Сравнительная оценка эффективности экспрессии трансгена в составе модельных генетических конструкций разной структуры

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 577.21.08

Комиссаров А.А., Карасева М.А., Сафина Д.Р., Рощина М.П., Беднова О.П., Казаков А.А.,

Демкин В.В., Демидюк И.В.

сравнительная оценка эффективности экспрессии трансгена в составе модельных генетических конструкций разной структуры

ФГБУН Институт молекулярной генетики Российской академии наук, 123182, Москва, Россия

Сравнение эффективности экспрессии трансгена в составе генетических конструкций различной структуры является важным этапом при создании новых и оптимизации существующих экс-прессионных векторов. Однако в настоящее время не существует универсального подхода для решения этой задачи. В данной работе предложена экспериментальная система для сравнительной оценки экспрессионной эффективности, обеспечиваемой различающимися по размеру и топологии невирусными генетическими векторами в культивируемых клетках человека. Система основана на использовании гена зеленого флуоресцентного белка в качестве репортера, проточной цитофлуориметрии для определения уровня его экспрессии и количественной ПЦР для подбора адекватных условий трансфекции. Предложенная система опробована на двух модельных конструкциях, представляющих собой линейную молекулу ДНК и плазмиду. Ключевые слова: экспрессионный вектор; генетическая конструкция; эффективность экспрессии; трансфекция; зеленый флуоресцентный белок.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-3-115-120.

Введение

Использование рекомбинантных конструкций для экспрессии генов в клетках животных и человека является стандартным подходом молекулярной биологии. Этот подход сегодня востребован не только при проведении научных исследований, но также находит применение в биотехнологии и медицине [1, 2]. Широкое распространение получили экспрессионные конструкции, созданные на основе вирусов. Основным достоинством таких векторов является способность обеспечивать одновременно эффективные доставку и экспрессию трансгена. В то же время они имеют ряд существенных недостатков, среди которых в первую очередь следует отметить небезопасность, например, при использовании в генной терапии, и сложность манипулирования с вирусными системами [3]. В связи с этим во многих приложениях более перспективными представляются векторы невирусной природы. Однако для доставки в клетки они требуют использования специальных средств, эффективность которых в настоящее время гораздо ниже по сравнению с вирусами [4]. Несмотря на это, высокий потенциал невирусных векторов стимулирует проведение большого числа работ, направленных на совершенствование как собственно векторов, так и средств их доставки.

При разработке новых невирусных векторов возникает необходимость сравнения эффективности их функционирования с уже существующими. Для количественной оценки обеспечиваемого конструкциями накопления продуктов экспрессии трансгенов могут быть успешно использованы различные методы [5]. При этом для корректного сравнения следует учитывать количество копий векторов в клетке. С одной стороны, это необходимо для нормировки экспрессионной эффективности. С другой стороны, сравнение должно проводиться с учетом того, что при высоких дозах гена наступает «насыщение» аппаратов транскрипции и/или трансляции [6, 7].

Невирусные векторы могут существенно различаться по своей структуре. Так, например, сегодня в качестве экспрессионных векторов применяются плазмиды

[8], конкатемерные ДНК [9], искусственные хромосомы [13], эписомные реплицирующиеся векторы [14, 15], ми-никольцевые ДНК и линейные ДНК [10—12]. Заданные количества векторов, имеющих разные размер и/или топологию, могут быть доставлены в клетки с помощью микроинъекции. К сожалению, этот метод требует наличия дорогостоящего оборудования и к тому же характеризуется высокой трудоемкостью, поэтому используется достаточно редко. Наиболее часто для введения ДНК применяют химические трансфицирующие агенты (ТА), которые более дешевы и подходят для высокопроизводительного скрининга [4, 16]. Однако эффективность доставки при использовании этих ТА часто зависит от размера и топологии ДНК [17], что, очевидно, приводит к необходимости прикладывать дополнительные усилия для выравнивания условий трансфекции и контроля количества вектора в клетке.

