КОМБИНАЦИЯ (ВАРИАНТЫ) И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ
COMBINATION (VERSIONS) AND PHARMACEUTICAL PREPARATION FOR TREATMENT OF RESPIRATORY TRACT DISEASES

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к медицине и фармакологии, конкретно к комбинации ингаляционного/перорального ингибитора фосфодиэстеразы типа 4 (PDE 4) в сочетании с ингаляционными антихолинергическими бронхолитическими агентами (антагонистами мускариновых рецепторов), предпочтительно рофлумиластом или AWD-12-281 и R,R-гликопирролатом для симптоматического или профилактического лечения заболеваний дыхательных путей, в особенности сопровождающихся обструкцией или воспалением, таких как хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD) или астма. Кроме того, изобретение включает представление данной комбинации в препарате для местного (ингаляционного) применения и применение в ингаляционном устройстве, например в Novolizer.
Уровень техники
Бронхиальная астма, поражающая такую большую часть, как 10% населения в промышленно развитых странах, характеризуется бронхостенозом, хроническим воспалением дыхательных путей, повышенной реактивностью дыхательных путей и отеком слизистых оболочек.
Ремоделирование дыхательных путей и измененная нехолинергическая неадренергическая нейротрансмиссия может участвовать в необратимой обструкции дыхательных путей и снижении легочной функции. Бронхиальная астма возникла в качестве большой проблемы общественного здравоохранения во всем мире в последние 20 лет. Хотя данные показывают, что современные терапевтические препараты против астмы ведут к ограниченному снижению уровней смертности, она продолжает оставаться значительной проблемой здравоохранения (см. статью Mannino et al., Surveill Summ., 2002, 51:1-13). Кроме того, во всем мире она представляет собой одно из ведущих оснований для профилактической госпитализации и является причиной потери нескольких миллионов рабочих дней. Наряду с расширением распространения астмы также резко возросли затраты, связанные с данным заболеванием.
Хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD) также очень распространено. Данное заболевание характеризуется прогрессирующими ограничениями потока воздуха, сопровождающимися воспалительными реакциями. Из обзора данных, полученных во всем мире, ясно, что курение табака не является единственной причиной COPD. Во всем мире старение также представляет собой определенный фактор риска.
Распространенность COPD варьирует, она может составлять от 3% до 10% при тенденции к неуклонному повышению. Хотя COPD является ведущей причиной болезни и смерти, ее признание в качестве проблемы общественного здравоохранения развивалось медленно, несмотря на возрастающий уровень смертности от COPD и снижение уровней смертности от большинства сердечно-сосудистых заболеваний (см. статью Hurd, Chest, 2000, 117 (2 Suppl):1S-4S). Кроме того, COPD дает существенную экономическую нагрузку на отдельных людей и общество.
В настоящее время имеется веское доказательство того, что воспаление дыхательных путей представляет собой доминирующую основную проблему у больных астмой. Патофизиология астмы включает сложную систему молекулярных и клеточных взаимодействий, хотя вклад каждого отдельного фактора, вероятно, различается у разных пациентов в зависимости от окружающей обстановки и стимула. Основные факторы, участвующие в развитии астматического фенотипа, включают пусковые стимулы, такие как сами аллергены, клетки, такие как Т-клетки, эпителиальные клетки и тучные клетки, которые продуцируют множество цитокинов, включая ИЛ-5 (интерлейкин-5), GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), ИЛ-3, ИЛ-4 и ИЛ-13, и хемокины, такие как эотаксин, молекулы адгезии и т.п. Современные подходы к пониманию воспалительных и иммунологических механизмов астмы показали много потенциальных терапевтических путей, которые могут предупредить или привести к обратному развитию отклонения от нормы, которые лежат в основе астмы.
В настоящее время фармакотерапия является основой лечения астмы. Имеются агонисты β2-адреноцепторов короткого и длительного действия. Агонисты β2-адреноцепторов короткого действия теперь используют по необходимости для быстрого облегчения симптомов. В последние годы возрастает роль агонистов β2-адреноцепторов длительного действия в лечении астмы, в особенности у пациентов с астмой средней тяжести до тяжелой. Антимускариновые лекарственные препараты даже менее эффективны в плане облегчения приступа астмы, чем агонисты β2-адреноцепторов (см. статью Rodrigo and Rodrigo, Chest, 2002, 121:1977-87).
