Применение N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в качестве средства для фототерапии псориаза и псориатического артрита
USE OF N-(6,8,8-TRIMETHYL-8,9-DIHYDROFURO[3,2-H]QUINOLIN-5-YL)ACETAMIDE AS AN AGENT FOR PHOTOTHERAPY OF PSORIASIS AND PSORIATIC ARTHRITIS

Изобретение относится к области медицинской химии, фармацевтики и дерматологии и может быть использовано для фототерапии псориаза и псориатического артрита.
Псориаз - хроническое аутоиммунное заболевание, поражающее кожу. Наиболее заметными проявлениями псориаза является появление красновато-розовых высыпаний, шелушение кожи и кожный зуд. Гистологическое обследование пораженных участков кожи позволяет выявить признаки акантоза. Псориаз ухудшает внешний вид кожи, существенно снижает качество жизни пациента. Причиной возникновения псориаза является гиперпролиферация лимфоцитов типа Th-17 и их скопление в поверхностном слое дермы у границы с эпидермисом. Гиперпродукция этими лимфоцитами лимфокина IL-17 является ключевым фактором, вызывающим гиперплазию клеток эпидермиса и их кератиницазию.
Псориатический артрит (псориатическая артропатия) - ассоциированное с кожной формой псориаза воспалительное поражение суставов. Причиной псориатического артрита, как и кожных проявлений псориаза, является гиперпролиферация лимфоцитов типа Th-17. Псориатический артрит выявляется у 5-7% пациентов с явно выраженными кожными проявлениями псориаза. В редких случаях клинические проявления псориатического артрита предшествуют кожным проявлениям псориаза. Псориатический артрит характеризуется наличием кожных бляшек, артралгиями, скованностью суставов, болями в позвоночнике, миалгиями, последующей деформацией позвонков и суставов. Псориатическая артропатия диагностируется преимущественно по клиническим и рентгенологическим признакам. Лечение псориатического артрита проводится длительно и системно с помощью противовоспалительных, сосудистых средств, хондропротекторов, физиотерапии, реабилитационных мероприятий. Прогрессирующее течение псориатического артрита, как правило, приводит к инвалидизации пациента.
Заболеваемость псориазом составляет до 2% от численности популяции России. Еще около 1% населения страдает от витилиго, склеродермии и других заболеваний кожи аутоиммунной природы, многие из которых, подобно псориазу, обусловлены гиперпролиферацией лимфоцитов типа Th-17.
Традиционным способом лечения псориаза, как и всех аутоиммунных заболеваний, является применение препаратов иммуносупрессорного действия: производных гидрокортизола (Преднизолон, Элоком, Адвантан), мазей и кремов с дитранолом (Цигнодерм, Псоракс, Цигнолин), аналогов витамина D3 (Псоркутан, Дайвонекс), салициловой кислоты, фторированных производных глюкокортикоидов (Випсогалом, Синалар, Белосалик, Целестодерм). Кроме того, для снижения уровня продукции цитотоксических факторов используют ароматические ретиноиды (или синтетические производные витамина А), в частности, Ацетритит (Неотигазон) и противовоспалительные средства: Диклофенак, Индометацин, Перитион цинка (Кожные и венерические болезни: Руководство для врачей, под ред. Ю.К. Скрипкина и В.Н. Мордовцева, Т. 2 / М: Медицина, 1999 с. 116-156). Для лечения псориатического артрита и особо тяжелых форм псориаза используют цитостатики, аналогичные тем, которые применяются в терапии опухолей, прежде всего, Циклоспорин А и Метотрексат.
Все перечисленные средства обеспечивают лишь симптоматический эффект и не затрагивают причину возникновения псориаза - гипрепролиферацию лимфоцитов типа Th-17 и гиперпродукцию ими лимфокина IL-17. Вследствие этого результат лечения оказывается нестойким и длится от одного до нескольких месяцев. Все перечисленные препараты снижают активность специфических систем иммунитета, повышая восприимчивость организма к целому ряду инфекционных заболеваний. Из-за этого пациенты часто страдают от сепсиса, оппортунистических инфекций, листериоза. У них отмечается повышенный риск возникновения опухолей.
Наиболее мощным и современным средством лечения псориаза является использование иммунобиологических препаратов - гуманизированных моноклональных антител к TNF-α: Инфликсимаб (Ремикейд), Адалимумаб (Хумира), Этанерцепт (Энбрел) и Голимумаб (Симпони), а также Секукинумаб (гуманизированное моноклональное антитело к IL-17A). Эти препараты обеспечивают длительный и радикальный лечебный эффект, однако, в виду высокой стоимости они доступны лишь для небольшого числа пациентов, страдающих от псориаза. Кроме того, перечисленные препараты, подобно глюкокортикоидам, существенно снижают общую активность иммунной системы, что приводит к осложнениям инфекционной и онкологической природы.
Фотохимиотерапия является на сегодня наиболее эффективным и наименее опасным с точки зрения побочных эффектов методом лечения псориаза по сравнению с другими традиционными терапевтическими средствами - иммунодепрессантами, производными витамина D, стероидами и другими. Этот метод, имеющий специфическое обозначение «ПУВА-терапия», представляет собой физиотерапию, включающую применение фотоактивного препарата с последующим облучением кожного покрова длинноволновым УФ-излучением (от 315 до 400 нм). ПУВА-терапия с успехом применяется в европейских странах и США при лечении псориаза, других дерматологических заболеваний: витилиго, атопического дерматита, грибовидного микоза. В соответствии со статистическими данными, положительный эффект достигается в 80-85% случаев.
