ШИПУЧАЯ КОМПОЗИЦИЯ В ТВЕРДОЙ ФОРМЕ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ВАГИНАЛЬНЫХ ПРИЛОЖЕНИЯХ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВАГИНАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ
EFFERVESCENT COMPOSITION IN SOLID FORM FOR USE IN VAGINAL APPLICATIONS FOR TREATING VAGINAL INFECTIONS

Настоящее изобретение относится к шипучей композиции в твердой форме для применения в вагинальных приложениях для лечения вагинальных инфекций.
Хорошо известно, что состав кишечной и мочеполовой микрофлоры является критическим пунктом для здоровья и благополучия индивидуума. Вагинальная экосистема состоит из эпителиальных клеток, которые выстилают влагалище и матку, железистых клеток, которые осуществляют секрецию в полость органа, и сложной бактериальной флоры, представленной разными видами микроорганизмов.
Данные микроорганизмы обладают способностью ферментировать гликоген, образующийся в результате лизиса парабазальных клеток эвтрофной вагинальной слизистой, с последующей продукцией молочной кислоты, конечным эффектом которой является установление и поддержание кислой вагинальной среды (со значениями pH 4-4,5 при физиологических условиях).
+
H, происходящий из молочной кислоты, способствует образованию пероксида водорода. Данная молекула является токсичной для большого числа видов бактерий, у которых нет фермента каталазы. На уровне вагинальных секретов легко достигаются концентрации 0,75-5 мкг/мл и они являются более чем достаточными для выражения токсического эффекта.
-
-
Объединенное действие пероксида водорода, пероксидазы матки (продуцируемой шейкой матки и эндометрием) и ионов CI и I также ограничивает рост бактерий путем непосредственного активирования полиморфонуклеаров, которые оказывают бактерицидное действие в эпителиальных межклеточных пространствах. У женщин в вагинальной экосистеме часто возникает дисбаланс из-за множества экзогенных и эндогенных факторов, таких как прием антибиотиков, состояние стресса, гормональные модуляции, связанные с беременностью и менструальным циклом или приемом высоких концентраций эстрогена. Изменение баланса вагинальной экосистемы приводит к преобладанию так называемых «оппортунистических» микроорганизмов (например, Candida albicans и glabrata) и/или патогенных микроорганизмов (например, Neisseria gonorrheae и Trichomonas vaginalis), которые могут приводить к кандидозу, вагиниту или формам вагиноза.
Эпидемиологические данные показывают, что в настоящее время вагинальные инфекции поражают более одного миллиарда женщин во всем мире каждый год с серьезными последствиями с социально-экономической точки зрения.
Обычно применяемой терапией является терапия антибиотиками и/или фунгицидами, которая обычно дает хорошие результаты в краткосрочной перспективе, но демонстрирует неспособность предупреждать повторные инфекции из-за все возрастающей устойчивости патогенов. Кроме того, не все субъекты, которых необходимо лечить, способны осуществлять и переносить терапию антибиотиками или противогрибковыми средствами.
Известно применение микроорганизмов, способных восстанавливать правильный состав вагинальной микрофлоры. Однако способ доставки микроорганизмов в вагинальную среду представляет собой весьма важный фактор. Например, известно, что получение мягких желатиновые капсул, обычно известных как мягкие гели, влечет за собой суспендирование пробиотического компонента в масляной матрице, которая после нанесения продукта имеет тенденцию к созданию физического барьера, способного замедлять или почти полностью ингибировать способность указанного пробиотического компонента заселять слизистую влагалища. Кроме того, масляная матрица могла бы оказывать токсический эффект на микроорганизмы до такой степени, чтобы значительно уменьшать их число и жизнеспособность.
Например, для растворения капсул может потребоваться относительно длительное время и в любом случае они не гарантируют адекватного распределения активного ингредиента по всей среде влагалища.
Например, применение гидрофильных суспензий или гидрогелей предполагает способ нанесения, который не является ни легким, ни слишком удобным. На самом деле субъекты должны оставаться в лежачем положении по меньшей мере в течение 20-30 минут после их нанесения для того, чтобы предотвратить вытекание продукта.
Наконец, традиционные вагинальные таблетки создают проблему высокого процента гибели микроорганизмов во время их производства и, кроме того, они не способны обеспечивать адекватное распределение микроорганизмов в вагинальной среде.
Таким образом, сохраняется потребность в том, чтобы иметь композицию, способную доставлять пробиотические бактерии в вагинальную среду и обеспечивать ее полное распространение/распределение.
Кроме того, сохраняется потребность в том, чтобы иметь фармацевтическую форму, которую можно легко вводить и которая является практичной для применения.
В частности, сохраняется потребность в том, чтобы иметь композицию, которая представляет собой действенную альтернативу терапии антибиотиками и/или противогрибковыми средствами и в то же самое время представляет собой усовершенствование по сравнению с известными формами введения.
