СОСТАВ, СОДЕРЖАЩИЙ ЭКСТРАКТ КОЖИЦЫ PORIA COCOS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ, ОБЛЕГЧЕНИЯ СОСТОЯНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ РАССТРОЙСТВ
COMPOSITION, CONTAINING EXTRACT OF PORIA COCOSUM TISSUE, INTENDED FOR PREVENTION, RELIEF AND TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISORDERS

Область техники
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей экстракт кожицы Poria cocos, предназначенной для профилактики, облегчения состояния или лечения нейродегенеративных расстройств.
Предшествующий уровень техники
Дегенеративное неврологическое заболевание - это заболевание, при котором происходит ухудшение ментальной функции из-за постепенной структурной и функциональной утраты нейронов. Дегенеративное неврологическое заболевание может сопровождаться такими симптомами, как деменция, экстрапирамидные нарушения, церебеллярные нарушения, сенсорные нарушения и двигательные расстройства, вызванные дегенерацией нервных клеток в определенных областях нервной системы. Могут также возникать сложные симптомы из-за одновременных множественных нарушений. Заболевание диагностируется в соответствии с клиническими проявлениями у пациента. Вместе с тем, симптомы широко варьируются и зачастую сходны с клиническими симптомами других заболеваний, что затрудняет постановку диагноза (Soc. Sci. Med. Vol. 40. No. 6, pp. 847-858, 1995).
В случае дегенеративных неврологических заболеваний симптомы заболевания прогрессируют медленно, и заболевание часто вызвано процессом старения. Болезнь прогрессирует непрерывно на протяжении нескольких лет или десятилетий вплоть до смерти и, таким образом, увеличивает бремя социального обеспечения. Известно, что заболевание с большой вероятностью связано с генетическими факторами, такими как семейная история, но приобретенные факторы также имеют большое значение. Дегенеративные неврологические расстройства классифицируются в соответствии с их клиническими симптомами, примеры включают в себя прогрессирующую деменцию (болезнь Альцгеймера и т.д.), неврологические расстройства (такие как болезнь Пика), расстройства контроля положения тела и двигательные расстройства (такие как болезнь Паркинсона), прогрессирующую атаксию, сенсорные и двигательные расстройства (International Journal of Engineering and Technology, Vol. 2, No.4, August 2010 Classification of Neurodegenerative Disorders Based on Major Risk Factors Employing Machine Learning Techniques).
Цитотоксичность Аβ бляшек и клубков гиперфосфорилированного тау-белка обращает на себя внимание как прямая причина деменции при болезни Альцгеймера - типичном дегенеративном заболевании мозга.
Бета-амилоид (Аβ) образуется из прекурсора АРР, продуцируется действием ферментов, таких как β-секретаза и γ-секретаза. Когда концентрация Аβ выше определенного уровня, Аβ белки связываются друг с другом с образованием нерастворимых сенильных бляшек. Это вещество может разрушать периферические нервные клетки и быть причиной воспаления и нейротоксичности. Например, считается, что с сенильными бляшками связаны гибель нейронов и микрогранулез, наблюдаемые у пациентов с болезнью Альцгеймера. Результаты анализа in vitro показали, что Аβ может индуцировать активацию микроглиальных клеток (мозговых макрофагов). Это подтверждает гипотезу о том, что основной причиной Аβ-пептиды вызывают микроэнцефалоцитоз и воспаление головного мозга, наблюдаемые у пациентов с болезнью Альцгеймера. На сегодняшний день не существует широко распространенных методов лечения или методов лечения, которые обеспечивали бы значимое растворение Аβ после образования сенильных бляшек или предотвращали бы образование отложений.
Тау-белок состоит из четырех частей: N-концевая выступающая часть, домен агрегации пролина, домен связывания микроорганелл и С-концевой фрагмент (Mandelkow et al., Acta. Neuropathol., 103, 26-35, 1996). Он играет роль в соединении микротрубочек, которые образуют физическую структуру нервных клеток. Известно, что дегенеративные заболевания головного мозга, такие как тауопатия, вызваны аномально гиперфосфорилированным или трансформированным тау-белком в нервных клетках центральной нервной системы. К типичным таупатиям относятся болезнь Альцгеймера, болезнь Пика, фронттемпоральная деменция и болезнь Паркинсона, связанные с хромосомой 17 (FTDP-17) и так далее (Lee et al., Annu. Rev. Neurosci., 24, 1121-1159, 2001; Bergeron et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 56, 726-734, 1997; Bugiani et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 58, 667-677, 1999; Delacourte et al., Ann. Neurol., 43, 193-204, 1998; Ittner and Gotz, Nat. Rev. Neurosci., 12, 65-72, 2011).
В теории Альцгеймера в 1980-е годы был выявлен терапевтический потенциал нейротрофических факторов в лечении дегенеративных неврологических расстройств (Nature. 1987 Sep 3-9; 329(6134):65-8. Amelioration of cholinergic neuron atrophy and spatial memory impairment in aged rats by nerve growth factor). Исследования показали, что холинергические нейроны в базальном переднем мозге, утраченные в результате старения, что, как известно, является одной из причин болезни Альцгеймера, восстанавливаются при введении в боковой желудочек нейротрофического ростового фактора (НРФ - NGF), в результате чего улучшался объем памяти экспериментальных животных. Таким образом, исследования по лечению дегенеративных неврологических заболеваний с помощью нейротрофических факторов были продолжены. В последующем исследовании было проведено исследование по восстановлению функции двигательного нерва при введении экспериментальным животным нейротрофического фактора головного мозга (НТФГМ), нейротрофина-3 (НТ-3), нейротрофина-4 (НТ-4), и цилиарного нейротрофического фактора (ЦНТФ), которые являются частью семейства нейротрофических факторов, нарушающих функцию двигательного нерва за счет образования узелков лицевого нерва и седалищного нерва, и были получены положительные результаты (Nature. 1992 Dec 24-31; 360(6406):757-9. Brain-derived neurotrophic factor prevents the death of motoneurons in newborn rats after nerve section). Кроме того, в эксперименте с использованием рекомбинантной линии мышей (wobbler) с заболеванием, при котором по мере старения постепенно утрачиваются количество и функция двигательных нейронов, количество данных нейронов увеличивалось и функция улучшалась при введении мышам НТФГМ и ЦНТФ (Science. 1994 Aug 19; 265(5175):1107-10. Arrest of motor neuron disease in wobbler mice co-treated with CNTF and BDNF). В дополнение к вышеуказанным исследованиям сообщалось, что нейротрофические факторы улучшают состояние экспериментальных животных при расстройствах памяти, когнитивных и поведенческих расстройствах за счет увеличения количества и функции нейронов в различных сенсорных и моторных нейропатических моделях.
