СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГИПЕРГОМОЦИСТЕИН ИНДУЦИРОВАННОЙ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ
METHOD FOR SIMULATING HYPERHOMOCYSTEIN INDUCED ENDOTHELIAL DYSFUNCTION

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной кардиофармакологии, и может быть использовано для оценки эндотелиопротективного действия ряда фармакологических препаратов при моделировании гипергомоцистеинемии.
Наиболее близким к заявленному решению является способ моделирования гипергомоцистеинемии, который заключается в введении метионина в дозах от 12 до 44 г/кг в корм экспериментальным животным или добавлении метионина в поилки экспериментальным животным (Sanjana Dayal, «Murine Models of Hyperhomocysteinemia and Their Vascular Phenotypes», Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2008; 28: 1596-1605).
Основными недостатками способа являются: недостаточно точное дозирование метионина при моделировании патологии; отсутствие оценки развития гипергомоцистеинемии и эндотелиальной дисфункции на различных сроках введения метионина в указанных дозировках; токсическое влияние метионина на физиологические показатели жизнедеятельности экспериментальных животных.
Задачей изобретения является разработка легко воспроизводимой и токсикологически безопасной модели гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции, основанной на внутрижелудочном введении метионина.
Технический результат достигается внутрижелудочным введением самцам крыс линии Wistar аминокислоты метионин в дозе 3 г/кг один раз в сутки в течение 7 дней, оценкой развития эндотелиальной дисфункции с помощью коэффициента эндотелиальной дисфункции и подтверждением развития гипергомоцистеинемии с помощью определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови.
Внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг приводит к развитию гипергомоцистеинемии у крыс линии Wistar. Гомоцистеин синтезируется в организме из незаменимой аминокислоты метионин и служит предшественником цистатионина и цистеина. Повышение уровня гомоцистеина коррелирует со снижением выраженности эндотелийзависимой вазодилатации. Из указанных данных можно сделать вывод о способности аминокислоты метионин вызывать эндотелиальную дисфункцию.
Способ осуществляется следующим образом.
Эксперименты выполнены на половозрелых самцах крыс линии Wistar массой 180-220 г. Раствор для внутрижелудочного введения метионина готовили ex tempore с помощью солюбилизатора ТВИН 80 и 1% крахмального раствора. С целью изучения возможности моделирования эндотелиальной дисфункции метионин (ООО «Полисинтез», г.Белгород) вводили по следующим схемам: 1) ежедневное, 2 раза в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг в течение 7 дней (n=10 животных); 2) ежедневное, 1 раз в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг в течение 14 дней (n=10 животных); 3) ежедневное, 1 раз в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 3 г/кг в течение 7 дней (n=10 животных); 4) ежедневное, 1 раз в сутки, в течение 7 дней внутрижелудочное введение 10% раствора ТВИН 80 в дозе 1 мл/кг (контроль, n=10 животных).
По окончании введения метионина, на 15 и 8 сутки, от начала эксперимента выживших животных наркотизировали (хлоралгидрат 300 мг/кг), вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляют в правую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика и компьютерной программы "Bioshell". Функциональные пробы: эндотелийзависимая вазодилатация (ЭЗВ) - внутривенное введение ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг, эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНЗВ) - внутривенное введение нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг.
Степень развития эндотелиальной дисфункции оценивается с помощью коэффициента эндотелиальной дисфункции, являющегося отношением площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение АХ.
Степень развития гипергомоцистеинемии оценивается по содержанию гомоцистеина в сыворотке крови экспериментальных животных. Концентрация гомоцистеина определяется методом иммунотурбодиметрии с помощью набора фирмы Pliva-Lachema Diagnostika s.r.o.
При статистической обработке данных рассчитывается среднее значение, величина стандартного отклонения. Различия считаются достоверными при р<0,05.
Пример конкретного выполнения.
Результаты проведенных экспериментов позволили установить, что ежедневное, в течение 7 суток, внутрижелудочное введение метионина дважды в день в дозе 5 г/кг вызывает гибель 60% экспериментальных животных. Начиная со вторых суток введения метионина, животные становились вялыми, малоподвижными, отказывались от пищи и воды. Начиная с третьих суток, наблюдалась гибель животных с клинической картиной, характерной для острого нарушения мозгового кровообращения. При вскрытии погибших животных обнаружена морфологическая картина ишемического инсульта, что согласуется с литературными данными о повышении тромбообразования и нарушении гемореологии под влиянием гипергомоцистеинемии.
Ежедневное, 1 раз в сутки, внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг в течение 14 дней вызывало гибель 40% животных к 7 суткам от начала эксперимента. Морфологическая и клиническая картина гибели животных соответствовала таковой у животных вышеобозначенной экспериментальной серии.
