СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ КЛЕТОЧНО-СВЯЗЫВАЮЩИЙ АГЕНТ-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО

1. Способ получения конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент, содержащего клеточно-связывающий агент (CysCBA), имеющий один или более неспаренных цистеиновых остатков, ковалентно связанных с цитотоксическим агентом, при этом способ включает следующие этапы:
(a) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным клеточно-связывающим агентом (cCysCBA), имеющим один или более неспаренных цистеиновых остатков, кэпированных кэпирующим агентом, с образованием восстановленного клеточно-связывающего агента, при этом кэпирующий агент удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном клеточно-связывающем агенте;
(b) проведение реакции восстановленного клеточно-связывающего агента с селективным окислителем с образованием CysCBA, где свободная тиоловая группа в неспаренном цистеиновом остатке не окисляется; и
(c) проведение реакции CysCBA с соединением формулы (I):
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется конъюгат, где восстановленный клеточно-связывающий агент, полученный на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки; и CysCBA, полученный на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки, где:
D представляет собой цитотоксический агент; и
L представляет собой линкер.
2. Непрерывный способ получения конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент (ADC), содержащего клеточно-связывающий агент (CysCBA), имеющий один или более неспаренных цистеиновых остатков, ковалентно связанных с цитотоксическим агентом, при этом способ включает следующие этапы:
(а) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным клеточно-связывающим агентом (cCysCBA), имеющим один или более неспаренных цистеиновых остатков, кэпированных кэпирующим агентом, с образованием восстановленного клеточно-связывающего агента, при этом кэпирующий агент удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном клеточно-связывающем агенте;
(b) проведение реакции восстановленного клеточно-связывающего агента с селективным окислителем с образованием CysCBA, где свободная тиоловая группа в неспаренном цистеиновом остатке не окисляется; и
(c) проведение реакции CysCBA с соединением формулы (I):
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется конъюгат,
где восстановленный клеточно-связывающий агент, полученный на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки; CysCBA, полученный на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки, и любой один или более этапов, выбранных из этапов (а)-(с), выполняются непрерывно, и где:
D представляет собой цитотоксический агент; и
L представляет собой линкер.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что этапы (а)-(с) выполняются непрерывно.
4. Непрерывный способ получения конъюгата клеточно-связывающий агент-цитотоксический агент (ADC), содержащего клеточно-связывающий агент (CysCBA), имеющий один или более неспаренных цистеиновых остатков, ковалентно связанных с цитотоксическим агентом, при этом способ включает следующие этапы:
(a) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным клеточно-связывающим агентом (cCysCBA), имеющим один или более неспаренных цистеиновых остатков, кэпированных кэпирующим агентом, с образованием восстановленного клеточно-связывающего агента, при этом кэпирующий агент удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном клеточно-связывающем агенте;
(b) проведение реакции восстановленного клеточно-связывающего агента с селективным окислителем с образованием CysCBA, где свободная тиоловая группа в неспаренном цистеиновом остатке не окисляется; и
(c) проведение реакции CysCBA с соединением формулы (I):
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется конъюгат; и
(d) удаление неконъюгированного соединения формулы (I);
где восстановленный клеточно-связывающий агент, полученный на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки; CysCBA, полученный на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки, любой один или более этапов, выбранных из этапов (a)-(d), выполняются непрерывно, и где:
D представляет собой цитотоксический агент; и
L представляет собой линкер.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что этапы (a)-(d) выполняются непрерывно.
6. Способ по п. 4 или 5, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этап (е) замены конъюгата в стабильный буфер.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что этап (е) выполняется непрерывно.
8. Способ по любому из пп. 4-7, отличающийся тем, что для удаления неконъюгированного соединения формулы (I) и/или замены ADC в стабильный буфер используют однопроходную тангенциальную поточную фильтрацию (SPTFF) и/или противоточную диафильтрацию.
9. Способ по любому из пп. 2-8, отличающийся тем, что на этапе (a) cCysCBA и/или восстанавливающий агент непрерывно добавляют в химический реактор во время протекания реакции и после образования по меньшей мере одного продукта.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что cCysCBA и восстанавливающий агент непрерывно добавляют в химический реактор, в то время как реакционная смесь непрерывно отводится и подается через проточный реактор.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что объемная скорость потока для отвода реакционной смеси из химического реактора равна суммарной скорости потока для восстанавливающего агента и cCysCBA, добавляемых в химический реактор.
12. Способ по любому из пп. 2-11, отличающийся тем, что на этапе (b) восстановленный клеточно-связывающий агент и селективный окислитель непрерывно добавляют в химический реактор во время протекания реакции и после образования по меньшей мере одного продукта.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что восстановленный клеточно-связывающий агент и селективный окислитель непрерывно добавляют в химический реактор, а реакционная смесь непрерывно отводится и подается через проточный реактор.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что объемная скорость потока для отвода реакционной смеси из химического реактора равна суммарной скорости потока для восстановленного клеточно-связывающего агента и селективного окислителя, добавляемых в химический реактор.
15. Способ по любому из пп. 2-14, отличающийся тем, что на этапе (a) CysCBA и/или соединение формулы (I) непрерывно добавляют в химический реактор во время протекания реакции и после образования по меньшей мере одного продукта.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что CysCBA и соединение формулы (I) непрерывно добавляют в химический реактор, реакционная смесь непрерывно отводится и подается через проточный реактор.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что объемная скорость потока отвода реакционной смеси из химического реактора равна суммарной скорости потока CysCBA и соединения формулы (I), добавляемых в химический реактор.
18. Способ по любому из пп. 9-17, отличающийся тем, что химический реактор представляет собой проточный реактор с непрерывным перемешиванием (CSTR).
19. Способ по любому из пп. 10, 11, 13, 14 и 16-18, отличающийся тем, что проточный реактор представляет собой реактор с пульсирующим потоком (PFR).
20. Способ по любому из пп. 3-19, отличающийся тем, что для удаления неконъюгированного лекарственного средства используют однопроходную тангенциальную поточную фильтрацию (SPTFF).
21. Способ по любому из пп. 3-19, отличающийся тем, что для удаления неконъюгированного лекарственного средства используют противоточную диафильтрацию.
22. Способ по любому из пп. 6-21, отличающийся тем, что SPTFF и/или противоточную диафильтрацию используют для замены ADC в стабильный буфер.
23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что CysCBA представляет собой сконструированное с цистеином антитело (CysAb) или его антигенсвязывающий фрагмент, и способ включает следующие этапы:
(a) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным сконструированным с цистеином антителом (cCysAb) или его антигенсвязывающий фрагментом, имеющим один или более сконструированных цистеиновых остатков, кэпированных кэпирующим агентом, с образованием восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом кэпирующий агент удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте;
(b) проведение реакции восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с селективным окислителем с образованием CysAb, где свободная тиоловая группа в сконструированном цистеиновом остатке не окисляется; и
(c) проведение реакции CysAb с соединением формулы (I):
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется конъюгат антитело-цитотоксический агент (ADC), где восстановленное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученный на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки; и CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент, полученный на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки, где:
D представляет собой цитотоксический агент; и
L представляет собой линкер.
