Технологические характеристики ганглиев кальмаров как сырья для получения фермента холинэстеразы

2012

Известия ТИНРО

Том 169

УДК 664.951.014:577.15 Е.В. Михеев, Н.Н. Ковалев*

Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр, 690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ГАНГЛИЕВ КАЛЬМАРОВ КАК СЫРЬЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

Приведено обоснование использования зрительных ганглиев кальмаров для получения фермента холинэстеразы. Определены рациональные параметры водной экстракции фермента (сырье : вода — 3 : 1), которые не зависят от способа обработки сырья. В то же время временные и температурные параметры экстракции холинэстераз для мороженного и сублимированного сырья различались. Определено влияние предварительной обработки сырья органическими растворителями на экстрактивность холинэстераз. Показано, что обработка спиртами приводит к инактивации фермента. Обработка сублимированного сырья смесью органических растворителей (бутанол : гексан) приводит к удалению из ткани 32 % липидов и переходу в раствор 67 % активности фермента. Определены рациональные параметры экстракции фермента из сублимированного, обработанного смесью органических растворителей сырья. Полученные данные могут быть использованы при разработке технологии выделения фермента как биохимического реактива.

Ключевые слова: зрительные ганглии, кальмар, холинэстераза, экстракция, органические растворители.

Mikheev E.V., Kovalev N.N. Technological characteristics of squid ganglia as a raw material for cholinesterase production // Izv. TINRO. — 2012. — Vol. 169. — P. 238-245.

Possibility of the squid eye ganglia using for production of cholinesterase is substantiated. Ratio of raw material to water for the enzyme water extraction is determined as 3:1 and it does not depend on the way of processing. However, temporal and temperature parameters of the water extraction are different for processing of frozen and fresh raw material. Influence on the extraction of the raw material preliminary processing by organic solvents is determined: the processing by alcohol inactivates the enzyme but after processing of dried raw material by a mixture of organic solvents (butanol and hexane) 32 % of lipids were removed from the tissue and 67 % of enzyme activity was transferred into solution. Rational parameters of the enzyme extraction from dried raw material by the mixture of the organic solvents are determined, as well. These results can be used for development of technology for extraction of the enzyme as a biochemical reagent.

Key words: eye ganglia, squid, cholinesterase, extraction, organic solvents.

* Михеев Евгений Валерьевич, младший научный сотрудник, e-mail: mikheev@ tinro.ru; Ковалев Николай Николаевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией, e-mail: kovalevnn@tinro.ru.

Введение

Исследование ферментов как биологических катализаторов представляет собой одно из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии и биохимии. В течение многих лет разрабатываются различные аспекты взаимосвязи структуры и активности, а также направления их практического применения в биотехнологии продуктов питания и БАД (Пивненко и др., 1997; Неклюдов и др., 2000; Калиниченко и др., 2008). Однако проблема выделения и очистки ферментов не теряет своей актуальности, так как развитие современных биотехнологических приемов позволяет упростить и удешевить многоступенчатую и высокозатратную процедуру. Все это предъявляет определенные требования к разработке технологических приемов выделения ферментов, масштабированию процессов, изучению специфических свойств ферментов.

Исследования последних лет убедительно показали наличие высокой холи-нэстеразной активности в нервной ткани различных видов гидробионтов (Козловская и др., 1990; Jebali et al., 2006; Podolska, Napierska, 2006; Михеев, Ковалев, 2008). Интерес к холинэстеразам (ХЭ) объясняется той ролью, которую играет фермент нервной ткани в быстропротекающих процессах синаптической передачи. Известно использование ХЭ как биохимического реактива при оценке эффективности инсектицидов и высокотоксичных фосфорорганических соединений, а также лекарственных средств (Садыков и др., 1976; Бресткин и др., 1997).

Ранее фермент ацетилхолинэстеразы из эритроцитов донорской крови человека как биохимический реактив производился в России на нескольких предприятиях Министерства здравоохранения. В настоящее время препарат не производится. Ферменты из органов и тканей гидробионтов в промышленных масштабах также не производятся, не являются исключением и ХЭ. Повышенные требования к контролю безопасности производств и охраны окружающей среды привели к разработке ряда ферментных тест-систем с использованием ХЭ для оценки уровня загрязнений, в том числе промышленными и бытовыми ядами (Стойкова и др., 2000; Beljakova et al., 2001; Порус и др., 2008). Основываясь на знании свойств ферментов нервной ткани, можно предложить обоснование технологии переработки нервной ткани кальмаров с целью получения препарата ХЭ.

