Способ диагностики врожденного иммунитета слизистых оболочек носа для обоснования выбора лечения детей с гипертрофией аденоидных вегетаций
METHOD FOR NASAL MUCOUS MEMBRANES INNATE IMMUNITY DIAGNOSTICS TO JUSTIFY SELECTION OF TREATMENT FOR CHILDREN WITH ADENOID VEGETATION HYPERTROPHY

Изобретение относится к медицине, а именно к оториноларингологии, и может быть использовано для оценки мукозального иммунитета слизистой оболочки носа и носоглотки.
Гипертрофия аденоидных вегетаций (АВ) у детей представляет серьезную медико-социальную проблему, обусловленную распространенностью этой патологии и широким кругом заболеваний, индуцированных гипертрофией и хроническим воспалением АВ. В структуре патологии ЛОР-органов гипертрофия АВ наблюдается у 20-50% детского населения [Богомильский М.Р., 2007], а в группе часто болеющих детей этот показатель достигает 70%. Аденотомии составляют основной объем хирургических вмешательств в детской оториноларингологии.
Однако, принимая во внимание тот факт, что в лимфоидной ткани носоглотки формируется мукозальный иммунитет ЛОР-органов, показания к хирургическому лечению поражений небных и глоточной миндалин значительно сужены. Гипертрофия лимфоидной ткани, возникающая как средство иммунной защиты при инфекции, очень часто и определяет вопрос об удалении аденоидов. В связи с этим необходима разработка и внедрение более точных диагностических тестов, позволяющих определить состояние мукозального иммунитета слизистой оболочки носоглотки с целью обоснованного выбора метода лечения гипертрофии АВ.
В настоящее время системе врожденного иммунитета отводится ключевая роль в защите слизистых оболочек от различных патогенов. Известно, что врожденный иммунитет является первой линией защиты организма от внешних патогенов и продуктов тканевой деструкции. Паттерн-распознающие рецепторы (в частности Toll-подобные рецепторы -TrRs) обеспечивают распознавание патогенов, а также индуцируют синтез эффекторных молекул, таких как цитокины, хемокины и противомикробные пептиды (ПМП). Бетта-дефензины продуцируются клетками слизистых оболочек и осуществляют защиту от патогенов. Анализ компонентов врожденного иммунитета (TrRs, ПМП) слизистой оболочки полости носа у детей с гипертрофией АВ имеет важное значение для оценки прогноза заболевания, дополнительного обоснования метода лечения.
Известен способ оценки состояния местного иммунитета слизистой оболочки полости носа в ринологической практике, включающий определение состояния местного иммунитета, при этом в носовом секрете определяют содержание лизоцима, sIgA, измеряют индекс авидности sIgA, рассчитывают индекс иммунного напряжения по формуле
где ИAsIgA - индекс авидности sIgA;
sIgA - содержание секреторного иммуноглобулина А, мг/л;
Liz - содержание лизоцима, мкг/мл;
100 - постоянный коэффициент для более наглядного отображения результатов,
и при значении ИИН 0,99±0,36 определяют высокую степень иммунного напряжения, 0,18±0,11 - низкую степень иммунного напряжения, при нормальном значении ИНН 0,45±0,15 (Патент РФ №2297633).
Известен способ оценки экспрессии генов распознающих рецепторов врожденного иммунитета Toll-подобных рецепторов, противомикробного пептида HBD-2 в клетках слизистой оболочки полости носа у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций. Уровень экспрессии исследуемых генов определялся в пробах, полученных из эпителиальных клеток слизистой оболочки полости носа методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Предложенный способ позволил оценить состояние системы врожденного иммунитета на уровне слизистой оболочки полости носа при различных заболеваниях ЛОР-органов и определить тактику лечения. Были обследованы 49 детей в возрасте от 2 до 8 лет с гипертрофией аденоидных вегетаций, группу сравнения составили 12 здоровых пациентов той же возрастной группы (Ковальчук Л.В., Рахманова И.В., Ганковская Л.В., Ганковский В.А. «Роль компонентов врожденного иммунитета в защите слизистой оболочки полости носа в норме и при гипертрофии аденоидных вегетаций». «Вестник оториноларингологии», изд. Медиа Сфера. Москва. 2011, №6, с. 73-75).
