Способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов
METHOD FOR INDIRECT IDENTIFICATION OF THE FMD VIRUS TITER IN NON-INACTIVATED RAW MATERIALS FOR A VACCINE DURING AMPLIFICATION OF VIRAL NUCLEIC ACID AND DETECTION OF RNA AMPLICONS APPLYING THE MOLECULAR BEACON TECHNOLOGY

Изобретение относится к области биотехнологии и производству противоящурных вакцин, а именно к способу опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов и разработанной показательной функции с основанием 10 зависимости величины порогового цикла амплификации РНК и титра вируса ящура.
Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных, которое относится к категории трансграничных инфекций [1]. Возбудитель принадлежит к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [2]. Характерной особенностью вируса ящура является наличие 7 типов: А, О, С, Asia-1, SAT-1, SAT-2, SAT-3. В пределах каждого типа существует множество генетических вариантов вируса [3].
Вирион вируса ящура имеет диаметр около 23-25 нм, геном представлен одноцепочечной позитивной РНК, состоящей приблизительно из 8500 н.о. с одной большой открытой рамкой считывания длиной около 7000 и.о., которая состоит из 1А-, 1 В-, 1С-, 1D-, 2А-, 2 В-, 2С-, 3А-, 3 В-, 3С-, 3D-генов. Весь геном возбудителя ящура характеризуется высокой степенью вариабельности нуклеотидов, за исключением генов, кодирующих неструктурные белки и 5'-нетранслируемой области (5'-NTR), которые стабильны для всех вакцинных штаммов вируса ящура. Обнаружение генов, кодирующих неструктурные белки или 5'-NTR позволяет детектировать вирус в исследуемом материале [1].
Данное заболевание причиняет серьезный экономический ущерб в связи с затратами на ликвидацию болезни и введением строгих ограничений, налагаемых на внутреннюю и международную торговлю продукцией животноводства. Система мер для борьбы с ящуром и его профилактики предусматривает массовую иммунизацию восприимчивых животных, а также контроль уровня напряженности поствакцинального иммунитета [1, 4].
3
При изготовлении противоящурных вакцин перед заражением чувствительной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21) не инактивированную вируссодержащую суспензию исследуют на определение титра вируса ящура для оценки его активности в клетках с развитием цитопатического действия (ЦПД). В 1,0 см не инактивированной суспензии вируса определяют количество инфекционных доз, вызывающих 50%-ное ЦПД, что фактически отражает концентрацию полных вирусных частиц, содержащих РНК в активном состоянии. В классическом варианте определения титра вируса ящура используют монослойную клеточную линию почки свиньи IB-RS-2, с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50% клеток (прототип) [2, 5]. Существенными недостатками данного способа являются: 1) длительная процедура титрования, связанная с развитием цитопатического действия (не менее 3 суток); 2) определенная степень субъективности при оценке результатов анализа; 3) высокая стоимость клеточной линии как тест-системы и затраты на ее поддержание; 4) высокая вероятность риска контаминации культуры клеток.
В связи с этим целесообразно провести поиск способа определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе реакции амплификации вирусной нуклеиновой кислоты.
Данный метод является объективным, высокочувствительным, специфичным и позволяет определять титр вируса ящура в неинактивированных вирусосодержащих суспензиях в течение 3-4 часов, не предполагает контаминации исследуемых образцов, поскольку во время анализа пробирки закрыты, не требует применения клеточных культур для анализа и затрат на их поддержание. Исходя из этого, целесообразно предложить новый способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокочувствительного и высокоспецифичного способа быстрого определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов с целью устранения вышеуказанных недостатков.
ВЯ
t РНК
Данная задача решена благодаря созданию нового способа оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов. Предложенный способ позволяет: 1) снизить время проведения анализа вирусосодержащих суспензий для определения титра вируса ящура до 3-4 ч; 2) исключить вероятность контаминации; 3) увеличить специфичность анализа за счет применения высокоспецифичных оригинальных праймеров и РНК-бикона; 4) увеличить чувствительность анализа; 5) удешевить способ анализа за счет использования реактивов только для получения РНК-ампликонов; 6) применение фермента Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы позволяет повторно использовать кДНК, что приводит к увеличению концентрации РНК-ампликонов не менее, чем на 1 порядок по сравнению с концентрацией РНК-праймеров; 7) применять технологию молекулярных биконов, меченых флуорофором малеимид Cyanine5 и неизлучающим тушителем свечения BHQ3 (Black Hole Quencher-3) и очищенных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии; 8) повысить достоверность проводимого анализа благодаря установлению зависимости между значениями титра вируса ящура (Т) и пороговыми циклами амплификации РНК (C) представленной в виде показательной функции с основанием 10:
2
с высокой достоверностью аппроксимации (R=0,9966) и эффективностью амплификации 98,89%. Предложенная модель позволяет количественно оценивать титр вируса ящура в неинактивированном сырье для противоящурной вакцины.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях: Фиг. 1 - Сущность реакции амплификации РНК.
