СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТКАНЕЙ
METHODS FOR PRODUCING TISSUES

По настоящей заявке испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 61/696479, зарегистрированной 4 сентября 2012 года, описание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
1. ВВЕДЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способам получения тканей и органов in vitro или ex vivo, включающим нанесение клеток и/или внеклеточного матрикса на поверхность, а также способам применения таких тканей и органов.
2. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Биопринтинг (например, биопринтинг органов) является областью исследований и инженерии, включающей устройства для печати, такие как модифицированные струйные принтеры, наносящие биологический материал. Технология включает быстрое создание и высвобождение жидких капель, содержащих клетки, с последующим их точным нанесением на поверхность. Ткани и органы, сконструированные с использованием основных клеточных материалов с помощью биопринтинга, представляют собой многообещающую альтернативу донорским тканям и органам, используемым в стандартных подходах трансплантологии в настоящее время.
3. СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения тканей (например, трехмерной ткани) или органа, включающему нанесение клеток и/или внеклеточного матрикса (ECM) на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что образуется указанная ткань. Клетки, которые можно использовать в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, описывают в разделе 4.1.1 ниже. Ткани и органы, которые можно конструировать в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, описывают в разделе 4.1.2 ниже. ECM, который можно использовать в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, описывают в разделе 4.1.3 ниже. Поверхности, на которые можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, описывают в разделе 4.1.4 ниже.
В одном из вариантов осуществления клетки и ECM, используемые в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, наносят как часть одной композиции. В другом варианте осуществления клетки и ECM, используемые в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, наносят как часть разных композиций. В конкретном варианте осуществления ECM, используемый в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, включает жидкий ECM. В другом конкретном варианте осуществления клетки и ECM, используемые в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, наносят как часть разных композиций, например, где ECM наносят отдельно, например, перед нанесением клеток, и/или где ECM дегидратируют перед нанесением клеток. В вариантах осуществления, в которых ECM дегидратируют, позднее его можно регидратировать в желаемый момент времени, например, в момент времени, когда клетки наносят на поверхность, на которую нанесены ECM и клетки.
В определенных вариантах осуществления клетки и ECM, используемые в способах получения трехмерных тканей in vivo, представленных в настоящем описании, наносят на поверхность одновременно, до или после нанесения одного или нескольких дополнительных компонентов, например, факторов роста, кросс-линкеров, полимеризуемых мономеров, полимеров, гидрогелей и т.д. В определенных вариантах осуществления поверхность, на которую наносят указанные клетки и ECM, является поверхностью, подвергнутой биопринтингу способами, представленными в настоящем описании.
В определенных вариантах осуществления клетки и жидкий ECM (а также дополнительные компоненты), используемые в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, печатают на указанной поверхности, например, клетки и ECM подвергают биопринтингу. В определенных вариантах осуществления поверхность, на которой подвергают биопринтингу указанные клетки и ECM, является поверхностью, подвергнутой биопринтингу способами, представленными в настоящем описании.
В определенных вариантах осуществления клетки и/или жидкий ECM (а также дополнительные компоненты), используемые в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, не печатают на указанной поверхности, например, клетки и ECM не подвергают биопринтингу, а наносят на указанную поверхность способом, не включающим биопринтинг. В определенных вариантах осуществления клетки и/или жидкий ECM (а также дополнительные компоненты), не подвергнутые биопринтингу на поверхности, наносят на поверхность, подвергнутую биопринтингу, например, клетки и/или жидкий ECM (а также дополнительные компоненты) наносят на каркас, например, синтетический каркас, такой как синтетический матрикс. В конкретном варианте осуществления клетки и/или жидкий ECM (а также дополнительные компоненты) наносят только на часть, например, одну сторону, каркаса (например, поверхность). В другом конкретном варианте осуществления клетки и/или жидкий ECM (а также дополнительные компоненты) наносят на все стороны каркаса, т.е. весь каркас содержит клетки и/или жидкий ECM, нанесенные на него. В другом конкретном варианте осуществления каркас является поликапролактоном (PCL).
В определенных вариантах осуществления поверхность, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, включает искусственную поверхность, т.е. поверхность, созданную человеком. В другом конкретном варианте осуществления поверхность, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, включает ткань или орган (или его часть), удаленные у индивидуума (например, человека). В определенных вариантах осуществления поверхность указанной ткани или органа, удаленного у индивидуума можно подвергать децеллюляризации, например, обрабатывать для удаления клеток со всей поверхности ткани или органа или с ее части. В определенных вариантах осуществления поверхность, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, является двухмерной. В определенных вариантах осуществления поверхность, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, является трехмерной. В конкретном варианте осуществления поверхность, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, является поверхностью, подвергнутой биопринтингу, например, подвергнутой биопринтингу способами, представленными в настоящем описании. В конкретном варианте осуществления поверхность является поликапролактоном (PCL).
Другой аспект настоящего изобретения относится к тканям и органам, полученным способами, представленными в настоящем описании, а также способам применения таких тканей и органов.
В определенных вариантах осуществления ткани (например, трехмерные ткани) и органы, сконструированные способами, представленными в настоящем описании, применяют в способах трансплантации, включая пересадку кожи и хирургические способы трансплантации.
В определенных вариантах осуществления ткани (например, трехмерные ткани) и органы, сконструированные способами, представленными в настоящем описании, применяют в экспериментальных способах, например, для оценки эффекта лекарственного средства или соединения в отношении указанной ткани или органа.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композициям, содержащим клетки и ECM (например, жидкий ECM), где указанные композиции пригодны для применения в способах, представленных в настоящем описании. Также настоящее изобретение относится к наборам, содержащим указанные композиции в одном или нескольких контейнерах, а также инструкции по применению указанных композиций одним или несколькими способами, представленными в настоящем описании.
3.1 КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 изображены каркасы, содержащие поликапролактон (PCL), подвергнутые биопринтингу под различными углами и таким образом, что получают каркасы с различным размером пор.
На фиг. 2 изображен множественный вид подвергнутых биопринтингу каркасов, где внеклеточный матрикс (ECM) наносят на обе стороны каркаса, а затем дегидратируют.
На фиг. 3 изображены результаты анализа клеточной пролиферации. Плацентарные стволовые клетки, культивируемые на гибридном каркасе, содержащем подвергнутый биопринтингу PCL и дегидратированный ECM, пролиферируют в течение 8-дневного периода культивирования.
На фиг. 4 изображены результаты анализа жизнеспособности клеток. Плацентарные стволовые клетки, культивируемые на гибридном каркасе, содержащем подвергнутый биопринтингу PCL и дегидратированный ECM, пролиферировали и оставались жизнеспособными в течение 8-дневного периода культивирования.
На фиг. 5 изображен интактный трехмерный гибридный каркас, содержащий PCL, ECM и плацентарные стволовые клетки, каждые из которых подвергали биопринтингу в виде слоев (слоев PCL и слоев ECM/клеток).
На фиг. 6 показано, что плацентарные стволовые клетки распределялись по всему трехмерному подвергнутому биопринтингу каркасу в течение 7-дневного периода культивирования.
На фиг. 7 изображены результаты анализа жизнеспособности клеток. Плацентарные стволовые клетки, подвергнутые биопринтингу с использованием ECM и PCL для получения трехмерного гибридного каркаса, пролиферируют и остаются жизнеспособными в течение 7-дневного периода культивирования.
На фиг. 8 показано, что стволовые клетки, подвергнутые биопринтингу с использованием ECM и PCL для получения трехмерного гибридного каркаса, распределялись по всему ECM в гибридных каркасах в течение 7-дневного периода культивирования.
На фиг. 9 изображены результаты анализа клеточной пролиферации. Плацентарные стволовые клетки, культивируемые в трехмерном гибридном каркасе, полученном посредством биопринтинга PCL, ECM и плацентарных стволовых клеток, пролиферируют в течение 7-дневного периода культивирования.
На фиг. 10 изображен подвергнутый биопринтингу каркас, содержащий PCL, плацентарный ECM и инсулин-продуцирующие клетки (клетки β-TC-6).
На фиг. 11 изображены результаты анализа клеточной пролиферации. Количества инсулин-продуцирующих клеток (клеток β-TC-6) в подвергнутом биопринтингу каркасе, содержащем PCL, плацентарный ECM и инсулин-продуцирующие клетки, оставались постоянными в течение 14-дневного периода культивирования.
На фиг. 12 изображены уровни продукции инсулина в подвергнутых биопринтингу каркасах, содержащих PCL, плацентарный ECM и инсулин-продуцирующие клетки (клетки β-TC-6).
На фиг. 13 изображены уровни продукции инсулина в подвергнутых биопринтингу каркасах, содержащих PCL, плацентарный ECM и инсулин-продуцирующие клетки, (клетки β-TC-6), после сахарной нагрузки (A) или в контролируемых условиях (B, C).
4. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу получения ткани (например, трехмерной ткани) или органа, включающему нанесение клеток и внеклеточного матрикса (ECM) на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что образуется указанная ткань. Клетки, которые можно использовать в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, описывают в разделе 4.1.1 ниже. Ткани и органы, которые можно конструировать в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, описывают в разделе 4.1.2 ниже. ECM, который можно использовать в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, описывают в разделе 4.1.3 ниже. Поверхности, на которые можно наносить клетки, ECM, и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, описывают в разделе 4.1.4 ниже.
Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения ткани (например, трехмерной ткани) или органа, включающему нанесение клеток и ECM на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что получают указанную ткань или орган.
Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения ткани (например, трехмерной ткани) или органа, включающему нанесение клеток и ECM на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что получают указанную ткань или орган, где указанный ECM включает жидкий ECM, и где указанные клетки и указанный жидкий ECM составляют как часть одной композиции. В конкретном варианте осуществления указанные клетки и указанный ECM наносят с использованием биопринтера. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки включают один тип клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки включают несколько типов клеток.
Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения ткани (например, трехмерной ткани) или органа, включающему нанесение клеток и ECM на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что получают указанную ткань или орган, где указанный ECM включает жидкий ECM, и где указанные клетки и указанный жидкий ECM составляют как часть отдельных композиций. В конкретном варианте осуществления указанные клетки и указанный ECM наносят с использованием биопринтера. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки включают один тип клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки включают несколько типов клеток.
Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения ткани (например, трехмерной ткани) или органа, включающему нанесение клеток и ECM на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что получают указанную ткань или орган, где указанный ECM включает жидкий ECM, и где указанные клетки и указанный жидкий ECM составляют как часть отдельных композиций. В конкретном варианте осуществления указанные клетки и указанный ECM наносят с использованием биопринтера. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки включают один тип клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки включают несколько типов клеток.
Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения ткани (например, трехмерной ткани) или органа, включающему нанесение клеток, ECM и одного или нескольких дополнительных компонентов на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что получают указанную ткань или орган.
Другой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения ткани (например, трехмерной ткани) или органа, включающему нанесение клеток, ECM и одного или нескольких дополнительных компонентов на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что получают указанную ткань или орган. В конкретном варианте осуществления указанные клетки, указанный ECM и указанные один или несколько дополнительных компонентов наносят с использованием биопринтера. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки включают один тип клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки включают несколько типов клеток. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки, указанный ECM и указанные один или несколько дополнительных компонентов составляют как часть одной композиции. В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки, указанный ECM и указанные один или несколько дополнительных компонентов составляют как часть отдельных композиций. В другом конкретном варианте осуществления указанными одним или несколькими дополнительными компонентами являются фактор роста, полимеризуемый мономер, кросс-линкер, полимер или гидрогель.
В определенных вариантах осуществления поверхность, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, включает искусственную поверхность, т.е. поверхность, созданную человеком. В другом конкретном варианте осуществления поверхность, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, включает ткань или орган (или его часть), удаленный у индивидуума (например, человека). В определенных вариантах осуществления поверхность указанной ткани или органа, удаленного у индивидуума, можно подвергать децеллюляризации, например, обрабатывать для удаления клеток со всей или с части поверхности ткани или органа. В определенных вариантах осуществления поверхность, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, является двухмерной. В определенных вариантах осуществления поверхность, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, является трехмерной. В конкретном варианте осуществления поверхностью, на которую можно наносить клетки, ECM и/или дополнительные компоненты в соответствии со способами получения тканей (например, трехмерных тканей) и органов, представленными в настоящем описании, является поверхность, подвергнутая биопринтингу, например, подвергнутая биопринтингу способами, представленными в настоящем описании. В конкретном варианте осуществления поверхность включает синтетический материал, например, синтетический полимер. В другом конкретном варианте осуществления синтетическим полимером является PCL.
