СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОВОКУПНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ КАК МАРКЕРА СОСТОЯНИЯ МЕСТНОГО ИММУНИТЕТА РАЗЛИЧНЫХ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ
METHOD FOR DETERMINING ANTIMICROBIAL PEPTIDE TOTAL ACTIVITY AS A MARKER OF TISSUE IMMUNITY STATE OF VARIOUS EPITHELIAL TISSUES

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской иммунологии и микробиологии. Изобретение предназначено для определения совокупной активности антимикробных пептидов (АМП) в клинических образцах слюны, мочи, вагинального и кожного секрета посредством действия данных образцов на тест-культуру микроорганизмов и измерения числа убитых клеток в присутствии контроля. Данный подход позволяет установить уровень эндогенной иммунной защиты локуса и усовершенствовать тактику лечения инфекционно-воспалительных заболеваний, а именно решить вопрос о необходимости проведения иммунокоррекции.
Инфекционно-воспалительные заболевания эпителиальных тканей обусловлены в большой степени снижением местного иммунитета, поэтому в данном случае анализ показателей, характеризующих общий иммунный статус организма, как правило, свидетельствует о норме. Традиционно для постановки диагноза и выработки тактики лечения клиницист руководствуется данными микробиологических исследований - выявлением возбудителя и in vitro подбором лекарственного препарата. Анализ данных литературы показывает, что уровень местных иммуноглобулинов отражает лишь небольшую часть из используемых организмом факторов защиты. Но даже при таком арсенале средств врач имеет мало информации о состоянии местного иммунитета пациента. Таким средством могут стать данные об уровне антимикробной защиты локуса, а именно о совокупной активности АМП - семейства катионных белков, призванных защищать эпителиальные ткани различной локализации. Со времени их открытия (около 15 лет назад) и до сих пор исследования в этой области касаются лишь фундаментального изучения их роли в патогенезе различных заболеваний, но не применения их свойств в клинической практике. При всем разнообразии АМП по аминокислотной последовательности, вторичной структуре и механизму действия на клетки микробов, результатом их воздействия является деструкция клеточных мембран. В каждом локусе секретируется целый спектр АМП, а результат их действия (зачастую синергичный) выражается в способности локуса противостоять инфекционным агентам. Именно поэтому для клинической диагностики более точным является анализ не количеств индивидуальных пептидов как таковых, а их совокупной активности.
Решением проблемы диагностики местного иммунитета является применение способа определения совокупной активности АМП, состоящего из следующих этапов:
- получение эпителиального секрета и его подготовка;
- подготовка тест-культуры клеток Candida albicans;
- соединение пробы эпителиального секрета с суспензией клеток С. albicans и инкубация смеси;
- окрашивание клеток в инкубированной смеси и подсчет процента убитых клеток по сравнению с контролем.
Известны научные публикации, в которых описано применение подобных методов для выявления активности АМП в образцах секрета различных типов эпителия. Например, известна работа в отношении водорастворимой фракции кожного секрета [J. Immunol., 2005; 174:8003-8010; J. Investigative Dermatology (2006) 126, 354-365]. Для этого метода характерно использование собственных бактерий, населяющих кожу пациента; использование более сложного и трудоемкого способа сбора секрета применением велоэргометра, использование определения активности единичного пептида - дермцидина, для которого применяется длительный и трудоемкий метод посевов. Известна работа в отношении слюны [Infection and immunity, 2003, p. 3251-3260, Vol. 71, No. 6; Antimicrobial agents and chemotherapy, 2005, p. 3883-3888 Vol. 49, No. 9]. В этом методе анализируют активность единичного пептида - гистатина; осуществляют использование количественного анализа дефензинов и кателицидина; для определения данных пептидов используется длительный и трудоемкий метод посевов. Известна работа в отношении урины [J. Biol. Chem., 2001, 16; 276(11):7806-10.; PLoS ONE 9(12): е114185. doi: 10.1371 / journal. pone. 0114185; Nienhouse, Vanessa, "Urinary Antimicrobial Peptides and the Urinary Microbiota in a UTI-Susceptible Population of Female Pelvic Floor Surgery Patients" (2012). Master′s Theses. Paper 727]. Методика характерна определением активности единичных пептидов, для чего используется длительный и трудоемкий метод посевов.
Наиболее близким аналогом является методика в отношении вагинального секрета [Am J Obstet Gynecol 2002; 187:561-8; Акушерство и гинекология - 2008. - №6. - С. 23-26.; A Search for Antibacterial Agents, - 2012, ISBN: 978-953-51-0724-8 Chapter 8. P. 125-146. DOI:
10.5772/34277].
