КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННЫЕ ЭКСПРЕССИРУЮЩИЕ КАССЕТЫ КИСЛОЙ α-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Нуклеиновая кислота, кодирующая кислую α-глюкозидазу (GAA), где указанная нуклеиновая кислота имеет более 86% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-5.
2. Нуклеиновая кислота по п.1, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 87% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-5.
3. Нуклеиновая кислота, кодирующая GAA, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 87% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 6-15.
4. Нуклеиновая кислота по п.3, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 88% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 6-15.
5. Нуклеиновая кислота по п.3, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 89% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 6-15.
6. Нуклеиновая кислота по п.3, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 90% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 6-15.
7. Нуклеиновая кислота по п.3, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 91% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 6-15.
8. Нуклеиновая кислота, кодирующая GAA, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 91% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 16-24.
9. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-8, где указанная нуклеиновая кислота содержит менее 127 динуклеотидов CpG.
10. Нуклеиновая кислота, кодирующая GAA, где указанная нуклеиновая кислота содержит менее 127 динуклеотидов CpG.
11. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит менее 126 динуклеотидов CpG.
12. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 126-120 динуклеотидов CpG.
13. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 120-110 динуклеотидов CpG.
14. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 110-100 динуклеотидов CpG.
15. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 100-90 динуклеотидов CpG.
16. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 90-80 динуклеотидов CpG.
17. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 80-70 динуклеотидов CpG.
18. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 70-60 динуклеотидов CpG.
19. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 60-50 динуклеотидов CpG.
20. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 50-40 динуклеотидов CpG.
21. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 40-30 динуклеотидов CpG.
22. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 30-20 динуклеотидов CpG.
23. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит менее 20 динуклеотидов CpG.
24. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 20-10 динуклеотидов CpG.
25. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит менее 10 динуклеотидов CpG.
26. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит приблизительно 10-5 динуклеотидов CpG.
27. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит 5 динуклеотидов CpG.
28. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит 4 динуклеотида CpG.
29.Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит 3 динуклеотида CpG.
30. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит 2динуклеотида CpG.
31. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит 1 динуклеотид CpG.
32. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-10, где указанная нуклеиновая кислота содержит 0 динуклеотидов CpG.
33. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-32, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 92% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-24.
34. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-32, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 93% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-24.
35. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-32, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 94% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-24.
36. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-32, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 95% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-24.
37. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-32, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 96% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-24.
38. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-32, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 97% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-24.
39. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-32, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 98% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-24.
40. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-32, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 99% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-24.
41. Нуклеиновая кислота по любому из пп.1-32, где указанная нуклеиновая кислота имеет более 99,5% идентичности последовательности в отношении последовательности, выбранной из группы, состоящей из любых из последовательностей, приведенных как SEQ ID NO: 1-24.
42. Нуклеиновая кислота, кодирующая GAA, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-24.
43. Экспрессирующая кассета, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-7 и 9-42, функционально связанную с элементом контроля экспрессии.
44. Экспрессирующая кассета по п.43, где указанный элемент контроля экспрессии располагают в 5’-направлении от указанной нуклеиновой кислоты.
45. Экспрессирующая кассета по п.44, дополнительно содержащая последовательность полиаденилирования, расположенную в 3’-направлении от указанной нуклеиновой кислоты.
46. Экспрессирующая кассета по пп.44 или 45, где указанный элемент контроля экспрессии или последовательность полиаденилирования имеет сниженное содержание CpG по сравнению с элементом контроля экспрессии или последовательностью полиаденилирования дикого типа.
47. Экспрессирующая кассета по любому из пп.43-46, где указанный элемент контроля экспрессии содержит последовательность энхансера/промотора ApoE/hAAT.
48. Экспрессирующая кассета по любому из пп.45-47, где указанная последовательность полиаденилирования содержит последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH).
49. Экспрессирующая кассета по пп.47 или 48, где указанная последовательность энхансера/промотора ApoE/hAAT или последовательность полиаденилирования bGH имеет сниженное содержание CpG по сравнению с последовательностью энхансера/промотора ApoE/hAAT или последовательностью полиаденилирования bGH дикого типа.
