ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ БИФИДОБАКТЕРИИ
IMMUNOMODULATORY COMPOSITION CONTAINING BIFIDOBACTERIA

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к композициям, получаемым из бифидобактерий, а также к способам и применениям, относящимся к ней, где указанная композиция модулирует иммунную систему. В частности, указанные композиции воздействуют на активность вируса и снижают вызываемые вирусом эффекты. Например, ослабляют воспаление, вызванное вирусной инфекцией, и подавляют репликацию вируса.
Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает снижение риска развития и снижение тяжести и частоты возникновения обострения хронических респираторных заболеваний, таких как астма и хроническое обструктивное заболевание легких (COPD).
Предпосылки изобретения
et al
Lactobacillus
Bifidobacterium
При рождении новорожденный младенец подвергается воздействию микробиоты матери и микроорганизмов из окружающей среды, которые начинают колонизировать поверхности слизистых оболочек в пищеварительном, дыхательном и урогенитальном трактах и кожи (Calder 2013). С этого процесса начинается созревание иммунной системы. Колонизирующая микробиота и иммунная система кишечника взаимодействуют с установлением между собой пожизненной толерантности и мутуализма (Tourneur & Chassin 2013). Это двустороннее взаимодействие представляет собой продолжающийся на протяжении всей жизни процесс, который влияет на функцию и гомеостаз нашей иммунной системы и здоровье. Поэтому состав и метаболизм микробиоты оказывают непосредственное влияние на наш иммунитет от рождения до смерти (Maynard  2012). Таким образом, модулирование облигатной микробиоты кишечника посредством введения пробиотических штаммов может играть важную роль в профилактике здоровья и в терапии конкретных состояний (Wall et al. 2009). Наиболее широко принятое определение пробиотиков было предложено рабочей группой FAO/WHO: "Живые микроорганизмы, которые при введении в достаточных количествах приносят пользу для здоровья хозяина" (FAO/WHO. Guidelines for the evaluation of probiotics in food 2001.Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). 2001.). Наиболее часто применяемыми пробиотиками являются молочнокислые бактерии, такие как относящиеся к родам  и .
Патогенные вирусы имеют множество форм и могут вызывать многочисленные эффекты и симптомы. Кроме того, несмотря на распространенность вирусных инфекций, для большинства из них существует не много способов лечения.
Инфекции риновируса человека (HRV) являются причиной простуды, и это заболевание возлагает большое бремя на общественное здравоохранение и экономику (Heikkinen T, Järvinen A. 2003).
Дети переносят в среднем 6-8 простудных заболеваний за год, а взрослые 1-4, из которых примерно половину вызывают риновирусы (Heikkinen T, Järvinen A. 2003).
В большинстве случаев простуда как таковая представляет собой самокупирующуюся болезнь и будет проходить без приема каких-либо лекарственных препаратов. Однако симптомы являются неприятными и могут длиться от нескольких дней до нескольких недель.
Риновирусы (и многие другие вирусы) обычно захватываются из окружающей среды путем самоинокуляции, например, при прикосновении к ноздре. Затем HRV проникают в носовую слизь и инфицируют эпителиальные клетки дыхательных путей. Реакция эпителия и клеток врожденного иммунитета вызывает воспалительный ответ и секрецию воспалительных медиаторов, таких как цитокины и хемокины, например, IL-1 бета, IL-6, RANTES (CCL5), GM-CSF, IP-10 и IL-8, имеющий важное значение. Эти цитокины опосредуют атаку иммунных клеток против инфицированных вирусом клеток, которая вызывает симптомы простуды. У здоровых субъектов HRV вызывают воспалительный ответ и симптомы простуды, которые будут проходить без какого-либо лечения. Подобные иммунные реакции возникают в ответ на другие вирусные инфекции.
Инфекции HRV ассоциированы с обострениями астмы, COPD и идиопатического фиброза легких (IPF) у субъектов, страдающих от этих состояний (Saraya et al. 2014). Приблизительно в 26-36% случаев астмы, 3-27% COPD и 5% IPF было обнаружено, что обострения вызваны инфекциями HRV (Saraya et al. 2014; таблица 1). С этиологией также ассоциированы и другие вирусы, такие как респираторно-синцитиальный вирус (RSV) и вирус гриппа (Gunawardana et al. 2014 Antiviral Research). Кроме того, инфекции HRV совместно с RSV и метапневмовирусом ассоциированы с ранним началом бронхообструктивных эпизодов (бронхиолита) у детей (Saglani 2014). Примерно у одной трети детей, у которых бронхиальная обструкция возникает в первые 3 года жизни, она продолжает присутствовать и в дальнейшей жизни, и поэтому бронхиальная обструкция, вызванная вирусными инфекциями или простудой, является фактором риска развития астмы (Sigurs et al. 2010; Jackson et al. 2012).
Известно, что у астматиков воспалительные цитокины, в том числе IL-8, ухудшают патологию, при этом наблюдается нейтрофильное, лимфоцитарное и эозинофильное воспаление с гиперреактивностью дыхательных путей и ремоделирование дыхательных путей, характерное для астматиков (Wark et al. 2002; Proud 2011). Астматики, как было обнаружено, имеют слабые противовирусные механизмы (Contoli 2006), при этом было продемонстрировано, что клиническая болезнь, вызванная интраназально инокулированным HRV, у астматиков коррелирует с вирусной нагрузкой и воспалением дыхательных путей (Message et al. 2008).
Проводилось несколько плацебо-контролируемых клинических исследований, в которых изучали эффективность пробиотиков (Hao 2011; Kang 2014) в отношении общих симптомов заболеваний респираторного тракта. Эти исследования указывают на то, что прием пробиотиков с пищей может снижать частоту возникновения и продолжительность болезни по сравнению с приемом плацебо с пищей (Hao 2011; Kang 2014). Однако в этих исследованиях изучали только симптомы респираторного заболевания, а не возбудителей, таких как вирусы.
Клинические испытания были направлены на изучение эффективности пробиотиков в отношении развития астмы у детей, но ни одно из исследований не было направлено на изучение связи риновирусов с развитием астмы (Azad 2013; Elazab 2013).
В исследованиях у субъектов с COPD обосновали роль воспалительных медиаторов при обострениях и существование четкой связи с вирусными инфекциями (Gunawardana et al. 2014). Исследовательская группа проверила пациентов с COPD легкой степени в экспериментальной риновирусной модели, в которой HRV инокулировали в нос множеству добровольцев с последующим наблюдением за титрами вируса и воспалением (Mallia et al. 2013). Они продемонстрировали, что уровни IL-8 были выше у пациентов с COPD, чем у здоровых контрольных лиц. Более того, в назальном лаваже пациентов с COPD были обнаружены более высокие титры вируса, чем у здоровых контрольных лиц (Gunawardana et al. 2014), что указывает на слабые антивирусные механизмы защиты у пациентов с COPD. Таким образом, воспаление (на которое указывает IL-8) и титры вируса являются выше у пациентов с COPD.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что применение бифидобактерий модулирует иммунную систему не только к воздействию на активность вируса, но также к снижению вызываемых вирусом эффектов, таких как воспаление. Кроме того, при наличии такого действия композиции по настоящему изобретению помогают облегчить обострения астмы и COPD, а также снижают риск вирусной инфекции, такой как инфекция HRV, которая предрасполагает субъекта к развитию астмы или COPD у восприимчивых индивидуумов.
Краткое описание
Bifidobacterium
Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении авторами настоящего изобретения того, что применение бифидобактерий (то есть вида ) модулирует иммунную систему. В частности, эти пробиотики воздействуют на активность вируса и вызываемые вирусом эффекты, в том числе репликацию вируса, и/или облегчают воспаление, вызванное вирусной инфекцией.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что введение бифидобактерий субъекту приводит к ингибированию репликации вируса и уменьшению воспалительного ответа.
Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что введение бифидобактерий субъекту модулирует адаптивный иммунный ответ во время вирусной инфекции. В частности, это происходит при риновирусной инфекции.
Поэтому в одном аспекте настоящего изобретения предусмотрена композиция, получаемая из бифидобактерий, для применения в модулировании иммунной системы субъекта путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта.
В другом аспекте настоящего изобретения предусмотрен способ модулирования иммунной системы субъекта путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта, предусматривающий применение композиции, подлежащей введению и/или приему внутрь указанным субъектом; и при этом указанная композиция может быть получена из бифидобактерий.
В дополнительном аспекте предусмотрено применение композиции, получаемой из бифидобактерий, в изготовлении композиции для модулирования иммунной системы субъекта путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта.
Также в данном документе предусмотрена композиция, получаемая из бифидобактерий, для применения в снижении риска развития и обострения хронических респираторных заболеваний у субъекта; предпочтительно с помощью модулирования иммунной системы субъекта путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта.
Предпочтительно указанная композиция по настоящему изобретению представляет собой лекарственный препарат, продукт питания или биологически активную добавку.
В другом аспекте в данном документе предусмотрена композиция, получаемая из бифидобактерий, для применения в модулировании иммунной системы субъекта, или способ, или применение указанной композиции, где модулирование иммунной системы обеспечивает модулирование уровней биомаркеров у субъекта, предпочтительно снижение уровней биомаркеров у субъекта. Предпочтительно указанные биомаркеры представляют собой цитокины и/или хемокины. Наиболее предпочтительно указанные биомаркеры представляют собой IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
Предпочтительно указанная композиция, способ или применение обеспечивают модуляцию врожденной иммунной системы, адаптивной иммунной системы или их обеих.
В дополнительном аспекте настоящего изобретения представлена композиция, получаемая из бифидобактерий, для применения в снижении риска развития и обострения хронических респираторных заболеваний у субъекта. Предпочтительно риск развития и обострения хронических респираторных заболеваний снижается в результате модулирования иммунной системы путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта; предпочтительно путем ингибирования репликации вируса и/или ослабления воспаления, вызванного вирусной инфекцией.
Предпочтительно композиция по настоящему изобретению снижает риск развития и обострения астмы и/или COPD.
В частности, в данном документе предусмотрена композиция, которая снижает риск развития и обострения астмы у детей.
Bifidobacterium
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04.
В одном примере, используемом в данном документе, указанная композиция может быть получена из бифидобактерий, предпочтительно из вида , предпочтительно , более предпочтительно из подвида (т. е."Bifidobacterium lactis"), более предпочтительно
.
Соответственно, предпочтительно указанная композиция может быть получена из бифидобактерий
Bifidobacterium animalis.
Соответственно, предпочтительно указанная композиция может быть получена из
Bifidobacterium animalis
lactis
Соответственно, предпочтительно указанная композиция может быть получена из  подвида .
Bifidobacterium lactis BL-04
Bifidobacterium lactis подвида lactis
.
Соответственно, предпочтительно указанная композиция может быть получена из , которая иногда упоминается как  BL-04Эти два термина являются взаимозаменяемыми.
В некоторых вариантах осуществления бифидобактерии для применения в соответствии с настоящим изобретением обладают хорошей устойчивостью к пепсину в условиях кислого рН, хорошей устойчивостью к панкреатину и/или хорошей стойкостью к солям желчных кислот.
Будет понятно, что композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть составлена в виде лекарственного препарата, продукта питания или биологически активной добавки. В предпочтительном варианте осуществления композиция составлена в виде биологически активной добавки.
Преимущественно, если продукт является пищевым продуктом, то бифидобактерии,и/или продукт ферментации бифидобактерий,и/или клеточный лизат бифидобактерийостаются эффективными (например, бактерии остаются жизнеспособными) в рамках обычного "срока реализации" или "срока годности", в течение которого продукт питания предлагается для продажи розничным торговцем. Предпочтительно, время эффективности должно превышать такие сроки, вплоть до окончания нормального периода свежести, когда порча пищевого продукта становится очевидной. Требуемые промежутки времени и нормальный срок хранения будут варьировать в зависимости от пищевого продукта, и специалистам в данной области техники будет понятно, что периоды срока хранения будут варьировать в зависимости от типа пищевого продукта, размера пищевого продукта, температур хранения, условий обработки, упаковочного материала и упаковочного оборудования.
Подробное описание
Подробные аспекты настоящего изобретения излагаются ниже. В частности, некоторые из подробных аспектов обсуждаются в отдельных разделах. Это делается для удобства ссылок и никоим образом не для ограничения. Все варианты осуществления, описанные ниже, одинаково применимы ко всем аспектам настоящего изобретения, если из контекста явно не следует иное.
Далее по тексту термин "содержащий" охватывает "включающий", а также "состоящий",например, композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из X или может включать что-то дополнительное,например, X+Y.
Слово "практически" не исключает "полностью",например, композиция, которая "практически не содержит" Y, может полностью не содержать Y. В соответствующем случае или в случае необходимости слово "практически'' может быть упущено из определения настоящего изобретения.
z
z ± 20
z ±
z ±
z ±
Термин "приблизительно" по отношению к числовому значению является необязательным и означает, например, %, предпочтительно 15%, предпочтительно 10%, предпочтительно 5%.
Термин в единственном числе включает единственное число, а также множественное число.
В одном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрена композиция, получаемая из бифидобактерий, для применения в модулировании иммунной системы субъекта путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта.
Используемый в данном документе термин "вирус" имеет свое общепринятое в данной области техники значение, и, таким образом, в целом относится к возбудителю заболевания, состоящему только из генетического материала, белковой оболочки и необязательно липидной оболочки, окружающей указанную белковую оболочку.
Примеры вирусов включают риновирус, коронавирус, вирус парагриппа, аденовирус, энтеровирус или респираторно-синцитиальный вирус.
Используемый в данном документе термин "риновирус" относится к возбудителю простуды. Этот термин охватывает любой штамм видов риновирусов рода Enterovirus семейства вирусов Picornaviridae. Этот термин включает риновирусы A, B и C.
"Риновирус человека" также упоминается в данном документе как "HRV".
Используемый в данном документе термин "вирусная инфекция" относится к состоянию, при котором вирус присутствует и размножается в субъекте. Вирусная инфекция может вызывать симптомы и болезнь у субъекта или может присутствовать в виде субклинической инфекции, не вызывая симптомов и болезни у субъекта.
Симптомы риновирусной инфекции включают боль в горле, чихание, заложенность носа, лихорадку, насморк, кашель, кашель с ощущением заложенности в груди и кашель с бронхиальной обструкцией.
Кроме того, риновирусная инфекция может вызвать воспаление дыхательных путей.
Указанное воспаление может иметь место в нижних дыхательных путях или верхних дыхательных путях.
Используемый в данном документе термин "воспаление" охватывает любое воспаление, ассоциированное с вирусной инфекцией, в том числе, например, тонзиллит, средний отит, ринит (воспаление слизистой оболочки носа); риносинусит или синусит (воспаление ноздрей и придаточных пазух носа, включая лобные, решетчатой кости, верхнечелюстные и клиновидные); назофарингит, ринофарингит (воспаление ноздрей, глотки, гортанной части глотки, небного язычка и миндалин); фарингит (воспаление глотки, гортанной части глотки, небного язычка и миндалин); эпиглоттит или супраглоттит (воспаление верхней части гортани и области над голосовой щелью); ларингит (воспаление гортани); ларинготрахеит (воспаление гортани, трахеи и области ниже голосовой щели); трахеит (воспаление трахеи и области ниже голосовой щели); бронхит (воспаление бронхов), бронхиолит, острый бронхит и вирусную или бактериальную пневмонию.
Используемые в данном документе термины "вызываемые вирусом эффекты" и "эффекты, которые вызывает вирус" используются взаимозаменяемо и относятся к любому одному или нескольким симптомам, которые может испытывать субъект, страдающий вирусной инфекцией, и, в частности, к тем, которые обсуждались выше, таким как боль в горле, чихание, заложенность носа, лихорадка, насморк, кашель, кашель с ощущением заложенности в груди и кашель с бронхиальной обструкцией, усталость или любое воспаление.
Используемые в данном документе термины "болезнь" и "заболевание" относятся к любому отклонению или нарушению нормальной структуры и/или функции любой части тела, органа или системы, которое проявляется характерной совокупностью симптомов и признаков. Этот термин охватывает состояния с известной или неизвестной этиологией и/или патологией.
Используемый в данном документе термин "заболевание дыхательных путей" или "инфекция дыхательных путей" относится к любому заболеванию, поражающему дыхательные пути, в том числе заболевания как верхних, так и нижних дыхательных путей.
В одном варианте осуществления заболевание дыхательных путей представляет собой заболевание верхних дыхательных путей.
Заболевание дыхательных путей может быть вызвано вирусной инфекцией, такой как риновирусная инфекция, и может вызвать любой один или несколько симптомов вирусной инфекции или вирусных эффектов, описанных выше.
Заболевание дыхательных путей может быть временным/острым или хроническим и/или рецидивирующим.
Заболевание дыхательных путей может быть результатом экологических, аллергенных или генетических факторов, в том числе бактериальной или вирусной инфекции, или любой комбинации таких факторов.
В одном варианте осуществления композицию в соответствии с настоящим изобретением можно применять для лечения или профилактики вызываемых вирусом эффектов. В предпочтительном варианте осуществления композицию в соответствии с настоящим изобретением можно применять для лечения или профилактики воспаления, вызванного вирусной инфекцией, в частности риновирусной инфекцией. В одном варианте осуществления заболевание дыхательных путей представляет собой заболевание нижних дыхательных путей.
Используемые в данном документе термины "вирусная активность" или "активность вируса" используются взаимозаменяемо и означают любую активность, которую осуществляет сам вирус, такую как заражение субъекта или репликация.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к снижению одного или нескольких из частоты возникновения и/или продолжительности или тяжести вирусной инфекции, предпочтительно частоты возникновения. В частности, это имеет место у пациентов с COPD и/или астмой. Наиболее предпочтительно вирусная инфекция представляет собой риновирусную инфекцию.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к снижению одного или нескольких из частоты возникновения и/или продолжительности или тяжести вирусной инфекции у субъектов, склонных к развитию астмы, в частности, если такими субъектами являются дети. Наиболее предпочтительно вирусная инфекция представляет собой риновирусную инфекцию.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к снижению частоты возникновения, продолжительности или тяжести (предпочтительно, частоты возникновения) вызываемых вирусом эффектов, испытываемых субъектом. В частности, к снижению интенсивности воспаления дыхательных путей, вызванного вирусной инфекцией.
Предпочтительно снижение частоты возникновения (числа или частоты), продолжительности или тяжести вирусной инфекции или ослабление вирусного воспаления, вызванного вирусной инфекцией, имеет место в результате введения композиции, полученной из бифидобактерий, по сравнению соответственно с частотой возникновения (числом или частотой), продолжительностью или тяжестью вирусной инфекции или симптомов вирусной инфекции у подлежащих сравниванию субъектов, которым не вводиликомпозицию, полученную из бифидобактерий.
Используемый в данном документе термин "получаемый" означает полученный или изготовленный из источника. Термин "получаемый" включает термин "полученный". Композиции по настоящему изобретению могут быть получены из цельных бифидобактерий, и/или продуктов ферментации бифидобактерий, и/или клеточного лизата бифидобактерий.
Хронические респираторные заболевания
В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрена композиция, получаемая для применения в снижении риска развития и обострения у субъекта хронических респираторных заболеваний, в частности астмы и COPD.
