Способ моделирования посттравматического стрессового расстройства у лабораторных крыс
METHOD FOR MODELING POST-TRAUMATIC STRESS DISORDER IN LABORATORY RATS

Изобретение относится к психологии поведения животных, психо-нейроэндокринологии, экспериментальной медицине, нейробиологии и касается моделирования симптомов посттравматических стрессорных расстройств в экспериментах на крысах с использованием модифицированной ними модели предаторного стресса.
За последнее время отмечен значительный рост числа лиц, у которых формируется посттравматической стрессовое расстройство (ПТСР). Основной чертой ПТСР является отсроченный характер, проявляющийся в манифестации спустя значительный промежуток времени после выхода организма из экстремальной ситуации. Некоторые признаки клинического синдрома моделируются легче, чем другие. При этом модели на животных, обычно с участием крыс или мышей, используются повсеместно и достаточно успешно. Соответствующие фундаментальные понимания могут быть сформированы у животных и далее экстраполированы в исследования человека [2; 3; 4; 5; 6; 7; 8].
Как показано выше, ПТСР имеет большое количество отдельных симптомов и более того, данное расстройство является чрезвычайно изменчивым среди пациентов. Так как это происходит в головном мозге, возможно, самой сложной части человеческого тела, разнообразие аспектов ПТСР далеко не просто воссоздать в моделях. Достоверность часто проверяется с использованием различных классических тестов таких, как крестообразный лабиринт и открытое поле, а также по результатам измерения гормонального или лекарственного ответа. На данный момент имеется несколько моделей для имитации ПТСР, которые охватывают практически все симптомы и имеют прогностическую достоверность.
Известен стресс хищником (предаторный стресс) - достаточно хорошо проверенная модель ПТСР, первоначально разработанная [1], предполагает использование в качестве стрессора - хищника, который вызывает у грызунов изменение поведения, избегания травм, социальную отстраненность и стойкие, похожие на тревогу ответы. Стресс хищником имеет большую ценность, как врожденная стрессовая угроза для грызунов, которая включает в себя фактическую или возможную смерть или получение серьезной травмы. При этом миндалина, префронтальные кортикальные и гиппокампальные контуры вовлечены в поведенческие изменения, вызванные предаторным стрессом [1].
Данная модель (стресс хищником) проводится один день в течение 10 минут (неизбежное воздействие кошки). Таким образом, животному (грызуну) предъявляется однократное воздействие стрессором, тем самым вызывая в нем острую реакцию на стресс (острый стресс).
Недостатком данного способа моделирования предаторного стресса является то, что не моделируются условия хронического стресса, в котором могут находиться, например, военные, оказавшиеся в затяжных боевых действиях или операциях, или дети, которые на протяжении долгого периода испытывали насилие в семье.
Известна модель предаторного стресса, которая включает воздействие запахом хищника, при этом воздействие хищника сводится к неизбегаемому воздействию кошачьих туалетов (мочи) [2; 3; 4; 8]. Здесь можно сказать, что воздействие на животного с помощью запаха, проходит через обонятельную луковицу, являющуюся частью большого лимбического круга Пейпца. Данная модель предаторного стресса прошла валидацию по таким симптомам ПТСР, как тревожность, страх, травматическая память и панические атаки. Кроме того, в отличие от других экспериментальных моделей ПТСР (стресс-рестресс, иммобилизационный стресс и т.д.) стресс с присутствием запаха хищника не приносит животному физических страданий и является исключительно психологическим стрессом. Данная модель предаторного стресса проводится один день в течение 10 минут.
Недостатком данного способа моделирования предаторного стресса является то, что данная модель направлена на воспроизведение симптомов ПТСР после острого стресса, но не после хронического. Помимо этого, стрессирование (воздействие стрессора) экспериментальных животных запахом хищника проводится вне клетки, то есть животных переносят из их клетки (их домика) в другую клетку, где находится стрессирующий фактор (моча кошки).
Известен способ моделирования «боевого стресса» (патент РФ №2530750, опубл. 10.10.2014), который заключается в том, что крысам на двое суток ограничивают прием пищи, сохраняя только питье, при этом помещают их в устройство, обеспечивающее ограниченное пространство, в котором между животными установлен только визуальный контакт без физического соприкосновения, на третьи сутки производят взрыв бездымного порохового заряда под устройством, спустя 3 часа после взрыва в крови животного определяют уровень гемоглобина, натрия, мочевой кислоты, аланинам инотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, СОЭ, количество лейкоцитов.
Оценивают поведение в течение последующих 8 часов. Через 6 суток после начала эксперимента производят повторный анализ крови. В течение последних 2 суток эксперимента проводят оценку уровня стрессируемости животных по «реакции испуга» и психической работоспособности - по скорости нахождения выхода из двойного Т-образного лабиринта.
