ЗУБНАЯ ПАСТА, СОДЕРЖАЩАЯ СМЕСЬ ЛИЗАТОВ БАКТЕРИЙ
TOOTH PASTE CONTAINING MIXED BACTERIAL LYSATE

Предпосылки создания изобретения
1. Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии. С целью повышения очищающего, противомикробного и иммуностимулирующего действия, восстановления естественной микрофлоры полости рта, разработана зубная паста, для изготовления которой используются лизаты бактерий, ферменты: папаин и лизоцим. Предлагаемая зубная паста позволяет активировать фагоцитоз, увеличить содержание лизоцима слюны, способствует увеличению количества иммунокомпетентных клеток. Зубная паста обладает хорошими органолептическими свойствами: она белого цвета, с приятным запахом и хорошими вкусовыми свойствами.
2. Уровень техники
Композиции для полости рта, такие как зубные пасты, гели, эликсиры, бальзамы, ополаскиватели предназначены, главным образом, для удаления зубного налета и/или предупреждения его образования при регулярном использовании. Зубной налет представляет собой многокомпонентный, постоянно формирующийся биотоп полости рта, основу которого составляют практически все представители микрофлоры полости рта в конгломерате с протеинами и полисахаридами. Антигены этих микроорганизмов стимулируют активность факторов иммунобиологической резистентности организма. В процессе образования зубного налета происходит выраженное изменение состава микрофлоры. В первой фазе, длительностью 2-4 часа образуется ранний зубной налет с преобладанием аэробных и факультативно-анаэробных бактерий - стрептококки, стафилококки, нейссерии и лактобактерии. Общее содержание бактерий составляет не более 100-1000 в 1 г. Во второй фазе (4-5-е сутки) происходит сдвиг аэробной и факультативно-анаэробной микрофлоры в сторону анаэробных лептотрихий и фузобактерий. Общее содержание бактерий увеличивается до 1-10 млн. в 1 г. В третьей фазе (6-7-е сутки и далее) заканчивается формирование качественного состава зубного налета - резко снижается содержание аэробов и факультативных анаэробов и преобладают облигатные анаэробы (бактероиды, фузобактерии, вейлонеллы, актиномицеты, пептострептококки), выделяющие комплекс токсических веществ, вызывающих разрушение Ig A и Ig G, резкий сдвиг pH в кислую сторону, что приводит к прогрессированию микробной инвазии, развитию кариеса и заболеваний пародонта.
Из уровня техники известны различные лечебно-профилактические зубные пасты, используемые для профилактики воспалительных заболеваний пародонта, содержащие противовоспалительные и противомикробные компоненты, например, экстракты лекарственных растений и витамины (Лечебно-профилактическая зубная паста «Silca Herb plus» (Германия) и масло чайного дерева зубная паста «Natural whitening toothpaste with tea tree oil» (США). Однако данная паста обладает низкой очищающей способностью, поскольку не содержит компонентов, направленно растворяющих зубной налет.
Известна зубная паста Lacalut Brilliant White Menta, удаляющая зубной налет за счет высокообразивных соединений.
Известна зубная паста с фермент-содержащей композицией, где фермент выбран из группы протеиназ, включающей в себя папаин, разрушающий белковую основу зубного налета (Отбеливающая зубная паста «Rembrandt» (США), а также паста, содержащая лизоцим, глюкозооксидазу, лактопероксидазу и лактоферрин (зубная паста «Biotene» (Финляндия), которая применяется для лечения ксеростомии. Описанная зубная паста в процессе чистки зубов генерирует активные формы кислорода и способна влиять только на аэробные и факультативно-анаэробные бактерии.
Из RU 2407512 С1 известна зубная паста, содержащая ферменты папаин; декстраназу; альфа-амилазу; инвертазу или глюкоамилазу; глюкозооксидазу; лактопероксидазу; лизоцим или лактоферрин, для восстановления микрофлоры полости рта и профилактики воспалительных заболеваний пародонта.
Из RU 2333768 C2 известны фермент-содержащие композиции с цетилпиридинием хлоридом с улучшенными гигиеническими свойствами против зубного налета.
Известен адгезивный бальзам для десен Асепта, содержащий хлоргексидина биглюконат - антисептик, эффективный против аэробных и факультативно-анаэробных бактерий и метронидазол - антибактериальный компонент, эффективный в отношении анаэробных бактерий и простейших.
Известна гелевая зубная паста Дентофам, содержащая концентрат бактериофагов, селективная в отношении видов Streptococcus и Staphylococcus.