Фиг. 2 - Спектры поглощения экстрактов суммарной РНК вируса ящура стандартных образцов для оценки степени их чистоты при определении концентрации титра вируса в исходных суспензиях (максимальные оптические сигналы для РНК вируса ящура зарегистрированы при длине волны 262 нм) (n=3).
Фиг. 3 - Зависимость порогового цикла амплификации вирусной РНК и титра вируса ящура при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов (n=3, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов амплификации РНК).
Фиг. 4 - Спектры поглощения экстрактов суммарной РНК вируса ящура исследуемых проб для оценки степени их чистоты при определении концентрации титра вируса в исходных суспензиях (максимальные оптические сигналы для РНК вируса ящура зарегистрированы при длине волны 262 нм) (n=3).
2
Сущность изобретения заключается в новом подходе по определению титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов. Заявляемый способ основан на: 1) проведении выделения РНК вируса ящура с применением 3М гуанидин-HCl и латексных частиц белого цвета диаметром 300 нм; 2) амплификации специфического фрагмента в 5'-NTR гена РНК вируса ящура с применение специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного бикона, меченого флуорофором малеимид Cyanine 5 и тушителем свечения BHQ3; 3) детекции РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде графика, стремящегося к экспоненте; 4) определении титра вируса ящура с применением показательной функции с основанием 10, выраженной в виде уравнения:  при R=0,9966 и эффективности амплификации (Е)=98,89%.
В настоящее время метод амплификации РНК применяют для детекции различных инфекционных агентов, в частности, возбудителя аспергиллеза, кандидоза, хламидиоза, гриппа птиц А, энтеровирусной инфекции, цитомегаловирусной инфекции, микобактериоза КРС, парагриппа-1, 2, 3, 4, сальмонеллеза животных и др. патогенов [6-13]. Однако ранее указанный метод применялся только для выявления возбудителя заболевания. Для количественной оценки вирусной нагрузки суспензии, в частности, для определения титра вируса ящура ранее данный метод не применялся. Иными словами, сведений об аналогах предлагаемого способа определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины авторами не обнаружено.
Разработанный способ опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов по сравнению с прототипом отличается более высокой чувствительностью и специфичностью, быстротой выполнения анализа и экономичностью в расходовании реагентов.
В отличие от прототипа разработанный способ включает этап выделения РНК вируса ящура с применением 3М гуанидин-HCl и латексных частиц белого цвета диаметром 300 нм; амплификацию специфического фрагмента в 5'-NTR РНК вируса ящура с применением специфических прямого и обратного праймеров, а также молекулярного бикона, меченого флуорофором малеимид Cyanine 5 и тушителем свечения BHQ3; детекцию РНК-ампликонов с помощью флуоресцентного свечения и отображения накопления сигнала в виде графика, стремящегося к экспоненте; новый подход к методике расчета титра вируса ящура с применением модели зависимости порогового цикла амплификации РНК для кривой флуоресценции и титра вируса ящура в виде показательной функции с основанием 10. Применение предложенного способа позволит снизить время проведения анализа вируссодержащих суспензий для определения титра вируса ящура до 3-4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить чистоту РНК вируса ящура; увеличить специфичность и чувствительность анализа; удешевить исследование; позволяет повторно использовать кДНК, что приводит к увеличению концентрации РНК-ампликонов не менее чем на 1 порядок по сравнению с концентрацией РНК-праймеров; применять технологию молекулярных биконов, меченых флуорофором малеимидом Cyanine 5 и тушителем свечения BHQ3; повысить достоверность проводимого анализа. Исходя их этого, актуально применять данный способ для определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Ключевым элементом заявляемого способа является детектирование пороговых циклов кривых реакции амплификации вирусной РНК в режиме реального времени для исследуемых проб и определение титра вируса ящура с использованием разработанной математической модели зависимости точки порогового цикла амплификации РНК-мишени для кривой накопления флуоресценции и титра вируса ящура.
Сопоставительный анализ с прототипами позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в применении способа амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов и разработанной показательной функции с основанием 10 зависимости величины порогового цикла амплификации РНК и титра вируса ящура для опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
t РНК
ВЯ
Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - графике зависимости величины порогового цикла амплификации РНК (C) и титра вируса ящура (Т) (Фиг. 3).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
3
3
50
Для определения титра вируса ящура подготавливают калибровочную панель стандартов вируса ящура, в качестве которых используют неинактивированные суспензии вируса ящура с титрами: 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10 ТЦД/см (тканевых цитопатических доз, вызывающих поражение 50% клеток, в 1,0 см). В данном анализе взят широкий диапазон возможных значений титра вируса ящура, применяемого при исследовании. В качестве отрицательного контроля применяют суспензию клеток почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), не зараженную вирусом ящура.
