СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ВОЗРАСТНЫХ И ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ КОЖНЫХ ПОКРОВОВ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR CORRECTION OF AGE-SPECIFIC AND PATHOLOGICAL HUMAN SKIN CHANGES

Изобретение относится к области медицины, в частности к дерматологии и клеточной терапии, способам омоложения и лечения кожи человека.
Способ включает введение в область лечения или омоложения тканей или органов суспензии аутогенных (того же организма) фибробластов в физиологическом растворе с добавлением гиалуроновой кислоты.
Кроме того, предлагается стимулировать пролиферативную и синтетическую активность вводимых фибробластов с помощью продуктов роста фибробластов, содержащихся в среде, которая используется для их роста. Для этого предлагается выделять эти факторы из среды и использовать их в качестве составляющих в косметическом средстве, которое затем можно использовать перед клеточной терапией для подготовки кожи, а также после терапии - для увеличения эффекта методики и его пролонгирования.
В настоящее время клеточная терапия осуществляется следующим образом. Шприцем вводят клетки в место, требующее коррекции, и затем ожидают результата. При этом используют как аутогенные, так и аллогенные клетки (Патент США 5660850 26.08.1997; Boss W.K. Jr, Usal H, Fodor P.B, Chemoff G. Autologous cultured fibroblasts: a protein repair system. Ann Plast Surg. 2000 May 44(55): 536-542).
Аналогичное описание методики приводится в другом патенте (Патент № 2281776 2.08.2006), в котором за основу принимается то, что для увеличения эффективности клеточной терапии берутся только фибробласты с высокой эффективностью клонирования.
Несмотря на все более широкое распространение метода, все же остается открытым вопрос об эффективности применения аутогенных клеток для клеточной терапии, особенно у взрослых и пожилых людей (Крехели Э.А, Згурский А.А., Терехов С.М. Применение аутогенных фибробластов в косметологии. Эстетическая медицина. 2004. Т.3. № 4. С.336-342). Проблема заключается в том, что не всегда приживаются клетки и они не всегда эффективно исправляют морщины или другие дефекты.
Предлагаемая методика позволяет значительно повысить выживаемость клеток и увеличить эффективность клеточной терапии.
Гиалуроновая кислота действует как наполнитель кожного матрикса, создавая жизненный объем для вводимых аутогенных клеток, увеличивает время сохранения клеток до введения их в область терапии и способствует лучшей приживаемости клеток после их введения. Ввод растворов препаратов осуществляется с помощью шприца в область терапии. Концентрация препаратов и время их действия подбирается индивидуально в соответствии с конкретными условиями и в зависимости от возраста пациента, физического состояния, конкретного органа и ткани.
5
Ранее уже были проведены эксперименты на животных. Например, было изучено влияние фибробластов кожи в сочетании с препаратом стабилизированной гиалуроновой кислоты (Рестилайн) на бестимусных мышах (Yoon E.S. et al. Advantages of the presence of living dermal fibroblasts within restylane for soft tissue augmentation // Ann Plast Surg. 2003 Dec; 51(6). P. 587-592). Авторы оценили возможность увеличения срока действия Рестилайна в комбинации с кожными фибробластами. При подкожных инъекциях мышам смеси 5х10 фибробластов, суспендированных в 200 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в сочетании с 200 мкл Рестилайна, масса образующихся узелков несколько уменьшалась в течение первых 2 недель и далее не изменялась до 16 недель. Контрольные узелки, образовавшиеся после введения Рестилайна, разбавленного ФСБ, уменьшались за время наблюдений в 2 раза. Иммунохимическое окрашивание показало присутствие человеческого коллагена в узелках опытной группы по сравнению с контрольной группой. Полученные результаты указывают, что Рестилайн, смешанный с культивируемыми фибробластами кожи человека, может быть успешно инъецирован как живой трансплантат с возможностью долговременного эффекта.
