СВЯЗАННЫЙ С ФЕРТИЛЬНОСТЬЮ ГЕН ТаМS7 ПШЕНИЦЫ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
FERTILITY-RELATED WHEAT TaMS7 GENE AND ITS APPLICATION METHOD

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящая заявка относится к области биотехнологии, в частности, она касается способа селекции гибридов пшеницы, включающего получение ядерной стерильной линии пшеницы и получение гибридных семян, более конкретно ядерного гена мужской стерильности пшеницы и его мутантов и применения при селекции гибридов.
Уровень техники
Пшеница - самоопыляемая культура, и в основе применения ее гетерозиса лежит создание технической системы для эффективного получения гибридных семян пшеницы. В настоящее время существует три главных способа применения гетерозиса в производстве пшеницы: первый способ - трехлинейная система, то есть для получения гибридных семян используется линия с мужской стерильностью (male sterile line) типа ядерно-цитоплазматического взаимодействия посредством взаимодействия стерильной линии, поддерживающей линии и восстановительной линии; второй способ - использование линии с химически индуцированной мужской стерильностью, то есть для получения гибридных семян применяются средства химической гибридизации, индуцирующие у пшеницы линии с мужской стерильностью; и третий способ - двухлинейная система, то есть для получения гибридных семян используется фототермочувствительная стерильная линия, фертильность которой изменяется в зависимости от фотопериода и температуры. Трехлинейная система исследовалась еще с 1950-х годов, до настоящего времени было выведено более 70 линий пшеницы с мужской стерильностью типа ядерно-цитоплазматического взаимодействия, и наиболее изученными линиями с мужской стерильностью являются линии T-типа, K-типа и Q-типа, цитоплазма которых в основном происходит из различных видов Aegilops, Triticum timopheevii, дикого овса, Haynaldia villosa и др. Хотя были получены комбинации из трех линий для большинства таких стерильных линий, однако из-за присущих им непреодолимых генетических дефектов, таких как меньшее количество восстановительных источников, неблагоприятное влияние чужеродной цитоплазмы, низкий уровень отбора сильно превосходящих комбинаций и низкая чистота семян стерильных линий, эти стерильные линии не получили широкого применения в производстве. В 1980-х годах достигли наивысшей точки исследования по методу химического гибридинга. Поскольку метод химического гибридинга преодолевает различные проблем трехлинейной системы, то он когда-то был известен как перспективная новая технология получения гибридных семян. Однако химические гибридизирующие средства имеют много недостатков, таких как низкая стабильность, отходы химических веществ, токсические и побочные эффекты химических веществ, сильное загрязнение окружающей среды и т.п. Еще предстоит дальнейшая разработка идеальных химических гибридизирующих средств, чтобы их можно было широко использовать в производстве. Поскольку трехлинейная система и метод химического гибридинга сталкиваются со многими трудностями, то быстро развивается двухлинейная система гибридной пшеницы, которая постепенно становится главной тенденцией развития исследований и применения гетерозиса пшеницы в будущем.
В основе двухлинейной системы лежит фототермочувствительная линия мужской стерильности, которая является разновидностью линий с мужской стерильностью, вызванной взаимодействием между генотипом и окружающей средой. Фототермочувствительная линия мужской стерильности обладает двойной функцией (это и линия мужской стерильности, и поддерживающая линия), что упрощает процесс воспроизведения стерильной линии, упрощает получение семян, имеет более широкий диапазон восстановительных линий, облегчает селекцию гибридов с превосходным гетерозисом, поэтому двухлинейная система имеет очень большую степень популяризации. В настоящее время оригинальная двухлинейная система технологии получения гибридной пшеницы в Китае опережает международный уровень, отобранные гибридные сорта пшеницы обладают сильной устойчивостью к стрессам и высокой степенью утилизации воды и удобрений, а повышение урожайности может достигать 15-20%, что оказывает существенное влияние на снижение себестоимости и повышение эффективности производства зерна. Однако мужская стерильность у фототермочувствительной линии стерильности сильно зависит от факторов окружающей среды, а изменение окружающей среды сильно влияет на урожайность, качество и чистоту гибридных семян, поэтому может потребоваться какое-то время, чтобы двухлинейный метод получения гибридной пшеницы пробился в производство, причем ключевым моментом является решение проблемы влияния окружающей среды.
Поскольку вышеуказанные традиционные стандартные способы селекции наталкиваются на узкие места, то ключевым моментом для преодоления узких мест может быть биологическая технология селекции, в которой главное место занимает современная молекулярная биология. В основе применения гетерозиса пшеницы лежит создание эффективной технической системы для получения гибридных семян пшеницы, а ключевым моментом создания эффективной технологии получения гибридных семян пшеницы является получение подходящей линии с мужской стерильностью в качестве женской родительской. Мужская стерильность означает то, что растение не может производить пыльники, пыльцу или мужские гаметы с нормальными функциями в процессе полового размножения, а механизм мужской стерильности является основой для повышения урожайности и качества пшеницы с помощью гетерозиса.
Геном пшеницы огромен и сложен, поэтому до сих пор накоплено мало информации о механизме мужской стерильности у пшеницы. Поэтому применение современной молекулярной биологии и клеточной биологии для исследования механизма мужской стерильности у пшеницы имеет важное теоретическое и практическое значение для расширения исследований и применения гетерозиса пшеницы.
Cущность изобретения
Все ссылки, приведенные в заявке, включены в нее путем ссылки.
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в заявке, имеют такие значения, которые понятны рядовым специалистам в данной области. Если не указано иначе, методы, используемые или упомянутые в заявке, представлены стандартными методиками, которые общеизвестны рядовым специалистам в данной области. Материалы, методы и примеры приводятся только для объяснения, а не для ограничения.
Изобретением предусмотрен связанный с фертильностью ген TaMS7, причем нуклеотидная последовательность связанного с фертильностью гена выбрана из одной из следующих групп последовательностей:
(a) нуклеотидных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 и 6;
(b) нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 7, 8 и 9;
(c) последовательностей ДНК, способных гибридизироваться с приведенными в (a) или (b) последовательностями ДНК в строгих условиях; или
(d) последовательностей ДНК, имеющих сходство на 80% (предпочтительно по меньшей мере на 85%) с любыми из последовательностей (a)-(c) и обладающих связанной с фертильностью функцией; или
(e) последовательностей ДНК, комплементарных любым из последовательностей (a)-(d).
Специалистам в данной области следует отметить, что связанный с фертильностью ген по изобретению также включает последовательность гомологичного гена, который имеет высокую гомологию с нуклеотидной последовательностью или белковой последовательностью гена TaMS7 и обладает такой же функцией регуляции или восстановления фертильности. Гомологичный ген с высокой гомологией и функцией регуляции фертильности включает последовательность ДНК, способную гибридизироваться с последовательностью ДНК, приведенной в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 или 6, или нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, который имеет сходство на 85% и более с аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 7, 8 или 9. “Строгие условия”, используемые в изобретении, хорошо известны, к примеру, это гибридизация в течение 12-16 часов при 53-60°C в гибридизационном растворе, содержащем 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES (рН 6,4) и 1 мМ ЭДТА, а затем отмывка промывочным раствором, содержащим 0,5×SSC и 0,1% SDS, в течение 15-60 мин при 62-68°C.
Вышеуказанный гомологичный ген также включает последовательность ДНК, которая имеет сходство по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% с полноразмерной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 или 6, а также обладает функцией регуляции фертильности и может быть выделена из любого растения. Степень сходства последовательностей можно получить по общедоступному алгоритму биоинформатики, включая алгоритм Myers and Miller, метод глобального совмещения Needleman-Wunsch, метод локального совмещения Smith-Waterman, метод поиска сходства Pearson and Lipman и алгоритм Karlin and Altschul. Они хорошо известны специалистам в данной области.
Изобретением также предусмотрена экспрессионная кассета, которая содержит последовательность ДНК связанного с фертильностью гена, предусмотренного изобретением, причем нуклеотидная последовательность связанного с фертильностью гена выбрана из одной из следующих групп последовательностей:
(a) нуклеотидных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 и 6;
(b) нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 7, 8 и 9;
(c) последовательностей ДНК, способных гибридизироваться с приведенными в (a) или (b) последовательностями ДНК в строгих условиях; или
(d) последовательностей ДНК, имеющих сходство на 80% (предпочтительно по меньшей мере на 85%) с любыми из последовательностей (a)-(c) и обладающих связанной с фертильностью функцией; или
(e) последовательностей ДНК, комплементарных любым из последовательностей (a)-(d).
В частности, связанный с фертильностью ген в такой экспрессионной кассете также функционально связан с промотором, который может управлять экспрессией связанного с фертильностью гена, причем промоторы включают, без ограничения, конститутивные экспрессирующие промоторы, индуцибельные промоторы, тканеспецифичные промоторы или пространственно-временные промоторы. Более предпочтительно промотор представлен специфичным для пыльников промотором. Предпочтительно нуклеотидная последовательность специфичного для пыльников промотора представлена в SEQ ID NO: 16, 17 или 18.
Экспрессионная кассета по изобретению также включает в себя ген инактивации пыльцы, причем ген инактивации пыльцы может нарушать функцию или образование мужских гамет, содержащих ген инактивации пыльцы, у растений. Гены инактивации пыльцы включают, без ограничения, ген барназы, ген амилазы, ген метилазы DAM и т.п. Более предпочтительно ген инактивации пыльцы представлен геном α-амилазы кукурузы, а нуклеотидная последовательность гена инактивации пыльцы предпочтительно представлена в SEQ ID NO: 25.
Экспрессионная кассета по изобретению также включает в себя отборочный ген, который может использоваться для отбора растений, клеток растительной ткани или вектора, содержащего экспрессионную кассету. Отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к антибиотикам или гены устойчивости к гербицидам или гены флуоресцентных белков и т.п. В частности, отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к хлорамфениколу, гены устойчивости к гигромицину, гены устойчивости к стрептомицину, гены устойчивости к мирамицину, гены устойчивости к сульфонамидам, гены устойчивости к глифосату, гены устойчивости к фосфинотрицину, ген bar, ген красной флуоресценции DsRED, ген mCherry, ген голубого флуоресцентного белка, ген желтого флуоресцентного белка, гены люциферазы, ген зеленого флуоресцентного белка и т.п.
Изобретением также предусмотрен способ регулирования фертильности растений, причем этот способ означает трансформирование мутанта ms7 с мужской стерильностью связанным с фертильностью геном для восстановления мужской фертильности мутанта ms7 с мужской стерильностью, причем нуклеотидная последовательность связанного с фертильностью гена выбрана из одной из следующих групп последовательностей:
(a) нуклеотидных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 и 6;
(b) нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 7, 8 и 9;
(c) последовательностей ДНК, способных гибридизироваться с приведенными в (a) или (b) последовательностями ДНК в строгих условиях; или
(d) последовательностей ДНК, имеющих сходство на 80% (предпочтительно по меньшей мере на 85%) с любыми из последовательностей (a)-(c) и обладающих связанной с фертильностью функцией; или
(e) последовательностей ДНК, комплементарных любым из последовательностей (a)-(d).
Изобретением также предусмотрен способ регулирования фертильности растений путем воздействия на экспрессию гена фертильности TaMS7. Мутантный материал с мужской стерильность ms7 получают, без ограничения, методом мутации гена TaMS7; или же ген TaMS7 используется для преобразования фенотипа мужской стерильности, вызванного мутацией TaMS7, посредством комплементации генов с восстановлением фертильности у мутантов с мужской стерильностью ms7. Мутации по изобретению включают замены, делеции или вставки одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидной последовательности гена, регулирующего фертильность. Методы мутации генов включают, без ограничения, физический мутагенез, химический мутагенез, RNAi или редактирование генов типа TALEN, CRISPR-Cas9 и т.п.
Изобретение также включает способ получения мутантов с мужской стерильностью ms7, который представляет собой процесс, который включает мутирование эндогенного гена TaMS7, регулирующего фертильность, или нуклеотидной последовательности сильно гомологичного ему гена, получая растения с мужской стерильностью. Аминокислотная последовательность указанного выше регулирующего фертильность гена TaMS7 представлена в SEQ ID NO: 7, 8 или 9. Нуклеотидная последовательность регулирующего фертильность гена TaMS7 представлена в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 или 6. “Мутации” включают, без ограничения, мутации генов, вызванные следующими методами типа физических или химических методов, причем химический метод включает мутагенез при помощи таких мутагенов, как EMS и др., а мутации также могут означать точечные мутации либо делеции или вставки ДНК или же глушение генов при помощи RNAi, сайт-направленного мутагенеза и т.д., причем сайт-направленный мутагенез генов включает, без ограничения, методы редактирования генов типа ZFN, TALEN и/или CRISPR/Cas9 и т.п.
Изобретением также предусмотрен способ применения мутантов ms7, причем мутанты вызваны мутацией нуклеотидной последовательности, а растения с мутантной нуклеотидной последовательностью проявляют фенотип мужской стерильности, причем нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность гена TaMS7, предпочтительно приведенную в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Применение мутантов с мужской стерильностью включает, без ограничения, применение в селекции гибридов, более конкретно растения-мутанты ms7 применяются в качестве женских растений с мужской стерильностью и гибридизируются с восстановительной линией для получения гибридных семян.
Изобретением также предусмотрен способ поддержания линий с мужской стерильностью. Способ включает использование мутантов с мужской стерильностью ms7 в качестве акцепторного материала при трансформации и трансформирование акцепторных растений с помощью 3 тесно связанных целевых генов. Эти 3 целевых гена - связанный с фертильностью ген TaMS7, ген инактивации пыльцы и ген селекционного маркера, соответственно. При этом связанный с фертильностью ген TaMS7 может восстанавливать фертильность стерильного акцептора трансформации, ген инактивации пыльцы может инактивировать пыльцу, содержащую трансформированный экзогенный ген, при этом теряется способность к оплодотворению, а селекционный ген может использоваться для отбора трансгенных семян или тканей и нетрансгенных семян или тканей, причем отобранные нетрансгенные семена используются в качестве стерильной линии для получения гибридных семян, а трансгенные семена используются в качестве поддерживающей линии для непрерывного и стабильного получения стерильной линии.
По изобретению, мутанты пшеницы с мужской стерильностью ms7 представляют собой мутанты с мужской стерильностью, вызванной мутацией гена TaMS7. Мутанты с мужской стерильностью по изобретению также могут называться линией стерильности ms7 или линией с мужской стерильностью ms7.
