Использование метода мультиядерной ЯМР-спектроскопии для определения качества лекарственных субстанций

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА МУЛЬТИЯДЕРНОЙ ЯМР-СПЕКТРОСКОПИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ

Н.Е. Кузьмина, С.В. Моисеев, В.А. Яшкир

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, Москва

vsk46@yandex.ru

Резюме: В статье показана возможность применения метода спектроскопии мультиядерного магнитного резонанса для комплексного, экспрессного и надежного определения основных показателей качества лекарственных субстанций — идентификации, контроля примесей, количественного определения, исследования стабильности. Приведены данные о преимуществах данного метода по сравнению с хроматографическими.

Ключевые слова: структурная интерпретация ЯМР-спектров, идентификация лекарственных субстанций, остаточные растворители, примеси, количественное определение, стабильность.

MULTINUCLEAR NMR SPECTROSCOPY FOR DRUG SUBSTANCES QUALITY ASSESSMENT N.E. Kuzmina, S.V. Moiseev, V.A. Yashkir

Abstract: The article describes the possibility of using multinuclear magnetic resonance spectroscopy for complex, express and reliable determination of basic drug substances quality indicators\parameters, specifically identification, impurity control, assay, stability tests. It also provides the data on the advantages of the mentioned method compared with chromatographic methods.

Key words: structural interpretation of NMR spectra, drug substances identification, residual solvents, imputities, assay, stability.

Одним из основных направлений совершенствования методологии фармацевтической (фармакопейной) экспертизы лекарственных субстанций (ЛСб) в нашей стране является разработка и внедрение новых аналитических методов контроля качества ЛСб, основанных на современных технологиях. Предпочтение отдается прямым недеструктивным методам анализа, отвечающим требованиям информативности, экспрессности и достоверности, которые позволяют исследовать химические превращения и устанавливать структуры побочных и промежуточных продуктов на всех стадиях аналитического контроля. Более других таким требованиям соответствует метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Использование метода ЯМР для решения аналитических задач началось в начале 50-х годов прошлого века с разработкой концепции химического сдвига и спин-спинового взаимодействия. В настоящее время данный метод описан в ГФ XII [1] и ведущих фармакопеях мира (Европейской, США, Японии [2 4]), где он рекомендован для установления подлинности ряда лекарственных субстанций (например, тобрамицина, бузере-лина, гозерелина, низкомолекулярного гепарина, орфенадрина цитрата, эноксапарина натрия и др.). Для определения других показателей качества ЛСб (идентификация примесей и остаточных растворителей, количественное определение, исследование стабильности) по-прежнему применяют традиционные физико-химические методы анализа, в первую очередь различные варианты хроматографии.

Хроматографические методы (ВЭЖХ, ГХ, тонкослойная хроматография) чаще других включаются в технологические регламенты, фармакопейные статьи и другую нормативную документацию. Метод ЯМР-спектроскопии в определении чистоты ЛСб в настоящее время практически не используется. Сужение круга фармацевтических задач, решаемых методом ЯМР, до недавнего времени было обусловлено его основными ограничениями — низкой по сравнению с хроматографическими методами чувствительностью и высокой стоимостью оборудования. Однако за последние десятилетия ситуация кардинально изменилась. Появление достаточного количества мультиядерных ЯМР-спектрометров со сверхпроводящими магнитами в исследовательских лабораториях, снижение стоимости серийной аппаратуры ЯМР, внедрение новых технических усовершенствований и приемов превратили метод ЯМР в рутинный инструмент для решения широкого круга прикладных медико-фармацевтических задач. В настоящее время метод ЯМР-спектроскопиии не только дополняет традиционные методы аналитического контроля ЛСб, но и с успехом может их заменять, решая те же задачи более эффективно, позволяя осуществлять тонкие структурные исследования, недоступные ранее. Цель данной работы — показать эффективность метода при комплекс -ном определении основных показателей качества ЛСб (идентификации компонентов ЛСб, их количественного определения, исследования стабильности ЛСб).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования использовали субстанции надропарина кальция серии 20100903, фуросемида серии АМ20210086, цефепима с аргинином серии 10026EJ86D-B, фосфомицина троме-тамола серии 20110202, рамиприла серии КР0101210. Структурные формулы перечисленных соединений представлены на рис. 1.

