СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ПРОУРОКИНАЗЫ М5
METHOD OF EXTRACTION AND PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN PROUROKINASE M5

300
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ выделения и очистки рекомбинантной человеческой проурокиназы с мутацией Lys→His (M5) из штамма-продуцента E.coli. Способ может быть использован для промышленного производства рекомбинантной проурокиназы человека M5 в целях получения лекарственных средств.
Предшествующий уровень техники
Проурокиназа является естественным ферментом, который секретируется клетками в виде одноцепочечного белка, состоящего из 411 аминокислот. Проурокиназа относится к группе активаторов плазминогена и представляет собой активатор плазминогена урокиназного типа. Она обладает высокой специфичностью к фибрин-связанному плазминогену и при этом не ингибируется специфическими ингибиторами, циркулирующими в плазме крови. Ряд проведенных крупных клинических исследований (SESAM, COMPASS, PRIMI) с рекомбинантной проурокиназой - саруплазой показал, что по эффективности проурокиназа сравнима с тканевым активатором плазминогена (альтеплазой), а месячная летальность в группе саруплазы оказалась достоверно меньше, чем при использовании стрептокиназы (Int. J. Clin. Pract. Suppl. 1998 Nov; 99:9-15; Am. J. Cardiol. 1997, Vol.79: 727-732).
В состав готовой лекарственной формы входит практически неактивная одноцепочечная форма (ОЦ-форма) проурокиназы. Чем ниже ее активность, тем меньше вероятность ее неспецифической активации в организме. Это очень важно, поскольку преждевременная неспецифическая активация вызывает системный тромболизис, что может приводить к возникновению кровотечений. Безопасность проурокиназы, как лекарственного препарата, считается более высокой, чем у тканевых активаторов плазминогена, за счет того, что разница между ферментативной активностью ее ОЦ-формы и активированной двухцепочной формы (ДЦ-форма, урокиназа) составляет около 4 порядков величины, а в случае тканевых активаторов эта разница составляет примерно 1,5 раза (патент РФ 2323001).
Однако нативная проурокиназа обладает коротким периодом полувыведения (около 9 минут), кроме того, существует мнение, что введение больших доз проурокиназы при проведении тромболитической терапии может способствовать активизации и метастазированию опухолей (РМЖ, Кардиология. Эндокринология, 2004 г, №9, с.538-542). Одной из сложностей применения нативной проурокиназы также является ее чувствительность к спонтанной активации в плазме, что может приводить к неспецифическому фибринолизу (Lancet, 1989, 1:863-868). Поэтому были предприняты попытки создания улучшенных препаратов проурокиназы путем введения мутаций в исходную молекулу (примеры таких работ приведены в Biochemistry. 1996, 35(45):14070-6, патентах US 5472692, US 5098840, EP 0210279 и т.д.). К настоящему моменту наиболее успешными оказались два таких препарата - это фибринолитики третьего поколения: отечественный препарат Пуролаза и зарубежный - проурокиназа M5.
Действующим веществом Пуролазы является модифицированная молекула нативной проурокиназы с заменой 24 аминокислотных остатков N-концевого домена. Изменение аминокислотной последовательности привело к удлинению периода полувыведения препарата: с 9 до 30 мин (РМЖ, Кардиология. Эндокринология, 2004 г, №9, с.538-542). Пуролаза преимущественно активирует фибрин-связанный плазминоген и не ингибируется специфическими ингибиторами, присутствующими в плазме крови. Однако при ее введении отмечаются признаки системного фибринолиза (снижение уровня фибриногена и α2-антиплазмина у 28% больных), кроме того, у 11% больных встречаются такие побочные эффекты, как микрогематурия, кровоточивость десен и кровотечения из мест пункции (В.А. Марков, Е.В. Вышлов, «Тромболитическая терапия при инфаркте миокарда», Томск: STT, 2011 г., стр.49).