В данном способе поддержания линий с мужской стерильностью гены инактивации пыльцы включают, без ограничения, ген барназы, ген амилазы, ген метилазы DAM и т.п. Более предпочтительно ген инактивации пыльцы представлен геном α-амилазы кукурузы Zm-AA, а его нуклеотидная последовательность предпочтительно представлена в SEQ ID NO: 25. Ген инактивации пыльцы связан со специфичным для мужских гамет промотором. В частности, специфичные для мужских гамет промоторы включают, без ограничения, промотор PG47, промотор Zm13 и т.п. Отборочный ген может применяться для отбора растений или векторов, содержащих экспрессионную кассету. Отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к антибиотикам или гены устойчивости к гербицидам или гены флуоресцентных белков и т.п. В частности, отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к хлорамфениколу, гены устойчивости к гигромицину, гены устойчивости к стрептомицину, гены устойчивости к мирамицину, гены устойчивости к сульфонамидам, гены устойчивости к глифосату, гены устойчивости к фосфинотрицину, ген bar, ген красной флуоресценции DsRED, ген mCherry, ген голубого флуоресцентного белка, ген желтого флуоресцентного белка, ген люциферазы, ген зеленого флуоресцентного белка и т.п.
Изобретением также предусмотрен способ размножения линий с мужской стерильностью, который включает следующие стадии:
(a) трансформирование линии с мужской стерильностью ms7 следующим вектором для получения поддерживающей линии, содержащей следующий вектор: связанный с фертильностью ген TaMS7, который может восстанавливать мужскую фертильность линии с мужской стерильностью ms7; и ген инактивации пыльцы, экспрессия которого нарушает функцию или образование у растений мужских гамет, содержащих ген инактивации пыльцы, поэтому фертильные мужские гаметы, образующиеся у растений, не содержат вектора; и отборочный ген, который используется для сортировки трансгенных семян или тканей и нетрансгенных семян или тканей; и
(b) самоопыление растений поддерживающей линии, трансформированных данным вектором, для получения семян линии с мужской стерильностью ms7 без вектора и семян поддерживающей линии, содержащих вектор; или же опыление растений линии с мужской стерильностью ms7 пыльцой растений поддерживающей линии для размножения семян линии с мужской стерильностью ms7.
В данном способе размножения линий с мужской стерильностью гены инактивации пыльцы включают, без ограничения, ген барназы, ген амилазы, ген метилазы DAM и т.п. Более предпочтительно ген инактивации пыльцы представлен геном α-амилазы кукурузы Zm-AA, а его нуклеотидная последовательность предпочтительно представлена в SEQ ID NO: 25. Ген инактивации пыльцы связан со специфичным для мужских гамет промотором. В частности, специфичные для мужских гамет промоторы включают, без ограничения, промотор PG47, промотор Zm13 и т.п. Отборочный ген может применяться для отбора растений или векторов, содержащих экспрессионную кассету. Отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к антибиотикам или гены устойчивости к гербицидам или гены флуоресцентных белков и т.п. В частности, отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к хлорамфениколу, гены устойчивости к гигромицину, гены устойчивости к стрептомицину, гены устойчивости к мирамицину, гены устойчивости к сульфонамидам, гены устойчивости к глифосату, гены устойчивости к фосфинотрицину, ген bar, ген красной флуоресценции DsRED, ген mCherry, ген голубого флуоресцентного белка, ген желтого флуоресцентного белка, ген люциферазы, ген зеленого флуоресцентного белка и т.п.
Изобретением также предусмотрен способ получения поддерживающих линий, который включает следующие стадии:
(a) трансформирование линии с мужской стерильностью ms7 следующим вектором для получения поддерживающей линии, содержащей следующий вектор: связанныйс фертильностью ген TaMS7, который может восстанавливать мужскую фертильность линии с мужской стерильностью ms7; и ген инактивации пыльцы, экспрессия которого нарушает функцию или образование у растений мужских гамет, содержащих ген инактивации пыльцы, поэтому фертильные мужские гаметы, образующиеся у растений, не содержат вектора; и отборочный ген, который используется для сортировки трансгенных семян или тканей и нетрансгенных семян или тканей; и
(b) самоопыление растений поддерживающей линии, трансформированных данным вектором, для получения семян линии с мужской стерильностью ms7 без вектора и семян поддерживающей линии, содержащих вектор; или же опыление растений линии с мужской стерильностью ms7 пыльцой растений поддерживающей линии для размножения семян линии с мужской стерильностью ms7.
В данном способе получения поддерживающих линий гены инактивации пыльцы включают, без ограничения, ген барназы, ген амилазы, ген метилазы DAM и т.п. Более предпочтительно ген инактивации пыльцы представлен геном α-амилазы кукурузы Zm-AA, а его нуклеотидная последовательность предпочтительно представлена в SEQ ID NO: 25. Ген инактивации пыльцы связан со специфичным для мужских гамет промотором. В частности, специфичные для мужских гамет промоторы включают, без ограничения, промотор PG47, промотор Zm13 и т.п. Отборочный ген может применяться для отбора растений или векторов, содержащих экспрессионную кассету. Отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к антибиотикам или гены устойчивости к гербицидам или гены флуоресцентных белков и т.п. В частности, отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к хлорамфениколу, гены устойчивости к гигромицину, гены устойчивости к стрептомицину, гены устойчивости к мирамицину, гены устойчивости к сульфонамидам, гены устойчивости к глифосату, гены устойчивости к фосфинотрицину, ген bar, ген красной флуоресценции DsRED, ген mCherry, ген голубого флуоресцентного белка, ген желтого флуоресцентного белка, ген люциферазы, ген зеленого флуоресцентного белка и т.п.
Изобретением также предусмотрен способ размножения поддерживающих линий, который включает следующие стадии:
(a) трансформирование линии с мужской стерильностью ms7 следующим вектором для получения поддерживающей линии, содержащей следующий вектор: связанныйс фертильностью ген TaMS7, который может восстанавливать мужскую фертильность линии с мужской стерильностью ms7; и ген инактивации пыльцы, экспрессия которого нарушает функцию или образование у растений мужских гамет, содержащих ген инактивации пыльцы, поэтому фертильные мужские гаметы, образующиеся у растений, не содержат вектора; и отборочный ген, который используется для сортировки трансгенных семян или тканей и нетрансгенных семян или тканей; и
(b) самоопыление растений поддерживающей линии, трансформированных данным вектором, для получения семян линии с мужской стерильностью ms7 без вектора и семян поддерживающей линии, содержащих вектор, в соотношении 1:1.
Изобретением также предусмотрен способ получения семян, который включает следующие стадии:
(a) трансформирование линии с мужской стерильностью ms7 следующим вектором для получения поддерживающей линии, содержащей следующий вектор: связанныйс фертильностью ген TaMS7, который может восстанавливать мужскую фертильность линии с мужской стерильностью ms7; и ген инактивации пыльцы, экспрессия которого нарушает функцию или образование у растений мужских гамет, содержащих ген инактивации пыльцы, поэтому фертильные мужские гаметы, образующиеся у растений, не содержат вектора;
(b) самоопыление растений поддерживающей линии, полученных при трансформации данным вектором; и
(c) после самоопыления получаются семена линии с мужской стерильностью ms7 без вектора и семена поддерживающей линии, содержащие вектор.
В данном способе размножения или поддержания линий с мужской стерильностью, способе получения или размножения поддерживающих линий и способе получения семян и т.п. по изобретению стадия (a) также может включать: введение вектора, содержащего связанный с фертильностью ген TaMS7, ген инактивации пыльцы и отборочный ген, в общее растение, затем получение трансгенных растений, содержащих вектор, гибридизацию трансгенных растений с линией мужской стерильности ms7, а затем получение, путем направленной селекции, растений поддерживающей линии, содержащих вектор на фоне мужской стерильности ms7.
В данном способе размножения или поддержания линий с мужской стерильностью, способе получения или размножения поддерживающих линий и способе получения семян и т.п. по изобретению нуклеотидную последовательность связанного с фертильностью гена выбирают из одной из следующих групп последовательностей:
(a) нуклеотидных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5 и 6;
(b) нуклеотидных последовательностей, кодирующих аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID NO: 7, 8 и 9;
(c) последовательностей ДНК, способных гибридизироваться с приведенными в (a) или (b) последовательностями ДНК в строгих условиях; или
(d) последовательностей ДНК, имеющих сходство на 80% (предпочтительно по меньшей мере на 85%) с любыми из последовательностей (a)-(c) и обладающих связанной с фертильностью функцией; или
(e) последовательностей ДНК, комплементарных любым из последовательностей (a)-(d).
Связанный с фертильностью ген TaMS7 также может быть функционально связан со специфичным для пыльников промотором, который будет управлять экспрессией гена TaMS7 в пыльниках растений. Промотор со специфичностью к экспрессии в пыльниках выбирают из одной из групп, состоящих из промоторов генов, регулирующих фертильность: NP1, MSP1, PAIR1, PAIR2, ZEP1, MELL, PSS1, TDR, UDT1, GAMYB4, PTC1, API5, WDA1, CYP704B2, MS26, MS22, DPW, MADS3, OSC6, RIP1, CSA, AID1, 5126, Ms45 и др. Более предпочтительно нуклеотидная последовательность специфичного для пыльников промотора представлена в SEQ ID NO: 16, 17 или 18. Связанный с фертильностью ген TaMS7 также может быть функционально связан с терминатором, который представлен терминатором любого общеизвестного гена, в частности, нуклеотидная последовательность терминатора представлена в SEQ ID NO: 22, 23 или 24.
В данном способе размножения или поддержания линий с мужской стерильностью, способе получения или размножения поддерживающих линий и способе получения семян и т.п. по изобретению гены инактивации пыльцы включают, без ограничения, ген барназы, ген амилазы, ген метилазы DAM и т.п. Более предпочтительно ген инактивации пыльцы представлен геном α-амилазы кукурузы Zm-AA, а его нуклеотидная последовательность предпочтительно представлена в SEQ ID NO: 25. Ген инактивации пыльцы связан со специфичным для мужских гамет промотором. В частности, специфичные для мужских гамет промоторы включают, без ограничения, промотор PG47, промотор Zm13 и др.
В данном способе размножения или поддержания линий с мужской стерильностью, способе получения или размножения поддерживающих линий и способе получения семян и т.п. по изобретению отборочный ген применяется для отбора растений или векторов, содержащих экспрессионную кассету. Отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к антибиотикам или гены устойчивости к гербицидам или гены флуоресцентных белков и т.п. В частности, отборочные гены включают, без ограничения, гены устойчивости к хлорамфениколу, гены устойчивости к гигромицину, гены устойчивости к стрептомицину, гены устойчивости к мирамицину, гены устойчивости к сульфонамидам, гены устойчивости к глифосату, гены устойчивости к фосфинотрицину, ген bar, ген красной флуоресценции DsRED, ген mCherry, ген голубого флуоресцентного белка, ген желтого флуоресцентного белка, ген люциферазы, ген зеленого флуоресцентного белка и т.п.
Изобретением также предусмотрены специфичные для пыльников промоторы, нуклеотидные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 16, 17 или 18. Их вставляют в вектор и соединяют с репортерным геном GUS. С помощью вектора трансформируют рис и пшеницу и в трансгенных растениях выявляют и анализируют активность и профиль экспрессии GUS. При анализе на окрашивание GUS в корнях, стеблях, листьях и цветках трансгенных растений оказывается, что предусмотренный изобретением промотор управляет экспрессией гена GUS в пыльниках растений. Это свидетельствует о том, что SEQ ID NO: 16, 17 или 18 по изобретению является промотором, специфичным для пыльников.
Специфичный для пыльников промотор по изобретению содержит нуклеотидную последовательность по SEQ ID NO: 16, 17 или 18 из списка последовательностей либо содержит нуклеотидную последовательность, которая имеет сходство на 90% с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 16, 17 или 18 либо содержит фрагмент из 500 и более чем 500 непрерывных нуклеотидов из последовательности SEQ ID NO: 16, 17 или 18, причем нуклеотидная последовательность, функционально связанная с промотором, управляет экспрессией в пыльниках растений. Экспрессирующие векторы, содержащие данные последовательности, трансгенные линии клеток и бактерии-хозяева и т.п. входят в объем охраны изобретения. Пары праймеров для амплификации любых нуклеотидных фрагментов промоторов по SEQ ID NO: 16, 17 или 18, приведенных в заявке, входят в объем охраны изобретения.
Термин “промотор” в настоящем изобретении означает регуляторный участок ДНК, обычно включающий TATA-бокс, который может направлять РНК-полимеразу II на инициацию синтеза РНК в соответствующем сайте инициации транскрипции определенной кодирующей последовательности. Промотор может включать в себя и другие распознающие последовательности, обычно расположенные по восходящей от блока TATA, которые называют вышележащими элементами промотора с функцией регуляции эффективности транскрипции. Как известно специалистам, хотя в заявке идентифицирована нуклеотидная последовательность области промотора, однако выделение и идентификация других регуляторных элементов, расположенных по восходящей от блока TATA в области данного промотора по изобретению, также входят в объем охраны изобретения. Таким образом, область промотора по изобретению в общем дополнительно определяется как последовательности, включающие вышележащие регуляторные элементы или энхансеры, регулирующие пространственные и временные паттерны экспрессии кодирующей последовательности. Таким же образом могут быть идентифицированы и выделены промоторные элементы, проявляющие тканеспецифическую экспрессию (к примеру, специфичную для мужских тканей), которые можно использовать вместе с другим базовым промотором для изучения преимущественной экспрессии в определенных мужских тканях. Под базовым промотором (core promoter) подразумевается минимальная последовательность, необходимая для инициации транскрипции, к примеру, последовательность, известная как TATA-бокс, которая обычно находится в промоторе кодирующего белок гена. Следовательно, в качестве альтернативы можно использовать вышележащий промотор гена TaMS7 в сочетании с его собственным базовым промотором или базовым промотором из других источников.
Базовым промотором может быть любой известный базовый промотор типа промотора 35S или 19S вируса мозаичности цветной капусты (U.S. Patent No. 5,352,605), промотор убиквитина (U.S. Patent No. 5,510,474), базовый промотор IN2 (U.S. Patent No. 5,364,780) или промотор вируса мозаичности норичника.
Функции промоторов генов можно анализировать следующими методами: нуклеотидную последовательность промотора функционально соединяют с репортерным геном, получая вектор, который можно использовать при трансформации, затем этим вектором трансформируют растения и получают трансгенные растения, а затем изучают экспрессию репортерного гена в каждом органе/ткани растений трансгенного потомства для определения специфичности экспрессии. В качестве альтернативы последовательность промотора, связанную с репортерным геном, субклонируют в экспрессирующий вектор для экспериментов по краткосрочной экспрессии и определяют функцию промотора или других регуляторных участков в экспериментах с краткосрочной экспрессией.
Выбор подходящего экспрессирующего вектора для проверки функции промотора или его регуляторных участков зависит от организма-хозяина и способа введения в него экспрессирующего вектора, причем такие методы хорошо известны рядовым специалистам. В последовательности экспрессирующего вектора для эукариот содержатся участки, контролирующие инициацию транскрипции и контролирующие процессинг. Эти участки функционально связаны с репортерным геном типа YFP, UidA, гена GUS или люциферазы. Экспрессирующий вектор с предполагаемым регуляторным участком из генома может быть введен в целый орган типа пыльцы на определенных стадиях развития или в каллус для функциональной проверки.
