МАСШТАБИРУЕМОЕ ПОЛУЧЕНИЕ ТРЕХМЕРНЫХ ЭЛАСТИЧНЫХ КОНСТРУКЦИЙ
SCALABLE PRODUCING OF THREE-DIMENSIONAL ELASTIC STRUCTURES

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к получению эластичных материалов из тропоэластина, и, в частности, формованию материалов в предпочтительные трехмерные формы, и, в частности, хотя не исключительно, материалам, которые можно использовать для терапии и восстановления тканей.
Предпосылки изобретения
Упоминание любого предшествующего уровня техники в описании не является и не должно приниматься в качестве признания или любой другой формы предположения, что этот предшествующий уровень техники формирует часть общепринятых знаний в Австралии или любой другой юрисдикции, или что этот предшествующий уровень техники, как можно было ожидать, устанавливается, понимается и рассматривается как соответствующий специалистом в данной области техники.
Существует значительный возрастающий спрос на трехмерные конструкции, которые можно использовать для восстановления тканей человека. Конструкции на основе природных биоматериалов (таких как эластин) появились в качестве ведущих кандидатов для различных областей применения тканевой инженерии благодаря их исключительным свойствам, в том числе эластичности, самосборке, долговременной стабильности и биологической активности.
Тропоэластин является субстратным материалом для образования эластина и эластичного волокна. Эластин образуют из тропоэластина при поперечном сшивании тропоэластина.
Тропоэластин растворим в большинстве водных растворов, и фактически растворим в физиологическом растворе и при физиологическом pH. Можно индуцировать осаждение тропоэластина из водного раствора путем нагревания водного раствора. Данный процесс известен как коацервация, в котором мономеры тропоэластина ассоциируются друг с другом с помощью контакта гидрофобных участков одного мономера тропоэластина с такими же участками другого мономера. Эта ассоциация мономеров является обратимой, и мономеры тропоэластина в коацерватном тропоэластине могут диссоциировать, например, путем изменения pH, концентрации соли или температуры, приводя к растворению мономеров тропоэластина коацервата в раствор и исчезновению коацервата. Это означает, что коацерват тропоэластина не достаточно прочный для образования предпочтительной трехмерной эластичной структуры, которая является стабильной в физиологических условиях.
Поперечное сшивание мономеров тропоэластина, либо в коацерватную форму, либо иным образом, приводит к ковалентному связыванию мономеров тропоэластина, которое, по-видимому, представляет ассоциацию мономеров тропоэластина, которые не могут быть диссоциированы с помощью регулирования pH, концентрации соли или температуры. Как правило, поперечно сшитые мономеры тропоэластина, как наблюдается в эластине и эластичном волокне, не могут быть диссоциированы друг от друга до тех пор, пока мономеры не гидролизованы, как описано в способах очистки эластина из природных источников предшествующего уровня техники.
Учитывая, как правило, необратимую ассоциацию мономеров тропоэластина, наблюдаемую в поперечно сшитом тропоэластине в виде эластина или эластичного волокна, поперечное сшивание тропоэластина было предложено в виде раствора для обеспечения образования предпочтительных трехмерных эластичных структур. Примеры этой технологии описаны в Miyamoto et al. (2009), WO 2008/033847 и WO 2009/099570, где электроформованный материал поперечно сшит в предпочтительные стабильные структуры. Некоторые из технологий поперечного сшивания требуют стадии нагревания, где содержащую тропоэластин композицию нагревают при образовании предпочтительной эластичной структуры. Как правило, стадия нагревания требуется для выпаривания растворителя и/или обеспечения требуемых температурных условий для реакции поперечного сшивания.
Одна проблема, связанная со способами, предусматривающими поперечное сшивание, заключается в том, что средства для поперечного сшивания не являются биосовместимыми ни в контексте устойчивости ткани к химическому составу кросс-линкеров, ни в контексте остаточного непрореагировавшего линкера, ни в контексте эластичной функции поперечно сшитого материала. Другая проблема заключается в том, что сложно образовать предпочтительную структуру из поперечно сшитого материала, поскольку после поперечного сшивания материал быстро затвердевает в тип структуры, которая не может затем соответствовать предпочтительной устойчивой форме. Таким образом, существуют ограничения касательно степени, в которой такие способы могут использоваться при образовании структур с помощью технологий формования путем разбрызгивания и т.п.
В конечном итоге, для образования стабильной предпочтительной трехмерной структуры из мономеров тропоэластина требуется соединить мономеры друг с другом таким образом, чтобы предотвратить диссоциацию друг от друга, которая бы привела к потере предпочтительной структуры или формы. Другой подход к образованию стабильной эластичной трехмерной конструкции заключается в использовании других молекул, которые, по-видимому, служат в роли линкеров для связывания одного мономера тропоэластина с другим. Примеры включают синтетические полимеры, как правило, описанные в WO 2009/099570. Другой подход заключается в напылении или покрытии нерастворимого в воде субстрата раствором растворимых эластичных мономеров, как описано в WO 2012/080706, WO 2011/127478 и WO 2007/029913. При этом последнем подходе нерастворимый субстрат, такой как нановолокнистая сеть, как описано в WO 2007/029913, или трубка, как описано в WO 2011/127478, по-видимому, связывает мономеры тропоэластина друг с другом таким образом, что они не диссоциируют в водных условиях. Неизбежная проблема этих подходов заключается в нерастворимом субстрате, который обеспечивает предпочтительную трехмерную форму, а не в молекулярных компонентах, которая оказывает влияние на весь эластичный профиль структуры и ограничивает способность образовывать трехмерные структуры.
Имеется необходимость в новых подходах к получению эластичных трехмерных структур.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение ориентируется на решение или по меньшей мере предложение улучшения одного или нескольких упомянутых выше ограничений, потребностей или проблем, и в одном варианте осуществления предлагает способ образования эластичного материала, предусматривающий:
- обеспечение раствора мономеров тропоэластина;
- нанесение раствора на поверхность;
- нагревание раствора на поверхности до температуры, достаточной для обеспечения связывания мономеров тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при контакте материала с водным раствором,
с образованием, таким образом, эластичного материала.
В другом варианте осуществления предлагается способ образования эластичного материала, предусматривающий:
- обеспечение раствора мономеров тропоэластина;
- нанесение раствора на поверхность;
- нагревание раствора на поверхности до температуры в диапазоне, определенном минимальным значением и максимальным значением,
где минимальное значение представляет собой температуру, свыше которой мономеры тропоэластина связываются друг с другом с целью образования материала, который не диссоциирует в водном растворе, и
где максимальное значение представляет собой температуру, свыше которой образуется неэластичный материал;
с образованием, таким образом, эластичного материала.
В другом варианте осуществления предлагается эластичный материал, образованный способом, описанным выше.
В другом варианте осуществления предлагается способ образования эластичного гидрогеля, предусматривающий:
- образование эластичного материала в соответствии со способом, описанным выше;
- контакт эластичного материала с водным раствором.
В другом варианте осуществления предлагается эластичный гидрогель, образованный способом, описанным выше.
В другом варианте осуществления предлагается конструкция, имплантат или устройство, в том числе эластичный материал или гидрогель, описанные выше.
В других вариантах осуществления предлагаются способы и области применения эластичного материала, гидрогеля, устройства, имплантата или конструкции, описанных выше, для восстановления и/или возобновления биологической ткани, и для применения эластичного материала в аналитических областях применения.
Настоящее изобретение будет более полно описано ниже, с упоминанием сопутствующих примеров и фигур. Необходимо понимать, однако, что последующее описание является только иллюстративным и в любом случае не должно восприниматься в качестве ограничения применимости настоящего изобретения, описанного выше.
Краткое описание фигур
Фигура 1. Термически обработанный раствор тропоэластина на водной основе. А. После нагревания до 160°C. В. После замачивания в PBS.
Фигура 2. Термически обработанный раствор тропоэластина на основе HFP. А. После нагревания до 160°C. В. После замачивания в PBS.
Фигура 3. Термически обработанный раствор тропоэластина на основе 70% этанола. А. До нагревания до 160°C. В. После нагревания до 160°C.С. Вид сбоку в PBS. D. После вымачивания в PBS.
Фигура 4. Термически обработанный раствор тропоэластина на основе HFP, применяемый для покрытия трубок. А. После нагревания до 160°C. В. После замачивания в PBS.
Фигура 5. Изображения, полученные при сканирующей электронной микроскопии, термически обработанного электроформованного тропоэластина. А. После нагревания до 160°C. В. После замачивания в PBS.
Фигура 6. Изображения, полученные при сканирующей электронной микроскопии, фибробластов, культивируемых на термически обработанном электроформованном тропоэластине.
Фигура 7. Изображения окрашенных WG биоптатов кожи, демонстрирующие устойчивость термически обработанного электроформованного тропоэластина.
Фигура 8. Пленки, изготовленные из термически обработанного раствора тропоэластина на водной основе А) после сушки при 37°C в течение 16 ч, В) после дополнительного нагревания до 160°C в течение 4 ч.
Фигура 9. Микроструктурированные пленки, изготовленные из термически обработанного раствора тропоэластина на водной основе. Паттерны желобков составляют 500 нм в глубину и 3,5 мкм в ширину.
Фигура 10. Расчет коэффициентов при 0-105% и 105-19% растяжении.
Подробное описание вариантов осуществления
Подробное описание некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения будет выполнено ниже. Несмотря на то, что настоящее изобретение будет описано в связи с вариантами осуществления, будет понятно, что целью не является ограничение настоящего изобретения этими вариантами осуществления. Напротив, настоящее изобретение предполагает охватить все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в область применения настоящего изобретения, как определено в формуле изобретения.
Специалист в данной области техники распознает многие способы и материалы, подобные или эквивалентные таковым, описанным в данном документе, которые могли бы использоваться при практическом применении настоящего изобретения. Настоящее изобретение ни в коем случае не ограничено описанными способами и материалами.
Будет понятно, что настоящее изобретение, раскрытое и описанное в данном описании, распространяется на все альтернативные комбинации двух или более отдельных особенностей, упомянутых или очевидных из текста или графических материалов. Все из этих отличающихся комбинаций составляют различные альтернативные аспекты настоящего изобретения.
Все из патентов и публикаций, упомянутых в данном документе, включены по ссылке во всей их полноте.
Настоящее описание впервые показывает, что биосовместимый материал, имеющий предпочтительные свойства, такие как прочность и эластичность, может быть синтезирован простым способом посредством нагревания тропоэластина. Соответственно, настоящее изобретение предлагает надежный, масштабируемый, дешевый путь получения биосовместимых трехмерных эластичных материалов. Настоящее изобретение соответствует высокопроизводительному получению и применению белка для получения многофункционального спектра биоматериалов (таких как пластины, трубки и волокна), которые полезны в терапевтических и аналитических областях применения in vitro. Материалы, полученные способом настоящего изобретения, обладают свойствами эластичности и прочности, которые являются отличительными признаками нативного эластина, но лишены химических примесей и токсических побочных продуктов, которые обычно встречаются в конструкциях или связаны с конструкциями, образованными при применении средств для поперечного сшивания.
Преимущественные свойства материалов настоящего изобретения описаны в настоящем описании, и, в частности, отображены в примерах, которые показывают, что материалы настоящего изобретения могут быть получены простым способом путем нагревания раствора тропоэластина, и что образованные материалы обладают необходимыми свойствами биосовместимости, прочности, упругой деформации, связывания с клетками и взаимодействий с внеклеточным матриксом, которые обеспечивают их применение в областях тканевой инженерии, а также при разработке методов анализа in vitro.
Как упомянуто выше, каркасы на основе биоматериалов использовались для областей применения тканевой инженерии в связи с их биосовместимостью и механическими свойствами. Однако способы предшествующего уровня техники синтеза трехмерных конструкций на основе биоматериалов являются неэффективными, медленными и ограниченными, а альтернативные, традиционные технологии тканевой инженерии в подавляющем большинстве случаев требуют применения медленных и дорогостоящих способов (которые требуют недель для получения конструкции), как правило, ограничены диффузией до нескольких сотен микрон толщиной, и постоянно отягчаются проблемами токсичности компонентов или побочных продуктов, которые требуют законодательного согласования.
Таким образом, в одном варианте осуществления предлагается способ образования эластичного материала, предусматривающий:
- обеспечение водного раствора мономеров тропоэластина;
- нанесение раствора на поверхность;
- нагревание раствора на поверхности до температуры, достаточной для обеспечения связывания мономеров тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при контакте материала с водным раствором,
с образованием, таким образом, эластичного материала.
Важным результатом настоящего изобретения является то, что стадия нагревания обеспечивает ассоциацию мономеров тропоэластина с такой аффинностью, что мономеры по существу не диссоциируют в случае, если агрегат контактирует с водным раствором. Нагревание приводит к образованию эластичного агрегата, массы или материала, который отличается от коацервата в такой степени, что в физиологических условиях он не диссоциирует на отдельные мономеры, и отличается от эластичного волокна или другого материала в том плане, что он не требует поперечного сшивания мономеров токсическими средствами для поперечного сшивания, такими как глутаральдегид, или применения растворителя, имеющего основной pH, для поддержания себя в твердой фазе или сохранения постоянства формы, в которой он образован. Преимущество заключается в том, что в результате способа биосовместимые мономеры более или менее постоянно собираются в постоянную структуру или форму, которые могут использоваться в областях применения тканей без опасений в отношении токсичности.
Обычно раствор нагревают до температуры, достаточной для обеспечения связывания мономеров тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при воздействии на материал физиологических условий, в частности, физиологических условий человеческого организма. В частности, агрегат не диссоциирует при физиологических условиях температуры и pH. Преимущественно агрегат не диссоциирует при следующих условиях:
температуры (от приблизительно 30 до приблизительно 45°C);
концентрации соли (концентрация от приблизительно 75 мМ до приблизительно 300 мМ);
pH (от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,0).
Поэтому этот материал является подходящим для применения не только при физиологических условиях, но также в других областях применения, таких как методы анализа in vitro, где он может подвергаться воздействию других, более жестких условий. Примечательно, что этот материал получают без осуществления любого поперечного сшивания мономеров тропоэластина и без использования каркаса для связывания с ним совокупностей пептида.
