Применение кумарина и его производных в качестве ингибиторов системы "кворум сенсинга" LuxI/LuxR типа у бактерий
APPLICATION OF COUMARIN AND ITS DERIVATIVES AS INHIBITORS OF LuxI / LuxR TYPE "QUORUM SENSING" SYSTEM IN BACTERIA

Изобретение относится к микробиологии и фармацевтике и касается молекул растительного происхождения, а также их химически синтезированных аналогов, способных подавлять плотностно-зависимую коммуникацию и регулируемое ей коллективное поведение («кворум сенсинг») у бактерий. Изобретение может найти применение при создании новых лекарственных препаратов, предназначенных для предупреждения и лечения бактериальных инфекций растений, животных и человека, возбудители которых используют систему «кворум сенсинга» для индукции своего патогенного потенциала.
Широкое неконтролируемое применение антибиотиков привело к формированию феномена антибиотикорезистентности бактериальных патогенов. Потенциал возможного совершенствования известных и создания новых антибиотиков, способных преодолевать подобную резистентность, к настоящему моменту практически исчерпан. В этой связи становится актуальной разработка принципиально новых методов борьбы с бактериальными инфекциями. Научная и практическая значимость решения данной проблемы определяется перспективой сокращения объемов применения, а в дальнейшем и полного прекращения использования антибиотиков в медицине и сельском хозяйстве с одновременным достижением выраженного и стабильного эффекта в отношении антибиотикорезистентных форм бактериальных патогенов растений, животных и человека.
В качестве одного из наиболее перспективных путей решения этой проблемы рассматривается воздействие на систему плотностно-зависимой коммуникации у бактерий, описываемую термином «кворум сенсинг» (англ. - quorum sensing) [1 - Jiang Т., Li М. Quorum sensing inhibitors: a patent review. Expert Opin. Ther. Pat. 2013, V. 23(7), Р. 867-894]. При этом первым из описанных и, как позже оказалось, наиболее распространенным вариантом оказался «кворум сенсинг» LuxI/LuxR типа, где синтезируемая под контролем гена luxI сигнальная молекула - ацилированный гомосерин лактон (АГЛ) диффундирует во внешнюю среду, а при достижении критической плотности популяции и определяемой этим собственной пороговой концентрации совершает обратное движение внутрь бактериальной клетки, связывается с рецепторным белком LuxR и запускает транскрипцию целевых генов.
Спектр предлагаемых технических решений для ингибирования систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа включает: 1) подавление образования АГЛ; 2) ферментативную или химическую деградацию этих молекул при их поступлении во внешнюю среду; 3) ингибирование связывания АГЛ с соответствующими LuxR-подобными рецепторными белками [2 - Bhardwaj A.K, Vinothkumar K. Rajpara N. Bacterial quorum sensing inhibitors: attractive alternatives for control of infectious pathogens showing multiple drug resistance. Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery, 2013, V. 8, P. 68-83]. Анализ открытых патентных источников позволяет констатировать, что на основе данных подходов предложено несколько десятков изобретений, с 1996 по 2014 гг. нашедших отражение в международных охранных документах WO 96/29392; WO 99/27786; WO 01/85664; WO 02/102370; WO 03/106445; WO 2004/016588; WO 2006/125262; WO 2014142748 и др.
Отдельным направлением подобного поиска является обнаружение и исследование природных (растительных) соединений, в естественных условиях ингибирующих «кворум сенсинг» фитопатогенных бактерий, а при переносе в организм человека или животного способных оказывать аналогичное воздействие на стереотипно устроенные системы плотностно-зависимой коммуникации LuxI/LuxR типа у антропо- и зоопатогенных микроорганизмов.
