НОВЫЕ АНАЛОГИ ГЛЮКАГОНА
NOVEL GLUCAGON ANALOGUES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к новым аналогам пептидов глюкагона для применения указанных пептидов в терапии, к способам лечения, включающим введение указанных пептидов пациентам, и к применению указанных пептидов в производстве лекарственных средств.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Точный контроль уровня глюкозы в крови жизненно важен для человека, а также для других млекопитающих. Хорошо известно, что для поддержания надлежащего уровня глюкозы в крови важны два гормона, инсулин и глюкагон. В то время как инсулин действует в печени и периферических тканях, снижая уровень глюкозы в крови за счет увеличения периферического поглощения глюкозы и снижения продукции глюкозы в печени, глюкагон воздействует, главным образом, на поджелудочную железу и печень путем увеличения уровня глюкозы в крови за счет активации глюконеогенеза и гликогенолиза. Также сообщалось, что глюкагон усиливает липолиз, индуцируя кетоз и снижая уровень триглицеридов в плазме [Schade and Eaton, Acta Diabetologica, 1977, 14, 62].
Глюкагон является важной частью механизма защиты от гипогликемии, и путем введения низкой дозы глюкагона можно предотвратить гипогликемию, вызванную инсулином, или улучшить способность к восстановлению после гипогликемии. Также было показано, что агонизм глюкагона оказывает воздействие на метаболизм липидов, расход энергии и потребление пищи [Habegger et al. Nature Reviews Endocrinology 2010, 6, 689-697].
Большое количество людей, страдающих диабетом, в частности, диабетом 2 типа, имеют избыточную массу или страдают ожирением. Ожирение является фактором высокого риска при серьезных и даже смертельных общих заболеваниях, и для большинства больных диабетом крайне желательно, чтобы их лечение не приводило к увеличению массы тела.
В данной области известно несколько патентных заявок, раскрывающих различные аналоги на основе глюкагона и ко-агонисты рецептора GLP-1/глюкагона, например, патенты WO 2008/086086, WO 2008/101017, WO 2007/056362, WO 2008/152403 и WO 96/29342. Другие раскрытые аналоги глюкагона представляют собой пегилированный (например, WO 2007/056362) или ацилированный в конкретных положениях нативный глюкагон человека (например, WO 96/29342). Пептиды глюкагона для предотвращения гипогликемии были раскрыты, например, в патентной заявке US 7314859.
Глюкагон имеет ограниченное потенциальное применение в фармацевтических препаратах из-за быстрого выведения из циркуляции, с периодом полувыведения около 5 мин. Высокий клиренс терапевтического агента неудобен в тех случаях, когда желательно поддерживать его высокий уровень в крови в течение длительного периода времени, поскольку в таких случаях возникает необходимость в повторных введениях. В некоторых случаях можно влиять на профиль высвобождения пептидов путем применения подходящих фармацевтических композиций, но этот подход имеет различные недостатки и не является общеприменимым.
В настоящее время глюкагон доступен в виде лиофилизированной композиции с короткой продолжительностью действия, ограниченной меньше чем часом, несмотря на достижение пикового уровня глюкагона, который намного превышает эндогенный уровень глюкагона. Вследствие этого, существует необходимость в химически модифицированных соединениях глюкагона, вводимых для поддержания непрерывного уровня глюкагона, так, чтобы достигался более длительный биологический период полувыведения, т.е. необходимость в модифицированных пептидах глюкагона с пролонгированным профилем действия.
Глюкагон имеет низкую физическую, а также химическую стабильность при растворении в водном растворе. Растворы глюкагона образуют гели и фибриллы в течение нескольких часов или дней в зависимости от чистоты пептида, концентрации соли, pH и температуры (Beaven et al. European J. Biochem. 1969, 11, 37-42). Глюкагон содержит несколько лабильных аминокислот или аминокислотных последовательностей, что может приводить к дезамидированию, расщеплению, образованию аспартимида и изомеризации. Кроме того, глюкагон человека очень плохо растворим в диапазоне pH 3,5-9,5.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к применению указанных пептидов в терапии, к способам лечения, включающим введение указанных пептидов пациентам, и к применению указанных пептидов в производстве лекарственных средств для применения в лечении диабета, ожирения и связанных заболеваний и состояний.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что в результате одной или нескольких замен аминокислот в положениях 3, 15 и/или 16 в пептиде глюкагона и присоединения в положении 24 указанного пептида глюкагона заместителя, включающего три или более отрицательно заряженных фрагмента, таким образом, что один из указанных отрицательно заряженных фрагментов находится дистальнее липофильного фрагмента, образуются агонисты глюкагона с улучшенной стабильностью.
В настоящем изобретении предусмотрены новые модифицированные пептиды глюкагона с улучшенной растворимостью при нейтральном рН, улучшенной физической стабильностью по отношению к образованию геля и фибрилл, улучшенной химической стабильностью и имеющие увеличенный период полувыведения, а также обладающие улучшенными фармакокинетическими свойствами.
В первом варианте воплощения (Вариант воплощения 1) настоящее изобретение относится к пептиду глюкагона, включающему:
24
3
15
16
- SEQ ID 1, где Х представляет собой Lys, где присутствует, по меньшей мере, одна из следующих замен: Х представляет собой His, Х представляет собой Glu или X представляет собой Ala, llе, Phe, Arg, Thr, Val, Leu, Glu, Trp или Tyr и до шести дополнительных аминокислотных замен в указанном пептиде глюкагона и
- заместитель, включающий липофильный фрагмент и три или более отрицательно заряженных фрагмента, где один из указанных отрицательно заряженных фрагментов находится дистальнее указанного липофильного фрагмента, и где заместитель присоединяется к атому азота боковой цепи Lys в положении 24,
или его фармацевтически приемлемой соли, амиду, кислоте или пролекарству.
В другом варианте воплощения настоящее изобретение также предусматривает эфирную форму пептида глюкагона.
Настоящее изобретение также относится к применению соединений настоящего изобретения в терапии, к фармацевтическим композициям, включающим соединения настоящего изобретения, и к применению соединений настоящего изобретения в производстве лекарственных средств.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 показано влияние аналогов глюкагона на массу тела крыс DIO. Крысам DIO ежедневно на протяжении трех недель подкожно вводили дозу (4 нмоль/кг) аналога глюкагона и ежедневно измеряли их массу тела. Все четыре аналога глюкагона с течением времени снижали массу тела.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пептиды настоящего изобретения обеспечивают новые модифицированные пептиды глюкагона с пролонгированным профилем действия, также предусмотрены такие модифицированные пептиды глюкагона в стабильных фармацевтических композициях при физиологическом pH. Настоящее изобретение относится к новым аналогам глюкагона с улучшенной растворимостью, улучшенной физической стабильностью по отношению к образованию геля и фибрилл, улучшенной химической стабильностью и увеличенным периодом полувыведения.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что соединения настоящего изобретения обладают улучшенной физической стабильностью по отношению к образованию геля и фибрилл, улучшенной химической стабильностью и увеличенным периодом полувыведения, одновременно обладая лучшей растворимостью в воде при нейтральном pH или слабо щелочном pH.
16
В одном из вариантов воплощения настоящее изобретение относится к пептиду глюкагона, где Х представляет собой llе, Phe, Arg, Val, Leu, Glu, Trp или Tyr.
Среди других вариантов воплощения настоящего изобретения существуют следующие:
2. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 1, где указанный пептид глюкагона включает ноль, один, два, три, четыре, пять или шесть дополнительных аминокислотных замен в указанном пептиде глюкагона.
3. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 1, где указанный пептид глюкагона включает ноль дополнительных аминокислотных замен в указанном пептиде глюкагона.
4. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 1, где указанный пептид глюкагона включает одну дополнительную аминокислотную замену в указанном пептиде глюкагона.
5. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 1, где указанный пептид глюкагона включает две дополнительных аминокислотных замены в указанном пептиде глюкагона.
6. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 1, где указанный пептид глюкагона включает три дополнительных аминокислотных замены в указанном пептиде глюкагона.
7. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 1, где указанный пептид глюкагона включает четыре дополнительных аминокислотных замены в указанном пептиде глюкагона.
8. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 1, где указанный пептид глюкагона включает пять дополнительных аминокислотных замен в указанном пептиде глюкагона.
9. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 1, где указанный пептид глюкагона включает шесть дополнительных аминокислотных замен в указанном пептиде глюкагона.
9
10
12
17
20
21
27
28
29
30
10. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-2 и 4-9, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут присутствовать в следующих положениях аминокислот в указанном пептиде глюкагона: X, X, X, X, X, X, X, X, X и/или X.
10
12
17
20
21
27
28
29
11. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 10, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут быть в следующих положениях аминокислот в указанном пептиде глюкагона: X, X, X, X, X, X, X и/или X.
12
17
20
21
27
28
12. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 11, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут быть в следующих положениях аминокислот в указанном пептиде глюкагона: X, X, X, X, X, и//или X.
10
12
27
28
13. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 12, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут быть в положениях X, X, X и/или X указанного пептида глюкагона.
12
27
28
14. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 13, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут быть в положениях X, X и/или X указанного пептида глюкагона.
10
12
27
29
15. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 11, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут быть в положениях X, X, X и/или X указанного пептида глюкагона.
12
27
29
16. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 15, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут быть в положениях X, X и/или X указанного пептида глюкагона.
17. Пептиды глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 10-16, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих положений указанного пептида глюкагона:
9
X представляет собой Glu;
10
X представляет собой Val;
12
X представляет собой Arg;
17
X представляет собой Lys;
20
X представляет собой Lys;
21
X представляет собой Glu;
27
X представляет собой Met(O), Val, Leu, lie, Ala или Glu;
28
X представляет собой Ser, Thr, Ala, Gln, Val, Leu, lle, Arg, Lys, His, Asp, Gly или Glu;
29
X представляет собой Ser, Gln, Ala, Val, Leu, lle, Pro, Arg, Lys, His, Asp или Glu и
30
X отсутствует или представляет собой Pro.
12
17
20
21
27
28
18. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 17, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих положений указанного пептида глюкагона: X представляет собой Arg, X представляет собой Lys, X представляет собой Lys, X представляет собой Glu, X представляет собой Leu, X представляет собой Ser, lle или Thr.
10
21
27
28
19. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 17, где указанные дополнительные аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих положений указанного пептида глюкагона: X представляет собой Val, X представляет собой Glu, X представляет собой Leu, X представляет собой Ser.
9
20. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 17, где X представляет собой Glu.
10
21. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 19, где X представляет собой Val.
12
22. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 18, где X представляет собой Arg.
16
23. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой Ala.
16
24. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой llе.
16
25. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой Phe.
16
26. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой Arg.
16
27. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой Thr.
16
28. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой Val.
16
29. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой Leu.
16
30. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой Glu.
16
31. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой Trp.
16
32. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где X представляет собой Tyr.
17
33. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 23-32, где X представляет собой Lys.
20
34. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 33, где X представляет собой Lys.
21
35. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 34, где X представляет собой Glu.
27
36. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 35, где X представляет собой Met(O), Met(O2), Val, Leu, lle, Ala или Glu.
27
37. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 36, где X представляет собой Leu или Glu.
27
38. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 36, где X представляет собой Leu.
27
39. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 36, где X представляет собой Glu.
28
40. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 33-39, где X представляет собой Ser, Thr, Ala, Gln, Val, Leu, lle, Arg, Lys, His, Asp, Gly или Glu.
28
41. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 40, где X представляет собой Ser, Thr, Gly или lle.
28
42. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 40, где X представляет собой Ser, Thr или lle.
28
43. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 40, где X представляет собой Ser.
28
44. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 40, где X представляет собой Thr.
28
45. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 40, где X представляет собой Gly.
28
46. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 40, где X представляет собой lle.
29
47. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 40-46, где X представляет собой Ser, Gln, Ala, Val, Leu, lle, Pro, Arg, Lys, His, Asp или Glu.
29
48. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 47, где X представляет собой Val, Leu или lle.
29
49. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 47-48, где X представляет собой Val.
29
50. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 47-48, где X представляет собой Leu.
29
51. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 47-48, где X представляет собой lle.
30
52. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 47-51, где X отсутствует или представляет собой Pro.
30
53. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 52, где X отсутствует.
54. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный заместитель имеет формулу II:
где,
1
Z представляет собой структуру, соответствующую одной из формул, IIa или IIb;
где n в формуле IIa представляет собой 6-20,
2
символ * в формулах IIa и IIb представляет собой точку присоединения к азоту в Z;
2
1
3
2
3
1
4
если Z отсутствует, Z присоединяется к азоту в Z в точке, обозначенной символом *, и если Z и Z отсутствуют, Z присоединяется к азоту в Z в точке, обозначенной символом *
2
Z отсутствует или представляет собой структуру, соответствующую любой из формул IId, IIe, IIf, IIg, IIh, IIi, IIj или IIk;
где каждый аминокислотный фрагмент независимо имеет L или D стереохимическую конфигурацию;
2
3
где Z через атом углерода, обозначенный *, связан с атомом азота Z, обозначенным *;
3
2
4
3
4
2
если Z отсутствует, Z через атом углерода, обозначенный *, связан с атомом азота Z, обозначенным *, и если Z и Z отсутствуют, Z через атом углерода, обозначенный *, связан с эпсилон атомом азота Lys в положении 24 пептида глюкагона;
3
Z отсутствует или представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IIm, IIn, IIo или IIp;
3
3
4
4
3
Z через атом углерода Z, обозначенный символом *, связан с атомом азота Z, обозначенным символом *, если Z отсутствует, Z через атом углерода, обозначенный символом *, связан с эпсилон атомом азота Lys в положении 24 пептида глюкагона;
4
4
Z отсутствует или представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IId, IIe, IIf, IIg, IIh, IIi, IIj или IIk; где каждый аминокислотный фрагмент независимо является L, либо D, где Z через атом углерода, обозначенный символом *, связан с эпсилон атомом азота Lys в положении 24 пептида глюкагона,
2
4
2
4
при условии, что либо Z, либо Z, либо Z и Z вместе присутствуют в указанном заместителе.
55. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный заместитель имеет формулу II:
где,
1
Z представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IIa или IIb;
где n в формуле IIa представляет собой 6-20,
2
Z отсутствует или представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IId, IIe, IIf, IIg, IIh, IIi, IIj или IIk;
где каждый аминокислотный фрагмент независимо имеет стереохимическую конфигурацию L или D.
3
Z отсутствует или представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IIm, IIn, IIo или IIp;
4
Z отсутствует или представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IId, IIe, IIf, IIg, IIh, IIi, IIj или IIk;
где каждый аминокислотный фрагмент независимо имеет стереохимическую конфигурацию L или D.
56. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где структуры, соответствующие формулам IId-IIk, имеют стереохимическую конфигурацию L.
57. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где структуры, соответствующие формулам IId-IIk, имеют стереохимическую конфигурацию D.
2
4
58. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z указанного заместителя формулы II отсутствует, если присутствует Z.
4
2
59. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z указанного заместителя формулы II отсутствует, если присутствует Z.
60. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный заместитель представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IIIa, IIIb, IIIc, IIId, IIIe, IIIf, IIIg, IIIh, IIIi, IIIj, IIIk, IIIl, IIIm, IIIn, IIIo, IIIp, IIIq, IIIr, IIIs, IIIt, IIIu, IIIv, IIIw, IIIx или IIIy:
61. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный заместитель представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IIIa, IIIb, IIIi, IIIn, IIIp, IIIr, IIIs, IIIt, IIIu, IIIv, IIIw, IIIx или IIIy:
62. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный заместитель представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IIIa, IIIp или IIIt:
4
63. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z указанного заместителя отсутствует.
3
4
64. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z и Z указанного заместителя отсутствуют.
2
4
65. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-62, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой отрицательно заряженный фрагмент, такой как γGlu, Glu и/или Asp.
2
4
66. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 65, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой до десяти указанных отрицательно заряженных фрагментов.
2
4
67. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 66, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой три указанных отрицательно заряженных фрагмента.
2
4
68. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 66, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой четыре указанных отрицательно заряженных фрагмента.
2
4
69. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 66, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой пять указанных отрицательно заряженных фрагментов.
2
4
70. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-62 и 65-69, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой фрагменты Glu и/или γGlu.