Анализ информации, касающейся фотосенсибилизаторов, используемых в ПУВА-терапии, показывает, что для лечения тяжелых кожных патологий в качестве фотоактивных препаратов применяют, главным образом, псоралены - линейные фурокумарины [US 4129576 опубл. 12.12.1978; US 4130568 опубл. 19.12.1978; US 4960408 опубл. 02.10.1990; US 4279922 опубл. 21.07.1981, US 4129575 опубл. 12.12.1978, US 5962512 опубл. 05.10.1999, Halpern S.M. et al, Guidelines for topical PUVA: a report of workshop of the British Photodermatology Group, British J. Dermatol. 2000, V 142, p. 22-31 и др.]. Наиболее массово применяющимся на территории РФ фотосенсибилизирующим препаратом для ПУВА-терапии является Аммифурин -фотосенсибилизирующее средство растительного происхождения, содержащее в качестве активного вещества фурокумарины (бергаптен, изопимпинеллин и ксантотоксин) плодов амии большой [http://www.neboleem.net/ammifurin.php]. В эффективных терапевтических дозах псоралены проявляют целый ряд нежелательных побочных действий. К ним относится развитие тяжелой эритемы кожи, а также общая генотоксичность, приводящая к возникновению точечных мутаций и хромосомных аберраций и, как следствие - к повышению риска развития рака кожи при облучении УФ-светом.
Характеризуя молекулярный механизм фотохимического действия псораленов (фурокумаринов), необходимо отметить, что для них характерна фотохимическая реакция с ДНК, приводящая к разрывам основной цепи. Поскольку молекулы фурокумаринов содержат два фотоактивных центра, фотохимическая реакция с их участием приводит к образованию кросс-сшивок комплементарных цепей ДНК и образованию фотоаддуктов - конъюгатов ДНК с белками и другими макромолекулами [Sibirtsev V.S., Tolmachev A.Yu., Kovaleva M.V., Garabadzhiu A.V., Traven V.F. Spectral Study of Interactions of 4,8,4'-Trimethylpsoralen and 4,4'-Dimethylangelicin Dyes with DNA. Biochemistry (Moscow), 2005, 70 (7), p. 822-832,]. Как показано в работе [Marzano et al, DNA damage and biological effects induced by photosensitization with new N(l)-unsubstituted furo[2,3-h]quinolin-2(1H)-ones Bioorganic and Medicinal Chem., 2002, 10, p. 2835-2844], образование таких аддуктов приводит к эффекту генотоксичности, т.е. стимулирует световой ожог кожи и повышает риск возникновения меланомы кожи. К практическим недостаткам псораленов в качестве фотосенсибилизатора для ПУВА-терапии можно отнести необходимость точного определения и строгого соблюдения минимальной фототоксической дозы, индивидуальной для каждого пациента и для каждого конкретного препарата. Трудоемкость этой процедуры и высокий риск для пациента в случае отклонения от минимальной фототоксической дозы в ходе лечения являются важным фактором, ограничивающим применение ПУВА-терапии.
Поиски соединений, сохраняющих полезные свойства псораленов, но лишенных фото- и генотоксичности, привели к открытию незамещенных по первому положению соединений ряда фурохинолона, которые в десятки раз менее опасны для пациентов по показателям фото- и генотоксичности, чем псоралены [Marzano et al, DNA damage and biological effects induced by photosensitization with new N(l)-unsubstituted furo[2,3-h]quinolin-2(1H)-ones Bioorganic and Medicinal Chem., 2002, 10, p.2835-2844]. Однако, для исследованных фурохинолонов характерна высокая гидрофобность (растворимость в водно-спиртовых растворах существенно ниже 1%), препятствующая доставке соединения в очаги кератоза, что не позволяет внедрить их медицинскую в практику. Таким образом, существует потребность в поиске новых фотосенсибилизаторов для ПУВА-терапии, свободных от указанных недостатков.
Техническая проблема, решение которой обеспечивается при осуществлении настоящего изобретения, состоит в расширении арсенала средств, которые могут быть использованы в качестве фотосенсибилизаторов в ПУВА-терапии псориаза и псориатического артрита.
Техническая проблема решена применением нового соединения N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида
в качестве фотосенсибилизатора в ПУВА-терапии псориаза и псориатического артрита.
Следующие фигуры чертежей поясняют сущность изобретения:
Фиг. 1. Спектр поглощения N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в диапазоне от 200 до 450 нм (0,0285% раствор в этаноле).
-1
-1
Фиг. 2. ИК-спектр очищенного N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида, полученный в режиме пропускания на пластинах из селенида цинка (ИК-Фурье-спектрометр «Вшкег», Германия, с детектором DTGS и светоделителем из KBr). Измерение проводят при разрешении 4 см в диапазоне 3000 - 400 см.
1
Фиг. 3. Н ЯМР-спектр N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в среде дейтерированного диметилсульфоксида, соотношение сигнал/шум равно 150 (Bruker АМ-300, Bruker Daltonics GmbH, Германия).
Фиг. 4. Усредненный по трем независимым измерениям спектр флуоресценции N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в 75% этаноле, концентрация 0,0285% (Флуорат-Панорама, Россия, кювета 10 мм).
Замещенные фуродигидрохинолины близки по строению к фурохинолонам. Они обладают комплексом свойств, позволяющих рассматривать их в качестве потенциальных перспективных фотосенсибилизаторов для ПУВА-терапии кожных заболеваний аутоиммуной природы. Эти соединения, подобно псораленам и фурохинолонам, имеют высокий выход триплетного состояния при фотовозбуждении, но, в отличие от псораленов, содержат лишь один фотоактивный центр, что исключает возможность образования сшивок и диаддуктов с молекулами ДНК. В работе [Лыго О.Н., Некипелова Т.Д., Ходот Е.Н., Кузьмин В.А. и др. «Спектрально-кинетические характеристики триплетного состояния 7,7,9-триметил-6,7-дигидрофуро[3,2-f]хинолина», Химия высоких энергий, 2012, Т. 46. №3. С. 211-215] показано, что введение фуранового кольца в структуру 1,2-дигидрохинолинов существенно повышает выход триплетного состояния, за образование которого отвечает атом азота хинолинового ядра.
