СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ИЗВЛЕЧЕННОГО ИЗ НЕМАТОДЫ ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩЕГО БЕЛКА (NAP)
METHOD OF PRODUCING ANTICOAGULATIVE PROTEIN, EXTRACTED FROM NEMATODES (NAP)

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка заявляет приоритет совместно рассматриваемой заявки «Способ лечения геморрагического заболевания с использованием ингибитора фактора VIIa/тканевого фактора», поданной 6 мая 2003 г.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способу производства белков, которые являются противосвертывающими веществами плазмы человека, и к белкам, произведенным данным способом. Конкретно настоящее изобретение относится к способам производства очищенных, извлеченных из нематоды противосвертывающих белков (NAP) и относится к очищенным NAP, произведенным по данному способу. В частности, настоящее изобретение относится к лекарственным веществам NAP и лекарственным продуктам NAP, и способам их производства.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Открытие и очистку лечебных белков, которые имеют потенциальное значение как фармацевтические препараты, можно выполнить в научно-исследовательской лаборатории с использованием материалов и методов, которые не подходят для крупномасштабного промышленного производства фармацевтических продуктов. Чтобы производить фармацевтические продукты в промышленном масштабе, биотехнологические производственные операции должны быть надежными и масштабируемыми без создания угрозы качеству продукта (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1 (4):54-61). Производственные процессы для фармацевтических продуктов должны обеспечивать рентабельные способы, повышенную выработку продукта, достаточный объем, чтобы удовлетворить спрос, и, в идеале, должны обеспечивать масштабируемость способа, чтобы реагировать на колебания в потребности. Производственные процессы для терапевтических белков должны совершенствовать рентабельные способы производства больших количеств белка в функционирующей форме, так же как способы очистки белка, чтобы производить фармацевтический продукт подходящей чистоты для его предполагаемого использования.
«Исследовательские» способы очистки белка, также известные как «лабораторные» или «стендовые» способы, часто тесно связаны со способами, которые использовались, чтобы обнаружить и охарактеризовать терапевтический белок. Часто выработки только микрограммов или миллиграммов очищенного белка достаточно для охарактеризования белка и определения последовательности его аминокислот. Даже после того как разработана экспрессионная система для рекомбинантного производства терапевтического белка, такие экспрессионные системы не обязательно подходят для производства белка в промышленном масштабе. Кроме того, в исследовательских способах очистки могут использоваться органические растворители, сильные кислоты или другие реактивы, которые нежелательно или непрактично использовать в промышленном масштабе, и иногда их не разрешено использовать в производстве фармацевтических продуктов. Кроме того, в данных способах очистки могут использоваться такие методы разделения, как эксклюзионная или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которые являются мощными способами очистки в лаборатории, но которые трудно масштабировать до уровня промышленного производства.
Способы пилотного производства, например объемов ферментации от 10 л до 100 л клеток хозяина, экспрессирующего терапевтический белок, подходят для дальнейшего исследования способа производства или для производства количеств терапевтического белка, достаточных для ранних клинических испытаний, но даже способы пилотного производства не всегда возможно масштабировать до производства количеств, требующихся для более поздней фазы клинических испытаний.
Один подход к увеличению объема биотехнологического производства включает расширение производительности или эффективности микробной экспрессионной системы. Для производства терапевтических белков доступно множество известных биологических «фабрик». Однако, поскольку продукция функционирующего белка тесно связана с клеточными механизмами организма, производящего белок, каждая экспрессионная система имеет преимущества и недостатки для использования в крупномасштабном производстве фармацевтических продуктов, в зависимости от белка. E. coli была «фабрикой» выбора для экспрессии многих белков, потому что с ней легко обращаться, она растет быстро, требует недорогой питательной среды и может секретировать белок в питательную среду, что облегчает выделение. Тем не менее, многие эукариотические белки, произведенные в E. coli, производятся в нефункционирующей, незаконченной форме, являются негликозилированными или не имеют других посттрансляционных изменений, кроме того, они не образуют соответствующих дисульфидных мостиков и не формируют соответствующей трехмерной конформации. Кроме того, вещество, произведенное в E. coli, может быть загрязнено эндотоксином. С подобными ограничениями часто сталкиваются при использовании видов Bacillus в качестве экспрессионных систем. Культуры клеток млекопитающих предоставляют малые количества эукариотических белков с надлежащим гликозилированием и конформацией, но культуры клеток млекопитающих дорогостоящи, их масштаб бывает трудно увеличить до промышленного уровня, они могут быть нестабильными и могут требовать использования сыворотки животных. Экспрессионные системы из клеток насекомого быстрые, их относительно легко разрабатывать, и они предлагают хорошие уровни экспрессии белков млекопитающих, но могут быть доростоящими, только умеренно масштабируемыми, и могут давать ненадлежащее гликозилирование. Дрожжевые экспрессионные системы популярны, потому что их легко выращивать, они быстрые и масштабируемые; однако некоторые дрожжевые экспрессионные системы дают неустойчивые результаты, и иногда трудно достигнуть высоких выходов.
Одной из дрожжевых экспрессионных систем, которая показалась многообещающей, является метанотрофная Pichia pastoris. По сравнению с другими эукариотическими экспрессионными системами Pichia предлагает много преимуществ, потому что она лишена как эндотоксиновой проблемы, связанной с бактериями, так и проблемы вирусного загрязнения белков, произведенных в культурах клеток животных (Cino, Am Biotech Lab, May 1999). В отсутствие глюкозы Pichia в качестве источника углерода использует метанол, используя индуцируемый метанолом промотор алкогольоксидазы (AOX1), который в норме подавляет экспрессию фермента, катализирующего первый этап метаболизма метанола, в качестве индуцируемого метанолом промотора, чтобы управлять экспрессией гетерологичных белков. Скорость пролиферативного роста Pichia делает ее легко масштабируемой до промышленного уровня производства, хотя трудности при увеличении масштаба включают управление pH, ограниченность кислорода, ограниченность питательных веществ, колебания температуры и соображения безопасности при использовании метанола (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1(4):54-61; Cino Am Biotech Lab, May 1999). Производство с Pichia pastoris, согласно нынешним условиям Good Manufacturing Practice (cGMP), возможно в масштабе 1000 л ферментации (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1 (4):54-61).
Другой подход к увеличению объема биотехнологического производства состоит в улучшении выделения белков и переработки продуктов ферментации. В переработке процессы должны быть регулируемыми, чтобы приспособиться к изменениям и улучшениям титра ферментации, композиции питательной среды и жизнеспособности клеток при максимизации производительности в существующем объеме (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1 (4):54-61). Недавние успехи хроматографии и фильтрации обеспечивают значительное увеличение селективности, выделения и предлагают большие объемы и малое время цикла, сравнимые с большим объемом и высокими уровнями экспрессии в современных процессах периодической ферментации с подпиткой (Gottschalk, 2003, BioProcess Intl 1 (4):54-61).
Несмотря на большие успехи в улучшении биотехнологического производства, не существует всеобъемлющих решений, годных для любого белка. Способ производства определенного терапевтического белка требует новых и рационализаторских решений проблем, которые могут быть специфичными для данного белка или семейства белков. Аналогично, успешные коммерческие применения часто зависят от комбинации специфических свойств белка или семейства белков и способов производства, используемых для производства данного белка или семейства белков в качестве фармацевтических продуктов.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предлагается способ производства очищенных извлеченных из нематоды противосвертывающих белков (NAP) и очищенного лекарственного вещества NAP и лекарственных продуктов NAP, произведенных данным способом. В настоящем изобретении предлагается способ производства больших (промышленного масштаба) количеств лекарственного вещества NAP и лекарственного продукта NAP. В частности, в настоящем изобретении предлагается способ производства лекарственного вещества NAP, включающий этапы: (a) процесс ферментации, включающий производство NAP в подходящем хозяине, где по меньшей мере одна последовательность, кодирующая NAP, интегрирована в геном хозяина; (b) процесс выделения, в котором NAP отделяется от клеток и фрагментов клеток; и (c) процесс очистки для очистки лекарственного вещества NAP от загрязнений. Подходящим хозяином является Pichia pastoris. Способ может дополнительно включать введение лекарственного вещества NAP в окончательную лекарственную композицию. Способ может дополнительно включать процесс заполнения, включающий фильтрацию в потоке лекарственного вещества NAP в окончательной лекарственной композиции, и этап заполнения, который может включать разделение лекарственного вещества NAP в окончательной лекарственной композиции на дозированные формы, чтобы произвести лекарственный продукт NAP, и может дополнительно включать лиофилизацию лекарственного продукта NAP. Предлагаемый здесь способ может использоваться для производства очищенного лекарственного вещества NAP или лекарственного продукта NAP из rNAPc2 (AcaNAPc2), rNAPc2/пролин (AcaNAPc2/пролин), AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44 или AcaNAP46.
В настоящем изобретении предлагается лекарственное вещество NAP, произведенное способом, раскрытым здесь. В настоящем изобретении предлагается лекарственное вещество NAP, произведенное с использованием NAP, выбранным из, но не ограниченным rNAPc2 (AcaNAPc2), rNAPc2/пролин (AcaNAPc2/пролин), AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44 или AcaNAP46. В одном варианте осуществления лекарственное вещество NAP по настоящему изобретению может быть произведено с использованием rNAPc2/пролин. Настоящее изобретение дополнительно предлагает лекарственный продукт NAP, произведенный способом, раскрытым здесь. В настоящем изобретении предлагается лекарственный продукт NAP, произведенный с использованием NAP, выбранным из, но не ограниченным rNAPc2 (AcaNAPc2), rNAPc2/пролин (AcaNAPc2/пролин), AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP44 или AcaNAP46. В одном варианте осуществления лекарственное вещество NAP по настоящему изобретению производится с использованием rNAPc2/пролин.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предлагается способ производства лекарственных веществ rNAPc2/пролин и лекарственных продуктов rNAPc2/пролин. Настоящее изобретение дополнительно предлагает лекарственное вещество rNAPc2/пролин и лекарственные продукты rNAPc2/пролин, произведенные способом, раскрытым здесь. В частности, в настоящем изобретении предлагается способ производства лекарственного вещества rNAPc2/пролин, включающий процесс ферментации, процесс выделения и процесс очистки. Предлагаемый здесь способ включает процесс ферментации, где rNAPc2/пролин производится в Pichia pastoris, имеющей по меньшей мере одну последовательность, кодирующую rNAPc2/пролин, интегрированную в геном, где процесс ферментации включает ферментацию посевного материала, чтобы размножить клетки хозяина до желаемой клеточной плотности, и процесс промышленной ферментации, включающий ферментацию с периодической подачей глицерина, ферментацию с подпиткой глицерином, ферментацию с адаптацией к метанолу и ферментацию с индукцией метанолом продолжительностью приблизительно до семи дней. Способ, предлагаемый здесь, дополнительно предусматривает процесс выделения, включающий ионообменную хроматографию во взвешенном слое, чтобы отделить rNAPc2/пролин от клеток и фрагментов клеток. Способ, предлагаемый здесь, дополнительно предлагает процесс очистки, включающий гидрофобную хроматографию, использующую среду для гидрофобной хроматографии, сбор фракций rNAPc2/пролин, по меньшей мере одну ультрафильтрацию/диафильтрацию (UF/DF) фракций rNAPc2/пролин, ионообменную хроматографию и сбор фракций rNAPc2/пролин с ионообменной хроматографии, где фракции rNAPc2/пролин с ионообменной хроматографии содержат лекарственное вещество rNAPc2/пролин. В соответствии с одним аспектом способ включает управление температурой ферментации, в частности, поддерживание температуры ферментации с адаптацией к метанолу приблизительно 28±2°С в течение приблизительно первых четырех часов и приблизительно 25±1°С в оставшееся время ферментации с адаптацией к метанолу. В соответствии с другим аспектом, поддерживается рН приблизительно 2,9±0,1 в течение ферментации с адаптацией к метанолу и ферментации с индукцией метанолом. В одном варианте осуществления процесс выделения включает хроматографию во взвешенном слое на ионообменной смоле Streamline SP XL при рН приблизительно 3,2±0,2, и этап очистки включает гидрофобную хроматографию на Source 15PHE при рН приблизительно 3,0±0,1, и ионную хроматографию на Source 15Q с последующей UF/DF фракций NAP с ионообменной хроматографии.
