ПРОИЗВОДНЫЕ 4-АМИНО-3-АРИЛАМИНО-6-АРИЛПИРАЗОЛО[3,4-d]ПИРИМИДИНА, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СРЕДСТВ
4-AMINO-3-ARYLAMINO-6-ARYLPYRAZOLO[3,4-d]PYRIMIDINE DERIVATIVES, METHODS FOR PREPARING AND APPLYING THEM AS ANTIVIRAL AGENTS

Уровень техники изобретения
Настоящее изобретение относится к производным 4-амино-3-ариламино-6-арилпиразоло[3,4-d]-пиримидина, способам их получения и их применению в качестве противовирусных средств, предпочтительно для лечения пикорнавирусных инфекций.
Пикорнавирусы, в частности энтеровирусы и риновирусы, ответственны за широкий спектр заболеваний человека. К энтеровирусам относятся более 60 различных патогенных для человека серотипов (Melnick J в: Fields В et al., editors. Virology. Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers; 1996, 655-712). Инфекции энтеровируса, ECHO-вируса, вируса коксаки группы А и группы В часто характеризуются неспецифическим жаром и вызывают заболевания верхних дыхательных путей, которые часто невозможно отличить от риновирусных инфекций. Более серьезные клинические картины, которые также могут иметь эпидемический характер, включают геморрагический конъюнктивит, герпангину, вирусную пузырчатку полости рта и конечностей, асептический менингит, энцефалит и острый миокардит. Проблема в данном случае состоит в том, что различные типы вирусов могут приводить к проявлению одинаковых симптомов или один тип вируса может служить причиной совершенно разных клинических картин. Благодаря введению современных и чувствительных методов вирусной диагностики, устойчивые РНК энтеровирусов и белки вирусов можно идентифицировать в связи с хроническими заболеваниями, такими как диабет II типа, полимиозит и большинство всех хронических миокардитов. Хронические энтеровирусные инфекции также наблюдаются у пациентов с агаммаглобулинемией и проявляются в данном случае в виде хронического энтеровирусного менингоэнцефалита. В качестве дополнительных симптомов часто наблюдаются дерматомиозит или полимиозит.
rd
Риновирусы включают около 100 серотипов. Риновирусные инфекции вызывают более половины всех респираторных заболеваний верхних дыхательных путей человека (Couch RB в: Fields ВМ et al., editors: Fields Virology, 3 edition. Lippincott-Raven, Philadelphia, 1996, 713-35). При среднем периоде болезни около 10 дней, указанные простудные заболевания, которые в основном принимают безобидный характер, служат причиной исчисляющихся миллионами посещений врачей и потерь рабочих и учебных часов. Возможными возникающими осложнениями являются отит среднего уха, синусит, обострение астмы и кистозный фиброз, а также инфекционные заболевания нижних дыхательных путей, главным образом у маленьких детей, пожилых пациентов и пациентов с ослабленным иммунитетом. Из-за огромного разнообразия существующих типов, профилактика путем вакцинации в настоящее время невозможна. Вследствие связанных с указанными заболеваниями потерь рабочего времени, визитов к врачам и приобретения лекарств, рино- и энтеровирусы ежегодно служат причиной огромных затрат. Данные вирусные инфекции до настоящего времени подвергались симптоматическому лечению, поскольку не существует специфичной к вирусам терапии (Rotbart НА: Antiviral Res 2002, 53(2), 83-98). Кроме того, часто без необходимости прописываются антибиотики. В силу вышесказанного, необходима разработка новых вирусостатиков.
Результаты интенсивного поиска возможных методов лечения энтеровирусных и риновирусных инфекций обобщил Rotbart в 2002 году в обзорной статье (Rotbart НА: Antiviral Res 2002, 53(2), 83-98). Например, рибавирин ингибирует фермент клетки хозяина, инозин 5'-монофосфат (IМР)-дегидрогеназу. Путем деактивации данного ключевого для синтеза пуриновых нуклеотидов фермента можно ингибировать репликацию пикорнавирусов in vitro и in vivo. Кроме того, рибавирин непосредственно встраивается в геном полиовирусов и таким образом дополнительно выступает в качестве мутагена для РНК вирусов (Crotty S et al.: Nat Med, 2000, 6(12),1375-9). Вследствие серьезных побочных эффектов, указанные соединения не применяются для лечения инфекционных заболеваний, вызванных рино- и энтеровирусами.
