Способ моделирования первично-множественного роста злокачественных опухолей с подавлением одной опухоли другой в условиях первичного иммунодефицита
A METHOD FOR MODELING THE PRIMARY MULTIPLE GROWTH OF MALIGNANT TUMORS WITH THE SUPPRESSION OF ONE TUMOR BY ANOTHER IN THE CONDITIONS OF PRIMARY IMMUNODEFICIENCY

Изобретение относится к онкологии, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для изучения патогенеза первично-множественного неопластического процесса в эксперименте.
Первично-множественные злокачественные опухоли (ПМЗО) - это особый феномен в онкогенезе, который характеризуется наличием двух или более первичных неоплазм у одного пациента (Peng С. et al., 2019). Диагноз ПМЗО основан на стандартах Уоррена: все опухоли являются злокачественными; каждая опухоль не зависит от другой, в том числе не является метастатическим отсевом; все опухоли происходят из разных органов (Peng С. et al., 2019). Когда вторичные новообразования диагностируются в течение шестимесячного периода, то ПМЗО называются синхронными, в более поздний срок - метахронными. Частота ПМЗО составляет приблизительно 0,7-11% (Weissman S. et al., 2019). Распространенность синхронных ПМЗО варьирует в диапазоне от 30% до 55% (Liu Z. et al, 2015; Lv M. et al., 2017).
Данные многочисленных исследований показывают, что за последние десятилетия во всем мире наблюдается увеличение количества больных с ПМЗО (Важенин А.В. и соавт., 2015; Weissman, S. et al., 2019). По официальным данным в 2011 году в России ПМЗО диагностировались у 4,7% онкологических больных, в 2013 году - у 6,1% больных (Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность), 2013, 2015). По сведениям В.В. Старинского и соавт. (2001), абсолютное число случаев возникновения ПМЗО в России за 1991-2000 гг.возросло в 2,8 раза и продолжило расти в последующее десятилетие. Так, в 1991 г. было выявлено 2838 больных с этим диагнозом (заболеваемость - 1,9 на 100000 населения), в 2000 г. ПМЗО были диагностированы у 7956 больных (5,5 на 100000 населения) (Шунько Е.Л., 2014), в 2011 году число ПМЗО составило уже 24774 (17,3 на 100000 населения), а к 2013 году абсолютное число случаев возникновения ПМЗО в России достигло показателя 32841 (22,9 на 100000 населения) (Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность), 2013, 2015).
Множество факторов влияют на распространенность ПМЗО в разных географических регионах: генетические факторы, факторы окружающей среды, методы диагностики и противоопухолевое лечение.
ПМЗО могут встречаться в любом возрасте, однако установлено, что пациенты, имеющие две первичные опухоли, старше, чем пациенты с одним первичным раком; более 75% пациентов, имеющих диагноз ПМЗО, старше 50 лет. Тем не менее, средний возраст диагностики первого первичного рака ниже в метахронной группе, чем в синхронной, что указывает на то, что молодые люди с большей вероятностью имеют метахронные опухоли и должны тщательно контролироваться в течение более длительного времени. В целом, у пациентов с синхронными опухолями выживаемость была меньше, чем у пациентов с метахронными опухолями (Ly М. et al., 2017). Curtis et al. (2000) сообщили, что у пациентов с раком вероятность развития дополнительной опухоли на 14% выше, чем у населения в целом.
В соответствии с имеющимися наблюдениями, у мужчин ПМЗО встречается чаще, чем у женщин, Более 60% пациентов мужчин с ПМЗО имеют первичные опухоли пищеварительной и дыхательной систем (Не Y. et al., 2014).
