Применение углеводно-минеральных отходов производства альгината натрия в качестве питательной среды для культивирования Bacillus thuringiensis var. Darmstadiensis (BtH 10)

УДК: 661.47:268.46

И. А. Наумов, Е. Э. Куприна, З. А. Канарская, Е. А. Буркова

ПРИМЕНЕНИЕ УГЛЕВОДНО-МИНЕРАЛЬНЫХ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА АЛЬГИНАТА НАТРИЯ В КАЧЕСТВЕ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis

Ключевые слова: альгинат натрия, отходы, питательная среда, Bacillus thuringiensis, бацикол.

Установлено, что состав отходов электрохимического производства альгината натрия является приемлемым для применения в составе питательной среды для культивирования Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10). Показано, что ферментативный гидролиз углеводов, присутствующих в отходах производства альгината натрия, повышает питательную ценность субстрата. Оптимизирован состав питательной среды, для культивирования Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10), на основе отходов электрохимического производства альгината натрия с частичной заменой соевой и кукурузной муки. Получаемый биопрепарат показал высокую инсектицидную активность на личинках комнатной мухи.

Keywords: sodium alginate, waste, nutrient medium, Bacillus thuringiensis, batsikol.

Found that the composition of waste electrochemical production of sodium alginate is acceptable for use in the composition of the nutrient medium for the cultivation of Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10). It has been shown that enzymatic hydrolysis of the carbohydrates present in the waste production of sodium alginate increases the nutritional value of the substrate. Optimized composition of the nutrient medium for the cultivation of Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10), based on the waste electrochemical production of sodium alginate with partial replacement of corn and soy flour. The resulting biological product showed high insecticidal activity on larvae of the housefly.

Экономической предпосылкой создания биотехнологического производства, является доступная сырьевая база для получения питательных сред. Стоимость компонентов питательных сред непосредственно влияет на конечную себестоимость получаемых биопродуктов. Поэтому при организации биотехнологических производств целесообразно ориентироваться, прежде всего, на использование в качестве сырья вторичных ресурсов или, как принято говорить, отходов других производств [1, 2].

За последнее время в области земледелия и сельскохозяйственного производства возникли, в частности, такие негативные тенденции, как снижение плодородия почв и потери урожаев, вызываемые распространением вредителей и болезней. Массированное применение минеральных удобрений, пестицидов и других средств химического синтеза приводит к нарушениям экологического баланса и к указанным выше негативным последствиям. Этими факторами обусловлен поиск альтернативных средств и приемов ведения сельского хозяйства. В последние годы такой альтернативой химизации в развитых странах мира является организация земледелия, основанного на биологических способах борьбы с насекомыми [3]. Причем, для борьбы с вредными насекомыми стараются использовать, в частности, такие микроорганизмы, которые способны также благоприятно влиять на состав почвы, осуществлять деструкцию опасных химических пестицидов и т.п. [4].

При этом наиболее эффективными и широко применяемыми (около 95 % рынка биопестицидов) среди таких средств являются препараты на основе грамположительной спорообразующей бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) - обладающей способностью образовывать при споруляции параспоральные (локализованные рядом со спорой) кристаллические включения белковой природы [5].

Эти кристаллические белки (или 5-эндотоксины), подразделяемые на два мультиген-ных семейства Cry- и Cyt-белки [6], и обуславливают инсектицидную активность Bt. Кроме того, многие штаммы этой бактерии продуцируют также и другие факторы активности в отношении насекомых, из которых наиболее активным является термостабильный ß-экзотоксин, высокотоксичный для многих видов насекомых [7].