Дополнительно предлагается способ производства жидкого лекарственного продукта rNAPc2/пролин, включающий производство лекарственного вещества rNAPc2/пролин по способу, описанному выше, после которого следуют введение лекарственного вещества rNAPc2/пролин в окончательную лекарственную композицию, процесс заполнения, включающий фильтрацию в потоке и этап заполнения, включающий распределение rNAPc2/пролин в окончательную дозированную форму, такое распределение в емкость или флакон, чтобы получить жидкий лекарственный продукт rNAPc2/пролин, и может дополнительно включать лиофилизацию лекарственного продукта rNAPc2/пролин. В настоящем изобретении предлагается жидкий лекарственный продукт rNAPc2/пролин, произведенный данным способом, и лиофилизованный лекарственный продукт rNAPc2/пролин, произведенный данным способом.
В настоящем изобретении предлагается способ производства больших (в промышленном масштабе) количеств лекарственного вещества NAP, в частности лекарственного вещества rNAPc2/пролин. Из лекарственного вещества NAP, произведенного по предложенному здесь способу, может быть приготовлена лекарственная форма, которая может быть приготовлена в виде лекарственного продукта NAP, в том числе в виде жидкого лекарственного продукта NAP или лиофилизованного лекарственного продукта NAP. Кроме того, из лекарственного вещества rNAPc2/пролин, произведенного предлагаемым здесь способом, может быть приготовлена лекарственная форма, которая может быть распределена в виде лекарственного продукта rNAPc2/пролин, в том числе в виде жидкого лекарственного продукта rNAPc2/пролин или лиофилизованного лекарственного продукта rNAPc2/пролин.
Данный способ подходит для эффективного промышленного производства лекарственного вещества NAP и лекарственных продуктов NAP желаемых уровней активности и чистоты. Напротив, ранее раскрытые способы очистки NAP были исследовательскими способами, которые невозможно масштабировать для крупномасштабного производства NAP, и использовали реактивы и материалы, которые не желательны в производстве лекарственных веществ и лекарственных продуктов. Например, ранее раскрытый способ выделения включал центрифугирование для удаления клеток. В предшествующем способе супернатант затем очищался катионообменной хроматографией, гель-фильтрационной хроматографией (также известной как эксклюзионная хроматография), и, наконец, обращенно-фазовой хроматографией. Однако, как предлагается здесь, свойства NAP, в особенности rNAPc2/пролин, допускают изменения исследовательского способа с тем, чтобы заменить этап центрифугирования масштабируемым и обеспечивающим очистку способом, устранить трудномасштабируемые этапы гель-фильтрационной хроматографии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ), которые включают использование огнеопасного органического растворителя и специализированного оборудования, и улучшить чистоту конечного продукта. В предлагаемом здесь способе этап ионообменной хроматографии во взвешенном слое, в частности, этап хроматографии во взвешенном слое Streamline SP XL, устранил операции многих блоков, обычно используемых для этапа процесса промышленного выделения (например, комбинацию микрофильтрации с ультрафильтрацией). Как предлагается здесь, этап Streamline SP XL использовался, чтобы отделить rNAPc2/пролин от фрагментов клеток и перевести продукт в буфер, подходящий для первого этапа очистки. Хотя в ранее раскрытом способе использовалась гель-фильтрационная и обращенно-фазовая хроматография, данные колоночные этапы в настоящем изобретении замещены гидрофобной хроматографией (HIC) и анионообменной хроматографией, в частности HIC с использованием Source 15PHE и анионообменной хроматографией с использованием Source 15Q, что привело к существенной очистке rNAPc2/пролин посредством удаления белковых и небелковых загрязнений. Представляется, что относительно низкая изоэлектрическая точка rNAPc2/пролин (pH 4,1) и других NAP может участвовать в создании того неожиданного результата, что более высокое связывание с матрицей и более высокое общее выделение продукта с этапа HIC зависит от выполнения данного этапа хроматографии при низком pH - приблизительно 3,2. Кроме того, отдача процесса явилась результатом выполнения этапов при pH приблизительно 3, начиная с поздних этапов ферментации и заканчивая хроматографией на Streamline и HIC, что устраняло замену буфера между этапами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг.1 изображена векторная карта экспрессионного вектора rNAPc2/пролин Pichia pastoris pYAM7sp8/rNAPc2/proline, используемого для производства rNAPc2/pro, показывающая контрольные точки.
На фиг. 2A и 2B изображена блок-схема ферментации, показывающая используемые материалы и реактивы, используемый процесс и оборудование, и регулируемые и контролируемые условия на каждом этапе процесса ферментации; ферментация начинается с подготовки колбы для посевного материала и продолжается от ферментации посевного материала до промышленной ферментации.
На фиг.3 изображена блок-схема выделения, показывающая используемые материалы и реактивы, используемый процесс и оборудование, и регулируемые и контролируемые условия на каждом этапе процесса выделения.
На фиг. 4A и 4B изображена блок-схема очистки, показывающая используемые материалы и реактивы, используемый процесс и оборудование, и регулируемые и контролируемые условия на каждом этапе процесса очистки; очистка включает этапы гидрофобной хроматографии на Source 15PHE, этап ультрафильтрации/диафильтрации #1 (UF/DF#1), этап ионообменной хроматографии на Source 15Q, этап заключительной UF/DF, фильтрацию в потоке, заполнение и хранение очищенного продукта.
На фиг.5 изображена блок-схема жидкого лекарственного продукта, показывающая используемые материалы и реактивы, используемый процесс и оборудование, и регулируемые и контролируемые условия на каждом этапе процесса изготовления жидкого лекарственного продукта. Данный процесс включает этап смешивания, этап фильтрации и заполнения, и передачу флаконов с жидким лекарственным продуктом на склад.
На фиг.6 изображена блок-схема приготовления лиофилизованного лекарственного продукта, показывающая используемые материалы и реактивы, используемый процесс и оборудование, и регулируемые и контролируемые условия на каждом этапе процесса приготовления лиофилизованного лекарственного продукта. Процесс включает этап UF/DF, этап смешивания, этап фильтрации в потоке и заполнения, и передачу в блок лиофилизации.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предлагается способ производства очищенных извлеченных из нематоды противосвертывающих белков (NAP), таких как раскрытые в патентах США № (далее «США») 5863894; 5864009; 5866542; 5866543; 5872098; и 5945275 (полное содержание каждого из них включено посредством ссылки), где NAP, охарактеризованные до настоящего времени, имеют противосвертывающее действие и/или обладают активностью сериновых протеаз. В настоящем изобретении предлагаются очищенные NAP, произведенные заявленным способом, где такой очищенный NAP представляет собой лекарственное вещество NAP, из которого может быть приготовлена лекарственная форма в виде лекарственного продукта NAP. Настоящее изобретение может особенно подходить для производства полипептидов, включающих по меньшей мере один домен NAP. В настоящем изобретении предлагаются лекарственные вещества NAP и лекарственные продукты NAP, произведенные по способу, раскрытому здесь. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ производства лекарственного вещества rNAPc2/пролин и лекарственного продукта rNAPc2/пролин, и предлагается лекарственное вещество rNAPc2/пролин и лекарственный продукт rNAPc2/пролин, произведенные по способу, раскрытому здесь.
Извлеченные из нематоды противосвертывающие белки (NAP) называются так потому, что первый первоначально выделенный NAP был извлечен из нематоды, собачьей анкилостомы, Ancyclostoma caninum. Термин «домен NAP» относится к последовательности, которая, как полагают, обладает противосвертывающими свойствами. Как правило, домен NAP представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую меньше чем приблизительно 120 аминокислотных остатков, и содержащую 10 остатков цистеина, как раскрыто в США 5863894; 5864009; 5866542; 5866543; 5872098 и 5945275. «Домен NAP» может также относиться к нуклеиновым кислотам или нуклеотидным последовательностям, кодирующим одну или более аминокислотных последовательностей или полипептидов, имеющих домены NAP. Показательные домены NAP, аминокислотные последовательности NAP, характеристики, в общих чертах определяющие данное семейство белков и молекул нуклеиновой кислоты, которые кодируют такие белки, раскрыты в США 5863894; 5864009; 5866542; 5866543; 5872098 и 5945275.
Лекарственные вещества NAP по настоящему изобретению включают противосвертывающие средства, характеризующиеся ингибированием свертывания крови, которое включает свертывание плазмы. Лекарственные вещества NAP по настоящему изобретению включают, среди прочих, те, которые увеличивают время свертывания плазмы человека, измеренное по протромбиновому времени (ПВ) и/или активированному частичному тромбопластиновому времени (АЧТВ), как раскрыто в США 5863894; 5864009; 5866542; 5866543; 5872098 и 5945275. Специалист в данной области может использовать другие методы анализа, чтобы определить противосвертывающую активность лекарственных веществ NAP. Специалист в данной области может аналогично использовать другие методы анализа, чтобы определить другие биологические активности лекарственных веществ NAP.
Термины «AcaNAPc2» или «rNAPc2» относятся к рекомбинантному белку семейства NAP. Получение и последовательность AcaNAPc2 описаны в США 5866542.
Термины «AcaNAPc2/пролин», «AcaNAPc2P», «rNAPc2/пролин» и «rNAPc2/Pro» относятся к рекомбинантному белку, имеющему аминокислотную последовательность AcaNAPc2, которая была изменена с тем, чтобы добавить остаток пролина к С-концу последовательности AcaNAPc2.
«Лекарственное вещество» или «активный фармацевтический ингредиент (API)» относится к фармацевтически активному веществу, из которого впоследствии вместе с наполнителями может быть приготовлена лекарственная форма, чтобы произвести лекарственный продукт. Лекарственное вещество может находиться в неразделенной на дозы форме. «Лекарственный продукт» относится к законченной дозированной лекарственной форме (например, капсуле, таблетке, жидкому продукту в флаконе, лиофилизованному порошку в флаконе), содержащей лекарственное вещество в буфере окончательной композиции и обычно содержащей неактивные ингредиенты. Лекарственный продукт может быть лекарственной формой, приготовленной из лекарственного вещества. «Наполнитель» относится к неактивным ингредиентам, преднамеренно добавленным к лекарственному продукту, где понимается, что инертные наполнители не имеют фармакологических свойств в используемых количествах. «Загрязнение» относится к компоненту, присутствующему в лекарственном веществе, композиции API, или лекарственном продукте, который не является желаемым продуктом, связанном с продуктом веществом или инертным наполнителем, где понимается, что загрязнение может быть связанным с продуктом или связанным со способом. «Продукты деградации» относятся к вариантам, в частности к молекулярным вариантам, возникающим с течением времени от изменений в лекарственном веществе или лекарственном продукте вследствие света, pH, температуры, воды или реакции с инертным наполнителем либо системой емкости/упаковки/крышки.
