Протективный эффект дендритных клеток при заражении мышей Klebsiella pneumoniae

УДК 591.883:615.37:616-022.1

N. K. Ahmatova1, M. V Kiselevsky2, E. A. Kurbatoea1, A. I. Makashin1, B. F Semenov1

PROTECTIVE EFFECT OF DENDRITIC CELLS IN MICE INFECTED OF KLEBSIELLA PNEUMONIAE

11.1. Mechnikov Institute of Vaccine and Serum RAMS, Moscow 2 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

The purpose of the present work was the studying of protective activity of dendritic cells (DC) against Klebsiella pneumoniae (К2) infection in mice. Mature DC were generated from mouse bone marrow cells. LPS of K. pneumoniae, lysat of K. pneumoniae K2 and polycomponental vaccine VP-4 (sum of bacterial antigens) were used as inducers of DC maturation. Intraperitoneal introduction of immature and mature DC into mice led to protective effect in 83,3-100 % animals infected by K. pneumoniae K2 (150 LD50). Protective effects did not depend on character of the stimulating agents.

Mature DC, probably, can upregulate immune responses by promoting the secretion of Th1 regulatory cytokines. Protective activity of immature DC may be connected with the subsequent induction of cytokines synthesis resulting from their maturation by the bacterial factors in vivo.

Creation of DC-vaccines for adoptive immunotherapy may be perspective in prevention and therapy of infectious diseases.

Key words: dendritic cells, TNF-a, К. pneumoniae, Immunovac-VP-4, LPS, immunophenotype.

H. К. Ахматова1, М. В. Киселевский2, E. А. Курбатова1, А. И. Макашин1, Б. Ф. Семенов1

ПРОТЕКТИВНЫЙ ЭФФЕКТ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ПРИ ЗАРАЖЕНИИ МЫШЕЙ KLEBSIELLA PNEUMONIAE

1ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. 'Мечникова РАМН, Москва

2ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

Цель настоящей работы — изучение протективной активности дендритных клеток (ДК) при заражении мышей линии СВА культурой штамма К. pneumoniae К2. В качестве индукторов созревания дендритных клеток, генерированных из костного мозга мышей, использованы липополисахарид К. pneumoniae, лизат штамма К. pneumoniae К2 и поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно-патогенных микроорганизмов. Незрелые ДК, так же как и зрелые, независимо от характера стимулирующего агента при внутрибрюшинном введении мышам оказывали протективное действие от 83,3 до 100 % при заражении К. pneumoniae (150 ЛД50).

ДК синтезируют целый набор цитокинов, что, возможно, способствует активации сложных механизмов межклеточных взаимодействий. Протективная активность незрелых ДК по отношению к заражению K. pneumoniae, возможно, связана с последующей индукцией синтеза цитокинов in vivo под воздействием ДК и микробных клеток. Полученные результаты позволяют сделать выводы о том, что ДК обладают высокой способностью стимулировать пролиферацию сингенных МЛ, что, вероятно, связано с участием ДК в реакциях межклеточного взаимодействия при формировании неспецифического иммунного ответа.

Создание вакцин на основе ДК для адоптивной иммунотерапии может быть перспективным в профилактике и терапии инфекционных заболеваний.

Ключевые слова: дендритные клетки, TNF-a, Иммуновак-ВП-4, липополисахарид К.pneumoniae, иммунофенотип.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время перспективным направлением в экспериментальной и практической медицине является адоптивная иммунотерапия. В основе ее лежит

применение естественных для организма веществ или активация естественных механизмов иммунной защиты. Исследования последних лет выявили эффективность методов адоптивной иммунотерапии в биотерапии опухолей [1; 2; 4; 18; 23] и лечении инфекционных

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

заболеваний [21]. Дендритные клетки, пульсирован-ные ex vivo различными белковыми антигенами, способны праймировать наивные Т-лимфоциты in vivo и индуцировать протективный иммунитет против различных опухолевых антигенов и бактериальных инфекций [14; 20; 22]. Использование ДК, обработанных антигеном, оказалось весьма эффективным для индукции антибактериального протективного иммунитета против внутриклеточных патогенов (Leishmania dono-vani и Mycobacterium tuberculosis), где Thl-клеточный доминантный ответ наиболее важен в регуляции инфекционного процесса [12; 16]. У лабораторных животных, зараженных Bordetella pertussis, ДК усиливают специфический иммунный ответ, характеризующийся синтезом иммуноглобулинов IgG и IgA в легких [13; 24].

