СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИМА ПИНОСТРОБИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
METHOD OF DETERMINING PINOSTROBIN OXIME IN BLOOD PLASMA

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии, и может быть использовано для количественного определения оксима пиностробина в плазме крови методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии.
Оксим пиностробина в экспериментах на лабораторных животных демонстрировал целый ряд фармакологических эффектов, а именно антиоксидантный, гепатопротекторный, иммуностимулирующий и др. (Sariev A.K., Abaimov D.A., et al. Experimental study of pinostrobine oxime biotransformation. Eksp Klin Farmakol., 2014; 77 (8): 39-44).
На сегодняшний день известен ряд работ по количественному хромато-масс-спектрометрическому определению неизмененного фитофлавоноида пиностробина, являющегося родительским веществом, из которого синтезируется оксим пиностробин (5-гидрокси-7-метокси-2-фенил-хромон-4-оксим). Однако указанные методы не могут быть применены для определения оксима пиностробина в плазме крови без существенных модификаций, поскольку оксим пиностробина отличается от своего прекурсора по физико-химическим свойствам, спектральным характеристикам и характеру фрагментации в масс-спектрометре (Salvador M.J., Sartori F.T., Sacilotto A.C., Pral E.M., Alfieri S.C., Vichnewski W: Bioactivity of flavonoids isolated from Lychnophora markgravii against Leishmania amazonensis amastigotes. Z Naturforsch C, 2009, 64 (7-8): 509-512; Alvarez-Ospina H., Rivero Cruz I., Duarte G., Bye R., Mata R: HPLC Determination of the Major Active Flavonoids and GC-MS Analysis of Volatile Components of Dysphania graveolens (Amaranthaceae), Phytochem Anal., 2012).
В патентной литературе способы определения оксима пиностробина в плазме крови также не выявлены.
Таким образом, техническим результатом заявляемого изобретения является создание биоаналитического метода количественного определения оксима пиностробина в плазме крови с высокой воспроизводимостью и точностью, адаптированного для решения задач экспериментальной и клинической фармакокинетики.
оxime
Технический результат достигается тем, что определение оксима пиностробина в плазме крови проводят путем анализа вещества высокоселективным методом хромато-масс-спектрометрии с использованием матрицы в виде плазмы крови с оксимом пиностробина и внутреннего стандарта - вещества, близкого по строению молекулы к анализируемому веществу, при этом разделение продуктов экстракции проводят на обращенно-фазной хроматографической колонке 4,6×100 мм, в качестве элюента применяют 10 мМ ацетат аммония и ацетонитрил, взятые в процентном соотношении 10:90 соответственно, с температурой разделения 30°C и скоростью подачи элюента 0,5 мл/мин, детектирование оксима пиностробина проводят по выбранному дочернему иону с m/z 269.10, образующемуся в результате фрагментации родительского молекулярного иона оксима пиностробина с m/z 286.10, а его концентрацию рассчитывают по формуле: C=2,073299×RS, где
оxime
C - концентрация оксима пиностробина (мкг/мл); RS - отношение площади хроматографического пика оксима пиностробина к площади пика внутреннего стандарта.
Способ осуществляется следующим образом.
Приготовление рабочих стандартных растворов. В качестве стандартного раствора используют рабочий стандартный раствор оксима пиностробина с концентрацией 1 мг/мл в метаноле. Из данного раствора методом последовательных разведений готовят рабочие стандартные растворы оксима пиностробина с концентрацией 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56 и 0,78 мкг/мл в метаноле. Все приготовленные растворы хранят в холодильнике при +4°C. Приготовленные стандартные растворы оксима пиностробина стабильны в течение всего периода исследования, начиная с момента разработки методики и до последнего дня анализа биологических образцов.
Приготовление модельных растворов в плазме крови. Модельные растворы в плазме крови готовят из рабочих стандартных растворов с концентрациями 50; 25; 12,5; 6.25; 3,12; 1,56 и 0,78 мкг/мл методом внесения 25 мкл аликвоты последних в 225 мкл интактной плазмы крови крыс с таким расчетом, чтобы конечная концентрация оксима пиностробина в плазме составляла 5; 2,5; 1,25; 0.625; 0.312; 0.156 и 0.078 мкг/мл.
