Динамика показателей периферической крови крыс в эксперименте с введением магнитных композитов на основе наноразмерных частиц оксида железа

УДК 615.45:538.955

Я. Г. Торопова, Д. В. Королев, М. В. Афонин, К. Г. Гареев, Н. А. Печникова, А. А. Матвиенко, В. Д. Богушевская

Динамика показателей периферической крови крыс в эксперименте с введением магнитных композитов на основе наноразмерных частиц оксида железа

Ключевые слова: магнитные наночастицы, эксперимент, крысы, показатели периферической крови. Keywords: magnetic nanoparticles, experiment, rats, peripheral blood.

Исследовали динамику периферической крови крыс на фоне введения различных магнитных на-ночастиц на основе оксида железа как потенциального средства адресной доставки лекарственных препаратов. Использовали наночастицы магнетита и коллоидные частицы на основе оксида железа и диоксида кремния FemOn—SiO2, получаемые одно- и двухстадийными способами. Через 3, 6 и 24 ч после введения определяли гематологические показатели. Установлено отсутствие значимых изменений со стороны периферической крови животных, что косвенно свидетельствует об отсутствии выраженных системных токсических эффектов магнитных композитов, приготовленных различными способами.

Введение

На сегодняшний день использование наночастиц находит широкое практическое применение в различных областях медицины и биологии. Нанораз-мерность частиц обусловливает существенное изменение их физико-химических свойств, а также приобретение абсолютно новых (температурных, магнитных, электрических и т. д.) свойств, не характерных для частиц большего размера. Это позволяет разрабатывать принципиально новые на-номатериалы и композиции, открывая широкие перспективы в совершенствовании диагностики и лечения различных заболеваний, в развитии медицинских технологий.

Особое место среди наноразмерных материалов, применяемых для диагностических и терапевтических целей, занимают магнитные наночастицы (МНЧ), обладающие такими уникальными свой-

ствами, как возможность избирательного накопления под действием внешнего магнитного поля, возможность сочетания контрастирующей способности (для наблюдения посредством магниторезонансной томографии) и высокого удельного показателя поглощения (SAR) (для гипертермической окклюзии капилляров [1], и уже зарекомендовавшие себя в медицинской визуализации, диагностике и терапии [2]. Применение МНЧ в качестве средства направленной доставки лекарственных веществ также продемонстрировало свою целесообразность [3]. Представленный широкий спектр применения МНЧ обусловлен широкими возможностями изменения их структуры и физико-химических характеристик с целью варьирования свойствами и «поведением» в организме в соответствии с актуальными задачами.

Наиболее перспективным и относительно дешевым методом получения наночастиц на основе магнетита в настоящее время является золь-гель-технология [4]. Следует отметить, что качество на-нообъектов такого рода зависит от процесса зароды-шеобразования, который, в свою очередь, требует либо подбора специальных условий, либо введения активных центров для роста частиц. Полученные таким способом наночастицы значительно отличаются по физическим свойствам от частиц, получаемых другими химическими методами. Применение золь-гель-технологии позволяет упростить фильтрацию частиц по размерным фракциям благодаря узкому распределению по размеру, а также получить агре-гативно-устойчивый коллоидный раствор на основе биологически и химически инертных наноразмер-ных частиц диоксида кремния без использования дополнительных органических стабилизаторов.

Однако необходимо учитывать тот факт, что на-норазмерные частицы в зависимости от свойств об-

ладают различной биосовместимостью, неся в себе потенциальную опасность вредного воздействия на биологические системы. В условиях негативного влияния наночастиц происходят функциональные изменения в периферической крови (как в одной из наиболее лабильных систем организма), которые носят, как правило, неспецифический характер, отражая в то же время системные процессы, происходящие в организме.

Цель исследования

Изучить динамику показателей периферической крови крыс при однократном внутривенном введении наночастиц магнетита и коллоидных частиц на основе оксида железа и диоксида кремния ¥етОп—8Ю2, получаемые одно- и двухстадийными способами.

Материал и методы

Исследование выполнено на 60 крысах-самцах стока Wistar массой 180—220 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария на полном пищевом рационе, соответствующем суточным нормативам питания, при стандартном суточном свето-темновом режиме. Опыты проводили, соблюдая принципы гуманного обращения с животными, регламентированные требованиями Европейской конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению и уходу за подопытными животными, а также по выводу их из эксперимента и последующей утилизации. В постановке опытов руководствовались требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.

