Способ лечения нейродегенеративных заболеваний
METHOD FOR TREATING NEURODEGENERATIVE DISEASES

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ лечения нейродегенеративных заболеваний путем использования содержащей эффективное количество пептида HAEE в эквимолярном комплексе с цинком и человеческим сывороточным альбумином фармацевтической композиции HAEE-Zn-HSA в форме спрея для местного назального применения.
Болезнь Альцгеймера (далее БА) является самой распространенной нейродегенеративной патологией в мире и клинически сопровождается неуклонным снижением когнитивных функций (Гаврилова С.И. (2007). Фармакотерапия болезни Альцгеймера. Москва: Пульс.). Наследственные варианты болезни Альцгеймера составляют менее 1% всех случаев этой патологии и ассоциированы с мутациями в генах (Rogaev E.I., Sherrington R., Rogaeva E.A., Levesque G., Ikeda M., Liang Y., Chi H., Lin C., Holman K., Tsuda T., and Et Al. (1995) Familial Alzheimer's disease in kindreds with missense mutations in a gene on chromosome 1 related to the Alzheimer's disease type 3 gene. Nature. 376, 775-778), приводящими к конституциональному превышению физиологически нормального уровня бета-амилоида (Aв), – короткого гетерогенного по С-концу полипептида длиной 39-43 аминокислотных остатков (Querfurth H.W., and Laferla F.M. (2010) Alzheimer's Disease. New England Journal of Medicine. 362, 329-344).
В патенте РФ № 2414925, публ.27.03.2011 представлено применение терапевтического человеческого альбумина для изготовления лекарственного средства для лечения пациентов, страдающих когнитивными расстройствами путем терапевтической плазмафильтрации. При этом, альбумин присутствует в среде замены при концентрации от 4% вплоть до 25 мас.%/об. При некоторых применениях альбумин присутствует при концентрации примерно от 4,5% до 5,5 мас.%/об. Причем независимо от концентрации бета-амилоида в крови, при применении терапевтической плазмафильтрации и замены объема нормоволемии альбумина с определенной частотой терапии происходит увеличение объема гиппокампа, которому сопутствует улучшение клинических симптомов болезни Альцгеймера. Это может быть следствием факторов, которые являются растворимыми и проницаемыми через гематоэнцефалический барьер. Однако способ плазмафильтрации часто вызывает осложнения и применим не для всех категорий пациентов.
Согласно широко принятой «амилоидной гипотезе», превращение физиологически нормального Aв из мономерного состояния в растворимые нейротоксичные олигомеры, а затем в нерастворимые полимерные агрегаты, которые в конце концов накапливаются в виде амилоидных бляшек, является пусковым процессом патогенеза БА (Karran E., Mercken M., and De Strooper B. (2011) The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10, 698-712.). Поэтому предотвращение церебрального амилоидогенеза путем ингибирования патологической олигомеризации Aв, т.н. анти-амилоидная терапия, считается наиболее перспективной стратегией лечения БА (Schenk D., Basi G.S., and Pangalos M.N. (2012) Treatment Strategies Targeting Amyloid в-Protein. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine.). Было найдено, что синтетический пептид HAEE специфически связывается с металл-связывающим доменом 1-16 Aв по участку 11-14, блокирует цинк-индуцированную димеризацию домена и замедляет агрегацию полноразмерного Aв in vitro (Tsvetkov P.O., Cheglakov I.B., Ovsepyan A.A., Mediannikov O.Y., Morozov A.O., Telegin G.B., and Kozin S.A. (2015) Peripherally Applied Synthetic Tetrapeptides HAEE and RADD Slow Down the Development of Cerebral beta-Amyloidosis in AbetaPP/PS1 Transgenic Mice. J Alzheimers Dis. 46, 849-853). Внутривенные инъекции пептида HAEE замедляли развитие церебрального амилоидогенеза у мышей линии B6C3-Tg(APPswe, PSEN1-dE9)85Dbo/j, которые используются в качестве животной модели БА: