Оценка чувствительности глиальных опухолей мозга к воздействию темодала в цитотоксическом тесте

50

Украгнський нейрохгрурггчний журнал, №2, 2004

УДК 616.831-006.484-009.6-076.5-018.1

Оценка чувствительности глиальных опухолей мозга к воздействию темодала в цитотоксическом тесте

Орлов Ю.А., Семенова В.М., Стайно Л.П.

Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова АМН Украины г. Киев, Украина

На краткосрочных суспензионных культурах изучена чувствительность 12 глиом головного мозга к воздействию темодала. Противоопухолевый эффект препарата оценен в тесте цитотоксичности с трипановым синим после инкубации культур с темодалом. Установлена вариабельность чувствительности клеток глиом к прямому воздействию различных концентраций темодала, что обосновывает необходимость ее определения перед началом лечения темодалом в каждом конкретном случае.

Ключевые слова: глиальные опухоли, темодал, чувствительность, цитотоксический тест, суспензионные культуры.

Вступление. Глиальные опухоли головного мозга составляют 50-60% всех опухолей центральной нервной системы. Как известно, результаты лечения этих новообразований остаются неудовлетворительными, а летальность высокой. Оптимизация результатов комбинированного лечения злокачественных глиом связана как с поиском новых эффективных антибластических препаратов, так и с использованием рациональных методов определения индивидуальной чувствительности этих опухолей к противоопухолевым препаратам.

В настоящее время основными требованиями к химиопрепаратам для применения их в нейроонкологии являются: способность преодолевать гематоэнцефалический барьер, низкая способность к связыванию белков крови, достижение адекватной концентрации в ткани головного мозга, высокая эффективность при первичных опухолях головного мозга, а также низкая нейротоксичность [5].

В последние годы появилось большое количество публикаций об использовании алкили-рующего цитостатического препарата темо-дала (темозоломида), относящегося к группе имидазотетразинонов, при комбинированном лечении злокачественных опухолей головного мозга. Сообщения касаются глиобластом, анап-ластических астроцитом, олигодендроглиом, метастазов солидных опухолей в головной мозг [3, 6, 8, 12, 13, 18, 19].

Темозоломид был синтезирован в 1984 г. в Великобритании [15] и прошел длинный путь экспериментальных и клинических исследований. Пероральный способ применения препарата, хорошая переносимость, низкая токсичность, в том числе и гематологическая, отсутствие кумулятивного эффекта, высокая степень проникновения через гематоэнцефа-лический барьер и достаточно высокая эффек-

тивность позволили рекомендовать его для лечения опухолей мозга различного генеза и степени анаплазии как в качестве первой линии терапии злокачественных опухолей головного мозга, так и в комплексе комбинированной терапии после удаления опухолей, при рецидивах опухолей, а также в сочетании с лучевой терапией [11, 14, 16].

Однако, по данным литературы [7, 10, 13, 16] эффективность терапии глиом темодалом авторы оценивают неоднозначно, она варьирует в широких пределах: от констатации максимального ответа опухоли на лечение препаратом или стабилизации опухолевого процесса до отсутствия эффекта при идентичных гистобиологических вариантах опухолей мозга. При этом зависимость между степенью злокачественности опухолей мозга и уровнем их чувствительности к темодалу в этих работах не анализируется.

Цель работы: выяснение возможных причин разноречивости результатов лечения темода-лом глиальных опухолей головного мозга. Для этого мы провели экспериментальное изучение прямого цитотоксического воздействия этого препарата на клетки глиом различной степени анаплазии на модели краткосрочных суспензионных культур, полученных из биоптического материала. По сравнению с эксплантацион-ными тканевыми культурами определение индивидуальной чувствительности опухоли к тестируемым химиопрепаратам на клеточной суспензии имеет ряд преимуществ: способность к росту опухолевых клеток в этой системе не требуется, разрастания клеток стромы и кло-нальный отбор сведены к минимуму, количественные результаты оценки цитотоксичности тестируемых препаратов могут быть получены в короткие сроки (на 2-е сутки). Ограничением метода является короткая продолжительность

опыта, что исключает возможность длительного наблюдения за воздействием тестируемых препаратов на опухолевые клетки в течение одного или нескольких клеточных циклов [17].

