СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГРИППА ПТИЦ
METHOD OF TREATING AVIAN INFLUENZA

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, в частности к средствам, обладающим противогриппозным действием, и может быть использовано для профилактики и лечения заболеваний вызванных высокопатогенным вирусом гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1).
Вирус гриппа является самым известным и распространенным среди вирусов, обуславливающих инфекционные заболевания верхних дыхательных путей. В настоящее время циркулируют два основных субтипа вируса гриппа A/H1N1 и A/H3N2 [1]. Кроме того, существует угроза возникновения новой пандемии гриппа, вызванной вирусом гриппа птиц субтипа A/H5N1. Заболевания людей, вызванные вирусом гриппа A/H5N1, впервые были выявлены в Гонконге в 1997 г. когда из 18 случаев заболевания было зафиксировано 6 смертельных исходов. Начиная с 1997 г. и по настоящее время высокопатогенные вирусы гриппа субтипа A/H5N1, циркулирующие среди дикой и домашней птицы в Юго-Восточной Азии и других регионах мира, вызвали заболевание 562 человек (по данным ВОЗ на 01.07.11 г.) с необычайно высокой смертностью, которая составила 59% [2]. С 2006 г., помимо Азии возбудитель распространился и внедрился в экологическую природную систему всей Европы, а также северной и центральной частей Африки. Не осталась незатронутой и территория России. Впервые зарегистрированный в 2005 г. в Новосибирской области вирус гриппа субтипа A/H5N1 в кратчайшие сроки распространился по всей Западной Сибири, а в дальнейшем - на центральные и южные регионы России. В последние годы, в целом, наблюдается тенденция к уменьшению количества вспышек, однако в сезон 2009-2010 г. количество случаев заболевания возросло до уровня сезонов 2006-2007 г. и 2007-2008 г. и значительно превысило уровень сезона 2008-2009 г. Последнее сообщение ВОЗ об инфицировании человека этим вирусом датируется 22.06.11 г., при этом случаев инфицирования человека другими подтипами вируса гриппа птиц (Н7 и Н9) за период с 2009 г. по июнь 2011 г. не зарегистрировано [3].
В связи с приведенной выше информацией необходимость разработки средств защиты от гриппозной инфекции, включающих не только профилактические и лечебные препараты, но и другие средства, чрезвычайно актуальна. В настоящее время лечение инфекции, вызванной вирусом гриппа, основано на комплексном применении этиотропных, патогенетических и симптоматических средств [4]. Поэтому остается актуальным подбор компонентов комбинированного лечения, проявляющих наибольшую эффективность. Известно, что применение ингибиторов М2-каналов (амантадин и ремантадин) часто является малоэффективным в отношении штаммов вируса гриппа птиц [5]. Это связано с возникновением мутаций в гене М2 белка, приводящих к появлению резистентности вируса гриппа к ремантадину [6].
Селективные ингибиторы вирусной нейраминидазы озельтамивир (Тамифлю) и занамивир (Реленза) эффективны в отношении как вируса гриппа А, так и вируса гриппа В. Причем Тамифлю является препаратом выбора при лечении лиц, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1, согласно рекомендациям ВОЗ [7]. Однако варианты вируса гриппа, резистентные к озельтамивиру, возникают довольно часто. Это подтверждает необходимость использования схем комбинированного лечения гриппа, сочетая препараты различной направленности. Комплексное лечение гриппа включает применение иммунотропных препаратов интерферона и его индукторов (ИИФН), обладающих этиотропным и иммуномодулирующим эффектом [4]. Эффективность ИИФН была неоднократно показана при экспериментальной гриппозной инфекции [8, 9]. Одним из наиболее эффективных ИИФН является Ридостин - высокомолекулярный индуктор интерферона на основе двуспиральной рибонуклеиновой кислоты киллерных штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisiae [10].
Однако при производстве Ридостина используется лабораторный штамм дрожжей [11]. В случае пандемии наработать его много весьма проблематично.
Целью настоящего изобретения является замена лабораторного штамма дрожжей на промышленный и, как следствие, эффективное лечение гриппа птиц A/H5N1 простым в производстве препаратом с низкой себестоимостью.
Цель достигается тем, что в качестве противогриппозного средства используется природный высокоэффективный индуктор интерферона, извлекаемый из сухих пекарских дрожжей с помощью оттитрованной щелочью олеиновой кислоты, или с помощью додецилсульфата натрия путем обработки выделенной РНК олеиновой кислотой - мылкий амфифильный комплекс высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae с олеатом натрия (предполагаемое рыночное название - Виталанг-2). Представляется актуальным изучение его действия в отношении высокопатогенного вируса гриппа птиц A/H5N1 в моделях на лабораторных животных.
Пример осуществления предлагаемого способа
Животные
В работе использовали здоровых половозрелых животных -беспородных белых мышей обоего пола, массой тела 14-16 г., полученных из питомника лабораторных животных ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор». Все эксперименты проводились в соответствии с [12].
