НАЦЕЛЕННЫЕ/ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СЛИТНЫЕ БЕЛКИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

1. Полинуклеотидная последовательность, содержащая нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую химерный слитый белок, содержащий по меньшей мере одну направляющую группировку для нацеливания на раковую клетку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, противодействующую иммунной толерантности, где направляющая группировка и иммуномодулирующая группировка соединены аминокислотным спейсером с достаточной длиной, измеряемой количеством аминокислотных остатков, так, что обе группировки могут успешно связываться с их отдельными мишенями.
2. Полинуклеотидная последовательность по п. 1, где иммуномодулирующая группировка специфически связывается с одной из следующих молекул: (1) трансформирущий фактор роста-бета (TGFβ), (2) лиганд запрограммированной гибели-1 (PD1), (3) 4-1BB, (4) инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1) или (5) интерлейкин-6 (IL-6).
3. Полинуклеотидная последовательность по п. 1, где направляющая группировка представляет собой антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR1, Erb-B1), HER2/neu (Erb-B2) (рецептор эпидермального фактора роста человека 2), CD20, CTLA-4 (антиген-4 цитотоксических Т-лимфоцитов), муцином-1 (MUC-1), IGF-1, эпителиальной молекулой клеточной адгезии (EpCAM), интерлейкином-2 (IL-2), рецептором интерлейкина-6 (IL-6), PD-L1 и 41BB-L1 или их частями.
4. Полинуклеотидная последовательность по п. 1, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере одну направляющую группировку, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26.
5. Полинуклеотидная последовательность по п. 1, где последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28.
6. Полинуклеотидная последовательность по п. 1, где направляющая группировка содержит тяжелую и легкую цепь антитела, связывающегося с молекулой, выбранной из группы, состоящей из EGFR1, HER2/neu, CD20, CTLA-4, интерлейкина-6 (IL-6), муцина-1 (MUC-1), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), эпителиальной молекулы клеточной адгезии (EpCAM) и интерлейкина-2 (IL-2).
7. Полинуклеотидная последовательность по п. 6, где иммуномодулирующая группировка слита с легкой и/или тяжелой цепью и представляет собой молекулу, выбранную из ECD (внеклеточный домен) TGF, ECD рецептора запрограммированной клеточной гибели (PD1), ECD рецептора CTLA-4, лиганда 4-1BB.
8. Полинуклеотидная последовательность по п. 1, где иммуномодулирующая группировка включает внеклеточный лиганд-связывающий домен рецептора трансформирующего фактора роста-бета TGFβRII, TGFβRIIb или TGFβRIII.
9. Оптимизированный ген, кодирующий слитый полипептид, содержащий по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, для лечения рака у субъекта-человека, где оптимизированный ген модифицирован для повышения его экспрессии у субъекта-человека и выбран из SEQ ID NO: 12-28.
10. Вектор, содержащий оптимизированные гены по п. 9, модифицированные для увеличения содержания CG-последовательностей.
11. Способ лечения рака у субъекта, включающий:
обеспечение по меньшей мере одного рекомбинантного вектора, содержащего нуклеотидные последовательности, кодирующие по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, выбранные из SEQ ID NO: 12-28; и
введение рекомбинантного вектора субъекту в таких условиях, что указанные нуклеотидные последовательности экспрессируются на уровне, обеспечивающем терапевтически эффективное количество кодируемых слитых белков у субъекта.
12. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотиды оптимизированных генов, кодирующих по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, выбранных из SEQ ID NO: 12-28.
13. Рекомбинантная клетка-хозяин, трансфицированная вектором экспрессии по п. 12.
14. Способ получения слитого белка по настоящему изобретению, включающий:
трансфицирование клетки-хозяина полинуклеотидными последовательностями, кодирующими химерные слитые белки, с получением трансформированной клетки-хозяина, где полинуклеотидные последовательности кодируют по меньшей мере одну направляющую группировку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку и выбраны из SEQ ID NO: 12-28; и
содержание трансформированной клетки-хозяина в биологических условиях, достаточных для экспрессии пептида.
