Иммуномодулирующая активность вакцинного штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита при экспериментальном онкогенезе

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ВАКЦИ нного ШТАММА ВИРУСА ВЕНЕСУЭЛЬСКОГО ЭНЦЕФАЛОМИЕЛИТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ОНКОГЕНЕЗЕ

Л.Н. Уразова, А.Ю. Г ромова, Т.И. Кузнецова

ГУ НИИ онкологии Томского научного центра СО РАМН

Пpeдстaвлeны данные по изучению влияния вакцинного штамма в^уса венесуэльского энцефаломиелита на paзличныe звенья иммунной системы мышей с пepeвивaeмыми опухолями и в условиях модельована ситуации paзвития втоpичныx опухолей (условное мeтaстaзиpовaниe) после удаления пepвичныx опухолевых узлов. Результаты пpовeдeнныx исследований показали, что изученный в^ус оказывает модул^ующее воздействие как на специфические (цитостатическая и су^ес-соpнaя активность лимфоцитов), так и неспецифические ^акция НКК, митогенный ответ лимфоцитов) пapaмeтpы иммунного ответа.

IMMUNOMODULATED ACTIVITY OF VACCINE STRAIN OF VENEZUELAN ENCEPHALOMYELITIS VIRUS IN EXPERIMENTAL ONCOGENESIS

L.N. Urazova, A.Yu. Gromova, T.I. Kuznetsova

Cancer Research Institute, Tomsk Scientific Center, SB RAMS

This review present the data on the influence of vaccine strain of Venezuelan encephalomyelitis virus on various links of immune system of mice with inoculated tumors and under conditions of modulating the situation of secondary tumor development after the removal of primary tumor. The results of the study showed that Venezuelan encephalomyelitis virus exerted influence on both specific (cytostatic and suppressor activities of lymphocytes) and non-specific (reaction of normal killer-cells, mitogenic response of lymphocytes) parameters of immune response.

Одним из наиболее перспективных направлений лечения злокачественный новообразований является использование терапевтических методов воздействия, позволяющих одновременно не только повреждать опухолевые клетки, но и активировать антибластом-ные потенции организма [4, 9-11, 13]. Актуальным представляется использование некоторый вакцинных штаммов вирусов, способных индуцировать изменения антигенной и иммуногенной характеристик опухолевых клеток и их лизис, вызывать образование интерферона, а также неспецифически модулировать иммунные реакции организма [12, 14]. Однако несмотря на многочисленные публикации, посвященные проблеме использования вирусов в терапии злокачественных опухолей, вопрос о механизмах, обеспечивающих их противоопухолевый эффект, практически не освещен, хотя актуальность его очевидна [4, 9, 10, 14]. В связи с этим целью представленной работы явилось изучение влияния вируса венесуэльского энцефаломиелита (ВЭЛ) на функциональную активность спленоцитов на фоне экспериментального онкогенеза.

Материалы и методы исследования

Эксперименты проведены на инбреднык половозрелых мышах линий БЛЬБ/е и С57ВЖТ массой 18-20 г, полученных из питомника лаборатории экспериментального биомоделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Содержание живот-нык осуществлялось в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальный и научных целей (Страсбург, 1986). В качестве экспериментальных моделей опухолевого роста использовались солидный вариант аденокарциномы Эрлиха и карцинома легких Льюис, которые перевивались взвесью опухолевых клеток в количестве 5х106/мы1Шь в мышцу задней лапы. В работе использован аттенуированный штамм вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ). Нативная вируссодержащая суспензия в объеме 0,2 мл, содержащая 104-105 ТЦД50/мл (единиц цитопатического действия/мл) вируса, вводилась мышам однократно на 3-и сут после перевивки опухолей. Иммунологические показатели оценивались у мышей