В определенных вариантах осуществления клетки и ECM (например, жидкий ECM) печатают не одновременно, а слоями. В конкретном варианте осуществления слой клеток печатают на поверхности с последующей печатью слоя ECM. В другом конкретном варианте осуществления слой ECM печатают на поверхности с последующей печатью слоя клеток. В определенных вариантах осуществления на поверхности можно печатать многочисленные слои ECM с последующей печатью многочисленных слоев клеток, и наоборот. Аналогично, дополнительные компоненты, печатаемые одновременно, до или после печати клеток и/или ECM, можно располагать слоями среди клеток и ECM способами, представленными в настоящем описании.
В определенных вариантах осуществления клетки и ECM (например, жидкий ECM) печатают таким образом, что поверхность, на которой печатают, полностью покрывают клетками и ECM. В других вариантах осуществления клетки и ECM (например, жидкий ECM) печатают таким образом, что поверхность, на которой печатают, частично покрывают клетками и ECM.
В определенных вариантах осуществления клетки и ECM (например, жидкий ECM) печатают таким образом, что поверхность, на которой печатают, покрывают клетками в конкретных желаемых областях и покрывают ECM в конкретных желаемых областях, где такие конкретные области могут перекрываться или не перекрываться.
В определенных вариантах осуществления клетки и ECM (например, жидкий ECM) можно печатать на поверхности в трех измерениях. Как применяют в настоящем описании, термин "трехмерная печать" относится к способу печати таким образом, что печатающие головки биопринтера двигаются ниже, выше и вокруг трехмерной поверхности, например, печатающие головки механически контролируют таким образом, что они вращаются вокруг конкретной оси. Как применяют в настоящем описании, трехмерная печать отличается от стандартных способов биопринтинга, известных в этой области, где печать осуществляют, начиная построение ткани на плоской/двухмерной поверхности.
В одном из вариантов осуществления ECM печатают на поверхности (например, протеза или кости) in vitro или ex vivo, и позднее клетки высевают на указанной поверхности, содержащей ECM, с использованием стандартных подходов культивирования клеток. Затем такую поверхность можно трансплантировать индивидууму. В другом варианте осуществления ECM печатают на поверхности (например, протеза или кости) in vitro или ex vivo, и указанную поверхность, содержащую ECM, трансплантируют индивидууму, где клетки индивидуума прикрепляются, и/или их выращивают на указанной поверхности.
Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения тканей, включающему нанесение клеток и ECM на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что образуется указанная ткань, где указанная поверхность включает кость, имеющую внутреннюю сторону и внешнюю сторону, и где первую клеточную композицию, содержащую первый тип клеток, печатают на указанной внутренней стороне, а вторую клеточную композицию, содержащую второй тип клеток, печатают на указанной внешней стороне. Как применяют в настоящем описании, "внутренняя сторона" кости представляет собой поверхность кости, предназначенную для расположения под стромальной и мышечной тканью, и "внешняя сторона" кости представляет собой поверхность кости, предназначенную быть обращенной к внешней поверхности организма реципиента. По этому варианту осуществления внутреннюю сторону можно покрывать частично или полностью, например, стромальными клетками, жировой тканью, мезенхимальными стволовыми клетками, миоцитами или подобными комбинациями, а внешнюю сторону можно покрывать частично или полностью, например, клетками дермы. В конкретном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает нанесение еще одного дополнительного компонента (например, кросс-линкера). В другом конкретном варианте осуществления указанную печать осуществляют в трех измерениях.
Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения печени, включающему нанесение клеток и ECM на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что образуется указанная печень, где указанная поверхность включает ткань печени. В конкретном варианте осуществления ткань печени получают от индивидуума, которому предполагают трансплантировать полученную печень. В другом конкретном варианте осуществления ткань печени получают не от индивидуума, которому предполагают трансплантировать полученную печень (например, получают ткань печени от живого донора или трупа). В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки, которые наносят, являются клетками печени (например, гепатоцитами). В конкретном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает нанесение еще одного дополнительного компонента (например, кросс-линкера). В другом конкретном варианте осуществления указанную печать осуществляют в трех измерениях.
Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу получения кожи, включающему нанесение клеток и ECM на поверхность in vitro или ex vivo таким образом, что образуется указанная кожа, где указанная поверхность включает ткань кожи. В конкретном варианте осуществления ткань кожи получают от индивидуума, которому предполагают трансплантировать полученную кожу. В другом конкретном варианте осуществления ткань кожи получают не от индивидуума, которому предполагают трансплантировать полученную кожу (например, получают ткань кожи от живого донора или трупа). В другом конкретном варианте осуществления указанные клетки, которые наносят, являются клетками кожи (например, клетками эпидермиса). В конкретном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает нанесение еще одного дополнительного компонента (например, кросс-линкера). В другом конкретном варианте осуществления указанную печать осуществляют в трех измерениях.
4.1 БИОПРИНТИНГ
Как применяют в настоящем описании, "биопринтинг", как правило, относится к нанесению живых клеток, а также других компонентов (например, жидкого ECM; синтетических матриксов) на поверхности с использованием стандартной или модифицированной технологии печати, например, технологии струйной печати. Основные способы нанесения клеток на поверхностях и биопринтинга клеток, включая клетки в комбинации с гидрогелями, описывают в Warren et al. US 6986739, Boland et al. US 7051654, Yoo et al. US 2009/0208466 и Xu et al. US 2009/0208577, описание каждого из которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Кроме того, биопринтеры, подходящие для получения тканей и органов, представленных в настоящем описании, являются коммерчески доступными, например, 3D-Bioplotter™ от Envisiontec GmbH (Gladbeck, Germany); и NovoGen MMX Bioprinter™ от Organovo (San Diego, CA).
Биопринтер, используемый в способах, представленных в настоящем описании, может включать механизмы и/или программное обеспечение, позволяющее контролировать температуру, влажность, силу сдвига, скорость печати и/или частоту воспламенения посредством модификаций, например, программного обеспечения принтера и/или физических характеристик принтера. В определенных вариантах осуществления программное обеспечение и/или технические средства биопринтера, предпочтительно, можно конструировать и/или устанавливать для поддержания температуры клеток приблизительно 37°C в течение печати.
В определенных вариантах осуществления струйное устройство для печати может включать двухмерный или трехмерный принтер. В определенных вариантах осуществления биопринтер включает DC струйный соленоидный клапан, один или несколько резервуаров для удержания одного или нескольких типов клеток, например, клеток в жидкой композиции, и/или ECM (например, жидкого ECM) перед печатью, например, соединенный со струйным клапаном. Биопринтер может включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более резервуаров, например, один для каждого типа клеток или каждого ECM, используемых для конструирования тканей и органов, представленных в настоящем описании. Клетки можно доставлять из резервуара к струйному клапану посредством давления воздуха, механического давления или другими способами. Как правило, биопринтером, например, печатающими головками в биопринтере, управляют с помощью компьютера таким образом, что один или несколько типов клеток и указанный ECM наносят с заранее определенным паттерном. Указанный заранее определенный паттерн может являться паттерном, воссоздающими или повторяющим природное расположение указанного одного или нескольких типов клеток в органе или ткани, из которого клетки происходят или их получают, или паттерном, отличающимся от природного расположения указанного одного или нескольких типов клеток.
В определенных вариантах осуществления биопринтер, используемый в способах, представленных в настоящем описании, может являться термическим пузырьково-струйным принтером, см., например, Niklasen et al. US 6537567, или принтером с печатающей головкой с вибрацией пьезокристалла, например, с использованием частот до 30 кГц и источников питания в диапазоне от 12 до 100 Ватт. В некоторых вариантах осуществления сопла печатающей головки биопринтера независимо составляют от 0,05 до 200 микрометров в диаметре, или от 0,5 до 100 микрометров в диаметре, или от 10 до 70 микрометров в диаметре, или от 20 до 60 микрометров в диаметре. В дополнительных вариантах осуществления сопла независимо составляют приблизительно 40 или 50 микрометров в диаметре. Можно использовать многочисленные сопла с одинаковыми или разными диаметрами. В некоторых вариантах осуществления сопла имеют круглое отверстие; в других вариантах осуществления можно использовать другие подходящие формы, например, овал, квадрат, прямоугольник и т.д., без отклонения от сущности изобретения.
В определенных вариантах осуществления анатомическое изображение ткани или органа, подлежащих биопринтингу, можно конструировать с использованием программного обеспечения, например, программного обеспечения для автоматизированного проектирования (CAD). По таким вариантам осуществления можно создавать программы, делающие возможной трехмерную печать на трехмерной поверхности, изображающей структуру ткани или органа, подлежащих печати. Например, если желательной является печать кости, можно конструировать анатомическое изображение кости и создавать программу, направляющую печатающие головки биопринтера для их вращения вокруг трехмерной поверхности кости в течение печати.
В определенных вариантах осуществления способы биопринтинга, представленные в настоящем описании, включают доставку/нанесение отдельных капель клеток (например, композиций, содержащих отдельные клетки, или композиций, содержащих множество клеток) и жидкого внеклеточного матрикса (ECM) на поверхности.
В определенных вариантах осуществления способы биопринтинга, представленные в настоящем описании, включают нанесение одного типа клеток и жидкого ECM на поверхности. Примеры типов клеток, которые можно использовать в соответствии с такими способами, представлены в разделе 4.1.1 ниже. ECM, включая жидкий ECM, описывают в разделе 4.1.3 ниже.
В других вариантах осуществления способы биопринтинга, представленные в настоящем описании, включают нанесение множества (например, двух, трех, четырех, пяти или более) типов клеток и жидкого ECM на поверхности. В конкретном варианте осуществления множество типов клеток наносят как часть одной композиции, т.е. источником клеток является одна композиция, содержащая множество типов клеток. В другом конкретном варианте осуществления множество типов клеток наносят как часть разных композиций, т.е. источником клеток являются отдельные композиции, содержащие множество типов клеток. В другом конкретном варианте осуществления часть множества типов клеток наносят как часть одной композиции (например, два или более типов клеток находятся в одной композиции), а другую часть множества типов наносят как другую композицию (например, один или несколько типов клеток находятся в одной композиции). Примеры типов клеток, которые можно использовать в соответствии с такими способами, представлены в разделе 4.1.2 ниже.
В конкретном варианте осуществления клетки и жидкий ECM, подлежащие нанесению, наносят на поверхность совместно (например, одновременно) как часть одной композиции. В другом конкретном варианте осуществления клетки и жидкий ECM, подлежащие нанесению, наносят на поверхность совместно как часть разных композиций. В другом конкретном варианте осуществления клетки и жидкий ECM, подлежащие нанесению, наносят на поверхность раздельно (например, в различные моменты времени).
В определенных вариантах осуществления клетки и жидкий ECM наносят с одним или несколькими дополнительными компонентами. В одном из вариантов осуществления один или несколько дополнительных компонентов составляют в той же композиции, что и клетки. В другом варианте осуществления один или несколько дополнительных компонентов составляют в той же композиции, что и ECM. В другом варианте осуществления один или несколько дополнительных компонентов составляют в той же композиции, что и клетки и ECM (т.е. одна композиция содержит клетки, жидкий ECM и один или несколько дополнительных компонентов). В другом варианте осуществления один или несколько дополнительных компонентов составляют в композиции, отдельной от композиций, содержащих клетки и/или ECM, и наносят одновременно, до или после нанесения клеток и/или ECM на поверхности. В конкретном варианте осуществления один или несколько дополнительных компонентов способствуют выживанию, дифференцировке, пролиферации клеток и т.д. В другом конкретном варианте осуществления один или несколько дополнительных компонентов включают кросс-линкер (см. раздел 4.1.3.2). В другом конкретном варианте осуществления один или несколько дополнительных компонентов включают гидрогель. В другом конкретном варианте осуществления один или несколько дополнительных компонентов включают синтетический полимер.
Специалистам в этой области понятно, что клетки и жидкий ECM, а также любые дополнительные компоненты, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, можно печатать из отдельных сопел принтера или через одно сопло принтера в общей композиции в зависимости от конкретной получаемой ткани или органа. Специалистам в этой области также понятно, что печать может являться одновременной или последовательной, или любой их комбинацией, и что некоторые из компонентов (например, клетки, жидкий ECM или кросс-линкеры) можно печатать в форме первого паттерна, а некоторые из компонентов можно печатать в форме второго паттерна и т.д. Конкретная комбинация и способ печати будут зависеть от конкретной ткани или органа, подлежащих печати.