Приготовление исследуемых агентов

В работе использованы МНЧ трех видов: наноча-стицы магнетита и коллоидные частицы на основе оксида железа и диоксида кремния ЕетОп—ВЮ2, получаемые одно- и двухстадийными способами. Краткая характеристика магнитных композитов на основе наноразмерных частиц железа, используемых в работе, представлена в табл. 1.

Синтез МНЧ1 проводили следующим образом. К раствору, содержащему смесь сульфатов железа (II), железа (III) в мольном соотношении 2 : 1 и объемом 700 мл, при постоянном перемешивании со скоростью 4 мл/мин добавляли смесь 25%-го раствора гидроксида аммония и 1%-го раствора ацетата аммония. Таким образом, отношение железа и ацетата аммония составляло 2 : 1 : 0,1. Синтез проводили до фиксации насыщенно черной окраски и установления значения рН = 8  9. Затем полученный коллоидный продукт отделяли центрифугированием и промывали 4 раза дистиллированной водой. Для подготовки сухой пробы полученные МНЧ отфильтровывали и подвергали лиофильной сушке при температуре 48 °С в течение 48 ч. Размер наночастиц магнетита составил 7—10 нм.

Коллоидный раствор наночастиц в физиологическом растворе готовили на ультразвуковом дис-пергаторе УЗД-2 (Россия) в течение 5 мин.

Одностадийный синтез МНЧ2 включал следующие технологические операции:

• подготовку водного раствора солей железа (ГеС13 -6Н2О и ЕеБО4 -7Н2О);

• добавление водного раствора аммиака для осаждения оксида железа (ГезО4 и у-Ге2Оз);

• добавление ТЭОС;

• растворение полученной суспензии в дистиллированной воде до требуемой концентрации и ультразвуковое диспергирование.

Двухстадийный синтез МНЧ3 проводили в следующей последовательности:

• приготовление раствора тетраэтоксисилана (ТЭОС) на основе изопропилового спирта;

• добавление водного раствора аммиака;

• сушка при комнатной температуре для удаления растворителя;

• термообработка при 300 °С;

• подготовка водного раствора солей железа (ЕеС13 -6Н2О и ЕеБО4 -7Н2О);

• ультразвуковое диспергирование порошка ВЮ2 в растворе солей;

• добавление водного раствора аммиака для осаждения оксида железа (ГезО4 и у-Ге2Оз);

• растворение полученной суспензии в дистиллированной воде до требуемой концентрации и повторное ультразвуковое диспергирование.

Размер коллоидных частиц ЕетОп—ВЮ2, полученных одно- и двухстадийным методами, составлял 75 нм.

Конечная концентрация всех трех типов нано-частиц в растворе составляла 0,7 мг/мл.

Протокол эксперимента

Исследование проводилось в течение 24 ч. За 12 ч до начала эксперимента животные подверглись пищевой депривации без ограничения доступа к питьевой воде. Животных фиксировали поочередно

Таблица 1 Краткая характеристика магнитных композитов на основе наноразмер-ных частиц железа, используемых в работе

Композиция Характеристика

МНЧ1 Наночастицы магнетита, 7-10 нм

МНЧ2 ЕетОп—ЗЮ2, одностадийный способ, 75 нм

МНЧ3 ЕетОп—ЗЮ2, двухстадийный способ, 75 нм

в рестрейнер и осуществляли однократное внутривенное введение исследуемых образцов в латеральную хвостовую вену согласно методике с соблюдением асептических условий.

Животным 1-й группы вводили МНЧ1, животным 2-й и 3-й групп — МНЧ2 и МНЧ3 соответственно (n = 15 в каждой группе, по 5 животных на каждую точку исследования). Контролем служила группа с введением физиологического раствора (n = 5).

Объем введения исследуемых препаратов не превышал максимально допустимые значения для лабораторных животных (крысам до 2 мл [5]) и составил 1 мл. Вводимые дозы наночастиц (0,7 мг) не превышали максимальных переносимых доз для железа [6].

Исследование периферической крови

Образцы для анализа брали через 3, 6 и 24 ч после введения исследуемых агентов. Пробы крови брали из десны животных согласно методике В. H. Зильфян и В. А. Кумкумджян.