N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид получают по способу, аналогичному ранее описанному в патенте [RU 2614248, опубл. 24.03.2017] «Способ синтеза триметилзамещенных фуродигидрохинолинов». Синтез N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида включает следующие основные стадии:
1. Получение N-(4-метоксифенил)ацетамида:
2. Получение N-[3-(хлорацетил)-4-гидроксифенил]ацетамида:
3. Получение N-[3-(хлорацетил)-4 гидрокси-5-нитрофенил]ацетамида:
4. Получение N-(3-гидрокси-7-нитро-2,3-дигидро-1-бензофуран-5-ил)ацетамида:
5. Получение N-(7-нитро-1-бензофуран-5-ил)ацетамида:
6. Получение N-(7-амино-1-бензофуран-4-ил)ацетамида:
7. Получение N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида:
По данным масс-спектрометрии, препарат N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида, получаемый в результате синтеза с последующей флэш-хроматографией конечного продукта, имеет чистоту 96,0-96,4%. Для получения эталонного препарата повышенной чистоты используют метод тонкослойной хроматографии (ТСХ): 2,0-2,7 мг вещества растворяют в этилацетате квалификации чда (ГОСТ 22300-76) и наносят на пластины для ТСХ (Pre-Coated TLC Plates SILICA GEL 60 F-254, Merck, Германия). Пластину помещают в камеру для ТСХ высотой 30 см и проводят разделение в токе этилацетата. Пластину высушивают и идентифицируют целевое вещество по флуоресценции, возбуждаемой с помощью источника УФ излучения с фильтром 350 нм. Сорбент, содержащий пятно вещества, собирают с помощью скальпеля, экстрагируют 100 мкл хлороформа, осч, и выпаривают под вакуумом. По данным масс-спектрометрии, препарат N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида, получаемый в результате очистки с помощью ТСХ, имеет чистоту 98,7%.
В таблице 1. Представлены показатели растворимости соединения в средах различной полярности.
Содержащаяся в молекуле ацетамидная группировка снижает гидрофобность соединения, способствуя повышению его растворимости в воде и спиртах. Так например, растворимость N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в физиологически приемлемом для накожного применения растворителе 75% водном этаноле составляет 6,25%, что более, чем на порядок превышает растворимость других известных производных фуродигидрохинолина в воде, этаноле или их смесях. В то же время, растворимость соединения в неполярных растворителях (например, в хлороформе) в 10-20 раз ниже, чем у незамещенного фуродигидрохинолина. Таким образом, по показателям растворимости (гидрофильности) N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид пригоден для применения в качестве фотосенсибилизатора для ПУВА-терапии.
Молекулярная масса полученного N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида, определенная с помощью масс-спектрометрии (масс-спектрометр micrOTOF-Q II» («Bruker Daltonics GmbH», Германия), равна 271,144 Да.
Приведенный на Фиг. 1 спектр поглощения N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида показывает наличие у вещества выраженного максимума в области длинноволнового ультрафиолетового излучения 345-365 нм, что позволяет использовать его в сочетании со стандартными источниками облучения для ПУВА-терапии.
Подтверждение структуры N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида выполнено с использованием ИК-спектроскопии по данным, представленным в Таблице 2. Полученный ИК-спектр показан на Фиг. 2
1
На Фиг. 3 показан Н ЯМР-спектр N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в среде дейтерированного диметилсульфоксида при соотношении сигнал/шум, равном 150 (Bruker АМ-300 «Bruker Daltonics GmbH», Германия), подтверждающий химическую структуру соединения.
Поскольку полученный N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид предназначен для проведения биологических испытаний в виде раствора в 75% водном этаноле, помимо характеристики химической чистоты сухой субстанции практическую важность имеет определение концентрации действующего вещества в растворе. Эту задачу решают, сравнивая интенсивность флуоресценции раствора испытуемого образца с 0,0285% раствором эталонного препарата чистотой 98,7%, полученного с помощью ТСХ, как описано выше. На Фиг. 4 показан усредненный по результатам трех независимых определений спектр флуоресценции эталонного препарата N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в 75% спирте.
В качестве параметра, позволяющего проводить оценку концентрации N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в растворе, используют интенсивность пика флуоресценции основного вещества при 438 нм (длина волны возбуждения 365 нм). Несоответствие величины пика ожидаемому может служить признаком наличия примесей в основном веществе.
На животных моделях нами показано, что при местном и системном введении N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид обладает способностью накапливаться в лимфоцитах (лимфотропностью). При местном (накожном) нанесении на псориатические повреждения кожи оно проникает через эпидермис в дерму и накапливается в лимфоцитах, скапливающихся в дерме у границы с эпидермисом, и ответственных за гиперпродукцию IL-17. В результате этого при облучении поврежденной кожи УФ светом длинноволнового диапазона (λ=365 нм) происходит повреждение геномной ДНК лимфоцитов, находящейся в комплексе с фотосенсибилизатором. Полученные нами с помощью конфокальной микроскопии данные показывают, что фибробласты, кератиноциты и другие клетки кожи не накапливают N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид и остаются жизнеспособными.
Ниже будет показано, что, в отличие от псораленов, N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид в качестве фотосенсибилизатора для ПУВА-терапии проявляет лечебный эффект при облучении кожи малыми дозами света, в несколько раз ниже минимального фототоксического уровня. Эта особенность резко упрощает использование N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида для лечения псориаза и псориатического артрита, так как не требует точного подбора минимальной фототоксической дозы, индивидуальной для каждого пациента.