Материал, образованный способом настоящего изобретения, имеет ряд преимуществ. Во-первых, мономеры тропоэластина остаются связанными друг с другом таким образом, что эта трехмерная форма эластичного материала, образованного из агрегата, сохраняется в водной среде. Во-вторых, свойства исходного материала, которые делают тропоэластин таким полезным в областях применения тканевой инженерии (например, эластичность, прочность, упругая деформация и биосовместимость) сохраняются в конечном изделии. В-третьих, пока агрегат может поглощать воду в водном растворе с целью образования гидрогеля, в процессе этого агрегат не диссоциирует, при этом сохраняется трехмерная структура эластичного материала.
В одном варианте осуществления раствор нагревают до температуры, достаточной для обеспечения связывания мономеров тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при контакте материала с водным раствором, имеющим pH от приблизительно 6,5 до приблизительно 8,0. Как применяется в данном документе, формулировка, определяющая границы диапазона длины, такая как, например, "от 1 до 5" обозначает любое целое число от 1 до 5, т.е. 1, 2, 3, 4 и 5. Другими словами, любой диапазон, определенный двумя целыми числами, упоминаемыми в явном виде, предполагает включение и раскрытие любого целого числа, определяющего упомянутые границы, и любого целого числа в указанном диапазоне. Например, раствор может иметь pH приблизительно 6,6, приблизительно 6,7, приблизительно 6,8, приблизительно 6,9, приблизительно 7,0, приблизительно 7,1, приблизительно 7,2, приблизительно 7,3, приблизительно 7,4, приблизительно 7,5, приблизительно 7,6, приблизительно 7,7, приблизительно 7,8, приблизительно 7,9 или приблизительно 8,0.
В одном варианте осуществления раствор нагревают до температуры, достаточной для обеспечения связывания мономеров тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при контакте материала с водным раствором, имеющим температуру от приблизительно 30 до приблизительно 45°C.Например, температура может составлять приблизительно 31°C, приблизительно 32°C, приблизительно 33°C, приблизительно 34°C, приблизительно 35°C, приблизительно 36°C, приблизительно 37°C, приблизительно 38°C, приблизительно 39°C, приблизительно 40°C, приблизительно 41°C, приблизительно 42°C, приблизительно 43°C, приблизительно 44°C или приблизительно 45°C.
В одном варианте осуществления раствор нагревают до температуры, достаточной для обеспечения связывания мономеров тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при контакте материала с водным раствором, имеющим концентрацию соли от приблизительно 75 мМ до приблизительно 300 мМ. Например, концентрация соли может составлять приблизительно 75 мМ, приблизительно 80 мМ, приблизительно 85 мМ, приблизительно 90 мМ, приблизительно 95 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 110 мМ, приблизительно 120 мМ, приблизительно 130 мМ, приблизительно 140 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 160 мМ, приблизительно 170 мМ, приблизительно 180 мМ, приблизительно 190 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 210 мМ, приблизительно 220 мМ, приблизительно 230 мМ, приблизительно 240 мМ, приблизительно 250 мМ, приблизительно 260 мМ, приблизительно 270 мМ, приблизительно 280 мМ, приблизительно 290 мМ или приблизительно 300 мМ.
В одном варианте осуществления раствор нагревают до температуры, достаточной для обеспечения связывания мономеров тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при воздействии на материал физиологических условий (например, pH от приблизительно 7,2 до приблизительно 7,5, температуры от приблизительно 36 до приблизительно 37°C и концентрации соли приблизительно 150 мМ).
В соответствии со способом раствор нагревают для получения эластичного материала настоящего изобретения. Как описано выше, целью стадии нагревания является образование материала, содержащего ассоциированные мономеры тропоэластина, более конкретно, для обеспечения связывания мономеров тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при контакте эластичного материала с водным раствором. Стадию нагревания необходимо проводить при температуре, достаточной для обеспечения связывания друг с другом мономеров тропоэластина в концентрате с целью образования агрегата или материала, содержащего мономеры тропоэластина. Как правило, нагревание будут проводить при температуре приблизительно 100°C или более, например, от 100°C до 160°C. Например, температура стадии нагревания может составлять 110°C или более, 120°C или более, 130°C или более, 140°C или более, 150°C или более, 160°C или более, 170°C или более или 180°C или более. Предпочтительно, температура составляет от приблизительно 120°C до приблизительно 180°C, от приблизительно 130°C до приблизительно 170°C или от приблизительно 140°C до приблизительно 160°C. Наиболее предпочтительно, температура составляет приблизительно 160°C.
В другом варианте осуществления предлагается способ образования эластичного материала, предусматривающий:
- обеспечение раствора мономеров тропоэластина;
- нанесение раствора на поверхность;
- нагревание раствора на поверхности до температуры в диапазоне, определенном минимальным значением и максимальным значением,
где минимальное значение представляет собой температуру, свыше которой мономеры тропоэластина связываются друг с другом с целью образования материала, который не диссоциирует в водном растворе, и
где максимальное значение представляет собой температуру, свыше которой образуется неэластичный материал.
В соответствии с вариантом осуществления ниже минимального значения эластичный материал настоящего изобретения не образуется. Другими словам, то, что образуется, является растворимым в водном растворе, в частности, в физиологических условиях. Таким образом, ниже минимального значения можно получить нечто, более похожее на коацерват. Ниже максимального значения материал сохраняет эластичные свойства, описанные в данном документе. Выше максимального значения материал может терять свойства эластичности.
Подходящие отрезки времени, в течение которого необходимо проводить нагревание раствора, включают приблизительно 10 минут или более, приблизительно 20 минут или более, приблизительно 30 минут или более, приблизительно 40 минут или более, приблизительно 50 минут или более, приблизительно 1 час или более, приблизительно 2 часа или более, приблизительно 3 часа или более, приблизительно 4 часа или более или приблизительно 5 часов или более. Однако, специалисту в данной области техники будет понятно, что температура, до которой раствор необходимо нагревать, а также время, в течение которого раствор необходимо нагревать, будут варьировать в зависимости от различных факторов, таких как:
тип используемого способа нагревания (например, нагревание сухим жаром, скоростное нагревание и др.);
концентрация мономеров тропоэластина в растворе;
объем раствора;
композиция мономеров тропоэластина;
степень предпочтительной ассоциации в агрегате или эластичном материале;
относительная влажность во время нагревания.
В некоторых вариантах осуществления можно использовать нагревание от 8 до 16 часов для получения субстрата, который является более кристаллическим и в то же время сохраняет эластичные свойства.
Как правило, влажность во время нагревания может составлять от приблизительно 20 до приблизительно 80%, предпочтительно, приблизительно 35, 45, 55, 65 или 75% относительной влажности.
Описанная в данном документе стадия нагревания может приводить к образованию эластичного материала, который вызывает изменение цвета. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления можно проверять образование эластичного материала или проверять завершение стадии нагревания с помощью определения изменения цвета материала. Изменение цвета, как правило, представляет собой изменение от нормального прозрачного внешнего вида до цвета, который может быть желтым или коричневатым. Необязательным является то, что весь материал приводит к изменению цвета. Как правило, изменение цвета может уменьшаться в эластичном материале с помощью увлажнения.
Специалисту в данной области техники также будет известно то, что с помощью использования различных способов нагревания можно получать агрегаты с различными внутренними структурами. Например, скоростное нагревание включило бы воздействие на концентрат сильного источника тепла только в течение очень ограниченного количества времени. Соответственно, нагревание будет происходить в течение достаточного количества времени для ассоциирования мономеров с целью образования агрегата, однако, будет слишком быстрым для выпаривания всего растворителя, захваченного в агрегат, приводя таким образом к образованию агрегата, имеющего вакуолеобразную структуру. Также агрегат можно было бы нагреть снова таким образом, что захваченный растворитель выпаривается, заставляя таким образом вакуоли расширяться и приводя к образованию пористого агрегата. Специалисту в данной области техники также будет известно то, что растворитель может не присутствовать внутри в агрегате, однако, может присутствовать на внешней поверхности агрегата (помимо или в качестве альтернативы к растворителю, присутствующему внутри агрегата).
Одним особо важным преимуществом способа является то, что в некоторых вариантах осуществления материал, образованный способом, может быть, по-видимому, непроницаемым для газа, образуясь в результате тщательного выравнивания белковых молекул, которое сохраняется на стадии нагревания. Это обеспечивает выдувание материала в определенную форму, почти такую же, как происходит в способах выдувания стекла.
Независимо от применяемого способа нагревания, специалисту в данной области будет понятно, что агрегат, образованный с помощью нагревания раствора, может, таким образом, в различной степени включать воду. Например, агрегат может включать значительное количество воды (например, более приблизительно 60% вес/вес воды), делая его по сути гидрогелем. Альтернативно, вода может присутствовать в агрегате в количестве только приблизительно 10% вес/вес. Поскольку содержание воды влияет на эластичность, то эластичность агрегата (и, соответственно, материала) может варьировать путем варьирования содержания воды в агрегате, которое, в свою очередь, может варьировать путем изменения различных факторов, таких как количество воды, присутствующее в концентрате до нагревания, а также время, способ и температура нагревания.
В одном варианте осуществления эластичный материал имеет содержание растворителя от более приблизительно 0 до приблизительно 50% (вес/вес) материала при завершении стадии нагревания. Например, эластичный материал может иметь содержание растворителя от приблизительно 0,5% (вес/вес), приблизительно 1% (вес/вес), приблизительно 2% (вес/вес), приблизительно 3% (вес/вес), приблизительно 4% (вес/вес), приблизительно 5% (вес/вес), приблизительно 10% (вес/вес), приблизительно 15% (вес/вес), приблизительно 20% (вес/вес), приблизительно 25% (вес/вес), приблизительно 30% (вес/вес), приблизительно 35% (вес/вес), приблизительно 40% (вес/вес), приблизительно 45% (вес/вес) или приблизительно 50% (вес/вес). В одном варианте осуществления растворителем является вода.
Раствор можно нагревать путем непосредственного нагревания раствора или путем нагревания поверхности, на которую раствор помещен. В последнем варианте осуществления поверхность могут нагревать до нанесения на нее раствора, или она может находиться при комнатной температуре во время нанесения раствора и затем нагреваться до соответствующей температуры. Таким образом, в одном варианте осуществления поверхность нагревают для нагревания раствора.
Как также описано ранее, главным преимуществом способа настоящего изобретения является то, что можно образовывать биосовместимые материалы, поскольку способ не требует применения средств, таких как кросс-линкеры, для воздействия на образование полимера. Соответственно, в одном варианте осуществления способ настоящего изобретения исключает применение средств для поперечного сшивания.
В другом варианте осуществления способ может исключать применение солей или других средств для коацервации для обеспечения образования полимеров на основе тропоэластина.
В другом варианте осуществления способ может исключать применение модифицирующих pH средств, которые влияют на необратимую агрегацию мономеров тропоэластина. В частности, в одном варианте осуществления стадию нагревания проводят при pH, который не является щелочным pH, например, pH может составлять, как правило, менее 8,5 или 8,0.
Как описано ранее, материалы настоящего изобретения образуют путем нагревания раствора тропоэластина на поверхности (такой как, например, в штампованной пресс-форме). Не желая привязываться к любой теории или способу выполнения, авторы настоящего изобретения считают, что в концентрированном растворе тропоэластина мономеры тропоэластина тщательно упакованы. Эта тщательное упаковывание облегчает связывание между мономерами при нагревании раствора, приводя, таким образом, к получению эластичного материала, который не диссоциирует на отдельные мономеры тропоэластина при помещении в водную среду.
Раствор, образующий растворитель мономеров тропоэластина, может быть водным раствором или неводным раствором.
Как применяется в данном документе, выражение "водный раствор" относится к содержащему воду раствору. Водный раствор может включать другие компоненты, такие как буфера, и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, и может также включать другие органические, смешивающиеся с водой растворители, такие как метанол, этанол и гексафторпропанол, и их комбинации. Если водный раствор включает другие растворители, специалисту в данной области техники будет понятно, что вода будет являться основным компонентом растворителя, а другой(другие) растворитель(растворители) будет(будут) составлять незначительную часть компонента растворителя. Использование водного раствора является особо преимущественным, поскольку это означает, что концентрат тропоэластина, и, соответственно, материал, образуется из композиции, которая не содержит других компонентов, которые являются не биосовместимыми или токсичными, или которые могут разрушаться в организме с образованием токсичных или нежелательных побочных продуктов.
Соответственно, предпочтительно, водный раствор не содержит никаких компонентов (растворителей, буферов и др.), которые являются токсичными или не биосовместимыми и/или которые образуют токсичные или не биосовместимые продукты при использовании материала (например, в организме или в методе анализа).
Как применяется в данном документе, выражение "неводный раствор" относится к раствору, который не содержит воду или который содержит воду в виде незначительного компонента растворителя. Примеры неводных растворителей включают HFP, например, как представлено в качестве примера в данном документе. Одним преимуществом использования неводного растворителя для образования неводного раствора является то, что, как правило, растворитель может иметь более низкую точку кипения, чем вода. Это позволило бы растворителю выпариваться, как требуется при осуществлении способа, без значительного добавления тепла.
В одном варианте осуществления раствор образуют способом, предусматривающим стадии:
- обеспечения раствора мономеров тропоэластина;
- повышения концентрации мономеров тропоэластина в растворе.
Конечный продукт может упоминаться как "концентрат". Концентрат может быть получен любым известным специалисту в данной области техники подходящим способом. Считается, что в концентрате мономеры тропоэластина приводятся в тесный контакт друг с другом, таким образом, что при нагревании мономеры будут образовывать агрегат или массу, которая будет соответствовать форме поверхности, на которой она образуется, и которая не диссоциирует или испытывает значительное разрушение связей, образованных во время нагревания, при помещении агрегата в водную среду.
Концентрат можно получить выпариванием растворителя из раствора с помощью, например, нагревания раствора или продувания воздуха или азота через раствор. Таким образом, в одном варианте осуществления концентрацию мономеров тропоэластина повышают с помощью выпаривания растворителя из раствора.
Растворитель могут выпаривать из раствора при нанесении раствора на поверхность. Растворитель могут выпаривать с обеспечением концентрации мономеров тропоэластина при нагревании раствора на поверхности до температуры, обеспечивающей связывание мономеров тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при контакте материала с водным раствором.
