СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОЧИСТКИ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА ОТ ПОЛИМЕРНЫХ ФОРМ
METHOD OF RAPID PURIFICATION OF DIHYDROQUERCETIN FROM POLYMERIC FORMS

Изобретение относится к технологии выделения и очистки растительных биофлавоноидов, в частности - к технологии очистки дигидрокверцетина (ДГК). Способ направлен на осуществление быстрой и эффективной очистки препаратов ДГК от высокомолекулярных полимеров (ВМП) и их агрегатов. Он реализуется за счет использования миллипоровых фильтров с различными размерами пор - от 0,05 до 0,45 микрон на заключительных этапах очистки. Способ осуществляется путем пропускания растворов ДГК через фильтры под давлением до 75-150 паскалей. Размеры фильтров могут варьировать от нескольких сантиметров до нескольких десятков сантиметров. Среди фильтров пригодны такие, материал которых обладает минимальной сорбцией мономерной формы ДГК и максимальной - полимерной. Способ включает пропускание раствора ДГК через фильтр при определенном соотношении между концентрацией ДГК и площадью фильтра по заданной технологии, после чего осуществляют концентрирование собранного раствора и регенерацию фильтров. Регенерация фильтров достигается обработкой кислотой - пропусканием растворов разбавленной кислоты через фильтры в обратном направлении, противоположном исходному. Использование миллипоровых фильтров на заключительных этапах позволяет проводить эффективную экспресс-очистку фракции ДГК от его высокомолекулярных полимерных форм. Изобретение позволяет получить более качественный целевой продукт, свободный от ВМП.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к технологии выделения и очистки растительных биофлавоноидов, прежде всего - к технологии очистки дигидрокверцетина (ДГК). Процесс очистки биофлаваноидов требует специальных приемов, направленных на удаление примесей, полимерных форм, предотвращение процессов порчи и окисления, а также - самополимеризации ДГК в ходе очистки.
ДГК относится к биофлавоноидам, содержащимся преимущественно в высших растениях, особенно в больших количествах - в лиственницах. ДГК обладает очень высокой антиоксидантной активностью. Он не уступает по эффективности таким мощным антиоксидантам как α-токоферол, витамин Е и β-каротин (Теселкин Ю.О., Жамбалова Б.А., Бабенкова И.В., Клебанов Г.И., Тюкавкина Н.А. // Биофизика. 1996. Т.41. №3. С.620-623). ДГК предохраняет растительные клетки от воздействия свободных радикалов, замедляет старение. В стволах деревьев ДГК находится как в мономерном, так и полимеризованном виде.
ДГК, используемый в составе БАД и лекарств, оказывает положительное влияние на широкий круг физиологических процессов, подавляет развитие аллергий, артритов, атеросклероза, онкологических заболеваний и т.д. (Уминский А.А., Хавстеен Б.Х., Баканева В.Ф. Биохимия флавоноидов и их значение в медицине. Пущино: Фотон-век. 2007).
Ввиду сильной склонности ДГК к образованию полимерных и агрегированных форм, обладающих гораздо меньшей биологической активностью, одной из основных проблем является трудность получения чистой мономерной формы, свободной от полимерных форм и примесей. Фракцию, обогащенную ДГК, обычно выделяют из древесины сибирской лиственницы (Larix sibirica). С помощью экстракции спиртовыми и эфирными растворителями (обычно в присутствии кислот, при pH 3-3,5) и последующей многоэтапной обработки удается получить монокристаллы ДКГ и достигнуть довольно высокой степени очистки от посторонних примесей - до 96-98% (Савватеев A.M. Оценка качества и стандартизация композиций на базе диквертина. Автореферат соиск. уч. ст. канд. фарм. наук. М., 2007). При промышленном производстве очистка от примесей обычно не превышает 91-95%. В большинстве случаев при этом, однако, остается неизвестным вклад полимерных форм самого ДГК.
Ковалентная полимеризация ДГК происходит очень активно как в процессе жизнедеятельности растительной клетки, так и в ходе длительной экстракции ДГК и его хранения. Наличие полимерных форм ДКГ в получаемых препаратах нежелательно по двум причинам: а) это лишний балласт, б) это сорбент, способный понижать действующую концентрацию самого ДГК (мономерной формы) и других активных веществ (при использовании в составе БАД и лекарств) - за счет их сорбции на полимерах.
