СРЕДА ПОВТОРНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ДЛЯ ПРЕВРАЩЕНИЯ ДЕДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ ХОНДРОЦИТОВ В ХОНДРОЦИТЫ ПРИ ПОВТОРНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ
REDIFFERENTIATION MEDIUM FOR CONVERTING DEDIFFERENTIATED CHONDROCYTES TO CHONDROCYTES WITH REDIFFERENTIATION

Область техники
Настоящее изобретение относится к среде повторной дифференцировки, используемой для превращения при повторной дифференцировке дедифференцированного хондроцита в исходный хондроцит, причем хрящевые характеристики указанного дедифференцированного хондроцита ослаблены вследствие дедифференцировки в процессе культивирования in vitro.
Уровень техники изобретения
Из хряща формируется ухо, нос, трахея, сустав и межпозвоночный диск, и хрящ также важен, как и кости для поддержания природного строения человека и для эффективной ежедневной жизнедеятельности. Когда хрящ поврежден при травме, такой как повреждение суставного хряща, при возрастных заболеваниях, таких как деформирующий артроз, воспалительных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, при обширном повреждении хряща после хирургической операции опухолей и при врожденном пороке повседневная жизнь существенно осложняется так, что жизнедеятельность, такая как ходьба, становится сложной и не поддерживается нормальное положении тела. Количество пациентов, подверженных таким связанным с хрящами заболеваниям, очень велико, и количество пациентов, с проявлениями деформирующего артроза, как оценивают, составляет приблизительно 900000 в год. Следовательно, эффективная терапия таких заболеваний необходима.
Тогда как данные заболевания традиционно лечат, используя искусственный хрящ или трансплантацию собственного хряща пациента, данные способы часто вызывают проблемы прочности, инфекции и нарушения в донорском участке. Следовательно, необходимы способы решения без таких проблем, и экстренно необходимо развитие технологии, позволяющей осуществлять регенеративную терапию хряща.
Технология эффективного культивирования хондроцита необходима для регенеративной терапии хряща. Тогда как опубликовано множество способов культивирования и пролиферации хондроцита (см. патентные документы 1 и 2), хондроцит дедифференцируется в подобные фибробластам клетки в процессе культивирования с достаточно высокой вероятностью. Так как в качестве контрмеры и способов решения в таком случае хондроциты заменяли на подобный фибробласту дедифференцированный хондроцит, предложен способ повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита с использованием гидростатического давления и способ повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в трехмерной культуре. Тем не менее, таково положение вещей, что дедифференцированный хондроцит не может легко и эффективно повторно дифференцироваться в исходный хондроцит такими способами. Для того, чтобы осуществить восстанавливающее хрящ лечение, следовательно, необходимо предложить технологию, способную эффективно и без труда осуществить повторную дифференцировку дедифференцированного хондроцита в исходный хондроцит, причем хрящевые свойства указанного дедифференцированного хондроцита ослаблены вследствие дедифференцировки в процессе культивирования in vitro.
Патентный документ 1: номер публикации Jpn. Pat. Appln. KOKAI 2003-534792
Патентный документ 2: номер публикации Jpn. Pat. Appln. KOKAI 2004-502401
Описание изобретения
Настоящее изобретение направлено на решение традиционных проблем и достигает следующей ниже цели.
А именно, цель изобретения заключается в предоставлении среды для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке и способа превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке, причем среда и способ важны для эффективного получения трансплантационных материалов для дефектных или поврежденных участков носа, уха, трахеи и сустава и косметических материалов для пластической хирургии; способных участвовать в развитии регенеративной терапии хряща и способных эффективно и без труда повторно дифференцировать дедифференцированный хондроцит, который изменяется до подобных фибробластам клеток при дедифференцировке в процессе культивирования in vitro, в исходный хондроцит.
