СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОТИНИЛИРОВАННОГО ПРОИЗВОДНОГО ОКИСЛЕННОГО ДЕКСТРАНА
METHOD FOR PREPARING BIOTINYLATED DERIVATIVE OF OXIDISED DEXTRAN

Изобретение относится к медицине, экспериментальной и клинической фармакологии, в частности оно может быть использовано при доклинических и клинических испытаниях окисленных декстранов, а именно исследовании их фармакокинетических параметров методом иммуноферментного анализа.
В экспериментальной медицине широко используются модифицированные производные полисахаридов, в частности декстрана, для изучения транспорта биологически активных веществ через клеточные мембраны (1).
Особый интерес для фармакологии представляют окисленные декстраны (ОД), так как они обладают высокой биосовместимостью, иммуномодулирующей активностью и могут использоваться в качестве перспективной матрицы для иммобилизации биологически активных веществ с целью их адресной доставки в различные клетки-мишени (2). Окисленные декстраны представляют собой производные декстрана, полученные путем его химического или радиационного окисления и содержащие карбонильные группы. С помощью окисленных декстранов получены перспективные лекарственные композиции (конъюгаты) для лечения туберкулеза (3), системных микозов (4) и вирусных заболеваний (5). Однако механизм действия окисленных декстранов до настоящего времени изучен недостаточно, так как отсутствуют способы получения их модифицированных производных с сохраненными карбонильными группами, образующиеся при окислении декстранов и обусловливающие их специфические биологические свойства.
Известно, что для визуализации окисленных декстранов используют метод их модификации различными флуоресцентными красителями, из которых наибольшую популярность приобрели родамин и флуоресцеин.
Известен, например, способ получения флуоресцентного производного декстрана, включающий активацию декстрана путем реакции с бромпропиламином, осаждение полученного аминопроизводного декстрана этанолом; очистку аминопроизводного декстрана диализом; проведение реакции аминопроизводного декстрана с 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеином путем конденсации в буферном растворе; отделение полученного флуоресцентного производного декстрана от свободного 5-([4,6-дихлоротриазин-2-ил]амино)-флуоресцеина ультрафильтрацией, в частности, диализом; очистку флуоресцентного аминопроизводного декстрана путем хроматографического разделения (6).
Недостатком известного способа является его непригодность для получения флуоресцентных производных окисленных декстранов, т.к. это может привести к полной потере карбонильных групп, обусловливающих специфические биологические свойства окисленных декстранов.
Наиболее близким к заявляемому способу - прототипом, является способ получения флуоресцентного производного окисленного декстрана, включающий проведение реакции флуоресцентного красителя с активированным окисленным декстраном с последующей очисткой конечного продукта от примесей путем ультрафильтрации, при этом в качестве флуоресцентного красителя используют флуоресцеин, в качестве активирующего реагента - 1,1′-карбонилдиимидазол и активацию окисленного декстрана производят путем добавления 1,1′-карбонилдиимидазола в реакционную смесь окисленного декстрана с флуоресцеином (7).
Недостатком известного способа является то, что получаемый флуоресцентный производный окисленного декстрана обладает низкой визуализирующей способностью, поскольку в декстран можно ввести ограниченное количество молекул флуоресцеина, при этом на сравнительно большой молекуле декстрана (около 250 глюкопиранозных звеньев для м.М. 40 кДа) будет находиться до 10 остатков флуоресцеина. Введение большего количества флуоресцентного красителя может изменить биологические и фармакологические свойства конъюгата. Кроме этого, большинство биологических объектов (клетки, тканевые гомогенаты, компоненты крови и др.) обладают весьма интенсивной собственной флуоресценцией, которая зачастую совпадает со спектральными характеристиками флуоресцентных красителей. Перечисленные недостатки не позволяют с высокой чувствительностью определять флуоресцентный производный ОД в сыворотке крови.
Задачей изобретения является получение биотинилированного производного окисленного декстрана (БОД) высокого качества, обеспечивающего высокую чувствительность его определения в сыворотке крови при проведении иммуноферментного анализа.
Поставленная задача достигается предлагаемым способом получения БОД, заключающимся в следующем.
Сухой окисленный декстран с молекулярной массой 40-70 кДа предварительно растворяют в трис-ацетатном буферном растворе с рН 5,0-5,5 до концентрации 5%. Для запуска реакции в реакционную смесь добавляют гидразид биотина в качестве активного реагента в весовом соотношении с декстраном 1:(20-25) в пересчете на массу сухого вещества. Реакцию проводят при температуре 80-90°С в течение 30-60 минут. Гидразид биотина взаимодействует с карбонильными группами окисленного декстрана с образованием азометиновой связи -C=N-.
Полученный БОД представляет собой конъюгат, в котором гидразид биотина и окисленный декстран связаны ковалентными связями. Именно наличие азометиновой связи в конъюгате гидразида биотина с окисленным декстраном обусловливает его специфические биологические свойства имитировать (моделировать) конъюгаты с лекарственными препаратами, имеющими в своей структуре первичные аминогруппы.
