Оценка чувствительности и специфичности ряда тестов для ускоренного выявления опухолевых промоторов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ EXPERIMENTAL ИССЛЕДОВАНИЯ INVESTIGATIONS

© Коллектив авторов, 1995 УДК 616-006.-092.9

И. В. Буду нова, Н. П. Щербак, Г. А. Белицкий,

Л. А. Миттелъман, О. В. Короткова

ОЦЕНКА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ РЯДА ТЕСТОВ ДЛЯ УСКОРЕННОГО ВЫЯВЛЕНИЯ ОПУХОЛЕВЫХ ПРОМОТОРОВ

Институт канцерогенеза, Отдел физиологии и фармакологии Медицинской школы Тель-Авивского университета, Израиль

Опухолевые промоторы — обширная группа соединений различного химического строения, которые, не являясь канцерогенами, усиливают и ускоряют канцерогенез, приводя к возникновению опухолей после действия на организм низких (в том числе допороговых) доз канцерогенов [2, 5, 6]. Признанная роль промоторов в возникновении опухолей определяет важность их выявления и регламентации в окружающей среде, продуктах питания, лекарствах и др. Среди многочисленных краткосрочных тестов, предложенных за последние 10—15 лет для первичного скрининга опухолевых промоторов, большой интерес представляют методы, оценивающие эффект воздействия промоторов на клеточную диффе-ренцировку и проницаемость щелевых контактов [4,12,14]. Обе группы методов отражают представление об эпигенетическом действии промоторов, способности их изолированно и разнонаправленно влиять наделение и диф-ференцировку нормальных и инициированных клеток.

В настоящей работе была предпринята попытка изучить действие опухолевых промоторов различной орга-нотропности и полных канцерогенов на дифференциров-ку клеток промиелоцитарной лейкемии человека НЬ-60 и эритробластной лейкемии мышей 08-19, клон А2, сравнить чувствительность этих тестов с тестом на ингибирование проницаемости щелевых контактов и оценить взаимодополняемость и/или взаимозаменяемость этих тестов при построении «батареи» тестов для скрининга опухолевых промоторов.

Материалы и методы. Проницаемость щелевых контактов определяли по уровню межклеточного обмена люциферовым желтым (ЛЖ) в трансформированных вирусом БУ40 фибробластах джунгарского хомячка (линия ДМ-15), полученных Е. С. Колпаковой (ОНЦ РАМН). Клетки выращивали на покровных стеклах в среде Игла, содержащей 10% бычьей сыворотки и 100 ед/мл мономицина. В опыте использовали культуры с плотностью 50—70% от сплошного монослоя.

После обработки тестируемым соединением клетки отмывали раствором гидролизата лактальбумина и покровные стекла с клетками помещали в камеру на предметном столике люминесцентного микроскопа, в которой постоянно протекал гидролизат. Насыщенный раствор Л Ж электрофоретически инъецировали в клетки с помощью стеклянных микроэлектродов с диаметром кончика 0,5 мкм. Измерения проводили при комнатной температуре. Количество окрашенных клеток-реципиентов подсчитывали через минуту после начала инъекции. Для определения уровня межклеточного обмена Л Ж производили 6—10

I. V. Budunova, N. P. Scherbak, G. A. Belitsky,

L. A. Mittelman, O. V. Korotkova

EVALUATION OF SENSITIVITY AND SPECIFICITY OF SOME TESTS FOR RAPID DETECTION OF TUMOR PROMOTERS

Research Institute of Carcinogenesis, Moscow, Physiology and Pharmacology Department, Medical School of Tel Aviv University, Israel

Tumor promoters are a large group of compounds with different chemical structure which though not car-cinogenous enhance and accelerate tumor generation under the effect of low (including those below threshold limit value) carcinogenic doses [2,5,6]. The recognized role of the promoters in tumor generation makes urgent the problem of their detection and control in the environment, foods, drugs, etc. Methods for evaluation of promoter effect on cell differentiation and cleft contact permeability [4,12,14] are of the most interest among the large variety of short-term tests proposed over the last 10—15 years for primary screening of tumor promoters. These methods reflect the concept of epigenetic effect of the promoters, their ability to exert isolated and diverse actions on division and differentiation of normal and initiated cells.

Our investigation attempted to study effects of tumor promoters with different organ preference and full carcinogens on cell differentiation of human promyelocytic leukemia HL-60 and murine erythroblastic leukemia DS-19 clone A2, to compare sensitivity of these tests with that of the cleft contact permeability inhibition test, and to evaluate the possibility of matching or/and interchanging these methods in test ’batteries’ for screening tumor promoters.

