Живая пробиотическая вакцина для профилактики инфекции, вызванной вирусом гриппа
LIVE PROBIOTIC VACCINE FOR PREVENTION OF INFECTION CAUSED BY INFLUENZA VIRUS

Изобретение относится к области медицины, вирусологии, микробиологии, молекулярной генетики и биотехнологии и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве живых вакцин для профилактики и лечения инфекций, вызванных вирусами гриппа.
Bui C. et al.
Ерофеева М.К., Никоноров И.Ю.,
На рубеже второго и третьего тысячелетий произошли кардинальные изменения эпидемического процесса при гриппе. Более 30 лет в мире наблюдается одновременная циркуляция двух штаммов вирусов подтипа А. Усилилась активность вирусов гриппа типа В. Кроме эпидемических штаммов вируса гриппа A подтипов A(H1N1) и A(H3N2), которые циркулируют в человеческой популяции, большую угрозу людям создают вирусы гриппа птиц, способные преодолевать межвидовой барьер - это высокопатогенные штаммы A(H5N1) и A(H7N9) [ Transbound Emerg Dis.12327(10):102-111, (2015)].С каждым годом появляется все больше новых лекарственных препаратов, обладающих противовирусными и другими свойствами, способными предупреждать заболевания гриппом. Но, несмотря на значительные успехи медицинской науки, грипп по-прежнему остается мало контролируемой инфекцией, способной вызывать ежегодные эпидемии, а при появлении нового варианта возбудителя - и пандемии [ Terra medica nova. 2 (2009)].
Заболевания, вызванные вирусами гриппа A, по распространению, показателям заболеваемости и смертности, относятся к социально значимым для населения Российской Федерации. Ежегодно от гриппа умирает от 291 000 до 646 000 человек во всем мире.
HA
NA
HA
NA
Slepushkin A. N. et al.
Основные антигены вируса гриппа - это поверхностные гликопротеины - гемагглютинин () и нейраминидаза (). Антитела против  являются вируснейтрализующими, антитела, специфичные к  облегчают протекание инфекции, но они также являются защитными, как показали еще в 70-е годы А. Н. Слепушкин и соавт. [ Journal of Hygiene. 69(4): 571-578, (1971)].
NA
N1
НА
NA
Hancock K. et al
Ранее было показано наличие у части людей перекрестно реагирующих антител к минорному антигенному компоненту вируса гриппа -  подтипа  в результате контактов с ранее циркулирующими вариантами [. New England Journal of Medicine. 361(20): 1945-1952, (2009)]. В условиях появления в циркуляции антигенных вариантов вирусов гриппа с новым подтипом  антитела к  могут сыграть решающую роль в защите от тяжелых форм инфекции в период, пока не будет развернута вакцинация новым антигенным вариантом.
de Vries R.D. et al.
Gottlieb T., Ben-Yedidia T.
NA
NA
NA
В настоящее время активная иммунопрофилактика инфекции вирусами гриппа осуществляется путем вакцинации населения. Из-за высокой изменчивости гемагглютинина вирусов гриппа штаммовый состав гриппозных вакцин необходимо обновлять почти ежегодно. Активно ведутся исследования в направлении создания универсальной противогриппозной вакцины. Р. де Врис с соавт. [ Expert Review of Vaccines. 1299-1301, (2015)] в своей статье суммируют имеющиеся данные по некоторым направлениям создания универсальной противогриппозной вакцины, включая возможность создания вакцины, которая индуцирует перекрестно-реагирующие антитела против  вируса гриппа. Т. Готтлиб с соавт. [ Journal of autoimmunity. 54: 15-20, (2014)] в своем обзоре освещает возможности создания универсальной противогриппозной вакцины, которая вызывала бы иммунный ответ против консервативных эпитопов вируса гриппа, включая . Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рассматривает  как один из целевых антигенов для создания гриппозной вакцины с наиболее широким спектром перекрестной реактивности.
Sridhar, S., K.A. Brokstad and R.J. Cox
Rajao D.S. and D.R. Perez,
Belshe, R.B., et al..
Rudenko L.
3
9
Для специфической профилактики гриппа применяются инактивированные (убитые) или живые аттенуированные (ослабленные) гриппозные вакцины [, Vaccines (Basel), (2): 373-89, (2015)]. Инактивированные вакцины - цельновирионные вакцины из инактивированных цельных вирусов; расщепленные вакцины, или сплит-вакцины; субъединичные вакцины - вакцины, содержащие вирусные субъединицы или виросомальные [ Front Microbiol, : 123 (2018)]. Живые гриппозные вакцины, содержащие аттенуированные вирусы, полученные методом генетической реассортации, разработаны в России и США [ N Engl J Med, 356(7): 685-96, (2007),  In proceedings of the international conference on options for the control of influenza VI, Toronto, Ontario, Canada. Jun 17-23, 122-124 (2007)].
Desheva YA, Smolonogina TA, Doroshenko EM, Rudenko LG.