24. Способ по п. 1 или 23, отличающийся тем, что этапы (а), (b) и (с) проводят в одном и том же химическом реакторе.
25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что одна или более межцепочечных дисульфидных связей в кэпированном сконструированном с цистеином антителе (cCysAb) или его антигенсвязывающем фрагменте восстанавливаются на этапе (а).
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что одна или более межцепочечных дисульфидных связей повторно образуются на этапе (b).
27. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (ТСЕР), трисгидроксипропилфосфин (ТНРР), трис(2-цианоэтил)фосфин, дитиотреитол (DTT), (дициклогексилфосфино)бензолсульфоновую кислоту, бис(п-сульфонатофенил)фенилфосфин, (дифенилфосфино)бензолсульфоновую кислоту, (дифенилфосфино)бензойную кислоту, 2-(дифенилфосфино)-N,N,N-триметилбензиламмоний трифлат, (дифенилфосфино)этиламин, 2-(диизопропилфосфино)этиламин или 3-(дифенилфосфино)пропиламин (DPPA).
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой ТСЕР или DPPA.
29. Способ по любому из пп. 1-28, отличающийся тем, что окислитель представляет собой дегидроаскорбиновую кислоту (DHAA), сульфат меди, кислород или воздух.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что окислитель представляет собой DHAA.
31. Способ по любому из пп. 1-30, отличающийся тем, что реакцию на этапе (а) проводят при рН от 5,0 до 8,5.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что реакцию на этапе (а) проводят при рН от 6,0 до 7,5.
33. Способ по любому из пп. 1-32, отличающийся тем, что реакцию на этапе (b) проводят при рН от 5,0 до 8,5.
34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что реакцию на этапе (b) проводят при рН от 6,0 до 7,5.
35. Способ по любому из пп. 1-34, отличающийся тем, что реакцию на этапе (с) проводят при рН от 5,0 до 8,5.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что реакцию на этапе (с) проводят при рН от 6,0 до 7,5.
37. Способ по любому из пп. 1-34, отличающийся тем, что реакцию на этапе (с) проводят при рН от 5,5 до 6,5.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что реакцию на этапе (с) проводят при рН 6,0.
39. Способ по любому из пп. 1-38, отличающийся тем, что способ дополнительно включает доведение рН реакционной смеси после этапа (b) перед взаимодействием CysCBA с цитотоксическим агентом на этапе (с).
40. Способ по любому из пп. 1-38, отличающийся тем, что рН реакционной смеси после этапа (b) не доводят перед взаимодействием CysCBA с цитотоксическим агентом на этапе (с).
41. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой ТСЕР, и реакцию на этапе (а) проводят при рН от 6,0 до 8,0.
42. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой ТСЕР, и реакцию на этапе (а) проводят при рН 7,5.
43. Способ по п. 41 или 42, отличающийся тем, что окислитель представляет собой DHAA, и реакцию на этапе (b) проводят при рН 7,5.
44. Способ по любому из пп. 41-43, отличающийся тем, что рН реакционной смеси после этапа (b) доводят от рН 7,5 до рН 6,0 перед взаимодействием CysCBA с цитотоксическим агентом на этапе (с).
45. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой DPPA, и реакцию на этапе (а) проводят при рН от 6,0 до 8,0.
46. Способ по любому из пп. 1-26, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой DPPA, и реакцию на этапе (а) проводят при рН 6,5.
47. Способ по п. 45 или 46, отличающийся тем, что окислитель представляет собой DHAA, и реакцию на этапе (b) проводят при рН 6,5.
48. Способ по любому из пп. 1-47, отличающийся тем, что конъюгат очищают с помощью тангенциальной поточной фильтрации (TFF), адсорбционной хроматографии, неадсорбционной хроматографии, адсорбционной фильтрации, селективного осаждения или их комбинации.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что конъюгат очищают с помощью тангенциальной поточной фильтрации.
50. Способ по любому из пп. 1-49, отличающийся тем, что на этапе (а) используют избыточное количество восстанавливающего агента по отношению к cCysCBA.
51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что молярное соотношение восстанавливающего агента к его cCysCBA составляет от 1:1 до 50:1, от 2:1 до 30:1 или от 5:1 до 25:1.
52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что молярное соотношение восстанавливающего агента к его cCysCBA составляет от 15:1 до 20:1.
53. Способ по любому из пп. 1-52, отличающийся тем, что молярное соотношение восстанавливающего агента на этапе (а) к окислителю на этапе (b) составляет от 2:1 до 1:2.
54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что молярное соотношение восстанавливающего агента к окислителю составляет от 1,2:1 до 1:1,5.
55. Способ по п. 53, отличающийся тем, что молярное соотношение восстанавливающего агента к окислителю составляет от 1:1 до 1:1,5.
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что молярное соотношение восстанавливающего агента к окислителю составляет 1:1.
57. Способ по п. 55, отличающийся тем, что молярное соотношение восстанавливающего агента к окислителю составляет 1:1,5.
58. Способ по любому из пп. 1-57, отличающийся тем, что на этапе (с) используют избыточное количество соединения формулы (I) по отношению к CysCBA.
59. Способ по п. 58, отличающийся тем, что от 2 до 5 молярных эквивалентов соединения формулы (I) используют для каждого эквивалента CysCBA.
60. Способ по любому из пп. 23-59, отличающийся тем, что CysAb представляет собой антитело, содержащее сконструированный цистеиновый остаток в одной или более позициях, выбранных из позиций тяжелой цепи антитела 40, 43, 84, 88, 103, 112, 113, 114, 115, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 161, 168, 172, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 244, 245, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 260, 262, 265, 267, 270, 272, 274, 279, 280, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 289, 293, 295, 297, 298, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 332, 334, 338, 339, 340, 341, 343, 345, 360, 361, 362, 375, 376, 377, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 391, 413, 422, 423, 424, 427, 428, 430, 431, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 440, 442, 443 и 446 по нумерации EU/OU.
61. Способ по любому из пп. 23-59, отличающийся тем, что CysAb представляет собой антитело, содержащее сконструированный цистеиновый остаток в позиции 442 тяжелой цепи антитела по нумерации EU/OU.
62. Способ по п. 61, отличающийся тем, что CysAb представляет собой антитело, содержащее сконструированный цистеиновый остаток в позиции 442 обеих тяжелых цепей по нумерации EU/OU.
63. Способ по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что кэпирующий агент представляет собой цистеин, гомоцистеин, глутатион или их комбинацию.
64. Способ по любому из пп. 1-63, отличающийся тем, что более 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 99,5% конъюгата является мономерным.
65. Способ по любому из пп. 1-64, где D представляет собой соединение бензодиазепина.
66. Способ по любому из пп. 1-64, где D представляет собой соединение майтанзиноида.
