ГЕНЕРАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕТА-КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ ПЛЮРИПОТЕНТНОЙ СТВОЛОВОЙ КЛЕТКИ, ДЕМОНСТРИРУЮЩИХ РЕАКЦИЮ В ВИДЕ ГЛЮКОЗОЗАВИСИМОГО МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ДЫХАНИЯ И ДВУХФАЗНОЙ СЕКРЕЦИИ ИНСУЛИНА

1. Способ дифференцировки панкреатических энтодермальных клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1, включающий культивирование панкреатических эндокринных клеток в среде, в которую добавили одно или более из UNC0638, UNC0642, UCN0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI9994 или MC1568.
2. Способ по п. 1, в котором в культуральную среду дополнительно добавляют гепарин, N-ацетилцистеин, состав I и один или более из T3, T4 или их аналога.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором культуральная среда не содержит ингибитора ALK5.
4. Способ по п. 1 или 2, в котором в культуральную среду добавляют ингибитор ALK5.
5. Способ по п. 1, в котором в среду добавляют ZM447439, гепарин, N-ацетилцистеин и один или более из T3, T4 или их аналога, и при этом среда не содержит ингибитора ALK5.
6. Способ по п. 5, в котором в среду добавляют T3.
7. Способ по п. 6, в котором в среду добавляют AZT.
8. Способ по п. 7, в котором в среду добавляют DEZA.
9. Способ по п. 1, в котором функциональные бета-клетки получают посредством поэтапной дифференцировки одной или более из клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы, клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки, клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток, клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток-предшественников, клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для незрелых бета-клеток, и клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для функциональных бета-клеток.
10. Способ по п. 1, включающий культивирование клеток на поверхности раздела воздух-жидкость.
11. Способ по п. 1, включающий культивирование клеток в скоплениях в суспензии.
in vitro
in vitro
12. Полученная  популяция функциональных бета-клеток, экспрессирующих единственный гормон инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA и полученных путем дифференцировки панкреатических эндокринных клеток .
13. Популяция по п. 12, в которой клетки также экспрессируют UCN3 и SLC2A1.
14. Популяция по п. 12, в которой клетки показывают стимулированную глюкозой секрецию инсулина и глюкозозависимое митохондриальное дыхание.
15. Популяция по п. 14, в которой стимулированная глюкозой секреция инсулина и глюкозозависимое митохондриальное дыхание аналогичны подобным в человеческих островковых клетках.
in vitro
,
16. Полученная  популяция панкреатических бета-клетокэкспрессирующих единственный гормон инсулин, PDX1, NKX6.1 и MAFA и полученных путем культивирования панкреатических эндокринных клеток в среде, в которую добавили одно или более из UNC0638, UNC0642, UCN0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI9994 или MC1568.
17. Популяция по п. 16, в которой в культуральную среду дополнительно добавляют гепарин, N-ацетилцистеин, состав I и один или более из T3, T4 или их аналога.
18. Популяция по п. 16 или 17, в которой культуральная среда не содержит ингибитора ALK5.
19. Популяция по п. 16 или 17, в которой в культуральную среду добавляют T3.
20. Популяция по п. 16, в которой в среду добавляют ZM447439, гепарин, N-ацетилцистеин, состав I и один или более из T3, T4 или их аналога, и при этом среда не содержит ингибитора ALK5.
21. Популяция по п. 16, в которой в среду добавляют T3.
22. Популяция по п. 21, в которой в среду добавляют AZT.
23. Популяция по п. 22, в которой в среду добавляют DEZA.
24. Популяция по п. 16, в которой клетки также экспрессируют UCN3 и SLC2A1.
25. Популяция по п. 16, в которой клетки показывают стимулированную глюкозой секрецию инсулина и глюкозозависимое митохондриальное дыхание.
26. Популяция по п. 16, в которой стимулированная глюкозой секреция инсулина и глюкозозависимое митохондриальное дыхание аналогичны подобным в островковых клетках.
