СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ФЕНОТИПИЧЕСКИ НЕВЫРАЖЕННЫХ ФОРМ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ
METHOD OF IDENTIFICATION OF PHENOTYPICALLY UNEXPRESSED FORMS OF POULTRY

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции сельскохозяйственной птицы. Известно, что прогнозировать продуктивные качества птицы возможно, прежде всего, по критерию - порода-линия-кросс (формы). В последнее время некоторые виды птиц, считавшихся ранее дикими, приобрели сельскохозяйственное значение. Но не везде ведется строгий контроль их происхождения. В связи с этим затруднено не только прогнозирование продуктивных качеств, но и селекционная работа. Для успешного проведения последней желательны критерии, позволяющие как можно раньше определить продуктивные качества особи. Так, например, страусы достигают взрослого состояния в 1,5 года. Очевидно, что для контроля правильности направления селекции желательны какие-то критерии, позволяющие более ранее определение продуктивных качеств.
Существуют методы определения происхождения животных и их наследственных качеств, основанные как на непосредственном анализе ДНК, так и на опосредованном - по иммунологическим реакциям. Но оба метода могут быть использованы только в том случае, если известны маркеры (Горбанчук О.Я. Страусы. Киев, 2003). В этом их основной недостаток. Определение по другим показателям, например по продолжительности периода эмбрионального развития, возможно лишь у тех видов животных, у которых выявлена их жесткая взаимосвязь с теми или иными формами, а величина различия достаточно велика.
В качестве прототипа предложен способ определения фенотипически невыраженных форм птиц по содержанию нитро- и нитрозосоединений в амнионе эмбрионов (Титов В.Ю., Варигина Е.С., Фисинин В.И. // Доклады РАСХН, 2007, т.33, №6, с.46-48; Винникова Э.З., Титов В.Ю. Птицеводство, 2008, 12, 33-34). Было показано, что их содержание относительно стабильно в течение всего периода существования амниотического мешка и отрицательно коррелирует со скоростью постэмбрионального роста. Причем разница в содержании нитро- и нитрозосоединений в амнионе быстрорастущих (мясных) и медленнорастущих (яичных) форм достигала двух порядков. Но в пределах одной линии или кросса этот показатель был стабилен (разброс в пределах 15%). Это дает возможность однозначно определить форму птицы, что было успешно применено нами при определении невыраженных форм страуса (Винникова Э.З., Титов В.Ю. Птицеводство, 2008, 12, 33-34). Недостатком способа является то, что очень проблематично взять отбор содержимого амниона, не убивая эмбрион. То есть определение формы родителей проводится ценой гибели какой-то части их потомства. А форму и продуктивные качества еще не родившейся особи определить невозможно - она погибнет после вмешательства.
В предлагаемом изобретении разработан способ определения фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственных птиц, простой для использования и дающий однозначный ответ, но лишенный вышеуказанного недостатка. В основе изобретения лежит обнаруженный нами факт отрицательной корреляции между содержанием нитро- и нитрозосоединений в амнионе и их содержанием в аллантоисе: у быстрорастущих (мясных) форм этот показатель многократно выше, чем у исходных, а также яичных. Технический результат заключается в определении раннего прогнозирования мясной продуктивности фенотипически невыраженных особей, а также для подбора пар в селекционной работе. Кроме того, отбор содержимого аллантоиса (в отличие от содержимого амниона) можно произвести без ущерба для жизнеспособности эмбриона.
Пример конкретного выполнения
Эксперименты проводились на содержимом амниона и аллантоиса эмбрионов птиц, полученных в ООО "Генофонд" (г.Сергиев Посад) - куры, перепела и индейки, в парке птиц "Воробьи" (Калужская область) - страусы. В каждом случае было исследовано от 15 до 30 эмбрионов.
2
В содержимом аллантоиса определялось суммарное содержание нитрата, нитрита, высокомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (то есть высоко- и низкомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (RNO+RNO).