Оценку цитотоксичности исследуемых веществ в цитотоксическом тесте проводят путем количественного определения доли поврежденных опухолевых клеток, включивших в цитоплазму трипановый синий в опытных культурах, в сопоставлении с контрольными наблюдениями. По данным литературы [1, 2, 9], эту модель широко применяют в экспериментальных исследованиях для тестирования чувствительности различных клеток к воздействию разнообразных повреждающих факторов (химиопрепараты, токсины, радиация, магнитные поля).

Материалы и методы. Нами поставлено 12 опытов по тестированию чувствительности гли-альных опухолей мозга к воздействию темодала на клетки глиом в суспензионных культурах. Предварительно в каждом наблюдении изучили гистоструктурные особенности удаленных на операции опухолей с учетом выраженности в их ткани клеточного полиморфизма и клеточной плотности, особенностей васкуляризации, проявлений дифференцировки, распространенности некрозообразования, а также уровня митотической активности. В соответствии с этим у 5 больных диагностировали астроцитомы II степени злокачественности, у 3 — анаплас-тические астроцитомы III степени злокачественности, у 4 — глиобластомы (IV степень злокачественности). Оценку гистоструктуры и степени злокачественности глиом проводили согласно современной гистобиологической классификации опухолей нервной системы [4].

Краткосрочные суспензионные культуры глиом получали из биоптического материала по общепринятой стандартной методике [17]. Культуры инкубировали с темодалом в концентрациях 12,5 мкг/мл, 25 мкг/мл, 50 мкг/мл на протяжение 24 ч. Выбор тестируемых концентраций темодала проводили согласно инструкции с учетом рекомендуемых доз препарата, применяемых в нейроонкологической практике (150-200 мг/м2), что позволило приблизиться к условно терапевтическим концентрациям препарата в крови больных с перерасчетом на 1 мл питательной среды в суспензионных культурах.

Результаты и их обсуждение. Анализ полученных результатов показал, что клетки высокодифференцированных астроцитом II степени анаплазии неоднозначно реагируют на прямое воздействие минимальных концентраций темодала (12,5 мкг/мл). В трех наблюдениях процентная доля поврежденных клеток

была достаточно высокой и составила 47,2, 56,6% и 62,3% соответственно. Однако в одном наблюдении этот показатель оказался равным только 19%, а в другом — повреждения клеток вообще не отмечено. С увеличением концентрации препарата до 25 мкг/мл эффективность воздействия темодала на опухолевые клетки культур возрастала от 57,4 до 72%. Дальнейшее увеличение концентрации препарата до 50 мкг/ мл сопровождалось увеличением количества поврежденных клеток, но уже не столь значительным (от 73 до 82,2%) (табл. 1).

Таблица 1. Содержание поврежденных клеток в суспензионных культурах глиом II степени анаплазии после воздействия различных концентраций темодала

Наблюдение, № Повреждение клетки после инкубации с темодалом в концентрациях (мкг/мл), %

12,5 25 50

I наблюдение 47,2 57,4 73,0

II наблюдение 56,6 66,6 77,5

III наблюдение 62,3 72,0 79,4

IV наблюдение 0 58,9 73,6

V наблюдение 19,0 72,0 82,2

Таким образом, повышение тестируемых концентраций темодала сопровождается увеличением доли поврежденных клеток в суспензионной культуре астроцитом II степени злокачественности.

