Формирование полноценных зубов из биоинженерных эквивалентов

ИМИ!

Новости клеточных технологий

17

Результатами своего исследования авторы считают, в первую очередь, открытие факта, что белок Рах7 функционально не только координирует выживание и пролиферацию клеток-миосателлитов, но и предотвращает их дифференцировку и слияние в мышечное волокно, сохраняя потенциал к регенерации у клеток-миосателлитов. Также был определен критический период зависимости от Рах7 во время перехода от ми-осателлитоцитов к состоянию стволовых клеток, обеспечивающих скелетным мышцам способность к регенерации. Этот период у мышей заканчивается на 21 сут. после рождения. Показана неотъемлемая роль РахЗ и Рах7 для эмбриональных мышечных предшественников, и роль только одного Рах7 для перинатальных. Совершенно неожиданно оказалось, что взрослые клетки-

сателлиты не нуждаются ни в РахЗ, ни в Рах7 для осуществления процессов мышечной регенерации.

Авторы серьезно пошатнули господствующую концепцию о том, что «регенерация повторяет развитие». Изменения в генетической программе мышечных стволовых клеток при переходе от эмбриональной стадии к ювенильной и далее к стадии взрослого организма подталкивает к осторожности в применении знаний, полученных при эмбриональных исследованиях, к биологии стволовых клеток взрослых. Зависимые от возраста изменения в свойствах стволовых клеток убеждают в необходимости тщательного анализа возраста клеточного материала, используемого при трансплантациях в регенеративной медицине.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Relaix F., Rocancourt D., Mansouri A., Buckingham M.A. Pax3/Pax7-dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature 2005; 435: 948-53.

2. Charge S.B., Rudnicki M.A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 2004; 84: 209—38.

3. Seale P., Ishibashi J., Scime A., Rudnicki M.A. Pax7 is necessary and sufficient for the myogenic specification of CD451:Sca11 stem cells

from injured muscle. PLoS Biol. 2DD4; 2: E13D.

4. Kuang S., Charge S.B., Seale P., Huh M., Rudnicki M.A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J. Cell Biol. 2006; 172: 103-13.

5. Pastoret C., Sebille A. Age-related differences in regeneration of dystrophic tmdx] and normal muscle in the mouse. Muscle Nerve 1995; 18: 1147-54.

Порготовип A.B. Иванов

По материалам: Lepper С., Conway S.J., Fan C-M. Adult satellite cells and embryonic muscle progenitors have distinct genetic reguirements. Nature 2009; 460: 627—31, Wang J„ Conboy I. Embryonic vs. Adult Myogenesis: Challenging the 'Regeneration Recapitulates Development’ Paradigm. Journal of Molecular Cell Biology, 2009: 1 —4

ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Формирование полноценных зубов из биоинженерных эквивалентов

Разработка и применение биотехнологических подходов требует понимания процессов клеточной биологии, эмбрионального гисто- и органогенеза, особенностей физиологической и репаративной регенерации в различных возрастных периодах. В настоящее время большинство исследований в области клеточных технологий сфокусированы на тканевом уровне организации — полное воспроизведение органогенеза на современном этапе представляется мало возможным, но является дальнейшим логическим продолжением развития научных разработок.

В этой связи, особый интерес представляет серия экспериментальных исследований лаборатории К. №као, направленных на получение биоинженерных эквивалентов зубов и оценку их гистологических, гистохимических, иммунофенотипических и функциональных особенностей.

Известно, что формирование зубных зачатков осуществляется на основе взаимодействия орального эпителия и клеток эктомезенхимы нервного гребня [2].

