Миелоидные дендритные клетки как объект исследований в инфекционной иммунологии

A

УДК 616/9-097:578.24

миелоидные дендритные клетки как объект исследований в инфекционной иммунологии

в.Ю. Талаев, М.Э. Цатуров, А.в. Матвеичев, М.в. Талаева, О.Н. Бабайкина, М.А. Ломунова,

И.Е. Заиченко, ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад.

И.Н. Блохиной Роспотребнадзора»

Талаев Владимир Юрьевич - раб. тел.: (831) 434-24-82.

В литературном обзоре кратко описаны свойства миелоидных дендритных клеток, охарактеризована их роль в процессе развития иммунного ответа на инфекцию или вакцину, отмечена необходимость исследования дендритных клеток с целью оптимизации средств профилактики инфекционных заболеваний. Обзор иллюстрирован результатами собственных исследований.

Ключевые слова: миелоидные дендритные клетки, Т-лимфоциты, цитокины,

фагоциты, рецепторы, экспрессия, паттерны.

Qualities of myeloid dendritic cells are described in brief in this review, their role in the process of development of immune answer to infection or vaccine is characterized. The necessity of the dendritic cells research aiming at optimization of prophylaxis of infectious diseases is showed. The review is illustrated with the results of our own research.

Key words: myeloid dendritic cells, T-lymphocyte, cytokine, phagocyte, receptor, expression, patterns.

Обязательным условием эффективной защиты нашего организма от множества инфекционных агентов является способность иммунной системы отличать чужеродные структуры от молекул собственного организма. Долгое время считалось, что эта функция различения «своего» и «чужого» осуществляется исключительно лимфоцитами. Роль анти-генпрезентирующих клеток при этом сводилась лишь к сбору и частичному ферментативному разрушению всего доступного для фагоцитоза материала, а затем пассивному пред-ставлениию полученной смеси Т-лимфоцитам - клеткам, в функцию которых входит поиск чужеродных молекул - антигенов. Однако представления об антигенпрезентирующих клетках, как о второстепенных и вспомогательных клетках иммунной системы, были принципиально пересмотрены после новых важнейших открытий. Первым из этих открытий было обнаружение уникальной системы распознавания «чужого», свойственной антигенпрезентирующим клеткам.

Основным элементом этой системы поиска «чужого» является ограниченное количество рецепторов, имеющих сродство к целым группам молекул, характерным только для микроорганизмов [1, 2]. Эти типичные для микроорганизмов молекулы получили название молекулярных паттернов патогенов. К ним относятся липополисахариды, пептидогликаны, фла-геллин, двухспиральная вирусная РНК, бактериальная ДНК, обогащенная CpG-последовательностями, и др. Дальнейшие исследования показали, что распознавание различных паттернов патогенов наиболее активными антигенпрезентирую-щими клетками - дендритными клетками (ДК) запускает продукцию различных наборов цитокинов, что в последующем определяет различия процесса дифференцировки распознавших антиген Т-лимфоцитов. В свою очередь, от направления функциональной дифференцировки Т-лимфоцитов будет зависеть тип иммунного ответа на антиген - пойдет ли он по пути продукции антител или по пути

РАЗДЕЛ I

РАЗДЕЛ I

стимуляции клеточных иммунных реакции [3, 4].

Таким образом, по современным представлениям распознавание инфекционных агентов иммунной системой осуществляется в несколько этапов с использованием двух принципиально различных систем поиска «чужого». Первичное распознавание осуществляется с помощью паттерн-распознающих рецепторов ДК, способных связывать весьма ограниченное количество наиболее типичных для микроорганизмов молекул. При обнаружении признаков инфекции в иммунный ответ вовлекаются Т-лимфоциты, способные с помощью своих антигенраспознающих рецепторов обнаружить практически любую макромолекулу, отличающуюся от молекул собственного организма. При этом характер иммунного ответа зависит от результата работы обоих систем поиска инфекционных агентов.

