Активность канонической wnt сигнальной системы в артикулярных хондроцитах гиалинового хряща в процессе формирования синовиального сустава

Рис.3. Оптимальная морфо-математическая модель правой венечной артерии и её ветвей при правовенечном варианте ветвления венечных артерий у людей старческого возраста: I -начальная треть огибающей части правой венечной артерии; II -средняя треть огибающей части правой венечной артерии; III -конечная треть огибающей части правой венечной артерии;

Рис.4. Изменения суммарного просвета правой венечной артерии и её ветвей при правовенечном варианте ветвления венечных артерий улюдей старческого возраста

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Глотов, В.А. Структурный анализ микрососудистых бифуркаций / В.А. Глотов. - Смоленск, 1995. - 178 с.

2. Коробкеев, А.А. Возрастная характеристика вариантной анатомии кровеностных сосудов сердца / А .А. Коробкеев, В.В. Соколов. - Ставрополь, 2004. - 156 с.

3. Кульчицкий, К.И. Сравнительная анатомия и эволюция кровеносных сосудов сердца / К.И. Кульчицкий, О.Ю. Роменский. - Киев, 1985. - 176 с.

4. Михайлов, С.С. Клиническая анатомия сердца / С.С. Михайлов. - М., Медицина, 1987. - 288 с.

5. Савилова, В.В. Острый инфаркт миокарда у пожилых: факторы риска и причина летального исхода / В.В. Савилова // Клиническая геронтология. - 2008. - №3. -С. 40-43.

6. Соколов, В.В. Сосуды сердца / В.В. Соколов. - Рос-тов-н/Д., 1997. - 90 с.

7. Шошенко, К.А. Архитектоника кровеносного русла / К.А. Шошенко, А .С. Голубь, В.И. Брод. - Новосибирск, 1982.

- 182 с.

8. Nicus, K.C. Mortality of patients with acute coronary syndromes still remains high: A follow-up stady of 1188 consecutive patients admitted to a university hospital / K.C. Nicus, M.J. Escola, V.K. Virtanen et al.// Ann Med. - 2007. - Vol. 39 (1). - P. 63-71.

9. Segev, A. Prognostic significance of admission heart in patients with non-ST-elevation acute coronary syndromes (from the Canadian Acute Coronary Syndrome Registries ) / A. Segev,

B.H. Strauss, M. Tan et al.// Amer. J. Cardiol. - 20o6. - Vol. 98 (4). - P. 470-473.

УДК: 611.018.3-07

АКТИВНОСТЬ КАНОНИЧЕСКОЙ ’№1ЧТ СИГНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ В АРТИКУЛЯРНЫХ ХОНДРОЦИТАХ ГИАЛИНОВОГО ХРЯЩА В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ СИНОВИАЛЬНОГО СУСТАВА

С.Л. Кузнецов - ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии, чл.-кор. РАМН, доктор медицинских наук, профессор; А.О. Молотков - ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова, докторант кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии, кандидат медицинских наук. Е-таИ: andreimolotkov@yahoo.com

ACTIVITY OF CANONICAL WNT SIGNAL SYSTEM IN HYALINE CARTILAGE ARTICULAR CHONDROCYTES IN PROCESS OF SYNOVIAL JOINT DEVELOPMENT

S.L. Kuznetsov - Moscow Medical Academy n.a. I.M. Sechenov, Head of Department of Histology, Cytology and Embryology, Professor, Doctor of Medical Science; A.O. Molotkov - Moscow Medical Academy n.a. I.M. Sechenov, Department of Histology, Cytology and Embryology, Candidate of Medical Science. Е-mail: andreimolotkov@yahoo.com

С.Л. Кузнецов, А.О. Молотков, Саратовский научно-медицинский журнал, 2009, том 5, № 1, с. 26-31

Каноническая Wnt сигнальная система (KWntCC) играет важную роль в регуляции остеогенеза, однако, до настоящего времени остается мало изученной роль этой системы в развитии синовиальных суставов и гиалинового хряща. Мы установили: 1) KWntCC неактивна в формирующейся промежуточной зоне сустава и в дифференцирующихся артикупярных хондроцитах на ранних эмбриональных стадиях развития (Е10.5 -Е14.5); 2) KWntCC активна в артикулярных хондроцитах на этапах позднего эмбрионального развития (Е18.5) и в течение постнатального развития (Р7 - Р10); 3) KWntCC снова неативна в артикулярных хондроцитах гиалинового хряща сустава взрослых животных. Механизмы и биологическое значения показанной нами регуляции активности KWntCC на разных этапах развития и дифференцировки артикулярных хондроцитов требует дальнейшего изучения.

Ключевые слова: Wnt, артикулярные хондроциты, развитие сустава.

