Средство растительного происхождения, обладающее антиоксидантным действием
HERBAL REMEDY WITH ANTIOXIDANT EFFECT

Изобретение относится к фармакологии и фармацевтической промышленности и может быть использовано для профилактики и терапии заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Изобретение относится к средствам на основе растительного сырья, обладающих антиоксидантным действием.
Многолетние фундаментальные исследования ученых многих стран показали, что нарушение активности антиоксидантной защиты живого организма является универсальным патогенетическим фактором возникновения и развития значительного ряда патологических состояний. Роль окислительного стресса в патогенетическом механизме сердечнососудистых, онкологических, легочных, нейродегенеративных, эндокринных заболеваний, нарушений мозгового кровообращения и др. является общепризнанной во всем мире (Боголепова А.Н. Роль оксидантного стресса в развитии сосудистых когнитивных расстройств //Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2020. - Т. 120, №8. - С.1-7. doi: 10.17116/jnevro20201200811; Иванов В.В., Шахристова Е.В., Стеновая Е.А. и др. Окислительный стресс в патогенезе сахарного диабета 1 типа: роль ксантиноксидазы адипоцитов //Бюллетень сибирской медицины. - 2017. - Т. 16, №4. - С.134-143. doi: 10.20538/1682-0363-2017-4-134-143; Менъщикова, Е.Б., Зенков, Н.К., Панкин, В.З. и др. Окислительный стресс. Патологические состояния и заболевания. - Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2017. - 284 с; Оксидативный стресс и воспаление: патогенетическое партнерство, /под. ред. О.Г. Хурцилавы, Н.Н. Плужникова, Я.А. Накатиса. - СПб.: Издательство СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2012. -340 с; Олефир Ю.В., Романов Б.К., Кукес В.Т. и др. Роль окислительного стресса в патогенезе социально значимых заболеваний человека и пути его медикаментозной коррекции //Медицинский вестник Северного Кавказа. - 2021. - Т. 16, №4. - С.450-455. doi: 10.14300/тппс.2021.16109; Поварова О.В., Городецкая Е.А., Каленикова Е.И. и др. Метаболические маркеры и окислительный стресс в патогенезе ожирения у детей //Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2020. - Т. 65, №1. - С.22-29. doi: 10.21508/1027-4065-2020-65-1-22-29; Ходос М.Я., Казаков Я.Е., Видревич М.Б. и др. Окислительный стресс и его роль в патогенезе //Вестник уральской медицинской академической науки. - 2017. - Т. 14, №4. - С.381-398. doi: 10.22138/2500-0918-2017-14-4-381-398; Mere Ilia A., Repetto М., Lazarowski А., et al. Hypoxia, oxidative stress, and Inflammation: three faces of neurodegenerative diseases //Journal of Alzheimers Disease. - 2021. - Vol.82, №s1. - Pp.109-126. doi: 10.3233/JAD-201074; Qaddumi W.N., Jose P.A. The role of the renal dopaminergic system and oxidative stress in the pathogenesis of hypertension //Biomedicines. - 2021. - Vol.9, №2. - Pp.139-162. doi: 10.3390/biomedicines9020139; Shao A., Lin D., Wang L., et al. Oxidative stress at the crossroads of aging, stroke and depression //Aging and Disease. - 2020. - Vol.11, №6.-Pp.1537-1566. doi: 10.14336/AD.2020.0225; Sies H. Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine //Redox Biology. - 2015. - Vol.4. - Pp.180-183. doi: 10.1016/j.redox.2015.01.002; Siti H.N., Kamisah Y., Kamsiah J. The role of oxidative stress, antioxidants and vascular inflammation in cardiovascular disease (a review) //Vascular Pharmacology. - 2015. - Vol.71. - Pp.40-56. doi: 10.1016/j.vph.2015.03.005; Zhang В., Li P., Li J., et al. Effect of oxidative stress on diaphragm dysfunction and exercise intervention in chronic obstructive pulmonary disease //Frontiers in Physiology. - 2021. - Vol.12:684453. doi: 10.3389/fphys.2021.684453). Среди прочих механизмов окислительный стресс играет важную роль в скорости старения (Luo J., Mills К., Cessie S. I., et al. Ageing, age-related diseases and oxidative stress: what to do next? //Ageing Research Reviews. - 2020. - Vol.57:100982. doi: 10.1016/j.arr.2019.100982). Имеются исследования о роли окислительного стресса в инфекциях SARS-CoV и SARS-CoV-2 (Даренская М.А., Колесникова Л.И., Колесников СИ. COVID-19: окислительный стресс и актуальность антиоксидантной терапии //Вестник РАМН. - 2020. - Т. 75, №4. - С.318-325. doi: 10.15690/vramn1360; Suhail S., Zajac J., Fossum C, et al. Role of Oxidative stress on SARS-CoV (SARS) and SARS-CoV-2 (COVID-19) Infection: a review //Journal of Protein Chemistry. - 2020. - Vol.39, №6. - Pp.644-656. doi: 10.1007/s10930-020-09935-8). В связи с этим, проблема поиска перспективных лекарственных средств, позволяющих тормозить и предотвращать реакции образования свободных радикалов, находится в центре внимания многих исследователей.
