Количественное содержание активатора прекалликреина в отечественных лекарственных препаратах альбумина человека

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Иммуномодуляторы эндогенной и экзогенной природы Immunomodulators of endogenous and exogenous nature

(нормальной) плазмы крови человека в тесте генерации тромбина; активность прокоагулянтных факторов свертывания крови (II, VII, IX, X, XI); а так же изменение неактивированного частичного тромбопластинового времени стандартной плазмы крови человека. Критериями оценки являются максимальное количество тромбина в тесте генерации тромбина, не превышающее 350 нМоль, латентный период (лаг-фаза) генерации не менее 11 мин., период образования максимального количества тромбина — не менее 19 мин., активность фактора Xfe, не превышающая 10 мМЕ/мл, факторов II, VII, IX, X и калликреина — менее 50 мМЕ/мл, а также отсутствие уменьшения времени образования сгустка в стандартной плазме крови человека. Выявлено, что в исследованных образцах препаратов иммуноглобулинов человека четырех отечественных производителей остаточное содержание факторов свертывания крови IX, Ка, VII не превышает установленный предел, активность факторов II и X не проявляется, установлено наличие в образцах антитромбина III в количестве более

1 МЕ/мл, латентный период генерации тромбина и период образования максимального количества тромбина не превышает 3 мин. Полученные результаты свидетельствуют о низком тромбогенном потенциале этих образцов.

Заключение. Обоснованные параметры и критерии могут быть использованы для подтверждения безопасности препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения в части оценки их возможного негативного влияния на свертывающую систему крови пациента. Тромбогенный потенциал изученных образцов препаратов иммуноглобулинов человека отечественного производства соответствует международным стандартам качества.

РАЗРАБОТКА ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПСОРИАЗА НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО РЕЦЕПТОРНОГО АНТАГОНИСТА ИНТЕРЛЕЙКИНА-36 (IL-36ra) ЧЕЛОВЕКА

Колобов А.А.1, 2, Кондратьева Е.В.1, Кудлинг Т.В.1, Карасев М.М.1, Калинин Р.С.1, Протасов Е.А.1, Нимирицкий П.П.1, 2, Стефанов В.Е.1, 2, Александров Г.В.1, Петров А.В.1, Симбирцев А.С.1

1ФГУП«Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА РФ, Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Введение. Генерализованный пустулезный псориаз (ГПП) — это редкая, в некоторых случаях смертельно опасная форма псориаза, которая вызывается рядом мутаций в гене рецепторного антагониста интерлейкина-36 (IL-36ra), сопровождающихся его сниженной экспрессией или активностью. Введение экзогенного IL-36ra могло бы применяться для лечения ГПП и других форм псориаза.

Цель и задачи. Цель данной работы — проведение доклинических исследований лекарственного средства для лечения псориаза на основе рекомбинантного IL-36ra человека. Задачи данной работы включали в себя создание плазмидных векторов для экспрессии гена IL-36ra, создание штамма-продуцента IL-36ra на основе E. coli, разработку методов очистки и хранения IL-36ra и доклинические исследования активности и токсичности IL-36ra.

Материалы и методы. Поскольку для полной биологической активности IL-36ra необходимо отщепление инициаторного остатка метионина, нами был получен

штамм-продуцент IL-36ra на основе E. coli, трансформированный плазмидами, несущими гены IL-36ra и ме-тионинаминопептидазы (МАП) E. coli. Была разработана методика культивирования штамма-продуцента IL-36ra в ферментерах. Была разработана схема хроматографи-ческой очистки IL-36ra на анионообменном сорбенте GE Q и гидрофобном сорбенте Tosoh Butyl-650. Была разработана композиция его готовой лекарственной формы. Была подобрана эффективная доза препарата. Были исследованы фармакокинетика и острая токсичность препарата на мышах, крысах и кроликах.

Результаты. Разработанная методика культивирования штамма-продуцента IL-36ra и его дальнейшей очистки позволяет получать с 1 литра бактериальной культуры до 40 мг очищенного IL-36ra с примесью < 5% его формы, содержащей неотщеплённый N-концевой остаток метионина. Показана способность полученного препарата IL-36ra купировать индуцированный псориазоподобный фенотип у мышей в дозе 0,5 мг/кг при подкожном введении. Дозы препарата до 200 мг/ кг не токсичны для грызунов и зайцеобразных. Препарат апирогенен и не оказывает местно-раздражающего действия.

Заключение. Полученный препарат рекомбинантно-го рецепторного антагониста интерлейкина-36 (IL-36ra) человека эффективно купирует псориазоподобный фенотип у мышей и не демонстрирует острой токсичности в дозах до 200 мг/кг, что в тысячи раз превосходит расчетную терапевтическую дозу для человека. Методика получения IL-36ra пригодна для промышленного масштабирования. После окончания доклинических испытаний препарат может быть испытан на людях.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ СОДЕРЖАНИЕ АКТИВАТОРА ПРЕКАЛЛИКРЕИНА В ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА

Кривых М.А., Корнилова О.Г., Жук И.Е.

ФГБУ«Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия

Введение. Количественное определение содержания активатора прекалликреина является одним из ключевых показателей качества, определяющих специфическую безопасность таких инфузионных препаратов крови, как альбумин человека. С присутствием в указанных препаратах активатора прекалликреина связывают возможные нежелательные реакции в виде гипотензии. До настоящего времени лекарственные препараты альбумина человека отечественного производства не подвергались контролю качества на содержание активатора прекалликреина ни в процессе производства, ни при выпуске готового лекарственного препарата. Всемирная организация здравоохранения рекомендует проводить определение содержания активатора прекалликреина в препаратах крови человека, включая альбумин. Фармакопейной статьей «Альбумин человека» ФС.3.3.2.0006.15 Государственной фармакопеи Российской Федерации XIII издания впервые в отечественной фармацевтической практике установлены требования по содержанию активатора прекал-ликреина на уровне не более 35 МЕ/мл.

