Противоопухолевый эффект апоптин-продуцирующего рекомбинантного штамма вируса осповакцины in vivo связан с блокированием митотического деления опухолевых клеток

23. Instruction for medical use drug Dioxidine, registration number: P №002534 02—2003 dated 10.04.2008.

M.S. Mazanko', VA. Chistyakov1,3, E.V. Prazdnova1, I.O. Pokudina', M.N. Churilov1, V.K. Chmyhalo1, M.M. Batyushin2

DIOXIDINE INDUCE ANTIBIOTIC-RESISTANT BACTERIA

Southern Federal University, the Academy of Biology and Biotechnology n.a. D.I. Ivanovsky, 2Rostov State Medical University 3Rostov Research Institute of Biotechnology

The ability of dioxidine to cause the formation of antibiotic resistance in bacteria was investigated. The study was conducted through the bioluminescence test using recombinant strains of Escherichia coli MG 1655 (pSoxS-lux), MG1655 (pKatG-lux), MG1655 (pRecA-lux), MG1655 (pColD-lux), whose genome contains a plasmid with operon luxCD-ABE from photobacteria Photorhabdus luminescens under the control of the appropriate stress-inducible promoters of E. coli. Classical methods of resistance mutation frequency determination were also allowed in non-pathogenic and conditionally-pathogenic strains of Escherichia coli, Bacillus amyloliquefaciens and Klebsiella pneumoniae. It is shown that dioxidine can cause induction of the promoters

PrecA and Pcda in Escherichia coli MG 1655, which indicates the induction of SOS-response in the bacterial cell. Induction of Pcda promoter was higher than of PrecA. The maximum induction was observed under the action of 2,25 • 10-5 M dioxidine solution. The drug also causes increased induction of psoxS and pkatG promoters, reacting to the presence of superoxide anion radical and hydrogen peroxide. That allows suggesting the possible involvement of oxidative mechanisms in DNA-damaging action of dioxidine. Maximum induction ratio was also registered at a concentration of 2,25 • 10"5 M.

Dioxidine induces antibiotic resistance mutations in all studied strains of bacteria. The increasing in a the frequency of mutations have been reported for rifampicin resistance (twice), ciprofloxacin (up to six times) and azithromycin (four times). Based on these data, the antibiotic designation is necessary to conduct antibiogram for all patients who take, or ever took dioxidine. Keywords: antibiotic resistance, lux-biosensors, mutagenesis frequency, dioxidine

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-149-154

For correspondence: Mazanko Maria sergeevna, a senior researcher at the laboratory of experimental mutagenesis, Academy of biology and biotechnology, Southern Federal University

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 578.821.51:578.1].083.2:615.277.3

Зонов Е.В.1, Кочнева Г.В.2, Тупицына А.В.1, Рябчикова Е.И.1

противоопухолевый эффект апоптин-продуцирующего рекомбинантного штамма вируса осповакцины IN VIVO свяэан

с блокированием митотического деления опухолевых клеток

'Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии наук, 630090,

Новосибирск, Россия;

2Государственный научный Центр биотехнологии и вирусологии «Вектор», 630559, Кольцово, Россия

Вирус осповакцины (ВОВ) обладает природной онколитической активностью, для усиления которой в геном вируса встраивают гены, кодирующие различные эффекторные молекулы, в частности, индуцирующие апоптоз опухолевых клеток. Одним из таких трансгенов является белок апоптин. Цель данной работы: изучить на модели сингенной опухоли мышей противоопухолевое действие рекомбинантного апоптин-продуцирующего штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ.

Мышам линии С57В1 подкожно или внутрибрюшинно прививали мышиную карциному Эрлиха, после формирования опухолей однократно интратуморально вводили 107 БОЕ/мышь штамма VVdGF-ApoS24/2, мышам контрольной группы вводили 0.9% раствор ЫаС1. Животных выводили из эксперимента в различные сроки после введения ВОВ. Образцы опухолевых узлов и клетки асцитической жидкости фиксировали в 4% параформальдегиде, проводили светооптическое, иммуноги-стохимическое и ультраструктурное исследование опухолей; определяли титр вируса в опухолевых клетках методом БОЕ. Штамм VVdGF-ApoS24/2 ВОВ вызывал отчетливое уменьшение объема и солидной, и асцитной карцином Эрлиха по сравнению с опухолями мышей группы контроля, несмотря на низкий уровень репродукции вируса в опухолевых клетках. Противоопухолевый эффект штамма VVdGF-ApoS24/2 не был связан с вирус-индуцированными деструкцией, некрозом и апоптозом опухолевых клеток, а также с накоплением эффекторных клеток иммунной системы в опухолях. На срезах карциномы наблюдалось снижение числа опухолевых клеток в состоянии митоза, а анализ количества Кь67- и РСЫА-позитивных клеток показал, что штамм VVdGF-ApoS24/2