В отличие от известных, традиционно применяемых для ПУВА-терапии псориаза фотосенсибилизаторов (8-метоксипсорален, 5-метоксипсорален, триметоксипсорален, производные псоралена растительного происхождения, например, входящие в состав препарата Аммифурин), молекулы которых включают два фотоактивных центра, молекула N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида имеет только один фотоактивный центр, соответствующий атому азота хинолинового ядра. Благодаря этому, при фотоактивации в комплексе с ДНК и белками он не вызывает образования кросс-сшивок цепей ДНК и конъюгатов белков друг с другом и с ДНК. Более того, как следует из результатов, представленных в работе [Лыго О.Н., Некипелова Т.Д., Ходот Е.Н., Кузьмин В.А. и др.. «Спектрально-кинетические характеристики триплетного состояния 7,7,9-триметил-6,7-дигидрофуро[3,2-f]хинолина», Химия высоких энергий, 2012, Т. 46. №3. С. 211-215], при УФ облучении производные фуродигидрохинолина могут выступать в качестве агента, восстанавливающего фотодимеры, образующиеся между соседствующими в цепи ДНК остатками тимина Таким образом, в отличие от псораленов, N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид, не обладает фотохимическими свойствами, лежащими в основе генотоксичности, в связи с чем есть все основания полагать, что в отличие от псораленов, он не способен вызывать тяжелые побочные эффекты, о которых говорилось выше.
Исследование специфической фармакологической активности испытуемого вещества N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида (далее ИВ) проведено в сравнении с разрешенным к применению в России препаратом Аммифурин (0,3% действующего вещества в 75%-ном этаноле), выпускаемым ФГУП Фармцентр ВИЛАР, Россия (далее - препарат сравнения). В качестве контроля (плацебо) взят 75%-ный этиловый спирт, использованный в качестве растворителя для ИВ и препарата сравнения. Исследование проводят на морских свинках при накожном нанесении. Дизайн исследования специфической фармакологической активности включает следующие стадии:
1. Определение минимальной фототоксической дозы для ИВ, а также для препарата сравнения и контроля.
2. Отработка животной модели псориаза (псориатического артрита) на морских свинках с использованием крема Кераворт (действующее вещество - иммуномодулятор Имиквимод).
3. Проведение фототерапии экспериментально индуцированного псориаза у морских свинок с оценкой результата методом гистологического анализа срезов кожи.
4. Исследование острой токсичности препарата N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид.
В опытах по исследованию специфической фармакологической активности препарата N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид используют морских свинок массой 400±40 г. Животные перед исследованием проходят двухнедельный карантин при следующих условиях содержания: температура воздуха -22±2°С, влажность 40-70%, световой режим - 12 часов день, 12 часов ночь. В качестве корма используют экструдированный комбикорм для лабораторных животных (сертификат № РОСС RU/ПО81.BОО.365 ГОСТ 50258-92), для питья очищенную воду. Животным обеспечивают свободный доступ к воде и пище на всем протяжении эксперимента.
Определение минимальной фототоксической дозы УФ облучения подопытных животных после сенсибилизации препаратом С целью установления минимальной фототоксической дозы УФ облучения животных распределяют на семь максимально рандомизированных, сбалансированных по полу групп по 10 животных в каждой. Животным один раз в 48 часов накожно наносят препарат в максимально рекомендованной терапевтической дозе, составляющей 50 мг/кг массы животного (в соответствии с рекомендациями Halpern S.M. et al, Guidelines for topical PUVA: a report of worshop of the British Photodermatology Group, British J. Dermatol. 2000, 142, p. 22-31 и принципов эквивалентного межвидового переноса доз по площади тела с использованием коэффициентов пересчета по Freireich E.J., Gehan Е.А., Rail D.P., Schmidt L.H., Skipper H.E. Quantitative comparison of toxicity of anticancer agents in mouse, rat, hamster, dog, monkey, and man. Cancer Chemother Rep. 1966; V 50(4), pp 219-44). В качестве растворителя и контроля используют 75%-ный водный этанол Условия эксперимента приведены в Табл. 3.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
У каждого животного предварительно освобождают от шерстного покрова участок кожи на спине и боках площадью 50 см. На оголенные участки кожи наносят исследуемые вещества, которые равномерно распределяют по коже, не допуская попадания раствора на шерсть. Через 1 час после нанесения производят наложение на обработанный участок кожи трафарета, делящего обработанный участок на 12 квадратов площадью 1 см каждый и проводят облучение с помощью «ультрафиолетовой расчески» UV 109 В (Herbert Waldmann GmbH & Co. KG, Германия) в следующих дозах: первый квадрат - 0,25 кДж/м, второй - 0,5 кДж/м, третий - 1 кДж/м, а каждый последующий - дозой, на 0,5 кДж/м превышающей предыдущий: 1,5 кДж/м, 2,0 кДж/м, 2,5 кДж/м, 3,0 кДж/м, 3,5 кДж/м, 4,0 кДж/м, 4,5 кДж/м, 5,0 кДж/м. Через 24 часа после облучения фиксируют наличие или отсутствие эритемы. Фиксируют минимальную фототоксическую дозу, соответствующую максимальной дозе облучения, не вызвавшей образования эритемы. Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что ИВ обладает в 14 раз менее выраженным фотосенсибилизирующим действием на кожу морской свинки по сравнению с препаратом сравнения Аммифурин.