Materials and Methods. Permeability of cleft contacts was determined by the level of intercellular exchange of Lucifer yellow (LY) in SV40 virus-transformed fibroblasts of Jungar hamster (line DM-15) derived by E. S. Kolpakova (CRC RAMS). The cells were grown on cover glasses in Eagle medium containing 10% of bovine serum and 100 U/ml monomycin. Cultures with a density of 50% to 70% of continuous monolayer were taken for the test.

The cells were treated with a test compound and washed with lac-talbumin hydrolysate solution, the cover glasses with the cells were then put in a chamber on the luminescent microscope stage with hydrolysate flowing continuously through the chamber. Saturated LY solution was injected ionophoretically into the cells using glass microelectrodes with edge diameter 0.5 mcm. The measurements were performed at room temperature. Stained recipient cells were counted at one minute following injection. To evaluate intercellular LY exchange we performed 6 to 10 microinjections per every test compound. A total of 2 to 3 drugs were used per every experimental point.

To perform the differentiation induction test we used suspension culture of human promyelocytic leukemia HL-60 from the cell culture

микроинъекций в клетки на каждом препарате. Всего на каждую точку в эксперименте использовали 2—3 препарата.

В тесте на индукцию дифференцировки использовали суспензионную культуру клеток промиелоцитарной лейкемии человека HL-60, полученную из коллекции клеточных культур Института цитологии (Санкт-Петербург). 5—10 тыс. клеток HL-60 в 0,1 мл ростовой среды вносили в каждую лунку 96-луночной платы («Falcon») и через 24 ч добавляли испытуемое соединение в соответствующей концентрации. На каждую концентрацию использовали три лунки. Для каждого соединения исследовали концентрации LDso (определялась заранее) и далее по ряду разведения 1:2. В качестве активного промотора (положительный контроль) использовали 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТФА). Через 6 ч после добавления исследовавшихся соединений при положительном результате в лунках появлялись единичные прикрепленные к пластику распластанные и образовавшие отростки клетки. Через 24 ч в этих лунках до 30% клеток дифференцировалось. Максимум дифференцировавшихся клеток наблюдали через 48 ч. В лунках с отрицательным результатом прикрепленных к пластику клеток не наблюдали. Результат учитывали через 48 ч при микроскопическом исследовании неокрашенных или окрашенных метиленовым синим клеток.

Для теста на ингибирование дифференцировки использовали клетки эритробластной лейкемии мышей DS-19, клон А2, полученный нами путем клонирования исходной культуры [3]. 5—15 тыс. клеток клона А2 в 0,2 мл ростовой среды, содержащей 2%. ДМСО («Sigma») вносили в лунки 96-луночной платы и спустя 6—8 ч добавляли в лунки испытуемое соединение в соответствующей концентрации. Условия опыта — аналогичны таковым на клетках HL-60. На 3—4-й день после добавления исследовавшегося соединения клетки в лунках окрашивали бин-зидином на гемоглобин и изучали под световым микроскопом. В лунках, в которых наблюдался эффект от действия промоторов, все клетки оставались неокрашенными, что свидетельствовало об отсутствии синтеза гемоглобина. В лунках, в которых вызванные ДМСО дифферен-цировка и синтез гемоглобина не блокировались, 60—95% (в зависимости от опыта) клеток были окрашены в интенсивно синий цвет.

Для культивирования клеток линий HL-60 и DS-19, клон А2, использовали среду RPMI-1640, содержащую 10% раствор эмбриональной сыворотки коров и 100 мкг/мл гентамицина.

В опытах с метаболической активацией исследовавшихся соединений в качестве «клеток подложки» использовали необлученные эмбриональные клетки беспородных крыс (КЭК), полученные из эмбрионов 17—19 дней беременности. КЭК 3—4-го пассажа сажали на покровные стекла в 40-миллиметровых пластиковых чашках. Через ночь в чашки добавляли (1,0—1,5)106 клеток HL-60 и исследовавшееся вещество в концентрации 0,5—0,25 от LDso. Через 48 ч подсчитывали число прикрепившихся к КЭК клеток HL-60. Для их метки были использованы моноклональные антитела ICO-60, полученные ранее в лаборатории клинической иммунологии ОНЦ РАМН ICO, которые связывались с поверхностными антигенами дифференцировавшихся клеток HL-60, но не реагировали с поверхностными антигенами мембран крысиных «клеток подложки». Связавшиеся моноклональные антитела выявляли в непрямой реакции иммунофлюоресценции на нефиксированных клетках [1], меченных Р1ТС((аЬ)2-фрагментами, полученными из коммерческой кроличьей сыворотки к у-глобулину белой мыши. Обработку клеток проводили в этих же чашках, затем покровное стекло переносили на предметное и подсчитывали количество меченых клеток под люминесцентным микроскопом.