На первом этапе исследования из всех стандартных образцов и контроля выделяют РНК вируса ящура. Для этого взамен частиц кремнезема [14] применяют латексные частицы белого цвета с диаметром 300 нм. Для лизиса клеточных структур и вирусных частиц, а также ингибирования РНКаз и ДНКаз используют хаотропный агент гуанидин-HCl, но не 4 М [14], а 3 М раствор. Этого оказалось достаточно для выделения РНК и количественного определения титра вируса ящура при амплификации РНК-мишени. Тем самым достигалась экономия в расходовании данного реактива. К 100 мкл исследуемой суспензии добавляют 400 мкл 3М гуанидин-HCl, перемешивают на вортексе в течение 5 мин. К полученному лизату добавляют 25 мкл латексной суспензии белого цвета с диаметром частиц 300 мкл и инкубируют в процессе перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Далее суспензию центрифугируют при 2000 об/мин, удаляют супернатант и проводят промывание латексных частиц от ингибиторов реакции амплификации РНК с помощью 2М раствора перхлората лития, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Затем смесь центрифугируют при 2000 об/мин, удаляют надосадочную жидкость. Проводят отмывание латексных частиц с применением 70% раствора этилового спирта в объеме по 500 мкл. Осуществляют центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Операцию с этиловым спиртом повторяют. Полученный осадок латексных частиц с адсорбированными молекулами вирусной РНК высушивают от остатков спирта с помощью сухого твердотельного термостата при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин. К высушенному осадку добавляют 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,0-7,3), свободного от РНКаз и ионов
2+
Mg, прогревают содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3-5 минут для получения элюата РНК вируса ящура. Содержимое пробирки центрифугируют при 14000 об/мин в течение 1 мин и отбирают элюат РНК. Полученный экстракт РНК хранят при температуре -20±2°С или сразу используют в дальнейшей работе.
262
280
1
1
1
262
235
2
2
2
320
На следующем этапе осуществляют спектральное исследование элюата РНК, определяя поглощение аналитом монохроматического ультрафиолетового света, что позволяет оценить степень чистоты экстракта, который в последующем тестируют в реакции амплификации. Измерения спектральной поглощающей способности образцов проводят при длинах волны в диапазоне 205-325 нм и температуре 22-25°С. В выделенных экстрактах оценивают содержание остатков фосфолипидов, полисахаридов и гуанидин-HCl, полипептидов и крупных взвешенных частиц, определяя значения оптической плотности (OD, optical density) при 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно [15]. Элюат РНК считают свободным от примесей белка, если OD/OD (коэффициент экстинкции R) находится в пределах 1,8-2,2 и оптимально составляет примерно 2,0. Более низкие значения Rуказывают на наличие ДНК, белковых составляющих в элюате. Более высокие значения коэффициента R свидетельствуют о деградации РНК и наличии свободных рибонуклеотидов. Экстракт нуклеиновой кислоты вируса ящура считают незагрязненным полисахаридами, если OD/OD(коэффициент экстинкции R) приближен к значению 2,000 [16]. При замещении 1% РНК на полисахаридные составляющие R снижается на 0,002. Значения коэффициента R2,000 могут указывать на деградацию молекул РНК. Отсутствие взвеси крупных частиц в элюате подтверждается, если OD приближено к нулевому значению [16].
После оценки степени чистоты полученного экстракта РНК вируса ящура проводят реакцию амплификации РНК для исследования контрольных образцов и исследуемых проб. Для постановки реакции готовят реакционную смесь, рецептура приготовления которой представлена в таблице 1.
+
-2
В качестве гомологичных 5'-NTR вируса ящура олигонуклеотидов используют Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-, Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-праймеры и 5'-NTR-RNA-FMDV-Cyanine5/BHQ3-6HKOH в концентрации 15 пМ на реакцию с внесением в реакционную смесь по 0,1 мкл. Для формирования нуклеотидных цепей продуктов реакции применяют дезоксирибонуклеозидтрифосфаты и рибонуклеозидтрифосфаты с их суммарной концентрацией в реакционной смеси 2 мМ. В качестве основы используют буферный раствор (10х), содержание которого составляет 10% от общего объема реакционной смеси. Буферный раствор включает в свой состав ионы калия (К) (5⋅10 М) и диметилсульфооксид (DMSO) (1%). DMSO включают в реакционную смесь, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание праймеров. В смесь добавляют 12 мМ хлорида магния. В качестве катализаторов реакции амплификации РНК применяют следующие ферменты: AMV-обратная транскриптаза (10 ед.), РНКаза Н Е. coli (10 ед.) и Т7 ДНК-зависимую РНК-полимеразу (10 ед.). Данные ферменты добавляют в реакционную смесь после прогревания до 65°С и приведения температуры к 41°С, поскольку эти компоненты реакции не термостабильны.
Элюаты суммарной РНК вируса ящура каждого образца добавляют к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.
