АНТИТЕЛА ПРОТИВ TNF-α И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTIBODIES AGAINST TNF-α AND USE THEREOF

1. ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Эта заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №61/170053, поданной 16 апреля 2009 года, содержание которой включено сюда посредством ссылки во всей ее полноте.
2. ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Перечень последовательностей, одновременно поданный с настоящим документом, включен сюда посредством ссылки.
3. ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к антителам против TNF-α, фармацевтическим композициям, содержащим антитела против TNF-α, и терапевтическим применениям таких антител.
4. ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) представляет собой провоспалительный цитокин, который высвобождается клетками иммунной системы и взаимодействует с клетками иммунной системы. Было показано, что TNF-α подвергается позитивной регуляции при некоторых человеческих заболеваниях, включая хронические заболевания, такие как ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит и рассеянный склероз. Например, повышенные уровни TNF-α обнаруживаются в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом и играют важную роль как при патологическом воспалении, так и при разрушении суставов, что является признаками ревматоидного артрита.
Человеческий TNF-α представляет собой 17 кДа белок, и активная форма существует в виде гомотримера (Pennica et al., 1984, Nature 312:724-729; Davis et al., 1987, Biochemistry 26:1322-1326; Jones et al., 1989, Nature 338:225-228). TNF-α оказывает свои биологические эффекты путем взаимодействия с двумя структурно родственными, но функционально отличными рецепторами клеточной поверхности, р55 и р75, которые коэкспрессируются на большинстве типов клеток (Loetscher et al., 1990, Cell 61:351-9; Smith et al., 1990, Science 248(4958):1019-23). р55 также известен как p55R; p55TNFR; CD120a; TNFR I; TNFR I и TNFRSFIa. p75 также известен как p75R; p75TNFR; CD120b; TNFR II; TNFR 2 и TNFRSFIb. Оба рецептора также протеолитически высвобождаются в виде растворимых молекул, способных к связыванию TNF-α.
1
50
-10
Ингибирование активности TNF-α как способ лечения заболевания, в частности ревматоидного артрита, было достигнуто несколькими разными способами с использованием ингибиторов, таких как антитела и растворимые рецепторы. Примеры включают этанерцепт, поставляемый на рынок Immunex Corporation как ENBREL, который представляет собой рекомбинантный слитый белок, содержащий два домена растворимого TNF-рецептора p75, связанных с Fc-частью человеческого иммуноглобулина. Инфликсимаб, поставляемый на рынок Centocor Corporation как REMICADE, представляет собой химерное антитело, имеющее мышиные вариабельные домены антитела против TNF-α и константные домены человеческого IgG. Другие ингибиторы включают полученные посредством генной инженерии молекулы TNF-α, которые образуют тримеры с нативным TNF-α и предотвращают связывание рецептора (Steed et al., 2003, Science 301:1895-1898; WO 03/033720; WO 01/64889). В этих современных способах ингибирования активности TNF-α блокируют связывание TNF-α и с р55, и с p75 рецепторами (смотрите, например, Mease, 2005, Expert Opin. Biol. Therapy 5(11):1491-1504). Адалимумаб, поставляемый на рынок Abbott Laboratories как HUMIRA, представляет собой рекомбинантное, полностью человеческое антитело против TNF-α (Tussirot and Wendling, 2004, Expert Opin. Pharmacother. 5:581-594). Адалимумаб специфически связывается с TNF-α и блокирует его взаимодействие с рецепторами TNF-α клеточной поверхности р55 и p75. Адалимумаб также лизирует in vitro клетки, экспрессирующие TNF-α на поверхности, путем комплементзависимой цитотоксичности ("CDC") и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности ("ADCC"). Адалимумаб не связывается с лимфотоксином (TNF-p) или не инактивирует его. Адалимумаб также модулирует биологические ответы, которые индуцирует или регулирует TNF, включая изменения в уровнях молекул адгезии, ответственных за миграцию лейкоцитов (ELAM-1, VCAM-1 и 1САМ-1 с ИК 1-2×10 М).
Несмотря на то, что адалимумаб является человеческим антителом, он может вызывать иммунный ответ при введении людям. Такой иммунный ответ может приводить к клиренсу антител или фрагментов из кровообращения, опосредованному иммунным комплексом, и делает повторное введение неподходящим для терапии, тем самым уменьшая терапевтическую пользу для пациента и ограничивая повторное введение антитела.
Соответственно, существует потребность в предоставлении улучшенных антител против TNF-α или фрагментов, которые решают одну или более чем одну из этих проблем, например путем создания вариантов с более высокой аффинностью, чем адалимумаб, которые можно вводить при пониженных дозировках, или вариантов с пониженной иммуногенностью по сравнению с адалимумабом.
Цитирование или идентификация любой ссылки в разделе 4 или в любом другом разделе этой заявки не следует истолковывать как признание того, что такая ссылка подходит в качестве предшествующего уровня техники по отношению к настоящему описанию.
5. КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к вариантам антитела против TNF-α D2E7 с улучшенным связыванием с TNF-α и/или с пониженной иммуногенностью по сравнению с D2E7. D2E7 имеет три CDR (гипервариабельный участок) тяжелой цепи, именуемые здесь (в порядке от амино- до карбоксильного конца) как CDR-H1 (SEQ ID NO:5), CDR-H2 (SEQ ID NO:6), и CDR-Н3 (SEQ ID NO:7), и три CDR легкой цепи, именуемые здесь (в порядке от амино- до карбоксильного конца) как CDR-L1 (SEQ ID NO:8), CDR-L2 (SEQ ID NO:9), и CDR-L3 (SEQ ID NO:10). Антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по описанию обычно имеют по меньшей мере одну аминокислотную замену в по меньшей мере одном CDR по сравнению с D2E7.
В определенных аспектах по меньшей мере одна аминокислотная замена или комбинация замен выбрана из Таблицы 11, Таблицы 12 и/или Таблицы 25. Дополнительные мутации (включая замены, делеции или вставки) могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 13-25.
D
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к вариантам антитела против TNF-α D2E7 с улучшенными свойствами связывания, например улучшенной аффинностью по отношению к TNF-α по сравнению с D2E7. В определенных воплощениях антитела по изобретению имеют большую аффинность, чем D2E7 в отношении TNF-α, например, улучшенную K при измерении BIAcore и/или улучшенную аффинность при измерении конкурентным ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ).
В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают по меньшей мере одну замену, выбранную из S3K в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), S3R в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), S3N в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4H в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4Q в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4V в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4F в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4W в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), T4Y в CDR-L2 (SEQ ID NO:9); L5R в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), L5K в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), Q6K в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), Q6R в CDR-L2 (SEQ ID NO:9), D1G в CDR-H1 (SEQ ID NO:5), Y2H в CDR-H1 (SEQ ID NO:5); A3G в CDR-H1 (SEQ ID NO:5) и T3N в CDR-H2 (SEQ ID NO:6). Дополнительными мутациями, которые могут быть включены в вариант антител против TNF-α с улучшенной аффинностью и анти-TNF-α-связывающих фрагментов с улучшенной аффинностью, могут быть деиммунизирующие замены, такие как замены, описанные в Таблице 11, а также другие мутации, например замены, которые не нарушают способность антител против TNF-α и анти-TNF-α-связывающих фрагментов связываться с TNF-α, включая известные мутации, описанные в Таблицах 13-24, или мутации, описанные в Таблице 25, но не ограничиваясь ими.
В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают по меньшей мере одну замену, выбранную из T4F в CDR-L2, T4W в CDR-L2, T4Y в CDR-L2, L5R в CDR-L2, L5K в CDR-L2, Q6R в CDR-L2, Y2H в CDR-H1, A3G в CDR-H1 и T3N в CDR-H2. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11 и 13-25.
В определенных других аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают по меньшей мере одну замену, выбранную из T4F в CDR-L2, T4W в CDR-L2, T4Y в CDR-L2, L5R в CDR-L2, L5K в CDR-L2, Q6R в CDR-L2, Y2H в CDR-H1, A3G в CDR-H1 и T3N в CDR-H2. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11 и 13-18.
В других аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают замены G5S+A11S или G5S+A11G в CDR-L1. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11-25.
В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают замены, выбранные из S3N в CDR-L2, T4V в CDR-L2, Q6K в CDR-L2 и D1G в CDR-H1, в комбинации с по меньшей мере одной заменой, выбранной из Таблиц 11, 12 и 25. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11-24.
В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают замены, выбранные из S3N в CDR-L2, T4V в CDR-L2, Q6K в CDR-L2 и D1G в CDR-H1, в комбинации по меньшей мере с одной заменой, выбранной из S3K в CDR-L2, S3R в CDR-L2, Т4Н в CDR-L2, T4Q в CDR-L2, T4F в CDR-L2, T4W в CDR-L2, T4Y в CDR-L2, L5R в CDR-L2, L5K в CDR-L2, Q6R в CDR-L2, Y2H в CDR-H1, A3G в CDR-H1, и T3N в CDR-H2.
В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают комбинации замен, выбранные из по меньшей мере одной из S3K, Т4Н, L5R и Q6R; S3K, T4Q, L5R и Q6K; S3K, T4Y и L5K; S3K и T4Y; S3N, T4V, L5R и Q6K; S3N, T4W, L5R и Q6R; S3R, T4F и L5R; S3R, T4F, L5R и Q6R; S3R, Т4Н и Q6K; S3R, T4W, L5K и Q6R; Т4Н, L5K и Q6K; Т4Н, L5K и Q6R; T4W, L5R и Q6R; и T4Y и L5R в CDR-L2, где шесть CDR в совокупности имеют вплоть до 17 аминокислотных замен по сравнению с последовательностями CDR антитела D2E7. Антитела против TNF-α или анти-TNF-α-связывающие фрагменты возможно включают одну или более чем одну дополнительную мутацию или одну или более чем одну дополнительную комбинацию мутаций, которые могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11-24.
В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают одну или более чем одну замену или одну или более чем одну комбинацию замен, выбранные из S3K, S3R, S3N, T4F, T4W, T4Y, Т4Н, T4Q, T4V, L5R, L5K, Q6R и Q6K в CDR-L2. Дополнительные мутации или комбинации мутаций, которые могут быть включены в такие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, могут быть выбраны из одной или более чем одной из Таблиц 11-24.
В других аспектах настоящее изобретение относится к вариантам антитела против TNF-α D2E7 с пониженной иммуногенностью по сравнению с D2E7. В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты включают по меньшей мере одну замену или по меньшей мере одну комбинацию замен в CDR-L1 (SEQ ID NO:8), выбранную из R7Q; A11S; R7Q+A11S; N8T; N8T+A11S; I6T; A11G; I6T+A11G; Q4G; Q4G+A11S; Q4G+A11G; Q4H; Q4H+A11S; Q4R; Q4R+A11S; G5S; G5S+A11S; N8S+A11S; I6T+A11S; и N8T+AUG. Дополнительные мутации, которые могут быть включены в антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты с пониженной антигенностью, включают замены, которые улучшают свойства связывания с TNF-α, такие как мутации, описанные в Таблице 12 и/или Таблице 25, а также другие мутации, например замены, которые не нарушают способность антител против TNF-α и анти-TNF-α-связывающих фрагментов связываться с TNF-α, включая известные мутации, описанные в Таблицах 13-25, но не ограничиваясь ими.
В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению имеют последовательности VH и VL, имеющие 80%-99% идентичности последовательности с последовательностями VH и VL D2E7 и включают по меньшей мере одну аминокислотную замену в по меньшей мере одном CDR по сравнению с D2E7. В конкретных воплощениях процент идентичности последовательности для тяжелой цепи и легкой цепи по сравнению с последовательностями VH и VL D2E7 в каждом случае независимо выбран из по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% идентичности последовательности.
В определенных аспектах антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению имеют вплоть до 17 аминокислотных замен в их CDR по сравнению с CDR D2E7. Варианты антител с 17 аминокислотными заменами, которые сохраняют свою способность к связыванию мишени, были описаны Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-14. Антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению также могут иметь вплоть до 16, вплоть до 15, вплоть до 14, вплоть до 13, вплоть до 12, вплоть до 11, вплоть до 10, вплоть до 9, вплоть до 8, вплоть до 7, вплоть до 6, вплоть до 5 или вплоть до 4 аминокислотных замен в их CDR по сравнению с последовательностями CDR антитела D2E7.
В конкретных воплощениях антитело против TNF-α или анти-TNF-α-связывающий фрагмент по изобретению независимо имеют:
- вплоть до одной или вплоть до двух, или вплоть до трех замен в CDR-Н1 по сравнению с соответствующим CDR D2E7;
- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех, вплоть до пяти или вплоть до шести замен в CDR-H2 по сравнению с соответствующим CDR D2E7;
- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех, вплоть до четырех или вплоть до пяти замен в CDR-H3 по сравнению с соответствующим CDR D2E7;
- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех или вплоть до четырех замен в CDR-L1 по сравнению с соответствующим CDR D2E7;
- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех или вплоть до четырех замен в CDR-L2 по сравнению с соответствующим CDR D2E7; и
- вплоть до одной, вплоть до двух, вплоть до трех или вплоть до четырех замен в CDR-L3 по сравнению с соответствующим CDR D2E7.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены фармацевтические композиции, содержащие модифицированные антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты, имеющие повышенную аффинность к TNF-α и/или пониженную иммуногенность по сравнению с D2E7.
В определенных аспектах антитело против TNF-α или анти-TNF-α-связывающий фрагмент по изобретению могут представлять собой биспецифичное антитело или TNF-α-связывающий фрагмент биспецифичного антитела. Биспецифичное антитело может быть специфичным к TNF-α и другому провоспалительному цитокину (такому как, например, лимфотоксин, интерферон-γ или интерлейкин-1).
Здесь предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению, также как и векторы, содержащие нуклеиновые кислоты. Дополнительно, здесь предложены прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, трансформированные вектором, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело против TNF-α или анти-TNF-α-связывающий фрагмент, а также эукариотические (такие как клетки млекопитающих) клетки-хозяева, сконструированные для экспрессии нуклеотидных последовательностей. Также предложены способы получения антител против TNF-α и анти-TNF-α-связывающих фрагментов путем культивирования клеток-хозяев.
Антитела против TNF-α и анти-TNF-α-связывающие фрагменты по изобретению являются полезными при лечении иммунных расстройств, например системной красной волчанки, ревматоидного артрита, тиреоидита, болезни «трансплантат против хозяина», склеродермии, сахарного диабета, болезни Грейвса, саркоидоза, хронического воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита или болезни Крона.
Следует отметить, что неопределенные артикли «а» и «an» и определенный артикль «the» используются в настоящей заявке, как обычно в заявках на патент, для обозначения одного или более чем одного, если контекст ясно не диктует иное. Далее, термин «или» используются в настоящей заявке, как обычно в заявках на патент, для обозначения разделительного «или» или соединительного «и».
Все публикации, упомянутые в этом описании, являются включенными сюда посредством ссылки. Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, статей или тому подобного, которые были включены в это описание изобретения, приведено исключительно в целях предоставления контекста для настоящего изобретения. Не следует принимать как допущение, что любой или все из этих объектов образуют часть основы уровня техники или были обычными общедоступными сведениями в области, имеющей отношение к настоящему описанию, как оно существовало где угодно до даты приоритета настоящей заявки.
Признаки и преимущества изобретения станут еще более очевидными из следующего подробного описания его воплощений.
6. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ТАБЛИЦ И ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Таблица 1 показывает пептиды VH D2E7 и пептиды VL D2E7, соответственно, которые тестировали на иммуногенность.
Таблица 2 показывает идентифицированные области эпитопов CD4+ Т-клеток в D2E7. Участки CDR подчеркнуты.
Таблица 3 показывает ассоциации HLA (главный комплекс гистосовместимости человека) класса II и относительный риск ответа на пептидные эпитопы области VL D2E7.
Таблица 4 показывает последовательности вариантов эпитопов CDR1 VL D2E7. Всего тестировали 99 доноров. Число респондеров, процент респондеров и средний индекс стимуляции показаны для каждого протестированного пептида.
Таблица 5 показывает мутации-кандидаты в CDR-L1 для снижения иммуногенности D2E7. Нумерация аминокислот в Таблице 5 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7.
D
50
Таблица 6 показывает результаты BIAcore и EL1SA для замен в CDR-L1, которые не приводят к значительному ослаблению связывания по сравнению D2E7. Нумерация аминокислот в Таблице 6 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7. Улучшение K (измеренной BIAcore) и ИК связывания (измеренной ELISA) показано посредством "WT/x". CV% относится к стандартному отклонению как доле в процентах от величины общего значения.
Таблица 7 показывает результаты анализа Т-клеток для всех одиночных и двойных мутаций эпитопа D2E7. Пептид 1 представляет собой родительский пептид. Модификации родительского пептида выделены жирным шрифтом.
Таблица 8 показывает предпочтительные варианты пептидов эпитопов, основанные только на результатах анализа Т-клеток. Нумерация аминокислот в Таблице 8 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7.
Таблица 9 показывает антипролиферативную биоактивность антител, сконструированных так, чтобы они содержали предпочтительные варианты пептидов эпитопов. Родительским является немодифицированное антитело D2E7. Нумерация аминокислот в Таблице 9 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7.
Таблица 10 показывает кинетику связывания D2E7 и вариантов D2E7 против TNF-α, проанализированную BIAcore. Нумерация аминокислот в Таблице 10 соответствует положениям в контексте легкой цепи D2E7.
