Сравнительное изучение адъювантных свойств препаратов хитозана при парентеральной иммунизации инактивированной гриппозной вакциной

Сравнительное изучение адъювантных свойств препаратов хитозана при парентеральной иммунизации инактивированной гриппозной вакциной

Н.К. Ахматова (anelly@mail.ru), С.Г. Маркушин (sm1937@yandex.ru), Г.Г. Кривцов, И.И. Акопова, И.Б. Коптяева, А.Д. Переверзев, В.Д. Лотте, А.С. Сухно, О.В. Борисова, Ю.З. Гендон

НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

Резюме

Исследовали влияние производных хитозана на отдельные звенья иммунного ответа при иммунизации мышей инактивированной гриппозной вакциной Ваксигрип, содержащей производные хитозана в качестве адъювантов. Показано, что препараты хитозана при парентеральном введении совместно с инактивированной гриппозной вакциной вызывают активацию механизмов как врожденного, так и адаптивного иммунитета, что подтверждается повышением численности субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, ЫК, ЫКТ, уЬТ-клеток, а также клеток, экспрессирующих Т1Н2 и Т1Н9. Парентеральное введение вакцины в комбинации с препаратами хитозана корригировало содержание числа клеток, экспрессирующих МНС II, устраняя повышенную реактивность клеток иммунной системы под воздействием вакцины. Показано, что активность микро/наночастиц сульфата хитозана как адъюванта была выше по сравнению с активностью глютамата хитозана. Полученные данные позволяют предположить, что включение различных форм хитозана в инак-тивированную гриппозную вакцину в процессе вакцинации позволяет корригировать переключение иммунного ответа с ТЬ2- на ТЬ1-путь.

Ключевые слова: инактивированная гриппозная вакцина, глютамат хитозана, микро/наночастицы сульфата хитозана, адъюванты, вакцинация, иммунитет, Т- и В-лимфоциты

Comparative Investigation of Adjuvant Properties of Chitosan Derivatives after Parenteral Immunization by Inactivated Influenza Vaccine

N.K. Akhmatova (anelly@mail.ru), S.G. Markushin (sm1937@yandex.ru), G.G. Krivtsov, I.I. Akopova, I.B. Koptiaeva, A.D. Pereverzev, V.D. Lotte, A.S. Suchno, O.V. Borisova, Yu.Z. Gendon I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera RAMS, Moscow (instmech@iitp.ru) Abstract

The influence of chitosan derivatives as adjuvants on different branches of immune response after immunization of mice by inactivated influenza vaccine Vaccigrip was investigated. It was shown, that chitosan derivatives after parenteral introduction in common with inactivated influenza vaccine caused the activation of innate as well as adaptive immunity. That is confirmed by the increase of subpopulations T- and B-lymphocytes quantity, NK, NKT, yôT cells and also cells, which expressed TLR2- and TLR9-receptors. Parenteral introduction of vaccine in common with chitosan derivatives corrects the quantity of cells, which expressed MHCII - markers and decreased heightened reactivity of immune system's cells under influence of vaccine. The activity of micro/nanoparticles of chitosansulfat particles as adjuvant was higher in comparison with activity of chitosan glutamate. Obtained data allowed to propose, that the including of different chitosan derivatives in inactivated influenza vaccine in the process of vaccination can correct switching over of immune response from Th2 to Th1 way.

Key words: inactivated influenza vaccine, chitosan glutamate, micro/nanoparticles chitosansulfat, adjuvants, vaccination, immunity, T- and B-lymphocytes

Введение

Инактивированные гриппозные вакцины являются одним из наиболее эффективных средств профилактики гриппа. Однако этот вид вакцин обладает сниженными защитными свойствами при иммунизации лиц пожилого возраста и плохо защищает от дрейфовых вариантов вируса гриппа [4, 6].

Для повышения иммуногенности инактивиро-ванных гриппозных вакцин используют адъюванты различного происхождения, в частности, в последние годы привлек внимание хитозан - кати-

онный полисахарид, производное природного ами-нополисахарида хитина, используемый как в виде растворов солей, так и в виде нано- и микрочастиц. Механизмы адъювантного действия хитозана остаются малоизученными. Показано, что мукозальное введение чистого хитозана лабораторным животным индуцирует синтез цитокинов, таких как ТИРа, 11.-12, И-4, 11.-10, ТОРр, а также способствует активации Т-лимфоцитов. В процессе поглощения хитозана иммунными клетками наблюдается увеличение процента дендритных клеток ОХ62+, кото-

рые увеличивают присутствие на своей поверхности антигенов II класса главного комплекса гисто-совместимости, без изменения экспрессии кости-муляторных молекул CD80 и CD86. Обнаружено повышение удельного содержания CDS-клеток [12]. Однако эти эффекты были отмечены при мукозаль-ном введении чистого хитозана.

Хитозан также был успешно использован в качестве адъюванта при парентеральном введении инактивированных гриппозных вакцин [7, 8]. При этом была показана способность препарата существенно увеличивать иммуногенность инактивированных гриппозных вакцин и индуцировать образование антител против дрейфовых вариантов вируса гриппа. Выявлены высокие адъювантные свойства различных форм хитозана, включая хито-зановые наночастицы и микрочастицы [5, 10, 13]. Вместе с тем механизмы адъювантного действия хитозана при парентеральном введении в комбинации с вирусными вакцинами только начинают изучаться [1].

В данной статье описана наша попытка оценить способность двух различных форм хитозана воздействовать на различные звенья иммунного ответа при парентеральном введении в комбинации с инактивированными гриппозными вакцинами. Эта работа - продолжение наших исследований, которые выявили способность хитозана, вводимого мышам парентерально вместе с инактивирован-ной гриппозной вакциной, усиливать клеточный иммунитет. По современным требованиям адъю-ванты для вакцин должны обладать способностью активировать клеточный иммунитет, поскольку защита против дрейфовых вариантов вируса гриппа может быть обусловлена клеточным иммунитетом, который обладает не столь высокой специфичностью по отношению к близким антигенам, как гуморальные антитела. Важным показателем действия иммунопрепаратов на эффекторные механизмы врожденного иммунитета и направленность развития адаптивного иммунитета является оценка суб-популяционной структуры лимфоцитов. В связи с этим особое внимание было уделено влиянию препаратов хитозана при комбинированном введении с инактивированными гриппозными вакцинами на иммунофенотип мононуклеарных лимфоцитов селезенок мышей.

