Использование хемилюминесцентных методов исследования в стоматологии

Р. Р. Фархутдинов, доктор медицинских наук, профессор, руководитель межвузовской лаборатории технических систем медико-биологических исследований БГМУ

X. М. Шайдуллина, кандидат медицинских наук, доцент кафедры терапевтической стоматологии БГМУ О. Н. Кравец, врач-пародонтолог, клиническая стоматологическая поликлиника БГМУ Башкирский государственный медицинский университет Уфа

Использование хемилюминесцентных методов исследования в стоматологии

Воспалительные заболевания пародонта являются одним из наиболее частых патологических состояний полости рта [6]. Несмотря на достигнутые успехи в профилактике и лечении данной патологии, некоторые вопросы, в частности, касающиеся уточнения механизмов развития воспалительного процесса, остаются недостаточно исследованными.

В последние годы при изучении патогенеза воспаления повышенное внимание уделяется роли нарушения свободнорадикального окисления (СРО) - генерации активных форм кислорода (АФК) и пере-кисному окислению липидов (ПОЛ) [2, 3, 11]. Считается, что избыток свободных радикалов вызывает поражение тканей и поддерживает воспалительный процесс, в то время как недостаток АФК, обеспечивающих микробицидную активность фагоцитов, способствует микробной инвазии [8]. В связи с этим ускорение СРО и увеличение свободных радикалов, равно как и уменьшение их содержания, могут играть определенную роль в развитии и прогрессировании воспалительных процессов. Коррекция СРО во многих случаях помогает предотвратить прогрессирование различных заболеваний, предупредить возможные осложнения или облегчить тяжесть их течения [1-3].

В то же время результаты изучения состояния СРО в тканях пародонта нередко противоречивы. В большинстве исследований констатируется лишь накопление продуктов окисления, что служит предпосылкой для назначения антиоксидантных препаратов. Вместе с тем возможность замедления процессов СРО клиницистами практически не учитывается. Объективная оценка характера и степени изменения данного процесса может открыть новые перспективы лечения и профилактики заболеваний

пародонта, однако сложность методов исследования и мониторинга состояния СРО в норме и при патологии делает их малодоступными для практического здравоохранения. Перспективным методом исследования СРО является регистрация хемилюминес-ценции (ХЛ) - свечения, возникающего при взаимодействии свободных радикалов [4, 5, 7, 11]. Данный метод успешно применяется в медицине для изучения СРО в крови при различных заболеваниях, а также для оценки антиокислительной активности (АОА) препаратов, пищевых добавок и т. д. [9, 10].

Несомненный научный и практический интерес представляют разработка и оценка возможности использования ХЛ-методов исследования в стоматологии для изучения СРО и влияния на него проводимого лечения.

Цель нашего исследования заключалась в оптимизации лечения пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта с учетом состояния СРО в ротовой жидкости, в разработке экспресс-метода оценки скорости окисления и в определении влияния на последнюю лекарственных препаратов.

Общая характеристика проведенных исследований представлена в табл. 1.

На первом этапе разрабатывались хемилюминес-центные методы исследования СРО и определения суммарной АОА ротовой жидкости. К 2 мл слюны добавляли 0,05 мл люминола (105 М), избирательно усиливающего свечение, связанное с образованием АФК. Определяли интенсивность ХЛ на приборе для регистрации свечения «Хемилюминомер-003» в течение 10 минут.

Для выявления источника АФК в ротовой жидкости последнюю центрифугировали в течение 10 минут при

Таблица 1

Этапы и объекты исследования

Этап исследования Объект исследования

Разработка способов оценки состояния СРО и антиокислительной активности ротовой жидкости, основанных на регистрации ХЛ, возникающей при взаимодействии свободных радикалов Слюна здоровых лиц и лиц, страдающих воспалительными заболеваниями пародонта

Изучение процессов СРО в ротовой жидкости в норме и при патологии Здоровые лица

Оценка влияния препаратов, широко используемых в стоматологии, на процессы СРО в модельных системах Препараты ротокан, настойка календулы, метрогил, хлорофиллипт, эраконд, настойка эхинацеи пурпурной

Изыскание способов направленной медикаментозной коррекции СРО при воспалительных заболеваниях пародонта Пациенты с заболеваниями пародонта в процессе лечения

1500 об/мин и отдельно измеряли люминолзависимую ХЛ в осадке и надосадочной части.

