Изучение эндотелио- и кардиопротективных эффектов витамина В6 и фолиевой кислоты при моделировании метионининдуцированной гипергомоцистеинемии

Изучение эндотелио- и кардиопротективных эффектов витамина В6 и фолиевой кислоты при моделировании метионининдуцированной гипергомоцистеинемии

М.В.Корокин1, М.В.Покровский2

'ГОУ ВПО Курский государственный медицинский университет Минздрава РФ; 2ФГАУ ВПО НИУ Белгородский государственный университет Минобрнауки РФ

Резюме. Проведено изучение эндотелио- и кардиопротективных эффектов витамина В6 (2 мг/кг) и фолиевой кислоты (0,2 мг/кг) при моделировании метионининдуцированной гипергомоцистеинемии с помощью внутрижелудочного введения метионина в дозе 3 г/кг. Показано, что сочетанное применение витамина В6 и фолиевой кислоты позволяет на фоне достоверного снижения концентрации гомоцистеина нормализовать показатели коэффициента эндотелиальной дисфункции и максимального левожелудочкового давления в ответ на внутривенное введение адреналина. Ключевые слова: эндотелиальная дисфункция, фолиевая кислота, витамин В6, гипергомоцистеинемия.

Studying of endothelio- and kardioprotective effects of vitamin В6 and folic acid at modelling methionine-induced hyperhomocysteinemia

M.V.Korokin', M.V.Pokrovskii2

'Kursk state medical university, Russia; 2Belgorod state university, Russia

Summary. Studying endothelio- and cardioprotective effects of vitamin В6 (2 mg/kg) is spent and folic acid (0,2 mg/kg) at modelling methionine-induced hyperhomocysteinemia by means of intragastric introduction of methionine in a dose 3 g/kg. Are shown, that combined application of vitamin В6 and folic acid allows homocyste to normalise against authentic decrease in concentration factor indicators endothelial dysfunctions and maximum left ventricle blood pressure in reply to intravenous introduction of adrenaline.

Key words: endothelial dysfunction, folic acid, vitamin В6, hyperhomocysteinemia. Сведения об авторах

Корокин Михаил Викторович - канд. мед. наук, докторант каф. нормальной физиологии КГМУ. E-mail: Mkorokin@mail.ru

Покровский Михаил Владимирович - д-р мед. наук, проф., зав. каф. фармакологии и фармацевтических дисциплин ИПМО ФГАУ ВПО НИУ БелГУ. Тел.: 8(4722) 30-13-73

Введение

К настоящему времени установлен целый ряд факторов различной природы [1, 2], способствующих развитию и прогрессированию сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) - дислипидемия, артериальная гипертензия, избыточная масса тела, курение, гиподинамия, сахарный диабет. Кроме того, отдельно можно выделить группу так называемых новых факторов риска, к которым прежде всего относят увеличение уровня гомоцистеина (ГЦ) в крови [3, 4]. Свыше 80 клинических и эпидемиологических исследований подтвердили, что гипергомоцистеине-мия является одним из значимых самостоятельных факторов риска раннего развития и быстрого про-грессирования атеросклероза [1, 4-6] и тромбоза коронарных, церебральных и периферических артерий и может быть прогностическим маркером летального исхода [7]. Полученные достоверные доказательства послужили основанием для создания го-моцистеиновой теории патогенеза развития атеросклероза [8, 9]. Первое сообщение о роли ГЦ в качестве возможного фактора риска ССЗ датируется 1964 г. S.Mudd, Т^гг^еп, H.Waismann и соавт. продемонстрировали, что повышенная концентрация ГЦ в

крови и, соответственно, в моче, приводя к гомоци-стеинурии, является следствием недостаточности фермента цистатионин-бета-синтетазы [10]. В связи с изложенным целью настоящего исследования явилось изучение эндотелио- и кардиопротективных эффектов витамина В6 и фолиевой кислоты при моделировании метионининдуцированной гипергомо-цистеинемии.

