МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ ФАКТОРА IX И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Полипептид Фактора IX, содержащий аминокислотную последовательность, модифицированную путем внедрения одного или более аминокислотных замещений или инсерций.
2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность, модифицирована путем внедрения одного или более сайтов гликозилирования.
3. Полипептид по п.2, отличающийся тем, что один или более сайтов гликозилирования выбраны из N-связанных сайтов гликозилирования и O-связанных сайтов гликозилирования.
4. Полипептид по п.2, дополнительно содержащий углеводную цепь, присоединенную к одному или более внедренным сайтам гликозилирования.
5. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что одно или более аминокислотных замещений выбраны из G4T; E33N; Е36Т; E36N; R37N; F75N; F77T; Е83Т; D85N; V86A; К91Т; А103Т; V107T; K122N; К122Т; S138N; A146N; T148N; F150T; P151N; T159N; А161Т; A161N; T169N; Q170N; T172N; D177N; D177E; F178T; K201N; К201Т; К214Т; V223N; G226N; Y226T; K228N; К228Т; E239N; E242N; I251T; A262T; E294N; R338A; R338N; K341N; F353N; H354V; H354I; Е355Т; V370N; T371V; T371I; Е372Т; E374N; M391N; K392V; G393T; E410N; K413N; L414I; Y1N и S3T; S3N и К5Т; G4N и L6T; K5N и Е7Т; L6N и Е8Т; E7N и F9T; F9N и Q11T; V10N и G12T; Q11N и N13T; G12N и L14T; N13 и Е15Т; L14N и R16T; E15N и Е17Т; M19N и Е21Т; E20N и К22Т; S24N и Е26Т; F25N и Е27Т; E26N и А28Т; E27N и R29T; A28N и Е30Т; R29N и V31T; E30N и F32T; V31N и Е33Т; F32N и N34T; T35N и R37T; T38N и Е40Т; T39N и F41T; E40N и W42T; F41N и К43Т; W42N и Q44T; K43N и Y45T; Q44N и V46T; Y45N и D47T; V46N и G48T; E52N и N54T; S53N и Р55Т; G59N и S61T; K63N и D65T; I66N и S68T; S68N и Е70Т; G76N и Е78Т; E78N и К80Т; E83N и D85T; L84N и V86T; I90N и N92T; K100N и S102T; S102N и D104T; A103N и N105T; D104N и К106Т; K106N и V108T; R116N и A118T; E119N и Q121T; Q121N и S123T; A127N и Р129Т; V135N и V137T; S136N и S138T; V137N и Q139T; Q139N и S141T; T140N и К142Т; S141N и L143T; E147N и V149T; T148N и F150T; V149N и Р151Т; P151N и V153T; D152N и D154T; V153N и Y155T; D154N и V156T; Y155N и N157T; V156N и S158T; S158N и Е160Т; T159N и А161Т; E160N и Е162Т; E162N и I164T; T163N и L165T; I164N и D166T; L165N и N167T; D166N и I168T; I168N и Q170T; T169N и S171T; S171N и Q173T; T172N и S174T; Q173N и F175T; S174N и N176T; G184N и D186T; E185N и А187Т; D186N и К188Т; A187N и Р189Т; P189N и Q191T; G200N и V202T; K201N и D203T; V202N и А204Т; E224N и G226T; T225N и V227T; G226N и К228Т; V227N и I229T; H236N и I238T; I238N и Е240Т; E240N и Е242Т; T241N и Н243Т; H243N и Е245Т; K247N и N249T; V250N и R252T; I251N и I253T; I253N и