СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДА РАСПРОСТРАНЕННОГО РАКА ЯИЧНИКОВ ПОСЛЕ АДЪЮВАНТНОЙ ХИМИОТЕРАПИИ ПО СХЕМЕ АР
METHOD FOR PREDICTING THE OUTCOME OF OVARIAN CANCER FOLLOWING ADJUVANT CHEMOTHERAPY ACCORDING TO THE AP

2
2
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для прогнозирования положительного исхода рака яичников после адъювантной химиотерапии по схеме АР (цисплатин 75 мг/м + доксорубицин 50 мг/м). Для индивидуализации и выбора оптимальной тактики лечения. Эпителиальный рак яичников (РЯ), являясь четвертой по значимости причиной смерти от рака у женщин, относится к опухолям с высокой чувствительностью к химиотерапии (XT).
В 75-80% случаев РЯ полностью или частично отвечают на терапию 1-ой линии (Deloia J.A., Bhagwat N.R., Darcy K.М. et al. Comparison of ERCC1/XPF genetic variation, mRNA and protein levels in women with advanced stage ovarian cancer treated with intraperitoneal platinum // Gynecologic Oncology. - 2012. - Vol. 126, №3. - S. 448-454). Таким образом, 20-25% пациенток получает заведомо неэффективную и токсичную терапию, ухудшающую качество их жизни и режим лечения (Богуш Т.А., Попова А.С. Дудко Е.А., и др. ERCC1 как маркер резистентности рака яичников к препаратам платины. // Антибиотики и химиотерапия. - 2015. - №3. - С. 42-50). В настоящее время в онкологии активно развивается использование молекулярно-биологических маркеров для прогнозирования течения злокачественного процесса и выбора рациональной терапии. Особое внимание при этом уделяется изучению маркеров, характеризующих ангиогенез - представителей семейства VEGF (Vascular endothelial growth factor) (Кит O.H., Франциянц Е.М., Моисеенко Т.И., и др. Факторы роста семейства VEGF И FGF 21 в сыворотке крови в динамике развития рака яичников. // Современные проблемы науки и образования - 2017. - №1. - С. 17-24) и системы репарации ДНК, в частности ERCC1 (excision repair cross complementing) (Almeida G.M., Duarte T.L., Farmer P.В., et al. Multiple end-point analysis reveals cisplatin damage tolerance to be a chemoresistance mechanism in a NSCLC model: implications for predictive testing. // Int J Cancer. - 2008. - Vol. 122, №8. - S. 1810-1819.). При диагностике - мониторинге злокачественных опухолей яичников оценивают экспрессию VEGF в опухолевой ткани (Premalata C.S., Umadevi K., Shobha K., et al. Expression of VEGF-A in Epithelial Ovarian Cancer: Correlation with Morphologic Types, Grade and Clinical Stage. // Gulf J Oncolog. - 2016. - Vol. 1(21). - S. 49-54.), содержание VEGF в опухолях и сыворотке крови (Гернштейн Е.С., Кушлинский Д.Н., Терешкина И.В., и др. Фактор роста эндотелия сосудов и опухоли женской репродуктивной системы. Онкогинекология. - 2015. - №2. - С. 4-11).
Считается установленным, что ERCC1 - белок системы эксзиционной репарации ДНК, играет роль предиктивного фактора резистентности клеток к препаратам платины (Arora S., Kothandapani A., Tillison K. et al Downregulation of XPF-ERCC1 enhances cisplatin efficacy in cancer cells. // DNA Repair (Amst). - 2010. - Vol. 9, №7. - S. 745-53. doi: 10.1016/j.dnarep.2010.03.010). Одним из подходов в оценке экспрессии ERCC1 является определение мРНК ERCC1 в опухолевых клетках. В одной из работ по исследованию 28 хирургических образцов РЯ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени показано, что в 70%-резистентной и в 33% чувствительной опухоли уровень экспрессии ERCC1 был выше среднего показателя по группе (р=0,059) (Dabholkar М., Vionnet J., Bostick-Bruton F. et al. Messenger RNA levels of XPAC and ERCC1 in ovarian cancer tissue correlate with response to platinum-based chemotherapy. 113. Clinical Investigation. - 1994. - Vol. 94, №2. - S. 703-708).
Известен способ определения продолжительности адъювантной химиотерапии при местно-распространенном колоректальном раке с метастазами в региональные лимфоузлы после радикальных оперативных вмешательств (патент RU 2618405, МПК G01N 33/48, опубл 03.05.2017, Бюл. №10), включающий исследование уровня VEGF и циркулирующих опухолевых клеток в крови больных на 7 сутки после оперативного вмешательства, определение уровня VEGF в периферической крови больного, а затем проведения 6 курсов адьювантной химиотерапии, причем через 3 недели после окончания 6 курса адъювантной химиотерапии определяют уровень VEGF и число циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови больного.
