СОСТАВЫ 2-ИМИНОБИОТИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
FORMULATIONS OF 2-IMINOBIOTINE AND USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к повышению растворимости 2-иминобиотина в водной среде. В соответствии с конкретным аспектом настоящее изобретение относится к составам, подходящим для введения 2-иминобиотина млекопитающим, страдающим нарушениями или состояниями, в отношении которых указанное введение оказывает благоприятный эффект.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Сообщалось, что 2-иминобиотин можно применять для предотвращения и/или лечения последствий перинатальной асфиксии (гипоксии-ишемии) у новорожденных (патент США №6894069, полное содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки). В частности, исследования in vivo на поросятах показали, что 2-иминобиотин более эффективно предотвращает и/или лечит данные последствия, чем аллопуринол (allopurinol) или дефероксамин (deferoxamine).
Однако низкая растворимость 2-иминобиотина при физиологических значениях рН ограничивает его применение в качестве терапевтического агента. В данной области техники существует потребность в разработке улучшенных составов 2-иминобиотина и способов повышения его растворимости. Настоящее изобретение обеспечивает указанные улучшения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предложен водный состав 2-иминобиотина (2-IB) или его производного, имеющий рН от примерно 3 до примерно 7 и содержащий примерно 1 мг/мл или более 2-иминобиотина или его производного, и от примерно 2,5 до примерно 40% содержащего замещенный бета-циклодекстрин.
В некоторых вариантах реализации указанный состав имеет рН от примерно 4 до примерно 7 и содержит примерно 2 мг/мл или более 2-иминобиотина или его производного и от примерно 2,5 до примерно 20% содержащего замещенный бета-циклодекстрин, предпочтительно выбранный из сульфобутилового эфира бета-циклодекстрина (SBE-CD) и гидроксипропил-бета-циклодекстрина (HP-CD).
В некоторых вариантах реализации указанный состав имеет рН от примерно 4 до примерно 5 и содержит примерно 3,5 мг/мл или более 2-иминобиотина, и от примерно 2,5 до примерно 40, предпочтительно от примерно 5 до примерно 10% содержащего замещенный бета-циклодекстрин, предпочтительно выбранный из сульфобутилового эфира бета-циклодекстрина (SBE-CD) и гидроксипропил-бета-циклодекстрина (HP-CD).
В некоторых вариантах реализации указанный состав имеет рН от примерно 4 до примерно 5 и содержит от примерно 3 до примерно 5 мг/мл, предпочтительно от примерно 4 до примерно 5 мг/мл 2-иминобиотина, и от примерно 2,5 до примерно 5% содержащего замещенный бета-циклодекстрин, предпочтительно выбранный из сульфобутилового эфира бета-циклодекстрина (SBE-CD) и гидроксипропил-бета-циклодекстрина (HP-CD).
Предпочтительно, указанный состав дополнительно содержит лимонную кислоту или ее депротонированную форму (цитрат) в качестве усилителя растворимости.
В некоторых вариантах реализации предложен состав 2-иминобиотина или его производного, имеющий рН, составляющий примерно 5 и содержащий примерно 3 мг/мл или более 2-иминобиотина и от примерно 3 до примерно 40%, предпочтительно примерно 5% SBE-CD.
В некоторых вариантах реализации предложен состав 2-иминобиотина или его производного, имеющий рН, составляющий примерно 4 и содержащий примерно 3 мг/мл или более 2-иминобиотина и от примерно 5 до примерно 40% HP-CD. Предпочтительно, указанный состав содержит от примерно 5 до примерно 20% HP-CD.
В некоторых вариантах реализации составы дополнительно содержат NaCl, предпочтительно от 0,1 до 2%, более предпочтительно от 0,5 до 0,8%, в качестве изотонического агента.
Другой аспект настоящего изобретения предусматривает водный состав 2-иминобиотина (2-IB) или его производного, имеющий рН от примерно 3 до примерно 7 и содержащий примерно 0,75 мг/мл или более 2-иминобиотина и лимонную кислоту, ее депротонированную форму или их смесь. Неожиданно было обнаружено, что 2-IB имеет более высокую растворимость в буфере на основе лимонной кислоты. В настоящем описании термин «буфер на основе лимонной кислоты» относится к лимонной кислоте, ее депротонированной форме или их смеси, и включает водные растворы, например, дегидрата цитрата натрия.
Предпочтительно, указанный состав имеет рН от примерно 3 до примерно 7, предпочтительно от примерно 3 до примерно 6, более предпочтительно от примерно 3,5 до примерно 4,5, еще более предпочтительно рН, равный примерно 4, и содержит от примерно 0,5 мг/мл до примерно 10 мг/мл, предпочтительно от примерно 0,5 мг/мл до примерно 5 мг/мл 2-иминобиотина, более предпочтительно от примерно 0,5 мг/мл до примерно 2 мг/мл, еще более предпочтительно от примерно 0,5 мг/мл до примерно 1 мг/мл 2-иминобиотина и лимонную кислоту, ее депротонированную форму или их смесь. Предпочтительно, составы содержат от примерно 1 до примерно 40, от примерно 5 до примерно 30, предпочтительно от примерно 10 до примерно 20, более предпочтительно от примерно 12,5 до примерно 17,5 мМ, еще более предпочтительно примерно 15 мМ лимонную кислоту, ее депротонированную форму или их смесь. Специалисту в данной области техники очевидно, что количество буфера можно регулировать для получения желаемого уровня рН. Предпочтительно, указанный состав содержит от 0,1 до 2% NaCl в качестве изотонического агента, более предпочтительно от 0,5 до 1,5%. Типичный состав имеет концентрацию NaCl, составляющую примерно 0,9%.
Предпочтительно, состав подходит для введения новорожденному, представляющему собой человека. Предпочтительно, 2-иминобиотин или его производное остается растворимым в течение по меньшей мере 3 дней при 5°С. В некоторых вариантах реализации 2-иминобиотин или его производное остается растворимым в течение по меньшей мере 0,5, 1, 1,5, 2 или 3 лет при 5°С.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен 2-иминобиотин или его производное, составы, описанные в настоящем документе, для применения для лечения последствий осложнений во время родов, предпочтительно для лечения перинатальной асфиксии или устранения риска ее возникновения у новорожденного. В некоторых вариантах реализации состав вводят новорожденному. В некоторых вариантах реализации состав вводят матери новорожденного до и/или во время родов.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложено применение 2-иминобиотина или его производного для лечения последствий осложнений во время родов, предпочтительно для лечения перинатальной асфиксии или устранения риска ее возникновения, при этом указанное лечение комбинируют с подверганием новорожденного гипотермии.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены способы лечения последствий осложнений во время родов у новорожденного, включающие введение терапевтически эффективного количества состава, описанного в настоящем документе, нуждающемуся в этом новорожденному. В некоторых вариантах реализации состав также вводят или вместо этого вводят нуждающейся в этом матери новорожденного до и/или во время родов. Предпочтительно, указанное осложнение представляет собой перинатальную асфиксию или риск ее возникновения.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены способы лечения последствий осложнений во время родов у новорожденного, включающие введение терапевтически эффективного количества 2-иминобиотина или его производного нуждающемуся в этом новорожденному и подвергание указанного новорожденного гипотермии. В некоторых вариантах реализации 2-иминобиотин или его производное также вводят или вместо этого вводят нуждающейся в этом матери новорожденного до и/или во время родов. Предпочтительно, указанное осложнение представляет собой перинатальную асфиксию или риск ее возникновения. Предпочтительно, 2-иминобиотин или его производное находится в составе, описанном в настоящем документе.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены применение 2-иминобиотина или его производного для получения лекарственного средства с составом, описанным в настоящем документе, для лечения последствий осложнений во время родов. В некоторых вариантах реализации указанное лечение комбинируют с подверганием новорожденного гипотермии. Предпочтительно, указанное осложнение представляет собой перинатальную асфиксию. Также предложены составы для применения для лечения заболевания или нарушения, отвечающего на лечение 2-иминобиотином.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены способы получения составов, описанных в настоящем документе, включающие этапы растворения 2-иминобиотина или его производного в водном растворе, содержащем бета-циклодекстрин, с последующей регулировкой рН раствора с получением раствора 2-иминобиотина или его производного. Предпочтительно, рН раствора 2-иминобиотина регулируют с использованием лимонной кислоты. Предпочтительно, рН доводят до диапазона от примерно 3 до примерно 7. Предпочтительно, водный раствор имеет рН от 4 до 6,6. Предпочтительно, указанный бета-циклодекстрин представляет собой SBE-CD. Предпочтительно, водный раствор содержит NaCl. Предпочтительно, водный раствор содержит лимонную кислоту или ее депротонированную форму.