с первичными опухолями Эрлиха и Льюис на 10-е и 20-е сут после введения вируса ВЭЛ. При изучении роста вторичных опухолей Эрлиха первичные опухоли, развившиеся в подушечке лапы, через 6-7 сут удаляли, ампутируя конечность по голеностопному суставу. Сразу после операции животным под кожу бедра задней конечности имплантировали ту же дозу клеток, что и при индукции первичных опухолей, с целью моделирования вторичных опухолей, или «условных метастазов». Динамику роста «условных метастазов» оценивали аналогично соответствующему показателю первичных опухолей. Способность лимфоцитов к пролиферации в ответ на неспецифические стимулы оценивали в реакции бласттрансформации лимфоцитов по включению 3Н-тимидина в ДНК пролиферирующих клеток в присутствии митогенов - конканавали-на А (КонА, 5 мкг/мл, «8егуа») и липополисахарида Е.соИ (ЛПС, 10 мкг/мл, «Sigma»). Пролиферативный ответ эффекторов оценивался на сцинтилляционном $-счетчике по включению 3Н-тимидина в клетки-мишени. Цитостатическую активность спленоцитов определяли по их способности подавлять пролиферацию клеток-мишеней мастоцитомы Р-815, либо аутологичных опухолевых клеток по методу ва&о1 (1982) в модификации И.В. Богдашина (1986). Показатели индуцированной митогенами супрессорной активности спленоцитов определяли по методике А.Н. Чередеева (1985). Спленоциты мышей-опухоленосителей инкубировались с супердозой КонА, затем обрабатывались мито-мицином С для подавления синтеза ДНК. Эффекторы добавляли в соотношении 1:1 к аллогенным спленоци-там интактных животных, предварительно стимулированным КонА. Для тестирования естественной киллер-ной активности лимфоцитов применяли метод М.Н. Рыковой с соавт. (1981). В качестве мишеней использовали клетки эритромиелолейкоза человека К-562, меченные 3Н-уридином. Результаты экспериментов обрабатывали методами вариационной статистики: подсчитывали среднее арифметическое, ошибку средней. Значимость различий между выборками определяли с помощью непараметрического критерия Вил-коксона - Манна - Уитни.

Результаты и обсуждение

Прогрессирующий рост первичных опухолей Эрлиха приводил к постепенному угнетению иммунных функций, что согласуется с данными литературы [2, 7]. Определение на 10-е сут после введения вируса спон-

10-е сутки после введения вируса 20000 т-----------

18000

16000

14000

12000

10000

8000

6000

4000

2000

о

Стншіїїіая пролиферация

КонА *

5, лпс

І

1

Рис. 1. Пролиферативная активность спленоцитов мышей с карциномой Эрлиха в ответ на митогены.

Примечания: 1 - интактные; 2 - опухоленосители; 3 -опухоленосители + вирус ВЭЛ; различия статистически значимы с соответствующим показателем: * - группы 1

танной пролиферации, а также пролиферативной активности спленоцитов в ответ на Т- и В-клеточные митогены показало, что эти параметры были снижены в группе 2 (опухоленосители), оставаясь в группе 3 (опухоленосители, получившие терапию вирусом ВЭЛ) сопоставимыми с аналогичными показателями у интактных мышей (группа 1). Полученные данные представлены на рис. 1. Кроме того, в указанный срок у мышей, которым вводили вакцину, была отчетливо снижена супрессорная активность спленоцитов (22 %) в сравнении с таковой у нелеченых животных (50,4 %). На рис. 2А, ЗА представлены данные, характеризующие способность клеток селезенки к цитостатическо-му и мембранотоксическому действию на 10-е сут после введения вируса. У мышей-опухоленосителей цитостатическая активность спленоцитов несколько выше, а активность натуральных киллеров ниже, чем у интактных животных, что согласуется с литературными данными [7, 8]. У мышей, получивших вирус, мы наблюдали выраженное увеличение этих показателей на 10-е сут после введения вируса (рис. 2А). Однако на 20-е сут различия между перечисленными параметрами у животных с первичными опухолями контро льных (опухоленосители) и опытных (опухоленосители, получившие терапию вирусом) групп статистически недостоверны, что согласуется с данными, полученными нами в опытах іп уіуо, - на 23-25-е сут у мышей опытных групп вновь начинают интенсивно развиваться опухоли. Сопоставимы индексы цитостатической и

х

К

Рис. 2. Влияние вируса ВЭЛ на цито статическую активность спленоцитов мышей с карциномой Эрлиха. Примечания: 1 - интактные; 2 - опухоленосители; 3 -опухоленосители + вирус ВЭЛ; различия статистически значимы с группой: * - 1

£

=

2 3

Ю-с суткн гтосле мслсння вируса

І

ІУ-с суті послс введення вируса

Рис. 3. Влияние вируса ВЭЛ на мембранотоксическую активность спленоцитов мышей с карциномой Эрлиха. Примечания: 1 - интактные; 2 - опухоленосители; 3 -опухоленосители + вирус ВЭЛ; различия статистически значимы с группой: * - 1

мембранотоксической активности спленоцитов мышей групп 2 и З (рис. 2Б, ЗБ), которые ниже в сравнении с аналогичными, полученными на 10-е сут после введения вируса, и существенно ниже, чем у интактных животных (рис. 2А, ЗА). При этом также повышается супрессорная активность лимфоцитов: на 20-е сут после введения вируса индекс супрессии у мышей контрольной и опытной групп был равен соответственно, 80,5 % и ll %, что примерно в З раза выше, чем у интактных животных (26,2 %).

