АНТИТЕЛА И ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, СПЕЦИФИЧНЫЕ К CD19
ANTIBODIES AND CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS SPECIFIC TO CD19

Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США 62/043,273, поданной 28 августа 2014 года, озаглавленной "Antibodies and Chimeric Antigen Receptors Specific for CD19", и предварительной заявки на патент США 62/078,942, поданной 12 ноября 2014 года, озаглавленной "Antibodies and Chimeric Antigen Receptors Specific for CD19", содержание которых полностью включено посредством отсылки.
Включение Списка последовательностей посредством отсылки
[0002] Настоящая заявка подается со Списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в файле под названием 735042000740seqlist.txt, созданном 28 августа 2015 года, размером 215 килобайтов. Информация из Списка последовательностей в электронном формате полностью включена посредством отсылки.
Область техники, к которой относится изобретение
[0003] Настоящее описание относится в некоторых аспектах к CD19-связывающим молекулам, в частности к антителам против CD19, включающим фрагменты антител. Настоящее описание также относится к рекомбинантным рецепторам, содержащим такие антитела, в том числе к химерным антигенным рецепторам (CAR), которые содержат такие антитела. Описание также относится к созданным с помощью методов генной инженерии клеткам, экспрессирующим такие рецепторы и антитела, и к их применению в адоптивной клеточной терапии.
Уровень техники
[0004] CD19 экспрессируется на нормальных В-клетках, а также клетках и тканях, связанных с различными заболеваниями и состояниями, включающими большинство В-клеточных злокачественных заболеваний. Большинство больных с В-клеточными злокачественными заболеваниями не поддаются лечению с применением доступных методов лечения, включая методы лечения, направленно воздействующие на CD19 и/или другие В-клеточные маркеры. Доступны различные CD19-связывающие молекулы, включающие антитела против CD19, и химерные антигенные рецепторы, содержащие части антител против CD19, а также клетки, экспрессирующие такие химерные рецепторы. Требуются улучшенные CD19-связывающие молекулы и рекомбинантные CD19-направленные клетки. Например, существует потребность в молекулах и клетках со сниженной иммуногенностью и/или в человеческих антителах, включающих фрагменты антител, которые специфично связываются с CD19, а также в химерных рецепторах, экспрессирующих такие человеческие антитела, для применения в адоптивной клеточной терапии. Предложены варианты осуществления, которые удовлетворяют такие потребности.
Сущность изобретения
[0005] Предложены CD19-связывающие молекулы, включающие полипептиды, такие как антитела против CD19, включающие антигенсвязывающие фрагменты антител, такие как одноцепочечные фрагменты, включающие scFv-фрагменты, и полипептиды, содержащие такие антитела, включающие слитые белки, рецепторы, например, рекомбинантные рецепторы, включающие химерные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR), содержащие антитело в качестве антигенраспознающего компонента. В конкретных вариантах осуществления антитела являются человеческими антителами, такими как человеческие одноцепочечные фрагменты, включающие scFv-фрагменты.
[0006] Предложены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, в том числе такие, которые специфично связываются с CD19. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат конкретные определяющие комплементарность области (CDR), включающие CDR области тяжелой цепи (CDR-H) и CDR области легкой цепи (CDR-L). В некоторых вариантах осуществления CDR области имеют или включают аминокислотные последовательности CDR референсного антитела или его цепи или последовательности.
[0007] В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент включают вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL). В некоторых вариантах осуществления антитело, например его VH область, включает определяющую комплементарность область тяжелой цепи 3 (CDR-H3), включающую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления VH область включает по меньшей мере или приблизительно 90% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью VH области, представленной в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62, например, по меньшей мере или приблизительно 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с ней. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент включают CDR-H1 в SEQ ID NO: 18 и CDR-H3 в SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент дополнительно включает последовательность CDR-H2, включающую SEQ ID NO: 81, 82, 19 или 72.
H
[0008] В некоторых вариантах осуществления антитело имеет CDR-H1, CDR-H2 и/или CDR-H3, которые соответственно включают аминокислотные последовательности последовательностей CDR 1, 2 и 3, содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи (V) референсного антитела. В некоторых вариантах осуществления VH область референсного антитела имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11 или 12. В некоторых вариантах осуществления она имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62.
L
L
[0009] В некоторых вариантах осуществления антитело имеет, например, дополнительно включает, CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3, соответственно включающие аминокислотные последовательности последовательностей CDR 1, 2 и 3, содержащихся в вариабельной области легкой цепи (V) референсного антитела. В некоторых вариантах осуществления V референсного антитела имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 или 17. В некоторых вариантах осуществления VL референсного антитела имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 65, 64, 66, 70, 69, 67, 90 или 91.
[0010] В некоторых вариантах осуществления CDR в референсном антителе, VH или VL относятся к CDR, определенной согласно любой схеме нумерации, например, схемам, определенным в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления CDR в референсном антителе или VH или VL относятся к CDR, определенной согласно схеме нумерации Кэбата, как описано в настоящей заявке, к CDR, определенной согласно схеме Чотиа, как описано в настоящей заявке, или согласно Контактной схеме, как описано в настоящей заявке.
[0011] В некоторых вариантах осуществления антитело содержит VH цепь, которая включает CDR-H1, CDR-H2 и/или CDR-H3, где CDR-H1 включает аминокислотную последовательность DYAMH (SEQ ID NO: 18) или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 18; CDR-H2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 или 82, или 19, или 72, или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 81 или с SEQ ID NO: 82, или с SEQ ID NO: 19, или с SEQ ID NO: 72; и/или CDR-H3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 20.
[0012] В некоторых вариантах осуществления антитело включает CDR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 или 82, и CDR-H3, включающую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 20.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
[0013] В некоторых вариантах осуществления антитело имеет CDR-1, включающую аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 110), где X является T, W, S или R; X является G или A; X является I, T, D или S; X является S, R, T или Q; X отсутствует или является S; X отсутствует или является D, N или G; X отсутствует или является V или L; X является X или отсутствует; X является X или отсутствует; X является X; X является X; X является Y, F, D или W; X является V, A или L, и X является S, N или A. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело имеет CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 111), где X является T, Q, S или R; X является G или A; X является I, T, D или S; X является S, R, T или Q; X отсутствует или является S; X является G, D, N или отсутствует; X отсутствует или является V или L; X является D, G, I, L, S или отсутствует; X является S, G, A, I, R или отсутствует; X является H, Y, F, S или N; X является R, N, D, H или Y; X является Y, F, D или W; X является V, A или L; и X является S, N или A; и/или
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
[0014] CDR-L2, включающую аминокислотную последовательность XXXXXXX (SEQ ID NO: 112), где X является D или S; X является F, V, N, K или A; X является S, T, D или N; X является K, V, N, Q или R; X является R, V или L; X является P, K, A или E; и X является S, P, A или T, и/или
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
[0015] CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 115), где X является X; X является S, Q, A или T; X является Y, S, W, R; X является A, D, R, T или Y; X является X; X является X; X является S, P, L, Y, G; X является X или отсутствует; X является X или отсутствует; X является L или отсутствует; X является X; и X является V, T или L. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело имеет CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 114), где X является S, G, T, A, Q, C или N; X является S, Q, A или T; X является Y, S, W, R; X является A, D, R, T или Y; X является A, S, P, G, N или D; X является I, S, G, T, A, L, H, R, N; X является S, P, L, Y, G; X является P, T, S, Q, M, R, N или отсутствует; X является S, L, N, A, M или отсутствует; X является L или отсутствует; X является Y, W, F, V, A или L; и X является V, T или L.
3
4
8
9
10
11
12
13
1
4
6
7
1
5
6
8
9
11
1
2
4
5
6
[0016] В некоторых таких вариантах осуществления, в указанной CDR-L1, X является I, T или S; X является S, T или Q; X является D, G, I, S или отсутствует; X является S, G, I или отсутствует; X является H, Y, S или N; X является R, N, D или H; X является Y или D; и X является V или L; и/или в указанной CDR-L2, X является D; X является K, V, N, Q или R; X является P, K или A; и X является S, A или T; и/или в указанной CDR-L3, X является S, G, T, A, Q, C или N; X является A, S, P, G, N или D; X является I, S, G, T, A, L, H, R или N; X является P, T, S, Q, M, R, N или отсутствует; X является S, L, N, A, M или отсутствует; и X является Y, W, F, V, A или L. В некоторых вариантах осуществления, в указанной CDR-L3, X является S, G, Q или N; X является S, Q или T; X является A, D, T или Y; X является A, S или G; и X является I, S, N, R, A, H или T.
[0017] В некоторых вариантах осуществления CDR-H2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19 (GISWNSGRIGYADSVKG); или CDR-H2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 72 (GISWNSGSIGYADSVKG).
[0018] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 75, 79, 78, 76, 21, 25, 28 или 31. В некоторых вариантах осуществления CDR-L1 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 78, 21 или 28.
[0019] В некоторых вариантах осуществления CDR-L2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 95, 99, 98, 96, 22, 26, 29 или 32. В некоторых вариантах осуществления CDR-L2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 98, 22 или 29.
[0020] В некоторых вариантах осуществления CDR-L3 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 104, 108, 107, 105, 102, 23, 24, 27, 30 или 33. В некоторых вариантах осуществления CDR-L3 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 107, 24 или 30.
[0021] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 24 или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 80, 100 и 109, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 77, 97 и 106, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 74, 94 и 103, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 73, 93 и 101, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 75, 95 и 104, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 79, 99 и 108, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 78, 98, и 107, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 76, 96 и 105, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 73, 93 и 102, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 77, 97 и 106, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними.
[0022] В некоторых вариантах осуществления CDR-L3 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 120 или 121, или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними.
[0023] В некоторых вариантах осуществления CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 81 и 20, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 19 и 20, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 82 и 20, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними; или CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 72 и 20, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности, соответственно, с ними.
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
[0024] В некоторых вариантах осуществления антитело имеет CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность XGXXXXXXXXXXXS (SEQ ID NO: 36), где X является T, S или Q, X является T, S или D, X является T или S, X отсутствует или является S, X отсутствует или является D или N, X отсутствует или является V, X отсутствует или является G или I, X отсутствует или является G или R, X является S, Y или N, X является D или N, X является D или Y, X является V или A; CDR-L2 включает аминокислотную последовательность XXXXRPS (SEQ ID NO: 37), где X является D или S, X является V, N или K, X является S, N или D, и X является K, Q или N; и/или CDR-L3 включает аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 113), где X является C, S, A, G или N; X является S, A или T; X является Y, W или R; X является A или D; X является G, D или S; X является R, S или N; X является Y, L или G; X является N или S; X является S, N или отсутствует; X отсутствует; X является V, A или W; и X является L или V.
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
[0025] В некоторых вариантах осуществления антитело имеет CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность XGXXXXXXXXXXXS (SEQ ID NO: 36), где X является T, S или Q, X является T, S или D, X является T или S, X отсутствует или является S, X отсутствует или является D или N, X отсутствует или является V, X отсутствует или является G или I, X отсутствует или является G или R, X является S, Y или N, X является D или N, X является D или Y, X является V или A; CDR-L2 включает аминокислотную последовательность XXXXRPS (SEQ ID NO: 37), где X является D или S, X является V, N или K, X является S, N или D, и X является K, Q или N; и/или CDR-L3 включает аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 38), где X является C, S, A, G или N; X является S, A или T; X является Y, W или R; X является A или D; X является G, D или S; X является R, S или N; X является Y, L или G; X является N или S; X является S или отсутствует; X является V, A или N; X является W или отсутствует; и X является L или V.
1
3
11
13
2
4
[0026] В некоторых таких вариантах осуществления, в CDR-L1, X является T или S, X является T или S, X является D или N, и X является V; и/или в CDR-L2, X является V или N, и X является K или Q.
[0027] В некоторых вариантах осуществления CDR-H2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19 (GISWNSGRIGYADSVKG), или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 19.
[0028] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1 включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, 25, 28 или 31, или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними; и/или CDR-L2 включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, 26, 29 или 32, или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними; и/или CDR-L3 включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, 24, 27, 30 или 33, или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними.
[0029] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и/или 23, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно.
[0030] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 24, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно.
[0031] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно.
[0032] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно. В некоторых вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними.
[0033] В некоторых вариантах осуществления области CDR тяжелой и легкой цепи являются любой комбинацией вышеуказанных последовательностей CDR-L и CDR-H, включающих последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними.
[0034] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VH область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0035] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VH область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0036] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0037] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0038] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0039] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0040] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0041] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VH область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0042] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VH область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0043] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VH область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0044] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VH область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0045] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VH область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0046] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0047] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0048] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 91 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0049] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0050] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 65 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0051] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0052] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0053] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0054] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0055] В определенных вариантах осуществления антитело или фрагмент включают VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67 или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ней.
[0056] В определенных вариантах осуществления VH область антитела или фрагмента включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, 60, 63 или 62, или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними; и/или VL область антитела или фрагмент включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, 16, 71, 90, 65, 64 или 69, или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними.
[0057] В некоторых вариантах осуществления области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 17, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0058] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 15, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0059] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 13, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0060] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 14, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0061] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 16, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0062] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 71, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0063] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 62 и 68, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0064] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 65, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0065] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 60 и 64, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0066] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 61 и 66, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0067] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 70, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0068] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 62 и 69, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0069] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 67, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно;
[0070] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 91, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно; или
[0071] Области VH и VL антитела или фрагмента включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 90, соответственно, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними, соответственно.
[0072] В некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 11, и VL область включает SEQ ID NO: 13; в некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 11, и VL область включает SEQ ID NO: 14; в некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 11, и VL область включает SEQ ID NO: 15; в некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 11, и VL область включает SEQ ID NO: 16, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними; в некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 11, и VL область включает SEQ ID NO: 17, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними.
[0073] В некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 12, и VL область включает SEQ ID NO: 13; в некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 12, и VL область включает SEQ ID NO: 14; в некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 12, и VL область включает SEQ ID NO: 15; в некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 12, и VL область включает SEQ ID NO: 16, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними; в некоторых вариантах осуществления VH область включает SEQ ID NO: 12, и VL область включает SEQ ID NO: 16, или последовательности, обладающие по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними.
[0074] В некоторых вариантах осуществления антитело является одноцепочечным фрагментом, таким как одноцепочечный фрагмент с двумя или более вариабельными областями, которые соединены одним или более гибкими иммуноглобулиновыми линкерами. В некоторых вариантах осуществления антителом является scFv. В некоторых вариантах осуществления scFv включает линкер, который богат серином и/или глицином, такой как линкер, включающий повторы GGGS (SEQ ID NO: 122) или GGGGS (SEQ ID NO: 123), такой как линкер, включающий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления линкер включает последовательность SEQ ID NO: 43.
[0075] В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела, например scFv, содержит VH область или ее часть, после которой расположен линкер, за которым следуют VL или ее части. В некоторых вариантах осуществления фрагмент антитела, например scFv, содержит VL область или ее часть, после которой расположен линкер, за которым следуют VH область или ее часть.
[0076] В некоторых вариантах осуществления scFv включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 или 10, или последовательность, обладающую по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности аминокислотной последовательности с ними.
[0077] В некоторых вариантах осуществления scFv включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 87 или 89, или имеет последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную такой последовательности.
[0078] В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент специфично связывается с таким же, подобным и/или перекрывающимся эпитопом в CD19, как эпитоп, специфично связываемый референсным антителом, и/или антитело конкурирует с референсным антителом за связывание с CD19. В некоторых аспектах референсное антитело является мышиным или химерным, или человеческим, или гуманизированным антителом против CD19, FMC63, SJ25C1, причем антитело имеет последовательность вариабельной области SEQ ID NO: 39 и/или 40, или антитело имеет последовательность вариабельной области SEQ ID NO: 41 и/или 42. В некотором аспекте референсное антитело является антителом, включающим последовательность, как описано в настоящей заявке, включая последовательность(и) любого из вышеуказанных вариантов осуществления. Например, в некоторых вариантах осуществления референсным антителом может быть scFv, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 87 или 89. В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело или фрагмент содержат одну или более, или все CDR области, которые отличаются от CDR областей в референсном антителе. Например, в некоторых вариантах осуществления предложенное антитело или фрагмент содержат одну или более, или все CDR области, которые отличаются от соответствующих CDR областей в антителе, обозначенном FMC63 или SJ25C1.
[0079] Например, предложены человеческое антитело и антигенсвязывающие фрагменты, которые специфично связываются с таким же или перекрывающимся эпитопом в CD19, как эпитоп, специфично связываемый референсным антителом, таким как FMC63, SJ25C1, причем антитело имеет последовательность вариабельной области SEQ ID NO: 39 и/или 40, или антитело имеет последовательность вариабельной области SEQ ID NO: 41 и/или 42, и включает CDR области тяжелой и легкой цепи, которые отличаются от CDR областей, присутствующих в референсном антителе.
[0080] В некоторых вариантах осуществления антитело конкурирует за связывание с референсным антителом, по меньшей мере, в такой же степени, в какой референсное антитело конкурирует с самим собой за связывание с CD19, или со степенью конкуренции, которая не более чем в 1,5 раза или 2 раза ниже, в 3 раза ниже, 4 раза ниже, 5 раз ниже или в 10 раз ниже, чем конкуренция с референсным антителом, и/или измеренная IC50 не более чем в 1,5 раза или 2 раза, или 3 раза, или 4 раза, или 5 раз, или в 10 раз выше, чем IC50 референсного антитела, конкурирующего за связывание с самим собой, например, при измерении в таком же анализе.
[0081] В некоторых вариантах осуществления антитело имеет аффинность связывания, которая, по меньшей мере, достигает или практически достигает аффинности связывания референсного антитела с CD19. В некоторых аспектах антитело имеет аффинность связывания EC50, которая является приблизительно такой же или ниже, чем EC50 референсного антитела, или не более чем приблизительно в 1,5 раза или не более чем приблизительно в 2 раза больше, не более чем в 3 раза больше и/или не более чем в 10 раз больше, чем EC50 референсного антитела. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания антитела сравнивают с соответствующей формой референсного антитела. Сравнение обычно выполняют с помощью такого же или подобного аназиза.
[0082] В некоторых из любых подобных вариантов осуществления CD19 является человеческим CD19. В некоторых из любых подобных вариантов осуществления антитело или фрагмент специфично связывают, демонстрируют аффинность связывания и/или конкурируют за связывание с человеческим CD19.
[0083] В некоторых вариантах осуществления антитело является человеческим. В некоторых вариантах осуществления антитело является рекомбинантным. В некоторых вариантах осуществления антитело является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления антитело является выделенным.
[0084] В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент дополнительно включают, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина. Константная область может включать какой-либо один или более из CH1, CH2, CH3 и/или CH4, и/или CL из человеческого или другого антитела, и может относиться к любому классу, в том числе IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, например, включая домены константной области IgG человека, например, IgG1 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления константная область включает или является Fc-областью, такой как Fc-область IgG человека.
[0085] Также предложены молекулы, такие как химерные и/или слитые молекулы, в том числе рецепторы, такие как рекомбинантные рецепторы, которые включают антитело согласно любому из вариантов осуществления (например, содержащееся в или являющееся частью внеклеточного домена) и дополнительные домены, такие как внутриклеточные сигнальные домены, спейсеры, линкеры и/или трансмембранные домены. В некоторых вариантах осуществления рецептор является химерным антигенным рецептором, включающим внеклеточную часть, включающую антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления, и внутриклеточный сигнальный домен.
[0086] В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент включают scFv. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен включает ITAM и/или сигнальный домен, способный передавать сигнал, приближенно соответствующий сигналу естественного связывания ITAM-содержащей молекулы или рецепторного комплекса, такого как TCR рецепторный комплекс. В некоторых аспектах внутриклеточный сигнальный домен включает сигнальный домен дзэта цепи CD3-дзэта (CD3ζ) цепи.
[0087] В некоторых вариантах осуществления рецептор дополнительно включает один или более доменов, таких как трансмембранный домен, соединяющий трансмембранный домен антитела, соединяющий внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых аспектах трансмембранный домен включает трансмембранную часть костимуляторной молекулы, такой как T-клеточная костимуляторная молекула, например CD28 и/или 41BB. В некоторых вариантах осуществления T-клеточная костимуляторная молекула выбрана из группы, состоящей из CD28 и 41BB, и, в некоторых вариантах осуществления, рецептор включает сигнальные домены из CD28 и 41BB.
[0088] Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело (включая фрагменты) согласно любому из вариантов осуществления или рецептор, например, химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления, векторы, включающие такие нуклеиновые кислоты, и клетки, содержащие векторы и/или нуклеиновые кислоты, например, для экспрессии антител и/или молекул.
[0089] Таким образом, также предложены клетки и векторы для продукции и экспрессии молекул, включающих антитела и молекулы, такие как рецепторы, например, химерные антигенные рецепторы (CAR). Например, предложены рекомбинантные клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления. В некоторых аспектах клетка является Т-клеткой. В некоторых аспектах клетка является NK-клеткой. В некоторых аспектах клетка является стволовой клеткой.
[0090] Также предложены композиции, включающие антитела, рецепторы, молекулы и/или клетки, в том числе фармацевтические композиции, например, дополнительно включающие фармацевтически приемлемые вещества, такие как носители.
[0091] Также предложены способы введения, в том числе способы лечения, осуществляемого путем введения клетки, антитела, рецептора, композиции или другой молекулы согласно любому из вариантов осуществления субъекту, например, в эффективном, например терапевтически эффективном, количестве. В некоторых вариантах осуществления субъект имеет или подозревается на наличие заболевания или нарушения, ассоциированного с CD19, такого как В-клеточное злокачественное заболевание, такое как В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ), пролимфоцитарные лейкозы, волосатоклеточные лейкозы, общие острые лимфоцитарные лейкозы, ноль-клеточные острые лимфобластные лейкозы, неходжкинские лимфомы, диффузные В-крупноклеточные лимфомы (ДВККЛ), множественные миеломы, фолликулярная лимфома, лимфома из клеток маргинальной зоны селезенки, лимфома из клеток мантийной зоны, индолентная В-клеточная лимфома или лимфома Ходжкина, или аутоиммунное или воспалительное заболевание, в которое вовлечены В-клетки.
[0092] В некоторых вариантах осуществления введение антитела или рецептора связано с более низкой степенью иммуногенности по сравнению с введением референсного антитела (или рецептора, содержащего референсное антитело), которое конкурирует за связывание с антителом или связывается с перекрывающимся эпитопом. В некоторых аспектах референсное антитело является гуманизированным, химерным или нечеловеческим антителом.
Краткое описание чертежей
Фигура 1
Фигурах 1A
1B
[0093] : На  и  показаны результаты анализа связывания, в котором сравнивают связывание примерных человеческих scFv-фрагментов с CD19-экспрессирующими клетками HEK293 и связывание с не экспрессирующими CD19 клетками HEK293. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигуре 2
[0094] На  показана оценка очистки в ДСН геле примеров антител против CD19 (scFv-фрагменты).
Фигура 3
Фигурах 3A
3B
3C
[0095] : На ,  и  показаны результаты исследований по оценке аффинности связывания различных примеров scFv-антител (scFv-фрагментов), включая антитела против CD19. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигуре 4
[0096] На  показаны результаты исследований с оценкой аффинности связывания различных примеров scFv-антител, включая scFv-фрагменты антител против CD19. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигура 5
Фигурах 5A
5B
[0097] : На  и  показаны результаты конкурентных анализов связывания по оценке связывания соответствующего меченого антитела в присутствии различных концентраций конкурирующих антител. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигуре 6
[0098] На  показаны результаты конкурентных анализов связывания по оценке связывания меченого референсного scFv-антитела в присутствии различных концентраций конкурирующих scFv-антител. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигура 7
Фигуре 7A
Фигуре 7B
[0099] : На  показаны результаты эксклюзионной хроматографии; колонку калибровали, вводили стандартные белки и собирали фракции с получением стандартных образцов. На  показаны результаты после введения scFv против CD19 (клон 18B) в такую же колонку и сбора фракции при таких же условиях.
Фигуре 8A
[0100] На  показаны результаты анализа связывания с оценкой связывания примеров клонов scFv человека с CD19-экспрессирующими клетками в следующем порядке, слева направо: только клетки, пустой супернатант (Ложн. супер.), антитело отрицательного контроля (Отр. контр.), Клон 18, Клоны 200-287, только клетки, Ложн. супер., Отр. контр. и Клон 18. Примерные положительные результаты, которые демонстрируют CD19-специфичное связывание (обозначено звездочкой) (в порядке слева направо): Клон 213, Клон 227, Клон 241, Клон 255, Клон 272, Клон 278, Клон 283 и Клон 285. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигуре 8B
[0101] На  показаны результаты анализа связывания с оценкой связывания примеров клонов scFv человека с CD19-экспрессирующими клетками в следующем порядке, слева направо: только клетки, пустой супернатант (Ложн. супер.), антитело отрицательного контроля (Отр. контр.), Клон 18B, Клоны 300-387, только клетки, Ложн. супер., Отр. контр. и Клон 18B. Примерные положительные результаты, которые демонстрируют CD19-специфичное связывание (обозначено звездочкой) (в порядке слева направо): Клон 302, Клон 305, Клон 313, Клон 314, Клон 318, Клон 324, Клон 327, Клон 328, Клон 336, Клон 339, Клон 377, Клон 379 и Клон 382. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигуре 8C
[0102] На  показаны результаты анализа связывания с оценкой связывания примеров клонов scFv человека с CD19-экспрессирующими клетками в следующем порядке, слева направо: только клетки, пустой супернатант (Ложн. супер.), антитело отрицательного контроля (Отр. контр.), Клон 18B, Клоны 400-487, только клетки, Ложн. супер., Отр. контр. и Клон 18B. Примерные положительные результаты, которые демонстрируют CD19-специфичное связывание (обозначено звездочкой) (в порядке слева направо): Клон 440 и Клон 448.
Фигуре 8D
[0103] На  показаны результаты анализа связывания с целью сравнения связывания примерных человеческих scFv-фрагментов с CD19-экспрессирующими клетками K562 и с не экспрессирующими CD19 клетками K562. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигуре 9
[0104] На  показана оценка очистки в ДСН геле примерных антител против CD19 (scFv-фрагменты).
Фигура 10
Фигурах 10A-E
[0105] : На  показаны результаты отдельных анализов связывания с оценкой аффинности связывания различных примерных scFv-антител, включающих scFv-фрагменты антител против CD19. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигуре 11
[0106] На  показаны результаты конкурентных анализов связывания с оценкой связывания меченого референсного scFv-антитела в присутствии различных концентраций конкурирующих scFv-антител. MFI=средняя интенсивность флуоресценции.
Фигуре 12A
+
[0107] На  показана экспрессия на поверхности клетки различных CAR-рецепторов, либо в VH-VL (HL) ориентации HL; темная линия), либо в VL-VH ориентации (LH; серая линия), в трансдуцированных CD8+ Т-клетках при измерении по экспрессии EGFRt для клеток до обогащения (до) и после обогащения с последующей сортировкой при использовании антитела к EGFR и размножением при стимуляции CD19 B-LCL (после).
Фигуре 12B
[0108] На  показан ДСН гель для оценки экспрессии примерных человеческих CAR-рецепторов против CD19 в трансдуцированных первичных человеческих Т-клетках.
Фигурах 13A
13B
+
[0109] На  и  показана цитолитическая активность первичных человеческих CD8 Т-клеток, экспрессирующих различные CD19-специфичные CAR-рецепторы, против CD19-экспрессирующих клеток. C обозначает один EGFRt (отрицательный контроль); FM - FMC63 scFv CAR, 18 - Клон 18 scFv CAR, 17 - Клон 17 scFv CAR, 76 - Клон 76 scFv CAR, 5 - Клон 5 scFv CAR и 18B - Клон 18B scFv CAR.
Фигурах 14A
14B
+
[0110] На  и  показана секреция цитокинов первичными человеческими CD8 Т-клетками, экспрессирующими различные CD19-специфичные CAR-рецепторы, после сокультивирования с CD19-экспрессирующими клетками. C обозначает один EGFRt (отрицательный контроль); FM - FMC63 scFv CAR, 18 - Клон 18 scFv CAR, 17 - Клон 17 scFv CAR, 76 - Клон 76 scFv CAR, 5 - Клон 5 scFv CAR и 18B - Клон 18B scFv CAR.
Фигуре 15
+
[0111] На  показана секреция цитокинов первичными человеческими CD4 Т-клетками, экспрессирующими различные CD19-специфичные CAR-рецепторы, после сокультивирования с CD19-экспрессирующими клетками. C обозначает один EGFRt (отрицательный контроль); FM - FMC63 scFv CAR, 18 - Клон 18 scFv CAR, 17 - Клон 17 scFv CAR, 76 - Клон 76 scFv CAR, 5 - Клон 5 scFv CAR и 18B - Клон 18B scFv CAR.
Фигуре 16A
16B
[0112] На  и  показана пролиферация первичных человеческих CD8+ Т-клеток или CD4+ Т-клеток, соответственно, экспрессирующих различные CD19-специфичные CAR-рецепторы против CD19-экспрессирующих клеток, после сокультивирования с CD19-экспрессирующими клетками.
Фигура 17
Фигуре 17A
Фигуре 17B
[0113] : На  показана противоопухолевая активность первичных человеческих CD8+ Т-клеток, экспрессирующих различные CD19-специфичные CAR-рецепторы, после введения NSG мышам, которым перевивали клетки Raji, экспрессирующие люциферазу светляка. На  показана противоопухолевая активность первичных человеческих CD4+ и CD8+ Т-клеток, экспрессирующих различные CD19-специфичные CAR-рецепторы и вводимые в соотношении 1:1 NSG мышам после перевивки клеток Raji.
Фигура 18
Фигуре 18A
Фигуре 18B
+
[0114] : На  показана аминокислотная последовательность из 74 остатков или 75 остатков мембрано-проксимальной области каждой из трех различных химерных молекул CD19. Ниже на Фигуре 18A показаны все три последовательности, причем каждое выровненное положение показанной области, в которой последовательности человека и макака-резуса содержат идентичную аминокислоту, отмечено звездочкой (*). Положения, в которых последовательность резуса содержит не идентичную, но консервативную аминокислотную замену по сравнению с человеческой последовательностью, отмечены знаком ":". Положения, в которых последовательность резуса содержит не идентичную, но полуконсервативную аминокислотную замену по сравнению с человеческими последовательностями, отмечены знаком ".". Положения, в которых последовательность резуса содержит вставку или неидентичную, неконсервативную/полуконсервативную замену по сравнению с человеческой последовательностью, не отмечены никаким знаком. На  показана секреция цитокинов первичными человеческими CD8 Т-клетками, экспрессирующими различные CD19-специфичные CAR-рецепторы, после сокультивирования с клетками, экспрессирующими человеческий CD19, CD19 макака-резуса или химерные резус/человеческие молекулы CD19 (V1, V2 или V3). C обозначает один EGFRt (отрицательный контроль); FM - FMC63 scFv CAR, 18 - Клон 18 scFv CAR, 17 - Клон 17 scFv CAR, 76 - Клон 76 scFv CAR, 5 - Клон 5 scFv CAR и 18B - Клон 18B scFv CAR.
Подробное описание
[0115] Предложены CD19-связывающие молекулы, включающие антитела (включающие антигенсвязывающие фрагменты антител, такие как одноцепочечные фрагменты, включающие scFv-фрагменты) и рекомбинантные рецепторы, включающие химерные рецепторы, содержащие такие антитела и фрагменты, нуклеиновые кислоты, кодирующие такие антитела и фрагменты, и клетки, такие как рекомбинантные клетки, экспрессирующие и предназначенные для продукции этих антител и фрагментов. Также предложены способы получения и применения антител и фрагментов, а также клеток, экспрессирующих или содержащих антитела и фрагменты.
I. CD19-связывающие молекулы
[0116] В некоторых аспектах предложены CD19-связывающие молекулы, такие как CD19-связывающие полипептиды. Такие связывающие молекулы включают антитела, которые специфично связываются с CD19, таким как молекула человеческого CD19, в том числе их антигенсвязывающие фрагменты. Также к связывающим молекулам относятся рекомбинантные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы, содержащие такие антитела.
A. Антитела к CD19
[0117] Предложены антитела против CD19, включающие функциональные фрагменты антител, в том числе такие, которые включают вариабельную тяжелую цепь и вариабельную легкую цепь, такие как scFv-фрагменты. Также предложены молекулы, содержащие такие антитела, например, слитые белки и/или рекомбинантные рецепторы, такие как химерные рецепторы, включающие антигенные рецепторы. Предложенные антитела против CD19 также включают человеческие антитела. В некоторых вариантах осуществления антитела, такие как человеческие антитела, специфично связываются с определенным эпитопом или областью CD19, как правило, внеклеточным эпитопом или областью. В некоторых вариантах осуществления антитела связываются с таким же или подобным эпитопом или областью CD19, как связывает другое антитело, такое как одно или более мышиных антител, FMC63 или SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления антитела связываются с перекрывающимся эпитопом CD19, как связывает одно из этих известных антител, и/или конкурируют за связывание с таким антителом. Антитела включают выделенные антитела. Молекулы включают выделенные молекулы.
2
[0118] Термин "антитело" в настоящем описании используется в самом широком смысле и включает поликлональные и моноклональные антитела, в том числе интактные антитела и функциональные (антигенсвязывающие) фрагменты антител, включая антигенсвязывающие (Fab) фрагменты, F(ab') фрагменты, Fab' фрагменты, Fv фрагменты, фрагменты рекомбинантного IgG (rIgG), одноцепочечные фрагменты антител, включая одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) и фрагменты однодоменных антител (например, sdAb, sdFv, нанотело). Термин охватывает полученные методами генной инженерии и/или иным образом модифицированные формы иммуноглобулинов, такие как интратела, пептитела, химерные антитела, полностью человеческие антитела, гуманизированные антитела и гетероконъюгаты антител, мультиспецифические, например биспецифические, антитела, диатела, триатела и тетратела, тандемные ди-scFv, тандемные три-scFv. Если не указано иное, следует понимать, что термин "антитело" охватывает функциональные фрагменты такого антитела. Термин также охватывает интактные или полноразмерные антитела, в том числе антитела любого класса или субкласса, включая IgG и его субклассы, IgM, IgE, IgA и IgD.
[0119] Термины "определяющая комплементарность область" и "CDR", являющиеся синонимами "гипервариабельной области" или "HVR", как известно в уровне техники, относятся к последовательностям, состоящим из нескольких несплошных последовательностей аминокислот в пределах вариабельных областей антитела, которые придают антигенную специфичность и/или аффинность связывания. Как правило, в каждой вариабельной области тяжелой цепи содержится три CDR (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) и три CDR - в каждой вариабельной области легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). "Каркасные области" и "FR", как известно в уровне техники, относятся к не-CDR частям вариабельных областей тяжелой и легкой цепей. Как правило, в каждой полноразмерной вариабельной области тяжелой цепи содержится четыре FR области (FR-H1, FR-H2, FR-H3 и FR-H4), и четыре FR области - в каждой полноразмерной вариабельной области легкой цепи (FR-L1, FR-L2, FR-L3 и FR-L4).
[0120] Точные границы аминокислотной последовательности данной CDR или FR могут быть с легкостью определены при использовании любой из ряда известных схем, включающих схемы, описанные в Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (схема нумерации "Кэбата"), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 (схема нумерации "Чотиа"), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography", J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Контактная" схема нумерации), Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains", Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 (схема нумерации "IMGT") и Honegger A and Pluckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool", J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, (схема нумерации "Aho").
[0121] Границы данной CDR или FR могут изменяться в зависимости от схемы, используемой для идентификации. Например, схема Кэбата основана на структурных выравниваниях, тогда как схема Чотиа основана на структурной информации. Нумерация для схем Кэбата и Чотиа основана на длинах стандартных последовательностей областей антител, при этом вставки обозначают инсерционными индексами, например "30a", и делециях, присутствующих в некоторых антителах. В двух указанных схемах в различные положения вводят определенные инсерции и делеции ("инделы"), что приводит к дифференцированной нумерации. Контактная схема основана на анализе комплексных кристаллических структур и подобна во многих отношениях схеме нумерации Чотиа.
[0122] В Таблице 1, ниже, приведены примерные границы положений CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 и CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, идентифицированные согласно схемам Кэбата, Чотиа и Контактной схеме, соответственно. Для CDR-H1 нумерация остатков приведена при использовании схем нумерации Кэбата и Чотиа. Области FR расположены между CDR-областями, например, область FR-L1 расположена между CDR-L1 и CDR-L2, и т.д. Следует отметить, что поскольку в показанной схеме нумерации Кэбата вставки помещены в H35A и H35B, положение конца петли CDR-H1 по Чотиа, при нумерации с использованием показанного правила нумерации Кэбата, изменяется между H32 и H34, в зависимости от длины петли.
