АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С ECL-2 КЛАУДИНА 3, ЕГО ФРАГМЕНТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODY SPECIFICALLY BINDING TO ECL-2 CLAUDIN 3, ITS FRAGMENT AND ITS USE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Эта заявка испрашивает приоритет на основании патентной заявки № 10-2018-0036190 Кореи, поданной 28 марта 2018 г., все содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение относится к антителу, которое специфически связывается с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, его фрагменту, и их применениям, и, более конкретно, к применению антитела, специфически связывающегося с ECL-2 клаудина 3, и его функциональным фрагментам при обнаружении раковых клеток, диагностике, визуализации и для лечения рака (противораковое применение самого антитела и применение в отношении ADC и CAR-экспрессирующих клеток (в частности, иммунных клеток)), антителу, которое содержит последовательность CDR, оказывающее заметный эффект при таких применениях, и его функциональному фрагменту.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Клаудин является основным и важным мембранным белком плотного контакта (TJ) между клетками, и у млекопитающих существует 27 семейств этого белка. У людей есть семейство клаудинов, за исключением клаудина 13 у млекопитающих. Семейство клаудинов имеет сходную структуру, которая проникает через клеточную стенку и внедряется в нее, и большинство из них имеет структуру с двумя внеклеточными петлями. Известно, что клаудин играет роль в контроле потока молекул между клетками, но недавние исследования показали, что он тесно связан с заболеваемостью раком, таким как рак толстой кишки, рак желудка, рак молочной железы, рак пищевода и рак яичников. Около 90% злокачественных опухолей происходят из эпителия. В нормальных эпителиальных клетках клетки расположены параллельно эпителиальной плоскости. Следовательно, клаудин, который образует TJ между нормальными эпителиальными тканями, трудно обнаружить на поверхности тканей или органов, но на ранних стадиях развития эпителиальной опухоли контроль митотического веретена ослабляется, и клетки размножаются за счет деления вне плоскости, обнажая клаудин на поверхность ткани.
В частности, сообщалось, что клаудин 3 и клаудин 4 из семейства клаудина сверхэкспрессируются при раке яичников, который, как известно, имеет плохой прогноз, поскольку нет очевидных симптомов и нет адекватного метода лечения, кроме хирургического вмешательства и химиотерапии (Claudin Proteins in Human Cancer: многообещающие новые мишени для диагностики и терапии, PJ Morin, Cancer Res. 65: 9604-9006 (2005)). Кроме того, по результатам подтверждения выживаемости 84 пациентов с серозной аденокарциномой яичников и уровня экспрессии клаудина 3 с помощью кривой выживаемости по методу Каплана-Мейера было сообщено об исследовании, показавшем, что уровень экспрессии клаудина 3 был тесно связан с сокращением продолжительности жизни пациента (Expression profile of tight junction protein claudin 3 and claudin 4 in ovarian serous adenocarcinoma with prognostic, Choi et al., Histol. Histopathol. 22: 1185 ~ 1195 (2005)). Как раскрыто выше, увеличение или уменьшение экспрессии клаудина с высокой специфичностью в раковых тканях можно использовать в качестве индикатора для прогнозирования возникновения рака. Кроме того, клаудин стал полезным биомаркером при диагностике и лечении рака, и различные группы компаний пытаются разработать терапевтические средства, нацеленные на клаудин.
Между тем конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) представляет собой комбинацию целевой специфичности моноклонального антитела и свойств эффективности лекарственного средства (например, цитотоксичности). ADC состоит из трех компонентов, включая лекарственные средства, моноклональные антитела и линкер, который соединяет антитело с лекарственным средством. Технология ADC в основном использует антитела, которые специфически связываются со специфическими антигенами, экспрессируемыми на поверхности раковых клеток. Она используется как способ доставки лекарственных средств к опухолевым клеткам. Однако не все антитела, которые просто нацелены на специфические раковые антигены, применимы для ADC.
Существующие антитела не могут проникать непосредственно в живые клетки из-за их большого размера и гидрофильности. Следовательно, большинство существующих антител специфически нацелены на белки или белки клеточной мембраны, секретируемые за пределы клетки. Обычные антитела и полимерные биофармацевтические препараты имеют ограничения в том, что они не могут связываться и ингибировать различные вещества, связанные с заболеванием, внутри цитоплазмы, поскольку они не могут проходить через гидрофобную клеточную мембрану. Как правило, коммерческие антитела, которые специфически связываются с внутриклеточными веществами, используемые в экспериментах для изучения механизмов, таких как рост клеток и специфическое ингибирование, нельзя применять непосредственно на живых клетках, и для связывания с внутриклеточными веществами является существенным процесс предварительной обработки с образованием перфорации в клеточной мембране посредством индукции проницаемости клеточной мембраны с использованием сапонина, амфифильного гликозида. В случае низкомолекулярных веществ, нуклеиновых кислот или наночастиц их можно транспортировать в живые клетки с помощью различных реагентов, электропорации или теплового шока, но в случае белков и антител большинство реагентов и экспериментальных условий, описанных выше, может отрицательно повлиять на истинную третичную структуру, приводя к потере их активности. В настоящий момент разрабатывается внутриклеточное антитело (интратело), которое специфически связывается с внутриклеточными белками и ингибирует их активность, но оно также не обладает способностью к проникновению через клеточную мембрану живых клеток, поэтому его можно применять только в целях генной терапии. Таким образом, возможности применения в будущем очень ограничены (Manikandan J et al., Protein i: interference at protein level by intrabodies, Front Biosci, 2007 Jan 1;12:1344-52).
Некоторые терапевтические подходы, включая конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), иммунотоксины и направленную доставку нуклеиновых кислот, требуют антител, которые не только связываются с рецепторами, но и интернализуются в клетки при связывании. Известно, что ADC должны проникать в клетки (интернализация) для того, чтобы ADC демонстрировали отличную эффективность. Однако, в зависимости от антитела, способность проникать в клетку отсутствует, или из-за того, что отклонение очень велико, антитела, которые могут быть разработаны с использованием реальных ADC, и их эффекты ограничены.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА
Таким образом, авторы настоящего изобретения при разработке антитела, обладающего различными свойствами, подходящего для использования в качестве ADC (конъюгата антитело-лекарственное средство), завершили настоящее изобретение после того, как подтвердили ценность антитела и функционального фрагмента, которые специфически связываются с клаудином 3 ECL-2 для обнаружения раковых клеток, диагностики, визуализации и применения для лечения рака (например, применение с ADC и CAR-экспрессирующими клетками (особенно иммунными клетками)). В качестве конкретного примера они подтвердили, что антитело, содержащее уникальную последовательность CDR, предусмотренную настоящим изобретением, не только само по себе обладает противораковой способностью, но также демонстрирует превосходную способность к нацеливанию на раковые клетки без перекрестной реактивности с другими семействами клаудина, также авторы подтвердили, что оно демонстрирует великолепную силу связывания (аффинность) по сравнению с существующим известным антителом к клаудину 3 и проявляет исключительные эффекты в вышеуказанном применении, обладая такими свойствами, как интернализация клеткой.
Следовательно, один из аспектов настоящего изобретения относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащим определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (VH-CDR1), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 3, определяющий комплементарность участок 2 тяжелой цепи (VH-CDR1), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 4 (VH-CDR2), и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющий комплементарность участок 3 тяжелой цепи (VH-CDR3), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 5, и
определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (VL-CDR1), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 6, определяющий комплементарность участок 2 легкой цепи (VL-CDR2), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющий комплементарность участок 3 легкой цепи (VL-CDR3), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 8.
Другой аспект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему антитело или его функциональный фрагмент, содержащему их вектору, содержащей их клетке, и способу получения антитела или его функционального фрагмента с использованием того же.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции для детекции клаудина 3, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента, и способу детекции клаудина 3 с использованием того же.
Дополнительно изобретение относится к композиции для детекции клаудина 3, состоящей из антитела или его функционального фрагмента, и способу детекции клаудина 3 с использованием того же.
Дополнительно изобретение относится к композиции для детекции клаудина 3, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента, и способу детекции клаудина 3 с использованием того же.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции для диагностики или визуализации рака, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для диагностики или визуализации рака, состоящей из антитела или его функционального фрагмента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для диагностики или визуализации рака, которая по существу состоит из антитела или его функционального фрагмента.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции для предотвращения и лечения рака, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, состоящей из антитела или его функционального фрагмента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, в частности, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, состоящей из антитела или его функционального фрагмента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции для внутриклеточной доставки лекарственного средства, содержащей антитело или его функциональный фрагмент, которое или который специфически связывается с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, в качестве активного ингредиента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для внутриклеточной доставки лекарственного средства, состоящей из антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3.
Дополнительно изобретение относится к композиции для внутриклеточной доставки лекарственного средства, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции для предотвращения и лечения рака, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором антитело или функциональный фрагмент связаны с лекарственным средством, в качестве активного ингредиента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, состоящей из конъюгата антитело-лекарственное средство, в котором антитело или его функциональный фрагмент связаны с лекарственным средством, в качестве активного ингредиента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, состоящей по существу из конъюгата антитело-лекарственное средство, в котором антитело или функциональный фрагмент связаны с лекарственным средством, в качестве активного ингредиента.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции для предотвращения и лечения рака, включая внутриклеточную доставку лекарственного средства, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором лекарственное средство связано с антителом или его функциональным фрагментом, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, в качестве активного ингредиента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, включая только внутриклеточную доставку лекарственного средства, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором лекарственное средство связано с антителом или его функциональным фрагментом, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, в качестве активного ингредиента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, включая по существу только внутриклеточную доставку лекарственного средства, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором лекарственное средство связано с антителом или его функциональным фрагментом, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, в качестве активного ингредиента.
Другой аспект настоящего изобретения относится к белку химерного рецептора антигена (CAR), содержащему: i) антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению; ii) трансмембранный домен и iii) внутриклеточный сигнальный домен.
Дополнительно изобретение относится к белку химерного рецептора антигена (CAR), содержащему: i) антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3; ii) трансмембранный домен и iii) внутриклеточный сигнальный домен.
Другой аспект настоящего изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему белок химерного антигенного рецептора (CAR), рекомбинантному вектору, содержащему его, и клетке (в частности иммунной клетке), трансформированной указанным вектором.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению антитела или его функционального фрагмента для получения агента для детекции клаудина 3, агента для диагностики рака, агента для визуализации рака и агента для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу специфической детекции клаудина 3, способу диагностики рака, способу визуализации рака и способу специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента, нуждающегося в этом субъекту.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению конъюгата антитело-лекарственное средство, в котором антитело или его функциональный фрагмент связаны с лекарственным средством, для получения агента для предотвращения и лечения рака.
Еще один дополнительный аспект настоящего изобретения относится к способу предотвращения и лечения рака, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором антитело или его функциональный фрагмент связаны с лекарственным средством, в качестве активного ингредиента, нуждающемуся в этом субъекту.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, для получения агента для внутриклеточной доставки лекарственного средства.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу внутриклеточной доставки лекарственного средства, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, в качестве активного ингредиента, нуждающемуся в этом субъекту.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, и связанного с ним лекарственного средства для получения агента для предотвращения и лечения рака.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу предотвращения и лечения рака, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей в качестве активного ингредиента антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются я с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, и лекарственное средство, связанное с ним, для нуждающегося в этом субъекта.
ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ
Вариант осуществления согласно одному аспекту настоящего изобретения относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащим:
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (VH-CDR1), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 3, определяющий комплементарность участок 2 тяжелой цепи (VH-CDR2), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 4, и определяющий комплементарность участок 3 тяжелой цепи (VH-CDR3), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 5, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (VL-CDR1), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 6, определяющий комплементарность участок 2 легкой цепи (VL-CDR2), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 7, и определяющий комплементарность участок 3 легкой цепи (VL-CDR3), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 8.
Вариант осуществления согласно одному аспекту настоящего изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему антитело или его функциональный фрагмент, вектору, содержащему то же самое, клетке, содержащей то же самое, и к способу получения антитела или его функционального фрагмента с использованием того же.
Вариант осуществления согласно одному аспекту настоящего изобретения относится к композиции для детекции клаудина 3, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента, и к способу детекции клаудина 3 с использованием того же.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для детекции клаудина 3, состоящей из антитела или его функционального фрагмента, и к способу детекции клаудина 3 с использованием того же.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для детекции клаудина 3, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента, и к способу детекции клаудина 3 с использованием того же.
Вариант осуществления согласно одному аспекту настоящего изобретения относится к композиции для диагностики или визуализации рака, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для диагностики или визуализации рака, состоящей из антитела или его функционального фрагмента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для диагностики или визуализации рака, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента.
Вариант осуществления согласно другому аспекту настоящего изобретения относится к композиции для предотвращения и лечения рака, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, состоящей из антитела или его функционального фрагмента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента.
Вариант осуществления согласно другому аспекту настоящего изобретения относится к композиции для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, в частности, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, состоящей из антитела или его функционального фрагмента.
Дополнительно изобретение относится к композиции для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента.
Дополнительно вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к композиции для внутриклеточной доставки лекарственного средства, содержащей антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, в качестве активного ингредиента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для внутриклеточной доставки лекарственного средства, состоящей из антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для внутриклеточной доставки лекарственного средства, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к композиции для предотвращения и лечения рака, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором лекарственное средство связано с антителом или его функциональным фрагментом, в качестве активного ингредиента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, состоящей из конъюгата антитело-лекарственное средство, в котором лекарственное средство связано с антителом или его функциональным фрагментом, в качестве активного ингредиента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к композиции для предотвращения и лечения рака, состоящей по существу из конъюгата антитело-лекарственное средство, в котором лекарственное средство связано с антителом или его функциональным фрагментом, в качестве активного ингредиента.
Дополнительно вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, и связанное с ним лекарственное средство, и к композиции для предотвращения и лечения рака, содержащей указанный конъюгат антитело-лекарственное средство в качестве активного ингредиента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, и связанному с ним лекарственному средству, и к композиции для предотвращения и лечения рака, состоящей из конъюгата антитело-лекарственное средство в качестве активного ингредиента.
Дополнительно настоящее изобретение относится к конъюгату антитело-лекарственное средство, содержащему антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, и связанное с ним лекарственное средство, и к композиции для предотвращения и лечения рака, содержащей указанный конъюгат антитело-лекарственное средство в качестве активного ингредиента.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к белку химерного рецептора антигена (CAR), содержащему: i) антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению, ii) трансмембранный домен и iii) внутриклеточный сигнальный домен. Дополнительно изобретение относится к белку химерного рецептора антигена (CAR), содержащему: i) антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, ii) трансмембранный домен и iii) внутриклеточный сигнальный домен.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему белок химерного антигенного рецептора (CAR), рекомбинантному вектору, содержащему его, и клетке (в частности иммунной клетке), трансформированной указанным вектором.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к применению антитела или его функционального фрагмента для получения агента для детекции клаудина 3, агента для диагностики рака, агента для визуализации рака и агента для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к способу специфической детекции клаудина 3, способу диагностики рака, способу визуализации рака и способу специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента, нуждающегося в этом субъекту.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к применению конъюгата антитело-лекарственное средство, в котором антитело или его функциональный фрагмент связаны с лекарственным средством, для получения агента для предотвращения и лечения рака, соответственно.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к способу предотвращения и лечения рака, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором антитело или его функциональный фрагмент связаны с лекарственным средством, в качестве активного ингредиента, нуждающемуся в этом субъекту.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к применению антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, для получения агента для внутриклеточной доставки лекарственного средства.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к способу внутриклеточной доставки лекарственного средства, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, в качестве активного ингредиента, нуждающемуся в этом субъекту.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к применению функционального фрагмента антитела, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, для получения агента для предотвращения и лечения рака, и полимера антитело-лекарственное средство, с которым связано лекарственное средство.