Материалы и методы

Антигены. В работе использовали инактивиро-ванные гриппозные вакцины сезона 2009/2010 годов Ваксигрип (Sanofi Pasteur, Франция) и Флюарикс (GlaxoSmithKlein).

Вирусы. В реакции торможения гемагглю-тинации и ИФА применяли вирусы A(H1N1)/ Brisbane/59/2007, A(H3N2)/Urugway/1716/2007, A(H1N1)IVR-116, A(H3N2)IVR-149.

Хитозан. В качестве адъювантов для гриппозных вакцин был взят раствор глютамата хитозана (МВ 300 кДа), деацетилированного на 85%,

в конечной концентрации - 0,5% (рН 6,2) [2], и суспензия микро/наночастиц сульфата хитозана (диаметром 500 - 1000 нм), полученная путем добавления к раствору хитозана сульфата натрия (25 ммоль) как фактора, способствующего разделению фаз. В экспериментах применялась 0,5% суспензия микрочастиц хитозана в 0,2 М фосфатном буфере (рН 6,2), содержащем 0,14 М NaCl.

Мыши. В работе использовали мышей линии СВА, а также беспородных белых мышей (весом 10 - 12 г).

Иммунизация. К инактивированным гриппозным вакцинам добавляли равные количества 1% раствора глютамата хитозана или 1% суспензии микро/наночастиц сульфата хитозана либо буферный раствор (контроль). Мыши были вакцинированы внутримышечно 0,2 мл препарата, содержащего по 3 мкг каждого компонента вакцины в комбинации с одним из компонентов: 0,5% глютамата хитозана, 0,5% микро/наночастиц сульфата хитозана или буфер. Мышей вакцинировали двукратно. Вторую прививку проводили на 21-й день после первой. Через 10 дней после второй дозы у животных брали кровь в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», а также извлекали легкие и различные отделы респираторного тракта.

Анализ ингибирующих гемагглютинацию антител. Сыворотку крови иммунизированных животных обрабатывали рецепторразрушающим энзимом (RDE). Начальное разведение сывороток равнялось 1:10 и затем производилось по стандартной методике [11].

ИФА для определения вирус-специфических IgG и IgA проводили по описанной методике [14] в 96-луночных планшетах (Corning Incorporated 3591), которые предварительно сенсибилизировали 400 ГАЕ/0,1 мл концентириро-ванного и очищенного штамма A(H1N1)IVR-116 или A(H3N2)IVR-149. За конечное разведение принимали наивысшее разведение оптической плотности (ОП) образца при 490 нм, превышающее среднюю ОП в контрольных образцах более чем на три стандартных отклонения.

Определение защитной эффективности вакцинных препаратов. Мышей линии СВА, иммунизированных гриппозными вакцинами с препаратами хитозана или буфером, через 10 дней после второй прививки инфицировали интраназально различными разведениями эпидемического штамма вируса гриппа A(H1N1)/Brisbane/59/2007. Инфекционный материал вносили под эфирным наркозом животным по 25 мкл в каждую ноздрю. Через 72 часа после инфицирования мышей забивали, извлекали легкие, гомогенизировали и готовили 10% суспензию. Материалы каждой группы, зараженной одним разведением вируса, объединяли. Далее проводили титрование материалов в 10-дневных куриных эмбрионах. Титры вируса определяли по методу Рида и Менча.

Выделение мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) селезенок мышей. Через сутки и спустя семь суток после первой и второй иммунизации у животных извлекали селезенку под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». В каждой группе было использовано по 10 животных. Селезенки мышей гомогенизировали, добавляли среду 199. Затем полученную взвесь спле-ноцитов центрифугировали при 400 g в течение 30 минут в градиенте плотности фиколл-урографин (Pharmacia, плотность 1,077 г/см3). МЛ, образовавшие интерфазное кольцо, собирали пипеткой и трехкратно отмывали в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g. Концентрацию клеток доводили до 1 x 106.

Проточная цитометрия (FACS-анализ) и характеристика антител. Оценку субпопуляцион-ной структуры лимфоцитов осуществляли методом проточной цитометрии с применением монокло-нальных антител (МКА) (фирмы Caltag Laboratories, США) против клеточных антигенов. Клетки отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ) с 1% фетальной телячьей сывороткой (ФТС) и окрашивали FITC- и PE-меченными антителами согласно инструкции производителя. Отмывали два раза холодным ФСБ. Результаты учитывали на проточном цитометре Facs Calibur (фирмы Becton Dickinson, США). На МЛ селезенок мышей исследовали уровни экспрессии молекул субпопуляций Т- и В-клеток ^D3, CD4, CD8, CD25, СD19, CD5, уб-Т-клетки), NK-клеток и белков MHC II класса. Также оценивали содержание клеток, экспресси-рующих TLRs. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 5000 клеток в гейте. Статистическая обработка материала для оценки суб-популяционной структуры проведена при помощи программного пакета WINMDI 2.8.

Культивирование клеток К562. Клетки-мишени опухолевой линии клеток К-562 (эритро-бластный лейкоз человека), чувствительной к NK, культивировали в среде RPMI-1640 («ПанЭко», Россия) с добавлением 5% фетальной сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина при 37 °С в атмосфере 4% СО2.

Электронно-микроскопическое исследование микро/наночастиц сульфата хитозана. 0,025% суспензию микрочастиц сульфата хитозана адсорбировали на электронно-микроскопические сеточки, покрытые формваровой пленкой, стабилизированной углеродом, и без промывки контрастировали 1% уранилацетатом и 50° этанолом. Препараты исследовали в электронном микроскопе JEM-100CX фирмы JEOL (Япония) при инструментальном увеличении в 10 тыс. раз, 80 кВ и апертур-ной диафрагме 50 мкм. Фотографирование проводили на фотопленку Agfa Alliace Camera CE.