Таблица 1
<b>CDR</b>
<b>Кэбат</b>
<b>Чотиа</b>
<b>Контактная</b>
CDR-L1
L24-L34
L24-L34
L30-L36
CDR-L2
L50-L56
L50-L56
L46-L55
CDR-L3
L89-L97
L89-L97
L89-L96
CDR-H1(нумерация Кэбата<sup>1</sup>)
H31-H35B
H26-H32..34
H30-H35B
CDR-H1(нумерация Чотиа<sup>2</sup>)
H31-H35
H26--H32
H30-H35
CDR-H2
H50-H65
H52--H56
H47-H58
CDR-H3
H95-H102
H95--H102
H93-H101
1 - Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD
2 - Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948
H
L
[0123] Таким образом, если не указано иное, следует понимать, что "CDR" или "определяющая комплементарность область", или индивидуально определенные CDR (например, "CDR-H1, CDR-H2) данного антитела или его области, такой как его вариабельная область, охватывают (или определенную) определяющую комплементарность область, как определено согласно любой из вышеуказанных схем. Например, в тех случаях, когда указано, что конкретная CDR (например, CDR-H3) содержит аминокислотную последовательность соответствующей CDR в данной аминокислотной последовательности V или V, подразумевается, что такая CDR имеет последовательность соответствующей CDR (например, CDR-H3) в пределах вариабельной области, как определено согласно любой из вышеуказанных схем. В некоторых вариантах осуществления указаны определенные последовательности CDR.
[0124] Аналогичным образом, если не указано иное, следует понимать, что FR или индивидуально определенная область(и) FR (например, FR-H1, FR-H2) данного антитела или его области, такой как вариабельная область, охватывает (или определенную) каркасную область, как определено согласно любой из известных схем. В некоторых случаях указана схема идентификации конкретной CDR, FR или областей FR или CDR, например, CDR, определенной согласно методу Кэбата, Чотиа или Контактному методу. В других случаях приведена определенная аминокислотная последовательность CDR или FR.
H
L
H
L
H
L
L
H
[0125] Термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (V и V, соответственно) нативного антитела обычно имеют аналогичную структуру, причем каждый домен включает четыре консервативных каркасных области (FR) и три CDR. См., например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). Один V или V домен могут быть достаточным для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связывают определенный антиген, могут быть выделены при использовании V или V домена из антитела, которое связывает антиген, с целью проведения скрининга библиотеки комплементарных V или V доменов, соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
2
[0126] Предложенные антитела включают фрагменты антител. "Фрагмент антитела" относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая включает часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, без ограничения перечисленными, Fv, Fab, Fab', Fabʹ-SH, F(ab'); диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, сформированные из фрагментов антител. В конкретных вариантах осуществления антитела являются одноцепочечными фрагментами антител, включающими вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, такими как scFv-фрагменты.
[0127] Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, включающие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления однодоменное антитело является человеческим однодоменным антителом.
[0128] Фрагменты антител могут быть получены различными методами, в том числе, без ограничения, протеолитическим расщеплением интактного антитела, а также в результате продукции рекомбинантными клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления антитела являются рекомбинантно полученными фрагментами, такими как фрагменты, включающие структуры, которые не встречаются в природе, такие как структуры с двумя или более областями или цепями антитела, которые соединены синтетическими линкерами, например пептидными линкерами, и/или которые не могут быть получены при расщеплении ферментами природного интактного антитела. В некоторых аспектах фрагменты антитела являются scFv-фрагментами.
[0129] "Гуманизированное" антитело является антителом, в котором все или по существу все аминокислотные остатки CDR происходят из нечеловеческих CDR, и все или по существу все аминокислотные остатки FR происходят из человеческих FR. Гуманизированное антитело необязательно может включать, по меньшей мере, часть константной области антитела, полученной из человеческого антитела. "Гуманизированная форма" нечеловеческого антитела, относится к варианту нечеловеческого антитела, которое подверглось гуманизации, обычно для уменьшения иммуногенности для людей, с сохранением специфичности и аффинности парентерального нечеловеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого происходят остатки CDR), например, для восстановления или повышения специфичности или аффинности антитела.
[0130] Предложенные антитела против CD19 включают человеческие антитела. "Человеческое антитело" является антителом с аминокислотной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности антитела, вырабатываемого человеком или клеткой человека, или полученного из нечеловеческого источника, который использует репертуар человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела, включая библиотеки человеческих антител. Термин исключает гуманизированные формы нечеловеческих антител, включающих нечеловеческие антигенсвязывающие области, такие как антитела, в которых все или по существу все CDR не являются человеческими.
[0131] Человеческие антитела могут быть получены путем ведения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для продукции интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные обычно содержат все или часть локусов человеческих иммуноглобулинов, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулинов, которые присутствуют внехромосомно или интегрированы случайным образом в хромосомы животного. У таких трансгенных животных эндогенные локусы иммуноглобулинов обычно инактивированы. Человеческие антитела также могут быть получены из библиотек человеческих антител, включая библиотеки фагового дисплея и бесклеточные библиотеки, содержащие последовательности, кодирующие антитела, полученные из человеческого репертуара.
[0132] Предложенные антитела включают моноклональные антитела, в том числе фрагменты моноклональных антител. Термин "моноклональное антитело" при использовании в настоящем описании относится к антителу, полученному из или в пределах популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных вариантов, содержащих природные мутации или возникающие в процессе получения препарата моноклонального антитела, причем такие варианты, как правило, присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных эпитопов, каждое моноклональное антитело в препаратах моноклональных антител направлено против одного эпитопа на антигене. Термин не должен рассматриваться как требование получения антитела каким-либо конкретным способом. Моноклональное антитело может быть получено множеством способов, включающих, без ограничения, получение из гибридомы, методы рекомбинантных ДНК, фаговый дисплей и другие методы дисплея антител.
[0133] Термины "полипептид" и "белок" используются попеременно для обозначения полимера из аминокислотных остатков и не ограничиваются минимальной длиной. Полипептиды, включающие предложенные антитела и цепи антител, а также другие пептиды, например, линкеры и CD19-связывающие пептиды, могут включать аминокислотные остатки, включающие природные и/или неприродные аминокислотные остатки. Данные термины также включают постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, сиалирование, ацетилирование, фосфорилирование и т.п. В некоторых аспектах полипептиды могут содержать модификации по сравнению с нативной или природной последовательностью, при условии, что белок сохраняет требуемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, как в случае сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, например, в результате мутаций организмов-хозяев, которые продуцируют белки, или ошибок в результате ПЦР-амплификации.
Примеры антител против CD19
H
L
[0134] В некоторых вариантах осуществления антитело против CD19, например антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержит определенные CDR последовательности тяжелой и/или легкой цепи, и/или последовательности вариабельной области (V или V) тяжелой и/или легкой цепи. Также предложенные антитела включают антитела, которые имеют последовательности по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные такой последовательности.
[0135] В некоторых вариантах осуществления антитело, например его антигенсвязывающий фрагмент, включает определяющую комплементарность область 3 тяжелой цепи (CDR-H3), включающую аминокислотную последовательность CDR-H3, присутствующую в референсном антителе, такую как последовательность, присутствующая в референсном антителе, содержащая VH область с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63, 62, 167 или 185, такой как представлено в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62. В некоторых вариантах осуществления CDR-H3 включает SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления антитело, например его антигенсвязывающий фрагмент, имеет VH область, обладающую по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательности (или 100% идентичности с ней) с аминокислотной последовательность VH области референсного антитела, например, с аминокислотной последовательностью VH области, представленной в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 62, 167 или 185, такой как представлено в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62.
[0136] В некоторых вариантах осуществления CDR-H1 содержит аминокислотную последовательность DYAMH (SEQ ID NO: 18), CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность GISWNSGRIG (SEQ ID NO: 81), GISWNSGSIG (SEQ ID NO: 82), аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19 (GISWNSGRIGYADSVKG), или аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 72 (GISWNSGSIGYADSVKG), и/или CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
[0137] В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело содержит CDR-H3, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
H
[0138] В некоторых вариантах осуществления антитело содержит V, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11 или 12, или имеет последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную такой последовательности. В некоторых вариантах осуществления антитело, например его антигенсвязывающий фрагмент, содержит VH область, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62, или последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную такой последовательности. В некоторых вариантах осуществления антитело, например его антигенсвязывающий фрагмент, содержит VH область, имеющую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63, 62, 167 или 185, или последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную такой последовательности.
[0139] В некоторых вариантах осуществления антитело содержит последовательность остатков 1-119 из SEQ ID NO: 11,12, 60, 61, 63, 62, 167 или 185 или последовательность, включающую часть SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63, 62, 167 или 185, содержащую первые три каркасных области и три CDR тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит последовательность остатков 1-119 из SEQ ID NO: 11,12, 60, 61, 63 или 62 или последовательность, включающую часть SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62, содержащую первые три каркасных области и три CDR тяжелой цепи.
L
[0140] В некоторых вариантах осуществления антитело против CD19 включает определяющие комплементарность области 1, 2 и/или 3 легкой цепи (CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3), соответственно, имеющие аминокислотные последовательности последовательностей CDR 1, 2 и/или 3, содержащихся в аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (V), представленной в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 65, 64, 66, 70, 69, 67, 90, 91 или 187-205, такой как представлено в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 или 17, или в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 90, 91, 68, 65, 64, 66, 70, 69 или 67.
[0141] В некоторых вариантах осуществления антитело против CD19 включает CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3, где:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
[0142] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность: XXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 110), где X является T, W, S или R; X является G или A; X является I, T, D или S; X является S, R, T или Q; X отсутствует или является S; X отсутствует или является D, N или G; X отсутствует или является V или L; X является X или отсутствует; X является X или отсутствует; X является X; X является X; X является Y, F, D или W; X является V, A или L, и X является S, N или A. Например, в некоторых вариантах осуществления CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 226), где X является T, Q, S или R; X является G, A или E; X является I, T, A, D или S; X является S, R, T Q, G или I; X отсутствует или является S, R или T; X является G, D, N или отсутствует; X отсутствует или является V, L или I; X является D, G, I, L, S или отсутствует; X является S, G, A, I, D, R или отсутствует; X является H, Y, F, S или N; X является R, N, D, H, Y или T; X является Y, F, D, W, H, T или S; X является V, A или L; и X является S, N или A. В некоторых вариантах осуществления CDR-L1 содержит аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 111), где X является T, Q, S или R; X является G или A; X является I, T, D или S; X является S, R, T или Q; X отсутствует или является S; X является G, D, N или отсутствует; X отсутствует или является V или L; X является D, G, I, L, S или отсутствует; X является S, G, A, I, R или отсутствует; X является H, Y, F, S или N; X является R, N, D, H или Y; X является Y, F, D или W; X является V, A или L; и X является S, N или A.
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
[0143] В некоторых вариантах осуществления CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность XXXXXXX (SEQ ID NO: 227), где X является D, S или G; X является F, V, N, K или A; X является S, T, D или N; X является K, V, N, Q или R; X является R, V или L; X является P, K, A или E; и X является S, P, A или T. В некоторых вариантах осуществления CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность XXXXXXX (SEQ ID NO: 112), где X является D или S; X является F, V, N, K или A; X является S, T, D или N; X является K, V, N, Q или R; X является R, V или L; X является P, K, A или E; и X является S, P, A или T.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
[0144] В некоторых вариантах осуществления CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 228), где X является S, G, T, A, Q, C или N; X является S, Q, A или T; X является Y, S, W, R; X является A, D, R, T или Y; X является A, S, P, G, N или D; X является I, S, G, T, A, L, H, R или N; X является S, P, L, Y, G; X является P, T, S, Q, M, R, N или отсутствует; X является S, L, N, A, M, R или отсутствует; X является L, D или отсутствует; X является Y, W, F, V, A или L; и X является V, T, P или L. В некоторых вариантах осуществления CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 115), где X является X; X является S, Q, A или T; X является Y, S, W, R; X является A, D, R, T или Y; X является X; X является X; X является S, P, L, Y, G; X является X или отсутствует; X является X или отсутствует; X является L или отсутствует; X является X; и X является V, T или L. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело имеет CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 114), где X является S, G, T, A, Q, C или N; X является S, Q, A или T; X является Y, S, W, R; X является A, D, R, T или Y; X является A, S, P, G, N или D; X является I, S, G, T, A, L, H, R, N; X является S, P, L, Y, G; X является P, T, S, Q, M, R, N или отсутствует; X является S, L, N, A, M или отсутствует; X является L или отсутствует; X является Y, W, F, V, A или L; и X является V, T или L
3
4
8
9
10
11
12
13
1
4
6
7
1
5
6
8
9
11
1
2
4
5
6
[0145] В некоторых вариантах осуществления, в CDR-L1, такой как представленная в SEQ ID NO: 110, 226 или 111, X является I, T или S; X является S, T или Q; X является D, G, I, S или отсутствует; X является S, G, I или отсутствует; X является H, Y, S или N; X является R, N, D или H; X является Y или D; и X является V или L; и/или, в CDR-L2, такой как представленная в SEQ ID NO: 227 или 112, X является D; X является K, V, N, Q или R; X является P, K или A; и X является S, A или T; и/или, в CDR-L3, такой как представленная в SEQ ID NO: 228, 114 или 115, X является S, G, T, A, Q, C или N; X является A, S, P, G, N или D; X является I, S, G, T, A, L, H, R или N; X является P, T, S, Q, M, R, N или отсутствует; X является S, L, N, A, M или отсутствует; и X является Y, W, F, V, A или L. В некоторых вариантах осуществления, в CDR-L3, X является S, G, Q или N; X является S, Q или T; X является A, D, T или Y; X является A, S или G; и X является I, S, N, R, A, H или T.
[0146] В некоторых вариантах осуществления антитело включает последовательность аминокислот, которая содержит CDR-L1, представленную в SEQ ID NO: 83, CDR-L2, представленную в SEQ ID NO: 84, и/или CDR-L3, представленную в SEQ ID NO: 85.
[0147] В некоторых вариантах осуществления антитело, например фрагмент антитела, содержит CDR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, 25, 28 или 31. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент содержат CDR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 75, 79, 78, 76, 21, 25, 28, 31 или 146-152, такую, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 75, 79, 78, 76, 21, 25, 28 или 31. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент содержат CDR-L1, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 78, 21 или 28.
[0148] В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент содержат CDR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, 26, 29 или 32. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент содержат CDR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 95, 99, 98, 96, 22, 26, 29, 32 или 153-157, такую, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 95, 99, 98, 96, 22, 26, 29 или 32. В некоторых вариантах осуществления, антитело или фрагмент содержит CDR-L2, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 98, 22 или 29.
[0149] В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент содержат CDR-L3, которая включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, 24, 27, 30 или 33. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент содержат CDR-L3, которая включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 104, 108, 107, 105, 102, 23, 24, 27, 30, 33, 158 или 159, такую, которая содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 104, 108, 107, 105, 102, 23, 24, 27, 30 или 33. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент содержат CDR-L3, которая включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 107, 24 или 30.
[0150] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 содержат последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 24, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 содержат последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно; или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 содержат последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно.
[0151] В некоторых вариантах осуществления CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 24, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 80, 100 и 109, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 77, 97 и 106, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 74, 94 и 103, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 73, 93 и 101, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 75, 95 и 104, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 79, 99 и 108, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 78, 98 и 107, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 76, 96 и 105, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 73, 93 и 102, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 77, 97 и 106, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 163, 164 и 165, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 80, 100 и 109, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 146, 97 и 106, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 28, 153 и 158, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 74, 94 и 103, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 147, 154 и 121, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 148, 94 и 103, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 75, 95 и 104, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 149, 155 и 119, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 150, 22 и 120, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 159, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 151, 26 и 118, соответственно; CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 28, 156 и 116, соответственно; или CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 152, 157 и 117, соответственно.
[0152] Также предложены антитела, имеющие последовательности, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.
[0153] В некоторых вариантах осуществления CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 81 и 20, соответственно; CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 19 и 20, соответственно; CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 82 и 20, соответственно; или CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 72 и 20, соответственно.
[0154] Также предложены антитела, имеющие последовательности, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.
[0155] В некоторых вариантах осуществления VH область антитела или фрагмент включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63, 62, 167 или 185, такую как SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62; и/или VL область антитела или фрагмент включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 90, 91, 68, 65, 64, 66, 70, 69, 67 или 187-205, такую как SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 90, 91, 68, 65, 64, 66, 70, 69 или 67. В некоторых вариантах осуществления VH область антитела или фрагмент включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, 60, 63 или 62; и/или VL область антитела или фрагмент включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, 16, 71, 90, 65, 64 или 69.
[0156] Также предложены антитела, имеющие последовательности, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.
[0157] В некоторых вариантах осуществления VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 17, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 15, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 13, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 14, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 16, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 71, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 62 и 68, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 65, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 60 и 64, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 61 и 66, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 70, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 62 и 69, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 67, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 91, соответственно; или VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 90, соответственно. В некоторых вариантах осуществления VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 14, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 16, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 71, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 65, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 60 и 64, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 62 и 69, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 90, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 167 и 207, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 168 или 63 и 208, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 169 или 11 и 209, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 170 или 61 и 210, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 171 или 61 и 211, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 172 и 212, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 173 или 11 и 213, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 174 или 11 и 214, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 175 или 11 и 215, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 176 или 61 и 216, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 177 или 61 и 217, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 178 или 61 и 218, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 179 или 61 и 219, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 180 или 12 и 220, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 181 или 12 и 221, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 182 или 11 и 222, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 183 или 60 и 223, соответственно; VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 184 или 11 и 224, соответственно; или VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 185 и 225, соответственно.
[0158] Также предложены антитела, имеющие последовательности, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичные таким последовательностям.
H
[0159] В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент содержат V область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 12, или остатки 1-119 из такой последовательности, или последовательность, обладающую по меньшей мере или приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.
L
[0160] В некоторых вариантах осуществления антитела включают или дополнительно включают V область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17 или последовательность, обладающую по меньшей мере или приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с такой последовательностью.
H
L
[0161] В некоторых вариантах осуществления антитело является одноцепочечным фрагментом антитела, таким как scFv или диатело. В некоторых вариантах осуществления одноцепочечное антитело включает один или более линкеров, соединяющих два домена или области антитела, такие как вариабельную область тяжелой цепи (V) и вариабельную легкую цепь (V). Линкер обычно является пептидным линкером, например, гибким и/или растворимым пептидным линкером. Линкеры включают линкеры, богатые глицином и серином, и/или, в некоторых случаях, треонином. В некоторых вариантах осуществления линкеры дополнительно включают заряженные остатки, такие как лизин и/или глутамат, что может повышать растворимость. В некоторых вариантах осуществления линкеры дополнительно включают один или более пролинов.
H
L
[0162] Таким образом, также предложены одноцепочечные фрагменты антитела, такие как scFv-фрагменты и диатела, в особенности человеческие одноцепочечные фрагменты, обычно включающие линкер(ы), соединяющий два домена или области антитела, такие как V и V домены. Линкер обычно является пептидным линкером, например, гибким и/или растворимым пептидным линкером, таким как линкер, богатый глицином и серином.
[0163] В некоторых аспектах линкеры, богатые глицином и серином (и/или треонином), включают по меньшей мере 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% такой аминокислоты (аминокислот). В некоторых вариантах осуществления они включают по меньшей мере или приблизительно 50%, 55%, 60%, 70% или 75% глицина, серина и/или треонина. В некоторых вариантах осуществления линкер по существу полностью состоит из глицина, серина и/или треонина. Линкеры, как правило, имеют длину от приблизительно 5 и до приблизительно 50 аминокислот, обычно от или от приблизительно 10 и до или до приблизительно 30, например, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30, и, в некоторых примерах, имеют длину от 10 до 25 аминокислот. Примеры линкеров включают линкеры, содержащие различные количества повторов последовательности GGGGS (4GS; SEQ ID NO: 123) или GGGS (3GS; SEQ ID NO: 122), например, в пределах 2, 3, 4 и 5 повторов такой последовательности. Примеры линкеров включают линкеры, которые содержат или состоят из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 34 (GGGGSGGGGSGGGGS). Примеры линкеров дополнительно включают линкеры, которые содержат или состоят из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG).
[0164] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления также предложены одноцепочечные фрагменты, например, scFv-фрагменты, включающие один или более вышеуказанных линкеров, таких как линкеры, богатые глицином/серином, в том числе линкеры, содержащие повторы GGGS (SEQ ID NO: 122) или GGGGS (SEQ ID NO: 123), такие как линкер, представленный как SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления линкер имеет аминокислотную последовательность, содержащую последовательность, представленную SEQ ID NO: 34.
H
L
L
H
[0165] Фрагмент, например scFv, может включать V область или ее часть, после которой расположен линкер, за которым расположена V или ее часть. Фрагмент, например, scFv, может включать V, после которой расположен линкер, а затем V.
[0166] В некоторых аспектах scFv имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 или 10, или имеет последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную такой последовательности.
[0167] В некоторых аспектах scFv имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 87 или 89, или имеет последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную такой последовательности.
[0168] В некоторых аспектах scFv имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 87, 89 или 207-225, или имеет последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную такой последовательности.
[0169] В некоторых аспектах scFv содержит VH, линкер и VL, как представлено в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 87, 89 или 207-225, или последовательность, по меньшей мере или приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичную такой последовательности, но в которой VH и VL расположены в противоположной ориентации, то есть VL-VH, по сравнению с такой последовательностью.
[0170] Антитело, например фрагмент антитела, может содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина, такой как один или более доменов константной области. В некоторых вариантах осуществления константные области включают константную область легкой цепи и/или константную область тяжелой цепи 1 (CH1). В некоторых вариантах осуществления антитело включает CH2 и/или CH3 домен, такой как Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область является Fc-областью IgG человека, такого как IgG1 или IgG4.
[0171] В некоторых вариантах осуществления любое из вышеуказанных антител, например, фрагмент антитела, является человеческим. Например, в настоящей заявке предложены человеческие антитела против CD19, которые специфично связывают CD19, например, специфично связывают человеческий CD19.
H
L
H
H
L
L
[0172] В некоторых вариантах осуществления предложенного антитела человека против CD19, человеческое антитело содержит V область, которая содержит часть, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидным V сегментом тяжелой цепи зародышевой линии человека, часть по меньшей мере с 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидным D-сегментом тяжелой цепи зародышевой линии человека, и/или часть, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидным J-сегментом тяжелой цепи зародышевой линии человека; и/или содержит V область, которая содержит часть по меньшей мере с 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидным V-сегментом каппа или лямбда-цепи зародышевой линии человека, и/или часть по меньшей мере с 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью, кодируемой нуклеотидным J-сегментом каппа или лямбда-цепи зародышевой линии человека. В некоторых вариантах осуществления часть V области соответствует CDR-H1, CDR-H2 и/или CDR-H3. В некоторых вариантах осуществления часть V области соответствует каркасной области 1 (FR1), FR2, FR2 и/или FR4. В некоторых вариантах осуществления часть V области соответствует CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3. В некоторых вариантах осуществления часть V области соответствует FR1, FR2, FR2 и/или FR4.
[0173] В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит CDR-H1, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью соответствующей области CDR-H1 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом тяжелой цепи зародышевой линии человека. Например, человеческое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит CDR-H1, имеющую последовательность, которая на 100% идентична или отличается не более чем одной, двумя или тремя аминокислотами по сравнению с соответствующей областью CDR-H1 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом тяжелой цепи зародышевой линии человека.
[0174] В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит CDR-H2, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью соответствующей области CDR-H2 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом тяжелой цепи зародышевой линии человека. Например, человеческое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит CDR-H2, имеющую последовательность, которая на 100% идентична или отличается не более чем одной, двумя или тремя аминокислотами по сравнению с соответствующей областью CDR-H2 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом тяжелой цепи зародышевой линии человека.
[0175] В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит CDR-H3, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью соответствующей области CDR-H3 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом, D-сегментом и J-сегментом тяжелой цепи зародышевой линии человека. Например, человеческое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит CDR-H3, имеющую последовательность, которая на 100% идентична или отличается не более чем одной, двумя или тремя аминокислотами по сравнению с соответствующей областью CDR-H3 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом, D-сегментом и J-сегментом тяжелой цепи зародышевой линии человека.
[0176] В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит CDR-L1, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью соответствующей области CDR-L1 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом легкой цепи зародышевой линии человека. Например, человеческое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит CDR-L1, имеющую последовательность, которая на 100% идентична или отличается не более чем одной, двумя или тремя аминокислотами по сравнению с соответствующей областью CDR-L1 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом легкой цепи зародышевой линии человека.
[0177] В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит CDR-L2, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью соответствующей области CDR-L2 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом легкой цепи зародышевой линии человека. Например, человеческое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит CDR-L2, имеющую последовательность, которая на 100% идентична или отличается не более чем одной, двумя или тремя аминокислотами по сравнению с соответствующей областью CDR-L2 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом легкой цепи зародышевой линии человека.
[0178] В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит CDR-L3, обладающую по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью соответствующей области CDR-L3 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом и J-сегментом легкой цепи зародышевой линии человека. Например, человеческое антитело в некоторых вариантах осуществления содержит CDR-L3, имеющую последовательность, которая на 100% идентична или отличается не более чем одной, двумя или тремя аминокислотами по сравнению с соответствующей областью CDR-L3 в последовательности, кодируемой нуклеотидным V-сегментом и J-сегментом легкой цепи зародышевой линии человека.
H
L
H
L
[0179] В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит каркасную область, которая содержит последовательности сегментов генов зародышевой линии человека. Например, в некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит V область, в которой каркасная область, например, FR1, FR2, FR3 и FR4, обладает по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с каркасной областью, кодируемой сегментом антитела зародышевой линии человека, таким как V и/или J-сегмент. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело содержит V область, в которой каркасная область, например, FR1, FR2, FR3 и FR4, обладает по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с каркасной областью, кодируемой сегментом антитела зародышевой линии человека, таким как V и/или сегмент. Например, в некоторых таких вариантах осуществления каркасная последовательность V и/или V последовательности отличается не более чем 10 аминокислотами, например, не более чем 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотой, по сравнению с каркасной областью, кодируемой сегментом антитела зародышевой линии человека.
[0180] Антитело, например фрагмент антитела, может содержать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина, такую как один или более доменов константной области. В некоторых вариантах осуществления константные области включают константную область легкой цепи и/или константную область тяжелой цепи 1 (CH1). В некоторых вариантах осуществления антитело включает CH2 и/или CH3 домен, такой как Fc-область. В некоторых вариантах осуществления Fc-область является Fc-областью IgG человека, такого как IgG1 или IgG4.
L
H
[0181] Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и/или их части, например цепи. Предложенные нуклеиновые кислоты включают нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела против CD19, описанные в настоящей заявке. Нуклеиновые кислоты могут включать нуклеиновые кислоты, охватывающие природные и/или не встречающиеся в природе нуклеотиды и основания, например, включающие нуклеотиды с модификациями скелета. Термины "молекула нуклеиновой кислоты", "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" могут использоваться попеременно и относятся к полимеру из нуклеотидов. Такие полимеры из нуклеотидов могут содержать природные и/или искусственные нуклеотиды и включают, без ограничения, ДНК, РНК и ПНК. "Последовательность нуклеиновой кислоты" относится к линейной последовательности нуклеотидов, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты или полинуклеотид. Примерные нуклеиновые кислоты и векторы являются такими, которые имеют последовательности, представленные в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 86 и 88, и в их CDR-кодирующих частях, а также последовательности, имеющие по меньшей мере или приблизительно 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности с ними. Нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, включающую V, и/или аминокислотную последовательность, включающую V антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела).
L
H
L
H
[0182] Также предложены векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, содержащие такие векторы, например, для продукции антител. Также предложены способы получения антител. В другом варианте осуществления предложены один или более векторов (например, векторов экспрессии), включающих такую нуклеиновую кислоту. В другом варианте осуществления предложена клетка-хозяин, включающая такую нуклеиновую кислоту. В одном таком варианте осуществления клетка-хозяин включает (например, была трансформирована следующим): (1) вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, включающую V антитела, и аминокислотную последовательность, включающую V антитела, или (2) первый вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, включающую V антитела, и второй вектор, включающий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, включающую V антитела. В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения антитела против CD19, где способ включает культивирование клетки-хозяина, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, как предложено выше, при условиях, подходящих для экспрессии антитела, и, необязательно, выделение антитела из клетки-хозяина (или среды культивирования клетки-хозяина).
[0183] Также предложены способы получения антител против CD19 (включая антигенсвязывающие фрагменты). Для рекомбинантной продукции антитела против CD19 нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, например, как описано выше, может быть выделена и встроена в один или более векторов для последующего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть с легкостью выделена и секвенирована при использовании стандартных методик (например, при использовании олигонуклеотидных зондов, которые способны специфично связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).
[0184] В дополнение к прокариотам эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, являются подходящими организмами-хозяевами для клонирования или экспрессии кодирующих антитела векторов, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были модифицированы с целью сымитировать или приближенно воспроизвести соответствующие механизмы в человеческих клетках, что приводит к продукции антитела с частично или полностью человеческом профилем гликозилирования. См. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).

[0185] Примерные эукариотические клетки, которые могут применяться для экспрессии полипептидов, включают, без ограничения, клетки COS, в том числе клетки COS 7; клетки 293, в том числе клетки 293-6E; клетки CHO, в том числе клетки CHO-S, DG44, Lec13, и клетки CHO FUT8; клетки PER.C6; и клетки NSO. В некоторых вариантах осуществления тяжелые цепи и/или легкие цепи антитела могут быть экспрессированы в дрожжах. См., например, патентную публикацию США US 2006/0270045 A1. В некоторых вариантах осуществления определенную эукариотическую клетку-хозяина выбирают по ее способности производить требуемые посттрансляционные модификации тяжелых цепей и/или легких цепей. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки CHO продуцируют полипептиды, которые имеют более высокий уровень сиалирования, чем такой же полипептид, продуцируемый в клетках 293.
[0186] В некоторых вариантах осуществления антитело получают в бесклеточной системе. Примеры бесклеточных систем описаны, например, в Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009); Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004); Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003).
[0187] Представленные варианты осуществления дополнительно включают векторы и клетки-хозяева, а также другие системы экспрессии для экспрессии и продукции антител и других связывающих белков, включая эукариотические и прокариотические клетки-хозяева, в том числе бактерии, нитчатые грибы и дрожжи, а также клетки млекопитающих, такие как клетки человека, а также бесклеточные системы экспрессии.
Примерные отличительные признаки
[0188] В некоторых аспектах предложенные антитела, включающие антигенсвязывающие фрагменты, обладают одним или более указанными функциональными признаками, такими как связывающие свойства, включая связывание с определенными эпитопами, такими как эпитопы, которые аналогичны или перекрываются с эпитопами для других антител, способность конкурировать за связывание с другими антителами и/или определенные аффинности связывания.
[0189] В некоторых вариантах осуществления антитела специфично связываются с белком CD19. В некоторых аспектах любого из вариантов осуществления в настоящей заявке, CD19 относится к CD19 человека. Как правило, наблюдение того, что антитело или другая связывающая молекула связывается с CD19 или специфично связывается с CD19, не должно обязательно означать, что они связываются с CD19 всех биологических видов. Например, в некоторых вариантах осуществления характеристики связывания с CD19, такие как способность специфично связываться с ним и/или конкурировать с референсным антителом за связывание с ним, и/или связываться с определенной аффинностью или конкурировать в определенной степени, в некоторых вариантах осуществления относятся к способности в отношении человеческого белка CD19, и при этом антитело может не обладать таким свойством в отношении CD19 других видов, таких как обезьяна или мышь.
Macaca mulatta
[0190] В некоторых вариантах осуществления предложенные антитела, включающие антигенсвязывающие фрагменты, связываются с человеческим CD19, например, с эпитопом или областью человеческого CD19, таким как человеческий CD19, представленный в 92 (рег. номер P15391), или его аллельный вариант или сплайс-вариант. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD19 связывается с эпитопом CD19, который является консервативным в CD19 различных биологических видов. В некоторых вариантах осуществления антитело против CD19 связывается с эпитопом CD19, который не является консервативным или является не полностью консервативным в CD19 различных биологических видов, таких как CD19 человека и  (макак-резус (резус)).
[0191] В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с эпитопом, содержащим одну или более аминокислот (или полностью расположенным) во внеклеточном домене CD19 и/или (или полностью расположенным) в мембрано-проксимальной области внеклеточной части CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело связывается с эпитопом, содержащим одну или более аминокислот в или полностью расположенным в Ig-подобном домене 2 CD19, части, кодируемой четвертым экзоном CD19, части, соответствующей положениям 176-277 последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92, и/или мембрано-проксимальной большей части из 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 44, 43, 43, 41 или 40 аминокислот внеклеточной части CD19. В некоторых вариантах осуществления такая часть или домен требуются для связывания антитела с CD19. В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит (или дополнительно содержит) одну или более аминокислот, которые расположены или полностью расположены в Ig-подобном домен 1 CD19, части, кодируемой вторым экзоном CD19, и/или части, соответствующей положениям 20-117 последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92. В некоторых вариантах осуществления такая часть или домен требуются для связывания антитела с CD19. В некоторых вариантах осуществления антитело специфично связывается с пептидом, включающим или состоящим из, или по существу состоящим из последовательности такой части, и не содержащим всю полноразмерную последовательность CD19.
[0192] В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит одну или более аминокислот в, расположен в или включает часть CD19, соответствующую остаткам 218-249 последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92, такую как часть, имеющую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 143.
[0193] В некоторых вариантах осуществления эпитоп включает аминокислоту в положении, соответствующем одному или более положениям CD19, соответствующим следующим аминокислотам в следующих положениях последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92: гистидин (H) в положении 218, аланин (A) в положении 236, метионин (M) в положении 242, глутамат (E) в положении 243, пролин (P) в положении 249 и/или лизин (K) и/или серин (S) в положениях 223 и 224. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в одном или более таких положениях является важной или необходимой для связывания антитела с CD19. В некоторых вариантах осуществления аминокислота в эпитопе, в одном или более положениях, соответствует аминокислоте в соответствующем положении в последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92.
[0194] В некоторых вариантах осуществления эпитоп включает аминокислоту (такую как гистидин) в положении CD19, соответствующую гистидину в положении 218 последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92; в некоторых вариантах осуществления такая аминокислота является важной для связывания антитела с CD19.
[0195] В некоторых вариантах осуществления эпитоп включает аминокислоту (такую как аланин) в положении CD19, соответствующую аланину в положении 236 последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92; в некоторых вариантах осуществления такая аминокислота является важной для связывания антитела с CD19.
[0196] В некоторых вариантах осуществления эпитоп включает аминокислоту (такую как метионин) в положении CD19, соответствующую метионину в положении 242 последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92; в некоторых вариантах осуществления такая аминокислота является важной для связывания антитела с CD19.
[0197] В некоторых вариантах осуществления эпитоп включает аминокислоту (такую как глутамат) в положении CD19, соответствующую глутамату в положении 243 последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92; в некоторых вариантах осуществления такая аминокислота является важной для связывания антитела с CD19.
[0198] В некоторых вариантах осуществления эпитоп включает аминокислоту (такую как пролин) в положении CD19, соответствующую пролину в положении 249 последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92; в некоторых вариантах осуществления такая аминокислота является важной для связывания антитела с CD19.
[0199] В некоторых вариантах осуществления эпитоп содержит аминокислоту(ы) (такую как лизин и/или серин) в одном или двух положениях, соответствующую лизину и/или серину в положениях 223 и 224 последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92; в некоторых вариантах осуществления такая аминокислота(ы) является важной для связывания антитела с CD19.
[0200] В некоторых вариантах осуществления эпитоп является таким же, аналогичен, перекрывается с или содержит одну или более таких же аминокислот, как эпитоп, который специфично связывает референсное антитело, такое как FMC63 или SJ25C1. В некоторых вариантах осуществления такая же одна или более аминокислот являются важными для связывания предложенного антитела и референсного антитела.
[0201] В некоторых вариантах осуществления степень связывания антитела против CD19 с не относящимся к, не являющимся CD19, белком, таким как нечеловеческий CD19 или другой, не являющийся CD19, белок, составляет меньше чем приблизительно 40% связывания антитела с человеческим CD19, при измерении, например, с помощью радиоиммунного анализа (РИА). В некоторых вариантах осуществления предложенные антитела являются антителами, у которых связывание с нечеловеческим CD19 или другим, не являющимся CD19, белком составляет меньше или приблизительно 30%, меньше или приблизительно 20% или меньше или приблизительно 10% связывания антитела с человеческим CD19.
H
L
[0202] В некоторых вариантах осуществления такие свойства предложенных антител, включающих антигенсвязывающие фрагменты, описаны в отношении свойств, наблюдаемых для другого антитела, например референсного антитела. В некоторых вариантах осуществления референсное антитело является нечеловеческим антителом против CD19, таким как мышиное или химерное, или гуманизированное антитело против CD19. В некоторых аспектах референсное антитело является антителом, обозначенным FMC63, или антителом, обозначенным SJ25C1 (см., например, Zola H et al., Immunol Cell Biol. 1991 Dec; 69 (Pt 6):411-22; U.S. Patent 7,446,190), и/или фрагментом, полученным из них, таким как соответствующий scFv-фрагмент, и/или антителом, содержащим V и V последовательности такого антитела и/или CDR-области тяжелой и легкой цепи такого антитела.