Таблица 11 показывает замены CDR-L1 или комбинации замен, которые могут быть включены в антитела, родственные D2E7, для снижения их иммуногенности.
D
D
50
Таблица 12 показывает аминокислотные замены CDR вне CDR-L1, приводящие к улучшенной K (проанализированной BIAcore), аффинности (измеренной ELISA) или им обеим по сравнению с D2E7. Нумерация аминокислот в Таблице 12 соответствует положениям в контексте легкой и тяжелой цепей D2E7. Улучшение K (измеренной BIAcore) и ИК связывания (измеренной ELISA) показано посредством "WTx". CV% относится к стандартному отклонению как доле в процентах от величины общего значения, и «НС» обозначает «не сделано».
Таблица 13 показывает известные мутации в CDR-H1, которые могут быть включены в антитела по изобретению.
Таблица 14 показывает известные мутации в CDR-H2, которые могут быть включены в антитела по изобретению. Включение 2 аминокислот в одну ячейку указывает на вариант CDR, который включает добавление к CDR или вставку в CDR. Штриховка ячейки указывает на вариант CDR, который не имеет заштрихованных аминокислотных остатков.
Таблица 15 показывает известные мутации в CDR-H3, которые могут быть включены в антитела по изобретению.
Таблица 16 показывает известные мутации в CDR-L1, которые могут быть включены в антитела по изобретению. Включение 2 аминокислот в одну ячейку указывает на вариант CDR, который включает добавление к CDR или вставку в CDR.
Таблица 17 показывает известные мутации в CDR-L2, которые могут быть включены в антитела по изобретению. Включение 2 аминокислот в одну ячейку указывает на вариант CDR, который включает указанную дополнительную N-концевую аминокислоту в CDR.
Таблица 18 показывает известные мутации в CDR-L3, которые могут быть включены в антитела по изобретению. Включение 2 аминокислот в одну ячейку указывает на вариант CDR, который включает указанную дополнительную N-концевую аминокислоту в CDR.
Таблица 19 показывает дополнительные известные мутации в CDR-H1, которые могут быть включены в антитела по изобретению.
Таблица 20 показывает дополнительные известные мутации в CDR-H2, которые могут быть включены в антитела по изобретению.
Таблица 21 показывает дополнительные известные мутации в CDR-H3, которые могут быть включены в антитела по изобретению.
Таблица 22 показывает дополнительные известные мутации в CDR-L1, которые могут быть включены в антитела по изобретению.
Таблица 23 показывает дополнительные известные мутации в CDR-L2, которые могут быть включены в антитела по изобретению.
Таблица 24 показывает дополнительные известные мутации в CDR-L3, которые могут быть включены в антитела по изобретению.
D
Таблица 25 показывает комбинации точечных мутаций в CDR-L2, приводящие к улучшению K (проанализированной BIAcore), аффинности (измеренной ELISA) или обоих показателей по сравнению с D2E7. Точечные мутации можно включать в антитела по изобретению поодиночке или в комбинации.
Фиг.1А-1Д. Фиг.1А показывает аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей D2E7 с областями CDR, выделенными жирным, подчеркнутым текстом. Фиг.1Б показывает последовательности CDR и соответствующие идентификаторы последовательностей D2E7. Фиг.1 В показывает таблицу соответствия между нумерацией CDR тяжелой цепи и нумерацией тяжелой цепи по Kabat. Фиг.1Г показывает таблицу соответствия между нумерацией CDR легкой цепи и нумерацией легкой цепи по Kabat. Фиг.1Д показывает нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей D2E7 (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3 соответственно), как опубликовано в патенте США №6090382.
Фиг.2 показывает процент ответов (внизу) и средние индексы стимуляции (наверху) пептидов VL D2E7.
Фиг.3 показывает средние индексы стимуляции (наверху) и процент ответов (внизу) на пептиды VH D2E7. Пептид №27 имел аномальный индекс стимуляции у одного донора и показан более темной штриховкой.
Фиг.4 показывает пептидные варианты эпитопа CDR1 VL D2E7. Незакрашенные значки показывают многочисленные повторные анализы немодифицированного родительского пептида в пределах набора данных. Закрашенные значки представляют уникальные пептидные варианты по аланиновому сканированию. Указана последовательность вариантов, индуцирующих наиболее сниженный ответ.
Фиг.5 показывает пептидные варианты эпитопа CDR1 VL D2E7. Незакрашенные значки показывают многочисленные повторные анализы немодифицированного родительского пептида в пределах набора данных. Закрашенные значки представляют уникальные пептидные варианты. Варианты, индуцирующие наиболее сниженный ответ, показаны кружком. Фиг.5 графически представляет данные из Таблицы 7.
Фиг.6 показывает результаты конкурентного ELISA вариантов антитела D2E7. Планшеты ELISA покрывали TNF-α. Биотинилированное D2E7 включали во все лунки в единственной концентрации и вариант антитела титровали в них. Значения HKso рассчитывали для каждого антитела. Эксперимент проводили три раза. Ось Y показывает средние результаты как процент связывания родительского антитела.
7. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
7.1 АНТИТЕЛА ПРОТИВ TNF-α
2
2
2
Согласно настоящему изобретению предложены антитела против TNF-α. Если не указано иное, термин «антитело» (Ab) относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с конкретным антигеном или является иммунологически реакционноспособной в отношении конкретного антигена и включает поликлональные, моноклональные, сконструированные посредством генной инженерии и иным способом модифицированные формы антител, включая химерные антитела, гуманизированные антитела, гетероконъюгатные антитела (например биспецифические антитела, диатела, триатела и тетратела), и антигенсвязывающие фрагменты антител, включая, например, фрагменты Fab', F(ab'), Fab, Fv, rIgG и scFv, но не ограничиваясь ими. Кроме того, если не указано иное, подразумевается, что термин «моноклональное антитело» (mAb) включает как интактные молекулы, так и фрагменты антитела (такие как, например, фрагменты Fab и F(ab')), которые способны специфически связываться с белком. Фрагменты Fab и F(ab') не имеют фрагмента Fc интактного антитела, быстрее выводятся из кровообращения животного или из растения и могут иметь меньшее неспецифичное связывание в ткани, чем интактное антитело (Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316).
Термин «scFv» относится к одноцепочечному Fv антителу, в котором вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи от традиционного антитела были соединены с образованием одной цепи.
Ссылки на "VH" относятся к вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина антитела, включая тяжелую цепь Fv, scFv или Fab. Ссылки на "VL" относятся к вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина, включая легкую цепь Fv, scFv, dsFv или Fab. Антитела (Ab) и иммуноглобулины (Ig) представляют собой гликопротеины, имеющие такие же структурные характеристики. В то время как антитела демонстрируют специфичность связывания в отношении специфической мишени, иммуноглобулины включают как антитела, так и другие антителоподобные молекулы, которые не имеют специфичности в отношении мишени. Нативные антитела и иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Дальтон, составленные из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая тяжелая цепь имеет на амино конце вариабельный домен (VH), за которым следует ряд рядом константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на амино конце (VL) и константный домен на карбокси конце.
Антитела против TNF-α по изобретению связываются с человеческим TNF-α и ингибируют активность рецептора TNF-α в клетке. Не будучи связанными какой-либо теорией, авторы изобретения считают, что данные антитела уменьшают связывание TNF-α как с низкоаффинным рецептором TNF-α (р75), так и с высокоаффинным рецептором TNF-α (р55).
Антитела против TNF-α по изобретению содержат области, определяющие комплементарность, (CDR), которые являются родственными CDR антитела D2E7 (также известного как адалимумаб или HUMIRA) по последовательности.
CDR также известны как гипервариабельные участки в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасом (FR). Как известно в данной области, положение аминокислоты/граница, очерчивающая гипервариабельный участок антитела, может варьировать, в зависимости от контекста и разных определений, известных в данной области. Некоторые положения в пределах вариабельного домена можно рассматривать как гибридные гипервариабельные положения из-за того, что эти положения могут считаться находящимися в пределах гипервариабельной области при одном наборе критериев, при этом считаясь находящимися вне гипервариабельной области при другом наборе критериев. Одно или более чем одно из этих положений также может находиться в расширенных гипервариабельных областях. Согласно описанию предложены антитела, содержащие модификации в этих гибридных гипервариабельных положениях. Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелой и легкой цепей содержат четыре FR области, главным образом, вследствие принятия конфигурации β-листа, соединенные тремя CDR, которые образуют петли, соединяющие структуру β-листа (и в некоторых случаях образующие ее часть). CDR в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости посредством FR областей в порядке FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 и с CDR из другой цепи, способствуя образованию сайта связывания мишени антител (смотрите Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987)). Нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулинов, как она используется здесь, осуществляется согласно системе нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулинов Kabat et al., если не указано иное.
Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи D2E7 представлены SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, соответственно, и кодируются SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3, соответственно. Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи также показаны на Фиг.1А. Последовательности CDR D2E7 и их соответствующие идентификаторы представлены на Фиг.1Б. Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи D2E7 (как опубликовано в патенте США №6090382) показаны на Фиг.1В. Любые нуклеотидные последовательности, кодирующие SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4, можно использовать в композициях и способах по настоящему изобретению.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предложены фрагменты антител против TNF-α, содержащие последовательности CDR, которые являются родственными последовательностям CDR D2E7. Термин «фрагмент антитела» относится к части полноразмерного антитела, обычно к области, связывающей мишень, или к вариабельной области. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv. Фрагмент "Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный сайт распознавания и связывания мишени. Эта область состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной, нековалентной ассоциации (димер VH-VL). Именно в этой конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют, определяя сайт связывания мишени на поверхности димера VH-VL. Часто шесть CDR придают антителу специфичность связывания в отношении мишени. Однако в некоторых случаях даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные в отношении мишени) может иметь способность распознавать и связывать мишень. Фрагменты антитела «одноцепочечный Fv» или «scFv» содержат домены VH и VL антитела в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменом VH и VL, который обеспечивает образование scFv желательной структуры для связывания мишени. «Однодоменные антитела» состоят из одиночных доменов VH или VL, которые демонстрируют достаточную аффинность в отношении TNF-α. В конкретном воплощении однодоменное антитело представляет собой антитело представителей сем. Верблюдовые (смотрите, например, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).
1
1
2
Фрагмент Fab - содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH) тяжелой цепи. Фрагменты Fab' отличаются от фрагментов Fab добавлением нескольких остатков на карбоксильном конце домена CH тяжелой цепи, включая один или более чем один цистеин из шарнирной области антитела. Фрагменты F(ab') продуцируются расщеплением дисульфидной связи между цистеинами шарнирной области F(ab')-продукта расщепления пепсином. Дополнительные химические связи фрагментов антител известны специалистам в данной области.
В определенных воплощениях антитела против TNF-α по изобретению представляют собой моноклональные антитела. Термин «моноклональное антитело», как он здесь используется, не ограничен антителами, продуцируемыми посредством гибридомной технологии. Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, которое происходит из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, а не к способу, посредством которого оно продуцируется. Моноклональные антитела, полезные в связи с настоящим изобретением, могут быть получены с использованием целого ряда методик, известных в данной области, включая использование гибридомных, рекомбинантных технологий и технологий фагового дисплея или их комбинаций. Антитела против TNF-α по изобретению включают химерные, приматизированные, гуманизированные или человеческие антитела.
Антитела против TNF-α по изобретению могут быть химерными антителами. Термин «химерное» антитело, как он используется здесь, относится к антителу, имеющему вариабельные последовательности, происходящие из нечеловеческого иммуноглобулина, такого как крысиное или мышиное антитело, и константные области человеческого иммуноглобулина, типично выбранные из матрицы (template) человеческих иммуноглобулинов. Способы продукции химерных антител известны в данной области. Смотрите, например, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; патенты США №5807715, 4816567 и 4816397, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.
2
Антитела против TNF-α по изобретению могут быть гуманизированными. «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, цепи иммуноглобулинов или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab') или другие связывающие мишень субдомены антител), которые содержат минимальные последовательности, происходящие из нечеловеческого иммуноглобулина. В общем, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все из участков CDR соответствуют участкам CDR нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все из областей FR представляют собой области FR с последовательностью человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), типично часть консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Способы гуманизации антител известны в данной области. Смотрите, например, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; патенты США №:5530101, 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370, выданные Queen et al.; EP 239400; публикация РСТ WO 91/09967; патент США №5225539; ЕР592106; ЕР 519596; Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka etal., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; и патент США №5565332, которые все тем самым включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.
Антитела против TNF-α по изобретению могут быть человеческими антителами. Полностью «человеческие» антитела против TNF-α могут быть желательными для терапевтического лечения пациентов-людей. Термин «человеческие антитела», как он здесь используется, включает антитела, имеющие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и включает антитела, выделенные из библиотек человеческих иммуноглобулинов или из животных, трансгенных в отношении одного или более чем одного человеческого иммуноглобулина, и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины. Человеческие антитела можно сделать рядом способов, известных в данной области, включая способы фагового дисплея с использованием библиотек антител, происходящих из последовательностей человеческого иммуноглобулина. Смотрите патенты США №4444887 и 4716111; и публикации РСТ WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741, каждая из которых включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте. Человеческие антитела также можно получить с использованием трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены человеческих иммуноглобулинов. Смотрите, например, публикации РСТ WO 98/24893, WO 92/01047, WO 96/34096, WO 96/33735; патенты США №5413923, 5625126, 5633425, 5569825, 5661016, 5545806, 5814318, 5885793, 5916771 и 5939598, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте. Кроме того, у компаний, таких как Medarex (Princeton, NJ), Astellas Pharma (Deerfield, IL), Amgen (Thousand Oaks, CA) и Regeneron (Tarrytown, NY) можно заказать производство человеческих антител, направленных против выбранного антигена, с использованием технологии, аналогичной технологии, описанной выше. Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, можно получать с использованием методики, называемой «направляемая (guided) селекция». В этом подходе выбранное нечеловеческое моноклональное антитело, например мышиное антитело, используют для направления селекции полностью человеческого антитела, распознающего тот же самый эпитоп (Jespers etal., 1988, Biotechnology 12:899-903).
Антитела против TNF-α по изобретению могут быть приматизированными. Термин «приматизированное антитело» относится к антителу, содержащему обезьяньи вариабельные области и человеческие константные области. Способы продукции приматизированных антител известны в данной области. Смотрите, например, патенты США №5658570, 5681722 и 5693780, которые включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.
Антитела против TNF-α по изобретению могут быть биспецифичными антителами. Биспецифичные антитела являются моноклональными, часто человеческими или гуманизированными антителами, которые обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух разных антигенов. В настоящем описании одна из специфичностей связывания может быть направлена в отношении TNF-α, другая может быть в отношении любого другого антигена, например в отношении белка поверхности клетки; рецептора; субъединицы рецептора; тканеспецифичного антигена; белка, происходящего из вирусов; белка, кодируемого вирусом оболочки; белка, происходящего из бактерии, или белка бактериальной поверхности и т.д.
Антитела против TNF-α по изобретению включают дериватизированные антитела. Например, но не в качестве ограничения, дериватизированные антитела типично модифицированы путем гликозилирования, ацетилирования, ПЭГилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации с применением известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком (смотрите раздел 7.6 для обсуждения конъюгатов антител) и т.д. Любую из многочисленных химических модификаций можно проводить известными методиками, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Дополнительно производное может содержать одну или более чем одну неприродную аминокислоту, например с использованием технологии ambrx (смотрите, например, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10): 1011-2).
В еще одном другом воплощении изобретения антитела против TNF-α или их фрагменты могут быть антителами или фрагментами антител, последовательности которых были модифицированы для изменения по меньшей мере одной функции биологического эффектора, опосредованной константной областью, относительно соответствующей последовательности дикого типа. Например, в некоторых воплощениях антитело против TNF-α по изобретению может быть модифицировано для ослабления по меньшей мере одной функции биологического эффектора, опосредованной константной областью, относительно немодифицированного антитела, например для ослабленного связывания с рецептором Fc (FcγR). Связывание с FcγR может быть снижено мутированием сегмента константной области иммуноглобулина антитела в конкретных областях, необходимых для взаимодействий с FcγR (смотрите, например, Canffeld and Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; и Lund etal., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). Уменьшение способности антитела к связыванию с FcγR также может снижать другие эффекторные функции, которые основываются на взаимодействиях с FcγR, такие как опсонизация, фагоцитоз и антигензависимая клеточная цитотоксичность ("ADCC").
В других воплощениях изобретения антитело против TNF-α или его фрагмент могут быть модифицированы для приобретения или улучшения по меньшей мере одной функции биологического эффектора, опосредованной константной областью, относительно немодифицированного антитела, например для усиления взаимодействий с FcγR (смотрите, например, US 2006/0134709). Например, антитело против TNF-α по изобретению может иметь константную область, которая связывается с FcγRIIA, FcγRIIB и/или FcγRIIIA с большей аффинностью, чем соответствующая константная область дикого типа.
Таким образом, антитела по изобретению могут иметь изменения биологической активности, которые приводят к повышенной или пониженной опсонизации, фагоцитозу или ADCC. Такие изменения известны в данной области. Например, модификации в антителах, которые снижают активность ADCC, описаны в патенте США №5834597. Иллюстративный вариант с пониженной ADCC соответствует «мутанту З» (показанному на Фиг.4 патента США №5834597), в котором остаток 236 удален и остатки 234, 235 и 237 (используя нумерацию EU) замещены аланинами.