В определенных вариантах осуществления клетки, ECM и/или любые другие материалы (например, синтетические матриксы, например, PCL) можно подвергать биопринтингу с конкретным паттерном для достижения желаемого результата. Например, подвергаемые биопринтингу материалы (например, клетки, ECM, матриксы и другие компоненты, представленные в настоящем описании) можно подвергать биопринтингу или иным способом наносить слоями под различными углами, таким образом, получая конкретные желаемые паттерны, такие как трехмерные структуры, имеющие конкретные размеры пор. В конкретном варианте осуществления подвергаемые биопринтингу материалы (например, клетки, ECM, матриксы и другие компоненты, представленные в настоящем описании) печатают или иным образом наносят крест-накрест, таким образом, получая подвергнутую биопринтингу структуру с порами желаемого размера коробчатой формы. В другом конкретном варианте осуществления подвергаемые биопринтингу материалы (например, клетки, ECM, матриксы и другие компоненты, представленные в настоящем описании) печатают или иным образом наносят под углами, таким образом, получая поры желаемого размера треугольной формы или в форме алмаза. Например, подвергаемые биопринтингу материалы (например, клетки, ECM, матриксы и другие компоненты, представленные в настоящем описании) можно печатать или иным образом наносить под конкретными углами, например, 30 градусов, 45 градусов, 60 градусов, для получения желаемых паттернов. В соответствии с такими способами можно получать структуры, имеющие желаемые качества, например, способность стимулировать рост клеток и пролиферацию. См. пример 1 ниже. В конкретном варианте осуществления матриксы, например синтетические матриксы, подвергают биопринтингу с конкретным паттерном, способствующим поддержанию роста и пролиферации клеток на указанных подвергнутых биопринтингу матриксах. В конкретных вариантах осуществления синтетический матрикс является PCL.
4.1.1 КЛЕТКИ
В соответствии со способами, представленными в настоящем описании, можно использовать любой тип клеток, известный в этой области, включая эукариотические клетки.
Клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, могут являться сингенными (т.е. генетически идентичными или близкородственными клеткам индивидуума-реципиента, таким образом, что минимизируют отторжение трансплантата ткани), аллогенными (т.е. от генетически неидентичного члена того же биологического вида, что и индивидуум-реципиент) или ксеногенными (т.е. от члена иного биологического вида, чем индивидуум-реципиент). Сингенные клетки включают аутогенные (т.е. от индивидуума-реципиента) и изогенными (т.е. от генетически идентичного, но другого индивидуума, например, идентичного близнеца). Клетки можно получать, например, от донора (живого или умершего) или из стабильного штамма клеток или клеточной линии. Например, клетки можно собирать от донора (например, потенциального реципиента) с использованием стандартных способов биопсии, известных в этой области.
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, содержаться в жидкой физиологически приемлемой композиции, например, воде, буферных растворах (например, фосфатном буферном растворе, цитратном буферном растворе и т.д.), жидких средах (например, 0,9 Н физиологическом растворе, растворе Кребса, модифицированном растворе Кребса, среде Игла, модифицированной среде Игла (MEM), модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), сбалансированном солевом растворе Хенкса и т.д.) и т.п.
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, могут включать первичные клетки, выделенные из ткани или органа с использованием одной или нескольких известных в этой области протеаз, например, коллагеназы, диспазы, трипсина, LIBERASE и т.п. Ткань органа можно физически диспергировать до, во время или после обработки ткани протеазой, например, посредством нарезания, мацерации, фильтрации и т.п. Клетки можно культивировать стандартными, известными в этой области способами культивирования клеток перед использованием клеток в способах, представленных в настоящем описании, например, для получения гомогенных или, по существу, гомогенных популяций клеток, для селекции по конкретным типам клеток и т.п.
В одном из вариантов осуществления типы клеток, используемые в способах, представленных в настоящем описании, включают стволовые клетки. Неограничивающий список стволовых клеток, которые можно использовать в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включает: эмбриональные стволовые клетки, эмбриональные половые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки, мезенхимальные стволовые клетки костномозгового происхождения (BM-MSC), адгезивные к пластику для культивирования тканей плацентарные стволовые клетки (PDAC), стволовые клетки пуповины, стволовые клетки амниотической жидкости, амниотические адгезивные клетки (AMDAC), остеогенные плацентарные адгезивные клетки (OPAC), жировые стволовые клетки, лимбальные стволовые клетки, стволовые клетки зубной пульпы, миобласты, эндотелиальные клетки-предшественники, нейрональные стволовые клетки, стволовые клетки, полученные из выпавших зубов, стволовые клетки волосяного фолликула, стволовые клетки дермы, стволовые клетки, полученные партеногенетически, перепрограммированные стволовые клетки, амниотические адгезивные клетки или стволовые клетки побочной популяции.
В конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, включают использование плацентарных стволовых клеток (например, плацентарных стволовых клеток, описываемых в US 7468276 и US 8057788). В другом конкретном варианте осуществления указанные плацентарные стволовые клетки являются PDACs. В одном из вариантов осуществления указанные PDAC являются CD34-, CD10+, CD105+ и CD200+. В другом варианте осуществления указанные PDAC являются CD34-, CD10+, CD105+ и CD200+, и дополнительно являются CD45-, CD80-, CD86- и/или CD90+.
В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, включают использование AMDAC (например, AMDAC, описываемых в публикации международной патентной заявки № WO 10/059828). В одном из вариантов осуществления указанные AMDAC являются Oct4-. В другом варианте осуществления указанные AMDAC являются CD49f+. В другом варианте осуществления указанные AMDAC являются Oct4- и CD49f+.
В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, включают использование PDAC и AMDAC.
В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, включают использование BM-MSC.
В другом варианте осуществления типы клеток, используемых в способах, представленных в настоящем описании, включают дифференцированные клетки. В другом конкретном варианте осуществления дифференцированные клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включают эндотелиальные клетки, эпителиальные клетки, клетки дермы, энтодермальные клетки, мезодермальные клетки, фибробласты, остеоциты, хондроциты, естественные киллеры, дендритные клетки, клетки печени, клетки поджелудочной железы и/или стромальные клетки. В другом конкретном варианте осуществления клетки являются инсулин-продуцирующими клетками, например, клетками поджелудочной железы (например, инсулоцитами), или инсулин-продуцирующей клеточной линией, например, клетками β-TC-6.
В другом конкретном варианте осуществления дифференцированные клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включают мукоциты слюнных желез, сероциты слюнных желез, клетки железы фон Эбнера, клетки молочной железы, клетки слезных желез, клетки церуминозных желез, темные клетки эккринных потовых желез, светлые клетки эккринных потовых желез, клетки апокринных потовых желез, клетки железы Молля, клетки сальных желез, клетки боуменовой железы, клетки бруннеровой железы, клетки семенных пузырьков, клетки предстательной железы, клетки бульбоуретральных желез, клетки бартолиновой железы, клетки желез Литтре, клетки эндометрия, выделенные бокаловидные клетки, мукоциты желудка, главные клетки желудочных желез, обкладочные клетки желудка, ацинарные клетки поджелудочной железы, клетки Панета, пневмоциты типа II и/или клетки Клара.
В другом конкретном варианте осуществления дифференцированные клетки, используемые в соответствии со способами, представленные в настоящем описании, включают соматотропные клетки, лактотрофные клетки, тиреотропные клетки, гонадотропоциты, кортикотропные клетки, клетки средней доли гипофиза, крупные нейросекреторные клетки, клетки кишечника, клетки дыхательных путей, эпителиальные клетки щитовидной железы, парафолликулярные клетки, клетки паращитовидной железы, главные клетки паращитовидной железы, оксифильные клетки, клетки надпочечника, хромаффинные клетки, клетки Лейдига, клетки внутренней оболочки фолликула яичника, клетки желтого тела, гранулезные лютеиновые клетки, паралютеиновые клетки, юкстагломерулярные клетки, клетки плотного пятна, периполярные клетки и/или мезангиальные клетки.
В другом конкретном варианте осуществления дифференцированные клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включают клетки фенестрированного эндотелия кровеносных сосудов и лимфатических сосудов, клетки непрерывного эндотелия кровеносных сосудов и лимфатических сосудов, клетки эндотелия кровеносных сосудов и лимфатических сосудов селезенки, синовиальные клетки, клетки серозных оболочек (выстилающие брюшную, плевральную и перикардиальную полости), сквамозные клетки, цилиндрические клетки, темные клетки, клетки мембраны Рейсснера (выстилающие эндолимфатическое пространство уха), базальные клетки сосудистой полоски, маргинальные клетки сосудистой полоски (выстилающие эндолимфатическое пространство уха), клетки Клаудиуса, клетки Беттхера, клетки сосудистого сплетения, сквамозные клетки пиа-арахноидального слоя, клетки пигментного эпителия ресничного тела, клетки непигментного эпителия ресничного тела, эндотелиальные клетки роговицы, peg cells, реснитчатые клетки дыхательных путей, реснитчатые клетки фаллопиевых труб, реснитчатые клетки эндометрия, реснитчатые клетки сети яичка, реснитчатые клетки отводящего канальца яичка и/или реснитчатые эпендимные клетки.
В другом конкретном варианте осуществления дифференцированные клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включают кератиноциты эпидермиса, базальные клетки эпидермиса, кератиноциты ногтей, базальные клетки ногтевого ложа, клетки мозгового слоя стержня волоса, клетки коркового слоя стержня волоса, кутикулярные клетки стержня волоса, кутикулярные клетки корневого влагалища волоса, клетки слоя Хаксли корневого влагалища волоса, клетки слоя Генле корневого влагалища волоса, внешние клетки корневого влагалища волоса, клетки матрикса волоса, поверхностные эпителиальные клетки многослойного плоского ороговевающего эпителия, базальные клетки эпителия и/или клетки эпителия мочевыводящих путей.
В другом конкретном варианте осуществления дифференцированные клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании включают внутренние волосковые клетки Кортиева органа, внешние волосковые клетки Кортиева органа, внутренние столбовые клетки Кортиева органа, внешние столбовые клетки Кортиева органа, внутренние фаланговые клетки Кортиева органа, внешние фаланговые клетки Кортиева органа, пограничные клетки Кортиева органа, клетки Гензена Кортиева органа, поддерживающие клетки вестибулярного аппарата, поддерживающие клетки вкусовой луковицы, поддерживающие клетки обонятельного эпителия, шванновские клетки, клетки-сателлиты, глиальные клетки кишечника, базальные клетки обонятельного эпителия, холодочувствительные первичные афферентные нейроны, теплочувствительные первичные афферентные нейроны, эпидермальные клетки Меркеля, обонятельные рецепторные нейроны, ноцицептивные первичные афферентные нейроны, фоторецепторные палочковидные клетки, фоторецепторные колбочковые клетки, реагирующие на синий цвет, фоторецепторные колбочковые клетки, реагирующие на зеленый цвет, фоторецепторные колбочковые клетки, реагирующие на красный цвет, проприоцептивные первичные афферентные нейроны, осязательные первичные афферентные нейроны, клетки каротидного синуса типа I, клетки каротидного синуса типа II (рецептор pH крови), волосковые клетки типа I вестибулярного аппарата (ускорение и гравитация), волосковые клетки типа II вестибулярного аппарата, клетки вкусовой луковицы типа I, холинергические нейроны, адренергические нейроны и/или пептидергические нейроны.
В другом конкретном варианте осуществления дифференцированные клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включают астроциты, нейроны, олигодендроциты, веретенообразные нейроны, клетки переднего эпителия хрусталика, кристалинн-содержащие волокна хрусталика, гепатоциты, адипоциты, клетки белой жировой ткани, клетки бурой жировой ткани, липоциты печени, париетальные клетки почечного клубочка, подоциты почечного клубочка, клетки щеточной каймы проксимальных почечных канальцев, клетки тонкого сегмента петли Генле, клетки дистальных почечных канальцев, клетки собирательных трубок почки, пневмоциты типа I, клетки главного протока поджелудочной железы, гладкомышечные клетки протоков, клетки протоков, клетки щеточной каймы энтероцитов, клетки исчерченных протоков экзокринных желез, эпителиальные клетки желчного пузыря, нереснитчатые клетки отводящего протока яичка, главные клетки придатка яичка и/или базальные клетки придатка яичка.
В другом конкретном варианте осуществления дифференцированные клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включают энамелобласты, эпителиальные клетки полулунной пластинки, интердентальные эпителиальные клетки Кортиева органа, фибробласты рыхлой соединительной ткани, кератоциты роговицы, фибробласты сухожилий, фибробласты ретикулярной ткани костного мозга, неэпителиальные фибробласты, перициты, клетки студенистого ядра, цементобласты/цементоциты, одонтобласты, одонтоциты, хондроциты гиалиновой хрящевой ткани, хондроциты волокнистой хрящевой ткани, хондроциты эластической хрящевой ткани, остеобласты, остеоциты, остеокласты, остеогенные клетки-предшественники, гиалоциты, звездчатые клетки (уха), звездчатые клетки печени (клетки Ито), звездчатые клетки поджелудочной железы, красные мышечные волокна, белые мышечные волокна, промежуточные мышечные волокна, сумчато-ядерные интрафузальные мышечные волокна, цепочно-ядерные интрафузальные мышечные волокна, клетки-сателлиты, рабочие кардиомиоциты, узловые кардиомиоциты, волокна Пуркинье, гладкомышечные клетки, миоэпителиальные клетки радужки и/или миоэпителиальные клетки экзокринных желез.