Цитотоксический тест. Для выявления цито-токсической активности МЛ селезенок использовали тест восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест). Ци-тотоксическую активность МЛ определяли на линии К-562. Опухолевые клетки (3 х 104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МЛ в соотношении 1:5 в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (Costar, Франция) 18 часов при 37 °С и 4% СО2. Затем в лунки добавляли 5% витальный краситель МТТ (Sigma, США) и по оптической плотности при длине волны 540 нм, измеряемой на муль-тискане MS (Labsystem, Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (процент цито-токсичности).

Окончательную статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стью-дента и критерия Вилкоксона при помощи стандартного пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 6.0).

Результаты и обсуждение

Электронно-микроскопическое исследование микрочастиц сульфата хитозана. При исследовании в электронном микроскопе микрочастицы сульфата хитозана представляли собой мономорф-ные гранулярные образования с неровными краями (рис. 1) высокой электронно-оптической плотности. Их диаметр составлял 500 нм, хотя в препарате присутствовало небольшое количество и более мелких частиц диаметром 300 нм и менее. Структура наночастиц не была гомогенной, скорее ее можно охарактеризовать как слоисто-волокнистую. В препарате наночастицы выявлялись в виде хорошо диспергированных дискретных образований, не проявлявших тенденции к агрегации.

На следующем этапе нашей работы было проведено сравнительное изучение адъювантных свойств раствора глютамата хитозана и суспензии микро/наночастиц сульфата хитозана при парентеральной иммунизации мышей инактивированны-ми гриппозными вакцинами Ваксигрип и Флюа-рикс. Как видно из таблицы 1, введение различных форм хитозана в состав инактивированных гриппозных вакцин приводило к существенному повышению гуморального иммунного ответа. Титр сывороточных антител, ингибирующих гемагглютина-цию, повышался в 16 раз к штамму A(H1N1) и в 8 раз к штамму A(H3N2) при парентеральном введении вакцины Флюарикс как с раствором глютамата хитозана, так и с микро/наночастицами сульфата хитозана по сравнению с данной вакциной без адъюванта. При парентеральном комбинированном введении вакцины Ваксигрип с препаратами хитозана наблюдалось четырехкратное повышение антител, ингибирующих гемагглютина-цию, по сравнению с контролем. Сходная картина наблюдалась и в отношении сывороточных IgG у иммунизированных мышей. Отмечалось повышение титра сывороточных антител при комбиниро-

Рисунок 1.

Электронно-микроскопическое исследование микрочастиц сульфата хитозана

ванном введении инактивированных гриппозных вакцин как с раствором глютамата хитозана, так и с микро/наночастицами сульфата хитозана по сравнению с вакцинами, вводимыми без адъюван-та, причем глютамат хитозана оказывал более активное действие.

На следующем этапе работы изучали влияние препаратов хитозана на индукцию секреторных антител при совместном парентеральном введении мышам инактивированных гриппозных вакцин. Как видно из таблицы 1, наблюдались крайне невысокие количества ^ в легких, носоглотке и трахее животных, иммунизированных вакциной Ваксигрип, содержащей препараты хитозана.

В легких, носоглотке и трахее мышей, иммунизированных вакциной Флюарикс с препаратами хитозана, отмечены следовые количества секреторных антител.

Полученные данные свидетельствуют о возможности повышения сывороточных ^ животных, иммунизированных инактивированными гриппозными вакцинами в комбинации с препаратами хитозана. С другой стороны, парентеральное введение инактивированных гриппозных вакцин, содержащих препараты хитозана в качестве адъювантов, неспособно повлиять на повышение уровня секреторных ^ во всех отделах респираторного тракта.

Таблица 1.

Сравнительное изучение адъювантных свойств 0,5% раствора глютамата хитозана и 0,5% суспензии микро/наночастиц сульфата хитозана в конечной концентрации

при парентеральной иммунизации инактивированными гриппозными вакцинами Ваксигрип и Флюарикс

препарат Титры сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию, у иммунизированных мышей Титры сывороточных IgG у иммунизированных мышей

A(H1N1)* A(H3N2)** A(H1N1) A(H3N2) носоглотка трахея легкие

Ваксигрип с 0,5% раствором глютамата хитозана 1280 2560 204 800 > 819 200 40 20 80

Ваксигрип с 0,5% суспензией микро/наночастиц сульфата хитозана 1280 2560 51 200 204 800 20 20 40

Ваксигрип с физраствором 320 640 2500 10 200 20 10 40

Флюарикс с 0,5% раствором глютамата хитозана 640 2560 102 400 409 600 20 < 10 < 10

Флюарикс с 0,5% суспензией микро/наночастиц сульфата хитозана 640 1280 51 200 819 200 20 10 20

Флюарикс с физраствором 40 320 12 800 102 400 10 < 10 20

Контроль (сыворотка неиммунных мышей) < 20 < 20 - - - - -

" A(H1N1)/Brisbane/59/2007/; ** A(H3N2)/Urugway/1716/2007/; *** A(H1N1)IVR-116.

Таблица 2.

Сравнительное изучение защитного эффекта иммунизации мышей вакциной Ваксигрип в комбинации с препаратами хитозана

размножение вируса в легких иммунизированных мышей, инфицированных затем интраназально различными разведениями вирулентного штамма A(H1N1)/Brisbane/59/2007

доза вирулентного штамма Brisbane неиммунизированные мыши (контроль) мыши, иммунизированные парентерально вакциной Ваксигрип с физраствором мыши, иммунизированные парентерально вакциной Ваксигрип с 0,5% раствором глютамата хито-зана мыши, иммунизированные парентерально вакциной Вакси-грипп в комбинации с 0,5% суспензией микро/наночастиц сульфата хитозана

107 ЭИД50/0,05 мл 106 ЭИД50/0,05 мл 105 ЭИД50/0,05 мл 104 ЭИД50/0,05 мл 103 ЭИД50/0,05 мл 102 ЭИД50/0,05 мл 101 ЭИД50/0,05 мл 4/4* 4/4 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 0/4 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 2/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4

Примечание: Мышей линии СВА, иммунизированных вакциной Ваксигрип с препаратами хитозана или буфером, через 10 дней после второй иммунизации инфицировали интраназально различными разведениями эпидемического штамма А(НШ1)/Вг1зЬапе/59/2007. Через 72 часа мышей забивали, извлекали легкие, готовили 10% суспензию. Материалы каждой группы, инфицированной одним разведением вируса, объединяли. Каждым разведением заражали четыре куриных эмбриона и определяли размножение вируса через 48 часов.

