СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПЕСТИЦИДНОГО ПРЕПАРАТА
METHOD FOR OBTAINING A BIOPESTICIDE PREPARATION

Изобретение относится к биотехнологии и к сельскохозяйственной микробиологии, в частности к способу получения биопестицидного препарата, и может быть использовано при производстве средств защиты растений от вредителей.
К разряду наиболее перспективных для применения в сельском хозяйстве относятся биопрепараты на основе штаммов Beauveria bassiana вследствие широкого спектра энтомопатогенной активности грибов (действует на представителей отрядов Lepidoptera, Coieoptera, Hymenoptera, Orthoptera, Acarina), а также безопасности для животных, человека и растений. Подобно большинству энтомопатогенных грибов, Beauveria bassiana инициирует заражение путем прорастания споры (конидии), прикрепляющейся к кутикуле насекомого-хозяина, а также действия каскада кутикулдеградирующих ферментов (протеазы, липазы, хитиназы). Для получения эффективного биопрепарата необходимо использование субстратов и условий, влияющих на рост, жизнеспособность и активность биологического агента - споросодержащую биомассу энтомопатогенной культуры.
Известны биопрепараты на основе энтомопатогенных грибов для защиты растений от вредителей и способы их получения путем поверхностного и глубинного культивирования одного из микроскопических грибов Verticillium lecanii, Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae на питательных средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим концентрированием и сушкой концентрата. Двухстадийным глубинно-поверхностным способом получают Вертициллин зерновой (ТУ 10.01.28-89), Вертициллин-К (ТУ 10.01.29-89), Боверин-концентрат Ж (ТУ 10.01.26-88). Недостатками этих препаратов являются снижение жизнеспособности спор, краткий срок хранения этих препаратов в жидком виде или дороговизна сухих препаратов, а также длительного культивирования грибов (не менее 14 суток).
Известен способ получения энтомопатогенного препарата (RU 2035144 С1, 1995) путем глубинного культивирования микроскопических грибов (Verticillium lecanii, Beauveria bassiana или Metarhizium anisopliae) на питательной среде, содержащей глюкозу, глицерин, гидролизат белково-витаминного концентрата, мел и воду. Культуральную жидкость концентрируют и получают препарат в жидком или сухом виде, при этом для получения препарата в жидком виде в концентрат вводят глицерин и поливинилпирролидин или полиэтиленоксид, а для получения сухого препарата в концентрат вводят смесь цеолита типа NaX и монтмориллонита или палыгорскита, затем гранулируют и сушат. Недостатками этих препаратов и способов их получения являются снижение жизнеспособности спор, короткий срок хранения этих препаратов в жидком виде или дороговизна сухих препаратов, а также необходимость длительного культивирования грибов и многостадийность способов получения.
Известна биопестицидная композиция для борьбы с муравьями рода Solenopsis (Патент США 4925663), которая содержит гриб Beauveria bassiana №447, АТСС 20872, и носитель (рис или измельченный рис). Используется в жидкой, порошкообразной, гранулированной формах внесением как приманка с порошком или гранулированным носителем вместе с маслом (нефтепродуктом) или любым другим аттрактантом в почву, окружающую гнездо. Недостатком является низкопроизводительный поверхностный способ культивирования на сложных и дорогих питательных средах.
Известен способ получения препарата хищных грибов для защиты растений и животных от паразитических нематод (RU 2106092 С1, 1998). Способ предусматривает культивирование гриба Arthrobotrys oligospora BKMF 3062 L на среде, содержащей мелассу, кукурузный экстракт и минеральный комплекс, и последующее использование для высушивания полученной мицелиальной массы или полученного гранулированием смешанного с биомассой наполнителя, в качестве которого используют каолин или цеолит в соотношении мицелиальная масса:наполнитель 1:2, для борьбы с нематодами растений и животных. Недостатками препарата и способа получения являются дороговизна и сложность состава компонентов питательной среды.