В другом конкретном варианте осуществления дифференцированные клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включают ретикулоциты, мегакариоциты, моноциты, макрофаги соединительной ткани, эпидермальные клетки Лангерганса, дендритные клетки, клетки микроглии, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы, тучные клетки, T-хелперы, T-супрессоры, цитотоксические T-лимфоциты, NKT-клетки, B-клетки, естественные киллеры, меланоциты, клетки пигментного эпителия сетчатки, оогоний/ооциты, сперматиды, сперматоциты, сперматогонии, сперматозоиды, фолликулярные клетки яичника, клетки Сертоли, эпителиальные клетки тимуса и/или интерстициальные клетки почек.
Клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, можно составлять в композициях. В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, содержащих только один тип клеток, т.е. популяция клеток в композиции является гомогенной. В других вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, содержащих несколько типов клеток, т.е. популяция клеток в композиции является гетерогенной.
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, дополнительно содержащих жидкий ECM (см. Раздел 4.1.3). Альтернативно, указанный жидкий ECM можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, одновременно, до или после нанесения указанных клеток. В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, дополнительно содержащих один или несколько синтетических мономеров или полимеров. Альтернативно, указанные синтетические мономеры или полимеры можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, одновременно, до или после нанесения указанных клеток. В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, дополнительно содержащих жидкий ECM и один или несколько синтетических мономеров или полимеров. В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, дополнительно содержащих кросс-линкер. Альтернативно, указанный кросс-линкер можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, одновременно, до или после нанесения указанных клеток.
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, дополнительно содержащих один или несколько дополнительных компонентов, например, компонентов, способствующих выживаемости, дифференцировке, пролиферации клеток и т.д. Такие компоненты могут включать, в качестве неограничивающих примеров, питательные вещества, соли, сахара, факторы выживаемости и факторы роста. Примеры факторов роста, которые можно использовать в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включают, в качестве неограничивающих примеров, инсулиноподобный фактор роста (например, IGF-1), трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета), костный морфогенетический белок, фактор роста фибробластов, фактор роста тромбоцитов (PDGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста соединительной ткани (CTGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов (FGF) (№ 1, 2 и 3), остеопонтин, морфогенетический белок кости-2, гормоны роста, такие как соматотропин, клеточные аттрактанты и молекулы адгезии и т.д., и их смеси. Альтернативно, указанные один или несколько дополнительных компонентов, способствующих выживаемости, дифференцировке, пролиферации клеток и т.д., можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании одновременно, до или после нанесения указанных клеток.
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, дополнительно содержащих полимеризуемые мономеры. Альтернативно, указанный полимеризуемый мономер можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, одновременно, до или после нанесения указанных клеток. В таких вариантах осуществления, например, непосредственно перед биопринтингом можно добавлять катализатор полимеризации таким образом, что после печати клеток мономер полимеруется, образуя гель, удерживающий и/или физически поддерживающий клетки. Например, композиция, содержащая клетки, может содержать мономеры акриламида, после чего в композицию непосредственно перед биопринтингом добавляют TEMED и персульфат аммония или рибофлавин. После нанесения клеток в композиции на поверхности акриламид полимеризуется, изолируя и поддерживая клетки.
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, дополнительно содержащих связующие средства. В конкретном варианте осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, дополнительно содержащих связующие средства мягких тканей, включая, в качестве неограничивающих примеров, цианоакрилатные сложные эфиры, фибриновый клей и/или желатин-резорцин-формальдегидный клей. В другом конкретном варианте осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях, дополнительно содержащих лиганды аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD), внеклеточные белки и/или аналоги внеклеточных белков.
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях таким образом, что клетки можно наносить на поверхность в виде отдельных клеток (т.е. клетки наносят по одной клетке за один раз).
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях таким образом, что клетки можно наносить на поверхность в виде агрегатов, содержащих множество клеток. Такие агрегаты могут включать клетки одного типа или могут включать множество типов клеток, например, два, три, четыре, пять или более типов клеток.
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, составляют в композициях таким образом, что клетки образуют ткань как часть композиции, где указанную ткань можно наносить на поверхность с использованием способов, представленных в настоящем описании. Такие ткани могут включать клетки одного типа или могут включать множество типов клеток, например, два, три, четыре, пять или более типов клеток.
В определенных вариантах осуществления клетки, используемые в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, наносят на поверхность в виде отдельных капель клеток и/или композиций, имеющих небольшой объем, например, от 0,5 до 500 пиколитров на каплю. В различных вариантах осуществления объем клеток или композиции, содержащей клетки, составляет приблизительно 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 20, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 пиколитров, или приблизительно от 1 до 90 пиколитров, приблизительно от 5 до 85 пиколитров, приблизительно от 10 до 75 пиколитров, приблизительно от 15 до 70 пиколитров, приблизительно от 20 до 65 пиколитров или приблизительно от 25 до приблизительно 60 пиколитров.
4.1.2 ТКАНИ И ОРГАНЫ
Настоящее изобретение относится к тканям и органам, сконструированным/полученным с использованием одного или нескольких способов, представленных в настоящем описании.
Используя способы, представленные в настоящем описании, можно получать любой тип ткани, известный в этой области. В определенных вариантах осуществления ткань, полученная способами, представленными в настоящем описании, содержит один тип клеток. В других вариантах осуществления ткань, полученная способами, представленными в настоящем описании, содержит множество типов клеток. В определенных вариантах осуществления ткань, полученная способами, представленными в настоящем описании, содержит несколько типов ткани.
В определенных вариантах осуществления способы, представленные в настоящем описании, включают нанесение клеток на поверхность, где указанная поверхность включает ткань от индивидуума, например, ткань от донора, индивидуума-реципиента, трупа или из другого источника. В определенных вариантах осуществления способы, представленные в настоящем описании, включают нанесение клеток на поверхность, где указанная поверхность включает ткань не от индивидуума, например, синтезированную ткань.
В конкретном варианте осуществления ткань, полученная способами, представленными в настоящем описании, является соединительной тканью.
В другом конкретном варианте осуществления ткань, полученная способами, представленными в настоящем описании, является мышечной тканью. Мышечная ткань, полученная способами, представленными в настоящем описании, может включать висцеральную (гладкую) мышечную ткань, скелетную мышечную ткань или сердечную мышечную ткань.
В другом конкретном варианте осуществления ткань, полученная способами, представленными в настоящем описании, является нервной тканью. Нервная ткань, полученная способами, представленными в настоящем описании, может включать ткань центральной нервной системы (например, ткань головного мозга или ткань спинного мозга) или ткань периферической нервной системы (например, черепно-мозговых нервов и спинномозговых нервов).
В другом конкретном варианте осуществления ткань, полученная способами, представленными в настоящем описании, является эпителиальной тканью, включая эндотелий.
В определенных вариантах осуществления ткани, полученные способами, представленными в настоящем описании, можно использовать для конструирования органа. В определенных вариантах осуществления ткани, полученные способами, представленными в настоящем описании, можно использовать для конструирования части органа.
Ткани и органы, сконструированные в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, могут быть ассоциированы с любой известной системой органов млекопитающих, т.е. пищеварительной системой, системой кровообращения, эндокринной системой, выделительной системой, иммунной системой, системой покровов тела, мышечной системой, нервной системой, половой системой, дыхательной системой и/или костной системой. Примеры органов, которые можно получать способами, представленными в настоящем описании, включают в качестве неограничивающих примеров, легкие, печень, сердце, головной мозг, почки, кожу, кости, желудок, поджелудочную железу, мочевой пузырь, желчный пузырь, тонкий кишечник, толстый кишечник, предстательную железу, яички, яичники, спинной мозг, глотку, гортань, трахею, бронхи, диафрагму, мочеточник, мочеиспускательный канал, пищевод, ободочную кишку, тимус и селезенку. В конкретном варианте осуществления поджелудочную железу получают способами, представленными в настоящем описании.
В конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, используют для конструирования кости. В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, используют для конструирования кожи. В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, используют для конструирования ткани легкого, или легкого или его части. В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, используют для конструирования ткани печени, или печени или ее части. В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, используют для конструирования нервной ткани, или нерва или его части.
В определенных вариантах осуществления ткань или орган, полученные способами, представленными в настоящем описании, дополнительно могут содержать компоненты, благоприятные для функционирования указанной ткани или органа. В определенных вариантах осуществления ткань или орган, полученные способами, представленными в настоящем описании, дополнительно могут содержать нервный проводящий канал, т.е. искусственные средства, направляющие регенерацию аксонов. В конкретном варианте осуществления нервный проводящий канал получают из полиангидрида, например, поли(o-карбоксифенокси)-p-ксилена) или поли(лактид-ангидрида). В определенных вариантах осуществления нервный проводящий канал можно наносить одновременно с печатью ткани или органа, т.е. нервный проводящий канал печатают вместе с тканью или органом. В других вариантах осуществления нервный проводящий канал можно получать перед печатью указанной ткани или органа и помещать (например, помещать вручную) в ткань или орган, когда их печатают. В других вариантах осуществления нервный проводящий канал можно получать перед печатью указанной ткани или органа и помещать (например, помещать вручную) в ткань или орган после их печати.
В определенных вариантах осуществления ткань или орган, полученные способами, представленными в настоящем описании, дополнительно могут содержать кровеносные сосуды, например, кровеносные сосуды, полученные от индивидуума (например, донора, индивидуума-реципиента или трупа), или кровеносные сосуды, сконструированные с использованием способов, представленных в настоящем описании.
В определенных вариантах осуществления ткани и органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, имеют ту форму ткани или органа, которую они имеют в природе, например, в организме человека. Например, легкое, полученное в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, может иметь сходство с легким человека, таким, как оно выглядит в организме человека.
В определенных вариантах осуществления ткани и органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, не имеют ту форму ткани или органа, которую они имеют в природе, но функционируют тем же образом или аналогично органу. Например, легкое, полученное в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, может не иметь сходство с легким человека, таким, как оно выглядит в организме человека, но сохраняет некоторые или все из функций легкого человека. В таких вариантах осуществления ткани и органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, могут иметь различные формы, включая, в качестве неограничивающих примеров, сферу, цилиндр, стержневидную или кубическую форму (т.е. куб).
4.1.3 ВНЕКЛЕТОЧНЫЙ МАТРИКС (ECM)
Способы, представленные в настоящем описании, включают нанесение клеток (например, композиции, содержащие отдельные клетки, и/или композиции, содержащие множество клеток) и внеклеточного матрикса (ECM), включая жидкий ECM, на поверхность. ECM можно получать из любого известного источника ECM, и его можно делать жидким с использованием любого известного в этой области способа. В конкретных вариантах осуществления ECM включает жидкий ECM. ECM можно делать жидким с использованием, например, способов, описываемых в разделе 4.1.3.1 ниже. В определенных вариантах осуществления ECM можно поперечно сшивать, например, с использованием способов, описываемых в разделе 4.1.3.2 ниже.
ECM (например, жидкий ECM), используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, можно составлять как часть композиции для применения в соответствии со способами, представленными в настоящем описании.
В определенных вариантах осуществления ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включает ECM млекопитающего, растительный ECM, ECM моллюска и/или ECM рыбы.
В конкретном варианте осуществления ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включает ECM млекопитающего. В другом конкретном варианте осуществления ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включает ECM млекопитающего, где указанный ECM млекопитающего получают из плаценты (например, плаценты человека). В другом конкретном варианте осуществления указанный полученный из плаценты ECM включает телопептид коллагена.
В другом конкретном варианте осуществления указанный полученный из плаценты ECM включает обработанный основанием и/или обработанный детергентом телопептид плацентарного коллагена типа I, химически модифицированный или приведенный в контакт с протеазой, где указанный ECM содержит менее 5% фибронектина или менее 5% ламинина по массе; от 25% до 92% коллагена типа I по массе; и от 2% до 50% коллагена типа III или от 2% до 50% коллагена типа IV по массе.
В другом конкретном варианте осуществления указанный полученный из плаценты ECM включает обработанный основанием, обработанный детергентом телопептид плацентарного коллагена типа I, не модифицированный химически или не приведенный в контакт с протеазой, где указанный ECM содержит менее 1% фибронектина или менее 1% ламинина по массе; от 74% до 92% коллагена типа I по массе; и от 4% до 6% коллагена типа III или от 2% до 15% коллагена тип IV по массе.
Плацентарный ECM, например, ECM, содержащий телопептид плацентарного коллагена, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, можно получать известными в этой области способами или можно получать следующим образом. Сначала, ткань плаценты (целую плаценту или ее часть) получают стандартными способами, например, собирают в кратчайшие практически целесообразные сроки после кесаревого сечения или нормальных родов, например, асептически. Ткань плаценты может быть из любой части плаценты, включая амнион, растворимый или нерастворимый или оба, хорион, пуповину, или из всей плаценты. В определенных вариантах осуществления композицию коллагена получают из целой плаценты человека без пуповины. Плаценту можно хранить при комнатной температуре или при температуре приблизительно от 2°C до 8°C до дальнейшей обработки. Предпочтительно, плаценту обескровливают, т.е. полностью дренируют от плацентарной и пуповинной крови, оставшейся после рождения. В определенных вариантах осуществления беременную женщину подвергают скринингу до родов, например, на ВИЧ, HBV, HCV, HTLV, сифилис, CMV и другие вирусные патогены, которые, как известно, заражают ткань плаценты.
