СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ, ОСНОВАННЫЙ НА ОПРЕДЕЛЕНИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, СПОСОБ ОПТИМИЗАЦИИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ

1. Способ идентификации одного или более аминокислотных остатков для замены в определенном положении в иммунобиндере, который включает:
H
L
a) обеспечение первой базы данных аминокислотных последовательностей V и/или V, сгруппированных в соответствии с подтипом;
H
L
b) обеспечение второй базы данных аминокислотных последовательностей V и/или V, сгруппированных в соответствии с подтипом и выбранных, как имеющие, по меньшей мере, одно желаемое функциональное свойство;
c) определение частоты встречаемости аминокислот для аминокислотного остатка в каркасном положении первой базы данных и в соответствующем каркасном положении второй базы данных;
d) идентификация аминокислотного остатка (i) как предпочтительного аминокислотного остатка для замены в соответствующем аминокислотном положении иммунобиндера, если аминокислота имеет фактор обогащения более 1, или (ii) как аминокислотного остатка, который должен быть исключен из соответствующего аминокислотного положения иммунобиндера, если аминокислотный остаток имел фактор обогащения менее 1.
2. Способ по п.1, в котором аминокислотный остаток стадии d) имеет фактор обогащения от 4 до 6.
H
L
H
L
3. Способ по любому из вышеуказанных пунктов, в котором первая базы данных включает эмбриональные аминокислотные последовательности V, V или V и V.
H
L
H
L
4. Способ по п.1, в котором первая база данных состоит из эмбриональных аминокислотных последовательностей V, V или V и V.
H
L
H
L
5. Способ по п.1, в котором первая база данных включает зрелые аминокислотные последовательности V, V или V и V.
H
L
H
L
6. Способ по п.1, в котором первая база данных состоит из зрелых аминокислотных последовательностей V, V или V и V.
H
L
H
L
7. Способ по п.1, в котором зрелые аминокислотные последовательности V, V или V и V получены из Kabat-базы данных (KDB).
H
L
H
L
8. Способ по п.1, в котором вторая база данных включает аминокислотные последовательности V, V или V и V scFv-антител, выбранные по QC-анализу.
H
L
H
L
9. Способ по п.1, в котором вторая база данных состоит из scFv antibody аминокислотные последовательности V, V или V и V scFv-антител, выбранные по QC-анализу.
H
L
H
L
10. Способ усовершенствования иммунобиндера, который имеет аминокислотные последовательности V, V или V и V, включающий:
a) идентификацию одного или более каркасных аминокислотных положений для мутации;
b) идентификацию для каждого определенного каркасного положения, как идентифицировано в стадии а), предпочтительного аминокислотного остатка для замены; и
c) мутирование аминокислотного остатка в каждом определенном каркасном положении относительно предпочтительного аминокислотного остатка, идентифицированного в стадии b).
11. Способ по п.10, в котором стадия а) осуществляется путем определения степени вариабельности в заданном каркасном положении.
12. Способ по п.10 или 11, в котором стадия а) осуществляется путем присвоения степени консервативности каждому каркасному положению, используя Индекс Симпсона.
13. Способ по п.10, в котором предпочтительный аминокислотный остаток из стадии b) идентифицируют в соответствии со способом по любому из пп.1-9.
14. Способ улучшения функционального свойства иммунобиндера, где иммунобиндер содержит вариабельную область тяжелой цепи или ее фрагмент и/или вариабельную область легкой цепи или ее фрагмент, включающий:
a) выбор одного или более аминокислотных положений в иммунобиндере для мутации; и
b) мутирование более чем одного аминокислотных положений, выбранных для мутации,
где если одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, являются аминокислотными положениями тяжелой цепи, то указанное аминокислотное положение выбирают из группы, состоящей из 1, 6, 7, 10, 12, 13, 14, 19, 20, 21, 45, 47, 50, 55, 77, 78, 82, 86, 87, 89, 90, 92, 95, 98, 103 и 107, используя АНо-номенклатуру (аминокислотных положений 1, 6, 7, 9, 11, 12, 13, 18, 19, 20, 38, 40, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76, 78, 79, 81, 82b, 84, 89 и 93, используя Kabat-номенклатуру), и
где одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, являются аминокислотными положениями легкой цепи, то указанное аминокислотное положение выбирают из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 12, 14, 18, 20, 24, 46, 47, 50, 53, 56, 57, 74, 82, 91, 92, 94, 101 и 103, используя АНо-номенклатуру (аминокислотных положений 1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 12, 14, 18, 20, 24, 38, 39, 42, 45, 48, 49, 58, 66, 73, 74, 76, 83 и 85, используя Kabat-номенклатуру).