Предпочтительно, производные 2-IB представляют собой карбоксипроизводные 2-иминобиотина. Предпочтительно, карбоксипроизводные 2-иминобиотина представляют собой гидразид 2-иминобиотина и/или N-гидроксисукцинимидный эфир 2-иминобиотина. Предпочтительно, составы, описанные в настоящем документе, содержат 2-IB.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДЛОЖЕННЫХ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ
2-иминобиотин (2-IB) имеет плохую растворимость в воде и, таким образом, его трудно приготовить в виде водного раствора для введения (см. Сравнительные примеры). В соответствии с настоящим изобретением было обнаружено, что растворимость 2-IB в воде можно в достаточной степени повышать для того, чтобы его можно было приготовлять в виде водного раствора, путем добавления 2-IB к буферу лимонная кислота/цитрат и/или замещенному бета-циклодекстрину. В настоящем описании термины «нерастворимый» и «плохо растворимый» употребляются для характеристики лекарственного средства в отношении его растворимости в воде. В настоящем описании термин «нерастворимый» относится к растворимости, составляющей менее 0,1 мг/мл, и термин «плохо растворимый» относится к растворимости в диапазоне от 0,1 до 1 мг/мл.
Растворимость 2-IB зависит от рН. Растворимость 2-IB в воде составляет примерно 0,34 мг/мл при рН 7,4, примерно 0,59 мг/мл при рН 5 и примерно 4,5 мг/мл при рН 3,5. Поскольку введение растворов с низким рН внутримышечно может вызывать боль у субъекта (Rukwied R., J Pain. 2007 Мау; 8(5):443-51) и может приводить к метаболическому ацидозу при введении в виде непрерывной внутривенной инфузии (Federman MD, Clinical Neuropharmacology 2009 Nov-Dec; 32(6):340-1), одной из целей настоящего изобретения является получение составов 2-IB с рН и концентрацией 2-IB, подходящими для введения в соответствии с терапевтическим планом.
При лечении состояний, ассоциируемых, например, с асфиксией или гипоксией, для того, чтобы лекарственное средство было эффективным, терапевтически эффективное количество лекарственного средства необходимо вводить в течение определенного периода времени. В случае составов уровня техники необходимо вводить значительный объем раствора 2-IB из-за низкой растворимости 2-IB. Чем больше объем раствора необходимо вводить, тем больше времени требуется для достижения терапевтически эффективной концентрации в организме. Для некоторых видов применения, таких как лечение новорожденных, объем раствора, который необходимо ввести в пределах терапевтического окна, является ограничивающим фактором. Как правило, максимальное количество жидкости, считающееся безопасным для введения внутривенно доношенному новорожденному с асфиксией, составляет 50 мл/кг/сутки. При увеличении растворимости 2-IB лекарственное средство можно вводить быстрее и в меньшем объеме.
Оптимально, составы 2-IB должны быть стабильными в течение длительных периодов времени, предпочтительно в течение нескольких лет. Кроме того, указанные составы не должны осаждаться при хранении в охлажденном состоянии, например, 5°С.
Получали различные составы лекарственных средств с использованием различных растворителей, сорастворителей, поверхностно-активных веществ, циклодекстринов и других наполнителей. Либо растворимость 2-IB была низкой, либо состав был токсичным (см. Сопоставимые примеры). Удивительно то, что приготовление 2-IB совместно с более 1% содержащих замещенный бета-циклодекстринов, в частности с 2,5% или более, и/или с буферами на основе лимонной кислоты позволяло получать растворы с повышенной растворимостью при подходящих значениях рН.
10
17
3
2
Составы, описанные в настоящем документе, подходят для получения фармацевтических растворов 2-IB (CHNOS), а также производных 2-IB. Производные 2-IB включают карбоксипроизводные 2-иминобиотина. Было показано, что карбоксипроизводные 2-иминобиотина являются ингибиторами индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS), что указывает на то, что свободная карбоксильная группа 2-IB не является необходимой для ингибирования iNOS (Sup SJ, et al. Biochem and Biophy Res Comm 1994 204:962-968). Предпочтительно, карбоксипроизводные 2-иминобиотина представляют собой 2-иминобиотина гидразид и/или 2-иминобиотина N-гидроксисукцинимидный эфир. Предпочтительно, составы, описанные в настоящем документе, содержат 2-IB.
Циклодекстрины варьируются по структуре и свойствам. Например, размер (например, диаметр и глубина) и функциональность (например, гидрофобность, заряд, реакционноспособность и способность образовывать водородные связи) гидрофобной полости варьируются среди замещенных и незамещенных альфа-, бета- и гамма-циклодекстринов. Термин «циклодекстрин» относится к соединению, содержащему циклические альфа связанные D-глюкопиранозные звенья. Термин «альфа-циклодекстрин» относится к циклодекстрину с 6 циклическими связанными D-глюкопиранозными звеньями, бета-циклодекстрин содержит 7 циклических связанных D-глюкопиранозных звеньев, и гамма-циклодекстрин содержит 8 циклических связанных D-глюкопиранозных звеньев. Данные циклические связанные D-глюкопиранозные звенья определяют гидрофобную полость и известно, что циклодекстрины образуют соединения включения с другими органическими молекулами, с солями и с галогенами либо в твердом состоянии, либо в водных растворах. Как правило, циклодекстрин, выбранный для состава, обладает размером и функциональностью, подходящей для целевого компонента и других компонентов указанного состава. К сожалению, существует много лекарственных средств, для которых образование комплекса с циклодекстрином либо не является возможным, либо не дает никаких очевидных преимуществ (J. Szejtli, Cyclodextrins in Drug Formulations: Part 11, Pharmaceutical Technology, 24-38, August, 1991).
Замещенные циклодекстрины могут содержать в качестве боковых цепей любую органическую группу или элементоорганическую группу. Предпочтительные циклодекстрины включают замещенные бета-циклодекстрины, которые были алкилированы, гидроксиалкилированы или подвергнуты реакции с образованием сульфоалкилового эфира. Предпочтительные бета-циклодекстрины включают гидроксипропил-бета-циклодекстрин, например, (S)-2-гидроксипропил-бета-циклодекстрин, 2-O-[(S)-2'-гидроксипропил]-бета-циклодекстрин, 2-O-[(R)-2'-гидроксипропил]-бета-циклодекстрин, 6-O-[(S)-2'-гидроксипропил]-бета-циклодекстрин, 2-O-[(R)-2',3'-гидроксипропил]-бета-циклодекстрин; гидроксиэтил-бета-циклодекстрин; карбоксиметил-бета-циклодекстрин; карбоксиметилэтил-бета-циклодекстрин; диэтил-бета-циклодекстрин; диметил-бета-циклодекстрин; глюкозил-бета-циклодекстрин; гидроксибутенил-бета-циклодекстрин; мальтозил-бета-циклодекстрин; и сульфобутиловый эфир бета-циклодекстрина. Для составов и способов согласно настоящему изобретению считается, что замещенные бета-циклодекстрины, такие как, например, гидроксипропил-бета-циклодекстрин и сульфобутиловый эфир бета-циклодекстрина, обладают размером и функциональностью, которые дополняют другие компоненты состава. Более предпочтительно, циклодекстрин представляет собой сульфобутиловый эфир бета-циклодекстрина («SBE-CD»).
В составах 2-IB тестировали два типа замещенных бета-циклодекстринов. Оба типа заметно повышали растворимость 2-IB (См. Примеры). Сульфобутиловый эфир бета-циклодекстрина (SBE-CD) представляет собой коммерчески доступное полианионное производное бета-циклодекстрина с сульфонатной солью натрия, отделенной от гидрофобной полости спейсерной группой бутилового эфира или сульфобутиловым эфиром (Каптизол™ (Captisol™) является торговым названием гепта-замещенного сульфобутилового эфира бета-циклодекстрина от CyDex Inc.) Гидроксипропил-бета-циклодекстрин (HP-CD) представляет собой коммерчески доступное производное бета-циклодекстрина, поставляемое Roquette Pharma S.A. под названием Клептоза™ (Kleptose™). Циклодекстрины дополнительно описаны в патентах США №5134127 и 5376645, полное содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки.
Составы 2-IB, описанные в настоящем документе, можно получать из сухих физических смесей 2-IB и замещенного бета-циклодекстрина или его сухих комплексов включения, которые при добавлении воды восстанавливаются с образованием водного состава. В качестве альтернативы, водный состав может быть высушен методом сублимации, а затем восстановлен водой.
В некоторых вариантах реализации составы 2-IB, описанные в настоящем документе, находятся в форме водного раствора и содержат кислотный буфер для регулировки рН в пределах диапазона от примерно 4 до примерно 7. Примеры кислотных буферов, подходящих для применения согласно настоящему изобретению, включают кислоты, такие как соляная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, бромистоводородная кислота и т.п., и органические кислоты, такие как щавелевая кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, уксусная кислота, метансульфоновая кислота, толуолсульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, этансульфоновая кислота и т.п. Также могут быть использованы кислые соли приведенных выше кислот. Предпочтительно, состав содержит количество лимонной кислоты и/или цитрата натрия или другой цитратной соли, достаточное для достижения желаемого рН. В некоторых вариантах реализации составы содержат 1-25 мМ лимонную кислоту. В некоторых вариантах реализации составы содержат 0,1-5 мМ цитрат натрия. В некоторых вариантах реализации составы содержат по меньшей мере 20 мМ лимонную кислоту/цитрат. Предпочтительно, составы содержат от примерно 1 до примерно 40, от примерно 5 до примерно 30, предпочтительно от примерно 10 до примерно 20, более предпочтительно от примерно 12,5 до примерно 17,5 мМ лимонную кислоту, ее депротонированную форму или их смесь. Предпочтительно составы содержат примерно 15 мМ лимонную кислоту, ее депротонированную форму или их смесь.