В предпочтительном варианте осуществления субъект является субъектом-человеком. В наиболее предпочтительном варианте осуществления субъект является человеческим ребенком, возраст которого наиболее предпочтительно составляет меньше 16 лет. В некоторых вариантах осуществления возраст человеческого ребенка составляет менее 10 лет. В некоторых вариантах осуществления возраст человеческого ребенка составляет менее 8 лет. В некоторых вариантах осуществления возраст человеческого ребенка составляет менее 6 лет. В некоторых вариантах осуществления возраст человеческого ребенка составляет менее 4 лет. В некоторых вариантах осуществления возраст человеческого ребенка составляет приблизительно 3 года или меньше.
.
Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ снижения риска развития и обострения хронических респираторных заболеваний у субъекта, при этом указанный способ предусматривает введение указанному субъекту композиции, получаемой из бифидобактерий
В дополнительном варианте осуществления в настоящем изобретении предусмотрено применение композиции, получаемой из бифидобактерий, в изготовлении композиции для снижения риска развития и обострения хронических респираторных заболеваний у субъекта.
Термин "хроническое респираторное заболевание" относится к заболеваниям дыхательных путей и любому другому заболеванию дыхательной системы, в том числе заболеваниям легких, которые проявляются постоянно или рецидивируют на протяжении жизни субъекта.
Хронические респираторные заболевания включают COPD, астму, хронический бронхит, кистозный фиброз, эмфизему и идиопатический фиброз легких.
et al.
Вирусная инфекция, и в частности риновирусная инфекция, может увеличить вероятность развития хронических респираторных заболеваний и обострить существующие хронические респираторные заболевания (Saraya  (2014)). Таким образом, настоящее изобретение преимущественно обеспечивает снижение риска хронических респираторных заболеваний и/или уменьшение обострения путем подавления риновирусной инфекции и/или ослабления воспаления, вызванного риновирусной инфекцией.
В частности, в одном варианте осуществления настоящее изобретение обеспечивает снижение интенсивности воспаления дыхательных путей, связанного с риновирусной инфекцией.
COPD
Хроническая обструктивная болезнь легких (COPD) представляет собой заболевание легких, характеризующееся хронической обструкцией воздушного потока легких, которая препятствует нормальному дыханию и не является полностью обратимой. Термины "хронический бронхит" и "эмфизема" в настоящее время включены в диагноз COPD в соответствии с определением Всемирной организации здравоохранения (WHO).
Диагноз COPD подтверждают простым тестом, называемым спирометрия, при котором измеряют насколько глубоко человек может дышать и как быстро воздух может перемещаться в легкие и из них. Такой диагноз следует рассматривать у любого пациента, у которого есть симптомы кашля, выработки мокроты или отдышки (тяжелое или затрудненное дыхание) и/или история воздействия факторов риска данного заболевания. В случае, если спирометрию нельзя провести, то диагноз COPD может быть поставлен при помощи других инструментов.
Для постановки диагноза могут быть использованы клинические симптомы и признаки, такие как аномальная нехватка воздуха при дыхании и увеличенное время форсированного выдоха. Низкая максимальная скорость выдоха согласуется с COPD, также как хронический кашель и выработка мокроты.
Астма
Астма представляет собой хроническое заболевание, характеризующееся повторяющимися приступами удушья, кашлем и бронхиальной обструкцией, которые различаются по тяжести и частоте у разных людей.
Симптомы могут возникать несколько раз на день или неделю у пораженных заболеванием индивидуумов, а у некоторых людей могут ухудшаться во время физической активности или ночью.
Во время приступа астмы выстилка бронхиальных интубационных трубок набухает, что приводит к сужению дыхательных путей и замедлению потока воздуха в легкие и из них. Повторяющиеся симптомы астмы часто приводят к бессоннице, дневной усталости, пониженным уровням активности, а также к вынужденным прогулам школы и работы.
Лечение острых симптомов астмы обычно осуществляют ингаляционным бета-2-агонистом короткого действия (таким как сальбутамол) и пероральными кортикостероидами. В очень тяжелых случаях можно применять внутривенные кортикостероиды.
Бифидобактерии
Bifidobacterium
Настоящее изобретение относится к любому представителю бифидобактерий, такому как любой представитель рода  - представители которого представляют собой грамположительные анаэробные бактерии, обычно выделенные из микробиоты желудочно-кишечного тракта.
,
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04
Хотя не предполагается, что настоящее изобретение ограничивается какими-либо конкретными видами бифидобактерийв некоторых особенно предпочтительных вариантах осуществления бифидобактерии предпочтительно представляют собой , более предпочтительно подвида (т. е."Bifidobacterium lactis"), более предпочтительно находит применение в настоящем изобретении. Предполагается, что этот термин включает виды, которые были повторно переклассифицированы (например,из-за изменений в идентификации организмов в результате генетических и других исследований) или переименованы в маркетинговых и/или других целях.
Bifidobacterium lactis
BL-04
Bifidobacterium lactis
BL-04 (также упоминаемая в данном документе как "BL-04" и "Bl-04")
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis
иначе называют подвида  BL-04, при этом эти термины используются в данном документе взаимозаменяемо. BL-04 также была известна как DGCC2908 и RB4825.
Bifidobacterium lactis
BL-04
et al.
был первоначально выделен из образца фекалий здорового взрослого человека, и он представляет собой коммерческий штамм, который был использован и депонирован на гарантированное хранение в Американской коллекции типовых культур (ATCC) как штамм SD5219 (см. Barrangou R. ; J. Bacteriol. 191:4144-4151(2009)). Это общедоступный штамм (доступный от DuPont).
Используемый в данном документе термин "продукт ферментациибифидобактерий" означает композицию, которую получают в результате культивирования (например, ферментации) бифидобактерий в подходящих средах; или ее надосадочную жидкость, или фракцию, или компонент. В одном варианте осуществления продукт ферментации бифидобактерийпредставляет собой цельную композицию, которую получают в результате культивирования (например, ферментации) бифидобактерийв подходящих средах. Продукт ферментации можно высушивать перед тем, как применять.
.
Продукт ферментациибифидобактерийв одном варианте осуществления может содержать жизнеспособныебифидобактерииПродукт ферментациибифидобактерийв другом варианте осуществления может представлять собой продукт ферментации, не содержащий клеток. Продукт ферментации, не содержащий клеток, может представлять собой продукт ферментации бифидобактерий,который получают в результате культивирования (например, ферментации) бифидобактерийв подходящих средах, которые были модифицированы для удаления и/или инактивации бактериальных клеток с получением ферментата, не содержащего клеток. В другом варианте осуществления продукт ферментации бифидобактерийможет содержать нежизнеспособные бифидобактерии,которые могут быть цельными или лизированными.
5
4
3
2
5
4
3
2
Используемый в данном документе термин "не содержащий клеток" означает, что продукт ферментации (предпочтительно ферментат) практически не содержит жизнеспособных бактериальных клеток, обычно содержит менее приблизительно 10 жизнеспособных бактериальных клеток/мл продукта ферментации, менее приблизительно 10 жизнеспособных бактериальных клеток/мл продукта ферментации, менее приблизительно 10 жизнеспособных бактериальных клеток/мл продукта ферментации, менее приблизительно 10 жизнеспособных бактериальных клеток/мл продукта ферментации или менее приблизительно 10 жизнеспособных бактериальных клеток/мл продукта ферментации. Предпочтительно продукт ферментации практически не содержит клеток, обычно содержит менее приблизительно 10 клеток/мл продукта ферментации, менее приблизительно 10 клеток/мл продукта ферментации, менее приблизительно 10 клеток/мл продукта ферментации, менее приблизительно 10 клеток/мл продукта ферментации или менее приблизительно 10 клеток/мл продукта ферментации.
В одном аспекте из продукта ферментации (например, ферментата) можно выделить одну или несколько клеток. Такое выделение можно осуществить с помощью любых способов, известных в данной области техники, в том числе с помощью центрифугирования и/или фильтрации. Например, продукт ферментации можно профильтровать (один или несколько раз при многостадийном способе) с удалением таких компонентов как взвешенные частицы, клетки и т. п. Альтернативно или дополнительно, из продукта ферментации (например, ферментата) с помощью центрифугирования можно выделить одну или несколько клеток и/или одну или несколько спор с получением таким образом надосадочной жидкости. В зависимости от скорости и продолжительности центрифугирования надосадочная жидкость может не содержать клетки (т. е. не содержащая клеток надосадочная жидкость) или надосадочная жидкость может содержать клетки, которые можно отфильтровать или дополнительно отцентрифугировать с получением не содержащей клеток надосадочной жидкости.
В некоторых аспектах продукт ферментации бифидобактерийможет представлять собой неочищенный экстракт культуральной среды.
.
В некоторых аспектах продукт ферментации бифидобактерийможет содержать смесь составляющих компонентов, присутствующих после (например, в конце) культивирования бифидобактерийВследствие этого, термин продукт ферментации может включать в дополнение к активным ингредиентам другие компоненты, такие как взвешенные частицы, твердые вещества, субстраты, не потребленные во время культивирования, дебрис, среды и клеточные отходы.
Используемый в данном документе термин "клеточный лизат бифидобактерий" означает клеточный дебрис и жидкость, полученные в результате лизиса клетки(клеток)бифидобактерий. Предпочтительно клетку(клетки) бифидобактерийвыделяют перед осуществлением лизиса.
Предпочтительно клетки бифидобактерийлизируют следующим способом: бифидобактериикультивируют анаэробно при 37°C в MRS (или другой подходящей среде для культивирования), дополненной 0,05% цистеином; бактериальные клетки собирают центрифугированием (6000 об./мин./5 мин.); надосадочную жидкость отсасывают и осадок необязательно замораживают при -70°C; к 1,5 мл осадка культуры бактериальных клеток добавляют 150 мкл T10E1 (10 мM Tris-HCl, pH 7,5; 1 мM EDTA) и встряхивают на вортексе для ресуспендирования осадка клеток; 1 мкл лизоцима Ready-Lyse™ (Epicentre, Vol. 10, No. 3, 2003) добавляют к каждому ресуспендированному осадку бактерий (от 1 до 1,5 мл культуры); инкубируют при 37°C в течение от 30 минут до всей ночи; 1 мкл протеиназы K (50 мкг/мкл) разбавляют до 150 мкл раствором для лизиса 2X T&C (оба поставляются в наборе для очистки ДНК MasterPure или продаются отдельно) для каждого 1-1,5 мл осадка культуры; 150 мкл смеси протеиназы K/раствора для лизиса добавляют к образцу и тщательно перемешивают; инкубируют при 65-70°C в течение 15 минут, кратковременно встряхивая на вортексе каждые 5 минут; охлаждают образцы до 37°C; 1 мкл РНКазы A (5 мкг/мкл, поставляется в наборе или продается отдельно) добавляют в каждый образец и тщательно перемешивают; инкубируют при 37°C в течение 30 минут; образцы помещают на лед.
Для лизиса бифидобактерий можно применять альтернативные способы лизиса для грамположительных бактерий,при этом они известны специалисту в данной области техники.
Соответственно, продукт ферментации бифидобактерийможет быть продуктом ферментации, который находится в фазе надосадочной жидкости, выделенной из культуры бифидобактерий,культивируемых при следующих условиях: анаэробно при 37°C в MRS (или другой подходящей среде), дополненной 0,05% цистеином.
o
В одном варианте осуществления продукт ферментации может быть получаемым (предпочтительно полученным) с помощью культивирования бактерий в среде для культивирования до тех пор, пока OD культуры при λ600 не достигнет по меньшей мере 0,6, предпочтительно от 0,6 до 1,5; необязательно с удалением бактерий с помощью центрифугирования и/или фильтрации (как, например, центрифугирования при 25C, 5 мин., 3000g и/или стерилизующей фильтрации) с получением в результате не содержащего клеток продукта-ферментата, содержащего активный ингредиент(ы).
Соответственно, продукт ферментации является получаемым (предпочтительно полученным) с применением среды для культивирования MRS либо с 1,0% сахара, либо без сахара. Соответственно, продукт ферментации является получаемым (предпочтительно полученным) с помощью культивирования бактерий при 37°C. Соответственно, продукт ферментации является получаемым (предпочтительно полученным) с помощью анаэробного культивирования бактерий.
Культивирование бифидобактерийможет проходить от приблизительно 1 до приблизительно 72 часов (ч.), от приблизительно 5 до приблизительно 60 ч., или от приблизительно 10 до приблизительно 54 ч., или от 24 до 48 ч.
В одном аспекте культивирование можно проводить до тех пор, пока не наступит истощение питательных веществ (предпочтительно полной питательной смеси).
В одном аспекте культивирование проводится в течение времени, эффективного для достижения стационарной фазы роста бактерий.
Температура во время культивирования может составлять от приблизительно 30 до приблизительно 50°C,от приблизительно 32 до приблизительно 40°C, или от приблизительно 34 до приблизительно 38°C, или при приблизительно 37°C.
Значение pH во время культивирования может представлять собой pH от приблизительно 5 до приблизительно 9,от приблизительно 5 до приблизительно 6, от приблизительно 6 до приблизительно 7, от приблизительно 7 до приблизительно 8.
В одном аспекте культивирование предпочтительно проводят при аэрировании.
Специалисту в данной области известно периодическое и непрерывное культивирование. Продукт ферментации по настоящему изобретению можно получать с применением периодического или непрерывного культивирования.
Соответственно, продукт ферментации можно собирать во время процесса культивирования или по его завершению.
В одном аспекте продукт ферментации по настоящему изобретению собирают во время экспоненциальной фазы или по ее завершению.
В одном аспекте продукт ферментации по настоящему изобретению собирают в период или во время стационарной фазы.
В одном аспекте настоящего изобретения продукт ферментации можно получать в чане при промышленных условиях.
В одном аспекте культуру во время культивирования (например, во время ферментации) взбалтывают и/или перемешивают.
В одном аспекте во время культивирования отслеживают и/или контролируют уровень насыщения кислородом.
Соответственно, композиция, содержащая бифидобактерии,в соответствии с настоящим изобретением, или продукт ферментации бифидобактерий,или клеточный лизат бифидобактериймогут быть в форме бактериальной суспензии до или после замораживания, или в форме концентратов, либо в сухой, лиофилизированной или замороженной форме. Какая бы форма не применялась, штамм можно замораживать.
В одном варианте осуществления композиция, содержащая бифидобактерии,в соответствии с настоящим изобретением не содержит дополнительного микроорганизма, например, не содержит дополнительной пробиотической бактерии.
В одном варианте осуществления композиция в соответствии с настоящим изобретением состоит из бифидобактерий,например, вместе с наполнителями, разбавителями или носителями.
Соответственно, композиция, содержащая бифидобактерии,и/или продукт ферментации бифидобактерий,и/или клеточный лизат бифидобактерий,в соответствии с настоящим изобретением может содержать одно или несколько вспомогательных веществ. Соответствующие вспомогательные вещества можно добавлять во время высушивания и/или во время лиофилизации композиции.
В одном варианте осуществления предпочтительно бифидобактериив композиции и/или продукте ферментации по настоящему изобретению являются жизнеспособными.
Термин "жизнеспособный" означает, что микроорганизм (бактерия) метаболически активен или способен размножаться.
В предпочтительном варианте осуществления композиция содержит жизнеспособные бифидобактерии.
В некоторых вариантах осуществления бифидобактерии(например, жизнеспособные клетки) выделяют из среды, в которой их культивировали, или продукта ферментации до образования композиции, содержащей бифидобактерии,по настоящему изобретению.
Дозирование
6
12
8
12
9
12
Композиция, получаемая из бифидобактерий,используемых в соответствии с настоящим изобретением, может содержать от 10 до 10КОЕ бактерий/г композиции, и более конкретно от 10 до 10КОЕ бактерий/г композиции, предпочтительно от 10 до 10КОЕ/г для лиофилизированной формы.
Bifidobacterium lactis
BL-04
6
12
8
12
8
12
6
12
8
12
Соответственно, композицию, получаемую из бифидобактерий,используемых в соответствии с настоящим изобретением, можно вводить в дозировке, составляющей от приблизительно 10 до приблизительно 10КОЕбифидобактерий/доза, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 10КОЕбифидобактерий/доза. Под термином "на дозу" подразумевается, что это количествобифидобактерийпредоставляется субъекту либо в день, либо за прием, предпочтительно в день. Например, если бифидобактерииподлежат введению с пищей (например, в йогурте), тогда йогурт предпочтительно будет содержать от приблизительно 10 до 10КОЕ бифидобактерий. Альтернативно, однако, это количество бифидобактерийможет быть разделено на несколько введений, каждое из которых состоит из меньшего количества микробной нагрузки - при условии, что общее количество бифидобактерий,полученных субъектом за любое конкретное время (например, за каждый 24-часовой период), составляет от приблизительно 10 до приблизительно 10КОЕ бифидобактерий, предпочтительно от 10 до приблизительно 10КОЕ .
6
6
12
8
12
В соответствии с настоящим изобретением эффективное количество бифидобактерийможет составлять по меньшей мере 10КОЕ микроорганизмов/доза, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 10КОЕ микроорганизмов/доза, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 10КОЕ микроорганизмов/доза.
6
12
8
12
6
12
8
12
В одном варианте осуществления предпочтительно бифидобактерии,используемые в соответствии с настоящим изобретением, можно вводить в дозировке, составляющей от приблизительно 10 до приблизительно 10 КОЕ микроорганизмов/доза, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 10КОЕ микроорганизмов/доза. Следовательно, эффективное количество в данном варианте осуществления может составлять от приблизительно 10 до приблизительно 10КОЕ микроорганизмов/день, предпочтительно от приблизительно 10 до приблизительно 10КОЕ микроорганизмов/день.
8
10
9
9
9
В одном варианте осуществления предпочтительно бифидобактерии,используемые в соответствии с настоящим изобретением, вводят в дозировке, составляющей от приблизительно 10 до приблизительно 10КОЕ/день, предпочтительно от приблизительно 1×10 до 3×10КОЕ/день, например, приблизительно 2×10КОЕ микроорганизмов/день.
КОЕ означает "колониеобразующие единицы".
Модификация лекарственного препарата
В одном варианте осуществления композицию, получаемую из бифидобактерий,и/или продукта ферментации бифидобактерий,и/или клеточного лизата бифидобактерий,в соответствии с настоящим изобретением можно применять для модификации приема лекарственного препарата (например, лекарственного препарата для облегчения или профилактики астмы/COPD) субъектом.
В одном варианте осуществления термин "модифицировать" означает "сокращать".
Модификация и/или сокращение в отношении лекарственного препарата означает модификацию или сокращение по сравнению с плацебо-контролем.
Плацебо-контролю не вводят композицию, получаемую из бифидобактерий,и/или продукта ферментации бифидобактерий,и/или клеточного лизата бифидобактерий,в соответствии с настоящим изобретением. Плацебо-контролю может быть введена сахароза.
Термин "лекарственный препарат" может включать лекарственный препарат для лечения и облегчения симптомов хронических респираторных заболеваний, таких как астма и COPD. Он может включать один или несколько из следующих типов лекарственных препаратов: ингаляционный бета-2-агонист короткого действия (такой как сальбутамол), антигистаминные препараты, иммуномодуляторы, пероральные кортикостероиды и внутривенные кортикостероиды.