Специфическими мишенями для ингибирования синтеза вирусной РНК являются сам геном, вирусная РНК-зависимая РНК полимераза и другие вирусные белки, необходимые для репликативного комплекса. В течение долгого времени, гуанидины, тиосемикарбазоны, бензимидазолы, дипиридамолы и флавоны были известны в качестве ингибиторов полимераз различных пикорнавирусов в культуре клеток. Таким образом достигались переменные успехи in vivo. Производные энвироксима рассматриваются как наиболее перспективный кандидат с широкой противоэнтеровирусной и противориновирусной активностью. Энвироксим блокирует синтез плюс-нить РНК путем связывания с вирусным протеином 3А, который необходим для образования РНК интермедиатов при воспроизведении вируса (Heinz ВА and Vance LM: J Virol, 1995, 69(7), 4189-97). В клинических исследованиях наблюдались средние терапевтические эффекты или их полное отсутствие, плохая фармакокинетика и нежелательные побочные эффекты (Miller FD et al.: Antimicrob Agents Chemother, 1985, 27(1), 102-6). До настоящего времени не существует клинических данных более новых производных с лучшими показателями биодоступности и переносимости.
Протеазный ингибитор AG 7088 был разработан на основе сведений о тонкой структуре и функции вирусной протеазы 2С. В культуре клеток в наномолярном диапазоне концентраций, AG 7088 эффективен против 48 типов риновируса и вируса коксаки группы А21 и группы В3, энтеровируса 70 и ЕСНО-вируса 11 (Pattick АК et al.: Antimicrobila Agents Chemother, 1999, 43(10), 2444-50). Окончательные данные клинических исследований до сих пор неизвестны.
Благодаря выяснению молекулярной структуры вирусных капсид, были получены предпосылки для целенаправленной разработки блокаторов капсид, "WIN веществ" (Diana GD: Curr Med Chem 2003, 2, 1-12). Они ингибируют адсорбцию и/или "раздевание" рино- и энтеровирусов. Некоторые из WIN веществ проявляют высокоспецифичное действие только против отдельных родов или вирусных типов пикорнавирусов. Другие производные ингибируют репликацию как рино-, так и энтеровирусов. К WIN веществам принадлежат, например, арилдон, дизоксарил и пиродавир. Указанные соединения проявляют очень хорошее противовирусное действие в культуре клеток. Плохая растворимость (арилдон), низкая биодоступность (арилдон и дизоксарил), быстрое разрушение в процессе обмена веществ и выведение из организма (дизоксарил и WIN 54954), а также побочные эффекты, такие как кожная сыпь (WIN 54954), сделали клиническое применение невозможным. Большие надежды возлагались на плеконарил, другой ингибитор капсид. Плеконарил имеет очень хорошую биодоступность при пероральном введении и, после связывания с гидрофобным "карманом" вирусной капсиды, ингибирует проникновение рино-, ECHO- и коксаки-вирусов (Pevear DC et al.: Antimicrob Agents Chemother 1999, 43(9), 2109-15; McKinlay MA et al.: Annu Rev Microbiol 1992, 46, 635-54). Поэтому он потенциально эффективен против широкого спектра вирусных заболеваний, от обычной простуды до вирусного менингита или миокардита. Наблюдалась резистентность к риновирусам, энтеровирусу 71 и вирусу коксаки группы В3 (Ledford RM et al.: J Virol 2004, 78(7), 3663-74; Groarke JM et al.: J Infect Dis 1999, 179(6), 1538-41). Клинические исследования детей и взрослых с энтеровирусным менингитом (Abzug MJ et al.: Pediatr Infect Dis J, 2003, 22, 335-41) и респираторными инфекциями, вызванными риновирусом (Hayden FG et al.: Antivir Ther, 2002, 7, 53-65; Hayden FG et al.: Clin Infect Dis, 2003, 36, 1523-32) продвигались в позитивном направлении. Однако, подтвержденный терапевтический эффект был недостаточным для регистрации плеконарила (Picovir, Viropharma, USA) в качестве средства для лечения риновирусных инфекций в США. В марте 2002 года соответствующая заявка была отклонена Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) из-за слишком низкого успеха терапии при одновременно наблюдающихся побочных эффектах.
Пиразолопиримидины также были описаны в качестве CRF антагонистов (например, ЕР 674642 и ЕР 691128), которые, например, ингибируют аденозин киназу (ЕР 496617 или US 4,904,666), ксантин оксигеназу (J. Heterocyc. Chem. 19,1565,1982) или другие ферментные системы (US 2,965,643 и US 3,600,389).