* В знаменателе - количество инфицированных вирионов, в числителе - количество эмбрионов, где наблюдалось размножение вируса.

На следующей стадии изучения проведен сравнительный анализ защитного эффекта инактивированных гриппозных вакцин, содержащих в качестве адъювантов различные формы хитозана. С этой целью были двукратно парентерально иммунизированы инактивирован-ной гриппозной вакциной Ваксигрип, а также этой же вакциной, содержащей препараты хитозана, три группы мышей линии СВА. Контрольную груп-

пу составляли неиммунизированные мыши. Через 10 дней после второй иммунизации мышей интраназально инфицировали вирулентными для мышей вирусами штамма A(H1N1)/Brisbane/59/2007 в различной концентрации и определяли защитный эффект вакцины по степени размножения данного штамма в легких иммунизированных мышей. Как видно из таблицы 2, инфекционная доза 102 ЭИД штамма A(H1N1)/Brisbane/59/2007

была способна вызвать размножение вируса в легких неиммунизированных мышей. Если мыши были иммунизированы парентерально вакциной Ваксигрип, инфекционная доза штамма A(H1N1)/ Brisbane/59/2007, необходимая для размножения вируса в легких мышей, значительно повышалась и составляла 104,5 ЭИД50. Комбинированное введение вакцины Ваксигрип с глютаматом хитозана существенно увеличивало защитную эффективность вакцины: теперь только инфекционная доза штамма A(H1N1)/Brisbane/59/2007, равная 1065 ЭИД50, могла вызвать инфекционный процесс в легких иммунизированных животных. Введение в вакцину суспензии микро/наночастиц сульфата хитозана приводило к еще более выраженному росту инфекционной дозы вирулентного штамма, способной вызвать инфекционный процесс в легких мышей.

Как видно из таблицы 2, защитная эффективность вакцины Ваксигрип при добавлении к ней препаратов хитозана возрастала на 2 - 2,5 lg.

Было важно выяснить, какие изменения произошли в иммунной системе мышей под влиянием вакцины в комбинации с препаратами хитозана, которые позволили повысить защитную эффективность вакцины. С этой целью мы в первую очередь исследовали влияние парентерального введения инактивированной гриппозной вакцины Вакси-грип, содержащей препараты хитозана, на субпопу-ляционную структуру лимфоцитов мышей. Вакцина без адъюванта в исследуемые сроки не увеличивала существенно содержания клеток, экспресси-рующих дифференцировочные маркеры, за исключением активационного маркера МНС II (табл. 3). Численность активированных клеток повышалась на седьмые сутки после одно- и двукратного введения вакцины почти в 1,6 раза по сравнению с контролем (физраствор).

Глютамат хитозана увеличивал численность Т-клеток (CD3) в 1,7 раза уже при однократном введении, а микро/наночастицы сульфата хитоза-на статистически значимо повышали их количество на седьмые сутки после двукратной аппликации (в 1,35 раза). Численность NK повышалась более чем в 3 раза на первые сутки после после одно-и двукратной аппликации как глютамата хитозана, так и микро/наночастиц сульфата хитозана. Количество NKT-клеток под воздействием микро/наночастиц сульфата хитозана увеличивалось с 0,53 (контроль) до 2,63% во все сроки наблюдения, в то время как глютамат хитозана увеличивал их количество до 1,5% только после двукратного введения. Количество Т-хелперов (CD4) значимо увеличивалось (в 1,5 раза) только при втором введении на седьмые сутки, в то время как численность Т-регуляторных клеток (CD4/CD25/Foxp3) повышалась уже при однократном введении на первые сутки в 2,4 раза. Как глютамат хитозана, так и микро/наночастицы сульфата хитозана увеличивали количество цитоток-сических лимфоцитов в 1,8 раза на седьмые сутки после двукратного введения препаратов хитоза-

на. При этом в крови мышей обнаруживались активированные клетки (МНС II-позитивные) практически во все сроки наблюдения (за исключением раствора глютамата хитозана, первые сутки при однократном введении). Это можно рассматривать как закономерное явление, поскольку молекула МНС II является более поздним маркером активации клеток.

Вакцина в комплексе с глютаматом хитоза-на повышала уровень Т-лимфоцитов с 24,4 (контроль) до 37,3%, а в комплексе с микро/наночасти-цами сульфата хитозана в последний срок наблюдения - до 56,1%. Количество NK при введении вакцины с глютаматом хитозана достигало 7,1% через сутки после однократного введения и 12,3% -после двукратного. Аналогичные результаты отмечались и с микро/наночастицами сульфата хито-зана при их комбинировании с вакциной, когда в первые сутки при одно- и двукратном введении содержание NK доходило до 11 и 9,55% соответственно. Следует учесть, что хитозан как в растворе, так и в микро/наночастицах в сочетании с вакциной увеличивал число NKT-клеток до 6,6 и 5,9% соответственно.

Количество Th-клеток ^D4) также повышалось при введении микро/наночастиц сульфата хитозана с вакциной - с 25,06 до 32,53% и при введении вакцины с глютаматом хитозана - с 22,6 до 28,4% (против 16,4% в группе контроля). При этом происходила активация хелперов, на что указывает повышение численности клеток с экспрессией раннего маркера активации CD25. Оледует учесть, что хитозан (как в виде глютамата, так и в виде ми-кро/наночастиц) незначительно влиял на содержание клеток, экспрессирующих CD4, что указывает на его адъювантное действие по отношению к вакцине. Наряду с активацией клеток в селезенках мышей возрастала численность популяции Т-регуляторных клеток с позитивной экспрессией CD4/CD25/Foxp3, что может свидетельствовать о включении регуляторных механизмов активации/ супрессии иммунного ответа. Отличительной особенностью инактивированной гриппозной вакцины является значительное усиление реактивности иммунокомпетентных клеток (повышение МНС II в 1,5 - 2,27 раза по отношению к контролю) без нарастания T-регуляторных.

