Способ моделирования атрофии ретинального пигментного эпителия
METHOD OF SIMULATING RETINAL PIGMENT EPITHELIUM ATROPHY

Изобретение относится к медицине, а именно, офтальмологии и может быть использовано в экспериментальной офтальмологии для моделирования атрофии ретинального пигментного эпителия для оценки эффективности различных способов лечения данной патологии.
Атрофия ретинального пигментного эпителия является одной из самых распространенных и прогностически неблагоприятных поражений органа зрения, приводящих к значительному и необратимому снижению зрительных функций. К основным заболеваниям, вызывающим атрофию пигментного эпителия сетчатки, относятся возрастная макулярная дегенерация (географическая атрофия) и врожденные дистрофии сетчатки, в основе патогенеза которых лежит дегенерация пигментного эпителия. Поражение пигментного эпителия - необратимый процесс, так как у него, как и у сетчатки отсутствуют механизмы регенерации. [A. Stem Cell Treatment in Retinal Diseases: Recent Developments // Turkish journal of ophthalmology. - 2018. - Т. 48. - №. l. - C. 33]
Варианты терапии для дегенеративных заболеваний сетчатки крайне ограничены и на современном этапе активно разрабатываются на экспериментальных моделях.
Экспериментальные модели повреждения сетчатки можно условно разделить на три основных типа: механические, термические и фотохимические. [R. D. Phototoxicity to the retina: mechanisms of damage // International journal of toxicology. - 2002. - T. 21. - №. 6. - C. 473-490.]
Известен способ моделирования атрофии сетчатки у кроликов с помощью фотодинамического повреждения с использованием фотосенсибилизатора Радахлорина и лазерного излучения с длиной волны, соответствующей максимальному поглощению фотосенсибилизатора. Мощность излучения была подобрана эмпирически. На 24 моделях на глазном дне кролика была получена экссудативная отслойка ПЭС, в поздние сроки переходящая в атрофию ПЭС [Экспериментальные модели заболеваний сетчатки для разработки клеточных технологий / В.Г. Лихванцева, А.В. Федоренко, Э.О. Султанова и др. // Сборник научных трудов Научно-практической конференции по офтальмохирургии с международным участием: Восток Запад. - ДизайнПолиграфСервис Уфа, 2011. - С. 249-250.]
Известна модель фототоксичности, демонстрирующая разрушающее действие света на сетчатку [Saenz-de-Viteri М, Heras-Mulero Н, Robredo Р, et al. Oxidative Stress and Histological Changes in a Model of Retinal Phototoxicity in Rabbits. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2014;2014:637137. doi:10.1155/2014/637137]
Рядом исследований доказано повреждающее действие синего спектра на сетчатку, и развитие на этом фоне ВМД [Kernt М, Walch A, Neubauer AS, et al. Filtering blue light reduces light-induced oxidative stress, senescence and accumulation of extracellular matrix proteins in human retinal pigment epithelium cells. Clinical and Experimental Ophthalmology. 2012;40(l):e87-e97.] Авторы отмечают высокие уровни перекисного окисления липидов во время воздействия света, но затухание повреждающего эффекта в течение недели после воздействия, при этом уровень окислительного повреждения сразу после облучения на 12% был выше, чем через неделю после него по данным гистологического исследования. На фоне окислительного стресса повреждается слой фоторецепторов и других клеток сетчатки, приводящий к апоптозу собственных клеток и истончению сетчатки.