H
L
[0203] Например, в некоторых вариантах осуществления референсное антитело содержит V область, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 39 или 41, или включает CDR1, CDR2 и/или CDR3 в такой последовательности, и/или содержит V, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID NO: 40 или 42, или включает CDR1, CDR2 и/или CDR3 в такой последовательности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитело конкурирует за связывание и/или связывается с таким же или перекрывающимся эпитопом CD19, что и FMC63 или SJ25C1, или их антигенсвязывающий фрагмент.
L
[0204] В некоторых вариантах осуществления референсное антитело имеет последовательность, присутствующую в антителе или его части, как описано в настоящей заявке. Например, в некоторых вариантах осуществления референсное антитело имеет аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи (V), представленную в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 или 17 и/или представленную в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 90, 91, 68, 65, 64, 66, 70, 69 или 67, и/или имеет вариабельную область тяжелой цепи (VH), представленную в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет CDR-области тяжелой и/или легкой цепи 1, 2 и/или 3, присутствующие в таком антителе. В некоторых вариантах осуществления референсным антителом может быть scFv, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51, 53,55, 57, 59, 87 или 89.
[0205] В некоторых вариантах осуществления антитело, все же, содержит CDR-области тяжелой и легкой цепи, которые отличаются от CDR-областей, присутствующих в референсном антителе или антителах, таких как FMC63 и SJ25C1. Например, предложенные антитела включают антитела, которые конкурируют за связывание и/или связываются с такими же или перекрывающимися эпитопами CD19, как эпитопы, связываемые референсным антителом или антителом, но при этом, все же, содержат другие CDR-области, например, другие CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой и/или легкой цепей. В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело содержит CDR-области тяжелой и легкой цепи, которые отличаются от CDR-областей, присутствующих в антителе, обозначенном FMC63, такие как CDR-области, которые присутствуют в VH области, представленной в SEQ ID NO: 39, и/или VL области, представленной в SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело содержит CDR-области тяжелой и легкой цепи, которые отличаются от CDR-областей, присутствующих в антителе, обозначенном SJ25C1, такие как CDR-области, которые присутствуют в VH области, представленной в SEQ ID NO: 41, и/или VL области, представленной в SEQ ID NO: 42.
[0206] Например, в некоторых вариантах осуществления антитело специфично связывается с эпитопом, который перекрывается с эпитопом CD19, связываемым референсным антителом, таким как антитела, которые связываются с тем же или подобным эпитопом, что и референсное антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело конкурирует с референсным антителом за связывание с CD19.
[0207] В некоторых вариантах осуществления антитела демонстрируют предпочтение связывания в отношении CD19-экспрессирующих клеток по сравнению с CD19-отрицательными клетками, такими как определенные клетки, известные в уровне техники и/или описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления наблюдается предпочтение связывания, когда значительно более высокая степень связывания измеряется в отношении CD19-экспрессирующих клеток по сравнению с клетками, не экспрессирующими CD19. В некоторых вариантах осуществления кратное изменение степени связывания, определяемое, например, при измерении средней интенсивности флуоресценции в анализе методом проточной цитометрии и/или константы диссоциации, или EC50, в отношении CD19-экспрессирующих клеток по сравнению с не экспрессирующими CD19 клетками, составляет по меньшей мере или приблизительно 1,5, 2, 3, 4, 5, 6 раз или больше, и/или является приблизительно таким же большим, приблизительно таким же, по меньшей мере таким же большим или по меньшей мере приблизительно таким же большим, или больше, чем кратное изменение, наблюдаемое для референсного антитела, такого как соответствующая форма референсного антитела. В некоторых случаях полная степень наблюдаемого связывания с CD19 или с CD19-экспрессирующими клетками является приблизительно такой же, по меньшей мере такой же большой, или больше, чем наблюдаемая для референсного антитела. В любом из предложенных вариантов осуществления сравнение связывающих свойств, таких как аффинность или конкуренция, может быть выполнено путем измерения такого же или подобного анализа.
[0208] Антитело "конкурирует за связывание" с CD19 с референсным антителом, если оно конкурентно ингибирует связывание референсного антитела с CD19, и/или если референсное антитело конкурентно ингибирует связывание антитела с CD19. Антитело конкурентно ингибирует связывание референсного антитела с антигеном, если присутствие антитела в избытке обнаружимо ингибирует (блокирует) связывание другого антитела с его антигеном. Определенная степень ингибирования может быть указана.
[0209] В некоторых вариантах осуществления добавление предложенного антитела в избытке, например, 1-, 2-, 5-, 10-, 50- или 100-кратном избытке, по сравнению с количеством или концентрацией референсного антитела, ингибирует связывание с антигеном референсного антитела (или наоборот). В некоторых вариантах осуществления ингибирование связывания составляет по меньшей мере 50%, и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 75%, 90% или 99%. В некоторых аспектах конкурентное ингибирование измеряют в конкурентном анализе связывания (см., например, Junghans et al., Cancer Res. 1990:50:1495-1502).
[0210] В некоторых вариантах осуществления, когда референсное антитело присутствует в концентрации 10 нМ, предложенное антитело ингибирует связывание референсного антитела с IC50 меньше или приблизительно 100, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 нМ, или меньше или приблизительно 9, 8, 7, 6 или 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления, когда предложенное антитело присутствует в концентрации 10 нМ, референсное антитело ингибирует связывание предложенного антитела с IC50 меньше или приблизительно 100, 50, 40, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 нМ, или меньше или приблизительно 9, 8, 7, 6 или 5 нМ.
[0211] В некоторых вариантах осуществления конкурентное ингибирование связывания референсного антитела предложенным антителом (или наоборот) осуществляется в или приблизительно в, или по меньше мере в, или приблизительно в такой же, степени, как степень конкурентного ингибирования связывания референсного антитела самим референсным антителом непосредственно, например, немеченым референсным антителом. В некоторых вариантах осуществления предложенное антитело ингибирует связывание референсного антитела, например связывание FMC63 или SJ25C1, с человеческим CD19 по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. Анализы конкурентного ингибирования известны и включают анализы на основе ELISA, анализы на основе проточной цитометрии и анализы на основе РИА. В некоторых аспектах анализы конкурентного ингибирования проводят путем включения избытка немеченой формы одного из антител и оценки его способности блокировать связывание другого антитела, которое помечено детектируемым маркером, при этом степень связывания и ее уменьшение можно оценить по обнаружению метки или маркера.
[0212] В некоторых вариантах осуществления два антитела специфично связываются с одним и тем же эпитопом, если все или по существу все аминокислотные мутации в антигене, которые уменьшают или устраняют связывание одного антитела, уменьшают или устраняют связывание другого антитела. В некоторых вариантах осуществления два антитела специфично связываются с перекрывающимся эпитопом, если, по меньшей мере, некоторые из аминокислотных мутаций в антигене, которые уменьшают связывание или устраняют связывание с антигеном одного антитела, также уменьшают или устраняют связывание с антигеном другого антитела.
[0213] В некоторых вариантах осуществления предложенные антитела способны к связыванию CD19, такого как человеческий CD19, по меньшей мере, с некоторой аффинностью, измеряемой с помощью любого из многих известных методов. В некоторых вариантах осуществления аффинность представлена константой диссоциации (Kd); в некоторых вариантах осуществления аффинность представлена EC50. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания (EC50) и/или константа диссоциации антитела с CD19 находится на уровне или приблизительно на уровне или меньше, или приблизительно составляет 100 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 нМ, например, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 15 нМ, например, от приблизительно 5 до приблизительно 10 нМ. В одном варианте осуществления степень связывания антитела против CD19 с не относящимся к CD19, не являющимся CD19, белком меньше или приблизительно составляет 10% от связывания антитела с CD19, при измерении, например, с помощью радиоиммунного анализа (РИА).
[0214] В некоторых аспектах аффинность находится на уровне или приблизительно соответствует такой же степени или по существу такой же степени аффинности по сравнению с референсным антителом, таким как мышиное антитело к CD19, например FMC63 или SJ25C1. В некоторых аспектах аффинность является по меньшей мере на 80, 85, 90, 95 или 99% такой же, как у референсного антитела. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания сравнивают в отношении соответствующей формы референсного антитела.
[0215] В некоторых вариантах осуществления антитело имеет аффинность, например, EC50 или Kd, приблизительно такую же или ниже, чем у референсного антитела, как, например, у соответствующей формы референсного антитела, например, не больше чем приблизительно в 1,5 раза или не больше чем приблизительно в 2 раза большую, не больше чем в 3 раза большую и/или не больше чем в 10 раза большую, чем EC50 референсного антитела, например, при измерении в таком же или подобном анализе.
[0216] Антитела против CD19, предложенные в настоящей заявке, могут быть идентифицированы, подвергнуты скринингу или исследованы по своим физическим/химическим свойствам, и/или биологическим активностям с помощью различных известных анализов. В одном аспекте антитело исследуют на его антигенсвязывающую активность, например, с помощью известных методов, таких как ELISA, Вестерн-блоттинг и/или проточно-цитометрические анализы, включая клеточные анализы связывания, например, оценку связывания антитела (например, конъюгированного с флуоресцентным маркером или меченого) с клеткой, экспрессирующей антиген-мишень, например CD19, в некоторых случаях в сравнении с результатами при использовании клеток, которые не экспрессируют антиген-мишень, например CD19. Аффинность связывания может быть измерена по Kd или EC50.
[0217] Конкурентные анализы могут применяться для идентификациии антитела, которое конкурирует с любым из антител, описанных в настоящей заявке. Также могут использоваться и являются известными анализы для картирования эпитопов, связываемых антителами и референсными антителами.
Иммуноконъюгаты
[0218] В некоторых вариантах осуществления антитело является или является частью иммуноконъюгата, в котором антитело конъюгировано с одной или более геторологичными молекуламами, такими как, без ограничения, цитотоксическое средство, визуализирующее средство, детектируемая молекула, мультимеризационный домен или другая геторологичная молекула. Цитотоксические средства включают, без ограничения, радиоактивные изотопы (например, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие средства); ингибиторы роста; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины. В некоторых вариантах осуществления антитело конъюгировано с одним или более цитотоксическими средствами, такими как химиотерапевтические средства или лекарственные средства, ингибиторы роста, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.
[0219] Иммуноконъюгаты включают конъюгаты антитела и лекарственного средства (ADC), в котором антитело конъюгировано c одним или более лекарственными средствами, включающими, без ограничения, майтанзиноид (см. патенты США 5,208,020, 5,416,064 и европейский патент EP 0 425 235 B1); ауристатин, такой как молекулы лекарственного средства монометилауристатина DE и DF (MMAE и MMAF) (см. патенты США 5,635,483 и 5,780,588 и 7,498,298); доластатин; калихеамицин или его производное (см. патенты США 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 и 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); и Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); и патент США 6,630,579); метотрексат; виндезин; таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, ларотаксел, тесетаксел и ортатаксел; трихотецин; и CC1065.
Pseudomonas aeruginosa
Aleurites fordii
Phytolaca americana
Momordica charantia
Sapaonaria officinalis
[0220] Также иммуноконъюгаты включают иммуноконъюгаты, в которых антитело конъюгировано с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включающими, без ограничения, A-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, A-цепь экзотоксина (из ), A-цепь рицина, A-цепь абрина, A-цепь модецина, альфа-сарцин, белки , диантиновые белки, белки  (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор , курцин, кротин, ингибитор , гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецины.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
[0221] Также иммуноконъюгаты включают иммуноконъюгаты, в которых антитело конъюгировано с радиоактивным атомом, с получением радиоконъюгата. Примеры радиоактивных изотопов включают At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu.
[0222] Конъюгаты антитела и цитотоксического средства могут быть получены при использовании любого из ряда известных белковых связывающих агентов, например линкеров (см. Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)), WO94/11026. Линкер может быть "отщепляемым линкером", облегчающим высвобождение цитотоксического средства в клетке, таким как кислото-лабильные линкеры, пептидаза-чувствительные линкеры, фотолабильные линкеры, диметильные линкеры и дисульфид-содержащие линкеры (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); патент США 5,208,020).
[0223] Конъюгаты также могут включать слитые белки, такие как Fc-слитые и химерные молекулы.
Мультиспецифические антитела
[0224] В некоторых вариантах осуществления CD19-связывающие молекулы, например антитела, являются мультиспецифическими. Мультиспецифические связывающие молекулы включают мультиспецифические антитела, в том числе, например, биспецифические. Мультиспецифические связывающие партнеры, например антитела, обладают специфичностями связывания в отношении по меньшей мере двух различных участков, которые могут быть в одних и тех же или разных антигенах. В некоторых вариантах осуществления одна из специфичностей связывания относится к CD19, а другая - к другому антигену. В некоторых вариантах осуществления биспецифические антитела могут связываться с двумя разными эпитопами CD19. Биспецифические антитела также могут применяться для локализации цитотоксических средств на клетках, которые экспрессируют CD19. Биспецифические антитела могут быть получены как полноразмерые антитела или фрагменты антител. Биспецифические антитела включают мультиспецифические одноцепочечные антитела, например, диатела, триатела и тетратела, тандемные ди-scFv-фрагменты и тандемные три-scFv-фрагменты. Также предложены мультиспецифические химерные рецепторы, такие как мультиспецифические CAR, содержащие антитела.
[0225] Примеры дополнительных антигенов включают другие специфичные В-клеточные антигены и антигены, экспрессируемые на Т-клетках. Примеры антигенов включают CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD74, CD80, CD126, CD138, B7, MUC-1, Ia, HM1.24, HLA-DR, тенасцин, фактор ангиогенеза, VEGF, PIGF, ED-B фибронектин, онкоген, продукт онкогена, CD66a-d, антигены некроза, Ii, IL-2, T101, TAC, IL-6, TRAIL-R1 (DR4) и TRAIL-R2 (DR5).
Варианты
[0226] В некоторых вариантах осуществления антитела включают одну или более аминокислотных вариаций, например, замен, делеций, вставок и/или мутаций, по сравнению с последовательностью антитела, описанного в настоящей заявке. Примерные варианты включают варианты, созданные с целью повышения аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела могут быть получены путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или с помощью пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Любая комбинация делеции, вставки и замены может быть сделана с целью получения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, антигенсвязывающими.
[0227] В некоторых вариантах осуществления антитела включают одну или более аминокислотных замен, например, по сравнению с последовательностью антитела, описанной в настоящей заявке, и/или по сравнению с последовательностью природного репертуара, например, репертуара человека. Представляющие интерес сайты для заместительного мутагенеза включают CDR и FR области. Аминокислотные замены могут быть введены в представляющее интерес антитело, и продукты - подвергнуты скринингу на наличие требуемой активности, например, сохраненное/улучшенное связывание антигена, сниженную иммуногенность, улучшенный полупериод существования и/или улучшенную эффекторную функцию, такую как способность вызвать антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). В некоторых вариантах осуществления вариант антитела демонстрирует сохраненное или улучшенное связывание с CD19.
[0228] В некоторых вариантах осуществления один или более остатков в CDR исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела) заменяют. В некоторых вариантах осуществления замену делают с целью возврата последовательности или положения в последовательности к последовательности зародышевой линии, такой как последовательность антитела, присутствующая в зародышевой линии (например, человеческой зародышевой линии), например, для уменьшения вероятности иммуногенности, например, при введении человеку.
H
L
[0229] В некоторых вариантах осуществления изменения делают в "горячих точках" CDR, остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации во время процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или остатках, которые контактируют с антигеном, после чего полученный вариант V или V тестируют на аффинность связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек было описано, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (OʹBrien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). В некоторых вариантах осуществления при созревании аффинности разнообразие в вариабельные гены, выбранные для созревания, вводят с помощью любого из множества методов (например, ПЦР пониженной точности, перетасовки цепей или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Затем создают вторичную библиотеку. После этого библиотеку подвергают скринингу с целью идентификации любых вариантов антитела с требуемой аффинностью. Другой способ введения разнообразия включает CDR-направленные методы, в которых рандомизируют несколько остатков в CDR (например, 4-6 остатков за один раз). Остатки CDR, участвующие в связывании антигена, можно специфично идентифицировать, например, при использовании мутагенеза методом аланинового сканирования или моделирования. В особенности, мишенями часто становятся CDR-H3 и CDR-L3.
H
L
[0230] В некоторых вариантах осуществления замены, вставки или делеции могут присутствовать в одной или более CDR, при условии, что такие изменения не вызывают существенного уменьшения способности антитела связывать антиген. Например, в CDR-областях могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, как предусмотрено в настоящей заявке), которые не приводят к существенному уменьшению аффинности связывания. Такие изменения могут, например, находиться за пределами контактирующих с антигеном остатков в CDR-областях. В некоторых вариантах осуществления вариантов V и V последовательностей, предложенных выше, каждая CDR либо не изменена, либо содержит не больше одной, двух или трех аминокислотных замен.
[0231] Вставки в аминокислотной последовательности включают N- и/или C-концевые слитые последовательности, имеющие различную длину, от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или более остатков, а также вставки в последовательность одного или множества аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние на N- или C-конце антитела с ферментом или полипептидом, который увеличивает полупериод существования антитела в сыворотке.
Модификации
[0232] В некоторых вариантах осуществления антитело изменяют с целью увеличения или уменьшения степени, в которой антитело гликозилировано, например, путем удаления или вставки одного или более участков гликозилирования, путем изменения аминокислотной последовательности и/или изменения олигосахарида(ов), присоединяемого на участках гликозилирования, например, при использовании определенных клеточных линий. Участки гликозилирования включают аспарагин 297 тяжелой цепи (согласно нумерации Кэбата).
[0233] Примерные модификации, варианты и клеточные линии описаны, например, в патентных публикациях США US 2003/0157108, US 2004/0093621, US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявке на патент США US 2003/0157108 A1, Presta, L; и WO 2004/056312 A1, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO2003/085107); WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); патенте США 6,602,684 (Umana et al.); а также в US 2005/0123546 (Umana et al.); WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).
[0234] Модифицированные антитела включают антитела, которые имеют одну или более аминокислотных модификаций в Fc-области, такие как антитела, которые имеют последовательность Fc-области человека или другую часть константной области (например, Fc-область IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), включающие аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более аминокислотных положениях.
[0235] Такие модификации могут быть сделаны, например, с целью улучшения полупериода существования, изменения связывания с одним или более типами Fc-рецепторов и/или изменения эффекторных функций.
[0236] Также варианты включают цистеин-сконструированные антитела, такие как "тиоМАт" (thioMAb), и другие цистеин-сконструированные варианты, в которых один или более остатков антитела заменены остатками цистеина с целью получения реакционно-способных тиоловых групп на доступных участках, например, для применения в конъюгировании средств и линкеров-средств, для получения иммуноконъюгатов. Цистеин-сконструированные антитела описаны, например, в патентах США 7,855,275 и 7,521,541.
[0237] В некоторых вариантах осуществления антитела модифицированы для введения дополнительных небелковых молекул, включая водорастворимые полимеры. Примеры полимеров включают, без ограничения перечисленными, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или случайные сополимеры), и декстран или поли-(N-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоль-пропионовый альдегид может иметь преимущества в производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может изменяться, и, если присоединяют больше одного полимера, они могут быть одинаковыми или различными молекулами. Как правило, количество и/или тип полимеров, используемых для получения производных, могут быть определены на основе факторов, включающих, без ограничения, специфические свойства или функции улучшаемого антитела, независимо от использования производного антитела в терапии при определенных условиях, и т.д.
B. Рекомбинантные рецепторы
[0238] Предложенные CD19-связывающие молекулы включают рекомбинантные рецепторы, такие как антигенные рецепторы и другие химерные рецепторы, которые специфично связываются с CD19, такие как рецепторы, содержащие предложенные антитела против CD19, например, фрагменты антител. Антигенные рецепторы включают функциональные, не относящиеся к TCR, антигенные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR). Также предложены клетки, экспрессирующие рекомбинантные рецепторы, а также их применение в адоптивной клеточной терапии, например, при лечении заболеваний и нарушений, связанных с экспрессией CD19.
[0239] Примерные антигенные рецепторы, в том числе CAR, и способы конструирования и введения таких рецепторов в клетки, включают описанные, например, в публикациях международных заявок на патенты WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, публикации заявок на патенты США US2002131960, US2013287748, US20130149337, патенты США: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 и 8,479,118, и европейской заявке на патент EP2537416, и/или описанные в Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. В некоторых аспектах антигенные рецепторы включают CAR, как описано в патенте США 7,446,190, а также описанные в публикации международной заявки на патент WO/2014055668 A1. Примеры CAR-рецепторов включают CAR, раскрытые в любой из вышеуказанных публикаций, таких как WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, патент США 7,446,190, патент США 8,389,282, например, и в которых антигенсвязывающая часть, например scFv, заменена антителом, например, как предложено в настоящей заявке.
H
L
[0240] Химерные рецепторы включают химерные антигенные рецепторы (CAR). Химерные рецепторы, такие как CAR, обычно включают внеклеточный антигенсвязывающий домен, который включает, является или содержится в одном из предложенных антител против CD19. Таким образом, химерные рецепторы, например CAR, обычно включают в своих внеклеточных частях одну или более CD19-связывающих молекул, таких как один или более антигенсвязывающих фрагментов, доменов или частей, или один или более вариабельных доменов антитела, и/или молекул антител, таких как описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления CAR включает CD19-связывающую часть или части молекулы антитела, такие как вариабельную область тяжелой цепи (V) и/или вариабельную область легкой цепи (V) антитела, например, scFv-фрагмент антитела.
[0241] CD19-направленные CAR описаны, например, в Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; и Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). См. также WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, патент США 7,446,190 и патент США 8,389,282.
[0242] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный рецептор, такой как CAR, например, его иммуноглобулиновая часть, дополнительно включает спейсер, который может представлять собой или включать, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина или его вариант или модифицированную версию, такую как шарнирную область, например, шарнирную область IgG4 и/или CH1/CL, и/или Fc-область. В некоторых аспектах часть константной области служит в качестве спейсерной области между антиген-распознающим компонентом, например scFv, и трансмембранным доменом. Спейсер может иметь длину, которая обеспечивает повышенную реактивность клетки после связывания антигена по сравнению с клеткой в отсутствие спейсера. В некоторых примерах спейсер имеет длину около или приблизительно 12 аминокислот или имеет длину не больше 12 аминокислот. Примерные спейсеры включают спейсеры, которые содержат по меньшей мере приблизительно 10-229 аминокислот, приблизительно 10-200 аминокислот, приблизительно 10-175 аминокислот, приблизительно 10-150 аминокислот, приблизительно 10-125 аминокислот, приблизительно 10-100 аминокислот, приблизительно 10-75 аминокислот, приблизительно 10-50 аминокислот, приблизительно 10-40 аминокислот, приблизительно 10-30 аминокислот, приблизительно 10-20 аминокислот или приблизительно 10-15 аминокислот, и включающие любое целое число в пределах любого из перечисленных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область содержит приблизительно 12 аминокислот или меньше, приблизительно 119 аминокислот или меньше или приблизительно 229 аминокислот или меньше. Примеры спейсеров включают отдельный шарнир IgG4, шарнир IgG4, связанный с CH2 и CH3 доменами, или шарнир IgG4, связанный с CH3 доменом. Примерные спейсеры включают, без ограничения, описанные в Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, публикации международной заявки на патент WO2014031687, патенте США 8,822,647 или в опубликованной заявке US2014/0271635.
[0243] В некоторых вариантах осуществления константная область или часть является частью IgG человека, такого как IgG4 или IgG1. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность ESKYGPPCPPCP (представленную в SEQ ID NO: 124) и кодируется последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 125. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 126. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 127. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть является частью IgD. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность, представленную в SEQ ID NO: 128. В некоторых вариантах осуществления спейсер имеет последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательность с любой из SEQ ID NO: 124, 126, 127 или 128.
[0244] Антиген-распознающий домен обычно связан с одним или более внутриклеточными сигнальными компонентами, такими как сигнальные компоненты, которые имитируют активацию через комплекс антигенного рецептора, такой как комплекс TCR, в случае CAR, и/или передают сигнал через другой рецептор клеточной поверхности. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления CD19-специфичный связывающий компонент (например, антитело) связан с одним или более трансмембранными и внутриклеточными сигнальными доменами. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен слит с внеклеточным доменом. В одном варианте осуществления применяется трансмембранный домен, который в естественном состоянии связан с одним из доменов в рецепторе, например, CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен выбирают или модифицируют путем аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или других поверхностных мембранных белков, с целью свести к минимуму взаимодействия с другими участниками рецепторного комплекса.
[0245] Трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления получен из природного или синтетического источника. В случаях, когда источник является природным, домен, в некоторых аспектах, получен из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают области, полученные из (то есть включают, по меньшей мере, трансмембранную область(и)) альфа, бета или дзэта-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, эпсилон CD3, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD 154, и/или трансмембранные области, содержащие их функциональные варианты, такие как трансмембранные области, которые сохраняют существенную часть их структурных, например, трансмембранных, свойств. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен является трансмембранным доменом, полученным из CD4, CD28 или CD8, например, CD8 альфа, или их функционального варианта. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления является синтетическим. В некоторых аспектах синтетический трансмембранный домен включает преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых аспектах триплет фенилаланина, триптофана и валина будет присутствовать на каждом конце синтетического трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления связывание осуществляется с помощью линкеров, спейсеров и/или трансмембранного домена(ов).
[0246] Внутриклеточные сигнальные домены включают домены, которые имитируют или приближенно воспроизводят сигнал через природный антигенный рецептор, сигнал через такой рецептор в комбинации с костимуляторным рецептором и/или сигнал только через костимуляторный рецептор. В некоторых вариантах осуществления короткий олиго- или полипептидный линкер, например линкер длиной 2-10 аминокислот, например, линкер, содержащий глицины и серины, например глицин-сериновый дуплет, присутствует и формирует связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR-рецептора.
[0247] Рецептор, например CAR, обычно включает по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный компонент или компоненты. В некоторых вариантах осуществления рецептор включает внутриклеточный компонент TCR комплекса, такой как CD3 цепь TCR, которая опосредует Т-клеточную активацию и цитотоксичность, например, дзэта-цепь CD3. Таким образом, в некоторых аспектах CD19-связывающее антитело связано с одним или более сигнальными модулями клетки. В некоторых вариантах осуществления сигнальные модули клетки включают трансмембранный домен CD3, внутриклеточные сигнальные домены CD3 и/или другие трансмембранные CD домены. В некоторых вариантах осуществления рецептор, например CAR, дополнительно включает часть одной или более дополнительных молекул, таких как Fc-рецептор γ, CD8, CD4, CD25 или CD16. Например, в некоторых аспектах CAR включает химерную молекулу между CD3-дзэта (CD3-ζ) или Fc-рецептором γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.
[0248] В некоторых вариантах осуществления при лигировании CAR, цитоплазматический домен или внутриклеточный сигнальный домен CAR активирует по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций или ответов иммунной клетки, например Т-клетки, полученной с помощью методов генной инженерии для экспрессии CAR. Например, в некоторых контекстах, CAR индуцирует функцию Т-клетки, такую как цитолитическая активность или T-хелперная активность, такая как секреция цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления усеченная часть внутриклеточного сигнального домена компонента антигенного рецептора или костимуляторная молекула используются вместо интактной иммуностимуляторной цепи, например, если она передает сигнал эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен или домены включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и, в некоторых аспектах, также последовательности корецепторов, которые в естественных условиях действуют совместно с таким рецептором, инициируя передачу сигнала после захвата антигенного рецептора, и/или любое производное или вариант таких молекул, и/или любую синтетическую последовательность, которая обладает такой же функциональной способностью.
[0249] В отношении прородного TCR, полная активация обычно требует не только сигнализации через TCR, но также и наличие костимуляторного сигнала. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления для индукции полной активации в CAR также включают компонент для генерации вторичного или костимуляторного сигнала. В других вариантах осуществления CAR не включает компонент для генерации костимуляторного сигнала. В некоторых аспектах дополнительный CAR экспрессируется в той же клетке и обеспечивает компонент для генерации вторичного или костимуляторного сигнала.
[0250] Активация Т-клеток в некоторых аспектах описывают как опосредуемую двумя классами цитоплазматических сигнальных последовательностей: тех, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и тех, которые действуют антигеннезависимым образом, обеспечивая вторичный или костимуляторный сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых аспектах CAR включает один или оба таких сигнальных компонента.
[0251] В некоторых аспектах CAR включает первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая регулирует первичную активацию TCR комплекса. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные тирозиновые активирующие мотивы или ITAM. Примеры ITAM, содержащего первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, включают мотивы, полученные из TCR-дзэта, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD8, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(ы) в CAR содержит цитоплазматический сигнальный домен, его часть или последовательность, полученную из CD3-дзэта.
[0252] В некоторых вариантах осуществления CAR включает сигнальный домен и/или трансмембранную часть костимуляторного рецептора, такого как CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 или ICOS, или CD27. В некоторых аспектах один и тот же CAR включает как активирующий, так и костимуляторный компоненты.
[0253] В некоторых вариантах осуществления активирующий домен (например, CD3-дзэта) включен в один CAR, тогда как костимуляторный компонент (например, CD28 или 4-1BB) представлен другим CAR, распознающим другой антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR включают активирующий или стимуляторный CAR-рецепторы, костимуляторные CAR-рецепторы, которые экспрессируются на одной клетке (см. WO2014/055668). В некоторых аспектах CD19-направленный CAR является стимуляторным или активирующим CAR; в других аспектах он является костимуляторным CAR. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно включают ингибиторные CAR-рецепторы (iCAR, см. Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (декабрь 2013), такие как CAR, распознающий антиген, отличный от CD19, в результате чего активирующий сигнал, передающийся через CD19-направленный CAR, ослабляется или ингибируется при связывании ингибиторного CAR с его лигандом, например, для уменьшения нецелевых эффектов.
[0254] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный компонент рекомбинантного рецептора, такого как CAR, включает внутриклеточный домен CD3-дзэта и костимуляторную сигнальную область. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен включает трансмембранный и сигнальный домен CD28, связанный с внутриклеточным доменом CD3 (например, CD3-дзэта). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен включает химерные CD28 и/или CD137 (4-1BB, TNFRSF9) костимуляторные домены, связанные с внутриклеточным доменом CD3-дзэта.
[0255] В некоторых вариантах осуществления CAR охватывает один или больше, например два или более, костимуляторных домена и активирующий домен, например, первичный активирующий домен, в цитоплазматической части. Примеры CAR включают внутриклеточные компоненты CD3-дзэта, CD28 и 4-1BB.
[0256] В некоторых вариантах осуществления CAR или другой антигенный рецептор дополнительно включают маркер, такой как маркер клеточной поверхности, который может применяться для подтверждения трансдукции или для конструирования клетки, экспрессирующей рецептор, такой как усеченная версия рецептора клеточной поверхности, такая как усеченный EGFR (tEGFR). В некоторых аспектах маркер включает весь или часть (например, усеченную форму) CD34, NGFR или рецептора эпидермального фактора роста (например, tEGFR) или их функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим линкерную последовательность, такую как расщепляемая линкерная последовательность, например, T2A. Например, маркер и, необязательно, линкерная последовательность, могут быть любыми, как раскрыто в опубликованной заявке на патент WO2014031687. Например, маркер может быть усеченным EGFR (tEGFR), то есть, необязательно, связанным с линкерной последовательностью, такой как расщепляемая линкерная последовательность T2A. Примерный полипептид усеченного EGFR (например, tEGFR) включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 138, или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 138. Примерная линкерная последовательность T2A включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 137, или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 137.
[0257] В некоторых вариантах осуществления маркер является молекулой, например, белком клеточной поверхности, обычно не присутствующим на Т-клетках или обычно не присутствующим на поверхности Т-клеток, или его частью.
[0258] В некоторых вариантах осуществления молекула является чужой молекулой, например, чужим белком, то есть таким, который не распознается как "свой" иммунной системой организма, в который адоптивно будут переносить клетки.
in vivo
[0259] В некоторых вариантах осуществления маркер не служит никакой терапевтической функции и/или не оказывает никакого действия кроме применения в качестве маркера для генной инженерии, например, для отбора успешно сконструированных клеток. В других вариантах осуществления маркер может быть терапевтической молекулой или молекулой, проявляющей иное требуемое действие, такой как лиганд для клетки, с которым она взаимодействует , такой как костимуляторная или иммунная контрольная молекула, усиливающая и/или ослабляющая ответы клеток после адоптивного переноса и контакта с лигандом.
[0260] В некоторых случаях CAR-рецепторы указывают как CAR-рецепторы первого, второго и/или третьего поколения. В некоторых аспектах CAR первого поколения представляет собой такой рецептор, который после связывания антигена формирует только индуцированный CD3-цепью сигнал; в некоторых аспектах CAR второго поколения является рецептором, который формирует такой сигнал и костимуляторный сигнал, таким как CAR-рецептор, включающий внутриклеточный сигнальный домен из костимуляторного рецептора, такого как CD28 или CD137; в некоторых аспектах CAR третьего поколения в некоторых аспектах является таким рецептором, который включает множество костимуляторных доменов различных костимуляторных рецепторов.
[0261] В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент, описанный в настоящей заявке. В некоторых аспектах химерный антигенный рецептор включает внеклеточную часть, содержащую антитело или фрагмент, описанный в настоящей заявке, и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент включают scFv, и внутриклеточный домен содержит ITAM. В некоторых аспектах внутриклеточный сигнальный домен включает сигнальный домен дзэта-цепи CD3-дзэта (CD3ζ) цепи. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор включает трансмембранный домен, связывающий внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых аспектах трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28. Внеклеточный домен и трансмембранный домен могут быть связаны прямо или опосредованно. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный связаны спейсером, таким как любой спейсер, описанный в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления рецептор содержит внеклеточную часть молекулы, из которой получен трансмембранный домен, такую как внеклеточная часть CD28. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен, полученный из Т-клеточной костимуляторной молекулы или его функциональный вариант, например, между трансмембранным доменом и внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых аспектах Т-клеточной костимуляторной молекулой является CD28 или 41BB.
[0262] Например, в некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, как предложено в настоящей заявке, трансмембранный домен, который является или содержит трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальную часть CD28 или ее функциональный вариант, и сигнальную часть CD3-дзэта или ее функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, как предложено в настоящей заявке, трансмембранный домен, который является или содержит трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант, и внутриклеточный сигнальный домен, содержащий сигнальную часть 4-1BB или ее функциональный вариант, и сигнальную часть CD3-дзэта или ее функциональный вариант. В некоторых таких вариантах осуществления рецептор дополнительно включает спейсер, содержащий часть молекулы Ig, такой как молекула Ig человека, такую как шарнир Ig, например шарнир IgG4, такой как спейсер, содержащий только шарнир.
[0263] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен рекомбинантного рецептора, например CAR, является или включает трансмембранный домен человеческого CD28 (например, рег. номер P01747.1) или его вариант, такой как трансмембранный домен, который включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 129, или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 129; в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен, содержащий часть рекомбинантного рецептора, включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 130, или последовательность аминокислот, обладающую по меньшей мере примерно или приблизительно 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности с ней.
[0264] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный компонент(ы) рекомбинантного рецептора, например, CAR, содержит внутриклеточный костимуляторный сигнальный домен человеческого CD28 или его функциональный вариант, или его часть, такую как домен с заменой LL на GG в положениях 186-187 нативного белка CD28. Например, внутриклеточный сигнальный домен может включать последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 131 или 132, или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 131 или 132. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен включает внутриклеточный костимуляторный сигнальный домен 4-1BB (например, рег. номер Q07011.1) или его функциональный вариант, или его часть, такую как последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 133, или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 133.
[0265] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен рекомбинантного рецептора, например CAR, включает стимуляторный сигнальный домен CD3-дзэта человека или его функциональный вариант, такой как 112 ак цитоплазматический домен изоформы 3 из CD3ζ человека (рег. номер P20963.2) или сигнальный домен CD3-дзэта, как описано в патенте США 7,446,190 или патенте США 8,911,993. Например, в некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен включает последовательность аминокислот 134, 135 или 136 или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 134, 135 или 136.
[0266] В некоторых аспектах спейсер содержит только шарнирную область IgG, например, только шарнир IgG4 или IgG1, такой как содержащий только шарнир спейсер, представленный в SEQ ID NO: 124. В других вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит шарнир Ig, например, полученный из IgG4 шарнир, необязательно связанный с CH2 и/или CH3 доменами. В некоторых вариантах осуществления спейсер является шарниром Ig, например, шарниром IgG4, связанным с CH2 и CH3 доменами, таким как представлено в SEQ ID NO: 127. В некоторых вариантах осуществления спейсер является шарниром Ig, например, шарниром IgG4, связанным только с CH3 доменом, таким как представлено в SEQ ID NO: 126. В некоторых вариантах осуществления спейсер является или включает богатую глицином-серином последовательность или другой гибкий линкер, такой как известный гибкие линкеры.
