ГАМК-СТЕРОИДНЫЕ АНТАГОНИСТЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ЛЕЧЕНИИ НАРУШЕНИЙ ЦНС
GABA-STEROID ANTAGONISTS AND APPLICATION THEREOF IN TREATING CNS DISTURBANCES

Изобретение относится к лечению, облегчению симптоматики или предотвращению заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), связанных с и/или вызванных ГАМК-стероидами, в частности к специфическим стероидным соединениям, предназначенным для данной цели, их применению для производства фармацевтических препаратов для указанного лечения, а также способам лечения, включающим их применение.
Предпосылки изобретения
Метаболиты половых и стрессовых гормонов прегненолона, прогестерона, дезоксикортостерона, кортизона и кортизола, известные как прегнанолоны, а также метаболиты тестостерона, андростендиона и дегидроэпиандростерона являются объектами различных исследований, по меньшей мере, частично раскрывающих их роль в неврологической сигнальной системе у млекопитающих.
Стероиды, вызывающие симптомы ЦНС и заболевания, представляющие интерес для настоящего изобретения, имеют структурное сходство, которое заключается в наличии 3альфа-гидрокси-группы, 5альфа или 5бета прегнан-стероидного остова и кетонной или гидрокси-группы в положении 17, 20 или 21.
Для стероидов, включающих 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-он/ол или 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-андростан-17-он/ол, показано, что они являются важными специфическими усилителями рецептора гамма-аминомасляной кислоты (А) (ГАМК-А). Они связываются с рецептором ГАМК-А, и их действие направлено на усиление эффекта ГАМК в плане частоты нахождения рецептора ГАМК-А в открытом состоянии и продолжительности открытого состояния. Данный эффект аналогичен эффекту как бензодиазепинов, так и барбитуратов. Указанные стероидные соединения, однако, имеют сайт связывания, отличный от сайтов связывания указанных соединений. Примеры такого рода стероидов, усиливающих действие ГАМК, и их номера согласно Chemical Abstracts Registry (CAS) представлены в таблице 1.
Номенклатура стероидов окончательно не устоялась, поэтому в данной заявке используется номенклатура, разработанная Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК).
Таблица 1
Номенклатура ГАМК-стероидов
Номенклатура ИЮПАК
Номер CAS
3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-он
516-54-1
3альфа-гидрокси-5бета-прегнан-20-он
128-20-1
3альфа,21-дигидрокси-5альфа-прегнан-20-он
567-02-2
3альфа,21-дигидрокси-5бета-прегнан-20-он
567-03-3
3альфа,11бета,17альфа,21-тетрагидрокси-5бета-прегнан-20-он
53-02-1
3альфа-11бета,17альфа,21-тетрагидрокси-5альфа-прегнан-20-он
302-91-0
3альфа-17альфа,21-тригидрокси-5альфа-прегнан-11,20-дион
547-77-3
3альфа-17альфа,21-тригидрокси-5бета-прегнан-11,20-дион
53-05-4
3альфа-гидрокси-5альфа-андростан-17бета-ол
1852-53-5
3альфа-гидрокси-5бета-андростан-17бета-ол
*
3альфа-гидрокси-5альфа-андростан-17-он
53-41-8
3альфа-гидрокси-5бета-андростан-17-он
53-42-9
* Номер CAS не найден
Для некоторых из указанных стероидов показано, что они обладают способностью вызывать анестезию при высоких фармакологических дозах. Их также можно применять в качестве противоэпилептических агентов или в качестве снотворных агентов. Также было показано, что некоторые из указанных соединений обладают анксиолитическими эффектами в экспериментах на животных. Однако для достижения указанных эффектов необходимы высокие концентрации или высокие дозы соединений. Кроме того, такие эффекты проявляются в сильной форме.
В отношении их непосредственного действия на ЦНС, как было упомянуто выше, эти соединения аналогичны бензодиазепинам и барбитуратам. Однако они также оказывают такие же неблагоприятные эффекты, которые обычно связаны с бензодиазепинами и барбитуратами. Неблагоприятные эффекты эндогенных 3альфа-гидрокси-прегнан-20-он-стероидов или 3альфа-гидрокси-андростан-стероидов лежат в основе отрицательного воздействия на ЦНС, вызванного указанными стероидами. Поскольку 3альфа-гидрокси-прегнан-стероиды и 3альфа-гидрокси-15 андростан-стероиды образуются в организме и являются метаболитами стероидных гормонов и некоторые из них необходимы для жизни, их выработку невозможно легко нарушить. Эти стероиды вырабатываются в большом количестве в течение от нескольких дней до недель в ходе лютеальной фазы менструального цикла, т.е. после высвобождения яйцеклетки из зрелого яичникового фолликула в ходе беременности и при стрессе. Они также вырабатываются в мозге.
Заболевания, вызванные 3альфа-гидрокси-стероидами
Нарушения, вызванные действием эндогенно образующихся 3альфа-гидрокси-5альфа стероидов или 3альфа-гидрокси-5бета стероидов на рецептор ГАМК-А, хорошо изучены и объяснены. Также известно, что 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероиды могут вызвать толерантность к самим себе и другим аналогичным веществам после воздействия и что после отмены препаратов 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов наблюдаются синдромы отмены. В целом известно, что 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероиды вызывают нарушения ЦНС посредством трех возможных указанных механизмов: а) прямого воздействия, б) индукции толерантности и в) эффекта отмены. Эти механизмы обсуждаются более подробно ниже.
а) Прямое воздействие
Установлено, что 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероиды могут непосредственно вызвать ингибирование функций ЦНС. Примерами симптомов, вызванных прямым воздействием 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов, являются успокоение, усталость, нарушение памяти, нарушение обучаемости, нарушение моторной функции, неуклюжесть, повышенный аппетит и неутолимый голод, подавленное настроение, раздражительность и депрессия, которые являются основными симптомами предменструальных дисфорических нарушений, предменструального синдрома и ухудшения состояния при малой эпилепсии. Примеры такого рода прямого воздействия можно также подразделить на успокоительные и анестезирующие эффекты; нарушение моторной функции; влияние на когнитивные функции, память и обучение; ухудшение состояния при малой эпилепсии; предменструальные симптомы; изменения настроения; индукцию беспокойства у тестируемых животных; гиперфагию и повышенный аппетит; неутолимый голод и т.п.
б) Толерантность
Непрерывное и длительное воздействие 3альфа-гидрокси-5альфа/бета стероидов вызывает нарушения в функционировании системы рецептора ГАМК-А. Формируется толерантность, и такого рода толерантность является первоначальным этапом процесса, который в конечном счете приводит к развитию чувствительности к стрессу, затруднению концентрации, потере контроля мотивации и депрессии. Также было обнаружено, что действие 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов является фактором, усиливающим лекарственную/наркотическую зависимость. Это явление стало объектом большого числа исследований. К настоящему времени основным предметом исследований были следующие вопросы: негативная регуляция и уменьшение функции ГАМК после длительной секреции больших количеств 3альфа-гидрокси-5альфа/бета стероидов; уменьшение чувствительности к бензодиазепину и 3альфа-гидрокси-5бета стероидам в ПМС и индукция зависимости.
в) Синдром отмены
Непрерывное, но более короткое воздействие 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов приводит к возникновению эффекта отмены при окончании воздействия. Это явление наблюдается, например, естественным образом в ходе менструации при прекращении продукции 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов желтым телом яичника. Такого рода феномены отмены также наблюдаются после родов (post partum), при прекращении продукции 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов плацентой. Такой же феномен также отмечен при завершении периода стресса, например при прекращении стресса, связанного с работой, во время выходных. Как ответ на стресс надпочечники продуцируют 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероиды. При прекращении их продукции может наблюдаться синдром отмены.