Количество цитотоксических лимфоцитов (CD8) при комбинированном введении вакцины с глютаматом хитозана повышалось с 15,46 до 21%, а при введении вакцины с микро/наночастицами сульфата хитозана - с 19,5 до 23%, в то время как сам глютамат и микро/наночастицы сульфата хитозана только на седьмые сутки после второго введения повышали уровень CD8 приблизительно до 13%.

Субпопуляция yôT-клеток также увеличивалась в численности в сравнении с контролем - в 3,3 -4,9 и 3,6 - 4,8 раза при введении вакцины с глютаматом хитозана и микро/наночастицами хитозана соответственно.

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 3 (58)/2011

Таблица 3.

Влияние хитозана на иммунофенотип лимфоцитов при комбинированном введении с инактивированной вакциной Ваксигрип

О) =1

Препарат Количество клеток, %

СЭЗ ГЖ СОЗ/ЫК СЭ4 СЭ25 С04/ СЭ25/РохрЗ СЭ8 мнем убТ СЭ19 СЭ5

Контроль (физраствор) 24,4 ±2,1 2 ±0,3 0,53 ± 0,15 16,4 ± 2,4 1,13 ± 0,25 0,8 ±0,35 7,27 ±1,15 20 ±4,5 0,33 ± 0,15 20,6 ± 2,15 0,97 ±0,3

Ваксигрип 1 -е сутки 29,3 ±3,1 2,13 ± 0,4 0,4 ±0,45 19,4 ±2,15 0,73 ±0,55 1,033 ±0,3 9,53 ± 1,8 25,1 ±2,6 0,266 ±0,25 18,5 ± 2,15 0,6 ± 0,1

7-е сутки 27,9 ±3,87 3,83 ±0,55 0,36 ± 0,15 19,8 ± 2,5 1 ±0,2 0,97 ±0,35 7,33 ±2,3 38,96 ± 1,76 0,3 ±0,3 13,7 ±3,75 0,57 ±0,3

2-я иммунизация, 1 -е сутки (22-е сутки после 1 -й иммунизации) 25,7 ±2,9 3,733 ±0,25 1,8 ±0,7 18,66 ± 1,95 0,9 ±0,25 1,15 ± 0,46 5,59 ± 1,065 42,27 ± 2,41 0,33 ±0,05 16,36 ± 1,95 0,66 ± 0,15

2-я иммунизация, 7-е сутки (28-е сутки после 2-й иммунизации) 23,3 ±2,26 3,1 ±0,5 0,933 ±0,3 22,23 ± 1,35 1,0±0,1 1,43 ±0,15 9,46 ±0,5 57,06 ±3,06 0,733 ±0,25 19,56 ±0,55 0,866 ± 0,15

Ваксигрип с 1% раствором хитозана 1 -е сутки 37,3 ±3,9 7,13± 1,25 3,7 ±0,45 22,6 ± 1,9 3,4 ±0,65 2,53 ±0,75 15,46 ± 1,95 32,86 ±2,3 0,9 ±0,35 22,7 ±4,45 1,83 ±0,25

7-е сутки 40,3 ± 3,11 6,1 ±2,4 2,6 ±0,45 24,56 ± 1,5 2,3 ±0,6 2,433 ±0,6 16,7± 1,95 35,2 ±5,9 0,83 ±0,3 23,4 ±3,1 1,36 ±0,15

2-я иммунизация, 1 -е сутки 36,5 ± 3,43 12,33 ±2,2 6,6 ±0,55 24,5 ±0,8 2,46 ±0,2 1,93 ±0,75 12,8 ± 1,35 29,9 ±2,5 1,1 ±0,2 24,26 ±2,1 1,53 ±0,3

2-я иммунизация, 7-е сутки 49,3 ±3,8 9,76 ±2,1 5,16 ± 0,35 28,43 ± 2,55 1,83 ±0,3 2,26 ±0,7 21,03 ± 1,65 35,66 ± 1,4 1,63 ±0,3 29,26 ± 1,85 1,9 ±0,25

Препарат Количество клеток, %

СЭЗ ГЖ соз/ык СЭ4 СЭ25 С04/ СЭ25/РохрЗ СЭ8 мнем убТ СЭ19 СЭ5

Ваксигрип + микрочастицы хитозана 1 -е сутки 45,6 ± 3,34 11,03 ± 2,95 4,33 ± 0,65 25,06 ± 4,05 3,91 ±1,685 2,59 ±0,86 19,5 ± 2,2 39,2 ±2,45 1,23 ±0,2 26,3 ±3,1 1,9 ± 0,2

7-е сутки 45,9 ± 3,55 5,5 ±0,3 2,5 ±0,5 28,2 ±2,35 3,2 ± 1,05 3 ± 0,35 16,73 ± 1,9 43,6 ±3,75 1,2 ± 0,5 30,83 ± 1,8 1,83 ±0,15

2-я иммунизация, 1 -е сутки 38,2 ± 2,15 9,55 ±0,83 5,93 ± 1,35 25,56 ±2,0 3,756 ± 0,815 1,96 ±0,55 13,7 ±2,1 28,4 ± 1,65 1,0 ±0,2 30,83 ± 2,35 1,7 ±0,099

2-я иммунизация, 7-е сутки 56,1 ±2,9 7,433 ± 0,55 4,533 ± 0,65 32,53 ± 1,75 1,73 ±0,3 2,23 ±0,6 23,73 ± 1,25 35,03 ± 1,25 1,6 ± 0,4 29,43 ± 3,95 1,533 ±0,25

