ХЛОРГИДРАТЫ ФТОРСОДЕРЖАЩИХ ЗАМЕЩЕННЫХ 5-[2-(ПИРИД-3-ИЛ)-ЭТИЛ]-2,3,4,5-ТЕТРАГИДРО-1Н-ПИРИДО[4,3-b]ИНДОЛОВ, В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВ СНИЖЕНИЯ НЕКОНТРОЛИРУЕМОЙ АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ В НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ, ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ИХ ОСНОВЕ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
FLUORINE-CONTAINING SUBSTITUTED 5-[2-(PYRID-3-YL)-ETHYL]-2,3,4,5-TETRAHYDRO-1H-PYRIDO[4,3-b]INDOLE HYDROCHLORIDES AS AGENTS DECREASING UNCONTROLLED PROTEIN AGGREGATION IN NERVOUS SYSTEM, BASED PHARMACEUTICAL PREPARATION AND METHOD OF USING IT

Изобретение относится к использованию химических соединений в области медицины и может быть использовано как эффективное средство при изготовлении фармакологических препаратов для предупреждения и лечения заболеваний, связанных с неконтролируемой агрегацией белков.
Неконтролируемая агрегация определенных типов белков является ключевым звеном развития нейродегенеративных процессов, лежащих в основе патогенеза многих нейродегенеративных заболеваний. Накопление в нервной системе различных промежуточных (олигомеров, протофибрилл) и конечных (фибриллярных и аморфных отложений) продуктов, многие из которых обладают цитотоксическими свойствами, приводит к функциональным нарушениям и, в конечном итоге, к гибели нейронов. Такой тип патологии, получивший название протеинопатия, объединил в одну группу неврологические расстройства с существенно различающимися клиническими проявлениями патологии. В эту группу заболеваний входят такие широко распространенные и в настоящее время неизлечимые нейродегенеративные расстройства, как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), боковой амиотрофический склероз (БАС), фронто-темпоральная дегенерация (ФТД), хорея Гентингтона и прионовые болезни. До сих пор лечение протеинопатий является преимущественно симптоматическим, поскольку не разработаны эффективные средства, непосредственно воздействующие на патогенетический процесс, лежащий в основе заболевания.
В настоящее время процесс неконтролируемой агрегации белков рассматривается как одна из важнейших мишеней для создания нового поколения терапевтических средств, которые позволят модифицировать процессы, лежащие в основе развития нейродегенерации, и тем самым замедлить течение болезни или даже остановить патологический процесс [Jacobsen J.S., Reinhart P., Pangalos M.N. NeuroRX. 2005. vol.2(4). p: 612-626; Walker L.C., Ibegbu C.C., Todd C.W., Robinsona H.L., Juckere M., IIIf H.L., Gandyg S. Biochemical Pharmacology. 2005. vol.69. p: 1001-1008; Christensen D.D. CNS Spectrums. 2007. vol.12. p: 113-123].
Известно, что производное соединений гидрированных пиридо(4,3-b)индолов, а именно гамма-карболина - отечественный препарат димебон, способен снижать содержание патологических включений амилоидного типа, образуемых склонным к агрегации белком гамма-синуклеином в тканях нервной системы модельных животных (С.О.Бачурин, А.А.Устюгов, О.Петерс, Т.А. Шелковникова, В.Л. Бухман, H.H. Нинкина, Доклады РАН, 2009, 428, 262-265).
Однако фармакокинетические свойства димебона не обеспечивают достаточно широкого спектра действия лекарств, изготовленных на его основе.
Предлагаемое изобретение решает задачу расширение арсенала средств, снижающих неконтролируемую агрегацию белков в нервной системе, приводящую к развитию разрушающих процессов в центральной и периферической нервной системе.
Поставленная задача решается применением хлоргидратов фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)-этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индолов, общей формулы (I) в качестве средства для снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе
1
1
6
где R=H, (C-C)алкил;
2
3
4
5
1
6
1
6
R, R, R, R=H, F, Cl, Br, (C-C)алкил, (C-C)алкокси,
6
3
R=F, CF.
Еще одним аспектом изобретения является фармакологическое средство для снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе, содержащее активное начало и фармацевтически приемлемый носитель, отличающееся тем, что в качестве активного начала содержит эффективное количество соединения формулы (I).
Также еще одним аспектом изобретения является способ снижения неконтролируемой агрегации белков в нервной системе, заключающийся во введении пациенту фармакологического средства, содержащего эффективное количество соединения формулы (I) в дозе 0,05-1.5 мг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.
2+
Применение хлоргидратов фторированных производных пиридо([4,3-b])индолов в качестве потенциальных средств для лечения таких нейродегенеративных расстройств, как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП), боковой амиотрофический склероз (БАС), шизофрения, рассеянного склероза и ряда других заболеваний за счет из способности к связыванию с гистаминным, адренергическим, допаминовым, серотониновым, имидазолиновым АМРА- и аминергическим протеин-связаным рецепторами, а также способности этих соединений влиять на захват Ca в синаптосомах мозга крыс и улучшать запоминание у обработанных скополамином крыс известно [заявка WO 2009/038764, A1, МПК C07D 471/04 (2006/01), опуб. 26.03.2009; заявка WO 2009/055828, A1, МПК C07D 471/04 (2006/01), опуб. 30.04.2009, заявка WO 2010/127177 A1 МПК A01N 43/42, опуб. 2010-11-04].
В наших исследованиях неожиданно было обнаружено, что хроническое применение хлоргидратов фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)-этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индолов формулы (I) на животных, у которых путем генетической модификации вызывалась усиленная экспрессия склонных к агрегации белков, в частности, белка гамма-синуклеина и белка тау приводит с существенному снижению агрегации этих белков, подавлению астроглиоза, увеличению числа живых нейронов.
Техническим эффектом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является расширение спектра действия лекарств, изготовленных на его основе.
Так, выявление у известных ранее соединений формулы (I) новых свойств, позволит применить их не только для более эффективного лечения болезни Альцгеймера (БА), болезни Паркинсона (БП), бокового амиотрофического склероза (БАС), фронтотемпоральной дедегенерации (ФТД), хореи Гентингтона, но и для предупреждения и лечения более широкого спектра нейродегенеративных заболеваний, в частности, прогрессирующего надъядерного паралича, кортикобазальной дегенерации, болезни Пика и прионовых болезней, напрямую связанных с неконтролируемой агрегацией белков в нервной системе.
1
19
В таблицах 1 и 2 приведены данные по выходу, температуре плавления и характеристикам спектров ЯМР H и F соединений, представляющих заявляемые классы соединений.
На фиг.1 показано иммуногистохимическое окрашивание срезов спинного мозга 12-ти месячных гомозиготных трансгенных мышей линии Thy1mγSN антителами против гамма-синуклеина, не получавших вещества (контроль) и животных, которые получали вещество, начиная с трех месячного возраста. Увеличение 100X.
На фиг.2 представлены результаты количественного подсчета гамма-синуклеин положительных агрегатов в срезах спинного мозга 12-месячных животных контрольной группы и животных, получавших вещество FC 203. Подсчитана плотность агрегатов на единицу площади.
На фиг.3 показано иммуногистохимическое окрашивание срезов спинного мозга четырех- и пятимесячных гомозиготных трансгенных мышей" линии P301S антителами против белка тау, не получавших препарат (контроль) и получавших FC-203, начиная с пятинедельного возраста. Увеличение 400X.