Вариант осуществления согласно еще одному аспекту настоящего изобретения относится к способу лечения рака, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей в качестве активного ингредиента антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, и лекарственное средство, связанное с ним, нуждающемуся в этом субъекта.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
В настоящем изобретении «антитело» также называется иммуноглобулином (Ig) и является общим термином для белков, которые избирательно связываются с антигенами и вовлечены в биологический иммунитет. Все антитела, встречающиеся в природе, обычно состоят из двух пар легких цепей (LC) и тяжелых цепей (HC), которые представляют собой полипептиды из нескольких доменов или основаны на двух парах HC/LC. Существует пять типов тяжелых цепей, составляющих антитела млекопитающих, обозначенных греческими буквами α, δ, ε, γ и μ, и различные типы антител, такие как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, могут быть сконструированны в зависимости от типа тяжелой цепи. Есть два типа легких цепей, составляющих антитела млекопитающих, обозначенных символами λ и κ.
Тяжелая и легкая цепи антитела структурно разделены на вариабельные и константные области в соответствии с вариабельностью аминокислотной последовательности. Константная область тяжелой цепи состоит из трех или четырех константных областей тяжелой цепи, таких как CH1, CH2 и CH3 (антитела IgA, IgD и IgG) и CH4 (антитела IgE и IgM), в зависимости от типа антитела и легкая цепь состоит из одной константной области CL. Вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи состоят из одного домена вариабельной области тяжелой цепи (VH) или вариабельной области легкой цепи (VL), соответственно. Легкая и тяжелая цепи расположены бок о бок с каждой вариабельной и константной областями, соединены одной ковалентной дисульфидной связью, а тяжелые цепи двух молекул, связанные с легкой цепью, соединены двумя ковалентными дисульфидными связями с образованием целого антитела. Целое антитело специфически связывается с антигеном через вариабельные области тяжелых и легких цепей, и поскольку целое антитело состоит из двух пар тяжелых и легких цепей (HC/LC), целое антитело одной молекулы обладает двухвалентной моноспецифичностью и связывается с одними и теми же двумя антигенами через две вариабельные области.
Вариабельная область, включающая сайт, где антитело связывается с антигеном, подразделяется на каркасную область (FR), имеющую низкую вариабельность последовательности, и определяющий комплементарность участок (CDR), который представляет собой гипервариабельный участок с высокой вариабельностью последовательности. Каждая VH и VL имеет по три CDR и четыре FR, расположенных в порядке FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 в направлении от N-конца к C-концу. CDR с наибольшей вариабельностью последовательности в вариабельной области антитела напрямую связываются с антигеном, что наиболее важно для антигенной специфичности антитела.
В настоящем изобретении термин «аффинность» относится к силе суммарных нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном).
Если не указано иное, используемый в данном документе термин «аффинность связывания» относится к аффинности собственного связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Сродство молекулы X к ее партнеру Y в целом можно выразить константой диссоциации (Kd). В настоящем изобретении «аффинность» антитела выражена как Kd, что означает равновесную константу диссоциации взаимодействия антитело-антиген, как описано выше. Чем больше значение Kd для связывания антитела с антигеном, тем слабее аффинность связывания с конкретным антигеном. Kd или аффинность можно измерить обычными методами, известными в данной области, и, например, можно использовать измерительное устройство, такое как Surface Plasmon Resonance или Ligand Tracer Green.
В настоящем изобретении «Клаудин 3 (также обозначаемый как CLDN3)» представляет собой белок, принадлежащий к семейству клаудина, который существует в части, где возникают плотные контакты, и он присутствует в области, где возникают плотные контакты, и играет уникальную роль в удалении пространства между клетками в плотных контактах.
Плотные контакты - это жесткие структуры, которые соединяют соседние клеточные мембраны в тканях организмов, таких как животные. Клаудин 3 - структурный белок, регулирующий межклеточную проницаемость небольших растворенных веществ, таких как ионы. Клаудин 3 представляет собой белок с четырьмя трансмембранными участками и имеет структуру, при которой экспонирует две пептидные петли за пределы клетки. Из этих двух пептидных петель петля аминокислотной области, расположенной ближе к N-концу, чем во всей последовательности белка клаудина 3, называется первой внеклеточной петлей (представленной в настоящем изобретении как ECL-1 или EL1), а другая петля называется в настоящем изобретении как внеклеточная вторая петля (в настоящем изобретении обозначается как ECL-2 или EL2). Предпочтительно, внеклеточная первая петля представляет собой область, содержащую аминокислоты 27-80 аминокислотной последовательности белка клаудина 3, и вторая внеклеточная петля представляет собой область, содержащую аминокислоты 144-159 аминокислотной последовательности белка клаудина 3 (SEQ ID NO: 2).
Известно, что клаудин 3 действует как рецептор для энтеротоксина Clostridium perfringens (CPE). CPE связывается с клаудином 3 и клаудином 4, а затем образует большой комплекс, который вызывает некроз клеток, создавая пустоты в клеточной мембране.
С другой стороны, внеклеточные домены белков клаудина участвуют в образовании TJ (плотного контакта). В нормальном монослое сливающихся эпителиальных клеток клаудин 3, как полагают, присутствует в нити TJ в апикальном сайте латеральной мембраны. Предполагается, что нарушение регуляции митотического веретена во время образования эпителиальной опухоли и внеплоскостной дифференцировки опухолевых клеток вызывает аномальное расположение компонента TJ на поверхности клетки (Saeki R, et al., Potency of claudin-targeting as antitumor therapy Mol Cell Pharmacol. 2010; 2: 47-51). В связи с этим сообщалось, что белок клаудин 3 увеличивает степень уязвимости во многих раковых тканях, такие как рак яичников, рак простаты, рак груди, рак матки, рак печени, рак легких, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря и рак толстой кишки. Веб-сайт Шведского атласа белков человека (HPA) (http://www.proteinatlas.org/) доступен в качестве справочника по профилю экспрессии клаудина 3 при заболевании. Экспрессия клаудина 3 и клаудина 4 особенно высока при устойчивом к химиотерапии и/или рецидивирующем раке матки, который, как известно, имеет самый высокий уровень смертности среди гинекологических онкологических заболеваний в Соединенных Штатах. Однако все еще существует предел специфической детекции клаудина 3, экспрессируемого в опухолевом состоянии.
В настоящем изобретении, если клаудин 3 известен в данной области как клаудин 3, его конкретное биологическое происхождение и последовательность не могут быть конкретно ограничены. Например, клаудин 3 по настоящему изобретению включает: последовательность, полученную от мыши (Mus musculus) с номером доступа NCBI (Genbank) и т.д., Q9Z0G9, последовательность, полученную от крысы (Rattus norvegicus) с номером доступа NCBI (Genbank) Q63400 и др., последовательность, полученную от курицы (Gallus gallus) с номером доступа NCBI (Genbank) Q98SR2 и т.д., последовательность, полученную от собаки (Canis lupus familiaris) с номером доступа NCBI (Genbank) Q95KM5 и т.д., последовательность, полученную от обезьяны (Macaca mulatta) с номером доступа UniProtKB Entry F6RQF6 и т.д., и последовательность, полученную от человека (Homo sapiens) с номером доступа NCBI (Genbank) O15551 и т.д. (см. SEQ ID NO: 1).
И в качестве примера такого антитела и его функционального фрагмента, антитело, имеющее уникальную последовательность CDR, согласно настоящему изобретению, оказывает заметный эффект ADCC (антитело-зависимая клеточная цитотоксичность) на клетки, экспрессирующие клаудин 3, и само по себе обладает противораковым действием. Кроме того, оно обладает превосходной способностью специфически нацеливаться только на клаудин 3 без перекрестной реактивности с другими семействами клаудина, проявляет прекрасную связывающую способность (аффинность) по сравнению с известным антителом к клаудину 3. Было также подтверждено, что оно обладает способностью интернализироваться клетками, поэтому оно отлично выполняет функции диагностики, визуализации и доставки лекарств при раке. В частности, антитела и их функциональные фрагменты по настоящему изобретению специфически прикрепляются к области ECL-2 клаудина 3, и, таким образом, клаудин 3 образует неполное соединение, в отличие от нормальных тканей, поверхность которых не подвергается воздействию. Антитело настоящего изобретения (или его функциональный фрагмент) является избирательно доступным, и эта способность значительно снижает проблему токсичности противоопухолевых препаратов против нормальных клеток и имеет большее техническое значение.
В частности, настоящее изобретение относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащему вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащие следующие последовательности CDR:
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (VH-CDR1), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 3, определяющий комплементарность участок 2 тяжелой цепи (VH-CDR2), содержащий аминокислотную последовательность, определенную SEQ ID NO: 4, и определяющий комплементарность участок 3 тяжелой цепи (VH-CDR3), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (VL-CDR1), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 6, определяющий комплементарность участок 2 легкой цепи (VL-CDR2), содержащий определенную аминокислотную последовательность в SEQ ID NO: 7, и определяющий комплементарность участок 3 легкой цепи (VL-CDR3), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 8.
В частности, настоящее изобретение относится к антителу или его функциональному фрагменту, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, содержащих следующие последовательности CDR:
определяющий комплементарность участок 1 тяжелой цепи (VH-CDR1), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 18, определяющий комплементарность участок 2 тяжелой цепи (VH-CDR2), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 19, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющий комплементарность участок 3 тяжелой цепи (VH-CDR3), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO 20, и
определяющий комплементарность участок 1 легкой цепи (VL-CDR1), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 21, определяющий комплементарность участок 2 легкой цепи (VL-CDR2), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 22, и вариабельную область легкой цепи, содержащую определяющий комплементарность участок 3 легкой цепи (VL-CDR3), содержащий аминокислотную последовательность, определенную в SEQ ID NO: 23.
Тип антитела согласно настоящему изобретению не ограничен, если он имеет комбинацию вышеупомянутых CDR. В частности, он может быть выбран из группы, состоящей из IgG, IgA, IgM, IgE и IgD, и особенно предпочтительно антитела IgG. IgG как его подтип включает, но не ограничивается, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и т. п. Кроме того, это может быть моноклональное антитело, полученное из одной B-клетки, или поликлональное антитело, полученное из нескольких B-клеток, но предпочтительно, чтобы антитело представляло собой моноклональное антитело, которое представляет собой группу антител, чьи аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи практически одинаковы. Кроме того, антитело или его фрагмент по настоящему изобретению можно конъюгировать с ферментом, флуоресцентным веществом, радиоактивным веществом и белком, но не ограничиваясь этим.
Антитело по настоящему изобретению может быть получено от любого животного, включая млекопитающих, включая людей, птиц и т. п., предпочтительно от человека, или от вида, отличного от антитела человеческого происхождения. Это может быть химерное антитело, содержащее часть антитела, полученного от животного.
В настоящем изобретении функциональный фрагмент антитела относится к фрагменту, который сохраняет антиген-специфическую связывающую способность всего антитела, и, в частности, он может быть в форме Fab, F (ab'), F (ab')2, Fv, scFv, диатело или dsFv.
Fab (антигенсвязывающий фрагмент) представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела и состоит из одного вариабельного домена и константного домена каждой из тяжелой и легкой цепей. F(ab')2 представляет собой фрагмент, полученный гидролизом антитела пепсином, и два Fab связаны дисульфидной связью в шарнирной области тяжелой цепи. F(ab') представляет собой фрагмент мономерного антитела, в котором шарнирная область тяжелой цепи добавлена к Fab, разделенному восстановлением дисульфидной связи фрагмента F(ab')2. Fv (вариабельный фрагмент) представляет собой фрагмент антитела, состоящий только из вариабельных областей каждой из тяжелой и легкой цепей. Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) представляет собой фрагмент рекомбинантного антитела, в котором вариабельная область тяжелой цепи (VH) и вариабельная область легкой цепи (VL) соединены гибким пептидным линкером. Диатело относится к фрагменту, в котором VH и VL scFv соединены очень коротким линкером, так что они не могут быть связаны друг с другом и образовывать димер путем связывания с VL и VH другого scFv того же типа, соответственно. dsFv относится к полипептиду, полученному заменой остатка цистеина на один из аминокислотных остатков VH и VL через связь S-S между остатками цистеина. Аминокислотные остатки, замещенные остатками цистеина, могут быть выбраны на основе предсказания конформационной структуры антитела в соответствии с методом, описанным Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
Антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению специфически связываются с клаудином 3 и, в частности, характеризуются тем, что они интернализуются внутрь клетки за счет специфического присоединения к внеклеточной петле 2 (ECL-2) клаудина 3 с очень высокой аффинностью.
Конкретное биологическое происхождение клаудина 3 особо не ограничено, поскольку он известен в данной области как клаудин 3 и включает, например, клаудины, которые получены от мышей, людей, крыс, кур, собак или обезьян, как описано выше. Предпочтительно, это может означать клаудины, полученные от человека, и ECL-2 человеческого клаудина 3 предпочтительно включает аминокислотную последовательность, определенную SEQ ID NO: 2.
В варианте осуществления настоящего изобретения было подтверждено, что антитело по настоящему изобретению не обладает перекрестной реактивностью с другим семейством клаудина, имеющим высокую филогенетическую связь с клаудином 3, и, таким образом, доказано, что специфичность связывания антитела по настоящему изобретению очень хорошая. Этот высокий уровень специфичности связывания очень важен, поскольку информация с высокой точностью может быть получена путем детекции клаудина 3 (особенно человеческого клаудина 3) и использования его для диагностики и визуализации конкретных заболеваний (особенно заболеваний, характеризующихся аномальной (избыточной) экспрессией клаудина 3).
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает композицию и набор для детекции клаудина 3, содержащие антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу специфической детекции клаудина 3, включающему: (1) контактирование антитела или его функционального фрагмента по настоящему изобретению с образцом, и (2) детекцию антитела или его функционального фрагмента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции и набору для детекции клаудина 3, состоящим из антитела или его функционального фрагмента.
Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции и набору для детекции клаудина 3, состоящим по существу из антитела или его функционального фрагмента.
18
123
, 124
125
32
35
67
Антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению могут быть представлены в помеченном состоянии для облегчения идентификации для связывания с клаудином 3, детекции и количественного определения клаудина 3. Таким образом, его можно обеспечить путем связывания с детектируемой меткой (например, ковалентно связанной или поперечно связанной). Детектируемая метка включает в себя, но не ограничивается ими, хромогенные ферменты (например, пероксидазу, щелочную фосфатазу), радиоактивные изотопы (например, F, II, I, P, S, Ga), хромофор, люминесцентный материал или флуоресцентный материал (например, FITC, RITC, флуоресцентный белок (GFP); EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок), RFP (красный флуоресцентный белок)); DsRed (красный флуоресцентный белок Discosoma sp.); CFP (голубой флуоресцентный белок), CGFP (голубой, зеленый флуоресцентный белок), YFP (желтый флуоресцентный белок), Cy3, Cy5 и Cy7.5), материалы для магнитно-резонансной томографии (например, гадолиний (Gd, гадолиний), суперпарамагнитные частицы)) или сверхсверхпарамагнитные частицы).
Антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению могут быть представлены в виде набора для детекции или диагностического набора для выполнения диагностического анализа, и в этом случае с реагентами, упакованными в заранее определенном количестве вместе с инструкцией по эксплуатации. Когда антитело помечено ферментом, набор может содержать кофактор, необходимый ферменту в качестве предшественника субстрата, обеспечивающего субстрат, и хромофор или флуорофор. Кроме того, могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы и буферы (например, блокирующий буфер или буфер для лизиса). Относительные количества различных реагентов можно широко варьировать, чтобы обеспечить концентрацию реагента в растворе, которая в достаточной степени оптимизирует чувствительность анализа.
Реагенты могут быть представлены в виде, как правило, лиофилизированного сухого порошка, содержащего наполнители, которые при растворении будут обеспечивать раствор реагента, имеющий подходящую концентрацию.
Набор включает в себя вестерн-блот анализ, ELISA (иммуноферментный анализ), радиоиммуноанализ, метод радиоактивной иммунодиффузии, метод иммунодиффузии Оухтерлони, ракетный иммуноэлектрофорез, иммуноокрашивание тканей, анализ иммунопреципитации, анализ связывания комплемента, проточную цитометрию (FACS) и анализ белковых чипов, и реагенты, вспомогательные вещества, контейнеры и твердые подложки, предоставленные вместе в соответствии с каждым методом анализа, хорошо известным в данной области.
