4С

1. Способ анализа частоты взаимодействия нуклеотидной последовательности-мишени с одной или несколькими представляющими интерес нуклеотидными последовательностями (например, одним или несколькими геномными локусами), включающий в себя стадии
(a) получения образца поперечно сшитой ДНК;
(b) расщепления поперечно сшитой ДНК первым ферментом рестрикции;
(c) лигирования поперечно сшитых нуклеотидных последовательностей;
(d) удаления поперечных сшивок;
(e) расщепления нуклеотидных последовательностей вторым ферментом рестрикции;
(f) лигирования одной или нескольких последовательностей ДНК с известным составом нуклеотидов с доступным сайтом (сайтами) расщепления вторым ферментом рестрикции, который фланкирует одну или несколько представляющих интерес нуклеотидных последовательностей;
(g) амплификации одной или нескольких представляющих интерес нуклеотидных последовательностей с использованием по меньшей мере двух олигонуклеотидных праймеров, при этом каждый праймер гибридизуется с последовательностями ДНК, которые фланкируют представляющие интерес нуклеотидные последовательности;
(h) гибридизации амплифицированной последовательности(ей) с чипом; и
(i) определения частоты взаимодействия между последовательностями ДНК.
2. Способ по п.1, в котором реакция лигирования на стадии (f) приводит к образованию колец ДНК.
3. Способ по п.1 или 2, в котором нуклеотидная последовательность-мишень выбрана из группы, состоящей из области геномной перестройки, промотора, энхансера, сайленсера, инсулятора, области связывания с матриксом, регуляторной области локуса, транскрипционной единицы, начала репликации, горячей точки рекомбинации, точки разрыва при транслокации, центромеры, теломеры, области с высокой плотностью генов, области с низкой плотностью генов, повторяющегося элемента и сайта интеграции (вируса).
4. Способ по п.1, в котором нуклеотидная последовательность-мишень представляет собой нуклеотидную последовательность, которая ассоциирована с заболеванием или вызывает заболевание, или расположена на расстоянии вплоть до 15 млн.п.о. или более на линейной матрице ДНК от локуса, который ассоциирован с заболеванием или вызывает заболевание.
nd
5. Способ по п.1, в котором нуклеотидная последовательность-мишень выбрана из группы, состоящей из AML1, MLL, MYC, BCL, BCR, ABL1, IGH, LYL1, TAL1, TAL2, LMO2, TCRα/δ, TCRβ и HOX или других локусов, ассоциированных с заболеванием, которые описаны в «Catalogue of Unbalanced Chromosome Aberrations in Man» 2 edition. Albert Schinzel. Berlin: Walter de Gruyter, 2001. ISBN 3-11-011607-3.
6. Способ по п.1, в котором первым ферментом рестрикции является фермент рестрикции, который узнает сайт узнавания длиной 6-8 п.о.
7. Способ по п.6, в котором первый фермент рестрикции выбран из группы, состоящей из BglII, HindIII, EcoRI, BamHI, SpeI, PstI и NdeI.
8. Способ по п.1, в котором вторым ферментом рестрикции является фермент рестрикции, который узнает сайт узнавания нуклеотидной последовательности длиной 4 или 5 п.о.
9. Способ по п.1, в котором сайт узнавания вторым ферментом рестрикции расположен на расстоянии более чем примерно 350 п.о. от первого сайта рестрикции в нуклеотидной последовательности-мишени.
10. Способ по п.1, в котором нуклеотидная последовательность является меченой.
11. Способ анализа частоты взаимодействия нуклеотидной последовательности-мишени с одной или несколькими нуклеотидными последовательностями (например, одним или несколькими геномными локусами), включающий в себя стадии
(a) получения образца поперечно сшитой ДНК;
(b) расщепления поперечно сшитой ДНК первым ферментом рестрикции;
(c) лигирования поперечно сшитых нуклеотидных последовательностей;
(d) удаления поперечных сшивок;
(e) расщепления нуклеотидных последовательностей вторым ферментом рестрикции;
(f) образования кольцевых нуклеотидных последовательностей;
(g) амплификации одной или нескольких нуклеотидных последовательностей, которые лигированы с нуклеотидной последовательностью-мишенью;
(h) необязательно гибридизации амплифицированных последовательностей с чипом; и
(j) определения частоты взаимодействия между последовательностями ДНК.