Примерами патологических состояний, которые находятся под влиянием такого феномена отмены, являются частичная эпилепсия, при которой у пациента формируется эпилептический фокус в коре головного мозга и происходит ухудшение в период отмены в ходе менструации. Этот феномен называют «менструальная эпилепсия». Другими примерами являются связанная с менструацией мигрень, мигрень, связанная со стрессом и изменение настроения после родов (post partum). Аналогичные симптомы и патологические состояния индуцируются при лечении стероидными гормонами, например, такими, которые применяются в пероральных противозачаточных средствах, терапии замещения постклимактерических гормонов, лечении стероидами при воспалительных заболеваниях и в ходе приема анаболических/андрогенных стероидов. В основе индукции прямых эффектов, развития толерантности и отмены лежат схожие механизмы.
Нарушения, вызванные сверхстимуляцией гамма-аминомасляной кислотой (ГАМК)
Известно, что интенсивная стимуляция самой ГАМК в определенных случаях ингибирует функцию обучения и памяти. Сверхпродукция ГАМК ухудшает функцию краткосрочного обучения и памяти. Это явление имеет особое клиническое значение у пожилых людей. В таком случае антагонизм эффекта ГАМК мог быть полезным и потенциально применимым для лечения нарушений памяти. Однако если антагонизм ГАМК является слишком сильно выраженным, он может быть опасным для пациента, например, вызывая конвульсии. Поэтому идет поиск специфических антагонистов, избирательно блокирующих патологические состояния, индуцированные ГАМК-стероидами, и антагонистов, которые также влияют на активированный ГАМК поток хлорид-ионов через рецептор ГАМК-А, но которые по существу не способны полностью блокировать ГАМК-А рецептор.
Настоящими изобретателями были неожиданно обнаружены вещества, которые, главным образом, оказывают антагонистическое влияние на действие ГАМК, а также вещества, главным образом, влияющие на воздействие ГАМК-стероидов на рецептор ГАМК-А. Важно различать эти эффекты, поскольку антагонизм действия ГАМК- стероидов проявляется в иных случаях, нежели прямой частичный антагонизм действия самой ГАМК.
В настоящее время лечение болезни Альцгеймера (БА) и легкого когнитивного нарушения (ЛКН) большей частью не осуществляется при отсутствии профилактической или лечебной терапии. Тот факт, что агонисты рецептора ГАМК-А, такие как ГАМК-стероиды, бензодиазепины и этанол, связаны с потерей памяти и что при БА нарушается функционирование большинства рецепторов ГАМК-А в областях мозга, делает рецепторы ГАМК-А потенциальными терапевтическими мишенями при АБ и ЛКН. В отличие от агонистов рецепторов ГАМК-А, связанных с амнезией, обратные агонисты или антагонисты ослабляют функцию рецепторов ГАМК-А. Показано, что антагонисты ГАМК-стероидов и антагонисты ГАМК улучшают у модельных животных эффективность выполнения задач на обучение и память. К сожалению, неселективные и лиганды, оказывающие полное блокирование, также вызывают конвульсии. Таким образом, существует потребность в частичных и селективных блокаторах (Maubach, K., GABA-A receptor subtype selective cognition enhancers, Curr. Drug Targets CNS Neurol Disord., 2003 (2) 233-239). Современные имеющиеся на рынке препараты, усиливающие восприятие, имеют значительные неблагоприятные эффекты при минимальной эффективности, и существует потребность в новых веществах, что является предметом настоящего изобретения.
Предшествующий уровень техники
Как известно авторам настоящего изобретения, стероидные вещества, которые селективно ингибируют действие ГАМК-стероидов или, главным образом, ингибируют воздействие ГАМК на рецептор ГАМК-А, не были описаны ранее. На предшествующем уровне техники было описано только общее воздействие на все эффекты ГАМК-стероидов.
Принс и Симмонс (Prince and Simmons, Neuropharmacology, vol. 32, no. 1, pp.59-63, 1993) использовали модель, основанную на мембранных фракциях целого мозга самцов крыс. В этих субфракциях гомогената целого мозга авторы использовали связывание бензодиазепина, 3Н-флунитразепама в качестве модели для оценки эффекта стероидов и изменения конформации рецептора ГАМК-А. Этот тест был предложен как индикатор аллостерической модуляции рецептора ГАМК-А. Однако взаимосвязь между изменением связывания флунитразепама (ФН3) и изменением потока хлорид-ионов при стимуляции ГАМК точно не установлена, и изменение связывания нельзя рассматривать ни как доказательство изменения потока ионов хлора через рецептор ГАМК-А, ни как доказательство изменения в функционировании рецептора ГАМК-А. Изменение потока хлорид-ионов является важным эффектом.
Главный вопрос, то есть существует ли взаимосвязь между изменением в связывании ФН3 и возбудимостью нейронов, является еще менее исследованным, и такие выводы нельзя делать только на основании результатов по связыванию ФН3. Изменение ФН3-связывающей способности или отсутствие такого изменения связывающей способности не означает изменение или отсутствие изменения активности нейронов или ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов.
Также хорошо известно, что рецептор ГАМК-А содержит несколько субъединиц, которые могут комбинироваться различными способами. Интересно, что в определенных комбинациях отсутствует сайт распознавания стероидов. Также известно, что влияние стероида на связывание вызывающего судороги вещества TBPS (t-butylbicyclo-phosphorothionate, t-бутилбицикло-фосфоротионата, ТБФТ) различается в различных областях мозга. Кроме того, известно, что связывание TBPS изменяется в ходе менструального цикла у самок крыс, что указывает на то, что изменение эффекта связано с выработкой овариальных гормонов. Понятно, что такого рода изменения, связанные с менструальным циклом, не могут быть выявлены у самцов крыс, применявшихся в исследованиях Принса и Симмонса (см. выше).
В патентах США 5,232,917 (Bolger et al.) и 5,939,545 (Upasani et al.) описан ряд 3альфа-гидрокси-стероидов. Оба эти патента относятся к агонистической модуляции рецептора ГАМК-А. Другими словами, предметом обоих патентов является бензодиазепин-подобный эффект 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов. Общей особенностью всех стероидов, представляющих собой модуляторы рецептора ГАМК-А, является единая 3альфа-гидрокси-структура. Стероиды с 3бета-гидрокси-структурой, упомянутые в этих документах, применялись только в качестве контролей, чтобы показывать специфичность 3альфа-гидрокси-стероидов. Для стероидов, имеющих только 3бета-гидрокси-структуру, не было показано модулирующего воздействия на рецептор ГАМК-А. Во всех случаях, когда было выявлено эффективное модулирующее воздействие на рецептор ГАМК-А, стероиды содержали 3альфа-гидрокси-группу.
В международной публикации WO 99/45931 (Backstrom & Wang) описано антагонистическое влияние одного определенного стероида, а именно 3бета-гидрокси-5альфа-прегнан-20-она, но данные, касающиеся действия других 3бета-гидрокси-стероидов, отсутствуют.
Антагонистическое воздействие 3бета-ОН-5альфа-прегнан-20-она по отношению к 3альфа-ОН-5альфа/бета-прегнан-20-ону впервые был описан Уэнгом и соавторами (Wang M.D., Backstrom Т. and Landgren S. (2000) The inhibitory effects of allopregnanolone and pregnanolone on the population spike, evoked in the rat hippocampal CA1 stratum pyramidaie in vitro, can be blocked selectively by epiallopregnanolone. Acta Physiol Scand 169, 333-341). В этой работе был показан зависимый от дозы антагонистический эффект 3бета-ОН-5альфа-прегнан-20-она на два 3альфа-ОН-5альфа/бета-стероида.
Международная публикация WO 03/059357 (Backstrom et al.) описывает применение прегнан-стероидов в лечении нарушений ЦНС. В этом источнике не упоминается возможность селективного ингибирования эффектов ГАМК-стероидов или действия на саму ГАМК.