Отработка животной модели псориаза (псориатического артрита), индуцированного накожным нанесением крема Кераворт, на морских свинках
Ключевым моментом в запуске псориаза и псориатического артрита является индукция дифференцировки лимфоцитов-предшественников в направлении фенотипа -17 и гиперпродукция ими IL-17. Оба эти эффекта могут быть вызваны в коже с помощью передозировки иммуномодулятора Имиквмод, готовая лекарственная форма которого (препараты Алдара и Кераворт) предназначены для борьбы с папиломами.
Моделирование заболевания у морских свинок производят ежедневным в течение 14 суток накожным нанесением крема для наружного применения Кераворт (5% действующего вещества Имиквимод); № ЛП-002245, 2013-09-23, Glenmark Generics Ltd. (Индия). Экспериментальная группа включает 12 животных.
2
У животных освобождают от шерстного покрова участок кожи на спине и боках площадью 50 см, который делят маркером на 4 одинаковых по площади квадрата. В течение 14 суток на каждый из секторов ежедневно равномерно наносят крем Кераворт в количестве 50, 100, 200 и 400 мкл на аппликацию соответственно. После этого трех животных забивают и исследуют степень индукции псориатического поражения методами гистологического анализа срезов пораженной кожи, а также с помощью анализа маркерных транскриптов лимфокинов IL-17α, IL-23α и IFNG (интерферон у), и рецептора IL-17 - IL17R методом количественной ПЦР с использованием следующих праймерных систем:
1. На кДНК IL-17α:
IL17A-F1
IL17A-R1
2. На кДНК IL-23α:
IL23A-F1
IL23A-R1
3. На кДНК IL17R:
IL17R-F1
IL17R-R1
4. На кДНК IFNG:
IFNG-F1
IFNG-R1
5. На кДНК GAPDH (нормировочный маркер):
GAPDH-F1
GAPDH-R1
Выделение суммарной РНК из кожи морских свинок
Образцы кожи массой 100 мг переносят в микропробирки объемом 2 мл, добавляют 300 мкл буфера RLT (QIAGEN) с β-меркаптоэтанолом (0,1%) и измельчают на лабораторном гомогенизаторе TissueLyser LT (QIAGEN) при помощи металлических шариков (максимальная амплитуда в течение 10-15 минут до полной гомогенизации образца. РНК из гомогената выделяют при помощи наборов RNeasy mini kit (QIAGEN) по протоколу производителя.
Содержание РНК в препарате определяют на флуориметре Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, США) с помощью набора RNA BR Assay Kit (Life Technologies). Качество выделенной РНК оценивают при помощи электрофореза в 1,5% агарозном геле, окрашенном добавлением 4 мкг/мл этидия бромида, при напряженности поля 10 В/см. Данный протокол применяют при выделении РНК из биопсий кожи для последующего анализа экспрессии генов при помощи количественной ПЦР в реальном времени.
Обратная транскрипция
Реакцию обратной транскрипции проводят с помощью набора MMLV RT kit (Евроген) по протоколу производителя. Реакцию останавливают путем прогревания смеси при 70°С в течении 15 мин.
Проведение количественной ПЦР в реальном времени
ПЦР в реальном времени проводят в 48-ми луночных оптически прозрачных планшетах с применением красителя SYBR Green в качестве ДНК-специфичного зонда. Реакцию проводят с использованием 5-кратной реакционной смеси с референсным красителем ROX qPCRmix-HS ROX+SYBR (Евроген, Россия).
Амплификацию проводят в термоциклере с оптической системой детекции Есо, (Illumina), используя программу Two-step (первичная денатурация при 95°С в течение 4 мин, затем 45 циклов: денатурация при 94°С в течение 15 сек, гибридизация и элонгация при 60°С в течение 30 сек - всего 45 циклов). Специфичность реакции оценивают по кривым плавления праймеров. В качестве выходного параметра используют величину Ct - порогового цикла, автоматически определяемого программным обеспечением термоциклера.
Остальных животных (9 голов) выдерживают в виварии в течение 21 суток без специфических воздействий, выводя из эксперимента по три животных на 7, 14 и 21 сутки после окончания индукции поражений аппликациями крема Кераворт.
Ежедневное накожное нанесение крема в течение 14 суток приводит к появлению типичных признаков псориатических папул и акантоза: круглой формы, с четкими краями, ярко-розового цвета с серебристо-белыми чешуйками. Также наблюдается триада симптомов, характерная для псориаза: феномен стеаринового пятна, феномен псориатической (терминальной) пленки и феномен Ауспитца. Через 24 часа после нанесения крема Кераворт на коже появляются эритемные пятна, соответствующие по размерам и форме области нанесения, через 72 часа - псориатические папулы круглой формы розового цвета с характерными чешуйками. На 8-е сутки толщина кератинизированного эпителия увеличивается и псориатические папулы полностью покрываются чешуйками. На 14 сутки клиническая картина характеризуется наличием полного набора симптомов, характерных для псориаза.
2
2
2
2
По данным визуального наблюдения устанавливают, что крем Кераворт в качестве индуктора экспериментального псориаза в дозировке 50 и 100 мкл/см вызывает менее выраженные поражения кожи, чем в дозировке 200 мкл/см, а различия в эффективности между дозировками 200 и 400 мкл/см практически отсутствуют. С учетом этого для моделирования псориаза в дальнейших экспериментах используют дозировку крема Кераворт 200 мкл/см.
2
2
2
При гистологическом исследовании кожи через 14 суток после начала индукции псориаза у всех животных визуализируются паракератотические пластинки, скопления полинуклеарных клеток (микроабсцессов Мунро-Сабуро), которые находятся в верхних слоях эпидермиса и в дерме, которые разделяются дермальными сосочками. Шиповатый слой выражен слабо. Эпидермальные отростки расширены в апикальной своей части по типу «булавы», симметричны на всем протяжении среза. Заметны многочисленные митозы в эпидермальных гребнях, а также на уровне базального слоя. Данные гистологического анализа срезов подтверждают ранее сделанный вывод о том, что крем Кераворт в качестве индуктора экспериментального псориаза в дозировке 50 и 100 мкл/см вызывает менее выраженные поражения кожи, чем в дозировке 200 мкл/см, а различия в эффективности между дозировками 200 и 400 мкл/см практически отсутствуют.