Составы 2-IB, описанные в настоящем документе, могут быть получены следующим образом: буфер на основе лимонной кислоты или другой кислоты растворяют в воде для инъекций. Замещенный бета-циклодекстрин (предпочтительно SBE-CD) при использовании растворяют в растворе кислотный буфер-вода. Затем в указанном растворе растворяют 2-IB. В качестве альтернативы, замещенный бета-циклодекстрин (предпочтительно SBE-CD) при использовании растворяют в водном растворе, а затем в указанном растворе растворяют 2-IB. рН доводят до диапазона от примерно 3 до примерно 6.
Составы предпочтительно получают и упаковывают для применения в качестве стерильных и апирогенных. Например, полученный раствор можно фильтровать в стерильных условиях, например, через мембранный фильтр 0,22 микрон и помещать в стерильные флаконы. Флаконы закрывают и герметизируют, и их можно подвергать заключительной стерилизации. Растворы также могут быть обеспечены в ампулах, шприцах, пакетах для внутривенного вливания или других дозирующих устройствах. Предпочтительно, состав обеспечивают в единице формы, содержащей одну дозу. Растворы можно автоклавировать, не оказывая влияния на стабильность 2-IB (Таблица 24).
Также может быть желательным включение изотонических агентов, например, сахаров, хлорида натрия и т.п. Пролонгированная абсорбция фармацевтической формы для инъекций может быть обеспечена применением агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
Составы 2-IB, предназначенные для введения детям, предпочтительно не содержат противопоказанных наполнителей (например, молочная кислота, докузат натрия, пропиленгликоль и т.д.). Предпочтительно, составы для введения детям также не содержат бензиловый спирт, пропилгаллат, полисорбат 20, 40 или 60, бензоат натрия, тимеросал, арахисовое масло или борную кислоту. Выбор подходящих дополнительных агентов находится в рамках компетенции специалиста в данной области техники.
Предпочтительно, составы 2-IB являются изотоническими. В некоторых вариантах реализации составы 2-IB дополнительно содержат NaCl, предпочтительно от 0,1 до 0,9%, более предпочтительно от 0,2 до 0,9%. В некоторых вариантах реализации составы 2-IB дополнительно содержат сахара, такие как глюкоза, лактоза или маннит, предпочтительно от 1 до 5%, более предпочтительно от 2 до 5%. Предпочтительно, особенно в случае состава для введения детям, сахар представляет собой глюкозу. Состав может содержать комбинацию NaCl и сахара в таком количестве, чтобы состав был изотоническим.
Согласно настоящему изобретению предложены растворы и лекарственные формы 2-IB предпочтительно для парентерального введения. В настоящем описании термин «парентеральное введение» относится к способам введения, включая, без ограничения, внутривенную, внутримышечную, внутриартериальную, интратекальную, интракапсулярную, внутриглазную, внутрисердечную, внутрикожную, интраперитонеальную, транстрахеальную, подкожную, подкутикулярную, внутрисуставную, субкапсулярную, субарахноидальную, интраспинальную и интрастернальную инъекцию и инфузию. Предпочтительно, составы вводят внутривенно.
Составы могут быть обеспечены во флаконах, ампулах, шприцах, пакетах для внутривенного вливания или других дозирующих устройствах. Их можно вводить субъекту напрямую или дополнительно разбавлять. Доза-концентрат предложенного состава может находиться в герметизированной емкости, содержащей количество указанного состава для использования со стандартным интервалом лечения, например, сразу же после разбавления или до 24 часов после разбавления при необходимости. Раствор для внутривенного введения может быть приготовлен, например, путем добавления состава, содержащего дозу-концентрат, в емкость (например, стеклянные или пластиковые бутылки, флаконы, ампулы) в комбинации с разбавителем для достижения желаемой концентрации для введения.
Добавление водного растворителя к жидкой дозе-концентрату можно удобным образом использовать для получения однократных доз жидких фармацевтических составов путем извлечения аликвоты или всей дозы-концентрата для разбавления. Дозу-концентрат можно добавлять в емкость для внутривенного (ВВ) введения, содержащую подходящий водный растворитель. Подходящие растворители представляют собой стандартные растворы для инъекций (например, 5% декстроза, физиологический раствор, раствор Рингера с лактатом или стерильная вода для инъекций и т.д.). Типичные пакеты для внутривенного вливания с однократной дозой представляют собой традиционные стеклянные или пластиковые емкости, имеющие входные и выходные отверстия и имеющие стандартные (например, 25 мл, 50 мл, 100 мл и 150 мл) объемы.
В других вариантах реализации может быть желательным упаковывание полученной лекарственной формы в емкость для защиты состава от света до применения. В некоторых вариантах реализации использование такой емкости с защитой от света может позволять ингибировать один или более путей распада. Например, флакон может представлять собой емкость с защитой от света, защищающую содержимое от воздействия света. В дополнение и/или в качестве альтернативы флакон может быть упакован в емкость любого типа, защищающую состав от воздействия света (например, вторичная упаковка флакона). Подобным образом, емкость любого другого типа может представлять собой емкость с защитой от света или может быть упакована в емкость с защитой от света.
Составы могут быть введены субъекту, включающему любое позвоночное животное, предпочтительно млекопитающее и более предпочтительно человека. Примеры субъектов включают людей, нечеловекообразных приматов, грызунов, морских свинок, кроликов, овец, свиней, коз, коров, лошадей, собак, кошек, птиц и рыб.
В некоторых вариантах реализации составы 2-IB подходят для введения новорожденным младенцам и, в частности, новорожденным, которые страдают, как предполагают, страдают или по иным оценкам подвергаются риску в результате осложнений во время родов, в частности, перинатальной асфиксии, которая может приводить к гипоксии-ишемии. Перинатальная асфиксия также может возникать задолго до рождения или после, и также подходит для лечения составами 2-IB, описанными в настоящем документе. Термины «новорожденный младенец» и «новорожденный» включают детей, рожденных в результате естественных родов, а также детей, рожденных в результате, например, кесарева сечения, а также включают детей, которые были рождены преждевременно и/или рождение которых было индуцировано искусственно.
В некоторых вариантах реализации составы 2-IB подходят для введения матери плода, когда предполагают, что новорожденный будет подвержен асфиксии. Термин «мать» относится к матери плода или новорожденного младенца, включая матерей с естественным оплодотворением, матерей, которым было произведено искусственное оплодотворение, матерей, роды у которых были искусственно индуцированы, и суррогатных матерей.
Как правило, лечение новорожденного составами 2-IB будет осуществляться вскоре после родов, например, во время «окна» для терапевтического воздействия. Как правило, данное окно охватывает первый день после родов и, в частности, первые 0-24 часов после родов. Однако если можно предположить, что ребенок будет подвержен асфиксии, можно проводить лечение матери до предполагаемых родов, в частности, примерно за 0-24 ч до родов.
В рамках такого лечения составы 2-IB, как правило, будут вводить новорожденным в одном или более фармацевтически эффективных количествах и, в частности, в одном или более количествах, которые эффективно предотвращают и/или лечат вышеуказанные последствия. Такое лечение может включать только однократное введение, но обычно и предпочтительно включает несколько введений в течение нескольких часов или дней, например, в рамках или в соответствии с режимом введения или схемой лечения. Такая схема лечения может быть, например, следующей: внутривенная инъекция вещества через каждые 4 часа в течение первых 24 часов.
Как правило, количество 2-IB, вводимое новорожденному, будет соответствовать от 0,01 до 30 мг на кг массы тела в сутки, предпочтительно от 0,1 до 25 мг/кг в сутки, более предпочтительно от 1,8 до 12 мг/кг/сутки. Данные количества относятся к активному компоненту и не включают вещества, представляющие собой носитель или адъювант, такие как углеводы, липиды или белки и т.п. Данные количества можно вводить в виде однократной дозы или в виде нескольких доз в сутки, или по существу непрерывно в течение определенного периода времени, например путем непрерывной инфузии. Предпочтительно, 2-IB вводят в 3-6 дозах/сутки. Предпочтительно, 2-IB вводят новорожденному, представляющему собой человека, в дозе от 0,01 до 1 мг/кг, предпочтительно от 0,05 до 0,75 мг/кг, более предпочтительно от 0,05 до 0,5 мг/кг. Типичные дозы составляют 0,075, 0,45 и предпочтительно 0,15 мг/кг.
Лечение можно продолжать до 24, 48 или 72 часов после асфиксии, или иного времени до тех пор, пока новорожденный по оценкам больше не будет подвергаться риску последствий, указанных выше. Однако лечение, особенно превентивное лечение, также может включать введение состава 2-IB матери до или во время разделения. Состав можно вводить матери, например, перорально, подкожно или путем внутривенной инъекции. Тогда количества для введения могут быть такими же или выше в зависимости от переноса через плаценту и метаболизма, эффекта первого прохождения через печень и объема распределения соединения. Таким образом, количества, вводимые матери, могут варьироваться, например, от 0,01-25 мг активного компонента на кг массы тела матери в сутки.