Современные трехвалентные гриппозные вакцины включают штаммы вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и В. В последние несколько лет появились четырехвалентные гриппозные вакцины, включающие два вируса гриппа В - В/Виктория и В/Ямагата [ Vopr Virusol, 61(1): 16-20, (2016)].
Живые вакцины обеспечивают не только общий гуморальный, но и местный иммунитет за счет синтеза секреторных IgА. Эти вакцины вводятся естественным путем - через нос или через рот, что в значительной мере облегчает их применение.
НА
NA
NA
NA
Smith GE., et al,
Традиционные инактивированные гриппозные вакцины содержат поверхностные вирусные гликопротеины, однако в отличие от , количество  в составе вакцин не стандартизировано. Большим преимуществом  является ее медленная эволюция и способность вызывать длительный иммунитет и перекрестную защиту. Используя технологию вирусоподобных частиц, Smith et al. изучили экспериментальную вакцину на основе  на хорьковой модели гриппозной инфекции H5N1; вакцина оказалась способной обеспечить эффективную защиту [ Virology, 509: 90-97 (2017)].
NA
NA
Другой подход к созданию вакцин на основе  - встраивание консервативных последовательностей  в пробиотические векторы. То есть, альтернативой использованию химических адъювантов для вакцинации является применение так называемых живых вакцин на основе пробиотиков. Живые вакцины применяют, как правило, однократно, вводят подкожно, накожно или внутримышечно, а некоторые вакцины перорально и ингаляционно. Главным преимуществом живых вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный прочный иммунный ответ.
Vintini EO., Medina MS.,
Bermudez-Hurnarun LG., Kharrat P., Chatel JM.,
Me Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G.
De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. еt al.
Пробиотики - препараты, оказывающие общее благотворное влияние на организм человека (чаще всего молочнокислые бактерии). Установлено, что некоторые пробиотики являются эффективными неспецифическими стимуляторами выработки специфических иммуноглобулинов против различных инфекций [ BMC Immunol., 12: 46 (2011),  Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011)]. Пробиотики стали использоваться в качестве векторов, в часть из которых успешно внесены плазмидные конструкции, обеспечивающие зкспрессию антигенов патогенных бактерий [ Microbiology, 158: 498-504 (2012),  BMC Microbiol. 12: 299 (2011)].
Персистенция подобных вариантов пробиотиков в организме способна не только стимулировать выработку протективных иммуноглобулинов, специфичных в отношении целевых антигенов возбудителя, но и обеспечить благоприятный фон для борьбы с инфекцией за счет усиления защитных реакций врожденного иммунитета.
Vintini E.O., Medina M.S.,
Bermudez-Hurnarun L.G., Kharrat P., Chatel J.M.,
Mе Y., Luo Y., Huang X., Song F., Liu G.
De Azevedo M., Karczzewski J., Lefeure F. еt al.
Lei H. et al.
Пробиотические микроорганизмы рассматриваются в настоящее время как хорошая основа для получения рекомбинантных живых вакцин, экспрессирующих вакцинные антигены возбудителей актуальных инфекций [ BMC Immunol., 12: 46 (2011);  Microb. Cell. Fact., 10: 17-24 (2011);  Microbiology, 158: 498-504 (2012),  BMC Microbiol. 12: 299 (2011),  Virology. Т. 476: 189-195 (2015)].
Lactococcus lactis
Lei H. et al.
В 2015 г. Хан Л. со своими коллегами создали химерную конструкцию на основе бактерии , содержащую на своей поверхности нейраминидазу вируса гриппа А, и доказали, что она способна защищать мышей от инфекции вирусами гриппа [ Virology. Т. 476: 189-195, (2015)]. Такая химерная конструкция может быть кандидатом для создания универсальной противогриппозной вакцины.
NA
NA
NA
Lactococcus lactis
L. lactis
L. lactis
L. lactis
Существующие вакцины против гриппа А преимущественно сосредоточены на гемагглютинине и формируют штаммо-специфическую защиту. Нейраминидаза намного меньше изучена в контексте гуморального иммунитета против вирусов гриппа. Целью исследования в работе Хан Л. является оценка перекрестного защитного иммунитета , представленного на поверхности  (), против гомологичных и гетерологичных вирусов гриппа А в мышиной модели. Важно отметить, что  / pNZ8110-pgsA- обеспечил защиту на 80% против H5N1, на 60% - защиту против H3N2 и H1N1, соответственно. Эти выводы свидетельствуют о том, что рекомбинантный  / pNZ110-pgs A при отсутствии адъюванта через пероральное введение может быть подан в качестве эффективной вакцины против различных штаммов вирусов гриппа.