При определении индивидуальной чувствительности к темодалу клеток анапластических глиом III степени анаплазии в цитотоксическом тесте получены почти идентичные результаты. В двух наблюдениях при наименьшей (12,5 мкг/ мл) концентрации темодала доля поврежденных клеток составила 41,6% и 47,7%, а в одном наблюдении она достигла только 12%. Увеличение концентрации препарата до 25 мкг/мл сопровождается увеличением повреждаемости клеток, хотя и не достигает того уровня, которое наблюдается в аналогичных пробах с глиомами II степени анаплазии при тестировании этой же концентрации темодала. Повышение концентрации темодала до 50 мкг/мл в двух наблюдениях не вызвало существенного нарастания повреждаемости опухолевых клеток. В одном из наблюдений при относительно низкой чувствительности клеток к воздействию малых (12,5 мкг/мл) концентраций темодала отмечали сохранение этой тенденции при воздействии и более высоких концентраций препарата: при 25 мкг/мл доля поврежденных клеток составила только 20%, а при 50 мкг/мл этот показатель достиг 52,2% (табл. 2).

Таблица 2. Содержание поврежденных клеток в суспензионных культурах глиом III степени анаплазии после воздействия различных концентраций темодала

Таким образом, уровни количественных показателей цитотоксичности высокой концентрации темодала, воздействующей на клетки глиом III степени злокачественности, оказываются более низкими по сравнению с таковыми при тестировании глиом II степени злокачественности.

Клетки глиобластом в суспензионных культурах также по-разному реагировали на воздействие темодала. В 3 наблюдениях получен положительный ответ на воздействие малой (12,5 мкг/мл) концентрации темодала, которая вызвала повреждение 21,9-53,1% опухолевых клеток. В одном из наблюдений зафиксирован минимальный (отрицательный) ответ на воздействие этой же концентрации — процент снижения поврежденных клеток составил только 3,5. Увеличение концентрации препарата в наблюдениях с положительной реакцией клеток глиобластом на малые концентрации сопровождалось увеличением числа поврежденных клеток по мере повышения концентрации препарата. Однако в случае с низкой чувствительностью опухолевых клеток к воздействию наименьшей концентрации темодала (IV наблюдение), увеличение концентрации препарата лишь незначительно усиливало цитотоксичес-кий эффект (табл. 3).

Таким образом, сравнительный анализ количественных показателей цитотоксичности темодала в отношении клеток глиом в суспен-

Таблица 3. Содержание поврежденных клеток в суспензионных культурах глиобластом IV степени анаплазии после воздействия различных концентраций темодала

Наблюдение, № Поврежденные клетки после инкубации с темодалом в концентрациях (мкг/мл), %

12,5 25 50

I наблюдение 37,5 56,6 61,1

II наблюдение 53,1 63,5 83,5

III наблюдение 21,9 66,2 79,0

IV наблюдение 3,5 3,5 5,0

зионных культурах показывает, что в условиях этой экспериментальной модели препарат проявляет достаточно высокую противоопухолевую активность в большинстве наблюдений независимо от степени анаплазии исходной опухоли.

В большой мере это объясняется многосторонним механизмом антибластического действия темодала на опухолевые клетки культур. Как известно [3, 12, 14, 15], этот препарат ингибирует механизмы репарации опухолевых клеток и синтез ДНК путем подавления активности ферментов, ответственных за эти процессы, а также повышает иммуногенность опухолей. Помимо этого причиной высокой чувствительности к воздействию темодала клеток большинства глиом является обеспечение прямого контакта опухолевых клеток с препаратом в условиях данного эксперимента.

Нами также установлено, что увеличение тестируемых концентраций темодала обычно сопровождается увеличением доли поврежденных опухолевых клеток, что указывает на дозозависимость цитотоксического эффекта темодала в отношении опухолевых клеток большинства глиом. В то же время выявляются различия индивидуальной чувствительности клеток глиом к малым, средним и высоким концентрациям темодала, что обосновывает необходимость ее предварительного определения перед назначением нейроонкологическим больным темодала с уточнением оптимальных доз препарата с целью получения максимального лечебного эффекта.

