Биосинтез субтилизиноподобной протеиназы Bacillus amyloliquefaciens h2 и биологические свойства фермента

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Том 150, кн. 2 Естественные науки 2008

УДК 579.22:579.852.11

БИОСИНТЕЗ СУБТИЛИЗИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS H2 И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА

Н.П. Балабан, А.М. Марданова, Л.А. Маликова,

О.Н. Ильинская, М.Р. Шарипова

Аннотация

Спорообразующие бактерии B. amyloliquefaciens H2 секретируют в среду субтили-зиноподобную протеиназу, максимальное накопление которой происходит через 28 и 46 ч роста в стационарной фазе роста культуры. Постановкой многофакторных экспериментов установлено оптимальное соотношение концентраций пептона и неорганического фосфата для эффективного биосинтеза бактериальной протеиназы. Исследовано влияние различных экзогенных факторов на уровень синтеза протеиназы, что позволило подобрать оптимальную питательную среду и повысить продуктивность культуры в

2 раза. Показано, что гомогенные препараты ферментов обладают фибринолитической, тромболитической и антикоагулянтной активностью.

Ключевые слова: cубтилизиноподобная протеиназа, Bacillus amyloliquefaciens, биосинтез, фибринолитические свойства, тромболитические свойства.

Введение

Внеклеточные сериновые протеиназы - это большая группа промышленных ферментов, которые успешно применяются в различных областях народного хозяйства. Способность микробных протеиназ осуществлять селективный про-теолиз белков крови человека определяет перспективность использования их в медицинской практике, и в частности, для лечения атеросклероза и тромботического состояния. Известные тромболитические препараты, такие, как стреп-токиназа, фибринолизин и другие, применяемые в тромболитической терапии, вызывают побочные эффекты, так как обладают выраженной токсичностью [1]. Бациллярные тромболитические препараты, такие, как тромбовазим, обладающий низкой токсичностью и высокой эффективностью, являются более перспективными для профилактики и лечения этого заболевания1.

Целью работы является подбор компонентов питательной среды для максимальной продукции субтилизиноподобной протеиназы B. amylolyquefaciens Н2 и исследование фибринолитических, тромболитических и антикоагулянтных свойств фермента.

1 См. www.infarct.net/catalog/articles/146

1. Материалы и методы

В работе использовали штамм B. amyloliquefaciens H2 из коллекции кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

Исходной питательной средой для культивирования служила среда следующего состава (г/л): пептон - 20, Са02-2Н2О - 0.1, MgS04•7Н20 - 0.3, NaCI - 3.0, MnS04 - 0.1, Na2HP0412H20 - 0.3, рН 8.5 [2]. Среду стерилизовали при 1 атм. В двухфакторных экспериментах пептон вносили в конечной концентрации 15-35 г/л. Растворы неорганического фосфата (Na2HP0412H20), цитрата аммония (C5H705C00NH4) и хлорида аммония (NH4O) стерилизовали отдельно при 1 атм и вносили в среду перед посевом: неорганический фосфат в конечной концентрации 0.2-0.4 г/л для протеиназы с максимальной активностью на 28-й ч и 0.15-0.35 г/л для протеиназы с максимальной активностью на 46-й ч, растворы солей аммония в конечной концентрации 1, 3, 5 мМ. Растворы желатина, казеина (Sigma), дрожжевого экстракта (Difco) стерилизовали отдельно при 1 атм и вносили в среду перед засевом в конечной концентрации 0.1, 0.5, 1.0%.

Культивирование проводили при 30 °C на вибростенде BS4 “B. Bauer” (Германия), 200 об/мин. Соотношение объема среды к объему колбы составляло 1 : 5. Посевным материалом служил 12-15-часовой инокулят (1 об. %).

Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 (Россия) при длине волны 590 нм. Количество биомассы выражали в единицах светопогло-щения в кювете толщиной 1 см.