Результаты и обсуждение. Всего в трех тестах (на индукцию или ингибирование дифференцировки клеток и на ингибирование проницаемости щелевых контактов) было изучено 24 соединения, большинство из которых — опухолевые промоторы различной органотропности и полные канцерогены. Мы включили полные канцерогены в круг исследуемых соединений, так как считали логичным предположить у этих соединений наличие свойств как инициаторов, так и промоторов. Результаты основных исследований приведены в табл. 1.

В тесте на ингибирование межклеточного обмена ЛЖ в культуре фибробластов ДМ-15 было изучено 18 соединений, включающих 10 промоторов различной органотропности и 4 полных канцерогена. 7 из 10 изученных

collection of the Cytology Institute (St.Peterburg). 5,000 to 10,000 HL-60 cells in 0.1 ml growth medium were transferred into each well of a 96-well plate (Falcon), the test compound at certain concentration was added to the wells 24 h later. Three wells were taken for every concentration. For each compound we studied concentrations LDso (determined earlier) to be followed by 1:2 dilutions. 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate (TPA) was used as an active promoter (positive control). Single cells with projects spreading out and sticking to the plastic could be observed at 6 h following addition of the test compounds in positive result wells. At 24 h 30% of the cells in these wells showed differentiation. The number of the differentiating cells reached maximum at 48 h. There were no cells adhering to the plastic in negative result wells. Test results were recorded at 48 h by microscopy of cells stained or not stained with methylene blue.

In the differentiation inhibition test we used cells of murine erythroblastic leukemia DS-19 clone A2 derived by cloning parent culture [3]. 5,000 to 15,000 cells of A2 clone in 0.2 ml growth medium containing 2% DMSO (Sigma) were placed into wells of a 96-well plate, a test compound at certain concentration was added to the wells 6 to 8 h later. Test conditions were similar to those with HL-60 cells. On day 3—4 following addition of test compounds the cells in the wells were stained with benzidine for hemoglobin and studied by light microscopy. In the promoter effect-positive wells all cells remained unstained which was evidence of no hemoglobin synthesis. While in the wells with no blockade of DMSO-induced differentiation and hemoglobin synthesis 60% to 95% (depending upon test conditions) of the cells were stained intense blue.

To culture HL-60 and DS-19 clone A2 cells we used RPMI-1640 medium with 10% embryonic calf serum and 100 mcg/ml gentamycin.

In tests with metabolic activation of test compounds we used cells of mongrel rat embryos of 17- to 19-day pregnancy not exposed to irradiation (REC) as cell substrate. REC of passages 3 or 4 were transferred onto cover glasses in 40 mm plastic cups. The test compounds at 0.5—0.25 LDso and (1.0—1.5)xl06 HL-60 cells were added overnight to the cups. HL-60 adhering to the REC were counted at 48 h. The cells were labeled with monoclonal antibody ICO-6O derived previously at the Clinical Immunology Laboratory, CRC RAMS, which bound to surface antigens of the differentiation HL-60 but did not react with membrane surface antigens of the rat substrate cells. The bound monoclonal antibodies were detected by indirect immunofluorescence on non-fixed cells [1] labeled with FITC(ab)2 fragments from commercial rabbit serum to white mouse gamma-globulin. The treatment of the cells was performed in the same cups, then the cover glasses were transferred onto ground slides to count the number of the labeled cells by luminescent microscopy.

Results. A total of 24 compounds (mainly tumor promoters with different organ preference and full carcinogens) were studied in the three tests for cell differentiation induction and inhibition, and for cleft contact permeability inhibition. The full carcinogens were included in the study because it seemed logical to expect these compounds to act as both initiators and promoters of carcinogenesis. Results of the study are summarized in table 1.

A total of 18 compounds including 10 promoters of different organ preference and 4 full carcinogens were studied in the test for LY intercellular exchange inhibition in the fibroblast DM-15 culture. 7 of the 10 tumor promoters showed inhibition of LY intercellular exchange. TPA, meserine, teleocidine and Ca2+ ionophore A 23187 showed the greatest inhibition of intercellular contact permeability. All these promoters acted quickly, at an optimal concentration (10-8 to 10-6 g/ml) they induced a 3 to 6-fold reduction in the number of stained recipient cells as compared to the control already at 30 min after incubation beginning. The liver promoter DDT and the promoter of broad-range preference butyl-hydroxytoluene also demonstrated a marked dissociating effect on the cleft contacts. The degree of inhibition of LY intercellular exchange was similar to that produced by the first four compounds though maximum effect was achieved only at much higher concentrations (50 to 100 mcg/ml) and after longer incuba-

Влияние опухолевых промоторов и полных канцерогенов на проницаемость щелевых контактов и дифференцировку клеток Effect of tumor promoters and full carcinogens on permeability of cleft contacts and cell differentiation

Тест

Соединение Концентрация, мкг/мл Свойства проницаемость щелевых контактов клеток ДМ-15 индукция дифференцировки клеток HL-60 ингибирование дифференцировки клеток A2

ТФА ТРА 0,1—0,001 Промотор/Promoter + + +

Телеоцидин Teleocidine О X о о + + +

Антралин Anthraline 50—0,015 tt + - -

Линдан Lindane 50—0,25 її нт / nt - -

ДДТ DDT 100—0,25 + - ?