Композиция, получаемая из бифидобактерий,и/или продукта ферментации бифидобактерий,и/или клеточного лизата бифидобактерий,в соответствии с настоящим изобретением может быть введена в составе или в виде продукта питания или может быть введена в виде фармацевтически приемлемой композиции.
Дополнительные микроорганизмы
В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция, получаемая из бифидобактерий,и/или продукта ферментации бифидобактерий,и/или клеточного лизата бифидобактерий,в соответствии с настоящим изобретением может содержать по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм, предпочтительно по меньшей мере одну дополнительную пробиотическую бактерию.
В данном описании термин "пробиотический микроорганизм" определяется как охватывающий любой непатогенный микроорганизм, который при введении живым (например, жизнеспособным) в достаточных количествах приносит пользу для здоровья хозяина. Данные пробиотические штаммы, как правило, обладают способностью выживать при прохождении через верхнюю часть пищеварительного тракта. Они являются непатогенными, нетоксичными и проявляют благоприятный эффект на здоровье, с одной стороны, посредством экологических взаимодействий с резидентной микробиотой в пищеварительном тракте, а с другой стороны, посредством их способности положительно влиять на иммунную систему посредством "GALT" (связанная с кишечником лимфоидная ткань). В зависимости от определения пробиотиков, эти микроорганизмы, когда их дают в достаточном количестве, обладают способностью к выживанию в кишечнике, однако, они не пересекают кишечный барьер, и их первичные эффекты, следовательно, индуцируются в просвете и/или стенке желудочно-кишечного тракта. Затем на протяжении периода введения они образуют часть резидентной микробиоты. Данная колонизация (или временная колонизация) дает возможность пробиотическому микроорганизму проявить благоприятный эффект, такой как подавление потенциально патогенных микроорганизмов, присутствующих в микробиоте, и взаимодействовать с иммунной системой кишечника.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04.
В определенных вариантах осуществления дополнительный пробиотический микроорганизм представляет собой бактерию, предпочтительно пробиотическую молочнокислую бактерию и/или другую пробиотическую бактерию, предпочтительно , более предпочтительно из подвида (т. e."Bifidobacterium lactis"), более предпочтительно
Lactococcus
Streptococcus
Pediococcus
Enterococcus
Leuconostoc, Carnobacterium
Propionibacterium
Bifidobacterium, Lactobacillus, Brevibacterium
Vagococcus
Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus, Bifidobacterium и Saccharomyces.
В некоторых вариантах осуществления бактерия может представлять собой бактерию из одного или нескольких следующих родов: , , , , , , и . В одном варианте осуществления по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм выбран из родов
Дополнительным микроорганизмом, подлежащим использованию в соответствии с настоящим изобретением, может быть микроорганизм, который общепризнан безопасным и который предпочтительно одобрен GRAS.
Специалист в данной области безо всяких сложностей будет имеет представление о конкретных видах и/или штаммах микроорганизмов из родов, описанных в данном документе, которые применяются в пищевой и/или сельскохозяйственной промышленностях, и которые в целом считаются подходящими для употребления человеком и/или животными.
Следовательно, композиция по настоящему изобретению может содержать дополнительный микроорганизм (штамм). Дополнительным микроорганизмом, используемым в соответствии с настоящим изобретением, является микроорганизм, который подходит для потребления человеком и/или животным.
Lactobacillus
Bifidobacterium
.
В одном варианте осуществления дополнительный микроорганизм относится к роду  или к роду  или представляет собой их смесь
L. acidophilus, L. curvatus, L. rhamnosus, L. casei, L. paracasei
L. salivarius, B. lactis, B. animalis, B. Longum
B. bifidum
Дополнительно или альтернативно, дополнительным микроорганизмом может быть штамм видов ,и/или.
L. acidophilus
L. curvatus, L. salivarius и/или B. lactis
В одном варианте осуществления дополнительным микроорганизмом может быть штамм видов, .
Streptococcus.
В одном варианте осуществления предпочтительно микроорганизм относится к роду
Enterococcus.
В одном варианте осуществления предпочтительно микроорганизм относится к роду
B. lactis
B. lactis
B. lactis
Предпочтительно микроорганизмом может быть штамм вида , такой как, например, 420 или  HN019.
Bifidobacterium
Lactobacillus
Lactobacillus,
L. acidophilus, L. salivarius
L. curvatus,
В некоторых вариантах осуществления дополнительный микроорганизм может представлять собой смесь более чем одного пробиотического микроорганизма (предпочтительно более чем одной пробиотической бактерии); смесь более чем одной бифидобактерии; или смесь одного или нескольких пробиотических микроорганизмов (предпочтительно пробиотических бактерий) и необязательно одной или нескольких молочнокислых бактерий. Например, смесь может содержать один или несколько штаммов вида и необязательно один или несколько дополнительных штаммов, таких как штамм вида . Дополнительный штамм может быть каталаза-отрицательным штаммом, с гомоферментативным типом метаболизма, приводящим к получению молочной кислоты, или может продуцировать бактериоцин, такой как, например, лактацин, активный против других микроорганизмов. Дополнительный микроорганизм может быть вида  такой как, например, и  при этом для применения в соответствии с настоящим изобретением предпочтительным является грамположительный штамм.
Lactobacillus
L. acidophilus, L. salivarius
L. curvatus
Бифидобактерии и/или дополнительный штамм, такой как вида , такой как и , для применения в соответствии с настоящим изобретением обладают хорошей устойчивостью к пепсину в условиях кислого рН, хорошей устойчивостью к панкреатину и/или хорошей стойкостью к солям желчных кислот.
Lactobacillus
L. acidophilus,
Lactobacillus
L. acidophilus,
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus
В одном варианте осуществления дополнительный штамм может быть вида , такой как, например, в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой микроорганизм, предпочтительно вид , такой как, например, который можно описать как "гидрофобный", т. e. обладающий сильным сродством к полярным или неполярным гидрофобным органическим растворителям, таким как, например, н-декан, хлороформ, гексадекан или ксилол.  в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой  PTA-4797. Штамм  был зарегистрирован Rhodia Chimie, 26, quai Alphonse Le Gallo, 92 512 BOULOGNE-BILLANCOURT Cedex France, в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур (ATCC), где он занесен под регистрационным номером PTA-4797.
Иммунная система
Используемый в данном документе термин "цитокин" относится к небольшому белку (около 5-20 кДа), высвобождаемому клетками, который влияет на взаимодействие между клетками, на связи между клетками или на поведение клеток. Цитокины включают интерлейкины, лимфокины и молекулы передачи клеточного сигнала, такие как фактор некроза опухоли и интерфероны. Изменения количества цитокинов могут запускать такие реакции, как воспаление и иммунный ответ на инфекции в организме. Используемый в данном документе термин "хемокин" относится к типу небольших цитокинов, которые обладают способностью индуцировать направленный хемотаксис (движение организма в ответ на химический стимул) близлежащих чувствительных клеток.
in vivo
in vitro
Используемый в данном документе термин "биомаркер" относится к широкой подкатегории медицинских признаков, которые могут быть измерены с точностью и воспроизводимостью. Их используют как объективные признаки медицинского состояния, наблюдаемого вне пациента. Биомаркеры можно измерить и оценить как показатель нормальных биологических процессов, патогенных процессов или фармакологических реакций на терапевтическое вмешательство. В качестве биомаркеров могут применяться как цитокины, так и хемокины. Биомаркеры можно измерить, например, в дыхательных путях, в носовом проходе, в назальном лаваже, или в крови, или мозговой жидкости. Измерения биомаркеров можно проводить  и .
Используемый в данном документе термин "модулирование" означает изменение или варьирование. Модулирование иммунной системы может включать повышение или снижение или изменение количества или уровня любого аспекта иммунной системы. В частности, в контексте данного документа модулирование иммунной системы может относиться к количеству присутствующих цитокинов или хемокинов по сравнению с контролем или плацебо. В одном варианте осуществления цитокины или хемокины присутствуют в дыхательных путях, в носовом проходе, в назальном лаваже или в крови. В одном варианте осуществления количество одного или нескольких цитокинов или хемокинов снижено. В другом варианте осуществления количество одного или нескольких цитокинов или хемокинов меняется под воздействием, например, понижается.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения модулирование иммунной системы обеспечивает снижение уровня по меньшей мере одного воспалительного биомаркера у субъекта. Предпочтительно указанные биомаркеры включают в себя по меньшей мере один цитокин или хемокин.
Предпочтительно цитокин представляет собой цитокин, который опосредует воспалительный ответ.
Предпочтительно хемокин представляет собой хемокин, который опосредует воспалительный ответ.
Предпочтительно хемокин представляет собой воспалительный хемокин, который привлекает воспалительные клетки к дыхательным путям. Он включает в себя без ограничения IL-8, MCP-1 IP-10, GM-CSF, MIP-3alpha и G-CSF.
Предпочтительно цитокин включает в себя без ограничения TNF-альфа, IL-1 бета и IL-6.
Некоторые цитокины и хемокины могут иметь как цитокиновую, так и хемокиновую функцию. Они включают в себя без ограничения IL-8.
Наиболее предпочтительно способы и применения настоящего изобретения уменьшают уровень по меньшей мере одного биомаркера, присутствующего у субъекта. Наиболее предпочтительно указанный биомаркер представляет собой хемокин и/или цитокин, наиболее предпочтительно воспалительный цитокин и/или воспалительный хемокин. В предпочтительном варианте осуществления уровни цитокинов и/или хемокинов снижены в нижних дыхательных путях. Цитокины и/или хемокины можно измерить, например, в бронхоальвеолярном лаваже или назальном лаваже. Наиболее предпочтительным измеряемым цитокином является IL-8. Поскольку этот цитокин связан с воспалением, сниженные уровни IL-8 указывают на уменьшенное воспаление у субъекта.
in vivo
in vitro
Биомаркер может присутствовать у субъекта в любом месте и измеряться в любом месте, например, в дыхательных путях, в носовом проходе, в назальном лаваже, или в крови, или мозговой жидкости. Измерения биомаркеров можно проводить  и .
Предпочтительно в настоящем изобретении снижение уровеня цитокинов и/или хемокинов приводит к снижению выдыхаемого оксида азота (eNO). Измерение количества eNO можно использовать для измерения степени воспаления в нижних дыхательных путях.
Более конкретно с помощью способов и применений по настоящему изобретению снижают уровень IL-8.
В другом варианте осуществления с помощью способов и применений по настоящему изобретению снижают уровень MCP-1.
В другом варианте осуществления с помощью способов и применений по настоящему изобретению снижают уровень IL-1 бета.
В другом варианте осуществления с помощью способов и применений по настоящему изобретению снижают уровень любого одного, или двух, или всех из IL-8, MCP-1 и IL-1 бета.
IL-8 представляет собой маркер воспаления. Известно, что он опосредует нейтрофильное, лимфоцитарное и эозинофильное воспаление с гиперреактивностью дыхательных путей и ремоделированием дыхательных путей, которые являются признаками астмы (Wark et al., 2002; Proud 2011).
Врожденная иммунная система отвечает за выработку воспалительных цитокинов и хемокинов в течение первых 4 дней развития инфекции (Proud 2011). Таким образом, IL-8 является маркером функции врожденной иммунной системы.
Термин "врожденная иммунная система" относится к аспектам иммунной системы, которые имеют место естественным образом в результате генетической конституции или физиологии человека и не возникают из-за предшествующей инфекции или вакцинации. В частности, в контексте настоящего изобретения врожденная иммунная система включает в себя аспекты иммунной системы, реагирующие на вирусную инфекцию и вырабатывающие цитокины, которые инициируют противовирусные механизмы защиты, и предупреждают клетки врожденного иммунитета, и индуцируют адаптивный иммунный ответ.
Адаптивная иммунная система (или специфический иммунный ответ) состоит из гуморального ответа и клеточно-опосредуемых ответов, которые осуществляются различными лимфоцитарными клетками, В-клетками и Т-клетками соответственно.
Адаптивный иммунитет создает специфический и сильный ответ против патогена и включает в себя различные типы клеток.
Кластер дифференцировки (CD) представляет собой классификацию идентификации различных типов клеток.
CD-антигены находятся на поверхности клеток и могут быть идентифицированы с применением антител и проточного цитометра. CD+ означает, что антиген присутствует, CD- означает, что антиген отсутствует.
Адаптивный иммунный ответ инициируется дендритными клетками, которые презентируют антигены лимфоцитам (CD3+ клетки).
Субпопуляция лимфоцитов называется Т-хелперными клетками (CD3+CD4+), которые являются частью иммунной системы. Эти клетки можно идентифицировать в крови, если они не являются моноцитами (CD14-), не являются B-клетками (CD19-) и являются CD3+CD4+.
Т-хелперные клетки, положительные для риновирусов, можно идентифицировать с применением тетрамеров МНС-II, которые нагружены HRV39-специфичными пептидами ("HRV39-специфичные").
Хемокиновый рецептор CCR5 нацеливает Т-хелперные клетки в очаг инфекции, в том числе дыхательные пути, из крови.
В предпочтительном варианте осуществления CD3+CD4+CD14-CD19-тетрамер+ клетки ("HRV39-специфичные Т-хелперные клетки") и CD3+CD4+CD14-CD19-тетрамер+CCR5+ клетки ("HRV39-специфичные CCR5+ T-хелперные клетки") можно идентифицировать в образцах крови субъекта.
В предпочтительном варианте осуществления композиции, способы и применения настоящего изобретения приводят к повышению количества вирус-специфичных Т-хелперных клеток у субъекта по сравнению с плацебо. В наиболее предпочтительном варианте осуществления у субъекта повышается количество T-хелперных клеток, положительных для риновирусов, по сравнению с плацебо. Известно, что такие клетки мигрируют в очаг вирусной инфекции, такой как слизистая оболочка дыхательных путей. Кроме того, такие клетки обеспечивают защиту от будущих риновирусных инфекций.
Субъект
Используемый в данном документе термин "субъект" означает животное. Предпочтительно субъект представляет собой млекопитающее, включая, например, сельскохозяйственные животные (в том числе крупный рогатый скот, лошади, свиньи, куры и овцы) и людей. В некоторых аспектах настоящего изобретения животное представляет собой домашнее животное (в том числе домашних питомцев), такое как, например, собака или кошка. В некоторых аспектах настоящего изобретения субъект, соответственно, может быть человеком.
В одном варианте осуществления субъект является человеком.
В одном варианте осуществления субъект может быть женского пола.
В одном варианте осуществления субъект может быть мужского пола.
В одном варианте осуществления субъект является ребенком. Используемый в данном документе термин "ребенок" означает человека, возраст которого составляет менее 16 лет.
В одном варианте осуществления субъект является человеком, возраст которого составляет 16 лет или старше.
В одном варианте осуществления субъект является человеком, возраст которого составляет 18 лет или старше.
В одном варианте осуществления субъект является субъектом не с ослабленным иммунитетом.
В одном варианте осуществления субъект является здоровым субъектом.
В одном варианте осуществления субъект имеет полностью развитую и неослабленную иммунную систему.
В одном варианте осуществления субъект страдает от хронического респираторного заболевания.
В одном варианте осуществления субъект страдает от астмы.
В дополнительном варианте осуществления субъект страдает от COPD.
В дополнительном варианте осуществления субъект склонен к развитию астмы или COPD. Это может быть связано с рядом причин, включающим одну или несколько из генетических факторов, воздействия патогенов, воздействия ядов и воздействия сигаретного дыма.
Преимущества
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что применение бифидобактерий значительно снижает частоту возникновения, продолжительность и/или тяжесть вирусных эффектов, в частности воспаление, вызванное вирусными инфекциями, по сравнению с плацебо у здоровых взрослых. Это указывает на то, что бифидобактерии могут модулировать врожденный иммунный ответ у здоровых взрослых. Это было продемонстрировано посредством снижения уровня специфических цитокинов IL-8, IL-1 бета, MCP-1.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что применение композиции, получаемой из бифидобактерий, значительно ингибирует репликацию вирусов и ослабляет воспаление, вызванное вирусной инфекцией. Это снижаетриск развития и обострения хронических респираторных заболеваний, таких как астма и COPD.
В частности, применениекомпозиции, получаемой из бифидобактерий,значительно снижаетриск развития и обострения астмы и COPD, которые ассоциированы с риновирусными инфекциями. Поскольку эти болезни могут оказывать долгосрочное влияние на качество жизни субъекта, в там числе повышение заболеваемости, настоящее изобретение является весьма преимущественным.
Неожиданным образом авторы настоящего изобретения обнаружили, что композиция, получаемая из бифидобактерий, оказывает влияние на адаптивную иммунную систему.
В частности, указанная композиция обеспечивает повышение количества HRV39-специфичных CCR5+ T-хелперных клеток, функция которых заключается в миграции в очаг вирусных инфекций, такой как слизистая оболочка дыхательных путей. Поскольку увеличение наблюдалось через 21 день после начала инфекции, повышение количества HRV39-специфичных CCR5+ T-хелперных клеток обеспечивает лучшую защиту от последующих случаев инфекции HRV. Уменьшение случаев инфекции HRV снижает вероятность развития и обострения хронических респираторных заболеваний, таких как астма и COPD, поскольку известно, что эти заболевания ассоциированы с инфекциями HRV (Saraya et al. 2014).
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04,
Неожиданным образом данный эффект был обнаружен с использованием одного штамма бифидобактерий, предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно  отдельно или без дополнительного микроорганизма в композиции.
Одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, чтоприменение композиции и способов по настоящему изобретению значительно снижает частоту возникновения, продолжительность и/или тяжесть симптомов вирусной инфекции. Это относится к здоровым индивидуумам, а также к индивидуумам, страдающим хроническими респираторными заболеваниями, или к тем, кто склонен к развитию хронических респираторных заболеваний.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что преимущественные эффекты, рассматриваемые в данном документе, могут быть получены с использованием одного штаммабифидобактерий в отдельности. Это может приводить ко многим преимуществам, в том числе к упрощению получения добавки и/или снижению стоимости производства добавки и добавки как таковой.
Дополнительным преимуществом является то, что один штамм бифидобактерийможно применять без дополнительных пробиотических бактерий, при этом данное преимущество заключается в том, что оно упрощает проблемы стабильности в отношении добавки. Поэтому одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, что композицию, получаемую из штамма бифидобактерий(например, в отдельности или без присутствия другого микроорганизма), легче стабилизировать, поскольку специалист в данной области техники беспокоится только о стабильности одной бактерии, а не нескольких бактерий.
Дополнительно или альтернативно, применение одного бактериального штамма в композиции может иметь преимущество, заключающееся в снижении эксплуатационных затрат на композицию по сравнению с композициями со смешанными штаммами.
Существенное дополнительное преимущество настоящего изобретения заключается в том, что авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что применение композиции, получаемой из бифидобактерий, в соответствии с настоящим изобретением можно использовать для модификации или сокращения приема лекарственного препарата субъектом, в частности субъектом, страдающим хроническим респираторным заболеванием.
Лекарственный препарат
Термин "лекарственный препарат", используемый в данном документе в отношении настоящего изобретения, охватывает лекарственные препараты для применения у человека и животного в области медицины человека и ветеринарии. Кроме того, используемый в данном документе термин "лекарственный препарат" означает любое вещество, которое обеспечивает терапевтический и/или благоприятный эффект. Используемый в данном документе термин "лекарственный препарат" не обязательно ограничивается веществами, для которых необходимо разрешение на продажу, но может включать вещества, которые можно применять в косметических средствах, нутрицевтиках, продуктах питания (в том числе, например, кормах и напитках) и лекарственных средствах природного происхождения.