Выводы. 1. Исследование прямого воздействия темодала на краткосрочные суспензионные культуры глиальных опухолей подтвердили его высокую противоопухолевую активность независимо от степени анаплазии исходных опухолей.

2. Обнаружение цитотоксического воздействия темодала на клетки высокодифференци-рованных глиом II степени злокачественности обосновывает необходимость проведения исследований по проверке данного явления в клинической практике.

3. Количественные показатели повреждаемости опухолевых клеток возрастают с повышением тестируемой концентрации темодала, но не пропорционально ее увеличению.

4. В диапазоне тестированных концентраций (12,5-50,0 мкг/мл) темодал не вызывает повреждения всех опухолевых клеток, что указывает на наличие в глиомах популяций клеток, абсолютно резистентных к воздействию малых концентраций темодала, но чувствительных к высоким его концентрациям, а также клеток с низкой чувствительностью к темодалу независимо от его концентрации.

Наблюдение, № Поврежденные клетки после инкубации с темодалом в концентрациях (мкг/мл), %

12,5 25 50

I наблюдение 47,7 62,3 65,3

II наблюдение 41,6 64,3 65,2

III наблюдение 12,2 20,0 52,2

5. Обнаружение индивидуальной чувствительности глиом к прямому воздействию темодала на клетки глиальных опухолей обосновывает необходимость ее определения перед назначением темодала.

6. Для повышения эффективности антиб-ластического действия темодала, по-видимому, целесообразно сочетание алкилирующего воздействия, которым обладает темодал, с назначением препаратов других механизмов действия и лучевой терапии.

Список литературы

1. Андриянов Ю.В., Андриянова О.И., Голованов М.В. и др. Влияние импульсных электрических полей и акустических ударных волн на культивируемые клетки / Междунар. симпоз. Биология клетки в культуре // Цитология. — 1999. — Т.41, №3-4.

— С.257-258.

2. Гоц Т.Ю. Вплив цитоюшв та дексаметазону на альвеолярш макрофаги людини // Лаб. д1агнос-тика. — 2001. — Т.1. — С.15-18.

3. Желудкова О.Г., Тарасова И.С., Горбатых С.В. и др. Лечение анапластических астроцитом и глиоблас-том у детей с использованием темодала // Соврем. онкология. — 2002. — Т.4, №2. — С.60-62.

4. Зозуля Ю.А., Верхоглядова Т.П., Шамаев М.И., Малышева Т.А. Гистобиологические принципы классификации опухолей нервной системы и ее клиническое значение // Укр.нейрохирург. журн.

— 2001. — №1. — С.32-41.

5. Орел Н.Ф. Новые цитостатики в лечении злокачественных опухолей // Под ред. Горбуновой В.А.

— М., 1998. — С.25-39.

6. Орлов Ю.А., Климнюк Г.И., Шаверский А.В. Опыт применения темодала при опухолях головного мозга у детей / Материалы III съезда нейрохирургов Украины. — 2003. — С.98.

7. Орлов Ю.А., Семенова В.М. Цитостатическое действие темодала на культуру тканей глиальных опухолей / Материалы III съезда нейрохирургов Украины. — 2003. — С.22-23.

8. Поддубная И.В. Новый век — новые возможности химиотерапии: темодал в лечении злокачественных опухолей // Соврем. онкология. — 2002. — Т.4, №1. — С.12-15.

9. Шишацкая Е.И., Еремеев А.В., Готельзон И.И. Исследование цитотоксичности полиоксиал-каноатов при действии их на культивируемые животные клетки / Междунар. симпоз. Биология клетки в культуре // Цитология. — 2001. — Т.43, №9. — С.904.

10. Avgtropoulos N.G., Batchelor T.T. New Treatment Strategies for Malignant Gliomas // The Oncologist.

— 1999. — V.4, №3. — P.209-224.