Однако с внедрением нового антихолинергического препарата тиотропиума применение антихолинергических агентов при заболеваниях дыхательных путей будет в значительной степени расти. Ингаляционные глюкокортикоиды стали основой терапии хронической астмы. Они являются наиболее клинически эффективными препаратами из имеющихся, но могут давать серьезные вторичные эффекты и, более того, неэффективны у астматиков с устойчивостью к кортикостероидам.
В целом о патогенезе COPD известно гораздо меньше, чем о патогенезе астмы. Недавнии исследования значительно расширили понимание патогенетических механизмов, лежащих в основе COPD. Так, пришли к мнению, что COPD также представляет собой воспалительное заболевание. С современной точки зрения на патогенез нейтрофильные гранулоциты, лимфоциты CD8+ и макрофаги играют, возможно, определяющие роли в патогенезе COPD.
3
В настоящее время лечение сконцентрировано на улучшении функции легких пациентов, страдающих COPD. Первой стадией в данном процессе является прекращение курения. Имеются доказательства, что уменьшение или отказ от курения может привести в результате к улучшению ряда респираторных параметров. Бронхолитические агенты (агонисты β2-адреноцепторов и антихолинергические агенты) в настоящее время являются основой симптоматической терапии. Агонисты β2-адреноцепторов короткого и длительного действия, такие как сальбутамол, фенотерол, сальметерол, формотерол, являются принятыми терапевтическими средствами для симптоматического лечения COPD. Из антимускариновых лекарственных препаратов короткого действия широко используют ипратропиум. Недавно во всем мире был внедрен тиотропиум, антихолинергический препарат длительного действия с некоторой избирательностью в отношении мускариновых рецепторов М (см. статью Hansel and Barnes, Drugs Today (Barc), 2002, 38:585-600). Антихолинергические агенты также можно эффективно использовать при лечении COPD у лошадей. Ипратропиум в дозе 2400 мкг/лошадь является эффективным бронхолитиком у лошадей, больных COPD (см. статьи Duvivier et al., Equine Vet J, 1999, 31:20-4; Bavlv et al., Equine Vet J., 2002, янв., 34(1):36-43).
В настоящее время проблема противовоспалительной терапии COPD не решена. Применение системных и ингаляционных глюкокортикоидов при COPD заметно возрастает в течение последних 20 лет. Они были протестированы в связи с предположением, что воздействие на воспаление при COPD должно изменить течение болезни. Хотя ингаляционные кортикостероиды имеют доказанный положительный эффект при лечении астмы, но до недавнего времени их эффективность при неастматическом COPD, связанном с курением, не была подтверждена (см. статью Bonay et al., Drug Saf, 2002, 25:57-71). Ингаляционные глюкокортикоиды оказывают относительно незначительное воздействие на воспалительные процессы, которые характеризуют COPD (см. статью Adcock and Chung, Curr Opin Investig Drugs, 2002, 3:58-60). Вследствие этого они показаны при наличии сильного бронхолитического ответа или когда пациент имеет более тяжелое заболевание с частыми обострениями (см. статью Alsaeedi et al., Am J Med, 2002, 113:59-65).
Обструкция потока воздуха и воспаление дыхательных путей являются признаками астмы, а также COPD. Хотя воспаление дыхательных путей при астме и COPD, соответственно, включает различные типы клеток, оба заболевания имеют хроническую воспалительную природу, ассоциированную с инфильтрацией и активацией клеток. Притом что бронхиальная астма в основном характеризуется эозинофилами и лимфоцитами CD4, главную роль в патогенезе COPD, по-видимому, играют нейтрофильные гранулоциты, лимфоциты CD8 и макрофаги. Таким образом, PDE, которые участвуют в расслаблении гладкой мускулатуры, и, кроме того, обнаружены в эозинофилах, а также нейтрофилах и других воспалительных и иммунокомпетентных клетках, вероятно, составляют основной элемент развития обоих заболеваний.
