СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КСЕНОТРАНСПЛАНТАТА С МОДУЛИРУЕМЫМИ ПАРАМЕТРАМИ ЖЕСТКОСТИ ДЛЯ ОФТАЛЬМОХИРУРГИИ
METHOD OF PRODUCING XENOGRAFT WITH MODIFIABLE STIFFNESS PARAMETERS FOR OPHTHALMOSURGERY

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для получения трансплантат-коллагенового материала требуемой жесткости (эластичности), в частности, для выполнения склеропластических хирургических вмешательств при лечении прогрессирующей миопии средней и высокой степени.
Известен способ обработки материала, получаемого из соединительной ткани животных и человека, включающий ее отмывку холодной водой, нарезку на полоски нужного размера, обработку в 6% растворе перекиси водорода в течение 1-3 часов и 4М растворе мочевины 15 часов, инкубацию в 2М растворе хлорида натрия, в смеси хлороформ: этанол в соотношении 1:1, отмывку водой, лиофилизацию и стерилизацию радиационным методом в дозе 1,7-2,5 Мрад [патент RU №2234289, 2004 г.].
Известен метод получения биоматериала посредством обработки перикарда сельскохозяйственных животных, который механически очищают, заливают физраствором и дистиллированной водой, после чего помещают в раствор аммиака и спирта этилового [патент RU №2054283, 1996 г.].
Однако указанные способы обработки биоматериала не всегда обеспечивают полное удаление гликопротеинов и растворимых белков, липидов, фосфолипидов, липопротеидов и других жиросодержащих веществ, способных в последующем при применении трансплантата вызывать антигенные реакции.
Известен способ получения материала при котором перикард крупного рогатого скота после механической очистки выдерживают в 10% растворе аммиака в течение 4-5 часов, промывают дистиллированной водой, подвергают многократной заморозке при температуре минус 10-12°С и разморозке при +40+45°С, обрабатывают 6% раствором перекиси водорода, оказывают воздействие ультразвуком, дегидратируют в спиртах входящей концентрации от 30 до 70 объемных процентов, стерилизуют ионизирующим излучением в дозе 1,5 Мрад [патент RU №2281061, 2006 г.].
Данный способ обработки позволяет в большинстве случаев освободиться от нежелательных антигенных свойств биоткани. Однако недостатком последнего остаются нестабильные биомеханические параметры эластичности материала, затрудняющие выполнение хирургических вмешательств.
Наиболее близким аналогом изобретения является способ получения ксеноматериала из перикарда крупного рогатого скота, основанный на его многостадийной обработке, который включает механическое очищение ткани, многократное выдерживание в растворе 10% аммиака, замораживание при температуре минус 12-16°С и размораживание при +35+45°С, промывание в растворах 15% муравьиной кислоты и 6% перекиси водорода, воздействие ультразвуком, обезвоживание в этиловом спирте, обработку рибофлавином и ультрафиолетом мощностью 5 мВт/см при длине волны 370 нм в течение 20 минут, стерилизацию радиационным методом в дозе 1,5 Мрад. Ультрафиолетовое сшивание с фотосенсибилизатором (рибофлавин) обеспечивает повышение прочностно-механических характеристик биоткани [патент RU №2607185, 2017 г.].
Однако при выполнении хирургических вмешательств важную роль играет степень жесткости и упруго-эластичных свойств трансплантата. При этом существует необходимость варьирования данными показателями в зависимости от состояния глазного яблока, в частности, его физиологического тонуса, длины передне-задней оси, а также навыков хирурга. Кроме этого, прототип предполагает ультрафиолетовую обработку материала с одной стороны, что обеспечивает только поверхностное сшивание коллагена ткани с облученной стороны.
Задачей изобретения является создание трансплантат-коллагенового материала для склеропластических хирургических вмешательств с модулируемыми прочностно-механическими свойствами.
Технический результат - получение трансплантат-коллагенового материала малой, средней и высокой жесткости, что способствует повышению биосовместимости трансплантата и сокращению продолжительности склероукрепляющей операции.
