Способность клеток-предшественниц гранулоцитов и макрофагов костного мозга мышей разных линий к образованию колоний in vitro при изменении содержания тимулина в организме и в культуре клеток

DOI: 10.23868/201707021

способность клеток-предшественниц гранулоцитов и макрофагов костного мозга мышей разных линий к образованию колоний in vitro при изменении содержания тимулина в организме и в культуре клеток

И.Ф. Лабунец, А.Е. Родниченко, Р.Г. Васильев

Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины, Киев, Украина

Capacity of bone marrow granylocyte and macrophage precursors in mice of different strains for in vitro colony formation under changed thymuline level in the organism and cell cultures

I.F. Labunets, A.E. Rodnichenko, R.G. Vasyliev

State Institute of Genetic and Regenerative Medicine, NAMS of Ukraine, Kiev, Ukraine

Тимулин/тимический сывороточный фактор — высокоактивный гормон тимуса, под действием которого повышается способность Т-лимфоцитов (предшественников и зрелых) продуцировать вещества, влияющие на гемо-поэз. Данная работа была выполнена с целью изучения у мышей разных линий количества и типа колоний, образуемых гранулоцитарно-макрофагальными клетками-предшественницами костного мозга, при изменении содержания тимулина в организме и в культуре клеток.

В качестве объекта исследований были выбраны мыши-самцы линий СВА/Са (генотип Н-2к) и FVB/N (генотип H-2q) в возрасте 3-4 мес. У интактных, ложноопериро-ванных и тимэктомированных мышей оценивали в крови уровень тимулина; в костном мозге число CD4+-, CD8+-T-лимфоцитов, колониеобразующих клеток-предшественниц гранулоцитов-макрофагов, а также изменение процентного соотношения гранулоцитарных, смешанных и макрофагаль-ных кроветворных колоний под влиянием тимулина in vitro; фагоцитарную активность макрофагов в селезенке.

В работе показано, что число колониеобразующих клеток-предшественниц гранулоцитов-макрофагов у ложноопе-рированных мышей обеих линий выше (p<0,05), чем у ин-тактных. Тимэктомия приводит к дальнейшему повышению числа колониеобразующих клеток-предшественниц грану-лоцитов-макрофагов у мышей линии СВА/Са и их снижению у мышей линии FVB/N. После тимэктомии у мышей линии СВА/Са уменьшается количество СD4+-Т-клеток, тогда как у мышей линии FVB/N наблюдается уменьшение количества СD8+ Т-клеток. Уровень в крови тимулина снижается после ложной операции (p<0,05) только у мышей линии СВА/Са. Активность макрофагов существенно уменьшается после тимэктомии у мышей линии СВА/Са, а у мышей линии FVB/N после ложной операции. У ложнооперированных мышей линии СВА/Са соотношение кроветворных колоний изменяется: в 5,8 раз повышается количество макрофа-гальных колоний по сравнению с интактными мышами. Этот эффект нивелируется у тимэктомированных мышей; наблюдается дозо-зависимое снижение количества макро-фагальных колоний под влиянием тимулина в системе in vitro. У мышей линии FVB/N количество макрофагальных колоний значительно снижается после тимэктомии, однако повышается под воздействием тимулина in vitro.

Таким образом, линейные различия колониеобразующего и дифференцировочного потенциалов кроветворных клеток костного мозга в условиях изменения функционирования тимуса в значительной степени могут быть связаны с особенностями его внутри- и межсистемных взаимодействий.

Ключевые слова: тимус, тимулин, костный мозг, клетки-предшественницы гранулоцитов и макрофагов, генотип.

Введение

В настоящее время для клеточной терапии ряда патологических состояний применяют трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), а также их мобилизацию in vivo [1, 2]. Одним из

e-mail: irina_labunets@ukr.net

Thymiline/thymic serum factor is a highly active thymic hormone, which increases the ability of progenitors and mature T-lymphocytes to produce factors that affect hematopoiesis. The present experiments were undertaken to investigate the linear differences in the number and type of bone marrow colonies formed by the granulocyte and macrophage precursors under changed thymuline level in the organism and cell cultures.

Young CBA/Ca (genotype H-2k) and FVB/N (genotype H-2q) male mice were the object of our research. In the intact, sham-operated and thymectomized mice, blood thymuline level, number of CD4+-, CD8+-T-lymphocytes and progenitor cells for granulocyte-macrophage colonies were measured in the bone marrow. Also, changes of percent ratios of granulocytic, mixed and macrophagal blood-forming colonies under influence of thymuline in vitro and phagocytic activities of macrophages in the spleen were registered.

The number of progenitor cells for granulocyte-mac-rophage colonies was found to be higher (p<0.05) in sham-operated versus intact mice of both strains. Thymectomy led to further increase of their number in CBA/Ca mice and decrease in FVB/N mice. After thymectomy, CD4+-T cells number decreased in CBA/Ca mice whereas CD8+ T cells in FVB/N mice. Blood thymuline level decreased after sham operation (p<0.05) only in CBA/Ca mice. The activity of macrophages decreased essentially after thymectomy in CBA/Ca mice and after sham operation in FVB/N mice. In sham-operated CBA/ Ca mice, the ratio of blood-forming colonies was changed: the number of macrophagal colonies increased 5.8-fold compared to intact mice. This effect leveled in thymectomized mice. We observed a dose-dependent decrease in the number of macrophagal colonies under thymuline effect in vitro. In FVB/N mice the number of macrophagal colonies decreased significantly after thymectomy. However it increased under thymuline influence in vitro.

