Способ фотодинамической терапии локальных очагов инфекции
METHOD FOR PHOTODYNAMIC THERAPY OF LOCAL FOCI OF INFECTION

Настоящее изобретение относится к микробиологии и медицине, а более конкретно к способам лечения локальных очагов хронической инфекции.
Проблема борьбы с инфекционными заболеваниями, связанная с возрастающей резистентностью патогенных бактерий, вызывающих хронические заболевания различной локализации, к антибиотикам широкого спектра действия, стала одной из основных проблем современной медицины. Установлено, что имеющие сложную структуру организованные сообщества патогенных бактерий (так называемые бактериальные биопленки) практически не поддаются терапии с помощью антибиотиков и являются причиной не только хронических инфекционных заболеваний (таких как гнойные раны, трофические язвы), но и возникающих тяжелых осложнений в кардиохирургии, урологии и других областях медицины, при которых в организм пациента вводятся медицинские изделия (катетеры, стенты, искусственные клапаны и суставы). Кроме того, установлено, что одной из причин образования почечных камней и камней желчного пузыря, а также до 80% инфекционных рецидивов мочекаменной болезни являются именно бактериальные биопленки [Романова Ю.М. и др. Микробные сообщества на мочевых камнях // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2015. №2. Стр. 20-25].
Сложная инфраструктура и иерархия бактерий в бактериальной биопленке, формирование ею специальных средств жизнеобеспечения и защиты в виде матрикса приводят к тому, что для лечения таких инфекционных поражений дозы антибиотиков надо было бы увеличивать в сотни раз, что выходит за пределы реальных возможностей организма.
Обнаружено, что для инактивации биопленок может быть использована фотодинамическая терапия, причем у бактерий не формируется резистентность к этому способу лечения. Наиболее целесообразно для повышения эффективности фотодинамической инактивации бактерий и биопленок использовать катионные фотосенсибилизаторы, которые позволяют эффективно воздействовать как на грамположительные, так и на грамотрицательные бактерии [Патент РФ №2282647, Патент РФ №2397172]. Возбуждение этих фотосенсибилизаторов осуществляется в спектральном диапазоне 670-770 нм.
2
n
n
32
16
8
3
Известен способ фотодинамической терапии очагов бактериального поражения [Патент РФ №2282647]. В этом способе осуществляют сенсибилизацию очага бактериального поражения фотосенсибилизатором на основе катионных кватернизованных хлорметилзамещенных фталоцианинов общей формулы МРс(СН Х)Cl (где Рс = остаток фталоцианина CHN, M=Zn, AlY, n=6÷8, Y=Cl, OH, OSOH). Этот способ фотодинамического лечения очагов бактериального поражения выбран в качестве ближайшего аналога.
Недостаток известного способа фотодинамической терапии обусловлен тем, что при значительной инвазии хронического инфекционного поражения в подлежащие ткани возбуждение фотосенсибилизаторов, накопившихся в очаге хронического инфекционного поражения, оказывается неэффективным, как показали исследования авторов, если облучение производится в спектральном диапазоне 670-780 нм. Авторами экспериментально установлено, что продукты жизнедеятельности формирующих биопленки бактерий, в частности возбудителей гнойных раневых инфекций, имеют широкую полосу интенсивного оптического поглощения в спектральном диапазоне 600-780 нм. При облучении таких очагов значительная часть света поглощается продуктами жизнедеятельности бактерий, и, соответственно, не возбуждает молекулы фотосенсибилизатора, вследствие чего эффективность фотодинамического лечения снижается.
В изобретении решается задача повышения эффективности фотодинамической терапии локальных очагов инфекции за счет увеличения доли светового излучения, которая возбуждает находящиеся в тканях молекулы фотосенсибилизатора.
3
Задача решается тем, что в способе фотодинамической терапии локальных очагов инфекции, включающем сенсибилизацию очагов катионным фотосенсибилизатором и их облучение светом на длине волны поглощения фотосенсибилизатора, используют фотосенсибилизатор с поглощением в спектральном диапазоне 810-850 нм, в качестве фотоактивной субстанции фотосенсибилизатора используют метиловый эфир 13-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида.
3
Задача решается также тем, что сенсибилизацию осуществляют композицией на основе метилового эфира 13-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида аппликационно.
3
Задача решается также тем, что сенсибилизацию осуществляют внутривенным введением водной композиции метилового эфира 13-N-(N-метилникотинил)-бактериопурпуринимида.
Задача решается также тем, что сенсибилизацию осуществляют в течение 60-180 мин.
Задача решается также тем, что в процессе сенсибилизации контролируют интенсивность флуоресценции фотосенсибилизатора, а облучение осуществляют после достижения максимальной интенсивности флуоресценции.