В соответствии со способом, специфичным для детекции клаудина 3, специалист в данной области может измерить присутствие или отсутствие и концентрацию белка клаудина 3, присутствующего (или включенного) в образце. В данном контексте детекция включает количественный и/или качественный анализ, а также обнаружение присутствия и отсутствия и измерение концентрации, и такие методы известны в данной области, и специалисты в данной области смогут выбрать подходящий метод для осуществления настоящей заявки.
Перед этапом (1) специалист в данной области может соответствующим образом выбрать известный метод детекции белка с использованием антитела или его функционального фрагмента и подготовить образец, подходящий для выбранного метода.
Кроме того, образцы могут быть клетками или тканями, цельной кровью (кровью), сывороткой, плазмой, слюной, спинномозговой жидкостью и т.д., полученными путем биопсии, взятой у субъекта, которому необходимо диагностировать заболевание (например, рак), характеризующееся аномальной (сверх)экспрессией клаудина 3, но не ограничиваясь этим.
Способ детекции белка с использованием антитела включает, например, вестерн-блот, иммуноблот, дот-блот, иммуногистохимическое окрашивание, иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ, анализ конкурентного связывания, иммунопреципитацию и т.д., но не ограничивается этим. Например, для иммуногистохимического окрашивания может проводиться предварительная обработка, такая как фиксация и блокировка срезов клеток или тканей.
Затем, на этапе (1), антитело или его функциональный фрагмент согласно настоящему изобретению приводят в контакт с образцом, полученным, как описано выше. При контакте образуется комплекс антиген (клаудин 3) - антитело.
На этапе (2) наличие или отсутствие белка клаудина 3 в образце и его уровень измеряют путем детекции комплекса антиген-антитело, образующегося в образце. Как описано выше, антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению, используемое для детекции, может быть представлено в меченом состоянии, и в этом случае метка может быть обнаружена немедленно. В противном случае можно использовать отдельно меченное вторичное антитело. Вторичное антитело представляет собой антитело, которое связывается с Fc-областью первичного антитела (в данном случае с антителом или его функциональным фрагментом по настоящему изобретению), и использование таких вторичных антител хорошо известно в данной области.
Способ детекции с помощью метки широко известен в данной области техники, но может быть выполнен, например, следующим образом. Если в качестве определяемой метки используется флуоресцентное вещество, можно использовать иммунофлуоресцентное окрашивание. Например, после реакции с пептидом по настоящему изобретению, меченного флуоресцентным веществом, с образцом и удаления несвязанных или неспецифических продуктов связывания флуоресценцию пептида можно наблюдать под флуоресцентным микроскопом. Кроме того, когда ферменты (например, люцифераза, пероксидаза, галактозидаза и т.д.) используют в качестве детектируемых меток, поглощение измеряют по цветовой реакции субстрата посредством ферментативной реакции, а в случае радиоактивных веществ это может быть выполнено с помощью измерения количества испускаемого излучения (например, с помощью сцинтилляционного счетчика). Кроме того, антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению получают в форме, конъюгированной с биотином, и могут быть обнаружены путем взаимодействия с соответствующим образом меченным стрептавидином. Кроме того, результат детекции может быть отображен в соответствии с известным методом визуализации с помощью детекционной метки.
Соответственно, антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению можно использовать для диагностики и визуализации заболеваний, характеризующихся (сверх)экспрессией клаудина 3. Диагностика и визуализация согласно настоящему изобретению возможна в отношении такого типа заболевания, для которого в данной области известно, что оно сопровождается аномальной экспрессией (особенно сверхэкспрессию) клаудина 3, при этом тип заболевания особо не ограничен, но предпочтительно представляет собой рак. Соответственно, настоящее изобретение относится к композиции для диагностики рака и композиции для визуализации рака, содержащей антитело по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента.
Оно также относится к композиции для диагностики рака и композиции для визуализации рака, состоящей из антитела по настоящему изобретению или его функционального фрагмента.
Кроме того, изобретение относится к композиции для диагностики рака и композиции для визуализации рака, состоящей по существу из антитела или его функционального фрагмента по настоящему изобретению.
В настоящей заявке тип рака (опухоли) особо не ограничивается, но предпочтительно может быть типом рака, сверхэкспрессирующим клаудин 3 по сравнению с нормальным состоянием, более предпочтительно эпителиальным раком, и конкретные примеры включают, но не ограничиваются ими, рак яичников, рак толстой кишки, рак мочевого пузыря, рак легкого, рак печени, рак желудка, рак пищевода, рак молочной железы, рак простаты, рак поджелудочной железы, рак матки, рак шейки матки или меланому.
Кроме того, антитело или его фрагмент по настоящему изобретению имеет очень высокую специфичность связывания с клаудином 3, как описано выше, и характеризуется тем, что интернализируется в клетки после связывания с клаудином 3 (особенно, ECL-2). Эта способность проникать в клетки дает большое преимущество при разработке конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), и известно, что для того, чтобы ADC продемонстрировали превосходную лекарственную эффективность, ADC должны проникать в клетки (интернализация).
В настоящем изобретении интернализация означает, что они проникают (проходят) внутрь клетки, и тип или вид интернализации особо не ограничен, но, например, это может быть эндоцитоз.
Соответственно, настоящее изобретение относится к композиции для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, содержащую антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению, описанные выше, в качестве активного ингредиента.
Кроме того, оно обеспечивает композицию для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, состоящую из антитела или его функционального фрагмента по настоящему изобретению, описанного выше.
Кроме того, оно обеспечивает композицию для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, состоящую по существу из антитела или его функционального фрагмента по настоящему изобретению, описанного выше.
В частности, настоящее изобретение обеспечивает конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором лекарственное средство связано с описанным выше антителом или его функциональным фрагментом. Кроме того, оно обеспечивает композицию для предотвращения и лечения рака, содержащую антитело или его функциональный фрагмент и связанное с ним лекарственное средство в качестве активного ингредиента.
В настоящем изобретении термин «конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC)» относится к конъюгату, в котором антитело (или его функциональный фрагмент) по настоящему изобретению и лекарственное средство связаны, и может также называться иммуноконъюгатом. Конъюгат антитело-лекарственное средство можно получить с использованием различных методов, известных в данной области.
Конъюгат антитело-лекарственное средство может представлять собой конъюгат, в котором две молекулы связаны напрямую, или косвенно две молекулы связаны любыми средствами, такими как линкер. Линкер может быть нерасщепляемым линкером или расщепляемым линкером. В общем, известно, что ADC идеально сконструирован для непрямого связывания с помощью таких средств, как линкер, а затем лекарственное средство может расщепляться внутри клеток-мишеней. Линкер может быть расщеплен расщепляющим агентом, присутствующим во внутриклеточной среде, например лизосомами или эндосомами, и может быть пептидным линкером, расщепляемым расщепляющим агентом, например, внутриклеточной пептидазой или протеазными ферментами (например, протеазами лизосомы или эндосомы). Обычно пептидный линкер имеет длину по меньшей мере 2 или более аминокислот. Например, расщепляемый линкер чувствителен к pH и может быть чувствительным к гидролизу при определенном значении pH. В общем, указано, что чувствительный к pH линкер может быть гидролизован в кислых условиях. Например, кислотонеустойчивые линкеры, которые могут быть гидролизованы в лизосомах, могут представлять собой, например, гидразон, семикарбазон, тиосемикарбазон, цис-аконитовый амид, сложный ортоэфир, ацеталь и кеталь. В качестве другого примера линкер может быть расщеплен в восстанавливающих условиях, например, ему может соответствовать дисульфидный линкер. Различные дисульфидные связи могут быть образованы с использованием SATA (N-сукцинимидил-S-ацетилтиоацетат), SPDP (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат), SPDB (N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)бутират) и SMPT (N-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)толуол).
Лекарственное средство и/или лекарственное средство-линкер можно случайным образом конъюгировать через лизин антитела или можно конъюгировать через цистеин, экспонируемый при восстановлении цепи дисульфидной связи. В некоторых случаях линкер-лекарственное средство могут быть связаны с помощью генно-инженерной метки, например цистеина, присутствующего в пептиде или белке. Пептид или белок имеют делецию на карбоксиконце пептида или белка или присоединяются через ковалентную связь спейсерной единицы к карбокси (С) концу пептида или белка.
В настоящем изобретении «лекарственное средство» может повышать эффективность самого терапевтического антитела за счет связывания с антителом по настоящему изобретению, или увеличивать период полужизни антитела в крови, или достигать места, на которое нацелено антитело, и включает без ограничения вещества, которые можно использовать для лечения заболеваний путем достижения целевого места антитела и уничтожения рака в мишени. Примеры включают цитотоксические лекарственные средства, токсины, цитокины, хемокины, антибиотики, ферменты, такие как нуклеазы, радионуклиды, фотосенсибилизаторы, фототермические наноматериалы, наночастицы и мицеллы, но не ограничиваются ими.
В настоящем изобретении лекарственное средство может быть соединено (связано) с антителом непосредственно или опосредованно известным методом. Кроме того, лекарственное средство, связанное с антителом, можно применять в конкретной форме на носителе (например, во всех формах, нанесенных на мицеллы, наночастицы, липосомы или дендримеры).
Цитотоксическое лекарственное средство относится к лекарственному средству, которое можно использовать для лечения заболевания. Например, в качестве лекарственного средства (противоракового агента), обладающего противораковой активностью, существуют ингибиторы формирования структуры микротубулина, ингибиторы мейоза, ингибиторы топоизомеразы или интеркаляторы ДНК. Цитотоксические лекарственные средства включают майтансиноид, ауристатин, доластатин, трихотецен, лекарственное средство CC-1065 (NSC 298223), калихеамицин, энедиины, таксан, антрациклин, метотрексат, адриамицин, виндезин, алкалоид винка, доксорубицин, мельфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин, дауномицин, этопозид, тенипозид, карминомицин, аминоптерин, дактиномицин, блеомицин, эсперамицин, 5-фторурацил, мельфалан, иприт азота (мехлоретамин HCL), цисплатин и его аналоги, цисплатин, CPT-11, доцетаксел, монометил ауристатин E, монометил ауристатин F, или эмтансин, DM, но не ограничиваются ими.
В настоящем изобретении термин «токсин» относится к лекарственному средству, обладающему токсичностью, продуцируемому организмом, и его тип особо не ограничивается, но включает фитотоксин, токсин животного происхождения, внебактериальный токсин или бактериальный токсин.
Как описано выше, антитело по настоящему изобретению не только обладает очень высокой специфичностью связывания с клаудином 3, но также обладает замечательным цитотоксическим действием за счет ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) после того, как само антитело связывается с клаудином 3.
Это хорошо показано в одном из вариантов в описании настоящего изобретения. Следовательно, настоящее изобретение обеспечивает композицию для предотвращения и лечения рака, содержащую антитело по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента.
Кроме того, оно обеспечивает композицию для профилактики и лечения рака, состоящую из антитела по настоящему изобретению.
Кроме того, оно обеспечивает композицию для профилактики и лечения рака, состоящую по существу из антитела по настоящему изобретению.
Антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) известна как один из механизмов уничтожения раковых клеток естественными клетками-киллерами.
NK-клетки экспрессируют CD16, рецептор Fc иммуноглобулина G (IgG), и через этот рецептор могут быть выполнены другие формы уничтожения, не ограниченного MHC. То есть ADCC NK-клеток зависит от наличия антитела, распознающего клетку-мишень. Когда антитело связывается с антигеном, область Fc антитела подвергается воздействию, и когда экспонированная область Fc связывается с рецептором NK-клеток, образуя мостик, цитотоксические вещества высвобождаются из NK-клеток посредством передачи сигнала, вызванного связыванием рецептора, что приводит к повреждению клеток-мишеней.
Как описано выше, поскольку антитело по настоящему изобретению само по себе обладает противораковым действием, оно проявляет замечательный синергетический эффект, когда антитело вводится вместе с противораковым активным лекарственным средством (особенно в форме ADC).
Настоящее изобретение также обеспечивает полинуклеотид, кодирующий антитело или его функциональный фрагмент.
Полинуклеотид, кодирующий антитело или его функциональный фрагмент, особо не ограничен комбинацией оснований, если он может кодировать антитело или его фрагмент, имеющие описанную выше конфигурацию CDR.
Когда аминокислотная последовательность идентифицирована, методы получения полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность, на основе информации о кодонах, известной в данной области техники, хорошо известны в данной области.
Полинуклеотид может быть представлен в виде одноцепочечной или двухцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, включая все последовательности ДНК, кДНК и РНК.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает рекомбинантный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению.
В настоящем изобретении термин «рекомбинантный» может использоваться взаимозаменяемо с термином «генетическая манипуляция» и относится к производству гена в форме, которая не существует в естественном состоянии, с использованием экспериментальных методов молекулярного клонирования, таких как модификация, разрезание и связывание генов.
В настоящем изобретении термин «экспрессия» означает, что белок или нуклеиновая кислота продуцируется в клетке.
В настоящем изобретении «рекомбинантный вектор экспрессии» представляет собой вектор, способный экспрессировать представляющие интерес белок или нуклеиновую кислоту (РНК) в подходящей клетке-хозяине, и относится к генетической конструкции, содержащей основные регуляторные элементы, функционально связанные таким образом, что полинуклеотидная вставка (ген) может быть экспрессирована. Термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты, и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей интересующий белок или РНК, для выполнения общей функции, и означает, что ген связан для экспрессии с помощью последовательности контроля экспрессии. Оперативная связь с рекомбинантным вектором может быть получена с использованием методов генной рекомбинации, хорошо известных в данной области, и для сайт-специфического расщепления и связывания ДНК используются ферменты, обычно известные в данной области. «Последовательность контроля экспрессии» относится к последовательности ДНК, которая контролирует экспрессию полинуклеотидной последовательности, функционально связанной в конкретной клетке-хозяине. Такие регуляторные последовательности включают промоторы для осуществления транскрипции, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательности, кодирующие подходящие сайты связывания рибосом мРНК, последовательности, регулирующие терминацию транскрипции и трансляции, кодон инициации, стоп-кодон, сигналы полиаденилирования и энхансеры. Промотор вектора может быть конститутивным или индуцибельным. Функционально связанная последовательность гена и последовательность контроля экспрессии могут быть включены в один вектор экспрессии, который включает маркер отбора и/или точку начала репликации для выбора клетки-хозяина, содержащей вектор. Кроме того, вектор экспрессии включает сигнальную последовательность или лидерную последовательность для нацеливания на мембрану или секреции, если необходимо, и может быть получен различными способами в соответствии с целью.
Могут использоваться сигнальные последовательности PhoA и сигнальная последовательность OmpA, когда хозяином являются бактерии Escherichia, сигнальная последовательность α-амилазы и сигнальная последовательность субтилизина, когда хозяином является бактерия Bacillus, сигнальная последовательность MFα и сигнальная последовательность SUC2, когда хозяином являются дрожжи, сигнальная последовательность инсулина, сигнальная последовательность α-интерферона, сигнальная последовательность молекулы антитела, когда хозяином является клетка животного, но не ограничиваются этим.
Тип рекомбинантного вектора экспрессии по настоящему изобретению особо не ограничивается, если это вектор, обычно используемый в области клонирования, и его примеры включают, но не ограничиваются ими, плазмидный вектор, космидный вектор, вектор бактериофага и вирусный вектор. Плазмиды включают плазмиды, полученные из E. coli (pBR322, pBR325, pUC118 и pUC119, pET-22b (+)), плазмиды, полученные из Bacillus subtilis (pUB110 и pTP5), и плазмиды дрожжевого происхождения (YEp13, YEp24 и YCp50). В качестве вируса можно использовать вирусы животных, такие как ретровирус, аденовирус или вирус осповакцины, и вирус насекомых, такой как бакуловирус, и плазмидную ДНК для клонирования (pcDNA).
В настоящем изобретении рекомбинантный вектор включает полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела или его функциональный фрагмент; полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела или его функциональный фрагмент, может быть предоставлен в форме одновременного включения (вставки) в один вектор или может быть предоставлен путем включения (вставки) каждого в два (включая разные типы) вектора.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает трансформированную с клетку рекомбинантным вектором экспрессии, содержащим полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению.
