МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ С УСИЛЕННЫМ ПРИРОДНЫМ СЛАДКИМ ВКУСОМ И ХОРОШЕЙ ТЕКСТУРОЙ
LACTIC ACID BACTERIA FOR PRODUCING FERMENTED FOOD PRODUCTS WITH INTENSIFIED NATURAL SWEET TASTE AND GOOD TEXTURE

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к штаммам бактерии Streptococcus thermophilus и к культурам со способностью усиливать сладкий вкус посредством выделения высоких уровней глюкозы, образованной посредством деградации лактозы, в комбинации с высокой текстурирующей способностью, к заквасочным культурам, содержащим такие штаммы, и к молочным продуктам, ферментированным данными культурами. Настоящее изобретение также относится к способу изготовления ферментированного молочного продукта и к применению таких штаммов для изготовления ферментированных молочных продуктов и для усиления сладкого вкуса ферментированных молочных продуктов при уменьшении содержания лактозы данных ферментированных молочных продуктов.
Предшествующий уровень техники
Чистые ферментированные молочные продукты распознаются по терпкому или кислому вкусу в результате превращения лактозы в молочную кислоту молочнокислыми бактериями во время ферментации. Следовательно, их часто подслащивают посредством добавления фруктов, меда, сахара или искусственных подсластителей для удовлетворения желания потребителей иметь продукт с более сладким вкусом.
В пищевой промышленности возрастает потребность в низкокалорийных пищевых продуктах со сладким вкусом для того, чтобы способствовать преодолению проблемы избыточного веса и ожирения, которые стали такими распространенными в последние 20 лет. Сладкий вкус, обычно рассматриваемый как доставляющее удовольствие ощущение, обеспечивается присутствием сахаров и немногих других веществ. Восприятие сладости сахаров очень отличается. Используя сахарозу в качестве контроля со значением 100, сладость лактозы составляет 16, галактозы - 32 и глюкозы - 74 (Godshall (1988). Food Technology 42(11):71-78). Глюкоза, таким образом, ощущается в 4 раза более сладкой, чем лактоза, все еще имея приблизительно такой же уровень калорий.
Сахар в ферментированных пищевых продуктах чаще заменяют подсластителями, такими как аспартам, ацесульфам K, сукралоза и сахарин, которые могут давать сладкий вкус с меньшим потреблением калорий. Однако применение искусственных подсластителей может приводить к постороннему привкусу, и несколько исследований, показывающих то, что потребление искусственных подсластителей связано с недостатками, такими как усиленное чувство голода, аллергии, рак и т.д., способствовало предпочтению потребителей в отношении ферментированных молочных продуктов, которые содержат только природные подсластители или, предпочтительно, не содержат добавленного подсластителя.
Таким образом, особая задача, требующая больших усилий, заключается в разработке ферментированных молочных продуктов, у которых имеется сильный природный (собственный) сладкий вкус.
Кислотность ферментированных молочных продуктов в значительной степени зависит от присутствующих молочнокислых бактерий и параметров способа, используемого для изготовления ферментированного молочного продукта.
Ферментация дисахарида лактозы очень хорошо исследована у молочнокислых бактерий, так как она является главным источником углерода в молоке. У многих видов лактоза после потребления расщепляется β-галактозидазой на глюкозу и галактозу. Глюкоза фосфорилируется глюкокиназой до глюкозо-6-фосфата и ферментируется посредством пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса (гликолиз) большинством молочнокислых бактерий (Фиг. 1).
Streptococcus thermophilus представляет собой одну из наиболее часто используемых молочнокислых бактерий для промышленной термофильной ферментации молока, где данный организм обычно используют как часть смешанной заквасочной культуры, причем другим компонентом являются виды Lactobacillus, например Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для йогурта или Lactobacillus helveticus для сыра швейцарского типа.
Стандартизованное определение йогурта во многих странах требует присутствия Streptococcus thermophilus, наряду с Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus. Оба вида генерируют желательные количества ацетальдегида, являющегося важным вкусоароматическим компонентом в йогурте.
Лактоза и сахароза легче ферментируются Streptococcus thermophilus, чем их составные моносахариды. В присутствии избытка галактозы ферментируется только глюкозная часть молекулы лактозы, и галактоза накапливается в ферментированных молочных продуктах при использовании Streptococcus thermophilus. В йогурте, где высокие концентрации кислоты ограничивают ферментацию, остается свободная галактоза, тогда как свободная галактоза, продуцируемая на ранних стадиях изготовления швейцарского сыра, позднее ферментируется Lactobacillus helveticus.
Однако, несколькими исследователями были описаны штаммы как Streptococcus thermophilus, так и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, ферментирующие галактозу (Hutkins et al. (1986) J. Dairy Sci. 69(1):1-8; Vaillancourt et al. (2002) J. Bacteriol. 184(3); 785-793), и в WO 2011/026863 (Chr. Hansen) описан способ получения штаммов Streptococcus thermophilus, которые ферментируют галактозу.
Для того чтобы удовлетворять требованиям пищевой промышленности, стало актуальным предлагать новые штаммы, в частности штаммы Streptococcus thermophilus и штаммы Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, которые обеспечивают более природный сладкий вкус без дополнительных калорий непосредственно в ферментированном продукте (собственный сладкий вкус) посредством выделения глюкозы.
Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8(5); 456-464) раскрывают штамм Lactococcus lactis, в котором полностью нарушен метаболизм глюкозы посредством делеции генов, кодирующих глюкокиназу, EII(man/glc) и недавно открытую глюкозо-PTS EII(cel). Способом конструирования является генетическая рекомбинация для получения всех мутаций, и полученный в результате штамм, следовательно, является генетически модифицированным организмом (ГМО), который в настоящее время не может быть использован в пищевых продуктах.
Thompson et al. (1985. J Bacteriol. 162(1); 217-223) исследовали метаболизм лактозы у Streptococcus lactis (в настоящее время переименован в Lactococcus lactis). В данной работе использовали 2-дезоксиглюкозу для получения мутанта в системе маннозо-PTS. Затем данный мутант был подвергнут мутагенезу ультрафиолетовым излучением (УФ), с последующим скринингом на глюкозонегативные колонии посредством получения отпечатков. Этим способом был выделен двойной мутант (маннозо-PTS и глюкокиназа). Данный двойной мутант использовали для исследования механизмов, участвующих в регуляции ферментации лактозы «заквасочными» организмами. Данные мутанты имеют несколько недостатков по сравнению с их родительским штаммом, которые делают их неподходящими для включения в имеющуюся в продаже заквасочную культуру. Выход клеток мутантов составлял половину от выхода родительского штамма на моль ферментированной лактозы, и у мутантов было значительно увеличено время удвоения при выращивании на лактозе. Подобным образом, выход молочной кислоты составлял половину от выхода родительского штамма на моль ферментированной лактозы. Поведение данных штаммов в молоке не анализировали, но предполагается, что скорость подкисления была бы значительно снижена.
Кроме того, Lactococcus lactis обычно не выбирают для продуцирования ацетальдегида, и он не обеспечивает выполнение требований в отношении стандартизованного определения йогурта.
Chervaux et al. (2000. Appl. And Environ. Microbiol., 66, 5306-5311) исследовали физиологию штаммов Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus в новой химически определенной среде и выделили мутантов, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе, которые были дефицитными по ферментации глюкозы. Наблюдали несколько разных фенотипов, и были описаны специфичные для штаммов эффекты.
В WO 2013/160413 раскрыты штаммы Streptococcus thermophilus и штаммы Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus с улучшенными свойствами в отношении природного подслащивания пищевых продуктов и уменьшения содержания лактозы ферментированного молока, а также способ скрининга и выделения таких штаммов.
В WO 2015/193449 раскрыт способ изготовления ферментированного молочного продукта с очень низкой концентрацией лактозы с использованием комбинации лактазы и молочнокислых бактерий с недостаточностью в метаболизме глюкозы.
В WO 2015/193459 раскрыт способ изготовления ферментированного молочного продукта с пониженным уровнем последующего закисления с использованием смеси четырех штаммов молочнокислых бактерий с недостаточностью в метаболизме глюкозы.
В WO 2011/026863 раскрыты штаммы Streptococcus thermophilus с улучшенными текстурирующими свойствами, несущие мутации в области промотора гена галактокиназы (GALK).
В WO 2011/092300 раскрыты штаммы Streptococcus thermophilus с улучшенными текстурирующими свойствами, отобранные на основе устойчивости к фагу. Улучшенные текстурирующие свойства являются результатом повышенного продуцирования бактериями экзополисахаридов (EPS).
Краткое изложение сущности изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены штаммы Streptococcus thermophilus, которые имеют улучшенные свойства усиления природного сладкого вкуса пищевых продуктов в комбинации с улучшенными текстурирующими свойствами. Неожиданно обнаружили, что штаммам Streptococcus thermophilus можно придавать как улучшенные свойства усиления природного сладкого вкуса пищевых продуктов, так и улучшенные текстурирующие свойства и, посредством этого, получать штаммы, которые имеют достаточную стабильность и скорость роста, так чтобы быть полезными для крупномасштабного производства ферментированных молочных продуктов. Это является неожиданным, так как каждая из обеих указанных способностей к усилению природного сладкого вкуса и улучшению текстуры требует фундаментальных изменений в метаболизме бактерий, причем каждое из них, как следует ожидать, причиняет бактериям такой стресс, который делает клетки нестабильными и/или уменьшает скорость роста клеток до уровня, не подходящего для промышленного производства.
В частности, для того чтобы ввести способность к усилению природного сладкого вкуса, штаммы Streptococcus thermophilus по настоящему изобретению были изменены таким образом, чтобы сделать их: 1) ферментирующими галактозу, 2) неспособными метаболизировать глюкозу, например, посредством мутации гена glcK, и, предпочтительно, 3) неспособными транспортировать глюкозу через клеточную мембрану в клетку. Ожидалось, что замена первичного углеводного источника бактерий с глюкозы, которая является предпочтительным углеводным источником бактерий, на галактозу, которая является значительно менее предпочтительным углеводным источником, в значительной степени снизит скорость роста и стабильность клеток.
Для того чтобы улучшить текстурирующие свойства штаммов Streptococcus thermophilus по настоящему изобретению, данные штаммы были модифицированы с введением мутации в промоторную область гена галактокиназы (galK), и было обнаружено, что такая мутация изменяет катаболизм галактозы таким образом, который приводит к усиленной продукции EPS. Опять же ожидалось, что усиленная продукция EPS значительно снизит скорость роста и стабильность клеток.
В итоге, неожиданно обнаружено, что штаммы Streptococcus thermophilus, подвергнутые комбинации изменений метаболических путей, описанных выше, имеют достаточную стабильность и скорость роста, для того чтобы быть полезными для промышленного производства.
Кроме того, неожиданно обнаружено, что изменение углеводного метаболизма бактерий, имея в виду две разные задачи, т.е. 1) увеличение продукции клетками EPS и 2) избежание катаболизма глюкозы и обеспечение катаболизма галактозы, не имеет каких-либо взаимных вредных эффектов друг на друга. В частности, ожидалось, что из доступного углеводного источника невозможно в одно и то же время образование в больших количествах и галактозы, и глюкозы, а также экзополисахарида (EPS). Таким образом, неожиданным является то, что в действительности возможно улучшать текстурирующие свойства, в то же время не ухудшая свойств подслащивания.
В частности, настоящее изобретение относится к следующим аспектам:
Штамм Streptococcus thermophilus, который является галактозоферментирующим, где данный штамм несет мутацию в последовательности ДНК гена glcK, кодирующего белок глюкокиназу, причем данная мутация инактивирует белок глюкокиназу или имеет отрицательный эффект в отношении экспрессии данного гена, и где данный штамм несет мутацию в промоторной области гена GalK, кодирующего белок галактокиназу,
при условии, что данный штамм не является штаммом Streptococcus thermophilus СНСС16731, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 28889.
Штамм Streptococcus thermophilus, выбранный из группы, состоящей из штамма СНСС19216 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 32227, и мутантного штамма, имеющего происхождение из него, где данный мутантный штамм получен с использованием одного из депонированных штаммов в качестве исходного материала, и где данный мутант имеет сохраненные или дополнительно улучшенные способности указанного депонированного штамма придавать текстуру и секретировать глюкозу.
4
12
Композиция, содержащая от 10 до 10 КОЕ (колониеобразующих единиц)/г штамма Streptococcus thermophilus по изобретению.
Способ изготовления ферментированного молочного продукта, включающий инокулирование и ферментирование молочного субстрата по меньшей мере одним штаммом Streptococcus thermophilus по изобретению.
Ферментированный молочный продукт, содержащий по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus по изобретению.
Применение штамма Streptococcus thermophilus по изобретению для изготовления ферментированного молочного продукта.
