Энтерококки и специфичные к ним бактериофаги в составе кисломолочных продуктов

научная публикация

энтерококки и специфичные к ним бактериофаги в составе кисломолочных продуктов

УДК 578.81:579.678

Бактерии рода Е^егососи (энтерококки) являются естественными обитателями кишечника человека, они одними из первых колонизируют организм новорожденных, а система врожденного иммунитета не распознает их как «врагов». Считается, что в норме в толстом кишечнике на грамм содержимого должно приходиться от 105 до 108 жизнеспособных клеток энтерококков.

Ольга Дмитриева,

аспирант Белорусского государственного технологического университета

Андрей Райский,

ассистент кафедры биотехнологии и биоэкологии Белорусского государственного технологического университета, кандидат биологических наук

Наталья Белясова,

доцент кафедры биотехнологии и биоэкологии Белорусского государственного технологического университета, кандидат биологических наук

Наиболее распространенными кишечными энтерококками являются представители двух видов - Е. Iавоит и Е. IавоаНв [1]. Эти бактерии чрезвычайно устойчивы к низким значениям рН, к желчным кислотам, колебанию температуры в широких пределах, что позволяет им заселять практически все отделы кишечника. Здесь энтерококки принимают активное участие в метаболических процессах, в частности обеспечивают гидролиз сахаров (например, лактозы), синтез витаминов, расщепление жирных кислот; выполняют функции активных иммуностимуляторов, поддерживая необходимый уровень цитокинов; способствуют элиминации из кишечника патогенных бактерий [2]. Столь весомое

значение энтерококков для нормального функционирования организма обусловливает необходимость коррекции их содержания в кишечнике с помощью пробиотиков.

В то же время энтерококки являются условно-патогенными бактериями, их вирулентные штаммы считают одними из главных возбудителей внутрибольничных инфекций, вызывающих заболевания мочеполовых путей, эндокардиты, бактериемию и др. [3].

«Плохие» штаммы энтерококков отличаются от «хороших» наличием и экспрессией генов патогенности. В остальном (по морфологическим и физиолого-биохимическим свойствам) эти штаммы могут быть неразличимы. Более того, по фенотипическим признакам энтерококки очень близки к термофильным стрептококкам, в частности к Streptococcus thermophilus, которые часто используют в составе заквасок для производства ряженки, йогуртов. В результате в некоторых случаях при составлении заквасок и баккон-центратов в них ошибочно включают вместо S. thermophilus бактерии рода Enterococcus, в том числе те, которые наследуют гены патогенности [3].

Известно, что в тех экологических нишах, где присутствуют бактерии, обычно встречаются и специфичные по отношению к ним бактериофаги, которые с высокой эффективностью способны лизи-ровать клетки чувствительных штаммов в ходе продуктивной инфекции. Представлялось интересным определить, насколько распространены энтерококки и специфичные к ним фаги (энтерококкофа-ги) в составе кисломолочных продуктов и в какой степени пробиотические штаммы энтерококков чувствительны к фагам.

Для ответа на этот вопрос понадобилось выделить из кисломолочных продуктов и пробиотических препаратов энтерококки и энтерококкофаги, идентифицировать и дифференцировать их, что стало целью настоящей работы.

Выделение и культивирование молочнокислых бактерий осуществляли на пептонно-дрожжевой среде М17 с глюкозой (0,4%) в качестве источника углерода. Наличие фагов в пробах продуктов и спектр литического действия определяли полосованием лизатов на газонах тест-культур методом двойных агаровых слоев. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием набора реактивов PCR MasterMix (2х) в программируемом термоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия). Уникальные последовательности ДНК фагов вида с2 амплифицировали с помощью праймеров: (c2A: 5'-CAA TCG AAG CAG GTG TAA AAG TTC GAG AAC-3') и (c2B: 5'-GCT TTA TCC ATT TGT AGG TAT GCT TCT GC-3'); фагов вида 936 - (936A: 5'-ATC

1 в мире науки 1

AGT TGG CTC AAT GGA AGA CCA AGC GG-3') и (936B: 5'-GTT GCT TCT GCT GTT GGT GTC AAA TGA GGA-3'); фагов вида Р335 - (P335A: 5'-GAA GCT AGG CGA ATC AGT AAA CTT GCT AG-3') и (P335B: 5'-CGG CTA TCT CGT CAA TTG TTC CGG TTG C-3'); фагов термофильных стрептококков - (5'-GAA TGA TAC TGC TGG CAG TAT TTC GGT TGG -3') и (5'-CAG TCA TGT AGC TAT CGA TGA AAT TCC AAC G-3').