К причинам, препятствующим достижению указанного ниже технического результата при использовании известного способа относится то, что он не может быть использован для прогнозирования положительного исхода РЯ после адъювантной XT еще до начала XT.
Сущность предлагаемого способа прогнозирования исхода распространенного рака яичников после адъюватной химиотерапии по схеме АР заключается в том, что определение проводят в опухолевой ткани первичной больной, полученной интраоперационно, с последующим расчетом интегрального показателя I по формуле , где х - показатель VEGF А, y - показатель ERCC1, причем, при значении I<2 прогноз считается положительным с вероятностью 81%, при значении I>2 прогноз считается неблагоприятным в 75% случаев.
Использование предлагаемого изобретения обеспечивает следующий технический результат: прогнозирование исхода рака яичников после адъювантной химиотерапии по схеме АР для индивидуализации тактики и улучшения результатов лечения больных.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается одномоментным определением уровней мРНК VEGFA и ERCC1.
Особенность заключается в том, что определение уровней матричной РНК проводят в опухолевой ткани первичной больной, полученной интраоперационно, с последующим расчетом интегрального показателя I по формуле , где х - показатель VEGFA, y - показатель ERCC1, причем, при значении I<2 прогноз считается положительным с вероятностью 81%, а при значении I>2 прогноз считается неблагоприятным в 75% случаев.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источником информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности существенных признаков аналога, позволило выявить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков в заявленном способе, изложенных в формуле изобретения.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".
Способ осуществляется следующим образом. Для молекулярных исследований были использованы интраоперационные опухолевые образцы 34 больных с верифицированным диагнозом «рак яичников», взятые до начала химиотерапевтического лечения. Образцы опухоли помещали в раствор RNALater (Ambion, USA) и сохраняли при температуре -80°С (после 24-часовой инкубации при +4°С) для дальнейшего выделения РНК. Для последующего анализа образцы измельчались стерильным пинцетом. Тотальная РНК была выделена из 68 образцов по 2 от каждого пациента (опухоль + условная норма) с помощью реагента ExtractRNA с использованием дополнительных реагентов (изопропанола, хлороформа) согласно протокола производителя (Евроген, Россия). На спектрофотометре Implen РЗЗО (Germany) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составила от 40 до 300 нг/мкл, А260/А280=1,8-2,05; А260/А230=1,7-2,31.
Для получения кДНК на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием MMLV - ревертазы с применением случайных гексануклеотидных праймеров в соответствии с инструкциями к набору (Набор реактивов MMLV RT kit, Евроген, Россия).
Уровень мРНК ERCC1 и VEGFA оценивали при помощи количественной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) по технологии TaqMan на амплификаторе CFX96 (BioRad, USA) в трех повторностях от каждого образца.
Для исследования экспрессии ERCC1 и VEGFA были использованы зонды Taq-Man Gene Expression Assay (Thermo Scientific, USA), готовая смесь для ПЦР (ООО «Евроген», Россия). Относительная экспрессия генов была оценена с помощью метода Pfaffl в условных единицах относительно генов рефери GAPDH, 18S.
ΔΔCt = ΔCt1(опыт) - ΔCt2(норма). Normalised target gene expression level = 2 (-ΔΔCt).
Для оценки направленности изменений полученные данные были прологарифмированы.
Изобретение является промышленно применимым, так как может быть использовано в медицинских учреждениях и научно-исследовательских институтах онкологического профиля, диспансерах.
Приводим клинические примеры применения "Способа прогнозирования исхода распространенного рака яичников после адъювантной химиотерапии по схеме АР".
12
9
Пример 1. Больная X, 1964 г.р., с жалобами на периодические боли внизу живота поступила на дообследование в гинекологическое отделение ГУЗ ОКОД. При обследовании: OAK от 29.06.2016: эритроциты - 2,85×10/л, гемоглобин - 95 г/л, лейкоциты - 2,6×10/л, СОЭ-8 мм/ч; бак. посев из цервикального канала от 18.01.2016 г. - микрофлора не выделена; УЗИ от 14.01.2016 г.: миометрий неоднородный, в структуре два жидкостных образований 16 и 13 мм с анэхогенным содержимым, в левом яичнике три жидкостных образованиях с анэхогенным содержимым -23,15,16 мм, к левом яичнику вплотную прилежит солидное образование 46×32 мм, с бугристым контуром, единичными кистозными включениями, при ЦДК выраженный кровоток, в малом тазу следы свободной жидкости; СА125 от 12.01.2016 г. 100,7 Ед/мл, ФКС от 22.01.2016 г.: патологии не выявлено, косвенные признаки спаек в брюшной полости; пункция малого таза, выскабливание полости матки от 05.02.2016 г.: о/ц №1521 - клетки мезотелия без атипии; лапаротомия, экстирпация матки с придатками, резекция большого сальника от 18.02.2016 г.: в сальнике инвазивные метастазы низкодифференцированной аденокарциномы, яичник и маточная труба с фиброзными изменениями, диффузный эндометриоз тела матки, эндометрий секреторного типа, кисты на шейки матки.
