СПОСОБ МАНИПУЛИРОВАНИЯ И СОРТИРОВКИ ОБЪЕКТОВ РАЗЛИЧНОЙ ПРИРОДЫ, МИКРОННОГО И СУБМИКРОННОГО МАСШТАБА В МИКРОФЛЮИДНЫХ СИСТЕМАХ ПРИ ПОМОЩИ ГРАДИЕНТОВ КОНЦЕНТРАЦИИ ПАРАМАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ
METHOD OF MANIPULATING AND SORTING OBJECTS OF VARIOUS NATURE, MICRON AND SUBMICRON SCALE IN MICROFLUID SYSTEMS BY MEANS OF GRADIENTS OF CONCENTRATION OF PARAMAGNETIC NANOPARTICLES

Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к области микрофлюидных технологий и аналитической сепарации биологических объектов (клеток, биофункциональных микрочастиц), может быть использовано для лабораторных и медицинских исследований и касается способов создания направленной диффузии бесконтактными методами.
Уровень техники.
На протяжении последних лет во всем мире отмечается значительный рост количества работ, посвященных созданию микрофлюидных систем. Точный контроль ламинарных потоков в микрофлюидных каналах позволяет манипулировать крайне малыми объемами биологических и химических образцов [1].
В связи с этим ставятся задачи по разработке новых методов создания локальных потоков и направленной диффузии различных объектов в системах каналов с характерным масштабом порядка нескольких десятков микрон. Один из способов основан на магнитных эффектах. Несомненными преимуществами магнитных полей перед другими физическими воздействиями является то, что биологические ткани и клетки в значительной степени проницаемы и слабо чувствительны к воздействию магнитного поля. Однако по этим же причинам применение магнитных методов манипулирования осложняется из-за необходимости добавления в систему компонентов, обладающих достаточной магнитной восприимчивостью, но не влияющих на другие процессы, происходящие с исследуемыми объектами.
До настоящего времени для осуществления манипулирования объектами в микрофлюидных системах при помощи магнитных полей применялись контактные методы, связанные с присоединением к целевым объектам парамагнитных наночастиц [2].
В разработке Yellen В.В. et al. [3] (ближайший аналог) был предложен бесконтактный способ магнитного манипулирования, основанный на вытеснении диамагнитных объектов, помещенных в среду с постоянной положительной магнитной восприимчивостью, из градиента магнитного поля. Для создания такой непрерывной среды использовалась феррофлюидная жидкость, содержащая парамагнитные наночастицы диаметром порядка 10 нм. В качестве объектов манипулирования использовались различные полимерные частицы размером от 90 нм до 5 мкм. Использование такой системы для манипулирования живыми клетками не исследовалось и не представляется возможным из-за свойств феррофлюида.
Техническим результатом заявленного способа является бесконтактное манипулирование, концентрирование или аналитическая сепарация биологических объектов (в том числе биофункциональных микрочастиц, клеток) при помощи магнитных полей.
Технический результат достигается способом, основанным на эффекте вытеснения объектов из градиента концентрации парамагнитных наночастиц. При этом исследуемый образец смешивают с коллоидным раствором парамагнитных наночастиц и помещают во внешнее магнитное поле. Под действием магнитной силы наночастицы движутся по направлению градиента поля (к источнику поля), за счет чего возникает градиент концентрации. Объекты манипулирования вытесняются из созданного таким образом градиента, при этом возникает их направленная диффузия от источника магнитного поля (против градиента магнитного поля).
Суть предложенного способа - использование коллоидных растворов парамагнитных наночастиц для создания в них градиентов концентрации, вызывающих направленную диффузию объектов манипуляций.
