СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИОННЫХ РАССАСЫВАЮЩИХСЯ МАТРИЦ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА И КОЛЛАГЕНА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КЛЕТОК КОЖИ ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR PREPARING COMPOSITE CHITOSAN AND COLLAGEN RESORBABLE MATRIXES FOR HUMAN SKIN CELL CULTURE

Способ относится к химии природных высокомолекулярных соединений, а именно получению композиционных материалов на основе хитозана и коллагена в виде пленок и губок, способных рассасываться в организме человека и пригодных для выращивания на них клеток кожи человека. Изобретение позволяет получать композиционные матричные материалы, пригодные для биомедицинских целей, при использовании в качестве общего растворителя двух природных полимеров (хитозана и коллагена) экологически безопасного 2%-ного водного раствора уксусной кислоты. С целью повышения стабильности матричных материалов в культуральной жидкости, времени их рассасывания на поверхности раны и повышения адгезии клеток к поверхности материала, их подвергают прогреву, в результате чего происходит химическая сшивка макромолекул полимеров.
В качестве полимерных матриц для выращивания клеток человека используют природные полимеры, такие как химически модифицированный хитин, хитозан, желатин, фиброин шелка и синтетические полимеры, например полилактоновую (полимолочную) кислоту [D.Ozdemir, G.Schoukens, O.Goktepe, F.Goktepe. Preparation of Di-Butyryl-Chitin Scaffolds by Using Salt Leaching Method for Tissue Engineering and Their Characteristics. // Journal of Applied Polymer Science. 2008. Vol.109. P. 2882-2887; M.N.V.Ravi Kumar, R.A.A. Muzzarelli, C.Muzzarelli, H.Sashiwa, A.J.Domb. Chitosan Chemistry and Pharmaceutical Perspectives. // Chem. Rev. 2004. Vol.104. P.6017-6084; H.Yamada, Y.Igarashi, Y.Takasu, H.Saito, K.Tsubouchi. Identification of fibroin-derived peptides enhancing the proliferation of cultured human skin fibroblasts. // Biomaterials. 2004. Vol.25. P. 467-472; A.Prokop, A.Jubel, H.J.Helling, T.Eibach, C.Peters, S.E.Baldusc, K.E.Rehm. Soft tissue reactions of different biodegradable polylactide implants. // Biomaterials. 2004. Vol.25. P. 259-267].
Наиболее близким по сущности является способ получения матричных материалов на основе хитозана и коллагена, предназначенных для выращивания клеток эпидермоидного рака [N.Shanmugasundaram, P.Ravichandran, P.N.Reddy, N.Ramamurty, S.Pal, K.Panduranga Rao. Collagen-chitosan polymeric scaffolds for the in vitro culture of human epidermoid carcinoma cells. // Biomaterials. 2001. Vol.22. P. 1943-1951]. Предварительно готовят растворы хитозана и коллагена с концентрацией 0,6-1,4% (массовых) в ледяной уксусной кислоте. Полученные растворы полимеров смешивают в заданных пропорциях, перемешивают и отливают на стеклянные пластины. С целью уменьшения набухания получаемых композиционных пленок в культуральной среде в растворы смесей полимеров вводят раствор глутарового альдегида в толуоле, с помощью которого проводят химическую сшивку макромолекул хитозана и коллагена. Получают композиционные материалы с содержанием коллагена 30,0-70,0% (массовых).
Существенными и очевидными недостатками способа являются использование в качестве растворителя полимеров ледяной уксусной кислоты и дополнительная стадия процесса химической сшивки макромолекул полимеров глутаровым альдегидом, растворенным в толуоле. Ледяная уксусная кислота при контакте с кожей человека вызывает сильные химические ожоги, а ее пары раздражают слизистые поверхности и глаза человека. Толуол является токсичным продуктом, по степени воздействия на организм человека относится к 3-му классу опасности и при высоких концентрациях его пары действуют наркотически. Поэтому требуется контроль за отсутствием толула в получаемых матричных материалах. Большое содержание коллагена в матричных материалах приводит к ухудшению прочностных характеристик полученных матриц.
Технической задачей и положительным результатом предлагаемого способа является получение пленочных и губчатых композиционных рассасывающихся матриц на основе хитозана и коллагена из растворов полимеров в безопасном для здоровья человека растворителе, без использования химического сшивающего реагента в растворе толуола и с небольшим содержанием коллагена. Разработанный способ прост в исполнении. В качестве общего растворителя полимеров используется водный 2,0%-ный раствор уксусной кислоты, а для повышения стабильности матриц взамен введения в растворы смесей полимеров химического сшивающего реагента (глутарового альдегида) используется прогревание полученных материалов при повышенной температуре в атмосферной среде.