ФБ PB 1000—0,25 и * - нт / nt

БГОТ BHOT 100—10 + нт / nt нт / nt

ЙУК IAA 10—0,12 - - нт / nt

ЛХК LCA 16—0,25 нт / nt - ?

ОК OA 50—0,5 — нт / nt - -

Мезерин Meserine 0,1—0,01 Слабый промотор Weak promoter + + +

А 23178 A 23178 10—0,1 То же / The same + нт / nt нт/nt

Твин-80 Twin-80 20—0,6, мкл/мл и нт / nt - -

Б (а) П B(a)P 2—0,015 Канцероген Carcinogen HT/nt — —

3-МХ 3-MC 10—0,015 it + - -

7,12-ДМБА 7,12-DMBA 10—0,015 •і + - -

ЭМС EMS 1000—10 и + нт / nt нт / nt

Асбест Asbestos 100—0,5 - нт / nt ?

Б (е) П B(e)P 10—0,3 Слабый канцероген Weak carcinogen — — —

Б (а) А B(a)A 10—0,3 To же / The same - нт / nt -

Антигорит Antigorite 200—15 ii нт/nt нт / nt -

Сивол Sivol 100—0,5 и нт / nt нт / nt -

НН SN 1500—120 ii + - нт / nt

Б (а) Ф B(a)F 10—1,0 Антиканцероген Anticarcinogen + нт/nt нт / nt

Compound Concentration, Properties DM-15 cleft contact permeability HL-60 differentiation induction А2 differentiation inhibition

mcg/ml Test

Примечание. * Усиление перетекания красителя; + положительная реакция; — отрицательная реакция; ? — эффект при токсических концентрациях; ФБ — фенобарбитал; БГОТ — бутил-гидрокситолуол; ЙУК — йодоуксусная кислота; ЛХК — литохолевая кислота; ОК — оротовая кислота; Б (е) П — бенз(е)пирен; ЭМС — этилметансульфонат; Б (а) А — бенз(а)антрацен; НН — нитрат натрия; 7, 12-ДМБА — 7, 12-диметилбензантрацен; Б (а) Ф — бенз(а)флавон. Здесь и в табл. 2: Б (а) П — бенз(а)пирен; 3-МХ — 3-метилхолантрен; нт — не тестировалось.

Note. * shows increase in dye exchange; + indicates positive reaction, - negative reaction; ? shows effect at toxic concentrations; PB, phenobarbital; BHOT, butylhydroxytoluene; IAA, iodacetic acid; LCA, lithocholic acid; OA, orotic acid; B(e)P, benzo(e)pyrene; EMS, ethylmethanesulfate; B(a)A, benz(a)an-thracene; SN, sodium nitrate; 7,12-DMBA, 7,12-dimethylbenzanthracene; B(a)F, benzo(a)flavone. Here and in table 2: B(a)P, benzo(a)pyrene; 3-MC, 3-methylcholanthrene; nt, not tested.

опухолевых промоторов ингибировали межклеточный обмен ЛЖ. Наиболее сильными ингибиторами проницаемости межклеточных контактов были промоторы для кожи — ТФА, мезерин, телеоцидин и Са2+ ионофор А 23187. Все эти промоторы действовали быстро, при оптимальной концентрации (10-8—10-6 г/мл) вызывали снижение количества окрашенных клеток-реципиентов в 3—6 раз по сравнению с контролем уже через 30 мин после начала инкубации. Промотор для печени ДДТ и промотор широкой органотропности бутил-гидроксито-

tions (4 to 24 h). Anthraline produced a weaker dissociating effect on the cleft contacts. The compound (50 mcg/ml, incubation duration 5 h) induced a 1.7 to 2.5-fold reduction in the number of stained cells only in 3 of 6 experiments. Anthraline showed no effect on cleft contact permeability in 1 experiment, in the remaining 2 experiments it was toxic at 50 mcg/ml while demonstrating no effect at lower concentrations as might be judged by cell morphology.