[0267] Например, в некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело против CD19, такое как фрагмент антитела против CD19, такого как любое из предложенных антител человека против CD19, например, одноцепочечных антител, включающих scFv-фрагменты, описанные в настоящей заявке, спейсер, такой как спейсер, содержащий часть молекулы иммуноглобулина, такую как шарнирная область и/или одна или более константных областей молекулы тяжелой цепи, такие как Ig-шарнир, содержащий спейсер, трансмембранный домен, содержащий весь или часть полученного из CD28 трансмембранного домена, полученного из CD28 внутриклеточного сигнального домена, и сигнального домена CD3-дзэта. В некоторых вариантах осуществления CAR включает антитело против CD19 или фрагмент, такой как любое из антител человека против CD19, включая scFv-фрагменты, описанные в настоящей заявке, спейсер, такой как любой содержащий шарнир Ig спейсер, полученный из CD28 трансмембранный домен, полученный из 4-1BB внутриклеточный сигнальный домен и полученный из CD3-дзэта сигнальный домен.
[0268] В некоторых вариантах осуществления такие конструкции CAR дополнительно включают последовательность элемента пропуска рибосомы T2A и/или tEGFR, например, после CAR, такую как представленные в SEQ ID NO: 137 и/или 138, соответственно, или последовательность аминокислот, которая демонстрирует по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или большую идентичность последовательности с SEQ ID NO: 137 или 138
C. Рекомбинантные клетки
[0269] Также предложены клетки, популяции клеток и композиции, содержащие клетки, например рекомбинантные клетки, которые, например, содержат сконструированный антигенный рецептор, который, например, содержит внеклеточный домен, включая антитело против CD19 или фрагмент, описанные в настоящей заявке. Композиции включают фармацевтические композиции и лекарственные формы для введения, например, для адоптивной клеточной терапии. Также предложены терапевтические способы введения клеток и композиций субъектам, например, больным.
[0270] Таким образом, также предложены полученные с помощью методов генной инженерии клетки, экспрессирующие рекомбинантные рецепторы, содержащие антитела, например, клетки, содержащие CAR. Клетки, как правило, являются эукариотическими клетками, такими как клетки млекопитающих, и обычно являются клетками человека. В некоторых вариантах осуществления клетки получены из крови, костного мозга, лимфы или лимфоидных органов, являются клетками иммунной системы, такими как клетки врожденного или приобретенного иммунитета, например, миелоидные или лимфоидные клетки, включая лимфоциты, обычно Т-клетки и/или NK-клетки. Другие примерные клетки включают стволовые клетки, такие как мультипотентные и плюрипотентные стволовые клетки, в том числе индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). Клетки, как правило, являются первичными клетками, такими как клетки, выделенные непосредственно у субъекта и/или выделенные у субъекта и замороженные. В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более субпопуляций Т-клеток или других типов клеток, таких как целые популяции Т-клеток, CD4+ клеток, CD8+ клеток и их субпопуляции, такие как определяемые функцией, состоянием активации, зрелостью, способностью к дифференцировке, размножению, рециркуляции, локализации и/или персистированию, антигенной специфичностью, типом антигенного рецептора, присутствием в определенном органе или компартменте, маркером или профилем секреции цитокинов, и/или степенью дифференцировки. В отношении субъекта, подлежащего лечению, клетки могут быть аллогенными и/или аутологичными. Способы включают стандартные способы. В некоторых аспектах, например, в случае стандартных технологий, клетки являются плюрипотентными и/или мультипотентными, такими как стволовые клетки, такие как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC). В некоторых вариантах осуществления способы включают выделение клеток у субъекта, их подготовку, обработку, культивирование и/или инженерию, как описано в настоящей заявке, и повторное введение их тому же пациенту, до или после криоконсервации.
N
EFF
SCM
CM
EM
[0271] Субтипы и субпопуляции Т-клеток и/или CD4+, и/или CD8+ Т-клеток включают наивные T (T) клетки, эффекторные Т-клетки (T), Т-клетки памяти и их субтипы, такие как стволовые T-клетки памяти (T), центральные T-клетки памяти (T), эффекторные T-клетки памяти (T) или терминально дифференцированные эффекторные Т-клетки памяти, инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL), незрелые Т-клетки, зрелые Т-клетки, Т-хелперы, цитотоксические Т-клетки, ассоциированные со слизистой инвариантные T (MAIT) клетки, естественные и адаптивные регуляторные T (Treg) клетки, Т-хелперы, такие как клетки TH1, клетки TH2, клетки TH3, клетки TH17, клетки TH9, клетки TH22, фолликулярные Т-хелперы, альфа/бета Т-клетки и дельта/гамма Т-клетки.
[0272] В некоторых вариантах осуществления клетки являются естественными киллерными (NK) клетками. В некоторых вариантах осуществления клетки являются моноцитами или гранулоцитами, например, миелоидными клетками, макрофагами, нейтрофилами, дендритными клетками, тучными клетками, эозинофилами и/или базофилами.
[0273] В некоторых вариантах осуществления клетки включают одну или более нуклеиновых кислот, введенных с помощью генной инженерии, и, таким образом, экспрессируют рекомбинантные или полученные с помощью методов генной инженерии продукты таких нуклеиновых кислот. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты являются геторологичными, то есть обычно не присутствуют в клетке или образце, полученном из клетки, таком как образец, полученный из другого организма или клетки, который, например, обычно не присутствует в рекомбинантной клетке и/или организме, из которого получена такая клетка. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты не встречаются в природе, то есть являются такими как нуклеиновая кислота, не присутствующая в природе, включая нуклеиновую кислоту, включающую химерные комбинации нуклеиновых кислот, кодирующих различные домены из множества различных типов клеток.
Векторы и методы генной инженерии
[0274] Также предложены способы, нуклеиновые кислоты, композиции и наборы для экспрессии связывающих молекул, в том числе рецепторов, включающих антитела, и для получения с помощью методов генной инженерии клеток, экспрессирующих такие связывающие молекулы. Генная инженерия обычно включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный или сконструированный компонент, в клетку, например, с помощью ретровирусной трансдукции, трансфекции или трансформации.
[0275] В некоторых вариантах осуществления перенос гена осуществляют сначала путем стимулирования клетки, например, комбинируя его со стимулом, который вызывает реакцию, такую как пролиферацию, выживание и/или активацию, например, измеряемую по экспрессии цитокина или маркера активации, с последующей трансдукцией активированных клеток и размножением в культуре до количеств, достаточных для клинических применений.
in vivo
in vivo
[0276] В некоторых контекстах оверэкспрессия стимуляторного фактора (например, лимфокина или цитокина) может быть токсичной для субъекта. Таким образом, в некоторых контекстах рекомбинантные клетки включают сегменты гена, которые делают клетки чувствительными к отрицательной селекции , например, при введении в адоптивной иммунотерапии. Например, в некоторых аспектах клетки изменены с помощью методов генной инженерии так, чтобы они могли быть элиминированы в результате изменения  условия в организме больного, которому их вводят. Отрицательный селективный фенотип может быть результатом вставки гена, который придает чувствительность к вводимому средству, например, соединению. Отрицательные селективные гены включают ген тимидинкиназы вируса простого герпеса 1-го типа (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II:223, 1977), который придает чувствительность к ганцикловиру; ген клеточной гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (HPRT), ген клеточной аденинфосфорибозилтрансферазы (APRT), бактериальную цитозин-деаминазу (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
[0277] В некоторых аспектах клетки также изменены с помощью методов генной инженерии для индукции экспрессии цитокинов или других факторов. Различные методы введения полученных с помощью методов генной инженерии компонентов, например, антигенных рецепторов, например CAR-рецепторов, известны и могут применяться с предложенными способами и композициями. Примерные методы включают методы переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы, в том числе с помощью вирусной, например ретровирусной или лентивирусной, трансдукции, транспозонов и электропорации.
[0278] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в клетки при использовании рекомбинантных инфекционных вирусных частиц, таких как, например, векторы, полученные из вируса обезьян 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в Т-клетки при использовании рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гамма-ретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557).
[0279] В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор содержит последовательность длинного концевого повтора (LTR), например, ретровирусный вектор, полученный из вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), миелопролиферативного вируса саркомы (MPSV), вируса эмбриональных стволовых клеток мышей (MESV), вируса стволовых клеток мышей (MSCV), вируса некроза селезенки (SFFV) или аденоассоциированного вируса (AAV). Большинство ретровирусных векторов получено из ретровирусов мышей. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают ретровирусы, полученные из любого источника клеток птиц или млекопитающих. Ретровирусы обычно являются амфотропными, что означает то, что они способны инфицировать клетки-хозяева организмов нескольких видов, включая людей. В одном варианте осуществления экспрессируемый ген заменяет ретровирусные последовательности gag, pol и/или env. Был описан ряд примеров ретровирусных систем (например, патенты США 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; и Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).
[0280] Методы лентивирусной трансдукции известны. Примеры методов описаны, например, в Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; и Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.
[0281] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в Т-клетки с помощью электропорации (см., например, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 и Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в Т-клетки с помощью транспозиции (см., например, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; и Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Другие методы введения и экспрессии генетического материала в иммунных клетках включают трансфекцию с фосфатом кальция (например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), слияние протопластов, опосредованную катионными липосомами трансфекцию; бомбардировку микрочастицами вольфрама (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и соосаждение ДНК фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).
[0282] Другие методы и векторы для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные продукты, описаны, например, в публикации международной заявки на патент WO2014055668 и патенте США 7,446,190.
in vivo
in vivo
[0283] Дополнительные нуклеиновые кислоты, например, гены для введения, включают гены для повышения эффективности терапии, например, способствующие жизнеспособности и/или функции переносимых клеток; гены, обеспечивающие генетический маркер для селекции и/или оценки клеток, например, для оценки выживания или локализации; гены для повышения безопасности, например, делающие клетку чувствительной к отрицательной селекции , как описано Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); и Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); см. также публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601 (Lupton et al.), в которых описано применение бифункциональных селективных слитых генов, полученных в результате слияния доминантного положительного селективного маркера с отрицательным селективным маркером. См., например, Riddell et al., патент США 6,040,177, в колонках 14-17.
Получение клеток для инженерии
[0284] В некоторых вариантах осуществления получение рекомбинантных клеток включает один или более этапов культивирования и/или подготовки. Клетки для введения CD19-связывающей молекулы, например CAR, могут быть выделены из образца, такого как биологический образец, например, образец, полученный или происходящий от субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект, у которого выделена клетка, является субъектом, имеющим заболевание или состояние или нуждающимся в клеточной терапии, или субъектом, который будет проходить клеточную терапию. Субъект в некоторых вариантах осуществления является человеком, нуждающимся в определенном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой клетки выделяют, обрабатывают и/или подвергают генно-инженерным манипуляциям.
[0285] Таким образом, клетки, в некоторых вариантах осуществления, являются первичными клетками, например, первичными клетками человека. Образцы включают ткань, жидкость и другие образцы, забранные непосредственно у субъекта, а также образцы, полученные в результате одного или более этапов обработки, таких как разделение, центрифугирование, генная инженерия (например, трансдукция вирусным вектором), промывка и/или инкубирование. Биологический образец может быть образцом, полученным непосредственно из биологического источника, или образцом, который обработан. Биологические образцы включают, без ограничения, физиологические жидкости, такие как кровь, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, синовиальную жидкость, мочу и пот, образцы ткани и органов, в том числе обработанные образцы, полученные из них.
[0286] В некоторых аспектах образец, из которого получены или выделены клетки, является кровью или полученным из крови образцом, или является или получен из продукта афереза или лейкафереза. Примеры образцов включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), лейкоциты, костный мозг, тимус, биоптат ткани, опухоль, лейкоз, лимфому, лимфатический узел, кишечно-ассоциированную лимфоидную ткань, слизисто-ассоциированную лимфоидную ткань, селезенку, другие лимфоидные ткани, печень, легкое, желудок, кишечник, толстую кишку, почку, поджелудочную железу, молочную железу, кость, предстательную железу, шейку матки, семенники, яичники, миндалину или другой орган, и/или клетки, полученные из них. Образцы включают, в рамках клеточной терапии, например адоптивной клеточной терапии, образцы из аутологичных и аллогенных источников.
[0287] В некоторых вариантах осуществления клетки получены из клеточных линий, например, линий Т-клеток. Клетки в некоторых вариантах осуществления получены из ксеногенного источника, например, из мыши, крысы, не относящегося к человеку примата и свиньи.
[0288] В некоторых вариантах осуществления выделение клеток включает один или более этапов подготовки и/или разделения клеток не на основе аффинности. В некоторых примерах клетки промывают, центрифугируют и/или культивируют в присутствии одного или более реактивов, например, для удаления нежелательных компонентов, обогащения требуемыми компонентами, лизиса или удаления клеток, чувствительных к определенным реактивам. В некоторых примерах клетки разделяют на основе одного или более свойств, таких как плотность, адгезионные свойства, размер, чувствительность и/или устойчивость к определенным компонентам.
[0289] В некоторых примерах клетки из циркулирующей крови субъекта получают, например, с помощью афереза или лейкафереза. Образцы, в некоторых аспектах, содержат лимфоциты, в том числе Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядросодержащие лейкоциты, эритроциты и/или тромбоциты, и, в некоторых аспектах, содержат другие клетки кроме эритроцитов и тромбоцитов.
++
++
[0290] В некоторых вариантах осуществления клетки крови, забранные у субъекта, промывают, например, для удаления фракции плазмы, и помещают клетки в подходящий буфер или среды для последующих этапов обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатносолевым буферным раствором (PBS). В некоторых вариантах осуществления промывочный раствор не содержит кальция и/или магния, и/или многих, или не содержит никаких двухвалентных катионов. В некоторых аспектах этап промывки выполняют на полуавтоматической "проточной" центрифуге (например, Cobe 2991 cell processor, Baxter) согласно инструкциям производителя. В некоторых аспектах этап промывки выполняют с помощью фильтрации в тангенциальном потоке (TFF) согласно инструкциям производителя. В некоторых вариантах осуществления клетки ресуспендируют в различных биологически совместимых буферах после промывки, таких как, например, PBS без Ca/Mg. В некоторых вариантах осуществления компоненты образца клеток крови удаляют, а клетки непосредственно ресуспендируют в питательных средах.
[0291] В некоторых вариантах осуществления способы включают методы разделения клеток по плотности, такие как получение лейкоцитов из периферической крови путем лизиса эритроцитов и центрифугирования в градиенте перколла или фиколла.
[0292] В некоторых вариантах осуществления способы выделения включают разделение различных типов клеток по экспрессии или присутствию в клетке одной или более определенных молекул, таких как поверхностные маркеры, например, поверхностные белки, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления может применяться любой известный метод разделения на основе таких маркеров. В некоторых вариантах осуществления разделение является разделением на основе аффинности или иммуноафинности. Например, выделение в некоторых аспектах включает разделение клеток и групп клеток на основе экспрессии клеток или уровня экспрессии одного или более маркеров, как правило, маркеров клеточной поверхности, например, путем инкубирования с антителом или партнером связывания, который специфично связывается с такими маркерами, обычно с последующими этапами промывки и разделения клеток, связанных антителом или партнером связывания, от тех клеток, которые не связались с антителом или партнером связывания.
[0293] Такие этапы разделения могут быть основаны на положительной селекции, в которой клетки, связанные реактивами, сохраняют для последующего использования, и/или отрицательной селекции, в которой сохраняют клетки, не связавшиеся с антителом или партнером связывания. В некоторых примерах обе фракции сохраняют для последующего использования. В некоторых аспектах отрицательная селекция может быть особенно полезной, когда не доступно антитело, которое специфично идентифицирует тип клетки в гетерогенной популяции, при этом разделение лучше всего выполнять на основе маркеров, экспрессируемых клетками, не входящими в требуемую популяцию.
[0294] Разделение может не приводить к 100% обогащению или удалению определенной популяции клеток или клеток, экспрессирующих определенный маркер. Например, положительная селекция клеток или обогащение клетками определенного типа, такими как клетки, которые экспрессируют маркер, относится к увеличению числа или процента таких клеток, но не должна приводить к полному отсутствию клеток, не экспрессирующих маркер. Аналогичным образом, отрицательная селекция, удаление или истощение клеток определенного типа, таких как клетки, которые экспрессируют маркер, относится к уменьшению числа или процента таких клеток, но не должно приводить к полному удалению всех таких клеток.
[0295] В некоторых примерах выполняют множество циклов этапов разделения, где положительно или отрицательно отобранную фракцию из одного этапа подвергают другому этапу разделения, такому как последующая положительная или отрицательная селекция. В некоторых примерах один этап разделения может обеспечивать уменьшение количества клеток, экспрессирующих множество маркеров, одновременно, например, путем культивирования клеток с множеством антител или партнеров связывания, каждый из которых специфичен к маркеру, являющемуся мишенью для отрицательной селекции. Аналогичным образом, множество типов клеток можно одновременно подвергать положительной селекции, культивируя клетки с множеством антител или партнеров связывания, экспрессируемых на различных типах клеток.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
[0296] Например, в некоторых аспектах определенные субпопуляции Т-клеток, такие как клетки, положительные или экспрессирующие высокие уровни одного или более поверхностных маркеров, например, CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD4, CD8, CD45RA и/или CD45RO Т-клетки, выделяют с помощью методов положительной или отрицательной селекции.
+
+

[0297] Например, CD3, CD28 Т-клетки можно подвергать положительной селекции при использовании CD3/CD28 конъюгированных магнитных гранул (например, DYNABEADS M-450 CD3/CD28T Cell Expander).
+
высокий
[0298] В некоторых вариантах осуществления выделение проводят путем обогащения конкретной популяции клеток с помощью положительной селекции или истощения конкретной популяции клеток с помощью отрицательной селекции. В некоторых вариантах осуществления положительную или отрицательную селекцию выполняют при культивировании клеток с одним или более антителами или другим связывающим средством, которые специфично связываются с одним или более поверхностными маркерами, экспрессируемыми (маркер) или экспрессируемыми на относительно более высоком уровне (маркер) на положительно или отрицательно отбираемых клетках, соответственно.
+
+
+
+
+
+
[0299] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки отделяют от образца МКПК с помощью отрицательной селекции маркеров, экспрессируемых на не относящихся к T-клеткам клетках, таких как В-клетки, моноциты или другие лейкоциты, такие как CD14. В некоторых аспектах этап селекции CD4 или CD8 используется для разделения CD4 хелперных и CD8 цитотоксических Т-клеток. Такие CD4 и CD8 популяции можно далее сортировать на субпопуляции с помощью положительной или отрицательной селекции по маркерам, экспрессируемым или экспрессируемым в относительно более высокой степени на Т-клетках одной или более субпопуляций: наивных, памяти и/или эффекторных.
+
+
+
CM
CM
[0300] В некоторых вариантах осуществления CD8 клетки дополнительно обогащают или истощают по содержанию наивных клеток, клеток центральной памяти, эффекторных клеток памяти и/или стволовых клеток центральной памяти, например, с помощью положительной или отрицательной селекции по поверхностным антигенам, связанным с соответствующей субпопуляцией. В некоторых вариантах осуществления обогащение по содержанию T-клеток центральной памяти (T) проводят с целью повышения эффективности, например, улучшения длительного выживания, размножения и/или приживаемости после введения, что в некоторых аспектах является особенно надежным в таких субпопуляциях. См. Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. В некоторых вариантах осуществления объединение T-обогащенных CD8 Т-клеток и CD4 Т-клеток дополнительно увеличивает эффективность.
+
-
+
-
+
+
+
[0301] В вариантах осуществления Т-клетки памяти присутствуют и в CD62L, и в CD62L субпопуляциях CD8 лимфоцитов периферической крови. МКПК могут быть обогащены или истощены по содержанию CD62LCD8 и/или CD62LCD8 фракций, например, при использовании антител к CD8 и к CD62L.
CM
CM
CM
+
+
+
[0302] В некоторых вариантах осуществления обогащение T-клетками центральной памяти (T) основано на положительной или высокой поверхностной экспрессии CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD 127; в некоторых аспектах оно основано на отрицательной селекции клеток, экспрессирующих или с высоким уровнем экспрессирующих CD45RA и/или гранзим B. В некоторых аспектах выделение CD8 популяции, обогащенной T клетками, выполняют путем уменьшения содержания клеток, экспрессирующих CD4, CD14, CD45RA, и с помощью положительной селекции или обогащения клетками, экспрессирующими CD62L. В одном аспекте обогащение T-клетками центральной памяти (T) проводят, начиная с отрицательной фракции клеток, отобранных по экспрессии CD4, которые подвергают отрицательной селекции по экспрессии CD14 и CD45RA, и положительной селекции по CD62L. Такие селекции в некоторых аспектах выполняют одновременно, а в других аспектах выполняют последовательно, в любом порядке. В некоторых аспектах такой же этап селекции по экспрессии CD4, используемый при получении популяции или субпопуляции CD8 клеток, также используется для получения популяции или субпопуляции CD4 клеток, при этом и положительную, и отрицательную фракции после разделения по CD4 сохраняют и используют в последующих этапах способов, необязательно после одного или более дополнительных этапов положительной или отрицательной селекции.
+
[0303] В конкретном примере образец МКПК или другой образец лейкоцитов подвергают селекции CD4 клеток, где сохраняют и отрицательную, и положительную фракции. Отрицательную фракцию затем подвергают отрицательной селекции на основе экспрессии CD14 и CD45RA или CD19, и положительной селекции на основе маркерных характеристик Т-клеток центральной памяти, таких как CD62L или CCR7, где положительную и отрицательную селекции проводят в любом порядке.
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
[0304] CD4 T-хелперные клетки сортируют на наивные клетки, клетки центральной памяти и эффекторные клетки при идентификации популяций клеток, которые имеют антигены клеточной поверхности. CD4 лимфоциты могут быть получены с помощью стандартных методов. В некоторых вариантах осуществления наивные CD4 Т-лимфоциты являются CD45RO, CD45RA, CD62L, CD4 Т-клетками. В некоторых вариантах осуществления CD4 клетки центральной памяти являются CD62L и CD45RO. В некоторых вариантах осуществления эффекторные CD4 клетки являются CD62L и CD45RO.
+
[0305] В одном примере, для обогащения CD4 клетками с помощью отрицательной селекции, смесь моноклональных антител обычно включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления антитело или партнер связывания связаны с твердой подложкой или матрицей, такой как магнитная гранула или парамагнитная гранула, чтобы обеспечить разделение клеток с целью положительной и/или отрицательной селекции. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки и популяции клеток разделяют или выделяют при использовании иммуномагнитных (или аффинномагнитных) методов разделения (см. обзор в Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher© Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[0306] В некоторых аспектах образец или композицию разделяемых клеток культивируют с мелким, намагничиваемым или магниточувствительным материалом, таким как магниточувствительные частицы или микрочастицы, такие как парамагнитные гранулы (например, такие как гранулы Dynalbeads или MACS). Магниточувствительный материал, например частица, обычно прямо или опосредованно присоединен к партнеру связывания, например антителу, которое специфично связывается с молекулой, например поверхностным маркером, присутствующим на клетке, клетках или популяции клеток, которые требуется разделить, например, которые необходимо подвергнуть отрицательной или положительной селекции.
[0307] В некоторых вариантах осуществления магнитная частица или гранула включает магниточувствительный материал, связанный с определенным связывающим элементом, таким как антитело или другой партнер связывания. Существует много известных магниточувствительных материалов, используемых в способах магнитного разделения. Подходящие магнитные частицы включают описанные в Molday, патент США 4,452,773 и описание европейского патента EP 452342 B, которые настоящим включены посредством отсылки. Другими примерами являются частицы коллоидных размеров, такие как описанные в Owen, патент США 4,795,698, и Liberti et al., патент США 5,200,084.
[0308] Инкубирование обычно выполняют при условиях, при которых антитела или партнеры связывания, или молекулы, такие как вторичные антитела или другие реактивы, которые специфично связываются с такими антителами или партнерами связывания, которые присоединены к магнитной частице или грануле, специфично связываются с молекулами клеточной поверхности в случае их присутствия на клетках в образце.
[0309] В некоторых аспектах образец помещают в магнитное поле, при этом клетки, к которым присоединены магниточувствительные или намагничиваемые частицы, будут притягиваться к магниту и отделяться от немеченых клеток. В случае положительной селекции сохраняют клетки, которые притягиваются к магниту; в случае отрицательной селекции сохраняют клетки, которые не притягиваются (немеченые клетки). В некоторых аспектах комбинацию положительной и отрицательной селекции проводят во время одного этапа селекции, при этом сохраняют положительные и отрицательные фракции, которые затем обрабатывают или подвергают последующим этапам разделения.
[0310] В некоторых вариантах осуществления магниточувствительные частицы покрыты первичными антителами или другими партнерами связывания, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления магнитные частицы присоединяют к клеткам посредством покрытия из первичных антител, специфичных к одному или более маркерам. В некоторых вариантах осуществления клетки, но не гранулы, помечены первичным антителом или партнером связывания, после чего добавляют магнитные частицы, покрытые специфичным в отношении конкретного типа клеток вторичным антителом или другим партнером связывания (например, стрептавидином). В некоторых вариантах осуществления покрытые стрептавидином магнитные частицы применяют в сочетании с биотинилированными первичными или вторичными антителами.
[0311] В некоторых вариантах осуществления магниточувствительные частицы оставляют присоединенными к клеткам, которые затем нужно инкубировать, культивировать и/или подвергать генно-инженерным манипуляциям; в некоторых аспектах частицы оставляют присоединенными к клеткам для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые или магниточувствительные частицы удаляют с клеток. Способы удаления намагничиваемых частиц с клеток известны и включают, например, использование конкурирующих немеченых антител, намагничиваемых частиц или антител, конъюгированных с отщепляемыми линкерами, и т.д. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые частицы являются биоразлагаемыми.
[0312] В некоторых вариантах осуществления селекцию на основе аффинности осуществляют с помощью магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Системы магнитно-активируемой сортировки клеток (MACS) способны осуществлять с высокой чистотой селекцию клеток, к которым присоединены намагниченные частицы. В некоторых вариантах осуществления MACS работает в режиме, в котором нецелевые и целевые элементы последовательно элюируются после приложения внешнего магнитного поля. Таким образом, клетки, присоединенные к намагниченным частицам, удерживаются на месте, тогда как неприсоединенные элементы элюируются. Затем, после завершения этого первого этапа элюции, элементы, которые были задержаны в магнитном поле и не могли элюироваться, освобождают некоторым образом, при этом они могут быть элюированы и выделены. В некоторых вариантах осуществления нецелевые клетки помечены и удаляются из гетерогенной популяции клеток.
[0313] В некоторых вариантах осуществления выделение или разделение проводят при использовании системы, устройства или прибора, которые выполняют один или более из этапов выделения, получения клеток, разделения, обработки, инкубирования, культивирования и/или изготовления композиции настоящих способов. В некоторых аспектах система применяется для выполнения каждого из указанных этапов в закрытой или стерильной среде, например, с целью свести к минимуму ошибку, выполняемые пользователем операции и/или контаминацию. В одном примере система является системой, как описано в международной заявке на патент WO2009/072003 или US 20110003380 A1.
[0314] В некоторых вариантах осуществления система или устройство выполняют один или более, например все, из этапов выделения, обработки, инженерии и изготовления композиции в интегрированной или отдельной системе, и/или в автоматическом или программируемом режиме. В некоторых аспектах система или устройство включают компьютер и/или компьютерную программу во взаимодействии с системой или устройством, которые позволяют пользователю программировать, контролировать, оценивать результат и/или регулировать различные аспекты этапов обработки, выделения, инженерии и изготовления композиции.
[0315] В некоторых аспектах этапы разделения и/или другие этапы выполняют при использовании системы CliniMACS (Miltenyi Biotic), например, для автоматизированного разделения клеток на уровне клинического масштаба, в закрытой и стерильной системе. Компоненты могут включать интегрированный микрокомпьютер, блок магнитного разделения, перистальтический насос и различные зажимные клапаны. Интегрированный компьютер в некоторых аспектах управляет всеми компонентами установки и предписывает системе выполнять повторные процедуры в стандартной последовательности. Блок магнитного разделения в некоторых аспектах включает подвижный постоянный магнит и держатель колонки селекции. Перистальтический насос регулирует скорость потока в трубке и, в сочетании с зажимными клапанами, обеспечивает контролируемый поток буфера через систему и постоянное поддержание клеток в суспензии.
[0316] В системе CliniMACS, в некоторых аспектах, используются связанные с антителом намагничиваемые частицы, которые поставляются в стерильном апирогенном растворе. В некоторых вариантах осуществления после мечения клеток магнитными частицами клетки промывают для удаления избыточных частиц. Пакет с препаратом клеток затем подсоединяют к системе трубок, которая в свою очередь связана с пакетом, содержащим буфер, и пакетом для сбора клеток. Система трубок состоит из предварительно собранной стерильной трубки, включающей предварительную колонку и разделительную колонку, и предназначена только для одноразового применения. После начала программы разделения система автоматически вводит образец клеток в разделительную колонку. Меченые клетки сохраняются в колонке, тогда как немеченые клетки удаляются в результате ряда этапов промывки. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для применения со способами, описанными в настоящей заявке, не помечены и не остаются в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для применения со способами, описанными в настоящей заявке, помечены и остаются в колонке. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток для применения со способами, описанными в настоящей заявке, элюируются из колонки после снятия магнитного поля, и собираются в пакете для сбора клеток.
[0317] В некоторых вариантах осуществления разделение и/или другие этапы проводят при использовании системы CliniMACS Prodigy system (Miltenyi Biotec). Система CliniMACS Prodigy в некоторых аспектах оборудована блоком обработки клеток, который позволяет проводить автоматическую промывку и фракционирование клеток с помощью центрифугирования. Система CliniMACS Prodigy может также включать встроенную камеру и программу распознавания изображений, которая определяет оптимальный результат фракционирования клеток, различая макроскопические слои продукта исходных клеток. Например, периферическая кровь автоматически разделяется на слои эритроцитов, лейкоцитов и плазмы. Система CliniMACS Prodigy может также включать встроенную камеру культивирования клеток, которая выполняет протоколы культивирования клеток, такие как, например, дифференцировку и размножение клеток, нагрузку антигенами и длительное культивирование клеток. Вводные порты могут обеспечивать стерильное удаление и обновление питательных сред, при этом мониторинг клеток можно проводить при использовании встроенного микроскопа. См., например, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82 и Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
[0318] В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящей заявке, собирают и обогащают (или обедняют) с помощью проточной цитометрии, в которой клетки, окрашенные на множество маркеров клеточной поверхности, пропускают в потоке жидкости. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящей заявке, собирают и обогащают (или обедняют) с помощью препаративной (FACS)-сортировки. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток, описанную в настоящей заявке, собирают и обогащают (или обедняют) при помощи чипа на микроэлектромеханических системах (MEMS) в комбинации с системой детектирования на основе FACS (см., например, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; and Godin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376). В обоих случаях клетки могут быть помечены множеством маркеров, что позволяет выделять четко определенные субпопуляции Т-клеток с высокой чистотой.
[0319] В некоторых вариантах осуществления антитела или партнеры связывания помечены одним или более детектируемыми маркерами для облегчения разделения при положительной и/или отрицательной селекции. Например, разделение может быть основано на связывании с флуоресцентно-меченными антителами. В некоторых примерах разделение клеток на основе связывания антител или других партнеров связывания, специфичных к одному или более маркерам клеточной поверхности, проводят в потоке жидкости, например, с помощью флуоресцентно активируемой сортировки клеток (FACS), включающей препаративный масштаб (FACS) и/или чипы на микроэлектромеханических системах (MEMS), например, в комбинации с проточно-цитометрической системой детектирования. Такие способы позволяют выполнять положительную и отрицательную селекцию по множеству маркеров одновременно.
[0320] В некоторых вариантах осуществления способы получения включают этапы замораживания, например криоконсервации, клеток, до или после выделения, инкубирования и/или инженерии. В некоторых вариантах осуществления замораживание и последующий этап размораживания позволяют удалить гранулоциты и, до некоторой степени, моноциты в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендируют в растворе для замораживания, например, после этапа промывки для удаления плазмы и тромбоцитов. Может использоваться любой из множества известных растворов для замораживания и параметров в некоторых аспектах. Один пример включает использование PBS, содержащего 20% ДМСО и 8% человеческого сывороточного альбумина (HSA), или другие подходящие среды для замораживания клеток. Затем его разбавляют 1:1 средами, чтобы конечная концентрация ДМСО и HSA составила 10% и 4%, соответственно. Затем клетки замораживают до -80°C со скоростью 1° в минуту и хранят в паровой фазе в резервуаре для хранения с жидким азотом.
[0321] В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают этапы культивирования, инкубирования, получения культур и/или генной инженерии. Например, в некоторых вариантах осуществления предложены способы инкубирования и/или инженерии обедненных популяций клеток и композиции для получения культуры.
[0322] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления популяции клеток инкубируют в композиции для получения культуры. Инкубирование и/или инженерия могут быть выполнены в емкости для культивирования, такой как блок, камера, лунка, колонка, пробирка, набор трубок, клапан, флакон, чашка для культивирования, пакет или другой контейнер для культур или культивирования клеток.
[0323] В некоторых вариантах осуществления клетки инкубируют и/или культивируют до или в сочетании с генной инженерией. Этапы инкубирования могут включать культуру, культивирование, стимуляцию, активацию и/или размножение. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки культивируют в присутствии стимулирующих условий или стимулирующего средства. Такие условия включают условия, подобранные для индукции пролиферации, размножения, активации и/или выживания клеток в популяции, имитации стимуляции антигеном и/или примирования клеток для генной инженерии, например, для введения рекомбинантного антигенного рецептора.
[0324] Условия могут включать одно или более из конкретных сред, температуры, содержания кислорода, содержания углекислого газа, времени, средств, например, питательные вещества, аминокислоты, антибиотики, ионы и/или стимуляторные факторы, такие как цитокины, хемокины, антигены, партнеры связывания, слитые белки, рекомбинантные растворимые рецепторы и любые другие средства, созданные для активации клеток.
[0325] В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия или средства включают одно или более средств, например, лиганд, который способен образовывать внутриклеточный сигнальный домен TCR комплекса. В некоторых аспектах средство запускает или инициирует внутриклеточный сигнальный каскад TCR/CD3 в Т-клетке. Такие средства могут включать антитела, такие как антитела, специфичные к компоненту TCR и/или костимуляторному рецептору, например, антитела к CD3, к CD28, например, связанные с твердой подложкой, такой как гранула, и/или один или более цитокинов. Необязательно способ размножения может дополнительно включать этап добавления антитела к CD3 и/или к CD28 в питательную среду (например, при концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 нг/мл). В некоторых вариантах осуществления стимулирующие средства включают IL-2 и/или IL-15, например, при концентрации IL-2 по меньшей мере приблизительно 10 единиц/мл.
[0326] В некоторых аспектах инкубирование проводят в соответствии с такими способами, как описанные в патенте США 6,040,177 (Riddell et al.), Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82 и/или Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
[0327] В некоторых вариантах осуществления Т-клетки размножают, добавляя к композиции для получения культуры питающие клетки, такие как неделящиеся мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), (например, так, что получаемая популяция клеток содержит по меньшей мере приблизительно 5, 10, 20 или 40 или больше питающих МКПК клеток на каждый Т-лимфоцит в первичной размножаемой популяции); и инкубируя культуру (например, в течение времени, достаточного для увеличения количества Т-клеток). В некоторых аспектах неделящиеся питающие клетки могут включать облученные гамма-излучением питающие МКПК клетки. В некоторых вариантах осуществления МКПК облучают гамма-излучением в диапазоне приблизительно 3000-3600 рад для предотвращения деления клеток. В некоторых аспектах питающие клетки добавляют в питательную среду перед добавлением популяций Т-клеток.
[0328] В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия включают температуру, подходящую для роста человеческих Т-лимфоцитов, например, по меньшей мере приблизительно 25 градусов Цельсия, обычно по меньшей мере приблизительно 30 градусов, и обычно примерно или приблизительно 37 градусов Цельсия. Необязательно инкубирование может дополнительно включать добавление неделящихся EBV-трансформированных лимфобластных клеток (LCL) в качестве питающих клеток. Клетки LCL могут быть облучены гамма-излучением в диапазоне приблизительно 6000-10000 рад. Питающие LCL-клетки в некоторых аспектах предоставлены в любом подходящем количестве, например, отношение питающих LCL-клеток к первичным Т-лимфоцитам составляет по меньшей мере приблизительно 10:1.
+
+
in vitro
[0329] В вариантах осуществления антигенспецифические Т-клетки, такие как антигенспецифические CD4 и/или CD8 Т-клетки, получают путем стимуляции наивных или антигенспецифических Т-лимфоцитов антигеном. Например, линии или клоны антигенспецифических Т-клеток могут быть получены к цитомегаловирусным антигенам при выделении Т-клеток у зараженных субъектов и стимуляции клеток  тем же антигеном.
II. Композиции, способы и применения
[0330] Также предложены композиции, включающие CD19-связывающие молекулы и рекомбинантные клетки, в том числе фармацевтические композиции и лекарственные формы, и способы применения и применения молекул и композиций, например, в лечении заболеваний, состояний и нарушений, при которых экспрессируется CD19, и/или способы обнаружения, диагностические и прогностические способы.
