СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАКРОПОРИСТОГО ПОЛИМЕРНОГО МАТЕРИАЛА МОНОЛИТНОГО ТИПА
METHOD OF OBTAINING MONOLITHIC MACROPOROUS POLYMER MATERIAL

Данное изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений. В качестве хроматографического материала (биоаффинная хроматография) или материала аналитической платформы (биологический микрочип) изобретение может найти применение в аналитической химии, молекулярной биологии, биотехнологии, фармакологии и медицине для анализа, выделения и очистки белков.
В настоящее время для применения в биоаффинной хроматографии из макропористых материалов монолитного типа, изготовленных в форме колонки, известен материал на основе сополимера глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата. Одним из способов получения данного сорбента является высокодисперсная эмульсионная полимеризация [Р.Krainc, N.Leber, D.Stefanec, S.Kontrec, A.Podgornik. // J. Chromatogr. A 2005. V.1065. P.69-73]. Высокодисперсная эмульсионная полимеризация (ВДЭП) является вариантом эмульсионной полимеризации, где водная фаза представляет более 74% от общего объема эмульсии. Материалы, полученные с использованием этого метода, имеют поровую структуру, которая формируется вследствие захвата водной фазы в ходе полимеризации и образования непрерывного полимерного скелета. После удаления жидкой фазы поровая структура конечного полимерного продукта сохраняется. Поскольку эмульсия представляет собой термодинамически нестабильную систему, то для ее стабилизации необходимым условием является использование поверхностно-активных веществ (ПАВ), или сурфактантов.
Данный способ с использованием подхода термоинициирования позволил получить материалы с пористостью 57-90%. При этом образцы с наименьшей пористостью характеризовались широким распределением пор по размерам. К существенным недостаткам данного способа относится длительность синтеза; время полимеризации при температуре 55°С составляет 48 часов. Также среди недостатков можно отметить плохие гидродинамические свойства получаемых материалов, связанные с особенностями поровой структуры, а именно с отсутствием равномерных проточных (транспортных) каналов. Поверхность данных материалов состоит из обособленных больших пор, связанных друг с другом множеством маленьким пор (мезопор). Кроме того, несмотря на высокие значения пористости получаемых материалов, средний размер пор лежит в интервале 100-500 нм.
В случае известных трехмерных материалов, используемых для получения непроточных биоаффинных материалов (платформы для создания биологических микрочипов), известным является способ получения материалов на основе полиакриламидных гелей, описанный в работах академика А.Д.Мирзабекова [А.Ю.Рубина, С.В.Паньков, С.М.Иванов, Е.И.Дементьева, А.Д.Мирзабеков. // ДАН. 2001. Т.381. №5, С.701-704]. Известная композиция для полимеризации включает мономер, а именно акриламид, метакриламид, 2-гидроксиэтилметакрилат и др., и сшивающий агент, например N,N'-метиленбисакриламид, которые полимеризуют на поверхности поддерживающей пластины с использованием метода фотоинициирования. Разработанный авторами способ позволяет получить материалы, представляющие собой сшитые сетчатые набухающие гидрогели. При эксплуатации биочипов на основе данных материалов лимитирующим время и эффективность анализа фактором является диффузия исследуемых веществ в гелевую структуру (сетку), степень упорядоченности которой и удельную рабочую поверхность контролировать практически невозможно. Более того, необходимость активации материала для введения аффинных биолигандов также относится к очевидным недостаткам данных носителей.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения макропористых материалов монолитного типа на основе сополимера глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА) [Т.Б.Тенникова, В.Д.Красиков, О.А.Шпигун. Пат. РФ 2298797]. Способ получения данных материалов основан на радикальной термо- и фотоиницируемой сополимеризации мономеров на поверхности стеклянных, алюминиевых или полимерных пластин в присутствии инициаторов азо-бис-изобутиронитрила, бензофенона и 2-гидрокси-2-метилпропиофенона и порообразующих растворителей додеканола или циклогексанола, или их композиции. Существенным недостатком полимеризации с использованием азо-бис-изобутиронитрила является необходимость проведения полимеризации при температурах 50-70°С в течение нескольких часов, а также ограничение по использованию в качестве порообразующих веществ только высококипящих растворителей. Способ получения, основанный на использовании в качестве инициатора бензофенона, также требует существенных временных затрат (более часа) и обеспечивает выход сополимера не более 86%. Кроме того, материалы, полученные с помощью данного способа, часто характеризуются широким распределением пор по размерам, т.е. неоднородной поровой структурой.