Известен способ получения композиции для борьбы с личинками жуков-щелкунов (RU 2311778 С1, 2007), состоящей из маточной культуры энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana F-65, сухого концентрата кормового лизина, янтарной кислоты и зерна пшеницы. Способ получения композиции включает приготовление посевного материала на агаризованных средах Чапека или сусло-агар, глубинное культивирование на тех же жидких питательных средах, выращивание гриба на зерне пшеницы, которое предварительно подвергают замачиванию, проращиванию и пастеризации в автоклаве, смешивание полученного зерна с сухим концентратом кормового лизина и янтарной кислотой в определенном соотношении компонентов и последующее твердофазное культивирование мицелиальной массы на полученной зерновой смеси. Недостатками данного способа являются многостадийность и длительность получения композиции, сложность процесса подготовки твердого носителя (зерна), дороговизна компонентов, а также узкая патогенная направленность полученной композиции.
Наиболее близким является способ получения композиции, состоящей из культуры энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana F-145 и древесных опилок хвойных пород в качестве носителя (Шарапова Н.Э. Биопестицидная композиция на основе лигноуглеводных субстратов и энтомопатогенного гриба // Актуальные проблемы региональной экологии и биодиагностика живых систем: Материалы XIII Всероссийской науч.-практ. конфер. с междунар. участием (Киров, 1-2 декабря 2015). – Киров, 2015. - Кн. 1. - С. 162-164). Способ получения композиции включает получение культуры гриба на агаризованной и жидкой среде Чапека, выращивание последовательным глубинным и глубинно-поверхностным культивированием на питательной среде, содержащей молочную (творожную) сыворотку и биогены (минеральный комплекс), инокулирование споровой суспензией и твердофазное культивирование на древесных опилках, предварительно обработанных органическим растворителем (обессмоливание) и щелочью (гидролиз). Недостатками данного способа являются длительность этапов выращивания гриба (до 14 суток при получении споросодержащей биомассы и 10-14 суток при твердофазном культивировании на опилках), многостадийность и сложность процесса подготовки носителя с использованием токсичных химических реагентов, что ведет за собой необходимость удаления их из древесной массы промывкой водой для экологической безопасности композиции при применении и возможности размножения гриба на носителе, а также отсутствие данных об активности и жизнеспособности гриба в составе описанной формы препарата - биопестицидной композиции.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка эффективного способа получения биопестицидного препарата, сокращение сроков культивирования, повышение активности и жизнеспособности препарата в различных формах путем оптимизации питательной среды по качественному и количественному составу компонентов и использования нового сельскохозяйственно приемлемого носителя, а также расширение арсенала биопестицидов против различных вредителей растений.
7
Технический результат достигается тем, что способ получения биопестицидного препарата включает выращивание посевного материала и накопительной культуры гриба Beauveria bassiana (ВКПМ F-145) глубинным и/или глубинно-поверхностным культивированием на питательной среде, содержащей пивную барду или смесь молочной сыворотки с пивной бардой, взятых в соотношении об. масс 1:1, минеральный комплекс и Твин-80 или дизельное топливо в качестве индукторов, концентрирование фильтрованием культуральной жидкости с содержанием КОЕ/мл не менее 10 для получения препарата в жидкой или пастообразной форме. При получении сухой формы препарата способ включает высушивание концентрата культуральной жидкости энтомопатогенного гриба, а при получении биопестицидного препарата на носителе способ дополнительно включает смешивание культуральной жидкости с сельскохозяйственно приемлемым носителем, взятыми в соотношении масс 0,3-1:1-10, при этом в качестве носителя используется пивная дробина, предварительно высушенная при Т=50-105°С, и, необязательно, твердофазное культивирование на носителе в течение 2-5 суток с последующим высушиванием препарата.