Праймеры для РНК-матрицы взяты в соответствии с рядом правил, которые отражены в работах В. Deiman и R. Sooknanan [17, 18]. Флуорофор Cyanine5 присоединен к 5'-концу, содержащему С, а гаситель флуоресценции BHQ3 - к 3'-концу, содержащему G. Данные условия соответствуют требованиям, предъявляемым к олигонуклеотидным праймерам и молекулярному бикону, которые участвуют в реакции амплификации РНК [17, 19, 20]. В качестве флуоресцентного красителя был выбран Cyanine5 с длиной волны максимальной абсорбции 650 нм и длиной волны с максимальной флуоресценцией 670 нм. Для тушения свечения использовали гаситель флуоресценции BHQ3 с длиной волны максимального поглощения при 672 нм и возможном диапазоне гашения 620-730 нм. Иными словами, была выбрана подходящая пара «флуорофор-гаситель».
При анализе нуклеотидных последовательностей гибридизационной части установили, что для олигонуклеотидных праймеров и бикона не характерно образование «шпилек» (за исключением «стеблевой» части бикона), а также не выявлено З'-комплементарности и сайтов, отжигающих сами на себя.
Последовательности праймеров и молекулярного бикона проверили на наличие нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот с использованием Банка данных последовательности РНК [21]. Последовательности праймеров также проанализировали на наличие внутренних вторичных структур с помощью программы сворачивания нуклеиновых кислот с помощью программы Mfold [22]. Было выявлено, что для разработанных олигонуклеотидов нежелательных совпадений с другими последовательностями нуклеиновых кислот, а также наличия внутренних вторичных структур не обнаружено.
Постановку реакции осуществляют в термоциклере с наличием флуориметра любой марки при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 2. Стадию плавления проводят при температуре 65°С в течение 5 мин за 1 цикл. Реакцию амплификации РНК в режиме реального времени осуществляют в течение 35 циклов при температуре 41°С в течение 105 минут. Каждый условный цикл длится 3 минуты и складывается из 6 подэтапов: отжиг прямого праймера на вирусной РНК, элонгация комплементарной ДНК (кДНК), разрушение гибрида РНК/кДНК, отжиг обратного праймера, элонгация второй цепи кДНК, активация промотора Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы и синтез вирусной РНК. Принципиальная схема процесса отражена на фиг. 1.
Принцип применяемого метода основан на проведении реакции амплификации РНК при фиксированной температуре 41°С с участием трех ферментов: AMV-ревертазы (ревертаза вируса миелобластоза птиц), РНКазы Н Е. coli и Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы, полученной рекомбинантным способом из бактериофага Т7, специфических прямого и обратного олигонуклеотидных праймеров и молекулярного бикона для экспонециальной амплификации РНК. В результате этого процесса в ходе реакции происходит накопление миллиардов специфических фрагментов вирусной РНК-мишени. После инкубации РНК вируса ящура при 65°С в течение 5 мин, при котором осуществляется денатурация нуклеиновой кислоты, начинается линейная стадия реакции амплификации, когда специфический прямой праймер (Forward-5'-NTR-RNA-FMDV-npaftMep) гибридизируется с участком вирусной РНК. Данный олигонуклеотидный праймер включает в свой состав специфическую гибридизационную часть, а также промоторную последовательность Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы. При температуре 41°С AMV-ревертаза проводит элонгацию, создавая ДНК-копию с вирусной РНК-мишени. В результате формируется гибрид типа РНК/кДНК. Для РНКазы Н E.coli данный гибрид является субстратом. Фермент гидролизует РНК, оставляя одноцепочечную кДНК. С данной нитью кДНК гибридизуется обратный праймер (Reverse-5'-NTR-RNA-FMDV-праймер). AMV-ревертаза вновь удлиняет к ДНК до 5'-конца с образованием двуцепочечной кДНК, что приводит промотор Т7 ДНК-зависимой РНК-полимеразы в функциональное состояние. Фермент Т7 ДНК-зависимая РНК-полимераза воспринимает двуцепочечную кДНК с функциональным промотором в качестве субстрата. Подготовленный молекулярный бикон, комплементарный определенному участку РНК-мишени, гибридизутся с РНК. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель флуоресценции в составе молекулярного бикона сближены. Благодаря механизму флуоресцентно-резонансного переноса энергии свечение подавлено. После линейной стадии реакция амплификации РНК вступает в циклический процесс.Обратный праймер гибридизуется с вновь синтезированной молекулой РНК вируса ящура. Фермент AMV-ревертаза проводит элонгацию кДНК. В результате образуется гибрид РНК/кДНК. За счет активности РНКазы Н Е. coli после отжига бикона происходит гидролиз РНК, наблюдается пространственное разделение флуорофора и гасителя свечения, что приводит к росту детектируемого сигнала при длине волны 670 нм. Затем прямой праймер гибридизируется с кДНК, а AMV-ревертаза удлиняет его с образованием двуцепочечной кДНК. Т7 ДНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует РНК вируса ящура. После этого запускается следующий цикл амплификации РНК [17, 23, 24].
t
Результаты реакции амплификации РНК в режиме реального времени анализируют, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации C рнк, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции  Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл амплификации РНК. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической РНК-матрицы кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость. Положительными считаются пробы, которым соответствуют экспонециальные кривые, полученные при анализе флуоресценции красителя, входящего в состав молекулярного бикона. Пробы считаются отрицательными, если при их анализе отсутствует экспонециальная кривая.