Дополнительно в надосадочной части определяли АОА. Для этого использовали модельную систему, состоявшую из КН2РО4 (20 мМ), KCL (10 мМ), натрия ли-монно-кислого (45 мМ), люминола (10-5М) рН = 7,45. При добавлении к ней 1 мл 5 мМ раствора сернокислого железа (FeS04 х 7Н2О) происходит генерация АФК, сопровождающаяся хемилюминесценцией. АОА надосадочной части определяли по подавлению ХЛ модельной системы и оценивали в процентах от величины угнетения свечения при добавлении 0,1 мл надо-садка. Расчет проводили по специальной формуле [10]:

SAOA = 100 % - (БМС - БМССПУБМС х 100 %, где SAOA - суммарная антиокислительная активность; БМС - светосумма модельной системы; БМССП - свето-сумма модельной системы + надосадочной части слюны.

На втором этапе проведено обследование 25 здоровых лиц и 98 больных хроническим генерализованным пародонтитом различных степеней тяжести и стадий процесса. У больных изучалась люминолзави-симая ХЛ ротовой жидкости и определялась ее АОА.

Третий этап заключался в оценке влияния на процессы СРО широко используемых при лечении воспалительных заболеваний пародонта препаратов. Были протестированы следующие медикаментозные средства: 1 % спиртовой раствор хлорофиллипта, ро-токан, эраконд, настойка календулы, настойка эхи-нацеи пурпурной, 0,5 % раствор метрогила. Препараты добавлялись в модельные системы, имитирующие процессы СРО (генерацию АФК и ПОЛ), наиболее часто встречающиеся в организме. В качестве первой использовали систему цитрат - фосфат - люминол, в качестве второй - липиды куриного желтка, напоминающие по своему составу липопротеиновые комплексы организма. Влияние указанных лекарственных средств на генерацию АФК в фагоцитирующих клетках определяли по изменению ХЛ крови, в которую добавляли данные препараты.

На четвертом этапе осуществялся подбор лекарственных средств с учетом состояния СРО в ротовой жидкости и оценивалось с помощью хемилюминесцен-тных методов исследования проводимое лечение.

При исследовании ХЛ ротовой жидкости регистрировалась кривая, типичная запись которой представлена на рис. 1: спонтанное свечение плавно переходит

2Щ ' ' Г.......... ' ' 1 ........ .......I ' '" 1 Г - ........ 1 ' ' I ' ' "Г""^,

1J0 :

f. -:-----:

1.40 :

1.» - —------—_ _;

1,00

0,80  —г-------:

? }

ч пео "1 "

й

£ о,«о :-----:

с о.г> - - -

I «>• :„...,.................,.................|........................,.......;

о Fsill Гй О ПГё

Рис. 1. Типичная запись хемилюминесценции нативной слюны

в медленную вспышку. Основными интегральными показателями ХЛ, характеризующими процессы СРО, являются светосумма свечения и ее максимальное значение за 10 минут измерения.

Полученные данные указывают на то, что в ротовой жидкости протекают реакции, связанные с образованием АФК. Эти реакции сопровождаются свечением в присутствии люминола.

На рис. 2 приведены записи люминолзависимой ХЛ осадка и надосадочной части. Как видно из записи, ХЛ ротовой жидкости обусловлена клетками, имеющимися в осадке.

4,00 3,60 3,20

2,80 -2,40 2,00 1 ,60

^ 1,20

¡£ 0,80

^ 0,40

0

НИН.

