СПОСОБ РЕАНИМАЦИИ ЭМБРИОНОВ ПЕРЕПЕЛОВ И СТИМУЛЯЦИИ ИХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
METHOD FOR RESUSCITATION OF QUAIL EMBRYOS AND STIMULATION OF THEIR NONSPECIFIC RESISTANCE

Данное изобретение относится к области сельского хозяйства - птицеводству, а именно - перепеловодству (прединкубационное применение раствора, в состав которого входят коламин, серин, янтарная кислота и пиридоксина гидрохлорид, а также обработка раствором янтарной кислоты при переводе на вывод).
6
Известны обработки инкубационных яиц растворами коламина, янтарной кислоты, серина и пиридоксина гидрохлорида с целью стимуляции эмбрионального развития кур яичных кроссов (Азарнова Т.О., 2020). Янтарная кислота и ее соли обладают адаптогенной способностью и оказывают антигипоксическое, антиоксидантное и нейротропное действие, нормализуют энергетический, пластический обмен и общее физиологическое состояние организма (Евглевский А.А., 2013). Коламин через холин поддерживает интенсивность реакций митохондриальной дыхательной цепи, ингибирует окисление жиров, витамина А и других соединений, имеющих ненасыщенные углеродные связи, принимает активное участие в окислительно-восстановительных процессах в организме животных, улучшает фосфорный и белковый обмен и, следовательно, является стимулятором роста (Шипунова Н.Н., 2014). В свою очередь, серин - гликогенная аминокислота, входящая в состав фосфолипидов мембран клеток и активные центры многих ферментов (Гараева С.Н., 2009). В (пиридоксина гидрохлорид) - водорастворимый витамин, активной формой которого являются фосфорилированные производные - пиридоксальфосфат и пиридоксаминофосфат. Пиридоксальфосфат входит в состав многих ферментов, которые принимают различное участие в процессах метаболизма. Так, например, он является коферментом декарбоксилаз, трансаминаз, кенурениназы, триптофансинтазы, цистеиноназы. При участии витамина В6 протекает реакция образования δ-аминолевулиновой кислоты (синтеза тема), также он повышает эффективность использования глюкозы организмом. В медицине и ветеринарии используют витамин В6 в виде пиридоксина гидрохлорида. В процессе метаболизма он всасывается в тонком отделе кишечника и превращается в активные формы. Продукты его метаболизма выделяются почками и не являются токсичными (Логинова Н.Ю., 2017). Необходимо отметить, что пиридоксин способен оказывать влияние на обмен аминокислот, содержащих серу, принимая участие в пересульфировании, т.е. переносе сульфгидрильных групп с одного соединения на другое. Так, ферменты, в состав которых входит фосфопиридоксаль, способствуют переносу серы с метионина на серин и образованию цистеина. Вместе с серином он участвует в синтезе сфинголипидов. Также принимает участие в образовании биогенных аминов, таких, например, как коламин. Пиридоксин способен взаимодействовать с янтарной кислотой, с образованием оксипиридинов, спектр антиоксидантного и антигипоксантного действия которых достаточно широк (Логинова Н.Ю., 2017). Таким образом, дополнение ранее изученной композиции, состоящей из коламина, янтарной кислоты и серина витамином В6 расширяет спектр антиоксидантного, гематопротекторного, обменостимулирующего антигипоксического действия ранее предложенных БАВ, обуславливая предпосылки для более качественного становления тканей, органов, целого организма.
Известно, что процесс тканевого дыхания обеспечивается двумя системами. Первая - система аэробного окисления субстрата митохондриальная дыхательная цепь (МДЦ) (является основной системой энергообеспечения в организме животных и птицы), и вторая - система анаэробного окисления субстрата, локализованная в цитоплазме и состоящая из набора ферментов гликолиза. В своей жизнедеятельности эмбрион использует обе системы дыхания, однако возможные нарушения или полное прекращение работы МДЦ способствует развитию гипоксии, приводящее к гибели, в первую очередь, клеток нервной системы (Медведев Ю.В., 2000).
