Бензимидазолы - конкурентные ингибиторы FAD-содержащей монооксигеназы

УДК 577.15.1

БЕНЗИМИДАЗОЛЫ - КОНКУРЕНТНЫЕ ИНГИБИТОРЫ FAD-СОДЕРЖАЩЕЙ МОНООКСИГЕНАЗЫ

A.А. Захарянц1,4, А.А. Полозников2,3,4, Д.М. Хушпульян1,4, Т.А. Осипова1,

B.И. Тишков1,4,5, И.Г. Газарян1,3

Бензимидазолы широко используются как антигельминтные препараты, мишенью которых является тубулин. Влияние четырех из них было изучено на хорошо известном и коммерчески доступном ферменте - пара-оксибензоатгидроксилазе (PHBH), входящей в число FAD-содержащих монооксигеназ класса А, который включает также и FAD-зависимый монооксигеназный домен молекулы MICAL. Продемонстрировано конкурентное ингибирование активности PHBH всеми бензимидазолами (ме-бендазол, албендазол, фенбендазол, оксибендазол) в микромолярном диапазоне концентрацией в гидроксилазной, но не в нефизиологической NADPH-дегидрогеназной реакции восстановления феррицианида. Характер ингибирования соответствует конкуренции бензимидазолов с иара-оксибензоатом за нативный фермент, косвенно указывая на упорядоченный механизм связывания субстратов. Моделирование подтверждает выводы, сделанные на основании изучения стационарной кинетики.

Ключевые слова: пара-оксибензоатгидроксилаза, ингибиторный анализ, окисление па-ра-оксибензоата, восстановление феррицианида, компьютерное моделирование. Список использованных в статье сокращений: PHBH - пара-оксибензоатгидрокси-лаза; МГСАЪ - молекула, взаимодействующая с CasL (Molecule Interacting with CasL); FAD - флавинадениндинуклеотид; NADPK - никотинамидадениндинуклеотид фосфат, восстановленная форма; PHB - пара-оксибензоат.

Бензимидазолы, такие как албендазол и фен-бендазол, являются антигельминтными препаратами, механизм действия которых состоит в ингиби-ровании перестроек тубулина. В организме человека они претерпевают окисление и расщепление с помощью FAD-содержащих моноокисгеназ, окисляющих серу до сульфона. Геном человека насчитывает более 60 генов FAD-зависимых монооксигеназ (МОГ), большинство из которых не описаны в индивидуальном состоянии, а их функции неизвестны. Хорошо изученную группу представляют монооксигеназы, которые не специфичны к окисляемому субстрату и наряду с цитохромом P-450 предназначены для расщепления ксенобиотиков. Кинетический механизм МОГ относится к механизму типа «пинг-понг» и включает в себя восстановление FAD с помощью NADPH, связывание и активацию кислорода восстановленным FAD с последующим окислением ксенобиотика [1].

_Наряду с FAD-зависимыми монооксигеназами,

действующими по механизму «пинг-понг», существуют другие специфические FAD-содержащие монооксигеназы. Они играют важную роль в ор-

ганизме человека, катализируя реакцию по механизму, отличному от механизма «пинг-понг». Например, FAD-зависимые монооксигеназы класса А (по классификации, предложенной недавно в [1]) специфичны к определенным субстратам. Только связывание этих субстратов вызывает конформационные изменения, позволяющие второму субстрату NADPH эффективно связаться с ферментом и восстановить FAD. Таким образом, механизм катализа включает в себя образование тройного комплекса. Различие в константах скорости восстановления FAD с помощью NADPH в отсутствие и в присутствии специфического субстрата составляет пять порядков (140 000 раз [2]). Представлялось интересным выяснить, являются ли антигельминтные бензимидазолы конкурентными субстратами для специфических FAD-содержащих монооксигеназ, каковыми они являются для неспецифических FAD-зависимых монооксигеназ. С этой целью в качестве модельной FAD-содержащей монооксигеназы класса А была выбрана пара-оксибензоатгидроксилаза из Pseudomonas sp. (4-оксибензоат, NADPH, кисло-

род, оксидоредуктаза, PHBH, КФ 1.14.13.2) - фермент, структура и механизм катализа которого изучены достаточно подробно [1-8]. Исследовано ингибирование PHBH в присутствии четырех бен-зимидазолов, только два из которых (албендазол и фенбендазол) имеют в составе легко окисляющуюся серу, в то время как оксибендазол и мебендазол легко окисляющихся групп не имеют (рис. 1).