Методы контроля степени очистки ДКГ, включая хроматографию, трудоемки и дорогостоящи, что обуславливает очень высокую себестоимость препаратов ДГК. На Российском рынке 1 кг очищенного ДГК продается по цене от 20 тыс.руб. до 100 тыс.руб., в зависимости от степени очистки.
Методы контроля очистки ДКГ недостаточно чувствительны, особенно когда речь идет об обнаружении микромолярных количеств полимеров. В настоящее время остро ощущается потребность в высокочувствительных экспресс-методах, позволяющих надежно детектировать и быстро устранять полимерные формы при получении препаратов ДГК и их хранении.
Недавно для детекции полимерных макромолекул ДКГ было предложено применение двух экспресс-методов (Векшин Н.Л. // Прикладная биохимия и микробиология. Т.44, 2008, в печати): УФ-спектрофотометрии (в комбинации с фильтрацией) и релеевского светорассеяния (с помощью спектрофлуориметра со скрещенными монохроматорами). Именно этими методами производилось, в рамках заявляемого изобретения, количественное измерение полимеров ДГК и контролировалось их присутствие или отсутствие после фильтрации при проведении испытаний.
Испытание методики проводилось на ДГК, имеющем, согласно сертификату, 96% очистки от примесей (ООО «Флавена», Пущино). Исходный концентрированный раствор ДГК (0,5 г/л или 1 г/мл) в дистиллированной воде разбавлялся двукратно, половина этого раствора - снова двукратно и т.д. Полученные пробы использовались для измерения оптической плотности и светорассеяния. Все пробы, включая концентрированные, были прозрачны, немутны, т.е. крупные агрегаты «на глаз» не обнаруживались.
Концентрация ДГК определялась по навеске и УФ-фотометрически при 328 нм в кварцевых 1-см кюветах в стандартном отсеке на спектрофотометре "М-40" (Германия). Вклады ионизованной (мономерной) формы и неионизованных мономерной и полимерной форм находились из спектров поглощения в диапазоне 250-400 нм.
Интенсивность слабого релеевского светорассеяния измерялась под прямым углом на спектрофлуориметре "SLM-4800" (США) со скрещенными монохроматорами (щели - 4 нм), установленными на длину волны 530 нм. Этот высокочувствительный способ измерения рассеяния был применен недавно для детекции агрегатов денатурированного инсулина (Векшин Н.Л. // Биохимия. 2008. Т.73. №4, в печати). Растворы ДГК помещались в стандартные прозрачные 1-см кюветы при температуре 17°С. Каждая точка записывалась в режиме 6-секундного накопления.
Удаление ВМП проводилось путем фильтрации раствора ДГК через миллипоровые фильтры из различных материалов (Millex GV, Millex HP, Millex GP, Flow-pore-D, FP и др.) с четырьмя характерными диаметрами пор: 0,45 микрон, 0,22 микрон, 0,1 микрон и 0,05 микрон.
4
-1
-1
Препараты ДГК в водном растворе обладали двумя интенсивными УФ-полосами поглощения - с максимумами в районе 290 и 328 нм (фиг.1). Исходя из известного закона светопоглощения Бугера-Бэра (Векшин Н.Л. Флуоресцентная спектроскопия биополимеров. Пущино: Фотон-век, 2006) было определено, что коэффициент молярной экстинкции ДГК при 328 нм составляет 2×10М см. Эта полоса целиком принадлежит тем молекулам ДГК, где фенольные гидроксильные группы ионизованы (Савватеев A.M. Автореф. соиск. уч. ст. канд. фарм. наук. М., 2007). Полоса при 290 нм принадлежит неионизованному ДГК (Савватеев A.M., там же). Причем нужно обратить внимание, что при 290 нм поглощают не только мономерные но и полимерные формы ДГК, т.к. полимеризация осуществляется в основном за счет ковалентного связывания через фенольные гидроксильные группы.
Полоса при 328 нм принадлежит преимущественно мономерной форме ДГК, а полоса при 290 нм - и мономерной, и полимерной. Действительно, при фильтрации раствора ДКГ через миллипоровые фильтры с различными порами интенсивность полосы при 290 нм заметно снижается, в то время как интенсивность полосы при 328 нм не меняется или меняется мало. Например, в случае фильтрации раствора 94 мкМ ДКГ через 0,45-микронный фильтр Flow-pore-D интенсивность полосы при 290 нм уменьшалась вдвое (фиг.1), а при использовании 0,1-микронного фильтра - почти втрое (см. таблицу) по сравнению с исходной. Процесс фильтрации через 0,45-микронный фильтр занимает около 1 минуты.