Разберем работу ДК при поиске инфекции, используя данные литературы и результаты собственных исследований. Как уже было сказано выше, ДК являются наиболее эффективными антигенпрезентирующими клетками, критически необходимыми для индукции первичного иммунного ответа на подавляющее большинство антигенов. ДК обнаружены во всех тканях организма человека за исключением иммунологически привилегированных зон центральной нервной системы, яичек и семенников. Наиболее богаты этими клетками барьерные ткани - кожа и слизистые оболочки. Популяция ДК не однородна. Отдельные группы ДК представляют собой различные стадии созревания и различные линии их дифференцировки [5]. Общим предшественником ДК являются CD34+ кроветворные предшественники, однако потомки этих клеток, вставшие на путь созревания моноцитов или лимфоцитов, могут долго сохранять способность превращаться в ДК. Созревание ДК из предшественников до стадии так называемых незрелых ДК осуществляется в местах их первичной тканевой локализации. В эпидермисе из предшественников миелоидного ряда кроветворения созревают клетки Лангерганса кожи. В соединительнотканных слоях кожи и слизистых из миелоидных предшественников и моноцитов крови созревают типичные миело-идные ДК. В микроокружении лимфоидных органов в основном созревают плазмацитоидные ДК. Стимуляторами образования незрелых ДК являются цитокины, которые продуцируются в зоне их первичной локализации. Исследовать процесс созревания ДК in situ чрезвычайно сложно, поэтому ученые вынуждены моделировать условия их созревания in vitro. Так, для получения миелоидных ДК из CD34+ предшественников используют одно- или двухстадийную стимуляцию сложной смесью цитокинов (фактор стволовых клеток, F^^raKA, трансформирующий фактор роста-b,

гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и интерлейкин-4 (ИЛ-4)). Однако чаще всего в качестве предшественников типичных миелоидных ДК используют моноциты периферической крови.

Стимуляция этих клеток смесью ИЛ-4 и ГМ-КСФ уже ко вторым суткам культивирования приводит к характерным для ДК изменениям морфологии клеток и экспрессии мембранных молекул. Увеличение срока культивирования до 5-7 суток приводит к формированию типичного фенотипа ДК, характеризующегося отсутствием моноцитарного маркера CD14, экспрессией молекул HLA-DR и CD86, появлением CD83 на части клеток. В культуре ДК обычно собраны в кластеры и выглядят как крупные округлые клетки с полулунным ядром и тонкими отростками на поверхности (рис. 1).

РИС. 1.

А: микрофотография культуры дендритных клеток, полученных из моноцитов крови культивированием с ИЛ-4 и ГМ-КСФ. Б: микрофотография дендритной клетки. Молекулы HLA-DR на мембране клетки окрашены с помощью моноклональных антител и иммуноферментного Набора LSAB2 (Dako).

Основной функцией незрелых ДК является поглощение и процессинг доступных им антигенов [3, 4]. Эти клетки являются активными фагоцитами, снабженными широким набором рецепторов, повышающих эффективность и специфичность фагоцитоза. Кроме того, существенную часть антигенного материала ДК получают за счет пиноцитоза. Материал, поглощаемый ДК, разнообразен. В условиях отсутствия инфекции ДК поглощают макромолекулы межклеточной жидкости, разрушенный внеклеточный матрикс, фрагменты клеток, погибших от апоптоза в результате естественных процессов обновления клеточных популяций. Сбор «молекулярного мусора» продолжается до тех пор, пока ДК не обнаружит признаки присутствия инфекции с помощью особых паттерн-распознающих рецепторов -толл-подобных рецепторов, расположенных на мембране ДК и внутри нее, а также NOD-белков, расположенных только в цитоплазме [1]. Распознавание этими рецепторами паттернов патогенов свидетельствует о том, что ДК среди разнообразного «мусора» поглотила заведомо чужеродный потенциально опасный объект. Сигнал, полученный через толл-подобный рецептор, запускает процесс функционального созревания ДК. В результате клетка лишается способности поглощать антигены, покидает место своей первичной локализации и мигрирует в региональный лимфатический узел. При этом на мембране ДК увеличивается количество молекул главного комплекса гистосовместимости для представления собранных антигенов Т-лимфоцитам, а также усиливается экспрессия костимулирующих молекул CD80, CD83, CD86, необходимых для дополнительной стимуляции Т-клеток. Аналогичные изменения экспрессии мембранных молекул происходят in vitro при стимуляции незрелых ДК паттернами патогенов (рис. 2).