The liver promoter phenobarbital showed a paradoxical effect on cleft contact permeability. At 1 mg/ml it en-

луол также оказывали выраженное разобщающее действие на щелевые контакты. Степень ингибирования межклеточного обмена ЛЖ была такой же, как и в случае первых четырех соединений, хотя для достижения максимального эффекта необходимо было использовать значительно более высокие концентрации — 50—100 мкг/мл и более длительное время инкубации — 4—24 ч. Антралин оказывал слабое разобщающее действие на щелевые контакты. Только в 3 опытах из 6 антралин (50 мкг/мл, время инкубации 5 ч) вызывал снижение количества окрашенных клеток в 1,7—2,5 раза. В 1 эксперименте антралин не оказывал никакого действия, а в остальных 2 экспериментах, судя по морфологии клеток, он был токсичен в концентрации 50 мкг/мл, а в более низких концентрациях не влиял на проницаемость щелевых контактов.

Промотор для печени фенобарбитал оказывал парадоксальное действие на проницаемость щелевых контактов. В концентрации 1 мг/мл он вызывал усиление межклеточного обмена ЛЖ в 1,5—2 раза через 5 ч после начала инкубации. При увеличении времени инкубации до 24 ч количество окрашенных клеток снижалось до уровня контроля.

Такие промоторы, как йодоуксусная кислота и бенз(е)пирен не оказывали никакого действия на проницаемость щелевых контактов. Из полных канцерогенов только 3-метилхолантрен и этилметансульфонат эффективно ингибировали проницаемость щелевых контактов, снижая количество окрашенных клеток-реципиентов в 2 раза и более, причем этилметансульфонат в дозах, близких к токсическим (600 мкг/мл и выше). Действие 7,12-ди-метилбензантрацена на проницаемость щелевых контактов было слабым: этот канцероген вызывал

ингибирование обмена ЛЖ на 30—40% только в 2 экспериментах из 4. Асбест вплоть до токсических концентраций не влиял на проницаемость щелевых контактов в клетках ДМ-15. К интересным находкам можно отнести разобщающее действие нитрита натрия — предшественника синтеза канцерогенных Ы-нитрозаминов и ингибитора арилгидроксилазы — 7,8-бенз(а)-флавона. Оба эти соединения в тесте на ингибирование щелевых контактов впервые изучены нами.

В тесте на индукцию дифференцировки клеток НЬ-60 было изучено 16 соединений, в том числе 11 опухолевых промоторов различной органотропности и 4 полных канцерогена. Для каждого вещества было протестировано 8—10 концентраций, начиная с концентрации, вызывавшей гибель 50% клеток. Индукцию дифференцировки клеток, как видно из табл. 1, стимулировали только промоторы для кожи, оказавшиеся и наиболее сильными ингибиторами проницаемости щелевых контактов. Динамика адгезии клеток к субстрату во всех опытах была сходной (см. методику). Все остальные исследовавшиеся соединения в нетоксических дозах не влияли на характер роста клеток.

В настоящее время доказано, что биологическая активность многих ксенобиотиков, в' частности полицик-лических ароматических углеводородов, обусловлена не самим соединением, а его метаболитами [15]. Так как вопрос о необходимости метаболической активации опухолевых промоторов для реализации их действия в процессе канцерогенеза остается открытым, действие ряда

hanced the LY intercellular exchange 1.5 to 2-fold at 5 h after incubation beginning. While after 24-h incubation the number of stained cells reduced to the control level.

Iodacetic acid and benzo(e)pyrene showed no effect on cleft contact permeability. Of the full carcinogens studied 3-methylcholanthrene and ethylmethanesulfonate only inhibited intensely the cleft contact permeability, they caused a 2-fold and greater reduction in the number of stained recipient cells, ethylmethanesulfonate producing this effect at doses close to toxic (600 mcg/ml and greater). The action of 7,12-dimethylbenzanthracene on the cleft contact permeability was but weak: there was a 30—40% inhibition in the LY exchange under the effect of this compound in 2 of 4 experiments. Asbestos upto toxic concentrations did not affect the DM-15 cleft contact permeability. The dissociating effect of sodium nitrite, a precursor of synthesis of carcinogenic N-nitrosamines, and the arylhydroxylase inhibitor 7,8-benzo(a)flavone was an interesting finding. We were the first to test these compounds for inhibition of the cleft contacts.

Sixteen compounds including 11 tumor promoters of different organ preference and 4 full carcinogens were tested for HL-60 differentiation induction. Each compound was tested at 8 to 10 concentrations starting with those inducing death of 50% of cells. Table 1 shows that skin promoters only stimulated cell differentiation induction, the same substances were the strongest inhibitors of the cleft contact permeability. Rates of cell adhesion to the substrate were similar in all experiments (see the methodology). All the rest of the compounds at non toxic doses failed to affect cell growth.