300
Проурокиназа M5 содержит одиночную мутацию Lys→His в участке, расположенном в петле каталитического домена. Указанная мутация привела к значительному повышению стабильности этого белка в плазме крови и к более быстрому фибринолизу в сравнении с обычной проурокиназой, предположительно за счет того, что как было показано (J. Biol. Chem. 1997, 272:23818-23), в случае M5 достигается пятикратное снижение активности ОЦ-формы проурокиназы, в то время как активность ее ДЦ-формы возрастает почти вдвое. Последующие исследования подтвердили, что тромболизис с использованием М5 позволяет в 10 раз уменьшить потери крови, в сравнении с контрольной группой, в которой применялся тканевый активатор плазминогена (J. Thromb. Haemost., 2006, 4:1559-65). В отличие от нативной проурокиназы, двухцепочечная форма M5, получающаяся за счет активации плазмином, необратимо инактивируется ингибитором Cl-эстеразы, что препятствует неспецифической генерации плазмина, приводящей к геморрагическим эффектам (PLoSOne 2011, 6:е21999). Указанные преимущества M5 обуславливают выбор данного белка в качестве объекта исследования.
К сожалению, в РФ высокая стоимость рекомбинантных тромболитиков служит сдерживающим фактором в вопросе их широкого применения. Поэтому разработка эффективного и легко масштабируемого способа получения мутантной проурокиназы M5 для производства лекарственного препарата является весьма актуальной и важной задачей, решение которой позволит расширить арсенал отечественных тромболитических средств.
В настоящее время известен ряд способов получения проурокиназы. Как правило, экспрессия проводится в штаммах E.coli (US 4511503, US 4599197, US 6583268), что позволяет сделать процесс более производительным, дешевым и менее трудоемким в сравнении с экспрессией в клетках млекопитающих. Экспрессия проурокиназы в бактериях приводит к получению телец включения, содержащих белок в ненативной конформации (например, патент РФ 2073720). Поэтому для получения биологически активного продукта требуется не только выделить белок из телец включения, но и провести его ренатурацию.
Общий подход к выделению белка из штаммов E.coli включает следующую последовательность операций: солюбилизацию телец включения, ренатурацию проурокиназы, последующую очистку.
Например, в патенте US 7074401 описывается выделение белка с использованием следующих стандартных стадий: разрушение клеток, растворение телец включения в гуанидин гидрохлориде, ренатурация, концентрирование и диафильтрация, хроматографическая очистка белка на SP-Сефарозе и гидроксиапатите с последующей гель-фильтрацией (всего 9 стадий). Выделение белка в описанных условиях весьма трудоемко, масштабирование процесса требует введения дополнительных стадий на разных этапах процесса и, в результате этого, неудобно для промышленного применения. Кроме того, при соблюдении описанных в патенте условий, в ходе стадий ренатурации и диафильтрации происходит выпадение осадка, что влечет за собой необходимость дополнительного центрифугирования и в конечном счете приводит к потерям белка.
Похожая схема выделения используется и в международной заявке WO 2004094344. Для получения проурокиназы предлагается способ, состоящий из стадий разрушения клеток, растворения телец включения в 8 M мочевине, ренатурации, концентрирования и диафильтрации, гель-фильтрации на Сефакрил S-300 с последующей хроматографической очисткой белка на SP-Сефарозе.
Та же самая принципиальная схема применяется и для получения отечественного активатора плазминогена урокиназного типа (патенты РФ №2247777 и №2140453): клетки разрушают при помощи ультразвука, растворяют тельца включения, проводят ренатурацию с использованием гуанидин гидрохлорида, очищают белок диализом.
Важно отметить, что во всех упомянутых выше методах ренатурация проурокиназы проводится без предварительной очистки, непосредственно после растворения телец включения. При этом реакционная смесь загрязнена белковыми и небелковыми клеточными примесями: ДНК клетки-хозяина, гидрофобными примесями и бактериальными эндотоксинами. В таких условиях ренатурация проходит с низким выходом, т.к. взаимодействие примесей с целевым белком препятствует его правильному сворачиванию. В одной из статей, посвященных очистке проурокиназы (Eur. J. Biochem. 1991, 195(3):691-7), авторы отмечают, что когда они провели с уже очищенной проурокиназой операции денатурации и ренатурации, то получили хорошие результаты - около 80% белка удалось восстановить. Однако их попытки очищать проурокиназу, полученную в тельцах включения, перед проведением ренатурации не привели к успеху.
Для того чтобы достичь приемлемого выхода (около 20%), ренатурация проводится при очень низких концентрациях белка, около 0,1 мг/мл (см., например, Chinese Medical J., 2001, 114, 2:186-190); после ренатурации необходимо концентрирование больших объемов растворов, осложняющееся выпадением осадка. В вышеупомянутых методах используется несколько стадий концентрирования и гель-фильтрации, что увеличивает общее количество стадий и соответственно потери белка. Кроме того, большинство приведенных методов описывают получение аналитических количеств белка, а их масштабирование неэффективно для производства коммерчески доступных лекарственных средств.