Таким образом, разработка высокоэффективных вирусостатиков для лечения рино- и энтеровирусных заболеваний продолжает оставаться важной задачей противовирусных исследований. Новые соединения должны быть хорошо переносимыми и способными преодолевать существующие виды устойчивости, например, к плеконарилу.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является разработка новых соединений, которые могут применяться в качестве противовирусных средств в отношении энтеровирусов и риновирусов и лишены недостатков, присущих существующему уровню техники, в частности проблем с устойчивостью и непереносимостью в отношении соответствующих лекарственных средств, а также описание получения и применения указанных соединений.
По настоящему изобретению, указанная задача решена с помощью особым образом замещенных производных 4-амино-3-ариламино-6-арилпиразоло[3,4-d]пиримидина общей формулы I, включая их фармацевтически приемлемые соли,
где
1
- группы А и В представляют собой, независимо друг от друга, фенил, нафтил, пиридил, хинолил, пиразинил, пиримидил, пиразолил, триазинил, имидазолил, фуранил, тиенил, и в каждой из упомянутых групп, независимо друг от друга, от одного до трех атомов водорода могут быть замещены радикалом R, определенным далее,
1
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
- радикалом R могут быть NO, CN, CONR , COOR, СНО, CONH, галоген, насыщенный или ненасыщенный, линейный или разветвленный алифатический радикал с числом атомов в цепи от 1 до 7, насьпценный или ненасыщенный, линейный или разветвленный алканол с числом атомов в цепи от 1 до 8, OR, SR, NR , SONR , ди- или трифторметил, фенил,
2
3
4
5
- радикалы R, R, R, R представляют собой, независимо друг от друга, Н, насыщенный или ненасыщенный, галогенированный или негалогенированный, линейный или разветвленный алифатический радикал с числом атомов в цепи от 1 до 7, бензил, фенил или нафтил, насыщенный или ненасыщенный, моно- или полигетероцикл с гетероатомами N, S, О, и каждая из только что перечисленных групп независимо может быть замещена фтором, хлором, бромом, трифторметилом, алкилом, алкокси-группой, циано-группой, нитро-группой, амино-группой, аминоалкилом, группой C(O)-алкил, группой C(O)O-алкил, бензилом, фенилом или нафтилом.
Зависимые пункты формулы изобретения разъясняют преимущественные варианты осуществления особым образом замещенных производных 4-амино-3-ариламино-6-арилпиразоло[3,4-d]-пиримидина и способы их получения и возможные пути их применения, не ограничивая ими настоящее изобретение.
В предпочтительно варианте осуществления, настоящее изобретение относится к соединениям общей формулы (I), выбранным из группы 6-фениламинопиразоло[3,4-d]пиримидинов, включающей:
1
4-амино-6-фенил-3-(три-R)фениламинопиразоло[3,4-d]пиримидин,
1
4-aминo-6-(тpи-R)фeнил-3-фeнилaминoпиpaзoлo[3,4-d]пиpимидин,
1
1-алкил-4-амино-6-фенил-3-(три-R)фениламинопиразоло[3,4-d]пиримидин,
1
4-амино-1,6-ди(тpи-R)фeнил-3-фeнилaминoпиpaзoлo[3,4-d]пиpимидин,
1
4-aминo-6-фeнил-3-(тpи-R)фeнилaлкилaминoпиpaзoлo[3,4-d]пиpимидин,
1
1-алкил-4-амино-6-фенил-3-(три-R)фенилалкиламинопиразоло[3,4-d]пиримидин.
Является предпочтительным, если настоящее изобретение также включает 6-фениламинопиразоло[3,4,d]пиримидины общей формулы (I), включая:
4-амино-3-(3-фторфенил)амино-6-фенилпиразоло[3,4-d]пиримидин,
4-амино-3-(3-фторфенил)амино-6-(4-хлорфенил)пиразоло[3,4-d]пиримидин,
4-aминo-3-(3-xлop)aминo-6-фeнилпиpaзoлo[3,4-d]пиpимидин,
4-амино-3-(3-метокси)амино-6-фенилпиразоло[3,4-d]пиримидин,
4-aминo-3-(4-фтopфeнил)aминo-6-фeнилпиpaзoлo[3,4-d]пиpимидин,
4-амино-3-(4-фторфенил)амино-6-(4-хлорфенил)пиразоло[3,4-d]пиримидин,
4-aминo-3-(4-xлopфeнил)aминo-6-фeнилпиpaзoлo[3,4-d]пиpимидин,
4-амино-3-(3-фторфенил)амино-1-метил-6-фенилпиразоло[3,4,d]пиримидин,
4-амино-1-бензил-3-(3-фторфенил)амино-6-фенилпиразоло[3,4,d]пиримидин.