Многие события и механизмы, участвующие в патогенезе данных заболеваний, ингибируются активацией пути передачи сигнала циклических нуклеотидов. Таким образом, повышение уровня внутриклеточного цАМФ (циклического аденозинмонофосфата) нарушает активацию лимфоцитов, эозинофилов, нейтрофилов и тучных клеток (мастоцитов) и блокирует продукцию цитокинов, репликацию клеток и хемотаксис клеток в области воспаления. Кроме того, активация пути передачи сигнала цАМФ в клетках гладкой мускулатуры дыхательных путей способствует расслаблению и блокирует репликацию клеток гладкой мускулатуры (см. статью Tomlinson et al., Biochem Pharmacol, 1995, 49:1809-19), препятствуя таким образом ремоделированию дыхательных путей, наблюдаемую на хронической стадии заболеваний.
PDE4 принадлежит к суперсемейству по меньшей мере 11 изоферментов, катализирующих гидролиз цАМФ и/или цГМФ (циклического гуанидинмонофосфата). PDE4 является основным ферментом, метаболизирующим цАМФ в иммунных и воспалительных клетках, гладких мышцах дыхательных путей и легочных нервах. На основе его клеточного и тканевого распределения селективные ингибиторы данного фермента подавляют выход медиаторов из воспалительных клеток (см. статьи Hatzelmann and Schudt, J Pharmacol Exp Ther, 2001, 297:267-79; Marx et al., Pulm Pharmacol Ther, 2002, 15:7-15; Kuss et al., J Pharmacol Exp Ther, 2003, 307:373-85). Показан широкий спектр их активности на моделях COPD на животных (см. статьи Billah et al., J Pharmacol Exp Ther, 2002, 302:127-37; Kusset et al., J Pharmacol Exp Ther, 2003, 307:373-85). Ассоциированные с данным классом побочные эффекты, в основном тошнота и рвота, по-видимому, по меньшей мере частично преодолеваются так называемыми ингибиторами PDE4 "второго поколения". Современные клинические исследования убедительно показывают терапевтическую применимость ингибиторов PDE4 как при астме, так и при COPD (см. статьи Dyke and Montana, Expert Opin Investig Drugs, 2002, 11:1-13; Grootendorst et al., Pulm Pharmacol Ther 2003, 16:341-7, Spina, Drugs, 2003, 63:2575-94). Попытки свести к минимуму или устранить вышеупомянутые вредные события, иногда ассоциированные с ингибиторами PDE4, включали создание ингибиторов, которые не проникают в центральную нервную систему, и введение ингибиторов PDE4 путем ингаляции, а не перорально.
Ингибиторы изофермента PDE4 уменьшают воспалительные процессы как при астме, так и при COPD. Таким образом, данные эффекты ингибиторов PDE4 приводят в результате к улучшению бронхиальной функции у пациентов, страдающих от бронхиальной астмы или COPD.
Антихолинергические лекарственные препараты приняты как важный способ лечения при COPD и хронической астме. Антихолинергический бронхолитик, антагонист мускаринового рецептора, используемый в данном изобретении, будет представлять собой соединение с длительным действием. Любое соединение данного типа может быть использовано в данном комбинированном терапевтическом подходе. Термином длительно действующий обозначают, что лекарственный препарат будет обладать эффектом на бронхи, который продолжается примерно 12 часов или более, до 24 часов. Недавно утвержденный ингаляционный антихолинергический лекарственный препарат длительного действия, тиотропиум, дает замедленную бронходилатацию в течение 24-часового дня (см. статью Calverley et al., Thorax, 2003, 58:855-60).
Гликопирролат принадлежит к так называемым антихолинергическим лекарственным препаратом и является антагонистом нейромедиатора ацетилхолина в его рецепторном центре. Данный эффект приводит к значительной бронходилатации и пониженной секреции слизи.
