Способ забора конденсата выдыхаемого воздуха новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции
METHOD FOR SAMPLING OF NEWBORNS EXHALED AIR CONDENSATE DURING ARTIFICIAL VENTILATION

Изобретение относится к области медицины, а именно к неонатологии, к способам забора конденсата выдыхаемого воздуха новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции с целью мониторинга состояния пациента.
В последние годы анализ летучих и нелетучих компонентов в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) превратился в новое средство для неинвазивного исследования окислительных маркеров и медиаторов воспаления в дыхательных путях [1]. Этот метод успешно используется в исследованиях по изучению маркеров оксидативного стресса у детей с бронхиальной астмой [2]. Для оценки оксидативного стресса и воспаления дыхательный путей у новорожденных стандартным шагом является забор образца с помощью трахеальной аспирации. Однако это весьма инвазивная процедура для рутинного использования у новорожденных, особенно тех, кто родился преждевременно [3]. Корреляция антиоксидантного статуса между образцами, полученными с использование трахеальной аспирации, и образцами КВВ была показана только совсем недавно [4]. В настоящее время исследования по оценке состояния новорожденных с использованием КВВ только начинают проводиться и представляют большой интерес ввиду неинвазивности процедуры сбора КВВ.
В качестве прототипа предлагаемого способа проведения анализа протеомного состава конденсата выдыхаемого воздуха новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции, взят метод, описанный в [4], согласно которому отбор проб КВВ новорожденных осуществлялся посредством включения системы сбора КВВ (Rtube, США) в выходной тракт аппарата искусственной вентиляции легких. Недостатком данного способа является необходимость адаптации стандартизированной для взрослых пациентов трубки Rtube. При этом авторы не указывают, использовали ли они в своей финальной конструкции такой стандартный компонент Rtube, как клапан на выдох, по типу «гусиный клюв». Известно, что выходной клапан - «гусиный клюв» - создает дополнительное сопротивление и требует создания избыточного давления, что в случае сбора КВВ у новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции, является дополнительный фактором риска и требует особой оговорки. В инструкции использования Rtube для взрослых пациентов отдельно оговаривается возможная закупорка клапана «гусиный клюв» и рекомендуется каждый раз, до использования, визуально проверять свободное открытие клапана. Вторым, не столь существенным недостатком системы Rtube является полимерный материал, из которого изготовлено устройство. Данный материал привносит примеси в виде полимеров при сборе КВВ, которые затем легко видны при хромато-масс-спектрометрическом анализе пробы. Третий существенный недостаток - это одноразовый тип устройств Rtube - после сбора пробы КВВ трубка утилизируется при том, что цена ее составляет 100 долларов США. Стоит также отметить, что у авторов в самой системе сбора отсутствовало какое-либо вспомогательное измерительное оборудование для контроля параметров сбора КВВ - наиболее важный параметр это температура охлаждения конденсора.
Задачей, разрабатываемой нами системы для сбора КВВ новорожденных, было устранения вышеперечисленных недостатков. Разработанное устройство состоит из системы сбора конденсата и вспомогательного измерительного модуля для контроля параметров сбора, как показано на Фиг. 1. Система сбора конденсата в общем виде представляет собой два соосных цилиндра, имеющих раздельные выходы сверху (Фиг. 2). Снизу внешний цилиндр запаян. Конденсация выдыхаемого воздуха осуществляется на внешнем цилиндре, который соприкасается с хладагентом. Внутренний цилиндр служит для транспортировки воздуха внутрь устройства и для увеличения пути выдыхаемого воздуха, что повышает эффективность функционирования. Хладагент, как и его начальная температура, определяются исходя из поставленных задач. Для повышения стабильности системы и увеличения длительности отбора система может помещаться в теплоизолирующий сосуд.
В качестве измерительного модуля температуры был выбран цифровой термометр с термопарным датчиком температуры. Модуль обладает функциями сохранения показаний температуры с заданной периодичностью, функцией хронометра и возможностью передачи сохраненных данных на персональный компьютер через USB-порт. Это позволяет регистрировать параметры, характеризующие отбор проб КВВ, и учитывать их при дальнейшем анализе полученных образцов.
