СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ КРАХМАЛОВ И КРАХМАЛОПРОДУКТОВ
METHOD FOR DETERMINING THE DEGREE OF RESISTANCE OF STARCHES AND STARCH PRODUCTS

Изобретение относится к крахмалопаточной отрасли пищевой промышленности и диетологии, а именно к методам оценки степени атакуемости крахмала, крахмалопродуктов и продуктов, содержащих крахмал, амилолитическими ферментами.
Изобретение представляет собой точный, высокоэффективный и простой способ количественного определения степени резистентности крахмалов (нативных, модифицированных), крахмалопродуктов и продуктов, содержащих крахмал.
Резистентный крахмал - это фракция крахмала, которая не гидролизуется до глюкозы под действием амилолитических ферментов, в тонком кишечнике человека и животных.
Изобретение используется в аналитической химии и биотехнологии для проведения ферментативного гидролиза и с дальнейшим определением углеводного состава гидролизата клейстера методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Основные параметры операций для проведения исследований с помощью существующих методов определения степени резистентности (CP) или массовой доли фракции резистентного крахмала (РК) представлены в таблице 1.
Известен аналогичный способ определения резистентности продуктов автора МакКлиари, в ходе которого гидролиз проводят с использованием панкреатической α-амилазы (ПАА) и амилоглюкозидазы (АМГ), при рН=6 и температуре 37°С в течение 4 часов для моделирования условий in vivo в тонком кишечнике человека, далее определяют массовую долю глюкозы спектрофотометрическим методом. Этот способ является обновленной модификацией методов: American Association of Cereal Chemists (AACC) Method 32-40.01, Association of Analytical Communities (AOAC) Method 2002.02 и CODEX Method Type II. [Megazyme Resistant starch assay procedure k-rstar 08/18 (100 Assay Kit) AOAC Method 2002.02+AACC Method 32-40.01+Codex Type II Method. Pdf-file from www.megazyme.com 2018. - P.15.]
Недостатками указанного метода являются время проведения исследования (5 часов), предел обнаружения (0,036 г/100 г), нестабильность окрашенных растворов.
Существует панкреатин-гравиметрический метод - самый инструментально независимый, в ходе которого фиксируется разница в весе образца до и после 16-тичасового ферментативного гидролиза панкреатином и пуллуланазой при температуре 37°С. Зафиксированная масса является массой негидролизованного, резистентного крахмала. [Akerberg А.K., Liljeberg, H.G., Granfeldt, Y.E. et al. An in vitro method, based on chewing, to predict resistant starch content in foods allows parallel determination of potentially available starch and dietary fiber // The Journal of Nutrition. - 1998. - No. 128. - P. 651-60]
Несовершенство метода заключается в высокой длительности проведения анализа и низкой точности получаемых результатов.
Известен способ по ГОСТ Р 54014-2010 «Продукты пищевые функциональные. Определение растворимых и нерастворимых пищевых волокон ферментативно-гравиметрическим методом». Метод основывается на определении общей массовой доли растворимых и нерастворимых пищевых волокон, в том числе резистентных крахмалов. Принцип метода заключается в проведении ферментативного гидролиза крахмальных и некрахмальных соединений с помощью - амилазы, протеазы и амилоглюкозидазы до моно-, диолигосахаридов и пептидов. Пищевые волокна осаждаются этиловым спиртом, высушивают и определяют гравиметрическим методом. [ГОСТ Р 54014-2010 «Продукты пищевые функциональные. Определение растворимых и нерастворимых пищевых волокон ферментативно-гравиметрическим методом»]
Недостатком известного способа является высокая продолжительность, сложность и ошибка опыта.
Известен способ АОАС 2002.02 - прототип, предусматривающий определение степени резистентности (CP) в пищевых продуктах. При этом образец гидролизуется панкреатином и амилоглюкозидазой, после этого из общего содержания крахмала, вычитается содержание глюкозы в растворенном щелочью осадке, которое определяется спектрофотометрическим методом. Общее время гидролиза составляет 16 часов, его проводят при температуре 37°С. После этого в гидролизаты добавляют окрашивающий реактив GOPOD и проводят определение содержания глюкозы на спектрофотометре. [McCleary BV, Monaghan DA Measurement of resistant starch// Food composition and additives - 2002. - 85/3 -665-675]
Недостатком известного способа является энергозатратность, высокая стоимость реагентов и длительность процесса.
Таким образом, задачей, на решение которой направлено данное изобретение является разработка высокоэффективного, аналитически точного простого способа количественного определения степени резистентности (массовой доли резистентной фракции) крахмала или крахмалопродуктов, содержащих в своем составе крахмал.
