КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ АНТИ-LYST ИММУНОМОДУЛЯЦИИ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR ANTI-LYST IMMUNOMODULATION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/987910, озаглавленной «Композиции и способы для анти-Lyst иммуномодуляции», поданной 2 мая 2014 года, содержание которой в полном объеме включено в качестве ссылки.
ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Список последовательностей, поданный 4 мая 2015 года в виде текстового файла с названием «NWCH100 PCT_ST25.txt», созданный 1 мая 2015 года, и с размером 51,000 байт, включен, таким образом, в качестве ссылки.
ЗАЯВЛЕНИЕ В ОТНОШЕНИИ РАЗРАБОТОК ИЛИ ИССЛЕДОВАНИЙ, КОТОРЫЕ СПОНСИРУЮТСЯ ГОСУДАРСТВОМ
Это изобретение было сделано при поддержке правительства в рамках гранта NIH R01 HL098228, присужденного Кристоферу Бройеру (Christopher Breuer) Национальным институтом здоровья. Правительство имеет определенные права на изобретение.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область изобретения, в основном, относится к композициям, устройствам и способам для улучшения регенерации сосудистой ткани, а также для снижения заболеваемости и смертности, ассоциированных с гиперплазией неоинтимы и фибропролиферативным заболеванием.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Восстановление ткани представляет собой сложный пошаговый процесс, который способствует упорядоченному удалению и замене мертвых или поврежденных клеток в ответ на стимуляторную передачу сигнала цитокинами от местных провоспалительных клеток к месту повреждения (Wynn и Baron, Semin Liver Dis., 30(3):245-257 (2010); Wynn, Clin. Invest. 117:524-529 (2007)). Однако, когда ответные реакции по восстановлению тканей некорректны или продолжаются в течение длительного периода, например, в ответ на хроническое заболевание или повторяющееся повреждение, нормальные механизмы регенерации могут привести к патологическим состояниям из-за избыточного роста новой ткани и накопления компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ) в месте повреждения.
Считают, что избыточная или повторная активация воспалительных и прокоагулянтных механизмов в месте повреждения сосуда вносит значительный вклад в развитие гиперплазия интимы. При патологических состояниях повреждение сосуда вызывает потерю эндотелиального слоя и запускает серии острых и хронических ответных реакций, которые характеризуются выработкой различных факторов роста и воспалительных цитокинов (Murakami, et al., Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol., 272:L197-L202 (1997); Cotran, et al., J Am Soc Nephrol., 1:225-235 (1990)). Гиперплазия интимы, происходящая после хирургических вмешательств, таких как ангиопластика и стентирование, хирургические шунтирования или эндоартериоэктомия для коронарных сосудов и/или при болезни периферических артерий может вызвать повторный стеноз кровеносных сосудов у 80% пациентов (Seedial, et al., J Vasc Surg., 57(5):1403-1414 (2013); Glagov, Circulation, 89:2888-2891 (1994)). Показано, что образование неоинтимы может быть ускорено за счет присутствия чужеродного материала, такого как протезы внутри кровеносных сосудов, и неконтролируемая гиперплазия интимы является основным препятствием, которое ограничивает длительную клиническую эффективность воздействия на сердечно-сосудистую систему (Frank, et al., Curr. Opin. Lipidol., 15:523 (2004)). Кроме того, образование неоинтимы ассоцировано с развитием и прогрессированием некоторых пролиферативных сердечно-сосудистых заболеваний, включая атеросклероз, гипертензию и сосудистые осложнения диабета.
Регенерация эндотелиального слоя ингибирует развитие неоинтимы и спосособствует восстановлению сосуда (Bauters, et al., Prog. Cardiovasc. Dis., 40:107-116 (1997); Kinlay, et al., Curr. Opin. Lipidol., 12:383 (2001)). Однако, доступные в настоящее время препараты против неоинтимы неизбирательно блокируют пролиферацию, как эндотелиальных клеток (ЭК), так и гладкомышечных клеток (ГМК), приводя к нарушению повторного образования эндотелия и удлиняя процесс заживления ран. Существует потребность в развитии антипролиферативной стратегии, которая будет ГМК-чувствительной.
Нерегулируемые воспалительные ответы на повторное повреждение тканей могут также приводить к патологическому фиброзу тканей и органов, таких как кожа, печень, сердце и легкое (Huang и Ogawa, Connect Tissue Res., 53(3):187-196 (2012)). Хроническое повреждение и воспаление ткани печени приводит к накоплению белков ВКМ, которые вызывают избыточное образование рубцовой ткани и искажают архитектуру печени, что, в свою очередь, приводит к циррозу и печеночной недостаточности (Battler и Brenner, J Clin Invest., 115:209-218 (2005)). Кроме того, избыточное отложение фиброзной ткани в легком приводит к нарастающему рубцеванию и необратимому нарушению легочной архитектуры, что, в конечном итоге, приводит к нарушению функции органа, нарушению газообмена и смерти от дыхательной недостаточности.
Активированные тромбоциты усиливают адгезию лейкоцитов к поврежденному эндотелию и содействуют активации лейкоцитов путем осаждения хемокинов на эндотелий. Это позволяет лейкоцитам прочно прикрепляться к сосудистой стенке и мигрировать через нее в подэндотелиальную ткань. Однако, также известно, что хемокины, производимые тромбоцитами, играют роль в пролиферации неоинтимы, рестенозе после повреждения артерии и атеросклерозе (Chandrasekar, et al., J Am College Cardiology, Vol 35, No. 3, pp. 555-562 (2000)). Определенные группы пациентов с нарушенной функцией тромбоцитов, включая пациентов с заболеванием почек, сахарным диабетом и гиперлипидемией, также имеют повышенный риск рестеноза.
Фибропролиферативные нарушения являются одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в Соединенных Штатах Америки (Bitterman и Henke, Chest, 99(3):s81-s84 (1991)). В частности, фиброзные заболевания печени и легких, как правило, устойчивы к лечению и приводят к высокому уровню смертности. Тяжелый цирроз печени имеет уровень смертности в течение 10 лет 34-66%, и сам по себе является причиной приблизительно 27,000 смертей каждый год в Соединенных Штатах Америки. Заболеваемость идиопатическим легочным фиброзом (ИЛФ) оценивают в пределах от 14 до 42,7 на 100,000, и эта цифра растет десятилетие за десятилетием последние тридцать лет (Olson, et al., Am J Respir Crit Care Med. 176:277-2843 (2007); Gribbin, et al., Thorax, 61:980-985 (2006)). В настоящее время наиболее эффективным лечением для фиброза печени или легких является трансплантация органа.
Таким образом, объектом изобретения является создание композиций, устройств, трансплантатов и способов их применения для модулирования иммунных процессов для уменьшения или профилактики образования неоинтимы, стеноза, рестеноза или их сочетаний у индивидуума.
Кроме того, объектом изобретения является создание композиций, устройств, трансплантатов и способов их применения для уменьшения или профилактики неуместной или вредной активации тромбоцитов у индивидуума.
Кроме того, объектом изобретения является создание композиций, способов и устройств для уменьшения или профилактики иммунного ответа на имплантированный протез у индивидуума.
Дополнительным объектом изобретения является создание композиций, способов и устройств, которые способствуют излечению и ингибируют образование рубцов, спаек и фибропролиферативные заболевания у индивидуума.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Установлено, что ингибирование белка-регулятора лизосомального транспорта («LYST») ассоциировано со снижением воспалительных ответов в месте повреждения ткани. Описаны композиции и способы для ингибирования экспрессии и функции белка LYST. Композиции и способы могут быть полезны для модуляции иммунных процессов, которые вносят вклад в образование неоинтимы и фибропролиферативные нарушения, изменяя функцию макрофагов, тромбоцитов и клеток-естественных киллеров для развития прорегенеративного иммунного ответа.
Описаны композиции, включающие один или более ингибиторов LYST в количестве эффективном для уменьшения или профилактики образования рубцовой ткани у индивидуума. Также описаны композиции, включающие один или более ингибиторов LYST в количестве эффективном для уменьшения или профилактики активации тромбоцитов у индивидуума.
Как правило, композиции включают физиологически приемлемый носитель. В предпочтительных вариантах осуществления количество одного или более ингибиторов LYST не препятствует образованию новой сосудистой ткани у индивидуума. Как правило, композиции включают один или более ингибиторов LYST в количестве в пределах 0,1-1000 мг/кг массы тела человека.
В одном из вариантов осуществления один или более ингибиторов LYST представляют собой антитело.
В другом варианте осуществления один или более ингибиторов LYST представляют собой функциональную нуклеиновую кислоту. Примеры функциональных нуклеиновых кислот включают антисмысловую молекулу, миРНК, мкРНК, аптамеры, рибозимы, триплекс-образующие молекулы, РНКи и внешние вспомогательные последовательности. Одну или более функциональных нуклеиновых кислот можно экспрессировать из экспрессирующего вектора.
В некоторых вариантах осуществления композиции одного или более ингибиторов LYST включают носитель. Примеры носителей включают наночастицы, микрочастицы, мицеллы, синтетические липопротеиновые частицы, липосомы и углеродные нанотрубки. Описанные композиции могут также включать одно или более дополнительных терапевтических средств. Описаны сосудистые трансплантаты и медицинские устройства, содержащие один или более ингибиторов LYST. В некоторых вариантах осуществления композицией одного или более ингибиторов LYST покрывают снаружи трансплантат или устройство или вводят внутрь трансплантата или устройства. Примеры медицинских устройств включают стенты, имплантаты, иглы, канюли, катетеры, шунты, баллоны и клапаны. Медицинское устройство может быть стентом, таким как стент с выделением лекарственного препарата, который выделяет композицию одного или более ингибиторов LYST. Примеры сосудистых трансплантатов включают аутологичные, аутологичные с консервантами, аллогенные, ксеногенные или синтетические трансплантаты.
Также предлагаются способы для уменьшения или профилактики образования рубцовой ткани у индивидуума, включающие введение нуждающемуся в этом индивидуума композиции, содержащей один или более ингибиторов LYST. Способы для уменьшения или профилактики развития венозного тромбоза или тромбоза артерий у индивидуума включают введение нуждающемуся в этом индивидууму композиции, содержащей один или более ингибиторов LYST. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет риск развития рестеноза или других нарушений сосудистой пролиферации или уже развившийся рестеноз или другие нарушения сосудистой пролиферации. В дополнительных вариантах осуществления индивидуум подвергался, подвергается или подвергнется сосудистой травме, ангиопластике, сосудистой хирургии или трансплантационной артериопатии. Способы могут способствовать излечению, уменьшению или профилактике развития гипертрофического рубцевания, келоидных рубцов, или спаек, уменьшению или профилактике фиброза печени, фиброза легких, фиброза сердца или фиброза почек, уменьшению или профилактике образования неоинтимы, стеноза или рестеноза, или любого их сочетания у индивидуума по сравнению с не подвергавшимся лечению индивидуумом, использующимся в качестве контроля. Способы могут способствовать интеграции, но блокировать инкапсуляцию одного или более протезных устройств, таких как кардиостимуляторы, стимуляторы нервов, электроды кардиостимулятора, сменные клапаны сердца и искусственные суставы или их компоненты. Способы могут быть эффективны для лечения или профилактики образования неоинтимы в месте имплантации сосудистого имплантата, в месте повреждения сосуда, или в месте хирургического вмешательства у индивидуума по сравнению с не подвергавшимся лечению индивидуумом, использующимся в качестве контроля. Способы могут быть эффективны для снижения или предотвращения экспрессии фактора роста тромбоцитов, трансформирующего фактора роста бета, или любого их сочетания у индивидуума по сравнению с не подвергавшимся лечению индивидуумом, использующимся в качестве контроля.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 представляет собой гистограмму, показывающую диаметр (мм) трубы внутри биоразлагаемых трубчатых имплантатов через две недели после имплантации мышам beige (bg; черный график) и мышам дикого типа (WT; серый график). N=10 и N=25 для мышей beige и мышей WT, соответственно.
Фигура 2 представляет собой гистограмму, показывающую число макрофагальных клеток (клеток/в поле зрения) внутри биоразлагаемых трубчатых имплантатов, извлеченных у мышей beige (Bg; серый график) и мышей дикого типа (WT; черный график), соответственно, через две недели после имплантации. P=0,0048.
Фигура 3 представляет собой схематическое изображение, показывающее различие между нуклеотидными последовательностями (сверху) экзона 52 гена LYST у мышей дикого типа (WT) и мышей Beige (Bg). Соответствующие различия между аминокислотными последовательностями белка LYST мышей WT и Bg также показаны в выравнивании аминокислотных последовательностей (в центре). Выравнивание аминокислотных последовательностей (снизу) показывает консервативность аминокислотных последовательностей полипептидов LYST человека, мыши и крысы. Положение делеции в LYST мышей Beige (Bg) показано *. Нуклеиновые кислоты и аминокислоты представлены с использованием соответствующих стандартных однобуквенных кодов.
Фигура 4 представляет собой гистограмму, показывающую относительный уровень мРНК, соответствующий продукту гена LYST, который был амплифицирован с использованием каждого из пяти различных олигонуклеотидных праймеров (LYST-1, LYST-3, LYST-4, LYST-5 и LYST-6), в клетках, полученных от мышей дикого типа (WT-1(1); WT-2 (2)), мышей Beige (Beige-1 (3); Beige-2 (4)) или стандартной клеточной линии «Raw» (5), соответственно.
tm1b
Фигура 5 представляет собой гистограмму, показывающую встречаемость стеноза (%) у мышей C57BL/6 (дикого типа) и нокаутных мышей C57BL/6 Lyst, соответственно, (n=5) после 2-недельной имплантации. ***p=0,0001.
Фигура 6 представляет собой гистограмму, показывающую количество фактора роста тромбоцитов (PDGF), секретируемого из плазмы, обогащенной тромбоцитами (PRP) (мкг/мл) у мышей, находящихся в покое (контроль), и активированных тромбином C57BL/6 (дикого типа), а также мышей C57BL/6 Beige (Bg), соответственно. Общие концентрации PDGF, секретированного из каждой группы (n=7), сравнивали с находящимися в покое, не активированными контролями (n=5).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Определения
Термин «стеноз» относится к патологическому сужению кровеносного сосуда, которое происходит после повреждения сосудистой стенки (эндотелия). В некоторых вариантах осуществления стеноз включает уменьшение окружности просвета на 50% или более. Термин «рестеноз» относится к стенозу на ранее стенозированном участке или к сужению просвета кровеносного сосуда или синтетического трансплантата после интервенционной процедуры. Рестеноз, как применяют в настоящем документе, включает окклюзию. Примеры повреждений, которые приводят к стенозу или рестенозу включают травмирование атеросклеротической бляшки (которое наблюдают при ангиопластике или стенте), удаление бляшки (которое наблюдают при эндартериоэктомии), внешнюю травму (например, повреждение при пережатии) или хирургический анастомоз.
Термин «неоинтимный стеноз» относится к патологическому сужению кровеносного сосуда из-за образования неоинтимы.
Термин «неоинтима» относится к обновленному или утолщенному слою интимы (внутренней выстилки), который формируется в кровеносном сосуде в ответ на сигналы от поврежденных эндотелиальных клеток.
Термины «рубцовая ткань» и «рубцевание» относятся к фиброзной ткани, которая вырабатывается для того чтобы заместить поврежденную ткань после травмы.
Термины «фибропролиферативные нарушения», «ФПН» и «фиброзные заболевания» используются взаимозаменяемо и включают доброкачественные и злокачественные заболевания или состояния, которые возникают из-за нарушенного и избыточного отложения соединительной ткани.
Термин «активация тромбоцитов» представляет собой поэтапный физиологический процесс, который вызывает агрегацию и адгезию циркулирующих тромбоцитов в ответ на повреждение ткани, такое как повреждение или разрыв эндотелия. Активация тромбоцитов вызывает экспрессию и секрецию хемотаксических веществ, таких как фактор роста тромбоцитов (PDGF) и трансформирующий фактор роста бета (TGFβ).
«Фармацевтически приемлемый носитель» включает любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатно-солевой буфер, вода и эмульсии, такие как эмульсия типа масло/вода или вода/масло, и различные типы увлажнителей.
«Ингибировать» или другие формы слова, такие как «ингибирующий» или «ингибирование» означает препятствовать конкретной характеристике или ограничивать конкретную характеристику. Следует понимать, что это рассматривается, как правило, относительно какого-то стандарта или ожидаемого значения, т.е., это относительно, но не всегда необходима ссылка на стандартное или ожидаемое значение. Например, «ингибирует LYST» означает препятствует или мешает активности гена LYST, или ограничивает активность гена LYST относительно стандарта или контроля. «Ингибирует LYST» может также означать ограничение или препятствие для синтеза, экспрессии или функции белка LYST относительно стандарта или контроля.
«Лечение» или «получавший лечение» означает введение композиции индивидууму или системе с нежелательным состоянием (например, рестенозом или фибропролиферативным нарушением). Состояние может включать заболевание. «Предотвращение» или «профилактика» означает введение композиции индивидууму или системе с риском развития состояния. Состояние может быть предрасположенностью к заболеванию. Эффектом от введения композиции индивидууму (или лечение и/или профилактика) может быть, в качестве неограничивающих примеров, прекращение конкретного симптома состояния, уменьшение или профилактика симптомов состояния, уменьшение тяжести состояния, полное устранение состояния, стабилизация или замедление развития или прогрессирования конкретного события или признака, или сведение к минимуму вероятности того, что будет происходить конкретное событие или появится признак.
Как применяют в настоящем документе, термин «антитело» применяют в самом широком смысле, если явно не указано иное. Таким образом, "антитело" может быть природным или искусственным, таким как моноклональные антитела, произведенные по общепринятой гибридомной технологии. Антитела включают моноклональные и поликлональные антитела, а также фрагменты, содержащие антигенсвязывающий домен и/или один или более определяющих комплементарность областей этих антител. «Антитело» относится к любой форме антитела или его антигенсвязывающему фрагменту и включает моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител.
II. Композиции
Установлено, что процессы восстановления ткани можно медиировать за счет экспрессии и функции гена LYST. Конкретно, потеря функции продукта гена LYST вызывает нарушения функционирования определенных иммунных клеток, приводя к нарушению иммунной функции и ассоциированному с ним снижению пролиферативных нарушений. Иммунные клетки, на которые можно воздействовать путем модуляции гена LYST или белка LYST, включают клетки врожденного иммунного ответа, макрофаги и тромбоциты.
Клетки врожденного иммунного ответа
Способы врожденного иммунитета, в том числе воспаление, удаление поврежденных клеток и продуктов распада, а также развитие новой ткани и другие механизмы заживления ран, являются важным компонентом физиологических ответов на повреждение. Заживление ткани включает четыре отдельных этапа, в том числе: a) свертывание/коагуляцию; b) воспаление; c) миграцию фибробластов/пролиферацию; и d) фазу конечного ремоделлинга, когда восстанавливается архитектура нормальной ткани. На самых ранних стадиях после повреждения ткани эпителиальные клетки и/или эндотелиальные клетки высвобождают медиаторы воспаления, которые инициируют каскад антифибринолиза-коагуляции, запускающий свертывание и развитие временного внеклеточного матрикса (ВКМ). Агрегация и последующая дегрануляция тромбоцитов способствует расширению кровеносного сосуда и повышенной проницаемости, содействуя эффективному накоплению воспалительных клеток, таких как нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты и эозинофилы, в поврежденной ткани. Нейтрофилы являются наиболее распространенными воспалительными клетками на самых ранних стадиях заживления ран, но они быстро замещаются макрофагами после дегрануляции нейтрофилов. Активированные макрофаги и нейтрофилы очищают рану, удаляют любые вторгшиеся организмы и вырабатывают ряд цитокинов и хемокинов, которые усиливают воспалительный ответ, а также запускают пролиферацию и рекрутинг фибробластов. После активации фибробласты трансформируются в миофибробласты, которые секретируют α-актин гладких мышц и компоненты ВКМ. Наконец, в фазе ремоделлинга эпителиальные/эндотелиальные клетки делятся и мигрируют поверх временного матрикса для регенерации поврежденной ткани. Таким образом, заживление и образование новой ткани представляет собой процесс с тонкой регуляцией, который уравновешивает потребность в регенерации ткани и утолщение стенок кровеносного сосуда без избыточного утолщения и стеноза, или фиброза.
Макрофаги
Показано, что присутствие циркулирующих моноцитов и инфильтрация макрофагами имеет решающее значение для заживления ран и развития новой ткани (Arras, et al., J Clin Invest, 101(1): 40-50 (1998)). Однако, избыточная инфильтрация макрофагами в месте повреждения ткани также коррелирует с нарушением регуляции пролиферации и образованием неоинтимы (Hibino, et al., FASEB J. 25(12):4253-63 (2011)). Более того, многочисленные исследования показали, что макрофаги и фибробласты являются основными эффекторными клетками, участвующими в патогенезе фиброза (рассмотрено в Wynn, Nat Rev Immunol. 4(8):583-94 (2004)).
После повреждения сосуда воспалительные моноцитарные клетки (CD16-hi, CD64-hi и CD14-hi у людей; CD115+, CD11b+ и Ly6c-hi у мышей) привлекаются в поврежденную ткань и дифференцируются в активированные макрофаги (Emr1-hi у людей; F4/80-hi у мышей) под воздействием местных факторов роста, провоспалительных цитокинов и микробных соединений (Geissmann et al., Science 327: 656-661 (2010)). Избыточная инфильтрация макрофагами приводит к стенозу, в то время как полное ингибирование инфильтрации макрофагами предотвращает образование новой ткани (Hibino, et al., FASEB J. 25(12):4253-63 (2011).
Были определены два различных состояния разнонаправленной активации для макрофагов: фенотип классически активированного (M1) макрофага и фенотип альтернативно активированного (M2) макрофага (Gordon и Taylor, Nat. Rev. Immunol. 5: 953-964 (2005); Mantovani et al., Trends Immunol. 23: 549-555 (2002)). Ролью классически активированного (M1) макрофага является эффекторная клетка при TH1-клеточных иммунных ответах, в то время как альтернативно активированный (M2) макрофаг, по-видимому, участвует в иммуносупрессии и заживлении ран/восстановлении ткани. M1- и M2-макрофаги имеют различные профили хемокинов и хемокиновых рецепторов, при этом M1 секретируют хемокины CXCL9 и CXCL10, привлекающие TH1-клетки, а M2-макрофаги экспрессируют хемокины CCL17, CCL22 и CCL24.