В некоторых воплощениях антитела против TNF-α по изобретению имеют низкие уровни фукозы или не имеют фукозы. Была установлена взаимосвязь между антителами, не имеющими фукозы, и повышенной активностью ADCC, особенно при низких дозах антитела. Смотрите Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al„ 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73. Способы получения бесфукозных антител включают рост в клетках миеломы крыс YB2/0 (АТСС CRL 1662). Клетки YB2/0 экспрессируют низкие уровни мРНК FUT8, которая кодирует α-1,6-фукозилтрансферазу - фермент, необходимый для фукозилирования полипептидов.
В еще одном другом аспекте антитела против TNF-α или их фрагменты могут быть антителами или фрагментами антител, которые были модифицированы для увеличения или снижения их аффинностей связывания с эмбриональным рецептором Fc, FcRn, например, путем мутирования сегмента константной области иммуноглобулина в конкретных областях, участвующих во взаимодействиях с FcRn (смотрите, например, WO 2005/123780). В конкретных воплощениях антитело против TNF-α класса IgG мутируют так, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков 250, 314 и 428 константной области тяжелой цепи замещают по отдельности или в любой их комбинации, как например в положениях 250 и 428, или в положениях 250 и 314, или в положениях 314 и 428, или в положениях 250, 314 и 428, с положениями 250 и 428 в специфеской комбинации. Для положения 250 замещающий аминокислотный остаток может быть любым аминокислотным остатком, отличным от треонина, включая аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, валин, триптофан или тирозин, но не ограничиваясь ими. Для положения 314 замещающий аминокислотный остаток может быть любым аминокислотным остатком, отличным от лейцина, включая аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан или тирозин, но не ограничиваясь ими. Для положения 428 замещающий аминокислотный остаток может быть любым аминокислотным остатком, отличным от метионина, включая аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан или тирозин, но не ограничиваясь ими. Конкретные комбинации подходящих аминокислотных замен идентифицированы в Таблице 1 патента США №7217797, которая включена сюда посредством ссылки во всей своей полноте. Такие мутации увеличивают связывание антитела с FcRn, что защищает антитело от деградации и увеличивает время его полувыведения.
В других аспектах антитело против TNF-α имеет одну или более чем одну аминокислоту, вставленную в одну или более чем одну из его гипервариабельных участков, например как описано в Jung and Pluckthun, 1997, Protein Engineering 10:9, 959-966; Yazaki et al., 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9. Epub 2004 Aug 17; и в заявке на патент США №2007/0280931.
7.2 НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ И СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ
Настоящее изобретение охватывает молекулы нуклеиновых кислот и клетки-хозяева, кодирующие антитела против TNF-α по изобретению.
Антитело против TNF-α по изобретению может быть получено путем рекомбинантной экспрессии генов легких и тяжелых цепей иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансфицируют одним или более чем одним рекомбинантным вектором экспрессии, несущим фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина антитела так, что легкие и тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине и, возможно, секретируются в среду, в которой культивируются клетки-хозяева, из которой можно выделять антитела. Для получения генов тяжелой и легкой цепи антитела, включения этих генов в рекомбинантные векторы экспрессии и введения векторов в клетки-хозяева используют стандартные методики технологии рекомбинантных ДНК, такие как методики, описанные в Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) и в патенте США №4816397.
В одном воплощении антитела против TNF-α похожи на D2E7, за исключением изменений в одном или более чем одном CDR, (именуемые ниже как имеющие последовательности, «родственные D2E7»). В другом воплощении антитела против TNF-α похожи на D2E7, за исключением изменений в одной или более чем одной каркасной области. В еще одном другом воплощении антитела против TNF-α похожи на D2E7, за исключением изменений в одном или более чем одном CDR и в одной или более чем одной каркасной области. Для генерации нуклеиновых кислот, кодирующих такие антитела против TNF-α, сперва получают фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепи. Эти ДНК можно получать амплификацией и модификацией ДНК зародышевой линии или кДНК, кодирующей вариабельные последовательности легкой и тяжелой цепи, например с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последовательности ДНК зародышевой линии для генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человека известны в данной области (смотрите, например, базу данных человеческих последовательностей зародышевой линии "VBASE"; смотрите также Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; и Сох et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждой из которых включено сюда посредством ссылки). Фрагмент ДНК, кодирующий вариабельную область тяжелой и легкой цепи D2E7, последовательность которого показана на Фиг.1В, может быть синтезирован и использован в качестве матрицы для мутагенеза для генерации варианта, как описано здесь, используя традиционные методики мутагенеза; в качестве альтернативы, фрагмент ДНК, кодирующий вариант, может быть прямо синтезирован.
Однажды получив фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL сегменты D2E7 или родственные D2E7, с этими фрагментами ДНК можно осуществлять дальнейшие манипуляции стандартными методиками рекомбинантных ДНК, например для превращения генов вариабельных областей в гены полноразмерных цепей антител, в гены фрагментов Fab или в ген scFv. В этих манипуляциях фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, является функционально связанным с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Подразумевается, что термин «функционально связанный», как он используется в этом контексте, означает, что два фрагмента ДНК связаны таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке-считывания.
1
2
3
4
1
2
3
4
1
4
1
Выделенная ДНК, кодирующая область VH, может быть превращена в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания ДНК, кодирующей VH, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH, СН, СН и возможно СН). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области (смотрите, например, Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242) и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР амплификацией. Константная область тяжелой цепи может быть константной областью IgG, IgG, IgG, IgG, IgA, IgE, IgM или IgD, но в определенных воплощениях представляет собой константную область IgG или IgG. Для гена фрагмента Fab тяжелой цепи ДНК, кодирующая VH, может быть функционально связанной с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область CH тяжелой цепи.
4
3
Выделенная ДНК, кодирующая область VL, может быть превращена в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген Fab легкой цепи) путем функционального связывания ДНК, кодирующей VL, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области (смотрите, например, Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition (U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242)) и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область легкой цепи может быть константной областью каппа или лямбда, но в определенных воплощениях представляет собой константную область каппа. Для создания гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL, функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (Gly~Ser) так, что последовательности VH и VL могут экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка с областями VL и VH, соединенными гибким линкером (смотрите, например, Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554).
Для экспрессии антител против TNF-α по изобретению ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, полученные как описано выше, вставляют в векторы экспрессии так, что гены являются функционально связанными с транскрипционными и трансляционными контрольными последовательностями. В этом контексте подразумевается, что термин «функционально связанный» означает то, что ген антитела лигирован в вектор так, что транскрипционные и трансляционные контрольные последовательности в пределах вектора выполняют предназначенную им функцию регулирования транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и последовательности контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимыми с используемой клеткой-хозяином экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела может быть вставлен в отдельные векторы или, более типично, оба гена вставляют в один и тот же вектор экспрессии.
Гены антитела вставляют в вектор экспрессии стандартными способами (например лигированием комплементарных сайтов рестрикции во фрагменте гена антитела и векторе или лигированием тупых концов, если отсутствуют сайты рестрикции). До вставки последовательностей легкой или тяжелой цепи D2E7 или родственных D2E7 вектор экспрессии уже может нести последовательности константной области антитела. Например, один подход для превращения последовательностей VH и VL D2E7 или родственных D2E7 в полноразмерные гены антитела представляет собой их вставку в векторы экспрессии, уже кодирующие константные области тяжелой цепи и легкой цепи, соответственно, так что сегмент VH функционально связан с сегментом(ами) СН в пределах вектора, и сегмент VL функционально связан с сегментом CL в пределах вектора. Дополнительно или альтернативно рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор так, что сигнальный пептид будет связан в рамке считывания с амино концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальным пептидом из неиммуноглобулинового белка).
Дополнительно к генам цепи антитела рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетке-хозяине. Подразумевается, что термин «регуляторная последовательность» включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185 (Academic Press, San Diego, CA, 1990). Специалистам в данной области будет понятно, что конструкция вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, требуемый уровень экспрессии белка и т.д. Подходящие регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые вызывают высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, имеющие происхождение от цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), вируса обезьяны 40 (SV40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Для дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей смотрите, например, патент США №5168062, выданный Stinski, патент США №4510245, выданный Bell et al., и патент США №4968615, выданный Schaffner et al.
-
В добавление к генам цепей антитела и регуляторным последовательностям, векторы рекомбинантной экспрессии по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например репликаторы) и селектируемые маркерные гены. Селектируемый маркерный ген облегчает селекцию клеток-хозяев, в которые был введен вектор (смотрите, например патенты США №4399216, 4634665 и 5179017, все от Axel et al.). Например, типично селектируемый маркерный ген придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, пуромицин, бластицидин, гигромицин или метотрексат, в клетке-хозяине, в которую был введен вектор. Подходящие селектируемые маркерные гены включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в клетках-хозяевах DHFR с метотрексатной селекцией/амплификацией) и ген neo (для селекции G418). Для экспрессии легких и тяжелых цепей вектор(векторы) экспрессии, кодирующие тяжелые и легкие цепи, трансфицируют в клетки-хозяева посредством стандартных методик. Подразумевается, что разные формы термина «трансфекция» охватывают широкое разнообразие методик, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например электропорацию, липофекцию, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию с DEAE-декстраном и тому подобное.
Антитела по изобретению можно экспрессировать либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах. В определенных воплощениях экспрессия антител осуществляется в эукариотических клетках, например клетках-хозяевах млекопитающего, для оптимальной секреции правильно сложенного и иммунологически активного антитела. Типичные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичников китайского хомячка (клетки СНО) (включая клетки СНО DHFR", описанные в Uriaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селектируемым маркером DHFR, например как описано в Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS, клетки 293 и клетки SP2/0. При введении векторов рекомбинантной экспрессии, кодирующих гены антител, в клетки-хозяева млекопитающих антитела продуцируются в результате культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для обеспечения экспрессии антитела в клетках-хозяевах или секреции антитела в культуральную среду, в которой выращены клетки-хозяева. Антитела можно выделять из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка. Клетки-хозяева также можно использовать для продукции частей интактных антител, таких как фрагменты Fab или молекулы scFv. Понятно, что вариации приведенной выше методики входят в объем настоящего изобретения. Например, может быть желательной трансфекция клетки-хозяина ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе) антитела против TNF-α по этому изобретению.
Технологию рекомбинантных ДНК также можно использовать для удаления некоторой или всей из ДНК, кодирующей одну из цепей, легкую или тяжелую, или обе цепи, легкую и тяжелую, которые не являются необходимыми для связывания с TNF-α. Молекулы, экспрессируемые с таких укороченных молекул ДНК, также охватываются антителами по изобретению.
Дополнительно можно продуцировать бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепь представляют собой антитело по изобретению, и другая тяжелая и легкая цепь являются специфичными в отношении антигена, отличного от TNF-α, путем перекрестного сшивания антитела по изобретению со вторым антителом стандартными способами химического перекрестного сшивания. Бифункциональные антитела также могут быть получены путем экспрессии нуклеиновой кислоты, сконструированной для кодирования бифункционального антитела.
В определенных воплощениях антитела двойной специфичности, т.е. антитела, которые связываются с TNF-α и неродственным антигеном с использованием такого же сайта связывания, можно продуцировать мутированием аминокислотных остатков в CDR легкой цепи и/или тяжелой цепи. В разных воплощениях антитела двойной специфичности, которые связываются с TNF-α и другим антигеном, например другим провоспалительным цитокином (таким как, например, лимфотоксин, интерферон-γ или интерлейкин-1), можно продуцировать мутированием аминокислотных остатков на периферии антигенсвязывающего сайта (смотрите, например, Bostrom et al., 2009, Science 323:1610-1614). Антитела двойной специфичности могут быть получены путем экспрессии нуклеиновой кислоты, сконструированной для кодирования антитела двойной специфичности.
Для рекомбинантной экспрессии антитела против TNF-α по изобретению клетку-хозяина можно котрансфицировать двумя векторами экспрессии по изобретению, первым вектором, кодирующим полипептид, происходящий из тяжелой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид, происходящий из легкой цепи. Типично каждый из двух векторов содержит отдельный селектируемый маркер. В качестве альтернативы, можно использовать один вектор, который кодирует полипептиды и тяжелой, и легкой цепи.
Как только сконструирована нуклеиновая кислота, кодирующая одну или более чем одну часть D2E7 или антитела против TNF-α с последовательностями CDR, родственными последовательностям CDR D2E7, в кодирующую последовательность можно вводить дополнительные изменения или мутации, например для получения нуклеиновых кислот, кодирующих антитела с разными последовательностями CDR, антитела с пониженной аффинностью в отношении рецептора Fc, или антитела различных подклассов.
nd
Антитела против TNF-α по изобретению также могут быть получены путем химического синтеза (например способами, описанными в Solid Phase Peptide Synthesis, 2 ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, III.). Варианты антител также можно генерировать с использованием бесклеточной платформы (смотрите, например, Chu et al., Biochemia No.2, 2001 (Roche Molecular Biologicals)).
Как только антитело против TNF-α по изобретению было продуцировано путем рекомбинантной экспрессии, его можно очистить любым способом, известным в данной области, для очистки иммуноглобулиновой молекулы, например хроматографией (например ионообменной, аффинной, в частности по аффинности в отношении TNF-α после селекции на Protein А или Protein G, и колоночной хроматографией с разделением по размеру (sizing column chromatography)), центрифугированием, способом, основанным на дифференциальной растворимости, или любой другой стандартной методикой очистки белков. Далее, антитела против TNF-α по настоящему изобретению или их фрагменты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными здесь или известными из иного источника в данной области, для облегчения очистки.
Когда антитело против TNF-α выделено, можно, если желательно, дополнительно очистить антитело против TNF-α, например посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (смотрите, например, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology (Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980)) или гель-фильтрации на колонке Superdex™ 75 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Швеция).
7.3 БИОЛОГИЧЕСКИЕ АКТИВНОСТИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNF-α
В определенных воплощениях антитела против TNF-α по изобретению имеют определенные биологические активности, такие как конкуренция с D2E7 за связывание с TNF-α или нейтрализация активности TNF-α.
4
6
5
Соответственно, в определенных воплощениях антитела против TNF-α по изобретению конкурируют с D2E7 за связывание с TNF-α. Способность конкурировать за связывание с TNF-α можно тестировать с использованием конкурентного анализа. В одном примере конкурентного анализа TNF-α прикрепляют к твердой поверхности, например к планшету с микролунками, путем приведения планшета в контакт с раствором TNF-α (например в концентрации 1 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°С). Планшет промывают (например 0,1%-ным Tween 20 в PBS) и блокируют (например в Superblock, Thermo Scientific, Rockford, IL). Смесь субнасыщающего количества биотинилированного D2E7 (80 нг/мл) и немеченого D2E7 («контрольное» антитело) или конкурирующего антитела против TNF-α («тестируемое» антитело) в серийном разведении (например в концентрации 2,8 мкг/мл, 8,3 мкг/мл или 25 мкг/мл) в буфере ELISA (например 1% BSA и 0,1% Tween 20 в PBS) добавляют в лунки, и планшеты инкубируют в течение 1 часа с мягким встряхиванием. Планшет промывают, добавляют в каждую лунку 1 мкг/мл стрептавидина, конъюгированного с HRP (пероксидаза хрена), разведенного в буфере ELISA и планшеты инкубируют в течение 1 часа. Планшеты промывают и связанные антитела детектируют добавлением субстрата (например ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин), Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD). Реакцию завершают добавлением останавливающего буфера (например Bio FX Stop Reagents, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD) и поглощение измеряют при 650 нм с использованием считывателя микропланшетов (например VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Вариации этого конкурентного анализа также можно использовать для тестирования конкуренции между антителом против TNF-α по изобретению и D2E7. Например, в определенных аспектах, антитело против TNF-α используют в качестве контрольного антитела и D2E7 используют в качестве тестируемого антитела. Дополнительно, вместо растворимого TNF-α можно использовать мембраносвязанный TNF-α, экспрессируемый на поверхности клеток (например клеток млекопитающих, таких как 293S) в культуре. В качестве альтернативы, вместо растворимого D2E7 и тестируемых антител также можно использовать антитела, экспрессируемые на поверхности клеток (например клеток млекопитающих, таких как 293с18). Обычно используют примерно от 10 до 10 трансфектантов, например примерно 10 трансфектантов. В данной области известны и могут использоваться другие форматы для анализов конкуренции.
В разных воплощениях антитело против TNF-α по изобретению уменьшает связывание меченого D2E7 по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или на долю, варьирующую между любыми из вышеприведенных значений (например, антитело против TNF-α по изобретению уменьшает связывание меченого D2E7 на 50%-70%) при использовании антитела против TNF-α в концентрации 0,08 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 100 мкг/мл или в концентрации, варьирующей между любыми из вышеприведенных значений (например, в концентрации, варьирующей от 2 мкг/мл до 10 мкг/мл).
В других воплощениях D2E7 уменьшает связывание меченого антитела против TNF-α по изобретению по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или на долю, варьирующую между любыми из вышеприведенных значений (например, D2E7 уменьшает связывание меченого антитела против TNF-α по изобретению на 50%-70%) при использовании D2E7 в концентрации 0,4 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл, 50 мкг/мл, 250 мкг/мл или в концентрации, варьирующей между любыми из вышеприведенных значений (например, в концентрации, варьирующей от 2 мкг/мл до 10 мкг/мл).