Еnterococcus faecium
Streptococcus agalactiae
Еnterococcus faecium
Гупалова Т.В., c соавт.,
Известен способ создания живой вакцины на основе штамма пробиотика  L3 для профилактики вагинальной инфекции, вызванной  (СГВ). На основе штамма пробиотика  L3 сконструирована первая генно-инженерная живая вакцина со встроенным в хромосому участком гена белка патогенного СГВ[ 2013).
bac
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
Суворов А.Н., с соавт.,
Также описано создание живой вакцины против СГВ, в которой использовался подход, основанный на введении  гена патогенных СГВ в хромосомную ДНК пробиотического штамма L3 при экспрессии в пилях. Пили из энтерококков являются идеальными кандидатами для вакцин из-за их экспозиции на клеточной поверхности. Они выступают за пределы бактериальных клеток и способны проникать сквозь капсулу, которая экранирует большинство белков-антигенов. Пили состоят из мономеров, способных к агрегации, за счет чего увеличивается доза антигена, и повышаются титры антител, специфичных к встраиваемому в структуру поверхностного белка энтерококка полипептидного фрагмента штамма патогенного СГВ. Поэтому способ введения гена патогенных стрептококков в пили пробиотического штамма  L3 выгодно отличается тем, что рекомбинантный белок экспрессируется не в цитоплазме, а на поверхности бактерии [ патент RU № 2640250].
Обычный подход к работе с живыми вакцинами на основе пробиотиков состоит в том, что пробиотики используют в качестве природных адъювантов иммунного ответа, а антиген вводится отдельно.
Принципиальное отличие заявляемого решения заключается в интеграции участка ДНК, кодирующего антигенный фрагмент белка патогенного микроорганизма, в структуру хромосомной ДНК энтерококка. Соответственно, задача генетической части работы состоит в осуществлении интеграции гетерологичного участка ДНК в структуру гена поверхностного белка пробиотика без нарушения открытой рамки считывания и повреждения участков кодирования компонентов, участвующих в процессинге поверхностного белка PilF.
Enterococcus faecium
Еnterococcus faecium
Yermolenko E., Suvorov A., Chernush A.,
Tarasova E., et al,
В качестве бактерии-реципиента использовали хорошо изученный пробиотический штамм L3, обладающий целым рядом уникальных биологических свойств. Штамм  L3 обладает выраженной антагонистической активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, способностью восстанавливать микробиоценоз кишечника на фоне дисбиотических состояний [ et al. International Congress Series, 1289: 363-366 (2006)], а также оказывать иммуномодулирующее действие на организм хозяина [ 2010].
Еnterococcus faecium
Suvorov A., Simanenkov V., Gromova L. et al.
Еnterococcus faecium
Суворов А., Алехина Г.Г., Пигаревский П.В. и др.
S.agalactiae и Staphylococcu aureus
Tarasova E., Yermolenko E., Donets V. et al.
Осуществлено физическое картирование штамма  L3 [ Prebiotic sand probiotic s potencial for human health, 104-112, (2011)]. В экспериментах на здоровых самках мышей показано, что интравагинальное введение высоких доз штамма  L3 не только не оказывает токсического действия на организм, но и не влияет на состояние слизистой оболочки влагалища [Гастробюллетень, 4: 29-31, (2001)], а также способствует экспрессии IL-10 клетками слизистой оболочки влагалища крыс с экспериментальным вагинитом, вызванном [ Beneficial Microbs, 1: 265-270, (2010)].
Еnterococcus faecium
Telford JL, Barocchi MA, Margarit I et al.
Camille Danne, Shaynoor Dramsi.
В штамме  L3, как и у других грамположительных бактерий, были найдены пили, которые представляют собой фимбрии длиной 0,3-3 μm и диаметром 2-10 nm [ Nature Reviews Microbiology 4: 509-519, (2006)]. Это длинные белок-подобные полимеры, тянущиеся на поверхности бактерий, которые представляют собой субъединицы белка пилина, соединенные ковалентной связью. Они играют большую роль в адгезии колонизации хозяина. Пили являются высокоиммуногенными структурами, которые находятся под селективным давлением иммунных реакций хозяина [ Researchin Microbiology, 163: 645-658, (2012)]. Принцип модификации пилей энтерококков вакцинными антигенами является эффективным решением при создании живых вакцин благодаря экспозиции целевого антигена на поверхности энтерококка.
Enterococcus faecium
Streptococcus pneumonie
Суворов А.Н., Гупалова Т.В., с соавт.
Еnterococcus faecium
pspf
Streptococcus pneumoniae
Этот принцип введения генов патогенных стрептококков в хромосомную ДНК пробиотического штамма  L3 для экспрессии в пилях был использован при создании живой вакцины для профилактики инфекции, вызванной [ Патент RU № 2701733 (14.12.2018)]. Авторами данного изобретения сконструирована генно-инженерная живая вакцина на основе штамма пробиотика  L3, содержащего пили на своей поверхности, со встроенным в хромосому участком гена  патогенного .
Еnterococcus faecium
Интраназальное введение вакцины  L3-PSPF+ стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интравазальной летальной пневмококковой инфекции инфекции у мышей СВА было показано, что трехкратная интравазальная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной пневмококковой инфекции.