Очистка раствора ДГК от ВМП с помощью миллипоровых фильтров с разным размером пор
Диметр пор фильтра (мкм)
D при 290 нм
D при 328 нм
Очистка от ВМП (%)
Время фильтрации (мин)
до и
после
до и
после
0,05
1,72
0,6
0,98
0,92
97
4
0,1
1,72
0,7
0,98
0,94
89
3
0,22
1,72
0,8
0,98
0,95
80
2
0,45
1,72
0,9
0,98
0,96
72
1
Таким образом, использование миллипоровых фильтров позволяет проводить эффективную экспресс-очистку фракции ДГК от его полимерных форм.
Из соотношения площадей полос при 290 и 328 нм и их изменений после фильтрации следует, что в используемом препарате ДКГ количество полимеров очень велико вопреки декларируемой в сертификате 96%-ной степени очистки. Доля полимеров размером свыше 0,45 микрон составляет не менее 30%, а свыше 0,1 микрон - еще около 10% от общего количества ДГК.
Степень фильтрационной очистки ДГК от ВМП находилась из данных по изменению оптической плотности (D). Фильтрация через 0,05- или 0,1-микронный фильтр дает заметно большую степень очистки от ВМП, чем через 0,45-микронный, или 0,22-микронный, но занимает немного больше времени (см. таблицу).
Необходимо подчеркнуть, что под размером ВМП подразумевается длина полимера. Толщина и ширина полимерной макромолекулы ДГК пренебрежимо малы (порядка 10 Å). Действительно, все растворы были немутны, совершенно прозрачны (спектральные линии на фиг.1 в районе 380-400 нм, где ДГК не поглощает, близки к оси абсцисс), т.е. больших количеств частиц полимеров и агрегатов с эффективным диаметром свыше половины длины световой волны спектрофотометрически не обнаруживается.
Однако агрегаты в препарате ДГК всё же имеются (в небольшом количестве). Об этом говорит тот факт, что при разбавлении раствора ДГК (предварительно профильтрованного через фильтр 0,45 микрон) в 2,5 раза соотношение оптических плотностей при 290 и при 328 нм уменьшается в разной степени (фиг.1): полоса при 328 нм снижается на 59%, а при 290 нм - лишь на 41%. Агрегаты составляют (при заданных условиях и концентрации) около 5-10% от всех молекул ДГК. Определить вклад агрегатов с большей точностью затруднительно, поскольку коэффициенты экстинкции ДГК в полимерных макромолекулах и их агрегатах неизвестны. В таких макромолекулах и их агрегатах обычно имеет место экранировочный гипохромизм - снижение среднего коэффициента экстинкции в расчете на один хромофор из-за конкуренции стопкообразно расположенных хромофоров за фотон, охватывающий их одним волновым цугом (Векшин Н.Л. Флуоресцентная спектроскопия биополимеров. Пущино: Фотон-век, 2006).
С помощью измерения релеевского светорассеяния высокочувствительным методом - на спектрофлуориметре со скрещенными монохроматорами - удается обнаружить полимерные и агрегированные формы даже при очень малых концентрациях. На участке от 3 до 94 мкМ ДГК имеет место почти линейная зависимость между концентрацией вещества и интенсивностью светорассеяния (фиг.2). Необходимо подчеркнуть, что на мономерных молекулах ДКГ релеевское рассеяние отсутствует, т.к. размер этих молекул во много сотен раз меньше длины световой волны. На полимерных макромолекулах и их агрегатах, если они имеют эффективный диаметр свыше половины длины волны, имеет место релеевское светорассеяние.
Нужно отметить, что измерения светорассеяния на спектрофлуориметре не были осложнены флуоресценцией, т.к. ДГК практически не флуоресцирует (в отличие от своего ближайшего аналога кверцетина). Кроме того, при 530 нм ДГК вообще не имеет полосы поглощения.
При повышении концентрации ДГК более 94 мкМ возникает некоторое снижение светорассеяния (фиг.2). Этот парадоксальный, на первый взгляд, факт объясняется тем, что при больших концентрациях макромолекулы полимерного ДГК начинают попарно «слипаться», т.е. количество рассеивающих частиц уменьшается.
На фиг.2 были приведены средние значения интенсивности светорассеяния (каждая точка получена усреднением не менее 30 значений) полимеров и агрегатов ДГК, содержащихся в растворе. При высокочувствительных измерениях реально некоторые значения «выпадали»: были примерно в 1,5-2 раза выше или ниже средних. Такой флуктуационный разброс (фиг.3) обусловлен попаданием в узкий световой пучок, проходящий через кювету, слишком крупных (хотя и немногочисленных) полимерных агрегатов, имеющих размер порядка 0,1-1 мм. Наиболее сильные и масштабные флуктуации наблюдались в концентрированных растворах.