среднее число амилоидных бляшек на срезе мозга уменьшалось с 14.2 ± 3.1 (для контрольных животных) до 5.8 ± 2.1 (для животных, подвергнутых терапевтическому воздействию) (Tsvetkov P.O., Cheglakov I.B., Ovsepyan A.A., Mediannikov O.Y., Morozov A.O., Telegin G.B., and Kozin S.A. (2015) Peripherally Applied Synthetic Tetrapeptides HAEE and RADD Slow Down the Development of Cerebral beta-Amyloidosis in AbetaPP/PS1 Transgenic Mice. J Alzheimers Dis. 46, 849-853.). По этому показателю эффективность препарата HAEE значительно превосходит анти-амилоидное действие Alzhemed (Tramiprosate) - одного из самых известных анти-агрегационных лекарственных кандидатов для лечения болезни Альцгеймера (Aisen P.S., Gauthier S., Ferris S.H., Saumier D., Haine D., Garceau D., Duong A., Suhy J., Oh J., Lau W.C., and Sampalis J. (2011) Tramiprosate in mild-to-moderate Alzheimer's disease - a randomized, double-blind, placebo-controlled, multi-centre study (the Alphase Study). Arch Med Sci. 7, 102-111.). При использовании Alzhemed в трансгенных мышах линии TgCRND8 происходило уменьшение числа амилоидных бляшек на 30% по сравнению с контрольными животными (Gervais F., Paquette J., Morissette C., Krzywkowski P., Yu M., Azzi M., Lacombe D., Kong X., Aman A., Laurin J., Szarek W.A., and Tremblay P. (2007) Targeting soluble Aв peptide with Tramiprosate for the treatment of brain amyloidosis. Neurobiology of Aging. 28, 537-547.). Таким образом, в настоящее время пептид HAEE является одним из самых эффективных антиамилодных препаратов в мире (Goyal D., Shuaib S., Mann S., and Goyal B. (2017) Rationally Designed Peptides and Peptidomimetics as Inhibitors of Amyloid-в (Aв) Aggregation: Potential Therapeutics of Alzheimer’s Disease. ACS Combinatorial Science. 19, 55-80.). Молекулярный механизм антиамилоидного действия тетрапептида HAEE хорошо установлен (Козин С.А., Барыкин Е.П., Митькевич В.А., Макаров А.А. (2018) Антиамилоидная терапия болезни Альцгеймера: современное состояние и перспективы. Биохимия. 83, 1331-1342.), и для оказания своего терапевтического воздействия эта субстанция должна проникать сквозь гематоэнцефалический барьер (ГЭБ).
Из уровня техники известно изобретение с целью лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера, имеющее отношение к новому пептидному соединению Ra-R1-R2-R3-R4-Rb (I) или Ra-R4-R3-R2-R1-Rb (II), где Ra представляет собой N-концевую первичную аминную группу аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную аминозащитной группой, Rb представляет собой гидроксильную группу С-концевой карбоксильной группы аминокислоты R1 или R4, либо свободную, либо замещенную гидроксизащитной группой, и R1-R2-R3-R4 или R4-R3-R2-R1 представляют собой HADD, KADD, DDAK, RADD, DDAR, KAED, DEAK, RAED, DEAR, HADE, EDAH, KADE, EDAK, RADE, EDAR, HAEE, EEAH, KAEE, EEAK, RAEE и EEAR, главным образом используемому для связывания с в-амилоидными пептидами и/или предотвращения или уменьшения образования амилоидных бляшек, главным образом за счет ингибирования полимеризации вышеупомянутого амилоидного пептида в виде амилоидных бляшек. Причем, предпочтительно пептидное соединение, соответственно данному изобретению, выбрано из соединений с формулой (I) или (II), где R1-R2-R3-R4 или R4-R3-R2-R1, представлено одним из двух тетрапептидов HAEE и RADD. Наиболее предпочтительные пептидные соединения соответствуют формулам Ac-HAEE-NH2 и Ac-RADD-NH2. Также описана композиция для снижения или предотвращения связывания ионов Zn (II) с в-амилоидным пептидом, содержащая в качестве активного вещества указанное пептидное соединение, степень чистоты которого составляет по меньшей мере 98%, и фармацевтически приемлемый носитель для парентерального, чрескожного или чресслизистого введения. (патент РФ № 2588143 от 24.10.2011года, правообладатель КИМОНЕЛЛА ВЕНЧЕРС ЛТД (CY)).