Гематологические показатели определяли на ветеринарном гематологическом анализаторе Abacus junior Vet (Diatron, Австрия). Для гематологического исследования использовали пробирки с ЭДТА-К3, в которых соотношение объема забранной крови к антикоагулянту составляло 1 см3 крови на 1,6 мг реагента [7]. Определяли следующие параме-

тры крови: содержание лейкоцитов (WBC, Г/л), фракции лейкоцитов: гранулоциты (Ог, %), лимфоциты (Ьут, %), моноциты (М1, %), количество эритроцитов (КВС, х1012/л), содержание гемоглобина (НЬ, г/л), эритроцитарные индексы: среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН, pg), среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците (МСНС, г/л), средний объем эритроцитов (МСУ, £1), гематокрит (НсЬ, %).

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0. Для оценки нормальности распределения данных использовали критерий Колмогорова—Смирнова. Для описания признаков с отличным от нормального распределением указывали медиану и 25-й и 75-й процентили [Ме (25; 75 %)]. Для оценки межгрупповых различий использовали критерий Манна—Уитни. Статистически значимыми считались различия при р < 0,05.

Результаты

Показатели периферической крови животных на различных этапах исследования представлены в табл. 2.

Таблица 2 Статистические показатели периферической крови крыс на различных этапах

после введения МНЧ

Этапы, Группа

ч Контроль

Лейкоциты WBC, г/л

3 9,4 [8,3; 12,0] 9,9 [7,0; 11,9] 13,0 [12,3; 16,5] 11,8 [9,8; 12,5]

6 10,2 [8,3; 12,1] 9,7 [8,5; 12,7] 12,0 [9,4; 16,9] 7,3 [6,7; 9,1]

24 10,5 [10,0; 11,0] 9,3 [8,3; 11,3] 11,2 [9,1; 12,4] 9,1 [8,2; 11,7]

Гранулоциты Gr, %

3 31,8 [29,3; 32,4] 34,0 [32,4; 38,1] 40,5 [34,5; 56,3] 38,2 [30,6; 42,3]

6 28,8 [27,1; 32,4] 38,7 [29,7; 40,4] 44,6 [38,3; 54,5]* 38,2 [30,6; 42,3]

24 30,0 [28,0; 32,4] 29,6 [27,8; 44,3] 24,4 [18,5; 34,3] 33,1 [28,3; 32,4]

Моноциты Mi, %

3 0,6 [0,6; 0,6] 11,2 [10,0; 13,0]*,*** 10,0 [6,1; 13,8]* 8,6 [4,6; 10,1]*

6 1,0 [0,6; 1,0] 11,7 [11,1; 12,3]* 6,9 [5,7; 10,2]* 9,7 [7,0; 12,3]*

24 0,9 [0,6; 1,0] 2,8 [0,7; 5,5]*,**,*** 11,6 [10,5; 12,6]*,** 8,6 [5,0; 12,1]*

Лимфоциты Lym, %

3 68,7 [66,9; 71,9] 57,6 [54,8; 70,7] 51,8 [37,7; 58,9] 49,6 [38,3; 52,5]*

6 70,2 [50,4; 71,9] 50,2 [47,3; 69,7] 45,9 [37,1; 54,2]* 52,1 [45,4; 55,6]

24 68,9 [51,0; 71,0] 64,1 [51,0; 65,0] 62,7 [55,0; 69,3] 58,9 [50,1; 63,1]

2

Нанотехнологии и наноматериалы

Продолжение табл. 2

Этапы, Группа

ч Контроль

Эритроциты ЯБС, 10 • 12/л

3 6,2 [6,2; 6,6] 8,3 [7,3; 8,7]* 7,5 [7,1; 8,2]* 7,1 [6,8; 7,2]*

6 6,2 [6,0; 7,1] 7,8[6,9; 8,1] 6,8[5,8; 7,5] 8,1[7,2; 8,5]

24 6,6 [6,2; 7,1] 6,8[6,5; 6,8] МСН рш 9,1[8,4; 12,4] 6,3[6,0; 6,7]

3 20,7 [20,6; 20,9] 19,5 [19,4; 19,6] 20,6 [19,7; 21,0] 19,6 [19,6; 21,2]

6 22,5 [20,4; 24,5] 20,7[20,7; 20,8] 20,6[19,9; 21,3] 20,5[19,6; 21,0]

