ФАКТОР РОСТА РЕТИКУЛОЦИТОВ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
GROWTH FACTOR OF RETICULOCYTES, METHOD FOR PRODUCTION AND APPLICATION THEREOF

Область техники
Настоящее изобретение относится к области медицинской биотехнологии и, более конкретно, к фактору роста ретикулоцитов, а также к способу его получения и применения.
Уровень техники
В настоящее время наиболее эффективным лекарственным средством для клинического лечения тяжелой анемии является эритропоэтин (rhu-EPO). С тех пор, как рекомбинантный человеческий (rhu) EPO американской компании Amgen Company был одобрен FDA в 1989 году, он стал общепринятым препаратом и является наиболее успешным примером лекарственного средства, полученного с помощью рекомбинантной ДНК. До настоящего времени EPO является единственным специфическим фактором увеличения числа красных кровяных клеток при их генерации. Хотя сообщалось, что фактор роста стволовых клеток (SCF) и колониестимулирующие факторы (CSFs) также оказывают активирующее действие на красные кровяные клетки, их функции являются многообразными и не сводятся исключительно к стимулированию красных кровяных клеток. К настоящему времени не обнаружены новые лекарственные средства для лечения тяжелой анемии.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цель настоящего изобретения заключается в выявлении нового фактора роста клеток - фактора роста ретикулоцитов (RGF), а также в разработке способа его получения и применения.
1
1
В ходе исследований по настоящему изобретению, в культуральной жидкости почечных клеток, белки с эритропоэтической активностью имеются как в человеческой моче, так и в плазме, но их молекулярные массы, иммуногенность и даже рецепторы отличаются от EPO. Содержание таких активных белков является очень низким, трудно получить достаточно чистые продукты для качественных исследований и, наконец, было обнаружено, что примеси из препарата α-антитрипсина из человеческой плазмы обладают высокой способностью стимулировать образование ретикулоцитов. Несколько высокоактивных белков, полученных биохимическими средствами и путем очистки, например, высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), являются пептидными фрагментами различной длины предшественника α-антитрипсина, и они содержат углеводные фрагменты различной длины, причем некоторые компоненты содержат небольшое количество или не содержат углеводов.
Технические решения, использованные в настоящем изобретении
1. Очистка RGF
1
a) Препарат α-антитрипсина (A-9024) производства Sigma Company, полученный из человеческой плазмы, обладает очень высокой активностью в стимулировании генерации ретикулоцитов. Для проверки активности применяли описанную ниже методику определения ретикулоцитов у мышей профессора Cheng Yaqin:
животные: самцы мышей ICR, массой 18-22 г;
образцы: подвергались разбавлению в соответствии с активностью RGF, обычно 5-20 мкг/мл;
методика: мышей делили на группы по три особи, осуществляли внутримышечную инъекцию 0,06 мл, 0,12 мл и 0,24 мл препаратов в течение трех дней подряд, на четвертый день отбирали кровь из глазной впадины, добавляли 7-8 капель в пробирку с колпачком, содержавшую 20 мкл 100 Ед/мл гепарина натрия, перемешивали до однородности, отбирали 50 мкл крови, по каплям наносили на высушенный краситель бриллиантовый крезиловый синий, которым предварительно покрывали один край стеклянной пластинки, тщательно перемешивали и помещали во влажную камеру при 37°C на 30 минут; затем перемещали один слой клеток на вторую стеклянную пластинку, высушивали в естественных условиях окружающей среды, фиксировали метиловым спиртом, повторно окрашивали по Райту, добавляли по каплям 0,02 моль/л PBS (pH 6,8), избегая высыхания, и через 30 минут промывали раствором красителя с PBS или дистиллированной водой;