Однако известно, что короткие заряженные пептиды типа HAEE имеют очень короткое время жизни в плазме крови (от нескольких секунд до нескольких минут) и с трудом проходят через ГЭБ, что существенно ослабляет эффективность их терапевтического воздействия (Fosgerau K., and Hoffmann T. (2015) Peptide therapeutics: current status and future directions. Drug Discovery Today. 20, 122-128; Wade J., and Otvos L. (2014) Current Challenges in Peptide-based Drug Discovery. Frontiers in Chemistry. 2.).
Известно, что альбумин обеспечивает транспорт ряда пептидов, включая бета-амилоид, через ГЭБ (Boada M., Anaya F., Ortiz P., Olazaran J. (2017) Efficacy and Safety of Plasma Exchange with 5% Albumin to Modify Cerebrospinal Fluid and Plasma Amyloid-в Concentrations and Cognition Outcomes in Alzheimer's Disease Patients: A Multicenter, Randomized, Controlled Clinical Trial. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 56, 129-143.) и образует стабильный комплекс с одним ионом цинка (Blindauer C.A., Harvey I., Bunyan K.E., Stewart A.J., Sleep D., Harrison D.J., Berezenko S., and Sadler P.J. (2009) Structure, Properties, and Engineering of the Major Zinc Binding Site on Human Albumin. Journal of Biological Chemistry. 284, 23116-23124.).
Известно, что HAEE образует специфический эквимолярный комплекс с цинк-связанным альбумином - HAEE-Zn-HSA.(патент №2709539), который в форме раствора для внутривенного введения, где фармацевтически приемлемым носителем является, например, физиологический раствор, позволяет при внутривенном введении экспериментальным животным:
˗ в два раза увеличить время полувыведения HAEE из организма;
˗ в пять раз увеличить биодоступность этой субстанции в мозге;
˗ на 20% улучшить когнитивные функции экспериментальных животных, по сравнению с чистым тетрапептидом HAEE.
Недостатком является то, что внутривенное введение композиции HAEE-Zn-HSA требует специально обученного медицинского персонала. Кроме того, недостаточное повышение когнитивных функций экспериментальных животных при внутривенном введении указанной композиции.
Задачей изобретения является расширение арсенала способов лечения нейродегенеративных заболеваний с использованием композиции HAEE-Zn-HSA.
Технический результат – повышение удобства введения композиции HAEE-Zn-HSA наряду с сохранением биодоступности и длительности действия активной субстанции - пептида HAEE, а также когнитивных функций у экспериментальных животных. Дополнительным преимуществом является отсутствие существенных различий между назальной и внутривенной формами выпуска препарата.
Поставленная задача достигается тем, что способ лечения нейродегенеративных деменций, в том числе болезни Альцгеймера, включает введение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество субстанции HAEE в эквимолярном комплексе с цинком и человеческим сывороточным альбумином (HAEE-Zn-HSA) в форме спрея для местного назального применения. Спрей как лекарственная форма (ЛФ) сейчас очень активно начинает использоваться в медицинской практике, т.к. его применение не требует использования специально обученного медицинского персонала, отсутствует опасность загрязнения лекарственного препарата извне, за счет того баллон герметически   закрыт, обеспечивается точная дозировка при использовании дозирующих клапанов, и др.