Целью настоящей работы явилось обоснование использования в качестве источника ХЭ нервных ганглиев кальмаров различных способов заготовки и параметров его экстракции.

Материалы и методы

В качестве источников фермента использовали сублимированные и мороженые ганглии тихоокеанского кальмара Todarodes pacificus и кальмара Бартрама Ommastrephes bartramii. Удельную ферментативную активность холинэстеразы в центрифугатах (800 g) водных гомогенатов (3 мг/мл) ганглиев определяли методом Элмана (Ellman et al., 1961) с использованием в качестве субстрата ацетилтиохолина (АТХ) (ICN, США).

Результаты и их обсуждение

Среди разнообразных способов и приемов хранения сырья наиболее часто используемыми являются морозильное хранение и сублимирование. Ранее было показано, что рациональным срок хранения для мороженых ганглиев кальмаров — 9 мес, а для сублимированных — 6 мес (Михеев, Ковалев, 2008).

Одной из основных задач технологии выделения ферментов является определение параметров их водной экстракции.

Полученные данные (на примере тихоокеанского кальмара) показывают (рис. 1), что для сырья различных способов заготовки рациональное соотношение сырье : экстрагент составляло 3 : 1.

1

2

а

<

1 : 1

2 : 1

3 : 1

4 : 1 Гидромодуль

5 : 1

10 : 1

15 : 1

Рис. 1. Активность холинэстеразы в экстракте ганглиев тихоокеанского кальмара при различных гидромодулях: 1 — ганглии мороженые; 2 — ганглии сублимированные; рН — 6,8

Fig. 1. Cholinesterase activity

Дальнейшее увеличение концентрации сырья в экстрагируемой смеси не приводило к увеличению перехода ХЭ в раствор в случае мороженых ганглиев и приводило к незначительному понижению в случае сублимированных ганглиев.

Таким образом, рациональным для эффективной экстракции ХЭ можно признать соотношение сырье : вода 3 : 1.

На примере мороженых и сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара проведено исследование влияния температуры на выход ХЭ в экстракт (рис. 2, 3). За рациональную температуру экстракции принимали значение показателя, при котором активность ХЭ в экстракте максимальна и варьирует в пределах 3 % от максимальной.

0,8

0,4

-5 0,2 412

S

й 7 6

S 5 Й 4

£ з

I 2 =

н 1 0

17

22

27

t, V

32

37

42

10

15

20

25 30

t, 0C

35

40

45

Рис. 2. Влияние температуры на экстрактивность холинэстеразы. Мороженые ганглии тихоокеанского кальмара, гидромодуль — 3 : 1; рН — 6,8

Fig. 2. Influence of temperature on extract content of cholinesterase from frozen pacific squid ganglia under water duty 3 : 1, pH 6.8

Рис. 3. Влияние температуры на экстрактивность холинэстеразы. Сублимированные ганглии тихоокеанского кальмара, гидромодуль — 3 : 1, рН — 6,8

Наибольшая активность фермента в экстракте из мороженых ганглиев наблюдалась в интервале температур от 18 до 25 0С (рис. 2). В то же время наибольшая активность ХЭ в экстракте при работе с сублимированными ганглиями отмечалась в интервале температур 18-22 0С (рис. 3).

Проведенные нами исследования показывают, что экстракция из мороженых ганглиев рассмотренных видов кальмаров имеет практически линейную зависимость от времени. Максимальная активность фермента в растворе для мороженой нервной ткани тихоокеанского кальмара и кальмара Бартрама отмечалась после 6 ч экстракции. Дальнейшая экстракция не приводила к увеличению выхода фермента в раствор (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость экстрактивности холинэстеразы из мороженых ганглиев кальмаров. Гидромодуль 3 : 1, t — 20 ± 2 0С, pH — 6,8

Fig. 4. Extract content of cholinesterase from frozen squid ganglia under water duty 3 : 1, temperature 20 ± 2 oC, pH 6.8

Важно отметить, что процесс сублимации сырья оказал влияние на временные параметры экстракции фермента (рис. 5).