Для корреспонденции: Рябчикова Елена Ивановна, д-р биол. наук, профессор, руководитель группы микроскопических исследований, Институт химической биологии и фундаментальной Медицины СО РАН, E-mail: lenryab@yandex.ru.

останавливает клеточный цикл в S-фазе, тормозя деление опухолевых клеток и замедляя рост опухоли. Полученные результаты свидетельствуют, что встройка гена, кодирующего апоптин, в геном исходного штамма Л-ИВП ВОВ усиливает его способность останавливать клеточный цикл опухолевых клеток карциномы Эрлиха.

Ключевые слова: рекомбинантный вирус осповакцины, апоптин, онколитическое действие, карцинома Эрлиха.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-154-159 Введение

Противоопухолевые свойства ряда вирусов, получивших название онколитических (ОВ), описаны в многочисленных публикациях [1—3]. Одним из перспективных ОВ является вирус осповакцины (ВОВ), природные онколитические свойства которого отмечены много лет назад [4]. Современные исследования направлены на усиление эффекторных свойств ВОВ, в том числе — путем встройки в его геном трансгенов, индуцирующих апоптоз опухолевых клеток, например, гена апоптина, кодирующего неструктурный белок вируса анемии цыплят, который избирательно индуцирует апоптоз в опухолевых клетках [5]. В ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» был сконструирован рекомбинантный штамм ВОВ VVdGF-ApoS24/2, несущий ген апоптина и делецию гена вирусного ростового фактора, обладающий усиленным онколитическим действием на опухолевые клетки in vitro по сравнению с исходным штаммом Л-ИВП [6]. Сравнительное изучение противоопухолевого действия этого штамма с исходным штаммом Л-ИВП на модели карциномы человека А431, привитой

иммунодефицитным мышам nude, показало более выраженный эффект рекомбинантного штамма, связанный с особенностями его взаимодействия со структурами опухолевых клеток [7]. Принимая во внимание, что мыши nude иммунодефицитны, было интересно исследовать действие рекомбинанта VVdGF-ApoS24/2 на опухоль у животных с полноценной иммунной системой.

Цель данной работы: изучить на модели сингенной опухоли мышей противоопухолевое действие штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ, продуцирующего белок апоп-тин, который избирательно вызывает апоптоз опухолевых клеток.

Материал и методы

Исходный штамм ВОВ Л-ИВП получен из Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Вирус клонирован и прошел 6 пассажей на культуре клеток почки африканской зеленой мартышки CV-1. Полная геномная последовательность штамма Л-ИВП депонирована в базе данных GenBank под номером KP233807. Подготовку вирусного препарата штамма Л-ИВП проводили как описано в [8]. Вирусный препарат рекомбинантного штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ, конструирование которого описано ранее [6], готовили аналогично препарату для введения в ксе-нографты карциномы А431 [7]. Вирусные препараты имели инфекционную активность 109 БОЕ/мл, необходимое для экспериментов количество образцов в стерильном 0,9% растворе NaCl хранили при -80 °C.

Для получения солидной опухоли самцам мышей линии C57B1 (массой 22—25 г) в правое бедро подкожно вводили 13^106 клеток мышиной карциномы Эрлиха в 0,4 мл 0,9% раствора NaCl. Через 7 сут мышам (17 особей) однократно интра-туморально вводили рекомбинантный вирус VVdGF-ApoS24/2 в дозе М07 БОЕ/мышь в 100 мкл 0,9% раствора NaCl, а мышам (17 особей) контрольной группы — 100 мкл 0,9% раствора NaCl. Регулярно измеряли объем опухолевых узлов как описано в [7]. Мышей выводили из эксперимента через 2; 4; 6; 8,; 12 и 14 сут после введения вируса, иссекали опухолевые узлы и фиксировали в 4% растворе параформальдегида.