В одном варианте осуществления концентрацию мономеров тропоэластина повышают с помощью отделения мономеров тропоэластина от растворителя. Мономеры тропоэластина можно отделить от растворителя с помощью электроформования мономеров тропоэластина. "Электроформование" представляет собой процесс, в котором волокна образуют из раствора или расплава с помощью направления электрически заряженного раствора или расплава через отверстие вдоль градиента потенциала. В одном варианте осуществления раствор имеет концентрацию мономеров тропоэластина от приблизительно 1% до приблизительно 40% (вес/объем) во время нанесения раствора на поверхность. Например, концентрация мономеров тропоэластина в растворе может составлять приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 4%, приблизительно 5%, приблизительно 6%, приблизительно 7%, приблизительно 8%, приблизительно 9%, приблизительно 10%, приблизительно 12%, приблизительно 14%, приблизительно 16%, приблизительно 18%, приблизительно 20%, приблизительно 22%, приблизительно 24%, приблизительно 26%, приблизительно 28%, приблизительно 30%, приблизительно 32%, приблизительно 34%, приблизительно 36%, приблизительно 38% или приблизительно 40% (вес/объем).
"Электроформованный материал" представляет собой любую молекулу или вещество, которое образует структуру или группу структур (таких как волокна, сети или капли) в результате процесса электроформования. Как правило, этот материал может быть природным, синтетическим или комбинацией таковых, однако, в настоящем изобретении предпочтительно применение тропоэластина.
С помощью электроформования матричный материал можно откладывать на тканевой подложке. Эта платформенная технология широко используется в тканевой инженерии для изготовления каркасов, состоящих из нано- и микроволокнистой структуры (Li et al. (2006) и Li et al. (2005)).
Процесс электроформования включает помещение текучей среды, содержащей полимер или мономер (например, раствора полимера или мономера, суспензии полимера или мономера или расплава полимера или мономера) в резервуар, оборудованный небольшим отверстием, таким как кончик иглы или пипетки, и дозировочным насосом. Один электрод высокого источника напряжения помещают в электрический контакт с текучей средой или отверстием, в то время как другой электрод помещают в электрический контакт с мишенью (обычно коллекторной сеткой или вращающейся оправкой). Во время электроформования текучую среду заряжают с помощью подачи высокого напряжения к раствору или отверстию (например, от приблизительно 3 до приблизительно 15 кВ) и затем проталкивают через небольшое отверстие с помощью дозировочного насоса, обеспечивая стабильный поток. В то время, как капля текучей среды на выходе из отверстия обычно имела бы полусферическую форму благодаря поверхностному натяжению, подача высокого напряжения заставляет иным образом каплю текучей среды полусферической формы на выходе из отверстия удлиняться для образования конической формы, известной как конус Тейлора. При достаточно высоком напряжении, подаваемом к текучей среде и/или отверстию, электростатическая сила отталкивания заряженной текучей среды преодолевает поверхностное натяжение и заряженная струя текучей среды выталкивается из кончика конуса Тейлора и ускоряется по направлению к мишени, которая обычно смещается от -2 до -10 кВ. Для направления траектории заряженной струи текучей среды может необязательно использоваться фокусирующее кольцо с подаваемым смещением (например, от 1 до 10 кВ). Когда заряженная струя текучей среды направляется к смещенной мишени, она испытывает сложное бьющее и изгибное движение. Если текучая среда представляет собой раствор или суспензию мономера или полимера, растворитель обычно выпаривается во время полета, оставляя позади полимерное или мономерное волокно на смещенной мишени. Если текучая среда представляет собой расплав полимера или мономера, расплавленный мономер/полимер охлаждается и затвердевает в полете и собирается в виде мономерного/полимерного волокна на смещенной мишени. По мере накопления полимерных/мономерных волокон на смещенной мишени, образуется пористая сетка на смещенной мишени.
Свойства электроформованной матрицы могут подгоняться с помощью различных условий электроформования. Например, если подложка находится сравнительно близко к отверстию, полученная в результате электроформованная сетка имеет склонность к содержанию волокон неравной толщины, вследствие чего некоторые области волокна имеют вид "бусинок". Однако, по мере дальнейшего продвижения подложки от отверстия, волокна сетки имеют склонность становиться более однородными по толщине. Более того, подложка может продвигаться по отношению к отверстию. В некоторых вариантах осуществления подложка движется взад-вперед равномерно и периодически, вследствие чего волокна сетки располагаются по существу параллельно друг другу. В этом случае полученная сетка может иметь более высокое сопротивление растяжению в направлении, параллельном волокнам, по сравнению с направлением, перпендикулярным волокнам. В других вариантах осуществления смещенная мишень движется по отношению к отверстию дву- или трехмерным образом для создания сетки, содержащей один или несколько структурированных слоев с подобной или различной ориентацией, толщиной волокон и т.д. В других вариантах осуществления подложка движется случайным образом по отношению к отверстию, вследствие чего сопротивление растяжению в плоскости сетки является изотропным. Свойства электроформованной матрицы могут также варьировать путем изменения величины напряжений, поданных к системе электроформования. В неограничивающем примере устройство для электроформования содержит отверстие, смещенное на 20 кВ. В другом неограничивающем примере устройство для электроформования содержит подложку, смещенную на -7 кВ. В еще одном неограничивающем примере устройство для электроформования содержит фокусирующее кольцо, смещенное на 3 кВ.
В одном варианте осуществления концентрация тропоэластина в растворе составляет от приблизительно 10 до приблизительно 350 мг/мл во время нанесения раствора на поверхность. Например, концентрация тропоэластина составляет приблизительно 15 мг/мл, приблизительно 20 мг/мл, приблизительно 25 мг/мл, приблизительно 30 мг/мл, приблизительно 35 мг/мл, приблизительно 40 мг/мл, приблизительно 45 мг/мл, приблизительно 50 мг/мл, приблизительно 55 мг/мл, приблизительно 60 мг/мл, приблизительно 65 мг/мл, приблизительно 70 мг/мл, приблизительно 75 мг/мл, приблизительно 80 мг/мл, приблизительно 85 мг/мл, приблизительно 90 мг/мл, приблизительно 95 мг/мл, приблизительно 100 мг/мл, приблизительно 110 мг/мл, приблизительно 120 мг/мл, приблизительно 130 мг/мл, приблизительно 140 мг/мл, приблизительно 150 мг/мл, приблизительно 160 мг/мл, приблизительно 170 мг/мл, приблизительно 180 мг/мл, приблизительно 190 мг/мл, приблизительно 200 мг/мл, приблизительно 210 мг/мл, приблизительно 220 мг/мл, приблизительно 230 мг/мл, приблизительно 240 мг/мл, приблизительно 250 мг/мл, приблизительно 260 мг/мл, приблизительно 270 мг/мл, приблизительно 280 мг/мл, приблизительно 290 мг/мл, приблизительно 300 мг/мл, приблизительно 310 мг/мл, приблизительно 320 мг/мл или приблизительно 340 мг/мл.
В одном варианте осуществления концентрация тропоэластина в растворе может зависеть от типа растворителя и температуры растворителя, при которой тропоэластин добавляется к нему.
Раствор или концентрат тропоэластина, который наносят на поверхность, может иметь целый ряд вязкостей. Он может содержать осажденный поперечно несшитый тропоэластин, такой как коацерват.
В некотором варианте осуществления раствор, наносимый на поверхность, может также содержать коацерватные мономеры тропоэластина.
В одном варианте осуществления предлагается способ образования эластичного материала, предусматривающий:
- обеспечение раствора мономеров тропоэластина;
- повышение концентрации мономеров тропоэластина в растворе для образования концентрата тропоэластина;
- нанесение концентрата на поверхность;
- нагревание концентрата на поверхности до температуры, достаточной для обеспечения связывания в концентрате тропоэластина друг с другом с целью образования эластичного материала, который не диссоциирует на мономеры тропоэластина при контакте материала с водным раствором,
с образованием, таким образом, эластичного материала. В одном варианте осуществления концентрат нагревают до температуры в диапазоне, определенном минимальным значением и максимальным значением;
где минимальное значение представляет собой температуру, свыше которой мономеры тропоэластина связываются друг с другом с целью образования материала, который не диссоциирует в водном растворе, и
где максимальное значение представляет собой температуру, свыше которой образуется неэластичный материал;
с образованием, таким образом, эластичного материала. Способ может включать стадию нагревания концентрата на поверхности для обеспечения потери воды от приблизительно 1 до 20% воды (вес/вес), предпочтительно приблизительно 15% воды (вес/вес) концентрата.
Тропоэластин представляет собой мономерный белок, кодируемый геномной последовательностью (или геном) эластина (ELN). По размеру мономеры тропоэластина составляют приблизительно 60-70 кДа. В тропоэластине имеется приблизительно 36 малых доменов и каждый имеет массу приблизительно 2 кДа. Внутри экзонов имеются чередующиеся гидрофобные домены, богатые неполярными аминокислотами, такими как глицин, валин, пролин, изолейцин и лейцин (домены которых часто встречаются в повторах от трех до шести пептидов, таких как GVGVP, GGVP и GVGVAP), и гидрофильные домены, богатые лизином и аланином. Гидрофильные домены часто состоят из участков лизина, отделенных двумя или тремя остатками аланина, такими как AAAKAAKAA. Помимо этого, тропоэластин заканчивается гидрофильной карбокситерминальной последовательностью, содержащей только два своих остатка цистеина. Тропоэластин не подвергается расщеплению во время сборки, и образование микрофибрилы достигается с помощью процесса самоассоциации, завершающегося коацервацией.
Агрегация тропоэластина происходит при физиологической температуре благодаря взаимодействиям между гидрофобными доменами. Этот процесс является обратимым и термодинамически регулируемым. Коацерват стабилизируется путем поперечного сшивания посредством лизилоксидазы. Затем коацерват становится нерастворимым и процесс является необратимым. Затем он конденсируется с целью образования поперечно сшитой структуры из двух остатков или четырех остатков в десмозине или изодесмозине.
В некоторых вариантах осуществления мономер тропоэластина, который используется в настоящем изобретении, содержит как гидрофильные, так и гидрофобные домены. Гидрофильные домены способствуют эластичной функции (с помощью, например, связывания с водой). Они также способствуют более широкому разнообразию биологических функций, в том числе связыванию с клетками и внеклеточным матриксом. Считается, что гидрофобные домены важны для обеспечения эластичности, которая является характеристикой материалов настоящего изобретения.
Некоторые примеры аминокислотных последовательностей, которые могут присутствовать в мономере тропоэластина, представлены ниже:
Тропоэластин для применения в настоящем изобретении может в некоторых вариантах осуществления содержать любую из описанных выше последовательностей или состоять из нее.
В одном варианте осуществления тропоэластин для применения в настоящем изобретении содержит представленную ниже последовательность или состоит из нее:
VXPGVG,
где X представляет собой любой аминокислотный остаток или отсутствие остатка,
ZXPGZG,
где Z представляет собой алифатический остаток,
VXP(I/L/V)V(I/L/V),
где (I/L/V) представляет собой изолейцин, лейцин или валин.
В одном варианте осуществления мономеры тропоэластина содержат гидрофильные и гидрофобные домены тропоэластина.
Другие подходящие последовательности тропоэластина известны из уровня техники и включают САА33627 (Homo sapiens), Р15502 (Homo sapiens), AAA42271 (Rattus norvegicus), AAA42272 (Rattus norvegicus), AAA42268 (Rattus norvegicus), AAA42269 (Rattus norvegicus), AAA80155 (Mus musculus), AAA49082 (Gallus gallus), P04985 (Bos taurus), ABF82224 (Danio rerio), ABF82222 (Xenopus tropicalis) и P11547 (Ovis aries). В предпочтительном варианте осуществления мономеры тропоэластина для применения в настоящем изобретении получены из тропоэластина человека. В одном варианте осуществления они имеют последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 27-724 элемента ААС98394 GenBank. Как указано в данном документе, настоящее изобретение также включает варианты, например, видовые варианты или полиморфные варианты тропоэластина.
Мономеры тропоэластина для применения в настоящем изобретении могут быть получены из рекомбинантных источников. Они также могут быть экстрагированы из природных источников или синтезированы (с помощью, например, методик твердофазного синтеза). Мономеры тропоэластина также имеются в продаже.
Имеется множество изоформ тропоэластина и, следовательно, точное число аминокислот, которые составляют полипептид тропоэластина, будет варьировать. Выражение "полипептид" или "полипептидная цепь" относится к полимеру аминокислот, обычно связанных вместе амидными связями. Функционально активный полимер аминокислот, как правило, относится к "белку". Настоящее изобретение также включает варианты тропоэластина, например, видовые варианты или полиморфные варианты. Настоящее изобретение предполагает охватывать все функционально активные варианты тропоэластина, которые проявляют такую же активность (т.е. биосовместимость и эластичность). Оно также включает апо- и голоформы тропоэластина, посттрансляционные модифицированные формы, а также гликозилированные или дегликозилированные производные. Такие функционально активные фрагменты и варианты включают, например, таковые, имеющие консервативные аминокислотные замены.
В одном варианте осуществления мономерами являются мономеры рекомбинантного тропоэластина, имеющие последовательность изоформы тропоэластина человека.
Выражение "функционально активный" в отношении фрагмента или варианта тропоэластина означает фрагмент или вариант (такой как аналог, производное или мутант), который способен к образованию эластичного материала, как также описано ниже. Такие варианты включают встречающиеся в природе варианты и не встречающиеся в природе варианты. Дополнения, делеции, замены и дериватизации одной или нескольких аминокислот рассматриваются до тех пор, пока модификации не приводят к потере функциональной активности фрагмента или варианта. Функционально активный фрагмент можно легко определить по укорочению аминокислотной последовательности, например, с помощью экзопептидазы, или с помощью синтеза аминокислотных последовательностей более короткой длины, а затем исследования способности образовывать эластичный материал, например, способами, представленными ниже в примерах.
При возникновении не встречающихся в природе вариаций, фрагмент может быть назван пептидомиметиком, что также находится в рамках области применения настоящего изобретения. Например, синтетические аминокислоты и их аналоги могут быть заменены одной или несколькими нативными аминокислотами, обеспечивая активность в отношении образования конструкции, как также описано ниже.
"Пептидомиметиком" является химическое соединение, которое имеет по существу ту же самую структуру и/или функциональные характеристики тропоэластина для применения в настоящем изобретении. Пептидомиметик, как правило, содержит по меньшей мере один остаток, который не синтезируется естественным путем. Не встречающиеся в природе компоненты пептидомиметических соединений могут соответствовать одному или нескольким из: а) групп сцепления остатка, отличных от встречающихся в природе сцеплений амидной связи ("пептидной связи"); b) не встречающихся в природе остатков вместо встречающихся в природе аминокислотных остатков; или с) остатков, которые индуцируют вторичную структурную мимикрию, т.е. индуцируют или стабилизируют вторичную структуру, например, бета-поворот, гамма-поворот, полипролиновый поворот, бета-складчатый слой, альфа-спиральную конформацию и т.п.