Известен способ оценки врожденного иммунитета, а именно Тоll-подобных рецепторов у детей с бронхиальной астмой, которой основан на измерении уровня экспрессии TLR2 и TLR9 на мононуклеарных клетках периферической крови методом проточной цитометрии. (High expression of Toll-like receptors 2 and 9 and Th1/Th2 cytokines profile in asthmatic children, Sánchez-Zauco N, Del Rio-Navarro B, Gallardo-Casas C, Del Rio-Chivardi J, Muriel-Vizcaino R, Rivera-Pazos C, Huerta-Yepez S, Cruz-López M, Maldonado-Bernal C. Allergy Asthma Proc. 2014 May-Jun; 35 (3):34-41). По данным исследования отмечается увеличение экспрессии рецепторов TLR2 и TLR9 у детей астматиков относительно группы здоровых детей.
Известен способ оценки врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой, согласно которому в соскобах со слизистой полости носа с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени определяют уровень экспрессии генов Toll-подобных рецепторов TLR2, TLR9 и при одновременном повышении уровней экспрессии указанных генов, по меньшей мере, в 20 и 9 раз соответственно, по сравнению с их уровнем, установленным для здоровых детей, диагностируют нарушение врожденного иммунитета, приводящее к обострению бронхиальной астмы на фоне острой респираторной инфекции (Заявка на патент РФ №2016125181 от 24.06.2016 г.).
Известен способ оценки показателей врожденного иммунитета слизистой оболочки полости носа, основанный на измерении Toll-подобных рецепторов TLR2, TLR4, TLR9 и генов противомикробных пептидов HBD1, HBD2 и HNP1, участвующих в реализации врожденного иммунитета, у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций II и III степени и здоровых детей. Пациентов разделили на 3 группы: тех, кому была показана консервативная терапия (группа I, 39 участников), тех, кому была произведена аденотомия (группа II, 38 участников), и контрольную группу (33 участника). В качестве клинического материала использовали соскоб эпителиальных клеток слизистой полости носа (группа I и контроль) и соскоб со слизистой глоточной миндалины (группа II). Достоверных различий в экспрессии генов по типу биологического материала не наблюдали. Уровни экспрессии изучаемых генов в группе I не отличались достоверно от показателей контрольной группы. В группе II было отмечено достоверное увеличение экспрессии генов TLR2 и TLR4 в 15,4 и 10,3 раза соответственно. Значительное увеличение уровней экспрессии генов TLR с одновременным снижением экспрессии генов противомикробных пептидов приводит к снижению защиты слизистых оболочек и может быть одной из причин развития аденоидитов и средних отитов. Это может быть дополнительным обоснованием хирургического метода лечения (М.Р. Богомильский, О.А. Свитич, В.А. Ганковский, И.В. Рахманова. Особенности врожденного иммунитета у здоровых детей и у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций. ВЕСТНИК РГМУ 2015, №4, с. 24-27).
Недостатком способа является его трудоемкость, он требует большого количества дорогостоящих реактивов, анализ и интерпретация шести показателей для обоснования метода лечения гипертрофии АВ в клинике затруднительны.
Способ выбран нами в качестве прототипа.
Задачей заявляемого способа является разработка достоверного способа диагностики врожденного иммунитета слизистых оболочек носа, т.е. показателей мукозального иммунитета у детей с гипертрофией аденоидных вегетаций.
Техническим результатом осуществления поставленной задачи является выработка критериев оценки показателей мукозального иммунитета для обоснования выбора лечения.
Сущность изобретения состоит в том, что в эпителиальных клетках слизистой оболочки полости носа определяют экспрессию двух показателей врожденного иммунитета: генов рецептора врожденного иммунитета (TLR2) и генов противомикробного пептида (HBD2) и при соотношении показателя HBD2 к TLR2 меньше 0,1, выбирают хирургический метод лечения гипертрофии аденоидов, в противном случае проводят консервативное лечение.
