Способ модификации развития аденокарциномы в эксперименте
METHOD OF MODIFYING THE DEVELOPMENT OF ADENOCARCINOMA EXPERIMENTALLY

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для изменения стандартного роста штамма аденокарциномы Герена при его подкожной перевивке, изучения патогенеза злокачественного роста перевивной опухоли эпителиальной природы у самцов крыс половозрелого возраста и дальнейшей разработки методов его экспериментальной коррекции.
Экспериментальная онкология - важное направление онкологии, позволяющее изучать многие патогенетические аспекты злокачественного роста, которые, в силу известных причин, невозможно исследовать в клинике. Базисом экспериментальной онкологии является создание различных моделей злокачественного процесса на животных. Объектом изучения в эксперименте, как правило, являются грызуны - крысы и мыши, на которых перевивают различные штаммы опухолей. Перевивные опухоли имеют ряд неоспоримых преимуществ перед индуцированными, основное - они позволяют одномоментно получить достаточное количество животных для формирования сопоставимых экспериментальных групп, поскольку перевивные опухоли легко воспроизводятся, выходят практически одномоментно и достаточно быстро.
Среди экспериментальных опухолей, растущих после стандартной перевивки в виде подкожного узла, у мышей наиболее известны меланомы: В16, Хардинга-Пасси и S-91 Клаудмана; карцинома легких Льюис и ряд других неоплазм. Меланома В16 возникла спонтанно в коже, расположенной у основания уха, мыши линии C57BL/6 в 1954 году. Штамм поддерживается на мышах линии C57BL/6 перевивкой опухолевой взвеси на 12-16 сутки роста. Популяция опухолевых клеток гетерогенна и включает участки с разным количеством меланина. При подкожной перевивке приживаемость опухоли составляет 100% (0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса или среде 199 (1:10)), при этом опухоль метастазирует в легкие, редко - в печень и/или селезенку (см. Фадеева Е.В. Экспериментальная модель меланомы В16 и методы иммунотерапии / Межд. журн. экспер. образ. - 2010. - №8. - С. 49-50.).
Эпидермоидная карцинома легких Льюис (LLC) возникла спонтанно у мышей С57В L/6 в 1951 г. Штамм поддерживается на самцах мышей линии C57BL/6 перевивкой опухолевой взвеси на 11-14 сутки роста. Опухоль состоит из полиморфных клеток. Пролиферативный пул в момент перевивки опухоли составляет 73,8%. Средняя продолжительность жизни животных - 24 дня. При внутримышечной перевивке приживаемость опухоли составляет 100% (в/м по 0,5 мл взвеси опухолевой ткани на растворе Хенкса или среде 199 (1:10)), при этом опухоль метастазирует только в легкие (см. Mayo Y.Y. Biological characterization of the subcutaneously implanted Lewis lung tumor. - Cancer Chemother. Rep. - 1972. - part 2. - v. 3. - №1. - pp 325-330; Эмануэль H.M. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов, М., Наука. 1975: 415).
Среди солидных опухолей у крыс в эксперименте наиболее часто используют саркомы и аденокарциномы. Штамм саркомы 45 получен в 1947 г. в лаборатории проф. Зильбера Л.А. в результате прививки фибросаркомы, возникшей у крысы в подкожной клетчатке после введения 9,10-диметил-1,2-бензантрацена. По своему морфологическому строению саркома 45 представляет собой веретеноклеточную злокачественную опухоль, состоящую из фибробластов. В опухоли много митозов. Саркома прививается на беспородных крыс почти в 100%. Средняя продолжительность жизни - 25-35 дней. При стандартной подкожной перевивке крысам любого пола опухоль растет в виде солитарного округлого узла и не метастазирует (см. Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов, М., Наука. 1975:415; Двадненко К.В., Гусев С.А., Федоренко Г.М., Матишов Д.Г. Ультраструкурные аспекты биологии злокачественного роста саркомы 45. Сибирский онкологический журнал, 2011, 43(1): 25-28).
Наряду с саркомами, востребованной в экспериментальной онкологии опухолью, поддерживаемой на крысах, является аденокарцинома Герена. Опухоль выделена из матки беспородной белой крысы в 1934 г. Герен П. и Герен М. В настоящее время по гистологическому строению - малодифференцированный рак, редко образующий железистоподобные структуры. Прививаемость опухоли колеблется от 50 до 90%, составляя в среднем, по данным Е.Е. Погосянц, 75%. Спонтанное рассасывание не наблюдается. Средняя продолжительность жизни - 30-40 дней (см. Ларионов Л.Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей. - М.: Медгиз, 1962 г.).