Пептидомиметики можно синтезировать с помощью множества процедур и способов, описанных в научной и патентной литературе (например, Gilman et al., al-Obeidi et al. (1998), Hruby et al. (1997) и Ostergaard & Holm (1997)).
Предпочтительно, функционально активный фрагмент составляет приблизительно 100 аминокислот в длину. Как правило, наиболее короткий фрагмент для применения в настоящем изобретении будет составлять приблизительно 10 аминокислот в длину. Таким образом, фрагмент может составлять от приблизительно 10 до приблизительно 100 аминокислот в длину. Более короткие фрагменты являются преимущественными в том случае, например, если требуется получение фрагментов с помощью синтетических методов, поскольку получение длинных фрагментов с помощью, например, твердофазного синтеза может быть сложным в осуществлении. Фрагменты, как правило, синтезируются in vitro, где желательно получать очень чистые продукты. Преимущество более длинных фрагментов заключается в том, что гидрофобная/гидрофильная природа фрагмента может быть легко тонко регулироваться, также как его эластичные свойства. Предпочтительно, функционально активный фрагмент или вариант имеет по меньшей мере приблизительно 60% идентичности с пептидом, таким как описанный выше, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% или 85% идентичности, еще более предпочтительно 90% идентичности, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности. Функционально активный фрагмент или вариант может соответствовать или иметь идентичность с прилегающей последовательностью аминокислот тропоэластина, однако, также предполагается, что функционально активный фрагмент соответствует или имеет идентичность с последовательностями аминокислот, которые группируются в пространстве в трехмерную структуру тропоэластина.
Такие функционально активные фрагменты и варианты включают, например, таковые, имеющие консервативные аминокислотные замены. Специалисты в данной области техники могут определять соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы (неограничивающие примеры описаны ниже), необходимые для достижения максимального выравнивания по полной длине сравниваемых последовательностей. При выравнивании аминокислотных последовательностей, процентная идентичность аминокислотной последовательности определенной аминокислотной последовательности А по отношению к, совместно или относительно определенной аминокислотной последовательности В (которую можно альтернативно охарактеризовать как определенную аминокислотную последовательность А, которая имеет или включает определенную процентную идентичность аминокислотной последовательности по отношению к, совместно или относительно определенной аминокислотной последовательности В) может быть рассчитана следующим образом: процентная идентичность аминокислотной последовательности = (X/Y) × 100, где X представляет собой число аминокислотных остатков, отмеченных в качестве идентичных совпадений с помощью программы выравнивания последовательностей или алгоритма выравнивания последовательностей А и В, a Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в В. Если длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, процентная идентичность аминокислотной последовательности А по отношению к В не будет равна процентной идентичности аминокислотной последовательности В по отношению к А.
При расчете процентной идентичности подсчитывают точные совпадения. Определение процентной идентичности между двумя последовательностями можно выполнить с помощью математического алгоритма. Неограничивающий пример математического алгоритма, применяемого для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin and Altschul (1990), модифицированный, как в Karlin and Altschul (1993). Такой алгоритм включен в программы BLASTN и BLASTX Altschul et al. (1990). Для получения содержащих гэпы выравниваний для сравнительных целей можно использовать Gapped BLAST (в BLAST 2.0), как описано в Altschul et al. (1997). Альтернативно, для выполнения итерационного поиска, который обнаруживает дистантные взаимодействия между молекулами, можно использовать PSI-Blast. См. Altschul et al. (1997) выше. В одном предпочтительном варианте осуществления применяется использование программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast, с параметрами по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTX и BLASTN). Выравнивание также можно выполнить вручную с помощью проверки. Другим неограничивающим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, является алгоритм ClustalW (Higgins et al. (1994)). ClustalW сравнивает последовательности и выравнивает всю аминокислотную последовательность или последовательность ДНК, и таким образом, может представить данные о консервативности последовательности всей аминокислотной последовательности. Алгоритм ClustalW используется в нескольких имеющихся в продаже пакетах программного обеспечения анализа ДНК/аминокислот, таких как модуль ALIGNX пакета программ Vector NTI (Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния). После выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью ClustaIW, можно определить процентную идентичность аминокислот. Неограничивающим примером программного обеспечения, применимого для анализа выравниваний ClustaIW, является GENEDOC™ или JalView (http://www.jalview.org/). GENEDOC™ обеспечивает определение аминокислотного (или ДНК) сходства и идентичности между многочисленными белками. Другим неограничивающим примером математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Майерса и Миллера (CABIOS 1988; 4: 11-17). Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программного обеспечения GCG Wisconsin Genetics, версия 10 (доступна от Accelrys, Inc., 9685 Scranton Rd., Сан-Диего, Калифорния, США). В одном предпочтительном варианте осуществления при оценке процентной идентичности используется программа ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей, таблица весовых остатков РАМ 120, штраф за продление гэпа 12 и штраф за внесение гэпа 4.
Выражение "консервативные аминокислотные замены" относится к замене аминокислоты другой аминокислотой того же класса, при этом классы представлены далее.
Неполярные: Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp
Незаряженные полярные: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin
Кислые: Asp, Glu
Основные: Lys, Arg, His.
Также могут выполняться другие консервативные аминокислотные замены, как указано далее.
Ароматические: Phe, Tyr, His
Донор протона: Asn, Gin, Lys, Arg, His, Trp
Акцептор протона: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gin.
В одном варианте осуществления мономеры имеют последовательность, которая имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью тропоэластина человека на протяжении по меньшей мере 50 последовательных аминокислот.
В одном варианте осуществления мономеры имеют последовательность, которая имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности с последовательностью тропоэластина человека на протяжении по меньшей мере последовательной аминокислотной последовательности, состоящей из VPGVG.
В настоящем изобретении можно применять один тип мономера тропоэластина или можно применять комбинации различных мономеров тропоэластина. Например, комбинация мономеров тропоэластина может включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10 или более различных типов мономеров тропоэластина. В другом варианте осуществления можно применять по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 или более различных мономеров тропоэластина. В другом варианте осуществления можно применять 1 или несколько, 2 или более, 3 или более, 4 или более, 5 или более, 6 или более, 7 или более, 8 или более, 9 или более или 10 или более различных типов мономеров тропоэластина.
Кроме этого, в других вариантах осуществления мономеры тропоэластина представляют собой любое число или комбинацию мономеров тропоэластина человека и/или отличного от человека вида (например, примата, коровы, лошади, овцы, козы, свиньи, собаки, кошки или грызуна).
Также следует принимать во внимание, что варьируя соотношение и/или идентичность каждого из мономеров тропоэластина, присутствующих в комбинации, можно создавать гидрогели на основе тропоэластина с желаемой эластичностью, прочностью на разрыв и формуемостью, и что прочность, эластичность, возможность поперечного сшивания и другое физическое и биохимическое поведение полимеров тропоэластина может, таким образом, варьироваться, и, возможно, контролироваться с помощью включения полиморфных форм тропоэластина в полимерные каркасы.
Кроме этого, соотношение и/или идентичность каждого из мономеров тропоэластина, присутствующих в комбинации, может варьироваться для совпадения мономеров тропоэластина, присутствующих в ткани, подлежащей восстановлению, замене или регенерации.
В одном варианте осуществления раствор наносят на поверхность путем разбрызгивания раствора на поверхности.
Выражение "поверхность", как применяется в данном документе, относится к любому объекту или устройству, которые можно использовать для получения полимерной конструкции на основе тропоэластина комплементарной формы. Например, поверхностью может быть плоская поверхность, такая как та, которую образует на себе агрегат в виде тонкой пленки, или может быть пресс-форма. Под пресс-формами, как правило, понимают объекты или устройства, которые содержат выдолбленную часть. Эту часть можно наполнять раствором мономеров тропоэластина, так что при нагревании концентрата он твердеет и располагается внутри пресс-формы, принимая свою форму. Форма может быть любой формы, предпочитаемой специалистом в данной области техники. Например, форма может быть сформована таким образом, что образованная из нее конструкция находится в форме конкретной биологической ткани, требующей восстановления и/или замещения (например, хряща, сосудистой ткани или кости), или может включать образец (каналов, борозд и т.п., как описано также ниже), который может использоваться в аналитических областях применения. Соответственно, в одном варианте осуществления поверхность предлагают в виде штампа, формы или отливки с обеспечением эластичного материла, образованного способом и подлежащего формованию в предварительно определенную форму.
В одном варианте осуществления эластичный материал может образовывать "поверхность", на которую можно наносить раствор мономеров тропоэластина в соответствии с описанным выше способом. Например, первое нанесение может приводить к образованию эластичного материала на небелковой поверхности. Второе нанесение можно выполнять на этом эластичном материале, образованном на небелковой поверхности, приводя к образованию эластичного материала на эластичном материале, полученном от первого нанесения. Способ можно повторять много раз, обеспечивая построение структур, например, путем покапельного нанесения растворов мономеров тропоэластина.
Настоящее изобретение также относится к эластичному материалу, образованному способом, предусматривающим:
- обеспечение раствора мономеров тропоэластина;
- нанесение раствора на поверхность; и
- нагревание раствора на поверхности до температуры, достаточной для обеспечения связывания мономеров тропоэластина в растворе друг с другом с целью образования агрегата мономеров тропоэластина.
Настоящее изобретение также относится к конструкции, содержащей эластичный материал, образованный с помощью тепловой ассоциации мономеров тропоэластина.
Эластичный материал может представлять собой трехмерную полимерную структуру, которую можно использовать для восстановления, усиления или замены (по меньшей мере части) живой ткани субъекта (например, для ветеринарных или медицинских (человек) областей применения). Кроме этого, эластичный материал может быть включен в трехмерную конструкцию или образовывать часть трехмерной конструкции. Например, агрегат может быть включен в виде слоя в конструкцию, которая используется для восстановления хряща, или может быть включен в стент.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что степень контакта мономеров тропоэластина в растворе до стадии нагревания также может влиять на свойства материала. Например, чем более концентрированным является раствор (с точки зрения количества тропоэластина, присутствующего в концентрате) до нагревания, тем больше мономеров тропоэластина будет взаимодействовать с целью образования агрегата, и тем менее эластичным будет полученный в результате материал. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления концентрация мономера тропоэластина может быть непосредственно связана со степенью полимеризации. Другие факторы могут также влиять на свойства материала, и таковые включают, например, тип применяемого мономера тропоэластина, температуру, при которой проводят стадию нагревания, и время, в течение которого проводят нагревание, как описано ранее.
Как упомянуто ранее, материалы, описанные в данном документе, могут быть пористыми, т.е. материалы могут иметь пористость, т.е. парциальный объем материала может состоять из открытого пространства, например, пор или других отверстий. Таким образом, пористость определяет объем пор в материале и представляет собой долю объема пор в общем объеме в виде процента от 0 до 100% (или от 0 до 1) (см., например, Coulson et al. (1978)). Определение пористости матрицы хорошо известно специалисту в данной области техники, например, с применением стандартизированных способов, таких как ртутная порометрия и адсорбция газа (такая как адсорбция азота). Как правило, пористость материала может варьировать от 0,5 до 0,99, от приблизительно 0,75 до приблизительно 0,99 или от приблизительно 0,8 до приблизительно 0,95. Предпочтительно, пористость материала составляет по меньшей мере 0,75, более предпочтительно по меньшей мере 0,8 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 0,9.
Пористые материалы могут иметь любой размер пор. Как применяется в данном документе, выражение "размер пор" относится к диаметру или эффективному диаметру поперечных сечений пор. Выражение "размер пор" также может относится к среднему диаметру или среднему эффективному диаметру поперечных сечений пор на основе измерения множества пор. Эффективный диаметр поперечного сечения, которое не является круглым, равняется диаметру круглого поперечного сечения, которое имеет такую же площадь поперечного сечения, как таковая некруглого поперечного сечения. Поры могут быть наполнены текучей средой, такой как вода, или воздухом. В некоторых вариантах осуществления поры материала могут иметь распределение размеров пор, варьирующее от приблизительно 50 нм до приблизительно 1000 мкм, от приблизительно 250 нм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 500 нм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 200 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 150 мкм, от приблизительно 15 мкм до приблизительно 125 мкм, от приблизительно 20 мкм до приблизительно 100 мкм или от приблизительно 40 мкм до приблизительно 65 мкм. В некоторых вариантах осуществления материал может иметь размер пор приблизительно 12 мкм, приблизительно 25 мкм, приблизительно 45 мкм, приблизительно 50 мкм или приблизительно 65 мкм. В некоторых вариантах осуществления материал может иметь размер пор 11,7±3,3 мкм, 23,4±5,8 мкм или 51±9 мкм.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что поры могут демонстрировать распределение размеров вокруг указанного "размера". Если не указано иное, выражение "размер", как применяется в данном документе, относится к моде распределения размера пор, т.е. значению, которое встречается наиболее часто в распределении размеров.
Поры могут быть по существу круглые в поперечном сечении или отверстии. Под "по существу круглым" подразумевается то, что отношение длин самых длинных и самых коротких перпендикулярных осей поперечного сечения поры менее или равно приблизительно 1,5. По существу круглый не требует линии симметрии. В некоторых вариантах осуществления отношение длин между самыми длинными и самыми короткими осями поперечного сечения пор менее или равно приблизительно 1,5, менее или равно приблизительно 1,45, менее или равно приблизительно 1,4, менее или равно приблизительно 1,35, менее или равно приблизительно 1,30, менее или равно приблизительно 1,25, менее или равно приблизительно 1,20, менее или равно приблизительно 1,15, менее или равно приблизительно 1,1.
Преимущественно, материалы настоящего изобретения являются эластичными. "Эластичным" материалом является материал, который возвращается к определенной форме или конформации после удаления силы (такой как сжатие или растяжение), которая была применена по отношению к нему. Его также обозначают как упруго сжимаемый и растяжимый, механически стойкий или гибкий материал сравнительно низкого гистерезиса. Этот материал можно обозначить как растяжимый, прочный на разрыв, упругий или способный к отдаче. Например, материал может иметь растяжимость от приблизительно 20 до приблизительно 400%.