В настоящем изобретении термин «клетка-хозяин» относится к прокариотической или эукариотической клетке, содержащей гетерологичную ДНК, введенную в клетку любым способом (примеры: метод электрошока, метод преципитации фосфатазы кальция, метод микроинъекции, метод трансформации, вирусная инфекция и т.д.).
Тип клетки (клетки-хозяина) по настоящему изобретению особо не ограничивается до тех пор, пока его можно использовать для экспрессии полинуклеотида, кодирующего антитело или его фрагмент, содержащегося в рекомбинантном векторе экспрессии по настоящему изобретению. Трансформированные клетки (клетки-хозяева) с рекомбинантным вектором экспрессии согласно настоящему изобретению могут быть прокариотами (например, E. coli), эукариотами (например, дрожжи или другие грибы), растительными клетками (например, клетками растений табака или томата), животными клетки (например, клетками человека, клетками обезьяны, клетками хомяка, клетками крысы и клетками мыши), клетками насекомых или полученными из них гибридомами. Предпочтительно, это может быть клетка, полученная от млекопитающих, включая человека.
В качестве более конкретного примера прокариоты представляют собой грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Enterobacteriaceae, например, Escherichia, например, E. Coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans, and Shigella, and B. subtilis and B. licheniformis, Pseudomonas, например, P. aeruginosa and Streptomyces. Клетки по настоящему изобретению могут не иметь особых ограничений при условии, что они способны экспрессировать вектор по настоящему изобретению, предпочтительно E. coli, но не ограничиваются этим, например E. coli ER2537, E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (ATCC 27325) или E. coli, экспрессирующая LacZ, и более предпочтительно E. coli ER2537. В качестве клетки настоящего изобретения Saccharomyces cerevisiae чаще всего используется у эукариот. Однако многие другие роды, виды и штаммы, но не ограничиваются ими, например, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces-хоязин, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. ickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophi larum (ATCC 36,906), K. thermotolerans и K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, например, Schwanniomyces occidentalis; и нитчатые грибы, например, Neurospora crassa, Penicillium, Tolypocladium и Aspergillus-хозяин, например, A. nidulans и A. niger.
F
F
Между тем клетка по настоящему изобретению может быть клеткой животного, в частности клеткой позвоночного. Размножение клеток позвоночных в культуре (культуре ткани) стало обычным методом, и методики широко доступны. Примерами полезных клеток-хозяев млекопитающих, но не ограничиваясь ими, могут быть линии CV1 почки обезьяны, трансформированные SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), линии эмбриональной почки человека (клетки 293 или 293, субклонированные из суспензионной культуры) [Graham et al., 1977, J Gen Virol. 36: 59]), клетки почек детенышей хомячка (BHK, ATCC CCL10), клетки яичников китайского хомячка/-DHFR" (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; например, DG44), клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, 1980, Biol. eprod. 23: 243-251), клетки почек обезьяны (CV1 ATCC CCL 70), клетки почек африканских зеленых мартышек (VERO-76, ATCC CRL-1587), клетки рака шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2), клетки почек собаки (MDCK, ATCC CCL 34), гепатоциты буйволовой крысы (BRL 3A, ATCC CRL 1442), клетки легких человека (W138, ATCC CCL 75), гепатоциты человека (Hep G2, HB 8065), опухоль молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51), Клетки TRI (Mather et al., 1982, Annals NY. Acad. Sci. 383: 44-68), клетки MRC 5, клетки FS4, линии клеток рака печени человека (Hep G2) - клетки HEK 293 (клетки эмбриональной почки человека) и клетки Expi293™, предпочтительно клетки CHO, клетки HEK 293 (клетки эмбриональной почки человека) или клетки Expi293™. Поскольку уровень экспрессии и модификация белка различаются в зависимости от клетки-хозяина, специалист в данной области может выбрать и использовать наиболее подходящую клетку-хозяина для этой цели. В одном варианте настоящего изобретения были использованы клетки яичника китайского хомяка (СНО)-S.
Трансформация включает любой метод введения нуклеиновой кислоты (полинуклеотида, кодирующего антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению) в организм, клетку, ткань или орган. Как известно в данной области, это может быть выполнено путем выбора подходящей стандартной методики в соответствии с клеткой-хозяином. Эти методы включают электропорацию, слияние протоплазмы, осаждение фосфатом кальция (CaPO4), осаждение хлоридом кальция (CaCl2), нитевидные кристаллы карбида кремния, обработку ультразвуком, опосредованную агробактериями трансформацию, осаждение PEG (полиэтиленгликоль), сульфат декстрана, липофектамин, тепловой шок, бомбардировку микрочастицами, но не ограничиваются ими.
Клетка включает полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела или его функциональный фрагмент, и рекомбинантный вектор, предоставленный в форме, в которой полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь или ее функциональный фрагмент, одновременно включен (вставлен) в один вектор, может быть введен, или может быть введено множество рекомбинантных векторов, предоставленных в форме, в которой полинуклеотиды включены (вставлены) по-отдельности в каждый из двух векторов, могут быть введены в одну клетку или множество клеток. Трансформированные клетки с рекомбинантным вектором экспрессии согласно настоящему изобретению продуцируют тяжелую цепь, легкую цепь или их функциональный фрагмент антитела согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также относится к способу получения антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с белком клаудином 3, причем способ включает:
получение полипептида, содержащего легкую цепь и вариабельную область тяжелой цепи, с помощью трансформированных клеток (в условиях, в которых экспрессируется полинуклеотид), и
выделение полипептида из клетки или культуральной среды, в которой культивируется клетка.
Стадия (а) заключается в получении полипептида тяжелой цепи, легкой цепи или функционального фрагмента антитела согласно настоящему изобретению из рекомбинантного вектора экспрессии, введенного в клетку-хозяина, путем культивирования трансформированной клетки-хозяина. Состав среды для культивирования клеток-хозяев, условия культивирования и время культивирования могут быть подходящим образом выбраны в соответствии с методами, обычно используемыми в данной области. Например, коммерчески доступная среда, такая как Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, МO), минимально необходимая среда (MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.) и среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM, Sigma-Aldrich Co.), может быть подходящей для культивирования клеток, но не ограничивается этим. Гормоны и/или другие факторы роста, соли, буферы, нуклеотиды, антибиотики, микроэлементы и глюкоза или эквивалентная энергия при необходимости источник может быть добавлен в среду.
Молекулы антител, продуцируемые в клетках-хозяевах, могут накапливаться в цитоплазме клетки, секретироваться вне клетки или культуральной среды с помощью соответствующей сигнальной последовательности или нацеливаться на периплазму. Это понятно со ссылкой на вышеизложенное.
Кроме того, предпочтительно, чтобы антитело согласно настоящему изобретению было преобразовано в белок и имело функциональную структуру (конформацию) с использованием способа, известного в данной области, чтобы поддерживать специфичность связывания клаудина 3 (особенно ECL-2). Кроме того, при продуцировании антитела IgG типа тяжелая и легкая цепи могут экспрессироваться в отдельных клетках, и тяжелая и легкая цепи могут контактировать на отдельной стадии с образованием полного антитела, а также возможно получение тяжелых цепей и легких цепей, экспрессируемых в одной и той же клетке, с образованием полного антитела внутри клетки.
Стадия (b) - получение антитела или его фрагмента, продуцируемого в клетке-хозяине.
Принимая во внимание характеристики антитела или полипептида функционального фрагмента, продуцируемого в клетке-хозяине, характеристики клетки-хозяина, метод экспрессии или то, является ли полипептид нацеленным, специалист в данной области может соответствующим образом выбрать и скорректировать способ получения. Например, антитело или его фрагмент, секретируемые в культуральную среду, можно выделить таким способом, как получение культуральной среды, в которой клетки-хозяева культивируются, и центрифугирование для удаления примесей. При необходимости клетки можно лизировать в степени, которая не влияет на функциональную структуру антитела или его функционального фрагмента, чтобы высвободить и выделить антитело, присутствующее в конкретной органелле или цитоплазме внутри клетки. Кроме того, полученное антитело можно дополнительно подвергнуть процессу дальнейшего удаления и концентрирования примесей с помощью такого метода, как хроматография, фильтрация или диализ.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать антитело, его функциональный фрагмент по настоящему изобретению или ADC, содержащий то же самое, или может быть составлена в подходящей форме с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, и она может дополнительно содержать вспомогательные вещества или разбавитель. Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксичной композиции, которая является физиологически приемлемой и не вызывает аллергических реакций или подобных реакций, таких как желудочно-кишечные расстройства и головокружение, при введении людям.
Фармацевтически приемлемый носитель может дополнительно включать, например, носитель для перорального введения или носитель для парентерального введения.
Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно включать, например, носители для перорального введения или носители для парентерального введения. Носители для перорального введения могут включать лактозу, крахмал, производные целлюлозы, стеарат магния и стеариновую кислоту. Кроме того, композиция может включать различные материалы для доставки лекарственных средств, используемые для перорального введения пептидного агента. Кроме того, носители для парентерального введения могут включать воду, подходящие масла, физиологический раствор, водную глюкозу и гликоли и, кроме того, включать стабилизаторы и консерванты. Подходящие стабилизаторы включают антиоксиданты, такие как гидросульфит натрия, сульфит натрия или аскорбиновая кислота. Подходящие консерванты включают хлорид бензалкония, метил- или пропилпарабены и хлорбутанол.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать лубрикант, увлажнитель, подсластитель, ароматизатор, эмульгатор и суспендирующий агент в дополнение к вышеуказанным компонентам.
Другие фармацевтически приемлемые носители и препараты могут относиться ко всем типам, известным в данной области.
Композицию по настоящему изобретению можно вводить млекопитающим, включая человека, любым способом. Например, ее можно вводить перорально или парентерально.
В частности, способ введения композиции по настоящему изобретению может представлять собой известный способ введения антитела, например, инъекцию или инфузию внутривенным, внутрибрюшинным, внутричерепным, подкожным, внутримышечным, внутриглазным, внутриартериальным, цереброспинальным или внутриочаговым путем или инъекция или инфузия с помощью системы замедленного высвобождения, описанной ниже. Например, антитело по настоящему изобретению можно вводить системно или местно.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составлена в виде агента для перорального или парентерального введения в соответствии со способом введения, как описано выше.
В фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению антитело, его функциональный фрагмент или ADC, содержащий его, можно вводить в различных пероральных и парентеральных составах во время клинического введения. Когда композиция составлена, она может быть приготовлена с использованием разбавителя или эксципиента, такого как наполнитель, разбавитель, связующее, смачивающий агент, разрыхлитель или поверхностно-активное вещество, которые обычно используются. Твердые составы для перорального введения включают таблетку, пилюлю, порошок, гранулы, капсулу, пасту и тому подобное. Эти твердые композиции могут быть приготовлены путем смешивания по меньшей мере одного вспомогательного вещества, например крахмала, карбоната кальция, сахарозы или лактозы или желатина. Кроме того, помимо простых вспомогательных веществ могут использоваться смазывающие вещества, такие как стеарат магния и тальк. Жидкие составы для перорального введения включают суспензию, раствор для внутреннего применения, эмульсию и сироп. Помимо часто используемых простых разбавителей, таких как вода и жидкий парафин, в жидких составах могут содержаться несколько вспомогательных веществ, например, увлажняющий агент, подсластитель, ароматизатор и консервант.
Агенты для парентерального введения включают стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензии, эмульсии, лиофилизированные агенты и суппозитории.
Терапевтические композиции по изобретению могут быть приготовлены в форме лиофилизированной лепешки или водного раствора для хранения после смешивания любого физиологически приемлемого носителя, вспомогательного вещества или стабилизатора с антителом, имеющим желаемую чистоту. Приемлемые носители, вспомогательного вещества или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают полные растворы, такие как фосфорная кислота, лимонная кислота и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; полипептиды с низкой молекулярной массой (менее примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпиридон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахарные спирты, такие как маннит или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и (или) неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как твин, плюроники или полиэтиленгликоль (PEG).
Агенты для парентерального введения могут быть приготовлены способами, известными в данной области, в виде инъекций, кремов, лосьонов, препаратов для наружного применения, масел, увлажняющих средств, гелей, аэрозолей и назальных ингаляторов. Эти составы описаны в формулах, обычно известных для всей фармацевтической химии.
В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция может быть доставлена с помощью интраназального спрея, ингаляции и/или других аэрозольных средств доставки. Способы прямой доставки генов, полинуклеотидов и пептидных композиций в легкие с помощью интраназального аэрозольного спрея можно отнести, например, к методам, описанным в патенте США № 5,756,353 и патенте США № 5,804,212.
Общее эффективное количество антитела или его функционального фрагмента по настоящему изобретению можно вводить в виде разовой дозы или можно вводить по протоколу фракционированного лечения, в котором несколько доз вводят в течение длительного времени. Они также могут варьироваться по дозировке при применении в виде ADC. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может варьировать содержание активного ингредиента (антитела или его функционального фрагмента по настоящему изобретению) в зависимости от степени и/или цели заболевания, но может вводиться повторно несколько раз через равные промежутки времени при эффективной дозе обычно от 0,01 мг/кг/день до 1000 мг/кг/день, предпочтительно от 0,1 мг/кг/день до 100 мг/кг/день и более предпочтительно от 1 мг/кг/день до 20 мг/кг/день. Однако дозировка фармацевтической композиции определяется с учетом различных факторов, таких как способ получения, путь введения и частота лечения, а также различных факторов, таких как возраст пациента, вес, состояние здоровья, пол, тяжесть заболевания, диета и скорость выведения. Ввиду этого средний специалист в данной области сможет определить подходящую эффективную дозировку композиций по настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению конкретно не ограничивается ее составом, путем введения и способом введения, поскольку показан эффект настоящего изобретения.
Как описано выше, антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению характеризуется уникальной конфигурацией CDR, как описано выше, и, таким образом, имеет превосходную специфичность и сродство к мишени клаудина 3.
Соответственно, антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению можно использовать для придания способности нацеливания на клаудин-3 клеткам, особенно иммунным клеткам.
Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает CAR (химерный рецептор антигена), содержащий антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению.
В частности, настоящее изобретение обеспечивает белок химерного рецептора антигена (CAR), содержащий:
i) внеклеточный домен, содержащий антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению, описанный выше;
(ii) трансмембранный домен и
iii) внутриклеточный сигнальный домен.
В настоящем изобретении термин «химерный рецептор антигена (CAR)» относится к рецептору, который не существует в природе, который может иметь специфичность в отношении специфического антигена к иммунной эффекторной клетке.
Обычно CAR относится к рецептору, используемому для трансплантации специфичности моноклонального антитела в Т-клетки. CAR обычно состоит из внеклеточного домена (эктодомена), трансмембранного домена и внутриклеточного домена (эктодомена).
(i) Внеклеточный домен включает антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению, описанный выше, и они содержат антигенсвязывающую область. Антитело, используемое для CAR, предпочтительно находится в форме фрагмента антитела, более предпочтительно в форме Fab или scFv, но не ограничивается этим.
Кроме того, (ii) трансмембранный домен CAR находится в форме, связанной с внеклеточным доменом, и может происходить из природного или синтетического домена. Когда он имеет природное происхождение, он может быть получен из мембраносвязываемого или проникающего через мембрану белка, он может быть частью, полученной из проникающей через мембрану области различных белков, таких как альфа, бета или дзета-цепь рецепторов Т-клеток, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 или CD8, но не ограничиваясь этим. Последовательность такого трансмембранного домена может быть получена из документа, известного в данной области, в котором раскрыто о части проникающей через мембрану области белка, способного проникать через мембрану.
В CAR, (iii) внутриклеточный сигнальный домен присутствует внутри клетки в форме, связанной с трансмембранным доменом. Внутриклеточный сигнальный домен по настоящему изобретению представляет собой область, которая генерирует или/и передает сигнал, который в первую очередь вызывает активацию клетки, когда антиген связывается с антигенсвязывающим сайтом CAR (т.е. антителом или его функциональным фрагментом по настоящему изобретению).