В качестве результата интенсивных исследований авторами изобретения, принимая во внимание существующее положение дел, было обнаружено, что дедифференцированный хондроцит, у которого характерные свойства хряща ослаблялись при дедифференцировке, мог эффективно и без труда повторно дифференцироваться в исходный хондроцит при использовании комбинации инсулина и ВМР-2 и предпочтительно совместно с ТЗ. Изобретение основано на упомянутом выше открытии авторов изобретения, и способы решения упомянутых выше проблем являются следующими:
<1> среда повторной дифференцировки, используемая для превращения дедифференцированного хондроцита в исходный хондроцит при повторной дифференцировке, причем хрящевые характеристики указанного дедифференцированного хондроцита ослаблены вследствие дедифференцировки в процессе культивирования in vitro; причем указанная среда содержит: инсулин и, по крайней мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из BMP-2 и его аналогов;
<2> среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке по пункту <1>, дополнительно содержащая ТЗ;
<3> среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке по любому из пунктов <1> и <2>, в которой аналог BMP-2 представляет собой ВМР-4;
<4> среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке по любому из пунктов с <1> по <3>, в которой инсулин находится в концентрации от 0,05 до 500 мкг/мл;
<5> среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке по любому из пунктов с <1> по <4>, в которой, по крайней мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из ВМР-2 и его аналогов, присутствует в концентрации от 1 нг/мл до 40 мкг/мл;
-9
-5
<6> среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке по любому из пунктов с <1> по <5>, в которой ТЗ присутствует в концентрации от 10 до 10 М;
<7> среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке по любому из пунктов с <1> по <6>, дополнительно содержащая, по крайней мере, один компонент, выбранный из группы, состоящей из фактора роста фибробластов 2 (FGF-2), инсулиноподобных факторов роста (IGF-1), паратиреоидного гормона (РТН), гормона роста (GH), глюкокортикоида, витамина D, антагониста рецептора IL-1, эстрогена, андрогена, трансформирующего фактора роста α (TGF-α), трансформирующего фактора роста β (TGF-β), морфогенетического белка кости (BMP), эпидермального фактора роста, тромбоцитарных факторов роста, трансферрина, селенистой кислоты, линолевой кислоты, альбумина, аскорбиновой кислоты, хондромодулинов, факторов, связывающих гепарин, фактора роста фибробластов α, васкулярного эндотелиального фактора роста, митогенного гормона, фактора роста соединительной ткани, фактора роста гепатоцитов, арахидоновой кислоты, простогландина А, простогландина В, простогландина Е, простогландина F и гистамина;
<8> среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке по любому из пунктов с <1> по <7>, где повторно дифференцированный хондроцит выбран из гиалинового хондроцита и эластического хондроцита;
<9> среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке по любому из пунктов с <1> по <8>, в которой повторно дифференцированный хондроцит культивируют посредством любого из культивирования на твердой среде, трехмерного культивирования и культивирования клеточной массы при осаждении;
<10> способ повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в исходный хондроцит при повторной дифференцировке, причем хрящевые характеристики указанного дедифференцированного хондроцита ослаблены вследствие дедифференцировки в процессе культивирования in vitro, причем указанный способ включает стадию повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в исходный хондроцит посредством культивирования дедифференцированного хондроцита с использованием среды по любому из пунктов с <1> по <9>;
<11> способ повторной дифференцировки по пункту <10>, в котором культивирование продолжается от 3 до 6 недель;
<12> способ повторной дифференцировки по любому из пунктов <10> и <11>, в котором отношение (C/D) величины (С) экспрессии и продукции коллагена II типа в повторно дифференцированных хондроцитах к величине (D) экспрессии и продукции коллагена II типа в дедифференцированном хондроците составляет 1 или более;
<13> способ повторной дифференцировки по любому из пунктов с <10> по <12>, в котором величина экспрессии/продукции коллагена I типа в дедифференцированном хондроците равна или больше чем величина экспрессии/продукции коллагена I типа в хондроцитах живого организма, величина продукции коллагена II типа равна или меньше чем величина экспрессии/продукции коллагена II типа в хондроците живого организма и величина экспрессии/продукции коллагена II типа равна или больше чем величина экспрессии/продукции коллагена II типа в дедифференцированном хондроците; и
<14> способ повторной дифференцировки по любому из пунктов с <10> по <13>, в котором прочность на сжатие, прочность на излом и модуль Юнга в дедифференцированных хондроцитах больше чем прочность на сжатие, прочность на излом и модуль Юнга в повторно дифференцированном хондроците.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показаны фотографии, на которых слева показан хондроцит (Р0) непосредственно после начала культивирования и справа показан хондроцит (Р4) четвертого пассированного пересева приблизительно через 30 дней после начала культивирования соответственно. На фотографиях сверху показаны полосы при электрофорезе, показывающие экспрессию генов в хондроците (Р0) непосредственно после начала культивирования и в хондроците (Р4) четвертого пассированного пересева приблизительно через 30 дней после начала культивирования.
Фиг.2 представляет собой график, показывающий результаты измерения величины экспрессии коллагена I типа в дедифференцированном хондроците, культивированном с использованием среды для повторной дифференцировки, содержащей инсулин, ВМР-2 и Т3 и с использованием среды культивирования, содержащей инсулин и BMP-2.
Фиг.3 представляет собой график, показывающий результаты измерения величины экспрессии коллагена II типа в дедифференцированном хондроците, культивированном с использованием среды для повторной дифференцировки, содержащей инсулин, BMP-2 и Т3, и с использованием среды культивирования, содержащей инсулин и BMP-2.
Фиг.4 представляет собой график, показывающий результаты измерения величины экспрессии коллагена Х типа в дедифференцированном хондроците, культивированном с использованием среды для повторной дифференцировки, содержащей инсулин, BMP-2 и Т3, и с использованием среды культивирования, содержащей инсулин и BMP-2.
Фиг.5 представляет собой график, показывающий данные, полученные при исследовании и сравнении предпочтительных диапазонов содержания BMP-2 в среде повторной дифференцировки, содержащей инсулин, BMP-2 и Т3 для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит в примере 2.
Фиг.6 представляет собой график, показывающий данные, полученные при исследовании и сравнении предпочтительных диапазонов содержания инсулина в среде повторной дифференцировки, содержащей инсулин, BMP-2 и Т3 для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит в примере 2.
Фиг.7 представляет собой график, показывающий данные, полученные при исследовании и сравнении предпочтительных диапазонов содержания Т3 в среде повторной дифференцировки, содержащей инсулин, ВМР-2 и Т3 для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит в примере 2.