Лечение
Следует понимать, что все ссылки на лечение в данном документе включают паллиативное и профилактическое лечение.
Практически чистая форма и/или выделенная форма
Для некоторых аспектов микроорганизм, и/или продукт ферментации, и/или клеточный лизат в соответствии с настоящим изобретением может находиться в практически чистой форме или может находиться в выделенной форме.
Термин "практически чистая форма" используется для указания того, что микроорганизм, и/или продукт ферментации, и/или клеточный лизат в соответствии с настоящим изобретением присутствуют на высоком уровне. Если микроорганизм, и/или продукт ферментации, и/или клеточный лизат находятся в практически чистой форме, то микроорганизм, и/или продукт ферментации, и/или клеточный лизат желательно являются преобладающим компонентом, присутствующим в композиции. Предпочтительно он присутствует на уровне более 30%, более 50%, более 75%, более 90% или даже более 95%, при этом указанный уровень определяется из расчета сухой вес/сухой вес по отношению ко всей рассматриваемой композиции.
При очень высоких уровнях (например, при уровнях более чем 90%, более чем 95% или более чем 99%) микроорганизм, и/или продукт ферментации, и/или клеточный лизат можно рассматривать как "выделенный".
Биологически активные вещества по настоящему изобретению (в том числе полипептиды, молекулы нуклеиновой кислоты, углеводы, идентифицированные/идентифицируемые посредством скрининга, липиды, идентифицированные/идентифицируемые посредством скрининга, фрагменты, идентифицированные/идентифицируемые посредством скрининга, и т. д.) можно получать в форме, которая практически не содержит одну или несколько загрязняющих примесей, с которыми вещество в ином случае может быть ассоциировано. Таким образом, например, они могут практически не содержать один или несколько потенциально загрязняющих молекул полипептидов и/или нуклеиновых кислот. Их можно получать в форме, которая практически не содержит других компонентов клетки (например, клеточных мембран, цитоплазмы и т. д.). Когда композиция практически не содержит конкретную примесь, примесь будет находиться на низком уровне (например, на уровне менее 10%, менее 5% или менее 1% из расчета сухой вес/сухой вес, как изложено выше).
Комбинация с другими компонентами
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04
Bifidobacterium
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04
Бифидобактерии, предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , и/или их продукт ферментации, и/или их клеточный лизат для применения в настоящем изобретении можно использовать в комбинации с другими компонентами. Таким образом, настоящее изобретение также относится к комбинациям. Бифидобактерии, предпочтительно из , более предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , и/или продукт их ферментации, и/или их клеточный лизат могут упоминаться в данном документе как "композиция по настоящему изобретению".
Комбинация по настоящему изобретению содержит композицию по настоящему изобретению и другой компонент, который подходит для употребления животным или человеком и способен обеспечивать медицинскую или физиологическую пользу для потребителя.
Другие компоненты комбинаций по настоящему изобретению включают полидекстрозу, такую как Litesse, и/или мальтодекстрин, и/или лактит. Эти другие компоненты можно необязательно добавлять к композиции для содействия процессу высушивания и способствования выживанию микроорганизмов.
Дополнительные примеры других подходящий компонентов включают одно или несколько из загустителей, желатинирующих средств, эмульгаторов, связующих, модификаторов кристаллов, подсластителей (в том числе искусственных подсластителей), модификаторов реологии, стабилизаторов, антиоксидантов, красителей, ферментов, носителей, сред-носителей, наполнителей, разбавителей, смазывающих веществ, вкусовых веществ, красящих веществ, суспендирующих средств, разрыхлителей, связующих для гранулирования и т. д. Эти другие компоненты могут быть натуральными. Эти другие компоненты можно получать с помощью химических и/или ферментативных методик.
В одном варианте осуществления микроорганизм, и/или продукт его ферментации, и/или его клеточный лизат могут быть включены в капсулу.
В одном предпочтительном варианте осуществления микроорганизм, и/или продукт его ферментации, и/или его клеточный лизат для применения в настоящем изобретении можно применять в комбинации с одним или несколькими липидами.
Например, микроорганизм, и/или продукт его ферментации, и/или его клеточный лизат для применения в настоящем изобретении можно применять в комбинации с одной или несколькими липидными мицеллами. Липидная мицелла может представлять собой простую липидную мицеллу или сложную липидную мицеллу.
Липидная мицелла может представлять собой скопление ориентированных молекул амфипатических веществ.
Липидные мицеллы могут представлять собой скопление коллоидных размеров ориентированных молекул амфипатических веществ, находящихся в равновесии с химическими соединениями в растворе, из которых они образованы. Мицеллы, как правило, несут электрический заряд. В водном растворе отдельные молекулы мицеллярного скопления ориентируют свои полярные группы, обращая по направлению к водной среде, а свой гидрофобный фрагмент направляют к центру мицеллы. Липидные мицеллы могут содержать липид и/или масло.
Используемый в данном документе термин "загуститель или желатинирующее средство" относится к продукту, который предотвращает разделение путем замедления или предотвращения перемещения частиц, будь то капельки несмешиваемых жидкостей, воздух или нерастворимые твердые вещества. Загустение происходит, когда отдельные гидратированные молекулы вызывают повышение вязкости, замедляя разделение. Желатинирование происходит, когда гидратированные молекулы связываются с образованием трехмерной сетки, которая захватывает частицы, тем самым иммобилизируя их.
Используемый в данном документе термин "стабилизатор" определяется как ингредиент или комбинация ингредиентов, которые не позволяют продукту (например, продукту питания) меняться с течением времени.
Используемый в данном документе термин "эмульгатор" относится к ингредиенту (например, ингредиенту продукта питания), который предотвращает разделение эмульсий. Эмульсии представляют собой два несмешиваемых вещества, причем одно, присутствующее в форме капель, содержится внутри другого. Эмульсии могут представлять собой масло-в-воде, где капельной или дисперсной фазой является масло, а непрерывной фазой является вода; или воду-в-масле, где вода становится дисперсной фазой, а непрерывной фазой является масло. Пены, которые представляют собой газ-в-жидкости, и суспензии, которые представляют собой твердое вещество-в-жидкости, также можно стабилизировать посредством применения эмульгаторов. Аэрация может происходить в трехфазной системе, где воздух захватывается жидким маслом, затем стабилизируется скоплениями кристаллов жира, стабилизированных эмульгатором. Эмульгаторы имеют полярную группу, характеризующуюся сродством к воде (гидрофильную), и неполярную группу, которая притягивается к маслу (липофильную). Они абсорбируются на границах раздела двух веществ, образуя пленку на границе раздела фаз, которая служит для стабилизации эмульсии. На гидрофильные/липофильные свойства эмульгаторов влияет структура молекулы. Эти свойства определяются значением гидрофильного/липофильного баланса (HLB). Низкие значения HLB указывают на более высокие липофильные свойства, которые применяют для стабилизации эмульсий вода-в-масле. Высокие значения HLB свойственны гидрофильным эмульгаторам, обычно применяемым в эмульсиях масло-в-воде. Эти значения получают на основе простых систем. Поскольку пищевые продукты часто содержат другие ингредиенты, которые влияют на свойства эмульгирования, значения HLB не всегда могут быть надежным ориентиром для выбора эмульгатора.
Используемый в данном документе термин "связующее" относится к ингредиенту (например, ингредиенту пищевого продукта), который связывает продукт вместе посредством физической или химической реакции. Например, во время "желатинирования" вода абсорбируется, обеспечивая эффект связывания. Однако связующие могут абсорбировать другие жидкости, такие как масла, удерживая их внутри продукта. В контексте настоящего изобретения связующие будут, как правило, использоваться в твердых продуктах или в продуктах с низким содержанием влаги, например, в выпекаемых продуктах, мучных изделиях, пончиках, хлебе и других.
Используемый в данном документе термин "модификатор кристаллов" относится к ингредиенту (например, ингредиенту пищевого продукта), который влияет на кристаллизацию либо жира, либо воды. Стабилизация кристаллов льда важна по двум причинам. Первая напрямую связана со стабильностью продукта с точки зрения разделения. Чем больше циклов замораживания/оттаивания переносит продукт, тем крупнее становятся кристаллы льда. Эти крупные кристаллы могут разрушать структуру продукта, либо естественную, как в случае клеточных стенок, либо ту, которая создается "желатинированием". Поскольку вода больше не находится на своем месте, продукт может характеризоваться синерезисом или конденсацией после оттаивания. Во-вторых, в случае продукта, который употребляют замороженным, эти крупные кристаллы приводят к нежелательному зернистому ощущению во рту.
"Носители" или "среды-носители" означают материалы, подходящие для введения соединения, и включают любой такой материал, известный в области техники, такой как, например, любая жидкость, гель, растворитель, жидкий разбавитель, солюбилизатор или подобное, который является нетоксичным и который не взаимодействует с какими-либо компонентами композиции с разрушительным характером.
Примеры приемлемых для применения в пищу носителей включают, например, воду, солевые растворы, спирт, силикон, воски, вазелиновое масло, растительные масла, полиэтиленгликоли, пропиленгликоль, липосомы, сахара, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, поверхностно-активные вещества, кремниевую кислоту, вязкий парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, сложные эфиры нефтяных жирных кислот, гидроксиметиллцеллюлозу, поливинилпирролидон и т. п.
Примеры наполнителей включают одно или несколько из микрокристаллической целлюлозы или других видов целлюлозы, лактозы, цитрата натрия, карбоната кальция, двухосновного фосфата кальция, глицина, крахмала, молочного сахара и полиэтиленгликолей с высоким молекулярным весом.
Примеры разрыхлителей включают одно или несколько из крахмала (предпочтительно кукурузного, картофельного или тапиокового крахмала), крахмалгликолята натрия, кроскармеллозы натрия и определенных комплексных силикатов.
Примеры связующих для гранулирования включают одно или несколько из поливинилпирролидона, гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMC), гидроксипропилцеллюлозы (HPC), сахарозы, мальтозы, желатина и гуммиарабика.
Примеры смазывающих веществ включают одно или несколько из стеарата магния, стеариновой кислоты, глицерилбегената и талька.
Примеры разбавителей включают одно или несколько из воды, этанола, пропиленгликоля и глицерина и их комбинаций.
Другие компоненты можно применять одновременно (например, когда их смешивают вместе, или даже когда их доставляют с помощью различных путей) или последовательно (например, их можно доставлять с помощью различных путей).
Предпочтительно, если композицию по настоящему изобретению смешивают с любыми другими компонентами, микроорганизмы остаются жизнеспособными.
Используемый в данном документе термин "компонент, подходящий для потребления животным или человеком" означает соединение, которое добавляют или могут добавлять в композицию по настоящему изобретению в качестве добавки, которая может иметь питательную ценность, представлять собой заменитель клетчатки или в целом иметь благоприятный эффект для потребителя. Ингредиенты можно применять в широком разнообразии продуктов, для которых требуется желирование, текстурирование, стабилизация, суспендирование, пленкообразование и структурирование, поддержание сочности без прибавления нежелательной вязкости. Предпочтительно, ингредиенты смогут продлить срок хранения и стабильность жизнеспособной культуры.
Компоненты могут представлять собой пребиотики, такие как альгинат, ксантан, пектин, камедь рожкового дерева (LBG), инулин, гуаровую камедь, галактоолигосахарид (GOS), фруктоолигосахарид (FOS), полидекстрозу (т. е. Litesse), лактит, лактосахарозу, олигосахариды сои, палатинозу, изомальтоолигосахариды, гликоолигосахариды и ксилоолигосахариды.
Оптимальное количество композиции для применения в комбинации по настоящему изобретению будет зависеть от продукта, подлежащего обработке, и/или способа приведения в контакт продукта с композицией, и/или предполагаемого применения такового. Количество жизнеспособного микроорганизма, применяемого в композициях, должно представлять собой достаточное количество, чтобы быть эффективным или оставаться достаточно эффективным при улучшении запаха, вкуса, мягкости, консистенции, текстуры, формы, вкусового ощущения, вязкости, структуры и/или органолептических свойств, питательной ценности и/или пользы для здоровья продуктов питания, содержащих указанную композицию. Этот промежуток времени эффективности должен превышать по меньшей мере срок использования продукта.
Концентраты
Композиции для применения в настоящем изобретении могут находиться в форме концентратов.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04
Обычно эти концентраты содержат существенно высокую концентрацию бифидобактерий, предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , и/или продукта их ферментации, и/или их клеточного лизата.
Порошки, гранулы и жидкие композиции в форме концентратов можно разбавлять водой или ресуспендировать в воде или других подходящих разбавителях, например, подходящей ростовой среде, такой как молоко или минеральные или растительные масла, с получением композиций, готовых к применению.
Комбинации по настоящему изобретению в форме концентратов можно получить в соответствии со способами, известными из уровня техники.
В одном аспекте настоящего изобретения продукт контактирует с композицией в концентрированной форме. Предпочтительно продукт контактирует с композицией, высушенной распылением и/или ресуспендированной.
Композиции по настоящему изобретению могут быть в порошкообразной форме.
Композиции по настоящему изобретению могут быть высушены, как например, высушены распылением или лиофилизированы способами, известными из уровня техники.
Типичные способы получения частиц с применением способа сушки распылением предусматривают растворение твердого материала в подходящем растворителе (например, культуры микроорганизмов в ферментационной среде). Альтернативно, материал можно суспендировать или эмульгировать в жидкости, не являющейся растворителем, с образованием суспензии или эмульсии. Другие ингредиенты (обсуждаемые выше) или такие компоненты, как противомикробные средства, стабилизирующие средства, красители и средства, способствующие процессу высушивания (иногда называемые влагопоглотителями), необязательно можно добавлять на этой стадии.
Затем раствор распыляют с образованием мелкодисперсного тумана из капель. Капли сразу же попадают в камеру сушки, где они контактируют с сушильным газом. Растворитель испаряется из капель в сушильный газ с затвердеванием капель, посредством чего образуются частицы. Затем частицы отделяют от сушильного газа и собирают.
Продукты
Любой продукт, который может получать пользу от композиции, может применяться в настоящем изобретении. Он включает без ограничения молочные продукты и продукты, получаемые из молочных продуктов, биологически активные добавки и фармацевтические продукты.
В качестве примера композицию по настоящему изобретению можно применять в качестве ингредиента для безалкогольных напитков, фруктового сока или напитка, содержащего сывороточный белок, лечебных чаев, какао-напитков, молочных напитков, продукта на основе бифидобактерий, напитков на основе молочнокислых бактерий, йогурта и питьевого йогурта, сыра, мороженого, фруктового льда и десертов, кондитерских изделий, бисквитов и смесей для кексов, закусок, пищевых продуктов и напитков для сбалансированного питания, фруктовых начинок, глазури для кексов, шоколадной начинки для хлебобулочных изделий, начинки с ароматом чизкейка, фруктовой начинки для кексов, глазури для кексов и пончиков, кремовой начинки для полуфабрикатов хлебобулочных изделий, начинки для печенья, готовой к употреблению начинки для хлебобулочных изделий, начинки со сниженной энергетической ценностью, диетологического напитка для взрослых, подкисленного соевого/сокового напитка, асептического/стерилизованного шоколадного напитка, смеси для батончиков, порошков для напитков, обогащенного кальцием соевого/натурального и шоколадного молока, обогащенного кальцием кофейного напитка.
Композицию можно дополнительно применять в качестве ингредиента для продуктов питания, таких как американский сырный соус, средство против слеживания для тертого и измельченного сыра, дип-соус для чипсов, сливочный сыр, сухая смесь обезжиренной сметаны для крема-поливки, молочные сливки для взбивания, выдерживающие замораживание/оттаивание, стабильные при замораживании/оттаивании взбитые сливки, легкий натуральный сыр чеддер пониженной жирности, швейцарский йогурт пониженной жирности, аэрированные замороженные десерты, твердое мороженое, твердое мороженое с безвредной этикеткой, улучшенными экономическими показатели и изысканным вкусом, мороженое пониженной жирности, мягкое мороженое, соус для барбекю, сырный дип-соус, творожный соус, сухая смесь для соуса "Альфредо", смесь для сырного соуса, сухая смесь для томатного соуса и прочее.
Для определенных аспектов предпочтительно настоящее изобретение можно применять совместно с получением йогурта, как например, ферментированного йогуртового напитка, йогурта, питьевого йогурта, сыра, ферментированных сливок, десертов на основе молока и прочего.
Соответственно, композицию можно дополнительно применять в качестве ингредиента в одном или нескольких из применений в сырах, применений в мясных продуктах или применений, включающих защитные культуры.
В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения пищевого продукта или ингредиента пищевого продукта, при этом способ включает смешивание композиции в соответствии с настоящим изобретением с другим ингредиентом пищевого продукта.
Преимущественно настоящее изобретение относится к продуктам, которые были приведены в контакт с композицией по настоящему изобретению (и необязательно с другими компонентами/ингредиентами), при этом композиция применяется в количестве, которое может повысить питательную ценность продукта и/или пользу для здоровья от продукта.
Используемый в данном документе термин "приведенный в контакт" относится к опосредованному или непосредственному применению композиции по настоящему изобретению по отношению к продукту. Примеры способов применения, которые можно применять, включают без ограничения обработку продукта в материале, содержащем композицию, непосредственное применение путем смешивания композиции с продуктом, распыление композиции на поверхность продукта или погружение продукта в препарат из композиции.
Если продуктом по настоящему изобретению является продукт питания, то композицию по настоящему изобретению предпочтительно смешивают с продуктом. Альтернативно, композицию можно включать в эмульсию или сырьевые ингредиенты продукта питания. В дополнительной альтернативе композицию можно применять как приправу, глазурь, смесь для окрашивания и т. п.
Для некоторых применений важно, чтобы композиция была доступна на или по отношению к поверхности продукта, подлежащего воздействию/обработке. Это позволяет композиции придавать одну или несколько из следующих положительных характеристик: питательную ценность и/или пользу для здоровья.
Композиции по настоящему изобретению можно применять для вкрапления, покрытия и/или пропитывания продукта контролируемым количеством жизнеспособных микроорганизмов.
Пищевой продукт
Композиция по настоящему изобретению может применяться в виде пищевого продукта или при его получении. В данном документе термин "пищевой продукт" используется в широком смысле и охватывает пищевой продукт для людей, а также пищевой продукт для животных (т. е. корм). В предпочтительном аспекте пищевой продукт предназначен для потребления человеком.
Пищевой продукт может находиться в форме раствора или в твердом виде в зависимости от применения, и/или способа применения, и/или способа введения.
В случае применения в качестве пищевого продукта, такого как функциональный пищевой продукт, или при его получении, композицию по настоящему изобретению можно применять в сочетании с одним или более из приемлемого для применения в пищу носителя, приемлемого для применения в пищу разбавителя, приемлемого для применения в пищу наполнителя, приемлемого для применения в пищу вспомогательного средства, активного в пищевом отношении ингредиента.
6
10
Предпочтительно композицию применяют для ферментации молока или обогащенного сахарозой молока или среды с сахарозой и/или мальтозой, при этом полученные среды, содержащие все компоненты композиции, т. е. указанный микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением, можно добавлять в качестве ингредиента в молоко для йогурта в подходящих концентрациях, таких как, например, в концентрациях в конечном продукте, которые обеспечивают суточную дозу 10-10 КОЕ. Микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением можно применять перед или после ферментации йогурта.
