Гематологические исследования

основе реакции ферментативного удлинения аллель-специфичного праймера (РЕХТ) с последующим биолюминесцентным твердофазным микроанализом. Геномную ДНК предварительно амплифицировали, используя праймеры, фланкирующие полиморфный сайт (dbSNP: rs6025). Продукты ПЦР использовали как матрицы для двух РЕХТ реакций. Анализ продуктов проводили с использованием химических конъюгатов обелин-стрептавидин. Генотип каждого из образцов геномной ДНК определяли по соотношению биолюминесцентного сигнала от удлинения N-праймера (G-аллель) и сигнала от удлинения М-праймера (А-аллель) (дискриминационный фактор (DF). Полученные результаты совпали с данными ПЦР анализа в реальном времени с использованием коммерческих наборов ООО «НПФ Литех» для тех же образцов ДНК. Коэффициент вариации DF составил 14,1% для гетерозиготного варианта G/A и 19,8% для нормального генотипа G/G. Для повышения производительности гено-типирования разработан метод одновременного выявления аллелей в одной лунке с использованием двух биолюминесцентных репортеров: фотопротеина обелина и целентеразин-зависимой люциферазы Renilla muelleri. Биолюминесцентный сигнал обелина свидетельствует о наличии нормального аллеля, а сигнал люциферазы - о наличии мутантного ал-леля. Использование двух биолюминесцентных репортеров позволяет проводить анализ обоих аллелей в одной лунке, и таким образом удвоить количество образцов, анализируемых на одном планшете, а применение СВР вместо свободного целентеразина для запуска биолюминесценции люциферазы существенно упрощает процедуру анализа.

М. А. Суховольская, Т. Н. Субботина, И. А. Ольховский, К. П. Базарин. Мутации в генах метилентетрагидрофо-латредуктазы (MTHFR) и метионинсинтазы (MTR) и факторы риска гипергомоцистеинемии у спортсменов.

Красноярский филиал ФГБУЗ ГНЦ Минздравсоцразвития РФ, КНЦ СО РАН, Сибирский федеральный университет, Красноярск

Хорошо известны наследственные особенности обмена метионина, негативный эффект которых в отношении развития гипергомоцистеинемия (ГГЦ) может усиливаться при интенсивных физических нагрузках и употреблении некоторых «спортивных» диет. В связи с этим обсуждается целесообразность скрининга спортсменов на носительство мутаций ферментов обмена метионина с целью разработки индивидуальных профилактических программ.

Цель работы - выявление зависимости концентрации гомоцистеина (ГЦ) в крови спортсменов с мутациями С677Т (Ala222Val) в гене MTHFR (rs 1801133) и A2756G (Asp919Gly) в гене MTR (rs1805087). Группу обследованных составили 50 спортсменов, представляющих различные виды спорта, имеющие 1-й разряд и выше, а в контрольную группу вошли 57 условно здоровых лиц, не испытывающих высоких физических нагрузок, придерживающихся обычной схемы питания. Показано статистически достоверное увеличение концентрации ГЦ в крови спортсменов, имеющих гомозиготное состояние гена С677Т MTHFR по сравнению со спортсменами, не имеющими мутацию (p < 0,001), или имеющими гетерозиготный аллель (p = 0,002). Достоверных изменений уровня ГЦ у здоровых лиц, имеющих гомозиготный полиморфизм гена MTHFR не обнаружено. У спортсменов, имеющих мутацию С677Т в гене MTHFR в гомозиготном состоянии показано статистически достоверное (p = 0,005) повышение уровня ГЦ по сравнению с контрольной группой гомозиготных лиц. В отношении мутации A2756G в гене MTR у спортсменов, имеющих таковую в гетерозиготном состоянии, показано статистически достоверное (p = 0,015) понижение уровня ГЦ по сравнению с контрольной группой лиц, гетерозиготных по исследуемому полиморфизму. Таким образом, спортсмены, имеющие мутацию С677Т в гене MTHFR, входят в потенциальную группу высокого риска развития ГГЦ. А гетерозиготное носительство мутации A2756G в гене MTR у спортсменов можно рассматривать в качестве протективной в отношении развития ГГЦ.

ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

В. А. Зимина, М. Н. Зенина, А. В. Козлов, Н. К. Губаренко. Исследование ликвора при онкогематологических заболеваниях. ГБОУ ВПО СЗГМУ им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург

Цель исследования - оценка состава ликвора при онкогематологических заболеваниях. Задачи - оценить концентрацию белка, цитоз и клеточный состав в ликворе у больных до начала лечения острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ), осложненного нейролейкозом, и множественной миеломы (ММ).

Использовали люмбальный ликвор, полученный от 41 больного (мужчины - 24, женщины - 17, возраст от 27 до 49 лет; диагноз ОЛЛ установлен у 15 пациентов, ММ - у 26).

Готовили препараты из осадка ликвора седиментацион-ным методом с использованием модификации аппарата Сайка с последующей окраской азур-эозином. Концентрация белка в ликворе составила у пациентов с ОЛЛ - 0,27±0,03 г/л, с ММ - 0,32±0,02 г/л, цитоз при ОЛЛ составил 3-950  106/л, при ММ 0,3-10,6 @. 106/л. При ОЛЛ выявлены бластные клетки в количестве от 8 до 68%. При ММ бластные клетки не были обнаружены, у 4-х пациентов были выявлены плазматические клетки в количестве от 2 до 8%. Лимфоциты были обнаружены у всех пациентов в количестве от 1 до 73%. У 8 пациентов с ОЛЛ макрофаги обнаружены в количестве от 1 до 14%, при ММ менее чем в половине случаев были найдены макрофаги в количестве, превышающем остальные клетки - сегментоядерные нейтрофилы, лимфоциты и моноциты в 2 раза.

Уровень белка в ликворе у пациентов с ОЛЛ и ММ существенно не различался. При ОЛЛ, осложненном нейро-лейкозом, в ликворе были обнаружены бластные клетки, при ММ - плазматические клетки. В связи с трудностями, возникающими при морфологическом изучении клеток ликвора пациентов с онкогематологическими заболеваниями, необходимо проведение дополнительных методов, включающих цитогенетические исследования и иммунофенотипирование с использованием моноклональных антител.

Е. Р. Кулюцина, В. П. Савельев, О. А. Глебова, Л. А. Сорокина. Информативность гематологических показателей при клинико-лабораторном обследовании пациентов с сосудистой деменцией. ГБОУ ДПО Пензенский институт усовершенствования врачей Минздравсоцразвития РФ, ГБУЗ Областная психиатрическая больница им. К. Р. Евграфова, Пенза

Пусковым механизмом развития сосудистой деменции зачастую являются инфекционные болезни мозга (энцефалиты, менингиты и др.), ведущие к церебральным повреждениям, которые учитываются как этиологический фактор при определении формы помощи и методов патогенетической терапии. Этиотропное лечение возможно при верификации диагноза органического заболевания мозга (дисфункции), в том числе связанного с нейроинфекцией (бактериальной, вирусной).

Цель исследования - оценка эффективности лаборатор-

КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 9, 2012

ных показателей общего анализа крови (OAK) и индексов интоксикации в качестве интегральных методов оценки скрытых воспалительных и аутоиммунных процессов, степени развития эндогенной интоксикации у больных с сосудистой деменцией на этапе оказания стационарной помощи.

Под наблюдением находились пациенты с сосудистой деменцией (18 женщин и 3 мужчин) в возрасте от 81 до 94 лет, находившиеся на стационарном лечении в психотерапевтическом отделении психиатрической больницы. Общий анализ крови выполнялся на автоматическом гематологическом анализаторе. Были рассчитаны индексы интоксикации - ЛИИ по Кальф-Калифу, ядерный индекс (ЯИ), индекс лимфоциты-СОЭ (ИЛСОЭ), индекс сдвига (ИС), интегральный индекс (ИнтИ).

В показателях красной крови у 15 % пациентов отмечалось незначительное снижение уровня гемоглобина до 106-110 г/л. Так же у 15% имелись признаки гемоконцентра-ции: количество эритроцитов достигало 6,13 • 1012/л, уровень гемоглобина 165 г/л. СОЭ были значительно повышены у 57% пациентов до 27-52 мм/ч. Это могло быть результатом диспротеинемии как при воспалительных, так и опухолевых процессах.