Применение штамма Streptococcus thermophilus по изобретению для усиления сладкого вкуса ферментированного молочного продукта.
Применение штамма Streptococcus thermophilus по изобретению для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
Применение штамма Streptococcus thermophilus по изобретению для усиления сладкого вкуса и для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
Применение штамма Streptococcus thermophilus по изобретению в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для изготовления ферментированного молочного продукта.
Применение штамма Streptococcus thermophilus по изобретению в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для усиления сладкого вкуса ферментированного молочного продукта.
Применение штамма Streptococcus thermophilus по изобретению в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
Применение штамма Streptococcus thermophilus по изобретению в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для усиления сладкого вкуса и для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
Ферментированный молочный продукт по изобретению для применения в предотвращении симптомов непереносимости лактозы.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 представлено схематическое изображение катаболизма лактозы у Streptococcus thermophilus. GlcK - глюкокиназа; LacS - транспортер лактозы; LacZ - β-галактозидаза; GalM - мутаротаза; GalK - галактокиназа; GalT - галактозо-1-фосфат-уридилтрансфераза; GalE - УДФ-глюкозо-4-эпимераза; Gal1P - галактозо-1-фосфат.
Подробное описание изобретения
Определения
Термин «молочнокислая бактерия», как он использован в данном документе, означает грамположительную, микроаэрофильную или анаэробную бактерию, которая ферментирует сахара с образованием кислот, включая молочную кислоту в качестве преимущественно продуцируемой кислоты, уксусную кислоту и пропионовую кислоту. Самые полезные с промышленной точки зрения молочнокислые бактерии находятся в пределах порядка «Lactobacillales», который включает Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. и Propionibacterium spp. Молочнокислые бактерии, включая бактерии вида Lactobacillus sp. и Streptococcus thermophilus, обычно поставляются для молочной промышленности или в виде замороженных, или в виде лиофилизированных культур для объемного размножения закваски, или в виде так называемых культур «для прямого внесения» (DVS), предназначенных для прямой инокуляции в ферментационный сосуд или чан для производства молочного продукта, такого как ферментированный молочный продукт. Такие культуры, в общем, называются «заквасочные культуры» или «закваски».
Использование терминов в единственном числе в контексте описания данного изобретения (особенно в контексте последующей формулы изобретения) следует истолковывать как охватывающее термины и в единственном, и во множественном числе, если здесь не указано иное, или это явно не противоречит контексту. Термины «содержащий», «имеющий», «включающий» и «вмещающий» следует истолковывать как открытые термины (т.е. означающие «включающий, но не ограничивающийся»), если не отмечено иное. Перечисление интервалов значений здесь просто предназначено для того, чтобы служить в качестве краткого способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в данный интервал, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в данное описание изобретения, как если бы оно было здесь индивидуально перечислено. Все описанные здесь способы могут быть осуществлены в любом подходящем порядке, если здесь не указано иное, или, в ином случае, это явно не противоречит контексту. Использование приведенных здесь любого и всех примеров или описывающих примеры формулировок (например, «такой как») предназначено просто для лучшего разъяснения изобретения и не накладывает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Никакие формулировки в описании изобретения не следует истолковывать как указывающие на любой не заявляемый элемент, как существенный для воплощения данного изобретения на практике.
В контексте настоящего изобретения выражение «усиление сладкого вкуса» означает усиление сладкого вкуса по сравнению со сладким вкусом, вызываемым материнским штаммом, не несущим мутацию в последовательности ДНК гена glcK, кодирующего белок глюкокиназу, где данная мутация инактивирует белок глюкокиназу или имеет отрицательный эффект в отношении экспрессии данного гена.
В контексте настоящего изобретения выражение «улучшение текстуры» означает улучшение текстуры по сравнению с текстурой, образуемой материнским штаммом, не несущим мутацию в промоторной области гена GalK.
Способность штаммов Streptococcus thermophilus придавать текстуру
В контексте настоящего изобретения улучшенная способность штамма Streptococcus thermophilus по изобретению придавать текстуру означает, что штамм Streptococcus thermophilus несет мутацию в промоторной области гена GalK.
Мутация в промоторной области гена GalK может быть получена любым традиционным способом получения такой мутации.
В одном воплощении изобретения штамм Streptococcus thermophilus несет мутацию в промоторной области гена GalK ниже -10 промоторного бокса, также известного как бокс Прибнова (TACGATS). В более конкретном воплощении изобретения мутация в промоторной области гена GalK представляет собой мутацию в положении 3 нуклеотидов ниже -10 промоторного бокса, в частности, мутацию С до А в положении 3 нуклеотидов ниже -10 промоторного бокса.
В другом воплощении изобретения мутация в промоторной области гена GalK представляет собой мутацию в -10 промоторного бокса. В конкретном воплощении изобретения С в -10 промоторного бокса заменяется нуклеотидом, выбранным из группы, состоящей из A, G и Т, в частности, из группы, состоящей из А и Т. В более конкретном воплощении изобретения С в -10 промоторного бокса заменяется на Т.
Штамм Streptococcus thermophilus по изобретению генерирует в ферментированном молочном продукте напряжение сдвига более чем примерно 40 Па, предпочтительно более 43 Па, более предпочтительно более 47 Па и наиболее предпочтительно более 50 Па, при измерении после 12 часов роста при 37 градусах С, например, при инокуляции в количестве по меньшей мере 10Е4 клеток на мл молока.
В настоящем изобретении выражение «ген GalK, кодирующий галактокиназу» означает любую последовательность ДНК Streptococcus thermophilus, кодирующую белок, имеющий галактокиназную активность. Галактокиназа катализирует реакцию, превращающую галактозу до галактозо-1-фосфата, см. Фиг. 1.
Текстуру (напряжение сдвига) можно анализировать с использованием следующего анализа:
Через семь суток после инкубации ферментированное молоко доводили до 13°C и слегка помешивали посредством палочки, оснащенной диском с отверстиями, до гомогенности образца. Реологические свойства образца оценивали на реометре (реометр Anton Paar Physica ASC/DSR301 (автосэмплер), Anton Paar GmbH, Австрия) с использованием следующих установок:
Время ожидания (для восстановления в некоторой степени исходной структуры)
5 минут без качания или вращения
Качание (для измерения G' и G'' для расчета G*)
у равно 0,3%, частота (f) равна [0,5…8] Гц
6 точек измерения за 60 с (одно измерение каждые 10 с)
Вращение (для измерения напряжения сдвига при 300 1/с и т.д.)
равно [0,2707-300] 1/с, и
21 точка измерения за 210 с (одно каждые 10 с), идущего вплоть до 300 1/с
и
21 точка измерения за 210 с (одно каждые 10 с), идущего вплоть до 0,2707 1/с.
Для дальнейшего анализа было выбрано напряжение сдвига при 300 1/с.
Способ получения текстурирующего штамма Streptococcus thermophilus
Один способ получения штамма Streptococcus thermophilus, дающего более высокое напряжение сдвига и/или прочность геля, чем материнский штамм, при использовании данной бактерии для ферментации молока, включает следующие стадии:
а) предоставление молочнокислого штамма Streptococcus thermophilus (материнский штамм) и
б) введение мутации в ген GalK данного штамма.
Способ по изобретению может дополнительно включать одну или более чем одну дополнительную стадию:
в1) скрининг на мутантный штамм, который образует текстуру, например штамм, который образует текстуру в большей степени, чем материнский штамм, или улучшает текстуру молочного субстрата, и
в2) скрининг на мутантный штамм, имеющий фенотип Gal+, такой как улучшенная галактозодеградирующая/ферментирующая активность по сравнению с материнским штаммом.
Второй способ получения штамма Streptococcus thermophilus, дающего более высокое напряжение сдвига и/или прочность геля, чем материнский штамм, при использовании данной бактерии для ферментации молока, включает следующие стадии:
а) предоставление штамма Streptococcus thermophilus (материнский штамм),
a1) подвергание штамма молочнокислой бактерии воздействию бактериофага, например бактериофага, который способен лизировать материнский штамм, например, фага, выбранного из группы, состоящей из СНРС658, СНРС1057, СНРС1089 и СНРС1152, и
б) выделение мутантного штамма материнского штамма, где мутантный штамм является устойчивым против данного фага (или штамм не лизируется данным фагом).
Также данный способ может включать следующие стадии:
а) предоставление штамма Streptococcus thermophilus (материнский штамм);
a1) подвергание штамма молочнокислой бактерии воздействию бактериофага, например бактериофага, который способен лизировать материнский штамм, например, фага, выбранного из группы, состоящей из СНРС658, СНРС1057, СНРС1089 и СНРС1152;
а2) инкубирование подвергнутых воздействию бактериальных клеток в ростовой среде; и
б) выделение мутантного штамма материнского штамма, где мутантный штамм не лизируется бактериофагом.
Данный способ может включать стадию:
в) мутирования (например, посредством химической обработки или обработки радиацией, или посредством методик генной инженерии) материнского штамма, например, до, во время или после стадии a1).
Также данный способ может включать стадию:
г) введения мутации в ген galK или в регуляторную последовательность galK (например, в промотор) штамма (например, посредством химической обработки или обработки радиацией, или посредством методик генной инженерии), например, до, во время или после стадии в) или до, во время или после стадии a1).
В представляющем интерес воплощении данный способ включает стадии:
- предоставления штамма Streptococcus thermophilus (материнский штамм),
- мутирования (например, посредством химической обработки или обработки радиацией, или посредством методик генной инженерии) материнского штамма,
- подвергания полученного в результате штамма молочнокислой бактерии воздействию бактериофага, например, бактериофага, который способен лизировать материнский штамм, например, фага, выбранного из группы, состоящей из СНРС658, СНРС1057, СНРС1089 и СНРС1152,
- инкубирования подвергнутых воздействию бактериальных клеток в ростовой среде; и
- выделения мутантного штамма материнского штамма, где мутантный штамм не лизируется бактериофагом.
Способность штаммов Streptococcus thermophilus усиливать сладкий вкус
В некоторых странах стандартизированное определение йогурта требует присутствия как Streptococcus thermophilus, так и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus. Оба вида генерируют желательные количества ацетальдегида, являющегося важным вкусовым компонентом в йогурте.
nd
Сыр, такой как моцарелла и сыр для пиццы, а также фета, также могут быть изготовлены посредством ферментации с использованием как Streptococcus thermophilus, так и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus ( et al. (2010) в The Technology of Cheese making, 2 Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).
Для того чтобы удовлетворять требованиям пищевой промышленности, становится желательной разработка новых штаммов, в частности штаммов Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и штаммов Streptococcus thermophilus, которые дают более натуральный сладкий вкус непосредственно в ферментированном продукте (собственный сладкий вкус), не давая дополнительных калорий.
Streptococcus thermophilus является одной из наиболее часто используемых молочнокислых бактерий для промышленной ферментации молока, где данный организм обычно используют как часть смешанной заквасочной культуры, причем другим компонентом является вид Lactobacillus, например Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для йогурта и Lactobacillus helveticus для сыра швейцарского типа.
Лактоза и сахароза ферментируются Streptococcus thermophilus легче, чем их составные моносахариды. Только глюкозная часть молекулы лактозы ферментируется Streptococcus thermophilus, а галактоза накапливается в ферментированных молочных продуктах при использовании Streptococcus thermophilus. В йогурте, где высокие концентрации кислоты лимитируют ферментацию, свободная галактоза сохраняется, тогда как свободная галактоза, продуцируемая на ранних стадиях изготовления швейцарского сыра, позднее ферментируется Lactobacillus helveticus. Lactobacillus lactis, находящаяся во многих заквасочных культурах, используемых для изготовления сыра, также способна потреблять галактозу, продуцируемую Streptococcus thermophilus.
Для обеспечения штаммов Streptococcus thermophilus с такой оптимальной эффективностью роста, какая только возможна, авторы настоящего изобретения подвергли галактозоферментирущие штаммы Streptococcus thermophilus воздействию селективного агента 2-дезоксиглюкозы. Типично мутанты, устойчивые к 2-дезоксиглюкозе, имеют мутации в гене, кодирующем глюкокиназу, и в генах, кодирующих белки транспорта глюкозы. Выделенный мутант СНСС 16731, который является устойчивым к 2-дезоксиглюкозе, имеет мутацию в его гене глюкокиназы (glcK). Помимо мутации в гене глюкокиназы, авторы настоящего изобретения обнаружили то, что и СНСС 16731, и СНСС 19216 имеют мутацию, которая означает, что секретированная глюкоза не транспортируется опять обратно в клетки. Хотя и не являясь частью объема настоящего изобретения, штамм 16731 используют здесь для иллюстрации штамма по изобретению, в частности, в отношении конкретных мутаций, которые может содержать штамм по настоящему изобретению.