1
3
3
Гликопирролат, соединение четвертичного аммония, состоит из четырех стереоизомеров. Он плохо всасывается из слизистых оболочек, уменьшая таким образом антихолинергические побочные эффекты (см. статью Ali-Melkkila et al., Acta Anaesthesiol Scand, 1993, 37:633-42). Гликопирролат не обладает селективностью в связывании с рецепторами М-М. Однако исследования кинетики показали, что гликопирролат медленно диссоциирует из мускариновых рецепторов М (см. статью Haddad et al., Br J Pharmacol, 1999, 127:413-20). Аналогично тиотропиуму данное поведение объясняет относительную рецепторную селективность и его длительное действие. В действительности имеется доказательство того, что рацемический гликопирролат дает существенные и длительно действующие бронхолитические эффекты, как у астматических пациентов, так и у пациентов c COPD (см. статьи Walker et al., Chest, 1987, 91:49-51, Schroeckenstein et al., J Allergy Clin Immunol, 1988, 82:115-9, Gilman et al., Chest, 1990, 98:1095-8, Cydulka and Emerman, Ann Emerg Med, 1995, 25:470-3). Поскольку астма и COPD характеризуются повышенной секрецией слизи, антисекреторный эффект антихолинергических агентов, таких как гликопирролат, является дополнительным преимуществом в плане их применения при терапии данных заболеваний.
Раскрытие изобретения
Современные препараты для лечения астмы и COPD неудовлетворительны. Учитывая широкое распространение данных заболеваний, усовершенствованные, более эффективные и более удобные терапевтические интервенции является крайне необходимыми.
Проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, было получить такие усовершенствованные терапевтические альтернативы с более высокой эффективностью и пониженными побочными эффектами.
Проблему решают с помощью нового комбинированного лекарственного препарата, содержащего ингибитор PDE4 и антихолинергический агент, который превосходит моносоединения в плане терапевтической эффективности, начала и продолжительности действия или побочных эффектов.
Неожиданно было показано, что применение комбинации, содержащей наружные (ингаляционные) антихолинергические агенты, а именно R,R-гликопирролата для наружного использования или его физиологически приемлемой соли, и ингаляционные/пероральные ингибиторы фосфодиэстеразы (PDE) 4, такие как AWD12-281 или рофлумиласт или их физиологически приемлемые соли, приводит в результате к более эффективному и более безопасному лечению бронхиальной астмы и хронических обструктивных легочных заболеваний (COPD), которые дают возможность использовать более низкие дозы или которые снижают побочные эффекты.
Фармакодинамические свойства обоих используемых лекарственных препаратов, R,R-гликопирролата и ингибиторов PDE4, дополняют друг друга и приводят в результате к более эффективному лечению упомянутых заболеваний. Кроме того, повышается также уровень удобства для пациентов.
Осуществление изобретения
Ингибитором PDE4, используемым в данном изобретении, может быть любое соединение, которое, как известно, ингибирует фермент PDE4 и которое, как обнаружено, действует как высокоспецифические ингибиторы PDE4 и которое предпочтительно используется для ингаляции. Например, предклинические и клинические исследования высокоактивного и селективного ингибитора PDE4 AWD 12-281 показали, что данное соединение обладает хорошей предклинической и клинической эффективностью. У бурых норвежских крыс AWD12-281 подавляет вызываемую аллергеном эозинофилию дыхательных путей с ID50 (50% ингибирующая доза) 7 мкг/кг при внутрилегочном введении. Это сравнимо с величиной ID50 известного кортикостероида беклометазона (0,1 мкг/кг). Вследствие своего уникального метаболического профиля соединение имеет приемлемый профиль безопасности после наружного (назального или ингаляционного) введения. Когда AWD 12-281 вводят собакам посредством ингаляции, это не вызывает рвоту вплоть до самых высоких допустимых доз (15 мг/кг), указывая на то, что AWD 12-281 применим для ингаляционного лечения астмы и COPD (см. статью Kuss et al., J Pharmacol Exp Ther, 2003, 307:373-85).
Оба, антихолинергический агент и ингаляционный/пероральный ингибиторы PDE4, могут быть эффективно использованы при лечении различных заболеваний дыхательных путей лошадей. Активированные нейтрофилы рекрутируются в легкие лошадей с COPD, что может вносить вклад в воспаление и повреждение легких. Продемонстрировано также, что ингибиторы PDE4 могут снижать активацию нейтрофилов in vivo у лошадей с COPD (см. статью Rickards et al., J Vet Pharmacol Ther, 2001, 24:275-81).