Дендритные клетки представляют собой профессиональные антигенпредставляющие клетки (АПК), обладающие уникальной способностью индуцировать первичный иммунный ответ [5; 8; 9; 11]. ДК могут праймировать наивные Т-клеток и ЦТЛ, а также активировать клетки памяти. Кроме того, ДК способны активировать NK и ККТ-клетки и индуцировать диффе-ренцировку В-клеток в IgM-продуцирующие клетки [10; 15].

В настоящее время глобальный характер приобретает неуклонное повышение резистентности как патогенных, так и условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам. В связи с этим особый интерес представляет разработка иммунотерапии оппортунистических и условно-патогенных инфекций, к которым относится K. pneumoniae.

Цель исследования — изучение протективной активности ДК при заражении мышей линии СВА культурой штамма K. pneumoniae K2.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для получения дендритных клеток (ДК) использованы клетки костного мозга 30 мышей линии СВА. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Культивирование ДК

ДК получали из клеток костного мозга мышей линии СВА. Костный мозг мышей гомогенизировали в среде RPMI-1640 (Sigma, США), трижды осаждали центрифугированием (по 250 g в течение 5 мин) и переводили в обогащенную среду культивирования (106 клеток в 1 мл среды RPMI-1640 с добавлением 100 мкг/мл гентамицина сульфата и 10% термоактивированной эмбриональной телячьей сыворотки), содержащую 80 нг/мл рекомбинантных GM-CSF и 20 нг/мл IL-4 (Biosource, США).

На 6-е сутки инкубации при температуре 37 °С в атмосфере 4% С02 производили смену среды с добавлением лизата штамма K. pneumoniae К2 (50 мкл/мл), или липополисахарида (ЛПС) K. pneumoniae (0,125 мг/мл) (Sigma, США), или поликомпонентной вакцины ВП-4 (50 мкг/мл) для индукции созревания ДК. Че-

рез 3 сут ДК отмывали от среды культивирования и вводили мышам.

Выделение мононуклеарных лейкоцитов

Селезенки мышей гомогенизировали в среде 199 (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) и трижды осаждали центрифугированием. Взвесь спленоцитов центрифугировали при 400 g в течение 30 мин в градиенте плотности фиколл-уро-графина (Pharmacia, плотностью 1,077 г/см3); МЛ, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и 3-кратно отмывали средой 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g.

Для получения лимфоцитов взвесь МЛ в среде RPMI-1640 разливали во флаконы и не прилипшие клетки переводили в среду культивирования (106 клеток в 1 мл обогащенной среды RPMI-1640).

Мышам суспензию ДК (1,5-3,0г106) вводили внут-рибрюшинно в левую область по 0,5 мл изотонического раствора натрия хлорида. Затем сразу внутрибрюшинно вводили К. pneumoniae К2 в правую область — 500 клеток (150 ЛД50) в 0,5 мл изотонического раствора.

Препараты

В работе использовали липополисахарид (ЛПС) К. pneumoniae (0,125 мг/мл) (Sigma), лизат штамма К. pneumoniae К2 (107 клеток/мл) и поликомпонентную вакцину Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно-патогенных микроорганизмов (ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова РАМН), содержащую ЛПС, ассоциированный с белком наружной мембраны грамотрицательных микроорганизмов, пептидогликан, тейхоевые кислоты и лабильные белковые компоненты стафилококка поли-компонентной вакцины ВП-4 (50 мкг/мл). Для сравнения степени зрелости ДК использовали коммерческий TNF-a (Biosours, США).