Тот факт, что 3бета стероиды также могут оказывать влияние на действие самой ГАМК, был описан Уэнгом и соавторами (Mingde Wang, Yejun He, Lawrence N. Eisenman, Christopher Fields, Chun-Min Zeng, Jose Mathews, Ann Benz, Tao Fu, Erik Zorumski, Joe Henry Steinbach, Douglas F. Covey, Charles F. Zorumski, and Steven Mennerick. 3beta-Hydroxypregnane Steroids Are Pregnenolone Sulfate-Like GABAA Receptor Antagonists. The Journal of Neuroscience, May 1, 2002, 22(9):3366-3375). В этой работе авторы показывают, что при максимальной стимуляции рецепторов ГАМК-А с использованием ГАМК определенные 3бета-гидрокси-прегнан-стероиды способны ингибировать действие самой ГАМК. Но такого рода 3бета-гидрокси-стероиды в основном ингибируют действие ГАМК-стероидов на ГАМК-управляемый поток хлорид-ионов, а другие стероиды, которые ингибировали бы действие самой ГАМК, обнаружены не были.
Остается нерешенной проблема выявления специфических антагонистов 3альфа-гидрокси-действия прегнан-стероидов со слабыми ингибирующим влиянием на ГАМК и выявления частичных антагонистов действия ГАМК, соединения которых являются физиологически безопасными и пригодными для фармацевтического применения и которые, кроме того, применимы в физиологически приемлемых дозах.
Таким образом, одной из задач настоящего изобретения является идентификация таких специфических блокаторов, которые представляют собой антагонисты ГАМК-стероидов и частичные антагонисты самой ГАМК, а также создание доступных новых фармацевтических препаратов и способов лечения, облегчения симптоматики или предотвращения нарушений ЦНС, связанных со стероидами и/или вызванных ими.
Другие задачи, связанные с ними решения и их преимущества станут ясны специалисту в данной области при ознакомлении с описанием изобретения, примерами и формулой.
Краткое описание изобретения
Согласно настоящему изобретению было обнаружено, что стероидные соединения, имеющие в своем составе донор водорода в 3бета-положении в форме гидрокси-группы и, кроме того, имеющие гидрокси-группу в 20 положении, неожиданно функционируют как эффективные блокаторы действия 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидов и обладают минимальной активностью, направленной против самой ГАМК. Таким образом, они полезны как терапевтические вещества для предотвращения и/или лечения нарушений ЦНС, связанных со стероидами или вызванных ими.
Кроме того, авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что прегнан-стероиды с ацетатной группой в 3 положении или в 3, 20 и 21 положениях способны частично ингибировать воздействие самой ГАМК на ГАМК-опосредованный поток хлорид-ионов. Следовательно, они полезны как терапевтические агенты, например, для предотвращения и/или лечения нарушений, при которых сверхстимулирована сама функция ГАМК, как в случае болезни Альцгеймера.
Согласно настоящему изобретению предложены четыре соединения, демонстрирующих слабое антагонистическое влияние на действие ГАМК, но обладающих значительным эффектом, направленным против действия 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов (ГАМК-стероидов) для применения для предотвращения и/или лечения нарушений ЦНС, связанных со стероидами или вызванных ими, и для производства фармацевтических препаратов для этих целей, а именно: 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛ, 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛ, 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛ, 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛ (см. таблицу 2).
Таблица 2
Перечень 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов, оказывающих антагонистическое воздействие на усиленный 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ГАМК-опосредованный поток хлорид-ионов, но обладающих слабым антагонистическим воздействием на ГАМК, протестированных в настоящем изобретении
Вещество*
Название продукта
1) 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛ
UC1011
2) 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛ
UC1013
3) 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛ
UC1019
4) 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛ
UC1020
* Вещества получены от Steraloids Inc., США, и от Sigma Chemicals Co.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены десять соединений, демонстрирующих частичное антагонистическое влияние на действие ГАМК для применения для предотвращения и/или лечения нарушений, являющихся следствим сверхстимуляции ГАМК и вызванных таким образом нарушений ЦНС, и для приготовления фармацевтических препаратов для этих целей, а именно: 5альфа-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОНА АЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОН; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОН; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета, 20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОНА 21-АЦЕТАТ (см. таблицу 3).
Одним из аспектов настоящего изобретения является терапевтическое применение вышеуказанных соединений в качестве блокирующих веществ, направленных против действия 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидов и действия ГАМК. Кроме того, настоящее изобретение предлагает применять эти вещества для производства фармацевтических препаратов для лечения многих специфических нарушений ЦНС, связанных со стероидами или вызванных ими, и для применения в способах лечения согласно пунктам прилагаемой формулы, которые включены в данную заявку посредством ссылки.
Таблица 3
Список 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов с сильным антагонистическим действием по отношению к ГАМК, протестированных в настоящем изобретении
Вещество*
Название продукта
1) 5альфа-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОНА АЦЕТАТ
UC1012
2) 5бета- ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОН
UC1014
3) 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОН
UC1015
4) 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ
UC1021
5) 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ
UC1022
6) 5альфа-ПРЕГНАН-3бет 20альфа-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ
UC1023
7) 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ
UC1024
8) 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ
UC1025
9) 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ
UC1026
10) 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОНА 21-АЦЕТАТ
UC1030
* Вещества получены от Steraloids Inc., США, и от Sigma Chemicals Co.
Краткое описание чертежей
Изобретение описано более подробно в следующем описании и примерах со ссылками на таблицы, включенные в описание, и прилагаемые графические материалы, где на Фиг.1 показана зависимость между ингибированием максимального ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов (30 мкМ ГАМК) и ингибированием усиленного 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов через рекомбинантные рецепторы ГАМК-А (альфа1, бета2, гамма2L), экспрессированные в ооцитах Xenopus laevis. 3начения соответствуют номерам продукта, а нумерация, согласованная с полными названиями, представлена в таблицах 2 и 3. Черный крестик (X) обозначает стероидного антагониста, который ингибирует усиленный 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном (3 мкМ) ответ ГАМК (3 мкМ). Черные точки (•) обозначают стероидного антагониста, который ингибирует как прямой ответ ГАМК (30 мкМ), так и усиленный 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ответ ГАМК.
На Фиг.2 показана связь между ингибированием активации 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов через рекомбинантные рецепторы ГАМК-А (альфа1, бета2, гамма2L), экспрессированные в ооцитах mXenopus laevis, и ингибированием активированного 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов в кортикальные микромешочки из кортекса самцов крыс. Значения соответствуют номерам продукта, а полные названия представлены в таблицах 2 и 3.
Описание изобретения
Перед описанием настоящего изобретения необходимо отметить, что терминология, применяемая в данной заявке, используется только с целью описания конкретных способов реализации изобретения и не является ограничивающей, поскольку область настоящего изобретения определена только прилагаемой формулой и ее эквивалентами.
В частности, следует отметить, что при использовании в данном описании и прилагаемой формуле слова в форме единственного числа также включают соответствующие им формы множественного числа, если иначе не следует из контекста.
В нижеследующем описании подразумевается, что термины «связанный со стероидами» и «индуцированный стероидами», например «нарушения, связанные со стероидами», охватывают три возможных механизма, посредством которых стероиды действуют в центральной нервной системе: а) прямое действие, б) индукция толерантности и в) эффект отмены. Примеры таких нарушений даны выше, но они представлены для иллюстрации каждого механизма и не ограничивают область изобретения.
Термин «блокирование» применяется для обозначения эффекта, при котором нарушается действие 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов на рецептор ГАМК-А.
Понятно, что «блокирование» полностью отличается от эффекта, обозначаемого терминами «модуляция» или «репрессия» или аналогичными терминами, которые означают, что действие все-таки происходит, но в меньшей степени или с более медленной скоростью.
Термином «антагонист» обозначается вещество, которое препятствует другому веществу, агонисту, вызывать его эффект. В данной заявке термины антагонист и блокатор используют параллельно.
Термин «фармацевтическая композиция» используется в широком значении, охватывающем все фармацевтически применимые композиции, содержащие, по меньшей мере, одно активное вещество и дополнительные носители, адъюванты, компоненты и т.п. Термин «фармацевтическая композиция» также охватывает композицию, которая содержит активное вещество в форме производного или пролекарства, например фармацевтически приемлемых солей, сульфатов и сложных эфиров. Производство фармацевтических композиций для различных путей введения находится в пределах компетенции специалиста в области химии галенов.
