Влияние фотодинамически индуцированной генерации афк на состояние митохондрий и лизосом культивируемых мезенхимных стромальных клеток человека

Влияние фотодинамически индуцированной генерации АФК на состояние митохондрий и лизосом культивируемых мезенхимных стромальных клеток человека

О.О. Ударцева, Е.Р. Андреева, Ю.В. Рыпова, Л.Б. Буравкова ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, Москва

Effects of photodynamically induced reactive oxygen species on mitochondria and lysosome status of human multipotent mesenchymal stromal cells

O.O. Udartseva, E.R. Andreeva, Y.V. Rylova. LB. Buravkova

State Scientific Center of Russian Federation - Institute for Biomedical problems RAS, Moscow

Исследовано влияние повышения уровня активных форм кислорода (АФК), индуцированного фотодинамическим воздействием (ФДВ), на состояние митохондрий и лизосом мезенхимных мультипотентных стромальных клеток из жировой ткани человека (жММСЮ, культивируемых при различном содержании Ог в среде (20% и 5% 0J. Уровень АФК в клетках оценивали по интенсивности флуоресценции HJDCF — продукта HJDCFDA. Для визуализации митохондрий и лизосом в клетках использовали флуоресцентные зонды Mitotracker Red 580 и Lysotracker Green соответственно.

Показано, что при культивировании в среде с пониженным содержанием Ог увеличивалась как доля жММСК, содержащих АФК, так и уровень АФК в них. При этом жизнеспособность клеток, культивируемых при 20% и 5% 0г, не отличалась. Культивирование жММСК при пониженном содержании 0г сопровождалось увеличением митохондриальной и снижением лизосомальной активности. ФДВ индуцировало повышение уровня АФК в жММСК и клеточную гибель. После ФДВ уменьшалось как количество функционирующих митохондрий и лизосом в клетках, так и доля жММСК, содержащих активные органеллы.

Таким образом, повышение уровня АФК в жММСК при пониженном содержании 0г не сопровождается уменьшением их функциональной активности, тогда как генерация АФК при ФДВ приводит к нарушению жизнедеятельности клеток.

Ключевые слова: мезенхимные мультипотентные стро-мальные клетки жировой ткани, пониженное содержание кислорода, активные формы кислорода, фотодинамическое воздействие.

Effects of photodynamically induced reactive oxygen species (ROS) on mitochondria and lysosome status of human multipotent mesenchymal stromal cells (atMSC) were studied. AtMSC were cultivated under various oxygen tensions — 5 or 20% 02. ROS were detected by HJDCFDA, intracellular ROS level were estimated as HJDCF fluorescence intensity per cell. Fluorescence dyes Mitotracker Red 580 and Lysotracker Green were used for mitochondria and lysosome detection.

It was found that the intracellular ROS level and the share of FtflCF-positive atMSC were higher under reduced oxygen tension. Low oxygen tension didn't affect cell viability. Photodynamic treatment (PDT) induced ROS generation more intensively than low 02, and cell viability decreased in this case.

AtMSC cultivation under 5% oxygen tension led to expansion in the number of active mitochondria in cells. PDT resulted in reduction of mitochondrial activity per cell as well as in decrease of Mitotracker-positive cells number.

Thus, increase of atMSC ROS level under low oxygen tension doesn't affect cellular functional status, while PDT-induced ROS generation induces reduction of mitochondrial transmembrane potential.

Key words: adipose tissue derived multipotent mesenchymal stromal cells, low oxygen tension, reactive oxygen species, photodynamic treatment.

Фотодинамическое воздействие (ФДВ) — двухкомпонентный метод, основанный на взаимодействии вещества-фотосенсибилизатора (ФС) и низкоинтенсивного лазерного излучения [1]. Под воздействием света определенной длины волны ФС переходит в возбужденное состояние и взаимодействует с молекулярным кислородом и макромолекулами клетки. В результате образуются активные формы кислорода (АФК), которые, как известно, влияют на различные клеточные процессы [2].