2
Устанавливают зависимость между пороговым циклом амплификации РНК и титром вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения показательной функции с основанием 10. Оценивают величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле:  где k - угловой коэффициент в зависимости  а также достоверность аппроксимации (R). На основе разработанной модели рассчитывают значение титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Выражение функции зависимости титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины и порогового цикла реакции амплификации вирусной РНК в виде показательного уравнения с основанием 10.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
50
Для определения титра вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 подготавливали калибровочную панель стандартов вируса ящура, в качестве которых использовали неинактивированные суспензии вируса ящура с титрами: 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10ТЦД/см. В качестве отрицательного контроля применяли суспензию клеток ВНК-21, не зараженную вирусом ящура.
2+
Из всех контролей выделяли РНК вируса ящура штамма Азия-1 /Таджикистан/2011. К 100 мкл исследуемых суспензий добавляли по 400 мкл 3М гуанидин-HCl, перемешивали на вортексе в течение 5 мин. К полученному лизату добавляли 25 мкл латексной суспензии белого цвета с диаметром частиц 300 мкл и инкубировали в процессе перемешивания на вортексе в течение 5 мин. Далее суспензию центрифугировали при 2000 об/мин, удаляли супернатант и проводили промывание латексных частиц от ингибиторов реакции амплификации РНК с помощью 2М раствора перхлората лития, добавляя его к осадку в объеме 400 мкл. Затем смесь центрифугировали при 2000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость. Далее проводили отмывание латексных частиц с применением 70% раствора этилового спирта в объеме по 500 мкл. Осуществляли центрифугирование содержимого пробирки при тех же условиях. Операцию с этиловым спиртом проводили дважды. Полученный осадок латексных частиц с адсорбированными молекулами вирусной РНК высушивали от остатков спирта с помощью сухого твердотельного термостата при температуре 60±2°С в течение 8-10 мин. К высушенному осадку добавляли 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис(оксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиамин-тетраацетат, рН 7,0-7,3), свободного от РНКаз и ионов Mg, прогревали содержимое пробирки при температуре 60±2°С в течение 3-5 минут для получения элюата РНК вируса ящура. Содержимое пробирки центрифугировали при 14000 об/мин в течение 1 мин и отбирали элюат РНК. Полученный экстракт РНК использовали в дальнейшей работе без замораживания.
На следующем этапе исследования с помощью спектрального анализа в излучении ультрафиолетового света проводили оценку степени чистоты полученных элюатов РНК вируса ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011 из разведений стандарта. Образцы РНК сканировали в кварцевых кюветах (1=10 мм) при температуре 23-25°С и регистрировали значения экстинкции в диапазоне от 205 до 325 нм через каждые 2 нм, производя запись спектра поглощения РНК с помощью компьютерной программы Specrtrum v. 5.0 (Фиг. 2, таблица 3).
263-325
260-262
1
1
1
2
2
По результатам анализа стандартов выявили, что значения OD205-259 и OD не превышают OD, что является признаком высокой степени чистоты полученных элюатов РНК (n=3). Из данных спектрального исследования стандартов отмечали отсутствие выраженных пиков на графиках (Фиг. 2, таблица 3) при длинах волны 205, 235, 270, 280 и 320 нм, что свидетельствовало о практически полном отсутствии загрязнения экстрактов РНК примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидин-HCl, полипептидов и крупных конгломератов, соответственно. Значения коэффициента экстинкции R для стандартов приближены к норме 2,000 (R=1,998-2,000), что подтверждало отсутствие ДНК и наличие лишь следовых количеств примесей белка. Деградации нуклеиновой кислоты и наличия свободных нуклеотидов в элюатах не наблюдалось, так как R не превышал 2,000. Экстракты вирусной РНК не загрязнены полисахаридами и гуанидин-HCl, поскольку значения коэффициента экстинкции Rприближены к норме 2,000 и соответствовали 1,992-2,000. Учитывая, что при замещении 1% РНК на углеводы значение R уменьшается на 0,002, в полученных экстрактах наличие полисахаридных примесей составило не более 4%, что допустимо. Разрушения РНК в экстрактах не обнаружено данным методом. Таким образом, экстракты РНК вируса ящура, выделенные из стандартов, характеризуются высокой степенью чистоты [15, 16] и могут быть использованы для дальнейшего исследования.