Р255Т; A261N и I263T; A262N и N264T; D276N и Р278Т; V280N и N282T; F302N и S304T; S304N и Y306T; R312N и F314T; V313N и Н315Т; F314N и К316Т; H315N и G317T; K316N и R318T; G317N и S319T; S319N и L321T; A320N и V322T; R327N и Р329Т; P329N и V331T; D332N и А334Т; L337N и S339T; S339N и К341Т; T340N и F342T; T343N и Y345T; G352N и Н354Т; F353N и Е355Т; H354N и G356T; E355N и G357T; G356N и R358T; G357N и D359T; E372N и Е374Т; W385N и Е387Т; G386N и Е388Т; A390N и К392Т; D85N, К122Т и I251T; D85N, К122Т и E242N; E125N, Р126А и А127Т; P126N, V128T и Р129А; T148N, F150T и Р151А; F150N, Р151А и D152T; P151N, V153T и A161N; P151N, V153T и T172N; V153N, Y155T и E294N; T172N, G226N и К228Т; F353N, H354V и Е355Т; F353N, H354I и Е355Т; V370N, T371V и Е372Т; V370N, T371I и Е372Т; M391N, K392V и G393T; D85N, P151N, V153T и K228N; D85N, P151N, V153T и E242N; К122Т, P151N, V153T и K228N; К122Т, P151N, V153T и E242N; К122Т, P151N, V153T и I251T; T148N, F150T, G226N и К228Т; P151N, V153T, T172N и R338A; P151N, V153T, D177E и F178T; P151N, V153T, G226N и К228Т; T172N, G226N, К228Т и R338A; D85N, К122Т, P151N, V153T и E242N; D85N, P151N, V153T, G226N и К228Т; К122Т, P151N, V153T, G226N и К228Т; S138N, P151N, V153T, G226N и К228Т; T148N, F150T, G226N, К228Т и R338A; P151N, V153T, T172N, G226N и К228Т; P151N, V153T, D177E, F178T и R338A; P151N, V153T, G226N, К228Т и R338A; и P151N, V153T, T172N, G226N, К228Т и R338A; и любых их комбинаций.
6. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что одно или более аминокислотных замещений выбраны из R37N; D85N; К122Т; S138N; A146N; A161N; Q170N; T172N; D177N; F178T; K201N; K228N; E239N; E242N; I251T; А262Т; E294N; E374N; E410N; G59N и S61T; K63N и D65T; G76N и Е78Т; S102N и D104T; A103N и N105T; D104N и К106Т; E119N и Q121T; Q121N и S123T; S136N и S138T; Q139N и S141T; T140N и К142Т; T148N и F150T; V149N и Р151Т; P151N и V153T; D152N и D154T; V153N и Y155T; D154N и V156T; V156N и S158T; S158N и Е160Т; E160N и Е162Т; E162N и I164T; T163N и L165T; I164N и D166T; D166N и I168T; I168N и Q170T; S171N и Q173T; T172N и S174T; Q173N и F175T; S174N и N176T; K201N и D203T; V202N и А204Т; E224N и G226T; T225N и V227T; G226N и К228Т; T241N и Н243Т; I251N и I253T; I253N и Р255Т; A262N и N264T; V280N и N282T; T343N и Y345T; E372N и Е374Т; D85N, К122Т и E242N; D85N, К122Т и I251T; F150N, Р151А и D152T; T172N, G226N и К228Т; D85N, P151N, V153T и K228N; D85N, P151N, V153T и E242N; К122Т, P151N, V153T и K228N; К122Т, P151N, V153T и E242N; К122Т, P151N, V153T и I251T; Р151, V153T, G226N и К228Т; D85N, К122Т, P151N, V153T и E242N; D85N, P151N, V153T, G226N и К228Т; S138N, P151N, V153T, G226N и К228Т; P151N, V153T, T172N, G226N и К228Т.
7. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что одно или более аминокислотных замещений выбраны из D85N; К122Т; S138N; T172N; K201N; K228N; E239N; E242N; I251T; А262Т; E294N; G59N и S61T; G76N и Е78Т; S102N и D104T; A103N и N105T; D104N и К106Т; E119N и Q121T; Q121N и S123T; S136N и S138T; Q139N и S141T; T140N и К142Т; T148N и F150T; V149N и Р151Т; P151N и V153T; D152N и D154T; S158N и Е160Т; E162N и I164T; T163N и L165T; T172N и S174T; Q173N и F175T; K201N и D203T; T225N и V227T; G226N и К228Т; I253N и Р255Т; A262N и N264T; V280N и N282T; E372N и Е374Т; и D85N, К122Т и E242N; D85N, К122Т и I251T; F150N, Р151А и D152T; T172N, G226N и К228Т; D85N, P151N, V153T и K228N; D85N, P151N, V153T и E242N; К122Т, P151N, V153T и K228N; К122Т, P151N, V153T и E242N; К122Т, P151N, V153T и I251T; Р151, V153T, G226N и К228Т; D85N, К122Т, P151N, V153T и E242N; D85N, P151N, V153T, G226N и К228Т; S138N, P151N, V153T, G226N и К228Т; P151N, V153T, T172N, G226N и К228Т.
8. Полипептид Фактора IX, содержащий аминокислотную последовательность
85
86
104
121
138
148
150
151
152
153
159
1
161
2
3
4
169
172
174
177
178
226
228
338
353
354
355
370
371
372
391
392
393
413
414
YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELXXTCNIKNGRCEQFCKNSAXNKVVCSCTEGYRLAENXKSCEPAVPFPCGRVSVXQTSKLTRAEXVXXXXDYVNSXEZXZEZTZILDNIXQSXQXFNXXTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETXVXITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLXSTKFTIYNNMFCAGXXXGGRDSCQGDSGGPHXXXVEGTSFLTGIISWGEECAXXXKYGIYTKVSRYVNWIKEKTXXT (SEQ ID NO: 3);
85
где Х выбран из D и Е;
86
где Х выбран из А, Е, Р, S и V;
104
где Х выбран из D, N и Т;
121
где X выбран из N, Q и Т;
138
где X выбран из N, S и Т;
148
150
где X и X выбраны из:
148
150
(i) X представляет собой Т и Х представляет собой F;
148
150
(ii) X представляет собой N и X представляет собой Т; и
148
150
(iii) X представляет собой N и Х представляет собой S;
151
где X выбран из А, Р и Т;
151
153
где X и X выбраны из:
151
(i) X представляет собой Р и Xi53 представляет собой V;
151
153
(ii) X представляет собой N и X представляет собой Т; и
151
153
(iii) X представляет собой N и X представляет собой S;
1
2
3
4
где Z, Z, Z и Z независимо выбраны из
(i) от нуля до двенадцати аминокислотных остатков и
(ii) SEQ ID NO: 2;
152
где X выбран из D, N и Т;
159
161
где X и X выбраны из:
159
161
(i) X представляет собой Т и X представляет собой А;
159
161
(ii) X представляет собой N и X представляет собой Т; и
159
161
(iii) X представляет собой N и X представляет собой S;
169
где X выбран из Т и N;
172
где X выбран из Т и N;
174
где X выбран из S и Т;
177
178
где X и Х выбраны из:
177
178
(i) X представляет собой D и Х представляет собой F;
177
178
(ii) X представляет собой Е и X представляет собой Т; и
177
178
(iii) X представляет собой Е или D и X представляет собой S;
226
228
где Х и Х выбраны из:
226
228
(i) Х представляет собой G и Х представляет собой К;
226
228
(ii) X представляет собой N и Х представляет собой Т; и
226
228
(iii) Х представляет собой N и Х представляет собой S;
338
где Х выбран из R и А;
353
354
355
где Х, Х и Х выбраны из:
353
354
355
(i) Х представляет собой F, Х представляет собой Н, Х представляет собой Е;
353
354
355
(ii) Х представляет собой N, Х представляет собой V, Х представляет собой Т;
353
354
355
(iii) Х представляет собой N, Х представляет собой I, Х представляет собой Т; и
353
354
355
(iv) Х представляет собой N, Х представляет собой Н, V или I, Х представляет собой S;
370
371
372
где Х, Х и Х выбраны из:
370
371
372
(i) Х представляет собой V, Х представляет собой Т, Х представляет собой Е;
370
371
372
(ii) Х представляет собой N, Х представляет собой V, Хпредставляет собой Т;
370
371
372
(iii) Х представляет собой N, Х представляет собой I, Хпредставляет собой Т; и