Наиболее близким к заявленному способу является способ получения проурокиназы, описанный в патенте US 5472692. Способ включает разрушение клеток E.coli ультразвуком, после чего лизат наносится на хроматографическую колонку с аффинным сорбентом, активированным ионами никеля. Эта стадия позволяет отделить проурокиназу, в молекулу которой предварительно введен N-концевой полигистидиновый домен. Очищенная проурокиназа инкубируется с иммобилизированной энтерокиназой, вследствие чего происходит удаление N-концевых гистидинов, и проходит повторную стадию очистки с использованием Ni-хелатного сорбента. После чего проводится ренатурация и стандартная очистка путем последовательных хроматографических стадий на колонках, содержащих Сефарозу-S, гидроксиапатит, Сефакрил-S-200 и бензамидин (описанная в упомянутой выше статье Eur J Biochem. 1991, 195(3):691-7 и включающая также стадию ультрафильтрации). Возможные примеси двухцепочечной урокиназы удаляются обработкой диизопропилфторфосфатом.
Данный способ позволяет на начальной стадии получить достаточно чистый препарат проурокиназы, что облегчает дальнейшую ренатурацию, однако необходимость вводить в молекулу полигистидиновый домен, а затем отщеплять его, добавляет дополнительные стадии к процессу очистки белка, что ведет к потерям продукта и удорожанию процесса. Кроме того, обработка диизопропилфторфосфатом нежелательна при получении лекарственных препаратов, т.к. само вещество весьма токсично.
Авторам настоящего изобретения удалось заменить многостадийный процесс предварительной очистки проурокиназы с использованием полигистидинового домена более простым и удобным методом, позволяющим обойтись без введения в молекулу дополнительных аминокислот.
Техническим результатом заявленного изобретения является упрощение технологии очистки рекомбинантной проурокиназы M5. Указанный технический результат достигается осуществлением заявленного способа очистки.
Раскрытие изобретения
Предлагаемый способ очистки мутантной проурокиназы M5, синтезируемой в клетках Е.coli в виде нерастворимых телец включения, состоит из нескольких последовательных стадий.
После культивирования рекомбинантного штамма-продуцента E.coli клетки разрушают ультразвуком или френч-прессом и осаждают тельца включения. Процесс очистки осуществляют посредством проведения следующих стадий: растворение телец включения в 8 M мочевине, предочистка белка совмещенной ионообменной хроматографией на Q и SP-Сефарозе, ренатурация и последующая хроматографическая очистка продукта псевдоаффинной металлхелатной хроматографией. Финальную очистку белка, удаление остаточных эндотоксинов и перевод его в буферный раствор для хранения проводят также совмещенной хроматографией на Q и SP-Сефарозе.
Одно из основных преимуществ данного способа выделения и очистки M5 состоит в проведении предварительной хроматографической очистки белка перед ренатурацией. Предочистка позволяет избавиться от белковых и небелковых клеточных примесей: удалить ДНК клетки-хозяина, гидрофобные примеси и значительную часть бактериальных эндотоксинов, что важно для эффективной ренатурации белка и для последующего терапевтического применения препарата. Высокое значение pI белка (8,6) позволило провести удобную, технологически масштабируемую предварительную хроматографическую очистку. Раствор тел включения в мочевине после центрифугирования пропускался через анионообменную колонку с Q-Сефарозой при pH 7,5. При этом pH целевой белок не сорбировался в отличие от большинства кислых клеточных белков, ДНК, эндотоксинов и других примесей. Дальнейшая очистка проводилась при том же значении pH на катионообменном сорбенте SP-Сефароза. В этих условиях, наоборот, целевой белок сорбировался на колонке, а оставшиеся клеточные примеси элюировались без сорбции. Такой подход позволил технологически объединить две хроматографические стадии последовательным соединением колонок с Q- и SP-Сефарозой. После выхода общего элюата несорбируемых веществ колонка с Q-Сефарозой отключалась, целевой белок элюировался с колонки SP-Сефароза буфером, содержащим 0,5М NaCl. Чистота белка после хроматографии была достаточной для проведения эффективной ренатурации.