При оценке характера иммунной реакции у мышей с вторично привитыми опухолями («условными метастазами») на 8-20-е сут после введения вируса мы получили аналогичные результаты - вирус опосредованно стимулировал регистрируемые показатели, однако реакция иммунной системы была более растянута во времени (их снижение наблюдалось в более поздние сроки, чем у животных опытных групп с первичной опухолью). Кроме того, в указанные сроки наблюдения определяемые показатели у оперированных животных были несколько выше, чем у животных, опухоли у которых не были удалены, следовательно, вторичные не перевивались.

На рис. 4 представлены данные, характеризующие пролиферативную активность спленоцитов мышей с «условными метастазами» карциномы Эрлиха на 8-е и 22-е сут после введения вируса (группа З). Показано, что на 22-е сут ответ спленоцитов на митогены у мышей этой группы выше, чем у животных группы 2, однако несколько ниже, чем у интактных (группа 1). При оценке в динамике ответа супрессорного звена иммунитета показано, что на 8-е сут индекс супрессии у животных группы 2 был равен 59 %, группы З - 1З %, а на 22-е сут - 66 % и 48 % соответственно.

Мы также оценили влияние вируса ВЭЛ на иммунологические показатели мышей с карциномой легких Льюис на фоне удаления первичных опухолей. Вирусная вакцина вводилась на 6-е сут после имплантации опухолевых клеток. В качестве клеток-эффекторов в тестах in vitro использовали спленоци-ты мышей следующих групп: 1 - интактные; 2 - с LLC без операции; З - с LLC, инфицированные вирусом ВЭЛ; 4 - оперированные с LLC; 5 - оперированные с LLC, инфицированные вирусом ВЭЛ. Как и в ситуации с опухолью Эрлиха, у неоперированных живот-ных-опухоленосителей с карциномой легких Льюис цитостатическая активность спленоцитов несколько выше (рис. 5), а активность натуральных киллеров ниже (рис. 6), чем у интактных животных, что не про-

Рис. 4. Влияние вируса ВЭЛ на пролиферативную активность спленоцитов мышей с вторичными опухолями Эрлиха. Примечания: 1 - интактные мыши, 2 - опухоленосители, 3 -опухоленосители + вирус ВЭЛ; * - различия статистически значимы с группой 1; при р<0,05; ** - при р<0,01

I. м м.

Рис. 6. Влияние вируса ВЭЛ на мембранотоксическую активность спленоцитов мышей с карциномой Льюис. Примечания: 1 - интактные мыши; 2 - опухоленосители без операции; 3 - опухоленосители без операции + вирус ВЭЛ; 4 - мыши с удаленными опухолями; 5 - мыши с удаленными опухолями + вирус ВЭЛ; различия статистически значимы с группой: * - 1 (р<0,01);

** - 2

Группы мышей

Рис. 5. Влияние вируса ВЭЛ на цитостатическую активность спленоцитов мышей линии С57В1/6 с карциномой Льюис.

Примечания: 1 - интактные мыши; 2 - опухоленосители без операции; 3 - опухоленосители без операции + вирус ВЭЛ; 4 -мыши с удаленными опухолями; 5 - мыши с удаленными опухолями + - вирус ВЭЛ; * - различия статистически значимы с группой 1: * - при р<0,05; ** - при р<0,01

КонА @ ЛПС

1

I

л

I

I

л

1 2 3 4 5

Группы мышей

Рис. 7. Влияние вируса ВЭЛ на пролиферативную активность спленоцитов мышей с карциномой Льюис в ответ на митогены.

Примечания: 1 - интактные мыши; 2 - опухоленосители без операции; 3 - опухоленосители без операции + вирус ВЭЛ; 4 -мыши с удаленными опухолями, 5 - мыши с удаленными опухолями + вирус ВЭЛ; различия статистически значимы с группой: * - 1

