УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД

Полезная модель для экспресс-определения токсичности поверхностных вод относится к области экологического мониторинга окружающей среды и может быть использована в качестве нового метода биотестирования для оценки состояния поверхностных пресных, грунтовых, питьевых и сточных вод.
Так как стандартные методы биотестирования [ПНД Φ Τ 14.1:2:3:4.10-04 «Методика измерений оптической плотности культуры водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris beijer) для определения токсичности питьевых, пресных природных и сточных вод, водных вытяжек из грунтов, почв, осадков сточных вод, отходов производства и потребления». - М.: 2004. - 38 с.] имеют низкую воспроизводимость и требуют проведение длительных рутинных операций возникает необходимость специфического оборудования, таким образом, в качестве замены и/или дополнения существующих методов определения токсичности предлагается данное устройство.
50
Известна модель устройства для экспресс-определения токсичности водных сред, которая представляет собой печатный электрод с иммобилизованными микроорганизмами [Wang X. et al. P-benzoquinone-mediated amperometric biosensor developed with Psychrobacter sp. for toxicity testing of heavy metals // Biosensors and Bioelectronics. - 2013- V. 41. - P. 557-562]. Устройство содержит измерительную кювету, магнитную мешалку, печатный электрод, состоящий из поликарбонатной подложки, на которую нанесен углеродный электрод, а на обратной стороне которой напечатан хлорид-серебряный электрод сравнения. На рабочий электрод нанесена суспензия микроорганизмов Psychrobacter sp.В кювету добавляют медиатор п-бензохинон. Данное устройство позволяет проводить экспресс-анализ токсичности водных сред. Существенным недостатком устройства является низкая чувствительность микроорганизмов к токсикантам: ионам свинца и кадмия, а также к фенолу. Чувствительность оценивается индексом ингибирования IC - концентрация токсиканта, которая приводит к снижению метаболической активности микроорганизмов на 50%.
Наиболее близким по своим признакам, принятое за прототип, является устройство для экспресс-определения токсичности водных сред [Gao G et al. A double-mediator based whole cell electrochemical biosensor for acute biotoxicity assessment of wastewater // Talanta. - 2017. - V. 167. - P. 208-216.]. Устройство содержит измерительную кювету с магнитной мешалкой, биосенсорную систему, состоящую из двух электродов: хлорид серебряного электрода сравнения и рабочего электрода из стеклоуглерода, модифицированного медиатором-медионином, с иммобилизованными на нем дрожжами S. cerevisiae, дополнительно в кювету вводится медиатор гексацианоферрат (III) калия.
Признаками прототипа, совпадающими с существенными признаками заявляемого устройства, является амперометрический способ фиксирования аналитического сигнала, а также использование клеток микроорганизмов одного штамма, что обеспечивает экспрессность анализа с помощью данного устройства и воспроизводимость получаемых результатов. Чувствительность биорецепторного элемента к токсикантам у прототипа значительно лучше, чем у аналога за счет обеспечения более эффективной передачи электронов на электрод, что достигается благодаря использованию системы двух медиаторов. Недостатками устройства являются низкая чувствительность микроорганизмов к токсикантам: ионам свинца и кадмия, а также к фенолу; высокая трудоемкость анализа, связанная с использованием дополнительного раствора медиатора.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является улучшение технических характеристик биосенсора для определения токсичности водных сред, в частности снижение трудоемкости анализа, а также увеличение чувствительности к токсикантам.
Данная задача решается за счет того, что заявленное устройство для экспресс-определения токсичности поверхностных вод, характеризующееся тем, что содержит измерительную кювету с буферным раствором, содержащую хлорид-серебряный электрод сравнения и рабочий электрод, модифицированный медиатором с иммобилизованным на поверхности по методу адсорбции биоматериалом, причем в качестве рабочего электрода взят уголь-пастовый, а в качестве биоматериала взяты клетки Е. coli и медиатор-ферроцен.
В таблице 1 представлены характеристики прототипа и заявляемого устройства для экспресс-определения токсичности водных сред.
Увеличение чувствительности связано с заменой дрожжей S. cerevisiae на бактерии Е. coli. то может связано с тем, что прокариоты Е. coli имеют более простое строение, чем дрожжи S. cerevisiae, поэтому перенос электронов осуществляется быстрее в связи с большей доступностью ферментативных центров для медиатора [Sayed Ε. Т., Abdelkareem Μ. A. // Old Yeasts-New Questions. InTech, 2017]. Поэтому при использовании клеток Ε. coli необходим только один медиатор, вводимый в измерительную кювету, в отличие от принятого прототипа, в котором для эффективной работы биоэлектрода на основе дрожжей S. cerevisiae требуется дополнительное введение в измерительную кювету медиатора гексацианоферрата (III) калия, что значительно упрощает конструкцию заявляемою устройства. Бактерии Е. coli используются в качестве тест-объекта в методах биотестирования [ПНД Φ Τ 14.1:2:3:4.1-96 «Методика определения токсичности вод, почв и донных отложений по ферментативной активности бактерий». - М.: 1996. - 8 с.], остро реагируют на присутствие тяжелых металлов в растворах, что повышает чувствительность при оценке токсичности.