PHBH является модельным ферментом специфических FAD-содержащих монооксигеназ класса А, таких как каталитический домен MICAL, специфически окисляющий актин [9] и играющий важную роль в модификации цитоскелета [10-12], проявляющейся как в навигации аксонов [13], так и в эпителиально-мезенхимной трансформации [14].

Материалы и методы

Все применяемые в работе реактивы изготовлены фирмой «Сигма» (США) и использованы без дополнительной очистки. Проведено предварительное изучение растворимости бензими-дазолов: оптимальная процедура растворения включала в себя приготовление 50 мМ раствора в диметилсульфоксиде, его разведение в 50%-м растворе этанола в воде и внесение расчетной аликвоты в реакционную смесь.

Активность измеряли в 50 мМ калий-фосфатном буфере (рН 7,5). Концентрацию активного фермента определяли спектрофотометрически по концентрации FAD, используя коэффициент экстинкции е450 = 10,2 мМ-1см-1 [6]. Скорость реакции измеряли по потреблению NADPH (е 440 = 6,22 мМ-1 см-1) на приборе «Spectramax M5» фирмы «Molecular Devices» (США). Концентрации субстратов варьировали в диапазоне 25-100 мкМ (NADPH) и 25-150 мкМ (пара-ок-сибензоат). Реакцию инициировали добавлением

NADPH. Для измерения диафоразной (NADPH-дегидрогеназной) активности использовали фер-рицианид (0,5 мМ) и NADPH (50-150 мМ). Измерение активности проводили по обоим субстратам (феррицианид s 420 = 1,04 мМ-1см-1). В расчетах использовали начальную скорость реакции (максимальный наклон кинетической кривой за первые 3 мин реакции). Все измерения проводили троекратно. Анализ ингибирования проводили в координатах Диксона. С помощью программы Discovery Studio 2.5 («Accelrys», США), используя две кристаллические структуры PHBH, осуществляли моделирование со связанным субстратом PHB (lPBE.pdb) и со связанным NADPH (1K0J.pdb).

Результаты и обсуждение

Постадийный каталитический цикл PHBH, представленный на схеме 1, включает в себя упорядоченное присоединение субстратов, PHB (^1S) и NADPH (k2N), восстановление FAD (k3), диссоциацию NADP (k4), окисление восстановленного FAD кислородом (k5), гидроксилирование PHB с помощью основания B в активном центре фермента (k6), протонирование и образование окиси-FAD, но уже при участии протонированной формы основания B (BH) в активном центре фермента (k7) и, наконец, отщепление гидроксилированного продукта (P) и молекулы воды (k8).

Все изученные бензимидазолы оказались ингибиторами фермента при измерении скорости ферментативной реакции по убыли NADPH. Если бы они выступали как конкурентные субстраты, то NADPH продолжал бы расходоваться на их окисление, и при измерении скорости реакции по убыли NADPH падения скорости реакции не должно происходить. Поскольку наблюдается значитель-

Рис. 1. Структура антигельминтных бензимидазолов: 1 - метил-5-

карбамат

С х е м а 1

Полный каталитический цикл реакции окисления пара-оксибензоата, катализируемой пара-оксибензоатгидроксилазой из Pseudomonas sp. [1]

ное падение скорости реакции, измеряемой по НАЭРН, можно заключить, что бензимидазолы являются истинными ингибиторами фермента, а не конкуретными субстратами, как было принято считать в случае албендазола и фенбендазола. Возможно, что даже если они окисляются как субстраты, то продукты их окисления являются ингибиторами фермента. Более того, мебендазол и ок-сибендазол, не имеющие легко окисляемой серы в составе молекулы, в отличие от албендазола и фенбендазола, также являются конкурентными ингибиторами фермента как по специфическому субстрату, так и по кофактору - НАЭРН (рис. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что значения константы ингибирования, определяемой как точка пересечения прямых в координатах Диксона, зависят от того, варьируют субстрат при фиксированной концентрации кофактора или кофактор при фиксированной концентрации специфического субстрата (рис. 2). Константа ингибиро-вания, определяемая при фиксированной концентрации НАЭРН, в 2-3 раза больше, чем при фиксированной концентрации пара-оксибензоата. При изучении в 1970-е годы стационарного меха-

