УСТРОЙСТВО ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ЖИДКОЙ ФАЗЕ

Полезная модель относится к области измерительной техники, в частности к оптическим биосенсорам, и может быть использована для обнаружения (детекции) микроорганизмов (патогенных биологических агентов) в исследуемых образцах, переведенных в жидкую фазу. Полезная модель может быть использована при контроле объектов окружающей среды на наличие патогенных биологических агентов.
Известны биосенсоры, предназначенные для выявления и определения различных веществ в исследуемых пробах: определения загрязненности воды органическими веществами [1], выявления токсических соединений в воздушной среде [2], определения капролактама [3], олиго- и полисахаридов [4], тиодигликоля [5]. Указанные разработки не позволяют выявлять микроорганизмы в образцах.
Известно устройство для формирования базы данных для определения биологических агентов и химических веществ [6]. Устройство включает блок с источником когерентного поляризованного монохроматического электромагнитного излучения, рабочую ячейку для определяемого объекта, приемный блок для записи и считывания оптической информации с набором ячеек базы данных для хранения информации о спектрах комбинационного рассеяния или распределения спектральных характеристик интенсивности электромагнитного излучения в областях минимальных значений диаграммы рассеяния излучения, а также блок управления, имеющий выход на компьютер. База данных составляется из спектров неупругого рассеивания и распределения спектральных характеристик интенсивности электромагнитного излучения в зоне минимальных значений диаграммы рассеивания излучения пробы, состоящей из базовой биологической среды и исследуемого объекта. По спектральным характеристикам, занесенным в базу данных, можно контролировать наличие в организме вирусов, бактерий, токсинов, или определять чужеродные компоненты.
Известно устройство для детекции подвижных микроорганизмов в воде, содержащее источник лазерного излучения, оптически связанный с кюветой с исследуемой средой, расположенной соосно с пучком лазерного излучения, два фотоприемника, оптически связанных с кюветой, дифференциальные усилители и блок обработки и индикации [7]. Кювета выполнена в виде полого оптического волновода. С помощью указанного устройства за счет наличия двух фотоприемников, расположенных на определенном расстоянии друг от друга, регистрируют спектр флуктуации интенсивности рассеянного излучения, который различен для чисто броуновских частиц и подвижных микроорганизмов. На блок обработки и индикации детектора подается только разностный сигнал от двух фотоприемников, содержащий информацию только о динамических процессах в кювете. Данное устройство не позволяет обнаружить неподвижные, в том числе, обеззараженные различными способами, микроорганизмы.
Описанные устройства с использованием лазерного источника излучения требуют при их эксплуатации соблюдения санитарных норм и правил устройства и эксплуатации лазеров [8].
В основу полезной модели поставлена задача создания простого в использовании биосенсорного устройства для быстрого выявления возбудителей особо опасных инфекций и их комплексов со специфическими антителами в жидкой фазе.
Технический результат заключается в повышении информативности исследования за счет исследования проб различного объема (микро- и макрообъемы) и использования широкого оптического диапазона.
Технический результат достигается путем разработки оптического устройства с галогеновым источником излучения, блоком считывания информации широкого спектрального диапазона, системами регулирования светового потока для исследования образцов микроорганизмов и их комплексов со специфическими антителами, помещенных как в кюветы, так и в микрокапилляры.
Сущность полезной модели заключается в том, что предложено устройство для детекции микроорганизмов в жидкой фазе содержащее галогеновый источник излучения, оптически связанный с блоком считывания информации через два блока - регулятора светового потока, с кюветой и/или микрокапилляром с исследуемым объектом, расположеными в блоках для фиксации кювет. Каждый из блоков - регуляторов светового потока включает собирающие линзы, поворачиваемое зеркало, и на входе и выходе связан с источником излучения и блоком считывания информации, при этом вход одного из блоков связан с источником излучения, выходы - с кюветами, выход второго - с блоком считывания информации, а входы - с кюветами. Оптическая связь между двумя блоками - регуляторами светового потока осуществляется посредством оптоволоконного кабеля.
Блоком считывания информации содержит спектроанализатор широкого спектрального диапазона (от 200 до 1100 нм.).
Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом в микрообъемах может включать держатель микрокапилляра, микрокапилляр, микрообъективы.
Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом в макрообъемах может включать коллимирующие линзы, держатель кюветы, кювету.
Блок - регулятор светового потока выполнены с возможностью регулирования светового потока по двум независимым оптическим путям.