Научное название тутового гриба - Poria cocos (пория кокосовидная). Poria cocos - это растение семейства Polyporaceae (полипоровые, трутовые грибы), порядка Aphyllophorales (афиллофоровые), класса Eubasidiomycetes (базидиомицеты), подкласса Hymenomycetidae (гименомицеты). Poria cocos - это вид гриба, относящегося к бациллам, который является грибком коричневой гнили, являющийся разновидностью сапрофитных организмов в сосне, но он также паразитирует и на корнях растущей сосны. Мицелий состоит разветвленных гиф белого цвета. Если имеются подходящие условия окружающей среды - температура и влажность, формируются твердые массы склероция. Они носят название bokryeong. В зависимости от цвета внутренней части, белый - это Poria cocos wolf, розовый - Jeokbokryeong. Внешнюю оболочку Poria cocos называют кожицей Poria cocos.
33
52
5
30
18
3
31
50
31
50
3
Основными компонентами Poria cocos являются пархимовая кислота (СНО), пинеколиновая кислота (CHO), 3β-гидерокси-ланоста-7.9(11), 24-триен-21-овая кислота, тумулозиновая кислота (CHO), эбрикоиновая кислота (СНО), отдельно сообщалось о присутствии тритерпеновой порикоиковой кислоты и ее производных в Poria cocos и кожице Poria cocos. Также содержит эргостерол, лецитин, аденин, холин, глюкозу, фруктозу и белок, большое количество неорганических веществ, а также пургиминовую кислоту, хвойную кислоту, политетангановую кислоты А и С и тритерпеноиды.
Кожица Poria cocos - сладкая, по своей природе теплая, вкус и свойства - легкие, поэтому она считается лекарственным веществом с охлаждающими свойствами. В литературе описано, что кожица Poria cocos может облегчать жажду, обладает мягкими мочегонными свойствами, удаляет влагу, облегчает состояние и повышает энергию за счет гармонизации функции пищеварительной системы, улучшает чрезмерное кровообращение в брюшной полости путем выравнивания талии. В основном она использовалась в рецептурах, относящихся к памяти. В недавних статьях сообщалось о противодиабетических и противораковых свойствах кожицы Poria cocos (Ling Hui, Evaluation of the chemotherapeutic and chemopreventive potential of triterpenoids from Poria cocos, Ling Hui, doctoral thesis of department of pharmacy, National University of Singapore, 2010).
Кожица Poria cocos - это внешняя оболочка склероции Poria cocos, относящихся к полипоровым. Она известна как лекарственное вещество, которое уменьшает отек, удаляя воду. В частности, в ней содержится в большом количестве тритерпеновая порикоиковая кислота на основе лоростана, в Donguibogam говорится о том, что кожица Poria cocos используется как компонент в препарате Opisan (кожура мандарина, околоплодник ареки, кожура имбиря, кожица белой шелковицы). В недавних исследованиях сообщалось, что кожица Poria cocos обладает такими терапевтическими эффектами, как: мочегонный, стимуляция образования мочи и уменьшение отека. (Triterpenes from the surface layer of Poria cocos, Takaaki tai, Phytochem, vol. 39, no. 5, 1995; Urinary metabonomic study of the surface layer of Poria cocos as an effective treatment for chronic renal injury in rats, ying yong zhao et al, Journal of Ethnopharmacology, vol. 148, no. 2, s2013).
Исходя из этого, авторы провели исследования для разработки материалов для фармацевтических и пищевых композиций для эффективной профилактики, облегчения и лечения дегенеративных неврологических заболеваний. В результате авторы настоящего изобретения подтвердили, что экстракты кожицы Poria cocos демонстрируют значительную активность в восстановлении памяти при нейропатии мозга, вызванной различными повреждениями головного мозга или нарушающими память лекарственными средствами, во время исследования нейропсихологической активности шелковицы и кожицы Poria cocos. Кроме того, было показано, что эти экстракты кожицы Poria cocos препятствуют выработке веществ, которые вызывают гибель нейронов в мозге, и защищают нервные клетки, стимулируя экспрессию белков, способствующих регенерации и дифференциации нервных клеток.
Подробное описание изобретения
Техническая задача
Цель настоящего изобретения заключается в разработке фармацевтической композиции для профилактики и лечения дегенеративных неврологических заболеваний и пищевой композиции для профилактики и улучшения дегенеративных неврологических заболеваний, в которых в качестве действующего вещества используется экстракт кожицы Poria cocos.
Техническое решение
Для достижения вышеуказанной цели в настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция для профилактики и лечения дегенеративных неврологических заболеваний и пищевая композиция для профилактики и улучшения дегенеративных неврологических заболеваний, содержащая экстракт кожицы Poria cocos.
Технические результаты изобретения
Согласно настоящему изобретению, экстракт кожицы Poria cocos ингибирует образование β-амилоид (Abeta) и фосфорилирование тау-белка, что может оказывать протекторное действие на нервные клетки. Кроме того, экстракт обладает свойством ингибирования ацетилхолинэстеразы (AChE), за счет чего повышается нервная проводимость, и опосредуется действие, улучшающее память. Таким образом, экстракт кожицы Poria cocos может быть эффективно использован для разработки фармацевтической композиции для профилактики и лечения дегенеративных неврологических заболеваний, включая деменцию, или для разработки композиций оздоровительного питания для профилактики и улучшения дегенеративных неврологических заболеваний.
