СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ РЕТРОСПЕКТИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗОВ ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR PRODUCING ANTIGEN FOR RETROSPECTIVE DIAGNOSIS OF ANIMAL CHLAMYDIAL INFECTION

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к средствам лабораторной диагностики хламидиозов животных.
Хламидиозы - это группа контагиозных заболеваний животных, птиц и человека, вызываемых антигеннородственными и морфологически идентичными микроорганизмами - хламидиями, поражающими практически все системы и органы. Заболевание характеризуется разнообразными клиническими проявлениями: пневмонии, конъюнктивиты, артриты, менингоэнцефалиты, аборты и многое другое.
В настоящее время в ветеринарии для диагностики хламидиоза животных используют реакцию связывания комплемента (РСК), в которой выявляют наличие специфических хламидийных антител с помощью специфического хламидийного антигена. Для постановки РСК используют антиген хламидий, общий для всего семейства Хламидиалес.
Однако недостатком всех известных способов получения антигена является низкая активность и специфичность, приводящая к малоэффективной диагностике хламидиоза в РСК и невозможности ее использования в более чувствительных тестах, например в иммуноферментном анализе (ИФА), кроме того, использование 2-меркаптанола, относящегося к группе сильнодействующих ядовитых веществ, наносит вред здоровью людей и требует специальных условий производства.
При создании изобретения ставилась задача получения хламидийного антигена с высокой активностью и специфичностью, позволяющей проводить диагностику хламидиоза не только в РСК, но и в ИФА, и кроме того, простого, доступного и экологически чистого, при производстве которого не используется вредных для здоровья человека и окружающей среды веществ.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения антигена для диагностики хламидиоза животных, включающей инфицирование желточных мешков эмбрионов кур, приготовление из них хламидиосодержащей суспензии, добавление к ней смеси детергентов - додецисульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта до конечной концентрации их, равной соответственно 0,1 и 2%, с последующей выдержкой в течение 96 часов при температуре 37°С, с последующей обработкой суспензии эфиром в соотношении 1:5, соответственно, при периодическом перемешивании, с дальнейшей выдержкой суспензии в течение 24 часов под вытяжной системой при комнатной температуре.
Предложенный способ позволяет повысить активность и специфичность антигена, за счет того что экстракцию антигена эфиром производят не из цельной микробной клетки, а предварительно обработанной, т.е. разрушенной детергентами, где клеточную структуру разрушает додецилсульфат натрия, а этиловый спирт выступает в качестве фиксатора, т.е. предупреждает разрушение данного антигенного комплекса, что улучшает доступность антигена для экстракции эфиром и приводит к повышению степени чистоты и активности полученного антигена. Кроме того, способ получения антигена не включает использование ядовитых веществ, не требует специальных условий производства, т.е. является простым, доступным и экологически чистым.
Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиоза животных состоит из нескольких последовательных этапов: получение биомассы хламидий на развивающихся эмбрионах кур; получение полуфабриката антигена, обработка полуфабриката додецилсульфатом натрия и 96,5%-ным этиловым спиртом и экстракция антигена эфиром.
Получение биомассы хламидий на развивающихся эмбрионах кур
-5,5-6,5
-4
50
Для получения исходного сырья при производстве антигена используют развивающиеся эмбрионы кур, которые заражают в 6-дневном возрасте в желточный мешок суспензией возбудителя хламидиоза (штамм «Ростиново -70») с инфекционным титром 10 ЭЛД в 0,3 мл в предварительно разведенной до 10. Далее зараженные эмбрионы инкубируют при 37-38°С. Исходным сырьем для изготовления антигена служат желточные мешки куриных эмбрионов, павших на 5-7 день после инфицирования, которые отбирают в стеклянные флаконы. От каждого эмбриона отбирают 1-2 г хорион-аллантоисной и желточной оболочек вместе с сопутствующим желтком. Хламидиосодержащий материал до использования хранят в замороженном состоянии при минус 20-30°С, во время хранения его подвергают термолизису путем трехкратного замораживания и оттаивания для лучшего отделения тканевого содержимого от элементарных телец хламидий.