A. Фармацевтические композиции и лекарственные формы
[0331] Предложены лекарственные формы, включающие CD19-связанную молекулу, например антитело или химерный рецептор, и/или рекомбинантные клетки, экспрессирующие такие молекулы. Фармацевтические композиции и лекарственные формы обычно включают один или более необязательных фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ. В некоторых вариантах осуществления композиция включает по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
[0332] Термин "лекарственная форма" относится к препарату, который находится в такой форме, которая обеспечивает эффективную биологическую активность действующего вещества, содержащегося в ней, и которая не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому вводят такую лекарственную форму.
[0333] "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к компоненту в лекарственной форме, за исключением действующего вещества, который не токсичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, без ограничения, буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант.
[0334] В некоторых аспектах выбор носителя частично определяется конкретной клеткой, связывающей молекулой и/или антителом, и/или способом введения. Таким образом, существует множество подходящих лекарственных форм. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В некоторых аспектах используется смесь двух или более консервантов. Консервант или смеси консервантов обычно присутствуют в количестве от приблизительно 0,0001% до приблизительно 2% в расчете на полный вес композиции. Носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Фармацевтически приемлемые носители обычно не токсичны для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают, без ограничения: буферы, такие как фосфатный, цитратный, и другие органические кислоты; антиоксиданты, включающие аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; пирокатехин; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (меньше чем приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильньные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включающие глюкозу, маннозу или декстрины; хелатообразующие вещества, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахарозу, маннит, трегалозу или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ).
[0335] В некоторых аспектах в композиции включают буферные вещества. Подходящие буферные вещества включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. В некоторых аспектах используется смесь двух или более буферных веществ. Буферное вещество или смеси буферных веществ обычно присутствуют в количестве от приблизительно 0,001% до приблизительно 4% в расчете на полный вес композиции. Способы получения вводимых фармацевтических композиций известны. Примеры способов описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).
[0336] Лекарственные формы антител могут включать лиофилизированные формы и водные растворы.
[0337] Лекарственная форма или композиция могут также содержать больше одного действующего вещества, применимого при определенном показании, заболевании или состоянии, которое лечат связывающими молекулами или клетками, предпочтительно действующие вещества, обладающие активностями, дополнительными к связывающей молекуле или клетке, где соответствующие активности не оказывают неблагоприятного воздействия друг на друга. Такие действующие вещества предпочтительно присутствуют в комбинации в количестве, которое является эффективным для предполагаемой цели. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно включает другие фармацевтически активные вещества или лекарственные средства, такие как химиотерапевтические средства, например, аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевину, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т.д. В некоторых вариантах осуществления клетки или антитела вводят в форме соли, например фармацевтически приемлемой соли. Подходящие фармацевтически приемлемые соли присоединения кислот включают соли, полученные из неорганических кислот, таких как соляная, бромоводородная, фосфорная, метафосфорная, азотная и серная кислоты, и органических кислот, таких как винная, уксусная, лимонная, яблочная, молочная, фумаровая, бензойная, гликолевая, глюконовая, янтарная и арилсульфоновая кислоты, например, п-толуолсульфоновая кислота.
[0338] Действующие вещества могут быть заключены в микрокапсулы, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы), или в макроэмульсии. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция изготовлена в форме комплекса включения, такого как циклодекстриновый комплекс включения, или в форме липосомы. Липосомы могут служить для направленного введения в реципиентные клетки (например, Т-клетки или NK-клетки) в определенной ткани. Доступно множество способов получения липосом, такие как описанные, например, в Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980) и в патентах США 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 и 5,019,369.
[0339] В фармацевтической композиции в некоторых аспектах могут использоваться системы доставки с контролируемым по времени высвобождением, задержкой высвобождения и пролонгированным высвобождением, при этом доставка композиции происходит до сенсибилизации, и с достаточным количеством времени, чтобы вызывать ее, на участке, подвергаемом лечению. Доступно и известно множество типов систем доставки с высвобождением. Такие системы могут позволить избежать повторного введения композиции, увеличивая, таким образом, удобство для субъекта и врача.
[0340] Фармацевтическая композиция в некоторых вариантах осуществления содержит связывающие молекулы и/или клетки в количестве, эффективном для лечения или предотвращения заболевания или состояния, таком как терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество. Терапевтическую или профилактическую эффективность в некоторых вариантах осуществления контролируют при периодическом обследовании прошедших лечение субъектов. В случае повторных введений в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение повторяют до появления требуемого подавления симптомов заболевания. Впрочем, могут быть полезными и могут быть определены другие схемы введения. Нужная дозировка может быть доставлена при однократном болюсном введении композиции, многократных болюсных введениях композиции или при непрерывном инфузионном введении композиции.
[0341] В некоторых вариантах осуществления, в отношении полученных методами генной инженерии клеток, содержащих связывающие молекулы, субъекту вводят диапазон от приблизительно одного миллиона до приблизительно 100 миллиардов клеток, такой как, например, от 1 миллиона до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток, или диапазон, определенный любыми двумя из предыдущих значений), такой как от приблизительно 10 миллионов до приблизительно 100 миллиардов клеток (например, приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 30 миллионов клеток, приблизительно 40 миллионов клеток, приблизительно 60 миллионов клеток, приблизительно 70 миллионов клеток, приблизительно 80 миллионов клеток, приблизительно 90 миллионов клеток, приблизительно 10 миллиардов клеток, приблизительно 25 миллиардов клеток, приблизительно 50 миллиардов клеток, приблизительно 75 миллиардов клеток, приблизительно 90 миллиардов клеток, или диапазон, определенный любыми двумя из предыдущих значений), и, в некоторых случаях, от приблизительно 100 миллионов клеток до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 120 миллионов клеток, приблизительно 250 миллионов клеток, приблизительно 350 миллионов клеток, приблизительно 450 миллионов клеток, приблизительно 650 миллионов клеток, приблизительно 800 миллионов клеток, приблизительно 900 миллионов клеток, приблизительно 3 миллиарда клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 45 миллиардов клеток) или любое значение в промежутке между этими диапазонами, и/или подобное количество клеток на килограмм массы тела субъекта.
in vivo
ex vivo
in vitro
[0342] Они могут быть введены при использовании стандартных способ введения, лекарстнвенных форм и/или устройств. Предложены лекарстнвенные формы и устройства, такие как шприцы и флаконы, для хранения и введения композиций. Введение клеток может быть аутологичным или геторологичным. Например, иммунореактивные клетки или клетки-предшественники могут быть получены от одного субъекта и введены тому же субъекту или другому, совместимому субъекту. Полученные из периферической крови иммунореактивные клетки или их потомство (например, полученные ,  или ) могут быть введены путем локализованной инъекции, в том числе катетерного введения, системной инъекции, локализованной инъекции, внутривенной инъекции или парентерального введения. При введении терапевтической композиции (например, фармацевтической композиции, содержащей генетически модифицированную иммунореактивную клетку), ее обычно изготавливают в виде стандартной лекарственной формы для инъекций (раствора, суспензии, эмульсии).
[0343] Лекарственные формы включают формы для перорального, внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, легочного, трансдермального, внутримышечного, интраназального, буккального, подъязычного введения или введения в форме суппозитория. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток вводят парентерально. Термин "парентеральный" при использовании в настоящем описании включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное и внутрибрюшинное введение. В некоторых вариантах осуществления популяции клеток вводят субъекту с применением периферической системной доставки путем внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.
[0344] Композиции в некоторых вариантах осуществления представлены в виде стерильных жидких препратов, например, изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, которые в некоторых аспектах могут быть буферизированы до выбранного pH. Жидкие препраты обычно легче изготавливать, чем гели, другие вязкие композиции и твердые композиции. Кроме того, жидкие композиции несколько более удобны для введения, в особенности путем инъекции. Вязкие композиции, с другой стороны, можно изготавливать в пределах подходящего диапазона вязкости, чтобы обеспечить более длительный период контакта с определенными тканями. Жидкие или вязкие композиции могут включать носители, которые могут быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, солевой раствор, фосфатно-солевой буферный раствор, полиолы (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси.
[0345] Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения связывающей молекулы в растворитель, например, в смеси с подходящим носителем, разбавителем или вспомогательным веществом, таким как стерильная вода, физиологический раствор, глюкоза, декстроза или подобное. Композиции могут быть также лиофилизированными. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие, диспергирующие или эмульгирующие вещества (например, метилцеллюлозу), pH буферные вещества, гелеобразующие или повышающие вязкость добавки, консерванты, ароматические вещества, красители и т.п., в зависимости от пути введения и требуемого препарата. В некоторых аспектах можно обращаться к стандартным текстам для получения подходящих препаратов.
[0346] Могут быть добавлены различные добавки, которые повышают стабильность и стерильность композиций, в том числе противомикробные консерванты, антиоксиданты, хелатообразующие и буферные вещества. Предотвращение воздействия микроорганизмов можно обеспечивать различными противобактериальными и противогрибковыми средствами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой и т.п. Пролонгированную абсорбцию лекарственной формы для инъекций можно обеспечивать при помощи средств, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
[0347] Могут быть изготовлены препараты с пролонгированным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с пролонгированным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащих антитело, где матрицы находятся в виде имеющих определенную форму изделий, например, пленок или микрокапсул.
in vivo
[0348] Лекарственные формы, применяемые для введения , как правило, являются стерильными. Стерильность может быть с легкостью достигнута, например, путем фильтрования через стерильные фильтрующие мембраны.
B. Терапевтические и профилактические способы и применения
[0349] Также предложены способы применения и применения CD19-связывающих молекул, включающих антитела против CD19, например, фрагменты антител, и/или рекомбинантных клеток, экспрессирующих рекомбинантные рецепторы. Такие способы и применения включают терапевтические способы и применения, например, включающие введение молекул, клеток или композиций, содержащих их, субъекту, имеющему заболевание, состояние или нарушение, экспрессирующее или связанное с экспрессией CD19, и/или при которых клетки или ткани экспрессируют CD19. В некоторых вариантах осуществления молекулу, клетку и/или композицию вводят в эффективном количестве с целью выполнить лечение болезни или нарушения. Применения включают применения антител и клеток в таких способах и лечениях, и в изготовлении лекарственного средства с целью выполнить такие терапевтические способы. В некоторых вариантах осуществления способы осуществляют путем введения антител или клеток, или композиций, включающих их, субъекту с наличием или подозреваемому на наличие заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления способы, таким образом, обеспечивают лечение заболевания или состояния, или нарушения у субъекта.
[0350] При использовании в настоящем описании "лечение" (и его грамматические вариации, такие как "лечить" или "лечащий") относятся к полному или частичному улучшению или уменьшению тяжести заболевания или состояния, или нарушения, или симптома, нежелательного действия или результата, или фенотипа, связанного с ними. Требуемые эффекты лечения включают, без ограничения, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастаза, уменьшение скорости прогрессии заболевания, улучшение или временное облегчение состояния заболевания и ремиссию или улучшение прогноза. Данные термины не подразумевают полного излечения заболевания или полного устранения какого-либо симптома или воздействия(й) на все симптомы или результаты.
[0351] При использовании в настоящем описании "задержка развития заболевания" означает отсрочить, препятствовать, замедлять, задерживать, стабилизировать, подавлять и/или отдалять развитие заболевания (такого как рак). Такая задержка может иметь различную длительность, в зависимости от истории болезни и/или проходящего лечение человека. Как очевидно специалисту в данной области, достаточная или значительная задержка может, в сущности, охватывать предотвращение, при котором заболевание у человека не развивается. Например, может быть отсрочено наступление поздней стадии рака, такой как развитие метастаза.
[0352] "Предотвращение", при использовании в настоящем описании, включает обеспечение профилактики в отношении появления или рецидива заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но у которого заболевание еще не было диагностировано. В некоторых вариантах осуществления предложенные молекулы и композиции применяются для задержки развития заболевания или замедления прогрессии заболевания.
[0353] При использовании в настоящем описании "подавлять" функцию или активность означает уменьшать функцию или активность по сравнению с такими же в ином случае состояниями, за исключением представляющего интерес состояния или параметра, или, в альтернативе, по сравнению с другим состоянием. Например, антитело или композиция, или клетка, которые подавляют рост опухоли, уменьшают скорость роста опухоли по сравнению со скоростью роста опухоли в отсутствие антитела или композиции, или клетки.
[0354] "Эффективное количество" средства, например, лекарственной формы, связывающей молекулы, антитела или клеток, или композиции, в отношении введения, относится к эффективному количеству, в дозировках/количествах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого результата, такого как терапевтический результат или профилактический результат.
[0355] "Терапевтически эффективное количество" средства, например, лекарственной формы, антитела или клеток, относится к эффективному количеству, в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического результата, например, при лечении заболевания, состояния или нарушения, и/или фармакокинетического или фармакодинамического эффекта лечения. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от таких факторов, как состояние заболевания, возраст, пол и вес субъекта, а также популяции вводимых клеток. В некоторых вариантах осуществления предложенные способы включают введение молекул, клеток и/или композиций в эффективных количествах, например, терапевтически эффективных количествах.
[0356] "Профилактически эффективное количество" относится к эффективному количеству, в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого профилактического результата. Обычно, но не обязательно, поскольку доза профилактического средства используется у субъектов до или на более ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше терапевтически эффективного количества.
[0357] При использовании в настоящем описании "субъект" является млекопитающим, таким как человек или другое животное, и обычно является человеком. Заболевания и нарушения включают В-клеточные злокачественные заболевания, такие как В-клеточные лейкозы и лимфомы, в том числе В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ), пролимфоцитарные лейкозы, волосатоклеточные лейкозы, общие острые лимфоцитарные лейкозы, ноль-клеточные острые лимфобластные лейкозы, неходжкинские лимфомы, диффузные В-крупноклеточные лимфомы (ДВККЛ), множественные миеломы, фолликулярную лимфому, лимфому из клеток маргинальной зоны селезенки, лимфому из клеток мантийной зоны, индолентную В-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина. Также заболевания и состояния включают аутоиммунные и воспалительные заболевания, в том числе связанные с нарушенными или повышенными количествами и/или активацией В-клеток. Примеры заболеваний и состояний включают рассеянный склероз, ревматоидный артрит и системную красную волчанку (СКВ).
[0358] В некоторых вариантах осуществления субъект имеет хроническое или рецидивирующее заболевание, например, после лечения другим CD19-специфичным антителом и/или клетками, экспрессирующими CD19-направленный химерный рецептор, и/или другой терапии, включая химиотерапию, радиацию и/или трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), например, аллогенную ТГСК. В некоторых вариантах осуществления введение обеспечивает эффективное лечение субъекта, несмотря на то, что субъект становится резистентным к другой CD19-направленной терапии. В некоторых вариантах осуществления субъект не имеет рецидивов, но у него обнаружен риск рецидива, такой как высокий риск рецидива, и, таким образом, соединение или композицию вводят профилактически, например, для уменьшения вероятности или для предотвращения рецидива.
[0359] В некоторых вариантах осуществления лечение не вызывает иммунный ответ у субъекта на терапию и/или не вызывает такой ответ в степени, которая препятствует эффективному лечению заболевания или состояния. В некоторых аспектах степень иммуногенности и/или реакции трансплантата против хозяина меньше, чем наблюдаемая при другом, но сопоставимом лечении. Например, в случае адоптивной клеточной терапии с применением клеток, экспрессирующих CAR-рецепторы, включающие предложенные антитела против CD19, степень иммуногенности уменьшается по сравнению с CAR-рецепторами, включающими другое антитело, которое связывается с подобным, например перекрывающимся, эпитопом и/или конкурирует с предложенным антителом за связывание с CD19, такое как мышиное антитело.
[0360] В некоторых вариантах осуществления способы включают адоптивную клеточную терапию, при которой полученные с помощью методов генной инженерии клетки, экспрессирующие предложенные рецепторы (например, CD19-направленные CAR-рецепторы), содержащие антитело против CD19, вводят субъектам. Такое введение может вызывать активацию клеток (например, активацию Т-клеток) CD19-направленным путем, при этом клетки заболевания или нарушения подвергаются направленному воздействию для разрушения.
[0361] Таким образом, предложенные способы и применения включают способы и применения для адоптивной клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления способы включают введение клеток или композиции, содержащей такие клетки, субъекту, в ткань или клетку, например, субъекту, имеющему, подверженному риску или подозреваемому на наличие заболевания, состояния или нарушения. В некоторых вариантах осуществления клетки, популяции и композиции вводят субъекту, имеющему определенное заболевание или состояние, подвергаемое лечению, например, с помощью адоптивной клеточной терапии, такой как адоптивная T-клеточная терапия. В некоторых вариантах осуществления клетки или композиции вводят субъекту, такому как субъекту с наличием или подверженному риску развития заболевания или состояния. В некоторых аспектах способы, таким образом, обеспечивают лечение, например уменьшение тяжести, одного или более симптомов заболевания или состояния, например, путем уменьшения опухолевой нагрузки при CD19-экспрессирующем раке.
[0362] Способы введения клеток для адоптивной клеточной терапии известны и могут применяться в сочетании с предложенными способами и композициями. Например, способы адоптивной Т-клеточной терапии описаны, например, в публикации заявки на патент США 2003/0170238 (Gruenberg et al); патенте США 4,690,915 (Rosenberg); Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). See, e.g., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.
[0363] В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например адоптивную клеточную терапию, например адоптивную T-клеточную терапию, выполняют путем аутологичного переноса, в котором клетки выделяют и/или иным образом получают у субъекта, который должен проходить клеточную терапию, или из образца, полученного у такого субъекта. Таким образом, в некоторых аспектах клетки получают у субъекта, например больного, нуждающегося в лечении, и вводят клетки после выделения и обработки тому же субъекту.
[0364] В некоторых вариантах осуществления клеточную терапию, например адоптивную клеточную терапию, например адоптивную T-клеточную терапию, выполняют путем аллогенного переноса, в котором клетки выделяют и/или иным образом получают у субъекта, за исключением субъекта, который должен проходить или который, в конечном счете, проходит клеточную терапию, например, первого субъекта. В таких вариантах осуществления клетки затем вводят другому субъекту, например второму субъекту, такого же вида. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субъекты являются генетически идентичными. В некоторых вариантах осуществления первый и второй субъекты являются генетически подобными. В некоторых вариантах осуществления у второго субъекта экспрессируется тот же класс или супертип HLA, что и у первого субъекта.
[0365] В некоторых вариантах осуществления субъект, которому вводят клетки, популяции клеток или композиции, является приматом, таким как человек. В некоторых вариантах осуществления примат является обезьяной или человекообразной обезьяной. Субъект может быть мужского или женского пола и может иметь любой подходящий возраст, включая младенца, ребенка, подростка, взрослого и пожилого субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект является не относящимся к приматам млекопитающим, таким как грызун. В некоторых примерах больной или субъект является утвержденной животной моделью заболевания, адоптивной клеточной терапии и/или для оценки токсических результатов, таких как синдром высвобождения цитокинов (СВЦ).
[0366] CD19-связывающие молекулы, такие как антитела и химерные рецепторы, содержащие такие антитела, и клетки, экспрессирующие их, можно вводить любыми подходящими способами, например, путем инъекции, например, внутривенной или подкожной инъекции, внутриглазной инъекции, окологлазной инъекции, субретинальной инъекции, интравитреальной инъекции, транссептальной инъекции, субсклеральной инъекции, интрахориоидальной инъекции, интракамеральной инъекции, субконъюнктивальной инъекции, субтеноновой инъекции, ретробульбарной инъекции, околобульбарной инъекции или задней околосклеральной доставки. В некоторых вариантах осуществления их вводят парентерально, внутрилегочно и интраназально, и, если требуется для местного лечения, путем внутриочагового введения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Применение и введение частично может зависеть от того, является ли введение быстрым или длительным. Различные схемы введения включают, без ограничения, разовые или многократные введения в различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.
[0367] Для предотвращения или лечения заболевания, подходящая схема применения связывающей молекулы или клетки может зависеть от типа заболевания, которое подвергают лечению, типа связывающей молекулы, тяжести и течения заболевания, от того, применяется ли связывающая молекула в профилактических или терапевтических целях, от предыдущей терапии, истории болезни больного и реакции на связывающую молекулу, а также от решения лечащего врача. Композиции и молекулы, и клетки в некоторых вариантах осуществления соответственно вводят пациенту, единовременно или в течение курса лечения.
[0368] В зависимости от типа и тяжести заболевания, схемы применения антител могут включать приблизительно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг), приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше, приблизительно от 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг. Множество доз могут вводить периодически, например, каждую неделю или каждые три недели. Могут вводить начальную более высокую насыщающую дозу с последующим введением одной или нескольких более низких доз.
[0369] В некоторых вариантах осуществления, в отношении полученных методами генной инженерии клеток, содержащих связывающие молекулы, субъекту вводят в пределах от приблизительно одного миллиона до приблизительно 100 миллиардов клеток и/или такое количество клеток на килограмм массы тела, такое как, например, от 1 миллиона до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 5 миллионов клеток, приблизительно 25 миллионов клеток, приблизительно 500 миллионов клеток, приблизительно 1 миллиард клеток, приблизительно 5 миллиардов клеток, приблизительно 20 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 40 миллиардов клеток, или диапазон, определяемый любыми двумя из предыдущих значений), например, от приблизительно 10 миллионов до приблизительно 100 миллиардов клеток (например, от приблизительно 20 миллионов клеток, приблизительно 30 миллионов клеток, приблизительно 40 миллионов клеток, приблизительно 60 миллионов клеток, приблизительно 70 миллионов клеток, приблизительно 80 миллионов клеток, приблизительно 90 миллионов клеток, приблизительно 10 миллиардов клеток, приблизительно 25 миллиардов клеток, приблизительно 50 миллиардов клеток, приблизительно 75 миллиардов клеток, приблизительно 90 миллиардов клеток, или диапазон, определяемый любыми двумя из предыдущих значений), и, в некоторых случаях, от приблизительно 100 миллионов клеток до приблизительно 50 миллиардов клеток (например, приблизительно 120 миллионов клеток, приблизительно 250 миллионов клеток, приблизительно 350 миллионов клеток, приблизительно 450 миллионов клеток, приблизительно 650 миллионов клеток, приблизительно 800 миллионов клеток, приблизительно 900 миллионов клеток, приблизительно 3 миллиардов клеток, приблизительно 30 миллиардов клеток, приблизительно 45 миллиардов клеток) или любое значение в промежутке между этими диапазонами, и/или на килограмм массы тела. Опять же, дозировки могут изменяться в зависимости от признаков, характерных для заболевания или нарушения, и/или пациента, и/или других лечений.
[0370] В некоторых вариантах осуществления клетки или антитела вводят как часть комбинированного лечения, например, одновременно или последовательно, в любом порядке, с другим терапевтическим вмешательством, таким как другое антитело или рекомбинантная клетка, или рецептор, или средство, такое как цитотоксическое или терапевтическое средство.
[0371] Клетки или антитела в некоторых вариантах осуществления вводят совместно с одним или более дополнительными терапевтическими средствами или в сочетании с другим терапевтическим вмешательством, одновременно или последовательно, в любом порядке. В некоторых случаях клетки вводят совместно с другой терапией достаточно близко по времени, таким образом, чтобы популяции клеток усиливали действие одного или более дополнительных терапевтических средств, или наоборот. В некоторых вариантах осуществления клетки или антитела вводят до одного или более дополнительных терапевтических средств. В некоторых вариантах осуществления клетки или антитела вводят после одного или более дополнительных терапевтических средств.
in vivo
ex vivo
[0372] После введения клеток млекопитающему (например, человеку) биологическую активность популяций рекомбинантных клеток и/или антител в некоторых аспектах измеряют с помощью любого из ряда известных методов. Параметры для оценки включают специфичное связывание рекомбинантных или природных Т-клеток, или другой иммунной клетки с антигеном, , например, с помощью визуализации, или , например, с помощью проточной цитометрии или ELISA. В некоторых вариантах осуществления способность рекомбинантных клеток разрушать клетки-мишени может быть измерена при помощи любого подходящего способа, известного в уровне техники, такого как анализы цитотоксичности, описанные, например, в Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009) и Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). В некоторых вариантах осуществления биологическая активность клеток также может быть измерена путем анализа экспрессии и/или секреции некоторых цитокинов, таких как CD 107a, IFNγ, IL-2 и ФНО. В некоторых аспектах биологическую активность измеряют при оценке клинического результата, такого как уменьшение опухолевой массы или нагрузки.
[0373] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные клетки модифицируют любым количеством способов, при этом их терапевтическая или профилактическая эффективность повышается. Например, рекомбинантные CAR или TCR, экспрессируемые популяцией, могут быть конъюгированы прямо или опосредованно, через линкер, с направляющей молекулой. Практика конъюгирования соединений, например, CAR или TCR, с направляющими молекулами известна в уровне техники. См., например, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995) и патент США 5,087,616.
C. Способы диагностики и обнаружения
in vitro
in vivo
[0374] Также предложены способы, включающие применение предложенных связывающих молекул, например, антител, включающих фрагменты антитела, и молекул (таких как конъюгаты и комплексы), содержащих одно или более таких антител, для обнаружения, прогнозирования, диагностики, определения стадии, определения связывания конкретной терапии с одной или более тканями или типами клеток, и/или информированный решений по лечению у субъекта, например, при обнаружении CD19 и/или присутствия его эпитопа, распознаваемого антителом. В некоторых вариантах осуществления способы являются диагностическими и/или прогностическими способами в связи с CD19-экспрессирующими заболеваниями или состояниями. Способы в некоторых вариантах осуществления включают инкубирование и/или зондирование биологического образца антителом, и/или введение антитела субъекту. В некоторых вариантах осуществления биологический образец включает клетку или ткань, или их часть, такую как ткань опухоли или злокачественной опухоли, или биоптат, или их срез. В некоторых вариантах осуществления контакт происходит при условиях, позволяющих связывание антитела против CD19 с CD19, присутствующим в образце. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно включают обнаружение образования комплекса между антителом против CD19 и CD19 в образце, такое как обнаружение наличия или отсутствия, или уровня такого связывания. Такой способ может быть  или  способом. В одном варианте осуществления антитело против CD19 применяют для отбора субъектов, пригодных для терапии антителом против CD19 или рекомбинантным антигенным рецептором, например, где CD19 является биомаркером для отбора пациентов.
[0375] В некоторых вариантах осуществления образец, такой как клетка, образец ткани, лизат, композиция или другой образец, полученный из них, подвергают контакту с антителом против CD19 и определяют или обнаруживают связывание или образование комплекса между антителом и образцом (например, CD19 в образце). Если связывание в тестируемом образце продемонстрировано или обнаружено по сравнению с референсной клеткой того же типа ткани, это может указывать на присутствие соответствующего заболевания или состояния, и/или на то, что терапевтическое средство, содержащее антитело (например, фрагмент антитела), будет специфично связываться с тканью или клеткой, которая является такой же или относится к такому же типу, что и ткань или клетка, или другой биологический материал, из которого получен образец. В некоторых вариантах осуществления образец получен из человеческих тканей и может быть из патологической и/или нормальной ткани, например, субъекта, имеющего заболевание или состояние, подвергаемое лечению, и/или субъекта того же вида, что и данный субъект, но который не имеет заболевания или состояния, подвергаемого лечению. В некоторых случаях нормальная ткань или клетка получена от субъекта, имеющего заболевание или состояние, подвергаемое лечению, но не является самостоятельно патологической клеткой или тканью, такой как нормальная ткань из того же или другого органа, чем раковая опухоль, которая присутствует у данного субъекта.
125
131
35
3
32
51
57
18
153
159
68
166
115
113
112
111
125
123
121
140
177
54
99
103
32
142
149
186
188
105
97
153
47
75
85
35
99
201
113
117
3
133
169
175
90
[0376] Могут применяться различные известные в уровне техники способы обнаружения специфичного связывания антитела и антигена. Примеры иммуноанализов включают поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА), флуоресцентный иммуноанализ (ФИА), иммуноферментный анализ (ИФА), нефелометрический ингибиторный иммуноанализ (НИА), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ (РИА). Индикаторную молекулу или метку могут присоединять к рассматриваемым антителам и подбирают так, чтобы она соответствовала потребностям различных применений способа, которые часто обусловлены доступностью аналитического оборудования и совместимых методик иммуноанализа. Примеры меток включают радионуклиды (например, I, I, S, H или P и/или хром (Cr), кобальт (Co), фтор (F), гадолиний (Gd, Gd), германий (Ge), гольмий (Ho), индий (In, In, In, In), иод (I, I, I), лантан (La), лютеций (Lu), марганец (Mn), молибден (Mo), палладий (Pd), фосфор (P), празеодим (Pr), прометий (Pm), рений (Re, Re), родий (Rh), рутений (Ru), самарий (Sm), скандий (Sc), селен (Se), (Sr), серу (S), технеций (Tc), таллий (Tl), олово (Sn, Sn), тритий (H), ксенон (Xe), иттербий (Yb, Yb), иттрий (Y), ферменты (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена, люциферазу или β-галактозидазу), флуоресцентные молекулы или белки (например, флуоресцеин, родамин, фикоэритрин, GFP или BFP) или люминесцентные молекулы (например, наночастицы QdotTM, поставляемые Quantum Dot Corporation, Palo Alto, Calif.). Известны различные общие методы, которые будут использоваться при выполнении различных иммуноанализов, отмеченных выше.
[0377] В целях диагностики, антитела могут быть помечены детектируемой молекулой, включающей, без ограничения радиоизотопы, флуоресцентные метки и различные фермент-субстратные метки, известные в уровне техники. Способы конъюгирования меток с антителом известны в уровне техники.
[0378] В некоторых вариантах осуществления антитела не должны быть мечеными, при этом их присутствие может быть обнаружено при использовании меченого антитела, которое связывается с любым из таких антител.
[0379] Антитела, предложенные в настоящей заявке, могут применяться в любом известном способе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и иммунопреципитационные анализы. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).
in vivo
in vivo
in vivo
111
99
14
131
125
3
[0380] Антитела и полипептиды также могут применяться для  диагностических анализов, таких как визуализация . Как правило, антитело помечено радионуклидом (таким как In, Tc, C, I, I или H), при этом представляющие интерес клетки или ткань могут быть обнаружены  после введения субъекту.
[0381] Антитело также может применяться в качестве окрашивающего реактива в патологических исследованиях, например, при использовании известных методов.
III. Изделия
[0382] Также предложены изделия, содержащие предложенные связывающие молекулы, например антитела и CAR-рецепторы, и/или полученные с помощью методов генной инженерии клетки, и/или композиции. Изделия могут включать контейнер и этикетку или вкладыш в упаковку на контейнере или связанные с ним. Подходящие контейнеры включают, например, флаконы, ампулы, шприцы, пакеты с в/в раствором и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из множества материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер в некоторых вариантах осуществления содержит композицию, которая является отдельной или объединена с другой композицией, эффективной для лечения, предотвращения и/или диагностики состояния. В некоторых вариантах осуществления контейнер имеет стерильный порт доступа. Примеры контейнеров включают пакеты с растворами для внутривенного введения, флаконы, включая флаконы с пробками, прокалываемыми иглой для инъекции. На этикетке или вкладыше в упаковку может быть указано, что композиция применяется для лечения CD19-экспрессирующего или ассоциированного заболевания или состояния. Изделие может включать: (a) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция включает антитело или рекомбинантный антигенный рецептор; и (b) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, где композиция включает другое средство, такое как цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Изделие может дополнительно включать вкладыш в упаковку, указывающий, что композиции могут применяться для лечения определенного состояния. В альтернативе или дополнительно изделие может также включать другой или тот же контейнер, включающий фармацевтически приемлемый буфер. Он может дополнительно включать другие материалы, такие как другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и/или шприцы.
[0383] При использовании в настоящем описании ссылка на "соответствующую форму" антитела означает, что при сравнении свойства или активности двух антител, свойство сравнивают при использовании такой же формы антитела. Например, если указано, что антитело обладает большей активностью по сравнению с активностью соответствующей формы первого антитела, это означает, что определенная форма, такая как scFv данного антитела, обладает большей активностью по сравнению с scFv формой первого антитела.
[0384] При использовании в настоящем описании указание того, что положения нуклеотидов или аминокислот "соответствуют" положениям нуклеотидов или аминокислот в раскрытой последовательности, например, представленной в Списке последовательностей, относится к положениям нуклеотидов или аминокислот, идентифицированным после выравнивания с раскрытой последовательностью при максимальной идентичности, с использованием стандартного алгоритма выравнивания, такого как алгоритм GAP. Например, в некоторых вариантах осуществления примеры соответствующих остатков из белка CD19, такого как человеческий белок CD19, могут быть идентифицированы при выравнивании последовательности с примерной последовательностью Vpx, представленной в SEQ ID NO: 92. При выравнивании последовательности специалист в данной области может идентифицировать соответствующие остатки, например, при использовании консервативных и идентичных аминокислотных остатков в качестве гидов. Как правило, для идентификации соответствующих положений последовательности аминокислот выравнивают так, чтобы получить совпадение наиболее высокого порядка (см., например: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New.Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
[0385] "Эффекторные функции" относятся к таким биологическим активностям, связанным с Fc-областью антитела, которые изменяются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; даунрегуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и активацию В-клеток.
[0386] Термин "Fc-область" в настоящем описании используется для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит, по меньшей мере, часть константной области. Термин включает нативную последовательность Fc-области и варианты Fc-области. В одном варианте осуществления Fc-область тяжелой цепи IgG человека тянется от Cys226 или от Pro230 до C-конца тяжелой цепи. Однако C-концевой лизин (Lys447) Fc-области может присутствовать или нет. Если в настоящем описании не определено иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
[0387] Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "полное антитело" используются в настоящем описании попеременно для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу аналогичную нативной структуре антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, как определено в настоящей заявке.
[0388] "Выделенное" антитело является антителом, которое было отделено от компонента его естественного окружения. В некоторых вариантах осуществления антитело очищено до более чем 95% или 99% чистоты согласно определению, например, с помощью электрофоретических (например, ДСН-ПААГЭ, изоэлектрического фокусирования (IEF), капиллярного электрофореза) или хроматографических (например, ионообменной или обращено-фазовой ВЭЖХ) методов. По поводу обзора методов исследования чистоты антител см., например, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
[0389] "Выделенная" нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но при этом молекула нуклеиновой кислоты присутствует внехромосомно или в хромосомном положении, которое отличается от ее естественного хромосомного положения.
[0390] "Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело против CD19" относится к одной или более молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в одном векторе или отдельных векторах, и такую молекулу(ы) нуклеиновой кислоты, присутствующей в одном или более положениях в клетке-хозяине.
[0391] Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев" используются попеременно и относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки", которые включают первичную трансформированную клетку и потомство, полученное из нее, независимо от количества пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным по содержанию нуклеиновой кислоты исходной клетке, но может содержать мутации. Мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, обнаруживаемой при скрининге или отобранной в первоначально трансформированной клетке, включено в настоящую заявку.
[0392] При использовании в настоящем описании "процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" и "процент идентичности", при использовании в отношении аминокислотной последовательности (референсной полипептидной последовательности), определяется как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности (например, рассматриваемом антителе или фрагменте), которые идентичны аминокислотным остаткам в референсной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения пропусков, в случае необходимости, с получением максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть выполнено различными способами, которые известны специалистам, например, при использовании общедоступной программы, такой как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включающие любые алгоритмы, требуемые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей.
[0393] Аминокислотная замена может включать замену одной аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой. Примерные замены показаны в Таблице 1. Аминокислотные замены могут быть введены в представляющую интерес связывающую молекулу, например, антитело, и продукты подвергнуты скринингу на наличие требуемой активности, например, сохраненное/улучшенное связывание антигена, уменьшенную иммуногенность или улучшенную ADCC или CDC.
[0394] Аминокислоты обычно можно сгруппировать по следующим общим свойствам боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Сер, Thr, Asn, Gln;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
[0395] Неконсервативные аминокислотные замены включают обмен члена одного из этих классов на другой класс.
[0396] Термин "вектор" при использовании в настоящем описании относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к размножению другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Термин включает вектор в качестве самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также в качестве вектора, включенного в геном клетки-хозяина, в которую он был введен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы указаны в настоящем описании как "векторы экспрессии".
[0397] Термин "вкладыш в упаковку" используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию по показаниям, применению, дозировке, введению, комбинированной терапии, противопоказаниям и/или предупреждениям относительно применения таких терапевтических продуктов.
[0398] При использовании в настоящем описании формы единственного числа, в оригинальном тексте настоящего описания, "a", "an" и "the" включают множественные ссылки, если из контекста прямо не следует иное. Например, "a" или "an" означают "по меньшей мере один" или "один или более". Следует понимать, что аспекты и вариации, описанные в настоящей заявке, включают "состоящий" и/или "состоящий по существу из" аспектов и вариаций.
[0399] По всему тексту настоящего описания различные аспекты заявленных объектов представлены в формате диапазона. Следует понимать, что описание в формате диапазона представлено просто для удобства и краткости, и не должно рассматриваться как жесткое ограничение объема заявленных объектов. Таким образом, следует понимать, что в описании диапазона прямо раскрыты все возможные поддиапазоны, а также отдельные численные значения в пределах такого диапазона. Например, в случаях, когда представлен диапазон значений, подразумевается, что каждое промежуточное значение между верхним и нижним пределом данного диапазона и любое другое указанное или промежуточное значение в таком указанном диапазоне включено в объем заявленных объектов. Верхний и нижний пределы таких меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, и также охвачены заявленными объектами за исключением какого-либо прямо исключенного предела в указанном диапазоне. В тех случаях, когда указанный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, исключающие один или оба из таких включенных пределов, также включены в заявленные объекты. Это применимо независимо от широты диапазона.