Неожиданно то, что такие мутанты сами по себе по-прежнему полностью способны подкислять молоко, хотя время подкисления до pH 5 задерживается на 2-5 часов. Следовательно, они, как таковые, являются полезными в применениях, связанных с ферментированным молоком, и они сохранили способность материнских штаммов к свертыванию молока, что характерно для йогурта. Дополнительно обнаружили то, что мутанты секретировали высокий уровень глюкозы при инокулировании мутантами 9,5%-ного В-молока с 0,05% сахарозой и ферментации при 40°C в течение по меньшей мере 20 часов. В то же самое время в ферментированном молоке сохраняются очень низкие уровни лактозы. Следовательно, применение таких штаммов для производства ферментированных молочных продуктов может быть важным для людей с непереносимостью лактозы.
Следовательно, конечное ферментированное молоко имеет повышенный индекс собственного сладкого вкуса, рассчитанный как описано Godshall (1988. Food Technology 42(11):71-78).
В одном аспекте настоящего изобретения штамм Streptococcus thermophilus представляет собой галактозоферментирующий мутантный штамм Streptococcus thermophilus, где данный мутантный штамм несет мутацию в последовательности гена glcK, кодирующего белок глюкокиназу, где данная мутация инактивирует кодируемый белок глюкокиназу или имеет отрицательный эффект на экспрессию данного гена. Способы измерения уровня глюкокиназной активности или уровня экспрессии гена глюкокиназы хорошо известны (Porter et al. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 709; 178-186) и включают ферментативные анализы с имеющимися в продаже наборами и транскриптомику или количественную ПЦР (полимеразная цепная реакция) с использованием материалов, которые легко доступны.
В предпочтительном воплощении изобретения штамм Streptococcus thermophilus по изобетению является устойчивым к 2-дезоксиглюкозе.
Бактериальный «штамм», как он использован здесь, относится к бактерии, которая остается генетически неизменной при росте и размножении. Множество идентичных бактерий включено в данный термин.
Термин «галактозоферментирующие штаммы Streptococcus thermophilus», как он использован здесь, относится к штаммам Streptococcus thermophilus, которые способны расти на/в среде M17 плюс 2% галактозы. Галактозоферментирующие штаммы Streptococcus thermophilus определены здесь как штаммы Streptococcus thermophilus, которые снижают pH бульона M17, содержащего 2% галактозы в качестве единственного углевода, до 5,5 или ниже при инокулировании из культуры, выращенной в течение ночи, в концентрации 1% и инкубировании в течение 24 часов при 37°C.
Термин «мутация инактивирует белок глюкокиназу», как он использован здесь, относится к мутации, которая приводит к «инактивированному белку глюкокиназе», белку глюкокиназе, который при присутствии в клетке не способен выполнять его нормальную функцию, а также к мутациям, которые предотвращают образование белка глюкокиназы или приводят к деградации белка глюкокиназы.
В частности, инактивированный белок глюкокиназа представляет собой белок, который по сравнению с функциональным белком глюкокиназой не способен облегчать фосфорилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата или облегчает фосфорилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата со значительно сниженной скоростью. Ген, кодирующий такой инактивированный белок глюкокиназу, по сравнению с геном, кодирующим функциональный белок глюкокиназу, содержит мутацию в открытой рамке считывания (ORF) данного гена, где указанная мутация может включать делецию, мутацию, приводящую к сдвигу рамки считывания, введение стоп-кодона или мутацию, которая приводит к замене аминокислоты, которая изменяет функциональные свойства белка, или мутацию промотора, которая уменьшает или отменяет транскрипцию или трансляцию данного гена, но не ограничивается ими.
В предпочтительных воплощениях мутация уменьшает активность (скорость фосфорилирования глюкозы до глюкозо-6-фосфата) белка глюкокиназы по меньшей мере на 50%, как, например, по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%.
Активность глюкокиназы можно определить с использованием ферментативных анализов глюкокиназы, как описано Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8; 456-464).
Термин «функциональный белок глюкокиназа», как он использован здесь, относится к белку глюкокиназе, который при присутствии в клетке облегчает фосфорилирование глюкозы до глюкозо-6-фосфата. В частности, функциональный белок глюкокиназа может кодироваться геном, содержащим ORF, которая имеет последовательность, соответствующую положению 1-966 в SEQ ID NO: 1, или последовательность, которая имеет по меньшей мере 85%-ную идентичность, как, например, по меньшей мере 90%-ную идентичность, например по меньшей мере 95%-ную идентичность, например по меньшей мере 98%-ную идентичность, например по меньшей мере 99%-ную идентичность относительно последовательности, соответствующей положению 1-966 SEQ ID NO: 1.
Процент идентичности двух последовательностей может быть определен с использованием математических алгоритмов, таких как алгоритм Karlin и Altschul (1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87; 2264), модифицированный алгоритм, описанный Karlin и Altschul (1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90; 5873-5877); алгоритм Myers и Miller (1988. CABIOS 4; 11-17); алгоритм Needleman и Wunsch (1970. J. Mol. Biol. 48; 443-453) и алгоритм Pearson и Lipman (1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448). Также доступна компьютерная программа для определения идентичности последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности на основе данных математических алгоритмов. Например, сравнение нуклеотидных последовательностей может быть проведено с использованием программы BLASTN, балл - 100, длина слова - 12. Сравнение аминокислотных последовательностей может быть проведено с использованием программы BLASTX, балл - 50, длина слова - 3. В том, что касается остальных параметров программ BLAST, можно использовать параметры по умолчанию.
Во многих странах неприемлемо применение генетически модифицированных организмов (ГМО) для ферментированных молочных продуктов. Вместо этого в настоящем изобретении предложены встречающиеся в природе или индуцированные мутантные штаммы, которые могут обеспечивать желательное накопление глюкозы в ферментированном молочном продукте.
Таким образом, в значительно более предпочтительном воплощении настоящего изобретения мутантный штамм представляет собой встречающегося в природе мутанта или индуцированного мутанта.
Термины «мутантная бактерия» или «мутантный штамм», как он использован здесь, относятся к природной (спонтанной, встречающейся в природе) мутантной бактерии или к индуцированной мутантной бактерии, содержащей в ее геноме (ДНК) одну или более чем одну мутацию, которая отсутствует в ДНК дикого типа. «Индуцированный мутант» представляет собой бактерию, где мутация была индуцирована обработкой человеком, такой как обработка химическими мутагенами, УФ- или гамма-излучением и т.д. В отличие от этого, «спонтанный мутант» или «встречающийся в природе мутант» не был мутагенизирован человеком. Мутантные бактерии здесь не являются ГМО (генетически модифицированный организм), т.е. они не модифицированы посредством технологии генной инженерии.
Термин «штамм дикого типа» относится к немутированной форме бактерии в том виде, в котором она находится в природе.
Такие термины, как «штаммы со способностью к усилению сладкого вкуса», «штаммы, которые могут обеспечивать желательное накопление глюкозы в ферментированном молочном продукте» и «штаммы с улучшенными свойствами в отношении природного усиления сладкого вкуса пищевых продуктов», используются здесь взаимозаменяемо для характеризации полезного аспекта применения штаммов по настоящему изобретению в ферментации молочных продуктов.
6
7
В предпочтительном воплощении мутантный штамм Streptococcus thermophilus по изобретению увеличивает количество глюкозы в 9,5%-ном В-молоке до по меньшей мере 5 мг/мл при инокулировании в 9,5%-ное В-молоко в концентрации 10-10 КОЕ (колониеобразующая единица)/мл и выращивании при 40°C в течение по меньшей мере 20 часов.
6
7
В другом предпочтительном воплощении мутантный штамм Streptococcus thermophilus по изобретению увеличивает количество глюкозы в 9,5%-ном В-молоке с 0,05% сахарозы до по меньшей мере 5 мг/мл при инокулировании в 9,5%-ное В-молоко с 0,05% сахарозы в концентрации 10-10 КОЕ/мл и выращивании при 40°C в течение по меньшей мере 20 часов.
В настоящем контексте 9,5%-ное В-молоко представляет собой кипяченое молоко, полученное с использованием восстановленного обезжиренного сухого молока с низким содержанием жира, до уровня сухого вещества 9,5% и пастеризованное при 99°C в течение 30 мин, с последующим охлаждением до 40°C.
В более предпочтительных воплощениях данного изобретения мутантный штамм приводит к увеличению количества глюкозы до по меньшей мере 6 мг/мл, например по меньшей мере 7 мг/мл, например по меньшей мере 8 мг/мл, например по меньшей мере 9 мг/мл, например по меньшей мере 10 мг/мл, например по меньшей мере 11 мг/мл, например по меньшей мере 12 мг/мл, например по меньшей мере 13 мг/мл, например по меньшей мере 14 мг/мл, например по меньшей мере 15 мг/мл, например по меньшей мере 20 мг/мл, например по меньшей мере 25 мг/мл.
В другом воплощении изобретения мутантный штамм Streptococcus thermophilus является устойчивым к 2-дезоксиглюкозе.
Термин «устойчивый к 2-дезоксиглюкозе» определен здесь тем, что конкретный мутантный бактериальный штамм имеет способность расти до колонии при посеве штрихами на чашку со средой M17, содержащей 20 мМ 2-дезоксиглюкозы, после инкубирования при 40°C в течение 20 часов. Присутствие 2-дезоксиглюкозы в культуральной среде будет предотвращать рост немутированных штаммов, тогда как рост мутированных штаммов не подвергается влиянию или не подвергается значительному влиянию. Немутированные штаммы, которые можно использовать в качестве чувствительных контрольных штаммов при оценке устойчивости, предпочтительно включают штаммы СНСС14994 и СНСС11976.
6
7
6
7
Мутантные штаммы Streptococcus thermophilus по изобретению выделяют глюкозу в молоко при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus по изобретению и ферментации штамма Streptococcus thermophilus по изобретению при 40°C в течение по меньшей мере 20 часов. Предпочтительно одни такие мутантные штаммы будут выделять по меньшей мере 5 мг/мл глюкозы в В-молоко при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus по изобретению и ферментации штамма Streptococcus thermophilus при 40°C в течение по меньшей мере 20 часов. Данные штаммы все еще полностью способны подкислять молоко, хотя время подкисления до pH 5 задерживается на 2-5 часов. Конечное ферментированное молоко содержит менее 15 мг/мл лактозы в ферментированном молоке. Конечное ферментированное молоко, следовательно, имеет более высокий индекс собственного сладкого вкуса, приблизительно в 2 раза или более.
600
В еще одном воплощении мутантный штамм по изобретению может отличаться его картиной роста. Это обнаружение иллюстрируется данными о том, что скорость роста мутантного штамма выше в среде M17 плюс 2% галактозы, чем в среде M17 плюс 2% глюкозы. Скорость роста измеряется как развитие оптической плотности экспоненциально растущей культуры при 600 нанометрах (ОП) с течением времени.
В предпочтительном воплощении скорость роста по меньшей мере на 5% выше, например по меньшей мере на 10% выше, например по меньшей мере на 15% выше, например по меньшей мере на 20% выше в среде M17 плюс 2% галактозы, чем в среде M17 плюс 2% глюкозы.
Мутация в гене glcK
В одном предпочтительном воплощении мутация приводит к замене кодона, кодирующего глицин, кодоном, кодирующим аргинин, в положении 249 в SEQ ID NO: 2. Предпочтительно мутация в гене glcK приводит к замене G на А в положении 745 в SEQ ID NO: 1. Штамм СНСС16731 имеет такую мутацию.
В предпочтительном воплощении данная мутация приводит к замене кодона, кодирующего серии, кодоном, кодирующим пролин, в положении 72 в SEQ ID NO: 2 (не показана). Предпочтительно мутация в гене glcK приводит к замене Т на С в положении 214 в SEQ ID NO: 1 (не показана).
В другом предпочтительном воплощении данная мутация приводит к замене кодона, кодирующего треонин, кодоном, кодирующим изолейцин, в положении 141 в SEQ ID NO: 2 (не показана).
Предпочтительно мутация в гене glcK приводит к замене С на Т в положении 422 в SEQ ID NO: 1 (не показана).
Следует подчеркнуть то, что ген glcK Streptococcus thermophilus может быть инактивирован другими типами мутаций в других сайтах гена glcK.
Мутация, уменьшающая транспорт глюкозы в клетку
В предпочтительном воплощении штамм Streptococcus thermophilus несет мутацию, которая уменьшает транспорт глюкозы в клетку.
Термин «мутация, которая уменьшает транспорт глюкозы в клетку», как он использован здесь, относится к мутации в гене, кодирующем белок, участвующий в транспорте глюкозы, которая приводит к накоплению глюкозы в среде клетки.
