Способ оценки антиоксидантной активности биологически активных препаратов
METHOD FOR ASSESSING ANTIOXIDANT ACTIVITY OF BIOLOGICALLY ACTIVE PREPARATIONS

Изобретение относится к области определения антиоксидантной активности (АОА) биологически активных препаратов и может быть использовано в фармацевтике, косметологии и пищевой промышленности для оценки и сравнения антиоксидантной активности жидких водорастворимых форм, полученных из природного сырья, а также индивидуальных водорастворимых соединений или их смесей.
На рынке присутствует множество лекарственных форм и биологических добавок на основе продуктов переработки лекарственных растений и другого природного сырья, содержащих большое разнообразие биологически активных веществ, обладающих, в том числе, антиоксидантной активностью. Для сравнения различных препаратов и выбора того или иного препарата в качестве эффективного антиоксиданта (АО) необходимо иметь объективный показатель их способности ингибировать свободные радикалы, образующиеся в ходе биохимических процессов. Однако, сложность количественного и качественного состава природных смесей, возможность взаимовлияния и синергизма компонентов делают разработку такого критерия нетривиальной задачей, которая не решена до настоящего времени. В работе [Тринеева О.В. «Методы определения антиоксидантной активности объектов растительного и синтетического происхождения в фармации (обзор)». Разработка и регистрация лекарственных средств. 2017, (4) с. 180-197] систематизированы известные методы определения антиоксидантной активности соединений, среди которых особый интерес представляют методы, основанные на спектрофотометрическом контроле процессов, протекающих в модельных системах, генерирующих супероксидный анион-радикал, который образуется в митохондириях при одноэлектронном восстановлении кислорода и является первичным звеном процессов свободнорадикального окисления в живых организмах [Yoshimi S., Masashi Н., Misa I., Keiko M., Erisa K., Yusaki H., Masakazu K., Keishi O. Scaving rate constants of hydrophilic antioxidants against multiple reactive oxygen species // Clin Biochem Nutrition, 2014, vol. 54, №2, pp. 67-74]. В качестве такой модельной системы используют процесс аутоокисления адреналина в щелочной среде, протекающий через стадию образования супероксидрадикала и включающий его последующее взаимодействие с адреналином и промежуточными продуктами окисления. На этой реакции основан способ определения антиоксидантной активности супероксиддисмутазы и химических соединений, описанный в изобретении [RU 2144674 С1, опубл. 20.01.2000], взятом за прототип. Согласно известному способу, АОА соединений оценивают по их способности ингибировать реакцию аутоокисления адреналина в щелочной среде (рН не менее 10,65). Скорость реакции оценивают спектрофотометрически по величине оптической плотности накапливающегося продукта аутоокисления адреналина, имеющего поглощение при длине волны 347 нм, образующегося в отсутствие и в присутствии исследуемых препаратов. Достаточное для количественной оценки накопление продукта, поглощающего при 347 нм, происходит в первые минуты после добавления в щелочной раствор низких концентраций адреналина. Реакцию проводят при комнатной температуре, используя готовую аптечную форму 0,1% раствора адреналина гидрохлорида, измерения проводят в течение 3-5 минут. Антиоксидантную активность оценивают по формуле:
опыт
контроль
где, по определению автора, ΔD и ΔD - скорости реакции аутоокисления адреналина, соответственно, в присутствии и в отсутствие антиоксиданта. Осуществление изобретения продемонстрировано на примерах определения АОА супероксиддисмутазы, аскорбиновой кислоты и цистеина.
Работа [Рябинина Е.И., Зотова Е.Е., Ветрова Е.Н., Пономарева Н.И., Илюшина Т.Н. «Новый подход в оценке антиоксидантной активности растительного сырья при исследовании процесса аутоокисления адреналина». // Химия растительного сырья. - 2011. - №3. С. 117-121] посвящена определению антиоксидантной активности водных извлечений лекарственных трав по ингибированию реакции аутоокисления адреналина. В работе также использован спектрофотометрический метод оценки АОА препаратов по взаимодействию с супероксидрадикалами в реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде при длине волны 347 нм, однако авторы считают, что недооценка временного фактора при определении АОА этим способом может привести к противоречивым результатам. Авторы предлагают за временной критерий принимать специфичное для каждого экстракта время периода индукции реакции аутоокисления, в течение которого, по мнению авторов, биологически активные вещества проявляют свое антиоксидантное действие. Оценку АОА препаратов проводят по формуле, аналогичной формуле (1), при этом величины поглощения при 347 нм определяют в течение промежутка времени, соответствующего индукционному периоду реакции аутоокисления, специфичному для каждого исследуемого образца.