Материалы и методы

Опыты проводились на белых крысах-самцах линии Wistar массой 200-250 г. Для моделирования гипергомоцистеинемии аминокислоту метионин (ОАО «Синтез») вводили внутрижелудочно в дозе 3 г/кг/сут в течение 7 дней. Раствор для внутрижелудочного введения метионина готовили ex tempore с помощью полисорбата ТВИН-80 и 1% крахмального раствора. В качестве контроля использовали данные, полученные при внутрижелудочном введении эквивалентного количества полисорбата 10% раствора ТВИН-80. Фолиевую кислоту (Валента Фармацевтика, ОАО) вводили внутрижелудочно в дозе 0,2 мг/кг/сут в течение 7 дней. Витамин В6 (Верофарм) вводили внутри-брюшинно в дозе 2 мг/кг/сут в течение 7 дней.

Таблица 1. Влияние витамина В6 и фолиевой кислоты на функциональные и биохимические показатели крыс при моделировании эндотелиальной дисфункции введением L-нитро-аргинин-метилового эфира

Группы животных САД, мм рт. ст. ДАД, мм рт. ст. КЭД, усл. ед.

Контроль 10% ТВИН-80 129,2±4,3 82,4±5,9 0,9±0,2

Метионин 3 г/кг 118,9±10,1 76,6±7,2 3,3±0,3*

Метионин + фолиевая кислота + витамин В6 121,4±5,6 82,6±6,1* 1,7±0,1**

Примечание. Здесь и далее в табл. 2, 3: *р<0,05 в сравнении с контролем; **р<0,05 в сравнении с группой «Метионин».

Таблица 2. Влияние витамина В6 и фолиевой кислоты на концентрацию ГЦ в сыворотке крови экспериментальных животных

Группы животных Контроль Метионин Метионин + фолиевая кислота + витамин В6

Концентрация ГЦ, мкмоль/л 8,6±1,4 53,5±8,1* 24,3±4,6**

Таблица 3. Влияние витамина В6 и фолиевой кислоты на показатели сократимости левого желудочка сердца крыс при проведении нагрузочных проб

Группа животных Адренореактивность, ЛЖД, мм рт. ст. Пережатие аорты, %

Контроль 189,7±9,1 85,4±3,1

Метионин 238,1±3,4* 69,8±3,4*

Метионин + фолиевая кислота + витамин В6 217,9±4,8** 72,4±4,1*

Животные были разделены на группы (п=10):

1. Ежедневное, 1 раз в сутки в течение 7 дней, внутри-желудочное введение 10% раствора ТВИН-80 в дозе 1 мл/кг (контроль, п=10 животных).

2. Ежедневное, 1 раз в сутки в течение 7 дней, внутри-желудочное введение метионина в дозе 3 г/кг (п= 10 животных).

3. С введением на фоне метионина фолиевой кислоты (0,2 мг/кг внутрижелудочно) и витамина В6 (2 мг/кг внутрибрюшинно) однократно в сутки в течение 7 дней.

На 8-й день от начала эксперимента под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) вводили катетер в левую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляли в бедренную вену. Показатели гемодинамики - систолическое АД (САД), диастолическое АД (ДАД) и частоту сердечных сокращений - измеряют непрерывно посредством датчика и компьютерной программы Вюрас. Помимо измерения АД проводили ряд функциональных проб в представленной последовательности: 1. Проба на эн-дотелийзависимое расслабление сосудов (внутривенное введение раствора ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г). 2. Проба на эндоте-лийнезависимое расслабление сосудов (внутривенное введение раствора нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг из расчета 0,1 мл на 100 г) [11-13].

Степень эндотелиальной дисфункции у экспериментальных животных, а также степень ее коррекции исследуемыми препаратами оценивали по расчетному коэффициенту эндотелиальной дисфункции (КЭД). Данный коэффициент рассчитывался по формуле: КЭД=SАДНП/SАДАХ, где ЗАДНП - площадь треугольника над кривой восстановления АД, причем точками меньшего катета являются точка максимального падения АД и точка выхода уровня АД на плато при проведении функциональной пробы с введением нитропруссида натрия, SАДАХ - площадь треугольника над кривой восстановления АД при проведении пробы с АХ, причем за меньший из катетов принимают разность между точкой окончания брадикар-дитического кардиального компонента и точкой восстановления АД [11-13].