Отличительными признаками настоящего изобретения являются - глубинное и/или глубинно-поверхностное культивирование штамма Beauveria bassiana (ВКПМ F-145) на питательной среде, содержащей пивную барду или смесь молочной сыворотки и пивной барды при соотношении масс 1:1, а также минеральный комплекс и дизельное топливо или Твин-80 в качестве индукторов; получение биопестицидного препарата на носителе путем смешивания культуральной жидкости с пивной дробиной, предварительно высушенной при Т=50-105°С, при соотношении масс 0,3-1:1-10 и дальнейшее, необязательно, твердофазное культивирование в течение 2-5 суток.
Входящие в состав питательной среды молочная сыворотка и пивная барда, а также носитель являются доступным и дешевым сырьем, так как представляют собой отходы производств. Молочная сыворотка - побочный продукт молочного производства (ТУ 9229-110-04610209-2002 «Сыворотка молочная пастеризованная», Молзавод «Сыктывкарский»), содержит белковые азотистые вещества, углеводы, липиды, минеральные соли, витамины, органические кислоты. Пивная барда - отход пивного производства (Пивзавод «Сыктывкарский»), суспензия светло-коричневого цвета с запахом зерна (брожения). Барда - это отходы, вызывающие загрязнение окружающей среды, но благодаря содержанию клетчатки, белка и микроэлементов является вторичным сырьевым ресурсом. Отход производства пива - пивная дробина содержит оболочки и частицы ядер зерна, 75-80% воды и 20-25% сухого вещества, состоящего из 28% белков, 8% жиров, 41% экстрактивных веществ, 17,5% целлюлозы и 5,5% минеральных веществ.
Способ получения биопестицидного препарата на основе энтомопатогенного гриба Beauveria bassiana (паспорт ВКПМ F-145) осуществляется следующим образом.
При выращивании и хранении маточной культуры гифомицета Beauveria bassiana (ВКПМ F-145) использовали среды картофельно-глюкозный агар или Сабуро, а также использовали прием пассивирования через инфицированных насекомых для достижения сохранности и повышения вирулентности энтомопатогенного гриба за счет белков, аминокислот, хитина и других БАВ, содержащихся в живых насекомых.
2
4
3
4
3
Получение накопительной культуры гриба Beauveria bassiana (ВКПМ F-145) осуществляли глубинным и/или глубинно-поверхностным культивированием на жидкофазной питательной среде следующего состава, г/100 мл: пивная барда - 70,0-90,0 или смесь молочной сыворотки - 35,0-45,0 и пивной барды - 35,0-45,0; индуктор: дизельное топливо (ДТ) - 0,1-0,2 или Твин-80 - 0,2-0,5; минеральный комплекс - 0,3-0,5 (KHPO - 0,1-0,2; KNO - 0,1-0,2; MgSO - 0,05; СаСО - 0,05; NaCl - 0,05); вода - остальное.
Культивирование включает стадии: нормализация щелочью рН питательной среды (рН=6,0-7,0); стерилизация питательной среды автоклавированием (1 атм в течение 30 мин); внесение посевного материала в количестве 1-5% от объема питательной среды; культивирование, которое проводится с использованием колб, шейкера или ферментера.
Глубинное культивирование осуществляли на питательной среде в течении 4-5 сут. при температуре Т=22±2°С и аэрации при 200-220 об/мин в динамичных условиях.
Глубинно-поверхностное культивирование осуществляли путем выращивания накопительной грибной культуры на поверхности питательной среды в течении 8-10 сут. при Т=18±2°С в стационарных условиях.
Глубинное и глубинно-поверхностное культивирование осуществляли в течении 7-8 сут. в два этапа: на первом - в течении 4-5 сут. накопительную культуру выращивали в динамичных условиях при Т=22±2°С и аэрации глубинным культивированием; а на втором - продолжали выращивать биомассу гриба на поверхности питательной среды в стационарных условиях еще в течение 2-3 сут.
Примеры получения накопительной культуры штамма В. bassiana глубинным и/или глубинно-поверхностным культивированием на жидкофазной питательной среде.
Пример 1. Накопительную культуру получали выращиванием на питательной среде следующего состава, г/100 мл: пивная барда 70-90, минеральный комплекс 0,3-0,5, в качестве индуктора - дизтопливо 0,1-0,2 и вода - остальное.
