NK-КЛЕТКИ С ХИМЕРНЫМ АНТИГЕННЫМ РЕЦЕПТОРОМ, ПОДОБНЫЕ КЛЕТКАМ ПАМЯТИ (CARML), И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНИЯ

1. Конструкция химерного антигенного рецептора (CAR), содержащая:
(i) нацеливающий фрагмент антитела к ассоциированному с заболеванием антигену;
(ii) трансмембранный домен; и
(iii) по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен,
где конструкция CAR может экспрессироваться или функционировать в естественном киллере, подобном клетке памяти (ML NK).
2. Конструкция CAR по п.1, где ассоциированный с заболеванием антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD33, CD123, CD20, BCMA, мезотелина, EGFR, CD3, CD4 BAFF-R, EGFR, HER2, gp120 или gp41.
3. Конструкция CAR по п.1, где трансмембранный домен выбран из группы, состоящей из NKG2D, FcγRIIIa, NKp44, NKp30, NKp46, actKIR, NKG2C, CD8α и ИЛ-15Rb.
4. Конструкция CAR по п.1, где по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен выбран из группы, состоящей из CD137/41-BB, DNAM-1, NKp80, 2B4, NTBA, CRACC, CD2, CD27, одного или более интегринов, ИЛ-15R, ИЛ-18R, ИЛ-12R, ИЛ-21R, IRE1a и их комбинаций.
5. Конструкция CAR по п.1, где по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен является трансмембранным адаптером.
6. Конструкция CAR по п.1, дополнительно содержащая трансмембранный адаптер или шарнирный домен.
7. Конструкция CAR по любому из пп.5, 6, где трансмембранный адаптер выбран из группы, состоящей из FceR1γ, CD3ζ, DAP12, DAP10 и их комбинаций.
8. Конструкция CAR по п.4, где один или более интегринов выбраны из группы, состоящей из ITGB1, ITGB2, ITGB3 и их комбинаций.
9. Конструкция CAR по п.1, где нацеливающий фрагмент антитела к ассоциированному с заболеванием антигену содержит scFv, выбранный из группы, состоящей из:
(i) scFv к CD19, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;
(ii) scFv к CD33, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и
(iii) scFv к CD123, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
10. Конструкция CAR по п.3, где трансмембранный домен выбран из группы, состоящей из:
NKG2D, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;
FcγRIIIa, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7;
NKp44, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;
NKp30, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;
NKp46, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;
actKIR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15;
NKG2C, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;
CD8α, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и
ИЛ-15Rb, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
11. Конструкция CAR по п.6, где шарнирный домен выбран из группы, состоящей из:
NKG2D, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
FcγRIIIa, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
NKp44, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
NKp30, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10;
NKp46, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;
actKIR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;
NKG2C, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
CD8α, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и
ИЛ-15Rb, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
12. Конструкция CAR по п.1, где по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен выбран из группы, состоящей из:
CD137/41-BB, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;
DNAM-1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23;
NKp80, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24;
2B4, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25;
NTBA, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26;
CRACC, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27;
CD2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28);
CD27, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29);
интегринов, ITGB1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, ITGB2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, или ITGB3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32;
ИЛ-15RB, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33;
ИЛ-18R, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34;
ИЛ-12R, ИЛ-12RB1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и ИЛ-12RB2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36;
ИЛ-21R, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37;
IRE1a, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и их комбинации.
13. Естественная клетка-киллер, подобная клетке памяти (ML NK-клетка), содержащая конструкцию CAR по п.1.
14. Способ получения естественных клеток-киллеров с химерным антигенным рецептором, подобных клеткам памяти (NK-клетки CARML), включающий:
получение NK-клеток, активирующих цитокинов, включающих ИЛ-12/15/18 и ИЛ-15; приведение в контакт NK-клеток и активирующих цитокинов в течение периода времени, достаточного для образования цитокин-активированных NK-клеток, подобных клеткам памяти (ML);
трансдукцию химерного антигенного рецептора (CAR) с помощью вирусного вектора в цитокин-активированные NK-клетки ML в присутствии ИЛ-15 в течение периода времени, достаточного для вирусной трансдукции CAR в цитокин-активированные NK-клетки ML, что приводит к получению CAR-трансдуцированных NK-клеток ML; и
инкубацию CAR-трансдуцированных NK-клеток ML в присутствии ИЛ-15 в течение периода времени, достаточного для образования CAR-экспрессирующих NK-клеток ML (NK-клеток CARML).