[0400] Термин "приблизительно" при использовании в настоящем описании относится к обычному диапазону ошибок для соответствующего значения, хорошо известному специалисту в данной области техники. Ссылка на "приблизительное" значение или параметр в настоящей заявке включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на такое значение или параметр, как таковой. Например, описание в отношении "приблизительно X" включает описание "X".
[0401] При использовании в настоящем описании композиция относится к любой смеси двух или более продуктов, веществ или соединений, в том числе клеток. Это может быть раствор, суспензия, жидкость, порошок, паста, водная, неводная или их любая комбинация.
[0402] При использовании в настоящем описании утверждение, что клетка или популяция клеток являются "положительными" на определенный маркер, относится к обнаруживаемому присутствию на или в клетке определенного маркера, обычно поверхностного маркера. При указании поверхностного маркера, данный термин относится к наличию поверхностной экспрессии, обнаруживаемой с помощью проточной цитометрии, например, при окрашивании антителом, которое специфично связывается с маркером, и обнаружении указанного антитела, где окрашивание обнаруживают с помощью проточной цитометрии при уровене существенно выше окрашивания, обнаруживаемого при проведении такой же процедуры с контрольным изотипом, при прочих равных условиях, и/или на уровне, по существу аналогичном уровню для клетки, которая, как известно, является положительной на маркер, и/или на уровне, значительно более высоком, чем в случае клетки, которая, как известно, является отрицательной на маркер.
[0403] При использовании в настоящем описании утверждение, что клетка или популяция клеток являются "отрицательными" на определенный маркер, относится к отсутствию существенного обнаруживаемого присутствия на или в клетке определенного маркера, обычно поверхностного маркера. При указании поверхностного маркера, данный термин относится к отсутствию поверхностной экспрессии, обнаруживаемой с помощью проточной цитометрии, например, при окрашивании антителом, которое специфично связывается с маркером, и обнаружении указанного антитела, где окрашивание не обнаруживают с помощью проточной цитометрии на уровне, существенно выше окрашивания, обнаруживаемого при проведении такой же процедуры с контрольным изотипом, при прочих равных условиях, и/или на существенно более низком уровне, чем в случае клетки, которая, как известно, является положительной на маркер, и/или на уровне, по существу аналогичном по сравнению с уровнем для клетки, которая, как известно, является отрицательной на маркер.
[0404] Если не определено иное, все специальные термины, примечания и другие технические и научные термины или терминология, используемые в настоящем описании, должны иметь то же значение, согласно которому их обычно понимает средний специалист в области техники, к которой относятся заявленные объекты. В некоторых случаях термины с обычно понимаемыми значениями определены в настоящем описании для ясности и/или для удобства ссылки, при этом включение таких определений в настоящее описании не следует рассматривать, как существенное различие по сравнению с тем, что является общеизвестным в уровне техники.
[0405] Все публикации, включая патентные документы, научные статьи и базы данных, указанные в настоящей заявке, полностью включены посредством отсылки во всех отношениях, в такой степени, как если бы каждая отдельная публикация была отдельно включена посредством отсылки. Если определение, представленное в настоящей заявке, противоречит или иным образом не соответствует определению, представленному в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, которые включены в настоящую заявку посредством отсылки, определение, представленное в настоящей заявке, превалирует над определением, которое включено в настоящую заявку посредством отсылки.
[0406] Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, представлены лишь в организационных целях и не должны считаться ограничением описанных объектов.
IV. Примеры осуществления
[0407] Предложенные в настоящей заявке варианты осуществления включают следующее:
1. Антитело против CD19 или его антигенсвязывающий фрагмент, где указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент включают вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где:
указанная VH область включает определяющую комплементарность область тяжелой цепи 3 (CDR-H3), включающую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 20 или
указанная VH область включает по меньшей мере 90% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью VH области, представленной в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62.
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие:
CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, соответственно включающие аминокислотные последовательности последовательностей CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, содержащихся в аминокислотной последовательности VH области, представленной в SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62; и/или
определяющие комплементарность области легкой цепи 1, 2 и 3 (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3), соответственно включающие аминокислотные последовательности последовательностей CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, содержащихся в аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (VL), представленной в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 65, 64, 66, 70, 69, 67, 90 или 91.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие:
CDR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 или 82, и CDR-H3, включающую аминокислотную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 20; и/или
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 111), где X является T, Q, S или R; X является G или A; X является I, T, D или S; X является S, R, T или Q; X отсутствует или является S; X является G, D, N или отсутствует; X отсутствует или является V или L; X является D, G, I, L, S или отсутствует; X является S, G, A, I, R или отсутствует; X является H, Y, F, S или N; X является R, N, D, H или Y; X является Y, F, D или W; X является V, A или L; и X является S, N или A;
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
CDR-L2, включающую аминокислотную последовательность XXXXXXX (SEQ ID NO: 112), где X является D или S; X является F, V, N, K или A; X является S, T, D или N; X является K, V, N, Q или R; X является R, V или L; X является P, K, A или E; и X является S, P, A или T, и
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 115), где X X; X является S, Q, A или T; X является Y, S, W, R; X является A, D, R, T или Y; X является X; X является X; X является S, P, L, Y, G; X является X или отсутствует; X является X или отсутствует; X является L или отсутствует; X является X; и X является V, T или L.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент варианта осуществления 3, где:
3
4
8
9
10
11
12
13
в указанной CDR-L1 X является I, T или S; X является S, T или Q; X является D, G, I, S или отсутствует; X является S, G, I или отсутствует; X является H, Y, S или N; X является R, N, D или H; X является Y или D; и X является V или L; и/или
1
4
6
7
в указанной CDR-L2 X является D; X является K, V, N, Q или R; X является P, K или A; и X является S, A или T; и/или
1
5
6
8
9
11
в указанной CDR-L3 X является S, G, T, A, Q, C или N; X является A, S, P, G, N или D; X является I, S, G, T, A, L, H, R или N; X является P, T, S, Q, M, R, N или отсутствует; X является S, L, N, A, M или отсутствует; и X является Y, W, F, V, A или L.
1
2
4
5
6
5. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент варианта осуществления 3 или варианта осуществления 4, где в указанной CDR-L3 X является S, G, Q или N; X является S, Q или T; X является A, D, T или Y; X является A, S или G; и X является I, S, N, R, A, H или T.
6. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-5, где:
CDR-H2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19 (GISWNSGRIGYADSVKG); или
CDR-H2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 72 (GISWNSGSIGYADSVKG).
7. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-6, где CDR-L1 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 75, 79, 78, 76, 21, 25, 28 или 31.
8. Антитело или фрагмент варианта осуществления 7, где указанная CDR-L1 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 80, 77, 74, 73, 78, 21 или 28.
9. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-8, где CDR-L2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 95, 99, 98, 96, 22, 26, 29 или 32.
10. Антитело или фрагмент варианта осуществления 9, где CDR-L2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 100, 97, 94, 93, 98, 22 или 29.
11. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-10, где CDR-L3 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 104, 108, 107, 105, 102, 23, 24, 27, 30 или 33.
12. Антитело или фрагмент варианта осуществления 11, где CDR-L3 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109, 106, 103, 101, 107, 24 или 30.
13. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-12, где:
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 23, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 24, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 80, 100 и 109, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 77, 97 и 106, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 74, 94 и 103, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 73, 93 и 101, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 75, 95 и 104, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 79, 99 и 108, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 78, 98 и 107, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 76, 96 и 105, соответственно;
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 73, 93 и 102, соответственно; или
CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 77, 97 и 106, соответственно.
14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-13, где:
CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 81 и 20, соответственно;
CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 19 и 20, соответственно;
CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 82 и 20, соответственно; или
CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 включают последовательности SEQ ID NO: 18, 72 и 20, соответственно.
15. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-14, где:
VH область антитела или фрагмент включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, 12, 60, 61, 63 или 62; и/или
VL область антитела или фрагмент включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 71, 90, 91, 68, 65, 64, 66, 70, 69 или 67.
16. Антитело или фрагмент варианта осуществления 15, где:
VH область антитела или фрагмент включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, 60, 63 или 62; и/или
VL область антитела или фрагмент включают аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, 16, 71, 90, 65, 64 или 69.
17. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-16, где:
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 17, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 15, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 13, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 14, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 16, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 71, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 62 и 68, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 65, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 60 и 64, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 61 и 66, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 70, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 62 и 69, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 67, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 12 и 91, соответственно; или
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 90, соответственно.
18. Антитело или фрагмент варианта осуществления 17, где:
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 14, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 16, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 71, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 11 и 65, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 60 и 64, соответственно;
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 62 и 69, соответственно; или
VH и VL области антитела или фрагмент включают аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 63 и 90, соответственно.
19. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-18, где антитело специфично связывается с CD19.
20. Антитело или фрагмент варианта осуществления 19, где антитело специфично связывается с тем же или перекрывающимся эпитопом CD19, как эпитоп, специфично связываемый референсным антителом против CD19, выбранным из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1.
21. Антитело или фрагмент варианта осуществления 19, где антитело конкурирует за связывание с CD19 с антителом против CD19, выбранным из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1.
22. Фрагмент человеческого антитела, который специфично связывается с тем же или перекрывающимся эпитопом CD19, как эпитоп, специфично связываемый референсным антителом, которое является антителом или его фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 1-21 или является антителом против CD19, выбранным из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1, где указанный фрагмент антитела включает CDR-области тяжелой и легкой цепи, которые отличаются от CDR-областей, присутствующих в FMC63 и SJ25C1.
23. Фрагмент человеческого антитела, который специфично связывается с CD19 и конкурирует за связывание с CD19 с референсным антителом, которое является антителом или фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 1-21 или является антителом против CD19, выбранным из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1, где указанный фрагмент антитела включает CDR-области тяжелой и легкой цепи, которые отличаются от CDR-областей, присутствующих в FMC63 и SJ25C1.
24. Антитело или фрагмент варианта осуществления 21 или 23, который конкурирует за связывание с референсным антителом, по меньшей мере, в такой же степени, как референсное антитело конкурирует с самим собой за связывание с CD19, или со степенью конкуренции, которая не больше чем в 1,5 раза или 2 раза ниже, чем конкуренция с референсным антителом.
25. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-24, где антитело обладают аффинностью связывания, которая является, по меньшей мере, такой же высокой или по существу такой же высокой, что и аффинность связывания с CD19 у референсного антитела, выбранного из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1.
26. Антитело или фрагмент варианта осуществления 25, которые обладают аффинностью связывания EC50, которая является приблизительно такой же или ниже, чем EC50 референсного антитела, или не больше чем приблизительно в 1,5 раза или не больше чем приблизительно в 2 раза больше, не больше чем в 3 раза больше, и/или не больше чем в 10 раза больше, чем EC50 референсного антитела.
27. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-26, где антитело или фрагмент являются человеческими.
28. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-27, где антитело или фрагмент являются рекомбинантными.
29. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-28, которые являются моноклональными.
30. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-29, которые являются одноцепочечным фрагментом.
31. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-30, которые являются фрагментом, включающим вариабельные области антитела, которые соединены гибким иммуноглобулиновым линкером.
32. Антитело или фрагмент варианта осуществления 30 или 31, где фрагмент включает scFv.
33. Антитело или фрагмент варианта осуществления 32, где scFv включает линкер, включающий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34.
34. Антитело или фрагмент варианта осуществления 32, где scFv включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 87 или 89.
35. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-34, которые дополнительно включают, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина.
36. Антитело или фрагмент варианта осуществления 35, где, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина включает Fc-область.
37. Антитело или фрагмент варианта осуществления 36, где Fc-область является Fc-областью IgG человека.
38. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-37, где CD19 является человеческим CD19.
39. Химерный антигенный рецептор (CAR), включающий внеклеточную часть, включающую антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38, и внутриклеточный сигнальный домен.
40. Химерный антигенный рецептор варианта осуществления 38, где антитело или фрагмент включают scFv, и внутриклеточный сигнальный домен включает ITAM.
41. Химерный антигенный рецептор варианта осуществления 39 или 40, где внутриклеточный сигнальный домен включает сигнальный домен дзэта-цепи CD3-дзэта (CD3ζ) цепи.
42. Химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления 39-41, дополнительно включающий трансмембранный домен, который связывает внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен.
43. Химерный антигенный рецептор варианта осуществления 42, где трансмембранный домен включает трансмембранную часть CD28.
44. Химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления 39-43, дополнительно включающий внутриклеточный сигнальный домен Т-клеточной костимуляторной молекулы.
45. Химерный антигенный рецептор варианта осуществления 44, где Т-клеточная костимуляторная молекула выбрана из группы, состоящей из CD28 и 41BB.
46. Рекомбинантная клетка, экспрессирующая химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления 39-45.
47. Рекомбинантная клетка варианта осуществления 46, которая является Т-клеткой.
48. Способ лечения, включающий введение клетки варианта осуществления 46 или 47 субъекту, имеющему заболевание или нарушение, ассоциированное с CD19.
49. Способ лечения, включающий введение антитела согласно любому из вариантов осуществления 1-38 субъекту, имеющему заболевание или нарушение, ассоциированное с CD19.
50. Способ варианта осуществления 48 или 49, где заболевание или нарушение является В-клеточным злокачественным заболеванием.
51. Способ варианта осуществления 50, где В-клеточное злокачественное заболевание выбрано из группы, состоящей из В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), пролимфоцитарных лейкозов, волосатоклеточных лейкозов, общих острых лимфоцитарных лейкозов, ноль-клеточных острых лимфобластных лейкозов, неходжкинских лимфом, диффузных В-крупноклеточных лимфом (ДВККЛ), множественных миелом, фолликулярной лимфомы, лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки, лимфомы из клеток мантийной зоны, индолентной В-клеточной лимфомы или лимфомы Ходжкина.
52. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или его фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38 или химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления 39-45.
53. Композиция, включающая антитело или его фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38, CAR согласно любому из вариантов осуществления 39-45, или клетка варианта осуществления 46 или 47.
54. Способ лечения, включающий введение композиции варианта осуществления 53 субъекту, имеющему заболевание или нарушение, ассоциированное с CD19.
55. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие:
определяющие комплементарность области тяжелой цепи 1, 2 и 3 (CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3), соответственно включающие аминокислотные последовательности последовательностей CDR 1, 2 и 3, содержащихся в аминокислотной последовательности вариабельной области тяжелой цепи (VH), представленной в SEQ ID NO: 11 или 12; и
определяющие комплементарность области легкой цепи 1, 2 и 3 (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3), соответственно включающие аминокислотные последовательности последовательностей CDR 1, 2 и 3, содержащихся в аминокислотной последовательности вариабельной области легкой цепи (VL), представленной в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 или 17.
56. Антитело или фрагмент варианта осуществления 55, где:
CDR-H1 включает аминокислотную последовательность DYAMH (SEQ ID NO: 18);
CDR-H2 включает аминокислотную последовательность GISWNSGRIGY (SEQ ID NO: 35);
CDR-H3 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
CDR-L1 включает аминокислотную последовательность XGXXXXXXXXXXXS (SEQ ID NO: 36), где X является T, S или Q, X является T, S или D, X является T или S, X отсутствует или является S, X отсутствует или является D или N, X отсутствует или является V, X отсутствует или является G или I, X отсутствует или является G или R, X является S, Y или N, X является D или N, X является D или Y, X является V или A;
1
2
3
4
1
2
3
4
CDR-L2 включает аминокислотную последовательность XXXXRPS (SEQ ID NO: 37), где X является D или S, X является V, N или K, X является S, N или D, и X является K, Q или N; и
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
CDR-L3 включает аминокислотную последовательность XXXXXXXXXXXX (SEQ ID NO: 38), где X является C, S, A, G или N, X является S, A или T, X является Y, W или R, X является A или D, X является G, D или S, X является R, S или N, X является Y, L или G, X является N или S, X является S или отсутствует, X является V, A или N, X является W или отсутствует, и X является L или V.
1
3
11
13
2
4
1
3
5
7
10
11
57. Антитело или фрагмент варианта осуществления 56, где: в CDR-L1 X является T или S, X является T или S, X является D или N, и X является V; в CDR-L2 X является V или N, и X является K или Q; и/или в CDR-L3 X является C, S, A или G, X является Y или W, X является G или D, X является Y или L, X является V или A, и X отсутствует.
58. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-57, где CDR-H2 включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 19 (GISWNSGRIGYADSVKG).
59. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-58, где CDR-L1 включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, 25, 28 или 31.
60. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-59, где CDR-L2 включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, 26, 29 или 32.
61. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-60, где CDR-L3 включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 23, 24, 27, 30 или 33.
62. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-61, где:
CDRL1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22, и 23, соответственно;
CDRL1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 21, 22 и 24, соответственно;
CDRL1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 25, 26 и 27, соответственно;
CDRL1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 28, 29 и 30, соответственно; или
CDRL1, CDR-L2 и CDR-L3 включают последовательности SEQ ID NO: 31, 32 и 33, соответственно.
63. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-62, где антитело или фрагмент включают:
VH область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 12; и
VL область, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16 или 17.
64. Антитело или фрагмент варианта осуществления 63, где VH область включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
65. Антитело или фрагмент варианта осуществления 63, где VH область включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
66. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-65, где антитело специфично связывается с CD19.
67. Антитело или фрагмент варианта осуществления 66, где антитело специфично связывается с тем же или перекрывающимся эпитопом CD19, как эпитоп, специфично связываемый референсным антителом против CD19, выбранным из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1.
68. Антитело или фрагмент варианта осуществления 66, где антитело конкурирует за связывание с CD19 с антителом против CD19, выбранным из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1.
69. Фрагмент человеческого антитела, который специфично связывается с тем же или перекрывающимся эпитопом CD19, как эпитоп, специфично связываемый референсным антителом, которое является антителом или его фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 55-68 или антителом против CD19, выбранным из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1, где указанный фрагмент человеческого антитела включает CDR-области тяжелой и легкой цепи, которые отличаются от CDR-областей, присутствующих в FMC63 и SJ25C1.
70. Фрагмент человеческого антитела, который специфично связывается с CD19 и конкурирует за связывание с CD19 с референсным антителом, которое является антителом или фрагментом согласно любому из вариантов осуществления 55-68 или антителом против CD19, выбранным из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1, где указанный фрагмент антитела включает CDR-области тяжелой и легкой цепи, которые отличаются от CDR-областей, присутствующих в FMC63 и SJ25C1.
71. Антитело варианта осуществления 68 или 70, которое конкурирует за связывание с референсным антителом, по меньшей мере, в такой же степени, в какой референсное антитело конкурирует с самим собой за связывание с CD19, или со степенью конкуренции, которая не больше чем в 1,5 раза или 2 раза ниже, чем конкуренция с референсным антителом.
72. Антитело согласно любому из вариантов осуществления 55-71, где антитело обладает аффинностью связывания, которая является, по меньшей мере, такой же высокой или по существу такой же высокой, как аффинность связывания с CD19 у референсного антитела, выбранного из группы, состоящей из FMC63 и SJ25C1.
50
50
50
73. Антитело варианта осуществления 72, которой обладает аффинностью связывания EC, которая является приблизительно такой же или ниже, чем EC референсного антитела, или не больше чем приблизительно в 1,5 раза или не больше чем приблизительно в 2 раза больше, не больше чем в 3 раза больше, и/или не больше чем в 10 раз больше, чем EC референсного антитела.
74. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-73, где антитело является человеческим.
75. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-74, где антитело является рекомбинантным.
76. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-75, которые являются моноклональным.
77. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-76, которые являются одноцепочечным фрагментом.
78. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-77, которые являются фрагментом, включающим вариабельные области антитела, которые соединены гибким иммуноглобулиновым линкером.
79. Антитело или фрагмент варианта осуществления 77 или 78, где фрагмент включает scFv.
80. Антитело или фрагмент варианта осуществления 79, где scFv включает линкер, включающий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 34.
81. Антитело или фрагмент варианта осуществления 80, где scFv включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 или 10.
82. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-81, которые дополнительно включают, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина.
83. Антитело или фрагмент варианта осуществления 82, где, по меньшей мере, часть константной области иммуноглобулина включает Fc-область.
84. Антитело или фрагмент варианта осуществления 83, где Fc-область является Fc-областью IgG человека.
85. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-84, где CD19 является человеческим CD19.
86. Химерный антигенный рецептор, включающий внеклеточную часть, включающую антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 55-85, и внутриклеточный сигнальный домен.
87. Химерный антигенный рецептор варианта осуществления 86, где антитело или фрагмент включают scFv, и внутриклеточный сигнальный домен включает ITAM.
88. Химерный антигенный рецептор варианта осуществления 87, где внутриклеточный сигнальный домен включает сигнальный домен дзэта-цепи CD3-дзэта (CD3ζ) цепи.
89. Химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления 86-88, дополнительно включающий трансмембранный домен, который связывает внеклеточный домен и внутриклеточный сигнальный домен.
90. Химерный антигенный рецептор варианта осуществления 89, где трансмембранный домен включает трансмембранную часть CD28.
91. Химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления 86-90, дополнительно включающий внутриклеточный сигнальный домен Т-клеточной костимуляторной молекулы.
92. Химерный антигенный рецептор варианта осуществления 91, где Т-клеточная костимуляторная молекула выбрана из группы, состоящей из CD28 и 41BB.
93. Рекомбинантная клетка, экспрессирующая химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления 86-92.
94. Рекомбинантная клетка варианта осуществления 93, которая является Т-клеткой.
95. Способ лечения, включающий введение клетки варианта осуществления 93 или 94 субъекту, имеющему заболевание или нарушение, ассоциированное с CD19.
96. Способ лечения, включающий введение антитела согласно любому из вариантов осуществления 55-85 субъекту, имеющему заболевание или нарушение, ассоциированное с CD19.
97. Способ варианта осуществления 95 или 96, где заболевание или нарушение является В-клеточным злокачественным заболеванием.
98. Способ варианта осуществления 97, где В-клеточное злокачественное заболевание выбрано из группы, состоящей из В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ), острого лимфоцитарного лейкоза (ОЛЛ), пролимфоцитарных лейкозов, волосатоклеточных лейкозов, общих острых лимфоцитарных лейкозов, ноль-клеточных острых лимфобластных лейкозов, неходжкинских лимфом, диффузных В-крупноклеточных лимфом (ДВККЛ), множественных миелом, фолликулярной лимфомы, лимфомы из клеток маргинальной зоны селезенки, лимфомы из клеток мантийной зоны, индолентной В-клеточной лимфомы или лимфомы Ходжкина.
99. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело согласно любому из вариантов осуществления 55-85 или химерный антигенный рецептор согласно любому из вариантов осуществления 86-92.
100. Композиция, включающая антитело согласно любому из вариантов осуществления 55-85, CAR согласно любому из вариантов осуществления 86-92 или клетку варианта осуществления 93 или 94.
101. Способ лечения, включающий введение композиции варианта осуществления 100 субъекту, имеющему заболевание или нарушение, ассоциированное с CD19.
102. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38 или 55-85, CAR согласно любому из вариантов осуществления 39-45 или 86-92, клетка согласно любому из вариантов осуществления 46, 47, 93 и 94, способ согласно любому из пунктов 48-51, 54, 95-98 и 101, нуклеиновая кислота варианта осуществления 52 или 99, или композиция согласно любому из пунктов 53 и 100, где антитело или фрагмент специфично связываются с эпитопом, содержащим одну или более аминокислот в области внеклеточной части CD19.
103. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38 или 55-85, CAR согласно любому из вариантов осуществления 39-45 или 86-92, клетка согласно любому из вариантов осуществления 46, 47, 93 и 94, способ согласно любому из пунктов 48-51, 54, 95-98 и 101, нуклеиновая кислота варианта осуществления 52 или 99, или композиция согласно любому из пунктов 53 и 100, где антитело или фрагмент специфично связываются с эпитопом, который расположен в области внеклеточной части CD19.
103. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38 или 55-85, CAR согласно любому из вариантов осуществления 39-45 или 86-92, клетка согласно любому из вариантов осуществления 46, 47, 93 и 94, способ согласно любому из пунктов 48-51, 54, 95-98 и 101, нуклеиновая кислота варианта осуществления 52 или 99, или композиция согласно любому из пунктов 53 и 100, где антитело или фрагмент специфично связываются с полипептидом, состоящим или по существу состоящим из области внеклеточной части CD19, или который включает область внеклеточной части CD19, но не какой-либо, или по существу никакой, другой части CD19.
104. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 102-103, где область внеклеточной части CD19 являются мембрано-проксимальной областью.
105. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 102-104, где область внеклеточной части CD19 являются частью, кодируемой четвертым экзоном CD19, или частью, соответствующей положениям 176-277 из последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92.
106. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 102-105, где область внеклеточной части CD19 состоит из или включает мембрано-проксимальную большую, содержащую 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 44, 43, 43, 41 или 40 аминокислот, часть внеклеточной части CD19.
107. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 102-106, где область внеклеточной части состоит из или включает Ig-подобный домен 1 из CD19, часть, кодируемую вторым экзоном CD19, и/или часть, соответствующую положениям 20-117 из последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92
108. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 102-106, которые необязательно являются любой из частей внеклеточной области, описанной в любом из вариантов осуществления 105-107.
109. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38 или 55-85, CAR согласно любому из вариантов осуществления 39-45 или 86-92, клетка согласно любому из вариантов осуществления 46, 47, 93 и 94, способ согласно любому из пунктов 48-51, 54, 95-98 и 101, нуклеиновая кислота варианта осуществления 52 или 99, или композиция согласно любому из пунктов 53 и 100, где антитело или фрагмент специфично связываются с эпитопом CD19, который содержит одну или более аминокислот в, расположен в или включает часть CD19, соответствующую остаткам 218-249 из последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92.
110. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция варианта осуществления 109, где часть включает последовательность, представленную в SEQ ID NO: 143.
111. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38 или 55-85, CAR согласно любому из вариантов осуществления 39-45 или 86-92, клетка согласно любому из вариантов осуществления 46, 47, 93 и 94, способ согласно любому из пунктов 48-51, 54, 95-98 и 101, нуклеиновая кислота варианта осуществления 52 или 99, или композиция согласно любому из пунктов 53 и 100, где антитело или фрагмент специфично связываются с эпитопом CD19, который содержит аминокислоту в положении, соответствующем положению последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92, выбранную из группы, состоящей из: гистидина (H) в положении 218, аланина (A) в положении 236, метионина (M) в положении 242, глутамата (E) в положении 243, пролина (P) в положении 249 и/или лизина (K) и/или серина (S) в положениях 223 и 224, и их комбинации.
112. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38 или 55-85, CAR согласно любому из вариантов осуществления 39-45 или 86-92, клетка согласно любому из вариантов осуществления 46, 47, 93 и 94, способ согласно любому из пунктов 48-51, 54, 95-98, и 101, нуклеиновая кислота варианта осуществления 52 или 99, или композиция согласно любому из пунктов 53 и 100, где аминокислота в положении, соответствующем положению последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92, выбранная из группы, состоящей из: гистидина (H) в положении 218, аланина (A) в положении 236, метионина (M) в положении 242, глутамата (E) в положении 243, пролина (P) в положении 249 и/или лизина (K) и/или серина (S) в положениях 223 и 224, и их комбинации, является необходимой или важной для связывания антитела с человеческим CD19.
113. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция варианта осуществления 111 или 112, где аминокислота идентична аминокислоте, присутствующей в соответствующем положении в SEQ ID NO: 92.
114. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 111-113, где аминокислота является или включает аминокислоту в положении, соответствующем гистидину в положении 218 CD19 человека, где необязательно аминокислота в указанном положении является гистидином.
115. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 111-114, где аминокислота является или включает аминокислоту в положении, соответствующем аланину в положении 236 последовательности CD19 человека, где необязательно аминокислота в указанном положении является аланином.
116. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 111-115, где аминокислота является или включает аминокислоту в положении, соответствующем метионину в положении 242 CD19 человека, где необязательно аминокислота в указанном положении является метионином.
117. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 111-116, где аминокислота является или включает аминокислоту в положении, соответствующем глутамату в положении 243 CD19 человека, где необязательно аминокислота в указанном положении является глутаматом.
118. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 111-117, где аминокислота является или включает аминокислоту в положении, соответствующем пролину в положении 249 CD19 человека, где необязательно аминокислота в указанном положении является пролином.
119. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция согласно любому из вариантов осуществления 111-118, где аминокислота является или включает аминокислоту(ы) в одном или обоих положениях, соответствующих лизину и/или серину в положениях 223 и 224 CD19 человека.
120. Антитело или фрагмент согласно любому из вариантов осуществления 1-38 или 55-85, CAR согласно любому из вариантов осуществления 39-45 или 86-92, клетка согласно любому из вариантов осуществления 46, 47, 93 и 94, способ согласно любому из пунктов 48-51, 54, 95-98 и 101, нуклеиновая кислота варианта осуществления 52 или 99, или композиция согласно любому из пунктов 53 и 100, где антитело или фрагмент специфично связываются с эпитопом, который перекрывается или идентичен, или включает эпитоп, специфично связываемый референсным антителом, где перекрывающаяся часть включает или расположена в части CD19: (a) включающей SEQ ID NO: 143, (b) соответствующей остаткам 218-249 из последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92, или (c) соответствующей области CD19, кодируемой экзоном 4 из CD19 человека, или (d) расположена в части, соответствующей 75-большим или 80-большим мембрано-проксимальным остаткам человеческого CD19.
121. Антитело, фрагмент, клетка, способ, нуклеиновая кислота или композиция варианта осуществления 120, где референсным антителом является FMC63, или где референсным антителом является SJ25C1.
V. ПРИМЕРЫ
[0408] Следующие примеры включены лишь в иллюстративных целях и не направлены на ограничение объема изобретения.
Пример 1: Получение и оценка антител против CD19
[0409] Примеры антител против CD19, которые специфично связываются с CD19-экспрессирующими клетками и обладают связывающими свойствами, подобными мышиным референсным антителам против CD19, и/или конкурируют за связывание с мышиными референсными антителами против CD19, были получены и исследованы.
1A. Отбор в библиотеках, получение антител
H
[0410] Примеры антител против CD19 (scFv-фрагменты) были получены в серии этапов отбора, выполненных в библиотеках дцДНК-кодируемых человеческих наивных антител, представленных в бесклеточной системе. Элементы V библиотеки отбирали по связыванию с живыми клетками в трех последовательных циклах, обогащая элементами, которые специфично связываются со стабильно трансфицированными CD19-экспрессирующими клетками HEK293, но не с исходными клетками HEK293 и/или с клетками CHOK1, которые не экспрессируют CD19. В конце каждого цикла отбора три отдельных пула элюции получали следующим образом: (a) снятие с поверхности для выделения связывающих элементов с клеток-мишеней, (b) конкурентная элюция с использованием мышиного антитела против CD19, FMC63 IgG, и (c) конкурентная элюция с использованием другого мышиного антитела против CD19, SJ25C1 ((b) и (c) выполняли для обогащения связывающими элементами, которые конкурируют с FMC63 и/или SJ25C1 за связывание с CD19).
H
H
L
H
3
L
[0411] В конце 3 циклов отборов эти обогащенные V библиотеки превращали в scFv библиотеки путем перетасовки V элементов этих соответствующих пулов и библиотеки наивных человеческих V в формате V-(G4S)-V. Полученные в результате scFv библиотеки подвергали четвертому циклу с обогащением элементами, которые специфично связывались с CD19-экспрессирующими клетками HEK293, но не с исходными клетками, с последующим снятием с поверхности.
[0412] Пятый цикл выполняли для дополнительного обогащения элементами, которые связывались с другими CD19-экспрессирующими клетками (CD19/K562). Отборы сопровождались получением отдельных пулов элюции при использовании либо (a) снятия с поверхности, (b) FMC63 конкурентной элюции, либо (c) SJ25C1 конкурентной элюции. В шестом цикле эти три пула по отдельности дополнительно обогащали путем отрицательной селекции элементами, которые не связывали исходные клетки (HEK293, дважды, K562), с последующей положительной селекцией элементов, которые связывали CD19-экспрессирующие клетки HEK293, и иммунопреципитацией с антителом к Myc, которое распознавало C-концевую метку на CD19, экспрессируемом на клетках HEK293.
H
H
L
[0413] В одном исследовании сорок восемь (48) клонов из каждого из трех полученных итоге пулов R6 scFv секвенировали при использовании прямого и обратного праймеров для определения аминокислотных последовательностей. 130 из определенных последовательностей scFv показали полноразмерное прочтение. Среди последовательностей наблюдали конвергенцию. Среди 130 последовательностей scFv (представляющих сорок шесть (46) из 130 клонов) обнаружили восемнадцать (18) копий. В этом исследовании одна последовательность V части, содержащая CDR-области 1-3 и FR-области 1-3, была обнаружена четырнадцать (14) раз в двух из разных пулах (10 копий в одном и 4 копий в другом), спаренная с 5 различными VL-областями. Другие копии обнаруживали от 2 до 5 раз в различных пулах; другие являлись однокопийными последовательностями. В другом исследовании идентифицировали и секвенировали дополнительные CD19-связывающие клоны. Такая же V часть была обнаружена среди них с различными V последовательностями.
1B. Специфичное связывание с CD19-экспрессирующими клетками
in vitro
in vitro
E.coli
in vitro
[0414] Связывание секвенированных клонов с CD19-экспрессирующими и контрольными клетками HEK293, в сравнении с клетками, которые не экспрессировали CD19, оценивали с помощью проточной цитометрии либо с  транслированным суммарным клеточным лизатом, либо с бактериально полученным супернатантом. Коротко, РНК каждого клона нормализовали и транслировали  в виде неочищенной scFv с C-концевой FLAG меткой. В анализе использовали CD19-экспрессирующие HEK293 и контрольные (ложно-трансфицированные) клетки HEK293. Связывание отдельных scFv-фрагментов с CD19 и контрольными клетками измеряли с использованием Alexa647-конъюгированного вторичного антитела к FLAG. В альтернативе scFv-связывающие пулы клонировали в векторы экспрессии  и получали в виде HIS-меченных scFv-фрагментов, которые детектировали Alexa647-конъюгированным антителом к HIS-метке в проточно-цитометрических анализах. Мышиные антитела к CD19 (scFv FMC63 и IgG FMC63) использовали в качестве положительных контролей; также использовали контрольный scFv. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) оценивали с помощью проточной цитометрии. Результаты показаны на Фигурах 1A и 1B и демонстрируют связывание идентифицированных клонов с CD19-экспрессирующими клетками. Среди оцениваемых клонов присутствовали scFv-фрагменты, включающие клоны 5, 17, 18 (идентифицированные при использовании  транслированных лизатов) и 76 (идентифицированный при использовании бактериального супернатанта), которые показали четкое предпочтение связывания с CD19-экспрессирующими клетками по сравнению с CD19-отрицательными клетками.
[0415] Как показано на Фигурах 1A и 1B, для некоторых клонов, обнаруженное кратное изменение степени связывания, в данном случае при измерении средней интенсивности флуоресценции, с CD19-экспрессирующими клетками по сравнению с не экспрессирующими CD19 клетками, было приблизительно таким же высоким, по меньшей мере, таким же высоким, или больше, чем кратное изменение, наблюдаемое для референсных антител положительного контроля, мышиных антител против CD19, scFv FMC63 и/или IgG FMC63. В некоторых случаях полная степень наблюдаемого связывания с CD19-экспрессирующими клетками была приблизительно такой же, по меньшей мере, такой же высокой, или больше, чем наблюдаемая для одного или более референсных антител положительного контроля.
H
L
H
L
H
H
L
H
L
H
L
[0416] Четыре (4) клона scFv, которые показали четкое предпочтение связывания с CD19-экспрессирующими клетками по сравнению с не экспрессирующими CD19 клетками ("клон 18", "клон 17", "клон 5" и "клон 76"), анализировали далее. Секвенирование показало, что клоны в своих V последовательностях содержали общие CDR последовательности, с разными V последовательностями и разными CDR-L. Идентификаторы последовательности, соответствующие последовательностям, включающим примеры аминокислотных последовательностей scFv, V, V и CDR (Кэбат) и кодирующих нуклеотидных scFv последовательностей, для четырех клонов, перечислены в Таблице 2. Вариант зародышевой линии клона 18 (обозначенный "клон 18B") был получен при замене цистеина (C) серином (S) в положении 89 по Кэбату; последовательности этого клона также перечислены в Таблице 2. Каждый из клонов имел последовательность V3 цепи. Клон 18 включал каркасную область легкой цепи, полученную из последовательности Vλ2 (причем клон 18B имел каркасную последовательность Vλ2 зародышевой линии); клоны 17 и 76 имели последовательности Vλ1, и клон 5 включал последовательность Vλ3. Клоны 18 и 17 были получены из множества ветвей и библиотек, включающих V-V перетасовку и scFv. Клон 76 был получен при V-V SJ25C1 конкурентной элюции (Цикл 6); клон 5 был получен при V-V FMC63 конкурентной элюции (Цикл 6).