3
В некоторых вариантах осуществления материал может иметь модуль упругости в диапазоне от приблизительно 1 кПа до приблизительно 10 кПа. Как применяется в данном документе, выражение "модуль упругости" относится к склонности объекта или вещества эластично деформироваться (т.е. неокончательно) при применении к нему силы. Как правило, модуль упругости объекта определяется как угол наклона его кривой давление-растяжение в области эластичной деформации. Описание того, как необходимо измерять давление и растяжение, в том числе, направления, позволяет определять многие типы модулей упругости. Модуль Юнга (Е) описывает упругость при растяжении или склонность объекта деформироваться вдоль оси при применении противодействующих сил вдоль этой оси; он определяется как отношение силы растяжения к деформации растяжения. Он часто обозначается просто как модуль упругости. Также следует принимать во внимание, что материал, образованный способом, эластично отвечает на сжатие. В некоторых вариантах осуществления материал может иметь модуль упругости в диапазоне от приблизительно 1 кПа до приблизительно 1000 кПа. В некоторых вариантах осуществления материал может иметь модуль упругости приблизительно 10 кПа, приблизительно 100 кПа или приблизительно 200 кПа.
Более высокий модуль Юнга для определенного материала в соответствии с настоящим изобретением можно получить с помощью любого из следующего:
нагревания в течение более длительного периода времени, например, от 8 до 16 часов;
добавления шелка до растворения тропоэластина и нагревания;
добавления линкеров.
Эти поправки приводят к получению материала, имеющего модуль Юнга до 10 мегапаскаль.
Материал настоящего изобретения можно добавлять в воду для образования гидрогеля. Соответственно, настоящее изобретение относится к гидрогелю, содержащему эластичный материал, где эластичный материал образуют способом, предусматривающим:
- обеспечение раствора мономеров тропоэластина;
- нанесение раствора на поверхность; и
- нагревание раствора на поверхности до температуры, достаточной для обеспечения связывания мономеров тропоэластина в концентрате друг с другом с целью образования агрегата мономеров тропоэластина,
с образованием, таким образом, эластичного материала.
Под гидрогелем, как правило, понимают сеть полимерных цепей (которые являются гидрофильными), в которых вода является дисперсной средой. Гидрогели хорошо поглощают воду - они могут содержать свыше 99,9% воды - и обладают степенью гибкости, близкой к живой ткани, благодаря своему значительному содержанию воды.
Соответственно, гидрогель, содержащий эластичный материал или агрегат настоящего изобретения, обычно будет содержать значительное количество воды. Однако, количество воды, в которую агрегат добавляют или погружают с целью образования гидрогеля, будет зависеть от факторов, таких как степень желаемой эластичности гидрогеля. Другими словами, количество воды, добавленной к агрегату, может быть количеством, едва ли достаточным для придания эластичности. Альтернативно, для получения конечного гидрогеля высокоэластичным можно добавить значительное количество воды. Специалисту в данной области техники будет понятно, что количество используемой воды также будет зависеть от эластичности самого агрегата (т.е. если агрегат является уже достаточно эластичным, потребуется добавить меньшее количество воды, чем если агрегат является менее эластичным).
Специалисту в данной области техники также будет понятно, что описания в данном документе применительно к дополнительным компонентам (например, клеткам, фармацевтически активным ингредиентам и т.п.) материалов настоящего изобретения, а также форм материалов настоящего изобретения (например, конструкций тканевой инженерии и методов анализа) также применяются к конструкциям и гидрогелям, содержащим эластичный материал настоящего изобретения.
Материалы, описанные в данном документе, можно использовать для областей применения тканевой инженерии. В некоторых вариантах осуществления тканевая инженерия преследует цель заменить, восстановить и/или регенерировать функцию ткани и/или органа или создать искусственные ткани и органы для трансплантации. Как правило, каркасы, используемые в тканевой инженерии, имитируют естественный внеклеточный матрикс (ЕСМ) и обеспечивают поддержку для адгезии, миграции и пролиферации клеток. В идеале, они обеспечивают дифференцировочную функцию, создание новых тканей и свою трехмерную организацию. Желаемые характеристики каркасов включают физические параметры, такие как механическая прочность и разрушаемость, в то время как биологические свойства включают биосовместимость и способность обеспечивать соответствующее микроокружение. Биоразрушаемые материалы являются преимущественными в некоторых областях применения (таких как регенерация тканей), поскольку после роста ткани полученные структуры создаются полностью или почти полностью из биологических компонентов.
В некоторых вариантах осуществления материалы, описанные в данном документе, можно использовать для многих областей применения тканевой инженерии, в том числе роста и/или замены сосудистых тканей, тканей сердца, мочевого пузыря, кожи, легких, сустава, сухожилия, эндокринных желез, печени, ткани почек, лимфатических узлов, поджелудочной железы, кости, хряща и других тканей. В некоторых вариантах осуществления материалы можно использовать для доставки сигналов к клеткам, выполнения функции поддерживающих структур для роста и функционирования клеток и обеспечения заполнения пространства.
Иллюстративные желаемые формы эластичного материала включают без ограничений листы, трубки и любую другую трехмерную форму. Эластичные материалы, образованные в форме листа, можно использовать при получении имплантатов, конструкций и трансплантатов для обеспечения восстановительной, заместительной и/или регенеративной терапии для тканей кожи, оболочек для процедур покрытия корней зубов, пленчатых тканей и т.п. Эластичные материалы, образованные в форме трубки, можно использовать при получении имплантатов, конструкций и трансплантатов для обеспечения восстановительной, заместительной и/или регенеративной терапии для артерий, вен, мочеточника, уретры, нервов, длинных костей и т.п. Эластичные материалы, образованные в форме любого другого трехмерного объекта, можно использовать при получении имплантатов, конструкций и трансплантатов для обеспечения восстановительной, заместительной и/или регенеративной терапии для трансплантатов органов, ремоделирования или исправления костей, зубных имплантатов или для мышечных, связочных, сухожильных и хрящевых трансплантатов.
В одном варианте осуществления эластичный материал можно образовывать в форме, обеспечивающей его применение в качестве готового лоскута, который затем можно пришить или иным образом прикрепить к поверхности. Примеры включают сердечный лоскут, кожный лоскут или лоскут, подходящий для роговицы.
Биосовместимый эластичный материал, образованный, отлитый или сформованный в виде листа, может представлять собой плоский лист или лист, имеющий изгибы, для точного совпадения контуров поврежденной, разрушенной или больной ткани или органа, подлежащих восстановлению, замене или регенерации. Листы могут быть любой геометрической формы, включая без ограничений квадраты, прямоугольники, трапеции, треугольники, круги, эллипсы и т.п.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Иллюстративные площади листов включают площади от приблизительно 1 мм до приблизительно 1 м, от приблизительно 1 мм до приблизительно 50 см, от приблизительно 1 мм до приблизительно 25 см, от приблизительно 1 мм до приблизительно 10 см, от приблизительно 1 мм до приблизительно 1 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 1 м, от приблизительно 1 см до приблизительно 500 см, от 1 см до приблизительно 250 см, от 1 см до приблизительно 200 см, от 1 см до приблизительно 150 см, до приблизительно 100 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 50 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 25 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 10 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 5 см, от приблизительно 1 смдо приблизительно 2,5 см, от приблизительно 10 мм до приблизительно 10 см, от приблизительно 0,1 см до приблизительно 10 см, от приблизительно 0,1 смдо приблизительно 1 см или любой их промежуточный диапазон. Например, диапазон площадей от 1 см до 100 см иллюстративного листа включает площади приблизительно 1 см, приблизительно 5 см, приблизительно 10 см, приблизительно 20 см, приблизительно 30 см, приблизительно 40 см, приблизительно 50 см, приблизительно 60 см, приблизительно 70 см, приблизительно 80 см, приблизительно 90 см и приблизительно 100 см.
Иллюстративные величины толщины образованного, литого или формованного эластичного материала в виде листа включают диапазон от приблизительно 0,1 мм до приблизительно 10 мм, от приблизительно 0,25 мм до приблизительно 7,5 мм, от приблизительно 0,5 мм до приблизительно 5 мм, от приблизительно 0,75 мм до приблизительно 2,5 мм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 2 мм или любой их промежуточный диапазон.
В другом варианте осуществления толщина может составлять приблизительно 0,1 мм, приблизительно 0,25 мм, приблизительно 0,5 мм, приблизительно 0,75 мм, приблизительно 1 мм, приблизительно 2 мм, приблизительно 3 мм, приблизительно 4 мм, приблизительно 5 мм, приблизительно 7,5 мм или приблизительно 10 мм или более.
Эластичный материал, образованный, отлитый или сформованный в виде трубки, может иметь любую желаемую длину, диаметр и толщину, вследствие чего размер каркаса является подходящим для восстановления, замены и/или регенерации поврежденной, разрушенной или больной ткани или органа. Иллюстративные длины трубки включают приблизительно 0,5 см, приблизительно 1 см, приблизительно 2,5 см, приблизительно 5 см, приблизительно 10 см, приблизительно 25 см, приблизительно 50 см, приблизительно 100 см, приблизительно 150 см, приблизительно 200 см, приблизительно 250 см, приблизительно 300 см, приблизительно 350 см, приблизительно 400 см, приблизительно 450 см, приблизительно 500 см или длиннее. Иллюстративные диаметры трубки включают приблизительно 0 мм (например, твердое волокно), 0,5 мм, приблизительно 1 мм, приблизительно 1,5 мм, приблизительно 2 мм, приблизительно 2,5 мм, приблизительно 3 мм, приблизительно 3,5 мм, приблизительно 4 мм, приблизительно 4,5 мм, приблизительно 5 мм, приблизительно 5,5 мм, приблизительно 6 мм, приблизительно 6,5 мм, приблизительно 7 мм, приблизительно 7,5 мм, приблизительно 8 мм, приблизительно 8,5 мм, приблизительно 9 мм, приблизительно 9,5 мм, приблизительно 10 мм, приблизительно 11 мм, приблизительно 12 мм или более мм в диаметре. В предпочтительном варианте осуществления трубка настоящего изобретения имеет диаметр от приблизительно 1 мм до приблизительно 10 мм.
Эластичный материал, образованный, отлитый или сформованный в виде других трехмерных объектов, может иметь любой желаемый объем и/или форму, вследствие чего размер каркаса является подходящим для восстановления, замены и/или регенерации поврежденной, разрушенной или больной ткани или органа.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Иллюстративные объемы трехмерных каркасов в форме составляют от приблизительно 100 мм до приблизительно 5 м, от приблизительно 100 мм до приблизительно 1000 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 1000 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 100 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 10 см, от приблизительно 10 см до приблизительно 1000 м, от приблизительно 10 см до приблизительно 100 см, от приблизительно 500 см до приблизительно 1000 см, от приблизительно 100 мм до приблизительно 5 см, от приблизительно 100 мм до приблизительно 2,5 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 5 см, от приблизительно 1 см до приблизительно 2,5 см, от приблизительно 750 см до приблизительно 1250 см, от приблизительно 850 смдо приблизительно 1150 см, от приблизительно 950 см до приблизительно 1050 см, от приблизительно 900 см до приблизительно 1000 см или любой их промежуточный диапазон. Например, диапазон объемов от 1 см до 10 смиллюстративной трехмерной формы включает объемы приблизительно 1 см, приблизительно 2 см, приблизительно 3 см, приблизительно 4 см, приблизительно 5 см, приблизительно 6 см, приблизительно 7 см, приблизительно 8 см, приблизительно 9 см и приблизительно 10 см. В одном варианте осуществления каркас может иметь объем от приблизительно 1 до приблизительно 100 микролитров.
В некоторых вариантах осуществления эластичный материал может находиться в виде пленки. Толщина пленки может варьировать от нанометров до миллиметров. Например, толщина пленки может варьировать от приблизительно 1 нм до приблизительно 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина пленки может составлять от приблизительно 1 нм до 1000 нм, от приблизительно 1 мкм до приблизительно 1000 мкм, от приблизительно 1 мм до приблизительно 1000 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина пленки может составлять от приблизительно 500 нм до приблизительно 750 мкм, от приблизительно 750 нм до приблизительно 500 мкм, от приблизительно 1000 нм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 100 мкм, от приблизительно 25 мкм до приблизительно 75 мкм. В некоторых вариантах осуществления толщина пленки варьирует от приблизительно 10 нм до приблизительно 1 мм. В некоторых вариантах осуществления толщина пленки может составлять приблизительно 50 мкм.
В некоторых вариантах осуществления эластичным материалом является пена. Пены можно получить способами, известными из уровня техники, в том числе, например, лиофильной сушки и вспенивания газа, при котором вода является растворителем или азот или другой газ является вспенивающим средством, соответственно.
В некоторых вариантах осуществления материалы можно использовать для разработки сложных устройств доставки, способных к строго определенным профилям высвобождения. Этого можно достичь посредством комбинирования лекарственных препаратов и устройств доставки лекарственных препаратов (т.е. наночастиц или микрочастиц) с материалами, описанными в данном документе, и использования их для разработки более сложных систем доставки лекарственных препаратов. Лишь в качества одного примера, материалы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать терапевтическое средство, подлежащее доставке (например, лекарственный препарат на основе малой молекулы, нуклеиновой кислоты, белка, липида и/или углевода). Такие материалы могут быть полезными для доставки лекарственного препарата к участку, который являлся мишенью для регенерации ткани. Например, материал, содержащий остеоиндуктивные клетки, который вводят субъекту с целью регенерации новой костной ткани, может дополнительно включать один или несколько морфогенетических белков кости (BMP), которые при их высвобождении могут способствовать дополнительной стимуляции роста новой костной ткани.
Эластичный материал, описанный в данном документе, можно комбинировать с другим материалом, например, биоматериалом, для образования композитного материала. Выражение "биоматериал", как применяется в данном документе, относится, как правило, к биосовместимым встречающимся в природе материалам. Иллюстративные биоматериалы включают без ограничений биополимеры, губки, шелк, децеллюляризованные ткани и желатин. Выражение "биополимер", как применяется в данном документе, относится к встречающемуся в природе полимеру или синтетическому полимеру, который является совместимым с биологической системой, или который имитирует встречающиеся в природе полимеры. Иллюстративные биополимеры включают без ограничений олигосахариды, полисахариды, такие как гликозаминогликаны, пептиды, белки, олигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, поликетиды, пептоиды, гидрогели, поли(гликоли), такие как поли(этиленгликоль), коллаген, шелк и полилактаты.
В одном варианте осуществления эластичный материал можно комбинировать с солью или с поливинилпирролидоном.