Известна модель посттравматического повреждения сетчатки, при которой проводили лазерную коагуляцию сетчатки глаза кроликов с помощью аргоновой лазерной установки. В результате прямого термического воздействия на пигментный эпителий, структуры сетчатки подверглись некрозу вплоть до изменения архитектоники. [Купрашвили И.Т. Экспериментальное изучение эффективности клеточной трансплантации при посттравматической патологии сетчатки: дис. - М.: Автореф. дис… канд. мед. наук, 2009]
Известен способ моделирования центральной дистрофии сетчатки с помощью сочетания локального воздействия видимым светом и безантиоксидантного режима. Исследование рассчитано на 100-120 дней, рацион кроликов включал ежедневно 50 тыс.ед. вит.А и 5 тыс.ед. вит Д. Освещенность от люминесцентных ламп составляла 3000-4000 Лк в течение 12 часов ежедневно. Полученные в ходе эксперимента изменения центральной зоны сетчатки соответствовали ВМД [А.М.Солдатова, О.Н.Воскресенский, М.В.Зуева Повреждающее действие видимого света на сетчатку глаза, Авт дисс. - к.т.н  М., 1980]
Известна модель возрастной макулярной дегенерации, получаемая в результате механического повреждения при использовании силиконового наконечника 20 G, которым проводили механический массаж центральной области сетчатки вплоть до разрушения пигментного эпителия сетчатки. Таким образом, модель получали в кратчайшие сроки. (RU 2480844, 27.04.2013)
Ближайшим аналогом предполагаемого изобретения является способ моделирования атрофии ретинального пигментного эпителия путем введения фосфатно - солевой буферной системы (PBS) или NaIO3 с помощью трассклерального доступа в субретинальное пространство. В эксперименте на кроликах были получены две доклинические модели географической атрофии сетчатки, используя [Petrus-Reurer S. et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy // Investigative ophthalmology & visual science. - 2017. - T. 58. - №. 2. - C. 1314-1322.] Введение NaIO3 сопровождается агрессивным характером повреждения: отмечаются изменения в виде тяжелой географической атрофии в сопровождении с хориоидальной атрофией. Данная морфологическая модель атрофии РПЭ, вызванная PBS раствором, не имеющая достаточных функциональных и клинических данных и отличающаяся относительной дороговизной, мотивирует на поиск более оптимальной модели.
Задачей изобретения является разработка простой, доступной, легкой в воспроизведении и экономичной модели атрофии ретинального пигментного эпителия.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение адекватной клинико-функциональной и морфологической модели атрофии ретинального пигментного эпителия, отражающей течение процесса наиболее близкое к естественному.
Технический результат достигается за счет введения раствора в субретинальное пространство с формированием субретинального пузыря, в качестве раствора используют 0.9% раствор хлорида натрия в объеме 0.03 мл, который вводят на расстоянии 0.5 pd ниже диска зрительного нерва.
При введении 0.9% раствора хлорида натрия в объеме 0.03 мл повреждаются апикальные ворсинки ретинального пигментного эпителия, пузырьки после введения не разделяют клетки ретинального пигментного эпителия между собой, хориоидея также остается интактной. Формирование субретинального пузыря в месте введения приводит к необратимым изменениям в виде дегенерации фоторецепторного слоя сетчатки и атрофии ретинального пигментного эпителия сетчатки. Раствор вводят на расстоянии 0,5 pd ниже диска зрительного нерва для наилучшей воспроизводимости и повторяемости модели, визуализации с помощью оптической когерентной томографии, использования постоянного ориентира (диска зрительного нерва) и точной стандартизированной топографии зоны атрофии.
Способ осуществляют следующим образом
В субретинальное пространство на расстоянии 0,5 pd ниже диска зрительного нерва вводят 0.9% раствор хлорида натрия в объеме 0.03 мл с формированием субретинального пузыря.
Для моделирования животных обезболивали внутримышечным введением Золетила и Ксилазина. Мидриаз достигался закапыванием Аппамида. Операцию проводили на правом глазу, оставляя парный глаз для контроля. Перед операцией местно закапывали Вигамокс и Алкаин. Выделяли глазные мышцы и брали на швы-держалки. В проекции плоской части цилиарного тела выполняли склеротомии с установкой портов 23 Ga соответственно 2,10 и 5 часам. На 5 часах устанавливали ирригационную канюлю. Проводили частичную витрэктомию. Раствор 0,9% натрия хлорида использовали в шприце объемом 1 мл, соединенным с удлинительной трубкой (управляемой ассистентом) и канюлей 41G DORK (управляемой хирургом), предварительно срезанной под углом 45°. Канюлю вводили через верхневисочный порт в субретинальное пространство на расстоянии 0,5 pd ниже диска зрительного нерва. После правильного позиционирования кончика, который визуализировался побледнением сетчатки, 0.03 мл физ. раствора вводили субретинально и медленно до образования пузыря, который хорошо визуализируется хирургом с помощью операционного микроскопа. После хирургического вмешательства всем кроликам субконъюнктивально вводили раствор Гентамицина и Дексаметазона в дозе 3 мг/кг и 0,2 мг/кг, соответственно. В последующие 7 дней в конъюнктивальную полость закапывали раствор Дексаметазона 0,1% 3р/д.