Эта живая вакцина принята в качестве прототипа заявляемого изобретения.
Еnterococcus faecium
Задачей настоящего изобретения явилось создание живой вакцины на основе пробиотического биологически активного штамма  L3 путем включения в структуру его пилей фрагмента гена нейраминидазы вируса гриппа.
Еnterococcus faecium
NA
Авторами сконструирована генно-инженерная живая вакцина на основе штамма пробиотика  L3, содержащего пили на своей поверхности. В качестве антигена использовали один из двух поверхностных антигенов вакцинного вируса гриппа A17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) - гликопротеин  за счет встраивания в хромосому участка гена нейраминидазы.
na)
Еnterococcus faecium
Задачу введения гена нейраминидазы(вируса гриппа в хромосомную ДНК пробиотического штамма  L3 для экспрессии в пилях решали следующим образом:
entF-na
а) получали слитый ген  и клонировали его;
б) выявляли бактериальные клоны, экспрессирущие ген слитого белка NA в пилях.
Еnterococcus faecium
NA
Для оценки протективной эффективности полученной вакцины проводили пероральную вакцинацию мышей живой пробиотической вакциной и определяли специфические к нейраминидазе антитела в крови и вагинальных смывах мышей. Пероральное введение вакцины  L3-стимулировало развитие специфического системного и местного иммунного ответа. На модели интраназальной летальной гриппозной инфекции у мышей было показано, что трехкратная пероральная вакцинация созданной живой пробиотической вакциной повышала защиту от летальной гриппозной инфекции.
Еnterococcus faecium
NA
Конструирование живой вакцины на основе биологически активного пробиотического штамма  L3 за счет включения в его пили антигена  позволило объединить в одном препарате эффективность полезных свойств пробиотика и специфического антигенного стимула.
entF-na
Для получения слитого гена  были сконструированы уникальные праймеры, представленные в таблице.
Таблица. Олигонуклеотидные праймеры
Название
Ориентация
Нуклеотидная последовательность от 5' к 3'
EV
прямой
G<u>CATATG</u>GCGATCCTGGCAAGTGTTAT
FV
обратный
G<u>GAATTC</u>CTAGAGCTGTCGTCGTTCC
A1
прямой
GCTCTAGAGCCGATGAGAGCAGCTGGTATTG
D1
обратный
CAACAGGATCCAAAGCATCGTTGG
B1
прямой
TGAGTGAACCACAGCCAGAA
Seq F
прямой
GGACACCACAACCATCGAAG
Seq R
обратный
AGCTGGACCATGCTACACA
Подчеркнутые звенья нуклеотидной последовательности указывают на сайты рестрикции.
pentF-pspf
Enterococcus faecium
pspf,
Суворов А.Н., Гупалова Т.В., с соавт.
pentF-pspf
pspf
na
pentF-pspf
pspf
na
Рекомбинантная плазмидная ДНК , представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика L3 и фрагмента гена описанная нами ранее [ Патент RU № 2701733 (14.12.2018)], была использована для настоящей конструкции. Для этого из плазмидной ДНК удаляли вставку гена пневмококка  и заменяли ее на вставку гена . Для этого плазмидную ДНК гидролизовали ферментами NdEI и EcoRI, сайты для которых ограничивают последовательность гена (фиг. 1). Такие же сайты рестрикции были заложены в праймеры EV и FV для амплификации фрагмента гена . Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.
pentF-pspf.
E.coli
РНК вируса гриппа A17/утка/Потсдам/86/92(H5N2) была выделена из вируссодержащей аллантоисной жидкости с помощью Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, Германия). ДНК на матрице вирусной РНК была получена с помощью одношаговой обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами EV и FV с помощью набора OneStep RT-PCR Kit (Qiagen, Германия). После электрофореза в 1.5% агарозном геле полученный ПЦР-продукт был вырезан из агарозного геля и гидролизован ферментами NdEI и EcoRI. Клонирование рестрицированного фрагмента после амплификации фрагмента ДНК, кодирующего фрагмент NA, осуществляли, используя верхний фрагмент после гидролиза плазмиды Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК рестрикты выделяли из агарозы с помощью набора «QIA quick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему  DH5α. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина. Из полученных 17 клонов после трансформации были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами EV и FV и со специально сконструированными праймерами SeqF и SeqR. Положительный ответ дали 8 трансформантов. Из двух из них были выделены плазмиды, которые содержали ожидаемую вставку. Наличие вставки подтверждалось гидролизом плазмиды ферментами NdEI и EcoRI (фиг. 2).
ent
-na
Таким образом, в результате клонирования были получена плазмида pF с ожидаемой вставкой и геном устойчивости к эритромицину.
В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой было получено 13 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами EV и FV. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали 12 трансформантов (фиг. 3).
