СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ДВУЦЕПОЧЕЧНЫХ БЕЛКОВ В БАКТЕРИЯХ

1. Способ получения иммуномобилизующего моноклонального T-клеточного рецептора против рака (ImmTAC), содержащего альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCR) и бета-цепь TCR, в прокариотической клетке-хозяине, причем способ включает:
(а) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде для экспрессии альфа-цепи TCR и бета-цепи TCR ImmTAC в условиях, включающих: температуру при фазе роста и скорость перемешивания при фазе роста, и температуру при фазе образования продукта и скорость перемешивания при фазе образования продукта, при этом после экспрессии происходит фолдинг и сборка альфа-цепи TCR и бета-цепи TCR с образованием биологически активного ImmTAC в клетке-хозяине;
при этом клетка-хозяин содержит полинуклеотид, содержащий (1) первую единицу трансляции, кодирующую альфа-цепь TCR ImmTAC; (2) вторую единицу трансляции, кодирующую бета-цепь TCR ImmTAC; и (3) третью единицу трансляции, кодирующую по меньшей мере один шаперонный белок, выбранный из группы, состоящей из пептидил-пролил-изомераз, протеин-дисульфид-оксидоредуктаз и их комбинаций;
при этом температура при фазе роста на 2-10 °С превышает температуру при фазе образования продукта, а скорость перемешивания при фазе роста на 50-250 об/мин превышает скорость перемешивания при фазе образования продукта; и
(b) выделение биологически активного ImmTAC из клетки-хозяина.
2. Способ получения иммуномобилизующего моноклонального T-клеточного рецептора против рака (ImmTAC), содержащего альфа-цепь Т-клеточного рецептора (TCR) и бета-цепь TCR, в прокариотической клетке-хозяине, причем способ включает:
(а) культивирование клетки-хозяина в культуральной среде для экспрессии альфа-цепи TCR и бета-цепи TCR ImmTAC в условиях, включающих: температуру при фазе роста и скорость перемешивания при фазе роста, и температуру при фазе образования продукта и скорость перемешивания при фазе образования продукта, при этом после экспрессии происходит фолдинг и сборка альфа-цепи TCR и бета-цепи TCR с образованием биологически активного ImmTAC в клетке-хозяине;
причем клетка-хозяин содержит полинуклеотид, содержащий: (1) первую единицу трансляции, кодирующую альфа-цепь TCR ImmTAC; (2) вторую единицу трансляции, кодирующую бета-цепь TCR ImmTAC; (3) третью единицу трансляции, кодирующую первый белок-шаперон; (4) четвертую единицу трансляции, кодирующую второй белок-шаперон; и (5) пятую единицу трансляции, кодирующую третий белок-шаперон,
причем первый, второй и третий шаперонные белки выбраны из группы, состоящей из пептидил-пролил-изомераз, протеин-дисульфид-оксидоредуктаз и их комбинаций;
при этом температура при фазе роста на 2-10 °С превышает температуру при фазе образования продукта, а скорость перемешивания при фазе роста на 50-250 об/мин превышает скорость перемешивания при фазе образования продукта; и
(b) выделение биологически активного ImmTAC из клетки-хозяина.
3. Способ по п. 1 или п. 2, отличающийся тем, что полинуклеотид дополнительно содержит три копии промотора, причем первая копия функциональным образом объединена с первой единицей трансляции, вторая копия функциональным образом объединена со второй единицей трансляции, а третья копия функциональным образом объединена с третьей единицей трансляции для запуска транскрипции первой цепи, второй цепи и белка-шаперона.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что промотор представляет собой индуцибельный промотор.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что индуцибельный промотор представляет собой промотор, индуцируемый IPTG, который запускает транскрипцию альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR и белка-шаперона в отсутствие IPTG-индукции.
6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что индуцибельный промотор представляет собой Pho-промотор, который запускает транскрипцию альфа-цепи TCR, бета-цепи TCR и белка-шаперона при исчерпании фосфата в культуральной среде.
