Адъювантный эффект тубулярных иммуностимулирующих комплексов, модифицированных эхинохромом а, в отношении порового белка из Yersinia pseudotuberculosis

Медицинская иммунология 2011, Т. 13, № 2-3, стр. 139-144 © 2011, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

АДЪЮВАНТНЫЙ ЭФФЕКТ ТУБУЛЯРНЫХ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИХ КОМПЛЕКСОВ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЭХИНОХРОМОМ А, В ОТНОШЕНИИ ПОРОВОГО БЕЛКА ИЗ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

Цыбульский А.В.1, Попов А.М.2, Портнягина О.Ю.2, Артюков А.А.2, Санина Н.М.1, Мазейка А.Н.1, Костецкий Э.Я.1

1 Дальневосточный федеральный университет, г. Владивосток

2 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, г. Владивосток

Резюме. Исследованы иммуногенные свойства вакцинных конструкций, построенных на основе липид-сапониновых тубулярных иммуностимулирующих (ТИ) комплексов и индивидуального антигена — мономерной и тримерной форм порина, выделенного из Yersinia pseudotuberculosis. Показана возможность усиления иммунного ответа на порин в составе ТИ-комплексов путем добавления в их состав эхинохрома А (ЭХА), выделенного из морского ежа Scaphechinus mirabilis. Иммунизация лабораторных мышей такой вакцинной конструкцией приводит к генерации более интенсивного специфического иммунного ответа гуморального типа к мономерной и тримерной формам порина.

Ключевые слова: адъюванты, ИСКОМ, ТИ-комплексы, субъединичный антиген, поровый белок, гуморальный иммунный ответ, эхинохром.

Tsybulsky A.V., Popov A.M., Portnyagina O.Yu., Artyukov A.A., Sanina N.M., Mazeyka A.N., Kostetsky E.Y. ADJUVANT EFFECT OF TUBULAR IMMUNOSTIMULATING COMPLEXES MODIFIED BY ECHINOCHROME A, TOWARDS A PORE PROTEIN FROM YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

Abstract. We investigated immunogenic properties of vaccine constructs based on lipid-saponin tubular immunostimulating complexes

Keywords: adjuvants, ISKOM, TI complexes, subunit antigen, porin, humoral immune response, echinochrome.

Адрес для переписки: Введен ие

Цыбульский Александр Васильевич Исследования, направленные на получение

690002, г. Владивосток, ул. Острякова, 4б, кв. 1. вакцин против возбудителей инфекционных за-Тел.: (4232) 45-77-79. болеваний, характеризуются усиливающимся

E-mail: avt_biotech@mail.ru интересом к получению вакцинных препаратов

139

Цыбульский А.В. и др.

Медицинская Иммунология

на основе индивидуальных субъединичных антигенов инфекционных агентов. Такие вакцины характеризуются отсутствием возможных негативных побочных реакций, характерных для цель-новирионных и сплит-вакцин. Индивидуальные антигены белковой природы позволяют более четко прогнозировать развитие специфической иммунной реакции. Разделение индивидуальных антигенов на составляющие их субъединицы делает возможным достигать уменьшения или полной нейтрализации токсичности, гемагглютинирующей и гемолитической активностей, характерных для многих бактерио- или вирусспецифических белков. Однако ценой подобных манипуляций с антигенами часто является существенное снижение их иммуногенной активности. В связи с этим применяются различные иммунологические адъюванты, в смеси с которыми антиген инъецируется в организм. Несмотря на давнюю историю подобных работ, арсенал адъювантов остается скромным и в большинстве случаев ограничивается солями алюминия.

С 80-х годов XX века одними из наиболее перспективных адъювантных систем считаются иммуностимулирующие комплексы ИСКОМ — гексагональные наноразмерные структуры, состоящие из фосфолипидов, холестерина и смеси сапонинов, названной QuillA и полученной из коры мыльного дерева Quillagia saponaria. ИСКОМ характеризуются выраженной способностью инкорпорировать белковый антиген в свою матрицу и проявлять иммуноадъювантную активность. Однако широкому применению вакцин на основе ИСКОМ прежде всего мешает отсутствие до настоящего времени полного определения структуры смеси гликозидов QuillA, которые при образовании комплекса с холестерином и в присутствии фосфолипидов формируют характерную округлую форму ИСКОМ [15].