Известен препарат «Лизоцим», выпускаемый в виде герметично укупоренных флаконах по 0,05; 0,1 и 0,15 г, оказывающий бактериолитическое действие и обладающий способностью стимулировать неспецифическую реактивность организма. Лизоцим катализирует реакцию гидролиза 1,4-связей между N-ацетилмурамовой кислотой и 2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкозой (N-ацетилглюкозамин), содержащихся в мукополисахаридах, мукопептидах и хитине клеточных стенок бактерий, грибов и простейших, обладает ярко выраженным антимикробным (разрушает клеточные стенки большинства грам-положительных и некоторых грам-отрицательных бактерий), микостатическим (задерживает развитие микроскопических грибов), а также ранозаживляющим действием. (Найдено из Интернет: <URL:http://provizor.org/node/11671)
Известен фермент папаин - растительный протеолитический фермент класса гидролаз, проявляющий широкую субстратную специфичность: катализирует гидролиз пептидных связей в белках и пептидах, а также гидролизует амиды, эфиры и тиоэфиры. (Найдено из Интернет:
<URL:http://slovari.yandex.ru/%D0%BF%D0%B0%D0%BF%D0%B0%D0%B8%D0%BD/%D0%91%D0%A1%D0%AD/%D0%9F%D0%B0%D0%BF%D0%B0%D0%B8%D0%BD/)
Известна лечебно-профилактическая зубная паста N-ZIM Prebio, выпускаемая компанией Артлайф с 2009 года (Лечебно-профилактическая зубная паста N-ZIM Prebio. 02.08.2011, Найдено из Интернет: <URL:http://www.artlife-chel.ru/main/466-n-zim-prebio>), включает лизат лактобактерий, который повышает местный иммунитет, препятствуя тем самым размножению патогенных микроорганизмов в полости рта и сохранению полезной микрофлоры. Зубная паста N-Z1M Prebio содержит также фермент папаин, который эффективно расщепляет зубной налет без повреждения зубной эмали.
Согласно данным компании Артлайф, зубная паста N-ZIM Prebio содержит: воду деминерализованную, сорбит, диоксид кремния, дикальций фосфат дигидрат, полиэтиленгликоль, натрий лауроилсаркозинат, натрий карбоксиметилцеллюлозу, ароматизатор, Д-пантенол, натрий лаурилсульфат, лизин, диоксид титана, папаин, натрий фтористый, аминофторид, аллантоин, сахарин, лизат лактобактерий, метилпарабен, пропилпарабен, стевиозид, экстракт алоэ; при этом массовая доля фторида составляет не менее 0,1%.
Заявленная зубная паста отличается от зубной пасты N-ZIM Prebio тем, что в качестве лизата бактерий содержит лизаты бактерий: Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactus, и, кроме того, паста содержит фермент лизоцим и тетракалия пирофосфат.
Известно использование лизата бактерий для местного применения в полости рта для лечения и профилактики воспалительных заболеваний полости рта и глотки, в частности, гингивита, пародонтоза, пародонтита, стоматита и т.п., в виде препарата Имудон в форме таблеток для рассасывания, содержащий смесь лизатов бактерий: 50 мг (сухого вещества): Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactus (Регистр лекарственных средств России РЛС Энциклопедия лекарств. 16-й вып., М., «РЛС-2008», 2007, с.351 ИМУДОН (IMU-DON)).
Заявленная зубная паста отличается от препарата Имудон тем, что используется, в том числе и для гигиены полости рта и содержит ферменты папаин и лизоцим, причем следует отметить, что лизоцим является фактором неспецифического иммунитета и усиливает иммуностимулирующее действие лизатов бактерий. Папаин гидролизует пептидные связи лизатов, что приводит к образованию большего числа соединений, обладающих иммуностимулирующим действием. За счет комплексного воздействия на отдельные компоненты иммунопатологических процессов посредством влияния на клеточный (субпопуляции Т-лимфоцитов, лимфокины) и гуморальный (В-лимфоциты, иммуноглобулины) иммунитет, способности расщеплять циркулирующие в крови и фиксированные в тканях иммунные комплексы, папаин оказывает регулирующее влияние на компоненты комплемента и адгезивные молекулы (ICAM-1, LFA и др.).
Из RU 2355420 и RU 2381021 известны композиции зубных паст, включающие ферменты, в частности, лизоцим и папаин, а также тетракалия пирофосфат.
Заявленная зубная паста отличается от RU 2355420 и RU 2381021 тем, что содержит лизаты бактерий.