В ходе проведенного анализа литературы нам не удалось обнаружить учитывающего перечисленные выше аспекты метода сравнения экспрессионной эффективности невирусных векторов разной структуры при использовании химических ТА. Поэтому в данной работе нами предложена экспериментальная система для сравнительной оценки экспрессионной эффективности, обеспечиваемой различающимися по размеру и топологии генетическими векторами в клетках человека in vitro. Система основана на использовании гена зеленого флуоресцентного белка в качестве репортера, проточной цитофлуориметрии для определения уровня его экспрессии и ПЦР в реальном времени для оценки количества трансгена в клетках. Предложенная система успешно опробована на двух модельных конструкциях, представляющих собой линейную молекулу ДНК, полученную при помощи ПЦР, и плазмидный вектор.

Материал и методы

Получение генетических конструкций. Для получения плазмиды pCI-EGFP ген усиленного зеленого флуоресцентного белка EGFP из конструкции pEGFP-N1 (Clontech, США) был перенесен в вектор pCI (Promega, США) по сайтам KpnI-NotI, используя соответствующие ферменты и буферные растворы (СибЭнзим, Россия). В работе также была использована плазмида pUC19 (Thermo Fisher Scientific, США). Для получения препаративных количеств плазмиды вводили в клетки E. coli TG1 (коллекция Института молекулярной генетики РАН) методом электропорации. Клетки культивировали в среде LB [18], содержащей 200 мкг/мл ампициллина, в течение 18—20 ч при 37 °C и 250 об/мин. Плазмиды выделяли с помощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fisher Scientific, США).

Линейную конструкцию lin-EGFP получали при помощи ПЦР. Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала: 0,03 пмоль pCI-EGFP в качестве матрицы, по 20 пмоль праймеров CCTTTTGCTCACATGGCTCG и CGGATCCTTATCGATTTTACCAC (Евроген, Россия), по 15 нмоль дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ, 5 единиц Taq ДНК-полимеразы и 5 мкл соответствующего 10-кратного

буфера (СибЭнзим, Россия). Реакцию проводили с помощью амплификатора Т100 (Bio-Rad, США) по следующей программе: 4 мин — 95 °C; 25 циклов: 45 сек — 95 °C, 45 сек — 60 °C, 2 мин — 72°C; 5 мин — 72 °C. Продукты реакции фракционировали при помощи вертикального электрофореза в 1% агарозном геле, используя буферный раствор, содержащий 89 мМ Трис, 89 мМ борной кислоты, 2 мМ ЭДТА, pH 7,6, в приборе Model 422 Electro-Eluter (Bio-Rad, США). Выделение ДНК из геля проводили с помощью набора Cleanup Standard (Евроген, Россия).

Концентрацию ДНК определяли спектрофотометри-чески, используя коэффициент поглощения для двухце-почечной ДНК, равный 0,02 мл/(мкгсм) [19].

Культивирование клеток человека и трансфекция. Клетки почки эмбриона человека линии НЕК293 (CRL 1573, ATCC) культивировали в среде DMEM/F12 (1:1 по объему) (ПанЭко, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, GE Healthcare, США) и 0,3 мг/мл глутамина (MP Biomedicals, США), при 37 °C в атмосфере с 5% С02. За 24 ч до трансфекции клетки пересевали в 48-луночный планшет (SPL, Корея) по 50 000 клеток в лунку (клетки подсчитывали при помощи гемоцитометра). Для приготовления трансфек-ционной смеси (ТС) к 50 мкл бессывороточной среды OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, США) добавляли 500 нг ДНК и 1 мкл трансфицирующего агента TurboFect (Thermo Fisher Scientific, США). После внесения ТС клетки инкубировали без смены среды 24 ч, а затем проводили анализ, используя проточную цитофлуориме-трию и ПЦР в реальном времени.