24 21,0 [17,9; 22,3] 21,5[20,4; 21,6] ИСУ, п 20,3[20,2; 20,8] 20,6[20,5; 20,8]

3 72,0 [71,0; 73,0] 66,0 [66,0; 68,0] 69,0 [66,0; 72,0] 67,0 [66,0; 74,0]

6 74,0 [70,0; 75,0] 70,0 [69,0; 71,0] 71,0 [69,0; 73,0] 70,0 [67,0; 71,0]

24 72,0 [70,0; 74,0] 70,0 [69,0; 72,0] 71,0 [70,0; 72,0] 72,0 [71,0; 72,0]

МСНС, г/л

3 287,0 [286,0; 288,0] 292,0 [290,0; 297,0] 298,0 [293,0; 300,0] 291,0[286,0; 294,0]

6 290,0 [288,0; 292,0] 297,0 [292,0; 300,0] 291,0 [288,0; 293,0] 294,0[288,0; 296,0]

24 285,0 [282,0; 288,0] 293,0 [291,0; 298,0] 287,0 [284,0; 294,0] 286,0[285,0; 287,0]

Гемоглобин НЬ, г/л

3 130,0 [127,0; 138,0] 161,0[153,0; 171,0]* 160,0[146,0; 170,0]* 145,0[141,0; 146,0*

6 132,0 [127,0; 141,0] 162,0 [143,0; 168,0] 141,0 [131,0; 158,0] 165,0[154,0; 170,0*

24 130,0 [126,0; 139,0] 147,0 [145,0; 152,0] 142,0 [133,0; 170,0] 131,0[122,0; 139,0]

Гематокрит НСТ, %

3 45,6 [44,4; 48,2] 56,8 [52,5; 59,5]* 51,0 [49,9; 56,3] 49,8 [47,7; 50,7]

6 45,5 [43,7; 47,2] 55,3 [48,8; 57,7] 47,1 [41,4; 50,3] 57,4 [51,8; 57,9]*

24 48,3 [42,2; 50,3] 48,7 [46,6; 50,0] 47,7 [47,4; 50,3] 45,7 [42,8; 48,5]

* р < 0,05 относительно контроля. ** р < 0,05 между группами. *** р < 0,05 для значений внутри группы.

Изменения в периферической крови крыс через 3 ч после введения МНЧ

На этом этапе эксперимента количество лейкоцитов в образцах периферической крови животных всех опытных групп достоверно не отличалось от контрольных значений (р > 0,05). Тем не менее по показателям относительного содержания отдельных видов лейкоцитов наблюдались различия между исследуемыми группами. Так, через 3 ч после введения МНЧ3 показатели Ьут, %, в группе 3 оказались на 27 % ниже контрольных значений (р < 0,05) и составили 49,6 [38,3; 52,5] %. Содержание моноцитов (М1, %) в образцах крови животных всех опытных групп значительно (р < 0,05) превышало контрольные значения и составило 11,2 [10,0;13,0] % (группа 1), 10,0 [6,1; 13,8] % (группа 2) и 8,6 [4,6; 10,1] % (группа 3). Содержание грану-

лоцитов (Ог, %) на этом этапе эксперимента не отличалось от таковых в группе контроля (р > 0,05). Изучение реакции со стороны красной крови показало, что через 3 ч после введения всех исследуемых МНЧ содержание эритроцитов (КВС, х1012/л) в образцах крови животных опытных групп, превышая значения таковых в контрольной группе, оставались в пределах физиологической нормы без изменений эритроцитарных индексов (МСН, pg; МСНС, г/л; МСУ, £1). Необходимо отметить, что на фоне введения МНЧ1 и МНЧ2 на этом этапе эксперимента показатели содержания гемоглобина (НЬ, г/л) превышали диапазон референсных значений. В группе контроля показатели гематокрита (НСТ, %) составили 45,6 [44,4; 48,2] %. Через 3 ч после введения МНЧ1 отмечалось достоверное увеличение этого показателя (56,8 [52,5; 59,5]) относительно контрольных значений (р < 0,05).