Состав реакционной смеси для (ПЦР): буфер для Taq-полимеразы (10х) - 2 мкл; смесь дезоксирибонуклеотидов (2мМ) -по 1 мкл; праймеры (10 мкМ) - по 1 мкл; Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 2 мкл; образец фаголизата (1 мкл, титр ~1O8 БОЕ/ мл); бидистиллированная вода - до 2O мкл. Режим амплификации для фаговых ДНК: 3 мин. при 94 °C; 35 циклов по 3O с. при 94 °C, 6O с. при 5O°C и 6O с. при 72 °C; последний шаг - 7 мин. при 72 °C. Выделение фаговой ДНК и электрофоре-тический анализ ДНК проводили общепринятыми методами, приведенными в руководстве J. Sambrook [4]. Рестрикцию фаговой ДНК осуществляли в условиях, рекомендуемых фирмой-изготовителем MBI Fermentas (Литва). Микроскопическое исследование проводили с помощью трансмиссионного электронного микроскопа марки JSM-3OO при напряжении 8O кВ. 1O мкл пробы фаговой суспензии наносили на пленки-подложки, которую смешивали с 1O мкл 2%-ного раствора фосфорновольфрамовой кис-

Таблица 1. Распространение энтерококкофагов в кисломолочных продуктах

Фаг Продукт Производитель Область

SO2, SO3 биопродукт кисломолочный, 1,7%-ной жирности ОАО «Молочные горки» Могилевская

И01 сырок творожный, 8%-ной жирности ОАО «Лепельский молочно-консервный комбинат» Витебская

И03 сметана, 25%-ной жирности ОАО «Лунинецкий молочный завод» Бресткая

И07 продукт сырный плавленый ОАО «Чаусский маслосырзавод» Могилевская

И18 сырок творожный, 20%-ной жирности ОАО «Осиповичский молочный комбинат» Могилевская

И21 йогурт молочный, 1,5%-ной жирности ОАО «Борисовский молочный комбинат» Минская

Пс03 сметана, 12%-ной жирности ОАО «Борисовский молочный комбинат» Минская

Пс05 сметана, 12%-ной жирности ОАО «Оршанский молочный комбинат» Витебская

An 1 сметана, 12%-ной жирности ОАО «Березовский сыродельный комбинат» Брестская

лоты. Выдерживали 60 с., избыток влаги удаляли фильтровальной бумагой и высушивали при комнатной температуре.

Из 10 образцов кисломолочных продуктов, произведенных на комбинатах пяти областей Республики Беларусь, выделено в виде чистых культур 26 штаммов термофильных молочнокислых кокков, которые были охарактеризованы, и для одного из них (штамм 3/1) определена принадлежность к роду Емвгососсив на основании секвенирования фрагментов гена ^-рРНК [5]. Бактерии рода ЕПеюсоссш sp. 3/1 выделены из сметаны 15%-ной жирности производства ОАО «Молочные горки» (Могилевская обл.). При использовании данных бактерий в качестве тест-культуры из образца «Продукта кисломолочного» 1,7%-ной жирности этого же комбината выделен фаг S02.

Поскольку между фагами и их хозяевами обычно существует высокая степень специфичности, можно было с высокой долей вероятности предполагать, что данный бактериофаг относится к числу энтерококкофагов.

Бактериофаги в подавляющем большинстве случаев способны адсорбироваться и инфицировать клетки представителей только одного вида (гораздо реже -рода), поэтому выделенные энтерококко-фаги S02 оказались хорошим инструментом для идентификации бактерий рода Еп1еюсосш. При этом фаготипирование по сравнению с процедурой секвениро-вания является гораздо более простым и дешевым методом идентификации бактерий.

В ходе титрования энтерококкофагов S02 на газонах 26 выделенных термо-

Г

1 г 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12

J

Рис. 1. ПЦР-продукты лизатов фаговых изолятов: 1, 12 - 100Ьр маркер; 2 - G5

Рис. 2. Рестрикционные профили ДНК энтерококкофагов: 1 - нативная ДНК фага S02; 2 - S02/MluI; 3 - Ml/MluI; 4 - ИОЗ/MluI; 5 - S02/HindIII; 6 - Ml/HindIII; l - ИОЗ/HindIII; 8 - S02/SmaI; 9 - Ml/SmaI; 10 - ИОЗ/SmaI; 11 - маркер A/HindIII

научная публикация

Таблица 2. Особенности выделенных из препарата «Линекс» бактери й

Диаметр зон ингибирования роста бактерий вокруг дисков с антибиотиками, мм Чувстви-