Пример 2. Накопительную культуру получали выращиванием на питательной среде, г/100 мл: пивная барда 70-90, минеральный комплекс 0,3-0,5, в качестве индуктора - Твин-80 0,2-0,5 и вода - остальное.
Пример 3. Накопительную культуру получали выращиванием на питательной среде, г/100 мл: пивная барда 35-45, молочная сыворотка 35-45, минеральный комплекс 0,3-0,5, в качестве индуктора - Твин-80 0,2-0,5 и вода - остальное.
Пример 4. Накопительную культуру штамма получали выращиванием на питательной среде, г/100 мл: пивная барда 35-45, молочная сыворотка 35-45, минеральный комплекс 0,3-0,5, в качестве индуктора - дизтопливо 0,1-0,2 и вода - остальное.
7
Зрелая мицелиальная масса гифомицета имеет гелеобразную консистенцию с содержанием инфекционных единиц КОЕ/мл не менее 10 и с содержанием сухого вещества биомассы не менее 10 г/л.
В накопительной культуре штамма В. bassiana, полученной глубинным и/или глубинно-поверхностным культивированием на питательных средах различного состава (Примеры 1-4), определяли ферментативную активность: каталазную (Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. 1976), целлюлозолитическую (Teather R.M., Wood P.J. Use of congo-red polysaccharide interaction in erumeration and characterization of cellulolytic bacteria the bovine rumen // Appl. Environ Microbiol. 1982. V. 43. P. 777-780), а также количество биологического агента (биомассу и титр инфекционных единиц КОЕ/мл). Результаты сведены в Таблицу 1.
По окончании культивирования штамма В. bassiana (примеры 1-4) на 5 и 8 сутки определена общая целлюлазная активность (Полыгалина Г.В., Чередниченко B.C., Римарева Л.В. Определение активности ферментов. Справочник. - М.: ДеЛи принт, 2003. - 375 с.). Результаты сведены в Таблицу 2.
11-12
7-8
Для получения пастообразной формы препарата культуральную жидкость концентрировали фильтрованием с использованием фильтровальной бумаги «Красная лента» или центрифугированием при 10000 об/мин в течении 10 мин. Исходный титр концентрата составлял - 1×10 КОЕ/г, после хранения в течение 4 месяцев при температуре Т=4-6°С титр 1×10 КОЕ/г.
9-10
6-7
Для получения сухой формы препарата концентрат культуральной жидкости гриба высушивали при Т=50±5°С. Сухой препарат представляет собой порошок с неоднородной (комковатой) консистенцией и титром 1×10 КОЕ/г, после хранения в течение 11 месяцев при Т=4-6°С титр 1×10 КОЕ/г.
3
8
Для получения сухого препарата на носителе использовали пивную дробину в качестве сельскохозяйственно приемлемого носителя. Культуральную жидкость смешивали с пивной дробиной, предварительно высушенной при температуре Т=50-105°С, при соотношении компонентов 0,3-1:1-10 и затем высушивали полученную смесь. При использовании концентрата культуральной жидкости возможно разбавление водой или фильтратом для равномерного распределения и фиксации биомассы на носителе. Получение препарата на носителе может дополнительно включать твердофазное культивирование в течение 2-5 суток с последующим высушиванием полученной смеси. КОЕ/г сухой формы препарата на носителе 10-10, в зависимости от использованной формы культуральной жидкости, а также от длительности твердофазной ферментации.
Характеристика различных форм биопестицидного препарата на основе штамма Beauveria bassiana (ВКПМ F-145), полученных предлагаемым способом.
Пример 5. Токсигенность жидкой формы препарата в отношении типичного вида почвенных нематод.