Композиции для полости рта, такие как зубные пасты, гели, эликсиры, ополаскиватели, для изготовления которых используют: ферменты: папаин, лизоцим и лизаты бактерий: Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactus не описаны.
Таким образом, задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить композицию для полости рта, состав исходных компонентов которой включает: папаин, лизоцим и лизаты бактерий: Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactus, которая может быть использована для гигиены полости рта, активации фагоцитоза, увеличения содержание лизоцима слюны, количества иммунокомпетентных клеток, восстановления микрофлоры полости рта и профилактики воспалительных заболеваний пародонта, вызываемых кариесогенными микроорганизмами, такими как S. mutans, S. aureus и другие.
Сущность изобретения
Согласно настоящему изобретению неожиданно обнаружено, что введение в состав зубной пасты в качестве исходных компонентов: папаина, лизоцима и лизатов бактерий: Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactus способствует значительному повышению иммуностимулирующей эффективности.
Описание предпочтительных воплощений
Лизаты бактерий: Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactus вводят в зубную пасту в концентрации от 0,001 до 5,0 мас.%, и, предпочтительно, от 0,01 до 5,0 мас.%.
Ферменты, которые могут быть использованы при осуществлении на практике настоящего изобретения представлены протеазами, гидролизующими белки и лизоцимом. В качестве протеолитических ферментов могут быть использованы растительные протеазы: папаин и бромелайн в концентрации от 0,01 до 5,0 мас.% и, предпочтительно, от 0,1 до 5,0 мас.%.
Лизоцим, полученный из яичного белка, с молекулярной массой примерно 15000 а.е.м. обладает противомикробным действием в отношении грамположительных бактерий и в меньшей степени грамотрицательных, гидролизуя фрагменты пептидогликановой стенки бактерий и может быть использован в концентрации от 0,01 до 5,0 мас.% и, предпочтительно, от 0,1 до 5,0 мас.%.
Зубная паста
При получении зубной пасты лизаты бактерий и ферменты смешивают с основой зубной пасты и получают продукт, способный оказывать иммуностимулирующее действие и эффективно удалять зубной налет.
Основа для зубной пасты
Приемлемые наполнители, используемые для получения зубных пасту по настоящему изобретению представлены гидрофильной фазой, состоящей из воды и увлажнителя, в качестве которого могут быть использованы пропиленгликоль, глицерин, сорбитол 70%, ПЭГ с молекулярной массой от 200 до 400 а.е.м., либо их смеси. Концентрация увлажнителя обычно составляет в сумме от 5 до 20,88 мас.%, и предпочтительно, от 5 до 20 мас.%. Вода, присутствующая в зубной пасте, будет составлять от 30,00 до 87,029 мас.%, и предпочтительно, от 34,88 до 86,23 мас.%.
Из абразивов могут быть использованы абразивы на основе диоксида кремния со средним размером частиц от 5 до 20 мкм, например Сорбосил АС 35; АС 39; ТС 15 (Inneos Silicas), Zeodent 113: 163 (J.M. Huber) и другие аналогичные по характеристикам. Другие, используемые в зубных пастах абразивы представлены трикальцийфосфатом, дикальций фосфат дигидратом, силикатом алюминия. Концентрация абразива обычно составляет в сумме от 2 до 20 мас.%, и предпочтительно, от 2 до 20 мас.%.
Из загустителей могут быть использованы природные и синтетические гидроколлоиды, такие как карбоксиметилцеллюлоза и ее соли, гидроксиэтилцеллюлоза, альгинат натрия, каррагенат натрия, ксантановая камедь под разными торговыми названиями. Концентрация загустителя обычно составляет в сумме от 0,05 до 5,0 мас.%, и предпочтительно, от 0,1 до 2,0 мас.%.
Из поверхностно-активных веществ могут быть использованы различные разрешенные к применению в средствах гигиены полости рта анионные, катионные и неионогенные поверхностно-активные вещества под разными торговыми названиями. Концентрация поверхностно-активного вещества обычно составляет в сумме от 0,1 до 2,0 мас.%, и предпочтительно, от 0,1 до 1,0 мас.%.
Из фторидов могут быть использованы натрия фторид, фторид олова, натрия монофторфосфат, аминофторид с концентрацией фторид-иона в диапазоне от 0,05 до 0,32 мас.%, и предпочтительно от 0,1 до 0,15 мас.%.