Получение лизата микробных клеток K. pneumoniae K2

Микробную культуру обрабатывали воздействием импульсного ультрафиолетового излучения на установке «Альфа-1» в течение 15 мин. Затем культуру разводили до концентрации 107/мл и двукратно подвергали процедуре замораживания и оттаивания. Полноту инактивации контролировали путем высева на чашки с питательным агаром. Лизат пропускали через фильтр (d=0,25) и 50 мкл/мл вводили в среду, содержащую ДК.

Анализ фенотипа ДК

Фенотип ДК исследовали с использованием моноклональных антител (Caltag Laboratories, США) против соответствующих антигенов. Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и окрашивали FITC (флюоресциинизотиоционат) и мечеными PE (фикоэритрин) антителами согласно инструкции производителя. Затем отмывали 2 раза холодным ФСБ. Результаты учитывали на проточном цитометре FacsCalibur (Becton Dickinson, США). На ДК, полученных из клеток костного мозга мышей, исследовались уровни экспрессии молекул F4/80, CD34, CD38, CD40, CD80, CD86, MHC I и МНС II. Гейт (окно) популяции

93

клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 10 000 клеток в гейте. Статистическая обработка материала проведена при помощи программного пакета WINMDI 2.8. Определение уровня цитокинов Уровень цитокинов определяли иммунофермент-ным методом с использованием тест-систем фирмы Biosource, США.

Оценка фагоцитарной активности ДК Фагоцитарную активность ДК оценивали по поглотительной способности в отношении латексных частиц диаметром 2,7 мкм

— среднее число бактерий, находящихся внутрикле-точно (частное от деления общего числа поглощенных бактерий на число клеток, вступивших в фагоцитоз). Оба показателя рассчитывали в мазках, сделанных после 30- и 90-минутной инкубации, т. е. в общей сложности 120-минутной инкубации.

Оценка пролиферативной активности МЛ под воздействием ДК мышей

Пролиферативную активность МЛ, полученных из селезенок, оценивали с помощью колориметрического теста с витальным красителем AlamarBlue (Biosours, USA) в стерильных условиях, используя ламинарный бокс с горизонтальным потоком воздуха (Juan VFS 906). Суспензию ДК в обогащенной среде RPMI-1640 вносили в 96-луночные планшеты в количестве 10г103 клеток на 1 лунку. Затем в эти же лунки добавляли взвесь сингенных МЛ в количестве 200х103 клеток на 1 лунку и смешанные культуры инкубировали в течение 4 сут в стандартных условиях культивирования. По окончании инкубации в лунки вносили краситель AlamarBlue (10%). Флюоресценцию измеряли после 4часовой инкубации при температуре 37 °С, 5% СО2 на флюориметре Versa Fluor V13 (Vtocal) при длине волны возбуждения 530-560 нм, эмиссии 590 нм и выражали в условных единицах (у. е.) флюоресценции. Рас-

считывали индекс стимуляции (ИС), представляющий собой отношение пролиферативной активности МНК при стимуляции зрелыми ДК и пролиферативной активности МНК при стимуляции незрелыми ДК.

Статистическую обработку данных проводили при использовании t-критерия Стьюдента с помощью стандартного пакета статистических программ Windows 98 (StatSoft 5.5).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате инкубации клеток костного мозга с GM-CSF и IL-4 были получены дендритные клетки, обладающие фенотипическими признаками незрелости (F4/80high, CD80low, CD86low) (табл. 1). Использование лизата штамма К. pneumoniae К2, ЛПС К. pneumoniae, вакцины ВП-4 и TNF-a в качестве индукторов созревания позволило получить зрелые ДК, характеризующиеся типичной морфологией и фенотипом CD34-, CD38high, CD40, CD80high, CD86high, MHC Ihigh, MHC Ilhigh, F4/80low (рис. 1). Наличие на мембране ДК, стимулированных исследуемыми бактериальными препаратами, макрофагального маркера F4/80 (рецептора к ЛПС) связано с присутствием в них бактериальных ЛПС. Эти результаты подтверждаются полученными ранее данными о способности ДК, обработанных ЛПС, экспрессировать не только антигены зрелых ДК, но и рецепторы к ЛПС [7]. Согласно полученным данным, все исследуемые препараты стимулировали созревание ДК. Данные клетки экспрессировали на своей поверхности костимулирую-щие молекулы (CD40, CD80, CD86) и молекулы МНС I и II класса, при этом наиболее (почти в 8 раз по сравнению с незрелыми ДК) повышалась экспрессия маркера СD80.

