Влияние комплекса кверцетин-железо на фосфолипидные мембраны

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2010. Вып. 2. С. 289-299

Биология

УДК 577.3

Влияние комплекса кверцетин-железо на фосфолипидные мембраны

Е.А. Ягольник, Б.Б. Махмутов, Ю.С. Тараховский, Е.Н. Музафаров,

О.М. Алексеева, Ю.А. Ким

Аннотация. Флавоноиды растительного происхождения, среди которых одним из наиболее распространенных и изученных веществ является кверцетин, доставляются в организм человека с пищей и оказывают существенное положительное влияние на здоровье. Эти вещества известные как антиоксиданты и хелаторы металлов, способны защищать организм от перекисного окисления. Комплексы флавоноидов с металлами, прежде всего с железом, могут иметь существенное фармакологическое значение, однако их взаимодействие с биологическими объектами мало изучено. В представленной работе мы исследуем влияние кверцетина и его комплексов с железом на фосфолипидный бислой, образованный фосфатидилхолином. Данные дифференциальной сканирующей калориметрии и адсорбционной спектроскопии в ультрафиолетовой и видимой областях спектра свидетельствуют о том, что комплексы кверцетин-железо способны взаимодействовать с фосфолипидным бислоем, влиять на процесс плавления липида и проникать через гидрофобный барьер бислоя. В работе обсуждается связь между величиной гидрофобности различных комплексов кверцетин-железо, рассчитанной на компьютере, и их способностью проникать через бислой.

Ключевые слова: флавоноиды, кверцетин, железо, фосфатидил-холин, биологические мембраны, хелаторы металлов, фосфолипид-ный бислой, липосомы.

Введение

Флавоноиды являются широко распространенными в природе фенольными веществами растительного происхождения. Они присутствуют в различных частях растения, включая плоды, листья, цветы. Высоко их содержание в различных растительных экстрактах, используемых в пище, особенно в чае и красном вине [1, 2]. В последние годы были обнаружены важные фармакологические свойства растительных флавоноидов, такие как антиопухолевая активность, способность подавлять размножение патогенных бактерий, нормализация функционирования сердечно-сосудистой системы, благоприятное

действие в лечении психо-эмоциональных расстройств. Физико-химической основой биологического действия флавоноидов на организм является его антиоксидантная активность, способность защищать организм от окислительного стресса [3-8]. Например, кверцетин, присутствующий в различных пищевых продуктах, обладает способностью удалять свободные радикалы из организма и связывать катионы металлов переменной валентности, которые инициируют процессы перекисного окисления. Среди металлов, инициирующих перекисное окисление, в организме животных и человека наибольшее значение имеет железо, способствующее появлению радикалов гидроксила в реакции Фентона [9, 10]. В этом случае флавоноиды связывают ионы железа и депротонируют гидроксильные группы с образованием феноксильных радикалов. Связывание свободных ионов железа предотвращает возможность протекания реакции Фентона и, благодаря этому, препятствует протеканию окислительного стресса. Способность связывать катионы металлов зависит от числа и расположения гидроксильных групп в кольцах полифенолов [11, 12].

Рис. 1. Различные формы комплексов кверцетина с железом [13]

Недавние исследования показали [13], что наиболее вероятными сайтами связывания ионов железа в молекуле кверцетина являются 3-я гидроксильная и 4-я карбонильная группы (рис. 1, а). За ними следуют 4-я карбонильная и 5-я гидроксильная группы (рис. 1,б), а также 3'-я и 4-я гидроксильные группы (рис. 1, в). Возможно также образование комплексов железа с двумя (рис. 1,г-е) и с тремя (рис. 1,ж) молекулами кверцетина. В комплексах железа с двумя молекулами кверцетина возможно образование симметричных форм трех видов. Молекулы кверцетина могут находиться в одной плоскости и иметь зеркальную симметрию Pr (рис. 1,г), инверсионную симметрию Pi (рис. 1,д), или находиться в ортогонально расположенных плоскостях О (рис. 1,е).