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

ТАБЛИЦА. СОДЕРЖАНИЕ АКТИВАТОРА ПРЕКАЛЛИКРЕИНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТАХ АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРОИЗВОДСТВА

Группировочное наименование лекарственного препарата (концентрация) Содержание активатора прекалликреина, МЕ/мл

№ образца хромогенный кинетический метод хромогенный метод по конечной точке

Альбумин человека (10%) 1 5,3±0,3 5,8±0,4

Альбумин человека (10%) 2 1,1±0,1 1,9±0,2

Альбумин человека (10%) 3 4,7±0,2 4,7±0,3

Альбумин человека (10%) 4 Менее 1 Менее 1

Альбумин человека (10%) 5 Менее 1 Менее 1

Альбумин человека (10%) 6 9,1±0,6 14,7±0,7

Альбумин человека (20%) 7 5,4±0,4 5,9±0,5

Альбумин человека (10%) 8 9,1±0,6 9,5±0,5

Цель. Изучить количественное содержание активатора прекалликреина в лекарственных препаратах альбумина человека отечественного производства.

Материалы и методы. Использовали образцы лекарственных препаратов альбумина человека, раствор для инфузий, 100 мг/мл (10%) и 200 мг/мл (20%) отечественного производства; стандартный образец активатора прекалликреина в альбумине BRP EP CRS, серия № 3 (кат. № Y0000263). Использовали исследуемые образцы без предварительного разведения, раствор прекалликреина (American Diagnostica Gmbh, Кат. № ADG472) в разведении 1:100. Определение проводили хромогенным кинетическим методом и с оценкой по конечной точке. Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистическими методами с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel. Результаты представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения

(X±Sx).

Результаты. Проведено исследование количественного содержания активатора прекалликреина в образцах 8 серий лекарственных препаратов альбумина человека отечественного производства. Полученные значения содержания активатора прекалликреина составили менее 15,4 МЕ/мл (табл.), что соответствует фармакопейным требованиям, предъявляемым к данной группе лекарственных препаратов.

Заключение. Содержание активатора прекалликреина в изученных сериях лекарственных препаратов альбумина человека отечественного производства находится на уровне, позволяющем обеспечить их специфическую безопасность, и соответствует современным международным стандартам качества.

ИММУНОКОРРИГИРУЮЩАЯ И ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛИСАХАРИДА ИЗ МОРСКИХ БАКТЕРИЙ PSEUDOALTEROMONAS NIGRIFACIENS ПО ОТНОШЕНИЮ К ВИРУСУ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Крылова Н.В., Смолина Т.П., Леонова Г.Н.

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Т.П. Сомова, Владивосток, Россия

Клещевой энцефалит (КЭ) относится к числу опасных нейровирусных инфекций, регистрируемых на Евразийском континенте. Для лечения пациентов с диагно-

зом КЭ лицензированных антивирусных препаратов до сих пор не существует. Установлена способность вируса КЭ (ВКЭ) модулировать иммунный ответ хозяина, что может оказывать решающее влияние на течение и исход заболевания (Robertson, 2009; Ye, 2013). В этой связи, актуальным является поиск противовирусных препаратов, которые могли бы не только ингибировать репликацию вируса, но и корригировать иммуносупрессию, индуцированную вирусом.

Цель. Комплексное изучение иммунокорригирующей и противовирусной активности капсульного полисахарида из морских бактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens в отношении вируса КЭ.

Материалы и методы. Капсульный полисахарид (КПС) получен в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН. Оценку уровня экспрессии мембранных молекул (CD69, HLA-DR, CD107a) на моноцитах, NK-клетках и CD8-T-лимфоцитах осуществляли стандартным методом двух- или трехцветного иммунофлюоресцентного окрашивания цельной крови здоровых доноров на проточном цитофлюориме-тре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Противовирусную активность соединения оценивали по цитопати-ческому действию (ЦПД) вируса на монослой культуры клеток СПЭВ, инфицированных ВКЭ и обработанных КПС (в диапазоне от 10 до 12000 мкг/мл).

Результаты. Установлено, что через 24 ч после инфицирования лейкоцитов крови здоровых доноров вирусом КЭ (moi 0.01) в инфицированных пробах, необработанных КПС, процент вирус-положительных клеток составил 57±8%; в пробах, обработанных 100 мкг/мл КПС, обнаружено 11±4% вирус-инфицированных клеток. Добавление 100 мкг/мл КПС к образцам цельной крови, инфицированным ВКЭ, приводило к увеличению (в 1,3-2,6 раза) уровня экспрессии активационных маркеров CD69 и HLA-DR на моноцитах, NK- и CD8-клетках, по сравнению с необработанными инфицированными образцами (p < 0,05). Кроме того, подобная обработка КПС инфицированных образцов крови повышала процент NK-и CD8+ клеток, экспрессирующих маркер дегрануляции CD107a (до 8,3-10,2%), по сравнению с необработанными инфицированными образцами (1,1-2,3%).

Исследование противовирусной активности КПС в отношении ВКЭ показало, что на 6 сут после инфицирования культуры клеток СПЭВ тестируемый полисахарид (в концентрации 1000 мкг/мл) снижает титр вируса на