Нами проведены исследования, в которых фибробласты кожи людей вводились в проблемные места кожи пациента в физиологическом растворе и также вместе с гиалуроновой кислотой. Соотношение было следующим. Брали 0,5 мл суспенции фибробластов с 1 млн. клеток в физиологическом растворе и туда добавляли 0,5 мл гуалуроновой кислоты. Получали 0,5 млн кл./мл раствора. Исходный раствор гиалуроновой кислоты был в пределах 0,02-0,1%, чтобы конечная концентрация в суспензии составляла 0,01-0,05%. Суспензию перемешивали и проводили обкалывание шприцом проблемных мест.
Результаты были следующими. Папулы инъекций фибробластов с гиалуроновой кислотой держатся в 2 раза дольше, чем без него. Это значит, инъецированные фибробласты имеют больше возможностей для выживания и выполнения заложенных в них функций - продукции коллагена и эластина, что естественно ведет к разглаживанию морщин и фактически видимому уменьшению их глубины, размягчению кожи, повышению ее эластичности и упругости. Визуально это наблюдается по уменьшению заметности морщин, сглаживанию складок, выравниванию рельефа кожи. Скорость уменьшения защипов увеличивается как минимум в 1,5 раза, что говорит о реальном омоложении кожи также в эквивалентной величине.
Полученные результаты указывают, что гиалуроновая кислота, смешанная с культивируемыми фибробластами кожи человека, может быть успешно инъецирована как живой трансплантат с возможностью долговременного эффекта.
Второе предложение состоит в том, чтобы стимулировать пролиферативную и синтетическую активность вводимых фибробластов. Для этого предлагается использовать продукты роста фибробластов, содержащиеся в среде, которая используется для их роста.
Обычно в косметическом средстве применяются вещества растительного происхождения или синтезированные химически, применяют также гиалуроновую кислоту (Патент РФ № 94040904 от 1994.08.19).
При культивировании в ростовой среде фибробласты кожи синтезируют и выделяют в окружающую среду большое количество биологически активных веществ, среди которых можно выделить различные факторы роста (EGF, FGF, TGF, KGF), компоненты внеклеточного матрикса (ГАГ, ГК, хондроитин сульфат) и ферменты (EGF - фактор роста эпидермиса, регулирует миграцию и пролиферацию эпидермальных клеток кожи. FGF - фактор роста фибробластов, стимулирует рост всех типов клеток и продукцию внеклеточного матрикса, TGF - транформирующий фактор роста, участвует в образовании новых кровеносных сосудов; KGF - фактор роста кератиноцитов (Крихели Э.А., Згурский А.А., Терехов С.М. Применение аутогенных фибробластов в косметологии. Эстетическая медицина. 2004. Т.3. № 4. С.336-342). Синтезируются также колланен и эластин - компоненты внеклеточного матрикса.
Авторы пришли к выводу, что эту среду можно использовать для приготовления косметического средства, которое можно будет применять как до, так и после применения клеточной терапии. При этом, такое косметическое средство можно смело назвать индивидуальным (личным), т.к. используются факторы, исходно принадлежащие реципиенту.
Присутствие в коже ростовых факторов и других перечисленных веществ от собственных клеток будет способствовать улучшению ее состояния, обеспечению выживаемости имеющихся и привнесенных извне, в результате клеточной терапии, клеток.
На основе данных факторов предлагается изготавливать индивидуальную косметику под общим названием: медицинское индивидуальное косметическое средство (МИКС).
Ее состав может быть следующим. Лиофилизированные факторы роста и белковые ингредиенты ростовой среды, в которой росли аутогенные фибробласты пациента, глицерин, в качестве наполнителя, гиалуроновая кислота для создания матрикса в дерме, ароматические компоненты для придания привлекательного запаха.
Предлагаются следующие рецептуры.
1. Клетки выращиваются 14-28 дней на среде, содержащей сыворотку, и на бессывороточной среде.