S.L. Kuznetsov, A.O. Molotkov, Saratov Journal of Medical Scientific Research, 2009, vol. 5, № 1, р. 26-31

Canonical and non-canonical Wnt systems are essential regulators of chondrogenesis and bone development. However, the roles of these systems in synovial joint development are not well studied. To determine if canonical Wnt system is active in developing articular chondrocytes we used immunohistochemistry for в-galactosidase and doublecortin (cell-type specific marker for articular chondrocytes) to double label sections through joint regions of E14.5, E18.5, P10 and adult mice. Here the following results are presented. Canonical Wnt signal system does not

work in developing articular chondrocytes at early embryonic stages (E14.5); it is active in the articular chondrocytes at late embryonic stages (E16.5-E18.5) and during postnatal development (P7-P10), but is turned off again in the adult articular chondrocytes. These results suggest that canonical Wnt signaling is being regulated during articular chondrocytes differentiation and joint formation.

Key words: canonical Wnt, articular chondrocytes, joint development.

Генетические исследования установили, что Wnt сигнальная система играет важную роль в регуляции развития скелетной ткани [6]. Трубчатые кости конечностей человека и животных формируются в процессе вторичного (непрямого) остеогенеза [15]. Многочисленными исследованиями установлено, что каноническая и неканоническая Wnt сигнальные системы участвуют в регуляции эндохондрального и перихон-дрального окостенения [26, 9, 14]. В отличие отхоро-шо изученных механизмов формирования костной ткани, механизмы развития синовиальных суставов (суставы, соединяющие костные элементы конечностей) изучены недостаточно. Развитие сустава начинается с формирования промежуточной зоны (interzone), разделяющей гомогенную (непрерывную) конденсацию мезенхимы на месте будущего сустава, и образования трехслойной промежуточной зоны [16]. Клетки мезенхимы, расположенные в промежуточной зоне, в ходе дальнейшей дифференцировки приводят к образованию различных клеточных структур сустава (суставные связки, гиалиновый хрящ и др.), в то время как клетки мезенхимы, прилежащие к промежуточной зоне, в дальнейшем участвуют в формировании зоны роста трубчатых костей и костной ткани [22]. Имеющиеся на настоящее время данные свидетельствуют о возможной роли Wnt в формировании синовиальных суставов и в регуляции дифференцировки мезенхимы промежуточной зоны [13]. Поскольку была показана экспрессия Wnt4, Wnt9A, Wnt11, Wnt16 в месте формирования суставов [24], это позволяет предположить роль канонической Wnt сигнальной системы (KWntCC) в регуляции развития структур суставов и в регенерации их тканей, измененных в результате старения или болезни [25]. Отметим, что в последние годы все более широкое распространение получает заместительная клеточная терапия (stem cell therapy) таких распространенных заболеваний суставов, как остеоартрит и ревматоидный артрит [23], что делает проблему изучения роли Wnt в развитии структур суставов высоко актуальной.

Сегодня известны три сигнальных системы, активируемых Wnt сигнальными молекулами: Wnt/Ca2+ си -стема, Wnt/PCP (planar cell polarity) и p- катенин зависимая KWntCC системы. Основная роль KWntCC системы заключается в регуляции уровня свободного внутриклеточного р-катенина, который, в свою очередь, регулирует экспрессию Wnt-зависимых генов [12]. В отсутствии Wnt сигнала, свободный цитоплазменный Р-катенин связывается комплексом GSK3a/APC/Axin, фосфорилируется и, в последующем, разрушается под воздействием протеаз. Активация KWntCC предотвращает фосфорилирование и деградацию р-катенина, что приводит к повышению уровня свободного Р-катенина в цитоплазме, его транслокации в ядро клетки, с последующей активацией транскрипции Wnt-зависимых генов.

В исследованиях на первичной культуре хондро-цитов было установлено, что Wnt9A, экспрессия которого показана в тканях сустава, активирует KWntCC в хондроцитах [25]. Генетические исследования на мышах, нокаутированных по Wnt4 и Wnt9A (Wnt4-/-;Wnt9A-/-) установили кооперативное взаимодействие между Wnt4 и Wnt9A в регуляции развития суставов и поддержании их целостности [25]. Это позволило предположить, что Wnt4 и Wnt9A действуют через ^пГСС, направляя дифференцировку хондроцитов в зоне сустава. Однако последние работы убедительно показали, что Wnt4 регулирует внутриклеточную локализацию р-катенина, вызывая передислокацию свободного р-катенина к клеточной мембране, тем

самым предотвращая его транслокацию в ядро клеток и ингибируя активацию KWntCC [8]. В дополнении к этому, Wnt11, экспрессируемый в тканях суставов, взаимодействуя с Lrp6 (ко-рецептор KWntCC), регулирует уровень Axin в цитоплазме клетки [17]. Axin -регулятор KWntCC, ограничивает уровень свободного ß-катенина, увеличивая его фосфорилирование и протеолиз, и, таким образом, снижает активность KWntCC [17].