Тип «клетки» особо не ограничивается, но предпочтительно может быть иммунной клеткой (иммунной эффекторной клеткой). Тип иммунной клетки особо не ограничивается, если в данной области известно, что эта клетка участвует в иммунной функции организма. Например, он включает Т-клетки, NK (естественные киллерные) клетки, NKT (естественные киллерные Т-клетки), моноциты, макрофаги или дендритные клетки, и это означает включение их клеток-предшественников.
Термин «активация клетки» означает, что активность клетки увеличивается, и тип такой активности особо не ограничивается, но может, например, способствовать иммунному ответу клетки. В частности, когда клетка является иммунной клеткой, активация может пониматься как включающая и увеличение количества иммунных клеток, и действие по стимулированию иммунного ответа самой клетки.
Внутриклеточный сигнальный домен конкретно не ограничен своим типом, если он может передавать сигнал, который может вызывать активацию клетки (особенно иммунных клеток), когда антиген связывается с антигенсвязывающим сайтом, расположенным вне клетки (антитела или функциональные их фрагменты настоящего изобретения).
Могут использоваться различные типы внутриклеточных сигнальных доменов, такие как мотив активации на основе тирозина иммунорецептора или ITAM, и ITAM может включать в себя CD3 дзета (ξ, дзета), TCR дзета, FcR гамма, FcR бета, CD3 гамма, CD3 дельта, CD3 эпсилон, CDS, CD22, CD79a, CD79b, CD278, CD66d, DAP10, DAP12, FcεRI (особенно γ) и их комбинации (одного, двух или более), но не ограничиваются ими.
Кроме того, CAR по настоящему изобретению может предпочтительно дополнительно включать костимулирующий домен вместе с внутриклеточным сигнальным доменом, в зависимости от типа клетки, но не ограничиваясь этим.
Костимулирующий домен представляет собой часть, которая включена в CAR по настоящему изобретению и играет роль в передаче максимального сигнала активации соответствующей клетке в дополнение к первичному сигналу внутриклеточного сигнального домена. Он относится к внутриклеточной части CAR, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. То есть некоторым иммунным клеткам, таким как Т-лимфоциты и NK-клетки, для максимальной активации требуются два сигнала, а именно сигнал первичной активации и костимулирующий сигнал. CAR может также необязательно включать костимулирующий домен, так что связывание антигена с внеклеточным доменом приводит к передаче как первичного сигнала активации, так и костимулирующего сигнала.
Костимулирующая молекула представляет собой молекулу на клеточной поверхности, что означает молекулу, необходимую для того, чтобы вызвать достаточный ответ иммунной клетки на антиген, и ее вид особо не ограничивается, поскольку известен в данной области. Например, она может быть выбрана из группы, состоящей из лиганда, специфически связывающегося с молекулами MHC (главный комплекс гистосовметсимости) класса I, белков рецептора TNF, иммуноглобулиноподобных белков и рецепторов цитокинов, интегринов, белков SLAM (сигнальные молекулы активации лимфоцитов), рецепторов, активирующих NK-клетки, BTLA, рецептор Toll-лиганда, OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18, функционально-связанный антиген-1 лимфоцитов), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8 альфа, CD8 бета, IL2R бета, IL2R гамма, IL7R альфа, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (тактильный), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, CD 83, PD-1 и их комбинации. Костимулирующий домен может быть внутриклеточной частью молекулы, выбранной из группы, состоящей из таких костимулирующих молекул и их комбинаций (одной, двух или более).
Костимулирующий домен может быть связан с N-концом или C-концом сигнального домена и может быть включен во множество сигнальных доменов.
Каждый домен, составляющий CAR, может быть напрямую связан, а также, выборочно, короткий олигопептидный или полипептидный линкер может связывать внутриклеточный домен и проницаемый для мембраны домен CAR. Даже если линкер включен в CAR по настоящему изобретению, если он является линкером, способным вызывать активацию Т-клеток через внутриклеточный домен, когда антиген связывается с антителом, расположенным вне клетки, он конкретно не ограничен его длиной. Например, можно использовать линкер (G4S)3, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 17).
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий белок химерного антигенного рецептора (CAR), и рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид. Полинуклеотид особо не ограничивается в комбинации оснований, если он кодирует белок CAR, включающий антитело или его функциональный фрагмент по настоящему изобретению, и может быть получен методом синтеза полинуклеотидов, известным в данной области. Кроме того, вектор включает полинуклеотид, кодирующий белок CAR, и относится к материалу, который можно использовать для доставки полинуклеотида в клетку, и сделана ссылка на приведенное выше описание рекомбинантного вектора.
Настоящее изобретение также относится к трансформированной клетке с вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий белок CAR. То есть изобретение обеспечивает клетку (экспрессирующую CAR клетку), модифицированную для экспрессии белка CAR, содержащего антитело по настоящему изобретению или его функциональный фрагмент.
Тип клетки особо не ограничивается, и любой тип клетки, полезный для передачи сигналов, может использоваться в зависимости от происхождения домена, составляющего CAR.
В настоящем изобретении клетка, модифицированная для экспрессии белка CAR, предпочтительно может быть иммунной клеткой.
Тип иммунных клеток особо не ограничивается, если известно, что клетки участвуют в иммунной функции организма в данной области техники, но он включает, например, Т-клетки, клетки NK (естественные киллеры), NKT (естественные киллеры) клетки, моноциты, макрофаги, дендритные клетки и их клетки-предшественники. Наиболее предпочтительно, это может быть Т-клетка.
+
+
+
В настоящем изобретении термин «Т-клетка» относится к лимфоциту, происходящему из тимуса, и играет основную роль в иммунитете клетки. Т-клетки включают CD4 Т-клетки (хелперные Т-клетки, TH-клетки), CD8 Т-клетки (цитотоксические Т-клетки, CTL), Т-клетки памяти, регуляторные Т-клетки (Treg-клетки) и естественные киллерные Т-клетки. В настоящем изобретении Т-клетка, в которую вводится CAR, предпочтительно может быть CD8 Т-клеткой, но не ограничивается этим.
+
+
+
Например, антиген-специфические CD8 Т-клетки оцениваются как наиболее эффективные иммунные клетки для иммунотерапии рака. Однако для выделения антиген-специфических CD8 Т-клеток для использования в иммунотерапии рака требуется сложный процесс и длительный период. Соответственно, Т-клетка, модифицированная химерным рецептором антигена (CAR), была разработана как один из способов массового производства антиген-специфических CD8 Т-клеток за короткое время (Porter DL et al., N. Engl J. Med.2011; 365: 725-33.). В качестве общего примера, хотя и не ограничиваясь им, CAR представляет собой домен передачи сигнала, который вызывает активацию Т-клеток с помощью scFv антитела, которое распознает конкретный антиген, и предпочтительно представляет собой белок в форме, в которой костимулирующая молекула и сигнальный домен передачи CD3ξ объединены. Когда часть антитела, составляющая CAR, распознает специфический антиген, она индуцирует сильную передачу сигналов пролиферации Т-клеток для селективной пролиферации CD8+ Т-клеток. Эти пролиферирующие клетки способствуют иммунотерапии рака.
В качестве такого терапевтического агента для иммунных клеток иммунные клетки, модифицированные для экспрессии CAR по настоящему изобретению, специфически распознают и связываются с клаудином 3 (особенно с областью ECL-2), воздействующими на раковые клетки, по сравнению с нормальными клетками. Соответственно, можно видеть, что он может оказывать эффект в лечении раковых клеток в соответствии с активацией иммунных клеток. Учитывая, что существующая технология CAR-модифицированной иммуноклеточной терапии в основном ориентирована на гематологический рак, включает большое количество технологий, а также учитывая, что существующие технологии CAR с высокой вероятностью будут нацелены на нормальные клетки, настоящее изобретение может конкретно нацеливаться только на солидные раковые клетки по сравнению с нормальными клетками, поэтому побочные эффекты (особенно побочные эффекты в отношении нормальных клеток) незначительны, и можно получить отличные лечебные эффекты при солидном раке. Таким образом, настоящее изобретение может обеспечить фармацевтическую композицию для предотвращения или лечения рака, содержащую экспрессирующие CAR клетки по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обеспечивают описанное выше применение для доставки лекарств антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей клаудина 3, как вышеописанное антитело, ADC, CAR и технологии клеток, экспрессирующих CAR (особенно иммунные клетки). Это понятно со ссылкой на вышеизложенное.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению антитела или его функционального фрагмента для получения агента для детекции клаудина 3, агента для диагностики рака, агента для визуализации рака и агента для специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу специфической детекции клаудина 3, способу диагностики рака, способу визуализации рака и способу специфичной доставки лекарственного средства к раковым клеткам, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей антитело или его функциональный фрагмент в качестве активного ингредиента, нуждающегося в этом субъекту.
Настоящее изобретение обеспечивает применение антитела, или антитело, или его функциональный фрагмент для получения агента для предотвращения и лечения рака, и полимер антитело-лекарственное средство, с которым связано лекарственное средство.
Настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения и лечения рака, включающий введение эффективного количества композиции, содержащей антитело в качестве активного ингредиента или антитело или его функциональный фрагмент, и полимер антитело-лекарственное средство, с которым лекарственное средство связано, в качестве активного ингредиента, нуждающемуся в этом субъекту.
Настоящее изобретение обеспечивает применение антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, для получения агента для внутриклеточной доставки лекарственного средства.
Настоящее изобретение обеспечивает способ внутриклеточной доставки лекарственного средства, включающий введение эффективного количества композиции, содержащей антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, в качестве активного ингредиента, нуждающемуся в этом субъекту.
В настоящем изобретении предложено применение антитела или его функционального фрагмента, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3, для получения агента для предотвращения и лечения рака; и полимер антитело-лекарственное средство, с которым связано лекарственное средство.
В настоящем изобретении предложен способ предотвращения и лечения рака, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, содержащей антитело или его функциональный фрагмент, которые специфически связываются с внеклеточной второй петлей (ECL-2) клаудина 3; и полимер антитело-лекарственное средство, с которым лекарственное средство связано, в качестве активного ингредиента.
«Эффективное количество» по настоящему изобретению относится к количеству, которое показывает улучшение, лечение, профилактику, детекцию, диагностику или ингибирующий эффект в отношении рака при введении индивиду, и «субъектом» может быть животное, предпочтительно млекопитающее, в частности, животное, включая человека, или может быть клеткой, тканью, органом или т.п., полученными от животного. Субъект может быть пациентом, нуждающимся в лечении.
«Лечение» согласно настоящему изобретению обычно относится к облегчению симптомов рака или рака, которое может включать лечение, существенное предотвращение или улучшение состояния такого заболевания. Оно включает, но не ограничивается этим, облегчение, лечение или предотвращение одного или большинства симптомов рака.
Термин «содержащий» согласно настоящему изобретению используется таким же образом, как «включающий» или «характеризующийся», и в композиции или способе не исключены дополнительные составляющие неупомянутые элементы или способы. Термин «состоящий из» означает исключение дополнительных элементов, этапов или ингредиентов, которые отдельно не раскрыты. Термин «по существу состоящий из» предназначен для включения в объем композиции или способа компонентов или этапов, которые существенно не влияют на их основные свойства, в дополнение к описанным компонентам или этапам.
БЛАГОПРИЯТНЫЙ ЭФФЕКТ
Антитела и их функциональные фрагменты, которые специфически связываются с ECL-2 клаудина 3, более эффективны при обнаружении раковых клеток, диагностике, визуализации и применении для лечения рака (применение к ADC и CAR-экспрессирующим клеткам (особенно иммунным клеткам)), чем другие виды раковых антигенов или обычных антител, нацеленных на ECL-1 клаудина 3. В частности, в качестве конкретного примера этого, антитело, содержащее уникальную последовательность CDR, предусмотренную настоящим изобретением, не только само по себе обладает противораковой способностью, но также демонстрирует превосходную способность к нацеливанию на раковые клетки без перекрестной реактивности с другими семействами клаудина по сравнению с известным антителом к клаудину 3. Оно демонстрирует превосходную силу связывания (афинность) и обладает такими свойствами, как интернализация клеток, и, таким образом, проявляет замечательные эффекты при использовании в вышеуказанном применении.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На фиг. 1 показан результат проточной цитометрии связывания с клетками CHO-K1 (отрицательная клеточная линия, контроль) в отношении scFv, выбранных из клеточной линии CHO-CLDN3 с использованием биопэннинга и клеточной линии L-Cludin 3 с использованием ELISA.
На фиг. 2 показан результат проточной цитометрии связывания с клетками CHO-CLDN3 по отношению к scFv, выбранным из линии клеток CHO-CLDN3 с использованием биопэннинга и линии клеток L-Claudin 3 с помощью ELISA.
На фиг. 3 подтверждено, что как легкая цепь, так и тяжелая цепь каждого антитела хорошо экспрессировались с ожидаемой молекулярной массой, в результатах экспериментов SDS-PAGE для белков антител 4G3 IgG, продуцируемых в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, соответственно.
На фиг. 4а показан филогенетический анализ взаимосвязи внутри семейств клаудина.
На фиг. 4b показана гомология последовательностей внеклеточной первой петли (EL1, внеклеточная 1япетля) и области внеклеточной второй петли (EL2, внеклеточная 2я петля) CLDN4, CLDN5, CLDN6, CLDN8, CLDN9, CLDN17 и CLDN1 и мышиного CLDN3, расположенного филогенетически близко к CLDN3.
На фиг. 5а и 5b показаны результаты, подтверждающие способность к специфическому связыванию антитела 4G3 по настоящему изобретению с клетками, экспрессирующими CLDN3, путем обработки клеток HEK293, трансформированных для экспрессии каждого белка семейства человеческого клаудина, и проведением проточной цитометрии.
На фиг. 5c показаны результаты, подтверждающие способность антитела 4G3 по настоящему изобретению связываться с клетками, экспрессирующими CLDN3, путем обработки клеток HEK293, трансформированных для экспрессии мышиного CLDN3, и проведением проточной цитометрии.
На фиг. 6 показаны результаты сравнительного подтверждения специфичности связывания антитела 4G3 при лечении OVCAR-3 и Caov-3, которые представляют собой линии клеток, сверхэкспрессирующих клаудин 3, как рак яичников, и TOV-112D, который представляет собой линию клеток с очень низкой экспрессией клаудина 3, и клеток hCLDN3/TOV-112D, трансформированных для сверхэкспрессии CLDN3, с антителом 4G3 по настоящему изобретению, и проведением проточной цитометрии.
На фиг. 7 показаны результаты анализа иммунопреципитации для клеток OVCAR-3, Caov-3, TOV-112D и hCLDN3/TOV-112D с использованием антитела 4G3 по настоящему изобретению (ввод: лизат клеток).
На фиг. 8а показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания для клеток OVCAR-3, Caov-3, TOV-112D и hCLDN3/TOV-112D с использованием контрольного антитела (контрольный IgG).
На фиг. 8b показаны результаты иммунофлуоресцентного окрашивания клеток OVCAR-3, Caov-3, TOV-112D и hCLDN3/TOV-112D с использованием антитела 4G3.
На фиг. 9а показаны результаты проточной цитометрии для связывания антитела по настоящему изобретению (4G3 IgG) с клетками CHO-K1 (отрицательная клеточная линия, контроль).
На фиг. 9b показаны результаты проточной цитометрии для связывания антитела по настоящему изобретению (4G3 IgG) с клетками CHO-CLDN3 (положительная линия клеток, контроль).
D
На фиг. 9c показаны результаты измерения аффинности связывания (константа диссоциации (K)) антитела по настоящему изобретению (4G3 IgG) в клетках, экспрессирующих CLDN3 (hCLDN3/HEK293 и hCLDN3/TOV-112D), с помощью LigandTracer Green (ridgeview).
Фиг. 10а представляет собой схематическую диаграмму паттерна (структуры) экспрессии каждого слитого белка в клетках, экспрессирующих слитый белок, включающий участок аминокислот с 1 по 104 CLDN1 в качестве внеклеточной первой петли и участок аминокислот с 104 по 220 CLDN3 в качестве внеклеточной второй петли (hCLDN1-3/HEK293), и в клетках (hCLDN3-1/HEK293), экспрессирующих слитый белок, содержащий участок аминокислот с 1 по 103 EL1 CLDN3 и участок аминокислот с 105 по 211 из EL2 CLDN1.