3
Сущность изобретения поясняется фиг. 1-4, где на фиг. 1 представлены результаты исследований раневой поверхности животных опытной группы (с антибактериальной ФДТ) и контрольной группы (без антибактериальной ФДТ) при аппликационной сенсибилизации, на фиг. 2 представлены данные одного из исследований по изучению зависимости эффективности фотодинамической инактивации биопленок Pseudomonas aeruginosa от дозы облучения, на фиг. 3 - зависимости эффективности фотодинамической инактивации биопленок Pseudomonas aeruginosa от времени инкубации в водной дисперсии на основе метилового эфира 13-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида с концентрацией 1 мМ, на фиг. 4 - результаты исследований раневой поверхности животных опытной группы (с антибактериальной ФДТ) и контрольной группы (без антибактериальной ФДТ) при внутривенном введении.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
3
Локальный очаг инфекции в течение 60-180 мин сенсибилизируют катионным фотосенсибилизатором. В качестве фотосенсибилизатора может быть использована композиция на основе метилового эфира 13-N-(N-метилникотинил)-бактериопурпуринимида. Сенсибилизацию осуществляют, в зависимости от вида локального очага инфекции, аппликационно либо внутривенным введением фотосенсибилизатора. Сенсибилизацию осуществляют в течение 60-180 мин, контролируя интенсивность флуоресценции фотосенсибилизатора, а после достижения максимальной интенсивности флуоресценции осуществляют облучение излучением, поглощаемым фотосенсибилизатором.
Ниже приведены конкретные примеры осуществления заявляемого изобретения.
7
3
2
2
Пример 1. Фотодинамическая терапия локальных очагов инфекции. Экспериментальные исследования in vivo проводили на белых мышах линии Balb/C, самцах массой 18-20 г. Использована модель хронической инфекции кожной раны. В эксперименте использовали клинический изолят Staphylococcus aureus. Мышам проводили обезболивание и наносили хирургическую кожную рану размером 1 см на спине. Поверхность раны инфицировали суточной бульонной культурой в объеме 20 мкл. Инокуляция составляла примерно 2⋅10 колониеобразующих единиц (КОЕ). На следующий день формировалась глубокая гнойная рана. Инфицированную раневую поверхность аппликационно сенсибилизировали в течение 1,5 часов наложением стерильной пленочной повязки Tegaderm™, пропитанной 200 мкл водной-кремофорной композицией метилового эфира 13-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида. После этого производили облучение в течение 20 мин длиной волны 825 нм и плотностью мощности 60 мВт/см (плотность световой дозы около 70 Дж/см). Клиническая оценка течения раневого процесса у экспериментальных животных производилась с учетом выраженности воспалительных явлений в области раны (отек, количество и характер гнойного отделяемого, сроки отторжения струпа и полного заживления). Результаты исследований раневой поверхности животных опытной группы (с антибактериальной ФДТ) и контрольной группы (без антибактериальной ФДТ) представлены на Фиг. 1.
Пример 2. Фотодинамическая инактивация биопленок грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa.
Культуру Pseudomonas aeruginosa 32 выращивали в LB-бульоне с аэрацией при 37°С 18 ч до стационарной фазы. Ночную культуру разводили в 100 раз LB-бульоном в объеме 20 мл и стерильно вносили в плоскодонные пластиковые планшеты по 200 мкл в лунку. Крышки «Calgary Device» погружали в лунки и инкубировали при 37°С 18 ч в темноте для образования биопленок.
2
После инкубации биопленки отмывали от планктонных бактерий, дважды опуская крышки с колышками в плоскодонные планшеты с 180 мкл дистиллированной воды в лунках. Раствор фотосенсибилизатора с концентрацией 1 мМ вносили в плоскодонные пластиковые планшеты по 200 мкл в лунку, а для контроля вносили физиологический раствор. Крышки с колышками «Calgary Device» погружали в планшеты и инкубировали в темноте при 37°С в течение 30, 60 или 90 мин. После инкубации крышки с колышками помещали в плоскодонные пластиковые планшеты с 200 мкл физиологического раствора в лунках для облучения. Дозу облучения изменяли от 0 до 40 Дж/см, изменяя время облучения. Облученные биопленки разрушали методом соникации в ультразвуковой бане в присутствии тающего льда в течение 30 минут. Из полученных суспензий отбирали 30 мкл и готовили шесть десятикратных разведений в физиологическом растворе в плоскодонных пластиковых планшетах и высевали по 20 мкл на чашки с L-агаром, визуально разделенные на 6 секторов, для подсчета жизнеспособных колоний. Подсчет жизнеспособных колоний проводили после инкубации чашек Петри при 37°С в течение 1 суток. Эффективность фотодинамического воздействия определяли по уменьшению количества КОЕ/мл (колониеобразующих единиц/мл) бактерий по сравнению с биопленками, не подвергавшимися облучению.
