Получение проростков маслины европейской с помощью метода эмбриокультуры

Микропобеги разделяли и высаживали на свежеприготовленную питательную среду для последующего культивирования.

В дальнейшем планируется получить укорененные микропобеги и адаптировать их к условиям in vivo.

Выводы

Выявлены наиболее вредоносные вирусы на изучаемых сортах персика. Установлены концентрации вироцидов и их влияние на жизнеспособность первичных эксплантов и оздоровление сортов персика „Золотая Москва', 'Советский', „Памятный Никитский', 'Орфей' и 'Лакомый' в условиях in vitro.

Изучено влияние регуляторов роста на процессы регенерации микропобегов исследуемых сортов персика в культуре in vitro.

Разработаны отдельные этапы оздоровления и микроразмножения персика in

vitro.

Список литературы

1. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. -М.: Наука, 1964. - 272 с.

2. Вердеревская Т.Д., Маринеску В.Г. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда. - Кишинев: Штиинца, 1985. - 311 с.

3. Воронин Э.И. Вирусные и микоплазменные болезни плодовых культур в Крыму // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 1977. - Т.59. - Вып. 2. - С. 147-152.

4. Елманова Т.С., Опанасенко Н.Е. Эколого-физиологические особенности персика. - К.: Аграрна наука, 2010. - 152 с.

5. Изучение вирусов и вирусных болезней косточковых плодовых культур на юге Украины и особенности оздоровления растений in vitro / О.В.Митрофанова, И.В.Митрофанова, В.Н.Ежов, Н.П.Лесникова-Седошенко, Л.А.Лукичева, А.В.Смыков, В.В.Се-нин, Т.В.Литвинова // Бюл. Никит. ботан. сада. - 2005. - Вып. 91. - С. 111-120.

6. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. - К.: Наук. думка, 1992. - 232 с.

7. Лесникова Н.П., Смыков А.В., Горина В.М. Культура зародышей и получение гибридных форм персика, абрикоса и алычи // Тр. Никит. ботан. сада - Ялта, 1997. - Т. 119. - С. 46-63.

8. Митрофанова О.В., Тесленко А.В. Диагностика вирусных болезней персика в Крыму // Вредители и болезни плодовых и декоративных культур Крыма: Сб. научн. тр. ГНБС. - 1982. - Т. 87. - С. 89-99.

9. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 1968. - V. 46, № 5. - Р. 417-421.

Рекомендовано к печати д.б.н. Митрофановой И.В.

ПОЛУЧЕНИЕ ПРОРОСТКОВ МАСЛИНЫ ЕВРОПЕЙСКОЙ С ПОМОЩЬЮ

МЕТОДА ЭМБРИОКУЛЬТУРЫ

Г.И.МЕЛИХОВА; И.В.МИТРОФАНОВА, доктор биологических наук Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Маслина (Olea europaea L.) - одно из древнейших культурных растений, которое уже более двух тысяч лет служит человечеству источником питательных

плодов и легкоусвояемого оливкового масла [3]. Кроме того, вечнозеленое оливковое дерево декоративно, неприхотливо, хорошо переносит обрезку, благодаря чему широко используется в озеленении городов ЮБК [4].

Размножение этой ценной культуры традиционными методами затрудняется тем, что черенки многих сортов маслины плохо укореняются, а семена в обычных условиях прорастают в течение 2-3 лет [3, 5]. Исследования биотехнологов средиземноморских стран показали, что достойной альтернативой семенному размножению и черенкованию может стать размножение с использованием методов культуры органов и тканей. При наличии отработанной схемы применение культуры in vitro позволяет значительно сократить сроки и снизить себестоимость получения высококачественного посадочного материала ценных генотипов O. europaea, а также ускорить селекционный процесс [1, 9].

В 80-х годах двадцатого столетия на территории СНГ в НБС-ННЦ С.В.Шевченко, В.А.Шолохова и Л.Ф.Мязина занимались исследованием данного вопроса. Использование метода эмбриокультуры позволило им получить из гибридных семян маслины растения, многие из которых в настоящее время вступили в стадию плодоношения [6]. Однако особенности морфогенеза in vitro крымских сортов O.europaea до сих пор исследованы недостаточно.

Цель нашей работы состояла в том, чтобы выявить морфогенетический потенциал органов и тканей перспективных сортов маслины в условиях in vitro. В задачи настоящего исследования входило получить асептическую культуру зародышей маслины, индуцировать развитие проростков, а также изучить особенности их формирования на агаризованной питательной среде.

Объекты и методы

Объектами исследования служили перспективные сорта маслины из коллекционных насаждений НБС - ННЦ: три сорта селекции НБС (Никитская, Обильная, Крымская Превосходная) и два кавказских сорта (Толгомская и Ломашенская). В качестве первичных эксплантов использовали зародыши, полученные от свободного опыления.