Количество тромбоцитов у всех пациентов было в пределах нормы. Несмотря на то что количество лейкоцитов у всех не превышало 9 • 109/л, интегральные показатели выявили явную патологию. ЛИИ был повышен у 64,3% пациентов (в среднем составил 1,65±0,83), ИЛСОЭ у 85,7% (6,61±3,93). В пользу аутоиммунных и отсутствия воспалительных процессов, связанных с бактериальной инфекцией, говорило повышение ИС только у 14,2% и повышение ИИ у 92,9% (0,437±0,11). ЯИ был повышен у большинства пациентов и отражал легкую (57,2%), среднюю (7,2%) степень тяжести состояния. С тяжелой степенью тяжести пациентов не было. Показатели ИнтИ, в расчете которого использовались уровни молекул средней массы (МСМ 254) и креатинина, были повышенными по сравнению с таковыми у доноров в 35,7%, варьировали от 7,71 до 11,32.

Таким образом, в качестве дополнительных и информативных тестов для оценки тяжести эндогенной интоксикации у больных с сосудистой деменцией на этапе стационарной помощи можно предложить доступные интегральные индексы интоксикации, не требующих дополнительных денежных затрат, и которые возможно автоматически рассчитать при наличии соответствующего программного обеспечения.

С. А. Луговская, М. Е. Почтарь, Е. В. Наумова, О. С. Плеханова, Д. Г. Кисиличина, Н. В. Цветаева, Е. А. Михайлова. Оценка ретикулоцитов при пароксизмальной ночной гемоглобинурии с использованием проточной цитофлюо-риметрии. ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития РФ, Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, Москва

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) - редкое приобретенное заболевание, характеризующееся соматической мутацией гена PIGA, что приводит к нарушению синтеза гликозилфосфатидилинозитолового (GPI) якоря, осуществляющего фиксацию целого ряда молекул (так называемых GPI-связанных белков) на мембранах клеток крови (CD59, CD55, CD14, CD16, CD24, CD48 и др.). Вследствие полного или частичного дефицита GPI-связанных белков эритроциты подвергаются внутрисосудистому гемолизу под действием системы комплемента, что и определяет клинические проявления заболевания. Размер эритроцитарного ПНГ-клона варьирует в зависимости от степени выраженности гемолиза, и он всегда меньше по сравнению с гранулоцитарным и моноцитарным клоном. В связи с этим представляет интерес изучить GPI-связанные белки на ретикулоцитах (RET) и сопоставить размеры ретикулоцитарного и эритроцитарного ПНГ-клона, сравнив их с размером ПНГ-клона среди моноцитов и гранулоцитов.

Исследование проведено с использованием проточной цитофлюориметрии на цитометре FC500 (Beckman Coulter) с применением гейтирующих антител CD235a FITC для эритроцитов, CD15PE/CD45PC-7 для гранулоцитов, CD64PC-5/ CD45PC-7 для моноцитов, и антител к GPI-связанным белкам CD59PE, FLAERFITC/CD24PC-5, FLAERFITC/CD14PE для эритроцитов, гранулоцитов и моноцитов, соответственно. Оценка ретикулоцитрного ПНГ-клона производилась с помощью Retic-Count Reagent (Becton Dickinson) и CD59PE.

Исследование проведено у 42 больных: 21 - с апластиче-ской анемией (АА), 16 - с подозрением на ПНГ, 5 - миелоди-спластическим синдромом - рефрактерной анемией (МДС-РА). У 23 пациентов выявлен ПНГ-клон (n = 13 с АА, n = 8 с ПНГ, n = 1 с МДС-РА), который обнаруживался как среди эритроцитов, так и RET, гранулоцитов и моноцитов. Размер RET ПНГ-клона всегда был больше, чем эритроцитарного и приближался к размеру клона среди гранулоцитов и моноцитов. В 2-х наблюдениях АА ретикулоцитарной ПНГ-клон составлял 3,2% и 4,1%, в то время как среди эритроцитов он не выявлялся. Минорный ПНГ-клон (< 1%) обнаружен в 2 случаях, в одном из них он выявлен только среди RET, эри-троцитарный ПНГ-клон отсутствовал.

Таким образом, исследование ретикулоцитов при ПНГ дает дополнительную информацию о существовании ПНГ-клона. По сравнению с эритроцитами, количество ретику-лоцитов с дефицитом CD59 дает возможность более точной оценки ПНГ-клона, особенно в случаях обнаружения минорного клона (менее 1%).