Полученное биотинилированное производное окисленного декстрана может быть с высокой чувствительностью проанализировано методом иммуноферментного анализа для исследования его фармакокинетических параметров.
На фиг.1 представлена химическая формула гидразида биотина, а на фиг.2 приведена схемы синтеза конъюгата гидразида биотина с окисленным декстраном.
Определяющим отличием предлагаемого способа от прототипа является то, что в качестве активного реагента используют гидразид биотина, взятый в оптимальном экспериментально подобранном весовом соотношении с окисленным декстраном, а именно: 1:(20-25), при этом реакцию биотинилирования окисленного декстрана проводят при температуре 80-90°С в течение 30-60 минут. Гидразид биотина является коммерчески доступным реагентом (например, Sigma, кат. № В7639), а получаемый целевой продукт не требует очистки от посторонних примесей (в отличие от продукта-прототипа).
Экспериментальным путем обнаружено, что именно совокупность предложенных признаков позволяет получать целевой продукт высокого качества, обеспечивающий высокую точность и чувствительность определения БОД в сыворотке крови при проведении иммуноферментного анализа. При понижении весового соотношения гидразида биотина с окисленным декстраном получают целевой продукт, не обеспечивающий высокую чувствительность его определения в сыворотке крови, при повышении весового соотношения - чувствительность определения БОД в сыворотке крови не увеличивается и остается на неизменном уровне. При увеличении рН буфера снижается степень присоединения гидразида биотина к окисленному декстрану и понижается чувствительность определения БОД в сыворотке крови, более низкие значения рН буфера, ниже 5,0, нельзя использовать для внутривенного введения in vivo. Понижение температуры ниже 80°С приводит к снижению степени присоединения гидразида биотина к окисленному декстрану и понижению чувствительности определения БОД в сыворотке крови, повышение температуры свыше 90°С приводит к разрушению компонентов и снижению чувствительности определения БОД в сыворотке крови.
В таблицах 1-4 представлены калибровочные графики количественного определения БОД с мол. массой 40 кДа (табл.1) и с мол. массой 70 кДа (табл.3) и калибровочные графики количественного определения флуоресцентных производных ОД с мол. массой 40 кДа (табл.2) и с мол. массой 70 кДа (табл.4) в сыворотке крови экспериментальных животных (мышей).
Как видно из представленных данных, чувствительность определения БОД в 5-10 раз выше, чем чувствительность определения флуоресцентных производных ОД, полученных способом-прототипом.
Заявляемое изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Брали 50 мг окисленного декстрана, растворяли его в 1 мл трис-ацетатного буфера с рН 5,0 и добавляли к полученному раствору 2 мг гидразида биотина, после чего полученный раствор нагревали при 80°С в течение одного часа. Полученный раствор БОД растворяли в сыворотке крови в повышающейся концентрации и анализировали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием следующих стандартных растворов реагентов:
ФСБТ - 35% водный раствор натрия фосфорнокислого двузамещенного с 1% твина 20;
РБР-С - 4% водный раствор ФСБТ с 0,1% проклин 300;
КГ - 2% раствор стрептавидин-пероксидазы хрена в стабилизаторе;
ТМБ - раствор диметилсульфоксида с 0,5% тетраметилбензидина;
Трис-ацетатный буфер - 0,6% водный раствор трис(гидроксиметил)аминометана, подкисленный уксусной кислотой до рН 5,0÷5,5.
Для проведения анализа БОД растворяли в сыворотке крови в концентрациях от 0,5 до 5,0 мкг/мл, разбавляли раствором РБР-С в соотношении 1:1 и добавляли в 96-луночный планшет, покрытый стрептавидином (GREINER BIO-ONE, Германия) из расчета 100 мкл раствора на лунку и инкубировали в течение получаса при 37°С и скорости перемешивания 500 об/мин. После чего планшет промывали пять раз раствором ФСБТ, во все лунки вносили по 100 мкл рабочего раствора КГ, инкубировали 20 мин при 37°С и скорости перемешивания 500 об/мин. После чего планшет промывали пять раз раствором ФСБТ, во все лунки вносили по 100 мкл раствора ТМБ, инкубировали 15 мин при 37°С и скорости перемешивания 500 об/мин, затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл 0,9 М раствора серной кислоты, интенсивность окраски оценивали на считывателе микропланшет BioTek EL808 на длинах волн 450/630 нм. Количество БОД устанавливали по калибровочному графику.
Чувствительность определения БОД составила 0,25 мкг в 1 мл сыворотки крови животного.
Пример 2.
Брали 50 мг окисленного декстрана, растворяли его в 1 мл трис-ацетатного буфера с рН 5,5 и добавляли к полученному раствору 2 мг гидразида биотина, после чего полученный раствор нагревали при 80°С в течение одного часа. Полученный раствор БОД анализировали методом иммуноферментного анализа аналогично примеру 1.
Чувствительность определения БОД составила 0,20 мкг в 1 мл сыворотки крови животного.
Пример 3.
