СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КАРБОНИЛИРОВАННЫХ БЕЛКОВ БЕЗ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОГО ОСАЖДЕНИЯ
METHOD FOR DETERMINING THE CONCENTRATION OF CARBONYLATED PROTEINS WITHOUT PRELIMINARY DEPOSITION

Изобретение относится к области медицины и биохимии, предназначено для оценки карбонильных производных белков, образующихся в результате их окислительной модификации.
Определение карбонильных групп аминокислотных остатков является одним из методов определения окислительной модификации белка и их содержания в белке - по литературным данным, наиболее адекватный и надежный показатель, количественно характеризующий выраженность химических изменений в структуре белка в зависимости от окислительных свободно-радикальных процессов. Метод комплексной оценки содержания карбонильных производных белков с 2,4-динитрофенилгидразином, с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов был предложен впервые R.L. Levine и был множество раз модифицирован.
Методика Levine R.L. и соавторов (R.L. Levine, D. Garland, C.N. Oliver, A. Amici, I. Climent, A. Lenz, B. Ahn, S. Shaltiel, and E.R. Stadtman /Determination of carbonyl contentin oxidatively modifiedproteins. // Methodsof Enzymology, 1990, 186: 464-478), в котором ДНФГ-реакцию используют для определения карбонильных групп в белках из тканей и клеточных культур. В результате реакции 2,4-динитрофенилгидразина с карбонильными продуктами окисления (карбонильными группами) белков, к последним через ковалентную связь присоединяются производные 2,4-динитрофенилгидразона, имеющие характерный спектр поглощения. Содержание карбонильных групп в белке пропорционально оптической плотности образовавшихся динитрофенилгидразонов, измеряемой, как правило, при длине волны 370 нм. Способ Levine R.L. и соавторов (1990 г.) по настоящее время является базовым для многочисленных модификаций спектрофотометрического метода определения карбонильных продуктов окисления белков по реакции с ДНФГ.
В современных исследованиях методы имеют ряд недостатков, которые могут ограничивать методики в чувствительности и доступности для разных форм белка.
Недостаток данных методов - использование традиционной ДНФГ - спектрофотометрии требует больших затрат времени, является трудоемким и сложным процессом, из-за необходимости осаждения, промывки, диспергирования с использованием органических растворителей (этанол / этилацетат и бензол). Кроме того, свободный ДНФГ также поглощает при 370 нм; следовательно, извлечение и промывка этих производных необходима, чтобы удалить ДНФГ, не вступивший в реакцию.
3
4
Современным методом - прототипом является спектрофотометрический анализ оценки концентрации карбонильных групп в окисленных белках щелочным методом с 2,4-динитрофенилгидразином Mesquita, С.S. и соавторы (Mesquita, С.S., Oliveira, R., Bento, F., Geraldo, D., Rodrigues, J. V., &Marcos, J.C. (2014). Simplified 2,4-dinitrophenylhydrazine spectrophotometric assay for quantification of carbonyls in oxidized proteins. AnalyticalBiochemistry, 458, 69-71. doi:10.1016/j.ab.2014.04.034). Способ осуществляют следующим образом: к 400 мл ДНФГ (10 мМ в 0,5 М НРО) вносится 400 мкл раствора белка и через 10 мин инкубации дополнительно вносится 200 мкл NaOH (6 М). Измерения осуществляется при 450 нм после 10 мин инкубации при комнатной температуре против контроля, где раствор белка заменен равным объемом буферного раствора. Динитрофенилгидразоны нестабильны в щелочной среде, поэтому время инкубации после добавления NaOH строго контролируется.
Данный метод имеет ряд преимуществ по сравнению с базовой методикой: в щелочной среде считываемые пики гидразонов сдвигаются и непрореагировавший ДНФГ не считывается, не создает погрешность и это дает возможность не проводить ряд манипуляций - осаждение, диспергирование и промывку. Это также упрощает общий процесс, уменьшает временные затраты.
В результате этот метод имеет ряд недостатков: нестабильность учитываемых динитрофенилгидразонов дает возможную погрешность, снижая точность и чувствительность методики. Ограничение по времени существенно сокращает возможное количество проведенных опытов или при большом количестве образцов будет увеличиваться погрешность в каждом последующем образце.
В нашем методе работа проводилась с основным белком протамином, модификация данного белка с образованием карбонильных соединений производилась системой генерации в растворе гидроксильного радикала - системой Фентона.
Реактивы:
4
1. Смесь 10 мМ растворов ЭДТА и 10 мМ FeSO в ацетатном буфере (0,2 М рН=7,4);
2. Раствор перекиси водорода 10 мМ в ацетатном буфере (0,2 М рН=7,4);
3. 1% раствор сульфата протамина;
4. 0,01М 2,4 ДНФГ в 1 М НСl;
5. Тритон х-100 0,3% в 1,25 М KОН;
Ход определения.