Кроме того, промотор по изобретению также может быть связан с другими нуклеотидными последовательностями, помимо гена TaMS7, для управления их экспрессией. Нуклеотидные последовательности, фрагменты и варианты промотора по изобретению могут быть собраны в одну экспрессионную кассету с гетерогенной нуклеотидной последовательностью и использованы для экспрессии в целевых растениях, более предпочтительно для экспрессии в мужских органах растений. Экспрессионная кассета содержит подходящие сайты расщепления для рестрикционных ферментов, которые используются для вставки промотора и гетерогенной нуклеотидной последовательности. Экспрессионные кассеты можно использовать для манипуляций на любых растениях для получения соответствующего ожидаемого фенотипа.
Специфичный для пыльников промотор по изобретению может применяться для управления экспрессией следующей гетерологичной нуклеотидной последовательности для получения трансгенных растений с мужской стерильностью, причем гетерологичная нуклеотидная последовательность может кодировать фермент, способствующий расщеплению углеводов, или модифицирующий фермент, амилазу, деветвящий фермент или пектиназу, более конкретно, к примеру, ген барназы, ген α-амилазы кукурузы, ген ауксина, ген rot B, ген цитотоксина, ген дифтерийного токсина, ген метилазы DAM или доминантный ген мужской стерильности. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота, которая может быть функционально связана с промотором настоящего изобретения по нисходящей, может представлять собой структурный ген, регуляторный ген, антисмысловую последовательность структурного гена, антисмысловую последовательность регуляторного гена или ген малой РНК, способной интерферировать с экспрессией определенного эндогенного гена.
Изобретением также предусмотрены последовательности терминаторов транскрипции, нуклеотидные последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 22, 23 или 24, которые имеют функции завершения транскрипции гена.
Изобретением также предусмотрены экспрессионные кассеты, векторы или инженерные штаммы, которые содержат специфичный для пыльников промотор SEQ ID NO: 16, 17 или 18, предусмотренный изобретением. В частности, нуклеотидная последовательность связанного с фертильностью гена TaMS7, предусмотренного изобретением, может быть встроена по нисходящей от промотора SEQ ID NO: 16, 17 или 18, предусмотренного изобретением, для управления экспрессией гена фертильности в акцепторных растениях при трансформации.
Специфичный для пыльников промотор по настоящему изобретению может применяться для специфической экспрессии экзогенного гена в пыльниках, чтобы избежать негативного эффекта, вызванного непрерывной экспрессией экзогенного гена в других тканях растения. Специфичный для пыльников промотор также может применяться для функционального анализа и идентификации генов, связанных с развитием пыльцы растений, а также для получения линий мужской стерильности и поддерживающих линий, а также может применяться для экспериментов по абортированию пыльцы, чтобы избежать проблемы биобезопасности, вызванной переносом трансгенных растений или утечкой пыльцы, а специфичный для пыльников промотор имеет важное значение для создания линий растений с мужской стерильностью и поддерживающих линий.
Нуклеотидная последовательность и последовательность промотора или экспрессионная кассета гена TaMS7, предусмотренного изобретением, может быть вставлена в вектор, плазмиду, искусственную дрожжевую хромосому, искусственную бактериальную хромосому или любой другой вектор, подходящий для трансформации в клетки хозяина. Предпочтительно клетки хозяина представляют собой бактериальные клетки, в особенности клетки для клонирования или содержания полинуклеотида или трансформирования растительных клеток, как-то Escherichia coli, Agrobaterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes. В случае, когда клетки хозяина представляют собой клетки растений, экспрессионная кассета или вектор могут быть вставлены в геном трансформированных клеток растения, причем вставка может быть сайт-специфичной либо случайной.
Способы введения нуклеотидной последовательности, вектора или экспрессионной кассеты в растения или же трансформации ими растений по изобретению представляют собой стандартные трансгенные методы, с помощью которых нуклеотидная последовательность, вектор или экспрессионная кассета попадает при трансформации в акцепторные клетки или акцепторные растения. Для введения рекомбинантного экспрессирующего вектора в растительные клетки можно использовать любые трансгенные методы, известные специалистам в области биотехнологии растений, при этом получают трансгенные растения по изобретению. Методы трансформации включают прямые и косвенные методы трансформации. Подходящие прямые методы трансформации включают захват ДНК, индуцированный полиэтиленгликолем, трансформацию при помощи липосом, бомбардировки частицами, электропорации и микроинъекции. Методы трансформации также включают метод трансформации растений при помощи Agrobacterium и др. По сравнению с предшествующим уровнем техники изобретение имеет следующие преимущества: оно обеспечивает связанный с фертильностью ген TaMS7 и его промотор, а также способы, в которых ген TaMS7 применяется для размножения и поддержания линий с мужской стерильностью ms7. Связанный с фертильностью ген TaMS7 и способ имеют важное значение для получения, популяризации и применения при селекции гибридов для получения культур. Ген фертильности по изобретению и образующиеся при его мутации стерильные линии обеспечивают ресурсы для селекции гибридов пшеницы, а также обеспечивают необходимые элементы для построения системы селекции гибридов третьего поколения. Линии с мужской стерильностью, образующиеся при мутации гена, применяются для получения гибридных семян, что имеет важное значение для прорыва и улучшения существующих “трехлинейных” и “двухлинейных” технологий селекции гибридов.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлен анализ экспрессии comp155942_c0_seq4 в пыльниках, когда пыльца находится на стадии мейоза (WT-0), одноядерной стадии (WT-1), двухъядерной стадии (WT-2) и трехъядерной стадии (WT-3). По горизонтальной оси представлены различные стадии развития пыльцы, а по вертикальной - FPKM, который отражает уровень экспрессии гена.
На фиг. 2 представлен анализ методом ОТ-ПЦР 3 гомологичных генов TaMS7 в различных тканях/органах и пыльниках на разных стадиях развития пшеницы. 1 - корни, 2 - стебли, 3 - листья, 4 - колосья с пыльцой на стадии мейоза, 5 - пыльники с одноядерными микроспорами, 6 - пыльники с двухъядерной пыльцой, 7 - пыльники с трехъядерной пыльцой, 8 - цветочные органы, за исключением пыльников с одноядерными микроспорами, 9 - цветочные органы, за исключением пыльников с двухъядерной пыльцой, и 10 - цветочные органы, за исключением пыльников с трехъядерной пыльцой.
На фиг. 3 представлены генотипы и фенотипы 7 рецессивных ядерных мутантных линий пшеницы с мужской стерильностью, полученных по технологии CRISPR-Cas9: a1 и a2 - два мутантных генотипа TaMS7-A, соответственно, b1 - один мутантный генотип TaMS7-B, d1 и d2 - два мутантных генотипа TaMS7-D, соответственно.
2
Фиг. 4. Тройной мутант tams7 проявляет признаки полной мужской стерильности. A - колосья дикого типа и тройного мутанта tams7; B - пыльники и пестики растений дикого типа и тройного мутанта tams7; C - зрелые пыльцевые зерна дикого типа и тройного мутанта tams7, окрашенные с помощью I-KI.
Раскрытие сущности изобретения
Ниже подробно описаны воплощения изобретения, которые реализованы по технической схеме изобретения в качестве предпосылки, а также представлены подробные реализации и конкретный способ работы, но объем защиты изобретения не ограничивается следующими воплощениями.
Воплощение 1. Анализ полногеномных профилей экспрессии в пыльниках пшеницы на разных стадиях развития и получение контигов, экспрессируемых в пыльниках с пыльцой на ранней стадии развития
Собирали пыльники в мейозе и пыльники с одноядерными микроспорами, двухъядерной пыльцой или трехъядерной пыльцой, соответственно. Экстрагировали тотальную РНК с помощью Trizol (Invitrogen) и проводили обработку ДНКазой I (Promega), а затем выделяли мРНК (Ambion). После этого проводили обратную транскрипцию (Invitrogen) очищенной мРНК, обработку ультразвуком (Fisher), приготовление библиотеки (Illumina) и ее амплификацию (Illumina) и секвенирование на установке Illumina.
Прочтения от высокопроизводительного секвенирования транскриптома собирали с помощью программы Trinity, из собранных последовательностей удаляли избыточные последовательности и проводили анализ кластеризации по подобию. Для анализа изменений экспрессии собранных контигов транскриптов сначала совмещали прочтения от высокопроизводительного секвенирования каждого образца с контигами собранных транскриптов с помощью программы TopHat (http://tophat.cbcb.umd.edu/). После этого измеряли нормализованные значения экспрессии совмещаемых контигов транскриптов с помощью программы Cufflink и представляли в виде FPKM (количество фрагментов на 1 т.о. (килобазу) модельного экзона на миллион отображаемых фрагментов).
При анализе полногеномных профилей экспрессии в пыльниках пшеницы на разных стадиях развития оказалось, что 7231 контиг транскриптов сильно экспрессируется в пыльниках с пыльцой на стадии мейоза и одноядерной стадии и не экспрессируется в пыльниках с пыльцой на двухъядерной стадии и трехъядерной стадии. Как видно из фиг. 1, comp155942_c0_seq4 сильно экспрессируется в пыльниках с пыльцой на стадии мейоза и одноядерной стадии и не экспрессируется в пыльниках с пыльцой на двухъядерной стадии и трехъядерной стадии. Ген, соответствующий comp155942_c0_seq4, назвали TaMS7.
Воплощение 2. Проверка специфичности экспрессии гена TaMS7 в различных тканях методом ОТ-ПЦР
Поскольку пшеница является аллогексаплоидом, состоящим из трех комплектов геномов A, B и D, среднее число копий генов составляет 2,8, из которых почти половина (46%) имеют 3-4 копии, 12% имеют 1-2 копии и 42% имеют 5 или более 5 копий. Используя последовательность comp155942_c0_seq4, данные по секвенированию обыкновенной пшеницы, опубликованные CerealsDB и IWGSC (Международный консорциум по секвенированию генома пшеницы), и данные по секвенированию Triticum urartu (донор генома A) и Aegilops tauschii (донор генома D), опубликованные в Nature в 2013 г., мы получили 3 гена TaMS7, которые назвали TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D, соответственно.
Последовательности геномной ДНК этих 3 генов TaMS7 представлены в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно, идентичность которых составляет 95-97%; последовательности CDS представлены в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6, соответственно, идентичность которых составляет 97-98%; а последовательности белков представлены в SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9, соответственно, идентичность которых составляет 98-99%.
Разработали специфичные праймеры для CDS TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D, соответственно, и анализировали специфичность экспрессии этих 3 генов во многих тканях пшеницы (корни, стебли и листья, пыльники на разных стадиях развития и другие цветочные органы, помимо пыльников) методом ОТ-ПЦР, а результаты, представленные на фиг. 2, показали, что гены TaMS7 специфически экспрессируются только в колосьях с пыльцой на стадии мейоза и в пыльниках с пыльцой на одноядерной стадии, не экспрессируются в пыльники с пыльцой на двухъядерной стадии и на трехъядерной стадии и не экспрессируются в других цветочных органах, кроме пыльников на разных стадиях развития, и в корнях, стеблях и листьях. Эти результаты показывают, что гены TaMS7 специфически экспрессируются именно в пыльниках, причем специфически экспрессируются только в пыльниках с пыльцой на ранней стадии развития, а промоторы генов TaMS7 являются специфичными для пыльников.
Праймеры для гена TaMS7-A при ОТ-ПЦР:
праймер 1: 5'-ATACTGACACAAGTTTATGGGGCTG-3' (SEQ ID NO: 10),
праймер 2: 5'-AATTACATTCAAATATGGCTCCTTG-3' (SEQ ID NO: 11).
Праймеры для гена TaMS7-B при ОТ-ПЦР:
праймер 3: 5'-GGCCTCGTGAACTCGTCGTATC-3' (SEQ ID NO: 12),
праймер 4: 5'-TGAATTACATGCAAATTTGGCTCCG-3' (SEQ ID NO: 13).
Праймеры для гена TaMS7-D при ОТ-ПЦР:
праймер 5: 5'-ATGTCCAACCAGGAGCACTTCAC-3' (SEQ ID NO: 14),
праймер 6: 5'-GCACAGTTTTTTGAAGCAATGTTG-3' (SEQ ID NO: 15).
Воплощение 3. Получение последовательности промоторов генов TaMS7
Используя последовательности геномной ДНК генов TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D, данные по секвенированию обыкновенной пшеницы, опубликованные CerealsDB и IWGSC (Международный консорциум по секвенированию генома пшеницы), и данные по секвенированию Triticum urartu (донор генома A) и Aegilops tauschii (донор генома D), опубликованные в Nature в 2013 г., выделяли промоторы генов TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D, которые назвали промотором TaMS7-A, промотором TaMS7-B и промотором TaMS7-D, соответственно, а также называли как pTaMS7-A, pTaMS7-B и pTaMS7-D, соответственно, в настоящей заявке. Длина этих промоторов составляла 2601 п.н., 2635 п.н. и 2821 п.н., соответственно, а их нуклеотидные последовательности представлены в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, соответственно.
Воплощение 4. Клонирование промотора TaMS7-D и конструирование экспрессирующего вектора для растений
Для дальнейшей проверки функций указанных выше промоторов проводили эксперимент по проверке функции промотора TaMS7-D по изобретению. Экспрессирующий вектор pBI121 для растений расщепляли двумя рестриктазами HindIII и EcoRI, а полученный фрагмент 35S:GUS лигировали с помощью ДНК-лигазы T4 в вектор pCAMBIA2300 корпорации CAMBIA, который также расщепляли одновременно HindIII и EcoRI, и новый вектор назвали p2300 35S:GUS.
Составляли праймеры для 5'-конца промотора TaMS7-D и по восходящей от ATG:
праймер 7: 5'-aagcttCTGACATAGTACATGTAATCTTTAAATCCATAAC-3' (SEQ ID NO: 19),
праймер 8: 5'-ggatccTTGCGCCGGCGAGCTCGGC-3' (SEQ ID NO: 20).
Последовательность aagctt в праймере 7 является рестрикционным сайтом HindIII, а последовательность ggatcc в праймере 8 является рестрикционным сайтом BamHI.
В качестве матрицы использовали геномную ДНК пшеницы, для амплификации использовали праймер 7 и праймер 8, а условия реакции были следующими: начальная денатурация при 94°C в течение 5 мин; затем 35 циклов, включающих денатурацию при 94°C в течение 30 сек; отжиг при 60°C в течение 30 сек; удлинение при 72°C в течение 2 мин и 30 сек; и окончательное удлинение при 72°C в течение 10 мин. По окончании реакции продукт ПЦР выявляли и извлекали методом электрофореза в 1% агарозном геле. Полученный продукт вставляли в вектор pMD20-T, отбирали и секвенировали положительный клон, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 18. Плазмиду назвали T-pTaMS7-D.