Один из аспектов настоящего изобретения предусматривает лечение осложнений при родах, включающее введение 2-IB в комбинации с гипотермией. Было показано, что гипотермия оказывает терапевтический эффект в нескольких моделях повреждения головного мозга. Например, существуют многочисленные публикации, демонстрирующие полезный эффект гипотермии в моделях неонатальной асфиксии как in vitro (Onitsuka, М., et al. 1998. Mild hypothermia protects rat hippocampal CA1 neurons from irreversible membrane dysfunction induced by experimental ischemia. Neuroscience Research 30:1-6), так и in vivo (Debillon, Т., et al. 2003. Whole-body cooling after perinatal asphyxia: a pilot study in term neonates. Developmental Medicine and Child Neurology 45:17-23).
В настоящем описании термин «гипотермия» относится к подверганию конкретного субъекта (в данном случае субъекта, представляющего собой новорожденного) гипотермическим условиям, например, путем понижения температуры тела техниками пассивного или активного воздействия. Как правило, подвергание гипотермическим условиям приводит к снижению метаболизма в тканях организма субъекта, что тем самым уменьшает потребность в кислороде.
В некоторых вариантах реализации внутреннюю температуру тела у млекопитающего уменьшают по меньшей мере на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10°С ниже нормальной внутренней температуры тела млекопитающего. В некоторых вариантах реализации внутреннюю температуру тела у млекопитающего уменьшают на 1-10, 2-6 или предпочтительно 2-4°С ниже нормальной внутренней температуры тела млекопитающего.
В одном из предпочтительных вариантов реализации температуру млекопитающего поддерживают на уровне от примерно 31°С до примерно 37°С. Более предпочтительно, температуру млекопитающего поддерживают на уровне от примерно 32 до примерно 36°С, более предпочтительно от примерно 32°С до примерно 35°С, еще более предпочтительно от примерно 33°С до примерно 35°С.
Индукцию гипотермии путем понижения внутренней температуры тела можно осуществлять любым способом, известным в данной области техники. В типичных способах индукции гипотермии используют охлаждение либо всего организма, либо головы. Гипотермию можно индуцировать с использованием льда/холодной воды или механических охлаждающих устройств, таких как охлаждение поверхности, система Olympic CoolCap™ и охлаждение с использованием катетеров, помещенных в крупный сосуд. В качестве альтернативы гипотермию можно индуцировать с использованием фармацевтических агентов, таких как, например, антагонисты ваниллоидных рецепторов, капсаициноиды или подобные капсаициноидам агонисты (описанные в публикации патента США 20090197966, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки) и аналоги нейротензина, способные проходить через гематоэнцефалический барьер, такие как NT69L и NT77 (описанные в патенте США №7319090, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки).
Гипотермию и 2-IB можно применять одновременно, последовательно или по отдельности. В настоящем описании термин «одновременно» употребляется для обозначения того, что 2-IB применяют параллельно с гипотермией, тогда как термин «в комбинации» употребляется для обозначения того, что 2-IB вводят если не одновременно, то «последовательно» в пределах диапазона времени, в котором 2-IB и гипотермия оба демонстрируют терапевтический эффект, т.е. их обоих можно использовать для оказания терапевтического действия в пределах одного и того же диапазона времени. Таким образом, введение «последовательно» может допускать введение 2-IB в течение 5 минут, 10 минут или нескольких часов до или после гипотермии при условии, что время полужизни 2-IB в системе кровообращения является таким, что данное вещество присутствует в терапевтически эффективном количестве, когда субъекта, представляющего собой новорожденного, подвергают гипотермическим условиям.
В отличие от терминов «в комбинации» или «последовательно», в настоящем описании термин «по отдельности» употребляется для обозначения того, что промежуток между введением 2-IB и подверганием субъекта, представляющего собой новорожденного, гипотермии является значительным, т.е. 2-IB может уже не присутствовать в кровотоке в терапевтически эффективном количестве, когда субъекта, представляющего собой новорожденного, подвергают гипотермическим условиям.
В одном из предпочтительных вариантов реализации 2-IB вводят в терапевтически эффективном количестве.
В другом предпочтительном варианте реализации 2-IB вводят в субтерапевтически эффективном количестве. Другими словами, 2-IB вводят в количестве, которое было бы недостаточным для оказания желаемого терапевтического эффекта при введении в отсутствии гипотермических условий. Еще более предпочтительно, комбинация 2-IB и гипотермии оказывает синергетический эффект, т.е. указанная комбинация является синергетической.
В некоторых вариантах реализации гипотермию поддерживают в течение периода времени, составляющего по меньшей мере примерно 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72 или 96 часов после гипоксически-ишемического (ГИ) поражения или после рождения. В одном из предпочтительных вариантов реализации гипотермию поддерживают в течение периода времени, составляющего от примерно 6 до примерно 24 часов после гипоксически-ишемического (ГИ) поражения или после рождения, предпочтительно по меньшей мере 72 часа.
Предпочтительно, лечение в соответствии со способом согласно настоящему изобретению инициируют в течение примерно 6 часов после гипоксически-ишемического (ГИ) поражения и более предпочтительно в течение примерно 2 часов, более предпочтительно в течение 1 часа после гипоксически-ишемического поражения.
В соответствии с другим аспектом 2-IB вводят до гипоксического поражения. Таким образом, в одном из предпочтительных вариантов реализации 2-IB вводят новорожденному через мать до рождения, например, путем введения матери до или во время родов. Предложены способы лечения неонатальной асфиксии у нуждающегося в этом млекопитающего, при этом указанные способы включают: (а) введение терапевтически эффективного количества 2-IB матери млекопитающего до и/или во время родов; и (b) подвергание млекопитающего гипотермии после рождения.
Предпочтительно, 2-IB вводят матери в течение примерно до 48 или 24 часа до родов, после родов. Затем после рождения новорожденного подвергают гипотермическим условиям. В некоторых вариантах реализации 2-IB вводят матери как только обнаруживают, что мать подвергается риску, или обнаруживают, что плод демонстрирует асфиксию или замедленный рост.
Термины «примерно» и «приблизительно» в целом означают приемлемый уровень ошибки для измеренного количества с учетом характера или точности измерений. Как правило, типичные уровни ошибки находятся в пределах 20 процентов (%), предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5% от конкретного значения или диапазона значений.
В настоящем описании лекарственное средство, которое «предотвращает» нарушение или состояние, относится к соединению, которое в статистической выборке уменьшает возникновение указанного нарушения или состояния в образце, получающем лечение, по сравнению с контрольным образцом, не получающим лечение, или отсрочивает появление или уменьшает тяжесть одного или более симптомов нарушения или состояния по сравнению с контрольным образцом, не получающим лечение.
Термин «лечение» включает профилактическое и/или терапевтическое лечение. Термин «профилактическое или терапевтическое» лечение известен в данной области техники и включает введение хозяину одной или более рассматриваемых композиций. Если ее вводят до клинического проявления нежелательного состояния (например, заболевания или другого нежелательного состояния хозяина, представляющего собой животное), то лечение является профилактическим (т.е. оно защищает хозяина от развития нежелательного состояния), тогда как если ее вводят после проявления нежелательного состояния, лечение является терапевтическим (т.е. оно предназначено для уменьшения, улучшения или стабилизации существующего нежелательного состояния или его побочных эффектов).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1: Растворимость 2-IB с 10% SBE-CD и без него при разных значениях рН.
ПРИМЕРЫ
2-IB содержит как кислую группу, представляющую собой карбоновую кислоту, так и основную аминогруппу. рКа для данных групп составляют 4,78 для группы, представляющей собой карбоновую кислоту, и 11,48 для аминогруппы, рассчитанные с использованием программного обеспечения для расчета PrologP. Благодаря наличию кислых и основных групп в 2-IB, 2-IB демонстрирует цвиттерионное поведение в диапазоне нейтрального рН. В результате растворимость 2-IB в воде сильно зависит от рН и является гораздо более низкой, чем рассчитанное значение 35 г/л в условиях нейтрального рН (см. Таблицу 1). Исходя из цвиттерионной природы 2-IB, трудно разработать подходящий состав. Следующие сравнительные примеры демонстрируют ряд попыток разработать состав 2-IB, подходящий для внутривенного введения.
Сравнительный пример 1; Выбор растворителя
Определяли растворимость 2-IB в следующих растворителях:
- 0,9% хлорид натрия в воде;
- 5% декстроза в воде;
-N,N-диметилацетамид;
-N,N-диметилформамид;
- диметилсульфоксид;
- этанол;
- пропиленгликоль;
- полиэтиленгликоль 400;
- кукурузное масло.
Взвешивали приблизительно 10 мг 2-IB в 10 мл пробирку. Затем поэтапно добавляли маленькие аликвоты (100 мкл - 100 мкл - 200 мкл - 400 мкл - 800 мкл - 1600 мкл
- 3200 мкл) соответствующих растворителей. После каждого добавления раствор интенсивно перемешивали и визуально оценивали на предмет растворимости. Конечный объем всех растворителей составлял 6400 мкл (1,6 мг/мл).
