Успешный опыт клонирования приматов

И I II II

III

Новости клеточных технологий

ЛИТЕРАТУРА:

1. Strain A.J., Neuberger J.M. A bioartificial liver state of the art. Science 2002; 295: 1005 9.

2. Dazzi F., Ramasamy R., Glennie S. et al. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis. Blood Rev. 2006; 20: 161 71.

3. Aggarwal S., Pittenger M. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses. Blood 2005; 105: 1815 22.

Подготовила A.C. Григорян По материалам: Parekkadan В„ Daan van Poll, Suganuma К. et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. PloS ONE 2007; 2(9): e941

КЛОНИРОВАНИЕ

Успешный опыт клонирования приматов

Идея клонирования воплощена в методе переноса ядра (nuclear transfer, NT) клетки донора в энуклеированную нео плодотворенную яйцеклетку, находящуюся в метафазе второго деления мейоза [1]. Ранее источником ядра для подобных исследований служили эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), получаемые из доимплантационной бластоцисты [2], затем предпочтения стали отдавать более доступным клет кам взрослого организма [1, 3]. Цели научных разработок в данной области заключаются как непосредственно в полу чении клонов животных для лабораторных исследований, так и в выделении генетически идентичных клеткам реципиента линий ЭСК, которые могут использоваться в области кле точных биотехнологий без реакции отторжения и необходи мого применения иммунодепрессантов [4].

В настоящее время с помощью метода переноса ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer, SCNT) достигнуты успехи в клонировании мышей (5], овец [3], ко ров (6], свиней (7). Однако для медицины большее значение имела бы отработанная технология получения клонов при матов и их эмбрионального материала, которые могут быть использованы для исследований ряда заболеваний челове ка, разработки вакцин, получения биологически активных веществ, что, зачастую, неосуществимо у других животных (8]. Однако клонировать приматов не удавалось из за про цессов преждевременной активации цитоплазмы овоцитов и нарушения ядерного репрограммирования (4].

После введения донорского ядра и активации цитоплаз мы яйцеклетки происходит ядерное ремоделирование, обус ловленное деятельностью активирующего мейоз фактора (maturation promoting factor, MPF) и способствующее про цессам репрограммирования. Активность MPF после прове дения SCNT зависит от вида животных доноров, клеточного материала и от примененных протоколов метода (9]. До не давнего времени в опытах по клонированию приматов эф фективность формирования бластоцист была очень низкой, наблюдалась преждевременная конденсация хромосом и распад ядерной мембраны (4], что связано с пониженной активностью MPF.

14 ноября 2007 года в он лайн версии журнала Nature были опубликованы результаты исследования J.A. Byrne и S.M. Mitalipov с соавт., которые получили бластоцисты макаки резуса и исследовали выделенные из них клони

рованные эмбриональные клетки (cloned rhesus embryonic stem, ORES) на предмет соответствия нормальным ЭСК животных.

В работе использовалась культура фибробластов кожи, полученная от девятилетней особи мужского пола, и овоци ты (п = 304) приматов (п = 14). Ядра фибробластов электро фузией вводили в цитоплазму энуклеированных овоцитов, находящихся в метафазе II. Активация цитоплазмы произ водилась по специальным протоколам, включающим ряд краткосрочных последовательных инкубаций в различных условиях, что выгодно отличает схему от применявшихся ранее другими исследователями в работах по клонирова нию. Этот протокол позволил предотвратить преждевре менную цитоплазматическую активацию и стимулировать деятельность MPF.

В эксперименте удалось получить только две «зиготы», об разованные из овоцитов разных особей и ядер фибробластов взрослого макаки самца. Таким образом, эффективность по лучения эмбрионов составила 0,7%. Культивирование произ водили до стадии бластоцист, из внутренней клеточной массы которых выделяли CRES. В дальнейшем сравнивали свойства двух линий клонированных клеток, полученных от ооцитов двух особей соответственно, между собой, с контрольной группой и культурой фибробластов кожи. Группу контроля составляли две линии ЭСК, полученных из оплодотворенных эмбрионов (до норами овоцитов служили те же особи, а донором спермы -второй самец).

Методами генетического анализа была показана иден тичность ядерной ДНК обеих линий CRES и фибробластов кожи, а также лейкоцитов крови, полученных от того же жи вотного донора. Нормальный кариотип 42 XY был сохра нен, однако у части клеток первой линии CRES выявлена изохромосома Y, состоящая из двух копий длинного плеча, а также у 12% CRES 1 наблюдалась потеря Y хромосомы. Было доказано соответствие нуклеотидных последователь ностей митохондриальных ДНК CRES и ооцитов женских особей доноров. Эти данные в совокупности являются до стоверным признаком клонированных клеток (4).