Предлагаемый способ получения трансплантат-коллагенового материала для склеропластических хирургических вмешательств осуществляется следующим образом:
1. Используют 1 кг перикарда крупного рогатого скота, полученного в течение 2 часов после забоя и доставленного в термоконтейнере, поддерживающем температуру около 8°С.
2. Проводят механическую очистку материала от сгустков крови, жировых отложений и нарезают его на пластины размером 10×15 см.
3. Материал обрабатывают 10% раствором аммиака при перемешивании в течение 4 часов с 5-кратной сменой раствора с использованием перемешивающего устройства ПЭ-6410М.
4. Промывают водой очищенной в течение 30 мин при перемешивании с 3-кратной сменой воды.
5. Замораживают материал при температуре минус 12-16°С в морозильной камере холодильника и размораживают в теплой очищенной воде при температуре +35+45°С.
6. Материал обрабатывают 15% раствором муравьиной кислоты однократно при перемешивании в течение 1,5 часов.
7. Промывают водой очищенной в течение 4 часов при перемешивании с 6-кратной сменой воды.
8. Замораживают материал при температуре минус 12-16°С в морозильной камере холодильника и размораживают в теплой воде очищенной при температуре +35+45°С.
9. Обрабатывают материал 6% раствором перекиси водорода при перемешивании в течение 6 часов с 3-кратной сменой раствора.
10. Промывают материал водой очищенной в течение 4 часов при перемешивании с 10-кратной сменой воды.
11. Обрабатывают материал ультразвуком в течение 30 мин на приборе Ретона УСУ - 0707 при частоте 120 кГц.
12. Нарезают материал на полоски размером (7×25) мм и (10×100) мм.
13. Повторно обрабатывают материал 10% раствором аммиака при перемешивании в течение 3 часов с 5-кратной сменой раствора.
14. Повторно промывают водой очищенной в течение 30 мин при перемешивании с 3-кратной сменой воды.
15. Повторно замораживают материал при температуре минус 12-16°С в морозильной камере холодильника и размораживают в теплой воде очищенной при температуре +35+45°С.
16. Повторно обрабатывают материал 15% раствором муравьиной кислоты однократно при перемешивании в течение 1 часа.
17. Повторно промывают водой очищенной в течение 3 часов при перемешивании с 8-кратной сменой воды.
18. Повторно замораживают материал при температуре минус 12-16°С в морозильной камере холодильника и размораживают в теплой воде очищенной при температуре +35+45°С.
19. Повторно обрабатывают материал 6%-ным раствором перекиси водорода при перемешивании в течение 1,5 часов с 3-кратной сменой раствора.
20. Промывают водой очищенной в течение 4 часов при перемешивании с 10-кратной сменой воды.
21. Проводят ультрафиолетовое сшивание (кросслинкинг) коллагена биоматериала для изменения его пластических и прочностно-механических свойств. Для получения рибофлавин-УФ сшитого материала с модулируемыми биомеханическими свойствами применяют 3 режима двухсторонней обработки биоматериала раствором рибофлавина мононуклеотида и ультрафиолетового облучения от диодного ультрафиолетового источника ROITHNER LASERTECHNIK марки UVLED370-10E при длине волны 370 нм с каждой стороны:
2
- для малой жесткости: обработка 0,1% раствором рибофлавина мононуклеотида в течение 30 мин и последующее УФ облучение мощностью 3 мВт/см продолжительностью 30 мин;
2
- для средней жесткости: обработка 0,25% раствором рибофлавина мононуклеотида 20 мин и УФ облучение мощностью 6 мВт/см - 20 мин;
2
- для высокой жесткости: обработка 0,5% раствором рибофлавина мононуклеотида в течение 20 мин и УФ облучение мощностью 9 мВт/см -20 мин.
22. Материал обезвоживают, используя спирт этиловый в восходящих концентрациях от 30 до 70 объемных процентов. В каждом растворе спирта этилового материал выдерживают 24 часа при перемешивании.