Ткань плаценты можно подвергать децеллюляризации перед получением ECM. Ткань плаценты можно подвергать децеллюляризации любым способом, известным специалистам в этой области, таким, как подробно описывают в публикациях патентных заявок США №№ 20040048796 и 20030187515, содержание которых включено, таким образом, в качестве ссылок в полном объеме.
Ткань плаценты можно подвергать осмотическому шоку. Осмотический шок можно осуществлять в дополнение к любому этапу очистки, или он может являться единственным этапом очистки по решению специалиста в этой области. Осмотический шок можно осуществлять в любых условиях осмотического шока, известных специалистам в этой области. Такие условия включают инкубацию ткани в растворах с высоким осмотическим потенциалом, или низким осмотическим потенциалом или с изменяющимся высоким и низким осмотическим потенциалом. Раствор с высоким осмотическим потенциалом может являться любым раствором с высоким осмотическим потенциалом, известным специалистам в этой области, таким как раствор, содержащий один или несколько из NaCl (например, 0,2-1,0 M или 0,2-2,0 M), KCl (например, 0,2-1,0 или 0,2 до 2,0 M), сульфата аммония, моносахарида, дисахарида (например, 20% сахарозу), гидрофильного полимера (например, полиэтиленгликоля), глицерина и т.д. В определенных вариантах осуществления раствор с высоким осмотическим потенциалом является раствором хлорида натрия, например, по меньшей мере 0,25 M, 0,5 M, 0,75 M, 11,0 M, 1,25 M, 1,5 M, 1,75 M, 2 M или 2,5 M NaCl. В некоторых вариантах осуществления раствор хлорида натрия является приблизительно 0,25-5 M, приблизительно 0,5-4 M, приблизительно 0,75-3 M или приблизительно 1,0-2,0 M NaCl. Раствор с низким осмотическим потенциалом может являться любым раствором с низким осмотическим потенциалом, известным специалистам в этой области, таким как вода, например, вода, деионизированная любым способом, известным специалистам. В некоторых вариантах осуществления раствор для осмотического шока содержит воду с осмотическим потенциалом менее такового для 50 мМ NaCl. В определенных вариантах осуществления осмотический шок осуществляют в растворе хлорида натрия, а затем водном растворе. В определенных вариантах осуществления после одной или двух обработок раствором NaCl осуществляют промывание водой.
В определенных вариантах осуществления композицию, полученную после осмотического шока, затем можно инкубировать с детергентом. Детергент может являться любым детергентом, известным специалистам в этой области, способным разрушать клеточные или внутриклеточные мембраны, например, ионным детергентом, неионным детергентом, дезоксихолатом, додецилсульфатом натрия, тритоном X100, TWEEN и т.п. Обработку детергентом можно осуществлять при температуре приблизительно от 0°C до приблизительно 30°C, от приблизительно 5°C до приблизительно 25°C, от приблизительно 5°C до приблизительно 20°C, от приблизительно 5°C до приблизительно 15°C, приблизительно 0°C, приблизительно 5°C, приблизительно 10°C, приблизительно 15°C, приблизительно 20°C, приблизительно 25°C или приблизительно 30°C. Обработку детергентом можно осуществлять, например, в течение приблизительно 1-24 часов, приблизительно 2-20 часов, приблизительно 5-15 часов, приблизительно 8-12 часов или приблизительно 2-5 часов.
4
В определенных вариантах осуществления композицию, полученную после обработки детергентом, затем можно инкубировать в щелочных условиях. Конкретные основания для обработки основанием включают биосовместимые основания, летучие основания или любые органические или неорганические основания в концентрации, например, 0,2-1,0 M. В определенных вариантах осуществления основание выбрано из группы, состоящей из NHOH, KOH и NaOH, например, 0,1 M NaOH, 0,25 M NaOH, 0,5 M NaOH или 1 M NaOH. Обработку основанием можно осуществлять при температуре, например, от 0°C до 30°C, от 5°C до 25°C, от 5°C до 20°C, от 5°C до 15°C, приблизительно 0°C, приблизительно 5°C, приблизительно 10°C, приблизительно 15°C, приблизительно 20°C, приблизительно 25°C или приблизительно 30°C, в течение, например, приблизительно 1-24 часов, приблизительно 2-20 часов, приблизительно 5-15 часов, приблизительно 8-12 часов или приблизительно 2-5 часов.
ECM можно получать без обработки основанием; невыполнение этапа обработки основанием, как правило, приводит к получению композиции ECM, содержащей относительно большее количество эластина, фибронектина и/или ламинина, чем композиция ECM, полученная без пропуска обработки основанием.
Как правило, описываемый выше способ для ткани плаценты человека приводит к получению плацентарного ECM, содержащего обработанный основанием и/или обработанный детергентом телопептид плацентарного коллагена типа I, химически модифицированный или приведенный в контакт с протеазой, где указанный ECM содержит менее 5% фибронектина или менее 5% ламинина по массе; от 25% до 92% коллагена типа I по массе; от 2% до 50% коллагена типа III; от 2% до 50% коллагена типа IV по массе; и/или менее чем 40% эластина по массе. В более конкретном варианте осуществления способ приводит к получению обработанного основанием, обработанного детергентом телопептида плацентарного коллагена типа I, где указанный коллаген не модифицирован химически или не приведен в контакт с протеазой, и где указанная композиция содержит менее 1% фибронектина по массе; менее 1% ламинина по массе; от 74% до 92% коллагена типа I по массе; от 4% до 6% коллагена типа III по массе; от 2% до 15% коллагена типа IV по массе; и/или менее 12% эластина по массе.
В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержащие жидкий ECM, дополнительно могут содержать другие компоненты. В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержащие жидкий ECM, дополнительно содержат один или несколько типов клеток, например, один или несколько типов клеток, подробно описанных в разделе 4.1.1 выше. Альтернативно, указанные клетки можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, одновременно, до или после нанесения указанного ECM.
В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержащие жидкие ECM, дополнительно содержат гидрогель (например, термочувствительный гидрогель и/или фоточувствительный гидрогель). Альтернативно, гидрогель можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, одновременно, до или после нанесения указанного ECM.
В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержащие жидкий ECM, дополнительно содержат один или несколько типов клеток, например, один или несколько типов клеток, подробно описанных в разделе 4.1.1 выше, и гидрогель. В конкретном варианте осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержащие жидкий ECM и гидрогель (например, термочувствительный гидрогель и/или фоточувствительный гидрогель) составляют таким образом, что соотношение ECM:гидрогель находится в диапазоне от приблизительно 10:1 до приблизительно 1:10 по массе.
Примеры гидрогелей могут включать органические полимеры (природные или синтетические), которые можно перекрестно сшивать с помощью ковалентных, ионных или водородных связей для получения трехмерной структуры открытой решетки, удерживающей молекулы воды для образования геля. Подходящие гидрогели для таких композиций включают самособирающиеся пептиды, такие как RAD 16. Материалы, образующие гидрогель, включают полисахариды, такие как альгинат и его соли, пептиды, полифосфазены и полиакрилаты, являющиеся перекрестно сшитыми посредством ионных связей, или блок-полимеры, такие как блок-сополимеры полиэтиленоксида-полипропиленгликоля, перекрестно сшитые с помощью температуры или pH, соответственно. В некоторых вариантах осуществления гидрогель или матрикс могут являться биодеградируемыми.
В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержащие жидкий ECM, дополнительно содержат синтетический полимер. В конкретном варианте осуществления синтетический полимер включает полиакриламид, поливинилиденхлорид, поли(o-карбоксифенокси)-p-ксилен) (поли(o-CPX)), поли(лактид-ангидрид) (PLAA), n-изопропилакриламид, диакрилат пентаэритрита, полиметилакрилат, карбоксиметилцеллюлозу и/или сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA). В другом конкретном варианте осуществления синтетический полимер включает термопластик, например, поликапролактон (PCL), полимолочную кислоту, полибутилентерефталат, полиэтилентерефталат, полиэтилен, полиэфир, поливинилацетат и/или поливинилхлорид. Альтернативно, один или несколько синтетических полимеров можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании одновременно, до или после нанесения указанного ECM. В конкретном варианте осуществления синтетическим полимером является PCL.
В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержащие жидкий ECM, дополнительно содержат тенасцин C, белок человека, который, как известно, взаимодействует с фибронектином, или его фрагмент. Альтернативно, тенасцин C можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании одновременно, до или после нанесения указанного ECM.
16
4
16
4
В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, содержащие жидкий ECM, дополнительно содержат сплав титан-алюминий-ванадий (TAlV). Альтернативно, TAlV можно наносить как часть отдельной композиции в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, одновременно, до или после нанесения указанного ECM.
В определенных вариантах осуществления можно дериватизировать ECM в композиции, представленной в настоящем описании, и/или дополнительный компонент композиции, такой как синтетический полимер. Способы дериватизации ECM и синтетических полимеров известны в этой области и включают, в качестве неограничивающих примеров, дериватизацию с использованием пептидов клеточной адгезии (например, пептида, содержащего один или несколько мотивов RGD), дериватизацию с использованием белков клеточной адгезии, дериватизацию с использованием цитокинов (например, фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) или морфогенетического белка кости (BMP)), и дериватизацию с использованием гликозаминогликанов.
4.1.3.1 Способы получения жидкого ECM
ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, можно делать жидким с использованием способов, известных в этой области и представленных в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, делают жидким посредством приведения ECM в контакт с кислотой или основанием, например, кислым или щелочным раствором, содержащим количество указанной кислоты или основания, достаточное для солюбилизации ECM. После получения жидкого ECM, при желании, композицию, содержащую ECM, можно делать нейтральной или доводить до желаемого pH известными в этой области способами.
В другом варианте осуществления ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, делают жидким посредством приведения ECM в контакт с ферментом или комбинацией ферментов, например, протеазой, такой как трипсин, химотрипсин, пепсин, папаин и/или эластаза. После того, как ECM делают жидким, при желании, ферменты можно инактивировать известными в этой области способами.
В другом варианте осуществления ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, делают жидким физическими способами. В конкретном варианте осуществления ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, делают жидким, перемалывая ECM, т.е. измельчая ECM таким образом, что преодолевают внутренние связывающие силы. В другом конкретном варианте осуществления ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, делают жидким, разрезая ECM, например, с помощью блендера или другого устройства. В другом конкретном варианте осуществления ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, делают жидким нарезая ECM. В определенных вариантах осуществления, когда ECM делают более жидким с помощью физических способов, ECM можно обрабатывать в замороженном состоянии (например, ECM лиофилизируют или замораживают в жидком азоте).
4.1.3.2 Способы перекрестной сшивки ECM
ECM, используемый в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, можно перекрестно сшивать способами, известными в этой области и представленными в настоящем описании.
В определенных вариантах осуществления ECM перекрестно сшивают перед его нанесением на поверхность, т.е. ECM можно перекрестно сшивать перед печатью. В соответствии с такими вариантами осуществления кросс-линкер можно включать в композицию, содержащую ECM, и, при необходимости, композицию, содержащую ECM, и кросс-линкер можно обрабатывать в условиях, делающих возможной перекрестную сшивку ECM перед печатью ECM.
В других вариантах осуществления ECM перекрестно сшивают после нанесения на поверхность, т.е. ECM можно перекрестно сшивать после печати. В одном из вариантов осуществления ECM перекрестно сшивают после нанесения на поверхность, сначала печатая ECM на указанной поверхности, затем печатая кросс-линкер на указанной поверхности (т.е. ECM и кросс-линкер печатают как отдельные композиции). По этому варианту осуществления, при необходимости, ECM затем можно перекрестно сшивать, обрабатывая ECM и кросс-линкер в условиях, делающих возможной перекрестную сшивку ECM.
В другом варианте осуществления ECM перекрестно сшивают после нанесения на поверхность посредством печати композиции, содержащей ECM и кросс-линкер, на поверхности, и после указанной печати обрабатывая ECM и кросс-линкер в условиях, делающих возможной перекрестную сшивку ECM.
В конкретном варианте осуществления ECM перекрестно сшивают с помощью химической перекрестной сшивки гиалуроновой кислотой, компонентом ECM. Примеры средств химической перекрестной сшивки гиалуроновой кислоты включают в качестве неограничивающих примеров, дивинилсульфоновый кросс-линкер, бис-эпоксидный кросс-линкер, бензиловый сложноэфирный кросс-линкер, кросс-линкер бутандиол-диглицидиловый простой эфир (BDDE), дисульфидный кросс-линкер с тиоловой модификацией, галогенацетатной модификацией HA, дигидразидной модификацией HA, тираминовой модификацией HA и использование циклоприсоединения Huisgen (т.е. "Click Chemistry"). Такие способы известны в этой области и описаны, например, в Burdick and Prestwich, 2011, Adv. Mater. 23:H41-H56.