Для получения асцитной формы опухоли самкам мышей линии C57Bl (массой тела 22—25 г) внутрибрюшинно вводили 3—3,5Ч06 клеток карциномы Эрлиха в 0,2 мл 0,9% раствора NaCl. Через 4 сут мышам (15 особей) интраперитонеально вводили штамм VVdGF-ApoS24/2 в дозе 1,6^107 БОЕ/мышь в 100 мкл 0,9% раствора NaCl, мышам контрольной группы (10 особей) — 100 мкл 0,9% раствора NaCl. Мышей выводили из эксперимента через 3; 6; 9 и 10 сут после введения вируса, отбирали асцитическую жидкость, осаждали опухолевые клетки центрифугированием, клетки промывали 0,9% раствором NaCl и обрабатывали для светооптического и ультраструктурного исследований, как описано в [8]. Исследования на животных проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г. № 755).

Парафиновые срезы опухолевых узлов и клеток карциномы Эрлиха асцитической жидкости готовили на микротоме Leica RM2255 (Leica, Германия). Иммуногистохимические реакции с антителами к белкам Ki-67 (Abcam, Великобритания) и PCNA (BioLegend, США) проводили в соответствии с рекомендациями производителей. Выявление на парафиновых срезах белка апоп-тина проводили, как описано в [7]. Парафиновые срезы изучали с помощью светового микроскопа Leica DM 2500 (Leica, Германия), оснащенного цифровой камерой Leica DFC420 C (Leica, Германия). Количество клеток в состоянии митоза и клеток, позитивных в реакции с антителами к белкам Ki-67 или PCNA, на парафиновых срезах подсчитывали при 400-кратном увеличении на 10 случайно выбранных полях зрения, учитывали не менее 2000 клеток для каждой временной точки эксперимента.

Для электронно-микроскопического исследования образцы опухолевых узлов и осадки опухолевых клеток асцитической жидкости обрабатывали стандартными методами [7]. Ультратонкие срезы получали с помощью ультратома Leica EM UC7 (Leica, Германия) и изучали в электронном микроскопе JEM 1400 (Jeol,

Япония). Электронограммы получали с помощью цифровой камеры бокового ввода Veleta (Olympus Corporation, Япония).

Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения Statistica 8.0.360.0. Значимость различий определяли с помощью метода Манна—Уитни—Вилкоксона (С-критерий).

Результаты и обсуждение

Однократное введение штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ в карциному Эрлиха у мышей приводило к уменьшению средних размеров опухолевых узлов по сравнению с введением 0,9% раствора NaCl (рис. 1). В отличие от ксенографтов карциномы А431, в клетках которых происходило активное размножение штамма VVdGF-ApoS24/2 [7], в клетках опухолевых узлов карциномы Эрлиха при микроскопическом исследовании признаки размножения вируса обнаружить не удалось. Выявление вируса методом титрования оказалось невозможным из-за структуры опухоли, узлы которой не имеют четкой границы, клетки прорастают между мышечных волокон. Штамм VVdGF-ApoS24/2 ВОВ не оказывал прямого деструктивного действия на карциному Эрлиха. В ткани опухолевых узлов не отмечалось увеличения количества опухолевых клеток в состоянии некроза или апоптоза, а также признаков повреждения кровеносных сосудов.

Известно, что компонентом противоопухолевого действия вирусов могут быть иммунные реакции, приводящие к разрушению опухолевых клеток [9]. Чтобы проверить, стимулирует ли штамм VVdGF-ApoS24/2 миграцию эффекторных клеток иммунной системы в ткань опухоли, на парафиновых срезах иммуногистохи-мически (рис. 2) выявляли Т-клетки (CD3-позитивные клетки), моноциты и гранулоциты (CDllb-позитивные клетки). Количество и локализация CD11b- и CD3-позитивных клеток в ткани карциномы Эрлиха мышей, получавших штамм VVdGF-ApoS24/2, не отличались от таковых у мышей после введения 0,9% раствора NaCl. Аналогичные данные были получены при введении мышам с карциномой Эрлиха исходного, не рекомбинант-ного штамма Л-ИВП ВОВ [8]. Таким образом, введение штамма VVdGF-ApoS24/2 не усиливало миграцию эф-фекторных клеток иммунной системы в ткань опухолевого узла по сравнению с введением 0,9% раствора NaCl, что исключило данный механизм из числа компонентов противоопухолевого эффекта рекомбинанта.