67. Способ по любому из пп. 1-64, где D представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
1
4
3
двойная линия  между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда это двойная связь, X отсутствует и Y представляет собой -Н или (С-С)алкил; а когда это одинарная связь, X представляет собой -Н или аминозащитную группу, Y представляет собой -ОН или -SOH или его фармацевтически приемлемую соль;
один из L', L'' и L''' представлен следующей формулой:
2
2
n
2
2
2
3
3
2
c
и два других, каждый независимо, выбраны из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, звена полиэтиленгликоля -(CHCHO)-R, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH], -OR, -NR'R'', -NO, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SOR', -SOH, -OSOH, -SONR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR', и -OCONR'R'';
1
2
5
один из Z и Z представляет собой -С(=O)-, а другой представляет собой -NR-;
1
P представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков;
x1
R представляет собой необязательно замещенный линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил;
e
k
k
101
101
102
101
102
2
2
n
R представляет собой -Н, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, или -(CH-CH-O)-R, где R представляет собой -Н, линейный, разветвленный циклический алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино (например, -NHR) или третичную амино (-NRR) группу или 5-или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, где R и R каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил;
2
2
n
c
R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, звена полиэтиленгликоля -(CHCHO)-R, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
2
2
2
n
c
R' и R'' каждый независимо выбраны из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, звена полиэтиленгликоля -(CHCHO)-R и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
c
R представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода;
n равен целому числу от 1 до 24;
1
2
2
n
c
X выбран из -Н, аминозащитной группы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, звена полиэтиленгликоля -(CHCHO)-R, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
1
Y выбран из -Н, оксогруппы, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, необязательно замещенного 6-18-членного арила, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов;
1
2
3
4
1
2
3
4
2
2
n
2
2
2
3
3
2
c
-
R, R, R, R, R', R', R' и R' каждый независимо выбраны из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, звена полиэтиленгликоля -(CHCHO)-R, галогена, гуанидиния [-NH(C=NH)NH], -OR, -NR'R'', -NO, -NCO, -NR'COR'', -SR, -SOR', -SOR', -SOH, -OSOH, -SONR'R'', циано, азидо, -COR', -OCOR', и -OCONR'R'';
6
2
R представляет собой -H, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO или галоген;
G представляет собой -CH- или -N-;
5
5
А и А' являются одинаковыми или разными и независимо выбраны из -О-, оксо (-С(=O)-), -CRR'O-, -CRR'-, -S-, -CRR'S-, -NR и -CRR'N(R)-; и
5
R в каждом случае независимо представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил.
68. Способ по п. 67, где D представлен следующей формулой:
или ее фармацевтически приемлемой солью.
1
1
3
1
3
1
1
3
1
3
69. Способ по п. 67 или 68, где X представляет собой -Н, -ОН, (С-С)алкил, галоген(С-С)алкил или фенил; и Y' представляет собой -Н, оксо группу, (С-С)алкил или галоген(С-С)алкил.
1
1
70. Способ по п. 69, где X представляет собой -Н, -ОН или -Me; и Y представляет собой -Н или оксо.
1
1
71. Способ по п. 69, где X представляет собой -Н; и Y представляет собой -Н.
72. Способ по любому из пп. 67-71, где А и А' являются одинаковыми или разными и выбраны из -О- и -S-.
73. Способ по п. 72, где А и А' представляют собой -О-.
6
74. Способ по любому из пп. 67-73, где R представляет собой -ОМе.
1
2
3
4
1
2
3
4
2
1
3
1
3
1
3
75. Способ по любому из пп. 67-74, где R, R, R, R, R', R', R' и R' независимо представляют собой -Н, галоген, -NO, -ОН, (С-С)алкил, галоген(С-С)алкил или (C-С)алкокси.
1
2
3
4
1
2
3
4
76. Способ по п. 75, где R, R, R, R, R', R', R' и R' все представляют собой -Н.
5
1
3
77. Способ по любому из пп. 67-76, где R, R', R'' и R каждый независимо представляют собой -Н или (С-С)алкил.
78. Способ по п. 67 или 68, где
1
2
3
4
1
2
3
4
R, R, R, R, R', R', R' и R' все представляют собой -Н;
6
R представляет собой -ОМе;
1
1
X и Y оба представляют собой -Н;
А и А' представляют собой -О-.
1
6
2
79. Способ по любому из пп. 67-78, где один из L', L'' и L''' представлен формулой (А') или (D'), а другие представляют собой -Н, линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, галоген, -ОН, (С-С)алкокси или -NO.
80. Способ по п. 79, где L' представлен формулой (A'); a L'' и L''' оба представляют собой -Н.
81. Способ по п. 79, где L' представлен формулой (D'); a L'' и L''' оба представляют собой -Н.
x1
1
3
1
3
1
3
82. Способ по любому из пп. 67-81, где R представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, необязательно замещенный галогеном, -ОН, (С-С)алкилом, (С-С)алкокси, галоген(С-С)алкилом или заряженным заместителем, или ионизируемой группой Q.
83. Способ по любому из пп. 67-82, где L' представлен следующей формулой.
где:
a
b
1
3
R и R, в каждом случае, каждый независимо представляет собой -Н, (С-С)алкил или заряженный заместитель или ионизируемую группу Q;
s равно целому числу от 1 до 6;
s1' равно 0 или целому числу от 1 до 6; и
1
3
1
3
1
3
Су представляет собой циклический алкил, содержащий 5 или 6 кольцевых атомов углерода, необязательно замещенный галогеном, -ОН, (С-С)алкилом, (С-С)алкокси или галоген(С-С)алкилом.
84. Способ по п. 83, где Су в формулах (В2') и (С2') представляет собой циклогексан; и s1' равно 0 или 1.
85. Способ по п. 83, где D представлен следующей формулой:
или ее фармацевтически приемлемой солью.
a
b
5
86. Способ по любому из пп. 83-85, где R и R оба представляют собой Н; и R представляет собой Н или Me.
3
3
3
2
3
2
3
2
3
2
2
2
11
12
11
12
14
15
16
14
15
16
14
16
+
-
+
-
-
87. Способ по любому из пп. 67-85, где заряженный заместитель или ионизируемая группа Q представляет собой i) -SOH, -Z'-SOH, -ОРОН, -Z'-OPOH, -РОН, -Z'-POH, -COH, -Z'-СОН, -NRR или -Z'-NRR, или их фармацевтически приемлемую соль; или ii) -NRRRX или -Z'-NRRRX; Z' представляет собой необязательно замещенный алкилен, необязательно замещенный циклоалкилен или необязательно замещенный фенилен; R-R каждый независимо представляет собой необязательно замещенный алкил; и X представляет собой фармацевтически приемлемый анион.
3
88. Способ по п. 87, где Q представляет собой -SOH или его фармацевтически приемлемую соль.
1
89. Способ по любому из пп. 67-88, где P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков.
1
90. Способ по п. 89, где P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.
1
91. Способ по п. 89 или 90, где P представляет собой пептид, расщепляемый протеазой.
1
92. Способ по п. 89, где P представляет собой пептид, расщепляемый протеазой, экспрессируемой в опухолевой ткани.
1
9
9
93. Способ по любому из пп. 67-88, где P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp, Cit, Phe-Ala, Phe-N-тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 56), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 58), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe и Gln-Ala.
1
94. Способ по п. 93, где P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala или D-Ala-D-Ala.
95. Способ по п. 67, где D представлен следующими структурными формулами:
3
или их фармацевтически приемлемой солью, где двойная линия  между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда это двойная связь, X отсутствует и Y представляет собой -Н, а когда это одинарная связь, X представляет собой -Н, Y представляет собой -SOH или его фармацевтически приемлемую соль.
96. Способ по любому из пп. 67-95, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;
23
24
R и R в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил.
m' равно целому числу от 0 до 10; и
h
R представляет собой Н или необязательно замещенный алкил.