Зрелые плоды, отобранные в ноябре, протирали марлевой салфеткой, смоченной в 70%-м этаноле, обрабатывали 96%-м этанолом, обжигали в пламени спиртовки, после чего удаляли околоплодник и извлекали зародыш. Экспланты помещали на агаризованную среду Монье [8] без регуляторов роста.

После этого зародыши подвергали стратификации путем помещения в холодовую камеру (отсутствие освещения, температура 0-5°С). Спустя 2,5 -3 месяца проростки, длина корешков которых составляла не менее 4 - 5 см, пересаживали на свежую питательную среду, заглубляя корешок. Пробирки с сеянцами переносили в культу-ральную комнату с температурой 24±1°С, 16-часовым фотопериодом и интенсивностью освещения 2000- 3000 лк (белый свет).

Контролем служили семена, высаженные в нестерильную почву в условиях in vivo. Скарификацию семян проводили, незначительно повреждая твердую оболочку скальпелем. Наряду с этим с помощью инструментов наносили и более глубокие повреждения. В качестве субстрата использовали смесь листовой земли, торфа и песка в соотношении 10:1:1,5. Проращивание осуществляли в условиях теплицы при температуре 20-25°С. Обработку результатов экспериментов производили при помощи методов статистического анализа. Повторность опыта была пяти-, десятикратной.

Результаты и обсуждение

Известно, что успех клонального микроразмножения субтропических плодовых культур, в том числе и маслины, зависит от возраста и состояния растения-донора. Публикации зарубежных исследователей свидетельствуют о том, что экспланты, отобранные с ювенильных растений, отличаются высокой жизнеспособностью и хорошо адаптируются к условиям in vitro [7, 10]. Для получения ювенильного материала O.europaea нами был заложен эксперимент по проращиванию семян в почвенном субстрате и на агаризованной питательной среде.

По классификации М.Г.Николаевой семена маслины европейской обладают экзогенным и эндогенным органическим покоем, что обуславливает их длительное прорастание при обычном посеве [2, 3]. Для ускоренного получения сеянцев семена этой культуры обрабатывают растворами сильных кислот и щелочей, царапают, надкалывают или полностью удаляют твердую оболочку механическим путем. В наших опытах при проращивании in vivo скарификация заключалась в нанесении поверхностных царапин или надпиливании на глубину 2-3 мм.

Частота всхожести семян, высаженных в нестерильный почвенный субстрат, в зависимости от материнской формы составила от 0 до 40%. Прорастание семян наблюдали через 100-120 суток при глубокой скарификации и только через 285-300 суток - при поверхностной. Полное раскрытие семядолей у образовавшихся проростков происходило соответственно в течение 120-135 и 297-330 суток с момента высева в субстрат (табл. 1).

Таблица 1

Влияние генотипа и условий культивирования на развитие проростков маслины

Исходная Количество Сроки полного

форма Условия проращивания развившихся семян, раскрытия

(сорт) % семядолей, сут

Никитская in vivo I 20 297±7,0

II 25 135±3,5

in vitro 100 60±2,3

Крымская in vivo I 0 -

Превосходная II 0 -

in vitro 100 92±4,5

Обильная in vivo I 40 330±6,3

II 28 121±6,6

in vitro 80 75±3,5

Толгомская in vivo I 0 -

II 0 -

in vitro 50 88±2,8

Ломашенская in vivo I 25 303±2,5

II 17 120±5,3

in vitro 100 86±1,6

Примечание. Скарификация: I - легкая, II - глубокая; ( - ) прорастания не наблюдали в течение 1,5 лет.

Результаты наших опытов по эмбриокультуре подтверждают имеющуюся в литературе информацию о том, что зародыши маслины при проращивании in vitro не нуждаются в периоде покоя [6]. Так, спустя 30 суток стратификации происходило увеличение размеров зародышей, полученных от сортов Никитская, Толгомская и Ломашенская, спустя 42 - сортов Обильная и Крымская Превосходная.

Известно, что в культуре зародышей маслины нередко происходит интенсивное формирование каллуса, а также первичный и вторичный соматический эмбриогенез [6, 7, 10]. Однако в нашем эксперименте развитие зародышей шло только по пути прямого формирования проростков. Спустя 40-47 суток культивирования на агаризованной питательной среде у 50 -100% зародышей появлялся зародышевый корешок. После этого полное раскрытие семядолей наблюдали в течение 4 - 6 суток, а появление первой пары настоящих листьев - через 7 -10 суток после выставления пробирок с проростками на свет.

У проростка О-2, полученного от свободного опыления сорта Обильная, сформировались два зародышевых корешка вместо одного. Еще одна интересная особенность - наличие трех одинаковых семядолей вместо двух - отмечена у проростка Н-3, материнской формой которого был сорт Никитская. Остальные зародыши развивались без отклонений от нормы.