27. Способ дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A:
a. дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в незрелые бета-клетки; и
b. дифференцировка незрелых бета-клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1, путем культивирования незрелых бета-клеток в среде, в которую добавили одно или более из UNC0638, UNC0642, UCN0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI9994 или MC1568.
28. Способ по п. 27, в котором глюкозозависимое митохондриальное дыхание функциональных бета-клеток аналогично подобному в человеческих островковых клетках.
29. Способ по п. 27, в котором стимулированная глюкозой секреция инсулина функциональными бета-клетками аналогична подобной в человеческих островковых клетках.
30. Способ по п. 27, в котором функциональные бета-клетки секретируют инсулин во множестве фаз.
31. Способ по п. 27, в котором в культуральную среду дополнительно добавляют гепарин, N-ацетилцистеин, состав I и один или более из T3, T4 или их аналога.
32. Способ по п. 27 или 31, в котором культуральная среда не содержит ингибитора ALK5.
33. Способ по п. 27 или 31, в котором в культуральную среду добавляют T3.
34. Способ по п. 27, в котором в среду добавляют ZM447439, гепарин, N-ацетилцистеин и один или более из T3, T4 или их аналога, и при этом среда не содержит ингибитора ALK5.
35. Способ по п. 34, в котором в среду добавляют T3.
36. Способ по п. 35, в котором в среду добавляют AZT.
37. Способ по п. 36, в котором в среду добавляют DEZA.
38. Способ по п. 27, включающий культивирование незрелых бета-клеток на поверхности раздела воздух-жидкость.
39. Способ по п. 27, включающий культивирование незрелых бета-клеток в скоплениях в суспензии.
40. Способ по п. 27, в котором стадия дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток включает:
a. дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы («клетки стадии 1»);
b. дифференцировку клеток стадии 1 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки («клетки стадии 2»);
c. дифференцировку клеток стадии 2 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки («клетки стадии 3»);
d. дифференцировку клеток стадии 3 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток («клетки стадии 4»);
e. дифференцировку клеток стадии 4 в панкреатические эндокринные клетки-предшественники («стадия 5»); и
f. дифференцировку клеток стадии 5 в незрелые бета-клетки.
41. Способ по п. 40, в котором стадии e. и f. включают культивирование на поверхности раздела воздух-жидкость.
42. Способ по п. 40, в котором стадии e. и f. включают культивирование клеток в скоплениях в суспензии.
43. Способ по п. 40, включающий дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки стадии 1 путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, в которую добавили соединение MCX и GDF-8.
44. Способ по п. 40, включающий дифференцировку клеток стадии 1 в клетки стадии 2 путем культивирования клеток стадии 1 в среде, в которую добавили FGF7 и аскорбиновую кислоту.
45. Способ по п. 40, включающий дифференцировку клеток стадии 2 в клетки стадии 3 путем культивирования клеток стадии 2 в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту.
46. Способ по п. 40, включающий дифференцировку клеток стадии 3 в клетки стадии 4 путем культивирования клеток стадии 3 в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту.
47. Способ по п. 40, включающий дифференцировку клеток стадии 4 в клетки стадии 5 путем культивирования клеток стадии 4 в среде, в которую добавили SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту.
48. Способ по п. 47, в котором в среду дополнительно добавляют один или более из T3, T4 или их аналога.
49. Способ по п. 40, включающий культивирование клеток стадии 5 в незрелые бета-клетки путем культивирования клеток стадии 5 в среде, в которую добавили ингибитор BMP, аскорбиновую кислоту, один или более из T3, T4 или их аналога.
50. Способ по п. 49, в котором в среду дополнительно добавляют ингибитор ALK 5 или ингибитор гамма-секретазы.
51. Способ по п. 27, включающий дифференцировку незрелых бета-клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A, путем культивирования незрелых бета-клеток в среде, которая не содержит ингибитора ALK5 и в которую добавили ZM447439, AZT, N-ацетилцистеин, DEZA, состав I и один или более из Т3, Т4 или их аналога.