низма реакции, катализируемой РЫБЫ, его классифицировали как неупорядоченное связывание с образованием тройного комплекса [2]. Можно предположить, что бензимидазолы конкурируют за нативную форму фермента и с субстратом, и с кофактором, однако в этом случае экспериментально определяемая константа ингибирования не должна зависеть от того, какой из субстратов фиксируют, а какой варьируют. Последующие детальные исследования механизма РЫБЫ, включающие работы по мутагенезу и кристаллизации мутантных форм с субстратом или продуктом, позволили уточнить механизм (схема 1). Однозначно показано, что конформационное изменение, сопровождающееся изменением положения фла-винового кольца, необходимого для взаимодействия с НАЭРН, происходит только как результат связывания пара-оксибензоата [1, 3, 8]. В дальнейшем было показано, что скорость-лимитиру-ющей стадией является диссоциация продукта НАЭР, протекающая в конце восстановительной полуреакции [3]. На схеме 1 этот процесс представлен как переход IV ^ V с константой скорости к4. Связывание кислорода и окисление пара-окси-

0,16

0 40 80

Мебендазол, мкМ

0,14

• 150мкМ РЫВ [NADPH] = 50 мкм О 28 мкМ РНВ  56мкМ РНВ

-20 0 20 40 60 80 Албендазол, мкМ

0,14

-40 0 40 80

Оксибендазол, мкМ

0,16

« 0,12

О 25 мкМ NADPH [РНВ] = 100 мкМ • 50мкМ NADPH Т 100 мкМ NADPH

Я 0,08

0,04

0,00

0,10

0 50 100 Мебендазол, мкМ

О 25мкМ NADPH [РНВ] = 150мкМс • 50 мкМ NADPH  100 мкМ NADPH

150

0,02 -

0,07

-20 0 20 40 Албендазол, мкм

О 25мкМ NADPH [РНВ] = 150 мкм,: • 50 мкМ NADPH Т 100 мкМ NADPH

0,01

-100

-50 0 50

Оксибендазол, мкМ

0,07

-10 0 10 Фенбендазон, мкМ

0,10

и S

"В 0,06

Я

S

О 25 мкМ NADPH [РНВ] = 50 мкМ • 50 мкМ NADPH Т 100 мкМ NADPH

0,02

-40 -20 0

Фенбендазон, мкМ

20

Рис. 2. Ингибирование бензимидазолами окисления пара-оксибс н зоата. катализируемого РНВН, в координатах Диксона при варьировании окисляемого субстрата (PHB) и фиксированной концентрации NADPН (левая колонка) и при варьировании NADPН и фиксированной концентрации пара-

оксибензоата

бензоата (на схеме 1 стадии k5, k6, k7, k8) не являют- ратимо связывается пара-оксибензоат (схема 2, ста-

ся скорость-лимитирующими стадиями. С учетом дия k1), затем связывается NADPН (схема 2, ста-

всех исследований каталитический цикл фермента дия k2), при этом происходит немедленное вос-

можно представить схемой, в которой первым об- становление FAD (константу скорости возможно

С х е м а 2

1 = (*_i + k2N + ) V

1

1

k2 N k1S

Ki k2 N k3

абсцисса точки пересечения прямых в координатах Диксона равна

I = -К,;

при фиксированной концентрации пара-оксибен-зоата и вводе его константы диссоциации К3

1 = + 4т) +

S

V k1S

K, k2N S

1 Ks

1

Ks K

где Ks = —а абсцисса точки пересечения пря-

мых в координатах Диксона равна

S

i = _K (1+—). K

Упрощенный каталитический цикл PHBH: Е - фермент, I - ингибитор

определить только для мутантов со значительным падением активности по восстановлению FAD), затем предполагается диссоциация NADP (k3), после чего происходят окисление FAD и гидроксилиро-вание субстрата в 3-положении. Предположение о необходимости диссоциации NADP обусловлено рассмотрением конформационных ограничений, связанных с окислением пара-оксибензоата [1]. Поскольку константы скорости полуреакции окисления намного превосходят константу скорости лимитирующей стадии всей реакции и диссоциации продукта NADP, а концентрация кислорода является постоянной при стационарных измерениях, стадии отщепления NADPH, окисления субстрата и его отщепления для упрощения объединены в одну, константа скорости которой равна константе скорости лимитирующей стадии (k3).

В таком упрощенном варианте уравнение скорости реакции в присутствии ингибитора I, взаимодействующего с нативной формой фермента E, можно представить двумя способами с разделением переменных (значений концентрации субстрата и кофактора) для облегчения анализа прямых в координатах Диксона (S = [PHB], N = [NADPH]): при фиксированной концентрации NADPH

