СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ РАСТЕНИЙ, НЕ СОДЕРЖАЩИХ ХЛОРОФИЛЛ
METHOD OF ASSESSING FUNCTIONAL STATE OF TISSUES AND ORGANS OF PLANTS, WHICH DO NOT CONTAIN CHLOROPHYLL

Способ относиться к биологии, физиологии растений и сельскому хозяйству и позволяет оценить функциональное состояние и жизнеспособность клеток, тканей и органов растений, не содержащих хлорофилл, например, каллюсные ткани in vitro, корни, некоторые виды плодов и овощей, одревесневшие побеги, лепестки цветов и т.п.
Известны методы оценки функционального состояния растений, основанные на определении количественного содержания фотосинтезирующих пигментов и их качественного состояния по фотометрическим или люминесцентным параметрам [1-4]. Данные методы эффективны только для работы с так называемыми хлорофиллсодержащими клетками, тканями и органами растений. Широкий класс растительных объектов, не содержащих фотосинтезирующие пигменты (семена, некоторые виды плодов и овощей, одревесневшие побеги, корни, лепестки цветов, каллюсные ткани in vitro) оказываются за рамками возможностей таких методов. Более универсальны приемы диагностики, основанные на цитологических исследованиях ультраструктуры тканей. Однако анатомические методы отличаются высокой трудоемкостью, препаративностью и не подходят для массового мониторинга. Известна неинвазивная экспресс-диагностика растений, основанная на регистрации степени когерентности светорассеяния [5]. Однако этот метод позволяет судить об изменениях функционального статуса растений, при поражении только теми факторами, которые модифицируют микроструктурное состояние тканей.
Целью данного изобретения является уменьшение трудоемкости анализов и увеличение достоверности информации о функциональном состоянии растительных клеток, тканей и органов, в том числе и не содержащих хлорофилл.
Для достижения поставленной цели в течение заданного времени от 3 секунд и более измеряют динамику мерцания спеклов отраженного или прошедшего через объект когерентного лазерного излучения и по степени и скорости флуктуации интенсивности заданного участка спекл-картины судят о функциональном состоянии тканей - чем они выше, тем выше уровень метаболической активности исследуемого объекта. Для количественной оценки данного показателя могут использоваться различные критерии и способы обработки данных - коэффициент вариабельности, дисперсия, частотный спектр, преобразование Фурье, Вейвлет и фрактальный анализ, первые и вторые производные и т.п.
2
Пример 1. Способ был применен для инструментальной оценки функционального состояния непигментированных участков листьев пестролистного растения лилейника полосатого (Hemerocallis). Определяли показатели мерцания спекл-поля, полученные от светлых участков листа (практически не содержащих хлорофилл) с разным функциональным состоянием. Аппаратурная регистрация мерцания спеклов заключалась в измерении зависимости интенсивности небольшого участка спекл-картины от времени. Параметры измерений: длина волны - 655 нм, интенсивность - 2400 Вт/м; максимальная длительность измерений - 180 секунд, частота съема данных - 5 Гц, область интегрирования спекл-поля - 5×5 пиксель, примерно равная среднему размеру спекла. Функциональное состояние листа оценивали по критерию удельной фотосинтетической активности (УФА) зеленых участков, содержащих хлорофилл. УФА определяли по методу медленной индукции флуоресценции хлорофилла по критерию отношения амплитуды переменой флуоресценции к стационарному уровню (Fv/Fm). Функциональное состояние листьев модифицировали тепловой обработкой (+60°C в течение 10 минут). Вариант опыта «Живой» - светлый участок листа с высокой функциональной активностью ФСА (Fv/Fm>0.6). Вариант опыта «Инактивированный» - светлый участок листа с низкой функциональной активностью ФСА (Fv/Fm<0.3).
В качестве критериев интенсивности мерцания спеклов использовали следующие показатели:
var
- коэффициент вариации (K);
- максимальная амплитуда первой производной ;
- число переходов первой производной через нулевой уровень;
- число отсчетов первой производной по некоторому порогу q ;
- Фурье анализ (БПФ).
На графике хорошо заметен многомодальный характер изменения сигнала (рис. 1). Можно выделить низкочастотные колебания с периодом несколько десятков секунд, модулированные сигналом более высоких частот. Для инактивированной ткани характерна низкая амплитудная выраженность всех составляющих, особенно высокочастотной. Присутствие высокочастотных колебаний дает возможность осуществить количественную оценку жизнеспособности ткани по мерцанию спеклов в течение нескольких секунд.
var
Обработку данных с помощью указанных алгоритмов проводили для пяти вариантов длительности измерений (количества отсчетов): 1,5; 3; 6: 12 и 192 секунды, что при заданной скорости съема данных позволяет получить соответственно 8, 16, 32, 64 и 1024 отсчета. Выявлено, что наиболее эффективны алгоритмы расчета коэффициента вариации (K) и числа пересечений первой производной установленного порога . Они позволяют получить высокий уровень различий за минимальное время измерений и количество отсчетов (табл. 1).