Первым из описанных анти-кворум соединений растительного происхождения стали галогенизированные фураноны, образуемые морской красной водорослью Delisea pulchra и имеющие выраженное структурное сходство с АГЛ. При этом основным механизмом их действия была признана дестабилизация комплекса «АГЛ:LuxR», приводящая к ускорению оборота данного рецепторного белка в клетках морских бактерий Vibrio fischeri и Vibrio harveyi [3 - Manefield M., Rasmussen T.B., Henzter M., Andersen J.B., Steinberg P., Kjelleberg S., Givskov M. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR tumover // J. Microbiolody (UK), 2002, V. 148, P. 1119-1127]. На данной основе был предложен патент [4 - WO 2004016588, Furanone derivatives and methods of making same], защищающий структуры соединений на основе натуральных и синтетических фуранонов, некоторые из которых по способности к подавлению систем «кворум сенсинга» даже превосходили свои природные аналоги. Однако большинство галогезированных фуранонов оказалось токсичными для человека и животных [5 - Hentzer М., Givskov М. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections. // J. Clin. Invest., 2003, V. 112, P. 1300-1307], что явилось существенным препятствием на пути их практического использования.
При исследовании съедобных растений внимание было обращено на чеснок Allium sativum, способность которого к продукции бактерицидов прямого действия (фитонцидов и фитоалексинов) достаточно хорошо изучена. В свою очередь идентификация анти-кворум активности данного растения позволила связать ее с присутствием аджоена: 2-пропенил-3[3-(2-пропенилсульфинил)-1-пропенил]дисульфида [6 - Jakobsen Т.Н., Van Gennip М., Phipps R.K., Shanmugham M.S., Christensen L.D., Alhede M., Skindersoe M.E., Friedrich K., Uthe F., Jensen P.O., Moser C., Nielsen K.F., Eberl L., Larsen Т.О., Tanner D., Hoiby N., Bjarnsholt Т., Rasmussen T.B., Givskov M. Ajoene, a sulfur-rich molecule from garlic, inhibits genes controlled by quorum sensing // Antimicrob. Agents Chemother., 2012, V. 56 (5), P. 2314-2325], по своей структуре напоминающего фитонцид аллицин и образующегося при его реакции с некоторыми пищевыми маслами. Полученный результат был положен в основу патента [7 - WO 2012076016, Process for the manufacture of ajoene derivatives], однако, собственный терапевтический потенциал данного соединения оказался ограничен, а наилучший результат был достигнут при его совместном использовании с антибиотиками: аджоен нарушает кворум-зависимое образование биопленки, что делает присутствующие в ней бактерии более чувствительными к антибиотику тобрамицину. Кроме того, у аджоена обнаружились и иные виды биологической активности, включающие индукцию апоптоза [8 - Dirsch V.M., Gerbes A.L., Vollmar A.M. Ajoene, a compound of garlic, induces apoptosis in human promyeloleukemic cells, accompanied by generation of reactive oxygen species and activation of nuclear factor kappaB. // Molecular Pharmacology, 1998, V. 53 (3), P. 402-407], необходимость учета которых усложняет перспективу его практического использования.
При исследовании лекарственных растений наиболее обширные сведения накоплены по эллагитанинам: вескалагину и его изомеру касталагину, изолированным из листьев произрастающего во Флориде (США) лекарственного растения Conocarpus erectus [9 - Adonizio А., Dawlaty J., Ausubel F.M., Clardy J., Mathee K. Ellagitannins from Conocarpus erectus exhibit anti-quorum sensing activity against Pseudomonas aeruginosa // Planta Med., 2008, V. 74, DOI: 10.1055/s-0028-1084373].
Экстракты названного растения и выделенные из него полифенольные соединения демонстрируют выраженную способность к ингибированию системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у широкого спектра фитопатогенных и зоопатогенных бактерий от Agrobacterium tumefaciens до Pseudomonas aeruginosa, что нашло свое отражение в материалах патента [10 - US 20110105421, Ellagitannins as inhibitors of bacterial quorum sensing]. Однако, ограниченный ареал распространения растения Conocarpus erectus, технологическая сложность выделения эллагитанинов при невозможности их химического синтеза делают практическое применение названных соединений высоко затратным и экономически неэффективным.
Таким образом, анализ открытых источников научной и патентной литературы свидетельствует как о всевозрастающем интересе к поиску растительных ингибиторов «кворум сенсинга» бактериальных патогенов, так и о существовании ряда препятствий для их практического использования.
В этой связи задачей данного изобретения является применение имеющих растительное происхождение, нетоксичных, лишенных серьезных побочных эффектов и доступных для химического синтеза органических молекул, способных ингибировать различные варианты систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий.