Рецептура приготовления геля, вариант 1:
Ростовая бессывороточная среда с БАВ
49%
Гиалуроновая кислота (гиалуронат натрия)
0,5-1,5%;
Глицерин (как основа)
49,5-48,5%;
Ароматизатор
0-0,5%
Рецептура приготовления геля, вариант 2:
Ростовая среда с сывороткой, содержащей БАВ
49%
Гиалуроновая кислота (гиалуронат натрия)
0,5-1,5%;
Глицерин (как основа)
49,5-48,5%;
Ароматизатор
0-0,5%
2. Биологически активные вещества, продуцируемые клетками в среду, концентрируются с использованием методик "Minhan", "Pillicon" -"Millipore" USA либо подвергаются лиофилизации. Содержание всех биологически активных веществ (БАВ), включая витамины и аминокислоты ростовой среды, факторы роста и др., составляет порядка 10 мг/мл в ростовой среде.
Рецептура приготовления геля, вариант 3:
БАВ (концентрат или лиофилизат)
0,5-3%
Глицерин (как основа)
70%;
Коллаген крупного рогатого скота
1,5%;
Гиалуроновая кислота (гиалуронат натрия)
1,5%;
Ароматизатор
0-0,5%
Вода очищенная
необходимое кол-во до 100%.
Срок хранения 50-60 дней при +4°С.
Курс применения 10 ампул по 2 мл в течение 20 дней через день.
Через 5-7 дней второй курс снова по 10 ампул через день - минимальный курс.
Курсы можно применять как до, так и после клеточной терапии. Косметика применяется следующим образом. Вскрывается 1 ампула и ее объем наносится вечером на проблемные места. После этого препарат не смывается до следующего утра. Через день на следующую ночь используется вторая ампула. В последующие дни аналогично используется 3-я и затем другие ампулы до 10. После клеточной терапии через 10 дней также используются другие 10 ампулы. Через 5-7 дней второй курс снова по 10 ампул через день.
Таким образом, имеются следующие варианты применения индивидуальной клеточной косметики:
1) 1 курс до клеточной терапии;
2) 2 курса после клеточной терапии;
3) 2 курса до и 2 курса после клеточной терапии.
Естественно, остается возможность применения клеточной технологии без использования МИКС.
МИКС является косметическим средством наружного применения.
Благодаря этим факторам и после их внесения на кожу, межклеточное вещество будет постепенно обновляться и, значит, омолаживаться.
Это также создает благоприятные условия для приживления аутогенных фибробластов и их лучшего функционирования в дальнейшем.
Были проведены испытания на добровольцах. Результаты испытаний описаны ниже, а также в таблице 1 и подтверждают промышленную применимость способа.
Таблица 1
Результаты применения терапии аутогенными фибробластами без гиалуроновой кислоты и совместно с последней
Параметры
Оценка параметра до терапии
Терапия:
фибробласты
фибробласты + гиалуроновая кислота
Добровольцы
Б.О.К., 52 г
Д.З.К., 54 г
Морщины
10
6
3
Тургор
3
5
6
Цвет кожи
9
7
5
Суб. оценка
3
5
7
Добровольцы
З.А.А.
З.З.К.
Морщины
8
6
4
Тургор
5
6
7
Цвет кожи
7
6
5
Суб. оценка
Добровольцы
К.В.А.
Д.А.М.
Морщины
9
5
4
Тургор
3
4
5
Цвет кожи
7
5
4
Суб. оценка
Добровольцы
В.Б.А.
В.О.В.
Морщины
8
6
3
Тургор
2
3
4
Цвет кожи
6
5
3
Суб. оценка
Добровольцы
Ф.Т.М.
Ш.С.К.
Морщины
7
6
4
Тургор
6
7
7
Цвет кожи
7
6
5
Суб. оценка
Добровольцы
Ж.Р.П.
М.Е.П.
Морщины
8
6
3
Тургор
4
5
6
Цвет кожи
6
4
3
Суб. оценка
Примечание. Морщины, баллы 10-1 (глубина). Тургор, баллы 1-10. Цвет кожи в области морщин, баллы 10-0 (темный - светлый). Субъективная оценка 1-10 баллов.