В работе изучена активность KWntCC в структурах синовиальных суставов в процессе эмбрионального (E11 - E18), постнатального развития (P3 -P28) и у взрослых мышей. Используя линию TOpgal (Wnt-репортер) мышей для обнаружения активности KWntCC в тканях [10] и anti-doublecortin (DCX) антитела в качестве специфической метки для артикулярных хондроцитов [27], мы убедительно продемонстрировали, что активность KWntCC регулируется в артикулярных хондроцитах во время эмбрионального и постнатального развития. Показано, что KWntCC неактивна в мезенхиме промежуточной зоны формирующегося сустава на ранних стадиях эмбрионального развития (Е10 - Е14); активна в дифференцирующихся артикулярных хондроцитых на поздних стадиях эмбрионального развития (Е16 - Е18) и в течение постнатального развития (Р7 - Р10), и снова неактивна в артикулярных хондроцитах взрослых животных.

Материалы и методы. Для иммуногистохими-ческой оценки экспрессии lacZ, DCX и Vinculin криос-татные срезы (10-12 m), полученные у TOPgal мышей на разных стадиях развития (Е14.5, Е 18.5, Р7, Р10 и врослых 6-месячных животных), использовали следующие первичные антитела: 1) кроличьи антитела к â-галоктозидазе (lacZ) (1:1000, Cappel, MP Biomedicals, Solon, Ohio, USA), 2) мышиные антитела к Vinculin (1:100, Santa Cruse Biotechnology, CA, USA), 3) антитела из морской свинки к Doublecortin (DCX) (1:100, Abcam). Вторичные антитела разводили в 1% сыворотке в 0.9% NaCl; во всех случаях вторичные антитела использовали в разведении 1:1000. Были использованы следующие вторичные антитела: 1) Alexa Fluor 488 goat anti-mouse, 2) Alexa Fluor 594 goat antimouse, 3) Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit, 4) Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit. Все вторичные антитела производства Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Для окраски ядер клеток использовался DAPI (1?g/ml).

Результаты ИГХ оценивались на микроскопе Zeiss Axiophot 2, оборудованном камерой AxioCam (Carl Zeiss, Inc., USA). Для получения конфокальных фотографий использовался конфокальный микроскоп Nikon Eclipse C1 (Nikon, USA). Полученные цифровые фотографии обрабатывались в программе Adobe Photoshop.

Для окраски Xgal образцы ткани и целые эмбрионы фиксировали в 1% глютеральдегиде и окрашивали в течение 12-24 часов в растворе субстрата, состоящего из 1 мг/мл 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside (Xgal), 5 мM K4Fe(CN)6, 5 мМ KjFe(CN)6 и 5 мМ MgCl2. После окраски эмбрионы и образцы тканей помещали в 3% агарозу и нарезали с толщиной 60-100 ?м на вибротоме (Leica VT1000S, Leica Microsystems, Germany).

Для in situ гибридизации образцы тканей фиксировали в течение 12-16 часов в 4% параформальдегиде, нарезали с толщиной 100 ?m на вибротоме Leica VT1000S и хранили при -20°C в 100% метаноле. In situ гибридизацию выполняли по методике, описанной ранее [20].

Результаты и их обсуждение. Для изучения активации KWntCC в тканях сустава была использова-

на линия ТОРда1 мышей, в геном которых введен ген а-галактозидазы (lacZ) под управлением 1_ЕРДОР Ь-катенин возбудимого промотера [10]. Таким образом, у ТОРда1 мышей экспрессия lacZ прямо связана с активацией ^пГСС и наличием свободного Ь-катенина в клетках. Экспрессия lacZ в тканях может быть обнаружена окраской с Xgal [10] или методом имунногис-тохимии (ИПХ) с помощью специфических антител к lacZ. TOPgal мыши с высоким успехом использовались в многочисленных исследованиях, направленных на изучение активации ^пГСС в различных тканях, как на этапах эмбрионального, так и постнаталь-ного развития, а также для выявления новых потенциальных мест сигнальной активности ^пГСС. Во всех случаях активация экспрессии lacZ совпадала с доказанной функцией ^пГСС в этих тканях [5].

На тOPgal мышах была применена Xgal окраска в почках передних конечностей Е10 - Е14 (эмбриональный день 10 - 14) мышиных эмбрионов (рис. 1). Отметим, что у Е 10.5 эмбрионов была обнаружена Xgal окраска, свидетельствующая об активности ^пГСС в клетках, в дорзальной и вентральной поверхностной эктодерме (длинные стрелки на рис.

