Сравнительное изучение полужидких питательных сред для выделения L-форм микобактерий

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ПОЛУЖИДКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ Ь-ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ

Е.В. Тарасова, В.Ю. Жабина

Аннотация. Проведенными исследованиями установлено, что элективная полужидкая питательная среда для выделения из патологического материала L-форм микобактерий, позволяет сократить сроки первичного роста и повысить выход биомассы L-форм микобактерий.

Ключевые слова: микобактерии, питательные среды, возбудители, химиопрепараты, патологоанатомический материал.

Диагностика является одним из основных звеньев как профилактических, так и оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных, в том числе крупного рогатого скота.

Основными методами первичной диагностики туберкулеза животных в настоящее время являются аллергический, патологоанатомический и бактериологический, результаты, которых предопределяют окончательный эпизоотический статус исследуемого поголовья животных, а также в целом фермы или хозяйства.

Вместе с тем, выделение микобактерий туберкулеза из патологического материала связано с определенными трудностями в силу генетических и фенотипических особенностей возбудителя. Основные из них — медленный рост на искусственных питательных средах и способность к L-трансформации и длительной перси-стенции возбудителя в измененной (Ь-) форме. L-трансформация микобактерий может происходить под воздействием самых различных факторов внешней среды, применяемых химиопрепаратов, защитных реакций организма [5,6,7]. При этом микробная клетка частично или полностью утрачивает свою клеточную стенку. Изменение морфологии микобактерии и понижение метаболизма предполагают и особые требования к условиям культивирования их L-форм, так как они либо вообще не растут на обычных питательных средах, применяемых при лабораторной диагностике туберкулёза, либо растут лишь отдельные культуры. Необходимы щадящие методы обработки биоматериала и элективные питательные среды, в которых обязательно присутствуют нативные белки и вещества, стабилизирующие осмотические свойства среды [5,6]. В настоящее время в ветеринарной и медицинской практике для выделения L-форм микобактерии из исследуемого материала используют полужидкую питательную среду Школьниковой в модификации Дорожковой [2,4].

Актуальность усовершенствования существующих питательных сред для изоляции, экспериментального получения и длительного культивирования L-форм патогенных микобактерии, а также отсутствие необходимых научных сведений о распространенности явления L-трансформации у патогенных и атипичных микобакте-рии, обнаруживаемых в патологоанатомическом материале, и предопределили направленность нашей работы.

Цель исследований явилось создание среды для выделения из патологического материала L-культуры ми-кобактерий, которая позволяет сократить сроки роста и повысить выход биомассы L-форм микобактерий.

Для выполнения поставленной цели било отобрано 75 проб патологического материала от крупного рогатого скота реагировавшего на туберкулин для млекопитающих (подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные лимфатические узлы.

Предпосевную обработку патологоанатомического материала, проводили по методу А.П. Аликаевой с

применением 2% раствора серной кислоты и последующей фильтрации гомогената через целлюлозные мембраны (0,45 мкм) фирмы "МШрог", а фильтрат высевали на глубину 0,3±0,05 см. среды Дорожковой И.Р. (контроль) и испытуемую питательную среду для выделения L-форм микобактерий следующего состава, г/л: калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5; сернокислый магний - 0,5; натрий фосфорнокислый - 2,5; железо лимоннокислое - 0,05; гликокол - 1; глицерин -40; агар - агар - 3; дистиллированная вода мл до 1000. В качестве стимулятора роста добавляли - стерильный картофельный отвар 9 - 12% и сыворотку крупного рогатого скота 10 - 20%. Среду разливали в пробирки по 6 мл, проверяли на стерильность на протяжении двух суток при температуре 37±0,5°С.

Полученные культуры в L-форме микобактерий пассажировали на питательной среде для выявления L-форм микобактерий и параллельно на среде Левен-штейна - Инсена.

Микроскопию мазкой в бактериальной форме окрашенных по методу Циль - Нильсена исследовали в световой микроскопии, а культуры в L-форме в фазовой - контрастной микроскопии.

Результаты проведенных исследований среды для выделения L-форм микобактерий из патологического материала, которая позволит сократить сроки роста и повысить выход биомассы L-форм микобактерий представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты сравнительного изучения элективных полужидких сред для выделения L-форм

Анализируя материалы, представленные в таблице 1 на питательной среде для выделения L-формы микобактерий, отмечали на 9±1,8, тогда как на среде И.Р. До-рожковой (контроле) на 20±0,3 выделенных из проб патологического материла без характерных изменений для туберкулеза. Из проб патологоанатомического материала в которых не было обнаружено изменений характерных для туберкулеза первичный рост на питательной среде для выделения L-формы микобактерий 6±0,5, а на среде И.Р. Дорожковой 16±0,3 сутки соответственно.