Доброволец Б. O.K. 53 г., пол женский [Контроль]. При осмотре кожи лица обнаружено: снижение тургора кожи в области щек, подбородка; глубокие морщины в области носогубных складок, на переносице, лбу, вокруг глаз; обезвоживание и изменение контура лица.
Диагноз: возрастные изменения кожи лица.
Коррекция проблемных зон кожи лица была проведена заявленным способом с использованием аутогенных клеток и гиалуроновой кислоты.
Назначение: пересадка аутологичных фибробластов в проблемные зоны кожи лица совместно с гиалуроновой кислотой.
2
2
2
2
2
2
2
Для этого у добровольца брали кусочек кожи с внутренней поверхности предплечья. Биопсию (диаметром 4 мм) после промывки (2 раза) в растворе питательной среды ДМЕМ с антибиотиками пенициллин (50 мкг/мл) и стрептомицин (50 ед/мл) помещали в чашку Петри и измельчали скальпелем в 0,1 мл 0,25% раствора коллагеназы II типа. После измельчения кусочки ткани закрывали покровным стеклом и в чашку заливали 2 мл того же раствора коллагеназы. Чашку Петри ставили в СО-инкубатор. Через 1,5 ч чашку вынимали, раствор коллагеназы выливали, промывали средой ДМЕМ с 20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) и вновь заливали ростовую среду. Через 1 сутки среду меняли на свежую. Через 5 суток кусочки кожи смывали, среду с кусочками кожи помещали в центрифужную пробирку, центрифугировали 3 мин при 1000 об/мин, надосадок выливали, осадок помещали в новую чашку Петри, закрывали покровным стеклом, заливали среду ДМЕМ с 20% ЭТС и ставили в С0-инкубатор. Периодически через 3 суток среду меняли на свежую. Через 15 суток после достижения монослоя кусочки кожи со средой помещали в центрифужную пробирку и выполняли аналогичные действия. Затем в чашку Петри 2 раза споласкивали клетки раствором ЭДТА, после чего заливали 1 мл раствора трипсина. Чашку Петри помещали в СО-инкубатор. Через 15 мин когда клетки откреплялись от ростовой поверхности в чашу залили 2 мл ростовой среды, клетки суспендировали и перенесли в культуральный флакон площадью 75 см и добавили 10 мл ростовой среды с 20% ЭТС, флакон поместили в СО-инкубатор. Через 7 суток после достижения монослоя клетки сняли с поверхности роста аналогичным образом и перенесли клетки во флакон площадью 150 см. В течение месяца клетки пересевали аналогичным образом до достижения монослоя в 10 флаконах площадью 150 см. Далее клетки 7 флаконов снимали аналогичным образом, суспензию центрифугировали 2 раза в физиологическом растворе и готовили суспензию на физиологическом растворе с концентрацией 2 млн кл/мл и разливали в ампулы по 1,5 мл. После этого производили ввод суспензии в область морщин инсулиновым шприцем. Перед терапией поверхность кожи обрабатывали 70% раствором этилового спирта или 0,5% раствором хлоргексидина, затем проводили местную анестезию 5% кремом Эмла. Ввод суспензии производили в поверхностный или средний слой дермы по 0,05 мл с интервалом 5-6 или 8-10 мм в зависимости от рода морщин. Делали 2 курса с интервалом в 2 недели
Вид поверхности кожи фиксировали на фотографиях, а также по визуальным наблюдениям и субъективным оценкам пациента до терапии и после.
Доброволец Д.З.К. 55 г., пол женский [Опыт]. Имел схожие признаки старения кожи с добровольцем Б.
Добровольцу проведены те же действия, что и добровольцу Б. Отличие состояло в том, что ему вводили суспензию аутогенных фибробластов совместно с гиалуроновой кислотой.
Для этого аналогичным образом готовили суспензию аутогенных фибробластов на физрастворе в концентрации 2 млн кл/мл и разливали в ампулы по 1,5 мл. После этого непосредственно перед процедурой к суспензии клеток 0,5 мл добавляли 0,5 мл гиалуроновой кислоты (гиалуронат натрия) и производили ввод суспензии в область морщин инсулиновым шприцем. Также делали 2 курса с интервалом в 2 недели
Вид поверхности кожи фиксировали на фотографиях, а также по визуальным наблюдениям и субъективным оценкам пациента до терапии и после.