Краткое описание чертежей
ФИГ. 1 представляет собой график, отражающий результаты теста «Условный рефлекс пассивного избегания» у экспериментальных животных, у которых функция памяти была ингибирована приемом скополамина после курса лечения экстрактом кожицы Poria cocos.
ФИГ. 2 представляет собой график, отражающий результаты теста «Y-образный лабиринт» у экспериментальных животных, у которых функция памяти была ингибирована приемом скополамина после курса лечения экстрактом кожицы Poria cocos.
ФИГ. 3 представляет собой график, отражающий результаты теста «Распознавание новых объектов» (РНО) у экспериментальных животных, у которых функция памяти была ингибирована приемом скополамина после курса лечения экстрактом кожицы Poria cocos.
ФИГ. 4 представляет собой график, отражающий результаты теста «Y-образный лабиринт» у экспериментальных животных, леченных экстрактом кожицы Poria cocos, после индукции у них симптомов болезни Альцгеймера после введения бета-амилоида в головной мозг.
ФИГ. 5 представляет собой график, отражающий результаты теста «Распознавание новых объектов» (РНО) у экспериментальных животных, леченных экстрактом кожицы Poria cocos, после введения бета-амилоида в головной мозг для индукции у них симптомов болезни Альцгеймера.
ФИГ. 6 представляет собой график, отражающий результаты теста окрашивания нейронных клеток экспериментальных животных, леченных экстрактом кожицы Poria cocos, после введения бета-амилоида в головной мозг для индукции у них симптомов болезни Альцгеймера.
ФИГ. 7 представляет собой график, отражающий результаты измерений концентрации бета-амилоида после лечения здоровых животных экстрактом кожицы Poria cocos.
ФИГ. 8 представляет собой график, отражающий результаты измерений концентрации НРФ после лечения здоровых животных экстрактом кожицы Poria cocos.
ФИГ. 9 представляет собой график, отражающий результаты измерений активности AChE после обработки нейронной клеточной линии SH-SY5Y экстрактом кожицы Poria cocos.
ФИГ. 10 представляет собой график, отражающий результаты измерений степени апоптоза в МТТ-тесте после обработки нейронной клеточной линии SH-SY5Y экстрактом кожицы Poria cocos.
ФИГ. 11 представляет собой график, отражающий результаты измерений степени фосфорилирования тау-белка после обработки нейронной клеточной линии SH-SY5Y экстрактом кожицы Poria cocos.
ФИГ. 12 представляет собой график, отражающий результаты измерений концентрации НРФ после обработки нейронной клеточной линии SH-SY5Y экстрактом кожицы Poria cocos.
Принцип изобретения
Далее настоящее изобретение описано подробно.
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения дегенеративных неврологических заболеваний, содержащей в качестве действующего вещества экстракт кожицы Poria cocos.
Экстракт кожицы Poria cocos согласно настоящему изобретению может быть получен в соответствии с обычным способом приготовления лекарственных растительных экстрактов, но конкретно означает экстракт, полученный с использованием воды, спирта или смеси воды и спирта. Спирт, который является одним из экстракционных растворителей, может быть, в том числе, низшим спиртом, имеющим от 1 до 4 атомов углерода, предпочтительно метанолом, этанолом, бутанолом или винным спиртом, предпочтительно этанолом. Винный спирт здесь означает этанол, полученный ферментированием крахмального или сахаридного сырья с последующей дистилляцией. Также смешанный растворитель из воды и спирта не ограничивается особым образом, и смесь может иметь любое желаемое соотношение.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения экстракт кожицы Poria cocos может быть экстрагирован смесью, содержащей от 60 до 80% этанола (по объему), от 65 до 75% этанола (по объему) или 70% (по объему), не ограничиваясь перечисленным.
Более конкретно, экстракт кожицы Poria cocos согласно настоящему изобретению может быть получен следующим образом. Сначала Poria cocos по настоящему изобретению промывают и высушивают, затем высушенное лекарственное растительное сырье нарезают с получением измельченного лекарственного растительного сырья. К измельченному сырью Poria cocos добавляют воду в количестве, в 1÷20 (об./масс.) раз большем массы этого сырья, предпочтительно в 5÷10 (об./масс.) раз большем массы этого сырья, или низший спирт, содержащий от 1 до 4 атомов углерода, или смесь воды и низшего спирта, содержащего от 1 до 4 атомов углерода, предпочтительно 70% (об./об.) этанола. Смесь экстрагируют при температуре от 10°С до 100°С, предпочтительно при комнатной температуре в течение от 1 до 72 часов, предпочтительно в течение 48 часов, используя либо холодную экстракцию, экстракцию горячей водой, ультразвуковую экстракцию, экстракцию с обратным холодильником, экстракцию с отводом тепла, суперкритическую экстракцию, экстракцию с горячей водой, предпочтительно один раз при помощи холодной экстракции, и концентрируют при пониженном давлении с получением экстракта кожицы Poria cocos.
Полученный в соответствии с настоящим изобретением экстракт кожицы Poria cocos может быть использован в качестве действующего вещества для лечения дегенеративных неврологических заболеваний. Соответственно, в настоящем изобретении предложены фармацевтическая композиция для профилактики и лечения дегенеративных неврологических заболеваний, которая включает экстракт кожицы Poria cocos в качестве действующего вещества, использование экстракта кожицы Poria cocos для приготовления лекарственного средства для применения при дегенеративных неврологических заболеваниях и способ лечения дегенеративного неврологического заболевания, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества экстракта кожицы Poria cocos.