Из фосфатов могут быть использованы тетрапирофосфаты натрия и/или калия, динатрия пирофосфат, полифосфат натрия с концентрацией в сумме от 0,5 до 5,0 мас.%, и предпочтительно, от 1,0 до 5,0 мас.%.
Из антибактериальных веществ могут быть использованы метил - и пропилпарабены или их соли с концентрацией в сумме от 0,15 до 0,4 мас.%, и предпочтительно от 0,2 до 0,3 мас.%.
Из ароматизаторов могут быть использованы любые разрешенные к применению вкусо-ароматические добавки с концентрацией в диапазоне от 0,05 до 1,5 мас.%, и предпочтительно от 0,1 до 1,5 мас.%.
Другие компоненты, которые могут быть введены в состав зубной пасты представлены десенсибилизаторами, отбеливающими добавками, красителями без оказания существенного воздействия на свойства и характеристики зубной пасты по данному изобретению.
Получение зубной пасты
Зубную пасту по данному изобретению обычно изготавливают общепринятыми способами, используя твердые или жидкие косметически приемлемые носители или эксципиенты, выбранные из эмульгаторов, диспергирующих агентов, консервантов, ароматизаторов, регуляторов pH, полимерных носителей и других эксципиентов, которые целесообразны для приготовления композиций для местного применения.
Примеры
В качестве воплощения заявленного изобретения предложена зубная паста, состав исходных компонентов которой включает, в масс.%: 0,001-5,0 лизатов бактерий Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactus, 0,01-5,0 лизоцима; 0,01-5,0 папаина; 2,00-20,00 абразивного компонента; 5,00-20,88 увлажнителя; 0,05-5,0 гидроколлоида; 0,10-2,00 поверхностно-активного вещества (ПАВ); 0,05-0,32 натрия фторида; 0,50-5,00 тетракалия пирофосфата; 0,15-0,40 консерванта; 0,05-1,50 ароматизатора; 30,00-87,029 воды.
В качестве предпочтительного воплощения заявленного изобретения предложена зубная паста, указанная выше, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Папаин
0,1-5,00
Абразивный компонент
2,00-20,00
Увлажнитель
5,00-20,00
Лизаты бактерий
0,01-5,00
Гидроколлоид
0,10-2,00
ПАВ
0,10-1,00
Натрий фторид
0,05-0,32
Лизоцим
0,01-5,00
Тетракалия пирофосфат
1,00-5,00
Консервант
0,20-0,30
Ароматизатор
0,10-1,50
Вода деминерализованная
34,88-86,23
Активными ингредиентом заявленной зубной пасты являются: папаин, лизоцим, лизаты бактерий Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactus. Папаин гидролизует пептидные связи лизатов, что приводит к образованию большего числа соединений, обладающих иммуностимулирующим действием. За счет комплексного воздействия на отдельные компоненты иммунопатологических процессов посредством влияния на клеточный (субпопуляции Т-лимфоцитов, лимфокины) и гуморальный (В-лимфоциты, иммуноглобулины) иммунитет, способности расщеплять циркулирующие в крови и фиксированные в тканях иммунные комплексы, папаин оказывает регулирующее влияние на компоненты комплемента и адгезивные молекулы (ICAM-1, LFA и др.).
Лизаты бактерий активируют фагоцитоз, увеличивают содержание лизоцима слюны, способствует увеличению количества иммунокомпетентных клеток.
Лизоцим, полученный из яичного белка, с молекулярной массой примерно 15000 а.е.м. является фактором неспецифического иммунитета, обладает противомикробным действием в отношении грамположительных бактерий и в меньшей степени грамотрицательных, гидролизуя фрагменты пептидогликановой стенки бактерий.
Таким образом, комплексное использование вышеуказанных активных компонентов приводит к следующему результату: модификация зубного налета с образованием легко удаляемых водорастворимых соединений, активация иммунной системы с целью противомикробной и защиты от воздействия патогенных микроорганизмов. Для приготовления зубной пасты используют субстанции: «Папаин», «Лизаты бактерий Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactus», «Лизоцим». Лиофильно высушенный порошок «Папаин» используется в медицине совместно с лизоцимом для лечения межпозвоночной грыжи, в виде присыпок и примочек в стоматологии при гингивите и пародонтите, и других воспалительных состояниях полости рта. Лизаты бактерий Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactus используются для лечения и профилактики дисбактериоза, ЛОР-заболеваний и воспалительных заболеваний пародонта.
Дополнительными преимуществами указанной композиции являются способность оказывать иммуностимулирующее действие.