Данные визуального наблюдения и исследования гистологических срезов кожи в очагах экспериментального псориатического поражения, подтверждают с помощью исследования маркерных транскриптов методом количественной ПЦР в реальном времени. Результаты такого исследования представлены в Таблице 4. Величины относительных Ct (пороговый цикл) получают путем вычитания из величины соответствующего абсолютного Ct сигнала кДНК GAPDH (типовой референс-ген группы «house-keeping»). Величины Ct и стандартные ошибки измерения определяют усреднением результатов, полученных в параллельном эксперименте с тремя животными, выведенными из эксперимента в одно и то же время.
Результаты эксперимента, представленные в Таблице 4, позволяют сделать следующие выводы:
- Все выбранные маркерные транскрипты показывают существенное отличие при сравнении нормальной кожи и кожи, подвергшейся воздействию крема Кераворт. Транскрипты достоверно определяются как в интактной, так и в обработанной коже. При этом увеличение содержания транскриптов в коже на 14 сутки после начала обработки составляет для IL-17α - 25,8 цикла (58 млн. раз), для IL-23α - 28,7 цикла (436 млн. раз.), для IFNG - 21,9 цикла (4 млн. раз), для IL17R- 10,1 цикла (1,1 тыс.раз).
2
2
2
- Анализ маркерных транскриптов подтверждает вывод о том, что при увеличении дозировки крема Кераворт в ряду 50→100→200 мкл/см происходит достоверное увеличение тяжести симптомов экспериментального псориаза, а при увеличении дозировки с 200 до 400 мкл/см достоверных изменений содержания маркерных транскриптов не происходит.Поэтому для моделирования псориаза в дальнейших экспериментах по исследованию специфической терапевтической активности ИВ на морских свинках используют дозировку крема Кераворт 200 мкл/см.
- Наиболее значимые различия динамики транскрипции при обработке кожи кремом Кераворт показывают гены цитокинов IL-17α и IL-23α. При этом в течение 3 недель после прекращения стимуляции для IL-17α характерно постепенное восстановление нормального уровня транскрипции со скоростью 6-7 циклов в неделю (64 раза), а для IL-23α такое восстановление начинается только через 7 суток после отмены стимуляции, и темпы нормализации составляют только 2 цикла в неделю (4 раза). Для транскриптов IFNG и IL17R, напротив, характерна быстрая нормализация уровня транскрипции, который полностью восстанавливается на 21-е сутки после отмены стимуляции. Таким образом, для дальнейшего исследования специфической терапевтической активности ИВ на морских свинках выбраны маркерные транскрипты IL-17α и IL-23α.
2
2
Проведение фототерапии экспериментально индуцированного псориаза у морских свинок с оценкой результата методом гистологического анализа срезов кожи Формируют четыре сбалансированных по полу и массе группы морских свинок, по 5 голов в каждой группе. У каждого животного освобождают от шерстного покрова участок кожи на спине и боках площадью 50 см, который делят маркером на 4 одинаковых сектора. В течение 14 суток на оголенную кожу каждого из секторов каждого животного ежедневно равномерно наносят крем Кераворт в дозировке 200 мкл на аппликацию (при площади единичного поля на поверхности кожи 1 см).
На 1, 3 и 5 сутки после окончания индукции акантоза кремом Кераворт проводят фототерапию с применением испытуемых препаратов. Для этого на депилированных участках кожи равномерно распределяют, не допуская попадания раствора на шерсть, по 1 мл растворов тестируемых препаратов, концентрация которых указана в Таблице 5 Через 1 час после нанесения проводят облучение с помощью «ультрафиолетовой расчески» UV 109 В (Herbert Waldmann GmbH & Co. KG, Германия) в дозах, указанных в Таблице 5.
* Минимальная фототоксическая доза
Через 10 дней после окончания индукции псориатических повреждений и начала фототерапии оценивают величину повреждений у животных всех групп, фотографируют каждое животное. Затем исследуют степень выраженности псориатического поражения методами гистологического анализа срезов пораженной кожи и с помощью анализа маркерных транскриптов методом количественной ПЦР. Для этого животных выводят из эксперимента, отбирают образцы кожи массой около 500 мг из каждого очага псориатического повреждения, консервируя их в растворе RNA Latter (Интерлабсервис) для оценки содержания маркерных транскриптов, и в 10% растворе формалина для гистологического исследования.
В дальнейшем из образцов кожи, законсервированных в растворе RNA Latter, выделяют суммарную РНК, проводят реакцию обратной транскрипции и ПЦР для выявления транскриптов IL-17a, IL-23a, а также неспецифического нормировочного транскрипта GAPDH (ген «house-keeping»).
Образцы кожи в ходе проведения гистологического исследования обрабатывают, как описано выше (см. раздел Отработка животной модели псориаз). При описании гистологических препаратов основное внимание уделяют соотношению кератиноцитов, кератина, коллагенового матрикса, фибробластов и лейкоцитов, а также целостности базальной мембраны кожи.
Визуальная оценка результативности фототерапии показывает, что на пятые сутки после начала лечения при использовании минимальной фототоксической дозы и более низких доз облучения, состояние кожи животных, получавших ИВ в концентрациях 1,0 и 0,3% (группы 1 и 2 соответственно) оказывается существенно лучше, чем в контроле (группа 2), и не отличается от группы сравнения (группа 4).