-7
Фиг.8 представляет собой график, показывающий результаты измерения величины экспрессии коллагена I типа в среде повторной дифференцировки для повторной дифференцировки культивируемого дедифференцированного хондроцита, когда содержание инсулина, BMP-2 и Т3 составляет 5 мкг/мл, 200 нг/мл и 10 М соответственно, и в среде повторной дифференцировки, имеющей такой же состав, как описано выше, за исключением того, что ВМР-2 заменен на ВМР-4.
-7
Фиг.9 представляет собой график, показывающий результаты измерения величины экспрессии коллагена II типа в среде повторной дифференцировки для повторной дифференцировки культивируемого дедифференцированного хондроцита, когда содержание инсулина, BMP-2 и Т3 составляет 5 мкг/мл, 200 нг/мл и 10 М соответственно, и в среде повторной дифференцировки, имеющей такой же состав, как описано выше, за исключением того, что BMP-2 заменен на BMP-4.
-7
Фиг.10 представляет собой график, показывающий результаты измерения величины экспрессии коллагена Х типа в среде повторной дифференцировки для повторной дифференцировки культивируемого дедифференцированного хондроцита, когда содержание инсулина, BMP-2 и Т3 составляет 5 мкг/мл, 200 нг/мл и 10 М соответственно, и в среде повторной дифференцировки, имеющей такой же состав, как описано выше, за исключением того, что ВМР-2 заменен на BMP-4.
Фиг.11 представляет собой график, показывающий результаты измерения прочности на сжатие в качестве механического свойства продуктов трехмерного культивирования, полученных при трехмерном культивировании.
На фиг.12 показаны фотографические данные продуктов трехмерного культивирования, полученных при трехмерном культивировании.
Фиг.13 представляет собой график, показывающий результаты измерения прочности на сжатие в качестве механического свойства продукта культивирования, который получали, используя среду повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит, и подкожно трансплантировали "голой" мыши (с мутацией nude) в течение 2 месяцев.
На фиг.14 показаны фотографические данные продукта культивирования, который получали, используя среду повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит, и подкожно трансплантировали мыши с мутацией nude в течение 2 месяцев.
Наилучший способ осуществления изобретения
(Среда повторной дифференцировки для превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке и способ превращения дедифференцированного хондроцита в хондроцит при повторной дифференцировке)
Среду повторной дифференцировки по настоящему изобретению для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит используют при повторной дифференцировке дедифференцированного хондроцита в исходный хондроцит, причем хрящевые характеристики указанного дедифференцированного хондроцита ослаблены вследствие дедифференцировки в процессе культивирования in vitro. Среда повторной дифференцировки содержит инсулин и, по крайней мере, один из BMP-2 и его аналогов и предпочтительно дополнительно содержит Т3 и, необязательно, дополнительно содержит надлежащим образом выбранные другие компоненты.
Способ повторной дифференцировки по настоящему изобретению для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит включает стадию повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в исходный хондроцит посредством культивирования дедифференцированного хондроцита в среде повторной дифференцировки по настоящему изобретению и, необязательно, дополнительную стадию соответствующим образом выбранной другой обработки, причем хрящевые характеристики указанного дедифференцированного хондроцита ослаблены вследствие дедифференцировки в процессе культивирования in vitro.
Среда повторной дифференцировки по изобретению для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит и способ по изобретению для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит будут описаны ниже.
Используемый инсулин особо не ограничен, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели. Например, инсулин может представлять собой либо коммерчески доступный инсулин, либо соответствующим образом синтезированный инсулин.
Хотя содержание инсулина в среде повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит особо не ограничено, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, содержание инсулина предпочтительно составляет от 0,05 до 500 мкг/мл.
Повторную дифференцировку не всегда можно индуцировать, если содержание инсулина менее чем 0,05 мкг/мл, тогда как индукцию повторной дифференцировки можно ингибировать, если содержание инсулина превышает 500 мкг/мл.
Упоминаемый выше ВМР-2 обозначает морфогенетический белок кости 2. BMP-2 особо не ограничен, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, и он может представлять собой либо коммерчески доступный продукт, либо соответствующим образом синтезированный продукт.
Хотя аналог BMP-2 особо не ограничен, и его можно соответствующим образом выбрать из аналогов, известных в данной области, предпочтительным примером является ВМР-4.
В отношении, по крайней мере, одного выбранного из BMP-2 и его аналогов, можно использовать BMP-2 и BMP-4 в комбинации. В дополнение, хотя BMP-2 или BMP-4 можно использовать по отдельности, предпочтительно использовать один только BMP-2.
В среде повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит содержание, по крайней мере, одного выбранного из BMP-2 и его аналогов особо не ограничено, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, но предпочтительное содержание его составляет, например, от 1 нг/мл до 40 мкг/мл.
Повторную дифференцировку невозможно индуцировать, если содержание, по крайней мере, одного выбранного из ВМР-2 и его аналогов менее чем 1 нг/мл, в то время как индукцию повторной дифференцировки можно ингибировать, если его содержание превышает 40 мкг/мл.
Т3 обозначает тиреоидный гормон (трийодтиронин). Хотя Т3 особо не ограничен и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели; можно использовать, например, либо коммерчески доступный продукт, либо соответствующим образом синтезированный продукт.