<b>Таблица 2: Последовательности примерных клонов (SEQ ID NO.)</b>
Клон #
Вариабельная область тяжелой цепи (VH)(аминокисл.)
Вариабельная область тяжелой цепи (VL)(аминокисл.)
Последовательность ScFv(аминокисл., нуклеотидн.)
CDR-H(1, 2, 3)(Кэбат)(аминокисл.)
CDR-L(1, 2, 3)(Кэбат)(аминокисл.)
5
12
17
10
18, 19, 20
31, 32, 33
17
12
15
6
18, 19, 20
25, 26, 27
18
11
13
2
18, 19, 20
21, 22, 23
18B
11
14
4
18, 19, 20
21, 22, 24
76
11
16
8
18, 19, 20
28, 29, 30
1C. Аффинности связывания, конкуренция с референсными антителами
[0417] Клоны 5, 17, 18, 18B и 76 очищали с помощью одностадийной очистки и оценивали очистку с помощью ДСН геля. Гель из примерного исследования показан на Фигуре 2 (дорожки 1 и 2=клон 5, невосстановленный, восстановленный; дорожки 3 и 4=клон 17, невосстановленный, восстановленный; дорожки 5 и 6=клон 18, невосстановленный и восстановленный; дорожки 7 и 8=клон 76, невосстановленный и восстановленный). В этом исследовании изоэлектрические точки были измерены как 5,36, 5,32, 7,11 и 5,32, соответственно, для клонов 5, 17, 18 и 76.
п
п
[0418] Измерения температуры плавления (Т) проводили при использовании прибора BioTad CFX96 с целью анализа включения в белок красителя Sypro orange при возрастающих температурах, получив значения Т, подобные наблюдаемым для референсного антитела FMC63 scFv. Результаты представлены в Таблице 3.
<b>Таблица 3: Исследование Т</b><sub><b>п</b></sub>
<b>Клон, условия</b>
<b>Т</b><sub><b>п</b></sub><b> (°C)</b>
5, имидазол
53
5, pH 6
61
5, pH 7
57
5, pH 8
57
17
51
18
59
18B
59
FMC63 scFv
56
50
[0419] Клоны титровали и их аффинности связывания (EC) с CD19-экспрессирующими клетками K562 оценивали с помощью проточной цитометрии, при этом референсное мышиное антитело к CD19, FMC63 scFv, использовали в качестве положительного контроля. Результаты из трех отдельных анализов, с включением и сравнением других аффинностей связывания с аффинностью связывания для клона 18, показаны на Фигурах 3A-3C.
50
50
50
[0420] В анализе, результаты которого показаны на Фигуре 3A, значения EC для клона 18, клона 17, другого клона, идентифицированного в исследовании (обозначенного клон 192; см. последовательности в Таблице 6), и референсного антитела (FMC63 scFv) были измерены как 3,79 нМ, 14,86 нМ, 12,80 нМ и 7,37 нМ, соответственно. В анализе, результаты которого показаны на Фигуре 3B, значения EC для клона 18, клона 18B и клона 76 были измерены как 7,1 нМ и 9,3 нМ, и 7,9 нм, соответственно. В анализе, результаты которого показаны на Фигуре 3C, значения EC для клона 18 и клона 76 были измерены как 4,1 нМ и 8,8 нМ, соответственно.
50
50
[0421] Таким образом, каждый из проанализированных клонов специфично связывался с CD19-экспрессирующими клетками с аффинностями, подобными аффинности референсного антитела, например, со значениями EC приблизительно такими же или ниже, чем у референсного антитела, или не больше чем приблизительно в 1,5 или не больше приблизительно в 2 раза, или не больше чем приблизительно в 3 раза больше, чем EC референсного антитела.
50
[0422] В другом анализе клоны 18, 5, 17, другие идентифицированные клоны (161, 170, 1 (см. информацию последовательности в Таблице 6)) и референсное антитело положительного контроля FMC63 scFv (один планшет), и клон 18, другие идентифицированные клоны (177, 184, 192, 198) и референсное антитело положительного контроля FMC63 scFv (другой планшет) оценивали в таком же анализе. Результаты представлены на Фигуре 4. Значения EC, наблюдаемые для этих двух планшетов, представлены в Таблицах 4A и 4B. Как показано, клоны, как наблюдали, имели аффинности связывания, сопоставимые с аффинностью связывания референсного антитела.
<b>Таблица 4A</b>
<b>Клон 18</b>
<b>Клон 5</b>
<b>Клон 17</b>
<b>Примеры дополнительных клонов</b><b>(клоны 161, 170, 1)</b>
<b>FMC63 scFv</b>
<b>EC</b><sub><b>50</b></sub><b>(нМ)</b>
4,79
15,84
8,32
52,26, 96,68, 213,80
5,06
<b>Таблица 4B</b>
<b>Клон 18</b>
<b>Примеры дополнительных клонов</b><b>(клоны 177, 184, 192, 198)</b>
<b>FMC63 scFv</b>
<b>EC</b><sub><b>50</b></sub><b>(нМ)</b>
3,11
53,33, 113,90, 12,02, 13,21
5,83
50
50
[0423] Конкурентные анализы связывания проводили для оценки конкуренции различных антител за связывание с CD19-экспрессирующими клетками. В одном анализе связывание 0,5 нМ (~EC) FITC-меченного SJ25C1 с клетками Ramos оценивали в присутствии или отсутствие различных концентраций неконъюгированного конкурентного IgG FMC63 или контрольного IgG; связывание оценивали с помощью проточной цитометрии (средняя интенсивность флуоресценции). Результаты, показанные на Фигуре 5A, указывают, что IgG FMC63 конкурировал за связывание с CD19 с IgG1 SJ25C1 в данном исследовании, и дают основание предположить, что SJ25C1 и FMC63 связывались с перекрывающимися эпитопами, например общим эпитопом, на CD19. В другом анализе CD19-экспрессирующие клетки инкубировали с меченным IgG FMC63 в присутствии различных концентраций (или отсутствие) клона 18 scFv, FMC63 scFv (положительный контроль) и контрольного scFv (отрицательный контроль). Результаты показаны на Фигуре 5B. Как показано, и клон 18 scFv, и FMC63 scFv (но не scFv отрицательного контроля), как наблюдали, конкурировали с IgG FMC63 за связывание с CD19-экспрессирующими клетками, с сопоставимыми значениями IC (24,0 нМ и 19,8 нМ, соответственно), что указывает на то, что клон 18 связывался с эпитопом CD19, который перекрывается с эпитопом, распознаваемым FMC63, и конкурировали за связывание с референсным антителом в подобной степени.
50
[0424] В другом анализе 10 нМ (EC) Alexa647-меченного FMC63 scFv инкубировали с CD19-экспрессирующими клетками K562 в присутствии или отсутствие переменных концентраций клона 18 scFv, клона 18B scFv, клона 17 scFv, клона 76 scFv, референсного антитела (FMC63 scFv) и антитела отрицательного контроля (R12). Результаты представлены на Фигуре 6. Клоны и референсное антитело, но не антитело отрицательного контроля, показали конкуренцию с FMC63 scFv за связывание с CD19, при этом конкуренция референсного антитела с самим собой была подобна конкуренции, наблюдаемой для тестируемых клонов.
50
50
50
50
[0425] В совокупности, в ряде исследований, следующие значения EC (аффинность связывания) и IC (конкуренция) наблюдали для различных клонов, как перечислено в Таблице 5. Как показано, среди идентифицированных человеческих антител к CD19 были такие антитела, которые обладают подобной степенью аффинности связывания с CD19 и подобной степенью конкурентного ингибирования для мышиного референсного антитела против CD19, по сравнению с самим референсным антителом, например, имеют приблизительно такую же, меньше или не больше чем в 1,5 раза, 2 раза или в 3 раза большую EC и/или IC.
<b>Таблица 5: Сводка данных, полученных в примерных исследованиях связывания</b>
Клон/антитело
EC<sub>50</sub> (CD19-экспрессирующие клетки) (нМ)
IC<sub>50</sub> (нМ)(конкуренция за связывание с FMC63)
Клон 18
4,1±0,57 (n=7)
20,1±9,8 (n=3)
Клон 18B
5,4±1,3 (n=5)
28 (n=1)
Клон 76
8,04±0,3
18,2±1,5 (n=2)
Клон 17
11,7±1,9
35,4±3,9 (n=2)
Клон 5
15,8 (n=1)
50 (n=1)
FMC63
6,1±1,2 (n=6)
20,5±6,7 (n=3)
1D. Эксклюзионная хроматография
[0426] Биофизические свойства клона 18B оценивали с помощью эксклюзионной хроматографии. Колонку HiLoad 16/600 Superdex 200 калибровали и вводили стандартные 150-1901 кДа белки Bio-Rad для гель-фильтрации, и собирали фракции при 1,5 мл/мин для получения стандартных точек. В колонку вводили 770 мкг клона 18B scFv и собирали фракцию при таких же условиях. Результаты показаны на Фигуре 7 (Фигура 7A=стандарт; Фигура 7B=Клон 18B). Результаты для клона 18B scFv показали одиночный пик с минимальными наблюдаемыми агрегатами большого размера.
Пример 2: Получение и исследование дополнительных антител против CD19
[0427] Дополнительные примерные антитела против CD19 (scFv фрагменты), обладающие подобными связывающими свойствами (и/или которые конкурируют за связывание) с мышиными референсными антителами против CD19, были получены и исследованы.
2A. Отбор в библиотеках, получение антител
[0428] Дополнительные примерные scFv-фрагменты против CD19 были получены двумя различными методами отбора, каждый из которых включал ряд этапов отбора, выполненных в библиотеках дцДНК-кодируемых человеческих антител, представленных в бесклеточной системе.
H
H
L
H
3
L
[0429] В одном методе (обозначенном "CDR3 графтинг клона 18") последовательность CDR3 тяжелой цепи (CDR-H3), присутствующую в клонах, идентифицированных в Примере 1 (SEQ ID NO: 20, DQGYHYYDSAEHAFDI), перевивали в библиотеки каркасных областей человеческих наивных V. Элементы полученной в результате CDR3-привитой библиотеки V перетасовывали с элементами библиотеки наивных человеческих V, с получением библиотеки scFv в формате V-(G4S)-V. Полученную библиотеку scFv подвергали трем циклам отбора для обогащения элементами, которые специфично связывались с CD19-экспрессирующими клетками HEK293, но не с исходными клетками, с последующим снятием с поверхности в цикле (R1), иммунопреципитации и скорости диссоциации в цикле 2 (R2).
H
L
L
H
H
L
H
L
E.coli
[0430] В другом методе (обозначенном "FMC63 направленная селекция") две исходных библиотеки scFv были получены, соответственно, путем: (a) перетасовки элементов библиотеки наивных V с Vобластью FMC63 и (b) перетасовки элементов библиотеки наивных V с V областью FMC63. После двух и трех циклов отбора, соответственно, для обогащения элементов библиотеки из (a) и (b) на CD19-связывание с направлением исходных V или V FMC63. Связывающие молекулы элюировали при снятии с поверхности клеток CD19/HEK293 (R1) и элюции FMC63 с клеток CD19/K562 (R2 и R3). Третья библиотека scFv была получена при перетасовке последовательностей V после отбора в (a) с последовательностями V, полученными в результате отбора в (b). Три дополнительных цикла отбора были выполнены на клетках CD19/HEK293 со снятием с поверхности (R1), затем клетках CD19/K562 с элюцией FMC63 (R2) и клетках CD19/HEK293 с иммунопреципитацией (R3). Связывание отобранных клонов scFv с CD19-экспрессирующими клетками подтверждали с помощью проточной цитометрии при использовании бактериально полученного супернатанта. Отобранные пулы scFv клонировали в векторы экспрессии  и получали в виде HIS-меченных scFv-фрагментов. Связывание отдельных клонов с CD19-трансфицированными клетками HEK293 детектировали Alexa647-конъюгатом антитела к HIS-метке с помощью проточной цитометрии. Клон 18 или Клон 18B использовали в качестве положительного контроля вместе с различными отрицательными контролями. Результаты показаны на Фигурах 8A-C (MFI=средняя интенсивность флуоресценции).
in vitro
[0431] Результаты, показанные на Фигуре 8D, подтверждают CD19-специфичное связывание примерными двадцатью тремя (23) из хитов (отмеченных звездочками на Фигурах 8A-C, представляющих 4 хита, идентифицированные с помощью метода графтинга CDR3, и 19 - с помощью FMC63-направленной селекции). Связывание -транслированных, FLAG-меченных scFv-фрагментов с CD19-экспрессирующими клетками K562, в сравнении с контрольными (ложно-трансфицированными) клетками K562, оценивали с помощью проточной цитометрии, как описано в Примере 1. Как показано, клоны специфично связывались с CD19-экспрессирующими клетками.
H
L
H
[0432] Эти и дополнительные CD19-специфичные клоны scFv, полученные с помощью методов селекции в Примерах 1 и 2, оценивали далее. Секвенирование выявило несколько CD19-специфичных связывающих антител (scFv-фрагментов) с различными другими последовательностями легкой цепи и содержащих общую последовательность CDR-H3 (SEQ ID NO: 20), также присутствующую в scFv-фрагментах, описанных в Примере 1. Идентификаторы последовательности, соответствующие различным последовательностям дополнительных CD19-связывающих scFv-фрагментов, перечислены в Таблице 6, в том числе для аминокислотных последовательностей scFv, V, V и CDR (Кэбат) (и кодирующих scFv нуклеотидных последовательностей). CD19-специфичные scFv клоны включали такие, которые имеют несколько различных вариабельных и CDR последовательностей легкой цепи, некоторые из которых имели CDR-H1, CDR-H2 и/или CDR-H3, присутствующие в SEQ ID NO: 11, CDR-H1, CDR-H2 и/или CDR-H3, имеющий последовательности SEQ ID NO: 18, 19 и/или 20, и/или CDR-H1, CDR-H2 и/или CDR-H3, имеющие последовательности 18, 72 и 20. Каждый из клонов, перечисленных в Таблице 6, был получен из человеческой каркасной V3 области (с каппа и лямбда сегментами V гена, из которых получали указанные клоны).
<b>Таблица 6: Последовательности примерных клонов (SEQ ID NO.)</b>
Клон #
Вариабельная область тяжелой цепи (V<sub>H</sub>)(аминокислотная)
Вариабельная область легкой цепи (V<sub>L</sub>)(аминокислотная)
Последовательность ScFv(аминокислотная, нуклеотидная)
CDR-H(1, 2, 3)(Кэбат)(аминокислотная)
CDR-L(1, 2, 3)(Кэбат)(аминокислотная)
Каркасная область легкой цепи получена из
488
63
71
45, 44
18, 72, 20
80, 100, 109
Vκ3
1304
62
68
47, 46
18, 72, 20
77, 97, 106
Vκ1
285
11
65
49, 48
18, 19, 20
74, 94, 103
Vλ2
192B
60
64
51, 50
18, 19, 20
73, 93, 101
Vλ2
328
61
66
53, 52
18, 19, 20
75, 95, 104
Vλ2
227
63
70
55, 54
18, 72, 20
79, 99, 108
Vκ1
1300
62
69
57, 56
18, 72, 20
78, 98, 107
Vκ1
1
12
67
59, 58
18, 19, 20
76, 96, 105
Vλ1
192
12
91
87, 86
18, 19, 20
73, 93, 102
Vλ2
241
63
90
89, 88
18, 72, 20
77, 97, 106
Vκ1
2B. Очистка и оценка
п
п
[0433] Клоны, описанные выше, в том числе клоны, перечисленные в Таблице 6 и/или описанные в Примере 1, очищали с помощью одностадийной очистки и оценивали очистку в ДСН геле. Результаты представлены на Фигуре 9 (дорожка 1=маркер мол. веса; дорожки 2, 9 и 10=клон 5 (1530, 2880, 1130 мкг/мл); дорожка 3=клон 18B (660 мкг/мл); дорожки 4, 11, 12 и 13=клон 17 (300, 1060, 180, 1440 мкг/мл); дорожка 5=клон 192B (1580 мкг/мл); дорожки 6 и 14=клон 76 (1340, 3220 мкг/мл); дорожка 7=клон 835 (470 мкг/мл); дорожка 8=клон 488 (340 мкг/мл)). Измерения температуры плавления (Т) проводили, как описано в Примере 1, получив значения Т, подобные наблюдаемым для референсного антитела и клонов в Примере 1 (Таблица 7).
<b>Таблица 7: Оценка Т</b><sub><b>п</b></sub>
<b>Клон</b>
<b>Т</b><sub><b>п</b></sub><b> (°C)</b>
5
58
18B
57
17
52
192B
64
76
51/59
488
63
285
68
227
60
[0434] Различные клоны титровали и их аффинность связывания (EC50) с различными CD19-экспрессирующими клетками оценивали с помощью проточной цитометрии. Референсное антитело FMC63 scFv использовали в качестве положительного контроля. Результаты пяти отдельных анализов, оценивающих аффинности связывания различных CD19-специфичных клонов scFv, показаны на Фигурах 10A-10E. Как показано, отбор привел к получению нескольких CD19-специфичных клонов scFv с различными аффинностями связывания и диапазоном насыщаемой связывающей активности.
50
50
50
[0435] Конкурентные анализы связывания проводили, как описано в Примере 1, для оценки способности различных идентифицированных антител (клонов scFv) конкурировать за связывание с мышиным референсным антителом при связывании с CD19-экспрессирующими клетками. В одном примере CD19-экспрессирующие клетки инкубировали с 10 нМ меченного FMC63 scFv в присутствии различных концентраций указанных клонов scFv, имеющих различные последовательности легкой цепи и обладающие общей тяжелой цепью CDR3 (или FMC63 scFv (положительный контроль)). Результаты, показанные на Фигуре 11, продемонстрировали, что клоны конкурировали с FMC63 scFv за связывание с CD19-экспрессирующими клетками, с различными значениями IC. Аналогичные исследования проводили для оценки свойств других клонов, идентифицированных в методах скрининга, описанных в Примерах 1 и 2. Значения EC (аффинность связывания) и IC (конкуренция), наблюдаемые для различных CD19-связывающих антител (scFv-фрагменты), перечислены в Таблице 8. Последовательности CDR-L3 клонов 79, 835, 184, 505, 506 и 305 представлены как SEQ I NO: 116, 117, 118, 119, 120, 121 и соответственно.
<b>Таблица 8: Результаты, полученные в различных связывающих и конкурентных анализах</b>
<b>Клон/антитело</b>
<b>EC</b><sub><b>50</b></sub><b> (CD19-экспрессирующие клетки) (нМ)</b>
<b>IC</b><sub><b>50</b></sub><b> (нМ) (конуренция за сязывание с FMC63)</b>
Клон 18B
4,9±0,8 (n=7)
32,9± 3,2 (n=3)
Клон 17
11,6±1,1 (n=5)
35,4±3,9 (n=2)
Клон 76
7,0±1,4 (n=5)
18,2±1,5 (n=2)
Клон 5
15,8 (n=1)
50 (n=1)
Клон 192B
7,7±1,4 (n=3)
15,7±2,5 (n=3)
Клон 488
2,9±0,4 (n=4)
6,1±0,7 (n=6)
Клон 79
65,7 (n=1)
102,5 (n=1)
Клон 835
71,8 (n=1)
>200
Клон 184
113,9 (n=1)
н.д.
Клон 505
138,9 (n=1)
н.д.
Клон 506
179,3 (n=1)
н.д.
Клон 1
213,8 (n=1)
н.д.
Клон 241
5,2 ±0,1 (n=2)
14,6±2,7 (n=3)
1300
1,3±0,1 (n=3)
3,9±0,5 (n=2)
227
31,8±5,3 (n=3)
56,1±3,9 (n=2)
285
2,5 ±0,5 (n=4)
9,4±1,4 (n=3)
305
32,2±6,9 (n=2)
>500 (n=2)
328
10,9±4,6 (n=4)
32,9 (n=1)
FMC63
6,0±0,8 (n=9)
15,0±2,8 (n=10)
50
50
[0436] Среди идентифицированных человеческих антител к CD19 (scFv фрагментов), многие продемонстрировали подобную или более высокую степень аффинности связывания (например, подобные или более низкие значения EC) с CD19 по сравнению с мышиным референсным антителом против CD19, FMC63. Многие также продемонстрировали подобные или более высокие степени конкуренции (например, подобные или более низкие значения IC) с мышиным референсным антителом против CD19 за связывание CD19, по сравнению со способностью референсного антитела конкурировать с самим собой.
50
50
50
50
[0437] Например, наблюдали клоны со значениями EC, которые были меньше чем, приблизительно такими же или не больше чем или приблизительно в 1,5 раза больше, 2 раза больше или в 3 раза больше, чем у референсного антитела. Аналогичным образом, несколько из идентифицированных антител против CD19 (scFv-фрагменты), как наблюдали, конкурировали с меченным FMC63 scFv за связывание с CD19-экспрессирующими клетками со значениями IC, которые были ниже, чем значения IC, наблюдаемые для FMC63 scFv, приблизительно такими же, как значения IC, наблюдаемые для FMC63, или не больше чем в 1,5 раза или 2 раза, или 3 раза выше (например, степень конкуренции, которая не больше чем в 1,5 раза или 2 раза, или 3 раза ниже, чем конкуренция с референсным антителом). Результаты показали, что данные исследования позволили идентифицировать множество антител, которые связываются с эпитопом CD19, который перекрывается с эпитопом, специфично связываемым FMC63.
Пример 3: Получение химерных антигенных рецепторов (CAR-рецепторов) против CD19 и инженерия клеток, экспрессирующих такие CAR-рецепторы
[0438] Различные примерные химерные антигенные рецепторы (CAR) получали с антигенсвязывающими областями, содержащими человеческие scFv-фрагменты против CD19, как описано в Примере 1. В частности, получали молекулы нуклеиновых кислот, которые кодировали CAR-рецепторы с scFv-фрагментами (в формате VH-VL), полученными из следующих клонов и имеющих аминокислотные последовательности, представленные в указанных идентификаторах последовательности: Клон 18 (SEQ ID NO: 2), Клон 18B (SEQ ID NO: 4), Клон 17 (SEQ ID NO: 6), Клон 76 (SEQ ID NO: 8) и Клон 5 (SEQ ID NO: 10). Кроме того, для каждого клона также были получены, конструкции, кодирующие CAR, имеющий одни и те же VH и VL последовательности, но присутствующие в обратной ориентации (VL-VH). CAR, содержащий мышиный scFv против CD19, полученный из FMC63 (в ориентации VH-VL), использовали в качестве контроля. Каждый CAR также содержал Ig-полученный спейсер; полученный из человеческого CD28 трансмембранный домен; полученный из человеческого 4-1BB внутриклеточный сигнальный домен; и полученный из человеческой CD3-дзэта сигнальный домен, усеченную последовательность EGFR (EGFRt) для применения в качестве маркера трансдукции, отделенную от последовательности CAR саморасщепляющейся последовательностью T2A.
+
+
[0439] Были получены первичные популяции человеческих Т-клеток, экспрессирующих различные CAR-рецепторы. Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие каждый CAR, индивидуально клонировали в лентивирусный вектор, который использовали для трансформации CD4 и CD8 Т-клеток в популяциях, выделенных из образцов человеческих МКПК, полученных от здоровых доноров (по существу как описано в Yam et al. (2002) Mol. Ther. 5:479; WO2015/095895).
+
+
+
+
[0440] После трансдукции и размножения, окрашивание антителом к EGFR использовали для проверки экспрессии маркера трансдукции EGFRt на поверхности CD4 и CD8 Т-клеток с помощью проточной цитометрии. На Фигуре 12A приведены репрезентативные результаты экспрессии различных CAR-рецепторов в CD8 клетках; подобные результаты наблюдали для CD4 клеток. Экспрессию белка CAR подтверждали с помощью вестерн-блоттинга при использовании антитела к CD247 (CD3-дзэта) (которое в каждом случае детектировало полосу приблизительно 50 кДа, соответствующую CAR, и полосу приблизительно 18 кДа, соответствующую эндогенной дзэта-цепи CD3, присутствующей в клетках) (Фигура 12B). Результаты продемонстрировали сопоставимые степени трансдукции и экспрессии белка CAR для каждой из различных, содержащих человеческий scFv, конструкций CAR (включающих VH-VL и VL-VH ориентации) и контрольных (мышиных, FMC63-производных) конструкций CAR в популяциях первичных Т-клеток. В клетках, не подвергнутых трансдукции, экспрессии EGFRt не обнаруживали. Результаты вестерн-блоттинга подтвердили, что CAR, полученный из клона 76, в VH-VL ориентации, присутствовал в различных гликозилированных формах.
+
+
[0441] Как показано на Фигуре 12A, популяции Т-клеток были успешно обогащены трансформированными клетками (на уровне или близко к 100% EGFRt, как подтверждено результатами проточной цитометрии) при окрашивании антителом к EGFR, сортировке в проточном цитометре и стимуляции в присутствии облученных (8000 рад) клеток из линии CD19 B-лимфобластных клеток (B-LCL), по существу как описано в Yam et al. (2002) Mol. Ther. 5:479; WO2015/095895.
Пример 4: Оценка эффекторных функций Т-клеток, сконструированных для экспрессии химерного антигенного рецептора против CD19 (CAR)
in vitro
[0442] Полученные с помощью методов генной инженерии человеческие Т-клетки (CD8+ или CD4+), экспрессирующие различные CAR-рецепторы, содержащие человеческие scFv-фрагменты против CD19, полученные как описано в Примере 3, оценивали по различным следующим ответам после сокультивирования с CD19-экспрессирующими клетками.
A. Цитолитическая активность
[0443] CD19-экспрессирующие клетки-мишени инкубировали с CD8+ Т-клетками, экспрессирующими различные CAR-рецепторы, и отдельно с клетками, трансформированными одним EGFRt (отрицательный контроль). После инкубирования наблюдали лизис клеток-мишеней. В частности, исследовали лизис CD19-трансформированных клеток K562 (K562/CD19), клеток Raji (линия CD19+ В-клеточной лимфомы) и нетрансформированных контрольных клеток K562 (отрицательный контроль) (Фигура 13A), и первичных клеток хронического лимфолейкоза человека (ХЛЛ; Фигура 13B).
51
[0444] Клетки-мишени (K562/CD19 Raji, нетрансформированные контрольные клетки K562 или ХЛЛ) оставляли на ночь для мечения Cr. Меченые клетки промывали и инкубировали в трех повторностях с эффекторными Т-клетками (экспрессирующими CAR и отрицательными контрольными CD8+ клетками) с отношением эффекторных клеток к клеткам-мишеням (E:T) 30:1. Для измерения спонтанного лизиса, клетки-мишени инкубировали с равным объемом среды, но без эффекторных клеток, и определяли максимальный лизис после инкубирования клеток-мишеней с детергентом для полного лизиса клеток-мишеней. Супернатанты собирали для γ-радиометрии после 4-часового инкубирования. Процент специфического лизиса для условий эксперимента вычисляли как: [(Экспериментальное высвобождение - Спонтанное высвобождение)/(Максимальное высвобождение - Спонтанное высвобождение)]×100.
[0445] Результаты представлены на Фигуре 13A и 13B. Как показано на Фигуре 13A, рекомбинантные CD8+ Т-клетки, экспрессирующие различные CAR-рецепторы, содержащие человеческие scFv против CD19, показали антигенспецифическую цитолитическую активность против CD19+ клеток в сопоставимой степени, как клетки, экспрессирующие CAR-рецепторы, содержащие мышиный scFv против CD19 (FMC63). Такую цитотоксическую активность не наблюдали против контрольных клеток K562, не экспрессирующих CD19. Степень цитолитической активности, наблюдаемой для клеток, экспрессирующих CAR с человеческими scFv-фрагментами в VH-VL (HL) ориентации, как наблюдали, была сопоставимой или больше, чем наблюдаемая для клеток, экспрессирующих CAR, содержащий мышиный scFv. Степень цитолитической активности, наблюдаемой для клеток, экспрессирующих CAR с данным человеческим scFv в VH-VL (HL) ориентации, в целом превышала наблюдаемую для клеток, экспрессирующих CAR с соответствующим scFv в обратной VL-VH (LH) ориентации. Как показано на Фигуре 13B, также наблюдали результаты, также продемонстрировавшие антигенспецифическую цитолитическую активность против первичных человеческих клеток ХЛЛ у рекомбинантных CD8+ клеток, экспрессирующих различные CAR, содержащие человеческий scFv против CD19 (в ориентации VH-VL).
B. Высвобождение цитокинов

[0446] Высвобождение цитокинов оценивали после инкубирования CAR-экспрессирующих клеток с антиген-экспрессирующими и контрольными клетками-мишенями. Трансдуцированные CD8+ и CD4+ Т-клетки сокультивировали в трех повторностях с клетками-мишенями (K562, K562/CD19, Raji) с соотношением эффекторных клеток к клеткам-мишеням (E:T) 2:1. Секрецию цитокинов после сокультивирования трансдуцированных CD8+ клеток с первичными клетками хронического лимфолейкоза человека (ХЛЛ) также исследовали аналогичным образом. Сокультивируемые клетки инкубировали в течение приблизительно 24 часов, и затем собирали супернатанты для измерения IFN-γ (CD8+ клетки) или IFN-γ, ФНО-α или IL-2 (CD4+ клетки) при использовании мультиплексного иммуноанализа цитокинов (Luminex).
[0447] Результаты для CD8+ клеток представлены на Фигурах 14A и 14B. Рекомбинантные CD8+ Т-клетки, экспрессирующие различные CAR-рецепторы, содержащие человеческий scFv против CD19, как наблюдали, секретировали IFN-γ антигенспецифически, после инкубирования с CD19+ клетками, в сопоставимой степени, как наблюдали для клеток, экспрессирующих CAR-рецепторы, содержащие мышиный scFv против CD19 (FMC63). Секрецию цитокинов не наблюдали после инкубирования контрольных клеток K562, не экспрессирующих CD19. Уровни секреции цитокинов, наблюдаемые для клеток, экспрессирующих CAR-рецепторы с протестированными человеческими scFv-фрагментами против CD19 в VH-VL ориентации, были сопоставимыми и, в некоторых случаях, превышали наблюдаемые для клеток, экспрессирующих CAR, содержащий мышиный scFv против CD19. Степень секреции IFNγ, наблюдаемая для клеток, экспрессирующих CAR с данным человеческим scFv в VH-VL ориентации, в целом превышала наблюдаемую для клеток, экспрессирующих CAR с соответствующим scFv в обратной (VL-VH) ориентации. Как показано на Фигуре 14B, антигенспецифическую секрецию цитокинов CD8+ рекомбинантными Т-клетками, экспрессирующими различные CAR-рецепторы, содержащие человеческие scFv против CD19 (в VH-VL ориентации), также наблюдали после сокультивирования с клетками ХЛЛ.
[0448] Результаты для CD4+ CAR-экспрессирующих Т-клеток приведены на Фигуре 15. Рекомбинантные CD4+ Т-клетки, экспрессирующие различные CAR-рецепторы, содержащие человеческие scFv против CD19 (в VH-VL ориентации), как наблюдали, секретировали цитокины антигенспецифически после инкубирования с CD19+ клетками-мишенями, на уровнях, сопоставимых и в целом превышающих наблюдаемые для клеток, экспрессирующих CAR, содержащий мышиный scFv (FMC63). Секрецию цитокинов не наблюдали после CD19-отрицательных контрольных клеток.
C. Пролиферация Т-клеток
[0449] Пролиферацию различных CAR-экспрессирующих Т-клеток после инкубирования с CD19-экспрессирующими клетками-мишенями оценивали с помощью проточной цитометрии. CD8+ или CD4+ CAR-экспрессирующие Т-клетки метили 0,2 мкМ карбоксифлуоресцеин сукцинимидилового сложного эфира (CFSE). Клетки промывали и культивировали в течение 72 часов в трех повторностях с клетками-мишенями (K562, K562/CD19 или Raji) в содержащей сыворотку среде без экзогенных цитокинов. Деление живых Т-клеток было показано при разведении CFSE, согласно результатам проточной цитометрии.
[0450] Результаты представлены на Фигуре 16A и 16B для CD8+ CAR-экспрессирующих Т-клеток и CD4+ CAR-экспрессирующих Т-клеток, соответственно. Как показано на Фигуре 16A, CD8+ Т-клетки, экспрессирующие каждую из протестированных конструкций CAR, содержащих человеческие scFv против CD19, подвергали пролиферации после сокультивирования с CD19-экспрессирующими K562/CD19 или Raji клетками-мишенями, но обычно не с контрольными клетками K562. Степень пролиферации, наблюдаемую для Т-клеток, экспрессирующих CAR-рецепторы с протестированным человеческим scFv против CD19, была сопоставима с наблюдаемой для клеток, экспрессирующих CAR, содержащий мышиный scFv против CD19. Степень пролиферации клеток, экспрессирующих CAR с данным человеческим scFv в VH-VL ориентации, как в целом наблюдали, превышала наблюдаемую для клеток, экспрессирующих CAR с соответствующим scFv в обратной (VL-VH) ориентации.
[0451] Антигенспецифическую пролиферацию CAR-экспрессирующих Т-клеток также наблюдали для CD4+ клеток. Как показано на Фигуре 16B, CD4+ Т-клетку, экспрессирующую каждую из протестированной конструкции CAR, содержащей человеческий scFv против CD19, размножали после сокультивирования с CD19-экспрессирующими K562/CD19 или Raji клетками-мишенями. Степень пролиферации, наблюдаемая для CD4+ Т-клеток, экспрессирующих CAR-рецепторы с протестированным человеческим scFv против CD19, была сопоставима с наблюдаемой для клеток, экспрессирующих CAR, содержащий мышиный scFv против CD19.
Пример 5: Противоопухолевое действие CAR-экспрессирующих Т-клеток после адоптивного переноса
in vivo
scid
tm1Wjl
6
6
[0452] Противоопухолевое действие CAR-экспрессирующих рекомбинантных первичных человеческих Т-клеток оценивали при мониторинге опухолей после адоптивного переноса клеток в модели полученных от пациентов ксенотрансплантатных (PDX) опухолей на животных. Самкам мышей NOD.Cg.PrkdcIL2rg/SzJ (NSG) возрастом от шести до восьми недель вводили внутривенно (в/в) 0,5×10 опухолевых клеток лимфомы Raji, трансфицированных люциферазой светляка (Raji-ffluc). Приживление опухоли проводили в течение 6 дней и подтверждали при использовании биолюминесцентной визуализации. В день 7 мыши получали одну внутривенную (в/в) инъекцию субоптимальной дозы (1×10 CAR-экспрессирующих Т-клеток в данном исследовании) различных рекомбинантных первичных человеческих Т-клеток (только CD8+ клетки (Фигура 17A) или объединенные CD4+ и CD8+ клетки в отношении 1:1 (Фигура 17B)), описанных в Примере 3. В качестве контроля мышам вводили клетки, которые были трансдуцированы одним EGFRt (отрицательный контроль). Субоптимальную дозу использовали для лучшей визуализации различий в противоопухолевом действии.
2
[0453] Противоопухолевую активность адоптивно перенесенных CAR-экспрессирующих клеток отслеживали с помощью биолюминесцентной визуализации в дни 6, 9, 13, 20 27 и 34. Для биолюминесцентной визуализации мыши получали внутрибрюшинные (в/б) инъекции субстрата люциферина (CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA), ресуспендированного в PBS (15 мкг/г массы тела). Мышам делали анестезию и проводили визуализацию, по существу как описано в WO2015/095895. Определяли среднюю интесивность свечения (ф/с/см/ср).
[0454] Как показано на Фигурах 17A и 17B, опухоли у контрольных мышей продолжали расти в течение исследования после адоптивного переноса контрольных Т-клеток (только CD8+ клетки (Фигура 17A) или комбинации CD4+ и CD8+ клеток (Фигура 17B), трансдуцированных одним EGFRt). По сравнению с контрольными мышами, мыши, которым производили адоптивный перенос рекомбинантных Т-клеток, экспрессирующих каждый из различных протестированных CAR, содержащих scFv против CD19, как наблюдали, имели более низкую степень биолюминесцентного сигнала, что указывало на уменьшение размера опухоли в динамике и/или более низкую степень роста опухоли у обработанных животных. В целом, как показано на Фигуре 17A, адоптивный перенос CD8+ Т-клеток, экспрессирующих только протестированные CAR-рецепторы с человеческими scFv против CD19, привел к сравнительному уменьшению размера опухоли, по меньшей мере, в такой же степени, что и адоптивный перенос клеток, экспрессирующих CAR, содержащий мышиный scFv против CD19 (FMC63). Как показано на Фигуре 17B, адоптивный перенос комбинации CD8+ и CD4+ Т-клеток, экспрессирующих протестированные человеческие CAR-рецепторы против CD19, как наблюдали, уменьшал размер опухоли в динамике. Размер опухоли (как указано биолюминесцентным сигналом) после адоптивного переноса таких клеток, экспрессирующих человеческий CAR против CD19, как наблюдали, был сравнительно ниже, чем размер опухоли, обнаруженный после адоптивного переноса клеток, экспрессирующих CAR с мышиным scFv.