1,А) и в апикальном эктодермальном гребне (АЭП) (короткая стрелка на рис. 1,А). Помимо этого была изучена Xgal окраска на поперечных срезах, проходящих через почку передней конечности (рис. 1,Б). Установлено, что кроме поверхностной эктодермы и АЭП, Xgal окраска присутствует в мезенхиме, непосредственно прилежащей к поверхностной эктодерме (длинные стрелки на рис. 1,Б), но отсутствует в зоне уплотнения мезенхимы - зародышевой зоны формирования будущей кости (показана прерывистой линией на рис. 1,Б). Обнаруженный паттерн Xgal окраски хорошо коррелирует с известным паттерном экспрессии Wnt сигнальных молекул ^^5А, Wnt7A и Wnt3) на стадии раннего развития конечности [9]. Экспрессия Wnt7A установлена в дорзальной поверхностной эктодерме, где Wnt7A, действуя через каноническую и неканоническую Wnt сигнальные системы, регулирует процессы развития дорзальной стороны конечности и участвует в поддержании паттерна экспрессии генов вдоль дорзальновентральной оси конечности [1]. Экспрессия Wnt3 показана в АЭП, где Wnt3, являющийся активатором ^пГСС, играет ключевую роль в поддержании функций АЭП и формировании дистальных структур конечности [7]. Wnt5A экспрессируется в дистальной мезенхиме, где регулирует клеточную пролиферацию и скорость проксимально-дистального роста развивающейся конечности [9]. Показанное в работе отсутствие Xgal окраски в зоне уплотнения мезенхимы (рис. 1,Б) подтверждает существующую на настоящий момент гипотезу, что низкая активность ^пГСС необходима для дифференцирования мезенхимы в хондроциты, а активация ^пГСС подавляет дифференцировку клеток мезенхимы в хондроциты за счет взаимодействия между Ь-катенин и Sox9 [2].

У Е12.5 эмбрионов Xgal окраска была обнаружена в зоне хондрогенного уплотнения, развивающихся костей предплечья и плеча - лучевой (Лу), локтевой (Л) и плечевой (П) (рис. 1, В,П, стрелки указывают на местоположение будущего локтевого сустава). Важно, что Xgal окраска не была обнаружена в области формирующегося локтевого сустава, а так -же в зоне, разделяющей локтевую и лучевую кости (стрелки на рис. 1, В,П). Отсутствие Xgal окраски в области формирующегося локтевого сустава свидетельствует, что ^пГСС не играет активной роли в формировании промежуточной зоны и на ранних стадиях развития локтевого сустава. Эти результаты противоречат ранее высказанной гипотезе [24], что ^пГСС подавляет хондрогенный потенциал клеток,

находящихся в промежуточной зоне, не позволяя им дифференцироваться в хондроциты и, таким образом, обеспечивая формирование сустава. Действительно, полученные нами данные показывают, что на этой стадии развития (Е12.5) Wnt4 (рис. 1,Д) и Wnt11 (рис. 1,Е) экспрессируются в зоне локтевого сустава (длинные стрелки на рис. 1, Д,Е,Ж), а Wnt5A экспрессируется в надкостнице (perichordium) плечевой кости (длинные стрелки на рис. 1,Ж). Отметим также, что экспрессия Wnt9A и Wnt16 была показана в районе суставов на ранних стадиях развития [21]. В пользу упомянутой гипотезы [25] также говорят данные, полученные в экспериментах с использованием Wnt4-/-;Wnt9A-/- мышей. Потеря экспрессии Wnt4 и Wnt9A у таких мышей привела к метаплазии и полному сращению нескольких суставов [24]. Более того, эктопическая экспрессия Col2a1 (специфический маркер хондроцитов) была показана в районе локтевого сустава Wnt4-/-;Wnt9A-/- мышей, что свидетельствует о возможной роли Wnt в регуляции хондрогенного потенциала клеток промежуточной зоны. В совокупности с данными о способности Wnt9A активировать KWntOO, приведенные результаты говорят в пользу активной роли канонического пути в развитии суставов. Однако результаты нашей работы не укладываются в эту гипотезу. Они в большей мере свидетельствуют, что ^пЮС не играет активной роли в формировании промежуточной зоны. Это подтверждают и недавно опубликованные результаты работ, доказывающие, что Wnt4 и Wnt11 являются не активаторами, а, наоборот, ингибиторами ^пГСС [8, 17]. Наши результаты косвенно подтверждаются данными, полученными с использованием мышей, нокаутированных по b-катенину[24]. В отсутствии b-катенина (ключевого компонента ^пГСС, без которого функционирование этой системы невозможно) у этих мышей сохранялась экспрессия генных маркеров, характерных для клеток промежуточной зоны развивающихся суставов, что доказывает отсутствие значимой роли ^пГСС в регуляции или поддержании фенотипа клеток промежуточной зоны суставов.

На основании полученных результатов и приведенных выше данных других авторов мы полагаем, что ^пГСС не активен на ранних этапах развития суставов и формирования промежуточной зоны, и что дефекты развития суставов, описанные у Wnt4-/-;Wnt9A-/- мышей, связаны с возможной ролью этих сигнальных молекул в активации неканонической Wnt сигнальной системы.