В настоящем изобретении эта задача решается применением соединений на основе кумарина (2H-хромен-2она) общей формулы 1
1
где в общей формуле 1 X означает, но не ограничивается:
3
- остаток водорода (H), гидроксильную (OH) или алкоксильную (OCH) группу, а производные данного соединения являются разновидностями умбиллиферона (7-гидроксикумарина) или герниарина (7-метокси-2H-хромен-2-она);
2
где в общей формуле 1 X означает, но не ограничивается
3
1
- остаток водорода (H), гидроксильную (OH) или алкоксильную (OCH) группу, в том числе сочетающуюся с присутствием различных по структуре радикалов X, а производные данного соединения являются разновидностями эскулетина (6,7-дигидроксикумарина), скополетина (7-гидрокси-6-метокси-2H-хромен-2-она) или скопарона (6,7-диметокси-2H-хромен-2-она);
3
где в общей формуле 1 X означает, но не ограничивается
1
2
3
- остаток водорода (H) или сочетающуюся с присутствием X и X дополнительную гидроксильную (OH) или алкоксильную (OCH) группу, а производные данного соединения являются разновидностями фраксетина (7,8-дигидрокси-6-метокси-2H-хромен-2-она), фраксидина (8-гидрокси-6,7-диметокси-2H-хромен-2-он) или изофраксидина (7-гидрокси-6,8-диметокси-2H-хромен-2-он).
В соответствии с настоящим изобретением регуляторный препарат (композиция) на основе производных кумарина содержит по весу от 0.0001 до 100% соединений общей формулы 1, остальное - нейтральные компоненты или иные вещества, например антибиотики группы аминогликозидов, позитивно модифицирующие (в том числе повышающие активность) данную композицию, а само подобное соотношение и форма его применения (в виде жидкостей, порошков, аппликаций и т.д.) определяются исходя из особенностей возбудителя инфекционного процесса и его локализации.
По сравнению с упомянутыми выше техническими решениями заявляемое изобретение имеет ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.
1) В отличие от патента US 20110105421 [10 - Ellagitannins as inhibitors of bacterial quorum sensing] способность к подавлению систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий установлена у соединений не из внесенного в Международную Красную книгу тропического растения Conocarpus erectus, но из широко распространенных в умеренном климатическом поясе восточной Европы растений семейства Астровых (Asteraceae) - одного из самых больших семейств двудольных растений, что снимает ресурсные (сырьевые) ограничения при получении присутствующих в них биологически активных компонентов. В частности, проведенный заявителями скрининг лекарственных растений из семейства Астровых позволил констатировать наличие искомой активности в экстрактах тысячелистника (Achillea), ромашки (Matricaria) и ряде других лекарственных растений, произрастающих на территории Российской Федерации, а последующий фитохимический анализ свидетельствовал о присутствии в них производных кумарина и их гликозидов, что позволяет рассматривать названные растения в качестве потенциальных источников получения природных соединений общей формулы 1.
2) В отличие от патента WO 2004016588 [4 - Furanone derivatives and methods of making same], соединения общей формулы 1 не проявляют выраженной токсичности в отношении человека и животных. В соответствии с заключением Европейского агентства по безопасности продуктов питания (EFSA) от 06.10.2004 г. кумарин признан нетоксичным соединением, пригодным для использования в парфюмерии и косметике, а с 2011 г. разрешено его включение в продукты питания (например, кондитерские изделия и алкоголь). Согласно оценкам Немецкого федерального Института оценки степени риска безопасное ежедневное потребление кумарина составляет 0,1 мг на 1 кг массы тела с возможностью существенного кратковременного превышения данного порога (например, при проведении лечебных мероприятий).
3
3) В отличие от патента WO 2012076016 [7 - Process for the manufacture of ajoene derivatives], соединения общей формулы 1 не имеют выраженных побочных эффектов, способных осложнить их практическое применение. Наиболее известным осложнением является влияние данной группы соединений на систему свертывания крови, в связи с чем некоторые кумарины: продукт его полимеризации дикумарол или сложное производное 4-гидрокси-3-(3-оксо-1-фенилбутил)-2H-хромен-2-он (варфарин) используются в качестве природного или синтетического антикоагулянтов соответственно. Однако, заявляемые в настоящем изобретении простые производные кумарина с гидроксильными (OH) и алкоксильными (OCH) группами в бензольном кольце лишены подобного варианта биологической активности.