Thus, the linear differences in capacity of bone marrow blood-forming cells to form colonies and be differentiated under conditions of changed functioning of the thymus can be largely linked with the specifics of its intra- and inter-systemic relationships.

Keywords: thymus, thymuline, bone marrow, progenitor cells for granulocyte-macrophage colonies, genotype.

основных источников ГСК является костный мозг, в котором гемопоэз регулируется центральными и периферическими сигналами, включающими гормоны, цитокины, межклеточные взаимодействия [3—6]. Подобные сигналы дают возможность этим

клеткам не только поддерживать себя, но и дифференцироваться в миелоидном и лимфоидном направлениях.

Как основной орган кроветворения, костный мозг взаимодействует с центральным органом иммунной системы — тимусом [7, 8]. В условиях гипофункции тимуса дифференцировка ГСК в костном мозге нарушается во всех направлениях кроветворения, особенно в гранулоцитарно-макрофагальном [7]. Известно, что гранулоциты и макрофаги представляют первую линию защиты организма от чужеродных агентов и участвуют в развитии иммунного ответа [3].

Есть данные о том, что изменение гемопоэза в костном мозге в условиях гипофункции тимуса может быть связано не только с дефицитом образующихся в железе определенных субпопуляций Т-лимфоцитов, но и гормонов [7—11]. Так, нарушенное у Т-дефицитных мышей (Balb/c nu/nu) образование гранулоцитов можно восстановить с помощью введения CD4+ Т-клеток, которые синтезируют ге-мопоэтические цитокины [9, 10]. Подобный эффект у тимэктомированных животных и у людей с комбинированным иммунодефицитом также можно получить путем введения in vivo биологически активных факторов тимуса (тимозин, тимостимулин, тималин) [7, 11].

Тимулин/тимический сывороточный фактор (ТСФ) — высокоактивный гормон тимуса. Было установлено, что под его действием повышается способность предшественниц Т-лимфоцитов продуцировать вещества, влияющие на гемопоэз [8]. По нашим данным, в костном мозге мышей линии СВА/Са в ответ на физиологические колебания в крови уровня тимулина изменяется количество колони-еобразующих клеток-предшественниц гранулоцитов-макрофагов (КОК-ГМ), что также свидетельствует о чувствительности гемопоэтической ткани костного мозга к тимулину [12]. Вместе с тем, механизмы регуляторного влияния тимулина до конца непонятны и нуждаются в дальнейшем исследовании.

Одним из перспективных экспериментальных подходов для оценки важности взаимодействий костного мозга и тимуса в регуляции гемопоэза может быть проведение исследований на мышах различных линий. В литературе уже представлены данные, указывающие на целесообразность учета генотипа животных при изучении возрастных изменений биологических свойств кроветворных стволовых клеток [13]. Более того, нами ранее в эксперименте на мышах линий СВА/Са и FVB/N установлены различия в функционировании тимуса, кроветворных клеток костного мозга и нейро-эндокринной системы не только в молодом возрасте, но и при старении [14].

Цель нашей работы — оценить у мышей разных линий количество и тип колоний, образуемых гра-нулоцитарно-макрофагальными клетками-предшественницами костного мозга, при изменении содержания тимулина в организме и в культуре клеток.

Материал и методы

Линии мышей

Исследования проводили на мышах-самцах линий СВА/Са (генотип H-2k, n = 43) и FVB/N (генотип H-2q, n = 46) в возрасте 3—4 мес. разводки вивария ГУ «Институт генетической и регенеративной медицины НАМН Украины». Все работы с эксперимен-

тальными животными выполняли с соблюдением законодательства и принципов биоэтики [15].

Выбор данных линий мышей обоснован, во-первых, линейными особенностями гемопоэза в костном мозге как в норме, так и под влиянием различных воздействий и, во-вторых, различиями в функционировании Т-звена иммунной системы и характере иммуноэндокринных взаимодействий с участием тимуса [12—14, 16]. Так, у мышей линии СВА/Са по сравнению с мышами линии FVB/N ниже частота не только спонтанных хромосомных аберраций в костномозговых клетках, но и возникающих с возрастом злокачественных лимфом/лейкозов. Если мыши линии СВА/Са чувствительны к облучению и химическим канцерогенным агентам, вызывающим миелоидный лейкоз, а также резистенты к вирусу мышиного лейкоза, то мыши линии FVB/N, наоборот, чувствительны к вирусу типа В лейкоза Френда.

Экспериментальные группы мышей

Гипофункцию тимуса у мышей (n = 16 для каждой линии) моделировали путем удаления органа под авертиновым наркозом (2,5% раствор, 0,2 мл/20 г, внутрибрюшинно). Контрольная группа — ложно-оперированные животные (n = 14 для линии СВА/Са; n = 13 для линии FVB/N). В работе также использовали интактный контроль (n = 13 для линии СВА/Са; n = 17 для линии FVB/N).