Присутствие M2-макрофагов было ассоцииировано с развитием неоинтимы и стенозом (Hibino, et al., FASEB J. 25(12):4253-63 (2011)). Корреляция между избыточной инфильтрацией макрофагами, образованием новой ткани и стенозом в определенные моменты времени после имплантации тканевого трансплантата предлагает способы для профилактики стеноза через модуляцию активности макрофагов.
Более того, макрофаги, как правило, расположены рядом с миофибробластными клетками, продуцирующими коллаген, и показано, что макрофаги моноцитарного происхождения критически поддерживают воспалительные ответы после повреждения, что является предварительным условием для фиброза (Wynn и Barron, Semin Liver Dis., 30(3):245-257 (2010)). Макрофаги вырабатывают профиброзные медиаторы, которые активируют фибробласты, в том числе тромбоцитарный фактор роста (PDGF), мощный хемотаксический агент, и трансформирующий фактор роста бета (TGF-B). Более конкретно, заметное увеличение не-классической M2 (CD14+, CD16+) субпопуляции макрофагов коррелировало с провоспалительными цитокинами и клиническим прогрессированием у пациентов, страдающих от острого заболевания печени. Во время прогрессирования фиброза моноцитарные макрофаги высвобождают цитокины, поддерживая хроническое воспаление, а также напрямую активируют звездчатые клетки печени (HSC), приводя к их пролиферации и трансдифференцировке в миофибробласты, продуцирующие коллаген (Zimmermann, et al., PLOS One, 5(6):e11049 (2010)).
Тромбоциты
Агрегированные тромбоциты помогают восстановлению кровеносных сосудов за счет секреции химических веществ, которые привлекают фибробласты из окружающей соединительной ткани в область повреждения для залечивания раны или, в случае нарушенной регуляции воспалительных ответов, для формирования рубцовой ткани. В ответ на повреждение ткани, тромбоциты активируются и высвобождают множество факторов роста, которые стимулируют отложение внеклеточного матрикса, таких как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), мощный хемотаксический агент, а также трансформирующий фактор роста бета (TGF-β). Показано, что оба этих фактора роста играют значительную роль в восстановлении и регенерации соединительных тканей. PDGF функционирует как первичный митоген и хемоаттрактант, который значительно увеличивает приток фибробластов и воспалительных клеток, а также стимулирует клеточную пролиферацию и экспрессию генов. PDGF позволяет лейкоцитам плотно присоединяться к сосудистой стенке и в итоге мигрировать через нее в субэндотелиальную ткань. Однако, также известно, что тромбоцитарные хемокины индуцируют пролиферацию гладкомышечных клеток (ГМК) и играют роль в пролиферации неоинтимы и фиброзе органов (Chandrasekar, et al., J Am College Cardiology, Vol 35, No. 3, pp. 555-562 (2000)). Повышенная экспрессия PDGF и его рецепторов ассоциирована со склеродермией легочной и кожной тканей. Более конкретно, есть доказательства того, что аутокринный рецептор PDGF опосредует сигнальную петлю в фибробластах при склеродермии легкого и кожи, вовлекая как TGF-β-, так и PDGF-пути в хронический фиброз при склеродермии (Trojanowska, Rheumatology;47:v2-v4 (2008)). Кроме того, отмена регуляции сигнального пути PDGF ассоциирована с сердечно-сосудистыми признаками, такими как легочная гипертензия и атеросклероз.
Пролиферация и миграция гладкомышечных клеток (ГМК) слоя медии в ответ на PDGF, индуцированный повреждением, являются основными событиями, вносящими вклад в утолщение неоинтимы (Fingerle, et al., Proc Natl Acad Sci., 86:8412 (1989); Clowes, et al., Circ. Res., 56:139-145 (1985)), которое в итоге приводит к сужению кровеносного сосуда и стенозу.
Другие, ассоциированные с заживлением, факторы роста, которые высвобождаются тромбоцитами, включают основной фактор роста фибробластов, инсулиноподобный фактор роста 1, тромбоцитарный эпидермальный фактор роста и фактор роста эндотелия сосудов.
Таким образом, ингибиторы гена LYST и белка LYST могут создавать прорегенеративное иммунное окружение, которое способствует заживлению ран и предотвращает пролиферативные нарушения, такие как гиперплазия интимы, развитие избыточной рубцовой ткани и фиброзное заболевание. Модуляция LYST может также модулировать активность и функцию тромбоцитов. Таким образом, ингибиторы гена LYST и/или белка LYST можно использовать для снижения или предотвращения биологических функций тромбоцитов, таких как агрегация тромбоцитов и выработка/экспрессия фактора роста тромбоцитов (PDGF).
Описаны композиции для ускорения регенерации тканей и профилактики или уменьшения заболеваний, характеризующихся образованием избыточной рубцовой ткани, за счет блокады экспрессии и/или функции белка LYST.
A. LYST
Продукт гена регулятора лизосомального транспорта (LYST) представляет собой повсеместно распространенный белок, ассоциированный с транспортом внутриклеточного материала к лизосоме. Было установлено, что мутации, которые снижают или ингибируют функцию белка LYST, мешают нормальному функционированию макрофагов, а также влияют на виды биологической активности клеток-естественных киллеров (NK) и тромбоцитов. Полагают, что модуляция белка LYST обеспечивает пути для модуляции иммунных процессов, которые вызывают сосудистые пролиферативные нарушения, образование неоинтимы, фиброз и избыточное рубцевание.
1. Ген LYST
Ген LYST человека расположен на хромосоме 1 (сегмент 1q42.1-q42.2; пары оснований от 235661030 до 235883707) (Barrat, et al., Am. J. Hum. Genet, 59:625-632 (1996)). Последовательности нуклеиновой кислоты для продукта гена LYST известны в данной области. См., например, референсную последовательность NCBI: NM_000081.3, регулятор лизосомального транспорта Homo sapiens (LYST), вариант траскрипта 1, мРНК, которая предлагает последовательность нуклеиновой кислоты:
1 GTGCGCGGCG GCGGCGGCAG CGGCGTCGGC TCGGGGTTCT CCGGGAGAGG GGGAGTGCGC
61 GGCGGCCGCA GCTGCCACAA ACCAGGTGAA GCTTTGTTCT AAGAATATTT GTTTCATCTA
121 GTTTATGAGT CCAAATGATA TAGACTGTAA ATGTCACAGC AGTGGTGAAA GACTGCTCGG
181 TCATGAGCAC CGACAGTAAC TCACTGGCAC GTGAATTTCT GACCGATGTC AACCGGCTTT
241 GCAATGCAGT GGTCCAGAGG GTGGAGGCCA GGGAGGAAGA AGAGGAGGAG ACGCACATGG
301 CAACCCTTGG ACAGTACCTT GTCCATGGTC GAGGATTTCT ATTACTTACC AAGCTAAATT
361 CTATAATTGA TCAGGCATTG ACATGTAGAG AAGAACTCCT GACTCTTCTT CTGTCTCTCC
421 TTCCACTGGT ATGGAAGATA CCTGTCCAAG AAGAAAAGGC AACAGATTTT AACCTACCGC
481 TCTCAGCAGA TATAATCCTG ACCAAAGAAA AGAACTCAAG TTCACAAAGA TCCACTCAGG
541 AAAAATTACA TTTAGAAGGA AGTGCCCTGT CTAGTCAGGT TTCTGCAAAA GTAAATGTTT
601 TTCGAAAAAG CAGACGACAG CGTAAAATTA CCCATCGCTA TTCTGTAAGA GATGCAAGAA
661 AGACACAGCT CTCCACCTCA GATTCAGAAG CCAATTCAGA TGAAAAAGGC ATAGCAATGA
721 ATAAGCATAG AAGGCCCCAT CTGCTGCATC ATTTTTTAAC ATCGTTTCCT AAACAAGACC
781 ACCCCAAAGC TAAACTTGAC CGCTTAGCAA CCAAAGAACA GACTCCTCCA GATGCTATGG
841 CTTTGGAAAA TTCCAGAGAG ATTATTCCAA GACAGGGGTC AAACACTGAC ATTTTAAGTG
901 AGCCAGCTGC CTTGTCTGTT ATCAGTAACA TGAACAATTC TCCATTTGAC TTATGTCATG
961 TTTTGTTATC TTTATTAGAA AAAGTTTGTA AGTTTGACGT TACCTTGAAT CATAATTCTC
1021 CTTTAGCAGC CAGTGTAGTG CCCACACTAA CTGAATTCCT AGCAGGCTTT GGGGACTGCT
1081 GCAGTCTGAG CGACAACTTG GAGAGTCGAG TAGTTTCTGC AGGTTGGACC GAAGAACCGG
1141 TGGCTTTGAT TCAAAGGATG CTCTTTCGAA CAGTGTTGCA TCTTCTGTCA GTAGATGTTA
1201 GTACTGCAGA GATGATGCCA GAAAATCTTA GGAAAAATTT AACTGAATTG CTTAGAGCAG
1261 CTTTAAAAAT TAGAATATGC CTAGAAAAGC AGCCTGACCC TTTTGCACCA AGACAAAAGA
1321 AAACACTGCA GGAGGTTCAG GAAGATTTTG TGTTTTCAAA GTATCGTCAT AGAGCCCTTC
1381 TTTTACCTGA GCTTTTGGAA GGAGTTCTTC AGATTCTGAT CTGTTGTCTT CAAAGTGCAG
1441 CTTCAAATCC CTTCTACTTC AGTCAAGCCA TGGATTTGGT TCAAGAATTC ATTCAGCATC
1501 ATGGATTTAA TTTATTTGAA ACAGCAGTTC TTCAAATGGA ATGGCTGGTT TTAAGAGATG
1561 GAGTTCCTCC CGAGGCCTCA GAGCATTTGA AAGCCCTAAT AAATAGTGTG ATGAAAATAA
1621 TGAGCACTGT CAAAAAAGTG AAATCAGAGC AACTTCATCA TTCGATGTGT ACAAGAAAAA
1681 GGCACAGACG ATGTGAATAT TCTCATTTTA TGCATCATCA CCGAGATCTC TCAGGTCTTC
1741 TGGTTTCGGC TTTTAAAAAC CAGGTTTCCA AAAACCCATT TGAAGAGACT GCAGATGGAG
1801 ATGTTTATTA TCCTGAGCGG TGCTGTTGCA TTGCAGTGTG TGCCCATCAG TGCTTGCGCT
1861 TACTACAGCA GGCTTCCTTG AGCAGCACTT GTGTCCAGAT CCTATCGGGT GTTCATAACA
1921 TTGGAATATG CTGTTGTATG GATCCCAAAT CTGTAATCAT TCCTTTGCTC CATGCTTTTA
1981 AATTGCCAGC ACTGAAAAAT TTTCAGCAGC ATATATTGAA TATCCTTAAC AAACTTATTT
2041 TGGATCAGTT AGGAGGAGCA GAGATATCAC CAAAAATTAA AAAAGCAGCT TGTAATATTT
2101 GTACTGTTGA CTCTGACCAA CTAGCCCAAT TAGAAGAGAC ACTGCAGGGA AACTTATGTG
2161 ATGCTGAACT CTCCTCAAGT TTATCCAGTC CTTCTTACAG ATTTCAAGGG ATCCTGCCCA
2221 GCAGTGGATC TGAAGATTTG TTGTGGAAAT GGGATGCTTT AAAGGCTTAT CAGAACTTTG
2281 TTTTTGAAGA AGACAGATTA CATAGTATAC AGATTGCAAA TCACATTTGC AATTTAATCC
2341 AGAAAGGCAA TATAGTTGTT CAGTGGAAAT TATATAATTA CATATTTAAT CCTGTGCTCC
2401 AAAGAGGAGT TGAATTAGCA CATCATTGTC AACACCTAAG CGTTACTTCA GCTCAAAGTC
2461 ATGTATGTAG CCATCATAAC CAGTGCTTGC CTCAGGACGT GCTTCAGATT TATGTAAAAA
2521 CTCTGCCTAT CCTGCTTAAA TCCAGGGTAA TAAGAGATTT GTTTTTGAGT TGTAATGGAG
2581 TAAGTCAAAT AATCGAATTA AATTGCTTAA ATGGTATTCG AAGTCATTCT CTAAAAGCAT
2641 TTGAAACTCT GATAATCAGC CTAGGGGAGC AACAGAAAGA TGCCTCAGTT CCAGATATTG
2701 ATGGGATAGA CATTGAACAG AAGGAGTTGT CCTCTGTACA TGTGGGTACT TCTTTTCATC
2761 ATCAGCAAGC TTATTCAGAT TCTCCTCAGA GTCTCAGCAA ATTTTATGCT GGCCTCAAAG
2821 AAGCTTATCC AAAGAGACGG AAGACTGTTA ACCAAGATGT TCATATCAAC ACAATAAACC
2881 TATTCCTCTG TGTGGCTTTT TTATGCGTAA GTAAAGAAGC AGAGTCTGAC AGGGAGTCGG
2941 CCAATGACTC AGAAGATACT TCTGGCTATG ACAGCACAGC CAGCGAGCCT TTAAGTCATA
3001 TGCTGCCATG TATATCTCTC GAGAGCCTTG TCTTGCCTTC TCCTGAACAT ATGCACCAAG
3061 CAGCAGACAT TTGGTCTATG TGTCGTTGGA TCTACATGTT GAGTTCAGTG TTCCAGAAAC
3121 AGTTTTATAG GCTTGGTGGT TTCCGAGTAT GCCATAAGTT AATATTTATG ATAATACAGA
3181 AACTGTTCAG AAGTCACAAA GAGGAGCAAG GAAAAAAGGA GGGAGATACA AGTGTAAATG
3241 AAAACCAGGA TTTAAACAGA ATTTCTCAAC CTAAGAGAAC TATGAAGGAA GATTTATTAT
3301 CTTTGGCTAT AAAAAGTGAC CCCATACCAT CAGAACTAGG TAGTCTAAAA AAGAGTGCTG
3361 ACAGTTTAGG TAAATTAGAG TTACAGCATA TTTCTTCCAT AAATGTGGAA GAAGTTTCAG
3421 CTACTGAAGC CGCTCCCGAG GAAGCAAAGC TATTTACAAG TCAAGAAAGT GAGACCTCAC
3481 TTCAAAGTAT ACGACTTTTG GAAGCCCTTC TGGCCATTTG TCTTCATGGT GCCAGAACTA
3541 GTCAACAGAA GATGGAATTG GAGTTACCTA ATCAGAACTT GTCTGTGGAA AGTATATTAT
3601 TTGAAATGAG GGACCATCTT TCCCAGTCAA AGGTGATTGA AACACAACTA GCAAAGCCTT
3661 TATTTGATGC CCTGCTTCGA GTTGCCCTCG GGAATTATTC AGCAGATTTT GAACATAATG
3721 ATGCTATGAC TGAGAAGAGT CATCAATCTG CAGAAGAATT GTCATCCCAG CCTGGTGATT
3781 TTTCAGAAGA AGCTGAGGAT TCTCAGTGTT GTAGTTTTAA ACTTTTAGTT GAAGAAGAAG
3841 GTTACGAAGC AGATAGTGAA AGCAATCCTG AAGATGGCGA AACCCAGGAT GATGGGGTAG
3901 ACTTAAAGTC TGAAACAGAA GGTTTCAGTG CATCAAGCAG TCCAAATGAC TTACTCGAAA
3961 ACCTCACTCA AGGGGAAATA ATTTATCCTG AGATTTGTAT GCTGGAATTA AATTTGCTTT
4021 CTGCTAGTAA AGCCAAACTT GATGTGCTTG CCCATGTATT TGAGAGTTTT TTGAAAATTA
4081 TTAGGCAGAA AGAAAAGAAT GTTTTTCTGC TCATGCAACA GGGAACTGTG AAAAATCTTT
4141 TAGGAGGGTT CTTGAGTATT TTAACACAGG ATGATTCTGA TTTTCAAGCA TGCCAGAGAG
4201 TATTGGTGGA TCTTTTGGTA TCTTTGATGA GTTCAAGAAC ATGTTCAGAA GAGCTAACCC
4261 TTCTTTTGAG AATATTTCTG GAGAAATCTC CTTGTACAAA AATTCTTCTT CTGGGTATTC
4321 TGAAAATTAT TGAAAGTGAT ACTACTATGA GCCCTTCACA GTATCTAACC TTCCCTTTAC
4381 TGCACGCTCC AAATTTAAGC AACGGTGTTT CATCACAAAA GTATCCTGGG ATTTTAAACA
4441 GTAAGGCCAT GGGTTTATTG AGAAGAGCAC GAGTTTCACG GAGCAAGAAA GAGGCTGATA
4501 GAGAGAGTTT TCCCCATCGG CTGCTTTCAT CTTGGCACAT AGCCCCAGTC CACCTGCCGT
4561 TGCTGGGGCA AAACTGCTGG CCACACCTAT CAGAAGGTTT CAGTGTTTCC CTGTGGTTTA
4621 ATGTGGAGTG TATCCATGAA GCTGAGAGTA CTACAGAAAA AGGAAAGAAG ATAAAGAAAA
4681 GAAACAAATC ATTAATTTTA CCAGATAGCA GTTTTGATGG TACAGAGAGC GACAGACCAG
4741 AAGGTGCAGA GTACATAAAT CCTGGTGAAA GACTCATAGA AGAAGGATGT ATTCATATAA
4801 TTTCACTGGG ATCCAAAGCG TTGATGATCC AAGTGTGGGC TGATCCCCAC AATGCCACTC
4861 TTATCTTTCG TGTGTGCATG GATTCAAATG ATGACATGAA AGCTGTTTTA CTAGCACAGG
4921 TTGAATCACA GGAGAATATT TTCCTCCCAA GCAAATGGCA ACATTTAGTA CTCACCTACT
4981 TACAGCAGCC CCAAGGGAAA AGGAGGATTC ATGGGAAAAT CTCCATATGG GTCTCTGGAC
5041 AGAGGAAGCC TGATGTTACT TTGGATTTTA TGCTTCCAAG AAAAACAAGT TTGTCATCTG
5101 ATAGCAATAA AACATTTTGC ATGATTGGCC ATTGTTTATC ATCCCAAGAA GAGTTTTTGC
5161 AGTTGGCTGG AAAATGGGAC CTGGGAAATT TGCTTCTCTT CAACGGAGCT AAGGTTGGTT
5221 CACAAGAGGC CTTTTATCTG TATGCTTGTG GACCCAACCA TACATCTGTA ATGCCATGTA
5281 AGTATGGCAA GCCAGTCAAT GACTACTCCA AATATATTAA TAAAGAAATT TTGCGATGTG
5341 AACAAATCAG AGAACTTTTT ATGACCAAGA AAGATGTGGA TATTGGTCTC TTAATTGAAA
5401 GTCTTTCAGT TGTTTATACA ACTTACTGTC CTGCTCAGTA TACCATCTAT GAACCAGTGA
5461 TTAGACTTAA AGGTCAAATG AAAACCCAAC TCTCTCAAAG ACCCTTCAGC TCAAAAGAAG
5521 TTCAGAGCAT CTTATTAGAA CCTCATCATC TAAAGAATCT CCAACCTACT GAATATAAAA
5581 CTATTCAAGG CATTCTGCAC GAAATTGGTG GAACTGGCAT ATTTGTTTTT CTCTTTGCCA
5641 GGGTTGTTGA ACTCAGTAGC TGTGAAGAAA CTCAAGCATT AGCACTGCGA GTTATACTCT
5701 CATTAATTAA ATACAACCAA CAAAGAGTAC ATGAATTAGA AAATTGTAAT GGACTTTCTA
5761 TGATTCATCA GGTGTTGATC AAACAAAAAT GCATTGTTGG GTTTTACATT TTGAAGACCC
5821 TTCTTGAAGG ATGCTGTGGT GAAGATATTA TTTATATGAA TGAGAATGGA GAGTTTAAGT
5881 TGGATGTAGA CTCTAATGCT ATAATCCAAG ATGTTAAGCT GTTAGAGGAA CTATTGCTTG
5941 ACTGGAAGAT ATGGAGTAAA GCAGAGCAAG GTGTTTGGGA AACTTTGCTA GCAGCTCTAG
6001 AAGTCCTCAT CAGAGCAGAT CACCACCAGC AGATGTTTAA TATTAAGCAG TTATTGAAAG
6061 CTCAAGTGGT TCATCACTTT CTACTGACTT GTCAGGTTTT GCAGGAATAC AAAGAGGGGC
6121 AACTCACACC CATGCCCCGA GAGGTTTGTA GATCATTTGT GAAAATTATA GCAGAAGTCC
6181 TTGGATCTCC TCCAGATTTG GAATTATTGA CAATTATCTT CAATTTCCTT TTAGCAGTTC
6241 ACCCTCCTAC TAATACTTAC GTTTGTCACA ATCCCACGAA CTTCTACTTT TCTTTGCACA
6301 TAGATGGCAA GATCTTTCAG GAGAAAGTGC GGTCAATCAT GTACCTGAGG CATTCCAGCA
6361 GTGGAGGAAG GTCCCTTATG AGCCCTGGAT TTATGGTAAT AAGCCCATCT GGTTTTACTG
6421 CTTCACCATA TGAAGGAGAG AATTCCTCTA ATATTATTCC ACAACAGATG GCCGCCCATA
6481 TGCTGCGTTC TAGAAGCCTA CCAGCATTCC CTACTTCTTC ACTACTAACG CAATCACAAA
6541 AACTGACTGG AAGTTTGGGT TGTAGTATCG ACAGGTTACA AAATATTGCA GATACTTATG
6601 TTGCCACCCA ATCAAAGAAA CAAAATTCTT TGGGGAGTTC CGACACACTG AAAAAAGGCA
6661 AAGAGGACGC ATTCATCAGT AGCTGTGAGT CTGCAAAAAC TGTTTGTGAA ATGGAAGCTG
6721 TCCTCTCAGC CCAGGTCTCT GTCAGTGATG TCCCAAAGGG AGTGCTGGGA TTTCCAGTGG
6781 TCAAAGCAGA TCATAAACAG TTGGGAGCAG AACCCAGGTC AGAAGATGAC AGTCCTGGGG