В других аспектах антитело против TNF-α по изобретению ингибирует активность TNF-α в ряде анализов in vitro, таких как анализ клеточной цитотоксичности, митогенеза, индукции цитокинов и индукции молекул адгезии. В качестве альтернативы, активность антитела против TNF-α по изобретению может быть измерена посредством анализов in vitro с использованием мембраносвязанного TNF-α, экспрессируемого на клетках естественным путем или рекомбинантно, таких как анализ способности индуцировать обратную передачу сигнала, индукции цитокинов, индукции молекул адгезии, CDC и ADCC. Типичный анализ нейтрализации TNF-α, в котором измеряют ингибирование цитотоксичности растворимого TNF-α с использованием клеток, чувствительных к TNF-α (например L929), описан ниже. Для оценки активности антител против TNF-α по изобретению также можно использовать другие анализы цитотоксичности TNF-α.
4
2
2
2
Таким образом, в типичном воплощении анализы цитотоксичности антител против TNF-α включают культивирование 3×10 мышиных клеток L929 в отдельных лунках плоскодонного 96-луночного планшета для микротитрования. Клетки инкубируют в течение ночи при 37°С в инкубаторе с увлажненным 5% CO. На следующие сутки готовят серийные разведения антитела против TNF-α (например 0,712 мкг/мл, 0,949 мкг/мл, 1,27 мкг/мл, 1,69 мкг/мл, 2,25 мкг/мл или 3 мкг/мл) в 25 мкл бессывороточной среды и добавляют к клеткам (например, конечная концентрация в 150 мкл культуры составляет 119 нг/мл, 158 нг/мл, 211 нг/мл, 282 нг/мл, 375 нг/мл или 500 нг/мл). После 2-часовой инкубации при 37°С, 5% CO, добавляют TNF-α в конечной концентрации 40 нг/мл (например 25 мкл в концентрации 240 нг/мл) и клетки дополнительно инкубируют в течение 48 часов при 37°С, 5% CO. Лунки оценивают на предмет цитотоксичности по сравнению с контрольными планшетами (которые в определенных воплощениях были обработаны TNF-α, который не был инкубирован с антителом против TNF-α, например были инкубированы с изотипическим контрольным антителом, и, в других воплощениях, были обработаны D2E7), используя анализ жизнеспособности (например CellTiter-Blue, Promega, Madison, WI). В данной области известны и могут использоваться другие форматы анализов нейтрализации TNF-α.
В разных воплощениях антитело против TNF-α по изобретению нейтрализует TNF-α по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или на долю, варьирующую между любыми из вышеприведенных значений (например антитело против TNF-α по изобретению нейтрализует активность TNF-α на 50%-70%) при использовании антитела против TNF-α в концентрации 2 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 20 нг/мл, 0,1 мкг/мл, 0,2 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл или в концентрации, варьирующей между любыми из вышеприведенных значений (например в концентрации, варьирующей от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл). В некоторых воплощениях эффективность антитела против TNF-α по изобретению составляет по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 110%, по меньшей мере 125% или по меньшей мере 150%, и вплоть до 110%, вплоть до 125%, вплоть до 150% или вплоть до 200% относительно эффективности D2E7 в нейтрализации TNF-α или находится в любом интервале между любой парой вышеприведенных значений (например от 80% до 125% относительно эффективности D2E7 или от 125% до 200% относительно эффективности D2E7 в нейтрализации TNF-α).
on
a
off
d
D
A
50
В определенных воплощениях антитела против TNF-α по изобретению имеют высокую аффинность связывания в отношении TNF-α. В конкретных воплощениях антитела против TNF-α по настоящему изобретению имеют характерные константы скорости ассоциации (значения k или k), константы скорости диссоциации (значения k или k), константы аффинности (значения K), константы диссоциации (значения K) и/или значения ИК. В определенных аспектах такие значения выбраны из следующих воплощений.
7.4 КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNF-α
on
on
5
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
6
-1
-1
7
-1
-1
7
-1
-1
8
-1
-1
5
6
-1
-1
7
8
-1
-1
В конкретном воплощении антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α с k по меньшей мере 10 Мс, по меньшей мере 5×10Мс, по меньшей мере 10 Мс, по меньшей мере 5×10 Мс, по меньшей мере 10 Mc, по меньшей мере 5×10 Мc, по меньшей мере 10 Мс или с k в любом интервале между любой парой вышеприведенных значений (например от 5×10 до 5×10 Мс или от 10 до 10 Мс).
off
off
-1
-1
-1
-1
-2
-1
-2
-1
-3
-1
-3
-1
-4
-1
-4
-1
-5
-1
-5
-1
-6
-1
-6
-1
-7
-1
-7
-1
-8
-1
-8
-1
-9
-1
-9
-1
-10
-1
-10
-1
-4
-1
-6
-1
-5
8
-1
В другом воплощении антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α с показателем k 5×10 с или менее, 10 с или менее, 5×10 с или менее, 10 с или менее, 5×10 с или менее, 10 сили менее, 5×10 с или менее, 10 с или менее, 5×10 с или менее, 10с или менее, 5×10 с или менее, 10 с или менее, 5×10 с или менее, 10 с или менее, 5×10 с или менее, 10 с или менее, 5×10 с или менее, 10 с или менее, 5×10 с или менее, 10 с или менее, или с показателем k в любом интервале между любой парой вышеприведенных значений (например от 5×10 с до 10 с или от 5×10 до 5×10' с).
A
on
off
A
11
-1
11
-1
12
-1
12
-1
13
-1
13
-1
14
-1
14
-1
15
-1
15
-1
16
-1
16
-1
17
-1
17
-1
18
-1
18
-1
19
-1
19
-1
20
-1
20
-1
21
-1
21
-1
22
-1
22
-1
23
-1
23
-1
24
-1
24
-1
14
22
-1
11
18
-1
В другом воплощении антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α с K (k/k) по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ, по меньшей мере 10 нМ, по меньшей мере 5×10 нМ или с K в любом интервале между любой парой вышеприведенных значений (например от 5×10 до 10 нМ или от 10 до 5×10 нМ).
D
off
on
D
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
-1
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
-5
-5
-6
-6
7
-3
В других воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α с K (k/k) 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 100 нМ или менее, 90 нМ или менее, 80 нМ или менее, 70 нМ или менее, 60 нМ или менее, 50 нМ или менее, 20 нМ или менее, 15 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5 нМ или менее, 3,8 нМ или менее, 2 нМ или менее, 1,5 нМ или менее, 1 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее, 5×10 нМ или менее, 10 нМ или менее или с K в любом интервале между любой парой вышеприведенных значений (например от 5×10 до 50 нМ или от 15 нМ до 5×10 нМ).
D
off
on
D
off
on
D
off
on
В определенных конкретных воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α с K (k/k) от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 1 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 2 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 3 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 4 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 5 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 6 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 7 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 8 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 9 нМ, или от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 10 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 0,1 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 1 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 2 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 3 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 4 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 5 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 6 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 7 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 8 нМ, или от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 9 нМ, или от приблизительно 0,6 нМ до приблизительно 1,1 нМ, или от приблизительно 0,7 нМ до приблизительно 1,2 нМ, или от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 нМ. В других конкретных воплощениях антитело против TNF-α связывается с TNF-α с K (k/k) примерно 5 нМ, примерно 3,5 нМ, примерно 1,5 нМ, примерно 1 нМ, примерно 0,5 нМ, примерно 0,1 нМ, примерно 0,05 нМ или примерно 0,01 нМ. В конкретных воплощениях значение K (k/k) определяют анализами, хорошо известными в данной области или описанными здесь, например ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), изотермической титрационной калориметрией (ITC), BIAcore или флюоресцентным поляризационным анализом.
50
50
50
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
-1
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
7
-3
В некоторых воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α и ингибирует связывание TNF-α с р55, р75 или с ними обоими со значением ИК менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 100 нМ, менее чем 90 нМ, менее чем 80 нМ, менее чем 70 нМ, 65 нМ, менее чем 60 нМ, менее чем 50 нМ, менее чем 40 нМ, менее чем 30 нМ, менее чем 25 нМ, менее чем 20 нМ, менее чем 15 нМ, менее чем 12 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5 нМ, менее чем 1 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ или менее чем 10нМ или с ИК в любом интервале между любой парой вышеприведенных значений (например от 5×10 до 50 нМ или от 15 нМ до 5×10 нМ). ИК можно измерять в соответствии со способами, хорошо известными в данной области или описанными здесь, например ELISA.
50
50
50
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
-1
-1
-2
-2
-3
-3
-4
-4
7
-3
В других воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α и нейтрализует TNF-α со значением ИК менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 100 нМ, менее чем 90 нМ, менее чем 80 нМ, менее чем 70 нМ, 65 нМ, менее чем 60 нМ, менее чем 50 нМ, менее чем 40 нМ, менее чем 30 нМ, менее чем 25 нМ, менее чем 20 нМ, менее чем 15 нМ, менее чем 12 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5 нМ, менее чем 1 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ, менее чем 10 нМ, менее чем 5×10 нМ или менее чем 10 нМ или с ИК в любом интервале между любой парой вышеприведенных значений (например от 5×10 до 50 нМ или от 15 нМ до 5×10 нМ). Типичный анализ нейтрализации, который можно использовать для измерения ИК антитела против TNF-α, описан в разделе 7.5 ниже.
50
2
2
3
4
4
5
5
6
6
7
В определенных конкретных воплощениях антитело против TNF-α связывается с TNF-α и ингибирует связывание TNF-α с р55, р75 или с ими обоими, или ингибирует активность TNF-α в анализе нейтрализации TNF-α со значением ИК от приблизительно 1 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 15 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 20 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 25 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 30 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 40 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 50 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 10нМ до приблизительно 10 нМ или от приблизительно 10 нМ до приблизительно 10 нМ.
50
В других конкретных воплощениях антитело против TNF-α связывается с TNF-α и ингибирует связывание TNF-α с р55, р75 или с ними обоими, или ингибирует активность TNF-α в анализе нейтрализации TNF-α со значением ИК от приблизительно 5 нМ до приблизительно 10 нМ, от приблизительно 5 нМ до приблизительно 15 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 15 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 20 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 30 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 40 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 50 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 20 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 30 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 40 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 50 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 15 нМ до приблизительно 25 нМ, от приблизительно 15 нМ до приблизительно 20 нМ.
50
В определенных аспектах вышеприведенных воплощений ИК измеряют в присутствии TNF-α в концентрации 0,001 мкМ, 0,005 мкМ, 0,01 мкМ, 0,05 мкМ, 0,1 мкМ, 0,5 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ, 20 мкМ, 30 мкМ, 40 мкМ, 50 мкМ, 60 мкМ, 70 мкМ, 80 мкМ, 90 мкМ, 100 мкМ, 200 мкМ, 300 мкМ, 400 мкМ, 500 мкМ, 600 мкМ, 700 мкМ, 800 мкМ, 900 мкМ, 1000 мкМ или в концентрации из любого интервала между любой парой вышеприведенных значений (например от 0,01 до 50 мкМ, или от 10 мкМ до 100 мкМ).
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
on
В определенных воплощениях кинетические свойства антитела по изобретению являются сравнимыми или улучшенными относительно антитела D2E7 в сопоставимом анализе. Например, в определенных воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α с величиной k, варьирующей от 0,2х до 5х относительно k D2E7, например с k 0,2х относительно k D2E7, k 0,3х относительно k D2E7, k 0,4х относительно k D2E7, k 0,5х относительно k D2E7, k 0,6х относительно k D2E7, k 0,7х относительно k D2E7, k 0,8х относительно k D2E7, k 0,9х относительно k D2E7, k 1х относительно k D2E7, k 1,1х относительно k D2E7, k 1,2х относительно k D2E7, k 1,3х относительно k D2E7, k 1,4х относительно k D2E7, k 1,5х относительно k D2E7, k 1,75х относительно k D2E7, k 2х относительно k D2E7, k 2,25х относительно k D2E7, k 2,5х относительно k D2E7, k 2,75х относительно k D2E7, k Зх относительно k D2E7, k 3,5х относительно k D2E7, k 4х относительно k D2E7, k 4,5х относительно k D2E7, k 5х относительно k D2E7 или k, варьирующей между любой парой вышеприведенных значений, например k 0,7х-1,5х относительно k D2E7, k 0,9х-1,3х относительно k D2E7, k 0,8х-2х относительно k D2E7, k 0,9х-3х относительно k D2E7 и т.д.
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
off
В воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α с величиной k, варьирующей от 0,2х до 5х относительно k D2E7, например с k 0,2х относительно k D2E7, k 0,3х относительно k D2E7, k 0,4х относительно k D2E7, k 0,5x относительно k D2E7, k 0,6x относительно k D2E7, k 0,7x относительно k D2E7, k 0,8x относительно k D2E7, k 0,9x относительно k D2E7, k 1x относительно k D2E7, k 1,1x относительно k D2E7, k 1,2x относительно k D2E7, k 1,3x относительно k D2E7, k 1,4x относительно k D2E7, k 1,5x относительно k D2E7, k 1,75x относительно k D2E7, k 2x относительно k D2E7, k 2,25x относительно k D2E7, k 2,5x относительно k D2E7, k 2,75x относительно k D2E7, k 3х относительно k D2E7, k 3,5x относительно k D2E7, k 4x относительно k D2E7, k 4,5x относительно k D2E7, k 5x относительно k D2E7 или k, варьирующей между любой парой вышеприведенных значений, например k 0,7х-1,5х относительно k D2E7, k 0,9х-1,3х относительно k D2E7, k 0,8х-2x относительно k D2E7, k 0,9х-3х относительно k D2E7 и т.д.
A
on
off
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
on
off
В других воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α с K (k/k), варьирующей от 0,04х до 25х относительно K D2E7, например ка 0,04х относительно K D2E7, K 0,1х относительно K D2E7, K 0,25х относительно K D2E7, K 0,5х относительно K D2E7, K 0,6х относительно K D2E7, K 0,7х относительно K D2E7, K 0,8х относительно K D2E7, K 0,9х относительно K D2E7, K 1x относительно K D2E7, K 1,1х относительно K D2E7, K 1,25х относительно K D2E7, K 1,5х относительно K D2E7, K 1,75х относительно K D2E7, K 2x относительно K D2E7, K 2,5х относительно K D2E7, K 3х относительно K D2E7, K 4x относительно K D2E7, ка 4х% относительно K D2E7, K 5x относительно K D2E7, K 7,5х относительно K D2E7, K 10х относительно K D2E7, K 12,5x относительно K D2E7, K 15х относительно K D2E7, K 20х относительно K D2E7, K 25х относительно K D2E7 или K, варьирующей между любой парой вышеприведенных значений, например K 0,7х-1,25х относительно K D2E7, ка 0,9х-1,5х относительно K D2E7, K 0,9х-2x относительно K D2E7, K 0,8х-1,75х относительно K D2E7, K 0,9х-5x относительно K D2E7 или любым значением или интервалом, который можно рассчитать из раскрытых здесь показателей k и k.
D
off
on
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
D
on
off
В других воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α с K (k/k), варьирующей от 0,04х до 25х относительно K D2E7, например K 0,04х относительно K D2E7, K 0,1х относительно K D2E7, K 0,25х относительно K D2E7, K 0,5х относительно K D2E7, K 0,6х относительно K D2E7, K 0,7х относительно K D2E7, K 0,8х относительно K D2E7, K 0,9х относительно K D2E7, K 1х относительно K D2E7, K 1,1х относительно K D2E7, K 1,25х относительно K D2E7, K 1,5х относительно K D2E7, K 1,75х относительно K D2E7, K 2х относительно K D2E7, K 2,5х относительно K D2E7, K 3х относительно K D2E7, K 4х относительно K D2E7, K 4х% относительно K D2E7, K 5х относительно K D2E7, K 7,5х относительно K D2E7, K 10х относительно K D2E7, K 12,5х относительно K D2E7, K 15х относительно K D2E7, K 20х относительно K D2E7, K 25х относительно K D2E7 или Ко, варьирующей между любой парой вышеприведенных значений, например K 0,7х-1,25х относительно K D2E7, K 0,9х-1,5х относительно K D2E7, K 0,9х-2х относительно K D2E7, K 0,8х-1,75х относительно K D2E7, K 0,9х-5х относительно K D2E7 или любым значением или интервалом, который можно рассчитать из раскрытых здесь показателей k и k.
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
В некоторых воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α и ингибирует связывание TNF-α с р55, р75 или с ними обоими со значением ИК, варьирующим от 50% до 200% от ИК D2E7, например ИК 50% от ИК D2E7, ИК 60% от ИК D2E7, ИК 70% от ИК D2E7, ИК 75% от ИК D2E7, ИК 80% от ИК D2E7, ИК 90% от ИК D2E7, ИК 95% от ИК D2E7, ИК 100% от ИК D2E7, ИК 110% от ИК D2E7, ИК 120% от ИК D2E7, ИК 125% от ИК D2E7, ИК 130% от ИК D2E7, ИК 140% от ИК D2E7, ИК 150% от ИК D2E7, ИК 160% от ИК D2E7, ИК 170% от ИК D2E7, ИК 175% от ИК D2E7, ИК 180% от ИК D2E7, ИК 190% от ИК D2E7, ИК 200% от ИК D2E7 или ИК в любом интервале между любой парой вышеприведенных значений, например ИК 75%-125% от ИК D2E7, ИК 90%-130% от ИК D2E7, ИК 95%-125% от ИК D2E7, ИК 90%-110% от ИК D2E7, ИК 90%-180% от ИК D2E7 или ИК 80%-175% от ИК D2E7. В других воплощениях одиночная замена CDR может приводить к вышеупомянутым различиям в ИК по сравнению с D2E7, тогда как антитело против TNF-α по изобретению может содержать такую замену и вплоть до 16 дополнительных замен по сравнению с D2E7.