Микрочастицы хитозана 1 -е сутки 29,3 ±3,1 7,2 ±0,85 2,3 ±0,3 20,62 ±2,2 1,7 ±0,35 2,43 ±0,4 9,23 ±0,65 33,6±3,1 0,43 ±0,15 21,83 ±2,45 1,23 ±0,25

7-е сутки 28,4 ±2,87 4,2 ±0,95 1,63 ±0,2 19,56 ± 1,75 1,03 ±0,3 1,43 ±0,3 9,06 ±0,3 40,9 ±2,95 0,73 ±0,3 22,9 ±2,85 1,9 ±0,45

2-я иммунизация, 1 -е сутки 29,43 ± 3,47 6,533 ±0,65 2,26 ± 0,25 20,2 ±0,95 1,433 ±0,15 2,1 ±0,25 8,66 ±0,35 36,16 ± 2,75 0,366 ±0,15 21,433 ± 1,05 1,566 ±0,3

2-я иммунизация, 7-е сутки 33,17 ± 1,8 4,16 ± 0,85 2 ±0,099 21,03 ± 1,25 0,833 ±0,2 1,933 ±0,35 13,13 ± 2,5 37,93 ±2,4 0,7 ±0,1 26,63 ±5 1,66 ±0,15

Хитозан 1 -е сутки 26,4 ±2,42 6,7 ± 0,6 0,96 ±0,25 18,03 ± 1,65 2,76 ±0,2 1,43 ±0,65 8,44 ±0,6 30,83 ±2,6 0,6 ± 0,1 18,93 ± 1,6 1,26 ±0,25

7-е сутки 33,06 ± 1 4,43 ± 1,05 0,96 ±0,2 22,6 ±2,35 0,96 ±0,25 1,5 ± 0,2 10,16 ± 2,05 37,96 ± 1,45 0,96 ±0,25 21,3± 1,5 1,46 ±0,25

2-я иммунизация, 1 -е сутки 29,1 ±3,05 5,933 ± 0,55 1,366± 0,3 19,4 ±2,45 1,0 ±0,3 1,5 ±0,3 8,866 ± 1,25 34,03 ± 1,1 0,633 ±0,2 20,37 ± 1,2 1,366 ±0,2

2-я иммунизация, 7-е сутки 37,2 ± 3,85 3,7 ±0,6 1,5 ± 0,2 24,2 ± 1,75 0,7 ±0,2 1,6 ±0,3 13,566 ± 0,5 37,433 ± 1,8 0,733 ±0,15 23,23 ± 1,6 1,5 ±0,2

Полужирным выделено (Р < 0,05) достоверное отличие от контрольной группы Ваксигрипа по критерию Вилкоксона и критерию Стьюдента.

ТТ02/(89) £ оЫ ехшхегафосШониГгаед и ви.кжоинэЬ'иие

Судя по количеству В-лимфоцитов, комбинация с глютаматом хитозана повышала активность вакцины в 1,4 раза (0019) только при двукратной иммунизации на седьмые сутки. Микро/наночасти-цы сульфата хитозана усиливали активность вакцины в 1,4 раза в более поздние сроки. Клеточная популяция В1 возрастала при комбинированном введении вакцины как с глютаматом хитозана, так и с микро/наночастицами сульфата хитозана приблизительно в 2 раза по сравнению с контрольной группой мышей.

Исследования экспрессии TLR. Как видно из таблицы 4, парентеральное введение вакцины Ваксигрип само по себе не повышало содержания клеток с То11-рецепторами. Микрочастицы хито-зана при парентеральном введении мышам увеличивали численность позитивных клеток ТЬЯ2 в 1,8 - 6,25 раза, при этом в комбинации с вакциной этот показатель в 3 - 6 раз превышал численность контрольных клеток. Глютамат хитозана увеличивал количество ТЬЯ2-экспрессирующих попу-

ляций в 2,25 - 4,3 раза, а в комбинации с вакциной наблюдалось несущественное повышение до 2-х раз только при двукратном введении через сутки.

В отношении ТЬЯ4-экспрессирующих клеток существенных изменений не было выявлено.

Микро/наночастицы сульфата хитозана значительно увеличивали количество экспрессирую-щих клеток ТЬЯ9 - в 3,6 - 9,2 раза, в то время как в комбинации с вакциной - в 5,8 - 9,2 раза. Глютамат хитозана увеличивал численность ТЬЯ9-экспрессирующей субпопуляции в 4,8 - 9,3 раза, а в комбинации с вакциной - лишь в 3,9 - 5,3 раза.

Оценка цитотоксической активности. Как видно из таблицы 5, наблюдалось повышение цитоток-сичности МЛ по отношению к ИК-чувствительной линии клеток эритробластного лейкоза человека у мышей, иммунизированных вакциной, приблизительно в 2 раза. Цитотоксическая активность ИК, стимулированных введением вакцины в сочетании с глютаматом хитозана, была выше активности МЛ

Таблица 4.

Влияние хитозана на экспрессию TLRs МЛ селезенок мышей

при комбинированном введении с инактивированной вакциной Ваксигрип

Препарат TLR2 TLR4 TLR9

Контроль (физраствор) 0,566 ± 0,15 0,366 ± 0,15 0,433 ± 0,15

Ваксигрип 1-е сутки 0,466 ± 0,3 0,366 ± 0,25 0,533 ± 0,15

7-е сутки 0,366 ± 0,15 0,366 ± 0,15 0,366 ± 0,25

2-я иммуниз., 1-е сутки 0,433 ± 0,15 0,4 ± 0,1 0,8 ± 0,1

2-я иммуниз., 7-е сутки 0,5 ± 0,1 0,433 ± 0,15 0,7 ± 0,1

Ваксигрип с 1% раствором хитозана 1-е сутки 0,933 ± 0,4 0,8 ± 0,25 2,166 ± 0,3

7-е сутки 0,533 ± 0,15 0,8 ± 0,2 0,9 ± 0,45

2-я иммуниз., 1-е сутки 1,1 ± 0,35 0,733 ± 0,2 2,3 ± 0,25

2-я иммуниз., 7-е сутки 0,966 ± 0,4 0,666 ± 0,2 1,7 ± 0,2

Ваксигрип с микрочастицами хитозана 1-е сутки 1,733 ± 0,5 0,933 ± 0,25 3,266 ± 0,6