Как указано выше, «дегенеративное неврологическое заболевание» в соответствии с настоящим изобретением означает дегенеративное заболевание, влияющее на ментальную функцию и вызванное постепенной структурной и функциональной потерей нервных клеток (нейронов). В частности, это понятие включает в себя заболевания из группы, в которую входят болезнь Альцгеймера, болезнь Крейтцфельдта-Якоба, болезнь Хантингтона, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре, болезнь Паркинсона, болезнь Лу Герига, прогрессирующая деменция, вызванная постепенной гибелью нейронов и прогрессирующая атаксия.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция для профилактики и лечения дегенеративных неврологических заболеваний может содержать в качестве действующего вещества в том числе экстракт кожицы Poria cocos в количестве от 0,01 до 90 массовых частей, или от 0,1 до 90 массовых частей, или от 1 до 90 массовых частей или от 10 до 90 массовых частей экстракта кожицы Poria cocos, на 100 массовых частей конечной фармацевтической композиции, которое может изменяться в зависимости от состояния, типа и прогрессирования заболевания.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция для профилактики и лечения дегенеративных неврологических заболеваний, содержащая в качестве действующего вещества экстракт кожицы Poria cocos может быть включена в состав фармацевтических препаратов для профилактики и лечения дегенеративных неврологических расстройств, включающих подходящие для фармацевтического применения носители, разбавители или вспомогательные вещества (эксципиенты).
Примерами носителей, вспомогательных веществ и разбавителей являются лактоза, декстроза, сахароза, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, аравийская камедь, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон, вода, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.
Также композиция по настоящему изобретению может быть включена в состав фармацевтических препаратов в форме порошков, гранул, таблеток, капсул, суспензий, эмульсий, препаратов для приема внутрь, таких как сиропы и аэрозоли, в форме препаратов для наружного применения, суппозиториев или стерилизованных растворов для инъекций. Как правило, лекарственную форму можно получить, используя обычно применяемые разбавители, такие как наполнитель, экстендер, связующее вещество, смачивающее вещество, разрыхлитель, поверхностно-активное вещество или вспомогательное вещество. К твердым лекарственным формам для приема внутрь относятся таблетки, пилюли, порошки, гранулы, капсулы и тому подобное; они могут содержать, по меньшей мере, одно вспомогательное вещество, например, крахмал, карбонат кальция, сахарозу, лактозу, желатин и тому подобное. В дополнение к простым наполнителям также могут использоваться лубриканты (смазывающие вещества), такие как стеарат магния и тальк. Примеры жидких лекарственных форм для приема внутрь включают в себя суспензии, растворы, эмульсии и сиропы, а различные вспомогательные вещества включают в себя увлажняющие вещества, сахарозаменители, ароматизаторы, консерванты и т.д. в дополнение к обычно используемым простым разбавителям, таким как вода и вазелиновое масло. К препаратам для парентерального введения относятся стерилизованные водные растворы, неводные растворы, суспензии, эмульсии, лиофилизированные препараты и суппозитории. Примерами суспендирующих веществ являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, например, оливковое масло, эфир для инъекционных лекарственных средств, например этилолеат, и так далее. Примеры основ для суппозиториев включают в себя витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лаурин и глицерожелатин.
Дозировка фармацевтической композиции для профилактики и лечения дегенеративных неврологических заболеваний, содержащей в качестве действующего вещества экстракт кожицы Poria cocos, согласно настоящему изобретению, может варьироваться в зависимости от возраста, пола и массы тела пациента. В целом, дозировка составляет от 0,1 до 100 мг/кг, предпочтительно от 1 до 30 мг/кг, с введением один или несколько раз в день. Дозировка может быть увеличена или уменьшена в зависимости от способа введения, степени тяжести заболевания, пола, массы тела, возраста, состояния здоровья, диеты, времени и способа введения, скорости выведения и т.д. Следовательно, дозировка никаким образом не ограничивает объем раскрытия изобретения.
Фармацевтическая композиция для профилактики и лечения дегенеративных неврологических заболеваний, содержащая экстракт кожицы Poria cocos согласно настоящему изобретению, может вводиться различными способами млекопитающим, таким как крысы, мыши, домашний скот, человек. Могут рассматриваться все способы введения, например, пероральное, ректальное или внутривенное, внутримышечное или подкожное введение, внутриутробная дуральная или интрацеребральная инъекция.
Экстракт кожицы Poria cocos в соответствии с настоящим изобретением имеет небольшую токсичность и побочные эффекты, поэтому его можно безопасно использовать для долгосрочного применения в профилактических целях.
Настоящее изобретение также предлагает пищевую композицию, включающую экстракт кожицы Poria cocos. Экстракт кожицы Poria cocos подавляет образование веществ, вызывающих гибель нейронов в мозге и способствует экспрессии белков, стимулирующих регенерацию и дифференциацию нейронов для защиты нервных клеток и может эффективно использоваться для производства продуктов здорового функционального питания и обычных продуктов питания, которые могут обладать, в частности, профилактическими и лечебными свойствами, при нейродегенеративных заболеваниях.
В частности, оздоровительный функциональный продукт питания, указанный в настоящем изобретении, определяется как «оздоровительный функциональный продукт питания, который включен в список Регламента, касающегося компонентов продуктов оздоровительного питания, или подтверждения о принадлежности, регулируемого Уведомлением Корейского управления по контролю за продуктами и лекарственными препаратами 2004-12 полного подтверждения функциональности и безопасности для организма человека», который был введен после «Регламента по оздоровительным функциональным продуктам питания в 2002 г.».
Полученная в соответствии с настоящим изобретением пищевая композиция, содержащая в качестве действующего вещества экстракт кожицы Poria cocos, может быть использована для лечения дегенеративных неврологических заболеваний. Пищевыми продуктами, к которым может быть добавлен лекарственный растительный экстракт согласно настоящему изобретению, являются различными продукты, такие как напитки, леденцы, чай, витаминные комплексы, продукты и напитки здорового функционального питания, их также можно использовать в виде пилюль, порошков, гранул, инъекционных препаратов, таблеток, капсул или напитков.
Обычно экстракт кожицы Poria cocos согласно настоящему изобретению может добавляться в композицию оздоровительного питания в количестве от 0,1% до 15% по массе, предпочтительно от 0,2% до 10%, а в случае композиции для напитка для здорового функционального питания - от 0,1 г до 30 г, предпочтительно от 0,2 г до 5 г, на объем 100 мл.