NA
na
pentF-na
Из них выбрали один и обозначили его как NA+ клон. Была проведена амплификация ДНК, выделенной из этого клона с праймерами В1 и FV и B1 и SeqR для проведения секвенирования. Секвенирование ДНК, выделенной из + клона, было проведено с праймерами, соответствующими последовательности гена (праймер SeqR) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В1) для подтверждения интеграции плазмидной ДНК  в хромосомную ДНК энтерококка (фиг. 4).
NA
NA
E. faecium
E. faecium
E. faecium
6
Этот клон энтерококков, экспрессирующий ген  белка, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования. Вакцинацию выбранным клоном энтерококков, экспрессирующим ген  белка, проводили перорально путем кормления мышей. Корм был получен на основе пшена, обработанного культурой  L3, содержащей рекомбинантный белок в структуре пилей. Один грамм сухого корма содержал (4-8)х10 КОЕ модифицированного  L3. Для контрольной группы мышей готовили корм на основе той же партии пшена, обработав его исходным вариантом  L3.
E. faecium
Вакцинацию проводили тремя курсами по пять дней с интервалом в две недели между курсами. Каждый вечер у мышей убирали традиционный комбикорм и в кормушки насыпали пшено, содержащее вакцинный препарат . Утром пшено заменяли комбикормом. В среднем за ночь мыши съедали по 2 г модифицированного энтерококком пшена. Режим кормления в контрольной и опытной группах был одинаковым.
Для оценки гуморального и местного специфического иммунного ответа через 4 дня после окончания второго и третьего курса вакцинации у контрольных и вакцинированных мышей забирали кровь. В сыворотке крови определяли уровень специфических IgG.
Было показано, что пероральная иммунизация мышей пробиотическим вектором, содержащим нейраминидазу подтипа N2, не только вызывала иммунный ответ к рекомбинантной нейраминидазе N1, но и защищала 67% иммунизированных животных от летальной инфекции вирусом пандемического гриппа A/Южная Африка/3626/13(H1N1) pdm.
Пример 1. Получение слитого гена
entF-na
и его клонирование.
pentF-pspf
Enterococcus faecium
pspf,
Суворов А.Н., Гупалова Т.В., с соавт.
entF-na
pentF-pspf
pspf
pentF-pspf
Рекомбинантная плазмидная ДНК , представляющая собой плазмидную ДНК, полученную в результате вставки суммарного фрагмента ДНК, состоящего из двух отдельных фрагментов гена пробиотика L3 и фрагмента гена описанная нами ранее [ Патент RU № 2701733 (14.12.2018)], была использована для создания слитого гена . Для этого из плазмидной ДНК вырезали вставку гена пневмококка , проведя гидролиз плазмидной ДНК ферментами NdEI и EcoRI. Полученный верхний фрагмент после гидролиза был использован для дальнейшего клонирования.
-psp f
На фиг. 1 представлена электрофореграмма рестрицированной плазмидной ДНК pentFферментами NdEI и EcoRI, где цифрами обозначены:
pentF-pspf
1 - плазмида  - исходная;
-pspf
2 - плазмида pentF рестрицированная;
3 - 100 п.н. ДНК-маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
pentF-pspf.
E. coli
К-ДНК, полученная на матрице РНК вируса гриппа A17/утка/Потсдам/86/92(H5N2), была амплифицирована с праймерами EV и FV. Программа ПЦР состояла из: а) денатурации при 94°С в течение 30 сек, б) отжига праймеров при 55°С в течение 1 мин и в) синтеза при 72°С в течение 2 мин. Этот цикл повторяли 30 раз, после чего смесь инкубировали при 72°С на 10 мин. Полученный ПЦР продукт был вырезан из геля и также гидролизован ферментами NdEI и EcoRI. Клонирование рестрицированного фрагмента после амплификации ДНК, кодирующего фрагмент NA, осуществляли, используя верхний фрагмент после гидролиза плазмиды Продукты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле. ДНК-рестрикты выделяли из агарозы с помощью набора «QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, USA), лигировали и трансформировали в гетерологичную систему  DH5α. Среда для отбора содержала 500 мкг/мл эритромицина. Из полученных 17 клонов после трансформации были выделены ДНК, которые были проверены в реакции ПЦР с праймерами EV и FV, а также со специально сконструированными праймерами SeqF и SeqR. Положительный ответ дали 8 трансформантов. Из двух из них были выделены плазмиды, которые содержали ожидаемую вставку. На фиг. 2 показана электрофореграмма рестрицированных плазмид NdEI и EcoRI), где цифрами обозначены: 1 - плазмида 1; 2 - плазмида 2; 3 - 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар).
entF-na,
.
Для дальнейшей работы выбрали плазмиду, выделенную из клона 1, характеризующуюся нуклеотидной последовательностью SEQ ID No:1 и обозначенную как pкоторая кодируетслитый белок NA, имеющий аминокислотную последовательностьSEQ ID No:2
Пример 2. Электропорация энтерококков.