370
371
372
391
392
393
(iv) Х представляет собой N, Х представляет собой Т, V или I, Х представляет собой S; где Х, Х и Х выбраны из:
391
392
393
(i) Х представляет собой М, Х представляет собой К, Х представляет собой G;
391
392
393
(ii) Х представляет собой N, Х представляет собой К, Х представляет собой Т;
391
392
393
(iii) Х представляет собой N, Х представляет собой V, Х представляет собой Т; и
391
392
393
(iv) Х представляет собой N, Х представляет собой V или К, Х представляет собой S;
413
414
где Х и X выбраны из:
413
414
(i) X представляет собой К и X представляет собой L;
413
414
(ii) X представляет собой N и X представляет собой L; и
413
414
(iii) X представляет собой N и Х представляет собой I; и
где полипептид FIX содержит, по меньшей мере, один внедренный сайт гликозилирования по сравнению с полипептидом FIX, имеющим последовательность SEQ ID NO: 1.
9. Полипептид по п.6, дополнительно содержащий аминокислотные замещения, выбранные из R338A и V86A.
10. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность модифицирована путем внедрения от 1 до 10 аминокислотных остатков между аминокислотными остатками 160-164 человеческого Фактора IX, полученного в результате внедрения одного или более сайтов гликозилирования.
11. Полипептид по п.10, отличающийся тем, что аминокислотные остатки вставлены между аминокислотными остатками 160-161, между аминокислотными остатками 161-162, между аминокислотными остатками 162-163 или между аминокислотными остатками 163-164.
12. Полипептид по п.11, отличающийся тем, что полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, внедрен между аминокислотными остатками 160-161, между аминокислотными остатками 161-162, между аминокислотными остатками 162-163 или между аминокислотными остатками 163-164.
13. Полипептид по п.11, дополнительно содержащий аминокислотные замещения, выбранные из V86A; R338A; V86A и R338A; T148N и F150T; D177E и F178T; P151N и V153T; P151N, V153T и T172N; G226N и К228Т.
14. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность модифицирована путем внедрения от 1 до 10 аминокислотных остатков при С-конце полипептида Фактора IX, полученного в результате внедрения одного или более сайтов гликозилирования.
15. Полипептид по п.14, отличающийся тем, что полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, внедрен при С-конце полипептида Фактора IX.
16. Полипептид Фактора IX, содержащий R338A замещение и V86A замещение.
17. Полипептид по п.4, отличающийся тем, что присоединение углеводной цепи по одному или более внедренных сайтов гликозилирования увеличивает сывороточный период полувыведения полипептида, по меньшей мере, на 30% относительно полипептида, не имеющего внедренных сайтов гликозилирования.
18. Полипептид по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что полипептид имеет удельную активность, по меньшей мере, 100 единиц на мг полипептида.
19. Фармацевтический препарат, содержащий полипептид Фактора IX по любому из пп.1-18 и фармацевтически приемлемый носитель.
20. Способ лечения гемофилии В, включающий введение субъекту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества фармацевтического препарата по п.19.
21. Последовательность ДНК, кодирующая полипептид по любому из пп.1-18.
22. Эукариотическая клетка-хозяин, трансфектированная последовательностью ДНК по п.21 способом, позволяющим клетке-хозяину экспрессировать полипептид Фактора IX.
23. Способ получения полипептида Фактора IX, включающий (i) модификацию аминокислотной последовательности полипептида путем внедрения одного или более сайтов гликозилирования; (ii) экспрессию полипептида способом, который допускает гликозилирование при одном или более сайтов гликозилирования; и (iii) очистку полипептида.