Когда пищевая композиция в соответствии с настоящим изобретением готовится в форме напитка, отсутствуют особые ограничения на жидкие ингредиенты, отличные от тех, которые содержат растительные экстракты в качестве основных ингредиентов в указанной пропорции. Кроме того, в качестве дополнительного ингредиента к обычным напитками могут добавляться различные ароматизаторы или натуральные углеводы.
Примеры вышеупомянутых натуральных углеводов включают в себя моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза; дисахариды, такие как мальтоза, сахароза; полисахариды; декстрин, циклодекстрин и тому подобное, или сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит и эритрит. В качестве натуральных ароматизаторов, кроме упомянутых выше, могут с успехом использоваться натуральные ароматизаторы (тауматин, экстракт стевии (например, ребаудиозид А, глицирризин, и т.д.)) и синтетические ароматизаторы (сахарин, аспартам и т.д.). Соотношение натуральных углеводов обычно около 1-20 г, предпочтительно около 5-12 г на 100 мл готовой композиции согласно настоящему изобретению.
В дополнение к вышеописанному, пищевая композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать различные добавки, такие как различные нутриенты, витамины и минералы (электролиты), ароматизаторы, такие как синтетические и натуральные ароматизаторы, красители и загустители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновая кислота и ее соли, альгиновая кислота и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы pH, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирты, карбонатные агенты, используемые в газированных напитках, и тому подобное. Кроме того, композиции согласно настоящему изобретению могут содержать натуральные фруктовые соки и мякоть для производства фруктовых соков и овощных напитков. Эти компоненты могут использоваться по отдельности или в комбинации. Соотношение таких добавок особо не ограничивается, но обычно выбирается в диапазоне от 0 до примерно 20 массовых частей на 100 массовых частей готовой пищевой композиции согласно настоящему изобретению.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение является способом профилактики, улучшения или лечения дегенеративных неврологических заболеваний, заключающимся в введении композиции, содержащей действующее вещество в виде экстракта кожицы Poria cocos. В других вариантах настоящее изобретение предлагает использование экстракта кожицы Poria cocos для профилактики, облегчения или лечения дегенеративных неврологических заболеваний. Дозировка, лекарственная форма, способ введения и прочее композиции, содержащей экстракт кожицы Poria cocos для такого способа или использования, такие же, как указано выше.
ПОДРОБНОЕ РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение будет более подробно раскрыто со ссылкой на следующие примеры и эксперименты. Однако следующие примеры и эксперименты только иллюстрируют настоящее изобретение, область действия настоящего изобретения ими не ограничена.
Пример 1. Приготовление экстракта кожицы Poria cocos в соответствии с настоящим изобретением
Высушенная кожица Poria cocos была приобретена в магазине лекарственных трав на рынке Kyungdong, для экспериментов использовали тщательно освобожденное от загрязнений и хорошо высушенное растительное сырье. Измельченную кожицу Poria cocos в количестве 100 г перемешали с 1 л дистиллированной воды (ДВ), или 30, 50, 70 или 95 (об)% водным раствором спирта, и смесь оставили при комнатной температуре на 48 часов. После фильтрации смесь концентрировали при пониженном давлении и затем лиофилизировали с получением экстрактов кожицы Poria cocos (неочищенные экстракты) для Примера 1 (см. таблицу 1).
Пример 1. Проверка эффекта улучшения памяти и цитопротекторного действия на нервные клетки кожицы Poria cocos
1-1. Подготовка экспериментальных животных с нарушением памяти под действием скополамина
Для эксперимента использовали шестинедельных мышей линии ICR, каждая экспериментальная группа состояла из 8 животных.
Через 30 минут после введения экстракта кожицы Poria cocos и препарата сравнения, внутрибрюшинно вводили скополамин в дозе 1 мг/кг (в/б). Контрольным животным вводили такое же количество физиологического раствора.
Поведенческие исследования проводились через 30 минут введения скополамина.
Модель с инъекцией Аβ
42
Для эксперимента использовали шестинедельных мышей линии ICR. Животных анестезировали, фиксировали в стереотаксическом аппарате (Stoelting) и вводили 3 мкл носителя (искусственная спинномозговая жидкость) или Аβ в течение 6 минут с помощью микрошприца Гамильтон (с иглой калибра 26).
42
42
Животных, которым был введен препарат Аβ, случайным образом распределяли в экспериментальные группы. Спустя 2 дня после введения Аβэкспериментальный препарат и положительный контрольный препарат (Донепезил) вводили один раз в день в течение 11 дней.
Лиофилизированный препарат, этанольные экстракты кожицы Poria cocos и контрольный препарат суспендировали в 3% водном растворе ГПМЦ (гидрокси пропил метил целлюлоза, НРМС), все препараты готовили в день эксперимента.
Измерение белка в головном мозге
Для исследования влияния экстрактов кожицы Poria cocos на выработку индуктора гибели нервных клеток и веществ, участвующих в защите клеток, шестинедельным мышам линии ICR в течение 5 дней вводили экстракт кожицы Poria cocos и контрольный препарат. На 5-й день через 4 часа после введения экспериментальных животных умерщвляли и отделяли головной мозг. Отделяли область гиппокампа и использовали для анализа белка. Для испытуемого образца проводили анализ для количественного определения общего содержания белка. Измеренные значения выражали как относительное количество белка.
1-2. Тест с пассивным избеганием
Эксперименты с пассивным избеганием проводились в двух независимо разделенных освещенном и темном квадратных боксах. Освещенные области (20×20×20 см) освещались лампами накаливания мощностью 50 Вт. Светлые и темные области (20×20×20 см) были расположены на расстоянии 1 см друг от друга, для чего были установлены 2 мм стержни из нержавеющей стали.
В фазе адаптации две секции разделялись гильотинной дверью (5×5 см), гильотинная дверь открывалась через 30 секунд после помещения экспериментальных животных в светлую область. Животные могли свободно перемещаться. Когда они достигли темной области, гильотинная дверь закрывалась и животных извлекали через 3 секунды.