На фиг.4 представлены результаты количественного подсчета тау положительных агрегатов в срезах спинного мозга 4-и 5-месячных животных в контрольной и экспериментальной группе (n=3, показана ± стандартная погрешность среднего значения).
На фиг.5 показано иммуногистохимическое окрашивание глиального фибриллярного кислого белка ГФКБ на поперечных срезах шейного отдела спинного мозга у 12-месячных трансгенных животных линии Thy1mγSN в контрольной и экспериментальной группе. Увеличение 400X.
На фиг.6 показано иммуногистохимическое окрашивание ГФКБ на поперечных срезах спинного мозга у 4-и 5-месячных трансгенных животных линии P301S в контрольной и экспериментальной группе.
На фиг.7 представлены средние значения продолжиельности нахождения мышей линии Thy1mγSN на стержне до падения для экспериментальной FC-203 (квадраты), получавших вещество с первого месяца жизни, и контрольной (круги) групп.
На фиг.8 представлены средние значения продолжиельности нахождения мышей линии P301S на вращающемся стержне до падения для экспериментальной FC-203 (квадраты), получавших вещество с первого месяца жизни, и контрольной (круги) групп.
На фиг.9 представлены средние значения продолжиельности нахождения мышей линии Thy1mγSN на на перевернутой сетке до падения для экспериментальной FC-203 (квадраты), получавших вещество с трех месяцев жизни, и контрольной (круги) групп.
На фиг.10 представлены средние значения продолжиельности нахождения мышей линии P301S на перевернутой сетке до падения для экспериментальной FC-203 (квадраты), получавших вещество с трех месяцев жизни, и контрольной (круги) групп.
На фиг.11 показана иммунодетекция склонной к агрегации рекомбинантной формы белка FUS человека, в клетках нейробластомы SH-SY5Y при помощи антител против C-концевого эпитопа этого белка.
На фиг.12 показана иммунодетекция аберрантной формы белка TDP-43 человека, обладающей повышенными агрегационными свойствами, в клетках нейробластомы SH-SY5Y при помощи антител против C-концевого эпитопа.
Синтез соединений.
Соединения формулы (I) - хлоргидраты фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)-этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индолы согласно изобретению получают с использованием способов, известных в данной области техники для получения сходных веществ, исходя из замещенных 2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индолов и фторсодержащих 3-винилпиридинов. Взаимодействие замещенных 2,3,4,5-тетрагидро-1Н-циридо[4,3-b]индолов и фторсодержащих 3-винилпиридинов осуществляют нагреванием эквимольной смеси реагентов в диметилсульфоксиде (ДМСО) при 135-140°C в течение 8-10 часов в присутствии каталитических количеств фторида цезия в результате чего образуются фторсодержащие замещенные 5-[2-(пирид-3-ил)-этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индолы (I), обработка которых соляной кислотой приводит к получению заявляемых хлоргидратов (схема 1)
Схема 1
Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.
Пример 1. Получение фторсодержащих замещенных 5-[2-(5-фторпирид-2-ил)-этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индолов (общая методика)
1 ммоль 2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индола, 1 ммоля фторсодержащего 3-винилпиридина, 200 мг CsF, 5 мг гидрохинона в 1,5 мл ДМСО нагревали при перемешивании при 135-140°C в течение 8 ч. ДМСО и винилпиридин удалили в вакууме 3 мм рт.ст., из остатка продукт экстрагировали хлористым метиленом. Хлористый метилен упаривали и остаток хроматографировали на силикагеле (60 меш), элюент метанол/хлороформ=1/5.
1
19
Выход, температуры плавления и данные спектров ЯМР H и F соединений 1-7, 22-28 приведены в таблицах 1 и 2.
Пример 2. Получение хлоргидратов фторсодержащих замещенных 5-[2-(5-фторпирид-2-ил)-этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индолов (общая методика)
К суспензии основания в 5 мл воды добавили 0.1 мл концентрированной соляной кислоты и нагревали до полного растворения основания. Воду и соляную кислоту упарили в вакууме и полученный остаток перкристаллизовали из 50% этанола.
1
19
Выход, температуры плавления и данные спектров ЯМР H и F соединений 8-21, 29-35 приведены в таблицах 1 и 2.
Биологическая активность полученных соединений
Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения подтверждается на примере соединения FC-203 (Fluorocontaining-Carboline) формулы 9.
Для исследований биологических свойств этого соединения были использованы как in vitro так и in vivo модели протеинопатий. В качестве in vitro моделей были использованы клетки нейробластомы человека SH-SY5Y с эктопической экспрессией амилоидогенных белков TDP-43 и FUS, которая дает возможность воспроизводить ключевые звенья молекулярной патологии, связанной c нарушением метаболизма этих белков.
Данный подход комплементарен исследованиям на трансгенных животных, имеющим своей целью выяснение механизмов возникновения и развития нейродегенеративных изменений, а также позволяет проводить первичный отбор потенциальных терапевтических средств, непосредственно влияющих на механизмы неконтролируемой агрегации. В качестве амилоидогенных модельных белков были избраны мутантные формы белка TDP -43 и FUS, которые способны образовывать патологические включения в тканях нервной системы. Установлено, что белки TDP-43 и FUS участвуют в регуляции процессинга, транспорта и метаболизма РНК. Нарушение функции данных белков может приводить к развитию протеинопатий. Так, у пациентов с наследственными и идиопатическими формами некоторых вариантов бокового амиотрофического склероза (БАС) и фронтотемпоральной дегенерации с убиквитинированными включениями (ФТД-У были выявлены точечные мутации, приводящие к замене аминокислоты в кодирующей части генов TDP -43 и FUS. Данный тип молекулярной патологии может быть воспроизведен в клеточных модельных системах.
Показано, что в экспрессия избранных модельных белков в клетках нейробластомы человека SH-SY5Y детектировалась неконтролируемая агрегация аберантных форм этих белков, сопровождающейся формированием и накоплением нерастворимых патологических включении. В подобных клеточных системах удается воспроизвести молекулярную патологию, специфичную для каждой из мутаций генов TDP -43 или FUS, приводящих к нарушению структуры кодируемых ими белков.
Биологическое действие соединения FC-203 (формула № 9) было исследовано на двух различных типах протеинопатий. В качестве in vivo моделей для исследований были использованы линии трансгенных мышей: Thy1mgSN и P301S. Линия трансгенных мышей Thy1mgSN на генетической основе в C57Bl6J характеризуется высоким уровнем эктопной экспрессии гамма-синуклеина человека в тканях центральной нервной системы модельных животных. Экспрессия трансгена направляется нейрон-специфическим промотором Thy-1 доступным в каталоге Jackson Laboratory (). В данной линии мышей происходит постепенное накопление склонного к агрегации белка гамма-синуклеина, формирование внутриклеточных патологических отложений амилоидного типа и накопление их в тканях различных отделов центральной нервной системы, что в свою очередь способствует воспроизведению ключевых звеньев патогенеза протеинопатии.
Другая линия трансгенных мышей P301S (полное название линии в соответствии с базой данных Jacksons Laboratory - B6;C3-Tg(Prnp-MAPT*P301S)PS19Vle/J) характеризуется сверхпродукцией аберантной формы белка тау человека. Под контролем промотора прионового белка Prnp экспрессия трансгена осуществляется в тканях центральной нервной системы модельных животных и ведет к накоплению гиперфосфорилированных форм белка тау, способных формировать нейрофибриллярные клубки, которые являются характерными гистопатологическими структурами, выявляемыми при таупатиях, таких как болезнь Альцгеймера, прогрессирующий надъядерный паралич, кортикобазальная дегенерация, и болезнь Пика. Таким образом линия P301S моделирует важное звено протеинопатий, связанных с неконтролируемой агрегацией белков.
