ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПОИСКА ПРЕПАРАТОВ, СНИЖАЮЩИХ РИСК ВОЗНИКНОВЕНИЯ ВТОРИЧНЫХ ЛЕЙКОЗОВ, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

1. Тест-система для исследования влияния препарата, используемого при химиотерапии, на вероятность возникновения вторичного лейкоза, представляющая собой лимфобластоидные клетки человека (LCL) RPMI 8866, геном которых содержит генетическую конструкцию, включающую гены систем направленного внесения двуцепочечных разрывов в хромосомы клетки в локусы, в качестве которых используют эндонуклеазу Cas9 и гидовые РНК, между которыми происходит лейкозогенная хромосомная перестройка, а также гены активатора транскрипции ТА и гены селективных маркеров, при этом гены направленного внесения двуцепочечных разрывов находятся под контролем индуцируемого трансактиватором ТА промотора, а в качестве локуса, между которым происходит лейкозогенная хромосомная перестройка, используют перестройку между генами АМН и ЕТО.
2. Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что в качестве линии клеток млекопитающих используют клетки, скорость деления которых составляет не менее одного деления в 2-3 суток и геном которых изучен настолько, чтобы было возможным подобрать нуклеазы, узнающие локусы, между которыми формируются хромосомные перестройки.
3. Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что в качестве селективных маркеров используют гены устойчивости к антибиотикам пуромицину и неомицину.
4. Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что гены системы направленного внесения двуцепочечных разрывов интегрированы в геном клеток исходной линии в локус, обеспечивающий их стабильную экспрессию.
5. Тест-система по п. 1, характеризующаяся тем, что гены системы направленного внесения двуцепочечных разрывов интегрированы в области первого интрона гена PPP1R12C, расположенного на 19 хромосоме.
6. Способ получения тест-системы по п. 1, характеризующийся тем, что производят создание генетической конструкции (1), включающей гены гидовых РНК, ген нуклеазы Cas9, находящийся под индуцируемом промотором TRE, и ген устойчивости к пуромицину; и генетической конструкции (2), включающей ген активатора транскрипции ТА и ген устойчивости к генетицину, затем полученные генетические конструкции трансфицируют в клетки исходной клеточной линии с последующим отбором клеток, содержащих генетические конструкции.
7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что используют гидовые РНК gRNA _AML1 и gRNA_ETO.
8. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что создание генетической конструкции (1) проводят амплификацией участков векторов, кодирующих гидовые РНК, и последовательностей, способствующих их встраиванию в геном трансфицируемых клеток, встраиванием полученных участков в плазмиду, содержащую ген Cas9 под индуцируемым промотором TRE и ген устойчивости к пуромицину.
9. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что в качестве последовательностей, способствующих встраиванию, используют участки, повторяющие последовательности длиной от 100 до 1000 нуклеотидов с каждой стороны от точки разрыва в геноме.
10. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что трансфекцию полученных генетических конструкций в клетки исходной клеточной линии осуществляют посредством электропорации.
11. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что отбор клеток производят посредством выращивания клеток в средах с селективными антибиотиками в концентрациях, при которых погибают клетки, не несущие генов устойчивости к данным антибиотикам, но при которых выживают клетки, несущие селективные маркеры.
12. Способ проведения исследования влияния препарата, используемого при химиотерапии, на вероятность возникновения вторичного лейкоза, с помощью тест-системы по п. 1, характеризующийся тем, что к суспензии, содержащей не менее 2 млн. клеток тест-системы, добавляют исследуемый препарат в концентрации, не превышающей IC50 для данного препарата, и доксициклин в концентрации, достаточной для запуска экспрессии Cas9, проводят инкубацию полученной смеси с последующим проведением количественной ПЦР и анализом полученных результатов и вывод о снижении вероятности возникновения вторичного лейкоза делают по уменьшению количества полученных транслокаций по сравнению с количеством транслокаций в контрольном образце.
13. Способ по п. 12, характеризующийся тем, что концентрация доксициклина составляет от 0,1 до 1 мкг/мл.
14. Способ по п. 12, характеризующийся тем, что количественную ПЦР проводят с использованием праймеров ETO_f1-AML_f1 и MYC_f-MYC_r.
15. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что используют праймеры с последовательностями SEQ ID NO: 3-6.
16. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что количественную ПЦР проводят по программе: активация полимеразы: 95°С, 10 мин; денатурация ДНК: 95°С, 20 сек, отжиг праймеров: 60°С, 1 мин; стадия элонгации: 72°С, 30 сек, всего 42 цикла, затем кривая плавления: 55-95°С, шаг 0.5°С в 5 сек.
17. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что анализ результатов ПЦР проводят путем подсчета количества транслокаций, полученные значения порогового цикла амплификации образца ДНК с соответствующей парой праймеров (Ct) подставляют в формулу (1):
i
где F - частота транслокаций AML/ETO, нормированная на количество ампликона праймеров Myc_f и Мус_r, Емус - эффективность амплификации ДНК с пары праймеров Myc_f и Myc_r, Eaml/eto - эффективность амплификации ДНК с пары праймеров ETO_f1 и AML_f1, которая определяется один раз в предварительном эксперименте в условиях, максимально соответствующих условиям дальнейшей работы; <Ct> - среднее по трем повторностям значение порогового цикла амплификации образца ДНК с соответствующей парой праймеров, где i означает Мус или AML1/ETO.
18. Способ по п. 14, характеризующийся тем, что сравнение данных, полученных исследуемых образцах и на контрольных, делают на основании множественного сравнения экспериментальных выборок с контрольной с помощью непараметрического критерия Даннета.