Приготовление полуфабриката антигена
Для получения полуфабриката антигена из хламидиосодержащего материала готовят 20%-ную исходную суспензию на 0,2 М фосфатно-буферном физиологическом растворе (ФБР) рН 7,2-7,4 с содержанием 0,5% фенола, для инактивации возбудителя, следующим образом: хламидиосодержащие оболочки быстро размораживают, взвешивают и суспендируют до 20%-ной концентрации на коллоидной мельнице, добавив расчетное количество ФБР. Суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 60 минут. В процессе центрифугирования суспензия расслаивается на 3 слоя. Верхний слой желток, нижний слой фрагменты тканей желточного мешка и средний слой собственно суспензия, содержащая элементарные тельца хламидий. После центрифугирования отсасывают средний слой центрифугата - взвесь хламидий. Осадок тканей и верхний желточный слой утилизируют. Для приготовления промышленных объемов антигена целесообразно использовать рефрижераторные центрифуги, рассчитанные на большой объем. Из отечественных моделей наиболее удобной является ЦР6-04 производства ОАО «Завод биофизической аппаратуры» (г.Москва) позволяющая центрифугировать одновременно до 11,0 л суспензии.
Для осаждения хламидий очищенную суспензию центрифугируют при 18-20 тыс. оборотов в минуту в течение 60 минут на высокоскоростных центрифугах. Для центрифугирования больших объемов удобно использовать центрифуги с проточным ротором. Из отечественных центрифуг можно использовать ОТР-101К-01. В процессе центрифугирования хламидии собираются на стенках проточного ротора или на дне стаканов в зависимости от типа центрифуги.
Осадок хламидий ресуспендируется в 0,2 М ФБР из расчета получения первоначального объема. Например, если при производстве первоначально было взято 2,0 кг биомассы, то осадок ресуспендируется в 2,0 л ФБР.
Для обработки полуфабриката антигена используют:
12
25
4
- додецилсульфокислоты натриевую соль (додецилсульфат натрия) CHONaS, ТУ 6-09-64-75 в классификации ч. (чистый);
2
5
- спирт этиловый ректификованный (CHOH) 96,5%-ной концентрации, ГОСТ Р 51652-2000;
4
10
- эфир диэтиловый, ч.д.а., (CHO) ТУ 2600-001-43852015-10.
Приготовление реагентов.
В полуфабрикате антигена концентрация додецилсульфата натрия и 96,5%-ного этилового спирта должна составлять 0,1% и 2% соответственно, поэтому сначала готовят исходную смесь этих реагентов. Для этого 1,0 г додецилсульфата растворяют в 80 мл дистиллированной воды (для лучшего растворения можно проводить процесс в водяной бане при температуре 40-50°С) и добавляют 20 мл этанола и получают 100 мл смеси, содержащей 1% и 20% реагентов соответственно. Смесь реагентов готовят непосредственно перед использованием.
Эфир используют в готовом виде.
Смесь реагентов добавляют к полуфабрикату антигена, разбавляя в 10 раз, чтобы получить нужную концентрацию реагента. Например, на 900 мл антигена добавляют 100 мл готовой смеси реагентов. Обработку ведут в стеклянных бутылях с герметичными пробками в термостате при 37°С в течение 96 часов, периодически, 2-3 раза в сутки, перемешивая бутыль.
По истечении этого периода к обработанному полуфабрикату добавляют эфир из расчета 1:5 соответственно. На 1000 мл полуфабриката антигена добавляют 5000 мл эфира, герметично закрывают, тщательно перемешивают и оставляют еще на 24 часа под принудительной вытяжной системой при комнатной температуре, периодически перемешивая.
В процессе обработки эфиром полуфабрикат расслаивается на 3 слоя:
- нижний слой: вода (ФБР), содержащий реагенты додецилсульфат и этанол;
- средний слой: клеточный дебрис и балластные вещества;
- верхний слой: эфир с растворенным в нем специфическим хламидийным антигеном.
Через 24 часа верхний слой (эфир) осторожно отсасывают, добавляют к нему ФБР, по объему равный первоначальному объему полуфабриката антигена (1000 мл), и испаряют эфир под принудительной вытяжной системой. В процессе испарения эфира липополисахаридный комплекс (антиген) постепенно полностью переходит в ФБР, в результате чего раствор приобретает белый цвет. Активность и специфичность антигена проверяют в РСК путем его титрования против контрольной положительной и отрицательной сывороток крови животных. Антиген должен реагировать с контрольной хламидийной сывороткой крови и не реагировать с отрицательной сывороткой крови.
Ниже, в таблице №1, приведены результаты испытаний трех серий антигенов, приготовленных по предлагаемому способу. По мере изготовления серий антигенов они исследовались на специфичность и активность и использовались для ретроспективной диагностики хламидиоза у животных.
Для определения специфичности и активности антигенов использовали заведомо отрицательные и положительные сыворотки крови овец, входящие в состав «Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Рег.№ПВР-12.7/02109; Сертификат соответствия №РОСС RU.ФВ01.Н21898; ТУ 9388-020-00492374-2007).