Рис. 5. Зависимость экстрактивности холинэстеразы из сублимированных ганглиев кальмаров. Гидромодуль 3 : 1, t — 20 ± 2 0С, рН — 6,8

Fig. 5. Extract content of cholinesterase from dry squid ganglia under water duty 3 : 1, temperature 20 ± 2 oC, pH — 6.8

Так, при работе с сублимированными ганглиями исследуемых видов кальмаров максимальная степень экстракции ХЭ у тихоокеанского кальмара наблюдалась после 12 ч и при увеличении времени экстракции оставалась неизменной. У кальмара Бартрама максимальная степень экстракции наблюдалась после 15 ч. Дальнейшая экстракция не приводила к увеличению выхода ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров (рис. 5). По-видимому, это связано с гидратацией сырья и переходом в раствор всего водорастворимого и части мембраносвязанного фермента.

Из литературных данных (Haas et al., 1986), известно, что ХЭ существует в виде растворимой и мембраносвязанной форм, причем до 50 % активности фер-

мента связано с мембраной. Следовательно, эффективное извлечение фермента невозможно без разрушения липидного слоя мембран. Один из способов разрушения липидного матрикса мембран — обработка сырья органическими растворителями.

Ранее (Бресткин, Певзнер 1966; Бресткин и др., 1969; 2огап еі аі., 2005) было показано влияние спиртов на реакционную способность и экстрактивность ХЭ эритроцитов крови лошади, крупного рогатого скота и человека. Также было показано, что наибольший эффект на разрушение мембран оказывает смесь органических растворителей (в соотношении спирт : гексан 1,5 : 1,0, соотношение смесь растворителей : сырье 10 : 1), что сопровождается повышением экстрактивности фермента (Эпштейн, 1974).

На примере сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара было проведено исследование влияния спиртов и их смеси с гексаном на реакционную способность и увеличение активности ХЭ в экстракте. Данные, полученные в ходе исследований, представлены в таблице.

Влияние органических растворителей на активность XЭ сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара

Organic solvents influence on activity of cholinesterase from dried pacific squid ganglia

Растворитель Активность XЭ в гомогенате, % от активности в контроле Активность XЭ в центрифугате после водной экстракции, % от активности в контроле

Контроль* 100 Б0,0

Этанол 80,0 36,0

Этанол+гексан 97,7 Б4,0

Пропиловый 1,6 -

Пропиловый+гексан 97,0 Б3,0

Бутиловый 16,7 6,4

Бутиловый+гексан 100 67,0

Пентиловый 4,3 -

Пентиловый+гексан 82,0 36,Б

Гегсиловый 73,0 12,0

Гексиловый+гексан 81,0 4Б,Б

Гептиловый 93,0 46,0

Гептиловый+гексан 92,0 47,0

Октиловый 80,0 48,0

Октиловый+гексан 99,3 Б4,0

^ниловый 80,0 48,0

Hониловый+гексан 96,3 Б3,0

Дециловый 80,0 4Б,0

Дециловый+гексан 98,Б 41,0

Примечание. Гидромодуль 3 : 1; і — 20 ± 2 0С; рН — 6,8; соотношение спирт : гексан 1,5 : 1,0; соотношение смесь растворителей : сырье 10 : 1; соотношение спирт : сырье 6 : 1; время экстракции 12 ч; центрифугирование проводили при 3500 об/мин.

* За 100 % принята активность в контроле — водном гомогенате сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара.

Установлено, что обработка спиртами (пропиловым, бутиловым и пентило-вым) приводила к практически полной потере активности фермента в гомогенате. Обработка этанолом приводила к потере 20 % активности ХЭ в гомогенате и переходу в раствор 36 % холинэстеразной активности. Обработка спиртами от гептилового по дециловый приводила к потере активности в гомогенате на 7,00,7 %, а гексиловым — на 27,0 % (см. таблицу).

Предварительная обработка спиртами не приводила к увеличению активности ХЭ в центрифугате по сравнению с контролем.

Снижение активности в центрифугате фермента может быть связано с тем, что при добавлении в водный раствор ХЭ органического растворителя, смеши-

вающегося с водой, последний будет “растворять” в себе неполярные радикалы гидрофобных аминокислот, нарушая или ослабляя тем самым их взаимодействие между собой. Так как гидрофобные углеводородные радикалы играют важную роль в организации и поддержании пространственной структуры белка, “растворение” гидрофобных участков под действием органического растворителя неизбежно должно привести к изменению общей конформации фермента, которое не может не сказаться на его реакционной способности в отношении субстратов и ингибиторов (Бресткин и др., 1969).