Результаты терапии без гиалуроновой кислоты (Доброволец Б. О. К.). Через 4-5 месяцев после пересадки фибробластов наблюдали сглаживание морщин и крупных складок лба; сглаживание морщин на переносице и в латеральной подглазничной области глаз; уменьшилась выраженность и глубина носогубных складок; заметно улучшился тургор кожи, улучшился контур и цвет лица.
Результаты терапии с гиалуроновой кислотой (Доброволец Д.З.К.). Через 4-5 месяцев после пересадки фибробластов эффект тот же, что у добровольца Б, однако степень разглаживания морщин выше на 2-3 балла по 10 бальной шкале, степень удовлетворенности пациента выше.
Аналогичные результаты получены еще на 10 пациентах, 5 из которых проводили терапию без гиалуроновой кислоты, а 5 с гиалуроновой кислотой. Подбирали пары добровольцев таким образом, чтобы их параметры были примерно одинаковыми.
Также были проведены испытания на добровольцах индивидуальной косметики МИКС.
Результаты описаны ниже и сведены в таблицу 2.
Добровольцам проведены те же действия, что описаны выше, т.е. таким же образом получали культуры аутогенных клеток и также готовили суспензии клеток. Отличие состояло в том, что части добровольцев вводили только суспензию фибробластов, а другим проводили, кроме курса клеточной терапии, курсы собственной косметики как до, так и после применения клеточной терапии.
Для этого аналогичным образом готовили суспензию аутогенных фибробластов на физрастворе в концентрации 2 млн кл/мл и разливали в ампулы по 1,5 мл. После этого производили ввод суспензии в область морщин инсулиновым шприцем 2 курсами с интервалом в 2 недели.
Вид поверхности кожи фиксировали на фотографиях, а также по визуальным наблюдениям и субъективным оценкам пациента до терапии и после.
Части добровольцев делали обработку кожи индивидуальной косметикой МИКС до клеточной терапии и после. Для этого готовили индивидуальную косметику, как описано выше.
Косметику МИКС применяли по следующей схеме:
1) 1 курс до клеточной терапии (10 ампул через день);
2) 2 курса после клеточной терапии (2 курса по 10 ампул через день).
Таблица 2
Результаты применения терапии аутогенными фибробластами без индивидуальной косметики МИКС и совместно с последней
Пациент
Оцениваемые Параметры
Состояние Оценка параметра до терапии
Терапия:
фибробласты
фибробласты + МИКС
Добровольцы
Б.О.К., 52 г
Д.З.К., 54 г
Морщины
10
6
3
Тургор
3
5
6
Цвет кожи
9
7
5
Суб. оценка
Добровольцы
З.А.А.
З.З.К.
Морщины
8
6
4
Тургор
5
6
7
Цвет кожи
7
6
5
Суб. оценка
Добровольцы
К.В.А.
Д.А.М.
Морщины
9
5
4
Тургор
3
4
5
Цвет кожи
7
5
4
Суб. оценка
После применения МИКС наблюдали следующие эффекты по сравнению с контролем.
Доброволец А.С., пол мужской, 54 г.: кожа ожила, произошло рассасывание уплотнений, образовавшихся после клеточной терапии, разгладилась кожа, мелкие морщины стали менее заметны.
Доброволец Ф.А., пол женский, 40 лет: кожа стала мягче, более упругой, посвежела, морщины разгладились.
Добровольцы Ф.О., пол женский, 45 лет, Л.Э., пол женский, 53 г., О.Е., пол мужской, 43 г.: произошли аналогичные изменения.
Во всех случаях отсутствовали отрицательные последствия применения МИКС, как объективные, так и субективные.
Таким образом, методика показала свою эффективность и отсутствие аллергических и др. негативных реакций.