Руководствуясь этими данными, К. Nakao с соавт. (2007) использовали в качестве исходного материала эпителиальные и мезенхимные клетки, полученные из зачатков резцов эмбрионов мышей возрастом 14,5 дней. Инъекции клеточных популяций проводили в капли коллагенового геля с получением культур в различных концентрациях [0,5-108 и 5-108 клеток/мл). Мезенхимные клетки помещались в базальную часть, а эпителиальные — в апикальную. На этапе разработки метода [2] после двух сут. культивирования половину образцов трансплантировали под капсулу почки мыши на две недели. Аналогичное время оставшуюся часть клеточных культур инкубировали in vitro. Формирование зубных зачатков с нормальной дифференцировкой клеток и гистогенезом наблюдалось во всех случаях in vivo при использовании материала с высокой плотностью клеток -

меченых клеточных популяций было показано развитие одонтобластов, компонентов пульпы зуба, костной ткани

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 4, 2009

I I I I I I

I I I

Новости клеточных технологий

и периодонтальной связки из мезенхимальных клеток, а амелобластов — из эпителиальных, что соответствует фундаментальным представлениям. Важно, что при использовании клеточных популяций, полученных из зубных зачатков резцов на более поздних стадиях эмбрионального развития, биоинженерные эквиваленты зубов формировались с гораздо меньшей частотой.

При культивировании клеток в коллагеновом геле in vitro также наблюдалось формирование множественных зубных зачатков к периферии от пограничной линии между эпителиальными и мезенхимными клетками уже через 2^3 дня инкубирования. В последующем происходила дифференцировка клеток в одонтобласты и амелобласты, продукция ими межклеточного вещества.

Клеточные компоненты всех биоинженерных эквивалентов зубов, полученных как in vivo, так и in vitro характеризовались экспрессией белков (эктодин, рецептор эктодисплазина), регулирующих процесс гистогенеза зубов в физиологических условиях [3].

Положительные результаты на первых этапах исследования позволили авторам перейти к оценке возможности получения нормальных зубов из их биоинженерных эквивалентов непосредственно в области их естественной локализации. Для этого, привитые в течение 14 сут. под капсулой почки зубные зачатки и культуры, инкубированные in vitro двое сут., трансплантировались

8-недельным мышам в область удаленного резца нижней челюсти. Спустя 14 сут. в обеих группах формировались зубы с правильной гистоархитектоникой, наличием периодонтальной связки и пульпой с сосудами и нервами.

Заключительный этап экспериментального исследования, опубликованный в журнале Nat. Methods в 2009 г. [4] был направлен на оценку функциональных особенностей коренных зубов, получаемых после трансплантации, соответствие их по физиологическим и биомеханическим характеристикам нормальным зубам.

Полученные in vitro зубные зачатки трансплантировались в область удаленного за три недели до операции верхнего первого большого коренного зуба. В более чем 55% случаев зуб прорезался Св среднем через 36 сут.) и через две недели достигал жевательной поверхности противоположного зуба нижней челюсти, после чего рост прекращался, что доказывает чувствительность восстановленного зуба к регуляции механической нагрузкой. Неудачные результаты (45%), по мнению авторов, связаны с погрешностями в осуществлении микрохирургических манипуляций. Полученные зубы имели нормальное строение, корни были окружены цементом и периодонтальной связкой. Кроме того, характеризовались наличием бугорков на жевательной поверхности, но меньшими размерами коронки в переднее-заднем и щечноязычном направлениях.

Схема эксперимента

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 4, 2009

ИМИ!

Новости клеточных технологий

И

Оценку твердости, определяющей жевательную функцию зубов, оценивали с помощью теста твердости Кну-па. Нормальный показатель, характерный для коренных зубов мышей возрастом 9 недель, равен в среднем 88 единицам, чему соответствовала твердость биоинже-нерных зубов. Более того, исследователи оценивали взаимодействие корней с окружающей их костной тканью, т.е. функционирование периодонтальной связки. Известно, что в физиологических условиях в точке компрессии костной ткани запускаются процессы резорбции, опосредованные действием остеокластов, а в области растяжения — остеогенез [3]. В этой связи, при выполнении постоянной механической нагрузки на биоинженерные зубы в щечном направлении (в течение 17 сут.) было показано, что в области компрессии кости локализуются остеокласты (положительная реакция на тартрат-резистентную кислую фосфатазу), а на противоположной, язычной стороне — остеобласты (ос-теокальцин-позитивные), что подтверждает вовлеченность периодонтальной связки в передачу механической нагрузке костной ткани.