Высокий риск для пациентов с ПМЗО, у которых не было семейной истории злокачественных новообразований, может быть частично обусловлен факторами окружающей среды и/или генетическими факторами, которые являются общими для двух злокачественных новообразований. Конкретный механизм неясен до сих пор. Тем не менее, обнаружено, что гены BRCA2, ATM, POLD1, PABL2, SMAD4 и некоторые другие играют важную роль в возникновении и патогенезе ПМЗО (Lu С. et al., 2015; Susswein L.R., Marshall M.L., 2016). В частности, мутации зародышевой линии BRCA1/BRCA2 были связаны с повышенным риском рака молочной железы, яичников, желудка, толстой кишки, матки и поджелудочной железы. Усечения ATM также были обнаружены при многих типах рака, в основном - при раке легких, желудка и простаты. Вариабельность гена PABL2 была связана с повышенным риском развития рака яичников и желудка (Lu С. et al., 2015). Мутация POLD1 была выявлена у больных с колоректальным раком и у женщин, предрасположенных к раку эндометрия (Palles С. et al., 2013). Все больше и больше исследований сообщают о распространенных вариациях генов при различных типах рака. В дополнение к списку генов была отмечена выраженная ассоциация между фенотипом микросателлитной нестабильности (MSI) и ПМЗО (Yun H.R. et al., 2009).
Высокий риск ПМЗО также связан со способами и эффектами лечения. Стратегии лечения синхронных и единичных опухолей различны. Согласно данным Williams-Brown M.Y. et al. (2011) в группе с синхронными опухолями 50% пациентов подвергаются хирургическому лечению еще до установления диагноза ПМЗО. Среди хирургов до сих пор нет единого мнения относительно надлежащего хирургического пособия при постановке диагноза ПМЗО, поэтому, прежде всего, врачи должны тщательно разработать стратегию лечения ПМЗО, включающую химиотерапию и/или лучевую терапию в соответствии с действующими рекомендациями, а затем провести тщательную предоперационную оценку, чтобы определить, есть ли необходимость в операции.
Показано, что канцерогенные эффекты химиотерапии и эндокринной терапии могут способствовать развитию ПМЗО. Например, у пациенток с раком молочной железы, получавших длительное лечение тамоксифеном или ралоксифеном, частота возникновения рака эндометрия увеличена в 2-3 раза по сравнению с общей популяцией (Williams-Brown M.Y. et al., 2011).
Таким образом, увеличивающаяся с каждым годом заболеваемость ПМЗО диктует необходимость изучения патогенеза этой онкологической патологии с целью разработки эффективных критериев ее диагностики и тактики лечения.
За последние два десятилетия экспериментальные модели с использованием мышей сыграли жизненно важную роль в понимании патогенетических основ канцерогенеза. В моделирование мышей внедряются геномные технологии, позволяющие лучше понять генез, прогрессирование и метастазирование опухолей. Однако несколько основных направлений остаются недооцененными и недостаточно изученными, например, процесс возникновения синхронно развивающихся опухолей. Разработка соответствующих экспериментальных моделей может внести большую пользу в понимание этого явления.
Экспериментальная онкология (греч, onkos масса, опухоль + logos учение; лат. experimentum проба, опыт) - раздел онкологии, занимающийся изучением опухолей в условиях эксперимента, что позволяет всесторонне изучить возникновение и развитие неоплазм, и, как следствие - разработать методы их диагностики, профилактики и лечения. В экспериментальной практике широко используются линейные животные. Результаты исследований, полученные на них, являются сопоставимыми и могут быть повторены в любое отдаленное время и в любом научном центре.
Выбор животного определяется видовой принадлежностью клеточного материала. Для исследования туморогенности клеточных линий грызунов и биопрепаратов, полученных на их основе, можно использовать здоровых сингенных животных. Для исследования всех остальных рекомендуется использовать иммунодефицитных животных. Наиболее предпочтительными моделями являются стандартные сертифицированные животные с генетически обусловленным иммунодефицитом: безтимусные (голые) мыши Nude. Эти животные являются носителями аутосомно-рецессивной мутации, которая в гомозиготном состоянии приводит к отсутствию внутриутробной закладки тимуса и волосяных луковиц, в результате чего они дефицитны по Т-лимфоцитам и лишены шерстного покрова. Используются как новорожденные, так и взрослые гомозиготные особи (Nu/Nu) (Lewis A.M.Jr., 2005; Rubio D. et al., 2005).