As proven recently the biologic activity of many xeno-biotics in particular of polycyclic aromatic hydrocarbons is due to the effects of both the compound itself and its metabolites [15]. Since it is not clear whether tumor promoters need to be activated to enhance carcinogenesis we studied the effect of several compounds (TPA, DDT, benzo(a)pyrene and 3-methylcholanthrene) on HL-60 differentiation using as cell substrates monolayers of rat embryo fibroblasts, because these cells demonstrate a high level of microsomal monooxygenases which take an active part in metabolism of xenobiotics and had been successfully used in similar in vitro studies of carcinogens’ transforming and genotoxic effects [9]. The test results are summarized in table 2.

The employment of the cell substrate in our experiments made more difficult interpretation of results: the rate of spontaneous adhesion of HL-60 to the monolayer was much higher as compared with the adhesion to the free plastic. Of note that the cells adhering to the rat fibroblast monolayer were round (undifferentiated?). TPA showed a mild effect on HL-60 differentiation and adhesion in mixed culture (the number of the adhering cells increased 25-35% on the average). The supposition may be made that rat embryo fibroblasts can block the TPA differentiating effect on HL-60, or REC are not adhesive for TPA-activated HL-60. One could hardly expect positive results of evaluation of DDT’s and other carcinogens’ effects on HL-60 differentiation. Indeed, 3-methylcholanthrene increased significantly the number of the adhering cells in 1 of 3 test series only, while benzo(a)pyrene produced such effect in 1

соединений (ТФА, ДДТ, бенз(а)пирен и 3-метилхолант-рен) на дифференцировку клеток HL-60 было изучено в опытах с использованием «клеточной подложки» — монослоя первичных эмбиональных фибробластов крысы, для которых характерен высокий уровень обусловливающих метаболизм ксенобиотиков микросомных моноок-сигеназ и которые с успехом применялись в сходных целях при оценке трансформирующего и генотоксического действия канцерогенов in vitro [9]. Сводные результаты опытов представлены в табл. 2.

В наших экспериментах введение «клеточной подложки» в тест-систему значительно затруднило интерпретацию результатов: уровень спонтанной адгезии клеток HL-60 к клеткам монослоя в отличие от адгезии к свободному пластику оказался достаточно высоким. При этом существенно, что к монослою крысиных фибробластов прикреплялись округлые (недифференциро-вавшиеся?) клетки. ТФА слабо влиял на дифференцировку и адгезию клеток HL-60 в смешанной культуре (количество прикрепившихся клеток увеличивалось в среднем на 25—35%). Можно предположить, что эмбриональные крысиные фибробласты могут «экранировать» дифференцировочное действие ТФА на клетки HL-60 или же КЭК неадгезионны для активированных ТФА клеток HL-60. В этих условиях трудно было ожидать положительных результатов при оценке влияния ДДТ и канцерогенов на дифференцировку клеток HL-60. Действительно, воздействие 3-метилхолантрена достоверно увеличило количество прикрепившихся клеток только в 1 серии опытов из 3, а бенз(а)пирен — в 1 из 2. ДДТ на количество прикрепившихся к клеточной подложке клеток HL-60 не влиял.

На клетках линии DS-19, клон А2, в тесте на ингибирование дифференцировки, индуцируемой ДМСО, было изучено 17 соединений: 9 опухолевых промоторов различной органотропности; 3 канцерогена и 1 слабоканцерогенный аналог из класса полициклических ароматических углеводородов; канцероген асбест и два его аналога (антигорит и сивол) с неизвестной канцерогенной активностью и нитрат натрия. Для каждого вещества было протестировано 8—10 концентраций, начиная с концентрации, вызывавшей гибель 50% клеток. Как видно из табл. 1, дифференцировку клеток А2 по эритро-идному типу эффективно ингибировали только три соединения — опухолевые промоторы для кожи ТФА, те-леоцидин и мезерин, которые дали положительный результат и в тесте на индукцию дифференцировки клеток HL-60, и в тесте с ЛЖ. При добавлении к клеткам, обработанным ДМСО, этих промоторов количество клеток, содержащих гемоглобин, снижалось с 90—65 до 0,05%, что соответствует уровню спонтанной дифференцировки клеток этого клона. Следует отметить, что литохолевая кислота, ДДТ и асбест также ингибировали дифференцировку, вызванную ДМСО, однако только в концентрациях, равных LD50 или половине ее, что, на наш взгляд, может быть связано с их токсическим действием и отражает отсроченную гибель клеток. Введение в систему тестирования «клеточной подложки» из эмбриональных фибробластов крысы в опытах с использованием ДДТ, бенз(а)пирена, 3-метилхолантрена, фенобарбитала, твина-80, линдана и литохолевой кислоты не привело к положительным результатам.