подсчет ретикулоцитов в пленках проводили с помощью объектива с высокой разрешающей способностью на масляной иммерсии, причем ядерное вещество ретикулоцитов можно окрасить таким образом, чтобы были видны темно-синие образования в форме точек, линий, цепочек или сгустков, тогда как красные кровяные клетки не содержат подобных структур; как правило, осуществляли подсчет 500-1000 красных кровяных клеток и вычисляли содержание ретикулоцитов в процентах; для каждого образца осуществляли исследование двух пленок, усредняли, затем повторно усредняли для трех мышей в каждой группе и вычитали процентную долю ретикулоцитов в контрольной группе (0,12 мкл нормального физиологического раствора), получая чистый прирост процентной доли ретикулоцитов, причем каждый 1% прироста считали приростом на одну единицу (Ед) и вычисляли удельную активность инъецированного количества белка (за один раз), а именно, принимая прирост в единицах, стимулированный каждым миллиграммом белка (Ед/мг), за показатель удельной активности;
1
получали препараты α-антитрипсина в различных концентрациях, разбавляя нормальным физиологическим раствором, 15 самцов мышей ICR (массой 18-22 г) делили на 5 групп по 3 животных в каждой, контрольной группе осуществляли внутримышечное введение 0,12 мл нормального физиологического раствора и оставшимся группам осуществляли инъекцию 0,12 мл препаратов антитрипсина в различных концентрациях, инъекции осуществляли в течение 3 дней подряд, на четвертый день отбирали образцы крови из глазных впадин, окрашивали бриллиантовым крезиловым синим, подсчитывали процентную долю ретикулоцитов среди красных кровяных клеток, используя объектив на масляной иммерсии, и полученные результаты демонстрировали, что активность препаратов антитрипсина в стимулировании образования ретикулоцитов являлась очень высокой, и эти препараты могут служить в качестве исходного материала для последующего разделения и очистки. Результаты показаны в таблице 1:
Таблица 1Активность препаратов α<sub>1</sub>-антитрипсина в стимулировании генерации ретикулоцитов
Концентрация препарата α<sub>1</sub>-антитрипсина
Ретикулоциты %
Чистый прирост количества ретикулоцитов%
0
1,8%
2 мкг/мл
8,2
6,4
5 мкг/мл
6,6
4,6
20 мкг/мл
16,45
14,65
80 мкг/мл
1,8
0
1
Приведенные данные показывают, что препараты α-антитрипсина действительно обладают высокой активностью в стимулировании генерации ретикулоцитов.
1
b) растворяли α-антитрипсин в количестве 2 мг/мл в PBS 0,02 моль/л, осуществляли нейтральное разделение с помощью ВЭЖХ на колонке C18 с обращенной фазой, получая 3 группы пиков, причем при исследовании полученных фракций было установлено, что лишь 3-я группа пиков обладает активностью, хроматограмма полученная на колонке с обращенной фазой C18, показана на Фиг.1, и результаты исследования активности компонентов показаны в таблице 2:
Таблица 2Активность фракций, полученных при разделении α<sub>1</sub>-антитрипсина с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой C18
Собранные фракции
Ретикулоциты %
Чистый прирост количества ретикулоцитов%
Контроль: физиологический раствор 0,12 мл
2,4
Пик 1 20 мкг/мл0,12 мл
3,3
0,9
Пик 2 20 мкг/мл0,12 мл
4,48
2,08
Пик 3 20 мкг/мл0,12 мл
8,6
6,2
с) Увеличивая элюирующий градиент, повторно осуществляли ВЭЖХ фракции, соответствующей группе пиков 3, на колонке с обращенной фазой C18, собирая 10 фракций, где в результате проверки активности выяснилось, что 8-я собранная фракция обладала наибольшей активностью, а 7-я и 9-я фракции имели вторую после 8-й активность, а остальные 7 фракций активностью не обладали. Полученная в результате разделения хроматограмма показана на Фиг.2, а результаты определения активности приведены в Таблице 3:
Таблица 3Активность фракций №№ 7, 8, 9 и 10 из числа 10 фракций, полученных при повторном разделении фракции, соответствующей третьему пику на исходной хроматограмме
Собранные фракции
Ретикулоциты %
Чистый прирост количества ретикулоцитов%
Контроль: физиологический раствор 0,12 мл
1,2
Пик №7 20 мкг/мл 0,12 мл
4,9
3,7
Пик №8 20 мкг/мл 0,12 мл
8,3
7,1
Пик №9 20 мкг/мл 0,12 мл
5,8
4,6
Пик №10 20 мкг/мл 0,12 мл
4,1
2,9
d) Осуществляли препаративный гель-электрофорез SDS-PAGE восьмой собранной фракции (результаты показаны на фиг.3), вырезали кусочки геля в соответствии с положением пятен, которое выявляли путем окрашивания, вырезали первую-четвертую полосы геля, соответственно, осуществляли растирание, экстрагировали водой в течение 24 часов, причем экстракцию осуществляли три раза подряд, объединяли супернатанты, осуществляли лиофилизацию и определяли активность, где только экстракты полос 1, 2 и 3 продемонстрировали активность, тогда как полоса 4 активностью не обладала, результаты приведены ниже:
Таблица 4Активность экстрактов соответствующих полос, выделенных при электрофорезе из активного пика восьмой фракции, полученной при разделении ВЭЖХ
Экстракты полос, полученных при электрофорезе
Ретикулоциты %
Чистый прирост количества ретикулоцитов%
Контроль: физиологический раствор 0,12 мл
1,2
Полоса 1 20 мкг/мл 0,12 мл
10,7
9,2
Полоса 2 20 мкг/мл 0,12 мл
8,1
6,6
Полоса 3 10 мкг/мл 0,12 мл
7,2
5,7
Полоса 4 20 мкг/мл 0,12 мл
1,7
0,2
1
1
Затем после лиофильной сушки осуществляли SDS-PAGE исследование полученных экстрактов, где экстракты полос 1 и 3 давали ярко окрашенные полоски, экстракт полосы 2 демонстрировал высокую активность, но был близок к полосе 1, возможно, был загрязнен, имел неявно выраженное окрашивание и очевидно не являлся одной полосой, поэтому образцы полос 1 и 3 посылали Suzhou ProtTech Inc. с целью секвенирования, причем полученные результаты показали, что полосы 1 и 3 соответствуют предшественнику α-антитрипсина, и авторы изобретения назвали пептидные фрагменты полученного семейства факторами роста ретикулоцитов (семейство RGF), где предшественник α-антитрипсина имеет показанную ниже последовательность:
2. Химические свойства RGF
1
Для определения химических свойств продуктов, соответствующих полосам 1 и 3 на SDS-PAGE, полосы геля, выявленные окрашиванием, отправляли Suzhou ProtTech Inc. для определения последовательностей N-конца и C-конца, и результаты показывают, что полоса 1 (RTF-6 в отчете о секвенировании Suzhou ProtTech Inc.) содержит четыре компонента, которые являются фрагментами предшественника α-антитрипсина различной длины, последовательности N-концевых участков имеют небольшие отличия, а C-концевые участки соответствуют C-концам предшественника, полоса 3 (RTF-8 в отчете о секвенировании Suzhou ProtTech Inc.) содержит только один компонент, N- и C-концы которого полностью соответствуют полосам 1-2 и компонент включает в общей сложности 394 аминокислотных остатка от положения 25 до положения 418, полоса 1 имеет молекулярную массу примерно 50 000, что на 10 000 больше, чем у полосы 3, известно, что полоса 1 содержит углеводы, т.е. компоненты полосы 1 являются гликопротеинами, полоса 3 не содержит углеводов, что видно из величины молекулярной массы, или содержит значительно меньшее количество углеводов.
1
Семейство RGF является группой фрагментов белков, имеющих различную длину и различное содержание углеводов, происходящих от предшественника α-антитрипсина. Они имеют следующие аминокислотные последовательности:
N-конец (полоса 1-1)
N-конец (полоса 1-2)
N-конец (1-3)
N-конец (полоса 1-4)
C-фрагмент
3. Биологические свойства RGF
a) Терапевтическое действие RGF на мышей с апластической анемией, проведение этого эксперимента было поручено департаменту фармакологии, обучения и исследований Института традиционной китайской медицины, Jiangsu.