12. Кольцевая нуклеотидная последовательность, содержащая первую и вторую нуклеотидные последовательности, в которой каждый конец первой и второй нуклеотидных последовательностей разделены сайтами узнавания разными ферментами рестрикции и в которой указанная первая нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность-мишень, а указанная вторая нуклеотидная последовательность может быть получена посредством поперечного связывания геномной ДНК.
13. Способ получения кольцевой нуклеотидной последовательности, включающий в себя стадии
(a) получения образца поперечно сшитой ДНК;
(b) расщепления поперечно сшитой ДНК первым ферментом рестрикции;
(c) лигирования поперечно сшитых нуклеотидных последовательностей;
(d) удаления поперечных сшивок;
(e) расщепления нуклеотидных последовательностей вторым ферментом рестрикции; и
(f) образования кольцевых нуклеотидных последовательностей.
14. Способ анализа частоты взаимодействия нуклеотидной последовательности-мишени с одной или несколькими нуклеотидными последовательностями (например, одним или несколькими геномными локусами), включающий в себя использование нуклеотидной последовательности по п.12.
15. Матрица зондов, иммобилизованных на подложке, содержащая один или несколько зондов, которые гибридизуются или способны гибридизоваться с нуклеотидной последовательностью по п.12.
16. Набор зондов, последовательность которых комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, граничащей с каждым из первых сайтов узнавания рестрикционными ферментами для первого фермента рестрикции в геномной ДНК.
17. Набор зондов по п.16, в котором последовательность зондов комплементарна последовательности нуклеиновой кислоты, граничащей с каждой стороны с каждым из первых сайтов узнавания рестрикционными ферментами для первого фермента рестрикции в геномной ДНК.
18. Набор зондов по п.16 или 17, в котором последовательности указанных зондов комплементарны последовательности нуклеиновой кислоты, которая расположена на расстоянии менее 300 пар оснований от каждого из первых сайтов узнавания рестрикционными ферментами для первого фермента рестрикции в геномной ДНК.
19. Набор зондов по п.16, в котором зонды комплементарны последовательности, которая расположена на расстоянии менее 300 п.о. от каждого из первых сайтов узнавания рестрикционными ферментами для первого фермента рестрикции в геномной ДНК.
20. Набор зондов по п.16, в котором зонды комплементарны последовательности, расположенной в пределах от 200 до 300 п.о. от каждого из первых сайтов узнавания рестрикционными ферментами для первого фермента рестрикции в геномной ДНК.
21. Набор зондов по п.16, в котором зонды комплементарны последовательности, расположенной в пределах от 100 до 200 п.о. или от 0 до 100 п.о. от каждого из первых сайтов узнавания рестрикционными ферментами для первого фермента рестрикции в геномной ДНК.
22. Набор зондов по п.16, в котором два или более зондов способны гибридизоваться с последовательностью, граничащей с каждым из первых сайтов узнавания рестрикционными ферментами для первого фермента рестрикции в геномной ДНК.
23. Набор зондов по п.22, в котором зонды перекрываются или частично перекрываются.
24. Набор зондов по п.23, в котором перекрывание составляет менее 10 нуклеотидов.
25. Набор зондов по п.16, в котором последовательность зондов соответствует всей или части последовательности между каждым из первых сайтов узнавания рестрикционными ферментами для первого фермента рестрикции и каждым ближайшим вторым сайтом узнавания рестрикционными ферментами для второго фермента рестрикции.
26. Набор зондов по п.16, в котором каждый зонд является по меньшей мере 25-мером.
27. Набор зондов по п.16, в котором каждый зонд является 25-60-мером.
28. Способ получения набора зондов, включающий в себя стадии
(a) идентификации каждого из первых сайтов узнавания рестрикционными ферментами для первого фермента рестрикции в геномной ДНК;
(b) конструирования зондов, которые способны гибридизоваться с последовательностью, граничащей с каждым из сайтов узнавания первым ферментом рестрикции в геномной ДНК;
(c) синтеза зондов; и
(d) объединения зондов с образованием набора зондов или по существу набора зондов.