2
4
2
4
2
12
В данном изобретении мы использовали парамагнитные наночастицы CoFeO[4,5]. Выделенная из исходной смеси фракция диаметром ~16 нм обладает достаточной магнитной восприимчивостью, чтобы в магнитных полях порядка 0,5 Тл противостоять тепловому броуновскому движению. На фигуре 1 приведены снимки и характеризация данных наночастиц с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ). Кроме того, так как предполагается использование наночастиц CoFeO для манипулирования бактериальными клетками, с помощью серии разведений, проводилась оценка количества жизнеспособных колоний в зависимости от присутствия наночастиц в суспензии клеток. Трансформированные клетки E.coli, штамм BL21 DE3, несущие плазмиду pET-22min-GFP-l, растили в минимальной жидкой среде с добавлением Изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) концентрацией 1 mM и антибиотиков до оптической плотности плотности OD (600nm)=0,6. Затем клетки смешивали с наночастицами, после чего была приготовлена серия разведений от 1:10 до 1:10 для каждого типа соответственно: клетки без наночастиц в качестве контроля, смесь, содержащая наночастицы. Полученные разведения были высажены на чашки Петри с минимальной средой и оставлены в термостате на 24 часа при 37°C до получения видимых колоний.
В результате подсчета колоний были получены следующие данные:
9
- в случае суспензии без наночастиц число жизнеспособных клеток составило 2,57·10КОЕ/мл;
9
- в случае суспензии, содержащей наночастицы, число жизнеспособных клеток составило 2·10КОЕ/мл.
При этом было показано, что клетки флуоресцируют в ультрафиолете. Таким образом, можно сделать вывод, что присутствие наночастиц в клеточной суспензии не влияет на жизнеспособность культуры.
<mrow><msub><mover accent="true"><mi>m</mi><mo>→</mo></mover><mi>p</mi></msub></mrow>
<mover accent="true"><mi>H</mi><mo>→</mo></mover>
Теоретическое описание эффекта вытеснения диамагнитных объектов из градиента концентрации парамагнитных наночастиц находит объяснение в терминах общей и теоретической физики. Все формулы приведены в размерности СИ. Сила, действующая на наночастицу с магнитным моментом
во внешнем поле
, задается уравнением (1) [6]:
Для теоретических оценок внешнего поля (поля постоянного магнита или катушки) используется дипольное приближение (2):
<mrow><msub><mover accent="true"><mi>m</mi><mo>→</mo></mover><mn>0</mn></msub></mrow>
где
- магнитный момент источника поля. Так как частицы являются парамагнетиками, их магнитный момент связан с внешним полем по линейному закону. Кроме того, следует учесть, что частицы находятся в жидкости, которая также имеет коэффициент магнитной восприимчивости, отличный от нуля. Таким образом, магнитная энергия парамагнитной частицы, находящейся в жидкости, задается соотношением (3):
<mrow />
ƒ
p
где
χ, χ - магнитная восприимчивость жидкости и магнитная восприимчивость наночатицы соответственно, отнесенные к единице объема. Здесь выполнен переход для расчета движения частицы в одномерном случае - по направлению дипольного момента источника поля. Подставляя (2) в (3) и дифференцируя все по R, получаем окончательное выражение для силы, действующей на парамагнитную наночастицу в жидкости (4):
m
c
Решим теперь уравнение диффузии для парамагнитных наночастиц во внешнем поле [7]. Кроме силы со стороны магнитного поля F (4) на частицу действует сила вязкого трения Стокса F (5) в приближении, что частица имеет сферическую форму:
p
c
m
где η - динамическая вязкость жидкости, r - радиус частицы, v - скорость частицы. В стационарных условиях силы F и F уравновешиваются, отсюда, приравняв (4) и (5), найдем скорость частицы (6):
m
Таким образом, частицы образуют поток j (7), обусловленный действием магнитной силы, равный числу частиц, пересекающих в единицу времени единичную площадку, расположенную перпендикулярно вектору силы:
d
где n - концентрация частиц. В результате такого движения частиц из-за ограниченности канала (наличия стенок) возникает градиент концентрации, приводящий в свою очередь к возникновению диффузионного потока частиц j, описываемого законом Фика (8):
где D - коэффициент диффузии частиц. Для сферических частиц коэффициент диффузии D можно оценить по формуле Стокса - Эйнштейна (9):