4
2
2
К 1 мл 1% раствора протамина вносится 2 мл смеси 10 мМ FeSO и 10 мМ ЭДТА на ацетатном буфере (рН=7,4), а так же 1 мл 10 мМ НО на ацетатном буфере (рН=7,4). Опыт дублируется, карбонильные соединения отмечаются через 1 час, 2 часа и 4 часа. Определение концентрации карбонилированных белков: в пробирку вносится 480 мкл опытной пробы, к опытной пробе вносится 120 мкл раствора 0,01М 2,4 ДНФГ в 1 М соляной кислоте. Одновременно ставится контроль - это смесь 1:3 протамина и ацетатного буфера, так же в пробирку вносим 480 мкл контрольной пробы, 120 мкл раствора 0,01М 2,4 ДНФГ в 1М соляной кислоте. Опытные и контрольные пробы помещаются в темноту при комнатной температуре на 40 минут. Затем в каждую пробирку вносится 0,9 мл тритон х-100 0,3% в 1,25 М KОН и постановка длится еще 30 минут при комнатной температуре в темноте. Измерение проводится на спектрофотометре от 400 нм до 540 нм против холостой пробы, состоящей из 480 мкл воды, 120 мкл ДНФГ и 0,9 мл тритон х-100 0,3% в 1,25 М KОН.
В щелочной среде сдвигаются пики гидразонов, это дает возможность избежать считывания непрореагировавшего ДНФГ. Нововведение дополнительного неионного поверхностно-активного вещества тритон х-100 стабилизирует динитрофенилгидразоны, что дает достигнуть большей аналитической точности и чувствительности измерений, снизив погрешность. Также тритон х-100 способствует стабилизации белкового материала, не допускает образования нерастворимых фрагментов. Данный метод сохранил и преимущества метода- прототипа, нет необходимости проводить осаждение, диспергирование и промывку. Это упрощает общий процесс, уменьшает временные затраты.
Метод имеет ряд преимуществ перед методом-прототипом: благодаря наличию тритон Х-100, учитываемые динитрофенилгидразоны приобретают большую стабильность. Это уменьшает погрешность, увеличивает точность и чувствительность методики. Снимает ограничение по времени, увеличивая возможное количество проведенных опытов, время измерения при большом количестве образцов не будет влиять на точность.
Пример 1. Выполнение метода определения концентрации карбонилированных белков без предварительного осаждения, в качестве модельного белка, подвергшемуся модификации системой Фентона, используется протамин.
Методика - прототип имеет конкретную длину волны, при которой измеряется оптическая плотность - 450 нм. В таблице 1 представлены сравнение значения оптической плотности при данной длине волны при выполнении метода-прототипа и нововведенного метода и их изменения во времени. Измерение оптической плотности проводились параллельно, в трех временных точках: сразу по истечении положенного времени, т.е. 0 минут, через 30 минут после положенной временной точки и через 60 минут.
Исходя из результатов таблицы отмечается нестабильное изменение значений оптической плотности во времени у метода-прототипа. При этом, наш модифицированный метод показывает незначительные изменения через 30 минут и нестабильность только через 60 минут.
На фигурах 1 и 2 приведены графики, которые иллюстрируют изменения оптической плотности при длине волны от 400 нм до 540 нм, опытных и контрольных проб метода-прототипа и модифицированного метода.
На графиках фиг. 1 метод-прототип отчетливо видна стабильность проб модифицированного метода: под номером 1 график контрольной пробы, под номером 2 графики четырех опытных проб, все четыре графика не обладают общностью значений начиная с длины волны 450 нм, под номером 3 график контрольной пробы через 30 минут после постановки - произошло повышение значения оптической плотности. Под номером 4 графики четырех опытных проб через 30 минут после постановки - следует обратить внимание на абсолютное расхождение значений по сравнению с предыдущими графиками, смещение графиков относительно первоначальных значение при длине волны от 450 нм до 540 нм.
Под номером 5 контрольная проба через 60 минут после постановки - также расхождение с первоначальным графиком значительны. Под номером 6 графики опытных проб через 60 минут после постановки. Отмечается также расщепление значений и смещение графиков относительно первоначальных значений. Так же сдвиги произошли и относительно графиков под номером 4. Таким образом подтверждается абсолютная нестабильность проб метода прототипа во времени.
На графиках фиг. 2. модифицированный метод отчетливо видна стабильность проб модифицированного метода: под номером 1 график контрольной пробы, под номером 2 графики четырех опытных проб, визуально все четыре графика не разделимы, под номером 3 график контрольной пробы через 30 минут после постановки - произошло повышение значения оптической плотности. Под номером 4 графики четырех опытных проб через 30 минут после постановки - отмечается расщепление значений, а также смещение графиков относительно первоначальных значение при длине волны от 450 нм до 540 нм.
Под номером 5 контрольная проба через 60 минут после постановки. Если проследить изменения значений графиков контрольной пробы, то следует отметить постепенное повышение значений оптической плотности.
Под номером 6 графики опытных проб через 60 минут после постановки. Отмечается также расщепление значений и смещение графиков относительно первоначальных значение. Если обобщить вывод по всем графикам под номером 6 - это нестабильность значений.
Таким образом, графики модифицированного метода (фиг. 2) показывают явную большую стабильность значений и повторяемость результатов.