УСТРОЙСТВО ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
DEVICE FOR CULTIVATION OF ANAEROBIC BACTERIA

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к устройству для культивирования анаэробных микроорганизмов и микроаэрофилов.
Анаэробы - микроорганизмы бактериальной природы, которым для нормальной жизнедеятельности, роста и размножения необходимо пониженное содержание кислорода или его полное отсутствие в среде обитания.
По отношению к кислороду анаэробы делятся на строгие (облигатные) анаэробы, которые практически не способны расти в присутствии кислорода, и условные (факультативные) анаэробы, которые могут расти и развиваться как в присутствии кислорода, так и без него. К первой группе относятся большинство клостридий, бактерии молочнокислого и маслянокислого брожения, ко второй группе - кокки, грибки и др.
Существуют также микроорганизмы, требующие для своего развития небольшой концентрации кислорода - микроаэрофилы (Clostridium spp., Fusobacterium, Actinomyces, Bifidumbacterium spp., Lactobacillus spp.).
Культивирование анаэробных микроорганизмов - сложный биотехнологический процесс, важнейшей особенностью которого является создание и поддержание безвоздушной среды, необходимой для нормальной жизнедеятельности и роста. Более того, контакт облигатных анаэробов с кислородом воздуха вызывает их быструю гибель. Критическое время выживания у большинства облигатных анаэробных микроорганизмов при контакте с воздухом не превышает, как правило, 15-60 минут. Поэтому, одной из основных биотехнологических задач, при выращивании анаэробов, является создание устройств, обеспечивающих поддержание анаэробиоза (бескислородной среды) в процессе культивирования анаэробных бактерий.
Для создания анаэробных условий в биотехнологии применяют следующие методы:
1) удаление кислорода из среды путем выкачивания воздуха или вытеснения индифферентным газом;
2) химическое поглощение кислорода при помощи гидросульфита натрия или пирогаллола;
3) комбинированное механическое и химическое удаление кислорода;
4) биологическое поглощение кислорода облигатными аэробными микроорганизмами, посеянными на одной половине чашки Петри (метод Фортнера);
5) частичное удаление воздуха из жидкой питательной среды путем ее кипячения, добавления редуцирующих веществ (глюкоза, тиогликолат, цистеин, кусочки свежего мяса или печени) и заливки среды вазелиновым маслом;
6) механическую защиту от кислорода воздуха, осуществляемую путем посева анаэробов в высокий столбик агара в тонких стеклянных трубках по методу Вейона.
Однако, одним из наиболее доступных и простых в технологическом плане способов создания анаэробных условий является вакуумзаместительный метод.
В настоящее время для лабораторных целей разработаны и выпускаются несколько моделей анаэростатов, предназначенных для культивирования анаэробов в чашках Петри и пробирках, отличающихся материалом изготовления и запорным механизмом крышек. В большинстве анаэростатов безвоздушная среда создается за счет использования специальных газогенерирующих пакетов.
Известен анаэростат АЭ-01, предназначенный для культивирования облигатных анаэробных микроорганизмов в чашках Петри. Анаэростат представляет собой цилиндрическую емкость, в которой герметизация рабочей емкости осуществляется с помощью ленточного замка. Емкость и крышка выполнены из оптически прозрачной пластмассы. Анаэростат рассчитан на 10 чашек Петри. Создание необходимой атмосферы для культивирования микроорганизмов возможно как с помощью химических газогенерирующих пакетов, так и посредством вакуумзаместительного заполнения анаэростата бескислородными газами или газовыми смесями.
Известна анаэробная станция «Bactron», предназначенная для работы со всеми микроорганизмами, чувствительными к присутствию кислорода, в том числе с факультативными и строгими анаэробами. Анаэробная станция «Bactron» представляет собой изолированный перчаточный бокс со встроенным инкубатором для создания стабильного анаэробиоза при исследованиях (индикации и идентификации) микроорганизмов, чувствительных к присутствию кислорода и малопригодна для получения рабочих и посевных культур.