В заявляемой полезной модели используется один галогеновый источник излучения с широким диапазоном длин волн, обеспечивающий уровень спектрального разрешения, достаточный для лабораторных измерений, имеются два независимых пути направления светового потока от источника излучения к исследуемым образцам и от исследуемых образцов к блоку считывания информации. Образцы, поступившие для лабораторного анализа особо опасных инфекций в макрообъемах исследуются в кювете, оптически связанной с источником света и блоком считывания информации. Образцы, поступившие для лабораторного анализа особо опасных инфекций в микрообъемах исследуются в микрокапилляре, оптически связанном с источником света и блоком считывания информации, преобразующий оптический сигнал в электрический, позволяющий регистрировать три базовых спектра излучения (поглощения, пропускания, отражения) в диапазоне от 200 до 1100 нм. Конструктивными элементами полезной модели являются два регулятора направления светового потока по двум независимым оптическим путям. Регуляторы направления светового потока содержат поворачиваемое зеркало, заключенное в непрозрачный кожух, фиксаторы зеркала в двух положениях, в кожухе имеются три отверстия, расположенных в точках пересечения светового потока (падающего и отраженного) со стенками кожуха регулятора направления светового потока, в два из которых установлены разъемы для крепления оптических кабелей. Внутри кожуха расположены три собирающие линзы, расположенные на фокусном расстоянии от центра симметрии зеркала и входных (выходных) отверстий.
На фиг.1 а, б представлена блок-схема устройства, где 1 - галогеновый источник излучения, 2 - блок - регулятор светового потока, 3 - блок считывания информации, 5 -блок для фиксации кювет с исследуемым объектом (макрообъемы), 4 - блок для фиксации кювет с исследуемым объектом (микрообъемы). Блок - регулятор светового потока содержит собирающие линзы 6, поворачиваемое зеркало 7. Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом (макрообъемы) содержит держатель кюветы 8, коллимирующие линзы 9. Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом (микрообъемы) содержит держатель микрокапилляра 10, микрообъективы 11.
При исследовании образцов в макроколичествах (объемом более 0,5 мл) зеркало 7 фиксируется таким образом, чтобы направить световой поток на собирающую линзу 6, оптически связанную с блоком для фиксации кювет с исследуемым объектом 8. Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом 8 с входной и выходной стороны имеет коллимирующие линзы 9 для формирования параллельного пучка светового потока и разъемы для крепления оптических кабелей. Линзы 9 и кювета 12 с исследуемым образцом расположены на одной оптической оси. Свет проходит через исследуемый образец в кювете, помещенной в блок для фиксации кювет с исследуемым объектом 8. Блок для фиксации кювет с исследуемым объектом соединен посредством оптического (оптоволоконного) кабеля 13 с блоком - регулятором светового потока 2, фокусирующим свет с помощью линзы на поверхность зеркала и направляющим световой поток к блоку считывания информации 3.
При исследовании образцов в микроколичествах (объемом 10-100 мкл) зеркало 7 фиксируется таким образом, чтобы направить световой поток на собирающую линзу 6, оптически связанную с блоком для фиксации кювет с исследуемым объектом 10 через микрообъектив 11, расположенный на фокусном расстоянии от входного отверстия микрокапилляра 14, и расположенного соосно с пучком светового потока. С выходной стороны микрокапилляра установлен микрообъектив 11, фокусирующий световой поток на выходе из микрокапилляра в оптический (оптоволоконный) кабель 13, расположенный от микрообъектива 11 на фокусном расстоянии и направляющий световой поток на собирающую линзу 6 блока - регулятора светового потока 2. Зеркало 7 блока - регулятора светового потока фиксируется в таком положении, чтобы световой поток был направлен на линзу 6, оптически связанную с блоком считывания информации 3.
Преимуществом заявляемого устройства является возможность исследования жидких образцов различного объема (от 10 мкл до 0,5 мл), содержащих микроорганизмы возбудители особо опасных инфекций и/или их комплексы со специфическими антителами как в кюветах, так и в микрокапиллярах, в широком спектральном диапазоне (от 350 до 1100 нм) за счет использования галогенового источника излучения - безопасного для персонала при эксплуатации, блока регулирования светового потока и регистрации нескольких видов спектров (поглощения, пропускания, отражения), что повышает информативность исследований, возможность адаптации к стандартному оборудованию.
Примеры использования заявляемого устройства:
Пример 1 детекции микроорганизмов в исследуемых образцах в макрообъмах.
9
В данном примере для исследования берут образец, содержащий клетки Yersinia pestis в концентрации 1×10 м.к./мл, растворитель - физиологический раствор и с помощью заявляемого устройства проводят качественный спектральный анализ растворов.
λ
λ
λ
λ
λ
λ
λ
λ
Перед началом измерений в блоках - регуляторах светового потока зеркала фиксируют в таком положении, чтобы направить световой поток на тот оптический путь, на котором расположен в кювете исследуемый объект. В кювету вносят физиологический раствор и пропускают через нее световой поток, направленный от источника излучения на блок считывания информации. Блок считывания информации регистрирует опорный спектр растворителя R и сохраняет его в виде таблицы. Затем на заданном оптическом пути кювету с растворителем заменяют на кювету с исследуемым образцом (клетки Yersinia pestis) в жидкой фазе и объеме 0,5 мл. Блок считывания информации регистрирует спектр исследуемого образца S и сохраняет его в виде таблицы. Значения аналитического сигнала определяют по формуле: А=S-R, где; А - аналитический сигнал при длине волны λ, S - сигнал образца при длине волны λ, R - опорный сигнал при длине волны λ.