Особый интерес для профилактики и терапии нарушений в организме естественного баланса скорости свободнорадикального окисления представляют природные антиоксиданты растительного происхождения (Владимиров Г.К., Сергунова Е.В., Измайлов Д.Ю., и др. Хемилюминесцентная методика определения общей антиоксидантной емкости в лекарственном растительном сырье //Вестник РГМУ. - 2016. - №2. - С.65-72; Скрыпник Л.Н., Мурашова А.А. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств растений некоторых видов рода Sambucus L. //Химия растительного сырья. - 2019. -ML- С.127-137. doi: 10.14258/jcprm.2019014037; Ферубко Е.В., Зеленков В.Н., Лапин А.А., и др. Оценка антиоксидантной активности растительных средств //Химия растительного сырья. - 2020. - №4. - С.187-193. DOI: 10.14258/jcprm.2020047705; Gupta V.K., Sharma S.K. Plants as natural antioxidants //Natural Product Radiance. - 2006. - Vol.5, №4. - Pp.326-334; Kasote D. M., Katyare S.S., Hegde M. V, et al. Significance of antioxidant potential of plants and its relevance to therapeutic applications //International Journal of Biological Sciences. - 2015. - Vol.11, №8. - Pp.982-991. doi: 10.7150/ijbs.12096). В растениях содержатся различные комбинации биологически активных веществ первичного и вторичного синтеза, что обуславливает их эффективность как антиоксидантов за счет синергических эффектов. Средства растительного происхождения можно рассматривать как естественные полифункциональные антиоксиданты, биологически активные вещества которых, способные инактивировать свободные радикалы по разным механизмам (Яшин Я.И., Рыжнев В.Ю., Яшин А.Я., и др. Природные антиоксиданты. Содержание в пищевых продуктах и их влияние на здоровье и старение человека. - М.: ТрансЛит, 2009. - 212 с). Кроме того, являясь природными естественными антиоксидантами, биологически активные вещества растений органично корректируют свободнорадикальные процессы в организме и практически не дают побочных эффектов, которые часто проявляются у синтетических препаратов.
Значительный резерв поиска растений антиоксидантов представляет род Vaccinium L. Компонентный состав видов рода Vaccinium L. представлен разнообразными группами фенольных соединений (Белова Е.А., Тритэк B.C., Шулъгау З.Т., и др. Изучение фенольных соединений ягод трех видов растений рода Vaccinium, произрастающих в Ханты-Мансийском автономном округе //Химия растительного сырья. - 2020. - №1. - С.107-116. doi: 10.14258/jcprm.2020014534; Марсов Н.Г. Фитохимическое изучение и биологическая активность брусники, клюквы и черники. Автореф. дис... канд. фарм. наук. - Пермь, 2006. - 24 с; Растительные ресурсы России: дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т. 2. Семейства Actinidiaceae-Malvaceae, Euphorbiaceae-Haloragaceae. /отв. ред. А.Л. Буданцев. - СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2009. - 513 с; Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Paeoniaceae-Thymelaeaceae. /отв. ред. П.Д. Соколов. - Л.: Наука, 1986. - 336 с; Vrancheva R., Ivanov I., Badjakov I., et al. Optimization of polyphenols extraction process with antioxidant properties from wild Vaccinium myrtillus L. (bilberry) and Vaccinium vitis-idaea L. (lingonberry) leaves //Food Science and Applied Biotechnology. - 2020. - Vol.3, №2. - Pp.149-156. doi: 10.3072l/fsab2020.v3A2.98; Su Z. Anthocyanins and flavonoids of Vaccinium L. //Pharmaceutical Crops. - 2012. - Vol.3, №1. - Pp.7-37. doi: 10.2174/2210290601203010007; Tundis R, Tenuta M. C, Loizzo M.R., et al. Vaccinium species (Ericaceae): from chemical composition to bio-functional activities //Applied Sciences. - 2021. - Vol.11, №12:5655. doi: 10.3390/appl 1125655; Bujor O-C, Tanase С, Popa M.E. Phenolic antioxidants in aerial parts of wild Vaccinium species: towards pharmaceutical and biological properties //Antioxidants. -2019. - Vol.8, №12:649. doi: 10.3390/antiox8120649), которые, как известно, относятся к экзогенным факторам актиоксидантной защиты первой линии. Фенольные соединения проявляют свою антиоксидантную активность путем прямого поглощения активных форм кислорода, ингибирования ферментов, участвующих в окислительном стрессе, в регенерации других антиоксидантов, хелатирования ионов металлов, ответственных за производство активных форм кислорода, а также в стимуляции эндогенных систем антиоксидантной защиты (Bujor О-С, Tanase С, Рора М.