Уровень глюкозы в культуральной среде штамма Streptococcus thermophilus может быть легко измерен способами, известными специалисту в данной области, также когда культуральная среда представляет собой молочный субстрат.
В предпочтительных воплощениях данная мутация уменьшает транспорт глюкозы в клетку по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%.
Транспорт глюкозы в клетку может быть определен анализом поглощения глюкозы, как описано в Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432).
Предпочтительно штамм Streptococcus thermophilus несет мутацию в гене, кодирующем компонент глюкозного транспортера, где данная мутация инактивирует белок глюкозного транспортера или имеет отрицательный эффект в отношении экспрессии данного гена.
Данным компонентом может быть любой компонент белка глюкозного транспортера, который является критически важным для транспорта глюкозы. Например, предусмотрено, что инактивация любого компонента глюкозной/маннозной PTS в Streptococcus thermophilus будет приводить к инактивации функции глюкозного транспортера.
Термин «мутация инактивирует глюкозный транспортер», как он использован здесь, относится к мутации, которая приводит к «инактивированному глюкозному транспортеру», представляющему собой белок глюкозного транспортера, который, при наличии в клетке, не способен выполнять его нормальную функцию, а также к мутациям, которые предотвращают образование белка глюкозного транспортера или приводят к деградации белка глюкозного транспортера.
В частности, инактивированный белок глюкозного транспортера представляет собой белок, который по сравнению с функциональным белком глюкозного транспортера не способен облегчать транспорт глюкозы через плазматическую мембрану или облегчает транспорт глюкозы через плазматическую мембрану при значительно сниженной скорости. Ген, кодирующий такой инактивированный белок глюкозного транспортера, по сравнению с геном, кодирующим функциональный белок глюкозного транспортера, содержит мутацию в открытой рамке считывания (ORF) данного гена, где указанная мутация может включать, без ограничения, делецию, мутацию, приводящую к сдвигу рамки считывания, введение стоп-кодона или мутацию, которая приводит к аминокислотной замене, изменяющей функциональные свойства белка, или мутацию промотора, которая уменьшает или отменяет транскрипцию или трансляцию гена.
В предпочтительных воплощениях данная мутация уменьшает активность (скорость транспорта глюкозы) белка глюкозного транспортера по меньшей мере на 50%, например по меньшей мере на 60%, например по меньшей мере на 70%, например по меньшей мере на 80%, например по меньшей мере на 90%.
Активность глюкозного транспортера может быть определена анализом поглощения глюкозы, как описано Cochu et al. (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432).
Термин «функциональный белок глюкозного транспортера», как он использован здесь, относится к белку глюкозного транспортера, который, при его наличии в клетке, облегчает транспорт глюкозы через плазматическую мембрану.
Man
Man
В предпочтительном воплощении изобретения штамм Streptococcus thermophilus по изобретению несет мутацию в последовательности ДНК гена manN, кодирующего белок IID системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы, где данная мутация инактивирует белок IID или имеет отрицательный эффект на экспрессию данного гена.
Man
СНСС16731 имеет замену треонина на пролин в положении 79 в гене manN, кодирующем белок IID системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы. Предпочтительно данная мутация в гене manN приводит к замене А на С в положении 235 в SEQ ID NO: 3.
Man
Таким образом, в предпочтительном воплощении штамм Streptococcus thermophilus по изобретению несет мутацию в последовательности ДНК гена manN, кодирующего белок IID системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы, где данная мутация приводит к замене треонина на пролин в положении 79 SEQ ID NO: 4.
Man
Man
В другом предпочтительном воплощении изобретения штамм Streptococcus thermophilus по изобретению несет мутацию в последовательности ДНК гена manM, кодирующего белок IIC системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы, где данная мутация инактивирует белок IIC или имеет отрицательный эффект на экспрессию данного гена.
Man
В особенно предпочтительном воплощении данная мутация приводит к замене кодона, кодирующего глутаминовую кислоту, на стоп-кодон в положении 209 SEQ ID NO: 6 белка IIC системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы (не показана). Предпочтительно данная мутация приводит к замене G на Т в положении 625 SEQ ID NO: 5 (не показана).
Предпочтительные штаммы Streptococcus thermophilus по изобретению
В предпочтительном воплощении изобретения штамм Streptococcus thermophilus выбран из группы, состоящей из штамма СНСС19216 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 32227, и мутантного штамма, имеющего происхождение из него, где данный мутантный штамм получен с использованием одного из депонированных штаммов в качестве исходного материала, и где данный мутант имеет сохраненные или дополнительно улучшенные способности указанного депонированного штамма придавать текстуру и/или секретировать глюкозу.
В настоящем контексте термин «мутантный штамм» следует понимать как штаммы, имеющие происхождение, или штаммы, которые могут иметь происхождение из штамма (или их материнского штамма) по изобретению посредством, например, генной инженерии, обработки радиацией и/или химической обработки. «Штаммы, имеющие происхождение из них» также могут быть спонтанно возникающими мутантами. Предпочтительным является то, что «штаммы, имеющие происхождение из них» являются функционально эквивалентными мутантами, например мутантами, которые имеют по существу такие же или улучшенные свойства по отношению к их материнскому штамму. Термин «мутантные штаммы», в особенности, относится к штаммам, полученным посредством подвергания штамма по изобретению любой традиционно используемой мутагенизирующей обработки, включая обработку химическим мутагеном, таким как этанметансульфонат (EMS) или N-метил-N'-нитро-N-нитрогуанидин (NTG), УФ (ультрафиолет) светом, либо к спонтанно возникающему мутанту. Мутант возможно был подвергнут нескольким мутагенизирующим обработкам (одну обработку следует понимать как одну стадию мутагенеза с последующей стадией скрининга/отбора), но в настоящее время предпочтительно, чтобы проводилось не более 20, или не более 10, или не более 5 обработок (или стадий скрининга/отбора). В предпочтительном в настоящее время мутанте менее 1%, менее 0,1%, менее 0,01%, менее 0,001% или даже менее 0,0001% нуклеотидов в бактериальном геноме было заменено другим нуклеотидом или подвергнуто делеции по сравнению с материнским штаммом.
Способ получения штамма Streptococcus thermophilus, усиливающего сладкий вкус
В предпочтительном воплощении изобретения исходным штаммом, используемым для разработки штамма Streptococcus thermophilus, усиливающего сладкий вкус, является текстурирующий штамм Streptococcus thermophilus, который может быть получен, как описано в данном описании изобретения.
В предпочтительном воплощении такой исходный текстурирующий штамм выбран из группы, состоящей из штамма СНСС11342 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 22932, штамма СНСС11976 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 22934, штамма СНСС12339 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 24090, и штаммов, имеющих происхождение из них.
В качестве альтернативы, исходным штаммом, используемым для разработки штамма Streptococcus thermophilus, усиливающего сладкий вкус, является не текстурирующий штамм Streptococcus thermophilus, причем в данном случае текстурирующее свойство придают штамму Streptococcus thermophilus, усиливающему сладкий вкус, как только он получен, т.е. штамм, усиливающий сладкий вкус, используют в качестве исходного штамма в способе получения текстурирующего штамма, описанного в данном описании изобретения.
Первой стадией способа получения штамма Streptococcus thermophilus, усиливающего сладкий вкус, является предоставление галактозопозитивного штамма, т.е. штамма, который способен использовать галактозу в качестве источника углеводов. Галактозопозитивные штаммы могут быть получены способом, включающим стадию посева штрихом бактерий, подлежащих тестированию, на чашки с агаром, такие как чашки с агаром M17, содержащие определенную концентрацию, например 2%, галактозы (единственный источник углеводов), и идентификацию колоний, способных расти на данных чашках.
Для селекции бактерий, имеющих мутацию в гене глюкокиназы (glcK), используют 2-дезоксиглюкозу и определение картины роста бактерий в среде M17 плюс 2% галактозы по сравнению со средой M17 плюс 2% глюкозы.
Один способ скрининга и выделения штамма Streptococcus thermophilus с мутированным геном glcK включает следующие стадии:
а) предоставление галактозоферментирующего материнского штамма Streptococcus thermophilus;
б) селекция и выделение из пула мутантных штаммов Streptococcus thermophilus, имеющих происхождение из материнского штамма, пула мутантных штаммов Streptococcus thermophilus, которые являются устойчивыми к 2-дезоксиглюкозе; и
в) селекция и выделение из пула мутантных штаммов Streptococcus thermophilus, которые являются устойчивыми к 2-дезоксиглюкозе, мутантного штамма Streptococcus thermophilus, если скорость роста данного мутантного штамма Streptococcus thermophilus выше в среде M17 плюс 2% галактозы, чем в среде M17 плюс 2% глюкозы.
Термин «устойчивый к 2-дезоксиглюкозе» определен здесь тем, что конкретный мутированный бактериальный штамм имеет способность вырастать до колонии при посеве штрихом на чашке со средой M17, содержащей 2% лактозы или 2% галактозы и содержащей 20 мМ 2-дезоксиглюкозы, после инкубации при 40°C в течение 20 часов. Присутствие 2-дезоксиглюкозы в культуральной среде будет предотвращать рост немутированных штаммов, тогда как рост мутированных штаммов не подвергается влиянию или не подвергается значимому влиянию. Немутированные штаммы, которые можно использовать в качестве чувствительных контрольных штаммов при оценке устойчивости, включают штамм СНСС11976.
В одном воплощении данный способ дополнительно включает стадию a1) подвергания материнского штамма мутагенезу, например, подвергания материнского штамма воздействию химического и/или физического мутагена.
В другом воплощении данный способ дополнительно включает стадию г) селекции и выделения штамма Streptococcus thermophilus из пула штаммов Streptococcus thermophilus, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе, имеющих происхождение из штамма Streptococcus thermophilus, отобранного на стадии в), если скорость роста штамма Streptococcus thermophilus является высокой в среде M17 плюс 2% сахарозы, но равна нулю или по меньшей мере на 0-50% снижена по сравнению со скоростью роста материнского штамма в среде M17 плюс 2% глюкозы.
Галактозоферментирующие материнские штаммы Streptococcus thermophilus способны расти на/в среде M17 плюс 2% галактозы и определяются здесь тем, что они имеют способность снижать pH в бульоне M17, содержащем 2% галактозы в качестве единственного углевода, до 5,5 или ниже при инокуляции из культуры, выращенной в течение ночи при 1%, и инкубировании в течение 24 часов при 37°C. Такие галактозопозитивные штаммы были описаны в WO 2011/026863 (Chr. Hansen A/S) и WO 2011/092300 (Chr. Hansen A/S).
В настоящем контексте термин «штаммы, имеющие происхождение из» следует понимать как штаммы, происходящие, или штаммы, которые могут быть получены из текстурирующих или галактозоферментирующих материнских штаммов Streptococcus thermophilus, посредством, например, генной инженерии, обработки радиацией и/или химической обработки. «Штаммы, имеющие происхождение из них» также могут представлять собой спонтанно возникающих мутантов. Предпочтительным является то, что «штаммы, имеющие происхождение из них» представляют собой функционально эквивалентных мутантов, например мутантов, которые имеют по существу такие же или улучшенные свойства (например, в отношении текстуры или ферментации галактозы), что и их материнский штамм. В особенности, термин «штаммы, имеющие происхождение из них» относится к штаммам, полученным посредством подвергания штамма по изобретению любой традиционно используемой мутагенизирующей обработке, включающей обработку химическим мутагеном, таким как этанметансульфонат (EMS) или N-метил-N'-нитро-N-нитрогуанидин (NTG), УФ свет, или к спонтанно возникающему мутанту. Мутант возможно был подвергнут нескольким мутагенизирующим обработкам (одну обработку следует понимать как одну стадию мутагенеза с последующей стадией скрининга/селекции), но в настоящее время предпочтительным является то, что проводится не более 20, или не более 10, или не более 5 обработок (или стадий скрининга/селекции). В предпочтительном в настоящее время мутанте менее 1%, менее 0,1%, менее 0,01%, менее 0,001% или даже менее 0,0001% нуклеотидов в бактериальном геноме было заменено другим нуклеотидом или подвергнуто делеции по сравнению с материнским штаммом.
В настоящем изобретении выражение «ген glcK, кодирующий глюкокиназу» означает любую последовательность ДНК Streptococcus thermophilus, кодирующую белок, имеющий глюкокиназную активность, включая специфическую глюкокиназу, кодируемую последовательностью ДНК SEQ ID NO: 1. Глюкокиназа катализирует реакцию, превращающую глюкозу в глюкозо-6-фосфат, см. Фиг. 1.
