Способ контроля содержания противотуберкулёзных препаратов основного ряда и их токсичных метаболитов в плазме крови
METHOD FOR MONITORING THE CONTENT OF ANTI-TUBERCULOSIS PREPARATIONS OF THE MAIN LINE AND THEIR TOXIC METABOLITES IN BLOOD PLASMA

Настоящее изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для контроля содержания основного ряда в плазме крови при лекарственной терапии туберкулеза легких и их токсичных метаболитов. К ним относятся соединения, имеющие различную химическую природу (или относящие к разным классам соединений): рифампицин и его метаболит 25-О-дезацетилрифампицин, изониазид и его метаболит ацетилизониазид, пиразинамид и его метаболит пиразиноевая кислота, этамбутол.
Туберкулез является одной из основных инфекционных причин смертности в мире. Созданные в 50-х годах прошлого века противотуберкулезные препараты (ПТП) (изониазид, рифампицин, пиразинамид, этамбутол) применяются и в настоящее время. Однако, специалисты обнаружили, что зарекомендовавшая себя стандартная схема из трех-четырех препаратов не дает эффекта. Ситуация осложняется развитием лекарственной устойчивости к используемым препаратам. Фактически началась новая эпоха - эпоха туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-туберкулеза). Сегодня это одна из главных проблем фтизиатрии. Эффективность лекарственной терапии существенно зависит от концентрации ПТП в крови, т.к. это влияет на их распределение в органе-мишени, пораженном туберкулезом, и максимальный терапевтический результат. При этом важно проводить как фармакокинетические исследования, позволяющие устанавливать оптимальные дозировки лекарств для достижения лечебного эффекта у конкретного пациента, так и контролировать токсичные метаболиты (ацетилизониазид, 25-О-дезацетилрифампицин проявляют гепатотоксический и аллергический эффекты, пиразиноевая кислота - гиперурикемию), для понижения степени побочных эффектов.
Известен способ определения рифампицина и его метаболитов методами колориметрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в плазме крови [1]. Данный способ, включающий осаждение белков плазмы крови водным раствором сульфата цинка (II) и дальнейшее проведение анализа, позволяет определять содержание рифампицина на уровне 0,3 мкг/мл. Однако известный способ имеет недостаточную концентрационную чувствительность, а также позволяет
определять содержание только одного лекарственного препарата, что недостаточно информативно, т.к. химиотерапия туберкулеза всегда подразумевает комплексный прием ПТП.
Известен способ одновременно определения рифампицина, этамбутола, пиразинамида, изониазида методом капиллярного зонного электрофореза со спектрофотометрическим детектированием [2]. В известном способе добавляли в состав буферного электролита водный раствор сульфата меди (II) для определения не поглощающего в видимом диапазоне излучения этамбутола без предколоночной дериватизации. Однако известный способ не апробирован на биологических объектах, характеризуется недостаточными пределами количественного обнаружения (2-9 мкг/мл).
Известен способ одновременного определения рифампицина, этамбутола, пиразинамида, стрептомицина в плазме крови методом тандемной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией с времяпролетным масс-анализатором [3]. Известный способ, включающий осаждение белков плазмы крови метанолом, выпаривание надосадочной жидкости в токе азота и перерастворение, смешивание с 4-гидроксибензойной кислотой в качестве матрицы, позволяет определять содержание ПТП на уровне 0,08-0,15 пмоль/мкл. Недостатком известного способа является отсутствие определения содержания токсичных метаболитов ПТП, что не позволяет оптимизировать лекарственную терапию туберкулеза, учитывая индивидуальные особенности метаболизма.
2
Известен способ одновременного определения изониазида, рифампицина и их метаболитов (25-О-дезацетилрифампицина, ацетилизониазида, изоникотиновой кислоты) в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии с тройным квадрупольным масс-анализатором с электроспрей ионизацией [4]. Однако известный способ не позволяет подбирать оптимальные дозировки ПТП и контролировать степени побочных эффектов, поскольку не определяет содержание других противотуберкулезных препаратов, входящих в комплексную терапию, в плазме крови, а именно пиразинамида, этамбутола и токсичного метаболита пиразинамида - пиразиноевой кислоты. В известном способе не учитывается нестабильность рифампицина, что вносит ошибку при количественном определении рифампицина. Недостатком известного способа является длительность процедуры подготовки плазмы крови к хроматографическому анализу, которая включает две стадии: первая - осаждение белков плазмы крови метанолом с добавкой 0.1% муравьиной кислоты, вторая - твердофазная экстракция для удаления липидов, что удлиняет и усложняет процесс, т.к. требуется большее время для пробоподготовки, возможны дополнительные потери компонентов на этой стадии, нет оперативности. Кроме того, в прототипе в количественном анализе используют внутренние стандарты - вещества, имеющие такую же структуру, как и определяемые аналиты, но некоторые атомы водорода заменены на изотопы Н (D). Поскольку изотопно-меченые соединения дорого стоят и часто коммерчески недоступны, это накладывает ограничения на применения данного способа при потоковых анализах.