Во всех экспериментах оставалось большое количество нерастворенного 2-IB после добавления 6400 мкл растворителя, что указывает на то, что 2-IB недостаточно растворим в любом из данных растворителей. После добавления 100 мкл 1Н соляной кислоты 2-IB полностью растворялся во всех растворителях. Это дополнительно иллюстрирует цвиттерионное поведение 2-IB и сильное влияние рН на растворимость.
Визуально, самая высокая доля 2-IB растворялась в пропиленгликоле. Поэтому эксперимент повторяли для пропиленгликоля, но с добавлением 100 мкл 1Н соляной кислоты после добавления 200 мкл пропиленгликоля (т.е. 10 мг 2-IB+200 мкл пропиленгликоля +100 мкл 1Н соляной кислоты). Это позволяло получить стабильный раствор 2-IB 33 мг/мл, в котором 2-IB был полностью растворен. Добавление воды к данному составу сразу же приводило к осаждению 2-IB, что показывает, что это не является действенным путем получения состава для внутривенного введения.
Поскольку для всех тестируемых растворителей было необходимо добавление кислоты для полной солюбилизации 2-IB, было решено продолжать с 5% декстрозой в воде, т.к. другие растворители были, очевидно, гораздо меньше биосовместимыми во время внутривенного введения или демонстрировали более высокий риск эффектов высаливания (0,9% хлорид натрия в воде).
Когда получают подкисленный состав 2-IB в 5% растворе декстрозы, рН после подкисления равен приблизительно 2 для номинальных концентраций 2-IB в диапазоне 1-5 мг/мл. Возможна частичная нейтрализация 0,1% гидроксидом натрия до рН, равного 3-3,5 (в зависимости от номинальной концентрации), но в итоге происходит осаждение 2-IB сначала в виде очень тонких подобных «волосу» иголок, которые вырастают до более крупных агломератов. При рН, равном 7, почти весь 2-IB выпадал в осадок из раствора на основе визуального наблюдения.
Сравнительный пример 2; Поверхностно-активные вещества
Следующие поверхностно-активные вещества исследовали на предмет их повышающего растворимость поведения:
- гексадецилтриметиламмоний бромид (катионное поверхностно-активное вещество, 1%);
- полиоксиэтилен(40)стеарат (неионное поверхностно-активное вещество, 1%, 0,1% и 0,01%);
- полисорбат 80 (неионное поверхностно-активное вещество, 1%);
- додецилсульфат натрия (анионное поверхностно-активное вещество, 1%, 0,1%, 0,01%).
Готовили исходные растворы поверхностно-активного вещества в 5% растворе декстрозы. Используемая процедура тестирования представляла собой поэтапное добавление соответствующего раствора поверхностно-активного вещества к маленькому количеству 2-IB (10 мг), как описано в сравнительном примере 1. 2-IB не растворялся ни в одном из растворов поверхностно-активных веществ в номинальной концентрации 1,6 мг/мл без добавления кислоты. После добавления кислоты он полностью растворялся, но после последующей (частичной) нейтрализации 0,1 Н гидроксидом натрия 2-IB снова выпадал в осадок точно так же, как наблюдали в экспериментах без использования поверхностно-активных веществ. Это приводит к выводу, что поверхностно-активные вещества не повышают растворимость 2-IB (также как и при низком рН) и, следовательно, не являются полезной добавкой для составов.
В Таблице 1 показано несколько примеров растворимости 2-IB в различных составах. К растворам растворитель/поверхностно-активное вещество добавляли избыток 2-IB, перемешивали при комнатной температуре, а затем фильтровали с удалением несолюбилизированного 2-IB. Затем данные растворы подвергали анализу путем ОФ-ВЭЖХ с определением доли солюбилизированного 2-IB.
Сравнительный пример 3. Циклодекстрины
Тестировали следующие циклодекстрины, все в 1% концентрации в 5% растворе декстрозы:
- α-циклодекстрин;
- β-циклодекстрин;
- гидроксипропил-α-циклодекстрин;
- (2-гидроксипропил)-β-циклодекстрин;
- (2-гидроксипропил)-γ-циклодекстрин.
Как и в случае поверхностно-активных веществ, не наблюдали увеличения растворимости в ходе ни одного из экспериментов, также как и при низком pH.
Сравнительный пример 4. Новые наполнители
Наконец, тестировали два новых наполнителя, Кремофор EL и Солютол (Solutol) HS 15. Готовили исходные растворы данных наполнителей в 10% концентрации в 5% растворе декстрозы, а затем выполняли методику поэтапной растворимости. Лучшие результаты получали с использованием Солютола HS 15 (после добавления соляной кислоты) и, следовательно, следующий этап заключался в оптимизации концентрации Солютола HS 15.
Тестировали пять концентраций, 5-10-15-20-25%), Солютола HS 15 при концентрации состава приблизительно 5 мг/мл (Таблица 2). Оптимальную растворимость 2-IB наблюдали в 20% Солютоле HS 15, но по-прежнему был необходим очень кислый (pH<2) исходный раствор для полной солюбилизации 2-IB. Однако при последующей частичной нейтрализации гидроксидом натрия выпадение 2-IB в осадок происходило при более высоком pH и в гораздо меньших количествах, чем наблюдаемое в составах 2-IB в декстрозе. Получали ряд составов 2-IB, которые хранили в течение 48 часов и измеряли на предмет содержания 2-IB.
На основании исследования, проведенного во время данного проекта, носитель, состоящий из 20% Солютола HS 15 и 5% декстрозы в воде, был выбран в качестве оптимального носителя для получения составов 2-IB. Вследствие цвиттерионной природы 2-IB состав может быть получен только при относительно низких значениях pH (т.е. <3,5-3,6).
Сравнительный пример 5. Исследование токсичности Солютола HS 15
Предварительное исследование токсичности посредством непрерывной внутривенной инфузии у крыс линии Wistar.
Группа I: носитель 20% Солютол (непрерывная внутривенная инфузия)
Животные получали непрерывную инфузию только носителя (20% Солютол в 5% декстрозе) в объеме дозы, составляющем 4 мл/кг/ч, в течение 24 часов.
Смертности не наблюдали и масса тела была нормальной. Для всех животных отмечали сгорбленную позу и пилоэрекцию через приблизительно 12 часов после начала инфузии и далее. Проводили вскрытие для исследования каких-либо макроскопических эффектов лечения Солютолом. Макроскопические данные при вскрытии состояли из пожелтения всего тела и полостей тела (2/4), минимального фибриноподобного слоя в полой вене (4/4), усиленного дольчатого рисунка печени (1/4), маленькой печени (1/4) и расширения почечных лоханок (1/4).
Группа II: носитель 5% Солютол (непрерывная внутривенная инфузия)
Животные получали непрерывную инфузию только носителя (5% Солютол в 5% декстрозе) в объеме дозы, составляющем 4 мл/кг/ч, в течение приблизительно 96 часов.
Не наблюдали смертности и соответствующих клинических признаков, и масса тела была нормальной. В конце лечения обнаруживали повышение аланинаминотрансферазы (2/3), аспартатаминотрансферазы (2/3) и билирубина (2/3) от умеренного до выраженного, и небольшое повышение щелочной фосфатазы (3/3) и глюкозы (3/3). Желтое окрашивание плазмы крови наблюдали для двух животных.
Группа III: 960 мг/кг/24 ч 2-IB в 5% Солютоле (непрерывная внутривенная инфузия).
Животные получали непрерывную инфузию (концентрация дозы 10 мг/мл в объеме дозы 4 мл/кг/ч) с использованием 5% Солютола/5% декстрозы (конечная концентрация декстрозы и физиологического раствора была гипотонической; приблизительно 2,5% и 0,45% соответственно). Инфузию завершали через 46 часов из-за нежелательных клинических эффектов и трудностей с составом в системе для инфузии (сигналы насоса, указывающие на блокировку систем для инфузии, вероятно, в шарнирах).
Одно животное погибло после 46 часов инфузии. Масса тела была увеличена у двух животных. Сгорбленную позу, пилоэрекцию и бледность наблюдали для всех животных во 2-3 день лечения. В конце лечения обнаруживали повышение аспартатаминотрансферазы (1/2), щелочной фосфатазы (1/2) и глюкозы (2/2) от легкого до умеренного, а также высокие значения креатинина и мочевины (1/2). Уровни билирубина были в пределах нормы.
Макроскопические данные при вскрытии состояли из отека (2/3), расширения почечных лоханок (2/3), увеличения печени (1/3), увеличения подвздошного лимфатического узла (1/3), темных пятен на легких (1/3) и фибриноподобного слоя в бедренной вене или вокруг нее. Пожелтения тканей не было.
На основании данных результатов был сделан вывод, что хотя лучшие характеристики растворения для 2-IB были обнаружены в 5-20% Солютоле, данный носитель не подходит для непрерывной внутривенной инфузии у крыс с используемыми объемами доз и скоростями.