В группе сравнения 4 положительный эффект наблюдается только при использовании минимальной фототоксической дозы, хотя в остальных группах также прослеживается тенденция к обратному развитию патогномических признаков псориаза. При использовании доз облучения, превышающих минимальную фототоксическую, в группе сравнения (4) наблюдаются признаки фотодерматита, в результате чего поражения кожи оказываются даже более тяжелыми, чем в случае плацебо.
2
На 9 сутки в группе 1 (1%-спиртовой раствор ИВ) визуально кожа животных приближается по всем признакам к интактной. В группе 2 (0,3% спиртовой раствор ИВ) и в группе 4 (препарат сравнения) имеется незначительное количество очагов гиперкератоза. Животные группы 3 (контроль) сохраняют все признаки гиперкератоза и воспаления. Однако, на 10 сутки в экспериментальных группах при всех дозах облучения и в группе сравнения, получающей минимальную фототоксическую дозу, визуально кожа животных приближается по всем признакам к интактной. В группе сравнения 4, у животных, получающих субминимальные фототоксические дозы (0,05 и 0,15 кДж/м), и в группе плацебо на 10 сутки на кожных покровах сохраняется незначительное количество очагов гиперкератоза. Таким образом, можно утверждать, что в отличие от препарата сравнения Аммифурин, ИВ проявляет терапевтический эффект при использовании как субминимальных, так и минимальных фототоксических доз.
Результаты визуального наблюдения дополняют анализом маркерных транскриптов IL-17α и IL-23α в составе участков кожи, подвергшихся индукции псориатических поражений с последующей фототерапией. Результаты анализа представлены в Таблице 6.
Величины относительных Ct, получены путем вычитания сигнала кДНК GAPDH (типовой референс-ген группы «house-keeping»). Величины Ct и стандартные ошибки измерения определены путем усреднения результатов, полученных в параллельном эксперименте с пятью животными, выведенными из эксперимента в одно и то же время.
Результаты, представленные в Таблице 6, позволяют сделать следующие выводы:
Использование N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида дает существенно лучшие показатели нормализации (снижения) уровня маркерных транскриптов в коже экспериментальных животных, чем использование препарата сравнения.
- ИВ проявляет специфическую активность в качестве фотосенсибилизирующего средства в интервале 1,0% - 0,3%, при этом, чем выше концентрация ИВ, тем более выражен эффект нормализации уровня маркерных транскриптов.
- Независимо от концентрации в исследованном диапазоне ИВ проявляет практически одинаковую терапевтическую эффективность при использовании как минимальной фототоксической дозы облучения, так и субминимальных фототоксических доз.
В этом отношении ИВ выгодно отличается от препарата Аммифурин, для которого показано, что, в отличие от ИВ, использование субминимальных фототоксических доз облучения лишь незначительно сказывается на содержании в коже маркерного транскрипта IL-17α и совсем не влияет на содержание в нем маркерного транскрипта IL-23α, в то время, как использование точно подобранной минимальной фототоксической дозы позволяет существенно снизить содержание маркерных транскриптов IL-17α и IL-23α по сравнению с плацебо. Использование сверхминимальной фототоксической дозы Аммифурина не позволяет добиться улучшения клинической картины за счет побочной фототоксичности препарата, вызывающей ожог кожи животного.
Таким образом, результаты визуального наблюдения за клинической картиной применения N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида на морских свинках в концентрациях 1% и 0,3%, а также гистологические исследования материалов от этих животных показывают, что при использовании минимальной фототоксической дозы исследуемое вещество превосходит по эффективности применяемый в настоящее время препарат сравнения Аммифурин. Особенностью применения ИВ является то, что участки кожи после нанесения N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида могут быть подвергнуты облучению ультрафиолетовым светом длинноволнового диапазона в дозе, как равной минимальной фототоксической, так и в несколько раз ниже минимальной.
Исследование, проводимое с применением анализа маркерных транскриптов IL-17α и IL-23 на морских свинках, подтверждает преимущество N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида перед препаратом сравнения, заключающееся в отсутствии необходимости точного соблюдения минимальной фототоксической дозы. Иными словами, при несколько более высокой терапевтической эффективности относительно препарата сравнения ИВ проявляет существенно менее выраженное фототоксическое действие на кожные покровы. Кроме того, в отличие от Аммифурина, N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид существенно снижает содержание в пораженной ткани маркерного транскрипта IL-23a.
Полученные результаты позволяют предполагать, что соединение N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид в условиях облучения длинноволновым УФ способно влиять не только на содержание в дерме эктопических лимфоцитов, являющихся источником IL-17α, но и на продукцию IL-23α эутопическими кератиноцитами и фибробластами, не вызывая их гибели. Таким образом эффект лечения может оказаться более длительным, чем при использовании существующих фотосенсибилизаторов группы псораленов. Изучение острой токсичности N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида
Определение острой токсичности выполнено в соответствии с требованиями Руководства по проведению доклинических исследований (в 2-х частях, под редакцией А.Н. Миронова, ФГБУ НЦЭСПМ Минздравсоцразвития РФ, Гриф и К, Москва, 2012). В частности, соблюдено требование по необходимости выполнения испытаний на трех видах животных, один из которых не относится к грызунам.
Оценка острой темповой токсичности на мышах при внутрижелудочном введении
50
Опыты проводят на белых мышах обоего пола массой 22±2 г. Животным однократно внутрижелудочно вводят ИВ в виде суспензии в 1% крахмальном клейстере, при помощи металлического зонда с гладкой оливой на конце в максимально допустимом для данного вида животных и массы их тела объеме - 0,5 мл., содержащем 0,1 г препарата, что соответствует дозе 5 г/кг. Для человека с массой тела 70 кг эквивалентная доза составляет приблизительно 28 г. О токсическом действии препарата судят по общему состоянию животных и их выживаемости. Подсчет выживших и погибших животных проводят на 3 сутки после затравки препаратами, с последующим наблюдением за выжившими животными на протяжении 2-х недель. При наличии смертности вычисляют LD.