Приготовление образцов для анализа. Для выделения оксима пиностробина из плазмы крови и очистки экстракта используют метод жидкостной экстракции. К 250 мкл плазмы крови, с предварительно внесенным внутренним стандартом - (4′-гидрокси-4-метокси-халкон 25 мкл, 100 мкг/мл), добавляют 500 мкл 0,2 М щелочного боратного буфера (pH 9,0) и перемешивают на вортекс-миксере в течение 5 минут при 2000 об/мин. К полученной смеси добавляют 6 мл этилацетата. Полученную смесь встряхивают на вортекс-миксере в течение 5 минут. После этого пробирки со смесью центрифугируют в течение 5 минут при 3000 об/мин до полного разделения слоев. Надосадочный органический слой декантируют, переносят в чистую пробирку и упаривают под вакуумом при температуре 60°C. Сухой остаток растворяют в 250 мкл метанола. Полученный раствор вводят в петлю прибора в объеме 10 мкл. Определение концентрации оксима пиностробина проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием.
2
Для осуществления хромато-масс-спектрометрического анализа используют жидкостный хроматограф «Surveyor» производства «Thermo Fisher Scientific» (США), оснащенный насосом «Finnigan Surveyor LC Pump Plus», автосамплером «Finnigan Surveyor AS Plus» с колоночным термостатом и масс-спектрометрическим детектором «LCQ Fleet MS» (квадрупольная ионная ловушка). Масс-спектрометр работает в режиме регистрации ионов, положительно заряженных электроспреем (ESI), который создается напряжением в 5 кВ. Скорость потока газа-небулайзера (азота): 4 л/мин, давление на распылителе - 100 psi. Температура интерфейса капилляра составляет 350°C, температура нагревателя - 300°C. Амплитуда возбуждения на концевых электродах ловушки 0,1 В. Масс-спектрометрический анализ MS проводят в режиме мониторинга выбранных ионов (SRM).
Детектирование оксима пиностробина проводят по выбранному дочернему иону с m/z 269.10, образующемуся в результате распада родительского молекулярного иона оксима пиностробина (m/z 286.10) при нормализованной энергии соударений 24 eV. Масс-спектр второго порядка оксима пиностробина при нормализованной энергии соударений 24 eV. представлен на фигуре 1 (по вертикали интенсивность (Intensity) по горизонтали масса заряда (m/z).
Детектирование внутреннего стандарта - 4′-гидрокси-4-метокси-халкона (1-(4-гидроксифенил)-3-(4-метоксифенил)проп-2-ен-1-он) проводят по выбранному дочернему иону с m/z 161.00, образующемуся в результате распада родительского молекулярного иона халкона (m/z 255.20) при нормализованной энергии соударений 29 eV. Масс-спектр второго порядка внутреннего стандарта - 4′-гидрокси-4-метокси-халкона при нормализованной энергии соударений 29 eV представлен на фигуре 2.
В качестве демпфирирующего газа в ионной ловушке используют гелий. Данные обрабатываются с помощью программы Xcalibur 2.1 w/Foundation 1.0.1.
T
Разделение осуществляют на обращенно-фазной хроматографической колонке Hypersil Gold, 5 мкм, 4,6×100 мм. Температура разделения 30°C. Элюирование осуществляют в изократическом режиме. Подвижная фаза состоит из двух растворов: 10 мМ ацетата аммония (раствор А) и смеси ацетонитрил - 10 мМ ацетат аммония (90:10; v/v) (раствор Б), взятых в процентном соотношении 10:90 соответственно. Скорость потока подвижной фазы 0,5 мл/мин. Объем пробы 10 мкл. Время удерживания R оксима пиностробина составляет в среднем 3,3±0,1 мин. Время анализа единичного образца составляет 5,0±0,5 минут.
T
T
T
T
На фигурах 3, 4, 5 представлены масс-хроматограммы экстрактов интактной плазмы крови и плазмы, содержащей оксим пиностробина в концентрациях 0,078 и 1,25 мкг/мл соответственно. На фигуре 3 показана масс-хроматограмма интактной плазмы крови (по вертикали относительное содержание (Relative abundance), по горизонтали время (Time) в минутах). На фигуре 4 представлена масс-хроматограмма экстракта плазмы крови, содержащей 0,078 мкг/мл оксима пиностробина. Пик с R 3,28 мин - пик оксима пиностробина. Пик с R 2,98 мин - пик внутреннего стандарта (4′-гидрокси-4-метокси-халкон). На фигуре 5 представлена масс-хроматограмма экстракта плазмы крови, содержащей 1,25 мкг/мл оксима пиностробина. Пик с R 3,28 мин - пик оксима пиностробина. Пик с R 3,00 мин - пик внутреннего стандарта (4′-гидрокси-4-метокси-халкон).