После фильтрации раствора ДГК интенсивность светорассеяния и амплитуда флуктуации резко снижаются. Максимальный эффект возникает при использовании фильтра с минимальным размером пор - 0,05 микрон. Пример показан на фиг.3, где нижняя кривая представляет собой интенсивность светорассеяния после фильтрации 0,94 мкМ раствора ДГК через 0,05-микронный фильтр. Процесс фильтрации занял около 4-х минут.
Таким образом, с помощью фильтрации растворов ДГК через миллипоровые фильтры из определенных материалов с фиксированным диаметром пор можно проводить эффективную экспресс-очистку от ВМП.
В отношении экстракции и очистки ДГК известны, например, такие авторские свидетельства и патенты:
- Патент РФ 2000797. Способ выделения дигидрокверцетина / В.А.Бабкин, Н.А.Тюкавкина, Л.А.Остроухова и др. // БИ 1993. 37 38.
- Патент РФ 2034559. Способ выделения дигидрокверцетина / Бабкин В.А., Святкин Ю.К., Остроухова Л.А., Глазырин В.В., Воробьев В.Г., Тюкавкина Н.А. - БИ. - 1995. - N13.
- Патент РФ 2158598. Способ получения дигидрокверцетина / В.А.Бабкин, Л.А.Остроухова, Д.В.Бабкин, Ю.А.Малков // БИ 31.2000.
- Патент РФ 2091076. БИ №27. 1997. Способ получения дигидрокверцетина. / Тюкавкина Н.А., Хуторянский В.А., Баженов Б.И.
- Патент РФ 2180566. БИ №8. 2002. / Нифантьев Э.Е., Коротеев М.П., Казиев Г.З., Уминский А.А.
Рассмотрим подробно патенты, которые являются близкими аналогами:
1) Патент РФ 2308267. Заявка 2006113632/15. Опубл. 2007.10.20. A61K 31/35 (2006.01) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ИЗОМЕРОВ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА. Тихонов В.П., Колесник Ю.А., Шматков Д.А. и др. Измельченную древесину лиственницы экстрагируют спиртом этиловым 90-95% при 55-66°С в течение 1-2 часов, фильтруют экстракт, добавляют пропиленгликоль, упаривают смесь, полученный остаток обрабатывают 5% раствором натрия хлорида при 20-30°С, образовавшуюся смолу отделяют. Полученный флавоноидный комплекс элюируют с колонны спиртом этиловым, упаривают элюат, осаждают охлажденной до +2°С водой, выпавший осадок кристаллизуют, отфильтровывают и высушивают. Полученный продукт, представляющий собой биофлавоноидный комплекс, измельчают с последующим растворением в смеси метиловый спирт: вода (10:90) и хроматографируют в обращенно-фазовом режиме, используя в качестве подвижной фазы раствор циклодестрина в смеси метиловый спирт: вода (10:90) при охлаждении колонки до 0°С. Собранные фракции индивидуальных энантиомеров упаривают и сушат. Изобретение позволяет повысить степень очистки комплекса и выделить индивидуальные энантиомеры дигидрокверцетина. Недостатками данного способа являются: большая длительность и многоэтапность процесса, трудоемкость хроматографии, использование ядовитого растворителя - метилового спирта, низкая производительность, отсутствие контроля за наличием небольших количеств ВМП в полученном препарате.
2) Патент РФ 2258525. Заявка 2004101747/15. Дата подачи заявки 2004.02.05. Опубл. 2005.08.20. A61K 35/78 A61K 31/33 A61K 31/343 A61K 31/353 C07D 301/00. СПОСОБ ОЧИСТКИ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И ДИГИДРОКЕМФЕРОЛА ИЗ ЭКСТРАКТОВ БИОФЛАВАНОИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ В ПРОЦЕССЕ ПЕРЕРАБОТКИ ДРЕВЕСИНЫ. Шилов Е.А., Катасонов А.Б. Способ получения дигидрокверцетина и дигидрокемферола из экстракта древесины лиственницы, содержащего биофлаваноиды, характеризуется тем, что в органическом растворителе - этилацетон и вода, взятых в определенном соотношении, растворяют лиофильно высушенный экстракт, далее полученный раствор наносят на колонку, заполненную сорбентом - мочевиной, предварительно уравновешенной этилацетатом в определенном соотношении сорбента к образцу; колонку элюируют сложным эфиром и/или кетоном с температурой кипения ниже 120°С или этилацетатом и ацетоном, взятым в определенном соотношении; полученный элюат собирают, упаривают до начала кристаллизации и охлаждают, выпавшие кристаллы промывают и высушивают. Способ позволяет проводить одностадийный процесс отделения дигидрокверцетина и дигидрокемферола от примесных смол и других полимерообразных соединений, удешевить процесс получения дигидрокверцетина и дигидрокемферола. Хотя способ позволяет отделить два нужных вещества от примесных смол и полимеров, но недостатками данного способа являются: длительность и трудоемкость колоночного разделения, использование мочевины и ядовитых летучих растворителей, а также отсутствие контроля наличия ВМП самого ДГК в полученном препарате.