«USP» относится к стандартам, представленным в Фармакопее США (USP) и Национальном фармакологическом справочнике (NF) (United States Pharmacopeial Convention, Inc., Роквилл, Мэриленд (2002), «USP26-NF-21», полное содержание которого тем самым включено посредством ссылки), и в Эталонах USP. Дополнительную информацию можно найти на http://www.usp.org или в USP-NF.
В настоящем изобретении предлагается способ производства лекарственного вещества NAP высокой чистоты, в котором на любой стадии ферментации или очистки не используется сырье животного происхождения. Данный способ масштабируем и подходит для проведения в промышленном масштабе. В настоящем изобретении предлагается способ производства лекарственного вещества NAP и лекарственного продукта NAP, где способ включает процессы ферментации, выделения, очистки, фильтрации и заполнения. Предлагается способ ферментации, по которому NAP производится в подходящем хозяине, где кодирующие NAP последовательности интегрированы в геном хозяина. Предлагается способ выделения, который улучшает выход и чистоту белков, выделяемых с этапа ферментации, где способ выделения позволяет более эффективно захватывать NAP по сравнению с традиционной методикой, такой как микрофильтрация и ультрафильтрация. Предлагается способ очистки, в котором лекарственное вещество NAP очищается от загрязнений, где желаемые композиции получают с использованием комбинации способов, включающих, но не ограниченных ультрафильтрацией, диафильтрацией, гидрофобной хроматографией и ионообменной хроматографией. Предлагается необязательный процесс заполнения, где лекарственный продукт NAP вводится в упаковочную тару и может быть лиофилизован.
Способы по настоящему изобретению подходят для производства лекарственного вещества NAP и лекарственных продуктов NAP. Специалист в данной области может изменить способы, как раскрыто здесь, чтобы улучшить экспрессию, выделение, очистку, приготовление лекарственной формы или заполнение, относящиеся к конкретному лекарственному веществу NAP. В неограничивающем примере специалист в данной области может определить изоэлектрическую точку (pI) конкретного интересующего NAP и может незначительно отрегулировать условия, такие как связывающая способность или pH этапа хроматографии, чтобы достигнуть улучшенной очистки желаемого лекарственного вещества NAP. В настоящем изобретении предлагаются лекарственные вещества NAP, очищенные как раскрыто здесь, из NAP, включая, но не ограничиваясь AcaNAPc2, AcaNAPc2/пролин, AcaNAP5, AcaNAP6, AcaNAP23, AcaNAP31, AcaNAP42, AcaNAP48, AceNAP5, AceNAP7, AduNAP4, AcaNAP24, AcaNAP25, AcaNAP46 и AcaNAP44. В частности, в настоящем изобретении предлагается rNAPc2/пролин. Специалист в данной области может определить другие белки NAP, подходящие для использования в способах, раскрытых здесь, для производства очищенного лекарственного вещества NAP.
Ферментация
В настоящем изобретении предлагается процесс ферментации, при котором NAP продуцируется в подходящем хозяине. Как предложено, одна или более последовательностей, кодирующих NAP, интегрированы в геном хозяина, и хозяин производит NAP в течение процесса ферментации. В одном варианте осуществления rNAPc2/пролин продуцируется Pichia pastoris в виде секретируемого белка в процессе ферментации, как предлагается здесь.
Как предлагается здесь, процесс ферментации включает процесс ферментации посевного материала, где клетки-хозяева размножаются до желаемой клеточной плотности, и процесс промышленной ферментации, где NAP производится до желаемого титра. Процесс ферментации посевного материала обеспечивает соответственно плотный инокулят для процесса промышленной ферментации, производящей высокие уровни NAP. Процесс ферментации, предлагаемый здесь, далее включает промышленную ферментацию для продуцирования высоких уровней NAP. Промышленная ферментация включает различные фазы: периодическую подачу глицерина; подпитку глицерином; адаптацию к метанолу и индукцию метанолом. В фазе периодической подачи глицерина формируется биомасса. В фазе подпитки глицерином к культуре подается обогащенный глицерином раствор, чтобы увеличить биомассу и подавить экспрессию. В фазе адаптации к метанолу подача глицерина прекращается и заменяется подачей метанола, который индуцирует продуцирование NAP хозяином. В фазе индукции метанолом поддерживаются условия конца фазы адаптации к метанолу, чтобы поддержать продуцирование NAP.
В соответствии с одним аспектом, чтобы достичь желаемого высокого титра NAP, управляют диапазоном pH ферментации. В одном варианте осуществления pH для ферментации удерживается в диапазоне pH приблизительно 2,9±0,1 единицы pH в течение ферментации с адаптацией к метанолу и ферментации с индукцией метанолом. В соответствии с другим аспектом управляют температурой ферментации. В одном варианте осуществления в фазу адаптации к метанолу удерживается температура приблизительно 28±2°C в течение первых четырех часов, чтобы содействовать успешной адаптации к подаче метанола, а в оставшееся время фазы адаптации к метанолу удерживается температура приблизительно 25±1°C, чтобы содействовать высокому титру NAP. В соответствии с одним аспектом титр NAP продолжает увеличиваться без вредных влияний на продукт в течение приблизительно семи дней, чем достигается высокий общий выход NAP.
В иллюстративных вариантах осуществления предлагаемый здесь процесс ферментации проводили в 15 л, 100 л, 150 л и 1000 л ферментерах и материал из 15, 100 и 150 л ферментации очищали, чтобы произвести лекарственное вещество NAP. В одном варианте осуществления в процессе ферментации продуцируется rNAPc2/пролин с высоким титром. В различных вариантах осуществления ферментация для продуцирования rNAPc2/пролин проводилась в 15 л, 100 л, 150 л и 1000 л ферментерах, и лекарственное вещество rNAPc2/пролин было очищено из 15, 100 и 150 л ферментации.
Выделение
В настоящем изобретении предлагается способ выделения, повышающий выход и чистоту белков NAP с этапа ферментации. Предлагаемый здесь процесс выделения позволяет захватить NAP и удалить клетки и фрагменты клеток, где предложенный здесь способ выделения более эффективен по сравнению с традиционной методикой, такой как микрофильтрация/ультрафильтрация. Не желая быть ограниченной данной теорией, повышенная эффективность предложенного здесь выделения может вытекать из комбинации аспектов системы Pichia, а именно того, что Pichia pastoris создает плотную биомассу в течение ферментации. Кроме того, белки NAP представляют собой относительно малые белки и, следовательно, требуют мембран для ультрафильтрации с малыми порами, которые имеют малую скорость потока, что приводит к большой продолжительности процесса. В соответствии с одним аспектом в процессе выделения используется ионообменная хроматография, включая использование ионообменной хроматографии во взвешенном слое, чтобы отделить NAP от клеток и фрагментов клеток и перевести продукт в буфер, подходящий для использования на последующих этапах очистки. В одном варианте осуществления для выделения лекарственного вещества NAP, как описано здесь, используется блок хроматографии во взвешенном слое на ионообменной смоле Streamline SP XL (Amersham Biosciences). В другом варианте осуществления rNAPc2/пролин отделяется от фрагментов клеток-хозяев, экспрессмрующих rNAPc2, с использованием хроматографии во взвешенном слое. В особенно предпочтительном варианте осуществления rNAPc2/пролин выделяется с использованием ионообменного блока Streamline XL.
Альтернативно, способ выделения, эффективно захватывающий NAP после этапа ферментации, может быть выполнен с использованием способов, отличающихся от ионообменной хроматографии во взвешенном слое. Специалист в данной области может проверить и оценить альтернативные способы захвата NAP и удаления клеток и фрагментов клеток, включающие, но не ограниченные аффинной хроматографией, центрифугированием, фильтрацией, дифференциальным осаждением и другими способами, которые будут определены.
Очистка
В настоящем изобретении предлагается процесс очистки, посредством которого лекарственное вещество NAP очищается от загрязнений. Как предлагается здесь, способ очистки включает гидрофобную хроматографию, сбор фракций NAP, по меньшей мере одну ультрафильтрацию и диафильтрацию (UF/DF) фракций NAP, ионообменную хроматографию, сбор фракций NAP с ионообменной хроматографии, еще один этап UF/DF и заключительную фильтрацию. Понятно, что каждый этап, предложенный в процессе очистки, увеличивает чистоту лекарственного вещества NAP, так что специалист в данной области может определить степень чистоты, требуемую для конкретного применения, и выбрать этапы и условия, необходимые, чтобы достигнуть желаемого уровня чистоты лекарственного вещества NAP. Общая эффективность способа была повышена путем поддержания низкого рН (приблизительно 3) раствора, начиная с жидкой среды для ферментации и включая этап выделения и первый этап очистки (гидрофобную хроматографию на Source 15PHE). Данные этапы были специально разработаны для выполнения при том же самом pH, чтобы удалить этапы смены pH/буфера, требующиеся в других способах, таким образом уменьшая затраты времени и труда, так же как уменьшая потенциальные потери продукта. Данные этапы выполняются при pH ниже приблизительно 5, предпочтительно при pH ниже приблизительно 4, более предпочтительно при pH приблизительно 3. В одном варианте осуществления в гидрофобной хроматографии используется среда для гидрофобной хроматографии Source 15PHE при pH приблизительно 3,0±0,1. Как предлагается здесь, в способе очистки используется гидрофобная хроматография, чтобы удалить загрязнения, где использование низкого pH позволяет гидрофобной среде связывать бульшие количества NAP и использование градиентного элюирования позволяет разделить близкородственные загрязнения. Как предлагается здесь, фракция NAP, элюированная со среды для гидрофобной хроматографии, подвергается ультрафильтрации и диафильтрации (UF/DF), чтобы сконцентрировать продукт и выполнить смену буфера, после чего NAP в подходящем буфере наносится на ионообменную среду, чтобы удалить бульшую часть оставшихся белковых и небелковых загрязнений, включая близкородственное загрязнение. Наконец, как предлагается здесь, фракция NAP, собранная с ионообменной хроматографии, содержащая высокоочищенное лекарственное вещество NAP (API), подвергается UF/DF, чтобы сконцентрировать лекарственное вещество NAP и перевести его в буфер окончательной композиции.
В одном варианте осуществления профильтрованный, приведенный в надлежащее состояние элюат с этапа хроматографии на Streamline SP XL, используемого для выделения NAP, вводится в колонку со средой для гидрофобной хроматографии Source 15PHE (Amersham Biosciences) при низком pH (приблизительно 3,0±0,1), где значительное количество NAP связывается с колонкой, после чего следует градиентное элюирование Source 15PHE, добавка гидроксида натрия, чтобы поднять pH приблизительно до 5 или выше, и затем UF/DF элюированной фракции NAP, после которой раствор NAP вводится в колонку со средой для ионной хроматографии Source 15Q (Amersham Biosciences), и градиентное элюирование используется, чтобы отделить лекарственное вещество NAP от близкородственных загрязнений. В одном варианте осуществления фракции NAP после ионообменной хроматографии содержат лекарственное вещество NAP. В другом варианте осуществления процесс очистки выполняется, как описано выше, чтобы получить высокоочищенное лекарственное вещество rNAPc2/пролин.