Группы экспериментальных и контрольных животных формировали из потомства от скрещивания гетерозиготных по трансгену родителей. Использовали когорты гомозиготных по трансгенной аллели самцов. Условия содержания были одинаковы для контрольной и для экспериментальной групп и не менялись на протяжении всей программы исследований: 12 часовой световой цикл при температуре 22°C, свободный доступ к корму и воде. Исследуемое соединение FC-203 растворяли в питьевой воде в концентрации 70 мкг/мл и данный раствор использовался в качестве единственного источника питьевой воды в экспериментальной группе мышей, доступ к питьевому раствору, содержащему соединение FC-203 не ограничивался. Питьевой раствор меняли 3 раза в неделю. Суточное потребление животными воды регистрировалось, оно соответствовало физиологической норме потребления жидкости и составляло в среднем 5 мл на мышь весом 30 грамм.
Потребление питьевого раствора, содержащего соединение FC-203, не отличалось от потребления чистой питьевой воды и также составляло 5 мл в день на мышь весом 30 грамм. Соответственно, при пересчете на массу тела животного, суточная доза потребления вещества составляла: 11.7 мг/кг.
<mtable columnalign="left"><mtr><mtd><mn>70</mn><mfrac><mrow><mi>μ</mi><mi>g</mi></mrow><mrow><mi>m</mi><mi>L</mi></mrow></mfrac><mo>×</mo><mn>5</mn><mi>m</mi><mi>L</mi><mo>=</mo><mn>350</mn><mi>μ</mi><mi>g</mi><mtext> </mtext><mi>в</mi><mtext> </mtext><mi>д</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>ь</mi><mtext> </mtext><mi>н</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>м</mi><mi>ы</mi><mi>ш</mi><mi>ь</mi></mtd></mtr><mtr><mtd><mfrac><mrow><mn>350</mn><mtext> </mtext><mi>μ</mi><mi>g</mi></mrow><mrow><mn>30</mn><mtext> </mtext><mi>g</mi></mrow></mfrac><mo>×</mo><mfrac><mrow><mn>1000</mn><mtext> </mtext><mi>g</mi></mrow><mrow><mn>1</mn><mtext> </mtext><mi>k</mi><mi>g</mi></mrow></mfrac><mo>×</mo><mfrac><mrow><mn>1</mn><mtext> </mtext><mi>m</mi><mi>g</mi></mrow><mrow><mn>1000</mn><mtext> </mtext><mi>μ</mi><mi>g</mi><mtext> </mtext></mrow></mfrac><mo>=</mo><mn>11.7</mn><mfrac><mrow><mi>m</mi><mi>g</mi></mrow><mrow><mi>k</mi><mi>g</mi></mrow></mfrac><mtext> </mtext><mi>в</mi><mtext> </mtext><mi>п</mi><mi>е</mi><mi>р</mi><mi>е</mi><mi>с</mi><mi>ч</mi><mi>ё</mi><mi>т</mi><mi>е</mi><mtext> </mtext><mi>н</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>в</mi><mi>е</mi><mi>с</mi></mtd></mtr></mtable>
Пример 4. Определение влияния соединения FC-203 на содержание патологических включений амилоидного типа, сформированных белком гамма-синуклеином, в пораженных отделах нервной системы модельных мышей линии Thy1mγSN
Экспериментальная группа мышей начинала получать вещество, когда возраст животных достигал 12 недель, и получала его на протяжении последующих 9 месяцев. Контрольная группа вещество не получала. В возрасте 12-ти месяцев у животных контрольной и экспериментальной групп после медикаментозной эвтаназии путем внутрибрюшинного введения летальной дозы пентобарбитала натрия (Euthatal) был произведен забор тканей спинного мозга для последующего анализа. Спинной мозг извлекали и фиксировали отдельно шейный, грудной и поясничный отделы. Препараты для последующей окраски специфическими агентами на амилоидные отложения фиксировали в холодном растворе Карнуа (60% этанол, 30% хлороформ, 10% ледяная уксусная кислота) при +4°C в течение ночи. Для фиксации препаратов, предназначенных для последующего иммуногистохимического анализа, использовали 4% раствор параформальдегида в фосфатном буфере (PBS). Затем образцы промывали дистиллированной водой (2 раза по 1 ч) и проводили дегидратацию тканей при комнатной температуре последовательно в 75% этаноле (в течение 15 мин), 96% этаноле (2 раза, по 5 и 10 мин), 100% этаноле (2 раза по 10 мин), смеси этанол-хлороформ (1:1, 30 мин), хлороформе (1 ч), затем инкубировали в хлороформе при 4°C в течение ночи, после чего заключали в парафин. Анализ количества и распределения агрегатов проводили на поперечных срезах спинного мозга.
Приготовление гистологических срезов. Срезы толщиной 8 мкм получали с помощью ротационного микротома Leica RM2265 и монтировали на предметные стекла SuperFrost (BDH, Poole, Великобритания) для последующего окрашивания Конго красным, либо на слайды Gold Seal Slides (Gold Seal Products, Великобритания) для последующего иммуноокрашивания. Срезы депарафинизировали в ксилоле (2 раза по 5 мин) с последующей регидратацией в серии спиртов (этанол, при комнатной температуре) понижающейся концентрации.
2
Окрашивание Конго красным и подсчет амилоидных отложений. После депарафинизации и регидратации в серии спиртов (этанол) понижающейся концентрации (100%, 90%, 70%) срезы дважды промывали дистиллированной водой (по 5 мин). Окраску срезов проводили в 0.5% растворе Конго красного (Sigma, США) в 50% спирте в течение 7 минут при комнатной температуре. Фиксацию окраски осуществляли 1 минуту в 0.2% KOH в 80% спирте. Затем срезы промывали водой и высушивали на воздухе. После нанесения капли среды для заключения в IмМu-Mount (Thermo Electron Corporation, США), предметное стекло накрывали покровным стеклом (50x24 мм) и подсушивали в сухожаровом шкафу при 37°C или при комнатной температуре. Анализ и регистрацию результатов проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DMI 4000B. Микрофотографии получали при помощи фотокамеры Leica DFS 490 и программного обеспечения Leica Application Suite 2.8.1 (Leica Microsystems, Германия). Подсчет количества окрашенных амилоидных отложений осуществляли на участке серого вещества площадью 0.1 мм с использованием программы ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Статистический анализ проводили при помощи программы Excel из пакета Microsoft Office (Microsoft Corp., США).
Результаты данного эксперимента, представленые на фиг. 1 и 2 показали, что систематическое применение соединения FC-203 существенно снижает количество амилоидных отложений в тканях спинного мозга трансгенных животных линии Thy1mγSN. Выявленное действие препарата может быть обеспечено двумя возможными механизмами: FC-203 может либо предотвращать образование новых агрегатов, либо влиять на стабильность уже предсформированных включений, например, активируя собственные защитные механизмы клетки, направленные на очистку внутреннего функционального пространства от аберантных белков и фибриллярных структур.