Преимуществами биопестицидов на основе Bt, по сравнению с химическими инсектицидами, являются: отсутствие загрязняющих остатков, высокая специфичность действия, обусловливающая их безопасность для нецелевых организмов, а также сравнительно низкая стоимость процедур, требуемых для регистрации этих препаратов в качестве средств защиты растений [4, 8, 9]

Представленные результаты исследований касаются производства экологически чистых биопрепаратов для сельского хозяйства - а именно, бактериального инсектицидного препарата на основе бактерии Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis H10. Данный серотип, помимо 5-эндотоксинов, продуцирует также термостабильный ß-экзотоксин - и потому, наиболее перспективен для производства биологических инсектицидов. Кроме того, вышеупомянутая бактериальная культура обладает выраженной ферментативной активностью по отношению к гидролизу многих сложных по составу субстратов - и потому, может быть культивирована на различных питательных средах [4]. В результате, препарат, создаваемый на основе Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis, может заменить, в частности, такие известные препараты как Биток-сибациллин и Лепидоцид.

Основными компонентами питательной среды при глубинном культивировании Bacillus

thuringiensis var. darmstadiensis являются соевая мука и кукурузный крахмал. При этом соевая мука используется преимущественно как источник азота и содержит факторы роста, а кукурузный крахмал является источником углерода [4]. Но указанные компоненты являются достаточно дорогими. Кроме того, их применение создает своего рода конкуренцию между потребителями данных продуктов - что приводит к дополнительному повышению цен на это сырье. Исходя из чего, поиск более доступных сырьевых источников для производства бактериального инсектицидного препарата на основе Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis весьма актуален.

При этом альтернативой вышеупомянутых компонентов питательных сред могут служить, в частности, углеводно-минеральные вторичные ресурсы производства из бурых водорослей альгината натрия (АН) - применяемого в медицине (в качестве энтеро-сорбента - который связывает и выводит из организма радионуклиды и тяжелые металлы, а также ускоряет процесс заживления ран - а также для снижения уровня холестерина в крови, для лечения кислотоза-висимых заболеваний желудочно-кишечного тракта и т.п.), в фармакологии и косметике (как стабилизатор эмульсии в кремах и лосьонах, а также как среда для приготовления кремов, мазей и помад), в пищевой промышленности (как загуститель и стабилизатор при изготовлении мармелада, конфет, желе, джемов; для осветления соков, замутнения безалкогольных напитков; при производстве майонезов, соусов, мясных и рыбных студней, а так же пищевых концентратов).

Указанные отходы производства альгината натрия выбрасываются во внешнюю среду в значительных количествах, имеют разнообразный состав как по минеральным, так и по органическим веществам (табл. 1), агрегатное состояние и рН (кислый у жидких и щелочной у пастообразных отходов), что обеспечивает возможность их длительного хранения, и таким образом добавляет привлекательности для биотехнологических производств) [10 - 12].

Таблица 1 - Химический состав отходов альги-натного производства

Таким образом, отсутствие технологий по переработке отходов альгинатного производства отрицательно влияет не только на экологическую обстановку в регионах, но и на их экономику. В частности, при мощности альгинатного производства 100 т в год в результате утилизации его жидких отходов возможно получение дополнительно до 15 - 18 т манни-та в год (притом, что стоимость последнего составляет в среднем 40 $ за 1 кг) [12].

Кроме того, и пастообразные отходы альгинатного производства (представляющие собой водонерастворимую фракцию, состоящую из полисахаридов водорослевых клеточных стенок -таких как целлюлоза, фукоидан, ламинаран и др.

- а также водорастворимых сахаров и прочих нутриентов водорослей, остающихся в осадке после отделения раствора АН) перспективны как основа питательных сред в различных биотехнологических производствах, а также применяются в настоящее время при производстве биогаза и биоэтанола [13 - 16].

При этом, для повышения питательной ценно -сти вторичных ресурсов производства АН водоне-растворимая фракция может подвергаться кислотному и ферментативному гидролизу. Для эффективного гидролиза стенок клеток тканей водорослей - представляющих собой многокомпонентную систему из фибрилл целлюлозы (1,4-ß-D-глюкан), пектиновых веществ, представленных альгиновой кислотой (ß-D-маннуроноая и a-L-гулуроновая кислоты), сульфатированных полисахаридов (ß-1,2-, ß-1,3-, ß-l^-фукан с небольшим количеством галактозы и других минорных сахаров) и белкового компонента - необходим целый комплекс различных ферментных препаратов [13, 17].