У Е14.5 эмбрионов мы обнаружили яркую Xgal окраску в районе развивающихся трубчатых костей (лучевой, локтевой и плечевой) и пальцевых фаланг (рис. 1, З,И,К). Характерно, что, как и в случае Е12.5, Xgal окраска отсутствовала в районе формирующегося локтевого сустава (длинные стрелки на рис. 1,1) и суставов между фалангами пальцев (короткие стрелки на рис. 1, З,И). Последнее соответствует результатам, полученным с использованием Е 12.5 эмбрионов, и подтверждает мысль, что ^пГСС не активна в клетках промежуточной зоны на ранних эмбриональных стадиях развития суставов.

Артикулярные хондроциты - вытянутые, веретенообразные клетки, которые играют ключевую роль в развитии и поддержании функций синовиальных суставов. Предполагается, что артикулярные хондроциты происходят из клеток промежуточной зоны, или из клеток, расположенных в пролиферативной части зоны роста (growth plate) трубчатых костей [16, 22].

В работе был использован метод иммуногистохимии (ИГХ) с антителами, специфически связывающимися с doublecortin (DCX), чтобы пометить артикулярные хондроциты. Подчеркнем, что DCX является специфическим маркером артикулярных хондроци-

тов, а экспрессия йСХ не обнаружена в хондроцитах, участвующих в формировании костной ткани [27].

Для изучения роли ^п1СС в развитии артикулярных хондроцитов были помечены срезы через локтевой сустав ТОРдаІ мышей на стадиях эмбрионального (Е14.5 и Е 18.5) и постнатального (Р7, Р10) развития антителами к lacZ и йСХ.

Хондроциты диффернцируются из клеток мезенхимы в процессе уплотнения (конденсация) мезенхимы [3]. В работе мы изучили экспрессию клеточных маркеров, характерных для клеток мезенхимы и артикулярных хондроцитов одновременно с оценкой активности ^пГСС в этих клетках. У Е 14.5 эмбрионов мезенхимальные клетки, помеченные антителами ^іпсиІіп (красная метка на рис. 2,А), наблюдались в наружных слоях формирующейся промежуточной зоны, в то время как артикулярные хондроциты (помечены антителами к ЬСХ, зеленая метка на рис. 2,А) располагались в среднем слое промежуточной зоны (см. рис. 2, А1). Интересно, что многие из йСХ положительных клеток (артикулярные хондроциты) также были помечены антителами к Vinculin (длинные стрелки на рис. 2,А1). Это свидетельствует, что на данной стадии эмбрионального развития (Е14.5) экспрессия клеточных маркеров, характерных для мезенхимы, по-прежнему обнаруживается в дифференцирующихся артикулярных хондроцитах.

С целью изучения активности ^пГСС были помечены срезы через переднюю конечность эмбрионов ТОРдаІ мышей (Е14.5) антителами к'УіпсиІіп и lacZ (рис. 2, Б,Б1). Интенсивная lacZ окраска была обнаружена в хондроцитах, расположенных в зоне роста длинных костей (звездочка на рис. 2, Б). Клетки мезенхимы (Vinculin+ клетки), расположенные во внешних слоях промежуточной зоны, прилежащих к зоне роста кости, были помечены антителами к Мп^т и lacZ (Мп^^ и lacZ+) (рис. 2, Б1). Это свидетельствует, что ^пГСС активен в клетках мезенхимы промежуточной зоны. Важно, что окраска срезов, проходящих через передние конечности Е14.5 TOPgal эмбрионов, с антителами к lacZ (красная окраска) и йСХ (зеленая окраска) показала, что только малая часть артикулярных хондроцитов (РСХ+ клетки), расположенныех в непосредственной близости от зоны lacZ+ клеток мезенхимы, были помечены одновременно lacZ и йСХ антителами (стрелки на рис. 2, В). Это свидетельствует, что ^пГСС активна только в малой части артикулярных хондроцитов на данной стадии развития (Е14.5).

У Е18.5 эмбрионов артикулярные хондроциты (РСХ+ клетки веретенообразной формы) формируют слой клеток (толщиной в 2-3 клетки) на поверхности эпифиза костей, входящих в локтевой сустав (зеленая окраска на рис. 2, Г,Г1). Важно, что в отличие отданных, полученных на Е14.5 эмбрионах, большинство артикулярных (РСХ+) хондроцитов также lacZ+ (т.е. метятся антителами к lacZ) (длинные стрелки на рис. 2,Г1). Это свидетельствует, что на данной стадии развития (Е18.5) ^пГСС активна в большинстве (если не во всех) артикулярных хондроцитах. Окраска с антителами к Мп^т была обнаружена только на поверхности эпифиза; ни одной клетки, помеченной одновременно антителами к ^п^Пп и к йСХ или lacZ, на данном этапе развития обнаружено не было (рис.

2,Д).