В указанном прототипе смесь готовят следующим образом. В качестве образца осуществляют сбор вагинального секрета, затем образец освобождают от эпителиоцитов и бактерий путем фильтрации и/или центрифугирования, а затем аликвоту данного образца соединяют в определенном соотношении с заранее подготовленной суспензией клеток экспоненциальной культуры Candida albicans определенной оптической плотности. Недостатком прототипа является наличие стадии лиофильного высушивания после смыва с тампона. Также для определения совокупной активности АМП используется длительный и трудоемкий метод посевов.
Задачей изобретения является способ определения совокупной активности антимикробных пептидов как маркера состояния местного иммунитета различных эпителиальных тканей, позволяющий за короткое время количественно оценить способность различных локусов противостоять инфекционным агентам.
Техническим результатом изобретения является возможность определить совокупную активность антимикробных пептидов как маркера состояния местного иммунитета различных эпителиальных тканей, а также за короткое время количественно оценить способность различных локусов противостоять инфекционным агентам. К техническому результату заявленного способа также относятся:
- применение стандартной тест-культуры С. albicans;
- использование более быстрого и менее трудоемкого способа сбора секрета;
- использование определения совокупной активности АМПвместо активности какого-либо единичного пептида или количественного анализа нескольких;
- для определения совокупной активности АМП используется метод окрашивания клеток тест-культуры С.albicans вместо более длительного и трудоемкого метода посевов;
- отсутствие стадии лиофильного высушивания после смыва с тампона.
Указанные задача и технический результат решаются тем, что в способе определения совокупной активности антимикробных пептидов как маркера состояния местного иммунитета различных эпителиальных тканей, заключающемся в том, что в качестве образца осуществляют сбор секрета эпителиальной ткани в виде слюны, либо мочи, либо вагинального секрета или осуществляют сбор водорастворимой фракции кожного секрета, затем образец освобождают от эпителиоцитов и бактерий путем фильтрации и/или центрифугирования, а затем аликвоту данного образца соединяют с заранее подготовленной суспензией клеток экспоненциальной культуры Candida albicans определенной оптической плотности, в таком соотношении, чтобы максимальная активность для образцов данного типа не превышала 95%, согласно изобретению приготовленную вышеуказанным способом смесь инкубируют в термостате 2 часа, центрифугируют и к полученному осадку добавляют раствор бромкрезолового пурпурного для окрашивания убитых клеток, затем вновь термостатируют и центрифугируют, а полученный осадок микроскопируют, фотографируют на цифровую камеру и после переноса полученного цифрового изображения в компьютер подсчитывают убитые клетки и рассчитывают совокупную активность АМП по формуле: % убитых клеток = (число мертвых клеток в образце/число мертвых клеток + число живых клеток в образце) × 100 - (число мертвых клеток в образце/число мертвых клеток + число живых клеток в контроле) × 100.
Предпочтительно полученный осадок микроскопируют при суммарном увеличении микроскопа не менее 1750×.
Предпочтительно подбор соотношений между объемами образца эпителиального секрета и суспензии клеток дрожжей Candida albicans осуществляют эмпирическим путем так, чтобы максимальная активность для образцов данного типа не превышала 95%. Практический пример такого подбора представлен в Таблице 1.
Осуществление изобретения
Способ был реализован для разных типов эпителия. Ниже показаны апробированные примеры реализации способа.