3) Патент РФ 2114631. Заявка 97111748/14. Дата подачи заявки 1997.07.22. Опубл. 1998.07.10. A61K 35/78 C07D 311/32. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА. Тюкавкина Н.А., Хуторянский В.А., Баженов Б.Н. и др. Способ осуществляется посредством предварительной обработки древесины лиственницы кипящей водой с последующей экстракцией водным раствором ацетона и очистки водно-ацетонового экстракта жидкостной хроматографией на обращенно-фазных сорбентах типа сферисорб С2-С18 с размером частиц 5-10 мкм с использованием в качестве подвижной фазы 30-50%-ного раствора ацетона в 0,1%-ном водном растворе трифторуксусной кислоты и удалении ацетона упариванием. Технический результат заключается в получении дигидрокверцетина высочайшей степени очистки, более 99,5%. Недостатками данного способа являются: большая длительность и многоэтапность процесса, трудоемкость хроматографии и дороговизна сорбентов, использование ядовитой трифторуксусной кислоты и летучего ацетона, отсутствие контроля за наличием ВМП самого ДГК в полученном препарате.
4) Патент 2279284. Заявка 2005106082/15. Дата подачи заявки 2005.03.04. Опубл. 2006.07.10 A61K 36/15 (2006.01) СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ДРЕВЕСИНЫ ЛИСТВЕННИЦЫ. Бережной А.Г., Саввин А.В., Гаврилов А.Б. Способ комплексной переработки древесины лиственницы, характеризующийся тем, что древесину лиственницы с определенной относительной влажностью измельчают в присутствии этилового спирта до определенного размера частиц, полученную измельченную пульпу экстрагируют этиловым спиртом при определенных условиях, затем механическим путем отделяют твердую и жидкую фазы, из последней механическим путем выделяют этиловый спирт с растворенным в нем дигидрокверцетином, а жидкую фазу фильтруют, затем упаривают, из полученного концентрата выделяют смесь эфирных масел и жирных органических кислот для использования в косметической промышленности, а из оставшейся органической фазы извлекают дигидрокверцетин. Данный способ позволяет повысить выход дигидрокверцетина и обеспечить наиболее полное использование исходного сырья, упростить технологическую схему процесса. Слишком упрощенная схема данного способа приводит к не слишком высокой очистке от примесей, причем способ не позволяет достигнуть реальной очистки от полимеров самого ДГК. В таких препаратах доля его ВМП, как было показано в проведенных опытах (см. выше), составляет не менее 40%.