По своим морфологическим характеристикам, как было показано при фазово-контрастной микроскопии, клетки, полученные при этих условиях, имели звездчатую или вуалевидную форму с характерными цитоплазматическим отростками, что соответствует описанию ДК другими исследователями [19].

-Q-

Таблица 1.

Влияние препаратов — индукторов созревания ДК, генерированных из клеток костного мозга мышей (я=15), на уровень экспрессии поверхностных молекул

Группа Концентрация компонентов в среде культивирования ДК Уровень экспрессии поверхностных молекул, %

Лизат, мкл/мл ЛПС, мкг/мл ВП-4, мкг/мл TNF-a, нг/мл CD34 CD38 CD40 CD80 CD86 МНС I МНСП F4/80

1 0 0 0 0 15,9±1,2 5,0±0,1 0,5±0,1 8,1±0,4 5,3±0,4 9,3±2,3 9,1±2,1 58,9±2,2

2 0 0 0 20 6,9±3,5 22,6±2,7* 23,2±3,4* 65,9±0,9* 61,2±2,8* 31,0±4,5* 32,3±4,2* 4,6±0,7*’

3 0 0 50 0 5,8±2,3* 13,5±1,2* 36,8±2,3* 66,3±0,8* 30,3±3,5* 18,1±3,8* 18,3±3,4* 36,5±2,5

4 0 0,125 0 0 6,2±1,5* 10,8±1,7* 10,6±3,5* 64,3±1,5* 59,1±8,5* 22,1 ±4,7* 17,5±2,5* 45,3±7,7

5 50 0 0 0 6,2±2,3* 12,3±1,2* 10,2±2,8* 63,1±1,6* 48,4±5,2* 21,6±0,7 14,7±0,8* 32,1±5,1

6 Исходный фенотип клеток костного мозга 28,2±3,7 0,3±1,5 0,3±0,1 0 0 0 0 0,5±0,1

: Достоверность различий между группами р1 и р2,3,4,5 <0,05.

№1/том 5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

-Q~

A

В

Рис. 1. Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров детерминации) зрелых ДК, полученных с использованием:

а — Иммуновак-ВП-4 (50 нг/мл); б — ЛПС K. pneumoniae (0,125 мг/мл); в — рекомбинантного TNF-a (20 нг/мл); верхний ряд, дот-плот — светорассеяние (популяция зрелых ДК в очерченной области); левый пик — аутофлюоресценция клеток при использовании изотипического контроля; правый пик — флюоресценция (FITC — флюоресциинизотиоционат и R-PE фикоэритрин) после окрашивания соответствующими антителами; по оси ординат — количество клеток; по оси абсцисс — интенсивность флюоресценции; CD — дифференцировочные антигены; МНС I, II — молекулы главного комплекса гистосовместимости I и II класса

Б

ДК обладали фагоцитарной активностью в отношении различных условно-патогенных микроорганизмов и фагоцитировали частицы латекса. ФИ30 незрелых ДК составил 95,12±1,56 %, ФЧ30 — 15,31±1,2 %, причем способность к фагоцитозу снижалась по мере созревания. У пульсированных ДК ФИ 120 составил 44,3±2,5 %, ФЧ120 — 6,7±0,88 % (р<0,05).

В культуральной среде со зрелыми ДК достоверно повышался уровень ряда цитокинов (1Ь-1Ь, 1Ь-6, !Ь-

12, !№-§ и Т№-а) по сравнению с незрелыми ДК, при

Индукция цитокинов дендритными клетками

этом наиболее высокими были концентрации 1Ь-6 (566,2±10,3 пг/мл), 1Ь-12 (152,1±7,2 пг/мл), Т№-а (733,2±12,8 пг/мл) и !№-§ (159,8±6,4 пг/мл) (табл. 2). Содержание 1Ь-2, 1Ь-10 не претерпевало существенных изменений, в то время как продукция 1Ь-4 зрелыми ДК была достоверно ниже, чем у незрелых форм.