+
+
В то же время по данным Слепневой Л.В. (2013) в условиях гипоксии снижается энергопродукция клетки (количество АТФ) при возрастающей доле анаэробного гликолиза. Так, конечный продукт гликолиза - пируват - не подвергается декарбоксилированию и не вовлекается в цикл Кребса, а, принимая восстановительные эквиваленты от цитоплазматического НАДН+Н, превращается в лактат с освобождением новых порций окисленной формы НАД. Активация лактатдегидрогеназного механизма поставки восстановленного НАД для гликолиза в конечном итоге приводит к истощению запасов гликогена и тканевому ацидозу вследствие накопления кислых продуктов метаболизма, прежде всего, в виде лактата. Избыточные концентрации которого тормозят последнюю реакцию гликолитического цикла. В итоге, регенерация НАД прекращается, и, именно, дефицит пиридиннуклеотида останавливает гликолиз и анаэробную продукцию АТФ. Клеточный ацидоз способствует нарушению проницаемости мембран, вплоть до разрушения лизосом. В цитоплазму поступают аутолитические ферменты. Развивается процесс аутолиза клеток, сопровождающийся повреждением тканей и органов. В организме формируются необратимые изменения. По данным Moran Jr Е.Т. (2007) недостаточное обеспечение энергосинтеза, нарушения обменных процессов не позволяют сформировать неспецифическую резистентность в полной мере, что негативно сказывается в первую очередь на дальнейшей жизнеспособности особи.
Таким образом, учитывая возможность изучаемых БАВ, многопланово реализовывать, прежде всего, антиоксидантные и обменостимулирующие свойства, можно прогнозировать улучшение энергообеспечения организма даже в условиях гипоксии, что позволит «реанимировать» зародышей на всех этапах эмбриогенеза и оптимизировать условия для становления механизмов неспецифической резистентности.
Стоит отметить, что данную композицию естественных метаболитов никогда не применяли для стимуляции эмбриогенеза перепелов. При этом использование янтарной кислоты на последнем этапе эмбриогенеза (перед переводом в выводные шкафы) связано с особенно высокими энергозатратами эмбриона, которые необходимо компенсировать и профилактировать такие категории отходов инкубации, как «задохлики» и «слабые».
Данный метод, взятый нами в качестве прототипа, заключаются в том, что коламин, янтарную кислоту, серин и пиридоксина хлорид использовали для обработки яиц кур мясного кросса. Вывод цыплят был выше на 2,47% и составил 91,67% (против 89,20% в контроле).
Технический результат - стимуляция эмбриогенеза, снижение количества всех категорий отходов инкубации вследствие «реанимации» зародышей перепелов, увеличение неспецифической резистентности организма путем однократной предынкубационной обработки яиц за 3-4 часа перед закладкой в инкубатор с помощью нанесения из пульверизатора на поверхность скорлупы водного раствора метаболитов: коламина, янтарной кислоты, серина и пиридоксина гидрохлорида в концентрациях: 0,1%, 0,1%, 0,2%, 0,001% соответственно, а при переводе на вывод - 1%-ным раствором янтарной кислоты,
Способ осуществляется следующим образом.
На поверхность скорлупы за 3-4 часа до инкубации из пульверизатора наносят, выявленный в серии ранее проведенных опытов, водный раствор препаратов - коламина, янтарной кислоты, серина и пиридоксина гидрохлорида в концентрациях: 0,1% 0,1%, 0,2%, 0,001%, соответственно. При переводе в выводные шкафы обработку проводят 1%-ым раствором янтарной кислоты. Предварительно препараты растворяют и смешивают в дистиллированной воде при температуре 18-22°С.
Пример 1. Яйца перепелов японской породы получали от одного родительского стада, сортировали по 270 штук в каждую партию при соблюдении аналогичности массы, времени снесения и сроков хранения. На поверхность скорлупы из пульверизатора наносили раствор препаратов по вышеуказанной схеме. В качестве контроля отбирали яйца этой же партии по принципу аналогов, которые обрабатывали по технологии, принятой в хозяйстве. Полученные данные представлены в таблице 1.