Пример 5. Определение влияния соединения FC-203 на содержание гисто-патологических включений амилоидного типа в тканях спинного мозга линии модельных мышей P301S
Для исследования влияния вещества FC-203 на содержание агрегатов белка тау человека была использована линия мышей с оверпродукцией гиперфосфорилированной формы белка тау, в которой отмечается ранняя неврологическая патология, связанная с отложением белка тау в нейронах. Экспериментальная группа трансгенных мышей P301S начинала получать препарат FC-203 с пятинедельного возраста, когда формирование нейрофибриллярных клубков еще не выявляется гистологическими методами. Таким образом, мыши в экспериментальной группе получали препарат в течение 15 или 20 недель (до 4-и 5-месячного возраста соответственно). Результаты анализа количества патологических агрегатов белка тау в тканях спинного мозга трансгенных животных линии P301S, представленные на фиг.3 и 4 показывают, что пролонгированное применение исследуемого вещества FC-203, начатое на пре-симптоматической стадии протеинопатии, ведет к статистически достоверному уменьшению количества тау позитивных отложений в нейронах спинного мозга трансгенных животных.
Таким образом, FC-203 эффективно снижает формирование отложений белка тау человека, что напрямую связано с его противоагрегационными свойствами in vivo.
Пример 6. Определение влияния соединения FC 203 на процессы астроглиоза в нейронах животных с повышенным синтезом белка гамма-синуклеина
Влияние соединений на процессы, связанные с реактивным астроглиозом как показателем воспалительной реакции, присущей заболеваниям с неконтролируемой агрегацией белков, осуществляли путем изучения уровня маркерного глиального фибриллярного кислого белка (ГФКБ). Для этого использовались трансгенные мыши двух линий Thy1mγSN и P301S. Чем меньше была воспалительная реакция в тканях нервной системы, которая выявляется специфической окраской активированных астроцитов, тем эффективнее было средство для подавления этой реакции. Для экспериментов использовались срезы спинного мозга, подготовленные по методике, описанной в предыдущем примере 5. Далее срезы инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами против ГФКБ (DAKO, США) в блокирующем буфере, используя разведение 1:1000, при температуре 4°C в течение ночи.
Как видно из приведенных на фиг. 5 данных о влиянии соединения FC-203 на процессы астроглиоза в нейронах животных с повышенным синтезом белка гамма-синуклеина, пролонгированное применение вещества существенно снижает уровень активиированных астроцитов у животных с гамма-синуклеинопатией.
Таким образом, FC-203 эффективно ингибирует нейроспецифическую воспалительную реакцию, обычно сопутствующую неконтролируемой агрегации белков в тканях нервной системе животных.
Пример 7. Определение влияния соединения FC-203 на развитие астроглиоза в нейронах животных с повышенным синтезом гиперфосфорилированной формы белка тау
Условия проведения эксперимента аналогичны примеру 6.
У мышей линии P301S с патологией, развивающейся в результате агрегации гиперфосфорилированного тау белка человека, количество выявляемых активированных астроцитов существенно возрастает по мере прогрессии нейродегенеративного процесса и соответствует стадии развития протеинопатии: у мышей линии Thy1mγSN симптоматическая стадия гамма-синуклеинопатии наблюдается, начиная с 6 месяцев, тогда как нейрональная симптоматика, обусловленная тау-патией у мышей линии P301S развивается гораздо раньше. Соответственно, и астроглиоз у мышей линии P301S развивается раньше, чем у мышей линии Thy1mγSN. Применение препарата существенно снижает выраженность астроглиоза в двух моделях на симптоматической стадии протеинопатии.
Как следует из данных, приведенных на фиг. 6, исследуемое вещество существенно снижает уровень астроглиоза, который вызван неконтролируемой агрегацией белка тау. Это является прямым указанием на то, что соединение FC-203 эффективно ингибирует воспалительную реакцию, связанную с процессом неконтролируемой агрегации белков в тканях нервной системы животных.
Пример 8. Определение влияния соединения FC-203 на прогрессию симптомов, связанных с неконтролируемой агрегацией белка гамма-синуклеина в нервной системе трансгенных животных: оценка баланса и координации на вращающемся стержне
Моторную функцию трансгенных мышей линии Thy1mγSN оценивали по способности животных удерживаться на стержне в ускоряющемся режиме вращения. Продолжительность каждого тестирования на вращающемся стержне составляла 5 мин, скорость вращения стержня за этот период возрастала от 4 до 40 об/мин. Регистрировалось время, которое животное способно удерживаться на стержне. Тестирование повторяли 3 раза для каждого животного с 30-минутными перерывами между тестами и брали среднее значение времени нахождения на стержне до падения.
Животные тестировались на вращающемся стержне в режиме постоянного ускорения. Представлены средние значения продолжительности нахождения животных на стержне до падения для экспериментальной, получавших вещество FC-203 с первого месяца жизни (квадраты) и контрольной (круги) групп.
Как видно из приведенных фиг. 7 данных, исследуемое вещество FC 203 существенно замедляет развитие клинических проявлений нейродегенеративного процесса, вызванного гамма-синуклеинопатией, поскольку баланс и координация трансгенных животных, получавших вещество статистически достоверно лучше, чем у контрольных животных, не получавших вещество.
Пример 9. Определение влияния соединения FC-203 на прогрессию симптомов, связанных с неконтролируемой агрегацией гиперфосфорилированной формы белка тау в нервной системе трансгенных животных: оценка баланса и координации на вращающемся стержне
Моторную функцию трансгенных мышей линии P301S оценивали по способности животных удерживаться на стержне в ускоряющемся режиме вращения. Продолжительность каждого тестирования на вращающемся стержне составляла 5 мин, скорость вращения стержня за этот период возрастала от 4 до 40 об/мин. Регистрировалось время, которое животное способно удерживаться на стержне. Тестирование повторяли 3 раза для каждого животного с 30-минутными перерывами между тестами и брали среднее значение времени нахождения на стержне до падения.
Животные тестировались на вращающемся стержне в режиме постоянного ускорения. На фиг. 8 представлены средние по группе значения тестирования контрольных мышей (круги) и экспериментальная группа FC-203 (квадраты), получавших вещество с первого месяца жизни. Как видно из приведенных данных исследуемое вещество существенно замедляет развитие клинических проявлений таупатии.
Таким образом, FC-203 эффективно уменьшает нарушения равновесия и координации у трансгенных животных линии P301S, вызванные аггрецией белка тау.
Пример 10. Определение влияния соединения FC-203 на прогрессию симптомов связанных с неконтролируемой агрегацией белка гамма-синуклеина в нервной системе трансгенных мышей: оценка способности животных удерживаться на перевернутой сетке
По мере прогрессии нейродегенеративных процессов, вызванных у трансгенных животных линии Thy1mγSN гамма-синуклеинопатией, регистрируется недостаточность двигательной функции, обусловленная дегенерацией нервов и развивитием мышечной слабости - животные утрачивают способность удерживаться на перевернутой сетке. Способность животных удерживаться на перевернутой сетке оценивали регулярно ежемесячно, начиная с трех месячного возраста в группе, получавшей соединение, и в контрольной группе трансгенных животных. В данном тесте регистрировалось время, которое животное удерживается на перевернутой сетке.
На фиг. 9 представлены средние по группе значения тестирования в контрольной группе мышей (круги) и в экспериментальной группе FC-203 (квадраты), получавших вещество с трех месяцев.
Как видно из приведенных данных, исследуемое вещество существенно замедляет развитие симптомов, обусловленных нарушением иннервации конечностей. Таким образом, соединение FC-203 эффективно влияет на прогрессию гамма-синуклеинопатии у В данном тесте регистрировалось время, которое животные линии P301S способны были удерживаться на перевернутой сетке.трансгенных мышей.