Указанная задача и результат достигаются тем, что способ включает приготовление растворов полисахарида - хитозана и белка - коллагена концентрации 1,0-4,0%) (мас.) в общем растворителе (водном 2%-ном растворе уксусной кислоты), их смешении в заданных соотношениях и формовании из растворов смесей полимеров пленочных и губчатых матриц. Формование пленок проводят путем отлива раствора через фильеру с регулируемым зазором на стеклянную подложку и последующим испарением растворителя. Получение губчатых материалов проводят путем отлива раствора смесей полимеров на полимерную подложку с его последующим замораживанием при Т=-45°C и лиофильной сушкой до полного удаления растворителя. С целью повышения стабильности матричных материалов в культуральной жидкости, времени их рассасывания на поверхности раны и повышения адгезии клеток к поверхности материала их подвергают прогреву в интервале температур 50-100°C в течение 1,0-5,0 часов в атмосферной среде. Количество коллагена в смесях полимеров составляет 2,5-10% (от массы хитозана).
Пример 1. Получение композиционной пленки, содержащей 1,0% коллагена (от массы хитозана).
3 г хитозана растворяют в 97 г водного 2%-ного раствора уксусной кислоты и получают 3%-ный раствор хитозана. 0,5 г коллагена растворяют в 99,5 г водного 2%-ного раствора уксусной кислоты и получают 0,5%-ный раствор коллагена. К 100 г 3%-ного раствора хитозана добавляют при перемешивании 6 г 0,5%-ного раствора коллагена в течение 1 часа. Полученный раствор смеси полимеров подвергают диализу против воды с целью уменьшения в растворе полимеров уксусной кислоты. Раствор смеси полимеров с помощи фильеры наносится на стеклянную подложку (или выливается в чашки Петри), после чего сушится при комнатной температуре до полного удаления растворителя. Полученная композиционная пленка содержит 1,0% (мас.) коллагена (табл.1, пример 1).
Пример 4. Получение композиционной пленки, содержащей 10,0% коллагена (от массы хитозана).
3 г. хитозана растворяют в 97 г водного 2%-ного раствора уксусной кислоты и получают 3%-ный раствор хитозана. 0,5 г коллагена растворяют в 99,5 г водного 2%-ного раствора уксусной кислоты и получают 0,5%-ный раствор коллагена. К 100 г 3%-ного раствора хитозана добавляют при перемешивании 60 г 0,5%-ного раствора коллагена в течение 1 часа. Полученный раствор смеси полимеров подвергают диализу против воды с целью уменьшения в растворе полимеров уксусной кислоты. Раствор смеси полимеров с помощи фильеры наносится на стеклянную подложку (или выливается в чашки Петри), после чего сушится при комнатной температуре до полного удаления растворителя. Полученная композиционная пленка содержит 10,0% (мас.) коллагена (табл.1, пример 4).
Таблица 1
Деформационно-прочностные характеристики композиционных пленок на основе хитозана и коллагена
Примеры
Содержание коллагена (мас.%)
Свойства пленок
Модуль Юнга, Е, ГПа
Прочность на разрыв, σ<sub>p</sub>, МПа
Удлинение при разрыве, ε, %
Удельная поверхность, м<sup>2</sup>/г
1
0
5,2
96,0
13,3
1,261
2
2,5
6,8
131,2
11,1
-
3
5,0
7,0
140,4
14,1
-
4
10,0
7,2
148,0
14,2
1,412
Примеры 2-3. Получение композиционных пленок осуществляют аналогично примеру 1 и 4.
Пример 5. Получение губчатого матричного материала, содержащего 10,0% коллагена (от массы хитозана).
Раствор смеси полимеров готовят аналогично примерам 1 и 4. Приготовленный раствор выливают в стеклянные или пластмассовые сосуды (или чашки Петри), замораживают при -45°C и подвергают лиофильной сушке. Полученный губчатый материал имеет характеристики:
- пористость - 34,5%;
3
- кажущаяся плотность - 27,2 кг/м;
2
- удельная поверхность - 7,22 м/г;
- влагопоглощение - 50,0%.
Пример 6. Повышение стабильности матриц в культуральной среде путем их тепловой обработки.
Для придания матрицам стабильности в культуральной среде, повышения адгезии клеток к их поверхности и времени рассасывания матриц на поверхности раны пленки и губки подвергают прогреву в интервале температур 50-100°C в течение 1,0-5,0 часов в атмосферной среде.
Изменение деформационно-прочностных характеристик матриц и их растворимости в воде показано на примере хитозановых пленок (табл.2).
Таблица 2
Изменение деформационно-прочностных характеристик и растворимости в воде хитозановых пленок в зависимости от времени их прогрева.
Дополнительная обработка пленок
Свойства пленок
Модуль Юнга, Е, ГПа
Прочность на разрыв, σ<sub>p</sub>, МПа
Удлинение при разрыве, ε, %
Растворимость в воде, %
Свежесформованная пленка
4,7
122,0
38,0
100
Прогрев 3 часа при 100°C
6,4
158,1
22,3
0
После дополнительного прогрева пленок происходит увеличение их прочности и модуля Юнга (упругости), указывающее на повышение жесткости пленок, а также потеря растворимости в воде.