Как предлагается здесь, растворы, содержащие NAP, могут подвергаться различным этапам фильтрации, чтобы получить лекарственное вещество NAP в желаемых концентрациях или в желаемых композициях. По желанию могут быть включены дополнительные этапы фильтрации. Соответственно, фракции NAP, элюированные с этапов хроматографии, могут быть профильтрованы, сконцентрированы, обессолены или подвергнуты замене буфера с использованием только ультрафильтрации (UF) или ее комбинации с диафильтрацией (DF), или комбинации ультрафильтрации и диафильтрации (UF/DF). Как предлагается здесь, UF/DF может использоваться, чтобы заменить элюирующий буфер гидрофобной хроматографии на загрузочный буфер ионообменной хроматографии или заменить элюирующий буфер ионной хроматографии на буфер окончательной композиции или основной объем лекарственной композиции, которая используется для лекарственного продукта NAP. UF/DF может быть выполнена с использованием одного или более фильтров. В соответствии с одним аспектом для UF/DF используется один фильтр (или фильтрующая мембрана) с размером пор для выбранной молекулярной массы. Альтернативно, множество фильтров может использоваться по мере необходимости для увеличения масштаба. В одном варианте осуществления фракция NAP с отрегулированным pH с этапа гидрофобной хроматографии подвергается ультрафильтрации с использованием фильтра с порами для веществ с молекулярной массой 3 кДа, чтобы достигнуть желаемой концентрации, затем совокупность ретентата, содержащего NAP, подвергается диафильтрации против 5 или большего числа объемов загрузочного ионообменного буфера с использованием той же самой фильтрующей мембраны с порами для веществ с молекулярной массой 3 кДа, пока не будет определено, что достигнуто желаемое состояние буфера. В одном варианте осуществления фракции NAP с ионообменной хроматографии подвергаются по меньшей мере одной заключительной UF/DF. В другом варианте осуществления фракции NAP с этапа ионообменной хроматографии подвергаются UF/DF, как описано выше, чтобы перевести лекарственное вещество NAP в буфер окончательной лекарственной композиции. В другом варианте осуществления для ультрафильтрации или диафильтрации используются фильтры для ультрафильтрации из искусственного целлюлозного волокна с порами для веществ с молекулярной массой 3 кДа. Специалист в данной области может выбрать и оценить фильтры или фильтрующие мембраны, подходящие и совместимые с экспериментальными условиями и желаемыми целями.
Фильтрация в потоке
Как предлагается здесь, лекарственное вещество NAP в буфере окончательной композиции может быть профильтровано и храниться в запасе или подвергаться дальнейшим этапам обработки. В одном варианте осуществления лекарственное вещество NAP в окончательной композиции подвергается процессу заполнения. В одном варианте осуществления основной объем лекарственного вещества NAP переносится в подходящие стерильные условия, например «чистое помещение класса 100» в производственном сооружении, и фильтруется в стерильные емкости. В одном варианте осуществления лекарственное вещество NAP фильтруется, например, с использованием 0,2-мкм фильтра, в автоклавированные емкости из подходящего материала, например емкости, сделанные из фторированного этиленпропилена (FEP), сополимера этилентетрафторэтилена (EFTE) или другого материала, который отвечает требованиям поправки по пищевым добавкам Федерального закона США по продуктам питания, лекарственным и косметическим средствам, а также требованиям класса VI USP. В одном варианте осуществления основной объем лекарственного продукта rNAPc2/пролин передается в чистое помещение класса 100 и фильтруется с использованием 0,2-мкм фильтра Millipak в автоклавированную 1-литровую литую бутыль серии Nalgene Tefzel FEP 1600 с литой беспрокладочной незагрязненной завинчивающейся крышкой TefzelETFE, после чего бутыли передаются в морозильник с температурой -20±10°C для хранения.
Основной объем лекарственного вещества NAP может быть повторно профильтрован и разлит, используя тот же самый способ заключительной фильтрации, например, содержимое меньших бутылей, заполненных как описано выше, может быть перенесено в бульшую емкость. В одном варианте осуществления содержимое тефлоновых бутылей FEP, содержащих лекарственное вещество rNAPc2/пролин, как описано выше, переносится в автоклавированную оплетенную бутыль в чистом помещении класса 100, повторно фильтруется и разливается.
Этап заполнения
В соответствии с одним аспектом настоящее изобретение дополнительно предлагает этап заполнения, где лекарственное вещество NAP в окончательной лекарственной композиции разливается в асептический флакон, емкость или другую упаковку. Этап заполнения может включать дополнительные этапы фильтрации и может включать использование разливочного комплекта перед заполнением отдельных флаконов, емкостей или других упаковок. Этап заполнения может предоставить флакон с лекарственным продуктом NAP, где лекарственный продукт NAP находится в окончательной дозированной форме. Этап заполнения жидкостью может предоставить флакон с лекарственным продуктом NAP в жидкой форме. Лекарственный продукт NAP может использоваться в форме, введенной во время этапа заполнения, например, стандартной дозы раствора, содержащего лекарственный продукт NAP. Альтернативно, составом лекарственного продукта NAP можно дополнительно управлять после этапа заполнения, например, лекарственный продукт NAP во флаконе после этапа заполнения жидкостью может быть лиофилизован. Как предлагается здесь, лекарственное вещество NAP в желаемой конечной концентрации может быть профильтровано в асептический разливочный комплект и затем разлито в отдельные предварительно простерилизованные флаконы.
3
В одном варианте осуществления основной объем лекарственного вещества rNAPc2/пролин (с концентрацией 12±1,2 мг/мл) разбавляется до 3 мг/мл раствором 0,2М аланина и 25 мМ дигидрофосфата натрия, pH 7,0. Разбавленный rNAPc2/пролин затем подвергается диафильтрации против ≥5 объемов раствора аланина/фосфат. Раствор rNAPc2/пролин удаляют и фильтры промывают раствором аланин/фосфат. Подвергнутый диафильтрации раствор rNAPc2/пролин затем разбавляют до 2 мг/мл (что измеряется УФ-пробой, описанной ниже в примерах) промывочной жидкостью с фильтров и раствором аланин/фосфат. Раствор rNAPc2/пролин, 2 мг/мл, затем разбавляется равным объемом 25 мМ фосфата натрия, 8%-ной сахарозы, pH 7,0, чтобы достигнуть концентрации rNAPc2 1,0±0,1 мг/мл. Наконец, созданный раствор rNAPc2/пролин, 1 мг/мл, перед этапом заполнения фильтруют с использованием 0,2 мкм фильтра Millipak (Millipore Corp.). Лекарственный продукт rNAPc2/пролин, 1 мг/мл, фильтруют в асептический разливочный комплект через два проходных 0,2-мкм фильтра Millipak. Затем rNAPc2/пролин разливают в предварительно простерилизованные стеклянные флаконы на 3 см и закрывают пробками.
В качестве альтернативного варианта осуществления из основного объема лекарственного вещества rNAPc2/пролин может быть приготовлена лекарственная форма для жидкого лекарственного продукта. Это описано в примере 5.1.
Лиофилизация
В настоящем изобретении предлагается необязательный этап лиофилизации, производящий лиофилизованный лекарственный продукт NAP. После этапа заполнения лекарственный продукт NAP во флаконах или других емкостях сушится сублимацией и затем герметизируется, например пробки во флаконах проталкиваются глубже и на флаконы одеваются колпачки. Лиофилизованная композиция сохраняет высокую чистоту и длительную стабильность, когда лекарственный продукт NAP подвергается тяжелому температурному стрессу, например 28 дней при 50°C.
Настоящее изобретение далее будет объяснено посредством конкретных примеров, представленных ниже, чтобы продемонстрировать характеристики процессов производства rNAPc2/пролин и характеристики rNAPc2/пролин, произведенного данными процессами, включая данные и способы исследования очищенного продукта. В следующих примерах вышеупомянутые эффекты разъясняются путем раскрытия способов производства лекарственного вещества rNAPc2/пролин, подходящего для приготовления лекарственной формы в виде лекарственного продукта для использования в фармацевтической композиции. Данные варианты осуществления, однако, сформулированы, чтобы проиллюстрировать изобретение и не должны рассматриваться как его ограничения, изобретение будет определено формулой изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Создание банков клеток для экспрессионной системы лекарственного вещества NAP
Пример 1.1. Экспрессионная система rNAPc2/пролин
Ген rNAPc2 клонировали в экспрессионном векторе Pichia pastoris, pYAM7sp8 (Laroche et al, 1994, Biotechnology 12:1119-1124), используя выделение с помощью ПЦР. Вектор pYAM7sp8 (фиг.1) является производным от pHIL-D2 (Despreaux and Manning, 1993, Gene 106:35-41). Он содержит промотор и сигнал терминации транскрипции гена AOX1 Pichia pastoris, сигнальный пептид секреции (слияние сигнальной последовательности кислой фосфатазы Pichia pastoris и пропоследовательности гибридного α-фактора полового размножения S. cerevisiae) и маркерный ген HIS4 для отбора трансфектантов.
Праймерами ПЦР, использованными для выделения гена rNAPc2/пролин из клона фага (Jespers et al, 1995, Biotechnology 13: 387-382), были:
5'
3'
TTT AAA
A8: GCG  GCA ACG ATG CAG TGT GGT G (SEQ ID NO: 1)
5'
3'
T CTA GA
A9: C GCA GCT TCA TGG GTT TCG AGT TCC GGG ATA TAT AAA GTC (SEQ ID NO: 2)
Данные праймеры добавляют участки Dral и Xbal к 5'- и 3'-концам выделенного фрагмента ДНК соответственно. Подчеркнуты нуклеотиды, которые гибридизируются с матрицей. Праймер A9 (SEQ ID NO: 2) также вставляет кодон пролина непосредственно перед терминирующим кодоном, что преобразует кодирующую последовательность из последовательности, кодирующей AcaNAPc2 (SEQ ID NO: 3), в последовательность, кодирующую AcaNAPc2/пролин (SEQ ID NO: 4). Полученный в результате ПЦР фрагмент расщепляли по Dral и XbaI и клонировали в pYAM7sp8, расщепленном по Stul и Spel. Лигирование тупых концов pYAM7sp8 (Stul) и ПЦР фрагмента (Dral) привело к слиянию внутри рамки сигнального пептида секреции P. pastoris и зрелой части rNAPc2/пролин. Лигирование концов XbaI и Spel ПЦР фрагмента и pYAM7sp8 привело к деструкции участка Spel pYAM7sp8.
Экспрессионный штамм P. pastoris был создан путем интеграции экспрессионной кассеты в геном P. pastoris гомологичной рекомбинацией. Конструкцию pYAM7sp8/NAPc2 расщепляли по Notl. Расщепленную плазмиду вводили посредством электропорации в клетки P. pastoris GS115 (his4-). Проводили скрининг трансфектантов на фенотип использования метанола (mut+) и высокий уровень экспрессии rNAPc2. Единственный изолят (обозначенный как GS115/AcaNAPc2P-55), был выбран для создания главного банка клеток (MCB). Промышленный штамм анализировали методом блоттинга по Саузерну с использованием в качестве зондов меченных радиоизотопом генов rNAPc2 или HIS4. Данный блоттинг показал, что множественные копии экспрессионной кассеты были интегрированы в 3'-участок гена AOX1.
Пример 1.2. Главный банк клеток (MCB)
Главный банк клеток (MCB) был приготовлен с использованием предбанка изолята из единственной колонии (GS115/AcaNAPc2P-55). Колба, содержащая питательную среду YEPD (бактопептон, дрожжевой экстракт и декстроза) с 2% глюкозы засеяли 0,5 мл из предбанка и выращивали до оптической плотности (A550нм) 0,5-1,0. Культуру собрали, разбавили глицерином в качестве криоконсерванта до конечной концентрации 15% и заморозили в криофлаконах, которые хранились при температуре ниже -60°C.