Экспериментальная модель опухоли - меланома В16 самопроизвольно возникла в коже мыши линии C57BL/6 в 1954 году. Доступность штамма меланомы В16 позволяет ученым всего мира исследовать особенности этиологии, патогенеза, метастазирования и разрабатывать новые возможности лечения меланомы кожи, в частности иммунотерапии и вакцинотерапии. Меланома В16 перевивается на самках и самцах мышей линии C57BL/6 путем подкожного введения 0,5 мл взвеси опухолевого штамма в растворе Хенкса или среде 199 (1:10) через 12-16 дней. Перевиваемость опухоли составляет 100%. При внутрибрюшной имплантации меланома В16 растет в виде множественных мелких узелков, выстилающих брюшную полость. Подкожная меланома В16 значительно более устойчива к химиотерапии, чем перевитая внутрибрюшинно. Клеточная популяция опухоли гетерогенна и включает как сильно пигментированные участки, так и фрагменты с незначительным содержанием или полным отсутствием меланина. Модальный класс опухоли насчитывает 40 хромосом. Пролиферативный пул в момент перевивки опухоли составляет 71,6% (Geran R.I., 1972). Метастазирует в легкие (60-90%), в остальных случаях - в печень, селезенку. Характеристики перевивной меланомы В16: короткий инкубационный период, быстрый рост, типичное метастазирование делают эту опухоль удобной моделью для лабораторных экспериментов и открывают широкие возможности исследования новых лекарственных средств.
Карцинома Герена (М.Е. Guerin, р. 1897 Г., франц. онколог; син. опухоль Т-8) - штамм перевиваемого малодифференцированного рака крыс, полученный из спонтанной аденокарциномы матки крыс. Прививается в 75% случаев (от 50 до 90%). В настоящее время по гистологическому строению малодифференцированный рак, редко образующий железистоподобные структуры. Опухолевые клетки имеют округлую форму, относительно большое ядро и узкий ободок цитоплазмы. Характерно расположение клеток в виде мелких ячеек и коротких тяжей, разделенных соединительнотканными прослойками.
Перевиваемые опухоли имеют ряд значительных преимуществ перед спонтанными и индуцированными. Во-первых, они делают возможной постановку массовых экспериментов, так как легко и быстро могут быть получены в большом количестве. Другим преимуществом штаммов перевиваемых опухолей является относительное постоянство их строения и биологических свойств.
Техническим результатом настоящего изобретения является создание экспериментальной модели роста В16/F10 и карциномы Герена у мышей BALB/c Nude.
Иммунодефицитные мыши Nude - безволосые альбиносы; область использования - онкология.
Поставленная цель достигается тем, что в эксперименте используют самок мышей линии BALB/c Nude, с рождения не имеющих тимус. Измененный генотип мышей способствует воспроизведению злокачественного роста.
Фиг. 1 Вид подкожных опухолей: меланомы B16/F10 (слева) и карциномы Герена (справа) у самки линии BALB/c Nude в модели ПМЗО; черное пятнышко в месте введения меланомы (стрелка).
Фиг. 2 Вид подкожной опухоли, расположенной слева - сторона перевивки меланомы B16/F10 у самки линии BALB/c Nude в модели ПМЗО, с выраженной венозной сетью (стрелка); ниже опухоли - округлое хрящевидное образование, диаметром около 5-6 мм (стрелка).
Изобретение «Способ моделирования первично-множественного роста злокачественных опухолей с подавлением одной опухоли другой в условиях первичного иммунодефицита» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии о модификации роста меланомы B16/F10 и карциномы Герена у мышей линии BALB/c Nude.
Новизна изобретения заключается в использовании самок мышей линии BALB/c Nude, развитие меланомы В16/F10 и карциномы Герена в организме которых при стандартной подкожной перевивке идет по стандартному «сценарию». Воспроизведение модели первично-множественного роста злокачественных опухолей с подавлением одной опухоли другой, заключающееся в подкожной перевивке меланомы B16/F10 и карциномы Герена мышам линии BALB/c Nude, усиливает злокачественный потенциал карциномы Герена и замедляет рост меланомы В16/F10 по сравнению с их ростом в самостоятельном варианте.
Изобретение «Способ моделирования первично-множественного роста злокачественных опухолей с подавлением одной опухоли другой в условиях первичного иммунодефицита» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для воспроизведения экспериментальной модели роста двух морфологически разнородных злокачественных опухолей, изучение их роста, особенностей метастазирования, влияния друг на друга при совместном росте на иммунодефицитных мышах.