Ранее на примере стромы эритроцитов человека было показано, что соотношение растворителей спирт : гексан 1,5 : 1,0 способствует максимальному выходу ацетилхолинэстеразы эритроцитов крови человека в раствор (Эпштейн, 1974). Данное соотношение органических растворителей нами было принято для всех исследуемых спиртов. Исследование показало, что смеси этилового, пропилово-го, октилового и нонилового спиртов с гексаном приводили к незначительному увеличению активности ХЭ в центрифугате по сравнению с водной экстракцией (см. таблицу). При этом обработка смесью бутанол : гексан позволяла перевести в раствор 67 % активности фермента.

Исследования по обработке мороженых ганглиев кальмара смесью органических растворителей показали, что данный технологический подход не дает положительных результатов вследствие образования стойкой эмульсии и, как следствие, невозможности получения сухого полуфабриката.

Установлено, что после обработки сублимированных ганглиев смесью органических растворителей (бутанол : гексан 1,5 : 1,0) происходит удаление из ткани 32 % липидов. Так, содержание липидов в сублимированных ганглиях до обработки составляло 2,67 %, а после — 1,78 % массы ткани.

Работы по определению рациональных сроков хранения полуфабриката сублимированного сырья, обработанного смесью органических растворителей бута-нол — гексан, показали, что хранение двух видов сырья при температуре минус 18 0С и плюс 2-5 0С не приводит к значительному снижению удельной активности. Хранение при температуре 20 0С в течение месяца приводило к потере удельной активности на 53 % в сырье, обработанном смесью органических растворителей (Михеев, Ковалев, 2008).

Для полуфабриката сублимированных ганглиев, обработанных смесью органических растворителей бутанол : гексан (1,5 : 1,0), был определен гидромодуль экстракции ХЭ (рис. 6).

5

£

С

5

S£

S

JO

н

о

о

X

m

s

н

S£

С

Гидромодуль

Рис. 6. Зависимость активности холинэстеразы в экстракте из сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара, обработанных смесью бутанол : гексан 1,5 : 1,0 от гидромодуля

Fig. 6. Influence of water duty on activity of cholinesterase in extract from dried pacific squid ganglia processed by the mixture buthanol : hexane 1.5 : 1.0 (solvents : raw material 10 : 1) under temperature 20 ± 2 oC, pH 6.8, time of extraction 12 h

Установлено, что максимальная активность ХЭ в экстракте наблюдалась при соотношении сырье : вода 3 : 1. Также следует отметить, что в пределах соотношений сырье : вода от 2 : 1 до 15 : 1 активность ХЭ в экстракте существенно не изменялась.

Заключение

На примере сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара хорошо видно влияние обработки спиртами на активность ХЭ в экстракте. Обработка смесью растворителей бутанол : гексан в соотношении 1,5 : 1,0 позволяет перевести в раствор 67 % общей активности в сырье, а также приводит к снижению количества липидов в сырье на 32 %. В результате проведенных исследований определен гидромодуль экстракции ХЭ из сублимированных ганглиев, обработанных смесью органических растворителей (соотношение сырье : вода 3 : 1). При этом активность ХЭ в экстракте при соотношении сырье : вода от 2 : 1 до 15 : 1 различалась незначительно, что необходимо учитывать в дальнейшем при разработке технологии получения препарата ХЭ. Исследования по обработке мороженых ганглиев кальмара смесью органических растворителей показали, что обработка мороженого сырья не давала положительных результатов вследствие образования стойкой эмульсии и, как следствие, невозможности получения сухого полуфабриката.

В ходе работы по определению рациональных параметров экстракции на примере тихоокеанского кальмара выяснилось, что наибольшая активность ХЭ в экстракте в случае мороженых ганглиев наблюдалась в интервале температур 18-25 0С, а в случае сублимированных ганглиев — 18-22 0С. Максимальная активность ХЭ в экстракте отмечена при гидромодуле 3 : 1 в случае как мороженых, так и сублимированных ганглиев. Максимальная активность ХЭ в экстракте из мороженых ганглиев тихоокеанского кальмара и кальмара Бартрама наблюдалась после 6 ч. Максимальное время экстракции ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров составило 12 ч для тихоокеанского кальмара и 15 ч для кальмара Бартрама. Полученные данные могут быть использованы при разработке технологии выделения холинэстеразы из нервных ганглиев кальмаров.

