СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГЛОБАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС
METHOD FOR SIMULATING GLOBAL CEREBRAL ISCHEMIA IN RATS

Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии и может быть использовано для моделирования глобального ишемического и реперфузионного повреждения головного мозга.
Известен способ моделирования глобальной ишемии головного мозга у крыс путем окклюзии четырех магистральных артерий, кровоснабжающих головной мозг [1]. Недостатками данного способа являются: двухэтапность воспроизведения модели (коагуляция позвоночных артерий в первый день и пережатие сонных артерий во второй день эксперимента), частичная ишемия вертебро-базиллярного бассейна, сохраняющаяся в период рециркуляции крови по сонным артериям, труднодоступность позвоночных артерий, риск повреждения ствола мозга при коагуляции позвоночной артерии. Последующие модификации данного способа моделирования глобальной ишемии головного мозга не устранили эти его существенные недостатки [2, 3].
Известен способ моделирования глобальной ишемии головного мозга у крыс, представляющий собой модификацию четырехсосудистой модели глобальной ишемии головного мозга, воспроизводимую в один этап, при одномоментной окклюзии общих сонных артерий с наложением хирургических микрозажимов на вертебральные артерии между вторым и третьим шейными позвонками [4]. Однако при этом также не исключается коллатерального кровоснабжения головного мозга у крыс, осуществляемого по вентральной спинномозговой артерии.
Наиболее близким способом моделирования глобальной ишемии головного мозга (прототипом) является способ экстракраниальной окклюзии сосудов, кровоснабжающих головной мозг (плечеголовного ствола, левой подключичной артерии и левой общей сонной артерии) [5]. Этот способ моделирования глобальной ишемии головного мозга лишен недостатков вышеуказанных способов: позволяет проводить операцию одноэтапно, создает состояние глобальной ишемии ткани головного мозга, исключающей коллатеральное и редуцированное кровоснабжение.
Недостатком данного способа является его повышенная травматичность, так как используется подход к дуге аорты и магистральным артериям, кровоснабжающим головной мозг, через вскрытие грудной клетки по нижнему краю III ребра. При этом повреждается плевральная полость, возникает пневмоторакс с необходимостью перевода животных на искусственное дыхание. О тяжести хирургического вмешательства при реализации этого способа свидетельствует гибель крыс в группе ложнооперированных животных [6].
Задачей данного изобретения является разработка способа моделирования глобальной ишемии головного мозга, который исключает пневмоторакс и снижает травматичность хирургического доступа к артериям, кровоснабжающим головной мозг.
Поставленная задача решается созданием способа моделирования глобальной ишемии головного мозга у крыс. Доступ к левой общей сонной артерии осуществляется через вентральную поверхность шеи, а доступ к плечеголовному стволу и левой подключичной артерии осуществляют через первое межреберье справа и слева соответственно в обход плевральной полости. При этом исключается пневмоторакс. Как следствие, отсутствует необходимость использования аппарата искусственной вентиляции легких в период проведения хирургического вмешательства. Это приводит к снижению травматичности хирургического вмешательства, отсутствию гибели крыс в группе ложнооперированных животных и отсутствию у них неврологического дефицита.
Новым в предлагаемом способе является то, что доступ к левой общей сонной артерии осуществляют через вентральную поверхность шеи, а доступ к плечеголовному стволу и левой подключичной артерии осуществляют через первое межреберье справа и слева соответственно в обход плевральной полости.
Отличительные признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе. Предлагаемое изобретение может быть использовано для моделирования ишемических и реперфузионных повреждений головного мозга, наблюдаемых в клинике при остановке сердца и при последующих реанимационных действиях, при хирургических операциях с применением искусственного кровообращения, для изучения патогенеза ишемических и реперфузионных нарушений головного мозга, поиска новых средств фармакотерапии ишемических и реперфузионных повреждений головного мозга.
Исходя из вышеизложенного следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Способ осуществляется следующим образом.
Эксперименты выполнены на аутбредных крысах-самцах Вистар (n=33) массой 220-240 г, полученных из клиники лабораторных животных ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН. Эксперименты на животных проведены в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [7].
Хирургические вмешательства проводили в асептических условиях. Крыс наркотизировали хлоралгидратом (450 мг/кг внутрибрюшинно), интубировали без нарушения целостности трахеи и оставляли на самостоятельном дыхании, поскольку использованный нами доступ к сосудам, кровоснабжающим головной мозг, исключал вскрытие плевральной полости. По средней линии вентральной поверхности шеи делали разрез, выделяли и затем лигируровали левую общую сонную артерию. На вентральной поверхности грудной клетки делали поперечный разрез кожи на уровне первого межреберья, проходящий над реберным хрящом I правого ребра, грудной костью и реберным хрящом I левого ребра. Разрезали межреберные мышцы в правом межреберье между реберными хрящами I и II ребер до грудной кости, разводили ребра с помощью ранорасширителя, выделяли плечеголовной ствол проксимальней отхождения правой подключичной артерии, осторожно отодвигая верхнюю полую вену, и с помощью малой лигатурной иглы Купера лигировали выделенный сосуд. Затем разрезали межреберные мышцы в левом межреберье между реберными хрящами I и II ребер до грудной кости, разводили ребра с помощью ранорасширителя, выделяли левую подключичную артерию, осторожно отодвигая левую верхнюю полую вену, и с помощью малой лигатурной иглы Купера лигировали выделенный сосуд. После подключения аппарата искусственной вентиляции к интубационной трубке по открытой схеме производили пережатие лигированных сосудов в течение 7 мин, после чего лигатуры снимали и послойно ушивали раны. Использование аппарата искусственного дыхания в период создания глобальной ишемии головного мозга обусловлено остановкой дыхания при пережатии магистральных сосудов, кровоснабжающих головной мозг.
