Выделение эмбриональных стволовых клеток человека из бластомеров

И I II II

I I I

Новости клеточных технологий

образом, только избыточная экспрессия гена №под обуслов ливала появление ЭСК подобных колоний и репрограммиро вание ядер взрослых клеток. Исследователи заключают, что №под играет значительную и, возможно, доминирующую роль в репрограммировании ядра взрослой соматической клетки до эмбриональной «стадии плюрипотентности».

Таким образом, авторы впервые чётко определили фак тор репрограммирования «взрослого клеточного ядра». Даль нейшая идентификация таких факторов и умение управлять ими может привести к развитию технологии создания соб ственных ЭСК подобных клеточных линий без использования эмбрионов, яйцеклеток и технологии переноса ядра.

Ясно, что №под не единственный «игрок в поле», но, возможно, основной. Уже известно, что плюрипотентное

состояние ЭСК поддерживается взаимодействием основ ных факторов Oct3/4, Nanog, Sox2 и, возможно, рядом дополнительных [5]. Так Yamanaka Shinya из Kyoto University месяц назад доложил о возможности репрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов до ЭСК подобного состояния введением комбинации факторов, включающих Sox2 и Oct3/4 [6]. Возможным механизмом репрограмми рования и плюрипотентности также могут являться белки (Wnt 3) и молекулы мРНК транскрипционных факторов (Oct 4, Rex 1, Nanog, SCL и GATA 2,4), содержащиеся в цитоплазме ЭСК или в мембранных везикулах и поддержива ющих «стволовость» [7]. Будущие работы будут направлены на более тщательное изучение этих факторов в человечес ких клетках.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Rideout W.M. 3rd, Eggan К., Jaenisch R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science 2001; 293: 1093 8.

2. Tada М., Takahama Y., Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr. Biol. 2001; 11: 1553 8.

3. Cowan C.A, Atienza J, Melton DA., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science 2005; 309:1369 73.

4. Chambers I., Colby D, Robertson M. et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 2003; 113:643 55.

5. Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 2005; 122(6): 947 56.

6. Shinya Y. Identification of factors that generate ES like pluripotent cells from fibroblast culture. Oral presentation at 4th ISSR Annual Meeting. June 29 July 1, 2006, Toronto, Canada.

7. Ratajczak J., Wysoczynski М., Hayek F. et al. Embryonic stem cell derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery. Leukemia 2006; 20: 847 56.

Подготовил A.B. Берсенев По материалам Nature 2006; 441(7096): 997-1001

Выделение эмбриональных стволовых клеток человека из бластомеров

Стандартный метод выделения эмбриональных стволо вых клеток человека (ЭСК) из внутренней клеточной массы бластоцисты вызывает ряд этических противоречий, свя занных с разрушением эмбрионов, несмотря на то, что этот материал утилизируется в клиниках искусственного опло дотворения. Чтобы избежать этических проблем, учёные предлагают технологию выделения линий ЭСК из единич ных бластомеров на более ранних стадиях развития чело веческого эмбриона. Так, в прошлом году группа Lanza из компании Advanced Cell Technology (Worcester, MA, USA) опубликовала работу по выделению линий ЭСК из мышиных бластомеров (1). Возможность выделения ЭСК человека из эмбрионов более ранних стадий развития (до бластоцисты) была также показана Н. Стрельченко, однако процедура со провождается разрушением эмбриона (2).

Новая технология выделение ЭСК из единичных бласто меров позиционируется как метод без разрушения эмбрио нов. Техника биопсии бластомера без разрушения эмбриона была отработана уже давно при разработке метода предим плантационной генетической диагностики (PGD) после про цедур экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). При этом было показано, что удаление одного бластомера из ранних эмбрионов (до развития стадии бластоцисты) не имеет ни какого орицательного влияния на последующее развитие зародыша и ребёнка в будущем (3). Результаты новой ра боты группы Lanza , описывающие технику выделения ЭСК из бластомеров человека, опубликованы в он лайн версии журнала Nature.

