Исследование люминесценции комплекса БТШ70-АТФ-Mg2+ и его тепловой денатурации

ФИЗИКО-МАТЕМАТИЧЕСКИЕ НАУКИ

Исследование люминесценции комплекса БТШ70-АТФ-М^2+ и его тепловой денатурации

12 3

Букина М. Н. , Бакулев В. М. , Лисаченко Д. А.

1 Букина Мария Николаевна /Bukina Maria Nikolaevna - кандидат физико-математических

наук, доцент, кафедра общей физики-2;

2Бакулев Владимир Михайлович /Bakulev Vladimir Mikhailovich - кандидат физикоматематических наук, старший научный сотрудник, кафедра молекулярной биофизики и физики полимеров;

3Лисаченко Дмитрий Андреевич / Lisachenko Dmitry Andreevich - кандидат физикоматематических наук, доцент, кафедра общей физики-2, физический факультет,

Санкт-Петербургский государственный университет, г. Санкт-Петербург

Аннотация: исследованы спектрально-люминесцентные свойства водных растворов белка БТШ70 и комплекса БТШ70-АТФ-Mg2+, получена зависимость интенсивности испускания люминесценции от температуры. Обнаружено, что температура плавления комплекса БТШ70-АТФ-Mg2+ на 9оС выше, чем свободного БТШ70, и температурный диапазон, в котором происходит конформационный переход, более узкий. Показано, что образование комплекса с АТФ в присутствии ионов магния стабилизирует вторичную структуру БТШ70 и уменьшает внутримолекулярную подвижность макромолекулы белка.

Abstract: spectral luminescent properties of aqueous solutions of protein HSP70 and of HSP70-ATP-Mg2+ complex are studied, the dependence of the emission luminescence spectrum on temperature is obtained. It is found that the melting temperature of HSP70-ATP-Mg2+ complex is 9C,C higher than that of free HSP70, and the temperature range in which the conformation transition occurs is more narrow. It is shown that the formation of a complex with ATP in the presence of Mg2+ ions stabilizes the secondary structure of HSP70 and decreases the intramolecular mobility of the protein macromolecule.

Ключевые слова: люминесценция, БТШ70, БТШ70-АТФ-Mg2+, тепловая денатурация. Keywords: luminescence, HSP70, HSP70-ATP-Mg2+, thermal denaturation.

УДК 57.043; 577.322.4

Введение

Белки семейства БТШ70 активно изучаются в последнее время, т. к. выполняют множество важных функций в организме: участвуют в фолдинге белков,

восстанавливают поврежденные белки после попадания клетки в стрессовое состояние, обладают иммуномодулирующими свойствами [1,2]. Все типы биологической активности БТШ70 опираются на АТФ-регулируемое связывание пептидов, обусловленное наличием двух основных функциональных доменов в нативном состоянии БТШ70. При этом N-концевой домен обладает АТФ-азной активностью, а COOH-терминальный домен связывается с полипептидами [3]. В состав макромолекулы БТШ70 входят люминесцирующие ароматические аминокислоты: фенилаланин (25 остатков), тирозин (15 остатков) и триптофан (2 остатка), что позволяет изучать особенности строения вторичной и третичной структуры полипептида спектрально-люминесцентным методом. В работе [4] показана успешность применения спектрально-люминесцентного метода для исследования тепловой денатурации водного раствора БТШ70. В данной работе спектрально-люминесцентным методом изучен комплекс БТШ70-АТФ-М§2+.

6

Известно, что в присутствии ионов Mg2+ АТФ связывается с определенными сайтами ИН2-концевого домена [3]. Обнаружено, что температура плавления такого комплекса на 9оС выше, чем свободного БТШ70, и температурный диапазон, в котором происходит конформационный переход, более узкий. Таким образом, образование комплекса с АТФ стабилизирует вторичную структуру БТШ70 и уменьшает динамическую внутримолекулярную подвижность макромолекулы белка.

Материалы и методика

В работе использовался высокоочищенный рекомбинантный человеческий белок БТШ70, наработанный с применением стандартной методики в ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов». Исследования проводились в водных буферных растворах (бидистиллированная вода, 0.05 М буфер трис-HCl, рН=6.5, АТФ 0.0025М, MgCl

0.05M) при концентрации БТШ70 0.5 мг/мл. Корректированные спектры испускания люминесценции растворов регистрировались на спектрофлуориметре Hitachi-850. Температурные исследования проводились на спектрофлуориметре LUMINA (Thermo Fisher Scientific) с использованием жидкостного термостата Thermo Scientific Haake Circulator ARCTIC SC 100-A10.