Термины «введение» и «способ введения», а также «путь введения» используются также в широком значении. Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить различными путями, зависящими в основном от того, какой способ введения, локальный, местный или системный, наиболее подходит для патологического состояния, которое подлежит лечению. Такими различными способами введения являются, например, местное введение (например, на кожу), локальное (включая глазное и введение через различные слизистые оболочки, например, вагинальная и ректальная доставка), оральный или парентеральный и легочный способы введения, в том числе в верхние и нижние дыхательные пути.
Способы получения такого рода композиций известны специалистам в области разработки фармацевтических препаратов и составов и их можно применять для разработки состава композиций согласно настоящему изобретению.
В ходе создания настоящего изобретения неожиданно оказалось, что фармацевтически приемлемые и практически применимые дозы стероидов, имеющих группу-донор водорода в 3бета положении и гидрокси-группу в 20 положении, могут ингибировать действие 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов in vitro и оказывают очень незначительное антагонистическое влияние на действие самой ГАМК. Таким образом, они блокируют развитие отрицательных эффектов 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов, но оказывают минимальные влияние на действие самой ГАМК. Были рассмотрены оба механизма действия 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов на развитие нарушений ЦНС и механизм действия 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнана или 3бета-сульфат-5альфа/дельта5-прегнан/прегнен стероидов на их взаимодействие с 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидами. Примеры таких соединений представлены в таблице 2.
Кроме того, согласно настоящему изобретению было неожиданно обнаружено, что фармацевтически приемлемые и практически применимые дозы стероидов, которые содержат ацетатную группу в 3 положении и/или в 3, 20 и 21 положениях способны частично ингибировать собственный эффект ГАМК на ГАМК-опосредованный поток хлорид-ионов. Следовательно, такие стероиды имеют применение в качестве терапевтических веществ для предотвращения и/или лечения нарушений, при которых свехстимулирована функция самой ГАМК, что наблюдается при болезни Альцгеймера. Примеры таких соединений представлены в таблице 3.
Настоящее изобретение касается всех стероидов, которые содержат группу-донор водорода в 3бета положении, в частности гидрокси- или сульфатную группу, и кроме того гидрокси-группу в 20 положении. В данном описании в качестве примеров приведены 3бета-гидрокси-прегнан-20-ол стероиды, представленные в таблице 2. Авторы настоящего изобретения показали, что такие стероиды антагонисты и способны оказывать антагонистическое влияние на действие 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов, но оказывают незначительное влияние на действие самой ГАМК в центральной нервной системе (ЦНС). Удивительно, что одновременная обработка 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидами и 3бета-гидрокси-прегнан-стероидами, упомянутыми в таблице 2, ингибирует транспорт хлорид-ионов через рекомбинантный рецептор ГАМК, экспрессированный в ооцитах Xenopus laevis, индуцированный 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидом, но оказывает незначительное влияние на поток хлорид-ионов, индуцированный только одной ГАМК.
Одним из преимуществ данного изобретения является то, что 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан,20-ол-стероиды, в частности 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛ, 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛ, 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛ, 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛ, оказывают эффективное антагонистическое влияние на модуляцию рецептора ГАМК-А 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидами, но в незначительной степени влияют на активацию рецептора ГАМК-А под действием ГАМК. Особым преимуществом является то, что указанное блокирование достигается в фармакологически и физиологически приемлемых концентрациях.
Новый и неожиданный эффект, положенный в основу настоящего изобретения, таким образом, заключается в том, что возможно селективно блокировать усиление ГАМК-активированного потока под действием 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов посредством введения 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-ол-стероидов в фармацевтически и физиологически приемлемых количествах с отсутствием или с незначительным влиянием на действие ГАМК.
Другой новый и удивительный эффект, обнаруженный при создании настоящего изобретения, заключается в том, что 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероиды с ацетатной группой или группами в 3, 20 и 21 положениях, в частности 5альфа-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОНА АЦЕТАТ; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛ 3-АЦЕТАТ; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОНА 21-АЦЕТАТ; и некоторые 3бета-5бета-стероиды, в частности 5бета-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОН и 5бета-ПРЕГНАН-3бета, 21-ДИОЛ-20-ОН, способны частично ингибировать прямой ответ ГАМК на рецептор ГАМК-А. Особое преимущество заключается в том, что такое блокирование достигается при фармакологически и физиологически приемлемых концентрациях.
Рецептор ГАМК-А является хлорид-ионным каналом, и рецептор ГАМК-А оказывает свое действие посредством изменения потока хлорид-ионов через канал. В области техники хорошо известно, что активность нейронов в мозге уменьшается, когда рецептор ГАМК-А открыт и осуществляется интенсивный приток хлорид-ионов в клетку. Также хорошо известно, что существует связь между количеством хлорид-ионов, перемещающихся внутрь клетки, и клиническим эффектом препаратов, активных по отношению к рецептору ГАМК-А.
Бензодиазепины, барбитураты и в какой-то мере алкоголь действуют через этот механизм. Тем не менее, это также считается и неблагоприятными эффектами данных препаратов. Проблема с рецептором ГАМК-А состоит в том, что он действует в большинстве областей мозга. Поэтому тотальные блокаторы действия ГАМК опасны и могут вызвать психотические симптомы и конвульсии. При необходимости подавления действия 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов желательно применять вещества, которые оказывают специфическое антагонистическое влияние на действие 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов и при отсутствии такого влияния на действие самой ГАМК. Однако в случаях, когда причиной нарушения является общая сверхстимуляция ГАМК-системы вследствие действия самой ГАМК, предпочтительно применение более общего антагониста, противодействующего действию самой ГАМК. Но если такие общие антагонисты полностью блокируют рецептор ГАМК-А, они являются опасными.
Следовательно, предпочтительными являются частичные антагонисты, такие как описанные в настоящем изобретении.
Как обсуждалось выше, существует ряд симптомов и патологических состояний, которые связаны с 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидами, и лечение указанных состояний можно проводить посредством блокирования действия 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов. Авторы настоящего изобретения обеспечивают вещества и способы для такого рода блокирования.
Кроме того, существуют состояния, которые обусловлены общей сверхстимуляцией системы ГАМК-А, и применение частичных блокаторов действия ГАМК представляло бы собой способ лечения таких состояний. Авторы настоящего изобретения обеспечивают вещества и способы для такого блокирования действия ГАМК.
В экспериментальной работе, описанной Принсом и Симмонсом (см. выше), использовали непрямой анализ связывания лиганда. Однако изучая связывание только ФН3, нельзя предположить, что такой же эффект будет наблюдаться при активности нейронов in vivo. Принс и Симмонс в своей работе также на это не претендовали. Они лишь обсуждают роль сайтов связывания стероидов и являются ли эти сайты одинаковыми или нет. Такое рассмотрение не является новым, и о возможности существования нескольких сайтов связывания стероидов сообщается в более ранних публикациях. Единственный вывод, сделанный ими, и возможные выводы, которые можно сделать на основании их экспериментальной идеи и модели, заключается в том, что стероид изменяет связывание ФН3 по-разному и некоторым образом взаимодействует с ФН3-связыванием. На основании результатов Принса и Симмонса невозможно сделать никакого вывода о влиянии на активность нейронов или клиническое значение.
В ходе создания настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что фармацевтически приемлемые и применимые дозы 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-ол-стероидов, в частности 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА, 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА, 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА; и 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА, являются селективными блокаторами действия 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов и, таким образом, блокируют развитие отрицательных эффектов 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов, но оказывают незначительное влияние на ингибирование ГАМК. Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что такие фармацевтически приемлемые и практически применимые дозы 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов с ацетатной группой (группами) в 3, 20 или 21 положениях, в частности 5альфа-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОНА АЦЕТАТА; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТА; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТА; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА 3-АЦЕТАТА; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТА; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА ДИАЦЕТАТА; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТА; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОНА 21-АЦЕТАТА, и некоторых 3бета-5 бета-стероидов, в частности 5бета-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОНА и 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОНА, являются частичными блокаторами действия ГАМК.