В заключении авторы оценивали проводимость но-цицептивной импульсации по нервным окончаниям пульпы зуба. Для этого устанавливали уровень экспрессии нейротрансмиттеров, участвующих в восприятии и проведении болевых раздражений (галанин, galanin) [4], пептид, связанный с геном кальцитонина (calcitonin gene-related peptide, CGRP [5]). Был показан высокий уровень продукции CGRP, а также закономерное увеличение экспрессии галанина при болевой стимуляции.

Таким образом, в серии исследований был отработан метод воспроизведения эмбрионального органогенеза in vitro, обоснована эффективность применения клеточных продуктов, сформированных на его основе, в эксперименте in vivo, а также показаны впечатляющие функциональные результаты трансплантации полученных биоинженерных эквивалентов. Нужно отметить, что данное исследование, базирующееся на использовании эмбрионального клеточного материала, имеет, главным образом, теоретическое и экспериментальное значение, позволяя продвинуться в изучении процессов эмбрионального гисто- и органогенеза, но пока не применимо в клинической практике.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ohazama A., Modino S.A. Stem-cell-based tissue engineering of murine teeth. J. Dent. Res. 2004; 83C7): 518-22.

2. Pispa J., Thesleff I. Mechanisms of ectodermal organogenesis. Dev. Biol. 2003; 262: 195-205.

3. Wise G.E., King G.J. Mechanisms of tooth eruption and orthodontic tooth movement. J. Dent. Res. 2008; 87: 414-34.

4. Deguchi Т., Takeshita N.. Balam T.A. et al. Galanin-immunoreactive nerve ?bers in the periodontal ligament during experimental tooth

movement. J. Dent. Res. 2003; 82: 677-81.

5. Byers M.R., Narhi M.V. Dental injurymodels: Experimental tools for understanding neuroinflammatory interactions and polymodal nociceptor functions. Crit. Rev. Oral Biol. Med. 1999; 10: 4-39.

6. Nakao K., Morita R., Saji Y. The development of a bioengineered organ germ method. Nat. Methods 2007; 4[3): 227-30.

7. Ikeda E., Morita R., Nakao K. Fully functional bioengineered tooth replacement as an organ replacement therapy. PNAS 2009; 106(321: 13475-80.

Подготовил ИЯ, Бозо

По материалам: Ikeda Е„ Morita R„ Nakao К. Fully functional bioengineered tooth replacement as an organ replacement therapy. PNAS 2009; 106(32): 13475-80

Новый подход к разработке тканеинженерных конструкций: первый опыт создания «безматриксного» эквивалента сердечной мышцы

Применение тканеинженерных конструкций на основе клеток-предшественниц кардиомиоцитов считается перспективным подходом в лечении пациентов, перенесших инфаркт миокарда, однако исследования в этой области пока ограничиваются доклиническими экспериментами на животных. В течение последних двух лет были опубликованы работы, в которых сообщается о создании жизнеспособных эквивалентов миокарда человека на основе кардиомиоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) человека. Кардиомиоциты вводили в сердечную мышцу экспериментальных животных с индуцированным инфарктом миокарда. Тем не менее, образовавшиеся in vivo фрагменты миокарда состояли из малого количества клеток, большая часть которых со временем гибла [1—3]. Предварительное помещение трансплантируемых клеток на обеспечивающие их адгезию трехмерные матриксы увеличивает

срок жизни и возможные размеры трансплантата [4, 5]. Однако, у подобных тканеинженерных конструкций есть другие недостатки, связанные с недостаточной биосовместимостью, неоптимальными механическими и другими характеристиками различных матриксов.

В 2008 г. научная группа под руководством С. Murry предложила новый подход к созданию макроскопических тканеинженерных конструкций, предназначенных для восстановления сердечной мышцы после ее повреждения [6]. Фрагменты сердечной ткани были получены из высокоочищенных кардиомиоцитов, индуцированных из ЗСК человека. Клетки центрифугировали и формировали плотный конгломерат, который затем трансплантировали под перикард реципиенту. Со временем, однако, из-за недостатка питания в трансплантате неизбежно развивался некроз, распространявшийся от его центра к периферии. В 2009 г. эта же группа исследователей

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 4, 2009