В некоторых аспектах микроорганизмы в соответствии с настоящим изобретением или композицию в соответствии с настоящим изобретением применяют в качестве кормов для животных, таких как корма для сельскохозяйственных животных, в частности корм для птицы (такой как курица) или корм для домашних питомцев, или при их получении.
Ингредиент пищевого продукта
Композицию по настоящему изобретению можно применять в качестве ингредиента пищевого продукта и/или ингредиента корма.
Используемый в данном документе термин "ингредиент пищевого продукта" или "ингредиент корма" включает состав, который добавляют или могут добавлять к функциональным пищевым продуктам или пищевым продуктам в качестве пищевой добавки.
Ингредиент пищевого продукта может находиться в форме раствора или в твердом виде в зависимости от применения, и/или способа применения, и/или способа введения.
Биологически активные добавки
Композиция по настоящему изобретению может представлять собой пищевые добавки, такие как биологически активные добавки, или может добавляться к ним.
Функциональные пищевые продукты
Композиция по настоящему изобретению может представлять собой функциональные пищевые продукты или может добавляться в них.
Используемый в данном документе термин "функциональный пищевой продукт" означает пищевой продукт, который способен обеспечивать не только питательный эффект, но также способен оказывать дополнительный благоприятный эффект для потребителя.
Соответственно, функциональные пищевые продукты представляют собой обычные пищевые продукты, которые содержат компоненты или ингредиенты (такие как описанные в данном документе), включенные в них, которые придают пищевому продукту определенный функционал, например, медицинскую или физиологическую пользу, помимо исключительно питательного эффекта.
Хотя не существует юридического определения функционального пищевого продукта, большинство сторон, заинтересованных в данной области, согласны, что они представляют собой пищевые продукты, позиционируемые как обладающие определенными эффектами на здоровье помимо основных питательных эффектов.
Некоторые функциональные пищевые продукты представляют собой нутрицевтики. Используемый в данном документе термин "нутрицевтик" означает пищевой продукт, который способен обеспечивать не только питательный эффект и/или вкусовое удовлетворение, но также способен оказывать терапевтический (или другой благоприятный) эффект на потребителя. Нутрицевтики преодолевают традиционные разграничения между пищевыми продуктами и лекарственным препаратом.
Пробиотик
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04
неперевариваемый ингредиент пищевого продукта, который благоприятно воздействует на хозяина путем избирательного стимулирования роста и/или активности одного или ограниченного числа полезных бактерий
Для некоторых применений считается, что жизнеспособные бифидобактерии, предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно  в композиции по настоящему изобретению могут проявлять эффект пробиотической культуры. В пределах объема настоящего изобретения также находится добавление к композиции по настоящему изобретению дополнительного пробиотика и/или пребиотиков. В данном контексте пребиотик представляет собой "".
Используемый в данном документе термин "пробиотическая культура" определяет живые микроорганизмы (в том числе, например, бактерии или дрожжи), которые, например, при приеме внутрь или местном применении в достаточных количествах благоприятно воздействуют на организм-хозяин, т. е. предоставляя одно или несколько очевидных преимуществ для здоровья организма-хозяина. Пробиотики могут улучшать баланс микробиоты на поверхностях одной или нескольких слизистых оболочек. Например, поверхность слизистой оболочки может находиться в кишечнике, мочевыводящих путях, дыхательных путях или на коже. Используемый в данном документе термин "пробиотик" также охватывает живые микроорганизмы, которые могут стимулировать значимые ветви иммунной системы и в то же время уменьшать воспалительные реакции на поверхности слизистой оболочки, например, кишечника.
6
12
6
10
8
9
Хотя не существует верхних или нижних пределов для приема пробиотиков, было высказано предположение, что по меньшей мере 10-10, предпочтительно по меньшей мере 10-10, предпочтительно 10-10 КОЕ в качестве суточной дозы будет эффективно для достижения благоприятных эффектов для здоровья организма-хозяина, такого как человек.
В дополнение к пробиотическому эффекту микроорганизм в соответствии с настоящим изобретением может, что также находится в пределах объема настоящего изобретения, обеспечивать пребиотики в качестве других соединений, которые могут включаться в комбинацию вместе с композицией. Пребиотический компонент комбинации, содержащей композицию по настоящему изобретению, характеризуется медленной ферментацией в толстой кишке. Такие пребиотики могут оказывать положительный эффект на микробиоту кишечника, особенно в левой части ободочной кишки, области кишечника, которая особенно подвержена нарушениям, в частности, колоректальному раку и язвенному колиту.
Пребиотики, как правило, представляют собой неперевариваемые углеводы (олиго- или полисахариды) или сахароспирт, которые не разрушаются или не всасываются в верхней части пищеварительного тракта. Известные пребиотики, применяемые в коммерческих продуктах и полезные в соответствии с настоящим изобретением, включают инулин (фруктоолигосахарид или FOS) и галактоолигосахариды (GOS) и трансгалактоолигосахариды (TOS). Другие подходящие пребиотики включают олигосахарид палатинозу, олигосахарид сои, гентиоолигосахарид, ксилоолигомеры, нераспадаемый крахмал, лактосахарозу, лактулозу, лактит, мальтит, полидекстрозу (т. е. Litesse) или подобное.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к комбинации бифидобактерий, предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно , и/или их продукта ферментации, и/или их клеточного лизата в соответствии с настоящем изобретением с пребиотиком.
Пребиотик можно вводить одновременно (например, совместно в смеси или доставляя одновременно с помощью одного или различных путей) или последовательно (например, с помощью одного или различных путей) с микроорганизмом в соответствии с настоящим изобретением, и/или продуктом его ферментации, и/или его клеточным лизатом.
Синбиотики
В настоящем изобретении также предусмотрено применение как пре-, так и пробиотиков в качестве ингредиентов в комбинации вместе с композицией по настоящему изобретению, которые при объединении становятся синбиотиками. Целью этого является объединение эффектов полезных бактерий и стимуляция собственных полезных бактерий организма. Развитие и потребление таких смесей является многообещающим, поскольку некоторые из них могут успешно проявлять сильные синергетические питательные эффекты и/или эффекты для здоровья.
Таким образом, композицию по настоящему изобретению можно специально разрабатывать так, чтобы она содержала различные компоненты, которые могут обеспечивать синбиотический эффект для потребителя.
Фармацевтический препарат
Композиция по настоящему изобретению может применяться в качестве фармацевтического препарата или при его получении. В данном документе термин "фармацевтический препарат" используется в широком смысле и охватывает фармацевтические препараты для людей, а также фармацевтические препараты для животных (т. е. применения в ветеринарии). В предпочтительном аспекте фармацевтический препарат предназначен для применения человеком и/или для животноводства.
Фармацевтический препарат может предназначаться для терапевтических целей, которые по характеру могут быть лечебными, или паллиативными, или профилактическими. Фармацевтический препарат может предназначаться даже для диагностических целей.
В случае применения в качестве фармацевтического препарата или при его получении, композицию по настоящему изобретению можно применять в сочетании с одним или несколькими из фармацевтически приемлемого носителя, фармацевтически приемлемого разбавителя, фармацевтически приемлемого наполнителя, фармацевтически приемлемого вспомогательного средства, фармацевтически активного ингредиента.
Фармацевтический препарат может находиться в форме раствора или в твердом виде в зависимости от применения, и/или способа применения, и/или способа введения.
Фармацевтический ингредиент
Микроорганизмы по настоящему изобретению можно применять в качестве фармацевтических ингредиентов. При этом композиция может представлять собой единственный активный компонент или она может представлять собой по меньшей мере несколько (т. е. 2 или больше) активных компонентов.
Фармацевтический ингредиент может быть в виде раствора или в виде твердого вещества - в зависимости от применения, и/или способа применения, и/или способа введения.
Формы
Микроорганизм по настоящему изобретению, и/или продукт его ферментации, и/или его клеточный лизат можно применять в любой подходящей форме - либо отдельно, либо в комбинации с другими компонентами или ингредиентами. Аналогичным образом, комбинации, содержащие композицию по настоящему изобретению и другие компоненты и/или ингредиенты (т. Е. такие ингредиенты, как ингредиенты пищевого продукта, ингредиенты функционального пищевого продукта или ингредиенты фармацевтического препарата), можно применять в любой подходящей форме.
Микроорганизм по настоящему изобретению или композицию по настоящему изобретению можно применять в форме твердых или жидких препаратов или их альтернатив. Примеры твердых препаратов включают без ограничения таблетки, капсулы, присыпки, гранулы и порошки, которые могут быть смачиваемыми, высушенными распылением или лиофилизированными. Примеры жидких препаратов включают без ограничения водные, органические или водно-органические растворы, суспензии и эмульсии.
Подходящие примеры форм включают одну или несколько из таблеток, пилюль, капсул, суппозиториев, растворов или суспензий, которые могут содержать вкусовые или красящие вещества, для применений с немедленным, отсроченным, модифицированным, длительным, пульсирующим или контролируемым высвобождением.
В качестве примера, если композиция по настоящему изобретению применяется в форме таблетки, например, для применения в качестве функционального ингредиента, то таблетки также могут содержать одно или несколько из: наполнителей, таких как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин; разрыхлителей, таких как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный или тапиоковый крахмал), крахмалгликолят натрия, кроскармеллоза натрия и определенные комплексные силикаты; связующих для гранулирования, таких как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC), гидроксипропилцеллюлоза (HPC), сахароза, желатин и гуммиарабик; смазывающих веществ, таких как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк, которые могут включаться.
Примеры приемлемых в пищевом отношении носителей для применения в получении форм включают, например, воду, солевые растворы, спирт, силикон, воски, вазелиновое масло, растительные масла, полиэтиленгликоли, пропиленгликоль, липосомы, сахара, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, поверхностно-активные вещества, кремниевую кислоту, вязкий парафин, парфюмерное масло, моноглицериды и диглицериды жирных кислот, сложные эфиры нефтяных жирных кислот, гидроксиметиллцеллюлозу, поливинилпирролидон и т. п.
Предпочтительные наполнители для форм включают лактозу, крахмал, целлюлозу, молочный сахар или полиэтиленгликоли с высоким молекулярным весом.
Для водных суспензий и/или эликсиров композицию по настоящему изобретению можно комбинировать с различными подсластителями или вкусовыми веществами, красящим веществом или красителями, с эмульгирующими и/или суспендирующими средствами и с разбавителями, такими как вода, пропиленгликоль и глицерин, а также их комбинациями.
Формы могут также включать желатиновые капсулы; капсулы из клетчатки, таблетки из клетчатки и т. д.; или даже напитки из клетчатки.
Дополнительные примеры находятся, например, в форме крема. Для некоторых аспектов микроорганизм и/или его метаболит можно включать в фармацевтические и/или косметические кремы, такие как, например, кремы для загара и/или кремы после загара.
В одном аспекте композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в аэрозоле, например, посредством назального спрея, например, для введения в дыхательные пути.
Аспекты настоящего изобретения далее будут описаны в виде пронумерованных пунктов.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04),
1. Композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно для применения в модулировании иммунной системы субъекта путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04),
Bifidobacterium lactis BL04
Bifidobacterium lactis BL04
2. Композиция для применения по пункту 1, где композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из  подвида , более предпочтительно , представляет собойкомпозицию, содержащую бифидобактерии (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно и/или продукт ферментации бифидобактерий (предпочтительно молочнокислой бактерии Bifidobacterium, более предпочтительно ), и/или клеточный лизат бифидобактерий (предпочтительно молочнокислой бактерии Bifidobacterium, более предпочтительно ).
3. Композиция для применения по пункту 1 или пункту 2, где обеспечение воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты включает ингибирование репликации вируса и/или ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией.
4. Композиция для применения по любому из пунктов 1-3, где указанный вирус представляет собой один или несколько из риновируса, коронавируса, вируса парагриппа, аденовируса, энтеровируса или респираторно-синцитиального вируса, по меньшей мере предпочтительно риновирус человека (HRV).
5. Композиция для применения по любому из пунктов 1-4, где модулирование иммунной системы обеспечивает модулирование уровней биомаркеров у субъекта, предпочтительно снижение уровней биомаркеров у субъекта.
6. Композиция для применения по пункту 5, где указанные биомаркеры представляют собой цитокины и/или хемокины.
7. Композиция для применения по любому из пунктов 5-6, где указанные биомаркеры представляют собой IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
8. Композиция для применения по любому из пунктов 1-7, где модулирование иммунной системы включает модулирование врожденной иммунной системы, адаптивной иммунной системы или их обеих.
9. Композиция для применения по любому из пунктов 1-8, где модулирование иммунной системы обеспечивает повышение количества вирус-специфичных Т-хелперных клеток.
10. Композиция для применения по любому из пунктов 1-9, где модулирование иммунной системы обеспечивает снижение уровней IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
11. Композиция для применения по любому из пунктов 1-10, где субъект является субъектом-человеком.
12. Композиция для применения по любому из пунктов 1-11, где субъект является человеческим ребенком.
13. Композиция для применения по любому из пунктов 1-11, где обеспечение воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты включает ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией, и приводит к ослаблению симптомов вирусной инфекции, в том числе одного или нескольких из группы, состоящей из воспаления дыхательных путей, боли в горле, чихания, заложенности носа, насморка, кашля, кашля с ощущением заложенности в груди и кашля с бронхиальной обструкцией.
14. Композиция для применения по любому из предыдущих пунктов, где применение является профилактическим.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
8
12
9
15. Композиция для применения по любому из предыдущих пунктов, где композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , составлена в дозе, составляющей от 10 до 10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно /в день, при этом предпочтительно указанная композиция составлена в дозе, составляющей 2×10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно  подвида , более предпочтительно /в день или около этого значения.
16. Композиция для применения по любому из предыдущих пунктов, содержащая по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм.
Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus
Saccharomyces.
17. Композиция для применения по пункту 16, где по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм выбран из родов , других бифидобактерий и
18. Композиция для применения по любому из предыдущих пунктов, где указанная композиция представляет собой лекарственный препарат, продукт питания или биологически активную добавку.
19. Композиция для применения по любому из предыдущих пунктов, где бактерии составлены в виде биологически активной добавки.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
20. Способ модулирования иммунной системы субъекта путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта, предусматривающий применение композиции, подлежащей введению и/или приему внутрь указанным субъектом; при этом указанная композиция может быть получена из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно ; при этом предпочтительно композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно, из подвида , более предпочтительно , представляет собой композицию, содержащую бифидобактерии (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно , и/или продукт ферментации бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно , и/или клеточный лизат бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно ; и/или где предпочтительно обеспечение воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты включает ингибирование репликации вируса и/или ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией.
21. Способ по пункту 20, где указанный вирус представляет собой риновирус, коронавирус, вирус парагриппа, аденовирус, энтеровирус или респираторно-синцитиальный вирус.
22. Способ по пункту 20, где указанный вирус представляет собой риновирус, предпочтительно риновирус человека (HRV).
23. Способ по любому из пунктов 20-22, где модулирование иммунной системы обеспечивает модулирование уровней биомаркеров у субъекта, предпочтительно снижение уровней биомаркеров у субъекта.
24. Способ по пункту 23, где указанные биомаркеры представляют собой цитокины и/или хемокины.
25. Способ по любому из пунктов 23-24, где указанные биомаркеры представляют собой IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
26. Способ по любому из пунктов 20-25, где модулирование иммунной системы включает модулирование врожденной иммунной системы, адаптивной иммунной системы или их обеих.
27. Способ по любому из пунктов 20-26, где модулирование иммунной системы обеспечивает повышение количества вирус-специфичных Т-хелперных клеток.
28. Способ по любому из пунктов 20-27, где модулирование иммунной системы обеспечивает снижение уровней IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
29. Способ по любому из пунктов 20-28, где субъект является субъектом-человеком.
30. Способ по любому из пунктов 20-29, где субъект является человеческим ребенком.
31. Способ по любому из пунктов 20-30, где ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией, приводит к ослаблению симптомов вирусной инфекции, в том числе одного или нескольких из группы, состоящей из воспаления дыхательных путей, боли в горле, чихания, заложенности носа, насморка, кашля, кашля с ощущением заложенности в груди и кашля с бронхиальной обструкцией.
32. Способ по любому из пунктов 20-31, где способ является профилактическим.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
8
12
33. Способ по любому из пунктов 20-32, где композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , составлена в дозе, составляющей от 10 до 10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно /в день.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
9
34. Способ по пункту 33, где композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , составлена в дозе, составляющей 2×10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно  подвида , более предпочтительно /в день или около этого значения.
35. Способ по любому из пунктов 20-34, предусматривающий введение и/или прием внутрь по меньшей мере одного дополнительного пробиотического микроорганизма.
Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus
Saccharomyces
36. Способ по пункту 35, где по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм выбран из родов , других бифидобактерий и .
37. Способ по любому из пунктов 20-36, где композиция составлена в виде лекарственного препарата, продукта питания или биологически активной добавки.
38. Способ по любому из пунктов 20-37, где композиция составлена в виде биологически активной добавки.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
39. Применение композиции, получаемой из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , в изготовлении композиции для модулирования иммунной системы субъекта путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта; при этом предпочтительно композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно ), представляет собой композицию, содержащую бифидобактерии (предпочтительно , более предпочтительно Bifidobacterium animalis подвида , более предпочтительно , и/или продукт ферментации бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно , и/или клеточный лизат бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно ; и/или где предпочтительно обеспечение воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты включает в себя ингибирование репликации вируса и/или ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией.
40. Применение по пункту 39, где указанный вирус представляет собой риновирус, коронавирус, вирус парагриппа, аденовирус, энтеровирус или респираторно-синцитиальный вирус.
41. Применение по пункту 39, где указанный вирус представляет собой риновирус, предпочтительно риновирус человека (HRV).
42. Применение по любому из пунктов 39-41, где модулирование иммунной системы обеспечивает модулирование уровней биомаркеров у субъекта, предпочтительно снижение уровней биомаркеров у субъекта.
43. Применение по пункту 42, где указанные биомаркеры представляют собой цитокины и/или хемокины.
44. Применение по любому из пунктов 39-43, где указанные биомаркеры представляют собой IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
45. Применение по любому из пунктов 39-44, где модулирование иммунной системы включает модулирование врожденной иммунной системы, адаптивной иммунной системы или их обеих.
46. Применение по любому из пунктов 39-45, где модулирование иммунной системы обеспечивает повышение количества вирус-специфичных Т-хелперных клеток.
47. Применение по любому из пунктов 39-46, где модулирование иммунной системы обеспечивает снижение уровней IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
48. Применение по любому из пунктов 39-47, где субъект является субъектом-человеком.
49. Применение по любому из пунктов 39-48, где субъект является человеческим ребенком.
50. Применение по любому из пунктов 39-49, где ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией, приводит к ослаблению симптомов вирусной инфекции, в том числе одного или нескольких из группы, состоящей из воспаления дыхательных путей, боли в горле, чихания, заложенности носа, насморка, кашля, кашля с ощущением заложенности в груди и кашля с бронхиальной обструкцией.