347(опыт)
347(контроль)
Далее по ходу описания под величинами ΔD и ΔD будем понимать прирост оптической плотности реакционной смеси при 347 нм за фиксированное от начала реакции время t в реакции, соответственно, ингибированного (в присутствии антиоксиданта) и неингибированного (в отсутствие антиоксиданта) аутоокисления адреналина в щелочной среде при комнатной температуре.
347(опыт)
347(опыт)min.
347(опыт)min.
347(опыт)
347(опыт)
347(опыт)
347(опыт)
Главным недостатком подходов, принятых в известных источниках, является недооценка известного факта, который состоит в том, что проявление антиоксидантной активности веществ нелинейно зависит от их количественного содержания в системе [Бурлакова Е.Б. «Биоантиоксиданты» // Российский химический журнал. 2007. Т. 51, №1. С. 3 - 12]. Увеличение концентрации соединения, способного ингибировать свободные радикалы, сначала приводит к усилению проявления его антиоксидантных свойств, а затем, при достижении специфичного для каждого вещества значения, антиоксидантный эффект сменяется на прооксидантный. Вследствие этого, зависимость величины прироста оптической плотности ΔD от концентрации антиоксиданта (ингибитора) за фиксированный промежуток времени t от начала реакции имеет V-образный характер со специфическим для каждого антиоксиданта положением минимума ΔD. Значение ΔD соответствует тому количественному содержанию тестируемого соединения в системе, при котором оно проявляет максимальную антиоксидантную активность. В качестве примера на Фиг. 1 показана кривая, характеризующая концентрационную зависимость величины прироста оптической плотности ΔD для модельной системы аутоокисления адреналина в присутствии известного природного антиоксиданта - хлорогеновой кислоты (условия: буфер рН=10,65, время t экспозиции - 3 минуты). Уменьшение величины прироста оптической плотности ΔD означает торможение образования промежуточных продуктов аутоокисления адреналина вследствие проявления тестируемым образцом антиоксидантных свойств. Как видно из рисунка, при увеличении концентрации хлорогеновой кислоты выше 2 μМ значения величины ΔD начинают возрастать за счет проявления прооксидантного действия соединения. Из этого примера видно, что использование описанных в аналогах методов оценки показателя АОА по величине ΔD даже для индивидуального вещества в модельных реакционных смесях, содержащих разные концентрации антиоксиданта, соответствующие нисходящей или восходящей ветви кривой на Фиг. 1, может привести к противоречивым результатам. Это тем более справедливо в случае сложных систем, полученных из природных объектов.
Для простой системы, содержащей одно соединение, обладающее антиоксидантными свойствами, в качестве критерия активности в отношении супероксидного анион-радикала в работе [И.Г. Малютина «Влияние хлорогеновой кислоты на процесс аутоокисления адреналина» // Материалы XVII научной конференции аспирантов, магистрантов и студентов. Тверь, 2019 г С. 15 - 17] предложена величина максимального снижения прироста оптической плотности по сравнению с неингибированным окислением адреналина, отнесенная к концентрации антиоксиданта, соответствующей этому максимальному снижению:
адр.+АO
адр.
где ΔD - прирост оптической плотности при 347 нм в реакции окисления адреналина в присутствии АО (опыт); ΔD - прирост оптической плотности при 347 нм в реакции неингибированного окисления адреналина (контроль).
347(опыт)
Однако, такой подход невозможен для оценки АОА жидких форм препаратов, полученных из природного сырья, поскольку в них концентрация активных соединений обычно неизвестна. Антиоксидантная активность (ингибирующий эффект) биологически активного препарата (ингибитора), представляющего собой, например, жидкий экстракт лекарственного растения или смеси лекарственных растений, является интегральным показателем, отражающим свойство сложной системы, содержащей смесь биологически активных соединений, присутствующих в разных концентрациях и способных к взаимодействию друг с другом. Ниже будет показано, что для образцов, полученных из природных объектов, характерный V-образный ход кривой зависимости величины ΔD от суммарного содержания в образце антиоксидантов сохраняется, хотя переход от нисходящей ветви кривой к восходящей ветви имеет более сглаженный характер из-за сложного многокомпонентного состава системы. Недооценка этой особенности концентрационной зависимости АОА может привести к ошибочным результатам при сравнении антиоксидантной эффективности различных препаратов природного происхождения.