В настоящее время ФДВ широко используется в клинической практике для элиминации новообразований, после чего в месте прежней локализации опухоли происходит частичное или полное восстановление исходной тканевой структуры. Основными клеточными

e-mail: olja_udartseva@rambler.ru

элементами тканевой репарации после ФДВ являются клетки стромы и паренхимы органов. Физиологический уровень 02 в тканях составляет 4—7%, а опухоли характеризуются еще более низким содержанием 02. Соответственно, репаративные процессы после ФДВ также будут происходить в условиях гипоксии. Однако исследования эффектов ФДВ на различных клеточных моделях проводятся, как правило, при стандартных условиях культивирования, подразумевающих нормоксический состав газовой среды (20% 02).

Ранее было показано, что культивирование мезенхимных мультипотентных стромальных клеток (ММСК), полученных из различных источников, в условиях пониженного содержания 02 стимулирует пролиферацию и повышает их устойчивость к различным

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

повреждающим факторам, то есть значительно изменяет их функциональные свойства [3—5]. В настоящей работе было изучено влияние гипоксии на чувствительность ММСК к ФДВ, а также влияние ФДВ и пониженного содержания 02 в среде на состояние митохондрий и лизосом.

Материал и методы

Выделение и культивирование ММСК

жировой ткани человека

ММСК выделяли из жировой ткани (жММСК) человека, полученной в ходе липосакции, путем ферментативной обработки 0,075% коллагеназой типа la (Sigma, США), согласно описанной ранее методике [5, 6]. Клетки культивировали в среде ДМЕМ с низким содержанием глюкозы (Биолот, Россия) с добавлением 10% ЗТС (HyClone, США), 2 мМ L-my-тамина (ПанЗко, Россия) и 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина (ПанЗко, Россия). После выделения одну часть клеток помещали в С02-инкубатор (5% С02, 20% 02, 75% Na), а другую — в мультигазовый инкубатор (5% С02, 5% 02, 75% N2). В экспериментах использовали жММСК 2-10 пассажей.

ФДВ

ФДВ проводили на жММСК, культивируемых в условиях 5% и 20% 02. В качестве фотосенсибилизатора использовали Фотосенс (ФС) (НИОПИК, Россия). Клетки, достигшие 70-80% конфлуентнос-ти, инкубировали в течение 24 часов с ФС в конечной концентрации 10 мкг/мл. Далее краситель отмывали, клетки облучали лазером (л = 675 нм) (АЗОР ФДВ). Доза облучения составляла 1 и 2 Дж/см2.

Выявление АФК в клетках

Для выявления активных форм кислорода (АФК) использовали дихлордигидрофлуоресцеиндиацетат (H2DCFDA) (Invitrogen, США), который добавляли на 30 минут в среду культивирования в концентрации 10 мкМ. Этот зонд не обладает собственной флюоресценцией, но в присутствии АФК превращается во флуоресциирующий продукт H2DCF, который может быть визуализирован. При изучении повышения уровня АФК, индуцированного ФДВ, H2DCFDA добавляли к клеткам непосредственно после облучения. Через 30 минут клетки трижды отмывали ФСБ (Gibco, США) и анализировали методами флуоресцентной микроскопии (Leica DM В5000) или проточной цитофлуори-метрии Epics XL (Beckman Coulter, США). Содержание

АФК в клетках оценивали в относительных единицах по среднему значению интенсивности флуоресценции H2DCF, приходящейся на клетку.

Оценка жизнеспособности клеток Жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора AnnexinV-FITC — Propidium Iodide (Immunotech, Франция). Клетки окрашивали по стандартному протоколу и анализировали на проточном цитофлуо-риметре. В случае ФДВ жизнеспособность клеток оценивали через 2 ч после облучения.

Оценка состояния митохондрий и лизосом Для определения функциональной активности митохондрий и лизосом использовали митотрекер (Mitotracker Red 580) и лизотрекер (Lysotracker Green) (Invitrogen, США) соответственно. Митотрекер — катионный потенциал-зависимый краситель, интенсивность флуоресценции которого определяется мембранным потенциалом. Лизотрекер является флуоресцентным индикатором закисления pH в различных клеточных компартментах. Красители добавляли в среду культивирования на 1 ч: митотрекер — в концентрации 500 нг/мл, лизотрекер — в концентрации 200 нг/мл. Далее клетки промывали ФСБ и анализировали методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии. Активность митохондрий и лизосом оценивали по среднему значению интенсивности флуоресценции зонда, приходящейся на клетку.