В подкожной клетчатке опухоль растет в виде мягких узлов, отграниченных очень тонкой соединительнотканной капсулой. Характерным для аденокарциномы Герена является расположение клеток в виде мелких ячеек и коротких тяжей, разделенных тонкими, но хорошо выраженными прослойками соединительной ткани. Образования истинных железистых структур не отмечается, на отдельных участках встречаются псевдожелезистые структуры. Регистрируется много патологических митозов. Наряду с обширными полями некроза наблюдаются многочисленные участки некробиоза (пикноз ядер, кариорексис, кариолизис и т.д.). Карцинома Герена по своим биологическим свойствам и морфологии в значительной мере сохранила свой эпителиальный характер, чем такие перевиваемые опухоли эпителиального происхождения, как опухоль Эрлиха, Броуна-Пирса и др. (см. «Модели и методы экспериментальной онкологии» Под ред. А.Д. Тимофеевского. «Медгиз», М., 1960; см. Черкашина Д.В., Лебединский А.С, Петренко Ю.А., Штеменко Н.И., Петренко А.Ю. Торможение роста карциномы Герена у крыс после ведения мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека и биорегуляторов стволовых и прогениторных клеток. Журн. АМН Украiни. 2010; 16 (3): 492-506).
В экспериментальных исследованиях, направленных на изучение природы и механизмов развития той или иной злокачественной патологии, важно иметь инструменты воздействия на злокачественный процесс - факторы, модифицирующие его развитие. Владея таким арсеналом, экспериментаторы получают возможность расширить границы своего познания в области онкологии.
Установлено, что особенности роста экспериментальных перевивных опухолей зависят не только от биологической природы опухолевого штамма, но и от способа перевивки опухолевого материала. Так, мышиная меланома B16/F10, которая при стандартной подкожной перевивке растет в виде подкожного узла и метастазирует в легкие, печень и селезенку; при внутрибрюшинном введении образует множественные мелкие узелки, выстилающие брюшную полость мышей; при введении опухолевых клеток в хвостовую вену - формирует метастазы в легких (см. Фадеева Е.В. Экспериментальная модель меланомы В16 и методы иммунотерапии / Межд. журн. экспер. образ. - 2010. - №8. - С. 49-50.). Введение в подключичную вену крыс клеток саркомы 45 приводит к образованию метастазов в легких (см. Патент на изобретение RU 2388064 С1, опубл. 27.04.2010 г., Бюл. №12), тогда как введение в селезенку, предварительно выведенную под кожу - к изолированным (в печени) или сочетанным (в печени и легких) метастазам саркомы 45 в органах в дополнение к солитарному опухолевому узлу в селезенке (см. Патент на изобретение RU 2538243 С1, опубл. 10.01.2015 г., Бюл. №1).
В целом, селезенка, являясь иммунокомпетентным органом, участвующим в противораковой защите, оказалась интересным сайтом для перевивки опухолевого материала. Было установлено, что при интраспленальном введении клеток аденокарциномы Герена крысам происходит обновление клеточного состава как в опухоли - активация пролиферации, так и в ткани селезенки - бласттрансформация (см. Бобро Л.И., Фильчаков Ф.В., Гриневич Ю.А., Шумилина Е.С. Морфологические изменения в органах иммуногенеза при трансплантации карциномы Герена в селезенку. Архив патологии. 2004, 4: 30-35). Особенно интересные качества, с точки зрения объекта для опухолевой трансплантации, приобрела селезенка при выведении ее под кожу: интраспленальное введение дало возможность мышиному штамму меланомы В16 развиваться в организме белых беспородных крыс, более того, «сценарий» развития меланомы в данной экспериментальной модели приближается к клинической картине развития меланомы в человеческой популяции с поражением не только паренхиматозных органов: легких, печени и селезенки, но и лимфоузлов, тимуса, поджелудочной железы и других (см. Патент на изобретение RU 2615908 С1, опубл. 04.11.2017 г., Бюл. №3).