Пример 11. Определение влияния соединения FC-203 на прогрессию симптомов, связанных с неконтролируемой агрегацией гипрфосфорилированной формы белка тау в нервной системе трансгенных мышей: оценка способности животных удерживаться на перевернутой сетке
Способность животных удерживаться на перевернутой сетке оценивали ежемесячно, начиная с двух-месячного возраста и в группе, получавшей исследуемое соединение FC-203 и в контрольной группе трансгенных животных.
Представлены средние по группе значения тестирования контрольных мышей (круги) и экспериментальная группа получавших вещество FC-203 с первого месяца жизни (квадраты).
Как видно из приведенных на фиг. 10 данных, исследуемое вещество существенно замедляет развитие симптомов, обусловленных нарушением иннервации конечностей таупатии. Таким образом, вещество FC 203 эффективно уменьшает выраженность симптомов, обусловленных неконтролируемой агрегацией белков в тканях нервной системы животных.
Пример 12. Определение влияния соединения FC-203 на образование агрегатов белка FUS в клеточных культурах
Способность исследуемого соединения влиять на процесс формирования и/или стабильности патогенных белковых агрегатов была исследована в культурах клеток, экспрессирующих аберрантные формы белка FUS человека склонного к агрегации. Перевиваемую культуру клеток нейробластомы человека SH-SY5Y трансфецировали плазмидными конструктами, содержащими последовательности, кодирующие мутантные формы белка FUS человека, ассоциированные с некоторыми наследственными формами бокового амиотрофического склероза (БАС), которые имеют повышенную склонность к агрегации и способны формировать патогенные белковые включения. Данная модельная система позволяет воспроизводить отдельные этапы молекулярной патологии протеинопатий, связанных c нарушением метаболизма этих белков. После трансфекции к клеточным культурам непосредственно в питательную среду добавляли соединение FC-203, а затем анализировали количество включений, образованных белком FUS. В контрольной культуре происходило последовательное накопление агрегатов белка FUS, которое в конечном итоге приводило к гибели клеток. Однако при добавлении соединения FC-203 процесс образование белковых агрегатов существенно замедлялся.
Как следует из фиг. 11, окрашенные FUS положительные агрегаты присутствуют в цитоплазме контрольной культуры клеток, тогда как в клетках, обработанных FC-203, окрашивание белка FUS происходит диффузно. Это указывает на то, что соединение ингибирует формирование агрегатов белка FUS.
Пример 13. Определение влияния соединения FC-203 на образование агрегатов белка TDP-43 в клеточных культурах
Для проверки неожиданно выявленных нами свойств соединения FC 203 ингибировать формирование цитоплазматических белковых агрегатов был использован другой белок. Белок TDP-43 так же, как и FUS, является ДНК/РНК связывающим белком, имеет схожую с ним доменную структуру и выполняет в клетке схожие функции регуляции метаболизма РНК. Более того, мутации в структурной части гена, приводящие к изменению первичной последовательности кодируемого им белка также как и для FUS, выявлены при ряде форм БАС и фронто-темпоральной дегенерации. Плазмидная ДНК, содержащая укороченную часть гена TDP-43 человека, кодирующую аберрантную форму этого белка с высокими агрегационными свойствами, в составе экспрессирующего эукариотического вектора была доставлена в клетки нейробластомы человека SH-SY5Y методом трансфекции, так же как и в предыдущем эксперименте. Через 18 часов в цитоплазме трансфецированых клеток детектировалось образование включений, количество которых было существенно меньше, если в питательную среду добавляли соединение FC-203, что также способствует предотвращению формирования агрегатов аберрантной формы белка TDP-43.
Как следует из фиг. 12, окрашенные TDP-43 положительные агрегаты присутствуют в цитоплазме контрольной культуры клеток, также имеется уменьшенное по сравнению с контрольной количество окрашенных TDP-43 положительных агрегатов в клетках, обработанных FC-203. Таким образом, учитывая особые агрессивные свойства используемой аберрантной формы белка TDP-43, соединение FC-203 предотвращает агрегацию TDP-43.
Следующим аспектом изобретения является фармакологическое средство для улучшения когнитивных функций и памяти, содержащее эффективное количество соединения формулы (I) и фармацевтически приемлемый носитель.
Фармакологическое средство согласно изобретению приготавливается с помощью общепринятых в данной области техники приемов и включает фармакологически эффективное количество активного агента, представляющего соединения формулы (1) (называемый далее "активное начало "), составляющее обычно от 1 до 20 вес.%, или от 1 мг до 20 мг в дозируемой форме, в сочетании с одной или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными добавками, такими как разбавители, связующие, разрыхляющие агенты, адсорбенты, ароматизирующие вещества, вкусовые агенты. В соответствии с известными методами фармацевтические композиции могут быть представлены различными жидкими или твердыми формами. Примеры твердых лекарственных форм включают, например, таблетки, пилюли, желатиновые капсулы и др.
Композиции, как правило, получают с помощью стандартных процедур, предусматривающих смешение активного начала с жидким или тонко измельченным твердым носителем.
Композиции согласно изобретению в форме таблеток содержат от 1 до 20% активного начала и наполнителя или носителя. В качестве таковых для таблеток применяются: а) разбавители: свекловичный сахар, лактоза, глюкоза, натрия хлорид, сорбит, маннит, гликоль, фосфат кальция двузамещенный; б) связующие вещества: магниевый силикат алюминия, крахмальная паста, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза и поливинилпирролидон; в) разрыхлители: декстроза, агар, альгиновая кислота или ее соли, крахмал, твин.
ПРИМЕР 1.
100 мг таблетки, содержащие по 5 мг препарата
Препарат
5 мг
Лактоза
50.0 мг
Альгиновая кислота
20.0 мг
Лимонная кислота
5.0 мг
Трагакант
20.0 мг
Таблетка может быть сформирована посредством прессовки или формовки активного ингредиента с одним или более дополнительными ингредиентами.
Получение прессованных таблеток осуществляется на специальной установке. Активный ингредиент в свободной форме, такой как порошок или гранулы, в количестве 50 г (количество вещества, необходимое для получения 10000 таблеток) перемешивается со связующим веществом - трагакантом (200 г), смешивается с разбавителем - лактозой (500 г), в смесь добавляется разрыхляющее вещество - альгиновая кислота (200 г) и лимонная кислота (50 г).
Для желатиновых капсул используются дополнительно красители и стабилизаторы. В качестве красителей используются: тетразин, индиго; в качестве стабилизаторов могут быть представлены: натрия метабисульфит, натрия бензоат. Предлагаемые желатиновые капсулы содержат от 1 до 20 % активного ингредиента.
ПРИМЕР 2
500 мг капсулы, содержащие по 20 мг препарата
Препарат
20 мг
Глицерин
100.0 мг
Сахарный сироп
319.0 мг
Мятное масло
40.0 мг
Натрия бензоат
10.0 мг
Аскорбиновая кислота
5.0 мг
Тетразин
5.0 мг
200 г активного вещества (количество, необходимое для приготовления 10000 капсул) тонко измельчают и смешивают в смесителе с глицерином (1000 г) и сахарным сиропом (3190 г). После перемешивания в смесь добавляют мятное масло (400 г), бензоат натрия (100 г), аскорбиновую кислоту (50 г) и тетразин (50 г). Желатиновые капсулы приготовляют капельным методом. Этот метод позволяет осуществлять одновременное капельное дозирование раствора лекарственного вещества и нагретой желатиновой массы (900 г желатина) в охлажденное вазелиновое масло. В результате образуются бесшовные шарообразные желатиновые капсулы, заполненные лекарственной смесью, полностью готовые к употреблению, содержащие 20 мг активного начала.