В другом конкретном варианте осуществления ECM перекрестно сшивают посредством химической перекрестной сшивки белков ECM. Примеры химических веществ, способных перекрестно сшивать белки ECM, включают, в качестве неограничивающих примеров, глутаральдегид, гексаметилендиизоцианат (HDMI), генипин, карбодиимид, полиэтиленгликоль, бензоилпероксид, BioGlue (кросс-линкер на основе глутаральдегида; Cryolife Inc.), полифосфоэфиры и гидролизуемый полиротаксан.
В другом конкретном варианте осуществления ECM перекрестно сшивают посредством фотополимеризации гиалуроновой кислоты с использованием, например, метакрилового ангидрида и/или глицидилметакрилата (см., например, Burdick and Prestwich, 2011, Adv. Mater. 23:H41-H56).
В другом конкретном варианте осуществления ECM перекрестно сшивают с помощью ферментов. Ферменты, подходящие для перекрестной сшивки ECM, включают, в качестве неограничивающих примеров, лизилоксидазу (см., например, Levental et al, 2009, Cell 139:891-906) и тканевые трансглутаминазы (см., например, Griffin et al, 2002, J. Biochem. 368:377-96).
Специалистам в этой области понятно, что кросс-линкеры необходимо выбирать с учетом предполагаемого применения подвергнутого биопринтингу продукта. Например, если способ, представленный в настоящем описании, используют для получения ткани или органа, подлежащего введению индивидууму, следует соблюдать осторожность в выборе и использовании кросс-линкеров, являющихся биосовместимыми, т.е. не причиняющими вреда указанному индивидууму. Альтернативно, если способ, представленный в настоящем описании, используют для получения ткани или органа, не подлежащего введению индивидууму, например, ткани или органа, подлежащего использованию в диагностических анализах, то практикующему специалисту, осуществляющему способ, нет необходимости соблюдать осторожность в выборе кросс-линкера.
4.1.4 ПОВЕРХНОСТИ
Любую подходящую поверхность можно использовать в качестве поверхности, на которую можно наносить (например, печатать) клетки, жидкий ECM и/или любые дополнительные компоненты таким образом, что получают ткани и органы, полученные способами, представленными в настоящем описании. Такие поверхности могут являться двухмерными (например, плоскими поверхностями) или трехмерными.
В одном из вариантов осуществления поверхность, на которую наносят клетки, жидкий ECM и/или любые дополнительные компоненты, включает искусственную поверхность, т.е. поверхность, созданную человеком. В конкретном варианте осуществления указанная искусственная поверхность является протезируемой. В определенных вариантах осуществления искусственную поверхность выбирают с учетом ее пригодности для введения и/или трансплантации индивидууму, например, человеку. Например, искусственную поверхность, о которой известно, что она не является иммуногенной (т.е. поверхность, не вызывающую иммунный ответ хозяина), можно выбирать для применения, когда ткань или орган, подлежащий нанесению на искусственную поверхность, получают с намерением трансплантировать его индивидууму. В определенных вариантах осуществления искусственную поверхность можно обрабатывать таким образом, чтобы делать ее подходящей для введения и/или трансплантации индивидууму, например, человеку.
В одном из вариантов осуществления поверхность, на которую наносят клетки, жидкий ECM и/или любые дополнительные компоненты, включает пластиковую поверхность. Примеры типов пластиковых поверхностей, на которые можно наносить указанные клетки, ECM и/или дополнительные компоненты, включают, в качестве неограничивающих примеров, полиэфир, полиэтилентерефталат, полиэтилен, поливинилхлорид, поливинилиденхлорид, полипропилен, полистирол, полиамиды, поликарбонат и полиуретаны.
В одном из вариантов осуществления поверхность, на которую наносят клетки, жидкий ECM и/или любые дополнительные компоненты, включает металлическую поверхность. Примеры типов пластиковых поверхностей, на которые можно наносить указанные клетки, ECM и/или дополнительные компоненты, включают в качестве неограничивающих примеров, алюминий, хром, кобальт, медь, золото, железо, свинец, магний, марганец, ртуть, никель, платину, серебро, олово, титан, вольфрам и цинк.
В определенных вариантах осуществления искусственные поверхности, на которые наносят клетки, жидкий ECM и/или любые дополнительные компоненты, конструируют таким образом, что они образуют конкретную форму. Например, искусственную поверхность можно конструировать таким образом, что она имеет форму кости (например, слуховой косточки), и соответствующие клетки (например, остеоциты, остеобласты, остеокласты и другие клетки, относящиеся к костной ткани), жидкий ECM и/или любые дополнительные компоненты можно наносить на указанную поверхность и/или вносить в нее таким образом, чтобы получать кость, подходящую для трансплантации индивидууму.
В другом варианте осуществления указанная поверхность включает ткань или орган от индивидуума (например, человека) или ткань или орган, полученные из клеток индивидуума. В определенных вариантах осуществления поверхность указанной ткани или органа от индивидуума можно подвергать децеллюляризации, например, обрабатывать для удаления клеток из всей поверхности ткани или органа или ее части. В конкретном варианте осуществления индивидуум, от которого получают поверхность ткани или поверхность органа, является индивидуумом, представляющим собой предполагаемого реципиента ткани или органа, получаемого способами, представленными в настоящем описании. В другом конкретном варианте осуществления индивидуум, от которого получают поверхность ткани или поверхность органа, не является индивидуумом, представляющим собой предполагаемого реципиента ткани или органа, получаемого способами, представленными в настоящем описании (например, индивидуум, от которого получают поверхность ткани или поверхность органа, на которой будут осуществлять печать, является донором или трупом).
В соответствии со способами, представленными в настоящем описании, клетки, жидкий ECM и/или любые дополнительные компоненты можно наносить (например, печатать) на любую подходящую ткань или орган от индивидуума. В конкретном варианте осуществления ткань, представляющая поверхность для печати, является соединительной тканью (включая костную ткань), мышечной тканью (включая висцеральную (гладкую) мышечную ткань, скелетную мышечную ткань и сердечную мышечную ткань), нервной тканью (включая ткань центральной нервной системы (например, ткань головного мозга или ткань спинного мозга) или ткань периферической нервной системы (например, черепно-мозговые нервы и спинномозговые нервы)) или эпителиальной тканью (включая эндотелий). В другом конкретном варианте осуществления орган, представляющий поверхность для печати, принадлежит к любой из известных систем органов млекопитающих, включая пищеварительную систему, систему кровообращения, эндокринную систему, выделительную систему, иммунную систему, систему покровов тела, мышечную систему, нервную систему, половую систему, дыхательную систему и/или скелетную систему. В другом конкретном варианте осуществления орган, представляющий поверхность для печати, является всем или частью легкого, печени, сердца, головного мозга, почки, кожи, кости, желудка, поджелудочной железы, мочевого пузыря, желчного пузыря, тонкого кишечника, толстого кишечника, предстательной железы, яичек, яичников, спинного мозга, глотки, гортани, трахеи, бронхов, диафрагмы, мочеточника, мочеиспускательного канала, пищевода, ободочной кишки, тимуса и селезенки. В другом конкретном варианте осуществления орган, представляющий поверхность для печати, является поджелудочной железой или ее частью.
В конкретном варианте осуществления клетки, жидкий ECM и/или любые дополнительные компоненты наносят (например, печатают) на поверхность, содержащую или состоящую из кости. Примеры костей, которые можно печатать, включают длинные кости, короткие кости, плоские кости, смешанные кости и сесамовидные кости. Конкретные кости, которые можно печатать, включают, в качестве неограничивающих примеров, кости черепа, кости лицевого черепа, слуховые косточки, кости фаланг, плечевые кости, бедренные кости, ребра, кости кистей рук и пальцев, кости ступней и пальцев ног, таранные кости, кости запястья, кости грудной клетки (например, грудину) и т.п.
В определенных вариантах осуществления поверхности, представленные в настоящем описании, служащие в качестве каркасов для нанесения (например, нанесения посредством биопринтинга или других способов) клеток, жидкого ECM и/или любых дополнительных компонентов, являются поверхностями, не подвергнутыми биопринтингу. В определенных вариантах осуществления поверхности, представленные в настоящем описании, служащие в качестве каркасов для нанесения (например, нанесения посредством биопринтинга или других способов) клеток, жидкого ECM и/или любых дополнительных компонентов, являются поверхностями, подвергнутыми биопринтингу, например, подвергнутыми биопринтингу способами, представленными в настоящем описании. В конкретном варианте осуществления подвергнутая биопринтингу поверхность включает синтетический материал. В конкретном варианте осуществления синтетическим материалом является PCL.
4.2 КОМПОЗИЦИИ
Настоящее изобретение относится к композициям, которые можно использовать в соответствии со способами, представленными в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композициям, содержащим клетки (например, клетки, описываемые в разделе 4.1.1 выше), пригодным для применения в соответствии со способами, представленными в настоящем описании. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям, содержащим жидкий ECM (например, жидкий ECM, описываемый в разделе 4.1.3 выше), пригодным для применения в соответствии со способами, представленными в настоящем описании. В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композициям, содержащим один или несколько кросс-линкеров (например, кросс-линкеры, описываемые в разделе 4.1.3.2 выше), пригодным для применения в соответствии со способами, представленными в настоящем описании.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей клетки (например, клетки, описываемые в разделе 4.1.1 выше) и жидкий ECM (например, жидкий ECM, описываемый в разделе 4.1.3 выше). В конкретном варианте осуществления клетки включают стволовые клетки, например, мезенхимальные стволовые клетки костномозгового происхождения (BM-MSC), адгезивные к пластику для культивирования тканей плацентарные стволовые клетки (PDAC) и/или амниотические адгезивные клетки (AMDAC). В другом конкретном варианте осуществления жидкий ECM получают из плаценты (например, плаценты человека).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей жидкий ECM (например, жидкий ECM, описываемый в разделе 4.1.3 выше) и один или несколько кросс-линкеров (например, кросс-линкеры, описываемые в разделе 4.1.3.2 выше).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей клетки (например, клетки, описываемые в разделе 4.1.1 выше) и один или несколько кросс-линкеров (например, кросс-линкеры, описываемые в разделе 4.1.3.2 выше).
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей клетки (например, клетки, описываемые в разделе 4.1.1 выше), жидкий ECM (например, жидкий ECM, описываемый в разделе 4.1.3 выше) и один или несколько кросс-линкеров (например, кросс-линкеры, описываемые в разделе 4.1.3.2 выше).
В конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит стволовые клетки и жидкий ECM, где указанные стволовые клетки являются PDAC, и где указанный жидкий ECM получают из плаценты. В другом конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит стволовые клетки и кросс-линкер, где указанные стволовые клетки являются PDAC. В другом конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит стволовые клетки, жидкий ECM и кросс-линкер, где указанные стволовые клетки являются PDAC, и где указанный жидкий ECM получают из плаценты.
В другом конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит стволовые клетки и жидкий ECM, где указанные стволовые клетки являются AMDAC, и где указанный жидкий ECM получают из плаценты. В другом конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит стволовые клетки и кросс-линкер, где указанные стволовые клетки являются AMDAC. В другом конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит стволовые клетки, жидкий ECM и кросс-линкер, где указанные стволовые клетки являются AMDAC, и где указанный жидкий ECM получают из плаценты.
В другом конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит стволовые клетки и жидкий ECM, где указанные стволовые клетки являются BM-MSC, и где указанный жидкий ECM получают из плаценты. В другом конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит стволовые клетки и кросс-линкер, где указанные стволовые клетки являются BM-MSC. В другом конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем описании, содержит стволовые клетки, жидкий ECM и кросс-линкер, где указанные стволовые клетки являются BM-MSC, и где указанный жидкий ECM получают из плаценты.