Биологический материал получали после дека-питации мышей под эфирным наркозом в утреннее время суток (9.00—10.00) через 4 нед. после операции.

Эксперимент состоял их двух этапов. На первом этапе эксперимента определяли функцию тимуса, клеточный состав костного мозга и функциональную активность периферических макрофагов. На втором этапе изучали влияние тимулина на гемопоэз в опытах in vitro.

Исследование эндокринной функции тимуса

У животных всех экспериментальных групп оценивали в крови уровень тимулина/(ТСФ) [17], значения которого у мышей с полностью удаленным тимусом должны быть нулевыми. Метод основан на способности тимического гормона восстанавливать чувствительность спонтанных розеткообразующих спленоцитов взрослых тимэктомированных мышей к азатиоприну. Сыворотку крови животных пропускали через ультрафильтр системы Centriflo CF-5OA (Amicon, США) для удаления высокомолекулярного ингибитора гормона. В реакции использовали по 0,1 мл цельной сыворотки и серийно разведенной питательной средой 199 (Sigma, США). Контроль — 0,1 мл среды 199. Спленоциты выделяли из селезенки мышей через 10—14 дней после тимэктомии: измельченную ткань селезенки фильтровали через капроновый фильтр, взвесь клеток 2 раза отмывали средой 199, центрифугируя 10 мин. при 1500 об/мин. Ядросодержащие жизнеспособные спленоциты подсчитывали в 0,16% растворе трипанового синего в камере Горяева и затем доводили средой 199 до концентрации 40х106/мл.

Взвесь спленоцитов в объеме 0,1 мл добавляли к сыворотке крови и контролю, инкубировали при 37°С в течение 60 мин. Затем в пробы добавляли

по 0,1 мл раствора азатиоприна (0,2 мг/мл среды 199) (Sigma, США), перемешивали, инкубировали при 37°С 30 мин. и добавляли по 0,1 мл суспензии эритроцитов барана (концентрация 120х10в/мл среды 199), предварительно отмытых в 0,9% растворе хлорида натрия. Взвесь перемешивали, центрифугировали 5 мин. при 1200 об/мин и инкубировали 60 мин. при 4—8°С. Осадок ресуспензировали в среде 199; подсчет образовавшихся розеток производили в камере Горяева. За розетку принимали спленоцит, присоединивший 4 и более эритроцитов барана. Титром тимулина считали последнее разведение сыворотки, вызывающее 50% редукцию числа розеткообразующих клеток по отношению к контролю. Результаты выражали в виде log2 титра гормона.

Оценка кроветворных колоний в костном мозге

Костный мозг получали из одной бедренной кости через 4 недели после операции путем вымывания средой RPMI-1640 (Sigma, США), содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) с помощью шприца с инъекционной иголкой. Клетки костного мозга отмывали дважды средой RPMI-1640, центрифугируя 10 мин. при 1500 об/мин. Количество ядросодержащих клеток подсчитывали в камере Горяева, используя 3% раствор уксусной кислоты, что позволяет исключить из учета эритроциты.

Количество КОК-ГМ в костном мозге определяли in vitro в полужидком агаре (Difco, США) [18]: 3х105 клеток костного мозга вносили в 1 мл питательной среды McCoy 5A (Gibco, Scotland) с добавлением 15% ЭТС (Sigma, США), 1,6% пирувата натрия (Sigma, США), L-глутамина (10 ммоль/л) (Gibco, Scotland), HEPES (20 ммоль/л) (Sigma, США), 0,94% бикарбоната натрия и 1% колониестимули-рующего фактора гранулоцитов-макрофагов (ГМ-КСФ) (в конечной концентрации 0,5 нг/мл) (Sigma, США). Культивирование проводили в течение 8 сут. при 37°С в увлажненной газовой смеси с 5% CO2. Под инвертированным микроскопом (Olympus IX71 с цифровой камерой Olympus DP20, Япония) подсчитывали общее количество колоний, содержащих не менее 50 клеток; результаты выражали в виде их относительного (на 106 клеток костного мозга) и абсолютного числа в костном мозге одной бедренной кости. При анализе колонии делили на три типа в зави^мости от диаметра: малые (до 140 мкм), средние (150—280 мкм), большие (свыше 300 мкм) [19]. Как показано авторами, колонии указанных выше размеров содержат не только клетки разной природы и их количество, но и отражают стадию развития кроветворных клеток костного мозга: это соответственно компактные (гранулоцитарные), смешанные (гранулоцитарно-макрофагальные) и диффузные (макрофагаль-ные) колонии [19].