Результаты и обсуждение

На рис. 1 представлены спектры испускания люминесценции водного раствора БТШ70 (кривые 1, 2) и комплекса БТШ70-АТФ-Mg2+ в фосфатном буфере (кривые 3, 4) при двух длинах волн возбуждения (260 и 295 нм). Облучение длиной волны 260 нм находится в области поглощения всех трех ароматических аминокислот, тогда как при 295 нм поглощает только триптофан.

Рис. 1. Нормированные по максимуму интенсивности спектры люминесценции водного раствора БТШ70

Несмотря на значительное превышение количества фенилаланина над триптофаном и тирозином, вклад люминесценции этой аминокислоты (Tmax = 282 нм) в люминесценцию БТШ70 не наблюдается из-за более низкого коэффициента молярной экстинкции и низкого квантового выхода флуоресценции. Обычно квантовый выход флуоресценции тирозина в белке значительно меньше квантового выхода тирозина в растворе за счет усиления различных процессов диссипации энергии возбуждения в белке, в том числе и путем переноса энергии возбуждения на

7

триптофан [5]. БТШ70 принадлежит к немногочисленному классу белков, в которых наблюдается люминесценция тирозина (Xmax = 303 нм) (рис. 1, спектр 1). Присоединение АТФ не меняет форму спектра люминесценции БТШ70 при Хвозб = 260 нм (рис. 1, спектр 3), несмотря на то, что поглощение АТФ при данной длине волны значительно больше поглощения ароматических аминокислот. Квантовый выход флуоресценции АТФ в воде при комнатной температуре очень низкий (~10-4 [6]), и отсутствие изменений в спектре БТШ70 при связывании с АТФ говорит о том, что квантовый выход флуоресценции АТФ при этом не увеличивается.

Триптофановые остатки в составе молекулы БТШ 70 расположены по одному в каждом функциональном концевом домене [7], поэтому спектр испускания БТШ70 с максимумом 335 нм при Хвозб = 295 нм (рис. 1, спектр 2) обусловлен только люминесценцией триптофана в гидрофобном неполярном окружении. При увеличении полярности среды максимум спектра люминесценции триптофана должен сдвигаться в длинноволновую сторону до 350 нм в водном растворе [5]. Взаимодействие АТФ с ИН2-концевым доменом БТШ 70 приводит к незначительному гипсохромному сдвигу максимума спектра люминесценции триптофана на 3 нм (рис. 1, спектр 4). Такой же незначительный сдвиг наблюдался в люминесценции бактериального белка теплового шока DnaK при связывании с АТФ [8]. Т. о., можно полагать, что в комплексе БТШ70-АТФ-М§2+ микроокружение триптофана становится чуть более гидрофобным, возможно, за счет стабилизации белковой глобулы.

Стабилизацию вторичной структуры БТШ70 при добавлении АТФ подтверждают полученные нами данные по тепловой денатурации БТШ70 и комплекса БТШ70 -АТФ-Mg24, представленные на рис. 2 и рис. 3.

Рис. 2. Изменение интенсивности люминесценции водного раствора БТШ70 (1) и его комплекса с АТФ (2) при повышении температуры. Хвоз6 = 295 нм, Хрег = 335 нм

На рис. 2 показаны зависимости интенсивности люминесценции БТШ70 и его комплекса с АТФ (возбуждение 295 нм, испускание 335 нм) от температуры. Видно, что при повышении температуры до 42оС интенсивность люминесценции БТШ70 (рис. 2, кривая 1) падает, что связано, очевидно, с увеличением эффективности безызлучательной деградации возбужденного состояния люминофора (температурное тушение). Далее, в диапазоне температур 42-52оС, интенсивность увеличивается. Известно [5], что для триптофана при переходе в полярное водное окружение кроме

8

батохромного сдвига спектра наблюдается также и возрастание квантового выхода флуоресценции. Таким образом, можно заключить, что подобный ход кривой 1 на рис. 2 связан с изменением конформации макромолекулы белка, в результате которого микроокружение триптофанов меняется с гидрофобного на гидрофильное, т. е. происходит разворачивание макромолекулы (тепловая денатурация). При этом, как было показано в [4], денатурация БТШ70 необратима. При повышении температуры выше 52оС снова наблюдается уменьшение интенсивности люминесценции денатурированного белка за счет температурного тушения.