Сравнительный пример 6. pH
Растворимость 2-IB (5 мг/мл) тестировали с использованием различных кислот. Растворимости достигали при относительно более высоком pH (pH 3,3) с использованием слабых кислот (уксусной кислоты и лимонной кислоты) по сравнению с pH 3,0 с использованием HCl. Это различие, вероятно, обусловлено синергетическим эффектом регулировки pH и образования водородных связей между 2-IB и карбоксильными группами слабых кислот.
Сравнительный пример 7. Цитратный буфер
Избыток 2-IB добавляли к цитратным буферам, перемешивали при комнатной температуре, а затем фильтровали с удалением несолюбилизированного 2-IB. Затем данные растворы подвергали анализу путем ОФ-ВЭЖХ с определением доли солюбилизированного 2-IB (Таблица 3). Определяли, что растворимость 2-IB в 50 мМ цитратном буфере в диапазоне pH составляла 11 мг/мл при pH 3,0 (комнатная температура). При pH 3,5 приблизительно половина количества 2-IB является солюбилизированной.
Пример 1
Хотя более ранние эксперименты показали, что циклодекстрин не повышал растворимость 2-IB в значительной степени, данные эксперименты повторяли с использованием более высоких концентраций циклодекстрина. Удивительно то, что в противоположность результатам, полученным с использованием 1% циклодекстрина, было обнаружено, что более высокая концентрация циклодекстрина действительно повышала растворимость 2-IB. Избыток 2-IB добавляли к растворам циклодекстрина, перемешивали при комнатной температуре в течение трех дней, а затем фильтровали с удалением неинкапсулированного/несолюбилизированного 2-IB. Затем данные растворы подвергали анализу путем ОФ-ВЭЖХ с определением доли солюбилизированного 2-IB (см. Таблицу 13). Приблизительно 14 мг/мл 2-IB было растворено/инкапсулировано в 40% SBE-CD в 50 мМ цитрате pH 4,0 с конечным pH состава, равным 5,1. При 40% SBE-CD, но с использованием цитратного буфера pH 5 с конечным pH, равным 5,5, было инкапсулировано приблизительно 10 мг/мл. При 40% SBE-CD, но с использованием воды с конечным pH, равным 6,8, было растворено/инкапсулировано приблизительно 4,2 мг/мл. Результаты данного эксперимента показывают, что подходящие уровни 2-IB могут быть инкапсулированы с использованием комбинации относительно низкого pH, низкого исходного pH и 5-20% концентрации циклодекстрина.
Данные результаты показывают четкую разницу между эффективностью инкапсуляции 2-IB для двух типов используемых циклодекстринов. Растворимость 2-IB в SBE-CD (сульфобутиловом эфире β-циклодекстрина) с водой показывает, что при 40% SBE-CD инкапсулировано 4,2 мг/мл 2-IB, это значительно больше, чем 1,2 мг/мл 2-IB, инкапсулированного с использованием 40% HP-CD (гидроксипропил-β-циклодекстрина). Более высокая растворимость 2-IB в SBE-CD, чем в HP-CD не может быть объяснена только образованием комплекса включения путем инкапсуляции, т.к. Mw SBE-CD (2163) больше, чем HP-CD (1400). В более высокую растворимость, вероятно, вносят вклад другие физические взаимодействия между молекулами 2-IB и SBE-CD, такие как образование водородных связей или взаимодействие зарядов.
Визуальный контроль составов циклодекстрина через 12 часов хранения при 5°C показал, что как pH состава, так и концентрация циклодекстрина влияют на стабильность состава с точки зрения осаждения/высвобождения из инкапсулированного состояния (Таблица 13). Для составов с SBE-CD, все составы оставались инкапсулированными (прозрачный раствор) за исключением состава с самой низкой концентрацией циклодекстрина или 2,5% при pH 4,4. При более высокой концентрации циклодекстрина (5%) с соизмеримым pH (4,5) 2-IB - оставался солюбилизированным. Подобным образом, при соизмеримой концентрации циклодекстрина (2,5%), но более высоком pH (5,0) 2-IB - оставался солюбилизированным, что указывает на то, что как pH, так и концентрация циклодекстрина вносят вклад в стабильность составов с SBE-CD при хранении при pH 5. В Таблицах 4А и 4В суммировано влияние pH и типа, и концентрации циклодекстрина на 2-IB.
Пример 2
Проверяли растворимость 2-IB в 10% растворах SBE-CD при разном pH, отрегулированном с помощью 0,1 М раствора лимонной кислоты. Этапы эксперимента приведены ниже.
1. Взвешивают 0,5 г SBE-CD в 10 мл стеклянный флакон.
2. В каждый флакон добавляют 3 мл воды для инъекций для растворения SBE-CD.
3. Взвешивают избыточное количество 2-IB (25 мг-100 мг) в разные флаконы.
4. Перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение 1 часа.
5. Доводят pH до целевого pH с помощью 0,1 М лимонной кислоты.
6. Определяют массу добавленной 0,1 М лимонной кислоты.
7. Добавляют воду для инъекций до общей массы, составляющей 5 г.
8. Снова измеряют pH после 1 часа перемешивания.
9. Фильтруют состав через 0,22 мкм фильтр ПВДФ.
10. Определяют растворимость 2-IB методом ВЭЖХ.
Растворимость 2-IB повышалась с 1,71 мг/г до 13,08 мг/г с уменьшением pH от 7,0 до 4,0 (Таблица 5). Насыщенные растворы были физически стабильными и при комнатной температуре осадков не наблюдали. Однако осадки 2-IB наблюдали через 5 дней хранения при 5°C (Таблица 5). В присутствии 10% SBE-CD растворимость 2-IB значительно повышалась по сравнению только с регулированием pH (pH 5,0: 5,2 против 0,59 мг/г; pH 4,0: 13,08 против 1,72 мг/г). Растворимость повышалась в 7,6-8,8 раз в присутствии 10% SBE-CD (Фиг. 1).
Пример 3
Получали шесть составов, содержащих 8-10% SBE-CD (Таблица 6). Концентрация 2-IB в каждом составе составляла приблизительно 75% от растворимости 2-IB для предотвращения осаждения 2-IB при низкой температуре (Таблица 6 по сравнению с Таблицей 5). Конечный pH доводили с помощью 0,1 М раствора лимонной кислоты (или 0,1 М цитрата натрия) до pH 4,0-6,0. Подробная процедура получения состава описана ниже с использованием F429-02-001P004 в качестве примера (см. Таблицу 14).
F429-02-001p004: 3,9 мг/г 2-IB, 10% SBE-CD, pH 5,0
1. Добавляют 82,93 г воды для инъекций в 200 мл стеклянную бутылку.
2. Взвешивают 10 г порошка SBE-CD в указанную стеклянную бутылку и растворяют при перемешивании с помощью магнитной мешалки.
3. Взвешивают 400 мг 2-IB.
4. Добавляют 6,67 г 0,1 мМ раствора лимонной кислоты.
5. Перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение 5 минут до полного растворения 2-IB.
6. Доводят pH до 5,0 с помощью 0,1 М цитрата натрия.
7. Фильтруют раствор через 0,22 мкм фильтр (Millex-GP (PES)).
8. Помещают 1,5 мл в 6 мл стеклянный флакон и хранят при 5, 25 и 40°C.
Хотя растворимость 2-IB при pH 7,0 составляет 1,71 мг/г, тестировали состав при pH 7,0 с 1,5 мг/г 2-IB в воде, и он оказался неподходящим, т.к. 2-IB полностью не растворялся после перемешивания в течение ночи. Это, вероятно, обусловлено разными подходами к тестированию растворимости и получению состава. Для тестирования растворимости избыточное количество порошка 2-IB добавляли к 10% раствору SBE-CD, и мелкие частицы 2-IB, вероятно, быстро растворялись для достижения равновесия. Однако для получения состава добавляли точное количество порошка 2-IB, содержащего частицы 2-IB разных размеров. Большой размер частиц 2-IB, вероятно, имеет очень низкую скорость растворения в воде при pH 7,0. Для шести составов в Таблице 6 2-IB быстро растворялся в течение 30 минут, что указывает на высокую скорость растворения. Все шесть составов представляли собой прозрачные и бесцветные растворы.
Невозможно сначала повысить растворимость путем получения состава при низком pH, а затем титровать до высокого pH. Наблюдали осаждение при титровании состава F429-02-001P004 от pH 5,0 до pH 5,9 и состава F429-02-001P006 от pH 4,0 до pH 5,1 с помощью 0,1 М трехзамещенного цитрата натрия.
Шесть составов из Таблицы 6 хранили при 5, 25 и 40°C в течение шести недель. В момент времени Т=0, 2 недели, 4 недели и 6 недель составы тестировали на предмет внешнего вида, pH, осмоляльности и чистоты, и содержания 2-IB (ВЭЖХ) (Таблица 15). Через 6 недель хранения в составах не наблюдали осадка в трех условиях хранения (Таблица 16). Внешний вид 6 составов не менялся при 5 и 25°C при визуальном контроле. Однако при 40°C наблюдали легкий коричневатый цвет. Оказалось, что интенсивность цвета увеличивалась с увеличением концентрации 2-IB и уменьшением pH. Причина этого неизвестна. По-видимому, 2-иминобиотин стабилен, и чистота и содержание не менялись. SBE-CD распадался только при экстремально низком pH и высокой температуре. pH и осмоляльность 6 составов оставались стабильными через 2, 4 и 6 недель хранения при 5, 25 и 40°C в сравнении со значениями Т=0.