Обе линии демонстрировали типичную морфологию ЭСК, сохраняли недифференцированное состояние после 20 пас сажей и экспрессировали ключевые факторы «стволовости», включая 0СТ4, SSEA4, TRA1 60 и TRA1 81, что отражает

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007

ИМИ!

Новости клеточных технологий

успешное репрограммирование. Двенадцать основных транскрипционных факторов, характерных для ЭСК макак резусов, были описаны в более ранней работе J.A. Byrne с соавт. (2006). Методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в молекуле ДНК клонированных клеток и группы контроля были определены гены NANOG, S0X2, LEFTYA, TDGF, TERT, высокий уровень экспрессии которых также служит критерием плюрипотентности и «ство ловости» [10].

Транскрипционный анализ клеточных культур показал, что экспрессия 90% специфических соматических генов в обеих линиях CRES и контроля была существенно ниже по сравнению с таковой в фибробластах кожи, а актив ность 85% генов, характерных для ЭСК, напротив, значи тельно выше.

Для оценки плюрипотентности клонированные клетки культивировали в условиях, необходимых для нейральной дифференцировки. В результате они приобретали удлинен ную форму, экспрессировали соответствующие иммуногисто химические маркеры - ассоциированный с микротрубочками белок 2 (МАР2), р III тубулин, тирозингидроксилаза. Кроме того, после инъекции в организм иммунодефицитных мышей обе линии CRES формировали тератомы, цитологический

состав которых был характерен для тканей, развивающихся из всех трех зародышевых листков.

Ранее уже проводились эксперименты с клонированием приматов [8, 11 ]. В частности, S.M. Mitalipov с соавт. еще в 2002 году опубликовал материалы исследования, в кото ром получил бластоцисты макак резусов методом переноса в ооциты ядер фетальных фибробластов и ЭСК, полученных из оплодотворенных эмбрионов. Однако выделение клеток доноров в этом случае предполагает значительно больше затрат ресурсов и времени, нежели в случае использования культуры фибробластов кожи взрослого животного. Более того, не представляется возможным использовать подобную методику в практике получения генетически идентичного клеткам реципиента пула ЭСК.

Таким образом, исследование J.A. Byrne и S.M. Mitalipov с соавт. открывает значительные перспективы в получении генетически идентичных клеткам реципиента ЭСК, как ми нимум, и, как максимум, в клонировании человека. Тем не менее, во всех описанных работах мониторинг эмбрионов производился лишь до стадии бластоцисты, а не на протяже нии всего эмбриогенеза и части постнатального развития, что оставляет возможные проблемы биолого социального пла на не раскрытыми.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Wilmut I., Schnieke A., McWhir J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385 (6619): 810 3.

2. Willadsen S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature 1986; 320: 63 5.

3. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A. et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64 6.

4. Byrne J.A., Pedersen D.A., Clepper L.L. et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 2007; 450: 497 502.

5. Wakayama T., Perry A., Zuccotti M. et al. Full term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394: 369 74.

6. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J. et al. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 1998; 280:1256 8.

7. Polejaeva I.A., Chen S.H., Vaught T.D. et al. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 2000; 407: 86 90.

8. Mitalipov S.M., Yeoman R.R., Nusser K.D et al. Rhesus monkey embryos produced by nuclear transfer from embryonic blastomeres or somatic cells. Biol. Reprod. 2002; 66: 1367 73.

9. Mitalipov S. M., Zhou Q., Byrne J.A. et al. Reprogramming following somatic cell nuclear transfer in primates is dependent upon nuclear remodeling. Hum. Reprod. 2007; 22: 2232 42.

10. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126:663 76.

11. Meng L., Ely J., Stouffer R. et al. Rhesus Monkeys Produced by Nuclear Transfer. Biology of reproduction 1997; 57: 454 9.

12. Byrne J.A., Mitalipov S.M., Clepper L. et al. Transcriptional profiling of rhesus monkey embryonic stem cells. Biol. Reprod. 2006; 75: 908 15.

Подготовил ИЯ. Бозо По материалам: Byrne J„ Pedersen D„ Clepper L. et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 2007:450: 497-502

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 4, 2007

А