Регистрацию спектров проводили на ЯМР-спектрометре Agilent DD2 NMR System 600 при температуре 25°С по стандартным методикам 1D и 2D экспериментов. В качестве растворителей использовали дейтерированные диметилсульфоксид и воду. При идентификации и количественном определении примесей использовали цифровое разрешение 0,2 гц, время задержки между импульсными последовательностями — 5 сек, число сканирований — 250.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Метод ЯМР-спектроскопии имеет ряд преимуществ по сравнению с другими аналитическими методами, что позволяет считать его применение в аналитическом контроле качества ЛСб полностью экономически оправданным:

1) не требует использования эталонов и внутренних стандартов при установлении подлинности, так

как решает задачу идентификации соединения напрямую, путем определения состава, строения и пространственной структуры соединения;

2) является абсолютным количественным методом, поэтому не требует использования стандартов при количественных измерениях;

3) не разрушает исследуемый образец, позволяя установить строение интересующих загрязнителей в

объекте исследования, количественно определить их содержание, выявить сырьевую и технологическую предысторию;

4) не требует сложной про-боподготовки, отличается высокой производительностью при небольшом расходе реактивов;

5) особенности агрегатного состояния, дисперсность, элементный состав, молекулярно-массовое распределение и другие характеристики системы не препятствуют получению спектров ЯМР

Идентификация

Подтверждение подлинности ЛСб (как и идентификацию любого ее

примесного компонента) можно осуществлять тремя способами:

1) сравнением спектров исследуемого образца и стандартного образца ЛСб;

2) сравнением спектров исследуемого образца ЛСб с

данными литературы (фармстатьи, спектральные базы данных, научные публикации);

3) самостоятельной структурной интерпретацией полученных спектральных данных, подтверждающей наличие и последовательность структурных фрагментов в молекуле исследуемого образца ЛСб.

В рутинной практике, как правило, используют первые два способа. Если сравниваемые соединения характеризуют конкретной структурной формулой, то вывод об идентичности их строения делают на основе полного совпадения спектров по величинам химических сдвигов (5), мультиплетности (т), констант спин-спинового взаимодействия ^) и интегральных интенсивностей (I). В большинстве случаев ограничиваются одномерными спектрами !Н и 13С. В случае, когда идентифицировать конкретное строение активного компонента ЛСб невозможно (например, активный компонент является полимером нерегулярного

R=H or S03 (0,5 Са), R'=H or S03 (0,5 Ca) or CO-CH3

R2=H and R3=C02 (0,5 Ca) or R2= C02 (0,5 Ca) and R3=H

Надропарин кальция (a) о. о0

СН3

h2n

н н Цефепим

Фуросемид

ОН ОН

Фосфомицина трометамол (d) НО

Рамиприл

Рис. 1. Структурные формулы надропарина кальция

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

мМгя

R=H or S03 (0,5 Ca), R'=H or S03 (0,5 Ca) or CO-CH3 R2=H and R3=C02 (0,5 Ca) or R2= C02 (0,5 Ca) and R3=H

ФтШтШ

Спектр 13C стандартного образца надропарина кальция (ЕР CRS).

Спектр С образца субстанции «Надропарин кальция» серии 20100903

Рис. 2. Сравнение ЯМР спектров 13С стандартного образца надропарина кальция и образца субстанции надропарина кальция серии 20100903

строения и не имеет конкретной общей формулы)

используют спектры ЯМР целиком как «отпечаток пальца» объекта. Как правило, предпочтение отдают углеродным спектрам, поскольку в спектрах 13С практически не наблюдается перекрывания сигналов вследствие более широкого диапазона химических сдвигов 13С. Кроме того, спектры 13С позволяют определять содержание четвертичных углеродных атомов и функциональных групп, не содержащих протоны. С помощью углеродных спектров можно оценивать вклады различных мономерных звеньев и заместителей в полимерную цепь. Например, на рис. 2 представлены спектры 13С стандартного образца надропарина кальция (2а) и образца субстанции «надропарин кальция» серии 20100903 (2Ь).