Была использована окраску с Xgal и методы ИГХ для анализа активности к^пГСС в артикулярных хондроцитах на стадиях постнатального развития. Xgal окраска продольных срезов через эпифиз бедренной кости

эпифиза (длинные стрелки на рис. 3,А1). Сходные результаты были получены с использованием ИГХ с антителами к lacZ на срезах эпифиза, взятых у Р10 TOPgal мышей (рис. 3Б). Характерные веретенообразные lacZ+ клетки расположены в поверхностном слое (гиалиновом хряще) эпифиза (стрелки на рис. 3, Б1); некоторые из этих клеток были также РСХ+ (стрелки на рис. 3, Б2). Наложение этих фотографий (Рис. 3Б3) показывает, что часть артикулярных хондроцитов (РСХ+ клетки) также lacZ+ (стрелки на рис. 3,Б3). Это доказывает, что ^пГСС активна в артикулярных хондроцитах на этапах постнатального развития.

Для изучения активности KWnt в артикулярных хондроцитах взрослых животных, были окрашены срезы через локтевой сустав, взятые у TOPgal мышей в возрасте 6 месяцев, используя ИГХ с антителами к lacZ и йСХ (рис. 3, В,Г). Многочисленные РСХ+ клетки (артикулярные хондроциты) были обнаружены в поверхностном слое гиалинового хряща суставной поверхности (рис. 3,В). ИГХ с использованием антител к lacZ показала, что активность ^п1СС отсутствует в клетках, расположенных в поверхностном слое эпифиза, но активна в клеточной популяции, расположенной во внутренней зоне эпифиза кости (длинные стрелки на рис. 3,Г); мы не смогли обнаружить клетки с двойной ЬСХ+ и lacZ+ окраской. Важно также, что lacZ+ клетки полностью отсутствовали в поверхностном слое гиалинового хряща.

Таким образом, результаты нашей работы свидетельствуют, что ^пГСС неактивна в артикулярных хондроцитах гиалинового хряща в синовиальных суставах взрослых животных. Заслуживает внимания выявленная нами популяция lacZ+ клеток, располагающаяся во внутреннем слое эпифиза. Как установлено, активация ^пГСС в клеточной популяции у взрослых животных и человека является характерной чертой их принадлежности к стволовым клеткам, раположенным в этой ткани [4, 18, 19]. Действительно, стволовые клетки были успешно изолированы из гиалинового хряща, полученного из сустава взрослого человека [11].

В процессе исследования мы не обнаружили lacZ+ клеток в гиалиновом хряще, но популяция lacZ+ клеток была найдена в зоне эпифиза, непосредственно примыкающей к гиалиновому хрящу (рис. 3, В,Г). Эти результаты требуют дальнейших исследований, на-првленных на выявление роли и функции lacZ+ клеток в регенерации гиалинового хряща и эпифиза кости, поврежденных вследствие старения или болезни. Другими словами, необходимо выяснить являются ли эти клетки действительно стволовыми клетками, способными дифференцировать в артикулярные хондроциты.

Полученные результаты достаточно убедительно свидетельствуют - каноническая Wnt сигнальная система не активна на ранних стадия эмбрионального развития суставов (стадия формирования промежуточной зоны), что противоречит гипотезе участия ^п1СС в регуляции дифференци-ровки клеток промежуточной зоны. Наши данные показывают, что активность ^п1СС динамично изменяется в процессе развития артикулярных хондроцитов гиалинового хряща. Мы установили, что ^п1СС не активна в дифференцирующих артикулярных хондроцитах на ранних стадиях развития (Е14.5) и в артикулярных хондроцитах суставов взрослых животных, но активна на этапах позднего эмбрионального (Е18.5) и постнатального развития (Р7 - Р10). Что касается биологической роли и механизмов обнаруженной нами регуляции активности ^п1СС в артикулярных ходроцитах, то они требуют дальнейшего изучения.

Рис. 1. Активность KWntCC на ранних этапах эмбрионального развития. А - Xgal окраска E10.5TOPgal эмбрионов; Б - Xgal окраска поперечных срезов через почку передней конечности E10.5TOPgal эмбрионов; В, Г - Xgal окраска срезов через передние конечности Е12.5 TOPgal эмбрионов (Лу, лучевая кость; Л, локтевая кость; П, плечевая кость); Д,Е,Ж - In situ гибридизация на срезах через передние конечности Е12.5 эмбрионов Д - Wnt4, Е - Wnt11, Ж-Wnt5A); З,И,К - Xgal окраска срезов через переднюю

конечность E14.5TOPgal эмбрионов

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Adamska, M. Genetic interaction between Wnt7a and Lrp6 during patterning of dorsal and posterior structures of the mouse limb / M. Adamska, A.C. Billi, S. Cheek et al. // Dev Dyn. -

2005. - V. 233(2). - P. 368-72.