6841 ATGAGTCCTG CCCACGCCGA CCTGATTACC TAAAGGGATT GGCCTCCTTC CAGCGAAGCC
6901 ACAGCACTAT TGCAAGCCTT GGGCTAGCTT TTCCTTCACA GAACGGATCT GCAGCTGTTG
6961 GCCGTTGGCC AAGTCTTGTT GATAGAAACA CTGATGATTG GGAAAACTTT GCCTATTCTC
7021 TTGGTTATGA GCCAAATTAC AACCGAACTG CAAGTGCTCA CAGTGTAACT GAAGACTGTT
7081 TGGTACCTAT ATGCTGTGGA TTATATGAAC TCCTAAGTGG GGTTCTTCTT ATCCTGCCTG
7141 ATGTTTTGCT TGAAGATGTG ATGGACAAGC TTATTCAAGC AGATACACTT TTGGTCCTCG
7201 TTAACCACCC ATCACCAGCT ATACAACAAG GTGTTATTAA ACTATTAGAT GCATATTTTG
7261 CTAGAGCATC TAAGGAACAA AAAGATAAAT TTCTGAAGAA TCGTGGATTT TCCTTGCTAG
7321 CCAACCAGTT GTATCTTCAT CGAGGAACTC AAGAATTGTT AGAATGCTTC ATCGAAATGT
7381 TCTTTGGTCG ACATATTGGC CTTGATGAAG AATTTGATCT GGAAGATGTG AGAAACATGG
7441 GATTGTTTCA GAAGTGGTCT GTCATTCCTA TTCTGGGACT AATAGAGACC TCTCTATATG
7501 ACAACATACT CTTGCATAAT GCTCTTTTAC TTCTTCTCCA AATTTTAAAT TCTTGTTCTA
7561 AGGTAGCAGA TATGTTGCTG GATAATGGTC TACTCTATGT GTTATGTAAT ACAGTAGCAG
7621 CCCTGAATGG ATTAGAAAAG AACATTCCCA TGAGTGAATA TAAATTGCTT GCTTGTGATA
7681 TACAGCAACT TTTCATAGCA GTTACAATTC ATGCTTGCAG TTCCTCAGGC TCACAATATT
7741 TTAGGGTTAT TGAAGACCTT ATTGTAATGC TTGGATATCT TCAAAATAGC AAAAACAAGA
7801 GGACACAAAA TATGGCTGTT GCACTACAGC TTAGAGTTCT CCAGGCTGCT ATGGAATTTA
7861 TAAGGACCAC CGCAAATCAT GACTCTGAAA ACCTCACAGA TTCACTCCAG TCACCTTCTG
7921 CTCCCCATCA TGCAGTAGTT CAAAAGCGGA AAAGCATTGC TGGTCCTCGA AAATTTCCCC
7981 TTGCTCAAAC TGAATCGCTT CTGATGAAAA TGCGTTCAGT GGCAAATGAT GAGCTTCATG
8041 TGATGATGCA ACGGAGAATG AGCCAAGAGA ACCCTAGCCA AGCAACTGAA ACGGAACTTG
8101 CGCAGAGACT ACAGAGGCTC ACTGTTTTAG CAGTCAACAG GATTATTTAT CAAGAATTTA
8161 ATTCAGACAT TATTGACATT TTGAGAACTC CAGAAAATGT AACTCAAAGC AAGACCTCAG
8221 TTTTCCAGAC CGAAATTTCT GAGGAAAATA TTCATCATGA ACAGTCTTCT GTTTTCAATC
8281 CATTTCAGAA AGAAATTTTT ACATATCTGG TAGAAGGATT CAAAGTATCT ATTGGTTCAA
8341 GTAAAGCCAG TGGTTCCAAG CAGCAATGGA CTAAAATTCT GTGGTCTTGT AAGGAGACCT
8401 TCCGAATGCA GCTTGGGAGA CTACTAGTGC ATATTTTGTC GCCAGCCCAC GCTGCACAAG
8461 AGAGAAAGCA AATTTTTGAA ATAGTTCATG AACCAAATCA TCAGGAAATA CTACGAGACT
8521 GTCTCAGCCC ATCCCTACAA CATGGAGCCA AGTTAGTTTT GTATTTGTCA GAGTTGATAC
8581 ATAATCACCA AGGTGAATTG ACTGAAGAAG AGCTAGGCAC AGCAGAACTG CTTATGAATG
8641 CTTTGAAGTT ATGTGGTCAC AAGTGCATCC CTCCCAGTGC ATCAACAAAA GCAGACCTTA
8701 TTAAAATGAT CAAAGAGGAA CAAAAGAAAT ATGAAACTGA AGAAGGAGTG AATAAAGCTG
8761 CTTGGCAGAA AACAGTTAAC AATAATCAAC AAAGTCTCTT TCAGCGTCTG GATTCAAAAT
8821 CAAAGGATAT ATCTAAAATA GCTGCAGATA TCACCCAGGC AGTGTCTCTC TCCCAAGGAA
8881 ATGAGAGAAA AAAGGTGATC CAGCATATTA GAGGAATGTA TAAAGTAGAT TTGAGTGCCA
8941 GCAGACATTG GCAGGAACTT ATTCAGCAGC TGACACATGA TAGAGCAGTA TGGTATGACC
9001 CCATCTACTA TCCAACCTCA TGGCAGTTGG ATCCAACAGA AGGGCCAAAT CGAGAGAGGA
9061 GACGTTTACA GAGATGTTAT TTAACTATTC CAAATAAGTA TCTCCTTAGG GATAGACAGA
9121 AATCAGAAGA TGTTGTCAAA CCACCACTCT CTTACCTGTT TGAAGACAAA ACTCATTCTT
9181 CTTTCTCTTC TACTGTCAAA GACAAAGCTG CAAGTGAATC TATAAGAGTG AATCGAAGAT
9241 GCATCAGTGT TGCACCATCT AGAGAGACAG CTGGTGAATT GTTACTAGGT AAATGTGGAA
9301 TGTATTTTGT GGAAGATAAT GCTTCTGATA CAGTTGAAAG TTCGAGCCTT CAGGGAGAGT
9361 TGGAACCAGC ATCATTTTCC TGGACATATG AAGAAATTAA AGAAGTTCAC AAGCGTTGGT
9421 GGCAATTGAG AGATAATGCT GTAGAAATCT TTCTAACAAA TGGCAGAACA CTCCTGTTGG
9481 CATTTGATAA CACCAAGGTT CGTGATGATG TATACCACAA TATACTCACA AATAACCTCC
9541 CTAATCTTCT GGAATATGGT AACATCACCG CTCTGACAAA TTTATGGTAT ACTGGGCAAA
9601 TTACTAATTT TGAATATTTG ACTCACTTAA ACAAACATGC TGGCCGATCC TTCAATGATC
9661 TCATGCAGTA TCCTGTGTTC CCATTTATAC TTGCTGACTA CGTTAGTGAG ACACTTGACC
9721 TCAATGATCT GTTGATATAC AGAAATCTCT CTAAACCTAT AGCTGTTCAG TATAAAGAAA
9781 AAGAAGATCG TTATGTGGAC ACATACAAGT ACTTGGAGGA AGAGTACCGC AAAGGAGCCA
9841 GAGAAGATGA CCCCATGCCT CCCGTGCAGC CCTATCACTA TGGCTCCCAC TATTCCAATA
9901 GCGGCACTGT GCTTCACTTC CTGGTCAGGA TGCCTCCTTT CACTAAAATG TTTTTAGCCT
9961 ATCAAGATCA AAGTTTTGAC ATTCCAGACA GAACTTTTCA TTCTACAAAT ACAACTTGGC
10021 GACTCTCATC TTTTGAATCT ATGACTGATG TGAAAGAACT TATCCCAGAG TTTTTCTATC
10081 TTCCAGAGTT CCTAGTTAAC CGTGAAGGTT TTGATTTTGG TGTGCGTCAG AATGGTGAAC
10141 GGGTTAATCA CGTCAACCTT CCCCCTTGGG CGCGTAATGA TCCTCGTCTT TTTATCCTCA
10201 TCCATCGGCA GGCTCTAGAG TCTGACTACG TGTCGCAGAA CATCTGTCAG TGGATTGACT
10261 TGGTGTTTGG GTATAAGCAA AAGGGGAAGG CTTCTGTTCA AGCGATCAAT GTTTTTCATC
10321 CTGCTACATA TTTTGGAATG GATGTCTCTG CAGTTGAAGA TCCAGTTCAG AGACGAGCGC
10381 TAGAAACCAT GATAAAAACC TACGGGCAGA CTCCCCGTCA GCTGTTCCAC ATGGCCCATG
10441 TGAGCAGACC TGGAGCCAAG CTCAATATTG AAGGAGAGCT TCCAGCTGCT GTGGGGTTGC
10501 TAGTGCAGTT TGCTTTCAGG GAGACCCGAG AACAGGTCAA AGAAATCACC TATCCGAGTC
10561 CTTTGTCATG GATAAAAGGC TTGAAATGGG GGGAATACGT GGGTTCCCCC AGTGCTCCAG
10621 TACCTGTGGT CTGCTTCAGC CAGCCCCACG GAGAAAGATT TGGCTCTCTC CAGGCTCTGC
10681 CCACCAGAGC AATCTGTGGT TTGTCACGGA ATTTCTGTCT TCTGATGACA TATAGCAAGG
10741 AACAAGGTGT GAGAAGCATG AACAGTACGG ACATTCAGTG GTCAGCCATC CTGAGCTGGG
10801 GATATGCTGA TAATATTTTA AGGTTGAAGA GTAAACAAAG TGAGCCTCCA GTAAACTTTA
10861 TTCAAAGTTC ACAACAGTAC CAGGTGACTA GTTGTGCTTG GGTGCCTGAC AGTTGCCAGC
10921 TGTTTACTGG AAGCAAATGC GGTGTCATCA CAGCCTACAC AAACAGATTT ACAAGCAGCA
10981 CGCCATCAGA AATAGAAATG GAGACTCAAA TACATCTCTA TGGTCACACA GAAGAGATAA
11041 CCAGCTTATT TGTTTGCAAA CCATACAGTA TACTGATAAG TGTGAGCAGA GACGGAACCT
11101 GCATCATATG GGATTTAAAC AGGTTATGCT ATGTACAAAG TCTGGCGGGA CACAAAAGCC
11161 CTGTCACAGC TGTCTCTGCC AGTGAAACCT CAGGTGATAT TGCTACTGTG TGTGATTCAG
11221 CTGGCGGAGG CAGTGACCTC AGACTCTGGA CGGTGAACGG GGATCTCGTT GGACATGTCC
11281 ACTGCAGGGA GATCATCTGT TCCGTGGCTT TCTCCAACCA GCCTGAGGGA GTATCTATCA
11341 ATGTAATCGC TGGGGGATTA GAAAATGGAA TTGTAAGGTT ATGGAGCACA TGGGACTTAA
11401 AGCCTGTGAG AGAAATTACA TTTCCCAAAT CAAATAAGCC CATCATCAGC CTTACATTTT
11461 CTTGTGATGG CCACCATTTG TACACAGCAA ACAGTGATGG GACCGTGATT GCCTGGTGTC
11521 GGAAGGACCA GCAGCGCTTG AAACAGCCAA TGTTCTATTC CTTCCTTAGC AGCTATGCAG
11581 CCGGGTGAAT GCGAATGAAC TTCACGTTCT CCAAAGCACT TTAACTCCAA ACTAGATTTG
11641 TTGACTTCAC CAGTTTTAGG AGGTTGAACC TAAAGAAATG GATGACTGGA CAAACCATCC
11701 AAATAATGAT AAAGTCTATT CATCTGCACA AAATTCTGAA GAGTCACATG ATCCTAAGAG
11761 GAAAGTTCTG TTCTATTTTA GTGATAATCT GGAAGATTGT GTCAATATGC ACTAGCCAAC
11821 AAGTTTTAAG CCTCGCATGG TACATTAAAA TGATATTCTT AAAATTTTTT CCCACCAAGG
11881 TATTCCAAAG AAAATATTAA GGTCTCCCCT TTTTCTATGA TTCCAAAAGG ACCAGTAGAA
11941 TTTAAATTGG TTGGTTGATT GTTTATATAA AACACACTAA AATTATATTT TAAAAGTTTA
12001 CTGCCATGAA ATACTCCTCC CACCACACAC ACATGCTCCA AAAGAGGAAA GAAAAAAAGA
12061 TAATTTTTAG GACTTGATAA TTGCTTTCTT TGAGAAGCAA ATTATTCAGT AGGTGCCTCT
12121 GTACCAAATA TTTTATGGAA TATCTAAATA CTAAAATAAA CTATGAATGA ATCTCAAAAT
12181 TAGGCAGTTT TTGCCAGTTG CTTTCTTAGC TCAAAGGAGA ACCAGAATTT TTTTGACAGC
12241 CACAAACAAG AATACAGGTA TCTTGGATTT CAGACACATT CTGTTTCTTC ATAAAAATTT
12301 TACTTAAAAT CTGTAACGCT AGATATTGAC TATCCTTAGT TGAGTCACTG AGGTTTAAAC
12361 ACAATGGTAA GTCTTAAAGT CTGCTATTTA CAGAGCATTG AATCTGTACC AATTTGCAAT
12421 AGAAAGCCTT CAGTATGCAA GAAGTTTGCA TGGGTATTAA GAACACAGCC TAAATAAGGC
12481 ATTTGATCTA ATCTGCAGGA AGAATTTTCT TCCCCAAAAC AGAATTATAA AAGCTTACTT
12541 TAAACAGGAG GCAGAATAAT TCTTTTAGGA AACCATTTCA TTCTGTTTCT ACTAACCTAT
12601 ACCATCTGAG AATTCTAGGA AGAATAATAA AATCTCGTGT ATTCCACAGC AAACTTACAT
12661 ACCATAAAGA CAGAATTCCT AAACATCTTG GAGCCGTCTG TCTCTCCCAT ATGATGGCTG
12721 TCTGTATATT TTTACTTGGG GTGCTGCTTT ATTGGCTTTG AAAACACTGT CAGATAAGCT
12781 CAGTAATATG TTACCATGGG ATAAAAATAT GTATCCCTGC CTAAGAATAA CTTGTGCATT
12841 TGTTATGGAA ATTTAATTCA TATGGTGTTT ACAGTACTAC TTTTGTAACT TCCAGACTTT
12901 CTAAAACATT CTGCTTAAAA ACCATATAAA ATATAATTCC AAAGTCTCTG CTGTCAAGAT
12961 AGATTCGAGA GAAAGCACGT GGCCATGTAT GCTTTAACCT TAAACTGCAT ACACATGTAG
13021 TGATACCTAG GCTGCATTTA GATCACCGTG TGCTCAGGCC AGGTGTGAAT CCTGAGGTCC
13081 ATGGAGGTGC AGAGATGAGA TTACTCCTAT TCACGTTGAA GTGATTTGCT TTGTTAACAA
13141 AAAATTGCAG CTATTGTCTA GCTTTCATTT TTTTACTGAG AACTTTAAAT TAGTCCCCTA
13201 TTAGAATAGG GTTGCTACTC ATCTTTTTTT AAAAACCGAA TTTCATCATT TATCTAAAGA
13261 GAAAATATGC AGAATAACTG GTCTTGTTAA GAGTGCAATA TTATATTTTT ATGTAAAAAT
13321 AAAAATTAAT TTGGGGGGAT TATTTATTCA GCATGAAACC TAATATGTAT ATGTTTGAAA
13381 TACTTCATAA TGTGCATGTT GTAGCAAACA TTTCTGTAAA TTATCACAAG CTCTGTTACC
13441 TTTATATACA CTGCCTCTTC AATTTGGAAA TAAATTTCAT AAAAATAGAT GTAAACAAAA
13501 AAA
(SEQ ID NO: 1). Также описаны нуклеотидные последовательности, которые имеют, по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичность аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 1.
2. Белок LYST
Полипептид LYST представляет собой цитоплазматический белок из 3801 аминокислоты (также известный как регулятор лизосомального транспорта, белок CHS, CHS1 или белок LYST) с молекулярной массой приблизительно 429 кДа (Barbosa, et al., Nature, 382(6588): 262-265 (1996)).
Белок LYST существует в виде одной из трех изоформ и, по прогнозам, принимает спиральную структуру (Barbosa, et al., Nature, 382(6588): 262-265 (1996)).
Белок LYST является высококонсервативным среди видов млекопитающих и экспрессируется на низких уровнях во всех типах клеток, но в большом количестве экспрессируется в тимусе плода и взрослого человека, лейкоцитах периферической крови, костном мозге и в нескольких областях головного мозга взрослого человека (см. обзор Dotta, et al., Orphanet Journal of Rare Diseases, 8:168 (2013), и ссылки в этом обзоре).
Аминокислотные последовательности белка LYST человека известны в данной области. См., например, номер доступа GeneBank U67615:
MSTDSNSLAR EFLTDVNRLC NAVVQRVEAR EEEEEETHMA TLGQYLVHGR GFLLLTKLNS 60
IIDQALTCRE ELLTLLLSLL PLVWKIPVQE EKATDFNLPL SADIILTKEK NSSSQRSTQE 120
KLHLEGSALS SQVSAKVNVF RKSRRQRKIT HRYSVRDARK TQLSTSDSEA NSDEKGIAMN 180
KHRRPHLLHH FLTSFPKQDH PKAKLDRLAT KEQTPPDAMA LENSREIIPR QGSNTDILSE 240
PAALSVISNM NNSPFDLCHV LLSLLEKVCK FDVTLNHNSP LAASVVPTLT EFLAGFGDCC 300
SLSDNLESRV VSAGWTEEPV ALIQRMLFRT VLHLLSVDVS TAEMMPENLR KNLTELLRAA 360
LKIRICLEKQ PDPFAPRQKK TLQEVQEDFV FSKYRHRALL LPELLEGVLQ ILICCLQSAA 420
SNPFYFSQAM DLVQEFIQHH GFNLFETAVL QMEWLVLRDG VPPEASEHLK ALINSVMKIM 480
STVKKVKSEQ LHHSMCTRKR HRRCEYSHFM HHHRDLSGLL VSAFKNQVSK NPFEETADGD 540
VYYPERCCCI AVCAHQCLRL LQQASLSSTC VQILSGVHNI GICCCMDPKS VIIPLLHAFK 600
LPALKNFQQH ILNILNKLIL DQLGGAEISP KIKKAACNIC TVDSDQLAQL EETLQGNLCD 660
AELSSSLSSP SYRFQGILPS SGSEDLLWKW DALKAYQNFV FEEDRLHSIQ IANHICNLIQ 720
KGNIVVQWKL YNYIFNPVLQ RGVELAHHCQ HLSVTSAQSH VCSHHNQCLP QDVLQIYVKT 780
LPILLKSRVI RDLFLSCNGV SQIIELNCLN GIRSHSLKAF ETLIISLGEQ QКДАSVPDID 840
GIDIEQKELS SVHVGTSFHH QQAYSDSPQS LSKFYAGLKE AYPKRRKTVN QDVHINTINL 900
FLCVAFLCVS KEAESDRESA NDSEDTSGYD STASEPLSHM LPCISLESLV LPSPEHMHQA 960
ADIWSMCRWI YMLSSVFQKQ FYRLGGFRVC HKLIFMIIQK LFRSHKEEQG KKEGDTSVNE 1020
NQDLNRISQP KRTMKEDLLS LAIKSDPIPS ELGSLKKSAD SLGKLELQHI SSINVEEVSA 1080
TEAAPEEAKL FTSQESETSL QSIRLLEALL AICLHGARTS QQKMELELPN QNLSVESILF 1140
EMRDHLSQSK VIETQLAKPL FDALLRVALG NYSADFEHND AMTEKSHQSA EELSSQPGDF 1200
SEEAEDSQCC SFKLLVEEEG YEADSESNPE DGETQDDGVD LKSETEGFSA SSSPNDLLEN 1260
LTQGEIIYPE ICMLELNLLS ASKAKLDVLA HVFESFLKII RQKEKNVFLL MQQGTVKNLL 1320
GGFLSILTQD DSDFQACQRV LVDLLVSLMS SRTCSEELTL LLRIFLEKSP CTKILLLGIL 1380
KIIESDTTMS PSQYLTFPLL HAPNLSNGVS SQKYPGILNS KAMGLLRRAR VSRSKKEADR 1440
ESFPHRLLSS WHIAPVHLPL LGQNCWPHLS EGFSVSLWFN VECIHEAEST TEKGKKIKKR 1500
NKSLILPDSS FDGTESDRPE GAEYINPGER LIEEGCIHII SLGSKALMIQ VWADPHNATL 1560
IFRVCMDSND DMKAVLLAQV ESQENIFLPS KWQHLVLTYL QQPQGKRRIH GKISIWVSGQ 1620
RKPDVTLDFM LPRKTSLSSD SNKTFCMIGH CLSSQEEFLQ LAGKWDLGNL LLFNGAKVGS 1680
QEAFYLYACG PNHTSVMPCK YGKPVNDYSK YINKEILRCE QIRELFMTKK DVDIGLLIES 1740
LSVVYTTYCP AQYTIYEPVI RLKGQMKTQL SQRPFSSKEV QSILLEPHHL KNLQPTEYKT 1800
IQGILHEIGG TGIFVFLFAR VVELSSCEET QALALRVILS LIKYNQQRVH ELENCNGLSM 1860
IHQVLIKQKC IVGFYILKTL LEGCCGEDII YMNENGEFKL DVDSNAIIQD VKLLEELLLD 1920
WKIWSKAEQG VWETLLAALE VLIRADHHQQ MFNIKQLLKA QVVHHFLLTC QVLQEYKEGQ 1980
LTPMPREVCR SFVKIIAEVL GSPPDLELLT IIFNFLLAVH PPTNTYVCHN PTNFYFSLHI 2040
DGKIFQEKVR SIMYLRHSSS GGRSLMSPGF MVISPSGFTA SPYEGENSSN IIPQQMAAHM 2100
LRSRSLPAFP TSSLLTQSQK LTGSLGCSID RLQNIADTYV ATQSKKQNSL GSSDTLKKGK 2160
EDAFISSCES AKTVCEMEAV LSAQVSVSDV PKGVLGFPVV KADHKQLGAE PRSEDDSPGD 2220
ESCPRRPDYL KGLASFQRSH STIASLGLAF PSQNGSAAVG RWPSLVDRNT DDWENFAYSL 2280
GYEPNYNRTA SAHSVTEDCL VPICCGLYEL LSGVLLILPD VLLEDVMDKL IQADTLLVLV 2340
NHPSPAIQQG VIKLLDAYFA RASKEQKDKF LKNRGFSLLA NQLYLHRGTQ ELLECFIEMF 2400
FGRHIGLDEE FDLEDVRNMG LFQKWSVIPI LGLIETSLYD NILLHNALLL LLQILNSCSK 2460
VADMLLDNGL LYVLCNTVAA LNGLEKNIPM SEYKLLACDI QQLFIAVTIH ACSSSGSQYF 2520
RVIEDLIVML GYLQNSKNKR TQNMAVALQL RVLQAAMEFI RTTANHDSEN LTDSLQSPSA 2580
PHHAVVQKRK SIAGPRKFPL AQTESLLMKM RSVANDELHV MMQRRMSQEN PSQATETELA 2640
QRLQRLTVLA VNRIIYQEFN SDIIDILRTP ENVTQSKTSV FQTEISEENI HHEQSSVFNP 2700
FQKEIFTYLV EGFKVSIGSS KASGSKQQWT KILWSCKETF RMQLGRLLVH ILSPAHAAQE 2760
RKQIFEIVHE PNHQEILRDC LSPSLQHGAK LVLYLSELIH NHQGELTEEE LGTAELLMNA 2820
LKLCGHKCIP PSASTKADLI KMIKEEQKKY ETEEGVNKAA WQKTVNNNQQ SLFQRLDSKS 2880
KDISKIAADI TQAVSLSQGN ERKKVIQHIR GMYKVDLSAS RHWQELIQQL THDRAVWYDP 2940
IYYPTSWQLD PTEGPNRERR RLQRCYLTIP NKYLLRDRQK SEDVVKPPLS YLFEDKTHSS 3000
FSSTVKDKAA SESIRVNRRC ISVAPSRETA GELLLGKCGM YFVEDNASDT VESSSLQGEL 3060
EPASFSWTYE EIKEVHKRWW QLRDNAVEIF LTNGRTLLLA FDNTKVRDDV YHNILTNNLP 3120
NLLEYGNITA LTNLWYTGQI TNFEYLTHLN KHAGRSFNDL MQYPVFPFIL ADYVSETLDL 3180
NDLLIYRNLS KPIAVQYKEK EDRYVDTYKY LEEEYRKGAR EDDPMPPVQP YHYGSHYSNS 3240
GTVLHFLVRM PPFTKMFLAY QDQSFDIPDR TFHSTNTTWR LSSFESMTDV KELIPEFFYL 3300
PEFLVNREGF DFGVRQNGER VNHVNLPPWA RNDPRLFILI HRQALESDYV SQNICQWIDL 3360
VFGYKQKGKA SVQAINVFHP ATYFGMDVSA VEDPVQRRAL ETMIKTYGQT PRQLFHMAHV 3420
SRPGAKLNIE GELPAAVGLL VQFAFRETRE QVKEITYPSP LSWIKGLKWG EYVGSPSAPV 3480
PVVCFSQPHG ERFGSLQALP TRAICGLSRN FCLLMTYSKE QGVRSMNSTD IQWSAILSWG 3540
YADNILRLKS KQSEPPVNFI QSSQQYQVTS CAWVPDSCQL FTGSKCGVIT AYTNRFTSST 3600
PSEIEMETQI HLYGHTEEIT SLFVCKPYSI LISVSRDGTC IIWDLNRLCY VQSLAGHKSP 3660
VTAVSASETS GDIATVCDSA GGGSDLRLWT VNGDLVGHVH CREIICSVAF SNQPEGVSIN 3720
VIAGGLENGI VRLWSTWDLK PVREITFPKS NKPIISLTFS CDGHHLYTAN SDGTVIAWCR 3780
KDQQRLKQPM FYSFLSSYAA G 3801
(SEQ ID NO: 2)
Описаны полипептиды LYST, которые имеют, по меньшей мере, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или 100% идентичность аминокислотных последовательностей с SEQ ID NO: 2.