тиворечит литературным данным [7, 8]. У животных, получивших вирус, мы наблюдали увеличение этих показателей. Однако у животных, оперированных в те же сроки после имплантации, эти показатели были еще выше, чем у мышей без удаления опухолей. Та же тенденция наблюдалась и при сравнении в указанные сроки пролиферативного ответа на митогены спленоцитов мышей - носителей первичных опухолей ЬЬС и мышей с ЬЬС, леченных вирусом, с аналогичным показателем клеток-эффекторов, взятых у мышей после операции (рис. 7). Через 7 сут после операции регистрируемые показатели активности иммунной системы этих мышей были несколько выше, чем у животных с опухолями. Согласно полученным нами данным, у мышей с карциномой Льюис операция приводила к увеличению массы метастазов в легких, чего не наблюдалось у мышей, получивших вирус ВЭЛ. Однако в сроки, когда проводилось исследование (до 20 сут), мы не наблюдали описанного в литературе снижения вышеперечисленных параметров иммунологической активности. Это объясняется, по-видимому, небольшим объемом хирургического вмешательства и выбором срока исследования, когда животные уже прошли период послеоперационного восстановления. С другой стороны, известно, что избыток опухолевых клеток и, соответственно, опухолевого антигена может тормозить развитие иммунного ответа, стимулируя Т-супрес-соры [3]. В связи с этим удаление опухолей, в сочетании с активностью исследуемого вируса приводило к усилению противоопухолевых иммунных функций, в результате чего и происходило более выраженное снижение послеоперационного метастазирования у животных, получивших вирус, в сравнении с опытными группами, состоящими из неоперированных животных.

При постановке реакции бласттрансформации лимфоцитов здоровых мышей в ответ на опухолевые клетки, взятые у мышей с карциномой Эрлиха на 8-е сут после введения вируса, было установлено, что индекс стимуляции пролиферации спленоцитов в 1,41,7 раза выше при добавлении в качестве антигена опухолевых клеток от мышей, получивших вирус, по сравнению с аналогичным показателем, полученным при использовании опухолевых клеток от нелеченых мышей-опухоленосителей (рис. 8).

Таким образом, результаты проведенных исследований достаточно убедительно показали, что механизмы противоопухолевой активности аттенуированного

Рис. 8. Пролиферативная реакция спленоцитов мышей в ответ на опухолевые клетки.

Примечания: А - соотношение эффекторы: антиген равно 2:1; Б - соотношение эффекторы: антиген равно 1:1: 1 -опухолевые клетки животных с карциномой Эрлиха; 2 -опухолевые клетки мышей с карциномой Эрлиха, инфицированных вирусом ВЭЛ; * - различия статистически значимы с группой 1

штамма вируса ВЭЛ базируются не только на прямом лигическом воздействии на опухолевые клетки, как было показано ранее, но и на модуляции активности эффек-торных и регуляторных клеток иммунной системы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Богдашин И.В. Цитостатическое действие клеток иммунной системы на опухолевые клетки // Бюл. эксп. биол. и мед. 1986. № 6. С. 744-746.

2. Кусмарцев С.А. Функциональное состояние В-лимфоцитов и активность супрессоров костного мозга на этапах злокачественного роста: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Томск, 1990. 26 с.

3. Мате Ж. Активная иммунотерапия рака, иммунопрофилактика и иммунореабилитация. М.: Медицина, 1980. 424 с.

4. Моисеенко В.М., Балдуева И.А., Хансон К. П. Вакцинотерапия злокачественных опухолей // Вопр. онкологии. 1999. Т. 45, № 3. С. 327-332.

5. Ройт А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991. 322 с.

6. Рыкова М.Н., Спиранде И.В., Зедгенадзе М.С. и др. Высокочувствительная модификация метода определения активности нормальных киллеров // Иммунология. 1981. № 3. С. 88-90.

7. Станкевич С.А. Функциональное состояние клеток тимуса и их участие в регуляции иммунитета при опухолевом росте: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. Томск, 1990. 24 с.

8. Фердат А.К., Муцениеце А.Я. Механизмы противоопухолевого действия вирусов и проблема иммунотерапии опухолей // Вопр. онкологии. 1988. Т. 34, № 11. С. 43-48.

9. Хансон К.П., Афанасьев Б.В., Берштейн Л.М. и др. Современные тенденции в развитии биологической терапии злокачественных опухолей // Вопр.онкологии. 1996. Т. 42, № 5. С. 7-13.

10. Якубовская Р.И. Современные подходы к биотерапии рака // Русский биотерапевт. журнал. 2002. Т. 1, № 3. С. 5-14.

11. Davis I. An overview of cancer immunotherapy // Immunol. Cell. Biol. 2000. Vol. 78. P. 179-195.

12. Deweese T. A phase l trial of CV706, a replication-competent, PSA selective oncolytic adenovirus, for the treatment of locally recurrent prostate cancer following radiation therapy // Cancer Res. 2001. Vol. 61. P 7464-7472.

13. Gavilondo I., Larrick J., Borrebaeck C. Human antibodies therapy // Immunologist. 2000. Vol. 8. P. 58-65.

14. Papanastassiou V et al. The potential for efficacy of the modified (ICP34.5(-) herpes simplex virus HSV11716 following intratumoural injection into human malignant glioma: a proof of principle study // Gene Ther. 2002. Vol. 9. P 398-406.

Поступила 12.09.05