk Res 2001;25(10):901 —7.

17. Wang L., Fortney J.E., Gibson L.F. Stromal cell protection of B-lineage acute lymphoblastic leukemic cells during chemotherapy requires active Akt. Leuk Res 2004;28(7):733-42.

18. Астрелина Т.А., Осипова Е.Ю., Румянцев C.A., Cторожаков Г.И., Короткова Н.В., Владимирская Е.Б. Клиническое значение чувствительности лейкемических клеток к химиотерапии при остром лимфобластном лейкозе у детей по результатам МТТ-теста ex vivo. Гематол и трансфузиол 2002;б:21—4.

19. Hongo T., Shuhei Yajima, Minoru Sakurai, Yasuo Horikoshi and Ryoji. In vitro drug sensitivity testing can predict induction failure and early relapse of childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 1997;89(8):2959-б5.

20. Janka-Schaub G.E., Harms D.O., den Boer M.L., Veerman A.J., Pieters R.

In vitro drug resistance as independent prognostic factor in the study COALL-O5-92 Treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia; two-tiered classification of treatments based on accepted risk criteria and drug sensitivity profiles in study COALL-06-97. Klin Padiatr 1999;211(4):233-8.

21. Kaspers G.J.L., Veerman A.J.P,

Piters R., Van Zantwijk C.H., Smets L.A., Van Wering E.R., Van Der Does-Van Den Berg A. In vitro cellular drug resistance and prognosis in newly diagnosed childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 1997;90:2723-9.

22. Veerman A.J.P., Pieters R. Drug sensitivity assaya in leukemia and lymphoma. Br J Haemotol 1990;74:381-4.