«Способ моделирования первично-множественного роста злокачественных опухолей с подавлением одной опухоли другой в условиях первичного иммунодефицита» выполняется следующим образом.
Подготовка В16/F10 и карциномы Герена к перевивке.
Инструменты, посуду, руки дезинфицируют обычным способом. Помощник декапитирует животное, обрабатывает кожу над опухолью 70% спиртом. Отступив от опухоли 1-2 см экспериментатор отсепаровывает кожу и отгибает ее таким образом, чтобы шерсть не попала внутрь. Подкожный опухолевый узел карциномы Герена выделяют, промывают стерильным физиологическим раствором и разрезают вдоль. Вырезают кусочки жизнеспособной ткани, имеющей серовато-розовый цвет, и переносят в стерильную чашку Петри, после чего иссекают оставшиеся мелкие участки некроза, прослойки соединительной ткани, сгустки крови, наличие которых ухудшает условия последующего приживления; кусочки ополаскивают стерильным физиологическим раствором. Опухолевую ткань измельчают механическим гомогенизатором и разводят стерильным физиологическим раствором. Для перевивки используют 0,5 млн. опухолевых клеток в 0,5 мл физиологического раствора.
После выделения подкожного опухолевого узла меланомы B16/F10, его ополаскивают физиологическим раствором и разрезают внешнюю соединительно-тканную капсулу. Внутреннее содержимое меланомы B16/F10 имеет мягкую пастообразную легко размазывающуюся консистенцию, поэтому сразу набирается в стерильный шприц до отметки 0,5 мл и разводится физиологическим раствором в отношении 1:20 по объему. Перед инъекцией взвесь опухолевых клеток тщательно перемешивают (каждую по-отдельности) и набирают в разные шприцы объем взвеси на одно животное. Этим достигается большая равномерность в количестве прививаемого опухолевого материала.
Перевивка В16/F10 и карциномы Герена мышам линии BALB/c Nude.
Кожу животного в месте инъекции смазывают 70% спиртом. Опухоли перевивают последовательно под кожу левой (B16/F10) и правой (карцинома Герена) боковой поверхности спины, несколько ниже угла лопаток. Сразу же после извлечения иглы ваткой со спиртом зажимают место введения опухолевой взвеси, во избежание ее вытекания. Контролем служат мыши-самцы линии BALB/c Nude с перевивкой либо меланомы B16/F10, либо карциномы Герена в той же дозе и объеме.
Особенности роста опухолей при стандартной и синхронной перевивке представлены в таблице 1.
У самок мышей линии BALB/c Nude крысиная карцинома Герена при подкожной перевивке выходила в среднем на 5 дней раньше (р<0,05), чем мышиная меланома В16/F10 также перевитая под кожу; срок появления подкожного узла карциномы Герена - с 6 по 9 сутки от момента перевивки, меланомы B16/F10 - с 11 по 15 сутки. У самок мышей с одномоментной перевивкой двух штаммов опухоли появлялись практически сразу: карцинома Герена у первой мыши выходила через сутки после введения опухолевых клеток, меланома В16/F10 - через два дня у 2 мышей; срок окончания выхода карциномы Герена - 4-5 сутки (по 1 мыши), меланомы В16/F10 - 5 (3 мыши) - 6 (1 мышь) сутки. Меланома имела вид черного просяного зернышка, карцинома Герена - белого округлого образования, диаметром 3-4 мм. Таким образом, в модели ПМЗО обе опухоли появлялись в среднем в три раза быстрее, чем при изолированной перевивке, при этом статистически значимой разницы по срокам выхода сочетанных опухолей не было (см. Табл. 1).
Объем подкожных опухолей у мышей во всех группах замеряли перед гибелью первых мышей с ПМЗО - на 14 сутки от момента трансплантации неопластического материала. На фигуре 1 представлена фотография мыши с двумя опухолевыми узлами после одновременной перевивки мышиной меланомы (слева) и крысиной карциномы Герена (справа).