Среда повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит, дополнительно содержащая Т3, обладает преимуществом над средой, содержащей инсулин и, по крайней мере, один выбранный компонент из BMP-2 и его аналогов без Т3, так как дедифференцированный хондроцит можно более эффективно повторно дифференцировать, в то время как экспрессию коллагена Х типа, которая повышается во время остеогенеза, можно эффективно подавлять.
-9
-5
Хотя содержание Т3 в среде повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит особо не ограничено, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, оно предпочтительно находится в диапазоне от 10 до 10 М.
-9
-5
Повторную дифференцировку невозможно эффективно индуцировать, если содержание Т3 менее чем 10 М, в то время как повторную дифференцировку можно ингибировать, если его содержание превышает 10 М. Когда содержание Т3 находится в указанном выше диапазоне, дедифференцированный хондроцит можно эффективно повторно дифференцировать по сравнению со средой, содержащей инсулин и, по крайней мере, один выбранный компонент из ВМР-2 и его аналогов, без Т3, в то время как можно эффективно подавлять экспрессируемый коллаген Х типа.
Несмотря на то, что другие компоненты особо не ограничены, и их можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, примеры их включают компоненты, которые могут влиять на повторную дифференцировку дедифференцированного хондроцита в хондроцит, и растворители.
Компоненты, которые могут влиять на повторную дифференцировку дедифференцированного хондроцита в хондроцит, особо не ограничены и их можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели. Примеры компонентов включают фактор роста фибробластов 2 (FGF-2), инсулиноподобные факторы роста (IGF-1), паратиреоидный гормон (РТН), гормон роста (GH), глюкокортикоид (дексаметазон), витамин D, антагонист рецептора IL-1, эстроген, андроген (такой как тестостерон), трансформирующий фактор роста α (TGF-α), трансформирующий фактор роста β (TGF-β), морфогенетические белки кости (BMP), эпидермальный фактор роста, тромбоцитарные факторы роста, трансферрин, селенистую кислоту, линолевую кислоту, альбумин, аскорбиновую кислоту, хондромодулины, факторы, связывающие гепарин, фактор роста фибробластов α, интраваскулярный фактор роста, гормон, ускоряющий клеточное деление, фактор роста соединительной ткани, фактор роста гепатоцитов, арахидоновую кислоту, простогландин А, простогландин В, простогландин Е, простогландин F и гистамин.
Каждый из описанных выше других компонентов можно использовать отдельно или можно использовать несколько из них в комбинации.
Растворитель особо не ограничен, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели. Предпочтительным примером является вода.
Вода включает стерильную воду и воду Millipore Q.
Содержание (общее содержание) других компонентов в среде повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит особо не ограничено, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели.
Дедифференцированный хондроцит в качестве объекта для среды повторной дифференцировки по изобретению для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит представляет собой полученную из хондроцита клетку, хрящевые характеристики которой ослаблены при дедифференцировке в процессе культивирования in vitro.
Хрящевые характеристики в качестве используемого здесь термина обозначают величину экспрессии/продукции коллагена I типа и коллагена II типа в живом организме. Ослабление хрящевых характеристик обозначает, что отношение (А/В) величины (А) экспрессии и продукции коллагена I типа к величине (В) экспрессии и продукции коллагена I типа в хондроците (предшественнике дедифференцированного хондроцита) до того, как хондроцит дедифференцируется, составляет 1 или более или что отношение (C/D) величины (С) экспрессии и продукции коллагена II типа к величине (D) экспрессии и продукции коллагена II типа в хондроците (предшественнике дедифференцированного хондроцита) до того, как хондроцит дедифференцируется, составляет 1 или менее.
Предшественник дедифференцированного хондроцита обозначает хондроцит в живом организме, из которого получают дедифференцированный хондроцит.
Представляет ли собой хондроцит дедифференцированный хондроцит, обладающий ослабленными хрящевыми характеристиками, предшественник дедифференцированного хондроцита или хондроцит (повторно дифференцированный хондроцит), повторно дифференцированный из дедифференцированного хондроцита, можно судить по величине экспрессии/продукции коллагена I типа, величине экспрессии/продукции коллагена II типа и величине экспрессии/продукции коллагена Х типа, прочности на сжатие, прочности на излом, модулю Юнга и равновесному коэффициенту сжатия.
Клетка, в которой величина экспрессии/продукции коллагена II типа меньше чем в хондроците в живом организме, величина экспрессии/продукции коллагена I типа больше чем в хондроците в живом организме и прочность на сжатие, прочность на излом, модуль Юнга и равновесный коэффициент сжатия ниже чем в хондроците в живом организме, как можно судить, весьма вероятно представляет собой дедифференцированный хондроцит, в то время как клетка, в которой величина экспрессии/продукции коллагена I типа меньше чем в хондроците в живом организме, величина экспрессии/продукции коллагена II типа больше чем в хондроците в живом организме и прочность на сжатие, прочность на излом, модуль Юнга и равновесный коэффициент сжатия выше чем в хондроците в живом организме, как можно судить, весьма вероятно представляет собой повторно дифференцированный хондроцит.