Исследователи использовали 16 эмбрионов, заморо женных на 8 10 клеточной стадиях в клиниках ЭКО. После

выделения отдельных бластомеров их помещали в среду, оптимальную для культивирования ЭСК. В течение недели исследователи наблюдали деление бластомеров и форми рование колоний ЭСК подобных клеток. Авторам удалось выделить 2 стабильные линии ЭСК. Эти линии демонст рировали все классические признаки плюрипотентности экспрессировали характерные маркёры, давали терато мы в SCID мышах, дифференцировались спонтанно или ин дуцированно в клетки всех 3 х зародышевых листков как in vitro, так и in vivo. Кроме того, эти линии по своим характе ристикам были практически неотличимы от стандартных зарегистрированных линий ЭСК, выделенных из бласто цист, и даже демонстрировали более выраженные признаки плюрипотентности.

Таким образом, авторы работы показали принципиальную возможность выделения стабильных линий ЭСК человека из единичных бластомеров, полученных из 8 10 клеточных эмбрионов, без их разрушения. Исследователи усовершен ствовали технику культивирования бластомеров и индукцию развития из них ЭСК. Более ранние попытки получения ЭСК из бластомеров человека оказывались нереализованными (4, 5].

Несмотря на красивую демонстрацию идеи «выделения ЭСК человека без разрушения эмбрионов», технология не найдёт широкого применения в будущем. Поскольку, как от мечает сам Lanza, она может применяться только у клиентов клиник ЭКО, проходящих процедуру PGD. Однако число та ких женщин и семейных пар крайне невелико, и гарантиро вать женщине донору яйцеклеток получение собственной линии ЭСК будущего ребёнка можно только при совершенной

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006

I I I I I I

I I I

Новости клеточных технологий

технике. Тем не менее, значение работы для научного мира велико, поскольку был реализован совершенно новый под ход. Разработанный метод может найти применение при изучении плюрипотентности в эмбриологии, а также для

получении лучших результатов ЭКО в клинической репро дуктологии. Компания также рекламирует, что в скором времени учёные получат свободный доступ к выделенным линиям для исследований.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Chung Y., Klimanskaya I., Becker S. et al. Embryonic and extraembryonic stem cell lines derived from single mouse blastomeres. Nature 2006; 439: 216 9.

2. Strelchenko N., Verlinsky 0., Kukharenko V., Verlinsky Y. Morula derived human embryonic stem cells. Reprod Biomed Online 2004; 9(6): 623 9.

3. Hardy K., Martin K.L., Leese H. et al. Human preimplantation development in vitro is not adversely affected by biopsy at the 8 cell stage.

Hum. Reprod. 1990; 5: 708 14.

4. Geber S., Winston R.M.L., Handyside A.H. Proliferation of blastomeres from cleavage stage human embryos in vitro: an alternative to blastocyst biopsy for preimplantation diagnosis. Hum. Reprod. 1995; 10: 1492 6.

5. Sills E.S, Takeuchi T, Tanaka N et al. Identification and isolation of embryonic stem cells in reproductive endocrinology: theoretical protocols for conservation of human embryos derived from in vitro fertilization. Theor. Biol. Med. Model. 2005; 2:25.

Подготовил A.B. Берсенев

По материалам Nature advance online publication 23 August 2006; doi:10,1038/nature05142

Выделение мультипотентных прогениторных клеток из фетальной печени человека

Трансплантация гепатоцитов или прогениторных клеток печени для лечения печёночной недостаточности является одним из самых востребованных направлений современной регенеративной медицины. Залогом успеха реализации этих подходов является понимание основных ступеней диффе ренцировки клеток предшественников в функционирующие гепатоциты в процессе эмбрионального развития, а также их характеристика, выделение и размножение в культуре. У грызунов прогениторные клетки печени присутствуют в каналах Геринга [1, 2] и могут дифференцироватья как в гепатоциты, так и в эпителиальные клетки выстилки желчных протоков, но не способны пролиферировать в ответ на повреж дение [3, 4].