После оценки степени чистоты полученного экстракта РНК вируса ящура проводили реакцию амплификации РНК для исследования стандартов. Для постановки реакции готовили реакционную смесь в соответствии с данными таблицы 1. В качестве катализаторов реакции применяли следующие ферменты: AMV-обратная транскриптаза (10 ед.), РНКаза Н Е. coli (10 ед.) и Т7 ДНК-зависимую РНК-полимеразу (10 ед.). Их добавляли в реакционную смесь после прогревания до 65°С и приведения температуры к 41°С. Элюаты суммарной РНК вируса ящура каждого образца добавляли к реакционной смеси по 5 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составил 25 мкл.
Постановку реакции осуществляли при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 2.
t рнк
t РНК
Результаты реакции амплификации РНК в режиме реального времени анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации РНК C, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl=f (C). Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации РНК и титром вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины в процессе построения показательной функции с основанием 10. Полученные данные отражены на фиг. 3 и выражены в виде показательной функции с основанием 10:  Оценивали величину эффективности реакции амплификации (Е) по формуле:  (k из функции  а также достоверность аппроксимации (R). Эффективность реакции амплификации РНК составила 98,89%, достоверность аппроксимации -0,9966, что соответствовало общепринятым требованиям, предъявляемым к молекулярно-биологическим тест-системам [24].
Пример 2. Опосредованное определение титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.
6,75
7,00
8,25
6,75
7,25
7,00
3
7,00
3
50
50
Для анализа использовали неинактивированные суспензии культурального вируса ящура штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, CAT-1/Ахал кал акский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-3/Бечуаналенд/65 с титрами вируса 10, 10, 10, 10, 10, 10 ТЦД/см, соответственно. В качестве положительного контроля применяли неинактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013 с титром вируса 10 ТЦД/см. Отрицательным контролем служила не инфицированная вирусом ящура суспензия клеток ВНК-21 с концентрацией 2,50-3,00 млн клеток/см. Испытуемые пробы и контрольные образцы исследовали в трех повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку реакции амплификации вирусной РНК проводили так, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 4 и на фиг. 4.
260-262
1
2
Из данных спектрограмм элюатов РНК проб вируса ящура (Фиг. 4) видно, что средние значения экстинкции при длинах волны 205-259 и 263-325 нм не превышали OD, иными словами, элюаты РНК характеризовались высокой степенью чистоты. Экстракты не были контаминированы примесями фосфолипидов, полисахаридов и остатков гуанидин-HCl, полипептидов и крупных конгломератов, поскольку на спектрограммах (фиг. 4) отсутствовали выраженные пики при X 205, 235, 270, 280 и 320 нм, соответственно. Коэффициент экстинкции R для проб вируса ящура штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, САТ-1/Ахалкалакский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-З/Бечуаналенд/65 составляют 1,992; 2,000; 1,988; 2,000; 1,992; 2,000, что приближено к значению нормы 2,000 и означает высокую степень чистоты элюатов РНК вируса ящура, практически полное отсутствие белка. Коэффициент экстинкции R для проб вируса ящура штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, САТ-1/Ахалкалакский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-3/Бечуаналенд/65 соответствовали значению нормы 2,000, что обуславливало высокую чистоту препаратов. Таким образом, полученные препараты удовлетворяли требованиям чистоты [15, 16] и их можно использовать для дальнейших исследований.
2
6,76
7,00
8,23
6,79
7,21
6,95
3
7,00
3
50
50
С полученными элюатами неинактивированного вируса ящура проводили реакцию амплификации РНК. С помощью разработанного способа опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов получали данные, отраженные в таблице 4. Из данных таблицы 4 следует, что средние значения пороговых циклов амплификации РНК для проб штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, САТ-1/Ахалкалакский/62, САТ-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-3/Бечуаналенд/65 составляли 12,72±0,01, 11,91±0,02, 7,73±0,01, 12,62±0,03, 11,18±0,03, 12,05±0,01, соответственно. Пользуясь разработанной показательной функцией  (R=0,9966, Е=98,89%), рассчитали средние значения титра вируса ящура для проб штаммов А/Забайкальский/2013, О/Саудовская Аравия/2008, Азия-1/Таджикистан/2011, САТ-1/Ахалкалакский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-3/Бечуаналенд/65: 10, 10, 10, 10, 10, 10ТЦД/см, соответственно. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации РНК составило 11,88±0,01, что соответствовало титру вируса ящура 10 ТЦД/см. Для отрицательного контроля график экспоненты не был сформирован, что означало отсутствие вируса ящура в данном образце.
Исследуемые пробы и контроли также тестировали классическим методом титрования в монослойной клеточной линии IB-RS-2. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанного способа, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99-100%. Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного способа опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.
Таким образом, предложенный способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов позволяет оценивать титр вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.
Пример 3. Определение аналитической чувствительности способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.