При образовании комплексов железа с тремя молекулами кверцетина, последние, наиболее вероятно, могут располагаться в 3-х ортогонально расположенных плоскостях (рис. 1,ж). Квантово-механические расчеты показывают [13], что наиболее устойчивыми являются комплексы железа с двумя молекулами кверцетина. При этом, стабильность комплексов снижается в ряду: О > Pr > Pi. Несмотря на то, что флавоноиды обладают значительным числом гидроксильных групп, их растворимость в воде весьма ограничена. Напротив, имеются многочисленные свидетельства их способности взаимодействовать с биологическими мембранами и проникать в фосфолипидный бислой, о чем свидетельствуют данные ЯМР и флуоресцентной спектроскопии [14, 15]. Флавоноиды могут располагаться как на периферии бислоя в интерфазной области, так и в более глубоких гидрофобных областях бислоя фосфолипидов [16]. С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии было показано, что флавоноиды способны также существенно влиять на процесс плавления фосфолипидного бислоя и, предположительно, способны влиять на фазовое поведение и структурную организацию биологических мембран [17]. Однако взаимодействие металлокомплексов флавоноидов с биологическими мембранами практически не изучено.

Данная работа посвящена исследованию взаимодействия комплексов кверцетина с железом с липосомами из фосфолипидов.

Материалы и методы

В работе использовали синтетический фосфолипид димиристоилфосфа-тидилхолин ДМФХ (Avanti Polar Lipids, США); яичный лецитин отечественного производства; кверцетин (Sigma,США); Трис-HCl (Serva, США).

Приготовление липосом. Для приготовления моноламеллярных ли-посом спиртовой раствор яичного лецитина высушивали в струе аргона и вакуумировали в течении ночи. Сухую пленку гидратировали в бидистил-лированной воде на шейкере в течение часа. Полученную суспензию муль-тиламеллярных липосом экструдировали через поликарбонатные фильтры (диаметр пор 100 нм) с помощью миниэкструдера производства Avanti Polar Lipids (США), по стандартной методике [18, 19].

Мультиламеллярные липосомы из димиристоил фосфатидилхолина производства Sigma (США) получали высушиванием в струе аргона раствора липида в хлороформе и последующим вакуумированием в течение ночи. Полученную пленку гидратировали путем встряхивания при 37 0C в течение часа.

Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия (ДСК).

Температурную зависимость избыточного удельного теплопоглощения препаратов липосом регистрировали с помощью дифференциального адиабатного сканирующего микрокалориметра ДАСМ-4 (ИБП РАН, г.Пущино, Россия). Скорость прогрева составляла 10К/мин. Для измерений использовали препараты с концентрацией липида 0,10-0,15 мг/мл.

Спектральные измерения. Спектры поглощения растворов кверцети-на и его комплекса с ионами железа измеряли на спектрофотометре Specord M 40.

Результаты и обсуждение

Адсорбционная спектрофотометрия водного раствора кверцетина показывает наличие нескольких максимумов поглощения, среди которых основными являются максимумы 255 нм и 374 нм (рис. 2, а). При образовании комплекса кверцетина с железом (2:1) наблюдается батохромный сдвиг максимумов поглощения к значениям 267 и 383 нм, соответственно (рис. 2, б), а также наблюдается некоторое снижение интенсивности поглощения длинноволновой части спектра (383 нм). В присутствии липосом наблюдаются существенные искажения спектра (рис. 2, в), связанные со светорассеянием, что выражается в увеличении поглощения, особенно в коротковолновой области.

Концентрация липида: 1*10_4 М, кверцетина 5*10_6 М, Fe2+ 2,5*10_6М. Все препараты находятся в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5.

Из спектра (3) вычтен спектр поглощения липосом, полученный перед добавлением комплекса.