получение моделей: осуществляли ip инъекции циклофосфамида 100 мг/кг самцам мышей массой 18-22 г в течение трех дней подряд;
тестирование: мышей делили на 5 групп и использовали EPO местного производства (NING Hongxin). RGF являлся продуктом, полученным в лаборатории, проводившей исследование, и результаты определения RBC и WBC после осуществления инъекций в течение 8 дней показаны в таблице 5:
Таблица 5Терапевтическое действие RGF на мышей с апластической анемией
Группы
Число мышей
Дозировка
Результат
Увеличение числа эритроцитов
Увеличение числа лейкоцитов
RBC
WBC
Контроль
20
Нормальный физ.раствор
487±149,3
487±149,3
Модель апластической анемии
20
Нормальный физ.раствор
305±102,5
115±36,5
EPO в группе моделей апластич. анемии
20
333 Ед/кг
429±94,8
201±79,6
40,66
77,78
RGF в группе моделей апластич. анемии
20
167 мкг/кг
442±105,1
195±81,1
40,92
69,57
EPO+RGF в группе моделей апластич. анемии
20
1/2EPO+1/2RPF
516±108,4
233±104,5
69,18
102,61
Циклофосфамид может достоверно вызывать анемию у мышей, генерацию красных кровяных клеток можно стимулировать инъекцией EPO или RGF, например, терапевтическое действие, которое достигается половиной обычной дозы EPO и половиной обычной дозы RGF, для совместного стимулирования генерации красных кровяных клеток, превосходит действие обычной полной дозы RGF или EPO, что свидетельствует о достижении достоверного синергетического эффекта, и следует отметить, что RGF или EPO оказывают стимулирующее действие на генерацию лейкоцитов и при этом также демонстрируют синергетический эффект.
b) Синергетическое действие RGF и EPO на генерацию ретикулоцитов у мышей
животные: 30 самцов мышей ICR массой 18-22 г, 10 групп по 3 мыши в каждой группе
эксперимент: готовили составы RGF и EPO в следующих концентрациях: (a) RGF 5 мкг/мл; (b) EPO (rhuEPO производства Amgen Company) 18 Ед/мл; (c) смесь RGF и EPO в половинных дозах; осуществляли инъекцию составов RGF и EPO a, b и c мышам каждой группы в количестве 0,06 мл, 0,12 мл и 0,24 мл в течение трех дней подряд, на четвертый день отбирали образцы крови из глазных впадин, наносили мазки, осуществляли окрашивание и определяли прирост числа ретикулоцитов в процентах под микроскопом, где полученные результаты приведены в таблице 6:
Таблица 6Синергетический эффект RGF и EPO (Amgen Company)
Объем инъекции (каждой мыши каждый день)
Чистый прирост числа ретикулоцитов %
EPO (18 Ед/мл)
RGF (5 мкг/мл)
EPO 9 Ед/млRGF 2,5 мкг/мл
0,06 мл
4,8%
4,9%
5,3%
0,12 мл
6,2%
6,6%
7,2%
0,24 мл
7,4%
7,8%
11,3%
Как RGF, так и EPO проявляли высокую активность в стимулировании генерации ретикулоцитов, активность EPO в концентрации 18 Ед/мл и RGF в концентрации 5 мкг/мл оказалась достаточно близкой, после смешивания EPO и RGF в том же суммарном количестве, наблюдался достоверный синергетический эффект, в частности, в тестовой группе, получавшей инъекцию 0,24 мл, прирост числа ретикулоцитов был выше, чем в группах, получавших 0,24 мл EPO или RGF примерно на 50%, поскольку можно было предположить, что данный эффект является недостоверным и вызван образованием мышиного EPO под действием RGF in vivo, авторы разработали методику, в которой после инъекции RGF в различных дозировках мышам в течение 3 дней, определяли уровни EPO в крови мышей с помощью моноклональных антител для сравнения с контрольной группой, получавшей нормальный физиологический раствор, при этом оказалось, что уровни EPO не повысились, что позволило исключить указанную выше возможность. Можно сделать вывод, что EPO и RGF действуют на разных стадиях процесса генерации красных кровяных клеток, и при последовательном действии EPO и RGF, реально возрастает скорость генерации красных кровяных клеток. Эта гипотеза подтверждается описанными ниже экспериментами с флуоресцентной меткой.