Мы предположили, что штамм VVdGF-ApoS24/2 может влиять на деление клеток карциномы Эрлиха и

Рис. 1. Изменение объема опухолевых узлов карциномы Эрлиха у мышей линии С57В1 после введения штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ и 0,9% раствора №С1

По оси абсцисс — время после введения вируса, сут; по оси ординат — объем опухолевых узлов карциномы Эрлиха, см3.

Рис. 2. Парафиновые срезы карциномы Эрлиха у мышей линии С57В1.

а, б — моноциты и гранулоциты (анти-CD11b антитела) через 8 сут после введения штамма VVdGF-ApoS24/2 (а) и 0,9% раствора ПС1 (б); в, г — Т-лимфоциты (анти-CD3 антитела) через 4 сут после введения штамма VVdGF-ApoS24/2 (В) и 0,9% раствора МаС1 (Г). Стрелками показаны скопления моноцитов и гранулоцитов (А, Б), Т-лимфоцитов (В, Г). Иммуногистохимические реакции, хромоген АЕС, докраска гематоксилином

таким образом замедлять рост опухоли. Визуальная оценка встречаемости митозов в ткани узлов карциномы Эрлиха указывала на снижение количества клеток в состоянии митоза. Однако корректный подсчет клеток в состоянии митоза на парафиновых срезах был невозможен из-за особенностей строения опухоли, которые не позволяют выбрать адекватные участки срезов разных опухолей для сравнения. Чтобы обойти эти сложности, последующие исследования проводили на карциноме Эрлиха в асцитной форме.

Основной макроскопической характеристикой развития асцитной формы опухоли в перитонеальной полости мышей является длина окружности брюха, или «объем брюха». Прямые измерения показали, что однократное внутрибрюшинное введение штамма VVdGF-ApoS24/2 приводит к значительному уменьшению объема брюха у мышей по сравнению с введением 0,9% раствора ПС1 (рис. 3, а). Электронно-микроскопическое исследование асцитной карциномы Эрлиха после введения вируса обнаружило в цитоплазме некоторых клеток локусы зернистой вироплазмы, скопления зрелых и незрелых частиц ВОВ, что свидетельствует о размножении вируса (рис. 3, б, в). Число инфицированных рекомбинантом клеток было очень невелико и оценивалось как 1:10 000 клеток. Морфологические характеристики репликации штамма VVdGF-ApoS24/2 не отличались от описанных ранее [7].

Оценка количества клеток асцитной карциномы Эр-лиха, в которых размножается штамм VVdGF-ApoS24/2 ВОВ, с помощью электронной микроскопии недостаточно точна, поскольку ультратонкий срез позволяет учесть сравнительно небольшое (около 300) количество клеток, на парафиновых срезах можно провести оценку с большей точностью. Количество зараженных клеток, выявляемых иммуногистохимически по экспрессии апоптина (рис. 3, г), который является однозначным маркером размножения штамма VVdGF-ApoS24/2 в клетке, состав-

ляло 4—5: 1000 клеток асцитной карциномы Эрлиха. Титрование вируса в асцитической жидкости мышей показало низкий уровень его репродукции: в большинстве случаев титр составляет около 102 БОЕ/мл асцитической жидкости (табл. 1), что подтверждает данные микроскопических исследований и наблюдаемое отсутствие вирус-индуцированной деструкции опухолевых клеток.

Прямой подсчет клеток асцитной карциномы Эрли-ха в состоянии митоза на парафиновых срезах выявил значительное снижение митотической активности после однократного введения штамма VVdGF-ApoS24/2 по сравнению с введением 0,9% раствора №С1 (рис. 4, а). Для изучения механизма снижения митотической активности клеток карциномы Эрлиха, вызванного штаммом VVdGF-ApoS24/2, были проанализированы изменения клеточного цикла. Иммуногистохимические реакции с антителами к белкам Кь67 (маркер клеток, находящихся в активной фазе клеточного цикла [10]) и PCNA (маркер S-фазы клеточного цикла [11]) выявили значительное увеличение количества К1-67- и PCNA-позитивных клеток по сравнению с введением 0,9% раствора №0 (рис. 5). Накопление Кь67- и PCNA-позитивных клеток наряду со снижением митотической активности свидетельствует о торможении S-фазы клеточного цикла под действием штамма VVdGF-ApoS24/2.