Влияние опухолевых промоторов и канцерогенов на дифференцировку клеток HL-60 в смешанной культуре с эмбриональными фибро-бластами

Effect of tumor promoters and carcinogens on differentiation of HL-60 cells in fixed culture with embryo fibroblasts

Культура Соединение Серия опытов

клеток 1 II III IV

КЭК/REC ТФА / TPA 0* 0 0 0

HL-60 ТФА/TPA 80,6 HT / nt 60,6 HT / nt

КЭК + HL-60 REC + HL-60 ТФА / TPA 42,9 36,9 42,2 20,3

КЭК + HL-60 REC + HL-60 3-MX / 3-MC нт / nt 32,6 45,4 36,5

КЭК + HL-60 REC + HL-60 Б (а) П / B(a)P нт / nt 56,2 ** 13,6

КЭК + HL-60 REC + HL-60 ДДТ/DDT нт / nt 10,4 ** 31,0

КЭК + HL-60 REC + HL-60 Ацетон Acetone нт / nt 30,6 18,1 26,2

Cell culture Compound 1 II III IV

Test series

*Количество меченых клеток, %.

**Клетки погибли в результате токсического действия соединения.

*, percentage of labeled cells.

**, cells dying under the toxic effect of the compound.

of 2 tests. DDT failed to make any effect on the number of cells adhering to the cell substrate of HL-60.

We studied inhibition of DMSO-induced differentiation of DS-19 clone A2 cells using 17 compounds including 9 tumor promoters with different organ specificity, 3 carcinogens and 1 analog with low carcinogenic activity from the class of polycyclic aromatic hydrocarbons, the carcinogen asbestos and two of its analogs (antigorite and sivol) with unknown carcinogenic activity, sodium nitrate. Each compound was tested at 8 to 10 concentrations beginning with concentrations inducing death of 50% of cells. Table 1 shows that three of the compounds only inhibited considerably the erythroid differentiation of A2 cells, namely, the skin-specific tumor promoters TPA, teleocidine and me-serine which gave positive results both in the test of HL-60 differentiation induction and in the tests with LY. After addition of these promoters to the cells treated with DMSO the number of hemoglobin-containing cells reduced from 90—65% to 0.05% which corresponded to the level of spontaneous differentiation of cells in this clone. Of note that lithocholic acid, DDT and asbestos also inhibited the differentiation but at concentrations equal to the whole or half of LD50 which in our opinion might be due to their toxicity and reflected delayed cell death. The inclusion of the rat embryo fibroblast substrate in the system of testing DDT, benzo(a)pyrene, 3-methylcholanthrene, phenobar-bital, twin-80, lindane and lithocholic acid failed to produce positive results.

Thus, the results of the cleft contact permeability inhibition test prove that this test can detect many tumor promoters with different organ preference as well as some of full carcinogens. The positive results of the tests on Jungar hamster fibroblasts for DDT, buthyl-hydroxytoluene,

Таким образом, результаты теста на ингибирование проницаемости щелевых контактов свидетельствуют о том, что многие опухолевые промоторы различной орга-нотропности, а также часть полных канцерогенов могут быть выявлены в этом тесте. Положительные результаты, полученные нами на фибробластах джунгарского хомячка для ДДТ, бутил-гидрокситолуола, ТФА, так же как и отрицательные результаты для антралина, асбеста, бенз(е)пирена, совпадают с данными литературы, а наличие ряда опухолевых промоторов, не влияющих на проницаемость щелевых контактов, по-видимому, свидетельствует о существовании различных механизмов промоции канцерогенеза.

По существу, открытым остается вопрос о влиянии полных канцерогенов с выраженной мутагенной активностью на проницаемость щелевых контактов. С этой точки зрения наши данные об эффективном действии на межклеточный обмен ЛЖ канцерогенов 3-метилхолант-рена и этилметансульфоната представляют большой интерес и вместе с данными о разобщающем действии 7,12-диметилбензантрацена [10], акрилонитрила и о-тулоиди-на [7], этилнитрозомочевины [8] свидетельствуют о принципиальной возможности ингибирующего действия мутагенных канцерогенов на проницаемость щелевых контактов.

Полученные нами данные о действии опухолевых промоторов и канцерогенов на дифференцировку клеток HL-60 и А2 показывают, что в нетоксических концентрациях в обеих системах эффективно влияли на дифференцировку клеток только три промотора кожного канцерогенеза— ТФА, телеоцидин и мезерин. Наши данные вместе с данными других авторов, показавших неспособность таких промоторов, как твин-60, кантаридин, фенобарбитал и сахарин, индуцировать дифференцировку хондроцитов [13], а также неспособность окадаевой кислоты — сильного промотора канцерогенеза в коже — ингибировать дифференцировку клеток эритролейкоза мыши [11], показывают ограниченность применения этих тестов для скрининга опухолевых промоторов.