Авторами настоящего изобретения экспериментально доказано, что способ введения композиция HAEE-Zn-HSA в форме спрея для местного назального применения, по сравнению с ее введением внутривенно, характеризуется не только более практичным и универсальным способом применения, но и имеет доказанный уровень эффективности воздействия тетрапептида HAEE.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.
Фиг.1. График «Результаты анализа пространственной памяти у экспериментальных  животных по итогам  теста Водный лабиринт Морриса».
Фиг.2. График «Результаты анализа пространственной долговременной памяти у экспериментальных животных по итогам  теста Т-образный водный лабиринт».
Фиг.3. График «Результаты анализа формирования долговременной памяти у экспериментальных животных в тесте «формирование страха».
ПРИМЕР 1.
Исследования фармакокинетики субстанции HAEE в композиции HAEE-Zn-HSA, меченой тритием (радиохимическая чистота более 98%), выполнены на кроликах породы Шиншилла. Определяли значения основных фармакокинетических показателей при однократном внутривенном и назальном введении композиции HAEE-Zn-HSA. Усредненные значения основных фармакокинетических показателей субстанции HAEE после однократного назального и однократного внутривенного введения композиции HAEE-Zn-HSA кроликам в дозе 120 мкг/кг приведены в таблице 1.
Таблица 1
Фармакокинетический показатель, единица измерения
Значение при назальном введении
Значение при внутривенном  введении
D, нг
440000
440000
Cmax, нг/мл
261
255
Tmax, мин
4
4
AUC(0-∞), (нг/мл)*мин
4352
4421
Cmax/AUC(0-∞), мин-1
0,06
0,058
Clт, мл/мин
105
100
MRT, мин
26
29
Kel, мин-1
0,037
0,035
T1/2(el), мин
19
20
Vd(B), мл
2920
2860
r2
0,997
0,9980
где
D – введенная доза вещества;
Cmax - максимальное измеренное значение концентрации вещества в плазме крови;
Tmax – время достижения максимальной концентрации вещества в плазме крови;
AUC0-∞ - площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время от нуля до бесконечности;
Cmax/AUC(0-∞) - относительная скорость всасывания;
Clт – общий клиренс (объем плазмы, который очищается от препарата в единицу времени);
MRT – среднее время удержания (среднее время пребывания соединения в крови);
Kel - константа скорости выведения вещества из крови;
T1/2(el) - время полувыведения вещества из крови;
Vd - кажущийся объем распределения вещества в центральном компартменте.
2
r – коэффициент детерминации;
У кроликов максимальная концентрация субстанции HAEE в крови независимо от способа введения отмечается через 4 минуты после применения препарата. Время полувыведения субстанции HAEE из крови кролика при назальном введении составляет 19 минут, при внутривенном – 20 минут. HAEE характеризуется быстрым выведением из крови, которое обусловлено его быстрым распределением по тканям организма с последующим протеолитическим гидролизом также независимо от способа введения. Практически значения всех фармакокинетических показателей близки между собой как при назальном, так и при внутривенном способе введения композиции HAEE-Zn-HSA.
Пример 2.
Однократное назальное введение мышам (N=36) композиции HAEE-Zn-HSA в дозе 300 мкг/кг.
Значения концентрации субстанции HAEE в крови и тканях мышей после однократного назального введения препарата в дозе 300 мкг/кг в различных временных точках приведены в таблице 2.
Для сравнения значения концентрации субстанции HAEE в крови и тканях мышей после однократного внутрибрюшинного введения препарата HAEE в дозе 0,3 мг/кг в различных временных точках приведены в таблице 3.
Из таблиц 3 и 4 видно, что субстанция HAEE характеризуется быстрым выведением из крови, которое обусловлено его быстрым распределением по тканям организма с последующим протеолитическим гидролизом. При этом концентрация субстанции НАЕЕ в мозге через 20 минут при назальном и внутрибрюшинном введении показала одинаковое значение 29±6  пмоль/г.