Lactobacillus delbrueckii подвид bulsaricus для применения в комбинации со штаммами Streptococcus thermophilus по изобретению
Глюкоза используется в качестве источника углеводов многими молочнокислыми бактериями, и любая выделенная глюкоза может потребляться другими микроорганизмами, присутствующими в ферментированном молочном продукте.
Для преодоления данной проблемы штамм Streptococcus thermophilus по настоящему изобретению предпочтительно следует использовать в комбинации с мутантами Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, устойчивыми к 2-дезоксиглюкозе, которые либо потеряли способность расти на глюкозе в качестве источника углеводов, либо демонстрируют ослабленную способность расти при таких условиях. Мутантные штаммы Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus не только не потребляют глюкозу, секретированную в молоко другими микроорганизмами, которые возможно присутствуют, они также выделяют большие количества глюкозы в окружающую среду и, неожиданно, все еще полностью способны подкислять молоко, хотя время подкисления до pH 5 задерживается на 2-5 часов. Они, следовательно, являются полезными как таковые в применениях, связанных с ферментированным молоком.
Подходящие мутанты Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, устойчивые к 2-дезоксиглюкозе, для применения в комбинации со штаммом Streptococcus thermophilus по настоящему изобретению описаны в WO 2013/160413. В предпочтительном воплощении изобретения штамм выбран из группы, состоящей из штамма СНСС16159 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 26420, штамма СНСС16160 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 26421, и мутантного штамма, имеющего происхождение из них, где данный мутантный штамм получают с использованием одного из указанных депонированных штаммов в качестве исходного материала, и где данный мутант имеет сохраненные или дополнительно улучшенные свойство ферментации лактозы и/или свойство секреции глюкозы указанного депонированного штамма.
Такие бактерии пищевого класса могут быть использованы для обогащения ферментированных молочных продуктов глюкозой. Глюкоза имеет более сильный воспринимаемый сладкий вкус, чем лактоза и галактоза, и выделение глюкозы в молочный субстрат, как таковое, будет приводить к более сильному воспринимаемому (собственному) сладкому вкусу в ферментированном молочном продукте.
Авторы настоящего изобретения обнаружили то, что при ферментации молочного субстрата штаммом Streptococcus thermophilus по изобретению и устойчивым к 2-дезоксиглюкозе мутантом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus уровень лактозы в молоке значительно снижается.
Непереносимость лактозы представляет собой состояние, вызванное неспособностью расщеплять лактозу. Большинство индивидов, не переносящих лактозу, могут переносить некоторое количество лактозы в их питании, и тяжесть их симптомов (включающих тошноту, спазмы, вздутие живота, диарея и метеоризм) возрастает с количеством потребленной лактозы.
Таким образом, в промышленности очень важно обеспечить возможность производить пищевые продукты, которые либо не содержат лактозу, либо имеют пониженное содержание лактозы.
Композиция
4
12
5
11
6
10
7
9
Настоящее изобретение дополнительно относится к композиции, содержащей от 10 до 10 КОЕ (колониеобразующая единица)/г штамма Streptococcus thermophilus по изобретению, например от 10 до 10 КОЕ/г, например от 10 до 10 КОЕ/г, или например от 10 до 10 КОЕ/г штамма Streptococcus thermophilus.
6
7
6
7
В предпочтительном воплощении штамм Streptococcus thermophilus не способен подкислять 9,5%-ное В-молоко, что определено по вызываемому снижению pH менее чем на 1,0 при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°C, и данная композиция дополнительно содержит количество соединения, которое может запускать подкисление 9,5%-ного В-молока штаммом СНСС16404 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 26722, что определено по вызываемому снижению pH на 1,0 или более при инокулировании 9,5%-ного В-молока с 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°C.
Предпочтительно данное соединение представляет собой сахарозу.
Предпочтительно количество сахарозы составляет от 0,000001% до 2%, например от 0,00001% до 0,2%, например от 0,0001% до 0,1%, например от 0,001% до 0,05%.
4
12
5
11
6
10
7
9
В особенно предпочтительном воплощении данная композиция дополнительно содержит от 10 до 10 КОЕ/г штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, например от 10 до 10 КОЕ/г, например от 10 до 10 КОЕ/г, или например от 10 до 10 КОЕ/г штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.
Предпочтительная композиция по настоящему изобретению содержит, например, штамм СНСС16159 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и/или штамм СНСС16160 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus в комбинации со штаммом СНСС16731 Streptococcus thermophilus. Другая предпочтительная композиция содержит штамм СНСС16159 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и/или штамм СНСС16160 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus в комбинации со штаммом СНСС19216 Streptococcus thermophilus.
Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, Streptococcus thermophilus и другие молочнокислые бактерии обычно используют в качестве заквасочных культур, служащих для технологических целей при производстве различных пищевых продуктов, например, в молочной промышленности, например, для ферментированных молочных продуктов. Таким образом, в другом предпочтительном воплощении данная композиция подходит в качестве заквасочной культуры.
Заквасочные культуры могут быть предоставлены в виде замороженных или высушенных заквасочных культур, помимо жидких заквасочных культур. Таким образом, в еще одном предпочтительном воплощении композиция находится в замороженной, лиофилизированной или жидкой форме.
Как раскрыто в WO 2005/003327, полезно добавлять в заквасочную культуру определенные криопротекторы. Таким образом, композиция заквасочной культуры по настоящему изобретению может содержать один или более чем один криопротектор, выбранный из группы, состоящей из инозин-5'-монофосфата (IMP), аденозин-5'-монофосфата (AMP), гуанозин-5'-монофосфата (GMP), уранозин-5'-монофосфата (UMP), цитидин-5'-монофосфата (СМР), аденина, гуанина, урацила, цитозина, аденозина, гуанозина, уридина, цитидина, гипоксантина, ксантина, гипоксантина, оротидина, тимидина, инозина и производного любого из таких соединений.
Способ изготовления ферментированного молочного продукта
Данное изобретение дополнительно относится к способу изготовления ферментированного молочного продукта, включающему инокулирование и ферментирование молочного субстрата по меньшей мере одним штаммом Streptococcus thermophilus по настоящему изобретению.
Термин «молоко» следует понимать как секрет молочных желез, полученный доением любого животного, такого как корова, овца, коза, буйволица или верблюдица. В предпочтительном воплощении молоко представляет собой коровье молоко.
Термин «молочный субстрат» может относиться к любому сырому и/или переработанному молочному материалу, который может быть подвергнут ферментации согласно способу по изобретению. Таким образом, полезные молочные субстраты включают растворы/суспензии любого молока или молокоподобных продуктов, содержащие белок, такие как цельное молоко или молоко пониженной жирности, обезжиренное молоко, пахта, восстановленный молочный порошок, сгущенное молоко, сухое молоко, сыворотку, пермеат сыворотки, лактозу, маточную жидкость от кристаллизации лактозы, концентрат белка сыворотки или сливки, но не ограничиваются ими. Очевидно то, что молочный субстрат может иметь происхождение из любого животного, например, будучи по существу чистым молоком млекопитающего или разведенным молочным порошком.
Предпочтительно по меньшей мере часть белка в молочном субстрате представляет собой белки, встречающиеся в природе в молоке, такие как казеин или белок сыворотки. Однако часть белка может представлять собой белки, которые не встречаются в природе в молоке.
До ферментации молочный субстрат может быть гомогенизирован и пастеризован согласно способам, известным в данной области техники.
Термин «гомогенизация», как он использован здесь, означает интенсивное перемешивание с получением растворимой суспензии или эмульсии. При проведении гомогенизации до ферментации, ее можно проводить таким образом, чтобы разбивать молочный жир до меньших размеров, так чтобы он больше не отделялся от молока. Это может быть осуществлено посредством пропускания молока через маленькие отверстия при высоком давлении.
Термин «пастеризация», как он использован здесь, означает обработку молочного субстрата для уменьшения или устранения присутствия живых организмов, таких как микроорганизмы. Предпочтительно пастеризация достигается поддержанием точно установленной температуры в течение точно установленного периода времени. Данная точно установленная температура обычно достигается нагреванием. Температура и продолжительность времени могут быть выбраны для того, чтобы уничтожать или инактивировать определенные бактерии, такие как вредные бактерии. Далее может следовать стадия быстрого охлаждения.
«Ферментация» в способах по настоящему изобретению означает превращение углеводов в спирты или кислоты посредством действия микроорганизма. Предпочтительно ферментация в способах по изобретению включает превращение лактозы в молочную кислоту.
Способы ферментации, подлежащие использованию в изготовлении ферментированных молочных продуктов, хорошо известны, и специалист в данной области будет знать, каким образом выбрать подходящие условия процесса, такие как температура, содержание кислорода, количество и характеристики микроорганизма(мов) и время переработки. Очевидно, что условия ферментации выбирают таким образом, чтобы поддерживать достижение задачи настоящего изобретения, т.е. для получения молочного продукта в твердом или в жидком виде (ферментированного молочного продукта).
Термин «ферментированный молочный продукт», как он использован здесь, относится к пищевому или кормовому продукту, где изготовление пищевого или кормового продукта включает ферментацию молочного субстрата молочнокислой бактерией. Термин «ферментированный молочный продукт», как он использован здесь, включает такие продукты, как йогурт, сыр, сметана и пахта, а также ферментированная сыворотка, но не ограничивается ими.
4
9
4
8
В предпочтительном воплощении концентрация инокулированных клеток Streptococcus thermophilus составляет от 10 до 10 КОЕ клеток Streptococcus thermophilus на мл молочного субстрата, например от 10 КОЕ до 10 КОЕ клеток Streptococcus thermophilus на мл молочного субстрата.
6
7
6
7
В другом предпочтительном воплощении способа по изобретению штамм Streptococcus thermophilus не способен подкислять 9,5%-ное В-молоко, что определено по достижению снижения pH менее чем на 1,0 при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°C, и в молочный субстрат добавляют эффективное количество соединения для инициирования подкисления 9,5%-ного В-молока штаммом Streptococcus thermophilus, что определено по достижению снижения pH на 1,0 или более при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°C.
Предпочтительно данное соединение представляет собой сахарозу.
Предпочтительно количество сахарозы составляет от 0,000001% до 2%, например от 0,00001% до 0,2%, например от 0,0001% до 0,1%, например от 0,001% до 0,05%.
В предпочтительном воплощении способ изготовления ферментированного молочного продукта включает инокулирование и ферментирование молочного субстрата по меньшей мере одним штаммом Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 формулы изобртения и по меньшей мере одним штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, предпочтительно устойчивым к 2-дезоксиглюкозе мутантом штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.
В другом предпочтительном воплощении ферментированный молочный продукт представляет собой йогурт или сыр.
nd
Примеры сыров, которые готовят ферментацией с использованием Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, включают сыр моцарелла и сыр для пиццы ( et al. (2010) в The Technology of Cheesemaking, 2 Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).
Предпочтительно ферментированный молочный продукт представляет собой йогурт.
В настоящем контексте йогуртовая заквасочная культура представляет собой бактериальную культуру, которая содержит по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus. В соответствии с этим, термин «йогурт» относится к ферментированному молочному продукту, который можно получать инокулированием и ферментацией молока с использованием композиции, содержащей штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus и штамм Streptococcus thermophilus.
Ферментированный молочный продукт
Настоящее изобретение дополнительно относится к ферментированному молочному продукту, содержащему по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus по данному изобретению.
В предпочтительном воплощении ферментированный молочный продукт содержит по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus по изобретению и по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, предпочтительно по меньшей мере один устойчивый к 2-дезоксиглюкозе мутант штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.
В другом предпочтительном воплощении ферментированный молочный продукт представляет собой йогурт или сыр. Предпочтительно ферментированный молочный продукт представляет собой йогурт.
Применение штамма Streptococcus thermophilus по изобретению
Другой аспект данного изобретения относится к применению штамма Streptococcus thermophilus по изобретению для изготовления ферментированного молочного продукта.
Другой аспект данного изобретения относится к применению штамма Streptococcus thermophilus по изобретению для усиления сладкого вкуса ферментированного молочного продукта.
Другой аспект данного изобретения относится к применению штамма Streptococcus thermophilus по изобретению для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
Другой аспект данного изобретения относится к применению штамма Streptococcus thermophilus по изобретению для усиления сладкого вкуса и для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
Другой аспект данного изобретения относится к применению для улучшения текстуры, где указанный штамм образует текстуру в ферментированном молочном продукте с показателем напряжения сдвига более чем примерно 40 Па, измеренным после 12 часов роста при 37 градусах С.
Другой аспект данного изобретения относится к применению штамма Streptococcus thermophilus по изобретению в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для изготовления ферментированного молочного продукта.
Другой аспект данного изобретения относится к применению штамма Streptococcus thermophilus по изобретению в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для усиления сладкого вкуса ферментированного молочного продукта.