Предлагаемая зубная паста уменьшает образование налета на 58,33% и совершенно безвредна и безопасна при длительном применении.
Существенными отличиями предлагаемой зубной пасты являются следующие.
Заявленная зубная паста обладает стабильностью в отношении активности ферментов, входящих в ее состав, при длительном хранении, которая достигается путем иммобилизации ферментов на полимерных носителях, содержащихся в указанной композиции. В качестве указанных полимерных носителей могут быть использованы любые полимеры, способные связываться с ферментами с образованием комплексов фермент-носитель. Примерами таких полимерных носителей являются альгинат натрия (FMC) и натрий карбоксиметилцеллюлоза (Hercules).
Активность заявленной зубной пасты обусловлена активностью входящих в ее состав ферментов и лизатами бактерий. Обнаружено, что зубная паста, состав исходных компонентов которой включает, в масс.%: 0,001-5,0 лизатов бактерий Streptococcus pyogenes groupe A, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcus sanguis, Staphylococcus aureus subsp. aureus, Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum, Candida albicans, Lactobacillus acidophilius, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactus, 0,01-5,0 лизоцима; 0,01-5,0 папаина; 2,00-20,00 абразивного компонента; 5,00-20,88 увлажнителя; 0,05-5,0 гидроколлоида; 0,10-2,00 поверхностно-активного вещества (ПАВ); 0,05-0,32 натрия фторида; 0,50-5,00 тетракалия пирофосфата; 0,15-0,40 консерванта; 0,05-1,50 ароматизатора; 30,00-87,029 воды, обладает стабильностью в отношении активности ферментов при ее длительном хранении, в то время как активность этих ферментов, приготовленных в виде раствора, быстро падает. Следовательно, заявленная композиция может быть использована для эффективной профилактики воспалительных заболеваний пародонта.
Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.
ПРИМЕР 1
Зубная паста, для изготовления которой используются папаин, лизоцим, лизаты бактерий и другие косметически приемлемые носители или эксципиенты имеет следующий состав:
Папаин
0,01
Диоксид кремния
2,00
Сорбитол 70%
10,00
Лизаты бактерий
0,001
Альгинат натрия
0,50
Полисорбат-20
0,10
Натрий фторид
0,05
Лизоцим
0,01
Тетракалия пирофосфат
0,50
Консервант
0,15
Ароматизатор
0,05
Вода деминерализованная
86,629
Указанную композицию готовят по следующей методике. В деминерализованной воде последовательно растворяют все компоненты кроме альгината натрия, затем добавляют альгинат натрия и перемешивают до образования геля. Полученную зубную пасту перемешивают, вакуумируют и гомогенизируют.
ПРИМЕР 2 Зубная паста, для изготовления которой используются папаин, лизоцим, лизаты бактерий и другие косметически приемлемые носители или эксципиенты имеет следующий состав:
Папаин
5,00
Дикальций фосфат дигидрат
20,00
Глицерин
20,00
Лизаты бактерий
5,00
Натрий КМЦ
5,00
ПЭГ-40 гидрогенизированное касторовое масло
2,00
Натрий фторид
0,32
Лизоцим
5,00
Тетракалия пирофосфат
5,00
Консервант
0,40
Ароматизатор
1,50
Вода деминерализованная
30,78
Указанную композицию готовят по следующей методике. В деминерализованной воде последовательно растворяют все компоненты кроме натрий КМЦ и дикальций фосфат дигидрата, затем добавляют натрий КМЦ и дикальций фосфат дигидрат, перемешивают до образования геля. Полученную зубную пасту перемешивают, вакуумируют и гомогенизируют.
Неожиданно обнаружено активизирующее влияние зубной пасты, содержащей лизаты бактерий на NK-клетки и моноциты. Под влиянием зубной пасты, содержащей лизаты NK-клетки представляют на клеточной поверхности активационные молекулы CD69, моноциты усиленно синтезируют и секретируют цитокины ИЛ-1β, ФНОα и ИЛ-8. Цитолитическая активность NK-клеток повышается после воздействием зубной пасты, содержащей лизаты бактерий в 3 раза. Зубная паста, содержащая лизаты бактерий оказывает отсроченное на 24 часа активирующее действие на нейтрофильные гранулоциты крови, что проявляется усилением экспрессии на этих клетках молекул CD69.
Активационное действие зубной пасты, содержащей лизаты бактерий на нейтрофилы проявляется только опосредовано через цитокины ИЛ-8 и др., которые вырабатываются активированными моноцитами.