Синергетическое действие RGF и EPO проявилось в двух экспериментах, это явление имеет важное значение для лечения тяжелой анемии и указывает на возможность более целесообразного и более эффективного лечения тяжелой анемии.
c) Эксперимент с флуоресцентной меткой
6
Осуществляли мечение EPO флуоресцентным родамином (RB200), в результате чего EPO выглядел красным при наблюдении на флуоресцентном микроскопе, осуществляли мечение RGF флуорохромом FITC, в результате чего RGF выглядел зеленым при наблюдениях на флуоресцентном микроскопе, отбирали образцы клеток костного мозга из длинных трубчатых костей четырех мышей объемом примерно 2 мл, осуществляли центрифугирование при 1000 об/мин в течение четырех минут, выливали супернатанты, ресуспендировали в 6 мл жидкости Хэнка, разделяли с помощью среды для отделения лимфоцитов, собирали и центрифугировали клетки с поверхности раздела; разбавляли клетки средой RPMI1640, получая суспензию клеток 1,8×10/мл, отбирали 5 мл клеточной суспензии, центрифугировали, ресуспендировали в 0,3 мл PBS, добавляли 60 мкл FITC-RGF и 60 мкл RB200-EPO, помещали в холодильник на 30 минут, после чего при наблюдении с помощью флуоресцентного микроскопа оказалось, что большинство клеток несут две метки, небольшое количество клеток мечено FITC-RGF, но нет клеток, меченых RB200-EPO. Наблюдаемое явление показывает, что RGF задействован на более ранних стадиях процесса формирования красных кровяных клеток, и рецептор EPO не появляется до тех пор, пока клетки не переходят на следующую стадию при содействии RGF, в результате чего образуются клетки, несущие на себе два рецептора, т.е. рецепторы RGF и EPO.
Полезные эффекты настоящего изобретения
Дифференцировка и созревание красных кровяных клеток является многостадийным, многофакторным сложным процессом, однако второй фактор, способствующий ускорению генерации красных кровяных клеток не удавалось найти в течение последних 20 лет, поэтому обнаружение фактора роста ретикулоцитов имеет большое значение. Если фактор роста ретикулоцитов и EPO применяются в комбинации, достигается лучший эффект, чем при применении фактора роста ретикулоцитов или EPO по отдельности. Это показывает, что различные стадии развития красных кровяных клеток требуют различной инициации и содействия различных факторов, что дает новый толчок для изучения общего процесса формирования красных кровяных клеток и лечения тяжелой анемии. Настоящее изобретение помогает объяснить синергетическое действие RGF и EPO, проявляющееся у нормальных мышей и мышей с апластической анемией. Поскольку они действуют на разных стадиях процесса формирования красных кровяных клеток, клетки костного мозга генерируют больше рецепторов EPO под действием RGF, в результате чего появляются клетки с двумя рецепторами, после чего EPO продолжает свое действие и более существенный эффект может быть понят в рамках предположения о последовательном действии. В рамках настоящего изобретения разработано новое лекарственное средство для лечения тяжелой анемии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА
1
Фиг.1 представляет собой хроматограмму, полученную при первом разделении α-антитрипсина с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой C18, где во время первого разделения собирали три фракции и 3-я фракция обладала активностью.
На Фиг.2 изображены 10 фракций, полученных на ВЭЖХ колонке C18 с обращенной фазой, при втором разделении, которое отличалось от первого увеличенным градиентом, где фракция, соответствующая восьмому пику, который отмечен стрелочкой, обладает наибольшей активностью.
Фиг.3 представляет собой диаграмму гель-электрофореза SDS-PAGE восьмой из десяти фракций, собранных при втором разделении ВЭЖХ, где из фракций с молекулярной массой примерно 50000, фракция с более интенсивной окраской представляет собой полосу 1 (RGF-B1), фракция с молекулярной массой примерно 40000 именуется полосой 3 (RGF-B3), и фракция между B1 и B3 именуется RGF-B2, и фракции выше B1 не обладают активностью.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1
1. Брали две бутыли α-антитрипсина, растворяли продукт в PBS pH 7,0, 0,02 моль/л, получая препарат с концентрацией 2,5 мг/мл, осуществляли нейтральное разделение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке C18 и получали 3 группы пиков среди которых, как показано на Фиг.1, 3-я группа пиков демонстрировала сильное стимулирующее действие на генерацию ретикулоцитов.