Нематоцидную активность токсинов, содержащихся в культуральной жидкости штамма В. bassiana, определяли по отношению к свободноживущим бактериотрофным нематодам семейства Rhabditidae, выращенных на газоне 3-суточной культуры бактерий Escherichia coli М-17-02 (ВКПМ В-8208). Использовали накопительную культуру - нативную культуральную жидкость (без разведения) и при разведении водопроводной водой в соотношении 1:100, в повторности проб которых вносили одинаковое количество нематод. Результаты сведены в Таблицу 3.
Пример 6. Патогенность сухой формы препарата.
Энтомопатогенную активность сухой формы биопрепарата на основе штамма В. bassiana определяли по продолжительности жизни тест-объекта - мушек Drosophila melanogaster. Высушенную биомассу гриба равным весовым количеством вносили во флаконы для последующего инфицирования насекомых. Результаты сведены в Таблицу 4.
Пример 7. Жизнеспособность сухой формы препарата на носителе.
Стадия сушки после смешивания биомассы и носителя существенно снижает исходный титр спор культуральной жидкости. Для определения жизнеспособности сухой формы препарата на носителе использовали предварительно высушенную при температуре 50-105°С и нативную (без обработки, влажностью 65-75%) пивную дробину (фракции 0,3-1,2 см), а также предобработанные древесные опилки хвойных пород (опилки обессмолены спиртотолуольной смесью, обработаны щелочным гидролизом, промыты водой до нейтрального рН и высушены при Т=105°С, фракции 0,1-1,2 см). Смешивание биомассы с носителем провели, используя культуральную жидкость, полученную на пивной барде с молочной сывороткой и дизтопливом. После смешивания биомассы культуральной жидкости и носителя провели высушивание при Т=50±5°С. Затем провели твердофазное культивирование, для чего отобрали одинаковое количество полученных препаратов на носителе и внесли в емкости, затем увлажнили стерильной дистиллированной водой. Наблюдения (5 суток при влажности не менее 60% и температуре 20±5°С) показали степень восстановления и жизнеспособности высушенной мицелиальной массы на лигноуглеводном субстрате. Результаты сведены в Таблицу 5.
Таким образом, предложенный способ получения препарата обеспечивает высокий титр жизнеспособных инфекционных единиц (КОЕ/мл) и биомассы в различных формах препарата, прежде всего вследствие выращивания на питательной среде оптимального состава для получения зрелой культуры энтомопатогенного гриба, при этом упрощен и сокращен весь цикл получения препарата за счет периодов жидкофазного и необязательного твердофазного культивирования в отличие от прототипа. На этапе культивирования внесение индукторов (Твин-80 или дизтоплива) обеспечивает интенсификацию процесса спороношения энтомопатогенного гриба, а также продуцирование токсинов и комплекса ферментов, в том числе и целлюлозолитических, для успешной адаптации и размножения на твердом носителе, так как известно, что резкая смена субстрата для всех живых организмов приводит к стрессу, задержке в развитии и даже к гибели. Предобработка носителя (древесные опилки) по прототипу повышает реакционную способность субстрата, но не способствует активному росту гриба на нем. Использование высушенной пивной дробины обеспечивает сохранение исходно содержащихся в ней питательных компонентов, а также легкость и равномерность распределения биоагента при получении препарата и при последующем его использовании. Носитель является одновременно и дополнительным источником питания (биоразлагаемый субстрат для микробиоты, компонент-удобрение для растений, структуратор почвы), а также носителем компонентов культуральной жидкости - прежде всего споросодержащей биомассы, экзоферментов и токсинов, способствующих повышению активности препарата по отношению к насекомым и к почвенным вредителям растений, а также является носителем остаточного белка и компонентов питательной среды как кормового аттрактанта, обеспечивающего привлечение вредителей за счет их повышенной чувствительности к аминокислотам. Способ получения различных форм биопестицидного препарата обеспечивает высокую активность, жизнеспособность, сохранность спор и мицелия, биосинтез собственных токсинов и комплекса ферментов помимо тех ферментов, которые эволюционно составляют инфективность энтомопатогенных грибов, а также расширяет спектр возможностей и условий применения препарата против различных вредителей растений.