Е. Phenolic antioxidants in aerial parts of wild Vaccinium species: towards pharmaceutical and biological properties //Antioxidants. - 2019. - Vol.8, №12:649. doi: 10.3390/antiox8120649; Бурлев B.A., Ледина А.В., Ильясова H.A. Флавоноиды: значение антиоксидантных и антиангиогенных свойств в акушерстве и гинекологии (обзор литературы) //Проблемы репродукции. -2010. - Т. 16, №1. - С.24-31; Зенков Н.К., Кандалинцева, Н. В., Ланкин, В.З., и др. Фенольные биоантиоксиданты. - Новосибирск: Сиб. отд-ние РАМН, 2003. - 328 с; Иванова М.В., Шумаев КБ., Дудылина А.Л., и др. Защитное действие природных фенольных соединений при окислении гомогената сердца крыс //Биорадикалы и антиоксиданты. - 2019. - Т. 6, №2. - С.25-37; Меньщикова Е.Б., Ланкин, В.З., Кандалинцева Н.В. Фенольные антиоксиданты в биологии и медицине. - Saarbrucken: LAP LAMBERT Academic Publishing, 2012. - 496 с).
Среди представителей рода Vaccinium L. известны антиоксидантные свойства черники обыкновенной Vaccinium myrtillus L. (Растительныересурсы России: дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Т.2. Семейства Actinidiaceae-Malvaceae, Euphorbiaceae-Haloragaceae. /отв. ред. А.Л. Буданцев. - СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2009. - 513 с; Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Paeoniaceae-Thymelaeaceae. /отв. ред. П.Д. Соколов. - Л.: Наука, 1986. - 336 с; Vrancheva R., Ivanov /., Badjakov I., et al. Optimization of polyphenols extraction process with antioxidant properties from wild Vaccinium myrtillus L. (bilberry) and Vaccinium vitis-idaea L. (lingonberry) leaves //Food Science and Applied Biotechnology. - 2020. - Vol.3, №2. - Pp.149-156. doi: 10.3072l/fsab2020.v3.i2.98; Su Z. Anthocyanins and flavonoids of Vaccinium L. //Pharmaceutical Crops. - 2012. - Vol.3, №1. - Pp.7-37. doi: 10.2174/2210290601203010007; Tundis R, Tenuta M. C, Loizzo M.R., et al. Vaccinium species (Ericaceae): from chemical composition to bio-functional activities //Applied Sciences. - 2021. - Vol.11, №12:5655. doi: 10.3390/appl 1125655; Bujor O-C, Tanase С, Popa M.E. Phenolic antioxidants in aerial parts of wild Vaccinium species: towards pharmaceutical and biological properties //Antioxidants. - 2019. - Vol.8, №12:649. doi: 10.3390/antiox8120649; Макарова H.B., Еремеева Н.Б. Сравнительное изучение влияния ультразвуковых воздействий на экстракцию антиоксидантных соединений ягод черники (Vaccinium myrtillus L.) //Химия растительного сырья. - 2020. - №1. - С 167-177. doi: 10.14258/jcprm.2020014425; Diaconeasa Z., Leopold L., Rugind D., et al. Antiproliferative and antioxidant properties of anthocyanin rich extracts from blueberry and blackcurrant juice //International Journal of Molecular Sciences. - 2015. - Vol.16, №2. - Pp.2352-2365. doi: 10.3390/ijmsl6022352; Tunde J., Vicas L. G., Marian E., et al. A new natural antioxidant supplement -design and development //Farmacia. - 2016. - Vol.64, №1. - Pp.135-142). С точки зрения систематики к чернике обыкновенной Vaccinium myrtillus L. близка черника пазушная Vaccinium axillare Nakai - оба вида относятся к секции Myrtillus Dumortier (Копанина А.В. Биология, экология и хозяйственное значение черники овалънолистной (Vaccinium ovalifolium Smith) на Сахалине. Автореф. дис... канд. биол. наук. - Владивосток, 2005. - 19 с; Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). Русское издание. - СПб.: Мир и семья, 1995. - 992 с). Черника пазушная Vaccinium axillare Nakai с филогенетической точки зрения представляет интерес как антиоксидантное средство. В патентной и научно-медицинской литературе авторами не обнаружено сведений об антиоксидантных свойствах черники пазушной Vaccinium axillare Nakai.