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
В других воплощениях антитело против TNF-α по изобретению связывается с TNF-α и нейтрализует TNF-α со значением ИК, варьирующим от 50% до 200% от ИК D2E7, например ИК 50% от ИК D2E7, ИК 60% от ИК D2E7, ИК 70% от ИК D2E7, ИК 75% от ИК D2E7, ИК 80% от ИК D2E7, ИК 90% от ИК D2E7, ИК 95% от ИК D2E7, ИК 100% от ИК D2E7, ИК 110% от ИК D2E7, ИК 120% от ИК D2E7, ИК 125% от ИК D2E7, ИК 130% от ИК D2E7, ИК 140% от ИК D2E7, ИК 150% от ИК D2E7, ИК 160% от ИК D2E7, ИК 170% от ИК D2E7, ИК 175% от ИК D2E7, ИК 180% от ИК D2E7, ИК 190% от ИК D2E7, ИК 200% от ИК D2E7 или ИК в любом интервале между любой парой вышеприведенных значений, например ИК 75%-125% от ИК D2E7, ИК 90%-130% от ИК D2E7, ИК 95%-125% от ИК D2E7, ИК 90%-110% от ИК D2E7, ИК 90%-180% от ИК D2E7 или ИК 80%-175% от ИК D2E7. В других воплощениях одиночная замена CDR может приводить к вышеупомянутым различиям в ИК по сравнению с D2E7, тогда как антитело против TNF-α по изобретению может содержать такую замену и вплоть до 16 дополнительных замен по сравнению с D2E7.
7.5 ПОНИЖЕННАЯ ИММУНОГЕННОСТЬ АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNF-α
В определенных аспектах согласно настоящему изобретению предложены антитела против TNF-α, имеющие пониженную иммуногенность по сравнению с D2E7. Согласно настоящему изобретению также предложены антитела против TNF-α, имеющие множественные аминокислотные замены в их CDR по сравнению с CDR D2E7, где по меньшей мере одна замена снижает иммуногенность антитела по сравнению с D2E7. В определенных воплощениях пониженная иммуногенность является результатом одной или более чем одной аминокислотной замены, которая приводит к устранению или уменьшению (mitigating) одного или более чем одного Т-клеточного эпитопа.
В определенных аспектах антитела против TNF-α по изобретению, имеющие пониженную иммуногенность, имеют сравнимую или улучшенную биологическую активность по сравнению с D2E7, например аффинность в отношении TNF-α или нейтрализацию активности TNF-α. Такие свойства можно протестировать, например способами, описанными в разделе 7.3 выше.
В определенных воплощениях иммуногенность антитела против TNF-α по изобретению понижена относительно антитела D2E7. Такие антитела обычно имеют последовательности, отличающиеся относительно вариабельной области тяжелой и/или легкой цепей в областях, соответствующих SEQ ID NO:81, и/или SEQ ID NO:82, и/или SEQ ID NO:83. Антитела обычно будут иметь одну, две или три аминокислотные замены в одной, двух или всех трех последовательностях, соответствующих SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 и SEQ ID NO:83, хотя здесь рассматриваются вплоть до четырех или пяти замен в одной, двух или всех трех областях.
Типичные замены CDR-L1, дающие антитела с меньшей иммуногенностью по сравнению с D2E7, перечислены в Таблице 11. Антитела по изобретению могут содержать любую из замен или комбинаций замен, перечисленных в Таблице 11, и, возможно, одну или более чем одну дополнительную замену, такую как мутация CDR в любой из Таблиц 12-25, одну или в комбинации.
Термин «пониженная иммуногенность». как он используется в настоящем описании, указывает на то, что отличающаяся последовательность по сравнению с SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:83 вызывает пониженный пролиферативный ответ в мононуклеарах периферической крови по сравнению с пептидом SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:83, соответственно. Типичный анализ пролиферации, который можно использовать для оценки пролиферативного ответа, изложен в разделе 8 ниже. Пониженный пролиферативный ответ может быть отражен в показателях процентного содержания клеток-респондеров, индекса стимуляции или обоих показателей.
В других воплощениях отличающаяся последовательность по сравнению с пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:83, приводит к по меньшей мере на 25% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 30% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 35% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 40% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 45% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 50% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 60% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 65% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 70% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 75% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 80% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 85% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 90% меньшему числу респондеров, к по меньшей мере на 95% меньшему числу респондеров, к меньшему на 100% числу респондеров или к уменьшению числа респондеров на величину, лежащую в интервале между любыми из вышеприведенных значений, например, к меньшему на 25%-75% числу респондеров, к меньшему на 50%-90% числу респондеров, к меньшему на 60%-100% числу респондеров, к меньшему на 70%-90% числу респондеров или к тому подобному.
В других воплощениях отличающаяся последовательность приводит к индексу стимуляции, который по меньшей мере на 5% меньше, по меньшей мере на 10% меньше, по меньшей мере на 15% меньше, по меньшей мере на 20% меньше, по меньшей мере на 25% меньше, по меньшей мере на 30% меньше, по меньшей мере на 35% меньше или по меньшей мере на 40% меньше, чем индекс стимуляции, вызванный пептидом SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:83, соответственно, или приводит к индексу стимуляции, сниженному на величину, лежащую в интервале между любыми из вышеприведенных значений, по сравнению с пептидом SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82 или SEQ ID NO:83, например на 5%-20% меньше, на 10%-30% меньше, на 25%-35% меньше, на 30%-40% меньше или тому подобное.
Типичные воплощения антител против TNF-α с пониженной иммуногенностью по сравнению с D2E7 содержат одну или более чем одну замену CDR или одну или более чем одну комбинацию замен, изложенные в Таблице 11.
7.6 КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛ
Антитела против TNF-α по изобретению включают конъюгаты антител, которые модифицированы, например путем ковалентного присоединения любого типа молекулы к антителу, так что ковалентное присоединение не мешает связыванию с TNF-α.
В определенных аспектах антитело против TNF-α по изобретению может быть конъюгировано с эффекторной группировкой или меткой. Термин «эФФекторная группировка», как он используется здесь, включает, например, противоопухолевые агенты, лекарственные средства, токсины, биологически активные белки, например ферменты, другие антитела или фрагменты антител, синтетические или природные полимеры, нуклеиновые кислоты (например ДНК и РНК), радионуклиды, в частности радиоактивный йод, радиоизотопы, хелатированные металлы, наночастицы и репортерные группы, такие как флуоресцентные соединения или соединения, которые можно детектировать посредством ЯМР (ядерный магнитный резонанс) или ЭСР-спектроскопии (спектроскопия электронного спинового резонанса).
В одном примере антитела против TNF-α можно конъюгировать с эффекторной группировкой, такой как цитотоксический агент, радионуклид или группировка лекарственного средства, для модификации исходного биологического ответа. Эффекторная группировка может быть белком или полипептидом, таким как, например и без ограничения, токсин (такой как абрин, рицин А, экзотоксин Pseudomonas или токсин Diphtheria), сигнальная молекула (такая как α-интерферон, β-интерферон, фактор роста нервов, тромбоцитарный фактор роста или тканевой активатор плазминогена), тромботический агент или антиангиогенный агент (например ангиостатин или эндостатин) или модификатор биологического ответа, такой как цитокин или фактор роста (например интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-6 (IL-6), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) или фактор роста нервов (NGF)).
В другом примере эффекторные группировки могут быть цитотоксинами или цитотоксическими агентами. Примеры цитотоксинов и цитотоксических агентов включают таксол, цитохалазин Б, грамицидин Д, бромистый этидий, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин Д, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол, и пуромицин, и их аналоги или гомологи.
Эффекторные группировки также включают антиметаболиты (например метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил, декарбазин), алкилирующие агенты (например мехлоретамин, тиотепа, хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин С5 и цис-дихлордиаминплатина(11) (DDP) цисплатин), антрациклины (например даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например дактиномицин (ранее актиномицин), блеомицин, митрамицин, антрамицин (АМС), калихеамицины или дуокармицины) и антимитотические агенты (например винкристин и винбластин), но не ограничиваются ими.
111
90
177
213
252
192
188
188
Другие эффекторные группировки могут включать радионуклиды, такие как In и Y, Lu, висмут, калифорний, иридий и вольфрам/рений, но не ограничиваясь ими, и лекарственные средства, такие как, алкилфосфохолины, ингибиторы топоизомеразы I, таксоиды и сурамин, но не ограничиваясь ими.
Методики конъюгирования таких эффекторных группировок с антителами хорошо известны в данной области (смотрите, например, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., на стр.623-53 (Robinson et al., eds., 1987)); Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58 и Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics 83:67-123).
В одном примере антитело или его фрагмент соединяют через ковалентную связь (например пептидную связь), через N-конец или С-конец антитела или внутреннюю часть, с аминокислотной последовательностью другого белка (или его частью, например с частью белка из по меньшей мере 10, 20 или 50 аминокислот). Антитело или его фрагмент можно связать с другим белком на N-конце константного домена антитела. Для создания таких слияний можно использовать методики рекомбинантных ДНК, например, как описано в WO 86/01533 и ЕР 0392745. В другом примере эффекторная молекула может увеличивать период полувыведения in vivo и/или увеличивать доставку антитела через эпителиальный барьер в иммунную систему. Примеры подходящих эффекторных молекул этого типа включают полимеры, альбумин; альбуминсвязывающие белки или альбуминсвязывающие соединения, например такие как описано в WO 2005/117984.
В определенных аспектах антитело против TNF-α конъюгируют с низкомолекулярным токсином. В определенных типичных воплощениях антитело против TNF-α по изобретению конъюгируют с доластатином или пептидными аналогами или производными долостатина, например с ауристатином (патенты США №5635483 и 5780588). Лекарственные группировки доластатина или ауристатина могут быть присоединены к антителу через его N (амино) конец, С (карбоксильный) конец или внутреннюю часть (WO 02/088172). Типичные воплощения ауристатина включают лекарственные группировки DE и DF монометилауристатина, связанные с N-концом, как раскрыто в патенте США №7498298, который таким образом включен сюда посредством ссылки во всей его полноте (раскрывающем, например, линкеры и способы получения соединений монометилвалина, таких как ММАЕ и MMAF, конъюгированных с линкерами).
1
3
3
1
1
1
1
1
1
1
В других типичных воплощениях низкомолекулярные токсины включают калихеамицин, майтанзин (патент США №5208020), трихотен и СС1065, но не ограничиваются ими. В одном воплощении изобретения антитело конъюгировано с одной или более чем одной молекулой майтанзина (например от примерно 1 до примерно 10 молекул майтанзина на молекулу антитела). Майтанзин, например, может быть превращен в May-SS-Me, который может быть восстановлен до May-SH3 и может взаимодействовать с антителом (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131) с образованием конъюгата слияния майтанзиноид-антитело или майтанзиноид-Fc. Структурные аналоги калихеамицина, которые также можно использовать, включают γ , γ , γ  N-ацетил-γ , PSAG и θ  (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928; патент США №5714586; патент США №5712374; патент США №5264586; патент США №5773001), но не ограничиваются ими.
Антитела по изобретению также можно конъюгировать с липосомами для направленной доставки (смотрите, например, Park et al., 1997, Adv. Pharmacol. 40:399-435; Marty & Schwendener, 2004, Methods in Molecular Medicine 109:389-401).
В одном примере антитела по настоящему изобретению можно присоединить к группировкам поли(этиленгликоля) (ПЭГ). В одном конкретном примере антитело представляет собой фрагмент антитела, и группировки ПЭГ могут быть присоединены через любую доступную аминокислотную боковую цепь или концевую аминокислотную функциональную группу, локализованную во фрагменте антитела, например любую свободную амино, имино, тиольную, гидроксильную или карбоксильную группу. Такие аминокислоты могут естественным образом содержаться во фрагменте антитела или могут быть встроены во фрагмент с использованием способов генной инженерии. Смотрите, например, патент США №5219996. Для присоединения двух или более чем двух молекул ПЭГ можно использовать множество сайтов. Группировки ПЭГ могут быть ковалентно связаны через тиольную группу по меньшей мере одного остатка цистеина, локализованного во фрагменте антитела. Когда тиольная группа используется как точка присоединения, можно использовать подходящим образом активированные эффекторные группировки (например селективные в отношении тиола производные, такие как малеимиды и производные цистеина).
В конкретном примере конъюгат антитела против TNF-α представляет собой модифицированный фрагмент Fab', который является ПЭГилированным, т.е. имеет ПЭГ (поли(этиленгликоль)), ковалентно присоединенный к нему, например, согласно способу, раскрытому в ЕР 0948544. Смотрите также Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, (J.Milton Harris (ed.), Plenum Press, New York, 1992); Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications, (J.Milton Harris and S.Zaiipsky, eds., American Chemical Society, Washington D.C., 1997); и Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences, (M.Aslam and A.Dent, eds., Grove Publishers, New York, 1998); и Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 54:531-545. ПЭГ может быть присоединен к цистеину в шарнирной области. В одном примере фрагмент Fab', модифицированный ПЭГ, имеет малеимидную группу, ковалентно связанную с одной тиольной группой в модифицированной шарнирной области. Остаток лизина может быть ковалентно связан с малеимидной группой и к каждой из аминогрупп на остатке лизина может быть присоединен метоксиполи(этиленгликолевый) полимер, имеющий молекулярную массу приблизительно 20000 Да. Общая молекулярная масса ПЭГ, присоединенного к фрагменту Fab', следовательно, может составлять приблизительно 40000 Да.
Слово «метка» при использовании здесь относится к детектируемому соединению или композиции, которые можно конъюгировать прямо или не прямо с антителом против TNF-α по изобретению. Сама метка может быть детектируемой (например радиоизотопные метки или флюоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение соединения-субстрата или композиции, которые являются детектируемыми. Полезные флуоресцентные группировки включают флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, 6-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и им подобные, но не ограничиваются ими. Полезные ферментативные метки включают щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена, глюкозооксидазу и им подобные, но не ограничиваются ими.
Дополнительные конъюгаты антитела против TNF-α, которые являются полезными, среди прочего, для диагностических целей, описаны в разделе 7.7 ниже.
7.7 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNF-α
Антитела против TNF-α по изобретению, включая те антитела, которые были модифицированы, например биотинилированием, пероксидазой хрена или любой другой детектируемой группировкой (включая группировки, описанные в разделе 7.6), можно преимущественно использовать для диагностических целей.
В частности антитела против TNF-α можно использовать, например, для очистки или детекции TNF-α, включая диагностические способы как in vitro, так и in vivo, но не ограничиваясь этим. Например, антитела имеют применение в иммуноанализах для качественного и количественного измерения уровней TNF-α в биологических образцах. Смотрите, например, Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988), которая включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте. В одном воплощении антитела против TNF-α по изобретению можно использовать для детекции и количественного измерения уровней TNF-α в сыворотке.
125
131
111
99
Настоящее изобретение дополнительно охватывает антитела или их фрагменты, конъюгированные с диагностическим агентом. Антитела можно использовать в диагностических целях, например для детекции экспрессии интересующей мишени в определенных клетках, тканях или сыворотке; или для мониторинга проявления или развития иммунологического ответа как части клинической процедуры тестирования, например для определения эффективности данной схемы лечения. Детекцию можно облегчать путем связывания антитела с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают разные ферменты, простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, биолюминесцентные вещества, радиоактивные вещества, позитрон-излучающие металлы, используемые в разных позитронно-эмиссионных томографиях, и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов. Детектируемое вещество может быть связано или конъюгировано либо прямо с антителом (или его фрагментом), либо опосредованно, через промежуточное соединение (такое как, например, линкер, известный в данной области) с использованием методик, известных в данной области. Примеры ферментативных меток включают люциферазы (например люциферазу светляка и бактериальную люциферазу; патент США №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, малатдегидрогеназу, уреазу, пероксидазу, такую как пероксидаза хрена (HRPO), щелочную фосфатазу, р-галактозидазу, ацетилхолинэстеразу, глюкоамилазу, лизоцим, сахаридоксидазы (например глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа), гетероциклические оксидазы (такие как уриказа и ксантиноксидаза), лактопероксидазу, микропероксидазу и тому подобное. Примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламина флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества включает люминол; примеры биолюминесцентных веществ включают люциферазу, люциферин и экворин; и примеры подходящего радиоактивного вещества включают I, I, I или Tc.
Согласно описанию предложена детекция экспрессии TNF-α, включающая приведение в контакт биологического образца (клеток, тканей или жидкости организма индивидуума) с использованием одного или более чем одного антитела против TNF-α по изобретению (возможно конъюгированного с детектируемой группировкой) и детекцию того, является или нет образец позитивным в отношении экспрессии TNF-α, или имеет ли образец измененную (например пониженную или повышенную) экспрессию по сравнению с контрольным образцом.
Заболевания, которые могут диагностироваться с использованием настоящих способов, включают описанные здесь заболевания, но не ограничиваются ими. В определенных воплощениях ткань или жидкость организма представляет собой периферическую кровь, лейкоциты периферической крови, материал биопсии тканей, такой как биопсийный материал легкого или кожи, и ткань.