При рас с мотр ении уравнений ( 1) , (2) становится очевидным, что точка пересечения при фиксированной концентрации NADPH соответствует истинной константе ингибирования (1), (1 а), а при фиксированной концентрации пара-оксибензоата константа ингибирования зависит от фиксированной концентрации пара-оксибензоата (2), (2а), вернее, от отношения его концентрации к константе связывания. Последняя (43 мкМ при рН 6,6) была определена в работе [2] по значительным спектральным изменениям фермента, происходящим при связывании субстрата. Учитывая использование концентраций пара-окси-бензоата в интервале 50-150 мкМ и увеличение константы его связывания с ферментом при повышении рН (в нашем случае рН 7,5) увеличение кажущейся константы ингибирования в 2-3 раза по сравнению с истинной можно считать соответствующей величине фактора [Sj/Ks. Таким образом, исходя из данных стационарной кинетики, можно предположить, что связывание бензими-дазолов предотвращает связывание пара-окси-бензоата. В пользу такого предположения говорит также тот факт, что изученные бензимида-золы не ингибируют неспецифическую реакцию восстановления феррицианида NADP^ катализируемую ферментами этого класса и протекающую по механизму «пинг-понг» (результаты не показаны).

Прежде чем перейти к анализу результатов компьютерного моделирования, следует отметить принципиальный для понимания ситуации момент. А именно, несмотря на долгое и плодотворное изучение фермента, его кристаллическая структура с NADPH так и не была получена, в то время как структуры нативного фермента (1PBE. pdb) и его многих мутантных вариантов со связанным пара-оксибензоатом хорошо известны. Единственная структура со связанным NADPH была получена для мутантного фермента с заменой Arg220Gln (1K0J.pdb) [7]. Загадочным обстоятельством здесь является положение молекулы NADP^ ориентированной по отношению к молекуле FAD с точностью до наоборот по сравнению с химически разумной ориентацией, вытекающей из данных всех спектральных экспериментов, проведенных на мутантных формах фермента, и факта экспериментального наблюдения комплекса с переносом заряда на нативном ферменте. Мож-

Рис. 3. Моделирование связывания мебендазола с PHBH: А - суперпозиция структур PBE1 и 1K0J (взаимное расположение субстратов и FAD в молекуле фермента); Б - докинг мебендазола в области связывания NADP^ показывающий экранирование ингибитором канала, ведущего к центру связывания пара-оксибензоата

но предположить, что либо реальное положение NADPН при катализе не соответствует кристаллической структуре, полученной для NADPН в мутанте, а молекула на самом деле перевернута, как предполагают в работе [1], либо фермент совершает немыслимые конформационные изменения, чтобы пригнуть никотинамидную часть молекулы NADPН к флавину FAD, как обсуждается в [3].

Для того чтобы показать на одной структуре, как расположены пара-оксибензоат, FAD и NADP^ пара-оксибензоат из структуры 1PBE (с сохранением координат его расположения по отношению к FAD и молекуле белка) был перенесен на структуру 1K0J (рис. 3, А). Как видно из рис. 3, А, пара-оксибензоат связывается в полости Работа выполнена при финансовой i

активного центра, проникая через канал, расположенный перпендикулярно к кольцу флавина. Несмотря на то что связывание молекулы NADPН в реальном каталитическом цикле может не соответствовать ее ориентации в кристаллической структуре 1K0J, принципиальным для моделирования моментом является расположение аденина в молекуле связанного кофактора. Докинг ингибиторов проводили таким образом, чтобы в центре сферы для докинга находился адениновый фрагмент NADPН в структуре 1K0J. В качестве примера полученных результатов показан докинг мебенда-зола (рис. 3, Б), где хорошо видно, как бензильная часть мебендазола частично перекрывает канал, ведущий к сайту связывания пара-оксибензоата.

Таким образом, анализ вариантов связывания бензимидазолов PHBH позволяет понять, почему связывание бензимидазолов, которые имеют в своем составе бензимидазольное кольцо, стерически эквивалентное адениновому кольцу NADP^ кон -курируют за связывание не столько с NADPН (ко -торый, как обсуждалось выше, может связываться с точностью до наоборот в реальном каталитическом акте), сколько с пара-гидроксибензоатом, создавая стерическое препятствие для связывания последнего, и таким образом невозможности перехода фермента в то конформационное состояние, которое соответствует активации FAD по отношению к NADPK

В заключение можно отметить, что ингиби-торный анализ, проведенный в настоящей работе, является дополнительным доказательством упорядоченного механизма связывания субстратов у FAD-зависимых монооксигеназ класса А. Именно к этому классу относится и FAD-содержащий моноксигеназный домен MICAL, активация катализа которым наблюдается только при связывании F-актина. Поскольку MICAL отвечает за перестройки актина, а бензимидазолы блокируют перестройки тубулина, то обнаружение ингибирования бензимидазолами модельного фермента класса А FAD-зависимых монооксигеназ (PHBH) ставит вопрос о возможном влиянии бензимидазолов на катализ FAD-содержащим монооксигеназным доменом MICAL, а следовательно, на перестройку актина (в дополнение к их известному влиянию на тубулин). Проводимые в настоящее время исследования рекомбинантного FAD-содержащего монооксигеназного домена в нашей лаборатории позволят ответить на этот вопрос в самом ближайшем будущем.