Рис. 2. Запись хемилюминесценции различных компонентов слюны: 1 - осадок; 2 - надосадочная часть

Затем была исследована АОА надосадочной части слюны. В модельной системе, генерирующей АФК, наблюдается ХЛ (рис. 3, кривая 1). При добавлении надосадочной части слюны к модельной системе интенсивность ХЛ снижалась (рис. 3, кривая 2).

Е4 00 .................................................

57.60 :

51.20 _____|

44.80 ^

30 40 ___у___|

32.00 _ / :

25.60 .:__/_11__|

5 19.20 I

£ В 40 ¿1/ \ \ I

о 00 ,, .г^ггр?.. |,,,, I,,,, |,,,, I,,,, |

0.0 1.0 2 0 3.0 4.0 5.0

Время, нин.

Рис. 3. Запись хемилюминесценции модельной системы

Рис. 3 наглядно иллюстрирует способность надо-садка угнетать свечение данной модельной системы. Иными словами, надосадочная часть слюны обладает антиокислительными свойствами. Данный феномен ингибирующего влияния биологической жидкости на генерацию АФК можно объяснить наличием в ней антиоксидантов, в частности - ферментов (суперок-сиддисмутазы, каталазы и других), угнетающих образование свободных радикалов на различных фазах цепной реакции СРО.

Далее были обследованы 98 пациентов (45 мужчин и 53 женщины) 25-45 лет. Лица моложе 30 лет соста-

' г в .....1'' '4'J ее .......... V« 1 ]«

/ / \

1\

0 1.0 2 0 3.0 4.0 5.0

Время,

вили 12,5 %, в возрасте 31 год - 39 лет - 36,8 %, в возрасте 40-45 лет - 50,7 %. Состояние пародонта определялось формой и степенью поражения, характеризовалось воспалением, деструкцией костной ткани межзубных перегородок, кровоточивостью десен при чистке зубов и приеме пищи и явлениями экссудации из патологических карманов.

Оценивался также местный статус в полости рта. При объективном обследовании у всех больных выявлялись отечность, гиперемия слизистой оболочки де-сневого края, его кровоточивость при зондировании, наличие над- и поддесневого зубного камня, глубина пародонтальных карманов достигала 5,26+0,09 мм. У значительной части пациентов гигиенический уход за полостью рта был недостаточным, что подтвержда-

дением и получала систематические курсы противовоспалительной терапии.

Немногочисленность работ, посвященных исследованию влияния широко применяемых медикаментов при лечении воспалительных заболеваний пародонта, отсутствие данных о действии проводимого лечения на состояние генерации АФК клетками слюны побудили нас изучить антиокислительные свойства препаратов, широко используемых в лечении хронических генерализованных пародонтитов.

О влиянии медикаментозных средств судили по их способности изменять генерацию свободных радикалов в трех различных модельных системах. Данные о воздействии препаратов на различные типы свободных радикалов представлены в табл. 2.

Таблица 2

Антиокислительная активность препаратов, применяемых при лечении хронических генерализованных пародонтитов,

% от контроля

Концентрация препарата в модельной системе, мг/мл Генерация АФК Перекисное окисление липидов Клетки