В наших исследованиях мы отказались от применения иммунологически нейтральных фосфолипидов и смеси тритерпеновых гликози-дов QuillA, используя в качестве формообразующих единиц моногалактозилдиацилглицерол (МГДГ), выделенный из морской водоросли Ulva fenestrata, индивидуальный тритерпеновый гли-козид кукумаризид А2-2 (КД) из дальневосточного вида промысловых голотурий Cucumaria japonica, обладающий выраженной иммуноадъювантной активностью, и холестерин [2, 3, 10].

Наноразмерные структуры тубулярной формы образовывались на основе механизмов самосборки липидных молекул и комплексообразования между КД и холестерином. Подобно ИСКОМ, эти суперструктуры, названные нами ТИ-комплексами, характеризовались способностью инкорпорировать белковые анти-

гены и проявлять иммуноадъювантную активность, но при этом имели существенно меньшую токсичность в сравнении с ИСКОМ [2, 14]. В качестве модельного антигена, способного с высокой эффективностью (не менее 95%) встраиваться в ТИ-комплексы мы использовали порообразующий белок (порин), выделенный из Y. pseudotuberculosis. Этот интегральный мембранный белок — один из факторов патогенности возбудителя и является его протективным антигеном [4, 7, 8, 9].

В настоящей работе для иммунизации экспериментальных животных мы использовали субъединичную мономерную термостабильную и нативную термолабильную тримерную формы по-рина, которые применялись как отдельно, так и в составе ИСКОМ и ТИ-комплексов. Исследована возможность повышения иммуноадъювантной активности липид-сапониновой матрицы ТИ-комплексов в отношении порина путем добавления в нее молекул эхинохрома А (ЭХА), обладающих большим спектром биологической активности [13] и способных, как мы предположили, за счет антиоксидантных свойств и особенностей взаимодействия с липидами повысить резистентность ТИ-комплексов к биодеградирующим воздействиям, пролонгируя таким образом антигенную стимуляцию.

Материалы и методы

Мыши линии СВА (120 голов) содержались в стандартных условиях. Все эксперименты проведены в соответствии с нормативами. Забой животных производили декапитацией под эфирным наркозом.

Порин выделяли из микробной массы Y. pseudotuberculosis (штамм 598, I серовар (НИИ-ЭМ СО РАМН, г. Владивосток). Изолированную термоденатурированную форму порина получали диссоциацией комплекса пептидогликан-белок при 100 °С в присутствии 2% SDS [7].

ТИ-комплексы получали методом гидратации липидных пленок, модифицированным нами [5]. ИСКОМ получали в соответствии с методом [15]. Введение порина в ТИ-комплексы и ИСКОМ осуществляли аналогичным способом [5].

ЭХА получен в ТИБОХ ДВО РАН (лаборатории биотехнологии ТИБОХ ДВО РАН, зав. к.х.н. Артюков А.А.). ЭХА добавляли к ТИ-комплексам одновременно с порином. При иммунизации животных использовали дозы порина из расчета 10 мкг/мышь. ЭХА использовали в дозе 4 мкг/ мышь.

Для экспериментов с мономером и тримером порина были сформированы одинаковые экспериментальные группы животных (по 10 голов в каждой): 1 — «контроль» (неиммунизированные

140

2011, Т. 13, № 2-3

Адъювантный эффект иммуностимулирующих комплексов с эхинохромом

мыши), 2 — «порин 10» (иммунизация мышей по-рином в дозе 10 мкг/мышь), 3 — «порин 10 + ИСКОМ» (иммунизация мышей порином в составе классических ИСКОМ), 4 — «порин 10 + ТИ» (иммунизация мышей порином в составе ТИ-комплексов), 5 — «порин 10 + ТИ + ЭХА» (иммунизация мышей порином в составе ТИ-комплексов с ЭХА). Иммунизацию животных порином и ТИ-комплексами с порином производили однократно подкожно (п/к) в объеме 0,2 мл ФСБ с pH 7.4. Контрольные животные получали только инъекцию раствора ФСБ. Кровь для анализа брали через 14 дней после иммунизации. Содержание специфических антипориновых антител в сыворотках крови животных, разведенных в ФСБ в соотношении 1/80, определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Сыворотки неиммунизированных животных служили в качестве контроля. Определение оптической плотности (ОП) проводили с использованием планшетного фотометра Elx808IU “Biotek 1тйг.”(США). Концентрацию антител выражали в единицах оптической плотности (ОП) при длине волны 492 нм.

Реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) проводили по стандартной методике. На 6-й день после первичной иммунизации порином в дозе 10 мкг/мышь (п/к в меж-

0,9 -

0,8 -

0,7 -

0,6 -

12

В Мономер

лопаточную область в объеме 0,2 мл ФСБ) всем животным в подушечку одной задней лапки вводили разрешающую дозу порина в половинной дозе от используемой для сенсибилизации в объеме 0,02 мл ФСБ. В контрлатеральную подушечку лапки в том же объеме вводили ФСБ. Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 ч путем определения веса опытной и контрольной лапок мышей. Интенсивность местной реакции определяли по индексу воспаления (ИВ) ГЗТ, рассчитываемого как процент прироста массы опытной лапки относительно контрольной.

Статистический анализ проводили с использованием прикладной программы SPSS 11/0 с определением критерия достоверности Фише-ра—Стьюдента.

Результаты

При анализе уровня содержания антипорино-вых антител в сыворотке крови установлено, что при однократной иммунизации в дозе 10 мкг/ мышь гуморальный иммунный ответ на тример порина не регистрировался, тогда как мономерная форма порина индуцировала существенный (р < 0,05) прирост содержания специфических антипориновых антител (рис. 1).

*

3 4 5

СИ Тример порина

Рисунок 1. Содержание антител против мономерной и тримерной формы порина из Y. pseudotuberculosis через 14 дней после однократной п/к иммунизации порином в дозе 10 мкг/мышь

Примечание. По оси абсцисс: экспериментальные группы животных.

1 - контроль; 2 - Порин 10; 3 - Порин 10 + ИСКОМ; 4 - Порин 10 + ТИ; 5 - Порин 10 + ТИ + ЭХА.

По оси ординат: ОП при 492 нм.

* - Достоверное отличие от группы № 2 при p < 0,05.

** - Достоверное отличие от группы № 2 при p < 0,01.

141

Цыбульский А.В. и др.

Медицинская Иммунология

Включение как мономера, так и тримера по-рина в состав липид-сапониноввгс наноразмерных адъювантных комплексов (классических ИСКОМ и ТИ-комплексов) не приводило к статистически значимым изменениям величины специфического иммунного ответа (p > 0,05). Заметное статистически достоверное (p < 0,05) усиление иммунного ответа к поровому белку мы обнаружили при использовании в качестве носителя ТИ-комплексов, модифицированных добавлением в липид-сапониновую матрицу молекул ЭХА. Химическая формула этого полиги-дроксинафтахинона представлена на рисунке 2. Для ЭХА характерен высокий антиоксидантный потенциал: он способен в первую очередь эффективно нейтрализовать пероксильные радикалы и супероксид-анионы [13]. Кроме этого ЭХА усиливает метаболизм глюкозы, снижая ее содержание в крови, а также резко повышает митохон-дриогенез в клетках. В связи с этим ЭХА способен достаточно быстро обеспечить повышение функциональных ресурсов различных клеток организма, в том числе и иммунокомпетентных клеток, за счет усиления процессов митохондри-огенеза и/или защиты митохондриального аппарата клеток от действия метаболитов, связанных с окислительным стрессом [1].

Добавление молекул ЭХА в ТИ-комплексы с порином приводило к достоверному повышению адъювантной активности комплексов в отношении как мономера (p < 0,05), так и тримера порина (p < 0,01) (рис. 1). Отметим, что сам по себе ЭХА не обладал иммуноадъювантной активностью в отношении этого же антигена, проявляя даже заметную тенденцию к подавлению порин-специфической реакции ГЗТ при п/к введении антигена в смеси с препаратом ЭХА (ИВ ГЗТ 1,9±0,4% при 6,5±1,3% у мышей, иммунизированных индивидуальным порином, p < 0,05). Такой супрессорный эффект ЭХА в отношении эффекторов ГЗТ, видимо, обусловлен характерной для ЭХА антиоксидантной и противовоспалительной активностью, приводящей к подавлению интенсивности воспалительной реакции

OH O

OH

OH

Рисунок 2. Химическая структура эхинохрома А

в месте инъекции. В итоге это приводит к снижению интенсивности общей реакции организма животных на антиген, поскольку известно, что механизмы генерации иммунного ответа и воспаления взаимосвязаны.

Также известно, что вещества фенольной и хиноидной природы разными механизмами частично блокируют работу транскрипционных факторов, способствуют гармонизации иммунного ответа и снижению побочных эффектов в виде системного воспалительного ответа, который напрямую зависит от транскрипционной активации генов цитокинов, контролируемых NF-kappaB и другими факторами транскрипции, отвечающими за реакции на стресс (SRTFs) [11, 12].