Из таблицы 1 следует, что вывод в опытной партии достоверно превышает контроль на 15,19%. Указанное обусловлено снижением всех категорий отходов инкубации, в частности таких как: «неоплод» и «кровяные кольца» - в 2,1 раза, «замершие» - в 2,5 раза «задохлики» - в 1,2 раза, «слабые» - в 2,2 раза.
По данным Moran Jr Е.Т. (2007) на начальных стадиях развития эмбрионов птиц переносчиком кислорода является примитивный гемоглобин. Кислород лимитирован и поступает только путем диффузии через поры в скорлупе. Необходимо отметить, что до закладки в инкубатор на птицефабриках проводят технологически необходимые обработки для дезинфекции яиц различными веществами, которые имеют возможность частичного или полного проникновения внутрь яйца и способствуют деструкции и инактивации многих белков, в том числе гемоглобина и лизоцима (Зотов А.А., 2015). В этой связи становятся понятной необходимость «реанимации» (т.е. восстановления резко нарушенных или утраченных жизненно важных функций) зародышей уже на ранних этапах эмбриогенеза путем восстановления гомеостаза и оптимизации становления, реализации механизмов неспецифической резистентности организма за счет сохранения белка лизоцима. Именно благодаря компонентам композиции БАВ, являющимися антигопоксантами и антиоксидантами удалось снизить количество «неоплода», очевидно, за счет снижения «ложного неоплода», а также уменьшить количество всех остальных категорий отходов инкубации. Вышеуказанное подтверждается данными литературы, свидетельствующей о ведущей роли гипоксии в увеличении гибели эмбрионов птиц. Исследованиями Scott et al. (1981), De Oliveira et al. (2008) установлено, что гипоксия часто предшествует вылуплению у птиц. По данным Тагирова М.Т. (2009) наиболее высокий риск гипоксии у зародышей птиц наблюдается в первую треть инкубации и перед выводом, в связи с отсутствием сформированного хориоаллантоиса в начале и его атрофии в конце инкубации. Аналогичного мнения придерживается и Nelson (2004), который указывает, что до формирования кровеносной системы аллантоиса, и в конце пренатального периода развития у эмбриона птиц метаболические пути проходят в анаэробных условиях. Однако для коррекции ацидоза и исключения быстрого истощения глюкозы, повышения эффективности энергосинтеза, очень важно сохранять то немногочисленное количество функционирующих МДЦ, в которые даже в условиях гипоксии кислород, растворенный в яйце, поступил, что осуществимо только антиоксидантами.
Витамин В6 по данным Логиновой Н.Ю. (2017) способен препятствовать развитию гипоксии, в частности - мышечных клеток (за счет участия в реакции синтеза гема, а также взаимодействия с янтарной кислотой с образованием оксипиридинов, обладающих выраженным антигипоксантным действием). В свою очередь, коламин и серин являются не только структурными компонентами фосфолипидов, непременно повреждающимися в условиях гипоксии, но и метаболитами, оптимизирующими энергобаланс клетки (Азарнова Т.О., 2020). Таким образом, представленные вещества, обладая целым комплексом уникальных свойств, в частности обуславливающими сохранение энергосинтетических процессов, способствуют увеличению жизнеспособности эмбриона, в том числе за счет повышения его неспецифической резистентности.
Необходимо отметить, что для породы японских перепелов норматив вывода цыплят составляет 65-70%, а выводимости яиц - более 70%. Как видно из полученных данных, данное птицеводческое предприятие получает в инкубаторе количество перепелов, соответствующее этим критериям. Однако при проведении трансовариальной обработки яиц композицией БАВ этот результат удалось значительно улучшить. Следует отметить, снижение количества отходов инкубации не единственный положительный эффект композиции БАВ.
Пример 2. У полученных перепелов суточного возраста была определена живая масса, а также масса желточного мешка с остаточным желтком (таблица 2).
Как видно из таблицы, у перепелят опытной и контрольной групп живая масса равнозначна и соответствует нормативам, однако масса желточного мешка с остаточным желтком у перепелов опытной группы достоверно ниже в 2 раза (р<0,05), что по данным Дядичкиной Л.Ф. (2011) свидетельствует о более ранних сроках вылупления цыплят опытной группы.