Заявитель неожиданно обнаружил, что пробиотический препарат в форме твердой композиции, соответствующим образом приготовленной, способен решать проблемы, сохраняющиеся в предшествующем уровне техники.
Объектом настоящего изобретения является шипучая композиция в твердой форме, как изложено в прилагающемся независимом пункте формулы изобретения.
Другие предпочтительные воплощения настоящего изобретения изложены в прилагающихся зависимых пунктах формулы изобретения.
В Таблице 1 представлены протестированные заявителем бактериальные штаммы, которые образуют объект настоящего изобретения.
В Таблице 2 представлен пример композиции согласно изобретению.
В Таблице 3 представлены данные по гибели пробиотических бактерий при разном прикладываемом давлении и стабильности таблеток (выраженной в виде периода полужизни бактериальной нагрузки) после 2 лет их хранения при 25°C.
В Таблице 4 представлена композиция, которая не соответствует настоящему изобретению.
В Таблице 5 представлена композиция в форме таблетки, которая не соответствует настоящему изобретению.
Заявитель осуществил длительное интенсивное экспериментальное исследование для определения оптимального качественного и количественного состава для получения композиции по настоящему изобретению, а также рабочих условий для ее получения.
Композиция по настоящему изобретению представляет собой шипучую композицию. Шипучесть обусловлена образованием диоксида углерода, которое происходит при приведении в контакт кислотно-основной системы, содержащей органическую кислоту и соль карбонатного и/или бикарбонатного аниона, с водой/влагой, присутствующей в вагинальной полости. Кислотно-основная система способна поддерживать внутривагинальный pH на стабильном уровне в пределах интервала, составляющего от 3 до 5,5, предпочтительно от 4 до 5. Внутривагинальный pH преимущественно составляет от 4,2 до 4,5.
Композиция по настоящему изобретению представляет собой шипучую композицию в твердой форме. В предпочтительном воплощении органическая кислота находится в твердой форме, предпочтительно порошка или гранул, и соль карбонатного и/или бикарбонатного аниона находится в твердой форме, предпочтительно порошка или гранул.
В предпочтительном воплощении шипучая композиция в твердой форме находится в форме таблетки, овули, пастилки или гранул.
Органическая кислота выбрана из группы, содержащей или, в качестве альтернативы, включающей лимонную кислоту, яблочную кислоту, винную кислоту, фумаровую кислоту, молочную кислоту и их смеси. В предпочтительном воплощении органическая кислота представляет собой лимонную кислоту.
Заявитель обнаружил, что применение адипиновой и/или аскорбиновой кислоты в качестве органической кислоты, присутствующей в вышеупомянутой кислотно-основной системе, провоцирует токсический эффект у микроорганизмов, приводящий к их гибели уже во время получения композиции в твердой форме, например в виде порошка или гранул. В случае получения таблетки указанная гибель происходит после смешивания компонентов с получением композиции в твердой форме, например в виде порошка или гранул, но перед прессованием. По этой причине композиция по настоящему изобретению не содержит адипиновую кислоту и/или аскорбиновую кислоту.
Соль карбонатного и/или бикарбонатного аниона выбрана из группы, включающей или, в качестве альтернативы, содержащей: карбонат натрия, карбонат калия, карбонат кальция, карбонат магния, натрия глицина карбонат, бикарбонат натрия, бикарбонат калия, бикарбонат кальция, бикарбонат магния, лактат натрия, лактат калия, карбонат лактат и их смеси. Предпочтительно указанная соль выбрана из группы, включающей или, в качестве альтернативы, содержащей соль бикарбонатного аниона. В предпочтительном воплощении соль представляет собой бикарбонат натрия.
В предпочтительном воплощении количество соли карбонатного или бикарбонатного аниона составляет от 1 до 15% по массе относительно общей массы композиции. Предпочтительно оно составляет от 3 до 13% по массе относительно общей массы композиции; еще более предпочтительно оно составляет от 4 до 12% по массе относительно общей массы композиции. Преимущественно оно составляет от 5 до 10% по массе относительно общей массы композиции.
В предпочтительном воплощении количество бикарбоната натрия составляет от 1 до 15% по массе относительно общей массы композиции. Предпочтительно оно составляет от 3 до 13% по массе относительно общей массы композиции; еще более предпочтительно оно составляет от 5 до 10% по массе относительно общей массы композиции. Преимущественно оно составляет от 5 до 10% по массе относительно общей массы композиции.
В предпочтительном воплощении кислотно-основная система содержит лимонную кислоту и бикарбонат натрия в таком количестве по массе, как описано выше.
Заявитель обнаружил, что, когда соль карбонатного или бикарбонатного аниона, например бикарбонат натрия, составляет более чем 15% по массе относительно общей массы композиции, проявляется токсический эффект против микроорганизмов из-за осмотического эффекта.