Недостатком данной модели «боевого стресса» является то, что указанный способ не предполагает оценку таких параметров, как уровень кортикостерона в крови так и содержание нейротрансмиттеров в головном мозге в динамике после завершения хронического стресса. Далее, не проводится фенотипирование крыс по индексу тревожности, что позволяет выявить устойчивых и предрасположенных к ПТСР.
Технической задачей предлагаемого изобретения является создание экспериментальной модели, релевантной состоянию сложного посттравматического стрессового расстройства после хронического стресса.
Техническая задача достигается тем, что способ моделирования посттравматического стрессового расстройства у лабораторных крыс, включает формирование стрессовой обстановки для крыс. Для этого опытных животных подвергают предаторному стрессу экспозицией кошачьей мочой в количестве 100 мл в течение 10 мин. ежедневно, в течение 10 суток, в последующие 30 суток постстрессового периода опытных и контрольных животных содержат в обычных условиях, при этом определяют концентрацию гамма-аминомасляной кислоты, кортикостерона, МАО-А, содержание норад-реналина у опытной и контрольной групп, проводят оценку поведенческих характеристик на каждые 3-ьи, 7-ые, 10-ые, 14-ые и 30-ые сутки после последнего воздействия предаторным стрессом.
Предлагаемый способ моделирования предаторного стресса состоит из следующих этапов: проводят экспозицию запахом хищника, при этом кошачья моча в количестве 100 мл устанавливается на 10 мин ежедневно, на протяжение 10 дней непосредственно в клетке лабораторных животных; производят оценку поведенческой активности животных на 3-ьи, 7-ые, 10-ые, 14-ые и 30-ые сутки; при этом определяют с помощью лабораторных и инструментальных методов уровень кортикостерона в крови и концентрацию нейромедиаторов в головном мозге, осуществляемых на 3-ьи, 7-ые, 10-ые, 14-ые и 30-ые сутки после завершения хронического стресса, что определяется особенностями развития синдрома ПТСР; производят фенотипирование животных по индексу тревожности после хронического стресса [2].
Предлагаемый нами способ моделирования предаторного стресса проводится в течение 10 мин - это наиболее оптимальное время за которое у животных формируются определенные реакции на стрессор, при более продолжительном времени стрессирования может вызвать у животных привыкание к стрессору, а менее продолжительное время может не вызвать ни каких реакций. В мировой практике наиболее авторитетные ученые [1, 3, 5, 6, 8] в своих экспериментальных моделях на животных чаще всего используют временной отрезок для стрессирования в 10 мин. Большинство моделей стресса на животных проводятся в течение одного дня, тем самым моделируя острый стресс, в нашем способе стрессирование проходит в течение 10 дней, тем самым мы моделируем хронический стресс.
В предлагаемом способе стрессирующий фактор (стрессор) помещают непосредственно в клетку животных (их домик). Такой подход моделирования хронического стресса может быть сопоставим или может соответствовать переживанию различных стихийных бедствий, или вторжению сил противника на территорию непосредственного проживания людей (дом, жилье).
В изобретении количество ежедневных эпизодов предаторного стресса составляет 10 дней, что позволило воспроизвести симптоматику ПТСР после хронического стресса. Хронический стресс может возникать, как во время затяжных боевых действий, так и в мирное время, например, связанный с нестабильной социальной или экономической обстановкой, а также с систематическим насилием в семье.
Поскольку клиническая картина ПТСР проявляется спустя латентный период после воздействия стрессора, а его развитие характеризуется определенной стадийностью, представляется важным проведенное в способе исследование поведенческой активности и нейрохимических изменений не только в период сформировавшихся расстройств, но и в динамике их формирования, начиная с момента воздействия стрессора.
Данный подход был отражен в наших исследованиях и были получены весьма интересные данные (приведены в Таблицах 1, 2, 3, 4, 5). В течение первой декады после завершения хронического предаторного стресса (экспозиции кошачьей мочой), прослеживаются три фазы формирования посттравматических стрессорных расстройств. В анксиолитическую фазу (на третий день после последнего эпизода стрессирования) отмечено постстрессорное снижение тревожности, синхронизированное с повышением содержания ГАМК в головном мозге и одновременным снижением уровня норадреналина (табл. 1).
Со снижением содержания ГАМК до контрольных значений связана вторая фаза (на седьмой день после последнего эпизода стрессирования), характеризующаяся отменой анксиолитических эффектов (табл. 2).
Третья фаза (на десятый день после последнего эпизода стрессирования) поведенческой динамики характеризуется повышенной тревожностью, которая синхронизирована с повышением содержания норадреналина в головном мозге (табл. 3).