Как следует из спектров, сравниваемые образцы характеризуются различным соотношением сигналов фуранозных (область 80^100 м.д.) и пиранозных (область 60^80 м.д.) углеродных атомов макромолекул надропарина кальция, что обусловлено несовпадением (допускаемом структурной формулой) молекулярных масс сравниваемых образцов. Кроме того, в спектре стандартного образца надропарина кальция наблюдается большая интенсивность сигналов карбонильных групп (область 173^177 м.д.), метильных групп при фрагментах NHC=O и 0С=0 (область 40^50 м.д.) и сдвиг сигналов пиранозных циклов в область сильного поля по сравнению со спектром

образца субстанции «надропарин кальция» серии 20100903. Это свидетельствует о различных заместителях пиранозных циклов в сравниваемых образцах. Замена SO3 на Н, CO2 или CO-CH3 (также допускаемая структурной формулой), приводит к диамагнитному сдвигу сигналов пиранозного цикла.

Сравнительную количественную информацию на основе спектров — «отпечатков пальцев» получают, интегрируя не отдельные спектральные линии, а целые спектральные диапазоны.

При самостоятельной структурной интерпретации спектральных данных учитывают существующие корреляции между спектральными характеристиками ядра (5, m, J, I) и его химическим окружением, которые лежат в основе аналитических возможностей метода ЯМР. Эти корреляции подробно описаны в литературе [5—9]. При этом наряду с одномерными спектрами дополнительно регистрируют ряд корреляционных спектров (COSY, HSQC, HMQS, HMBC, CIGAR, INADEQUATE и т.д.) и спектров с переносом намагниченности (DEPT, INEPT и т.д.), позволяющих более точно осуществить идентификацию строения исследуемого образца ЛСб. Подробное описание возможностей указанных селективных ЯМР-экспериментов представлено в обзоре [10]. При правильной интерпретации совокупность одномерных и двумерных гомо- и гетероядерных ЯМР спектров дает полное представление о молекулярных

б

конформациях, межъядерных и межмолекулярных расстояниях, углах и свойствах связей, молекулярной динамике [10].

При самостоятельной расшифровке спектральных данных информацию о строении исследуемых образцов представляют на различных уровнях дискретизации: фрагментном, структурном, компонентном. На фрагментном уровне определяют структурные фрагменты, присутствующие в исследуемом образце. Однотипные ядра, принадлежащие различным структурным фрагментам, имеют характеристические для этих фрагментов химические сдвиги, что позволяет осуществлять их дифференцированное определение. На основе анализа значений химических сдвигов одномерных спектров 1Н, 13С, 14N, 15N, 17О, 19F, 31Р, 33S (в большинстве случаев ограничиваются ядрами 1Н и 13С), DEPT (INEPT), гетероядерных двумерных прямых корреляционных спектров 1H-13C-HSQC (HMQS) делают вывод о содержании в исследуемом образце различных углеводородных фрагментов, ге-тероатомных фрагментов и функциональных групп (-О-, =О, -ОН, >С=О, -СН=О, СООН, -S-, >S<, -SH-, NH2, >NH, >N-, =N- и т.д.). На структурном уровне определяют последовательность соединения структурных фрагментов в молекулах и особенности их пространственного строения. При определении последовательности соединения структурных фрагментов используют информацию о системах спин-взаимодействующих ядер (данные COSY), корреляционном взаимодействии 1H-1H через связь (данные HMBC, CIGAR), о прямом корреляционном взаимодействии 13С-13С (INADEQUATE), мульти-плетности сигналов, значениях J. Особенности пространственного строения устанавливают на основе значений мультиплетности сигналов и величин J, данных спектров NOESY, ROESY На компонентном уровне определяют компонентный состав испытуемого образца ЛСб и устанавливают количественное содержание каждого компонента в образце ЛСб. Определение компонентного состава осуществляют на основе значений интегралов сигналов ЯМР спектров с учетом информации структурного уровня. Примером самостоятельной интерпретации совокупности спектральных данных (1Н, 13С, Ш-Ш-COSY, 1H-13C-HSQC, 1H-13C-HSQC) на различных информационных уровнях может служить проведенная нами оценка качества образцов субстанций азитро-мицина [11] и рутина [12].