Комбинированная терапия, предлагаемая данным изобретением, включает введение ингибитора PDE4 с антихолинергическим бронхолитическим агентом длительного действия с целью предупреждения начала события легочной болезни или лечения имеющегося состояния и уменьшения воспаления дыхательных путей. Соединения можно вводить вместе в одной дозированной форме. В противном случае они могут быть введены в разных дозированных формах. Они могут быть введены в одно и то же время. В противном случае их можно ввести либо близко по времени, либо отдаленно, например, когда один лекарственный препарат вводят утром, а другой лекарственный препарат вводят вечером. Комбинацию можно использовать профилактически или после начала проявления симптомов. В ряде случаев комбинация(и) может быть использована для предупреждения развития легочного заболевания или для того, чтобы остановить снижение функции, например легочной функции.

Данные лекарственные препараты, антихолинергические агенты и ингибиторы PDE4 обычно вводят в виде аэрозоля с содержанием или без содержания пропеллента, либо в виде ингаляционного порошка, например, с использованием Novolizer. Данное изобретение предлагает совместное введение обоих лекарственных препаратов в одной доставляющей форме, такой как ингалятор, когда оба лекарственных препарата помещают в один и тот же ингалятор. Составы входят в компетенцию специалистов в области техники (например, включают такие наполнители, как моногидрат лактозы).
Активные ингредиенты можно давать от 1 до 8 раз в день, что достаточно для проявления требуемой активности. Предпочтительно, когда активные компоненты дают приблизительно один или четыре раза в день, более предпочтительно - один или два раза в день.
Ингибитор PDE4 может быть введен взрослому человеку в количестве от 200 до 5000 мкг/день, предпочтительно от 500 до 2000 мкг/день в зависимости от интенсивности воспаления дыхательных путей. Ингибитор PDE4, например, рофлумиласт, можно вводить ингаляционно или перорально. Ингаляционный антихолинергический лекарственный препарат, рацемический гликопирролат, один из его энантиомеров, в особенности R,R-гликопирролат, или один из его диастереомеров либо их смесь и его соли, сольваты и гидраты, можно ввести взрослому человеку в количестве от 5 до 500 мкг/день, предпочтительно от 15 до 300 мкг/день. Особенно предпочтительным является интервал доз от 5 до 100 мкг/день.
Полагают, что оба активных агента нужно вводить в одно и то же время или очень близко по времени. Альтернативно один лекарственный препарат можно было бы принимать утром и другой позднее днем. В противном случае по другой схеме один лекарственный препарат можно принимать два раза в день, а другой - один раз в день, либо одновременно с тем, дозирование которого осуществляют два раза в день, либо раздельно. Предпочтительно, когда оба лекарственных препарата принимают вместе в одно и то же время.
Для ветеринарного применения антихолинергический агент, в особенности R,R-гликопирролат можно давать лошадям в количестве 1-32 мкг/кг/день, предпочтительно от 4 до 16 мкг/кг/день в виде монотерапии или в комбинации с ингаляционным ингибитором PDE4, вводимым в количестве от 4 до 100 мкг/день для взрослого, предпочтительно от 10 до 40 мкг/день в зависимости от интенсивности воспаления дыхательных путей.
Изобретение иллюстрируют, но не ограничивают следующими примерами.
Пример 1. Порошковая ингаляция 50 мкг R,R-гликопирролата и 500 мкг AWD 12-281 на однократную дозу.
Микронизированный R,R-гликопирролатв количестве 50 г смешивают со 100 г моногидрата α-лактозы, смесь помещают на сито с размером ячеи 0,5 мм и в конце снова перемешивают. 500 г микронизированного AWD 12-281 смешивают с 1000 г моногидрата α-лактозы, смесь помещают на сито с размером ячеи 0,8 мм и в конце снова перемешивают. Две полученные смеси перемешивают и добавляют моногидрат α-лактозы до 12000 г. Затем снова перемешивают и полученной порошковой смесью наполняют порошковые ингаляторы, выделяющие 12 мг порошка/однократную дозу. На однократную дозу из порошкового ингалятора выделяется 50 мкг R,R-гликопирролата и 500 мкг AWD 12-281 и попадает в дыхательные пути пациента.