Еnterococcus faecium
entF-na
Для электропорации энтерококков культуру L3 сеяли в 3 мл бульона Tood-Hewitt (THB) («Hi Media», Индия) и выращивали в течение ночи при 37°С, затем пересевали в 50 мл бульона THB 1 мл ночной культуры и выращивали ее до оптической плотности 0.3 при длине волны 650 нм. После этого культуру помещали в лед и затем отмывали трижды в 20 мл 10% глицерина при температуре 4°С. Полученный осадок суспендировали в 0.5 мл стерильного раствора глицерола, переосаждали, конечный осадок ресуспендировали в 0.3 мл того же раствора, разлили в пробирки по 50 мкл и проводили электропорацию в кювете с расстоянием между электродами 1 мм при напряжении 2100 В. Во льду к клеткам добавили полученную интегративную плазмиду p, 300 нг. Оптимальная продолжительность импульса составила 4-5 миллисекунд. После проведения разряда тока в кювету добавляли 1 мл THB, инкубировали 1 час и высевали на чашки с селективной средой, которая содержала 10 мкг/мл эритромицина. Затем ожидали появления трансформантов через 24 часа.
В результате электропорации энтерококков созданной интегративной плазмидой было получено 13 трансформантов. Они были проверены в реакции ПЦР с праймерами EV и FV. Для этого из трансформантов выделяли ДНК, используя набор ДНК-экспресс (Литех, Россия). Положительный ответ дали 12 трансформантов. На фиг. 3 приведена электрофореграмма амплифицированных ДНК-фрагментов, где цифрами обозначены:
1 - 8 - продукты ПЦР ДНК из полученных клонов (1-8);
9 - 100 п.н. ДНК-маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар);
entF-na;
10 - продукт ПЦР плазмидной ДНК p
11-15 - продукты ПЦР ДНК из полученных клонов (9-13);
16- 100 п.н. ДНК - маркер (сверху вниз: 3000, 2000, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 и 100 нуклеотидных пар);
pentF-na;
17 - продукт ПЦР плазмидной ДНК
18-19 - продукт ПЦР без добавления ДНК.
pentF-na
na
Из них выбрали один и обозначили его как NA+ клон. Была проведена амплификация ДНК, выделенной из этого клона, с праймерами EV и FV и SeqF и SeqR. Для подтверждения интеграции плазмидной ДНК в хромосомную ДНК энтерококка было проведено секвенирование ДНК, выделенной из NA+ клона, с праймерами, соответствующими последовательности гена (праймер SeqR) и последовательности хромосомной ДНК энтерококков (праймер В1).
pentF-na
На фиг. 4 показан фрагмент нуклеотидной последовательности, SEQ ID No:1, отражающий интеграцию плазмидной ДНК в хромосомную ДНК энтерококка. Жирным шрифтом выделены последовательности праймеров В1 и SeqR.
NA+
NA
Клон энтерококков , экспрессирующий ген слитого белка, выбран в качестве вакцинного препарата для дальнейшего исследования.
Пример 3. Живая пробиотическая вакцина с включением
NA
при пероральном введении защищала мышей от летальной инфекции вирусом гриппа.
NA
N1
NA
N1
Мыши линии СВА были иммунизированы перорально (по 10 животных в группе). Сыворотки крови были собраны через 4 дня после окончания второго и третьего цикла кормления для определения IgG антител к  подтипа . Результаты изучения иммуногенности представлены на фиг. 5, IgG к рекомбинантной  подтипа , в сыворотках иммунизированных животных после пероральной иммунизации (ИФА)).
50
Через 10дней после окончания третьего цикла вакцинации мыши были интраназально инфицированы вирусом пандемического гриппа A/Южная Африка/3626/13(H1N1)pdm09, десять 50 процентных мышиных летальных доз (МЛД). Результаты изучения защитной эффективности представлены на фиг. 6, где показана летальность (а) и динамика изменения веса (б) после инфицирования мышей вирусом A/Южная Африка/3626/13(H1N1)pdm09).