Активность субтилизиноподобной протеиназы определяли по гидролизу хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNA по методу, описанному ранее [3]. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 нмоль субстрата за 1 мин. Продуктивность культуры в отношении синтеза субтилизиноподобной протеиназы определяли как отношение величины протеолитической активности в культуральной жидкости к величине биомассы и выражали в условных единицах или процентах. Подсчитывали удельную скорость и = d ln D/dt и удельную скорость прироста активности протеиназы є = d ln A dt.

При изучении спорообразования инокулятом служила 50-часовая культура, которую синхронизировали кратковременным прогреванием при температуре 80 °С 5-6 раз по 30 с. Для подсчета свободных спор клетки окрашивали по Пешкову (см. [4]). Количество свободных спор выражали в процентах по отношению к общему количеству вегетативных и спорулирующих клеток (100%), подсчет которых проводили в режиме фазово-контрастной микроскопии (микроскоп Carl Zeiss Jena) при увеличении в 1600 раз в 5-10 полях зрения.

Гомогенные препараты субтилизиноподобной протеиназы получали, как описано в [5].

Фибринолитическую активность протиназы определяли на фибриновых пластинках по методу Аструпа - Мюллерца [6], оценивали по размеру зон лизиса фибрина и выражали в ед/мг. За условную единицу фибринолитической активности принимали количество фермента, образующее зону лизиса фибриновой пластинки площадью 1 мм2 за 1 ч инкубации при 37 °С. Тромболитиче-ские и антикоагулянтные свойства протеиназ изучали in vitro на тромбах, обра-

зованных из цитратной плазмы кролика и тромбина. Для определения тромбо-литической активности протеиназы 0.2 мл плазмы смешивали с 0.05 мл тромбина (2 мг/мл) в физиологическом растворе, инкубировали при 37 “С в течение 5 мин. К образовавшемуся сгустку добавляли 0.1 мл раствора фермента в концентрациях 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, 1.0 мг/мл (в контрольную пробирку вносили 0.1 мл физиологического раствора). Отмечали время полного растворения тромба. Для оценки антикоагулянтных свойств протеиназы 0.2 мл плазмы крови инкубировали при 37 “С с 0.1 мл ферментного раствора в концентрации 0.1 и 1.0 мг/мл и отмечали время образования тромба в контрольной и опытных пробирках.

Результаты двухфакторных экспериментов обрабатывали с помощью комплекса программ BI0PT [7].

2. Результаты и обсуждение

В культуральной жидкости B. amyloliquefaciens проводили определение активности протеиназы по гидролизу синтетического субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNA, специфического для субтилизинов. Фермент обнаруживается на 12-й ч роста культуры, после чего уровень активности фермента повышается и достигает двух максимумов, соответствующих ранней (28-й ч) и поздней (46-й ч) стационарным фазам роста культуры (рис. 1). Субтилизиноподобную протеи-назу, соответствующую 28-му и 46-му ч роста, мы назвали ранней и поздней протеиназой. Наибольшая удельная скорость роста бактерий (ц) наблюдалась в период от 8 до 10 ч культивирования. Удельная скорость накопления субтили-зиноподобной протеиназы (є) в культуральной жидкости B. amyloliquefaciens возрастала в период, когда удельная скорость роста падала и достигала максимальной величины на 18-й ч роста в фазу замедления роста бацилл. Таким образом, протеиназа активно синтезируется и секретируется бактериями при переходе культуры в стационарную фазу и является катаболическим ферментом, поскольку максимальный синтез наступает в период замедления роста культуры и перехода ее в стационарную фазу роста. Эти результаты близки к полученным нами ранее данным по биосинтезу субтилизиноподобной протеиназы B. intermedius, где впервые были определены два максимума накопления специфической ферментативной активности в стационарной фазе роста [8, 9].