50. Экспрессирующая кассета по п.49, где указанная последовательность полиаденилирования bGH дикого типа содержит последовательность SEQ ID NO: 27.
51. Экспрессирующая кассета по п.49, где указанная последовательность энхансера/промотора ApoE/hAAT дикого типа содержит последовательность SEQ ID NO: 28 или 29.
52. Экспрессирующая кассета по п.49, где указанная последовательность полиаденилирования bGH со сниженным содержанием CpG содержит последовательность SEQ ID NO: 26.
53. Экспрессирующая кассета по любому из пп.43-52, дополнительно содержащая интрон, расположенный между 3'-концом указанного элемента контроля экспрессии и 5'-концом указанной нуклеиновой кислоты.
54. Последовательность нуклеиновой кислоты или экспрессирующая кассета по любому из пп.1-53, где указанная GAA содержит последовательность, приведенную как SEQ ID NO: 25.
55. Вектор аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий нуклеиновую кислоту или экспрессирующую кассету по любому из пп.1-54.
56. Вектор AAV по п.55, где указанный вектор AAV содержит:
a) один или более капсидов AAV и
b) один или более инвертированных концевых повторов (ITR) AAV, где указанные ITR AAV фланкируют 5’- или 3’-конец указанной нуклеиновой кислоты или указанной экспрессирующей кассеты.
57. Вектор AAV по п.56, дополнительно содержащий интрон, расположенный в 5’- или 3’-направлении от указанного одного или более ITR.
58. Вектор AAV по п.56 или 57, где по меньшей мере один или более из указанных ITR или указанных интронов модифицирован для снижения содержания CpG.
59. Вектор AAV по любому из пп.55-58, где указанный вектор AAV имеет серотип капсида, содержащий модифицированный капсид VP1, VP2 и/или VP3 AAV или вариант капсида VP1, VP2 и/или VP3 AAV, имеющий 90% или более идентичности последовательности в отношении AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8 или последовательности VP1, VP2 и/или VP3 SEQ ID NO: 30, 31 или 32, или капсид, имеющий 95% или более идентичности последовательности в отношении AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8, или последовательности VP1, VP2 и/или VP3 SEQ ID NO: 30, 31 или 32, или капсид, имеющий 100% идентичности последовательности в отношении AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74, AAV3B, AAV-2i8 или последовательности VP1, VP2 и/или VP3 SEQ ID NO: 30, 31 или 32.
60. Вектор AAV по любому из пп.56-59, где указанные ITR содержат один или более ITR из любого из: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh10, Rh74 или AAV3B, серотипов AAV или их комбинации.
61. Фармацевтическая композиция, содержащая множество векторов AAV по любому из пп.55-60 в биологически совместимом носителе или эксципиенте.
62. Фармацевтическая композиция по п.61, дополнительно содержащая пустые капсиды AAV.
63. Фармацевтическая композиция по п.62, где соотношение указанных пустых капсидов AAV и указанного вектора AAV составляет в пределах или приблизительно 100:1-50:1, приблизительно 50:1-25:1, приблизительно 25:1-10:1, приблизительно 10:1-1:1, приблизительно 1:1-1:10, приблизительно 1:10-1:25, приблизительно 1:25-1:50 или приблизительно 1:50-1:100.
64. Фармацевтическая композиция по п.62, где соотношение указанных пустых капсидов AAV и указанного вектора AAV составляет приблизительно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 или 10:1.
65. Фармацевтическая композиция по любому из пп.62-64, дополнительно содержащая поверхностно-активное вещество.
66. Способ лечения человека, нуждающегося в кислой α-глюкозидазе (GAA), включающий:
(a) получение нуклеиновой кислоты или экспрессирующей кассеты по любому из пп.1-54, или вектора AAV по любому из пп.55-60, или фармацевтической композиции по любому из пп.61-65; и
(b) введение количества указанной нуклеиновой кислоты, экспрессирующей кассеты, вектора AAV или фармацевтической композиции указанному человеку, где указанная GAA экспрессируется в указанном человеке.
67. Способ по п.66, где указанный человек имеет болезнь Помпе.