В группах животных, получавших метионин в дозе 3 г/кг и 10% раствор ТВИН 80 в дозе 1 мл/кг, гибели животных не отмечалось на протяжении всего периода введения.
Выживших животных выводили из эксперимента в соответствии с вышеописанным дизайном исследования.
В табл. 1 представлены данные о влиянии внутрижелудочного введения метионина на функциональные показатели сердечно-сосудистой системы экспериментальных животных.
Обнаружено, что ежедневное введение метионина по обозначенным схемам не вызывает достоверных изменений артериального давления и частоты сердечных сокращений (табл.1).
Обработка полученных экспериментальных данных при проведении функциональных проб на эндотелийзависимое (ацетилхолин 40 мкг/кг в/в) и эндотелийнезависимое (нитропруссид 30 мг/кг в/в) расслабление сосудов у экспериментальных животных позволила установить, что внутрижелудочное введение 10% раствора ТВИН 80 в дозе 1 мл/кг не вызывает повышения коэффициента эндотелиальной дисфункции. Внутрижелудочное введение метионина в дозе 5 г/кг 2 раза в сутки в течение 7 дней вызывает повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции до 3,7±0,5 (табл. 1).
Наибольшее значение КЭД получили в группе животных с внутрижелудочным введением метионина в дозе 5 г/кг 1 раз в сутки в течение 14 дней. В данной группе КЭД был равен 3,9±0,2. Достоверное повышение коэффициента эндотелиальной дисфункции получили и в группе животных с внутрижелудочным введением метионина в дозе 3 г/кг в течение 7 дней (КЭД равен 3,3±0,3) (табл. 1).
Таблица 1
Влияние метионина на показатели гемодинамики и коэффициент эндотелиальной дисфункции при моделировании гомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции (М±m)
Группы животных
Функциональная проба
САД, мм рт.ст.
ДАД, мм рт.ст
S сосудистой реакции при проведении ЭЗВД с АХ и ЭНВД с НП, усл.ед.
КЭД, усл.ед.
10% ТВИН 80
Исходные
129,2±4,3
82,4±5,9
1 мл/кг
АХ
74,1±2,9
39,4±3,1
1124,2±63,7
0,9±0,2
Контроль
НП
67,2±5,1
42,9±5,4
1011,8±94,6
Метионин 5 г/кг 2 раза/сутки в течение 7 дней
Исходные
117,2±4,1
78,4±5,6
АХ
77,6±6,1
45,4±4,1
794,3±54*
3,7±0,5*
НП
65,4±7,1
38,3±3,4
2938,1±184*
Метионин 5 г/кг 1 раза/сутки в течение 14 дней
Исходные
121±4,2
79,6±2,4
3,9±0,2*
АХ
81,4±4,8
42,4±2,5
658,1±71,2*
НП
56,1±8,6
34,2±8,3
2566,6±181,4**
Метионин 3 г/кг 1 раза/сутки в течение 7 дней
Исходные
118,9±10,1
76,6±7,2
АХ
80,1±2,9
41,4±2,3
854,6±61,4*
3,3±0,3*
НП
72,3±6,7
45,9±4,3
2820,2±210,4*
Примечание: * - р<0,05 - в сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН 80. САД - систолическое артериальное давление, ДАД - диастолическое артериальное давление, S - площадь над кривой восстановления артериального давления при проведении фармакологических проб, КЭД - коэффициент эндотелиальной дисфункции.
Результаты определения концентрации гомоцистеина в сыворотке крови позволили установить достоверное повышение уровня гомоцистеина во всех группах экспериментальных животных. Значения концентрации гомоцистеина достоверно отличались от таковых в контрольной группе животных (таблица 2).
Наибольшее повышение уровня гомоцистеина обнаружено в сыворотке крови животных, получавших метионин в дозе 5 г/кг в течение 14 дней (табл. 2).
Таблица 2
Влияние метионина на концентрацию гомоцистеина при моделировании гомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции (М±m)
Группы животных
10% ТВИН 801 мл/кгКонтроль
Метионин 5 г/кг 2 раза/сутки в течение 7 дней
Метионин 5 г/кг 1 раза/сутки в течение 14 дней
Метионин 3 г/кг 1 раза/сутки в течение 7 дней
Концентрация гомоцистеина (мкмоль/л)
8,6±2,1
92,3±11,3*
104,7±8,9*
53,5±3,2*
Примечание: * - р<0,05 - в сравнении с группой животных, получавших 10% ТВИН 80.
Таким образом, моделирование гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции с помощью внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней следует признать адекватной экспериментальной моделью гипергомоцистеинемии, которая может быть использована для изучения эндотелио- и кардиопротективных эффектов различных групп фармакологических препаратов при данной модели патологии