2
Определение содержания RNO+RNO осуществлялось при помощи метода, основанного на способности нитрозосоединений ингибировать фермент каталазу. Он подробно описан в следующих работах: [Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. (2008) Биохимия, 73, 113-118, Titov V. (2008) Current Enzyme Inhibition, 4, 73-81].
2
Порядок определения RNO+RNO и необходимые реактивы
2
4
2
4
40 мМ р-р KHPO (или NaHPO);
1,5 М маточный раствор NaCl;
25 мкМ маточный водный раствор нитрита (натрия либо калия) - для калибровки;
3
30 мМ маточный водный раствор хлорида ванадия (VCl) - восстановитель нитро- соединений в нитрозо-.
Гемолизированные эритроциты коровы, полученные путем разбавления крови дистиллированной водой в 10 раз;
Перекись водорода (3%-ный р-р).
Порядок отбора содержимого аллантоиса
3
Отбор аллантоисной жидкости эмбрионов осуществлялся на заключительной стадии предплодного периода. Прокол скорлупы осуществлялся иглой одноразового шприца объемом 5 см, или аналогичной толщины острым стальным стержнем, или тонким сверлом у яиц с толстой скорлупой. Чем острее игла, тем меньше вероятность образования трещин.
Применение химических средств для размягчения скорлупы (цитрат, ЭДТА), как показал наш опыт, приводит к ее истончению, что влечет повышенную хрупкость и как следствие - образование трещин. Оптимальным является механический прокол немодифицированной скорлупы, производимый под прямым углом.
Прокол следует выполнять под овоскопом, чтобы не повредить сосуды аллантоиса, а также амниотическую оболочку и сам эмбрион. Но, к сожалению, в случае яиц с окрашенной скорлупой контроль затруднен. В связи с этим следует соблюдать следующие условия:
- прокол осуществлять с тупого конца (но не через пугу), иглу шприца погружать на глубину не более 1 см;
- максимальный объем отбираемой пробы - не более 500 мкл;
2
- репарацию поврежденной скорлупы осуществлять путем замазки отверстия белком, закрытия яичной скорлупой. Сверху для удержания последней желательно приклеить сегмент скотча (площадь не более 1 см).
Порядок проведения анализа
1. Определяется активность каталазы в реакционной среде, содержащей 40 мМ фосфатного буфера, рН 6,0, 150 мМ NaCl, 9 нМ фирменного препарата каталазы, либо гемолизированные эритроциты коровы (можно другого млекопитающего) - 100 мкМ гемоглобина по гемм-группе, содержащие эндогенную каталазу. Это контрольный образец.
2. Проводится калибровка. Определяется активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 125, 250 и 500 нМ нитрита.
3
2
3. Образец аллантоисной жидкости (200 мкл) инкубируется в течение 15 минут с равным объемом 30 мМ р-ра VC1. Затем переносится в основную среду (см п.1). Суммарное содержание RNO+RNO определяется по степени снижения активности каталазы в соответствии с калибровкой (см. п.2).
Активность каталазы определяется любым известным методом, не требующим использования перекиси водорода в концентрации более 9 мМ.
Установлено, что линии и кроссы птиц, отличающиеся высокой скоростью прироста живой массы, содержат в амниотической жидкости многократно меньше нитро- и нитрозосоединений, чем исходные и яичные формы (Титов В.Ю., Варигина B.C., Фисинин В.И. // Доклады РАСХН, 2007, т.33, №6, с.46-48), а в аллантоисе - многократно большие (таблицы 1, 2). Причем имеет место отрицательная корреляция между содержанием нитро- и нитрозосоединений в амнионе и в аллантоисе (таблица 2).