Задача изобретения - предложить новое нетоксичное средство растительного происхождения, обладающее антиоксидантным действием в условиях окислительного стресса.
Техническим результатом данного изобретения является расширение арсенала средств растительного происхождения, обладающих антиоксидантным действием.
Технический результат достигается благодаря применению водного экстракта черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, полученного экстракцией измельченных до 3 мм плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием, в качестве средства с антиоксидантным действием.
Впервые установлено, что в качестве средства растительного происхождения, обладающего антиоксидантной и антирадикальной активностью можно использовать экстракт плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai.
Черника пазушная Vaccinium axillare Nakai встречается на территории материковой и островной части российского Дальнего Востока и имеет достаточно обеспеченную сырьевую базу (Копотева Т.А., Великое А.В., Мечикова Г.Я. Ресурсы черники пазушной (Vaccinium axillare Nakai) в Хабаровском крае. //Природопользование на Дальнем Востоке России: сб. тез. докл. региональной науч. конф., Хабаровск, 19-20 января 2006 г. - Хабаровск: ИВЭП ДВО РАН, 2006. - С.17-18 с; Копотева Т.А., Великое А.В. Урожайность дикорастущего ягодного кустарника черники овальнолистной (Vaccinium ovalifolia) на нижнем Амуре //Весник Красноярского государственного аграрного университета. - 2009. - №5. - С.50-55; Копотева Т.А., Великое А.В. Фитоценотические условия произрастания и урожайность плодов Vaccinium axillare (Ericaceae) на нижнем Амуре //Растительные ресурсы. - 2011. - Т. 47, №2. - С.57-65; Нечаев А.А., Грек B.C., Морин В.А. Сохранение генофонда Vaccinium axillare Nakai в нижнем Приамурье (Хабаровский край) //Хвойные бореальной зоны. - 2012. - Т. 30, №1-2. - С.136-139; Нечаев А.А. Продуктивность и ресурсы ягод брусники, черники пазушной и рябины бузинолтсьной на Дальнем Востоке //Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства: материалы Междунар. науч.-практ.конф., посвящ. 85-летию ВНИИОЗ, Киров, 22-25 мая 2007 г. - Киров.: ГНУ ВНИИОЗ, 2007. - С.315-316 с; Нечаев А.А. Черника пазушная на Дальнем Востоке: экология, продуктивность, ресурсы //Классификация и динамика лесов Дальнего Востока: материалы Междунар. конф., Владивосток, 5-7 сентября 2001 г. - Владивосток.:Дальнаука, 2001. - С.259-261 с). За пределами Российской Федерации этот трансконтинентальный вид описан для Японии и Северной Америки (Копанина А.В. Биология, экология и хозяйственное значение черники овалънолистной (Vaccinium ovalifolium Smith) на Сахалине. Автореф. due... канд. биол. наук. - Владивосток, 2005. - 19 с).
Черника пазушнная Vaccinium axillare Nakai ценный ягодник, имеющий пищевое и лекарственное значение. Плоды черники пазушной Vaccinium axillare Nakai применяют в народной медицине в качестве вяжущего средства при острых и хронических расстройствах желудочно-кишечного тракта, для уменьшения усталости глаз, при малокровии, воспалении, геморроидальных кровотечениях, почечно-каменной болезни, подагре, авитаминозе (Копанина А.В. Биология,экология и хозяйственное значение черники овалънолистной (Vaccinium ovalifolium Smith) на Сахалине. Автореф. дис... канд. биол. наук. - Владивосток, 2005. - 19 с; Сабитов А.Ш., Чебукин П.А., Чжан Ц., и др. Мобилизация генетического разнообразия диких родичей культурных растений Дальнего Востока России и Северо-Восточного Китая (по материалам экспедиций ДВОС ВИР 2001-2013 гг.) //Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. - 2014. - Т. 175, №4. - С.28-45; Hummer К.Е., Sabitov A.S., Vavilov N.I., et al. Vaccinium from Primorsky, Khabarovsk, Amursky and the Sakhalin territories, russia //Acta Horticulturae. - 2006. - №715. - Pp.91-96. doi: 10.17660/ActaHortic.2006.1'15.11; Sabitov A., Chebukin P., Hummer K.E. Plant exploration for fruit genetic resources in Sakhalin territory //Acta Horticulturae. - 2007. - №760. - Pp.381-388. doi: 10.17660/ActaHortic.2007.760.51). В эксперименте глюкозотолерантного теста для побегов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai установлено гипогликемическое и глюкозурическое действие; гипогликемический эффект побегов подтвержден также в эксперименте на модели аллоксанового диабета (Степанова Т.А., Мечикова Г.Я., Морозова В.Е., и др. Применение побегов черники пазушной в качестве средства, проявляющего активизацию утилизации глюкозы мозгом при лечении сахарного диабета. Пат. РФ №2418602; опубл. 