Выбор этих показателей обусловлен тем, что TLR2 распознает широкий спектр различных патогенов. Бетта-дефенсин 2 (HBD2), синтез которого индуцируется при действии патогенов на TLR2, оказывает прямое противомикробное действие в слизистых оболочках носа. Для простоты оценки мукозального иммунитета предлагается определять коэффициент, который рассчитывается как соотношение количества копий гена HBD2 к количеству копий гена TLR2, и при значениях этого коэффициента, равных или меньшим 0,1, можно прогнозировать нарушение иммунной защиты слизистой ЛОР-органов, что служит важным критерием для обоснования хирургического метода лечения гипертрофии АВ.
Способ осуществляют следующим образом. Для изучения экспрессии генов TLR2 и HBD1 сначала получают эпителиальные клетки слизистой полости носа, затем выделяют из полученных клеток рибонуклеиновую кислоту (РНК), синтезируют на матрице РНК копию дезоксирибонуклеиновой кислоты (к ДНК) и проводят полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Клетки слизистой полости носа получали с помощью цитощеточки типа D и отмывали от слизи культуральной средой Игла на центрифуге (1500 об/мин, 10 мин). Осадок, содержащий клетки слизистой полости носа, разбавляли культуральной средой Игла объемом 100 мкл и использовали в работе. К полученной суспензии добавляли по 100 мкл лизирующего буфера для выделения РНК. Выделение РНК проводили по стандартным протоколам. Для выделения РНК использовали наборы "Рибо-сорб" (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, АмплиСенс, РФ). Выделения РНК проводили строго по инструкции фирмы-производителя с добавлением RNA Stabilization Reagent (Qiagen, Германия). Полученные образцы нуклеиновых кислот хранили при температуре минус 70°С. Количество полученной РНК оценивали с помощью NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). В реакции обратной транскрипции использовали 0,2 мкг РНК. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием наборов ОТ-1 (Синтол, РФ). Полученные образцы кДНК хранили при температуре минус 70°С. В качестве контроля прохождения реакции обратной транскрипции и для стандартизации метода использовали ПЦР-систему на определение экспрессии гена β-актина (Синтол, РФ). Полимеразную цепную реакцию в реальном времени ставили с использованием наборов реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I (Синтол, Россия) и специфических праймеров. В готовую смесь добавляли по 2 мкл кДНК, полученной при реакции обратной транскрипции. Условия прохождения ПЦР со специфическими праймерами к исследуемым генам были смоделированы с помощью программы VectorNTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК, опубликованными в базе данных Gene Bank. Отрицательным контролем служила проба с реакционной смесью, не содержащая мРНК. ПЦР в реальном времени проводят на приборе ДТ-96 (ДНК-технология, РФ) по следующей схеме (94°С 15 с и 60°С 50 с) 40 циклов. Полученные результаты анализировали с помощью лицензированной программы, прилагающейся к прибору ДТ-96. Расчет количества копий TLR2 проводили относительно 1×106 копий β - актина.
Клинические примеры осуществления способа
3
3
Пример 1. Ребенок А., 5 лет, поступил на прием к ЛОР-врачу с жалобами на затруднение носового дыхания, покашливание по утрам в течение года, храп в ночное время. Из анамнеза известно, что ребенок 2 раза перенес двусторонний острый средний катаральный отит, 1 раз двусторонний острый средний гнойный отит, ОРИ в сочетании с острым аденоидитом 4 раз за последний год. При ЛОР-осмотре: Носовое дыхание затруднено, слизистая оболочка носа розовая, средние носовые ходы свободны, в общих носовых ходах слизь. Миндалины II степени, стекает слизь из носоглотки, уши: AD et AS слуховые проходы широкие, свободные. МТ AD et AS бледные, просвечивает экссудат. Была произведена тимпанометрия, по результатам которой определялся тип «В» на оба уха, что указывало на наличие двустороннего экссудативного среднего отита. При проведении аудиограммы определяется двусторонняя кондуктивная тугоухость I степени. При диагностической эндоскопии носоглотки: В носоглотке определяется лимфоидная ткань, практически полностью прикрывающая просвет хоан. Лимфоидная ткань отечная, покрыта слизью. Глоточные устья слуховых труб не обозримы. Трубные валики обычных размеров. Был поставлен диагноз: Гипертрофия аденоидных вегетаций III степени с блоком глоточных устьев слуховых труб. Аденоидит. Двусторонняя кондуктивная тугоухость I степени. Двусторонний экссудативный средний отит. По предложенной методике определяли уровень экспрессии гена TLR2, который составил 77,625*10, и уровень генов противомикробного пептида (HBD2), который составил 0,302*10. Результат представлен в количестве копий к ДНК исследуемого гена по отношению к 1 млн количества копий гена актина.