На фиг. 10b показан результат проточной цитометрии после обработки антителом 4G3 против клеток hCLDN1-3/HEK293 или hCLDN3-1/HEK293 (вверху) и результат вестерн-анализа, подтверждающего, что желаемый слитый белок был должным образом экспрессирован в клетках (внизу).
На фиг. 11а показаны результаты наблюдения за тем, как по прошествии времени антитело по настоящему изобретению связывается с клаудином 3, а затем проникает в клетки линий рака яичников OVCAR-3 и клетки Caov-3 посредством эндоцитоза с использованием иммунофлуоресцентного окрашивания.
На фиг. 11b показан эффект интернализации антитела по настоящему изобретению по сравнению с другими антителами, которые, как известно, присоединяются к клаудину 3 (KM3907).
На фиг. 12а-12е показаны результаты сравнительного подтверждения уровня экспрессии клаудина 3 в различных раковых клетках путем обработки антителом 4G3 по настоящему изобретению и выполнения проточной цитометрии.
На фиг. 13a-13e показаны результаты подтверждения эффекта антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) путем обработки антитела 4G3 в клетках в зависимости от концентрации.
На фиг. 14а показаны результаты, подтверждающие способность антитела 4G3 по настоящему изобретению к нацеливанию на опухоль in vivo на животной модели ксенотрансплантата опухоли,
На фиг. 14b показаны результаты количественного определения интенсивности флуоресценции после извлечения органа на животной модели.
Способ осуществления изобретения
Далее настоящее изобретение далее будет описано подробно.
Однако следующие примеры являются лишь иллюстрацией настоящего изобретения, и содержание настоящего изобретения не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Скрининг ScFv, специфически связывающийся с клаудином 3 (CLDN3)
1-1. антиген
В качестве антигена клаудин 3 был предоставлен в форме линий клеток, экспрессирующих клаудин 3, и липочастиц клаудина 3, соответственно, во время процесса скрининга. Клеточную линию CHO-K1 использовали для получения линии клеток, экспрессирующей клаудин 3 (номер доступа NCBI_O15551 (см. SEQ ID NO: 1)). Для создания вектора экспрессии клаудина 3 ген клаудина 3 вставляли в pcDNA3.1 (Invitrogen) с использованием рестрикционных ферментов HindIII и BamH1. Полученный вектор экспрессии клаудина 3 трансфицировали и обрабатывали 400 мкг/мл генетицина (g418) для отбора трансформантов. Липочастицы, экспонирующие клаудин 3 на поверхности (далее называемые липочастицами клаудина 3), были заказаны у компании Integralmolecular (кат. № RR-0733A).
1-2. scFv фаговый скрининг
Для скрининга антитела, которое специфически связывается с клаудином 3, использовали библиотеку фагового дисплея.
Библиотека представляла собой библиотеку синтезированного scFv человека, и для получения конкретной информации о библиотеке см. Non-Combinatorial Synthetic CDR Diversity (Bai X. et al., PLoS ONE., 10(10):e0141045 (2015)).
ScFv, экспрессируемый в библиотеке scFv, был помечен меткой HA, чтобы его можно было обнаружить с помощью антитела против HA FITC (Genscript, A01621).
Биопэннинг проводили с использованием библиотеки scFv следующим образом.
7
7
Сначала выполняли биопэннинг с использованием линии клеток CHO-K1, экспрессирующей клаудин 3 (далее обозначаемой как CHO-CLDN3), полученной в примере 1-1. Сток библиотечного scFv блокировали 3% FBS/PBS (эмбриональная бычья сыворотка/фосфатно-солевой буфер) при комнатной температуре. Каждые из 1×10 клеток CHO-CLDN3 и 1×10 клеток CHO-K1 (отрицательная клеточная линия) получают с использованием трипсина. Клетки CHO-K1 (отрицательная клеточная линия) смешивают с блокирирующим стоком библиотеки, и истощение проводят при комнатной температуре в течение 1 часа. По окончании истощения супернатант, полученный центрифугированием, смешивают с антигеном клеток CHO-CLDN3 и подвергают реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. Клеточный осадок, полученный центрифугированием, промывали 3% FBS/PBS, а затем подвергали реакции со 100 мМ TEA (триэтиламин) в течение 5 минут при комнатной температуре, так что только специфически связанный scFv-фаг мог быть элюирован и нейтрализован Трис с pH 8,5. После реакции его получали в виде конъюгата scFv-антиген. Приготовленный конъюгат scFv-антиген (конъюгат) добавляли к клеткам E. coli TG1 для заражения, а затем инкубировали в течение ночи при 37°C в агаровой среде LB (среда Лурия-Бертани)/ампициллин/глюкоза.
11
12
Клетки E. coli TG1 переносили в среду SB/ампициллин и культивировали до тех пор, пока значение OD600 не достигло 0,5, а затем добавляли 1×10 ~ 1×10 вспомогательного фага, и повторяли при 37°C в течение 1 часа. После культивирования добавляли канамицин и снова культивировали в течение ночи. После центрифугирования ночной культуры супернатант реагировал с раствором PEG (полиэтиленгликоль) при 4°C, а затем снова центрифугировали для отделения осадка.
После растворения осадка в PBS супернатант, полученный центрифугированием, получали в виде раствора библиотеки scFv. Этот процесс повторяли 4 раза для получения группы-кандидата scFv, которая специфически связывается с антигеном клаудина 3.
11
12
Во втором способе биопэннинг проводился с использованием липочастиц. Исходную библиотеку scFv смешивали с нулевыми липочастицами (липочастицами, не содержащими клаудин 3), и блокирование и истощение проводили одновременно при комнатной температуре в течение 1 часа с 4% обезжиренным молоком. 1 мл PBS, содержащего липочастицы клаудина 3, добавляли в пробирку для иммунной реакции и проводили реакцию при 4°C в течение 16 часов, чтобы покрыть внутреннюю поверхность пробирки. Раствор антигена декантировали и один раз промывали для удаления антигена без покрытия. Антиген, нанесенный на пробирку для иммунной реакции (липочастицы Cludin 3), блокировали 4% обезжиренным молоком при комнатной температуре в течение 1 часа. После завершения блокирования обезжиренное молоко удаляли, смешивали с исходным материалом библиотеки scFv и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания PBS его подвергали взаимодействию со 100 мМ TEA в течение 5 минут при комнатной температуре, так что могли быть элюированы только специфически связанные scFv-фаги, и нейтрализовали трис с pH 8,5 для получения формы конъюгата scFv-антиген. Приготовленный конъюгат scFv-антиген (конъюгат) добавляли к клеткам E. coli TG1 для заражения, а затем инкубировали в течение ночи при 37°C в агаровой среде LB (среда Лурия-Бертани)/ампициллин/глюкоза. Клетки E. coli TG1 переносили в среду SB/ампициллин и культивировали до тех пор, пока значение OD600 не достигло 0,5, а затем добавляли 1×10 ~ 1×10 вспомогательного фага, и после инкубации при 37°C в течение 1 часа добавляли канамицин и снова культивировали в течение ночи. После центрифугирования ночной культуры супернатант реагировал с раствором PEG (полиэтиленгликоль) при 4°C, и затем его снова центрифугировали для отделения осадка. Осадок растворяли в PBS, а затем центрифугировали для получения супернатанта в виде раствора библиотеки scFv. Этот процесс повторяли 4 раза для получения группы-кандидата scFv, которая специфически связывается с антигеном клаудина 3.
1-3. Скрининг на антитела scFv, которые специфически связываются с клаудином 3 (CLDN3)
Чтобы выбрать scFv, обладающий превосходной связывающей способностью, из группы кандидатов scFv, полученной в примере 1-2, ELISA-анализ выполняли на линии клеток, экспрессирующих клаудин 3.
5
Клеточную линию, экспрессирующую клаудин 3 (далее называемую клетками L-клаудина 3), трансфицировали вектором экспрессии клаудина 3, полученным в примере 1-1, в L-клетки, а затем использовали 600 мкг/мл генетицина (g418) для отбора трансформантов. Каждый из исходных материалов библиотеки, отобранных на каждом этапе в примере 1-2 (результаты скрининга с использованием линии клеток, экспрессирующих клаудин 3, или липочастиц клаудина 3 использовались отдельно), культивировали в течение ночи в среде SB/ампициллин/глюкозный агар, а затем каждую отдельную колонию инокулировали в 200 мкл среды SB/ампициллин. После инкубации при 37°C в течение 3 часов смесь перемешивали так, чтобы концентрация IPTG стала 1 мМ, а затем снова культивировали при 30°C в течение ночи. Когда культивирование было завершено, культуральный раствор центрифугировали для отделения только клеток, и затем клетки лизировали с использованием буфера TES для получения scFv. Полученный scFv обрабатывали на планшете, в котором были распределены 1×10 клеток L-клаудин 3, подвергали реакции при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем добавляли вторичное антитело (анти-HA HRP, santacruz, кат. №. sc-7392), и реакция длилась 40 минут. Когда реакция со вторичными антители была завершена, добавляли TMB для проведения цветной реакции и анализировали с использованием ридера ELISA (450 нм). Путем сравнения значений анализа ELISA были в первую очередь выбраны 23 лучших scFv (1C4, 1F11, 2A12, 2B4, 2E5, 2E12, 2F8, 3A2, 3H8, 4A2, 4A3, 4B7, 4B10, 4D7, 3D2, 3D7, 3F11, 4A8, 4A9, 4A12, 4E4, 4G3, 4G7).
5
Что касается кандидатов scFv, отобранных с помощью ELISA, связывание с клетками CHO-CLDN3 подтверждали с помощью проточной цитометрии. В качестве контроля использовали нативные клетки CHO-K1. Субкультивированные клетки были разделены на отдельные группы клеток с использованием трипсина и приготовлены в 3% растворе FBS/PBS. Отобранные кандидаты scFv инокулировали в 5 мл среды SB/ампициллин, инкубировали при 37°C в течение 3 часов, перемешивали так, чтобы концентрация IPTG составляла 1 мМ, а затем снова культивировали при 30°C в течение ночи. Когда культивирование было завершено, культуральный раствор центрифугировали для отделения только клеток, и затем клетки лизировали с использованием буфера TES для получения scFv. Клетки CHO-K1 (отрицательная клеточная линия, контроль) и клетки CHO-CLDN3 (экспериментальная группа) были приготовлены с концентрацией 2×10 клеток в 3% в FBS/PBS для каждой группы, а затем после обработки полученного scFv его подвергали реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. По завершении реакции, после промывания 3% в FBS/PBS, антитело против HA taq FITC разводили 1:100 (разбавляли 100 мкл 3% в FBS/PBS), обрабатывали 100 мкл и подвергали реакции при комнатной температуре в течение 1 часа. После завершения реакции его промывали и анализировали с помощью BD FACS Calibur. В это время коммерчески доступные антитела против CLDN3 (FAB4620F, R&D systems) использовали в качестве контрольной группы. По сравнению с контрольной группой (см. фиг. 1) были выбраны группы кандидатов scFv, в которых сдвиг пика произошел только в экспериментальной группе (см. фиг. 2) (2B4, 4A2, 4B7, 4B10, 4D7, 4A8, 4A9, 4A12, 4E4, 4G3, 4G7).
Затем окончательные результаты биопэннинга (данные не показаны) с использованием липочастиц клаудина 3 сравнивали с результатами группы кандидатов scFv, выбранной на вышеуказанных экспериментальных этапах. Секвенирование было выполнено на выбранном scFv, и два клона 2B4 и 4G3 были получены в эксперименте на липочастицах клаудина 3 и клеточных линиях, экспрессирующих клаудин 3 (линия клеток CHO-CLDN3 и/или линия клеток L-клаудина 3). Результаты анализа аминокислотной последовательности scFv 2B4 и 4G3 показаны в таблице 1 ниже.
Таблица 1
Антитело
Вариабельная область тяжелой цепи
CDRH1
CDRH2
CDRH3
2B4
GYYWS (SEQ ID NO: 18)
TIHPGDSDTRYNPSLQG (SEQ ID NO: 19)
RQGYSLFDI(SEQ ID NO: 20)
4G3
SYAMS (SEQ ID NO: 3)
IINPSGASTSHAQRFQG (SEQ ID NO: 4)
RYGRYGSFDI(SEQ ID NO: 5)
Антитело
Вариабельная область легкой цепи
CDRL1
CDRL2
CDRL3
2B4
RASQSVASDLA(SEQ ID NO: 21)
AASRLQS (SEQ ID NO: 22)
QQYNSYPPT (SEQ ID NO: 23)
4G3
SGSTSNIGRNYVS (SEQ ID NO: 6)
DTSNKHF (SEQ ID NO: 7)
QSYDSSKVV (SEQ ID NO: 8)
Пример 2: Превращение и экспрессия антитела 4G3 scFv в IgG
2-1. Конструирование полного вектора экспрессии IgG
Ранее выбранный scFv 4G3 был преобразован в форму IgG, которая является более часто используемым антителом. Вектор экспрессии, способный экспрессировать всю форму IgG, был сконструирован на основе участков CDR scFv. Сначала с помощью ПЦР получали вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи scFv соответственно, и для 4G3 использовали праймеры, показанные в таблице 2 ниже. Последовательность вариабельной области легкой цепи клонируют в вектор экспрессии pOptiVec (Invitrogen), в который вставлена последовательность константной области легкой цепи, и последовательность вариабельной области тяжелой цепи клонируют в вектор экспрессии pcDNA 3.3 (Invitrogen), в который была вставлена константная область тяжелой цепи, соответственно. Константные области легкой цепи и тяжелой цепи экспрессируются вместе с вариабельной областью легкой цепи и вариабельной областью тяжелой цепи scFv, клонированных из вектора, и в результате продуцируется целое антитело IgG, включая области CDR scFv.
Таблица 2
Вариабельная область
Последовательность праймера
SEQ ID NO:
Легкая цепь F
5'-ATTCGATCGATATGGAGACAGACACACTCCTG CTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCA CGTGGCAGAGCGTGCTGACCCAGCCT-3'
9
Легкая цепь R
5'-AGCCACCGTACGCAGCACGGTCAGCTTGGTACC-3'
10
Тяжелая цепь F
5'-ATTCGATCGATATGGAGACAGACACACTCCTG CTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACGTGGGAAGTGCAGCTGCTGGAAAGT-3'
11
Тяжелая цепь R
5'-CTTGGTGCTAGCGCTGCTCACGGTCACCAGAGT-3'
12
2-2. Конструирование клеточной линии (пула) CHO-S, экспрессирующей полное антитело IgG
Клетки CHO-S (Life Technologies Inc.) использовали для получения клеточных линий, экспрессирующих 4G3 IgG-антитело, соответственно. Оптимизацию кодонов проводили с видами Cricetulus griseus для последовательностей генов, кодирующих тяжелую и легкую цепи, полученные в Примере 2-1, и эти последовательности клонировали в Freedom pCHO1.0Vector, а клетки CHO-S трансдуцировали реагентом для трансфекции (FreeStyle™ MAX Reagent; Life Technologies Inc.). Чтобы выбрать экспрессирующую антитело клеточную линию после трансдукции, ее отбирали в два этапа с использованием пуромицина и МТХ (метотрексата). В частности, первый отбор проводили с 10 мкг/мл пуромицина и 100 нМ МТХ или 20 мкг/мл пуромицина и 200 нМ МТХ, а второй процесс выполняли, когда жизнеспособность клеток была в пределах стандарта. Вторичный скрининг проводили с использованием 30 мкг/мл пуромицина и 500 нМ метотрексата или 50 мкг/мл пуромицина и 1000 нМ MTX. Когда достигается окончательный стандарт жизнеспособности клеток, вторичный скрининг прекращается и группа с высоким уровнем экспрессии отбирается с помощью SFB (простое стационарное культивирование с подпиткой).