При исследовании динамики спорообразования обнаружено, что к моменту максимального накопления субтилизиноподобной протеиназы в поздней стационарной фазе роста количество свободных спор не превышало 5% (рис. 1). Это позволило сделать вывод, что поздняя субтилизиноподобная протеиназа является секретируемым белком, а не накапливается в среде в результате лизиса клеток. Массовый лизис клеток наблюдался к 68-72-му ч роста культуры, когда в культуральной жидкости обнаруживалось до 70% свободных спор. Эти данные согласуются с ранее полученными результатами для клеток B. intermedius, когда с помощью репортерного белка ß-галактозидазы было показано, что фермент поздней стационарной фазы роста являлся секретируемым белком [9]. Возможно, функциональная роль протеиназы, секретируемой на поздних стадиях развития культуры, связана с расщеплением белков оболочки материнской клетки для выхода спор в среду [10].

ОВ590 -10, А,ед/мл ц е ч

Споры, %

ч

Рис. 1. Динамика роста культуры (1), протеолитической активности (2) и спорообразования (3), B. amyloliquefaciens Н2. Удельная скорость роста ц (4), удельная скорость накопления протеиназы е (5); I - субтилизиноподобная протеиназа, секретируемая на 28-й ч, II - субтилизинподобная протеиназа, секретируемая на 46-й ч роста

Исходной для выращивания В. amyloliquefaciens бралась среда, используемая для культивирования В. Шегте^ш [2]. Однако уровень синтеза субтилизино-подобной протеиназы В. amyloliquefaciens был значительно ниже по сравнению с В. intermedius, что обусловило необходимость оптимизации питательной среды для максимальной продукции фермента. Для определения оптимальных концентраций основных компонентов питательной среды проводили двухфакторный эксперимент, в котором исследовали влияние соотношения концентраций пептона (Х1) и неорганического фосфата (Х2) на накопление субтилизинопо-добной протеиназы в культуральной жидкости В. amyloliquefaciens. Результаты двухфакторных экспериментов представлены на рис. 2 в виде линий уровня активности субтилизиноподобной протеиназы, где выделяется зона, оптимальная по двум рассматриваемым факторам. Таким образом, оптимальные концентрации пептона и неорганического фосфата, необходимые для максимальной активности ранней субтилизиноподобной протеиназы, составили 23 и 0.24 г/л (рис. 2, а), для максимальной активности поздней протеиназы - 23 и 0.3 г/л соответственно (рис. 2, б). Использование подобранных концентраций пептона и фосфора позволило повысить уровень активности субтилизиноподобной про-теиназы В. amyloliquefaciens и продуктивность культуры на 28 и 46 ч роста в 2 раза по сравнению с исходной средой (табл. 1). Следует отметить также, что на оптимальной среде активность и продуктивность культуры в отношении синтеза ранней протеиназы по сравнению с поздней протеиназой выше на 10-12%.

Рис. 2. Линии уровня активности субтилизиноподобной протеиназы, секретируемой в ранней (а) и поздней (б) стационарных фазах роста В. атуЬЩыв/аавт

Табл. 1

Активность субтилизиноподобной протеиназы B. amyloliquefaciens и продуктивность культуры на исходной и оптимизированной средах

Субтилизиноподобная протеиназа B. amyloliquefaciens, секретируемая на: Исходная среда Оптимизированная среда

Активность, нМ/мл Продуктивность, усл. ед Активность, нМ/мл Продуктивность, усл. ед

28-й ч 65 6.0 121 14.5

46-й ч 60 5.5 109 12

При культивировании микроорганизмов в состав питательной среды часто включают кукурузный и дрожжевой экстракты, содержащие большой набор дополнительных факторов роста (витамины, аминокислоты, пептиды, микроэлементы), которые способствуют интенсификации синтеза протеиназ.