Проточная цитофлуориметрия. Для проведения анализа среду удаляли, клетки промывали 500 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ, ПанЭко, Россия). К клеткам добавляли 80 мкл 0,25% трипсина в растворе Хенка (ПанЭко, Россия), инкубировали 5 мин при 37 °C в атмосфере с 5% CO2, после чего вносили 320 мкл среды DMEM/F12 с 10% ЭТС. Клетки суспендировали и осаждали центрифугированием (5 мин, 300 g). Затем клетки промывали в 500 мкл ФСБ и ресуспенди-ровали в том же объеме ФСБ. Суспензию анализировали с помощью цитофлуориметра BD Accuri C6 (BD Biosciences, США). Флуоресцентный сигнал EGFP детектировали в диапазоне 533 ± 15 нм при возбуждающем излучении 488 нм. Для каждого образца было проанализировано 10 000 частиц, которые по параметрам прямого и бокового светорассеяния соответствовали отдельным клеткам.

С использованием частиц AcGFP Flow Cytometer Calibration Beads (Clontech, США) было показано, что отклик детектора цитофлуориметра по каналу флуоресценции EGFP линейно зависит от количества флуоресцентного белка AcGFP (спектральные характеристики которого идентичны EGFP [20]) с коэффициентом достоверности линейной аппроксимации R2, равным 0,9993.

Экспериментальные данные обрабатывали при помощи программы BD Accuri C6 Software (BD Biosciences, США).

ПЦР в реальном времени. Обработку клеток проводили так же, как и для проточной цитофлуориметрии, за тем исключением, что используемый для промывки ФСБ дополнительно содержал 2 мМ ЭДТА. Полученный осадок клеток ресуспендировали в 100 мкл ли-зирующего раствора, содержащего 20 мМ Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,5% Triton Х-100 (Serva, Германия), 0,5% NP-40 (LKB, Швеция) и 0,1 мкг/мкл протеиназы К (Синтол, Россия), инкубировали 20 мин при 37 °C и 10 мин при 95 °C, после чего добавляли 900 мкл 10 мМ Трис-HCl буфера (pH 7,5), содержащего 1 мМ

ЭДТА. В ПЦР брали 5 мкл полученного раствора. Реакцию проводили на приборе CFX-96 (Bio-Rad, США), используя праймеры CTGCTGCCCGACAACCAC и TGTGATCGCGCTTCTCGTT (Евроген, Россия), а также зонд типа TaqMan (Vic-CTGAGCACCCAGTCCGCCCT-BHQ2, ДНК-Синтез, Россия). Амплифицируемый участок ДНК размером 73 п.н. локализован в гене EGFP. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала по 20 пмоль праймеров и зонда, а также 5 мкл готовой смеси для ПЦР qPCRmix-HS (Евроген, Россия). Программа ПЦР: 5 мин — 95 °C; 42 цикла: 30 с — 95 °C, 45 с — 60 °C. Каждый образец анализировали в 5 повторениях. Результаты обрабатывали при помощи программы CFX-Manager (Bio-Rad, США). Количество копий гена в образце определяли по калибровочным кривым, построенным с использованием 10-кратных разведений растворов pCI-EGFP и lin-EGFP в лизате клеток HEK293, приготовленном как описано в разделе «Проточная цитофлуориметрия». Линейную зависимость порогового цикла (Ct) от количества pCl-EGFP и lin-EGFP наблюдали во всем использованном диапазоне концентраций (104—108 копий/мкл образца). Для pCI-EGFP коэффициент достоверности линейной аппроксимации R2 составил 0,9994, а расчетная эффективность ПЦР 97,3%, для lin-EGFP — 0,9993 и 98,9% соответственно.

Для оценки эффективности удаления внеклеточной ДНК в процессе пробоподготовки клетки культивировали как для проведения трансфекции, через 24 ч после засева в каждую лунку 48-луночного планшета добавляли 500 нг плазмиды pCl-EGFP в 50 мкл среды OptiMEM и инкубировали клетки без смены среды 24 ч. Затем клетки промывали и лизировали, как описано выше. Полученные лизаты были использованы для проведения количественной ПЦР. При этом целевая ДНК в образцах не детектировалась, что свидетельствует об эффективном удалении внеклеточной ДНК.