Эластичный материал настоящего изобретения может также включать другие компоненты, такие как фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и биологически активные средства (например, лекарственные препараты, витамины и минералы), для обеспечения восстановления и/или регенерации целевой ткани, и/или для обеспечения способа достижения целевой доставки биологически активных соединений. Такие компоненты можно добавлять к раствору тропоэластина до нагревания (вследствие чего они включаются в эластичный материал при его образовании) или их можно поместить в эластичный материал после его образования. Кроме этого, компоненты могут присутствовать в водном растворе, используемом для образования гидрогеля из эластичного материала. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в случае, если компоненты, подлежащие добавлению, являются нестабильными в условиях, необходимых для получения эластичного материала, компоненты необходимо добавить после того, как эластичный материал уже образован.
Любое биологически активное средство, известное специалисту в данной области техники как эффективное при диагностике, лечении или предотвращении заболевания, рассматривается в качестве терапевтического средства в контексте настоящего изобретения. Терапевтические средства включают гормоны, факторы роста, ферменты, ДНК, плазмидную ДНК, РНК, siPHK, вирусы, белки, липиды, провоспалительные молекулы, антитела, антибиотики, провоспалительные средства, антисмысловые нуклеотиды и трансформирующие нуклеиновые кислоты или их комбинации. Любое из терапевтических средств можно комбинировать до той степени, пока такая комбинация является биологически совместимой.
Подходящие факторы роста и цитокины включают без ограничений фактор стволовых клеток (SCF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), фактор стромальных клеток 1, стальной фактор, VEGF, TGF8, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), ангиопоэтины (Ang), эпидермальный фактор роста (EGF), bFGF, HNF, NGF, морфогенетический белок кости (BMP), фибробластический фактор роста (FGF), фактор роста гепатоцитов, инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), интерлейкин (IL)-3, IL-1α, IL-β, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11 и IL-13, колониестимулирующие факторы роста, тромбопоэтин, эритропоэтин, Ш-лиганд и фактор некроза опухоли α (TNFα). Другие примеры описаны в Dijke et al. (1989); Mulder et al. (1998); Ziegler et al. (1997). Подходящие гормоны включают без ограничений антимюллеров гормон (или ингибирующий фактор или гормон Мюллера), адипонектин, адренокортикотропный гормон (или кортикотропин), ангиотензиноген и ангиотензин, антидиуретический гормон (или вазопрессин, аргинин-вазопрессин), атриальный натрийуретический пептид (или атриопептин), кальцитонин, холецистокинин, кортикотропин-рилизинг-гормон, эритропоэтин, фолликулостимулирующий гормон, гастрин, грелин, глюкагон, гонадотропин-рилизинг-гормон, гормон роста-рилизинг-гормон, хорионический гонадотропин человека, плацентарный лактоген человека, гормон роста, инсулиноподобный фактор роста 1, инсулиноподобный фактор роста (или соматомедин), лептин, лютеинизирующий гормон, меланоцитстимулирующий гормон MSH, орексин, окситоцин, паратиреоидный гормон, пролактин, релаксин, секретин, соматостатин, тромбопоэтин, тиреостимулирующий гормон (или тиротропин) и тиротропин-рилизинг-гормон.
Иллюстративные фармацевтически активные соединения (например, терапевтические средства) включают без ограничений таковые, встречающиеся в Harrison et al., Physicians Desk Reference, Pharmacological Basis of Therapeutics (1990), фармакопеи Соединенных Штатов, текущем издании Goodman and Oilman The Pharmacological Basis of Therapeutics и текущем издании The Merck Index.
В другом варианте осуществления эластичный материал (или гидрогель, образованный из него) включает популяцию мультипотентных или плюрипотентных стволовых клеток (описанных также ниже), и гормоны, факторы роста, цитокины, морфогены (например, ретиноевую кислоту и др.), вещества внеклеточного матрикса (например, фибронектин, ламинин, коллаген и др.) или другие материалы (например, ДНК, вирусы, другие типы клеток и др.), которые облегчают дифференцировку клеточной популяции в процессе определенного пути развития после имплантации эластичного материала или гидрогеля в пациента. Альтернативно, или кроме этого, клетки могут дифференцироваться in vitro во время культивирования клеток с эластичным материалом или гидрогелем.
Биоактивное средство может ковалентно связываться с эластичным материалом посредством линкера. Линкер может быть расщепляемым линкером или нерасщепляемым линкером, в зависимости от применения. Как применяется в данном документе, "расщепляемый линкер" относится к линкерам, которые способны к расщеплению при различных условиях. Условия, подходящие для расщепления, могут включать без ограничений pH, УФ-излучение, ферментативную активность, температуру, гидролиз, реакции элиминации и замещения, окислительно-восстановительные реакции и термодинамические свойства связи. Во многих случаях предполагаемая природа взаимодействия конъюгации или сопряжения или желаемый биологический эффект будут определять выбор группы линкеров.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества включают любые и все растворители, дисперсные среды, разбавители или жидкие носители, дисперсные или суспензионные вспомогательные средства, поверхностно-активные средства, изотонические средства, уплотнители или эмульгаторы, консерванты, твердые связующие, замасливатели и т.п., в зависимости от конкретной желаемой дозированной формы. Gennaro (2006) раскрывает различные вспомогательные вещества, используемые при составлении фармацевтических композиций, и известные способы для их получения. Кроме случаев, когда любое традиционное вспомогательное вещество является несовместимым с веществом или его производными, например, вследствие получения любого нежелательного биологического эффекта или иного вредного взаимодействия с любым(любыми) другим(другими) компонентом(компонентами) гидрогеля, его применение рассматривается в рамках области применения настоящего изобретения.
Фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, используемые при изготовлении фармацевтических композиций, включают без ограничений инертные разбавители, диспергирующие и/или гранулирующие средства, поверхностно-активные средства и/или эмульгаторы, средства для улучшения распадаемости, связывающие средства, консерванты, буферные средства, смазывающие средства и/или масла. Такие вспомогательные вещества можно необязательно включать в содержащие тропоэластин растворы. Вспомогательные вещества, такие как красящие средства, покрывающие средства, подсластители, ароматизаторы и отдушки, могут присутствовать в растворе в соответствии с решением составителя. Общие подходы при составлении и/или изготовлении фармацевтических средств можно найти, например, в Gennaro (2006).
Количество тропоэластина и биологически активного средства, присутствующего в материале, будет в обязательном порядке зависеть от конкретного лекарственного препарата и состояния, подлежащего лечению. Специалисту в данной области техники также будет известно о соответствующих средствах и количествах, которые следует применять для лечения состояния.
Терапевтически эффективное количество материала настоящего изобретения можно доставлять пациенту и/или в организм до, одновременно и/или после диагностики заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество материала настоящего изобретения доставляют пациенту и/или в организм до, одновременно и/или после появления симптомов заболевания, нарушения и/или состояния.
Выражение "терапевтически эффективное количество", как применяется в данном документе, относится к количеству материала настоящего изобретения, которое является достаточным для лечения, смягчения, улучшения, облегчения, задержки появления, подавления прогрессирования, уменьшения тяжести и/или снижения встречаемости одного или нескольких симптомов или признаков заболевания, нарушения и/или состояния.
Как упомянуто ранее, материалы настоящего изобретения можно использовать для областей применения тканевой инженерии. В некоторых вариантах осуществления тканевая инженерия преследует цель заменить, восстановить и/или регенерировать функцию ткани и/или органа или создать искусственные ткани и органы для трансплантации. Как правило, каркасы, используемые в тканевой инженерии (например, каркасы гидрогеля), имитируют естественный ЕСМ и обеспечивают поддержку для адгезии, миграции и пролиферации клеток. В идеале, они обеспечивают дифференцировочную функцию, создание новых тканей и свою трехмерную организацию. Желаемые характеристики эластичных каркасов включают физические параметры, такие как механическая прочность и разрушаемость, в то время как биологические свойства включают биосовместимость и способность обеспечивать соответствующее микроокружение. Биоразрушаемые материалы являются преимущественными, поскольку после выращивания ткани полученные структуры создаются полностью или почти полностью из биологических компонентов.
В некоторых вариантах осуществления материалы, подлежащие использованию для доставки лекарственных препаратов, можно изменять с помощью способов, которые приводят к увеличенному времени удержания, длительной доставке лекарственных препаратов и/или целевой доставке лекарственных препаратов. Свойства материала, такие как проницаемость (например, области применения пролонгированного высвобождения), природа реакции на окружение (например, области применения пульсирующего высвобождения), поверхностная функциональность (например, покрытия PEG для скрытого высвобождения), биоразрушаемость (например, области применения биорассасывания) и наличие участков биораспознавания поверхности (например, области применения целевого высвобождения и биоадгезии), можно изменять и/или оптимизировать для областей применения контролируемой доставки лекарственных препаратов. Например, с помощью контроля длины цепи тропоэластина, композиции тропоэластина и/или концентрации тропоэластина возможно контролировать плотность материала. Контроль плотности обеспечивает, помимо прочего, контроль свойств пролонгированного высвобождения полученного материала.
В некоторых вариантах осуществления в материалы можно инкапсулировать ферменты для создания систем доставки лекарственных препаратов, которые являются чувствительными к биологическим аналитам.
Эластичные материалы, описанные в данном документе, могут дополнительно включать одну или несколько добавок. Добавками могут быть рассасывающиеся (биоразрушаемые) полимеры, маннит, крахмальный сахар, инозит, сорбит, глюкоза, лактоза, сахароза, хлорид натрия, хлорид кальция, аминокислоты, хлорид магния, лимонная кислота, уксусная кислота, гидроксил-бутандиовая кислота, фосфорная кислота, глюкуроновая кислота, глюконовая кислота, полисорбит, ацетат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия, стеарат цинка, стеарат алюминия, стеарат магния, карбонат натрия, бикарбонат натрия, гидроксид натрия, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоли, карбоксиметилцеллюлозы, метилцеллюлозы, крахмал, микрочастицы, наночастицы, апротинин, фактор XIII или их смеси. Не желая привязываться к теории, одна или несколько добавок в материале могут изменять (например, уменьшать или увеличивать) скорость разрушения материала.
В некоторых вариантах осуществления материалы, описанные в данном документе, можно использовать для областей применения культивирования тканей in vitro. В некоторых вариантах осуществления материалы, описанные в данном документе, можно использовать для разработки методов анализа, которые полезны для изучения лекарственных препаратов и биологических исследований (например, сборные массивы четко определенных материалов для лекарственного скрининга высокой пропускной способности). Например, присутствие питающих клеток (например, эндотелиальных клеток или фибробластов) в присутствие функциональных клеток (например, гепатоцитов) можно использовать для повышения сохранности функционального типа клеток. Таким образом, возможно создавать трехмерные структуры, которые имитируют нативную структуру функциональных органов, которые впоследствии можно использовать для изучения лекарственных препаратов и/или диагностических методов анализа.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что в случае, если клетки, подлежащие включению в эластичный материал, являются нестабильными в условиях, необходимых для образования эластичного материала, клетки необходимо добавить после того, как эластичный материал уже образован. Например, клетки могут присутствовать в водном растворе, используемом для образования гидрогеля из эластичного материала.
В некоторых вариантах осуществления материалы, описанные в данном документе, можно использовать для методов анализа токсичности, которые могут исследовать токсичность испытуемого вещества (например, с помощью материалов, в которые были инкапсулированы клетки печени).
В некоторых вариантах осуществления материалы, описанные в данном документе, можно использовать для получения и покрытия различных структур, таких как микрофлюидные каналы. При этом подходе стенки микроканалов можно получить из блоков конструкций, а не из более часто применяемых материалов, таких как полистирол, стекло и PDMS. Микрофлюидные каналы, полученные из блоков конструкций, могли бы быть полезными для многих целей, например, в областях применения, в которых для стенок микрофлюидного канала желаемым является притяжение и связывание клеток.
В некоторых вариантах осуществления материалы, описанные в данном документе, можно использовать для диагностических областей применения. Лишь в качестве одного примера, содержащие клетки материалы можно использовать для создания тканеподобных материалов и/или блоков материалов, которые можно использовать в методах анализа, которые исследуют присутствие одного или нескольких конкретных микроорганизмов. Например, если известно, что микроорганизмы (например, бактерии, вирусы, грибы и др.) специфически связываются с определенной тканью, то можно изготовить тканеподобные материалы, с помощью которых изучалось бы присутствие микроорганизма в образце.
Материалы, описанные в данном документе, могут быть структурированными (например, микроструктурированный эластичный материал).
Микроструктурированные материалы можно получить с применением, например, способа, предусматривающего контакт раствора тропоэластина с поверхностью формы, при этом форма содержит по меньшей мере на одной своей поверхности трехмерную отрицательную конфигурацию предварительно определенной микроструктуры, подлежащей отложению, и составную часть по меньшей мере с одной поверхностью эластичного материала, и нагревание раствора во время контакта с микроструктурированной поверхностью формы с обеспечением, таким образом, микроструктурированного эластичного материала. Эластичные материалы, полученные таким образом, содержат предварительно определенную и разработанную микроструктуру по меньшей мере на одной поверхности материала, структурная организация которого эффективна для облегчения выравнивания клеток, восстановления, роста или регенерации тканей, или является эффективной для обеспечения доставки белка или терапевтического средства. Геометрию микроструктуры можно контролировать с помощью форм соответствующей структурной организации или размера. Также микроструктуру можно охарактеризовать в отношении морфологии поверхности с помощью известных методов, таких как автоэлектронная сканирующая и атомно-силовая микроскопия.
В некоторых вариантах осуществления микроструктура находится в форме борозд или каналов. Размер (ширина) борозды может варьировать от приблизительно 500 нм до приблизительно до 500 мкм. В некоторых вариантах осуществления размер борозды может варьировать от приблизительно 1 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 100 мкм или от приблизительно 20 мкм до приблизительно 75 мкм. В некоторых вариантах осуществления размер борозды составляет приблизительно 50 мкм или приблизительно 20 мкм.
Расстояние между бороздами также можно оптимизировать для желаемого применения. Например, расстояние между бороздами может варьировать от приблизительно 500 нм до приблизительно до 500 мкм. В некоторых вариантах осуществления расстояние между бороздами может варьировать от приблизительно 1 мкм до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 10 мкм до приблизительно 100 мкм или от приблизительно 20 мкм до приблизительно 75 мкм. В некоторых вариантах осуществления расстояние между бороздами составляет приблизительно 50 мкм или приблизительно 20 мкм.
Толщина борозды может варьировать от приблизительно 250 нм до приблизительно до 500 мкм. В некоторых вариантах осуществления толщина борозды может варьировать от приблизительно 500 нм до приблизительно 250 мкм или от приблизительно 750 нм до приблизительно 1000 нм.
