СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ВНУТРИ ВОДОУСТОЙЧИВОГО ПОЧВЕННОГО АГРЕГАТА
METHOD FOR DETERMINING ENZYMATIC ACTIVITY IN WATERPROOF SOIL AGGREGATE

Изобретение относится к области биохимии и физики почв и может быть использовано для изучения биохимических процессов во внутренней части почвенного агрегата, а также для сравнения ферментативной активности во внутренней и периферической частях почвенного агрегата. Определение активности различных ферментов во внутренней части и на периферии почвенного агрегата позволят детальнее изучить процессы гумусоообразования, а также процессы формирования почвенный агрегатов.
Прототипом являются методы определения ферментативной активности на основе изменения в результате ферментативной реакции концентрации целевого вещества - субстрата или образованного продукта реакции - специфичного для данного фермента [Хазиев, 2005], применяемые для почвенных агрегатов предварительно, вручную, препарированных для разделения внутренней части (ядра) и периферической (коры) [Bach and Hofmocke, 2014]. Существенный недостаток этих способов - высокая трудоемкость и невозможность работы с мелкими (меньше 2 мм) агрегатами без специального оборудования (увеличительных приборов, механических манипуляторов). Другой недостаток этих способов: невозможность отделить водоустойчивые агрегаты от неводоустойчивых для определения ферментативной активности, в то время как первые имеют особое значение для структуры почвы [Шеин 2005].
Целью изобретения является определение ферментативной активности во внутренней части водоустойчивых почвенных агрегатов, в том числе с размерами меньше 2 мм.
Способ осуществляется следующим образом. Из почвенной массы в воздушно-сухом состоянии набором сит выделяют воздушно-сухие агрегаты естественного сложения целевой размерной фракции.
Выделенные агрегаты помещают на сито с диаметром ячеек, равным наименьшему размеру выделенной фракции (если выделена фракция 2-1 мм, то используют сито с ячейками диаметром 1 мм). Сито с агрегатами опускают в воду, затем в течение 1 мин вертикальными и горизонтальными покачиваниями отделяют водоустойчивые агрегаты от остальных структурных отдельностей, размер которых уменьшается в результате разрушающего действия воды, и они проходят сквозь сито. Количество водоустойчивых агрегатов определяют по разнице между массой исходной навески и массой частиц, прошедших через сито. Полученные водоустойчивые агрегаты используют для определения ферментативной активности внутри и на их периферии.
Для определения ферментативной активности используют водоустойчивые агрегаты непосредственно после процедуры их выделения, пока они еще насыщены водой (не высушивая).
В отдельной навеске полученные водоустойчивые агрегаты измельчают и в них определяют ферментативную активность. В результате определяется ферментативная активность всего агрегата в целом.
В другой навеске используют ненарушенные водоустойчивые агрегаты. Из-за того, что агрегат насыщен водой, обмен вещества между ядром агрегата и окружающим раствором замедлен, в связи с этим, при определении ферментативной активности специфическая реакция фермент-субстрат идет только на периферии агрегата. Таким образом, ферментативная активность определяется только в периферической части агрегата.
По разнице между ферментативными активностями всего агрегата и его периферической частью рассчитывают ферментативную активность внутри агрегата.
Примеры использования
Пример 1. Определение пероксидазной активности внутри водоустойчивых почвенных агрегатов типичного чернозема разных видов использования: 1. Залежь с 1997 г. после бессменного черного пара с 1964 г. и 2. Ежегоднокосимая заповедная степь.
Определение пероксидазной активности проводили на основе количественного определения парабензохинона - продукта окисления гидрохинона за счет кислорода перекиси водорода по методу Карягиной и Михайловой [Хазиев, 2005].
Исследовали внутриагрегатную пероксидазную активность внутренней части водоустойчивых агрегатов типичного чернозема в вариантах: 1. Залежь с 1997 г. после бессменного черного пара с 1964 г. и 2. Ежегоднокосимая заповедная степь. Навеску воздушно-сухих агрегатов 1-2 мм помещали на сито 1 мм и опускали в воду, покачивая, получали водоустойчивые агрегаты, количество водоустойчивых агрегатов определяли по разнице между массой исходной навески и массой частиц, прошедших через сито. Полученные агрегаты разделили на две части. Первую часть использовали для определения ферментативной активности периферической части агрегата, вторую часть агрегатов измельчали для определения активности всего агрегата; соотношение почвы и реакционной смеси 1 г на 21 мл (10 мл 0,1 М гидрохинона, 1 мл 1,5 мМ перекиси водорода, 10 мл 96% этилового спирта). Полученные показатели активностей всего агрегата и периферийной части использовали для расчета активности внутренней части агрегата.