Определение Т-лимфоцитов в костном мозге

Поскольку удаление тимуса сопровождается выпадением не только эндокринной, но и цитокринной функций [8, 20], в костном мозге мышей оценивали количество субпопуляций Т-лимфоцитов, влияющих на кроветворение. Для фенотипирования Т-лимфоцитов костного мозга использовали моно-клональные антитела (МАТ) анти-СD4, меченные

фикоэритрином; анти-С08, меченные аллофикоци-анином (Becton Dickinson, США). Клетки костного мозга инкубировали с МАТ в течение 30 мин. при + 4°С, отмывали, добавляли фосфатный буфер, содержащий 1% ЭТС, пропускали через клеточные фильтры с диаметром пор 70 мкм, разбавляли раствором FACSFlow для проточной цитометрии и анализировали на проточном цитофлюориметре-сорте-ре B0 FACSAria (Becton Dickinson, США).

Исследование функциональной активности

макрофагов

В селезенке определяли функциональную активность макрофагов, как один из возможных показателей способности костномозговых КОК-ГМ к дифференцировке в макрофагальном направлении с миграцией клеток этого ряда на периферию. Известно, что в селезенке присутствуют макрофаги (в красной пульпе) и уровень функциональной активности макрофагов лимфоидных органов высок [20]. Кроме того, адгезивные молекулы (прежде всего интегрины: макрофаги экспрессируют ин-тегрины Р1 и три типа Р2-интегринов) и рецепторы макрофагов обусловливают высокую адгезивность к субстратам различной природы. Суспензию спле-ноцитов, полученную через 4 недели после операции (методика выделения спленоцитов описана выше), в концентрации 8х106/0,2 мл наслаивали на покровные стекла и инкубировали в увлажненной газовой смеси с 5% СО2 при 37°С. После инкубации к адгезировавшим клеткам добавляли 0,2 мл суспензии частичек латекса (5х108/мл) в среде 199, инкубировали 30 мин. в атмосфере с 5% СО2 при 37°С (Sigma, США). Затем смывали свободные частички латекса, адгезированные клетки фиксировали в течение 5 мин. в парах 4% параформальде-гида (рН 7,2—7,4) и окрашивали по Романовскому — Гимзе [21]. Оценку функциональной активности макрофагов проводили под инвертированным микроскопом. Подсчитывали процент фагоцитирующих клеток (фагоцитарный индекс, ФИ) и количество частичек, которые поглощены одним фагоцитирующим макрофагом (фагоцитарное число, ФЧ). Фагоцитарную активность (ФА) определяли путем деления количества поглощенных частиц латекса на сто подсчитанных клеток. ФЧ и ФА выражали в условных единицах (усл. ед.).

Оценка прямого влияния тимулина на гемопоэз

в костном мозге in vitro

Для изучения in vitro возможности прямого влияния тимулина на гемопоэз в костном мозге к све-жевыделенным из бедренной кости клеткам костного мозга тимэктомированных мышей однократно добавляли тимулин (Sigma, США) в концентрации 1 нг/мл или 10 нг/мл, инкубировали в полужидком агаре в течение 8 сут. и подсчитывали количество КОК-ГМ с помощью указаного выше метода. Контроль — клетки костного мозга тимэктомированных мышей, культивированные без тимулина.

Статистический анализ

Сравнение количественных данных между группами осуществляли с помощью параметрического метода (t-критерий Стьюдента) [22].

результаты

Клеточный состав костного мозга, периферические макрофаги и функция тимуса у мышей разных линий

В результате проведеного исследования было обнаружено, что количество ядросодержащих клеток в костном мозге интактных, ложнооперирован-ных и тимэктомированных мышей линий СВА/Са и РУВ/Ы практически не различается (табл.). Однако, относительное количество КОК-ГМ, значительно повышенное в костном мозге ложнооперированных мышей обеих линий, еще больше увеличивается после тимэктомии у мышей линии СВА/СА и, наоборот, снижается у мышей линии РУВ/Ы (в 1,3 раза по сравнению с ложнооперированными) (табл.). Кроме того, если после тимэктомии в костном мозге мышей линии СВА/Са преимущественно уменьшается количество С04+-клеток, то у мышей линии РУВ/Ы — С08+-клеток, что приводит к разнонаправленным изменениям у них баланса исследованных типов клеток (табл.).

Следовательно, у мышей, лишенных тимуса, линейные различия в изменении клеточного состава костного мозга проявляются как со стороны кроветворных клеток, так и регуляторных Т-лимфоцитов. Разнонаправленность изменений количества КОК-ГМ в костном мозге тимэктомированных мышей линий СВА/Са и РУВ/Ы была основанием для исследований у них макрофагов на периферии, количество и свойства которых в значительной степени сопряжены со способностью гранулоцит-макрофагальных предшественников костного мозга к направленной дифференцировке.

Было выявлено, что количество ядросодержащих клеток в селезенке мышей линии СВА/Са и РУВ/Ы

практически не различается между экспериментальными группами (табл.). При этом показатели у ложнооперированных и тимэктомированных мышей линии РУВ/Ы превышают таковые у мышей линии СВА/Са.

Установлено значительное уменьшение числа фагоцитирующих макрофагов и их активности в селезенке тимэктомированных мышей линии СВА/Са, тогда как у мышей линии РУВ/Ы снижение числа фагоцитирующих макрофагов регистрируется уже после ложной операции и сохраняется практически на том же уровне после удаления тимуса (табл).