Количественное определение

Количественную оценку любого компонента ЛСб осуществляют, определяя его абсолютное или относительное содержание в ЛСб. Абсолютное содержание компонента определяют методом внутреннего стандарта (ВС). В качестве ВС выбирают вещество, сигналы которого находятся вблизи сигналов исследуемого образца ЛСб, не перекрываясь с ними.

Абсолютное процентное содержание анализируемого вещества (лекарственного вещества, примеси, остаточного растворителя) в испытуемом образце в пересчете на абсолютно сухое вещество вычисляют по формуле:

х%„,„ = ЮО X ф X (^) X О .где:

5а — среднее приведенное значение интегральной интенсивности сигнала анализируемого вещества, равное измеренной интегральной интенсивности, деленной на количество ядер в структурном фрагменте (например, в !Н спектре для СН2 — измеренная интегральная интенсивность, деленная на 2, для СН3 — измеренная интегральная интенсивность, деленная на 3, и т.д.);

5 ст — среднее приведенное значение интегральной интенсивности сигнала ВС;

Ма — молекулярная масса анализируемого вещества;

Мст — молекулярная масса ВС;

та — навеска испытуемого образца;

тст — навеска ВС;

W — содержание влаги в процентах.

Относительное содержание анализируемого компонента (лекарственного вещества, примеси, остаточного растворителя) определяют как долю компонента в смеси установленных веществ. Относительное мольное процентное (Хмоль%) и относительное весовое процентное (Х масс%) содержание анализируемого вещества 1 в исследуемом образце - смеси п установленных веществ определяют по формулам:

;=п ]=п

-^.моль = •4,'( ' $/ -^1,масс = Х5г ' М1 X Б]

;=1 ]=1

•^1,моль (%) = -^моль X 100 -^;,масс (%) = -^масс X 100

Определение относительного содержания анализируемого компонента испытуемого образца ЛСб проводят без использования стандарта, то есть метод ЯМР является прямым количественным методом, основанным на стехиометрических отношениях и свободным от неопределенностей, связанных со взвешиванием и переносом проб образцов ЛСб и стандарта.

Погрешность количественных измерений в рамках метода ЯМР определяется погрешностью интегрирования и в общем случае составляет ±(2-5%).

Контроль примесей

Широко распространенным заблуждением являются представления об исключительно низкой чувствительности метода ЯМР, ограничивающей его использование при контроле примесей ЛСб. Аппаратурные возможности современных импульсных ЯМР-спектрометров со сверхпроводящими магнитами позволяют фиксировать примеси на уровне сотых долей процента, в то время как нормативные до-

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Примесь А

Примесь С

Примесь D

I

Примесь A, D

\

8.5 8.0

V I I

7.0

1 VI

6.5

V н

6.0

5.0

РРт

Рис. 3. Фрагмент спектра 1Н субстанции фуросемида серии АМ20210086 с сигналами родственных примесей A-D

Таблица 1. Результаты анализа образца ЛС «Фуросемид» серии АМ20210086методами ЯМР-спектроскопии и ВЭЖХ по показателю «Посторонние примеси»

Требования Метод Метод

проекта НД ЯМР ВЭЖХ

Посторонние примеси: не более

- примесь А; 0,25 % не более 0,06 % 0,030

- примесь В; 0,25 % не более 0,05 % 0,020

- примесь С; 0,25 % не более 0,03 % 0,040

- примесь D; 0,25 % не более 0,06 % 0,025

- примесь Е; 0,25 % не не

не более обнаружена обнаружена

- сумма примесей 0,5 % 0,22 % 0,115 %

Натрия эдетеат Не более 200 ppm не обнаружен

Остаточные органиче-

ские растворители, %:

- изопропиловый данные не

спирт; отсутствуют данные 0,006 % обнаружен не

- п-пентан; отсутствуют данные 0,002 % обнаружен не

- уксусная кислота отсутствуют 0,008 % обнаружена

кументы, как правило, устанавливают максимально допустимые концентрации примесных компонентов на уровне 0,1-0,5 весовых процентов. На рисунке 3 представлен фрагмент спектра 1Н субстанции фу-росемида серии АМ20210086, содержащий сигналы родственных примесей А^ с интегральными интенсивностями в интервале 0,03^0,07. В таблице 1 приведено сравнение результатов контроля примесей в субстанции фуросемида серии АМ20210086, проведенного методами ВЭЖХ и ЯМР, из которого следует, что количественные данные, полученные с исполь-

зованием различных методов, хорошо согласуются между собой.

Кроме родственных примесей в субстанции фуросемида серии АМ20210086 методом ЯМР также обнаружены примеси остаточных растворителей. На рис. 4 представлен фрагмент спектра субстанции фуросемида серии АМ20210086, содержащий сигналы изопропанола, пентана, уксусной кислоты.

Следует отметить, что при проведении контроля примесей методом ВЭЖХ остаточные растворители в субстанции фуросемида не наблюдаются. Данный пример иллюстрирует одно из важных преимуществ метода ЯМР перед традиционными хроматографическими методами при проведении контроля примесей: метод ЯМР позволяет фиксировать все примеси, присутствующие в анализируемом образце, в то время как хроматографические методы — только те примеси, которые наблюдаются при выбранных условиях хроматографирования.

Другой наглядный пример — контроль примесей субстанции «цефепим с аргинином» серии 10026EJ86D-B. При проведении аналитического контроля данного образца по показателю «родственные примеси» рекомендованным нормативной документацией (НД) методом ВЭЖХ он был признан соответствующим требованиям НД, так как в нем не было обнаружено посторонних примесей в количестве более 0,2 весовых процентов. При определении родственных примесей в этом же образце методом ЯМР была обнаружена примесь в количестве 2,29 весовых процентов. Было установлено, что она имеет строение циклического лактона, который получается при отщеплении пирролидинового фрагмента от молекулы цефепима с последующей циклизацией. Фрагмент протонного спектра субстанции «цефепим с аргинином» серии 10026EJ86D, содержащий сигнал

3.5

3.0

2.5

I

2.0

1.5

1.0

Рис. 4. Фрагмент спектра 1Н субстанции фуросемида серии АМ20210086 с сигналами остаточных растворителей

примесного циклического лактона с интегральной интенсивностью 7,59, представлен на рисунке 5.

Очевидно, что условия хроматографирования, подобранные для обнаружения предусмотренных НД родственных цефепиму примесей, не подходили для визуализации данного соединения.

Другое важное преимущество метода ЯМР перед традиционными хроматографическими методами при проведении контроля примесей заключает-

ся в том, что с его помощью задачи подтверждения подлинности, идентификации и количественного определения примесей (включая остаточные растворители), решаются параллельно, на основе использования одной пробы образца ЛСб, без приготовления серии калибровочных растворов стандартных образцов примесей и остаточных растворителей. Приведем пример субстанции фосфомицина трометамола. В соответствии с НД подтверждение подлинности

Рис. 5. Фрагмент спектра 1Н субстанции «цефепим с аргинином» серии 10026EJ86D-B с сигналом примесного циклического лактона

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Рис. 6. Фрагмент спектра 31Р субстанции фосфомицина трометамола серии 20110202 с сигналами родственных примесей A, D

вДМСО-с16

В 020

Рис. 7. Фрагменты спектров 13Срастворов субстанции рамиприла серии RP0101210 в D2O и ДМСО-d6

данной субстанции проводят методами ИК и ТСХ, контроль родственных примесей — ВЭЖХ, контроль остаточных растворителей — методом ГХ. В рамках каждого метода проводят свою пробоподготовку, используя различные реактивы, и применяют различные стандарты. В рамках ЯМР все три задачи решают с использованием одной ампулы с раствором образца субстанции в дейтерированном диметил сульфоксиде. Идентификацию и количественное определение родственных примесей осуществляют на основе данных спектра 31Р, подтверждение подлинности, идентификацию и количественное определение остаточных растворителей — на основе данных спектра 1Н.