23. Расфасовывают материал во флаконы с 70%-ным этиловым спиртом, укупоривают.
60
24. Проводят стерилизацию ионизирующим излучением дозой 1,5 Мрад на установке Со.
25. Выполняют бактериологический анализ образцов материала.
Проведение УФ сшивания ксенотрансплантата способствует
образованию дополнительных химических связей между коллагеновыми фибриллами, что значительно повышает прочностно-механические свойства материала [Wollensak G., Spoerl Е., Seiler Т. Riboflavin / ultraviolet-a-induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus // Am. J. Ophthalmol. - 2003. - Vol. 135. - N 5. - P. 620-627; Wollensak G., Iomdina E., Dittert D., Salamatina O., Stoltenburg G. Cross-linking of sclera collagen in the rabbit using riboflavin and UVA // Acta. Ophthalmol. Scand. - 2005. - Vol. 83. - N 4. - P. 477-482]. Следует также отметить о бактерицидном эффекте УФ воздействия на биоткань [Ramona В., Catalina С, Andrei М., Daciana S., Calin Т. Collagen crosslinking in the management of microbial keratitis // Rom J. Ophthalmol. - 2016. - Vol. 60. - N 1. - P. 28-30].
2
2
2
Исследование прочностно-механических свойств образцов трансплантат-коллагенового материала различной степени жесткости проводили в 4-х группах на универсальной разрывной установке, совмещенной с персональным компьютером. В 1-ой группе исследовали ксенотрансплантаты без обработки рибофлавин-УФ-облучением. Во 2-ой - для получения материала малой жесткости проводили обработку 0,1% раствором рибофлавина мононуклеотида в течение 30 мин и дельнейшим УФ облучением мощностью 3 мВт/см длительностью 30 мин. В 3-й группе (средней жесткости) - 0,25% рибофлавина мононуклеотидом 20 мин и УФ облучение мощностью 6 мВт/см - 20 мин. В 4-ой (высокой жесткости) 0,5% раствором рибофлавина мононуклеотида в течение 20 мин и УФ облучение мощностью 9 мВт/см - 20 мин.
Перед проведением прочностных тестов обработанные лоскуты материала исследуемых групп предварительно выдерживали (2 мин) в физиологическом растворе, нагретом до 45°С. Измеряли деформацию и растяжение на универсальной разрывной установке с последующим расчетом модуля продольной упругости (модуля Юнга) по формуле:
m - масса образца (кг),
2
g - ускорение свободного падения (м/с),
2
S - площадь поперечного сечения образца (мм),
0
l - длина образца до растяжения (мм),
0
Δl - приращение длины образца (мм).
Р - предел прочности материала
Величина модуля Юнга в контроле (1 группа) была равной 6,5±1,1 мПа, тогда как в опытных группах: во второй группе для материала малой жесткости этот показатель составил 10,2±2,3 мПа, в третьей группе для средней жесткости - 16,0±1,9 мПа, в четвертой группе для материала высокой жесткости - 19,5±2,0 мПа.
Особенности клинического применения ксенотрансплантатов различной жесткости было изучено при выполнении экспериментальной склеропластической операции по Хатминскому на 8 кроликах (16 глаз) породы Шиншилла. Животные были разделены на 4 группы по 2 кролика, (4 глаза) в каждой. Соответствие нумерации групп при выполнении разрывных тестов и хирургических вмешательств сохранялось.
Эксперименты проводили в условиях операционной вивария. В качестве анестезиологического пособия применяли 2% раствор «Ксилазина» внутримышечно в дозе 0,2 мл/кг в сочетании с инсталляционной анестезией (0,4% раствор оксибупрокаина, «Инокаин»).