7-е сутки 0,8 ± 0,3 0,8 ± 0,2 1,23 ± 0,3

2-я иммуниз., 1-е сутки 3,33 ± 0,3 0,3 ± 0,3 3,966 ± 0,4

2-я иммуниз., 7-е сутки 2,16 ± 0,2 0,66 ± 0,25 2,5 ± 0,25

Микрочастицы хитозана 1-е сутки 1,06 ± 0,55 0,66 ± 0,15 1,566 ± 0,35

7-е сутки 1,8 ± 0,2 0,433 ± 0,15 4,533 ± 0,3

2-я иммуниз., 1-е сутки 3,5 ± 0,3 0,733 ± 0,2 4,33 ± 0,3

2-я иммуниз., 7-е сутки 2,5 ± 0,2 0,7 ± 0,2 2,733 ± 0,35

Хитозан 1-е сутки 1,26 ± 0,4 0,8 ± 0,4 1,133 ± 0,4

7-е сутки 1,13 ± 0,4 1,433 ± 0,35 3,6 ± 0,45

2-я иммуниз., 1-е сутки 2,433 ± 0,15 1,5 ± 0,2 4,00 ± 0,35

2-я иммуниз., 7-е сутки 1,833 ± 0,2 0,866 ± 0,15 2,066 ± 0,2

Полужирным выделено ^ < 0,05) достоверное отличие от контрольной группы Ваксигрипа по критерию Вилкоксона и ^критерию Стьюдента.

Таблица 5.

Комбинированное действие хитозана и инактивированной гриппозной вакцины на цитотоксическую активность мононуклеарных лейкоцитов селезенок мышей

препараты № группы Время взятия селезенки (сутки/ прививка) цитотоксическая активность достоверность различий между группами р < 0,05

% ци1

Контроль (физраствор) 1 1/0 17,86 ± 2,43 - -

Ваксигрип, 24 ч 2 1/1 35,4 ± 0,77* 1,98 P 2 и 6, 10, 14, 18

3 7/1 38,4 ± 1,6* 2,15 P 3 и 7, 11

4 1/2 38,66 ± 1,5* 2,16 P 4 и 8, 12, 16, 20

5 7/2 34,66 ± 2,5* 1,94 P 5 и 9, 13, 17, 21

Ваксигрип с1% раствором хитозана, 24 ч 6 1/1 58,6 ± 4,92** 3,28 -

7 7/1 49,16 ± 3,5** 2,75 -

8 1/2 71,66 ± 2,5** 4 P 8 и 16, 20

9 7/2 59,8 ± 2,7** 3,34 P 9 и 13, 21

Ваксигрип с микрочастицами хитозана, 24 ч 10 1/1 68 ± 4,2** 3,8 -

11 7/1 59,2 ± 4,2** 3,31 P 11 и 15, 19

12 1/2 72,7 ± 1,55** 4,1 P 12 и 16, 20

13 7/2 67,8 ± 1,8** 3,8 P13 и 17, 21

1% раствор хитозана, 24 ч 14 1/1 58 ± 2,7** 3,25 -

15 7/1 45,4 ± 2,0* 2,54 -

16 1/2 50,40 ± 1,75* 2,82 -

17 7/2 42,06 ± 1,2* 2,35 -

Микрочастицы хитозана, 24 ч 18 1/1 58,7 ± 4,5** 3,3 -

19 7/1 46,23 ± 3,25** 2,59 -

20 1/2 58,16 ± 2,75** 3,25 -

21 7/2 49,73 ± 1,7** 2,78 -

1 Цитотоксический индекс (ЦИ) - отношение цитотоксической активности мононуклеарных лейкоцитов (к клеткам опухолевой линии К562) в опытной группе к цитотоксической активности мононуклеарных лейкоцитов неиммунизированных мышей (физ. р-р);

* достоверное отличие от значений контрольной группы (физ. р-р) неиммунизированных мышей по критерию Вилкоксона и Ь-критерию Стьюдента;

# достоверное отличие от значений группы Ваксигрипа по критерию Вилкоксона и Ь-критерию Стьюдента.

в контроле в 2,7 - 4 раза, а стимулированных введением вакцины с микро/наночастицами сульфата хитозана - в 3,3 - 4,1 раза. При этом активность самого глютамата хитозана или микро/наночастиц сульфата хитозана была ниже активности комплекса «вакцина - препарат хитозана», что может свидетельствовать об адъювантном действии препаратов хитозана на МЛ селезенок мышей.

Изучение уровня цитокинов в сыворотке крови иммунизированных мышей. Полученные данные демонстрируют, что парентеральное введение мышам инактивированной гриппозной вакцины сопровождалось повышением в сыворотке крови мышей ряда цитокинов: !ИРу, !Ы7, ТИРа, 11.-5, ТОРр, И-6, !Ы0. Наблюдалось особо заметное повышение ТИРа (в 10 раз), ТОРр (в 8 - 10 раз) и умеренное - И-6 и !Ы0 (в 2 - 2,5 раза).

Следует отметить, что в контрольных опытах парентеральное введение препаратов глютамата хитозана мышам приводило к появлению в сыворотке крови мышей значительного количества IL-6, IL-10 и умеренного - IL-5. Парентеральное введение вакцины Ваксигрип в комбинации с препаратами хитозана сопровождалось в отдельных случаях противоположными эффектами, в частности, приводило к повышению или понижению определенных цитокинов в сыворотке крови иммунизированных животных. Так, было отмечено резкое повышение IL-12 (более чем в 10 раз) и умеренное - INFy, IL-17, IL-1ß и IL-5. В то же время наблюдалось снижение продукции TNFa и TGFß, что позволяет говорить о подавлении повышенной реактивности клеток иммунной системы под воздействием как глютамата хитозана, так и микро/ наночастиц сульфата хитозана.