0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
3
2,5
9,0
3
1,5
2,5
3
0,5
1,5
3
7,0
9,0
3
4,0-
7,0
3
2,5
4,0
3
1,5
2,5
3
0,5
1,5
3
6,75
3
0,0
0,5
3
0,5
3
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
50
Для определения аналитической чувствительности способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов использовали неинактивированную суспензию культурального вируса ящура штамма А/Забайкальский/2013. Подготавливали калибровочную панель стандартов вируса ящура с титрами: 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10 ТЦД/см. Испытуемые контрольные образцы исследовали в пяти повторностях. Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку реакции амплификации вирусной РНК проводили, как описано в примере 1. Результаты исследования представлены в таблице 5, в которой представлен сравнительный анализ определения титра вируса ящура разработанным способом в сравнении с прототипным способом. Выявлено, что с достоверностью 96% разработанным способом определены титры вируса ящура со значениями от 10 до 10 ТЦД/см, с достоверностью 93-96% - с титрами от 10 до 10 ТЦД/см, с достоверностью 91-94%) - с титрами от 10 до 10 ТЦД/см. При сравнении результатов определения титра вируса ящура предложенным способом с эталонными значениями достоверность составила для диапазона 10-10 ТЦД/см 99-100%), для 1010ТЦД/см - 98-99%, для 10 - 10 ТЦД/см 96-97%, для 10 - 10ТЦД/см - 94-96%, для 10 - 10 ТЦД/см - 93-94%. Наиболее часто для производства противоящурных вакцин применяют неинактивированные суспензии вируса ящура с титрами более 10, ТЦД/см, следовательно, для данных образцов достоверность определения титра вируса 97-100%. При анализе проб с титрами от 10 до 10 ТЦД/см титры вируса ящура были определены с достоверностью 40-91%, однако, прототипными методами определить значения вирусной нагрузки суспензии не удалось, поскольку аналитическая чувствительность тест-систем, применяемых при титровании вируса в культуре клеток и методом ОТ-ПЦР-РВ, выше, чем 10 ТЦД/см
50
Таким образом, аналитическая чувствительность способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов составляет 10 ТЦД/см с достоверностью результатов исследования 91-100%.
Пример 4. Оценка специфичности способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов.
3,0
3
50
Для оценки специфичности способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов, исследовали неинактивированные суспензии вируса ящура штаммов А/Забайкальский/13, О/Приморский/14, Азия-1/Шамир/89, САТ-1/Ахалкалакский/62, CAT-2/Саудовская Аравия/2000, САТ-З/Бечуаналенд/65. Также тестировали суспензии вирусов бешенства, инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых, весенней виремии карповых, инфекционного некроза поджелудочной железы, везикулярной болезни свиней, везикулярного стоматита. Титр вирусов в суспензиях составлял 10 ТЦД/см. Исследования проводили в трех повторностях.
1
2
Этапы выделения РНК, оценки степени их чистоты и постановку реакции амплификации вирусной РНК проводили так, как описано в примере 1. Выделенные экстракты РНК характеризовались высокими показателями степени чистоты, поскольку коэффициенты экстинкции R и R находились в диапазоне 1,995-2,002, что соответствовало требованиям [15, 16].
С полученными элюатами неинактивированного вируса ящура проводили реакцию амплификации РНК, как отражено в примере 1. В ходе реакции амплификации РНК вирусов с олигонуклеотидами, специфичными 5'-NTR вируса ящура, фиксировали экспоненциальные графики накопления флуоресцентного сигнала только для штаммов вируса ящура. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,0125 у.е.) (таблица 6). Иными словами, подтверждена специфичность способа опосредованной оценки титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов
Основными преимуществами предлагаемого изобретения по сравнению со способом титрования в культуре клеток является возможность снизить время проведения анализа неинактивированных вируссодержащих суспензий для определения титра вируса ящура до 3-4 ч; исключить вероятность контаминации; увеличить специфичность и чувствительность анализа; удешевить исследование. В предлагаемом изобретении между титром вируса ящура и пороговым циклом амплификации РНК установлена зависимость, отраженная в виде показательной функции с основанием 10 с высокими достоверностью аппроксимации (R=0,9966) и эффективностью амплификации 98,89%. Предложенная математическая модель  дает возможность оценивать значение титра вируса ящура разных типов в неинактивированном сырье для производства вакцины.
Предлагаемое изобретение позволяет быстро и с высокой степенью достоверности определять значение титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины на основе амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов и с последующим применением разработанной математической модели.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ опосредованного определения титра вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины при амплификации вирусной нуклеиновой кислоты и детекции РНК-ампликонов с применением технологии молекулярных биконов»:
1. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2018. - Ch. 3.1.8.
2. Пономарев А.П., Узюмов В.Л. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.
3. Alexandersen, S., Zhang, Z., Donaldson, A.L. and Garland, A.J.M. (2003) The pathogenesis and diagnosis of foot and mouth disease. J. Compr. Pathol., V. 129. - P. 268-282.
th
4. Lubroth, J., Rodriguez, L. and Dekker, A. (2006) Vesicular diseases. In: Straw, B.E., Zimmerman, J.J., D'Allaire, S. and Taylor, D.J., editors. Diseases of Swine. 9 ed. Blackwell Publishing Professional, Ames, Iowa, USA. P. 517-536.