16
4
16
4
Композиции, представленные в настоящем описании, в дополнение к клеткам (например, клеткам, описываемым в разделе 4.1.1 выше), и/или жидкому ECM (например, жидкому ECM, описываемому в разделе 4.1.3 выше) и/или одному или нескольким кросс-линкерам (например, кросс-линкерам, описываемым в разделе 4.1.3.2 выше), дополнительно могут содержать другие компоненты. В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, дополнительно содержат гидрогель (например, термочувствительный гидрогель и/или фоточувствительный гидрогель). Альтернативно, гидрогель можно составлять в композиции отдельно от представленных в настоящем описании композиций, содержащих клетки и ECM. В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, дополнительно содержат синтетический полимер, такой как полиакриламид, поливинилиденхлорид, поли(o-карбоксифенокси)-p-ксилен) (поли(o-CPX)), поли(лактид-ангидрид) (PLAA), n-изопропилакриламид, диакрилат пентаэритрита, полиметилакрилат, карбоксиметилцеллюлозу, сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) и/или термопластик (например, поликапролактон, полимолочную кислоту, полибутилентерефталат, полиэтилентерефталат, полиэтилен, полиэфир, поливинилацетат и/или поливинилхлорид). Альтернативно, синтетический полимер можно составлять в композиции отдельно от представленных в настоящем описании композиций, содержащих клетки и ECM. В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, дополнительно содержат тенасцин C или его фрагмент. Альтернативно, тенасцин C или его фрагмент можно составлять в композиции отдельно от представленных в настоящем описании композиций, содержащих клетки и ECM. В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, дополнительно содержат сплав титан-алюминий-ванадий (TAlV). Альтернативно, TAlV можно составлять в композиции отдельно от представленных в настоящем описании композиций, содержащих клетки и ECM. В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, дополнительно содержат лекарственное средство (например, низкомолекулярное лекарственное средство). Альтернативно, лекарственное средство можно составлять в композиции отдельно от представленных в настоящем описании композиций, содержащих клетки и ECM. В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, дополнительно содержат антитело (например, терапевтическое антитело). Альтернативно, антитело можно составлять в композиции отдельно от представленных в настоящем описании композиций, содержащих клетки и ECM.
В определенных вариантах осуществления композиции, представленные в настоящем описании, дополнительно содержат один или несколько дополнительных компонентов, способствующих выживаемости, дифференцировке, пролиферации и т.д. клеток, используемых в композициях. Такие компоненты могут включать, в качестве неограничивающих примеров, питательные вещества, соли, сахара, факторы выживаемости и факторы роста. Примеры факторов роста, которые можно использовать в соответствии со способами, представленными в настоящем описании, включают, в качестве неограничивающих примеров, инсулиноподобный фактор роста (например, IGF-1), трансформирующий фактор роста-бета (TGF-бета), костный морфогенетический белок, фактор роста фибробластов, фактор роста тромбоцитов (PDGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фактор роста соединительной ткани (CTGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), эпидермальный фактор роста, фактор роста фибробластов (FGF) (№№ 1, 2 и 3), остеопонтин, морфогенетический белок кости-2, гормоны роста, такие как соматотропин, клеточные аттрактанты и молекулы адгезии и т.д., и их смеси. Альтернативно, один или несколько дополнительных компонентов, способствующих выживаемости, дифференцировке, пролиферации клеток и т.д., можно составлять в композиции отдельно от представленных в настоящем описании композиций, содержащих клетки и ECM.
4.3 ПРИМЕНЕНИЕ
Ткани и органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, можно применять для любой подходящей цели. В конкретном варианте осуществления ткани и органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, применяют в терапевтических целях, например, ткани и/или органы используют в трансплантатах. В другом конкретном варианте осуществления органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, применяют в экспериментальных целях, например, для оценки эффекта одного или нескольких соединений и/или хирургических способов в отношении указанной ткани или органа.
4.3.1 Терапевтическое применение
В определенных вариантах осуществления ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму, нуждающемуся в такой трансплантации.
Примеры тканей и органов, которые можно трансплантировать индивидууму, описывают в разделе 4.1.2. Способы трансплантации, включая пересадку (например, пересадку кожи) и хирургические способы трансплантации, хорошо известны специалистам в этой области.
В определенных вариантах осуществления клетки и/или ECM, из которых получают трансплантируемую ткань и/или орган, получают от реципиента трансплантата. В других вариантах осуществления клетки и/или ECM, из которых получают трансплантируемую ткань и/или орган, получают не от реципиента трансплантата, а от другого индивидуума, например, донора, трупа и т.д.
В определенных вариантах осуществления клетки, из которых получают трансплантируемую ткань и/или орган, получают от реципиента трансплантата, и ECM, из которого получают трансплантируемую ткань и/или орган, получают не от реципиента трансплантата, а из другого источника. В конкретном варианте осуществления ECM, из которого получают трансплантируемую ткань и/или орган, получают из плаценты (например, плаценты человека).
В определенных вариантах осуществления ECM, из которого получают трансплантируемую ткань и/или орган, получают от реципиента трансплантата, и клетки, из которых получают трансплантируемую ткань и/или орган, получают не от реципиента трансплантата, а из другого источника.
В конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, применяют для получения кожи, подходящей для трансплантации, и указанную кожу трансплантируют (т.е. пересаживают) индивидууму, нуждающемуся в такой трансплантации (например, индивидууму с ожогами). В конкретном варианте осуществления указанный индивидуум является человеком.
В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, применяют для получения кости, подходящей для трансплантации, и указанную кость трансплантируют (например, хирургически трансплантируют) индивидууму, нуждающемуся в такой трансплантации (например, страдающему остеопорозом или раком костей). В конкретном варианте осуществления указанный индивидуум является человеком.
В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, применяют для получения печени или ее части, подходящей для трансплантации, и указанную печень или ее часть трансплантируют (например, хирургически трансплантируют) индивидууму, нуждающемуся в такой трансплантации (например, страдающему циррозом печени, гепатитом или раком печени). В конкретном варианте осуществления указанный индивидуум является человеком.
В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, применяют для получения легкого или его части, подходящей для трансплантации, и указанное легкое или его часть трансплантируют (например, хирургически трансплантируют) индивидууму, нуждающемуся в такой трансплантации (например, страдающему раком легких). В конкретном варианте осуществления указанный индивидуум является человеком.
В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, применяют для получения нервной ткани, подходящей для трансплантации (например, ткани головного мозга или ткани спинного мозга), и указанную нервную ткань трансплантируют (например, хирургически трансплантируют) индивидууму, нуждающемуся в такой трансплантации. В конкретном варианте осуществления указанный индивидуум имеет диагностированное неврологическое заболевание (т.е. заболевание центральной или периферической нервной системы). В другом конкретном варианте осуществления указанный индивидуум страдает травмой, повредившей центральную или периферическую нервную систему индивидуума, например, индивидуум страдает черепно-мозговой травмой (TBI) или повреждением спинного мозга (SCI). В другом конкретном варианте осуществления указанный индивидуум является человеком.
В другом конкретном варианте осуществления способы, представленные в настоящем описании, применяют для получения ткани сердечно-сосудистой системы, подходящей для трансплантации (например, ткани сердца, артерий или вен), и указанную ткань сердечно-сосудистой системы трансплантируют (например, хирургически трансплантируют) индивидууму, нуждающемуся в такой трансплантации. В конкретном варианте осуществления указанный индивидуум является человеком.
4.3.1.1 Группы пациентов
Ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, можно применять с пользой для различных групп пациентов. В одном из вариантов осуществления ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, применяют для индивидуумов, которым необходима трансплантация ткани и/или органа.
В конкретном варианте осуществления ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму с диагностированным злокачественным образованием, т.е. для замены всего или части одного или нескольких органов/тканей указанного индивидуума, пораженных злокачественным новообразованием. В конкретном варианте осуществления ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму с диагностированной саркомой костной или соединительной ткани, злокачественным новообразованием головного мозга, раком молочной железы, раком яичников, раком почки, раком поджелудочной железы, раком пищевода, раком желудка, раком печени, раком легких (например, мелкоклеточным раком легких (SCLC), немелкоклеточным раком легких (NSCLC), раком гортани и мезотелиомой) и/или раком предстательной железы.
В другом конкретном варианте осуществления ткани легкого и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму с диагностированным респираторным заболеванием, например, индивидууму с диагностированной астмой, хронической обструктивной болезнью легких(COPD), эмфиземой, пневмонией, туберкулезом, раком легких и/или кистозным фиброзом.
В другом конкретном варианте осуществления ткани печени и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму с диагностированным заболеванием печени, например, индивидуум с диагностированным гепатитом (например, гепатитом A, B или C), раком печени, гемохроматозом или циррозом печени.
В другом конкретном варианте осуществления костные ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму с диагностированным заболеванием костей, например, индивидууму с диагностированным раком костей (например, остеосаркомой), остеонекрозом, метаболическим заболеванием костей, оссифицирующей прогрессирующей фибродисплазией или остеопорозом.
В другом конкретном варианте осуществления ткани и/или органы нервной системы, полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму с диагностированным неврологическим заболеванием (т.е. заболеванием центральной или периферической нервной системы), например, индивидууму с диагностированным злокачественным новообразованием головного мозга, энцефалитом, менингитом, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона, инсультом или рассеянным склерозом.
В другом конкретном варианте осуществления ткани эпидермиса (например, кожи), полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму с диагностированным заболеванием кожи (т.е. заболеванием, поражающим кожу), например, индивидууму с диагностированным раком кожи, экземой, акне, псориазом, опоясывающим лишаем, кератозом; или индивидууму с рубцами.
В другом конкретном варианте осуществления ткани и/или органы нервной системы, полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму, подвергшемуся травме, повредившей центральную или периферическую нервную систему индивидуума, например, индивидууму, страдающему черепно-мозговой травмой (TBI) или повреждением спинного мозга (SCI).
В другом конкретном варианте осуществления ткани и/или органы системы кровообращения, полученные способами, представленными в настоящем описании, трансплантируют индивидууму с диагностированным заболеванием системы кровообращения, например, индивидууму с диагностированным коронарным заболеванием сердца, кардиомиопатией (например, первичной или вторичной кардиомиопатией), инфарктом миокарда, инсультом, воспалительным заболеванием сердца, гипертензивной кардиомиопатией или клапанным заболеванием сердца.
В некоторых вариантах осуществления индивидуум, которому трансплантируют ткань или орган, полученные способами, представленными в настоящем описании, является животным. В определенных вариантах осуществления животное является птицей. В определенных вариантах осуществления животное является собакой. В определенных вариантах осуществления животное является кошкой. В определенных вариантах осуществления животное является лошадью. В определенных вариантах осуществления животное является коровой. В определенных вариантах осуществления животное представляет собой млекопитающее, например, лошадь, свинью, мышь или примата, предпочтительно, человека. В конкретном варианте осуществления индивидуум, которому трансплантируют ткань или орган, полученные способами, представленными в настоящем описании, является человеком.
В определенных вариантах осуществления индивидуум, которому трансплантируют ткань или орган, полученные способами, представленными в настоящем описании, является взрослым человеком. В определенных вариантах осуществления индивидуум, которому трансплантируют ткань или орган, полученные способами, представленными в настоящем описании, является младенцем. В определенных вариантах осуществления индивидуум, которому трансплантируют ткань или орган, полученные способами, представленными в настоящем описании, является ребенком.
4.3.2 Экспериментальное применение
В определенных вариантах осуществления ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, применяют в экспериментальных целях.
В конкретном варианте осуществления ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, применяют для скрининга эффекта лекарственных средств в отношении указанных тканей и/или органов. В соответствии с такими способами ткань или орган, полученные способами, представленными в настоящем описании, можно подвергать воздействию указанного лекарственного средства (например, лекарственного средства, подлежащего оценке) и контроля (например, композиции, не содержащей лекарственное средство) и оценивать эффект лекарственного средства в отношении ткани или органа способами, известными специалистам в этой области (например, посредством оценки токсичности лекарственного средства по сравнению с контролем; эффективности лекарственного средства в вызывании конкретного результата по сравнению с контролем и т.д.).
В определенных вариантах осуществления ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, можно трансплантировать не являющемуся человеком животному и оценивать эффект лекарственного средства в отношении указанной ткани или органа у не являющегося человеком животного, вводя лекарственное средство первому не являющемуся человеком животному, подвергнутому такой трансплантации, вводя контроль (например, композицию, не содержащую лекарственное средство) второму не являющемуся человеком животному, подвергнутому такой трансплантации, и сравнивая результаты.
В определенных вариантах осуществления ткани и/или органы, полученные способами, представленными в настоящем описании, можно трансплантировать не являющемуся человеком животному, и оценивать эффект хирургической операции в отношении указанной ткани или органа у не являющегося человеком животного, осуществляя хирургическую операцию по трансплантации ткани/органа первому не являющемуся человеком животному, подвергнутому такой трансплантации, и не осуществляя хирургическую операцию второму не являющемуся человеком животному, подвергнутому такой трансплантации, и сравнивая результаты.
В конкретном варианте осуществления ткани и/или органы, полученные способами, представленные в настоящем описании, применяют для экстракорпоральных целей. Например, ткань или орган, полученные способами, представленные в настоящем описании, находится вне организма индивидуума, но выполняет функцию, приносящую пользу индивидууму, например, ткань или орган выполняют функцию, в норме выполняемую тканью или органом, находящимися в организме индивидуума.
4.4 НАБОРЫ
Настоящее изобретение относится к фармацевтической упаковке или набору, содержащему один или несколько контейнеров, наполненных одним или несколькими ингредиентами композиций, представленных в настоящем описании. Необязательно, вместе с такими контейнерами можно включать предупреждение в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических или биологических продуктов, в котором отражают одобрение государственным органом производства, использования или продажи для введения человеку.