Важно отметить, что сорбенты на основе сополимера ГМА-ЭДМА известны не только как материалы, используемые для создания трехмерных биочипов (планарные биоаффинные сорбенты), но и как хроматографические сорбенты [Т.Tennikova, M.Bleha, В.Belenkii, F.Svec. US Pat. 4.889.632, 4.923.610 и 4.952.349], которые получают также методом термоинициируемой полимеризации в стеклянных, стальных или полимерных колонках требуемого размера.
Сополимер ГМА-ЭДМА, а следовательно, и макропористые полимерные материалы, изготовленные из этого сополимера, содержат реакционноспособные эпоксидные группы, позволяющие проводить одностадийную модификацию поверхности аминосодержащими биолигандами (белками). К существенным недостаткам материала на основе сополимера ГМА-ЭДМА относится длительность реакции биофункционализации, а также низкая иммобилизационная емкость получаемых аффинных сорбентов. Для достижения максимума количества вводимого в поверхность сорбента белка требуется время, равное 16-18 часам при температуре 37°С.
Технической задачей и положительным результатом предлагаемого изобретения является способ получения макропористого материала монолитного типа на основе тройного сополимера N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты (ГФИАК) с глицидилметакрилатом и этиленгликольдиметакрилатом, имеющего форму колонки или планарной платформы для создания аффинных сорбентов, который получают при комнатной температуре за относительно короткий промежуток времени (не более часа) в условиях, позволяющих получать гомогенную внутрипоровую структуру, узкое распределение пор по размерам, а также обеспечивающий формирование материалов с вариацией поровых характеристик. Кроме того, содержащиеся в структуре сополимера высокореакционные активированные сложноэфирные группы обеспечивают одностадийное прикрепление биоаффинного лиганда (белка) в течение короткого времени (2 часа) при температуре 20-22°С, не требуют проведения дополнительных стадий активации или постмодификации сорбента, а также позволяют получать аффинные сорбенты с более высокой иммобилизационной емкостью по сравнению с известными материалами на основе сополимера ГМА-ЭДМА.
Заявляемый способ получения макропористого материала для создания аффинных сорбентов обладает совокупностью существенных признаков, которые включают подготовку реакционной формы, формирование рабочего слоя путем сополимеризации мономеров N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата в присутствии порообразующих веществ, иммобилизацию на образующемся сополимере биологических макромолекул (лигандов), отмывку и сушку полученного аффинного сорбента. При этом подготовку реакционной формы проводят следующим образом: в случае стеклянных пластин первоначально лазерным фрезерованием изготавливают операционные ячейки размером 0.2 мм × 25 мм × 50 мм, поверхность которых затем обрабатывают сначала 0.1 М NaOH в течение 40 минут, затем промывают водой, высушивают при 100°С и выдерживают в 15% растворе 3-(триметоксисилил)пропилметакрилата в толуоле в течение 17-20 часов при 20°С; в случае использования кварцевых колонок высотой 30 мм с внутренним диаметром 3 мм стадия фрезерования отсутствует, а химическая модификация аналогична способу, описанному для стеклянных пластин.
Синтез макропористого полимерного материала монолитного типа осуществляют методом радикальной сополимеризации в форме соответствующего дизайна (колонка или планарная ячейка) с использованием фотоинициирования, а именно УФ-облучением с длинной волны 320 нм. Полимеризацию проводят в инертной атмосфере при комнатной температуре. Содержание смеси мономеров было постоянно во всех экспериментах (мол.%): ГФИАК - 13.4, ГМА - 53.3, ЭДМА - 33.3. Соотношение мономеры : порообразующие вещества в смеси составляет 40:60 или 25:75 об.%. В качестве порообразующих веществ используют композиции различного состава, состоящие из 1,4-диоксана, додеканола, полиэтиленгликоля с молекулярными массами 400 и 600 (ПЭГ-400 и ПЭГ-600). Во всех композициях порогенов доля 1,4-диоксана была постоянна и равна 42 мас.%. Долю остальных порогенов варьируют, как представлено в Таблицах 1-3.