Степень развития гипергомоцистеинемии и ее коррекции исследуемыми препаратами оценивали

по содержанию ГЦ в сыворотке крови экспериментальных животных. Концентрацию ГЦ определяли методом иммунотурбодиметрии с помощью набора фирмы Pliva-Lachema Diagnostika s.r.o. Для оценки функциональных возможностей миокарда у животных, находящихся на управляемом дыхании, катетеризировали полость левого желудочка и проводили нагрузочные пробы в представленной последовательности: 1. Проба на адренореактивность (внутривенное одномоментное введение раствора адреналина гидрохлорида 1х10-5 моль/л из расчета 0,1 мл на 100 г) [11-13]. В ходе данной пробы проводилась оценка максимального подъема левожелудочкового давления (ЛЖД) в ответ на введение адреналина. 2. Нагрузка сопротивлением - пережатие восходящей аорты на 30-й секунде [11-13]. После проведения данной пробы рассчитывался показатель исчерпания миокардиального резерва (в %), равный отношению прироста ЛЖД на 5-й секунде пережатия аорты к приросту ЛЖД на 25-й секунде пережатия аорты. Достоверность изменений абсолютных параметров определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов (М), средней арифметической (±m) и вероятности возможной ошибки (р) по таблицам Стью-дента. Различия оценивали как достоверные при p<0,05. Статистические расчеты проводились с использованием программы Microsoft Excel 7.0.

Результаты исследования

Согласно дизайну исследования, гипергомоци-стеининдуцированную эндотелиальную дисфункцию моделировали ежедневным в течение 7 сут внут-рижелудочным введением метионина в дозе 3 г/кг. Внутрижелудочное введение метионина в указанной дозе привело к достоверному увеличению КЭД до 3,3±0,3, тогда как КЭД в контрольной группе животных составил 0,9±0,2. Значения САД и ДАД оставались в пределах физиологической нормы во всех сериях экспериментов. Одновременное введение метионина, витамина B6 и фолиевой кислоты привело к достоверному снижению КЭД до 1,7±0,1 (табл. 1).

Результаты исследования концентрации ГЦ в сыворотке крови экспериментальных животных представлены в табл. 2. При внутрижелудочном введении метионина обнаружено достоверное повышение

38 | КАРДИОСОМАТИКА | ТОМ 3 | № 2 | www.con-med.ru |

концентрации ГЦ, а сочетанное введение витамина В6 и фолиевой кислоты позволило достоверно уменьшить этот показатель и приблизить его значение к таковому в контрольной группе животных.

При проведении пробы на адренореактивность в группе животных, которым осуществляли внутриже-лудочное введение витамина В6 и фолиевой кислоты на фоне введения метионина обнаружено снижение абсолютных цифр ЛЖД, что свидетельствует о предотвращении гипергомоцистеининдуцированного повышения адренореактивности (табл. 3). При проведении пробы на нагрузку сопротивлением витамин В6 и фолиевая кислота не предотвращали падение сократимости с 5 на 25-ю секунду пережатия аорты. Так, показатель исчерпания миокардиального резерва на 25-й секунде проведения пробы в контрольной группе животных составил 85,4±3,1%. В группе животных, которым вводили метионин, -69,8±3,4%. Результаты в группе животных, получавших витамин В6 и фолиевую кислоту, оказались равны 72,4±4,1%.

Обсуждение

Исследования возможной роли ГЦ в развитии ССЗ начались после того, как К.МсСиПу продемонстрировал в 1969 г. предрасположенность к атеротромбозу у пациентов с тяжелой гипергомоцистеинемией (ГЦ>100 мкмоль/л) [1]. Механизм развития атеро-склеротического поражения сосудов при гипергомо-цистеинемии остается до конца не ясным. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что продукты аутоокисления ГЦ, протекающего с образованием активных форм кислорода, индуцируют формирование атеросклеротической бляшки путем повреждения эндотелия, нарушения целостности сосудистой стенки и стимуляции пролиферации гладко-мышечных клеток медии [6-8]. ГЦ также нарушает нормальную продукцию N0 эндотелиальными клетками, понижает биодоступность N0, так как уменьшается синтез последнего. Усиление перекисного окисления липидов с участием ГЦ приводит как к уменьшению продукции N0 ферментом N0-синта-зой, так и прямой деградации N0 [6].