2. Осуществляли повторное разделение третьей группы пиков, увеличивая элюирующий градиент и получая 10 отдельных фракций, где лишь 7-я, 8-я и 9-я из собранных фракций продемонстрировали стимулирующее действие на генерацию ретикулоцитов, причем 8-я фракция имела наибольшую активность, как показано на Фиг.2 и Фиг.3.; осуществляли препаративный электрофорез SDS-PAGE 8 фракции, разрезали кусок геля в продольном направлении, окрашивали красителем кумасси бриллиантовый синий для определения положения белков, где полоса с более интенсивной окраской и большей шириной находится в положении, соответствующем молекулярной массе примерно 50000; вырезали соответствующий блок геля в качестве полосы 1, вырезали полосу с интенсивной окраской в положении, соответствующем молекулярной массе примерно 40000 в качестве полосы 3, где 3-4 окрашенных полосы между полосой 1 и полосой 3 характеризовались малоинтенсивной окраской, одна из этих полос была близка к полосе 1 и ее назвали полосой 2, и полосу между молекулярными массами 50000-68000 назвали полосой 4; по отдельности измельчали гель указанных четырех фрагментов стеклянными палочками, экстрагировали водой в течение 24 часов, отсасывали супернатант и повторяли экстракцию еще три раза; на 5-й день объединяли четыре полученных экстракта и подвергали лиофильной сушке, растворяли продукт в небольшом количестве воды и определяли активность полученных продуктов, причем результаты показали, что экстракты полос 1, 2 и 3 обладали высокой активностью, а полоса 4 не обладала активностью, и результаты измерений показаны в таблице 3;
1
4. Осуществляли SDS-PAGE экстрактов полос 1, 2 и 3, где полосы 1 и 3 после окрашивания образовывали интенсивно окрашенные полоски, а полоса 2 слабо окрашенные полоски, некоторые полоски по положению оказались очень близки к полосе 1, поэтому окрашенные гели полос 1 и 3 отправляли ProtTech Inc. для секвенирования, и результаты показали, что полосы 1 и 3 соответствуют фрагментам предшественника α-антитрипсина, причем полученные результаты представлены аминокислотными последовательностями, приведенными в тексте заявки;
1
1
5. Для определения химических свойств продуктов, соответствующих полосам 1 и 3, высушенные блоки геля SDS-PAGE полосы 1 и полосы 3 отправляли Suzhou ProtTech Inc. для секвенирования, результаты которого показаны в приложении 2. Результаты секвенирования N- и C-концов показали, что четыре компонента, содержащихся в полосе 1, являются фрагментами различной длины предшественника α-антитрипсина, где этот предшественник состоит из 418 аминокислотных остатков, указанные фрагменты имеют различающиеся начальные точки N-концов, которые соответствуют положениям аминокислотных остатков 24, 25, 27 и 30 в молекуле предшественника α-антитрипсина; C-концы соответствуют концевым фрагментам предшественника. Полоса 3 содержит единственный компонент, который полностью аналогичен по структуре компонентам полос 1-2 и состоит 394 аминокислотных остатков с 25-го по 418-го положение. Но его молекулярная масса меньше компонента полосы 1, который содержит углеводные остатки, и, исходя из значений молекулярных масс, компонент полосы 3 не содержит или содержит значительно меньше углеводов;
1
6. Последовательность предшественника α-антитрипсина известна, его молекулярная масса также известна и составляет 55000-56000, молекулярная масса компонентов обеих полос 1 и 3 меньше молекулярной массы предшественника и несколько компонентов с молекулярными массами 50000-40000 также демонстрируют активность. Считается, что предшественник антитрипсина может разрушаться с образованием группы пептидных фрагментов различной длины, и эти пептидные фрагменты, кроме того, имеют углеводные цепи различной длины или не содержат углеводов. До настоящего времени неизвестно, имеют ли активные белковые группы, состоящие из пептидных фрагментов, отличающиеся активные сайты, но все компоненты семейства антитрипсина обладают способностью регулировать генерацию красных кровяных клеток в организме совместно с EPO.