В равновесном состоянии потоки (7) и (8) должны уравновешивать друг друга, откуда следует (10):
здесь для сокращения записи введено обозначение (11):
Интегрируя (10) по длине (или ширине - в зависимости от расположения магнита) канала с некоторыми граничными условиями, получаем соотношение для зависимости концентрации парамагнитных наночастиц от расстояния до источника поля (12):
0
0
0
здесь R - расстояние от источника поля до ближайшей к нему стенки канала, n-концентрация у этой стенки в равновесии. Граничное условие n может быть найдено из условия постоянства полного числа частиц в закрытом (изолированном) канале (13):
t
t
p
p
1
2
где N и V - полное число частиц в канале и общий объем канала соответственно. Полученная зависимость изображена на фигуре 2. Решим теперь уравнение для диффузии микрообъектов в градиенте концентрации парамагнитных наночастиц. Приведем выкладки для оценки силы, действующей на цилиндр, ось которого расположена по направлению градиента концентрации наночастиц. Цилиндр является приближением формы бактерии E.coli. На фигуре 3 приведена поясняющая иллюстрация. Здесь выполнен переход к плотности ρ=n·m суспензии парамагнитных наночастиц, где m - масса одной наночастицы, и давлению Р частиц на торцы цилиндра. Тогда давления P и Pбудут задаваться выражениями (14):
1
2
здесь  Подставляя в (14) выражения для концентрации наночастиц и магнитной силы (12) и (4) и вычитая Р-Р, получим выражение для оценки силы, действующей на бактерию (15):
где Δh - длина бактерии. Приравняв эту силу к силе вязкого трения (также, как и в случае с наночастицами) можно найти стационарную скорость вытеснения бактерии из градиента концентрации парамагнитных наночастиц. Кроме того, при больших концентрациях всплывающих объектов нужно учитывать диффузионный поток по закону Фика, также как это было проделано для парамагнитных наночастиц.
Раскрытие изобретения.
4
6
2
4
Одно из применений эффекта вытеснения диамагнитных объектов из градиента концентрации парамагнитных наночастиц в микрофлюидных устройствах может заключаться в повышении локальной концентрации объектов у той или иной стенки микрофлюидного канала, например, для контакта с модифицированными участками поверхности. Для этого раствор с целевыми объектами смешивают с суспензией парамагнитных наночастиц в соотношении 10÷10 наночастиц CoFeO на один объект манипуляций. Далее смесь вводят в микрофлюидную систему. При поднесении к системе магнита возникает локальное повышение концентрации целевых объектов у противоположной от магнита стенки канала (фигура 4).
Устройство на фигуре 5 предназначено для сортировки исходной смеси по размерам входящих в нее компонентов. Вначале в микрофлюидную систему вводят суспензию парамагнитных наночастиц. С помощью магнита создается и удерживается градиент их концентрации. Затем в систему вводят смесь, требующую сортировки. С помощью какого-либо внешнего устройства через канал создают поток жидкости в направлении, перпендикулярном градиенту концентрации парамагнитных наночастиц. Объекты разного размера выходят из основного потока на разном расстоянии от точки введения за счет различной скорости их вытеснения из градиента концентрации парамагнитных наночастиц. Таким образом осуществляется сепарация.
Устройство на фигуре 6 предназначено для сортировки объектов исходной смеси по их магнитной восприимчивости. В этой микрофлюидной системе также создается и удерживается градиент концентрации парамагнитных наночастиц. Затем в систему вводят смесь, требующую сортировки. С помощью какого-либо внешнего устройства через канал создают поток жидкости в направлении, перпендикулярном градиенту концентрации парамагнитных наночастиц. Объекты с большей магнитной восприимчивостью (на фигуре обозначены зеленым цветом) глубже погружаются в градиент концентрации наночастиц, уравновешивая силу, притягивающую их к магниту с силой, выталкивающей их из градиента. Объекты же с меньшей магнитной восприимчивостью (на фигуре черного цвета), соответственно погружаются в градиент на меньшую глубину. Таким образом происходит «фокусировка» и сепарация объектов с различной магнитной восприимчивостью на выходе из канала.
Пример реализации изобретения.