Пример 3. У полученных перепелов была определена температура под крылом для прогнозирования их дальнейшей жизнеспособности (таблица 3).
Как видно из таблицы, у перепелов опытной группы температура была достоверно выше на 2,1°С (р<0,05) по сравнению с контролем, что по данным Агеечкина А.П. (2010) свидетельствует о более высокой биологической полноценности молодняка суточного возраста.
Учеными доказано, что эмбрион представляет собой пойкилотермный организм и поддерживает постоянную температуру тела за счет внешних источников (Tazawa Н. Et al., 1987). Однако только что вылупившийся перепеленок быстро становится гомеотермным и уровень потребления кислорода молниеносно возрастает при вылуплении благодаря уникальной системе дыхания, характерной для птиц. В этой связи, необходимость сохранения работы митохондриальной дыхательной цепи становится еще более очевидной, поскольку энергетические затраты АТФ в момент вылупления становятся как никогда высоки. Побочное тепло, производимое в ходе катаболизма, в частности, сжигания жирных кислот β-окисления), способствует переходу новорожденного от пойкилотермного к гомеотермному состоянию (Uni et al., 2005).
В этой связи, необходимость использования композиции БАВ, способной сохранить энергию митохондриальной дыхательной цепи и стимулировать в ряде случаев субстратное фосфорилирование в условиях возрастающей гипоксии становится очевидной, обуславливая возможность «реанимации» зародышей перепелов на всех этапах эмбрионального развития.
Таким образом, композиция БАВ способствовала «реанимации» зародышей за счет целого комплекса антиоксидантных, обменостимулирующих и антигипокических свойств. Указанное определило более высокую жизнеспособность эмбрионов перепелят, что по данным Агеечкина (2010) обуславливает благоприятный прогноз на дальнейший онтогенез, определяя, прежде всего, условия для более низких показателей падежа на более поздних этапах онтогенеза, что возможно только на фоне повышения естественной резистентности. Указанное во многом нашло свое подтверждение при анализе данных таблицы 4.
Пример 4. У полученных перепелов была взята кровь и сыворотка крови для определения уровня естественной резистентности и основных биохимических показателей (таблицы 4, 5).
Как видно из таблицы, у опытных перепелов достоверно возросла БАСК - на 3,7% (р<0,05), содержание лизоцима возросло на 2,9% (р<0,05) относительно контроля.
Как видно из таблицы 5, у перепелов опытной группы происходит активация белкового обмена, о чем свидетельствует возрастание общего белка в сыворотке крови на 12,9% (р<0,05), а также альбумина на 2,1%, и показателей углеводно-энергетического обмена, что подтверждается увеличением активности α-амилазы на 11,6% (р<0,05), содержания глюкозы - на 4,5%, что подтверждается данными Тагирова М.Т. (2009) о том, что углеводы являются основным источником энергии после вылупления. Также зафиксировано снижение активности ЛДГ в 1,2 раза и уменьшение содержания лактата - на 5,9% относительно контроля, что свидетельствует о том, что энергии от аэробного гликолиза для организма достаточно. При этом показатели липидного обмена у опытных особей также несколько ниже: содержание общих липидов уменьшилось на 8%, а активность липазы - в 1,6 раза, что указывает на факт отсутствия необходимости у организма в их использовании (Никулин В.Н., 2006). Необходимо отметить, что рост гемоглобина у опытных особей в 1,5 раза относительно контроля является положительным фактором в «реанимации» эмбрионов в условиях гипоксии (Медведев Ю.В., 2000).
Таким образом, использование композиции БАВ позволило стимулировать механизмы становления и реализации термогенеза, неспецифической резистентности перепелят, что во многом обусловило более высокое качество особей, условия для «реанимации», а вместе с тем повышения жизнеспособности молодняка.
Литература
1. Азарнова Т.О., Луговая И.С., Кочиш И.И., Найденский М.С., Луговой М.М., Антипов А.А. / Способ оптимизации гистогенеза органов желудочно-кишечного тракта у эмбрионов кур мясного направления продуктивности при использовании биологически активных веществ перед инкубацией повышения и синхронизации вывода цыплят посредством профилактики оксидативного стресса у эмбрионов кур // патент №2711748 от 21.01.2020 г.