Количество органической кислоты, используемой в кислотно-основной системе, рассчитывают сразу после определения количества соли карбонатного или бикарбонатного аниона, использованного согласно вышеописанным концентрациям. Использованное количество органической кислоты является стехиометрическим и представляет собой функцию использованной соли и служит единственно цели образования диоксида углерода. В присутствии указанной соли органическая кислота способна к развитию шипучести из-за образования диоксида углерода после гидратации внутри вагинальной полости.
Шипучая таблетка, приготовленная в виде препарата соответствующим образом, способна доставлять большую популяцию молочнокислых бактерий для быстрого заселения всего эпителия вагинальной слизистой. Благодаря стабилизированной шипучей системе с контролем pH молочнокислые бактерии доставляются в вагинальную полость в хорошем физиологическом состоянии, которое дает им возможность расти и размножаться.
Преимущественно композиция по настоящему изобретению в форме шипучей таблетки способна обеспечивать оптимальное распределение бактерий по вагинальной слизистой. Кроме того, указанная композиция способна обеспечивать и поддерживать анаэробную или микроаэрофильную среду внутри вагинальной полости благодаря образованию диоксида углерода.
Заявитель обнаружил, что смесь, содержащая или, в качестве альтернативы, состоящая из микрокристаллической целлюлозы : арабиногалактана, предпочтительно в соотношении по массе от 1:1 до 3:1, способна сохранять число и жизнеспособность клеток микроорганизмов, когда желательно получить таблетку из композиции в форме порошка.
В предпочтительном воплощении композиция по настоящему изобретению содержит смесь, включающую микрокристаллическую целлюлозу : арабиногалактан в соотношении от 1:1 до 3:1 по массе.
Предпочтительно используется арабиногалактан, полученный из растений. Преимущественно используется арабиногалактан, происходящий из лиственницы (например, FiberAid из линейки продуктов Larex, распространяемых Lonza Inc. США).
Заявитель подобным образом обнаружил, что применение кукурузного крахмала в качестве агрегирующего вещества в композиции по настоящему изобретению дает неудовлетворительные результаты при использовании композиции в форме порошка для получения таблеток, поскольку таблетки, полученные после прессования порошка, кэппированы (имеют отслоившуюся верхнюю или нижнюю часть).
Смесь, содержащая или, в качестве альтернативы, включающая микрокристаллическую целлюлозу : арабиногалактан в соотношении по массе от 1:1 до 3:1, с другой стороны, обеспечивает получение таблеток без возникновения эффекта кэппинга.
По этой причине таблетки, полученные из композиции по настоящему изобретению, не содержат кукурузного крахмала. Вместо кукурузного крахмала используется смесь, содержащая микрокристаллическую целлюлозу : арабиногалактан в соотношении по массе, предпочтительно составляющем от 1:1 до 3:1. Микрокристаллическая целлюлоза может быть либо частично, либо полностью заменена целлюлозой в форме порошка. И микрокристаллическая целлюлоза, и целлюлоза в форме порошка присутствуют в списке пищевых добавок как E460.
Арабиногалактан представляет собой биополимер, состоящий из арабинозных и галактозных мономеров. Существует два класса арабиногалактанов: арабиногалактаны, происходящие из растений, и арабиногалактаны микробного происхождения.
Микрокристаллическая целлюлоза (или целлюлоза в форме порошка) присутствует в количестве, составляющем от 2 до 45% по массе относительно общей массы композиции, предпочтительно от 5 до 25%.
Арабиногалактан присутствует в количестве, составляющем от 5 до 30% по массе относительно общей массы композиции, предпочтительно от 10 до 20%.
Предпочтительно композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный компонент, выбранный из группы, содержащей: карбоксиметилцеллюлозу натрия, безводный гидрофосфат кальция и гидроксипропилметилцеллюлозу.
По меньшей мере один указанный дополнительный компонент присутствует в композиции по настоящему изобретению в общем количестве, которое варьирует от 3 до 70% масс./масс., более предпочтительно от 6 до 40% масс./масс. и еще более предпочтительно от 10 до 25% масс./масс. относительно общей массы композиции.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения композиция по настоящему изобретению дополнительно содержит стеарат магния в количестве от 0,5% до 7% масс./масс., предпочтительно от 1% до 3,5% масс./масс. относительно общей массы композиции.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать диоксид кремния в количестве от 0,5% до 4% масс./масс., предпочтительно от 1% до 2% масс./масс. относительно общей массы композиции.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать пальмитат сахарозы в количестве от 0,5% до 7% масс./масс., предпочтительно от 1% до 3,5% масс./масс. относительно общей массы композиции.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать смесь глицеридов (омыляемые жиры) в количестве от 0,5% до 10% масс./масс., предпочтительно от 2% до 7% масс./масс. относительно общей массы композиции.
Согласно предпочтительному воплощению изобретения композиция может дополнительно содержать от 0,5% до 10% масс./масс., предпочтительно от 1% до 5% масс./масс. сложного эфира сахарозы, причем процентные содержания выражены относительно общей массы композиции.