23
24
97. Способ по п. 96, где R и R оба представляют собой Н; и m' равно целому числу от 1 до 6.
h
98. Способ по п. 96 или 97, где R' представляет собой Н.
99. Способ по п. 96, где L представлен следующей структурной формулой:
или ее фармацевтически приемлемой солью.
100. Способ по любому из пп. 67-99, отличающийся тем, что фармацевтически приемлемая соль представляет собой натриевую или калиевую соль.
101. Способ по любому из пп. 1-64, где соединение представлено следующей формулой.
или ее фармацевтически приемлемой солью.
102. Способ по п. 101, где соединение представлено следующей формулой:
103. Способ по любому из пп. 1-64, где D представлен следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
1
4
3
двойная линия  между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда это двойная связь, X отсутствует и Y представляет собой -Н или (C-С)алкил; а когда это одинарная связь, X представляет собой -Н или аминозащитную группу, Y представляет собой -ОН или -SOH или его фармацевтически приемлемую соль;
X' выбран из группы, состоящей из -Н, -ОН, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, фенила и аминозащитной группы;
Y' выбран из группы, состоящей из -Н, оксогруппы, замещенного или незамещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила;
А и А' выбраны из -О- и -S-;
e
e
e
e
2
2
W' отсутствует или выбран из -О-, -N(R)-, -N(R)-C(=O)-, -N(C(=O)R)-, -S- или -CH-S-, -CHNR-;
x
R отсутствует или выбран из линейного, разветвленного или циклического алкила;
e
k
k
101
101
102
101
102
2
2
n
R представляет собой -Н, линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил, или -(CH-CH-O)-R, где R представляет собой -Н, линейный, разветвленный циклический алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода, необязательно несущий вторичную амино (например, -NHR) или третичную амино (-NRR) группу или 5- или 6-членный азотсодержащий гетероцикл, где R и R каждый независимо представляет собой линейный, разветвленный или циклический алкил, алкенил или алкинил;
n равен целому числу от 1 до 24;
G выбран из -СН- или -N-;
6
2
R представляет собой -Н, -R, -OR, -SR, -NR'R'', -NO или галоген; и
2
2
n
c
R в каждом случае независимо выбран из группы, состоящей из -Н, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, звена полиэтиленгликоля -(CHCHO)-R, необязательно замещенного арила, содержащего от 6 до 18 атомов углерода, необязательно замещенного 5-18-членного гетероарильного кольца, содержащего один или более гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, или необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
2
2
2
n
c
R' и R'' каждый независимо выбраны из -Н, -ОН, -OR, -NHR, -NR, -COR, необязательно замещенного линейного, разветвленного или циклического алкила, алкенила или алкинила, звена полиэтиленгликоля -(CHCHO)-R и необязательно замещенного 3-18-членного гетероциклического кольца, содержащего от 1 до 6 гетероатомов, независимо выбранных из О, S, N и Р;
c
R представляет собой -Н или необязательно замещенный линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода.
104. Способ по п. 103, где D представлен следующей структурной формулой:
или ее фармацевтически приемлемой солью.
105. Способ по п. 103 или 104, где
X' и Y' оба представляют собой -Н;
А и А' оба представляют собой -О-;
6
R представляет собой -ОМе;
e
e
W' представляет собой -N(R)- или -N(R)-C(=O)-;
e
k
k
2
2
n
R представляет собой -Н, линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или -(CH-CH-O)-R, где R представляет собой -Н, линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода;
n равен целому числу от 2 до 6; и
x
R представляет собой линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 6 атомов углерода.
106. Способ по п. 103, где D представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
e1
1
6
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
xa
1
6
R представляет собой (С-С)алкил;
e2
k
2
2
n
R представляет собой -(CH-CH-O)-R;
n равен целому числу от 2 до 6;
k
R представляет собой -Н или -Me; и
xb
1
6
R представляет собой (С-С)алкил.
107. Способ по п. 106, где D представлен следующей формулой:
или ее фармацевтически приемлемой солью.
108. Способ по любому из пп. 1-64, где D представлен следующей формулой:
1
2
1
3
где m' равно 1 или 2; и R и R, каждый независимо представляют собой -Н или (C-С)алкил.
109. Способ по п. 108, где D представлен следующей формулой:
110. Способ по любому из пп. 103-109, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D, и s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;
10
11
q
Е представляет собой -(CRR)-, циклоалкил или циклоалкилалкил;
2
9
9
2
9
9
9
2
2
p
9
2
2
р
2
2
p
9
2
2
p
9
Z отсутствует, представляет собой -SONR-, -NRSO-, -C(=O)-NR-, -NR-С(=O)-, -С(=O)-O-, -O-С(=O)-, -C(=O)-NR-(CHCHO)-, -NR-С(=O)-(CHCHO)-, -(OCHCH)-C(=O)NR-, или -(OCHCH)-NR-C(=O)-;
р равно целому числу от 1 до 24;
Q представляет собой Н, заряженный заместитель или ионизируемую группу;
9
10
11
12
13
R, R, R, R, и R в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил; и
q и r в каждом случае независимо равны целому числу от 0 до 10.
10
11
q
111. Способ по п. 110, где Е представляет собой -(CRR)-.
112. Способ по п. 111, где Е представляет собой
9
9
113. Способ по любому из пп. 110-112, где Z представляет собой -C(=O)-NR- или -NR-С(=O)-.
114. Способ по п. 110, где L представлен следующей структурной формулой:
где
9
10
11
12
13
1
3
R, R, R, R, и R в каждом случае независимо представляют собой -Н или (C-С)алкил.
9
115. Способ по любому из пп. 110-114, где R представляет собой -Н.
116. Способ по любому из пп. 110-115, где Q' представляет собой:
i) Н;
3
3
3
2
3
2
3
2
3
2
2
2
11
12
14
15
ii) -SOH, -Z'-SOH, -ОРОН, -Z'-OPOH, -РОН, -Z'-РОН, -СОН, -Z'-СОН, -NRR, или -Z'-NRR, или их фармацевтически приемлемую соль; или
+
-
+
-
14
15
16
14
15
16
iii) -NRRRX или -Z'-NRRRX;
Z' представляет собой необязательно замещенный алкилен, необязательно замещенный циклоалкилен или необязательно замещенный фенилен;
14
15
16
R, R и R каждый независимо представляют собой необязательно замещенный алкил; и
-
X представляет собой фармацевтически приемлемый анион.
3
117. Способ по п. 116, где Q' представляет собой Н или -SOH или его фармацевтически приемлемую соль.
9
10
11
12
13
118. Способ по любому из пп. 110-117, где R, R, R, R, и R все представляют собой Н; и q и r каждый независимо равны целому числу от 1 до 6.
119. Способ по п. 114, где
12
13
1
3
R и R, в каждом случае каждый независимо представляют собой Н или (C-С)алкил;
3
Q представляет собой Н или -SOH или их фармацевтически приемлемую соль
9
9
Z представляет собой -C(=O)-NR- или -NR-C(=O)-;
9
1
3
R представляет собой Н или (С-С)алкил;
10
11
1
3
R и R в каждом случае независимо представляют собой Н или (С-С)алкил; и
q и r равны целому числу от 1 до 5.