Штаммы бактерий Морфологические особенности и диаметр

1/1 белые, прозрачные, 0,5-1,0 19 11 16 0 0 35 0 0 +

1/2 желтые, непрозрачные, 1,0-1,5 17 27 23 23 32 36 20 18

1/3 белые, непрозрачные, 1,0-1,5 12 16 13 12 24 24 26 15 +

фильных молочнокислых кокков удалось зарегистрировать негативные колонии на семи из них: 3/2, 2/1, 2/2, 301, 310, 400, 2б. Таким образом, можно утверждать, что из 26 изолятов термофильных кокков почти четверть представлена бактериями рода ЕШвгососсив, иными словами, энтерококки довольно широко распространены в составе кисломолочных продуктов отечественного производства. Следует иметь в виду к тому же, что идентифицированы лишь те энтерококки, которые чувствительны к фагу S02. Вполне вероятно, что в исследуемой выборке присутствуют и другие представители рода ЕШвгососсив, не проявляющие чувствительность к данному фагу. Причиной широкого распространения энтерококков в составе молочных продуктов может служить их содержание в составе заквасок и бакконцентратов, что довольно вероятно при отсутствии эффективных

схем анализа и контроля видового разнообразия заквасок.

Из восьми чувствительных к фагу S02 штаммов бактерий выбрали три (3/1, 2/1, 202б), которые использовали в качестве тест-культур при выделении энтерокок-кофагов. На содержание бактериофагов проанализировано 84 образца кисломолочных продуктов, произведенных на комбинатах различных регионов Республики Беларусь, в результате чего выделено 10 штаммов энтерококкофагов (табл. 1).

Из представленных данных следует, что количество контаминированных энтерококкофагами молочных продуктов в данном исследовании составляет 10,7%. В действительности их число, по-видимому, еще больше, поскольку выделенные фаговые изоляты получены при использовании всего трех бактериальных штаммов в качестве хозяев.

Ранее для фагов других молочнокислых бактерий - лактококков - было показано, что они содержатся в 10,2% произведенных в Беларуси кисломолочных продуктов и отличаются очень широким разнообразием [6]. Чтобы получить дополнительное подтверждение того, что выделенные фаговые изоляты не относятся к числу лактофагов или фагов термофильных стрептококков, предприняли ПЦр-анализ их ДНК с использованием праймеров, специфичных к уникальным последовательностям геномов лактофа-гов самых распространенных видов (с2, 936, Р335) и фагов 5. МвгторМиэ. На рис. 1 приведены результаты подобной мультиплексной ПЦР, которые подтверждают сделанные выше выводы.

Для дифференцировки энтерококко-фагов в выборке использовали такие их признаки, как спектр литического действия, рестрикционные профили и морфологию вирионов. Исследование спектра литического действия показало, что фаговые изоляты не различаются по этому признаку и способны лизировать клетки всех восьми штаммов энтерококков, идентифицированных ранее.

Рестрикционный анализ, известный как нетрудоемкий и надежный метод дифференциации микроорганизмов, основанный на общности в наличии и расположении сайтов рестрикции в геномах [7], также не позволил найти существенных различий между изолятами. Изучено

г

Рис. 3. Рестрикционные профили ДНК энтерококкофагов : 1 - нативная ДНК фага И07; 2 - H07/PstI; 3 - H07/PstI; 4 - ИОЗ/PstI; 5 - S02/SalI; 6 - H07/SalI; 7 - И03/ Sali; 8 - S02/BamHI; И07 9 - №7/BamHI; 10 - ИОЗ/BamHI; 11 - маркер A/HindIII

Рис. 4. Электронные микрофотографии вирионов энтерококкофагов S02 и И07

1 в мире науки 1

наличие и положение в ДНК энтерококкофагов сайтов рестрикции для 10 эндонку-леаз: EcoR\, EcoRV, Hind\\\, Nco\, BamH\, Pst\, Sma\, Bgl\\, Sali, Mlu\.

Оказалось, что расщеплять фаговые геномы способны ферменты EcoRI, Mlui, EcoRV, Ncoi, BamHI, Bgii и HindlII. При этом нуклеазы EcoRI и Mlui расщепляют ДНК всех фагов на 3 фрагмента, EcoRV и BamHI - на 2 фрагмента, BgüI - на 1 фрагмент, HindlII - на 7 фрагментов, а Ncoi - на большое число фрагментов, в результате чего ДНК перестает визуализироваться.

На рис. 2 и 3 приведены результаты рестрикционного анализа ДНК трех фаговых изолятов (S02, И03, И07).

Таким образом, рестрикционный анализ показал, что фаги S03, И01, И03, И07, И18, И21, Пс03, Пс05, An 1, S02 являются генетически идентичными, несмотря на то что большинство из них выделено из разных источников.

Используя трансмиссионную электронную микроскопию, установили морфологию вирионов фагов S02 и И07. Как видно из рис. 4, оба фага имеют схожую морфологию - головки изометрической формы и длинные несократимые отростки, что позволяет отнести их к одному семейству Shiphoviridae. Сходство в структуре этих фагов, которые выделены из молочных продуктов, произведенных на разных комбинатах (табл. 1), еще раз подтверждает сделанные выше выводы об их генетическом родстве.