Композиция по изобретению служит для вагинальных приложений для лечения вагинальных инфекций, таких как вагинит, вагиноз, кандидоз, гонорея, герпес или мягкий шанкр.
В предпочтительном воплощении композиция находится в форме таблетки. В качестве альтернативы, таблетка может быть покрыта одним или более чем одним полимерным веществом, известным в данной области.
В отношении микробной популяции препаратов согласно настоящему изобретению имеет преимущества применение пробиотических микроорганизмов, используемых индивидуально или в смеси, даже тех, которые состоят из разных родов или видов.
Пробиотические микроорганизмы, по определению, представляют собой микроорганизмы, преимущественно бактерии человеческого происхождения, которые способны индуцировать полезные эффекты при регулярном приеме в достаточном количестве и в течение адекватного количества времени.
Композиция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один штамм пробиотических бактерий, обладающий способностью уменьшать и/или устранять присутствие патогенных агентов, выбранных из группы, содержащей: Candida albicans, Candida giabrata, Candida parapsilosis, Candida krusei, Candida tropicalis, Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Herpex simplex и Haemophilus ducreyi.
Предпочтительно указанный бактериальный штамм принадлежит по меньшей мере к одному виду, выбранному из группы, включающей: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus casei, Lactobacillus casei ssp. paracasei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus reuteri, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium animalis ssp. lactis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium catenulatum или Bifidobacterium infantis.
Среди вышеупомянутых видов бактерий бактериальные штаммы, перечисленные в Таблице 1, продемонстрировали то, что они являются особенно предпочтительными.
В предпочтительном воплощении бактериальные штаммы выбраны среди Lactobacillus salivarius CRL 1328, Lactobacillus paracasei CRL 1289, Lactobacillus gasseri CRL 1259, Lactobacillus crispatus CRL 1251, Lactobacillus crispatus CRL 1266, Lactobacillus acidphilus CRL 1294, Lactobacillus paracasei LPC 00, Lactobacillus plantarum LP 02 и Lactobacillus fermentum LF 10.
В предпочтительном воплощении композиция по настоящему изобретению, предпочтительно находящаяся в форме таблетки, содержит по меньшей мере два штамма, выбранных из вышеупомянутой группы.
В предпочтительном воплощении композиция по настоящему изобретению, предпочтительно находящаяся в форме таблетки, содержит по меньшей мере три штамма, выбранных из вышеупомянутой группы.
В предпочтительном воплощении композиция по настоящему изобретению, предпочтительно находящаяся в форме таблетки, содержит по меньшей мере четыре штамма, выбранных из вышеупомянутой группы.
Было продемонстрировано, что штаммы, выбранные из Lactobacillus salivarius CRL 1328, Lactobacillus paracasei CRL 1289, Lactobacillus gasseri CRL 1259, Lactobacillus crispatus CRL 1266 и Lactobacillus fermentum LF 10, имеют преимущество.
В таблетках согласно изобретению микроорганизмы предпочтительно используются в форме лиофилизированной культуры, имеющей число жизнеспособных организмов, обычно составляющее от 10 до 200 миллиардов колониеобразующих единиц (КОЕ)/г, предпочтительно присутствующей в количестве от 0,5 до 20% масс./масс., предпочтительно от 1 до 15% масс./масс., еще более предпочтительно от 3 до 10% масс./масс. относительно общей массы таблетки.
В одном из предпочтительных воплощений для того, чтобы увеличить пробиотическую эффективность препаратов согласно настоящему изобретению, конкретные пребиотические компоненты вводятся в порошковую смесь так, что получают симбиотическую композицию. Пребиотический компонент обычно представляет собой неперевариваемую смесь сахаридной природы, по меньшей мере, частично растворимую в воде или в водном растворе, которая стимулирует рост и/или активность одного или более чем одного пробиотического бактериального штамма, как описано выше. Среди этих пребиотических агентов предпочтительными являются пищевые волокна.
Предпочтительно указанное пребиотическое пищевое волокно выбрано из группы, содержащей: фруктоолигосахариды (FOS), галактоолигосахариды (GOS), транс-галактоолигосахариды (TOS), ксилоолигосахариды (XOS), хитозановые олигосахариды (COS), α-галактозиды (такие, как раффиноза и стахиоза), пектины, камеди, частично гидролизованные камеди, инулин, подорожник, аравийскую камедь, рожковое дерево, волокно овса или бамбука, волокна цитрусовых и, в общем, волокна, включающие растворимую и нерастворимую часть в варьирующем соотношении друг с другом.
Преимущественно указанное пребиотическое волокно выбрано среди фруктоолигосахаридов (FOS), галактоолигосахаридов (GOS) и ксилоолигосахаридов (XOS). Данные волокна не используются дрожжами из рода Candida, что таким образом дает конкурентное преимущество бактериальным штаммам, присутствующим в композиции по настоящему изобретению.