2
Пример 1. Водорастворимая фракция кожного секрета: на участок спины человека, не принимавшего душ и не наносившего на кожу никаких препаратов за 12 часов до анализа, ставят стеклянное кольцо, плотно прижимают и в него вносят 1,5 мл дистиллированной воды из пластикового шприца без иглы, содержащего 3 мл воды, растирают участок кожи внутри кольца в разных направлениях в течение 10 секунд, после чего воду собирают обратно в шприц без остатка, затем переставляют кольцо на соседний (сухой) участок кожи и вновь повторяют процедуру; таких повторов должно быть всего 4, то есть в сумме должно быть охвачено 4 участка кожи (общая площадь - 500 см); собранный водный смыв фильтруют через мембранный фильтр "Amicon" с диаметром пор 0,22 мкм для удаления бактерий и эпителиоцитов в пробирку, из которой отбирают 1 мл в пробирку Эппендорфа и соединяют с 15 мкл суспензии клеток Candida albicans, полученной из 1 суточной культуры этих дрожжей, выращенной на среде Сабуро в течение 20 часов при 28 градусах и приготовленной из расчета 1 петля 1 мм, суспендированная в 50 мкл физраствора; после чего приготовленную смесь инкубируют 2 часа при 32 градусах, затем центрифугируют 5 мин со скоростью 10000 об/мин; контролем является 1 мл физраствора, соединенный с 15 мкл упомянутой смеси; затем к полученным осадкам добавляют по 300 мкл 0,2 мМ раствора бромкрезолового пурпурного, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере рН 4,6, и инкубируют 45 мин при 32 градусах, после чего пробирки вновь центрифугируют в том же режиме и полученные осадки микроскопируют при суммарном увеличении × 1750, фотографируют на цифровую камеру путем совмещения объектива камеры с окуляром микроскопа и, перенеся цифровое изображение в компьютер, подсчитывают клетки так, чтобы в конечном счете оказалось 400-500 клеток на один образец; при этом совокупная активность АМП выражается как процент клеток, убитых за счет АМП, а именно: % убитых клеток = (число желтых клеток в опытном образце/число желтых + число белых в опытном образце) × 100 - (число желтых клеток в контрольном образце /число желтых + число белых в контрольном образце) × 100, учитывая, что белые клетки - живые, а желтые клетки - мертвые.
Из таблицы 2 видно, что в группе больных акне вульгарис антимикробная активность кожи в среднем снижена в 1,6 раза по сравнению с группой контроля.
Пример 2. Слюна: после чистки зубов и языка и многократного полоскания ротовой полости порцию слюны собирают в контейнер, из которого отбирают 1,2 мл слюны в пробирку Эппендорфа, центрифугируют 5 мин со скоростью 10000 об/мин, отбирают 900 мкл супернатанта и соединяют с 50 мкл суспензии клеток Candida albicans, полученной из 1 суточной культуры этих дрожжей, выращенной на среде Сабуро в течение 20 часов при 28 градусах и приготовленной из расчета 1 петля 1 мм, суспендированная в 50 мкл физраствора (далее аналогично примеру 1).
Пример 3. Вагинальный секрет: тампон OBI "normal" ввести во влагалище на 10 минут, затем тампон вынуть и поместить его в новый пластиковый шприц объемом 10 мл, из которого предварительно удален поршень, эту заготовку поместить иглой вниз в отверстие резиновой пробки, вставленной в колбу Бунзена с пробиркой внутри, а отводную трубку колбы подключить к вакуумному насосу. На тампон, находящийся в шприце, нанести 7 мл дистиллированной воды двумя порциями, дать ей впитаться, после чего включить насос и, нажимая на тампон стеклянной палочкой, собрать в пробирку элюат и замерить его объем мерной пробиркой (около 5 мл). Полученный элюат профильтровать через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм (удаление микрофлоры и эпителиоцитов), для чего использовать одноразовый фильтр из нитроцеллюлозы, помещенный в фильтродержатель, который вставлен в ту же колбу Бунзена с новой пробиркой для сбора фильтрата. 800 мкл фильтрата соединить с 50 мкл суспензии тест-культуры (далее см. пример 1).
В исследование были включены 44 женщин с вульвовагинальным кандидозом (BBK), в возрасте от 22 до 35 лет. Для оценки тяжести течения BBK использовали совокупность следующих симптомов: зуд; жжение; характер и количество выделений; боли при мочеиспускании; диспареуния; дерматит перианальной зоны; отечность, гиперемия и эрозивные поражения стенок влагалища. Каждый симптом оценивали по трехбалльной шкале от 0 до 2, где за 0 принимали отсутствие симптома, за 1 - умеренную выраженность, а за 2 - яркую выраженность симптома.
Сравнительный анализ изученных параметров до и после лечения антимикотиками показал, что в результате лечения происходило уменьшение тяжести течения BBK, частоты положительных культуральных тестов на грибковую микрофлору, а также повышение местного противомикробного иммунитета.
Пример 4. Урина. Утреннюю порцию мочи высевали на чашки агаром Эндо, остальное центрифугировали 5 мин при 16000 об/мин и 1 мл супернатанта соединяли с 30 мкл суспензии тест-культуры (далее см. пример 1). Выросшие на чашках культуры были идентифицированы как Escherichia coli.
Из таблицы 5 видно, что отсутствие активности АМП в урине сопровождается появлением оппортунистических микроорганизмов.