Список литературы

Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.Н. и др. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов : монография. — Владивосток : ТИНРО-центр, 1997. — 466 с.

Бресткин А.П., Майзель Е.Б., Розенгарт Е.В. Влияние некоторых органических растворителей на реакционную способность холинэстеразы // Биохимия. — 1969. — Т. 34, вып. 5. — С. 1062-1067.

Бресткин А.П., Певзнер Д.Л. Октаноловый способ получения и каталитические свойства ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови теплокровных животных // Биохимия. — 1966. — Т. 31, № 6. — С. 1174-1180.

Калиниченко Т.П., Ярочкин А.П., Тимчишина Г.Н., Кузнецов Ю.Н. Возможность ферментирования сырья при производстве майонеза из молок минтая // Изв. ТИНРО. — 2008. — Т. 155. — С. 355-360.

Козловская В.И., Мензикова О.В., Чуйко Г.М., Майер Ф.Л. Холинэстеразы водных животных // Физиология, биохимия и токсикология пресноводных животных. — Л., 1990. — С. 42-66.

Михеев Е.В., Ковалев Н.Н. Обоснование биотехнологии производства ферментного препарата из зрительных ганглиев кальмаров // Мат-лы науч. конф. “Современное состояние водных биоресурсов”, посвящ. 70-летию С.М. Коновалова. — Владивосток : ТИНРО-центр, 2008. — С. 904-907.

Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов // Прикл. биохимия и микробиология. — 2000. — Т. 36, № 4. — С. 371-379.

Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Получение и характеристика белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Изв. ТИНРО. — 1997. — Т. 120. — С. 23-31.

Порус М.В., Дубачева Г.В., Сиголаева Л.В. и др. Определение активностей холинэстераз в смеси с использованием двухэлектродной сенсорной системы // Сенсор. системы. — 2008. — Т. 22, № 1. — С. 86-93.

Садыков А.С., Розенгарт Е.В., Абдувахабов А.А., Асланов Х.А. Холинэстера-зы. Активный центр и механизм действия : монография. — Ташкент : ФАН, 1976. — 204 с.

Стойкова Е.Е., Белякова С.В., Будников Г.К., Евтюгин Г.А. Ферментные тест-системы для определения остаточных количеств фосфорорганических пестицидов в растительном материале // Всерос. конф. “Химический анализ веществ и материалов”. — М., 2000. — С. 128.

Эпштейн Л.М. Получение и свойства холинэстеразы : дис. ... канд. биол. наук. — Л., 1974. — 132 с.

Beljakova S.V., Stoikova E.E., Evtugyn G.A., Latypova V.Z. Enzymatic test kit for the rapid and sensitive detection of insecticides in the corn // Environ. Radioecol. Appl. Ecol. — 2001. — Vol. 7, № 2. — P. 35-42.

Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.Jr., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. — 1961. — Vol. 7, № 1. — Р. 88-95.

Haas R., Braudt P.T., Knigt J., Rosenbery T.L. Identification of amino components in a glicolipid membrane-binding domain at the C-terminus of human erythrocyte acetylcholinesterase // Biochemistry. — 1986. — Vol. 25, № 11. — P. 3098-3105.

Jebali J., Bani M., Guerbej H. et al. Effects of malathion and cadmium on acetylcholinesterase activity and metallothionein levels in the fish Seriola dumerilli // Fish. Physiol. Biochem. — 2006. — Vol. 32. — P. 93-98.

Podolska M., Napierska D. Acetylcholinesterase activity in host (herring Clupea harengus) and parasites (Anisakis simplex larvae) from the southern Baltic // J. of Marine Science. — 2006. — Vol. 63. — P. 161-168.

Zoran A., Matjaz Z., Milan S. Inhibition of erythrocyte acetylcholinesterase by n-butanol at high concentration // Arch. Biochem. and Biophys. — 2005. — Vol. 437, № 1. — P. 78-84.

Поступила в редакцию 2.04.12 г.