ПРИМЕР 6: Идентификация области в человеческом CD19, распознаваемой антителами против CD19
Macaca mulatta
[0455] CAR, содержащие некоторые антитела против CD19 (scFv-фрагменты), описанные в Примере 1, или мышиный scFv против CD19 (FMC63), оценивали на связывание с различными молекулами CD19. Клетки K562 были сконструированы для экспрессии (a) человеческого CD19 (имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 92), (b) CD19  (макака резуса (резуса)) (имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 139; рег. номер F7F486) или (c) одной из трех различных химерных молекул CD19 человека/резуса, V1, V2 и V3, которые содержали мембрано-проксимальные области, последовательности которых показаны на Фигуре 18A. Кроме области, показанной на Фигуре 18A, остальные области каждой химерной молекулы были идентичными по последовательности соответствующим областям CD19 резуса.
Химерный CD19 V1
[0456] : Мембрано-проксимальная область из 74 аминокислот, показанная на Фигуре 18A, химерной молекулы, обозначенной V1, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 140, которая была идентична последовательности соответствующей области (остатки 218-291) человеческой молекулы CD19, имеющей последовательность, представленную в SEQ ID NO: 92.
Химерный CD19 V2
[0457] : Мембрано-проксимальная область из 75 аминокислот, показанная на Фигуре 18A, химерной молекулы CD19, обозначенной V2, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 141. В этой области мембрано-проксимальная часть из 27 аминокислот была идентична по последовательности соответствующей части (остатки 265-291) человеческого CD19. Остальная часть показанной области была идентична по последовательности соответствующей части последовательности CD19 резуса, представленной в SEQ ID NO: 139. Положения в этой остальной части, содержащие замену или вставку по сравнению с соответствующей человеческой последовательностью, подчеркнуты.
Химерный CD19 V3
[0458] : Область из 74 аминокислот, показанная на Фигуре 18A, химерной молекулы, обозначенной V3 CD19, имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 142. В этой показанной области часть из 47 аминокислот была идентична по последовательности соответствующей части (остатки 218-264) последовательности CD19 человека, представленной в SEQ ID NO: 92. Остальная мембрано-проксимальная часть из 27 аминокислот была идентична по последовательности соответствующей части последовательности CD19 резуса, представленной в SEQ ID NO: 139. Положения в этой остальной части из 27 аминокислот, содержащие замену по сравнению с соответствующей человеческой последовательностью, подчеркнуты.
[0459] Первичные человеческие Т-клетки, экспрессирующие различные CAR-рецепторы, содержащие человеческие scFv против CD19, или CAR, содержащий мышиный scFv против CD19 (FMC63), получали, как описано в Примере 3, и сокультивировали с различными клетками-мишенями K562, трансфицированными молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими различные молекулы CD19, с отношением эффекторных клеток к клеткам-мишеням (E:T) 2:1. Клетки инкубировали в течение 24 часов и собирали супернатанты для измерения IFN-γ при использовании иммуноанализа цитокинов как индикатора функционального связывания CAR-рецепторов, содержащих scFv против CD19, с соответствующими молекулами CD19 на поверхности клеток-мишеней. Результаты показаны на Фигуре 18B.
[0460] Каждый из протестированных CAR-рецепторов против CD19 демонстрировал поддающиеся обнаружению уровни цитокина после сокультивирования с клетками, экспрессирующими молекулу CD19 человека (что указывает на функциональное связывание с ними), но не после сокультивирования с клетками, экспрессирующими CD19 резуса. Для каждого из протестированных CAR-рецепторов против CD19 наблюдали поддающиеся обнаружению уровни секреции после сокультивирования с клетками, экспрессирующими химерные молекулы резуса/человека, обозначенные V1 (вся мембрано-проксимальная область из 74 аминокислот, человеческая) и V3 (мембрано-проксимальная часть из 27 аминокислот, резуса), но не с клетками, экспрессирующими химерную молекулу резуса/человека, обозначенную V2 (мембрано-проксимальная часть из 27 аминокислот, человеческая).
[0461] Эти результаты показали, что, по меньшей мере, часть содержащего 32 аминокислоты фрагмента (SEQ ID NO: 143 (HPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLP) человеческой молекулы CD19 (соответствующей остаткам 218-249 из SEQ ID NO: 92), была важной для функционального связывания с CD19 каждого из проверенных CAR-рецепторов против CD19. В частности, тогда как каждая из V1 и V3 содержала указанную последовательность из 32 аминокислот (выделенную жирным шрифтом на Фигуре 18A), соответствующая часть V2 содержала аминокислотную последовательность из 33 остатков (RPKGPKSSLLSLELKDDRPDRDMWVVDTGLLLT), представленную в SEQ ID NO: 144, которая была идентична по последовательности соответствующей части молекулы CD19 резуса, но содержала пять аминокислотных замен (в положениях 218, 236, 242, 243 и 249 человеческой последовательности CD19, SEQ ID NO: 92) и одну вставку (между положениями 223 и 224 человеческой последовательности CD19, SEQ ID NO: 92) по сравнению с соответствующей человеческой последовательностью, каждая подчеркнута на Фигуре 18A. Таким образом, результаты указывают, что аминокислота(ы), присутствующая по меньшей мере в одном из указанных положений в человеческой последовательности (положения 218, 236, 242, 243, 249 и/или 223-224 в SEQ ID NO: 92), была важной для способности каждого протестированного CAR специфично связываться с человеческим CD19. Таким образом, результаты подтверждают вывод, что каждый из протестированных CAR-рецепторов, содержащих человеческие scFv, связывался с подобным и/или перекрывающимся эпитопом в сравнении с CAR, содержащим мышиный scFv, FMC63.
[0462] Объем настоящего изобретения не должно ограничиваться конкретными раскрытыми вариантами осуществления, которые представлены, например, для иллюстрации различных аспектов изобретения. Различные модификации описанных композиций и способов станут очевидными из описания и принципов, представленных в настоящем документе. Такие изменения могут быть осуществлены на практике без отступления от фактического объема и сущности настоящего описания и, как предполагается, включены в объем настоящего описания.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
[0463]
<b>ТАБЛИЦА 9</b>
SEQ ID NO.
Последовательность
Описание
1
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGCTTTCCTGGACAATCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCACCAGTGATGATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCCAACTTATGCTTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCCGGGGTCCCTCATCGCTTCTCTGGCTCCAGGTCTGGCAGAGCGGCCTCCCTGATCATCTCTGGGCTCCAGACTGAGGATGAGGCTGATTATTTCTGCTGCTCATATGCAGGCCGATACAACTCTGTCCTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
Клон 18 scFv (нт)
2
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCCSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL
Клон 18 scFv (ак)
3
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGCTTTCCTGGACAATCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCACCAGTGATGATGTCTCCTGGTACCAACAACACCCAGGCAAAGCCCCCCAACTTATGCTTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCCGGGGTCCCTCATCGCTTCTCTGGCTCCAGGTCTGGCAGAGCGGCCTCCCTGATCATCTCTGGGCTCCAGACTGAGGATGAGGCTGATTATTTCTGCAGCTCATATGCAGGCCGATACAACTCTGTCCTTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
Клон 18B scFv (нт)
4
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCSSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL
Клон 18B scFv (ак)
5
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTTCTGCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTC
Клон 17 scFv (нт)
6
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITIFCTGTSSDVGGYNYVSWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSVVFGGGTKLTVL
Клон 17 scFv (ак)
7
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGGAGGTCACCATCTCCTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAACTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATGATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGGAACATGGGATGGCAATCTGAGTGCTGTATTCGGCGGAGGGACCAAGGTGACCGTCCTA
Клон 76 scFv (нт)
8
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQEVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNDKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDGNLSAVFGGGTKVTVL
Клон 76 scFv (ак)
9
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGTCCTATGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGGATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCAGGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGATAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGACCGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCGGAAGATGAGGCTGACTACTACTGCAACTCCCGGGACAGCAGTGGTAACAATTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
Клон 5 scFv (нт)
10
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYDKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNNWVFGGGTKLTVL
Клон 5 scFv (ак)
11
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VH(клоны 18, 18B обратный, 76, 285)(ак)
12
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSS
VH (клоны 17, 5, 1, 192)(ак)
13
QSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCCSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL
VL Клон 18 (ак)
14
QSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCSSYAGRYNSVLFGGGTKLTVL
VL, Клон 18B(ак)
15
QSALTQPASVSGSPGQSITIFCTGTSSDVGGYNYVSWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSVVFGGGTKLTVL
VL, Клон 17 (ак)
16
QSVLTQPPSVSAAPGQEVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNDKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDGNLSAVFGGGTKVTVL
VL, Клон 76 (ак)
17
SYELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYDKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNNWVFGGGTKLTVL
VL, Клон 5 (ак)
18
DYAMH
CDR-H1 (ак)
19
GISWNSGRIGYADSVKG
CDR-H2 (ак)
20
DQGYHYYDSAEHAFDI
CDR-H3 (ак)
21
TGTTSDDVS
Клоны 18, 18B CDR-L1 (ак)
22
DVSKRPS
Клоны 18, 18B CDR-L2 (ак)
23
CSYAGRYNSVL
Клон 18 CDR-L3 (ак)
24
SSYAGRYNSVL
Клон 18B CDR-L3 (ак)
25
TGTSSDVGGYNYVS
Клон 17 CDR-L1 (ак)
26
SNNQRPS
Клон 17 CDR-L2 (ак)
27
AAWDDSLSVV
Клон 17 CDR-L3 (ак)
28
SGSSSNIGNNYVS
Клон 76 CDR-L1 (ак)
29
DNDKRPS
Клон 76 CDR-L2 (ак)
30
GTWDGNLSAV
Клон 76 CDR-L3 (ак)
31
QGDSLRSYYAS
Клон 5 CDR-L1 (ак)
32
DKNNRPS
Клон 5 CDR-L2 (ак)
33
NSRDSSGNNWV
Клон 5 CDR-L3 (ак)
34
GGGGSGGGGSGGGGS
Линкер (ак)
35
GISWNSGRIGY
CDR-H2
36
X<sub>1</sub>GX<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>13</sub>SX<sub>1</sub>=T, S или Q; X<sub>3</sub>=T, S или D; X<sub>4</sub>=T или S; X<sub>5</sub>=отсутствует или S; X<sub>6</sub>=отсутствует, D или N; X<sub>7</sub>=отсутствует или V; X<sub>8</sub>=отсутствует, G или I; X<sub>9</sub>=отсутствует, G или R; X<sub>10</sub>=S, Y или N; X<sub>11</sub>=D или N; X<sub>12</sub>=D или Y; X<sub>13</sub>=V или A
CDR-L1 консенсус
37
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>RPSX<sub>1</sub>=D или S; X<sub>2</sub>=V, N или K; X<sub>3</sub>=S, N или D; X4=K, Q или N
CDR-L2 консенсус
38
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>1</sub>=C, S, A, G или N; X<sub>2</sub>=S, A или T; X<sub>3</sub>=Y, W или R; X<sub>4</sub>=A или D; X<sub>5</sub>=G, D или S; X<sub>6</sub>=R, S или N; X<sub>7</sub>=Y, L или G; X<sub>8</sub>=N или S; X<sub>9</sub>=S или отсутствует; X<sub>10</sub>=V, A или N; X<sub>11</sub>=W или отсутствует;X<sub>12</sub>=L или V.
CDR-L3
39
EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
FMC63 VH
40
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT
FMC63VL
41
EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTVTVSS
SJ25C1VH
42
DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEI
SJ25C1 VL
43
GSTSGSGKPGSGEGSTKG
Линкер
44
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAGACCGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTATTAACCACTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCCGGCTCCTCATCTATGATGCCTCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTCACCCTCGAATGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAACTGGATATCAAA
Клон 488 scFv (нт)
45
EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGETATLSCRASQSINHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSHPRMYTFGQGTKLDIK
Клон 488 scFv (ак)
46
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCCATCCGGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCGTCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAGAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATGTGAAAGCAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGGGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCAGGCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
Клон 1304 scFv (нт)
47
QMQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIRMTQSPSSLSASVGDRVTVTCQASQDISNYLNWYQQKPGRAPKLLIYDASNVKAGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQAYTFGQGTKLEIK
Клон 1304 scFv (ак)
48
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGACCTTGGTGGTTACAATTATGTCTCCTGGTATCAACACCGCCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATCATTTATGATGTCACTGTTCGGCCCTCAGGGGTTTCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCGGCTCATATACAAGCAGTAGCACTCTTCTTTGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTCACCGTCCTA
Клон 285 scFv (нт)
49
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
Клон 285 scFv (ак)
50
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTGCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAATCAGCAGTGGTGTTGATAGTCATAGGTATGTCTCCTGGTACCAACACCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATTTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGTTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTACTATTGCAGCTCATATGCAGCCATCTCCCCTAATTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGCTCACCGTCCTA
Клон 192B scFv (нт)
51
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPRSVSGSPGQSVTISCTGISSGVDSHRYVSWYQHHPGKAPKLMIYDFSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAAISPNYVFGTGTKLTVL
Клон 192B scFv (ак)
52
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACATTCGATCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGAAGTGACGTCGGTGGTTTTGATTATGTCTCCTGGTACCAGCATAACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATAATTTATGATGTCACTAAGCGGCCCTCAGGGGTCTCTAATCGCTTCTCTGGCGCCAAGTCTGGCATCACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCACCTCATATAGACCCGGTCCAACATTTGTCTTCGGCACCGGGACCAAGCTCACCGTCCTA
Клон 328 scFv (нт)
53
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGHSITISCTGTRSDVGGFDYVSWYQHNPGKAPKLIIYDVTKRPSGVSNRFSGAKSGITASLTISGLQAEDEADYYCTSYRPGPTFVFGTGTKLTVL
Клон 328 scFv (ак)
54
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGGTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATTTGGAAACAGGGGTCCCATCCAGGTTCAGTGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTTACTTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATATTGCAACATATTACTGTCAACAGTATGATAATCTCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
Клон 227 scFv (нт)
55
EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
Клон 227 scFv (ак)
56
CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCCATCCGGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTGGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGCATTAGTCACTACTTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTTTGATGCCTCCCGTTTGGCAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCGACATACTACTGTCAACAGAGTTACGGTGCCCCTATGTTCACTTTCGGCCCTGGGACCAGAGTGGATCTCAAA
Клон 1300 scFv (нт)
57
QMQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIRMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISHYLAWYQQKPGKAPKLLIFDASRLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGAPMFTFGPGTRVDLK
Клон 1300 scFv (ак)
58
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACAGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCCCGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCTGCACTGGGACCAGCAGTGACGTTGGTGCTTATAACTTTGTCTCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACAGCCCCCAAATTCCTCATTTATGACAATAATAAACGACCCCCAGGGATTCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCCGATTATTACTGCGCAACATGGGATAGCGGCCTGAGTGCTGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
Клон 1 scFv (нт)
59
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNFVSWYQQLPGTAPKFLIYDNNKRPPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCATWDSGLSAVVFGGGTKLTVL
Клон 1 scFv (ак)
60
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSS
VHКлон 192B(ак)
61
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 328(ак)
62
QMQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 1304Клон 1300(ак)
63
EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлоны 227, 488, 241(ак)
64
QAVLTQPRSVSGSPGQSVTISCTGISSGVDSHRYVSWYQHHPGKAPKLMIYDFSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAAISPNYVFGTGTKLTVL
VLКлон 192B(ак)
65
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
VLКлон 285(ак)
66
QSALTQPASVSGSPGHSITISCTGTRSDVGGFDYVSWYQHNPGKAPKLIIYDVTKRPSGVSNRFSGAKSGITASLTISGLQAEDEADYYCTSYRPGPTFVFGTGTKLTVL
VLКлон 328(ак)
67
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGAYNFVSWYQQLPGTAPKFLIYDNNKRPPGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCATWDSGLSAVVFGGGTKLTVL
VLКлон 1(ак)
68
AIRMTQSPSSLSASVGDRVTVTCQASQDISNYLNWYQQKPGRAPKLLIYDASNVKAGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQAYTFGQGTKLEIK
VLКлон 1304(ак)
69
AIRMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISHYLAWYQQKPGKAPKLLIFDASRLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGAPMFTFGPGTRVDLK
VLКлон 1300(ак)
70
DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGGGTKVEIK
VLКлон 227(ак)
71
EIVLTQSPATLSLSPGETATLSCRASQSINHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSHPRMYTFGQGTKLDIK
VLКлон 488(ак)
72
GISWNSGSIGYADSVKG
CDR-H2Клон 1304Клон 1300Клон 227Клон 488Клон 241(ак)
73
TGISSGVDSHRYVS
CDR-L1Клон 192BКлон 192(ак)
74
TGTSSDLGGYNYVS
CDR-L1Клон 285(ак)
75
TGTRSDVGGFDYVS
CDR-L1Клон 328(ак)
76
TGTSSDVGAYNFVS
CDR-L1Клон 1(ак)
77
QASQDISNYLN
CDR-L1Клон 1304Клон 241(ак)
78
RASQSISHYLA
CDR-L1Клон 1300(ак)
79
RASQSISRWLA
CDR-L1Клон 227(ак)
80
RASQSINHYLA
CDR-L1Клон 488(ак)
81
GISWNSGRIG
CDR-H2
82
GISWNSGSIG
CDR-H2
83
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>13</sub>X<sub>14</sub>X<sub>1</sub>=T, Q или R; X<sub>2</sub>=G или A; X<sub>3</sub>=I, T или S; X<sub>4</sub>=S, R или Q; X<sub>5</sub>=отсутствует или S; X<sub>6</sub>=отсутствует, D или G; X<sub>7</sub>=отсутствует, V или L; X<sub>8</sub>=D, G или S; X<sub>9</sub>=S, G, A или I; X<sub>10</sub>=H, Y, F, S или N; X<sub>11</sub>=R, N, D или H; X<sub>12</sub>=Y, F или W; X<sub>13</sub>=V или L; X<sub>14</sub>=S, N или A
CDR-L1Консенсус
84
DX<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>2</sub>=F, V, N или A; X<sub>3</sub>=S, T или N; X<sub>4</sub>=K, V, N или R; X<sub>5</sub> =R, V или L; X<sub>6</sub>=P, K, A или E; X<sub>7</sub>=S, P, A или T
CDR-L2Консенсус
85
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>13</sub>X<sub>14</sub>X<sub>1</sub>=S, G, T, A или Q; X<sub>2</sub>=S, T или Q; X<sub>3</sub>=Y, W или S; X<sub>4</sub>=A, T, R, D или Y; X<sub>5</sub>=A, S, P, G или N; X<sub>6</sub>=I, S, G, T, L, A или H; X<sub>7</sub>=S, P или L; X<sub>8</sub>=P, T, S, Q, M, R или отсутствует; X<sub>9</sub>=N, L, A, M или отсутствует; X<sub>10</sub>=L или отсутствует; X<sub>11</sub>=Y, W, F, V или L; X<sub>12</sub>=V или T
CDR-L3Консенсус
86
GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGGATAGGCTATGCGGACTCTGTAAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGCAGGCTGTGCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAATCAGCAGTGGTGTTGATAGTCATAGGTATGTCTCCTGGTACCAACACCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATTTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGTTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTACTATTGCTGCTCATATGCAGCCATCTCCCCTAATTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTA
Клон 192 scFv (нт)
87
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPRSVSGSPGQSVTISCTGISSGVDSHRYVSWYQHHPGKAPKLMIYDFSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAAISPNYVFGTGTKLTVL
Клон 192 scFv (ак)
88
GAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCAGGGGTATCATTACTATGATAGTGCCGAACATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAGTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGCCATCCGGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCGTCACTTGCCAGGCGAGTCAGGACATTAGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAGAGCCCCTAAGCTCCTGATCTACGATGCATCCAATGTGAAAGCAGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGGGGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCAGGCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGATATCAAA
Клон 241 scFv (нт)
89
EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIRMTQSPSSLSASVGDRVTVTCQASQDISNYLNWYQQKPGRAPKLLIYDASNVKAGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQAYTFGQGTKLDIK
Клон 241 scFv (ак)
90
AIRMTQSPSSLSASVGDRVTVTCQASQDISNYLNWYQQKPGRAPKLLIYDASNVKAGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQAYTFGQGTKLDIK
VLКлон 241 (ак)
91
QAVLTQPRSVSGSPGQSVTISCTGISSGVDSHRYVSWYQHHPGKAPKLMIYDFSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAAISPNYVFGTGTKLTVL
VL Клон 192
92
MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR
CD19Рег. номер P15391
<i>Homo Sapiens</i>
93
DFSKRPS
CDR-L2Клон 192B, Клон 192
94
DVTVRPS
CDR-L2Клон 285
95
DVTKRPS
CDR-L2Клон 328
96
DNNKRPP
CDR-L2Клон 1
97
DASNVKA
CDR-L2Клон 1304Клон 241
98
DASRLAS
CDR-L2Клон 1300
99
DASNLET
CDR-L2Клон 227
100
DASNRAT
CDR-L2Клон 488
101
SSYAAISPNYV
CDR-L3Клон 192B
102
CSYAAISPNYV
CDR-L3Клон 192
103
GSYTSSSTLLWV
CDR-L3Клон 285
104
TSYRPGPTFV
CDR-L3Клон 328
105
ATWDSGLSAVV
CDR-L3Клон 1
106
QQSYSTPQAYT
CDR-L3Клон 1304Клон 241
107
QQSYGAPMFT
CDR-L3Клон 1300
108
QQYDNLPLT
CDR-L3Клон 227
109
QQSYSHPRMYT
CDR-L3Клон 488
110
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>13</sub>X<sub>14</sub>X<sub>1</sub>=T, Q, S или R;X<sub>2</sub>=G или A;X<sub>3</sub>=I, T, D или S;X<sub>4</sub>=S, R, T или Q;X<sub>5</sub>=отсутствует или S;X<sub>6</sub>=отсутствует, D, D или G;X<sub>7</sub>=отсутствует, V или L;X<sub>8</sub>=X или отсутствует;X<sub>9</sub>=X или отсутствует;X<sub>10</sub>=X;X<sub>11</sub>=X;X<sub>12</sub>=Y, F, D или W;X<sub>13</sub>=V, A или L;X<sub>14</sub>=S, N или A
CDR-L1 консенсус
111
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>13</sub>X<sub>14</sub>X<sub>1</sub>=T, Q, S или R;X<sub>2</sub>=G или A;X<sub>3</sub>=I, T, D или S;X<sub>4</sub>=S, R, T или Q;X<sub>5</sub>=отсутствует или S;X<sub>6</sub>=G, D, N или отсутствует;X<sub>7</sub>=отсутствует, V или L;X<sub>8</sub>=D, G, I, L, S или отсутствует;X<sub>9</sub>=S, G, A, I, R или отсутствует;X<sub>10</sub>=H, Y, F, S или N;X<sub>11</sub>=R, N, D, H или Y;X<sub>12</sub>=Y, F, D или W;X<sub>13</sub>=V, A или L;X<sub>14</sub>=S, N или A
CDR-L1 консенсус
112
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>1</sub>=D или S;X<sub>2</sub>=F, V, N, K или A;X<sub>3</sub>=S, T, D или N;X<sub>4</sub>=K, V, N, Q или R;X<sub>5</sub> =R, V или L;X<sub>6</sub>=P, K, A или E;X<sub>7</sub>=S, P, A или T
CDR-L2Консенсус
113
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>1</sub>=C, S, A, G или N;X<sub>2</sub>=S, A или T;X<sub>3</sub>=Y, W или R;X<sub>4</sub>=A или D;X<sub>5</sub>=G, D или S;X<sub>6</sub>=R, S или N;X<sub>7</sub>=Y, L или G;X<sub>8</sub>=N или S;X<sub>9</sub>=S, N или отсутствует;X<sub>10</sub> =отсутствует;X<sub>11</sub>=V, A или W;X<sub>12</sub>=L или V.
CDR-L3
114
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>1</sub>= S, G, T, A, Q, C или N;X<sub>2</sub>= S, Q, A или T;X<sub>3</sub>= Y, S, W, R;X<sub>4</sub>= A, D, R, T или Y;X<sub>5</sub>= A, S, P, G, N или D;X<sub>6</sub>= I, S, G, T, A, L, H, R, N;X<sub>7</sub>= S, P, L, Y, G;X<sub>8</sub>= P, T, S, Q, M, R, N или отсутствуетX<sub>9</sub>= S, L, N, A, M или отсутствует;X<sub>10</sub>= L или отсутствует;X<sub>11</sub>= Y, W, F, V, A или L;X<sub>12</sub>= V, T или L
CDR-L3 консенсус
115
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>1</sub>= X;X<sub>2</sub>= S, Q, A или T;X<sub>3</sub>= Y, S, W, R;X<sub>4</sub>= A, D, R, T или Y;X<sub>5</sub>= XX<sub>6</sub>= XX<sub>7</sub>= S, P, L, Y, G;X<sub>8</sub>= X или отсутствуетX<sub>9</sub>= X или отсутствуетX<sub>10</sub>= L или отсутствует;X<sub>11</sub>= XX<sub>12</sub>= V, T или L
CDR-L3 консенсус
116
GTWDISLRFGV
CDR-L3Клон 79
117
CSYEAPTHTYV
CDR-L3Клон 835
118
AAWDDSLNVV
CDR-L3Клон 184
119
CSYAGSYTFEV
CDR-L3Клон 505
120
CSFAGYYTYWL
CDR-L3Клон 506
121
SSXAGRKYV
CDR-L3Клон 305
122
GGGS
Линкерискусственный
123
GGGGS
Линкерискусственный
124
ESKYGPPCPPCP
спейсер (шарнир IgG4) (ак)
<i>Homo sapiens</i>
125
GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT
спейсер (шарнир IgG4) (нт)
<i>Homo sapiens</i>
126
ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Шарнир-CH3 спейсер
<i>Homo sapiens</i>
127
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
Шарнир-CH2-CH3 спейсер
<i>Homo sapiens</i>
128
RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH
IgD-шарнир-Fc
<i>Homo sapiens</i>
129
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
CD28 (аминокислоты 153-179 из Рег. номер P10747)
<i>Homo sapiens</i>
130
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
CD28 (аминокислоты 114-179 из Рег. номер P10747)
<i>Homo sapiens</i><i>Homo sapiens</i>
131
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD28 (аминокислоты 180-220 из P10747)
<i>Homo sapiens</i>
132
RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
CD28 (LL→GG)
<i>Homo sapiens</i>
133
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
4-1BB (аминокислоты 214-255 из Q07011.1)
<i>Homo sapiens</i>
134
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN ELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALP PR
CD3 дзэта
<i>Homo sapiens</i>
135
RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN ELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALP PR
CD3 дзэта
<i>Homo sapiens</i>
136
RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYN ELQKDKMAEA YSEIGMKGER RRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALP PR
CD3 дзэта
<i>Homo sapiens</i>
137
LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR
T2Aискусственный
138
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM
tEGFRискусственный
139
MPPPCLLFFLLFLTPMEVRPQEPLVVKVEEGDNAVLQCLEGTSDGPTQQLVWCRDSPFEPFLNLSLGLPGMGIRMGPLGIWLLIFNVSNQTGGFYLCQPGLPSEKAWQPGWTVSVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLNSSQLYVWAKDRPEMWEGEPVCGPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVRPKGPKSSLLSLELKDDRPDRDMWVVDTGLLLTRATAQDAGKYYCHRGNWTKSFYLEITARPALWHWLLRIGGWKVPAVTLTYLIFCLCSLVGILQLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQVDGAVGSRSPPGAGPEEEEGEGYEEPDSEEGSEFYENDSNFGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGLLYAAPQLRTIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSAR
CD19 макака-резусаРег. номер F7F486
140
HPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK
химерный V1, резус/человек, соответствует остаткам 218-291 CD19 человека
141
RPKGPKSSLLSLELKDDRPDRDMWVVDTGLLLTRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWK
химерный V2, резус/человек, соответствует остаткам 218-291 CD19 человека
142
HPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNWTKSFYLEITARPALWHWLLRIGGWK
химерный V3, резус/человек, соответствует остаткам 218-291 CD19 человека
143
HPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLP
Искусственный
144
RPKGPKSSLLSLELKDDRPDRDMWVVDTGLLLT
Искусственный
145
DQGXHXYDSAEHAFXI
CDR-H3клон 305
146
QASQDISNYLN
CDR-L1Клон 255
147
TGTGRDIGAYDYVS
CDR-L1Клон 305
148
TETSSDLGGYNYVS
CDR-L1Клон 327
149
TGASTDVGGYNYVS
CDR-L1Клон 505
150
TGASSDVGGYDHVS
CDR-L1Клон 506
151
SGSSSNIGSNTVN
CDR-L1Клон 184
152
TGPISGVGDYTSVS
CDR-L1Клон 835
153
DNNKRPS
CDR-L2Клон 272
154
GVNKRPS
CDR-L2Клон 305
155
DVNKRPS
CDR-L2Клон 505
156
DNNKRPS
CDR-L2Клон 79
157
DVTQRPS
CDR-L2Клон 835
158
GTWDSSLNRDWV
CDR-L3Клон 272
159
CSYAGRYNSVP
CDR-L3Клон 508
160
TSGVGVG
CDR-H1Клон 1265
161
LIYWDDDKRYSPSLKS
CDR-H2Клон 1265
162
IDYGSGSYSPRTSYYYYMSV
CDR-H3Клон 1265
163
RASQGISSYLN
CDR-L1Клон 1265
164
AASNLQS
CDR-L2Клон 1265
165
QQGDAFPLT
CDR-L3Клон 1265
166
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHIDYGSGSYSPRTSYYYYMSVWGKGTTVTVSS
VHКлон 1265
167
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 213
168
EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 255
169
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 272
170
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 283
171
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 302
172
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSXXGRXXISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAXYYCAXDQGXHXYDSAEHAFXIWGQGTVVTVSS
VHКлон 305
173
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 314
174
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 379
175
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 324
176
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAXNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 327
177
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 336
178
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 440
179
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 448
180
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSS
VHКлон 505
181
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSS
VHКлон 506
182
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 508
183
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSS
VHКлон 184
184
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSS
VHКлон 79
185
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRLAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAKDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSS
VHКлон 835
186
AIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLNWYQQRAGKAPELLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSVQPEDFATYFCQQGDAFPLTFGPGTKVTIR
VLКлон 1265
187
EIVLTQSPATLSLSPGETATLSCRASQSINHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSHPRMYTFGQGTKLEIK
VLКлон 213
188
AIRMTQSPSSLSASVGDRVTVTCQASQDISNYLNWYQQKPGRAPKLLIYDASNVKAGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQAYTFGQGTKLDIK
VLКлон 255
189
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLNRDWVFGGGTKLTVL
VLКлон 272
190
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
VLКлон 283
191
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
VLКлон 302
192
QSVLXXPXXASGSPGQSVTVSCTGTGRDIGAYDYVSWYQQHPGKAPKLLIYGVNKRPSGVPDRFSGSKSDNTASLTVSGLQVEDEADYYCSSXAGRKYVFGTGXKVTVL
VLКлон 305
193
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
VLКлон 314
194
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
VLКлон 379
195
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
VLКлон 324
196
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTETSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVXDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
VLКлон 327
197
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
VLКлон 336
198
QSALTQPASVSGSPGHSITISCTGTRSDVGGFDYVSWYQHNPGKAPKLIIYDVTKRPSGVSNRFSGAKSGITASLTISGLQAEDEADYYCTSYRPGPTFVFGTGTKLDIK
VLКлон 440
199
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLDIK
VLКлон 448
200
QSVLTQPRSLSGSPGQSVTIACTGASTDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVPDRFSGSKSGNTAFLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTFEVFGGGTKLTVL
VLКлон 505
201
QLVLTQPPSVSGSPGQSVTFSCTGASSDVGGYDHVSWYQHHPGKGPKLLIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSFAGYYTYWLFGGGTKVTVL
VLКлон 506
202
QSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCCSYAGRYNSVPFGGGTKLTVL
VLКлон 508
203
SYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLNVV
VLКлон 184
204
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEGDYYCGTWDISLRFGVFGGGTKVTVL
VLКлон 79
205
QSVLTQPRSVSGSPGQSVTISCTGPISGVGDYTSVSWYQHYPGKTPKLIIYDVTQRPSGVPNRFSGSKSGNTASLTISGLQADDEADYYCCSYEAPTHTYVFGTGTKLTVL
VLКлон 835
206
QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYWDDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAHIDYGSGSYSPRTSYYYYMSVWGKGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLNWYQQRAGKAPELLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTITSVQPEDFATYFCQQGDAFPLTFGPGTKVTIR
scFvКлон 1265
207
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPATLSLSPGETATLSCRASQSINHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQSYSHPRMYTFGQGTKLEIK
scFvКлон 213
208
EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIRMTQSPSSLSASVGDRVTVTCQASQDISNYLNWYQQKPGRAPKLLIYDASNVKAGVPSRFSGGGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQAYTFGQGTKLDIK
scFvКлон 255
209
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLNRDWVFGGGTKLTVL
scFvКлон 272
210
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
scFvКлон 283
211
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
scFvКлон 302
212
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSXXGRXXISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAXYYCAXDQGXHXYDSAEHAFXIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLXXPXXASGSPGQSVTVSCTGTGRDIGAYDYVSWYQQHPGKAPKLLIYGVNKRPSGVPDRFSGSKSDNTASLTVSGLQVEDEADYYCSSXAGRKYVFGTGXKVTVL
scFvКлон 305
213
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
scFvКлон 314
214
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
scFvКлон 379
215
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
scFvКлон 324
216
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAXNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTETSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVXDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
scFvКлон 327
217
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLTVL
scFvКлон 336
218
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGHSITISCTGTRSDVGGFDYVSWYQHNPGKAPKLIIYDVTKRPSGVSNRFSGAKSGITASLTISGLQAEDEADYYCTSYRPGPTFVFGTGTKLDIK
scFvКлон 440
219
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDLGGYNYVSWYQHRPGKAPKLIIYDVTVRPSGVSDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCGSYTSSSTLLWVFGGGTKLDIK
scFvКлон 448
220
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSSQSVLTQPRSLSGSPGQSVTIACTGASTDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVNKRPSGVPDRFSGSKSGNTAFLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTFEVFGGGTKLTVL
scFvКлон 505
221
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQLVLTQPPSVSGSPGQSVTFSCTGASSDVGGYDHVSWYQHHPGKGPKLLIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSFAGYYTYWLFGGGTKVTVL
scFvКлон 506
222
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPRSVSGFPGQSVTISCTGTTSDDVSWYQQHPGKAPQLMLYDVSKRPSGVPHRFSGSRSGRAASLIISGLQTEDEADYFCCSYAGRYNSVPFGGGTKLTVL
scFvКлон 508
223
QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQFPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEAEYYCAAWDDSLNVV
scFvКлон 184
224
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTVVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEGDYYCGTWDISLRFGVFGGGTKVTVL
scFvКлон 79
225
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRLAPGKGLEWVSGISWNSGRIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAKDTAVYYCARDQGYHYYDSAEHAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQPRSVSGSPGQSVTISCTGPISGVGDYTSVSWYQHYPGKTPKLIIYDVTQRPSGVPNRFSGSKSGNTASLTISGLQADDEADYYCCSYEAPTHTYVFGTGTKLTVL
scFvКлон 835
226
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>13</sub>X<sub>14</sub>X<sub>1</sub>= T, Q, R или S;X<sub>2</sub>= G, A или E;X<sub>3</sub>= I, T, S, D, A или P;X<sub>4</sub>= S, R, Q, G или I;X<sub>5</sub>= отсутствует, S, R или T;X<sub>6</sub>= G, D, N или отсутствует;X<sub>7</sub>= V, L, отсутствует или I;X<sub>8</sub>= D, G, S, I, L или отсутствует;X<sub>9</sub>= S, G, A, I, отсутствует или D;X<sub>10</sub>= H, Y, F, S или N;X<sub>11</sub>= R, N, D, H, Y или T;X<sub>12</sub>= Y, F, W, D, H, T или S;X<sub>13</sub>= V, A или L;X<sub>14</sub>= S, N или A
CDR-L1консенсус
227
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>1</sub>= D, S или G;X<sub>2</sub>= F, V, N, K или A;X<sub>3</sub>= S, T, N или D;X<sub>4</sub>= K, V, N, R или Q;X<sub>5</sub>= R, V или L;X<sub>6</sub>= P, K, A или E;X<sub>7</sub>= S, P, A или T
CDR-L2консенсус
228
X<sub>1</sub>X<sub>2</sub>X<sub>3</sub>X<sub>4</sub>X<sub>5</sub>X<sub>6</sub>X<sub>7</sub>X<sub>8</sub>X<sub>9</sub>X<sub>10</sub>X<sub>11</sub>X<sub>12</sub>X<sub>1</sub>= S, G, T, A, Q, C или N;X<sub>2</sub>= S, Q, A или T;X<sub>3</sub>= Y, S, W или R;X<sub>4</sub>= A, D, R, T или Y;X<sub>5</sub>= A, S, P, G, N или D;X<sub>6</sub>= I, S, G, T, A, L, H, R или N;X<sub>7</sub>= S, P, L, Y или G;X<sub>8</sub>= P, T, S, Q, M, R или N;X<sub>9</sub>= S, L, N, A, M, отсутствует или R;X<sub>10</sub>= L, отсутствует или D;X<sub>11</sub>= Y, W, F, V, A или L;X<sub>12</sub>= V, T, L или P
CDR-L3консенсус