Хотя белок LYST был ассоциирован с большим количеством разнообразных активностей клетки, в частности, с внутриклеточной миграцией белка в эндосомы и лизосомы, биологическая функция белка LYST, в основном, остается неизвестной.
Нарушения экспрессии и функции продукта гена LYST вовлечены в многочисленные патологические нарушения, в том числе в аутоиммунные заболевания, гиперпролиферативные нарушения и нарушения функции тромбоцитов. Более конкретно, мутации в гене LYST ассоциированы с заболеванием человека, синдромом Чедиака-Хигаши (CHS) (Barrat, et al., Am. J. Hum. Genet, 59:625-632 (1996)). У пациента с CHS ген LYST содержит мутацию со сдвигом рамки считывания в нуклеотидах 117-118 кодирующего домена.
CHS представляет собой редкую болезнь лизосомального накопления, которая характеризуется гипопигментацией, тяжелым иммунодефицитом, склонностью к кровотечениям, неврологическими нарушениями, нарушением внутриклеточного транспорта к лизосоме и от лизосомы и включениями в виде гигантских телец в различных типах клеток. По меньшей мере, 30 мутаций в гене LYST были идентифицированы у людей с синдромом Чедиака-Хигаши. Эти мутации нарушают нормальное функционирование белка-регулятора лизосомального транспорта, что приводит к нарушению размера, структуры и функции лизосом и связанных с ними внутриклеточных структур. Люди с мутациями LYST имеют аномально большие лизосомы и связанные с ними структуры повсюду в организме. Эти увеличенные структуры мешают нормальным функциям клетки. В клетках иммунной системы, таких как макрофаги, увеличенные лизосомы препятствуют адекватному ответу этих клеток на бактерии и другие чужеродные организмы; крупные перинуклеарные лизосомы выстроены на манер трубочек внутри макрофагальных клеток у людей с CHS. Пораженные нейтрофилы и моноциты имеют хемотаксические и миграционные свойства, которые составляют приблизительно 40% от свойств нормальных клеток. Пострадавшие пациенты также имеют склонность к кровотечениям из-за тромбоцитарной дисфункции. В результате снижения ответа на хемотаксические стимулы неисправная иммунная система не может защитить организм от тяжелых рецидивирующих инфекций. CHS часто приводит к смерти, поскольку у пациентов ослаблен иммунитет и они не способны наращивать эффективный иммунный ответ на инфекцию.
У мышей линии Beige (Bg) мышиный гомолог LYST («Lyst») разрушен делецией, которая исключает экспрессию функционального белка Lyst. Было обнаружено, что мыши Bg демонстрируют уменьшение пролиферативных заболеваний, в том числе более низкую скорость стенозирования после имплантации трансплантатов сосудистой ткани по сравнению с мышами дикого типа. Влияние нефункционального белка LYST у мышей Bg высокоспецифично по отношению к макрофагам, как было определено при помощи экспериментов с трансплантатом костного мозга (см. Примеры).
C. Ингибиторы LYST
Установлено, что блокада белка LYST может уменьшать или предотвращать иммунные процессы, которые вызывают сосудистые пролиферативные нарушения, фибропролиферативное заболевание и избыточное образование рубцовой ткани после травмы. Описаны агенты для иммуномодуляции, которые ингибируют или снижают транскрипцию, трансляцию или функцию белка LYST.
Ингибиторы LYST могут связываться с геном LYST или с белком LYST и напрямую или опосредованно блокировать биологическую функцию белка LYST. Ингибиторы могут также блокировать биологическую функцию одного или более путей передачи сигнала, которые составляют нижележащую биологическую функцию LYST. В некоторых вариантах осуществления ингибиторы LYST действуют, препятствуя взаимодействию с белком LYST эндогенных лигандов белка LYST или их непосредственному связыванию с белком LYST. Ингибиторы могут блокировать белок-белковые взаимодействия, включающие белок LYST, или они могут предотвращать или уменьшать функциональную активность комплекса белка LYST и лиганда. Ингибиторы, которые связываются напрямую с белком LYST, могут действовать путем прямого загораживания активного центра на белке LYST, или через непрямое загораживание, такое как стерическая блокада взаимодействий LYST. Например, в некоторых вариантах осуществления ингибитор препятствует функции или загораживает домен взаимодействия белка, такого как соленоидный белковый домен, образованный тандемными копиями повторяющегося мотива WD40. В других вариантах осуществления ингибиторы связываются с местом, которое пространственно отделено от активного центра.
Ингибиторы, которые связываются с белком LYST, могут препятствовать функции LYST при помощи механизмов, включающих в качестве неограничивающих примеров, индуцирование димеризации, индуцирование олигомеризации, индуцирование конформационных изменений, препятствование каталитическим функциям, индуцирование разрушения, индуцирование захвата иммунными клетками, предотвращение захвата клетками-мишенями, предотвращение связывания с лигандом, предотвращение фосфорилирования, индуцирование денатурации, предотвращение одной или более посттрансляционных модификаций или иной модификации, изменяющей третичную структуру белка LYST.
Следует понимать, что инициация или трансдукция клеточного пути передачи сигнала путем LYST может потребовать связывания лиганда с белком LYST. Таким образом, белки, антитела или низкомолекулярные соединения, которые блокируют пути передачи сигнала с участием LYST и необязательно предотвращают связывание LYST и его рецепторов, подходят в качестве иммуномодуляторных агентов. Нижеописанные классы ингибиторов LYST включают антитела и функциональные нуклеиновые кислоты.
1. Антитела
Описаны антитела, которые ингибируют функцию LYST за счет непосредственного связывания с белком LYST, его лигандами или его вспомогательными молекулами. Любое специфическое антитело можно использовать в способах и композициях, предлагаемых в настоящем документе. Антитела могут включать антигенсвязывающий участок, который связывается с эпитопом на белке LYST. Связывание антитела с LYST может ингибировать или уменьшать функцию белка LYST через один или более различных механизмов.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент специфически связываются с эпитопом внутри белка, который кодируется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. Эпитоп может быть линейным эпитопом и может включать одну или более последовательных аминокислот из первичной последовательности SEQ ID NO: 2. В других вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут связываться с конформационным эпитопом, который включает трехмерную деталь поверхности, форму или третичную структуру белка LYST. В некоторых вариантах осуществления трехмерная деталь поверхности может включать любое число аминокислот из SEQ ID NO: 2, или соответствующие остатки в его гомологе, ортологе, паралоге или варианте.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с эпитопом внутри белка, который кодируется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, могут связываться только если белок, кодируемый аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2, не связан с лигандом или низкомолекулярным соединением.
1
2
3
4
В описанных композициях и способах можно использовать различные типы антител и фрагментов антител, включая полноразмерный иммуноглобулин любого класса, его фрагменты, и синтетические белки, содержащие, по меньшей мере, антигенсвязывающий вариабельный домен антитела. Антитело может быть антителом IgG, таким как IgG, IgG, IgG, или IgG. Антитело может быть в форме антигенсвязывающего фрагмента, включая Fab фрагмент, F(ab')2 фрагмент, одноцепочечную вариабельную область, и т.п. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными (МАТ). Моноклональные антитела включают «химерные» антитела, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как оставшаяся часть цепи/цепей идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных от других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител, при условии, что они специфически связываются с целевым антигеном и/или проявляют желаемую биологическую активность (патент США № 4816567; и Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Описанные антитела также могут быть модифицированы рекомбинантными способами, например, путем делеций, добавлений или замены аминокислот, для повышения эффективности антитела при опосредовании желаемой функции. Замены могут быть консервативными заменами. Например, по меньшей мере, одна аминокислота в константной области антитела может быть замещена другим остатком (см., например, патент США № 5624821; патент США № 6194551; WO 9958572; и Angal, et al., Mol. Immunol. 30:105-08 (1993)). В некоторых случаях, замены вносят для снижения нежелательных активностей, например, комплементзависимой цитотоксичности. Антитело может быть биспецифическим антителом со специфичностью связывания, по меньшей мере, для двух различных антигенных эпитопов. В одном из вариантов осуществления эпитопы могут быть из одного антигена. В другом варианте осуществления эпитопы принадлежат различным антигенам. Биспецифические антитела могут включать биспецифические фрагменты антител (см., например, Hollinger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90:6444-48 (1993); Gruber, et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)).
Ряд антител, которые связываются с белком LYST человека коммерчески доступны во многих источниках, например, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, каталожный номер sc-136746). Антитела можно получать любым способом, известным в данной области. Примеры описаний способов для создания и выработки антител включают Delves, Antibody Production: Essential Techniques (Wiley, 1997); Shephard, et al., Monoclonal Antibodies (Oxford University Press, 2000); Goding, Monoclonal Antibodies: Principles And Practice (Academic Press, 1993); и Current Protocols In Immunology (John Wiley & Sons, самое последнее издание). Фрагменты интактных молекул Ig можно получать при помощи способов, хорошо известных в данной области, включая ферментативное расщепление и рекомбинантные способы.
2. Функциональные нуклеиновые кислоты
Описаны функциональные нуклеиновые кислоты, которые ингибируют транскрипцию, трансляцию или функцию продуктов генов LYST. Функциональные нуклеиновые кислоты представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, которые имеют специфическую функцию, такую как связывание с целевой молекулой или катализ конкретной реакции. Как обсуждается более подробно далее, функциональные молекулы нуклеиновой кислоты можно подразделить на следующие неограничивающие категории: антисмысловые молекулы, миРНК, мкРНК, аптамеры, рибозимы, триплекс-образующие молекулы, РНКи и внешние направляющие последовательности (EGS). Функциональные молекулы нуклеиновой кислоты могут действовать как эффекторы, ингибиторы, модуляторы и стимуляторы специфической активности, принадлежащей молекуле-мишени, или функциональные молекулы нуклеиновой кислоты могут иметь активность de novo, независимую от каких-либо других молекул.
Функциональные молекулы нуклеиновой кислоты могут взаимодействовать с любой макромолекулой, такой как ДНК, РНК, полипептиды, или углеводные цепи. Таким образом, функциональные нуклеиновые кислоты могут взаимодействовать с мРНК или геномной ДНК полипептида LYST или они могут взаимодействовать непосредственно с полипептидом LYST. Функциональные нуклеиновые кислоты часто конструируют для взаимодействия с другими нуклеиновыми кислотами на основании гомологии последовательностей между молекулой-мишенью и функциональными молекулами нуклеиновой кислоты. В других ситуациях, специфическое распознавание между функциональными молекулами нуклеиновой кислоты и молекулой-мишенью основано не на гомологии последовательностей между функциональными молекулами нуклеиновой кислоты и молекулой-мишенью, а скорее на образовании третичной структуры, которая позволяет происходить специфическому распознаванию. Таким образом описанные композиции могут включать одну или более функциональных нуклеиновых кислот, разработанных для снижения экспрессии или функции белка LYST.
В некоторых вариантах осуществления композиция включает функциональную нуклеиновую кислоту или полипептид, разработанный для нацеливания и снижения или ингибирования экспрессии или трансляции мРНК LYST; или для снижения или ингибирования экспрессии, снижения активности или усиления деградации белка LYST. В некоторых вариантах осуществления композиция включает вектор, подходящий для экспрессии in vivo функциональной нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления функциональная нуклеиновая кислота или полипептид разработаны для нацеливания на сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, или на комплементарную ей последовательность, или ее варианты, имеющие последовательность нуклеиновой кислоты на 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичную нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
В других вариантах осуществления функциональная нуклеиновая кислота или полипептид разработаны для нацеливания на сегмент последовательности нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 1, или на комплементарную ей последовательность, или ее варианты, имеющие последовательность нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, на 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичную SEQ ID NO: 1.
В некоторых вариантах осуществления функциональная нуклеиновая кислота гибридизуется с нуклеиновой кислотой из SEQ ID NO: 1, или с комплементарной ей последовательностью, например, при жестких условиях. В некоторых вариантах осуществления функциональная нуклеиновая кислота гибридизуется с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая кодирует SEQ ID NO: 2, или с комплементарной ей последовательностью, например, при жестких условиях.
Способы получения и применения векторов для экспрессии in vivo описанных функциональных нуклеиновых кислот, таких как антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК, кшРНК, мкРНК, EGS, рибозимы и аптамеры, известны в данной области.
i.Антисмысловые молекулы
d
-6
-8
-10
-12
Функциональные нуклеиновые кислоты могут быть антисмысловыми молекулами. Антисмысловые молекулы разработаны для взаимодействия с молекулой-мишенью нуклеиновой кислоты путем или канонического или не-канонического спаривания оснований. Взаимодействие антисмысловой молекулы и молекулы-мишени разработано для облегчения разрушения молекулы-мишени, например, путем деградации гибрида РНК-ДНК, опосредованной РНКазой H. Альтернативно, антисмысловая молекула разработана для прерывания функции процессинга, которая в норме происходила бы с молекулой-мишенью, такой как транскрипция или репликация. Антисмысловые молекулы можно разрабатывать на основании последовательности молекулы-мишени. Существует множество способов для оптимизации антисмысловой эффективности за счет поиска наиболее доступных областей молекулы-мишени. Примеры способов включают эксперименты отбора in vitro и исследования модификаций ДНК с использованием диметилсульфида (DMS) и диэтилпилокарбоната (DEPC). Предпочтительно, чтобы антисмысловые молекулы связывались с молекулой-мишенью LYST с константой диссоциации (K), менее чем или равной 10, 10, 10 или 10.
ii. Аптамеры
d
d
d
d
-12
-6
-8
-10
-12
Функциональные нуклеиновые кислоты могут быть аптамерами. Аптамеры представляют собой молекулы, которые взаимодействуют с молекулой-мишенью, предпочтительно определенным образом. Как правило, аптамеры представляют собой малые нуклеиновые кислоты в диапазоне от 15-50 пар оснований в длину, которые сложены в определенные вторичные и третичные структуры, такие как «стебель-петля» или G-квартеты. Аптамеры могут связываться с низкомолекулярными соединениями, такими как АТФ и теофиллин, а также крупными молекулами, такими как обратная транскриптаза и тромбин. Аптамеры могут связываться очень прочно с K с молекулой-мишенью менее чем 10M. Предпочтительно, чтобы аптамеры связывались с молекулой-мишенью LYST с K менее чем 10, 10, 10, или 10. Аптамеры могут связываться с молекулой-мишенью с очень высокой степенью специфичности. Например, были выделены аптамеры, которые имели разницу в аффинностях связывания более чем в 10,000 раз между молекулой-мишенью и другой молекулой, которые различались только по одному положению в молекуле. Предпочтительно, чтобы аптамер имел K с молекулой-мишенью LYST, по меньшей мере, в 10, 100, 1000, 10000, или 100000 раз ниже, чем K с молекулой для фонового связывания. Предпочтительно, при сравнении для молекул, таких как полипептид, чтобы фоновая молекула была другим полипептидом.
iii. Рибозимы
Функциональные нуклеиновые кислоты могут быть рибозимами. Рибозимы представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, которые способны к катализу химической реакции или внутримолекулярно, или межмолекулярно. Предпочтительно, чтобы рибозимы катализировали межмолекулярные реакции. Описаны различные типы рибозимов, которые катализируют реакции нуклеазного типа или типа полимеразы нуклеиновых кислот, которые основаны на рибозимах, встречающихся в природных системах, таких как молотоголовые рибозимы. Также описаны рибозимы, которые не встречаются в природных системах, а были сконструированы для катализа определенных реакций de novo. Предпочтительные рибозимы расщепляют РНК- или ДНК-субстраты, и, более предпочтительно, расщепляют РНК-субстраты. Рибозимы, как правило, расщепляют субстраты из нуклеиновых кислот путем распознавания и связывания субстрата-мишени с последующим расщеплением. Это распознавание часто основано, главным образом, на канонических и неканонических взаимодействиях пар оснований. Это свойство делает рибозимы особенно хорошими кандидатами для нацеленного специфического расщепления нуклеиновых кислот, поскольку распознавание субстрата-мишени основано на последовательности субстратов-мишеней.
iv. Триплекс-образующие олигонуклеотиды
d
-6
-8
-10
-12
Функциональные нуклеиновые кислоты могут быть молекулами триплекс-образующих олигонуклеотидов. Триплекс-образующие функциональные молекулы нуклеиновой кислоты представляют собой молекулы, которые могут взаимодействовать или с двухцепочечной, или с одноцепочечной нуклеиновой кислотой. Когда триплексные молекулы взаимодействуют с областью-мишенью, образуется структура, называемая триплекс, в которой три цепи ДНК образуют комплекс, зависящий как от спаривания оснований по Уотсону-Крику, так и от спаривания по Хугстину. Триплексные молекулы являются предпочтительными, потому что они связываются с областями-мишенями с высокой аффинностью и специфичностью. Предпочтительно, чтобы триплекс-образующие молекулы связывались с молекулой-мишенью с K менее чем 10, 10, 10, или 10.
v.Внешние направляющие последовательности
Функциональные нуклеиновые кислоты могут быть внешними направляющими последовательностями. Внешние направляющие последовательности (EGS) представляют собой молекулы, которые связываются с молекулой-мишенью нуклеиновой кислоты с образованием комплекса, который распознается РНКазой P с последующим расщеплением молекулы-мишени. EGS можно разрабатывать конкретно для выбранной молекулы-мишени РНК. РНКаза P помогает при процессинге транспортной РНК (тРНК) внутри клетки. Бактериальную РНКазу P можно привлечь для расщепления практически любой последовательности РНК при помощи EGS, которая образует комплекс РНК-мишень:EGS, чтобы имитировать природный тРНК-субстрат. Аналогично, можно использовать эукариотическое EGS/РНКазное P-направленное расщепление РНК для расщепления желаемых мишеней внутри эукариотических клеток. Типичные примеры того, как получать и применять молекулы EGS для облегчения расщепления ряда различных молекул-мишеней, известны в данной области.
vi. РНК-интерференция
В некоторых вариантах осуществления функциональные нуклеиновые кислоты индуцируют выключение гена путем РНК-интерференции (миРНК). Экспрессию гена LYST можно эффективно подавить специфическим образом при помощи РНК-интерференции.