в 1тах Б 1тах в 1тах

Хлорофиллипт 0,1 25,3±3,2 20,09±2,6 4,4±0,4 2,3±0,5 - -

0,05 51,1+6,4 55,6±6,2 7,5±0,7 4,3±0,4 - -

0,01 78,5±6,2 67,8±7,1 44,9±4,3 41,8±5,7 33,4±5,2 42,5±6,9

Настойка календулы 0,01 52,8±7,1 41,9+5,3 274,2±12,5 306,7±12,6 - -

0,005 71,1+6,9 62,2±4,6 235,7±14,8 292,4±14,5 - -

0,001 94,9±7,2 93,7±4,3 199,2±14,3 277,5±16,1 38,9±6,9 52,3±6,3

Настойка эхинацеи 0,01 20,02±2,3 15,4±3,4 20,2±5,7 22,8±5,7 - -

0,005 45,5±4,6 45,3+6,1 57,3±3,4 66,5±5,3 - -

0,001 71,9±5,7 70,3±5,7 73,8±4,3 79,8±4,3 22,3±2,5 27,9±5,3

Ротокан 0,01 33,3±6,3 17,4±6,9 9,4±0,5 4,9±0,5 - -

0,005 44,7±6,1 28,8±5,7 17,4 ±1,1 9,1+0,7 - -

0,001 58,8±7,6 48,9±5,2 73,3±5,7 78,6±2,5 6,7±0,4 10,7±2,8

Метрогил 0,01 60,9±4,3 71,1+4,8 84,2±5,7 85,7±6,1 - -

0,005 74,5±6,5 74,2±5,2 91,6±4,6 93,01+4,3 - -

0,001 80,1+8,1 75,9+5,1 98,1+6,1* 96,1±2,4* 19,2±3,4 37,3±5,7

Эраконд 1 49,5±5,6 87,5±3,4 12,2±5,7 8,3±0,7 - -

0,5 74,1±6,8 90,1+4,1 15,9±2,5 8,4±0,9 - -

0,25 91,5±4,2 96,4±2,4 21,9+5,1 11,08+0,7 4,03±0,3 6,6±0,7

Примечание. Приведены средние значения 10 измерений. Различия между данными статистически достоверны (р < 0,05) за исключением случаев, отмеченных звездочкой.

лось высокими значениями индекса гигиены Грина -Вермиллиона, который в среднем составил 2,8 ± 0,04 балла. Степень воспаления в десне - 41± 0,1 %, среднее значение ПИ - 4,86 ± 0,02.

У здоровых лиц уровень ХЛ ротовой жидкости находился в следующих пределах: 1тах - от 5,1 до 6,4 усл. ед., Б - от 37,0 до 61,0 усл. ед. У 68 больных хроническим генерализованным пародонтитом выявлено повышение ХЛ ротовой жидкости: 1тах - от 6,5 усл. ед. и выше, Б - от 61,1 усл. ед. и выше. У 23 больных выявлено понижение ХЛ ротовой жидкости: 1тах-от 0,8 до 5,0 усл. ед., Б - от 1,5 до 37 усл. ед., что свидетельствовало о низком уровне генерации АФК. В обе эти группы больных входили лица, впервые обратившиеся за помощью к пародонтологу и не получавшие никакого лечения. У 7 больных показатели ХЛ ротовой жидкости были в пределах нормы. Данная группа больных находилась под диспансерным наблю-

Как видно из табл. 2, в системе, генерирующей АФК, настойка эхинацеи пурпурной в наибольшей степени угнетала ХЛ. В липосомах наиболее интенсивно подавлял процесс ПОЛ хлорофиллипт. Эра-конд вызывал угнетение образования АФК фагоцитами крови. Настойка календулы в системе, генерирующей АФК, и в фагоцитах цельной крови проявила выраженный антиокислительный эффект, в то время как в липосомах данный препарат выступил в роли прооксиданта.

Таким образом, большинство исследованных лекарственных средств способны взаимодействовать с АФК и радикалами, образующимися при ПОЛ.

При лечении больных с повышенными показателями ХЛ ротовой жидкости применялись препараты, обладающие наибольшей АОА. В ходе проводимой терапии происходило клиническое выздоровление больных с дальнейшей длительной ремиссией

12

проблемы СТОМЯТОЛОГИИ 2007 № I

заболевания, что сопровождалось нормализацией показателей ХЛ ротовой жидкости. Оценка состояния свободнорадикального окисления в ротовой жидкости при воспалительных заболеваниях паро-донта, лечение с учетом этих изменений и влияния лекарственных средств на процессы СРО повышает эффективность лечебных мероприятий. В одних случаях (при высокой интенсивности СРО в ротовой жидкости и низкой ее АОА) следует назначать противовоспалительные средства, обладающие анти-оксидантными свойствами. В других (при недостаточности микробицидной активности ротовой жидкости) для предотвращения микробной инвазии в полости рта необходимы препараты или физиотерапевтические воздействия, усиливающие генерацию активных форм кислорода.