Согласно изобретению способ улучшения когнитивных функций и памяти заключается во введении пациенту фармакологического средства, содержащего эффективное количество хлоргидратов фторсодержащих замещенных 5-[2-(пирид-3-ил)-этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо[4,3-b]индолов формулы (I), в дозе 1-150 мг по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.
Назначаемая для приема доза активного компонента - соединения формулы (I) - варьируется в зависимости от многих факторов, таких как возраст, пол, вес человека, конкретно назначаемое соединение, способ приема, форма препарата, в виде которой назначается активное соединение.
Как видно из приведенных примеров, применением соединений формулы (I) предлагаемое изобретение решает задачу расширения арсенала средств, снижающих неконтролируемую агрегацию белков в нервной системе, приводящую к развитию разрушающих процессов в центральной и периферической нервной системе.
Таблица 1
Выходы, температуры плавления синтезированных
оснований 1-7, 22-28
и хлоргидратов 8-21, 29-35.
<img file="00000005.tif" he="61" wi="57" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000006.tif" he="61" wi="57" img-content="undefined" img-format="tif" />
№
R1
R2
R3
R4
R5
R6
HCl
Выход, %
Т.пл., °C
1
Me
H
H
H
H
F
-
68
97-99
2
Me
H
Me
H
H
F
-
72
103-104
3
Me
H
Br
H
H
F
-
69
100-102
4
Me
H
Cl
H
H
F
-
73
111-112
5
Me
H
F
H
H
F
-
70
92-94
6
Me
H
MeO
H
H
F
-
65
105-107
7
Et
H
Me
H
H
F
-
76
93-95
8
Me
H
H
H
H
F
HCl
85
235-237
9
Me
H
Me
H
H
F
HCl
91
238-240
10
Me
H
Br
H
H
F
HCl
81
213-215
11
Me
H
Cl
H
H
F
HCl
88
252-254
12
Me
H
F
H
H
F
HCl
90
237-239
13
Me
H
MeO
H
H
F
HCl
82
214-216
14
Me
H
CF<sub>3</sub>O
H
H
F
HCl
77
228-230
15
Et
H
H
H
H
F
HCl
87
220-222
16
Et
H
Me
H
H
F
HCl
93
216-218
17
Et
H
Br
H
H
F
HCl
86
229-230
18
Et
H
Cl
H
H
F
HCl
82
241-243
19
Et
H
F
H
H
F
HCl
84
231-233
20
Et
H
MeO
H
H
F
HCl
80
202-204
21
Et
H
CF<sub>3</sub>O
H
H
F
HCl
74
201-203
22
Me
H
H
H
H
CF<sub>3</sub>
-
67
87-89
23
Me
H
Me
H
H
CF<sub>3</sub>
-
72
94-96
24
Me
H
Cl
H
H
CF<sub>3</sub>
-
65
84-86
25
Me
H
F
H
H
CFa
-
69
85-87
26
Me
H
MeO
H
H
CF<sub>3</sub>
-
63
91-93
27
Me
H
F
H
F
CF<sub>3</sub>
-
76
101-103
28
Et
H
Cl
H
H
CF<sub>3</sub>
-
78
масло
29
Me
H
H
H
H
CF<sub>3</sub>
HCl
89
111-113
30
Me
H
Me
H
H
CF<sub>3</sub>
HCl
92
115-116
31
Me
H
Cl
H
H
CF<sub>3</sub>
HCl
95
117-119
32
Me
H
F
H
H
CF<sub>3</sub>
HCl
87
112-114
33
Me
H
MeO
H
H
CF<sub>3</sub>
HCl
91
132-134
34
Me
H
F
H
F
CF<sub>3</sub>
HCl
90
121-122
35
Et
H
Cl
H
H
CF<sub>3</sub>
HCl
88
57-59
Таблица 2
Данные спектров ЯМР <sup>1</sup>H и <sup>19</sup>F синтезированных соединений
№
Спектр ЯМР <sup>1</sup>H, δ, м.д. (J/Гц)
Спектр ЯМР <sup>19</sup>F, δ, м.д., (J, Гц)
1
2.58 (с+т, 5H), 2.77 (т, 2H, J=6.1 Гц), 3.08 (т, 2H, J=3.1 Гц), 3.70 (с, 2H), 4.45 (т, 2H, J=3.1 Гц), 6.93 (д, 1H J=7.2 Гц), 7.05-7.33 (м, 4H), 7.47 (д, 1H J=3.1 Гц), 8.20 (с, 1H), 8.38 (д, 1H, J=3.1 Гц)
-47.12 (д, J=9 Гц)
2
2.44 (с, 3H), 2.58 (с+т, 5H), 2.71 (т, 2H, J=6.1 Гц), 3.02 (т, 2H, J=6.1 Гц), 3.63 (с, 2H), 4.21 (т, 2H, J=6.1 Гц), 6.88 (д, 1H, J=7.1 Гц), 6.98 (д, 1H, J=7.1 Гц), 7.10 (д, 1H J=7.1 Гц), 7.21 (с, 1H), 8.13 (с, 1H), 8.32 (д, 1H, J=3 Гц)
-47.46 (д, J=9 Гц)
3
2.53 (с+т, 5H), 2.76 (т, 2H, J=6.2 Гц), 3.06 (т, 2H, J=6.2 Гц), 3.65 (с, 2H), 4.26 (т, 2H, J=6.2 Гц), 6.88 (д, 1H, J=6.8 Гц), 7.07 (д, 1H, J=6.8 Гц), 7.26 (д, 1H J=6.8 Гц), 7.57 (с, 1H), 8.15 (с, 1H), 8.37 (д, 1H, J=3 Гц)
-49.02 (д, J=9.5 Гц)
4
2.48 (с+т, 5H), 2.57 (т, 2H, J=6.2 Гц), 2.92 (т, 2H, J=6.2 Гц), 3.45 (с, 2H), 4.11 (т, 2H, J=6.2 Гц), 6.6 (д, 1H, J=7.2 Гц), 6.97 (с, 2H), 7.28 (с, 1H), 8.01 (с, 1H), 8.25 (д, 1H, J=3 Гц)
- 48.22 (д, J=9.7 Гц)
5
2.56 (с+т, 5H), 2.76 (т, 2H, J=5.9 Гц), 3.07 (т, 2H, J=5.9 Гц), 3.64 (с, 2H), 4.27 (т, 2H, J=5.9 Гц), 6.90 (м, 2H), 7.11 (м, 2H), 8.17 (с, 1H), 8.37 (д, 1H, J=3 Гц)
-46.13 (дт, 1F, J=4.2 Гц, J=9.7 Гц), -49.11 (д, 1F, J=9 Гц)
6