Неожиданно, соединения по данному изобретению демонстрируют сильную противовирусную активность в отношении пикорнавирусов, в частности в отношении энтеро- и риновирусов, в нано- или микромолярном диапазоне концентраций.
Поэтому изобретенные фармацевтические препараты, содержащие соединение формулы (I), особенно подходят для лечения у людей и животных респираторных инфекций, асептического менингита, энцефалита, герпангины и т.д., которые могут быть вызваны пикорнавирусами, в частности энтеро- и риновирусами.
Далее приведено подробное объяснение изобретения посредством способов синтеза, отдельных производных 4-амино-3-ариламино-6-арилпиразоло[3,4-d]пиримидина общей формулы (I), а также их полезного эффекта и применения против пикорнавирусных инфекций.
На Фиг. 1 показана общая схема синтеза изобретенного пиразоло[3,4-d]пиримидина 1, и на первой стадии она включает конденсацию [бис(метилтио)метилен]малононитрила 2 с ариламинами 3 в спирте с получением арильных производных 4. Каждый из последних можно выделить и очистить для проведения дальнейших реакций или использовать непосредственно в последующих реакциях без очистки (однореакторный синтез). Следующая стадия - это взаимодействие арильного производного 4 с гидразином или производными гидразина. Реакция идет при кипячении в течение 1-4 часов и дает пиразол 5 с высоким выходом. Решающей стадией синтеза пиразоло[3,4-d]пиримидина 1 является конденсация пиразола 5 с ариламидинами 6 в присутствии уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты или ацетата натрия.
Альтернатавным методом синтеза является протекающая в одном реакционном сосуде реакция малононитрила с арилизотиоцианатами в присутствии гидрида натрия и последующая обработка реакционной смеси метилиодидом или диметилсульфатом. В описанном процессе образуются большие количества енаминов. В данном случае конденсация пиразола 5 с ариламидинами 6 в присутствии кислоты, такой как уксусная кислота, трифторуксусная кислота, или их солей (ацетатов) также является решающей стадией получения пиразоло[3,4-d]пиримидина 1.
В последующих примерах перечислены отдельные соединения общей формулы (I), которые предпочтительно применяют против пикорнавирусных инфекций (не ограничивая ими настоящее изобретение), и изобретенные соединения можно получать в виде раствора или суспензии в фармацевтически приемлемой водной, органической или водно-органической среде для местного или парентреального введения путем внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекции или для интраназального введения, или их вводят в состав таблетки, капсулы или водных суппозиториев.
Представленные соединения формулы (I) могут использоваться в дозировках от 0,1 до 1000 мг/кг веса тела.
1. Получение и анализ производных 4-амино-3-ариламино-6-арилпиразоло[3,4-d]пиримидина
Структура изобретенных соединений была установлена посредством синтеза, элементного анализа, ЯМР спектроскопии и масс-спектроскопии.
Исходные вещества
5-Амино-4-циано-3-ариламинопиразолы были синтезированы согласно методике, показанной на Фиг.1, и описанию, приведенному Tominaga Y et al. (J. Heterocycl. Chem., 1990, 27, 775-779). Согласно предшествующему уровню техники, ариламидины были синтезированы из соответствующих соединений, являющихся источником циана (Boere, RT et al.: J. Organomet. Chem., 1987, 331, 161-167; Garigipati RS: Tetrahedron Lett., 1990, 31, 1969-1978; Dann О et al.: Justus Liebigs Ann. Chem., 1982, 1836-1839).
Пример 1
4-амино-3-фениламино-6-фенилпиразоло[3,4-d]пиримидин
3,0 г (17,24 ммоль) гидрата бензамидин гидрохлорида и 2,2 г (23,0 ммоль) ацетата натрия добавляют к 2,3 г (11,5 ммоль) 5-амино-4-циано-3-фениламинопиразола при перемешивании. Реакционную смесь нагревают при 220°C в течение 30 мин. Полученный материал обрабатывают 50 мл воды, фильтруют и промывают 20 мл холодного метанола и 20 мл холодного эфира. Продукт очищают кристаллизацией из смеси ДМФА/вода.
f
Светло-желтое твердое кристаллическое вещество. Выход 57%. Т.пл. 253-5°C. R (хлороформ - метанол; 10/1) - 0,8 (силикагель 60).