Наиболее близким аналогом (прототипом) может являться способ, описанный в пункте 5 (5-м варианте способа) Патента РФ 2003111011. Заявка 2003111011/04. Дата подачи заявки 2003.04.18. Дата публикации заявки 2004.11.20 C09F 1/00 C08B 37/00 C07D 311/40. СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ ДРЕВЕСИНЫ ЛИСТВЕННИЦЫ, СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОФЛАВОНОИДОВ И СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АРАБИНОГАЛАКТАНА, ПОЛУЧЕННЫХ В ПРОЦЕССЕ КОМПЛЕКСНОЙ ПЕРЕРАБОТКИ. Уминский А.А., Уминская К.А., Писарев Р.П., Белоев Т.Т. …5. Способ выделения биофлавоноидов путем обработки углеводородно-эфирной фазы, полученной в результате комплексной переработки древесины лиственницы, с последующей кристаллизацией биофлавоноидов, отличающийся тем, что используют водную фазу биофлавоноидов, представляющую собой продукт комплексной пеработки древесины лиственницы по п.1, полученную в результате абсорбции углеводородно-эфирной жидкой фазы экстракта деионизированной водой при температуре от 90 до 94°С в потоке инертного газа, и последовательно осуществляют баромембранную фильтрацию водной фазы биофлавоноидов при температуре от 90 до 94°С через пористые фильтры с капиллярными отверстиями диаметром 0,005-0,050 мкм, очистку фильтрата на углеродсорбционном пористом слое при избыточном давлении от 0,5 до 6,0 атм, упаривание и кристаллизацию биофлавоноидов в виде кристаллогидрата дигидрокверцетина, дигидрокемпферола и нарингенина с последующей перекристаллизацией его из спиртовой и водной фаз. Удачным решением в данном способе является применение пористых фильтров с фиксированными размерами пор, что позволяет в значительной степени снизить количество ВМП в препарате. Недостатками данного способа являются: длительность и многоэтапность процесса, трудоемкость, применение высокой температуры (могущей повреждать ДГК и приводить к его полимеризации, непосредственно в ходе очистки), необходимость работы в потоке инертного газа (что затрудняет работу и повышает себестоимость препарата), получение смеси трех веществ, а не чистого ДГК, отсутствие контроля за наличием полимеров самого ДГК. Фильтрация по данному способу имеет существенный недостаток: отсутствие количественного контроля и удаление тех ВМП, которые образовались на заключительном этапе при высокой температуре. Доля ВМП в препарате, полученном таким способом, составляет (по данным подателя настоящей заявки) не менее 10%.
Недостатком всех перечисленных способов является получение недостаточно очищенного (и поэтому недостаточно качественного) целевого продукта, содержащего заметное количество полимерных форм.
В отличие от указанного прототипа и вышеописанных аналогов технический результат предлагаемого изобретения позволяет быстро (за 1-4 минуты) получить более качественный целевой продукт. Ранее автором данной заявки был использован подход с миллипоровыми фильтрами на заключительном этапе очистки мельчайших биологических органелл - протомитохондрий (Шишмаков Д.А., Анисимов Р.Л., Векшин Н.Л. // Биол. мембраны, 2004, т.21, N5, с.389-395). Сходный подход теперь применен заявителем в отношении очистки ДГК от ВМП, причем, как было представлено выше, разработаны два метода контроля ВМП в следовых (микромолярных) количествах.
Способ реализуется следующим образом.
Первично очищенный одним из обычных способов раствор ДГК в концентрации порядка 1 г/л пропускают через миллипоровые фильтры диаметром от нескольких сантиметров до нескольких десятков сантиметров с размером пор от 0,05 до 0,45 микрон под давлением до 75-150 паскатей, после чего осуществляют концентрирование собранного раствора и регенерацию фильтров путем пропускания разбавленной кислоты в обратном направлении.
Предлагаемый способ позволяет получить целевой продукт - препарат ДГК с улучшенными свойствами, практически свободный от ВМП.
Пример
Получение ДГК, практически свободного от ВМП
1) Приготовить водный раствор исходно очищенного от примесей ДГК в концентрации 1 г/л.
2) Набрать раствор в большой шприц объемом 1 л.
3) Насадить на головку шприца или на специальный переходник подходящего размера стандартную миллипоровую фильтр-насадку Millex GV диаметром не менее 10 см.
4) Плотно укрепить фильтр-насадку.
5) Приложить к поршню шприца давление до 75 паскалей и при этом собирать вытекающий фильтрат в стеклянную емкость, при охлаждении.
6) После постепенного засорения фильтра (отмечаемого по повышению необходимого для фильтрации давления) прекратить фильтрацию и, используя другой шприц, заполненный таким же объемом 0,1 н. соляной кислоты, промыть фильтр-насадку, в обратном направлении.
7) Промыть фильтр водой (в любом направлении).
8) Использовать регенерированный фильтр повторно.
9) Полимерный раствор в кислоте, собранный промывкой с фильтра, гидролизовать и после этого использовать для получения мономерного ДГК повторно.
10) Собранный фильтрат (содержащий ДГК, свободный от ВМП) обычным образом упарить до сухого вида и хранить на холоде.
Из 1 г первично очищенного от сторонних примесей ДГК можно получить от 0,5 до 0,95 г ДГК, свободного от ВМП. В случае промышленной очистки, где обычно используются десятки и сотни килограммов экстракта, необходимо лишь увеличить объемы растворов и площадь фильтров-насадок.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет улучшить потребительские качества целевого продукта. Данный способ полностью совместим с традиционной технологией, становясь ее одним из важнейших заключительных этапов.