Другой аспект данного изобретения относится к применению штамма Streptococcus thermophilus по изобретению в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
Другой аспект данного изобретения относится к применению штамма Streptococcus thermophilus по изобретению в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для усиления сладкого вкуса и для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
Другой аспект данного изобретения относится к применению для улучшения текстуры, где указанный штамм образует текстуру в ферментированном молочном продукте с показателем напряжения сдвига более чем примерно 40 Па, измеренным после 12 часов роста при 37 градусах С.
Другой аспект данного изобретения относится к применениям, включающим штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, где штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus является штаммом, устойчивым к 2-дезоксиглюкозе.
Другой аспект настоящего изобретения относится к ферментированному молочному продукту по изобретению для применения в снижении потребления калорий.
Полагают, что ферментированный молочный продукт по изобретению является особенно полезным в питании людей, страдающих от избыточного веса или ожирения.
Таким образом, в предпочтительном воплощении ферментированный молочный продукт по изобретению предназначен для использования в снижении потребления калорий у человека, страдающего от избыточного веса или ожирения.
2
Избыточный вес и ожирение представляют собой медицинские состояния, определенные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), как аномальное или избыточное накопление жира, которое представляет риск для здоровья. Индекс массы тела (BMI) можно использовать как приблизительное руководство для классификации избыточного веса и ожирения у взрослых, и он рассчитывается как масса субъекта в килограммах, поделенная на квадрат его роста в метрах (кг/м). Определение ВОЗ утверждает то, что BMI выше или равный 25 соответствует избыточному весу, и что BMI выше или равный 30 соответствует ожирению.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению штамма Streptococcus thermophilus по изобретению для уменьшения содержания лактозы в ферментированном молочном продукте.
Другой аспект настоящего изобретения относится к ферментированному молочному продукту по изобретению для использования в предотвращении симптомов непереносимости лактозы.
Другой аспект относится к композиции по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.
Воплощения настоящего изобретения описаны ниже посредством неограничивающих примеров.
Перечень последовательностей
SEQ ID NO: 1 показывает последовательность ДНК мутированного гена глюкокиназы штамма СНСС16731.
SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3 показывает последовательность ДНК мутированного гена ManN штамма СНСС16731.
SEQ ID NO: 4 показывает аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 5 показывает последовательность ДНК гена ManM (немутированного) штамма СНСС16731.
SEQ ID NO: 6 показывает аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO: 5.
Перечень аспектов и воплощений изобретения
1. Штамм Streptococcus thermophilus, который является галактозоферментирующим, где данный штамм несет мутацию в последовательности ДНК гена glcK, кодирующего белок глюкокиназу, причем данная мутация инактивирует белок глюкокиназу или имеет отрицательный эффект в отношении экспрессии данного гена, и где данный штамм несет мутацию в промоторной области гена GalK, кодирующего белок галактокиназу,
при условии, что данный штамм не является штаммом СНСС16731 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 28889.
2. Штамм Streptococcus thermophilus по пункту 1, где данный штамм является устойчивым к 2-дезоксиглюкозе.
3. Штамм Streptococcus thermophilus по пункту 1 или 2, где данный штамм несет мутацию, которая уменьшает транспорт глюкозы в клетку.
4. Штамм Streptococcus thermophilus по пункту 3, где данный штамм несет мутацию в гене, кодирующем компонент глюкозного транспортера, где данная мутация инактивирует глюкозный транспортер или имеет отрицательный эффект в отношении экспрессии данного гена.
Man
Man
5. Штамм Streptococcus thermophilus по пункту 4, где штамм по изобретению несет мутацию в последовательности ДНК гена manN, кодирующего белок IID системы глюкозо/маннозофосфотрансферазы, где данная мутация инактивирует белок IID или имеет отрицательный эффект в отношении экспрессии данного гена.
6
7
6. Штамм Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-5, где данный штамм увеличивает количество глюкозы в 9,5%-ном В-молоке до по меньшей мере 5 мг/мл при инокулировании в 9,5%-ное В-молоко в концентрации 10-10 КОЕ/мл и выращивании при 40°C в течение 20 часов.
6
7
7. Штамм Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-6, где данный штамм увеличивает количество глюкозы в 9,5%-ном В-молоке с 0,05% сахарозы до по меньшей мере 5 мг/мл при инокулировании в 9,5%-ное В-молоко с 0,05% сахарозы в концентрации 10-10 КОЕ/мл и выращивании при 40°C в течение 20 часов.
8. Штамм Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-7, где данный штамм несет мутацию в промоторной области гена GalK ниже -10 бокса промотора (бокса Прибнова).
9. Штамм Streptococcus thermophilus по пункту 8, где мутация в промоторной области гена GalK представляет собой мутацию в положении 3 нуклеотидов ниже -10 бокса промотора.
10. Штамм Streptococcus thermophilus по пункту 9, где мутация в промоторной области гена GalK представляет собой мутацию С до А в положении 3 нуклеотидов ниже -10 бокса промотора.
11. Штамм Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-10, где мутация в промоторной области гена GalK представляет собой мутацию в -10 бокса промотора.
12. Штамм Streptococcus thermophilus по пункту 11, где С в -10 бокса промотора заменен на нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из A, G и Т.
13. Штамм Streptococcus thermophilus по пункту 12, где С в -10 бокса промотора заменен на нуклеотид, выбранный из группы, состоящей из А и Т.
14. Штамм Streptococcus thermophilus по пункту 13, где С в -10 бокса промотора заменен на Т.
15. Штамм Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-14, где данный штамм образует текстуру в ферментированном молочном продукте с показателем напряжения сдвига более чем примерно 40 Па, измеренным после 12 часов роста при 37 градусах С.
16. Штамм Streptococcus thermophilus, выбранный из группы, состоящей из штамма СНСС19216 Streptococcus thermophilus, который был депонирован в Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур под № доступа DSM 32227, и мутантного штамма, имеющего происхождение из него, где данный мутантный штамм получен с использованием одного из указанных депонированных штаммов в качестве исходного материала, и где данный мутант имеет сохраненные или дополнительно улучшенные текстурирующую способность и способность секретировать глюкозу у указанного депонированного штамма.
4
12
17. Композиция, содержащая от 10 до 10 КОЕ/г штамма Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16.
6
7
6
7
18. Композиция по пункту 17, где штамм Streptococcus thermophilus не способен подкислять 9,5%-ное В-молоко, что определено по достижению снижения pH менее чем на 1,0 при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°C, и где данная композиция дополнительно содержит количество сахарозы, эффективное для инициирования подкисления 9,5%-ного В-молока, что определено по достижению снижения pH на 1,0 или более при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°C.
4
12
19. Композиция по пункту 17 или 18, дополнительно содержащая от 10 до 10 КОЕ/г устойчивого к 2-дезоксиглюкозе мутанта штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.
20. Способ изготовления ферментированного молочного продукта, включающий инокулирование и ферментирование молочного субстрата по меньшей мере одним штаммом Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16.
6
7
6
7
21. Способ по пункту 20, где штамм Streptococcus thermophilus не способен подкислять 9,5%-ное В-молоко, что определено по достижению снижения pH менее чем на 1,0 при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°C, и где в молочный субстрат добавлено количество сахарозы, эффективное для инициирования подкисления В-молока, что определено по достижению снижения pH на 1,0 или более при инокулировании 9,5%-ного В-молока 10-10 КОЕ/мл штамма Streptococcus thermophilus и инкубировании в течение 14 часов при 40°C.
22. Способ по любому из пунктов 20-21, включающий инокулирование и ферментирование молочного субстрата по меньшей мере одним штаммом Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 и по меньшей мере одним устойчивым к 2-дезоксиглюкозе мутантом штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.
23. Ферментированный молочный продукт, содержащий по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16.
24. Ферментированный молочный продукт по пункту 23, содержащий по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-15 и по меньшей мере один устойчивый к 2-дезоксиглюкозе мутант штамма Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus.
25. Применение штамма Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 для изготовления ферментированного молочного продукта.
26. Применение штамма Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 для усиления сладкого вкуса ферментированного молочного продукта.
27. Применение штамма Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
28. Применение штамма Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 для усиления сладкого вкуса и для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
29. Применение по любому из пунктов 27-28, где указанный штамм образует текстуру в ферментированном молочном продукте с показателем напряжения сдвига более чем примерно 40 Па, измеренным после 12 часов роста при 37 градусах С.
30. Применение штамма Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для изготовления ферментированного молочного продукта.
31. Применение штамма Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для усиления сладкого вкуса ферментированного молочного продукта.
32. Применение штамма Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
33. Применение штамма Streptococcus thermophilus по любому из пунктов 1-16 в комбинации со штаммом Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus для усиления сладкого вкуса и для улучшения текстуры в ферментированном молочном продукте.
34. Применение по любому из пунктов 32-33, где указанный штамм образует текстуру в ферментированном молочном продукте с показателем напряжения сдвига более чем примерно 40 Па, измеренным после 12 часов роста при 37 градусах С.
35. Применение по любому из пунктов 30-34, где штамм Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus представляет собой штамм, устойчивый к 2-дезоксиглюкозе.
36. Ферментированный молочный продукт по любому из пунктов 23-24 для использования в предотвращении симптомов непереносимости лактозы.
ПРИМЕРЫ
Материалы и методы
Среда:
Для Streptococcus thermophilus используемая среда представляет собой среду M17, известную специалистам в данной области.
2
Агаризованная среда M17 имеет следующий состав на литр HO:
агар 12, 75 г
аскорбиновая кислота 0,5 г
казеиновый пептон (триптический) 2,5 г
пентагидрат β-глицерофосфата динатрия 19 г
гидрат сульфата магния 0,25 г
мясной экстракт 5 г
мясной пептон (пептический) 2,5 г
соевый пептон (папаиновый) 5 г
дрожжевой экстракт 2,5 г
конечный pH 7,1 плюс/минус 0,2 (25°C);
2
и бульон M17 имеет следующий состав на литр HO:
аскорбиновая кислота 0,5 г
сульфат магния 0,25 г
мясной экстракт 5 г
мясной пептон (пептический) 2,5 г
глицерофосфат натрия 19 г
соевый пептон (папаиновый) 5 г
триптон 2,5 г
дрожжевой экстракт 2,5 г
конечный pH 7,0 плюс/минус 0,2 (25°C).
Добавленные источники углерода представляют собой стерильную лактозу 20 г/л, глюкозу 20 г/л или галактозу 20 г/л.
Как известно специалисту в данной области, среда M17 представляет собой среду, которая считается подходящей для роста Streptococcus thermophilus. Кроме того, как понятно специалисту в данной области, в настоящем контексте, концентрат M17 может быть предоставлен от разных поставщиков и, независимо от конкретного поставщика (в пределах стандартной неопределенности измерений), здесь будет достигаться тот же самый значимый результат устойчивости к 2-дезоксиглюкозе для рассматриваемой здесь клетки, представляющей интерес.
Среда, использованная для культивирования Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus, представляла собой среду MRS-IM. MRS-IM использовали либо в виде чашек с агаром, либо бульона.
2
Агаризованная среда MRS-IM имела следующий состав на литр HO:
После автоклавирования pH доводили до 6,9 плюс/минус 0,1 при 25°C.
2
Бульон MRS-IM, использованный для жидких культур в примерах, приведенных ниже, имел следующий состав на литр HO:
После автоклавирования pH доводили до 6,9 плюс/минус 0,1 при 25°C. Источники углерода - 20 г/л лактозы или 20 г/л глюкозы - сначала подвергали стерилизующей фильтрации и затем добавляли в автоклавированный бульон.
Приведенные выше среды MRS-IM могут быть в некоторой степени изменены без влияния на способность данных сред поддерживать рост Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus. Кроме того, как будет понятно специалисту в данной области, концентрат MRS-IM или разные описанные выше компоненты могут быть приобретены у разных поставщиков и использованы для приготовления среды MRS-IM. Эти среды аналогичным образом будут использованы в примерах, приведенных ниже, в частности, в селекционном анализе устойчивости к 2-дезоксиглюкозе.
Материнские штаммы
Streptococcus thermophilus СНСС11976 (галактозоферментирующий штамм с мутацией в гене GalK, как описано в WO 2011/026863).
Streptococcus thermophilus СНСС12339 (фагоустойчивый и текстурирующий, как описано в WO 2011/092300).
Streptococcus thermophilus СНСС18948 (галактозоферментирующий мутант CGCC12339 с мутацией в гене GalK).
Штаммы, устойчивые к 2-дезоксиглюкозе
Streptococcus thermophilus СНСС16165 (мутант СНСС11976, устойчивый к 2-дезоксиглюкозе).
Streptococcus thermophilus СНСС16731 (усиливающий сладкий вкус и тектсурирующий мутант СНСС16165).