Результаты

Влияние пониженного содержания Os и ФДВ на содержание внутриклеточных АФК и жизнеспособность жММСК

При культивировании в условиях 20% 02 АФК в клетках практически не детектировались методом флуоресцентной микроскопии (рис. 1 А). Однако посредством проточной цитофлуориметрии было показано, что в среднем 38,5% жММСК при культивировании в стандартных условиях содержат АФК в небольших количествах (рис. 2А). При культивировании в среде с пониженным содержанием 02 92,9% жММСК содержали АФК и средняя интенсивность флуоресценции на клетку была выше, чем у клеток в условиях 20% 02 (рис. 1Б; 2Б). Несмотря на то, что содержание АФК в жММСК, культивируемых в условиях 5 и 20% 02, различалось, жизнеспособность этих клеток была одинаковой (рис. 3).

Рис. 1. Активные формы кислорода [АФК] в мезенхимных мультипотентных стромальных клетках жировой ткани человека [жММСК], флуоресцентная микроскопия: А - АФК в жММСК, культивируемых в условиях 20% 03 в среде; Б - АФК в жММСК, культивируемых в условиях 5% 03 в среде; В - АФК в жММСК, культивируемых при 20% 02, после ФДВ 1 Дж/см2

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

Рис. 2. График распределения количества АФК в жММСК при разных условиях культивирования, проточная цитофлуориметрия, данные репрезентативного эксперимента [п = 4):А - АФК в жММСК, культивируемых в условиях 20% 03 в среде; Б - АФК в жММСК, культивируемых в условиях 5% 03 в среде [средняя интенсивность флуоресценции 9,7 усл.ед.}; В - АФК в жММСК после ФДВ 1 Дж/см2 [средняя интенсивность флуоресценции 20,7 усл.ед.}; Г - АФК в жММСК после ФДВ 2 Дж/см2 [средняя интенсивность флуоресценции 12,2 усл.ед.)

20% О,  S% О,

Hh

rh

Без воздействия ФС + I Дж/см2 ФС + 2 Дж/см2

Рис. 3.

Диаграмма, отражающая влияние ФДВ на жизнеспособность жММСК, культивируемых в условиях 20% и 5% содержания 03 в среде

Рис. 4. Влияние пониженного содержания кислорода на состояние митохондрий и лизосом: А, Б, В- жММСК, культивируемые при 20% 03; Г.ДЕ- жММСК, культивируемые при 5% 03.А,Г - фазовый контраст; Б,Д - окраска митохондрий Mitotracker Red 580; В,Е - окраска лизосом Lysotracker Green

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

Облучение жММСК, нагруженных ФС, приводило к образованию АФК, при этом уровень внутриклеточных АФК после ФДВ был выше, чем при снижении содержания 02 в среде. Количество клеток, содержащих АФК, зависело от дозы облучения. При облучении дозой 1 Дж/см2 практически все жММСК содержали АФК (см. рис. 1 В; 2В), а при облучении дозой 2 Дж/см2 ^только 72% клеток (рис. 2Г). Влияние ФДВ на жизнеспособность определялось дозой облучения (см. рис. 3). Так, ФДВ с использованием дозы 2 Дж/см2 обладало выраженным цитотоксичес-ким эффектом и снижало жизнеспособность жММСК до 70%, что объясняет уменьшение доли АФК-содер-жащих клеток при этой дозе облучения, поскольку при повреждении клеточных мембран Н2ОСР выходит из клеток.

Влияние пониженного содержания 02 и ФДВ на состояние митохондрий и лизосом жММСК При культивировании в среде с пониженным содержанием 02 интенсивность флуоресценции зонда в митохондриях возрастала, что свидетельствовало о повышении функциональной активности митохондрий (рис. 4Б, Д). Одновременно с этим, активность лизосом в клетках снижалась (рис. 4В, Е).

Накопление ФС клетками, культивируемыми при различном содержании 02, не оказывало влияния на состояние митохондрий и активировало лизосомаль-ный компартмент жММСК (рис. 5).

Рис. 5. График распределения количества митохондрий и лизосом в жММСК при ФДВ, проточная цитофлуориметрия, данные репрезентативного эксперимента: А, В - окраска митохондрий Mitotracker Red 580; Б, Г - окраска лизосом Lysotracker Green.