Таким образом, у мышей экспериментальных групп наблюдается корреляция между изменением количества КОК-ГМ в костном мозге и фагоцитирующих макрофагов в селезенке. Линейные особенности такой корреляции могут определяться как биологическими свойствами самих кроветворных клеток костного мозга, так и влиянием на последние факторов тимуса (направленная дифферен-цировка и миграция клеток миелоидного и лим-фоидного рядов из костного мозга на периферию) [7, 8].

Нами установлено, что при отсутствии различий в уровне тимулина у интактных мышей линии СВА/Са и РУВ/Ы (соответственно 5,3±0,5, п = 6 и 5,2±0,4, п = 8), его значения после ложной операции существенно снижаются у мышей линии СВА/Са (до 3,3±0,5, п = 6) и остаются практически на прежнем уровне у мышей линии РУВ/Ы (5,8±0,5, п = 6). У тимэктомированных мышей обеих линий тимиче-ский гормон в крови не определяется.

В дальнейших исследованиях представляло интерес оценить особенности влияния тимического гормона на кроветворные клетки костного мозга мышей разных линий.

таблица. Показатели клеточного состава костного мозга и функциональной активности макрофагов селезенки у мышей экспериментальных групп, M±m

Мыши линии СВА/Са

Мыши линии FVB/N

Показатель Интактные

Костный мозг

Число ядросодержащих клеток,106 15,9±1,4 15,23±1,5 16,8±1,1 18,9±1,9 17,8±1,6 17,7±1,4

Число КОК-ГМ/106 клеток/КМ 12,1±2,5 29,9±4,6* 39,5±7,4* 14,7±3,9 31,5±6,9* 24,9±5,3#

Число КОК-ГМ/бедро 202,3±57,3 426,1±79,8* 602,4±119,4 243,7±58,4 589,9±158,2* 410,5±82,1

Сй4+, % 27,3±1,7 24,8±3,7 21,4±1,8* 26,7±2,6 27,4±2,4 29,4±1,7#

Сй8+, % 27,2±2,5 24,3±3,5 28,6±3,0 27,1±2,9 25,6±2,3 22,4±2,1

С04+/С08+, усл. ед 1,0±0,1 1,0±0,3 0,8±0,1 1,0±0,1 1,1±0,1 1,4±0,1* #

Селезенка

Число ядросодержащих клеток,106 140,0±46,0 130,0±8,0 117,0±7,0 177,0±23,0 210,0±22,0 # 235,0±32,0#

ФИ, % 74,1±4,4 76,8±4,0 59,3±2,7* ** 76,0±4,6 62,7±4,6 * # 63,8±6,9

ФА, усл. ед. 3,5±0,5 3,2±0,4 1,9±0,1 * ** 3,2±0,3 2,7±0,4 2,8±0,5

ФЧ, усл. ед. 4,5±0,2 4,1±0,3 3,2±0,1 * ** 4,1±0,3 4,2±0,3 4,0±0,4 #

Л/оп — «ложнооперированные»; Т/э — тимэктомированные; КМ- костный мышами; **— Р<0,05 по сравнению с «ложнооперированными» мышами; СВА/Са.

мозг; * — Р<0,05 по сравнению с интактными # — Р<0,05 по сравнению с мышами линии

Типы кроветворных колоний в костном мозге экспериментальных групп мышей и их изменения под действием тимулина in vitro

При индивидуальном анализе костномозговых колоний, образованных гранулоцитарно-макрофа-гальными предшественниками, оказалось, что они неоднородны и отличаются размерами и клеточным составом у мышей всех исследованных экспериментальных групп (рис. 1).

Ранее нами была показана разнородность кроветворных колоний у интактных молодых мышей-самцов линий СВА/Са и FVB/N [14]. В настоящем исследовании обнаружено, что у интактных мышей линии СВА/Са количество макрофагальных колоний в 2 раза ниже, чем у мышей линии FVB/N (рис. 2, 3).

При сопоставлении данных, полученных в группе ложнооперированных мышей линии СВА/Са, с ин-тактной группой, установлено снижение количества гранулоцитарных и смешанных колоний (соответственно в 2,5 и 1,9 раза) и повышение количества макрофагальных колоний (в 5,8 раза) (рис. 2), что указывает на усиление дифференцировки КОК-ГМ в макрофагальном направлении в условиях операционного стресса. Подобные изменения в процентном соотношении разных типов колоний нивелируются у мышей, лишенных тимуса.

Если у ложнооперированных мышей линии РУВ/Ы изменения соотношения колоний разного типа были незначительными по отношению к интактной группе, то после тимэктомии они становились существенными (рис. 3).

О ,Г, . 4

m 1- * ' -щ

В

пи

: y

• ' да&г - щ

• « ** <yt

V ъД

V^ : ; •

У Л V. » F г, . Irr .1 >

** . 'Ч. •

И-4" ' ÀL

л. Q i Г1 .