Входить в состав этого комплекса должны, прежде всего, гидролитические ферменты, относящиеся по своей субстратной специфичности к самым разным классам: целлюлазам (гидролизующим 1,4-ß-D-глюканы), амилазам (гидролизующим 1,4-a-D-глюканы), пектиназам, протеазам и т.д.

При этом роль пектиновых веществ в матриксе клеточной стенки бурых водорослей выполняет альгиновая кислота. А ферменты, гидролизующие пектиновые вещества (полигалактуроновые кислоты) и альгиназы (полиманнуроновые и гулуроно-вые кислоты) относятся к одному подклассу ферментов и имеют сходный механизм действия.

Некоторые из вышеозначенных гидролизующих ферментов продуцирует сама Bacillus thuringiensis [4]. Но для повышения питательной ценности субстратов перспективно также применение дополнительной ферментативной обработки для гидролиза полимеров [13, 17].

В связи с вышесказанным, целью исследования стало определение возможности использования углеводно-минеральных вторичных ресурсов производства АН в качестве питательной среды для культивирования Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (BtH1Q).

При этом решались следующие задачи:

- определение углеводного состава вышеупомянутых ресурсов,

- определение целесообразность применения ферментов для увеличения содержания в этих ресурсах редуцирующих веществ,

- оптимизация состава питательной среды для культивирования BtH10, на основе данных ресурсов

- с частичной заменой дорогостоящих компонентов.

Отходы Содержание сухих веществ Содержание, % сухого вещества

Органические вещества Азотистые вещества Маннит Альгиновая кислота Клетчатка Минеральные вещества

Жидкие 3,5 55,0 8,0 26,0 5,6 — 45,0-47,0

Пастообразные 7,3 - 7,8 90,0 18,8 - 3,0 37,5 10,0-15,0

Материалы и методы

В экспериментах использовались отходы, образующиеся при электрохимическом получении АН на стадии отделения щелочного раствора после проведения экстрагирования АН из сырья [10].

При этом, массовая доля воды в данных отходах определялась по стандартной методике в соответствии с ГОСТ 26185-84.

Определение редуцирующих веществ в минерально-углеводных отходах производства АН проводилось по следующей методике. Сначала, навеску биомассы массой 50 г (влажность 95 %) суспензировали в 500 мл дистиллированной воды и выдерживали сутки при 4 С. После этого, полученную суспензию центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин. Далее, надосадочный раствор концентрировали под вакуумом при 45 °С на ротарном испарителе «BUCHI R-200» (фирмы «Buchi», Швейцария) до объема 20 мл. Затем, концентрат пропускали через колонку с ионообменной смолой «Dowex 50WX8» (фирмы «Acros», США) и выпаривали досуха под вакуумом при 45 °С. После чего, полученный осадок растворяли в 1 мл деионизированной воды и фильтровали через 0,22 м нейлоновый фильтр «Spin-X» (фирмы «Costar», США).

Далее, состав редуцирующих веществ в полученном растворе определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), используя для этого систему «JASCO LC-900» (фирмы «Jasco International CO LTD», Япония). При этом, детектирование редуцирующих сахаров осуществляли методом послеколоночной реакции. Сахара разделяли на хроматографической колонке «SUPELCOSIL LC-NH2» (фирмы «Supelco Gland», Швейцария). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонит-рил / вода (85/15 об/об). В качестве окрашиваемого реактива использовали раствор 2,3,5-трифенил-тетразолия хлорида (фирмы «Fluka Chemie AG»). А поглощение окрашенного комплекса измеряли при длине волны 487 нм.