T-pTaMS7-D расщепляли двумя рестриктазами HindIII и BamHI, полученный промотор TaMS7-D лигировали с помощью ДНК-лигазы T4 в вектор p2300 35S:GUS, который также расщепляли одновременно HindIII и BamHI, а затем получали экспрессирующий вектор p2300pTaMS7-D:GUS для растений.
Воплощение 5. Генетическая трансформация риса и гистохимическое выявление экспрессии гена GUS в различных тканях/органах трансгенных растений риса
Экспрессионным вектором p2300TaMS7-D:GUS для растений трансформировали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0 методом теплового шока.
0
Agrobacterium tumefaciens использовали для инфицирования эмбрионального каллюса риса, а затем Agrobacterium tumefaciens и эмбриональные каллюсы риса совместно культивировали в темноте в течение 2-3 дней. После двух стадий скрининга на устойчивость, предварительной дифференцировки, дифференцировки, укоренения и т.п., наконец, получали трансгенные растения риса p2300TaMS7-D:GUS поколения T с устойчивостью к канамицину.
Отбирали трансгенные проростки подходящего размера или определенные ткани, погружали в окрашивающий буфер GUS и инкубировали в течение ночи при 37°C. Затем удаляли реакционный раствор, проводили градиентное обесцвечивание этиловым спиртом и проводили наблюдения под микроскопом. Результаты показали, что экспрессия гена GUS не выявляется в питательных органах трансгенного риса, таких как корни, стебли и листья, и экспрессия гена GUS не выявляется в пыльниках и других цветочных органах с двухъядерной и трехъядерной пыльцой и других цветочных органах, за исключением пыльников с пыльцой на стадии мейоза и на одноядерной стадии, причем промотор TaMS7-D запускал экспрессию гена GUS только в пыльниках с пыльцой на стадии мейоза и на одноядерной стадии, свидетельствуя о том, что промотор TaMS7-D является специфичным для пыльников промотором на ранней стадии развития пыльцы. В соответствии со способом проверки функции промотора TaMS7-D также проверяли функции промотора TaMS7-A и промотора TaMS7-B и оказалось, что промотор TaMS7-A и промотор TaMS7-B тоже являются специфичными для пыльников промоторами, что соответствует результатам эксперимента в воплощении 2.
Воплощение 6. Сайт-направленный нокаут гена фертильности TaMS7 и анализ фенотипа у мутантов
В данном изобретении для сайт-направленного мутагенеза в геноме пшеницы использовали технологию CRISPR-Cas9. В частности, в качестве целевой последовательности в заявке была выбрана последовательность CTGGTGGACCAGCCCATGGT (SEQ ID NO: 21), которая представляет собой консенсусную последовательность генов TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D по нуклеотидам 1017-1036 положительной нити TaMS7-A, по нуклеотидам 1035-1054 положительной нити TaMS7-B и по нуклеотидам 1038-1057 положительной нити TaMS7-D. Экспрессионную кассету sgRNA с целевой последовательностью и экспрессионную кассету с Cas9 вставляли в один и тот же вектор pAHC20 и вводили в незрелые зародыши пшеницы с помощью плазмиды, экспрессирующей ген bar, методом бомбардировки частицами, после чего получали трансгенные растения пшеницы.
Проводили молекулярную идентификацию трансгенных растений пшеницы, при этом были идентифицированы мутации в целевых сайтах генов TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D: было два типа мутаций в гене TaMS7-A, делеция 5 п.о. и вставка 55 п.о., соответственно; один тип мутации в гене TaMS7-B, делеция 13 п.о. и вставка 54 п.о. одновременно; и два типа мутаций в гене TaMS7-D, один тип - делеция 9 п.о., а другой тип - делеция 7 п.о. и вставка 103 п.о. одновременно (см. фиг. 3).
Осмотр растений, содержащих гомозиготную мутацию или биаллельную мутацию в целевых сайтах генов TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D, показал, что растения с таким генотипом проявляли тонкие, мелкие и невыразительные пыльники без пыльцевых зерен с полной мужской стерильностью (см. фиг. 4), их опыляли пыльцой дикого типа для получения семян; тогда как растения, содержащие гомозиготную мутацию или биаллельную мутацию только в одном или двух из генов TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D, не проявляли фенотипа мужской стерильности. Это свидетельствует о том, что ген TaMS7 по изобретению является рецессивным геном мужской генной стерильности.
Воплощение 7. Функциональная комплементация трансгенов
В вектор pAHC20 встраивали фрагменты геномной ДНК (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3) областей, кодирующих TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D, соответственно, добавляли спереди 2,5 т.п.н. фрагментов нативного вышележащего промотора (SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18) для управления экспрессией генов и позади 1,4 т.п.н. нижележащих фрагментов (SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24), соответственно, получая векторы, которые были названы pAHC20pTaMS7-A:gTaMS7-A, pAHC20pTaMS7-B:gTaMS7-B и pAHC20pTaMS7-D:gTaMS7-D, соответственно.
2
Для трансформации или совместной трансформации этими 3 векторами функциональной комплементации мутантов TaMS7-abd пшеницы использовали метод бомбардировки частицами. Пыльцевые зерна положительных трансгенных растений окрашивали с помощью I-KI и осматривали, показывая, что пыльцевые зерна развивались нормально и были фертильными. Эти анализы также свидетельствуют о том, что гены TaMS7 участвуют в регуляции и контроле развития пыльцы, а мутации генов TaMS7 дают фенотип мужской стерильности.
Воплощение 8. Применение генов TaMS7 в методе селекции гибридов нового поколения
Гены TaMS7 могут применяться в технологии селекции гибридов нового поколения, а основная идея этой технологии заключается в следующем: рецессивные мутанты пшеницы с генной мужской стерильностью используют в качестве материала-акцептора при трансформации, причем стерильных мутантов трансформируют тремя близкородственными целевыми генами. При этом ген-восстановитель фертильности может восстанавливать фертильность акцептора трансформации, ген инактивации пыльцы может инактивировать пыльцевые зерна, содержащие трансгены, то есть у этих зерен пыльцы теряется способность к оплодотворению, ген-маркер семян (отборочный) может использоваться для сортировки трансгенных семян от нетрансгенных семян, а отобранные нетрансгенные семена можно использовать в качестве стерильной линии, тогда как трансгенные семена можно использовать в качестве поддерживающей линии. Поддерживающая линия может опылять стерильную линию для размножения стерильной линии, в то же время поддерживающая линия может самоопыляться, производя потомство в качестве нового поколения поддерживающей линии. В этой технологии применяется биотехнология для получения нетрансгенного продукта, решается проблема искусственного или механического выхолащивания при получении гибридных семян пшеницы, исключаются операции искусственного или механического выхолащивания, получаются семена лучшего качества и чистоты для сеялок и сокращаются трудовые затраты.
Исходя из этих принципов, авторы изобретения использовали ген TaMS7 пшеницы для конструирования экспрессирующего вектора для растений. Перед созданием экспрессирующего вектора для пшеницы авторы изобретения сначала трансформировали пшеницу каждой из трех экспрессионных кассет, ZmBT1-ZmAA, TaMS7 и mCherryW, соответственно, а также проверили функцию каждой экспрессионной кассеты. Результаты показали, что каждая экспрессионная кассета может работать хорошо, как и было задумано, когда ими независимо трансформировали пшеницу.
Далее авторы изобретения сконструировали вектор для трансформации путем сборки следующих ДНК-элементов:
1) вектор pAHC20 использовали в качестве остова, в который операбельно вставляли следующие экспрессионные кассеты;
2) восстанавливающая фертильность экспрессионная кассета гена TaMS7, содержащая связанный с фертильностью ген TaMS7, его промотор и терминатор, которые все были получены из сорта пшеницы CB037, причем три гена TaMS7 из геномов A, B и D пшеницы, а именно TaMS7-A, TaMS7-B и TaMS7-D, могут использоваться для восстановления фертильности стерильной линии ms7 пшеницы одновременно или поодиночке. При этом последовательность геномной ДНК, последовательность промотора и последовательность терминатора гена TaMS7-A представлена в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 22, соответственно; последовательность геномной ДНК, последовательность промотора и последовательность терминатора гена TaMS7-B представлена в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 23, соответственно; а последовательность геномной ДНК, последовательность промотора и последовательность терминатора гена TaMS7-D представлена в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 24, соответственно;
3) экспрессионная кассета гена инактивации пыльцы PG47:ZmBT1-ZmAA-IN2-1: ген инактивации пыльцы ZmAA и транзитный пептид ZmBT1, причем открытую рамку считывания ZmBT1-ZmAA (нуклеотидная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 25) лигировали по нисходящей от промотора PG47 (нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 26) и по восходящей от терминатора IN2-1 (нуклеотидная последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 27);
4) экспрессионная кассета гена-маркера семян (отборочного) CaMV35S-LTP2:mCherryW-PINII: открытую рамку считывания гена mCherryW (SEQ ID NO: 28) лигировали между энхансером CaMV35S-промотором LTP2 (SEQ ID NO: 29) и терминатором PINII (SEQ ID NO: 30), получая экспрессионную кассету гена (энхансер CaMV35S-LTP2:mCherryW-PINII).
Итак, авторы изобретения создали вектор, содержащий экспрессионную кассету для восстановления фертильности только с одним геном TaMS7, экспрессионную кассету гена инактивации пыльцы и экспрессионную кассету гена-маркера семян. Кроме того, был также сконструирован вектор, содержащий экспрессионную кассету для восстановления фертильности с двумя генами TaMS7, экспрессионную кассету гена инактивации пыльцы и экспрессионную кассету отборочного гена-маркера.
Для трансформации этими 2 векторами мутантов TaMS7-abd пшеницы использовали метод бомбардировки частицами и получили 12 и 9 положительных трансгенных растений, соответственно, в которых трансген представлен единственной копией. Проводили определение активности у пыльцы трансгенных растений и контрольных растений, и результаты показали, что доля стерильных пыльцевых зерен в общей массе пыльцевых зерен у нетрансгенных растений пшеницы дикого типа составляет менее 2%, причем пыльники мутантных растений TaMS7-abd нетрансгенной пшеницы не содержат пыльцевых зерен, тогда как пыльники трансгенных растений содержат пыльцевые зерна, причем доля стерильных пыльцевых зерен в общей массе пыльцевых зерен составляет около 50%. Эти результаты показали, что ген TaMS7 в векторе по изобретению восстанавливает фенотип мужской стерильности у мутантов TaMS7-abd, а ген ZmBT1-ZmAA способен инактивировать пыльцу, как и ожидалось.
Проводили анализ расщепления на флуоресцентные семена и нефлуоресцентные семена у семян поколения T1, вырабатываемых данными трансгенными растениями, который показал разделение в соотношении 1:1, а именно: флуоресцентные семена, несущие экзогенный ген, и нефлуоресцентные семена без экзогенного гена проявляли разделение в соотношении 1:1, указывая на то, что каждый элемент вектора, предусмотренный изобретением, хорошо экспрессируется в целом, а задача создания и селекции стерильной линии может быть реализована; при этом ген TaMS7 может восстанавливать фертильность у мутантного акцептора мужской стерильности, а экспрессия гена ZmBT1-ZmAA и гена mCherryW способна инактивировать пыльцу и маркировать трансгенные семена по флуоресценции, как и ожидалось, соответственно. Таким образом, была установлена технологическая система селекции гибридов нового поколения, а именно: на основе линии пшеницы с генной мужской стерильностью ms7 при трансформации указанным вектором образуется поддерживающая линия, содержащая экзогенный вектор, которая может использоваться для непрерывного получения поддерживающей линии и стерильной линии ms7, причем эта технологическая система решает проблему того, что линия пшеницы с генной мужской стерильностью ms7 не способна размножаться, а полученная линия с мужской стерильностью ms7 может использоваться для получения гибридных семян.
Данная технологическая система также может быть получена следующим способом, а именно: указанным вектором трансформируют обычную пшеницу дикого типа, а трансгенные растения скрещивают с мужской стерильной линией ms7, затем гибридные растения самоопыляются, а семена подвергаются скринингу для получения поддерживающей линии, содержащей экзогенный вектор на фоне гомозиготной мутации ms7, причем поддерживающая линия, содержащая экзогенный вектор, может использоваться для непрерывного получения поддерживающей линии и стерильной линии ms7.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  FRONTIER LABORATORIES OF SYSTEMS CROP DESIGN CO.,LTD.