В условиях предлагаемого способа - модифицированной модели предаторного стресса нами было отмечено на 14 и 30 сутки снижение уровня кортикостерона как в крови, так и в самих надпочечниках, что соответствует данным литературы о наличии кортикостероидэмии при ПТСР (табл. 4 и 5). Помимо этого на 30-ые сутки отмечено значительное увеличение времени пребывания животных в закрытых рукавах.
Кроме того, в предлагаемом способе произведено фенотипирование животных по индексу тревожности после хронического стресса [2]. Согласно разработанным критериям рациональной оценки моделей стресса [5; 6; 7] нам удалось воспроизвести симптоматику ПТСР с помощью хронического стресса. Известно, что не у всех переживших психологическую травму в дальнейшем развивается ПТСР, в общей когорте лиц, переживших психологическую травму, выделяют устойчивых и предрасположенных к развитию симптомов ПТСР. В связи с этим было проведено фенотипирование животных по индексу тревожности (ИТ) после хронического стресса, а не после острого стресса.
ИТ вычисляют формуле (1) согласно полученным результатам в проведенном тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» [2; 3]:
ИТ=1 - {[(время в открытых рукавах/ ∑время в лабиринте)+(количество заходов в открытые рукава /∑общее количество заходов)]/2} (1),
- где ИТ - индекс тревожности;
- время в открытых рукавах - сумма времени нахождения крыс в открытых рукавах крестообразного лабиринта (сек);
- ∑время в лабиринте - суммарное время нахождения крыс в крестообразном лабиринте (сек);
- количество заходов в открытые рукава - количество заходов крыс в открытые рукава крестообразного лабиринта;
- ∑общее количество заходов - суммарное количество заходов крыс в открытые и закрытые рукава крестообразного лабиринта.
На основании определенных в ходе эксперимента значений ИТ, животных разделяют на 2 фенотипа: фенотип 1 - животные с ИТ<0,8; фенотип 2 - животные с ИТ>0,8. Фенотип 1 - животные устойчивые к посттравматическим стрессорным расстройствам (низко-тревожные), фенотип 2 - животные, предрасположенные к посттравматическим стрессорным расстройствам (высоко-тревожные).
Разделение животных на фенотипы с повышенной тревожностью и с нормальной тревожностью можно производить на каждом исследованном этапе после завершения предаторного стресса. По результатам проведенных исследований, различия по уровню тревожности были синхронизированы с различиями по содержанию моноаминов-нейротрансмиттеров и моноаминоксидазным активностям. Характер различий приурочен к фазам постстрессорной динамики изменений поведенческой активности.
В предложенном способе моделирования посттравматического стрессового расстройства у лабораторных крыс изучена динамика постстрессорных изменений поведенческой активности, уровень кортикостерона в крови, уровень МАО-А (моноаминооксидаза типа А) и содержания нейротрансмиттеров в головном мозге в первой декаде (3, 7, 10, 14 и 30 сутки). Также проводилось фенотипирование животных по индексу тревожности и изучались обозначенные выше показатели.
Пример. Способ поясняется следующим экспериментом, который проведен на половозрелых самцах крыс линии Вистар. Формируется 2 группы по 100 животных в каждой:
- опытная группа (стрессируемые крысы) - 100 экз. - подвергаются неизбегаемому предаторному стрессу - экспозиция с кошачьей мочой в течение 10 мин. ежедневно 10 суток и последующего периода содержания в обычных условиях в течение 30 суток (ПТСР). Кошачью мочу в количестве 100 мл наливают в чашку Петри и ставят ее непосредственно в клетку животных на 10 мин., что позволяет воспроизвести симптоматику ПТСР после хронического стресса. Животных опытной группы содержат в отдельных клетках по 20 особей, имеющих индивидуальную маркировку (номера), при температуре 20-24°С, 12-часовом световом дне, получая стандартный комбинированный пищевой рацион и воду;
- группа контроля (крысы не подвергающиеся стрессу) - 100 экз. Группа контроля не подвергалась стрессированию, но при этом крысам так же ставилась чашка Петри с водой в количестве 40-70 г. непосредственно в клетку на 10 мин. ежедневно в течение 10 суток. Животные данной группы содержали в отдельных клетках по 20 особей, имеющих индивидуальную маркировку (номера), при температуре 20-24°С, 12-часовом световом дне, получая стандартный комбинированный пищевой рацион и воду.
После окончания 10-дневного периода стресса обе группы лабораторных крыс по 100 животных содержались в обычных условиях в отдельных клетках по 20 особей, имеющих индивидуальную маркировку (номера), при температуре 20-24°С, 12-часовом световом дне, получая стандартный комбинированный пищевой рацион и воду.