Для оценки влияния встройки гена апоптина на противоопухолевые свойства исходного штамма Л-ИВП, описанные нами ранее [8], мы сравнили количество клеток карциномы Эрлиха в состоянии митоза, Ю-67- и PCNA-позитивных клеток после введения мышам рекомбинантного ВОВ и после введения штамма Л-ИВП. Встройка гена апоптина не оказывала влияния на митотическую активность клеток асцит-ной карциномы Эрлиха (табл. 2), тогда как количество Ю-67- и PCNA-позитивных клеток после введения ре-комбинантного ВОВ было значимо выше (р < 0,05),

Рис. 3. Действие штамма VVdGFApoS24/2 ВОВ на асцитную карциному Эрлиха. а) — изменение объема брюха мышей линии С57В1 с асцитной карциномой Эрлиха после введения штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ и 0,9% раствора ПС1. а) — по оси абсцисс — время после введения вируса, сут; по оси ординат — длина окружности брюха мышей, мм.; б, в) — ультратонкие срезы клеток асцитной карциномы Эрлиха, 9 сут после введения штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ. Пунктирной линией обведена вирусная фабрика, стрелками показаны незрелые частицы ВОВ, звездочкой показана вироплазма. в) — зрелые частицы ВОВ в цитоплазме клетки асцитной карциномы Эрлиха. Увеличение в 15 (б) и 80 (в) тысяч раз; г) — иммуногистохимическое выявление апоптина на парафиновых срезах клеток асцитной карциномы Эрлиха через 9 сут после введения штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ. Стрелкой показана клетка, в цитоплазме которой выявляется белок апоптин. Хромоген

АЕС, докраска гематоксилином. 100-кратное увеличение.

Рис. 4. Количество клеток асцитной карциномы Эрлиха в состоянии митоза на парафиновых срезах.

а) по оси абсцисс — время после введения вируса, сут; по оси ординат — количество клеток асцитной карциномы Эрлиха в состоянии митоза, %. Белые столбцы — введение 0,9% раствора ПС1, серые — введение штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ; б) клетки асцитной карциномы Эрлиха в состоянии митоза (показаны стрелками); 3 сут после введения штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ. Парафиновый срез, окрас гематоксилином и эозином,

40-кратное увеличение.

Рис. 5. Увеличение количества Ki-67- (а) и PCNA — положительных клеток (б) асцитной карциномы Эрлиха после введения штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ и 0,9% раствора NaCl, %.

По оси абсцисс — время после введения вируса, сут; по оси ординат — количество позитивных клеток асцитной карциномы Эрлиха, %. Белые столбцы — введение 0,9% раствора NaCl, серые — введение штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ.

Таблица

Инфекционный титр штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ в асцитической жидкости мышей линии

С57В1 с карциномой Эрлиха в различные сроки после введения вируса

1

Сутки п/в 3 6 9 10

Номер мыши Apo3 Apo8 Apo15 Apo7 Apo12 Apo14 Apo6 Apoll Apo13 Apo1 Apo2

Титр вируса, БОЕ/мл

1,0х102 < 102 1,5х103 < 102 < 102 1,5х102 > 106 2,6x10" 4х102 1х102 1х105

Примечание. У выделенных жирным шрифтом животных титр вируса был достаточен для обнаружения методом электронной микроскопии (более 104).

чем после введения Л-ИВП [8] (см. табл. 2). Полученные данные свидетельствуют о более выраженном торможении клеточного цикла карциномы Эрлиха в S-фазе после встройки в геном штамма Л-ИВП гена, кодирующего апоптин.

Обсуждение Современные онколитические штаммы ВОВ, как правило, аттенуированы, а их противоопухолевые свойства усилены за счет встройки трансгенов [12— 17]. В этом ряду особый интерес представляет штамм VVdGF-ApoS24/2, продуцирующий онкотоксический белок апоптин. Штамм обладает отчетливым онколити-ческим действием in vitro [6], показан его противоопухолевый эффект на ксенографтах карциномы человека А431, привитой иммунодефицитным мышам [7]. Логическим продолжением исследований противоопухолевых свойств штамма VVdGF-Apos24/2 является его изучение на модели сингенной опухоли, карциномы Эрлиха, привитой иммунокомпетентным мышам. Проведенные нами эксперименты показали выраженное