68. Способ по п.66, где указанный человек имеет инфантильную форму болезни Помпе.
69. Способ по п.66, где указанный человек имеет болезнь Помпе с поздним началом.
70. Способ по п.66, где указанный человек имеет гликогеноз (GSD).
71. Способ по п.70, где указанный GSD выбран из: GSD типа I (болезни Гирке), GSD типа III (болезни Форбса), GSD типа IV (болезни Андерсен, амилопектиноза), GSD типа V (болезни Мак-Ардла), GSD типа VI (болезни Герса), GSD типа VII (болезни Таруи) и летального врожденного GSD сердца.
72. Способ по любому из пп.66-71, где указанный вектор AAV вводят указанному человеку внутривенно, внутриартериально, внутриполостно, внутрислизисто или через катетер.
73. Способ по любому из пп.66-72, где указанная GAA экспрессируется на повышенных уровнях, необязательно, выше 1% уровней GAA, обнаруживаемых у человека, ненуждающегося в GAA.
8
14
74. Способ по любому из пп.66-73, где указанный вектор AAV вводят в диапазоне от приблизительно 1×10 до приблизительно 1×10 векторных геномов на килограмм (ВГ/кг) массы указанного человека.
75. Способ по любому из пп.66-74, где указанным способом снижают, уменьшают или ингибируют один или более симптомов указанной потребности в GAA или указанного заболевания; или предотвращают или снижают прогрессирование или ухудшение одного или более симптомов указанной потребности в GAA или указанного заболевания; или стабилизируют один или более симптомов указанной потребности в GAA или указанного заболевания; или улучшают один или более симптомов указанной потребности в GAA или указанного заболевания.
76. Способ по п.75, где указанный один или более симптомов выбраны из группы, состоящей из: проблемы с приемом пищи; отсутствие набора веса; плохой контроль головы; плохой контроль шеи; проблемы с дыханием; легочные инфекции; увеличенное сердце; утолщение сердца; пороки сердца; увеличение языка; проблемы с глотанием; увеличение печени; низкой мышечной силы; низкого мышечного тонуса; слабости в ногах; слабости в области талии; слабости в руках; одышку; проблемы с выполнением физических упражнений; трудности с дыханием во время сна; искривление позвоночника и анкилоз.
77. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту или экспрессирующую кассету по любому из пп.1-54.
78. Клетка, продуцирующая вектор AAV по любому из пп.55-60.
79. Способ получения вектора AAV по любому из пп.55-60, включающий
a. встраивание векторного генома AAV, содержащего указанную нуклеиновую кислоту или экспрессирующую кассету по любому из пп.1-54, в упаковывающую хелперную клетку; и
b. культивирование указанной хелперной клетки в условиях для получения указанного вектора AAV.
80. Способ получения вектора AAV по любому из пп.55-60, включающий
a. встраивание указанной нуклеиновой кислоты или экспрессирующей кассеты по пп.1-54 в упаковывающую хелперную клетку; и
b. культивирование указанных хелперных клеток в условиях для получения указанного вектора AAV.
81. Клетка или способ по любому из пп.77-80, где указанная клетка включает клетки млекопитающих.
82. Клетка или способ по любому из пп.77-80, где указанная клетка выполняет хелперные функции по упаковке указанного вектора в вирусную частицу.
83. Клетка или способ по любому из пп.77-80, где указанная клетка выполняет AAV-хелперные функции.
84. Клетка или способ по любому из пп.77-80, где указанная клетка предоставляет белки Rep и/или Cap AAV.
85. Клетка или способ по любому из пп.77-80, где указанную клетку стабильно или транзиторно трансфицируют с использованием полинуклеотидов, кодирующих последовательности белков Rep и/или Cap.
86. Клетка или способ по любому из пп.77-80, где указанная клетка предоставляет белки Rep78 и/или Rep68.
87. Клетка или способ по любому из пп.77-80, где указанную клетку стабильно или транзиторно трансфицируют с использованием последовательностей, кодирующих белки Rep78 и/или Rep68.
88. Клетка или способ по любому из пп.77-80, где указанная клетка включает клетки HEK-293.