В эксперименте было использовано 210 мышей, из них 126 животных - в опыте (18 групп по 7 мышей в группе) и 84 - в контроле (12 групп по 7 мышей в группе).
Препарат Виталанг-2
Виталанг-2 получали по способу [13], стерилизовали по методу [14], растворяли в стерильном физиологическом растворе (ФР) встряхивая 15-30 мин в день проведения эксперимента.
Вирусы
7,83
50
В работе использовали высокопатогенный вирус гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), полученный из отдела коллекции микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» и наработанный на перевиваемой клеточной линии MDCK (клетки почки взрослой самки кокер-спаниеля) с титром 10 ТЦД/мл.
Испытание противовирусной активности препарата Виталанг-2 (профилактическая схема)
50
50
Препарат Виталанг-2 вводили мышам внутримышечно трехкратно в течение дня с интервалом в 4 ч (11.00, 15.00 и 19.00) в суммарной дозе 0,1 мг/кг массы животного (3-й группы по 7 мышей в группе), 0,5 мг/кг массы (3-й группы по 7 мышей в группе) и 1,0 мг/кг массы (3-й группы по 7 мышей в группе) в объеме 200 мкл/одно введение. В качестве положительного контроля использовали 3-й группы по 7 мышей, которым один раз в день в течение 5 дней перорально вводили противогриппозный препарат Тамифлю в дозе 5 мг/кг массы мыши в объеме 200 мкл/одно введение. В качестве отрицательного контроля использовали 3-й группы по 7 мышей, которым внутримышечно вводили ФР в объеме 200 мкл/одно введение три раза в течение дня в те же сроки, что и в опыте. Через 1 ч после третьего введения всех препаратов (20.00) животных заражали интраназально под эфирным наркозом летальной дозой (10 LD, содержащих 1,49 lg ТЦД) вируса гриппа птиц A/H5N1 в объеме 40 мкл/мышь. Гибель животных учитывали ежедневно в течение последующих 16 дней, оценивали процент гибели, коэффициент защиты и среднюю продолжительность жизни. За максимальную величину продолжительности жизни выживших животных принимали 16 сут, т.е. следующий день после прекращения гибели инфицированных мышей. Коэффициент защиты рассчитывали по формуле: % гибели в контроле - % гибели в опыте.
Испытание противовирусной активности препарата Виталанг-2 (лечебная схема)
50
50
Мышей опытных и контрольных групп инфицировали интраназально под эфирным наркозом летальной дозой (10 LD, содержащих 1,49 lg ТЦД) вируса гриппа птиц A/H5N1 в объеме 40 мкл/мышь (10.00).
Через 1 ч (11.00) после инфицирования мышам вводили препарат Виталанг-2 внутримышечно и затем еще дважды в течение дня с интервалом в 4 ч (15.00 и 19.00) в суммарной дозе 0,1 мг/кг массы животного (3-й группы по 7 мышей в группе), 0,5 мг/кг массы (3-й группы по 7 мышей в группе) и 1,0 мг/кг массы (3-й группы по 7 мышей в группе) в объеме 200 мкл/одно введение. В качестве положительного контроля использовали 3-й группы по 7 инфицированных мышей, которым через 1 ч после инфицирования вводили препарат Тамифлю перорально в дозе 5 мг/кг массы мыши в объеме 200 мкл/одно введение с последующим ежедневным в течение 4-х дней введением этого препарата. В качестве отрицательного контроля использовали 3-й группы по 7 инфицированных мышей, которым через 1 ч внутримышечно вводили ФР в объеме 200 мкл/одно введение и затем еще дважды в течение дня с интервалом в 4 ч (15.00 и 19.00) в том же объеме. Гибель животных учитывали ежедневно в течение последующих 16 дней, оценивали процент гибели, коэффициент защиты и среднюю продолжительность жизни.
Статистическая обработка
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.0», используя t-критерий Стьюдента, а также U-критерий Манна-Уитни. Достоверность различий средних величин устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента при р<0,05. Результаты исследований
50
При инфицировании мышей 10 LD вируса гриппа птиц A/H5N1 было обнаружено, что достоверное преимущество по количеству выживших мышей по сравнению с контролем (введение ФР) наблюдалось в группах, получавших Виталанг-2 до заражения (профилактическая схема). При этом наблюдалась четкая зависимость количества выживших животных от дозы препарата: процент выживших мышей составил 23,8; 28,6 и 38,1 при дозах 0,1; 0,5 и 1,0 мг/кг массы животного, соответственно, при 100%-ной гибели в контроле). Следует отметить, что использование в этих экспериментах максимальной из исследованных доз - 1 мг/кг массы (суммарная доза 20 мкг/мышь) приводило к защите мышей (38,1%) от гриппозной инфекции, аналогичной (38,1%) в случае использования коммерческого препарата Тамифлю при суммарной его дозе на мышь в 25 раз большей (500 мкг/мышь).