Предпочтительно пребиотический компонент присутствует в композиции в количестве вплоть до 70% масс./масс., предпочтительно составляющем от 5 до 50% масс./масс., еще более предпочтительно от 10 до 30% масс./масс., относительно общей массы композиции.
В предпочтительном воплощении композиция согласно изобретению может включать дополнительные активные компоненты, например витамины, минеральные вещества, растительные экстракты или другие соединения с эффектом, который является синергичным или дополняющим эффект популяции микроорганизмов, присутствующих в препаратах согласно изобретению.
Предпочтительно указанные дополнительные активные компоненты присутствуют в композиции в количестве вплоть до 70% масс./масс., предпочтительно составляющем от 0,5 до 40% масс./масс., еще более предпочтительно от 1 до 20% масс./масс. относительно общей массы композиции.
Комбинация технологических эксципиентов для прессования и шипучести согласно настоящему изобретению обеспечивает адекватную связность порошков таблетки и обеспечивает желательную кинетику высвобождения активных ингредиентов после их приема внутрь.
Смешивание разных компонентов, обычно в форме порошка, можно осуществлять добавлением компонентов в совершенно любом порядке, заботясь о том, чтобы добавлять культуру микроорганизмов, предпочтительно в форме лиофилизата, в качестве последнего ингредиента для предупреждения возможности того, что избыточное время перемешивания может индуцировать механический шок в стенке бактериальных клеток с последующими повреждением и пониженной стабильностью конечного продукта.
Препараты, получаемые согласно способу по настоящему изобретению, характеризуются превосходной текучестью, параметром, который благоприятствует однородной загрузке пресс-форм (т.е. пространства, предназначенного для приспособления того, чтобы прессовалось конкретное количество порошка) в таблеточном прессе. Указанные таблеточные прессы обычно содержат устройство для загрузки пресс-форм (обычно представленное мерным бункером для доставки порошковой смеси) и металлический диск подходящего радиуса, в толще которого получают сами пресс-формы; в зависимости от установки они присутствуют в варьирующем числе и в них происходит стадия прессования порошка благодаря одновременному синергичному движению двух подвижных частей установки, определяемых как штампы.
Во время стадии прессования нижний штамп определяет своим положением объем пресс-формы (и, таким образом, количество порошка, загружаемого каждый раз), тогда как верхний штамп, расположенный вне пресс-формы во время ее загрузки порошковой смесью, способен опускаться во время стадии прессования и приходить в контакт с порошком, присутствующим в пресс-форме, таким образом налагая благодаря оказываемому усилию более или менее заметную механическую деформацию на частицы, составляющие порошок. В конце стадии прессования верхний штамп поднимается, таким образом удаляясь из пресс-формы, и затем нижний штамп также поднимается, выталкивая вновь образованную таблетку из пресс-формы.
Указанные таблеточные прессы дополнительно содержат целый ряд устройств для управления главными рабочими параметрами (положение нижнего штампа в начале цикла прессования, самое нижнее положение, достигаемое верхним штампом во время цикла прессования, скорость вращения диска, в котором присутствуют пресс-формы и так далее).
Существует альтернатива ротационным таблеточным прессам согласно общим принципам работы пресса и, следовательно, числу таблеток, которое он способен производить за данную единицу времени. Таблетки, таким образом, можно производить с использованием таблеточных машин, известных в данной области, и с использованием штампов варьирующей формы, предпочтительно двояковыпуклых круглых и овальных штампов.
Сила сжатия, прикладываемая во время изготовления, оценивается измерением с помощью тестера твердости посредством количественного измерения силы, требующейся для разрушения таблетки. Указанная сила измеряется в кп (килопонд) (1 кп равен 9,807 ньютонам (H)). Отрицательный эффект сжатия на популяцию микроорганизмов проявляется, и когда прилагаемые силы являются высокими, например, в таблетках с твердостью 10-12 кп (98,07-117,684 H), и когда они являются низкими, как, например, в таблетках с твердостью 5-6 кп (49,035-58,842 H). Недостатком применения высоких сил является большее уменьшение числа микроорганизмов, тогда как с меньшими силами обычно получают пониженную связность таблетки. Предпочтительно таблетки по настоящему изобретению демонстрируют силу сжатия, составляющую от 5 до 12 кп (от 49,035 до 117,684 H) в зависимости от типа таблетки, который желательно получить.
В производственных испытаниях на таблетках, содержащих L. paracasei LPC 00, L. acidphilus LA 02 и L. salivarius CRL 1328 (Таблица 2), заявитель получил очень положительные результаты как в показателях выживания, так и в показателях последующей стабильности.
В частности, наблюдали гибель клеток, варьирующую от 4 до 15%, когда прикладываемая сила сжатия была такой, чтобы получать таблетки с твердостью, составляющей от 5 до 6 кп (от 49,035 до 58,842 H), и гибель клеток, варьирующую от 10 до 25%, когда прикладываемая сила сжатия была такой, чтобы получать таблетки с твердостью, составляющей от 10 до 12 кп (от 98,07 до 117,684 H). Другим преимуществом способа согласно изобретению является то, что он делает возможным производство достаточно связных таблеток даже при низких силах сжатия, например таблеток с твердостью 5-6 кп (49,035-58,842 H).