2-IB оставался стабильным в шести составах через 6 недель хранения при 5, 25 и 40°C исходя из чистоты, содержания и степени извлечения (Таблица 17). Чистоту 2-IB в 6 составах рассчитывали на основании % площади пика 2-IB, измеренной методом ВЭЖХ. Она составляла приблизительно 99% и не уменьшалась через 6 недель хранения при 5, 25 и 40°C. Причина слегка более высокого содержания и степени извлечения в сравнении с Т=0, вероятно, заключалась в аналитической вариации метода ВЭЖХ.
Пример 4
Условия получения составов дополнительно исследовали, как показано в Таблицах 18 и 19. Каждый состав получали до конечного объема 10 мл. 2-IB взвешивали для получения состава с учетом содержания воды, как указано в сертификате анализа (CoA) данной партии (4,2% масс./масс.). Предварительную стабильность составов оценивали путем визуального контроля в течение 3 дней хранения при 5, 25 и 40°C. При Т-0 образцы дополнительно характеризовали на предмет pH и осмоляльности.
Пример 5
Два состава из Примера 4 исследовали более подробно. Составы F30 и F34 получали следующим образом. 2-IB взвешивали в предварительно взвешенную стеклянную бутылку с учетом содержания воды (4,2% масс./масс.). Добавляли лимонную кислоту 100 мМ (90% от общего количества), исходный раствор NaCl/SBE-CD и воду для инъекций (80% от общего количества). Смесь перемешивали с использованием плитки магнитной мешалки. pH был выше 4,0 и его доводили до 4,0±0,2 с использованием 100 мМ раствора лимонной кислоты. Конечную массу раствора регулировали путем добавления воды для инъекций с получением 750 г. Полученный состав фильтровали с использованием Millipak 20 Durapore (мембраны ПВДФ). Оба состава распределяли по 9 пакетам из этиленвинилацетата для инфузии, содержащим приблизительно 70 мл раствора. Композиция состава представлена в Таблице 6.
Образец обоих составов тестировали на предмет внешнего вида, pH, осмоляльности, содержания и чистоты 2-IB сразу же после получения. Образцы для тестирования стабильности хранили при трех температурах: 5°C, 25°C и 40°C. Моменты времени для тестирования стабильности представляли собой 1 день, 2 дня и 3 дня. В каждый момент времени для тестирования стабильности образцы 2-IB во всех условиях хранения тестировали на предмет внешнего вида, pH, содержания и чистоты 2-IB. Было обнаружено, что оба тестируемых состава являлись стабильными в течение 3 дней при 5°C, 25°C и 40°C (см. Таблицы 19А и 19В).
Пример 6
Тестировали два состава из Примера 4 для прогнозирования возможности их осаждения после инъекции на основе статической модели серийного разведения in vitro, описанной в статье Li P.; Vshnuvajjala R.; Tabibi S.Е.; Yalkovsky S.H. "Evaluation of in-vitro precipitation methods", опубликованной в J. Pharma Sci, 1998 Feb; 87 (2): 196-9.
Процедуру выполняли следующим образом:
Три мл состава разводили 3 мл изотонического фосфатного буфера Соренсена (ISPB) или носителя и встряхивали. (Изотонический фосфатный буфер Соренсена (ISPB) pH 7,4 получали с использованием гептагидрата двухосновного фосфата натрия - 2,146%, дегидрата дигидрофосфата натрия - 0,296% и хлорида натрия - 0,178%). Затем три мл полученного раствора/суспензии смешивали с другими 3 мл ISPB/носителя. Данный этап повторяли до получения 7-серийных разведений. Кроме того, готовили контрольную пробирку для каждого разведения с использованием в качестве разбавителей носителя вместо ISPB.
Визуальное наблюдение использовали для определения наличия или отсутствия осадка при смешивании. После данных первичных наблюдений смеси состав-буфер помещали на водяную баню при 37°C и 50 об/мин в течение 1 часа, а затем центрифугировали. Верхнюю фазу подвергали анализу методом ВЭЖХ.
Для целей анализа данных соотношение состав-разбавитель определяют как отношение объема состава к общему объему (объем состава+объем ISPB). Разница между контрольной концентрацией и измеренной концентрацией в каждом разведении представляет собой количество лекарственного средства, отсутствующего на мл исходного состава.
Статическая модель серийного разведения in vitro для состава F30
Тестировали состав F30 для прогнозирования возможности его осаждения после инъекции с использованием статической модели серийного разведения in vitro. В данном методе состав последовательно разводили ISPB в соотношении один к одному. Внешний вид состава на различных этапах разведения представлен в Таблице 7. Равновесная концентрация 2-IB, полученная на каждом этапе разведения, и количество лекарственного средства, отсутствующего на мл, представлены в Таблице 8 (n=3 для каждого разведения). Равновесную концентрацию в каждом разведенном растворе определяли методом ВЭЖХ. Разница между контрольной концентрацией и измеренной концентрацией в каждом разведении равна количеству лекарственного средства, осажденному из 1 мл исходного состава. Соотношение состав-разбавитель определяют как отношение объема состава к общему объему. При соотношении состав-разбавитель, составляющем 0,5, состав становился полупрозрачным, и наблюдали легкое осаждение при стоянии. Количество лекарственного средства, потерянного при данном соотношении разбавителя, было незначительным и, вероятно, является результатом осаждения лекарственного средства. Соотношения состав-разбавитель, составляющие 0,25-0,0625, позволяли получать прозрачный раствор, но результаты анализа показали, что лекарственное средство было потеряно. Недостающее количество лекарственного средства может являться следствием очень незначительного осаждения, которое визуально не наблюдали, или адсорбции лекарственного средства на стенке пробирки.
Статическая модель серийного разведения in vitro для состава F34
Тестировали состав F34 для прогнозирования возможности его осаждения после инъекции с использованием статической модели серийного разведения in vitro. Внешний вид состава на различных этапах разведения представлен в Таблице 9. Равновесная концентрация 2-IB, полученная на каждом этапе разведения, и количество лекарственного средства, отсутствующего на мл, усреднены в Таблице 10. При соотношениях состав-разбавитель, составляющих 0,5-0,125, состав становился мутным-полупрозрачным, и наблюдали осаждение. Количество лекарственного средства, потерянного при данном соотношении разбавителя, было ощутимым и, вероятно, является результатом осаждения лекарственного средства. По мере продолжения разведения и достижения соотношения 0,0625, осаждение наблюдали, но не детектировали с помощью аналитического теста, вероятно, вследствие незначительного количества осадка. Ниже соотношения 0,0625 точки равновесной концентрации перекрывают контрольную кривую с наблюдением повторного растворения осадка.
Для состава F30 4 мг/мл результаты не показали помутнения или осаждения после серийного разведения и были обнаружены ожидаемые концентрации 2-IB, что указывает на то, что состав 2-иминобиотина (4 мг/мл) на основе SBE-CD маловероятно осаждается in vivo благодаря физиологическому разведению кровотоком при внутривенном введении.
Пример 7
Характер и цель данного исследования заключались в оценке перехода 2-иминобиотина (2-IB) через плаценту и возможного прохождения 2-IB через гематоэнцефалический барьер при введении путем двух подкожных инъекций самкам крыс линии Wistar в 20 день после коитуса.
Четырем самкам крыс линии Wistar в 20 день после коитуса вводили 55 мг/кг 2-IB путем подкожной инъекции (каждая инъекция по 27,5 мг/кг). 2-IB получали в физиологическом растворе, pH 3,6-3,8, с концентрацией 2,75 мг/мл. В течение периода исследования не наблюдали смертности среди животных-матерей, и все плоды были жизнеспособными. Вскрытие проводили приблизительно через один час после второй инъекции. Забирали образцы крови и головного мозга как у матери, так и плодов.
2-IB поддавался количественному определению в образцах плазмы крови всех животных-матерей и плодов. Концентрации 2-IB в плазме крови были в 3-7 раз выше для животных-матерей (средняя концентрация составляла 10039 нг/мл), чем для их плодов (средняя концентрация составляла 1765 нг/мл для самцов и 1903 нг/мл для самок).
2-IB поддавался количественному определению в образцах головного мозга всех животных-матерей и плодов. Концентрации 2-IB в головном мозге были соизмеримы у животных-матерей (средняя концентрация составляла 268 нг/г) и их плодов (средняя концентрация составляла 329 нг/г для самцов и 369 нг/г для самок).
В целом, прохождение 2-IB в головной мозг оказалось относительно более низким у животных-матерей (среднее соотношение головной мозг-плазма крови составляло 0,03, в диапазоне от 0,02 до 0,04), чем у их плодов (среднее соотношение головной мозг-плазма крови составляло 0,19, в диапазоне от 0,15 до 0,21 для самцов и 0,20, в диапазоне от 0,15 до 0,22 для самок).