Поскольку хондроцит образует хрящевую основу и является метахроматическим в отношении толуидинового синего, недедифференцированный хондроцит или повторно дифференцированный хондроцит можно отличить при окрашивании толуидиновым синим.
В хондроците, в общем случае, величина экспрессии/продукции коллагена I типа меньше, величина экспрессии/продукции коллагена Х типа, которая увеличивается при превращении в кость, меньше, величина экспрессии/продукции коллагена II типа больше и экспрессия, по крайней мере, одного из гена COL2A1, гена COL9A1, гена COL11A2, гена агрекана, гена матриллина 3 и гена хондромодулина 1 выше чем у дедифференцированного хондроцита.
Соответственно хондроцит, вероятно, изменяется до подобного фибробласту дедифференцированного хондроцита, когда коллаген I типа экспрессируется и продуцируется в хондроците. Так как ген COL2A1, ген COL9A1, ген COL11A2, ген агрекана, ген матриллина 3 и ген хондромодулина 1 являются высоко экспрессируемыми в нормальном хондроците, данные гены и белки, такие как коллаген II типа, как результат экспрессии данных генов могут служить маркерами нормального хондроцита. Протеогликан может также служить маркером нормального хондроцита дополнительно к данным белкам.
Определенные примеры хондроцитов включают гиалиновый хондроцит, такой как суставной хондроцит (хондроцит, получаемый из ненагружаемой части суставного хряща) и реберный хондроцит (хондроцит, получаемый из реберного хряща) и эластический хондроцит, такой как хондроцит ушной раковины (хондроцит, получаемый из хряща ушной раковины).
Несмотря на то, что каждый из таких хондроцитов обычно используют по отдельности, несколько из них можно использовать вместе.
Примеры повторно дифференцированного хондроцита являются такими же, что и для предшественника дедифференцированного хондроцита. В то время как повторно дифференцированный хондроцит особо не ограничен при условии, что отношение (C/D) величины экспрессии коллагена II типа (С) к величине экспрессии коллагена II типа (D) в дедифференцированном хондроците превышает 1, отношение предпочтительно составляет 10 или более, более предпочтительно от 100 до 1000.
5
9
6
8
Несмотря на то, что величина засева дедифференцированного хондроцита в среду для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит особо не ограничена, и ее можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, она предпочтительно составляет приблизительно от 10 до приблизительно 10 клеток/мл, более предпочтительно приблизительно от 10 до приблизительно 10клеток/мл.
5
9
Клетка может гипертрофироваться, если величина засева дедифференцированного хондроцита меньше чем 10 клеток/мл, в то время как клетка может быть гипоксичной и гипотоничной, если величина засева дедифференцированного хондроцита превышает 10клеток/мл.
Дедифференцированный хондроцит, высеваемый в среду для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит, особо не ограничен, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели. В то время как предпочтительные примеры дедифференцированного хондроцита включают хондроциты, измененные до дедифференцированного хондроцита при дедифференцировке хондроцита в процессе культивирования in vitro, и хондроциты, выделяемые как дедифференцированный хондроцит, первый наиболее предпочтителен.
Условия культивирования дедифференцированного хондроцита в среде повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит особо не ограничены, и их можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели.
Несмотря на то, что время культивирования особо не ограничено, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, оно обычно составляет 1 неделю или более, предпочтительно от 3 до 6 недель.
Повторная дифференцировка может быть недостаточной, если время культивирования меньше чем 1 неделя.
Несмотря на то, что температура культивирования особо не ограничена, и ее можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, она обычно составляет от 32 до 42°С, предпочтительно от 34 до 39°С.
Повторная дифференцировка может ухудшаться или клетки могут погибнуть, если температура культивирования менее чем 32°С.
Несмотря на то, что парциальное давление кислорода особо не ограничено, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, обычно оно составляет от 10 до 30%, предпочтительно от 15 до 25%.
Повторная дифференцировка может ухудшаться или клетки могут погибнуть, если парциальное давление кислорода менее чем 10%.
Несмотря на то, что величина рН в культуре особо не ограничена, и ее можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели, она обычно составляет от 6 до 8, предпочтительно от 6,5 до 7,5.
Повторная дифференцировка может ухудшаться или клетки могут погибнуть, если величина рН менее чем 6 или превышает 8.
Способ культивирования особо не ограничен, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели. Примеры способов культивирования включают культивирование на твердой среде (однослойная культура), трехмерное культивирование и культивирования клеточной массы при осаждении.
Каждый из данных способов можно использовать отдельно, или несколько из данных способов можно использовать в комбинации. Среди них предпочтительно трехмерное культивирование.
Культивирование на твердой среде (однослойная культура) представляет собой двумерное культивирование, производимое на плашке или чашке Петри.
В трехмерной культуре клетки культивируют на или внутри трехмерного матрикса (каркасного материала), изготовленного из коллагена, фибрина или гиалуроновой кислоты.
Промышленно доступные материалы, такие как атероколлаген (производимый Kawaken Fine Chemicals Co.), можно использовать при трехмерном культивировании.
Трехмерный матрикс (каркасный материал) особо не ограничен, и материал, его состояние, форму, структуру и размер можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели.