120. Способ по п. 119, где L представлен любой из следующих структурных формул:
или ее фармацевтически приемлемой солью.
121. Способ по любому из пп. 103-109, где L представлен следующей структурной формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
s1 представляет собой сайт, ковалентно связанный с D; s2 представляет собой сайт, ковалентно связанный с малеимидной группой;
19
20
21
22
R, R, R и R, в каждом случае независимо представляют собой Н или необязательно замещенный алкил;
u и v каждый независимо равны целому числу от 0 до 10;
h
R представляет собой Н или необязательно замещенный алкил;
L
2
2
j
L
P представляет собой необязательно замещенный алкилен, -(CH-CH-O)- (в котором атом кислорода связан с группой -(С=O)-, присоединенной к P), аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислотных остатков; и
j равно целому числу от 1 до 24.
19
20
21
22
122. Способ по п. 121, где R, R, R и R все представляют собой Н; и u и v каждый независимо равны целому числу от 1 до 6.
L
123. Способ по п. 121 или 122, где P представляет собой аминокислотный остаток или пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислотных остатков.
L
124. Способ по п. 123, где P представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.
L
9
9
125. Способ по п. 110, где P выбран из группы, состоящей из: Ala-Val, Val-Ala, Val-Cit, Cit-Val. Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Phe-N-тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 55), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 56), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 57), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala., Ala-Met, Met-Ala, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, Gly-Gly-Gly, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Val-Cit, Ala-Val-Ala и β-Ala-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 58).
L
126. Способ по п. 125, отличающийся тем, что P представляет собой Gly-Gly-Gly, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Val-Ala или β-Ala-Gly-Gly-Gly.
127. Способ по п. 121, где L представлен следующей структурной формулой:
или ее фармацевтически приемлемой солью.
128. Способ по любому из пп. 1-64, где соединение формулы (I) представлено следующей формулой.
или ее фармацевтически приемлемой солью.
129. Способ по п. 128, где соединение представлено следующей формулой:
130. Способ по любому из пп. 1-64, где соединение формулы (I) представлено следующей формулой.
или их фармацевтически приемлемой солью, где DM представляет собой фрагмент лекарственного средства, представленный следующей формулой:
131. Способ по любому из пп. 1-64, где соединение формулы (I) представлено следующей формулой.
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
2
'
L представляет собой спейсер, содержащий малеимидный фрагмент;
А представляет собой аминокислоту или пептид, содержащий от 2 до 20 аминокислот;
1A
2A
1-3
R и R каждый независимо представляют собой Н или Салкил;
1
L представляет собой спейсер; и
1
D-L-SH представляет собой цитотоксический агент.
1A
2A
132. Способ по п. 131, где по меньшей мере один из R и R представляет собой Н.
1A
2A
133. Способ по п. 131, где R и R каждый независимо представляют собой Н или Me.
1A
2A
134. Способ по п. 131, где один из R и R представляет собой Н; а другой представляет собой Me.
1A
2A
135. Способ по п. 133, где R и R оба представляют собой Н.
1
1
1
136. Способ по любому из пп. 131-135, где L представляет собой -L'-C(=O)-; и L' представляет собой алкилен или циклоалкилен.
1
1-10
137. Способ по п. 136, где L' представляет собой Салкилен.
1
2
1-8
3A
4A
3A
4A
138. Способ по п. 137, где L представляет собой -CRR-(CH)-C(=O)-; R и R каждый независимо представляют собой Н или Me.
1
2
3-5
3A
4A
139. Способ по п. 138, где L представляет собой -CRR-(CH)-C(=O)-.
3A
4A
140. Способ по п. 138 или 139, где R и R оба представляют собой Me.
1
2
4-6
141. Способ по п. 139, где L представляет собой -(СН)-С(=O)-.
2
142. Способ по любому из пп. 131-141, где L' представлен следующей структурной формулой:
где:
A
R представляет собой алкилен, циклоалкилалкилен или арилен;
B
C
R и R каждый независимо отсутствуют, представляют собой алкилен, циклалкилен или арилен;
2
2
p1
2
2
p1
V и V' каждый независимо представляют собой -(O-CH-CH)- или -(CH-CH-O)-;
p1 равно 0 или целому числу от 1 до 10;
A
B
C
CB
A
W отсутствует, представляет собой  или  где s2' указывает сайт, связанный с V, R или J' и s3' указывает сайт, связанный с R, V', R или J;
CB
'
J представляет собой
A
J представляет собой -С(=O)-.
C
143. Способ по п. 142, где p1 равно 0, и R отсутствует.
2
144. Способ по любому из пп. 131-142, где L' представлен следующими структурными формулами:
где:
x
y
+
+
1-4
3
40
41
42
1-4
3
40
41
42
40
41
42
1-4
R и R, в каждом случае независимо представляют собой Н, -ОН, галоген, -O-(C алкил), -SOH, -NRRR или С алкил, необязательно замещенный -ОН, галогеном, -SOH или NRRR, где R, R и R каждый независимо представляют собой Н или С алкил;
l и l1 каждый независимо равны целому числу от 1 до 10;
k1 равно целому числу от 1 до 12.
x
y
145. Способ по п. 144, где R и R все представляют собой Н.
146. Способ по п. 144 или 145, где l и l1 каждый равны целому числу от 2 до 6.
147. Способ по любому из пп. 131-146, где А представляет собой пептид, расщепляемый протеазой.
148. Способ по п. 126, где А представляет собой пептид, расщепляемый протеазой, экспрессируемой в опухолевой ткани.
1
2
1
149. Способ по любому из пп. 131-146, где А представляет собой пептид, содержащий аминокислоту, ковалентно связанную с -NH-CRR-S-L-D, выбранную из группы, состоящей из Ala, Arg, Asn, Asp, Cit, Cys, селино-Cys., Gln, Glu, Gly, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr и Val, каждая независимо в виде L- или D-изомера.
1
2
1
150. Способ по любому из пп. 131-149, где аминокислота, связанная с -NH-CRR-S-L-D, представляет собой L-аминокислоту.
151. Способ по любому из пп. 147-150, где А представляет собой пептид, содержащий от 2 до 5 аминокислотных остатков.
9
9
1
2
2
1
152. Способ по любому из пп. 131-147, где А выбран из группы, состоящей из Gly-Gly-Gly, Ala-Val, Val-Ala, D-Val-Ala, Val-Cit, D-Val-Cit, Val-Lys, Phe-Lys, Lys-Lys, Ala-Lys, Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Phe-Ala, Phe-N-тозил-Arg, Phe-N-нитро-Arg, Phe-Phe-Lys, D-Phe-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Leu-Ala-Leu, Ile-Ala-Leu, Val-Ala-Val, Ala-Ala-Ala, D-Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala-D-Ala, Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 56), β-Ala-Leu-Ala-Leu (SEQ ID NO: 57), Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: 58), Val-Arg, Arg-Arg, Val-D-Cit, Val-D-Lys, Val-D-Arg, D-Val-Cit, D-Val-Lys, D-Val-Arg, D-Val-D-Cit, D-Val-D-Lys, D-Val-D-Arg, D-Arg-D-Arg, Ala-Ala, Ala-D-Ala, D-Ala-Ala, D-Ala-D-Ala, Ala-Met, Gln-Val, Asn-Ala, Gln-Phe, Gln-Ala, D-Ala-Pro и D-Ala-tBu-Gly, где первая аминокислота в каждом пептиде связана с группой L, а последняя аминокислота в каждом пептиде связана с -NH-CRR-S-L-D.