Пример 1.3. Рабочий банк клеток изготовителя (MWCB)
600нм
Новый рабочий банк клеток изготовителя (MWCB) приготовили из флакона MCB. Флакон MCB использовался, чтобы засеять колбу, содержащую дрожжевую пептоновую среду (пептон и дрожжевой экстракт) и 2% декстрозы. Колбу инкубировали при 28±2°C и 250 об/мин, пока оптическая плотность (A) не составила 17,0±5,0. Культуру собрали и разбавили глицерином в качестве криоконсерванта до конечной концентрации 9%. Аликвоты по 1,1±0,1 мл были перелиты в криофлаконы по 2,0 мл, заморожены и хранились при -70±10°C.
Пример 1.4. Методы, используемые для анализа главного банка клеток
Идентификация хозяина. Культура клеток rNAPc2/пролин из банка была засеяна штрихом на чашки Петри с соевым агаром Trypticase (TSA), и чашки Петри инкубировались для роста. Изолят подготовили для идентификации с использованием системы идентификации Vitek, которая использует камеру с контролируемой температурой и блок фотометрического датчика, чтобы контролировать изменения мутности в суспензии изолята, который засеяли на тестовую карту для дрожжей Vitek, содержащую субстраты для 26 общепринятых биохимических тестов. Для идентификации хозяина rNAPc2/пролин из банка клеток результирующий биорисунок реакции сравнивали с биорисунком реакции организма, который был положительным контролем (Pichia pastoris, ATCC No. 76273).
Концентрация жизнеспособных клеток. Концентрация жизнеспособных клеток из банка клеток rNAPc2/пролин измеряли подсчетом жизнеспособных колониеобразующих единиц (КОЕ) посредством приготовления последовательных разведений из флаконов из банка клеток (каждый из начала, середины и конца). Разведения высевали в трех экземплярах на чашках Петри с TSA и инкубированные КОЕ подсчитывали, и выполняли вычисления, чтобы определить концентрацию клеток в виде КОЕ/мл.
Определение структурной последовательности гена. Культуру из банка клеток подготавливали к определению последовательности гена посредством амплификации гена rNAPc2/пролин, интегрированного в геном хозяина, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукт ПЦР очищали и определяли концентрацию. Затем определяли последовательность продукта ПЦР с использованием метода терминации дидеоксицепи (метода Сангера). Полученную в результате последовательность гена из банка клеток сравнивали с известной последовательностью ДНК rNAPc2. Тождественность была подтверждена 100%-ным совпадением.
Анализ на загрязнение другими микроорганизмами. Жидкую питательную среду для ферментации rNAPc2/пролин проверяли на загрязнение другими микроорганизмами, высевая по 100 мкл на каждую из девяти чашек Петри с TSA. Три чашки Петри инкубировали при трех температурах (20-25°C, 30-34°C и 35-39°C). В течение семи дней инкубации чашки Петри осматривались на микробные колонии, которые отличались от типичных для хозяина, в частности отмечались различия в морфологии колонии, цвете и/или размере колонии. Финальная чашка Петри, по которой читался результат, также исследовалась окрашиванием по Граму. В анализ были включены адекватные отрицательные контроли.
Пример 1.5. Способы анализа рабочего клеточного банка изготовителя
Идентификация хозяина. Культуру rNAPc2/пролин из банка клеток высевали штрихом на чашки Петри с агаром Сабуро, содержащим декстрозу (SDA), чашки Петри инкубировались для роста при 20-25°C в течение 7 дней. Параллельно положительный контроль (штамм ATCC K. pastoris - второе название для P. pastoris) высевали штрихом на чашки Петри с SDA тем же самым образом. Отобранные выросшие колонии были исследованы окрашиванием по Граму.
После инкубации по меньшей мере две морфологически схожие колонии от каждой чашки Петри с SDA выбирались из чашек Петри с SDA, засеянных исследуемой пробой, и чашек Петри с SDA, засеянных положительным контролем. Данные колонии пересевали на отдельные чашки Петри с SDA и инкубировали при 20-25°C в течение 7 дней. Рост на каждой чашке Петри с пересеянной культурой подвергался тесту API 20C AUX и окрашиванию по Граму. Тестовая система API (bioMérieux SA; Marcy l'Etoile, Франция) представляет собой ручной тест для идентификации микробов, который содержит 20 миниатюрных биохимических тестов. Тестовая полоска 20C AUX содержит 20 биохимических тестов, специфичных для идентификации дрожжей. Результаты теста API пробы из банка клеток rNAPc2/пролин сравнивали с результатами, полученными для положительного контроля, чтобы подтвердить идентификацию.
Концентрация жизнеспособных клеток. Концентрация жизнеспособных клеток из банка клеток rNAPc2/пролин измеряли подсчетом жизнеспособных колониеобразующих единиц (КОЕ) посредством приготовления последовательных разведений из двух флаконов из банка клеток, один флакон извлекали перед замораживанием банка и один флакон извлекали после того, как банк был заморожен. Аликвоты по 100 мкл из каждого разведения высевали на две чашки Петри с TSA и инкубировали в течение 5-7 дней. Учитывались все чашки Петри с исчисляемыми колониями (30-300 КОЕ). Вычисляли среднее чисел, полученных от чашек Петри с одним и тем же разведением исследуемой пробы, умножали на их разведение и делили на размер аликвоты 100 мкл, чтобы сообщить результаты как КОЕ/мл.
TM
Определение последовательности ДНК. Из недавно созданного банка клеток (образца для испытания) выделяли ДНК целиком. Ген NAPc2/пролин амплифицировали полимеразной цепной реакцией (ПЦР), используя праймеры, гомологичные 5'- и 3'-последовательностям клонируемого гена NAPc2/пролин. Полученный в результате фрагмент ДНК (приблизительно 500 пар оснований) очищали с использованием стандартных способов и использовали в качестве матрицы для определения последовательности ДНК с использованием метода «шагающих» праймеров, выполненного с использованием комплекта Thermo Sequenase для циклового определения последовательности с меченным терминатором (Amersham Biosciences, Piscataway, Нью-Джерси). Пленки с последовательностями читались оцифровкой, и данные о последовательности собирались и анализировались, используя программное обеспечение Sequencher версии 3.0 (Gene Codes Corp., Анн-Арбор, Мичиган). Консенсусную последовательность, полученную из образца для испытания, затем сравнивали с теоретической последовательностью для гена NAPc2/пролин.
Загрязнение другими микроорганизмами. Перед замораживанием недавно созданного банка клеток (образца для испытания), флакон был подвергнут анализу на микроорганизмы, отличающиеся от хозяина. Проба жидкой среды была разбавлена физиологическим раствором в тысячу раз. По две чашки Петри с девятью различными типами питательных сред были засеяны 100 мкл разбавленной исследуемой пробы. Кроме того, положительный контроль (штамм ATCC K. pastoris - другое название для P. pastoris) был разбавлен и засеян на чашки Петри тем же самым способом. Другой набор чашек Петри не был засеян и был назначен отрицательным контролем. Все чашки Петри, кроме содержащих SDA, инкубировались при 30-35°C в течение 48-72 часов; чашки Петри с SDA инкубировались при 20-25°C в течение 7 дней. Чашки Петри исследовались на рост после 1-го и 2-го или 3-го дня. Кроме того, чашки Петри с SDA исследовались на рост после 7 дней. Любые колонии, отклоняющиеся от нормального типа, идентифицировались с помощью теста API и окрашивания по Граму.
После 2-го или 3-го дня по меньшей мере две морфологически подобные колонии с каждой чашки Петри с TSA были выбраны из чашек Петри с TSA, засеянных исследуемой пробой, и чашек Петри с TSA, засеянных положительным контролем. Данные колонии пересевали на отдельные чашки Петри с TSA и инкубировали при 30-35°C в течение 48-72 часов. Рост на каждой чашке Петри с пересеянной культурой подвергся тесту API 20C AUX и окрашиванию по Граму. Тестовая система API (bioMérieux SA; Marcy l'Etoile, Франция) представлял собой ручной тест идентификации микробов, который содержал 20 миниатюрных биохимических тестов. Тестовая полоска 20C AUX содержит 20 биохимических тестов, специфических для идентификации дрожжей. Результаты теста API образца для испытания сравнивали с результатами, полученными для положительного контроля, чтобы подтвердить идентификацию.
Пример 2. Производство лекарственного вещества rNAPc2/пролин
Промышленный процесс производства лекарственного вещества rNAPc2/пролин состоял из ферментации, выделения, очистки, фильтрации в потоке и заполнения. В последующих секциях описываются операции отдельных блоков для каждой стадии процесса. Блок-схемы для каждой операции блока представлены на фиг. 2-4, где на блок-схемах суммировано оборудование, буферы, компоненты и входные и выходные параметры. Замена поставщиков и эквивалентных материалов может происходить по мере необходимости, пока поддерживается соответствие требованиям Протокола хорошего производства (GMP) активного фармацевтического ингредиента (API) Международной конференции по гармонизации технических требований к регистрации фармацевтических препаратов для использования человеком (ICH).
Пример 2.1 Ферментация
В данной секции описываются процедуры ферментации для производства rNAPc2/пролин. Белок rNAPc2/пролин производился в виде секретируемого белка Pichia pastoris. Процесс ферментации для rNAPc2/пролин состоял из колб с посевным материалом, ферментации посевного материала и промышленной ферментации (фиг.2, блок-схема ферментации). Во всех компонентах питательной среды используется очищенная вода, USP.
Колбы с посевным материалом для ферментации посевного материала. Цель операции блока колбы с посевным материалом состояла в том, чтобы обеспечить инокулят подходящей плотности для ферментации посевного материала. Три флакона из MWCB оттаивали и один миллилитр использовали, чтобы асептически засеять каждую из трех двухлитровых встряхиваемых колб с перегородкой, содержащих 250 мл автоклавированной питательной среды с pH 6,0±0,1 (таблица 1). Колбы были закрыты и перенесены в термостат со встряхивателем при 250±5 об/мин и 28±2°C. Колбы инкубировались в течение 27,5±2,0 часа, пока клеточная плотность, измерявшаяся по влажной массе клеток (WCW), не составила ≥30 г/л. Как только два данных параметра были достигнуты, содержимое двух колб было асептически перенесено в автоклавированную инокуляционную бутыль.
Таблица 1
Питательная среда в колбе с посевного материала
Компоненты
Концентрация
Калия гидрофосфат
2,30 г/л
Калия дигидрофосфат
11,8 г/л
Глицерин
10 мл/л
Дрожжевое азотистое основание без аминокислот
13,4 г/л
Биотин
0,4 г/л
Ферментация посевного материала
Цель ферментации посевного материала состояла в том, чтобы обеспечить инокулят подходящей плотности для промышленной ферментации. Питательная среда для ферментации посевного материала (таблица 2), включая следовые соли PTM4 (таблица 3), переносилась в ферментер для посевного материала. Питательную среду стерилизовали паром, давали охладиться и приводили pH к 5,0±0,2 стерилизованным фильтрацией 28-30% гидроксидом аммония. Затем через перегородку добавляли стерилизованный фильтрацией 5% (об./об.) раствор пеногасителя KFO880 в 50%-ном метаноле до концентрации 0,5 мл/л. Когда температура стабилизировалась на уровне 28,0±1,0°C, питательную среду засевали содержимым инокуляционной бутыли для колбы с посевным материалом в отношении 2,5%. pH культуры в ферментере поддерживали на уровне 5,0±0,2 28-30% гидроксидом аммония. Рост ферментации контролировали, измеряя влажную массу клеток (WCW).
Ферментация проводилась в течение 15±2 часа и до конечной влажной массы клеток ≥20 г/л. Часть культуры ферментации посевного материала переносили посредством простерилизованной паром линии передачи в автоклавированную инокуляционную емкость. Пробу завершающей ферментации посевного материала проверяли на загрязнение другими микроорганизмами.