Streptococcus thermophilus СНСС19216 (усиливающий сладкий вкус и текстурирующий мутант СНСС18948).
ПРИМЕР 1: Использование 2-дезоксиглюкозы для выделения мутанта по глюкокиназе Streptococcus thermophilus СНСС11976 с усиленной секрецией глюкозы
Для того чтобы выделить мутантов штамма СНСС11976 Streptococcus thermophilus, клетки, полученные в результате роста одной колонии, инокулировали в 10 мл бульона M17, содержащего 2% лактозы, и выращивали в течение ночи при 40°C.
На следующие сутки штаммы высевали в серийных разведениях на чашки с агаризованной M17, содержащей 2% галактозы и 2-дезоксиглюкозу в концентрации 20 мМ (СНСС11976), и инкубировали в течение 20 часов при 40°C. Устойчивые колонии сначала повторно высевали штрихом на тот же самый тип чашек с агаром, на котором они были подвергнуты селекции. Выживших использовали для инокуляции в свежий бульон M17, содержащий 2% лактозы, 2% галактозы или 2% глюкозы, и измеряли рост.
На основе этого идентифицировали ряд мутантов, которые были способны расти на галактозе быстрее, чем на глюкозе, как описано в Примере 2. Один из таких мутантов представлял собой СНСС16165.
ПРИМЕР 2: Картина роста мутанта, устойчивого к 2-дезоксиглюкозе
Для обеспечения отбора мутантов, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе, которые могут расти на галактозе, использовали два штамма, которые были отобраны из коллекции галактозоферментирующих штаммов. В то время как эти галактозоферментирующие штаммы все еще растут по меньшей мере на 10% быстрее в экспоненциальной фазе в бульоне M17 плюс 2% глюкозы, чем в бульоне M17 плюс 2% галактозы, устойчивый к 2-дезоксиглюкозе мутант, происходящий из СНСС11976, а именно СНСС16165, с другой стороны, отличается более быстрым ростом в экспоненциальной фазе в бульоне M17 плюс 2% галактозы, чем в бульоне M17 плюс 2% глюкозы.
600
Рост в экспоненциальной фазе измеряют здесь как нарастание оптической плотности экспоненциально растущей культуры при 600 нанометрах (ОП) с течением времени при 40°C.
600
Как известно специалисту в данной области, возможно варьирование от вида к виду, когда культура находится в экспоненциальном росте. Специалисту известно как определять рост в экспоненциальной фазе, например в интервале ОП 0,1-1,0.
Оптическую плотность (ОП) культуры измеряют на спектрофотометре.
Заключение:
На основе картины роста устойчивого к 2-дезоксиглюкозе мутанта в данном Примере 2 - для конкретного интересующего штамма (например, штамма из релевантного имеющегося в продаже продукта) - специалист может согласно устоявшейся практике протестировать, имеет ли данный конкретный интересующий штамм релевантную здесь картину роста, которая является свойством отобранных мутантов.
ПРИМЕР 3: Отбор сверхферментирующего лактозу и секретирующего глюкозу мутанта Streptococcus thermophilus СНСС16165
Для того чтобы выделить сверхферментирующий лактозу и секретирующий глюкозу мутант штамма СНСС16165 Streptococcus thermophilus, клетки, полученные в результате роста одной колонии, инокулировали в 10 мл бульона M17, содержащего 2% галактозы, и выращивали в течение ночи при 40°C.
На следующие сутки данный штамм высевали в серийных разведениях на чашки с агаризованной M17, содержащей 2% сахарозы и 2-дезоксиглюкозу в концентрации 40 мМ, и инкубировали в течение 20 часов при 40°C. Отбирали 10 случайных колоний с чашки и использовали для инокулирования в свежий бульон M17, содержащий 2% сахарозы, и инкубировали в течение ночи при 40°C. Мутантов СНСС16165 переносили на свежие среды M17, содержащие 2% сахарозы.
ПРИМЕР 4: Анализ углеводов ферментированного молока
Мутантов, полученных в Примере 3, и штамм СНСС16165 выращивали в 9,6%-ном В-молоке, содержащем 0,01% сахарозы. После заквашивания молоко, подкисленное СНСС16165, имело концентрацию лактозы 14,9, концентрацию галактозы 8,4 и концентрацию глюкозы 5,7. По сравнению с этим, молоко, подкисленное лучше всего работающим мутантом СНСС16165, имело концентрацию лактозы 9,3, концентрацию галактозы 10,5 и концентрацию глюкозы 9,9. Указанный лучший мутант СНСС16165 был обозначен СНСС16731 и был подвергнут дальнейшему тестированию в ферментации молока при использовании в комбинации со штаммами СНСС16159 и СНСС16160 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (описанными в WO 2013/160413).
Выращенные в течение ночи культуры СНСС16165 и СНСС16731 в комбинации с каждым из СНСС16159 и СНСС16160 добавляли к 200 мл образцов В-молока и заквашивали при 40°C.
Результаты были такими, как показано в Таблице 1:
Как следует из результатов Таблицы 1, СНСС16731 способен удалять почти всю лактозу из молока. Также СНСС16731 продуцирует и секретирует в молоко высокие уровни и галактозы, и глюкозы. Принимая во внимание то, что сладость сахарозы, взятой за контроль, составляет 100, а сладость лактозы составляет 16, сладость галактозы составляет 32 и сладость глюкозы 74,3, ферментированный молочный продукт, полученный с использованием СНСС16731, имеет значительно усиленный сладкий вкус.
ПРИМЕР 5: Получение галактозопозитивного мутанта Streptococcus thermophilus СНСС12339
Streptococcus thermophilus CHCC12339 выращивали в течение ночи в М17, содержащей 2% лактозы, при 40°C. Выращенную в течение ночи культуру высевали (100 мкл) на чашку M17, содержащую 2% галактозы, и инкубировали при 40°C в анаэробных условиях. На чашках с M17, содержащей 2% галактозы, появились 22 колонии. 16 из них повторно высевали штрихом на тот же самый тип чашек, и 8 из них переносили в жидкую M17, содержащую 2% галактозы, все из которых приводили к росту, и 4 из данных культур замораживали. 2 из замороженных культур распределяли на чашки с M17, содержащей 2% галактозы и 40 мМ 2-дезоксиглюкозы, и для каждой культуры отбирали 8 образующихся колоний. 16 мутантов по 2-дезоксиглюкозе переносили в жидкую M17, содержащую 2% лактозы и 2% галактозы, и выращивали в течение ночи при 40°C, после чего данных мутантов выращивали в жидкой M17, содержащей 2% галактозы, в течение 3 ночей, и продуцируемую галактозу и глюкозу измеряли и отслеживали на протяжении роста. На основе продуцирования галактозы и глюкозы отбирали 7 культур для тестирования подкисления молока посредством добавления 2 мл культуры в 200 мл 9,5%-ного В-молока, содержащего 0,05% сахарозы. 3 мутанта имели профили подкисления, имеющие сходство с профилем подкисления материнского штамма СНСС12339, и данные 3 мутанта высевали штрихом для получения одиночных колоний и инкубировали в течение 48 часов. Затем данные колонии переносили в жидкую M17, содержащую 2% галактозы, и рост данных 3 мутантов тестировали относительно СН12339. Отбирали мутанта, имеющего самый сильный рост, и очищали еще раз посредством высевания одиночной колонии штрихом 3 раза с получением очищенного галактозопозитивного штамма, названного СНСС18948 (галактозопозитивный вариант СНСС12339).
ПРИМЕР 6: Получение устойчивого к 2-дезоксиглюкозе мутанта Streptococcus thermophilus СНСС18948 с повышенной секрецией глюкозы
100 мкл культуры СНСС18949 распределяли на чашки с M17, содержащей 2% галактозы и 20 мМ или 40 мМ 2-дезоксиглюкозы, и инкубировали в течение ночи при 40°C. Отбирали 8 колоний с чашек с 20 мМ и 8 колоний с чашек с 40 мМ и выращивали в жидкой M17, содержащей 2% галактозы и 20 мМ 2-оксиглюкозы. Образующиеся культуры замораживали и повторно высевали штрихом, и 12 из образовавшихся колоний включали в среду M17 и использовали для подкисления В-молока. 1% выращенной в течение ночи культуры мутанта по 2-дезоксиглюкозе инокулировали в 200 мл 9,5%-ного В-молока, содержащего 0,05% сахарозы, и заквашивали при 40°C. Все 12 мутантов СНСС18948, устойчивых к 2-дезоксиглюкозе, продуцировали ферментированные молочные продукты с низкими концентрациями лактозы и высокими концентрациями галактозы и глюкозы. 7 мутантов отбирали для повторного тестирования по отдельности и для тестирования вместе со штаммами СНСС16159 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (описанными в WO 2013/160413). Вновь, 1% выращенной в течение ночи культуры мутанта по 2-дезоксиглюкозе инокулировали в 200 мл 9,5%-ного В-молока, содержащего 0,05% сахарозы, и заквашивали при 40°C.
Результаты приведены в Таблице 2:
Тремя наилучшими мутантами являются мутанты 2, 3 и 12, и их повторно тестировали в В-молоке, содержащем 0,05% сахарозы, в отдельности и в комбинации со штаммами СНСС16159, СНСС16160 и СНСС16161 Lactobacillus delbrueckii подвид bulgaricus (описанными в WO 2013/160413).
Результаты приведены в Таблице 3:
На основе приведенных выше данных СНСН18948-Мутант3 был отобран как лучший мутант, и он был обозначен СНСС19216. Как следует из приведенных выше данных, СНСС19216 способен удалять почти всю лактозу из молока. СНСС19216 также продуцирует и секретирует в молоко высокие уровни и галактозы, и глюкозы. Принимая во внимание то, что сладость сахарозы, взятой за контроль, составляет 100, а сладость лактозы составляет 16, сладость галактозы составляет 32, и сладость глюкозы 74,3, ферментированный молочный продукт, полученный с использованием СНСС19216, имеет значительно усиленный сладкий вкус.
ПРИМЕР 7: Текстурирующее свойство СНСС16731 и СНСС19216
Текстурирующее свойство штаммов СНСС16731 и СНСС19216 тестировали путем измерения напряжения сдвига с использованием следующего анализа:
Через семь суток после инкубации ферментированное молоко доводили до 13°C и слегка помешивали посредством палочки, оснащенной диском с отверстиями до достижения гомогенности образца. Реологические свойства образца оценивали на реометре (реометр Anton Paar Physica ASC/DSR301 (автосэмплер), Anton Paar GmbH, Австрия) с использованием следующих установок:
Время ожидания (для восстановления в некоторой степени исходной структуры)
5 минут без качания или вращения
Качание (для измерения G' и G'' для расчета G*)
у равно 0,3%, частота (f) равна [0,5…8] Гц
6 точек измерения за 60 с (одно измерение каждые 10 с)
Вращение (для измерения напряжения сдвига при 300 1/с и т.д.)
и
21 точка измерения за 210 с (одно каждые 10 с), идущего вплоть до 300 1/с
и
21 точка измерения за 210 с (одно каждые 10 с), идущего вплоть до 0,2707 1/с.
Для дальнейшего анализа было выбрано напряжение сдвига при 300 1/с.
Штаммы СНСС16731 и СНСС19216 в смесях, перечисленных в Таблице 4, использовали для подкисления образцов 200 мл 9,5%-ного В-молока с использованием инокулюма 0,024% до достижения pH 4,55.
Результаты приведены в Таблице 4:
Lb: штамм СНСС16159 L. delbruecki подвид bulgaricus.
St: Streptococcus thermophilus.
Как следует из данных результатов, штаммы СНСС16731 и СНСС19216, при использовании в культуральной смеси в качестве единственного S. thermophilus, продуцируют ферментированный молочный продукт с напряжением сдвига 41,3 Па и 51,5 Па, соответственно. При использовании в комбинации штаммы СНСС16731 и СНСС19216 продуцируют ферментированный молочный продукт с напряжением сдвига 43,3 Па.
Данный уровень напряжения сдвига является высоким по сравнению с традиционными штаммами, усиливающими сладкий вкус, как раскрыто, например, в WO 2013/160413.