Ферментативный гидролиз углеводов осуществляли следующим образом. Сначала, навеску углеводно-минерального продукта массой 40 г помещали в коническую колбу и добавляли 40 мл дистиллированной воды (причем, готовили сразу три таких по-вторности). Затем, колбы помещали в водяной термостат на заданную температуру. Через 60 минут колбы доставали из термостата и замеряли рН суспензий. После этого, к суспензии добавляли 0,1Н раствор соляной кислоты до такого значения рН, при котором планировалось проводить ферментативный гидролиз. Затем, суспензии перемешивали стеклянной палочкой и добавляли навески ферментных препаратов «Вискофло» и «Дистицим» (каждого - в количестве 0,1 % от массы сухих веществ углеводно-минерального продукта). После этого, суспензии снова перемешивали, и колбы с ними помещали в термостат на 3 часа, затем колбы помещали в баню кипящую на 15 минут для инактивации ферментного препарата. На полученных гидролизатах приготовляли питательные среды.

Разработка рецептуры приготовления питательной среды для культивирования BtH10, на основе углеводно-минеральных отходов электрохимического производства АН. Для оптимизации состава питательной среды было предложено исследовать глубинное культивирование BtHi0 на жидкой питательной среде разного состава - чтобы получить максимальные титры при рациональном использовании отхода и других компонентов. После чего, проводились испытания биологической эффективности отобранных на 1-ом этапе вариантов оптимальных питательных сред - на основе чего выбирали их наиболее рациональный состав.

При этом, культивирование проводили как на средах с исходным нейтрализованным углеводно-минеральным продуктом, так и после дополнительной ферментативной обработки оного. Кроме того, в средах варьировали количества углеводно-минерального продукта, а также основных питательных компонентов: соевой муки, глюкозы, кукурузного крахмала. После чего, рН полученных сред доводили до нейтрального значения. Затем, среды разливали по колбам, стерилизовали и засевали.

Приготовление посевного материала. Исходный штамм бактерии BtH10 засевали в пробирки со скошенной агаризованой средой СПА и в течение 72 часов выдерживали в термостате при 29 °С.

Культивирование BtH10. Полученный посевной материал заливали стерильной водой в количестве 2 мл и суспендировали стерильной петлей. Потом, пересевали по 1 мл полученной суспензии в колбы с 40 мл жидкой среды. Затем, культивировали оные в течение 3 суток при температуре 28 °С:

- на качалке «New brunswick scientific» (США) при 220 мин-1,

- а также на ферментере «LabFerm System 7» (Россия) - в условиях активного перемешивания (800 мин-1), контроля пены, рН и DO.

После чего, в полученной культуральной жидкости определяли число колониеобразующих единиц (КОЕ).

Определение КОЕ в 1 мл культуральной жидкости. Чашечный метод Коха. В ходе наших исследований было установлено, что при культивировании на средах, содержащих водорослевые отходы, происходит агломерация бактериальных колоний между собой и адсорбция их на поверхности компонентов питательной среды - что при обычном высеве не позволяет достоверно оценить КОЕ. Поэтому, с целью отмывки от компонентов питательной среды и разобщения бактериальных агломератов, в воду для приготовления разведений до стерилизации было рекомендовано вводить детергент «Твин 80» в количестве 0,25 %.

Затем, исходную исследуемую культуральную жидкость (КЖ) тщательно перемешивают - для чего 10 мл КЖ переносят в пустую стерильную пробирку с притертой пробкой и взбалтывают в течение 60 секунд (контроль времени обязателен -по секундомеру либо песочным часам).

Потом, стерильной пипеткой отбирают 1 мл суспензии и переносят его в другую пробирку, за-

полненную 9 мл стерильной водопроводной воды с заранее добавленным детергентом.

Далее встряхивают пробирку, аналогично отбирают из неё 1 мл суспензии, переносят оную в 3-ю пробирку с 9 мл воды - и так 7 раз.

Наконец, 0,5 мл суспензии из 7-го разведения (предварительно тщательно перемешанного) переносят на поверхность чашки Петри и заливают теплой агаризованной питательной средой и инкубируют в термостате в течение 72 ч при 20°С, 48 ч при 30 °С или 24 ч при 35 °С. Далее ведут подсчет КОЕ в 1 мл исходной пробы по формуле:

N = nx2x10Z,

где n - количество колоний в 0,5 мл разведенной пробы; z - коэффициент разведения.

При этом расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 30 %.