Выключение гена изначально наблюдали при добавлении двухцепочечной РНК (дцРНК) (Fire, et al. (1998) Nature, 391:806-11; Napoli, et al. (1990) Plant Cell 2:279-89; Hannon, (2002) Nature, 418:244-51). После попадания дцРНК в клетку ее расщеплял РНКаза III-подобный фермент под названием Дайсер (Dicer) на двухцепочечные малые интерферирующие РНК (миРНК) длиной 21-23 нуклеотида, которые содержали «липкие» концы из двух нуклеотидов на 3' концах (Elbashir, et al., Genes Dev., 15:188-200 (2001); Bernstein, et al., Nature, 409:363-6 (2001); Hammond, et al., Nature, 404:293-6 (2000); Nykanen, et al., Cell, 107:309-21 (2001); Martinez, et al., Cell, 110:563-74 (2002)). Воздействие иРНК или миРНК или их применение не ограничено никаким типом механизма.
В одном из вариантов осуществления миРНК запускает специфическую деградацию гомологичных молекул РНК LYST, таких как мРНК LYST, в пределах области идентичности последовательностей между миРНК и РНК-мишенью LYST.
В клетках млекопитаюших выключения последовательности конкретного гена можно достигнуть с использованием синтетических коротких двухцепочечных РНК, которые имитируют миРНК, производимую дайсер-ферментом (Elbashir, et al., Nature, 411:494-498 (2001)) (Ui-Tei, et al., FEBS Lett, 479:79-82 (2000)).
TM
TM
миРНК могут быть синтезированы химически или in vitro или могут быть получены из короткой двухцепочечной шпилечной РНК (кшРНК), которая процессируется в миРНК внутри клетки. Например, WO 02/44321 раскрывает миРНК, способную к сиквенс-специфической деградации мРНК-мишеней при спаривании с 3'-«липкими концами», и включена в настоящий документ в качестве ссылки на способ получения этих миРНК. Синтетические миРНК, как правило, конструируют с использованием алгоритмов и общепринятого синтезатора ДНК/РНК. Поставщики включают Ambion (Austin, Texas), ChemGenes (Ashland, Massachusetts), Dharmacon (Lafayette, Colorado), Glen Research (Sterling, Virginia), MWB Biotech (Esbersberg, Germany), Proligo (Boulder, Colorado), и Qiagen (Vento, The Netherlands). миРНК можно также синтезировать in vitro при помощи наборов, таких как Ambion's SILENCER miRNA Construction Kit. В некоторых вариантах осуществления композиция включает вектор, экспрессирующий функциональную нуклеиновую кислоту. Продукция миРНК из вектора наиболее часто происходит путем транскрипции короткой шпилечной РНК (кшРНК). Доступны наборы для продукции векторов, включающих кшРНК, такие как, например, Imgenex's GENESUPPRESSOR Construction Kits и Invitrogen's BLOCK-IT индуцибельная плазмида с РНКи и лентивирусные векторы. В некоторых вариантах осуществления функциональная нуклеиновая кислота является миРНК, кшРНК, или мкРНК.
B. Эксципиенты, носители и устройства
Ингибиторы LYST можно вводить и перемещать внутрь клеток индивидуума при помощи носителя или без носителя. Подходящие носители для описанных ингибиторов известны в данной области и можно выбирать те, которые подходят конкретному ингибитору. В предпочтительном варианте осуществления ингибитор вводят путем инъекции внутривенно, подкожно, интраперитонеально или местно. Типичные носители представляют собой физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, и другие носители, подходящие для инъекций.
Описаны составы, включающие один или более ингибиторов LYST с носителем или без носителя. Описанные ингибиторы LYST можно формулировать в фармацевтические композиции, включающие один или более фармацевтически приемлемых носителей. Фармацевтические композиции можно формулировать для различных механизмов введения, в соответствии с ингибитором и назначаемым применением. Описаны фармацевтические композиции, сформулированные для введения парентеральным (внутримышечная, интраперитонеальная, внутривенная (в/в) или подкожная инъекция), местным или трансдермальным (или пассивно, или с использованием ионофореза или электропорации) путем введения или при помощи биоразлагаемых вкладышей.
1.Парентеральное введение
В некоторых вариантах осуществления один или более ингибиторов LYST и необязательно носитель формулируют для введения в водном растворе путем парентеральной инъекции. Состав также может быть в форме суспензии или эмульсии. В основном, предлагаются фармацевтические композиции, содержащие эффективные количества активного средства, нацеливающую группу, и необязательно носитель и необязательно фармацевтически приемлемые разбавители, консерванты, солюбилизаторы, эмульгаторы, адъюванты и/или носители. Такие композиции включают разбавители в виде стерильной воды, забуференного физиологического раствора с различным содержанием буфера (например, Tris-HCl, ацетат, фосфат), pH и ионной силой и необязательно добавки, такие как детергенты и солюбилизаторы (например, TWEEN 20, TWEEN@ 80, также обозначаемый как полисорбат 20 или 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), и консерванты (например, тимеросал, бензиловый спирт), и вещества, придающие объем (например, лактоза, маннит). Примерами неводных растворителей или носителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло и кукурузное масло, желатин, и инъекционные органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Составы можно лиофилизировать и растворять/ресуспендировать непосредственно перед применением. Состав может быть стерилизован, например, при помощи фильтрации через фильтр, задерживающий бактерии, путем введения стерилизующих агентов в композиции, путем облучения композиций или путем нагревания композиций.
2. Введение через легкие и слизистую
В дополнительных вариантах осуществления один или более ингибиторов LYST и необязательно носитель формулируют для введения на слизистую, такую как слизистая рта, глаз, легких, носа, пероральную слизистую (сублингвальную, буккальную), вагинальную или ректальную слизистую.
Составы для введения на слизистую, как правило, будут в виде частиц лекарственного средства, высушенных распылением, которые могут быть включены в таблетку, гель, капсулу, суспензию или эмульсию. Стандартные фармацевтические эксципиенты доступны у любого разработчика рецептур.
В одном из вариантов осуществления соединения формулируют для введения через легкие, такого как интраназальное введение или пероральная ингаляция. Дыхательные пути представляют собой структуру, которая участвует в газообмене между атмосферой и кровотоком. Верхние и нижние дыхательные пути называются проводящими дыхательными путями. Концевые бронхиолы подразделяются на респираторные бронхиолы, которые затем ведут к конечной респираторной зоне, альвеолам или глубокому легкому. Глубокое легкое, или альвеолы, является первичной мишенью для вдыхаемых терапевтических аэрозолей для системной доставки лекарственного средства. Терапевтические средства, которые активны в легких, можно вводить системно и нацеливать через легочную абсорбцию. Как применяют в настоящем документе, термин «аэрозоль» относится к любому препарату тонкораспыленных частиц, который может быть в растворе или суспензии, производится ли он с использованием пропеллента или без него. Аэрозоли можно получать с использованием стандартных способов, таких как ультразвуковая обработка или обработка высоким давлением.
Носители для легочных составов можно подразделить на составы в виде сухого порошка и составы для введения в виде растворов. Аэрозоли для доставки терапевтических средств к дыхательным путям известны в данной области. Для введения через верхние дыхательные пути состав можно формулировать в виде раствора, например, водного или изотонического физиологического раствора, забуференного или не забуференного, или в виде суспензии, для интраназального введения в виде капель или в виде спрея. Предпочтительно, такие растворы или суспензии являются изотоническими по отношению к назальному секрету и приблизительно с таким же pH, в диапазоне, например, приблизительно от pH 4,0 до приблизительно pH 7,4 или, от pH 6,0 до pH 7,0. Буферы должны быть физиологически совместимыми и включают, просто в качестве примера, фосфатные буферы. Специалист в данной области может легко определить подходящий состав физиологического раствора и pH для безопасного водного раствора для назального введения и/или введения через верхние дыхательные пути.
Композиции можно вводить в легкие во время вдыхания и перемещения через эпителиальную выстилку легких в кровоток при доставке в виде или аэрозоля, или частиц, высушенных распылением, с аэродинамическим диаметром менее чем приблизительно 5 микрон.
Составы в виде сухого порошка («DPF») с большим размером частиц имеют улучшенные характеристики текучести, такие как меньшая агрегация, более легкое распыление, и потенциально меньший фагоцитоз. Аэрозоли с сухим порошком для ингаляционной терапии, как правило, производят со средними диаметрами прежде всего в диапазоне менее чем 5 микрон, хотя предпочтительный диапазон аэродинамического диаметра расположен между одним и десятью микронами. Крупные частицы «носителя» (не содержит лекарственного средства) вводят совместно с терапевтическими аэрозолями, чтобы, помимо других возможных преимуществ, помочь достигнуть эффективного распыления. Составы для легочного введения включают однослойные фосфолипидные везикулы, липосомы, или липопротеиновые частицы. Составы и способы получения таких составов, содержащих нуклеиновую кислоту, хорошо известны специалисту в данной области. Можно использовать широкий диапазон механических устройств, разработанных для легочного введения терапевтических продуктов, включая в качестве неограничивающих примеров небулайзеры, ингаляторы отмеренных доз и порошоковые ингаляторы, все из которых хорошо известны специалистам в данной области.
3. Местное и трансдермальное введение
Активное средство и необязательно носитель можно вводить местно. Местное введение может включать введение напрямую в сосудистую систему или к тканям, или к протезам, например, во время операции, или путем прямого нанесения на кожу.
Можно также готовить трансдермальные составы. Это, как правило, будут мази, лосьоны, спреи или пластыри, все из которых можно получать с использованием стандартной технологии. Трансдермальные составы могут включать усилители впитывания. Стандартные фармацевтические эксципиенты для местного или трансдермального введения доступны у любого разработчика рецептур.
4. Матрицы с контролируемым высвобождением
Полимерные устройства для контролируемого высвобождения можно производить для долгосрочного систематического высвобождения после имплантации полимерного устройства (стержня, цилиндра, пленки, диска) или инъекции (микрочастицы). Матрица может быть в форме микрочастиц, таких как микросферы, где ингибиторы LYST диспергированы внутри плотной полимерной матрицы или микрокапсул, в которых сердцевина изготовлена из материала, отличного от полимерной оболочки, и один или более ингибиторов LYST диспергированы или суспендированы в сердцевине, которая может быть жидкой или твердой по своей природе. Если не определено конкретно в настоящем документе, микрочастицы, микросферы, и микрокапсулы используют взаимозаменяемо. Альтернативно, полимер может быть отлит в виде тонкой пластины или пленки, в диапазоне от нанометров до четырех сантиметров, произведен в виде порошка путем дробления или другими стандартными способами, или даже в виде геля, такого как гидрогель.
Можно использовать не биоразлагаемые или биоразлагаемые матрицы для доставки описанных ингибиторов LYST, хотя предпочтительными являются биоразлагаемые матрицы. Эти матрицы могут быть природными или синтетическими полимерами, хотя предпочтительными являются синтетические полимеры из-за лучших характеристик деградации и профилей высвобождения. Полимер выбирают на основании периода желаемого высвобождения. В некоторых случаях наиболее полезным будет линейное высвобождение, хотя в других случаях пульсовое высовождение или «масштабное высвобождение» может обеспечить более эффективные результаты. Полимер может быть в форме гидрогеля (как правило, поглощая приблизительно 90% воды по массе), и может быть необязательно перекрестно-сшитым с мультивалентными ионами или полимерами.
Матрицы могут быть образованы путем выпаривания растворителя, сушки распылением, экстракции растворителя и другими способами, известными специалистам в данной области. Биоразрушаемые микросферы можно получать при помощи любого из способов, разработанных для получения микросфер для доставки лекарственных средств, например, описанного Mathiowitz и Langer, J. Controlled Release 5:13-22 (1987); Mathiowitz, et al., Reactive Polymers 6:275-283 (1987); и Mathiowitz, et al., J. Appl. Polymer Sci. 35:755-774 (1988). Устройства можно формулировать для местного высвобождения для обработки области имплантации или инъекции, которое, как правило, доставляет дозу, значительно меньшую, чем доза для лечения всего организма. Устройства можно также формулировать для местного или системного высвобождения.
Микро- и наночастицы, разработанные для доставки грузов, таких как лекарственные средства и антитела, в сосудистую систему, к сосудистым гладкомышечным клеткам, или участкам, или сгусткам, или тромбозу, известны в данной области. См., например, Wickline, et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, 26:435-441 (2006), опубликованную онлайн (декабрь 2005), и опубликованные заявки США №№. 2002/0168320, 2003/0086867, 2003/0129136, 2004/0058951, 2004/0115192, 2006/0147380, 2006/0239919, 2007/0140965, 2007/0202040, 2007/0258908, 2008/0175792, 2008/0247943 и 2013/0064765.
Например, наночастицы из перфторуглерода, изначально рассматривавшиеся в качестве искусственных заменителей крови, были превращены в технологическую платформу для молекулярной визуализации и направленной доставки лекарственных средств, т.е., в так называемую «лечебно-диагностическую» технологию. Эти частицы, инкапсулированные в липиды, номинально 250 нм в диаметре, можно вводить внутривенно, и они, как правило, ограничены по размеру до интактной сосудистой системы.
В некоторых вариантах осуществления носитель является липосомой. Если ингибитор LYST представляет собой антитело, белок или низкомолекулярное соединение, предпочтительный носитель может быть липосомой. Описаны липосомы для доставки описанных ингибиторов LYST непосредственно к конкретному типу клеток, например, к макрофагальным клеткам. Макрофагальные клетки могут поглощать липосомы, что приводит к доставке одного или более ингибиторов во внутриклеточные отделы макрофага. Подходящие способы, материалы и липиды для получения липосом известны в данной области. Липосомные носители коммерчески доступны во множестве источников. Липосомы могут быть сформированы в виде одиночного липидного бислоя (т.е., липосома может быть однослойной) или более концентрических липидных бислоев (т.е., липосома может быть многослойной). Липосома может быть сформирована из одного липида; однако, в некоторых вариантах осуществления липосома сформирована из комбинации более чем одного липида. Липиды могут быть нейтральными, анионными, или катионными при физиологическом pH.
Подходящие нейтральные и анионные липиды включают стерины и липиды, такие как холестерин, фосфолипиды, лизолипиды, лизофосфолипиды, и сфинголипиды. Нейтральные и анионные липиды в качестве неограничивающих примеров включают, фосфатидилхолин (ФХ) (такой как ФХ желтка, соевый ФХ), в том числе 1,2-диацил-глицеро-3-фосфохолины; фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилглицерин, фосфатидилинозитол (ФИ); гликолипиды; сфингофосфолипиды, такие как сфингомиелин, сфингогликолипиды (также известные как 1-церамидилгликозиды), такие как церамид галактопиранозид, ганглиозиды и цереброзиды; жирные кислоты, стерины, содержащие группу карбоновой кислоты, такие как холестерин или его производные; и 1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламины, в том числе 1,2-диолеоил-sn-Глицеро-3-фосфоэтаноламин или 1,2- диолеоилглицерил фосфатидилэтаноламин (DOPE), 1,2-дигексадецилфосфоэтаноламин (DHPE), 1,2-дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), 1,2-дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), и 1,2-димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), триметиламмонийные соли, также обозначаемые как TAP-липиды, например, в виде метилсульфатной соли. Подходящие TAP-липиды в качестве неограничивающих примеров включают, DOTAP (диолеоил-), DMTAP (димиристоил-), DPTAP (дипальмитоил-), и DSTAP (дистеароил-). Другие подходящие катионные липиды включают диметилдиоктадециламмоний бромид (DDAB), 1,2-диацилокси-3-триметиламмоний пропаны, N-[1-(2,3-диолоилокси)пропил]-N,N-диметиламин (DODAP). Другие подходящие липиды включают пегилированные производные вышеописанных нейтральных, анионных и катионных липидов. Введение одного или более пегилированных липидных производных приводит к получению липосомы с полиэтиленгликолевыми цепями, расположенными на поверхности. Полученные липосомы могут обладать повышенной стабильностью и временем циркуляции in vivo по сравнению с липосомами без цепей ПЭГ на поверхности.
Если ингибитор LYST представляет собой нуклеиновую кислоту или вектор, носитель может быть вирусным вектором, например, коммерчески доступным препаратом, таким как аденовирусный вектор (Quantum Biotechnologies, Inc. (Laval, Quebec, Canada). Доставка при помощи вирусного вектора может происходить через вирусную систему, такую как система ретровирусного вектора, которая может упаковать рекомбинантный ретровирусный геном (см. например, Pastan et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4486; Miller et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895). Рекомбинантный ретровирус затем можно использовать для заражения и, таким образом, доставки в инфицированные клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей ингибитор LYST. Конкретный способ введения измененной нуклеиновой кислоты в клетки млекопитающих, конечно, не ограничен применением ретровирусных векторов. Другие широко распространенные способы для этой процедуры включают использование аденовирусных векторов (Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5:941-948 (1994)), аденоассоциированных вирусных (AAV) векторов (Goodman et al., Blood 84:1492-1500 (1994)), лентивирусных векторов (Naidini et al., Science 272:263-267 (1996)), псевдотипированных ретровирусных векторов (Agrawal et al., Exper. Hematol. 24:738-747 (1996)).
Также можно использовать способы физической трансдукции, такие как липосомная доставка и рецептор-опосредованный эндоцитоз и другие механизмы эндоцитоза (см., например, Schwartzenberger et al., Blood 87:472-478 (1996)). Хорошо известны коммерчески доступные липосомные препараты, такие как LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-BRL, Inc., Gaithersburg, Md.), SUPERFECT (Qiagen, Inc. Hilden, Germany) и TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wis.), а также другие липосомы, разработанные в соответствии со стандартными способами в данной области. Кроме того, описанную нуклеиновую кислоту или вектор можно доставлять in vivo при помощи электропорации, которая доступна у Genetronics, Inc. (San Diego, Calif.) а также способами сонопорации или при помощи ультразвуковой машины (ImaRx Pharmaceutical Corp., Tucson, Ariz.). Описанные композиции и способы можно использовать в сочетании с любыми из этих или других широко используемых способов переноса генов.
5. Трансплантаты и Медицинские устройства
Описанными композициями для иммуномодуляции путем ингибирования LYST можно покрывать снаружи медицинские устройства или вводить внутрь в медицинские устройства, или их можно использовать для предварительной обработки имплантируемых сосудистых трансплантатов ex vivo.
Трансплантаты
Ингибиторы LYST можно использовать для предварительной обработки сосудистых трансплантатов ex vivo перед имплантацией индивидууму. Композиции, включающие один или более ингибиторов LYST и необязательно носитель, можно наносить на ткань способами, которые обеспечивают адгезию и распределение на всем протяжении ткани или трансплантата в оптимальных местах для обработки лекарственным средством. В некоторых вариантах осуществления один или более ингибиторов LYST вводят с использованием наночастиц, микрочастиц, липосом, мицелл, эмульсий, гелей или покрытий, которые разработаны для адгезии в интересующей области, для переноса достаточной нагрузки лекарственным средством, чтобы обеспечить местное лечение в течение длительных периодов, для высвобождения ингибиторов LYST с желаемой частотой или скоростью, для проникновения внутрь ткани или трансплантата в оптимальной степени, или их сочетания.
Трансплантаты для применения в хирургии также можно формировать путем высеивания клеток ex vivo на биоразлагаемый каркас. Трансплантаты могут быть аутологичными, например, подкожная вена или радиальная артерия; аутологичными с консервированием, например, криоконсервированной веной; аллогенными; ксеногенными; или синтетическими, например, тканый полиэстер, полиуретан (LYCRA), политетрафтороэтилен (PTFE), GORE-TEX, или полиэтилен терефталат (DACRON). Артериальные гомотрансплантаты с использованием внутренней грудной, радиальной или подчревной артерий представляют собой примеры полезных и долговечных сосудистых протезов. Примеры трансплантатов обсуждаются ниже.
Тканеинженерный сосудистый трансплантат
Описаны тканеинженерные сосудистые трансплантаты (TEVG), содержащие один или более ингибиторов LYST. Тканеинженерные сосудистые трансплантаты (TEVG) имеют большие перспективы для развития области хирургии врожденных пороков сердца, где его способность к росту можно использовать в полной мере. Например, TEVG можно сконструировать для применения в качестве сосудистого протеза, соединяющего нижнюю полую вену с легочной артерией у пациентов, подвергающихся модифицированной операции Фонтена. Долгосрочные (>10 лет) результаты пилотного исследования, оценивающего использование TEVG у 25 пациентов с сердечными аномалиями в одном желудочке, продемонстрировали отсутствие смертей, связанных с трансплантатом, или отказов трансплантата. Была также подтверждена способность роста TEVG, что делает его первым искусственным трансплантатом со способностью к росту. Первичным осложнением, связанным с трансплантатом, был стеноз, поразивший приблизительно 30% пациентов, при этом 16% (4/25) потребовалась ангиопластика для лечения угрожающего стеноза.
В одном из вариантов осуществления TEVG образован из биоразлагаемого трубчатого каркаса, изготовленного из трубки из волокон полигликолевой кислоты. Трубка может быть покрыта сополимером, таким как полимолочная кислота (ПМК) и поликапролактон в соотношении 50:50. Каркас можно засеять клетками перед имплантацией индивидууму. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой аутологичные клетки от предполагаемого реципиента.
Было установлено, что избыточная инфильтрация макрофагами в тканеинженерных сосудистых трансплантатах (TEVG) способствовала рубцеванию, приводя к утолщению сосуда, закупорке и стенозу. Таким образом, композиции и способы, описываемые в настоящем документе, можно использовать для доставки одного или более ингибиторов LYST местно и контролируемым образом к TEVG для профилактики или ингибирования инфильтрации макрофагами.
Шунт
Описаны шунты, содержащие один или более ингибиторов LYST. В общей форме операция шунтирования включает иссечение подкожной вены на ноге для аутотрансплантации в коронарную артерию. В значительном числе случаев эти трансплантаты выходят из строя, по большей части из-за рестеноза, вызванного гиперплазией неоинтимы. Композиции и способы, описываемые в настоящем документе, можно использовать для доставки одного или более ингибиторов LYST местно и контролируемым образом к аутологичному трансплантату. Ингибитор можно вводить до, во время и/или сразу же после операции. После иссечения подкожной вены ткань может быть (и так часто происходит) в течение нескольких часов суспендирована в физиологическом растворе во время открытия грудной клетки и подготовки для имплантации трансплантата. Композиции, содержащие один или более ингибиторов LYST и необязательно нацеливающий сигнал, носитель или их сочетание, можно инкубировать вместе с подкожной веной в течение этого периода.