Метод БПФ для экспресс-оценки мерцания биоспеклов (за 1,5-6 с) не дает преимуществ по сравнению с другими критериями, но может быть полезен при исследовании медленнопротекающих процессов. Алгоритм БПФ, примененный к 128 отсчетам интенсивности спеклов во времени (после сглаживания скользящим средним с окном в 10 с) позволяет выделить различия в специфике метаболических движений живой и термоинактивированной ткани. У живых клеток превалируют колебания с частотой 0,0156 Гц, которые у инактивированной ткани практически отсутствуют (рис. 2).
Пример 2. Способ использовали для оценки жизнеспособности (метаболической активности) корней карликового подвоя 62-396 в процессе высыхания. Корни извлекали от жизнеспособных растений и оставляли высыхать при температуре 20-22°C и влажности 40-45% в течение 2 недель. Через 4 часа после отделения корней от маточного растений и в последующие 2 недели ежедневно проводили измерения мерцания спеклов при отражении лазерного пучка по методике, описанной в примере 1 в течение 300 секунд по 8-10 отсчетов в секунду. Определяли метаболическую активность клеток неповрежденной зоны покровной ткани. Как видно из рис. 3-6, в процессе высыхания корней уменьшается амплитуда и частота флуктуаций интенсивности. Высокочастотная составляющая практически полностью затухает к 7 дню пребывания корней без влаги. Если в качестве критерия интенсивности мерцания спеклов использовать среднее ± среднюю ошибку квадрата первой производной интенсивности спекл-поля для участка длиной в 1500…3000 отсчетов, то получим следующие количественные оценки функционального состояния корней по заявляемому способу:
- 0…4 часа высушивания - 7,11±0,207
- 1 сутки - 2,33±0,768
- 7 суток - 0,56±2,29
- 21 сутки - 0,33±0,0088
Пример 3. Способ использовали для оценки функционального состояния растений черной смородины после перезимовки. Побеги длиной 50-80 см отделяли в первой декаде марта. Через 2 часа после адаптации при комнатной температуре регистрировали интенсивность мерцания спеклов от коры нижней и верхней зоны побега по методике, описанной в примере 2. Частота съема данных - 10 Гц. В качестве количественного критерия функционального состояния использовали коэффициент вариации интенсивности небольшого участка спекл-картины, примерно равного среднему размеру спекла. Расчет коэффициента вариации (Квар) проводился для 600 отсчетов. Верхняя часть побега, которая не укрыта снегом, подсыхает существенно сильнее, чем нижняя, количество свободной воды в них меньше, что и находит свое отражение в существенно меньших значениях коэффициента вариации мерцания спеклов. У некоторых побегов интенсивность мерцания спеклов верхней зоны побега лежит в диапазоне значений для сухой древесины, что говорит о сильной потере влаги. По сумме показаний, сорт Зеленая Дымка лучше других исследованных сортов переносит зимние условия вегетации. (табл. 2).
Таким образом, заявляемый способ оценки функционального состояния растительных тканей, не содержащих хлорофилл, позволяет судить о метаболической активности, функциональном состоянии, жизнеспособности и реакции растений на действующий фактор.
Литература
1. Веселовский В.А. Люминесценция растений. Теоретические и прикладные аспекты / В.А. Веселовский, Т.В. Веселова. - М.: Наука, 1990. - 200 с.
2. Дмитриев А.П Фотометрический метод определения устойчивости зерновых культур к болезням / А.П. Дмитриев, И.С. Лискер, Г.С. Коновалова, С.В. Соловьев // Микология и фитопатология. - 1999. - Т. 33, Вып. 6. - С. 412-420.
3. Мерзляк М.Н. Спектры отражения листьев и плодов при нормальном развитии, старении и стрессе / М.Н. Мерзляк, А.А. Гительсон, С.И. Погосян, О.Б. Чивкунова, Л. Лехимена, М. Гарсон, Н.П. Бузулукова, В.В. Шевырева, В.Б. Румянцева // Физиология растений. - 1997. - Т. 44, №5. - С 707-716.
4. Lichtenthaler, H.K. The role of chlorophyll fluorescence in the detection of stress conditions in plant / H.K. Lichtenthaler, U. Rindere // CRC Critical Reviews in Analytical Chemistry. - 1988. - V. 19, Sup. 1. - P. 29-85.
5. Патент РФ №2342825. Неразрушающий способ функциональной диагностики растений / А.В. Будаговский, О.Н. Будаговская, И.А. Будаговский. - Заявка №2007104756 от 07.02.2007. - Опубл. 10.01.2009. - Бюл. №1.