15. Способ по п.14, где NK-клетки выделены из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC).
16. Способ по п.14, где период времени, достаточный для образования цитокин-активированных NK-клеток, составляет от приблизительно 8 до приблизительно 24 часов, приблизительно 12 часов или приблизительно 16 часов.
17. Способ по п.14, где период времени, достаточный для вирусной трансдукции CAR в NK-клетки ML, составляет от приблизительно 12 часов до приблизительно 24 часов.
18. Способ по п.14, где период времени, достаточный для образования NK-клеток ML, экспрессирующих CAR (NK-клеток CARML), составляет по меньшей мере от приблизительно 3 дней до приблизительно 8 дней или приблизительно 7 дней.
19. Способ по п.14, где вирусный вектор, содержащий химерный антигенный рецептор (CAR), является CAR-лентивирусом.
20. Способ по п.14, вирусный вектор является лентивирусным вектором, выбранным из группы, состоящей из pMND-G, pMND-Lg, pMDN-REV и их комбинаций.
21. Способ по п.14, где трансдукцию химерного антигенного рецептора (CAR) с помощью вирусного вектора в цитокин-активированные NK-клетки ML осуществляют в отсутствие полибрена.
22. Естественная клетка-киллер с химерным антигенным рецептором, подобная клеткам памяти (NK-клетка CARML), полученная способом по любому из пп.14-21, содержащая конструкцию CAR по любому из пп.1-13.
23. Способ индукции иммунного ответа на заболевание у нуждающегося в этом индивидуума, включающий:
введение индивидууму NK-клетки с химерным антигенным рецептором, подобной клетке памяти (CARML),
где NK-клетка CARML содержит химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий
(i) нацеливающий фрагмент антитела к ассоциированному с заболеванием антигену;
(ii) трансмембранный домен; и
(iii) по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен.
24. Способ по п.23, где ассоциированный с заболеванием антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD33, CD123, CD20, BCMA, мезотелина, EGFR, CD3, CD4 BAFF-R, EGFR, HER2, gp120 или gp41.
25. Способ по п.23, где трансмембранный домен выбран из группы, состоящей из NKG2D, FcγRIIIa, NKp44, NKp30, NKp46, actKIR, NKG2C, CD8α и ИЛ-15Rb.
26. Способ по п.23, где по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен выбран из группы, состоящей из CD137/41-BB, DNAM-1, NKp80, 2B4, NTBA, CRACC, CD2, CD27, одного или более интегринов, ИЛ-15R, ИЛ-18R, ИЛ-12R, ИЛ-21R, IRE1a и их комбинаций.
27. Способ по п.23, где по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен является трансмембранным адаптером.
28. Способ по п.23, дополнительно включающий трансмембранный адаптер.
29. Способ по любому из пп.27-28, где трансмембранный адаптер выбран из группы, состоящей из FceR1γ, CD3ζ, DAP12, DAP10 и их комбинаций.
30. Способ по п.26, где один или более интегринов выбраны из группы, состоящей из ITGB1, ITGB2, ITGB3 и их комбинаций.
31. Способ по п.23, нацеливающий фрагмент антитела к ассоциированному с заболеванием антигену содержит scFv, выбранный из группы, состоящей из:
(i) scFv к CD19, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;
(ii) scFv к CD33, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и
(iii) scFv к CD123, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
32. Способ по п.25, где трансмембранный домен выбран из группы, состоящей из:
NKG2D, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5;
FcγRIIIa, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7;
NKp44, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;
NKp30, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;
NKp46, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13;
actKIR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15;
NKG2C, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17;
CD8α, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; и
ИЛ-15Rb, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.