Для реализации заявляемого способа сбора КВВ можно использовать любое типовое устройство для сбора КВВ из инертного материала, например, из стекла, с соответствующей конструкцией, подходящей для адаптации к ИВЛ. Нами был выбран концентрический стеклянный сосуд типового производства (Lenz Laborglasinstrumente, Wertheim, Germany), схематичное изображение которого представлено на Фиг. 2. Стеклянный сосуд подсоединялся с использованием тефлоновых трубок к типовым соединениям ИВЛ. Во время процедуры сбора стеклянный сосуд помещался в термос с охлаждающей жидкостью (хладагентом), предварительно охлажденном до оптимальной
температуры (Табл. 1). Путем повторных экспериментов с варьированием времени сбора (12-20 мин) определялось время, необходимое для сбора достаточного количества конденсата (около 1 мл) для дальнейшего анализа с использованием метода жидкостной хромато-масс-спектрометрии.
Возможность реализации заявляемого изобретения с получением заявленного технического результата иллюстрируют нижеследующие примеры 1-5 осуществления сбора КВВ у новорожденных, находящихся на ИВЛ, при использовании различных хладагентов и варьировании времени сбора (Табл. 1).
КВВ забирался у новорожденных, находящихся на традиционной вспомогательной ИВЛ, т.е. каждое дыхательное усилие пациента поддерживалось аппаратным вдохом.
В аппарате AVEA использовали следующие виды вспомогательной ИВЛ:
- вентиляция цикличная по времени с ограничением по давлению (TCPL - time cycled pressure limited). Этот режим используется по умолчанию для новорожденных, инспираторный поток для новорожденных установлен по умолчанию 8 л/мин,
- вспомогательно-принудительный режим вентиляции по давлению (Pessure А/С), инспираторный поток подбирается самим аппаратом в диапазоне 6-10 л/мин,
- вспомогательно-принудительный режим вентиляции по объему (Volume А/С), инспираторный поток устанавливается по умолчанию 8 л/мин.
На примерах 1-5 показано, что с использованием предложенного способа и устройства забора КВВ, изображенного на Фиг. 1, возможно осуществить забор пробы конденсата выдыхаемого воздуха необходимого объема (от 0.5 мл до 1 мл) при использовании различных хладагентов и варьировании времени сбора от 10 до 20 мин. В таблице 1 приведены условия экспериментов с использованием различных хладагентов: лед с добавлением соли (NaCl), лед, этанол (-80°С). Показано, что лучше всего использовать этанол, охлажденный до низкой температуры -80°С. При изменении времени сбора пробы КВВ от 10 мин до 20 мин показано, что оптимальный является время сбора 20 мин. За период времени 20 мин удается собрать объем пробы порядка 1.2 мл, что является оптимальным для дальнейшего анализа молекулярного состава пробы КВВ с использованием, например, метода жидкостной хромато-масс-спектрометрии.
Повторные эксперименты показывают (см. Пример 4-5), что существенных изменений в объеме конденсата не наблюдается при соблюдении хорошего уплотнения в соединительных местах контура.
На примере 4 показано, что с использованием разработанных подходов может быть проведен анализ протеомного состава конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ) у 6-ти новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции в отделении реанимации и интенсивной терапии. Показано, что в течение 20 минут в режиме ИВЛ удается собрать необходимое количество КВВ объемом 1.2 мл для дальнейшего протеомного анализа с использованием хромато-масс-спектрометрии. Удалось идентифицировать характерные белки в составе выдыхаемого воздуха новорожденных на разных стадиях развития и с различными патологиями. В конденсате, собранном в режиме с ИВЛ, присутствовал постоянный спектр инвариантных белков кератинов 1, 10, 2, 9, которые являются экзогенными белками, как нами было показано ранее при исследовании КВВ взрослых пациентов [5]. Также в пробах КВВ новорожденных были идентифицированы некератиновые белковые компоненты, содержание которых вариабельно у разных пациентов, в зависимости от стадии развития и патологии (Табл. 2, Фиг. 3).