+
МС m/z 302 (М).
1
6
2
Н ЯМР (ДМСО-d) δ 12,38 (1H, с, NH(9)), 8,32-8,36 (2Н, кв, СН(18), СН(19)), 8,23 (1Н, ушир. с, NH(7)), 7,67 (2Н, д, СН(2), СН(6)), 7,48 (2Н, ушир. с, NH), 7,42 (3Н, м, СН(20), СН(21), СН(22)), 7,12 (2Н, д, СН(3), СН(5)) и 6,98 (1H, м, СН(4)) м.д.
13
6
С ЯМР (ДМСО-d) δ 161,0 (С(11)), 156,2 (С(12)), 153,0 (С(10)), 144,2 (С(8)), 138,3 (С(17)), 136,0 (С(1)), 130,3 (С(4)), 129,8 (С(22)), 128,8 (С(3), С(5)), 128,0 и 127,7 (С(18), С(19)), 120,4 (С(4)), 120,2 (С(2), С(6)), 88,7 (С(13)) м.д.
17
14
6
Вычислено для CHN: С, 67,54; Н, 4,67; N, 27,80
Найдено: С, 67,61; Н, 4,82; N, 27,79
Пример 2
4-Амино-3-(3-фторфенил)амино-6-фенилпиразоло[3,4-d]пиримидин
Получение осуществлялось способом, описанным в примере 1.
f
+
Светло-желтое твердое кристаллическое вещество. Выход 46%. Т.пл. 267-9°C. R (хлороформ - метанол; 10/1) - 0,85 (силикагель 60). МС m/z 320 (М).
1
6
2
Н ЯМР (ДМСО-d) δ 12,61 (1H, с, NH(9)), 8,35-8,38 (2Н, кв, СН(18), СН(19)), 8,64 (1H, ушир. с, NH(7)), 7,46 (2Н, ушир. с, NH), 7,3-7,52 (6Н, м, СН(2), СН(4), СН(6), СН(20), СН(21), СН(22)), 6,60 (1H, т, СН(5)) м.д.
13
6
С ЯМР (ДМСО-d) δ 166,2 и 161,2 (С(3)), 162,2 (С(11)), 161,8 (С(10)), 156,1 (С(12)), 144,3 (С(1)), 143,4 (С(8)), 130,0 (С(17)), 129,8 (С(5)), 128,5 (С(22)), 127,0 (С(18), С(19)), 112,5 (С(6)), 105,5 и 105,8 (С(2)), 102,6 и 103,9 (С(4)), 89,39 (С(13)) м.д.
17
14
6
Вычислено для СНFN: С, 63,74; Н, 4,09; N, 26,24
Найдено: С, 63,60; Н, 4,02; N, 27,99
Пример 3
4-Амино-3-(3-метилфенил)амино-6-фенилпиразоло[3,4-d]пиримидин
Получение осуществлялось способом, описанным в Примере 1.
f
+
Почти белое, твердое кристаллическое вещество. Выход 73%. Т.пл. 246-8°C. R (хлороформ - метанол; 10/1) - 0,90 (силикагель 60). MC m/z 316 (M).
1
6
2
3
Н ЯМР (ДМСО-d) δ 12,38 (1H, с, NH(9)), 8,32-8,36 (2Н, кв, СН(18), СН(19)), 8,23 (1Н, ушир. с, NH(7)), 7,42-7,67 (6Н, м, NH, СН(6), СН(20), СН(21), СН(22)), 7,21-7,29 (2Н, м, СН(2), СН(5)) и 6,42 (1H, д, СН(4)), 2,17 (3Н, с, СН) м.д.
18
16
6
Вычислено для CHN: С, 68,34; Н, 5,10; N, 26,56
Найдено: С, 68,43; Н, 5,16; N, 26,71
Пример 4
4-Амино-3-(4-метилфенил)амино-6-фенилпиразоло[3,4-d]пиримидин
Получение осуществлялось способом, описанным в Примере 1.
Физико-химические параметры следующие:
почти белое, твердое кристаллическое вещество. Выход 43%. Т.пл. 266-8°C.
f
+
R (хлороформ - метанол; 10/1) - 0,85 (силикагель 60). MC m/z 316 (M).