Оценка иммуностимулирующего действия зубной пасты
Для изучения влияния зубной пасты, содержащей лизаты бактерий на клетки крови человека у здоровых доноров утром натощак забирали кровь из локтевой вены в пробирки с гепарином натрия с помощью системы «Vacutainer» («Becton Dickinson») и использовали не позднее, чем через 6 часов после получения.
2
Зубную пасту, содержащую лизаты бактерий растворяли в концентрации 1 мг на 1 мл в среде RPMI 1640 и фильтровали через фильтр с размером пор 0,22 мкм. Готовили необходимые разведения зубной пасты в полной среде RPMI 1640 в диапазоне от 0,016 до 100 мкг/мл и вносили по 0,2 мл в лунки 48-луночной панели для культивирования клеток («Nunc»), В качестве отрицательного контроля вносили 0,2 мл полной среды RPMI 1640. Во все лунки добавляли по 0,2 мл цельной гепаринизированной крови. Образцы инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO в течение 3-48 часов. После инкубации отбирали по 0,2 мл культуральной жидкости в центрифужные пробирки емкостью 0,5 мл и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочную жидкость замораживали при - 70°C и хранили до определения содержания цитокинов. Клетки, оставшиеся в лунке переносили в полиэтиленовые пробирки емкостью 1,2 мл для определения поверхностных маркеров активации методом трехцветной лазерной цитофлюориметрии.
Секрецию моноцитарных цитокинов исследовали методом ИФА в культуральной среде. Для измерения концентрации интерлейкина ИЛ-1β использовали набор фирмы «Immunotech» (Франция), для измерения концентраций фактора некроза опухоли (ФНОα) и ИЛ-8 - наборы фирмы «Innogenetics» (Бельгия). Интенсивность реакции измеряли на автоматическом фотометре «MRX Microplate Reader» («Dynex Technology Inc» (США).
2
2
3
Цитолитическую активность ТЛ-клеток изучали по следующей методике. Из цельной гепаринизированной крови выделяли мононуклеарную фракцию путем центрифугирования (30 мин. при 300 g и комнатной температуре) в ступенчатом градиенте плотности фиколла («Pharmacia»). Выделенные клетки отмывали в среде 199 и разводили до концентрации 2 млн. в 1 мл в среде RPMI 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 20 мМ HEPES-буфера (pH 7,4) и 10 мкг/мл гентамицина (полная среда-ПС). В лунки 12-луночного планшета («Nunc») вносили по 1 мл клеточной суспензии, затем добавляли по 1 мл ПС (контроль) или 1 мл раствора зубной пасты, содержащей лизаты бактерий (20 vru/vk) или 1 мл раствора ИЛ-2 (20 МЕ/мл, «Cetus»). Образцы инкубировали в течение 3 часов при 37°C в атмосфере с 5% CO. После инкубации клетки собирали в центрифужные пробирки, осаждали центрифугированием (10 мин при 300 g) и доводили их концентрацию до 5 млн. в 1 мл ПС. Полученные клетки служили эффекторами цитолиза. Серию двукратных разведении в ПС клеток-эффекторов разливали по 0,1 мл в триплетах в лунки 96-луночного круглодонного планшета. Во все лунки добавляли по 10 тыс. меченных H-уридином клеток-мишеней К-262 в объеме 0,1 мл ПС. Смесь клеток-эффекторов и клеток-мишеней инкубировали в течение 4 часов при 37°C в атмосфере 5% CO. После инкубации клетки переносили на бумажные фильтры с помощью сборщика клеток «Titertek Cell Harvester 550» и подсчитывали радиоактивность на счетчике «Wallac 1409».
Оценка стабильности ферментов в зубной пасте
Поскольку главным недостатком ферментов является их нестабильность при длительном хранении готовых форм на их основе в течение срока годности, была проведена сравнительная оценка сохранения активности фермента папаина при хранении в виде раствора и в виде композиции для местного применения. Активность папаина определяли по следующим методикам. Для определения протеолитической активности папаина использовали модифицированный метод Кунитца. За одну протеолитическую единицу принимают такое количество фермента, при воздействии которого на субстрат казеин в течение 10 минут в стандартных условиях освобождается такое количество продуктов гидролиза, которое приводит к возрастанию оптической плотности при длине волны 280 нм на одну единицу.
Результаты приведены в следующей таблице.