20.05.2011). Показано, что побеги черники пазушной Vaccinium axillare Nakai обладают большей способностью активировать утилизацию глюкозы мозгом при сахарном диабете, по сравнению с черникой обыкновенной Vaccinium myrtillus L. Из листьев черники Vaccinium axillare Nakai были структурно идентифицированы и изучены in vitro десять вторичных метаболитов фенольной природы как потенциальные противораковые средства (Mechikova G.Y., Kuzmich A.S., Ponomarenko L.P., et al. Cancer-preventive activities of secondary metabolites from leaves of the bilberry Vaccinium smallii A. Gray. //Phytotherapy Research. -2010. - Vol.24, №11. - Pp.1730-1732. doi: 10.1002/ptr.3282). Результаты исследования показали, что соединения ингибируют EGF-индуцированную неопластическую трансформацию клеток мыши JB6 С1 41 Р+ в мягком агаре с ингибирующей концентрацией (INCC50) 20-80 мкм. Для плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai продемонстрирована антипролиферативная активность в отношении раковых клеточных линий и показано влияние на дифференцировку клеток HL-60 в зрелые моноциты (Yoshizawa Y., Kawaii S., Urashima M., et al. Differentiation-inducing effects of small fruit juices on HL-60 leukemic cells //Journal of Agricultural and Food Chemistry. - 2000. - Vol.48, № 8. - Pp.3177-3182. doi: 10.1021/jf9908650; Yoshizawa Y, Kawaii S., Urashima M., et al. Antiproliferative effects of small fruit juices on several cancer cell lines //Anticancer Research. - 2000. - Vol.20, №6B. - Pp.4285-4289).
Патентно-информационный поиск показал, что полного аналога предлагаемого средства, обладающего антиоксидантной и антирадикальной активностью, нет.Заявителями не обнаружены данные о средстве растительного происхождения, обладающим антиоксидантным и антирадикальным действием в условиях окислительного стресса и представляющим собой водный экстракт черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, полученный экстракцией измельченных до 3 мм плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием.
Биологически активный комплекс плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, как показали исследования, содержит различные группы фенольных соединений (Мечикова Г.Я., Чумак К.А., Степанова Т.А. К вопросу о содержании биологически активных веществ в плодах дальневосточных видов черники - ч. пазушной и ч. волосистой. //Ресурсы и экологические проблемы Дальнего Востока: материалы межрегиональной науч.-практ.конф., Хабаровск, 20-22 февраля 2006 г. - Хабаровск: ДВГГУ, 2006. - С.218-222; Чумак К.А., Мечикова Г.Я., Степанова Т.А. Сравнительный анализ содержания биологически активных веществ в замороженных плодах черники. //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. - Пятигорск: ПГФА, 2008. - С.109-110). Многолетние исследовании фенольных соединений с 2003 года показали, что содержание общей суммы фенольных соединений, антоцианов и дубильных веществ в плодах черники пазушной Vaccinium axillare Nakai находится в пределах 6,5-10,2%, 1,1-2,9% и 5,1-8,9%, соответственно. С помощью хроматографии в тонком слое сорбента с использованием веществ свидетелей в плодах черники пазушной Vaccinium axillare Nakai были обнаружены оксикоричные кислоты, флавоноиды группы кверцетина. Анализ показал, что плоды черники пазушной Vaccinium axillare Nakai богаты органическими кислотами - содержание колеблется от 12,1 до 19,1%, макро- и микроэлементами.
Новизной данного изобретения является то, что впервые в качестве средства растительного происхождения, обладающего антиоксидантным действием в условиях окислительного стресса, предлагается использовать водный экстракт черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, полученный экстракцией измельченных до 3 мм плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием.
Применение экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, полученного экстракцией измельченных до 3 мм плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием, по предлагаемому назначению стало возможным в результате выявления в модели эксперимента in vivo его новых фармакологических свойств, а именно активное ингибирование процессов генерации свободных радикалов и препятствие снижению активности перекисной резистентности и активности антиоксидантной и антирадикальной защиты системы в условиях окислительного стресса.
Новые обнаруженные свойства экстракта черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, полученного экстракцией измельченных до 3 мм плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием, явным образом не следуют из уровня техники и не являются очевидными для специалистов.
Заявленное изобретение может быть использовано при создании нового лекарственного растительного препарата, для серийного производства лекарственных растительных средств.
Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.
Пример 1. Исследование острой токсичности экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai.