Исследовали влияние дрожжевого экстракта на биосинтез субтилизиноподобной протеиназы B. amyloliquefaciens. При внесении в питательную среду дрожжевого экстракта в концентрации 0.1-1.0% наблюдалось значительное снижение продуктивности культуры в отношении синтеза фермента ранней стационарной фазы роста (70-95%). Продукция поздней протеиназы также снижалась, но в меньшей степени (30-80%) (табл. 2). По-видимому, здесь имеет место репрессия биосинтеза фермента продуктами азотного метаболизма. Похожие результаты получены для внеклеточных протеиназ Bifidobacterium adolescentis, удельная активность которых снижалась на среде с дрожжевым экстрактом [11].

Так как протеолитические ферменты являются деградативными, то их синтез должен подвергаться индукции субстратом. Из литературы известно положительное влияние сложных белковых субстратов на биосинтез внеклеточных ферментов. Например, установлено, что присутствие белка в среде является необходимым условием для синтеза протеиназ у термофильных грибов Paecelomyces variotii и Aspergillus carneus [12]. Нами исследовано влияние сложных белковых субстратов казеина и желатина, внесенных в питательную среду перед засевом, на биосинтез субтилизиноподобной протеиназы B. amyloliquefaciens (табл. 2). Показано, что желатин в концентрации 1% снижал продукцию протеиназы на 50% как в раннюю, так и позднюю стационарную фазу

Табл. 2

Влияние различных добавок, внесенных в питательную среду, на продукцию субтили-зиноподобной протеиназы В. ату1оИдие/ас1ет' Н2

Субти-лино-подобная про-теиназа B.amylo liquefac iens, секре-тируемая на: Продуктивность, %

Дрожжевой экстракт, % о4 Я тинла ела Казеин, % Хлорид аммония, мМ ,я и н о м І ат тр

0.1 0.5 1.0 0.1 0.5 1.0 0.1 0.5 1.0 1 3 5 1 3 5

28-й ч 32 10 5 102 100 50 80 42 20 98 108 110 100 135 98

48-й ч 72 60 22 110 80 56 39 30 42 107 107 92 74 80 75

роста культуры. При меньших концентрациях желатина продуктивность культуры в отношении синтеза протеиназы на 28-й и 46-й ч роста оставалась практически на уровне контроля. При добавлении 0.1-1.0% казеина также наблюдалось значительное снижение продукции фермента (до 40-80%). Возможно, это обусловлено репрессией синтеза протеиназ конечными продуктами азотного метаболизма. Похожие результаты получены для B. pumilus и B. firmus [13, 14].

Известно, что неорганические соединения азота в сочетании с органическими (например пептоном) могут существенно влиять на биосинтез протеоли-тических ферментов. Так, добавление в среду ионов аммония увеличивало продукцию глутамилэндопептидазы B. intermedius [15], а также стимулировало секрецию экзопротеиназ у Asp. oryzae [16]. Проведенные нами исследования показали, что хлорид аммония не влиял на продукцию субтилизиноподобной протеиназы, секретируемой на 28-й и 46-й ч роста клетками B. amyloliquefaciens (табл. 2). Цитрат аммония по-разному влиял на уровень накопления фермента.

3 мМ цитрата аммония повышали продуктивность культуры в отношении ранней протеиназы до 35% и незначительно снижали продуктивность культуры в отношении поздней протеиназы (табл. 2). Похожие результаты получены для протеиназ микромицета Alternaria alternata [17]. Можно предположить, что обнаруженные некоторые различия по влиянию белковых субстратов и цитрата аммония на накопление субтилизиноподобной протеиназы B. amyloliquefaciens в разные стадии стационарной фазы роста культуры связаны с модуляцией механизмов регуляции синтеза фермента при изменениии физиологического состояния культуры [10].

Таким образом, влияние компонентов питательной среды на синтез субти-лизиноподобной протеиназы зависит от комбинации экзогенных факторов среды и их концентрации, а также от стадии развития продуцента. Полученные нами результаты позволили разработать оптимальные питательные среды для получения протеиназы, секретируемой в разные часы стационарной фазы роста, и повысить продуктивность культуры в отношении синтеза фермента более чем в 2 раза.