На примере 5 показана возможность обнаружения в собранных пробах КВВ новорожденных некоторых групп летучих альдегидов, преимущественно алканалы, 2-алкеналы, 4-гидрокси-2-алкеналы, которые могут являться метаболитами при перекис-ном окислении липидов, содержащих остатки полиненасыщенных жирных кислот (Табл. 3, Фиг. 4). Было предложено использовать их содержание в биологических жидкостях для оценки уровня окислительного стресса, т.е. эти вещества могут выступать в качестве биомаркеров окислительного стресса[7, 8].
Возможность реализации заявляемого изобретения с получением заявленного технического результата продемонстрирована на примерах 1-5. Показано, что изобретение позволяет эффективно проводить отбор пробы КВВ объемом не менее 1 мл за время 20 мин у новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции, не внося каких-либо изменений в режим вентиляции. Показано на примерах 1-5, что систему сбора КВВ можно термостатировать хладагентом в виде охлажденной предварительно жидкости (этанол, -80°С), залитой в сосуд Дьюар. На примерах 1-5 показано, что данный способ может быть реализован в условиях неонатальных отделений, занимающихся интенсивной реанимацией, выхаживанием и лечением недоношенных новорожденных. На примерах 4-5 показано, что данный способ позволяет неинвазивно получать биоматериал от пациента и проводить протеомный и метаболомный анализ проб для получения дополнительной информации о состоянии пациентов с целью уточнения диагноза и тактики лечения.
Таким образом, изобретение позволяет неинвазивным и безопасным способом собрать необходимый объем конденсата выдыхаемого воздуха у новорожденных, находящихся на искусственной вентиляции, для дальнейшего анализа молекулярного состава КВВ с целью получения дополнительной информации о состоянии пациентов с целью уточнения диагноза и тактики лечения.
На Фиг. 1 показана схема установки по сбору КВВ в системе с подключение к аппарату с искусственной вентиляцией легких (ИВЛ).
На Фиг. 2 показано схематичное изображение концентрического стеклянного сосуда для сбора КВВ.
На Фиг. 3 показан пример автоматизированного хромато-масс-спектрометрического анализа КВВ пробы. Вверху - хроматограмма. В центре - масс-спектра в момент времени, выделенный на хроматограмме. Внизу: масс-спектр столкновительно фрагментация (CID) пика, выделенного в масс-спектре.
На Фиг. 4 показан пример масс-спектра конденсата выдыхаемого воздуха, (а) - обзорный масс-спектр, (б)-(ж) увеличенные области масс, соответствующие отдельным (б), (в) 2-алкеналам, (г)-(ж) 4-гидрокси-2-алкеналам.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Filippone М, Bonetto G, Corradi M, et al. Evidence of unexpected oxidative stress in airways of adolescents born very pre-term. Eur Respir J. 2012. 40 (5). pp. 1253-9.
2. Ahsman M.J., Tibboel D., Mathot R.A.A., et al. Sample collection, biobanking, and analysis. Handbook of Experimental Pharmacology. 2011. 205. pp. 203-217.
3. Marraro GA, Chen C, Piga MA, et al. Acute respiratory distress syndrome in the pediatric age: an update on advanced treatment. Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. 2014. 16 (5). pp. 437-47.
4. Rosso MI, Roark S, Taylor E, et al. Exhaled breath condensate in intubated neonates-a window into the lung’s glutathione status. Respiratory Research. 2014. 15:1.
5. В.С. Курова, А.С. Кононихин, И.А. Попов и др. Экзогенные белки в конденсате выдыхаемого человеком воздуха. Биоорганическая химия. 2011. Т. 37. №1. с. 48-52.
6. Hakim, М.; Broza, Y. Y.; Barash, О.; Peled, N.; Phillips, M.; Amann, A.; Haick, H. Chem. Rev. 2012, 112, 5949-5966.
7. Gueraud, F.; Atalay, M.; Bresgen, N.; Cipak, A.; Eckl, P. M.; Huc, L.; Jouanin, I.; Siems, W.; Uchida, K. Free Radical Res. 2010, 44, 1098-1124.