1
6
2
3
Н ЯМР (ДМСО-d) δ 12,38 (1H, с, NH(9)), 8,33-8,38 (2Н, кв, СН(18), СН(19)), 8,15 (1H, ушир. с, NH(7)), 7,60 (2Н, д, СН(2), СН(6)), 7,48 (2Н, ушир. с, NH), 7,42 (3Н, м, СН(20), СН(21), СН(22)), 6,84 (2Н, д, СН(3), СН(5)) и 2,34 (3Н, с, СН) м.д.
13
6
3
С ЯМР (ДМСО-d) δ 161,0 (С(11)), 156,2 (С(12)), 153,0 (С(10)), 144,2 (С(8)), 138,3 (С(17)), 136,0 (С(1)), 130,3 (С(4)), 129,8 (С(22)), 128,0 и 127,7 (С(18), С(19)), 123,8 (С(3), С(5)), 118,2 (С(2), С(6)), 88,9(С(13)), 20,8(СН) м.д.
18
16
6
Вычислено для CHN: С, 68,34; Н, 5,10; N, 26,56
Найдено: С, 68,38; Н, 5,07; N, 26,47
Пример 5
4-Амино-3-(4-бромфенил)амино-6-фенилпиразоло[3,4-d]пиримидин
1,87 г (10,7 ммоль) гидрата бензамидин гидрохлорида и 0,89 г (10,7 ммоль) ацетата натрия добавляют к 1,0 г (3,6 ммоль) 5-амино-4-циано-3-(4-бромфенил)аминопиразола в 20 мл уксусной кислоты при перемешивании. Полученную смесь кипятят в течение 4 ч, обрабатывают 50 мл воды, фильтруют и промывают 20 мл холодного метанола и 20 мл холодного эфира. Сырой продукт очищают кристаллизацией из этанола. Физико-химические параметры следующие:
f
желтое, кристаллическое, твердое вещество. Выход 38%. Т.пл. 272-4°C. R (хлороформ - метанол; 10/1) - 0,9 (силикагель 60).
+
MC m/z 381 (М).
1
6
2
Н ЯМР (ДМСО-d) δ 12,44 (1H, с, NH(9)), 8,33-8,38 (2Н, кв, СН(18), СН(19)), 8,12 (1H, ушир. с, NH(7)), 7,40-7,53 (7Н, м, NH, СН(3), СН(5), СН(20), СH(21), СН(22)), 7,10 (2Н, д, СН(2), СН(6)) м.д.
17
13
6
Вычислено для CHBrN: С, 53,65; Н, 3,44; N, 22,04
Найдено: С, 5,80; Н, 3,48; N, 21,95
Пример 6
4-Амино-3-(4-фторфенил)амино-6-фенилпиразоло[3,4-d]пиримидин
Получение осуществлялось способом, описанным в Примере 5, в качестве растворителя используют трифторуксусную кислоту. Кристаллизацию конечного продукта осуществляют из смеси этанол/ДМФА. Физико-химические параметры следующие:
бело-желтое, кристаллическое, твердое вещество. Выход 58%. Т.пл. 259-263°C.
f
R (хлороформ - метанол; 10/1) - 0,8 (силикагель 60).
+
МС m/z 320 (М).
1
6
2
Н ЯМР (ДМСО-d) δ 12,69 (1Н, с, NH(9)), 8,33-8,41 (4Н, м, СН(2), СН(6), СН(18), СН(19)), 8,18 (1H, ушир. с, NH(7)), 7,58-65 (5Н, м, NH, СН(20), СH(21), СН(22)), 7,27-7,31 (2Н, м, СН(3), СН(5)) м.д.
17
14
6
Вычислено для CHFN: С, 63,74; Н, 4,09; N, 26,24
Найдено: С, 63,57; Н, 4,07; N, 26,33
2. Применение изобретенных производных 4-амино-3-ариламино-6-арилпиразоло[3,4-d]пиримидина в качестве противовирусных средств
2.1 Переносимость соединений из только что описанных Примеров 1-6 в культуре клеток
4
2
50
1×10 клеток HeLa (DSMZ, АСС 57) высевали в лунки планшета для микроанализа в 0,2 мл питательной среды RPMI 1640. Титрационные микропланшеты инкубировали без тестируемого соединения согласно стандарту (при 37°C, 5% CO и около 95% относительной влажности) в течение 48 ч при физиологических условиях, получая субконфлюэнтные монослои. После этого к монослоям добавляли последовательно разбавленные тестируемые вещества и инкубировали при физиологических условиях в течение 72 ч. По окончании времени инкубирования измеряли экстинкцию всех лунок титрационных микропланшетов при 660 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Sunrise, Тесаn) после фиксации глутаровым альдегидом и покраски метиленовым синим, и определяли значения СС с помощью программы анализа "Magellan". Поскольку пре-инкубирование HeLa клеток само по себе ведет к образованию субконфлюэнтного сплошного слоя клеток, цитолиз во время последующего инкубирования с тестируемым веществом является решающим для анализа.