Изучение пролиферативной активности МЛ, полученных из предшественников костного мозга мышей, выявило способность ДК усиливать бласттрансформа-цию сингенных МНК (табл. 3). Спонтанная пролифера-

Таблица 2.

ДК IL-ip IL-2 IL-4 IL-6 IL-10 IL-12 TNF-a INF-у

Незрелые 1,03±0,05 13,6±1,5 44,9±5,3 90,9±4,8 101,4±5,9 5,0±0,03 77,2±5,6 18,42±2,1

Зрелые 26,6+1,7** 13,6+1,7 19,1+1,8* 566,2±10,3** 109,6+6,2 152,1±7,2*‘ 733,2+12,8** 159,8+6,4**

Достоверность различий: * p < 0,05, ** p < 0,001.

95

Таблица 3.

Способность зрелых дендритных клеток стимулировать пролиферацию сингенных МНК

Группа Концентрация компонентов в среде культивирования Пролиферативная активность МНК, у. е.

МНК ДК Индукторы созревания ДК

ВП-4, мкг/мл Лизат, мкл/мл ЛПС, мкг/мл TNF-a, нг/мл Оптическая плотность ИС

1-я 10б 0 0 0 0 0 0,650±0,073 —

2-я 10б 5 х 104 0 0 0 0 0,666±0,054 —

3-я 10б 5 х 104 0 0 0 100 1,458±0,074* 2,2

4-я 106 5 х 104 50 0 0 0 1,592±0,080* 2,3

5-я 10б 5 х 104 0 50 0 0 1,564±0,090* 2,3

6-я 10б 5 х 104 0 0 0,125 0 1,348±0,033* 2,0

Примечание: ИС (индекс стимуляции) — отношение пролиферативной активности МНК при стимуляции зрелыми ДК и пролифератив-

незрелыми формами представлять антиген [5; 8]. Только зрелые ДК экспрессируют высокий уровень кости-мулирующих молекул, обеспечивающих формирование вспомогательных сигналов при активации лимфоцитов, и высокий уровень молекул МНС I и MHC II, обеспечивающих эффективное представление антигена [13]. Таким образом, результаты наших исследований согласуются с данными ряда авторов [11; 12].

Высокий уровень фагоцитарной активности дендритных клеток (особенно незрелых) позволяет говорить о возможности их использования в создании ДК-вакцин для биотерапии инфекционных заболеваний [14; 24].

Значимое повышение содержания IL-6, IL-12 и TNF-a в культуре зрелых ДК, генерированных из предшественников костного мозга мышей и обработанных исследуемыми препаратами, свидетельствует о значении ДК в активации клеток иммунной системы. IL-6 является мощным фактором дифференцировки Ви Т-лимфоцитов, в особенности главным индуктором конечного этапа созревания В-клеток и макрофагов, а также цитотоксических лимфоцитов [3].

Повышение концентрации IL-12 в культуральной среде генерированных клеток индуцирует образование INF-y в Т-лимфоцитах, который, в свою очередь, влияет на приобретение Т-лимфоцитами свойств ТЬ1-типа [5]. Таким образом, ключевая роль IL-12 связана с направлением дифференцировки предшественников в ТЫ-клетки, стимуляцией дифференцировки наивных CD8+ Т-клеток в функционально-активные цитотокси-ческие Т-клетки, а также усилением цитолитической активности NK-клеток и их пролиферации. ДК синтезируют целый набор цитокинов, что способствует активации сложных механизмов межклеточных взаимодействий. Очевидно, что эти механизмы обеспечивают выраженное противоинфекционное действие зрелых

№1/том 5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

-о-

ной активности МНК при стимуляции незрелыми ДК (2-я группа).

Достоверность различий между группами: *p2 и p3,4,5,6 < 0,05.

тивная активность МЛ в условиях данного опыта составляла 0,650±0,073 у. е. (1-я группа). При культивировании МЛ в присутствии зрелых ДК, пульсирован-ных бактериальными препаратами и TNF-a, отмечалось повышение пролиферативной активности мононуклеаров (p<0,05), причем все исследуемые препараты усиливали активность ДК практически в равной степени. Присутствие незрелых ДК не оказывало заметного влияния на пролиферацию МЛ.