29. Способ по п.28, в котором зонды являются продуктами ПЦР-амплификации.
30. Набор зондов или по существу набор зондов, который получен или может быть получен способом по п.28 или 20.
31. Чип, содержащий матрицу зондов по п.15 или по существу набор зондов по любому из пп.16-27 или 30.
32. Чип, содержащий набор зондов по любому из пп.16-27 или 30.
33. Чип по п.31 или п.32, в котором матрица содержит примерно 300000-400000 зондов.
34. Чип по п.31, в котором матрица содержит примерно 385000 или более зондов, предпочтительно, примерно 750000 зондов, более предпочтительно 6·750000 зондов.
35. Чип по п.31, в котором матрица содержит или состоит из представления полного генома данного вида при более низком разрешении.
36. Чип по п.35, в котором матрица содержит один из каждых 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 зондов, которые расположены по порядку на линейной хромосомной матрице.
37. Способ получения чипа, включающий в себя стадию иммобилизации на твердой подложке по существу матрицы зондов по п.15 или по существу набора зондов по любому из пп.16-27 или 30.
38. Способ получения чипа, включающий в себя стадию иммобилизации на твердой подложке матрицы зондов по п.16 или набора зондов по любому из пп.16-27 или 30.
39. Чип, который получен или может быть получен способом по п.37 или 38.
40. Способ идентификации одного или нескольких ДНК-ДНК-взаимодействий, которые являются показателем конкретного патологического состояния, включающий в себя стадию осуществления стадий (a)-(i) по пп.1-11, при этом на стадии (a) образец поперечно сшитой ДНК получают из пораженной заболеванием и не пораженной заболеванием клетки, и при этом разница между частотой взаимодействия между последовательностями ДНК из пораженной заболеванием клетки и не пораженной заболеванием клетки свидетельствует о том, что ДНК-ДНК-взаимодействие является показателем конкретного патологического состояния.
41. Способ диагностики или прогнозирования заболевания или синдрома, вызванного или связанного с изменением ДНК-ДНК-взаимодействия, включающий в себя стадию осуществления стадий (a)-(i) по любому из пп.1-11, при этом стадия (a) заключается в получении образца поперечно сшитой ДНК от субъекта; и стадия (i) включает в себя сравнение частоты взаимодействия между последовательностями ДНК с частотой взаимодействия в непораженном контроле; при этом разница между значением, полученным для контроля, и значением, полученным для субъекта, является показателем того, что субъект имеет данное заболевание или синдромом, или является показателем того, что субъект будет иметь данное заболевание или синдром.
42. Способ по п.41, в котором переход от низкой к высокой частоте ДНК-ДНК-взаимодействия является показателем сбалансированной и/или несбалансированной точки разрыва.
43. Способ по п.41, в котором обратная картина частот ДНК-ДНК-взаимодействий для образца, полученного от субъекта, по сравнению с контролем является показателем сбалансированной и/или несбалансированной инверсии.
44. Способ по п.41, в котором уменьшение частоты ДНК-ДНК-взаимодействия для образца, полученного от субъекта, по сравнению с контролем, в комбинации с увеличением частоты ДНК-ДНК-взаимодействия для более отдаленных областей является показателем сбалансированной и/или несбалансированной делеции.
45. Способ по п.41, в котором увеличение или уменьшение частоты ДНК-ДНК-взаимодействия для образца, полученного от субъекта, по сравнению с контролем является показателем сбалансированной и/или несбалансированной дупликации или инсерции.
46. Способ по любому из пп.41-45, в котором применяют спектральное кариотипирование и/или FISH перед осуществлением указанного способа.
47. Способ по п.41, в котором заболевание является наследственным заболеванием.
48. Способ по п.41, в котором заболеванием является злокачественная опухоль.
49. Способ диагностики или прогнозирования заболевания или синдрома, вызванного или ассоциированного с изменением ДНК-ДНК-взаимодействия, включающий в себя стадию осуществления стадий (a)-(i) по любому из пп.1-11, при этом стадия (a) включает в себя получение образца поперечно сшитой ДНК от субъекта; и при этом указанный способ включает в себя дополнительную стадию (j) идентификации одного или нескольких локусов, которые были подвергнуты геномной перестройке, которая ассоциирована с заболеванием.