Таблетки, полученные согласно настоящему изобретению, были протестированы для оценки времени распада согласно Европейской Фармакопее в редакции X, статье 2.9.1. Хрупкость непокрытых таблеток тестировали согласно статье 2.9.7., а устойчивость к дроблению - согласно статье 2.9.8.
В Таблице 2 представлен пример композиции согласно изобретению.
В Таблице 3 представлены данные по гибели пробиотических бактерий (композиция показана в таблице 2) в соответствии с разными оказываемыми давлениями и стабильностью таблеток (выраженной в виде периода полужизни бактериальной нагрузки) после 2 лет их хранения при 25°C. Таблетки, полученные с использованием препаратов согласно изобретению, имели толщину около 7,7 мм в случае таблеток с высокой степенью твердости и около 8,4 мм - в случае таблеток с низкой степенью твердости.
В Таблице 3 стабильность выражена как период полужизни пробиотического компонента препарата, т.е. времени, которое проходит до момента, когда исходное число жизнеспособных клеток уменьшается в два раза.
Также было измерено следующее:
9
(1) Число жизнеспособных клеток 1×10 КОЕ/г порошка, ожидаемое в момент времени ноль
9
(2) Число жизнеспособных клеток 1×10 КОЕ/г порошка, обнаруженное в момент времени ноль
(3) % гибели клеток из-за прессования
9
(4) Число жизнеспособных клеток 1×10 КОЕ/таблетку после 2 лет при 25°C
(5) Период полужизни в сутках
Приведенные выше данные получали путем оценки числа пробиотических бактерий, присутствующих в порошковой композиции и в композиции после прессования, с использованием способа подсчета жизнеспособных бактерий на чашке согласно способам, известным специалистам в данной области.
В случае порошковой композиции количество, составляющее от 1 до 4 грамм образца, ресуспендировали в подходящем объеме стерильной жидкой среды, обычно 0,85%-ного физиологического раствора хлорида натрия, в который добавлен бактериологический пептон в пропорции 1 г/л.
После растворения порошка и последующей гомогенизации с использованием подходящей установки с поршнем число клеток/мл уменьшают с помощью последующих последовательных десятикратных разведений исходного образца.
На практике 1 мл самого концентрированного разведения каждый раз переносят с использованием стерильной пипетки в 9 мл разбавителя; данную операцию проводят такое число раз, которое является достаточным для доведения количества микроорганизмов, присутствующих на мл разбавителя, до числа, составляющего от 10 до 300, так, что после их переноса на чашку Петри и добавления подходящей агаризованной культуральной среды они образуют отдельные и, таким образом, поддающиеся подсчету колонии.
В случае таблеток соблюдали протокол, который обеспечивает предварительное разрушение трех-пяти таблеток и продолжение анализа, как описано выше для порошковой композиции.
Экспериментальные данные демонстрируют низкий уровень гибели клеток как в таблетках с высокой степенью твердости (приблизительно 16,4% от исходной популяции), так и в таблетках с более низкой степенью твердости (приблизительно 8,2% от исходной популяции). Дополнительным преимущественным аспектом композиции по настоящему изобретению является улучшенная стабильность во времени пробиотических микроорганизмов (пробиотического компонента), присутствующих в ней, по сравнению с обычной стабильностью препарата предшествующего уровня техники. Данное преимущество обусловлено применением смеси, содержащей [микрокристаллическую целлюлозу : арабиногалактан] в соотношении по массе, предпочтительно составляющем от 1:1 до 3:1. Эта смесь способна значительно ограничивать механическое повреждение, причиняемое пробиотическим бактериальным клеткам стадией прессования, и обеспечивать получение таблеток без проявления эффекта кэппинга.
Заявитель обнаружил, что периоды полужизни пробиотического компонента в порошковой композиции и в таблетках варьирующей твердости, изготовленных с использованием препарата согласно данному изобретению, являются очень сходными, демонстрируя тот факт, что используемые технологические компоненты способны минимизировать механическое повреждение, вызванное стадией прессования.
Преимущественно таблетки согласно изобретению демонстрируют высокий показатель выживания пробиотических микроорганизмов даже после стадии прессования.
Другим преимущественным аспектом является способность высвобождать диоксид углерода по мере того, как таблетка распадается, приводя к созданию анаэробной или микроаэрофильной среды, особенно благоприятной для заселения вагины используемыми пробиотиками.
Шипучесть способна дополнительно обеспечить адекватное и гомогенное распределение пробиотического активного ингредиента в вагинальной среде посредством увеличения эффективности заселения.