Оптимизация ренатурации проводилась варьированием величины pH и температуры реакции, количества и соотношения окислительно-восстановительных реагентов (β-меркаптоэтанол/цистин), ионной силы раствора, концентрации детергента (полисорбат-80), концентрации белка и времени реакции. В подобранных условиях удалось добиться проведения ренатурации без выпадения осадка (в отличие от методов, описанных в разделе «Предшествующий уровень техники»), что позволяет без дополнительных стадий фильтрации или центрифугирования наносить раствор белка на хроматографическую колонку сразу после ренатурации. Сочетание предочистки белка и оптимизированных условий ренатурации позволяет проводить достаточно эффективную ренатурацию с выходом не менее 20%.
2+
2+
После ренатурации целевой белок селективно отделяют от образовавшихся близкородственных неприродных продуктов металлхелатной хроматографией, использующей обнаруженное нами свойство проурокиназы M5 псевдоаффинно связываться с ионами двухвалентных переходных металлов. В качестве сорбента может быть использована, например, Chelating-Сефароза, IMAC-Сефароза или аналогичные матрицы с пришитыми остатками производных иминодиуксусной или нитрилтриуксусной кислоты, активированные ионами Со или Zn. Белок сорбировался на колонке по псевдоаффинному механизму при высокой ионной силе и нейтральном значении pH. Обычно применяемая в таких случаях элюция имидазолом не позволяла эффективно отделить близкородственные продукты ренатурации. Для решения этой задачи был разработан оригинальный способ элюции белка. Проурокиназа M5 имеет сильный положительный заряд при нейтральных и кислых значениях pH, поэтому она способна удерживаться на вышеупомянутых сорбентах при отсутствии связанного иона металла по катионообменному механизму. После понижения pH и удаления ионов металла раствором ЭДТА белок ресорбировался на колонке уже за счет своего высокого pI. Таким образом, хроматография начинается как псевдоаффинная мелаллхелатная, а заканчивается как ионообменная на одном и том же сорбенте, что значительно повышает эффективность и специфичность процесса выделения.
Десорбция белка проводилась без мочевины при слабощелочном значении pH ступенчатым повышением ионной силы. При этом с колонки элюировался преимущественно целевой биологически активный белок. Связанными на колонке оставались близкородственные неактивные продукты ренатурации, практически нерастворимые в буферных растворах, не содержащих мочевину. Такой подход позволил получить на выходе только правильно ренатурированную проурокиназу M5 и достичь за одну стадию 90-95% чистоты белка.
5
Доведение белка до требуемой хроматографической чистоты (более 95%) и максимальной удельной активности (около 10 МЕ/мг), а также перевод в буфер готовой формы проводился на колонке с SP-Сефарозой с предколонкой, содержащей Q-Сефарозу.
Одним из существенных преимуществ разработанной методики является отсутствие обычно применяемых стадий гель-фильтрации, концентрирования или диафильтрации.
Изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.
Пример 1: Получение очищенной проурокиназы M5.
Лизис клеток и растворение телец включения. Биомассу (40-45 г, из 0,5 л культуральной жидкости) клеток Е.coli суспендировали в 400 мл буферного раствора 50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. Клетки разрушали в ледяной бане ультразвуковым дезинтегратором. После этого в суспензию добавляли Triton XI00 до конечной концентрации 1% и инкубировали 20 мин. Суспензию центрифугировали при 30000 g в течение 30 мин. Осадок суспендировали в 400 мл буферного раствора 50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2 М мочевина. Суспензию подвергали воздействию ультразвука и центрифугировали в условиях, описанных выше.
Осадок суспендировали в 400 мл буферного раствора 50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 8 М мочевина, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ DTT, 0,1% полисорбат 80. Суспензию инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 16-18 ч при +8°C и центрифугировали при 30000 g в течение 40 мин.
Хроматографическая предочистка. Значение pH супернатанта доводили до 7,5 с помощью 0,5 М HCl и пропускали его через колонку с Q-Сефарозой (50 мл), соединенную с колонкой с SP-Сефарозой (20 мл). Обе колонки предварительно уравновешивались буферным раствором 50 мМ HEPES (pH 7,5), 8 M мочевина, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 0,05% полисорбат 80. После выхода элюата несорбируемых веществ колонку Q-Sepharose отсоединяли. Колонку SP-Sepharose промывали тем же буферным раствором, содержащим 20% изопропанол (10 объемов колонки), и уравновешивали вновь буферным раствором без изопропанола. Целевой белок с колонки SP-Сефароза элюировали обратным потоком буферным раствором 50 мМ HEPES (pH 7,5), 8 M мочевина, 0,5 М NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 0,05% полисорбат 80.