4) Предлагаемое применение кумарина и его производных общей формулы 1 в качестве ингибиторов систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий ранее не описано.
Известное применение данных соединений в микробиологии и фармацевтике, отраженное в патентных обзорах по этой теме [11 - Kontogiorgis С., Detsi A., Hadjipavlou-Litina D. Coumarin-based drugs: а patent review (2008 - present) // Expert Opin. Ther. Pat., 2012, V. 22 (4), P. 437-454; 12 - Katsori A., Hadjipavlou-Litina D. Coumarin derivatives: an updated patent review (2012-2014) // Expert Opin. Ther. Pat., 2014, V. 24 (12), P. 1323-1347], включает только прямые антибактериальные эффекты кумарина и его производных. В частности, патентом [13 - US 20030068389, Antibacterial agent] оговаривается применение экстракта кумаринов из кожуры цитрусовых в качестве антибактериального агента, а патент [14 - WO 2003063619, Anti-bacterial compositions] оговаривает состав антибактериальной композиции с участием кумарина, эскулетина, скополетина и умбеллиферона, проявляющей подобную активность против Escherichia coli 0157, Salmonella spp., Listeria spp., Campylobacter spp., а также метициллин-резистентных штаммов Staphylococcus aureus.
Единственное известное упоминание использования родственной группы соединений растительного происхождения для ингибирования «кворум сенсинга» у Vibrio harveyi, а также подавления кворум-зависимого образования биопленок Escherichia coli, Salmonella typhimurium и Pseudomonas aeruginosa относится к фуранокумаринам, изолированным из сока грейпфрута [15 - Girennavar В., Cepeda M.L., Soni K.A., Vikram A., Jesudhasan P., Jayaprakasha G.K., Pillai S.D., Patil B.S. Grapefruit juice and its furocoumarins inhibits autoinducer signaling and biofilm formation in bacteria // Int. J. Food Microbiol. 2008, V. 125, P. 204-208]. Однако, по структуре своих молекул фуранокумарины существенно отличаются от соединений общей формулы 1 наличием дополнительного лактонного кольца.
Сказанное позволяет утверждать, что из открытых патентных источников применение кумарина и его производных в качестве ингибиторов систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий не известно.
5) При обосновании настоящего изобретения заявителями получены оригинальные экспериментальные данные, доказывающие возможность применения соединений общей формулы 1 для ингибирования широкого спектра систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий, включающих индуцируемые различными по структуре ацилированными гомосерин-лактонами (АГЛ) системы LuxI/LuxR Vibrio fischeri, Cvil/CviR Chromobacterium violaceum, а также присутствующие у Pseudomonas aeruginosa системы RhlI/RhlR и LasI/LasR. При этом в некоторых случаях зафиксирована и прямая антибактериальная активность кумарина и его производных, на фоне которой способность к подавлению «кворум сенсинга» проявляют субингибиторные концентрации тестируемых соединений.
6) Кроме того, в рамках разработки настоящего изобретения авторами впервые была доказана возможность усиления анти-кворум эффекта кумарина и его производных при их сочетании с антибиотиками из группы аминогликозидов (канамицином, гентамицином, амикацином и др.). При этом углубленный анализ причин повышения активности подобной композиции позволил связать ее с синергетическим действием антибиотика и соединения общей формулы 1, первый из которых нарушал образование регуляторных молекул (АГЛ), а второй ингибировал их взаимодействие с соответствующим LuxR-подобным рецепторным белком.
Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.
Пример 1. Применение кумарина и его производного - скополетина (7-гидрокси-6-метоксихромен-2-она) для ингибирования различных систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий.
В качестве ингибиторов «кворум сенсинга» у бактерий, соответствующих общей формуле 1, были использованы соединения 1а-б.