Острая токсичность экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, полученного экстракцией измельченных до 3 мм плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием была изучена на 24 белых мышах самцах массой 20-25 г. Изучение общей токсичности проводили в соответствии с руководством по проведению экспериментальных (доклинических) исследований лекарственных средств (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая, /подред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с; Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, /под общей ред. Р. У. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 2005. - 832 с). Подопытных животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с нормативными требованиями: при свободном доступе к воде и пище, стандартном температурном и световом режиме и т.д. (Федеральный закон от 12.04.2010 №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» (ред. от 26.03.22 г. ); ГОСТ 33044-2014. Принципы надлежащей лабораторной практики. - М.: Стандартинформ, 2019. - 16 с; ГОСТ 33215-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур. - М.: Стандартинформ, 2019. - 20 с; ГОСТ 33216-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами. - М.: Стандартинформ, 2019. - 15 с; Федеральный закон от 27.12.2018 №498-ФЗ «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации»). Перед началом эксперимента животные прошли карантин в течение 14 дней. Экспериментальные опытные группы и контрольная группа состояли из шести животных, контролем служили интактные животные. Экстракт плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai вводили однократно перорально с помощью зонда в диапазоне доз 5 мл/кг - 20 мл/кг. При выборе доз ориентировались на адекватную среднесуточную дозу экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai для человека и на максимальный объем жидкости, допустимой при внутрижелудочном введении мышам.
В первый день после введения экстракта животные находились под непрерывным наблюдением. Общая продолжительность наблюдения за животными при исследовании острой токсичности составляла 14 дней. Регулярно фиксировалось общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, координация движений, реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, частота и глубина дыхательных движений, состояние волосяного и кожного покрова, положение хвоста, количество и консистенция фекальных масс, потребление корма и воды.
После введения экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai в течение 15 минут животные казались несколько вялыми, что объяснялось реакцией на введение. По истечении 15 минут данные явления прекращались, и животные чувствовали себя нормально. Дальнейшие наблюдения не выявили нарушений или отклонений общего состояния экспериментальных групп животных по сравнению с контрольной группой животных. Симптомы острого отравления отсутствовали. Гибели животных в течение всего эксперимента не наблюдалось (табл.1).
Результаты исследования не позволили определить LD50 экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, так как все животные были живы. Максимальная вводимая доза экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai составила 20 мл/кг веса животного, при введении больших доз по объему у подопытных животных могли возникнуть осложнения.
Таким образом, полученные результаты определения острой токсичности в соответствии с классификацией токсичности химических веществ по ГОСТ 12.1.007-76 показали, что экстракт плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai безопасен и при пероральном введении относится к группе «Малоопасные вещества» (IV класс токсичности) (ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. - М.: Стандартинформ, 2007.- 7 с).
Пример 2. Исследование антиоксидантной активности экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai.
Исследования антиоксидантной активности проводили in vivo на белых мышах самцах линии СВА массой 20-25 г. Подопытных животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с нормативными требованиями: при свободном доступе к воде и пище, стандартном температурном и световом режиме и т.д. (Федеральный закон от 12.04.2010№61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» (ред. от 26.03.22 г. ); ГОСТ 33044-2014. Принципы надлежащей лабораторной практики. - М.: Стандартинформ, 2019. - 16 с; ГОСТ 33215-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила оборудования помещений и организации процедур. - М.: Стандартинформ, 2019. - 20 с; ГОСТ 33216-2014. Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами. - М.: Стандартинформ, 2019. - 15 с). При выведении животных из эксперимента руководствовались Федеральным законом №498 «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации» (Федеральный закон от 27.12.2018 №498-ФЗ «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации») и Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22.09.2010 о защите животных, использующихся для научных целей. Протокол исследования утвержден на заседании этического комитета при ФГБОУ ВО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Минздрава России. Животные, участвующие в эксперименте, были акклиматизированы к лабораторным условиям за 2 недели до начала эксперимента. Во время «привыкания» животным давали стандартный лабораторный рацион пищи и воду ежедневно взвешивали; последнее взвешивание проводили за 1 сутки до начала эксперимента.
Антиоксидантную активность плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai изучали на модели индуцированной нефротоксичности. Повреждение почек животных вызывали однократной инъекцией противоопухолевого препарата Цисплатин-ЛЭНС, обладающего, как известно, мощным токсическим действием на органы и ткани. Исследования последних лет показали, что ключевым механизмом его токсичности является индуцированный окислительный стресс, основными мишенями которого являются митохондрии клеток. В серии экспериментов на животных было продемонстрировано увеличение перекисного окисления липидов, что подтверждалось повышенным уровнем малондиальдегида, а также снижение активности эндогенных антиоксидантных ферментов, таких как супероксиддисмутазы, каталазы, глутатион пероксидазы в клеточных мембранах в результате индуцированной цисплатином нефротоксичности и гепатотоксичности (Fang Су., LouDy., ZhouLq., etal. Natural products: potential treatments for cisplatin-induced nephrotoxicity. //Acta Pharmacologica Sinica. -2021. - Vol.42, №12. -Pp.1951-1969. doi: 10.1038/s41401-021-00620-9).