Ренатурация. Готовили буферный раствор для ренатурации: 50 мМ Трис/HCl (pH 7,6), 2 М мочевина, 2 мМ β-меркаптоэтанол, 0,3 М гуанидин/HCl, 0,3 мМ цистин, 0,01% полисорбат 80. Объем раствора рассчитывали так, чтобы конечная концентрация белка составила 0,2-0,25 мг/мл. Раствор охлаждали до 8°C и добавляли в него фракцию белка. Ренатурацию проводили при перемешивании в течение 18 ч при 8°C.
Хроматографическая очистка. В раствор ренатурированного белка добавляли раствор 1 M HEPES (pH 7,0) до концентрации 50 мМ, pH раствора при необходимости доводили до 7,5 при помощи 1 М соляной кислоты, после чего раствор наносили на колонку с Chelating-Сефарозой FF (100 мл). Колонка предварительно промывалась 200 мл раствора 100 мМ хлорида кобальта, водой и уравновешивалась буферным раствором 50 мМ HEPES (pH 7,5), 2 М мочевина, 0,3 M NaCl, 0,01% полисорбат 80. После нанесения белка колонку промывали буферным раствором до выхода элюата несорбируемых веществ. Колонку промывали буферными растворами 50 мМ HEPES (pH 7,5), 20 мМ NaCl, 0,01% полисорбат 80; 20 мМ цитрат натрия (pH 5,0), 20 мМ NaCl, 0,01% полисорбат 80; 20 мМ цитрат натрия (pH 5,0), 20 мМ ЭДТА, 0,01% полисорбат 80. Целевой белок элюировали буферным раствором 50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 0,01% полисорбат 80.
Приготовление готовой формы. Фракцию целевого белка разбавляли буферным раствором 20 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,01% полисорбат 80 примерно в 3 раза до проводимости 7-8 мСим/см. При необходимости доводили pH до 6,8 при помощи разбавленной фосфорной кислоты. Раствор наносили на колонку с SP-Сефарозой (5 мл), уравновешенную буферным раствором 20 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,01% полисорбат 80. Целевой белок элюировали тем же буферным раствором, содержащим 0,3 М NaCl. Получали примерно 50 мг очищенного белка с удельной активностью (по ДЦ-форме) порядка 105 МЕ/мг в буферном растворе готовой формы (см. пример 3, образец M5-1).
Пример 2: Масштабирование процесса выделения M5.
При масштабировании процесса выделения и очистки M5 в способ, описанный в Примере 1, были внесены изменения, позволяющие оптимизировать данный способ для применения в промышленных условиях, что одновременно позволило увеличить выход со 100 мг до 150 мг очищенного белка в пересчете на 1 л культуральной жидкости.
Лизис клеток и растворение телец включения. Клетки E.coli (из 2 л культуральной жидкости, около 150 г биомассы) суспендировали в 1 л буферного раствора 50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. Клетки разрушали в ледяной бане ультразвуковым дезинтегратором. В полученную суспензию добавляли Triton X100 до конечной концентрации 1% и инкубировали 20 мин. Суспензию центрифугировали при 30000 g в течение 30 мин. Осадок суспендировали в 1 л буферного раствора 50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2 М мочевина. Суспензию подвергали воздействию ультразвука и центрифугировали в условиях, описанных выше.
Осадок суспендировали в 1 л буферного раствора для солюбилизании 50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 8 М мочевина, 1 мМ ЭДТА, 20 мМ DTT, 0,1% полисорбат 80. Доводили объем суспензии до 2 л буфером для солюбилизации и инкубировали при постоянном перемешивании 18 ч при 8°C. После инкубации суспензию центрифугировали при 30000g в течение 40 мин.