Определение биологической эффективности культуральной жидкости. В качестве тест-объекта для этого были использованы личинки комнатной мухи 3-х суточного возраста однородной популяции, отродившиеся в течение одного дня из одной яйцекладки и выращенные на среде постоянного состава. При этом был использован общеизвестный международный метод оценки инсектицидного действия препаратов на основе Bacillus thuringiensis [18].

Результаты и обсуждение

Экспериментально установлено, что массовая доля воды в отходе составляет 94 - 96 %. Результаты анализов на редуцирующие растворимые сахара в отходе приведены в таблице 2. Из них видно, что суммарное количество вышеозначенных сахаров в отходе составляет около 0,5 мг на 100 г биомассы влажностью 95 %.

Таблица 2 - Результаты анализов на редуцирующие сахара

Редуцирующие сахара мкг/100 г биомассы

Ксилоза 45,6

Фруктоза 20,5

Глюкоза 377

Мелибиоза 66,0

Сумма 509,1

Определение оптимальной концентрации отхода в питательной среде. Состав питательной среды и полученные КОЕ в культуральных жидкостях через 72 часа культивирования приведены в таблице 3.

Было установлено, что сахаров во всех вышеупомянутых питательных средах достаточно для сокращения ЛАК-фазы роста ВШ^.

В результате культура ВШ^ успевает адаптироваться и синтезировать собственные ферменты для потребления полисахаридов водорослей. Из чего следует, что водорослевая питательная среда применима для культивирования выбранной бактерии.

В тоже время, из результатов анализа КОЕ (см. таблицу 3) видно, что наибольший титр по В£Н10 среди исследовавшихся питательных сред имела среда с 40 % отходов производства АН в ней. При дальнейшем увеличении доли отходов титр среды снижался (хотя и не так значительно, как при уменьшении доли отходов от 40 %) - вероятно, в силу высокой вязкости среды и недостаточной аэрации. При концентрации же 40 % титр по В£Н10 составил 1,02 млрд. спор в 1 мл культуральной жидкости. При этом, при микроскопии культуры наблюдалось спорообразование на 95 % и присутствие сформированных внешних белковых кристаллов, а содержание экзотоксина по ЛК50 для личинок комнатной мухи составило 4,68 мкл препарата на 1 г корма. Это подтверждает пригодность водорослевой питательной среды для выращивания BtH¡o.

Таблица 3 - Составы питательных сред при различной концентрации отхода и КОЕ в культуральных жидкостях

Компонент Варианты питательных сред

1 2 3 4 5

Соевая мука 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Дрожжи кормовые 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Глюкоза 0 0,5 0,5 0,5 0,5

К2НРО4 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

MgSO4 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02

СаС12 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Отход с влажность 95 % 10 20 30 40 50

рН исходный 8,93 10,28 10,22 10,3 10,05

рН до стерилизации 7,02 7,08 7,18 7,18 7,1

рН после стерилизации 7,04 7,08 7,19 7,23 7,13

Титр, млрд КОЕ/мл 0,006 0,01 0,5 1,02 0,92

Повышение продуктивности питательной среды. Однако уже применяемый аналогичный биопрепарат «Бацикол» имеет титр не менее 2 млрд. КОЕ/мл при содержании экзотоксина (оцениваемого по ЛК50 для личинок комнатной мухи) не более 15 мкл препарата на 1 г корма. Поэтому дальнейшие наши исследования были направлены на создание питательных сред, обеспечивающих при культивировании достижение более высоких показателей титра по В£Н10

Для этого было проведено дополнительное глубинное культивирование на средах разного состава. В результате чего было установлено, что улучшения продуктивности питательной среды необходимо увеличить содержание в ней соевой муки и кукурузного крахмала (см. таблицу 4).

При этом, хотя питательная среда №6 в наибольшей степени соответствовала требованиям на «Бацикол», среда №9 оказалась наиболее оптимальной из исследованных по экономическим показателям.

При этом, при культивировании на этой среде содержание экзотоксина по ЛК50 для личинок комнатной мухи составило 3,74 мкл препарата на 1 г корма.