33. Способ по п.23, дополнительно включающий шарнирный домен, выбранный из группы, состоящей из:
NKG2D, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
FcγRIIIa, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
NKp44, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
NKp30, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11;
NKp46, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;
actKIR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14;
NKG2C, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16;
CD8α, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и
ИЛ-15Rb, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.
34. Способ по п.23, где по меньшей мере один внутриклеточный сигнальный домен выбран из группы, состоящей из:
CD137/41-BB, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;
DNAM-1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23;
NKp80, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24;
2B4, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25;
NTBA, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26;
CRACC, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27;
CD2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28;
CD27, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29;
интегринов, ITGB1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, ITGB2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и ITGB3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32;
ИЛ-15RB, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33;
ИЛ-18R, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34;
ИЛ-12R, ИЛ-12RB1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и ИЛ-12RB2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36;
ИЛ-21R, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37;
IRE1a, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; и их комбинаций.
35. Способ по п.23, где конструкция CAR может экспрессироваться или функционировать в естественной клетке-киллере, подобной клетке памяти (NK-клетке ML).
36. Способ по п.23, где NK-клетка CARML индуцирует иммунный ответ на антиген-специфическую мишень.
37. Способ по п.23, где NK-клетка CARML снижает опухолевую нагрузку.
38. Способ по п.23, где нацеливающий фрагмент антитела к ассоциированному с заболеванием антигену содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) к ассоциированному с заболеванием антигену.
39. Способ по п.23, где индивидуум имеет заболевание, имеющее ассоциированный с заболеванием антиген.
40. Способ по п.23, где антиген является B-клеточным антигеном, и заболевание выбрано из группы, состоящей из гемобластоза, аутоиммунного заболевания и нарушений иммунной системы.
41. Способ по п.23, где антиген является опухолеассоциированным антигеном (TAA), и заболевание является злокачественным новообразованием.
42. Способ по п.23, где NK-клетка CARML имеет повышенный функциональный ответ на антигены-мишени или эпитопы по сравнению с контролем.
43. Способ по п.42, где контроль представляет собой NK-клетку ML без CAR, MLNK-клетку без scFv, NK-клетку с CAR, NK-клетку с CAR scFv, NK-клетку ML, содержащую scFv, неассоциированный с мишенью, или NK-клетку, содержащую scFv, неассоциированный с мишенью.
44. Способ по п.23, где индивидуум имеет злокачественное новообразование, аутоиммунное состояние или инфекционное заболевание (например, бактериальное, вирусное).
45. Способ введения NK-клеток CARML нуждающемуся в этом индивидууму, включающий:
выделение NK-клеток из индивидуума или донора;
получение NK-клеток CARML по п.14; и
введение индивидууму терапевтически эффективного количества NK-клеток CARML.
7
46. Способ по п.45, где терапевтически эффективное количество NK-клеток CARML составляет приблизительно 10 клеток/кг.
47. Способ по п.45, где индивидууму вводят rhIL-2 или ИЛ-15.
48. Конструкция химерного антигенного рецептора (CAR), содержащая:
(i) scFv к CD19, содержащий SEQ ID NO: 1, scFv к CD33, содержащий SEQ ID NO: 2, или scFv к CD123, содержащий SEQ ID NO: 3;
(ii) трансмембранный домен CD8α, содержащий SEQ ID NO: 19, трансмембранный домен NKp30, содержащий SEQ ID NO: 11, или трансмембранный домен NKG2D, содержащий SEQ ID NO: 5; и
(iii) внутриклеточный сигнальный домен CD137, содержащий SEQ ID NO: 22, внутриклеточный сигнальный домен ИЛ-15R, содержащий SEQ ID NO: 33, или внутриклеточный сигнальный домен 2B4, содержащий SEQ ID NO: 25;
где конструкция CAR может экспрессироваться или функционировать в естественном киллере, подобном клетке памяти (NK-клетке ML).