Объем каждой опухоли, одномоментно перевитых на одну мышь, превысил объем соответствующих опухолей, перевитых в самостоятельном варианте: опухолевый узел слева (в зоне введения клеток меланомы B16/F10) по сравнению с одиночной подкожной опухолью меланомы B16/F10 - в 7,5 раза, опухолевый узел справа (в зоне введения клеток карциномы Герена) по сравнению с одиночной подкожной опухолью карциномы Герена - в 2,2 раза (см. Табл. 1). Подкожная опухоль, расположенная в месте введения злокачественных клеток меланомы B16/F10, имела нетипичный для меланомы внешний вид: округлую форму, мягко-эластическую упругую консистенцию, светлый цвет (за исключением небольшого пятнышка - точка перевивки, диаметром 3-4 мм, которое было черной окраски) и ярко выраженную венозную сеть на коже (см. Фиг. 2).
При вскрытии обнаружено, что карцинома Герена метастазировала в меланому и практически полностью подавляла ее рост. Большую часть подкожного опухолевого узла, расположенного слева, занимала карцинома Герена. Меланома была представлена небольшим «островком» опухолевой ткани неравномерной окраски, расположенным «сверху» опухоли Герена. Сразу под кожей в месте введения клеток меланомы визуализировался участок опухоли диаметром 3-4 мм черной окраски. Вокруг темного «центра» располагалась светлая часть меланомы такой же рыхлой пастообразной консистенции, как и темная часть, диаметром 6-7 мм. На остальном протяжении опухоль слева имела вид вытянутого узла серовато-розового цвета, плотной упругой консистенции - также, как и опухоль справа, которая была значительно больше по объему. Правая и левая опухоли не сливались друг с другом, между ними было небольшое расстояние около 2-3 мм. В центре правого опухолевого узла карциномы Герена регистрировался небольшой очаг казеозного некроза, диаметром 6-7 мм, слева - некроза не было. Меньшие размеры, отсутствие некроза, визуально более «молодая» ткань карциномы слева свидетельствовали о более позднем ее возникновении, чем справа, что в сочетании с остатками меланомы, спаянными с левой опухолью, указывали на метастатическую природу карциномы Герена слева. Меланома B16/F10 не метастазировала даже на типичные сайты - легкие, селезенка, печень. Округлое образование под кожей, расположенное ниже левой опухоли, оказалось окончанием грудины, развернутой правым опухолевым узлом (см. Фиг. 2).
Продолжительность жизни мышей с ПМЗО была минимальной - чуть больше 2 недель (см. Табл. 1). На неделю дольше жили мыши с изолированной карциномой Герена. Продолжительность мышей с меланомой B16/F10 оказалась максимальной - более 3 недель (см. Табл. 1)
Таким образом, одномоментная подкожная перевивка мышиной меланомы В16/F10 и крысиной карциномы Герена самкам мышей линии BALB/c Nude способствовало подавлению опухолевого роста меланомы B16/F10 и увеличивало злокачественный потенциал карциномы Герена.
Технико-экономическая эффективность «Способа моделирования первично-множественного роста злокачественных опухолей с подавлением одной опухоли другой в условиях первичного иммунодефицита» заключается в том, что воспроизведение модели первично-множественного злокачественного роста путем подкожной перевивки меланомы B16/F10 и карциномы Герена мышам линии BALB/c Nude замедляет рост меланомы В16/F10, по сравнению с ростом одной меланомы B16/F10, и усиливает злокачественный потенциал карциномы Герена - активизирует рост, усиливает метастазирование, по сравнению с ростом карциномы Герена в самостоятельном варианте.
Это дает возможность изучать патогенез синхронного злокачественного роста при неравномерном развитии обеих злокачественных опухолей, что важно для клиники, а также проводить поиск мишеней для таргетной терапии полинеоплазий. Способ экономичен, доступен.
Список литературы.
1. Фадеева Е.В. Экспериментальная модель меланомы В16 и методы иммунотерапии // Международный журнал экспериментального образования. 2010; 8:49-51; URL: ht°tp://expeducation.ru/ru/article/view?id=728.
2. Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность) / под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: ФГБУ «МНИОИ им. ПА. Герцена» Минздрава России, 2013; 289.
3. Злокачественные новообразования в России в 2013 году (заболеваемость и смертность) / под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена - филиал ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России. 2015; 250.