ддержке РФФИ (грант № 13-04-01909).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Crozier-Reabe K, Moran G.R. //Int. J. Mol. Sci. 2012. Vol. 13. P. 15601.

2. Husain M., Massey V. // J. Biol. Chem. 1979. Vol. 254. P. 6657.

3. Entsch B., Cole L.J., Ballou D.P. // Arch. Biochem. Bio-phys. 2005. Vol. 433. P. 297.

4. Hosokawa K., Stanier R.Y. // J. Biol. Chem. 1966. Vol. 241. P. 2453.

5. HowellL. G, Spector T, Massey V. // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247. P. 4340.

6. Berkel W. van, Westphal A., Eschrich K., Eppink M., Kok A. de // Eur J Biochem/FEBS. 1992. Vol. 210. P. 411.

7. Wang J., Ortiz-Maldonado M., Entsch B., Massey V., Ballou D., Gatti D. L. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99. P. 608.

8. Westphal A. H., Matorin A., Hink M.A., Borst J.W., Berkel W. van, VisserA.J. // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281. P. 11074.

9. Zucchini D., Caprini G., Pasterkamp R. J., Tedeschi G., Vanoni M.A. // Arch. Biochem. Biophys. 2011. Vol. 515. P. 11.

10. Hung R.J., Pak C.W., Terman J.R. // Science. 2011. Vol. 334. P. 1710.

11. Hung R.J., Spaeth C.S., Yesilyurt H.G., Terman J.R. // Nature cell biology. 2013. Vol. 15. P. 1445.

12. Hung R.J., Yazdani U., Yoon J., Wu H., Yang T., Gupta N., Huang Z., Berkel W. van, Terman J.R. // Nature. 2010. Vol. 463. P. 823.

13. Lee B.C., Peterfi Z., Hoffmann F.W., Moore R.E., Kaya A., Avanesov A., Tarrago L., Zhou Y., Weerapana E., Fo-menko D.E., Hoffmann P.R., Gladyshev V.N. // Molecular cell. 2013. Vol. 51. P. 397.

14. Lundquist M.R., Storaska A.J., Liu T.C., Larsen S.D., Evans T., NeubigR.R., Jaffrey S.R. // Cell. 2014. Vol. 156. P. 563.

Поступила в редакцию 01.08.15

BENZIMIDAZOLES AS COMPETITIVE INHIBITORS OF FAD-DEPENDENT MONOOXYGENASE

A.A. Zakhariants, A.A. Poloznikov, D.M. Hushpulian, T.A. Osipova, V.I. Tishkov, I.G. Gazaryan

Benzimidazoles represent the drugs targeting tubulin and widely used to treat intestinal parasites. Four benzimidazoles were tested with the well-characterized and commercially available bacterial para-hydroxybenzoate hydroxylase (PHBH), which belongs to the group of FAD-dependent monooxygenases class A including such enzymes as FAD-containing monooxygenase domain of MICAL. PHBH was shown to be competitively inhibited by all four benzimidazoles (mebendazole, albendazole, fenbendazole, oxibendazole) in the micromolar range in the hydroxylase reaction, but not in the non-physiological NADPH-dehydrogenase reaction of ferricyanide reduction. Inhibition pattern is consistent with benzimidazoles competing with para-hydroxybenzoate for the resting state of the enzyme, indirectly indicating the ordered mechanism of substrate binding. Modeling studies support the conclusions derived from steady-state kinetics.

Key words: para-hydroxybenzoate hydroxylase, ferricyanide reduction, inhibition analysis, computer modeling, docking.

Сведения об авторах: Захарянц Арпеник Ашотовна - аспирант кафедры химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова, мл. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ»; Полозников Андрей Александрович - зав. лабораторией биохимии и энзимологии ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Министерства здравоохранения Российской Федерации, ст. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. хим. наук; Хушпульян Дмитрий Михайлович -мл. науч. сотр. кафедры радиационной химии МГУ имени М.В. Ломоносова, ст. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. хим. наук; Осипова Татьяна Алексеевна - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук; Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, генеральный директор ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», докт. хим. наук (vitishkov@gmail.com); Газарян Ирина Георгиевна - вед. науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова, сотр. Института им. УМ. Берка, Медицинский колледж Корнельского университета, США, докт. хим. наук, профессор.