2
4
71. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 70, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой γGlu, γGlu-Glu, γGlu-Glu-Glu, γGlu-Glu-Glu-Glu, γGlu-Glu-Glu-Glu-Glu.
2
4
72. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-62 и 65-69, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой фрагменты Glu и/или Asp.
2
4
73. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 72, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой фрагменты γGlu и/или Asp.
2
4
74. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 72-73, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой фрагменты Asp.
2
4
75. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 74, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой Asp, Asp-Asp, Asp-Asp-Asp или Asp-Asp-Asp-Asp.
2
4
76. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 70 или 72, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой фрагменты Glu.
2
4
77. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 76, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой Glu, Glu-Glu, Glu-Glu-Glu, Glu-Glu-Glu-Glu, Glu-Glu-Glu-Glu-Glu.
2
4
78. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 70 или 73, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой фрагменты γGlu.
2
4
79. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 78, где Z и Z указанного заместителя независимо представляют собой γGlu, γGlu-γGlu, γGlu-γGlu-γGlu, γGlu-γGlu-γGlu-γGlu, γGlu-γGlu-γGlu-γGlu-γGlu.
80. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный заместитель включает алкильную группу с прямой цепью или разветвленную алкильную группу.
1
81. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z представляет собой структуру, соответствующую формуле IIa, и n в формуле IIa представляет собой 12-18.
1
82. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z представляет собой 19-карбоксинонадеканоил, 17-карбоксигептадеканоил, 15-карбоксипентадеканоил, 13-карбокситридеканоил или 4-[16-(1Н-тетразол-5-ил)гексадеканоилсульфамоил]бутаноил.
1
83. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z представляет собой 19-карбоксинонадеканоил, 17-карбоксигептадеканоил, 15-карбоксипентадеканоил или 13-карбокситридеканоил.
1
84. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z представляет собой 4-[16-(1Н-тетразол-5-ил)гексадеканоилсульфамоил]бутаноил.
1
85. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z представляет собой 19-карбоксинонадеканоил.
1
86. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z представляет собой 17-карбоксигептадеканоил.
1
87. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z представляет собой 15-карбоксипентадеканоил.
1
88. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где Z представляет собой 13-карбокситридеканоил.
89. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный заместитель нековалентно связан с альбумином.
90. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный заместитель отрицательно заряжен при физиологическом pH.
Авторы изобретения неожиданно обнаружили, что соединения настоящего изобретения обладают улучшенной растворимостью в воде при нейтральном pH или слабо щелочном pH. Более того, авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что аналоги глюкагона настоящего изобретения обладают улучшенной стабильностью по отношению к образованию геля и фибрилл в водных растворах. Аналоги глюкагона настоящего изобретения также неожиданно обладают улучшенной химической стабильностью, т.е. снижена химическая деградация аналогов. Авторы изобретения обнаружили, что соединения настоящего изобретения обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, т.е., имеют пролонгированный период полувыведения in vivo. Более того, соединения настоящего изобретения приводят к значительному снижению массы тела при подкожном введении.
Растворимость при разных значениях pH может быть измерена, как описано в анализе IX.
Физическую стабильность соединений настоящего изобретения можно измерить способом, описанным в анализе II.
Химическую стабильность аналогов можно измерить, как описано в анализе X.
Период полувыведения можно определить в фармакокинетическом исследовании на таких видах животных, как крысы (анализ VIII) или карликовые свиньи (анализ XI). Снижение массы тела можно измерить на мышах DIO, как описано в анализе XII.
Пролонгированное действие соединений настоящего изобретения означает, что период времени, на протяжении которого они проявляют биологическую активность, увеличен.
Лучший контроль уровня глюкозы в крови при диабетах 1 и 2 типов может быть достигнут путем совместного введения глюкагона с известным антидиабетическим агентом, таким как инсулин, агонисты GLP-1 и агонисты GIP.
В одном из вариантов воплощения аналоги глюкагона этого изобретения могут быть введены в одну композицию с аналогами GLP-1 или аналогами инсулина с образованием стабильных фармацевтических композиций.
Комбинирование терапии инсулином и глюкагоном может быть предпочтительным по сравнению с терапией только инсулином. В норме, в постпрандиальный период, когда уровень глюкозы в крови понижается, первым гормональным ответом является снижение продукции инсулина. Когда уровень глюкозы в крови снижается еще сильнее, вторым ответом является продукция глюкагона, что приводит к увеличению выброса глюкозы из печени. Когда больные диабетом получают очень высокую экзогенную дозу инсулина, присутствие экзогенного инсулина продавляет естественный ответ в виде повышения глюкагона, поскольку инсулин обладает ингибирующим эффектом на продукцию глюкагона. Следовательно, небольшой избыток в дозе инсулина может вызвать гипогликемию. В настоящее время многие пациенты с диабетом предпочитают использовать дозы инсулина несколько меньшие оптимальных из-за боязни гипогликемических эпизодов, которые могут представлять опасность для жизни.
Соединения настоящего изобретения растворимы при нейтральном pH, и поэтому их можно вводить в одну комбинацию с инсулином, что предусматривает применение при более высоком уровне глюкозы в крови и снижение числа гипогликемических эпизодов, а также снижение риска осложнений, связанных с диабетом.
Другими вариантами воплощения настоящего изобретения являются следующие.
91. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный пептид глюкагона удлинен с С-конца на один аминокислотный остаток.
92. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где пептид глюкагона представляет собой C-концевой амид или C-концевую карбоновую кислоту.
93. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный пептид глюкагона представляет собой C-концевой амид.
94. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный пептид глюкагона представляет собой C-концевую карбоновую кислоту.
95. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный пептид глюкагона выбирают из глюкагона (1-29), глюкагона (1-29)-амида или их аналогов.
96. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, выбранный из группы, состоящей из: Chem.1; Chem.2; Chem.3; Chem.4; Chem.5; Chem.6; Chem.7; Chem.8; Chem.9; Chem.10; Chem.11; Chem.12; Chem.13; Chem.14; Chem.15; Chem.16; Chem.17; Chem.18; Chem.19; Chem.20; Chem.21; Chem.22; Chem.23; Chem.24; Chem.25; Chem.26; Chem.27; Chem.28; Chem.29; Chem.30; Chem.31; Chem.32; Chem.33; Chem.34; Chem.35; Chem.36; Chem.37; Chem.38; Chem.39; Chem.40; Chem.41; Chem.42; Chem.43; Chem.44; Chem.45; Chem.46; Chem.47; Chem.48; Chem.49; Chem.50; Chem.51; Chem.52; Chem.53; Chem.54; Chem.55; Chem.56; Chem.57; Chem.58; Chem.59; Chem.60; Chem.61; Chem.62; Chem.63; Chem.64; Chem.65; Chem.66; Chem.67; Chem.68; Chem.69; Chem.70; Chem.71; Chem.72; Chem.73; Chem.74; Chem.75; Chem.76; Chem.77; Chem.78; Chem.79; Chem.80; Chem.81; Chem.82; Chem.83; Chem.84; Chem.85; Chem.86; Chem.87; Chem.88; Chem.89; Chem.90; Chem.91; Chem.92; Chem.93; Chem.94; Chem.95; Chem.96 и Chem.97.
Следующие варианты воплощения настоящего изобретения относятся к введению соединений настоящего изобретения совместно с антидиабетическими агентами или агентами против ожирения.
97. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения в комбинации с соединением глюкагоноподобным пептидом 1 (GLP-1).
98. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения в комбинации с инсулиновым соединением.
99. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения в комбинации с эксендином-4.
100. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, который находится в двухкамерной системе, композиции депо и/или в микрокапсулированной композиции.
101. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения в комбинации с соединением глюкагоноподобным пептидом (GLP-1) для получения лекарственного средства для лечения диабетов и/или ожирения.
102. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения в комбинации с инсулиновым соединением для получения лекарственного средства для лечения диабетов и/или ожирения.
103. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения в комбинации с эксендином-4 для получения лекарственного средства для лечения диабетов и/или ожирения.
104. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 97-103, где соединение GLP-1 и инсулиновое соединение представлены формулами G1-G4 и G5, соответственно:
N-эпсилон26-((S)-4-Карбокси-4-гексадеканоиламино-бутирил)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Карбокси-4-({транс-4-[(19-карбоксинонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][дезаминоHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-Карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбокси-пентадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
NεВ29-гексадекандиоил-γ-Glu-(desB30) инсулин человека
105. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 104, где соединение GLP-1 представлено формулой G1:
N-эпсилон26-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламино-бутирил)[Arg34]GLP-1-(7-37):
106. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 104, где соединение GLP-1 представлено формулой G2:
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-({транс-4-[(19-карбоксинонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][дезаминоHis7, Glu22, Arg26, Arg34, Lys37]GLP-1-(7-37):
107. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 104, где соединение GLP-1 представлено формулой G3:
N-эпсилон26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Arg8, Arg34]GLP-1-(7-37):
108. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 104, где соединение GLP-1 представлено формулой G4:
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбокси-пентадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
109. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 104, где инсулиновое соединение представлено формулой G5:
NεВ29-гексадекандиоил-γ-Glu(desB30) инсулин человека
110. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 97-104, где указанный пептид глюкагона выбран из группы, состоящей из Chem.1 - Chem.97, и находится в комбинации с соединением GLP-1, выбранным из группы: G1-G4.
111. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 97-104, где указанный пептид глюкагона выбран из группы, состоящей из Chem.1 - Chem.97, и находится в комбинации с инсулиновым соединением, таким как G5.
112. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 97-104, где указанный пептид глюкагона выбран из группы, состоящей из Chem.1 - Chem.97, и находится в комбинации с эксендином-4.
GLP-1 представляет собой инкретиновый гормон, продуцируемый эндокринными клетками кишечника после приема пищи. GLP-1 является регулятором метаболизма глюкозы и секреции инсулина бета клетками островков Лангерганса в поджелудочной железе. GLP-1 также вызывает секрецию инсулина при диабете. Период полувыведения in vivo GLP-1 как такового, тем не менее, очень короткий, поэтому способы увеличения периода полувыведения GLP-1 in vivo привлекают много внимания.
WO 98/08871 раскрывает аналоги GLP-1 и производные на основе GLP-1(7-37) человека с пролонгированным действием, имеющие увеличенный период полувыведения, в том числе лираглутид, производное GLP-1 для введения один раз в день, разработанное Novo Nordisk A/S, продающееся для лечения диабета 2 типа.
Эксенатид представляет собой коммерческий миметик инкретина для лечения сахарного диабета 2 типа, произведенный и продающийся Amylin Pharmaceuticals and Eli Lilly & Co. Эксенатид основан на эксендине-4, гормоне, найденном в слюне ядозуба. Он проявляет биологические свойства, аналогичные свойствам GLP-1 человека. US 5424286 относится, среди прочего, к способу стимулирования высвобождения инсулина у млекопитающих путем введения эксендина-4 (SEQ ID NO 3).
Использованный здесь термин "соединение GLP-1" относится к GLP-1(7-37) человека, эксендину-4, а также аналогам, пептидам слияния и их производным, которые сохраняют активность GLP-1.
Что касается нумерации положений в соединениях GLP-1: для целей настоящего документа любую замену аминокислоты, делецию и/или вставку указывают относительно последовательности GLP-1(7-37) (SEQ ID 2) и/или эксендина-4. Однако нумерация аминокислотных остатков в Перечне последовательностей всегда начинается с номера 1, тогда как для целей настоящего документа в соответствии с принятой в данной области техники практикой авторы начинают нумерацию с аминокислотного остатка номер 7, и присваивают ему номер 7 в случае GLP-1(7-37). Таким образом, обычно, любое указание номера положения в последовательности GLP-1(7-37) в настоящем документе представляет собой указание позицию в последовательности начинающей с His в положении 7 и заканчивающей Gly в положении 37.
Соединения GLP-1 могут быть получены, как известно в данной области техники.
Активность GLP-1 можно определить, используя любой способ, известный в данной области техники, например, анализ (II), описанный в настоящем документе (стимуляция образования сАМР в клеточной линии, экспрессирующей человеческий рецептор GLP-1).
Более того, соединение GLP-1 представляет собой соединение, которое:
i) может включать, по меньшей мере, один из следующих остатков: дезаминоHis7, Aib8, Aib22, Arg26, Aib35 и/или Lys37;
ii) может представлять собой производное GLP-1, включающее связывающий альбумин фрагмент, который включает, по меньшей мере, одну, предпочтительно, по меньшей мере, две, более предпочтительно две свободные карбоксильные группы; или его фармацевтически приемлемую соль;
iii) может представлять собой производное GLP-1, включающее связывающий альбумин фрагмент, который включает ацильный радикал дикарбоновой кислоты, предпочтительно включающий всего от 12 до 24 атомов углерода, такой как С12, С14, С16, С18, С20, С22 или С24, более предпочтительно С16, С18 или С20; где предпочтительно а) ацильный радикал через линкер присоединяется к эпсилон амино группе остатка лизина пептида GLP-1; b) линкер включает, по меньшей мере, один радикал OEG, и/или, по меньшей мере, один радикал 4-аминометил-циклогексанкарбоновой кислоты, и, необязательно, дополнительно, по меньшей мере, один Glu; и/или
iv) может быть выбрано из группы, включающей соединения N-эпсилон26-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламино-бутирил)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-({транс-4-[(19-карбоксинонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][дезаминоHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбокси-пентадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
и их фармацевтически приемлемые соли, амиды, алкилы и эфиры.
"Инсулин" в соответствии с изобретением следует понимать как инсулин человека, аналог инсулина и производное инсулина.
Инсулиновое соединение представляет собой соединение, которое, например, может быть представлено:
NεB29-гексадекандиоил-γ-Glu-(desB30) инсулином человека
Соединения настоящего изобретения и агенты против ожирения или антидиабетические агенты, как определено в настоящем описании изобретения, можно вводить одновременно или последовательно. Эти факторы могут быть доставлены в виде единичной дозированной формы, где единичная дозированная форма содержит оба соединения, или в форме в виде набора с несколькими составляющими, включающей препарат соединения настоящего изобретения в качестве первой единичной дозированной формы и препарат агента против ожирения или антидиабетического агента в качестве второй единичной дозированной формы. Во всех случаях, когда в данном описании упоминается первая или вторая, или третья и т.д. единичная дозированная форма, это не указывает на предпочтительный порядок введения, но сделано лишь из соображений удобства.
«Одновременное" введение препарата соединения настоящего изобретения и препарата агента против ожирения и антидиабетического агента означает введение соединений в единичной дозированной форме или введение первого агента с последующим введением второго агента не более чем через 15 минут, предпочтительно 10 минут, более предпочтительно 5 минут, более предпочтительно 2 минуты. Любой фактор может быть введен первым.
"Последовательное" введение означает введение первого агента с последующим введением второго агента через 15 минут и более. Любая из двух единичных дозированных форм может быть введена первой. Предпочтительно, оба продукта вводят одним путем с помощью внутривенной инъекции.
Как уже указывалось, во всех способах лечения или показаниях, раскрытых выше, можно вводить только соединение настоящего изобретения. Тем не менее, его также можно вводить в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными агентами, веществами или соединениями, либо последовательно, либо одновременно.
Стандартная доза соединения настоящего изобретения при применении в способе в соответствии с настоящим изобретением находится в диапазоне от примерно 0,0001 до примерно 100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно от примерно 0,001 до примерно 10 мг/кг массы тела, более предпочтительно от примерно 0,001 до примерно 5 мг/кг массы тела в день, например, от примерно 0,001 до примерно 10 мг/кг массы тела в день или от примерно 0,001 до примерно 5 мг/кг массы тела в день при введении в одной или нескольких дозах, например, от 1 до 3 доз. Точная доза будет зависеть от частоты и способа введения, пола, возраста, массы и общего состояния субъекта, получающего лечение, природы и тяжести состояния, подвергающегося лечению, любых сопутствующих заболеваний, подлежащих лечению, и других факторов, очевидных специалистам в данной области техники.
Соединения настоящего изобретения включают соединения, которые, как полагают, хорошо подходят для введения с более длительными интервалами, чем, например, один раз в день, поэтому, надлежащим образом введенные в композиции соединения настоящего изобретения могут подходить, например, для введения два раза в неделю или один раз в неделю подходящим способом введения, таким как один из описанных здесь способов.