Вычитание спектра рассеяния исходных липосом из спектра поглощения комплексов не позволяет полностью устранить данный дефект, поскольку после добавления к липосомам комплекса кверцетина с железом происходит дополнительный рост светорассеяния (данные не представлены). В присутствии липосом положение максимумов поглощения комплекса изменяется мало. Расположенный в центральной части спектра максимум при 383 нм остается неизменным. Максимум при 267 нм сдвигается к 263 нм, очевидно, вследствие подъема коротковолнового плеча спектра. Полученные данные позволяют считать, что влияние липосом на спектральные характеристики комплекса кверцетина с железом незначительно.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (рис. 3) показывает наличие существенного влияния кверцетина и его комплекса с железом на плавление бислоя, образованного димиристоил фосфатидилхолином (ДМФХ).

Рис. 2. Спектры поглощения кверцетина и его комплексов в УФ и видимой области: а — спектр кверцетина (10~5 М); б — спектр поглощения комплекса кверцетина с железом (2:1 моль/моль); в — спектр комплекса кверцетина с железом в присутствии моноламеллятных везикул из яичного

лецитина диаметром 100 нм

Метка 25 мкВт

I-----1-1--'-1---1-1--1-1---'-1---1-1--'-1-----1-1

5 10 15 20 25 30 35 40 45

°с

Рис. 3. Термограммы мультиламеллярных липосом из димиристоил фосфатидилхолина: а — исходные липосомы (концентрация липида 0,16 мг/мл, что составляет 23,610~5 М); б — к липосомам добавлен кверцетин (510 5 М); в — к липосомам добавлен комплекс: кверцетин + железо (2:1

моль/моль)

Мультиламеллярные липосомы, образованные ДМФХ плавятся при температуре 24 °С, что на представленной термограмме (рис. 3, а) можно наблюдать виде узкого пика полуширина которого менее одного градуса (табл. 1).

Добавление кверцетина к суспензии липосом (липид:кверцетин ~ 5:1 моль/моль) снижает температуру плавления липида на 0,5 град., а также приводит к уменьшению высоты и увеличению полуширины пика (рис. 3, б).

Этот эффект существенно усиливается при добавлении таких же количеств комплекса кверцетина с железом (рис. 3, в).

Таблица 1

Влияние кверцетина и его комплекса с железом (кверц : железо 2:1) на термодинамические характеристики фазового перехода (плавления) мультиламеллярных липосом из димиристоил фосфатидилхолина

Вещество Энтальпия АН, кДж/моль Максимум Т^, °С Высота, кДж/грамм/°К Полуширина, °К

ДМФХ 26,0 24 22,7 0,68

ДМФХ + кверцетин 28,4 23,5 13,4 1,1

ДМФХ + комплекс 27,1 23,5 9,0 1,4

При этом энтальпия процесса плавления липида, пропорциональная площади пика плавления, изменяется на величину < 10% от исходной и находится в пределах ошибки измерения, связанной с трудностью точного определения нулевой линии, относительно которой вычисляется площадь пика (Табл. 1). Таким образом, можно предполагать, что уменьшение высоты пиков компенсировалось увеличением их ширины, при этом их площадь существенно не изменялась.

Следует отметить, что кверцетин и его комплекс с железом был добавлен к уже сформированным мультиламеллярным липосомам. При этом только внешний монослой липида непосредственно мог соприкасаться с водным раствором, в который был добавлен кверцетин. Для изменения термодинамических характеристик плавления всего объема липида, наблюдаемого на представленной термограмме, необходимо проникновение кверцетина или его комплекса с железом через все бислойные структуры липида внутрь мультиламеллярных липосом. Подобное явление уже было описано нами в экспериментах с флавоноидом таксифолином, который также был добавлен к предварительно сформированным мультиламеллярным липосомам из ДМФХ и был способен проникать через бислои липида без нарушения целостности липосом [20]. В настоящей работе мы впервые показали, что кверцетин, а также его комплекс с железом способен проникать через фос-фолипидный бислой.