Известен анаэростат (см. патент N 2131461, кл. С12М, 1/00, заявка №96103166/13, 19.02.96, опубл. 27.04.98), в котором герметичность рабочей емкости обеспечивается стягиванием стяжной лентой прижимов, которые охватывают наклонные грани клиновидных фланцев крышки и рабочей емкости. Данный анаэростат был выбран в качестве прототипа. Создание необходимой атмосферы для культивирования микроорганизмов возможно как с помощью химических газогенерирующих пакетов, так и посредством вакуумзаместительного заполнения анаэростата бескислородными газами или газовыми смесями.
3
Принципиальным недостатком всех известных анаэростатов является то, что они не позволяют проводить культивирование анаэробов на твердых и в жидких питательных средах с использованием больших лабораторных емкостей (матрацы, колбы и бутыли до 5 дм и т.п.). Это не позволяет надежно обеспечить последующие стадии биотехнологического производства по наработке анатоксинов и диагностических препаратов в необходимых количествах. Кроме того, материалы из которых изготовлены анаэростаты не предполагают использование в многократных циклах тепловой стерилизации и обработки концентрированными дезинфектантами. Крайне важно, что в комплекты поставок не входят газогенерирующие пакеты и необходимое газовое оборудование, что значительно увеличивает стоимость установок и усложняет их эксплуатацию.
3
Задача настоящего изобретения заключается в разработке устройства многократного использования для выращивания анаэробов в условиях глубокого вакуума и в безвоздушной газовой среде определенного состава с использованием лабораторной посуды большой вместимости (матрацы, колбы и бутыли до 5 дм и т.п.), надежно обеспечивающей создание необходимых посевных доз на следующих стадиях получения анатоксинов и диагностических препаратов.
Устройство предназначено как для автономной работы с использованием вакуумного насоса, так и для применения в стационарных условиях.
Устройство для культивирования анаэробных бактерий (чертеж) конструктивно состоит из рабочей емкости (12) с крышкой (14), выполненной с фланцами (13). В крышку вмонтированы штуцер для присоединения мановакууметра (2), а также трубка для стравливания вакуума (11). Снизу к рабочей емкости через штуцер (4) подсоединяются гибкие трубопроводы газонаполнительного оборудования и вакуумного насоса (5). Анаэробные условия в установке создаются путем вакуумирования рабочей емкости, т.е. удаления свободного кислорода и доведения оставшегося в рабочем объеме устройства газа до давления ниже атмосферного. Разрежение в анаэростате создается вакуумным насосом и контролируется мановакууметром. Рабочая емкость и крышка выполнены из нержавеющей стали марки 12Х18Н10Т.
Устройство работает следующим образом. В рабочую емкость устанавливают чашки Петри, флаконы, пробирки, колбы, бутыли с посевами культур анаэробных микроорганизмов. После установки лабораторной посуды с посевами осуществляют прижим крышки к фланцу рабочей емкости. Герметизация крышки осуществляется с помощью вспомогательной планки с Г-образными концами (3) и Т-образного винта (1), обеспечивающих максимально плотное соединение крышки с фланцем рабочей емкости.
После этого производят вакуумирование устройства с помощью вакуумного насоса. Контроль создаваемого разрежения осуществляется мановакууметром, расположенным на крышке. Удаляемый из рабочей емкости воздух отводится через противогазовые коробки ЕО-16 (6) в вытяжную систему лаборатории.
Создание необходимой для культивирования микроорганизмов газовой атмосферы в анаэростате обеспечивается с помощью подсоединенного через тройник газоподающего оборудования. В состав данного оборудования входят: баллоны (10) с необходимыми газами (аргон, углекислый газ и др.), газовые редукторы и манометры. Контроль подачи газов осуществляется при помощи манометров на газовом редукторе (9) (общее давление в баллоне) и манометра (7) на гибкой линии подачи газа (давление подаваемого газа). Подаваемый газ из баллонов проходит через противогазовые коробки ЕО-16(8) с целью его очистки от посторонних примесей. Сравнительные характеристики предлагаемого изобретения с известными аналогами представлены в таблице 1.
Эксплуатация установки показала, что вакуум или газовая атмосфера в рабочей емкости создаются в течение 30-60 секунд и сохраняются до двух и более суток. Перед взятием проб вакуум или газовая атмосфера аккуратно стравливаются через противогазовые коробки ЕО-16. В случае необходимости по показанию мановакууметра условия могут корректироваться за счет увеличения вакуума или подачи газовой среды.