СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ ВАСКУЛЯРИЗАЦИИ
VASCULARITY DEGREE ESTIMATION METHOD

Изобретение относится к медицине, а именно к способам физического анализа биологических материалов, и может быть использовано при исследовании образца ткани, в частности для определения биологической агрессивности опухоли.
Известен способ определения удельной плотности сосудов, включающий иммуногистохимическое исследование образца ткани с использованием моноклональных антител к CD34, выявляющих эндотелиальные клетки сосудов. Однако при использовании известного способа возможна лишь приблизительная количественная оценка степени васкуляризации исследуемого образца ткани, на уровне много/мало. (CD 34: structure, biology and clinical utility. // Blood. - 1996. - vol.87, №1. - pp.1-13).
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи создания достоверного инструмента уточняющей диагностики онкологических заболеваний.
Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических и экономических результатов:
- возможность определения количества сосудов на всей площади парафинового среза образца исследуемой ткани,
- сокращение продолжительности проведения исследования за счет точного выбора участка ткани, предназначенного к исследованию, минимизации ручной корректировки при подсчете количества сосудов,
- снижение затрат на приобретение специализированной аппаратуры,
- возможность проведения исследования в рамках телемедицины.
Указанные технические и экономические результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что, так же как в известном способе определения удельной плотности сосудов, осуществляют иммуногистохимическое исследование образца ткани с использованием моноклональных антител к CD34, выявляющих эндотелиальные клетки сосудов.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что дополнительно оцифровывают всю площадь среза исследуемой ткани с помощью пленочного сканера, полученное изображение подвергают многостадийному контрастированию, включающему сдвиг цветов, размытие и изменение яркостных характеристик изображения препарата, при этом сосуды, интересующая ткань и участки препарата, не используемые при измерении, выделяют максимально контрастными цветами путем перекрашивания, и рассчитывают отношение количества сосудов к площади исследуемой ткани - удельную плотность сосудов.
Сущность изобретения заключается в следующем.
При определении реальной картины опухолевого процесса и, следовательно, при выборе оптимальной тактики лечения онкологических заболеваний незаменимую роль играет оценка степени кровоснабжения, от которого непосредственно зависит питание и оксигенация опухоли, что напрямую связано с биологической агрессивностью опухоли. Одним из важнейших критериев оценки степени кровоснабжения опухоли является определение плотности сосудов, т.е. количества сосудов на единицу площади в опухоли. Указанный критерий является определяющим при прогнозировании течения опухолевого заболевания, приживляемости тканевых трансплантатов, чувствительности опухоли к лучевой и химиотерапии таргетными препаратами.
Методика, разработанная авторами заявляемого изобретения, позволяет производить подсчет количества сосудов на всей площади парафинового среза образца исследуемой ткани и определять их удельную плотность на единицу площади. Способ осуществляют с использованием пленочного фотосканера высокого разрешения. Для выполнения задачи одновременно оцифровывают всю площадь среза исследуемой ткани с сосудами, выявленными с помощью иммуногистохимических реакций. Это позволяет точно выбрать участок ткани, предназначенный к исследованию, что сокращает время, необходимое для оцифровки соответствующих площадей препарата при использовании микроскопа. При этом отпадает необходимость дополнительной калибровки, поскольку размеры изображения обозначены в миллиметрах.
Далее оцифрованное изображение подвергают многостадийному контрастированию в соответствии со специально разработанной методикой обработки изображения. Это позволяет минимизировать ручную корректировку при подсчете количества сосудов. Все стадии обработки сохраняют в отдельных слоях файла изображения, обеспечивая возможность визуального контроля и последующего уточнения полученных результатов.
При использовании заявляемого способа снижается стоимость оборудования, снижаются требования к квалификации оператора, что важно при проведении соответствующих исследований в режиме телемедицины.
Способ осуществляют следующим образом.