11. Chinot O., Honore S., Dufour H. et al. Safety and efficacy of temozolomid in patients with recurrent anaplastic oligodendrogliomas after standart

radiotherapy and chemotherapy // J. Clin. Oncol.

— 2001. — V.19. — P.2449-2455.

12. Fridman H.S., Dolan M.E., Pegg A.E. et al. Activity of temozolomide in the treatment of central nervous system tumor / Cancer Pes. — 1995. — V.55.

— P. 2853-2857.

13. Levin V.A., Yung A., Prodos M. et al. Temodal (temozolomide) at first relapse in anaplastic astrocytoma patients // J. Neurooncol. — 1997.

— V.35 (suppl. 1). — P.185.

14. Newlandas E.S., Blackledge G.R., Slack J.A. et al. Phase I trial temozolomide // Br. J. Cancer. — 1992.

— V.65. — P.287-291.

15. Stevens M.F.G., Hickman J.A., Langdon S.P. et al. Antitumor activity and pharmacokinetics in mice of 8-carbonyl-3-methyl-imidoso [5,1-d]- 1,2,3,5-tetrazin-4 (3H)-one (CCPG 81045$ M&B 39831), a novel drug with potential as an alternative dacarbasine // Cancer Res. — 1987. — V.47. — P.5846-5852.

16. Stupp R., Dietrich P. et al. Promising survival for patients with newly diagnosed glioblastoma multiform treated with concomitant radiation plus temozolomide followed by adjuvant temozolomide // J. Clin. Oncjl. — 2002. — V.20. — P.1375-1382.

17. Wilson A.P., Neal F.E. / Культура животных клеток. Методы / Под ред. Р.Фрешни. — М.: Мир, 1989. — С.256-303.

18. Yung A., Prodos M., Yaya-Tur R. et al. Temodal at first relapse in anaplastic astrocytoma patients // J. Clin. Oncol. — 1999. — V.17, №9 — Р.2762-2771.

19. Yung A., Albright R.E., Olson J. A phase II stady of temozolomide vs. procarbazine in patients with glioblastoma multiforme at first relapse // Brit. J. Cancer. — 2000. — V.83, №5. — P.588-593.

Оцшка чутливост гиальних пухлин мозку до впливу темодалу у цитотоксичному тест1 Орлов Ю.О., Семенова В.М., Стайно Л.П.

На короткострокових суспензшних культурах вивчено чутливють 12 глюм головного мозку до впливу темодалу. Протипухлинний ефект препарату оцшений за тестом цитотоксичност з трипановим сишм шсля шкубацп культур з темодалом. Встановлено вар1абельшсть чут-ливост кл1тин глюм до прямо! дп темодалу в р1знш концентрацп, що обГрунтовуе необхщшсть 11 визначення перед початком х1мютерапп з використанням препарату у кожного хворого.

Estimation of sensitivity of brain's gliomas to the influence of temodal in citotoxicityc test Orlov Y.A., Semenova V.M., Staino L.P.

The sensitivity of 12 brain's gliomas to the influence of temodal was stadied on shortterm suspension cultures. Anti-tumor effect of the preparation was estimated using citotoxicityc test after their incubation with temodal. The variation sensivsty of glioma's tumour cells to the direct influence of different concentration of temodal was detected, therefore in every concrete case, there is a necessity to difine the sensitivity before starting the chemotherapy with temodal.

Коментар

до статтi Орлова Ю.А., Семеновой В.М., Стайно Л.П. "Оценка чувствительности глиальных опухолей мозга к воздействию темодала в цитотоксическом тесте"

HayKOBi дослщження, присвячен застосуванню антибластичноТ xiMioTepani'i в лкуванш злояюсних пухлин головного мозку, насамперед, шального походження, здшснюють понад 25 роюв. Недостатня ефективнють кнуючих хiмiопрепaрaтiв та стандартних схем Тх використання, значна частота ускладнень, спричинених Тх нейротоксичною, мieлосyпресивною, нефротоксичною дieю, зумовлюе песимiзм та стримане ставлення до цього методу лкування. Тому поява нового протипухлинного препарату, який перший за останн 20 роюв (M. Stevens та сшвавт.) синтезо-ваний для використання саме в нейроонкологи, е визначною подiею для клшщислв.