Композиции по настоящему изобретению делают возможным получение таблеток, содержащих пробиотические микроорганизмы, которые являются эффективными и стабильными во времени, даже не при неохлаждающих температурах, поскольку компоненты, образующие композицию, были выбраны и отобраны с целью уменьшения гибели клеток из-за смешивания и их гибели из-за прессования без ухудшения связности порошка. По этой причине композиция по настоящему изобретению, предпочтительно в форме таблетки, не содержит ни адипиновой кислоты, ни аскорбиновой кислоты, количество присутствующей соли карбонатного или бикарбонатного аниона меньше чем 15% по массе относительно общей массы композиции и вместо кукурузного крахмала используется смесь микрокристаллической целлюлозы и арабиногалактана.
Заявитель пришел к этим результатам, начиная с композиции, для которой было продемонстрировано, что она не является адекватной (Таблица 4).
Композиция из таблицы 4 демонстрирует: 80,8% гибель клеток из-за смешивания, 40,5% гибель клеток из-за прессования и общую гибель клеток (из-за смешивания и прессования) - 88,6%.
Композиция из таблицы 4 демонстрирует заметную гибель клеток уже на уровне порошка до прессования. pH растворения (в физиологическом растворе в соотношении 1:10) не является проблемой, так как равен 5,22 для первого препарата и 5,53 - для второго препарата.
Обнаружили, что адипиновая кислота является токсичной. Но данная токсичность объясняет лишь определенную часть наблюдаемой гибели клеток (примерно 60% от общей гибели клеток). Обнаружили, что аскорбиновая кислота является токсичной. Но эта токсичность объясняет другую часть гибели клеток. Удаление аскорбиновой кислоты из композиции из Таблицы 4 снижает гибель клеток с 73,8 до 26,7%. Сама по себе адипиновая кислота в любом случае является токсичной (45,8% при pH 4,24); ее токсичность, по-видимому, увеличивается в присутствии аскорбиновой кислоты. Аскорбиновая кислота таким образом, по-видимому, демонстрирует синергичную токсичность с токсичностью адипиновой кислоты.
Однако важно отметить, что сумма токсичности, обусловленной адипиновой кислотой и аскорбиновой кислотой, не объясняет общую наблюдаемую гибель клеток.
По этой причине заявитель исследовал присутствие других компонентов, способных проявлять токсический эффект, с целью объяснения общей токсичности, наблюдаемой в композиции из Таблицы 4.
Следовательно, некоторые другие компоненты (в отличие от pH, который уже рассматривался) должны объяснять остальную токсичность таким же образом, как и адипиновая, и аскорбиновая кислота.
Установили, что уровень гибели клеток обусловлен осмотическим давлением, задаваемым бикарбонатом, присутствующим в избыточном количестве. Выявили, что эта гибель клеток равна примерно 20%. За наблюдаемую токсичность ответственны адипиновая кислота, аскорбиновая кислота и осмотические эффекты, опосредованные бикарбонатом. Сам по себе бикарбонат не является токсичным: он становится таким только из-за осмотического эффекта.
По этой причине композицию (Таблица 5) готовили без адипиновой кислоты и аскорбиновой кислоты и с количеством бикарбонатного аниона (например, бикарбоната натрия), меньшим чем 15% по массе относительно общей массы композиции.
2
2
Например, 84 мг бикарбоната натрия составляет 1 ммоль, и CO, который высвобождается, занимает общий объем 25,4 мл при 37°C и при атмосферном давлении. Количество лимонной кислоты было выбрано таким образом, чтобы обеспечить полное высвобождение CO из бикарбоната натрия при значениях pH, наблюдавшихся после растворения таблетки.
Композиция из Таблицы 5 демонстрировала проблемы, когда она подвергалась стадии прессования для того, чтобы получить таблетки.
Порошок (Таблица 5) демонстрировал плохие свойства связности из-за применения в препарате кукурузного крахмала с низким содержанием влаги. Вся продукция таблеток из таблеточного пресса была кэппирована еще до пропускания через пылеотделитель.
После этого теста на сжатие заявитель произвел замену кукурузного крахмала смесью, содержащей микрокристаллическую целлюлозу : арабиногалактан в соотношении по массе, предпочтительно составляющем от 1:1 до 3:1.