16
50
84
Показано, что после внутрижелудочного введения мышам исследуемого вещества N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в дозе 5,0 г/кг изменения поведения животных, токсических явлений и падежа мышей не наблюдается. Рассчитать значения LD, LD и LD препарата по методу Штабского [Руководство по проведению доклинических исследований под редакцией А.Н. Миронова, см выше] не представляется возможным в виду достижения объема, максимально допустимого для внутрижелудочного введения данному виду животных. Полученный результат позволяет отнести N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид к IV классу опасности «Малотоксичные лекарственные вещества». Состояние испытуемых животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих терапевтические в сотни раз [Н. Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimor, 1975, 427 p.; Руководство по проведению доклинических исследований под редакцией А.Н. Миронова, см выше].
Оценка острой фотоиндуцированной токсичности на морских свинках при накожном нанесении
2
Опыты проводят на морских свинках массой 400±40 г, распределенных на четыре группы по 6 животных в каждой группе. У каждого животного предварительно освобождают от шерстного покрова участок кожи на спине и боках площадью 50 см, и равномерно наносят 6% спиртовой раствор N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида и препарат сравнения Аммифурин (0,3%) Спиртовой раствор наносят порциями от 200 мкл до 1 мл, давая спирту испариться на воздухе в течение 2-5 минут, после чего наносят следующую порцию до тех пор, пока не будет нанесена вся запланированная доза 3,75 г/кг/сут.
Через 1 час после нанесения с помощью диодного источника света аппарата квантовой терапии с длиной волны 365 нм (Herbert Waldmann GmbH & Co. KG, Германия) проводят облучение в экспериментально установленной максимальной субэритемной дозе:
2
- 3,0 кДж/м для N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида,
2
- 0,25 кДж/м для препарата сравнения Аммифурин,
2
- 5,5 кДж/м для 75% раствора этилового спирта.
При отсутствии гибели животных в течение 3 суток, наблюдение за ними продолжают до двух недель после острой затравки. В случае падежа введение препаратов продолжают с уменьшением дозировки с фиксированным шагом до тех пор, пока гибель животных будет отсутствовать.
50
5o
О токсическом действии препарата судят по общему состоянию животных и их выживаемости, LD. Подсчет выживших и погибших животных проводят на 3 сутки после затравки препаратами с последующим наблюдением за выжившими животными на протяжении 2 недель. На основании полученных результатов рассчитывают LD по методу Штабского.
В качестве контроля используют данные, полученные на контрольных животных. Формируют три контрольные группы: группа 1 - порциями по 200 мкл наносился 75% спиртовой раствор в объеме соответствующем нанесении исследуемых препаратов, не содержащий испытуемого препарата, и проводят облучение в том же режиме, что и в основной экспериментальной группе, группа 2 - не наносят на поверхность никаких растворов, но проводят облучение в таком же режиме, как и в основной экспериментальной группе; группа 3 - порциями от 200 мкл до 1 мл наносят препарат сравнения Аммифурин и проводят облучение в том же режиме, что и в основной экспериментальной группе. Результаты показаны в Табл. 7.
Проведенные исследования показывают, что после накожного нанесения препарата N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид в дозах 1,125 и 3,75 г/кг/сут с последующим облучением обработанных участков кожи длинноволновым УФ светом в экспериментально установленной максимальной субэритемной дозе и в контрольных группах токсических явлений и падежа морских свинок не наблюдается. Заметных изменений в поведении животных не наблюдается, даже при нанесении дозы N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида, которая достигает предполагаемого максимума для данного способа введения (3,75 г/кг/сут.) при воздействии длинноволнового УФ облучения в физиологических дозах, соответствующих дозам при ПУВА-терапии.
Полученные данные позволяют отнести N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамид к IV классу «Малотоксичные лекарственные вещества». Состояние переживших острую интоксикацию животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих терапевтические в сотни раз (Н. Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimor, 1975, p.427; описание классификации степени токсичности соединений по К.К. Сидорову см в Руководстве по проведению доклинических исследований под редакцией А.Н. Миронова, см. выше).
Оценка острой токсичности при внутривенном введении на кроликах
Опыты проводят на кроликах обоего пола массой 3000±300 г. В экспериментальной группе испытуемое вещество вводят внутривенно медленно в виде стерильного апирогенного раствора с содержанием действующего вещества 0,0025% и содержанием этилового спирта 1%. Однократная доза введения - 20 мл раствора. Введение повторяют пять раз в сутки с интервалом 2 часа (общая доза введения 0,025 г в сутки или 9 мг/кг массы тела (0,2 максимальных суточных терапевтических дозы).
Формируют две контрольные группы: группа 1 - внутривенно пять раз в сутки вводят 0,3%-ный спиртовой раствор, не содержащий препарата исследования, в эквивалентной дозе, группа 2 - внутривенно вводят в том же режиме препарат сравнения Аммифурин. Результаты представлены в Табл. 8
Проведенные исследования показывают, что после внутривенного введения кроликам N-(6,8,8-триметил-8,9-дигидрофуро[3,2-h]хинолин-5-ил)ацетамида в дозе 9 мг/кг никаких изменений в поведении животных, токсических явлений и падежа животных не наблюдается
Полученные экспериментальные данные позволяют отнести данный препарат к III классу умеренно токсичных лекарственных средств, а учитывая данные по исследованию острой токсичности при внутрижелудочном введении и накожном нанесении - к IV классу «Малотоксичные лекарственные вещества». Состояние испытуемых животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих терапевтические в сотни раз.