На рисунках 6 и 7 приведены сигналы родственных примесей (А и D) и этанола, присутствующих в образце субстанции фосфомицина трометамола серии 20110202.

Исследование стабильности

Исследование стабильности осуществляют, изучая механизм физических или химических процессов, происходящих при длительном хранении ЛСб или методом «ускоренного старения». Оценивают стабильность, определяя в ЛСб количество основного компонента и продуктов его разложения. Метод ЯМР является надежным инструментом контроля

8

Рис. 8. Фрагмент спектра 1Нсубстанции «цефепим с аргинином» серии 10026Е186Б-В с сигналом примесного циклического лактона

стабильности (устойчивости) ЛСб, так как он позволяет фиксировать продукты разложения, устанавливать их строение и количественно определять снижение содержания активного компонента ЛСб и рост содержания примесей, путем сравнения спектров ЯМР растворов ЛСб со спектром исходного образца.

С его помощью можно также наблюдать все структурные изменения (конформационные превращения, инверсию конфигурации, валентную изомеризацию), не относящиеся к необратимым превращениям активного компонента в продукт разложения под действием какого-нибудь фактора (температуры, влажности, упаковочного материала и т.д.). Возможность метода ЯМР фиксировать конформационные превращения молекул может быть проиллюстрирована на примере ЛСб рамиприла. Рамиприл в растворе существует в виде двух конформеров (цис- и транс относительно амидной связи), поэтому в протонном и углеродном спектрах наблюдают удвоенный набор сигналов, соответствующих этим конформерам.

Транс-конформер преобладает, потому что его молекула стабилизирована внутримолекулярной водородной связью О-Н...О с участием карбоксильной и амидной групп. Мольное соотношение конформеров зависит от влияния растворителя на эффективность внутримолекулярной Н-связи. На рисунке 8 приведены фрагменты спектров 13С субстанции рамиприла серии КР0101210 в D2O и ДМСО-ёб, содержащие сигнал четвертичных углеродных атомов ароматических циклов цис- и транс-конформеров.

Сравнивая их интегральные интенсивности (1:4 и 1:2,9 в D2O и ДМСО-ёб соответственно), можно убедиться, что ДМСО более активно взаимодейству-

ет с рамиприлом, ослабляя внутримолекулярную водородную связь в молекуле рамиприла за счет более активного межмолекулярного водородного связывания. В результате происходит выравнивание мольных концентраций конформеров.

Таким образом, метод ЯМР является более информативным при анализе стабильности ЛСб, чем традиционные хроматографические и спектральные (ИК, УФ) методы, потому что позволяет делать выводы о всех структурных преобразованиях компонентов ЛСб.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Учитывая динамику развития техники ЯМР, а также появление все новых специальных методик измерения, следует ожидать скорого внедрения данного метода в количественный фармакопейный анализ. Его высокая производительность (для пробоподго-товки вещество достаточно растворить в подходящем растворителе, а измерение обычного протонного спектра требует не более двух минут), информативность, универсальность, комплексность и надежность делают его крайне привлекательным при выборе метода проведения аналитического контроля качества ЛСб. Особенно целесообразно применять метод ЯМР в тех случаях, когда компоненты ЛСб имеют близкие времена удерживания, важно содержание определенного пространственного или оптического изомера в смеси, необходимо качественно идентифицировать все возможные примеси и количественно оценить их содержание при отсутствии стандартных образцов.

ЭКСПЕРТИЗА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