Растения, полученные путем культуры зародышей, исходными формами которых служили сорта Обильная и Никитская, характеризовались быстрым развитием и спустя 120 суток от начала эксперимента имели по 3 - 4 пары настоящих листьев, основной корень и массу корешков второго порядка (табл. 2). В дальнейшем нами планируется получить культуру пазушных побегов и провести адаптацию проростков к условиям in vitro.

Таблица 2

Морфологические характеристики проростков маслины спустя 120 суток культивирования в условиях in vitro

Генотип Высота надземной части, см Количество пар настоящих листьев, шт. Размеры листьев, см Количество корешков 2-го порядка, шт.

длина ширина

1 2 3 4 5 6

Н-1 7,6 4 1,30±0,03 0,31±0,03 23

Н-2 6,3 3 1,13±0,05 0,38±0,03 10

Н-3 3,8 3 1,10±0,04 0,42±0,02 12

1 2 3 4 5 6

О-1 5,0 3 1,10±0,05 0,43±0,02 22

О-2 6,7 3 1,00±0,03 0,47±0,04 15

Л-1 1,0 0 - - 4

Л-2 1,1 0 - - 3

Т-1 2,0 1 1,25±0,06 0,25±0,03 3

КП-1 2,3 0 - - 0

Примечание. Материнские формы (сорта): Н - Никитская, О - Обильная, КП -Крымская Превосходная, Л - Ломашенская, Т - Толгомская.

Выводы

1. Сочетание методов скарификации, стратификации и эмбриокультуры позволяет значительно повысить частоту всхожести, ускорить прорастание семян и стимулировать развитие проростков маслины европейской по сравнению с посевом в почвенный субстрат в условиях in vivo.

2. Установлено, что основным путем развития зародышей маслины в культуре in vitro является прямой органогенез с формированием полноценных проростков. Показана высокая частота прорастания у сортов Никитская и Обильная.

3. Использование культуры зародышей маслины позволяет провести ювенили-зацию растений и получить сеянцы, характерной особенностью которых является быстрый рост. Полученные проростки могут представлять интерес для селекционной работы.

Список литературы

1. Митрофанова И.В. Клональное микроразмножение субтропических и тропических плодовых культур (обзор литературы) // Тр. ГНБС. - Ялта, 1997. - Т. 119. -С. 63-95.

2. Николаева М.Г. Физиология глубокого покоя семян. - Л.: Наука, 1967. - 207 с.

3. Николаева М.Г. Некоторые итоги изучения покоя семян // Ботан. журн. - 1977. -Т. 62, № 9. - С. 1350-1368.

4. Орехоплодные и субтропические плодовые культуры: Справ. изд. / Ядров A.A., Синько Л.Т., Казас A.K и др. - Симферополь: Таврия, 1990. - 160 с.

5. Слизик-Маслова Л.Н. Растения крымских парков. Четыре времени года. -Севастополь: Библекс, 2008. - 256 с.

6. Шевченко С.В., Шолохова ВА, Мязина Л.Ф. Эмбриокультура маслины европейской (Olea europaea L., сем. Oleaceae) // Бюл. ГНБС. - Ялта, 2GG9. - Вып. 99. -С. 97-1GG.

7. In vitro germination of three Tunisian olive varieties / Maalej M., Drira N., Chaari-Rkhis A., Trigui A. // Acta Horticulturae. - 2GG2. - №586. - P. 9G3-9G6.

8. Monnier M. Croissance et developpement des embryons globularies de Capsella bursa-pastories cultives in vitro dans du milleu a base d une nouvelle solution minerale // Bull. Soc. Bot. France Memories, Coll. Morphologie. - 1973. - P. 179-194.

9. New perspective for biotechnologies in olive breeding: morphogenesis, in vitro selection and gene transformation / Rugini E., Gutierrez-Pesce P., Spampinato P.L., Ciarmiello A., D'Ambrosio C. // Acta Horticulturae. - 1999. - №474. - P. 1G7-11G.

1G. Rugini E. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Olive (Olea europaea L.) // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 1988. - V. 14., №3.- P. 2G7-214.

Рекомендовано к печати д.б.н., проф. Шевченко С.В.

ОСОБЕННОСТИ ВВЕДЕНИЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO НЕКОТОРЫХ СОРТОВ САДОВОЙ ГРУППЫ МИНИАТЮРНЫХ РОЗ

Т.И.СИДЕНКО;

И.В.МИТРОФАНОВА, доктор биологических наук

Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Садовая роза широко используется в озеленении и занимает одно из ведущих мест в декоративном цветоводстве. В Никитском ботаническом саду имеется богатейшая коллекция садовых роз. Важной биологической особенностью миниатюрных роз является раннее, длительное и многократно повторяющееся