52. Способ по пп. 14, 25 и 28, в котором глюкозозависимое митохондриальное дыхание имеет реакцию в виде увеличения скорости потребления кислорода после стимуляции глюкозой в диапазоне от около 20% до около 80% сверх исходной скорости потребления кислорода.
53. Способ по п. 52, в котором реакция в виде увеличения скорости потребления кислорода происходила через по меньшей мере 15 минут после стимуляции глюкозой.
54. Способ по пп. 14, 25 и 28, в котором стимулированная глюкозой секреция инсулина представляет собой быструю двухфазную секрецию инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой.
55. Способ по п. 54, в котором в первой фазе двухфазной секреции инсулина наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере четырех до по меньшей мере восьми раз по сравнению с секрецией на исходном уровне, а во второй фазе наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере двух раз до по меньшей мере четырех раз по сравнению с секрецией на исходном уровне.
56. Способ по п. 54, в котором секреция инсулина происходит в интервале от по меньшей мере пяти минут до по меньшей мере десяти минут после стимуляции глюкозой.
57. Способ по п. 51, в котором глюкозозависимое митохондриальное дыхание функциональных бета-клеток аналогично подобному в человеческих островковых клетках.
58. Способ по п. 51, в котором стимулированная глюкозой секреция инсулина функциональными бета-клетками аналогична подобной в островковых клетках.
59. Способ по п. 57, в котором глюкозозависимое митохондриальное дыхание имеет реакцию в виде увеличения скорости потребления кислорода после стимуляции глюкозой в диапазоне от около 20% до около 80% сверх исходной скорости потребления кислорода.
60. Способ по п. 59, в котором реакция в виде увеличения скорости потребления кислорода происходила через по меньшей мере 15 минут после стимуляции глюкозой.
61. Способ по п. 58, в котором стимулированная глюкозой секреция инсулина представляет собой быструю двухфазную секрецию инсулина в ответ на стимуляцию глюкозой.
62. Способ по п. 61, в котором в первой фазе двухфазной секреции инсулина наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере четырех до по меньшей мере восьми раз по сравнению с секрецией на исходном уровне, а во второй фазе наблюдается увеличение секреции от по меньшей мере двух раз до по меньшей мере четырех раз по сравнению с секрецией на исходном уровне.
63. Способ по п. 61, в котором секреция инсулина происходит в интервале от по меньшей мере пяти минут до по меньшей мере десяти минут после стимуляции глюкозой.
64. Способ по п. 40, в котором клетки стадии 4 являются криоконсервированными.
65. Способ по п. 40, в котором стадия e включает культивирование криоконсервированных клеток стадии 4.
66. Способ по пп. 6, 21, 35 и 51, в котором T3 относится к диапазону от 1 нМ до 100 нМ.
67. Способ по пп. 48-50, в котором в среду добавляют T3, и при этом T3 относится к диапазону от 1 нМ до 1 мкМ.
68. Способ дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A:
a. дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы, полученные путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, в которую добавили активин А и WNT3A;
b. дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы, в незрелые бета-клетки; и
с. дифференцировка незрелых бета-клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A1, путем культивирования незрелых бета-клеток в среде, в которую добавили одно или более из UNC0638, UNC0642, UCN0646, TC-E5003, A366, PF03814735, ZM447439, SB747651A, PFI1, LY303511, MS436, AZT, DEZA, пироксамида, CI9994 или MC1568.
69. Способ по п. 68, в котором глюкозозависимое митохондриальное дыхание функциональных бета-клеток аналогично подобному в человеческих островковых клетках.
70. Способ по п. 68, в котором стимулированная глюкозой секреция инсулина функциональными бета-клетками аналогична подобной в человеческих островковых клетках.
71. Способ по п. 68, в котором функциональные бета-клетки секретируют инсулин во множестве фаз.
72. Способ по п. 68, в котором в культуральную среду дополнительно добавляют гепарин, N-ацетилцистеин, состав I и один или более из T3, T4 или их аналога.
73. Способ по п. 68 или 72, в котором культуральная среда не содержит ингибитора ALK5.
74. Способ по п. 68 или 72, в котором в культуральную среду добавляют T3.