Таблица 2

Сравнение количества клеток в состоянии митоза, Ki-67- и PCNA-позитивных клеток асцитной карциномы Эрлиха после введения рекомбинантного штамма VVdGF-ApoS24/2 и исходного штамма Л-ИВП [8]

Сутки п/в VVdGF-ApoS24/2 Л-ИВП [8]

Количество клеток в со- 3 2,92 ± 0,34 3,72 ± 0,41

стоянии митоза, % 9 1,6 ± 0,42 1,08 ± 0,47

Количество К-67- 3 45,31 ± 3,12* 35,63 ± 4,88*

позитивных клеток, % 9 44,28 ± 1,77* 38,27 ± 3,53*

Количество PCNA- 3 47,67 ± 5,43* 36,16 ± 2,27*

позитивных клеток, % 9 56,89 ± 4,02* 34,72 ± 4,36*

Примечание. * — - p < 0,05.

замедление роста и асцитной, и солидной форм карциномы при чрезвычайно скудной или вовсе не регистрируемой репликации штамма VVdGF-ApoS24/2, низкий уровень которой, очевидно, связан с видоспецифичностью ВОВ. Известно, что ВОВ плохо размножается в культуре клеток карциномы SCCF1 кошек, которые наряду с мышами не являются природными хозяевами для ВОВ [18].

Несомненно, обнаруженное нами снижение объемов опухолей на фоне репликации вируса, близком к нулю, вызывает много вопросов. В настоящее время считается, что в основе противоопухолевого действия ОВ лежат три основных механизма: вирусный лизис опухолевых клеток, вирус-индуцированный противоопухолевый иммунный ответ и вирус-индуцированное разрушение кровеносных сосудов в ткани опухоли [19]. Проведенное исследование показало, что на модели мышиной карциномы Эрлиха у иммунокомпетентных мышей не «включается» ни один из этих механизмов, а противоопухолевый эффект обусловлен вирус-индуцированным торможением клеточного цикла и блокированием митотического деления опухолевых клеток. Количество К1-67- и PCNA-roзитивных клеток асцитной карциномы Эрлиха после введения штамма VVdGF-ApoS24/2 было значительно выше, чем у мышей, получавших исходный штамм Л-ИВП [8]. Это позволяет предположить, что экспрессия трансгена апоптина усиливает «тормозящее» действие рекомбинантного штамма VVdGF-ApoS24/2 на S-фазу клеточного цикла карциномы Эрлиха по сравнению со штаммом Л-ИВП.

Репликация штамма VVdGF-ApoS24/2 в опухолевых клетках сопровождается экспрессией белка апоптина [7], который в клетке циркулирует между ядром и цитоплазмой, взаимодействуя с такими белками как APC1, ШР-70, а-ШЬиНп, р-ШЬиНп и Р-асйп. Белок APC1 (субъединица комплекса APC/C) участвует в регуляции клеточного цикла, и его взаимодействие с апоптином приводит к нарушению сборки комплекса APC/C и G2/M-аресту клеточного цикла [20—22]. Возможно, именно это взаимодействие обеспечивает усиление «тормозящего» эффекта штамма VVdGF-ApoS24/2, который складывается из природных свойств штамма Л-ИВП [8] и действия апоптина, экспрессируемого в составе генома рекомбинантного штамма VVdGF-ApoS24/2 ВОВ.

Таким образом, показано, что рекомбинантный

апоптин-продуцирующий штамм VVdGF-ApoS24/2 ВОВ оказывает противоопухолевое действие на солидную и асцитную формы карциномы Эрлиха у мышей, несмотря на низкий уровень его репродукции. Встройка в геном штамма Л-ИВП ВОВ гена, кодирующего апоптин, усиливает его способность «затормаживать» клеточный цикл карциномы Эрлиха в S-фазе, останавливая тем самым рост опухоли.

Финансирование. Исследование было поддержано Министерством образования и науки России, Соглашение № 14.604.21.0057 от 27 июня 2014 г., уникальный идентификатор проекта RFMEFI60414X0057.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Buijs P.R.A., Verhagen J.H.E., van Eijck C.H.J, van den Hoogen B.G., Bernadette G. Oncolytic viruses: From bench to bedside with a focus on safety. Human Vaccines & Immunotherapeuticsю 2015; 11(7): 1573—84.