Испытания по формированию рефлекса проводили спустя 24 часа. Через 30 минут после введения препарата и контрольного препарата вводили внутрибрюшинно 1 мг/кг скополамина, а через 30 минут проводили поведенческий эксперимент. Экспериментальных мышей первоначально размещали в освещенной области, через 30 секунд дверка между областями открывалась. После того, как экспериментальные мыши входили в темную область, гильотинная дверь закрывалась и немедленно применялось электроболевое раздражение лап животных через стержень из нержавеющей стали в течение 2 секунд с интенсивностью 0,5 мА, измеряли время, необходимое экспериментальным животным для входа в темную область.
После проведения опытов по формированию рефлекса и 24-часового периода отдыха экспериментальных животных помещали в освещенную область для определения сохранения рефлекса и измеряли время, необходимое экспериментальным животным для входа в темную область. Как в опытах по формированию, так и в опытах по сохранению рефлекса определяли время, необходимое для того, чтобы мышь вошла всеми четырьмя лапами в темную область из светлой области.
В результате, как показано на ФИГ. 1, было подтверждено существенное улучшение пространственной памяти после введения внутрь водно-этанольных (этанол 0, 30, 50, 70 и 95% (по объему)) экстрактов кожицы Poria cocos. Наиболее сильным действием обладал 70% этанольный экстракт кожицы Poria cocos, сходным с действием препарата донепезил (DPZ) 1 мг/кг, известным ингибитором ацетилхолинэстеразы (Фиг. 1).
1-3. Тест с Y-образным лабиринтом
Эксперимент с Y-образным лабиринтом проводили для исследования влияния на кратковременную память. Животных помещали в одну из ветвей Y-образного лабиринта и оставляли на 8 минут без ограничения перемещения. Измеряли спонтанное чередование и общее количество вхождений. Когда животные последовательно входили в три ветви, это определялось как чередующееся вхождение, и следующее отношение рассчитывали соотношение по формуле 1.
[Формула 1]
Отношение спонтанного чередования (%) = [(количество изменений) / (Общее количество вхождений в ветвь - 2)]×100
42
В результате, как показано на ФИГ. 2, введение внутрь водно-этанольных (этанол 0, 30, 50, 70 и 95% (по объему)) экстрактов кожицы Poria cocos в дозе 100 мг/кг приводит к улучшению пространственной памяти у экспериментальных животных с ингибированной вследствие введения скополамина функцией памяти. Как показано на Фиг. 4, пространственная память также восстанавливалась на модели болезни Альцгеймера, вызванной введением Aβ (Фиг. 2 и 4).
1-4. Тест на распознавание новых объектов (РНО)
Внутри черного ящика шириной 45 см, длиной 45 см, высотой 50 см устанавливали два пластиковых объекта того же размера, но разной формы. Экспериментальным животным было позволено свободно перемещаться в течение 8 минут. Измеряли время, затрачиваемое на каждый предмет (тренировка). Через 24 часа экспериментальных животных помещали в ящик с одним знакомым на этапе тренировки предметом и одним новым предметом. Измеряли время, затрачиваемое на каждый предмет (время проверки). Полученные значения использовали для расчета по формуле (2), которая выражает результат распознавания нового объекта.
[Формула 2]
Скорость распознавания новых объектов (%) = Время, затраченное на новые объекты / (Время, затраченное на новые объекты + Время, затраченное на знакомые объекты)×100
42
Как показано на ФИГ. 3, введение внутрь водно-этанольных (этанол 0, 30, 50, 70 и 95% (по объему)) экстрактов кожицы Poria cocos в дозе 100 мг/кг приводит к улучшению когнитивной памяти у экспериментальных животных с ингибированной вследствие введения скополамина функцией памяти. Как показано на ФИГ. 5, на модели болезни Альцгеймера, вызванной введением Aβ, также отмечено восстановление когнитивной памяти (ФИГ. 3, 5).
1-5. Иммуногистохимическое окрашивание
2
2
2
2
Для иммуногистохимического окрашивания животным с введенным Аβ, как описано в Экспериментальном примере 1-1, выполняли перфузию 1×ФСБР (фосфатно-солевой буферный раствор), фиксировали 4% параформальдегидом, после чего удаляли головной мозг. Головной мозг фиксировали в том же растворе в течение одного дня и хранили в 30%-ном растворе сахарозы, раствор меняли каждые два дня до замораживания при 4°С. После этого мозговую ткань замораживали до нужной степени при -20°С, помещая в криостат в среду для быстрого замораживания до ОСТ (оптимальная температура резки), затем получали срезы толщиной 30 мкм и хранили при 4°С в растворе консерванта. Выполняли иммуногистохимическое окрашивание срезов из области гиппокампа. Ткани, промытые ФСБР, обрабатывали 1% HOв течение 15 минут, после чего ткани обрабатывали 0,05 М ФСБР, 1,5% раствором нормальной сыворотки козы 1,5%, 0,5 мг/мл раствором бычьего сывороточного альбумина, 0,3% раствором тритона Х-100 и раствором первичного козьего антитела NeuN (1:500) и обрабатывали при 4°С в течение 24 часов для предотвращения неспецифических реакций. После вымывания первичного антитела, ткани обрабатывали вторичным антителом, конъюгированным с пероксидазой (1:200) в течение 90 минут, ABC разбавляли буферным раствором и оставляли для протекания в течение 1 часа. После трехкратной промывки с помощью ФСБР, ткань проявляли с 0,02% раствора DAB и 0,01% HO и проводили обезвоживание этанолом и ксилолом для получения микроскопических препаратов.
В результате, как показано на ФИГ. 6, при введении внутрь водно-этанольных экстрактов кожицы Poria cocos (этанол 0, 30, 50, 70 и 95 (об.)%) в дозе 100 мг/кг по действием повышенной токсичности бета-амилоида существенно снижалось количество нейронов (NeuN положительные) (Фиг. 6). Было подтверждено, что экстракт кожицы Poria cocos обладает протекторным эффектом на нервные клетки и может повышать емкость памяти.