Известно, что флавоноиды способны погружаться в фосфолипидный бислой и их действие на процесс плавления липидов сходен с действием холестерина [21], которое заключается в описанном выше снижением температуры плавления липида и увеличении полуширины перехода. Предполагается, что молекула кверцетина находится в интерфазной области бислоя и частично погружена в гидрофобную область углеводородных цепей. При этом ее длинная ось направлена перпендикулярно плоскости бислоя [17].

Образование комплексов кверцетина с железом может оказывать существенное влияние на гидрофобность молекулы и ее взаимодействие с фос-фолипидным бислоем. Так, расчеты коэффициента распределения молекул в системе октанол/вода (log P) показывают, что комплекс кверцетин-железо (1:1) менее гидрофобен, чем молекула кверцетина, однако гидрофобность существенно возрастает в комплексах кверцетин-железо 2:1 и 3:1 (Табл. 2).

Таблица 2

Коэффициент распределения кверцетина и его комплексов с железом в системе октанол/вода. Данные получены с использованием программы Chem3DUltra 9,0 (программный пакет Chemical Office, производитель

Cambridge Soft)

Вещество Log P

кверцетин 1,30757

кверцетин-железо (1:1) 0,86626

кверцетин-железо (2:1) 3,47752

кверцетин-железо (3:1) 6,08878

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что образование комплекса кверцетина с железом не препятствует взаимодействию этого фла-воноида с фосфолипидным бислоем. В соответствии с расчетами, данное взаимодействие может усиливаться в комплексах с соотношением кверцетин-железо 2:1 или 3:1. Такие комплексы способны проникать сквозь многочисленные бислойные структуры, о чем свидетельствуют данные ДСК.

Мы предполагаем, что при суммарном соотношении кверцетина к железу 2:1, используемому в наших экспериментах, возможно образование комплексов с различной стехиометрией:

(Кверцетин + 1Ре) ^ (Кверцетин + 2Ре) ^ (Кверцетин + 3Ре).

Эти комплексы могут в различной степени погружаться в бислой, при этом наиболее гидрофильный комплекс (Кверцетин + 1Ре) находится в воде и способен взаимодействовать с поверхностью бислоя, более гидрофобный комплекс (Кверцетин + 2Ре) может погружаться в область углеводородных цепей, тогда как наиболее гидрофобный комплекс способен проникать в центральную часть бислоя. Переход из одной формы комплекса в другую может способствовать их проникновению через бислой (рис. 4).

Способность проникновения флавоноидов через плазматичекую мембрану клеток может не только определять их биологическое действие на живые клетки, но также и возможность усвоения этих веществ организмом из растительных пищевых источников. В настоящее время обнаружено большое разнообразие белков, служащих для транспортировки различных веществ через мембраны клеток, что может быть сопряжено с расходом энергии [22]. Обнаружено много различных белков, которые могут участвовать в транспорте флавоноидов [23]. Флавоноиды могут транспортироваться через

плазматическую мембрану с участием белков принадлежащих к семейству транспортеров АВС (ATP binding cassette). Существуют также транспортеры, способствующие трансмембранному переносу веществ по градиенту концентрации без использования энергии. Некоторые транспортеры глюкозы способны участвовать в транспорте гликозидов кверцетина. Среди транспортеров можно также назвать полипептиды, участвующие в транспорте органических анионов. Даже специфические транспортеры нуклеотидов, органических катионов, церамидов и т.д. также могут быть вовлечены в транспорт флавоноидов. В кишечном эпителии существенное значение в транспорте флавоноидов может играть билирубин транслоказа [23].