2. Zeyaullah M., Patro M., Ahmad I., Ibraheem K., Sultan P., Nehal M. et al; Oncolytic Viruses in the Treatment of Cancer: A Review of Current Strategies. Pathology and Oncology Research. 2012; 18(4): 771—81.

3. Kochneva G.V., Sivolobova G.F., Yudina K.V., Babkin I.V., Chumakov P.M., Netesov S.V. Oncolytic poxviruses. Mol. Genet. Microbiol. Virol. 2012; 27(1): 7—15.

4. Thorne S.H., Hwang T.H., Kirn D.H. Vaccinia Virus and Oncolytic Viro-therapy of Cancer. Curr. Opin. Mol. Ther. 2005; 7(4): 359—65.

5. Danen-Vаn Oorschot A.M., Fisher D.F., Grimbergen J.M., Klein B., Zhuang S.M., Falkenburg J.H. et al; Apoptin induces apoptosis in human transformed and malignant cells but not in normal cells; Proc. Natl. Acad. Sci. 1997; 94: 5843—7.

6. Kochneva G.V., Babkina I.N., Lupan T.A., Grazhdantseva A.A., Iudin P.V., Sivolobova G.F. et al. Apoptin enhances the oncolytic activity of vaccinia virus. Mol. Biol. (Mosk); 2013; 47(5): 842—52.

7. Kochneva G., Zonov E., Grazhdantseva A., Yunusova A., Sibolobova G., Popov E. et al. Apoptin enhances the oncolytic properties of vaccinia virus and modifies mechanisms of tumor regression; Oncotarget. 2014; 5(22): 11269—82.

8. Zonov E., Kochneva G., Yunusova A., Grazhdantseva A., Richter V., Ry-abchikova E; Features of the Antitumor Effect of Vaccinia Virus Lister Strain. Viruses. 2016; 8(1).

9. Forbes N.E., Krishnan R., Diallo J: Pharmacological Modulation ofAnti-Tu-mor Immunity Induced by Oncolytic Viruses. Front. Oncol. 2014; 4(191).

10. Seigneurin D., Guillaud P. Ki-67 Antigen, a Cell Cycle and Tumor Growth Marker. Pathol. Biol. (Paris). 1991; 39(10): 1020—8.

11. Shönenberger F., Deutzmann A., Ferrando-May E., Merhof D; Discrimination of Cell Cycle Phases in PCNA-immunolabeled Cells. BMC Bioin-formatics. 2015; 16(180).

12. Zakay-Roness Z., Bernkoff H. Effect of Active and Ultraviolet-Irradiated Inactive Vaccinia Virus on the Development of Shay Leukemia in Rats. Cancer Res. 1964; 24: 373—8.

13. Yu Z., Li S., Brader P., Chen N., Yu Y.A., Zhang Q. et al. Oncolytic vaccinia therapy of squamous cell carcinoma. Molecular Cancer. 2009; 8(45).

14. He S., Li P., Chen C.H., Bakst R.L., Chernichenko N., Yu Y.A. et al. Effective oncolytic vaccinia therapy for human sarcomas. J. Surg. Res. 2012; 175(2): 53—60.

15. Breitbach C.J., Arulanandam R., De Silva N., Thorne S.H., Patt R., Daneshmand M. et al. Oncolytic vaccinia virus disrupts tumor-associated vasculature in humans. Cancer Res. 2013; 73(4): 1265—75.

16. Lun X., Chan J., Zhou H., Sun B., Kelly J.J., Stechishin O.O. et al. Efficacy and safety/toxicity study of recombinant vaccinia virus JX-594 in two immunocompetent animal models of glioma. Mol. Ther. 2010; 18(11): 1927—36.

17. Adelfinger M., Bessler S., Frentzen A., Cecil A., Langbein-Laugwitz J., Gentschev I. et al. Preclinical Testing Oncolytic Vaccinia Virus Strain GLV-5b451 Expressing an Anti-VEGF Single-Chain Antibody for Canine Cancer Therapy. Viruses. 2015; 7: 4075—92.

18. Parviainen S., Autio K., Vähä-Koskela M., Guse K., Pesonen S., Rosol T.J. et al. Incomplete but Infectious Vaccinia Virions Are Produced in the Absence of Oncolysis in Feline SCCF1 Cells. PLoS One. 2015; 10(3).