2. Akiyama, H. Interactions between Sox9 and beta-catenin control chondrocyte differentiation / H. Akiyama, J.P. Lyons, Y. Mori-Akiyama et al. // Genes Dev. - 2004. - V. 18(9). - P. 1072-87.

3. Archer, C.W. and Francis-West, P. The chondrocyte // Int J Biochem Cell Biol. - 2003. - V. 35(4). - P. 401-4.

4. Barker, N. Tracking down the stem cells of the intestine: strategies to identify adult stem cells / N. Barker, H.Clevers // Gastroenterology. - 2007. -V. 133(6). - P. 1755-60.

5. Barolo, S. Transgenic Wnt/TCF pathway reporters: all you need is Lef? / S. Barolo // Oncogene. - 2006. - V. 25(57).

- P. 7505-11.

6. Baron, R. Wnt signaling: a key regulator of bone mass / R. Baron, G. Rawadi, S. Roman-Roman // Curr Top Dev Biol.

- 2006. - V. 76. - P. 103-27.

7. Barrow, J.R. Ectodermal Wnt3/beta-catenin signaling is required for the establishment and maintenance of the apical ectodermal ridge / J.R. Barrow, K.R. Thomas, O. Boussadia-Zahui // Genes Dev. - 2003. - V. 17(3). - P. 394-409.

8. Bernard, P. Wnt4 inhibits beta-catenin /TCF signaling by redirecting beta-catenin to the cell membrane / P. Bernard, A. Fleming, A. Lacombe // Biol Cell. - 2007. - V. 1. - P. 1.

9. Church, V.L. Wnt signalling during limb development / V.L. Church, P. Francis-West // Int J Dev Biol. - 2002. - V. 46(7). - P. 927-36.

10. DasGupta, R. Multiple roles for activated LEF/TCF transcription complexes during hair follicle development and differentiation / R. DasGupta, E. Fuchs // Development. - 1999.

- V. 126(20). - P. 4557-4568.

11. Dowthwaite, G.P. The surface of articular cartilage contains a progenitor cell population / G.P. Dowthwaite, J.C. Bishop, S.N. Redman // J Cell Sci. - 2004. -V. 117(Pt 6). - P. 889-97.

12. Gordon, M.D. Wnt signaling: multiple pathways, multiple receptors, and multiple transcription factors / M.D. Gordon, R. Nusse // J Biol Chem. - 2006. - V. 281(32). - P. 22429-33.

13. Hartmann, C. Skeletal development—Wnts are in control / C. Hartmann // Mol Cells. - 2007. - V. 24(2). - P. 177-84.

14. Hartmann, C. A. Wnt canon orchestrating osteoblastogenesis /C. A. Hartmann //Trends Cell Biol. - 2006.

- V. 16(3). - P. 151-8.

15. Karsenty, G. Reaching a genetic and molecular understanding of skeletal development/G. Karsenty, E.F. Wagner // Dev Cell. - 2002. - V. 2(4). - P. 389-406.

16. Khan, I.M. The development of synovial joints / I.M. Khan, S.N. Redman, R. Williams // Curr Top Dev Biol. - 2007.

- V. 79. - P. 1-36.

17. Kofron, M. Wnt11/beta-catenin signaling in both oocytes and early embryos acts through LRP6-mediated regulation of axin / M. Kofron, B. Birsoy, D. Houston // Development. -2007. - V. 134(3). - P. 503-13.

18. McGowan, S.L. Stem cell markers in the human posterior limbus and corneal endothelium of unwounded and wounded corneas / S.L. McGowan, H.F. Edelhauser, R.R. Pfister // Mol Vis. - 2007. - V. 13. - P. 1984-2000.

19. Michaelidis, T.M. Wnt signaling and neural stem cells: caught in the Wnt web /T.M. Michaelidis, D.C. Lie //Cell Tissue Res. - 2008. - V. 331(1). - P. 193-210. Epub 2007 Sep 9.

20. Molotkov, A. Retinoic acid guides eye morphogenetic movements via paracrine signaling but is unnecessary for retinal dorsoventral patterning /A. Molotkov, N. Molotkova, G. Duester // Development. - 2006. - V. 133(10). - P. 1901-10.

21. Pacifici, M. Mechanisms of synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries / M. Pacifici, E. Koyama, M. Iwamoto // Birth Defects Res C Embryo Today. - 2005. - V. 75(3). - P. 237-48.

22. Pacifici, M. Cellular and molecular mechanisms of synovial joint and articular cartilage formation / M. Pacifici, E. Koyama, Y. Shibukawa // Ann N Y Acad Sci. - 2006. - V. 1068. - P. 74-86.

23. Richter, W. Cell-based cartilage repair: illusion or solution for osteoarthritis/ W. Richter // Curr Opin Rheumatol. - 2007.

- V. 19(5). - P. 451-6.

24. Spater, D. Role of canonical Wnt-signalling in joint formation / D. Spater, T.P. Hill, M. Gruber // Eur Cell Mater. -

2006. - V. 12. - P. 71-80.