Изобретение поясняется следующими экспериментальными данными. Экспериментальные исследования были проведены на 10 кроликах (10 глаз) породы альбино, массой 2,0-2,5 кг. Продолжительность эксперимента составила один месяц. Через месяц животных выводили из эксперимента методом воздушной эмболии после введения кролика в наркоз (согласно приказу МинВуза СССР №724 от 13.11.184). Глазные яблоки энуклеировали целиком, после чего фиксировали в нейтральном 10% растворе формалина в течение 1 суток. После фиксации глазные яблоки разрезали на 3 колодки таким образом, чтобы зона индуцированной атрофии оказывалась в центральной колодке. После стандартной гистологической проводки центральные колодки заливали в парафин. С парафиновых блоков готовили серийные срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике. Обзорное микроскопическое исследование проводили на микроскопе, оборудованном цифровой фотокамерой при увеличении объектива ×20.
Типичными морфологическими признаками, наблюдаемыми при экспериментальном моделировании атрофии, сетчатки являются выраженные в различной степени дистрофические изменения во всех слоях сетчатки с нарушением ее гистоархитектоники и стратификации, очаги разряжения ядерных слоев и слоев нервных волокон, субатрофия и вакуолизация слоя ганглиозных клеток. Изменения пигментного эпителия представлены очагами баллонной дистрофии и деструкции с внеклеточным выпадением и депонированием глыбок пигмента, деструкция и лизис пигментных клеток с субтотальной атрофией и исчезновением слоя пигментных клеток.
В сроки наблюдения на 2 день, через 2 недели и 1 месяц после оперативного вмешательства проведена оптическая когерентная томография на обоих глазах.
На 2 день после оперативного вмешательства на ОКТ-снимке визуализировалась отслойка нейросенсорной сетчатки с разрывом соответственно месту вкола, дезорганизация его слоев. На аутофлюоресенции определялась неравномерная гиперфлюоресценция (Фиг. 1).
На 2 неделе отмечалось неравномерное прилегание нейроэпителия, самопроизвольное закрытие разрыва, повышение гиперрефлективности в зоне предполагаемой атрофии. На аутофлюоресценции определялась зона гипофлюоресценции, соответствующая зоне атрофии, окруженной ободком крапчатой гиперфлюоресценции (Фиг. 2).
Через один месяц после оперативного вмешательства визуализировалась зона атрофии ретинального пигментного эпителия, приводящая к повышенному проникновению лазерного луча в подлежащие ткани. В зоне атрофии определялось истончение пигментного эпителия и хориоидеи, утрата хориокапилляров. На аутофлюоресценции глазного дна определялась зона гипофлюоресценции, соответствующая зоне атрофии (Фиг. 3).