Различия в действии ЭХА на анти-пориновый иммунный ответ при его применении в смеси с ТИ-комплексами или без них позволяет предполагать, что ЭХА при добавлении к ТИ-комплексам за счет своей гидрофобности встраивается в липидную матрицу и действует как составная часть ТИ-комплексов, а не как самостоятельный участник в динамике развития иммунного ответа к порину. Возможно, что ЭХА повышает стабильность ТИ-комплексов, защищая их от агрессивных проокислительных механизмов внутренней среды организма. Это позволяет увеличить срок жизни ТИ-комплексов с антигеном, изменить процесс либерализации белка из вакцинной конструкции и, возможно, изменять конформацию и иммуноген-ность антигена. Таким образом, участие молекул ЭХА в составе ТИ-комплексов несет в себе перспективы как усиления общей иммуноадъювантной активности таких модифицированных носителей белковых антигенов, так и снижения риска возникновения побочных реакций при иммунизации.

Отдельный вопрос при анализе полученных в данном эксперименте результатов связан с установлением более высокой иммуногенной активности мономера порина в сравнении с нативным тримером (p < 0,01) (рис. 1). Общим правилом, как известно, является наличие более высокой иммуногенности у белков, сохраняющих нативную структуру, в сравнении с их субъединицами. Именно низкая иммуногенность субъединичных антигенов активизировала работы по созданию на их основе различных вакцинных конструкций, имеющих в своем составе иммуноадъювантную матрицу. Полученные нами обратные результаты обусловлены особенностями белка, взятого в качестве антигена. Поровый белок Y. pseudotuberculosis является фактором патогенности этого возбудителя и в данной дозе 10 мкг/мышь, очевидно, сохраняет иммуноток-

142

2011, Т. 13, № 2-3

Адъювантный эффект иммуностимулирующих комплексов с эхинохромом

сическое действие, приводящее к негативной модуляции интенсивности иммунного ответа.

Тример порина, являясь структурно и функционально полноценным белком, оказывается существенно токсичнее, что может проявляется, в том числе, в повреждении мембран иммунокомпетентных клеток по механизму порообразования и, как следствие, приводить к транзитор-ной иммуносупрессии. Мономерная субъединица в данных концентрациях не проявляет мембранотоксичности, что подтверждено в серии более ранних экспериментов [7, 9]. Мономеры порина могут спонтанно организовываться в олигомерные комплексы, в том числе — образовывать и тримеры, способные проявлять специфичные для поринов функции и, в конечном итоге, приводить к повреждению мембран клеток. Очевидно, что использованная нами доза мономера порина не является достаточной для формирования критической концентрации функционально полноценных олигомеров, способных лизировать клетки, в том числе иммунокомпетентные. Результатом является отсутствие явлений мембранотоксичности, которая, видимо, имеет место в случае применения тримерной формы белка и приводит, в конечном итоге, к снижению силы иммунного ответа на этот антиген.

Обсуждение

Тример порина из Y. pseudotuberculosis в дозе 10 мкг/мышь проявляет меньшую иммуноген-ность в сравнении с мономерной формой пори-на вследствие, как мы полагаем, сохранения по-рообразующей функции у тримера и связанной с этим мембранотоксичности этого антигена. Мы полагаем, что повреждение тримером пори-на мембран иммунокомпетентных клеток может быть объяснением отсутствия гуморального иммунного ответа к этому антигену при использовании однократного введения данной дозы этого белка (при использовании схемы бустер иммунизации и меньших доз мономера и тримера порина регистрируется обратная картина — более высокая иммуногенность именно тримерной формы белка: эти результаты находятся в печати). Использование липид-сапониновых комплексов (ИСКОМ и ТИ-комплексов) в качестве носителей и адъювантов для порина не приводит при однократной иммунизации к усилению гуморального порин-специфического иммунного ответа. В целом, эти данные позволяют говорить о проблематичности использования порового белка как антигена для вакцинных конструкций ввиду его слабой иммуногенности и заметного потенциала к проявлению токсической активности. Только при модификации состава ТИ-комплексов с помощью добавления в них молекул ЭХА происхо-

дит оптимизация свойств получаемой вакцинной конструкции, обеспечивающая усиление имму-ногенности порового белка. Вероятно, это происходит вследствие редокс-стабилизирующего влияния молекул ЭХА на липид-сапониновую структуру матрицы комплексов. Следствием этого может быть повышение стабильности таких комплексов и более растянутое во времени высвобождение антигена из них.