Табл. З

Тромболитическая активность субтилизиноподобных протеиназ бацилл

Субтилизиноподобные протеиназы Концентрация фермента, мкг/мл Время лизиса, ч Лизис тромба, %

Протеиназа 100 24 100

B. amilolyquefaciens, секретируемая на 28-й ч 1000 3 100

Протеиназа 100 24 100

B. amilolyquefaciens, секретируемая на 4б-й ч 1000 2.3 100

Протеиназа 150 24 33

B. intermedius [19] 35G iS 100

1000 4.5 100

В связи с распространением заболеваний, связанных с тромбообразованием, в настоящее время проводится активный поиск ферментов, способных эффективно лизировать тромбы. Мы предположили, что субтилизиноподобная протеи-наза B. amyloliquefaciens может обладать биологической активностью по аналогии с другими бациллярными ферментами [18]. Для исследования фибриноли-тической, тромболитической и антикоагулянтной активности субтилизинопо-добной протеиназы, секретируемой клетками B. amyloliquefaciens в ранней и поздней стационарных фазах роста, получали гомогенные препараты фермента. Очистку проводили с помощью ионообменной хроматографии на КМ-целлю-лозе и высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Mono S в системе FPLC. Были получены препараты протеиназы, соответствующей разным часам роста культуры. Их гомогенность была подтверждена электрофорезом [5]. Проведенные нами исследования показали, что оба препарата протеиназы обладают высокой фибринолитической активностью. При внесении 25 мкг обоих препаратов протеиназы на фибриновые пластины зоны лизиса появлялись уже через 15 мин инкубации при 37 °С. Через 1 ч инкубации в этих же условиях площади зон лизиса составили 252 и б00 мм соответственно. Ранее нами показано, что при внесении 20 мкг субтилизиноподобной протеиназы B. intermedius 7Р за 1 ч инкубации при 37 °С образовывалась зона лизиса фибриновой пластины площадью 135 мм2 [19]. Субтилизиноподобная протеиназа Thermoactinomyces vulgaris в аналогичных условиях также образовывала зону лизиса площадью 13S мм2 [20]. Таким образом, субтилизиноподобная протеиназа B. amyloliquefaciens обладает фибринолитической активностью в 1.5-3 раза выше, чем протеиназы B. intermedius и T. vulgaris [19, 20].

Способность протеолитического фермента лизировать фибриноген не всегда адекватно отражает его способность лизировать тромб, образованный из плазмы крови, поскольку в ней могут содержаться ингибиторы протеиназ. Мы исследовали тромболитическую активность фермента: способность протеиназы B. amyloliquefaciens лизировать предобразованный тромб (тромболитическая активность) и препятствовать формированию тромба (антикоагулянтная активность). Как видно из табл. 3, оба препарата субтилизиноподобной протеиназы B. amyloliquefaciens в концентрации 100 мкг/мл лизировали тромб за 24 ч на 100%, тогда как субтилизиноподобная протеиназа B. intermedius в концентра-

ции 150 мкг/мл лизировала тромб за то же время лишь на 33% [1S]. При концентрации протеиназ B. amyloliquefaciens 1000 мкг/мл время лизиса тромба значительно сокращалось, причем протеиназа B. amyloliquefaciens поздней стационарной фазы роста лизировала тромб на 40 мин быстрее, чем протеиназа ранней стационарной фазы роста, и в 2 раза быстрее, чем протеиназа B. intermedius. При использовании протеиназы B. amyloliquefaciens в меньших концентрациях (10, 25 и 50 мкг/мл) лизис тромба за 24 ч был незначительным.

При исследовании антикоагулянтных свойств протеиназы B. amyloliquefaciens установлено, что в контрольном варианте тромб образовывался через 2 мин после внесения тромбина в цитратную плазму крови, однако в присутствии препаратов протеиназы B. amyloliquefaciens в концентрации 1000 и 100 мкг/мл тромб не образовывался в течение 24 ч. Таким образом, протеиназа B. amyloliquefaciens обладает выраженными антикоагулянтными свойствами, сопоставимыми с таковыми для ранее исследованной нами субтилизиноподобной протеиназы B. intermedius [1S].

