СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРИЖИЗНЕННЫХ ПАРАНЕКРОТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ТКАНЕЙ ОРГАНОВ И КОСТНОЙ СИСТЕМЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD OF DETECTING LIFETIME PARANECROTIC CHANGE OF TISSUES AND SKELETAL SYSTEM IN ANIMALS

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может использоваться при моделировании патологических реакций, процессов и состояний человека для определения прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментальных животных.
Паранекротическими названы те изменения в тканях органов, которые могут в зависимости от условий перейти в необратимую стадию некроза либо восстановиться в исходное состояние (1). Известно, что паранекротические процессы возрастают в структурах нервной ткани и в других органах при различных воздействиях на организм экспериментальных животных (2), а также при нарушениях эндокринной регуляции (3), которые сопровождаются повышением сорбции витальных красителей.
До сих пор в экспериментальной медицине структурно-функциональные изменения в тканях органов выявляются после умерщвления животных, исследования биоптатов предполагаемых поврежденных органов (4). Существуют также химический способ выявления прижизненного изменения в тканях органов путем исследования химического состава крови (5) и гистохимический способ оценки прижизненных паранекротических изменений в тканях органов (6). Однако эти способы имеют ряд недостатков, связанных с необходимостью обязательного умерщвления животных и травматизации изучаемых органов.
В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ гистохимического определения паранекротических прижизненных изменений в тканях органов, заключающийся в том, что по количеству адсорбированной тканью органов краски нейтральрот судят о наличии паранекротических прижизненных изменений (7), так как эта краска окрашивает денатурационные изменения в клетке в обратимой стадии (8).
Способ осуществляется следующим образом. Подопытному животному (в данном случае крысе) внутрибрюшинно вводят 0.5% водный раствор нейтральрота в количестве 0.25 мл на 100 г массы. Затем спустя 30 мин животное забивают и извлекают органы, которые помещают в элюируемую среду (подкисленный концентрированной серной кислотой раствор 70° этилового спирта) в объеме 5 мл на 1 орган. Через 24 часа элюат фотометрируют для определения адсорбированной краски тканью органов. Для оценки тканевого распределения краски органы помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°. Результат оценивают в мг на грамм сухой ткани.
Данный способ определения паранекротических прижизненных изменений обладает недостатком, связанным с необходимостью обязательного умерщвления животных для последующей экстракции краски из тканей органов, и, таким образом, отсутствует возможность изучения прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментальных животных в динамике.
Техническим результатом изобретения является возможность изучения прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментального животного в динамике, а также определение прижизненных паранекротических изменений в тканях органов животного без его умерщвления.
Технический результат достигается тем, что у экспериментальных животных определяют молекулы средней массы (МсМ) в диапазоне 250-300 нМ в плазме крови и при их увеличении относительно исходного уровня в диапазоне 250-270 нМ длин волн определяют прижизненные изменения в тканях органов и костной системе.
Способ осуществляется следующим образом:
В плазме крови (0.5 мл) экспериментального животного по методу М.Я.Малаховой (8) определяют МсМ. Забор крови в объеме 1 мл осуществляют при декапитации или из хвостовой вены (у крыс). Осаждение крупномолекулярных белков проводят 15% раствором трихлоруксусной кислоты (к 0.5 плазмы крови добавляют 0.5 мл 15% р-ра трихлоруксусной кислоты). Сгусток денатурированных белков размешивают стеклянной палочкой, после чего центрифугируют при 5000 оборотах в минуту. Затем к 0.5 мл центрифугата добавляют 9.5 мл дистиллированной воды и фотометрируют на спектрометре при длинах волн от 250 до 300 нМ. Полученные результаты оценивают по величине площади фигуры, образованной кривой величины поглощения и осью нулевой отметки. Выражают эту величину в условных единицах. Затем - постановка эксперимента, заключающегося в моделировании патологических реакций, процессов и состояний. В данном случае использовали модель травматического воздействия на организм животного путем механического перелома трубчатых костей голени. Спустя 24 часа после нанесения травмы исследуют кровь на содержание МсМ и при их увеличении относительно исходного уровня в диапазоне 250-270 нМ длин волн определяют прижизненные изменения в тканях органов и костной системе экспериментального животного.
Отличительным существенным признаком заявляемого способа является определение у экспериментальных животных молекул средней массы (МсМ) в плазме крови и при их увеличении относительно исходного уровня в диапазоне 250-270 нМ длин волн определение прижизненных изменений в тканях органов и костной системе.
Причинно-следственная связь между отличительным существенным признаком заявляемого способа и достигаемым результатом:
Как известно, воздействие многих патогенных факторов может привести к существенным сдвигам нейроэндокринной регуляции с последующим нарушением внутренней среды и появлениям ряда гуморальных факторов эндогенизации патологических процессов (9). При этом вовлекаются в патологический процесс и не поврежденные органы (в данном случае не травмированные органы), усугубляя течение основного патологического процесса. В настоящее время среди факторов эндогенной интоксикации важнейшее значение придается МсМ (10), которые представлены классами соединений с молекулярной массой до 5000Д. Диапазон 250-270 нМ длин волн, предлагаемый в данном способе для определения прижизненных изменений в тканях органов и костной системе экспериментального животного, подобран авторами заявки экспериментальным путем.
Нами впервые установлена коррелятивная взаимосвязь между увеличением относительно исходного уровня МсМ, определяемого в спектре длин волн от 250 до 270 нм, и прижизненными паранекротическими изменениями в тканях внутренних органов и костной системе экспериментального животного.