Таблица 1
Выбранный штамм
Номер депонирования
Дата депонирования
Депонент
Lactobacillus salivarius CRL 1328
DSM 24441
04.01.2011
Probiotical SpA (по лицензии от Cerela)
Lactobacillus paracasei CRL 1289
DSM 24440
04.01.2011
Probiotical SpA (по лицензии от Cerela)
Lactobacillus gasseri CRL 1259
DSM 24512
25.01.2011
Probiotical SpA (по лицензии от Cerela)
Lactobacillus crispatus CRL 1251
DSM 24438
04.01.2011
Probiotical SpA (по лицензии от Cerela)
Lactobacillus crispatus CRL 1266
DSM 24439
04.01.2011
Probiotical SpA (по лицензии от Cerela)
Lactobacillus acidophilus CRL 1294
DSM 24513
25.01.2011
Probiotical SpA (по лицензии от Cerela)
Lactobacillus fermentum LF 5
CNCM I-789
21.07.1988
Probiotical SpA
Lactobacillus fermentum LF 10
DSM 19187
20.03.2007
Probiotical SpA
Lactobacillus fermentum LF 09
DSM 18298
24.05.2006
Probiotical SpA
Lactobacillus fermentum LF 11
DSM 19188
20.03.2007
Probiotical SpA
Lactobacillus paracasei LPC 00
LMG P-21380
31.01.2002
Probiotical SpA
Lactobacillus plantarum LP 01
LMG P-21021
16.10.2001
Laboratorio Microbiologico Grana Provolone SRL
Lactobacillus plantarum LP 02
LMG P-21020
16.10.2001
Laboratorio Microbiologico Grana Provolone SRL
Lactobacillus pentosus LPS 01
DSM 21980
14.11.2008
Probiotical SpA
Lactobacillus acidophilus LA 02
DSM 21717
06.08.2008
Probiotical SpA
Lactobacillus rhamnosus LR04
DSM 16605
20.07.2004
Probiotical SpA
Lactobacillus rhamnosus LR05
DSM 19739
27.09.2007
Probiotical SpA
Lactobacillus rhamnosus LR06
DSM 21981
14.11.2008
Probiotical SpA
Lactobacillus paracasei LPC 08
DSM 21718
06.08.2008
Probiotical SpA
Lactobacillus delbrueckii LDD01 (MB 386)
DSM 22106
10.12.2008
Probiotical SpA (Steve Jones srl)
Lactobacillus reuteri
DSM 17938
BioGaia
Lactobacillus reuteri LRE 01
DSM 23877
05.08.2010
Probiotical SpA
Lactobacillus reuteri LRE 02
DSM 23878
05.08.2010
Probiotical SpA
Lactobacillus reuteri LRE 03
DSM 23879
05.08.2010
Probiotical SpA
Lactobacillus reuteri LRE 04
DSM 23880
05.08.2010
Probiotical SpA
Lactobacillus salivarius LS03
DSM 22776
23.07.2009
Probiotical SpA
Lactobacillus plantarum PR ci
LMG P-21022
16.10.2001
Laboratorio Microbiologico Grana Provolone SRL
Lactobacillus plantarum 776/2 hi
LMG P-21023
16.10.2001
Laboratorio Microbiologico Grana Provolone SRL
Lactobacillus pentosus 9/1 ei
LMG P-21019
16.10.2001
Laboratorio Microbiologico Grana Provolone SRL
Таблица 2
Состав
мг/таблетку
Бактериальные штаммы: L. paracasei LPC 00, L. acidphilus LA 02 и L. salivarius CRL 1328 с концентрацией, составляющей от 20 до 100×10<sup>9</sup> КОЕ/г
58
Фруктоолигосахариды (FOS)
327
Арабиногалактан
250
Целлюлоза микрокристаллическая
270
Безводный гидрофосфат кальция
95
Смесь глицеридов
65
Лимонная кислота
64
Бикарбонат натрия
56
Нерастворимое пищевое волокно
43
Пальмитат сахарозы
26
Диоксид кремния
26
Стеарат магния
20
ВСЕГО (1 таблетка)
1300
Таблица 3
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Порошок
5,9
6,1
/
1,3
327
Препарат из таблицы 2
Таблетки масс./низкая степень твердости (5-6 кп (49,035-58,842 H))
/
5,6
8,2
1,2
328
Таблетки масс./высокая степень твердости (10-12 кп (98,07-117,684 H))
/
5,1
16,4
1
292
Таблица 4
Неадекватная композиция
Состав
мг/таблетку
Бактериальные штаммы: (L. paracasei LPC 00, L acidophilus LA 02, L. paracasei CRL 1289 с концентрацией, составляющей от 20 до 100×10<sup>9</sup> КОЕ/г)
291
Кукурузный крахмал
335
Адипиновая кислота
268
Бикарбонат натрия
210
Аскорбиновая кислота
100
Стеарат магния
42
Лактоза безводная
34
Стеариновая кислота
12
Диоксид кремния
8
ВСЕГО: (1 таблетка)
1300
Таблица 5
1300 мг композиции
Компоненты
мг/таблетку
Бактериальные штаммы: (L paracasei LPC 00, L. acidophilus LA 02, L. paracasei CRL 1328 с концентрацией, составляющей от 20 до 10<sup>9</sup> КОЕ/г)
199
Арабиногалактан
300
Галактоолигосахариды (GOS)
315
Кукурузный крахмал
315
Нерастворимые пищевые волокна
43
Лимонная кислота
38
Стеарат магния
34
Бикарбонат натрия
28
Диоксид кремния
18
Стеариновая кислота
10
ВСЕГО (1 таблетка)
1300