Зрелые ДК, мигрировавшие в лимфатический узел, встраиваются в состав пространственной сетки, образованной другими ДК, и вступают в контакты с проходящими через лимфатический узел Т-лимфоцитами. При контакте с Т-клеткой, специфичной к одному из принесенных чужеродных антигенов, ДК получает последний, необходимый для терминальной дифференцировки сигнал через молекулу CD40, что вызывает дополнительное усиление экспрессии костимулирующих молекул CD80 и CD86 и активирует продукцию цитокинов, необходимых для дифференцировки активированной антигеном Т-клетки. В свою очередь Т-лимфоцит, распознавший презентируемый антиген, получает мощный активирующий сигнал через Т-клеточный антигенраспознающий рецептор и рецептор костимулирую-щего сигнала СР28, что ведет к вовлечению Т-клетки в процесс размножения, а продуцируемые дендритной клетокой цитокины определят направление дифференцировки активированной Т-клетки [3, 4]. Необходимо отметить, что состав этих цитокинов зависит, в частности, от того, какой из толл-подобных рецепторов вызвал созревание ДК, иными словами от того, какой паттерн патогена запустил весь описанный выше процесс. Так, миелоидные ДК, стимулированные вирусными паттернами (например, двухцепочечной

РНК), превращаются в мощные продуценты ИЛ-12р70. Наивный CD4+ Т-лимфоцит, распознавший антиген, принесенный этой ДК, созреет в Т-хелпер первого типа и запустит адаптивный иммунный ответ клеточного типа, необходимый для эрадикации вирусной инфекции. В то же время, ДК, стимулированные определенными бактериальными паттернами, будут слабее продуцировать ИЛ-12 и сильнее ИЛ-10. Результатом их контакта с Т-лимфоцитом может стать превращение наивного CD4+ Т-лимфоцита в Т-хелпер второго типа - стимулятор продукции антител.

Следует отметить, что отдельные группы ДК, представляя антиген Т-лимфоцитам, не запускают протективный иммунный ответ, а индуцируют иммунологическую толерантность за счет стимуляции регуляторных Т-клеток с супрессорными свойствами и устранения «обычных», иммунных антигенспецифических Т-лимфоцитов [6, 7, 8]. Способность индуцировать толерантность связывают с незрелыми ДК, не контактировавшими с паттернами патогенов. Стабилизировать толерогенные свойства незрелых ДК могут регуляторные Т-лимфоциты, а также медиаторы с противовоспалительной активностью (ИЛ-10, трансформирующий фактор роста-р, гранулоцитарный КСФ, фактор роста гепатоцитов, вазоактивный кишечный пептид,

РИС. 2.

Верхний ряд: экспрессия молекулы главного комплекса гистосовместимости HLA-DR и отсутствие CD14 на зрелых ДК, полученных из моноцитов с помощью стимуляции ИЛ-4 и ГМ-КСФ с последующей активацией ЛПСSalmonella typhi (слева). Моноциты, росшие 9 суток без стимуляторов сохраняют CD14 и имеют меньшую плотность экспрессии HLA-DR (справа). Нижний ряд: зрелые ДК имеют высокий уровень экспрессии CD80, CD83 и CD86 (жирная сплошная линия) по сравнению с моноцитами (закрашенная гистограмма). Тонкая линия - изотипический контроль окрашивания. Названия исследуемых маркеров - у соотв. осей графиков. Результат цитометрического анализа.

РАЗДЕЛ I

РАЗДЕЛ I

глюкокортикоиды) и некоторые химические соединения (метаболиты витамина D3, циклоспорин А, рапамицин, аспирин). Поскольку условием сохранения толерогенных свойств ДК является отсутствие контактов с паттернами патогенов, представляется вероятным, что толерогенные ДК презентируют в основном антигены собственного организма и участвуют в предотвращении аутоиммунных реакций.

Многообразие функций ДК не исчерпывается презентацией антигенов и регуляцией адаптивного иммунного ответа. ДК участвуют в важнейших для формирования иммунной системы процессах тимической селекции и Т-клеточного гомеостаза [9]. Кроме того, ДК участвуют в реакциях врожденного иммунитета. В частности, предшественники плаз-мацитоидных ДК являются важнейшими продуцентами интерферонов первого типа [3].