5. Жильцова M.B. Биологические свойства эпизоотических изолятов вируса ящура типов А, О и Азия-1: Дис… канд. ветер, наук: 16.00.03. -Владимир, 2008. - 146 с.
6. Baeumner, A.J., Humiston, М.С, Montagna, R. A., and Durst, R.А. (2001) Detection of viable oocysts of Cryptosporidium parvum following nucleic acid sequence based amplification. Anal. Chem. - Vol.73. - P. 1176-1180.
7. Blok, M.J., Goossens, V.J., van Herle, S.J., et al. (1998a) Diagnostic value of monitoring human cytomegalovirus late pp67 mRNA expression in renalallograft recipients by nucleic acid sequence-based amplification. J. Clin. Microbiol. - Vol. 36. - P. 1341-1346.
8. Mahony, J.В., Song, X., Chong, S., Faught, M., Salonga, Т., and Kapala, J. (2001) Evaluation of the NucliSens Basic Kit for Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Genital Tract Specimens Using Nucleic Acid Sequence-Based Amplification of 16S rRNA. J. Clin. Microbiol. - Vol.39. - P. 1429-1435.
9. Morre, S. A., Sillekens, P. Т., Jacobs, M. V., et al. (1996) RNA amplification by nucleic acid sequencebased amplification with an internal standard enables reliable detection of Chlamydia trachomatis in cervical scrapings and urine samples. J. Clin. Microbiol. - Vol. 34. - P. 3108-3114.
10. Ovyn, C, van Strijp, D., Ieven, M., Ursi, D., van Gemen, В., and Goossens, H. (1996) Typing of Mycoplasma pneumoniae by Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA. Molecular and Cellular Probes - Vol. 10 - P. 319-324.
11. Song, X., Coombes, В. K., and Mahony, J.B. (2000) Quantitation of Chlamydia trachomatis 16S rRNA using NASBA amplification and a bioluminescent microtiter plate assay. Comb. Chem. High Throughput Screening. - Vol. 3. - P. 303-313.
12. Van der Vliet, G., Cho, S-N., Kampirapap, K., et al. (1996) Use of NASBA RNA amplification for detection of Mycobacterium leprae in skin biopsies from untreated and treated leprosy patients. Int. J. Lepr. Other Mycobact. Dis.-Vol.64.-P. 396-4103.
13. Van Deursen, P.В. H., Gunther, A. W., Spaargarenvan Riel, С.C, et al. (1999) A novel quantitative multiplex NASBA method: application to measuring tissue factor and CD14 mRNA levels in human monocytes. Nucleic Acids Res. - Vol. 27, e15 (i-vi).
14. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M.M., Hansen C.L. et al. Rapid and simple method for the purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 495-503.
15. The Analysis of DNA or RNA using Its Wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. Bioteachnology.com [Электронный ресурс] / URL: http://bioteachnology.com/dna/analysis-dna-rna-wavelengths-230-260-280-nm. (Дата обращения 02.11.2019).
16. Peirson S.N. RNA extraction from mammalian tissues / S.N. Peirson, J.N. Butler // Methods in Molecular Biology. - 2007. - Vol. 362. - P. 315-327.
17. Deiman В., van Aarle P., Sillekens P. Characteristics and applications of nucleic acid sequence based amplification // Mol. Biotech. - 2002. - Vol.20. - P. 163-179.
18. Sooknanan R., van Gemen В., Malek L. Nucleis acid sequence-based amplification // Molecular methods for virus detection-London: Academic press, 1995.-P. 261-285.
19. Lambrechts, A.C, Bosma, A.J., Klaver, S.G., et al. (1999) Comparison of immunocytochemistry, reverse transcriptase polymerase chain reaction, and Nucleic Acid Sequence-Based Amplification for the detection of circulating breast cancer cells. Breast Cancer Res. Treat. - Vol. 56. - P. 219-231.
20. Loeffler, J., Hebart, H., Cox, P., Flues, N., Schumacher, U., and Einsele, H. (2001) Nucleic acid sequence-based amplification of aspergillus RNA in blood samples. J. Clin. Microbiol. - Vol. 39. - P. 1626-1629.
21. GenBank. [Электронный ресурс] / URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.12.2019).
22. The RNA Institute college of arts and science university at Albany. The mfold Web Server. RNA Folding Form. [Электронный ресурс] / URL: http://bioinfo.math.rpi.edu/~mfold/dna/form.cgi (Дата обращения: 21.12.2019).
23. Uyttendaele, M., Bastiaansen, A., and Debevere, J. (1997) Evaluation of the NASBA nucleic acid amplification system for assessment of the viability of Campylobacter jejuni. Int. J. Food Microbiol. - Vol.37. - P. 13-20.
24. Van Strijp D., van Aarle P. NASBA: a method for nucleic acid diagnostics // Methods in molecular medicine-Totowa, NJ: Humana press. - 1995. - P. 331-340.