Таблица 1
Исследуемые образцы
Основные ингредиенты
Стабильность при хранении
1
2
3
Паста №1
Согласно Примеру 1
Активность 95% для папаина в течение 1 года наблюдения
Паста №2
Согласно Примеру 2
Активность 82% для папаина в течение 1 года наблюдения
Раствор нативного фермента
-
Активность 10% для папаина в течение 7 суток
Как видно из представленной таблицы 1, введение ферментов в зубные пасты позволяет получить стабильные косметические композиции для местного применения при профилактике воспалительных заболеваний пародонта. Несмотря на то, что при введении ферментов в состав таких композиций происходит незначительная потеря ферментативной активности, при дальнейшем хранении в течение 1 года ферменты не изменяют своей активности благодаря фиксации лабильной структуры фермента полимером-носителем.
Антимикробную активность лизоцима определяли методом серийных разведении. В качестве питательной среды использовали мясопептонный бульон; в качестве тест-микроорганизмов - чистые культуры: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Esherichia coli, Candida albicans. В каждую пробирку вносили односуточную культуру в количестве 1000 клеток/мл. Культуры клеток: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Esherichia coli выращивали в пробирках на среде с мясопептонным бульоном при 37°C в течение суток, а культуру Candida albicans на агаризированной среле Сабуро при 24°C двое суток. Титрование начинали с концентрации 10 мг/мл (с разведения 1/10). В качестве контроля использовали пробирку, в которую вносилась только питательная среда и микроорганизм. Концентрацию в последней пробирке с отсутствием роста принимали за минимальную ингибирующую концентрацию. Для оценки бактерицидного действия из пробирок с отсутствием роста сделали пересев на чашки с мясопептонным бульоном. Чашки термостатировали при 37°C в течение суток. Бактерицидное действие отмечали в случае отсутствия роста на плотной питательной среде.
Таблица 2
Наименование ингредиента
Staphylococcus aureus
Bacillus cereus
Esherichia coli
Candida albicans
МИК, мг/мл
МЦК, мг/мл
МИК, мг/мл
МЦК, мг/мл
МИК, мг/мл
МЦК, мг/мл
МИК, мг/мл
МЦК, мг/мл
Лизоцим
2
4
2
4
20
40
30
50
Как видно из таблицы 2 оптимальная ингибирующая концентрация составляет: для лизоцима: 2 мг/мл - в случае Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli; 30 мг/мл - для Candida albicans; бактерицидная концентрация для лизоцима - 4 мг/мл - в случае Staphylococcus aureus, Bacillus cereus; 40 мг/мл -для Escherichia coli; 50 мг/мл - для Candida albicans;
Клинические испытания предлагаемой зубной пасты проводили в течение одного месяца на 30 добровольцах в возрасте 21-24 лет, клинически здоровых, без деформаций зубов и челюстей. Для определения очищающего действия пасты проводили контролируемую и неконтролируемую чистку зубов предлагаемой пастой. Контролируемую чистку зубов пробанты проводили согласно методике, предложенной в «Методических указаниях по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытаниям профилактических и лечебных зубных паст» (Москва-София, 1983), в течение 3 мин на 1-й, 7-й, 14-й, 21-й и 28-1 день. В остальные дни пробанты чистили зубы той же щеткой и пастой, утром и вечером, в домашних условиях без контроля. Перед контролируемой чисткой и после нее проводилось определение индекса гигиены по Грину-Вермиллиону:
Количественная оценка проводилась по 4-х бальной системе:
- окрашивание всей поверхности коронки зуба оценивалось в 3 балла;
- окрашивание 2/3 поверхности коронки зуба оценивалось в 2 балла;
- окрашивание 1/3 поверхности коронки зуба оценивалось в 1 балл;
- отсутствие окрашивания поверхностей зубов оценивалось в 0 баллов.
Расчет показателей индекса гигиены по Грину-Вермиллиону проводился по формуле:
ср
К=К/n, где
ср
К - усредненный цифровой показатель индекса гигиены у всех зубов, у которых проводилось определение показателей индекса;
К - общая сумма значений индекса у всех зубов, у которых проводилась оценка показателей;
n - число зубов, у которых проводилась оценка показателей.
Очищающая эффективность зубной пасты рассчитывалась по формуле:
до1
доX
до1
Очищающая эффективность=[(ИГ-ИГ)/ИГ]×100, где
до1
ИГ - показатель индекса гигиены полученный при первичном осмотре, до чистки зубов;
доX
ИГ - показатель индекса гигиены полученный при последующем осмотре (7, 14, 21, 28 дни осмотра), до чистки зубов.