Сравнение значений фармакокинетических показателей субстанции HAEE в крови и внутренних органах мышей после однократного назального введения препарата HAEE (Н) в дозе 300 мкг/кг, и  после однократного внутрибрюшинного введения препарата HAEE (В) в дозе 0,3 мг/кг  приведены в таблице 4.
где:
Cmax - максимальное измеренное значение концентрации вещества в плазме крови;
Tmax – время достижения максимальной концентрации вещества в плазме крови;
AUC0(0-20) - площадь под фармакокинетической кривой «концентрация-время» от нуля до 20 минут;
Cmax/AUC(0-20) - относительная скорость всасывания от нуля до 20 минут;
fт – тканевая доступность фармакологического средства, fт = AUC(0-20)ткань/AUC(0-20)кровь;
Kd – кажущийся коэффициент распределения фармакологического средства; Kd = Сткань / Скровь.
В исследовании распределения субстанции HAEE между кровью и периферическими тканями, как при назальном, так и при внутрибрюшинном введении, показано, что его максимальная концентрация зафиксирована в тканях почек мышей. Наименьшая концентрация субстанции HAEE отмечена в жировой ткани сальника. Для всех исследуемых органов изменение концентрации HAEE во времени было пропорционально изменению его уровня в системном кровотоке. Также видно, что субстанция HAEE способна преодолевать гематоэнцефалический барьер – для ткани мозга кажущийся коэффициент распределения пептида HAEE при внутрибрюшинном введении имел значение Kd = 0,17, при назальном Kd = 0,13.
Таким образом, приведенные примеры подтверждают, что введение  композиции HAEE-Zn-HSA назально в форме  спрея сохранениет биодоступность и длительность действия активной субстанции - пептида HAEE.
ПРИМЕР 3. Сравнительный анализ влияния композиции HAEE-Zn-HSA, представленной в инъекционной и назальной форме, на когнитивные функции экспериментальных животных.
Для сравнительной оценки влияния HAEE и фармацевтической композиции HAEE-Zn-HSA на характеристики памяти и обучения экспериментальных животных была использована стандартная методика оценки пространственной памяти в водном лабиринте Морриса, метод Т-образного водного лабиринта и тест моделирования страха.
Были использованы пять групп семимесячных мышей:
- мыши линии «App/PSI», подверженные болезни Альцгеймера и не получающие лечение (N «intact» = 10 голов) (группа 1),
- мыши линии «App/PSI» (N «HAEE» = 10 голов), которым вводили препарат HAEE внутривенно в дозе 50 мкг/кг три раза - в возрасте 4, 5 и 6 месяцев перед началом эксперимента) (группа 2),
- мыши линии «App/PSI» (N «HAEE-Zn-HSA» = 10 голов); которым вводили композицию HAEE-Zn-HSA внутривенно в дозе 50 мкг/кг три раза - в возрасте 4, 5 и 6 месяцев перед началом эксперимента) (группа 3),
- мыши линии «App/PSI» (N «HAEE-Zn-HSA» = 10 голов); которым вводили композицию HAEE-Zn-HSA назально в дозе 50 мкг/кг три раза - в возрасте 4, 5 и 6 месяцев перед началом эксперимента) (группа 4),
- контрольные мыши дикого типа (N «wt» = 10 голов) (группа 5).
Пример 3.1. Водный лабиринт Морриса
Водный лабиринт Морриса является классическим инструментом для оценки пространственной памяти, зависящей от функции гиппокампа. Важно отметить, что именно в гиппокампе у пациентов при болезни Альцгеймера и у трансгенных мышей линии «App/PSI» агрессивно развивается церебральный амилоидоз.
Результаты анализа пространственной памяти животных, продемонстрировали значительную разницу между интактными и инъектированными мышами линии «App/PSI». Данные представлены в таблице 5 и на фигуре 1.