Рост отмечали в глубине посева в виде облакопо-добных помутнений в толще среды. При сравнении количества выделенных культур на питательной среде для выделения L-формы микобактерий рост отмечали 90,5%, а в контроле на среде И.Р. Дорожковой только в 41,3% посевов.

При проведение фазово-контрастной микроскопии (20^40), в поле зрения наблюдали микроструктурные элементы разной оптической плотности в виде сферических тел разного размера и оптической плотности в виде аморфной массы и другими морфологическими формами.

микобактерий

Патологический материал от КРС Количество проб Питательная среда для выделения Ь-форм микобактерий Рост на среде Дорожковой И.Р.

Выделено в сутках Кол-во культур Выделено в сутках Кол-во культур

Количество проб с пат. изменениями 22 6±0,5 22 16±0,3 19

Количество проб без пат. изменениями 53 9±1,8 48 20±0,3 12

Таблица 2 - Результаты изучения реверсирующих свойств выделенных L-форм микобактерий путем пассажи-рования___

Исследуемый Количество культуры В том числе на пассаже

материал в L-форме 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

С пат. изменениями 41 10 14 11 6 - - - - - -

Без пат. изменениями 60 22 14 8 6 2 1 3 2 2 -

Все выделенные 101 культура в L-форме микобактерий подвергались пассажированию на питательной среде для выделения L-формы микобактерий. Результаты пассажирования представлены в таблице 2.

Из результатов, представленных в таблице 2, L-варианты 41, которые были выделены из патологоана-томического материала и с характерными для туберкулеза изменений, пассажировались до 4 пассажа.

Тогда как культуры L-формы микобактерий выделенные из проб без характерных туберкулезных изменений, являлись более стабильными и пассажировались до 9 пассажа.

При пассажирование в 10 пассаже на среде полужидкой рост в виде облокоподобных не отмечали, а на плотной среде первичный рост был выявлен на 18±0,2 сутки, виде единичных колоний в виде просяного зерна, гладкие с ровными краями. При микроскопии мазков, окрашенных по методу Циля-Нильсенва в поле зрения микроскопа отмечали короткие, толстые красного цвета палочки.

Выводы:

1. Предлагаемая элективная полужидкая питательная среда для выделения L-форм микобактерий позволяет сократить сроки первичного роста L-форм микобактерий в 2-3 раза.

2. Повысить интенсивность накопления биомассы в 2 раза, необходимой для дальнейшего изучения особенностей вызываемого ими инфекционного процесса.

Список использованных источников

1 Аликаева А.П. Туберкулез. Лабораторные методы исследования в ветеринарии. - М.: Сельхозгиз, 1964. - Т. 3. -С. 25-27.

2 Галатова Л.В., Гертман М.И., Нетров А.А. Свойства L-форм микобактерий // Ветеринария. - 1990. - № 2. - С. 32-33.

3 Гертман М.И., Галатова Л.В., Петров А.А. Выделение L-форм микобактерий из молока коров // Ветеринария. — 1990. — № 6. — С. 30-31.

4 Дорожкова Н.Р. ДГС как фактор индукции L-форм микобактерий туберкулеза // Антибиотики. - 1972. - № 10. - С. 915-922.

5 Выделение L-форм микобактерий из патологического материала больных туберкулезом / З.Н. Кочемасова, А.В. Кудрявцев, М.Н. Дыхно и др. // Проблемы туберкулеза. - 1970. - № 12. - С. 63-65.

6 L - трансформация микобактерий / В.С. Федосеев, И.Н. Рубцова, Н.Г. Кириленко и др. // Ветеринария. - 1985. - №12.

7 Туберкулёз сельскохозяйственных животных / В.П. Шишков, В.П. Урбана, А.М. Колычев. - М.: Агропромиздат, 1991. - 255 с.

8 Щеткин А.А. Реверсия L-форм микобактерий туберкулеза бычьего вида // Научн.-техн. бюл. Всерос. Академии сельского хозяйства им. Ленина, Сиб. Отд-ние. -1985. - Вып. 30. - С. 37-39.

Информация об авторах

Тарасова Елена Владимировна, кандидат ветеринарных наук, старший преподаватель кафедры инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВО «Белгородский ГАУ им. В.Я. Горина», тел. +7951-768-14-36.

Жабина Виктория Юрьевна, ассистент кафедры инфекционной и инвазионной патологии ФГБОУ ВО «Белгородский ГАУ им. В.Я. Горина», тел. +7920-566-55-05.