51. Применение по любому из пунктов 39-50, где применение является профилактическим.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
8
12
52. Применение по любому из пунктов 39-51, где композиция, содержащаябифидобактерии (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно , составлена в дозе, составляющей от 10 до 10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно /в день.
9
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
53. Применение по пункту 52, где указанная композиция составлена в дозе, составляющей 2×10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно  подвида , более предпочтительно /в день или около этого значения.
54. Применение по любому из пунктов 39-53, где композиция содержит по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм.
Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus
Saccharomyces
55. Применение по пункту 54, где по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм выбран из родов , других бифидобактерий и .
56. Применение по любому из пунктов 39-55, где указанная композиция представляет собой лекарственный препарат, продукт питания или биологически активную добавку.
57. Применение по любому из пунктов 39-56, где бактерии составлены в виде биологически активной добавки.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04),
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04),
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04),
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
58. Композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , для применения в снижении риска развития и обострения хронических респираторных заболеваний у субъекта; при этом предпочтительно композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно представляет собой композицию, содержащую бифидобактерии (предпочтительно , более предпочтительно  подвида , более предпочтительно и/или продукт ферментации бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно и/или клеточный лизат бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно .
59. Композиция для применения по пункту 58, где риск развития и обострения хронических респираторных заболеваний снижается в результате модулирования иммунной системы путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты у указанного субъекта; предпочтительно путем ингибирования репликации вируса и/или ослабления воспаления, вызванного вирусной инфекцией.
60. Композиция для применения по пункту 58 или 59, где указанные хронические респираторные заболевания представляют собой астму и/или COPD.
61. Композиция для применения по любому из пунктов 58-60, где указанный вирус представляет собой риновирус, коронавирус, вирус парагриппа, аденовирус, энтеровирус или респираторно-синцитиальный вирус.
62. Композиция для применения по пункту 61, где указанный вирус представляет собой риновирус, предпочтительно риновирус человека (HRV).
63. Композиция для применения по любому из пунктов 59-62, где модулирование иммунной системы обеспечивает модулирование уровней биомаркеров у субъекта, предпочтительно снижение уровней биомаркеров у субъекта.
64. Композиция для применения по пункту 63, где указанные биомаркеры представляют собой цитокины и/или хемокины.
65. Композиция для применения по любому из пунктов 63-64, где указанные биомаркеры представляют собой IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
66. Композиция для применения по любому из пунктов 59-65, где модулирование иммунной системы включает модулирование врожденной иммунной системы, адаптивной иммунной системы или их обеих.
67. Композиция для применения по любому из пунктов 59-66, где модулирование иммунной системы обеспечивает повышение количества вирус-специфичных Т-хелперных клеток.
68. Композиция для применения по любому из пунктов 59-67, где модулирование иммунной системы обеспечивает снижение уровней IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
69. Композиция для применения по любому из пунктов 58-68, где субъект является субъектом-человеком.
70. Композиция для применения по любому из пунктов 58-69, где субъект является человеческим ребенком.
71. Композиция для применения по любому из пунктов 58-70, где ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией, приводит к ослаблению симптомов вирусной инфекции, в том числе одного или нескольких из группы, состоящей из воспаления дыхательных путей, боли в горле, чихания, заложенности носа, насморка, кашля, кашля с ощущением заложенности в груди и кашля с бронхиальной обструкцией.
72. Композиция для применения по любому из пунктов 58-71, где применение является профилактическим.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
8
12
73. Композиция для применения по любому из пунктов 58-72, где композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , составлена в дозе, составляющей от 10 до 10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно  подвида , более предпочтительно /в день.
9
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
74. Композиция для применения по пункту 73, где указанная композиция составлена в дозе, составляющей 2×10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно /в день или около этого значения.
75. Композиция для применения по любому из пунктов 58-74, содержащая по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм.
Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus
Saccharomyces.
76. Композиция для применения по пункту 75, где по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм выбран из родов , другой бифидобактерии и
77. Композиция для применения по любому из пунктов 58-76, где указанная композиция представляет собой лекарственный препарат, продукт питания или биологически активную добавку.
78. Композиция для применения по любому из пунктов 58-77, где бактерии составлены в виде биологически активной добавки.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04),
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04).
79. Способ снижения риска развития и обострения хронических респираторных заболеваний у субъекта, при этом указанный способ предусматриваетвведение и/или прием внутрь указанным субъектом композиции, получаемой из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно ; при этом предпочтительно указанная композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно представляет собой композицию, содержащую бифидобактерии (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно , и/или продукт ферментации бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно , и/или клеточный лизат бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно
80. Способ по пункту 79, где риск развития и обострения хронических респираторных заболеваний снижается в результате модулирования иммунной системы путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты; при этом предпочтительно обеспечение воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты включает ингибирование репликации вируса и/или ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией.
81. Способ по пункту 79 или пункту 80, где указанные хронические респираторные заболевания представляют собой астму и/или COPD.
82. Способ по любому из пунктов 79-81, где указанный вирус представляет собой риновирус, коронавирус, вирус парагриппа, аденовирус, энтеровирус или респираторно-синцитиальный вирус.
83. Способ по пункту 82, где указанный вирус представляет собой риновирус, предпочтительно риновирус человека (HRV).
84. Способ по любому из пунктов 80-83, где модулирование иммунной системы обеспечивает модулирование уровней биомаркеров у субъекта, предпочтительно снижение уровней биомаркеров у субъекта.
85. Способ по пункту 84, где указанные биомаркеры представляют собой цитокины и/или хемокины.
86. Способ по любому из пунктов 84-85, где указанные биомаркеры представляют собой IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
87. Способ по любому из пунктов 80-86, где модулирование иммунной системы включает модулирование врожденной иммунной системы, адаптивной иммунной системы или их обеих.
88. Способ по любому из пунктов 80-87, где модулирование иммунной системы обеспечивает повышение количества вирус-специфичных Т-хелперных клеток.
89. Способ по любому из пунктов 80-88, где модулирование иммунной системы обеспечивает снижение уровней IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
90. Способ по любому из пунктов 79-89, где субъект является субъектом-человеком.
91. Способ по любому из пунктов 79-90, где субъект является человеческим ребенком.
92. Способ по любому из пунктов 79-91, где ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией, приводит к ослаблению симптомов хронических респираторных заболеваний, в том числе одного или нескольких из группы, состоящей из воспаления дыхательных путей, боли в горле, чихания, заложенности носа, насморка, кашля, кашля с ощущением заложенности в груди и кашля с бронхиальной обструкцией.
93. Способ по любому из пунктов 79-92, где способ является профилактическим.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
8
12
94. Способ по любому из пунктов 79-93, где композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно , составлена в дозе, составляющей от 10 до 10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно  подвида , более предпочтительно /в день.
9
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
95. Способ по пункту 94, где указанная композиция составлена в дозе, составляющей 2×10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно /в день или около этого значения.
96. Способ по любому из пунктов 79-95, предусматривающий введение и/или прием внутрь по меньшей мере одного дополнительного пробиотического микроорганизма.
Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus
Saccharomyces
97. Способ по пункту 96, где по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм выбран из родов , другой бифидобактерии и .
98. Способ по любому из пунктов 79-97, где композиция составлена в виде лекарственного препарата, продукта питания или биологически активной добавки.
99. Способ по любому из пунктов 79-98, где композиция составлена в виде биологически активной добавки.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04).
100. Применение композиции, получаемой из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно в изготовлении композиции для снижения риска развития и обострения хронических респираторных заболеваний у субъекта; при этом предпочтительно указанная композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно  представляет собой композицию, содержащую бифидобактерии (предпочтительно , более предпочтительно  подвида , более предпочтительно , и/или продукт ферментации бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно , и/или клеточный лизат бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно
101. Применение по пункту 100, где риск развития и обострения хронических респираторных заболеваний снижается в результате модулирования иммунной системы путем обеспечения воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты; при этом предпочтительно обеспечение воздействия на активность вируса и/или вызываемые вирусом эффекты включает ингибирование репликации вируса и/или ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией.
102. Применение по пункту 100 или пункту 101, где указанные хронические респираторные заболевания представляют собой астму и/или COPD.
103. Применение по любому из пунктов 100-102, где указанный вирус представляет собой риновирус, коронавирус, вирус парагриппа, аденовирус, энтеровирус или респираторно-синцитиальный вирус.
104. Применение по пункту 103, где указанный вирус представляет собой риновирус, предпочтительно риновирус человека (HRV).
105. Применение по любому из пунктов 101-104, где модулирование иммунной системы обеспечивает модулирование уровней биомаркеров у субъекта, предпочтительно снижение уровней биомаркеров у субъекта.
106. Применение по пункту 105, где указанные биомаркеры представляют собой цитокины и/или хемокины.
107. Применение по любому из пунктов 105-106, где указанные биомаркеры представляют собой IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
108. Применение по любому из пунктов 101-107, где модулирование иммунной системы включает модулирование врожденной иммунной системы, адаптивной иммунной системы или их обеих.
109. Применение по любому из пунктов 101-108, где модулирование иммунной системы обеспечивает повышение количества вирус-специфичных Т-хелперных клеток.
110. Применение по любому из пунктов 101-109, где модулирование иммунной системы обеспечивает снижение уровней IL-8, и/или IL-1 бета, и/или MCP-1.
111. Применение по любому из пунктов 100-110, где субъект является субъектом-человеком.
112. Применение по любому из пунктов 100-111, где субъект является человеческим ребенком.
113. Применение по любому из пунктов 100-112, где ослабление воспаления, вызванного вирусной инфекцией, приводит к ослаблению симптомов хронических респираторных заболеваний, в том числе одного или нескольких из группы, состоящей из воспаления дыхательных путей, боли в горле, чихания, заложенности носа, насморка, кашля, кашля с ощущением заложенности в груди и кашля с бронхиальной обструкцией.
114. Применение по любому из пунктов 100-113, где применение является профилактическим.
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04),
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
8
12
115. Применение по любому из пунктов 100-114, где композиция, получаемая из бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно из подвида , более предпочтительно составлена в дозе, составляющей от 10 до 10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно бифидобактерий , более предпочтительно  подвида , более предпочтительно /в день.
9
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04)
116. Применение по пункту 115, где указанная композиция составлена в дозе, составляющей 2×10 КОЕ бифидобактерий (предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно /в день или около этого значения.
117. Применение по любому из пунктов 100-116, где композиция содержит по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм.
Lactobacillus, Streptococcus, Enterococcus
Saccharomyces
118. Применение по пункту 117, где по меньшей мере один дополнительный пробиотический микроорганизм выбран из родов , другой бифидобактерии и .
119. Применение по любому из пунктов 100-118, где указанная композиция представляет собой лекарственный препарат, продукт питания или биологически активную добавку.
120. Применение по любому из пунктов 100-119, где бактерии составлены в виде биологически активной добавки.
121. Композиция, или способ, или применение, где указанная композиция дополнительно содержит или состоит из одного или нескольких из противомикробного средства, стабилизирующих средств, красителя и влагопоглотителя.
122. Способ, применение или композиция, как в целом изложено в данном документе со ссылкой на примеры и фигуры.
Фигуры
На фигуре 1 показана блок-схема, подробно описывающая поток субъектов в исследовании из примера 1.
На фигуре 2 показано графическое представление результатов анализа назального смыва в отношении уровней IL-8
только в подгруппе инфицированных риновирусом субъектов.
На фигуре 3 показано графическое представление результатов анализов цитокинов в назальном смыве. Цитокиновый ответ в день 0 и день 4 для G-CSF (A), IL-1 бета (B), IL-6 (C), IP-10 (D) и MCP-1 (E). Красными линиями (сплошные линии) обозначена средняя динамика цитокинового ответа со дня 0 по день 4.
На фигуре 4 показано графическое представление титра риновирусной нагрузкив дни исследования 1, 2, 3, 4 и 5. Кругами обозначено среднее геометрическое оценки вирусной нагрузки риновирусом, а вертикальными линиями обозначен 95% доверительный интервал.
На фигуре 5 показано графическое представление времени, проходящего до вирусовыделения. Линия, обозначенная -o-, представляет группу пробиотика, а линия выше, обозначенная -Δ-, представляет группу плацебо.
На фигуре 6 показана кратность изменения HRV39-специфичных CCR5+ T-хелперных клеток.
На фигуре 7 показан фенотип мышей (контрольная группа по сравнению с группой пробиотика) в день 56.
На фигуре 8 показаны титры вируса гриппа в легких мышей (контрольная группа по сравнению с группой пробиотика).
На фигуре 9 показано количество и доля лимфоцитов в жидкости бронхоальвеолярного лаважа ("BALF").
На фигуре 10 показано количество и доля макрофагов в BALF.
Примеры
Настоящее изобретение будет дополнительно описано со ссылкой на следующие примеры.
Пример 1. Применение BL-04 здоровыми взрослыми
Дизайн и ход выполнения исследования
Здоровых взрослых добровольцев отбирали в соответствии с протоколом клинического исследования для участия в рандомизированном, двойном слепом, плацебо-контролируемом исследовании. Пробиотик Bl-04 или плацебо вводили в течение 28 дней перед интраназальной инокуляцией риновируса человека (HRV). Назальные лаважи отбирали ежедневно вплоть до 5-го дня после инфицирования для анализа вирусной нагрузки и маркера воспаления IL-8.
Это исследование представляло собой рандомизированное, двойное слепое плацебо-контролируемое испытание для оценки эффектов перорально принятого пробиотика на ответ хозяина на экспериментальную риновирусную инфекцию. День введения вируса представлял собой день исследования 0. Здоровые молодые взрослые добровольцы начинали прием Bl-04 или плацебо в день исследования -28 после того, как были собраны исходные пробы крови и назального лаважа. Субъектов инструктировали принимать один саше исследуемого продукта каждый день и приходить в исследовательский центр в дни исследования -21, -14 и -7 для повторной выдачи исследуемого продукта и для обеспечения соблюдения приема. Прием исследуемого продукта продолжали до 5-го дня исследования.
В день исследования 0 перед инокуляцией вируса собирали кровь и образцы назального лаважа для анализов в рамках исследования. Затем добровольцев ежедневно наблюдали в течение следующих 5 дней для регистрации симптомов и нежелательных явлений и для сбора образцов назального лаважа для анализа вирусной культуры.
В дни исследования 0, 5 и 21 собирали кровь для анализа клеток адаптивного иммунитета с помощью проточной цитометрии.
Субъекты.
Семьсот восемьдесят девять (789) субъектов подписали согласие на участие в испытании. Исследование проводили в трех когортах, две весной 2013 года и одна осенью 2013 года. Поток субъектов в исследовании показан на фигуре 1.
Сто девяносто (190) субъектов рандомизировали в группу лечения, а после прекращения участия и исключения согласно протоколу 115, 58 в активной группе и 57 в группе плацебо, были доступны для анализа. Размер выборки для запланированного анализа в рамках исследования составлял 120. Основной анализ в рамках исследования проводили, как описано в статистическом плане, с теми субъектами, которые были инфицированы риновирусом, 51 субъект в активной группе и 55 субъектов в группе плацебо. Следует отметить, что большое количество исключений из исследования было связано с приемом запрещенных пищевых продуктов (например, других пробиотиков) и добровольного прекращения участия (см. фигуру 1).
Исследуемая популяция была взята в основном из популяции студентов UVa, и демографические характеристики исследования отражали эту популяцию. Группы исследования были надлежащим образом сбалансированы в отношении измеренных демографических характеристик. Подробная информация о демографических характеристиках субъектов исследования приведена в таблице 1 ниже.
Таблица 1. Демографические характеристики исследования
<b>Активная (N=58)</b>
<b>Плацебо (N=57)</b>
<b>Р-значение</b>
<b>Пол</b><b>Мужской</b><b>Женский</b>
19 (33%)39 (67%)
24 (42%)33 (57%)
0,339
<b>Раса</b><b>Монголоидная</b><b>Негроидная</b><b>Европеоидная</b><b>Другие</b>
2 (3%)3 (5%)52 (90%)1 (2%)
8 (14%)2 (4%)46 (81%)1 (2%)
0,270
<b>Этническая принадлежность</b><b>Испаноязычные</b><b>Неиспаноязычные</b><b>Неизвестная</b>
3 (5%)54 (93%)1 (2%)
4 (7%)52 (91%)1 (2%)
0,857
<b>Возраст (года, среднее (SD))</b>
22 (6)
23 (7)
0,975
Эффективность "ослепления" субъектов в отношении исследуемого средства для лечения оценивали после приема добровольцами исследуемого средства для лечения в течение 28 дней и до того, как им проводили заражение вирусом (см. таблицу 2 ниже). Большинство добровольцев в обеих группах лечения полагали, что они принимали препарат плацебо, однако подтверждающих данных о расслеплении не было (отношение правдоподобия по критерию Хи-квадрат: P=0,56).
Таблица 2. Оценка "ослепления"
<b>Предположение субъекта</b>
<b>Фактическая группа </b>
Активная
Плацебо
Не знаю
<b>Активная (N (%))</b>
11 (19,0)
31 (53,4)
16 (27,6)
<b>Плацебо (N (%))</b>
7 (12,3)
31 (54,4)
19 (33,3)
Во время исследования серьезных нежелательных явлений не было.
Результаты
Bifidobacterium animalis
Bifidobacterium animalis
lactis
Bifidobacterium lactis BL-04,
Общая цель данного исследования состояла в рассмотрении гипотезы о том, что профилактика у добровольцев с использованием пробиотических бифидобактерий, предпочтительно , более предпочтительно подвида , более предпочтительно будет подавлять индуцированные вирусом врожденные воспалительные ответы, характеризуемые, например, по IL-8, при одновременном усилении адаптивного ответа хозяина, например, выработки антител. В исследовании были рассмотрены следующие конкретные показатели исхода.
Первичная конечная точка клинического исследования
1) Воспалительный ответ в слизистой оболочке носа, который характеризовали по уровням IL-8 в назальных лаважах
(таблица 3, строка "День 3"; фигура 2).
(таблица 3, строка "День, в целом"; фигура 2),
.
(таблица 4).
Концентрацию IL-8 в назальных лаважах оценивали путем сравнения изменения относительно исходного значения концентрации через 72 часа наблюдения (измерение в 72 ч. минус измерение в 0 ч.). Повышение концентрации IL-8 между днем исследования 0 и днем исследования 3 значимо не различалось между группами пробиотика и плацебо (соотношение геометрических средних, активная:плацебо, в отношении изменения концентрации в день 3=0,69, p=0,14) Однако было значимое различие в изменении IL-8 в ответ на вирусную инфекцию в течение 5 дней после заражения вирусом (соотношение геометрических средних (A:P)=0,65, p=0,03 указывая на то, что общее воспаление во время инфекции было слабее в группе пробиотикаВ каждом случае концентрации IL-8 не были разными в день -28, когда начали обработку согласно исследованию. Однако в день 0 перед заражением концентрации IL-8 в лаваже, взятом у добровольцев, получавших плацебо, были значительно снижены относительно дня -28 и были значительно ниже, чем в группе активного лечения Концентрация IL-8 в назальном лаваже увеличивалась после заражения вирусом, но значения этого увеличения не были статистически значимыми в группе активного лечения. Повышение концентрации IL-8 было статистически значимым в группе плацебо в дни исследования 3, 4 и 5 (таблица 5; фигура 1).