Авторы настоящего изобретения установили как механизмы, лежащие в основе нарушений, вызванных 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидами, так и самой ГАМК. В области техники установлено, что 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероиды вызывают нарушения ЦНС посредством трех возможных механизмов: а) прямое действие, б) индукция толерантности и в) эффект отмены. Кроме того, установлено, что глобальная сверхстимуляция ГАМК в конечном счете нарушает функцию системы ГАМК-А, и в число нарушаемых функций входят память и обучение, что, как известно, происходит, например, при болезни Альцгеймера.
Для сравнения, в ранее описанных изобретениях, например Bolger et al., патент США №5,232,917, и Upasani et al., патент США №5,939,545, не описаны какие-либо 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероиды в качестве модуляторов рецептора ГАМК-А, ни в патентах, ни в соответствующих им научных публикациях (Lan N.C., Gee K.W, Bolger M.B. & Chen J.S. (1991), Differential responses of expressed recombinant human gamma-aminobutyric acidA receptors to neurosteroids. Journal of Neurochemistry, 57(5): 1818-1821).
Следовательно, в наиболее широком своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает химические вещества, способные блокировать действие 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидов на рецептор ГАМК-А, но не действие самой ГАМК, а также частичные антагонисты действия ГАМК.
В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, которая содержит соединение, способное блокировать действие 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидов на рецептор ГАМК-А человека или представляющее собой частичный блокатор действия ГАМК. Предпочтительно указанное соединение (таблицы 2, 3) присутствует в форме применимой и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно соли натрия.
В другом своем аспекте настоящее изобретение обеспечивает общий способ лечения и/или предотвращения связанных со стероидами нарушений ЦНС у пациентов, согласно которому пациенту вводят, по меньшей мере, одно соединение, которое способно блокировать действие 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидов на рецептор ГАМК-А человека. Предпочтительно указанное соединение содержит группу-донор водорода в 3бета положении, который представляет собой группу, выбранную из гидрокси- и сульфатной группы, и гидрокси-группу в 20 положении. Наиболее предпочтительно указанное соединение выбрано из веществ, представленных в таблице 2. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает общий способ для лечения и/или предотвращения у пациента нарушений ЦНС, связанных с общей сверхстимуляцией рецепторов ГАМК-А, согласно которому указанному пациенту вводят, по меньшей мере, одно соединение, способное частично блокировать действие ГАМК на рецептор ГАМК-А. Наиболее предпочтительные соединения входят в список соединений, приведенный в таблице 3. Предпочтительно указанное соединение применяют в форме подходящей и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно натриевой соли.
Согласно настоящему изобретению, по меньшей мере, одно указанное соединение вводят посредством одного из следующих путей введения: внутривенно, назально, ректально, интравагинально, через кожу и орально.
Согласно одному из предпочтительных способов реализации изобретения, по меньшей мере, один стероид вводят внутривенно. Согласно другому предпочтительному способу реализации изобретения, по меньшей мере, один указанный стероид вводят назально.
Назальное введение, в частности, является перспективным выбором, поскольку оно предлагает преимущества, связанные с удобством и возможностью самостоятельного приема пациентом. Самостоятельный прием имеет преимущество, позволяющее пациенту регулировать дозу или частоту приема лекарственного препарата в соответствии либо с субъективной оценкой своего состояния, либо в соответствии с расписанием, предписанным лечащим врачом. Термин «расписание, предписанное лечащим врачом» включает возможность, при которой пациент субъективно оценивает свое состояние либо с помощью вопросника или оценочной шкалы, либо без нее, либо используя алгоритм или компьютерную программу, указывающую следующую подходящую дозу.
Введение через кожу с применением веществ, входящих в состав препаратов в форме крема, геля, мази или в форме клейких медицинских пластырей с замедленным высвобождением, представляет собой другую возможную форму введения, также подходящую для самостоятельного лечения. Преимущества самостоятельных способов введения препарата, указанные выше, относятся также к способам введения через кожу с дополнительным преимуществом, заключающимся в том, что при желании или необходимости введение можно легко предотвратить, например при удалении медицинского пластыря.
В любом из перечисленных или других путях введения препарата состав композиции может быть адаптирован или скорректирован согласно стандартным фармакологическим процедурам, включая эффективные фармацевтические препараты в химической форме, пригодной для выбранного пути введения, наряду с применимыми адъювантами и носителями, применяемыми в обычной практике и известными специалистам.
Применяемые в обычной практике адъюванты и носители для орального введения представляют собой, например, наполнители или суспендирующие средства, такие как диоксид титана, лактозный ангидрид, двуокись кремния, коллоидная двуокись кремния, метилцеллюлоза, стеарат магния, микрокристаллическая целлюлоза и т.п.
Применяемые в обычной практике адъюванты и носители для внутривенного введения представляют собой, например, стерильную воду для инъекций (ВДИ), стерильные буферы (например, буферные растворы с рН 7,4), альбуминовые растворы, липидные растворы и т.п.
Применяемые в обычной практике адъюванты и носители для трансдермального введения представляют собой, например, вазелин, жидкий парафин, глицерин, воду и т.п.
Дозы можно легко варьировать в зависимости от способа введения, конкретного патологического состояния, подлежащего лечению, или желаемого эффекта, пола, возраста, веса и состояния здоровья пациента, а также, возможно, и других показателей, оцененных лечащим врачом.
Согласно настоящему изобретению при внутривенном введении, по меньшей мере, одного указанного стероида подходящий интервал дозирования составляет от приблизительно 0,2 до 200 мг на кг массы тела, предпочтительно от 0,2 до 2; от 2 до 10; от 10 до 20; от 20 до 40; от 40 до 80; от 80 до 120; 120-160 и от 160 до 200 мг на кг массы тела. Предварительные исследования на животных показали, что предпочтительный интервал для внутривенного введения составляет от приблизительно 20 до 100 мг на кг массы тела.
Соответствующие диапазоны дозирования для других способов введения может легко вычислить специалист в данной области и при необходимости проверить их при помощи не находящихся на уровне изобретения тестов на животных или доклинических или клинических исследований.
Один из способов реализации настоящего изобретения представляет собой способ лечения связанных со стероидами или вызванных ими нарушений ЦНС, в частности предменструального синдрома, согласно которому развитие толерантности и понижающей регуляции рецептора ГАМК-А предотвращают посредством введения, по меньшей мере, одного вещества согласно настоящему изобретению. Такое лечение должно сохранить чувствительность системы ГАМК-А и ингибировать развитие состояния с меньшей чувствительностью во время лютеальной фазы. В экспериментах на крысах показано, что в ходе продолжительной обработки прогестероном наблюдается изменение рецептора ГАМК-А. Лечение 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидами или 3бета-сульфат-5альфа/дельта5-прегнан/прегнен-стероидами согласно настоящему изобретению назначают для предотвращения развития толерантности и, таким образом, для препятствования возникновению эффекта отмены при прекращении приема 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов.
Развитие толерантности уменьшает чувствительность к образующимся эндогенно ГАМК-А-усиливающим веществам, таким как 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-он или бензодиазепины. При быстром прекращении приема лекарства, так же как в конце лютеальной фазы менструального цикла, после отмены 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-стероидов возникает эффект спада. Такую ситуацию наблюдают у людей с усилением мигрени и эпилептических приступов в ходе менструации вскоре после прекращения продукции и отмены доступа стероидов.
Таким образом, другой способ реализации настоящего изобретения представляет собой способ лечения или предотвращения развития толерантности и/или симптомов отмены путем введения, по меньшей мере, одного вещества согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу лечения и/или предотвращения связанных со стероидами или вызванных ими нарушений настроения у пациентов, описанных выше, согласно которому указанному пациенту вводят, по меньшей мере, один 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-ол-стероид.
Предпочтительно указанное стероидное соединение выбрано из стероидов, представленных в таблице 2. Наиболее предпочтительно указанное соединение применяют в форме подходящей и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно натриевой соли.