3
Влиять на развитие опухолевых штаммов можно и используя в качестве объекта для перевивки опухолевого материала генно-модифицированных животных. Было установлено, что подкожная трансплантация меланомы B16/F10, обычно осуществляемая на мышах линии C57BL/6, мышам линии C57BL/6-PlautmI.IBug-ThisPlau6FDhu/GFDhu - с целевой мутацией (нокаут) с получением белка (uPA), неспособного связываться с рецептором активатора плазминогена урокиназного типа, модифицировала злокачественный рост меланомы. У самцов опухоли характеризовались достаточно активным ростом с двумя пиками увеличения объема (2 и 4 неделя), регистрировались кровоизлияния в легких и сердце, метастазов не было; у самок отмечалось торможение опухолевого роста - к 4 неделе канцерогенеза объем подкожных опухолей не превышал 1,0 см, визуализировались единичные метастазы в легких, кровоизлияний не было (см. Патент на изобретение RU 2718671 С1, опубл. 13.04.2020 г., Бюл. №1).
Считается, что карцинома Герена прививается у крыс обоего пола любой породы и линии. Однако, как правило, в работах используются молодые самки, достаточно часто - неполовозрелые (см. Шмараков И.А., Катан Н.В. Индукция ретиноидами гидроксилазной активности цитохрома 3450 карциномы Герена, Биомедицинская химия, 2012, 58 (5): 539-548; см. Жиленко В.В., Залеток С.П. Влияние фенугрека на уровень малонового диальдегида в органах и некоторые гематологические показатели у животных с перевиваемыми опухолями, Сибирский онкологический журнал, 2013, 2: 58-61; см. Орел В., Митрелиас Т., Целепи М., Головко Т., Дынник О., Николов К, Романов А., Рыхальский А., Варне С.К., Ярошенко О., Орел И., Супрунюк Д.. Щепотин И. Визуализация карциномы Герена при проведении магнитной нанотерапии. Journal of Nanopharmaceutics and Drug Delivery. Vol. 2, 1-11, 2014), поскольку опухоль у них выходит чаще и растет активнее, чем у самцов.
Известно исследование «Влияние фенугрека на уровень малонового диальдегида в органах и некоторые гематологические показатели у животных с перевиваемыми опухолями», в котором влияние фенугрека на ряд показателей организма изучалось на экспериментальной модели опухолевого роста карциномы Герена (см. Жиленко В.В., Залеток С.П. «Влияние фенугрека на уровень малонового диальдегида в органах и некоторые гематологические показатели у животных с перевиваемыми опухолями», Сибирский онкологический журнал, 2013, 2, с. 58-61). В этом способе в качестве объекта исследования выступали самки крыс с массой 120-150 грамм (ориентировочно возраст составлял 2,5-3,0 месяца), которым перевивали субштаммы карциномы Герена по 0,5 мл 20% (разведение 1:4) суспензии опухолевых клеток, то есть используется достаточно большой объем опухолевого материала. В эксперимент брали животных, у которых вышли опухоли.
Известен способ «Индукции ретиноидами гидроксилазной активности цитохрома 3450 карциномы Герена», в котором на модели карциномы Герена была исследована взаимосвязь процессов роста злокачественного новообразования и обеспеченности организма витамином А. Показано, что восстановление ресурсов витамина А авитаминозного организма с опухолью дозозависимо модулирует темпы роста карциномы Герена (см. Шмараков И.А., Катан Н.В. Индукция ретиноидами гидроксилазной активности цитохрома З450 карциномы Герена. Биомедицинская химия, 2012, т. 58, 5, 539-548.). Однако, в этом способе эксперимент проводился на самках белых беспородных крыс неполовозрелого возраста, массой 40-50 грамм.
Карциному Герена перевивали на фоне гиповитаминоза А или на фоне витаминной нагрузки, то есть воздействие осуществляли из вне: крыс кормили витаминами ежедневно - до, во время и после перевивки (см. Шмараков И.А., Катан Н.В. Индукция ретиноидами гидроксилазной активности цитохрома 3450 карциномы Герена. Биомедицинская химия, 2012, т. 58, 5, 539-548.).
Задачей предлагаемого изобретения является изменение стандартного роста штамма аденокарциномы Герена при его подкожной перевивке.
Техническим результатом является разработка способа модификации развития аденокарциномы в эксперименте.
Технический результат достигается тем, что в возрасте 3,5-4,0 месяцев у самцов белых беспородных крыс используют перевязку седалищных нервов, а через 45 дней в подкожную клетчатку спины перевивают 0,5 мл взвеси эпителиальных опухолевых клеток штамма аденокарциномы Герена в физиологическом растворе в разведении 1:5.
Изобретение «Способ модификации развития аденокарциномы в эксперименте» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии.
Новизна изобретения заключается в лигировании седалищных нервов перед перевивкой аденокарциномы Герена у половозрелых самцов крыс, что способствует 100% выходу опухолей с резким увеличением их объема за 7 дней до ранней гибели животных.