Итак, в культуральной жидкости B. amyloliquefaciens выявлена протеоли-тическая активность с максимальным накоплением фермента на 2S^ и 4б-й ч роста культуры. Установлено оптимальное соотношение концентраций пептона и неорганического фосфата для эффективного биосинтеза субтилизиноподоб-ной протеиназы B. amyloliquefaciens разных фаз роста, что позволило повысить продуктивность культуры в 2 раза. Субтилизиноподобная протеиназа обладает выраженными фибринолитическими, тромболитическими и антикоагулянтны-ми свойствами и поэтому может рассматриваться как перспективный фермент для применения в качестве тромболитического препарата.

Summary

N.P. Balaban, A.M. Mardanova, L.A. Malikova, O.N. Ilinskaya, M.R. Sharipova. The Biosynthesis of the Bacillus amyloliquefaciens H2 Subtilisin-Like Proteinase and Its Biological Activity.

Subtilisin-like proteinase is secreted by spore-forming bacteria B. amyloliquefaciens H2 on 2S and 4б h in a stationary phase of growth. Optimum ratio of peptone and inorganic phosphate concentration for effective bacterial proteinase biosynthesis is determined by multifactorial experiments. Influence of various exogenous factors on synthesis level of proteinase is investigated, that has allowed selecting an optimum nutrient medium and raising the culture efficiency twice. It is shown that homogeneous preparations of enzymes possess fi-brinilytic, thrombolytic and anticoagulative activity.

Key words: subtilisin-like proteinase, Bacillus amyloliquefaciens, biosynthesis, fibrini-lytic activity, thrombolytic activity.

Литература

1. Сидоренко Б.А., Преображенский Д.В. Клиническое применение антитромботиче-ских препаратов. - М.: Эвтаназия, 1997. - 17б с.

2. Ицкович Е.Л., Знаменская Л.В., Балабан Н.П., Ершова Т.А., Лещинская И.Б. Биосинтез щелочной внеклеточной протеиназы Bacillus intermedius // Микробиол. -1995. - Т. б4, № 5. - С. б2б-б29.

3. Люблинская Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н. p-Нитроанилиды пироглутамилпепти-дов - хромогенные субстраты сериновых протеиназ // Биоорг. химия. - 19S7. -Т. ІЗ, № б. - С. 74S-753.

4. ЕгоровН.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 19S3. - 22 І с.

5. Балабан Н.П., Маликова Л.А., Марданова А.М., Руденская Г.Н., Шарипова М.Р. Получение и характеристика субтилизиноподобных протеиназ, секретируемых в стационарную фазу роста Bacillus amyloliquefaciens H2 // Биохимия. - 2007. - Т. 72, Вып. 4. - С. 56S-575.

6. Astrup T., Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity // Arch. Biochem. Biophys. - І952. - V. 40, No 2. - P. З4б-З5І.

7. Краснов С.И., Знаменская Л.В. Комплекс программ “BIOPT” для оптимизации в биологических исследованиях // Биол. науки. - І992. - № 2. - С. 15-iS.

S. Балабан Н.П., Шарипова М.Р., Габдрахманова Л.А., Марданова А.М., Токмакова Ю.С., Соколова Е.А., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Синтез и секреция протеиназ Bacillus intermedius З-І9 на поздних стадиях спорообразования // Микро-биол. - 2003. - Т. 72, № 3. - С. 33S-342.

9. Balaban N.P., Gabdrahkmanova L.A., Sharipova M.R., Mardanova A.M., Sokolova E.A., Malikova L.A., Leshchinskaya I.B. Selection of cultivation medium for production of late phase serine proteinases from Bacillus intermedius // J. Basic Microbiol. - 2004. - V. 44, No б. - P. 4І5-42З.