Примеры каркасного материала включают поли-D-лактид, поли-L-лактид, поли-DL-лактид, полигликолевую кислоту, полимолочную кислоту, гидроксиапатит, фосфат кальция, атероколлаген, коллаген, фибрин, альгинат, агар и желатин. Один из данных материалов можно использовать отдельно, или можно использовать несколько материалов вместе. Среди них предпочтителен атероколлаген.
Предпочтительным состоянием матрикса является гель.
Форму можно соответствующим образом выбрать в зависимости от необходимой формы для материалов, используемых для трансплантации или косметических материалов.
Примеры предпочтительных структур, в общем, включают пористую структуру, ячеистую структуру и губчатую структуру.
При культивировании клеточной массы при осаждении хондроцит, культивируемый в культуре на твердой среде, снимают и культивируют в среде культивирования при аккуратном центрифугировании. Плотный сгусток культивируемых клеток получают при культивировании клеточной массы при осаждении. Посредством культивирования клеточной массы при осаждении возможно получить в результате культивируемые клетки, которые будут сгущаться при высокой степени плотности.
Согласно способу повторной дифференцировки по настоящему изобретению, в котором дедифференцированный хондроцит повторно дифференцируют в хондроцит, используя среду повторной дифференцировки по настоящему изобретению для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит, полученный в результате повторно дифференцированный хондроцит можно использовать для получения трансплантационного материала для поврежденного или пораженного хряща носа, уха, трахеи и сустава и для косметического материала для пластической хирургии.
Способ культивирования или пролиферации полученного в результате повторно дифференцированного хондроцита особо не ограничен, и его можно соответствующим образом выбрать в зависимости от цели. Например, способ включает упомянутое выше культивирование на твердой среде, трехмерное культивирование и культивирования клеточной массы при осаждении.
Несмотря на то, что каждый из данных способов можно использовать в отдельности или несколько из способов можно использовать в комбинации, предпочтительным среди других является способ трехмерного культивирования.
Хотя существует такая проблема, что хондроцит относительно легко дедифференцируется и изменяется до подобного фибробласту дедифференцированного хондроцита, когда хондроцит культивируют или осуществляют пролиферацию in vitro с целью регенеративной терапии хряща, дедифференцированный хондроцит можно эффективно и без труда повторно дифференцировать в хондроцит, используя среду повторной дифференцировки по настоящему изобретению для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит или используя способ по настоящему изобретению для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит. Соответственно полученный в результате хондроцит (масса хондроцитов), полученный при дополнительном культивировании повторно дифференцированного хондроцита можно успешно использовать для лечения различных заболеваний, связанных хрящем, внедряя хондроцит в участок повреждения хряща. Изобретение можно с пользой применять для регенеративной терапии хряща, так как хондроцит, извлеченный из самого пациента, можно культивировать и возвращать пациенту, чтобы использовать клетку в качестве хряща (массы хондроцитов).
Примеры
Хотя примеры изобретения подробно описаны ниже, изобретение никоим образом не ограничивается данными примерами.
- Дифференцировка хондроцита в дедифференцированный хондроцит вследствие дедифференцировки -
Среду для пролиферации хондроцита (10 мл; производимую Cambrex Co.), содержащую FGF-2 (фактор роста фибробластов 2), IGF-1 (инсулиноподобный фактор роста 1), инсулин, трансферрин и селенистую кислоту, добавляли к 5 мас.% FBS (эмбриональная бычья сыворотка) в чашку Петри и хондроцит (полученный из хряща ушной раковины человека; 200000 клеток) пассировали в чашке Петри в течение 30 дней посредством культивирования на твердой среде (однослойного культивирования). Условия культивирования на твердой среде (однослойного культивирования) представляли собой 37°С, 30 дней, рН 7 и парциальное давление кислорода 20%.
На фиг.1 на фотографии слева показан хондроцит (РО) непосредственно после начала культивирования и на фотографии справа показан хондроцит (Р4) четвертого пассированного пересева приблизительно через 30 дней после начала культивирования. На фотографиях сверху на фиг.1 показаны полосы при электрофорезе, демонстрирующие экспрессию генов коллагена I типа, коллагена II типа и GADPH (глицеральдегид-6-фосфатдегидрогеназы) в хондроцитах (Р0) непосредственно после начала культивирования и в хондроците (Р4) четвертого пассированного пересева приблизительно через 30 дней после начала культивирования.
Данные фотографии демонстрируют, что коллаген II типа экспрессировался и коллаген I типа не экспрессировался в хондроците (Р0) непосредственно после начала культивирования. Такие данные демонстрируют характеристики хондроцита (предшественника дедифференцированного хондроцита), и хондроцит (Р0) непосредственно после начала культивирования, как установлено, не являлся дедифференцированным. С другой стороны, величина экспрессии коллагена II типа уменьшилась, тогда как экспрессировался коллаген I типа в хондроците (Р4) четвертого пассированного пересева приблизительно через 30 дней после начала культивирования. Такие данные демонстрируют характеристики дедифференцированного хондроцита, и было установлено, что хондроцит (Р4) четвертого пассированного пересева приблизительно через 30 дней после начала культивирования являлся дедифференцированным.
