СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ И ОЧИСТКИ ОРТОПОКСВИРУСА

1. Способ получения и очистки ортопоксвируса дикого типа, аттеньюированного и/или рекомбинантного ортопоксвируса, включающий следующие этапы:
a) приготовление культуры пакующих клеток;
b) инфицирование культуры пакующих клеток ортопоксвирусом;
c) культивирование инфицированных пакующих клеток до получения потомства ортопоксвируса;
d) инкубация в присутствии одной или более нуклеаз;
e) выделение ортопоксвирусов из супернатанта культуры и/или пакующих клеток;
f) добавление моновалентных солей к ортопоксвирусам, выделенным на этапе е), в условиях, подходящих для ингибирования активности нуклеазы (нуклеаз) и для предотвращения адсорбции указанных ортопоксвирусов к анионообменному адсорбенту на этапе g);
g) осуществление контакта смеси, полученной на этапе f) с анионообменным адсорбентом в условиях, подходящих для захвата нуклеиновых кислот;
h) осветление смеси, полученной на этапе g), в условиях, подходящих для удаления клеточного дебриса;
i) промывка анионообменного адсорбента раствором, содержащим моновалентные соли, в условиях, подходящих для выделения оставшихся ортопоксвирусов в фильтрате;
j) концентрирование фильтрата, полученного на этапе h), и фильтрата, полученного на этапе i);
k) диафильтрация содержащей ортопоксвирус фракции, полученной на этапе j).
2. Способ по п.1, в котором пакующие клетки представляют собой иммортализованные клеточные линии, предпочтительно иммортализованные линии клеток птиц.
3. Способ по п.2, где иммортализованные линии клеток птиц способны расти в суспензии без (микро)носителей, причем указанные клетки предпочтительно культивируют в среде, свободной от продуктов животного происхождения.
4. Способ по п.1, в котором пакующие клетки представляют собой первичные или вторичные клетки птиц, и предпочтительно представляют собой фибробласты куриного эмбриона (CEF).
5. Способ по п.1, в котором рН лежит в диапазоне между 7,0 и 9,0, предпочтительно между 7,5 и 8,5, и более предпочтительно равен 8,0,
6. Способ по п.1, в котором нуклеаза (нуклеазы) представляет (представляют) собой эндонуклеазу (эндонуклеазы) и предпочтительно представляет собой Benzonase.
7. Способ по п.1, в котором концентрация нуклеазы (нуклеаз) находится в диапазоне от 5 до 100 ед/мл, предпочтительно в диапазоне от 5 до 50 ед/мл, и более предпочтительно составляет 10 ед/мл.
8. Способ по п.1, в котором перед этапом выделения ортопоксвирусов осуществляют
1) этап обеспечения разрушения мембран пакующих клеток, предпочтительно путем использования высокоскоростного гомогенезатора или путем обработки ультразвуком; и
2) этап инкубирования смеси, полученной на этапе 1), в течение по меньшей мере 1 часа, что обеспечивает разрушение ранее добавленной нукпеазой (нуклеазами) нуклеиновых кислот, высвобождаемых из пакующих клеток.
9. Способ по п.1, в котором анионообменный адсорбент состоит из матрикса, состоящего из гранул, имеющих диаметр, превышающий размер пор фильтров, используемых на этапе осветления, предпочтительно диаметр более 8 мкм, более предпочтительно диаметр, лежащий в диапазоне между 50 мкм и 150 мкм, более предпочтительно диаметр, лежащий в диапазоне между 90 мкм и 120 мкм, и еще более предпочтительно диаметр, равный 120 мкм.
10. Способ по п.1, в котором функциональные группы анионообменного адсорбента выбраны из группы, состоящей из диметиламиноэтила (DMAE), диэтиламиноэтила (DEAE), триметиламиноэтила (ТМАЕ) и триэтиламиноэтила (ТЕАЕ), и предпочтительно представляет собой триметиламиноэтил (ТМАЕ).
11. Способ по п.1, в котором этап осветления осуществляют путем глубинной фильтрации и предпочтительно на фильтрах с размером пор, равным 8 мкм, в комбинации с фильтрами с размером пор, равным 5 мкм.
12. Способ по п.1, в котором этап концентрирования осуществляют путем микрофильтрации на фильтрах с размером пор, лежащим в диапазоне между 0,09 и 0,15 мкм, и предпочтительно на фильтрах с размером пор, равным 0,1 мкм.
13. Способ по п.1, в котором этап диафильтрации осуществляют на фильтрах с размером пор, лежащим в диапазоне между 0,09 и 0,15 мкм, и предпочтительно на фильтрах с размером пор, равным 0,1 мкм.
14. Способ по п.1, в котором способ дополнительно включает
1) этап гель-фильтрации; и
2) этап диафильтрации.
15. Способ по п.1, в котором моновалентные соли, используемые на этапе f), представляют собой NaCl.
16. Способ по п.1, в котором концентрация моновалентных солей, используемых на этапе f), находится в диапазоне от 50 до 150 мМ, и предпочтительно составляет 100 мМ.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором указанный ортопоксвирус представляет собой вирус осповакцины или модифицированный вирус осоповакцины анкара (MVA).