? е - ея * " та ' « •

.Л

А\о

Рис. 1. Типы колоний, которые образуют гранулоцитарно-макрофагальные клетки-предшественницы в костном мозге мышей разных линий: А — компактная (гранулоцитарная); Б — диффузная с плотным ядром (смешанная); В — диффузная (макрофагальная). Фазовый контраст. Ув. х100

CBA/Ca

40 50 10

1 26,4 57,8

38,7 48,3 13

31,5 С

72,9 1

FVB/N -г

7,4 5,9

0%

гранулоцитарные

50%

смешанные

100% макрофагальные

48 32 20

46 38,8 15,2

73,7 23,1

44,2 28,2 27,6

3,2

58,3

0%

гранулоцитарные

50%

смешанные

-1

100%

макрофагальные

Рис. 2. Процентное соотношение колоний разного типа, которые образуют гранулоцитарно-макрофагальные клетки-предшественницы в костном мозге мышей линии СВА/Са: 1 — интактные; 2 — «ложнооперированные»; 3 — тимэктомированные;

4, 5 — тимэктомированные + in vitro тимулин в дозах 1,0 нг/мл и 10 нг/мл, соответственно

Рис. 3. Процентное соотношение колоний разного типа, которые образуют гранулоцитарно-макрофагальные клетки-предшественницы в костном мозге мышей линии FVB/N: 1 — интактные; 2 — ложнооперированные; 3 — тимэктомированные;

4, 5 — тимэктомированные + in vitro тимулин в дозах 1,0 нг/мл и 10 нг/мл, соответственно

Так, у тимэктомированных мышей количество ма-крофагальных колоний уменьшалось в 6,3 раза по сравнению с интактным контролем, тогда как грану-лоцитарных повышалось в 1,5 раза.

В опытах in vitra были установлены изменения в процентном соотношении колоний разного типа после инкубации клеток костного мозга тимэктомированных мышей с тимулином (рис. 2, 3). При этом у мышей линии СВА/Са наблюдалось дальнейшее дозо-зависимое снижение количества макрофагаль-ных колоний, а также повышение количества гра-нулоцитарных и смешанных колоний по сравнению с контролем. Напротив, у мышей линии FVB/N после инкубации с тимическим гормоном количество макрофагальных и смешанных колоний повышалось, а гранулоцитарных снижалось.

Таким образом, в результате проведенных исследований показана определенная корреляция между изменением способности к колониеобразованию и дифференцировке кроветворных клеток костного мозга, коммитированных в гранулоцитарно-макро-фагальном направлении, и функционированием тимуса, которая имеет некоторые линейные особенности.

обсуждение

Известно, что стресс — это адаптивная реакция организма, к ранним проявлениям которой можно отнести повышение в крови уровня адренокортико-тропного гормона и глюкокортикоидов, изменение в костном мозге количества стволовых клеток и усиление гранулопоэза, перераспределение и мобилизацию лимфоцитов, миграцию Т-лимфоцитов из тимуса в костный мозг [23, 24]. При некоторых видах стресса повышенный уровень глюкокортикоидов в крови животных сохраняется и в течение 1 мес. [23].

Ранее нами было показано, что в костном мозге мышей линии СВА/Са, в отличие от мышей линии FVB/N, число КОК-ГМ значительно повышается уже через 24 ч. после операционного стресса [25]. В настоящем исследовании нами установлено повышение количества КОК-ГМ в костном мозге мышей обеих линий через 4 недели после ложной операции. При этом у мышей линии СВА/Са усиление способности гранулоцитарно-макрофагальных клеток-предшественниц к колониеобразованию сочетается с активацией их дифференцировки в макрофагаль-ном направлении. У мышей линии FVB/N, несмотря на более высокий исходный дифференцировочный потенциал этих клеток, наблюдается только усиление их способности к колониеобразованию, без значительных изменений соотношения кроветворных колоний разного размера. Таким образом, для мышей линии FVB/N характерна другая временная динамика развития адаптивной реакции кроветворной ткани костного мозга на стресс, а также ее проявление в отдаленные сроки после стрессового воздействия. Мы полагаем, что возможными причинами линейных различий в реализации биологических свойств кроветворной ткани костного мозга могут быть особенности не только внутрисистемных, но и иммуноэндокринных взаимодействий с участием тимуса.

В литературе есть данные о влиянии тимуса на функционирование таких компонентов микроокружения костного мозга, как Т-лимфоциты и мульти-потентные мезенхимальные стромальные клетки

(ММСК) [12]. Известно, что Т-хелперы костного мозга синтезируют ряд цитокинов (например, интер-лейкин (ИЛ)-17), которые изменяют пролиферацию ММСК и продукцию ими гранулоцитарного и грануло-цитарно-макрофагального колониестимулирующих факторов [10]. В отсутствие активированных С04+Т-клеток, но не С08+Т-кпеток, гранулопоэз в костном мозге нарушается [9]. В свою очередь ММСК продуцируют ИЛ-7, который активирует С08+Т-клетки костного мозга и усиливает их пролиферацию [10]. В реализации этих сложных клеточных взаимодействий тимулин направленно влияет на образование разных субпопуляций Т-лимфоцитов в тимусе, функционирование зрелых Т-клеток в костном мозге, а также пролиферативный потенциал костномозговых ММСК [8, 12, 26].