Брали 50 мг окисленного декстрана, растворяли его в 1 мл трис-ацетатного буфера с рН 5,5 и добавляли к полученному раствору 2 мг гидразида биотина, после чего полученный раствор нагревали при 90°С в течение 30 минут. Полученный раствор БОД анализировали методом иммуноферментного анализа аналогично примеру 1.
Чувствительность определения БОД составила 0,25 мкг в 1 мл сыворотки крови животного.
Пример 4.
Брали 50 мг окисленного декстрана, растворяли его в 1 мл трис-ацетатного буфера с рН 5,5 и добавляли к полученному раствору 2,5 мг гидразида биотина, после чего полученный раствор нагревали при 90°С в течение 60 минут. Полученный раствор БОД анализировали методом иммуноферментного анализа аналогично примеру 1.
Чувствительность определения БОД составила 0,25 мкг в 1 мл сыворотки крови животного.
Использование предлагаемого способа позволит получать БОД со свойствами, позволяющими с высокой чувствительностью проводить количественное определение окисленных декстранов в сыворотке крови при проведении биологических и фармакологических исследованиях, в том числе доклинических испытаниях новых лекарственных препаратов на основе конъюгатов окисленного декстрана.
Таблица 1
Номер образца
Концентрация БОД-40, мкг/мл
0,5
1
2
5
3начение оптической плотности, е.о.п.
1
0,254
0,289
0,281
0,400
2
0,309
0,256
0,256
0,328
3
0,253
0,322
0,430
0,605
4
0,296
0,324
0,395
0,464
Среднее
0,278
0,298
0,341
0,449
SE
0,014
0,016
0,042
0,059
Таблица 2
Номер образца
Концентрация флуоресцентного производного ОД-40, мкг/мл
5
10
20
50
Значение оптической плотности, е.о.п.
1
0,307
0,305
0,370
0,540
2
0,286
0,327
0,410
0,478
3
0,300
0,331
0,402
0,595
4
0,293
0,309
0,398
0,478
Среднее
0,297
0,318
0,395
0,523
SE
0,005
0,006
0,009
0,028
Таблица 3
Номер образца
Концентрация БОД-70, мкг/мл
0,5
1
2
5
Значение оптической плотности, е.о.п.
1
0,290
0,385
0,498
0,971
2
0,374
0,389
0,457
0,619
3
0,301
0,356
0,468
0,787
4
0,363
0,418
0,487
0,803
Среднее
0,332
0,387
0,478
0,795
SE
0,021
0,013
0,009
0,072
Таблица 4
Номер образца
Концентрация ОД-70, мкг/мл
2,5
5
10
15
Значение оптической плотности, е.о.п.
1
0,275
0,367
0,461
0,815
2
0,356
0,378
0,489
0,720
3
0,312
0,410
0,475
0,768
4
0,294
0,388
0,491
0,805
Среднее
0,309
0,386
0,479
0,777
SE
0,017
0,009
0,007
0,022
Источники информации
1. Shimizu N, Kawazoe Y. - A new method for permeabilization of the plasma membrane of cultured mammalian cells. III. Intemalization of fluorescent dex-trans into cultured mammalian cells by vortex-stirring in the presence of high molecular weight polyacrylic acid. - Biol Pharm Bull. 1996 Aug; 19(8); 1023-5.
2. Shkurupii V.A., Arkhipov S.A., Troitskii A.V., Luzgina N.G., Zaikovskaja M.V., Gulyaeva E.P., Bystrova T.N., Ufimtseva E.G., Il′in D.A., Akhramenko E.S. In vitro effect of oxidizeg dextrans of peritoneal cells // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, Supplement 1. - 2008. - P.120-122.
3. Shkurupii V.A., Archipov S.A., Tkachev V.O., Troitskii A.V, Luzgina N.G., Zaikovskaya M.V., Gulyaeva E.P, Bystrova T.N., Ufimtseva E.G. In Vitro Effects of Molecular Nanosomal Hybrid Compositions with Oxidized Dextrans, Conjugated with Isonicotinic Acid Hydrazine on Peritoneal Macrophages // Bulletin of Experimental Biology and Medicine - 2008 - Vol.146. - No.5 - P.627-629.
4. Шкурупий B.A., Селятицкая В.Г., Цырендоржиев Д.Д., Пальчикова Н.А., Курилин В.В., Травин М.А., Надев А.П., Троицкий А.В. Эффекты модифицированного амфотерицина В при системном кандидозе в эксперименте. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007 - Т. 143. - №4 - С.367-370.
5. Шкурупий В.А., Шаркова Т.В., Потапова О.В., Шестопалов A.M. Регенераторно-пластические процессы в печени млекопитающих при гриппе птиц A/H5N1 и его профилактике модифицированным декстраном. // IV Всероссийская научно-практическая конференция «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». - Новосибирск, 2009. - С.289.
6. Prigent-Richard S., Cansell М., Vassy J., Viron A., Puvion E., Jozefonvicz J., Letourneur D. - Fluorescent and radiolabeling of polysaccharides: Binding and internalization experiments on vascular cells. - J Biomed Mater Res, 1998, 40, 275-281.
7. Патент RU 2426545 C1, опубл. 20.08.2011