2
50
Клетки GMK высевали в титрационные микропланшеты и пре-инкубировали при 5% СO, 37°C и влажности 95% в инкубаторе в течение 48 ч для получения сплошного слоя клеток (Schmidtke М et al.: J Virol Meth, 2001, 95(1-2), 133-143). Затем удаляли среду и добавляли вещества в различных концентрациях (100 мкл/лунка/концентрация, коэффициент разбавления 2) в питательной среде. Для определения каждого из контрольных значений использовали 100 мкл среды (шесть контрольных образцов клеток, не подвергающихся обработке). Через 72 ч после добавления вещества и инкубирования, клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым в метаноле. После экстракции красителя измеряли оптическую плотность (OD) каждой отдельной лунки в планшетном фотометре компании Dynatech (550/630 нм) и сравнивали со средним значением контрольных образцов клеток. Среднее значение контрольных образцов принимали за 100%. По усредненным кривым доза-эффект вычисляли 50% цитотоксические концентрации (СС), применяя метод линейной интерполяции.
Примеры
50% цитотоксическая концентрация (мкг/мл) в
клетки HeLa
клетки GMK
1
39.6
>50
2
45.7
>50
3
27.7
не исследовалось
4
>50
>50
5
8.5
42.9
6
44.3
>50
2.2 Противовирусный эффект соединений из вышеописанных примеров 1-6 в культуре клеток
Тест на ингибирование цитопатического эффекта (срЕ) с международной стандартной линией вируса коксаки группы В3 Nancy (CVB3 Nancy), человеческого риновируса 2 и 8 (HRV2 и HRV14) в клетках HeLa
Репликация вирусов, используемых в данном тесте, приводит к полному разрушению клеток хозяина, сильному цитопатическому эффекту (срЕ). Добавлением противовирусных средств (100 мкл/лунка/концентрация, коэффициент разбавления 2) можно специфично ингибировать вирус-индуцируемый срЕ (Schmidtke М. et al.: J Virol Meth, 2001, 95(1-2), 133-143). В данном тесте, необработанные и обработанные веществами компактные сплошные слои клеток инфицировали вирусом в дозировке, приводящей к полному срЕ в необработанных контрольных вирусных образцах через 24 ч (CVB3 Nancy) или 72 ч (HRV2 и HRV8) после инфицирования. В этот момент времени все еще адгезивные клетки фиксировали и окрашивали раствором кристаллического фиолетового в формалине. Ингибирование вирус-индуцируемого срЕ количественно определяли фотометрически в считывающем устройстве для микропланшетов Dynatech после элюирования красителя. Противовирусный эффект вычисляли путем сравнения оптических плотностей обработанных веществами и необработанных клеток, инфицированных вирусами, принимая среднюю оптическую плотность контрольных образцов клеток за 100%. По усредненным кривым доза-эффект вычисляли 50% ингибирующую концентрацию. В качестве контрольного вещества применяли плеконарил. Результаты, полученные с веществами, описанными в примерах, приведены в следующей таблице.