На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы.

1. В ротовой жидкости идут реакции генерации АФК, и в то же время надосадочная часть слюны обладает антиокислительной активностью. При заболеваниях пародонта процессы свободноради-кального окисления в ротовой жидкости ускоряются, что сопровождается усилением хемилюминес-ценции.

2. Лекарственные препараты, использующиеся для местного лечения воспалительных заболеваний пародонта, оказывают влияние на процессы свобод-норадикального окисления в модельных системах и ротовой жидкости.

3. Метод регистрации хемилюминесценции позволяет своевременно выявлять нарушения процессов свободнорадикального окисления и антиокислительной активности ротовой жидкости, изучить вли-

яние препаратов, применяемых при лечении данной патологии, и эффективность воздействия лечебно-профилактических мероприятий на состояние свобод-норадикального окисления в ротовой полости.

Списокиспользованной литературы

1. Алехин Е. К., Богданова А. Ш., Плечев В. В., Фархутдинов Р. Р. Влияние лекарственных средств на процессы свободнорадикального окисления. Уфа, 2002.

2. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы в биологических системах II Соросовский образовательный журнал. 2000. № 12. С. 13-19,

3. Владимиров Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты II Вестн. РАМН. 1998. № 7. С. 43-51.

4. Владимиров Ю. А. Электронный парамагнитный резонанс и хемилю-минесценция: прямые методы исследования свободных радикалов и реакций, в которых они участвуют II Эфферентная терапия. 1999. № 4. С. 18-27.

5. Владимиров Ю. А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции II Соросовский образовательный журнал. 1999. № 6. С. 25-32.

6. Григорьян А. С., Грудянов А. И., Рабухина Н. А., Фролова О. А. Болезни пародонта. М.: Мед. информ. агентство, 2004.

7. Журавлев А. И. Теоретические и методические основы биохемилюми-несценции. М., 1986.

8. Маянский А. Н. Лекции по иммунологии. Н. Новгород, 2005.

9. Фархутдинов Р. Р., Тевдорадзе С. И., Баймурзина Ю. Л. Определение антиокислительной активности методом регистрации хемилюминесценции II Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения. М., 2005. С. 115-121.

10. Фархутдинов Р. Р. Методики исследования хемилюминесценции биологического материала на хемилюминомере ХЛ 003 II Методы оценки антиок-сидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения. М., 2005. С. 123-132.

11. Фархутдинов Р. Р., Лиховских В. А. Хемилюминесцентные методы исследования свободнорадикального окисления в биологии и медицине. Уфа, 1995.

М. И. Плюснина, врач-стоматолог Железнодорожная стоматологическая поликлиника Челябинск

Применение современных методов шинирования при лечении пародонтитов

Заболевания пародонта в наше время, к сожалению, широко распространены. Медицинские исследования показывают, что практически у каждого пациента имеются проявления поражения десны той или иной степени.

Пародонтит - основное заболевание десен, постепенно приводящее к расшатыванию и потере зубов, если лечение не начать вовремя. Коварство паро-донтита состоит в том, что он не обнаруживает себя долгие годы и имеет тенденцию к прогрессированию. Наличие изменений в связочном аппарате, дистрофических процессов в костной ткани ведет к возникновению вторичных деформаций зубных рядов (даже при интактном зубном ряде).

Патология положения зубов, их подвижность создают для пациента ряд проблем, связанных с неудовлетворительной эстетикой лица, улыбки, чистоты речи, а также с нарушением функций зубочелюстной системы (откусывание и пережевывание пищи) и функции височно-нижнечелюстных суставов.

Применение современных шинирующих конструкций для лечения заболеваний пародонта способствует ликвидации воспалительных явлений, улучшению кровоснабжения и трофики тканей, в результате чего устраняются патологическая подвижность, травмирующее действие жевательного давления, нормализуются окклюзионные соотношения. Длительное время приоритетным методом лечения считалось ши-