Энтерококки имеют большое значение для нормального функционирования желудочно-кишечного тракта человека, поэтому широкое распространение в молочных продуктах вирулентных по отношению к ним фагов может обусловить снижение концентрации этих бактерий и нарушение баланса нормальной кишечной микробиоты.

Для определения способности выделенных из молочных продуктов фагов инфицировать пробиотические штаммы энтерококков выделили бактерии E. faecium из пробиотического препарата «Линекс». Согласно литературным источникам [2], эти бактерии получены из кишечника

здорового человека, то есть являются представителями его нормальной микро-биоты.

При высеве содержимого капсулы препарата «Линекс» на плотную среду М17 и инкубировании при 42 °С получены колонии трех морфологических типов и выделены 3 чистые культуры грам-положительных термофильных кокков, способных формировать характерные цепочки клеток и сквашивать молоко. Выделенные штаммы различались не только культуральными признаками, но и чувствительностью к антибиотикам. Фаготипирование этих бактерий позволило установить, что штаммы 1/1 и 1/3 чувствительны ко всем исследованным энтерококкофагам ^02, S03, И01, И03, И07, И18, И21, Пс03, Пс05, Ап 1) и устойчивы к четырем идетрифицированным ранее лактофагам (Е9, ¿5, Е7, Х411), что служит веским основанием считать данные бактерии представителями рода Enterococcus. Бактерии E. faecium SF68, входящие в состав препарата «Линекс», согласно заявленным разработчиками свойствам, обладают чувствительностью к стрептомицину, эритромицину, гентамицину, тетрациклину и устойчивостью к канамицину, ампициллину, лин-комицину и пенициллину - признаками, характерными для клеток штамма 1/1.

Литература

Это позволяет считать штаммы 1/1 и E. faecium SF68 идентичными.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что пробиотические бактерии E. faecium SF68 чувствительны к энтерокок-кофагам, встречающимся в составе кисломолочных продуктов отечественного производства. При этом показано широкое распространение энтерококкофагов в составе продуктов, произведенных в разных областях Республики Беларусь. Таким образом, кишечная микробиота человека подвержена лизису со стороны этерококкофагов, присутствующих в молочных продуктах. Кроме того, одновременный прием пробиотиков, содержащих энтерококки, в частности широко известный препарат «Линекс», и контами-нированных энтерококкофагами молочных продуктов может снизить или даже свести на нет эффективность первых.

Считаем, что данные обстоятельства следует учитывать при подборе заквасок и по возможности не включать в их состав чувствительные к фагам штаммы энтерококков. Это должно способствовать сокращению фаговых популяций на комбинатах и, как следствие, уменьшению количества энтерококкофагов в молочных продуктах.

Дата поступления статьи в редакцию: 10.10.2011 г.

1. Самсыгина Г.А. Нарушения микробиоценоза кишечника // Педиатрия. №2, 2009. С. 11-14.

2. Ушкалова Е.А. «Живое» лекарство: Линекс // ВРАЧ. 2007, спец. вып. С. 31-35.

3. Ботина С.Г. Отечественные штаммы энетерококков, использумые в качестве завасок, не содержат гены вирулентности, обычно присутствующие в штаммах Enterococcus faecalis. / С.Г. Ботина, В.В. Суходолец // Биотехнология. №2, 2005. С. 33-37.

4. Sambrook J. Molecular cloning a laboratory manual / J. Sambrook, David W. Russell. 3rd ed. - New York, 2001.

5. Дмитриева О.В. Выделение и характеристика термофильных молочнокислых бактерий и специфичных к ним фагов / О.В. Дмитриева [и др.] // Труды БГТУ. Сер. IV, Химия и технология органических веществ. 2011. Вып. XIX. С. 203-205.

6. Молекулярно-генетические свойства распространенных в Беларуси бактериофагов лактококков / А.П. Райский [и др.] // Вестн. Белорус.гос.ун-та. Сер. 2. №1, 2009. С. 70-73.

7. Coveney J.A. Detailed characterization and comparison of four lactic streptococcal bacteriophages based on morphology, restriction mapping, DNA homology, and structural protein analysis / J.A. Coveney, G.F. Fitzgerald, C. Daly // Appl. Environ. Microbiol. 1987. Vol. 53, №7. P. 1439-1447.

Summary

The paper presents the results of the study of 10 strains of enterococci phages isolated from 84 samples of dairy products produced in Belarus. About 10.7% of food samples were shown to be contaminated with enterococcus phages. Spectrum of lytic action, morphology of virions and restriction profiles were analyzed. Ability of common in dairy products enterococcus phages to lyse probiotic bacteria cells Enterococcus faecium SF68 was ascertained.