К настоящему времени были успешно выделены и до вольно хорошо описаны прогениторные клетки из фетальной печени и эпителиальные клетки из печени взрослых грызунов. Suzuki et al. [5] изолировали из фетальной печени мышей клетки с фенотипом с mer/CD49FVCD29VCD45V CDTER119 , которые были способны к дифференцировке в гепатоциты и клетки желчных протоков, а также в эпители альные клетки поджелудочной железы. Однако выделение мультипотентных клеток из фетальной печени человека и создание их линий гораздо более сложны, и к настоящему времени не было получено постоянной линии таких клеток печени [6].

Недавно группа исследователей из Вашингтонского Уни верситета (Seattle, USA) впервые выделила и описала новую популяцию клеток фетальной печени человека, способных дифференцироваться как в мезенхимальном направлении, так и формировать гепатоциты. Эти клетки были названы фетальными мультипотентными прогениторными клетками печени hFLMPC (hepatic Fetal Liver Multipotent Progenitor Cells).

hFLMPC были выделены из семи фетальных печеней че ловека (74 108 дни гестации), после чего поддерживались в первичной культуре в течение трёх месяцев. Далее от них получали клоны, которые культивировались ещё в течение шести месяцев (100 удвоений популяции, 20 пассажей). Фенотипически hFLMPC представляли собой мелкие клетки с небольшим количеством цитоплазмы, экспрессирующие весьма интересный набор маркёров. Так, hFLMPC были

позитивны по CD34, CD90 (thy 1), с kit и SSFA 4. Эти маркеры характерны для стволовых клеток крови и при сутствуют также на клетках фетальной печени грызунов (7). Также hFLMPC позитивны по эпителиальным маркерам, та ким как ЕРСАМ, СК18 и СК19. СК18 и СК19, являющимися маркерами гепатоцитов и эпителиальных клеток желчных протоков соответственно. Интересно, что hFLMPC также позитивны по мезенхимальным маркерам CD44h и вимен тину, но негативны по другим характерным для мезенхимы поверхностным молекулам, включая CD105, CD73 и 6SMA. Они негативны по гемопоэтическим маркерам CD45 и АС133, позитивны по характерному для гепатоцитов с met, но не экспрессируют других гепато специфичных маркеров, таких, как альбумин, а фетопоэтин и транскрипционных факторов HNF1 а, HNF3P и HNF4p. Таким образом, hFLMPC несут смешанный набор мезодермальных и энтодермаль ных маркеров.

Было установлено, что иммунофенотипические и морфо логические характеристики, а также дифференцировочные потенциалы hFLMPC разных пассажей идентичны. Клетки в культурах после первого, пятого и двадцатого пассажей име ли одинаковую длину теломеров хромосом и не демонстри ровали никаких признаков клеточного старения или «ухода» в апоптоз. Когда исследователи попытались найти в феталь ной печени предшественников hFLMPC, пометив различные субпопуляции печёночных клеток флуоресцентным белком GFP, выяснилось, что ни одна из полученных из них колоний hFLMPC не была позитивна по GFP. hFLMPC оказались совер шенно независимой популяцией клеток фетальной печени, вряд ли связанной с дедифференцированными паренхималь ными гепатоцитами или трансдифференцированными муль типотентными мезенхимальными стромальными клетками костного мозга (ММСК). В различных условиях культиви рования hFLMPC дифференцировались в гепатоциты и эпителиальные клетки желчных протоков, а также в адипо циты, хондроциты, остеоциты и эндотелиальные клетки, то есть вели себя одновременно как энтодермальные и мезен химальные предшественники.

Чтобы определить способность hFLMPC функционировать как гепатоциты in vivo, их трансплантировали иммунотолерант ным мышам. Через тридцать дней от начала эксперимента у

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006