При внутрибрюшинном введении ДК мышам, зараженным штаммом К. pneumoniae К2 (150 ЛД50) отмечалось выраженное протективное действие от 83,3 до 100 % (табл. 4). Защитный эффект наблюдался как при воздействии зрелых ДК, обработанных липополи-сахаридом, лизатом К. pneumoniae или вакциной ВП-4, так и при действии непульсированных (незрелых) ДК.

Зрелые ДК обладают рядом особенностей, позволяющих им максимально эффективно по сравнению с

Таблица 4.

Неспецифическая протективная активность ДК мышей, генерированных из костного мозга при заражении мышей штаммом K. pneumoniae К2 в дозе 150 LD50

Группа Индуктор, используемый для созревания ДК Количество выживших мышей, %

1-я Лизат штамма К. pneumoniae Км 100,0

2-я Лизат штамма К. pneumoniae К2 83,3±15,2

3-я ЛПС К. pneumoniae 100,0

4-я ВП-4 100,0

5-я Контроль (незрелые ДК) 100,0

ДК независимо от использованного индуктора созревания. Отсутствие достоверных различий, очевидно, обусловлено тем, что все использованные агенты (ЛПС, поликомпонентная вакцина ВП-4 и лизат K. pneumoniae) содержат в своем составе в качестве фактора созревания липополисахарид.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обнаруженная в настоящей работе протективная активность незрелых ДК при их одновременном внут-рибрюшинном введении с летальной дозой K. pneumoniae, очевидно, связана со способностью незрелых ДК активно фагоцитировать микробные клетки и усиливать механизмы врожденного иммунитета через TLR (Toll Like Receptors), в частности вызывать активацию макрофагов и NK. Кроме того, возможна индукция синтеза цитокинов ДК под воздействием ЛПС и микробных клеток in vivo. Известно, что патогены могут манипулировать ДК. Например, связывание M. tuberculosis с ДК приводит к инактивации последних. Отсутствие действенной лизосомной системы у ДК позволяет P. gingivalis существовать в их предшественниках (С04+-клетках) более суток, в то время как моноцитам достаточно 60 мин для разрушения этого патогена [5]. Весьма вероятно, что в данных условиях ЛПС K. pneumoniae вызывал созревание ДК.

В предыдущих исследованиях [8; 13; 16; 24] ДК, пульсированные бактериальными антигенами, применялись в режиме профилактических вакцинаций (не менее чем за 2 нед. до заражения экспериментальных животных) с целью формирования специфического иммунного ответа. В настоящей работе показано, что ДК могут оказывать протективный эффект на фоне инфекционного процесса, при этом, очевидно, происходит активация преимущественно врожденного иммунитета.

Таким образом, адоптивная иммунотерапия с использованием ДК может быть перспективны направлением в профилактике и терапии инфекционных заболеваний.

ЛИТЕРАТУРА

1. Барышников А. Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма // Практ. онкол. — 2003. — Т. 4, № 3. — С. 127-129.

2. Давыдов М. И., Нормантович В. А., Киселевский М. В. и др. Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах: клинико-лабораторное исследование // Рос. онкол. журн. — 2000. — № 6. — С. 14-17.

3. Ковальчук Л. В., Ганковская Л. В., Хорева М. В., Соколова Е. В. Система цитокинов, комплемента и современные методы иммунного анализа. — М.: Рос. гос. мед. ун-т, 2001. — С. 120.

4. Кузнецова А. В., Данилова Т. И., Гладских О. П. и др. Дендритные клетки и их использование в иммунотерапии // Молек. мед.. — 2003. — № 3. — С. 3-17.

5. Пальцев М. А. Введение в молекулярную медицину. — М.: Медицина, 2004. — 496 с.

6. Пащенков М. В., Пинегин Б. В. Основные свойства дендритных клеток // Иммунология. — 2001.

— С. 7-6.