Хроматографическая предочистка. Величину pH супернатанта доводили до 7,5 с помощью 1 М HCl и пропускали его через колонку с Q-Сефарозой (300 мл), соединенную с колонкой с SP-Сефарозой (80 мл). Обе колонки предварительно уравновешивались буферным раствором 50 мМ HEPES (pH 7,5), 8 М мочевина, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 0,05% полисорбат 80. После выхода элюата несорбируемых веществ колонку с Q-Сефарозой отсоединяли. Колонку с SP-Сефарозой промывали тем же буферным раствором, содержащим 20% изопропанол (10 объемов колонки), и уравновешивали вновь буферным раствором без изопропанола. Целевой белок с колонки с SP-Сефарозой элюировали буферным раствором 50 мМ HEPES (pH 7,5), 8 М мочевина, 0,5 М NaCl, 10 мМ β-меркаптоэтанол, 0,05% полисорбат 80.
Ренатурация. Готовили буферный раствор для ренатурации: 50 мМ Трис/HCl (pH 7,6), 2 М мочевина, 2 мМ β-меркаптоэтанол, 0,3 М гуанидин/HCl, 0,3 мМ цистин, 0,01% полисорбат 80. Объем раствора рассчитывали так, чтобы конечная концентрация белка составила 0,15-0,20 мг/мл. Раствор охлаждали до 8°C и добавляли в него фракцию белка. Ренатурацию проводили при перемешивании в течение 24 ч при 8°C.
Хроматографическая очистка. В раствор ренатурированного белка добавляли раствор 1 M HEPES (pH 7,0) до концентрации 50 мМ, значение pH раствора при необходимости доводили до 7,5 при помощи 1 М HCl, после чего раствор наносили на колонку с IMAC Сефарозой FF (360 мл). Колонка предварительно промывалась 500 мл раствора 100 мМ хлорида кобальта, водой и уравновешивалась буферным раствором 50 мМ HEPES (pH 7,5), 2 М мочевина, 0,3 М NaCl, 0,01% полисорбат 80. После нанесения белка колонку промывали буферным раствором до выхода элюата несорбируемых веществ. Колонку промывали буферными растворами 50 мМ HEPES (pH 7,5), 20 мМ NaCl, 0,01% полисорбат 80; 20 мМ цитрат натрия (pH 5,0), 20 мМ NaCl, 0,01% полисорбат 80; 20 мМ цитрат натрия (pH 5,0), 20 мМ ЭДТА, 0,01% полисорбат 80. Целевой белок элюировали буферным раствором 50 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 0,01% полисорбат 80.
Приготовление готовой формы. Все последующие операции проводили при 4°C. Фракцию целевого белка разбавляли апирогенным буферным раствором 20 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,01% полисорбат 80 примерно в 3 раза до проводимости 7-8 мСим/см. При необходимости доводили pH до 6,8 при помощи разбавленной фосфорной кислоты. Раствор пропускали через колонку с Q-Сефарозой (20 мл), соединенную с колонкой с SP-Сефарозой (20 мл), уравновешенные апирогенным буферным раствором 20 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,01% полисорбат 80. После выхода элюата несорбируемых веществ колонку с Q-Сефарозой отсоединяли. Целевой белок элюировали тем же буферным раствором, содержащим 0,3 М NaCl.
5
Получали примерно 280-300 мг белка с удельной активностью (по ДЦ-форме) 0,76-1,22×10 МЕ/мг в буферном растворе готовой формы (см. пример 3, образец M5-2). Содержание эндотоксинов, определенное методом гель-тромб теста в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации, издание XII (ГФ XII, ч.1, стр.128), не превышало 2-5 Ед/мл.
Пример 3. Определение удельной активности рекомбинантной проурокиназы М5 хромогенным методом.
Интактный препарат M5 представляет собой латентную ОЦ-форму, практически не обладающую биологической активностью. Испытуемые образцы перед проведением анализа разделяли на две аликвоты, одна из которых подвергалась обработке плазмином с целью перевода белка М5 в высокоактивную ДЦ-форму.
Обработка плазмином:
Для обработки белка М5 использовали плазмин (American Diagnostica), предварительно разведенный до концентрации 8 мкг/мл реакционным буфером, содержащим 50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,01% полисорбат-20.
В реакционную смесь с плазмином добавляли образцы до конечной концентрации 60 мкг/мл согласно следующей схеме:
Таблица 1
Образец
Исходная концентрация, мг/мл
Количество буфера для разведения, мкл
Количество образца, мкл
Количество плазмина, мкл
M5-1
3,7
190,7
4,3
5
M5-2
9,9
193,8
1,2
5
Реакционный буфер: 50 мМ г. Трис/HCl (pH 8,0); 100 мМ NaCl, 0,01% полисорбат-20.