Г. В. Никитина, A. A. Славинский. Цитохимические маркеры активации нейтрофильных лейкоцитов при гипер-тиреозе. Кубанский государственный медицинский университет, Краснодар

Гипертиреоз проявляется аутоагрессивным воздействием на клетки и ткани организма, что приводит к активации ней-трофильных лейкоцитов (НЛ). Маркерными ферментами активации НЛ является щелочная фосфатаза (ЩФ) и НАДФН-оксидаза. Цель работы - оценить активность ЩФ и НАДФН-оксидазы НЛ крови у больных с гипертиреозом.

Исследованы лейкоконцентраты венозной крови 22 больных с диффузным токсическим зобом. Контрольную группу составили 20 относительно здоровых лиц. Щелочную фосфа-тазу выявляли способом азосочетания, активность НАДФН-оксидазы определяли с помощью НСТ-теста. Визуально оценивали процент положительно реагирующих клеток (ППК), вычисляли средний цитохимический коэффициент (СЦК).

Проведенное исследование показало, что при гипер-тиреозе ППК ЩФ увеличивается в 1,7 (р < 0,001) раза до 81,9±0,35%, при этом СЦК фермента составляет 0,91±0,09 отн. ед., что в 1,3 раза выше, чем у группы контроля. У пациентов с гипертиреозом циркулирует 59,6±2,2% формазан положительных НЛ, активность фермента равна 1,94±0,06 отн. ед. Сравнительно с контрольной группой у больных диффузным токсическим зобом ППК НАДФН-оксидазы возрастает в 5 раз, а СЦК фермента выше, чем у здоровых лиц в 2,3 раза (р < 0,001).

В результате исследования выявлено, что при гиперти-реозе в активированных НЛ крови значительно возрастает активность НАДФН-оксидазы, что провоцирует избыточную генерацию токсичных радикалов кислорода, усугубляющих повреждение тканей. Полученные данные могут служить дополнительными лабораторными диагностическими критериями для прогнозирования осложнений гипертиреоза.

М. Е. Почтарь, С. А. Луговская, Е. В. Наумова, Д. Г. Кисиличина, О. С. Плеханова, А. С. Миненков. Использование гематологического анализатора ADVIA 2120 для расширенной характеристики эритроцитов у больных с различными формами анемий. ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоц-развития РФ, ГБУЗ ГКБ им. С. П. Боткина, Москва

Анемии разнообразны по своему механизму развития и часто имеют смешанный патогенез. Успешная терапия анемий во многом зависит от точной и своевременной диагностики характера изменения эритропоэза, которые находят свое отражение в характеристиках эритроцитов.

Исследование периферической крови проводили на гематологическом анализаторе ADVIA 2120 (Siemens) у 72 больных с анемией, из которых 61 человек с подозрением на пароксизмальную ночную гемоглобинурию (ПНГ) [n = 33 - с апластической анемией (АА)], n = 14 - миелодиспластиче-ским синдромом-рефрактерной анемией (МДС-РА), n = 14 - ПНГ), 14 больных с железо дефицитной анемией (ЖДА)]. Оценивались как классические (RBC, Hb, MCV, МСНС, RET), так и дополнительные эритроцитарные параметры (СНСМ, СН, %Нуро, %Hyper, %Micro, %Масго, MCVr, СНСМг). Исследование ПНГ-клона проводили на проточном цитофлюо-риметре FC 500 (BeckmanCoolter) при помощи 4-цветной проточной цитометрии.

Для статистического анализа данных использовались значения медианы распределения (Me). Из 33 больных с АА ПНГ-клон выявлен у 17 пациентов. Существенных отличий в характере анемии между больными с наличием или отсутствием ПНГ-клона не наблюдалось. Анемия носила ги-перхромный, нормо- или макроцитарный (МСНMe - 32,50 пг и 34,2 пг; MCVMe - 94,10 фл и 102,85 фл соответственно) характер, %Hypo и %Нурег RBC были в пределах нормы. Процент ретикулоцитов (%RET) колебался в пределах нормы (%RETMe - 0,93% и 1,17% соответственно), в то же время абсолютное число ретикулоцитов (#RET) находилось на нижней границе нормы (#RETMe - 29,7  109/л и 34,0 109/л соответственно), наблюдалась тенденция к макроцитозу (MCVrMe - 129,0 фл и 131,1 фл соответственно).