Показано, что пероральная иммунизация мышей пробиотическим вектором, содержащим нейраминидазу подтипа N2, не только вызывала иммунный ответ к рекомбинантной нейраминидазе N1, но и защищала 67% иммунизированных животных от летальной инфекции вирусом пандемического гриппа A/Южная Африка/3626/13 (H1N1) pdm.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ФГБНУ "ИЭМ"
<120>  Живая пробиотическая вакцина для профилактики инфекции, вызванной
вирусом гриппа
<140>
<141>
<150>
<151>
<160>   1
<170>
<210>  1
<211>  1692
<212>  Нуклеотидная последовательность
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Нуклеотидная последовательность гена нейраминидазы вируса гриппа,
Escherichia coli
экспрессированная в системе
<400>  1
atgagagcag  ctggtattga  gttgaatgat  acatttctat  ctatttacag  tttaaatgga  60
cagtatcagc  aacgtgtgtc  ttggtataat  gacaataatg  aatctgtcgg  tgaacgtaat  120
attgatatga  gagaatttgt  tgggtatgaa  aaaatgggta  gcttacctta  ttttgtcaca  180
acagatacag  catgtgcaga  atacaaagct  cctgcgttat  caacaaacaa  tttaacttca  240
aaagtagtgg  gaggacgtgc  agaaaaggct  tatagctcga  atgatcattt  caccgatgtt  300
gtaggagctg  atacttatca  cagaagtggt  gtaacgtata  cgcttcaagg  cgcttcccca  360
acattcatga  ttggcgcaaa  tacgaatagt  atgatgttta  gctttgatac  tgcattgcta  420
tggacaccac  aaccatcgaa  gcctacaaaa  gaagtgttta  acaaagctaa  tactgaagag  480
gcagcacaca  atattgacaa  aaaagtgatt  ccacaaggat  cagatgttta  ctatcatatt  540
catcaaaagt  ttgatgcatt  aacagtcaac  acaatgaaca  aatacaaatc  atttaaaatc  600
actgatacct  ttgacagcaa  aaattttgat  atggtatcgg  atgggaaaaa  ctatgatggc  660
gcattggcat  atggcgatcc  tggcaagtgt  tatcaatttg  cactcgggca  ggggaccaca  720
ctagacaaca  aacattcaaa  tggcacaata  catgatagaa  tccctcatcg  aaccctatta  780
atgaatgagt  tgggtgttcc  atttcattta  ggaaccaaac  aagtgtgtgt  agcatggtcc  840
agctcaagtt  gtcacgatgg  aaaagcatgg  ttgcatgttt  gtgtcactgg  ggatgataga  900
aatgcaactg  ctagcttcat  ttatgacggg  aggcttgtgg  acagtattgg  ttcatggtct  960
caaaatatcc  tcaggaccca  ggagtcggaa  tgcgtttgta  tcaatgggac  ttgcacagta  1020
gtaatgactg  atggaagtgc  atcaggaaga  gccgatacta  gaatactatt  cattaaagag  1080
gggaaaattg  tccatattag  cccattgtca  ggaagtgctc  agcatataga  ggagtgttcc  1140
tgttaccctc  gatatcctga  cgtcagatgt  atctgcagag  acaactggaa  aggctctaat  1200
aggcccgtta  tagacataaa  tatggaagat  tatagcattg  attccagtta  tgtgtgctca  1260
gggcttgttg  gcgacacacc  caggaacgac  gacagctcta  ggaattccgg  ttctgcgcga  1320
gtgatagata  tgagtacagg  aaaagatatt  acttcagaag  gtacactaac  ctatgatagc  1380
aatttaagaa  cgctgaaatg  ggaagcttcc  gctgatttct  taagtaaaaa  tcttttagat  1440
ggacgagaaa  ttcaactgat  atttacagct  aaaactccac  tacagtcaga  aaaaaatatt  1500
gataaccaag  ccgtagcagc  agtagagaat  gtttctaata  aaacgaatgt  tgtaacaatt  1560
ggtgttgatc  ctaacttacc  acaagtcatt  gttcctagaa  caggttctac  acatttagta  1620
acaattttag  tggttagctt  agtattactt  gtgttagcta  ctcttagtta  tgtggctctg  1680
aagttcaatt  aa                                                          1692
<210>  2
<211>  563
<212>  Аминокислотная последовательность
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гена слитого белка NA, способного
вызывать синтез анти-NA IgG антител, обладающих протективными свойствами в
отношении вируса гриппа
<400>  2
Met  Arg  Ala  Ala  Gly  Ile  Glu  Leu  Asn  Asp  Thr  Phe  Leu  Ser  Ile  Tyr
1                   5                        10                       15
Ser  Leu  Asn  Gly  Gln  Tyr  Gln  Gln  Arg  Val  Ser  Trp  Tyr  Asn  Asp  Asn
20                       25                       30
Asn  Glu  Ser  Val  Gly  Glu  Arg  Asn  Ile  Asp  Met  Arg  Glu  Phe  Val  Gly
35                       40                       45
Tyr  Glu  Lys  Met  Gly  Ser  Leu  Pro  Tyr  Phe  Val  Thr  Thr  Asp  Thr  Ala
50                       55                       60
Cys  Ala  Glu  Tyr  Lys  Ala  Pro  Ala  Leu  Ser  Thr  Asn  Asn  Leu  Thr  Ser
65                       70                       75                       80
Lys  Val  Val  Gly  Gly  Arg  Ala  Glu  Lys  Ala  Tyr  Ser  Ser  Asn  Asp  His
85                       90                       95