Изменения в периферической крови крыс через 6 ч после введения МНЧ

Общее количество лейкоцитов в периферической крови животных опытных групп через 6 ч после введения всех видов МНЧ оставалось на уровне предыдущих значений. На этом этапе эксперимента в группе 2 отмечалось достоверное (р < 0,05) снижение показателя Ьут, %, относительно контрольных значений, тогда как значения такового в группах 1 и 3 достоверно не отличались от контроля (р > 0,05). Значения М^ %, через 6 ч после введения МНЧ во всех опытных группах оставались на уровне, соответствующем предыдущей точке исследования. Через 6 ч после введения МНЧ в группах 1 и 3 содержание гранулоцитов (Ог, %) достоверно не отличалось от таковых в группе контроля (31,8 [29,3;

32.4]) % (р > 0,05). В то же время показатель Ог, %, в образцах крови группы 2 составил 44,6 [38,3;

54.5] %, что достоверно превышало контрольные значения (р < 0,05). На этом этапе эксперимента во всех исследуемых группах содержание эритроцитов оставалось в пределах физиологических значений. На фоне введения МНЧ3 через 6 ч в группе 3 содержание гемоглобина (НЬ, г/л) составило 165,0 [154,0; 170,0] г/л, причем значения по этому показателю достоверно превышали таковые в группе контроля (р < 0,05). Показатели гематокрита (НСТ, %) в группах 1 и 2 оказались на уровне контрольных значений (р > 0,05). В группе 3 отмечалось достоверно значимое (р > 0,05) увеличение этого показателя по сравнению с контролем. Показатели НСТ, %, в этой группе составили 57,4 [51,8; 57,9] %.

Изменения в периферической крови крыс через 24 ч после введения МНЧ

На момент окончания эксперимента в образцах всех исследуемых групп количество лейкоцитов достоверно не отличалось от контрольных значений (р > 0,05). Показатели Ьут, %, во всех опытных группах также достоверно не отличались от контрольных значений (р > 0,05). Через 24 ч после введения МНЧ значения М^ %, в образцах крови животных группы 1 оказались достоверно ниже (р < 0,05) таковых в группах 2 и 3 (11,6 [10,5; 12,6] % и 8,6 [5,0; 12,1] % соответственно), оставаясь при этом на достоверно более высоком уровне (р < 0,05) относительно контрольных значений. Показатели содержания гранулоцитов (Ог, %) в периферической крови животных на этом этапе эксперимента во всех исследуемых группах оказались на уровне контрольных значений (р > 0,05). Через 24 ч после введения МНЧ содержание эритроцитов (КВС, 10 х 12/л) и гемоглобина (НЬ, г/л) в образцах крови всех исследуемых групп оставалось в пределах физиологической нормы. Среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН, pg), средняя кон-

центрация гемоглобина в эритроците (МСНС, г/л), а также средний объем эритроцитов (МСУ, £1) в образцах крови всех исследуемых групп на этом этапе эксперимента не отличались от контрольных значений, (р > 0,05). Показатели гематокрита (НСТ, %) во всех опытных группах также оказались на уровне контроля (р > 0,05).

Обсуждение

На всех этапах исследования в образцах всех исследуемых групп количество лейкоцитов находилось в пределах физиологической нормы. В ходе проведения эксперимента отмечалось снижение Ьут, %, относительно контрольных значений в группе 3 (через 3 ч после введения на 27 %) и в группе 2 (через 6 ч после введения на 33 %). Однако на момент окончания эксперимента (24 ч) показатели Ьут, %, во всех опытных группах достоверно не отличались от контрольных значений. Можно предположить, что описанные на этапах эксперимента изменения по содержанию лимфоцитов обусловлены вариабельностью показателей в силу физиологических особенностей животных и (или) возможной погрешностью метода измерения. Через 3 ч после введения МНЧ показатели М^ %, в образцах крови животных всех опытных групп значительно превышали физиологические значения, что косвенно свидетельствует об ответной реакции ретикуло-эндотелиальной системы в ответ на попадание МНЧ в кровоток, при этом выход моноцитов в кровеносное русло направлен на транспортировку МНЧ в печень, селезенку и костный мозг. Через 6 часов после введения МНЧ значения М^ %, во всех опытных группах оставались на уровне, соответствующем предыдущей точке исследования. Однако в дальнейшем в группе 1 наблюдалась статистически значимая тенденция к снижению этого показателя, который на заключительном этапе исследования (24 ч) соответствовал рефе-ренсным значениям. Описанную динамику можно объяснить следующим образом: существует вероятность того, что размер отдельных наночастиц магнетита (МНЧ1) со временем мог изменяться ввиду способности к их агрегации и составлять до 500 нм. В таком случае больший размер магнетита относительно других видов МНЧ обусловил меньшее время циркуляции МНЧ в крови. В то же время сохраняющие высокие значения значения М^ %, в образцах крови животных групп 2 и 3 могут свидетельствовать о неполной биотрансформации МНЧ2 и МНЧ3 через 24 ч после их введения. Вероятно, меньшая способность к агрегации данных видов МНЧ при отсутствии внешнего магнитного поля, обусловила их более длительное нахождение в крови относительно частиц магнетита. В группах 1 и 3 содержание гранулоцитов (Ог, %) на всех этапах эксперимента достоверно не отличалось от таковых в группе контроля (31,8 [29,3; 32,4]) (р > 0,05). Че-