Изобретение «Способ модификации развития аденокарциномы в эксперименте» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной модели злокачественного процесса аденокарциномы со 100% выходом опухолей и их измененным ростом у половозрелых самцов белых беспородных крыс с целью изучения особенностей патогенеза этого процесса и дальнейшей разработки методов его экспериментальной коррекции.
«Способ модификации развития аденокарциномы в эксперименте» выполняется следующим образом.
Все манипуляции с животными производятся в боксе. Инструменты, посуду, руки дезинфицируют общепринятым способом.
Каждому животному вводят ксила-золетиловый наркоз: за 10 минут до основного наркоза с целью премедикации животному внутримышечно вводят ксилазин (препарат Ксила) в дозе 0,05 мл/кг массы тела (по инструкции), затем - Золетил-50 в дозе 10 мг/100 г массы тела.
После наступления медикаментозного сна ассистент фиксирует крысу в положении на животе, удаляет шерсть сзади в районе проекции седалищных нервов и смазывает кожу 70% спиртом. Экспериментатор в стерильных условиях накладывает на седалищный нерв нерассасывающуюся лигатуру, ушивает рану и обрабатывает шов 5% спиртовым раствором йода. Затем все манипуляции повторяются с другим седалищным нервом.
Через 45 дней после операции (возраст крыс - 5,0-5,5 месяцев) подкожно вводят 0,5 мл взвеси клеток опухоли Герена в физиологическом растворе в разведении 1:5.
Для этого, соблюдая все условия асептики, описанные выше, ассистент фиксирует крысу спиной кверху, предварительно сбрив шерсть и обработав кожу 5% спиртовым раствором йода книзу от угла правой лопатки. Экспериментатор рукой в стерильной перчатке захватывает обработанную кожную складку, иглой шприца прокалывает кожу и вводит опухолевую взвесь. Затем извлекает иглу, и место введения плотно прижимает ватным тампоном, смоченным в 70% спирте с небольшим добавлением йода, на 1 минуту, чтобы исключить вытекание вводимой взвеси. Через 10 дней после введения взвеси штамма карциномы Герена начал регистрироваться подкожный рост опухоли.
Контролем служили половозрелые крысы самцы с подкожной перевивкой карциномы Герена в той же дозе и объеме, что и у животных из основной группы, но без предварительного лигирования седалищных нервов.
Подкожная опухоль у крыс основной группы (12 штук) начала определяться со 2 недели канцерогенеза, ее средний объем в этот период составил 17,7 см, на 3 неделе опухоль увеличилась в 3,7 раза по сравнению со 2 неделей, на 4 неделе - в 8,2 раза по сравнению со 2 неделей и в 2,2 раза, по сравнению с 3 неделей. Опухоль выходила у всех самцов (перевиваемость опухоли составила 100%).
По мере развития опухолевого узла с 10 по 14 сутки на коже в зоне неопластического роста появился некроз. Через 17 дней крысы основной группы начали дохнуть. Средняя продолжительность их жизни составила 25 дней, максимальная - 28 дней (см. Таблица 1).
В контрольной группе животных (10 штук) подкожная опухоль, как и у крыс основной группы, выходила на 2 неделе канцерогенеза, а ее объем на 2 и 3 неделях злокачественного роста статистически значимо не отличался от основной группы животных в эти же периоды исследования. У 2 животных из 12 опухоль не выходила (перевиваемость опухоли составила 83%).
На 4 неделе от момента перевивки карциномы Герена рост подкожной опухоли тормозился.
На 5 неделе отмечалось незначительное увеличение объема опухоли - размер опухолевого узла становился в 1,6 раза (р<0,05) больше, чем у крыс на 2 неделе канцерогенеза.
У крыс контрольной группы внешний некроз появлялся одномоментно на 14 сутки. Контрольные крысы начали дохнуть на неделю позже крыс основной группы - через 24 дня. Средняя продолжительность их жизни составила 31 день, максимальная - 37 дней. Оба показателя превышали значения животных основной группы: средняя продолжительность жизни была дольше на 6 дней, а гибель последнего животного состоялась позже на 9 дней (см. Табл. 1).
Таким образом, предваряющее перевивку аденокарциномы Герена лигирование седалищных нервов, способствовало выходу опухолей у всех половозрелых самцов крыс, уменьшению продолжительности их жизни со значительным увеличением объема неоплазмы перед гибелью животных.
Технико-экономическая эффективность «Способа модификации развития аденокарциномы в эксперименте» заключается в том, что его применение позволяет модифицировать злокачественный рост экспериментальной опухоли эпителиальной природы.