А, Б- жММСК человека, культивируемые при 20% 03 в среде; В, Г- жММСК человека, культивируемые при 5% 03 в среде. Синим цветом обозначена флуоресценция зонда в клетках без воздействия; зеленым цветом - в клетках, инкубированных 24 ч с Фотосенсом; красным цветом - в клетках после ФДВ 1 Дж/см2

Активация лизосом проявлялась как в увеличении количества окрашенных лизотрекером клеток, так и в повышении интенсивности их окраски. Облучение клеток, накопивших ФС, приводило к одновременному снижению функциональной активности митохондрий и лизосом жММСК, что выражалось как в уменьшении количества окрашенных зондами клеток, так и в снижении интенсивности флуоресценции зонда на клетку (см. рис. 5).

Обсуждение

Одним из основных клеточных элементов, принимающих участие в тканевой регенерации и репарации, являются ММСК. В настоящее время практически все исследования, посвященные изучению функциональных особенностей этих клеток, проводятся при атмосферном содержании 02 в среде — 20%. Однако общеизвестно, что физиологический уровень 02 в тканях составляет 4^7%, а в очагах повреждения клетки находятся в условиях еще меньшего содержания 02. В нашей лаборатории ранее было показано, что культивирование ММСК при 5% 02 сопровождается изменением их морфологии, стимулирует пролиферативную активность и не влияет на иммунофенотип и жизнеспособность клеток [4, 5].

АФК постоянно образуются в живых клетках как продукты нормального метаболизма 02. АФК могут также возникать спонтанно в реакциях перекисного окисления макромолекул клетки. В образовании АФК участвуют не только митохондрии, но и эндоплазма-тический ретикулум, и другие органеллы. Кроме того, продукция АФК в клетках может быть вызвана внешним (например, фотодинамическим) воздействием. Биологический эффект АФК в зависимости от концентрации может быть регуляторным, защитным или токсическим [2, 7—9]. Патологические последствия возникают при чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и их вторичных продуктов — состоянии, называемом обычно окислительным стрессом. В настоящей работе сравнивали эффекты увеличения внутриклеточного содержания АФК, происходящего при физиологических условиях (снижение содержания 02 в среде) и индуцированного ФДВ. Как ФДВ, так и культивирование жММСК при 5% 02 сопровождались повышением уровня АФК, однако эти факторы по-разному влияли на функциональное состояние клеток.

Известно, фотодинамический эффект обусловлен образованием АФК в клетках и определяется дозой облучения и концентрацией фотосенсибилизатора. С помощью метода ФДВ мы индуцировали контролируемую генерацию АФК в жММСК. После ФДВ 2 Дж/см2 окрашенных зондом клеток было меньше, чем после ФДВ 1 Дж/см2. Можно предположить, что этот эффект объясняется нарушением целостности клеток при избыточной генерации АФК, поскольку дозы ФДВ выше 1 Дж/см2 вызывали клеточную гибель. Уровень АФК в жММСК, культивируемых при 5%, был ниже, чем после ФДВ. Снижение содержания 02 в среде не оказывало влияния на жизнеспособность клеток.

При изучении влияния АФК на состояние митохондрий и лизосом жММСК было показано, что эффект АФК определяется способом их генерации. Так, при образовании АФК в условиях пониженного содержания 02 функциональная активность митохондрий в клетках возрастала, а лизосом — снижалась. Это свидетельствовало об усилении клеточного

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

метаболизма. В частности, снижение активности ли-зосом может указывать на преобладание процессов анаболизма над процессами катаболизма в клетках. ФДВ приводило к снижению активности как митохондрий, так и лизосом, что может свидетельствовать о преобладании процессов клеточной деструкции и подтверждается данными по жизнеспособности клеток.

В отличие от ФДВ, механизмы образования АФК и клеточного сигналинга при снижении содержания 02 мало изучены и требуют дальнейших исследований. Согласно результатам некоторых исследователей, уменьшение содержания 02 в среде увеличивает продукцию АФК в клетках, что коррелирует с полученными нами данными [10—14]. Основную роль в продукции АФК при гипоксии отводят митохондриям, в частности, митохондриальному комплексу III [12, 13]. Предполагают, что супероксид-анион в этих условиях накапливается в межмембранном пространстве митохондрий, где и метаболизируется супероксиддис-мутазой. Образующаяся Н202, вероятно, способна стабилизировать фактор гипоксии (Н1Р), который инициирует синтез различных белков, обеспечивающих выживание и адаптацию клеток [10].