Биоаналитические результаты показали, что все животные-матери и их плоды подвергались действию 2-IB после подкожных инъекций, при этом животные-матери демонстрировали в 3-7 раз более высокие концентрации в плазме крови, чем их плоды (средняя концентрация 2-IB в плазме крови составляла 10039 нг/мл для животных-матерей и 1765 нг/мл для плодов-самцов, и 1903 нг/мл для плодов-самок). Кроме того, концентрации 2-IB можно было измерить в головном мозге всех животных-матерей (средняя концентрация составляла 268 нг/г) и их плодов (средняя концентрация составляла 329 нг/г для плодов-самцов и 369 нг/г для плодов-самок). Прохождение 2-IB в головной мозг оказалось относительно более низким у животных-матерей (среднее соотношение головной мозг-плазма крови составляло 0,03), чем у их плодов (среднее соотношение головной мозг-плазма крови составляло 0,20). Исходя из вышеприведенных результатов, переход 2-IB через плаценту и гематоэнцефалический барьер подтверждается после двух подкожных инъекций у крыс линии Wistar на общем уровне дозы 55 мг/кг.
Пример 8
Растворы 2-IB в концентрациях 0,6 мг/г, 0,75 мг/г и 1 мг/г в цитратных буферах при pH, равных 3,8, 4,0 и 4,2, готовили до конечной массы 20 г следующим образом (целевая буферная емкость при pH 4,0 составляла 15 мМ):
Готовили 0,1 М раствор лимонной кислоты и 0,1 М раствор дигидрата цитрата натрия каждый в воде для инъекций. Раствор лимонной кислоты добавляли к 2-IB, взвешенному в предварительно взвешенный стеклянный флакон (с учетом содержания воды, как указано в сертификате анализа данной партии (4,2% масс./масс.). Добавляли воду для инъекций для разведения, а затем добавляли ОДМ раствор дигидрата цитрата натрия с доведением pH до необходимого значения pH. Воду для инъекций добавляли до общей массы 20 г с последующим измерением pH.
Затем 12 полученных нерасфасованных растворов разделяли и хранили в климатических камерах при 5°C±3°C и 25°C±2°C в течение 3 дней. Все хранимые растворы оценивали на предмет pH и внешнего вида в каждый момент времени (0, 1, 2, 3 дня).
В Таблице 20 представлена композиция составов с буфером, представляющим собой лимонную кислоту, намеченные и измеренные значения pH до и после добавления воды для инъекций до общей массы состава 20 г.
Пример 9
В следующем исследовании исследовали стабильность составов 2-IB с нитратным буферным раствором при pH 4±0,2 при температуре 15°C±3°C и 25°C±2°C. Получали составы 2-IB-цитратный буфер с концентрациями 2-IB, составляющими 0 мг/мл (Плацебо), 0,75 мг/мл и 1 мг/мл, в цитратном буфере pH 3,8, 4,0 и 4,2, как описано в Примере 8. Каждый состав получали до конечной массы 20 г (целевая буферная емкость составляла 15 мМ при pH 4,0), и каждый состав визуально исследовали на предмет внешнего вида и определяли pH. Растворы разделяли и хранили в климатических камерах при 15°C±3°C и 25°C±2°C в течение 3 дней. Все хранимые растворы оценивали на предмет pH и внешнего вида в моменты времени Т=0, 1, 2 и 3 дня.
В Таблице 21 представлена композиция каждого из составов с буфером, представляющим собой лимонную кислоту, намеченные и измеренные значения pH до и после добавления воды для инъекций до общей массы состава 20 г. Также представлен внешний вид и данные pH для каждого из моментов времени.
Пример 10
Растворимость 2-иминобиотина оценивали в буферном 5% растворе Каптизола для значений pH 4,0-6,2. Составы также содержали NaCl для регулировки осмоляльности, и целевая концентрация нитратного буфера для pH 4,0 составляла 15 мМ. Концентрации 2-IB в данных растворах составляли 4,0, 2,0, 1,0, 0,75 и 0 мг/г (Плацебо) 2-IB.
Получение 0,1 М раствора лимонной кислоты и 0,1 М раствора дигидрата цитрата описано в Примере 8. Готовили нерасфасованный раствор 25% Каптизола-2,45% NaCl и использовали его для дальнейшего получения составов.
Каждый из конечных нерасфасованных составов визуально исследовали на предмет внешнего вида и определяли pH. Растворы разделяли и хранили в климатических камерах при 5°C±3°C и 25°C±2°C в течение 3 дней. Все хранимые растворы оценивали на предмет pH и внешнего вида в моменты времени Т=0, 1, 2 и 3 дня.
В Таблицах 22 и 23 представлена композиция растворов 2-IB с цитратным буфером и внешний вид, и данные pH.
Пример 11
Проводили исследование кратковременной стабильности (STS) 2-IB в цитратном буфере (моменты времени: Т=0, 2 недели, 4 недели и 6 недель) с использованием следующих составов:
состав 03-15, содержащий: 0,75 мг/г 2-IB в цитратном буфере pH 6,0 с раствором 5% каптизола и 2,45% NaCl (для изотоничности), и
состав 02-5В, содержащий: 0,75 мг/г 2-IB в цитратном буфере pH 4,0 с NaCl для изотоничности.
Исследовали следующие параметры: внешний вид, pH, осмоляльность, данные количественного анализа, определение примесей и продуктов разложения (IDD), прозрачность, видимые частицы и частицы, невидимые невооруженным глазом. Изменение pH (0,1 единицы за 6 недель при pH 6,0) было незначительным. Не было никаких признаков, что есть проблемы со стабильностью при какой-либо из тестируемых температур.
Пример 12
Проводили исследование растворимости высушенного 2-IB по сравнению с гидратированным 2-IB. Получали три состава на основе состава #02-5. Состав 07-1 получали из вещества 2-IB «как есть» (т.е. 2-IB, взятого прямо из флакона) после сушки. Состав 07-2 получали из полностью гидратированного вещества 2-IB, оставляя вещество 2-IB «как есть» при 20°C/относительной влажности (70±5%). Состав 07-3 получали из вещества 2-IB «как есть». Растворы исследовали на предмет внешнего вида и pH. Определяли, что содержание воды в высушенном веществе, веществе «как есть» и полностью гидратированном веществе составляло 1%, 12% и 18% соответственно.
В Таблице 12 ниже представлены количества ингредиентов, используемых для получения составов (07-1, 07-2 и 07-3), время, потребовавшееся для растворения вещества 2-IB (используемого в каждом составе) в 0,1 М растворе лимонной кислоты, конечные значения pH трех составов и их внешний вид.
Пример 13
Исследование заключительной стерилизации 2 составов 2-IB в цитратном буфере с каптизолом или без него проводили для определения того, какие способы стерилизации можно использовать без распада 2-IB.
Получали четыре (4) буферных состава 2-IB, включая составы с плацебо, не содержащие 2-IB. Каждый из данных растворов фильтровали через 0,22 мкм фильтр PES. Определяли pH, осмоляльность, внешний вид и содержание 2-IB. pH также определяли после титрования раствора 2-IB и лимонной кислоты раствором цитрата натрия.
Каждый состав делили на 4×10 г порции. Каждую порцию помещали в 20 мл стеклянный флакон. Каждый из 4 образцов помещали в паровой стерилизатор Tuttnauer и автоклавировали (Программа 6 (для жидкостей, 121°C в течение 15 минут)). После автоклавирования образцам давали охладиться до комнатной температуры. Из каждого из четырех флаконов брали 5 г образец для определения внешнего вида, pH и осмоляльности. Оставшиеся 5 г состава использовали для анализа.
В Таблице 24 представлены вещества и их количества, используемые для получения каждого из 4 составов, буферная емкость цитрата, внешний вид, pH и количественный анализ до и после заключительной стерилизации. Количественный анализ, указанный в Таблице 24, относится к стабильности растворов, контролируемой путем анализа методом ВЭЖХ. Как показано в Таблице 24, составы можно автоклавировать без значительного уменьшения стабильности 2-IB.
Пример 14
Проводили исследование для оценки возможности осаждения 2 выбранных составов in vivo. Для этой цели использовали статическую модель серийного разведения in vitro, как описано в Примере 6.
В Таблице 25 представлены количества веществ, используемых для препаратов 09-1, 09-1V, 09-2 и 09-2V, их буферные емкости и pH, и внешний вид после титрования раствора 2-IB и лимонной кислоты цитратом натрия. В Таблицах 26 и 27 представлен внешний вид и значения pH для разведений 09-1 и 09-1V в ISPB и разведений 09-1 в носителе. Результаты оценки внешнего вида и pH, представленные в Таблицах 26 и 27, показывают, что для всех выполненных разведений, оба препарата 09-1 и 09-2 не демонстрируют осаждение при разведении буфером Соренсена, имитирующим физиологический pH. Следовательно, риск осаждения данных составов in vivo должен быть маленьким. Кроме того, изменение pH в сторону более физиологических значений происходит быстро, что повышает совместимость/безопасность in vivo.
ТАБЛИЦЫ