Таким образом, ДК в зависимости от тканевой локализации, стадии созревания и, что чрезвычайно важно, в зависимости от условий активации способны выполнять разнообразные функции. Так, зрелые ДК, активированные паттернами патогенов, способны эффективно вовлекать Т-лимфоциты в иммунный ответ. При этом Т-лимфоциты получают от ДК инструкцию к определенному пути созревания, в зависимости от состава паттернов, активировавших ДК. Незрелые ДК, не контактировавшие с паттернами патогенов, являются слабыми индукторами иммунного ответа, а при определенных обстоятельствах могут индуцировать иммунологическую толерантность -специфическую неотвечаемость на антиген. Эти положения становятся чрезвычайно актуальными при разработке новых вакцин, особенно вакцин, основанных на рекомбинантных антигенах. Вакцины, представляющие собой убитые или живые аттенуированные микроорганизмы, имеют не только богатый антигенный состав, но и полноценный набор молекулярных паттернов патогенов. Введение таких вакцин в организм человека вызывает реакцию иммунной системы, весьма точно моделирующую развитие иммунного ответа на инфекцию, начиная с процесса дифферен-цировки поглотивших вакцину ДК. Процесс взаимодействия ДК с вакциной можно исследовать в эксперименте in vitro. Рис. 3 иллюстрирует функциональное созревание ДК после поглощения живой вакцины БЦЖ. В результате ДК приобретают способность эффективно стимулировать Т-лимфоциты к размножению и продукции интерферона-g - цитокина, управляющего клеточными формами адаптивного иммунного ответа, важнейшего для защиты от туберкулеза. Не вызывает сомнения, что вакцины, воспроизводящие весь процесс иммунного ответа, обладают значительным протективным действием, однако оборотной стороной точного моделирования иммунного ответа являются нежелательные реакции на введение вакцин. Кроме того свойства некоторых микроорганизмов не позволяют создавать на их основе живые или убитые кор-

пускулярные вакцины. В связи с этим создаются вакцины на основе очищенных, в том числе рекомбинантных, антигенов микроорганизмов. Эти вакцины содержат наиболее иммуногенные антигены, но могут вовсе не содержать молекулярных паттернов патогенов, необходимых для полноценной стимуляции ДК. В связи с этим существует насущная необходимость исследования реакции ДК детей и взрослых на паттерны разнообразных патогенов, на новые вакцины и их потенциальные компоненты, в частности, синтетические лиганды толл-подобных рецепторов. Такие исследования позволят разработать методы корректной оценки действия новых вакцин на созревание ДК и поляризацию иммунного ответа, а в будущем позволят разработать вакцины, не только несущие антигенную информацию, но и направляющие иммунный ответ по пути, наиболее выгодному для защиты от конкретной инфекции.

соотношение ДК и отвечающих лимфоцитов

РИС. 3.

Дозовая зависимость продукции интерферона-g аллогенными лимфоцитами, стимулированными незрелыми ДК и ДК, созревавшими в присутствии ЛПС и фактора некроза опухоли-a или БЦЖ в концентрации 0,0002, 0,002 и 0,2 дозы/мл. По оси Х - соотношение ДК и лимфоцитов. По оси Y - концентрация интерферона-g (пг/мл).

ЛИТЕРАТУРА IZ3

1. Симбирцев А.С. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета. Иммунология, 2005. Т. 26. № 6. С. 368-377.

2. Janeway C. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp.Quant.Biol., 1989. Vol. 54. P. 1-13.

3. Пащенков М. В., Пинегин Б. В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки. Иммунология. 2006. T. 27.

№ 6. С. 368-378.

4. Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Thery C., Amigorena S. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu. Rev. Immunology, 2002. Vol. 20. P. 621-667.

5. Wu L., Dakie A. Development of dendritic cell system. Cell. Mol. Immunol., 2004. Vol. 1. Р. 112-118.

6. Hubert P., Jacobs N., Caberg J.-H., Boniver J., Delvenne P. The cross-talk between dendritic and regulatory Tcells: good or evil? Journal of Leukocyte Biol., 2007. Vol. 82. № 4. P. 787-794.

7. Steinman R. M., Hawiger D., Nussenzweig M. C. Tolerogenic dendritic cells. Annu. Rev. Immunology, 2003. Vol. 21. P. 685-711.

8. Wallet M. A., Sen P., Tisch R. Immunoregulation of Dendritic Cells. Clinical Medicine & Research, 2005. Vol. 3. P. 166-175.

9. Ярилин А.А. Гомеостатические процессы в иммунной системе. Контроль численности лимфоцитов. Иммунология, 2005. Т. 26. № 5. С. 312-319.