Нами установлено, что после тимэктомии количество ММСК в костном мозге мышей линии СВА/Са снижается [12]. В данной работе показано, что баланс регуляторных Т-лимфоцитов сдвигается в сторону накопления С08+Т-клеток у тимэктомированных мышей линии СВА/Са и С04+Т-клеток у тимэктомированных мышей линии FVB/N, и, кроме того, по-разному изменяется и эндокринная функция тимуса у ложнооперированных мышей этих линий. По-видимому, поэтому в условиях стрессовых влияний изменение функционирования составляющих микроокружения костного мозга проявляет линейные особенности. Как нами показано, в костном мозге мышей линии СВА/Са в ранние сроки после операционного стресса (через 24 ч.) пролифератив-ный потенциал ММСК усиливается, однако у мышей линии FVB/N остается без изменений [25]. Линейные различия в биологических свойствах ММСК костного мозга наблюдали и другие исследователи 127]. Необходимо отметить, что характер изменений количества ММСК в костном мозге мышей линий СВА/Са и FVB/N сопряжен с таковым КОК-ГМ, что свидетельствует о существовании линейных особенностей взаимодействий указанных типов костномозговых клеток [25].

Вместе с тем, мы не исключаем возможности существования линейных различий и в результатах прямого влияния гормонов тимуса на свойства кроветворных клеток костного мозга [28]. При изучении изменений соотношения кроветворных колоний разного размера после их инкубации in vitro с тимулином было установлено, что сниженный после тимэктомии дифференцировочный потенциал КОК-ГМ еще больше уменьшается у мышей линии СВА/Са и, наоборот, усиливается у мышей линии FVB/N. С одной стороны, факт изменения количественного соотношения разных типов колоний подтверждает возможность прямого влияния ти-мического гормона на свойства костномозговых кроветворных клеток у мышей обеих линий. С другой стороны, только у тимэктомированных мышей линии FVB/N мы наблюдали определенное улучшение в процентном соотношении кроветворных колоний после инкубации с тимулином. Выявленные особенности реакции кроветворных клеток на действие ти-мического гормона у взрослых мышей линии СВА/Са можно объяснить тем, что у них в физиологических условиях тимулин влияет на гемопоэз в костном мозге преимущественно через факторы микроокружения (ММСК и Т-лимфоциты), тогда как прямое действие гормона на эти клетки проявляется, как правило, в больших дозах [28]. Вместе с тем, нами показана

возможность непосредственного влияния тимиче-ского гормона уже в невысоких дозах на функционирование кроветворных клеток костного мозга старых мышей линии СВА/Са, у которых мы наблюдали изменение внутрииммунных взаимосвязей [28]. Поскольку у взрослых мышей линии FVB/N взаимодействие тимуса и костного мозга изменено, можно полагать, что в этих условиях преимущественно реализуется прямой путь влияния тимического гормона на кроветворные клетки костного мозга.

Среди иммуноэндокринных взаимодействий, которые могут изменить биологические свойства кроветворной ткани костного мозга у мышей разных линий, представляют интерес взаимоотношения тимуса с эпифизом и корой надпочечников [14, 29]. Так, у мышей линии СВА/Са в ответ на стресс повышается в крови уровень мелатонина [28]. Мелатонин регулирует экспрессию рецепторов к глюкокортико-идам на эпителиалиальных клетках тимуса и усиливает синтез Сй4+Т-кпетками костного мозга опиоид-ных пептидов, которые повышают продукцию ММСК костного мозга гемопоэтических цитокинов (ГМ-КСФ) [30, 31]. Уровень мелатонина в крови мышей линии FVB/N значительно снижен по сравнению с мышами линии СВА/Са [14]. Кроме того, у мышей линии FVB/N угнетена реакция эндокринной функции тимуса на прямое влияние глюкокортикоидов [25]. Повышение содержания тимулина у мышей этой

ЛИТЕРАТУРА:

1. Felfly H., Haddad G.G. Hematopoietic stem cells: potential new applications for translational medicine. J. Stem Cells 2014; 9(3): 163-97.

2. Hosing C. Hematopoietic stem cell mobilization with G-CSF. Methods Mol. Biol. 2012; 904: 37-47.

3. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология, пер. с англ. Москва: Мир; 2000.

4. Geiger H., Rudolf K.L. Aging in the lympho-hematopoietic stem cell compartment. Trends Immunol. 2009; 30(7): 360-5.

5. Kalinkovich A., Spiegel A., Shivtiel Sh. et al. Blood-forming stem cells are nervous:direct and indirect regulation of immature human CD34+ cells by the nervous system. Brain Behav. Immun. 2009; 23: 1059-65.

6. Mendelson A., Frenette P.S. Hematopoietic stem cell niche maintenance during homeostasis and regeneration. Nat. Med. 2014; 20(8): 833-46.

7. Гриневич Ю.А., Чеботарев В.Ф., редакторы. Иммунобиология гормонов тимуса. Киев: Здоровье; 1989.

8. Ярилин А.А., Пинчук В.Г., Гриневич Ю.А. Структура тимуса и дифференцировка Т-лимфоцитов. Киев: Наукова думка; 1991.