+
+
+
Определение способности данных соединений к ингибированию «чувства кворума» проводилось с использованием четырех различных бактериальных тест-систем LuxI/LuxR типа, каждая из которых индуцировалась определенным АГЛ и содержала соответствующие ему LuxR-подобный рецепторный белок. При этом три из них были сформированы на основе Escherichia coli JLD271 с мутацией в гене sdiA, ответственном за восприятие экзогенных АГЛ, что исключало интерференцию с клонированными в данном хозяйском штамме генноинженерными биолюминесцентными конструкциями [16 - Lindsay A., Ahmer В.М. Effect of sdiA on biosensors of N-acylhomoserine lactones // J. Bacteriol, 2005, V. 187(14), Р. 5054-5058]. В свою очередь сами подобные генетические конструкции были представлены плазмидами с последовательностями генов rhlRrhlI::luxCDABE, luxRluxI::luxCDABE и lasRlasI::luxCDABE, специфически реагирующими развитием свечения при появлении в среде культивирования С4-АГЛ (N-бутаноил-L-гомосеринлактона), C6-оксо-АГЛ (N-(оксогексаноил)-L-гомосеринлактона) и C12-оксо-АГЛ (N-(оксододеканоил)-L-гомосеринлактона), соответственно. Четвертая тест-система была представлена Chromobacterium violaceum NCTC 13274, особенностью которого являлась инсерция транспозона Tn5 в ген cviI, ответственного за синтез C6-АГЛ (N-гексаноил-L-гомосеринлактона), с сохранением функционально активного гена cviR и кодируемого им рецепторного белка, ответственного за восприятие данного автоиндуктора [17 - McClean K.H., et al. Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acyl homoserine lactones // Microbiology, 1997, V. 143, Р. 3703-3711]. Вследствие подобной генетической организации данный штамм в присутствии экзогенно вносимого C6-АГЛ образовывал доступный для оптической регистрации (575 нм) сине-фиолетовый пигмент виолацеин.
Возможность применения соединений 1а-б для ингибирования перечисленных систем «кворум сенсинга» доказывалась путем внесения серий их двукратных разведений в жидкие питательные среды, содержащие бактериальный биотест и соответствующий ему автоиндуктор (АГЛ). Характеристикой ингибирующего эффекта служили выраженные в мМ величины EC50 - концентрации исследованных соединений общей формулы 1, вызывающие подавление биолюминесценции или нарушение образования пигмента виолацеина на 50% от максимально возможного выраженного эффекта, рассчитанного относительно соответствующих контролей: 0% - в отсутствие АГЛ; 100% - в присутствии только АГЛ. Результаты анализа зависимостей «доза-эффект», иллюстрирующие ингибирующий эффект соединений 1а-б в отношении различных вариантов системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа у бактерий, отображены на Фиг. 1, а в обобщенном виде приведены в таблице 1, содержащей сведения о достигаемых ими значениях EC50.
Из приведенных значений видно, что кумарин (1а) проявляет выраженное ингибирующее воздействие на три из четырех исследованных систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа, характеризуемое величинами EC50 от 1,0 до 2,5 мМ, будучи менее активным в исследуемом диапазоне исследуемых концентраций данного соединения в отношении биотеста на основе Chromobacterium violaceum NCTC 13274. В свою очередь скополетин (1б), напротив, оказывался наиболее активным в системе «кворум сенсинга» с автоиндуктором C6-АГЛ и соответствующим ему рецепторным белком CviR (EC50=3,0 мМ), в то время как его ингибирующий эффект в отношении трех других систем был слабее и не достигал величины EC50 в диапазоне концентраций данного соединения до 4,0 мМ включительно.
Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность подавления систем «кворум сенсинга» фитопатогенных и зоопатогенных бактерий. При этом различный эффект в отношении определенных комбинаций «АГЛ : LuxR-подобный рецепторный белок» создает дополнительную возможность выбора соединения общей формулы 1 для ингибирования конкретного варианта системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа, имеющейся у целевого микроорганизма.
Пример 2. Усиление анти-кворум активности кумарина при его совместном использовании с антибиотиками из группы аминогликозидов.
В отношении систем «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа, ингибирование которых с использованием кумаринов оказывается недостаточно эффективным, подобный результат может быть достигнут при их совместном применении с антибиотиками из группы аминогликозидов, например канамицином, гентамицином или амикацином. При этом обоснование эффективности подобной композиции заключается в аддитивном эффекте антибиотика и кумарина на систему «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа, где первый нарушает синтез АГЛ, а второй блокирует его восприятие соответствующим LuxR-подобным рецепторным белком.