Анализ содержимого аллантоиса указанных в таблице 2 пород, линий и кроссов показал, что все формы кур, перепелов, индеек и страусов, считающиеся мясными, содержат многократно большую концентрацию нитро- и нитрозосоединений, чем исходные и яичные - сотни и тысячи микромоль против десятков соответственно (таблицы 1, 2). Причем если содержание нитро- и нитрозосоединений в амнионе относительно стабильно (Титов В.Ю., Винникова Э.З., Фисинин В.И., Близнецова Г.Н., Рецкий М.И. Доклады РАСХН, 2008, №4, 44-45), то в аллантоисе происходит их накопление по мере развития эмбриона. Наивысшая их концентрация регистрируется в конце предплодного периода (таблица 1). Поэтому отбор содержимого аллантоиса желательно производить на этом этапе эмбрионального развития.
x
1. Изменение состава метаболитов NO в аллантоисе эмбрионов кур быстрорастущего мясного кросса Смена-7 и медленнорастущего яичного Радонеж с момента окончательного формирования зародыша (7 суток) до заключительной стадии предплодного периода (16 суток) (Х±m).
Таблица 1
Срок инкубации (сутки)
Суммарное содержание RNO+RNO<sub>2</sub>, мкМ
Кросс Смена-7 (быстрорастущий, мясной)
7
210,0±50,0
11
200,0±40,0
16
580,0±90
Кросс Радонеж (медленнорастущий, яичный)
7
42,0±19,0
11
37,0±10,0
16
52,0±20,0
2
2
У кур в аллантоисе эмбрионов мясных форм содержание RNO+RNO к концу предплодного периода достигало 500-600 мкМ (Г6, Смена 7, мини №5), что на порядок выше, чем у яичных (Радонеж) и мясо-яичных (Г8). Промежуточное положение по содержанию RNO+RNO как в аллантоисе, так и в амнионе занимают мини-яичные формы. Известно, что скорость роста у них несколько выше, чем у обычных яичных. Но мини-мясная форма (№5) имела более высокий показатель содержания нитро- и нитрозосоединений в аллантоисе, чем яичные (П-11, плимутрок с геном карликовости). Аналогичные закономерности выявлены у перепелов и индюков, а также страусов (таблица 2).
x
2. Содержание метаболитов NO в амнионе и в аллантоисе эмбрионов ряда видов птиц на заключительной стадии предплодного периода: куры - 16, перепела - 12, индейки - 21, страусы - 30 сутки (X±m).
Таблица 2
Породы, линии, кроссы
RNO+RNO<sub>2</sub>, мкМ
амнион
аллантоис
КУРЫ
Радонеж (яичый кросс)
5500±1500
52±20
Г8 (родительская форма мясного кросса Смена 7, мясо-яичная)
5000±500
80,0±35,0
П-11 - мини-яичные
1500±250
195±40
Плимутрок с привитьм геном карликовости (мясо-яичная)
850±200
280±60
Мини-мясные №5
60±20
490±60
Г6 (родительская форма мясного кросса Смена 7)
35,0±9,0
680±150
Кросс Смена-7 (мясной)
30±10
580±90
ПЕРЕПЕЛА (породы)
Японская серая (яичная)
5500±1000
50±20
Эстонская (мясо-яичная)
50±10
220±50
Фараон (мясная)
100±50
240±50
ИНДЕЙКИ (линии кросса BUT-8)
В-5 (легкая)
5200±500
50±20
В-1 (тяжелая)
50±20
950±200
В-8 (тяжелая)
70±30
950±200
СТРАУСЫ (подвиды)
Черношеий (Ч)
75000±20000
530±120
Голубошеий (Г)
70000±23000
540±100
Потомство Ч×Г
7000±1500
5000±1000
В таблице 3 представлены факты идентификации фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание нитро- и нитрозосоединений в аллантоисе. Тест во всех случаях давал однозначные ответы.
3. Определение фенотопически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание метаболитов NO в аллантонсе.
Таблица 3
Самец
Самка
Содержание RNO+RNO<sub>2</sub> в амнионе, мкМ
Вывод
№
Формы
№
Формы
1
Черношеий
1
невыражена
500
Самка черношеяя
2
Голубошеий
2
невыражена
4800
Самка черношеяя
2
Голубошеий
3
невыражена
450
Самка голубошеяя
3
Черношеий
4
невыражена
5100
Самка голубошеяя
3
Черношеий
5
невыражена
4600
Самка голубошеяя
3
Черношеий
6
невыражена
520
Самка черношеяя