2-3. Производство и очистка общих антител IgG
2
Каждую линию клеток, продуцирующую антитела, полученную в 2-2, культивировали в среде CD FortiCHO™ с 8% CO, 37°C, 100-120 об/мин в течение всего 14 дней, добавляя 4 г/л, 4 г/л и 6 г/л глюкозы соответственно на 3, 5 и 7 дни. После завершения культивирования культуральный раствор центрифугировали на ультрацентрифуге при 6000 g, и супернатант отфильтровывали с использованием фильтра 0,2 мкм. Смолу с белком А (Mabselect SuRe, 11-0026-01 AD, GE Healthcare Life Sciences) использовали для очистки и использовали равновесный буфер (20 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, pH 7,2), промывочный буфер (35 мМ фосфат натрия, 500 мМ NaCl, pH 7,2), буфер для элюции (0,1 М цитрат натрия, pH 3,6). Используя AKTA™ avant, он был очищен с использованием равновесного буфера в 2 раза больше объема колонки, промывочного буфера в 5 раз больше объема колонки и буфера для элюции в 5 раз больше объема колонки. Во время элюирования раствор трис-HCl с pH 8,0 добавляли к 1/5 объема колонки для нейтрализации. После двукратного преобразования буфера в PBS с использованием фильтрующей мембраны (CelluSep, 1430-45) его концентрировали с помощью центробежного фильтра (Amicon Ultra-15, UFC905024, Merck).
Белки антител IgG, продуцируемые в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях, соответственно, были подтверждены стандартным методом SDS-PAGE, и было подтверждено, что легкие и тяжелые цепи каждого антитела хорошо экспрессируются при ожидаемой молекулярной массе. На фиг. 3 показаны результаты подтверждения в SDS-PAGE для антител IgG 4G3.
Пример 3: Оценка специфичности связывания и способности связывания антитела по настоящему изобретению с клаудином 3
3-1. Конструирование клеточных линий CLDN/HEK293 для различных клаудинов
Чтобы подтвердить антигенную специфичность антитела, полученного в примере 2-3, клаудины филогенетически расположены близко к человеческому CLDN3, в частности, возможность связывания с человеческим CLDN4 (номер доступа NCBI: O14493), CLDN5 (O00501), CLDN6 (P56747), CLDN8 (P56748), CLDN9 (O95484) и CLDN17 (P56750) сравнивали и оценивали (см. фиг. 4A и 4B). Кроме того, CLDN1 (O95832), типичный клаудин, использовался в качестве контрольной группы в этом эксперименте, хотя он подвергается гораздо более систематическому анализу, чем описанные выше типы клаудина. Кроме того, было исследовано, связывается ли разработанное антитело также с мышиным CLDN3 (Q9Z0G9) (см. 4b). Каждый из генов, кодирующих описанные выше клаудины, был клонирован в pcDNA3.1(+) (Invitrogen). Каждый из полученных таким образом векторов экспресии клаудина трансдуцировали в HEK293 (KCLB) с использованием реагента для трансфекции Fugene HD (E231A, Promega), а затем отбирали устойчивые клеточные линии с помощью G418.
Для полученных таким образом клеточных линий (hCLDN/HEK293), которые устойчиво экспрессируют человеческий клаудин, было подтверждено, хорошо ли экспрессируется каждый клаудин, с использованием коммерчески доступных анти-CLDN1 (FAB4618G, R&D systems), анти-CLDN3 (FAB4620F, R&D systems), анти-CLDN4 (FAB4219F, системы R&D), анти-CLDN5 (ab131259, Abcam), анти-CLDN6 (ABIN1720916, Antibodies-online), анти-CLDN8 (MAB5275, R&D systems), анти-CLDN9 (ab187116, Abcam) и анти-CLDN17 (MAB4619, R&D systems) антител.
3-2. Оценка перекрестной реактивности антител по настоящему изобретению в клеточных линиях CLDN/HEK293
5
В линиях клеток hCLDN/HEK293 и mCLDN3/HEK293 для различных клаудинов, полученных в примере 3-1, была подтверждена перекрестная реактивность антитела, полученного в примере 2-3. Исходные клетки HEK293 использовали в качестве отрицательного контроля. Сначала клетки разделяли на отдельные клетки с использованием буфера для диссоциации клеток (Gibco, 13151-014), а затем засевали 2,5×10 клеток, добавляли к ним 5 мкг/мл каждого антитела и проводили реакцию на льду в течение 1 часа.
После реакции его промывали 1% BSA/PBS, обрабатывали разведением 1:100 антитела козы к IgG-FITC человека (109-095-098, Jackson Immunoresearch) в качестве вторичного антитела и подвергали реакции на льду в течение 1 часа. После реакции его промывали 1% BSA/PBS и анализировали с использованием BD FACSCalibur с помощью проточной цитометрии.
На фиг. 5а и 5b показаны результаты проточной цитометрии и сравнение специфичности связывания антитела 4G3 с клаудином 3. Никакого сдвига пика не наблюдали ни в одной экспериментальной группе с использованием CLDN4, CLDN5, CLDN6, CLDN8, CLDN9 и CLDN17, которые были филогенетически близки к CLDN3. Результаты экспериментов с использованием мышиного CLDN3 показаны на фиг. 5c, и было подтверждено, что антитело по настоящему изобретению также связывается с мышиным CLDN3, имеющим высокую гомологию с человеческим CLDN3.
Таким образом, было подтверждено, что каждое антитело по настоящему изобретению не связывается с другими семействами клаудина, кроме человеческого CLDN3 и мышиного CLDN3. То есть каждое антитело по настоящему изобретению специфически связывает только CLDN3 без перекрестной реакции с другими типами клаудина, имеющими высокую гомологию.
3-3. Подтверждение способности обнаруживать раковые клетки in vitro с помощью проточной цитометрии
Была подтверждена способность антител, полученных в примере 2-3, связываться с раковыми клетками. В случае рака яичников OVCAR-3 (ATCC) и Caov-3 (ATCC), которые являются клеточными линиями, которые сверхэкспрессируют клаудин 3, использовали TOV-112D (ATCC), которые являются клеточной линией с очень низкой экспрессией клаудина 3, и hCLDN3/TOV-112D, трансформированные для сверхэкспрессии CLDN3. Получение клеток hCLDN3/TOV-112D выполняли таким же образом, как описано в Примере 3-1. Обработку антителом и проточную цитометрию клеток проводили таким же образом, как в Примере 3-2.
В результате эксперимента сдвиг пика наблюдали в экспрессирующих клаудин 3 клетках OVCAR-3, Caov-3 и hCLDN3/TOV-112D, и сдвиг пика не наблюдали в отрицательной клеточной линии TOV-112D. В качестве примера на фиг. 6 показана сравнительная специфичность связывания антитела 4G3 с раковыми клетками.
3-4. Повторное подтверждение специфического связывания клаудина 3 путем реакции иммунопреципитации
Посредством иммунопреципитации было подтверждено, что антитело по настоящему изобретению связывается с клаудином 3 в раковых клетках. В качестве отрицательного контроля антитела (контрольное IgG) использовали коммерчески доступное цельное человеческое антитело (009-000-003, Jackson Immunoresearch).
Каждая клетка OVCAR-3 (ATCC), Caov-3 (ATCC), TOV-112D (ATCC), hCLDN3/TOV-112D высвобождалась с добавлением PBS с ингибитором протеазы (11697498001, Roche), а затем повдергали измельчению в режиме включения на 2 с, выключения на 5 с 10 раз с помощью ультразвуковой измельчителя, центрифугирование выполняли при 15000 об/мин, 4°C в течение 15 минут для получения супернатанта. Концентрацию белка в каждом клеточном лизате (супернатанте) измеряли методом количественного определения BCA, а затем брали 1 мг белка, добавляли 1 мкг каждого антитела и подвергали реакции при вращении при 4°C в течение 1 часа. Гранулы белка A (11719408001, Roche) уравновешивали PBS, и гранулы блокировали 5% BSA/PBS при вращении при 4°C в течение 1 часа. К образцу добавляли 50 мкл гранул, чтобы реакция антител завершилась, и реакцию проводили при вращении при 4°C в течение 1 часа. Когда реакция между антителом и гранулами была завершена, после 3-кратной промывки PBS добавляли 30 мкл загрузочного буфера 2X SDS, кипятили при 100°C в течение 10 минут, центрифугировали при 12000 об/мин в течение 3 минут и надосадочную жидкость подвергали 15% SDS-гель-электрофорезу.
Вестерн-блоттинг выполняли обычным методом, и в это время в качестве первичного антитела использовали анти-CLDN3 (341700, Invitrogen).
В результате анализа полоса не наблюдалась в контрольной группе, обработанной IgG, и полоса наблюдалась только в экспериментальной группе с использованием клеток OVCAR-3, Caov-3 и hCLDN3/TOV-112D, обработанных антителом по настоящему изобретению. На фиг. 7 показана степень связывания антитела 4G3 с клаудином 3, экспрессируемым клетками. Это подтвердило, что каждое антитело по настоящему изобретению связывается с белком клаудином 3 раковых клеток.
3-5. Повторное подтверждение специфического связывания клаудина 3 путем реакции иммунопреципитации
5
Посредством иммунофлуоресценции было повторно подтверждено, что антитело по настоящему изобретению специфически нацелено на клаудин 3 в раковых клетках. Каждую клетку OVCAR-3 (ATCC), Caov-3 (ATCC), TOV-112D (ATCC) и hCLDN3/TOV-112D добавляли на слайд с 4-луночной культурой клеток по 2×10 клеток и культивировали в течение 24 часов. Контрольное антитело (ChromePure Human IgG, 009-000-003, Jackson ImmonoResearch) или антитело по настоящему изобретению добавляли в культуральную среду до концентрации 5 мкг/мкл и проводили реакцию при перемешивании при 4°C в течение 1 часа. После промывания 4% PBS клетки фиксировали формальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре. После промывания PBS блокирование выполняли с помощью 5% BSA/PBS при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания PBS добавляли антитело козы против IgG-FITC человека (109-095-098, Jackson Immunoresearch) в качестве вторичного антитела в соотношении 1:100 и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания PBS добавляли Hoechst 33342 (H3570, Invitrogen) в соотношении 1:5000 для окрашивания ядер и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем дважды промывали PBS.
После нанесения на водную среду для заливки FluoromountTM (F4680, SIGMA) покровное стекло закрывали и флуоресценцию наблюдали с помощью конфокального микроскопа (LSM700, Carl Zeiss, Inc.).
В результате анализа флуоресценция не наблюдалась во всех линиях клеток группы, обработанной контрольным антителом (контрольный IgG) (см. фиг. 8A), тогда как в группе, обработанной антителом, по настоящему изобретению вся флуоресценция наблюдалась на поверхности клеток линий клеток hCLDN3/TOV-112D, OVCAR-3 и Caov-3, экспрессирующих CLDN3, и не наблюдали флуоресценции в линии клеток TOV-112D, не экспрессирующих CLDN3. На фиг. 8b показаны типичные экспериментальные результаты для антитела 4G3.
3-6. Сравнение силы связывания с клаудином 3 и подтверждение кинетики связывания
Что касается антител 4G3 IgG, полученных в Примере 2-3, их способность связываться с клаудином 3 была подтверждена. Проточную цитометрию выполняли с использованием клеток CHO-CLDN3, а конкретные экспериментальные методы выполняли таким же образом, как в примерах 1-3. Исходные клетки CHO-K1 использовали в качестве контроля, а коммерчески доступные антитела против CLDN3 (FAB4620F, R&D systems) использовали в качестве контрольной группы.
5
2
Кроме того, подтверждение аффинности связывания антитела с клаудином 3 измеряли с использованием LigandTracer Green (ridgeview). LignadTrcer Green (ridgeview) - это устройство для измерения на основе клеток, которое может измерять в реальном времени, связывается ли антитело, конъюгированное с FITC, с антигеном на антиген-экспрессирующих клетках. FITC конъюгировали с разработанным антителом с использованием набора для маркировки антител FITC (53027, Pierce). В качестве пустого контроля один день назад исопльзовали 500 мкл каждого из 5% молока/PBS, контрольную линию клеток с очень низкой экспрессией клаудина 3 и линию сверхэкспрессирующих клеток CLDN3 в концентрации 3×10 клеток/мл (размером с монету) добавляли на квадрант 100 мм культуральной чашки. После инкубации в течение 6 часов при 37°C и 5% CO среду удаляли, промывали PBS, а затем добавляли 10 мл среды и культивировали в течение ночи. HEK293 (KCLB) и TOV-112D (ATCC) использовали в качестве эталонных клеточных линий, а hCLDN3/HEK293 и hCLDN3/TOV-112D использовали в качестве клеточных линий со сверхэкспрессией CLDN3. В день эксперимента после удаления всей среды и замены ее на 3 мл среды чашку для культивирования устанавливали на оборудование, и после стабилизации FITC-конъюгированные антитела последовательно добавляли до конечной концентрации 3 нМ и 9 нМ. Каждый из них реагировал до тех пор, пока величина флуоресценции не достигла равновесия, и, наконец, степень диссоциации была подтверждена после замены 3 мл новой среды. Время измерения флуоресценции составляло 15 секунд, время задержки измерения составляло 4 секунды, а интервал измерения составлял 72 секунды. Путем трехкратного повторения эксперимента значения флуоресценции в клетках hCLDN3/HEK293 по сравнению с клетками HEK293 и значения флуоресценции в клетках hCLDN3/TOV-112D по сравнению с клетками TOV-112D были проанализированы с помощью подгоняемой модели двух состояний (two state fitting model) с отношением один к одному. Результирующие значения показаны на фиг. 9C и в таблице 3.
[Таблица 3]
Клеточные линии CLDN3
Подгоняемая модель
k<sub>a</sub>1(М<sup>-1</sup>с<sup>-1</sup>)
K<sub>d</sub>1 (с<sup>-1</sup>)
k<sub>a</sub>2 (с<sup>-1</sup>)
K<sub>d</sub>2 (с<sup>-1</sup>)
K<sub>D</sub> (нМ)
Chi2 (%)
hCLDN3/HEK293
1:1, два состояния
4,66×10<sup>4</sup>
6,71×10<sup>-4</sup>
1,56×10<sup>-4</sup>
4,35×10<sup>-5</sup>
4,03
34,27
hCLDN3/TOV-112D
1:1, два состояния
4,74×10<sup>4</sup>
3,37×10<sup>-4</sup>
7,77×10<sup>-4</sup>
2,57×10<sup>-5</sup>
2,35
10,15
Как показано на фиг. 9a и 9b, было подтверждено, что все антитела 4G3 IgG демонстрировали сдвиги пиков и связывались с клаудином 3. В это время разница в сдвиге пика была больше в группе, обработанной антителом 4G3 IgG, и в результате было подтверждено, что антитело 4G3 IgG имеет лучшую способность к специфическому связыванию с клаудином 3, чем обычное коммерчески доступное антитело.
Кроме того, в результате анализа аффинности связывания, как показано на фиг. 9c и в таблице 3, кинетическая ценность (KD) 4G3 для клеток, экспрессирующих клаудин 3, составляла 4,03 нМ (hCLDN3/HEK293) и 2,35 нМ (hCLDN3/TOV-112D) в двух клеточных линиях, соответственно, и подтверждала высокое сродство 4G3 к клаудину 3. Эти результаты показывают, что антитело 4G3 IgG по настоящему изобретению имеет значительно лучшую аффинность, чем существующие антитела против клаудина 3. Например, аффинность более чем в 5 раз выше, чем у существующего антитела IgGH6 от Chiara Romani et al. Oncotarget. 2015.