Проблема, решаемая настоящим изобретением, заключается в модифицировании известного спектрофотометрического способа оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ, основанного на модельной реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде, с учетом того, что проявление антиоксидантной активности веществ нелинейно зависит от их количественного содержания в системе.
Проблема решена предлагаемым способом оценки антиоксидантной активности биологически активных препаратов путем оценки их способности ингибировать аутоокисление адреналина в щелочной среде по величине оптической плотности продукта аутоокисления адреналина, поглощающего при длине волны 347 нм, образующегося в отсутствие и в присутствии тестируемых биологически активных препаратов, отличающимся тем, что измерение оптической плотности проводят в реакционной смеси, содержащей такое количество тестируемого биологически активного препарата, которое соответствует минимуму на кривой зависимости величины прироста оптической плотности при 347 нм от количественного содержания препарата в системе.
Краткое описание фигур чертежей, поясняющих сущность изобретения.
347
На Фиг. 1 показана зависимость величины прироста оптической плотности реакционной смеси при длине волны 347 нм (ΔD) в реакции ингибированного аутоокисления адреналина в щелочной среде (рН 10,65) от концентрации (С) ингибитора - хлорогеновой кислоты. Время t от начала реакции - 3 минуты.
347
На Фиг. 2 показано семейство кинетических кривых, характеризующих зависимость оптической плотности реакционной системы D от времени t протекания реакции аутоокисления адреналина в щелочной среде для серии образцов, содержащих разные объемы V водно-пропиленгликолевого экстракта ромашки аптечной. Кривая 1 - контроль (отсутствие антиоксиданта), кривые 2, 3, 4, 5, 6 относятся к реакционным смесям, содержащим 20 мкл, 7 мкл, 2 мкл, 0,7 мкл и 0,2 мкл экстракта (соответственно). Кривые приведены к нулевому значению оптической плотности в начальный момент времени (t=0).
347
На Фиг. 3 показаны кривые зависимости величин прироста оптической плотности реакционных смесей при длине волны 347 нм (ΔD) в реакциях ингибированного аутоокисления адреналина в щелочной среде от объема V содержащихся в реакционных смесях в качестве ингибиторов водно-пропиленгликолевых экстрактов из череды трехраздельной (кривая 1), ромашки аптечной (кривая 2) и тысячелистника обыкновенного (кривая 3). Время t от начала реакции - 3 минуты.
347(опыт)min
347(опыт)
Сущность изобретения состоит в том, что для получения корректной оценки АОА биологически активных препаратов различного состава и происхождения необходимо учитывать их количественное содержание в реакционной системе. В отличие от аналогов, не накладывающих каких-либо ограничений на количественное содержание тестируемого образца в реакционной смеси, согласно предлагаемому способу спектрофотометрические измерения проводят в реакционных смесях, содержащих такое количество исследуемого образца, которое соответствует максимальному проявлению его антиоксидантной активности. Этот подход может быть применен для оценки АОА как индивидуальных веществ, так и их смесей природного или искусственного происхождения. Количество образца, соответствующее максимальному проявлению его антиоксидантной активности, определяется положением минимума ΔD на кривой зависимости величины прироста оптической плотности ΔD от количественного суммарного содержания антиоксидантов в реакционной системе. Положение этого минимума для каждого образца различно и зависит от его химического состава, на который может оказывать влияние видовая принадлежность сырья, его генетические особенности, условия произрастания, время и способ заготовки, условия хранения и способ выделения смеси биологически активных веществ из природного объекта.