Использование в качестве медиатора-ферроцена существенно снижает время единичного измерения за счет более низкой константы гетерогенного переноса электронов с молекулы медиатора на электрод, благодаря чему биохимическая реакция происходит на порядок быстрее. [Kharkova A.S., Arlyapov, V.Α., Turovskaya, A.D., Shvets, V.I., & Reshetilov, A.N. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity // Enzyme and Microbial Technology- 2019. - P. 1 - 13.]. Кроме того, использование одного медиатора снижает трудоемкость одного анализа, так как медиатор-ферроцен сразу встроен в конструкцию электрода и не требует дополнительного введения/удаления из измерительной кюветы после каждого измерения.
Заявляемое устройство для экспресс-определения токсичности поверхностных вод (фиг. 1) состоит из следующих элементов: угольно-пастовый электрод 1, модифицированный ферроценом с иммобилизованными на поверхность бактериями штамма Escherichia coli 2. Рабочий электрод 1 и хлорид-серебряный электрод сравнения 3 помещены в измерительную кювету 4 объемом 5 мл. Перемешивание раствора осуществляется с помощью магнитной мешалки 5.
Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является улучшение характеристик устройства, в частности увеличение чувствительности биорецепторного элемента к токсикантам, что связано с использованием в качестве биоматериала клеток прокариот Е. coli, и сокращение времени единичного измерения за счет применения медиатора-ферроцена.
3
3
Рабочий угольно-пастовый электрод 1 готовят на основе графитовой пасты следующего состава: ферроцен - 10 мг, графитовая пудра - 90 мг, минеральное масло - 40 мкл. Ферроцен растворяют в ацетоне объемом 500 мкл. После испарения ацетона данной смесью наполняют пластиковый корпус электрода. Затем на зачищенную поверхность электрода наносят биоматериал с титром 330 мг/см, при этом наносимый объем суспензии составляет 10 мкл, который закрывают диализной мембраной для предотвращения вымывания. Мембрану фиксируют пластиковым кольцом. Принцип работы устройства заключается в следующем: измерения проводят в двухэлектродной системе, погруженной в измерительную кювету 4 объемом 5 мл, содержащую калий-натрий фосфатный буфер (рН=6,8). Рабочим электродом 1 служил угольно-пастовый, модифицированный медиатором-ферроценом с иммобилизованными клетками, электродом сравнения 3 - насыщенный хлорсеребряный. Измерения проводят при непрерывном перемешивании с помощью магнитной мешалки 5. Температура измерения составляет 20°С, объем ячейки равен 5 см.
3
3
3
3
3
3
3
После установления стабильного тока в кювету вносят анализируемую пробу. Для приготовления анализируемой пробы отбирают воду в объеме 100 см, фильтруют и переносят в стакан на 200 см. Для получения анализируемых проб в четыре аналогичных стакана добавляют по 48 см дистиллированной воды, после чего в первый из них переносят 24 см тестируемой воды, во второй, третий и четвертый - по 24 см, соответственно, из первого, второго и третьего стаканов. 24 см из последнего стакана отбрасывают. В анализируемые пробы добавляют глюкозу, конечная концентрация которой составляет 0,1 моль/дм. Каждую подготовленную пробу, а также контрольный раствор глюкозы вводят в измерительную кювету 4 в количестве 500 мкл, и фиксируют скорость биоразложения глюкозы, как амплитуду силы тока до и после введения в измерительную кювету 4 (ответ сенсора, ΔΙ, мкА). Для каждого разбавления, содержащего анализируемый образец, рассчитывают индекс ингибирования по формуле
,
глюкоза
где ΔI - ответ биосенсора на контрольный образец глюкозы,
анализируемая проба
ΔI - ответ биосенсора на анализируемую пробу.
Вывод о токсичности каждого разбавления делают в соответствии с ПНД Φ Τ 14.1:2:3:4.10-04: проба является токсичной, если индекс ингибирования или индекс стимулирования превышает 20% и 30% соответственно [ПНД Φ Τ 14.1:2:3:4.10-04 «Методика измерений оптической плотности культуры водоросли хлорелла (Chlorella vulgaris beijer) для определения токсичности питьевых, пресных природных и сточных вод, водных вытяжек из грунтов, почв, осадков сточных вод, отходов производства и потребления». - М.: 2004. - 38 с.].
Таким образом, заявленное устройство для экспресс-определения интегральной токсичности позволяет отслеживать качество водных сред в режиме реального времени, отличается своей портативностью и не требует привлечения высококвалифицированного персонала для проведения анализа.