7.8 ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ ПРОТИВ TNF-α
7.8.1 Клиническая польза
Антитела против TNF-α по настоящему изобретению являются полезными для лечения расстройств или симптомов разных иммунных и аутоиммунных патологий, а также воспалительных заболеваний. Патологии и заболевания, связанные с TNF-α, которые можно лечить антителами против TNF-α по изобретению, включают следующие, но не ограничиваются ими:
- острые и хронические иммунные и аутоиммунные патологии, такие как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, тиреоидит, заболевание «трансплантат против хозяина», склеродермия, сахарный диабет, болезнь Грейвса и им подобные;
- инфекции, включая синдром сепсиса, кахексию, циркуляторный коллапс и шок, происходящие в результате острой или хронической бактериальной инфекции, острых и хронических паразитарных и/или бактериальных, вирусных или грибковых инфекционных заболеваний, таких как СПИД (включая осложнения, такие как кахексия, аутоиммунные расстройства, умственное расстройство при СПИД и инфекции), но не ограничиваясь ими;
- воспалительные заболевания, такие как хронические воспалительные патологии и сосудистые воспалительные патологии, включая хронические воспалительные патологии, такие как саркоидоз, хроническое воспалительное заболевание кишечника, язвенный колит, патология Крона и сосудистые воспалительные патологии, такие как диссеминированное внутрисосудистое коагулирование, атеросклероз и патология Кавасаки, но не ограничиваясь ими;
- нейродегенеративные заболевания, включая демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидальные и мозжечковые расстройства, такие как поражения кортикоспинальной системы; расстройства базальных ганглиев или мозжечковые расстройства; гиперкинетические расстройства движения, такие как хорея Гентингтона и сенильная хорея, расстройства движения, индуцированные лекарственными средствами, такие как расстройства, индуцированные лекарственными средствами, которые блокируют ЦНС (центральная нервная система), дофаминовые рецепторы; гипокинетические расстройства движения, такие как болезнь Паркинсона; прогрессирующий супрануклеарный паралич, мозжечковые и спиномозжечковые расстройства, такие как неструктурные поражения мозжечка; спиномозжечковые дегенерации (спинальная атаксия, наследственная атаксия Фридрайха, мозжечковые корковые дегенерации, множественные системные дегенерации (Менцеля, Дежерина-Тома, Ши-Драгера и Мачадо-Джозефа); и системные расстройства (болезнь Рефсума, абеталипопротеинемия, атаксия, телеангиэктазия и митохондриальные мультисистемные расстройства); демиелинизирующие коровью (core) расстройства, такие как рассеянный склероз, острый поперечный миелит; расстройства моторных единиц, такие как нейрогенные мышечные атрофии (дегенерация клеток переднего рога спинного мозга, такая как боковой амиотрофический склероз, мышечная атрофия спинного мозга у детей раннего возраста и юношеская мышечная атрофия спинного мозга); болезнь Альцгеймера; синдром Дауна в среднем возрасте; болезнь с диффузными тельцами Леви; сенильная деменция с тельцами Леви, синдром Вернике-Корсакова; хронический алкоголизм; болезнь Крейтцфельдта-Якоба; подострый слерозирующий панэнцефалит, болезнь Галлервордена-Шпаца и деменция боксеров, или их любое подмножество, но не ограничиваясь ими;
- злокачественные патологии, включая опухоли, секретирующие TNF-α, или другие злокачественные образования с участием TNF-α, такие как, лейкозы (острый, хронический миелоидный, хронический лимфоцитарный и/или миелодиспластический синдром); лимфомы (лимфомы Ходжкина и не-ходжкинские лимфомы, такие как злокачественные лимфомы (лимфома Беркитта или грибовидный микоз), но не ограничиваясь ими, и
- гепатит, индуцированный алкоголем;
В определенных конкретных воплощениях антитела по изобретению используют для лечения одного или более чем одного из:
- от умеренного до тяжелого ревматоидного артрита (RA) у взрослых;
- от умеренного до тяжелого полиартикулярного ювенильного идиопатического артрита (JIA) у детей в возрасте 4 лет или старше;
- псориатического артрита (PsA) у взрослых;
- анкилозирующего спондилита (AS) у взрослых;
- от умеренной до тяжелой болезни Крона (CD) у взрослых, которые не давали хорошего ответа на традиционные лечения;
- от умеренного до тяжелого хронического бляшечного псориаза (Ps) у взрослых.
Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены способы лечения любого из вышеупомянутых заболеваний у пациента, нуждающегося в этом, включающие: введение пациенту антитела против TNF-α по изобретению. Возможно указанное введение повторяют, например через одни сутки, двое суток, трое суток, пять суток, одну неделю, две недели, три недели, один месяц, пять недель, шесть недель, семь недель, восемь недель, два месяца или три месяца. Повторное введение может осуществляться в такой же дозе или в другой дозе. Введение может повторяться один раз, два раза, три раза, четыре раза, пять раз, шесть раз, семь раз, восемь раз, девять раз, десять раз или более. Например, согласно определенным схемам дозировки пациент получает терапию против TNF-α в течение длительного периода времени, например 6 месяцев, 1 года или более. Количество антитела против TNF-α, введенное пациенту в определенных воплощениях, представляет собой терапевтически эффективное количество. Как этот термин используется здесь, «терапевтически эффективное» количество антитела против TNF-α можно вводить в виде одной дозы или по ходу схемы лечения, например в течение недели, двух недель, трех недель, одного месяца, трех месяцев, шести месяцев, одного года или дольше. Типичные схемы лечения описаны в разделе 7.11 ниже.
Согласно настоящему изобретению лечение заболевания охватывает лечение пациентов, у которых уже диагностировали какую-либо форму заболевания на любой клинической стадии проявления; задержку начала или развития, или обострения, или ухудшения симптомов или признаков заболевания; и/или предупреждение, и/или уменьшение тяжести заболевания.
«Субъект» или «пациент», которому вводят антитело против TNF-α по изобретению, предпочтительно представляет собой млекопитающее, такое как млекопитающее, не являющееся приматом (например корова, свинья, лошадь, кошка, собака, крыса и т.д.), или примат (например обезьяна или человек). В определенных воплощениях субъект или пациент представляет собой человека. В определенных аспектах человек представляет собой педиатрического пациента. В других аспектах человек представляет собой взрослого пациента.
7.9 ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ И ПУТИ ВВЕДЕНИЯ
Здесь предложены композиции, содержащие антитело против TNF-α по изобретению и, возможно, один или более чем один дополнительный терапевтический агент, такие как комбинация терапевтических агентов, описанная в разделе 7.10 ниже. Композиции обычно будут поставляться в виде части стерильной фармацевтической композиции, которая обычно будет включать фармацевтически приемлемый носитель. Эта композиция может находиться в любой подходящей форме (в зависимости от желательного способа ее введения пациенту).
Антитела против TNF-α по данному изобретению можно вводить пациенту целым рядом способов как, например, перорально, чрескожно, подкожно, интраназально, внутривенно, внутримышечно, внутриглазным способом, местно, интратекально и интрацеребровентрикулярно. Самый подходящий путь введения в любом данном случае будет зависеть от конкретного антитела, субъекта и природы и тяжести заболевания и физического состояния субъекта.
Для лечения по показаниям, описанным здесь, эффективная доза антитела против TNF-α по изобретению может варьировать от примерно 0,001 до примерно 75 мг/кг на одиночное (например болюсное) введение, многократные введения или непрерывное введение, или для достижения концентрации в сыворотке 0,01-5000 мкг/мл на одиночное (например болюсное) введение, многократные введения или непрерывное введение, или любой эффективный интервал или значение в этом интервале, в зависимости от состояния, которое лечат, пути введения и возраста, массы и состояния субъекта. В определенных воплощениях каждая доза может варьировать от примерно 0,5 мкг до примерно 50 мкг на килограмм массы тела, например от примерно 3 мкг до примерно 30 мкг на килограмм массы тела. Антитело можно приготовить в виде препарата в виде водного раствора и вводить посредством подкожной инъекции.
Фармацевтические композиции могут быть удобно представлены в лекарственных формах, содержащих заданное количество антитела против TNF-α по изобретению на дозу. Такая единица может содержать, например, но без ограничения, от 5 мг до 5 г, например от 10 мг до 1 г или от 20 до 50 мг. Фармацевтически приемлемые носители для применения в изобретении могут принимать целый ряд форм, в зависимости, например, от состояния, которое лечат, или пути введения.
Терапевтические препараты антител против TNF-α по изобретению можно приготовить для хранения в виде лиофилизированных препаратов или водных растворов путем смешивания антитела, имеющего желательную степень чистоты, с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами, типично применяемыми в данной области (которые все именуются здесь как "носители"), т.е. буферными агентами, стабилизирующими агентами, консервантами, изотонирующими агентами, неионными детергентами, антиоксидантами и другими разнообразными добавками. Смотрите Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Такие добавки должны быть нетоксичными для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях.
Буферные агенты помогают поддерживать рН в интервале, который приближается к физиологическим условиям. Они могут присутствовать в концентрациях, варьирующих от примерно 2 мМ до примерно 50 мМ. Подходящие буферные агенты для применения в настоящем изобретении включают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, такие как цитратные буферы (например смесь мононатрия цитрата-динатрия цитрата, смесь лимонной кислоты-тринатрия цитрата, смесь лимонной кислоты-мононатрия цитрата и т.д.), сукцинатные буферы (например смесь янтарной кислоты-мононатрия сукцината, смесь янтарной кислоты-гидроксида натрия, смесь янтарной кислоты-динатрия сукцината и т.д.), тартратные буферы (например смесь винной кислоты-тартрата натрия, смесь винной кислоты-тартрата калия, смесь винной кислоты-гидроксида натрия и т.д.), фумаратные буферы (например смесь фумаровой кислоты-мононатрия фумарата, смесь фумаровой кислоты-динатрия фумарата, смесь мононатрия фумарата-динатрия фумарата и т.д.), глюконатные буферы (например смесь глюконовой кислоты-глюконата натрия, смесь глюконовой кислоты-гидроксида натрия, смесь глюконовой кислоты-глюконата калия и т.д.), оксалатный буфер (например смесь щавелевой кислоты-оксалата натрия, смесь щавелевой кислоты-гидроксида натрия, смесь щавелевой кислоты-оксалата калия), лактатные буферы (например смесь молочной кислоты-лактата натрия, смесь молочной кислоты-гидроксида натрия, смесь молочной кислоты-лактата калия и т.д.) и ацетатные буферы (например смесь уксусной кислоты-ацетата натрия, смесь уксусной кислоты-гидроксида натрия и т.д.). Дополнительно можно использовать фосфатные буферы, гистидиновые буферы и соли триметиламина, такие как Трис.
Для задержки роста микроорганизмов можно добавлять консерванты и можно добавлять в количествах, варьирующих от 0,2% до 1% (масс./об.). Подходящие консерванты для применения согласно настоящему изобретению включают фенол, бензиловый спирт, мета-крезол, метилпарабен, пропилпарабен, хлорид октадецилдиметилбензиламмония, галогениды бензалкония (например хлорид, бромид и йодид), хлорид гексаметония и алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен, катехол, резорцинол, циклогексанол и 3-пентанол. Можно добавлять изотонирующие агенты, иногда известные как "стабилизаторы", для обеспечения изотоничности жидких композиций по настоящему изобретению, и они включают многоатомные сахарные спирты, например сахарные спирты с тремя или большим числом гидроксильных групп, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит.Термин «стабилизаторы» относится к широкой категории эксципиентов, функция которых может варьировать от наполнителя до добавки, которая солюбилизирует терапевтический агент или помогает предотвратить денатурацию или прилипание к стенке контейнера. Типичные стабилизаторы могут быть многоатомными сахарными спиртами (перечисленными выше); аминокислотами, такими как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, L-лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т.д., органическими сахарами или многоатомными спиртами, такими как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннит, сорбит, ксилит, рибит, миоинозит, галактит, глицерин и тому подобное, включая циклиты, такие как инозит; полиэтиленгликолем; полимерами аминокислот; восстанавливающими агентами, содержащими серу, такими как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, α-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярными полипептидами (например пептидами из 10 остатков или меньше); белками, такими как человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильными полимерами, такими как поливинилпирролидон, моносахаридами, такими как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахаридами, такими как лактоза, мальтоза, сахароза, и трисахаридами, такими как рафиноза; и полисахаридами, такими как декстран. Стабилизаторы могут присутствовать в интервале от 0,1 до 10000 массовых долей на часть по массе активного белка.
Неионные поверхностно-активные вещества или детергенты (также известные как «увлажняющие агенты») могут быть добавлены с тем чтобы способствовать солюбилизации терапевтического агента, а также для защиты терапевтического белка против агрегации, индуцированной встряхиванием, что также позволяет подвергать препарат поверхностному напряжению сдвига не вызывая денатурацию белка. Подходящие неионные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т.д.), полиоксамеры (184, 188 и т.д.), плюроновые (pluronic) полиолы, моноэфиры полиоксиэтилен сорбитана (TWEEN-20, TWEEN-80 и т.д.). Неионные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в интервале от примерно 0,05 мг/мл до примерно 1,0 мг/мл, например от примерно 0,07 мг/мл до примерно 0,2 мг/мл.
Дополнительные разнообразные эксципиенты включают наполнители (например крахмал), хелатообразователи (например EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота)), антиоксиданты (например аскорбиновая кислота, метионин, витамин Е) и сорастворители. Дополнительные препараты, подходящие для антител против TNF-α по изобретению, раскрыты в заявке на патент США №2004/0033228 А1, содержание которой включено сюда посредством ссылки во всей его полноте.
Приведенный здесь препарат также может содержать комбинированный терапевтический агент в добавление к антителу против TNF-α по данному изобретению. Примеры подходящих комбинированных терапевтических агентов приведены в разделе 7.10 ниже.
Схема дозировки для подкожного введения может варьировать от одного раза каждые шесть месяцев, пять месяцев, четыре месяца, три месяца, два месяца, один месяц до одного раза в две недели, в неделю или в сутки, в зависимости от целого ряда клинических факторов, включая тип заболевания, тяжесть заболевания и чувствительность пациента к антителу против TNF-α.
Дозировка антитела против TNF-α по данному изобретению, подлежащая введению, будет варьировать в зависимости от конкретного антитела, типа аутоиммунного или воспалительного заболевания, субъекта, природы и тяжести заболевания, физического состояния субъекта, терапевтической схемы (например применяют ли комбинированный терапевтический агент) и выбранного пути введения; подходящая дозировка может быть легко определена специалистом в данной области.
Для лечения и/или профилактики аутоиммунного или воспалительного заболевания у людей и животных фармацевтические композиции, содержащие антитела против TNF-α, могут вводиться пациентам (например человеческим субъектам) в терапевтически или профилактически эффективных дозировках (например дозировках, которые приводят к ингибированию аутоиммунного или воспалительного заболевания и/или к облегчению симптомов аутоиммунного или воспалительного заболевания) с использованием любого подходящего пути введения, такого как инъекция и другие пути введения, известные в области клинических продуктов на основе антител.
Специалисту в данной области будет понятно, что оптимальное количество и интервал во времени между отдельными дозировками антитела против TNF-α по изобретению будет определяться природой и степенью тяжести состояния, которое лечат, формой, путем и местом введения, и возрастом и состоянием конкретного субъекта, которого лечат, и тем, что лечащий врач в конечном счете определит как подходящие дозировки, подлежащие применению. Эта дозировка может повторяться настолько часто, насколько это является целесообразным. При развитии побочных эффектов количество и/или частоту дозировки можно изменять или снижать, в соответствии с нормальной клинической практикой.
7.10 КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ
Ниже описаны комбинаторные способы, в которых могут быть использованы антитела против TNF-α по изобретению. Комбинаторные способы по изобретению включают введение пациенту по меньшей мере двух агентов, первый из которых представляет собой антитело против TNF-α по изобретению, и дополнительный(ые) агент (агенты) представляет(ют) собой комбинированный терапевтический агент. Антитело против TNF-α и комбинированный(ые) терапевтический(ие) агент (агенты) можно вводить одновременно, последовательно или раздельно.
Способы комбинированной терапии по настоящему изобретению могут приводить к более чем аддитивному эффекту, обеспечивающему терапевтическую пользу, когда ни антитело против TNF-α, ни комбинированный терапевтический агент не вводятся в таком количестве, которое в одиночку является терапевтически эффективным.
В настоящих способах, антитело против TNF-α по изобретению и комбинированный терапевтический агент могут вводиться параллельно - либо одновременно, либо последовательно. Говорят, что антитело против TNF-α по изобретению и комбинированный терапевтический агент, как эти термины используются здесь, вводятся последовательно, если их вводят пациенту в одни и те же сутки, например на протяжении одного и того же визита пациента. Последовательное введение может происходить с разницей в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 часов. Напротив, говорят, что антитело против TNF-α по изобретению и комбинированный терапевтический агент вводятся раздельно, если их вводят пациенту в разные сутки, например, антитело против TNF-α по изобретению и комбинированный терапевтический агент можно вводить с 1-суточным, 2-суточным или 3-суточным, однонедельным, 2-недельным или месячным интервалами. В способах по настоящему изобретению введение антитела против TNF-α по изобретению может предшествовать или следовать после введения комбинированного терапевтического агента.
В качестве неограничивающего примера антитело против TNF-α по изобретению и комбинированный терапевтический агент можно вводить параллельно в течение некоторого периода времени, с последующим вторым периодом времени, в котором введение антитела против TNF-α по изобретению и комбинированного терапевтического агента чередуются.
Из-за потенциально синергичных эффектов введения антитела против TNF-α по изобретению и комбинированного терапевтического агента, такие агенты можно вводить в количествах, которые при введении одного из данных агентов или обоих агентов поодиночке, не являются терапевтически эффективными.
В определенных аспектах комбинированный терапевтический агент представляет собой противоревматическое лекарственное средство, противовоспалительный агент, химиотерапевтический агент, радиотерапевтический агент, иммунодепрессант или цитотоксическое лекарственное средство.