2.54 (с+т, 5H), 2.75 (т, 2H, J=5.9 Гц), 3.06 (т, 2H, J=5.9 Гц), 3.67 (с, 2H), 3.90 (с, 3H), 4.26 (т, 2H, J=5.9 Гц), 6.83 (д, 1H, J=6.9 Гц), 6.92 (с, 1H), 7.13 (д, 1H, J=5.9 Гц), 7.30 (с, 2H), 8.18 (с, 1H), 8.36 (д, 1H, J=3 Гц)
-49.11 (д, J=9 Гц)
7
1.20 (т, 3H, J=6.2 Гц), 2.46 (с+т, 5H), 2.63 (м, 2H), 2.76 (м, 2H), 3.01 (т, 2H), 3.67 (с, 2H), 4.20 (т, 2H), 6.87 (д, 1H), 6.97 (с, 1H), 7.09 (д, 1H), 7.23 (1, 2H), 8.16 (с, 1H), 8.32 (д, 1H, J 3)
- 48.22 (д, J=9 Гц)
8
2.95 (д, 3H, J=4.9 Гц), 3.05-3.24 (м, 4H), 3.46 (м, 1H), 3.76 (м, 1H), 4.29 (м, 1H), 4.45 (т, 2H, J=4.9 Гц), 4.62 (м, 1H), 7.09 (м, 2H), 7.46 (м, 2H), 7.80 (д, 1H, J=9 Гц), 8.33 (с, 1H), 8.53 (д, 1H, J=3 Гц), 11.23 (уш.с, 1H)
-48.70 (д, J=9 Гц)
9
2.92 (д, 3H, J=4.4 Гц), 3.07-3.26 (м, 4H), 3.43 (м, 1H), 3.70 (м, 1H), 4.24 (м, 1H), 4.38 (т, 2H, J=4.9 Гц), 4.55 (м, 1H), 6.95 (д, 1H, J=8.6 Гц), 7.21 (с, 1H), 7.34 (д, 1H, J=8.6 Гц), 7.88 (д, 1H, J=9.7 Гц), 8.36 (с, 1H), 8.58 (уш.с, 1H), 11.39 (уш.с, 1H)
- 47.23 (д, J=9 Гц)
10
2.92 (д, 3H, J=4.4 Гц), 3.07-3.26 (м, 4H), 3.44 (м, 1H), 3.75 (м, 1H), 4.24 (м, 1H), 4.43 (т, 2H, J=4.9 Гц), 4.58 (м, 1H), 7.22 (д, 1H, J=8.6 Гц), 7.44 (д, J=8.6, Гц), 7.69 (с, 1H), 7.76 (д, 1H, J=9.5 Гц), 8.28 (с, 1H), 8.48 (д, 1H, J=3 Гц), 11.39 (уш.с, 1H)
- 49.21 (д, J=9.5 Гц)
11
2.92 (д, 3H, J=4.4 Гц), 3.07-3.26 (м, 4H), 3.44 (м, 1H), 3.75 (м, 1H), 4.24 (м, 1H), 4.43 (т, 2H, J=4.9 Гц), 4.55 (м, 1H), 7.10 (дд, 1H, J=2.3 Гц, J=8.8 Гц), 7.48 (д, J=8.8 Гц), 7.55 (д, 1H, J=2.3 Гц), 7.89 (д, 1H, J=9.7 Гц), 8.37 (с, 1H), 8.58 (д, 1H, J=3), 11.51 (уш.с, 1H)
- 47.98 (д, J=9.7 Гц)
12
2.95 (д, 3H, J=4.9 Гц), 3.07-3.24 (м, 4H), 3.46 (м, 1H), 3.76 (м, 1H), 4.23 (м, 1H), 4.43 (т, 2H, J=4.9 Гц), 4.54 (м, 1H), 6.96 (ддд, 1H, J=2.7 Гц, J=9.1 Гц, J=9.7 Гц), 7.27 (дд, 1H, J=2.7 Гц, J=9.7), 7.47 (дд, J=9.1 Гц, J=4.2 Гц), 7.78 (д, 1H, J=9 Гц), 8.30 (с, 1H), 8.51 (д, 1H, J=3 Гц), 11.23 (уш.с, 1H)
- 46.51(дт, 1F, J=4.2 Гц, J=9.7 Гц), - 49.00 (д, 1F, J=9 Гц)
13
2.94 (д, 3H, J=4.4 Гц), 3.07-3.26 (м, 4H), 3.42 (м, 1H), 3.73 (м, 1H), 3.77 (с, 3H); 4.24 (м, 1H), 4.37 (т, 2H, J=4.9 Гц), 4.55 (м, 1H), 6.98 (д, 1H, J=2.3 Гц), 7.10 (дд, 1H, J=2.3 Гц, J=8.6 Гц), 7.36 (д, J=8.6 Гц), 7.72 (д, 1H, J=9.7 Гц), 8.29 (с, 1H), 8.48 (д, 1H, J=3 Гц), 10.96 (уш.с, 1H)
- 49.36 (д, J=9 Гц)
14
2.95 (д, 3H, J=4.0 Гц), 3.07-3.24 (м, 4H), 3.46 (м, 1H), 3.76 (м, 1H), 4.23 (м, 1H), 4.43 (м, 2H), 4.54 (м, 1H), 7.07 (дд, 1H, J=2.0 Гц, J=9.3 Гц), 7.56 (д, 1H, J=9.3 Гц), 7.82 (д, 1H, J=9.7 Гц), 8.36 (с, 1H), 8.53 (д, 1H, J=2 Гц), 11.43 (уш.с, 1H)
20.81 (c, 3F), -48.63 (д, 1F, J=8.5 Гц)
15
1.40 (т, 3H, J=4.9 Гц), 3.07-3.24 (м, 4H), 3.29 (м, 2H), 3.46 (м, 1H), 3.76 (м, 1H), 4.29 (м, 1H), 4.25 (м, 2H), 4.63 (м, 1H), 7.07 (м, 2H), 7.47 (м, 2H), 7.76 (д, 1H, J=9.0 Гц), 8.30 (с, 1H), 8.48 (д, 1H, J=3.0 Гц), 11.00 (уш.с, 1H)
- 49.07 (д, J=9 Гц)
16
1.38 (т, 3H, J=4.9 Гц), 2.38 (с, 3H), 3.06-3.24 (м, 4H), 3.27 (м, 2H), 3.45 (м, 1H), 3.78 (м, 1H), 4.26 (м, 2H), 4.30 (м, 1H), 4.58 (м, 1H), 6.95 (д, 1H, J=8.0 Гц), 7.27 (с, 1H), 7.34 (д, J=8.0 Гц), 7.75 (д, 1H, J=9.0 Гц), 8.27 (с, 1H), 8.49 (д, 1H, J=3.1 Гц), 10.87 (уш.с, 1H)
- 49.13(д, J=9 Гц)
17
1.36 (т, 3H, J=5.1 Гц), 3.07 (м, 2H), 3.05-3.31 (м, 4H), 3.40 (м, 1H), 3.75 (м, 1H), 4.22 (м, 1H), 4.66 (м, 1H), 7.10 (д, 1H, J=8.0 Гц), 7.48 (д, J=8.0 Гц), 7.59 (с, 1H), 8.11 (д, 1H, J=9.0 Гц), 8.44 (с, 1H), 8.72 (уш.с, 1H), 10.54 (уш.с, 1H)
- 49.01 (д, J=9 Гц)
18
1.37 (т, 3H, J=4.9 Гц), 3.08 (м, 2H), 3.07-3.30 (м, 4H), 3.44 (м, 1H), 3.80 (м, 1H), 4.24 (м, 1H), 4.65 (м, 1H), 7.09 (д, 1H, J=8.0 Гц), 7.46 (д, J=8.0 Гц), 7.59 (с, 1H), 8.09 (д, 1H, J=9.0 Гц), 8.45 (с, 1H), 8.70 (уш.с, 1H), 10.56 (уш.с, 1H)
- 48.93 (д, J=9 Гц)
19
1.24 (т, 3H, J=4.9 Гц), 2.68 (к, 2H, J=4,9 Гц), 2.55 (м, 2H), 2.80 (м, 2H), 3.06 (т, 4H, J=4.9 Гц), 3.67 (с, 2H), 4.26 (т, 2H, J=4.9 Гц), 6.91 (м, 2H), 7.12 (м, 2H), 8.16 (с, 1H), 8.38 (д, 1H, J=3.3 Гц), 11.23 (уш.с, 1H)