PEKING UNIVERSITY
<120>  Wheat fertility-related gene TaMS7 and application method thereof
<130>
<150>  201710321452.3
<151>  2017-05-09
<160>  30
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  1923
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  1
atggcacttg gccgcgcgag atcgccggcg ctggtgctcg ccgccgccgt ccttggcgcg     60
ctctgcgtcg tcgcgctctc ggaggatggt gcgtgtgttc ggggttttgc atgtcagcta    120
gtacggagta cgtgcctgtg tctgttatca tgatcaatga ccgatggtgg cgtgcgtgtg    180
cagagcaact ggagaacctg cggttcgtgc agcacgcgca ggacgcgccg ctggtgtcgc    240
actacaacta catcgtggtg ggcggcggca cgtccgggtg cccgctggcg gcgacgctgt    300
cggagcactc gcgggtgctg ctgctggagc gcgggggcct cccctaccgc aacatgtcca    360
accaggagca cttcacggac gcgctggccg acacgtcgct ggcgtccccg gcgcagcggt    420
tcgtgtccac ggacggcgtg gtgaacgcgc gggcgcgggt gctgggcggc gggagctgcc    480
tcaacgccgg gttctacacg cgggccagca acgagtacgt gcgcacggcc gggtgggacg    540
ccggcctcgt caactcgtcg taccggtggg tggagcgcgc gctggtgttc cgcccggacg    600
tgccgccgtg gcaggccgcg ctccgggacg cgctgctgga ggccggcgtc acccccgaca    660
acggcttcac cttcgaccac gtcacgggga ccaagatcgg cggcaccatc ttcgacaaca    720
acgggcagcg ccacacggcc gccgacttcc tccggcacgc ccggccgcgg gggctcaccg    780
tggtgctcta cgccacggtg tcgcgggtcc tgttcaggag ccaggagggg gtgccgtacc    840
cggtggcgta cggggtggtg ttcgcggacc cgctgggggt gcagcaccgg gtgtacctcc    900
gggacggggg caagaacgag gtgatcctgt cggcggggac gctggggagc ccgcagctgc    960
tgatgctgag cggcgtgggc ccgcaggtgc acctggaggc gcacagcatc caggtgctgg   1020
tggaccagcc catggtcggg cagggcgtgg ccgacaaccc catgaactcg gtcttcatcc   1080
cgtcgccggt gccggtgggg ctgtccctgg tgcaggtcgt cgggatcacc aagtccggca   1140
gcttcatcga gggcgtgagc ggctccgagt tcggcatccc ggtgtccaac ggcgcccgcc   1200
ggctggccag cttcgggctc ttctccccgc agaccgggca gctcggcacg ctgccgccgg   1260
ggcagaggac gccggaggcg ctgcagcgcg cggcggaggc gatgcggcgg ctggacaggc   1320
gggcgttccg gggcggcttc atcctggaga agatcctggg gccggtgtcg acggggcaca   1380
tcgagctgcg cagcaccgac ccgcgcgcca acccggccgt gaccttcaac tacttccagg   1440
aggcggagga cctggagcgg tgcgtccggg ggatccagac gatcgagcgg gtgatccagt   1500
cgcgcgcctt ctccaacttc acctacgcca acaccaccgt ggagtccatc ttcaccgact   1560
cggccaactt ccccgtcaac ctgctgccgc gccacgtcaa cgactcccgc tcgccggagc   1620
agtactgcag ggagaccgtc atgaccatct ggcactacca cggcgggtgc cacgtcggcg   1680
ccgtcgtcga cgacaactac cgggtgttcg gggtcagggg gctcagggtc atcgacagct   1740
ccaccttcag gtactccccc ggcaccaacc cgcaggccac cgtcatgatg ctcggcaggt   1800
aaacgcaact ctcaaatcac ccccgcaatt atactgatct gaatgaactc aactaacaca   1860
actgttgtaa atctgtacag gtatatgggc ataaagattc aggccgagag atggaggaaa   1920
tga                                                                 1923
<210>  2
<211>  1954
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  2
atggcacttg gccgcgcgag atcaccggcg ctggtgctcg ccgccgccgt tcttggcgcg     60
ctctgcatcg tcgcactctc ggaggatggt gcgtgtgttc acctgcatgg tttttctggg    120
ggttttgcgt cagctacgtg cgtgtgtctt ttatcatgat caatggacgc tgtgatgatc    180
aatggtgccg tgcgtgtgca gagcaactgg agaacctgcg gttcgtgcag cacgcgcagg    240
acgcgccgct ggtgtcgcac tacaactaca tcgtggtcgg cggcggcacg tccgggtgcc    300
cgctggcggc gacgctgtcg gagcactcgc gggtgctcct gctggagcgc gggggcctcc    360
cctaccgcaa catgtcgaac caggagcact tcacggacgc gctggccgac acgtcgctgg    420
cgtccccggc ccagcggttc atctccacgg acggcgtggt gaacgcgcgg gcgcgggtgc    480
tgggcggcgg gagctgcctc aacgccggat tctacacgcg ggccagcaac gagtacgtgc    540
gcacggccgg gtgggacgcc ggcctcgtga actcgtcgta tcggtgggtg gagcgcgcgc    600
tggtgttccg ccccgacgtg ccgccgtggc aggccgcgct ccgggacgcg ctgctcgagg    660
ccggcgtcac ccccgacaac ggcttcacct tcgatcacgt cacggggacc aagatcggcg    720
gcaccatctt cgacaacaac gggcagcgcc acacggccgc cgacttcctc cggcacgccc    780
ggccccgggg gctcaccgtc gtgctctacg ccacggtgtc ccggatcctg ttcagaagcc    840
aggagggggt gccgtatccg gtggcgtacg gggtggtgtt cgcggacccg ctgggggtgc    900
agcaccgggt gtacctccgg gacgggggga agaacgaggt gatactgtcg gcggggacgc    960
tggggagccc gcagctgctg atgctgagcg gcgtcggccc gcaggcgcac ctcgaggcac   1020
acggcatcca ggtgctggtg gaccagccca tggtcgggca gggcgtggcc gacaacccca   1080
tgaactcggt cttcatcccg tcgccggtgc cggtggggct ctccctggtg caggtcgtcg   1140
ggatcaccaa gtccggcagc ttcatcgagg gcgtgagcgg ctccgagttc ggcatcccgg   1200
tctccgacgg cgcccgccgc ctggccagct tcggcctctt ctccccccag accgggcagc   1260
tcggcacgct gccgccgggg cagaggacgc cggaggcgct gcagcgcgcg gcggaggcga   1320
tgaggcggct ggacaggcgg gcgttccggg gcgggttcat cctggagaag atcctggggc   1380
cggtgtccac gggccacatc gagctgcgca gcaccgaccc gcgcgcgaac ccggcggtga   1440
cgttcaacta cttccaggag gcggaggacc tggagcggtg cgtccggggg atccagacga   1500
tcgagcgggt gatccagtcg cgcgccttct ccaacttcac ctacgccaac accaccgtcg   1560
agtccatctt caccgactcg gccaacttcc ccgtcaacct gctgccgcgg cacgtcaacg   1620
actcccgctc gccggagcag tactgcaggg agaccgtcat gaccatctgg cactaccacg   1680
gcggatgcca cgtcggcgcc gtcgtcgacg acaactaccg ggtgttcggg gtgagggggc   1740
tcagggtgat cgacagctcc accttcaggt actcccccgg caccaacccg caggccaccg   1800
tcatgatgct cggcaggtaa acgcaagtct gaaatgaccc tcgcaattat actgatctga   1860
atgaatgaat caactcaact caactaacac aactatgata aatctgtaca ggtatatggg   1920
cataaagatt caggccgaga gatggaggaa atga                               1954
<210>  3
<211>  1952
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  3
atggcacttg gccgcgcgag atcgccgacg ctggtgctcg ccgccgcggt ccttggcgcg     60
ctctgcgtcg tcgcactctc ggaggacggt gcgtgtgttc acctgcatgg tttttctggg    120
ggttttgcac gtcagctacg tgcgttgtct cttttatcat gatcactgga cgctgtgatg    180
accaatggtg ccatacgtgt gcagagcaac tggagaacct gcggttcgtg cagcacgcgc    240
aggacgcgcc gctggtgtcg cactacaact acatcgtggt cggcggcggc acgtccgggt    300
gcccgctggc ggcgacgctg tcggagcact cgcgggtgct gctgctggag cgcgggggcc    360
tcccctaccg caacatgtcc aaccaggagc acttcacgga tgcgctggcc gacacgtcgc    420
tggcgtcccc ggcccagcgg ttcgtctcca cggacggcgt ggtgaacgcg cgggcgcggg    480
tgctgggcgg cgggagctgc ctcaacgccg ggttctacac gcgggccagc aacgagtacg    540
tgcgcacggc cgggtgggac gccggcctcg tcaactcgtc gtaccggtgg gtggagcgcg    600
cgctggtgtt ccgccccgac gtgccgccgt ggcaggccgc gctccgggac gcgctgctcg    660
aggccggcgt cacccccgac aacggcttca ccttcgacca cgtcacgggg accaagatcg    720
gcggcaccat cttcgacaac agcgggcagc gccacaccgc ggccgacttc ctccggcacg    780
cccggccccg gcggctcacc gtcgtgctct acgccacggt gtcgcggatc ctgttcagaa    840
gccaggaggg ggtgccgtac ccggtggcgt acggggtggt gttcgcggac ccgctggggg    900
tgcagcaccg ggtgtacctc cgggacggcg ggaagaacga ggtgatactg tcggcgggga    960
cgctggggag cccgcagctg ctgatgctga gcggcgtggg cccgcaggcg cacctggagg   1020
cgcacggcat ccaggtgctg gtggaccagc ccatggtcgg gcagggcgtg gccgacaacc   1080
ccatgaactc ggtcttcatc ccgtcgccgg tgccggtggg gctctccctg gtgcaggtcg   1140
tcgggatcac caagtccggc agcttcatcg agggcgtgag cggctccgag ttcggcatcc   1200
cggtctccga cggcgcccgc cgcctggcca gcttcggcct cttctccccc cagaccgggc   1260
agctcggcac gctgccgccg gggcagagga cgccggaggc gctgcagcgc gcggcggagg   1320
cgatgaggcg gctggacagg cgggcgttcc ggggcggctt catcctggag aagatcctgg   1380
ggccggtgtc gacggggcac atcgagctgc gcagcaccga cccgcgcgcc aacccggccg   1440
tgaccttcaa ctacttccag gaggcggagg acctggagcg gtgcgtccgg gggatccaga   1500
cgatcgagcg ggtgatccag tcgcgcgcct tctccaactt cacctacgcc aacaccaccg   1560
tcgagtccat cttcaccgac tcggccaact tccccgtcaa cctgctgccg cggcacgtca   1620
acgactcccg ctcgccggag cagtactgca gggagaccgt catgaccatc tggcactacc   1680
acggcgggtg ccacgtcggc gccgtcgtcg acgacaacta ccgggtgttc ggggtgaggg   1740
ggctcagggt catcgacagc tccaccttca ggtactcccc cggcaccaac ccacaggcca   1800
ccgtcatgat gctcggcagg taaacgcaag tctgagatga cccccgcaat tatactgatc   1860
tgaatgaatg aatcaactct actaacacaa ctatgataac tctgtacagg tatatgggca   1920
taaagattca ggccgagaga tggaggaaat ga                                 1952
<210>  4
<211>  1746
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  4
atggcacttg gccgcgcgag atcgccggcg ctggtgctcg ccgccgccgt ccttggcgcg     60
ctctgcgtcg tcgcgctctc ggaggatgag caactggaga acctgcggtt cgtgcagcac    120
gcgcaggacg cgccgctggt gtcgcactac aactacatcg tggtgggcgg cggcacgtcc    180
gggtgcccgc tggcggcgac gctgtcggag cactcgcggg tgctgctgct ggagcgcggg    240
ggcctcccct accgcaacat gtccaaccag gagcacttca cggacgcgct ggccgacacg    300
tcgctggcgt ccccggcgca gcggttcgtg tccacggacg gcgtggtgaa cgcgcgggcg    360
cgggtgctgg gcggcgggag ctgcctcaac gccgggttct acacgcgggc cagcaacgag    420
tacgtgcgca cggccgggtg ggacgccggc ctcgtcaact cgtcgtaccg gtgggtggag    480
cgcgcgctgg tgttccgccc ggacgtgccg ccgtggcagg ccgcgctccg ggacgcgctg    540
ctggaggccg gcgtcacccc cgacaacggc ttcaccttcg accacgtcac ggggaccaag    600
atcggcggca ccatcttcga caacaacggg cagcgccaca cggccgccga cttcctccgg    660
cacgcccggc cgcgggggct caccgtggtg ctctacgcca cggtgtcgcg ggtcctgttc    720
aggagccagg agggggtgcc gtacccggtg gcgtacgggg tggtgttcgc ggacccgctg    780
ggggtgcagc accgggtgta cctccgggac gggggcaaga acgaggtgat cctgtcggcg    840
gggacgctgg ggagcccgca gctgctgatg ctgagcggcg tgggcccgca ggtgcacctg    900
gaggcgcaca gcatccaggt gctggtggac cagcccatgg tcgggcaggg cgtggccgac    960
aaccccatga actcggtctt catcccgtcg ccggtgccgg tggggctgtc cctggtgcag   1020
gtcgtcggga tcaccaagtc cggcagcttc atcgagggcg tgagcggctc cgagttcggc   1080
atcccggtgt ccaacggcgc ccgccggctg gccagcttcg ggctcttctc cccgcagacc   1140
gggcagctcg gcacgctgcc gccggggcag aggacgccgg aggcgctgca gcgcgcggcg   1200
gaggcgatgc ggcggctgga caggcgggcg ttccggggcg gcttcatcct ggagaagatc   1260
ctggggccgg tgtcgacggg gcacatcgag ctgcgcagca ccgacccgcg cgccaacccg   1320
gccgtgacct tcaactactt ccaggaggcg gaggacctgg agcggtgcgt ccgggggatc   1380
cagacgatcg agcgggtgat ccagtcgcgc gccttctcca acttcaccta cgccaacacc   1440
accgtggagt ccatcttcac cgactcggcc aacttccccg tcaacctgct gccgcgccac   1500
gtcaacgact cccgctcgcc ggagcagtac tgcagggaga ccgtcatgac catctggcac   1560
taccacggcg ggtgccacgt cggcgccgtc gtcgacgaca actaccgggt gttcggggtc   1620
agggggctca gggtcatcga cagctccacc ttcaggtact cccccggcac caacccgcag   1680
gccaccgtca tgatgctcgg caggtatatg ggcataaaga ttcaggccga gagatggagg   1740
aaatga                                                              1746
<210>  5
<211>  1746
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  5
atggcacttg gccgcgcgag atcaccggcg ctggtgctcg ccgccgccgt tcttggcgcg     60
ctctgcatcg tcgcactctc ggaggatgag caactggaga acctgcggtt cgtgcagcac    120
gcgcaggacg cgccgctggt gtcgcactac aactacatcg tggtcggcgg cggcacgtcc    180
gggtgcccgc tggcggcgac gctgtcggag cactcgcggg tgctcctgct ggagcgcggg    240
ggcctcccct accgcaacat gtcgaaccag gagcacttca cggacgcgct ggccgacacg    300
tcgctggcgt ccccggccca gcggttcatc tccacggacg gcgtggtgaa cgcgcgggcg    360
cgggtgctgg gcggcgggag ctgcctcaac gccggattct acacgcgggc cagcaacgag    420
tacgtgcgca cggccgggtg ggacgccggc ctcgtgaact cgtcgtatcg gtgggtggag    480
cgcgcgctgg tgttccgccc cgacgtgccg ccgtggcagg ccgcgctccg ggacgcgctg    540
ctcgaggccg gcgtcacccc cgacaacggc ttcaccttcg atcacgtcac ggggaccaag    600
atcggcggca ccatcttcga caacaacggg cagcgccaca cggccgccga cttcctccgg    660
cacgcccggc cccgggggct caccgtcgtg ctctacgcca cggtgtcccg gatcctgttc    720
agaagccagg agggggtgcc gtatccggtg gcgtacgggg tggtgttcgc ggacccgctg    780
ggggtgcagc accgggtgta cctccgggac ggggggaaga acgaggtgat actgtcggcg    840
gggacgctgg ggagcccgca gctgctgatg ctgagcggcg tcggcccgca ggcgcacctc    900
gaggcacacg gcatccaggt gctggtggac cagcccatgg tcgggcaggg cgtggccgac    960
aaccccatga actcggtctt catcccgtcg ccggtgccgg tggggctctc cctggtgcag   1020
gtcgtcggga tcaccaagtc cggcagcttc atcgagggcg tgagcggctc cgagttcggc   1080
atcccggtct ccgacggcgc ccgccgcctg gccagcttcg gcctcttctc cccccagacc   1140
gggcagctcg gcacgctgcc gccggggcag aggacgccgg aggcgctgca gcgcgcggcg   1200