Как видно из рис. 2, добавление АТФ к БТШ70 приводит к значительному температурному сдвигу конформационного перехода. По нашему мнению, первая производная интенсивности по температуре (рис. 3) лучше подчеркивает различия в характере тепловой денатурации БТШ70 и его комплекса с АТФ.

Рис. 3. Первая производная интенсивности люминесценции водного раствора БТШ70 (1) и его комплекса с АТФ (2) по температуре. Исходные данные приведены на рис. 2

Температура плавления комплекса, определенная по максимуму первой производной интенсивности перехода от температуры, на 9оС больше температуры плавления БТШ70 (Рис. 3). Наблюдается также большая высота и значительно меньшая полуширина пика первой производной комплекса по сравнению и пиком БТШ70, что говорит о более сильной кооперативности и более «тонкой настройке» вторичной структуры комплекса БТШ70-АТФ-Mg2+.

Таким образом, показано, что связывание БТШ70 с АТФ в присутствии ионов М^+слабо меняет форму спектров люминесценции, но приводит к стабилизации конформации белка и сдвигу температуры плавления приблизительно на 9оС.

Работа выполнена с использованием оборудования ресурсного центра «Оптические и лазерные исследования» научного парка СПбГУ.

Литература

1. Bukau B., Norwich, A.L. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines // Cell. 1998. V. 92.

P. 351-366.

9

2. Srivastava P. K., Menoret A., Basu S., Binder R. J., McQuade K. L. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world // Immunity. 1998. V. 8. P. 657-665.

3. Mayer M. P, Bukau B. Hsp70 chaperones: cellular functions and molecular mechanism // Cell.Mol.Life Sci. 2005. V. 62. № 6. P. 670-684.

4. Букина М. Н., Бакулев В. М., Бармасов А. В., Жахов А. В., Ищенко А. М. Спектральнолюминесцентные проявления изменения конформации белка БТШ70 в процессе тепловой денатурации // Оптика и Спектроскопия. 2015. Т. 118. № 6. С. 930-932.

5. Lakowicz J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, NY.: Plenum Press, 1999. 954 p.

6. Kononov A. I., Bukina M. N. Luminescence excitation spectra reveal low-lying excited states in stacked adenine bases // J. Biom. Struct. Dyn. 2002. V. 20. P. 465-472.

7. Черников В. А., Гороховец Н. В., Савватеева Л. В., Северин С. Е. Функциональная характеристика доменов и междоменных взаимодействий в рекомбинантных белках HSP70 человека // Молекулярная биология. 2011. Т. 45. № 5. С. 903-913.

8. VogelM., Mayer M. P., Bukau B. Allosteric Regulation of Hsp70 Chaperones Involves a Conserved Interdomain Linker // J. Biol. Chem. 2006. V. 281. P. 38705-38711.

Исследования факторов, ограничивающих применимость модели однократного резерфордовского обратного рассеяния ионов: учет состава исходного пучка частиц Кибардин А. В.

Кибардин Алексей Владимирович / Kibardin Alexey Vladimirovich - кандидат физикоматематических наук, доцент,

кафедра вычислительной техники, физико-технологический институт,

Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б. Н. Ельцина,

г. Екатеринбург

Аннотация: в работе рассматриваются вопросы численного моделирования

факторов, влияющих на формирование спектров резерфордовского обратного рассеяния ионов в тонких пленках: состава исходного пучка ионов, энергетического распределения ионов в пучке и аппаратной функции измерительной системы.

Abstract: the work deals with the numerical modeling of factors influencing the formation of the Rutherford backscattering spectra of ions in thin films: the original structure of the ion beam, the energy distribution of the ions in the beam and the instrumental function of the measuring system.

Ключевые слова: тонкие пленки, ионы, состав ионного пучка, упругое рассеяние, энергетические спектры, аппаратная функция, математическое моделирование. Keywords: thin films, ions, composition of the ion beam, elastic scattering, the energy spectra, the instrumental function, mathematical modeling.

Учет влияния состава пучка ионов на формирование энергетических спектров обратного рассеяния ионов

В предыдущей статье [1] мы рассмотрели модель, позволяющую эффективно описывать спектры однократного резерфордовского рассеяния ионов многослойными структурами. Для исследования образцов данным методом используют электростатические ускорители (генераторы Ван-дер-Граафа). Генераторы Ван-дер-Граафа считаются наиболее исследованными и усовершенствованными ускорителями прямого действия. Преимуществами этих аппаратов считается высокая стабильность и моноэнергетичность ускоренных ионов. Ввиду этого практически не

10