Молярные количества ассоциированных с клетками тестируемых конструкций рассчитывали на основе значений массовой доли целевой ДНК в ТС («>днк), учитывая найденные отношения количества ассоциированной с клетками целевой ДНК к ее количеству, внесенному в ТС (г), по формуле mx ^х г , где m — общая масса ДНК в ТС, M — молярная масса конструкции.

Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли с помощью пакета MS Excel 2007 (Microsoft Corporation, США). Для проведения регрессионного анализа использовали программу sig-maPlot 10.0 (Systat Software Inc., США).

Результаты и обсуждение

Для сравнительной оценки эффективности экспрессии в данной работе были использованы модельные генетические конструкции, несущие ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) [22]. Первая, pCI-EGFP, представляла собой плазмиду, созданную на основе коммерческого экспрессионного вектора. Вторая, lin-EGFP, была получена путем ПЦР-амплификации участка

А >-ГП М >

CMV enh/prom Int EGFP SV40 р

Рис. 1. Экспрессионная кассета в составе pCI-EGFP и lin-EGFP.

CMV enh/prom — энхансер и промотор ранних генов цитомегаловируса человека; Int — химерный интрон; EGFP — репортерный ген усиленного зеленого флуоресцентного белка; SV40 p(A) — сигнал полиаденили-рования мРНК поздних генов вируса SV40.

Рис. 2. Количество ассоциированных с клетками копий репортерного гена.

Анализ проведен через 24 ч после трансфекции. а — количество копий гена EGFP на клетку в зависимости от доли целевой ДНК в трансфекци-онной смеси Общее количество ДНК при трансфекции составляло 500 нг. Данные представлены как среднее значение двух независимых

экспериментов с тремя повторениями в каждом. Планками обозначен диапазон двух стандартных отклонений; б — отношение количества ассоциированной с клетками целевой ДНК к ее количеству, внесенному в трансфекционную смесь. Представлены средние значения экспериментальных результатов при всех для каждой конструкции (п = 30). Планками обозначен доверительный интервал, рассчитанный с использованием распределения Стьюдента для вероятности 99%.

плазмиды рС1-ЕОРР, включающего репортерный ген и необходимые для его экспрессии регуляторные элементы. Таким образом, обе конструкции содержали одну и ту же экспрессионную кассету (рис. 1), но различались топологией (кольцевая рС1-ЕОРР, линейная Нп-ЕОРР) и размером (4739 и 2110 п.н. соответственно).

Для доставки в клетки конструкций разной структуры предпочтительно использовать носители, эффективность которых не зависит от топологии и размера молекул ДНК. Этому требованию удовлетворяют трансфицирующие агенты (ТА) на основе полиэтиленимина и его аналогов [17]. Поэтому в рамках данной работы для введения ДНК в культивируемые клетки человека был выбран относящийся к этой группе коммерческий катионный полимер РитЬоРес1 Эффективность трансфекции с использованием катионных полимерных ТА определяется массовым соотношением ДНК:ТА и концентрацией комплексов ДНК с ТА. Следовательно, чтобы провести трансфек-цию различными генетическими конструкциями в одинаковых условиях, необходимо использовать одинаковую массу ДНК. Очевидно, если размер конструкций существенно различается, в клетки будет доставляться разное количество копий трансгена. При этом если различия в количестве копий трансгена значительны, то, по-видимому, прямое сравнение экспрессионной эффективности проводить некорректно. Кроме того, известно, что при высоких концентрациях генетических конструкций в клетках наблюдается эффект насыщения [7]: накопление продукта экспрессии слабо зависит от числа копий трансгена, что, по-видимому, связано с перегрузкой аппарата трансляции [21, 23]. Таким образом, для сравнения экспрессионной эффективности разных конструкций необходимо обеспечить их содержание в клетках в эквимолярных и не слишком больших количествах. Для выполнения этого требования нами был использован известный подход, позволяющий доставить в клетки разное количество копий экспрессионных конструкций при одинаковых условиях трансфекции. Данный подход основан на применении так называемой «балластной» (то есть не несущей трансгена) ДНК и заключается в поддержании постоянной общей массы ДНК в трансфекционной смеси (ТС) за счет смешивания целевой и балластной ДНК,