10. Кириллова Ю.М., Михайлова Е.О., Балабан Н.П., Марданова А.М., Руденская Г.Н., Костров С.В., Шарипова М.Р. Особенности биосинтеза субтилизиноподобной се-риновой протеиназы Bacillus intermedius рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis // Микробиол. - 200б. - Т. 75, № 2. - С. 179-1S5.

11. Астапович Н.И., Самапцев А.А. Нативный субтилизин Карлсберг и модифицированный субтилизин 72 как эффективные катализаторы образования пептидных связей в органической среде // Микробиол. - І997. - Т. бб, № 5. - С. І5З-І59.

12. Базаржапов Б.Б., Лаврентьева Е.В., Дунаевский Я.Е., Биланенко Е.Н., Намсара-ев Б.Б. Внеклеточные протеолитические ферменты микроскопических грибов термальных источников Баргузинской долины (северное Прибайкалье) // Прикл. био-хим. и микробиол. - 200б. - Т.42, № 2. - C. 209-2І2.

13. Маликова Л.А., Марданова А.М., Соколова О.В., Балабан Н.П., Руденская Г.Н., Шарипова М. Р. Условия биосинтеза внеклеточной субтилизиноподобной протеи-назы Bacilluspumilus KMM62 // Микробиол. - 2007. - Т. 7б, № 3. - С. ЗІЗ-З20.

14. Ландау Н.С., Гуликова О.М., Егоров Н.С. Особенности контроля синтеза протеиназ с плазминоподобной и активаторной активностями у морских бактерий // Микробиол. - 2000. - Т. 69, № 2. - С. iS5-i90.

15. Шакиров Е.В., Габдрахманова Л.А., Балабан Н.П., Шарипова М.Р., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Влияние компонентов питательной среда на накопление глутами-лэндопептидазы в культуральной жидкости Bacillus intermedius // Микробиол. -2000. - Т. 69, № 1.- С. 29-33.

16. Безбородов А.М., Астапович Н.И. Секреция ферментов у микроорганизмов. - М.: Наука, 19S4. - 70 с.

17. Дунаевский Я.Е., Грубань Т.Н., Белякова Г.А. Влияние состава среды на количественный и качественный состав внеклеточных протеаз микромицетов // Микробиол. -І999. - Т. 6S, № 3. - С. 324-329.

iS. Ицкович Е.Л., Лютова Л.И., Балабан Н.П., Марданова А.М., Шакиров Е.В., Шарипова М.Р., Лещинская И.Б., Руденская Г.Н. Тромболитические и антикоагулянтные

свойства тиолзависимой сериновой протеиназы Bacillus intermedius З-І9 // Вопр. мед. химии. - 199S. - № 3. - С. 2SS-291.

19. Балабан Н.П., Шарипова М.Р., Ицкович Е.Л., Лещинская И.Б., Руденская Г.Н. Сек-ретируемая сериновая протеиназа спорообразующих бактерий Bacillus intermedius З-І9 // Биохимия. - І994. - Т. 59, Вып. 9. - С. ІЗ9З-І400.

20. Лютова Л.В., Андреенко Г.В., Карабасова М.А., Цаплина И.А., Руденская Г.Н. Исследование тромболитических и фибринолитических свойств тиолзависимой сери-новой протеиназы (ТСП) из Thermoactinomyces vulgaris in vivo // Прикл. биохим. и микробиол. - І990. - Т. 26, № 5. - C. 623-62S.

Поступила в редакцию 21.02.0S

Балабан Нэлли Павловна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: Nelly.Balaban@ksu.ru

Марданова Айслу Миркасымовна - кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: Ayslu.Mardanova@ksu.ru

Маликова Лилия Александровна - аспирант кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: Lilianna_kazan@mail.ru

Ильинская Ольга Николаевна - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: Olga.Ilinskaya@ksu.ru

Шарипова Маргарита Рашидовна - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского государственного университета.

E-mail: Margarita.Sharipova@ksu.ru