153. Способ по п. 152, где А представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly.
154. Способ по любому из пп. 131-153, где D представляет собой майтанзиноид.
155. Способ по п. 154, где D представлен следующей формулой:
156. Способ по п. 155, где D представлен следующей формулой:
157. Способ по любому из пп. 131-154, где соединение формулы (I) представлено следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
3A
4A
R и R каждый независимо представляют собой Н или Me;
r1 и t1 каждый независимо равны целому числу от 1 до 6;
r2 и t2 каждый независимо равны целому числу от 1 до 7;
t3 равно целому числу от 1 до 12;
1
D представлено следующей формулой:
158. Способ по п. 157, где А представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro или D-Ala-tBu-Gly.
159 Способ по п. 157 или 158, где r1 равно целому числу от 2 до 4; и r2 равно целому числу от 3 до 5.
160. Способ по п. 159, где соединение формулы (I) представлено следующей формулой:
где:
r1 и t1 каждый независимо равны целому числу от 2 до 6;
r2 и t2 каждый независимо равны целому числу от 2 до 5; и
t3 равно целому числу от 2 до 12.
3A
4A
161. Соединение по любому из пп. 157-160, где R и R оба представляют собой Me.
3A
4A
162. Соединение по любому из пп. 157-160, где R и R оба представляют собой Н.
163. Соединение по п. 157, где соединение представлено следующими формулами:
или его фармацевтически приемлемой солью, где:
А представляет собой Ala-Ala-Ala, Ala-D-Ala-Ala, Ala-Ala, D-Ala-Ala, Val-Ala, D-Val-Ala, D-Ala-Pro, или D-Ala-tBu-Gly; и
1
D представлено следующей формулой:
164. Способ по п. 163, где соединение представлено следующими формулами:
1
где D представлен следующей формулой:
165. Способ по п. 164, где соединение формулы (I) представлено следующей формулой:
166. Способ по любому из пп. 23-165, отличающийся тем, что сконструированное с цистеином антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело против фолатного рецептора или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело против EGFR или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело против CD33 или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело против CD19 или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело против Muc1 или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело против CD37 или его антигенсвязывающий фрагмент, антитело против cMet или его антигенсвязывающий фрагмент, или антитело против ЕрСАМ или его антигенсвязывающий фрагмент.
167. Способ по любому из пп. 23-165, отличающийся тем, что сконструированное с цистеином антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело против CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент.
H
H
H
L
L
L
168. Способ по п. 167, отличающийся тем, что антитело против CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6; и b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.
H
L
169. Способ по п. 167, отличающийся тем, что антитело против CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность V из SEQ ID NO: 7 и последовательность V из SEQ ID NO: 9.
170. Способ по п. 167, отличающийся тем, что антитело против CD123 содержит: (а) тяжелую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8; и
b) легкую цепь иммуноглобулина, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10.
171. Способ по любому из пп. 23-165, отличающийся тем, что сконструированное с цистеином антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело против ADAM9 или его антигенсвязывающий фрагмент.
172. Способ по п. 171, отличающийся тем, что антитело против ADAM9 или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело против ADAM9 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое специфически связывается с ADAM9 человека и ADAM9 яванского макака.
H
H
H
L
L
L
173. Способ по п. 172, отличающийся тем, что гуманизированное антитело против ADAM9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 24, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 25, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 26; и b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23.
H
L
174. Способ по п. 172 или 173, отличающийся тем, что гуманизированное антитело против ADAM9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (V) SEQ ID NO: 27 и последовательность вариабельного домена легкой цепи (V) SEQ ID NO: 28.
175. Способ по п. 174, отличающийся тем, что гуманизированное антитело против ADAM9 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 29; и легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 30.
176. Способ по любому из пп. 171-175, отличающийся тем, что гуманизированное антитело против ADAM9 или его ADAM9-связывающий фрагмент оптимизированы для обеспечения по меньшей мере 100-кратного увеличения аффинности связывания с ADAM9 яванского макака и сохраняют высокую аффинность связывания с ADAM9 человека по сравнению с химерным или мышиным родительским антителом.
177. Способ получения конъюгата антитело-цитотоксический агент (ADC), представленного следующей формулой:
включающий этапы:
(а) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным сконструированным с цистеином антителом (cCysAb), представленным следующей формулой:
с образованием восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом кэпирующий агент (Сар) удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте;
(b) проведение реакции восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с селективным окислителем с образованием CysAb, где свободная тиоловая группа в сконструированном цистеиновом остатке не окисляется; и
(c) проведение реакции CysAb с соединением, представленным следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется ADC, где восстановленное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки, и CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки, где:
H
H
H
L
L
L
представляет собой сконструированное с цистеином антитело (CysAb) или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно связанные с цитотоксическим агентом через тиоловую группу, расположенную в сконструированном цистеиновом остатке; и где CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело против ADAM9 или его ADAM9-связывающий фрагмент, содержащие домен CDR1, домен CDR2, домен CDR3 и домен CDR1, домен CDR2 и домен CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26 и SEQ ID NO: 21, 22, 23, соответственно;
c
q равно 1 или 2;
1
D представлено следующей формулой:
Сар представляет собой кэпирующий агент.
178. Непрерывный способ получения конъюгата антитело-цитотоксический агент (ADC), представленного следующей формулой:
включающий этапы:
(a) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным сконструированным с цистеином антителом (cCysAb), представленным следующей формулой:
с образованием восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом кэпирующий агент (Сар) удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте;
(b) проведение реакции восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с селективным окислителем с образованием CysAb, где свободная тиоловая группа в сконструированном цистеиновом остатке не окисляется; и
(c) проведение реакции CysAb с соединением, представленным следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется ADC, где восстановленное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки, CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки, этапы (а)-(с) выполняются непрерывно, и
где:
H
H
H
L
L
L
представляет собой сконструированное с цистеином антитело (CysAb) или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно связанные с цитотоксическим агентом через тиоловую группу, расположенную в сконструированном цистеиновом остатке; и где CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело против ADAM9 или его ADAM9-связывающий фрагмент, содержащие домен CDR1, домен CDR2, домен CDR3 и домен CDR1, домен CDR2 и домен CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26 и SEQ ID NO: 21, 22, 23, соответственно;
c
q равно 1 или 2;
1
D представлено следующей формулой:
Сар представляет собой кэпирующий агент.