Исследования проводили на 40 животных, из которых были сформированы случайным образом 4 группы по 10 особей в каждой: группа интактных животных, контрольная группа, группа «цисплатин» и группа «цисплатин + черника». В контрольной группе животные получали перорально с помощью зонда ежедневно в течение 10 дней физиологический раствор натрия хлорида в дозе 10 мл/кг массы животного. Интактная группа животных использовалась в эксперименте как дополнительный контроль и в течение всего эксперимента содержалась в стандартных условиях вивария. В группе «цисплатин» животные получали физиологический раствор натрия хлорида в технике и режиме контрольной группы, на пятый день эксперимента однократно путем внутрибрюшинной инъекции был введен цисплатин в дозе 7,5 мг/кг. Животные группы «цисплатин + черника» ежедневно в течение 10 дней получали перорально с помощью зонда экстракт плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai в дозе 10 мл/кг, на пятый день эксперимента однократно путем внутрибрюшинной инъекции был введен цисплатин в дозе 7,5 мг/кг. Используемая доза экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai была определена как наиболее адекватная к среднесуточному применению экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai для человека в пересчете на используемых в исследованиях подопытных животных.
На одиннадцатый день эксперимента животных четырех групп выводили из эксперимента путем быстрой декапитации, предварительно использовали эфирный наркоз. У каждого животного извлекали левую почку, которую гомогенизировали для последующего анализа.
Для оценки процессов биогенеза свободных радикалов в гомогенизированных тканях почек использовали метод хемилюминесценции, который по праву считается одним из основных методов изучения свободнорадикальных процессов в научных и клинических исследованиях (Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная хемилюминесценция. //Успехи биологической химии. - 2009. - Т. 49. - С.341-388).
Регистрацию хемилюминесценции осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50 В «PERKIN ELMER». Стандартизацию сигнала и математическую обработку кривых хемилюминесценции выполняли с помощью встроенной программы «Finlab».
2+
2+
2
2
2
2
Алгоритм хемилюминесцентного исследования свободнорадикального статуса гомогенизированных тканей почек включал определение одного параметра интенсивности спонтанного (собственного) свечения и четырех параметров активированного свечения биосубстрата. Анализировали светосумму за 1 минуту спонтанной хемилюминесценции (Ssp) (интенсивность генерации свободных радикалов), максимум амплитуды быстрой вспышки Ре-индуцированного свечения (h), светосумму за 2 минуты после быстрой вспышки Ре-индуцированной хемилюминесценции (Sind-1), максимум биологического свечения НО-индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции (Н) и светосумму за 2 минуты НО-индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции (Sind-2). Показатель h свидетельствует о содержании гидроперекисей липидов, a Sind-1 отражает скорость образования перекисных радикалов преимущественно липидной природы. Величины Н и Sind-2 обратно коррелируют с перекисной резистентностью субстрата и с активностью антиоксидантной антирадикальной системы защиты, соответственно. Интенсивность хемилюминесценции, измеренную в милливольтах, рассчитывали на 1 г влажной ткани, взятой во время забоя животных, и выражали в относительных единицах. Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически при помощи программ Microsoft Excel, а также компьютерной прикладной программы "Statistica 10 for Windows". О достоверности различий выборок судили методом проверки гипотезы с использованием t-критерия Стьюдента. Критический уровень значимости Р при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05. Экспериментальные данные представлены в виде среднего арифметического М и стандартной ошибки среднего т.Результаты исследований представлены в таблице 2.
Сравнение данных по критерию Стьюдента показало отсутствие достоверных различий показателей свободнорадикального статуса (Ssp) в гомогенате тканей почек интактной и контрольной группах животных. Активность антиоксидантной и антирадикальной системы защиты и уровень перекисной резистентности в обеих группах животных также находились на одном уровне, о чем свидетельствовали соответствующие хемилюминесцентные величины: Sind-2 и Н. Содержание гидроперекисей липидов (h) и перекисных радикалов липидной природы (Sind-1) в гомогенате тканей интактной и контрольной групп животных также значимо не различались.