Иллюстрацией данного положения является эксперимент по совместному воздействию кумарина с канамицином, гентамицином и амикацином на систему «кворум сенсинга» Chromobacterium violaceum ATCC 31532, обладающего функционально активным геном cviI, ответственным за синтез собственного автоиндуктора C6-АГЛ, а также геном cviR, кодирующим воспринимающий его рецепторный белок [18 - Blosser R.S., Gray K.M. Extraction of violacein from Chromobacterium violaceum provides a new quantitative bioassay for N-acylhomoserine lactone autoinducers // J. Microbiol. Methods. 2000, V. 40, Р. 47-55]. Как следует из Примера 1, данный вариант системы «кворум сенсинга» LuxI/LuxR типа оказывается относительно устойчивым к кумарину, что определило задачу усиления его ингибирующего эффекта.
При проведении подобного исследования серии двукратных разведений кумарина и антибиотика вносились в перпендикулярных друг другу направлениях в ячейки 96-луночного планшета, как показано на Фиг. 2, так что в каждой из них формировалось индивидуальное соотношение «кумарин : антибиотик». Контрольными пробами являлись ряды разведений, содержащие только кумарин (ряд К1) или только антибиотик (ряд К2). Далее ячейки заполнялись жидкой питательной средой, содержащей Chromobacterium violaceum ATCC 31532 и инкубировались при +28°C в течение 24-48 часов для проявления роста бактериальной культуры с развитием эффекта «кворум сенсинга», оцениваемого по образованию экстрагируемого из бактериальной биомассы сине-фиолетового пигмента виолацеина.
Характеристикой эффекта служили выраженные в мМ или мкг/мл величины минимальных ингибирующих концентраций (МИК) кумарина и антибиотика, вызывающие полное подавление роста бактериальной культуры, а также EC50 - концентрации исследованных соединений, вызывающие подавление образования пигмента виолацеина на 50% от максимально возможного выраженного эффекта в контроле (в отсутствие обоих воздействующих соединений - ячейка К3).
Пример совместного использования кумарина и амикацина иллюстрируется Фиг. 2, а обобщенные данные об эффективности ингибирующего воздействия кумарина и антибиотиков из группы аминогликозидов на систему «кворум сенсинга» C.violaceum ATCC 31532, оцененного концентрациями кумарина (EC50, мМ), ведущими к 50% подавлению образования пигмента виолацеина при различных концентрациях антибиотика, приведены в таблице 2.
Кумарин проявлял собственную антибактериальную активность, характеризуемую МИК=12,5 мМ, а его субингибиторные концентрации подавляли кворум-зависимое образование пигмента виолацеина с EC50=9,0 мМ. В свою очередь собственные МИК антибиотиков характеризовались величинами 25 мкг/мл (канамицин), 12,5 мкг/мл (гентамицин) и 50 мкг/мл (амикацин), а их анти-кворум активность характеризовалась величинами EC50, равными 9,4; 2,3 и 10,4 мкг/мл соответственно.
В присутствии кумарина МИК антибиотиков снижалась двукратно (до 12,5; 6,25 и 25 мкг/мл, соответственно), что позволяло говорить об аддитивном характере действия использованных соединений на рост Chromobacterium violaceum ATCC 31532. На этом фоне еще более выраженный эффект подобной композиции был зарегистрирован в отношении кворум-зависимого образования пигмента виолацеина: крайние субингибиторные концентрации антибиотиков обеспечивали полное подавление «кворум сенсинга», а при их последующем уменьшении концентрации кумарина, требуемые для его ингибирования, существенно снижались. Так, в присутствии амикацина в диапазоне концентраций 0,2-6,25 мкг/мл концентрация кумарина, необходимая для 50% подавления продукции виолацеина, уменьшалась от 8,0 до 3,1 мМ, во всем исследованном диапазоне не достигая контрольных значений (собственный эффект кумарина в отсутствие антибиотика).
Положительным результатом подобного использования заявляемого изобретения является возможность взаимного усиления антибактериального и анти-кворум эффектов кумаринов и антибиотиков из группы аминогликозидов, что позволяет снизить дозу и объемы применения антибиотика с сохранением выраженного и стабильного эффекта в отношении антибиотикорезистентных форм бактериальных патогенов растений, животных и человека.