Противоревматические лекарственные средства включают ауранофин, азатиоприн, хлорохин, D-пеницилламин, тиомалат золота и натрия, гидроксихлорохин, миокризин и сульфасалзина метотрексат, но не ограничиваются ими.
Противовоспалительные агенты включают дексаметазон, пентазу, месалазин, азакол, кодеина фосфат, бенорилат, фенбуфен, напрозин, диклофенак, этодолак и индометацин, аспирин и ибупрофен, но не ограничиваются ими.
Химиотерапевтические агенты включают радиоактивные молекулы, токсины, также именуемые цитотоксинами или цитотоксическими агентами, которые включают любой агент, который является вредным для жизнеспособности клеток, агенты, липосомы или другие везикулы, содержащие Химиотерапевтические соединения, но не ограничиваются ими. Примеры подходящих химиотерапевтических агентов включают 1-дегидротестостерон, 5-фторурацила декарбазин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, актиномицин Д, адриамицин, алдеслейкин, алкилирующие агенты, аллопуринол натрия, алтретамин, амифостин, анастрозол, антрамицин (АМС)), антимитотические агенты, цисдихлордиамин платина(И) (DDP) цисплатин), диаминодихлорплатина, антрациклины, антибиотики, антиметаболиты, аспарагиназа, живая BCG (бацилла Кальметта-Герена) (внутривезикулярная (intravesical)), бетаметазона натрия фосфат и бетаметазона ацетат, бикалутамид, блеомицина сульфат, бусульфан, кальция лейковорин, калихеамицин, капецитабин, карбоплатин, ломустин (CCNU), кармустин (BSNU), хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, колхицин, конъюгированные эстрогены, циклофосфамид, циклотосфамид, цитарабин, цитарабин, цитохалазин Б, цитоксан, дакарбазин, дактиномицин, дактиномицин (ранее актиномицин), даунирубицин HCl, даунорубицина цитрат, денилейкин дифтитокс, дексразоксан, дибромманнит, дигидроксиантрациндион, доцетаксел, долазетрон мезилат, доксорубицин HCl, дронабинол, L-аспарагиназа Е. coli, эолоциксимаб, эметин, эпоетин-α, L-аспарагиназа Erwinia, этерифицированные эстрогены, эстрадиол, эстрамустина натрия фосфат, бромистый этидий, этинил-эстрадиол, этидронат, этопозид фактор citrororum, этопозид фосфат, филграстим, флоксуридин, флуконазол, флударабин фосфат, фторурацил, флутамид, фолиновую кислоту, гемцитабин HCl, глюкокортикоиды, гозерелина ацетат, грамицидин Д, гранисетрон HCl, гидроксимочевину, идарубицин HCl, ифосфамид, интерферон α-2b, иринотекан HCl, летрозол, лейковорин кальция, лейпролида ацетат, левамизол HCl, лидокаин, ломустин, майтансиноид, мехлорэтамин HCl, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, мелфалан HCl, меркаптипурин, месна, метотрексат, метилтестостерон, митрамицин, митомицин С, митотан, митоксантрон, нилутамид, октреотида ацетат, ондансетрон HCl, паклитаксел, памидронат динатрий, пентостатин, пилокарпин HCl, плимицин, полифепросан 20 с кармустиновым имплантом, порфимер натрия, прокаин, прокарбазин HCl, пропранолол, ритуксимаб, сарграмостим, стрептозотоцин, тамоксифен, таксол, тенипозид, тенопозид, тестолактон, тетракаин, тиоепа хлорамбуцил, тиогуанин, тиотепу, топотекан HCl, торемифена цитрат, трастузумаб, третиноин, валрубицин, винбластина сульфат, винкристина сульфат и винорелбина тартрат, но не ограничиваются ими.
В других аспектах изобретения комбинированный терапевтический агент представляет собой антагонист TNF-α, отличный от антитела против TNF-α по изобретению. Примеры таких антагонистов TNF-α включают растворимые рецепторы TNF-α; этанерцепт (ENBREL™; Immunex) или его фрагмент, производное или аналог; инфликсимаб (REMICADE; Centacor) или его производное, аналог или антигенсвязывающий фрагмент; IL-10, который, как известно, блокирует продукцию TNF-α посредством макрофагов, активируемых интерфероном-γ (Oswald et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8676-8680), TNFR-IgG (Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539); мышиный продукт TBP-1 (Serono/Yeda); вакцину CytoTAb (Protherics); антисмысловую молекулу 104838 (ISIS); пептид RDP-58 (SangStat); талидомид (Celgene); CDC-801 (Celgene); DPC-333 (Dupont); VX-745 (Vertex); AGIX-4207 (AtheroGenics); ITF-2357 (Italfarmaco); NPI-13021-31 (Nereus); SCIO-469 (Scios); TACE (TNF-α-превращающий фермент) таргетер (targeter) (Immunix/AHP); CLX-120500 (Calyx); тиазолпирим (Dynavax); ауранофин (ридаура) (SmithKline Beecham Pharmaceuticals); хинакрин (мепакрина дихлоргидрат); тенидап (ЕпаЫех); меланин (Large Scale Biological); и агенты против р38 МАРК от Uriach; но не ограничиваются ими.
Дополнительные вторые терапевтические агенты, полезные. в комбинации с антителом против TNF-α, и конкретные показания, для которых полезна комбинированная терапия с такими вторыми терапевтическими агентами, раскрыты в WO 2004/004633, которая включена сюда посредством ссылки во всей ее полноте.
7.11 ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СХЕМЫ
Согласно настоящему изобретению предложены терапевтические схемы, включающие введение антител против TNF-α по изобретению. Терапевтическая схема будет варьировать в зависимости от возраста пациента, массы и болезненного состояния. Терапевтическая схема может длиться от 2 недель до неопределенного времени. В конкретных воплощениях терапевтическая схема продолжается в течение от 2 недель до 6 месяцев, от 3 месяцев до 5 лет, от 6 месяцев до 1 или 2 лет, от 8 месяцев до 18 месяцев или тому подобное. Терапевтическая схема может быть схемой постоянной дозировки или схемой множественной вариабельной дозировки, например как описано в WO 2005/110452, которая включена посредством ссылки во всей ее полноте.
Для типичных схем дозировки, описанных ниже, антитело против TNF-α можно вводить в виде стерильного, не содержащего консервантов раствора для подкожного введения.
В определенных воплощениях лекарственный продукт поставляется либо в виде предварительно заполненного шприца-ручки для однократного применения, в котором заключен предварительно заполненный стеклянный шприц объемом 1 мл, либо в виде однодозового предварительно заполненного стеклянного шприца объемом 1 мл. Для взрослых пациентов в определенных воплощениях шприц доставляет 0,8 мл фармацевтически приемлемого раствора, содержащего антитело против TNF-α по изобретению. В конкретном воплощении в добавление к антителу раствор содержит 4,93 мг хлорида натрия, 0,69 мг одноосновного фосфата натрия дигидрата, 1,22 мг двухосновного фосфата натрия дигидрата, 0,24 мг цитрата натрия, 1,04 мг моногидрата лимонной кислоты, 9,6 мг маннита, 0,8 мг полисорбата 80 и воду для инъекции (USP - фармакопея США) с гидроксидом натрия, добавленным как необходимо для подведения рН. Для педиатрических пациентов в определенных воплощениях шприц доставляет 0,4 мл фармацевтически приемлемого раствора, содержащего антитело против TNF-α по изобретению. В конкретном воплощении в добавление к антителу раствор содержит 2,47 мг хлорида натрия, 0,34 мг одноосновного фосфата натрия дигидрата, 0,61 мг двухосновного фосфата натрия дигидрата, 0,12 мг цитрата натрия, 0,52 мг моногидрата лимонной кислоты, 4,8 мг маннита, 0,4 мг полисорбата 80 и воду для инъекции (USP) с гидроксидом натрия, добавленным как необходимо для подведения рН.
Для лечения ревматоидного артрита, псориатического артрита и анкилозирующего спондилита антитело против TNF-α по изобретению можно вводить в дозе от 10 до 50 мг (например 10 мг, 15 мг, 20 мг, 25 мг, 30 мг, 35 мг, 40 мг, 45 мг или 50 мг) один раз в две недели. Введение метотрексата, глюкокортикоидов, салицилатов, нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID), анальгетиков или других противоревматических лекарственных средств, модифицирующих заболевание (DMARD) может продолжаться во время лечения антителом против TNF-α по изобретению. При ревматоидном артрите некоторые пациенты, не принимающие сопутствующий метотрексат, могут получать дополнительную пользу от увеличения частоты дозировки от одного раза в две недели до одного раза в неделю.
Для лечения ювенильного идиопатического артрита антитело против TNF-α по изобретению вводят в дозе, которая зависит от массы пациента. В определенных неограничивающих воплощениях доза для педиатрических пациентов, весящих от 15 кг (33 фунта) до менее 30 кг (66 фунтов), варьирует от 5 до 25 мг (например 5 мг, 7,5 мг, 10 мг, 12,5 мг, 15 мг, 20 мг или 25 мг) один раз в две недели. В определенных неограничивающих воплощениях доза для педиатрических пациентов, весящих больше, чем 30 кг (66 фунтов) варьирует от 10 до 50 мг (например 10 мг, 15 мг, 20 мг, 25 мг, 30 мг, 35 мг, 40 мг, 45 мг или 50 мг) один раз в две недели. Введение метотрексата, глюкокортикоидов, салицилатов, NSAID или анальгетиков может продолжаться во время лечения антителом против TNF-α.
Для лечения болезни Крона антитело против TNF-α по изобретению может вводиться в определенных неограничивающих воплощениях в дозе 40-280 мг (например 40 мг, 80 мг, 100 мг, 120 мг, 140 мг, 160 мг, 180 мг, 200 мг, 240 мг или 280 мг), которую дают первоначально (в сутки 1 или разделенной между сутками 1 и сутками 2), с последующей дозой, составляющей приблизительно от 40% до 60% (например 50%) от исходной дозы через две недели (сутки 15). Через две недели (сутки 29) вводится поддерживающая доза, составляющая от 20% до 30% (например 25%) от исходной дозы, один раз в две недели. Введение аминосалицилатов, кортикостероидов и/или иммуномодулирующих агентов (например 6-меркаптопурина и азатиоприна) может продолжаться во время лечения антителом против TNF-α.
Для лечения бляшечного псориаза антитело против TNF-α по изобретению может вводиться в определенных неограничивающих воплощениях в дозе 40-160 мг (например 40 мг, 80 мг, 100 мг, 120 мг, 140 мг или 160 мг), которую дают первоначально с последующей половиной исходной дозы, которую дают один раз в две недели, начиная через одну неделю после исходной дозы.
7.12 ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ НАБОРЫ
Настоящее изобретение охватывает фармацевтические наборы, содержащие антитела против TNF-α (включая конъюгаты антител) по изобретению. Фармацевтический набор представляет собой упаковку, содержащую антитело против TNF-α по изобретению (например либо в лиофилизированной форме, либо в виде водного раствора) и одно или более чем одно из следующего:
- комбинированный терапевтический агент, например как описано в разделе 7.10 выше;
- устройство для введения антитела против TNF-α, например шприц-ручка, игла и/или шприц; и
- вода или буфер фармацевтического качества для ресуспендирования антитела, если антитело находится в лиофилизированной форме.
В определенных аспектах каждую единичную дозу антитела против TNF-α упаковывают раздельно, и набор может содержать одну или более чем одну единичную дозу (например две единичные дозы, три единичные дозы, четыре единичные дозы, пять единичных доз, восемь единичных доз, десять единичных доз или более). В конкретном воплощении каждая одна или более чем одна единичная доза содержится в шприце или ручке-шприце.
Здесь также охватываются диагностические наборы, содержащие антитела против TNF-α (включая конъюгаты антител) по изобретению. Диагностический набор представляет собой упаковку, содержащую антитело против TNF-α по изобретению (например либо в лиофилизированной форме, либо в виде водного раствора) и один или более чем один реагент, полезный для проведения диагностического анализа. Когда антитело против TNF-α мечено ферментом, набор может включать субстраты и кофакторы, требующиеся для данного фермента (например субстрат-предшественник, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). Кроме того, могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например блокирующий буфер или буфер для лизиса) и тому подобное. В определенных воплощениях антитело против TNF-α, включенное в диагностический набор, иммобилизовано на твердой поверхности, или твердая поверхность (например предметное стекло), на которой можно иммобилизовать антитело, включена в набор. Относительные количества разных реагентов могут широко варьировать для обеспечения концентраций реагентов в растворе, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. В конкретном воплощении антитело и один или более чем один реагент могут быть предоставлены (по-отдельности или совместно) в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включающих эксципиенты, которые при растворении будут давать раствор реагента, имеющий подходящую концентрацию.
8. ПРИМЕР 1: ИДЕНТИФИКАЦИЯ ДЕИММУНИЗИРОВАННЫХ ВАРИАНТОВ D2E7
8.1 МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
8.1.1 Пептиды
Пептиды синтезировали с использованием многоконтактного (multi-pin) формата от Mimotopes (Adelaide, Australia). Последовательности V областей легкой и тяжелой цепи D2E7 синтезировали в виде 15-мерных пептидов, перекрывающихся на 12 аминокислот (Фиг.1 и Таблица 1), в общей сложности для 69 пептидов. Пептиды прибывали в лиофилизированной форме и были ресуспендированы в DMSO (диметилсульфоксид) (Sigma-Aldrich) приблизительно в концентрации 1-2 мг/мл. Маточные растворы пептидов хранили замороженными при -20°С.
8.1.2 Человеческие мононуклеары периферической крови
Продукты лейкоцитарной пленки общественных доноров приобретали у Standford Blood Center, Palo Alto, CA. Вещество лейкоцитарной пленки разводили 1:1 (об.:об.) DPBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко), не содержащим кальций или магний. Разбавленное вещество лейкоцитарной пленки (25-35 мл) подслаивали в 50 мл конические центрифужные пробирки (Sarsted или Costar) с 12,5 мл FicollPaque-PLUS (GE Healthcare). Образцы центрифугировали при 900 g в течение 30 минут при комнатной температуре. Мононуклеары периферической крови (РВМС) собирали с поверхности. Добавляли DPBS для доведения конечного объема до 50 мл, и клетки центрифугировали при 350 g в течение 5 минут. Осажденные клетки ресуспендировали в DPBS и подсчитывали.
8.1.3 Дендритные клетки
8
7
2
2
Для выделения дендритных клеток в культуральные колбы Т75 (Costar) высевали 10 свежеизолированных РВМС в общем объеме среды AIM V (Invitrogen) 30 мл. Избыток РВМС замораживали при -80°С в 90%-ной фетальной телячей сыворотке (FCS), 10% DMSO в концентрации 5 х 10клеток/мл. Колбы Т75-инкубировали при 37°С в 5% CO в течение 2 часов. Неприкрепленные клетки удаляли и прикрепленный монослой промывали DPBS. Для различения дендритных клеток и моноцитов добавляли 30 мл среды AIM V, содержащих 800 единиц/мл GM-CSF (R and D Systems) и 500 единиц/мл IL-4 (R and D Systems). Колбы инкубировали в течение 5 суток. На сутки 5 добавляли IL-1a (Endogen) и TNF-α (Endogen) до 50 пг/мл и 0,2 нг/мл. Колбы инкубировали в течение еще двух суток. На сутки 7 собирали дендритные клетки добавлением 3 мл 100 мМ EDTA, содержащего от 0,5 до 1,0 мг митомицина С (Sigma-Aldrich), до конечной концентрации 10 мМ EDTA и от 16,5 до 33 мкг/мл митомицина С. В качестве альтернативы, дендритные клетки можно облучить 4000 рад (40 Гр) для фиксации. Колбы инкубировали еще один час при 37°С и 5% CO. Дендритные клетки собирали и промывали в среде AIM V 2-3 раза.
8.1.4 Культура клеток
5
4
На сутки 7 ранее замороженные аутологические РВМС быстро размораживали на водяной бане при 37°С. Клетки немедленно разводили в DPBS или среде AIM V и центрифугировали при 350 g в течение 5 минут. Клетки CD4+ обогащали путем негативной селекции с использованием магнитных шариков (набор Easy-Sep CD4+, Stem Cell Technologies). Аутологические CD4+ Т-клетки и дендритные клетки сокультивировали при 2×10 CD4+Т-клеток на 2×10 дендритных клеток на лунку в 96-луночных круглодонных планшетах (Costar 9077). Пептиды добавляли в концентрации приблизительно 5 мкг/мл. Контрольные лунки содержали только носитель DMSO (Sigma) в концентрации 0,25% об./об. Лунки положительного контроля содержали 0,25% DMSO и столбнячный анатоксин (List Biologicals или CalBioChem) в концентрации 1 мкг/мл. Культуры инкубировали в течение 5 суток. На сутки 5 добавляли 0,25 мкКи меченного тритием тимидина на лунку (Amersham или GE Healthcare). Культуры собирали на сутки 6 на фильтровальные подложки с использованием клеточного коллектора Packard Filtemnate. Сцинтилляционный подсчет проводили с использованием сцинтилляционного счетчика Wallac MicroBeta 1450 (Perkin Elmer).