Таблица 4 - Влияние состава питательных сред на КОЕ в культуральных жидкостях

Однако, чтобы ещё повысить титр по BtH10 питательной среды №9 - она была дополнительно обработана двумя ферментными препаратами по описанной выше методике (см. среду № 11 из таблицы 4). Результаты микроскопии питательной среды № 11 (см. рис. 1) показали, что через 72 часа культура BtH10 практически на 100 % заспорулировалась и образовала белковые кристаллы, отделенные от спор. При этом, титр данной питательной среды составил 2,6 млрд. КОЕ/мл, а содержание в ней экзотоксина -2,95 мкл препарата на 1 г корма (по ЛК50 для личинок комнатной мухи), что полностью соответствует требованиям на уже зарекомендовавший себя к применению биологический инсектицид «Бацикол» на основе Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis BtH10.

1

Рис. 1 - Микроскопия препарата на основе питательной среды №11

Таким образом, благодаря использованию в составе питательной среды № 11 для культивирования В1Н10 отходов электрохимического производства АН, удалось понизить расход ценного кукурузного крахмала - что привело к снижению себестоимости получения данного бактериального препарата, а также помогло в решении проблемы утилизации углеводного отхода, образующегося при получении АН (в частности, при производстве 1т описываемого бактериального препарата с титром по В£Н10 не менее 2,6*109 спор/мл утилизируется до 400 кг влажного отхода).

Заключение

Установлено, что состав углеводно-минеральных вторичных ресурсов электрохимиче-

ского производства альгината натрия (АН) является приемлемым для применения в составе питательной среды для культивирования Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10). Показано, что ферментативный гидролиз углеводов, присутствующих во вторичном ресурсе производства АН, повышает питательную ценность субстрата.

Оптимизирован состав питательной среды, для культивирования Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis (BtH10), на основе углеводно-минеральных вторичных ресурсов электрохимического производства АН. При этом полученный биопрепарат показал высокую инсектицидную активность на личинках комнатной мухи (международный тест-объект для оценки инсектицидной активности препаратов, на основе экзотоксиноген-ных штаммов Bacillus thuringiensis.

Литература

1. Alonso S1, Rendueles M, Diaz M. Microbial production of specialty organic acids from renewable and waste materials. Crit Rev Biotechnol. 22. (2014).

2. Poopathi, S.; Mani, C.; Rajeswari, G. Potential of sugarcane bagasse (agro-industrial waste) for the production of Bacillus thuringiensis israelensis. Tropical Biomedicine. Vol. 30 Issue 3. p504. (2013).

3. Кандыбин Н.В., Патыка В.Ф., Ермoлова В.П., Патыка Т.И. Микробиоконтроль численности насекомых и его доминанта Bacillus thuringiensis /Инновационный центр защиты растений. С. Петербург. Пушкин. 244 с.

4. Kousik Mandal, Balwinder Singh, Monu Jariyal, V.K. Gupta Microbial degradation of fipronil by Bacillus thuringiensis Original Research Article. Ecotoxicology and Environmental Safety. Vol. 93. P. 87-92. (2013).

5. Feitelson J.S., Payne J., Kim I. Bio/Technology., v. 10. Р. 271-275. (1992).

6. Crickmore N., Zeigler D.R., Feitelson J., Schnepf E., van Rie J., Lereclus D., Baum J., Dean D.H. Mol. Biol. Rev., v. 62, 3, p. 807-813. (1998).

7. Levinson B.I. In: Analytical chemistry of Bacillus thuringiensis. Ed. by L. A. Hickle, W. L. Fitch. Washington, D. C, American Chemical Society. p. 115-136. (1990).

8. Andrews R.E., Jr., Faust R.M., Wabiko H., Raymond K.C., Bulla L.A., Jr. CRC Crit. Rev. Biotechnol. v. 6., № 2, p. 163-232. (1987).