Объем реакционной смеси: 200 мкл.
Конечная концентрация плазмина в реакционной смеси: 0,2 мкг/мл.
Реакционную смесь инкубировали в течение 6 часов при 37°C. После окончания инкубации в каждую пробу вносили по 5 мкл апротинина (Sigma-Aldrich, исходная концентрация 7956 KIU/мл) до его конечного содержания в 200 KIU.
Измерение активности белка M5 кинетическим методом с использованием хромогенного субстрата:
Для измерения активности ОЦ- и ДЦ-форм белка M5 использовали синтетический хромогенный субстрат Pefachrome uPA 8294 Pyroglu-Gly-Arg-pNA*HCl (Pentapharm) с концентрацией 8 мМ. Биологическую активность оценивали по скорости гидролиза хромогенного субстрата в присутствии испытуемого образца.
Для построения калибровочной прямой использовали международный стандарт урокиназы (NIBSC, код 87/594) с активностью 4300 МЕ/мл (после восстановления лиофилизованного содержимого флакона в 1 мл растворителя), который разводили до 280, 140, 70, 35, 17,5 МЕ/мл и вносили по 50 мкл в лунки 96-луночного планшета. В качестве препарата сравнения использовали буфер для разведения (50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,01% полисорбат-20, 200 KIU/мл  апротинина).
Обработанные плазмином образцы разводили в лунках 96-луночного планшета из расчета 2 мкл образца на 48 мкл буфера для разведения (50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,01% полисорбат-20, 200 KIU/мл апротинина).
Образцы, не обработанные плазмином, вносили по 50 мкл на лунку без разведения либо в 3-кратном разведении из расчета 16,7 мкл образца на 33,3 мкл буфера для разведения (50 мМ Трис/HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl, 0,01% полисорбат-20, 200 KIU/мл  апротинина).
Далее в каждую лунку вносили по 50 мкл хромогенного субстрата и помещали планшет в спектрофотометр, где регистрировали кинетику изменения оптической плотности при 405 нм в течение 1 часа при 37°C с интервалом между измерениями 10-20 сек.
Для каждого калибровочного и испытуемого образца определяли максимальную скорость изменения оптической плотности (Vmax). Определяли зависимость Vmax от известной биологической активности в разведениях международного стандарта урокиназы. Полученную зависимость выражали в виде уравнения линейной функции, с помощью которой рассчитывали биологическую активность испытуемых образцов. Рассчитывали также удельную активность, равную отношению биологической активности к концентрации белка, а также эффективность активации, равную отношению удельной активности ДЦ-формы и ОЦ-формы одного и того же образца.
В результате измерений были получены следующие данные:
Таблица 2
Образец
Конц-ция по UV<sub>280</sub> (мг/мл)
Удельная активность ОЦ-формы (МЕ/мг)
Удельная активность ДЦ-формы (МЕ/мг)*
Эффективность активации
М5-1
3,7
6,4
1,05·10<sup>5</sup>±1,9%
1,64·10<sup>4</sup>
М5-2
9,9
5,4
1,07·10<sup>5</sup>±1,5%
1,98·10<sup>4</sup>
*указан доверительный интервал в процентах (при p=0,05)
5
5
4
Измеренная удельная активность ДЦ-формы белка M5 составляет около 10 МЕ/мг, что сравнимо с удельной активностью международного стандарта урокиназы (около 0,7×10 МЕ/мг). В то же время, удельная активность ОЦ-формы примерно в 10 раз ниже активности ДЦ-формы, что является хорошим показателем безопасности препарата.
Пример 4. Фармацевтическая композиция.
Рекомбинантная проурокиназа M5, полученная в Примерах 1 и 2, разливается по флаконам объемом 20 и 100 мл и хранится в буферном растворе (20 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,3 М хлорид натрия и 0,01% полисорбат 80) при -70°C. Концентрация белка в таком растворе может составлять от 0,1 до 10 мг/мл в зависимости от производственных потребностей.
Данная фармацевтическая субстанция может далее использоваться для получения готовых лекарственных средств, в частности растворов для инъекций или лиофилизированных форм с использованием способов и методов, обычно применяемых в фармацевтической химии.