В конкретном варианте осуществления набор, представленный в настоящем описании, включает композицию, содержащую клетки, представленные в настоящем описании, и жидкий ECM, представленный в настоящем описании. Такой набор, необязательно, может включать композицию, содержащую один или несколько дополнительных компонентов (например, кросс-линкер). В другом конкретном варианте осуществления набор, представленный в настоящем описании, включает композицию, содержащую клетки, представленные в настоящем описании, жидкий ECM, представленный в настоящем описании, и один или несколько кросс-линкеров, представленных в настоящем описании. Наборы, представленные в настоящем описании, можно применять в соответствии со способами, представленными в настоящем описании.
5. ПРИМЕРЫ
5.1 ПРИМЕР 1: ПОДВЕРГНУТЫЕ БИОПРИНТИНГУ КАРКАСЫ ПОДДЕРЖИВАЮТ ПРИКРЕПЛЕНИЕ И РОСТ ПЛАЦЕНТАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
В этом примере показано, что синтетический материал можно подвергать биопринтингу для получения каркасов с контролируемым диаметром волокна и размером пор, и что такие каркасы представляют собой подходящий субстрат для нанесения внеклеточного матрикса (ECM). В этом примере также показано, что каркасы, содержащие подвергнутый биопринтингу синтетический материал и ECM (гибридные каркасы), представляют собой подходящий субстрат для прикрепления и роста клеток, включая плацентарные клетки, такие как плацентарные стволовые клетки.
5.1.1 Способы
2
Для получения гибридных каркасов, содержащих синтетический материал и ECM, поликапролактон (PCL) (Mn 45,000, Sigma) сначала печатали в виде каркасов (54×54×0,64 мм) с использованием биопринтера (EnvisionTEC, Gladbeck, Germany). Условия печати являлись следующими: температура 90°C, давление печати 3-5,5 бар, скорость печати 2-6 мм/с, с иглами подходящего размера. ECM выделяли из плаценты человека, как описано ранее (см., например, Bhatia MB, Wounds 20, 29, 2008). Выделенный ECM наносили на обе стороны подвергнутых биопринтингу каркасов из PCL и позволяли высушиваться (дегидратироваться) для получения гибридных каркасов, содержащих PCL и ECM. Полученные гибридные каркасы PCL-ECM штамповали в диски диаметром 10 мм, предварительно увлажняли с использованием сред в течение ночи и засевали плацентарными стволовыми клетками, полученными способами представленными в настоящем описании (см., например, раздел 4.1.1), при плотности 12500 клеток/см. Клетки культивировали в течение 8 дней. Анализы окрашивания кальцеином и пролиферации MTS осуществляли по стандартным протоколам в разные моменты времени (n=3) для определения жизнеспособности и пролиферации клеток.
5.1.2 Результаты
Оптимизируя условия печати, получали каркасы из PCL с различными размерами волокон, размерами пор и структурами пор (фиг. 1). Напечатанные волокна образовывали стабильную сеть для получения гибридных каркасов, содержащих PCL и ECM. Кроме того, печать волокон различного размера и с различными структурами пор делает возможной получение гибридных каркасов, имеющих различные свойства.
Дегидратация ECM на обеих сторонах подвергнутых биопринтингу каркасов из PCL приводила к получению гибридных каркасов. Наблюдали хорошую интеграцию между PCL и ECM; не отмечали отделения PCL от ECM при воздействии на гибридные каркасы при обработке или культивировании каркасов, включающих регидратацию (фиг. 2).
С течением времени плацентарные стволовые клетки распределялись по поверхности гибридных каркасов и покрывали большую часть поверхности гибридных каркасов на 6-ой день культивирования. При анализе клеточной пролиферации MTS наблюдали значимое повышение количества клеток с течением времени (фиг. 3). Кроме того, плацентарные стволовые клетки, высеянные на гибридные каркасы, демонстрировали хорошую жизнеспособность в течение 8-дневного периода культивирования, о чем свидетельствует окрашивание кальцеином (фиг. 4). В совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что гибридные каркасы PCL-ECM поддерживают прикрепление, выживаемость и рост клеток.
5.1.3 Заключение
В этом примере показано, что гибридные каркасы, содержащие ECM и синтетический материал (PCL), можно получать способами, включающими биопринтинг, и что клетки не только прикрепляются к таким каркасам, но и выживают и пролиферируют при культивировании на таких каркасах.
5.2 ПРИМЕР 2: ПОДВЕРГНУТЫЕ БИОПРИНТИНГУ КАРКАСЫ ПОДДЕРЖИВАЮТ ПРИКРЕПЛЕНИЕ И РОСТ ПЛАЦЕНТАРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
В этом примере показано, что синтетический материал и ECM, содержащий клетки, такие как плацентарные клетки, например, плацентарные стволовые клетки, можно одновременно подвергать биопринтингу для получения гибридных каркасов. Как показано в этом примере, подвергнутые биопринтингу клетки не только выживали при биопринтинге, но и пролиферировали с течением времени при культивировании с гибридными каркасами.
5.2.1 Способы
2
ECM получали, как описано в примере 1, и смешивали с 0,5% альгинатным гидрогелем, содержащим 1 миллион/мл плацентарных стволовых клеток. Затем PCL и ECM, содержащий клетки, подвергали биопринтингу слоями для получения гибридного каркаса, содержащего PCL и ECM. В каждом слое каркаса сначала печатали PCL, затем печатали компонент ECM/клетки для заполнения пропусков между линиями PCL. Для получения гибридных каркасов печатали два или пять таких слоев и перекрестно сшивали их с использованием раствора CaCl. Подвергнутые биопринтингу каркасы, содержащие клетки (клетки/ECM/PCL), культивировали в течение семи дней и оценивали пролиферацию и выживаемость клеток в различные моменты времени с помощью анализов окрашивания кальцеином и клеточной пролиферации MTS.
5.2.2 Результаты
Подвергнутые биопринтингу каркасы поддерживали интактную структуру на всем протяжении культивирования клеток (фиг. 5). PCL представлял хорошую структурную поддержку для гидрогелей ECM, позволяя получать трехмерные конструкции. После биопринтинга и на всем протяжении культивирования клетки хорошо распределялись по всем трехмерным конструкциям; клетки обнаруживали по всей глубине каркасов в течение культивирования (фиг. 6).
Плацентарные стволовые клетки выживали при биопринтинге и продолжали пролиферировать в трехмерных подвергнутых биопринтингу гибридных каркасах на всем протяжении культивирования, что подтверждали с помощью окрашивания кальцеином (фиг. 7). Как показано на фиг. 8, обнаруживали, что большинство клеток распределялось по всему ECM в гибридных каркасах, что свидетельствует о том, что ECM усиливал прикрепление клеток и их распределение в гидрогеле ECM. Это подтверждали, сравнивая локализацию клеток только в альгинате с таковой для клеток в каркасах. Кроме того, как показано на фиг. 9, при анализе клеточной пролиферации MTS наблюдали повышение количества клеток в случаях и 2-слойного, и 5-слойного каркасов, что свидетельствует о том, что эти гибридные каркасы поддерживали рост клеток.
5.2.3 Заключение
В этом примере показано, что гибридные каркасы, содержащие ECM и синтетический материал (PCL), можно получать способами, включающими одновременный биопринтинг ECM и PCL. В этом примере также показано, что клетки можно подвергать биопринтингу вместе с компонентами гибридного каркаса (ECM и PCL), и что клетки выживают при биопринтинге. Кроме того, клетки, подвергнутые биопринтингу вместе с компонентами гибридного каркаса, пролиферируют при культивировании на таких каркасах и распределяются по всему каркасу лучше, чем при культивировании только в клеточном матриксе (альгинате).
5.3 ПРИМЕР 3: ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОДВЕРГНУТЫЕ БИОПРИНТИНГУ КАРКАСЫ
В этом примере показано, что синтетический материал и ECM, содержащий клетки, можно подвергать биопринтингу для получения функциональных каркасов.
Клетки β-TC-6, инсулин-продуцирующую клеточную линию, подвергали биопринтингу с внеклеточным матриксом (ECM), полученным из плаценты человека, в подвергнутый биопринтингу каркас. Каркас имел размер 15×15×2,5 мм и содержал 5 слоев. В каждом слое сначала печатали поликапролактон (PCL) с последующей печатью клеток β-TC-6, смешанных в количестве 15 миллионов клеток/мл в гидрогеле альгинат-ECM (1% альгинат и 12% ECM), между линиями PCL. Весь каркас пропитывали 1%-ным раствором хлорида кальция для поперечной сшивки в течение 20 минут. Затем каркасы культивировали в среде DMEM, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, в инкубаторе для культивирования клеток в 6-луночных планшетах (от 3 до 5 мл среды на лунку). В разные моменты времени каркасы собирали для анализов окрашивания кальцеином и пролиферации MTS для определения жизнеспособности клеток и клеточной пролиферации, соответственно. На фиг. 10 показана структура подвергнутых биопринтингу каркасов.
При окрашивании кальцеином наблюдали, что клетки β-TC-6 выживали при печати и оставались жизнеспособными в течение культивирования. На поперечных срезах каркасов видно, что клетки равномерно распределялись по всему каркасу и оставались жизнеспособными в каждом слое (см. фиг. 10). При анализе MTS подтверждали, что инсулин-продуцирующие клетки β-TC-6 оставались жизнеспособными в течение до 3 недель, при этом общее количество жизнеспособных клеток оставалось постоянным (см. фиг. 11).
Для определения того, могут ли клетки β-TC-6 функционировать в подвергнутом биопринтингу каркасе, измеряли продукцию инсулина клетками. Для измерения продукции инсулина подвергнутые биопринтингу каркасы помещали в свежую среду для выращивания (3 мл/лунку в 6-луночном планшете) на 2 часа и измеряли концентрацию инсулина в аликвотах супернатанта от каждого каркаса с использованием набора для ELISA инсулина мыши (Millipore). Наиболее высокий уровень продуцируемого инсулина определяли в день 0 (см. фиг. 12). Позднее уровни секретируемого инсулина в культуре снижались (день 3 и день 6), но оставались стабильными в культуре в дни с 3 по 6 (см. фиг. 12). Таким образом, клетки β-TC-6 сохраняли способность продуцировать и секретировать инсулин после биопринтинга.
Ключевой функцией инсулин-продуцирующих клеток в поджелудочной железе является продукция инсулина в ответ на повышенные уровни глюкозы в крови. Таким образом, определяли, сохраняют ли подвергнутые биопринтингу каркасы, содержащие PCL, ECM и клетки β-TC-6, эту функцию, подвергая каркасы провокационной пробе с повышением глюкозы (см. фиг. 13). Один каркас ("A" на фиг. 13) подвергали воздействию условий глюкозного голодания (среда IMDM без глюкозы, 10% FCS) в течение двух дней, а затем осуществляли провокационную пробу в условиях продукции инсулина (50 мМ глюкоза/1 мМ IBMX). В качестве контролей, подвергнутые биопринтингу каркасы поддерживали в нормальной среде для культивирования с постоянными уровнями глюкозы ("B" и "C" на фиг. 13). В контролях среду меняли в то же время, когда осуществляли провокационную пробу в условиях продукции инсулина для тестируемого каркаса (т.е. A на фиг. 13). Супернатант каждой культуры (A, B и C) забирали каждые полчаса и измеряли концентрацию инсулина в каждом супернатанте с помощью ELISA. На фиг. 13 показаны уровни продукции инсулина в каждой культуре в разные моменты времени и показано, что в подвергнутом биопринтингу каркасе, помещенному в условия глюкозного голодания с последующей провокационной пробой в условиях продукции инсулина глюкоза (т.е. A на фиг. 13), через 3 часа после провокационной пробы более чем в 80 раз больше инсулина по сравнению с уровнем продукции инсулина в нем через 0,5 часа после провокационной пробы, в то время как в контролях (т.е. B и C на фиг. 13) продуцировалось значительно меньше инсулина (лишь приблизительно в 2 раза больше инсулина через 3 часа после замены среды по сравнению с уровнем продукции инсулина через 0,5 часа после замены среды).
В этом примере показано, что можно получать подвергнутые биопринтингу каркасы, содержащие синтетический материал, клетки и ECM, и что клетки в подвергнутых биопринтингу каркасах остаются жизнеспособными и функциональными.
Композиции и способы по настоящему изобретению не предназначены для ограничения объемом конкретных вариантов осуществления, представленных в настоящем описании. Более того, различные модификации композиций и способов в дополнение к описываемым станут очевидны специалистам в этой области из изложенного выше описания и сопутствующих фигур. Такие модификации попадают в объем формулы изобретения.
В настоящем описании процитированы различные публикации, патенты и патентные заявки, описания которых включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.