Концентрация инициатора в реакционной среде составляет 0.8-1.0 мас.%. В качестве инициаторов полимеризации использовали 2-гидрокси-2,2-диметилацетофенон или метиловый эфир бензоина. Для приготовления полимеризационной смеси в сосуд, содержащий предварительно взвешенный инициатор, вносят порообразующие вещества, а затем добавляют смесь мономеров. С целью удаления молекулярного кислорода, ингибирующего процесс полимеризации, через реакционную смесь пропускают азот в течение 5 минут. Далее смесь помещают в реакционную форму, а именно предварительно полученные на стекле и обработанные силанизирующим агентом ячейки или кварцевые колонки, и облучают в течение 30 или 50 минут соответственно. После завершения процесса полимеризации полученный сополимер промывают несколькими порциями этилового спирта для удаления остатков непрореагировавших мономеров, а также порообразующих веществ, и высушивают в вакууме при 40°С в течение суток. При прочих равных условиях синтеза поровые характеристики полученных макропористых материалов на основе сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА не зависят от геометрического дизайна (колонки или слои) материала и определяются только композиционным составом полимеризационной смеси.
Для получения аффинного сорбента в порах полимерного материала проводят ковалентную иммобилизацию биологических макромолекул (белков) с получением биологического аффинного зонда. Максимум количества белка, связанного с сорбентом посредством реакции по активированным сложноэфирным группам, достигается в щелочных условиях (рН 9.4) при концентрациях раствора белка 4-5 мг/мл и составляет 0.25-0.30 мкмоль белка/г сополимера. Время достижения максимума составляет 2 часа. Реакцию проводят при температуре 20-22°С. Полученный аффинный сорбент хранят при 4°С в 0.01 М натрий-фосфатном буфере, рН 6.8-7.0, с добавлением 0.15 моль/л хлорида натрия и 0.2% азида натрия.
Пример 1. Предварительную обработку поверхности реакционной формы проводили единообразно и так, как описано выше. Для синтеза использовали мономеры 97-99% чистоты. Соотношение мономеры : порообразующие вещества в смеси составляло 25:75 об.%. Состав смеси мономеров был следующим и постоянным во всех экспериментах (мол.%): ГФИАК - 13.4, ГМА - 53.3, ЭДМА - 33.3. Состав композиций порообразующих веществ представлен в Таблице 1. С целью оптимизации полимеризационный процесс осуществляли в условиях вариации концентрации инициатора в пределах 0.2-2.0 мас.% и времени облучения от 5 до 60 мин. Изучение зависимости выхода сополимера от концентрации инициатора и времени облучения показало, что оптимальная концентрация инициатора составляет 1.0 мас.% для 2-гидрокси-2,2-диметилацетофенона и 0.8 мас.% в случае метилового эфира бензоина. Оптимальное время полимеризации - 30 мин для слоев и 50 мин для колонок. Проведение синтеза в оптимальных условиях обеспечивает максимальный выход полимерного продукта, равный 90-95%.
Таблица 1
Материал
Композиция порообразующих веществ (мас.%)
Средний размер пор, нм
S<sub>уд</sub>., м<sup>2</sup>/г
Пористость, %
1,4-диоксан - 42;
1160
5
55
M1
додеканол - 17;
ПЭГ-400 - 41
1,4-диоксан - 42;
М2
додеканол-23;
1350
5
55
ПЭГ-400 - 35
1,4-диоксан - 42;
М3
додеканол - 29;
1570
4
54
ПЭГ-400 - 29
1,4-диоксан - 42;
М4
додеканол-35;
1610
4
50
ПЭГ-400 - 23
1,4-диоксан - 42;
М5
додеканол - 23;
1450
44
70
ПЭГ-600 - 35
1,4-диоксан - 42;
М6
додеканол - 29;
1900
14
61
ПЭГ-600 - 29
-1
Качественное исследование сополимера проводили методом ИК-спектроскопии. Введение ГФИАК в структуру тройного ГФИ-ГМА-ЭДМА сополимера по сравнению с двойным ГМА-ЭДМА сополимером подтверждалось появлением в спектре двух характеристических полос поглощения при 1788 и 1817 см, соответствующих валентным колебаниям сложноэфирных и имидных карбонилов.