Пример 2. Воздействие R,R-гликопирролата в комбинации с ингибиторами PDE4 на секрецию ФНО (фактора некроза опухолей) исследуют с использованием человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs). Исследование санкционировано комиссией по этике института в соответствии с Хельсинкской и Токийской международными декларациями.
2
PBMCs выделяют из образцов гепаринизированной крови здоровых доноров центрифугированием в градиенте плотности. К образцам цельной гепаринизированной крови добавляют равный объем буфера Хенкса (Life Technologies, Heidelberg, Germany). На 15 мл Histopaque-1077 (Sigma, Deisenhofen, Germany) наслаивают максимум 40 мл смеси кровь/Хенкс и центрифугируют в течение 30 минут при комнатной температуре (2000 об./мин). Видимую полосу, содержащую PBMCs, переносят в новую пробирку и дважды промывают буфером Хенкса. Наконец, клетки высевают на среду RPMI 1640 (Life Technologies, Heidelberg, Germany) с добавлением Glutamax I (Gibco BRL, Eggenstein) и 10% сыворотки телячьих эмбрионов (Boehringer Mannheim, Penzberg, Germany). После выделения PBMCs культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением 10% сыворотки телячьих эмбрионов (FCS) при 37°С в 5% CO в течение ночи. PBMCs выделяют из других клеток адгезионным способом, неадгезивные клетки удаляют путем замены среды.
6
2
Клетки ресуспендируют с густотой 10 клеток/мл и инкубируют в объемах 500 мкл в 24-луночных планшетах для культур тканей (Falcon Becton Dickinson Labware) при 37°С, 5% CO. После предварительного инкубирования с тест-субстанциями (0,5 мкл/500 мкл среды) в течение 30 мин клетки стимулируют липополисахаридом (LPS) (1 мкг/мл). В указанные моменты времени клетки осаждают центрифугированием, собирают супернатанты и хранят в замороженном виде при -80°С до определения белка; клетки лизируют буфером для лизиса RLT (Qiagen, Hilden, Germany) и замораживают при -80°С до проведения анализа.
3
4
Измерения цитокинов в супернатантах культур проводят сэндвичевым ELISA (твердофазным иммуноферментным анализом) при использовании подходящих друг другу пар антител (Pharmingen, Heidelberg, Germany). Планшеты для ELISA (Maxisorb, Nunc) покрывают в течение ночи антицитокиновым моноклональным антителом (mAb) в 0,1 М карбонатном буфере, pH 9,5. После промывания планшеты блокируют разбавителем для анализа (Assay Diluent) (Pharmingen, Heidelberg, Germany) в течение 1 часа и снова промывают. Соответствующим образом разведенные образцы супернатанта и стандарты распределяют в повторностях и инкубируют планшеты в течение 2 часов при комнатной температуре. П41 ланшеты промывают, инкубируют в течение 1 часа с рабочим агентом для детекции (биотинилированное антицитокиновое антитело и конъюгат авидин-пероксидаза хрена). После промывания добавляют субстрат (ТМВ и пероксид водорода). Реакцию останавливают добавлением 1М НРО. Планшеты читают при длине волны 450 нм (эталон 570 нм) в ридере для микропланшетов (Dynatech). Результаты выражают как процент от контрольного уровня продукции цитокинов клетками, стимулированными в отсутствие соединения.
35
35
После стимуляции LPS исходный уровень выхода ФНОα из моноцитов возрастает от 328 пг/мл до 7258 пг/мл. R,R-гликопирролат в виде монокомпонента не влияет на индуцируемый LPS выход ФНОα в концентрациях до 10 мкмоль/л. Ингибитор PDE4 ролипрам ингибирует выход ФНОα зависимым от концентрации образом. Значение IC (35% подавляющая концентрация) ролипрама составляет 68,9±15,2 нмоль/л. Одновременное добавление 10 мкмоль/л R,R-гликопирролата неожиданно и очень существенно снижает IC до 1,70±1,18 нМ (р=0,0151).
Данные результаты показывают, что R,R-гликопирролат существенно и неожиданно повышает противовоспалительную активность ингибиторов PDE4 сверхаддитивным образом.