В постстрессовый период оценка поведенческих характеристик, концентрация гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), кортикостерона, МАО-А и содержание норадреналина у опытной и контрольной групп - проводится в динамике на 3, 7, 10, 14 и 30 сутки после последнего воздействия стрессором (кошачьих туалетов (мочи)). Для этого на каждые фиксированные сутки (3, 7, 10, 14 и 30 сутки) изымали из обеих групп по 20 экз., итого 20 экз. на каждые фиксированные сутки и определяли поведенческие характеристики, после чего выводили из опыта передозировкой диэтилового эфира и определяли концентрацию гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), кортикостерона в крови и содержание норадреналина. Данные исследований приведены в Таблицах 1, 2, 3, 4, 5.
Оценку эмоциональной реакции тревоги (поведенческая активность) у крыс проводили в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт» в течение 600 сек (10 мин). Оценивали время нахождения в открытых и закрытых рукавах; локомоторную активность (ЛА - число зон, пересекаемых за 600 с); число и виды психоэмоциональных проявлений, разделенных на классы: контекстные (остановки, колебания в развилках, стойки), пассивно-оборонительные (груминг, сидение, замирание, вокализация), активно-оборонительные (грызение стенок и пола, чихание, отряхивание, стучание зубами, тик, испуг, выпрыгивание).
В качестве интегрального показателя, характеризующего наличие тревожных расстройств, использовали индекс тревожности (ИТ), который вычислялся по формуле (1).
Концентрацию гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) в головном мозге крыс определяли флюорометрически. Метод основан на взаимодействии ГАМК с нингидрином в щелочной среде и присутствии глутамата. Определение содержания норадреналина, в гомогенатах головного мозга осуществляли методом колоночной хроматографии с адсорбцией на окиси алюминия и детектированием флуоресценции продуктов окисления при рН 4,2; 6,2 на флуориметре «ФЛЮОРАТ-02 АБЛФ-Т» с использованием наборов светофильтров I - 410-520 нм; II - 360-520 нм; III - 360-410 нм.
При помощи микропланшетного иммуноферментного анализатора «ANTHOS 2010» с использованием иммуноферментных наборов («IBL» Германия) в сыворотки крови определяли уровень кортикостерона.
Каталитическая активность МАО-А определяется в митохондриях, которые выделяются из гомогенатов цельного мозга. Интенсивность активности МАО-А оценивается по содержанию продукта окислительного дезаминирования серотонина при длине волны 250 нм.
Таким образом, предлагаемое изобретение представляет собой экспериментальную модель, релевантную состоянию сложного посттравматического стрессового расстройства после хронического стресса, что также подтверждается полученными результатами, в т.ч.: поведенческая активность на 14-ые и 30 сутки характеризуется повышенной тревожностью и сниженным уровнем кортикостерона.
Нами исследована поведенческая и нейрохимическая активность не только в период сформировавшихся расстройств, но и в динамике их формирования, что позволило выявить определенную стадийность после хронического стресса: анксиолитическая фаза - на 3-е сутки после стрессирования; отмена анксиолитической фазы - на 7-е сутки после стрессирования; анксиогенная фаза - на 10-е и 30-е сутки после стрессирования.
В предлагаемом способе моделирования (экспериментальной модели) хронического стресса, нам удалось на основании индекса тревожности ИТ (1) выявить крыс, предрасположенных и устойчивых к посттравматическим стрессорным расстройствам. Кроме того, весьма важным является то, что различия по уровню индекса тревожности были синхронизированы с различиями по моноаминооксидазной активности и содержанию биогенных аминов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Adamec R.Е., & Shallow Т. Lasting effects on rodent anxiety of a single exposure to a cat. Physiology and Behavior, 1993; 54(1), 101109.
2. Cohen H., Yehuda R. Gender differences in animal models of posttraumatic stress disorder. Disease Markers, 2011; 30(23), 141150.
3. Cohen H., Kozlovsky N., Alona C, Matar M. A., & Joseph Z. Animal model for PTSD: From clinical concept to translational research. Neuropharmacology, 2012; 62(2), 715724.
4. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, Gold AL, Shin LM, Lasko NB, Zeidan MA, Handwerger K, Orr SP, Rauch SL. Neurobiological basis of failure to recall extinction memory in posttraumatic stress disorder. Biol Psychiatry 2009; 66: 1075-1082
5. Yehuda R., Flory, J.D., Pratchett L.C., Buxbaum J., Ising, M., & Hols-boer F. Putative biological mechanisms for the association between early life adversity and the subsequent development of PTSD. Psychopharmacology, 2010; 212(3), 405417.
6. Yehuda R., Koenen К.C., Galea S., & Flory J.D. The role of genes in defining a molecular biology of PTSD. Disease Markers, 2011; 30(23), 6776.
7. Yehuda R. Status of glucocorticoid alterations in post-traumatic stress disorder. Ann N Y Acad Sci 2009; 1179: 56-69
8. Zoladz P.R., & Diamond D. M. Current status on behavioral and biological markers of PTSD: A search for clarity in a conflicting literature. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 2013; 37(5), 860895.