Коэффициент соотношения HBD2/ TLR2=0,003890451.
3
3
По сравнению со средними показателями здоровых детей (таблица 1, пример 4) отмечено достоверное увеличение экспрессии генов TLR2 и снижение экспрессии противомикробного пептида HBD2, что свидетельствует о нарушении врожденного иммунитета слизистых оболочек, приводящего к частым ОРВИ, отитам. Это явилось еще одним обоснованием для назначения хирургического метода лечения. Рекомендовано: аденотомия под эндоскопическим контролем. После проведения оперативного лечения слух восстановился, тимпанограмма тип «А» с двух сторон, аудиограмма - слух в пределах нормы. Показатели врожденного иммунитета спустя 3 мес после оперативного вмешательства практически не отличались от показателей здоровых детей и составили для гена TLR2 1,1*10 и для HBD2 - 7,9*10. Коэффициент HBD2/ TLR2=7,2.
3
3
Пример 2. Ребенок К., 5 лет, поступил на прием к ЛОР-врачу с жалобами на затруднение носового дыхания в течение 4 месяцев, гнусавость. За последний год ребенок 4 раза перенес эпизоды ОРИ и аденоидита, дважды перенес острый средний катаральный отит. Ребенок посещает детский сад. При осмотре: носовое дыхание затруднено, слизистая розовая, в общих носовых ходах слизь, средние носовые ходы свободные, миндалины II степени, скудная слизь. Отоскопия: МТ AD et AS бледные, контурируются. Проведена тимпанометрия, по результатам которой определялся тип «А» на оба уха. Проведена диагностическая эндоскопия носоглотки: в носоглотке определяется лимфоидная ткань, на 1/2 прикрывающая просвет хоан. Лимфоидная ткань практически не отечная, скудная слизь. Глоточные устья слуховых труб обозримы. Был поставлен диагноз: Аденоиды II степени. Аденоидит, остаточные явления. Со слизистой полости носа был получен соскоб и методом ПЦР в реальном времени определена экспрессия генов TLR2 и HBD2. Уровень экспрессии гена TLR2 составил 2,188*10, гена HBD2 - 6,607*10. Результат представлен в количестве копий кДНК исследуемого гена по отношению к 1 млн количества копий гена актина. Коэффициент HBD2/ TLR2=3,01995172. Изменений в показателях врожденного иммунитета не выявлено. Больному назначено консервативное лечение.
3
3
Пример 3. Ребенок С., 4 года, поступил на прием к ЛОР-врачу с жалобами на затруднение носового дыхания в течение 6 месяцев, храп в ночное время, кашель по утрам, периодически переспрашивает. Из анамнеза известно, что ребенок болел ОРИ и аденоидитом пять раз за последний год. Эпизоды острого среднего отита за последний год не отмечались. Ребенок посещает детский сад. При осмотре: носовое дыхание затруднено, слизистая розовая, средние носовые ходы свободны, в общих носовых ходах вязкая слизь. Миндалины II степени, по задней стенке глотки стекает слизь. МТ AD et AS бледные, втянутые. Проведена тимпанометрия, по результатам которой определялся тип «С» на оба уха. Ребенку была сделана диагностическая эндоскопия носоглотки: В носоглотке определяется лимфоидная ткань, на 2/3 прикрывающая просвет хоан. Лимфоидная ткань отечная, покрыта слизью. Глоточные устья слуховых труб прикрыты отечной лимфоидной тканью. Был поставлен диагноз: Острый аденоидит, двусторонний тубоотит, гипертрофия аденоидных вегетаций II-III степени. Со слизистой полости носа был получен соскоб и методом ПЦР определена экспрессия генов TLR2 и HBD2. Уровень экспрессии гена TLR2 составил 5,012*10, гена HBD2 - 2,754*10. Результат представлен в количестве копий кДНК исследуемого гена по отношению к 1 млн. кол-ва копий гена актина. Коэффициент HBD2/ TLR2=0,549540874. Больному назначено консервативное лечение.