gaggcgatga ggcggctgga caggcgggcg ttccggggcg ggttcatcct ggagaagatc   1260
ctggggccgg tgtccacggg ccacatcgag ctgcgcagca ccgacccgcg cgcgaacccg   1320
gcggtgacgt tcaactactt ccaggaggcg gaggacctgg agcggtgcgt ccgggggatc   1380
cagacgatcg agcgggtgat ccagtcgcgc gccttctcca acttcaccta cgccaacacc   1440
accgtcgagt ccatcttcac cgactcggcc aacttccccg tcaacctgct gccgcggcac   1500
gtcaacgact cccgctcgcc ggagcagtac tgcagggaga ccgtcatgac catctggcac   1560
taccacggcg gatgccacgt cggcgccgtc gtcgacgaca actaccgggt gttcggggtg   1620
agggggctca gggtgatcga cagctccacc ttcaggtact cccccggcac caacccgcag   1680
gccaccgtca tgatgctcgg caggtatatg ggcataaaga ttcaggccga gagatggagg   1740
aaatga                                                              1746
<210>  6
<211>  1746
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  6
atggcacttg gccgcgcgag atcgccgacg ctggtgctcg ccgccgcggt ccttggcgcg     60
ctctgcgtcg tcgcactctc ggaggacgag caactggaga acctgcggtt cgtgcagcac    120
gcgcaggacg cgccgctggt gtcgcactac aactacatcg tggtcggcgg cggcacgtcc    180
gggtgcccgc tggcggcgac gctgtcggag cactcgcggg tgctgctgct ggagcgcggg    240
ggcctcccct accgcaacat gtccaaccag gagcacttca cggatgcgct ggccgacacg    300
tcgctggcgt ccccggccca gcggttcgtc tccacggacg gcgtggtgaa cgcgcgggcg    360
cgggtgctgg gcggcgggag ctgcctcaac gccgggttct acacgcgggc cagcaacgag    420
tacgtgcgca cggccgggtg ggacgccggc ctcgtcaact cgtcgtaccg gtgggtggag    480
cgcgcgctgg tgttccgccc cgacgtgccg ccgtggcagg ccgcgctccg ggacgcgctg    540
ctcgaggccg gcgtcacccc cgacaacggc ttcaccttcg accacgtcac ggggaccaag    600
atcggcggca ccatcttcga caacagcggg cagcgccaca ccgcggccga cttcctccgg    660
cacgcccggc cccggcggct caccgtcgtg ctctacgcca cggtgtcgcg gatcctgttc    720
agaagccagg agggggtgcc gtacccggtg gcgtacgggg tggtgttcgc ggacccgctg    780
ggggtgcagc accgggtgta cctccgggac ggcgggaaga acgaggtgat actgtcggcg    840
gggacgctgg ggagcccgca gctgctgatg ctgagcggcg tgggcccgca ggcgcacctg    900
gaggcgcacg gcatccaggt gctggtggac cagcccatgg tcgggcaggg cgtggccgac    960
aaccccatga actcggtctt catcccgtcg ccggtgccgg tggggctctc cctggtgcag   1020
gtcgtcggga tcaccaagtc cggcagcttc atcgagggcg tgagcggctc cgagttcggc   1080
atcccggtct ccgacggcgc ccgccgcctg gccagcttcg gcctcttctc cccccagacc   1140
gggcagctcg gcacgctgcc gccggggcag aggacgccgg aggcgctgca gcgcgcggcg   1200
gaggcgatga ggcggctgga caggcgggcg ttccggggcg gcttcatcct ggagaagatc   1260
ctggggccgg tgtcgacggg gcacatcgag ctgcgcagca ccgacccgcg cgccaacccg   1320
gccgtgacct tcaactactt ccaggaggcg gaggacctgg agcggtgcgt ccgggggatc   1380
cagacgatcg agcgggtgat ccagtcgcgc gccttctcca acttcaccta cgccaacacc   1440
accgtcgagt ccatcttcac cgactcggcc aacttccccg tcaacctgct gccgcggcac   1500
gtcaacgact cccgctcgcc ggagcagtac tgcagggaga ccgtcatgac catctggcac   1560
taccacggcg ggtgccacgt cggcgccgtc gtcgacgaca actaccgggt gttcggggtg   1620
agggggctca gggtcatcga cagctccacc ttcaggtact cccccggcac caacccacag   1680
gccaccgtca tgatgctcgg caggtatatg ggcataaaga ttcaggccga gagatggagg   1740
aaatga                                                              1746
<210>  7
<211>  581
<212>  PRT
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  7
Met Ala Leu Gly Arg Ala Arg Ser Pro Ala Leu Val Leu Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Val Leu Gly Ala Leu Cys Val Val Ala Leu Ser Glu Asp Glu Gln Leu
20                  25                  30
Glu Asn Leu Arg Phe Val Gln His Ala Gln Asp Ala Pro Leu Val Ser
35                  40                  45
His Tyr Asn Tyr Ile Val Val Gly Gly Gly Thr Ser Gly Cys Pro Leu
50                  55                  60
Ala Ala Thr Leu Ser Glu His Ser Arg Val Leu Leu Leu Glu Arg Gly
65                  70                  75                  80
Gly Leu Pro Tyr Arg Asn Met Ser Asn Gln Glu His Phe Thr Asp Ala
85                  90                  95
Leu Ala Asp Thr Ser Leu Ala Ser Pro Ala Gln Arg Phe Val Ser Thr
100                 105                 110
Asp Gly Val Val Asn Ala Arg Ala Arg Val Leu Gly Gly Gly Ser Cys
115                 120                 125
Leu Asn Ala Gly Phe Tyr Thr Arg Ala Ser Asn Glu Tyr Val Arg Thr
130                 135                 140
Ala Gly Trp Asp Ala Gly Leu Val Asn Ser Ser Tyr Arg Trp Val Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ala Leu Val Phe Arg Pro Asp Val Pro Pro Trp Gln Ala Ala Leu
165                 170                 175
Arg Asp Ala Leu Leu Glu Ala Gly Val Thr Pro Asp Asn Gly Phe Thr
180                 185                 190
Phe Asp His Val Thr Gly Thr Lys Ile Gly Gly Thr Ile Phe Asp Asn
195                 200                 205
Asn Gly Gln Arg His Thr Ala Ala Asp Phe Leu Arg His Ala Arg Pro
210                 215                 220
Arg Gly Leu Thr Val Val Leu Tyr Ala Thr Val Ser Arg Val Leu Phe
225                 230                 235                 240
Arg Ser Gln Glu Gly Val Pro Tyr Pro Val Ala Tyr Gly Val Val Phe
245                 250                 255
Ala Asp Pro Leu Gly Val Gln His Arg Val Tyr Leu Arg Asp Gly Gly
260                 265                 270
Lys Asn Glu Val Ile Leu Ser Ala Gly Thr Leu Gly Ser Pro Gln Leu
275                 280                 285
Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Gln Val His Leu Glu Ala His Ser
290                 295                 300
Ile Gln Val Leu Val Asp Gln Pro Met Val Gly Gln Gly Val Ala Asp
305                 310                 315                 320
Asn Pro Met Asn Ser Val Phe Ile Pro Ser Pro Val Pro Val Gly Leu
325                 330                 335
Ser Leu Val Gln Val Val Gly Ile Thr Lys Ser Gly Ser Phe Ile Glu
340                 345                 350
Gly Val Ser Gly Ser Glu Phe Gly Ile Pro Val Ser Asn Gly Ala Arg
355                 360                 365
Arg Leu Ala Ser Phe Gly Leu Phe Ser Pro Gln Thr Gly Gln Leu Gly
370                 375                 380
Thr Leu Pro Pro Gly Gln Arg Thr Pro Glu Ala Leu Gln Arg Ala Ala
385                 390                 395                 400
Glu Ala Met Arg Arg Leu Asp Arg Arg Ala Phe Arg Gly Gly Phe Ile
405                 410                 415
Leu Glu Lys Ile Leu Gly Pro Val Ser Thr Gly His Ile Glu Leu Arg
420                 425                 430
Ser Thr Asp Pro Arg Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Asn Tyr Phe Gln
435                 440                 445
Glu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Cys Val Arg Gly Ile Gln Thr Ile Glu
450                 455                 460
Arg Val Ile Gln Ser Arg Ala Phe Ser Asn Phe Thr Tyr Ala Asn Thr
465                 470                 475                 480
Thr Val Glu Ser Ile Phe Thr Asp Ser Ala Asn Phe Pro Val Asn Leu
485                 490                 495
Leu Pro Arg His Val Asn Asp Ser Arg Ser Pro Glu Gln Tyr Cys Arg
500                 505                 510
Glu Thr Val Met Thr Ile Trp His Tyr His Gly Gly Cys His Val Gly
515                 520                 525
Ala Val Val Asp Asp Asn Tyr Arg Val Phe Gly Val Arg Gly Leu Arg
530                 535                 540
Val Ile Asp Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ser Pro Gly Thr Asn Pro Gln
545                 550                 555                 560
Ala Thr Val Met Met Leu Gly Arg Tyr Met Gly Ile Lys Ile Gln Ala
565                 570                 575
Glu Arg Trp Arg Lys
580
<210>  8
<211>  581
<212>  PRT
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  8
Met Ala Leu Gly Arg Ala Arg Ser Pro Ala Leu Val Leu Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Val Leu Gly Ala Leu Cys Ile Val Ala Leu Ser Glu Asp Glu Gln Leu
20                  25                  30
Glu Asn Leu Arg Phe Val Gln His Ala Gln Asp Ala Pro Leu Val Ser
35                  40                  45
His Tyr Asn Tyr Ile Val Val Gly Gly Gly Thr Ser Gly Cys Pro Leu
50                  55                  60
Ala Ala Thr Leu Ser Glu His Ser Arg Val Leu Leu Leu Glu Arg Gly
65                  70                  75                  80
Gly Leu Pro Tyr Arg Asn Met Ser Asn Gln Glu His Phe Thr Asp Ala
85                  90                  95
Leu Ala Asp Thr Ser Leu Ala Ser Pro Ala Gln Arg Phe Ile Ser Thr
100                 105                 110
Asp Gly Val Val Asn Ala Arg Ala Arg Val Leu Gly Gly Gly Ser Cys
115                 120                 125
Leu Asn Ala Gly Phe Tyr Thr Arg Ala Ser Asn Glu Tyr Val Arg Thr
130                 135                 140
Ala Gly Trp Asp Ala Gly Leu Val Asn Ser Ser Tyr Arg Trp Val Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ala Leu Val Phe Arg Pro Asp Val Pro Pro Trp Gln Ala Ala Leu
165                 170                 175
Arg Asp Ala Leu Leu Glu Ala Gly Val Thr Pro Asp Asn Gly Phe Thr
180                 185                 190
Phe Asp His Val Thr Gly Thr Lys Ile Gly Gly Thr Ile Phe Asp Asn
195                 200                 205
Asn Gly Gln Arg His Thr Ala Ala Asp Phe Leu Arg His Ala Arg Pro
210                 215                 220
Arg Gly Leu Thr Val Val Leu Tyr Ala Thr Val Ser Arg Ile Leu Phe
225                 230                 235                 240
Arg Ser Gln Glu Gly Val Pro Tyr Pro Val Ala Tyr Gly Val Val Phe
245                 250                 255
Ala Asp Pro Leu Gly Val Gln His Arg Val Tyr Leu Arg Asp Gly Gly
260                 265                 270
Lys Asn Glu Val Ile Leu Ser Ala Gly Thr Leu Gly Ser Pro Gln Leu
275                 280                 285
Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Gln Ala His Leu Glu Ala His Gly
290                 295                 300
Ile Gln Val Leu Val Asp Gln Pro Met Val Gly Gln Gly Val Ala Asp
305                 310                 315                 320
Asn Pro Met Asn Ser Val Phe Ile Pro Ser Pro Val Pro Val Gly Leu
325                 330                 335
Ser Leu Val Gln Val Val Gly Ile Thr Lys Ser Gly Ser Phe Ile Glu
340                 345                 350
Gly Val Ser Gly Ser Glu Phe Gly Ile Pro Val Ser Asp Gly Ala Arg
355                 360                 365
Arg Leu Ala Ser Phe Gly Leu Phe Ser Pro Gln Thr Gly Gln Leu Gly
370                 375                 380
Thr Leu Pro Pro Gly Gln Arg Thr Pro Glu Ala Leu Gln Arg Ala Ala
385                 390                 395                 400
Glu Ala Met Arg Arg Leu Asp Arg Arg Ala Phe Arg Gly Gly Phe Ile
405                 410                 415
Leu Glu Lys Ile Leu Gly Pro Val Ser Thr Gly His Ile Glu Leu Arg
420                 425                 430
Ser Thr Asp Pro Arg Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Asn Tyr Phe Gln
435                 440                 445
Glu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Cys Val Arg Gly Ile Gln Thr Ile Glu
450                 455                 460
Arg Val Ile Gln Ser Arg Ala Phe Ser Asn Phe Thr Tyr Ala Asn Thr
465                 470                 475                 480
Thr Val Glu Ser Ile Phe Thr Asp Ser Ala Asn Phe Pro Val Asn Leu
485                 490                 495
Leu Pro Arg His Val Asn Asp Ser Arg Ser Pro Glu Gln Tyr Cys Arg
500                 505                 510
Glu Thr Val Met Thr Ile Trp His Tyr His Gly Gly Cys His Val Gly
515                 520                 525
Ala Val Val Asp Asp Asn Tyr Arg Val Phe Gly Val Arg Gly Leu Arg
530                 535                 540
Val Ile Asp Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ser Pro Gly Thr Asn Pro Gln
545                 550                 555                 560
Ala Thr Val Met Met Leu Gly Arg Tyr Met Gly Ile Lys Ile Gln Ala
565                 570                 575