Из 14 больных МДС у 3 был выявлен ПНГ-клон. Характеристики эритроцитарных параметров данной группы были аналогичны таковым при АА.

У 14 больных ПНГ анемия имела нормоцитарный характер (MCVMe = 93,45 фл; диапазон 79,8-116,4 фл) с тенденцией к гипохромии (МСН^ = 28,1 пг; диапазон 21-34 пг), при этом %Нуро RBC колебался в пределах 1,8-75,7% ("/оНуро^ = 27,6), %Micro варьировал от 0,7% до 11,4% (%MicroMe = 2,6%). Отмечался относительный ретикулоцитоз (%RETMe = 3,6%, #RETMe = 99,25  109/л) с тенденцией к макроцитозу (MCVrM = 122,25 фл) и гипохромии ретикулоцитов (СНСМгн

= 266,0 г/л).

Среди 14 больных ЖДА с классической картиной микро-цитарной (MCVMe = 71,6 фл; диапазон 63-91,2 фл) гипох-ромной (МСН^ = 20,9 пг; диапазон 16,8-24,4 пг) анемией ПНГ-клон отсутствовал. Процент гипохромных эритроцитов (%Hypo) в данной группе составлял от 16,8 до 77,2% (%НуроНб = 26,75%), количество микроэритроцитов колебалось в "пределах 2,0-48,8%) (%MicroMe = 17,2%). Относительное и абсолютное число ретикулоцитов было в пределах

нормы (%RETMe = 1,1%, #RETMe = 45,6  109/л) с выраженным микроцитозом и гипохромией ретикулоцитов (MCVrMe = 96,1 фл, ШСМт^ = 253,00 г/л).

Таким образом, исследование дополнительных эритроци-тарных параметров на гематологическом анализаторе ADVIA 2120 (Siemens) позволяет дать более точную оценку изменениям эритроцитов при различных видах анемий.

Н. Н. Руденко, К. П. Базарин, И. А. Ольховский, У. В. Зыкова. Возможности автоматизированной оценки фракций ретикулоцитов в практике медицинского контроля тренировочного режима спортсменов. КНЦ СО РАН, Красноярский филиал ФГБУЗ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, Сибирский федеральный университет, Красноярск

Одной из важных физиологических реакций организма, определяющих адаптацию спортсмена к высокой физической нагрузке, является мобилизация эритроидного ряда форменных элементов и поддержание адекватной кисло-родтранспортной системы крови. Обусловленный повышенной потребностью тканей спортсмена в кислороде выброс эритропоэтина вызывает выход в периферическое русло молодых ретикулоцитов, являющихся в физиологических условиях показателем чувствительности системы к стимулирующему действию эритропоэтина. Различное содержание рибонуклеиновых кислот в созревающих ретикулоцитах лежит в основе дифференцировки молодых и зрелых клеток в современных многопараметровых геманализаторах. Цель работы - оценка соотношения субпопуляций ретикулоцитов в периферической крови спортсменов-разрядников в различные фазы соревновательно-тренировочного цикла, характеризующиеся разным уровнем физических нагрузок. В исследовании участвовали спортсмены-разрядники: 40 юношей и 17 девушек. Исследование проводили на гемоанализаторе Sysmex-XT-2000i. Исследование выявило закономерные отличия мужчин и женщин в уровне эритроцитов и гемоглобина, вместе с тем и у юношей и у девушек наблюдалось значимое (p < 0,05) увеличение фракции незрелых ретикулоцитов (IFR): у мужчин до 6,4% на пике нагрузки и до 8,1% в первые дни после соревнований по сравнению с 5,5% в период снижения нагрузок и у женщин до 4,9% и до 9,3%) по сравнению с 4,3% соответственно. При этом фракция наиболее зрелых ретикулоцитов (LFR) в течение выбранных фаз тренировочного процесса пропорционально снижалась (p > 0,05), а общее число ретикулоцитов значимо не менялось. Включение в программу лабораторного обследования спортсменов показателей зрелости ретикулоцитов периферической крови позволяет определять уровень напряженности и адекватности эритропоэза у спортсмена и входить в меню критериев для коррекции индивидуальных тренировочных планов и медицинских мероприятий.