Как описано выше, соединения настоящего изобретения можно вводить или применять в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями или веществами, и подходящие дополнительные соединения или вещества могут быть выбраны, например, из антидиабетических агентов, антигиперлипидемических агентов, агентов против ожирения, антигипертензивных агентов и агентов для лечения осложнений, вызванных или ассоциированных с диабетом.
Подходящие антидиабетические агенты включают инсулин, производные или аналоги инсулина, производные или аналоги GLP-1 (глюкагоноподобный пептид-1) или другие аналоги GLP-1, такие как лираглутид (Victoza, Novo Nordisk A/S), эксенатид (Byetta, Eli Lilly/Amylin), таспоглютид (Roche), альбиглютид (Syncria, GlaxoSmithKline), амилин, аналоги амилина (например, Symlin™/Pramlintide), а также орально активные гипогликемические агенты.
Соединения настоящего изобретения имеют более высокую селективность к рецептору глюкагона по сравнению с пептидами, ранее раскрытыми в данной области техники. Пептиды настоящего изобретения также имеют пролонгированный период полувыведения in vivo. Соединения настоящего изобретения могут представлять собой растворимые агонисты рецептора глюкагона, например, с растворимость, по меньшей мере, 0,1 ммоль/л, 0,2 ммоль/л, по меньшей мере, 0,5 ммоль/л, по меньшей мере, 2 ммоль/л, по меньшей мере, 4 ммоль/л, по меньшей мере, 8 ммоль/л, по меньшей мере, 10 ммоль/л или, по меньшей мере, 15 ммоль/л.
В данном контексте, если не указано иное, термины "растворимый", "растворимость", "растворимый в водном растворе", "растворимый в воде", "водорастворимый", "растворимость в воде" и "водорастворимость" относятся к растворимости соединения в воде или в водном солевом или водном буферном растворе, например, в 10 мМ фосфатном растворе, или в водном растворе, содержащем другие соединения, но не в органических растворителях.
Использованные здесь термины "полипептид" и "пептид" означают соединения, состоящие, по меньшей мере, из пяти входящих в их состав аминокислот, соединенных пептидными связями. Входящие в состав аминокислоты могут представлять собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, и могут быть природными аминокислотами, не кодируемыми генетическим кодом, а также могут быть синтетическими аминокислотами. Природные аминокислоты, не кодируемые генетическим кодом, представляют собой, например, гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, орнитин, фосфосерин, D-аланин и D-глутамин. Синтетические аминокислоты включают аминокислоты, полученные химическим синтезом, т.е. D-изомеры кодируемых генетическим кодом аминокислот, такие как D-аланин и D-лейцин, Aib (α-аминоизобутановая кислота), Abu (α-аминобутановая кислота), Tle (трет-бутилглицин), β-аланин, 3-аминометил бензойная кислота, антраниловая кислота.
Использованный здесь термин "аналог", относящийся к полипептиду, означает модифицированный пептид, в котором один или несколько аминокислотных остатков пептида были замещены другими аминокислотными остатками, и/или в котором один или несколько аминокислотных остатка были удалены из пептида, и/или в котором один или несколько аминокислотных остатка были добавлены в пептид. Такие добавления и делеции аминокислотных остатков могут происходить на N-конце пептида и/или на С-конце пептида. Для описания аналогов используется простая система. Формулы аналогов пептида и их производные изображают, используя стандартные однобуквенные или трехбуквенные сокращения для аминокислот в соответствии с номенклатурой IUPAC-IUB.
Использованный здесь термин "производное" по отношению к пептиду означает химически модифицированный пептид или его аналог, где, по меньшей мере, один заместитель не присутствует в не модифицированном пептиде или его аналоге, т.е., пептид был ковалентно модифицирован. Стандартными модификациями являются получение амидов, присоединение углеводов, алкильных групп, ацильных групп, получение эфиров и тому подобное.
Все аминокислоты, для которых не указан оптический изомер, следует считать L-изомерами.
Использованный здесь термин "пептид глюкагона" означает пептид глюкагона, соединение глюкагона, соединение в соответствии с настоящим изобретением, соединение настоящего изобретения, соединение, соответствующее формуле I, аналог глюкагона, производное глюкагона или производное аналога глюкагона, глюкагон человека, глюкагон человека (1-29), глюкагон (1-30), глюкагон (1-31), глюкагон (1-32), а также аналоги, пептиды слияния и их производные, сохраняющие активность глюкагона.
1
29
Относительно нумерации положений в соединениях глюкагона: для целей настоящего документа любой аминокислотный заместитель, делецию и/или вставку указывают относительно последовательности природного глюкагона человека (1-29) (SEQ ID 1). Положения аминокислот 1-29 в глюкагоне человека в настоящем документе соответствуют положениям аминокислот от X до X. Глюкагон человека (1-29) имеет последовательность His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr (SEQ ID 1).
Глюкагон (1-30) означает глюкагон человека с дополнительной аминокислотой на С-конце, глюкагон (1-31) означает глюкагон человека с двумя дополнительными аминокислотами на С-конце, глюкагон (1-32) означает глюкагон человека с тремя дополнительными аминокислотами на С-конце.
Использованный здесь термин "дистальный" означает наиболее удаленный (концевой) от точки присоединения.
Использованный здесь термин "отрицательно заряженный фрагмент" означает отрицательно заряженный химический фрагмент, такой как, фрагмент карбоновой кислоты, сульфоновой кислоты или тетразола, но не ограничиваясь ими.
Использованный здесь термин "липофильный фрагмент" означает алифатический или циклический углеводородный фрагмент с более чем 6, но менее чем 30 атомами углерода, где указанный углеводородный фрагмент может содержать дополнительные заместители.
Использованный здесь термин "заместитель" означает химический фрагмент или группу, замещающую водород.
Термин "1Н-тетразо-5-ил", использованный здесь как часть химического названия, предназначен для обозначения как 1Н-тетразол-5-ила, так и 2Н-тетразол-5-ила.
Ниже приведены следующие варианты воплощения настоящего изобретения.
113. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный пептид глюкагона представляет собой защищенное от DPPIV соединение.
114. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный пептид глюкагона является DPPIV стабилизированным.
115. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный пептид глюкагона представляет собой агонист рецептора глюкагона.
50
116. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где указанный пептид глюкагона представляет собой агонист рецептора глюкагона с ЕС<1 нМ.
Использованный здесь термин "защищенный от DPP-IV" по отношению к полипептиду означает полипептид, который был химически модифицирован для того, чтобы сделать указанное соединение устойчивым к пептидазе дипептидил аминопептидазе (DPP-IV) плазмы крови. Известно, что фермент DPP-IV в плазме участвует в деградации нескольких пептидных гормонов, например, глюкагона, GLP-1, GLP-2, оксинтомодулина и т.п. Поэтому были приложены значительные усилия, чтобы разработать аналоги и производные полипептидов, чувствительных к опосредованному DPP-IV гидролизу, чтобы снизить скорость их деградации под действием DPP-IV.
Более того, соединения настоящего изобретения могут быть устойчивы к расщеплению DPP-IV в анализе без альбумина, как описано в анализе VII.
В настоящем контексте термин "агонист" предназначен для обозначения вещества (лиганда), которое активирует данный тип рецептора.
В настоящем контексте термин "антагонист" предназначен для обозначения вещества (лиганда), которое блокирует или нейтрализует действие агониста.
50
Использованный здесь термин "агонист глюкагона" относится к любому пептиду глюкагона, который полностью или частично активирует рецептор глюкагона человека. В предпочтительном варианте воплощения "агонистом глюкагона" является любой пептид глюкагона, который активирует рецептор глюкагона, предпочтительно с аффинностью и активностью (ЕС) ниже 1 мкМ, например, ниже 100 нМ или ниже 1 нМ, как измерено в анализе I.
В настоящем контексте термин "фармацевтически приемлемая соль" предназначен для обозначения соли, безвредной для пациента. Такие соли включают фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли, фармацевтически приемлемые соли металлов, соли аммония и соли алкилированного аммония. Кислотно-аддитивные соли включают соли неорганических кислот, а также органических кислот. Примеры подходящих неорганических кислот включают соляную, бромистоводородную, йодистоводородную, фосфорную, серную и азотную кислоты и тому подобное. Примеры подходящих органических кислот включают муравьиную, уксусную, трихлоруксусную, трифторуксусную, пропионовую, бензойную, коричную, лимонную, фумаровую, гликолевую, молочную, малеиновую, яблочную, малоновую, миндальную, щавелевую, пикриновую, пировиноградную, салициловую, янтарную, метансульфоновую, этансульфоновую, винную, аскорбиновую, памоевую, бисметилен-салициловую, этандисульфоновую, глюконовую, цитраконовую, аспарагиновую, стеариновую, пальмитиновую, ЭДТА, гликолевую, п-аминобензойную, глутаминовую, бензолсульфоновую, п-толуолсульфоновую кислоты и тому подобные. Другие примеры фармацевтически приемлемых неорганических или органических кислотно-аддитивных солей включают фармацевтически приемлемые соли, приведенные в J. Pharm. Sci. (1977) 66, 2, включенном в настоящий документ посредством ссылки. Примеры соответствующих солей металлов включают соли лития, натрия, калия и магния и тому подобные. Примеры солей алкилированного аммония включают соли метиламмония, диметиламмония, триметиламмония, этиламмония, гидроксиэтиламмония, диэтиламмония, бутиламмония и тетраметиламмония и тому подобные.
В настоящем документе термин "терапевтически эффективное количество" соединения относится к количеству, достаточному для лечения, облегчения или частичного торможения клинических проявлений данного заболевания и/или его осложнений. Количество, достаточное для этого, определяется как "терапевтически эффективное количество". Эффективное для каждой цели количество будет зависеть от тяжести заболевания или повреждения, а также от массы и общего состояния субъекта. Следует понимать, что определение соответствующей дозировки можно осуществить обычным экспериментированием, путем построения матрицы значений и тестирования различных точек в матрице, что находится в пределах обычной квалификации врача или ветеринара.
Использованные здесь термины "лечение" и другие его варианты относятся к ведению пациента и уходу за пациентом для борьбы с состоянием, таким как заболевание или расстройство. Термины предназначены для включения полного спектра видов лечения для того или иного состояния, от которого страдает пациент, таких как введение данного активного соединения (соединений) для облегчения симптомов или его осложнений, для замедления прогрессирования заболевания, расстройства или состояния, для лечения или устранения заболевания, расстройства или состояния и/или предотвращения состояния, где предотвращение следует понимать как ведение пациента и уход за пациентом для борьбы с заболеванием, состоянием или расстройством, включающие введение данного активного соединения (соединений) для предотвращения возникновения симптомов или осложнений. Пациентом, нуждающимся в лечение, предпочтительно являются млекопитающее, в частности человек, но в рамках настоящего изобретения находится лечение других животных, таких как собаки, кошки, коровы, лошади, овцы, козы и свиньи.
Использованный здесь термин "связывающий альбумин остаток" означает остаток, который нековалентно связывается с сывороточным альбумином человека. Связывающий альбумин остаток, присоединенный к терапевтическому полипептиду, как правило, имеет аффинность к сывороточному альбумину человека ниже 10 мкМ и предпочтительно ниже 1 мкМ. Ряд связывающих альбумин остатков включают некоторые линейные и разветвленные липофильные фрагменты, содержащие 4-40 атомов углерода.
Другие варианты воплощения относятся к фармацевтическим композициям.
117. Фармацевтически приемлемая композиция, включающая пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116.
118. Фармацевтически приемлемая композиция в соответствии с вариантом воплощения 117, также включающая одно или несколько дополнительных терапевтически активных соединений или веществ.
119. Фармацевтически приемлемая композиция в соответствии с любым из вариантов воплощения 117-118, также включающая соединение GLP-1.
120. Фармацевтически приемлемая композиция в соответствии с вариантом воплощения 119, где соединение GLP-1 выбирают из группы, состоящей из:
N-эпсилон26-((S)-4-карбокси-4-гексадеканоиламино-бутирил)[Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-({транс-4-[(19-карбоксинонадеканоиламино)метил]циклогексанкарбонил}амино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][дезаминоHis7,Glu22,Arg26,Arg34,Lys37]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон26-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутириламино]этокси}этокси)ацетиламино]этокси}этокси)ацетил][Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37):
N-эпсилон37-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4-карбокси-4-(15-карбокси-пентадеканоиламино)-бутириламино]-этокси}-этокси)-ацетиламино]-этокси}-этокси)-ацетил][Aib8,22,35,Lys37]GLP-1-(7-37):
и их фармацевтически приемлемых солеи, амидов, алкилов или эфиров.
121. Фармацевтически приемлемая композиция в соответствии с любым из вариантов воплощения 117-118, дополнительно включающая инсулиновое соединение.
122. Фармацевтическая композиция в соответствии с вариантом воплощения 121, где инсулиновое соединение представляет собой:
NεВ29-гексадекандиоил-γ-Glu-(desB30) инсулин человека
123. Фармацевтически приемлемая композиция в соответствии с любым из вариантов воплощения 105-110 в единичной лекарственной форме, содержащая от примерно 0,01 мг до примерно 1000 мг, например, от примерно 0,1 мг до примерно 500 мг, от примерно 0,5 мг до примерно 5 мг, например, от примерно 0,5 мг до примерно 200 мг пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116.
124. Фармацевтически приемлемая композиция в соответствии с любым из вариантов воплощения 117-123, подходящая для парентерального введения.
125. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 для применения в терапии.
Предусмотрены другие варианты воплощения настоящего изобретения.
126. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении или предотвращении гипергликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа и ожирения.
127. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения для замедления или предотвращения прогрессирования диабета 2 типа.
128. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении ожирения или предупреждения избыточной массы.
129. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения для снижения потребления пищи.
130. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями, для применения для увеличения расхода энергии.
131. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения для снижения массы тела.
132. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения для замедления прогрессирования нарушения толерантности к глюкозе (IGT) в диабет 2 типа.
133. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения для замедления прогрессирования диабета 2 типа в инсулинозависимый диабет.
134. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения для регулирования аппетита.
135. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения для симулирования насыщения.
136. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения для предотвращения набора массы тела после успешной потери массы.
137. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении заболевания или состояния, связанного с избыточной массой тела или ожирением.
138. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении булимии.
139. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении компульсивного переедания.
140. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении атеросклероза.
141. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении гипертензии.
142. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении диабета 2 типа.
143. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении нарушения толерантности к глюкозе.
144. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении дислипидемии.
145. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении ишемической болезни сердца.
146. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении стеатоза печени.
147. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении стеатоза печени.
148. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении отравления бета-блокаторами.
149. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения для ингибирования моторики желудочно-кишечного тракта при исследовании желудочно-кишечного тракта с помощью таких методик, как рентгеновское, КТ- и ЯМР-сканирование.
150. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении гипогликемии.
151. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении гипогликемии, индуцированной инсулином.
152. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения для лечения и предотвращения реактивной гипогликемии.
153. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении диабетической гипогликемии.
154. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении недиабетической гипогликемии.
155. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении гипогликемии натощак.
156. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении лекарственной гипогликемии.
157. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении гипогликемии, вызванной шунтированием желудка.
158. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении гипогликемии при беременности.
159. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении алкогольной гипогликемии.
160. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении инсулиномы.
161. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями для применения в лечении и предотвращении болезни фон Гирке.
Другие варианты воплощения настоящего изобретения относятся к следующим способам.