Ткань фиксируют 10% нейтральным формалином в течение 24 часов, обезвоживают, пропитывают парафином, заливают в парафин. Затем изготовляют срезы толщиной 4 мкм, которые помещают на высокоадгезивные стекла. Проводят иммуногистохимическое исследование по стандартной методике с использованием моноклональных антител к CD34, выявляющих эндотелиальные клетки сосудов.
Процедура оцифровки среза исследуемой ткани с предварительно проведенной иммуногистохимической реакцией на сосуды заключается в том, что вместо фотопленки в фотосканер помещают стекло с исследуемым срезом и сканируют (т.е. оцифровывают) в соответствии с инструкцией к конкретному сканеру. Разрешение при сканировании среза должно быть не менее 2400 dpi. Сканер выдает линейные размеры изображения в миллиметрах, что позволяет легко определить общую площадь захваченного изображения без проведения процедур калибровки. (Единица измерения линейных размеров изображения, оцифрованного сканером, - миллиметры, например 1,5×2,5 мм, что позволяет легко определить площадь участка изображения с целевым объектом).
В программе обработки изображения (Adobe Photoshop или подобной поддерживающей полноценные слои и α-каналы) проводят многостадийное контрастирование полученного изображения препарата.
Последовательность действий при разметке изображений следующая.
1. Вручную выделяют и закрашивают черным цветом участки изображения, не относящиеся к опухоли (например, пустые места, структуры нормальной ткани и др.). Сохраняют выделение в α-канале.
2. Сдвигают цвета изображения для повышения цветового контраста (инструмент HUE) на +82°, что облегчает визуальное выделение участков со слабой иммуногистохимической окраской.
3. Инструментом Magic Wang выделяют участки, соответствующие сосудам. Чувствительность (диапазон значений пикселей относительно точки выделения) инструмента подбирается под конкретное изображение. Сохраняют выделение в α-канале.
4. Контролируют точность выделения на исходном изображении. (Слой Background). Добавляют пропущенные объекты в предыдущее выделение и сохраняют в α-канале.
5. Закрашивают выделенные объекты красным цветом.
6. Инвертируют выделение (Select/Invers). Выделенными оказываются структуры без сосудов. Сохраняют выделение в α-канале.
7. Закрашивают выделение голубым цветом.
8. Меняя прозрачность соответствующих слоев, производят контроль правильности разметки. В результате, получают изображение, где все сосуды закрашены красным цветом, участки, не содержащие сосуды, - голубым, неопухолевые участки - черным. При этом отсутствует оптическая гетерогенность внутри соответствующих областей изображения. Граница между структурами четкая, структуры однозначно определяются с помощью программ анализа изображений.
Определение процента площади на изображении, занимаемого тканью, и количества участков изображения, соответствующих сосудам, производят в программе анализа изображений (Например, Leica QWIN 500IW).
Определение отношения количества сосудов к площади исследуемой ткани - удельной плотности сосудов - осуществляют с помощью электронных таблиц.
2
2
2
Предлагаемый метод оценки степени васкуляризации проверен на опухолях мочевого пузыря разной степени дифференцировки - высокодифференцированных (G1), умереннодифференцированных (G2), низкодифференцированых (G3). Получены средние значения для этих групп: G1 - 83,1 сосудов/мм, G2 - 124,3 сосудов/мм, G3 - 188 сосудов/мм. Таким образом, выявлена достоверная корреляция между степенью дифференцировки опухоли и степенью ее васкуляризации, что отражает биологическую агрессивность опухоли и должно учитываться при выборе тактики лечения.
2
На фиг 1 представлено изображение отсканированного среза исследуемой ткани с предварительно проведенной иммуногистохимической реакцией на сосуды, площадь которого составляет 114 мм.
2
2
На фиг.2 представлено изображение области интереса того же среза ткани с выделенными сосудами, подвергнутого компьютерной обработке в соответствии с заявляемой методикой. Площадь области обсчета составляет 44,87 мм, определено 4007 сосудов, удельная плотность сосудов равна 89,3 сосуда/мм.
Заявляемый способ обладает значительными преимуществами и отвечает критериям патентоспособности.