По полученным значениям проводят учет результатов.
При значениях аналитического сигнала  усл. ед. и отсутствием максимумов и минимумов в аналитическом спектре в диапазоне 700-1100 нм - в образце клетки микроорганизмов отсутствуют. При значениях  усл. ед. и расположением максимумов и минимумов в диапазоне 700-1100 нм - в образце присутствуют клетки микроорганизмов. С использованием заявляемого устройства по полученным аналитическим спектрам можно определять присутствие микроорганизмов в образцах.
На фиг.2 графически отображены значения аналитического сигнала исследуемого образца и растворителя.
Пример 2 детекции растворимых антигенов Y. pestis, и Vibrio cholerae в исследуемых образцах в микрообъмах.
При наличии исследуемого образца в малых количествах (менее 0,5 мл.) исследования проводят с использованием другого оптического пути. В блоках - регуляторах светового потока зеркала фиксируют в таком положении, чтобы направить световой поток на оптический путь, на котором расположен микрокапилляр.
Исследуемые образцы и соответствующий растворитель вносят во взаимозаменяемые микрокапилляры, и с помощью заявляемого устройства проводят качественный спектральный анализ растворов. Исследования проводят аналогично примеру 1. При значениях  усл. ед. и отсутствием максимумов и минимумов в аналитическом спектре образца в диапазоне 450-950 нм - в образце растворимые антигены микроорганизмов отсутствуют. При значениях  усл. ед и расположением максимумом и минимумов в диапазоне 450-950 нм - в образце присутствуют растворимые антигены микроорганизмов.
На фиг.3 графически отображены значения аналитического сигнала исследуемого образца и растворителя, отражающие наличие указанных антигенов в исследуемых образцах и их дифференциальные отличия по спектральным характеристикам. С использованием заявляемого устройства по полученным аналитическим спектрам можно определять присутствие антигенов микроорганизмов в образцах.
Пример 3 детекции и определения микроорганизмов в исследуемых образцах в макрообъмах с использованием специфических антител.
Детекцию микроорганизмов осуществляли аналогично примеру 1.
9
9
λ
λ
λ
Для определения микроорганизмов используют образец 1, содержащий клетки Y. pestis в концентрации 1×10 м.к./мл и образец 2, содержащий клетки F. tularensis в концентрации 5×10 м.к./мл, образец 3 - контроль антител к Y. pestis, образец 4 - контроль клеток Y. pestis. В образцы 1 и 2 вносят специфические антитела (иммуноглобулины чумные агглютинирующие) в рабочем разведении. В качестве отрицательных контролей используют препарат иммуноглобулинов чумных агглютинирующих в рабочем разведении (образец 3) и препарат взвеси микробных клеток Y. pestis без специфических антител (образец 4). Образцы инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С. Исследуемые образцы вносят в кюветы поочередно и через них пропускают световой поток от источника излучения к блоку считывания информации. Вычисляют значения аналитического сигнала A, образцов и соответствующих отрицательных контролей аналогично примера 1 и осуществляют учет результатов. Определяют стандартное отклонение σ отношений значений A отрицательных контролей к значениям A исследуемых образцов. При значениях стандартного отклонения σ>2 - в исследуемом образце выявлен микроорганизм, специфически взаимодействующий с используемыми в исследовании специфическими антителами. При значениях стандартного отклонения σ≤2 - в исследуемом образце не выявлен микроорганизм, специфически взаимодействующий с используемыми в исследовании специфическими антителами. С помощью заявляемого устройства по полученным аналитическим спектрам можно определять вид микроорганизмов в образцах при наличии соответствующих специфических антител.
На фиг.4 графически отображены значения аналитического сигнала исследуемых образцов 1, 2, 3 и 4, отражающих различие спектральных характеристик при наличии и отсутствии специфического взаимодействия антител с клетками микроорганизмов.
Таким образом заявляемое устройство позволяет осуществлять детекцию цельных клеток микроорганизмов и их антигенов, а также определять вид микроорганизма при использовании специфических антител с помощью спектрального анализа без применения меченных реагентов.
Источники:
1. патент на полезную модель РФ №73975, кл. G01N 33/18, 2008.
2. патент на полезную модель РФ №64381, кл. G01N 33/48, H04R 9/00, 2007.
3. патент на полезную модель РФ №70661, кл. C12N 1/00, 2008.
4. патент на полезную модель РФ №66815, кл. G01N 27/26, 2007.
5. свидетельство на полезную модель РФ №30994, кл. G01N 30/74, 2003.
6. патент РФ №2269116, кл. G01N 21/01, A61N 5/00, G01N 33/487, 2006
7. патент РФ №2143487, кл. С12М 1/34, 1999.
8. Санитарные нормы и правила устройства и эксплуатации лазеров. СанПиН 5804-91, М., 1991.