Подходящие пути введения являются, например, следующими: внутривенный, назальный, ректальный, интравагинальный, введение через кожу и оральный способы введения.
Однако для лечения большинства нарушений ЦНС и для применения в качестве противоанестезирующих агентов предпочтительно внутривенное введение эффективного соединения или соединений.
Подходящими дозами согласно изобретению при внутривенном способе введения являются дозы в интервале от приблизительно 0,2 до приблизительно 200 мг на кг массы тела, предпочтительно от 0,2 до 2; от 2 до 10; от 10 до 20; от 20 до 40; от 40 до 80; от 80 до 120; 120-160 и от 160 до 200 мг на кг массы тела, наиболее предпочтительно от приблизительно 20 до 100 мг/кг.
Как описано выше, состав композиции может быть адаптирован или скорректирован в соответствии со стандартными фармакологическими процедурами. Кроме того, дозу можно легко варьировать в зависимости от способа введения, конкретного патологического состояния, которое подлежит лечению или желаемого эффекта, пола, возраста, веса и состояния здоровья пациента, а также, возможно, и других показателей по оценкам лечащего врача.
Кроме того, настоящее изобретение охватывает способы лечения и/или предотвращения связанных со стероидами или вызванных ими нарушений ЦНС у пациента, согласно которым указанному пациенту вводят один или более 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-ол-стероидов (см. таблицу 2) в фармацевтически и физиологически приемлемой дозе. Предпочтительно указанное стероидное соединение выбрано из стероидов, представленных в таблице 2. Наиболее предпочтительно указанное соединение применяют в форме подходящей и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно натриевой соли.
Примерами симптомов и патологических состояний, вызванных действием 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов, являются успокоение, усталость, нарушение памяти, нарушение обучения, нарушение моторной функции, неповоротливость, повышенный аппетит и тяга к пище, подавленное настроение, раздражительность и депрессия, которые являются основными симптомами предменструального синдрома и ухудшения состояния при малой эпилепсии.
Состояния и симптомы, вызванные развитием толерантности после длительного (дни) воздействия 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов, представляют собой, например, чувствительность к стрессу, затруднение концентрации, связанные со стрессом или менструальным циклом трудности концентрации, нарушения сна, усталость, потерю контроля мотивации и депрессию. 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероиды также усиливают лекарственную/наркотическую зависимость. Согласно настоящему изобретению такие состояния или симптомы можно предотвратить, облегчить или лечить путем введения, по меньшей мере, одного 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-ол-стероида пациенту. Предпочтительно указанное стероидное соединение выбрано из стероидов, представленных в таблице 2. Наиболее предпочтительно указанное соединение применяют в форме подходящей и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно натриевой соли.
Непрерывное, но более короткое воздействие 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидами приводит к возникновению эффекта отмены при прекращении воздействия. Это явление наблюдается в ходе менструации при прекращении выработки 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов желтым телом яичника. Такой феномен отмены также наблюдается после родов (post partum) при прекращении продукции 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов плацентой. Такой же феномен также отмечен при завершении периода стресса и при прекращении продукции 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-стероидов надпочечниками, наблюдаемой в ходе стресса. Примерами патологических состояний, которые находятся под влиянием такого феномена отмены/абстиненции, являются частичная эпилепсия, при которой у пациента формируется эпилептический фокус в коре головного мозга и ухудшение происходит в период отмены в ходе менструации. Этот феномен называют «менструальная эпилепсия». Другими примерами являются связанная с менструацией мигрень, мигрень, связанная со стрессом, и изменение настроения после родов (post partum). Синдром отмены является признаком сформировавшейся ранее толерантности.
Примеры таких нарушений, которые, как предполагается, связаны со стероидами или вызваны ими, включают следующие: эпилепсия, эпилепсия, зависимая от менструального цикла, депрессия, депрессия, связанная со стрессом, мигрень, усталость и в частности связанная со стрессом усталость, предментсруальный синдром, предментсруальное дисфорическое расстройство, связанные с менструальным циклом изменения настроения, связанные с менструальным циклом изменения памяти, связанные со стрессом изменения памяти, связанные с менструальным циклом трудности концентрации, связанное с менструальным циклом нарушение сна и усталость. Существуют четкие указания на то, что ожирение и повышенный аппетит, а также некоторые формы нарушений баланса, злоупотребление алкоголем и некоторыми веществами также являются нарушениями, связанными со стероидами или вызванными ими. Настоящее изобретение, таким образом, обеспечивает вещества и способы лечения, облегчения симптоматики или предотвращения таких патологических состояний.
Одним из предпочтительных способов реализации настоящего изобретения, направленным на проблему, с которой сталкиваются многие женщины, является способ лечения и/или предотвращения побочных эффектов постклимактерической терапии у пациентов, согласно которому указанному пациенту вводят, по меньшей мере, один 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-ол-стероид. Предпочтительно указанное стероидное соединение выбирают из стероидов, представленных в таблице 2. Наиболее предпочтительно указанное соединение применяют в форме пригодной и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно натриевой соли.
Другой предпочтительный способ реализации изобретения представляет собой способ лечения и/или предотвращения побочного действия пероральных противозачаточных средств у пациентов, при таком способе лечения указанному пациенту вводят, по меньшей мере, один 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-ол-стероид. Предпочтительно указанное стероидное соединение выбирают из стероидов, перечисленных в таблице 2. Наиболее предпочтительно указанное соединение применяют в форме подходящей и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно натриевой соли.
В данной заявке предпочтительным является введение пациенту эффективной композиции, которая содержит, по меньшей мере, один из приведенных выше 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов или 3бета-сульфат-5альфа/дельта5-прегнан/прегнен-стероидов, совместно с пероральным противозачаточным средством, применяемым пациентом. Назальное введение и введение через кожу являются также пригодными путями введения.
Таким образом, одним из частных способов реализации настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, которая содержит пероральное противозачаточное средство и терапевтически подходящую дозу, по меньшей мере, одного химического соединения, способного блокировать действие 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидов на рецептор ГАМК-А человека, причем указанное/указанные соединение/соединения содержат группу-донор водорода в 3бета положении в виде группы, выбранной из гидрокси- и сульфатной групп, и гидрокси-группу в 20 положении. Предпочтительно указанное соединение выбрано из стероидов, перечисленных в таблице 2. Наиболее предпочтительно указанное соединение применяют в форме подходящей и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно натриевой соли.
Кроме того, в указанном способе реализации настоящего изобретения доза химического соединения, способного блокировать действие 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидов на рецептор ГАМК-А человека предпочтительно согласована с уровнем эндогенных стероидов в ходе стресса или в менструальный период. Согласно настоящему изобретению химическое соединение, способное блокировать действие 3альфа-гидрокси-прегнан-стероидов на рецептор ГАМК-А человека, можно включить в состав перорального противозачаточного средства для того, чтобы как облегчить, так и снять побочные эффекты пероральных противозачаточных средств, или для того, чтобы облегчить или снять какой-либо нежелательный эффект периодических изменений уровня эндогенных стероидов.
В общем, настоящее изобретение охватывает применение 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-ол-стероидов, в частности стероидов, перечисленных в таблице 2, либо по отдельности, либо в комбинации для производства фармацевтического препарата для лечения или предотвращения любого из нарушений, связанных с 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидами или вызванных ими, описанных в изобретении, и в особенности одного или нескольких следующих нарушений: эпилепсии, эпилепсии, зависимой от менструального цикла, депрессии, связанной со стрессом депрессии, мигрени, усталости, в частности усталости, связанной со стрессом, предменструального синдрома, предменструального дисфорического расстройства, изменений настроения, связанных с менструальным циклом, изменений памяти, связанных с менструальным циклом, связанных со стрессом изменений памяти, затруднений концентрации, связанных с менструальным циклом, связанных с менструальным циклом нарушений сна и усталости. Предпочтительно указанное соединение применяют в форме подходящей и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно натриевой соли.