что позволяет варьировать количество целевой конструкции в широком диапазоне [24]. Как правило, в качестве балласта выступают бактериальные плазмиды, в составе которых отсутствуют эукариотические промоторы [25, 26]. В рамках данной работы мы вводили разное количество конструкций рС1-ЕОРР и Нп-ЕОРР в клетки человека линии НЕК293, используя в качестве балласта плазмиду риС19. Количество ассоциированной с клетками целевой ДНК определяли через 24 ч после трансфекции при помощи ПЦР в реальном времени. Для обеих конструкций было установлено, что с уменьшением массовой доли целевой ДНК в ТС количество детектируемых в клетках копий репортерного гена уменьшается линейно (рис. 2, а). При этом отношение количества ассоциированной с клетками целевой ДНК к ее количеству, внесенному в ТС, оставалось постоянным для каждой конструкции при всех сочетаниях целевая/балластная ДНК. Однако в случае рС1-ЕОРР это значение было примерно в 1,7 раза больше, чем для Нп-ЕОРР (рис. 2, б), что может быть связано с различиями в стабильности и/или эффективности доставки данных конструкций. Следует отметить, что, согласно опубликованным данным, через 26 ч после трансфекции при помощи полиэтиленимина с клетками НЕК293 ассоциировано около 48% плазмидной ДНК от ее исходного количества в ТС [21]. Это хорошо согласуется с полученным нами для рС1-ЕОРР значением 51 ± 6% (среднее значение ± доверительный интервал, п = 30) (рис. 2, б).

Для оценки уровня экспрессии репортерного гена клетки НЕК293 трансфицировали разными количествами тестируемых конструкций, используя метод балластной ДНК. Накопление ЕОРР анализировали через 24 ч после трансфекции с помощью проточной цитофлуориметрии. (Интенсивность флуоресценции ЕОРР пропорциональна его количеству в клетках [22].) Клетки считали экспресси-рующими трансген, если их флуоресцентный сигнал превышал фоновую автофлуоресценцию, границу которой определяли в каждом эксперименте, анализируя культуры клеток, трансфицированных плазмидой риС19 (рис. 3, а). Было установлено, что в культурах, трансфицированных как рС1-ЕОРР, так и Нп-ЕОРР, с уменьшением снижалась доля клеток, демонстрирующих зеленую флуо-

1100

500

1 100-

I ИНН I ГШ! МШИ 1М11И I ППМ I 111111 I 101 102 103 104 105 106 107

500-

НИ11 мин

101 102 103 104 105 106 107

Интенсивность флуоресценции ЕОРР

55504540-

+" 35,4; 30-

2520151050-

Ш РС1-Е0РР П Пп-ЕОРР

1т

б

5 ' 10 ' 20 ' 30 ' 40 ' 50 ' 80 ' 100 '

сотс

'-"пик- >

Рис. 3. Определение количества EGFP-положительных клеток в трансфицированных культурах.

Общее количество ДНК при трансфекции составляло 500 нг; для каждого образца проанализировано 10 000 клеток; анализ проведен через 24 ч после трансфекции. а — определение границы фоновой автофлуоресценции. Границу выбирали на гистограммах интенсивности флуоресцентного сигнала по каналу EGFP таким образом, чтобы область EGFP-положительных (EGFP+) клеток содержала не более 1% клеток, трансфицированных только риС19, балластной ДНК. На гистограммах обозначена область и доля EGFP+ клеток в процентах от общего числа проанализированных клеток. Представлены результаты типичного эксперимента; б — доля EGFP+ клеток в трансфицированных культурах. Представлены результаты двух независимых экспериментов с тремя повторениями в каждом, планками обозначен диапазон двух стандартных отклонений. — доля целевой

ДНК в трансфекционной смеси.