Пример 4: Идентификация сайта связывания антигена
В пределах областей, в которых CLDN3, естественно экспрессируемый в клетках, подвергается воздействию снаружи клетки, в частности, была предпринята попытка подтвердить, где находится антигенсвязывающий сайт, с которым связывается антитело по настоящему изобретению. Соответственно, чтобы подтвердить это, был создан слитый белок, в котором области, соответствующие внеклеточной 1-й петле и внеклеточной 2-й петле CLDN3, были заменены соответствующими областями в CLDN1. Ген, экспрессирующий аминокислоты с 1 по 104 из CLDN1 и с 104 по 220 CLDN3 (hCLDN1-3), или ген, экспрессирующий аминокислоты CLDN1 с 105 по 211 и аминокислоты с 1 по 103 CLDN3 (hCLDN3-1), были соответственно клонированы в pcDNA.3.1(+) (Invitrogen). После того, как каждый ген был трансдуцирован в HEK293 (KCLB), была отобрана линия устойчивых клеток с использованием G418 для получения линии клеток, непрерывно экспрессирующей слитый белок hCLDN1-3 или hCLDN3-1. Они были обозначены как hCLDN1-3/HEK293 и hCLDN3-1/HEK293 соответственно (см. Фиг. 10a). Подтверждение того, экспрессируется ли желаемый слитый белок в каждой клеточной линии, было выполнено обычным методом вестерн-блоттинга с использованием анти-CLDN3 (341700, Invitrogen), анти-CLDN1 (sc-137121, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (см. нижнюю часть фиг. 10b). Обработку антителом 4G3 и проточную цитометрию для клеток hCLDN1-3/HEK293 или hCLDN3-1/HEK293 проводили таким же образом, как в Примере 3-2.
В результате анализа, как показано на фиг. 10b, сдвиг пика наблюдался в эксперименте для hCLDN1-3/HEK293, и сдвиг пика не наблюдали в эксперименте для hCLDN3-1/HEK293.
й
В результате было подтверждено, что антитело 4G3 связывается с областью внеклеточной 2 петли hCLDN3.
Пример 5: Подтверждение эндоцитоза антитела IgG 4G3
5
Чтобы подтвердить способность антитела по настоящему изобретению к интернализации в клетки, OVCAR-3 (ATCC) и Caov-3 (ATCC), которые являются линиями клеток рака яичников, сверхэкспрессирующими клаудин 3, были добавлены на 4-луночные слайды с культурами клеток по 2×10 штук и инкубировали 24 часа. 1 мМ LysoTracker Red DND-99 (L7528, Life Technologies Inc.), окрашивающий лизосомы в клетках после культивирования, контрольный IgG (ChromePure Human IgG, 009-000-003, Jackson ImmonoResearch) или KM3907 (антитело, имеющее VH с SEQ ID NO: 13 и VL с SEQ ID NO: 14, полученные таким же образом, как в Примере 2-1 (см. SEQ ID NO: 15 и 16 для полного антитела KM3907)/мишень CLDN3 и CLDN4, связывание ECL-1) использовали как контрольное антитело и антитело 4G3 по настоящему изобретению обрабатывали до концентрации 10 мкг/мл и инкубировали в течение 1 часа, 2 часов, 4 часов и 6 часов при 37°C. После завершения культивирования каждый раз его промывали PBS и фиксировали в течение 15 минут при комнатной температуре 4% формальдегидом. После промывания PBS обрабатывали 0,1% Triton-X100/PBS трижды в течение 5 минут. После промывания PBS блокирование проводили в течение 1 часа при комнатной температуре с помощью 5% BSA/PBS. После промывания PBS добавляли антитела козы против IgG-FITC человека (109-095-098, Jackson Immunoresearch) в соотношении 1:100 в качестве вторичных антител и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа. Для окрашивания ядер после промывки PBS добавляли Hoechst 33342 (H3570, Invitrogen) в соотношении 1:5000 и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем дважды промывали PBS. После нанесения на водную среду для заливки FluoromountTM (F4680, SIGMA) покровное стекло закрывали и флуоресценцию наблюдали с помощью конфокального микроскопа (LSM700, Carl Zeiss, Inc.).
В результате на фиг. 11а видно, что было подтверждено, что антитело 4G3 проникло в клетку и расположилось на лизосоме. Кроме того, как показано на фиг. 11b, в случае KM3907, который представляет собой известное антитело против клаудина 3, интернализация в клетки не наблюдалась.
Пример 6: Подтверждение антителозависимой цитотоксичности против раковых клеток
Для подтверждения антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC) антитела по настоящему изобретению использовали клеточную линию (далее именуемая NK-92MI-CD16), которая непрерывно экспрессирует ген CD16 рецептора Fc в NK-92MI. Для получения клеточной линии NK-92MI-CD16 ген CD16 вставляли в pcDNA3.1(+) (Invitrogen) с использованием рестрикционных ферментов Nhe1 и EcoR1, а вектор экспрессии CD16 трансфицировали в клетки NK-92MI с помощью электропорации.
4
4

После отбора устойчивой клеточной линии с соединением G418 сверхэкспрессирующую клеточную линию выделяли с помощью оборудования FACS Aria. Чтобы подтвердить эффект экспрессии клаудина 3 в различных раковых клетках, уровень экспрессии клаудина 3 в каждой клетке сначала подтвердили проточной цитометрией с этим антителом, а затем сравнили MFI (средняя интенсивность флуоресценции) (см. фиг. 12a-12e). Обработку антителом и проточную цитометрию клеток проводили таким же образом, как в Примере 3-2. Чтобы наблюдать антителозависимую цитотоксичность, каждую клетку добавляли в 96-луночный планшет по 2×10 клеток и культивировали в течение 24 часов. После обработки контрольного антитела (ChromePure Human IgG, 009-000-003, Jackson ImmonoResearch) или антитела 4G3 0 нг/мл, 0,1 нг/мл, 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл, 1000 нг/мл и 10000 нг/мл, клетки NK-92MI-CD16 добавляли к каждой из 8×10 клеток и культивировали при 37°C в течение 4 часов. Чтобы измерить LDH (лактатдегидрогеназу), из которой растворяются клетки, супернатант отбирали после центрифугирования и измеряли оптическую плотность при 490 нм с помощью CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (G1780, Promega). Формула расчета для измерения антителозависимой цитотоксичности выглядит следующим образом:
В результате анализа фиг. 13a-13e видно, что цитотоксичность не наблюдалась в группе, обработанной контрольным антителом (контрольный IgG), а в группе, обработанной антителом 4G3, цитотоксичность наблюдалась в клетках, экспрессирующих клаудин 3. При сравнении эффекта ADCC в соответствии с уровнем экспрессии клаудина 3, когда значение MFI экспрессии клаудина 3 увеличивалось, цитотоксическая EC50 имела тенденцию к снижению.
В указанном выше эксперименте клетки NK-92MI-CD16, непрерывно экспрессирующие CD16 (FcγRIIIa), проявляют цитотоксический эффект в отношении антигена клаудина 3, что позволяет предположить, что раковые клетки могут быть уничтожены с помощью механизма, аналогичного принципу технологии CAR-NK. Фактически, оценка эффективности ADCC показала, что тенденция эффективности была согласованной в соответствии с экспрессией клаудина 3, что указывает на то, что разработанное антитело можно применять для получения клеток CAR-NK.
Пример 7: Подтверждение способности нацеливания на опухоли in vivo
6
Животную модель ксенотрансплантата опухоли получали путем суспендирования 5×10 клеток рака яичников человека OVCAR-3 (ATCC) и клеток рака молочной железы T47D (ATCC) в 100 мкл PBS и их подкожной инъекции в нижнюю часть бока 6-недельной бестимусной голой мыши-самки. В случае T47D пеллеты 17β-эстрадиола (SE-121, Innovative Research of America) вводили с ними подкожно.
Чтобы подтвердить способность антитела по настоящему изобретению нацеливаться на опухоли in vivo, контрольное антитело (ChromePure Human IgG, 009-000-003, Jackson ImmonoResearch) и антитело 4G3 конъюгировали с флуорофором CF750 с использованием набора для быстрой маркировки антител VivoBriteTM. (92161, Biotium). Измеренное молярное соотношение флуоресценция/антитело (степень мечения, DOL) составило 2,29 и 2,82 соответственно согласно рекомендуемым ожидаемым соотношениям согласно формуле, предоставленной в наборе.
На 60-й день после имплантации опухоли животной модели контрольное антитело или антитело 4G3, меченное флуоресцентной меткой CF750, вводили внутривенно в дозе 100 мкг/100 мкл. Сигнал флуоресценции, испускаемый мышью, был обнаружен с использованием системы биометрической визуализации мелких животных через 6 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа и 96 часов, а печень, почки, легкие, селезенка, тонкий кишечник и опухоль были вырезаны для подтверждения сигнала флуоресценции распределения антител по тканям в последний момент времени. Сигналы флуоресценции анализировали с использованием программного обеспечения Living Imaging Software, поставляемого производителем.
Как показано на фиг. 14а и 14b, было подтверждено, что антитело 4G3 по настоящему изобретению специфично нацелено на трансплантированную опухоль по прошествии времени по сравнению с контрольным антителом, и оно накапливалось в опухоли по сравнению с другими тканями.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Изобретение по настоящей заявке относится к применению антитела, связывающегося конкретно с ECL-2 клаудина 3, и его функциональным фрагментам при обнаружении раковых клеток, диагностике, визуализации и применении для лечения рака (противоопухолевое применение самого антитела и применение к ADC и CAR-экспрессирующим клеткам (особенно иммунным клеткам)), антителу, которое включает характерную последовательность CDR, оказывающую заметный эффект при таких применениях, и его функциональному фрагменту.
Антитела и их функциональные фрагменты, которые специфически связываются с ECL-2 клаудина 3, более эффективны при обнаружении раковых клеток, диагностике, визуализации и применении для лечения рака (применение к ADC и CAR-экспрессирующим клеткам (особенно иммунным клеткам)), чем другие виды раковых антигенов или обычных антител, нацеленных на ECL-1 клаудина 3. В частности, в качестве конкретного примера этого, антитело, содержащее уникальную последовательность CDR, предусмотренную настоящим изобретением, не только само по себе обладает противораковой способностью, но также демонстрирует превосходную способность к нацеливанию на раковые клетки без перекрестной реактивности с другими семействами клаудина. Оно также полезно для неклинических экспериментов по оценке токсичности и эффективности из-за связывания с клаудином 3 мыши, демонстрирует превосходную силу связывания (аффинность), обладает такими свойствами, как интернализация в клетки, и, таким образом, проявляет замечательные эффекты при использовании в вышеуказанном применении. Следовательно, оно имеет широкое промышленное применение в диагностической и фармацевтической промышленности.
--->
<110>    АБИОН ИНК.
<120>    АНТИТЕЛО, СПЕЦИФИЧЕСКИ СВЯЗЫВАЮЩЕЕСЯ С ECL-2 КЛАУДИНА 3,
ЕГО ФРАГМЕНТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130>    OP20-0072/PCT/RU
<150>    PCT/KR2019/003594
<151>    2019/03/27
<150>    KR 10-2018-0036190
<151>    2018-03-28
<160>    23
<170>    KoPatentIn 3.0
<210>    1
<211>    220
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    CLDN3(homo sapiens)
<400>    1
Met Ser Met Gly Leu Glu Ile Thr Gly Thr Ala Leu Ala Val Leu Gly
1               5                  10                  15
Trp Leu Gly Thr Ile Val Cys Cys Ala Leu Pro Met Trp Arg Val Ser
20                  25                  30
Ala Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Gln Asn Ile Trp Glu Gly
35                  40                  45
Leu Trp Met Asn Cys Val Val Gln Ser Thr Gly Gln Met Gln Cys Lys
50                  55                  60
Val Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Leu Pro Gln Asp Leu Gln Ala Ala Arg
65                  70                  75                  80
Ala Leu Ile Val Val Ala Ile Leu Leu Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val
85                  90                  95
Ala Leu Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala
100                 105                 110
Lys Ala Lys Ile Thr Ile Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Leu Ala Ala
115                 120                 125
Leu Leu Thr Leu Val Pro Val Ser Trp Ser Ala Asn Thr Ile Ile Arg
130                 135                 140
Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met Gly
145                 150                 155                 160
Ala Gly Leu Tyr Val Gly Trp Ala Ala Ala Ala Leu Gln Leu Leu Gly
165                 170                 175
Gly Ala Leu Leu Cys Cys Ser Cys Pro Pro Arg Glu Lys Lys Tyr Thr
180                 185                 190
Ala Thr Lys Val Val Tyr Ser Ala Pro Arg Ser Thr Gly Pro Gly Ala
195                 200                 205
Ser Leu Gly Thr Gly Tyr Asp Arg Lys Asp Tyr Val
210                 215                 220
<210>    2
<211>    16
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Последовательность внеклеточной 2-й петли CLDN3
<400>    2
Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln Lys Arg Glu Met
1               5                  10                  15
<210>    3
<211>    5
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VH-CDR1 4G3
<400>    3
Ser Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>    4
<211>    17
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VH-CDR2 4G3
<400>    4
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Ala Ser Thr Ser His Ala Gln Arg Phe Gln
1               5                  10                  15
Gly
<210>    5
<211>    10
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VH-CDR3 of 4G3
<400>    5
Arg Tyr Gly Arg Tyr Gly Ser Phe Asp Ile
1               5                  10
<210>    6
<211>    13
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VL-CDR1 4G3
<400>    6
Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Arg Asn Tyr Val Ser
1               5                  10
<210>    7
<211>    7
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VL-CDR2 4G3
<400>    7
Asp Thr Ser Asn Lys His Phe
1               5
<210>    8
<211>    9
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VL-CDR3 4G3
<400>    8
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Lys Val Val
1               5
<210>    9
<211>    92
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер для легкой цепи 4G3
<400>    9
attcgatcga tatggagaca gacacactcc tgctatgggt actgctgctc tgggttccag         60
gttccacgtg gcagagcgtg ctgacccagc ct                                       92
<210>    10
<211>    33
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер для легкой цепи 4G3
<400>    10
agccaccgta cgcagcacgg tcagcttggt acc                                      33
<210>    11
<211>    92
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Прямой праймер для тяжелой цепи 4G3
<400>    11
attcgatcga tatggagaca gacacactcc tgctatgggt actgctgctc tgggttccag         60
gttccacgtg ggaagtgcag ctgctggaaa gt                                       92
<210>    12
<211>    33
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Обратный праймер для тяжелой цепи 4G3
<400>    12
cttggtgcta gcgctgctca cggtcaccag agt                                      33
<210>    13
<211>    119
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VH KM3907(ссылка на патент EP2138576A1)
<400>    13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                  10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Ile Ser Thr Ser
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asn Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50                  55                  60
Met Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Thr Arg Gly Asp Arg Trp Ser Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210>    14
<211>    108
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VL KM3907(ссылка на патент EP2138576A1)
<400>    14
Gly Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                  10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Trp
35                  40                  45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu
65                  70                  75                  80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Phe Pro
85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105
<210>    15
<211>    468
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Тяжелая цепь KM3907
<400>    15
Met Glu Trp Pro Cys Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Glu Gly
1               5                  10                  15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Ile
35                  40                  45
Ser Thr Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asn Pro Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gly Lys Phe Met Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Pro Ser Ser
85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100                 105                 110
Tyr Phe Cys Thr Arg Gly Asp Arg Trp Ser Gly Ala Met Asp Tyr Trp
115                 120                 125
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130                 135                 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145                 150                 155                 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165                 170                 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180                 185                 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195                 200                 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210                 215                 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225                 230                 235                 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245                 250                 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260                 265                 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405                 410                 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210>    16
<211>    237
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Легкая цепь KM3907
<400>    16
Met Asp Phe Leu Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1               5                  10                  15
Val Ala Met Ser Arg Gly Gly Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
20                  25                  30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser
35                  40                  45
Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly
50                  55                  60
Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65                  70                  75                  80
Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
85                  90                  95
Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100                 105                 110
Gln Tyr Ser Gly Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu
115                 120                 125
Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130                 135                 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145                 150                 155                 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165                 170                 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180                 185                 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195                 200                 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210                 215                 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>    17
<211>    15
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    Линкер
<400>    17
ggggsggggs ggggs                                                          15
<210>    18
<211>    5
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VH-CDR1 2B4
<400>    18
Gly Tyr Tyr Trp Ser
1               5
<210>    19
<211>    17
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VH-CDR2 2B4
<400>    19
Thr Ile His Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Gln
1               5                  10                  15
Gly
<210>    20
<211>    9
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VH-CDR3 2B4
<400>    20
Arg Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Asp Ile
1               5
<210>    21
<211>    11
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VL-CDR1 2B4
<400>    21
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ala Ser Asp Leu Ala
1               5                  10
<210>    22
<211>    7
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VL-CDR2 2B4
<400>    22
Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1               5
<210>    23
<211>    9
<212>    ПРТ
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    VL-CDR3 2B4
<400>    23
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr
1               5
<---