До и после оперативного вмешательства проведена оценка состояния кровотока в сосудах глаза при помощи метода цветового дуплексного сканирования в режимах цветового доплеровского картирования (ЦДК) и импульсной допплерографии. В верхней глазной артерии не отмечалось существенных изменений состояния кровотока, выявлено незначительное снижение максимальной систолической скорости кровотока V syst (до 15%) по сравнению с парным интактным глазом. Однако в центральной артерии сетчатки (ЦАС) и задних коротких цилиарных артериях (ЗКЦА) на пораженном глазу отмечалось выраженное снижение максимальной систолической скорости кровотока V syst (на 30-35%) и конечной диастолической скорости кровотока V diast в ЦАС (до 50%) по сравнению с парным глазом. Таким образом, установлены признаки дефицита ретинального и хориоидального кровообращения в глазах с атрофией ретинального пигментного эпителия (РПЭ). Учитывая, что у животных, в отличие от человека, крайне сложно проводить электроокулографию (ЭОГ) с принудительным движением глаз для оценки функции пигментного эпителия сетчатки (РПЭ), у кроликов функциональную состоятельность РПЭ косвенно оценивали по активности фоторецепторов сетчатки, жизнеспособность которых критично зависит от РПЭ. Известно, что клетки РПЭ активно участвуют в окислительном метаболизме, обновлении наружных сегментов фоторецепторов, метаболизме зрительных пигментов, удалении отходов жизнедеятельности в наружной сетчатке. РПЭ также способствует формированию и поддержанию межфоторецепторного матрикса, который имеет решающее значение для адгезии сетчатки. Поэтому изменение активности фоторецепторов по данным ЭРГ является косвенным маркером патологии клеток РПЭ и позволяет опосредованно судить об их сохранности.
С помощью электроретинографии оценивали функциональную активность не только фоторецепторов, но и нейронов внутреннего ядерного слоя (ВЯС) сетчатки.
У 10 здоровых кроликов-альбиносов с помощью диагностической системы Roland Consult RETIscan21 (Германия) регистрировали ЭРГ по стандартам ISCEV до и после моделирования атрофии РПЭ. Исследовали палочковый ответ, скотопическую максимальную ЭРГ, колбочковую ЭРГ на одиночные стимулы и ритмическую ЭРГ (РЭРГ) на мелькания с частотой 30 Гц, а также ритмическую фотопическую ЭРГ на мелькания в широком спектре частот (8,3, 10, 12 и 30 Гц). Оценивали амплитудные и временные показатели биопотенциалов сетчатки и амплитудное соотношение b-волны к а-волне максимальной и колбочковой ЭРГ (индекс b/а). Результаты ЭРГ, полученные на глазах с моделью атрофии РПЭ, сравнивали с показателями парного интактного глаза в динамике через 1 месяц после субретинального введения физиологического раствора в объеме 0,03 мл.
На глазах с атрофией отмечалось умеренное снижение функциональной активности ON- биполярных клеток и клеток Мюллера, выявленное по динамике b-волны палочковой и максимальной скотопической ЭРГ. Выявлено существенное угнетение а-волны ЭРГ, амплитуда которой у разных кроликов составляла 70-50% от ее значений в здоровом глазу (Фиг. 4 - Максимальная ЭРГ в опытном (OD) и здоровом глазу (OS). Кролик 20). Это указывает на вовлечение в патологический процесс фоторецепторов сетчатки. Снижение функциональной активности фоторецепторов может быть связано с нарушением кинетики регенерации в них зрительных пигментов при атрофии РПЭ или дефицитом их поддержки кислородом и питательными веществами из хориоидеи, связанной с нарушением трофической функции РПЭ.
Поскольку снижение амплитуды b-волны было менее выраженным, это явилось причиной значительного повышения индекса b/а максимальной ЭРГ. Данный индекс является чувствительным маркером интерфейса наружная / внутренняя сетчатка и отражает в условиях наших экспериментов нарушение передачи зрительных сигналов от фоторецепторов к биполярным клеткам. Пиковая латентность а- и b-волн не отличалась от значений в здоровых глазах. При регистрации фотопической РЭРГ широкого спектра частот, которая отражает активность нейронов колбочковой системы сетчатки без вклада клеток Мюллера, в опытных глазах отмечено угнетение амплитуды только на частоту световых мельканий на 8,3 и 10 Гц (Фиг. 5 - Колбочковая ЭРГ в опытном (OD) и здоровом глазу (OS). Кролик 20). Данный ответ связывают исключительно с активностью фоторецепторов, но не биполярных клеток.
Таким образом, моделирование атрофии РПЭ с помощью однократного субретинального введения физиологического раствора позволяет получить стойкие изменения функциональной активности сетчатки, прежде всего, в слое фоторецепторов, наряду с дефицитом ретинального и хориоидального кровообращения через месяц наблюдения. Относительная простота воспроизведения модели атрофии позволяет широко использовать ее в экспериментальных исследованиях.