ресценцию. Однако снижение было незначительным: при уменьшении количества конструкций в 20 раз количество флуоресцирующих клеток сокращалось всего в 2 раза. При этом доля EGFP-экспрессирующих клеток при одинаковых юддК для pCI-EGFP и lin-EGFP практически не различалась (рис. 3, б). В то же время суммарная интенсивность флуоресцентного сигнала популяции EGFP-положительных клеток для обеих конструкций нелинейно снижалась с уменьшением юднК. Вместе с тем при равных юддК для плазмиды параметр F? всегда был выше, чем в случае линейной конструкции (рис. 4, а). Данный результат позволяет заключить, что pCI-EGFP превосходит lin-EGFP по экспрессионной эффективности. Однако для количественной оценки этой разницы необходимо учесть число копий репортерного гена в клетках.

Количество трансгена в клетках меняется во времени сложным образом, что обусловливается динамикой проникновения в клетки и кинетикой деградации экс-прессионных конструкций. При этом репортерный белок также деградирует (время полужизни EGFP в клет-

ках млекопитающих составляет 22—24 ч [27]). Чтобы учесть все это, в идеале необходимо было бы в каждом случае детально исследовать все три процесса. Однако эта задача является чрезмерно трудоемкой для рутинных исследований. Поэтому в рамках данной работы мы сравнивали значения юдаК, соответствующие эквимоляр-ным количествам используемых конструкций в клетках через 24 ч после трансфекции, то есть в момент измерения юднк. Молярные количества были рассчитаны на основе значений юдак, учитывая найденные отношения количества ассоциированной с клетками целевой ДНК к ее количеству, внесенному в ТС. На основе экспериментальных данных мы провели регрессионный анализ и построили математические модели зависимости Fs от го днк для каждой конструкции. Полученные модели имели вид Fs = а(1 - #юднк)), для pCI-EGFP значения коэффициентов составили: а = 14,007 и Ь = 0,987, а для lin-EGFP — а = 4,696 и Ь = 0,981. Коэффициенты достоверности аппроксимации Я2 для обеих конструкций были выше 0,99. Используя найденные закономерности, были рас-

* 3-___

" 2,5----

2-|-1-1-1-1-1

О 15 30 45 60 75

Количество трансгена в клетках, фмоль

Рис. 4. Накопление продукта экспрессии гена EGFP в клетках. Общее количество ДНК при трансфекции составляло 500 нг; для каждого образца проанализировано 10 000 клеток; анализ проведен через 24 ч после трансфекции. а — зависимость суммарной интенсивности флуоресцентного сигнала (Р£) популяции ЕОРР-положительных (ЕОРР+) клеток от доли целевой ДНК в трансфекционной смеси со^ц. Представлены результаты двух независимых экспериментов с тремя повторениями в каждом, планками обозначен диапазон двух стандартных отклонений; о.е. — относительные единицы. б — зависимость отношения Р£ для конструкции рС1-ЕОРР к Р£ для конструкции Нп-ЕОРР (Рг) при эквимолярных количествах конструкций в клетках от количества трансгена в клетках.

считаны отношения РЕ(рС1-ЕОРР) к Р^(Нп-ЕОРР) при эквимолярных количествах конструкций в клетках. Зависимость параметра РЕ(рС1-ЕОРР):РЕ(Нп-ЕОРР) от количества трансгена в клетках демонстрирует, что на всем диапазоне использованных в работе концентраций ДНК различие в экспрессионной эффективности исследованных модельных конструкций практически постоянно: плазмида рС1-ЕОРР обеспечивает приблизительно в 2,8 раза более высокий уровень экспрессии трансгена по сравнению с Нп-ЕОРР (рис. 4, б).

Наблюдаемая разница в экспрессионной эффективности между протестированными конструкциями, вероятно, обусловлена различием в их топологии. Можно предположить, что наличие большого количества ДНК с незащищенными 5'- и 3'-концами распознается клеткой как повреждение геномной ДНК, что вызывает запуск защитных механизмов, приводящих, например, к аресту клеточного цикла и, как следствие, к снижению экспрессионной активности. Можно дать и более тривиальное объяснение. При получении Нп-ЕОРР конструкция неизбежно накапливает мутации в результате ошибок ДНК-полимеразы в процессе ПЦР. Нельзя исключить, что такие мутации, локализуясь в регуляторных участках и/или в белок-кодирующей последовательности, могут приводить к снижению эффективности экспрессии или изменению спектральных характеристик репортерного белка. Однако, независимо от подлинных причин наблюдаемого различия, использованная экспериментальная система позволяет данное различие обнаружить и охарактеризовать количественно.