Phe  Thr  Asp  Val  Val  Gly  Ala  Asp  Thr  Tyr  His  Arg  Ser  Gly  Val  Thr
100                      105                      110
Tyr  Thr  Leu  Gln  Gly  Ala  Ser  Pro  Thr  Phe  Met  Ile  Gly  Ala  Asn  Thr
115                      120                      125
Asn  Ser  Met  Met  Phe  Ser  Phe  Asp  Thr  Ala  Leu  Leu  Trp  Thr  Pro  Gln
130                      135                      140
Pro  Ser  Lys  Pro  Thr  Lys  Glu  Val  Phe  Asn  Lys  Ala  Asn  Thr  Glu  Glu
145                      150                      155                      160
Ala  Ala  His  Asn  Ile  Asp  Lys  Lys  Val  Ile  Pro  Gln  Gly  Ser  Asp  Val
165                      170                      175
Tyr  Tyr  His  Ile  His  Gln  Lys  Phe  Asp  Ala  Leu  Thr  Val  Asn  Thr  Met
180                      185                      190
Asn  Lys  Tyr  Lys  Ser  Phe  Lys  Ile  Thr  Asp  Thr  Phe  Asp  Ser  Lys  Asn
195                      200                      205
Phe  Asp  Met  Val  Ser  Asp  Gly  Lys  Asn  Tyr  Asp  Gly  Ala  Leu  Ala  Tyr
210                      215                      220
Gly  Asp  Pro  Gly  Lys  Cys  Tyr  Gln  Phe  Ala  Leu  Gly  Gln  Gly  Thr  Thr
225                      230                      235                      240
Leu  Asp  Asn  Lys  His  Ser  Asn  Gly  Thr  Ile  His  Asp  Arg  Ile  Pro  His
245                      250                      255
Arg  Thr  Leu  Leu  Met  Asn  Glu  Leu  Gly  Val  Pro  Phe  His  Leu  Gly  Thr
260                      265                      270
Lys  Gln  Val  Cys  Val  Ala  Trp  Ser  Ser  Ser  Ser  Cys  His  Asp  Gly  Lys
275                      280                      285
Ala  Trp  Leu  His  Val  Cys  Val  Thr  Gly  Asp  Asp  Arg  Asn  Ala  Thr  Ala
290                      295                      300
Ser  Phe  Ile  Tyr  Asp  Gly  Arg  Leu  Val  Asp  Ser  Ile  Gly  Ser  Trp  Ser
305                      310                      315                      320
Gln  Asn  Ile  Leu  Arg  Thr  Gln  Glu  Ser  Glu  Cys  Val  Cys  Ile  Asn  Gly
325                      330                      335
Thr  Cys  Thr  Val  Val  Met  Thr  Asp  Gly  Ser  Ala  Ser  Gly  Arg  Ala  Asp
340                      345                      350
Thr  Arg  Ile  Leu  Phe  Ile  Lys  Glu  Gly  Lys  Ile  Val  His  Ile  Ser  Pro
355                      360                      365
Leu  Ser  Gly  Ser  Ala  Gln  His  Ile  Glu  Glu  Cys  Ser  Cys  Tyr  Pro  Arg
370                      375                      380
Tyr  Pro  Asp  Val  Arg  Cys  Ile  Cys  Arg  Asp  Asn  Trp  Lys  Gly  Ser  Asn
385                      390                      395                      400
Arg  Pro  Val  Ile  Asp  Ile  Asn  Met  Glu  Asp  Tyr  Ser  Ile  Asp  Ser  Ser
405                      410                      415
Tyr  Val  Cys  Ser  Gly  Leu  Val  Gly  Asp  Thr  Pro  Arg  Asn  Asp  Asp  Ser
420                      425                      430
Ser  Arg  Asn  Ser  Gly  Ser  Ala  Arg  Val  Ile  Asp  Met  Ser  Thr  Gly  Lys
435                      440                      445
Asp  Ile  Thr  Ser  Glu  Gly  Thr  Leu  Thr  Tyr  Asp  Ser  Asn  Leu  Arg  Thr
450                      455                      460
Leu  Lys  Trp  Glu  Ala  Ser  Ala  Asp  Phe  Leu  Ser  Lys  Asn  Leu  Leu  Asp
465                      470                      475                      480
Gly  Arg  Glu  Ile  Gln  Leu  Ile  Phe  Thr  Ala  Lys  Thr  Pro  Leu  Gln  Ser
485                      490                      495
Glu  Lys  Asn  Ile  Asp  Asn  Gln  Ala  Val  Ala  Ala  Val  Glu  Asn  Val  Ser
500                      505                      510
Asn  Lys  Thr  Asn  Val  Val  Thr  Ile  Gly  Val  Asp  Pro  Asn  Leu  Pro  Gln
515                      520                      525
Val  Ile  Val  Pro  Arg  Thr  Gly  Ser  Thr  His  Leu  Val  Thr  Ile  Leu  Val
530                      535                      540
Val  Ser  Leu  Val  Leu  Leu  Val  Leu  Ala  Thr  Leu  Ser  Tyr  Val  Ala  Leu
545                      550                      555                      560
Lys  Phe  Asn
563
<---