2
4
5
В качестве модельных объектов для демонстрации возможностей метода бесконтактного манипулирования на основе эффекта вытеснения из градиента концентрации парамагнитных наночастиц используют лабораторный штамм E.coli без жгутиков. АСМ снимки и характеризация этих образцов приведены на фигуре 7. Микрофлюидную систему собирают при помощи технологии быстрого прототипирования в клеящейся пленке (3М, США). Для детекции движения объектов используют инвертированный иммерсионный микроскоп (ЛОМО, Россия). Схема и фотография установки представлены на фигуре 8. В качестве источника поля используют электромагнит. В микрофлюидную систему вводят смесь парамагнитных наночастиц CoFeO и бактерий в объеме 14 мкл в соотношении ~10 наночастиц на одну бактерию. Далее при помощи цифровой камеры с микроскопа записывают видео, раскадровка которого представлена на фигуре 9. Электромагнит находится справа, размер кадра ~90 мкм. В промежуток времени 0 с-4 с бактерии находятся в свободном броуновском движении; на 4 с включается магнит, что вызывает слабое течение по направлению к магниту из-за активного дрейфа магнитных наночастиц в эту зону; на 13 с выстроившегося градиента наночастиц оказывается достаточно для того, чтобы начать "вытеснять" бактерии от магнита, что и наблюдается начиная с 14 с. Скорость движения бактерий при их вытеснении из градиента концентрации магнитных наночастиц составляет ~15 мкм/с и увеличивается со временем.
2
4
5
Для демонстрации возможностей метода при работе с диамагнитными микрочастицами в качестве модельных объектов используют флуоресцентные латексные микросферы (Life Technologies, FluoSpheres, США). Размер частиц - 200 нм, краситель - флуоресцеинизотиоцианат (FITC). Микрофлюидную систему собирают при помощи технологии быстрого прототипирования в клеящейся пленке (ЗМ, США). Схема микрофлюидной системы представлена на фигуре 10. Для детекции движения объектов используют инвертированный флуоресцентный микроскоп (Nikon, Япония). В качестве источника поля используют постоянный неодимовый магнит (Стандарт Магнит, N42, Россия). В микрофлюидную систему вводят смесь парамагнитных наночастиц CoFeO и флуоресцентных латексных микросфер в объеме 14 мкл в соотношении ~10 наночастиц на одну микросферу. Для создания основного потока используют гидростатический перепад давлений ~2 см. Далее при помощи цифровой камеры микроскопа записывают микрофотографии движения флуоресцентных микросфер в канале, которые представлены на фигуре 11, размер кадра ~500 мкм. На первой микрофотографии заснято движение флуоресцентных микросфер под действием основного потока, созданного гидростатическим перепадом давлений, в отсутствии магнитного поля. На второй микрофотографии заснято движение частиц в основном потоке при наложении магнитного поля. Стрелками показаны направления движения микросфер. Магнит находится справа внизу. Из микрофотографий видно, что диамагнитные микрочастицы латекса вытесняются из градиента концентрации парамагнитных наночастиц. О наличии градиента концентраций парамагнитных наночастиц свидетельствует изменение направления и скорости движения латексных флуоресцентных микрочастиц по мере удаления от магнита.
Литература
[1] Whitesides G. М. // Nature. 2006. V. 442. Р. 368- 373.
[2] Bhagat A.A. S., Bow Н., Hou Н.W., Tan S.J., Han J., Lim С.Т. // Med. Biol. Eng. Comput. 2010. V. 48. P. 999-1014.
[3] Yellen В.В., Hovorka O., Friedman G. // PNAS. 2005. V. 102. P. 8860-8864.
[4] Stan C., Cristescu C.P., Balasoiu M., Duginov V. N., Mamedov T.N. // Prepr. The Joint Inst. for nucl. res. 2012. V. 14. P. 103.
[5] Bica D. // Rom. Rep. Phys. 1995. V. 47. P. 265-272.
[6] Ландау Л.Д., Лифшиц E.M. // Теоретическая физика. Том 2. Теория поля. // М. ФИЗМАТЛИТ. 2003. Р. 138-153.
[7] Ландау Л.Д., Лифшиц Е.М. // Теоретическая физика. Том 6. Гидродинамика. // М. ФИЗМАТЛИТ. 2001. Р. 319-332.