--->
SEQUENCE LISTING
<110>  Chr. Hansen A/S
<120>  Lactic acid bacteria for preparing fermented food products with
increased natural sweetness and high texture
<130>  P5991EP00
<160>  6
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  966
<212>  DNA
<213>  Streptococcus thermophilus
<400>  1
atgagtaaga aactcttagg tattgacctt ggtggaacaa ctgttaagtt tggtattttg       60
actgcagatg gtgaagttca agaaaaatgg gctattgaaa caaatacgtt tgaaaatggt      120
agccacattg ttcctgacat tgtagaatct ttgaaacacc gtttggaatt gtatggactt      180
actgctgaag attttattgg aattggtatg ggatctccag gtgcagttga ccgagaaaat      240
aaaacagtaa cgggtgcctt taacttgaac tgggcagaaa ctcaagaagt tggctctgtt      300
attgaaaaag aacttggtat tccattcgct attgataatg atgctaatgt ggctgcactg      360
ggtgaacgtt gggttggtgc tggtgctaac aatcggaatg ttgtctttat aacattgggt      420
acaggtgttg gtggcggtgt tatcgctgat ggtaacttaa ttcatggtgt tgccggtgct      480
ggtggggaaa ttggtcacat tattgttgaa cctgacacag gatttgagtg tacttgcgga      540
aacaaggggt gtctggaaac tgtagcttca gcaacaggta ttgtacgtgt agcacatcat      600
ttggcagaaa aatacgaagg aaactcttct attaaagctg ctgtagacaa tggtgagttt      660
gtgacaagta aagatattat cgtagctgct actgaaggtg ataagtttgc tgacagcatt      720
gttgataaag tctctaaata cctcagactt gcaacagcaa acatctcaaa cattcttaac      780
ccagattctg tcgttatcgg tggtggtgtt tctgccgcag gagaattctt gcgtagtcgt      840
gttgaaggat actttacacg ttatgcattc ccacaagttc gccgtacaac aaaagtgaaa      900
ttagcggagc ttggaaatga tgcaggaatc attggagctg ctagtcttgc ttatagtatt      960
gacaaa                                                                 966
<210>  2
<211>  322
<212>  PRT
<213>  Streptococcus thermophilus
<400>  2
Met Ser Lys Lys Leu Leu Gly Ile Asp Leu Gly Gly Thr Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Phe Gly Ile Leu Thr Ala Asp Gly Glu Val Gln Glu Lys Trp Ala Ile
20                  25                  30
Glu Thr Asn Thr Phe Glu Asn Gly Ser His Ile Val Pro Asp Ile Val
35                  40                  45
Glu Ser Leu Lys His Arg Leu Glu Leu Tyr Gly Leu Thr Ala Glu Asp
50                  55                  60
Phe Ile Gly Ile Gly Met Gly Ser Pro Gly Ala Val Asp Arg Glu Asn
65                  70                  75                  80
Lys Thr Val Thr Gly Ala Phe Asn Leu Asn Trp Ala Glu Thr Gln Glu
85                  90                  95
Val Gly Ser Val Ile Glu Lys Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ala Ile Asp
100                 105                 110
Asn Asp Ala Asn Val Ala Ala Leu Gly Glu Arg Trp Val Gly Ala Gly
115                 120                 125
Ala Asn Asn Arg Asn Val Val Phe Ile Thr Leu Gly Thr Gly Val Gly
130                 135                 140
Gly Gly Val Ile Ala Asp Gly Asn Leu Ile His Gly Val Ala Gly Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gly Glu Ile Gly His Ile Ile Val Glu Pro Asp Thr Gly Phe Glu
165                 170                 175
Cys Thr Cys Gly Asn Lys Gly Cys Leu Glu Thr Val Ala Ser Ala Thr
180                 185                 190
Gly Ile Val Arg Val Ala His His Leu Ala Glu Lys Tyr Glu Gly Asn
195                 200                 205
Ser Ser Ile Lys Ala Ala Val Asp Asn Gly Glu Phe Val Thr Ser Lys
210                 215                 220
Asp Ile Ile Val Ala Ala Thr Glu Gly Asp Lys Phe Ala Asp Ser Ile
225                 230                 235                 240
Val Asp Lys Val Ser Lys Tyr Leu Arg Leu Ala Thr Ala Asn Ile Ser
245                 250                 255
Asn Ile Leu Asn Pro Asp Ser Val Val Ile Gly Gly Gly Val Ser Ala
260                 265                 270
Ala Gly Glu Phe Leu Arg Ser Arg Val Glu Gly Tyr Phe Thr Arg Tyr
275                 280                 285
Ala Phe Pro Gln Val Arg Arg Thr Thr Lys Val Lys Leu Ala Glu Leu
290                 295                 300
Gly Asn Asp Ala Gly Ile Ile Gly Ala Ala Ser Leu Ala Tyr Ser Ile
305                 310                 315                 320
Asp Lys
<210>  3
<211>  909
<212>  DNA
<213>  Streptococcus thermophilus
<400>  3
atggctgaaa aaattcaatt atctcaagcg gatcgtaaaa aggtttggtg gcgctcacaa       60
ttcttgcaag gtgcatggaa ctatgaacgt atgcaaaact tgggttgggc ttactcactc      120
attcctgcta tcaaaaaact ttatactaac aaagaggacc aagccgcagc tcttaaacgt      180
cacttggaat tcttcaacac tcacccttac gtagctgctc ctatcatagg ggttccctta      240
gctcttgaag aagaaaaagc taatggtact gaaatcgaag atgcggctat ccaaggggtt      300
aaaatcggta tgatgggtcc acttgccggt atcggtgacc ctgtcttctg gttcacaatt      360
cgtccaattc ttggtgccct tggtgcatca ttggcacaag ctggtaacat tgctggtcca      420
cttatcttct tcattggttg gaaccttatc cgcatggcct tcttgtggta cactcaagaa      480
cttggttaca aagcaggttc agaaatcact aaagacatat ctggtggtat cttgaaagat      540
attactaaag gggcatcaat acttggtatg ttcatcttgg ccgtcctcgt tgaacgttgg      600
gtatctgtcg tcttcactgt aaagcttcca ggtaaagttt tgcctaaagg tgcttatatt      660
gaatggccaa aaggatatgt tactggtgac caactaaaaa ctatccttgg tcaagtcaac      720
gataagctta gctttgataa gattcaagtc gataccctac aaaaacaatt ggattcatta      780
attccaggtt tgacgggact tctccttact tttgcatgta tgtggttgct taagaagaaa      840
gtttcaccaa tcacaatcat catcggactc tttgtagttg gtattattgc aagcttcttc      900
ggaatcatg                                                              909
<210>  4
<211>  303
<212>  PRT
<213>  Streptococcus thermophilus
<400>  4
Met Ala Glu Lys Ile Gln Leu Ser Gln Ala Asp Arg Lys Lys Val Trp
1               5                   10                  15
Trp Arg Ser Gln Phe Leu Gln Gly Ala Trp Asn Tyr Glu Arg Met Gln
20                  25                  30
Asn Leu Gly Trp Ala Tyr Ser Leu Ile Pro Ala Ile Lys Lys Leu Tyr
35                  40                  45
Thr Asn Lys Glu Asp Gln Ala Ala Ala Leu Lys Arg His Leu Glu Phe
50                  55                  60
Phe Asn Thr His Pro Tyr Val Ala Ala Pro Ile Ile Gly Val Pro Leu
65                  70                  75                  80
Ala Leu Glu Glu Glu Lys Ala Asn Gly Thr Glu Ile Glu Asp Ala Ala
85                  90                  95
Ile Gln Gly Val Lys Ile Gly Met Met Gly Pro Leu Ala Gly Ile Gly
100                 105                 110
Asp Pro Val Phe Trp Phe Thr Ile Arg Pro Ile Leu Gly Ala Leu Gly
115                 120                 125
Ala Ser Leu Ala Gln Ala Gly Asn Ile Ala Gly Pro Leu Ile Phe Phe
130                 135                 140
Ile Gly Trp Asn Leu Ile Arg Met Ala Phe Leu Trp Tyr Thr Gln Glu
145                 150                 155                 160
Leu Gly Tyr Lys Ala Gly Ser Glu Ile Thr Lys Asp Ile Ser Gly Gly
165                 170                 175
Ile Leu Lys Asp Ile Thr Lys Gly Ala Ser Ile Leu Gly Met Phe Ile
180                 185                 190
Leu Ala Val Leu Val Glu Arg Trp Val Ser Val Val Phe Thr Val Lys
195                 200                 205
Leu Pro Gly Lys Val Leu Pro Lys Gly Ala Tyr Ile Glu Trp Pro Lys
210                 215                 220
Gly Tyr Val Thr Gly Asp Gln Leu Lys Thr Ile Leu Gly Gln Val Asn
225                 230                 235                 240
Asp Lys Leu Ser Phe Asp Lys Ile Gln Val Asp Thr Leu Gln Lys Gln
245                 250                 255
Leu Asp Ser Leu Ile Pro Gly Leu Thr Gly Leu Leu Leu Thr Phe Ala
260                 265                 270
Cys Met Trp Leu Leu Lys Lys Lys Val Ser Pro Ile Thr Ile Ile Ile
275                 280                 285
Gly Leu Phe Val Val Gly Ile Ile Ala Ser Phe Phe Gly Ile Met
290                 295                 300
<210>  5
<211>  828
<212>  DNA
<213>  Streptococcus thermophilus
<400>  5
atgtcagata tgtcaattat ttctgcgatt ttggtcgtag ctgttgcctt ccttgctggt       60
cttgaaagta tccttgacca attccaattc caccaaccac ttgttgcatg taccctcatc      120
ggtgctgcca caggtaacct cactgcaggt atcatgcttg gtggttctct tcaaatgatt      180
acccttgctt gggcaaacat cggtgctgcc gtagctcctg acgttgccct tgcatctgtt      240
gccgctgcca tcattttggt taaaggtggt aaatttacag ctgaaggtat cggtgttgcg      300
attgcaatag ctatcctgct tgcagttgca ggtctcttcc taactatgcc tgttcgtaca      360
gcatctattg cctttgttca tgctgcagat aaagctgcag aacacggaaa catcgctggt      420
gttgaacgtg catactacct cgctctcctt cttcaaggtt tgcgtattgc tgtgccagca      480
gcccttcttc ttgccatccc ggcccaatct gttcaacatg cccttggctt gatgcctgac      540
tggctcaccc atggtttggt tgtcggtggt ggtatggtcg tagccgttgg ttacgccatg      600
attatcaata tgatggctac tcgtgaagtt tggccattct tcgccattgg ttttgctttg      660
gcagcaatta gccaattgac acttatcgct cttagtacca ttggtgttgc catcgccttc      720
atctacctca acctttctaa acaaggtggc ggaaatggtg gcggaaatgg tggcggaact      780
tcatctggtt caggcgaccc aatcggcgat atcttggaag actactag                   828
<210>  6
<211>  275
<212>  PRT
<213>  Streptococcus thermophilus
<400>  6
Met Ser Asp Met Ser Ile Ile Ser Ala Ile Leu Val Val Ala Val Ala
1               5                   10                  15
Phe Leu Ala Gly Leu Glu Ser Ile Leu Asp Gln Phe Gln Phe His Gln
20                  25                  30
Pro Leu Val Ala Cys Thr Leu Ile Gly Ala Ala Thr Gly Asn Leu Thr
35                  40                  45
Ala Gly Ile Met Leu Gly Gly Ser Leu Gln Met Ile Thr Leu Ala Trp
50                  55                  60
Ala Asn Ile Gly Ala Ala Val Ala Pro Asp Val Ala Leu Ala Ser Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Ala Ile Ile Leu Val Lys Gly Gly Lys Phe Thr Ala Glu Gly
85                  90                  95
Ile Gly Val Ala Ile Ala Ile Ala Ile Leu Leu Ala Val Ala Gly Leu
100                 105                 110
Phe Leu Thr Met Pro Val Arg Thr Ala Ser Ile Ala Phe Val His Ala
115                 120                 125
Ala Asp Lys Ala Ala Glu His Gly Asn Ile Ala Gly Val Glu Arg Ala
130                 135                 140
Tyr Tyr Leu Ala Leu Leu Leu Gln Gly Leu Arg Ile Ala Val Pro Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Leu Leu Ala Ile Pro Ala Gln Ser Val Gln His Ala Leu Gly
165                 170                 175
Leu Met Pro Asp Trp Leu Thr His Gly Leu Val Val Gly Gly Gly Met
180                 185                 190
Val Val Ala Val Gly Tyr Ala Met Ile Ile Asn Met Met Ala Thr Arg
195                 200                 205
Glu Val Trp Pro Phe Phe Ala Ile Gly Phe Ala Leu Ala Ala Ile Ser
210                 215                 220
Gln Leu Thr Leu Ile Ala Leu Ser Thr Ile Gly Val Ala Ile Ala Phe
225                 230                 235                 240
Ile Tyr Leu Asn Leu Ser Lys Gln Gly Gly Gly Asn Gly Gly Gly Asn
245                 250                 255
Gly Gly Gly Thr Ser Ser Gly Ser Gly Asp Pro Ile Gly Asp Ile Leu
260                 265                 270
Glu Asp Tyr
275
<---