Таблица№1
Результаты исследования антигена на специфичность и активность
Номер серии антигена
Наименование сывороток
Титр антигена в РСК
1
хламидийная
1:256
отрицательная
0
2
хламидийная
1:512
отрицательная
0
3
хламидийная
1:512
отрицательная
0
Как видно из таблицы, антиген реагировал с положительной хламидийной и не реагировал с отрицательной сыворотками крови овец, что говорит о его специфичности. Также видно, что титр антигена, изготовленного по предлагаемому способу, со специфической хламидийной сывороткой был в пределах 1:256 - 1:512, что говорит о высокой активности антигена, изготовленного по предлагаемому способу.
Были проведены испытания предлагаемого антигена для диагностики хламидиоза у сельскохозяйственных животных. Для этого использовали сыворотки крови крупного рогатого скота из неблагополучного по хламидийной инфекции хозяйства, где диагноз на хламидиоз был подтвержден выделением возбудителя. Также в опыте использовали сыворотки крови овец, вакцинированных против хламидиоза.
В результате проведенных исследований было установлено, что все испытуемые и контрольные сыворотки, а также антиген, не обладали антикомплементарностью.
Отрицательная контрольная сыворотка не реагировала с антигеном. Титр контрольной хламидийной сыворотки с предлагаемым антигенами был 1:40.
Полученные результаты контролей свидетельствовали о специфичности проведенной реакции с использованием предлагаемого антигена.
Результаты исследований сывороток крови КРС и овец обобщены и представлены в таблице №2.
Таблица №2
Результаты сравнительного исследования в РСК на хламидиоз сывороток крови с двумя специфическими хламидийными антигенами.
Наименование групп сывороток
Номер пробы
Результат исследования (титр) в РСК предлагаемым с антигеном
Сыворотки крови крупного рогатого скота, принадлежащие ОАО «им. Токарликова» Альметьевского района Республики Татарстан
1
1:20
2
1:10
3
1:5
4
-
5
-
6
-
7
-
8
1:10
9
-
10
-
11
1:10
12
-
13
1:10
14
1:10
15
1:10
16
1:10
17
-
18
-
19
1:20
20
-
21
1:10
22
1:5
23
1:20
24
1:20
25
1:20
26
1:5
27
-
28
1:20
29
-
30
1:10
31
1:5
32
-
33
1:5
Итого реагировало проб:
20
Средний титр антител:
1:11,7
Сыворотки крови овец
1 вакц.
1:320
2 вакц.
1:320
3 вакц.
1:160
4 не вакц.
-
Средний титр антител:
1:266
SS
1:40
SN
-
Из таблицы №2 видно, что из 33 сывороток в титре 1:5 и выше с предлагаемым антигеном реагировало 20 (60%) проб. При этом следует отметить, что титры антител были 1:5-1:20, что соответствует диагностическому уровню. Средний титр антител с предлагаемым антигеном составил 1:11,7.
Сыворотки крови иммунизированных против хламидиоза овец реагировали с предлагаемым антигеном в титрах 1:320, 1:320 и 1:160 соответственно. Средний титр антител у вакцинированных против хламидиоза овец с предлагаемым антигеном был 1:266.
Сыворотка крови овцы, не вакцинированной против хламидиоза, в РСК с хламидийными антигенами не реагировала.
Нами была исследована 141 сыворотка крови различных половозрастных групп крупного рогатого скота из 6 неблагополучных по хламидиозу хозяйств РТ и РФ, полученные данные сведены в таблицу 3.
Таблица №3
Результаты исследования в РСК на хламидиоз сывороток крови с предлагаемым специфическим хламидийным антигеном
№ п/п
Наименование хозяйств
Исследовано проб
Положительно реагировало в РСК с антигеном
известный
предлагаемым
1
OOO «Нур-Агро», Ютазинский район РТ
25
5
14
2
OOO а/ф «Сирази», Чистопольский район, нетели
16
4
7
3
ИП «Сулейманов А.И.» Кукморский район
7
2
5
4
OOO «Намус», Кукморский район, вакцинированные
18
10
19
5
«Актай», Мамадышский район РТ
38
8
19
6
OOO «Сергеевское», Саратовская область, Каменский район
37
9
18
Итого по хозяйствам
141
38 (27%)
82 (58%)
Средний титр проб (М±м):
7,3±0,43
10,9±0,35
Как видно из таблицы, с предлагаемым антигеном реагировало положительно 82 (58%).
Таким образом, полученный антиген специфичен, обладает высокой чувствительностью и активностью в РСК.