179. Непрерывный способ получения конъюгата антитело-цитотоксический агент (ADC), представленного следующей формулой:
включающий этапы:
(a) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным сконструированным с цистеином антителом (cCysAb), представленным следующей формулой:
с образованием восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом кэпирующий агент (Сар) удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте;
(b) проведение реакции восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с селективным окислителем с образованием CysAb, где свободная тиоловая группа в сконструированном цистеиновом остатке не окисляется;
(c) проведение реакции CysAb с соединением, представленным следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется ADC; и
(d) удаление неконъюгированного соединения формулы (I11);
где восстановленное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки, CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки, этапы (a)-(d) выполняются непрерывно, и
где:
H
H
H
L
L
L
представляет собой сконструированное с цистеином антитело (CysAb) или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно связанные с цитотоксическим агентом через тиоловую группу, расположенную в сконструированном цистеиновом остатке; и где CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело против ADAM9 или его ADAM9-связывающий фрагмент, содержащие домен CDR1, домен CDR2, домен CDR3 и домен CDR1, домен CDR2 и домен CDR3, имеющие последовательности SEQ ID NO: 24, 25 и 26 и SEQ ID NO: 21, 22, 23, соответственно;
c
q равно 1 или 2;
1
D представлено следующей формулой:
Сар представляет собой кэпирующий агент.
180. Способ по п. 179, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этап (е) замены конъюгата в стабильный буфер.
181. Способ по п. 180, отличающийся тем, что этап (е) выполняется непрерывно.
182. Способ по любому из пп. 179-181, отличающийся тем, что для удаления неконъюгированного соединения формулы (I) и/или замены ADC в стабильный буфер используют однопроходную тангенциальную поточную фильтрацию (SPTFF) и/или противоточную диафильтрацию.
183. Способ по любому из пп. 179-182, отличающийся тем, что для удаления неконъюгированного соединения формулы (I) на этапе (d) используют противоточную диафильтрацию.
184. Способ по любому из пп. 178-183, отличающийся тем, что на стадии (a) cCysAb и восстанавливающий агент непрерывно добавляют в химический реактор, в то время как реакционная смесь непрерывно отводится и подается через проточный реактор.
185. Способ по п. 184, отличающийся тем, что объемная скорость потока отвода реакционной смеси из химического реактора равна суммарной скорости потока восстанавливающего агента и cCysAb, добавляемых в химический реактор.
186. Способ по любому из пп. 178-185, отличающийся тем, что на этапе (b) восстановленное антитело и селективный окислитель непрерывно добавляют в химический реактор, в то время как реакционная смесь непрерывно отводится и подается через проточный реактор.
187. Способ по п. 186, отличающийся тем, что объемная скорость потока отвода реакционной смеси из химического реактора равна суммарной скорости потока восстановленного антитела и селективного окислителя, добавляемых в химический реактор.
188. Способ по любому из пп. 178-187, отличающийся тем, что на этапе (с) CysAb и соединение формулы (I11) непрерывно добавляют в химический реактор, а реакционная смесь непрерывно отводится из химического реактора и подается через проточный реактор.
189. Способ по п. 188, отличающийся тем, что объемная скорость потока отвода реакционной смеси из химического реактора равна суммарной скорости потока CysAb и соединения формулы (I11), добавляемых в химический реактор.
190. Способ по любому из пп. 182-189, отличающийся тем, что химический реактор представляет собой проточный реактор с непрерывным перемешиванием (CSTR).
191. Способ по любому из пп. 182-190, отличающийся тем, что проточный реактор представляет собой реактор с пульсирующим потоком (PFR).
H
L
192. Способ по любому из пп. 177-191, отличающийся тем, что гуманизированное антитело против ADAM9 или его АВАМ9-связывающий фрагмент содержит вариабельный домен тяжелой цепи (V) и вариабельный домен легкой цепи (V), имеющие последовательности SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28, соответственно.
193. Способ по любому из пп. 177-191, отличающийся тем, что гуманизированное антитело против ADAM9 содержит тяжелую цепь и легкую цепь, имеющие последовательности SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, соответственно.
194. Способ по любому из пп. 177-193, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой DPPA.
195. Способ по п. 194, отличающийся тем, что на этапе (а) используют от 10 до 20 молярных эквивалентов DPPA для каждого эквивалента cCysAb.
196. Способ по п. 194, отличающийся тем, что на этапе (а) используют от 15 до 17 молярных эквивалентов DPPA на каждый эквивалент cCysAb.
197. Способ по п. 194, отличающийся тем, что на этапе (а) используют 16 молярных эквивалентов DPPA на каждый эквивалент cCysAb.
198. Способ по любому из пп. 177-197, отличающийся тем, что реакцию на этапе (а) проводят при рН от 6,0 до 7,0 или при рН от 6,3 до 6,7.
199. Способ по п. 198, отличающийся тем, что реакцию на этапе (а) проводят при рН 6,5.
200. Способ по любому из пп. 177-199, отличающийся тем, что окислитель представляет собой DHAA.
201. Способ по п. 200, отличающийся тем, что на этапе (b) используют от 20 до 30 молярных эквивалентов DHAA на каждый эквивалент cCysAb.
202. Способ по п. 200, отличающийся тем, что на этапе (b) используют от 23 до 25 молярных эквивалентов DHAA на каждый эквивалент cCysAb.
203. Способ по п. 200, отличающийся тем, что на этапе (b) используют 24 молярных эквивалента DHAA на каждый эквивалент cCysAb.
204. Способ по любому из пп. 177-203, отличающийся тем, что реакцию на этапе (b) проводят при рН от 6,0 до 7,0 или при рН от 6,3 до 6,7.
205. Способ по п. 204, отличающийся тем, что реакцию на этапе (b) проводят при рН 6,5.
206. Способ по любому из пп. 177-205, отличающийся тем, что реакцию на этапе (с) проводят при рН от 6,0 до 7,0 или при рН от 6,3 до 6,7.
207. Способ по п. 206, отличающийся тем, что реакцию на этапе (с) проводят при рН 6,5.
208. Способ по любому из пп. 177-207, отличающийся тем, что на этапе (с) используют от 2 до 10 молярных эквивалентов соединения формулы (I11) на каждый эквивалент CysAb.
209. Способ по п. 208, отличающийся тем, что используют 4,6 молярных эквивалента соединения формулы (I11) на каждый эквивалент CysAb.
210. Способ по любому из пп. 177-209, отличающийся тем, что Сар представляет собой цистеин, глутатион или их комбинацию.
c
211. Способ по любому из пп. 177-210, где q равно 2.
212. Способ получения конъюгата антитело-цитотоксический агент (ADC), представленного следующей формулой:
включающий этапы:
(а) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным сконструированным с цистеином антителом (cCysAb), представленным следующей формулой:
с образованием восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом кэпирующий агент удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте;
(b) проведение реакции восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с селективным окислителем с образованием CysAb, где свободная тиоловая группа в сконструированном цистеиновом остатке не окисляется; и
(c) проведение реакции CysAb с соединением, представленным следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется ADC, где восстановленное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки, и CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки, где:
3
+
двойная линия  между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда это двойная связь, X отсутствует и Y представляет собой -Н, а когда это одинарная связь, X представляет собой -Н, a Y представляет собой -SOM, и М представляет собой Н или катион;
представляет собой сконструированное с цистеином антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно связанные с цитотоксическим агентом через тиольную группу, расположенную в сконструированном цистеиновом остатке; где сконструированное с цистеином антитело представляет собой антитело против CD123 или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:
H
H
H
a) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6; и
L
L
L
c
b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; q равно 1 или 2;
Сар представляет собой кэпирующий агент.