1-6. Измерение образования Аβ в головном мозге
Для оценки ингибирующего действия экстрактов кожицы Poria cocos на образование бета-амилоида, который известен как основная причина развития болезни Альцгеймера, были проведены эксперименты с использованием ИФА (ELISA).
40
Экстрагировали головной мозг здоровых животных, указанных в Экспериментальном примере 1-1, добавляли RIPA-буфер и гомогенизировали механическим способом. После центрифугирования отбирали супернатант и измеряли концентрацию бета-амилоида (IBL). Измеряли количество образовавшегося Аβ в 1 мг белка.
В результате, как показано на ФИГ. 7, введение внутрь водно-этанольного экстракта (этанол 0, 30, 50, 70 и 95% (по объему)) кожицы Poria cocos в дозе 100 мг/кг существенно снижало концентрацию бета-амилоида в мозге (Фиг. 7). На основании приведенных выше результатов было сделано заключение, что экстракт кожицы Poria cocos удалял бета-амилоид, который является причиной деменции болезни Альцгеймера.
1-7. Измерение уровня НРФ (нейротрофический ростовой фактор)
Для подтверждения действия экстракта кожицы Poria cocos на образование НРФ, который, как известно, обладает регенерирующим и дифференцирующим действием на нейроны, были проведены эксперименты с использованием ИФА. После экстрагирования головного мозга здоровых животных в Экспериментальном примере 1-1, отделяли область гиппокампа, добавляли RIPA-буфер и гомогенизировали механическим способом. Для измерения НРФ в зависимости от массы каждого головного мозга добавляли соответствующее количество буфера с высоким содержанием соли и детергента и гомогенизировали механическим способом. После добавления 10 мкл 4N HCl смесь оставляли на 15 минут, диссоциировалось связывание НРФ с рецептором, добавляли 4N NaOH и смесь оставляли еще на 15 минут. Отбирали супернатант после центрифугирования и концентрацию НРФ измеряли в головном мозге с использованием набора для измерения НРФ (Millipore).
В результате, как показано на ФИГ. 8, введение внутрь водно-этанольных экстрактов (этанол 0, 30, 50, 70 и 95 (об.%) в дозе 100 мг/кг приводило к существенному снижению концентрации НРФ в головном мозге. Данные результаты свидетельствуют о том, что экстракты кожицы Poria cocos способствуют защите нервных клеток, способствуя образованию НРФ.
Пример 2. Подтверждение протекторного эффекта экстрактов кожицы Poria cocos в условиях in vitro на клетках нейробластомы
2-1. Измерение активности ацетилхолинэстеразы (AChE) в нейронных клеточных линиях
6
3
4
Были разработаны и используются различные ингибиторы ацетилхолестеразы, поскольку они увеличивают объем памяти и улучшают деменцию, активируя холинергические нейроны, увеличивая концентрацию ацетилхолина в нейротрансмиттере ганглия. Измерение активности ацетилхолинэстеразы проводили для подтверждения ингибирующего действия экстракта кожицы Poria cocos на ацетилхолинэстеразу. Нейронная клеточная линия, клетки SH-SY5Y, были закуплены в KCLB (Корейский банк клеточных линий). Клетки SH-SY5Y (1×10 кл./лунка) инокулировали в 6-и луночных культуральных планшетах и культивировали в течение 48 часов в среде DMEM/F12 (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла: питательная смесь F12), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Через 5 дней дифференциации с использованием среды DMEM/F12, содержащей 10 мкМ ретиноевой кислоты и 3% ФБС, клетки обрабатывали экстрактом кожицы Poria cocos (10, 100 мкг/мл). Лизис клеток выполняли с использованием RIPA-буфера (смесь ингибиторов протеаз: 150 мМ NaCl, 0,5% тритона Х-100, 50 мМ трис-HCl, pH 7,4, 25 мМ NaF, 20 мМ EGTA, 1 мМ DTT, 1 мМ NaVO) и содержание белка количественно определяли с использованием ВСА реагента, закупленного от компании Pierce. Активность ацетилхолинэстеразы определяли при помощи ацетилхолина как субстрата в соответствии с методом Элмана. Тиохолин, полученный под действием ацетилхолинэстеразы, подвергали взаимодействию с DTNB и полученный 5-тио-2-нитробензоат определяли путем измерения изменения оптической плотности при 405 нм.
42
В результате, как показано на ФИГ. 9, в случае обработки нейронных клеточных линий водно-этанольными (0, 30, 50, 70, 95 (об)%) экстрактами кожицы Poria cocos в концентрации 10 мкг/мл, индуцированная Аβактивность ацетилхолинэстеразы была снижена до нормального уровня (Фиг. 9).
2-2. Цитопротекторный эффект на модели нейронной клеточной линии
42
42
4
Цитопротекторный эффект экстрактов кожицы Poria cocos peel измеряли с использованием МТТ-теста (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида) на модели токсического поражения нервных клеток, вызванных веществом, которое искусственно вызывает агрегацию Аβ. Клетки SH-SY5Y (1×10 кл./лунка) инокулировали в 96-и луночных культуральных планшетах и культивировали в течение 48 часов в среде DMEM/F12 (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла: питательная смесь F12), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Через 5 дней обработки с использованием среды DMEM/F12, содержащей 10 мкМ ретиноевой кислоты и 3% ФБС, клетки обрабатывали экстрактом кожицы Poria cocos в концентрации 0,01, 0.1, 1, 10, 100 и 200 мкг/мл и оставляли на 6 часов. После этого клетки обрабатывали Аβ и культивировали в общем в течение 48 часов. После 4 часов обработки 2 мг/мл МТТ формазон растворяли в ДМСО и измеряли оптическую плотность при 590 нм.
42
Как показано на ФИГ. 10, после обработки клеток водно-этанольными (этанол 0, 30, 50, 70 и 95 (об) %) экстрактами кожицы Poria cocos в концентрации 10 мкг/мл цитотоксичность, вызванная Аβ, снижалась зависящим от концентрации образом, а также повышалось количество клеток (ФИГ. 10).