162. Способ лечения или предотвращения гипогликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа и ожирения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
163. Способ замедления и предотвращения прогрессирования диабета 2 типа, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
164. Способ лечения ожирения или предупреждения избыточной массы тела, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1 -116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
165. Способ снижения потребления пищи, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
166. Способ для применения для увеличения расхода энергии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
167. Способ для применения для снижения массы тела, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
168. Способ для применения для замедления прогрессирования нарушения толерантности к глюкозе (IGT) в диабет 2 типа, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
169. Способ для применения для замедления прогрессирования диабета 2 типа в инсулинозависимый диабет, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
170. Способ для применения для регулирования аппетита, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
171. Способ для применения для стимулирования насыщения, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
172. Способ для применения для предупреждения набора массы тела после успешной потери массы, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
173. Способ для применения в лечении заболевания или состояния, связанного с избыточной массой тела или ожирением, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
174. Способ для применения в лечении булимии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
175. Способ для применения в лечении компульсивного переедания, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
176. Способ для применения в лечении атеросклероза, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
177. Способ для применения в лечении гипертензии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
178. Способ для применения в лечении диабета 2 типа, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
179. Способ для применения в лечении нарушения толерантности к глюкозе, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
180. Способ для применения в лечении дислипидемии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
181. Способ для применения в лечении ишемической болезни сердца, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
182. Способ для применения в лечении стеатоза печени, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
183. Способ для применения в лечении отравления бета-блокаторами, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
184. Способ для применения для ингибирования моторики желудочно-кишечного тракта в связи с исследованиями желудочно-кишечного тракта с помощью таких методик как рентгеновское, КТ- и ЯМР-сканирование, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
185. Способ для применения в лечении или предупреждении гипогликемии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
186. Способ для применения в лечении или предупреждении гипогликемии, индуцированной инсулином, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
187. Способ для применения в лечении или предупреждении реактивной гипогликемии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
188. Способ для применения в лечении или предупреждении диабетической гипогликемии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
189. Способ для применения в лечении или предупреждении недиабетической гипогликемии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
190. Способ для применения в лечении или предупреждении гипогликемии натощак, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
191. Способ для применения в лечении или предупреждении лекарственной гипогликемии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
192. Способ для применения в лечении или предупреждении гипогликемии, вызванной шунтированием желудка, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
193. Способ для применения в лечении или предупреждении гипогликемии при беременности, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
194. Способ для применения в лечении или предупреждении алкогольной гипогликемии, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
195. Способ для применения в лечении или предупреждении инсулиномы, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
196. Способ для применения в лечении или предупреждении болезни фон Гирке, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1- 116, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями.
Следующие варианты воплощения настоящего изобретения относятся к следующим применениям.
197. Применение пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 для получения лекарственного средства.
198. Применение пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждении гипергликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа и ожирения.
199. Применение пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 для получения лекарственного средства для замедления и предупреждения прогрессирования заболевания в диабет 2 типа, лечения ожирения или предупреждении избыточной массы тела, для снижения потребления пищи, увеличения расхода энергии, снижения массы тела, замедления прогрессирования нарушения толерантности к глюкозе (IGT) в диабет 2 типа; замедления прогрессирования диабета 2 типа в инсулинозависимый диабет; регулирования аппетита; стимулирования насыщения; предупреждения набора массы тела после успешной потери массы; лечения заболевания или состояния, связанного с избыточной массой или ожирением; лечения булимии; лечения компульсивного переедания; лечения атеросклероза, гипертензии, диабета 2 типа, IGT, дислипидемии, ишемической болезни сердца, стеатоза печени, лечения отравления бета-блокаторами, для ингибирования моторики желудочно-кишечного тракта в связи с исследованиями желудочно-кишечного тракта с помощью таких методик, как рентгеновское, КТ- и ЯМР-сканирование.
200. Применение пептида глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 1-116 для получения лекарственного средства для лечения или предупреждении гипогликемии, индуцированной инсулином гипогликемии, реактивной гипогликемии, диабетической гипогликемии, недиабетической гипогликемии, гипогликемии натощак, лекарственной гипогликемии, гипогликемии, вызванной шунтированием желудка, гипогликемии при беременности, алкогольной гипогликемии, инсулиномы и болезни фон Гирке.
Ниже приведены следующие варианты воплощения настоящего изобретения.
201. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе образования фибрилл с ThT обнаружение указанного пептида глюкагона составляет более 70%.
202. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе образования фибрилл с ThT обнаружение указанного пептида глюкагона составляет более 90%.
203. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе образования фибрилл с ThT обнаружение указанного пептида глюкагона составляет примерно 100%.
204. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе образования фибрилл с ThT лаг-период для указанного пептида глюкагона составляет более 7 часов.
205. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе образования фибрилл с ThT лаг-период для указанного пептида глюкагона составляет более 20 часов.
206. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе образования фибрилл с ThT лаг-период для указанного пептида глюкагона составляет более 45 часов.
207. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе химической стабильности деградация указанного пептида глюкагона составляет менее 14%.
208. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе химической стабильности деградация указанного пептида глюкагона составляет менее 13%.
209. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе химической стабильности деградация указанного пептида глюкагона составляет менее 12%.
210. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе химической стабильности деградация указанного пептида глюкагона составляет менее 10%.
211. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе химической стабильности деградация указанного пептида глюкагона составляет менее 9%.
212. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе химической стабильности деградация указанного пептида глюкагона составляет менее 7%.
213. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе химической стабильности деградация указанного пептида глюкагона составляет менее 5%.
214. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где в анализе химической стабильности деградация указанного пептида глюкагона составляет менее 3%.
215. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где селективность указанного пептида глюкагона в 30 раз выше по отношению к рецептору глюкагона, чем к рецептору GLP-1.
216. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где селективность указанного пептида глюкагона в 50 раз выше по отношению к рецептору глюкагона, чем к рецептору GLP-1.
217. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где селективность указанного пептида глюкагона в 100 раз выше по отношению к рецептору глюкагона, чем к рецептору GLP-1.
218. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где селективность указанного пептида глюкагона в 250 раз выше по отношению к рецептору глюкагона, чем к рецептору GLP-1.
219. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где селективность указанного пептида глюкагона в 500 раз выше по отношению к рецептору глюкагона, чем к рецептору GLP-1.
220. Пептид глюкагона в соответствии с любым из предыдущих вариантов воплощения, где селективность указанного пептида глюкагона в 1000 раз выше по отношению к рецептору глюкагона, чем к рецептору GLP-1.
50
50
Селективность к рецептору GLP-1 в сравнении с селективностью к рецептору глюкагона можно измерить как отношение между значениями ЕС или значениями IC для двух рецепторов. Для измерения активности рецепторов глюкагона и GLP-1 можно использовать анализ (I) и (III), соответственно.
В случае введения пептида глюкагона настоящего изобретения, необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями или веществами, как раскрыто выше, для целей, связанных с лечением и предупреждением ожирения или избыточного веса, т.е. связанных со снижением избытка жировой ткани или предупреждением появления избытка жировой ткани, вероятно, предпочтительно применять такое введение в комбинации с хирургическим вмешательством для достижения снижения массы или предупреждения повторного набора массы, например, в комбинации с бариатрическим хирургическим вмешательством. Примеры часто используемых методик бариатрического хирургического вмешательства включают, но ограничиваются следующими методиками: вертикальная ленточная гастропластика (также известная как "ушивание желудка"), при которой часть желудка сшивается, чтобы получить желудочный карман меньшего объема, служащий в качестве нового желудка; бандажирование желудка, например, с использованием регулируемой системы желудочного бандажа (например, Swedish Adjustable Gastric Band (SAGB), LAP-BAND™ или MIDband™), при котором желудочный карман меньшего объема, служащий в качестве нового желудка, получают с использованием эластомерного (например, силиконового) бандажа, который может быть отрегулирован по размеру для пациента; и операция желудочного шунтирования, например, "Roux-en-Y" шунтирование, в котором небольшой желудочный карман получают с использованием сшивающего устройства, таким образом, что он оказывается связан с дистальным тонким кишечником, где верхнюю часть тонкого кишечника заново присоединяют в Y-видной конфигурации.
Вводить пептид глюкагона настоящего изобретения (необязательно в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтически активными соединениями или веществами, как раскрыто выше) можно перед проведением соответствующего бариатрического хирургического вмешательства и/или после него. Во многих случаях может быть предпочтительным начать введение соединения настоящего изобретения после проведения бариатрического хирургического вмешательства.
Термин "ожирение" предполагает избыток жировой ткани. Когда потребление энергии превышает расход энергии, избыток калорий запасается в жировой ткани, и если этот баланс длительное время является положительным, возникает ожирение, т.е., существуют две составляющие, уравновешивающие друг друга, и нарушения с обеих сторон (потребление или расход) могут привести к ожирению. В этом контексте ожирение лучше всего рассматривать как любую степень избытка жировой ткани, которая представляет риск для здоровья. Различие между нормальными индивидуумами и страдающими ожирением индивидуумами можно определить только примерно, но риск здоровью, вызванный ожирением, вероятно, постоянно присутствует с увеличением жировой ткани. Тем не менее, в контексте настоящего изобретения индивидуумов с индексом массы тела (ИМТ = масса тела в килограммах, деленная на квадрат роста в метрах) более 25 следует рассматривать, как страдающих ожирением.
Используемые в данном контексте аббревиатуры аминокислот имеют следующие значения:
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением можно вводить пациентам, нуждающимся в таком лечении, несколькими способами введения, такими как лингвальный, сублингвальный, буккальный, через рот, пероральный, в желудок и кишечник, назальный, ингаляционный, например, через бронхиолы и альвеолы, или комбинируя эти два способа, эпидермальный, дермальный, трансдермальный, вагинальный, ректальный, глазной, например, через конъюктиву, уретеральный и парентеральный.
Фармацевтические композиции можно вводить нуждающемуся в таком лечении пациенту в разные участки тела, например, местно, например, в кожу и слизистые, минуя стадию абсорбции, например, введение в артерию, в вену, в сердце, и в участки, в которых происходит абсорбция, например, введение в кожу, под кожу, в мышцы или в живот.
Фармацевтическая композиция может включать пептид глюкагона в концентрации от [0,01] мг/мл до [50] мг/мл. Композиция может также включать буферную систему, консервант (консерванты), агент (агенты), регулирующий (регулирующиее) тоничность, хелатирующий агент (агенты), стабилизаторы и ПАВ. В одном из вариантов воплощения настоящего изобретения фармацевтическая композиция представляет собой водную композицию, т.е. композицию, включающую воду. Такая композиция обычно представляет собой раствор или суспензию. В следующем варианте воплощения настоящего изобретения фармацевтическая композиция представляет собой водный раствор. Термин "водная композиция" определяется как композиция, включающая, по меньшей мере, 50% вес/вес воды. Кроме того, термин "водный раствор" определяется как раствор, включающий, по меньшей мере, 50% вес/вес воды, и термин "водная суспензия" определяется как суспензия, включающая, по меньшей мере, 50% вес/вес воды.
В другом варианте воплощения фармацевтическая композиция представляет собой сухую композицию (например, лиофилизированную или высушенную распылением), готовую для применения без предварительного растворения.
Буфер может быть выбран из группы, состоящей из ацетата, карбоната, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, фосфата, кислого фосфата и трис(гидроксимети)-аминометана (TRIS), бицина, трицина, сукцината, аспарагиновой кислоты, аспарагина или их смеси.
th
В следующем варианте воплощения настоящего изобретения композиция включает фармацевтически приемлемый консервант. В следующем варианте воплощения настоящего изобретения консервант выбирают из группы, состоящей из фенола, м-крезола, метил-п-гидроксибензоата, пропил-п-гидроксибензоата, 2-феноксиэтанола, бензилового спирта, хлорбутанола, хлоркрезола, бензетония хлорида или их смеси. Применение консерванта в фармацевтической композиции хорошо известно специалистам в данной области техники. Для удобства может быть дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
th
В следующем варианте воплощения настоящего изобретения композиция включает изотонический агент. Изотонический агент может быть выбран из группы, состоящей из соли (например, хлорид натрия), сахара, такого как моно-, ди- или полисахариды, или водорастворимые глюканы, в том числе, например, фруктозы, глюкозы, маннозы, лактозы, сахарозы, трегалозы, декстрана, или сахароспиртов, а также аминокислот (например, L-глицин, L-гистидин, аргинин, лизин, изолейцин, аспарагиновая кислота, триптофан, треонин), альдитов (например, глицерол (глицерин), 1,2-пропандиол (пропиленгликоль), 1,3-пропандиол, 1,3-бутандиол), полиэтиленгликоля (например, PEG400), или их смеси. Сахароспирты включают, например, маннит, сорбит, инозит, галактит, дульцит, ксилит и арабит. Применение изотонического агента в фармацевтических композициях хорошо известно специалисту в данной области техники. Для удобства может быть дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
В следующем варианте воплощения настоящего изобретения композиция включает хелатирующий агент. В следующем варианте воплощения настоящего изобретения хелатирующий агент выбирают из солей этилендиаминотетрауксусной кислоты (ЭДТА), лимонной кислоты и аспарагиновой кислоты, EGTA и их смеси.
th
В следующем варианте воплощения настоящего изобретения композиция включает стабилизатор. Применение стабилизатора в фармацевтических композициях хорошо известно специалисту в данной области техники. Для удобства может быть дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут также включать некоторое количество аминокислотного основания, достаточное для уменьшения агрегации полипептидов или белков в процессе хранения композиции. "Аминокислотное основание" предполагает аминокислоту или комбинацию аминокислот, где любая данная аминокислота присутствует либо в форме свободного основания, либо в форме его соли. Такими аминокислотами могут быть аргинин, лизин, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, аминогуанидин, орнитин и N-моноэтил L-аргинин, этионин и бутионин, и S-метил-L-цистеин.
В следующем варианте воплощения настоящего изобретения для ингибирования окисления остатков метионина до метионинсульфоксида, когда полипептид, действующий в качестве терапевтического агента, представляет собой полипептид, включающий, по меньшей мере, один остаток метионина, подверженный такому окислению, в композицию может быть добавлен метионин (или другие серосодержащие аминокислоты или аналоги аминокислот). "Ингибирование" предполагает минимальное накопление окисленного метионина с течением времени. Ингибирование окисления метионина приводит к тому, что полипептид в большей степени сохраняет свою надлежащую молекулярную форму. Можно использовать любой стереоизомер метионина (L или D) или их комбинацию. Добавляемое количество должно представлять собой количество, достаточное для ингибирования окисления остатков метионина, такое, чтобы количество метионинсульфоксида соответствовало требованиям регулирующих ведомств. Как правило, это означает, что композиция содержит не более чем от примерно 10% до примерно 30% метионинсульфоксида. Обычно, этого можно добиться путем добавления метионина, таким образом, чтобы соотношение добавленного метионина к остаткам метионина находилось в диапазоне от примерно 1:1 до примерно 1000:1, например, от 10:1 до примерно 100:1.
В следующем варианте воплощения настоящего изобретения композиция также включает стабилизатор, выбранный из группы высокомолекулярных полимеров или низкомолекулярных соединений. В следующем варианте воплощения настоящего изобретения стабилизатор выбирают из полиэтиленгликоля (например, PEG 3350), поливинилового спирта (PVA), поливинилпирролидона, карбокси-/гидроксицеллюлозы или ее производных (например, НРС, HPC-SL, HPC-L и НРМС), циклодекстринов, серосодержащих веществ, таких как монотиоглицерин, тиогликолевая кислота и 2-метилтиоэтанол, и различных солей (например, хлорид натрия).
th
В следующем варианте воплощения настоящего изобретения композиция также включает поверхностно-активное вещество (ПАВ). Стандартными ПАВ (в квадратных скобках [] приведены примеры торговых названий) являются сложные эфиры полиоксиэтилен сорбитана и жирных кислот, такие как полиоксиэтилен (20) сорбитан монолаурат [Tween 20], полиоксиэтилен (20) сорбитан монопальмитат [Tween 40] или полиоксиэтилен (20) сорбитан моноолеат [Tween 80], полоксамеры, такие как полиоксипропилен-полиоксиэтилен блок-сополимер [Pluronic F68/poloxamer 188], полиэтиенгликоль октилфениловый эфир [Triton Х-100] или полиоксиэтиленгликоль додециловый эфир [Brij 35]. Применение ПАВ в фармацевтических композициях хорошо известно специалистам в данной области техники. Для удобства дана ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
В следующем варианте воплощения настоящего изобретения композиция также включает ингибиторы протеаз, такие как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и бензамидин HCl, но также можно использовать другие коммерчески доступные ингибиторы протеаз. Применение ингибиторов протеаз особенно выгодно в фармацевтических композициях, включающих зимогены протеаз или активированный фермент, такой как FVIIa, для того, чтобы ингибировать автокатализ.
Возможно, что другие ингредиенты могут присутствовать в фармацевтической композиции пептида настоящего изобретения. Такие дополнительные ингредиенты могут включать увлажняющие агенты, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, модификаторы тоничности, хелатирующие агенты, ионы металлов, масляные носители, белки (например, сывороточный альбумин человека, желатин или белки) и цвиттерионы (например, аминокислоты, такие как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин).