Артериовенозный трансплантат (АВТ)
Описаны артериовенозные трансплантаты, содержащие один или более ингибиторов LYST. Терминальная почечная недостаточность учащается в Соединенных Штатах Америки. Болезненность сосудистого доступа для гемодиализа остается одной из главных проблем качества жизни для пациентов; она также представляет собой значительные издержки для общества. Природный артериовенозный анастомоз (АВА) остается наилучшим сосудистым проводником для создания доступа для гемодиализа и обеспечивает превосходные результаты при сравнении с другими возможностями, такими как искусственный АВТ. К сожалению, каждый индивидуум ограничен числом природных АВА, которые могут быть созданы, из-за ограниченного числа подходящих участков и сосудов. Участки доступа ограничены, поскольку пациенты с терминальной почечной недостаточностью, как правило, имеют серьезные сопутствующие заболевания, требующие обширных венепункций для диагностики и терапии до конца жизни. У пациентов, которые исчерпали все возможности для первичного АВА, новые места доступа должны использовать артериовенозные трансплантаты. Эти трансплантаты предрасположены к рестенозу за счет гиперплазии неоинтимы, что ограничивает их эффективность. Инкубацию композиции, содержащей один или более ингибиторов LYST, и необязательно включающей нацеливающий сигнал, носитель, или их сочетание, на трансплантате можно производить во время операции.
Медицинские устройства
В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую один или более ингибиторов LYST, наносят снаружи или вводят внутрь медицинского устройства или его компонента (например, внутрь полимерных резервуаров в сосудистых стентах) для уменьшения или ингибирования нарушений сосудистой пролиферации, такой как образование неоинтимы у индивидуума. Устройство может быть устройством, которое вводится индивидууму временно, или устройством, которое имплантируется на постоянный срок. В некоторых вариантах осуществления устройство представляет собой хирургическое устройство.
Примеры медицинских устройств в качестве неограничивающих примеров включают, иглы, канюли, катетеры, шунты, баллоны и имплантаты, такие как стенты и клапаны.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор LYST или фармацевтическую композицию можно формулировать так, чтобы обеспечить их включение в медицинское устройство, которое может наносить ингибитор непосредственно на место для профилактики или лечения состояний, таких как рестеноз или другие нарушения сосудистой пролиферации. Ингибитор LYST или его фармацевтическую композицию можно формулировать, включая их в состав покрытия медицинского устройства. Существуют различные покрытия, которые можно использовать, такие как, например, полимерные покрытия, которые могут высвобождать ингибитор в течение заданного периода времени. Ингибитор или его фармацевтическая композиция могут быть внедрены непосредственно внутрь медицинского устройства. В некоторых вариантах осуществления ингибитор LYST наносят снаружи или внутри устройства в носителе, таком как микрочастица или липосома, который облегчает его высвобождение и доставку.
Стенты
В некоторых вариантах осуществления медицинское устройство представляет собой сосудистый имплантат, такой как стент. Стенты применяют в медицине для профилактики или устранения сужений сосудов. Стенты можно вставлять в суженный сосуд таким образом, что суженный сосуд расширяется. Опыт работы с такими сосудистыми имплантатами указывает на то, что избыточный рост прилежащих клеток снова приводит к сужению сосуда, в частности на концах имплантатов, что уменьшает эффективность имплантатов. Если стент вводят в артерию человека для устранения атеросклеротического стеноза, в пределах года может происходить гиперплазия интимы на концах сосудистого имплантата и приводить к возобновлению стеноза.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления стенты покрывают или нагружают композицией, содержащей ингибитор LYST и необязательно носитель.
Многие стенты являются коммерчески доступными или так или иначе известны в данной области. Стенты могут быть сформированы, т.е., вытравлены или вырезаны, из тонкой трубки подходящего материала, или из тонкой пластинки подходящего материала и свернуты в трубку.
Подходящие материалы для стента в качестве неограничивающих примеров включают нержавеющую сталь, иридий, платину, золото, вольфрам, тантал, палладий, серебро, ниобий, цирконий, алюминий, медь, индий, рутений, молибден, ниобий, олово, кобальт, никель, цинк, железо, галлий, марганец, хром, титан, алюминий, ванадий, и углерод, а также их комбинации, сплавы и/или ламинации. Например, стент может быть сформирован из сплава кобальта, такого как L605 или MP35N@, Nitinol (никель-титановый сплав с памятью формы), ABI (палладий-серебряный сплав), Elgiloy@ (кобальт-хром-никелевый сплав), и т.д. Также предполагают, что сплав может быть сформирован из двух или более материалов, которые ламинированы вместе, такой как тантал, который ламинирован с MP35N. Стенты могут также быть сформированы из проволок, имеющих концентрированные слои разных металлов, сплавов или других материалов. Варианты осуществления стента могут быть также сформированы из полых трубок или трубок, которые были заполнены другими материалами. Вышеуказанные материалы и ламинации приведены в качестве примеров и никоим образом не являются ограничивающими.
Стенты могут быть стентами с выделением лекарственного средства. Различные стенты, выделяющие лекарственное средство, которые одновременно доставляют терапевтическое вещество к месту лечения и обеспечивают искусственную круговую поддержку тканям стенки, известны в данной области. Внешние поверхности внутрипросветных устройств, в том числе стентов, можно покрывать веществом, таким как вещество, высвобождающее лекарственное средство, фактор роста, антитело, или т.п. Стенты могут также быть разработаны в виде полой трубчатой структуры с отверстиями или входами, прорезанными через боковую стенку, для элюции лекарственного средства из центрального просвета. Хотя полая природа стента позволяет заполнять центральный просвет раствором лекарственного средства, который доставляется через входы и отверстия в боковой стенке стента, полая трубчатая структура может не иметь подходящей механической силы для обеспечения адекватной поддержки сосуду.
Описаны стенты, которые выделяют ингибиторы LYST. В некоторых вариантах осуществления устройства также покрыты или пропитаны ингибитором LYST и одним или более дополнительными терапевтическими средствами, включая в качестве неограничивающих примеров, антитромбоцитарные средства, противо свертывающие средства, противомикробные средства, и противометаболические препараты.
Примеры стентов, которые можно использовать с композициями и способами, описываемыми в настоящем документе, в качестве неограничивающих примеров включают стенты, описанные в патентах США №№ 5891108, 6918929, 6923828, 6945992, 6986785, 7060090, 7144419, 7163555, 7323008, 7651527, 7655034, 7678141, 7744645, 7942917, 8001925, 8001925, 8034099, 8048149, 8066760, 8100960, 8157855, 8172893, 8182524, 8187284, 8187322, 8197528, 8206432, 8221490, 8231669, 8236044, 8252048, 8252065, 8257425, 8257431, 8292945, 8298278, 8298280, 8348991, 8348992, 8348993, 8353952, 8359998, 8361140, 8372134, 8372138, 8377112, 8388676, 8398695, 8414637, 8414639 и 8414656.
Биопротезы
Многие другие протезные устройства могут содержать один или более ингибиторов LYST, включая в качестве неограничивающих примеров сердечные клапаны, искусственные суставы, кардиостимуляторы, вживленные катетеры и косметические имплантаты.
Полагают, что описанные ингибиторы LYST могут уменьшать или предотвращать воспалительные ответы и фибропролиферативные нарушения, ассоциированные с присутствием биопротеза. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления биопротезы покрывают композицией или на них наносят композицию, включающую ингибитор LYST и необязательно носитель.
IV. Способы применения
Предлагаются способы применения описанных ингибиторов LYST. Способы могут включать введение индивидууму эффективного количества композиции, включающей один или более ингибиторов LYST, для профилактики, снижения, или ингибирования экспрессии или функции LYST у индивидуума; предварительную обработку медицинского устройства или сосудистого трансплантата эффективным количеством композиции, включающей ингибитор LYST для профилактики, снижения, или ингибирования образования неоинтимы после введения или имплантации устройства или трансплантата индивидууму; или их сочетание.
A. Нарушения и заболевания, подлежащие лечению
Ингибиторы LYST можно использовать для изменения иммунных функций, включая в качестве неограничивающих примеров, функцию макрофагов, тромбоцитов и клеток-естественных киллеров, создавая прорегенеративное иммунное окружение. Способы применения ингибиторов LYST, включая в качестве неограничивающих примеров, способы, разработанные для ингибирования или блокирования транскрипции, трансляции или функции белка LYST можно использовать для модулирования иммунного ответа. В некоторых вариантах осуществления способы споособствуют образованию новой сосудистой ткани, ингибируют образование неоинтимы и улучшают проходимость сосуда, например, после операции на сосудах. Предлагаются способы применения ингибиторов LYST для профилактики гиперплазии интимы и неоинтимы как в биологических, так и в синтетических сосудистых протезах. Способы могут уменьшать или предотвращать стеноз при TEVG и улучшать функцию TEVG.
Дополнительно, ингибиторы LYST могут иметь более обширные проявления, связанные с содействием регенерации тканей, улучшением заживления ран и модуляцией ответа на чужеродное тело. Таким образом, также описаны способы применения ингибиторов LYST в качестве дополнения к способам регенеративной медицины. В некоторых вариантах осуществления способы применения ингибиторов LYST могут способствовать заживлению и предотвращать образование рубца, например, способствовать заживлению и предотвращать спайки после хирургии брюшной полости.
Способы могут модулировать количество фактора роста тромбоцитов (PDGF), производимого в результате повреждения ткани. Таким образом, способы могут лечить заболевания, ассоциированные с избыточной и нежелательной экспрессией PDGF.
Способы могут также предотвращать или лечить заболевания, возникшие в результате избыточного фиброза, например фиброзные заболевания печени, легкого или сердца. Наконец, способы анти-LYST терапии могут приводить к иммуномодуляции, которая изменяет ответ на чужеродное тело и способствует интеграции, но блокирует инкапсуляцию биопротеза, таким образом, улучшая функциональность и долговечность устройств, таких как кардиостимулятор или стимуляторы нервов или интеграцию замененных сердечных клапанов или искусственных суставов.
В предпочтительных вариантах осуществления один или более ингибиторов LYST являются эффективными для уменьшения, ингибирования или замедления одного или более симптомов заболевания, нарушения или состояния у индивидуума. Описанные ингибиторы LYST имеют широкий спектр терапевтических и профилактических применений, например, их можно использовать для лечения или профилактики сосудистых пролиферативных нарушений после травмы или различных хирургических процедур, рубцевания и фиброзных заболеваний. Описаны способы применения одного или более ингибиторов LYST для лечения заболевания, которое характеризуется наличием избыточной рубцовой или фиброзной ткани. Также предлагаются способы применения одного или более ингибиторов LYST для антитромбоцитарной терапии, например, лечения заболеваний, вызванных нарушенной, избыточной или иной нежелательной активностью тромбоцитов или сигнального пути PDGF.
Сосудистые пролиферативные нарушения
В некоторых вариантах осуществления описанные ингибиторы LYST можно использовать для лечения или профилактики сосудистых пролиферативных нарушений. Примеры таких нарушений в качестве неограничивающих примеров включают сосудистую пролиферацию вовлеченную в атеросклероз, сосудистую пролиферацию после имплантации внутрисосудистого устройства, сосудистую пролиферацию в месте сосудистого анастомоза, как правило, происходящую после процедуры реваскуляризации или артерио-венозного шунтирования, сосудистую пролиферацию после каротидной эндартериоэктомии, и трансплантационную васкулопатию.
Предлагаются способы лечения или профилактики сосудистых пролиферативных нарушений путем введения одного или более ингибиторов LYST. Способы, как правило, уменьшают или ингибируют инфильтрацию макрофагальными клетками, или переход макрофагальных клеток из фенотипа M1 в M2, или и то, и другое, по сравнению с контролем. В некоторых вариантах осуществления способы уменьшают или ингибируют пролиферацию макрофагальных клеток без уменьшения или ингибирования развития новой сосудистой ткани. Индивидуум может иметь стеноз, рестеноз или другие нарушения сосудистой пролиферации, или он может быть идентифицирован, как имеющий риск рестеноза или других нарушений сосудистой пролиферации, например, индивидуумы, которые подвергались, подвергаются или подвергнутся сосудистой травме, ангиопластике, сосудистой хирургии или трансплантационной артериопатии, и т.д. Заболевания, нарушения и состояния, которые можно лечить при помощи описанных композиций рассматриваются более подробно ниже.
Сосудистая травма
В некоторых вариантах осуществления один или более ингибиторов LYST можно применять до, во время или после сосудистой травмы.
Сосудистая травма запускает каскад событий, которые включают слущивание или дисфункцию эндотелия, воспаление, а также активацию и пролиферацию сосудистых гладкомышечных клеток (СГМК). Множество факторов роста и цитокинов высвобождается при помощи дисфункциональных эндотелиальных клеток, воспалительных клеток, тромбоцитов и СГМК. Эти факторы роста и цитокины медиируют хемоаттракцию, клеточную миграцию, пролиферацию, апоптоз и модуляцию матрикса, и вовлечены в ряд сосудистых пролиферативных нарушений.
Сосудистые пролиферативные заболевания и нарушения могут инициироваться механическим, биохимическим или иммунологическим повреждением стенок кровеносного сосуда. Типичные сосудистые травмы включают травмы, ассоциированные как с тупыми, так и с проникающими повреждениями, включая в качестве неограничивающих примеров, рваные раны, колотые раны, травмы сдавления, огнестрельные раны, ножевые раны, производственный травматизм, падения, и автомобильные аварии, а также медицинские вмешательства, такие как операция или ангиопластика.
В некоторых вариантах осуществления индивидуум подвергался, подвергается, или будет подвергаться хирургической операции. Хирургические операции могут включать инвазивные, минимально инвазивные или чрескожные операции. Например, в некоторых вариантах осуществления индивидуум подвергается операции для лечения или восстановления аневризмы брюшной аорты, стеноза сонных артерий, варикозного расширения вен, окклюзионной болезни периферических артерий, острой ишемии конечностей или расслоения аорты. Распространенные сосудистые операции в качестве неограничивающих примеров включают восстановление открытой аневризмы брюшной аорты, восстановление внутрисосудистой аневризмы (EVAR), каротидную эндартериоэктомию, каротидное шунтирование, экстракцию вен, склеротерапию и пенную склеротерапию, внутривенное лечение лазером, радиочастотную абляцию вен, амбулаторную флебоэктомию, ангиопластику с наличием/отсутствием стентирования, шунтирование с эндартерэктомией и атерэктомией, баллонную эмболэктомию, тромбэктомию, шунтирование, операции с открытым доступом, восстановление торакальной внутрисосудистой аневризмы (TEVAR). Хирург может наносить один или более ингибиторов LYST на операционное поле во время операции, перед операцией или после операцией, для улучшения процесса заживления ран или для профилактики развития сосудистых пролиферативных нарушений, таких как нарушения, вызывающие стеноз или рестеноз.
Гиперплазия интимы
Гиперплазия интимы представляет собой физиологический заживляющий ответ на повреждение эндотелия кровеносных сосудов. Повреждение эндотелиального слоя запускает серии острых и хронических воспалительных ответов, которые вызывают агрегацию тромбоцитов, осаждение фибрина и привлекают лейкоциты в область повреждения (Murakami, et al., Am J Physiol., 272:L197-L202 (1997); Cotran, et al., J Am Soc Nephrol., 1:225-235 (1990)). Таким образом, регенеративные процессы, которые вызывают образование новых сосудов и гиперплазию интимы, по-видимому, являются иммунно-опосредованными явлениями, аналогично предложенной роли для моноцитов-макрофагов в других сосудистых биологических процессах человека, таких как адаптация венозного трансплантата (Ratliff и Myles, Arch. Pathol. Lab. Med. 113:772-776 (1989); Motwani и Topol, Circulation 97:916-931 (1998)).
Стеноз
Гиперплазия интимы может приводить к утолщению внутренней оболочки кровеносного сосуда, приводя к осложнению в виде стеноза кровеносного сосуда. Считают, что активация воспалительных и прокоагулянтных механизмов вносит значительный вклад в инициацию и развитие стеноза. В период времени в диапазоне от нескольких недель до месяцев, гладкомышечные клетки из области медии поврежденного кровеносного сосуда перемещаются в область интимы. Эти клетки пролиферируют и откладывают внеклеточный матрикс для формирования неоинтимы в месте повреждения в процессе, аналогичном образованию рубца (Fingerle, et al., Proc Natl Acad Sci., 86:8412 (1989); Clowes, et al., Circ. Res., 56:139-145 (1985)). Таким образом, сильный заживляющий ответ приводит к внутреннему утолщению сосудистой стенки (гиперплазии интимы) и, в итоге, уменьшает просвет сосуда, вызывая стеноз. Образование гиперплазии интимы можно ускорить присутствием чужеродного материала, такого как протез внутри сосуда, и можно вызвать при внутрисосудистом вмешательстве, включая ангиопластику, шунтирование и трансплантационную артериопатию, и т.д. (Glagov, Circulation, 89:2888-2891 (1994)).
Таким образом, предлагаются способы применения описанных ингибиторов LYST для профилактики гиперплазии интимы и стеноза.
Рестеноз
Предлагаются способы для профилактики или уменьшения рестеноза коронарной сосудистой системы или периферической кровеносной системы. Рестеноз кровеносных сосудов, как правило, вызван гиперплазией интимы. Хирургическое устройство, такое как стент, может быть вставлено для открытия стенозированного сосуда, однако это также представляет собой проблему, поскольку стент сам по себе может стимулировать гиперплазию интимы. Кроме того, гиперплазийная ткань интимы может прорастать через отверстия стента без покрытия и повторно стенозировать сосуд. Хотя стенты с покрытием могут предотвращать эти события, гиперплазия интимы все еще может происходить у концов стента, поскольку там происходит наибольшее раздражение сосудистой стенки. Пациенты с рестенозом в стенте имеют риск развития серьезных осложнений, поскольку стеноз, вызванный гиперплазией интимы, зачастую сложно лечить. В отличие от мягких атероматозных бляшек, эти стенозы твердые и требуют длительных высоких давлений раздувания для расширения с помощью баллона. Стенозы часто возвращаются повторно и повторное расширение сосуда приводит к повторному повреждению интимы и закрепляет заживляющую реакцию интимы.
Таким образом, описанные композиции, устройства, или трансплантаты можно вводить индивидууму для уменьшения или ингибирования пролиферации гладкомышечных клеток, миграции, и их сочетания, в количестве, эффективном для уменьшения или ингибирования образования неоинтимы и, таким образом, лечения или профилактики рестеноза и других нарушений сосудистой пролиферации у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления проходимость трансплантатов и устройств можно повысить при использовании композиции, содержащей ингибитор LYST. Таким образом, предлагаются способы для введения композиции, содержащей ингибитор LYST, к устройствам и трансплантатам или индивидууму перед или после имплантации.
Атеросклероз
Атеросклероз включает множество процессов, в том числе воспаление, сосудистую пролиферацию и изменение матрикса (обзор у Dzau, et al., Nat Med,. 8(11) (2002)). При атеросклерозе СГМК вызывают воспаление, удержание липопротеинов из крови, а также развитие фиброзного отложения, которое составляет бляшку. Показано, что воспаление медиирует все этапы атеросклероза: при развитии атеромной бляшки СГМК вырабатывают провоспалительные медиаторы, такие как моноцитарные белки-хемоаттрактанты, и синтезируют молекулы матрикса, которые приводят к удержанию липопротеинов из крови; и, после развития бляшки, местное воспалительное окружение может индуцировать экспрессию коллагеназы и ингибировать экспрессию протеолитических ингибиторов, делая фиброзную покрышку слабой и восприимчивой к разрыву. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления описанные ингибиторы LYST применяют для лечения, уменьшения, ингибирования, или профилактики нарушений сосудистой пролиферации у индивидуума.
Ангиопластика
В некоторых вариантах осуществления индивидуум подвергался, подвергается, или будет подвергаться ангиопластике. Ангиопластика представляет собой способ механического расширения суженных или закупоренных артерий, таких как артерии, закупоренные в результате атеросклероза. Как правило, ангиопластика включает введение в сосудистую систему индивидуума пустого и сдутого баллона на проволочном направителе, известного как баллонный катетер, который проходит в суженное место, а затем надувается до фиксированного размера. Баллон с силой расширяет внутренние бляшечные отложения лейкоцитов/тромбов и окружающей мышечной стенки, открывая кровеносный сосуд для улучшенного потока, и баллон затем сдувают и удаляют. Стент можно вводить или не вводить во время баллонирования, чтобы просвет сосуда оставался открытым. Ангиопластика включает периферическую ангиопластику (т.е., кровеносные сосуды вне коронарных артерий, такие как сосуды в брюшной полости или в ногах), коронарную ангиопластику, ангиопластику почечных артерий, каротидную ангиопластику и ангиопластику мозговых артерий.
В некоторых вариантах осуществления индивидуум подвергался, подвергается, или будет подвергаться чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластике (PTCA). Применение PTCA значительно уменьшает число летальных исходов у пациентов с инфарктом миокарда (Fischman, et al., N Engl J Med., 331:496-501 (1994); Elezi, et al., Circulation 98:1875-1880 (1998); Bennett и O'Sullivan, Pharmacol Ther., 91:149-166 (2001)). Во время PTCA, стенки артерии расширяются в несколько раз от их первоначального диаметра в попытке увеличить диаметр просвета и улучшить кровоток. К сожалению, этой технике создает проблемы высокая встречаемость повторного сужения сосудов или рестеноз, встречающийся у 30-40% пациентов в пределах 6 месяцев после процедуры (Anderson et al., J Interv. Cardiol.,6:187-202 (1993); Fischman et al., N Engl J Med, 331:496-501 (1994); Elezi et al., Circulation 98:1875-1880 (1998); Bennett и O'Sullivan, Pharmacol Ther, 91:149-166 (2001); Heckenkamp et al., J Cardiovasc. Surg. (Torino), 43:349-357 (2002)).
Профилактика рестеноза после успешной PTCA остается одной из наиболее сложных задач в лечении обструктивной ишемической болезни сердца. Попытки улучшить этот пролиферативный ответ включают применение коронарных стентов, которое значительно улучшило краткосрочный и долгосрочный результат после процедур интервенционной коронарной реваскуляризации. Несмотря на снижение скорости рестеноза за счет развертывания стента, рестеноз все еще встречается у 15-30% пациенты в пределах 6 месяцев (Fischman et al., N Engl J Med, 331:496-501 (1994); Elezi et al., Circulation, 98:1875-1880 (1998)). Ожидают, что эта встречаемость рестеноза в стенте будет увеличиваться, поскольку коронарное стентирование становится более частым и применяется для менее идеальных поражений. Описанные ингибиторы LYST можно использовать для лечения или профилактики рестеноза, брюшных спаек и рубцевания после ангиопластики.