Выводы

1. Иммунизация мышей инактивированными гриппозными вакцинами Ваксигрип и Флюа-рикс в комбинации с препаратами хитозана показала высокие адъювантные свойства как раствора глютамата хитозана, так и суспензии микро/наночастиц сульфата хитозана.

2. И глютамат хитозана, и микро/наночастицы сульфата хитозана оказывают существенное влияние на активацию не только гуморального, но и клеточного иммунитета.

3. Вакцина в комбинации с препаратами хитозана существенно повышает количество Т-, ИК-, ИКТ-цитотоксических клеток. Наблюдалось повышение количества Т-лимфоцитов через семь суток после применения разных форм хитозана, но в виде раствора глютамата он оказывался более действенным в отношении активации Т-клеток, так как уже после первого введения численность данной популяции повышалась до 37,2%.

4. Под воздействием хитозана как в растворимой форме, так и в виде микро/наночастиц повышалась не только численность ИК-клеток, но и их функциональная активность в тесте цитоток-сичности МЛ. В отношении ИКТ-клеток микро/ наночастицы сульфата хитозана были активнее раствора глютамата хитозана, поскольку численность ИКТ под воздействием микро/нано-частиц повышалась во все сроки наблюдения даже после однократной иммунизации. При парентеральном введении вакцины в комбинации с микро/наночастицами сульфата хито-зана количество Т-клеток в селезенках мышей в 1,5 раза превышало численность их у мышей, которым вводили вакцину с раствором глютамата хитозана.

5. Введение вакцины в комбинации с различными формами хитозана приводит к повышению содержания клеток, экспрессирующих 004 и 0025,

что указывает на процессы активации клеток. При этом увеличивается содержание Т-регуляторных клеток, экспонирующих маркер 004/0025/Рохр3. Повышение содержания клеток данного типа может свидетельствовать о включении механизмов саморегуляции иммунной системы для предотвращения чрезмерной активации при введении вакцины в комбинации с хитозаном. Этот феномен позитивно коррелирует с повышением цитотоксических и убТ-лимфоцитов, а также В-клеток, в том числе субпопуляции В1 (005).

6. Резюмируя вышеизложенное, можно предположить, что препараты хитозана при парентеральном введении с инактивированной гриппозной вакциной вызывают активацию механизмов как врожденного, так и адаптивного иммунитета, что подтверждается повышением численности субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, ИК, ИКТ, убТ-клеток, а также клеток, экспрессирующих ТЬЯ2- и ТЬЯ9-рецепторы. При этом активность микро/наночастиц сульфата хитозана была выше активности раствора глютама-та хитозана.

7. Парентеральное введение вакцины в комбинации с препаратами хитозана корригировало содержание числа клеток, экспрессиру-ющих МНС II, устраняя повышенную реактивность клеток иммунной системы под воздействием вакцины. Повышение количества 008, ИК, ИКТ, убТ-клеток может указывать на усиление свойств клеток, распознающих внутриклеточные патогены, а следовательно, на активацию не только гуморального, но и клеточного иммунитета.

В связи с этим можно предположить, что дополнительное включение различных форм хитозана в вакцинацию позволяет корригировать переключение иммунного ответа с ТИ2- на ТИ1-путь. ш

Литература

1. Ахматова Н.К., Егорова Н.Б., Курбатова Е.А. и др. Влияние хитозана на иммунофенотип и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов мышей при иммунизации инактивированной противогриппозной вакциной // ЖМЭИ. 2008. № 6. С. 31 - 35.

2. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Кривцов Г.Г. и др. Способ повышения им-муногенности инактивированной гриппозной вакцины. 2008. Патент на изобретение № 2323742.

3. Bacon A., Makin J., Sizer P.J. et al. Carbohydrate biopolymers enhance antibody responses to mucosally delivered vaccine antigens // Infect. Immun. 2000. V. 68. P. 5764 - 5770.

4. Belshe R., Gruber W., Mendelman P. et al. Efficacy of vaccination with live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine against a variant A/Sydney not contained in the vaccine // J. Pediatr. 2000. V. 136. P. 168 - 175.

5. Воrges O., Silva M., de Sousa A. et al. Alginate coated chitosan nanopar-ticles are an effective subcutaneous adjuvant for hepatitis B surface antigen // Int. Immunopharmacol. 2008. V. 8. P. 1773 - 1780.

6. De Jong J., Beyer W., Palache A. Mismath between the 1997/1998 influenza vaccine and the major epidemic A/H3N2 virus strain as the cause

of an inadequate vaccine-induce antibody response to this strain in the elderly // J. Med. Virol. 2000. V. 61. P. 94 - 99.

7. Ghendon Y., Markushin S., Krivtsov G., Akopova I. Chitosan as an adjuvant for parenterally administered inactivated influenza vaccines // Arch. Virol. 2008. V. 153. P. 831 - 837.

8. Ghendon Y., Markushin S., Vasiliev Y. et al. Evaluation of properties of chitosan as an adjuvant for inactivated influenza vaccines administered parenterally // Journal of Medical Virology. 2009. V. 81. P 494 - 506.

9. Illum L., Jabbal-Gill I., Hinchcliffe M. et al. Chitosan as a novel nasal delivery system for vaccines // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001, V. 51. P 81 - 96.

10. Kang M.L., Cho C.S., Yoo H.S. Application of chitosan microspheres for nasal delivery of vaccines // Biotechnol. Adv. 2009. V. 27. P. 857 - 865.

11. Kendal A., Pereira M., Skehel J. Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. - Geneva: WHO, 1982.

12. Porporatto C., Bianco I.D., Correa S.G. Local and systemic activity of the poplysaccharide chitosan at lymphoid tissues after oral administration // J. Leukocyte Biology. 2005. V. 78. P. 715 - 723.

13. Prego C., Paolicelly P, Diaz B. et al. Chitosan-based nanoparticles for improving imunization against hepatitis infection // Vaccine. 2010. V. 28. P 2607 - 2614.

14. Rowe T., Abernathy R., Hu-Primmer J. et al. Detection of antibody to avian influenza A(H5N1) virus in human serum by using a combination of serological assays // J. Clin. Microbiology. 1999. V. 37. P. 937 - 943.