Таблица 3. Скорректированные по исходному уровню (день -28) межгрупповые сравнения изменения концентрации IL-8 во время инфекции со дня 0 с выражением в виде соотношения геометрических средних
День
Соотношение
Расчетноесоотношение геометрических средних
Нижняя граница 95%CL
Верхняя граница 95%CL
НескорректированноеР-значение
Нижняя граница 95%CLпо Бонферрони
Верхняя граница 95%CL по Бонферрони
Скорректиро-ванноеР-значениепо Бонферрони
1
A:P
0,75
0,53
1,05
0,096
0,48
1,16
<b>0,385</b>
2
A:P
0,63
0,37
1,06
0,083
0,32
1,24
<b>0,334</b>
3
A:P
0,69
0,42
1,13
<b>0,141</b>
4
A:P
0,63
0,38
1,05
0,077
0,33
1,22
<b>0,308</b>
5
A:P
0,56
0,33
0,96
0,034
0,29
1,11
<b>0,135</b>
В целом
A:P
0,65
0,44
0,95
<b>0,026</b>
Таблица 4. Краткое изложение результатов анализа концентрации IL-8 (loge[пг/мл]) в день 0 через 28 дней приема пробиотика с пищей
Группа исследова-ния
Расчетное геометри-ческоесреднее концентра-ции IL-8
Нижняя граница 95%Доверитель-ногоинтервала
Верхняя граница 95%Доверитель-ногоинтервала
Активная
97,2
68,5
137,9
Плацебо
58,0
43,4
77,5
Параметрсравнения
Соотноше-ниев группе исследова-ния
Расчетное соотноше-ние геометри-ческихсредних
Нижняя граница 95%CL
Верхняя граница 95%CL
Р-значениеHo: соотношение=1
Геометри-ческое среднее
Активная: Плацебо
1,68
1,07
2,62
<b>0,025</b>
Таблица 5. Нескорректированные оценки изменения концентрации IL-8 во время инфекции (дни 1-5) со дня 0 (т. e. исходного уровня) с выражением в виде соотношения геометрических средних
Группа исследо-вания
Соотноше-ние
Расчетное соотношение геометричес-ких средних
Нижняя граница 95%CL
Верхняя граница 95%CL
Р-значениеHo: соотношение=1
Активная
День 1: день 0
0,68
0,53
0,87
0,003
Плацебо
0,91
0,72
1,15
0,432
Активная
День 2: день 0
0,88
0,60
1,29
0,507
Плацебо
1,40
0,97
2,02
<b>0,069</b>
Активная
День 3: день 0
1,34
0,94
1,93
0,108
Плацебо
1,96
1,38
2,77
<b><0,001</b>
Активная
День 4: день 0
1,16
0,80
1,68
0,417
Плацебо
1,85
1,30
2,63
<b>0,001</b>
Активная
День 5: день 0
0,91
0,62
1,33
0,622
Плацебо
1,62
1,12
2,33
0,011
Вторичные конечные точки
1. Ответ, определяемый по биомаркерам в слизистой оболочке носа
(фигура 3; таблица 6).
Профили биомаркеров (цитокина и хемокина) измеряли в назальных лаважах с помощью мультиплексных анализов ELISA. Следующие биомаркеры анализировали в дни -28, 0, 1, 2 и 4 относительно заражения вирусом: TGF-бета1, G-CSF, GM-CSF, IFN-гамма, IL-1 альфа, IL-12p70, IL-15, MIP-3 альфа, IL-1 бета, IL-6, IL-10, IP-10, MCP-1, MIP-1 альфа, RANTES и TNF-альфа (тример). Концентрации многих из этих аналитов были слишком низкими, чтобы обеспечить адекватный анализ. Результаты для G-CSF, MIP-3 альфа, IL-1 бета, IL-6, IP-10 и MCP-1 рассматривались как адекватные для анализа. Было отмечено, что уровни маркеров врожденного иммунитета повышались после заражения, как и ожидалось. Значимых различий между группами лечения не было. Однако наблюдалась тенденция к более высокому ответу IL-1 бета (p=0,071) и MCP-1 (p=0,075) в назальных лаважах для группы плацебо при анализе изменения ответа со дня 0 (заражение) по день 4 Этот результат подтверждает результаты по IL-8, поскольку как IL-1 бета, так и MCP-1 являются воспалительными цитокинами. Поэтому можно увидеть, что воспаление уменьшалось.
Таблица 6
Цитокин
Активная,день 0, GM,[95% CI]
Плацебо,день 0, GM,[95% CI]
Р-значение,активная по сравнению с плацебо
Активная,соотношение GM(день 4: день 0)
Активная,соотношение GM(день 4: день 0),Р-значение
Плацебо,соотношение GM(день 4: день 0)
Плацебо,соотношение GM(день 4: день 0),Р-значение
Активная по сравнению с плацебо(день 4: день 0),Р-значение
G-CSF
33,4 [20,1, 55,4]
20,4 [12,7, 32,6]
0,155
3,35 [1,95, 5,73]
<0,001
4,87 [2,78, 8,54]
<0,001
0,336
IL-1 бета
0,9 [0,6, 1,5]
0,6 [0,4, 1,0]
0,250
1,04 [0,54, 1,85]
0,889
2,13 [1,24, 3,69]
0,007
0,071
IL-6
5,5 [3,5, 8,6]
3,9 [2,6, 5,9 ]
0,283
3,73 [2,12, 6,57]
<0,001
5,56 [3,08, 10,05]
<0,001
0,331
IP-10
439,1 [317,0, 608,3]
298,8 [198,2, 450,6]
0,144
4,10 [2,57, 6,53]
<0,001
6,24 [3,66, 10,62]
<0,001
0,236
MCP-1
12,9 [9,8, 17,0]
12,2 [9,5, 15,6]
0,757
1,02 [0,71, 1,48]
0,878
1,55 [1,18, 2,02]
0,002
0,075
2. Репликация риновируса
(таблица 7, фигура 4).
(p=0,026) (таблица 8).
(фигура 5)
(фигура 5).
Количество риновируса измеряли в назальном лаваже с помощью стандартных способов культивирования. Титры вируса в назальном лаваже были в целом больше у субъектов, получавших плацебо, чем получавших пробиотик, однако это различие не было статистически значимым (p=0,1) При формулировании предположения о противовирусной эффективности Bl-04 и использовании популяции всех субъектов, получавших лечение, которая включала тех, у кого не возникла клиническая простуда, хотя HRV инокулировали, наблюдали статистически меньшее количество риновируса в назальных лаважах субъектов в группе пробиотика С использованием логарифмического рангового критерия в ретроспективном анализе (без поправки Бонферрони) было обнаружено, что время до вирусовыделения было длительнее (p=0,02) и доля субъектов с вирусовыделением была ниже (p=0,04) в группе, получавшей пробиотик Таким образом, репликация риновируса нарушена у субъектов, получавших пробиотик.
Таблица 7
Источник вариации
Степени свободы
Статистика Вальдахи-квадрат
Р-значение
<b>Группа исследования </b>
<b>1</b>
<b>2,68</b>
<b>0,101</b>
День исследования
4
97,37
<0,001
Группа исследования х день исследования
4
7,44
0,114
Таблица 8
Источник вариации
Степени свободы
Статистика Вальдахи-квадрат
Р-значение
<b>Группа исследования </b>
<b>1</b>
<b>4,92</b>
<b>0,026</b>
День исследования
4
93,01
0,000
Группа исследования х день исследования
4
8,95
0,062
+
Количество циркулирующих RV-специфичных T-клеток в подгруппе DR4+ субъектов. Два тетрамера HRV39-пептид/MHC II будут использоваться для прямого количественного анализа ex vivo количества циркулирующих HRV39-специфичных CD4 T-клеток с использованием образцов PBMC. Было обнаружено, что кратность изменения HRV39-специфичных CCR5+ T-хелперных клеток была больше в группе пробиотика в день 21 (p=0,042) (фигура 6).
Результаты на фигуре 6 выглядят следующим образом.
День
Соотношение
Кратность изменения
Нижн. Гран. 95% CL
Верх. Гран. 95% CL
Нескорректир. Р - значение
Нижн. Гран. 95% CL по Бонферрони
Верх. Гран. 95% CL по Бонферрони
Скорректир. Р – значение по Бонферрони
5
Пробиотик плацебо
1,24
0,75
2,06
0,390
0,69
2,23
0,780
21
1,84
1,11
3,05
0,021
1,02
3,31
0,042
Результаты указывают на то, что адаптивный иммунный ответ против HRV39 улучшался после заражения, и поэтому прием Bl-04 с пищей может обеспечить преимущество против повторных заражений HRV.
Результаты примера 1 показывают, что профилактическое применение Bl-04 в экспериментальной модели риновирусной инфекции снижало уровни воспалительного цитокина IL-8 в назальном лаваже. Сниженный воспалительный ответ при инфекции HRV при помощи Bl-04 подтверждался тенденцией к более высокой индукции воспалительных цитокинов IL-1 бета и MCP-1 в группе плацебо, а не в группе пробиотика. Эти результаты указывают на то, что прием Bl-04 может ослабить воспалительный ответ в дыхательных путях. Кроме того, приведенные выше результаты показывают, что прием Bl-04 является эффективным в отношении репликации HRV у здоровых субъектов. Это также указывает на то, что Bl-04 может предупредить развитие астмы у младенцев и/или детей и быть полезным в предупреждении обострений астмы и COPD, ассоциированных с риновирусными инфекциями.
Пример 2. Хронические респираторные заболевания
Введение
B.lactis
Вышеприведенное исследование демонстрирует, что пробиотик  Bl-04 уменьшает выделение риновируса и уровни IL-8 во время инфекции HRV у людей, что указывает соответственно на противовирусный и противовоспалительный эффект пробиотика.
Не вдаваясь в теорию, авторы настоящего изобретения полагают, что введение Bl-04 может снизить риск (противовирусный эффект) или тяжесть (противовоспалительный эффект) обострений астмы или COPD. Чтобы проверить это, модель на мышах, которых сделали восприимчивыми к риновирусам человека (Bartlett et al. 2008), использовали для тестирования эффективности приема Bl-04 с пищей в отношении обострений астмы или COPD.
Астму изучали на мышах, которые сенсибилизированы к овальбумину, модельному аллергену, а COPD изучали на мышах, которых длительно подвергали воздействию сигаретного дыма (Stevenson and Birrell 2011). Необязательно пробиотик Bl-04 вводили с целью профилактики в экспериментальной модели заражения риновирусом с участием субъектов-людей с астмой или COPD, имеющих умеренное и стабильное заболевание (Del Vecchio et al. 2015; Contoli et al. 2007; Cheung et al. 1995).
Исследования на животных
Животная модель инфекции HRV
Эффект приема Bl-04 с пищей в отношении риновируса изучали на мышах с использованием мышей, инфицированных риновирусом минорной группы, или мышей, трансгенных по рецептору ICAM-1 человека, который действует у людей как естественный рецептор для риновирусов человека мажерной группы (например, Bartlett 2008 Nat. Med). Эту модель использовали для исследования эффекта Bl-04 в отношении инфекции HRV. В сочетании с другими конкретными моделями, объясненными ниже, можно исследовать (i) снижение риска развития астмы, (ii) снижение риска обострения астмы и (iii) снижение риска обострения COPD.
Дозирование пробиотика в экспериментах на животных
9
Bl-04 предпочтительно давали в дозе 2*10 КОЕ/день в течение 2 недель перед заражением HRV. Пробиотик вводили либо через желудочный зонд, либо смешивали с небольшим количеством корма или жидкости, чтобы обеспечить прием дозы.
Эффект пробиотика Bl-04 на развитие астмы
Восприимчивым к HRV мышам вводили Bl-04 или плацебо в течение 1 недели перед обеспечением воздействия на них инфекции HRV, RSV или плацебо на 7-й день после рождения (Schneider 2012). Заражение проводили при 50% инфекционной дозе. Обоснованием для включения RSV являлось то, что Bl-04 может быть потенциально эффективным против других предрасполагающих к астме вирусов помимо HRV (Schwarze et al. 1997). RSV вызывает бронхиальную обструкцию чаще, чем HRV. Авторы настоящего изобретения контролировали воспаление дыхательных путей и титры вируса у мышей во время инфекции. Bl-04 оказывал антагонистические эффекты на уровни HRV и IL-8.
После заражения HRV мышей дополнительно сенсибилизировали модельным антигеном овальбумином (OVA), который можно использовать для индуцирования астмоподобных симптомов в дыхательных путях тремя последовательными дозами с использованием квасцов в качестве адъюванта. Воспаление дыхательных путей и развитие гиперреактивности дыхательных путей контролировали стандартными гистологическими и молекулярными способами. Прием Bl-04 с пищей в раннем или постнатальном периоде жизни и снижение патологии HRV и воспаления во время инфекции снижали интенсивность воспаления и патологию астмы у взрослых мышей позднее на протяжении жизни.
Эффект пробиотика Bl-04 на обострения астмы
Восприимчивых к HRV мышей сенсибилизировали к овальбумину с квасцовым адъювантом или с PBS в качестве контроля. OVA вводили в течение трех последовательных дней для индукции воспаления дыхательных путей. Прием Bl-04 или плацебо с пищей для восприимчивых к HRV мышей начинали, как описано выше. После 2 недель приема Bl-04 с пищей мышам проводили заражение HRV при 50% инфекционной дозе и анализировали воспаление (например, по IL-8) дыхательных путей и титры риновируса в лаважах дыхательных путей. Кроме того, патологию дыхательных путей контролировали гистологическим способом. В группе Bl-04 воспаление, титр HRV и патология были ослаблены и потенциальная инфекционность HRV снижена.
Эффект пробиотика Bl-04 на обострения COPD
Восприимчивых к HRV мышей подвергали воздействию сигаретного дыма в течение по меньшей мере 1 месяца (или не подвергали в случае группы плацебо) для индуцирования иммунологических и патологических изменений, наблюдаемых при COPD (Stevenson 2007). Прием Bl-04 или плацебо с пищей для мышей начинали через 2 недели после того, как появились хронические подобные COPD изменения. Затем мышам инокулировали 50% инфекционную дозу HRV, чтобы вызвать острое, индуцированное вирусом обострение. Анализировали воспаление (в том числе IL-8), титры HRV и патологию легких. В группе Bl-04 воспаление, титр HRV и патология были ослаблены и потенциальная инфекционность HRV снижена.
Пример 3. Эффект Bl-04 на обострение астмы
Дизайн исследования
Группы обработки
2
1. Группа отрицательного контроля. Обработка средой-носителем (HO).
2. Обработка Bl-04.
Количество мышей на группу=15.
Индуцированное домашним пылевым клещом (HDM) обострение астмы
Дни 0-28: введение HDM в 30 мкл PBS назально три раза в неделю.
2
Дни 28-49: ежедневное введение Bl-04 или среды-носителя (HO) путем обработки зернового продукта.
День 49: введение сублетальной дозы вируса гриппа (PR8) назально.
День 52: 5 животных из каждой группы умерщвляли для анализа.
День 54: 5 животных из каждой группы умерщвляли для анализа.
День 56: 5 животных из каждой группы умерщвляли для анализа.
Мышей BALB/c 8-недельного возраста использовали для исследования. Питьевая вода и пища были доступны в неограниченном количестве.
В дни 0-28 животным три раза в неделю вводили 15 мкг HDM в объеме 30 мкл PBS назально. Мышей анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 9,75 мг ксилазола и 48,75 мг кетазола на кг и вводили 15 мкг HDM в объеме 30 мкл PBS назально.
9
9
В дни 28-49 животным вводили среду-носитель (вода, группа 1) или Bl-04 (группа 2) с помощью желудочного зонда (1×10 КОЕ/день) и путем обработки зернового продукта (1×10 КОЕ/день/зерновой продукт).
9
200 мкл воды или Bl-04, восстановленного в воде при концентрации 5×10 КОЕ/мл, помещали на один кусочек зернового продукта ('Special K' производства Kellogg). Пробиотическое средство для обработки готовили свежим в каждый день введения. Один кусочек зернового продукта из расчета на одну мышь в каждой клетке помещали в лоток для кормления, который находился внутри клетки, и мыши могли есть в течение дня.
В тот же день 200 мкл воды или восстановленного пробиотика вводили мышам с помощью желудочного зонда.
В день 49 мышам инокулировали сублетальную дозу вируса гриппа A (250 PFU назально; штамм вируса гриппа H1N1 PR/8/34)). Вирусный материал хранили при -75°C ± 10°C и размораживали перед введением. После размораживания материал разбавляли холодным PBS (4°C), что соответствовало 250 PFU/50 мкл для A/PR/8/34. Разбавленный вирус держали на льду до введения мышам.
Животных анестезировали внутрибрюшинной инъекцией 9,75 мг ксилазола и 48,75 мг кетазола на кг веса тела и каждое животное получало 50 мкл раствора вируса путем интраназальной инокуляции.
В дни 52, 54 и 56 по пять животных из группы умерщвляли путем летальной внутрибрюшинной инъекции пентабарбитола, после чего сразу же проводили бронхоальвеолярный лаваж (BAL) в 500 мкл солевого раствора и выделяли ткани (легкого).
Клетки выделяли из жидкости BAL и проводили дифференциальные подсчеты клеток (подсчет 200 клеток/образец). Общее количество клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BAL) определяли с применением счетчика Coulter (IG Instrumenten-Gesellschaft AG, Базель, Швейцария). Дифференциальные подсчеты клеток проводили (подсчет 200 клеток/образец) на основе стандартных морфологических и цитохимических критериев для цитоцентрифуг с окрашиванием раствором Diff-Quik (Dade Behring, Siemens Healthcare Diagnostics, Дирфилд, Иллинойс).
Доли легких выделяли для количественной оценки вирусной нагрузки в легочной ткани с помощью количественной ПЦР. Доли легких осторожно выделяли и помещали в пробирки Эппендорфа объемом 2 мл, содержащие 1 мл TRI-реагента (Molecular Research Centre Inc., номер по каталогу: TR 118), и быстро замораживали в сухом льду. Затем образцы хранили при -80°C до обработки.
Доли легких, сохраненные в TRI-реагенте, медленно размораживали при комнатной температуре. Стерильные шарики из нержавеющей стали (Qiagen. номер по каталогу: 69989) помещали в каждую пробирку с образцом и легкие гомогенизировали с применением TissueLyser (Qiagen, номер по каталогу: 85220) с частотой 25 Гц в течение 3 минут.
Экстракцию РНК с применением TRI-реагента (Molecular Research Centre Inc., номер по каталогу: TR 118) осуществляли согласно инструкциям производителя
(http://mrcgene.com/wp-content/uploads/2014/06/TRIMay2014.pdf).
Концентрацию РНК в каждом образце измеряли с применением спектрофотометра Thermo Scientific NanoDropTM 1000 (Thermo Fisher Scientific). РНК обрабатывали ДНКазой (Invitrogen), чтобы избежать загрязнения геномной ДНК до превращения РНК в кДНК с помощью обратной транскрипции, и кДНК количественно определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Образцы нормализовали относительно уровней экспрессии β-актина.