Glu Arg Trp Arg Lys
580
<210>  9
<211>  581
<212>  PRT
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  9
Met Ala Leu Gly Arg Ala Arg Ser Pro Thr Leu Val Leu Ala Ala Ala
1               5                   10                  15
Val Leu Gly Ala Leu Cys Val Val Ala Leu Ser Glu Asp Glu Gln Leu
20                  25                  30
Glu Asn Leu Arg Phe Val Gln His Ala Gln Asp Ala Pro Leu Val Ser
35                  40                  45
His Tyr Asn Tyr Ile Val Val Gly Gly Gly Thr Ser Gly Cys Pro Leu
50                  55                  60
Ala Ala Thr Leu Ser Glu His Ser Arg Val Leu Leu Leu Glu Arg Gly
65                  70                  75                  80
Gly Leu Pro Tyr Arg Asn Met Ser Asn Gln Glu His Phe Thr Asp Ala
85                  90                  95
Leu Ala Asp Thr Ser Leu Ala Ser Pro Ala Gln Arg Phe Val Ser Thr
100                 105                 110
Asp Gly Val Val Asn Ala Arg Ala Arg Val Leu Gly Gly Gly Ser Cys
115                 120                 125
Leu Asn Ala Gly Phe Tyr Thr Arg Ala Ser Asn Glu Tyr Val Arg Thr
130                 135                 140
Ala Gly Trp Asp Ala Gly Leu Val Asn Ser Ser Tyr Arg Trp Val Glu
145                 150                 155                 160
Arg Ala Leu Val Phe Arg Pro Asp Val Pro Pro Trp Gln Ala Ala Leu
165                 170                 175
Arg Asp Ala Leu Leu Glu Ala Gly Val Thr Pro Asp Asn Gly Phe Thr
180                 185                 190
Phe Asp His Val Thr Gly Thr Lys Ile Gly Gly Thr Ile Phe Asp Asn
195                 200                 205
Ser Gly Gln Arg His Thr Ala Ala Asp Phe Leu Arg His Ala Arg Pro
210                 215                 220
Arg Arg Leu Thr Val Val Leu Tyr Ala Thr Val Ser Arg Ile Leu Phe
225                 230                 235                 240
Arg Ser Gln Glu Gly Val Pro Tyr Pro Val Ala Tyr Gly Val Val Phe
245                 250                 255
Ala Asp Pro Leu Gly Val Gln His Arg Val Tyr Leu Arg Asp Gly Gly
260                 265                 270
Lys Asn Glu Val Ile Leu Ser Ala Gly Thr Leu Gly Ser Pro Gln Leu
275                 280                 285
Leu Met Leu Ser Gly Val Gly Pro Gln Ala His Leu Glu Ala His Gly
290                 295                 300
Ile Gln Val Leu Val Asp Gln Pro Met Val Gly Gln Gly Val Ala Asp
305                 310                 315                 320
Asn Pro Met Asn Ser Val Phe Ile Pro Ser Pro Val Pro Val Gly Leu
325                 330                 335
Ser Leu Val Gln Val Val Gly Ile Thr Lys Ser Gly Ser Phe Ile Glu
340                 345                 350
Gly Val Ser Gly Ser Glu Phe Gly Ile Pro Val Ser Asp Gly Ala Arg
355                 360                 365
Arg Leu Ala Ser Phe Gly Leu Phe Ser Pro Gln Thr Gly Gln Leu Gly
370                 375                 380
Thr Leu Pro Pro Gly Gln Arg Thr Pro Glu Ala Leu Gln Arg Ala Ala
385                 390                 395                 400
Glu Ala Met Arg Arg Leu Asp Arg Arg Ala Phe Arg Gly Gly Phe Ile
405                 410                 415
Leu Glu Lys Ile Leu Gly Pro Val Ser Thr Gly His Ile Glu Leu Arg
420                 425                 430
Ser Thr Asp Pro Arg Ala Asn Pro Ala Val Thr Phe Asn Tyr Phe Gln
435                 440                 445
Glu Ala Glu Asp Leu Glu Arg Cys Val Arg Gly Ile Gln Thr Ile Glu
450                 455                 460
Arg Val Ile Gln Ser Arg Ala Phe Ser Asn Phe Thr Tyr Ala Asn Thr
465                 470                 475                 480
Thr Val Glu Ser Ile Phe Thr Asp Ser Ala Asn Phe Pro Val Asn Leu
485                 490                 495
Leu Pro Arg His Val Asn Asp Ser Arg Ser Pro Glu Gln Tyr Cys Arg
500                 505                 510
Glu Thr Val Met Thr Ile Trp His Tyr His Gly Gly Cys His Val Gly
515                 520                 525
Ala Val Val Asp Asp Asn Tyr Arg Val Phe Gly Val Arg Gly Leu Arg
530                 535                 540
Val Ile Asp Ser Ser Thr Phe Arg Tyr Ser Pro Gly Thr Asn Pro Gln
545                 550                 555                 560
Ala Thr Val Met Met Leu Gly Arg Tyr Met Gly Ile Lys Ile Gln Ala
565                 570                 575
Glu Arg Trp Arg Lys
580
<210>  10
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  10
atactgacac aagtttatgg ggctg                                           25
<210>  11
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  11
aattacattc aaatatggct ccttg                                           25
<210>  12
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  12
ggcctcgtga actcgtcgta tc                                              22
<210>  13
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  13
tgaattacat gcaaatttgg ctccg                                           25
<210>  14
<211>  23
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  14
atgtccaacc aggagcactt cac                                             23
<210>  15
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  15
gcacagtttt ttgaagcaat gttg                                            24
<210>  16
<211>  2601
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  16
tgactctgtc catcctgaac caaaagaatg ggaaacactt gactaaaact tcaggttcaa     60
ctctccttag caagtaccag tgctactgat atgtgtgatt caagcagcta gtttttgtaa    120
cctcatgatg attacagttg atcttacttt tgtggtgatc acaggtctct tcatatgtga    180
tggcggatgg ggttggccta actttcttgc tctcaagaaa ctcaagaaag gctatgttgt    240
agggtcgagc tgcattgtga aggcagatct cactatcgtt ggtttatcca atgatggcta    300
gatctttacc tcatgccgat ggagataaag ccctttcatc ctcctagcaa gacttatata    360
tgagataatg ttgtggtagc agcactaaaa acttgtgggg tgattagtag taatgagctg    420
gatttgagaa gtgagatgac ttcacgcata tatttctagg tattatatat caagcagaaa    480
tatgttattg gaagtacttg agtttgcatg gatgatgcaa ctatgtcggt cagcttgtct    540
cgctacatgg atgtttgatt cagctgaacc atgttatctc tcgcttggtt tttgtgcacc    600
atggatgtcc ccagttgatg aatcttatgg ttccatgtaa agcactttgc ttctatttat    660
tttgagaagg aaaacggctc ttcccttgtc caccgtccat ttattttgat cccatggtcc    720
aggttttaga actcctagtc ccggaaataa acaactatct tgcaagtgct tcatgtacaa    780
ttgcaacgat gagcaggtga ctaacctaat actccctccg tttctaaata tttgtctttc    840
tagatatttt aacaagtgac tacatacgga gcaaaatgag tggatctaca ctctaaaata    900
tgtctacgta catccgtata tagtagccat ttgaaatgtc tagaaagaca aatatttagg    960
aacagaggga gtatttatta tacttttata aagaatgttg gagtacccat ctctggggag   1020
cctctgcgtg tgaaaatgtc ctccgcgctg tttgttgcac gttggccacc cgcggctggc   1080
tccctggggc gctccgggcc atcgatctag gcggccgcct cgcacccgga ctgcttgcct   1140
ctgggtccat gacgaggggg tgcgggcgcg gttggatcca tcgtgatgtg gtgtttttgg   1200
tcacaccagt ttgtgccctc ttgttggttg tcctgcgcgt gatgggccga ccgaatctgc   1260
ctgtctgtcg tgttgaccac ccgcggctag ctccctgggg cgctccgggc cattgatcta   1320
ggcagccgcc tcgcacctgg actgcttgcc tctgggtcca tgacgagggg tgcgggtgca   1380
gtcggatcca tcgtgatgtg gtgttttcgg tcacaccagt ttgtgccctc ttgttgattg   1440
ccctgcgcgt gatgggctga ccggatctgc ctgttagtgt tgtgttggcc acccgcggct   1500
ggctccttgg ggcgctccag gtcatcgatc taggcggtcg cctcgcaccc ggactgcttg   1560
cctctgggtc catgacgaga ggatgcgggc gcggtcggat ccatcatgat gtggtgtttt   1620
cggtcacacc agtttgtgct ctcttgttgg ttgtcctgcg cgtgatgggc cgaccggatc   1680
tgcctgtcag tgttgtgttg gccacccgcg gctggctcct tggggcgctc cgggctatcg   1740
atctaggcgt ccgcctcgca cccggactgc ttgcctctgg gtccatgacg aggaggtgcg   1800
gacgcggtcg gatccatcat gatgtggtgt tttcggtcac accagtttat gccctcttgt   1860
tggttgatct gcgcgtgatg ggccgactag atctgcctgt cagtgttgtg ttggccaccc   1920
gcggctggct ccatggggcg ctccgcgcca tcgatctagg gggccgcctc gcatccagac   1980
tgcttcagga actgacatcc gttcatttat tttgtcagtt catttatttg aggcaaattt   2040
cttcaggaac tgacatccgt tccatggggc atacgttggg gattggtttc tggcgaacgt   2100
tcgccagatt atctttaccg ctttttttta gtttctaggt ttttcttggt attttattat   2160
tttcttatag tttggaccga tctccttaca tcatagtttt gccttggtac ctgtaatatg   2220
tatttgtgct tgtatataaa aatggaggga gtatagtttt ttcgggaaaa atatagtgca   2280
cgcgcaaaac cgtctcaaga tcggccagta aaccctcccc cttgctgctt catcgcattt   2340
gatatgatat actcaacagc tcctcccgtc taaaaagaaa gttcatcact tctgcatttc   2400
acaaccgatg cattccattt gatataacca ttccctttct atactgacac aagtttatgg   2460
ggctgttctt tgcactgcaa ccgcctccgc attatttaac acatctaccc tcgatctacc   2520
cgcgcgctaa ctcgaggttt ataaaccaag cgaacttttc gcgtccctga agcgcaaagg   2580
atgccgagct cgccggcgca a                                             2601
<210>  17
<211>  2635
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  17
tgctgccaaa gaagaatgga gctttggagg tcaaccatta tcgaccaatc agcttgatcc     60
actctgttgc taagctaatc tccaaagtgc tcgttgcaag gctggcaggg gccctggata    120
aaatcatctc accggcgtag actgcatttc agaaaggcaa atgcagccac gagagctatc    180
agtacgtgca aagctgcgtt cggatgttac ataggacgaa gaaaaaggca cttttcttca    240
aactcgacat agcaaaggct tttgattcgg tgacatggga ggacttgctc gagctcaagc    300
aaaaaaatgg gtttccctcc tagatgggga aactggatag cgctgctact ctcttctacc    360
acctcctcct gcttgctcaa cgaaacgcag agccaatcaa tatctcatgg ttgtggcttt    420
aggcagggtg attcgctatc cctgctgctt ttcatcctgg cgatcgaccc tcttcaccac    480
ctccttcaag ctgctgcaga ggaagagatg atcgctcagc tgacaggccg tgggatcagc    540
atgtggatta gcttatacgc tgatgacgcc gtcattttcg ccaacccggt gaaggaagaa    600
gtggacacgc tgttgttttt gctcagcaga ttcggggagg ccacgggact gaagttaaac    660
caggcaaaat ctgaagtcat cccaattaac tgtgctgatg ttcagttaac tgaggttctg    720
caaaactttg gggggctgca gtccacgttc ccaaccacat acctgggact gccaatctct    780
ccaaggaagc taaggctggt gcatttccaa tttatcattg accggatacg ctcaaggttg    840
gctggttgga aaggcaagct gatgaacatg gcaggtagaa gggtactggt gcgtgctgtg    900
ttgatggcac tgccggtgtt tgcaatgaca gtactcaaag tgccgaagaa gattttaaaa    960
gaggtggaaa aagcaaggag gcagtttcta tgggcacatg atgagaatgt cactggcgcc   1020
aaatgcaagg tggcctgggg caaagtctgt cttccggtgg ccaagggggg gctaggtttg   1080
ttggacctcc atcgtttcag cacagctctc cggctgcgct ggttgtggct ctcctggcaa   1140
cagccacacc ggccctggat gaacttcccg gcccaaggag gacctggagc tgtttgcatc   1200
ggccaccttt gtgcacttgg gcaacggaaa aacagcgcgt ttctggactt gcaaatggat   1260
ctgggcggtg gcgctgcaac acgagttccc atcattgttt cagcatgcca gaagaaaaaa   1320
caggatggtt catgatgcgc tgacaaatga cacatgggta cgtgatctcc ggcatggcaa   1380
catagtagag attgctcacc ggtttttgca aatgtggaga aagattcagg gtgcaggcat   1440
tgttctctcc tccaacgagg accggatcag ctgggtggca accagaggag gaggaagcta   1500
ctcggctaag gctgcttacg atctacaaat cagtgacatt cctccttcag gaggcaaagc   1560
tgcgatttgg agggcttggg cgccaggcac ggtgaagatc ttcgcctggc tgctccacca   1620
ggacaagctt tggtgcaacg atcgcctgca acggcgaggg tggcccaatg ggtatttttg   1680
cgtatgctgc aacagaaatc tggaaagctc aatacacctt ttctgggact gcccttttgc   1740
ccgatctgtc tggccggcag tgtcgcgtag atatggttgc gctgtgctca aagaagcgcg   1800
ggacgcaggt cacagttccc tcagacattg ggaaagactg accgcactaa cgcctcaaag   1860
ttgcagaaaa gggctaaggt cgatgctgtt gctgatcact tgggagtttt ggaaagagag   1920
gaacgcgtgt gtatttagag gaaaaacgcc ccagacggag gatgttcagc gagccatcaa   1980
gaacacgatg gagctctggc gggcagcagg agctcgatgc attgaggccc tgttctgtag   2040
cgagataaaa cgtacggctc atgtagctgg cctagttttg gccattctta gctcttctca   2100
aaccatgatc acttgatcgc ccatgtattt cccactgctt tcttctaaat caatgaagca   2160
ggtgaacccg gatctttcaa aaaaaaacct cctgatgtac tcagtgtcgt ggccggtgat   2220
ttaaccgtgt ccactgatta attggaatgt atggtgttcc aggtcaaaaa agaatgtcaa   2280
atgtaattct ttcggaaaaa atatagtgca cgcgcaaaac cgtctcaaga ttggccagta   2340
aaccctctcg cttgctgctc cgtcgcattt gatatactca acagctcctc ctgtctaaaa   2400
agaaagttca tcacttctgc atttcacgac caatgcattg catttgatat aaccattccc   2460