При назальном использовании композиции HAEE-Zn-HSA эффект улучшения когнитивных функций  сопоставим с  эффектом при внутривенных инъекциях указанной композиции и даже несколько лучше (группа 3 и группа 4), при этом заметно улучшен по сравнению с введением препарата HAEE (группа 2). Таким образом, фармацевтическая композиция HAEE-Zn-HSA сохраняет эффективность терапевтического действия пептида HAEE при назальном введении.
Пример 3.2.
Установка "Т-лабиринт" позволяет исследовать рабочую память грызунов, лежащую в основе поведения чередования рукавов (спонтанного или подкрепленного) и чувствительную к дисфункции септо-гиппокампальной системы. Водный вариант теста позволяет избежать влияния обонятельных меток, оставляемых животными, и не требует пищевого подкрепления. Он сочетает в себе преимущества "сухого" Т-лабиринта и теста Морриса.
Результаты Т-образного водного лабиринта также подтверждают эффективность композиции HAEE-Zn-HSA, как в инъекционной форме, так и в форме спрея. Причем введение композиции в форме назального спрея (группа 4) также как и в предыдущем примере показывает несколько лучший эффект по сравнению с введением композиции HAEE-Zn-HSA в инъекционной форме (группа 3).  Обе формы показывают свою эффективность по сравнению с введением препарата HAEE (группа 2) и значительно превосходят группу интактных животных. Данные представлены в таблице 6 и на фигуре 2.
Пример 3.3
Тест «моделирование страха» проводят в течение 3-х дней. В первый, тренировочный день, каждое животное помещают в экспериментальную установку с металлической решёткой на полу, и дают возможность свободно исследовать обстановку в течение 120 секунд. В последние 2 секунды теста на решётку подают электрический импульс. Спустя 24 часа ( на 1 день тестирования) животное помещают в ту же установку и регистрируют процент времени, проведённого животным в состоянии замирания (оцепенения) в течение 180 секунд, затем животное оставляли в установке на дополнительные 7 минут, не подавая на решётку электрический импульс. Спустя ещё 24 часа (на 2 день тестирования) животное помещали в экспериментальную установку и в течение 180 секунд измеряли процент времени, проведённого в состоянии замирания (оцепенения).[Strekalova T. et al., 2018].
Замирания являются формой реакции животных на воздействие аверсивного стимула, которым в данном тесте являлся электрический разряд, а время, проведённое животным в состоянии замирания, отражало формирование памяти у животных на контекст, в котором происходило воздействие данного аверсивного стимула. На второй день исследования, после воздействия стимула, мыши 2,3,4 и 5 групп проводили достоверно меньшее время в состоянии замирания по сравнению с животными 1 группы, что указывает на формирование рефлекса долговременной памяти у групп 2,3,4 и 5. (фигура 3).
Во всех поведенческих тестах видна заметная разница между интактными животными и животными из групп экспериментов. Суммарное улучшение когнитивных функций трех экспериментов между первой и четвертой группами составляет 2,84 раза. Эффективность фармацевтической композиции HAEE-Zn-HSA( группы 3, 4) по сравнению с группой 2, которой вводили чистый пептид HAEE,  выше в 1,39 раза.
Эксперименты показывают, что использование композиции HAEE-Zn-HSA в форме назального спрея позволяет повысить удобство введения наряду с сохранением биодоступности и длительности действия активной субстанции - пептида HAEE, а также когнитивных функций у экспериментальных животных  по сравнению с внутривенным введением указанной композиции.
Таким образом, поставленная задача изобретения по расширению арсенала способов лечения нейродегенеративных заболеваний с использованием композиции HAEE-Zn-HSA решена.
Технический результат – повышение удобства введения композиции HAEE-Zn-HSA наряду с сохранением биодоступности и длительности действия активной субстанции - пептида HAEE, а также улучшения когнитивных функций у экспериментальных животных достигнут.