Образцы амплифицировали в одностадийной RT-PCR при конечном объеме реакционной смеси 10 мкл, содержащей 5 мкл реакционной смеси iTaq universal SYBR Green (BIO-RAD Laboratories, номер по каталогу 172-5150), 0,125 мкл обратной транскриптазы iScript (BIO-RAD, номер по каталогу: 172-5150), 0,5 мкл прямого и обратного праймеров гена матриксного белка вируса гриппа PR8 (5_-GGACTGCAGCGTAGACGCTT-3_ и 5_-CATCCTGTATATGAGGCCCAT-3) или бета-актина (5_-GATCAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3_ и 5_-CAGCTCAGTAACAGTCCGCC- 3_), 0,375 мкл не содержащей РНКаз воды (BIO-RAD, номер по каталогу: 172-5150) и 4 мкл РНК при концентрации 125 нг/мкл.
Термоциклирование проводили в системе для ПЦР в режиме реального времени CFX-96 (BIO-RAD) с применением следующего протокола: реакция обратной транскрипции 10 мин. при 50°С, затем активация полимеразы и денатурация ДНК 1 мин. при 95°С, затем денатурация 95°C в течение 10 с, затем отжиг/достройка+считывание планшета 30 с при 60°С, в общей сложности 40 циклов.
Графики и статистический анализ
Статистическую обработку данных проводили либо в виде непарного t-теста (количественный анализ титра вируса в легочной ткани), либо в виде одностороннего ANOVA. Планки погрешностей на фигурах представляют стандартную ошибку среднего (SEM).
Результаты
Введение пробиотика хорошо переносилось мышами. Мыши получали пробиотик через желудочный зонд, что гарантировало, что все мыши подвергались воздействию бактерий, и дополнительно зерновые продукты в клетке каждый день пропитывали пробиотиком, при этом мыши их быстро съедали. Никакого существенного варьирования в группах не отмечали, которое указывало бы на то, что некоторые мыши потребляли больше пропитанного бактериями зернового продукта, чем другие мыши.
Обработка мышей HDM приводила к астмоподобным состояниям у мышей. После обработки пробиотиками или средой-носителем мышей заражали вирусом гриппа. Внешний вид обработанных пробиотиком мышей поразительно отличался, при этом у обработанных пробиотиком мышей наблюдали меньшую заболеваемость. Это наблюдение позволяет предположить, что обработанные пробиотиком мыши могли быть защищены от изначальной аллергической астматической реакции и/или пробиотические бактерии обеспечивали защиту в отношении заболеваемости (и потенциальной смертности) во время вирусной инфекции. Таким образом, общее самочувствие мышей, по-видимому, улучшалось (фигура 7). Это также иллюстрируется тенденцией в более низкой интенсивности вирусной инфекции у мышей, обработанных пробиотиками, по сравнению с мышами, обработанными средой-носителем (фигура 8).
Первичные измерения иммунного ответа против инфекции вируса гриппа у мышей с "астмой" показали тенденцию, что Bl-04 может модулировать иммунный ответ в легких во время инфекции вируса гриппа. Основные иммуноклеточные составляющие компоненты дыхательных путей определяли количественно с помощью микроскопии, т. е. лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы. Количество макрофагов в день 56 и количество лимфоцитов в дыхательных путях в день 54 были значительно выше у мышей, обработанных пробиотиками, чем у мышей, получавших среду-носитель (фигуры 9 и 10). Макрофаги играют важную роль в поддержании гомеостаза тканей и борьбе с инфекциями, поэтому в контексте этой модели ожидается, что увеличение количества макрофагов в день 56 будет полезным явлением (Tate et al. 2013). Аналогично, лимфоциты важны для элиминации вируса, и их повышенное присутствие также будет считаться положительным эффектом.
Результаты количественных измерений вирусной нагрузки в легочной ткани можно увидеть в таблице 9 ниже и на фигуре 8. Эти результаты показывают, что титры вируса гриппа (нормализованные относительно уровней β-актина) были значительно ниже в день 54 в группе пробиотика по сравнению с контрольной группой, поддерживая мнение, что обработка пробиотиком может снижать вирусную нагрузку и/или играть роль в элиминации вируса.
Таблица 9
Клиническое исследование на людях с участием здоровых взрослых показало, что Bl-04 может модулировать врожденный иммунный ответ (измеренный как IL-8), который может подавить выделение риновируса в слизистой оболочке носа. На мышиной модели HDM наблюдали подтверждающие доказательства эффекта Bl-04 на иммунное модулирование, поскольку обнаруживали повышенные количества макрофагов и лимфоцитов в BALF. Эти изменения, связанные с иммуномодулированием, могут объяснить улучшенное состояние мышей и потенциально более низкий титр вируса в легких мышей, что согласуется со сниженным титром риновируса у людей. Таким образом, Bl-04, по-видимому, улучшает противовирусный иммунитет к риновирусу у здоровых взрослых и к вирусу гриппа у мышей с "астмой". В целом, результаты свидетельствуют о том, что Bl-04 может применяться людьми с астмой для предупреждения или ослабления обострений астмы, вызванных вирусом.
Пример 4. Клинические исследования на людях
Обострения астмы и COPD у взрослых
Протокол, аналогичный описанному в настоящем изобретении по экспериментальной модели риновирусной инфекции в примере 1, применяли для изучения эффекта приема Bl-04 с пищей в отношении обострения астмы и COPD (Del Vecchio 2015). Вместо здоровых субъектов отбирали пациентов с астмой и COPD от легкой до умеренной степени заболевания с применением стандартных клинических критериев.
Эффект Bl-04 в отношении предупреждения и ослабления обострений астмы, вызванных HRV
Исследуемый продукт
9
Пробиотик Bl-04 или плацебо вводили в дозе 2×10 КОЕ/день в смеси с напитком в течение 28 дней перед заражением HRV и 4 дня после заражения.
Дизайн исследования
Рандомизированное, двойное слепое плацебо-контролируемое.
Конечные точки исследования
пневмотахометра
Нарушение проходимости потока воздуха у субъектов измеряли с помощью максимальной объемной скорости выдоха (PEF). Она представляет собой максимальную скорость выдоха человека, которую измеряют с помощью . Также измеряли объем форсированного выдоха за одну секунду от прогнозируемого (прогнозируемый FEV1%) или любые другие необходимые измерения потока воздуха. PEF и прогнозируемый FEV1% измеряли в дни -28, 0, 1, 2 и в конце исследования в день 4.
Воспаление дыхательных путей измеряли с использованием измерения eNO согласно примеру 1, а также путем измерения IL-8 в бронхоальвеолярном лаваже. Эти измерения проводили в дни -28, 0, 1, 2 и 4.
Респираторные симптомы измеряли с помощью осмотра в дни -28, 0, 1, 2, 3 и 4 (предпочтительно с использованием анкеты и FEV).
Титр вируса в бронхоальвеолярном и назальном лаваже измеряли согласно примеру 1.
Критерии включения:
астма легкой или умеренной степени согласно показателям PEF, прогнозируемого FEV1% и частоты симптомов (Yawn. 2008),
возраст 18-65 лет,
отсутствие беременности.
Критерии исключения:
применение противовоспалительных лекарственных средств,
другое хроническое заболевание,
регулярный прием пробиотиков,
лечение антибиотиками.
Эффект Bl-04 в отношении предупреждения и ослабления обострений COPD, вызванных HRV
Проводили идентичное исследование как в исследовании астмы, описанном выше, но в данном случае вместо астмы субъекты имели COPD легкой или умеренной степени (Vestbo 2013).
Развитие астмы у детей
Эффект Bl-04 в отношении предупреждения астмы у детей
Беременных матерей, которые склонны к атопии (то есть аллергической гиперчувствительности, которая, как известно, ассоциирована с повышением вероятности развития астмы (Elward et al. 2010)), и их младенцев привлекали к участию в исследовании. Пробиотик Bl-04 вводили детям с рождения вплоть до 12 лет. Частоту возникновения вирусных инфекций в течение первого года жизни контролировали при посещении педиатров и этиологию выявляли с помощью стандартных лабораторных методик. Кроме того, развитие иммунной системы и частоту возникновения атопии, бронхиальной обструкции и астмы контролировали до 3 лет, анализируя цитокины Th2, IgE и используя PEF, FEV1%, скарификационные пробы и другие возможные диагностические измерения для атопии и астмы.
Исследуемый продукт
9
Пробиотик Bl-04 или плацебо вводили в дозе 2×10 КОЕ/день в смеси с молоком, начиная с рождения и вплоть до 12 месяцев.
Дизайн исследования
Рандомизированное, двойное слепое плацебо-контролируемое.
Конечные точки исследования
В дополнение к нарушению проходимости потока воздуха, которое измеряли как описано выше, проводили следующие измерения:
скарификационные пробы (измерение кожной реакции на аллергены),
респираторные симптомы регистрировали родители при помощи анкеты,
частоту возникновения инфекций HRV и RSV измеряли при осмотре родителями и врачами.
Критерии включения:
склонность к атопии у родителей,
здоровые новорожденные.
Критерии исключения:
лечение антибиотиками,
другие врожденные аномалии при рождении.
Все публикации, упомянутые в приведенном выше описании, включены в данный документ с помощью ссылки. Различные модификации и варианты описанных способов и совокупность принципов настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники без отступления от объема и сущности настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение было описано с привязкой к конкретными предпочтительными вариантами осуществления, следует понимать, что заявляемое изобретение не должно чрезмерно ограничиваться такими конкретными вариантами осуществления. В действительности, различные модификации описанных способов осуществления изобретения, которые очевидны специалистам в области микробиологии, биохимии и молекулярной биологии или смежных областей, как предполагается, входят в объем прилагаемой формулы изобретения.
Ссылки
Azad MB, Coneys JG, Kozyrskyj AL, Field CJ, Ramsey CD, Becker AB, Friesen C, Abou-Setta AM, Zarychanski R. Probiotic supplementation during pregnancy or infancy for the prevention of asthma and wheeze: systematic review and meta-analysis. BMJ. 2013 Dec 4;347:f6471. doi: 10.1136/bmj.f6471.
Barrangou R., Briczinski EP, Traeger LL, Loquasto JR, Richards M, Horvath P, Coûté-Monvoisin AC, Leyer G, Rendulic S, Steele JL, Broadbent JR, Oberg T, Dudley EG, Schuster S, Romero DA, Roberts RF. Comparison of the complete genome sequences of Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 10140 и Bl-04J. Bacteriol. 2009 191:4144-4151
Bartlett NW, Walton RP, Edwards MR, Aniscenko J, Caramori G, Zhu J, Glanville N, Choy KJ, Jourdan P, Burnet J, Tuthill TJ, Pedrick MS, Hurle MJ, Plumpton C, Sharp NA, Bussell JN, Swallow DM, Schwarze J, Guy B, Almond JW, Jeffery PK, Lloyd CM, Papi A, Killington RA, Rowlands DJ, Blair ED, Clarke NJ, Johnston SL. Mouse models of rhinovirus-induced disease and exacerbation of allergic airway inflammation. Nat Med. 2008 Feb;14(2):199-204. doi: 10.1038/nm1713. Epub 2008 Feb 3
Calder, PC 2013. Feeding the immune system. Proc Nutr Soc 72(3): 299-309.
Cheung D, Dick EC, Timmers MC, de Klerk EP, Spaan WJ, Sterk PJ. Rhinovirus inhalation causes long-lasting excessive airway narrowing in response to methacholine in asthmatic subjects in vivo. Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov;152(5 Pt 1):1490-6.
Contoli M, Message SD, Laza-Stanca V, Edwards MR, Wark PA, Bartlett NW, Kebadze T, Mallia P, Stanciu LA, Parker HL, Slater L, Lewis-Antes A, Kon OM, Holgate ST, Davies DE, Kotenko SV, Papi A, Johnston SL. Role of deficient type III interferon-lambda production in asthma exacerbations. Nat Med. 2006 Sep;12(9):1023-6. Epub 2006 Aug 13.
Contoli M, Caramori G, Mallia P, Papi A, Johnston SL. A human rhinovirus model of chronic obstructive pulmonary disease exacerbations. Contrib Microbiol. 2007;14:101-12. Review.
Del Vecchio AM, Branigan PJ, Barnathan ES, Flavin SK, Silkoff PE, Turner RB. (2015) Utility of animal and in vivo experimental infection of humans with rhinoviruses in the development of therapeutic agents for viral exacerbations of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Pulm Pharmacol Ther. 2014 Nov 13;30C:32-43. doi: 10.1016/j.pupt.2014.10.005. [опубликовано до печати] PMID:25445932[PubMed - как предоставлено издателем]
Elazab N, Mendy A, Gasana J, Vieira ER, Quizon A, Forno E. Probiotic administration in early life, atopy, and asthma: a meta-analysis of clinical trials. Pediatrics. 2013 Sep;132(3):e666-76. doi: 10.1542/peds.2013-0246. Epub 2013 Aug 19.
Elward, Graham Douglas, Kurtis S. (2010). Asthma. London: Manson Pub. pp. 27-29. ISBN 978-1-84076-513-7.
FAO/WHO. Guidelines for the evaluation of probiotics in food 2001. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). 2001. Health and Nutritional
Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria,
http://www.who.int/foodsafety/publications/fs_management/en/probiotics.pdf
Gunawardana N, Finney L, Johnston SL, Mallia P. Experimental rhinovirus infection in COPD: implications for antiviral therapies. Antiviral Res. 2014 Feb;102:95-105. doi: 10.1016/j.antiviral.2013.12.006. Epub 2013 Dec 24. Review.
Hao Q, Lu Z, Dong BR, Huang CQ, Wu T. Probiotics for preventing acute upper respiratory tract infections. Cochrane Database Syst Rev. 2011 Sep 7;(9):CD006895. doi: 10.1002/14651858.CD006895.pub2. Review.
Heikkinen T, Järvinen A. The Common Cold. Lancet. 2003 Jan 4;361(9351):51-9. Review.
Jackson DJ, Evans MD, Gangnon RE, Tisler CJ, Pappas TE, Lee WM, Gern JE, Lemanske RF Jr. Evidence for a causal relationship between allergic sensitization and rhinovirus wheezing in early life. Am J Respir Crit Care Med. 2012 Feb 1;185(3):281-5. doi: 10.1164/rccm.201104-0660OC. Epub 2011 Sep 29.
Kang EJ, Kim SY, Hwang IH, Ji YJ. The effect of probiotics on prevention of common cold: a meta-analysis of randomized controlled trial studies. Korean J Fam Med. 2013 Jan;34(1):2-10. doi: 10.4082/kjfm.2013.34.1.2. Epub 2013 Jan 28.
Mallia P, Message SD, Contoli M, Gray KK, Telcian A, Laza-Stanca V, Papi A, Stanciu LA, Elkin S, Kon OM, Johnson M, Johnston SL. Neutrophil adhesion molecules in experimental rhinovirus infection in COPD. Respir Res. 2013 Jul 8;14:72. doi: 10.1186/1465-9921-14-72.
Maynard, CL, Elson, CO, et al. 2012. Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system. Nature 489(7415): 231-241.
Message SD, Laza-Stanca V, Mallia P, Parker HL, Zhu J, Kebadze T, Contoli M, Sanderson G, Kon OM, Papi A, Jeffery PK, Stanciu LA, Johnston SL. Rhinovirus-induced lower respiratory illness is increased in asthma and related to virus load and Th1/2 cytokine and IL-10 production. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 9;105(36):13562-7. doi: 10.1073/pnas.0804181105. Epub 2008 Sep 3.
Proud D. Role of rhinovirus infections in asthma. Asian Pac J Allergy Immunol. 2011 Sep;29(3):201-8. Review.
Saglani S. Innate immunity in paediatric viral wheezers is virus specific and not interferon dependent. Thorax. 2014 Oct;69(10):887-8. doi: 10.1136/thoraxjnl-2014-205561. Epub 2014 May 28. Реферат недоступен.
Saraya T, Kurai D, Ishii H, Ito A, Sasaki Y, Niwa S, Kiyota N, Tsukagoshi H, Kozawa K, Goto H, Takizawa H. Epidemiology of virus-induced asthma exacerbations: with special reference to the role of human rhinovirus. Front Microbiol. 2014 May 26;5:226. doi: 10.3389/fmicb.2014.00226. eCollection 2014. Review.
Schneider D, Hong JY, Popova AP, Bowman ER, Linn MJ, McLean AM, Zhao Y, Sonstein J, Bentley JK, Weinberg JB, Lukacs NW, Curtis JL, Sajjan US, Hershenson MB. Neonatal rhinovirus infection induces mucous metaplasia and airways hyperresponsiveness. J Immunol. 2012 Mar 15;188(6):2894-904. doi: 10.4049/jimmunol.1101391. Epub 2012 Feb 13
Schwarze J, Hamelmann E, Bradley KL, Takeda K, Gelfand EW. Respiratory syncytial virus infection results in airway hyperresponsiveness and enhanced airway sensitization to allergen. J Clin Invest. 1997 Jul 1;100(1):226-33.
Sigurs N, Aljassim F, Kjellman B, Robinson PD, Sigurbergsson F, Bjarnason R, Gustafsson PM. Asthma and allergy patterns over 18 years after severe RSV bronchiolitis in the first year of life. Thorax. 2010 Dec;65(12):1045-52. doi: 10.1136/thx.2009.121582. Epub 2010 Jun 27.
Stevenson CS, Docx C, Webster R, Battram C, Hynx D, Giddings J, Cooper PR, Chakravarty P, Rahman I, Marwick JA, Kirkham PA, Charman C, Richardson DL, Nirmala NR, Whittaker P, Butler K. Comprehensive gene expression profiling of rat lung reveals distinct acute and chronic responses to cigarette smoke inhalation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2007 Nov;293(5):L1183-93. Epub 2007 Aug 24.
Stevenson CS, Birrell MA. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacol Ther. 2011 May;130(2):93-105. doi: 10.1016/j.pharmthera.2010.10.008. Epub 2010 Aug 11. Review. PMID:21074553[PubMed - индекс для MEDLINE]
Tate MD, Pickett DL, van Rooijen N, Brooks AG and Reading PC. Critical role of airway macrophages in modulating disease severity during influenza virus infection of mice. J Virol 2010, 84(15), pp. 7569-7580.
Tourneur, E and Chassin, C 2013. Neonatal immune adaptation of the gut and its role during infections. Clin Dev Immunol 2013: 270301.
Vestbo, Jørgen 2013. "Diagnosis and Assessment". Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. pp. 9-17
Wall, R, Ross, RP, et al. 2009. Role of gut microbiota in early infant development. Clin Med Pediatr 3: 45-54.
Wark PA, Johnston SL, Simpson JL, Hensley MJ, Gibson PG. Chlamydia pneumoniae immunoglobulin A reactivation and airway inflammation in acute asthma. Eur Respir J. 2002 Oct;20(4):834-40.
Yawn BP. Factors accounting for asthma variability: achieving optimal symptom control for individual patients. Primary Care Respiratory Journal 2008. 17 (3): Sept:138-147.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  DuPont Nutrition Biosciences ApS
<120>  композиция
<130>  NB40880-PCT-US
<150>  US 62/108260
<151>  2015-01-27
<160>  4
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  1
ggactgcagc gtagacgctt                                                   20
<210>  2
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Праймер
<400>  2
catcctgtat atgaggccca t                                                 21
<210>  3
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Прямой праймер для бета-актина
<400>  3
gatcaagatc attgctcctc ctga                                              24
<210>  4
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Обратный праймер для бета-актина
<400>  4
cagctcagta acagtccgcc                                                   20
<---