Таблица 2
Питательная среда для ферментации посевного материала
Компоненты
Концентрация
Фосфорная кислота, 85%
8,8 г/л
Кальция сульфата дигидрат
0,93 г/л
Магния сульфата гептагидрат
14,3 г/л
Калия гидроксид
4,2 г/л
Аммония сульфат
5,0 г/л
Калия сульфат
18,2 г/л
Глицерин, 100%
7,9 мл/л
PTM4 следовые соли (см. таблицу 3)
3,0 мл/л
Таблица 3
PTM4 следовые соли
Компоненты
Концентрация
Меди сульфат, пентагидрат
2,0 г/л
Натрия иодид
0,08 г/л
Натрия молибдат, дигидрат
0,2 г/л
Цинка хлорид
7,0 г/л
Железа(II) сульфат, гептагидрат
22,0 г/л
Борная кислота
0,02 г/л
Кобальта хлорид, гексагидрат
0,5 г/л
Магния сульфат, моногидрат
3,0 г/л
d-биотин
0,2 г/л
Серная кислота
1,0 мл/л
Промышленная ферментация
Цель промышленной ферментации состояла в том, чтобы произвести высокие уровни белка rNAPc2/пролин. Чтобы достичь этого, культуру выращивали до высокой клеточной плотности перед индукцией гена rNAPc2/пролин. Питательную среду для промышленной ферментации (таблица 4) приготовляли в промышленном ферментере. Данные компоненты питательной среды растворялись и перемешивались с очищенным водным USP, а затем стерилизовались паром. Резервуар охлаждали до начальной рабочей температуры 28,0±1,0°C. Затем добавляли стерилизованный фильтрацией 5% (об./об.) раствор пеногасителя KFO880 в 50%-ном метаноле. pH приводили к начальному рабочему диапазону 5,0±0,3 стерилизованным фильтрацией 28-30% гидроксидом аммония. Когда достигались начальные эксплуатационные условия, питательную среду засевали содержимым инокуляционной емкости ферментации посевного материала в отношении 1 кг инокулята на 10 кг первоначальной дозы питательной среды (массы до внесения инокулята).
Таблица 4
Питательная среда для промышленной ферментации
Компоненты
Концентрация
Фосфорная кислота, 85%
8,8 мл/л
Кальция сульфата дигидрат
0,93 г/л
Магния сульфата гептагидрат
14,3 г/л
Калия гидроксид
4,13 г/л
Калия сульфат
18,2 г/л
Аммония сульфат
5,0 г/л
Глицерин, 100%
23,8 мл/л
Соли PTM4 (см. таблицу 3)
3,0 мл/л
Промышленная ферментация состояла из четырех различных фаз: периодической подачи глицерина, подпитки глицерином, адаптации к метанолу и индукции метанолом. На всем протяжении ферментации поддерживался уровень растворенного кислорода приблизительно 35% путем добавления воздуха с постоянной скоростью и использования противодавления, и переменного перемешивания. Если требовался дополнительный кислород, как только достигалось максимальное перемешивание, в воздушный поток добавляли кислород. pH культуры в ферментере поддерживался 28-30% гидроксидом аммония. Периодически добавляли раствор пеногасителя для борьбы со вспениванием.
В первую фазу ферментации, фазу периодической подачи глицерина, формировалась биомасса. Ферментер работал при 28±2°C до исчерпания глицерина в питательной среде, что обнаруживалось по пику кислорода, вызванному прекращением метаболизма глицерина.
За ней следовала фаза подпитки глицерином, в которой 50% мас./мас. раствор глицерина подавался к культуре со скоростью 18,0±1,0 мл/кг массы до введения инокулята/час в общей сложности в течение 8,5 часов, чтобы увеличить биомассу и подавить экспрессию. В течение первых 4,5 часов данной фазы подпитки глицерином заданное значение pH культуры понижали с 5,0±0,3 до 2,9±0,1 со скоростью 0,5 единицы pH в час и поддерживали такой pH в оставшееся время ферментации, то есть в течение индуцированной метанолом фазы индукции гена. На всем протяжении данной фазы поддерживали температуру 28±2°C. Перед концом фазы подпитки глицерином WCW составляла ≥225 г/л.
В фазе адаптации к метанолу подачу глицерина прекращали и заменяли подачей метанола, которая побуждала организм производить rNAPc2. Подачу метанола (содержащего 6,0 мл/л пеногасителя KFO880) начинали с 3,0 мл/кг массы до введения инокулята. Культуру проверяли на адаптацию к метанолу, начиная с 2 часов после начала добавления метанола. Тест на адаптацию к метанолу состоял из кратковременного прекращения подачи и подтверждения пика растворенного кислорода. После первых четырех часов добавления метанола температуру снижали до 25±1°C за 2 часа. После первых четырех часов добавления метанола и после подтверждения того, что культура использовала метанол, скорость подачи метанола увеличивали на 1,0 мл/кг массы до внесения инокулята/час. Потребление метанола измеряли ежечасно, чтобы гарантировать, что метанол полностью исчерпан, в этот момент скорость подачи метанола увеличивали на 1,0 мл/кг массы до внесения инокулята/час до заключительной скорости подачи 6,0 мл/кг массы до внесения инокулята/час.
В течение фазы индукции метанолом условия процесса, соответствующие концу фазы адаптации к метанолу, поддерживали в течение всей оставшейся ферментации. Начиная приблизительно с 48 часов общего времени ферментации продукцию rNAPc2/пролин контролировали, определяя концентрацию в супернатанте жидкой питательной среды, измеренную обращенно-фазовой С8. Продукцию ферментера собирали через 144-168 часов в промышленном ферментере и после того, как концентрация rNAPc2/пролин, измеренная обращенно-фазовой С8, составляла ≥0,55 г/л. Пробу завершающей ферментации проверяли на загрязнение другими микроорганизмами.
В течение фазы адаптации к метанолу и фазы индукции метанолом поддерживали рН 2,9±0,1. Жидкая среда для ферментации имела рН 2,9±0,1.
Пример 2.2 Выделение
В данной секции описываются операции выделения для производства rNAPc2/пролин. Процесс выделения rNAPc2/пролин состоял из операции блока хроматографии во взвешенном слое, как показано на блок-схеме на фиг.3.
Ионообменная хроматография на Streamline SP XL
Цель этапа ионообменной хроматографии на Streamline SP XL состояла в том, чтобы отделить rNAPc2/пролин от фрагментов клеток и перевести продукт в буфер, подходящий для первого этапа хроматографической очистки. Среда, которая использовалась, чтобы достичь разделения, представляла собой колонку для ионообменной хроматографии во взвешенном слое со смолой Streamline SP XL (Amersham Biosciences).
Жидкую среду ферментации (при рН 2,9±0,1) разбавляли очищенной водой, пока электропроводность не достигала ≤9 мСм/см. Раствор был приведен к концентрации 150 мМ ацетата, и рН был приведен к рН 3,1±0,2, используя 17, 4М уксусную кислоту. Загрузочный раствор наносили на расширяющийся слой смолы, который уравновесили 500 мМ ацетатом натрия, рН 3,2, за которым последовал 50 мМ ацетат натрия, рН 3,2. Колонку промыли восходящим потоком 50 мМ ацетата натрия, рН 3,2, а затем 50 мМ ацетатом натрия/150 мМ NaCl, рН 3,2. Слою смолы дали отстояться и дополнительно промыли нисходящим потоком 50 мМ ацетата натрия/150 мМ NaCl, рН 3,2. rNAPc2/пролин элюировали путем введения 50 мМ ацетата натрия/350 мМ NaCl, рН 3,2, и концентрацию rNAPc2/пролин измеряли методом обращенно-фазовой С8.
При подготовке к этапу очистки хроматографией на Source 15РНЕ твердый сульфат натрия добавляли к элюату Streamline до конечной концентрации 0,85 М. рН привели к 3,1±0,2, используя 2,4 М лимонную кислоту, и было подтверждено, что электропроводность составляет 100±10 мСм/см. Приведенный в надлежащее состояние элюат Streamline профильтровали сквозь 0,45 мкм фильтры.
Пример 2.3. Очистка
В данной секции описываются процедуры очистки для производства rNAPc2/пролин. Производственный способ очистки для rNAPc2/пролин состоял из этапа гидрофобной хроматографии, этапа ультрафильтрации и диафильтрации, этапа ионообменной хроматографии, за которой следовал этап ультрафильтрации/диафильтрации, и заключительной фильтрации и заполнения лекарственным веществом rNAPc2/пролин, также называемым активным фармацевтическим ингредиентом (API), как показано на фиг.4.
Гидрофобная хроматография на Source 15PHE
Начальный этап очистки частично очищал продукт путем удаления некоторых белковых и небелковых загрязнений из rNAPc2/пролин, используя колонку со средой Source 15PHE для гидрофобной хроматографии (Amersham Biosciences).
Профильтрованный, приведенный в надлежащее состояние элюат Streamline был введен в колонку с Source 15PHE, предварительно уравновешенную 50 мМ цитратом натрия/1,1M сульфатом натрия, pH 3,0. После загрузки колонку промывали уравновешивающим буфером. Белок rNAPc2/пролин элюировался из колонки с использованием 15 объемов колонки градиентом от 1,1M до 0,3M сульфата натрия в 50 мМ цитрате натрия, pH 3,0, вслед за чем градиент удерживался 0,3M сульфатом натрия, пока УФ-поглощательная способность не возвращалась к нулевой линии. Фракции забирались по ширине пика элюирования rNAPc2/пролин и затем анализировались обращенно-фазовой С18. Фракции, содержащие rNAPc2/пролин высокой чистоты, объединяли и проверяли концентрацию УФ-пробой. pH объединенных фракций Source 15PHE был приведен к pH 5,3±0,1 добавлением 5н. NaOH.
Этап ультрафильтрации/диафильтрации #1 (UF/DF #1)
Цель UF/DF #1 состояла в том, чтобы сконцентрировать продукт и перевести rNAPc2/пролин в буфер, используемый для хроматографии на Source 15Q. Использовались фильтры для ультрафильтрации из целлюлозных волокон с порами для веществ с молекулярной массой 3 кД.
Объединенные фракции Source 15PHE с отрегулированным pH концентрировали до 2,0±0,5 г/л (что измерялось концентрацией по УФ) на мембранах UF/DF #1, которые были предварительно уравновешены 50 мМ ацетатом натрия, pH 5,3. Затем объединенные фракции подверглись диафильтрации с ≥5 объемами 50 мМ ацетата натрия, pH 5,3, и пока pH составлял 5,3±0,1, электропроводность составляла <6,0 мСм/см. Подвергнутые диафильтрации объединенные фракции UF/DF#1 фильтровали через 0,2-мкм фильтр в подготовке к загрузке колонки с Source 15Q.
Ионообменная хроматография на Source 15Q
Операция заключительного блока хроматографии удаляла большинство оставшихся белковых и небелковых загрязнений из rNAPc2/пролин с использованием колонки с Source 15Q средой для ионообменной хроматографии (Amersham Biosciences).
Профильтрованные объединенные фракции UF/DF #1 вводили в хроматографическую колонку с Source 15Q, предварительно уравновешенную 500 мМ ацетатом натрия, pH 5,3, а затем 50 мМ ацетатом натрия, pH 5,3. После загрузки колонку промывали уравновешивающим буфером с 50 мМ ацетатом натрия, pH 5,3. В колонку был введен линейный градиент от 0 до 400 мМ NaCl в 50 мМ ацетате натрия, pH 5,3, объемом 20 объемов колонки. Фракции забирались во время пика элюирования и анализировались обращенно-фазовой C18. Фракции, содержащие rNAPc2/пролин высокой чистоты, объединяли и проверяли их концентрацию УФ-пробой.