8.7.5 Анализы данных
Средние фоновые значения СРМ (число импульсов в минуту) рассчитывали. путем усреднения индивидуальных результатов от 6 до 12 повторностей. Значения СМР четырех лунок положительного контроля усредняли. Значения для лунок с двойной повторностью или тройной повторностью для каждого пептида усредняли. Значения индекса стимуляции для лунок положительного контроля и лунок с пептидами рассчитывали путем деления средних экспериментальных значений СРМ на средние контрольные значения. Для того, чтобы быть включенным в набор данных, требовался индекс стимуляции больший, чем 3,0 в лунках положительного контроля со столбнячным анатоксином. Отмечали ответ для любого пептида, приводящий к индексу стимуляции 2,95 или выше. Пептиды тестировали с использованием образцов периферической крови от группы из 81 донора. Собирали ответы на все пептиды. Для каждого протестированного пептида рассчитывали процентную долю от группы доноров, которая отвечала с индексом стимуляции 2,95 или выше. Дополнительно рассчитывали средний индекс стимуляции для всех доноров.
8.7.6 Анализ генотипа HLA
Для каждого донора определяли аллели HLA DRB1 и HLA DQB1, используя имеющиеся в продаже наборы для типирования Dynal RELI (Invitrogen, UK). Представлены результаты по SSO (олигонуклеотиды, специфичные к последовательности) низкой точности. Определяли ассоциации HLA в отношении чувствительности к любому данному пептиду, используя критерий хи-квадрат (одна степень свободы). При присутствии аллеля как в популяции респондеров, так и в популяции нереспондеров, сообщали величину относительного риска.
8.7.7. Конкурентный ELISA антител-вариантов D2E7
TNF-α прикрепляли на планшет с микролунками путем приведения в контакт планшета с раствором TNF-α в концентрации 1 мкг/мл в PBS в течение ночи при 4°С. Планшет промывали в 0,1%-ном Tween 20 в PBS и блокировали в Superblock (Thermo Scientific, Rockford, IL). В лунки добавляли смесь субнасыщающего количества биотинилированного D2E7 (80 нг/мл) и немеченого D2E7 («контрольное» антитело) или конкурирующего антитела против TNF-α («тестируемое» антитело) в серийном разведении (в концентрации 2,8 мкг/мл, 8,3 мкг/мл или 25 мкг/мл) в буфере ELISA (например 1% BSA и 0,1% Tween 20 в PBS) и планшеты инкубировали в течение 1 часа при легком встряхивании. Планшет промывали, в каждую лунку добавляли 1 мкг/мл стрептавидина, конъюгированного с HRP, разведенного в буфере ELISA, и планшеты инкубировали в течение 1 часа. Планшеты промывали и связанные антитела детектировали добавлением ТМВ (Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD). Реакцию завершали добавлением останавливающего буфера (например Bio FX Stop Reagents, Biofx Laboratories Inc., Owings Mills, MD) и поглощение измеряли при 650 нм, используя устройство для считывания микропланшетов (например VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Значения HKso рассчитывали для каждого антитела. Данный эксперимент проводили три раза и средние результаты показаны как процент от результата связывания родительского антитела.
8.1.8 Биоанализ
4
2
2
2
50
3×10 мышиных клеток L929 высевали в отдельные лунки плоскодонного 96-луночного планшета для микротитрования. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в инкубаторе с увлажненным 5% CO. На следующие сутки готовили серийные разведения антитела против TNF-α (например 0,712 мкг/мл, 0,949 мкг/мл, 1,27 мкг/мл, 1,69 мкг/мл, 2,25 мкг/мл или 3 мкг/мл) в 25 мкл среды, не содержащей сыворотку, и добавляли к клеткам (так, что конечная концентрация в 150 мкл культуры составляла 119 нг/мл, 158 нг/мл, 211 нг/мл, 282 нг/мл, 375 нг/мл или 500 нг/мл). После 2-часовой инкубации при 37°С в 5% CO добавляли 25 мкл 240 нг/мл раствора TNF-α до конечной концентрации 40 нг/мл и клетки дополнительно инкубировали в течение 48 часов при 37°С в 5% CO. Лунки оценивали на цитотоксичность по сравнению с контрольными планшетами, которые обрабатывали TNF-α, но инкубировали с изотипическим контрольным антителом или с родительским антителом, D2E7), используя анализ жизнеспособности CellTiter-Blue (Promega, Madison, WI). Определяли значения ИК и выражали как процент от результата родительского D2E7.
8.1.9 Кинетический анализ вариантов D2E7 посредством BIAcore
3
4
Аффинности связывания антител против TNF-α измеряли с использованием системы поверхностного плазменного резонанса BIAcore 2000 и 3000 (BIAcore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Поликлональное антитело козы против человеческого Fc (Jackson Immunoresearch) сначала иммобилизировали на поверхности биосенсора с использованием стандартных для BIAcore аминных связывающих реагентов (N-этил-N'-диметиламино-пропилкарбодиимид, EDC; N-гидроксисукцинимид, NHS; и этаноламин HCl, рН 8,5) с последующим захватом антител против TNF-α (D2E7 и вариантов D2E7) на параллельных поверхностях при низкой скорости потока 5 мкл/мин. RL поддерживали на низком уровне для достижения низкого Rmax 25-60 RU (единицы резонанса). Захват антитела не осуществлялся на контрольной поверхности, для того чтобы она служила в качестве отрицательного контроля. Затем TNF-α инъецировали во все проточные ячейки при скорости потока 80 мкл/мин в течение трех минут для отслеживания ассоциации, с последующим 30-минутным потоком проточного буфера HBS-P (10 мМ HEPES, 150 мМ хлорид натрия, 0,005% Р-20, рН 7,4) для отслеживания фазы диссоциации. В каждом цикле над поверхностью инъецировали TNF-α (R&D Systems, Minneapolis, MN) в 6 разных концентрациях TNF, варьирующих от 0 нМ до 128 и с четырехкратными инкрементами. Поверхность регенерировали 1,5% HPO при скорости потока 100 мкл/мин двумя короткими импульсами в конце каждого цикла.
D
on
off
Кинетику связывания каждой пары TNF-α и антитела рассчитывали из общего анализа данных сенсограммы, полученных с разными концентрациями TNF-α, используя программу BIAevaluate. В каждом анализе применяли двойной контроль для устранения фоновых ответов от контрольной поверхности и контроля только буфера (0 нМ TNF-α). Константы диссоциации (K), константы скорости ассоциации (k) и константы скорости диссоциации (k) каждой пары связывания получали путем одновременного приближения (fitting) фаз ассоциации и диссоциации сенсограммы с использованием связывания 1:1 по Лангмюру с моделью переноса массы. Каждую группу экспериментов проводили по-отдельности 3 раза.
8.2 РЕЗУЛЬТАТЫ
8.2.1 Идентификация эпитопов CD4+ Т-клеток в областях VH и VL D2E7
Пептиды эпитопов CD4+ Т-клеток идентифицировали анализом процента ответов на пептиды в пределах группы из 81 донора. Средний процент ответа и стандартное отклонение рассчитывали для всех протестированных пептидов, описывающих тяжелую цепь и легкую цепь D2E7. Величина ответа, большая чем средний фоновый ответ плюс три стандартных отклонения или равный среднему фоновому ответу плюс три стандартных отклонения, рассматривалась как показатель потенциального эпитопа CD4+ Т-клеток. Для V области легкой цепи D2E7 протестировали 32 пептида (Фиг.2), в результате чего средний фоновый процент ответа составил 5,09+3,53%. Определили, что три стандартных отклонения выше фона составляют 15,68%. Один пептид в положении 8 демонстрировал этот уровень ответа в наборе данных для пептидов легкой цепи D2E7 с величиной ответа 17,28% (Фиг.2). Кроме того, пептид в положении 11 демонстрировал очень высокую величину ответа - 12,35%. Для V области тяжелой цепи D2E7 протестировали 37 пептидов (Фиг.3). Средний фоновый процент ответа составил 2,64+2,04%. Три стандартных отклонения выше фона составили 8,78%. Для одного пептида в пределах набора данных для тяжелой цепи D2E7, #20, процент ответа достиг 8,64% (Фиг.3).
Средний индекс стимуляции рассчитывали для всех пептидов в наборе данных. Пептид #8 легкой цепи имел высокий средний индекс стимуляции 1,97+0,08 s.e.m. (стандартная ошибка среднего). Пептид в положении #11 давал средний индекс стимуляции 1,63+0,32 s.e.m. Пептид #27 в наборе данных для легкой цепи имел средний ИС (индекс стимуляции) 1,83. Это обусловлено одним донором с необычно высоким индексом стимуляции 29 в отношении данного пептида. Пептид #20 тяжелой цепи имел среднее значение индекса стимуляции 1,34+0,05 s.e.m. Все эти значения значительно выше, чем средний индекс стимуляции для всех пептидов в двух наборах данных (1,02+0,02 для всех 68 пептидов тяжелой цепи и легкой цепи).
Эти данные указывают на то, что в D2E7 имеются две главные области эпитопов CD4+ Т-клеток (Таблица 2). В области VH эпитоп находится в положении 20 пептида, который охватывает соединение каркаса 2 и CDR2. В Таблице 2 подчеркнуты аминокислоты, происходящие из CDR. В легкой цепи большая область, которая может содержать более чем один эпитоп CD4+ Т-клеток, включает пептиды #8 и #11. Эти пептиды перекрывают отрезок каркаса 1, CDR1 и каркаса 2 легкой цепи.
8.2.2 Ассоциации HLA с ответами на пептиды эпитопов VL
Генотипы HLA класса II всех 81 доноров в наборе данных пептидов определяли с использованием способа на основе ПЦР с SSO низкой точности. Ассоциации между присутствием конкретного аллеля HLA и ответами на два пептида VL определяли посредством критерия хи-квадрат. Для всех типов HLA и обоих пептидов определяли значения Р Фишера и относительные риски (Таблица 3). Отсутствовали значимые корреляции между каким-либо типом HLA, DR или DQ, и ответом на пептид VL #8 (T22-Y36). Этот результат свидетельствует о том, что данный пептид способен связываться с молекулами HLA класса II по большей части случайным образом. Пролиферативные ответы CD4+ Т-клеток на пептид #11 VL (N31-K45) были тесно связаны с присутствием HLA-DQ2 (р=0,003; относительный риск=7.7). Поскольку HLA-DR3 находится в неравновесном состоянии связывания с HLA-DQ2, ассоциация между ответом на этот пептид и HLA-DR3 присутствовала, но не достигала статистической значимости (р=0,10; относительный риск 3,3). Помимо HLA-DQ2, была обнаружена ассоциация между HLA-DR12 и ответом на N31-K45 (р=0,03; относительный риск 5,2). Ответы HLA на пептид #20 VH не тестировали, так как в общей сложности было слишком мало респондеров. Поскольку респондеры на два пептида VL были обособленными, можно заключить, что они представляют два отдельных пептидных эпитопа. Следовательно, область VH и VL D2E7 содержит три выраженные области пептидных эпитопов.
8.2.3 Идентификация вариантов с пониженной иммуногенностью
Модификации аланинового сканирования: Последовательность легкой цепи D2E7 из двадцати одной аминокислоты охватывает эпитопы в T22-Y36 и N31-K45. Выбранной последовательностью из двадцати одной аминокислоты была С23-Л45. Аланиновые модификации включали по каждой аминокислоте (Таблица 4). Группу из 99 доноров тестировали с вариантами пептидов (Фиг.4). В пределах набора пептидов родительский 21-мер был создан 4 раза. Эти четыре повторности служат в качестве контроля воспроизводимости данного анализа. Средний ответ родительского пептида составлял 8,3% с CV% 30%. Следовательно, варианты пептидов со средним процентом менее чем 5,8% могли бы рассматриваться как имеющие пониженную величину ответа. Вариантами с наибольшим снижением были С23А (2,02%) и Р40А (3,03%, смотрите Фиг.4). Цистеин в положении 23 является инвариантным и, следовательно, не является хорошим кандидатом для модификации в целом белке. Из-за уникальной природы остатков пролина модификация этого остатка также, вероятно, не приведет к функциональному варианту антитела. Третьим кандидатом был бы Y32A (4,04%). Дополнительно, существует целый ряд вариантов, которые приводили к средней величине ответа 5,05%. Эти изменения также могли бы быть эффективными, но потребовали бы тестирования в составе целых молекул белка как на пониженную иммуногенность, так и на функциональную активность.
Также был протестирован набор пептидов, модифицированных аланином, на основе последовательности пептида эпитопа VH D2E7 (данные не показаны). Величина ответа родительского немодифицированного пептида в повторном тесте была очень низкой. Следовательно, этот пептид больше не исследовали.
Исследование связывания антигена: Участок CDR-L1 антитела D2E7 подвергали исчерпывающему мутационному анализу. На основе исследований по связыванию антигена, проведенных в сочетании с мутационным анализом, был идентифицирован набор аминокислотных замен-кандидатов в пределах участка CDR-L1, которые значимо не снижают аффинность данного антитела к TNF-α (Таблица 5). Несколько вариантов антител, содержащих замены-кандидаты в CDR-L1, анализировали с использованием BIAcore и ELISA (Таблица 6). Генерировали пептиды, содержащие аминокислотные модификации в участке CDR-L1, которые имеют свойство изменения аминокислотной последовательности при сохранении аффинности всей молекулы антитела (Таблица 7). Модифицированные пептиды-эпитопы тестировали в виде модификаций одиночных аминокислот или в виде двойных модификаций. Двойные модификации содержали глутамин или глицин в положении 32, или серин или глицин в положении 34. Всего протестировали 79 пептидов, включая два синтетических родительских 21-мерных пептида. Всего протестировали 102 доноров с вариантами пептидов, и результаты показаны на Фиг.5. Средний процент ответа родительских пептидов составлял 10,3+2,1%. Для того, чтобы величина процента ответа была меньше 3 стандартных отклонений от родительского, данная величина ответа должна была бы составлять меньше 4%. Средний индекс стимуляции для родительских пептидов составлял 1,49+0,15. Для того, чтобы индекс стимуляции достигал трех стандартных отклонений ниже родительского ответа, он должен был бы составлять 1,03 или ниже.
Последующие измерения аффинности мутаций Y32G и Y32Q показали, что эта аминокислотная модификация имела негативное влияние на связывание антигена. Следовательно, все пептиды, несущие эту модификацию, были удалены из анализа. Всего 10 пептидов выбрали для дальнейшего исследования. Все выбранные пептиды имели величину ответа меньше, чем 4%. Однако ни один из данных пептидов не демонстрировал индексы стимуляции, меньшие на 3 стандартных отклонения, чем средний родительский ответ (Таблица 8).
5.2.4 Тестирование аффинности и биоактивности модифицированных антител-вариантов D2E7
1
Десять конструкций вариантов области VL D2E7 наряду с немодифицированной областью VH клонировали в человеческую плазмиду, содержащую IgG, экспрессируемую в клеточных линиях 293Т/17, путем временной трансфекции, и антитела очищали на основании аффинности к Protein А или Protein G. Очищенные антитела тестировали на связывание TNF-α в анализе конкурентным ELISA. Все десять вариантов конкурировали за связывание TNF-α с немодифицированным антителом D2E7. Однако был выявоен диапазон аффинностей: от приблизительно эквивалентной аффиности варианта Q27R+A34S до 10-кратного снижения аффинности у варианта N318+A34S (Фиг.6).
50
Проводили биопробу токсичности TNF-α. Клетки L292 высевали в 96-луночные планшеты и добавляли в культуральную среду TNF-α в постоянной концентрации. Данную среду титровали антителами-вариантами. Для каждого варианта определяли значение EC (Таблица 9). Аналогично вариант Q27R+A34S демонстрировал значение ЕСво приблизительно эквивалентное родительскому антителу D2E7.
Наконец, аффинность антител в отношении TNF-α определяли анализом BIAcore (Таблица 10). Из десяти протестированных вариантов все варианты Q27H+A34S, Q27R+A34S и G28S+A34S демонстрировали скорости ассоциации и диссоциации, аналогичные D2E7. Конечные значения аффинности для вариантов находились в 130 пМ интервале по сравнению с D2E7 с измеренной в этих экспериментах аффинностью 114 пМ.
9. ПРИМЕР 2: ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВАРИАНТОВ D2E7 С ПОВЫШЕННОЙ АФФИННОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ TNF-α
Антитело D2E7 подвергали исчерпывающему мутационному анализу для идентификации мутантов, которые имели повышенную аффинность к TNF-α по сравнению с D2E7. Повышенную аффинность мутантов-кандидатов к TNF-α анализировали ELISA и BIAcore для подтверждения их характеристик по сравнению с D2E7.
9.1 МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
9.1.1 КОНКУРЕНТНЫЙ ELISA
Анализы конкурентным ELISA проводили как описано в Разделе 8.1.7. ELISA повторяли дважды, и средняя кратность улучшения ИКбо показана как WT/x.
9.1.2 BIAcore
Анализы BIAcore проводили как описано в Разделе 8.1.9.
9.2 РЕЗУЛЬТАТЫ
D
Варианты CDR D2E7 имели улучшенную K (измеренную BIAcore), улучшенную способность конкурировать в ELISA или и то, и другое относительно D2E7, как показано в Таблицах 12 и 25.
10. КОНКРЕТНЫЕ ВОПЛОЩЕНИЯ. ЦИТИРОВАНИЕ ССЫЛОК
Все публикации, патенты, патентные заявки и другие документы, процитированные в этой заявке, являются тем самым включенными посредством ссылки во всей их полноте для всех целей в такой же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент, патентная заявка или другой документ были бы индивидуально указаны как включенные посредством ссылки для всех целей.
В то время как были проиллюстрированы и описаны разные конкретные воплощения, будет понятно, что можно сделать разные изменения без отступления от сущности и объема изобретения (изобретений).