50
По показателю средней продолжительности жизни (СПЖ) при заражении мышей 10 LD вируса гриппа значения в группах животных, получавших Виталанг-2 до заражения во всех исследуемых дозах были достоверно выше, чем в контрольной группе (ФР), и составили 10,10±0,88; 11,14±1,27; 11,43±0,14 и 8,66±0,08 при использовании доз препарата 0,1; 0,5; 1,0 мг/кг и ФР, соответственно.
5
Введение Виталанга-2 после заражения мышей летальной дозой (10 LDo) вируса гриппа (лечебная схема) защищало только 9,5% животных вне зависимости от используемой дозы препарата. При этом в контрольных группах животных, получавших Тамифлю и ФР, выжило 28,6 и 0%, соответственно. СПЖ при лечебной схеме введения Виталанга-2 была достоверно выше контроля (ФР) только при использовании его максимальной дозы 1 мг/кг и составила 9,90±1,78, но была достоверно ниже СПЖ при использовании Тамифлю (10,33±0,17).
Незначительный защитный эффект Виталанга-2 от гриппозной инфекции при использовании лечебной схемы по сравнению с достаточно выраженной защитой при применении профилактической схемы может быть связан с тем, что репликативный цикл вируса гриппа составляет 5-8 ч (через 5 ч после заражения почкующиеся вирионы обнаруживаются на клеточной мембране, через 6 ч вирус выходит в среду, и через 7-8 ч инфекционный вирус достигает максимальной концентрации в среде). Вероятно, к 6-7 ч после заражения уровень эндогенного интерферона, индуцированного Виталангом-2, недостаточен для ослабления инфекции. При заражении же животных летальной дозой вируса гриппа через 9 ч после начала введения препарата Виталанг-2 (профилактическая схема) количество выживших мышей было значительно выше по сравнению с этими показателями в лечебной схеме, что, может быть связано с достаточно выраженной индукцией интерферона Виталангом-2 к 9 часу.
Таким образом, препарат Виталанг-2 является эффективным противогриппозным средством и после соответствующих доклинических и клинических испытаний может быть рекомендован для лечения заболеваний вызванных высокопатогенным вирусом гриппа птиц A/H5N1. Лечение необходимо начинать при первых признаках болезни, терапевтическая доза - 1 мг/кг массы тела животного или человека.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт №16.512.11.2018 от 11.02.2011).
Источники информации
1. Грипп: Руководство для врачей. Под ред. Г.И. Карпухина. СПб., 2001, 360.
2. Огарков П.И. Всемирный научный форум о подготовке к возможной пандемии гриппа. Бюл. «Вакцинация. Грипп». - 2003. - №3 (27).
3. Tipatov, A.S., Evseenco, V.A., Yen, H.L., Zaykovskaya, A.V., Durimanov, A.G., Zolotykh, S.I., Netesov, S.V., Drozdov, I.G., Onishchenko G.G., Webster, R.G., Shestopalov, A.M. Influenza (H5N1) Viruses in Poultry, Russian Federation, 2005-2006 // Emerg. Infect. Dis. - 2007. - V.13. - N.4. - P.539-546.
4. Ершов Ф.И., Романцев М.Г. Лекарственные средства, применяемые при вирусных заболеваниях. М., 2007, 368.
5. Watts J. Asian nations step up action to curb spread of avian influenza. Lancet. 2004, 363, 9406: 373.
6. Li K.S., Guan Y., Wang J. et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature. 2004, 430, 6996: 209-213.
7. Сухинин В.П., Зарубаев В.В.. Платонов В.Г. Защитное действие циклоферона при экспериментальной гриппозной инфекции. Вопросы вирусологии. 2000, 5:26-31.
8. Ершов Ф.И., Мощик К.В. Эффективность индукторов интерферона при экспериментальном гриппе. Вопросы вирусологии. 1984, 6:706-707.
9. Сухинин В. П., Зарубаев В. В.. Платонов В.Г. Защитное действие циклоферона при экспериментальной гриппозной инфекции. Вопросы вирусологии. 2000, 5: 26-31.
10. Пат. 2083221 РФ. Индуктор интерферона Ридостин / Аликин Ю.С., Веревкина К.Н., Дубатолова Т.Д. и др.; опубл. 10.07.1997.
11. Пат. 2398596 РФ. Способы профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа птиц A/H5N1, с использованием индуктора интерферона и ингибитора нейраминидазы / Скарнович М.О., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н. и др.; опубл. 10.09.2010.
12. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Страсбург, 1986.
13. Пат. 2403288 РФ. Способ получения высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей / Ямковая Т.В., Загребельный С.Н., Панин Л.Е. Ямковой В.И.; опубл. 10.11.2010.
14. Пат. 2397988 РФ. Способ терминальной стерилизации высокополимерной дрожжевой РНК / Ямковая Т.В., Кузовкова Е.В., Железнова Ю.П. и др.; опубл. 27.08.2010.