рез 6 ч после введения МНЧ2 показатель Ог, %, в образцах крови составил 44,6 [38,3; 54,5], достоверно превышая контрольные значения (р < 0,05). Этот факт свидетельствует о возможной активации выхода гранулоцитов в кровеносное русло для эн-доцитоза циркулирующих МНЧ2 [8]. Можно предположить, что на фоне введения МНЧ2 отмечался кратковременный каскад воспалительной реакции организма с активированием гранулоцитов, подключая их к уже высокому уровню моноцитов для более быстрой нормализации физиологического состояния организма. Так, в динамике в группе 2 наблюдалась дальнейшая нормализация этого показателя до уровня контрольных значений. Исследование показателей эритроцитов позволило установить отсутствие выраженных влияний всех видов МНЧ на клетки красной крови. Об этом свидетельствовало отсутствие изменений со стороны показателей содержания эритроцитов и эритроцитарных индексов. Динамика содержания гемоглобина позволяет предполагать о частичном включении МНЧ композиций 2 и 3 в синтез железосодержашего белка. Изменения гематокрита в различных группах на различных этапах исследования, вероятно, обусловлены стрессовой реакцией животных в ответ на осуществляемые манипуляции.

Выводы

Введение магнитных наночастиц, приготовленных различными способами, не дает значимых изменений со стороны периферической крови животных, что косвенно свидетельствует об отсутствии выраженных системных токсических эффектов магнитных композитов на основе наноразмерных частиц железа. Тем не менее проведенное исследование не позволяет окончательно сделать выводы о биосовместимости и токсичности магнитных на-

ночастиц, требуется дополнительное детальное изучения эффектов их влияния на уровне целостного организма. Необходимо учитывать более широкий спектр оценочных критериев биосовместимости и токсичности в разрезе биораспределения частиц в организме в зависимости от их состава и физико-химических характеристик.

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда

Разработка технологии коллоидных частиц на основе оксида железа и диоксида кремния выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ

Литература

1. Paulraj R. J. Iron Oxide Nanoparticles Induced Oxidative Damage in Peripheral Blood Cells of Rat Usha Singh Gaharwar // Biomedical Science and Engineering. 2015. N 8. Р. 274-286.

2. Обоснование использования магнитных наночастиц для направленной доставки лекарственных препаратов в ишеми-зированную скелетную мышцу / Д. В. Королев, М. М. Гала-гудза, М. В. Афонин [и др.] // Биотехносфера. 2012. № 1 (19). С. 2-6.

3. Different capacity of monocyte subsets to phagocytose iron-oxide nanoparticles / Settes M. Etzrodt M. Kosanke K. [et al.] // PLoS One. 2011. N 6 (10). е. 25197. Р. 1-9.

4. Brinker C. J., Scherer G. W. Sol-Gel Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing //Academic Press. INC., Am Imprint of Elsevier, 1990. Р. 908.

5. Хабриев Р. У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. 2-е изд., доп. М.: Медицина, 2005. С. 832.

6. Waynforth H. B., Flecknell P. A. Experimental and Surgical Technique in the Rat // New York: Academic Press,1992. Р. 400.

7. МУ 1.2.2741-10. Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных. Бюл. нормативных и методических документов госсанэпиднадзора. 2011. Вып. 1 (43). С. 35.

8. Якушева Е. В., Мирошников С. А., Кван О. В. Оценка влияния наночастиц металлов на морфологические показатели периферической крови животных//Вест. Оренбургского государственного университета. 2013. № 12 (161). С. 203-207.