- Повторная дифференцировка дедифференцированного хондроцита в хондроцит -
-7
Хондроцит (Р4; дедифференцированный хондроцит, 200000 клеток) четвертого пассированного пересева приблизительно через 30 дней после начала культивирования культивировали, помещая в трехмерный матрикс атероколлагена, в течение 7 дней, используя среду (среда из примера 1 для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит), содержащую 5 мкг/мл инсулина (производимого МР Biochemicals Co.) и 200 нм/мл ВМР-2 (рекомбинантного морфогенетического белка кости 2 человека, производимого Yamanouchi Pharmaceutical Co.) в минимальной среде Dulbecco's modified Eagle's Medium Nutrient Mixture F-12 НАМ (торговое название: DMEM/F12, производимой Sigma Chemicals Co.), и используя среду (среду из примера 2 для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит), содержащую 10 М Т3 (L-3,3',5'-трийодтиронин) дополнительно к упомянутым выше компонентам в минимальной среде. Такое культивирование соответствует способу по изобретению повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит.
Измеряли величины экспрессии коллагена I типа (Col-I), коллагена II типа (Col-II) и коллагена Х типа (Col-Х) в дедифференцированных хондроцитах, культивированных с использованием двух упомянутых выше сред культивирования. Величины экспрессии коллагена I типа, коллагена II типа и коллагена Х типа в дедифференцированном хондроците (контроль) показаны на фиг.2, 3 и 4 соответственно. На фиг.2-4 BI обозначает среду, содержащую BMP-2 и инсулин, тогда как BIT обозначает среду, содержащую BMP-2, инсулин и Т3.
Результаты на фиг.2-4 демонстрируют, что величина экспрессии коллагена I типа, характеристика дедифференцированного хондроцита, снижается, величина экспрессии коллагена II типа, характеристика хондроцита, увеличивается и величина экспрессии коллагена Х типа, экспрессирующегося, когда хрящ превращается в кость, имеет тенденцию к небольшому увеличению по сравнению с дедифференцированным хондроцитом в качестве контроля, если дедифференцированный хондроцит культивируют с использованием среды для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 1 (BI), содержащей инсулин и ВМР-2. Отношение (C/D) величины (С) экспрессии и продукции коллагена II типа, когда дедифференцированный хондроцит культивируют с использованием среды из примера 1 (BI) для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит, содержащей инсулин и BMP-2, к величине (D) экспрессии и продукции коллагена II типа в дедифференцированном хондроците в качестве контроля составляло приблизительно 10.
С другой стороны, когда дедифференцированный хондроцит культивируют с использованием среды для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 2 (BIT), содержащей инсулин, BMP-2 и Т3, величина экспрессии коллагена I типа, характеристика хондроцита, значительно снижается, величина экспрессии коллагена II типа, характеристика дедифференцированного хондроцита, значительно увеличивается и величина экспрессии коллагена Х типа, экспрессирующегося, когда хрящ превращается в кость, имеет тенденцию к небольшому увеличению по сравнению с дедифференцированным хондроцитом в качестве контроля. Отношение (C/D) величины (С) экспрессии и продукции коллагена II типа, когда дедифференцированный хондроцит культивируют с использованием среды для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 2 (BIT), содержащей инсулин, ВМР-2 и Т3, к величине (D) экспрессии и продукции коллагена II типа в дедифференцированном хондроците в качестве контроля составляло 20 или более.
Данные результаты демонстрируют, что хондроцит можно повторно дифференцировать в хондроцит, культивируя хондроцит, дифференцированный в дедифференцированный хондроцит посредством дедифференцировки, используя среду повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит по примерам 1 и 2. Также было обнаружено, что если использовали среду повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 2, дедифференцированный хондроцит можно было эффективно и без труда повторно дифференцировать в хондроцит по сравнению с использованием среды для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 1.
- Исследование предпочтительного количества каждого компонента в среде, превращающей при повторной дифференцировке дедифференцированный хондроцит в хондроцит -
Предпочтительные диапазоны содержания инсулина, BMP-2 и Т3 в среде для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 2, содержащей инсулин, BMP-2 и Т3, выяснялись посредством трех следующих ниже сравнений.
-7
Во-первых, когда содержание ВМР-2 изменяли до 400 нг/мл, 200 нг/мл и 100 нг/мл соответственно при содержании инсулина 5 мкг/мл и содержании Т3 10 М, величина экспрессии коллагена II типа была наибольшей, когда содержание BMP-2 составляло 200 нг/мл (фиг.5).
-6
-7
-8
-7
Во-вторых, когда содержание Т3 изменяли до 10 М, 10 М и 10 М соответственно при содержании инсулина 5 мкг/мл и содержании BMP-2 200 нг/мл, величина экспрессии коллагена II типа была наибольшей, когда содержание Т3 составляло 10 М (фиг.6).
-7
В-третьих, содержание инсулина изменяли до 50 мкг/мл, 5 мкг/мл и 0,5 мкг/мл соответственно при содержании BMP-2 200 нг/мл и содержании Т3 10 М, величина экспрессии коллагена II типа была наибольшей, когда содержание инсулина составляло 5 мкг/мл (фиг.7).