В литературе имеются сведения о том, что применение витамина В6 и фолиевой кислоты позволяет эффективно снижать уровень ГЦ [7]. В проведенном нами исследовании применение терапевтических доз витамина В6 и фолиевой кислоты позволило нормализовать соотношение эндотелийзависимой и эн-дотелийнезависимой вазодилатации с достоверным уменьшением показателя КЭД. При проведении нагрузочных проб в эксперименте на открытом сердце внутрижелудочное введение витамина В6 и фолиевой кислоты на фоне введения метионина позволило снизить адренореактивность, однако не привело к предотвращению исчерпания миокардиального резерва. Положительная динамика функциональных показателей сопровождалась достоверным снижением концентрации ГЦ.

Указанные факты подтверждают важную роль витамина В6 и фолиевой кислоты в реализации протек-тивного эффекта при гипергомоцитеинемии, однако

ставят вопрос о возможности сочетанного их использования с традиционными препаратами, использующимися для лечения сердечно-сосудистой патологии (ингибиторы АПФ, блокаторы АТ^рецеп-торов и т.д.).

Выводы

1. Сочетанное применение витамина В6 в дозе 2 мг/кг и фолиевой кислоты в дозе 0,2 мг/кг оказывает эн-дотелиопротективное действие на модели метио-нининдуцированной гипергомоцистеинемии.

2. Комбинированное использование витамина В6 в дозе 2 мг/кг и фолиевой кислоты в дозе 0,2 мг/кг на фоне моделирования метионининдуцированной гипергомоцистеинемии уменьшает максимальное значение давления в полости левого желудочка сердца при проведении пробы на адренореактив-ность и не влияет на показатель исчерпания мио-кардиального резерва при проведении пробы на нагрузку сопротивлением.

Литература

1. Кули ДА Сердечно-сосудистые заболевания;устранение факторов риска и другие профилактические мероприятия. Междунар. мед. журн. 1999; 1:15-9.

2. Оганов Р.Г. Профилактическая кардиология: от гипотез к практике. Кардиология. 1999; (2): 4-10.

3. ОкороковАН.Диагностика болезней внутренних органов.

Т. 6. Диагностика болезней сердца и сосудов.М.:Мед.лит,, 2003.

4. Сидоренко ГИ, Мойсеенок АГ, Колядко МГ. и др. Гомоцистеин - важный фактор риска сердечно-сосудистых заболеваний. Кардиология. 2001; (1): 6-11.

5. Лысенко М.Э. Коррекция гипергомоцистеинемии у больных ИБС. Укр. терапевт, журн. 2004; (1): 69-736. Мухин НА, Моисеев СВ,, Фомин ВВ. Гипергомоцистеинемия как фактор риска развития заболеваний сердечно-сосудистой системы. Клин. медицина. 2001; 6: 7-13

7. de Jong SC, Stehouwer CD, van den BM et al. Normohomocysteinae-mia and vitamintreated hyperhomocysteinaemia are associated with similar risks of cardiovascular events in patients with premature peripheral arterial occlusive disease. A prospective cohort study.

J Intern Med 1999; 246: 87-96.

8. Баркаган З.С., Костюченко ГИ,, Котовщикова Е.Ф. Гипергомоцистеинемия как самостоятельный фактор риска поражения и тромбирования кровеносных сосудов. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2002; 1:65-71.

9. Шмелева ВМ. Гипергомоцистеинемия и тромбоз. Тромбоз, гемостаз и реология. 2000; 4:26-9.

10. ArnadottirM, Hultberg. Homocysteine in renal disease, in Homocysteine in health and disease. Cambridge University Press, Cambridge, UK-2001; p 321-30.

11. Корокин МВ, Полонская КВ., Покровский МВ. и др. Возможности моделирования гипергомоцистеининдуцированной эндоте-лиальной дисфункции. Кубанский научн. мед. вестн. 2009; 5:43-8.

12. Покровский МВ, Кочкаров ВИ, Покровская ТГ. и др. Методические подходы для количественной оценки развития эндо-телиальной дисфункции приL-NAME-индуцированноймодели дефицита оксида азота в эксперименте. Кубанский научн. мед. вестн. 2006; 10: 72-713. Покровский МВ, Покровская ТГ,, Кочкаров ВИ. Патент. 2301015, Российская Федерация, МПК7 А61В 5/02. -

№2005113243/14, заявл. 10.1.2006; опубл. 20.06.07, Бюл.№17.