4. Старинский В.В., Петрова Г.В., Харченко Н.В., Грецова О.П. Основные показатели онкологической помощи населению России в 2000 г. // Новые информационные технологии в онкологической статистике / под ред. В.М. Мерабишвили. СПб. 2001: 8-9.
5. Шунько Е.Л. Проблема риска развития первично-множественного рака после лучевой и химиотерапии первой опухоли в современной англоязычной литературе // Современные проблемы науки и образования. 2014; №6: URL: http://www.science-education.ru/120-16901 (дата обращения: 16.01.2015).
6. Важенин А.В., Шунько Е.Л., Шаназаров Н.А. Эволюция критериев первичной множественности и классификации первично-множественных злокачественных опухолей. Современные проблемы науки и образования. 2015; 6: URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=21773.
7. Geran R.I., Greenberg N.H., Macdonald M.M. Protocol for screening agents and natural products against animal tumors and other biological systems. Cancer Chemother. Rep. 1972; 3(2): 9-11.
8. Williams-Brown M.Y., Salih S.M., Xu X., Veenstra T.D., Saeed M., Theiler S.K., Diaz-Arrastila C.R., Salama S.A. The effect of tamoxifen and raloxifene on estrogen metabolism and endometrial cancer risk. J Steroid Biochem Mol Biol. 2011; 126: 78-86. doi: 10.1016/j.jsbmb.2011.05.001
9. Weissman S., Sebrow J., Gonzalez H.H., Weingarten M.J., Rosenblatt S., Mehta T.I., Thaker R., Krzyzak M., Saleem S. Diagnosis of Primary Colorectal Carcinoma with Primary Breast Cancer: Associations or Connections?. Cureus. 2019; 11(3), e4287. https://doi.ora/10.7759/cureus.4287
10. Peng C., Li Z., Gao H., Zou X., Wang X., Zhou C., Niu J. Synchronous primary sigmoid colon cancer and primary thyroid cancer followed by a malignant tumor of the kidney: Case report of multiple primary cancer and review of the literature. Oncology letters. 2019; 17(2), 2479-2484. https://doi.org/10.3892/ol.2018.9867
11. Curtis R.E., Freedman D.M., Ron E., Ries L.A., Hacker D.G., Edwards B.K., Tucker M.A., Fraumeni J.F. Jr. National Cancer Institute; Bethesda, MD, NIH Publ.: 2006. New malignancies among cancer survivors: SEER cancer registries, 1973-2000. N. 05-5302.
12. Palles C., Cazier J.B., Howarth K.M. Germline mutations affecting the proofreading domains of POLE and POLD1 predispose to colorectal adenomas and carcinomas. Nat Genet. 2013; 45:136-44.
13. Yun H.R., Yi L.J., Cho Y.K. Double primary malignancy in colorectal cancer patients: MSI is the useful marker for predicting double primary tumors. Int J Colorectal Dis. 2009; 24:369-375.
14. Lu C., Xie M., Wendl M.C. Patterns and functional implications of rare germline variants across 12 cancer types. Nat Commun. 2015; 6: 10086.
15. Susswein L.R., Marshall M.L. Pathogenic and likely pathogenic variant prevalence among the first 10,000 patients referred for next-generation cancer panel testing. Genet Med. 2016; 18:823-832.
16. He Y., Jiang В., Li L.S. Changes in smoking behavior and subsequent mortality risk during a 35-year follow-up of a cohort in  China. Am J Epidemiol. 2014; 179: 1060-1070.
17. Liu Z., Liu C., Guo W. Clinical analysis of 152 cases of multiple primary malignant tumors in 15,398 patients with malignant tumors. PLoS One. 2015; 10: e0125754.
18. Ly M., Zhang X., Shen Y., Wang F., Yang J, Wang В., Chen Z., Li P., Zhang X., Li S., Yang J. Clinical analysis and prognosis of synchronous and metachronous multiple primary malignant tumors. Medicine. 2017; 96(17): e6799. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000006799
19. Lewis A.M.Jr. Regulatory implications of neoplastic cell substrate tumorigenicity / U.S. Food and Drug Administration. 2005; 31.
20. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M.C. et al. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005; 65: 3035-3039.