Таким образом, в данной работе предложена экспериментальная система для сравнения экспрессионной эффективности генетических конструкций, которые значительно различаются по структуре. Эта система включает EGFP в качестве репортера, полимерный катионный трансфицирующий агент для доставки ДНК в клетки и ПЦР в реальном времени для определения количества ассоциированных с клетками экспрессионных конструкций. Предложенная система протестирована с использованием модельных конструкций, несущих идентичные экспрессионные кассеты и представляющих собой линейную молекулу ДНК и плазмиду. Показано, что сравнение суммарной интенсивности флуоресцентного сигнала EGFP-положительных клеток при эквимолярных количествах ассоциированных с клетками конструкций позволяет получить константу, характеризующую различия в их экспрессионной эффективности.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 14-14-00526).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Khan K.H. Gene expression in mammalian cells and its applications. Adv. Pharm. Bull. 2013; 3 (2): 257—63.

2. Misra S. Human gene therapy: a brief overview of the genetic revolution. J. Assoc. Physicians India. 2013; 61 (2): 127—33.

3. Thomas C.E., Ehrhardt A., Kay M.A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 2003; 4 (5): 346—58.

4. Yin H., Kanasty R.L., Eltoukhy A.A., Vegas A.J., Dorkin J.R., Anderson D.G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nat. Rev. Genet. 2014; 15 (8): 541—55.

5. Roth C.M. Quantifying gene expression. Curr. Issues Mol. Biol. 2002; 4 (3): 93—100.

6. Cohen R.N., van der Aa M.A., Macaraeg N., Lee A.P., Szoka F.C. Jr. Quantification of plasmid DNA copies in the nucleus after lipoplex and polyplex transfection. J. Control. Release. 2009; 135 (2): 166—74.

7. Tachibana R., Harashima H., Ide N., Ukitsu S., Ohta Y., Suzuki N. et al. Quantitative analysis of correlation between number of nuclear plasmids and gene expression activity after transfection with cationic liposomes. Pharm. Res. 2002; 19 (4): 377—81.

8. Gill D.R., Pringle I.A., Hyde S.C. Progress and prospects: the design and production of plasmid vectors. Gene Ther. 2009; 16 (2): 165—71.

9. Maucksch C., Bohla A., Hoffmann F., Schleef M., Aneja M.K., Elfinger M. et al. Transgene expression of transfected supercoiled plasmid DNA concatemers in mammalian cells. J. Gene Med. 2009; 11 (5): 444—53.

10. Schakowski F., Gorschlüter M., Buttgereit P., Märten A., Lilienfeld-Toal M.V., Junghans C. et al. Minimal size MIDGE vectors improve transgene expression in vivo. In Vivo. 2007; 21 (1): 17—23.

11. Nafissi N., Alqawlaq S., Lee E.A., Foldvari M., Spagnuolo P.A., Slavcev R.A. DNA ministrings: highly safe and effective gene delivery vectors. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2014; 3: e165.

12. Chen Z.Y., He C.Y., Ehrhardt A., Kay M.A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Mol. Ther. 2003; 8 (3): 495—500.

13. Kim J.H., Kononenko A., Erliandri I., Kim T.A., Nakano M., Iida Y. et al. Human artificial chromosome (HAC) vector with a conditional centromere for correction of genetic deficiencies in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108 (50): 20048—53.

14. Van Craenenbroeck K., Vanhoenacker P., Haegeman G. Episomal vectors for gene expression in mammalian cells. Eur. J. Biochem. 2000; 267 (18): 5665—78.