9. Monteiro J.P., Benjamin A., Costa E.S. et al. Normal hematopoiesis is maintained by activated bone marrow CD4+ T-cells. Blood 2005; 105(4): 1484-91.

10. Di Rosa F. T-lymphocyte interaction with stromal, bone and hematopoietic cells in the bone marrow. Cell Biol. 2009; 87(1): 20-9.

11. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции старения. СПб: ИКФ «Фолиант»; 2001.

12. Лабунец И.Ф. Эпифиз и ритмы функций иммунной системы при старении. Экспериментальное исследование. Saarbrucken: LAP LAMBERT Academic Publishing; 2012.

13. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. 2-е изд. Санкт-Петербург: Наука; 2008.

14. Labunets I.F. The peculiarities of age-related changes in the cellular composition of bone marrow, pineal melatonin-forming function, and thymus endocrine function in mice of different strains. Adv. Gerontol. 2014; 4(2): 134-9.

15. Белоусов Ю.Б., редактор. Этическая экспертиза биомедицинских исследований. Практические рекомендации. Москва: Российское общество клинических исследователей; 2005.

16. Machler J.F., Stokes W., Mann P.C. et al. Spontaneous lesions in aging FVB/N mice. Toxicol. Pathol. 1996; 24(6): 710-6.

линии может способствовать активации CD8+^ клеток костного мозга [8]. По-видимому, поэтому у мышей линии FVB/N мы наблюдали преимущественно усиление клоногенного потенциала КОК-ГМ в ответ на стресс, без изменений дифференцировочного. Особенности иммуноэндокринных взаимодействий у мышей исследованных линий могут также иметь значение для линейных отличий в миграции клеток моноцитарно-макрофагального ряда из костного мозга в периферические лимфоидные органы [8].

Таким образом, полученные результаты углубляют наше представление о возможной роли гормонов тимуса и образующихся в нем разных Т-субпопуляций лимфоцитов во внутрисистемном контроле гемо-поэза в костном мозге. Результаты могут быть основанием при разработке подходов к мобилизации собственных кроветворных клеток (например, введение гемопоэтических цитокинов) в организмах с дисфункцией тимуса или при клеточной терапии с использованием ГСК от доноров с патологией эндокринной функции тимуса, что, в конечном итоге, позволит повысить эффективность восстановительного потенциала этих клеток. Установленные линейные различия во внутрисистемных и межсистемных взаимодействиях с участием тимуса могут быть полезными при поиске подходов к индивидуализированной клеточной терапии патологий, сочетающихся с нарушением функционирования тимуса.

17. Bach J.F., Bach M.A., Blanot D. et al. Thymic serum factor (FTS). Bull. Inst. Pasteur (Paris) 1978; 76: 325-98.

18. Bradley T.R., Metcalf D. The growth of mouse bone marrow cells in vitro. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1966; 44: 286-300.

19.Чертков И.Л., Фриденштейн А.Я. Клеточные основы кроветворения. Москва: Медицина; 1977.

20. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Москва: Медицина; 1999.

21. Стефанов О.В., редактор. Доклинические исследования лекарственных средств (методические рекомендации). Киев: Авиценна; 2001.

22. Лакин Г.Ф. Биометрия. Москва: Высшая школа; 1990.

23. Корнева Е.А., Шхинек Э.К. Гормоны и иммунная система. Ленинград: Наука; 1988.

24. Zhao E., Xu H., Wang L. et al. Bone marrow and the control of immunity. Cell. Mol. Immunol. 2012; 9: 11-9.

25. Лабунец И.Ф., Кучук О.В., Родниченко А.Е. и др. Генетические особенности функционального состояния иммунной системы у интактных мышей и в условиях стрессовых влияний. В: Германов В.Г., редактор. Актуальные проблемы акушерства и гинекологии, клинической иммунологии и медицинской генетики. Сборник научных трудов. Киев-Луганск: Издательство ЛугДМУ; 2010; Выпуск 19. с. 271-81.

26. Pardo J., Schwerdt J.I., Reggiani P.C. et al. Physiology, molecular biology and therapeutic potential of the thymic peptide thymulin. Physiol. Mini Reviews 2012; 6(1): 2-12.

27. Peister A., Mellad J.A., Larson B.L. et al. Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential. Blood 2004; 103: 1662-8.

28. Лабунец И.Ф. Роль эпифиза в регуляции биоритмов функций иммунной системы при старении [диссертация]. Киев: Институт геронтологии им. Д.Ф. Чеботарева НАМН Украины; 2012.

29. Savino W., Mendes-da-Cruz A., Lepletier A. et al. Hormonal control of T-cell development in health and disease. Nature Reviews Endocrinology 2016; 12: 77-89.

30. Saintz R.M., Mayo J.C., Reiter R.J. et al. Melatonin regulates glucocorticoids receptor an answer to its antiapoptotic action in thymus. FASEB J. 1999; 13(12): 1547-56.

31. Сarrilo-Vico A., Lardone P.J., Alvarez-Sanchez N. et al. Melatonin: Buffering the Immune System. Int. J. Mol. Sci. 2013; 14: 8638-83.

Поступила: 19.07.2016