7. Чикилева И. О., Халтурина Е. О., Киселевский М. В. Современные подходы и направления в иммунотерапии и иммунопрофилактике злокачественных новообразований // Молек. мед. — 2003. — № 2.

— С. 40-50.

8. Ahuja S., Reddick R., Sato N. et al. Dendritic Cell (DC)-Based Anti-Infective Strategies: DCs Engineered to Secrete IL-12 Are a Potent Vaccine in a Murine Model of an Intracellular Infection // J. Immunol. — 1999 — Vol. 163. — P. 3890-3897.

9. Ardavin C., Martinez delHoyo G., Martin P et al. Origin and differentiation of dendritic cells // Trends Immunol. — 2001. — Vol. 22. — P. 691-700.

10. Blankenstein T., Schuler T Cross-priming versus cross-tolerance: are two signsls enough? // Trends Immunol. — 2002. — Vol. 23. — P. 171-173.

11. Cho B. K. A proposed mechanism for the induction of cytotoxic T-lymphocyte production by heat shock fusion proteins // Immunity. — 2000. — Vol. 12. — P. 263-272.

12. Fiorentino D., Zlotnik A., Vieira P. et al. IL-10 acts on the antigen-presenting cell to inhibit cytokine production by Th1-cells // J. Immunol. — 1991 — Vol. 146.

— P. 34-44.

13. George-Chandy A., Mielcarek N., Nordstrom I. et al. Vaccination with Bordetella pertussis-Pulsed Autologous or Heterologous Dendritic Cells Induces a Mucosal Antibody Response In vivo and Protects against Infection // Infect. Immun. — 2001. — Vol. 69, No. 6. — P. 4120-4124.

14. Gilboa E., Nair S., Lyerly H.Immunotherapy of cancer with dendritic-cell-based vaccines // Cancer Immunol. Immunother. — 1998. — Vol. 46. — P. 82-85.

15. Granucci F., Andrews D. M., Degli-Espoti M., Ricciardi-Castagnoli P. IL-2 mediates adjuvant effect of dendritic cells // Trends Immunol. — 2002. — Vol. 23. — P. 169-171.

16. Johansson M., Schon K., Ward M., Lycke N. Genital tract infection with Chlamydia trachomatis fails to induce protective immunity in g-interferon receptor-deficient mice despite a strong local immunoglobulin A response // Infect. Immun. — 1997. — Vol. 65. — P. 10-32.

17. Лилли P. Патогистологическая техника и практическая гистохимия/ — М.: Мир, 1969. — С. 128-131.

18. Liu X., Li D., Zhang C., Ba D. et al. Treatment of 121 patients with malignant effusion due to advanced lung cancer by intrapleural transfer of autologus or allogenic LAK cells combined with RIL-2 // Med. Sci. J. — 1993.

— Vol. 8. — P. 186-189.

19. Lotze M. T., Thomson A. W. Dendritic cells. Biology and clinical applications, 1999. — P. 14-237.

20. Priebe G. P., Meluleni G. J., Coleman F. T. et al. Protection against Fatal Pseudomonas aeruginosa Pneumonia in Mice after Nasal Immunization with a Live, Attenuated aroA Deletion Mutant // Infect. Immun. — 2003. — Vol. 7. — P. 22-25.

-e-

21. Simpson E. Immunotherapy and gene therapy // E. Drugs. — 2004. — Vol. 7(2). — P. 105-108.

22. Su H., Messer R., Whitmire W. et al. Vaccination against chlamydial genital tract infection after immunization with dendritic cells pulsed ex vivo with nonviable chlamydiae // J. Exp. Med. — 1998. — Vol. 188. — P. 809-816.

23. Wan T., Zhou X., Chen G. et al. Novel heat shock protein Hsp70L1 activates dendritic cells and acts as a Th1

polarizing adjuvant // Blood. — 2004. — Vol. 103(5). — P. 1747-1754.

24. Worgall S., Kikuchi T., Singh R. et al. Protection against Pulmonary inatction with Pseudomonas aeruginosa following immunization with P. aeruginosa-pulsed dendritic cells // Infect. Immun. — 2001. — Vol. 69, No.

7. — P. 4521-4527.

Поступила 06.09.2005.