Темозолaмiд (темодал) — цитостатичний алктуючий препарат другого поколiння, що належить до класу iмiдaзотетрaзинiв, основний мехашзм дiТ якого — метилювання ДНК. ^м того, темодал здатний пригшчувати aктивнiсть ферментiв, що вщповщають за репaрaцiю ДНК, це один з основних мехaнiзмiв його дм, який дозволяе здолати хiмiорезистентнiсть кл^ин пухлини, що досить швидко росте при застосуванш iнших aлкiлyючих агенлв i, насамперед, препaрaтiв — похщних нiтрозосечовини. Темодал вiдповiдaе бiльшостi вимог, як пред'являють до хiмiопрепaрaтiв, що можуть бути застосоваш в нейроонкологи, це стосуеться його високоТ протипухлинноТ aктивностi та проникностi крiзь гемaтоенцефaлiчний бар'ер, прийнятного профiлю побiчних реакцш, зрyчностi застосування (всередину). Важливою властивктю препарату е його спонтанний гiдролiз в активний компонент MTIK (обминаючи гепатоб^арний бар'ер), з якого походить юн метилдiaзонiyмy, що реaлiзyе цитотоксичн ефекти темодалу. Haявнiсть цього ефекту дозволила авторам провести на моделi суспензшних культур, отриманих з бюптату, експериментальне вивчення прямого цитотоксичного впливу препарату на кл^ини глiоми рiзного ступеня aнaплaзiТ. Використання саме щеТ моделi загальноприйняте пiд час проведення наукових дослщжень з тестування чутливосп клiтин пухлини до впливу рiзних пошкоджуючих чинникiв.

Haйбiльш цiкaвим, на мою думку, е висновок aвторiв вщносно iснyючоТ iндивiдyaльноТ чyтливостi глюми до впливу темодалу та необхщносл ТТ обов'язкового визначення перед проведенням хiмiотерaпiТ. Вiн спiвпaдaе з отриманими нами результатами визначення шдивщуальноТ чутливосп до темодалу в тест з глутатюнтрансферазою in vitro. Проте висновки, що стосуються дозозалежност дiТ препарату при M^i рiзного ступеня анаплазп, дещо передчaснi, оскiльки для отримання статистично значущих даних необхiднa бтьша, нiж 12, кiлькiсть спостережень.

Дискутабельним питанням у нейроонкологи е доцтьнють проведення хiмiотерaпiТ за нaявностi вщносно доб-роякiсноТ глiоми (aнaплaзiя II ступеня), осктьки протягом тривалого часу панувала думка про первинну хiмiо- та радюрезистентнють цих пухлин, i Тх лiкyвaння обмежували хiрyргiчним втручанням. Заслуговуе на увагу i е, на мш погляд, вiрним принцип наукового пщходу aвторiв пiд час вивчення ефективносп хiмiопрепaрaтy при m^i не тiльки III—IV ступеня анаплазп, а й високодиференцшованоТ астроцитоми. В лiтерaтyрi е повiдомлення про усшшне лiкyвaння пухлин II ступеня анаплазп, але це стосувалось ттьки ол^одендроглюми та олiгодендроaстроцитоми. Зважаючи на це, дослщження з вивчення ефективносп темодалу при M^i низького ступеня анаплазп безперечно слщ продовжити не ттьки в експерименл, а й в клшщк

О.Я. Главацький, доктор мед. наук, ст. наук. спвроб. кл1н1ки внутр'шньомозкових пухлин ¡нституту нейрох/'рургп ¡м.акад.А.П.Ромоданова АМН УкраУни