Это достигается тем, что способ определения степени резистентности крахмалопродуктов, отбор навески по сухому веществу, клейстеризацию, ферментирование-термостатирование, центрифугирование, отделение осадка, промывку и растворение осадка, повторное ферментирование-термостатирование, проведение определения углеводного состава методом ВЭЖХ. По сравнению с другими методами является более дешевым, простым в ходе определения и менее энергозатратным - общая продолжительность ферментирования-термостатирования - 2,5 ч, проводится в 2 стадии, у аналога - 4 ч, у прототипа - 16 ч, а также наиболее чувствительным - предел обнаружения массовой доли глюкозы на ВЭЖХ составляет 0,028 г/100 г, аналога, с использованием фотоэлектроколориметра - 0,036 г/100 г.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Способ реализуется следующим образом. Готовят 1%-ный раствор крахмала или крахмалопродукта (с учетом сухих веществ), клейстеризуют его при температуре не менее 85°С в течение 15 мин, полученный клейстер охлаждают до комнатной температуры, добавляют к нему 10 см фосфатного буферного раствора с рН=6,86 и доводят объем дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают, добавляют 4 см панкреатической α-амилазы с активностью 100 ед./см и 0,4 см амилоглюкозидазы с активностью 300 ед./см, перемешивают данную смесь и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч, останавливают гидролиз путем добавления 4 см 50%-ного раствора этилового спирта для окончания процесса ферментации, гидролизат центрифугируют и отбирают надосадочную жидкость для определения углеводного состава на жидкостном хроматографе (проба 1), а полученный осадок дважды промывают 10 см 50%-ного раствора этилового спирта и повторно центрифугируют и растворяют в 2 см 2М раствора гидроокиси калия, приливают 8 см буферного раствора ацетата натрия рН=3,86 и 0,1 см амилоглюкозидазы активностью 300 ед./см и выдерживают при температуре 50°С в течение 90 мин и проводят определение углеводного состава на жидкостном хроматографе (проба 2). Расчет степени резистентности проводится по количественному содержанию глюкозы, которая образуется в результате ферментативного процесса.
Степень резистентности крахмала рассчитывают по формуле:
где CP - степень резистентности крахмала, %;
СВ
СВ
М - масса испытуемого крахмала по сухому веществу, подвергнутая ферментативному гидролизу, г (М=1 г);
1
M - масса глюкозы в жидкой фазе (проба 1) в пересчете на 1 г испытуемого крахмала, г;
2
М - масса глюкозы в осадке (проба 2) в пересчете на 1 г испытуемого крахмала, г;
100 - коэффициент пересчета массовой доли РК в %.
ф
где Г - массовая доля глюкозы в жидкой фазе (проба 1), определенная хроматографически, %;
СВ
св
М - масса навески испытуемого крахмала по сухому веществу, подвергнутая ферментативному гидролизу, г (М=1 г);
100 - коэффициент пересчета массовой доли глюкозы фильтрата в г;
0,9 - коэффициент перевода количества глюкозы, определенного хроматографически, в количество крахмала (по соотношению молекулярных масс ангидроглюкозного звена крахмала и глюкозы 162/180=0,9).
СВ
СВ
где М - масса навески испытуемого крахмала по сухому веществу, подвергнутая ферментативному гидролизу, г (М=1 г);
о
Г - массовая доля глюкозы в осадке (проба 2), определенная хроматографически, %;
100 - коэффициент пересчета массовой доли глюкозы осадка в г;
0,9 - коэффициент перевода количества глюкозы, определенной хроматографически, в количество крахмала (по соотношению молекулярных масс ангидроглюкозного звена крахмала и глюкозы 162/180=0,9).
За окончательный результат принимаем среднее арифметическое результатов 2 определений. Вычисления проводят с точностью до первого десятичного знака.
Далее приведены примеры конкретного выполнения изобретения.
Пример 1. Определение степени резистентности нативного картофельного крахмала
3
3
1. Навеску картофельного крахмала массой 1,00 г по сухому веществу, помещают в мерную колбу на 100 см, добавляют 50-80 см дистиллированной воды, нагревают до температуры не менее 85°С и выдерживают при этой температуре в течение 15 мин, перемешивая колбу.
3
2. Полученный клейстер охлаждают до комнатной температуры, добавляют 10 см фосфатного буферного раствора с рН=6,86 и доводят объем дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.
3
3
3
3
3. К рабочему раствору крахмала добавляют ферментные препараты: 4 см ПАА активностью 100 ед./см и 0,4 см АМГ активностью 300 ед./см.