- 47.37 (дт, 1F, J=4.4 Гц, J=9.7 Гц), -49.10 (д, 1F, J=9 Гц)
20
1.35 (т, 3H, J=4.9 Гц), 3.09 (м, 2H), 3.08-3.30 (м, 4H), 3.43 (м, 1H), 3.62 (с, 3H); 3.88 (м, 1H), 4.25 (м, 1H), 4.65 (м, 1H), 7.08 (д, 1H, J=8.0 Гц), 7.44 (д, 1H, J=8.0 Гц), 7.59 (с, 1H), 8.11 (д, 1H, J=9.0 Гц), 8.49 (с, 1H), 8.71 (уш.с, 1H), 10.53 (уш.с, 1H)
- 48.93 (д, J=9 Гц)
21
1.39 (т, 3H, J=4.9 Гц), 3.06 (м, 2H), 3.07-3.31 (м, 4H), 3.45 (м, 1H), 3.82 (м, 1H), 4.23 (м, 1H), 4.66 (м, 1H), 7.09 (д, 1H, J=8.0 Гц), 7.47 (д, 1H, J=8.0 Гц), 7.61 (с, 1H), 8.10 (д, 1H, J=9.0 Гц), 8.47 (с, 1H), 8.71 (уш.с, 1H), 10.55 (уш.с, 1H)
20.89 (с, 3F), - 48.55 (д, 1F, J=8.5 Гц)
22
2.25 (т, 2H, J=4.9 Гц), 2.39 (с, 3H), 2.55 (т, 2H, J=4.9 Гц), 2.99 (т, 2H, J=4.9 Гц), 3.50 (с, 2H), 4.13 (т, 2H, J=4.9 Гц), 7.00 (м, 4H), 7.28 (д.д, 1H), 7,34 (д, 1H, J=8.1 Гц), 8.30 (с, 1H),
9.24 с
23
2.24 (т, 2H, J=4.8 Гц), 2.39 и 2,42 оба (т, 6H, J=4.8 Гц), 2.53 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.03 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.47 (с, 2H), 4.16 (т, 2H, J=4.8 Гц), 6.82 (д, 1H, J=8.2 Гц), 6.95 (м, 2H), 7.07 (с, 1H), 7.36 (д, 1H, J=8.2 Гц), 8.34 (с, 1H),
9.59 с
24
2.24 (т, 2H, J=4.8 Гц), 2.39 (с, 3H), 2.54 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.02 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.45 (с, 2H), 4.16 (т, 2H, J=4.8 Гц), 6.76 (т.д., 1H), 6.98 (м, 3H), 7.37 (д, 1H, J=8.0 Гц), 8.32 (с, 1H),
9.62 с
25
2.26 (т, 2H, J=4.8 Гц), 2.38 (с, 3H), 2.53 (т, 2H, J=4.8 Гц), 2.96 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.42 (с, 2H), 4.09 (т, 2H, J=4.8 Гц), 6.94 (м, 2H), 7.03 (д, 1H, J=8.1 Гц), 7.25 (с, 1H), 7.36 (д, 1H, J=8.1 Гц), 8.24 (с, 1H),
- 45.12 (м, 1F), 9.51 (с, 3F)
26
2.23 (т, 2H, J=4.9 Гц), 2.52 (с, 3H), 2.53 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.03 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.47 (с, 2H), 3.78 (с, 3H), 4.15 (т, 2H, J=4.8 Гц), 6.67 (м, 2H), 6.94 (м, 2H),7.36 (д, 1H, J=8,0 Гц), 8.34 (с, 1H),
9.42 с
27
2.33 (т, 2H, J=4.8 Гц), 2.22 (т, 2H, J=4.8 Гц), 2.55 (м, 4H), 2.98 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.48 (с, 2H), 4.13 (т, 2H, J=4.8 Гц), 6.95 (м, 3H), 7.34 (м, 2H), 8.35 (с, 1H),
- 57.24 (м, 1F), - 44.05 (м, 1F), 9.09 (c 3F)
28
1.13 (т, 1H, J=4.8 Гц), 2.39 (с, 3H), 2.54 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.02 (т, 2H, J=4.8 Гц), 3.45 (с, 2H), 4.16 (т, 2H, J=4.8 Гц), 6.76 (т.д., 1H, J=4.8 Гц, J=6.5 Гц), 6.98 (м, 3H), 7.37 (д, 1H, J=8.1 Гц), 8.32 (с, 1H),
9.53 с
29
2.76 (с, 3H), 2.99 (м, 4H), 3.52 (м, 2H), 3.92-4,55 (м, 4H), 6,91 (м, 1H), 7,26 (м, 2H), 7,60 (м, 3H), 8.39 (м, 1H), 11,27 (уш.с, 1H)
11.47 с
30
2.38 (с, 3H), 2.92 (с, 3H), 3.11 (м, 2H), 3.61 (м, 4H), 4.07-4.76 (м, 4H), 6.94 (д, 1H, J=6.8 Гц), 7.21 (с, 1H), 7.23 (д, 1H, J=6.8 Гц), 7.82 (м, 2H), 8.54 (с, 1H), 11,13 (уш.с, 1H)
11.39 с
31
2.59 (с, 3H), 2.80 (м, 2H), 3.13 (м, 4H), 4.12 (м, 4H), 6,74 (д, 1H, J=6.9 Гц), 7,05 (м, 1H), 7,20 (с, 1H), 7,47 (м, 2H), 8.21 (с, 1H), 11,27 (уш.с, 1H)
11.54 с
32
2.52 (с, 3H), 2.91 (м, 3H), 3.11 (м 3H), 4,17-4,64 (м 4H), 6,92 (м, 1H), 7,25 (д, 1H, J=7.1 Гц), 7,39 (м, 1H), 7,76 (м, 1H), 7,86 (м, 1H), 8,54 (с 1H), 11,43 (уш.с, 1H)
- 44.59 (м, 1F), 11.49 (c 3F)
33
2.92 (д, 3H, J=3.8 Гц), 3.11 (м, 2H), 3.62 (м, 4H), 3.78 (с, 3H); 4.13-4.68 (м, 4H), 6.74 (д.д, 1H, J=2.7 Гц, J=6.8 Гц), 6.99 (д, 1H. J=6.8 Гц)), 7.33 (д, 1H. J=6.8 Гц), 7.83 (м, 2H), 8.54 (с, 1H), 11.04 (уш.с, 1H)
11.53 с
34
2.54 (с, 3H), 2.77 (м, 4H), 3.32 (м, 1H), 3.88 (м, 2H), 4.11 (м, 3H), 6,56 (т, 1H. J=6.7 Гц), 6.79 (д, 1H. J=6.7 Гц), 7,40 (м, 2H), 8.08 (с, 1H), 11,09 (уш.с, 1H)
- 57.48 (м, 1F), - 44.12 (м, 1F), 11.61 (c 3F)
35
1.37 (т, 3H. J=5.1 Гц), 3.12 (м, 2H), 3.10-3.35 (м, 4H), 3.42 (м, 1H), 3.75 (м, 1H), 4.23 (м, 1H), 4.71 (м, 1H), 7.10 (д.д, 1H, J=2.5 Гц, J=6.8 Гц), 7.45 (д, 1H, J=6.8 Гц), 7.62 (д, 1H, J=6.8 Гц), 7.74-8.01 (м, 2H,), 10.52 (уш.с, 1H)
11.38 с