19. Weibel S., Raab V., Yu Y.A., Worschech A., Wang E., Marincola F.M, et al. Viral-mediated oncolysis is the most critical factor in the late-phase of the tumor regression process upon vaccinia virus infection. BMC Cancer. 2011; 11(68).

20. Teodoro J.G., Heilman D.W., Parker A.E., Green M.R. The viral pro-

tein Apoptin associates with the anaphase-promoting complex to induce G2/M arrest and apoptosis in the absence of p53. Genes. Dev. 2004; 18(16): 1952—7.

21. Heilman D.W., Teodoro J.G., Green M.R. Apoptin Nucleocytoplasmic Shuttling Is Required for Cell Type-Specific Localization, Apoptosis, and Recruitment of the Anaphase-Promoting Complex/Cyclosome to PML Bodies. J. Virol. 2006; 80(15): 7535—45.

22. Wirth K.G., Ricci R., Gimenez-Abian J.F., Taghybeeglu S., Kudo N.R., Jochum W. et al. Loss of the anaphase-promoting complex in quiescent cells causes unscheduled hepatocyte proliferation. Genes. Dev. 2004; 18(1): 88—98.

Поступила 12.03.16

Сведения об авторах

Зонов Евгений Владимирович (Zonov Evgeniy) — аспирант ИХБФМ СО РАН;

Кочнева Галина Вадимовна (Kochneva Galina) — зав. лаб. ГНЦ ВБ «Вектор»;

Тупицына Анастасия Васильевна (Tupitsyna Anastasiya) — старший лаборант ИХБФМ СО РАН;

Рябчикова Елена Ивановна (Ryabchikova Elena) — д-р биол. наук, проф. руководитель группы микроскопических исследований ИХБФМ СО РАН, lenryab@yandex.ru

Zonov E.V.1, Kochneva G.V.2, Tupitsyna A.Y.1, Ryabchikova E.I.1

ANTITUMOR EFFECT OF APOPTIN-PRODUCING

RECOMBINANT VACCINIA VIRUS STRAIN IN VIVO IS RELATED WITH BLOCKAGE OF MITOTIC DIVISION IN CANCER CELLS

'Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine Siberian Branch of Russian Academy of Sciences, 630090, Novosibirsk, Russia; 2State Research Centre of Virology and Biotechnology "Vector", 630559, Koltsovo, Rissia

Vaccinia virus (VACV) possesses natural oncolytic activity, which could be enhanced by insertion of genes encoding various effector molecules, in particular, inducers of apoptosis in tumor cells. Apoptin, a protein of chicken anemia virus, is one of such inducers. This work was aimed at examination of antitumor activity of apoptin-producing recombinant VACV (VVdGF-ApoS24/2), in a model of syngenic murine tumor. The Ehrlich carcinoma was implanted subcutaneously or intraperitoneally to C57B1 mice and after formation of a tumor, mice received 107 PFU/mouse of VVdGF-ApoS24/2 strain or 0.9% of NaCl intratumorally. Animals were monitored, and sacrificed in different periods after virus injection. Tumor specimens and cells of ascitic fluid were fixed in 4% paraformaldehyde and examined using light and electron microscopy, immunohistochemistry, virus titers were determined in tumor cells by PFU method.

The VVdGF-Apo24/2 strain caused a distinct decrease in volume of both solid and ascitic Ehrlich carcinomas compared to control mice, despite the low level of viral replication in tumor cells. Antitumor effect of VVdGF-ApoS24/2 strain was not related with virus-induced destruction, necroses and apoptosis of tumor cells, as well as with accumulation of the effector cells of immune system in tumors. We observed evident decrease in the number of mitoses in tumor cells in carcinoma sections. Analysis of amount of Ki-67- and PCNA-positive cells allowed to conclude that VVdGF-ApoS24/2 strain block cell cycle in S-phase, thereby inhibiting tumor cell division and slowing tumor growth. The results obtained showed that insertion of apoptin gene into genome of VACV LIVP strain enhance ability of VACV to block cell cycle of Ehrlich carcinoma.

Keywords: recombinant VACV, apoptin, oncolytic effect, Ehrlich carcinoma.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-4-154-159

For correspondence: Elena I. Ryabchikova, Prof., Head of Microscopy Group, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, E-mail: lenryab@yandex.ru