Как упомянуто ранее, эластичные материалы, описанные в данном документе, можно использовать в тканевой инженерии и восстановлении тканей. Как применяется в данном документе, выражение "восстановление" относится к любой коррекции, усилению, исправлению, лечению, восполнению, отзыву, обновлению, налаживанию, заделке и т.п., что возобновляет функцию. Соответственно, выражение "восстанавливать" также может обозначать корректировать, усиливать, исправлять, лечить, восполнять, отзывать, обновлять, налаживать, заделывать или иным образом возобновлять функцию.
Специалисту в данной области техники будет понятно, что гидрогели, образованные из эластичных материалов настоящего изобретения, можно использовать в тканевой инженерии, а также восстановлении тканей. Поэтому, в случаях, когда эластичный материал настоящего изобретения упомянут в этих контекстах, будет понятно, что при необходимости, гидрогели, образованные из материалов, можно использовать в дополнение, или в качестве альтернативы, к самим эластичным материалам. Специалисту в данной области техники будет понятно, что гидрогели можно образовывать из эластичных материалов непосредственно с помощью контакта эластичных материалов с физиологическими условиями посредством поглощения эластичным материалом воды из окружающей среды.
Под "лечением", "предотвращением" или "улучшением" понимается задержка или предотвращение наступления, реверсия, смягчение, улучшение, подавление, замедление или остановка прогрессирования, обострения, ухудшения или прогрессирования тяжести состояния, связанного с заболеванием или нарушением.
Эластичные материалы настоящего изобретения можно вводить с помощью любого количества и любого пути введения, эффективного для лечения. Точное требуемое количество будет варьировать от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести инфекции, конкретного гидрогеля, способа его введения, формы его активности и т.п.
В другом варианте осуществления эластичные материалы, описанные в данном документе, используются в регенеративной медицине для остеопатических областей применения, включая без ограничения черепно-лицевые, дентальные и периодонтальные области применения. В одном варианте осуществления обеспечивают конструкцию или устройство, содержащее эластичный материал (или гидрогель, образованный из эластичного материала) для применения при реконструкции и регенерации тканей ротовой полости и черепно-лицевых тканей.
В определенных вариантах осуществления эластичный материал (или гидрогель, образованный из эластичного материала) содержит один или несколько мономеров тропоэластина и коллаген человека. Полученные материалы и гидрогели разрабатываются инженерным путем в отношении желаемой топографии поверхности, пористости, прочности и эластичности. В некоторых вариантах осуществления эластичный материал или гидрогель не содержит белков или полипептидов, помимо тропоэластина.
В одном варианте осуществления эластичный материал выливают в виде листа и могут использовать в качестве регенеративной оболочки в различных клинических областях применения, например, направленной регенерации тканей (GTR) или процедурах покрытия корней. В одном варианте осуществления эластичный материал выливают в виде листа и высевают с клетками периодонтальной связки (PDL) с образованием имплантата или трансплантата, который является подходящим для применения в процедуре покрытия корней. Сразу после образования имплантата хирург трансплантирует имплантат в процедуре покрытия корней с применением способов, известных специалистам в данной области техники.
В другом варианте осуществления эластичный материал выливают в трехмерную форму для применения в качестве заполняющего материала кости. Можно получить практически любую форму, поскольку предварительно нагретый раствор находится в формуемой форме. Сразу после помещения в форму или желаемую область раствор может "твердеть" с помощью нагревания. Кроме этого материал может поддерживать уникальные клинические области применения в периодонтальной медицине для процедур направленной регенерации кости (GBR) и устранять потребность в костном наполнителе и оболочке для содержания костного трансплантата.
В определенном варианте осуществления эластичный материал (или гидрогель, образованный из материала), или имплантат, содержащий эластичный материал или гидрогель, образованный из материала, формуется в желаемую форму и содержит одну или несколько популяций клеток.
Как правило, клетки, подлежащие применению в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой любые типы клеток. Клетки должны быть жизнеспособными при включении в эластичные материалы настоящего изобретения (или гидрогели, образованные из эластичных материалов). В некоторых вариантах осуществления подходящие клетки включают без ограничений клетки млекопитающих (например, клетки человека, клетки приматов, клетки млекопитающих, клетки грызунов и др.), клетки птиц, клетки рыб, клетки насекомых, клетки растений, клетки грибов, клетки бактерий и гибридные клетки. В некоторых вариантах осуществления иллюстративные клетки включают стволовые клетки, тотипотентные клетки, плюрипотентные клетки и/или эмбриональные стволовые клетки. В некоторых вариантах осуществления иллюстративные клетки включают без ограничений первичные клетки и/или клеточные линии из любой ткани. Например, в соответствии с настоящим изобретением можно применять кардиомиоциты, миоциты, гепатоциты, кератиноциты, меланоциты, нейроны, астроциты, эмбриональные стволовые клетки, взрослые стволовые клетки, гематопоэтические стволовые клетки, гематопоэтические клетки (например, моноциты, нейтрофилы, макрофаги и др.), амелобласты, фибробласты, хондроциты, остеобласты, остеокласты, нейроны, сперматозоиды, яйцеклетки, клетки печени, эпителиальные клетки из легкого, эпителиальные клетки из желудочно-кишечного тракта, эпителиальные клетки из кишечника, печени, эпителиальные клетки из кожи и др. и/или их гибриды.
Иллюстративные клетки млекопитающих включают без ограничений эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC), клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки HeLa, клетки почки собак Madin-Darby (MDCK), клетки почки новорожденного хомяка (ВНК), клетки NS0, клетки MCF-7, клетки MDA-MB-438, клетки U87, клетки А172, клетки HL60, клетки А549, клетки SP10, клетки DOX, клетки DG44, клетки HEK 293, SHSY5Y, клетки Jurkat, клетки ВСР-1, клетки COS, клетки Vero, клетки GH3, клетки 9L, клетки 3T3, клетки МС3Т3, клетки С3Н-10Т1/2, клетки NIH-3T3 и клетки С6/36.
В некотором варианте осуществления для облегчения регенерации тканей или костей одна или несколько клеточных популяций включают клетки костного мозга, мезенхимальные стволовые клетки или преостеобластические клетки. Кроме того, можно использовать остеогенный потенциал материала/гидрогеля/имплантата в качестве единственной терапии или в комбинации с имеющимися в настоящее время в продаже продуктами костных наполнителей или первичными аутологичными костными заборами. Специалист в данной области распознает, что любой тип костных тканей можно восстановить, заменить или регенерировать с помощью изложенных выше методик.
В некоторых вариантах осуществления условия, при которых клетки включаются в эластичные материалы (или гидрогели, образованные из них), изменяют с целью максимизации жизнеспособности клеток. В некоторых вариантах осуществления условия (например, pH, ионная сила, доступность питательных веществ, температура, доступность кислорода, осмолярность и др.) окружающей среды могут нуждаться в регуляции и/или изменении с целью максимизации жизнеспособности клеток.
Жизнеспособность клеток можно измерять с помощью мониторинга одного или нескольких показателей жизнеспособности клеток. В некоторых вариантах осуществления показатели жизнеспособности клеток включают без ограничений активность внутриклеточной эстеразы, целостность плазматической мембраны, метаболическую активность, экспрессию генов и экспрессию белков. Лишь в качестве одного примера, в случае воздействия на клетки субстрата флуорогенной эстеразы (например, кальцеина AM), живые клетки флуоресцируют зеленым в результате активности внутриклеточной эстеразы, которая гидролизует субстрат эстеразы до зеленого флуоресцентного продукта. В качестве другого примера, в случае воздействия на клетки флуоресцентного красителя нуклеиновой кислоты (например, гомодимера этидия 1), мертвые клетки флуоресцируют красным, так как их плазматические мембраны являются поврежденными и, следовательно, проницаемыми для красителя с высоким сродством к нуклеиновым кислотам.
5
8
6
7
Как правило, процент клеток в материале (или гидрогеле, образованном из него) представляет собой процент, который обеспечивает образование эластичных материалов и/или гидрогелей в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления процент клеток, который является подходящим, варьирует от приблизительно 0,1% вес/вес до приблизительно 80% вес/вес, от приблизительно 1,0% вес/вес до приблизительно 50% вес/вес, от приблизительно 1,0% вес/вес до приблизительно 40% вес/вес, от приблизительно 1,0% вес/вес до приблизительно 30% вес/вес, от приблизительно 1,0% вес/вес до приблизительно 20% вес/вес, от приблизительно 1,0% вес/вес до приблизительно 10% вес/вес, от приблизительно 5,0% вес/вес до приблизительно 20% вес/вес или от приблизительно 5,0% вес/вес до приблизительно 10% вес/вес. В некоторых вариантах осуществления процент клеток в растворе, который является подходящим для образования эластичных материалов, в соответствии с настоящим изобретением составляет приблизительно 5% вес./вес. В некоторых вариантах осуществления концентрация клеток в водном растворе, который является подходящим для образования гидрогелей в соответствии с настоящим изобретением, варьирует от приблизительно 1×10 клеток/мл до 1×10 клеток/мл или от приблизительно 1×10 клеток/мл до 1×10 клеток/мл. В некоторых вариантах осуществления один эластичный материал или гидрогель, образованный из него, содержит популяцию идентичных клеток и/или типов клеток. В некоторых вариантах осуществления один эластичный материал или гидрогель, образованный из него, содержит популяцию клеток и/или типов клеток, которые не являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления один эластичный материал или гидрогель, образованный из него, может содержать по меньшей мере два различных типа клеток. В некоторых вариантах осуществления один эластичный материал или гидрогель, образованный из него, может включать 3, 4, 5, 10 или более типов клеток.
Для роста и/или сохранения клеток можно использовать любую из множества сред для культивирования клеток, в том числе сложные среды и/или бессывороточные среды для культивирования, которые способны к поддержанию роста одного или нескольких типов клеток или клеточных линий. Обычно среда для культивирования клеток содержит буфер, соли, источник энергии, аминокислоты (например, встречающиеся в природе аминокислоты, не встречающиеся в природе аминокислоты и др.), витамины и/или микроэлементы. Среды для культивирования клеток могут необязательно содержать ряд других ингредиентов, включая без ограничений источники углерода (например, встречающиеся в природе сахара, не встречающиеся в природе сахара и др.), кофакторы, липиды, сахара, нуклеозиды, компоненты животного происхождения, гидролизаты, гормоны, факторы роста, поверхностно-активные вещества, индикаторы, минералы, активаторы специфических ферментов, активаторы ингибиторов специфических ферментов, ферменты, органические соединения и/или метаболиты малых молекул. Среды для культивирования клеток, подходящие для применения в соответствии с настоящим изобретением, имеются в продаже от ряда источников, например, АТСС (Манассас, Виргиния). В некоторых вариантах осуществления для роста клеток используют одну или несколько из следующих сред: среду RPMI-1640, модифицированную по способу Дульбекко среду Игла, минимальную эссенциальную среду Игла, среду F-12K, модифицированную по способу Дульбекко среду Пскова.
Как описано выше, одним значительным преимуществом настоящего изобретения является разработка материалов (и соответствующих гидрогелей) с уникальными свойствами, например, прочностью на разрыв, эластичностью и гибкостью/жесткостью, полученными в результате комбинирования 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более отдельных изоформ тропоэластина, самих по себе имеющие уникальные свойства. Такие уникальные материалы (и соответствующие гидрогели) можно подгонять для применения в местах в организме, где уникальные свойства являются наиболее преимущественными. Например, самые прочные волокна можно использовать для восстановления мышц, самые эластичные волокна можно использовать для создания мочевых пузырей и других растяжимых органов (например, кровеносных сосудов и тканей сердца), а самые жесткие волокна можно использовать при восстановлении хряща.
Настоящее изобретение также относится к способу восстановления и/или возобновления биологической ткани, способу, предусматривающему введение терапевтически эффективного количества эластичного материала настоящего изобретения субъекту, испытывающему потребность в нем.
Настоящее изобретение также относится к применению терапевтически эффективного количества эластичного материала настоящего изобретения для восстановления и/или возобновления биологической ткани.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает эластичный материал настоящего изобретения при использовании в способе восстановления и/или возобновления биологической ткани.
Настоящее изобретение также относится к способу применения терапевтически эффективного количества эластичного материала настоящего изобретения для восстановления и/или возобновления биологической ткани. Настоящее изобретение также включает применение этого материала для получения лекарственного средства для восстановления и/или возобновления биологической ткани.
Как указано ранее, следует принимать во внимание, что в этих вариантах осуществления гидрогель, образованный из эластичного материала настоящего изобретения, можно использовать в качестве альтернативы эластичному материалу, при условии, что его затем обрабатывают соответствующим образом (например, с помощью воздействия воды) для образования гидрогеля.
Настоящее изобретение также относится к способу восстановления и/или возобновления биологической ткани, предусматривающему стадии:
- выявления субъекта, имеющего повреждение ткани; и
- введения субъекту терапевтически эффективного количества эластичного материала настоящего изобретения,
- введения субъекту терапевтически эффективного количества гидрогеля, образованного из эластичного материала настоящего изобретения, или
- введения субъекту количества эластичного материала настоящего изобретения для образования терапевтически эффективного количества гидрогеля с последующей обработкой эластичного материала настоящего изобретения для образования гидрогеля.
Настоящее изобретение также относится к способу ускорения восстановления и/или возобновления биологической ткани, предусматривающему введение субъекту, испытывающему потребность в нем:
- терапевтически эффективного количества эластичного материала настоящего изобретения,
- терапевтически эффективного количества гидрогеля, образованного из эластичного материала настоящего изобретения, или
- количества эластичного материала настоящего изобретения для образования терапевтически эффективного количества гидрогеля с последующей обработкой эластичного материала для образования гидрогеля.
Эластичные материалы настоящего изобретения и гидрогели, образованные из них, обычно разрабатывают в составе стандартных лекарственных форм для облегчения введения и однородности дозирования. Будет понятно, однако, что общая суточная доза материалов и/или гидрогелей настоящего изобретения будет выбрана при посещении врача в рамках тщательной медицинской оценки.
Специфический уровень терапевтически эффективной дозы для любого конкретного субъекта или организма будет зависеть от ряда факторов, в том числе нарушения, подлежащего лечению, и тяжести нарушения; активности используемых конкретных активных ингредиентов; используемого конкретного полимера и/или клеток; возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола и питания субъекта; времени введения, пути введения и скорости экскреции используемого конкретного активного ингредиента; продолжительности лечения; лекарственных препаратов, используемых в комбинации или случайным образом с используемым конкретным активным ингредиентом и подобными факторами, хорошо известными в областях медицины.