Трансплантационная артериопатия
В некоторых вариантах осуществления индивидуум подвергался, подвергается, или будет подвергаться трансплантации. Хроническая трансплантационная артериопатия (CTA) является основной причиной позднего отторжения аллотрансплантата после пересадки сердца или почки (Taylor, et al., J. Heart Lung Transplant., 24:945-955 (2005), Burke, et al., Transplantation, 60:1413-1417 (1995); Cornell и Colvin, Curr. Opin. Nephrol Hypertens., 14:229-234 (2005)). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления описанные ингибиторы LYST применяют для уменьшения, ингибирования, или профилактики трансплантационной артериопатии у реципиента трансплантата.
Избыточное рубцевание
Описанные ингибиторы LYST можно использовать для лечения, замедления или профилактики рубцевания, включая образование келоидных рубцов и брюшных спаек, например, после травмы, заболевания или хирургических процедур.
Предлагаются способы применения одного или более ингибиторов LYST для уменьшения уровня роста кровеносных сосудов в месте повреждения или операции. В некоторых вариантах осуществления способы предотвращают или уменьшают образование высокоплотной клеточной и соединительной ткани, которая вызывает рубцевание, келоиды или спайки. Предпочтительно, количество одного или более ингибиторов LYST не препятствует заживлению ран.
Гипертрофическое рубцевание
В некоторых вариантах осуществления описанные ингибиторы LYST применяют для лечения, уменьшения, ингибирования или профилактики развития гипертрофических рубцов. Избыточное рубцевание может происходить, когда тканевой ответ не пропорционален количеству рубцовой ткани, необходимой для нормального восстановления и заживления. Когда глубокая рана включает в себя значительную потерю дермы, гипертрофическая рубцовая ткань может располагаться на месте раны. Рубцовая ткань отличается высокой плотностью клеток, увеличенным объемом соединительной ткани и увеличенным запасом сосудов за счет повышенного числа кровеносных сосудов. Гпертрофические рубцы могут происходить в результате дефектов в фазе ремоделлинга при восстановлении ткани (Ehrlich и Kelley, Plast Reconstr Surg., 90:993-998 (1992)).
Описанные ингибиторы LYST можно использовать для уменьшения или профилактики развития кровеносных сосудов в области раны для уменьшения, замедления или профилактики развития гипертрофического рубцевания.
Келоиды
В некоторых вариантах осуществления описанные ингибиторы LYST применяют для лечения, уменьшения, ингибирования или профилактики развития келоидных рубцов. Келоидный рубец представляет собой индуцированный или утолщенный шрам, который выходит за границы повреждения и может продолжать развиваться и увеличиваться в течение длительного периода времени. Во время развития келоидного роста коллаген, который используется в восстановлении раны, разрастается, производя узел во много раз больший, чем узел исходного рубца.
Ингибиторы LYST можно использовать для профилактики развития келоида, связанного с повреждениями кожи, например, пирсингом ушей, рваной раной, ожогами, вакцинацией или воспалительными процессами. Ингибиторы LYST можно применять местно или наружно по мере необходимости.
Спайки
Спайки представляют собой фиброзные тяжи, которые формируются между тканями и органами, часто в результате повреждений во время операции. Их можно считать внутренними рубцовыми тканями, которые соединяют ткани, не связанные в норме, как правило, черз фактическое пространство, такое как перитонеальная полость. После операции на брюшной полости или травмы, выработка или активность фибринолитических ферментов нарушена из-за повреждения, и развивается фиброзная спайка. Если это происходит, клетки, восстанавливающие ткань, такие как макрофаги, фибробласты и другие клетки кровеносных сосудов, проникают в фиброзную спайку для отложения коллагена и других компонентов матрикса для формирования постоянной фиброзной спайки.
Примеры спаек, которые можно вылечить, уменьшить или предотвратить описанными ингибиторами LYST, включают спайки брюшной полости, спайки тазовой полости, включая спайки тазовой полости, возникшие в результате эндометриоза, перикардиальные спайки, перидуральные спайки и околосухожильные спайки. Симптомы спаек могут включать боль в животе, непроходимости, хроническую тазовую боль, судороги, тошноту, ограничение гибкости и воспаление или опухание в месте спайки.
Другие фибропролиферативные заболевания
В некоторых вариантах осуществления один или более ингибиторов LYST можно применять для лечения фибропролиферативного заболевания.
Фиброз представляет собой отложение избытка фиброзной соединительной ткани в орган или ткань в ответ на воспаление и/или повреждение (Wynn, Nat Rev Immunol., 4(8): 583-594 (2004)). Восстановление поврежденных тканей включает выработку компонентов внеклеточного матрикса в месте повреждения ткани. Макрофаги и поврежденные ткани высвобождают цитокины и TGF бета, которые стимулируют клетки складывать соединительную ткань, в том числе коллаген и гликозаминогликаны. Однако, нарушение регуляции этого процесса может приводить к избыточному отложению соединительной ткани, которая может уничтожать структуру и функцию органов, приводя к патологии фиброзного заболевания. Фиброз может происходить во многих тканях в организме, включая печень, легкие, сердце и почку. Предлагаются способы лечения фиброза жизненно важных органов и фибропролиферативных нарушений.
Цирроз печени
Фиброз печени приводит к повреждению печени, поскольку гепатоциты замещаются нефункциональными рубцовыми тканями в процессе, известном как цирроз (Masuoka, et al. Ann NY Acad. Sci., 1281:106-122 (2013)). Фиброз печени и последующий цирроз представляют конечный общий путь практически всех острых заболеваний печени и могут приводить к печеночной недостаточности, раку печени и смерти, связанной с печенью. Цирроз печени возникает в виде рубцовой ткани. которая замещает нормальную паренхиму. После острого повреждения печени (например, вирусным гепатитом) паренхимальные клетки регенерируют и замещают некрозные или апоптозные клетки в процессе, ассоциированном с воспалительным ответом. Если повреждение печени продолжается, процесс регенерации печени в конце концов терпит неудачу и гепатоциты замещаются обильным внеклеточным матриксом, включая фибриллярный коллаген. Прогрессирующий фиброз характеризуется накоплением белков внеклеточного матрикса, богатого фибрилярными коллагенами (преимущественно коллагеном I и коллагеном III) (обзор у Iredale, J Clin Invest., 117(3):529-548 (2007); Bataller и Brenner, J Clin Invest, 115(2):209-218 (2005)). Воспалительные клетки, которые активируют звездчатые клетки печени (HSC) для секреции коллагена, являются важным фактором в фиброзном заболевании печени. Повышенное число моноцитов было ассоциировано с прогрессированием заболевания, в частности, с прогрессированием из не-циррозного в циррозное заболевание.
Предлагаются способы лечения фиброза печени у индивидуума, включающие введение индивидууму эффективного количества одного или более ингибиторов LYST для уменьшения, снижения, ограничения, или профилактики одного или более симптомов заболевания печени по сравнению с не подвергавшимся лечению индивидуумом, использующимся в качестве контроля. Типичные симптомы заболеваний печени в качестве неограничивающих примеров включают увеличение массы брюшной полости, утомляемость, боль в животе, кахексию, желтуху, обструктивные синдромы, включая лимфатическую блокаду и накопление асцитической жидкости, анемию и позвоночную боль (Sun, et al., Clin J. Oncol. Nurs., 12:759-766 (2008)). В некоторых вариантах осуществления один или более ингибиторов LYST улучшают функцию печени, уменьшают воспаление, уменьшают фиброз, или их сочетание у индивидуума с заболеванием печени по сравнению с не подвергавшимся лечению индивидуумом, использующимся в качестве контроля.
Легочный фиброз
Легочный фиброз характеризуется накоплением избытка фиброзной ткани в легких, что вызывает заметное искажение архитектуры и потерю альвеолярных пространств, приводящие к органной недостаточности и, в конечном итоге, смерти от дыхательной недостаточности. Легочный фиброз включает постепенную замену нормальной легочной паренхимы фиброзной тканью, вызывая необратимое снижение диффузионной емкости для кислорода.
Легочный фиброз (также известный как криптогенный фиброзирующий альвеолит) ассоциирован с интерстициальными легочными болезнями (ИБЛ), такими как заболевания соединительной ткани или хроническое воспалительное заболевание (например, ревматоидный артрит), инфекциями, идиопатическим заболеванием легких и злокачественными новообразованиями. Воздействие вдыхаемых токсинов на окружающую среду, прием лекарственных препаратов и лучевая терапия были также ассоциированы с легочным фиброзом.
Предлагаются способы лечения или профилактики легочного фиброза у индивидуума, включающие введение индивидууму эффективного количества одного или более ингибиторов LYST для уменьшения, снижения, ограничения, или профилактики одного или более симптомов легочного фиброза по сравнению с не подвергавшимся лечению индивидуумом, использующимся в качестве контроля. Типичные симптомы включают хронический сухой кашель, одышку, утомляемость и слабость, дискомфорт в груди, потерю аппетита и потерю массы тела. В некоторых вариантах осуществления один или более ингибиторов LYST улучшают дыхательную функцию, уменьшают воспаление, уменьшают фиброз или их сочетание у индивидуума с легочным фиброзом по сравнению с не подвергавшимся лечению индивидуумом, использующимся в качестве контроля.
Другие фиброзные заболевания
Предлагаются способы лечения или профилактики заболевания, которое характеризуется избыточным фиброзом у индивидуума, включающие введение индивидууму эффективного количества одного или более ингибиторов LYST для уменьшения, снижения, ограничения, или профилактики одного или более симптомов избыточного фиброза по сравнению с не подвергавшимся лечению индивидуумом, использующимся в качестве контроля. Примеры заболеваний и нарушений, которые можно лечить при помощи описанных способов включают нефросклероз, склеродермию, синдром Шарпа, нейрофиброматоз, миелофиброз, системный склероз, синдром Дюпюитрена и дегенерацию желтого пятна. Кроме того, предлагаются способы для лечения рубцевания и фиброза, ассоциированного с операционными осложнениями, химиотерапевтического, или вызванного другим лекарственным средством фиброза, фиброза, индуцированного облучением, фиброза, вызванного травмой и ожогами.
Заболевания, ассоциированные с тромбоцитарной функцией
Предлагаются способы лечения или профилактики заболеваний, характеризующихся избыточной или повреждающей активацией тромбоцитов и/или сигнального пути, опосредованного фактором роста тромбоцитов (PDGF). Поскольку тромбоциты играют ключевую роль в процессе тромбообразования, способы лечения, направленные против тромбоцитов, являются одними из наиболее важных в борьбе с сосудистыми заболеваниями сердца и головного мозга. Неуместная или чрезмерная активация тромбоцитов может вызвать образование сгустка внутри неповрежденного сосуда (тромбоз). Сгусток, который освобождается и начинает путешествовать по всему телу (тромбоэмболия), может привести к закупорке или непроходимости сосуда, гемостазу, ишемии, инсульту и/или смерти.
Было установлено, что сниженный LYST приводит к снижению активации тромбоцитов и уменьшению экспрессии PDGF (см. Пример 7). Таким образом, ингибиторы LYST можно использовать в качестве антитромбоцитарных лекарственных средств для уменьшения или профилактики повреждающей активации тромбоцитов, агрегации тромбоцитов и образования тромба. Предлагаются способы лечения или профилактики заболеваний, которые характеризуется избыточной или повреждающей активацией тромбоцитов у индивидуума, включающие введение индивидууму эффективного количества одного или более ингибиторов LYST для уменьшения, снижения, ограничения, или профилактики одного или более симптомов повреждающей или избыточной агрегации тромбоцитов по сравнению с не подвергавшимся лечению индивидуумом, использующимся в качестве контроля. Таким образом, ингибиторы LYST можно использовать для лечения или профилактики заболеваний или нарушений, ассоциированных с нежелательным или повреждающим функционированием тромбоцитов. Примеры нарушений, возникающих в результате неуместной/повреждающей активации тромбоцитов, включают гиперагрегацию тромбоцитов или увеличение среднего объема тромбоцита (MPV) и тромбоцитоз, артериальный тромбоз; венозный тромбоз (синдром Бадда-Киари; тромбоз кавернозного синуса; тромбоз мозгового венозного синуса; тромбоз глубоких вен; синдром Педжета-Шреттера; тромбоз воротной вены; тромбоз яремной вены; тромбоз почечной вены); и тромбоз микроциркуляторного русла. Артериальный тромбоз может частично или полностью перекрывать ток крови, вызывая ишемию, инсульт или инфаркт миокарда нижележащей области.
Повышенная или неконтролируемая сверхэкспрессия фактора роста тромбоцитов (PDGF) и неконтролируемая передача сигнала через PDGF вовлечены в рост, ангиогенез и метастазирование злокачественных клеток, а также в заболевания, ассоциированные с развитием, выживанием и метастазированием опухолей (рассмотрены в Andrae, et al., Genes Dev., 22:pp1276-1312 (2008)). Было показано, что ингибирование PDGF уменьшает рост клеток глиомы. Некоторые ингибиторы передачи сигнала, опосредованного PDGFR, такие как иматиниб, вступили в стадию клинических испытаний для лечения ряда злокачественных новообразований. Таким образом, один или более ингибиторов LYST можно использовать для лечения или профилактики любого заболевания, ассоциированного с повышенной или активированной экспрессией PDGF и/или неконтролируемой передачей сигнала через PDGF. Примеры заболеваний включают злокачественные опухоли, такие как глиобластомы (например, анапластические олигодендроглиомы) и саркомы (например, саркому кожи; плоскоклеточные саркомы пищевода), а также сосудистое заболевание сетчатки (например, ишемические ретинопатии).
B. Способы лечения
Ингибирование LYST можно использовать в качестве терапевтического механизма посредством местной или системной доставки. В некоторых вариантах осуществления композиции вводят с распределением в системном кровотоке. Можно выбирать и использовать носители для нацеливания ингибиторов на конкретное место или тип клеток. В других вариантах осуществления ингибиторы вводят непосредственно в сосудистую систему с использованием устройства или трансплантата, таких как описанные выше. В дополнительных вариантах осуществления путь введения направляет ингибиторы непосредственно к конкретному органу или местному участку повреждения.
Было установлено, что процессы сосудистой пролиферации и воспаление связаны. Полагают, что LYST умеряет иммунные процессы, которые участвуют в пролиферативных нарушениях, таких как процесс рестеноза. Раннее фармакологическое вмешательство может предотвратить длительную терапию и любые потенциальные побочные эффекты, связанные с длительной терапией. Например, композиции, описываемые в настоящем документе, могут уменьшать или предотвращать образование неоинтимы, но позволяют происходить росту новой ткани. Способы лечения и профилактики заболеваний и нарушений с использованием описанных ингибиторов LYST, необязательно включающие носитель, обсуждаются более подробно ниже.
Контроли
Эффект ингибитора LYST можно сравнивать с контролем. Подходящие контроли известны в данной области и включают, например, необработанные клетки или не подвергавшегося лечению индивидуума. В некоторых вариантах осуществления контроль представляет собой необработанную ткань от индивидуума, которого лечат или от не подвергавшегося лечению индивидуума. Предпочтительно, контрольные клетки или ткань получены из той же самой ткани, что и обработанные клетки или ткань. В некоторых вариантах осуществления не подвергавшийся лечению индивидуум, использующийся в качестве контроля страдает от такого же заболевания или состояния, что и леченный индивидуум. Например, в некоторых вариантах осуществления один или более фармакологических или физиологических маркеров или путей, на которые воздействуют анти-LYST лечением сравнивают с тем же самым фармакологическим или физиологическим маркером или путем в необработанных контрольных клетках или у не подвергавшихся лечению контрольных индивидуумов. Например, индивидуумов, леченных анти-LYST, можно сравнивать с индивидуумами, которых лечили другими ингибиторами образования неоинтимы, такими как рапамицин. Индивидуумы, которых лечили другими ингибиторами образования неоинтимы, могут иметь более высокую встречаемость послеоперационного стеноза или сниженное образование новой сосудистой ткани, чем индивидуумы, которых лечили ингибиторами LYST.
Фармацевтические композиции, содержащие один или более ингибиторов LYST, можно вводить рядом способов, в зависимости от того местное или системное лечение необходимо, и в зависимости от области, которую надо лечить. Например, описанные композиции можно вводить внутривенно, интраперитонеально, внутримышечно, подкожно, внутрь полости, или трансдермально. Композиции можно вводить парентерально (например, внутривенно), путем внутримышечной инъекции, путем интраперитонеальной инъекции, трансдермально, экстракорпорально, местно или т.п., включая местное интраназальное введение или введение путем ингаляции.
Парентеральное введение композиции, при использовании, как правило, характеризуется инъекцией. Составы для инъекций можно получать в общепринятых формах, или в виде жидких растворов или суспензий, твердых форм, подходящих для раствора суспензии в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий. Также рассматривается введение, включающее использование системы замедленного высвобождения или пролонгированного высвобождения, таким образом, что поддерживается постоянная доза.
В определенных вариантах осуществления композиции вводят местно, например, путем инъекции непосредственно в место, которое нужно лечить. Местная доставка лекарственных средств может уменьшать побочные эффекты или токсичность, связанные с системной доставкой, и может приводить кулучшенному результату лечения за счет повышенной местной дозы.
Предлагаются способы введения описанных ингибиторов LYST местно (т.е., посредством местной доставки лекарственного средства, LDD). В определенных вариантах осуществления ингибиторы LYST можно вводить непосредственно в ткань для лечения, такую как артерия или вена, без возникновения нежелательных системных воздействий. В дополнительных вариантах осуществления композиции вводят путем инъекции или другим путем непосредственно к одному или более участкам операции. Как правило, местная инъекция вызывает повышенную локальную концентрацию композиций, которая выше чем та, которая достигается системным введением. В предпочтительных вариантах осуществления композиции доставляются напрямую в ткань, протезы, трансплантаты или медицинские устройства путем местной инъекции или наружного введения. В некоторых вариантах осуществления ингибиторы LYST, доставляемые местно, приводят к концентрациям, которые в два раза, 10 раз, 100 раз, 500 раз, 1000 раз или более чем в 1000 раз выше, чем концентрации, достигаемые при системном введении этого же соединения. В некоторых вариантах осуществления местно вводимые ингибиторы LYST непрерывно высвобождаются в месте доставки с постоянной скоростью с течением времени. Предпочтительно, непрерывное высвобождение поддерживает желаемую концентрацию ингибитора LYST в месте доставки.
Описанные ингибиторы LYST можно вводить в период до, во время или после появления симптомов заболевания, или в любую комбинацию периодов до, во время или после появления одного или более симптомов заболевания. Например, индивидууму можно вводить одну или более доз композиции каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 7, 14, 21, 28, 35, или 48 суток до появления симптомов заболевания. Индивидууму можно вводить одну или более доз композиции каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14, 21, 28, 35, или через 48 суток после появления симптомов заболевания. В некоторых вариантах осуществления множественные дозы композиции вводят до появления улучшения в состоянии заболевания. Например, в некоторых вариантах осуществления индивидуум получает 1, 2, 3, 4, 5, 6 7, 14, 21, 28, 35, или 48, в течение периода 1, 2, 3, 4, 5, 6 7, 14, 21, 28, 35, или 48 суток или недель до появления улучшения заболевания или состояния.
Таким образом, описанные композиции, содержащие один или более ингибиторов LYST, можно вводить в различное время в зависимости от диагноза, прогноза, операции или травмы, в зависимости от заболевания или нарушения, которое необходимо лечить. Сроки начала анти-LYST терапии должны быть определены в зависимости от потребностей индивидуума, и могут варьировать от времени хирургической операции или травмы от одних или более суток, недель, месяцев после операции или травмы. Предлагаются способы для применения составов для отсроченного высвобождения ингибиторов LYST. В некоторых вариантах осуществления терапия с использованием ингибиторов LYST может быть прекращена, как только произошел рост новой сосудистой ткани.
В некоторых вариантах осуществления однократную дозу одного или более ингибиторов LYST вводят индивидууму в виде одной или более болюсных доз для повышения в крови концентрации одного или более ингибиторов до желаемого уровня. Болюс можно вводить любыми способами, такими как посредством инъекции. Размещение болюсной дозы может варьировать в зависимости от желаемого эффекта и органа-мишени или ткани-мишени, которые предполагается лечить. В конкретном варианте осуществления болюс вводят перед введением других лекарственных форм, таких как лекарственные формы с пульсирующим высвобождением. Таким образом, желаемую концентрацию одного или более ингибиторов LYST в крови можно поддерживать в течение желаемого периода времени при помощи комбинации составов для немедленного, отложенного или пульсирующего высвобождения.
В случае спаек, размещение соединительной ткани между нормальными анатомическими структурами не нужно, и, таким образом, профилактика развития сосудистой ткани не наносит ущерба. Таким образом, для профилактики и уменьшения спаек, ингибиторы LYST будут, как правило, применяться во время операции или вскоре после нее, например, в течение одной недели. В случае хирургических процедур с риском образования неоинтимы, например, стеноза, или рестеноза тканевых трансплантатов или стентов, один или более ингибиторов LYST можно вводить во время операции. В случае травмы или операции, затрагивающей кожу, ингибиторы LYST можно применять после реэпителизации поверхности кожи.
Покрытие трансплантатов и устройств
Один или более ингибиторов LYST можно вводить местно за счет введения одного или более ингибиторов в медицинское устройство, такое как стент или другой протез, за счет загрузки ингибитора/ингибиторов внутрь или снаружи структурного или изолирующего материала устройства. Скорость высвобождения ингибитора/ингибиторов можно контролировать рядом способов, в том числе, варьируя одно или более соотношений абсорбируемого материала к препарату, молекулярную массу абсорбируемого материала, композицию ингибитора/ингибиторов, композицию абсорбируемого полимера, толщину покрытия, число слоев покрытия и их относительную толщину, концентрацию ингибитора, и/или физическое или химическое связывание или связывание ингибитора/ингибиторов с устройством или изолирующим материалом. Можно также применять верхние покрытия полимеров и других материалов, в том числе абсорбируемых полимеров, для контроля над скоростью высвобождения одного или более ингибиторов.