Реакцию проводят при комнатной температуре. Прирост оптической плотности при 347 нм определяют за фиксированный промежуток времени t от начала реакции. Показатель антиоксидатной активности рассчитывают по формуле:
347(контроль)
347(опыт)min
347(опыт)
где ΔD - значение величины прироста оптической плотности реакционной смеси на длине волны 347 нм за фиксированный промежуток времени от начала реакции неингибированного аутоокисления адреналина, ΔD - значение величины прироста оптической плотности реакционной смеси на длине волны 347 нм за тот же промежуток времени t от начала реакции ингибированного аутоокисления того же количества адреналина в присутствии в качестве ингибитора биологически активного препарата в количестве, соответствующем минимуму на кривой зависимости величины ΔD от количественного содержания ингибитора в смеси.
347
На Фиг. 2 сопоставлен ход кинетических кривых процесса аутоокисления адреналина в присутствии разного количества антиоксиданта - водно-пропиленгликолевого экстракта ромашки аптечной, и в отсутствии антиоксиданта (контроль). Уже через 8-9 минут все кривые выходят на плато, характеризующее практическое завершение процесса окисления вследствие расходования антиоксиданта и достижения глубокого превращения адреналина. С целью минимизации погрешности фиксированный промежуток времени t выбирают так, чтобы значение ΔD образцов находилось в интервале от 35 до 65% от максимального значения, соответствующего полному завершению реакции - выходу кинетических кривых на плато. Оптимальный интервал времени, в течение которого определяют нарастание оптической плотности реакционной системы, составляет 2-4 минуты.
347(опыт)
В случае оценки АОА индивидуальных соединений или их смесей искусственного происхождения концентрация антиоксидантов в реакционной системе известна, и положение минимума легко определяется из концентрационных зависимостей значений величины ΔD. В отличие от индивидуальных веществ, количество биологически-активных соединений в образцах, полученных из природных объектов, обычно неизвестно. Поэтому вместо неопределенного для сложных систем природного происхождения параметра концентрации антиоксидантов в качестве меры суммарного содержания антиоксидантов в реакционной смеси используют объем введенной в реакционную модельную систему аликвоты исследуемого жидкого образца или его разведения. Суммарная концентрация антиоксидантов в реакционной модельной системе пропорциональна объему введенной в реакцию аликвоты исследуемого образца.
347(опыт)min
347(опыт)
Таким образом, для определения количественного показателя, характеризующего антиоксидантную активность образца жидкой смеси природных антиоксидантов, измерение оптической плотности при 347 нм следует проводить в реакционной смеси, содержащей такую аликвоту исследуемого образца, которая обеспечивает концентрацию антиоксидантов, при которой образец проявляет максимальную ингибирующую активность. Как было сказано выше, максимальное ингибирующее (антиоксидантное) действие коррелирует с минимальным значением величины ΔD на кривой зависимости ΔD от V - объема аликвоты исследуемого образца в реакционной смеси.
347(опыт)
347(опыт)min
На Фиг. 3 сопоставлены зависимости величины прироста поглощения, ΔD от объема аликвот введенных в реакционную смесь водно-пропиленгликолевых экстрактов череды трехраздельной (кривая 1), ромашки аптечной (кривая 2) и тысячелистника обыкновенного (кривая 3) в реакциях аутоокисления адреналина в щелочной среде. Время от начала реакции t составляет 3 минуты. Каждая кривая проходит через характеристичный минимум, положение которого соответствует объему введенной в реакционную систему аликвоты образца, содержание антиоксидантов в котором обеспечивает максимум ингибирующей активности. Именно этот объем образца следует вводить в модельную реакционную смесь для определения значения величины ΔD для оценки показателя его антиоксидантной активности по соотношению (3). Полученные таким образом количественные характеристики АОА позволяют проводить корректное сравнение антиоксидантной эффективности жидких образцов, полученных из разных природных объектов.
Поскольку в качестве растворителя в модельной реакции аутоокисления адреналина используют водный карбонатно-бикарбонатный буфер, способ может быть применен к жидким образцам, смешивающимся с водными средами.
Изобретение осуществляют следующим образом:
1. Готовят серию реакционных смесей одинакового объема, содержащих одинаковое количество адреналина в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе и разные объемы V исследуемого жидкого водорастворимого образца (опыт). Для этого используют микропипетки и, при необходимости - соответствующие водные разведения исходного образца. В качестве контроля готовят реакционную смесь, содержащую то же количество адреналина в отсутствие антиоксиданта (контроль). Для проведения реакции используют аптечный 0,1%-ный водный раствор адреналина гидрохлорида. Концентрацию адреналина гидрохлорида в реакционной смеси предпочтительно выбирают в диапазоне от 0,002 до 0,01%, за рамками которого значения величин оптической плотности могут выходить за пределы, обеспечивающие приемлемые уровни относительной погрешности измерений. Поскольку скорость реакции сильно зависит от рН среды, соотношение карбоната и бикарбоната натрия в буферном растворе подбирают так, чтобы скорость нарастания оптической плотности в реакционной системе находилась в оптимальных пределах от 0,05 до 0,15 единиц оптической плотности в минуту, обеспечивающих приемлемые скорость реакции и погрешность измерений.