Рис. 4. Схематическое изображение фосфолипидного бислоя, образованного молекулами фосфатидилхолина

На примере кверцетина представленная работа показывает возможность самостоятельного проникновения флавоноидов через фосфолипидный бислой. Образование комплексов с железом не препятствует, а скорее, способствует этому процессу. Вопрос о том, способны ли флавоноиды проникать в клетку самостоятельно или с участием транспортных белков остается открытым. Аналогичная ситуация уже известна на примере исследования свободных жирных кислот, способных проникать в клетку не только с участием белков, но и самостоятельно [24]. Для оценки возможного биологического значения этого явления необходимо определение скорости диффузии флаво-ноидов и их комплексов с металлами через фосфолипидный бислой и через клеточные мембраны.

Список литературы

1. Bioactive compounds in nutrition and health-research methodologies for establishing biological function: the antioxidant and anti-inflammatory effects of flavonoids on atherosclerosis / P.M. Kris-Etherton [et al.] // Ann. Rev. Nutr. 2004. V.24. P.511-538.

2. Kuhnau J. The flavonoids. A class of semi-essential food components: their role in human nutrition // World Rev. Nutr. Diet. 1976. V.24. P.117-191.

3. Folts J.D. Potential health benefits from the flavonoids in grape products on vascular disease // Adv. Exp. Med. Biol. 2002. V.505. P.95-111.

4. Halliwell B, Rafter J., Jenner A. Health promotion by flavonoids, tocopherols, tocotrienols, and other phenols: direct or indirect effects? Antioxidant or not? // Am. J. Clin. Nutr. 2005. V.81. P.268S-276S.

5. Hertog M.G. Epidemiological evidence on potential health properties of flavonoids // Proc. Nutr. Soc. 1996. V.55. P.385-397.

6. Lee E.R., Kang G.H., Cho S.G. Effect of flavonoids on human health: old subjects but new challenges // Recent Pat Biotechnol. 2007. V.1. P.139-150.

7. Stangl V., Lorenz M., Stangl K. The role of tea and tea flavonoids in cardiovascular health // Mol. Nutr. Food Res. 2006. V.50. P.218-228.

8. Flavonoids in food and their health benefits / L.H. Yao [et al.] // Plant Foods Hum. Nutr. 2004. V.59. P.113-122.

9. Sutton H.C., Winterbourn C.C. On the participation of higher oxidation states of iron and copper in Fenton reactions // Free Radic. Biol. Med. 1989. V.6. P.53-60.

10. Winterbourn C.C. Toxicity of iron and hydrogen peroxide: the Fenton reaction // Toxicol. Lett. 1995. V.82-83. P.969-974.

11. Cornard J.P., Merlin J.C. Spectroscopic and structural study of complexes of quercetin with Al(III) // J. Inorg. Biochem. 2002. V.92. P.19-27.

12. Iron chelation by the powerful antioxidant flavonoid quercetin / M. Leopoldini [et al.] // J. Agric. Food Chem. 2006. V.54. P.6343-6351.

13. Complexation of flavonoids with iron: structure and optical signatures / J. Ren [et al.] // J. Phys. Chem. B. 2008. V.112. P.1845-1850.

14. Investigation of the membrane localization and distribution of flavonoids by high-resolution magic angle spinning NMR spectroscopy / H.A. Scheidt [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. 2004. V.1663. P.97-107.

15. van Dijk C, Driessen A.J., Recourt K. The uncoupling efficiency and affinity of flavonoids for vesicles // Biochem. Pharmacol. 2000. V.60. P.1593-1600.

16. Bimodal distribution and fluorescence response of environment-sensitive probes in lipid bilayers / A.S. Klymchenko [et al.] // Biophys. J. 2004. V.86. P.2929-2941.

17. Tarahovsky Y.S., Muzafarov E.N., Kim Y.A. Rafts making and rafts braking: how plant flavonoids may control membrane heterogeneity // Mol. Cell Biochem. 2008. V.314. P.65-71.

18. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles / R.C. MacDonald [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V.1061. P.297-303.

19. Characteristics of spectrin-induced leakage of extruded, phosphatidylserine vesicles / N.K. Subbarao [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V.1063. P.147-154.