213. Непрерывный способ получения конъюгата антитело-цитотоксический агент (ADC), представленного следующей формулой:
включающий этапы:
(a) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным сконструированным с цистеином антителом (cCysAb), представленным следующей формулой:
с образованием восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом кэпирующий агент удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте;
(b) проведение реакции восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с селективным окислителем с образованием CysAb, где свободная тиоловая группа в сконструированном цистеиновом остатке не окисляется; и
(c) проведение реакции CysAb с соединением, представленным следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется ADC, где восстановленное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки, и CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки, и этапы (а)-(с) выполняются непрерывно,
где:
3
+
двойная линия  между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда это двойная связь, X отсутствует и Y представляет собой -Н, а когда это одинарная связь, X представляет собой -Н, a Y представляет собой -SOM, и М представляет собой Н или катион;
представляет собой сконструированное с цистеином антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно связанные с цитотоксическим агентом через тиольную группу, расположенную в сконструированном цистеиновом остатке; где сконструированное с цистеином антитело представляет собой антитело против CD123 или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:
H
H
H
a) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6; и
L
L
L
c
b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; q равно 1 или 2;
Сар представляет собой кэпирующий агент.
214. Непрерывный способ получения конъюгата антитело-цитотоксический агент (ADC), представленного следующей формулой:
включающий этапы:
(а) проведение реакции восстанавливающего агента с кэпированным сконструированным с цистеином антителом (cCysAb), представленным следующей формулой:
с образованием восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, при этом кэпирующий агент удаляется с образованием свободной тиоловой (-SH) группы в восстановленном антителе или его антигенсвязывающем фрагменте;
(b) проведение реакции восстановленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с селективным окислителем с образованием CysAb, где свободная тиоловая группа в сконструированном цистеиновом остатке не окисляется; и
(c) проведение реакции CysAb с соединением, представленным следующей формулой:
или его фармацевтически приемлемой солью, в результате чего образуется ADC; и
(d) удаление неконъюгированного соединения формулы (I1a), где восстановленное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (а), используют на этапе (b) без очистки, и CysAb или его антигенсвязывающий фрагмент, полученные на этапе (b), используют на этапе (с) без очистки; и этапы (a)-(d) выполняются непрерывно,
где:
3
+
двойная линия  между N и С представляет собой одинарную связь или двойную связь, при условии, что когда это двойная связь, X отсутствует и Y представляет собой -Н, а когда это одинарная связь, X представляет собой -Н, a Y представляет собой -SOM, и М представляет собой Н или катион;
представляет собой сконструированное с цистеином антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, ковалентно связанные с цитотоксическим агентом через тиольную группу, расположенную в сконструированном цистеиновом остатке; где сконструированное с цистеином антитело представляет собой антитело против CD123 или антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:
H
H
H
а) вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6; и
L
L
L
c
b) вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина, содержащую CDR1, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, CDR2, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, и CDR3, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3; q равно 1 или 2;
Сар представляет собой кэпирующий агент.
215. Способ по п. 214, отличающийся тем, что способ дополнительно включает этап (е) замены конъюгата в стабильный буфер.
216. Способ по п. 215, отличающийся тем, что этап (е) выполняется непрерывно.
217. Способ по любому из пп. 214-216, отличающийся тем, что для удаления неконъюгированного соединения формулы (I) и/или замены ADC в стабильный буфер используют однопроходную тангенциальную поточную фильтрацию (SPTFF) и/или противоточную диафильтрацию.
218. Способ по любому из пп. 214-216, отличающийся тем, что для удаления неконъюгированного соединения формулы (I) на этапе (d) используют противоточную диафильтрацию.
219. Способ по любому из пп. 213-218, отличающийся тем, что на стадии (a) cCysAb и восстанавливающий агент непрерывно добавляют в химический реактор, в то время как реакционная смесь непрерывно отводится и подается через проточный реактор.
220. Способ по п. 219, отличающийся тем, что объемная скорость потока отвода реакционной смеси из химического реактора равна суммарной скорости потока восстанавливающего агента и cCysAb, добавляемых в химический реактор.
221. Способ по любому из пп. 213-220, отличающийся тем, что на этапе (b) восстановленное антитело и селективный окислитель непрерывно добавляют в химический реактор, в то время как реакционная смесь непрерывно отводится и подается через проточный реактор.
222. Способ по п. 221, отличающийся тем, что объемная скорость потока отвода реакционной смеси из химического реактора равна суммарной скорости потока восстановленного антитела и селективного окислителя, добавляемых в химический реактор.
223. Способ по любому из пп. 213-222, отличающийся тем, что на этапе (с) CysAb и соединение формулы (I1a) непрерывно добавляют в химический реактор, а реакционная смесь непрерывно отводится из химического реактора и подается через проточный реактор.
224. Способ по п. 223, отличающийся тем, что объемная скорость потока отвода реакционной смеси из химического реактора равна суммарной скорости потока CysAb и соединения формулы (I1a), добавляемых в химический реактор.
225. Способ по любому из пп. 219-224, отличающийся тем, что химический реактор представляет собой проточный реактор с непрерывным перемешиванием (CSTR).
226. Способ по любому из пп. 219-225, отличающийся тем, что проточный реактор представляет собой реактор с пульсирующим потоком (PFR).
H
L
227. Способ по любому из пп. 212-214, отличающийся тем, что антитело против CD123 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность V SEQ ID NO: 7 и последовательность V SEQ ID NO: 9.
228. Способ по любому из пп. 212-214, где антитело против CD123 содержит:
a) тяжелую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 8; и
b) легкую цепь, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 10.
229. Способ по любому из пп. 212-228, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой DPPA или ТСЕР.
230. Способ по п. 229, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой ТСЕР.
231. Способ по любому из пп. 212-230, отличающийся тем, что реакцию на этапе (а) проводят при рН от 5,0 до 8,5, от 7,0 до 8,0 или от 7,5 до 7,7.
232. Способ по п. 231, отличающийся тем, что реакцию на этапе (а) проводят при рН 7,5.
233. Способ по любому из пп. 212-232, отличающийся тем, что окислитель представляет собой DHAA.
234. Способ по любому из пп. 212-233, отличающийся тем, что реакцию на этапе (b) проводят при рН от 5,0 до 8,5, от 7,0 до 8,0 или от 7,5 до 7,7.
235. Способ по п. 233, отличающийся тем, что реакцию на этапе (b) проводят при рН 7,5.
236. Способ по любому из пп. 212-235, отличающийся тем, что реакцию на этапе (с) проводят при рН от 5,0 до 8,5, от 5,5 до 6,5 или от 5,8 до 6,2.
237. Способ по п. 236, отличающийся тем, что реакцию на этапе (с) проводят при рН 6,0.
238. Способ по любому из пп. 212-237, отличающийся тем, что восстанавливающий агент представляет собой ТСЕР; реакцию на этапе (а) проводят при рН 7,5; окислитель представляет собой DHAA; реакцию на этапе (b) проводят при рН 7,5; и рН реакционной смеси после стадии (b) доводят от рН 7,5 до рН 6,0 перед проведением реакции CysAb с цитотоксическим агентом на этапе (с).
239. Способ по любому из пп. 212-238, отличающийся тем, что кэпирующий реагент представляет собой цистеин, гомоцистеин, глутатион или их комбинацию.