После восстановления ритмичного самостоятельного дыхания животных экстубировали. У ложнооперированных животных проводили аналогичное оперативное вмешательство, но без наложения лигатур на сосуды.
Неврологический дефицит оценивали по шкале Stroke-index McGraw в нашей модификации суммой баллов по исследуемым показателям [8]. Оценку функционального состояния высшей нервной деятельности проводили на 1-е, 3-и и 5-е сутки после воспроизведения модели глобальной ишемии головного мозга по следующим показателям: спонтанная двигательная активность (нормальная, повышенная или сниженная, отсутствие), расстройства походки (скованность, шаткость, замедленность движений, нарушение ориентации), рефлексы отдергивания хвоста, обеих передних и задних лап, реакция на звук, тремор, судороги, тонус мышц туловища и конечностей (нормальный, повышенный, отсутствие), признаки птоза (отсутствие, односторонний, двусторонний). Каждый показатель оценивали в баллах: 0 баллов - норма; 1 балл - умеренно выраженные изменения; 2 балла - резко выраженные изменения.
Выживаемость животных регистрировали на 1-е, 3-и и 5-е сутки после глобальной ишемии головного мозга с реперфузией.
Результаты, свидетельствующие об эффективности использования предложенного способа, изложены в примерах 1 и 2.
Пример 1. В группе ложнооперированных животных проведенные оперативные вмешательства без наложения лигатур на магистральные сосуды дуги аорты не вызывали гибели крыс (таблица 1). К 1-м суткам после оперативного вмешательства у крыс этой группы наблюдались лишь легкие изменения спонтанной двигательной активности, которые в последующие сроки исчезали. Средний балл неврологического дефицита составил в 1-е сутки 0,4±0,2 балла, в последующие сроки наблюдения неврологических нарушений не выявлено (таблицы 2 и 3).
Пример 2. В группе опытных животных к 1-м суткам после глобальной ишемии головного мозга с репефузией погибло 30,4% животных, что примерно соответствует выживаемости крыс при воспроизведении у них способа по прототипу [6]. К 3-м суткам наблюдения смертность возросла до 43,5%, к 5-м суткам - до 52,2% (таблица 1).
В первые 2-5 ч после глобальной ишемии головного мозга с репефузией у крыс опытной группы наблюдались наиболее тяжелые симптомы поражения ЦНС в виде арефлексии, судорог, спастического паралича конечностей, тонического напряжения мышц туловища, бокового положения.
У крыс опытной группы средний балл неврологического дефицита к 1 суткам после воспроизведения глобальной ишемии головного мозга составил 9,3±1,7 балла с последующим уменьшением к 3-м суткам до 7,7±1,9 и к 5-м -4,4±0,9 (таблица 2).
Таблица 1
Выживаемость животных после глобальной ишемии головного мозга с реперфузией, %
Группы животных
1 сут
3 сут
5 сут
Ложнооперированные (n=10)
100
100
100
Ишемия (n=23)
69,6∗
56,5∗
47,8∗
Примечание. В таблицах 1-2 ∗ - p<0,05 по сравнению с показателями ложнооперированных животных.
Таблица 2
Средний балл неврологического дефицита у крыс после глобальной ишемии головного мозга с реперфузией
Группы животных
1 сут
3 сут
5 сут
Ложнооперированные (n=10)
0,4±0,2
0
0
Ишемия (n=23)
9,3±1,7∗
7,7±1,9∗
4,4±0,9∗
Таким образом, глобальная ишемия головного мозга с реперфузией, вызываемая окклюзией плечеголовного ствола, левой подключичной артерии и левой общей сонной артерии, сопровождается явлениями выраженного и стойкого неврологического дефицита. Используемый в данном способе доступ к магистральным сосудам, снабжающим кровью головной мозг, без повреждения плевральной полости позволяет сделать модель менее травматичной, снижает отход опытных животных и, судя по результатам выживаемости ложнооперированных крыс, позволяет минимизировать последствия хирургического вмешательства.
Список использованных источников
1. Pulsinelli W.A., Brierley J.B. A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat // Stroke. - 1979. - Vol.10, №3. - P.267-272.
2. Sugio K., Horigome N., Sakaguchi Т., Goto M. A model of bilateral hemispheric ischemia-modified four-vessel occlusion in rats // Stroke. - 1988. - Vol.19, №7. P.922.
3. Pulsinelli W.A., Buchan A.M. The four-vessel occlusion rat model: method for complete occlusion of vertebral arteries and control of collateral circulation // Stroke. - 1988; Vol.19. - P.913-914.
4. Yamaguchi M., Calvert J.W., Kusaka G., Zhang J.H. One-stage anterior approach for four-vessel occlusion in rat // Stroke. - 2005. - Vol.36, №10. - P.2212-2214.
5. Патент РФ 2464645. Способ моделирования глобальной ишемии головного мозга у мелких лабораторных животных.
6. Щербак Н.С., Галагудза М.М., Кузьменков А.Н. и др. Новый способ момделирования обратимой глобальной ишемии головного мозга // Бюл. экперим. биол. и мед. - 2011. - Т.152, №11. - С.592-595.
7. European Convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes // ETS №123. Strasbourg. 1986.
8. McGraw C.P. Experimental cerebral infarction: effects of pentobarbital in Mongolian gerbils // Arch. Neurol. - 1977. - Vol.34. - P.334-336.