Редукция зубного налета при однократной чистке зубов определялась по формуле, при каждой контролируемой чистке зубов:
доX
послеX
доX
Редукция=[(ИГ-ИГ)/ИГ]×100, где
доX
ИГ - показатель индекса гигиены полученный при осмотре перед началом контролируемой чистки зубов (1, 7, 14, 21, 28 дни);
послеX
ИГ - показатель индекса гигиены полученный при осмотре после проведения контролируемой чистки зубов (1, 7, 14, 21, 28 дни).
Из табл.3, 4 и 5 видно, что предлагаемая зубная паста обладает повышенной очищающей способностью, а следовательно и противокариесным эффектом за счет более выраженного удаления зубных отложений и обеспечивает удаление 58,33% зубного налета.
Для определения противовоспалительных свойств предлагаемой зубной пасты все пробанты (те же 30 человек) проводили контролируемую чистку зубов в течение одного месяца.
Противовоспалительное действие пасты оценивалось по изменению состояния прикрепленной к зубам десны с помощью индекса РМА по формуле:
Индекс РМА=[Сумма показателей /(3×число зубов)]×100, где
Р - воспаление десневого сосочка, которое оценивается в 1 балл;
М - воспаление десневого края, которое оценивается в 2 балла;
А - воспаление прикрепленной десны альвеолярного отростка, которое оценивается в 3 балла.
Оценка противовоспалительного действия зубной пасты проводилась на основании анализа динамики индекса РМА, который определяли при повторных осмотрах на 1-й, 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни. Противовоспалительная эффективность рассчитывалась по формуле:
1
x
1
Противовоспалительная эффективность=[(PMA-РМА)/РМА]×100, где
1
РМА - показатель индекса РМА полученный при первичном осмотре в 1-й день исследования;
x
РМА - показатель индекса РМА полученный при последующем осмотре (7, 14, 21 и 28 дни).
Данные приведены в табл.6 и 7. Из них наглядно видно, что после использования данной пасты состояние тканей пародонта значительно улучшалось: у 100% пробантов исчезали явления катарального гингивита, а индекс РМА снижался с 48,3 до 6,2, что соответствовало 87,16% противовоспалительной эффективности данной пасты.
Оценка кровоостанавливающего действия проводилась по индексу кровоточивости Кечке:
I степень - редко, оценивается в 2 балла;
II степень - во время чистки зубов, оценивается в 4 балла;
III степень - во время еды и самопроизвольно, оценивается в 8 баллов.
Кровоостанавливающая эффективность определялась по формуле:
1
x
1
Кровоостанавливающая эффективность=[(ИК-ИК)/ИК×100, где
1
ИК - индекс кровоточивости в начале исследования;
x
ИК - индекс кровоточивости в конце эксперимента.
Данные приведены в табл.8 и 9. Из них видно, что после использования данной пасты состояние тканей пародонта улучшается, и кровоточивость десен снижается с 2,5 до 0,6 баллов, что соответствует 76% кровоостанавливающей эффективности данной пасты.
Таким образом, предлагаемая зубная паста обладает более высоким очищающим (58,33% очищающая эффективность), противовоспалительным (87,16% противовоспалительный эффект) и кровоостанавливающим (76% кровоостанавливающая эффективность) эффектом.
Табл.3
Состояние
OHI-S Green-Vermillion
1-й день
7-й день
14-й день
21-й день
28-й день
До чистки
2,4
2,0
1,6
1,13
1,00
После чистки
1,3
1,1
1,0
0,82
0,78
Табл.4
Редукция зубного налета при однократном использовании зубной пасты
1-й день
7-й день
14-й день
21-й день
28-й день
45,83%
45,0%
37,5%
27,43%
22,0%
Табл.5
Очищающая эффективность пасты (по сравнению с 1-м днем)
7-й день
14-й день
21-й день
28-й день
16,67%
33,33%
52,92%
58,33%
Табл.6
Индекс РМА
1-й день
7-й день
14-й день
21-й день
28-й день
48,3%
27,5%
15,8%
10,09%
6,2%
Табл.7
Противовоспалительная эффективность
7-й день
14-й день
21-й день
28-й день
43,06%
67,29%
79,11%
87,16%
Табл.8
Индекс кровоточивости по Кечке
1-й день
7-й день
14-й день
21-й день
28-й день
2,5
2,1
1,8
1,3
0,6
Табл.9
Кровоостанавливающая эффективность
7-й день
14-й день
21-й день
28-й день
16,0%
28,0%
48,0%
76,0%