50. Способ по п.49, в котором две или более амплифицированных последовательностей метят по-разному.
51. Способ по п.49, в котором две или более амплифицированных последовательностей метят идентично в том случае, когда последовательности находятся на разных хромосомах.
52. Способ по п.49, в котором две или более амплифицированных последовательностей метят идентично в том случае, когда последовательности находятся на одной и той же хромосоме на расстоянии, которое является достаточно большим, чтобы было минимальное перекрывание между сигналами ДНК-ДНК-взаимодействия.
53. Способ анализа для идентификации одного или нескольких агентов, которые модулируют ДНК-ДНК-взаимодействие, включающий в себя стадии
(a) контактирования образца с одним или несколькими агентами; и
(b) осуществления стадий (a)-(i) по любому из пп.1-11, при этом стадия (a) включает в себя получении поперечно сшитой ДНК из образца;
при этом разница между (i) частотой взаимодействия между последовательностями ДНК в присутствии агента и (ii) частотой взаимодействия между последовательностями ДНК в отсутствие агента является показателем того, что агент модулирует ДНК-ДНК-взаимодействие.
54. Способ определения положения сбалансированного и/или несбалансированного точечного разрыва (например, в случае транслокации), включающий в себя стадию
(a) осуществления стадий (a)-(i) по любому из пп.1-11; и
(b) сравнения частоты взаимодействия между последовательностями ДНК с частотой взаимодействия в контроле;
при этом переход от низкой к высокой частоте ДНК-ДНК-взаимодействия в образце по сравнению с контролем является показателем положения точки разрыва.
55. Способ определения положения сбалансированной и/или несбалансированной инверсии, включающий в себя стадии
(a) осуществления стадий (a)-(i) по любому из пп.1-11; и
(b) сравнения частоты взаимодействия между последовательностями ДНК с частотой взаимодействия в контроле;
при этом обратная картина частот ДНК-ДНК-взаимодействий для образца по сравнению с контролем является показателем инверсии.
56. Способ определения положения делеции, включающий в себя стадии
(a) осуществления стадий (a)-(i) по любому из пп.1-11; и
(b) сравнения частоты взаимодействия между последовательностями ДНК с частотой взаимодействия в контроле;
при этом уменьшение частоты ДНК-ДНК-взаимодействия в образце по сравнению с контролем является показателем делеции.
57. Способ определения положения дупликации, включающий в себя стадии
(a) осуществления стадий (a)-(i) по любому из пп.1-11; и
(b) сравнения частоты взаимодействия между последовательностями ДНК с частотой взаимодействия в контроле;
при этом увеличение или уменьшение частоты ДНК-ДНК-взаимодействия в случае образца от субъекта по сравнению с контролем является показателем дупликации или инсерции.
58. Агент, который получен или может быть получен способом анализа по п.53.
59. Применение нуклеотидной последовательности по п.12 для идентификации одного или нескольких ДНК-ДНК-взаимодействий в образце.
60. Применение нуклеотидной последовательности по п.12 для диагностики или прогнозирования заболевания или синдрома, вызванного или ассоциированного с изменением ДНК-ДНК-взаимодействия.
61. Применение матрицы зондов по п.15 или набора зондов по любому из пп.16-27 или 30 для идентификации одного или нескольких ДНК-ДНК-взаимодействий в образце.
62. Применение матрицы зондов по п.15 или набора зондов по любому из пп.16-27 или 30 для диагностики или прогнозирования заболевания или синдрома, вызванного или ассоциированного с изменением ДНК-ДНК-взаимодействия.
63. Применение чипа по любому из пп.31-36 или 39 для идентификации одного или нескольких ДНК-ДНК-взаимодействий в образце.
64. Применение чипа по любому из пп.31-36 или 39 для диагностики или прогнозирования заболевания или синдрома, вызванного или ассоциированного с изменением ДНК-ДНК-взаимодействия.
65. Применение по любому из пп.61, 63 или 65, в котором диагностика или прогнозирование являются пренатальной диагностикой или прогнозированием.
66. Способ, матрица зондов, набор зондов, прием, чип, способ анализа, агент или применение, по существу, как описано в данной публикации со ссылками на любые примеры или фигуры.