20. Взаимодействие таксифолина (дигидрокверцентина) с мультиламеллярными липосомами из димиристоилфосфатидилхолина / Ю.С. Тараховский [и др.] // Биофизика. 2008. Т.53, вып.1. С.78-83.

21. Membrane-rigidifying effects of anti-cancer dietary factors / H. Tsuchiya [et al.] // Biofactors. 2002. V.16. P.45-56.

22. Braun V., Endriss F. Energy-coupled outer membrane transport proteins and regulatory proteins // Biometals. 2007. V.20. P.219-231.

23. Bioavailability of flavonoids: a review of their membrane transport and the function of bilitranslocase in animal and plant organisms / S. Passamonti [et al.] // Curr. Drug Metab. 2009. V.10. P.369-394.

24. Kampf J.P., Kleinfeld A.M. Is membrane transport of FFA mediated by lipid, protein, or both? An unknown protein mediates free fatty acid transport across the adipocyte plasma membrane // Physiology (Bethesda.). 2007. V.22. P.7-14.

Ягольник Елена Андреевна (yea_88@mail.ru), студент, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.

Махмутов Болат Бижанович (bolat76@rambler.ru), к.х.н., старший преподаватель, Кызылординский государственный университет им. Коркыт-ата, Кызылорда, Казахстан.

Тараховский Юрий Семенович (tarahov@rambler.ru), д.б.н., ведущий научный сотрудник, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино.

Музафаров Евгений Назибович (enmuzafarov@mail.ru), д.б.н., профессор, кафедра биотехнологии, Тульский государственный университет.

Алексеева Ольга Михайловна (olgavek@yandex.ru), к.б.н., старший научный сотрудник, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва.

Ким Юрий Александрович (yuk01@rambler.ru), д.ф.-м.н., ведущий научный сотрудник, Институт биофизики клетки РАН, Пущино.

Interaction of quercetin-iron complexes with phospholipid membranes

E.A. Yagolnic, B.B. Mahmutov, Y.S. Tarahovsky, E.N. Muzafarov,

O.M. Alexeeva, Yu.A. Kim

Abstract. Plant flavonoids, including one of the best studied and broadly distributed compound quercetin, are delivered with food and express a considerable beneficial effect on human health. These compounds are known as antioxidants and chelators of metals and responsible for protection from peroxidation. Though

complexes of flavonoids with metals, especially with iron, are pharmacologically considered compounds their interaction with biological objects are scarcely known. Here we studied interaction of quercetin and quercetin-iron complexes with phospholipid bilayer composed by phosphatidylcholines. The differential scanning calorimetry and UV-Vis adsorption spectrophotometry demonstrate the ability of quercetin-iron complexes to interact with phospholipid bilayer, influence lipid melting and penetrate through the hydrophobic barrier of the bilayer. A correlation between a computer calculated hydrophobicity of quercetin-metal complexes and their ability to penetrate through the lipid bilayer is also discussed.

Keywords : flavonoids, quercetin, iron, phosphatidylcholine, biological membranes, metal chelators, phospholipid bilayer, liposomes.

Yagolnic Elena (yea_88@mail.ru), student, department of biotechnology, Tula State University.

Mahmutov Bolat (bolat76@rambler.ru), candidate of chemical sciences, senior teacher, Kyzylorda State University, Kyzylorda, Kazakhstan.

Tarahovsky Yuri (tarahov@rambler.ru), doctor of biological sciences, leader researcher, Institute of Theoretical and Experimental Biophysics of RAS, Pushchino.

Muzafarov Evgenii (enmuzafarov@mail.ru), doctor of biological sciences, professor, department of biotechnology, Tula State University.

Alexeeva Olga (olgavek@yandex.ru), candidate of biological sciences, senior researcher, Emanuel Institute of Biochemical Physics of RAS, Moscow.

Kim Yuri (yuk01@rambler.ru), doctor of physical and mathematical sciences, leader researcher, Institute of Cell Biophysics of RAS, Pushchino.

Поступила 27.03.2010