Примеры
50% ингибирующая концентрация (мкг/мл)
CVB3 Nancy
HRV2
HRV8
Плеконарил
неэффективен
0.01
1.3
1
0.002
неэффективен
неэффективен
2
0.001
4.1
4.6
3
0.02
1.1
1.0
4
0.08
1.8
2.2
5
0.04
0.7
1.0
6
0.03
0.9
2.0
Реакция подавления бляшкообразования (PRT) с веществом из примера 1 и вирусом коксаки групп В1, В2, В4, В5, В6 (CVB1, CVB2, CVB4, CVB5, CVB6)
50
Для проведения данного теста, компактные сплошные слои клеток HeLa возрастом 2-3 дня инфицировали в 12-луночном планшете для культур тканей 50-80 бляшкообразующими единицами (PFU) (Schmidtke М et al.: J Virol Meth, 2001, 95(1-2), 133-143). Две неинфицированные лунки в планшете использовались в качестве контрольных образцов клеток (СС). После адсорбции вируса при 37°C в течение 1 ч, вируссодержащий супернатант удаляли. Инфицированные клетки покрывали контрольной средой, содержащей 0,4% агара без (вирусные контрольные образцы) или с веществом в не-цитотоксических концентрациях (коэффициент разбавления 2, два образца на концентрацию) и инкубировали при 37°C в течение 48 ч. После фиксации и окрашивания планшетов кристаллическим фиолетовым в формалине, удаляли агар и промывали планшеты проточной водой. Число индуцированных вирусом бляшек подсчитывали на просмотровом столе с подсветкой, и после этого вычисляли пропорциональное уменьшение числа бляшек, вызванное веществом. Проводили три идентичных теста и по усредненной кривой доза-эффект вычисляли концентрацию, вызывающую 50%-ное уменьшение числа бляшек (IC). Результаты, полученные с веществом из примера 1, приведены в следующей таблице.
Вирусы
50% цитотоксическая концентрация в клетках HeLa (СС<sub>50</sub>) в мкг/мл
50% ингибирующая концентрация в клетках HeLa (IC<sub>50</sub>) в мкг/мл
Коэффициент селективности (SI) = СС<sub>50</sub>:IС<sub>50</sub>
CVB1
39.6
12.7
3.1
CVB2
39.6
0.3
132
CVB4
39.6
7.1
5.6
CVB5
39.6
2.8
14.1
CVB6
39.6
2.6
15.3
2.3 Острая и подострая токсичность соединений из примеров 2 и 4 для мышей
Острую токсичность веществ из примеров 2 и 4 определяли для мышей возрастом 4-5 недель (без определения линии). 1-2 капли TWIN-80 добавляли к 1% водному раствору карбоксиметилцеллюлозы, и полученную смесь использовали для получения суспензии вещества. 1500, 2000, 2500, 3000, 4000 или 5000 мг/кг веществ из примеров 2 и 4 вводили перорально 5 мышам, каждое количество по одному разу. В течение следующих трех дней определяли общее состояние здоровья мышей, изменения их веса, ректальную температуру и коэффициент выживаемости.
Выжили все животные, которым вводили концентрации вещества вплоть до 3000 мг/кг, если вещества из примеров 2 и 4 вводили однократно (смотри таблицу далее). Не подверглись изменениям ни общее состояние здоровья мышей, ни ректальная температура, ни вес тела.
50% летальная доза для двух исследованных веществ составила около 3500 мг/кг (вычислено согласно Kärber in Mayer et al. Virologische Arbeitsmethoden. (Virological working methods) Gustav-Fischer-Verlag, Jena, 1973). После введения дозировки 5000 мг/кг животные погибали в течение 3-5 ч.
Концентрация (мг/кг)
Число погибших/выживших мышей
Пример 2
Пример 4
1500
0/5
0/5
2000
0/5
0/5
2500
0/5
0/5
3000
0/5
0/5
4000
3/5
4/5
5000
5/5
5/5
На основе полученных результатов, вещества из примеров 2 и 4 можно рассматривать как хорошо переносимые после однократного перорального введения.
Подострую токсичность тех же самых веществ (примеры 2 и 4) определяли для мышей возрастом 4 недели (без определения линии). 1-2 капли TWIN-80 добавляли к 1% водному раствору карбоксиметилцеллюлозы, и полученную смесь использовали для получения суспензии веществ. 100 мг/кг веществ из примеров 2 и 4 вводили перорально каждой из 7 мышей однократно в течение 5 дней. За мышами наблюдали в течение 10 дней. Каждый день определяли общее состояние здоровья, изменения веса, изменения ректальной температуры и коэффициент выживаемости. По окончании теста исследовали морфологические изменения селезенки, легких и печени после взятия срезов.
Обработка веществами не оказала какого-либо влияния на общее состояние здоровья или температуру тела. Вес тела мышей, которым вводились вещества, в период наблюдения рос таким же образом, как вес контрольных животных, которым вещества не вводились. Ни одно из животных не погибло.
Таким образом, вещества из примеров 2 и 4 в концентрации 100 мг/кг могут рассматриваться как хорошо переносимые после их пятикратного перорального введения.
Обозначения позиций
1 - пиразоло[3,4-d]пиримидин
2 - [бис(метилтио)метилен]малононитрил
3 - ариламин
4 - арильное производное
5 - пиразол
6 - ариламидин