9. Federici B.A., Maddox J.V. Bioscience. V. 46, № 6, p. 410-421. (1996).

10. Наумов И.А., Гарабаджиу А.В., Куприна Е.Э., Кириллов А.И., Канарская З.А. Влияния электрохимического способа обработки Laminaria saccharina на выход и вязкость альгината натрия // Вест. Казанс. Технол. ун. № 1. 188-192. (2014).

11. Наумов И.А., Гарабаджиу А.В., Куприна Е.Э., Кириллов А.И., Канарская З.А. Совершенствование технологии консервирования Laminaria saccharina// Вест. Казанс. Технол. ун. №8, 206-210. (2014).

12. Суховеева М.В., Подкорытова А.В. Промысловые водоросли и травы морей Дальнего Востока: биология, распространение, запасы, технология переработки. — Владивосток: ТИНРО-центр. 243 с. (2006).

13. Галынкин В.А., Еникеев АХ., Гарабаджиу А.В., По-мешалкин Е.И., Наумов И.А., Козлов Г.В. Морские биоресурсы - перспективная сырьевая база биотопливиой индустрии. Химия и полная переработка биомассы леса. С.-П. (2010).

Компонент Варианты питательных сред,

6 7 8 9 10 11

Соевая мука 2,5 1,5 1,5 2,5 2,5 2,5

Дрожжи кормовые 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Кукурузный крахмал 2,5 0 0,5 0,5 0 0,5

К2НРО4 0,3

MgSO4 0,02

СаС12 0,1

Отход с влажностью 95 % 0 40 40 40 40 40*

рН перед засевом 7,0±0,2

Титр, млрд. КОЕ/мл 2,1 0,76 1,02 1,8 0,9 2,6

* - в опыте взят отход после ферментативной обработки

14. Horn S.J., Aasen I.M., Ostgaard K. Ethanol production from seaweed extract. J Ind Microbiol Biot. 25:249-54. (2000).

15. Adams J.M., Gallagher J.A., Donnison I.S. Fermentation study on Saccharina latissima for bioethanol production considering variable pre-treatments. J Appl Phycol. 21:569-74. (2009).

16. Ji Ye Leea, Young Soo Kima, Byung Hwan Umb, Kyeong Keun Oha Pretreatment of Laminaria japonica for bioethanol production with extremely low acid concentration. Renewable Energy. V. 54. P. 196-200. (2013).

17. Алексеева З.Ю., Галъткин В.А., Гарабаджиу А.В., Еникеев А.Х., Козлов Г.В. Полиферментативный гидролиз полисахаридов водорослей Laminaria saccharina. Известия С.-П. гос. технол. ин. (технического университета). № 6. (2009).

18. Hodgman T.C., Ziniu Y., Ming S., Sawyer T., Nicholls C.M., Ellar D.J. Characterization of a Bacillus thuringiensis strain which is toxic to the housefly Musca domestica. FEMS Microbiol. Lett. 114 (1) pp. 17-22. (1993).

© И. А. Наумов - научный сотрудник ОАО «ГИПРОРЫБФЛОТ», г. Санкт-Петербург, IgorNaumov@bk.ru; Е. Э. Куприна - др тех. наук, проф., зав. лаб. ОАО «ГИПРОРЫБФЛОТ», г. Санкт-Петербург, elkuprina@yandex.ru; З. А. Канарская - канд. тех наук, доц. каф. Пищевой биотехнологии КНИТУ, zosya_kanarskaya@mail.ru; Е. А. Буркова - аспирант каф Пищ.БТ, КНИТУ, ekaterina_1012@mail.ru.

© I. A. Naumov - research associate of JSC "GIPRORYBFLOT", St. Petersburg, IgorNaumov@bk.ru; E. E. Kuprina - Doctor of Technical Sciences, prof., Head. labs. JSC "GIPRORYBFLOT", St. Petersburg, elkuprina@yandex.ru; Z. A. Kanarskaya - Ph.D, Associate Professor, Department of Food Biotechnology, KNITU, zosya_kanarskaya@mail.ru; E. A. Burkova- graduate, Department of Food Biotechnology, KNITU, ekaterina_1012@mail.ru.