15. Способ по п.14, в котором иммунобиндер включает VН3-вариабельную область тяжелой цепи и одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, выбирают из группы, состоящей из аминокислотных положений 1, 6, 7, 89 и 103 VH3, используя АНо-номенклатуру (аминокислотных положений 1, 6, 7, 78 и 89, используя Kabat-номенклатуру).
16. Способ по п.14, в котором иммунобиндер включает VH1-вариабельную область тяжелой цепи и одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, выбирают из группы, состоящей из аминокислотных положений 1, 6, 12, 13, 14, 19,21, 90, 92, 95 и 98 VH1a, используя АНо-номенклатуру (аминокислотных положений 1, 6, 11, 12, 13, 18, 20, 79, 81, 82b и 84, используя Kabat-номенклатуру).
17. Способ по п.14, в котором иммунобиндер включает VH1b-вариабельную область тяжелой цепи и одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, выбирают из группы, состоящей из аминокислотных положений 1, 10, 12, 13, 14, 20, 21, 45, 47, 50, 55, 77, 78, 82, 86, 87 и 107 VH1b, используя АНо-номенклатуру (аминокислотных положении 11, 9, 11, 12, 13, 19, 20, 38, 40, 43, 48, 66, 67, 71, 75, 76 и 93, используя Kabat-номенклатуру).
18. Способ по п.14, в котором иммунобиндер включает Vκ1-вариабельную область легкой цепи и одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, выбирают из группы, состоящей из аминокислотных положений 1, 3, 4, 24, 47, 50, 57, 91 и 103 Vκ1, используя АНо-номенклатуру (аминокислотных положений 1, 3, 4, 24, 39, 42, 49, 73 и 85, используя Kabat-номенклатуру).
19. Способ по п.14, в котором иммунобиндер включает Vκ3-вариабельную область легкой цепи и одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, выбирают из группы, состоящей из аминокислотных положений 2, 3, 10, 12, 18, 20, 56, 74, 94, 101 и 103 Vκ3, используя АНо-номенклатуру (аминокислотных положений 2, 3, 10, 12, 18, 20, 48, 58, 76, 83 и 85, используя Kabat-номенклатуру).
20. Способ по п.14, в котором одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, выбирают из группы, состоящей из аминокислотных положений 1, 2, 4, 7, 11, 14, 46, 53, 82, 92 и 103 Vλ1, используя АНо-номенклатуру (аминокислотных положений 1, 2, 4, 7, 11, 14, 38, 45, 66, 74 и 85, используя Kabat-номенклатуру).
21. Способ по п.14, в котором мутирование дополнительно включает одно или более (предпочтительно все) замены цепей аминокислотных положений в тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из аминокислотных положений 12, 13 и 144, используя АНо-номенклатуру (аминокислотных положений 12, 85 и 103, используя Kabat-номенклатуру).
22. Способ по п.14, в котором одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, мутированы до аминокислотного остатка, обнаруженного в соответствующем аминокислотном положении в последовательности антител, выбранной по QC-анализу.
23. Способ по п.14, в котором одно или более аминокислотных положений, выбранных для мутации, мутированы до аминокислотного остатка, идентифицированного в соответствии со способом по любому из пп.1-9.
24. Способ по п.1, в котором иммунобиндер представляет собой scFv-антитело, полноразмерный иммуноглобулин, Fab-фрагмент, Dab или Нанотело.
25. Способ по любому из пп.1 или 14, в котором функциональное свойство представляет собой улучшенную стабильность, улучшенную растворимость, отсутствие агрегации, повышение экспрессии, повышение рефолдинга с последующим процессом очистки от примесей, или комбинацию из двух или более указанных улучшений.
26. Способ по п.25, в котором повышение экспрессии наблюдается в прокариотической клетке.
27. Способ по любому из пп.1 и 25 при условии, что функциональным свойством не является улучшение связывания с антигеном.
28. Иммунобиндер, приготовленный в соответствии со способом по любому из предшествующих пунктов.
29. Композиция, содержащая иммунобиндер по п.28 и фармацевтически приемлемый носитель.