Результаты исследования показали преобладание активности внутри почвенного агрегата в залежи и, напротив, в ежегоднокосимой степи преобладает ферментативная активность на перифериии почвенного агрегата. Внутри водоустойчивых агрегатов было отмечено 34% и 67% активности (от общей) для ежегоднокосимой степи и для залежи после пара соответственно. Меньшую пероксидазную активность внутри водоустойчивых агрегатов чернозема ежегоднокосимой степи можно объяснить доминированием анаэробных процессов внутри агрегатов [Шеин, 2005] и, как следствие, на фоне низкой активности пероксидаз наблюдается локализация активности на периферии агрегатов, где больше кислорода и соответственно условий для образования пероксидов.
Пример 2. Сравнение внутриагрегатной полифенолоксиадзной активности типичного чернозема и дерново-подзолистой почвы
Определение полифенолоксидазной активности проводили на основе количественного учета парабензохинона - продукта окисления гидрохинона полифенолоксидазами за счет кислорода воздуха по методу Карягиной и Михайловой [Хазиев, 2005].
Типичный чернозем под ежегоднокосимой степью и дерново-подзолистая почва под лесом являются ненарушенными зональными вариантами этих почвенных подтипов. Навеску воздушно-сухих агрегатов 1-2 мм помещали на сито 1 мм и опускали в воду, покачивая, получали водоустойчивые агрегаты, количество водоустойчивых агрегатов определяли по разнице между массой исходной навески и массой частиц, прошедших через сито. Полученные агрегаты разделили на две части. Первую часть использовали для определения ферментативной активности периферической части агрегата, вторую часть агрегатов измельчали для определения активности всего агрегата; соотношение почвы и реакционной смеси 1 г на 20 мл (10 мл 0,1 М гидрохинона, 10 мл 96% этилового спирта). Интенсивность окраски реакционной смеси, зависящая от концентрации парабензохинона, определяли на многофункциональном ридере для микропланшетов FilterMax F5 при длине волны 450 нм.
Было показано преобладание внутриагрегатной активности в дерново-подзолистой почве (94%), в то время как для типичного чернозема внутриагрегатная активность соответствовала только 34%.
Пример 3. Изучение внутриагрегатной каталазной активности типичного чернозема и дерново-подзолистой почвы разных вариантов использования
Каталазную активность определяли по количеству неизрасходованной перекиси водорода по методу Джонсона и Темпле [Хазиев, 2005].
Исследовались почвы с нарушенной и ненарушенной структурой вследствии антропогенной деятельности: дерново-подзолистая под лесом (ненарушенная) и пахотная (нарушенная), а также типичный чернозем - ежегоднокосимая заповедная степь (ненарушенная) и залежь с 1997 г. после бессменного черного пара с 1964 г. (нарушенная). Навеску воздушно-сухих агрегатов 1-2 мм помещали на сито 1 мм и опускали в воду, покачивая, получали водоустойчивые агрегаты, количество водоустойчивых агрегатов определяли по разнице между массой исходной навески и массой частиц, прошедших через сито. Полученные агрегаты разделили на две части. Первую часть использовали для определения ферментативной активности периферической части агрегата, вторую часть агрегатов измельчали для определения активности всего агрегата; соотношение почвы и реакционной смеси 1 г на 25 мл (20 мл дистиллированной воды, 2,5 мл 8,8 мМ перекиси водорода, 2,5 мл 3 нормальной серной кислоты). Количество неизрасходованной перекиси водорода определяли титрованием 0,5 нормальным перманганатом калия.
Результаты исследования показали слабую зависимость распределения каталазной активности внутри водоустойчивых агрегатов в пределах одного из рассматриваемых типов почв. Так, для дерново-подзолистой почвы внутриагрегатная активность соответствовала 68% и 61% для варианта под лесом и пахотной соответственно. Для чернозема 21% для ежегоднокосимой степи и 28% для залежи.
Список литературы
Шеин Е.В. Курс физики почв. - М.: Изд-во МГУ, 2005, 432 с.
Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. - М.: Наука, 2005.
Bach Е.M., Hofmockel K.S., Soil aggregate isolation method affects measures of intra-aggregate extracellular enzyme activity // Soil Biology & Biochemistry. 2014. V. 69. P. 54-62.