На фигуре 6 представлена калибровочная кривая зависимости концентрации оксима пиностробина от отношения площадей хроматографических пиков анализируемого вещества и внутреннего стандарта (Area Ratio).
Количественный анализ проводят методом внутреннего стандарта с использованием программного обеспечения «Quan Browser» компании «Termo Fisher Scientific». Калибровочную кривую получают в результате анализа проб плазмы с добавками известных количеств стандарта определяемого соединения (оксима пиностробина). Для построения калибровочной кривой готовят рабочий стандартный раствор оксима пиностробина в метаноле - 1 мг/мл. Из него далее методом последовательных разведений готовят серию стандартных растворов оксима пиностробина в плазме крови с концентрациями: 5; 2,50; 1,25; 0,625; 0,312; 0,156 и 0,078 мкг/мл. В каждый образец плазмы крови добавляют 25 мкл раствора внутреннего стандарта с концентрацией 100 мкг/мл. Для определения калибровочной зависимости применяют регрессионный метод наименьших квадратов. Калибровочная зависимость линейна в изучаемом диапазоне концентраций. График описывается линейным уравнением:
Y=0,482323×Х,
где Y - отношение площадей пиков оксима пиностробина к площадям пиков внутреннего стандарта в условных единицах интегрирования;
X - концентрация оксима пиностробина, мкг/мл.
oxime
S
Концентрация оксима пиностробина рассчитывается по формуле: C=2,073299×R,
oxime
где C - концентрация оксима пиностробина (мкг/мл),
S
R - отношение площади хроматографического пика оксима пиностробина к площади пика внутреннего стандарта. Предел количественного обнаружения в плазме без предварительного концентрирования - 0,078 мкг/мл. Для определения меньших концентраций применяли метод концентрирования - объем плазмы крови увеличивают до 1 мл, сухой остаток растворяют 100 мкл метанола.
Прецизионность и правильность методики оценивается по трем концентрационным уровням рабочих стандартных растворов оксима пиностробина после 6 определений каждого уровня (таблица 1). Для концентрации 0,078 мкг/мл ошибка метода не превышала 15%.
Каждый из образцов, предназначенных для контроля качества, анализируют в течение 1 рабочего дня (6 определений). Предел количественного определения для оксима пиностробина составляет 0,078 мкг/мл. Для 0,078 мкг/мл средняя точность составляет 3,09% C.V., средняя воспроизводимость - 0,64% dev. Остальные пробы с концентрациями 1,25 и 5 мкг/мл имеют точность от 1,44 до 4,21% C.V. Воспроизводимость варьирует от -0,80 до 2,67% dev. Результаты представлены в таблице 1.
Точность выражается в виде коэффициента вариации (% C.V.) для каждой серии образцов согласно уравнению:
где SD - стандартное отклонение серии определений в течение рабочего дня концентраций оксима пиностробина;
<mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover>
- среднее арифметическое значение полученных концентраций оксима пиностробина.
Воспроизводимость измеряется как процент отклонения (% dev.) от теоретического значения по формуле:
где x - среднее арифметическое значение полученных концентраций оксима пиностробина;
<mover accent="true"><mi>μ</mi><mo>¯</mo></mover>
- теоретическая концентрация оксима пиностробина.
Метрологические характеристики разработанной методики представлены в таблице 2. Относительная ошибка определения оксима пиностробина не превышает 15%.
<mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover>
- среднее арифметическое значение полученных концентраций оксима пиностробина;
SD - стандартное отклонение серии определений концентраций оксима пиностробина;
<mrow><msub><mi>S</mi><mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover></msub></mrow>
- стандартное отклонение среднего значения серии определений концентраций оксима пиностробина;
<mrow><mi>Δ</mi><mover accent="true"><mi>x</mi><mo>¯</mo></mover></mrow>
- полуширина доверительного интервала (Р=0,95);
ε % - ошибка среднего результата полученных значений концентраций оксима пиностробина.
Таким образом, заявленный способ обладает высокой эффективностью, не требует проведения многочисленных предварительных химических реакций и не предусматривает использование большого количества химических реактивов.
Высокая точность и воспроизводимость биоаналитического метода количественного определения оксима пиностробина в плазме крови обеспечивает идентификацию вещества с установленными характеристиками погрешности, что позволяет использовать данную методику как в экспериментальной, так и клинической фармакокинетики.