ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИКАНТОВ
TEST SYSTEM FOR IMMUNOENZYMOMETRIC DETERMINATION OF TOXICANTS

Изобретение относится к аналитической химии и может использоваться при мониторинге загрязнений окружающей среды и контроле качества пищевых продуктов.
В современной практике для качественного определения токсикантов различного происхождения широко применяются различные тест-методы анализа.
Наиболее распространенными форматами тест-методов являются иммунохроматографические стрипы (С.Paepens, S.De Saeger, L.Sibanda, I.Bama-Vetro, I.Leglise, F.Van Hove, C.Van Peteghem. A flow-through enzyme immunoassay for the screening of fumonisins in maize Analytica Chimica Acta 523 (2004) 229-235; A.Y.Kolosova, S.De Saeger, L.Sibanda, R.Verheijen, C.Van Peteghem. Development of a colloidal gold-based lateral-flow immunoassay for the rapid simultaneous detection of zearalenone and deoxynivalenol Anal Bioanal Chem (2007) 389:2103-2107) и иммунофильтрационные тесты (D.Saha, D.Acharya, D.Roy, D.Shrestha, Т.К.Dhar. Simultaneous enzyme immunoassay for the screening of aflatoxin Bl and ochratoxin A in chili samples Analytica Chimica Acta 584 (2007) 343-349). Оба типа тестов основаны на использовании мембран, содержащих тестовую зону, окраска которой зависит от концентрации определяемого вещества в образце, и контрольную зону, окраска которой появляется всегда. Контрольная зона служит для двух целей:
1. На основе сравнения интенсивности окраски тестовой и контрольной полос можно сделать вывод о концентрации определяемого вещества.
2. Развитие окраски контрольной зоны указывает на валидность (работоспособность) теста.
Недостатком данных тест-методов является не всегда достаточная чувствительность и необходимость проведения пробоподготовки при использовании интенсивно окрашенных матриц.
Известна тест-система для определения токсикантов в виде колонки с детектирующим иммунослоем, который представляет собой иммуноаффинный гель с привитыми специфическими антителами (см. патент ЕР №0893690, МПК G01N 33/543K; G01N 33/569F).
Данная система позволяет существенно повысить чувствительность определения в сравнении с мембранными тестами, однако не содержит контрольной зоны.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является тест-система для определения пирена в воде. Тест-система представляет собой колонку, на дне которой размещен иммуноаффинный гель с привитыми специфическими антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами. Исследуемую воду (природная, питьевая вода, снег) пропускают через колонку, затем вводят конъюгат с ферментной меткой. Для удаления излишков конъюгата используется стадия промывки. Затем в колонку добавляют субстрат, катализирующий развитие окраски. В случае появления окраски - результат считают отрицательным образцом, в случае отсутствия окраски - образец положительный (Goryacheva I.Yu., Beloglazova N.V., Eremin S.A., Mikhirev D.A., Niessner R., Knopp D. Gel-based immunoassay for non-instrumental detection of pyrene in water samples // Talanta 2008. Vol.75. N 2. P.517-522).
Недостатком данной системы является отсутствие контрольного слоя, что усложняет интерпретацию результатов и оценку работоспособности теста.
Задачей заявляемого изобретения является разработка иммуноферментной тест-системы определения токсикантов в продуктах питания и объектах окружающей среды.
Технический результат заключается в упрощении интерпретации результатов анализа без усложнения процедуры пробоподготовки, концентрирования и иммуноферментного определения токсикантов.
Поставленная задача достигается тем, что тест-система для иммуноферментного определения токсикантов, содержащая колонку, внутри которой размещен тестовый слой в виде иммуноаффинного геля с привитыми специфическими к токсиканту антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами, согласно решению дополнительно содержит контрольный слой в виде иммуноаффинного геля с привитыми специфическими к ферментной метке антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами.
Изобретение поясняется чертежами, на фиг.1 схематически изображена тест-система, на фиг.2 - схема проведения иммуноферментного определения токсиканта, где: 1 - колонка; 2 - пористые фильтры (фриты); 3 - иммуноаффинный гель с привитыми антителами, специфическими к токсикантам; 4 - иммуноаффинный гель с привитыми антителами, специфическими к ферментной метке; 5 - проба; 6 - конъюгат, 7 - промывочный буфер; 8 - субстрат.
Тест-система для иммуноферментного определения токсикантов содержит колонку 1, внутри которой размещен тестовый слой в виде иммуноаффинного геля 3 с привитыми специфическими к токсиканту антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами 2, и на расстоянии 1-10 мм контрольный слой в виде иммуноаффинного геля 4 с привитыми специфическими к ферментной метке антителами, зафиксированный сверху и снизу пористыми фильтрами 2.
Тест-система работает следующим образом.
Пробу 5 пропускают через колонку 1 сверху вниз, затем вводят конъюгат 6, который представляет собой токсикант или его аналог, ковалентно связанный с ферментом, играющим роль метки. Для удаления излишков конъюгата 6 используется стадия промывки, с помощью промывочного буфера 7. Затем в колонку 1 добавляют субстрат 8, развитие окраски которого катализирует фермент, и наблюдают развитие окраски. В случае появления окраски иммуноаффинного геля 3 с привитыми антителами, специфическими к токсину, результат считают отрицательным образцом, в случае отсутствия окраски - образец положительным. Окраска иммуноаффинного геля 4 с привитыми антителами, специфическими к ферментной метке, должна развиваться в любом случае. Отсутствие окраски указывает на нерабочее состояние тест-системы.
Рассмотрим пример конкретного использования предложенной тест-системы для иммуноферментного определения токсикантов на примере определения бензо[а]пирена, пирена и 2,4,6-тринитротолуола в природной и питьевой воде.
Для определения токсикантов использовали колонку емкостью 1 мл, в которую помещали детектирующий иммунослой, представляющий собой гель с привитыми специфическими к пирену (для определения бензо[а]пирена или пирена) или к 2,4,6-тринитротолуолу (для определения 2,4,6-тринитротолуола) антителами, и контрольный слой, представляющий собой гель с привитыми специфическими к ферменту антителами.
Для работы тест-системы водные образцы не требуют проведения пробоподготовки, т.к. примеси в воде остаются на поверхности верхнего пористого фильтра. Для проведения определения аликвоту (10 мл) анализируемой речной, озерной, питьевой воды, растаявшиего снега пропускали через колонку с тестовым и контрольным слоями с помощью шприца, затем пропускали раствор конъюгата бензо[а]пиренбутановой кислоты с пероксидазой хрена (для определения бензо[а]пирена) или раствор конъюгата пиренбутановой кислоты с пероксидазой хрена (для определения пирена) или раствор конъюгата 2,4,6-тринитробензойной кислоты с пероксидазой хрена (для определения 2,4,6-тринитротолуола). Конъюгат оставляли в колонке на 3-5 минут, затем удаляли промыванием колонки 5-10 мл фосфатно-солевого буфера с добавкой Твин 20. Последним шагом определения являлось добавление в колонку субстрата на основе тетраметилбензидина, после чего в течение нескольких минут наблюдалось развитие синей окраски обоих слоев (при отсутствии токсиканта в пробе). При присутствии токсиканта выше предела обнаружения, тестовый слой остается белым, развивается окраска лишь контрольного слоя. Развитие окраски фиксировали визуально.