Содержание функционального мономера ГФИАК устанавливали методом элементного анализа. Показано, что содержание ГФИАК в тройном сополимере составляет 9-10 мол.%. Поверхность макропористых материалов исследовали методом растровой электронной микроскопии. Поверхность полученных материалов имела однородную микроглобулярную структуру.
Поровые характеристики, а именно средний размер пор, удельную площадь поверхности, распределение пор по размерам и общую пористость, полученных материалов оценивали методом интрузионной ртутной порозиметрии. В зависимости от использованной системы порообразующих веществ средний размер пор полученных материалов лежал в интервале от 1160 до 1900 нм. Увеличение доли более гидрофобного компонента смеси - додеканола - в смеси приводило к увеличению среднего размера пор.
2
2
Согласно данным интрузионной ртутной порозиметрии материалы М1-М4 характеризовались узким мономодальным распределением пор с долей макропор >100 нм в интервале 80-90%. При этом значение удельной площади поверхности составляло 4-5 м/г. В случае образцов М5 и М6, т.е. при переходе от ПЭГ-400 к ПЭГ-600, имело место бимодальное поровое распределение с долей макропор >100 нм, равной 70-80%, и долей мезопор <50 нм, соответствующей 7-8%, что в свою очередь выражалось в увеличении значения удельной площади поверхности до 14 и 44 м/г. Значения общей пористости находились в интервале 50-70%.
Получение аффинных сорбентов и их тестирование осуществляли с использованием модельных аффинных пар: ингибитор трипсина - трипсин и мышиный иммуноглобулин G - антитела к мышиному иммуноглобулину G, полученные путем иммунизации коз. В качестве образцов сорбента использовали материалы M1-М6. Введение макромолекул белка в качестве аффинных зондов (лигандов) осуществляется путем проведения прямых реакций ковалентного связывания с поверхностью макропористого материала. Концентрацию раствора белка варьировали в пределах от 0.2-5.0 мг/мл; значения рН буферных растворов, используемых для иммобилизации аффинных лигандов, составляли 7.4 и 9.4. Показано, что максимум количества связанного с полимерным материалом белка (лиганда) достигался в щелочных условиях (рН 9.4) при концентрациях раствора белка 3-5 мг/мл. Время достижения максимума составляло 2 часа. Важно отметить, что эпоксидные группы, входящие в состав сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА, не участвуют в процессе иммобилизации в течение выбранного времени реакции (2 часа). Несмотря на то, что количество активированных сложноэфирных групп в сополимере ГФИАК-ГМА-ЭДМА в 4 раза меньше количества эпоксидных групп в сополимере ГМА-ЭДМА, полученное значение максимального связанного лиганда для тройного сополимера было в 1.5-2 раза выше, чем для известного аналога. Если проводить реакцию в течение 16 часов, допуская протекание иммобилизации также и по эпоксидным группам, то суммарная иммобилизационная емкость для сорбента на основе сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА будет в 2.5-3 раза выше, чем для случая известного двойного сополимера ГМА-ЭДМА.
Аффинные сорбенты, полученные в виде колонок, были протестированы в модельных экспериментах по аффинной хроматографии, а планарные - в качестве биологических микрочипов. Наилучшие результаты, выражающиеся в более высокой эффективности аффинного связывания, были получены для материалов М5 и М6.
Пример 2. Соотношение мономеры : порообразующие вещества в смеси составляло 40:60 об.%. Вариации систем порогенов и характеристики полученных макропористых материалов на основе сополимера ГФИАК-ГМА-ЭДМА представлены в Таблице 2. В качестве реакционной формы использовали ячейки стеклянных пластин. Прочие условия и общая методология синтеза были аналогичными таковым описанным в Примере 1.