Отличительный существенный признак заявляемого способа является новым и позволяет определять прижизненные паранекротические изменения в тканях органов животного без его умерщвления, что дает возможность изучать прижизненные паранекротические изменения в тканях органов и костной системе экспериментального животного в динамике.
Пример конкретного выполнения:
(Крысы №3а и 4а из протокола №7). Постановка эксперимента: перелом костей правой голени под общей анестезией. Исследование спустя 18 дней по способу-прототипу и предлагаемому способу.
У крысы №3а из хвостовой вены была взята кровь и исследована по заявляемому способу на определение в плазме крови МсМ в диапазоне 250-300 нМ, при этом использовали спектрофотометр. При этом было установлено, что в диапазоне 250-270 нМ МсМ составило 33,7 у.е., в то время как у контрольной крысы этот показатель равнялся 10,8 у.е., что свидетельствует о прижизненных паранекротических изменениях в тканях органов и костной системе крысы №3а.
У крысы №4а из хвостовой вены также была взята кровь и исследована по заявляемому способу на определение в плазме крови МсМ в диапазоне 250-300 нМ. При этом было установлено, что в диапазоне 250-270 нМ МсМ составило 8,9 у.е., у контрольной крысы этот показатель равнялся 10,8 у.е., что свидетельствует об отсутствии прижизненных паранекротических изменениях в тканях органов и костной системе крысы №4а.
Полученные данные подтверждаются результатами, полученными при исследовании прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе крысы по способу-прототипу:
Органы
Содержание краски мг на 1 грамм ткани
Контроль
Крыса 3а
Крыса 4а
Головной мозг
0.0039
0.0069
0.0041
Спинной мозг
0.0041
0.0073
0.0043
Печень
0.0021
0.0081
0.0018
Сердце
0.0068
0.0109
0.0059
Почки
0.0118
0.0428
0.0109
Бедренная кость
0.0015
0.0046
0.0016
Кости голени
0.0017
0.0039
0.0020
Сущность способа поясняется результатами исследования, полученными на крысах с переломом трубчатых костей (таблица - Сравнительная таблица оценки прижизненных паранекротических изменений тканей органов и костной системы крыс с экспериментальным переломом костей голени по способу-прототипу и по заявляемому способу).
Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что прижизненные паранекротические изменения в тканях органов крыс, определяемые по способу-прототипу, выявляются при использовании заявляемого способа.
Таким образом, заявляемый способ может быть использован для выявления прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментальных животных без их умерщвления, что дает возможность изучения прижизненных паранекротических изменений в тканях органов и костной системе экспериментальных животных в динамике.
Таблица 1
Сравнительная таблица оценки прижизненных паранекротических изменений тканей органов и костной системы крыс с экспериментальным переломом костей голени по способу-прототипу и по заявляемому способу
Сроки наблюдения
КОНТРОЛЬ (п=9)
Через 24 часа (п=8)
Через 18-21 день (п=7)
Ткани органов:
Головной мозг
0.0043+0.0002
0.0081+0.0006*
0.0039+0.0006
Спинной мозг
0.0039+0.0006
0.0061+0.0004*
0.0047+0.0008
Печень
0.0016+0.0001
0.0072+0.0008*
0.0013+0.0001
Сердце
0.0075+0.0008
0.0210+0.0010*
0.0082+0.0004
Почки
0.0130+0.0020
0.0520+0.0110*
0.0160+0.0020
Бедренная кость
0.0017+0.0001
0.0
0.0019+0.0003
Кости голени
0.0021+0.0002
035+0.0001*
0.0022+0.0005
(способ-прототип)
0.0036+0.0002*
Молекулы средней
11.3+2.7 у.е.
25.2+3.4 у.е.*
9.8+3.7 у.е.
массы (у.е. - условные единицы)
(250-270 нМ)
(250-270 нМ)
(250-270 нМ)
31.5+3.1 у.е
17.8+5.4 у.е.
29.6+3.2 у.е.
(заявляемый способ)
(280-300 нМ)
(280-300 нМ)
(280-300 нМ)
Примечание: * - достоверные изменения (р<0.05)
Источники информации
1. Александров В.Я., Кислюк И.М. Реакция клеток на тепловой шок: физиологический аспект // Цитология. - 1994. Т.36, №1. - С.5-60.
2. Романов С.Н. Биологическое действие механических колебаний. - Л., 1983. - 208 с.
3. Хегай М.Д. Патофизиологические основы развития осложнений при инсулинозависимом сахарном диабете. - Автореф. дисс. на соискание уч. степени докт. мед. наук. - СПб., 1998. - 39 с.
4. Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. - М., 2000. Т.1. С.11-23.
5. Хомуло П.С. Неврогенный атеросклероз и липидоз аорты. - М., 1972. С.237-247.
6. Граменицкий Е.М. Прижизненная окраска клеток и тканей. - Л., 1963. - 149 с.
7. Трошин А.С. Распределение веществ между клеткой и средой. - Л., 1985. - 192 с.
8. Медицинские лабораторные технологии. Справочник / под ред. А.И.Карпищенко, Т.2. - С-Петербург, 2002. 400 с.
9. Крыжановский Г.Н. Введение в общую патофизиологию. - М., 2000. - 71 с.
10. Копытова Т.В. Молекулы средней массы как субстрат эндогенной интоксикации при тяжелых дерматозах // Успехи современного естествознания. 2006. №9. С.7-10.