На Фиг. 2 для иллюстрации приведены данные одного из исследований по изучению зависимости эффективности фотодинамической инактивации биопленок Pseudomonas aeruginosa от дозы облучения. Сенсибилизацию биопленок проводили в водной дисперсии на основе предлагаемого фотосенсибилизатора с концентрацией 1 мМ в течение 60 мин: кривая 2 - количество колониеобразующих единиц в единице объема (КОЕ/мл) после фотосенсибилизации, но без облучения (контроль), кривая 1 - количество КОЕ/мл в облученных лунках).
3
2
На Фиг. 3 для иллюстрации приведены данные одного из исследований по изучению зависимости эффективности фотодинамической инактивации биопленок Pseudomonas aeruginosa в лунках 24-луночного планшета от времени сенсибилизации (30, 60 или 90 мин) в водной дисперсии метилового эфира 13-N-(N-метилникотинил)-бактериопурпуринимида с концентрацией 1 мМ: темные столбики - количество колониеобразующих единиц в единице объема (КОЕ/мл) после без облучения (контроль), светлые столбики - количество КОЕ/мл в облученных лунках (доза облучения 35 Дж/см). Использованы следующие обозначения: обозначение ФС - сенсибилизация фотосенсибилизатором, время сенсибилизации указано под обозначением; обозначение К - контроль, при котором бактериальная биопленка в течение 90 мин находится в контакте с физиологическим раствором без ФС. Время, плотность мощности и плотность дозы для всех лунок одинаковы.
Пример 3. Фотодинамическая терапия локальных очагов инфекции.
7
3
3
Экспериментальные исследования in vivo проводили на 2 группах белых мышей линии Balb/C, самцах массой 18-20 г. Использована модель хронической инфекции кожной раны. В эксперименте использовали клинический изолят Staphylococcus aureus. Мышам проводили обезболивание и наносили хирургическую кожную рану размером 1 см на спине. Поверхность раны инфицировали суточной бульонной культурой в объеме 20 мкл. Инокуляция составляла примерно 2⋅10 колониеобразующих единиц (КОЕ). На следующий день формировалась глубокая гнойная рана. Инфицированную раневую поверхность сенсибилизировали внутривенным введением водной композиции метилового эфира 13-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида. Контролировали интенсивность флуоресценции метилового эфира 13-N-(N-метилникотинил)-бактериопурпуринимида в спектральном диапазоне 830-860 нм.
2
2
Обнаружено, что максимальная интенсивность флуоресценции в инфицированной ране достигается во временном интервале 60-180 мин, при этом фотосенсибилизатор селективно накапливается в инфицированной ране, соотношение между интенсивностями флуоресценции в инфицированной ране и здоровой коже превышает 5. Через 120 минут после введения проводили облучение мышей опытной группы в течение 4 мин излучением с длиной волны 825 нм и плотностью мощности 60 мВт/см (плотность световой дозы около 14 Дж/см); мыши контрольной группы не облучались. Клиническая оценка течения раневого процесса у экспериментальных животных производилась с учетом выраженности воспалительных явлений в области раны (отек, количество и характер гнойного отделяемого, сроки отторжения струпа и полного заживления). Результаты исследований раневой поверхности животных опытной группы (с антибактериальной ФДТ) и контрольной группы (без антибактериальной ФДТ) при внутривенном введении представлены на фиг. 4.
3
3
Субстанцию метилового эфира 13-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида получали в несколько стадий, включающих получение метилового эфира N-аминобактериопурпуринимида за счет взаимодействия гидразингидрата с бактериопурпурином, полученным из бактериохлорофилла а, и последующего метилирования продукта реакции с помощью диазометана. На второй стадии метиловый эфир N-аминобактериопурпуринимида обрабатывают хлорангидридом никотиновой кислоты и кватернизуют пиридиновый атом азота в ацилированном бактериопурпуринимиде иодметаном, что приводит к заявляемому катионному метиловому эфиру 13-N-(N-метилникотинил)бактериопурпуринимида с основной полосой поглощения при 827 нм.
Анализ результатов исследований свидетельствует о высокой эффективности фотодинамического лечения инфицированных ран. Время полного заживления инфицированных ран после фотодинамического лечения значительно короче по сравнению со временем заживления инфицированной раны без лечения; антибактериальная ФДТ сокращает время заживления инфицированных ран практически вдвое.