2
Согласно данным ртутной порозиметрии средний размер пор полученных материалов М7-М10 лежал в пределах 60-170 нм в зависимости от использованной системы порообразующих веществ. Увеличение доли более гидрофобного компонента смеси - додеканола, также, как и в Примере 1, приводило к увеличению среднего размера пор. Значения удельной площади поверхности уменьшаются при увеличении среднего размера пор с 85 до 52 м/г при переходе от материала М7 к М10. Значения общей пористости лежали в интервале 47-52%. Таким образом, уменьшение доли порообразующих веществ в полимеризационной смеси с 75 до 60% сопровождалось существенным уменьшением среднего размера пор (см. Таблицы 1 и 2).
В случае использования материалов М9 и М10 в качестве платформ для непроточного микроанализа (биологические микрочипы) существенно возрастало время, требуемое для реализации промывных процедур. Так стандартная процедура промывания для данных материалов занимала 2 часа вместо 40 минут для материалов с размером пор более 1000 нм (M1-М6). В то же время увеличение удельной площади поверхности в случае образцов М9 и M10 благоприятно влияло на чувствительность биоанализа, которая была в 1.5-2 раза выше, чем в случае использования материалов М1-М6.
Таблица 2
Материал
Композиция порообразующих веществ (мас.%)
Средний размер пор, нм
S<sub>уд.</sub>, м<sup>2</sup>/г
Пористость, %
1,4-диоксан - 42;
М7
додеканол - 17;
60
85
52
ПЭГ-600 - 41
1,4-диоксан - 42;
М8
додеканол - 23;
70
78
50
ПЭГ-600 - 35
1,4-диоксан - 42;
М9
додеканол - 29;
130
58
50
ПЭГ-400 - 29
1,4-диоксан - 42;
М10
додеканол - 35;
170
52
47
ПЭГ-400 - 23
Пример 3. В качестве порообразующих веществ использовали 1,4-диоксан, циклогексанол, додеканол и ПЭГ-600. Вариации систем порообразующих веществ и характеристики полученных макропористых материалов представлены в Таблице 3. Прочие условия синтеза были аналогичными таковым, описанным в Примере 1.
2
Согласно данным ртутной порозиметрии средний размер пор полученных материалов М11-М16 лежал в пределах 15-65 нм в зависимости от использованной системы порообразующих веществ. Добавление в систему циклогексанола и увеличение его доли в системе (образцы M13-М16) приводило к незначительному увеличению среднего размера пор от 30 (образец M11) до 65 нм (образец М13). Данные материалы характеризовались очень низкими значениями общей пористости. Значения удельной площади поверхности лежали в интервале 85-155 м/г и были обратно пропорциональны среднему размеру пор.
Таблица 3
Материал
Композиция порообразующих веществ (мас.%)
Средний размер пор, нм
S<sub>уд.</sub>, м<sup>2</sup>/г
Пористость, %
М11
1,4-диоксан - 42; циклогексанол - 58
30
155
40
М12
1,4-диоксан - 42; ПЭГ-600 - 58
15
-
-
М13
1,4-диоксан - 42; циклогексанол - 17; ПЭГ-600 - 41
25
138
40
М14
1,4-диоксан - 42; циклогексанол - 29; ПЭГ-600 - 29
30
142
40
М15
11,4-диоксан - 42; циклогексанол - 29; додеканол - 29
20
-
42
М16
1,4-диоксан -42; циклогексанол - 17; додеканол - 41
65
85
42
Таким образом, способ синтеза оригинальной химической структуры заявляемого материала позволяет получить большое количество вариаций поровых характеристик. Характеристики материалов, а именно средний размер пор, распределение пор по размерам, удельная площадь поверхности, общая пористость являются однородными, контролируемыми, воспроизводимыми и могут быть стандартизованы. Предсказуемость процесса иммобилизации белка, а также высокая реакционная способность активированных сложноэфирных групп обеспечивает меньший расход дорогостоящего биологического материала и большую иммобилизационную емкость сорбента.