Известен способ одновременного определения четырех ПТП (пиразинамид, изониазид, этамбутол и рифампицин) в плазме крови человека методом ОФ ВЭЖХ с тандемным масс-спектрометрическим детектированием с электроспрей ионизацией наиболее близкий к заявляемому изобретению по достижению технического результата и выбранный в качестве прототипа [5]. В известном способе проводят предварительную подготовку пробы к анализу путем добавления к пробе в качестве антиоксиданта аскорбиновой кислоты, осаждения белков и разбавления надосадочной жидкости деионизированной водой в соотношении 1:10. Однако в известном способе определяют содержание токсичных метаболитов препаратов основного ряда, входящих в комплексную терапию, а именно токсичного метаболита пиразинамида - пиразиноевой кислоты, метаболита рифампицина - 25-О-деацетилрифампицина, метаболитов изониазида - ацетилизониазида и изоникотиновую кислоту, что, таким образом, не позволяет контролировать степень их побочных эффектов и подбирать оптимальные дозы ПТП для лечения туберкулеза.
Заявляемое изобретение свободно от указанных недостатков.
Техническим результатом предлагаемого способа является информативность, поскольку заявленный способ позволяет одновременно контролировать содержание четырех ПТП (изониазид, рифамипицин, пиразинамид, этамбутол) и их токсичных метаболитов (ацетилизониазид, пиразиноевая кислота, 25-О-дезацетилрифампицин) в плазме крови. Заявленный способ обеспечивает достоверность результатов определения ПТП и их метаболитов при достижении достаточной (высокой) чувствительности определения и селективности разделения ПТП и их метаболитов за счет использования режима мониторинга множественных реакций (MRM-режима) масс-спектрометрического детектирования, т.е. детектирование лекарственных препаратов и их метаболитов по их осколочным ионам.
Указанный технический результат достигается тем, что плазму крови подготавливают к анализу путем добавления в пробу в качестве антиоксиданта аскорбиновой кислоты, осаждения белков и разбавления надосадочной жидкости деионизированной водой в соотношении 1:10, получают хроматограмму противотуберкулезных препаратов и их метаболитов в плазме крови методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиентном режиме элюирования с масс-спектрометрическим детектированием (тройной квадрупольный масс-анализатор с электроспрей ионизацией). Детектирование проводят путем мониторинга множественных реакций (MRM-режим). Для идентификации аналитов используют 2 осколочных иона, тогда как для количественного определения - ион максимальной интенсивности. Количественное определение аналитов проводят по площадям пиков определяемых соединений согласно градуировочным зависимостям по каждому компоненту пробы. Определение метаболитов ПТП проводят в режиме сканирования экстракта плазмы крови. Подтверждением является анализ по осколочным ионам, их масс-спектр, а также химическая природа метаболита и исходного противотуберкулезного препарата.
Таким образом, технико-экономическая эффективность заявленного способа состоит в более достоверной и полной информации по сравнению с известными аналогами контроля содержания ПТП в плазме крови, что позволяет контролировать проводимую лекарственную терапию туберкулеза и уменьшить степень побочных эффектов.
Перечисленная совокупность существенных признаков обеспечивает достижение указанного технического результата.
Туберкулез легких в настоящее время остается одной из главных проблем здравоохранения во всем мире, от него ежегодно умирают около трех миллионов человек. Предложенный способ имеет высокую социальную значимость, поскольку позволит оптимизировать комплексную терапию туберкулеза легких по определяемым концентрациям четырех лекарственных препаратов и их токсичных метаболитов, что обеспечит возможность достигать максимальный терапевтический эффект и минимизировать сопутствующие побочные эффекты.
Заявленный способ апробирован в лабораторных условиях Санкт-Петербургского государственного университета и Научно-исследовательского института пульмонологии и результаты апробации приведены в виде конкретных примеров реализации.
Как видно из приведенного примера 1, предложенный способ обеспечивает достаточную селективность и чувствительность определения четырех ПТП (изониазид, рифамипицин, пиразинамид, этамбутол) в плазме крови с учетом заявленной процедуры пробоподготовки, описанной в нижеприведенных примерах.
ПРИМЕР 1
На Фиг. 1 представлена хроматограмма экстракта образца плазмы крови больного туберкулезом легких, принимающего 4 противотуберкулезных препарата. На хроматограмме регистрируется 5 пиков - 1-этамбутол, 2-изониазид, 3-пиразинамид, 4-хинон рифампицина, 5-рифампицин.
Пробоподготовку образца плазмы крови проводят следующим образом. Берут аликвоту 100 мкл плазмы крови и помещают в микропробирку Эппендорфа, Добавляют аскорбиновую кислоту в концентрации 1 мг/мл в качестве антиоксиданта для уменьшения окисления рифампицина в хинон рифампицина и добавляют 300 мкл ацетонитрила, перемешивают в течение 2 мин. Затем пробу центрифугируют 10 мин со скоростью 10000 об/мин при температуре 4°С для отделения образовавшегося осадка и отбирают надосадочную жидкость. Разбавляют образец в 10 раз для уменьшения матричного влияния пробы и проводят хроматографический анализ.