4. Тщательно перемешивают смесь, закрывают полимерной пробкой и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч в водяном термостате.
3
5. Для остановки гидролиза добавляют 4 см 50%-ного раствора этилового ректификованного спирта и перемешивают.
3
6. Гидролизат центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин в полимерных пробирках для центрифугирования объемом 100 см.
3
3
7. После расслоения гидролизата надосадочную жидкость переносят в химический стакан (объемом ~150 см) и отбирают из него 25 см для определения углеводного состава на жидкостном хроматографе (проба 1).
3
3
8. К оставшемуся осадку добавляют 2 см гидроокиси калия (2 моль/дм), закрывают полимерной пробкой и перемешивают на лабораторном ротаторе при 250 кол./мин в течение 20 мин.
3
3
3
3
9. Раствор переливают в коническую колбу на 250 см, приливают 8 см буферного раствора ацетата натрия рН=3,86 и 0,1 см АМГ активностью 300 ед./см, закрывают полимерной пробкой и выдерживают в водяном термостате при температуре 50°С в течение 90 мин (проба 2).
10. Проводят определение углеводного состава на жидкостном хроматографе, состоящем из бинарного насоса со смесителем, колонки хроматографической обращенно-фазной углеводной (не менее 125 мм в длину, с диаметром частиц сорбента 4,6 мкм, но не более 5,0 мкм); термостата для хроматографической колонки, обеспечивающей температуру нагрева до (75,0±0,1)°С.
11. Производят расчет массовой доли РК по приведенной формуле.
Пример 2. Определения степени резистентности высокоамилозного кукурузного крахмала
3
3
1. Навеску высокоамилозного кукурузного крахмала массой 1,00 г по сухому веществу, помещают в мерную колбу на 100 см, добавляют 50-80 см дистиллированной воды, нагревают до температуры не менее 85°С и выдерживают при этой температуре в течение 15 мин, перемешивая крахмальную дисперсию в колбе.
3
3
2. Полученный клейстер охлаждают до комнатной температуры, затем к нему добавляют 10 см фосфатного буферного раствора с рН=6,86 и доводят объем дистиллированной водой до 100 см, после чего тщательно перемешивают.
3
3
3
3
3. Далее к рабочему раствору крахмала добавляют ферментные препараты: 4 см ПАА активностью 100 ед./см и 0,4 см АМГ активностью 300 ед./см.
4. Тщательно перемешивают данную смесь, закрывают полимерной пробкой и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч в водяном термостате.
3
5. Для прекращения гидролиза добавляют 4 см 50%-ного раствора этилового ректификованного спирта и перемешивают.
3
6. Гидролизат центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин в полимерных пробирках для центрифугирования объемом 100 см.
3
3
7. После расслоения гидролизата надосадочную жидкость переносят в химический стакан объемом 150 см и оставшийся осадок промывают 10 см 50%-ным раствором этилового ректификованного спирта, повторно центрифугируют и смыв переносят в стакан с фильтратом - повторяют данную процедуру еще 1 раз.
8-11. Операции аналогичны примеру 1.
Пример 3. Определения степени резистентности модифицированного горохового крахмала
3
3
1. Навеску модифицированного горохового крахмала массой 1,00 г по сухому веществу, переносят в мерную колбу на 100 см, добавляют 50-80 см дистиллированной воды, нагревают до температуры не менее 90°С и выдерживают при этой температуре в течение 15 мин, перемешивая колбу.
3
2. Полученный клейстер охлаждают до комнатной температуры, добавляют к нему 10 см фосфатного буферного раствора с рН=6,86 и доводят объем дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают.
3
3
3
3
3. К рабочему раствору крахмала добавляют ферментные препараты: 4 см ПАА активностью 100 ед./см и 0,4 см АМГ активностью 300 ед./см.
4. Тщательно перемешивают данную смесь, закрывают полимерной пробкой и инкубируют при температуре 37°С в течение 1 ч в водяном термостате.
3
5. Для остановки гидролиза добавляют 4 см 50%-ного раствора этилового ректификованного спирта и перемешивают.
3
6. Далее гидролизат центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин в полимерных пробирках для центрифугирования на 100 см.
3
3
7. После расслоения гидролизата надосадочную жидкость переносят в химический стакан объемом 150 см и оставшийся осадок промывают 10 см 50%-ным раствором этилового спирта, повторно центрифугируют и смыв переносят в стакан с фильтратом - повторяют данную процедуру еще 1 раз.
8-11. Операции аналогичны примеру 1.