Можно предположить, что различие клеточных ответов жММСК на АФК объясняется следующими причинами. Известно, что биологический эффект АФК зависит от их концентрации [7—9], причем при низких концентрациях АФК наблюдается преимущественно регуляторный эффект, а при высоких — ток-

сический. В нашей работе было показано, что количество АФК, образующихся после ФДВ, выше, чем при гипоксии. Соответственно, АФК, образующиеся при снижении концентрации 02 в среде, могут инициировать Независимую транскрипцию генов и адаптивный ответ [12]. В то же время ФДВ приводит к образованию избыточного количества АФК и индуцирует клеточную гибель. Локализация АФК, образующихся при гипоксии и после ФДВ, вероятно, также различается. Как упоминалось выше, при снижении концентрации 02 супероксид-анион продуцируется в межмембранном пространстве митохондрий [13], где в ходе ферментативных реакций он превращается в менее активные продукты. При ФДВ в зависимости от структуры фотосенсибилизатора образование АФК происходит в мембране, цитоплазме или различных органеллах [1 ], что приводит к одновременному повреждению различных клеточных структур.

Таким образом, в нашей работе показано, что уровень АФК в жММСК, культивируемых при 5% 02, выше, чем в клетках, культивируемых при 20% 02. Биологический эффект АФК зависит от их уровня в клетках и способа генерации. АФК, возникающие при гипоксии, не снижают функциональную активность жММСК, тогда как фотодинамически опосредованная индукция АФК приводит к нарушению жизнедеятельности клеток.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Castano А.Р., Demidova T.N., Hamblin M.R. Mechanisms in photodynamic therapy: part one — photosensitizers, photochemistry and cellular localization. Photodiag. Photodyn. Ther. 2004; 1: 279—93.

2. Stowe D.F., Camara K.S. Mitochondrial reactive oxygen species production in excitable cells: modulators of mitochondrial and cell functions. Antiox. Redox Sig. 2DD9; 11 [61: 1373—1414.

3. Lennon D.P., Edmison J.M., Caplan A.I. Cultivation of rat marrow-derived mesenchymal stem cells in reduced oxygen tension: effects of in vitro and in vivo osteochondrogenesis. J. Cell Physiol. 2DD1; 187: 345—55.

4. Буравкова Л.Б., Анохина Е.Б. Влияние гипоксии на стромальные клетки-предшественники из костного мозга крыс на ранних этапах культивирования. Бюл. эксперим. биол. мед. 2DD7; 143(41: 386-9.

5. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р. и др. Характеристика мезенхимных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода. Цитология 2009; 51И): 5—11.

6. Zuk Р.А., Zhu М., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 2002; 13: 4279-95.

7. Suzuki Y.J., Forman H.J., Sevanian A. Oxidants as stimulators of signal transduction. Free Rad. Biol. Med. 1997; 22: 269—85.

8. Wiseman H., Halliwell B. Damage to DIMA by reactive oxygen and nitrogen species: role in inflammatory disease and progression to cancer. J. Biochem. 1996; 313: 17—29.

9. Grayson W.L., Zhao F., Izadpanah R. et al. Effects of hypoxia on human mesenchymal stem cell expansion and plasticity in 3D constructs. J. Cell Physiol. 2006; 207: 331-9.

10. Анохина Е.Б., Буравкова Л.Б. Механизмы регуляции транскрипционного фактора HIF при гипоксии. Биохимия 2010; 75С2]: 185-95.

11. Cash Т.Р., Pan Y., Simon М.С. Reactive oxygen species and cellular oxygen sensing. Free Rad. Biol. Med. 2007; 43C9): 1219—25.

12. Chandel N.S., Budinger G.R. The cellular basis for diverse response to oxygen. Free Rad. Biol. Med. 2007; 42C2): 165—74.

13. Guzy R.D., Schumacker P.T. Oxygen sensing by mitochondria at complex III: the paradox of increased reactive oxygen species during hypoxia. Exp. Physiol. 2006; 91 [51: 807—19.

14. Semenza G.L. Perspectives on oxygen sensing. Cell 1999; 98 [33: 281-4.

Поступила 17,12,2009

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том V, № 4, 2010

А