Анализ пробы после пробоподготовки проводят методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с тройным квадрупольным масс-анализатором с электроспрей ионизацией «Shumadzu» LC-MS 8030; колонка Luna С18 (2) (150×2 мм, 5 мкм), подвижная фаза: А - 0.1% водный р-р муравьиной кислоты (по объему), Б - ацетонитрил, градиентный режим, скорость подвижной фазы - 0,3 мл/мин, объем вводимой пробы - 20 мкл. Условия фрагментации в MRM-режиме масс-спектрометрического детектирования: этамбутол 205,0 → 116,2 m/z (15 eV), изониазид 138,1 → 121,1 m/z (20 eV), пиразинамид 124,1 → 81,1 m/z (20 eV), рифамицин 823,3 → 791,6 m/z (30 eV).
Для проведения количественного определения компонентов пробы строится градуировочная зависимость площади пика от концентрации аналита по каждому компоненту пробы. Калибровочные растворы готовили путем растворения навески лекарственного препарата в 1 мл пула образцов плазмы крови, полученных от 6 доноров. Линейный диапазон концентраций составил для этамбутола 0,002-10 мкг/мл, для рифампицина, пиразинамида, изониазида 0,01-10 мкг/мл. Пределы обнаружения оценивались как отношение сигнал/шум=3:1 и составили 10, 10, 15 и 2 нг/мл для пиразинамида, изониазида, рифампицина, этамбутола, соответственно.
ПРИМЕР 2
Как видно из приведенного примера 2 предложенный способ обеспечивает достаточную чувствительность и селективность определения токсичных метаболитов ПТП в плазме крови по осколочным ионам.
На Фиг. 2 представлена хроматограмма экстракта образца плазмы крови пациента, больного туберкулезом легких, при определении метаболитов ПТП.
Хроматографический анализ проводился методом обращено-фазовой ВЭЖХ с тройным квадрупольным масс-анализатором с электроспрей ионизацией «Shumadzu» LC-MS 8030; колонка Luna С18 (2) (150×2 мм, 5 мкм), подвижная фаза: А - 0.1% водный р-р муравьиной кислоты (по объему), Б - ацетонитрил, градиентный режим, скорость подвижной фазы - 0,3 мл/мин, объем вводимой пробы - 20 мкл. Подготовка плазмы крови к анализу проводилась по схеме, описанной в примере 1.
Наличие данных метаболитов определяется при хромато-масс-спектрометрическом анализе экстракта плазмы крови в режиме сканирования. Подтверждением наличия метаболитов является анализ по осколочным ионам (791,6 m/z - 25-О-дезацетилрифампицин, 121,1 m/z - ацетилизониазид, 81,1 m/z - пиразиноевая кислота), их масс-спектр, а также химическая природа метаболита и исходного противотуберкулезного препарата.
Как видно из приведенных примеров 1 и 2 лабораторных испытаний заявленный способ позволяет достигнуть указанный технический результат, как было указано выше - оптимизировать комплексную терапию туберкулеза легких по определяемым концентрациям четырех лекарственных препаратов и их токсичных метаболитов.
Используемая литература
[1] Патент US 6,790,668 B1. Ferreire M.F. et. al. Monitoring patient compliance and bioavailability of drugs by deproteinizing body fluids.
[2] A.F. Faria, M.V.N, de Souza, R.E. Bruns, M.A.L. de Oliveira. Simultaneous determination of first-line anti-tuberculosis drugs by capillary zone electrophoresis using direct UV detection // Talanta. 2010. V. 82. P. 333-339. Doi: 10.1016/j.talanta.2010.04.044
[3] S. Notari, C. Mancone, M. Sergi, F. Gullotta, N. Bevilacqua, M. Tempestilli, R. Urso, F.N. Lauria, L.P. Pucillo, M. Tripodi, P. Ascenzi. Determination of antituberculosis drug concentration in human plasma by MALDI-TOF/TOF // IUBMB Life. 2010. V. 62. P. 387-393. Doi: 10.1002/iub.321
[4] K.H. Нее, J.J. Seo, L.S. Lee. Development and validation of liquid chromatography tandem mass spectrometry method for simultaneous quantification of first line tuberculosis drugs and metabolites in human plasma and its application in clinical study // J. Pharm. Biomed. Anal. 2015. V. 102. P. 253-260. Doi: 10.1016/j.jpba.2014.09.019
[5] E.A. Бессонова, Л.А. Карцова, C.A. Соловьёва. Хроматографическое и хромато-масс-спектрометрическое определение противотуберкулезных препаратов основного ряда в плазме крови. // Аналитика и контроль. 2016. Т. 20. №2. С. 161-167. DOI: 10.15826/analitika.2016.20.2.007 (прототип).