Другой предпочтительный способ реализации изобретения представляет собой способ лечения и/или предотвращения нарушений, вызванных сверхстимуляцией гамма-аминомасляной кислотой (ГАМК) при помощи 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов котрые содержат ацетатную группу или группы в 3, 20 и 21 положениях, и некоторых 3бета-гидрокси-5бета-прегнан-стероидов.
Известно, что интенсивная стимуляция рецептора ГАМК-А самой ГАМК в определенных случаях ингибирует функцию обучаемости и памяти. Сверхстимуляция системы рецептора ГАМК-А ухудшает функцию краткосрочного обучения и памяти, что имеет особо важное клиническое значение у пожилых людей. В таком случае антагонистическое влияние на действие ГАМК должно быть полезным и может применяться в качестве лечения нарушений памяти. Однако если антагонистическое действие на ГАМК является слишком интенсивным, оно будет опасным и вызовет конвульсии. Следовательно, предпочтительными являются антагонисты, которые оказывают частичное антагонистическое влияние на ГАМК-индуцированные изменения в рецепторе ГАМК-А, но полностью не блокируют рецептор ГАМК-А. Кроме того, настоящее изобретение охватывает способ лечения и/или предотвращения нарушений ЦНС у пациентов, вызванных общей сверхстимуляцией системы рецептора ГАМК-А, согласно которому указанному пациенту вводят в фармацевтически и физиологически приемлемой дозе один или более 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероид, который содержит ацетатную группу или группы в 3, 20 и 21 положениях, и некоторые 3бета-гидрокси-5бета-прегнан-стероиды (см. таблицу 3). Предпочтительно указанное стероидное соединение выбрано из группы, включающей следующие стероиды: 5альфа-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОНА АЦЕТАТ; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА 3-АЦЕТАТ; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛА ДИАЦЕТАТ; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОНА21- АЦЕТАТ, 5бета-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОН и 5бета-ПРЕГНАН-3бета, 21-ДИОЛ-20-ОН, указанные в Таблице 3. Наиболее предпочтительно указанное соединение применяют в виде подходящей и фармацевтически приемлемой соли, наиболее предпочтительно натриевой соли. Особое преимущество состоит в том, что блокирование осуществляется в фармакологически и физиологически приемлемых концентрациях.
Примерами таких нарушений, которые, как считают, связаны с сверхстимуляцией системы ГАМК или вызваны ей, являются болезнь Альцгеймера (AD) и легкое когнитивное нарушение (ЛКН) в особенности у пожилых людей. Настоящее изобретение, таким образом, предоставляет вещества и способы лечения, облегчения симптоматик или предотвращения таких патологических состояний.
Примеры
Настоящее изобретение основано на экспериментах in vitro, выполненных для подтверждения специфичности раздельного действия на блокирование усиленного 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидами ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов и блокирующего действия на ответ собственного действия ГАМК. Результаты, полученные в тестах in vitro с рекомбинантными рецепторами ГАМК-А, экспрессируемыми на поверхности ооцитов Xenopus laevis, подтверждены в тестах с использованием кортикальной ткани самцов крыс, выполненных авторами настоящего изобретения.
Изучение изменения потока хлорид-ионов через рекомбинантные рецепторы ГАМК-А (альфа1, бета2, гамма2L), экспрессированные в ооцитах Xenopus laevis с применением методов фиксации напряжения
Рекомбинантный рецептор ГАМК-А, используемый для тестирования стероидов по настоящему изобретению, экспрессировали в ооцитах Xenopus laevis. Ооциты обладают способностью синтезировать белки, располагающиеся на поверхности мембраны, с молекулы мРНК, инъецированной в ооцит. Рецептор содержит пять белков трех различных типов, и в условиях настоящего тестирования получали мРНК для подтипов рецептора альфа1, бета2, гамма2L. Эти подтипы рецептора ГАМК-А являются наиболее общими в центральной нервной системе. Такие рецепторы ГАМК-А содержат два белка альфа1, два бета2 и один белок гамма. После 48 часов инкубации рецепторы ГАМК-А встраивались в мембрану и вели себя в условиях in vitro так же, как рецептор in situ. Поэтому эта модельная система рассматривается специалистами как подходящая система тестирования in vitro лекарственных препаратов, активных по отношению к рецептору ГАМК-А. Поток хлорид-ионов через хлорный канал является результатом действия ГАМК на рецептор ГАМК-А, а модуляторы рецептора ГАМК-А, такие как 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероиды, могут повышать эффективность действия ГАМК. Поток хлорид-ионов через рецептор измеряют как электрический ток, индуцированный перемещением ионов, при помощи метода фиксации напряжения. Можно получить кривые доза-ответ для агонистов и антагонистов, и ток зависит от активации рецептора ГАМК-А, наблюдающейся после взаимодействия между различными дозами агонистов и антагонистов. Нормируя данные относительно определенного значения тока, в настоящем анализе составляющего 2 мкА, можно сравнивать результаты для различных ооцитов, а нормируя изменение тока относительно определенной дозы, составляющей в данном анализе 10 мкМ, можно сравнивать различные тестируемые вещества. Индуцированное 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном усиление ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов было принято за 1 и было получено путем обработки ооцитов, экспрессирующих ГАМК-А рецептор, 3 мкМ ГАМК + 3 мкМ 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-она в термостате в условиях in vitro. Поток хлорид-ионов оценивали как ток, индуцированный транспортом хлорид-ионов через рецепторы ГАМК-А. Индуцированный ГАМК поток хлорид-ионов принимали за 1 и получали путем обработки ооцитов, экспрессирующих ГАМК-А рецептор, in vitro 30 мкМ ГАМК. Ингибирующий эффект на 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-он-индуцированное усиление ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов тестируемых UC-стероидов сравнивали с ингибирующим эффектом таких же UC-стероидов на активизацию ГАМК рецептора ГАМК-А. Результаты показаны на Фиг.1 и в таблице 4. На Фиг.1 UC-стероиды с низким уровнем антагонизма по отношению к ГАМК обозначены X, а UC-стероиды с частичным антагонизмом по отношению к ГАМК обозначены черной точкой (•).
На Фиг.1 показана взаимосвязь между ингибированием максимального ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов (30 мкМ ГАМК), Х-оси, и ингибированием усиленного 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов, Y-оси, в рекомбинантных рецепторах ГАМК-А (альфа1, бета2, гамма2L), экспрессированных в ооцитах Xenopus laevis. На чертеже результаты нормированы относительно контрольных значений тока, активированного 30 М ГАМК или 3 мкМ ГАМК + 3 мкМ 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном. Контрольное значения тока в отсутствие стероидных антагонистов нормировано к 0. Каждый стероидный антагонист тестировали при 10 мкМ. Черные крестики (X) обозначают стероиды, демонстрирующие слабое снижение ингибирования ГАМК, но которые значительно ингибируют усиленный 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ГАМК-опосредованный ответ. Черной точкой (•) обозначены стероидные антагонисты, ингибирующие как прямой ответ ГАМК (30 мкМ), так и усиленный 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ответ ГАМК. 3начения соответствуют номерам продукта, а нумерация с соответствующими полными названиями различных веществ представлена в таблицах 2 и 3.
В таблице 4 представлены результаты проанализированного антагонистического влияния UC-стероидов на стимулированный 3 мкМ ГАМК + 3 мкМ 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном поток хлорид-ионов, а также на поток хлорид-ионов, стимулированный 30 мкМ ГАМК. На антагонизм были протестированы 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-20-гидрокси-стероиды и 3бета-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероиды с ацетатной группой или группами в 3, 20 и 21 положениях и некоторые 3бета-гидрокси-5бета-прегнан-стероиды, показанные в таблицах 2 и 3. Некоторые из стероидов (5альфа АЛЬФА-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОН, UC1010; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛ; UC1011; 5альфа-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОНА АЦЕТАТ, UC1012; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛ, UC1013; 5бета-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОН, UC1014; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОН, UC1015) были ранее описаны в заявках на патент WO 99/45931 и WO 03/059357 и включены в данную заявку только для полноты представленных данных. Для некоторых стероидов, описанных в WO 03/059357, в настоящем исследовании было показано наличие дополнительных эффектов, а именно слабого антагонистического влияния на саму ГАМК (5альфа-ПРЕГНАН-3бета,20бета-ДИОЛ, UC1011; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,20альфа-ДИОЛ, UC1013), тогда как для других в настоящем исследовании было показано наличие частичного антагонистического влияния на действие ГАМК (5альфа-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОНА АЦЕТАТ, UC1012; 5бета-ПРЕГНАН-3бета-ОЛ-20-ОН, UC1014; 5бета-ПРЕГНАН-3бета,21-ДИОЛ-20-ОН, UС1015).