7. Способ по любому из пп. 1-6, отличающийся тем, что полинуклеотид дополнительно содержит селективный маркер, а культуральная среда содержит селективный агент, состоящий из одиночного антибиотика, вызывающий сохранение полинуклеотида в клетке-хозяине.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что первая единица трансляции содержит первую область инициации трансляции (TIR), которая функциональным образом объединена с кодирующей областью альфа-цепи TCR, а вторая единица трансляции содержит вторую область инициации трансляции (TIR), которая функциональным образом объединена с кодирующей областью бета-цепи TCR, причем относительная интенсивность трансляции первой и второй TIR составляет от около 1,0 до около 3,0
9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что по меньшей мере один белок-шаперон или первый белок-шаперон включает пептидил-пролил-изомеразу.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что пептидил-пролил-изомераза представляет собой белок FkpA.
E. coli
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что FkpA представляет собой FkpA .
12. Способ по любому из пп. 9-11, отличающийся тем, что по меньшей мере один белок-шаперон дополнительно включает или один или оба из второго белка-шаперона, а третий белок-шаперон включает протеин-дисульфид-оксидоредуктазу.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что протеин-дисульфид-оксидоредуктаза представляет собой один или оба из белка DsbA и белка DsbC.
E. coli
E. coli
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что по меньшей мере одна протеин-дисульфид-оксидоредуктаза представляет собой один или оба из DsbA и DsbC .
15. Способ по любому из пп. 1-14, отличающийся тем, что прокариотическая клетка-хозяин представляет собой грамотрицательную бактерию.
E. coli
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что грамотрицательная бактерия представляет собой .
E. coli
degpS210A
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что принадлежит к штамму с мутацией .
E. coli
fhuA
phoA ilvG2096
)
prc
degP
manA lacI
ompT
menE degpS210A
r
Q
18. Способ по п. 16, отличающийся тем, что представляет собой штамм с генотипом W3110 ΔΔ(ValΔspr43H1 ΔΔΔΔ.
19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что альфа-цепь TCR содержит вариабельный домен альфа-цепи TCR и константный домен альфа-цепи TCR, при этом бета-цепь TCR содержит вариабельный домен бета-цепи TCR и константный домен бета-цепи TCR.
20. Способ по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что две цепи ImmTAC связаны друг с другом по меньшей мере одной дисульфидной связью.
21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что ImmTAC дополнительно содержит фрагмент антитела, который связывает Т-клетку и активирует Т-клеточный ответ.
22. Способ по п. 21, отличающийся тем, что фрагмент антитела содержит фрагмент одноцепочечного антитела против CD3.
23. Способ по любому из пп. 1-22, отличающийся тем, что ImmTAC содержит TCR, который модифицирован так, чтобы обладать повышенным сродством к антигену, по сравнению со сродством к антигену TCR, который не был модифицирован.
24. Способ по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что ImmTAC выделяют из периплазмы клетки-хозяина.
25. Способ по любому из пп. 1-24, отличающийся тем, что температура при фазе роста находится в диапазоне от около 30°C до около 34 °C в течение фазы роста, а температура при фазе образования продукта находится в диапазоне от около 25 °С до около 29 °C в течение фазы образования продукта.
26. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что скорость перемешивания при росте достаточна для достижения клеткой-хозяином в течение фазы роста скорости поглощения кислорода, которая на 0,5-2,5 ммоль/л/мин превышает пиковую скорость поглощения кислорода клеткой-хозяином в течение фазы образования продукта.
27. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что пиковая скорость поглощения кислорода клеткой-хозяином в течение фазы роста находится в диапазоне от 3,5 до 4,5 ммоль/л/мин, а скорость поглощения кислорода клеткой-хозяином в течение фазы образования продукта находится в диапазоне от 1,0 до 3,0 ммоль/л/мин.
28. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что скорость перемешивания при фазе роста превышает скорость перемешивания при фазе образования продукта на 10-40%.