В некоторых вариантах осуществления количество ингибитора LYST, присутствующего на устройстве или тканевом трансплантате можно корректировать за счет смены носителя. Проникновение ингибитора на всем протяжении ткани также можно корректировать. Таким образом, количество лекарственного средства, которое местно высвобождается на участке имплантации, можно тщательно контролировать. Как правило, ингибитор LYST или носитель с ингибитором контактируют с материалом устройства или трансплантата ex vivo. Контакт происходит в отсутствие или в присутствии мягкого перемешивания или других известных в данной области способов, чтобы гарантировать, что ингибитор прикрепился к устройству или тканевому трансплантату или проник в них. Перемешивание можно производить, например, путем инкубации на орбитальном шейкере, или путем вертикального вращения, такого как инкубация на вертикальной карусели в термостате для гибридизации. Протокол инкубации можно варьировать чтобы повлиять на размещение частиц на устройстве или трансплантате. Количество и локализацию прикрепления носителей, таких как частицы, к устройству или трансплантату, можно также варьировать за счет изменения типа и плотности прикрепления и нацеливающих лигандов, таких как описанные лиганды, присутствующих на носителе. Примеры композиций и способов для доставки лекарственных средства к сосудистым трансплантатам ex vivo описаны в опубликованных заявках США №№ 2006/0002971, 2010/0151436, и патенте США № 7534448.
Композиции и способы можно использовать для местной доставки ингибиторов LYST к трансплантатам с наличием или отсутствием необходимости дальнейших инвазивных процедур, таких как размещение сосудистого трансплантата или стента.
C. Дозы и эффективные количества
В некоторых подходах in vivo композиции ингибиторов LYST вводят индивидууму в терапевтически эффективном количестве. Как применяют в настоящем документе, термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» означает дозу, достаточную для лечения, ингибирования или облегчения одного или более симптомов заболевания, подлежащего лечению, или иным способом обеспечивающую желаемый фармакологический и/или физиологический эффект. Точная доза будет варьировать в соответствии с рядом факторов, таких как переменные, зависимые от индивидуума (например, возраст, здоровье иммунной системы и т.д.), заболевания или нарушения, и эффективность лечения.
Для всех описанных соединений, поскольку проводят дополнительные исследования, будет появляться информация относительно соответствующих уровней дозировки для лечения различных состояний у различных пациентов, и обычный квалифицированный работник с учетом терапевтического контекста, возраста и общего состояние здоровья реципиента, будет иметь возможность удостовериться в надлежащей дозировке. Выбранная доза зависит от желаемого терапевтического эффекта, пути введения и длительности желаемого лечения. В основном, уровни доз в диапазоне от 0,001 и до 100 мг/кг массы тела ежедневно вводят млекопитающим, наиболее предпочтительно, людям. Как правило, для внутривенной инъекции или инфузии доза может быть ниже. Предпочтительно, композиции формулируют для достижения уровня ингибитора LYST в сыворотке приблизительно от 1 и приблизительно до 1000 мкМ в месте, где требуется лечение.
В некоторых вариантах осуществления ингибиторы LYST эффективны для предотвращения нормальных видов биологической активности иммунных клеток, таких как макрофаги, тромбоциты и NK-клетки. Например, один или более ингибиторов могут быть в количестве, эффективном для уменьшения или профилактики миграционной или хемотаксической активности макрофагов.
В одном из вариантов осуществления один или более ингибиторов LYST присутствуют в количестве, эффективном для профилактики или уменьшения образования неоинтимы у индивидуума. В предпочтительном варианте осуществления количество одного или более ингибиторов LYST не препятствует заживлению ран или образованию новой ткани у индивидуума, по сравнению с не подвергавшимся лечению контролем. Предпочтительно, количество одного или более ингибиторов LYST является эффективным для профилактики или уменьшения образования неоинтимы и способствует заживлению ран у индивидуума, по сравнению с не подвергавшимся лечению контролем.
В другом варианте осуществления один или более ингибиторов LYST присутствуют в количестве, эффективном для уменьшения степени роста кровеносных сосудов в месте операции или травмы, для профилактики и снижения образования высокоплотной клеточной и соединительной ткани, которая дает начало фиброзу, рубцеванию, келоидам или спайкам. Предпочтительно, количество одного или более ингибиторов LYST не препятствует заживлению ран.
В другом варианте осуществления один или более ингибиторов LYST присутствуют в количестве, эффективном для уменьшения или ингибирования активации тромбоцитов. Например, ингибиторы LYST могут быть в количестве, эффективном для профилактики или ингибирования неуместной агрегации тромбоцитов и секреции хемокинов в месте повреждения или операции. В дополнительном варианте осуществления один или более ингибиторов LYST присутствуют в количестве, эффективном для уменьшения количества фактора роста тромбоцитов (PDGF) и/или трансформирующего фактора роста Бета (TGFβ), которые вырабатываются или секретируются клетками в ответ на активацию тромбином в месте повреждения или операции. Один или более ингибиторов LYST могут быть эффективны для уменьшения выработки или секреции PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C или PDGF-D. Таким образом, один или более ингибиторов LYST могут быть эффективны для уменьшения количества биологически активного PDGF в сыворотке. Например, количество PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD или PGDF-AB можно уменьшить по сравнению с количеством у не подвергавшегося лечению контроля. Таким образом, один или более ингибиторов LYST могут быть эффективны для снижения или профилактики одного или более видов биологической активности, происходящих из-за PDGF, или в результате предыдущих сигнальных событий, контролируемых PDGF. Например, один или более ингибиторов LYST могут быть эффективны для снижения или профилактики активации одного или более тирозинкиназных рецепторов, таких как рецептор α PDGF (PDGFRα); рецептор β PDGF (PDGFRβ); и/или рецептор αβ PDGF (PDGFαβ). За счет снижения или профилактики активности одного или более PDGF ингибиторы LYST могут уменьшать или предотвращать опосредованную PDGF индукцию нескольких путей передачи сигнала, контролирующих клеточные функции, в том числе клеточную пролиферацию, хемотаксис и реорганизацию актина.
В другом варианте осуществления один или более ингибиторов LYST присутствуют в количестве, эффективном для профилактики и снижения образования высокоплотной клеточной и соединительной ткани, которая дает начало фиброзу, рубцеванию, келоидам или спайкам. Предпочтительно, количество одного или более ингибиторов LYST не препятствует заживлению ран.
D. Способы комбинированного лечения
Описанные композиции, устройства и трансплантаты, содержащие ингибиторы LYST, можно вводить по отдельности или в комбинации с одним или более дополнительными активными средствами, как часть терапевтической или профилактической схемы лечения. Например, композицию можно вводить на первые, вторые, третьи или четвертые сутки, или их сочетания. Композицию можно вводить в те же самые сутки, что и второе активное средство, или в другие сутки.
Термин «комбинация» или «комбинированный» применяют по отношению к совместному, одновременному или последовательному введению двух или более веществ. Таким образом, комбинации можно вводить или совместно (например, в виде смеси), или раздельно, но одновременно (например, через раздельные капельницы одному индивидууму) или последовательно (например, одно из соединений или веществ дают перед вторым).
Дополнительные терапевтические средства могут быть другими препаратами против неоинтимы, химиотерапевтическими средствами, антителами, антибиотиками, противовирусными препаратами, стероидными и нестероидными противовоспалительными средствами, общепринятыми иммунотерапевтическими средствами, иммунносупрессорами, цитокинами, хемокинами и/или факторами роста, антипролиферативными или противомиграционными препаратами, разработанными для лечения или профилактики образования неоинтимы или рестеноза, препаратами, которые воздействуют на миграцию и выработку внеклеточного матрикса, препаратами, которые воздействуют на осаждение тромбоцитов или образование тромба и препаратами, которые способствуют заживлению сосудов и реэндотелизации, описанными в Tanguay et al. Current Status of Biodegradable Stents, Cardiology Clinics, 12:699-713 (1994), J. E. Sousa, P. W. Serruys и M. A. Costa, Circulation 107 (2003) 2274 (Part I), 2283 (Part II), K. J. Salu, J. M. Bosmans, H. Bult и C. J. Vrints, Acta Cardiol 59 (2004) 51.
Примеры противотромбиновых препаратов в качестве неограничивающих примеров включают гепарин (в том числе низкомолекулярный гепарин), R-гирудин, гирулог, аргатробан, эфегатран, антикоагулянтный пептид клещей и Ppack.
Примеры антипролиферативных препаратов в качестве неограничивающих примеров включают паклитаксел (таксол), QP-2 винкристин, метотрексат, ангиопептин, митомицин, BCP 678, антисмысловой c-myc, ABT 578, актиномицин-D, RestenASE, 1-хлор-дезоксиаденозин, PCNA рибозим и целекоксиб.
Примеры препаратов, модулирующих клеточную репликацию/пролиферацию, включают мишени рапамицина (TOR), ингибиторы (в том числе сиролимус, эверолимус и ABT-578), паклитаксел и антинеопластические средства, в том числе алкилирующие средства (например, циклофосфамид, мехлоретамин, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин, ломустин, ифосфамид, прокарбазин, дакарбазин, темозоломид, алтретамин, цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин), противоопухолевые антибиотики (например, блеомицин, актиномицин D, митрамицин, митомицин C, этопозид, тенипозид, амсакрин, топотекан, иринотекан, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, эпирубицин, митоксантрон и митоксантрон), антиметаболиты (например, дезоксикоформицин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, азатиоприн, 2-хлордезоксиаденозин, гидроксимочевина, метотрексат, 5-фторурацил, капецитабин, цитозинарабинозид, азацитидин, гемцитабин, фосфат флударабина и аспарагиназу), антимитотические средства (например, винкристин, винбластин, винорелбин, доцетаксел, эстрамустин) и молекулярно направленные препараты (например, иматиниб, третиноин, бексаротен, бевацизумаб, гемтузумаб огомицин и денилейкин дифтитокс).
Примеры противорестенозных препаратов в качестве неограничивающих примеров включают иммуномодуляторы, такие как сиролимус (рапамицин), такролимус, биорест, мизорибин, циклоспорин, интерферон гамма 1b, лефлюномид, траниласт, кортикостероиды, микофеноловую кислоту и бифосфонат.
Примеры противомиграционных препаратов и модуляторов внеклеточного матрикса в качестве неограничивающих примеров включают галофугинон, ингибиторы пропилгидроксилазы, ингибиторы протеиназы С, ингибиторы MMP, батимастат, пробукол.
Примеры антитромбоцитарных средств в качестве неограничивающих примеров включают гепарин.
В некоторых вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой N-3,4-тригидроксибензамид или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир, дидокс, имидат или гидроксимочевину, как описано в патенте США № 8029815.
Дополнительные терапевтические средства можно вводить местно или системно индивидууму, или покрывать снаружи устройство или трансплантат или вводить в устройство или трансплантат. Дополнительные терапевтические средства можно вводить одним или разными путями и различными способами. Например, один или более ингибиторов LYST можно вводить местно в сочетании с одним или более из паклитаксела, таксотера и других таксановых соединений, метотрексата, антрациклинов, таких как доксорубицин, эверолимус, серолимус, рапамицин или производные рапамицина, доставляемых различными путями, такими как системный.
В дополнительных вариантах осуществления один или более ингибиторов LYST можно использовать для уменьшения или профилактики нежелательных побочных эффектов, связанных с применением одного или более дополнительных терапевтических средств. Например, один или более ингибиторов LYST можно использовать с противоопухолевым препаратом блеомицином для профилактики легочного фиброза, ассоциированного с блеомицином.
Настоящее изобретение будет более понятно со ссылкой на следующие неограничивающие примеры.
Примеры
Пример 1: Мутация beige уменьшает стеноз в тканевых трансплантатах
Способы и материалы
Тканеинженерные сосудистые трансплантаты (TEVG) были разработаны для засеивания аутологичных мононуклеарных клеток из костного мозга на биоразлагаемый трубчатый каркас, изготовленный из трубки из волокон полигликолевой кислоты, покрытой 50:50 сополимером полимолочной кислоты и поликапролактона.
Мышиная модель для оценки функционирования TEVG была разработана, чтобы прояснить клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе образования TEVG. Модель интерпозиционного трансплантата из нижней полой вены (IVC) представляет собой утвержденную модель для исследования применения сосудистых трансплантатов в системе кровообращения с высоким кровотоком и низким давлением, аналогичной циркуляции Фонтена. Эту модель применяли расширенно для изучения образования новой ткани в TEVG.
Биоразлагаемый трубчатый трансплантат, состоящий из PGA-PCL/LA, был имплантирован в нижнюю полую вену мышей дикого типа и мышей, мутантных по beige, соответственно, без засеивания клетками. Трансплантаты извлекали через 2 недели после операции, разрезали, измеряли диаметр сосуда и оценивали проходимость.
Результаты
Значительные различия в степени стеноза наблюдали, когда TEVG были имплантированы в виде интерпозиционных трансплантатов IVC, в зависимости от линии мышей. Конкретно, было отмечено, что TEVG, имплантированные мышам с мутацией beige, имели исключительно низкие уровни стеноза. Проходимость и диаметр просвета TEVG, имплантированных в виде интерпозиционных трансплантатов IVC, сравнивали у C57B6 (мыши дикого типа) (N=25) и мутантов по beige (N=10) (Таблица 1). Мыши дикого типа демонстрировали 80% стеноз с измеренным диаметром просвета 0,33 мм, в то время как мыши beige демонстрировали 10% стеноз с измеренным диаметром просвета 0,71 мм (T-критерий <0,001 и хи-квадрат 0,0002) (фигура 1).
Таблица 1: Различия в проходимости и диаметрах просвета TEVG, извлеченных у мышей Beige (Bg) и дикого типа (Wt).
Линии
n
Диаметр
SD
Проходимость (>0,45 мм)
Проходимость (%)
Beige
10
0,71
0,16
9
90
Lyst-tm1b
5
0,73
0,17
5
100
WT
25
0,33
0,17
5
20
Пример 2: Мутация beige уменьшает инфильтрацию макрофагами в тканевых трансплантатах
Способы и материалы
Ранее было показано с использованием мышиной модели, что образование новой сосудистой ткани возникает из местных клеток, и что процесс образования новой сосудистой ткани направляется иммунной системой, в частности, местными макрофагами. Избыточная инфильтрация макрофагами приводит к стенозу, в то время как ингибирование инфильтрации макрофагами препятствует образованию новой ткани.
Число макрофагов в извлеченных вышеописанных трансплантатах в Примере 1 измеряли у мышей beige и мышей дикого типа. Иммуногистохимию проводили на тканевых срезах каждого трансплантата, чтобы охарактеризовать число и морфологию эндотелиальных клеток в каждой группе с использованием антитела, специфичного к клеточному маркеру CD31.
Результаты
TEVG, имплантированные мышам beige, продемонстрировали значительно меньшую инфильтрацию макрофагами, чем TEVG, имплантированные мышам дикого типа, через 2 недели после операции. См. фигуру 2. Следует отметить, что иммуногистохимия эндотелиальных клеток (с использованием антитела, специфичного по CD31) не выявила никаких различий между срезами трансплантата от мышей дикого типа и beige, указывая на то, что образование новой ткани было сходным в обеих группах.
Пример 3: Фенотип beige возникает из-за мутации в гене LYST
Способы и материалы
Мутация beige возникает из-за самопроизвольной мутации в гене LYST (фигура 3). Для анализа экспрессии белка были разработаны 6 различных праймеров, обозначенные LYST1, LYST3, LYST4, LYST5 и LYST6, соответственно, и покрывающие полностью область гена LYST. Праймер LYST5 покрывал область экзона 52, который содержит аминокислотную мутацию, выявленную в генотипе мыши beige. В качестве стандарта для расчета относительных уровней мРНК использовали клетки Raw.
Результаты
Была выявлена конкретная мутация, которая отвечает за фенотип beige у мышей Beige. Полноразмерный ген LYST кодирует полипептид из 3801 аминокислоты. Мутация LYST происходит в экзоне 52, приводя к делеции аминокислоты изолейцин (ile3741del) (фигура 3).
Молекулярный анализ продемонстрировал, что не было значимых отличий в экспрессии мРНК между двумя группами. Несмотря на эквивалентные уровни транскрипции белков дикого типа и мутантных белков, трансляции мутантного белка не происходило.
Более того, экспрессия белка LYST была снижена у мутантных мышей beige по данным иммуногистохимии и вестерн-блоттинга (фигура 4). Эти результаты указывают на то, что мутация гена LYST у мыши beige мышь воздействует на уровне модификации белка после трансляции гена.
Пример 4: Мутация beige в гене LYST изменяет иммунные процессы
Способы и материалы
Проверяли гиоптезу о том, мутация beige ингибирует образование стеноза TEVG за счет модулирования иммунной системы. Костный мозг был трансплантирован от мышей C57B6 (дикого типа) мутантным мышам beige, и наоборот. Проводили анализы при помощи клеточного сортера с возбудителем флуоресценции (FACS) для того чтобы определить процентное содержание моноцитов LYST у мышей Beige и мышей дикого типа. Кроме того, способность тромбоцитов активироваться после стимуляции фибрином была снижена у мышей с мутацией beige по сравнению с мышами дикого типа.
Результаты
Было продемонстрировано значительное ингибирование стеноза TEVG у мышей дикого типа, которым был трансплантирован костный мозг от мышей beige. Аналогично, когда TEVG были имплантированы мышам beige, которым был трансплантирован костный мозг от мышей дикого типа, они демонстрировали высокие уровни стеноза TEVG. Эти открытия указывают на то, что мутация beige ингибирует стеноз TEVG за счет ее воздействия на иммунную систему. Анализы моноцитов и макрофагов от мышей Wt и Beige с использованием FACS продемонстрировали различие в популяциях фенотипо. Серии точечных диаграмм разброса, показывающих типичные результаты аналитической проточной цитометрии, демонстрируют долю моноцитарных клеток, окрашенных по CD115 (ось Y) и CD11b (ось X) от мышей WT3, WT4, bg3 и bg4, соответственно. Также было определено распределение клеток, окрашенных по LYC6 и F4/80, для мышей WT3, WT4, bg3 и bg4, соответственно. Рассчитывали процентное содержание клеток, обозначенных как LYC6 «Hi» и LYC6 «lo». Результаты являются типичными для перитонеальных макрофагов через 3 суток после стимуляции тиогликолатом, с гейтингом для исключения мертвых клеток и дебриса.
Точечные диаграммы разброса показывают типичные результаты аналитической проточной цитометрии, представляя на графике клетки, окрашенные по PE-A (ось Y) против флуоресценции FITC-A (ось X) от мышей WT и мышей Beige, соответственно. Клетки проходили гейтинг для исключения мертвых клеток и дебриса после активации тромбоцитов после стимуляции фибрином. Число моноцитов LY6C «hi» было выше в группе дикого типа (WT3, WT4), в то время как число моноцитов Ly6C «low» было выше в группе beige (bg 3, bg) среди перитонеальных макрофагов через 3 суток после стимуляции тиогликолатом.
Анализы FACS также продемонстрировали, что способность тромбоцитов к активации после стимуляции клеток фибрином была снижена у мышей, мутантных по beige, по сравнению с мышами дикого типа.
Пример 5: Иммуномодуляцию, опосредованную LYST, можно получить с использованием антитела к белку LYST
Способы и материалы
Эффекты блокирования белка LYST были исследованы с использованием антитела к LYST. Мышей C57B6 обрабатывали антителом к LYST, а затем им имплантировали TEVG. Антитело к LYST инъецировали в брюшину мыши дикого типа в каждой из трех различных групп лечения (0 мг/кг (контроль), 10 мг/кг, или 50 мг/кг) на 1 сутки после операции, а также через 1 неделю после операции. Мышей умерщвляли, и извлекали трансплантат и селезенку через 2 недели после операции. Гистологический анализ проводили, окрашивая трансплантат гематоксилином и эозином (ГЭ-окрашивание). Ткань селезенки анализировали Вестерн-блоттингом с использованием антитела, специфичного для белка LYST, чтобы определить относительное эффективное количество белка LYST в каждой группе лечения.
Результаты
Системная инъекция антитела против LYST показала улучшение проходимости трансплантата дозозависимым образом. Наблюдали заметное ингибирование инфильтрации макрофагами и уменьшение стеноза TEVG. Это дозозависимое повышение проходимости сопровождалось дозозависимым снижением присутствия белка LYST в ткани селезенки, которое было определено иммуногистохимией. Таким образом, был установлен способ иммуномодуляции, который приводит к улучшенному образованию новой ткани и ингибирует возникновение стеноза TEVG.
Пример 6: У трансгенных мышей с отсутствием функционального гена LYST не развивается стеноз TEVG
Способы и материалы
tm1b
Получали трансгенных мышей C57BL/6 с отсутствием функционального белка LYST. Этих мышей обозначили C57BL/6 Lyst. Способ, который применяли для создания этой нокаутной линии, использует репортерный ген LacZ. ПЦР для LacZ подтвердила нокаутную модель.
tm1b
tm1b
Для того чтобы определить, может ли у нокаутных мышей C57BL/6Lyst развиваться стеноз после имплантации TEVG, пяти мышам C57BL/6 Lyst и пяти мышам C57BL/6 дикого типа имплантировали незасеянный TEVG. TEVG извлекали и исследовали через две недели после имплантации.
Результаты
tm1b
100% незасеянных тканеинженерных сосудистых трансплантатов (TEVG), имплантированных нокаутным мышам Lyst (n=5), были проходимы через две недели после имплантации (см. фигуру 5; Таблицу 1). Напротив, мыши C57BL/6 дикого типа демонстрировали приблизительно 90% встречаемости стеноза.
Пример 7: Lyst модулирует функцию тромбоцитов в ответ на активацию
Способы и материалы
Очевидно, что белок LYST вовлечен в фунционирование тромбоцитов, и синдром Чедиака-Хигаши, человеческий аналог, характеризуется как «дефицит пула тромбоцитов». Плазму, обогащенную тромбоцитами (PRP), получали от мышей Beige (Bg) и мышей дикого типа (WT). Образцы активировали тромбином и сравнивали общие концентрации секретированного PDGF (фактора роста тромбоцитов) в каждой группе (n=7) с находящимися в покое, неактивированными контролями (n=5).
Результаты
И в активированной группе, и группе, находящейся в покое, тромбиновая активация приводила к значительно более высоким концентрациям PDGF. Однако, секреция PDGF из активированных тромбоцитов была значительно снижена в группе Beige по сравнению с диким типом (см. фигуру 6). Таким образом, уменьшение активности Lyst также уменьшает PDGF, указывая на то, что препараты, которые уменьшают активность Lyst, могут также действовать как антитромбоцитарные препараты.