Заключительный этап ультрафильтрации/диафильтрации (заключительная UF/DF)
Цель заключительной UF/DF состояла в том, чтобы сконцентрировать продукт и перевести rNAPc2/пролин в буфер окончательной композиции. Использовались фильтры для ультрафильтрации из целлюлозных волокон с порами для веществ с молекулярной массой 3 кДа.
Объединенные Source 15Q фракции концентрировали до 12,0±0,5 г/л (что измерялось по концентрации по УФ-пробе) на мембранах заключительной UF/DF, предварительно уравновешенных буфером окончательной композиции, 65 мМ фосфатом натрия/80 мМ хлоридом натрия, pH 7,0. Объединенные фракции затем подвергали диафильтрации с ≥6 объемами буфера композиции до тех пор, пока pH равнялся 7,0±0,1.
Пример 2.4. Фильтрация в потоке и заполнение
Очищенный API rNAPc2/пролин перемещали в помещение класса 100 и фильтровали, используя 0,2-мкм фильтр Millipak, в автоклавированную 1-литровую литую бутыль Nalgene Tefzel FEP (фторированный пропилен-этилен) серии 1600 с литой незагрязненной TefzelETFE (сополимер тетрафторэтилена и этилена) завинчивающейся крышкой без прокладки. Бутыли перемещались в морозильник с температурой -20±10°C для хранения.
Основной объем API может быть повторно профильтрован и разлит, используя тот же самый способ для заключительной фильтрации. Содержимое тефлоновых бутылей FEP переносили в автоклавированную оплетенную бутыль в чистом помещении класса 100, повторно фильтровали и разливали. Относительно емкостей для хранения и крышек: и FEP, и ETFE отвечают требованиям поправки по пищевым добавкам Федерального закона США по продуктам питания, лекарственным и косметическим средствам. Материал отвечал требованиям определенного для класса VI USP.
Пример 3. Контроль в ходе процесса; методы исследования rNAPc2/пролин в ходе процесса
Условия, которые контролировались, включая критерии приемлемости хода процесса, перечислены на блок-схемах процесса (фиг. 2-4). Краткие описания методов исследования в ходе процесса перечислены ниже.
Методы исследования rNAPc2 в ходе процесса
pH. Проба контролировалась с использованием pH-метра, который был калиброван с прослеживаемыми NIST стандартами pH немедленно перед исследованием. pH пробы читался при 25±2°C.
Электропроводность. Электролитические компоненты раствора измеряли с использованием кондуктометра, который был стандартизирован стандартами электропроводности, находящимися в диапазоне измерений. Удельная электропроводность пробы читалась при ~25°C.
Влажная масса клеток. Приблизительно 1,5 мл пробы ферментации добавляли в уравновешенные микроцентрифужные пробирки и центрифугировали при 10000 об/мин в течение приблизительно 5 минут. Супернатант в каждой пробирке сливали с осадка и пробирки, содержащие твердое вещество, взвешивали. Влажная масса клеток была равна весу нетто, разделенному на первоначальный объем пробы.
Анализ на загрязнение другими микроорганизмами. Пробы заключительной жидкой среды для ферментации посевного материала и промышленной ферментации проверяли на загрязнение другими микроорганизмами, высевая по 100 мкл на каждую из девяти чашек Петри с TSA. Три чашки Петри инкубировались при трех температурах (20-25°C, 30-34°C и 35-39°C). В течение семи дней инкубации чашки Петри осматривались на микробные колонии, которые отличались от характерных для хозяина, в частности, отмечались различия в морфологии колонии, цвете и/или размере колонии. Финальные данные чтения также подверглись окрашиванию по Граму. В анализ были включены адекватные отрицательные контроли.
Анализ на обращенно-фазовой C8 (концентрация и чистота). Супернатанты проб промышленной ферментации и проб Streamline SP XL фильтровали через 0,22-мкм фильтр и затем вводили в Kromasil CS, 4,6×250 мм обращенно-фазовую колонку. Колонка была уравновешена 22%-ным ацетонитрилом, 0,1% трифторуксусной кислотой (ТФК) до введения пробы. Затем был запущен линейный градиент от 22-28% ацетонитрила в 0,1% ТФК в течение двадцати минут по 1 мл/мин, чтобы элюировать вещество rNAPc2/пролин. Стандартные разведения rNAPc2/пролин с известными концентрациями использовались, чтобы создать калибровочную кривую, основанную на линейной регрессии мг/мл rNAPc2/пролин против площади пика. Количество rNAPc2/пролин в любой пробе экстраполировали по калибровочной кривой и делили на объем введенной пробы, чтобы определить концентрацию rNAPc2/пролин в пробах. Чистоту rNAPc2/пролин вычисляли как процент от всей площади пика.
-1
-1
Концентрация по УФ. Концентрацию каждой совокупности очищенных фракций, начиная с Source 15PHE и до этапа заключительной UF/DF включительно, определяли с использованием поглощательной способности при 280 нм на соответственно откалиброванном спектрофотометре. До ввода исследуемых проб инструмент был обнулен с использованием подходящего буферного раствора. Исследуемые пробы приготавливали, разбавляя в пределах линейного диапазона (от 0,13 до 1,62 AU). Среднюю поглощательную способность при 280 нм делили на коэффициент поглощения (0,59 AU/см (мг/мл)) и умножали на коэффициент разбавления, чтобы получить концентрацию в мг/мл.
Обращенно-фазовая C18 (чистота). Чистота фракций и объединенных фракций Source 15PHE, объединенных фракций UF/DF #1, фракций и объединенных фракций Source 15Q и объединенных фракций заключительной UF/DF была в каждом случае проанализирована обращенно-фазовой C18. rNAPc2/пролин отделяли от других компонентов пробы обращенно-фазовой хроматографией с линейным градиентом. При необходимости пробы разбавляли приблизительно до 1 мг/мл в cPBS и 30 мкл вводили в обращенно-фазовую колонку Waters Symmetry C18 (частицы 5 мкм, внутренний диаметр 4,6 мм, длина 250 мм, Waters Corp., Бедфорд, Массачусетс), уравновешенную 78% подвижной фазой A (0,1% ТФУ в воде) и 22%-ной подвижной фазой B (0,1% ТФУ в ацетонитриле). Процентное содержание подвижной фазы B затем линейно увеличивали до 26% за двадцать минут, применяя скорость потока 1 мл/минуту. Пики были проверены УФ-детектором при 210 нм. Чистоту rNAPc2/пролин вычисляли, разделяя площадь пика rNAPc2/пролин на общую площадь пика на хроматограмме и выражая это отношение в процентах.
Пример 4. Способы исследования API rNAPc2/пролин
-1
-1
Внешний вид, pH и концентрация: аликвоту образца для испытания исследовали визуально на цвет, прозрачность и любые видимые посторонние включения. Проба читалась с использованием pH-метра, калиброванного прослеживаемыми NIST стандартами pH непосредственно до исследования. pH пробы читался при 25±2°C. Концентрацию пробы определяли с использованием ее поглощательной способности при 280 нм на соответственно калиброванном спектрофотометре. Прибор обнулялся с использованием разбавителя проб до ввода исследуемых проб. Для исследования приготовляли по три пробы, разбавляя в пределах линейного диапазона (от 0,13 до 1,62 AU), установленного во время проверки правильности метода. Среднюю поглощательную способность при 280 нм делили на 0,59 AU/см (мг/мл) (коэффициент ослабления) и умножали на коэффициент разбавления, чтобы получить концентрацию в мг/мл.
Пептидная карта: перед ферментативным расщеплением образец rNAPc2/пролин для испытания и эталон rNAPc2/пролин восстанавливали и алкилировали. rNAPc2/пролин денатурировали обработкой высокой концентрацией гидрохлорида гуанидина, затем восстанавливали дитиотреитолом. Восстановленные цистеины затем алкилировали иодацетамидом. Препараты восстановленного и алкилированного rNAPc2/пролин расщеплялись 2% мас./мас. трипсином в течение приблизительно 16 часов при 37±2°C. Трипсиновые пептиды от каждой расщепленной пробы белка rNAPc2/пролин затем разделялись обращенно-фазовой хроматографией, чтобы создать схему фрагментов в форме хроматограммы или «отпечатка пальцев». Профиль элюирования пробы визуально сравнивали со стандартным профилем элюирования с использованием пикового времени удерживания. Профили должны быть сопоставимыми, без новых или отсутствующих пиков.
Электрофорез в ДСН-ПААГ с Кумасси (идентичность/чистота): пробы для испытаний, эталон rNAPc2/пролин и маркер интенсивности rNAPc2/пролин разбавляли с добавлением восстановителя и без него, используя Novex NuPAGE LDS буфер для подготовки пробы (pH 8,4), до конечной концентрации 0,5, 0,5, и 0,005 мг/мл соответственно. Смесь белковых стандартов (Novex Mark 12) разбавляли согласно инструкциям изготовителя. Восстановленные пробы нагревали в течение пяти минут до 95±2°C. Восстановленные и невосстановленные пробы разделяли на отдельных гелях. Десятимикрограммовая пробная загрузка эталона и пробы для испытаний, 0,1-микрограммовая загрузка маркера интенсивности (1% пробной загрузки) и адекватная масса стандарта Mark 12 анализировались электрофорезом на готовом 4-12% акриламидном Bis-Tris геле Novex NuPAGE с pH 6,4. Гели окрашивались коллоидным Кумасси синим Novex. Чтобы подтвердить идентичность, главную полосу визуально сравнивали с эталоном и со смесью белковых стандартов. Интенсивность любых полос загрязнений визуально сравнивали с маркерной полосой 1%-ной интенсивности. Отмечали любую полосу загрязнения, превосходящую маркерную. Если полоса загрязнения, превосходящая маркерную, отсутствовала, отмечали, что чистота сопоставима с эталоном. Отмечено, что полоса rNAPc2/пролин не появлялась в области молекул ожидаемого размера. Из-за своей несферической формы rNAPc2/пролин двигался как молекула большей кажущейся молекулярной массы. В невосстановленных гелях полоса rNAPc2/пролин двигалась между стандартами 21,5 и 31 кДа, в то время как в восстановленных гелях полоса rNAPc2/пролин двигалась вместе со стандартом 21,5 кДа. (Продукты Novex - от Invitrogen Corp., Карлсбад, Калифорния).
Анализ на обращенно-фазовой C18: rNAPc2/пролин отделяли от компонентов пробы обращенно-фазовой ВЭЖХ с линейным градиентом. О чистоте rNAPc2/пролин сообщали как об отношении площади пика rNAPc2/пролин к общей площади пика на хроматограмме, выраженном в процентах. Тридцатимикролитровые объемы разбавлений пробы до приблизительно 1 мг/мл в cPBS вводили в обращенно-фазовую колонку Waters Symmetry C18 (частицы 5 мкм, 4,6 мм внутренний диаметр × 250 мм длина, Бедфорд, Массачусетс), уравновешенную 78% подвижной фазы A (0,1% ТФУ в воде) и 22% подвижной фазы B (0,1% ТФУ в ацетонитриле). Процентное содержание подвижной фазы B затем линейно увеличивали до 26% за двадцать минут, применяя скорость потока 1 мл/минуту. Пики контролировали УФ-детектором при 210 нм.
Эндотоксин: замер на эндотоксин выполняли по методу USP.