-7
Описанные выше результаты демонстрировали, что способность дедифференцированного хондроцита к повторной дифференцировке в хондроцит была наивысшей, когда содержание инсулина, BMP-2 и Т3 составляли 5 мкг/мл, 200 нг/мл и 10 М соответственно в среде для повторной дифференцировки дифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 2.
- Влияние аналогов -
Влияние аналогов на повторную дифференцировку дедифференцированного хондроцита в хондроцит исследовали, как описано ниже, заменяя BMP-2 на его аналог BMP-4 в среде по изобретению для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит. Дедифференцированный хондроцит культивировали, как описано ранее, используя такую же среду культивирования для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примеров 1 и 2 и среду из примера 2, в которой BMP-2 заменяли на BMP-4. Измеряли величины экспрессии коллагена I типа, коллагена II типа и коллагена Х типа в культивированных дедифференцированных хондроцитах. Величины экспрессии коллагена I типа, коллагена II типа и коллагена Х типа в дедифференцированных хондроцитах (контроль) показаны на фиг.8, 9 и 10 соответственно. На фиг.8-10 «BI» обозначает среду, содержащую ВМР-2 и инсулин; «BIT» обозначает среду, содержащую BMP-2, инсулин и Т3 и «ВМР-4» обозначает среду, содержащую BMP-4, инсулин и Т3.
Отношение (C/D) величины (С) экспрессии и продукции коллагена II типа, полученной при культивировании дедифференцированного хондроцита с использованием среды, содержащей инсулин, BMP-4 и Т3, к величине (D) экспрессии и продукции коллагена II типа в дедифференцированном хондроците (контроль) составляло 20 или более.
Результаты на фиг.8-10 демонстрируют, что среда повторной дифференцировки проявляет приблизительно такую же способность к повторной дифференцировке, как и в примере 2, даже если BMP-2 заменен на его аналог BMP-4 в среде для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 2.
- Механические свойства культивируемого продукта повторно дифференцированного хондроцита -
-7
Хондроцит (Р4) четвертого пассированного пересева приблизительно через 30 дней после начала культивирования или 200000 клеток хондроцита, дифференцированного до дедифференцированного хондроцита, культивировали, помещая в трехмерный матрикс атероколлагена, в течение 21 дня. Используемая среда культивирования представляла собой среду для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит, используемую в примере 1, которая содержит 5 мкг/мл инсулина (производимого МР Biomedicals Со.) и 200 нм/мл ВМР-2 (рекомбинантного морфогенетического белка кости 2 человека, производимого Yamanouchi Pharmaceutical Co.) в минимальной среде Dulbecco's modified Eagle's Medium Nutrient Mixture F-12 HAM (торговое название: DMEM/F12, производимой Sigma Chemicals Co.), и среду повторной дифференцировки для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит, используемую в примере 2, которая содержит 10 М Т3 (L-3,3',5'-трийодтиронин, производимый EMD Bioscience Co.) дополнительно к упомянутым выше компонентам в минимальной среде. Такие способы культивирования соответствует способу повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит по изобретению.
Как показано на фиг.11, прочность на сжатие (гр) (измеренная при помощи VENUSTRON, произведенного Axsym Co) в качестве механического свойства продукта трехмерного культивирования при трехмерном культивировании проявляла тенденцию к увеличению по сравнению с продуктом культивирования хондроцита (контроль), культивированного в среде, содержащей инсулин, BMP-2 и Т3 (см. фиг.11 и 12). На фиг.11 и 12 «BI» обозначает среду, содержащую BMP-2 и инсулин, тогда как «BIT» обозначает среду, содержащую BMP-2, инсулин и Т3.
- Механические свойства культивируемого продукта повторно дифференцированного хондроцита -
Дедифференцированный хондроцит (200000 клеток) культивировали в трехмерном матриксе атероколлагена в течение 21 дня, используя среду для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 1 и среду для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит из примера 2. Продукт культивирования трансплантировали в мышь с мутацией nude в течение 2 месяцев и прочность на сжатие (гр) продукта культивирования измеряли, как описано выше.
Как показано на фиг.13, прочность на сжатие (гр) продукта культивирования, который получили, используя среду для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит по примеру 2, была более высокой по сравнению с продуктом культивирования хондроцита в качестве контроля, и прочность на сжатие была приблизительно такой же, как и в хряще ушной раковины (природном хряще) в живом организме (см. фиг.13 и 14). На фиг.13 и 14 «BI» обозначает среду, содержащую ВМР-2 и инсулин, тогда как «BIT» обозначает среду, содержащую BMP-2, инсулин и Т3.
Среда для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит и способ повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит по изобретению способны эффективно и без труда повторно дифференцировать дедифференцированный хондроцит, в котором характеристики хряща ослаблены при дифференцировке в процессе культивирования in vitro, в хондроцит, и их можно с пользой применять для продолжительного культивирования. Хондроцит, культивируемый и пролиферируемый при повторной дифференцировке из дедифференцированного хондроцита, используя среду для повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит и способ повторной дифференцировки дедифференцированного хондроцита в хондроцит по изобретению, можно с пользой применять в качестве трансплантационных материалов для дефектных или поврежденных участков хряща носа, уха, трахеи и сустава и в качестве косметических материалов для пластической хирургии, и он вполне применим для регенеративной терапии хряща.