Композиции настоящего изобретения могут также быть смешаны с носителем лекарственного средства, системой доставки лекарственного средства и усовершенствованной системой доставки лекарственного средства или присоединены, например, за счет ковалентных, гидрофобных и электростатических взаимодействий, к носителю лекарственного средства, системе доставки лекарственного средства и усовершенствованной системе доставки лекарственного средства для дальнейшего повышения стабильности соединения, повышения биодоступности, увеличения растворимости, уменьшения побочных эффектов, осуществления хронотерапии, хорошо известной специалистам в данной области техники, и облегчения соблюдения режима и схемы лечения для пациента, или любой их комбинации. Примеры носителей, систем доставки лекарственного средства и усовершенствованных систем доставки лекарственного средства включают, но не ограничиваются ими, полимеры, например, целлюлоза и производные, полисахариды, например, декстран и его производные, крахмал и его производные, поли(виниловый спирт), акрилатные и метакрилатные полимеры, полимолочную и полигликолиевую кислоту и их блок со-полимеры, полиэтиленгликоли, белки-носители, например, альбумин, гели, например, термогелевые системы, например, системы блок сополимеров, хорошо известные специалистам в данной области техники, мицеллы, липосомы, микрочастицы, наночастицы, жидкие кристаллы и их дисперсии, фазу L2 и ее дисперсии, хорошо известные специалистам в области фазовой проницаемости в системах липид-вода, полимерные мицеллы, множественные эмульсии, самоэмульгирующиеся, самопроизвольно образующие эмульсию вещества, циклодекстрины и их производные, и дендримеры.
Парентеральное введение можно осуществить путем подкожной, внутримышечной, внутрибрюшинной или внутривенной инъекции с помощью шприца, необязательно шприца-ручки. Альтернативно, парентеральное введение можно осуществить с помощью инфузионного насоса. Еще одним вариантом является композиция, которая может представлять собой раствор или суспензию для введения пептида глюкагона в форме назального или ингаляционного спрея. В качестве еще одного варианта, фармацевтические композиции, содержащие пептид глюкагона настоящего изобретения, также могут быть адаптированы для трансдермального введения, например, путем безыгольной инъекции или с помощью пластыря, необязательно ионтофоретического пластыря, или для трансмукозального, например, буккального введения.
Фармацевтические композиции для перорального применения терапевтических белков и полипептидов могут включать инкапсулированное в наночастицы и микрочастицы активное соединение, а также другие виды лекарственных форм, состоящих из множества частиц. Еще одним вариантом является применение усилителей проникновения, таких как поверхностно-активные соединения, проникающие в клетку пептиды, мукоадгезивные системы доставки лекарственных средств, хелатирующие агенты и другие. Еще одним вариантом может быть добавление ингибиторов протеаз. Другим вариантом является применение систем доставки лекарственных средств на основе липидов, таких как SEDDS, SMEDDS SNEDDS (самоэмульгирующиеся, самопроизвольно образующие микроэмульсии или самопроизвольно образующие наноэмульсии системы доставки лекарственных средств). Вышеуказанные системы доставки лекарств могут быть составлены в таблетки или быть покрыты подходящей твердой или мягкой капсулой, которая сама может иметь покрытие для высвобождения активного соединения в управляемом режиме или в предпочтительном сегменте кишечника.
Настоящее изобретение также предусматривает следующие варианты воплощения.
221. Пептид глюкагона, включающий:
24
3
15
16
- SEQ ID 1, где X представляет собой Lys, и где присутствует, по меньшей мере, одна из следующих замен: X представляет собой His, X представляет собой Glu и/или X представляет собой Ala, lle, Phe, Arg, Thr, Val, Leu, Glu, Trp или Tyr, и присутствуют вплоть до шести аминокислотных замен в указанном пептиде глюкагона, и
- заместитель, включающий три и более отрицательно заряженных фрагмента, где один из указанных отрицательно заряженных фрагментов находится дистальнее липофильного фрагмента и где заместитель присоединен по азоту боковой цепи Lys в положении 24,
или его фармацевтически приемлемая соль, амид, кислота или пролекарство.
222. Пептид глюкагона в соответствии с вариантом воплощения 221, где указанные аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих положений указанного пептида глюкагона:
12
X представляет собой Arg
17
X представляет собой Lys
20
X представляет собой Lys
21
X представляет собой Glu
27
X представляет собой Leu
28
X представляет собой Ser, lle или Thr
223. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 221-222, где указанный заместитель соответствует формуле II:
,
где
1
Z представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IIa, IIb или IIc;
где n в формуле IIa представляет собой 6-20,
m в формуле IIc представляет собой 5-11
COOH группа в формуле IIc может быть присоединена к положениям 2, 3 или 4 фенильного цикла,
2
символ * в формуле IIa, IIb и IIc представляет собой точку присоединения к азоту в Z;
2
1
3
2
3
1
4
если Z отсутствует, Z присоединен к азоту Z в точке, обозначенной символом *, и если Z и Z отсутствуют, Z присоединен к азоту Z в точке, обозначенной символом *
2
Z отсутствует или представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IId, IIe, IIf, IIg, IIh, IIi, IIj или IIk;
где каждый аминокислотный фрагмент независимо имеет стереохимическую конфигурацию L или D;
2
3
где Z через атом углерода, обозначенный *, связан с атомом азота Z, обозначенным *;
3
2
4
3
4
2
если Z отсутствует, Z через атом углерода, обозначенный *, связан с атомом азота Z, обозначенным *, и если Z и Z отсутствуют, Z, через атом углерода, обозначенный *, связан с эпсилон азотом лизина или дельта азотом орнитина пептида глюкагона.
3
Z отсутствует или представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IIm, IIn, IIo или IIp;
3
3
4
4
3
Z через атом углерода Z, обозначенный *, связан с атомом азота Z, обозначенным символом *, если Z отсутствует, Z через атом углерода, обозначенный *, связан с эпсилон азотом лизина или дельта азотом орнитина пептида глюкагона
4
4
Z отсутствует или представляет собой структуру, соответствующую одной из формул IId, IIe, IIf, IIg, IIh, IIi, IIj или IIk; где каждый аминокислотный фрагмент независимо имеет стереохимическую конфигурацию либо L, либо D, где Z через атом углерода, обозначенный символом *, связан с эпсилон азотом лизина или дельта азотом орнитина пептида глюкагона.
224. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 221-223, где указанный заместитель представляет собой структуру, соответствующую формулам IIIa, IIIb, IIIc, IIId, IIIe, IIIf, IIIg, IIIh, IIIi, IIIj, IIIk, IIIl, IIIm, IIIn, IIIo, IIIp, IIIq или IIIr:
225. Пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 221-224, выбранный из группы, состоящей из: Chem.1, Chem.2, Chem.3, Chem.4, Chem.5, Chem.6, Chem.7, Chem.8, Chem.9, Chem.10, Chem.11, Chem.12, Chem.13, Chem.14, Chem.15, Chem.16, Chem.17, Chem.18, Chem.19, Chem.20, Chem.21, Chem.22, Chem.23, Chem.24, Chem.25, Chem.26, Chem.27, Chem.28 и Chem.29.
226. Фармацевтическая композиция, включающая пептид глюкагона в соответствии с любым из вариантов воплощения 221-225.
227. Фармацевтическая композиция в соответствии с вариантом воплощения 226, также включающая одно или несколько дополнительных активных соединений или веществ.
228. Фармацевтическая композиция в соответствии с одним из вариантов воплощения 226-227, также включающая соединение GLP-1.
229. Фармацевтическая композиция в соответствии с одним из вариантов воплощения 226-228, также включающая инсулиновое соединение.
230. Фармацевтическая композиция в соответствии с одним из вариантов воплощения 226-229, подходящая для парентерального введения.
231. Пептид глюкагона в соответствии с одним из вариантов воплощения 221-225 для применения в терапии.
232. Применение пептида глюкагона в соответствии с одним из вариантов воплощения 221-225 для получения лекарственного средства.
233. Применение пептида глюкагона в соответствии с одним из вариантов воплощения 221-225 для получения лекарственного средства для лечения и предотвращения гипергликемии, диабета 2 типа, нарушения толерантности к глюкозе, диабета 1 типа и ожирения.
234. Применение пептида глюкагона в соответствии с одним из вариантов воплощения 221-225 для получения лекарственного средства для замедления или предотвращения прогрессирования заболевания в диабет 2 типа, лечения ожирения или предупреждения избыточной массы тела, для снижения потребления пищи, увеличения расхода энергии, снижения массы тела, замедления прогрессирования нарушения толерантности к глюкозе (IGT) в диабет 2 типа; замедления прогрессирования диабета 2 типа в инсулинозависимый диабет; регулирования аппетита; стимулирования насыщения; предотвращения набора массы тела при успешной потере массы; лечения заболевания или состояния, связанного с избыточной массой или ожирением; лечения булимии; лечения компульсивного переедания; лечения атеросклероза, гипертензии, диабета 2 типа, IGT, дислипидемии, ишемической болезни сердца, стеатоза печени, лечения отравления бета-блокаторами, применения для ингибирования моторики желудочно-кишечного тракта в связи с исследованиями желудочно-кишечного тракта с помощью таких методик, как рентгеновское, КТ- и ЯМР-сканирование.
235. Применение пептида глюкагона в соответствии с одним из вариантов воплощения 221-225 для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения гипогликемии, индуцированной инсулином гипогликемии, реактивной гипогликемии, диабетической гипогликемии, недиабетической гипогликемии, гипогликемии натощак, лекарственной гипогликемии, гипокгликемии, вызванной шунтированием желудка, гипогликемии при беременности, алкогольной гипогликемии, инсулиномы и болезни фон Гирке.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Список сокращений
ВОС:
трет-бутилоксикарбонил
DCM:
Дихлорметан
DIC:
Диизопропилкарбодиимид
Fmoc:
9-флуоренилметилоксикарбонил
HOAt:
1-гидрокси-7-азабензотриазол
HPLC:
Высокоэффективная жидкостная хроматография
LCMS:
Жидкостная хроматография Масс-спектрометрия
MeCN:
Ацетонитрил
Mtt:
4-метилтритил
NMP:
N-метилпирролидон
Oxyma Pure:
Этиловый эфир циано-гидроксиимино-уксусной кислоты
RP:
Обращенно-фазная
RP-HPLC:
Обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография
RT:
Комнатная температура
Rt:
Время удерживания
SPPS:
Твердофазный пептидный синтез
TFA:
Трифторуксусная кислота
TIPS:
Триизопропилсилан
UPLC:
Сверхпроизводительная жидкостная хроматография
Основные способы
Этот раздел относится к способам синтеза связанного со смолой пептида (способы SPPS, в том числе способы деблокирования аминокислот, способы отщепления пептида от смолы и его очистки), а также к способам обнаружения и изучения свойств полученного пептида (методы LCMS и UPLC).
Основные способы SPPS
Использовали стандартные рекомендованные Fmoc-защищенные производные аминокислот: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-lle-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Lys(BOC)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Trp(BOC)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH и Fmoc-Lys(Mtt)-OH, полученные, например, от Anaspec, Bachem, Iris Biotech или NovabioChem.
SPPS проводили, используя химические методики на основе Fmoc, с помощью твердофазного пептидного синтезатора Prelude от Protein Technologies (Tucson, AZ 85714 U.S.A.). Смолой, подходящей для получения С-концевых карбоновых кислот, является предварительно нагруженная смола с низкой нагрузкой Wang, доступная от NovabioChem (например, смола с низкой нагрузкой fmoc-Thr(tBu)-Wang, LL, 0,27 ммоль/г). N-концевую альфа аминогруппу защищали с помощью Boc.
Fmoc-деблокирование проводили 20% пиперидином в NMP в течение 2×3 мин. Для присоединения аминоксилот использовали либо DIC/HOAt/коллидин, либо DIC/Oxyma Pure/коллидин. К смоле добавляли растворы аминокислота/HOAt или аминокислота/Oxyma Pure (0,3 М/0,3 М в NMP в молярном избытке 3-10 раз), далее добавляли эквивалентное в молярном отношении количество DIC (3 М в NMP) с последующим добавлением коллидина (3 М в NMP). Например, для присоединения использовали следующие количества 0,3 М раствора аминокислота/HOAt для следующих реакций: количество/мл, 0,05 ммоль/1,5 мл, 0,10 ммоль/3,0 мл, 0,25 ммоль/7,5 мл. Время присоединения составляло либо 2×30 мин, либо 1×240 мин.
Mtt группу удаляли, промывая смолу HFIP/DCM (75:25) (2×2 мин), промывая DCM, и суспендируя смолу в HFIP/DCM (75:25)(2×20 мин), последовательно промывая по порядку пиперидином/NMP (20:80), DCM(1x), NMP(1x), DCM(1x), NMP(1x). Введение заместителя по ε-азоту лизина осуществляли, используя лизин, защищенный Mtt (Fmoc-Lys(Mtt)-OH). Аналогичным образом, если присутствовала боковая цепь в боковой цепи орнитина, дельта аминогруппу орнитина, которую нужно было ацетилировать, защищали Mtt (например, Fmoc-Orn(Mtt)-OH). Также ε-азот лизина можно было защищать ivDde группой (Fmoc-Lys(ivDde)-OH). Дельта аминогруппа орнитина могла быть защищена ivDde группой аналогичным образом (Fmoc-Orn(ivDde)-ОН). Введение гамма-Glu фрагментов в боковую цепь осуществляли присоединением аминокислоты Fmoc-Glu-OtBu.
Введение каждого фрагмента в боковую цепь осуществляли, используя пролонгированное время присоединения (1×6 часов) с последующим блокированием уксусным ангидридом или алтернативно уксусной кислотой/DIC/HOAt/коллидином. Ацетилирование концевого азота заместителя осуществляли, используя уксусный ангидрид (10 экв.) и коллидин (20 экв.) в NMP.
Присоединение заместителей
Связывающий альбумин фрагмент можно ввести в соответствии с пошаговой методикой с помощью пептидного синтезатора Prelude, как описано выше, используя надлежащим образом защищенные строительные блоки, с той модификацией, что производные аминокислот и производные жирных кислот, в том числе Fmoc-Ado-OH, Fmoc-Glu-OtBu и моно-трет-бутиловый эфир октадекандиовой кислоты (или аналоги моно-трет-бутиловых эфиров C8, C10, C12-, C14- C16-, C20- дикислот), присоединяли в течение 6 часов на каждом шаге. После каждого шага присоединения непрореагировавший пептидный интермедиат блокировали, используя ангидрид уксусной кислоты и коллидин в избытке (>10 экв.). Соединения, содержащие 4-[16-(1Н-тетразол-5-ил)гексадеканоилсульфамоил]бутаноиловый фрагмент, получали аналогичным способом, используя в качестве строительного блока 4-(N-(16-(тетразол-5-ил)гексадеканоил)сульфамоилбутановую кислоту (доступна по методу синтеза, описанному в WO 2007/009894).
Отщепление от смолы
После синтеза смолу промывали DCM и отщепляли пептид от смолы путем 2-3-часовой обработки смесью TFA/TIS/вода (95/2,5/2,5) с последующим осаждением диэтиловым эфиром. Осадок промывали диэтиловым эфиром.
Очистка и количественный анализ
Неочищенный пептид растворяли в подходящей смеси воды и MeCN, например, вода/MeCN (4:1) и очищали с помощью обращенно-фазной препаративной HPLC (Waters Deltaprep 4000 или Gilson) на колонке, содержащей C18-силика гель. Элюцию проводили увеличивающимся градиентом MeCN в воде, содержащей 0,1% TFA. Соответствующие фракции проверяли с помощью аналитической HPLC или UPLC. Фракции, содержащие чистый целевой пептид, объединяли и концентрировали при пониженном давлении. Полученный раствор анализировали (HPLC, LCMS) и количественно определяли продукт с использованием хемилюминесцентного специфичного к азоту детектора HPLC (Antek 8060 HPLC-CLND) или путем измерения поглощения УФ при 280 нм. Продукт помещали в стеклянные флаконы. Флаконы закрывали предфильтрами из стекловолокна Millipore. В результате лиофилизации образуется трифторацетат пептида в виде белого твердого вещества.
Методы детекции и измерения параметров
Методы LCMS
Метод: LCMS_2
Для определения массы образца после элюции из системы HPLC Perkin Elmer Series 200 использовали масс-спектрометр Perkin Elmer Sciex API 3000. Элюенты: A: 0,05% трифторуксусная кислота в воде; B: 0,05% трифторуксусная кислота в ацетонитриле. Колонка: Waters Xterra MS C-18 X 3 мм, id 5 мкм. Градиент: 5% - 90% B в течение 7,5 мин при 1,5 мл/мин.