Все оперативные вмешательства проведены одним хирургом. Протокол операции: после двукратной обработки операционного поля раствором спирта и наложения блефаростата предварительно размечали участки предполагаемых разрезов конъюнктивы в 6-7 мм от лимба в нижне-внутреннем и верхне-наружном квадрантах. Производили разрезы конъюнктивы около 5 мм и обнажали склеру в 6-7 мм от лимба. Затем под мышцы в косом направлении за экватор заводили предлагаемые ксенотрансплантаты. На конъюнктиву накладывали непрерывные швы.
Низкая биомеханическая стабильность биоткани в 1-ой группе (контроль) крайне затрудняла выполнение хирургических манипуляций, в частности, при «заведении» трансплантата к заднему полюсу глаза. В свою очередь использование предлагаемых трансплантат-коллагеновых материалов в трех опытных группах, благодаря повышенным упруго-жесткостным свойствам, существенно облегчало выполнение склероукрепляющей операции. По усмотрению хирурга для удобства хирургического вмешательства может быть выбран трансплантат малой, средней или высокой жесткости. Было зафиксировано, что продолжительность операции с трансплантатом средней и высокой жесткости была сокращена в среднем на 20-25%.
2-4 сутки эксперимента характеризовались гиперемией конъюнктивы и отеком оперированных глаз кроликов, которые были более значительными в группе контроля. На 5-6-е сутки после операции при биомикроскопии на фоне стандартной противовоспалительной и антибактериальной терапии явления гиперемии конъюнктивы животных опытных групп сохранялись, в то время как у кроликов контрольной группы отмечали более выраженный отек конъюнктивы. На 7 сутки у всех прооперированных кроликов сняты швы с конъюнктивы. Положение трансплантатов у всех животных стабильное, конъюнктива незначительно раздражена, оптические среды глаза прозрачные. Результаты биомикроскопии и офтальмоскопии на 14-30 сутки после операции во всех исследуемых группах: глаза спокойные, конъюнктива над трансплантатами бледно-розовая, трансплантаты сохраняли правильное положение.
Таким образом, вариации упруго-эластичных свойств биоматериала позволяют его дифференцированно применять в зависимости от состояния глазного яблока, в частности, физиологического тонуса, а также навыков хирурга. Каких-либо осложнений, связанных с применением предлагаемых трансплантат-коллагеновых материалов, не отмечали.
На 14 и 30 сутки кролики были выведены из эксперимента посредством воздушной эмболии. Биомикроскопия энуклеированных глаз животных (14 сутки) показала сохранение правильного положения трансплантатов на склере во всех группах (спереди - в области мест прикрепления прямых мышц, сзади - в 3-4 мм от зрительного нерва). При этом сращение со склерой определяли по всей площади прилегания трансплантата.
Морфологическое исследование глаз кроликов контрольной группы (14 сутки) выявило трансплантат с очагами незначительного воспаления и набуханием коллагеновых структур. К концу срока наблюдений (30 сутки) трансплантат прорастал к склере и был окружен значительным количеством клеток (лимфоциты, моноциты), отмечали образование соединительнотканных структур.
Исследование образцов гистоматериала трех опытных групп в целом было аналогичным контролю, однако с менее выраженным воспалительным компонентом. Одной из причин этого могло быть сокращение продолжительности хирургических манипуляций.
Гистологическое исследование энуклеированных глаз кроликов, оперированных по поводу склеропластики, в контрольной и опытной группах показало хорошее приживление трансплантатов, обработанных предлагаемым методом. При этом регистрировали локальные зоны умеренной, либо слабо выраженной воспалительной реакции. В свою очередь интенсивность воспаления снижалась по мере повышения жесткости трансплантат-колагенового материала.
Предлагаемый трансплантат-коллагеновый материал для склеропластических хирургических вмешательств, полученный за счет дополнительной двусторонней рибофлавин-ультрафиолетовой обработки, обладая повышенными прочностно-механическими свойствами, облегчает проведение хирургических манипуляций и сокращает их продолжительность, позволяет применять его в зависимости от патологического состояния и физиологических особенностей глазного яблока, выполняет каркасные функции и может использоваться при прогрессирующей миопии средней и высокой степени, стабилизируя опорные свойства склеры.