Применение ЭХА в составе вакцинных конструкций, таким образом, является перспективным способом усиления их иммуногенности и снижения риска возможных побочных реакции при иммунизации. Требует специального изучения механизм действия молекул ЭХА на характеристики собственно липид-сапониновой матрицы, а также — на конформацию и иммуногенность белкового антигена в ее составе.

Благодарности

Работа поддержана грантом Правительства РФ для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых в российских образовательных учреждениях, договор 11.G34.31.0010 и грантом Министерства образования и науки РФ (проект АВЦП 2.2.2/603/1013).

Список литературы

1. Кривошапко О.Н., Попов А.М., Артю-ков А.А. Здоровье. Медицинская экология. Наука. - 2009. - № 4-5. - С. 85-88.

2. Ли И.А., Попов А.М., Цыбульский А.В., Санина Н.М., Костецкий Э.Я., Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Мазейка А.Н. Иммуностимулирующие свойства липид-гликозидного носителя антигена на основе кукумариозида А2-2 и мо-ногалактозилдиацилглицерола из морских водорослей // Прикладная биохимия и микробиология. - 2008. - № 6. - С. 694-700.

3. Мазейка А.Н., Попов А.М., Калинин В.И., Авилов С.А., Сильченко А.С., Костецкий Э.Я. Комплексообразование тритерпеновых гликози-дов голотурий с холестерином как основа липидсапониновых носителей субъединичных антигенов // Биофизика. — 2008. — № 5.- С. 826-835.

4. Новикова О.Д., Зыкова Т.А., Ядыкина Г.М., Глазунов В.П., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Изучение иерсинина - основного полипептида внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Биологические мембраны. - 1985. - Т. 2. -С. 714-723.

5. Попов А.М., Санина Н., Костецкий Э.Я., Ли И.А., Цыбульский А.В., Шныров В.Л. Носитель и адъювант для антигенов // Патент РФ. -2007. - № 2311926.

143

Цыбульский А.В. и др.

Медицинская Иммунология

6. Попов А.М. Механизмы биологической активности гликозидов женьшеня: сравнение с гликозидами голотурий // Вестник ДВО РАН. — 2006. - № 6. - С. 92-104.

7. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. Динамика иммунного ответа к порину из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. — 1999. — № 10. — С. 437-440.

8. Супотницкий М.В. Протективные свойства порообразующих белков патогенных бактерий // Вестник РАМН. — 1996. — № 8. — С. 18-22.

9. Тимченко Н.Ф., Новикова О.Д., Павлова Т.Н., Венедиктов В.С., Соловьева Т.Ф. Про-тективные свойства порина из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Журн. микроби-ол., эпидемиол. и иммунобиол. — 1990. — № 11. — С. 48-50.

10. Цыбульский А.В., Санина Н.М., Ли И.А., Попов А.М., Костецкий Э.Я., Портнягина О.Ю., Шныров В.Л. Разработка нового адьювантного липид-сапонинового комплекса и его применение при экспериментальной иммунизации бактериальным антигеном // Биомедицинская химия. — 2007. — № 3. — С. 297-306.

11. Checker R., Sharma D., Sandur S.K., Khanam S., Poduval TB. Anti-inflammatory

effects of plumbagin are mediated by inhibition of NF-kappaB activation in lymphocytes // Int. Immunopharmacol. — 2009. — Vol. 9. — P. 949-958.

12. Hawiger J.. Innate immunity and inflammation: a transcriptional paradigm // Immunol Res. — 2001. — Vol. 23. — P. 99-109.

13. Lebedev A.V, Ivanova M.V., Levitsky D.O. Iron chelators and free radical scavengers in naturally occurring polyhydroxylated 1,4-naphthoquinones // Hemoglobin. — 2008. — Vol. 32. — P. 165-179.

14. Lee I.A., Popov A.M. Sanina N.M., Kostetsky E.Y., Novikova O.D., Reunov A.V., Nagorskaya VP., Shnyrov V.L. Morphological and immunological characterization of immunostimulatory complexes based on glycoglycerolipids from Laminaria japonica // Acta Biochim. Polon. — 2004. — Vol. 51. — P. 263-272.

15. fLivgren K., Morein B. The requirement of lipids for the formation of immunostimulating complexes (iscoms) // Biotech. Appl. Biochem. — 1988. — Vol. 10. — P. 161-172.

поступила в редакцию 18.03.2011 отправлена на доработку 21.03.2011 принята к печати 25.03.2011

144