Биоактивность: rNAPc2/пролин в зависимости от концентрации удлинял время свертывания плазмы человека, инициированной добавлением тромбопластина. Противосвертывающее действие rNAPc2/пролин на свертывание плазмы человека измеряли непосредственно в автоматизированном анализе протромбинового времени (ПВ), используя тромбопластин мозга кролика (тканевой фактор, Simplastin-Excel), чтобы инициировать свертывание. И эталон rNAPc2/пролин, пробу и rNAPc2/пролин разбавляли до 1035 нМ в аналитическом буфере. Измерительный прибор (Coag-A-Mate MAX, Organon Teknika, теперь принадлежащий bioMérieux, Дарем, Северная Каролина) затем делал ряд разбавлений плазмы человека стартового препарата и измерял полученное в результате время свертывания (ВС) в секундах. Графики были построены путем подбора линейной регрессии логарифма ВС rNAPc2/пролин против концентраций разбавления. Затем вычисляли биоактивность образца для испытания как отношение наклона графика образца для испытания к наклону графика времен эталона активности эталона.
Бионагрузка: общее число анаэробов (ТАС) и общее число дрожжей/плесневых грибов (TYMC) в пробе определяли путем фильтрования двух 10-мл аликвот через отдельные 0,45 мкм мембранные фильтры из эфиров целлюлозы. Мембраны фильтров обрабатывали и одну инкубировали в чашке Петри с агаром TSA при 30-35°С в течение 48-72 ч, а другую - в чашке Петри с агаром SDA при 20-25°С в течение 5-7 дней. После периода инкубации подсчитывали колониеобразующие единицы (КОЕ) на обоих типах агара. Сообщали объединенное число КОЕ на 10 мл пробу.
Остаточная ДНК: Анализ на пороговую общую ДНК (Molecular Devices Corp., Саннивейл, Калифорния) был специфичным для одноцепочечной ДНК. Он проходил в три стадии. На реакционной стадии одноцепочечная ДНК реагировала с двумя связывающими белками в меченом реактиве. Один связывающий белок обладал высокой аффинностью, белок, связывающий одноцепочечную ДНК (SSB) от E. coli, конъюгированный к биотину. Стрептавидин, также присутствующий, плотно связывался с биотином в конъюгате SSB. Другой связывающий белок представлял собой моноклональное антитело против одноцепочечной ДНК, конюгированное к ферменту уреазе. Данные связывающие белки образовывали комплексное соединение с ДНК в растворе при 37°C.
Стадия разделения осуществлялась на Threshold Workstation. Комплексное соединение ДНК фильтровали через нитроцеллюлозную мембрану, покрытую биотином. Биотин на мембране реагировал со стрептавидином в комплексном соединении ДНК, захватывая комплексное соединение. На этапе быстрой промывки с мембраны удалялся неспецифический фермент. На стадии обнаружения палочку (содержащую нитроцеллюлозную мембрану, покрытую биотином) помещали в Threshold Reader, который содержал субстрат мочевину. Ферментная реакция изменяла местный рН раствора субстрата. Кремниевый датчик записывал изменение поверхностного потенциала, которое было пропорциональным изменению рН. В каждом участке измерения изменения поверхностного потенциала контролировались с помощью компьютера Threshold Workstation и Threshold Software. Компьютер анализировал данные кинетические измерения и количественно определял результаты, используя ранее созданный стандартный график. С помощью Threshold Software вычисляли концентрацию каждой пробы в пикограммах ДНК.
Эксклюзионная хроматография: rNAPc2/пролин отделяли от других компонентов пробы эксклюзионной хроматографией на основании различий в размере молекул. Идентичность rNAPc2/пролин подтверждали, сравнивая среднее время удерживания (RT) трех повторов пробы с пятью стандартами пригодности системы. % RT должен составлять от 97,0 до 103,0%. Чистоту rNAPc2/пролин вычисляли, деля площадь пика rNAPc2/пролин на общую площадь пика хроматограммы и выражая ее в процентах. Подготавливали разведения пробы в cPBS до номинальной концентрации приблизительно 1 мг/мл и вводили их в эксклюзионную колонку (Superdex 75 10/30, Amersham Biosciences). Поддерживали скорость потока 0,5 мл/мин. Пики контролировали УФ-детекцией при 210 нм.
Молекулярная масса по данным масс-спектрометрии: молекулярную массу определяли электрораспылительной масс-спектрометрией, используя VG Bio-Q (Quattro II Upgrade) квадрупольный масс-спектрометр (произведен Micromass, Денверс, Массачусетс, в настоящее время принадлежащей Water Corp., Бедфорд, Массачусетс). Пробу разбавляли до приблизительно 1 мг/мл водным 0,1%-ным раствором трифторуксусной кислоты и вводили в предварительно промытый Trap Cartridge для удаления солей. Затем картридж промывали через порт для ввода и смыв вводили в спектрометр.
Определение N-концевой последовательности: определяли последовательность 15 N-концевых остатков образца для испытания с использованием Procise N-Terminal Sequencing System (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния). До и после образца для испытания определяли последовательность 15 остатков калибровочного стандарта - β-лактоглобулина. Cys (цистеиновые) остатки не наблюдались на системе Procise. Полученную последовательность сравнивали с теоретической последовательностью образца для испытания.
Пример 5. Производство лекарственного продукта rNAPc2/пролин
Пример 5.1. Производство жидкого лекарственного продукта
Процесс производства жидкого лекарственного продукта rNAPc2/пролин отображен на фиг.5, блок-схеме лекарственного продукта. Замороженный API rNAPc2/пролин извлекали из -20°C хранилища и оттаивали при 2-8°C. После оттаивания API переносили в зону смешивания для объединения и смешивания. Чтобы произвести лекарственный продукт, API разбавляли 65 мМ фосфатом натрия/80 мМ NaCl, pH 7,0, до конечной концентрации 1,0±0,1 мг/мл, измеряемой концентрацией по УФ-пробе (описанной выше). Данное разбавление выполняли ступенчато с измерениями концентрации в процессе, чтобы обеспечить достижение указанной концентрации. Разбавленный API затем фильтровали через 0,2 мкм фильтр Millipore Millipak и помещали в хранилище для кратковременного хранения при 2-8°C.
3
Для этапа заполнения разбавленный API фильтровали в асептический разливочный набор через два проходных фильтра Millipore Millipak. Для определения стерильности основного объема брали пробы. Разбавленный API затем разливали в простерилизованные флаконы по 2 см, которые немедленно закрывали пробками и колпачками. Конечный объем во флаконах составил 0,6 мл.
До хранения 100% флаконов визуально осматривали в контролируемых условиях, используя осветители и фон, разработанные, чтобы подсвечивать флаконы и продукт так, чтобы дефектные флаконы или флаконы, содержащие видимые частицы, могли быть легко обнаружены и удалены из партии. Флаконы затем загружали в маркированные лотки для хранения и держали в хранилище для кратковременного хранения при 2-8°C и хранилище для длительного хранении при -20±10°C. В таблице 5 приведена композиция жидкого лекарственного продукта rNAPc2/пролин на флакон.
Таблица 5
Жидкая лекарственная композиция rNAPc2/пролин
Название вещества
Качество
Количество на флакон
rNAPc2/пролин
нет данных
0,6±0,06 мг
Натрия гидрофосфата гептагидрат
USP
6,4 мг
Натрия дигидрофосфата моногидрат
USP
2,1 мг
Натрия хлорид
USP
2,8 мг
Вода для инъекций
USP
сколько потребуется до 0,6 мл
Фосфорная кислота
NF
сколько потребуется, чтобы привести pH к 7,0±0,1
1 н. гидроксид натрия в воде для инъекций
приготовлен из гранул, соответствующих NF
сколько потребуется, чтобы привести pH к 7,0±0,1
Пример 5.2. Производство лиофилизованного лекарственного продукта
Раствор основной массы лекарственного вещества rNAPc2/пролин (с концентрацией 12±1,2 мг/мл в 65 мМ фосфате натрия/80 мМ хлориде натрия с pH 7,0±0,1) разбавляли до 3 мг/мл раствором 0,2М аланина и 25 мМ дигидрофосфата натрия, pH 7,0. Разбавленный rNAPc2/пролин затем подвергали замене буфера на раствор аланина/фосфата. Раствор rNAPc2/пролин затем разбавляли до 2 мг/мл (концентрацию измеряли УФ-пробой) раствором аланина/фосфата. Раствор 2 мг/мл rNAPc2/пролин затем разбавляли равным объемом 25 мМ фосфата натрия, 4%-ой сахарозы, pH 7,0, чтобы достигнуть концентрации rNAPc2 1,0±0,1 мг/мл. Наконец, созданный раствор 1 мг/мл rNAPc2/пролин фильтровали с использованием 0,2-мкм фильтра.
3
Для заполнения раствор rNAPc2/пролин, 1 мг/мл, фильтровали через 0,2-мкм фильтр. Затем rNAPc2/пролин разливали в отдельные простерилизованные стеклянные флаконы на 3 см и прикрывали пробками. Затем флаконы подвергали сублимационной сушке в лиофилизаторе. После лиофилизации пробки проталкивали глубже и на флаконы надевали колпачки. Лиофилизованный препарат сохраняет высокую чистоту и длительную стабильность, если лекарственный продукт NAP подвергается тяжелой температурной нагрузке, например 28 дней при 50°C. В таблице 6 перечислен состав лиофилизованного лекарственного продукта rNAPc2/пролин на флакон.
Таблица 6
Лиофилизованная лекарственная композиция rNAPc2/пролин
Название вещества
Качество
Количество на флакон
rNAPc2/пролин
нет данных
0,83 мг
Аланин
USP
7,5 мг
Натрия дигидрофосфата моногидрат
USP
2,9 мг
Сахароза
USP
3,3 мг
Вода для инъекций
USP
сколько потребуется, чтобы довести объем до 0,83 мл
1 н. гидроксид натрия в воде для инъекций
приготовлен из гранул, соответствующих NF
сколько потребуется, чтобы привести pH к 7,0±0,1
Пример 6. Прогноз изоэлектрических точек белка NAP
Ex
P
A
Sy
http://us.expasy.org/tools/protparam.html
http://www.up.univ-mrs.fr/~wabim/d_abim/compo-p.html,
Изоэлектрическую точку (pI) различных NAP определяли, чтобы подтвердить, что способ, раскрытый здесь, подходит для производства других лекарственных веществ NAP и лекарственных веществ NAP. Последовательности белков NAP, раскрытые в 5866542, обрабатывались программами прогнозирования pI. В таблице 7 представлены pI белков NAP, раскрытых в США, как было вычислено ProtParam и Atalier BioInformatique. ProtParam, в которой используется ExPASy (pert rotein nalysis stem), разработанная Swiss Institute of Bioinformatics (SIB), найдена по адресу , хозяином сервера является North Carolina Supercomputing Center (NCSS). Atalier BioInformatique (aBi) найдена по адресу  хозяином сервера является University Aix-Marseille I.
Таблица 7
Прогноз изоэлектрических точек (pI) для белков NAP
Название последовательности
pI, вычисленная ProtParam
pI, вычисленная Atalier BioInformatique
AcaNAP5
4,32
4,10
AcaNAP6
4,25
4,03
AcaNAPc2
4,31
4,10
AcaNAPc2/пролин
4,31
4,10
AcaNAP23
4,54
4,30
AcaNAP24
4,72
4,45
AcaNAP25
4,72
4,48
AcaNAP31,42,46
4,28
4,07
AcaNAP44
4,74
4,48
AcaNAP48
4,34
4,13
AceNAP5
4,49
4,25
AceNAP7
4,62
4,37
AduNAP4
4,55
4,33
HpoNAP5
7,62
7,50