2-3. Измерение фосфорилированного тау-белка в нейронных клеточных линиях
6
Уровни фосфорилированного тау-белка измеряли с целью подтверждения ингибиторного эффекта экстрактов кожицы Poria cocos на гиперфосфорилирование тау-белка. Клетки SH-SY5Y (1×10 кл./лунка) инокулировали в 6-и луночных культуральных планшетах и культивировали в течение 48 часов в среде DMEM/F12 (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла: питательная смесь F12), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Через 5 дней дифференциации с использованием среды DMEM/F12, содержащей 10 мкМ ретиноевой кислоты и 3% ФБС, через 6 часов после обработки экстрактами кожицы Poria cocos (10 или 100 мкг/мл), клетки обрабатывали Аβ42 и в культивировали в целом в течение 48 часов. После лизиса клеток с использованием RIPA-буфера, содержание белка количественно определяли с использованием ВСА реагента, закупленного от компании Pierce. Уровни фосфорилированного тау-белка измеряли с использованием набора для анализа Тау [pS199] при помощи иммуносорбентного анализа (ИФА), закупленного в компании Invitrogen.
42
Как показано на ФИГ. 11, после обработки нейронных клеточных линий водно-этанольными (этанол 0, 30, 50, 70 и 95 (об) %) экстрактами кожицы Poria cocos в концентрации 10 мкг/мл индуцированное Аβ фосфорилирование тау-белка было подавлено и восстановлено до нормального уровня. Донепезил, который широко используется для лечения деменции, типичного дегенеративного заболевания головного мозга, не оказывал ингибирующего влияния на фосфорилирование тау-белка (Фиг. 11).
2-4. Измерение уровня нейротрофического ростового фактора (НРФ) в нейронных клеточных линиях
6
Уровни НГФ измеряли с целью определения механизма когнитивного улучшения экстрактов кожицы Poria cocos. Клетки SH-SY5Y (1×10 кл./лунка) инокулировали в течение 48 часов в 6-и луночных планшетах в среде DMEM/F12 (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки. Через 5 дней дифференциации с использованием среды DMEM/F12, содержащей 10 мкМ ретиноевой кислоты и 3% ФБС, клетки обрабатывали экстрактом кожицы Poria cocos (10 или 100 мкг/мл). Лизис клеток осуществляли с использованием RIPA-буфера, содержание белка количественно определяли с использованием ВСА реагента, закупленного от компании Pierce. Уровни НГФ измеряли с использованием закупленного в компании Abcam набора для определения ростового фактора бета-нервов человека человека посредством ферментного (твердофазного) иммуносорбентного анализа (ИФА).
Как показано на ФИГ. 12, образование НРФ было существенно увеличено в нейронной клеточной линии после обработки клеток водно-этанольными (этанол 0, 30, 50, 70 и 95 (об) %) экстрактами кожицы Poria cocos в концентрации 10 мкг/мл. Донепезил, который широко используется для лечения деменции, типичного дегенеративного заболевания головного мозга, не оказывал влияния на НРФ (Фиг. 12).
Как описано выше, экстракты кожицы Poria cocos в соответствии с настоящим изобретением препятствуют возникновению или развитию заболевания путем ингибирования образования бета-амилоида и фосфорилирования тау-белка, которые вызывают дегенеративные заболевания головного мозга вследствие гибели нейронов, и усиливает функцию памяти за счет ингибирования ацетилхолинэстеразы. Это также способствует образованию НРФ, который способствует защите нейронов и нейронной дифференциации. Таким образом, изобретение может быть использовано для профилактики, улучшения состояния и лечения прогрессирующей вследствие постепенной гибели нейронов деменции не только при таком заболевании как болезнь Альцгеймера, но и при болезни Крейтцфельдта-Якоба, болезни Хантингтона, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре, болезнь Паркинсона, болезнь Лу Герига. Может также использоваться для профилактики, улучшения состояния и лечения дегенеративных неврологических заболеваний, включая расстройства позы и движения, прогрессирующую атаксию, мышечную атрофию и слабость, а также сенсорные и двигательные расстройства.
Далее приводится описание получения примера композиции, содержащей экстракты кожицы Poria cocos по примеру 1 настоящего изобретения, но это лишь подробное описание настоящего изобретения и настоящее изобретение этим не ограничено.
Приготовление Примера 1: Приготовления раствора для инъекций
Экстракт по Примеру 1
100 мг
Натрия метабисульфит
3,0 мг
Метилпарабен
0,8 мг
Пропилпарабен
0,1 мг
Стерилизованная дистиллированная вода для инъекций
Соответствующее количество
Описанные выше компоненты перемешивали и превращали в раствор объем 2 мл с помощью обычного способа приготовления раствора для инъекций. Затем смесь фасовали в ампулу вместимостью 2 мл и стерилизовали для получения раствора для инъекций.
Приготовление Примера 2: Приготовление таблеток
Экстракт по Примеру 1
200 мг
Лактоза
100 мг
Крахмал
100 мг
Стеарат магния
Соответствующее количество
Описанные выше компоненты перемешивали и прессовали в таблетки с помощью обычного способа приготовления таблеток.
Приготовление Примера 3: Приготовление капсул
Экстракт по Примеру 1
100 мг
Лактоза
50 мг
Крахмал
100 мг
Тальк
2 мг
Стеарат магния
Соответствующее количество
Описанные выше компоненты перемешивали и фасовали в желатиновые капсулы с помощью обычного способа приготовления капсул.
Приготовление Примера 4: Приготовление раствора
Этанольный экстракт по Примеру 1
1000 мг
Сахар
20 г
Высокофруктозный сироп кукурузы
20 г
Лимонный ароматизатор
Соответствующее количество
Воды очищенной до общего объема раствора после добавления
100 мл
Описанные выше компоненты перемешивали с помощью обычного способа приготовления жидких препаратов, фасовали во флаконы темного стекла вместимостью 100 и стерилизовали с получением жидкого препарата.