Введение животным однократной инъекции цисплатина в дозе 7,5 мг/кг вызвало достоверную интенсификацию процессов свободнорадикального окисления в почках мышей. Как следует из таблицы, наблюдается гиперпродукция свободных радикалов - показатель светосуммы за 1 минуту спонтанной хемилюминесценции (Ssp) в группе животных «цисплатин» превышает аналогичный показатель в контрольной и интактной группах почти в 3 раза. В этой же группе животных в гомогенате тканей почек зарегистрирована закономерная активация процессов перекисного окисления липидов. Так, скорость накопления перекисных радикалов липидной природы (Sind-1) возросла в 2 раза по сравнению с контрольной группой. Неизбежным следствием последнего явилось превышение контрольных значений содержания гидроперекисей липидов (h) в группе животных «цисплатин» в 2,4 раз. Нарушение процессинга свободных радикалов в обсуждаемой опытной группе животных на фоне однократной инъекции цисплатина, обусловлено угнетением систем антиоксидатной антирадикальной защиты, о чем свидетельствует показатель Sind-2, который возрос по сравнению с интактной и контрольной группами в среднем в 2,5 раза. Угнетение защитных систем привело к снижению резистентности к перекисному окислению (Н) в группе животных «цисплатин» по сравнению с контрольной группой и интактной группой почти в 3 раза.
Таким образом, выявленные достоверные изменения показателей хемилюминесценции в группе животных «цисплатин» по отношению к контрольной и интактной группам свидетельствуют о декомпенсированном накоплении продуктов свободнорадикального окисления, то есть о формировании окислительного стресса на фоне однократной внутрибрюшинной инъекции цисплатина из расчета 7,5 мг/кг.
2
2
В группе животных «цисплатин+черника» все исследуемые хемилюминесцентные показатели хотя и сохраняли статистически значимые отличия от контрольной группы и интактной группы, но достоверно были ниже аналогичных показателей в группе животных «цисплатин». Так, уровень генерации активных кислородных метаболитов (Ssp) в группе животных, у которых цисплатин модулированный окислительный стресс был реализован на фоне экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, был достоверно снижен на 36%, по сравнению с группой животных «цисплатин». Внутрижелудочное системное введение водного экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai позволило также снизить в гомогенате тканей почек мышей содержание гидроперекисей липидов (h) на 40% и уменьшить интенсивность накопления перекисных радикалов липидной природы (Sind-1) в 1,5 раз, по сравнению с группой животных «цисплатин», не принимавшей экстракт плодов. Биологически активные вещества плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai в эксперименте модулированного окислительного стресса продемонстрировали повышение перекисной резистентности биологического объекта: максимум свечения (Н), обратно коррелирующий с потенциальной способностью субстрата к перекисному окислению, в группе животных «цисплатин+черника» достоверно уменьшился на 28%, по сравнению с группой животных «цисплатин». На фоне приема экстракта плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai зафиксировано меньшее угнетение цисплатином защитных систем -светосумма за 2 минуты HO-индуцированной люминол-зависимой хемилюминесценции (Sind-2), значение которой обратно активности антиоксидантной и антирадикальной системы защиты биологического объекта, уменьшилась в группе животных «цисплатин+черника» на 26%, по отношению к группе «цисплатин».
Известно, что показателем степени выраженности окислительного стресса может являться антиоксидантная активность биологического объекта как интегральный параметр, отражающий антиоксидант/оксидантный статус организма в целом или его отдельной системы. В связи с этим, полученные данные параметров хемилюминесценции в группе животных «цисплатин+черника» позволяют сделать вывод, что биологически активные вещества черники пазушной Vaccinium axillare Nakai явились регуляторами процессов, протекающих с участием свободных радикалов. Результат этой регуляции, как свидетельствуют проведенные исследования, проявился в уменьшении последствий окислительного стресса.
Таким образом, экстракт черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, полученный экстракцией измельченных до 3 мм плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием, проявляет выраженное антиоксидантное действие с повышенной терапевтической активностью, что заключается в достоверном уменьшении возникших последствий окислительного стресса в живом организме.
Экстракт черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, полученный экстракцией измельченных до 3 мм плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием, отличается отсутствием токсичности, что исключает проблему возникновения побочных эффектов.
Технический результат достигнут благодаря использованию экстракта черники пазушной Vaccinium axillare Nakai, полученного экстракцией измельченных до 3 мм плодов черники пазушной Vaccinium axillare Nakai водой при соотношении сырья к экстрагенту 1:10 на кипящей водяной бане в течение 15 мин с последующим охлаждением до комнатной температуры и процеживанием, в качестве средства с антиоксидантным действием, отличающимся доступной ресурсной сырьевой базой, что позволило расширить арсенал средств растительного происхождения с антиоксидантной активностью.
Все вышесказанное открывает перспективы для расширения производства растительных средств для профилактики и лечения заболеваний, связанных с окислительным стрессом путем его фармакологической коррекции.