347(опыт)
347(контроль)
2. Определяют значения величин прироста оптической плотности ΔD для каждой из реакционных смесей серии и для контрольной реакционной смеси ΔD за фиксированный промежуток времени t от начала реакции, который, как отмечено выше, выбирают в интервале 2-4 минуты.
347(опыт)
347(опыт)min
3. Строят зависимость величины прироста оптической плотности реакционной смеси ΔD от объема V аликвоты содержащейся в ней исследуемой жидкой формы и определяют значение ΔD, соответствующее максимальной антиоксидантной активности образца.
AOA
4. По формуле 3 рассчитывают показатель антиоксидантной активности образца I.
Способ дает корректную количественную оценку антиоксидантных свойств препаратов, полученных из различных природных источников, позволяет сравнивать различные препараты по антиоксидантной эффективности и обосновывать необходимую дозировку. Способ может быть использован для оценки и сравнения антиоксидантных свойств настоек, экстрактов, извлечений и других водорастворимых форм препаратов, полученных из растительного и другого природного сырья. Способ также может быть использован для сравнительной оценки антиоксидантных свойств индивидуальных водорастворимых веществ или их смесей.
Осуществление изобретения проиллюстрировано приведенным ниже примером оценки и сравнения антиоксидантной активности препаратов, полученных экстракцией высушенных растений тысячелистника обыкновенного, череды трехраздельной, ромашки аптечной смесью воды с 1,2-пропиленгликолем.
Экстрагирование сухого растительного сырья проводят 50%-ным водным раствором 1,2-пропиленгликоля при массовом отношении сырья и экстрагента 1:19 (10 г сырья на 190 г водно-пропиленгликолевой смеси) в колбе Эрленмейера при температуре 50 С в течение 4 часов при периодическом перемешивании. Размер частиц сырья 0,5-5 мм. Экстракт фильтруют через трехслойный фильтр из марли и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут.
Карбонатно-гидрокарбонатный буферный раствор с рН=10,65 - 10,7 готовят, как описано в [Досон Р. и др. Справочник биохимика. - М.: Мир, 1991. - 544 с.].
Объем реакционной смеси для проведения спектрофотометрических измерений - 4,26 мл. Контрольный раствор готовят смешением 4 мл буфера с 0,2 мл 0,1% раствора адреналина гидрохлорида и 0,06 мл воды. Для приготовления серии растворов, содержащих разные объемы исследуемых образцов, к 0,2 мл 0,1%-ного раствора адреналина добавляют различные объемы аликвот исследуемых экстрактов, доводят водой объем до 0,26 мл и приливают 4 мл буферного раствора. Регистрацию оптической плотности проводят на длине волны 347 нм в течение 3 минут на фоне кюветы с карбонатно-гидрокарбонатным буфером. Для каждого образца выполняют описанную выше последовательность операций 1-4. Результаты измерений приведены в таблице и на Фиг. 3. Для сравнения в таблице приведены результаты определения этим методом показателя антиоксидантной активности хлорогеновой кислоты.
Полученные результаты показывают, что из трех сравниваемых образцов, полученных из природного сырья, наибольшую антиоксидантную активность проявляет водно-пропиленгликолевый экстракт тысячелистника обыкновенного, при этом его активность близка к активности хлорогеновой кислоты - распространенного в растительном мире биологически активного соединения, для которого ранее продемонстрирована высокая акцепторная активность в отношении супероксидного анион-радикала [Yoshimi S., Masashi Н., Misa I., Keiko M., Erisa K.,Yusaki H., Masakazu K., Keishi O. "Scaving rate constants of hydrophilic antioxidants against multiple reactive oxygen species" // Clin Biochem Nutrition, 2014, vol. 54, №2, pp. 67-74].