3
3
Пример 4. Ребенок В., 5 лет, поступил на диспансеризацию к ЛОР-врачу. Активных жалоб не предъявляет. Спит с закрытым ртом. За последний год болел ОРИ 2 раза, при этом острых средних отитов, экссудативных средних отитов выявлено не было. При осмотре: носовое дыхание свободное, слизистая оболочка полости носа розовая, Общие и средние носовые ходы свободны. Миндалины II степени, без налетов и наложений. Задняя стенка глотки розовая, чистая. Отоскопия: МТ AD et AS бледные, контурируются. Проведена тимпанометрия, по результатам которой определялся тип «А» на оба уха. Проведена диагностическая эндоскопия носоглотки: В носоглотке определяется лимфоидная ткань, на 1/3 прикрывающая просвет хоан. Лимфоидная ткань не отечная. Глоточные устья слуховых труб обозримы. Трубные валики обычных размеров. Со слизистой полости носа был получен соскоб и методом ПЦР определена экспрессия генов TLR2 и HBD2. Уровень экспрессии гена TLR2 составил 1,175*10, уровень экспрессии гена HBD2 составил 19,50*10. Результат представлен в количестве копий кДНК исследуемого гена по отношению к 1 млн количества копий гена актина. Коэффициент HBD2/ TLR2=16,59586907. Нарушения в мукозальном иммунитете не выявлены. Был поставлен диагноз: здоров, аденоиды I степени.
Способ осуществляли на базе детской Морозовской больницы и «НЦЗД» МЗ РФ.
В таблице 1 представлены обобщенные данные экспрессии генов молекул врожденного иммунитета (TLR2 и HBD2) в слизистой оболочке носа у здоровых детей в возрасте от 3-х до 7-ми лет, детей с гипертрофией аденоидов II и III степени, которым показано консервативное лечение (группа I), у часто болеющих детей с гипертрофией лимфоидной ткани носоглотки, сопровождающейся частыми отитами и ОРВИ, которым показано хирургическое лечение (группа II).
Было выявлено, что у детей с аденоидами II-III, III степени, у которых отмечаются эпизоды ОРИ и аденоидитов более 6 раз за год острые средние, с экссудативными средними отитами, снижением слуха (группа II), отмечено резкое увеличение экспрессии гена распознающего рецептора TLR2, сочетается со сниженной экспрессией гена противомикробного пептида бета-дефензина - HBD2. Исследуемый коэффициент HBD2/ TLR2 у детей этой группы детей менее 0,1. В то время как в группе детей, которым показано консервативное лечение (группа I), этот коэффициент определяется в диапазоне от 0,1 до 10. У здоровых детей значения коэффициента более 10. Выявленный дисбаланс в распознающих и эффекторных молекулах врожденного иммунитета может быть одной из причин возникновения аденоидита, гипертрофии лимфоидной ткани носоглотки, которая, в свою очередь, может приводить к блоку глоточных устьев слуховых труб, средним отитам, а это, в свою очередь, является показанием для оперативного лечения.
Предлагаемый способ прост, доступен для применения в большинстве клиник и, несомненно, будет способствовать правильному ведению пациентов с воспалительными заболеваниями ЛОР-органов.
Использование способа позволяет решить важную практическую задачу в определении тактики и методов лечения различных воспалительных заболеваний ЛОР-органов, что весьма важно в практическом отношении и основано на конкретных показателях.