75. Способ по п. 68, в котором в среду добавляют ZM447439, гепарин, N-ацетилцистеин и один или более из T3, T4 или их аналога, и при этом среда не содержит ингибитора ALK5.
76. Способ по п. 75, в котором в среду добавляют T3.
77. Способ по п. 76, в котором в среду добавляют AZT.
78. Способ по п. 77, в котором в среду добавляют DEZA.
79. Способ по п. 68, включающий культивирование незрелых бета-клеток на поверхности раздела воздух-жидкость, в скоплениях в суспензии, в роллерных флаконах или на микроносителях.
80. Способ по п. 68, включающий культивирование незрелых бета-клеток в роллерных флаконах.
81. Способ по п. 80, включающий культивирование незрелых бета-клеток в роллерных флаконах на микроносителях.
82. Способ по п. 68, в котором стадия дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток включает:
a. дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивной энтодермы («клетки стадии 1»), путем культивирования плюрипотентных стволовых клеток в среде, в которую добавили активин А и WNT3A;
b. дифференцировку клеток стадии 1 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток первичной кишечной трубки («клетки стадии 2»);
c. дифференцировку клеток стадии 2 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки («клетки стадии 3»);
d. дифференцировку клеток стадии 3 в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток («клетки стадии 4»);
e. дифференцировку клеток стадии 4 в панкреатические эндокринные клетки-предшественники («стадия 5»); и
f. дифференцировку клеток стадии 5 в незрелые бета-клетки.
83. Способ по п. 82, в котором стадии e. и f. включают культивирование на поверхности раздела воздух-жидкость, в скоплениях в суспензии, в роллерных флаконах или на микроносителях.
84. Способ по п. 82, в котором стадии e. и f. включают культивирование клеток в роллерных флаконах.
85. Способ по п. 82, в котором стадии e. и f. включают культивирование незрелых бета-клеток в роллерных флаконах на микроносителях.
86. Способ по п. 82, включающий дифференцировку клеток стадии 1 в клетки стадии 2 путем культивирования клеток стадии 1 в среде, в которую добавили FGF7 и аскорбиновую кислоту.
87. Способ по п. 82, включающий дифференцировку клеток стадии 2 в клетки стадии 3 путем культивирования клеток стадии 2 в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC и аскорбиновую кислоту.
88. Способ по п. 87, в котором среда не содержит ингибитора BMP.
89. Способ по п. 82, включающий дифференцировку клеток стадии 3 в клетки стадии 4 путем культивирования клеток стадии 3 в среде, в которую добавили FGF7, ретиноевую кислоту, SANT-1, активатор PKC и аскорбиновую кислоту.
90. Способ по п. 89, в котором среда не содержит ингибитора BMP.
91. Способ по п. 82, включающий дифференцировку клеток стадии 4 в клетки стадии 5 путем культивирования клеток стадии 4 в среде, в которую добавили SANT-1, активатор PKC, ингибитор BMP и аскорбиновую кислоту.
92. Способ по п. 91, в котором в среду дополнительно добавляют один или более из T3, T4 или их аналога.
93. Способ по п. 82, включающий культивирование клеток стадии 5 в незрелые бета-клетки путем культивирования клеток стадии 5 в среде, в которую добавили ингибитор BMP, аскорбиновую кислоту, один или более из T3, T4 или их аналога.
94. Способ по п. 93, в котором в среду дополнительно добавляют ингибитор ALK 5 или ингибитор гамма-секретазы.
95. Способ по п. 68, включающий дифференцировку незрелых бета-клеток в функциональные бета-клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1, MAFA, UCN3 и SLC2A, путем культивирования незрелых бета-клеток в среде, которая не содержит ингибитора ALK5 и в которую добавили ZM447439, AZT, N-ацетилцистеин, DEZA, состав I и один или более из Т3, Т4 или их аналога.
96. Способ по п. 27, в котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой человеческие клетки H1 или H9.
97. Способ по п. 68, в котором плюрипотентные стволовые клетки представляют собой клетки CyT49 человека.