2. Евглевский, А.А. Биологическая роль и метаболическая активность янтарной кислоты / А.А. Евглевский, Г.Ф. Рыжкова, Е.П. Евглевская, Н.В. Ванина, И.И. Михайлова, А.В. Денисова, Н.Ф Ерыженская // Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - №9. - С. 67-69.
3. Шипунова, Н.Н. Влияние моноэтаноламина на основные субстраты гликолиза животных / Н.Н. Шипунова, Н.А. Лушников // Главный зоотехник. - 2014. - №5. - С. 56-59.
4. Гараева, С.Н. Аминокислоты в живом организме / С.Н. Гараева, Г.В. Редкозубова, Г.В. Постолати. - Издательство Академии Наук Молдовы, 2009. - 552 с.
5. Логинова, Н.Ю. Витамин В6: Общие аспекты метаболизма / Н.Ю. Логинова // В сборнике: Фундаментальные и прикладные научные исследования: актуальные вопросы, достижения и инновации сборник статей победителей V Международной научно-практической конференции: в 4 частях. - 2017. - С. 226-229.
6. Тагиров, М.Т. Питание и основные метаболические пути в развивающемся зародыше птицы / М.Т. Тагиров, О.В. Терещенко // Вестник Харьковского национального университета имени В.Н, Каразина. Серия: биология. Выпуск 10. - №878.- 2009.- С. 48-59.
7. Агеечкин, А.П. Промышленное птицеводство / А.П. Агеечкин, Ф.Ф. Алексеев, А.В. Аралов и др. Под ред. В.И. Фисинина. - Сергиев Посад: ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии, 2010. - 599 с.
8. Дядичкина, Л.Ф. Качество мясных цыплят разного возраста после вылупления /Л.Ф. Дядичкина, Т.В. Цилинская // Птицеводство. - 2011. - №11. - С. 15-17.
9. Nelson D.L., Сох М.М. Lehninger Principles of Biochemistry. - 4th edition. - 2004. - 1119 p.
10. De Oliveira J.I., Uni Z., Ferket P.R. Important metabolic pathways in poultry embryos prior to hatch // World's Poultry Science Journal. - 2008. - V.64. - P. 488-499.
11. Moran Jr E.T. Nutrition of the developing embryo and hatchling // Poultry Science. - 2007. - №86. - P. 1043-1049.
12. Scott T.R., Jonson W.A., Satterlee D.G., Gildersleeve R.P. Circulating levels of corticosterone in the serum of developing chick embryos and newly hatched chicks // Poultry Science. - 1981. - №60. - P. 1314-1320.
13. Зотов, А.А. Продуктивность цыплят-бройлеров в зависимости от режимов предынкубационной обработки яиц / А.А. Зотов // дис. … канд. с-х. наук. - Сергиев Посад, - 2015. - 138 с.
14. Tazawa H., Rahn H. Temperature and metabolism of chick embryos and hatchlings after prolonged cooling // Journal of Experimental Zoology. - 1987. - Suppl. 1 - P. 105-109.
15. Uni Z., Ferket P.R., Tako E., Kedar O. In ovo feeding improves energy status of late-term chicken embryos // Poult. Sci. - 2005. - №84. - P. 764-770.
16. Слепнева, Л.В. Механизм повреждения энергетического обмена при гипоксии и возможные пути его коррекции фумаратсодержащими растворами / Л.В. Слепнева, Г.А. Хмылова // Трансфузиология. - №2. - Т. 14. - 2013. - С. 49-65.
17. Медведев Ю.В., Толстой А.Д. Гипоксия и свободные радикалы в развитии патологических состояний организма - М.: ООО «Терра-Календер и Промоушн», 2000. - 232 с.
18. Никулин, В.Н. Уровень липидного обмена кур-несушек при совместном использовании пробиотика лактомикроцикола и йодида калия / В.Н. Никулин, В.В. Курушкин // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2006. - №4 (12). - С. 33-36.