Таблица 4
Среднее нормированное-1 значение антагонистического действия веществ UC, 10 мкМ, по отношению к стимулированному 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном+ГАМК или только одной ГАМК потоку хлорид-ионов через рецептор ГАМК-А крысы, экспрессированный в ооцитах Xenopus laevis в виде альфа1, бета2, гамма2L
Код UС
Среднее нормированное-1 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-он ингибирование
Среднее нормированное-1 ГАМК ингибирование
только ГАМК
,00
3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-он
,00
UC1010
-,37
-,26
UC1011
-,21
-,17
UC1012
-,42
-,37
UC1013
-,30
-,23
UC1014
-,45
-,39
UC1015
-,43
-,40
UC1019
-,36
-,17
UC1020
-,41
-,10
UC1021
-,34
-,44
UC1022
-,40
-,27
UC1023
-,42
-,32
UC1024
-,36
-,59
UC1025
-,43
-,41
UC1026
-,30
-,45
UC1030
-,45
-,31
Исследования по ингибированию 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-она проводили в присутствии 3 мкМ ГАМК + 3 мкМ 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-она. Исследования по антагонизму по отношению к ГАМК проводили при концентрации 100 мкМ ГАМК. Полученные значения тока нормировали относительно стимулирования 2 микроампер, средние значения эффекта, представленные в таблице, нормированы-1 относительно 3 мкМ 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-она и 100 мкМ ГАМК соответственно. Количество анализируемых клеток n=3-10.
Изучение гомогената кортикальной ткани
Некоторые из стероидов (см. Фиг.2), проанализированных на модели ооцитов Xenopus, были также протестированы авторами настоящего изобретения на способность ингибировать эффект 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов на модели рецептора ГАМК-А тока хлорид-ионов. Рецепторы ГАМК-А, использованные в экспериментах по току хлорид-ионов, были получены из кортикальной ткани крыс, которая является репрезентативной частью головного мозга для оценки эффектов рецепторов ГАМК-А. Поскольку результаты, полученные при помощи двух методик, являются сходными, с высокой степенью вероятности можно предположить, что результат, полученный в этой модели, может быть подтвержден на высших млекопитающих и человеке.
В этих способах анализа кортикальную ткань от зрелых самцов крыс гомогенизировали в буфере. Как результат этой процедуры получали суспензию маленьких везикул, при этом указанные везикулы имели на своей поверхности рецепторы ГАМК-А.
При добавлении радиоактивных хлорид-ионов к этой суспензии определенное количество попадало в везикулы. Эта количество зависит от того, насколько рецептор ГАМК-А является открытым. Лекарственные препараты, которые открывают рецептор, увеличивают количество хлорид-ионов в везикулах относительно дозы препарата. Аналогично, лекарства, которые закрывают рецептор ГАМК-А, уменьшают количество хлорид-ионов, попадающих в везикулы. Меченые хлорид-ионы вне везикул смывают и отделяют от хлорид-инонов внутри везикул. Количество радиоактивно меченных хлорид-ионов в везикулах затем измеряли в жидкостном сцинтилляторе и получали кривую. В каждом эксперименте использовали контроль с возрастающими дозами ГАМК для проверки работы образцов ткани. В качестве второго использованного контроля строили кривую верхняя доза-ответ с 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнано-20-оном + 10 мкм ГАМК.
На Фиг.2 показана взаимосвязь между ингибированием усиленного 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов через рекомбинантные рецепторы ГАМК-А (альфа1, бета2, гамма2L), экспрессированные в ооцитах Xenopus laevis, и ингибированием усиленного 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном ГАМК-опосредованного тока хлорид-ионов в кортикальные микромешочки из кортекса самцов крыс. Данные на осях Х и Y представлены как нормированные значения -1 для демонстрации ингибиторного эффекта отдельных веществ. Эффект 3 мкМ ГАМК + 3 мкМ 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-она принимали за 0 для данных ооцитов. Каждый стероид тестировали в концентрации 10 мкМ. Данные, полученные при анализе потока хлорид-ионов, нормировали против эффекта 10 мкМ ГАМК + 1 мкМ 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-она, который был принят за 0. Каждый стероид тестировали в концентрации 30 мкМ. 3начения соответствуют номерам продукта, а полные наименования различных веществ представлены в таблицах 2 и 3. Линия регрессии для зависимости дает нормированное-1 значение ингибирования 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-одна в ооцитах = -0,04+0,96*.
Нормированное-1 значение тока хлорид-ионов в кортикальные микромешочки. Коэффициент корреляции Пирсона r=0,90; р<0,002. Два различных метода для выявления ингибирующих свойств UC-стероидов дают хорошо согласующиеся результаты. Результаты показывают, что существуют различия в эффектах стероидов.
Рекомбинантный рецептор ГАМК-А, применяемый для тестирования стероидов в настоящем изобретении, экспрессировали в ооцитах Xenopus laevies. Ооциты обладают широкими возможностями для экспрессии мембранных белков на основе мРНК, инъецированной в ооцит. Рецептор содержит три различных белка, и в условиях настоящего эксперимента получали мРНК для подтипов рецептора альфа1, бета2, гамма2L. Эти подтипы рецептора ГАМК-А являются наиболее распространенными в центральной нервной системе. Такие рецепторы ГАМК-А ведут себя в условиях in vitro так же, как рецептор in situ, и поэтому рассматриваются специалистами как подходящая система тестирования in vitro лекарственных препаратов, активных по отношению к рецептору ГАМК-А. Поток хлорид-ионов через хлорный канал является результатом действия ГАМК на рецептор ГАМК-А, и эффективность ГАМК могут повышать модуляторы рецептора ГАМК-А, такие как 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероиды. Электрический ток, индуцированный потоком хлорид-ионов через рецептор, измеряют при помощи метода фиксации напряжения. Можно получить кривые доза-ответ, и нормируя данные относительно определенного значения тока, в настоящем анализе составляющего 2 мкА, можно сравнивать результаты для различных ооцитов, а нормируя изменение тока относительно определенной дозы, составляющей в данном анализе 10 мкМ, можно сравнивать различные тестируемые вещества. Ингибирующий эффект протестированных UC-стероидов на индуцированное 3альфа-гидрокси-5альфа-прегнан-20-оном усиление ГАМК-опосредованного потока хлорид-ионов сравнивали с ингибирующим эффектом тех же UC-стероидов на активацию ГАМК рецептора ГАМК-А. Результаты представлены с различными обозначениями на Фиг.1. Для некоторых из стероидов (см. Фиг.2), исследованных на модели ооцитов Xenopus, настоящими изобретателями также было показано, что они ингибируют эффект 3альфа-гидрокси-5альфа/бета-прегнан-стероидов на модели транспорта хлорид-ионов через рецептор ГАМК-А. Рецепторы ГАМК-А, использованные в экспериментах по поглощению хлорид-ионов, были получены из кортикальной ткани крыс, являющейся репрезентативной частью мозга для измерения эффектов рецептора ГАМК-А. С высокой степенью вероятности можно предположить, что результаты, полученные в этой модели, могут быть подтверждены на высших млекопитающих и человеке.
Хотя изобретение описано в отношении предпочтительных способов его реализации, которые представляют наилучший способ, известный на настоящий момент изобретателям, следует понимать, что различные изменения и модификации, как очевидно для специалистов в данной области, можно осуществлять, не выходя за объем охвата изобретения, который изложен в формуле, прилагаемой к этому документу.