Метод: LCMS_4
LCMS_4 проводили на установке, состоящей из системы UPLC Waters Acquity и масс-спектрометра LCT Premier ХЕ от Micromass. Элюенты: A: 0,1% муравьиная кислота в воде, B: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле. Анализ проводили при RT, нанося необходимый объем образца (предпочтительно 2-10 мкл) на колонку, который элюировали градиентом A и B. Условия проведения UPLC, настройки детектора и настройки масс-спектрометра были следующими: колонка: Waters Acquity UPLC ВЕН, C-18, 1,7 мкм, 2,1 мм × 50 мм. Градиент: линейный 5% - 95% ацетонитрила в течение 4,0 мин (альтернативно 8,0 мин) при 0,4 мл/мин. Детекция: 214 нм (аналоговый сигнал от TUV (настраиваемый УФ детектор)) Способ ионизации для MS: API-ES
Сканирование: 100-2000 а.е.м (альтернативно 500-2000 а.е.м), шаг 0,1 а.е.м.
Метод: LCMS_13
LCMS_13 проводили с помощью системы Waters Acquity UPLC SQD 2000, состоящей из системы UPLC с УФ детектором PDA и одним квадрупольным анализатором массы с ионизацией электрораспылением. Элюенты: A: 0,1% трифторуксусная кислота в воде; B: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле. Колонка: Waters Acquity UPLC ВЕН C18, 100Å, 1,7 мкм, 2,1 мм × 100 мм. Градиент: линейный 10% - 90% B в течение 3 мин, поток 0,3 мл/мин, общее время анализа 4 мин. Диапазон сканирования MS: 500-2000 а.е.м.
Метод: LCMS_AP
Для определения массы образца после элюции из системы HPLC, состоящей из двойной системы Gradient Modul Waters 2525, коллектора фракций Waters 2767, фотодиодного матричного детектора Waters 2996 и детектора ELS Waters 2420, использовали масс-спектрометр Micromass Quatro micro API. Элюенты: A: 0,1% трифторуксусная кислота в воде; B: 0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле. Колонка: Phenomenex Synergi MAXRP, 4 мкм, 75 × 4,6 мм. Градиент: 5% - 95% B в течение 7 мин при 1,0 мл/мин.
Методы UPLC
Метод 04_A3_1
UPLC (метод 04_A3_1): RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C.
Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими:
2
3
A: 90% HO, 10% CHCN, 0,25 М бикарбонат аммония
3
2
B: 70% CHCN, 30% HO
Использовали следующий линейный градиент: от 75% A, 25% B до 45% A, 55% B в течение 16 минут при скорости потока 0,35 мл/мин.
Метод 04_A4_1
UPLC (метод 04_A4_1): RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C.
Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими:
2
3
A: 90% HO, 10% CHCN, 0,25 М бикарбонат аммония
3
2
B: 70% CHCN, 30% HO
Использовали следующий линейный градиент: от 65% A, 35% B до 25% A, 65% B в течение 16 минут при скорости потока 0,35 мл/мин.
Метод: 04_A2_1
2
3
3
2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 90% HO, 10% CHCN, 0,25 М бикарбонат аммония; B: 70% CHCN, 30% HO. Использовали следующий линейный градиент: от 90% A, 10% B до 60% A, 40% B в течение 16 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: 04_A6_1
2
3
2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130 Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 10 мМ Tris, 15 мМ сульфат аммония, 80% HO, 20%, pH 7,3; B: 80% CHCN, 20% HO. Использовали следующий линейный градиент: от 95% A, 5% B до 10% A, 90% B в течение 16 минут при скорости потока 0,35 мл/мин.
Метод: 04_A7_1
2
3
2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 10 мМ Tris, 15 мМ сульфат аммония, 80% HO, 20%, pH 7,3; B: 80% CHCN, 20% HO. Использовали следующий линейный градиент: от 95% A, 5% B до 40% A, 60% B в течение 16 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: 04_A9_1
2
4
2
4
2
4
2
3
3
2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН Shield RP18, C18, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 60°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 200 мМ NaSO+ 20 мМ NaHPO + 20 мМ NaHPO в 90% НО/10% CHCN, pH 7,2; B: 70% CHCN, 30% HO. Использовали следующий ступенчатый градиент: от 90% A, 10% B до 80% A, 20% B в течение 3 минут, от 80% A, 20% B до 50% A, 50% B в течение 17 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод 05_B5_1
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130 Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C.
Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими:
2
4
3
4
3
A: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (pH 3,5)
3
2
B: 70% CHCN, 30% HO
Использовали следующий линейный градиент: от 60% A, 40% B до 30% A, 70% B в течение 8 минут при скорости потока 0,35 мл/мин.
Метод: 05_B7_1
2
4
3
4
3
3
2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (pH 3,5); B: 70% CHCN, 30% HO. Использовали следующий линейный градиент: от 80% A, 20% B до 40% A, 60% B в течение 8 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: 05_B8_1
2
4
3
4
3
3
2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (pH 3,5); B: 70% CHCN, 30% HO. Использовали следующий линейный градиент: от 50% A, 50% B до 20% A, 80% B в течение 8 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: 05_B9_1
2
4
3
4
3
3
2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (pH 3,5); B: 70% CHCN, 30% HO. Использовали следующий линейный градиент: от 70% A, 30% B до 20% A, 80% B в течение 8 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: 05_B10_1
2
4
3
4
3
3
2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% CHCN (pH 3,5); B: 70% CHCN, 30% HO. Использовали следующий линейный градиент: от 40% A, 60% B до 20% A, 80% B в течение 8 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: 07_B4_1
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C.
2
3
Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 99,95% HO, 0,05% TFA; B: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Использовали следующий линейный градиент: от 95% A, 5% B до 5% A, 95% B в течение 16 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: 09_B2_1
2
3
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 99,95% HO, 0,05% TFA; B: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Использовали следующий линейный градиент: от 95% A, 5% B до 40% A, 60% B в течение 16 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: 09_B4_1
2
3
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 99,95% HO, 0,05% TFA; B: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Использовали следующий линейный градиент: от 95% A, 5% B до 5% A, 95% B в течение 16 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод 08_B2_1
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C.
Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими:
2
A: 99,95% HO, 0,05% TFA
3
B: 99,95% CHCN, 0,05% TFA
Использовали следующий линейный градиент: от 95% A, 5% B до 40% A, 60% B в течение 16 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод 08_B4_1
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 40°C.
Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими:
2
A: 99,95% HO, 0,05% TFA
3
B: 99,95% CHCN, 0,05% TFA
Использовали следующий линейный градиент: от 95% A, 5% B до 5% A, 95% B в течение 16 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод 10_B4_2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 50°C.
Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими:
2
A: 99,95% HO, 0,05% TFA
3
B: 99,95% CHCN, 0,05% TFA
Использовали следующий линейный градиент: от 95% A, 5% B до 5% A, 95% B в течение 12 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод 10_B5_2
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 50°C.
Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими:
A: 70% MeCN, 30% воды
2
4
3
4
B: 0,2 М NaSO, 0,04 М HPO, 10% MeCN, pH 2,25
Использовали следующий линейный градиент: от 40% A в течение 1 мин, 40 → 70% A в течение 7 мин при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: 10_B14_1
2
3
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC BEHS hieldRP18, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 50°C. Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 99,95% HO, 0,05% TFA; B: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Использовали следующий линейный градиент: от 70% A, 30% B до 40% A, 60% B в течение 12 минут при скорости потока 0,40 мл/мин.
Метод: АР_B4_1
RP-анализ проводили с помощью системы UPLC Waters, оборудованной двухполосным детектором. Измерения УФ проводили при 214 нм и 254 нм, фракции собирали с помощью ACQUITY UPLC ВЕН130, C18, 130Å, 1,7 мкм, колонка 2,1 мм × 150 мм, 30°C.
2
3
Система UPLC была соединена с двумя емкостями с элюентом, содержащими: A: 99,95% HO, 0,05% TFA; B: 99,95% CHCN, 0,05% TFA. Использовали следующий линейный градиент: от 95% A, 5% B до 5% A, 95% B в течение 16 минут при скорости потока 0,30 мл/мин.
Пример 1
ε24
15
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.1:
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 12,84 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,61 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 3,7 мин, m/3 = 1427; m/4 = 1071; m/5 = 857
Пример 2
ε24
3
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[His,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.2:
Метод UPLC: 05_В9_1: Rt = 8,4
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,8 мин, m/4 = 1106
Пример 3
ε24
3
20
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[His,Lys,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.3:
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: RT = 2,8 мин, m/3 = 1474; m/4 = 1106; m/5 = 885
Пример 4
ε24
3
16
20
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[His,Glu,Lys,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.4:
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 12,0 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,0 мин
Метод LCMS: LSMS_4: RT = 2,8 мин, m/3 = 1488; m/4 = 1117; m/5 = 893
Пример 5
ε24
3
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[His,Lys,Leu]-глюкагон
Chem.5:
Метод UPLC: 09_В4 Rt = 8,29 мин
Метод UPLC: Rt = 7.66 мин
Метод LCMS: LCMS_4 Rt = 2,85; m/Z = 4452; Μ/3: 1483, Μ/4: 1113
Пример 6
ε24
3
17
21
24
27
28
Ν-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[His,Lys,Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.6:
Метод UPLC: 04_А9_1; Rt = 12,2 мин
Метод UPLC: 09_В4_1; Rt = 8,2 мин
Метод LCMS: LCMS_4; RT = 2,1 мин; m/3 = 1421; m/4 = 1066; m/5 = 853
Пример 7
ε24
16
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Val,Lys,Leu]-глюкагон
Chem.7:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 12,9 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1485; m/4 = 1114; m/5 = 891
Пример 8
ε24
16
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[lle,Lys,Leu]-глюкагон
Chem.8:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 13,2 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,7 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt 13,6 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1489; m/4 = 1117; m/5 = 894
Пример 9
ε24
3
15
16
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[His,Glu,Thr,Lys,Leu]-глюкагон
Chem.9:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 12,4 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,2 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 12,7 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1493; m/4 = 1120; m/5 = 896
Пример 10
ε24
12
16
24
27
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Thr,Lys,Ler]-глюкагон
Chem.PAGE81:
Метод UPLC: 09_B2_1: Rt = 12,6 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,3 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 13,4 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1495, m/4 = 1121; m/5 = 897
Пример 11
ε24
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[lle,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.11
:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 15,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1480; m/4 = 1110; m/5 = 889
Пример 12
ε24
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Thr,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.12:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 12,7 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,4 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 12,9 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
Пример 13
ε24
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.PAGE83:
Метод UPLC: 09_B2_1: Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 15,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1480; m/4 = 1110; m/5 = 889
Пример 14
ε24
12
15
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.14:
Метод UPLC: 09_B4_1: Rt = 8,4 мин
Метод UPLC: 04_А6_1: Rt = 5,9 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 13,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1486; m/4 = 1115; m/5 = 892
Пример 15
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Leu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.15:
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,7 мин
Метод UPLC: 04_А6_1: Rt = 7,2 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 16,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1490; m/4 = 1117; m/5 = 894
Пример 16
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Ala,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.PAGE85:
Метод UPLC: 09_B2_1: Rt = 12,7 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,4 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 14,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
Пример 17
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Phe,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.17:
Метод UPLC: 09_B2_1: Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 15,9 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,5 мин, m/3 = 1501; m/4 = 1126; m/5 = 901
Пример 18
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Leu,Lys,Leu,lle]-глюкагон
Chem.18:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 13,0 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 15,4 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1499; m/4 = 1124; m/5 = 899
Пример 19
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Leu,Lys,Leu,Thr]-глюкагон
Chem.19:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 15,6 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,5 мин, m/3 = 1494; m/4 = 1121; m/5 = 897
Пример 20
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Arg,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.20:
Метод UPLC: 09_B4_1: Rt = 10,6 мин;
Метод UPLC: 04_А6_1: Rt = 5,9 мин;
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,1 мин; m/3 = 1504; m/4 = 1128; m/5 = 903
Пример 21
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Val,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.21:
Метод UPLC: 10_B4_1: Rt = 8,5 мин;
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 14,5 мин;
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,1 мин; m/3 = 1485; m/4 = 1114; m/5 = 891
Пример 22
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Thr,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.22:
Метод UPLC: 04_A9_1; Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 10_B4_1; Rt = 8,4 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,2; m/3 = 1485; m/4 = 1114; m/5 = 892
Пример 23
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,lle,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.23:
Метод UPLC: 10_В4_1: Rt = 8,6 мин;
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 15,2 мин;
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,1 мин; m/3 = 1490; m/4 = 1118; m/5 = 894
Пример 24
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(13-карбокситридеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Leu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.24:
Метод UPLC: 09_B2_1: Rt = 11,7 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 7,7 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 13,2 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1471; m/4 = 1103; m/5 = 883
Пример 25
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Leu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.25:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 12,4 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,2 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 14,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1481; m/4 = 1110; m/5 = 889
Пример 26
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(19-карбоксинонадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Leu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.26:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 14,0 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 9,2 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 16,6 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,5 мин, m/3 = 1499; m/4 = 1124; m/5 = 900
Пример 27
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Arh,Leu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.27:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 13,0 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 14,7 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1489; m/4 = 1117; m/5 = 894
Пример 28
ε24
12
16
24
27
28
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Arg,Leu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.28:
Метод UPLC: 09_В2_1: Rt = 13,0 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,5 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 14,7 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1489; m/4 = 1117; m/5 = 894
Пример 29
ε24
12
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg,Leu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.29:
Метод UPLC: 09_B2_1: Rt = 13,2 мин
Метод UPLC: 09_В4_1: Rt = 8,7 мин
Метод UPLC: 04_А9_1: Rt = 15,2
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,5 мин, m/3 = 1392; m/4 = 1045; m/5 = 836
Пример 30
ε24
16
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Val,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.30:
Метод UPLC: 10_В4_1; Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_А6_1; Rt = 7,3 мин
Метод LC-MS: LCMS_4; Rt = 2,3, m/3 = 1475; m/4 = 1107; m/5 = 886
Пример 31
ε24
16
21
24
27
28
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Thr,Glu,Lys,Leu,Ser]-глюкагон
Chem.31:
Метод UPLC: 10_В4_1; Rt = 8,4 мин
Метод UPLC: 04_А9_1; Rt = 13,3 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,2, m/3 = 1481; m/4 = 1111; m/5 = 889
Пример 32
ε24
15
24
27
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Glu,Lys,Leu,lle]-глюкагон
Chem.32:
Метод UPLC: 10_В4_1; Rt = 8,8 мин
Метод UPLC: 04_А9_1; Rt = 13,5 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,4, m/3 = 1446; m/4 = 1085; m/5 = 868
Пример 33
ε24
15
24
27
29
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Glu,Lys,Leu,Vаl]-глюкагон
Chem.33:
Метод UPLC: 10_В4_1; Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_А9_1; Rt = 12,9 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,4, m/3 = 1442; m/4 = 1081; m/5 = 865
Пример 34
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил[Glu15,Lys24,Leu27,Leu29]-глюкагон
Chem.34:
Метод UPLC: 10_В4_1; Rt = 8,9 мин
Метод UPLC: 04_А9_1; Rt = 13,8 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,5, m/3 = 1446; m/4 = 1085; m/5 = 868
Пример 35
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Thr16,Lys24,Leu27,lle29]-глюкагон
Chem.35:
Метод UPLC: 09_В4_1; Rt = 8,8 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; Rt = 2,4 мин, m/3 = 1446; m/4 = 1085; m/5 = 868
Пример 36
ε24
N[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Val29]-глюкагон
Chem.36:
Метод UPLC: 09_B4_1; Rt = 8,6 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; Rt = 2,3 мин; m/4 = 1085; m/5 = 868
Пример 37
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Leu29]-глюкагон
Chem.37:
Метод UPLC: 09_В4_1; Rt = 8,9 мин
Метод LS-MS:LCMS_2: Rt = 6,2 мин; m/3 = 1451, m/4 = 1088
Пример 38
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Val10,Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.38:
Метод UPLC: 06_В4_1: Rt = 8,4 мин
Метод LS-MS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1494.1; m/4 = 1120,5; m/5 = 896.8
Пример 39
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон амид
Chem.39:
Метод UPLC: 08_В2_1: Rt = 12,6 мин
Метод UPLC: 08_В4_1: Rt = 8,3 мин
Метод UPLC: 04_А3_1: Rt = 15,3 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
Пример 40
ε24
N-[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.40:
Метод UPLC: 08_В2_1: Rt = 12,6 мин
Метод UPLC: 08_В4_1: Rt = 8,3 мин
Метод UPLC: 04_А3_1: Rt = 12,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
Пример 41
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.41:
Метод UPLC: 08_В2_1: Rt = 12,6 мин
Метод UPLC: 08_В4_1: Rt = 8,3 мин
Метод UPLC: 04_А3_1: Rt = 11,4 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,1 мин, m/3 = 1485; m/4 = 1114; m/5 = 892
Пример 42
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Glu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.42:
Метод UPLC: 08_В2_1: Rt = 12,6 мин
Метод UPLC: 08_В4_1: Rt = 8,3 мин
Метод UPLC: 04_А3_1: Rt = 11,4 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1495; m/4 = 1121; m/5 = 897
Пример 43