15. Haase R., Argyros O., Wong S.P., Harbottle R.P., Lipps H.J., Ogris M. et al. pEPito: a significantly improved non-viral episomal expression vector for mammalian cells. BMC Biotechnol. 2010; 10: 20.

16. Gardlik R., Palffy R., Hodosy J., Lukacs J., Turna J., Celec P. Vectors

and delivery systems in gene therapy. Med. Sci. Monit. 2005; 11 (4): RA110-21.

17. Hsu C.Y., Uludag H. Effects of size and topology of DNA molecules on intracellular delivery with non-viral gene carriers. BMC Biotech-nol. 2008; 8: 23.

18. Bertani G. Studies on lysogenesis. I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. J. Bacteriol. 1951; 62 (3): 293—300.

19. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 4th Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.

20. Vierra M., Garachtchenko T., Gupta V., Schmid I., Hawley T., Cimbro R. et al. AcGFP and mCherry calibration beads for flow cytometry. J. Biomol. Tech. 2014; 25 (Suppl.): S20.

21. Carpentier E., Paris S., Kamen A.A., Durocher Y. Limiting factors governing protein expression following polyethylenimine-mediated gene transfer in HEK293-EBNA1 cells. J. Biotechnol. 2007; 128 (2): 268—80.

22. Soboleski M.R., Oaks J., Halford W.P. Green fluorescent protein is a quantitative reporter of gene expression in individual eukaryotic cells. FASEB J. 2005; 19 (3): 440—2.

23. Pham P.L., Perret S., Cass B., Carpentier E., St-Laurent G., Bisson L. et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotech-nol. Bioeng. 2005; 90(3): 332—44.

24. Kichler A., Leborgne C., Danos O. Dilution of reporter gene with stuffer DNA does not alter the transfection efficiency of polyethylen-imines. J. Gene Med 2005; 7(11): 1459—67.

25. Darquet A.M., Cameron B., Wils P., Scherman D., Crouzet J. A new DNA vehicle for nonviral gene delivery: supercoiled minicircle. Gene Ther. 1997; 4(12): 1341—9.

26. Niopek D., Benzinger D., Roensch J., Draebing T., Wehler P., Eils R. et al. Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells. Nat. Commun. 2014; 5: 4404.

27. Andersen J.B., Sternberg C., Poulsen L.K., Bjorn S.P., Givskov M., Molin S. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 1998; 64 (6): 2240—6.

Поступила 17.04.16

Komissarov AA, Karaseva M.A., Safina D.R., Roschina MP, Bednova O.P., Kazakov AA, Demkin V.V., DemidyukI.V.

COMPARATIVE EVALUATION OF THE TRANSGENE EXPRESSION EFFICIENCY PROVIDED BY THE MODEL GENETIC CONSTRUCTS OF DIFFERENT STRUCTURE

Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation

Comparative evaluation of the transgene expression efficiency provided by the model genetic constructs of different structure is an important stage in the development of new expression methods and optimization of the existing expression vectors. However, presently there is no versatile approach to this problem. The goal of this work was to suggest an experimental system for comparative evaluation of the expression efficiency provided by nonviral genetic vectors of various size and topology in human cell cultures. Such system is based on the gene of the green fluorescence protein used as a reporter as well as flow cytofluorometry for evaluation of the expression level and quantitative PCR for adequate selection of the transfection conditions. This system was tested in two model constructs: linear molecule of DNA and plasmid.

Keywords: expression vector, genetic construct, expression efficiency, transfection, green fluorescence protein

For citation: Komissarov A.A., Karaseva M.A., Safina D.R., Roschina M.P., Bednova O.P., Kazakov A.A., Demkin V.V., Demidyuk I.V. Comparative Evaluation of the Transgene Expression Efficiency Provided by the Model Genetic Constructs of Different Structure. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology) 2016; 34(3): 4-11 (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-3-115-120.

For correspondence: Ilya V. Demidyuk, Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, 123182, Moscow, Russian Federation; E-mail: duk@img.ras.ru

Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Funding. This work was supported by the Russian Science Foundation (Project No. 14-14-00526).