Общим свойством соединений, эффективно модифицирующих дифференцировку клеток в наших экспериментах, является то, что они прямые активаторы Са2+ фосфолипидзависимой протеинкиназы С (ПКС), играющей важную роль в передаче сигналов внутри клетки. Возможно, что остальные опухолевые промоторы, не обладая способностью действовать на ПКС прямо, влияют на дифференцировку клеток более медленно, через ряд опосредованных звеньев.

Одним из последствий этого предположения может быть неэффективность используемых нами тестов, применение которых давало относительно быстрые эффекты промоторов на дифференцировку.

Поступила 22.04.94 / Submitted 22.04.94

ТРА, as well as the negative results for anthraline, asbestos, benzo(e)pyrene correspond to the data reported in the literature. The fact that some promoters do not affect permeability of the cleft contacts suggests the existence of different mechanisms of carcinogenesis promotion.

It is not clear whether full carcinogens with marked mutagenic activity influence the cleft contact permeability. In this respect our findings of the effect of the carcinogens 3-methylcholanthrene and ethylmethanesulfate on the LY exchange are of much interest, at the same time reports on the dissociating effect of 7,12-dimethylbenzanthracene [10], acrylonitrile, and o-tuloidine [7], ethylnitrosourea [8] prove the possibility of inhibition of the cleft contact permeability under the action of mutagenic carcinogens.

Our findings in the tests of tumor promoters’ effect on differentiation of HL-60 and A2 showed that three promoters only could produce a noticeable effect in both systems when at non-toxic concentrations. These are TPA, teleocidine and meserine. Our data as well as similar results of other investigations demonstrating inability of the promoters twin-60, cantharidine, phenobarbital and saccharin to induce differentiation of chondrocytes [13], and ocadaic acid (a strong promoter of cutaneous carcinogenesis) to inhibit differentiation of murine erythroleukemic cells [11] prove the limited applicability of these tests for tumor promoter screening.

The compounds able to modify effectively cell differentiation in our experiments have a feature in common: they are direct activators of Ca2+ of phospholipid-depend-ent proteinkinase С (PKC) which contributes greatly to intracellular signal transmission. The rest of the tumor promoters unable to act on PKC directly might influence the cell differentiation slower, through some mediators. The inefficiency of the tests in question might be due to this reason, because these tests detect rather quick effects of promoters on cell differentiation.

ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES

1. Кадагидзе 3. Г., Барышников А. Ю. и др. Иммунодиагностика гемобластозов человека: Метод, рекомендации. — М., 1986. — С. 9—11.

2. ТурусовВ. С. //Экспер. онкол. — 1985. —Т.7,№3. — С.75—12.

3. Щербак Н. П., Березов М. Т. Простой надежный метод клонирования клеточных культур с использованием агара и 96-луноч-ных плат. Рукопись депонирована в ВИНИТИ, 334-В. — 1992.

4. Barret J. С., Karunaka Т. et al. // IARC Sci. Public. — 1986 — N 83. — P. 287—303.

5. Borzsonyi V., Day N. E. et al. // IARC Sci. Public. — 1984. — N 56. — P. 1—623.

6. Diamond O’Brien T. G., Baird W. M. // Advanc. Cancer Res. — 1980. — Vol. 32. — P. 1—74.

7. Elmore E., Korytynski E. A., Smits M. P. // WHO. Elsevier Sci. Public. — 1985. — P. 597—612.

8. Elmore E., Milman A., Wyatt G. P. II Advanc. Modem Environm. Tocxicol. — 1987. — Vol. 14. — P. 265—292.

9. Hueberman E., Sachs L. II Int. J. Cancer. — 1974. — Vol. 14. — P. 326—338.

10. Jongen W. M. F., Sijtsma S. R. et al. // Carcinogenesis. — 1987. — Vol. 8. — P. 767—772.

11. Katoh F., Fitzgerald D. J. et al. // Jap. J. Cancer Res. — 1990. — Vol. 81, —P. 590—597.

12. Sivak A. II Mutat. Res. — 1982. — Vol. 98. — P. 377—387.

13. Takigawa М., Tajima K. et al. // J. Biochem. — 1987. — Vol. 101. — P. 397—404.

14. Trosko I. E., Yotti L. P. et al. // Carcinogenesis. — 1982. — Vol. 3. — P. 565—585.

15. Williams G. М., Wesburger J. H. Toxicology the Basic Science of Poisons. — 4-th Ed. — New York, 1991. — P. 127—200.