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Als16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.43:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 12,6 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,4 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 13,2 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1466; m/4 = 1100; m/5 = 880
Пример 44
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Thr16,Lys24,Glu27,Ser28]-глюкагон
Chem.44:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 11,9 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 7,9 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 9,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,0 мин, m/3 = 1491; m/4 = 1118; m/5 = 895
Пример 45
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.45:
Метод UPLC: 09_B2_1: Rt = 14,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1532; m/4 = 1149; m/5 = 920
Пример 46
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.46:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,9 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 9,4 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 15,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1494; m/4 = 1121; m/5 = 897
Пример 47
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Glu27,Ser28]-глюкагон
Chem.47:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 12,9 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,8 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 10,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,1 мин, m/3 = 1495; m/4 = 1121; m/5 = 897
Пример 48
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Gln28]-глюкагон
Chem.48:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,6 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 9,2 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 14,9 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1503; m/4 = 1127; m/5 = 902
Пример 49
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-арбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.49:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,9 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 11,5 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,1 мин, m/3 = 1427; m/4 = 1070; m/5 = 857
Пример 50
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Val10,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.50:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,2 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 9,0 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 12,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1406; m/4 = 1054; m/5 = 844
Пример 51
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-арбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино] бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.51:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,2 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 9,0 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 12,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1436; m/4 = 1077; m/5 = 862
Пример 52
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.52:
Метод UPLC: 04_A9_1; Rt = 12,2 мин
Метод UPLC: 10_B4_1; Rt = 8,3 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,2, m/3 = 1490; m/4 = 1118; m/5 = 894
Пример 53
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,lle16,Glu21,Lys24,Glu27,Ser28]-глюкагон
Chem.53:
Метод UPLC: 04_A9_1; Rt = 11,0 мин
Метод UPLC: 10_B4_1; Rt = 8,0 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,2, m/3 = 1499, m/4 = 1125, m/5 = 900
Пример 54
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Val10,Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Glu27,Ser28]-глюкагон
Chem.54:
Метод UPLC: 04_A9_1; Rt = 9,0 мин
Метод UPLC: 10_B4_1; Rt = 8,1 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,2, m/3 = 1474; m/4 = 1106; m/5 = 885
Пример 55
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Glu27,Ser28]-глюкагон
Chem.55:
Метод UPLC: 04_A9_1; Rt = 8,8 мин
Метод UPLC: 10_B4_1; Rt = 8,1 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,2; m/3 = 1495; m/4 = 1121; m/5 = 898
Пример 56
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Ala16,Lys24,Leu27,Gln28]-глюкагон
Chem.56:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,3 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 9,0 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 13,5 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1480; m/4 = 1110; m/5 = 888
Пример 57
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Ala16,Lys24,Glu27,Ser28]-глюкагон
Chem.57:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 12,5 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 9,5 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1471; m/4 = 1104; m/5 = 883
Пример 58
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон амид
Chem.58:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,2 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 9,0 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 14,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1476; m/4 = 1107; m/5 = 886
Пример 59
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu15,Lys24.Glu27,Ser28]-глюкагон
Chem.59:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 12,5 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,5 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 8,6 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,1 мин, m/3 = 1481; m/4 = 1111; m/5 = 889
Пример 60
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu15,Lys24,Leu27,Gln28]-глюкагон
Chem.60:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,9 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 12,2 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1489; m/4 = 1117; m/5 = 894
Пример 61
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Val10,Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон амид
Chem.61:
Метод UPLC: 04_A9_1; Rt = 16,1 мин
Метод UPLC: 10_B4_1; Rt = 9,6 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,5; m/3 = 1459; m/4 = 1094; m/5 = 875
Пример 62
ε24
N-[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]-[Val10,Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.62:
Метод UPLC: 05_B4_1: Rt = 9,6 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; Rt = 2,5 мин; m/3 = 1459; m/4 = 1095; m/5 = 876
Пример 63
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Val10,Leu16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.63:
Метод UPLC: 05_B4_1: Rt = 8,6 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; Rt = 2,6 m/3 = 1463; m/4 = 1098; m/5 = 878
Пример 64
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-[Val10,Arg12,Thr16,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.64:
Метод UPLC: 05_B4_1: Rt = 9,7 мин
Метод LS-MS: LCMS_4; RT = 2,5 мин; m/3 = 1468; m/4 = 1101; m/5 = 881
Пример 65
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[4-[16-(1H-тетразол-5-ил)гексадеканоилсульфамоил]бутаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]-амино]бутаноил]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.65:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 12,1 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1481; m/4 = 1111
Пример 66
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[4-[16-(1H-тетразол-5-ил)гексадеканоилсульфамоил]бутаноиламино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.66:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 12,2 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1437
Пример 67
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-[4-[16-(1H-тетразол-5-ил)гексадеканоилсульфамоил]бутаноиламино]бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.67:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 12,5 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1542; m/4 = 1157
Пример 68
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[4-[16-(1H-тетразол-5-ил)гексадеканоилсульфамоил]бутаноиламино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.68:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 12,6 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1499; m/4 = 1124
Пример 69
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.69:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 11,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1467; m/4 = 1100
Пример 70
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Glu15,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.70:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 11,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1476; m/4 = 1107
Пример 71
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Glu15,Glu21,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.71:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 11,7 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1481
Пример 72
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.72:
Метод UPLC: 09_B4_1: Rt = 7,9 мин
Метод LCMS: LCMS_13: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1369; m/4 = 1027
Пример 73
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.73:
Метод UPLC: 09_B4_1: Rt = 7,9 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1412; m/4 = 1060; m/5 = 848
Пример 74
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.74:
Метод UPLC: 09_B4_1: Rt = 8,1 мин
Метод LCMS: LCMS_13: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1426; m/4 = 1070
Пример 75
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[lle16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон амид
Chem.75:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,0 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 15,2 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1426; m/4 = 1070; m/5 = 856
Пример 76
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон амид
Chem.76:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 12,9 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,5 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 14,6 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1421; m/4 = 1066; m/5 = 853
Пример 77
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон амид
Chem.77:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,0 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 15,2 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1426; m/4 = 1070; m/5 = 856
Пример 78
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.78:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 12,9 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,5 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 12,4 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1422; m/4 = 1066; m/5 = 853
Пример 79
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[lle16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.79:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,0 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 13,1 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1426; m/4 = 1070; m/5 = 856
Пример 80
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.80:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,1 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 13,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1426; m/4 = 1070; m/5 = 856
Пример 81
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.81:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 11,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1466
Пример 82
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Thr16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.82:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 11,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,5 мин, m/3 = 1476
Пример 83
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.83:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 11,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1457; m/4 = 1093
Пример 84
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.84:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 11,8 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1466; m/4 = 1100
Пример 85
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.85:
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 12,2 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,4 мин, m/3 = 1471; m/4 = 1103
Пример 86
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.86:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,0 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 15,4 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,6 мин, m/3 = 1436; m/4 = 1077; m/5 = 862
Пример 87
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ala28]-глюкагон
Chem.87:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 12,9 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,5 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 15,5 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,6 мин, m/3 = 1484; m/4 = 1113; m/5 = 891
Пример 88
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Gly28]-глюкагон
Chem.88:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 13,0 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,6 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 16,0 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,6 мин, m/3 = 1479; m/4 = 1110; m/5 = 888
Пример 89
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ala28]-глюкагон
Chem.89:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 12,2 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,0 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 14,4 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,5 мин, m/3 = 1475; m/4 = 1106; m/5 = 885
Пример 90
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Gly28]-глюкагон
Chem.90:
Метод UPLC: 08_B2_1: Rt = 12,3 мин
Метод UPLC: 08_B4_1: Rt = 8,1 мин
Метод UPLC: 04_A3_1: Rt = 14,9 мин
Метод LCMS: LCMS_4: Rt = 2,5 мин, m/3 = 1470; m/4 = 1103; m/5 = 882
Пример 91
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Leu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.91:
Метод UPLC: 09_B4_1: Rt = 8,2 мин
Метод LCMS: LCMS_13: Rt = 2,2 мин, m/3 = 1383; m/4 = 1038
Пример 92
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.92:
Метод UPLC: 09_B4_1: Rt = 8,5 мин
Метод LCMS: LCMS_13: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1379; m/4 = 1034
Пример 93
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Glu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.93:
Метод UPLC: АР_B4_1: Rt = 7,8 мин
Метод LCMS: LCMS_AP: Rt = 5,1 мин, m/3 = 1476; m/4 = 1107
Пример 94
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Glu16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.94:
Метод UPLC: АР_B4_1: Rt = 7,8 мин
Метод LCMS: LCMS_AP: Rt = 5,3 мин, m/3 = 1485; m/4 = 1116
Пример 95
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.95:
Метод UPLC: AP_B4_1: Rt = 8,0 мин
Метод LCMS: LCMS_AP: Rt = 5,2 мин, m/3 = 1466; m/4 = 1100
Пример 96
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-(17-карбоксигептадеканоиламино)бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Ala16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.96:
Метод UPLC: 09_B4_1: Rt = 8,4 мин
Метод LCMS: LCMS_13: Rt = 2,3 мин, m/3 = 1422; m/4 = 1067
Пример 97
ε24
N-[(4S)-4-карбокси-4-[[(4S)-4-карбокси-4-[[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-карбокси-4-(15-карбоксипентадеканоиламино)бутаноил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]этокси]этокси]ацетил]амино]бутаноил]амино]бутаноил]-[Arg12,Val16,Lys24,Leu27,Ser28]-глюкагон
Chem.97:
Метод UPLC: AP_B4_1: Rt = 8,2 мин
Метод LCMS: LCMS_AP: Rt = 5,2 мин, m/3 = 1475; m/4 = 1106
СПОСОБЫ
Анализ (I)
Активность глюкагона
2
Рецептор глюкагона клонировали в клетках НЕК-293, имеющих связанный с мембраной биосенсор сАМР (ACTOne™). Клетки (14000 на лунку) инкубировали (37°C, 5% CO) в течение ночи в 384-луночных планшетах. На следующий день клетки нагружали чувствительным к кальцию красителем, который распределялся только в цитоплазме. Для предотвращения утечки красителя из клеток добавляли пробенецид, ингибитор транспорта органических ионов. Для предотвращения деградации образовавшегося сАМР добавляли ингибитор PDE. Планшеты помещали в FLIPRTETRA и добавляли аналоги глюкагона. Данные в конечной точке получали через 6 минут. Увеличение внутриклеточной концентрации сАМР было пропорционально увеличению концентрации кальция в цитоплазме. Когда кальций связывался с красителем, возникал флуоресцентный сигнал. Значения ЕС50 рассчитывали в Prism5.
Анализ (II)
Анализ образования фибрилл с ThT для оценки физической стабильности пептидных композиций
В результате низкой физической стабильности пептида могут образовываться амилоидные фибриллы, которые обнаруживаются в образце в виде высокоупорядоченных, нитевидных макромолекулярных структур, что, в конечном счете, приводит к образованию геля. Обычно такие изменения оценивали путем визуального осмотра образца. Тем не менее, такого рода измерения являются очень субъективными и зависят от наблюдателя. Поэтому намного целесообразнее применять низкомолекулярные индикаторные зонды. Тиофлавин Т (ThT) является таким зондом и имеет характерную флуоресценцию при связывании с фибриллами [Naiki et al. (1989) Anal. BioChem. 177, 244-249; LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309, 274-284].
Динамику образования фибрилл можно описать с помощью сигмоидальной кривой в соответствии со следующей формулой [Nielsen et al. (2001) BioChemistry 40, 6036-6046]:
Здесь F представляет собой зависимость флуоресценции ThT от времени t. Константа t0 представляет собой время, необходимое для достижения 50% от максимальной флуоресценции. Два важных параметра, описывающие образование фибрилл, представляют собой лаг-период, вычисленный как t0 - 2τ, и константу кажущейся скорости kapp 1/τ.
В качестве общего механизма инициирования образования фибрилл предлагают образование частично свернутого интермедиата пептида. Некоторые из этих интермедиатов собираются с образованием матрицы, с которой могут объединяться последующие интермедиаты, и происходит образование фибрилл. Лаг-период соответствует интервалу, в котором зародышевое ядро достигает критической массы, и константа кажущейся скорости представляет собой скорость, с которой образуются сами фибриллы.
2
Перед каждым анализом готовили свежие образцы. Состав каждого образца приведен в описаниях к экспериментам. pH образца доводили до необходимого значения соответствующим количеством концентрированных NaOH и HCl. Тиофлавин T добавляли к образцам из исходного раствора в HO до конечной концентрации 1 мкМ.
Аликвоты образцов 200 мкл помещали в 96-луночный микротитрационный планшет (Packard OptiPlate™-96, белый полистирол). Обычно, четыре или восемь повторностей каждого образца (соответствующие одному тестируемому условию) помещали в один столбец лунок. Планшет запечатывали с помощью Scotch Pad (Qiagen).
Инкубацию при заданной температуре, встряхивание и измерение эмиссии флуоресценции ThT проводили в планшетном спектрофлуориметре Fluoroskan Ascent FL (Thermo Labsystems). Температуру устанавливали на необходимом значении, как правило, 30°C или 37°C. Планшет инкубировали либо без встряхивания (отсутствие внешнего физического стресса), либо с орбитальным встряхиванием, установленным на 960 оборотов в минуту с амплитудой 1 мм. Измерение флуоресценции проводили с использованием возбуждения через фильтр с пропусканием при 444 нм и измерением эмиссии с фильтром пропусканием при 485 нм.
Каждое измерение инициировали путем инкубации планшета при температуре проведения анализа в течение 10 мин. Параметры образцов в планшете измеряли каждые 20 минут в течение необходимого периода времени. Между каждыми измерениями планшет встряхивали и нагревали, как описано выше.
После завершения анализа с ThT четыре из восьми повторностей каждого образца объединяли и центрифугировали при 20000 оборотов в минуту в течение 30 минут при 18°C. Супернатант профильтровали через фильтр 0,22 мкм и аликвоту перенесли во флакон для HPLC.
Концентрацию пептида в исходном образце и в отфильтрованном супернатанте определяли с помощью обращено-фазной HPLC с использованием стандарта в качестве сравнения. Процентное отношение концентрации отфильтрованного образца по сравнению с концентрацией исходной образца обозначали как обнаружение.
Точки измерений сохраняли в формате Microsoft Excel для последующей обработки и построения кривой, аппроксимацию кривой проводили с использованием GraphPad Prism. Фоновая эмиссия ThT в отсутствие фибрилл была незначительной. Измеренные значения, как правило, представляли собой среднее значение для четырех или восьми образцов, и приведены с планками погрешностей стандартного отклонения. На одном графике представляли только данные, полученные в одном эксперименте (т.е. образцы на одном и том же планшете), что обеспечивало относительное измерение образования фибрилл между экспериментами.
Данные можно аппроксимировать уравнением Eq. (1). Тем не менее, лаг-период до образования фибрилл можно оценить визуально по кривой, определяя момент времени, в который флуоресценция ThT значительно увеличивается по сравнению с фоновым уровнем.