Гистологический анализ №29927, 29947 низкодифференцированная муцинозная аденокарцинома яичника с распространенными некрозами и участками с резко выраженным ядерным полиморфизмом дистрофической природы.
Установлен диагноз: рак яичников III T3N0M1
В интраоперационном материале определена экспрессия белка VEGF (-0.602) и экспрессия гена ERCC1 (0,133).
Больной после проведения консультации химиотерапевта проведено 6 курсов химиотерапии по схеме АР. При СРКТ-контроле и уровне СА125 через 5 недель после 6 курса химиотерапии данных за прогрессирование процесса не выявлено. При контрольном обследовании в апреле 2017 данных за прогрессирование процесса не выявлено.
12
9
Пример 2. Больная Z., 1961 г.р., с жалобами на периодические боли внизу живота, увеличение объема живота в течение 1 месяца и общую слабость поступила на дообследование в гинекологическое отделение ГУЗ ОКОД. При обследовании: OAK от 20.11.2016: эритроциты - 4,85×10/л, гемоглобин - 105 г/л, лейкоциты - 4,6×10/л, СОЭ-38 мм/ч; бак. посев из цервикального канала от 18.11.2016 г. - микрофлора не выделена; УЗИ малого таза: структура матки однородная, шейка матки чистая, солидные образования обоих яичников, при ЦДК выраженный кровоток, в малом тазу следы свободной жидкости; СА125 от 15.11.2016 г. 905,3 Ед/мл. ФКС от 22.11.2016 г.: патологии не выявлено; Экстирпация матки с придатками, оментэктомия от 20.01.2017: гистологический анализ №38674, №38695 низкодифференцированный рак яичника эндометриоидного типа, MTS по серозе матки, большом сальнике, железистый полип эндометрия, многоузловая миома матки. Шейка матки без особенностей.
Установлен диагноз: рак яичников IV T3N0M1, Канцероматоз плевры, 2017
В интраоперационном материале определена экспрессия белка VEGF (-1.039) и экспрессия гена ERCC1 (3.805).
Больной после проведения консультации химиотерапевта проведено 6 курсов химиотерапии по схеме АР. При СРКТ-контроле и уровне СА125 через 5 недель после 6 курса химиотерапии данных за прогрессирование процесса не выявлено. При контрольном обследовании в апреле 2018 г.рецидив (через 9 месяцев после последнего курса химиотерапии).
Под нашим наблюдением находилось 34 больных распространенным раком яичников T3N0M1. Диагноз был верифицирован во всех случаях. Всем больным выполнена радикальная операция: экстирпация матки с придатками, оментэктомия. Всем больным в интраоперационно полученной опухолевой ткани были определены мРНК VEGF-A и ERCC1.
Из 34 больных распространенным раком яичников в возрасте от 38 до 53 лет, пролеченных в ГУЗ ОКОД, у 21 из 25 больной с I<2 через 5, 28 и 48 недель после 6-го курса химиотерапии по схеме АР данных за прогрессирование процесса не выявлено. Из 13 больных с I>2 у 10 больных был рецидив заболевания через 9 месяцев после 6 курса химиотерапии по схеме АР.
Полученные результаты позволили нам сделать вывод, что при I меньше 2 положительный исход распространенного рака яичников после адъювантной химиотерапии по схеме АР имеет место с вероятностью 81%; при значении I больше 2 неблагоприятный прогноз имеет место с вероятностью 71%, что является показанием при выборе схемы адъювантной химиотерапии.
Технико-экономическая эффективность «Способа прогнозирования исхода распространенного рака яичников после адъювантной химиотреапии по схеме АР» заключается в том, что использование способа позволяет прогнозировать ответ организма при распространенном раке яичников на химиотерапию по схеме АР, что позволяет индивидуализировать тактику лечения, способ прост в исполнении. Способ позволяет снизить затраты на лечение распространенного рака яичников путем исключения заведомо неэффективной схемы химиотерапии первой линии.
Способ прогнозирования исхода распространенного рака яичников после адъювантной химиотерапии по схеме АР, включающий исследование в полученной интраоперационно опухолевой ткани первичной больной уровней мРНК VEGF-A и ERCC 1 и последующий расчет показателя , где х - показатель мРНК VEGF-A, y - показатель мРНК ERCC1, при значении I<2 определяют с вероятностью 81% положительный исход рака яичников, при I>2 определяют с вероятностью 75% неблагоприятный исход рака яичников при химиотерапии по схеме АР, что является показанием к использованию или исключению этой схемы при планировании лечения.