25. Spater, D. Wnt9a signaling is required for joint integrity and regulation of Ihh during chondrogenesis / D. Spater, T.P. Hill, R. J. O'Sullivan // Development. - 2006. - V. 133(15). -P. 3039-49.

26. Yang, Y. Wnt5a and Wnt5b exhibit distinct activities in coordinating chondrocyte proliferation and differentiation / Y. Yang, L. Topol, H. Lee // Development. - 2003. - V. 130(5). -P. 1003-15.

27. Zhang, Y. Doublecortin is expressed in articular chondrocytes / Y. Zhang, J.A. Ryan, P.E. Di Cesare // Biochem Biophys Res Commun. - 2007. - V. 19. - P. 19.

УДК 616.1 -057.875 -035.2:612.172.6]:001.891

МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ И ФАКТОРЫ РИСКА РАЗВИТИЯ СЕРДЕЧНОСОСУДИСТЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ В ОЦЕНКЕ СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ СТУДЕНТОВ

А.В. Лобачева - ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава, ассистент кафедры лечебной физкультуры, спортивной медицины и физиотерапии; В.Н. Николенко - ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава, проректор по научной работе, заведующий кафедрой анатомии человека, профессор, доктор медицинских наук; А.А. Свистунов - ГОУ ВПО Саратовский ГМУ Росздрава, проректор по учебной работе, заведующий кафедрой фармакологии и клинической фармакологии, профессор, доктор медицинских наук; С. Л. Бибер - Университет Вайоминга, США, заведующий кафедрой статистики, профессор, доктор медицинских наук. E-mail: Alina_Lobacheva@mail.ru

MORPHOFUNCTIONAL INDICES AND RISK FACTORS OF CARDIOVASCULAR HEART DISEASES AT STUDENTS’ HEALTH EVALUATION

A.V. Lobacheva - Saratov State Medical University, Department of Therapeutic Physical Training, Sport Medicine and Physiotherapy, Assistant; V.N. Nikolenko - Saratov State Medical University, Pro-rector of Scientific work, Head of Department of Human Anatomy, Professor, Doctor of Medical Science; A.A. Svistunov - Saratov State Medical University, Pro-rector of Educational work, Head of Department of Pharmacology and Clinical Pharmacology, Professor, Doctor of Medical Science; S.L. Bieber -University of Wyoming, USA, Head of Department of Statistics, PhD Professor. E-mail: Alina_Lobacheva@mail.ru

А.В. Лобачева, В.Н. Николенко, А.А. Свистунов, С.Л. Бибер, Саратовский научно-медицинский журнал, 2009, том 5, №1, 31-36

В работе отражены результаты изучения морфо-функциональных показателей, определения соматоти-пов, выявления факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, оценки состояния здоровья студентов, которые могут быть использованы для разработки индивидуальных программ его сохранения.

Ключевые слова: антропометрия, тип конституции, факторы риска, здоровый образ жизни.

A.V. Lobacheva, V.N. Nikolenko, A.A. Svistunov, S.L. Bieber, Saratov Journal of Medical Scientific Research, 2009, vol. 5, № 1, р. 31-36

This article contains the results of examination of morphofunctional parameters; determination of somatotypes; identification of cardiovascular diseases’ risk factors, and evaluation of health condition of students - all of which can be used for the development of personalized health preservation programs.

Key words: anthropometrical examination, constitutional type, riskfactors, healthy life style.

Состояние здоровья нации и, в первую очередь, молодого поколения свидетельствует об эффективности системы здравоохранения. Человек и его здоровье - это главное достояние и главный приоритет социальной политики государства и является предметом пристального внимания Министерств образования и здравоохранения РФ [6,8]. Удельный вес сердечно-сосудистых заболеваний в структуре общей смертности остается высоким, причем лидирующее положение занимает ишемическая болезнь сердца и цереброваскулярная патология [8]. Такие факторы риска, как курение, ги-подинамия, избыточный вес, нарушения режима питания и рациона, артериальная гипертензия, са-харный диабет, наследственная предрасположенность, лидируют в развитии сердечно-сосудистых заболеваний [3, 6, 8]. Эта проблема остается акту-

альной и в настоящее время, так как недостаточная информация о состоянии здоровья студентов затрудняет проведение первичной профилактики. Для усовершенствования профилактических мероприятий возможно использование методов клинической антропологии [2, 5, 7, 10], которые позволяют на основании изучения соматотипов [1, 4, 9] выделить группы студентов, имеющих факторы риска развития сердечно-сосудистых заболеваний. Существующие в литературе столь необходимые данные явно недостаточны, а подчас и противоречивы.

В связи с этим целью работы явилось выявление морфо-функциональных показателей, факторов риска и степени риска сердечно-сосудистых заболеваний для оценки состояния здоровья студентов и разработки программ его сохранения.