Материалы настоящего изобретения (и гидрогели, образованные из них) можно вводить любым способом. В некоторых вариантах осуществления материалы настоящего изобретения вводят с помощью ряда способов, в том числе прямого введения в пораженный участок. Например, материалы (и/или гидрогели, образованные из них) можно вводить локально вблизи участка, который испытывает потребность в регенерации ткани.
В некоторых вариантах осуществления эластичные материалы настоящего изобретения (и/или гидрогели, образованные из них) для получения желаемого терапевтического эффекта можно вводить так, что включенные клетки и/или терапевтические средства, подлежащие доставке, высвобождаются в концентрациях, варьирующих от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 50 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,5 мг/кг до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг или от приблизительно 1 мг/кг до приблизительно 25 мг/кг массы тела субъекта в сутки, один или несколько раз в сутки. Желаемую дозу можно доставлять, например, три раза в сутки, два раза в сутки, один раз в сутки, через сутки, через трое суток, каждую неделю, каждые две недели, каждые три недели или каждые четыре недели. В некоторых вариантах осуществления желаемую дозу можно доставлять с применением нескольких введений (например, двух, трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати и более введений).
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает "терапевтические коктейли", содержащие эластичные материалы настоящего изобретения (и/или гидрогели, образованные из них). В некоторых вариантах осуществления материалы содержат один тип клеток и необязательно терапевтическое средство. В некоторых вариантах осуществления материалы содержат несколько различных типов клеток и необязательно терапевтическое средство.
Следует принимать во внимание, что содержащие клетки эластичные материалы в соответствии с настоящим изобретением (и гидрогели, образованные из них) можно использовать в комбинированных видах терапии. Определенная комбинация видов терапии (лечебных средств или процедур) для использования в комбинированной схеме будет учитывать степень совместимости желаемых лечебных средств и/или процедур и желаемый терапевтический эффект, который необходимо достичь. Следует принимать во внимание, что используемые виды терапии могут достичь желаемого эффекта для одной и той же цели (например, гидрогель, содержащий некоторый тип клеток, подлежащий использованию для активирования роста ткани, можно вводить совместно с другим терапевтическим средством, используемым для стимуляции роста той же самой ткани), или могут достичь различных эффектов (например, контроль побочных эффектов, таких как воспаление, инфекции и др.).
Настоящее изобретение предлагает ряд наборов, содержащих один или несколько из материалов настоящего изобретения. Например, настоящее изобретение обеспечивает набор, содержащий эластичный материал и инструкции для применения. Набор может содержать несколько различных эластичных материалов. Набор может необязательно содержать мономеры тропоэластина, концентрированный раствор мономеров тропоэластина, ассоциированные мономеры тропоэластина, биологические активные соединения и т.п. Набор может содержать любой из множества дополнительных компонентов или реагентов в любой комбинации. Все из различных комбинаций не изложены в явном виде, однако каждая комбинация включена в область настоящего изобретения. Несколько иллюстративных наборов, которые обеспечены в соответствии с настоящим изобретением, описаны в следующих абзацах.
В соответствии с некоторыми вариантами настоящего изобретения набор может содержать, например, (i) раствор мономеров тропоэластина; (ii) форму и (iii) инструкции для нагревания и образования эластичного материала из раствора.
Набор может также содержать, например, (i) концентрат мономеров тропоэластина; (ii) форму и (iii) инструкции для образования эластичного материала из концентрата.
Наборы могут дополнительно содержать другие материалы, желаемые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в том числе другие буфера, разбавители, наполнители, иглы и шприцы.
Наборы обычно содержат инструкции для применения материалов настоящего изобретения. Инструкции могут, например, включать протоколы и/или описывать условия получения эластичных материалов, введения материалов субъекту, испытывающему потребность в них, получения блоков материалов и др. Наборы будут, как правило, содержать один или несколько сосудов или емкостей для того, чтобы некоторые или все из отдельных компонентов и реагентов могли располагаться отдельно. Наборы могут также содержать средство для вложения отдельных емкостей в относительно замкнутое пространство для промышленной продажи, например, пластиковую коробку, в которую можно вложить инструкции, упаковочные материалы, такие как пенополистирол и др.
Набор или "промышленное изделие" может содержать емкость и маркировку или упаковочный вкладыш на емкости или связанные с емкостью. Подходящие емкости включают, например, бутылки, флаконы, блистерные упаковки и др. Емкости можно получать из множества материалов, таких как стекло или пластик. Маркировка или упаковочный вкладыш указывает, что конструкция или композиция используется для лечения выбранного состояния. В одном варианте осуществления маркировка или упаковочный вкладыш включает инструкции для применения и указывает, что терапевтическая композиция может применяться для восстановления или регенерации ткани.
Примеры
Пример 1 - Применение воды в качестве растворителя для тропоэластина
100 мг тропоэластина растворяли в 333 мкл воды при 4°C. Для помещения капли раствора тропоэластина на предметное стекло использовали 31-калиберный шприц на 1 мл. Оставляли при 160°C на 1 минуту. Добавляли дополнительную каплю тропоэластина; перед добавлением дополнительной капли оставляли на 1 минуту. Повторяли приблизительно 10 раз. Оставляли при 160°C на 4 ч. Материал становился стекловидным и темно-коричневым (А). При помещении в PBS материал медленно увлажнялся, не растворялся и становился вполне эластичным (В).
Пример 2 - Применение HFP в качестве растворителя для тропоэластина
100 мг тропоэластина растворяли в 500 мкл 1,1,1,3,3,3-гексафторо-2-пропаноле (HFP) на ночь при комнатной температуре. Для помещения капель раствора тропоэластина на предметное стекло, расположенное на верху блока нагревания, установленного при 70°C, использовали 31-калиберный шприц на 1 мл. Оставляли при 160°C на 4 ч. Материал, по-видимому, пузырился в печи и становился стекловидным и коричневым (А). При помещении в PBS материал медленно увлажнялся, становился мягким и эластичным, по-видимому, имел пузырьки газа, захваченные внутри материала (В).
Пример 3 - Применение 70% EtOH в качестве растворителя для тропоэластина
100 мг тропоэластина растворяли в 650 мкл 70% EtOH (154 мг/мл). Для помещения капель раствора тропоэластина на предметное стекло, расположенное на верху блока нагревания, установленного при 85°C, использовали 31-калиберный шприц на 1 мл. При ожидании ~ 1 минуты между помещением каждой капли можно было создавать 3D структуру капли на капле. Оставляли в печи при 160°C на 4 ч. Материал, по-видимому, пузырился в печи и становился стекловидным и темно-коричневым.
Пример 4 - Покрытие неживого объекта
20% вес/объем тропоэластин в HFP применяли для покрытия части трубки Tygon с помощью повторного погружения в раствор. Покрытую трубку помещали при 160°C на 4 ч. Раствор тропоэластина становился твердым и стеклоподобным и не мог удаляться из трубки. Увлажняли PBS. Материал становился мягким и эластичным, он мог отслаиваться от трубки и не растворялся.
Пример 5 - Электроформование
20% (вес/объем) тропоэластин в HFP электроформовали, при условиях - скорость 1 мл/ч, ~17 см от кончика шприца до коллектора, при заземлении 20 кВ(+), объем раствора 0,1 мл, выравненные коллектором провода длиной 4 см располагали на расстоянии 2 см. Оставляли при 160°C на 24 ч. При смачивании материала PBS, он не растворялся; становился гелеобразным, сохранял форму. Контролировали с помощью SEM.
Пример 6 - Рост фибробластов кожи человека in vitro на термически обработанном электроформованном тропоэластине
5
2
20% (вес/объем) тропоэластин в HFP электроформовали, как описано ранее. Неонатальные фибробласты кожи человека (NHF8909; 5×10 клеток/лунку) высевали на термически обработанные электроформованные выравненные волокна, которые прикрепляли к пластиковым покровным стеклам внутри 6-луночных планшетов. После культивирования в течение 48 ч в DMEM + 10% FBS + Pen/Strep при 37°C в 5% CO образцы готовили для анализа в SEM. Образцы фиксировали 2% глутаральдегидом в 0,1 М какодилате натрия / 0,1 М сахарозы, постфиксировали 1% раствором осмия, обезвоживали в этаноле возрастающих концентраций, помещали на предметное стекло и покрывали золотом. Термически обработанный электроформованный тропоэластин поддерживал прикрепление, распространение и пролиферацию клеток.
Пример 7 - Подкожная имплантация термически обработанного электроформованного тропоэластина у мышей
Невыравненные электроформованные конструкции тропоэластина получали с помощью 20% тропоэластина в HFP. Образцы (невыравненные) формовали при 20 кВ в круглый коллектор на расстоянии 17 см, при скорости 1 мл/ч. На одну конструкцию использовали 0,2 мл раствора. Оставляли при 160°C на 22 ч.
Каждой мыши имплантировали одну термически обработанную невыравненную электроформованную конструкцию тропоэластина и один контроль Integra. Для каждой временной точки использовали двух мышей в течение 1 недели, 3 недель и 6 недель. Подкожную имплантацию проводили с помощью надрезов размером 10 мм, которые делали на спине каждой мыши и рассекали для создания подкожных карманов. Электроформованные каркасы или каркас Integra (Integra LifeSciences Corporation) без наружного слоя силикона вставляли в каждый карман. Затем раны закрывали шелковыми швами 6-0 и покрывали с помощью раневых повязок IV3000 (Smith & Nephew) в течение 5 дней. Карпрофен (5 мг/кг) вводили во время анестезии и затем на следующий день после операции для обезболивания. После операции каждую мышь помещали в отдельную клетку в течение первых двух дней, а затем по две мыши в клетку, с последующим свободным доступом к воде и пище. Биоптаты кожи собирали для гистологического анализа в 1-ю, 3-ю и 6-ю недели после имплантации. Эксплантированные каркасы и окружающую кожу окрашивали Verhoeff-Van Gieson (WG), демонстрируя эластичную природу имплантата.
Термически обработанный электроформованный тропоэластин сохранялся у мышей как минимум в течение 6 недель после имплантации.
Пример 8 - Термически обработанные пленки тропоэластина на водной основе
100 мг тропоэластина растворяли в 1 мл воды при 4°C. Раствор отмеряли пипеткой в лунки 8-луночного предметного стекла. Раствор концентрировали и высушивали, оставляя при 37°C на 16 ч. Образцы дополнительно нагревали до 160°C в течение 4 ч. После нагревания при 37°C каркасы были прозрачными и светло-коричневыми. После нагревания при 160°C образцы все еще были прозрачными, однако более темными по цвету.
Пример 9 - Микроструктурированные термически обработанные пленки тропоэластина на водной основе
70 мг тропоэластина растворяли в 1 мл воды при 4°C. Раствор отмеряли пипеткой в литейную форму PDMS (полидиметилсилоксана), содержащую гребни шириной 3,5 мкм и глубиной 500 нм. Раствор концентрировали и высушивали, оставляя при 37°C на 16 ч. Образцы дополнительно нагревали до 160°C в течение 4 ч. Изображения получали с помощью светового микроскопа с объективами 20х и 40х.
Литературные источники
al-Obeidi, F. et al. Peptide and peptidomimetic libraries: molecular diversity and drug design. Mol Biotechnol 9(3), 205-223 (1998).
Altschul, S. F. et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215(3), 403-410 (1990).
Altschul, S. F. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25(17), 3389-3402 (1997).
Anderson, et al. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nature Biotechnology 22, 863-866 (2004).
Anderson, et al. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials 26. 4892-4897 (2005).
rd
Coulson J. M. et. al., Chemical Engineering, 1978, volume 2, 3 Edition, Pergamon Press, 126.
Dijke et al. Growth factors for wound healing. Bio/Technology 7, 793-798 (1989).
Falsey, et al. Peptide and small molecule microarray for high throughput cell adhesion and functional assays. Bioconjugate Chemistry 12, 346-353 (2001).
Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed. (2006), Lippincott Williams & Wilkins.
Gilman et al. (eds) Organic Syntheses Collective Volumes, John Wiley & Sons, Inc., NY.
th
Harrison, T. R. et al. (eds) Harrison's Principles of Internal Medicine, 13 Edition, McGraw-Hill N.Y., NY.
Higgins, D. G. et al. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res 22(22), 4673-4680 (1994).
Hruby, V. J. et al. Synthesis of oligopeptide and peptidomimetic libraries. Curr Opin Chem Biol 1(1), 114-119(1997).
Karlin, S. & Altschul, S. F. Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc Natl Acad Sci USA 87(6), 2264-2268 (1990).
Karlin, S. & Altschul, S. F. Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences. Proc Natl Acad Sci USA 90(12), 5873-5877 (1993).
Miyamoto, K. et al. Creation of cross-linked electrospun isotypic-elastin fibers controlled cell-differentiation with new cross-linker. I'nt J Biol Macromolecules 45, 33-41 (2009).
Li, M. et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials 26(30), 5999-6008 (2005).
Li, M. et al. Electrospinning polyaniline-contained gelatin nanofibers for tissue engineering applications. Biomaterials 27(13), 2705-2715 (2006).
Liu, et al. Nanostructured materials designed for cell binding and transduction. Biomacromolecules 2(2), 362-368 (2001).
Mulder GD, Haberer PA, Jeter KF (eds). Clinicians' Pocket Guide to Chronic Wound Repair. 4th ed. Springhouse, PA: Springhouse Corporation; 1998:85.
Orner, et al. Arrays for the combinatorial exploration of cell adhesion. Journal of the American Chemical Society 126, 10808-10809 (2004).
Ostergaard, S. & Holm, A. Peptomers: a versatile approach for the preparation of diverse combinatorial peptidomimetic bead libraries. Mol Divers 3(1), 17-27 (1997).
th
Pharmacological Basis of Therapeutics, 8 Edition, Goodman and Gilman, 1990.
th
Physicians Desk Reference, 50 Edition, 1997, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.
Taurniare, G. et al. Polymer microarrays for cellular adhesion. Chem Comm 2118-2120 (2006).
United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP XII NF XVII, 1990.
Ziegler T.R., Pierce, G.F., and Herndon, D.N., 1997, International Symposium on Growth Factors and Wound Healing: Basic Science & Potential Clinical Applications (Boston, 1995, Serono Symposia USA), Publisher: Springer Verlag.