Таблица 2
Время полувыведения аналогов глюкагона в карликовых свиньях
Пример
Фармакокинетика при iv введении карликовым свиньям [T1/2] (ч)
Пример 13
76,4
Пример 15
77,4
Пример 16
86,6
Пример 24
4,1
Пример 25
59,6
Пример 38
83,0
Пример 63
63,7
Пример 80
60,9
Анализ (III)
Активность GLP-1
2
50
Рецептор GLP-1 клонировали в клетках НЕК-293, имеющих связанный с мембраной биосенсор сАМР (ACTOne™). Клетки (14000 на лунку) инкубировали (37°C, 5% CO) в течение ночи в 384-луночных планшетах. На следующий день клетки нагружали чувствительным к кальцию красителем, который распределялся только в цитоплазме. Для предотвращения утечки красителя из клеток добавляли пробенецид, ингибитор транспорта органических ионов. Для предотвращения деградации образовавшегося сАМР добавляли ингибитор PDE. Планшеты помещали в FLIPRTETRA и добавляли аналоги глюкагона. Данные в конечной точке получали через 6 минут. Увеличение внутриклеточной концентрации сАМР пропорционально увеличению концентрации кальция в цитоплазме. Когда кальций связывался с красителем, возникал флуоресцентный сигнал. ЕС-значения рассчитывали в Prism5.
Анализ (IV)
LOCI анализ
Образцы анализировали на наличие пептидов с помощью иммунолюминесцентного анализа с каналированием кислорода (LOCI). Донорные частицы покрыты были стрептавидином, а акцепторные частицы конъюгированы с моноклональным антителом (1F120), специфичным для глюкагона. Другое глюкагон-связывающее моноклональное антитело (2F7) было биотинилировано. Три реактанта объединяли с аналитом, что приводило к формированию двойного иммунокомплекса. В результате воздействия света на комплекс из донорных частиц высвобождались синглетные атомы кислорода. Они направлялись к акцепторным частицам и вызывали хемилюминесценцию, которую измеряли в планшетном спектрофотометре EnVision. Количество испускаемого света пропорционально концентрации пептида.
Один мкл образца/калибранта/контроля наносили в лунки 384-луночных планшетов для LOCI, далее добавляли 15 мкл смеси акцепторных частиц, покрытых антителом (0,5 мкг/лунку) и биотинилированного антитела. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при 21-22°C. Далее в каждую лунку добавляли 30 мкл донорных частиц, покрытых стрептавидином (2 мкг/лунку) и инкубировали в течение 30 минут при 21-22°C. После возбуждения лазером 680 нм в планшетном спектрофотометер EnVision с фильтром, имеющим ширину пропускания 520-645 нм, при 21-22°C планшеты становились красными. Общее время измерения на лунку составляло 210 мс, включая 70 мс на возбуждение.
Анализ (V)
Потеря массы тела у крыс с алиментарным ожирением
Для этого исследования использовали шестьдесят четыре крысы Sprague Dawley из Taconic Europe на диете с высоким содержанием жира (Research Diet D12492) и восемь таких же крыс на диете с низким содержанием жира (Research Diet D12450 B). Крысы перед дозированием должны были весить около 970 г и 730 г, соответственно. Крысы должны были иметь неограниченный доступ к воде и содержаться отдельно, чтобы можно было осуществлять ежедневный мониторинг приема пищи. Свет был выключен в период с 10 утра до 10 вечера.
Крыс поделили на две группы по восемь и ежедневно на протяжении 15 дней один раз в день подкожно (sc) вводили дозу двух исследуемых веществ, объем дозы составлял 0,5 мл/кг. Перед началом дозирования на протяжении 5 дней крыс ежедневно брали руками и готовили для sc дозирования.
На 5-ый день дозирования из-за резкой потери массы тела у крыс дозу аналога глюкагона изменили с 30 нмоль/кг на 3 нмоль/кг и с 300 нмоль/кг на 30 нмоль/кг.
На 11 день у крыс проводили измерение профиля глюкозы в крови. Исследование заканчивали либо на 15, либо на 16 день, и собирали образцы крови для измерения инсулина и холестерина.
Анализ (VI)
Протокол эксперимента для тестирования эффективности производных глюкагона в тесте на аппетит с использованием модели на крысах с неограниченным кормлением
В экспериментах использовали крыс Sprague Dawley (SD) из Taconic Europe, Дания. Масса тела крыс составляла 200-250 г в начале эксперимента. Крысы были получены за 14 дней до начала эксперимента, чтобы они акклиматизировались к условиям проведения эксперимента. В течение этого периода животных два раза брали на руки. После прибытия крыс держали по одной в течение одной недели и в течение двух недель при обратном режиме освещения/темноты (имеется в виду, что свет был выключен в дневное время и включен в ночное время). Поскольку крысы обычно активны и съедают большую часть своего ежедневного рациона питания в темновой период, дозы крысам вводили утром прямо перед выключением света. Этот набор результатов характеризовался самым низким разбросом данных и самой высокой чувствительностью. Эксперимент проводили в собственных клетках крыс, и крысы имели свободный доступ к пище и воде в течение всего периода акклиматизации и периода эксперимента. Каждую дозу производного испытывали на группе из 5 крыс. В тесты каждый раз включали группу из 6-7 крыс, получающих носитель. Дозу крысам вводили подкожно (sc) один раз в соответствии с массой тела в виде 0,01-3 мг/кг раствора. После дозирования крыс возвращали в их клетки, где они имели доступ к пище и воде. Потребление пищи непрерывно регистрировали для каждого животного в отдельности путем он-лайн регистрации или вручную каждый час на протяжении 7 часов, далее через 24 ч и снова спустя 48 часов. В конце эксперимента животных подвергали эвтаназии.
Данные по индивидуальным особям записывали в листы Microsoft Excel. Выбросы в данных отбрасывали после применения критерия статистической оценки Граббса для выбросов. Данные представляли в виде суммарного приема пищи как функции времени. Сравнения между группой, которой вводили носитель, и исследуемыми группами проводили с использованием t-критерия Стьюдента или однофакторного ANOVA.
Анализ (VII)
Анализ стабильности к DPP-IV
10 мкМ пептида инкубировали с DPP-IV (2 мкг/мл) в двух повторностях при 37°C в HEPES буфере с добавлением Tween 20 до 0,005%. В этом эксперименте в качестве положительного контроля использовали GLP-1 человека. Аликвоты образца отбирали через 3, 15, 30, 60, 120 и 240 мин, а для остановки реакции добавляли три объема этанола. Исходный пептид в образцах анализировали с помощью LC-MS. Данные приведены в соответствии с кинетикой первого порядка, и стабильность описана в виде периодов полувыведения.
Анализ (VIII)
Профиль РК
Пятнадцать самцов крыс (Sprague Dawley, 400 г, Taconic Europe) поделили на три группы по пять крыс. В момент времени t=0 крысам вводили дозу 15 нмоль/кг IV, или 30 нмоль/кг SC, или 100 нмоль/кг, соответственно. Дозирование IV осуществляли через хвостовую вену, при этом крыс брали сразу после анестезии изофлураном. Образцы крови собирали через подъязычную вену в моменты времени t = -15 мин, 5 мин (только крысы, которым проводили IV введение), 15 мин, 30 мин, 1 час, 1½ часа, 2 часа, 4 часа, 6 часов 12 часов, 24 часа, 48 часов и 72 часа. Образцы плазмы хранили замороженными до проведения анализа IV.
Анализ (IX)
Зависимость растворимости от pH
Растворимость пептидов и белков зависит от pH раствора. Часто белок или пептид выпадает в осадок при pH, равном или близком к его изоэлектрической точке (pl), в которой его суммарный заряд равен нулю. При низком pH (т.е. ниже, чем pl) белки и пептиды обычно положительно заряжены, при pH выше, чем pl, они заряжены отрицательно.
Для терапевтического пептида выгодно, если в соответствующей концентрации он растворим при заданном pH, подходящем как для создания стабильного лекарственного продукта, так и для введения лекарственного продукта пациенту, например, путем подкожной инъекции.
Кривые растворимости в зависимости от pH получали, как описано: готовили раствор композиции или пептида в воде, и аликвоты доводили до значений pH в желаемом диапазоне путем добавления HCl и NaOH. Эти образцы оставляли уравновешиваться при комнатной температуре на 2-4 дня. Далее эти образцы центрифугировали. Небольшие аликвоты из каждого образца отбирали для анализа обращено-фазной HPLC для определения концентрации белка в растворе. После центрифугирования измеряли pH каждого образца, и концентрации каждого белка отображали в зависимости от измеренного pH.
Анализ (X)
Оценка химической стабильности
Химическую стабильность аналогов глюкагона исследовали с помощью RP-UPLC разделения и УФ-детектирования. Лиофилизированные образцы растворяли в буфере (подробный состав см. ниже) до конечной концентрации 333 мкМ и pH, равного 8,15, и инкубировали на протяжении 14 дней при 5°C и 37°C с последующим анализом RP-UPLC. Чистоту определяли как процент площади основного пика относительно общей площади всех интегрированных пиков в каждой хроматограмме. Снижение чистоты после 14 дней при 37°C определяли как разницу чистоты между образцами, инкубированными при 5°C и 37°C, деленную на чистоту образца после инкубации на протяжении 14 дней при 5°C.
Анализ RP-UPLC проводили с использованием колонки Waters ВЕН 130 2.1 мм × 150 мм, 1.7 мкм, при 50°C и скорости потока 0,4 мл/мин, с использованием системы подвижной фазы, состоящей, как правило, из A: 50 мМ фосфата, 10% вес/вес ацетонитрила, pH 3, и B: 80% объем/объем ацетонитрила. УФ-детектирование проводили при 215 нм. Стандартный профиль градиента, использованный для большинства образцов, приведен ниже.
Время/мин
В
Инъекция
20
30
50
31
99
32
99
34
20
35
20
40
20
В случае некоторых отдельных аналогов, элюирующихся при существенно различающихся значениях времени удерживания по сравнению с большинством аналогов, для лучшей оценки чистоты между образцами в профиль градиента были внесены некоторые корректировки. Также, чтобы улучшить отмывку от материала одной инъекции перед другой инъекцией в последовательности, состав компонентов подвижной фазы канала В в некоторых анализах был заменен на 90% объем/объем раствор ацетонитрила. Тем не менее, это было соответствующим образом учтено путем пересчета профиля градиента.
Буфер:
50 мМ динатрий фосфат дигидрат
184 мМ пропиленгликоль
58 мМ фенол
3
4
pH доводили до 8,15 с помощью HPO. В тех случаях, когда pH доводили до 8,15 после ресуспендирования аналогов, использовали 0,2 М NaOH.
Анализ (XI)
Исследование фармакокинетики на карликовых свиньях
Целью данного исследования являлось определение фармакокинетических свойств производных глюкагона in vivo после i.v. введения карликовым свиньям. Для этого проводили фармакокинетическое исследование (РК), в котором среди прочих параметров определяли конечный период полувыведения и клиренс исследуемого производного. Увеличение конечного периода полувыведения и снижение клиренса означает, что исследуемое соединение удаляется из организма медленнее. В случае аналогов глюкагона это влечет за собой увеличение продолжительности фармакологического действия.
В исследованиях использовали самцов или самок карликовых свиней Göttingen, полученных из Ellegaard Göttingen Minipigs (Dalmose, Дания), их возраст составлял примерно 7-14 месяцев, а масса тела примерно 16-35 кг. Карликовые свиньи содержались либо по отдельности (свиньи с постоянными катетерами), либо в группе, их кормили ограниченно дважды в день или один раз в день в соответствии с диетой SDS для карликовых свиней (Special Diets Services, Essex, UK). В некоторых исследованиях каждому животному после, по меньшей мере, 2 недель акклиматизации в вену cava caudalis или cava cranialis помещали два постоянных центральных венозных катетера. Животные в течение 1 недели восстанавливались после операции, а далее их использовали в повторяющихся фармакокинетических исследованиях с подходящим периодом для выведения препарата из организма между последовательным дозированием производных глюкагона. В других исследованиях животные акклиматизировались в течение 1 недели, после чего их использовали в повторяющихся фармакокинетических исследованиях с подходящим периодом для выведения препарата из организма между последовательными дозированием производных глюкагона. Для каждого введения свиньям ставили катетер типа венфлон в одну ушную вену, через который вводили дозы производных. Забор крови осуществляли пункцией v. jugularis или v. cava cranialis.
Животные голодали, либо не голодали в течение примерно 18 ч перед введением и от 0 до 4 ч после введения, но имели неограниченный доступ к воде в течение всего периода.
Z
Z
Производные глюкагона обычно растворяли в 50 мМ фосфата натрия, 145 мМ хлорида натрия, 0,05% Tween 80, pH 7,4 до концентрации, обычно, 20-60 нмоль/мл. Внутривенные инъекции (объем, соответствующий обычно 2-3 нмоль/кг, составлял, например, 0,1 мл/кг) соединений проводили через один катетер или через венфлон, и образцы крови собирали в заранее установленные моменты времени в течение 13 дней после введения (предпочтительно через другие катетеры или путем пункции вены). Образцы крови (например, 0,8 мл) собирали в пробирки с буфером с ЭДТА (8 мМ) (иногда добавляли апротинин 500 KIU/мл крови) и далее центрифугировали при 4°C и 1942 G в течение 10 минут. Плазму переносили в пробирки Micronic на лед и хранили при -20°C до анализа концентрации соответствующего производного глюкагона в плазме с использованием подходящего количественного анализа, такого как ELISA или LCMS. На основе этих измерений составляли профили зависимости концентрации исследуемого соединения в плазме от времени и проводили так называемый некомпартментный фармакокинетический анализ данных с помощью WinNonlin v. 5.0 или Phoenix v. 6.2 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA) или другого применимого программного обеспечения для анализа РК. Для большинства соединений конечный участок профилей концентрации в плазме на полулогарифмическом графике был линейным, что соответствует тому, что после начального распределения препарат удаляется из организма с постоянной фракционной скоростью. Скорость (лямбда Z или λ) равна отрицательному наклону конечного участка графика. Используя эту скорость, также можно рассчитать конечный период полувыведения, как t½=In(2) / λ (см, например, Johan Gabrielsson and Daniel Weiner: Pharmacokinetics and Pharmacodynamic Data Analysis. Concepts & Applications, 3rd Ed., Swedish Pharmaceutical Press, Stockholm (2000)).
rd
Клиренс определяли в виде дозы (D), деленной на площадь под кривой (AUC) профиля зависимости концентрации в плазме от времени (Rowland, М and Tozer TN: Clinical Pharmacokinetics: Concepts and Applications, 3 edition, 1995 Williams Wilkins)
Анализ (XII)
Влияние аналогов глюкагона на массу тела крыс с алиментарным ожирением (DIO)
Целью этого анализа является анализ влияния аналогов глюкагона на массу тела крыс с алиментарным ожирением (DIO).
Кратко, крыс кормили пищей с высоким содержанием жиров в течение 10 недель до достижения массы тела около 600 г. Далее крысам DIO ежедневно на протяжении трех недель подкожно вводили дозу аналогов глюкагона. Измерение массы тела проводили каждый день при дозировании.
Самцов крыс Sprague Dawley, Taconic (Дания), с массой по прибытии около 325 г, разместили по три в клетку и обеспечили им неограниченный доступ к пище с высоким содержанием жиров (Research Diets, R12492, 60% калорий из жира) и воде. Через 4 недели на диете с высоким содержанием жиров животных случайным образом разместили по две в клетку и спустя еще неделю начали однонедельное исследование с ежедневным подкожным введением доз аналогов глюкагона. После этого, перед тем, как начать данное исследование, животным на протяжении четырех недель проводили период выведения препарата из организма. После периода выведения животных случайным образом поделили на 16 групп по 6 крыс и одну группу с 10 крысами, которая представляла собой группу, получающую носитель. В течение всего срока животных содержали при 12-часовом цикле освещения и темноты.
2
4
Аналоги глюкагона растворяли в 50 мМ NaHPO, 145 мМ NaCl и 0,05% Tween и крысам DIO ежедневно на протяжении трех недель подкожно вводили дозу аналога глюкагона (в 4 часа дня), составляющую 0,5 мл/кг. Измерение массы тела проводили каждый день при дозировании.
Хотя некоторые признаки изобретения были проиллюстрированы и описаны в данном описании, для специалистов в данной области очевидно множество модификаций, замен, изменений и эквивалентов. Таким образом, следует понимать, что прилагаемая формула изобретения охватывает все такие модификации и изменения, которые соответствуют сущности изобретения.