Способ выделения и очистки РНК из материала гинекологических соскобов путем фенольной экстракции

Способ выделения и очистки РНК из материала гинекологических соскобов путем фенольной экстракции, включающий основные этапы выделения и очистки РНК методом фенольной экстракции, отличающийся тем, что после извлечения цитощетки из эппендорфа с фиксирующим раствором IntactRNA цервикальную щетку с клиническим материалом погружают в пустой эппендорф и осушают коротким центрифугированием, в результате чего на цервикальной щетке остается только клинический материал, а остатки раствора IntactRNA оседают на дне эппендорфа, цитощетку переносят в эппендорф, содержащий 600 мкл RNAzol, параллельно этому оставшийся от данного образца раствор IntactRNA объединяют в один эппендорф, добавляют к нему равный объем фосфатного буферного раствора (PBS), приготовленный на деионизированной воде, обработанной диэтилпирокарбонатом, проводят центрифугирование при 12000 G и 4°С в течение 5 мин, при помощи аспиратора FTA-1 верхнюю фазу удаляют и растворяют осадок в 360 мкл RNAzol перемешиванием на вортексе, капли осаждают со стенок и смешивают все полученные части лизата от одного образца в одном эппендорфе, для повышения чистоты итогового образца РНК проводят осаждение нераспавшихся фрагментов ткани и других нерастворимых в RNAzol органических составляющих путем центрифугирования при 7000 G и 17°С в течение 5 мин, затем из каждого образца отбирают три аликвоты по 400 мкл осветленного лизата, после добавления воды, на этапе преципитации ДНК и белков, проводят центрифугирование при 14000 G и 4°С в течение 20 мин для разделения фаз, далее после добавления равного объема изопропанола для осаждения РНК образец перемешивают на вортексе в течение 40 с и оставляют для преципитации при -20°С на сутки, затем центрифугируют его при 14000 G и 4°С в течение 45 мин, затем верхнюю фазу удаляют при помощи аспиратора, к осадку добавляют 900 мкл 80%-ного этанола, приготовленного на DEPC-воде, омывают все внутренние поверхности эппендорфа, включая крышку, для удаления следов компонентов реагента RNAzol, изопропанола и солей, затем центрифугируют при 7 000 G и 17°С в течение 5 мин, спирт удаляют аспиратором и после первой промывки спиртом осадок растворяют в 100 мкл DEPC-воды и проводят переосаждение РНК при помощи добавления равного объема 12М раствора LiCl, раствор перемешивают на вортексе в течение 15 с, содержимое пробирки осаждают коротким центрифугированием и затем инкубируют в течение суток при -20°С, после чего проводят центрифугирование при 14 000 G и 4°С в течение 45 мин, полученный осадок промывают трижды в 80%-ном этаноле: верхнюю фазу убирают аспиратором, добавляют 300 мкл 80%-ного этанола, стенки эппендорфа омывают и проводят центрифугирование при 7 000 G и 17°С в течение 5 мин, очищенную РНК растворяют в 20 мкл деионизированной воды высокой степени очистки MQ и прогревают при 70°С в термостате в течение 3 мин для полного растворения.