15. Химерный слитый белок, содержащий по меньшей мере одну направляющую группировку для нацеливания на раковую клетку и по меньшей мере одну иммуномодулирующую группировку, противодействующую иммунной толерантности, где направляющая группировка и иммуномодулирующая группировка соединены аминокислотным спейсером с достаточной длиной, измеряемой количеством аминокислотных остатков, так, что обе группировки могут успешно связываться с их отдельными мишенями, где иммуномодулирующая группировка выбрана из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10; где аминокислотный спейсер выбран из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 11; и где одна направляющая группировка представляет собой антитело, выбранное из антитела против HER2/Neu (тяжелая цепь SEQ ID NO: 1 и легкая цепь SEQ ID NO: 2); антитела против EGFR1 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 5 и легкая цепь SEQ ID NO: 6); антитела против CTLA4 (тяжелая цепь SEQ ID NO: 7 и легкая цепь SEQ ID NO: 82); кантузумаба (тяжелая цепь SEQ ID NO: 29 и легкая цепь SEQ ID NO: 30); циксутумумаба (тяжелая цепь SEQ ID NO: 31 и легкая цепь SEQ ID NO: 32); кливатузумаба (тяжелая цепь SEQ ID NO: 33 и легкая цепь SEQ ID NO: 34); и притумумаба (тяжелая цепь SEQ ID NO: 35 и легкая цепь SEQ ID NO: 36).
16. Способ лечения опухолевого заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, химерного слитого белка по п. 15.
17. Способ получения терапевтически активных слитых белков «антитело-пептид», включающий:
а) получение кодон-оптимизированной последовательности указанного слитого белка;
б) клонирование оптимизированной последовательности указанного слитого белка в клетке-хозяине, способной к временной или продолжительной экспрессии;
в) выращивание клетки-хозяина в среде в достаточной степени и предоставление ей возможности экспрессировать клонированный белок; и
г) очистку экспрессированного белка и, возможно, проверку способности белка к биспецифическому связыванию с его мишенями.
18. Способ по п. 17, где терапевтически активные слитые белки «антитело-пептид» представляют собой направляющее антитело, слитое с одной или более иммуномодулирующими группировками, противодействующими иммунной толерантности раковой клетки.
19. Способ по п. 18, где иммуномодулирующая группировка присоединена аминокислотным спейсером, длина которого достаточна для обеспечения возможности биспецифического связывания молекулы.
20. Способ по п. 19, где иммуномодулирующая группировка связана с С-концом тяжелой или легкой цепи антитела.
21. Способ по п. 20, где иммуномодулирующая группировка представляет собой внеклеточный домен (ECD) (1) трансформирущего фактора роста-бета (TGFβ), (2) лиганда запрограммированной гибели-1 (PD1), (3) 4-1BB, (4) инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1) или (5) интерлейкина-6 (IL-6).
22. Способ по п. 21, где антитело связывается с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR1, Erb-B1), HER2/neu (Erb-B2), CD20, CD6, CTLA-4, муцином-1 (MUC-1), интерлейкином-2 (IL-2) или интерлейкином-6 (IL-6).
23. Способ по п. 17, где клетка-хозяин представляет собой транзиторную клеточную линию или стабильную клеточную линию.
24. Способ по п. 23, где транзиторную экспрессию осуществляют посредством трансфицирования или трансформирования хозяина векторами, переносящими слитые белки в клетки-хозяева, являющиеся клетками млекопитающих.
25. Способ по п. 24, где транзиторно экспрессированные слитые пептиды подвергают очистке и анализируют их in vitro для проверки их биспецифичности.
26. Способ по п. 25, где анализ in vitro представляет собой ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ) или анализы связывания с NK/T-клетками для подтверждения бифункционального связывания с мишенями или стимуляции иммунокомпетентных клеток.
27. Способ по п. 25, где пептиды, демонстрирующие желаемую биспецифичность, отбирают для субклонирования в стабильную клеточную линию для экспрессии и очистки в большем масштабе.
28. Способ по п. 27, где уровни экспрессии в стабильной клеточной линии сопоставимы с более ранними поколениями.
29. Способ по п. 17, где хозяин представляет собой линию клеток млекопитающих.
30. Способ по п. 29, где клетка млекопитающего представляет собой HEK293 (клетки почек эмбриона человека), CHO (клетки яичников китайского хомячка) или NSO.
31. Способ по п. 30, где среда представляет собой среду с определенным химическим составом.
32. Способ по п. 32, где в клеточную культуру изначально или в режиме подпитки добавляют соль двухвалентного переходного металла для уменьшения накопления лактата во время культивирования и/или для уменьшения неоднородности слитых белков.