tttctatagt aacacatgtt tatgggctcc tcgcggctct tctttgcact gcaaccgcct   2520
ccgcattatt taacacatct accctcgatc tacccgcgcg ctaactccag gtttataagc   2580
gaagcgaact tttcgcgtcc ctgaagcgta aaggatgccg agctcgccgg cgcaa        2635
<210>  18
<211>  2821
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  18
ctgacatagt acatgtaatc tttaaatcca taaccttctg tttctatcag tgctactagg     60
ttgtaaaatg ttatgtctga caccatcata gatctctcaa tgttgtctct gtcatggaaa    120
tgcatcctca attcccaaac ctcatcatcc agactgcaaa taatataaag cactaatgaa    180
acactaataa aactaataac caaatgtaaa ccctagggca caggacaaac aaagcacaac    240
atcagaacta atctaaaaat gtcaacccta ggcacaggac aaacaaagca cataatctga    300
actaatctaa ataatgtcct agggcacatg acaacaaaat cacaacattt gacacttgta    360
ctgcatttga taggatagaa caatatgaac actaacccta ggggtaccct cgcaacacaa    420
ttgaatggag taccctggca acgcaattga atggagaacg ggaagggaag agcaaagaaa    480
agtggatctc actatacgcc gccgaaggat gacgcgatgt gctggcttcc cgtcgaattg    540
gccttcaccg ccgcggcgaa tgctctggcc gccctgtatt ccatcgaata ttgcgggtcc    600
tcctcctcct cttcctctga cggcttgcta gggttcgaac tcgcgcacag ctcgcctaga    660
tccactgcgg gtcctcctcc actacgtacg atgcgtgcgg cgctgccggg cggagagccg    720
ccaccagcat ctccaccttt cgccggactg cgcatctctg tgtttctatg gaatggcgac    780
ggcaccaatg ggggagggcg acggcagcgg gagcgaggag gagggggaag aagaatgggg    840
gagggcgacg gcggcgggag cgaggaggag ggggaagaag aatgggggag ggcgacggcg    900
gcgggagcga ggaggagggg gaagaagaat gggggagggc gacggcggcg ggagcgagga    960
gggggaaaag agacggatgc gggagtggat gactaaagac gagccctaac ggcgccgtct   1020
aacgccgact gccggctgtc gggacggcct ggagtgccat gtaggcgaaa aacgggccca   1080
acctgtcata aactcactta acacggcccg atccgccgat cagtggtttt tgcaaaacaa   1140
ttacgataga cgtggtgctt tctgcaacaa ttctgtaacc taatgttttc cgcaaaccta   1200
gccctcaaag tggtggtttt atgcaattta ctctgattac agttgatctt acttttgtgg   1260
tgatcacagg tctcttcgta tgtgatggcg gatggggttg gcctaacttt cttggactca   1320
agaaactcaa gaaaggctat gttgtagggt cgagctgcat tgtgaaggca gatctcacta   1380
tcgttggttt atacaatgat ggctagatct ttacctcatg cctatggaga gataaagccc   1440
tttcatcctc ctagcaagac ttatatatga gatgatgttg tggtagcagc actaaaaact   1500
ttttttttag aaaaggagca gcactaaaaa cttggggtga ttagtagtaa tgagctggat   1560
ttgagaagtg agatgacttc acgcatatat ttctaggtat tatatatcaa gcagaaatat   1620
gatattggaa gtacttgtgt ttgcatggat gatgcaacta tgtcggtcag cttgtctcgc   1680
tacatggatg tttgattcag ctaaaccatg ttatctctcg cttggttttt gtgcaccatg   1740
gatgttccag ttgatgaatg gttccatgta aagcgctttg cttctattta ttttgggaag   1800
gaaaacggct ctttccattg tccaccgtcc atttattttg atcccatggg ccagatttta   1860
gaactcccgg tcccggaact aaactaatat ttattacttc tataaagaat gttggagtat   1920
caggtcttcg gggagccttt gcgtgtgaaa atgtcctccg cgttgttcgt tgcatgttgg   1980
ccacccgcgg ttggctccct ggggcgctct gggccgtccg atctaggcag gcgcctcaca   2040
cccggacgac ttgcctatgg gtccatgccg ggggggctgc gggcacggtt gggtccatcg   2100
tgatgtggtg ttttcgatca caccagtttg tgccctcttg ttggttgcct tgcgcgtgac   2160
gggccgaccc tgttggtgta gttcgcttgt gccaggcaag ccgcgcacac ccccggatcg   2220
gggtggcgcg tgttaggaaa ccggagaggg ccatccggcc agccgtcgcg atggcgggcc   2280
agccggccaa ggttcattta tttgaggcaa atttctttag tgacatccgt gctatggggc   2340
gtttgctggg gattggtttc tagcgaacgt tcgccagatt atctttaccg ctttctttta   2400
gtatctaggt ttttcttagt attttattat ttttctcata gtttggaccg atctcctcac   2460
gtcagaatgt caaatgtaat cctttcgaaa aaaatatagt gcacgcgcga aaaccgtctc   2520
aagattggcc agtaaaccct cctgcttact gctccatcgc atttgatata ctccttctgt   2580
gtaaaaagaa tgttcatcac ttttgcattt cacaaccaat gcattgcatt tgatataacc   2640
attccctttc tatagtaaca caagtttatg ggctcctcgc agctgttctt tgcactgcaa   2700
ccgcctccgc attatttaac agatctaccc tcgatctacc cgcgcgctaa ctcgaggttt   2760
ataaaccaag cgaacttttc gcgtccctga agcgcaaagg atgccgagct cgccggcgca   2820
a                                                                   2821
<210>  19
<211>  40
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  19
aagcttctga catagtacat gtaatcttta aatccataac                           40
<210>  20
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  20
ggatccttgc gccggcgagc tcggc                                           25
<210>  21
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  21
ctggtggacc agcccatggt                                                 20
<210>  22
<211>  1453
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  22
tatttcaagg agccatattt gaatgtaatt catggcataa tattgtattt ggggaacctg     60
gtttagacag attaatttgt ttttttccac ttattctcta ggcatagtct tttagtgcct    120
gtttgttgat tattatgaaa cccagtcatc cctttaacat gcatttctct gcattgcaaa    180
ataagaagga aaaacttatg ttgcaaaggc atgacggtgg ttcaagcaac aatacttcga    240
tcaaaaaaat tggaaaccgg ttgccacatc cacctaccaa tttccattga taacaagagt    300
agcaaaccag aatactgtgc aggatgcatt tacagttttg tactagaaac ttaatttcat    360
gaaattacat accactattt tacttggtgg ttgttacatg ctacaaacgc caggttccct    420
tcagagggat ccagcaagcc atcatcttat ctatacaggg accgagtaca tgtcaaagga    480
acatgatgag ttaagaatgg aacagccaaa ggcagaaatg acttgaacat tttttttcct    540
tgtttccaac ttgccctact tgcctgctac ctatatattg gcttgcgaaa ttctctccct    600
acctatgtta tcaggaacca gaaaatgcta cttcggcatc tctgttgtcc agaataccca    660
agaagtcacc aacaattgca tgcttgcata agaataattc atatagtgag gttttcttgg    720
atggccgtga aggagccaca aatgtttccg cccatgtctg ggaatgtcgc acatcctggc    780
aagggtttca ccttgccttt acggtcaaca cttacagggt acttgaggag gtggcctctc    840
atctcagtca cctcatttgc aaagaactga tcccagttat gttgcccgag ttgacgaacc    900
cgcctcatgc actctaggct ctctggatgg ttaaagtctt cctcgataat tccaatatgc    960
tcagcccaga gggacattct gtagccataa atctacataa aaaatcacca aacttgattt   1020
aagagtataa tccagaaata ccagctgcgt cataactaga ttattaccct aagagatgag   1080
atgatatacc ccgacaacct ttttcacttg ctgttttaga atgcacatat tagtatttat   1140
attcacataa ctgtacttgt agaattgcca ccaacagtat ttatgtgtca ttacatgtct   1200
atagtttagt gtatatataa ttgaaaaaaa ggtaaatgtt aaatgggtgt agttggaggc   1260
agtctctcta aataaggtga aacaattgta atgaagcagc agttctaagc aacgcataac   1320
atcaggaaga caagtacaaa atctgcaggc acaatctcaa aatgcaagct catgaaaaca   1380
cctgtcttct gcaggtacca aaagatgtga ttcagcagct tgaacttgaa acatgaggca   1440
ttacctgtcc acg                                                      1453
<210>  23
<211>  1446
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  23
tatttcacgg agccaaattt gcatgtaatt catggcataa tattgtattt gggggacctg     60
gtttagaaca gattaatttg gtttttccac ttattctcta ggcatagtct tttagtgcct    120
gtttgttgat tattatgaaa cccatacatc cctttaacat gcatttctct gcactgtaaa    180
ataagaagga aaacttatgt cccaaaggca tgatggtggt tcaagcaaca atacttcggt    240
aaaaaaatgg aaccggttgc cacatccacc caccaatttc cattgatgac aagaggagca    300
aaccaaggcc caacattgct tcagaatagt gtgaaggatg catttacagt tttgcactag    360
aaactttgtt tcatcaaatt acatataaca tactactatt tctcttggtg gttgtcactt    420
gctacaaacg ccaggttccc ttcagaggga tccagcatgt aatcatctta catatacagg    480
gaccgaatac atgtaaaagg aacatgatta gttaagatgg gaacaaccaa aaggcagaaa    540
tgacttgatt tttttttcct tgtttccaac ttgccctact tgcctgctac ctacatattg    600
gcttgcgaaa ttctctccct acctatgtta tcaggaacca gaaagtgcta cttcggcatc    660
tctgttgtcc ataataccca agaagtcacc aacaattgca tgcttgcata agcagaattc    720
atattgtgag gttttcctgg atggccgtga aggagccaca aatgtttccg cccatgtctg    780
ggaatgtcgc acatcctggc aagggtttca ccttgccttt acggtcaaca cttacagggt    840
acttgaggag gtggcctctc atctcagtca cctcatttgc aaagaactga tcccagttat    900
gttgcccgag ttgacgaacc cgcctcatgc actctaggct ctctggatgg ttaaagtctt    960
cctcgataat tccaatatgc tcagcccaga gggacattct gtagccataa atctacataa   1020
aaaatcacca aacttgattt agagtataat ccagaaatac cagctgcgtc ataagtcata   1080
actagattat taccctaaga gatgagataa tatacccaga caaccttttt cactgctgtt   1140
ttagaatgca catattagta tttaattcac ataagaactg tacttgtaga attgccacca   1200
acagtatgta tgtgtcatta cgtgtctata gtttagtgta tatataatta aaaaaaggta   1260
aatgttaaat gggcgtagtt ggaggcagtc tctctgaaaa cgtaaaaaat aagtaaggtg   1320
aaacaattgt aatgaagcag tggttctaag caacgcataa catcaggaag acaagtacaa   1380
aatctgcagg cacaatctca aaatgcaagc tcatgaaaac acctgtcttc tgcaggtacc   1440
aaaaaa                                                              1446
<210>  24
<211>  1472
<212>  DNA
<213>  Triticum aestivum L.
<400>  24
tatttcacgg agccaaattt gcatgtaatt cgtggcataa tattgtattt gggggacctg     60
gtttagaaca gattaatttg gtttttccac ttattctcta ggcatagtct tttagtgcct    120
gtttgttgat tactatgaaa cccagacatc cctttaacat gcatttctct gcattgcaaa    180
ataagaaaga aaacttatgt tgcaaaggca tgatggtggt tcaagcaaca atacttcggt    240
aaaaaaatgg aaaccggttg caacatccac ccaccaattt ccattgatga caagagtagc    300
aaaccaaggc ccaacattgc ttcaaaaaac tgtgcaggat gcatttacag ttttgcacta    360
gaaacttagt ttcatcaaat tacatataac atactactat ttctcttggt ggttgtcact    420
tgctacaaac gccaggttcc cttcagaggg atccagcatg taatcatctt acctatacag    480
ggaccgaata catgtaaaag gaacatgatt agttaagacg ggaacaacca aaaggcagaa    540
atgacttgaa ttttttttcc ttgtttccaa cttgccctac ttgcctgcta cctacatatt    600
ggcttgcgaa attctctccc tacctatgtt atcaggaacc agaaagtgct acttcggcat    660
ctctgttgtc cagaataccc aagaagccaa caattgcatt cttgcataag cagaattcat    720
attgtgaggt tttcctggat ggccgtgaag gagccacaaa tgtttccgcc catgtctggg    780
aatgtcgcac atcctggcaa gggtttcacc ttgcctttac ggtcaacact tacagggtac    840
ttgaggaggt ggcctctcat ctcagtcacc tcattggcaa agaactgatc ccagttatgt    900
tgcccgagtt gacgaacccg cctcatgcac tctaggctct ctggatggtt aaagtcttcc    960
tcgataattc caatatgctc agcccagagg gacattctgt agccataaat ctacataaaa   1020
gatcaccaaa cttgatttag agtataatcc agaaatacca gctgcgtcat aactagatta   1080
ttaccctata agagatgaga tgatataccc cgacaacctt tttcacttgc tgttttagaa   1140
tgcacatatt agtatttata ttcacataag aactgtactt gtataattgc caccaacagt   1200
atttatgtgc cattacgtgt ctatagttta gtgtatatat aataaaaaag ggtaaatgtt   1260
aaataggtgt agttggaggc agtctctctg aaaacgtaaa aaataagtta aaacaattgt   1320
aatgaagcag cggttctaag caacgcataa catcaggaag acaagtacaa aatctgcagg   1380
cacaatctca aaatgcaagc tcatgagaac acctgtcttc tgcaggtacc aaaaaatgtg   1440
attcagcagc ttgaacttga aacatgaggc at                                 1472
<210>  25
<211>  1487
<212>  DNA
<213>  Zea mays
<400>  25
atggcggcga caatggcagt gacgacgatg gtgacgagga gcaaggagag ctggtcgtca     60
ttgcaggtcc cggcggtggc attcccttgg aagccacgag gtggcaagac cggcggcctc    120
gagttccctc gccgggcgat gttcgccagc gtcggcctca acgtgtgccc gggcgtcccg    180
gcggggcgcg acccgcggga gcccgatccc aaggtcgtcc gggcggcctg cggcctggtc    240
caggcacaag tcctcttcca ggggtttaac tgggagtcgt gcaagcagca gggaggctgg    300
tacaacaggc tcaaggccca ggtcgacgac atcgccaagg ccggcgtcac gcacgtctgg    360
ctgcctccac cctcgcactc cgtctcgcca caaggctaca tgccaggccg cctatacgac    420
ctggacgcgt ccaagtacgg cacggcggcg gagctcaagt ccctgatagc ggcgttccac    480
ggcaggggcg tgcagtgcgt ggcggacatc gtcatcaacc accggtgcgc ggaaaagaag    540
gacgcgcgcg gcgtgtactg catcttcgag ggcgggactc ccgacgaccg cctggactgg    600
ggccccggga tgatctgcag cgacgacacg cagtactcgg acgggacggg gcaccgcgac    660
cgggcgaggg gttcgcggcg gcgcccgaca tcgaccacct caacccgcgc gtgcagcggg    720
agctctccgc ctggctcaac tggctcaggt ccgacgccgt ggggttcgac ggctggcgcc    780
tcgacttcgc caagggctac tcgccggccg tcgccagaat gtacgtggag agcacggggc    840
cgccgagctt cgtcgtcgcg gagatatgga actcgctgag ctacagcggg gacggcaagc    900
cggcgcccaa ccaggaccag tgccggcagg agctgctgga ctggacgcgg gccgtcggcg    960
ggcccgccat ggcgttcgac ttccccacca agggcctgct gcaggcgggc gtgcaggggg   1020
agctgtggcg gctgcgcgac agctccggca acgcggccgg cctgatcggg tgggcgcccg   1080
agaaggccgt caccttcgtc gacaaccatg acaccgggtc gacgcagaag ctctggccgt   1140
tcccatccga caaggtcatg cagggctacg cctacatcct cacccatcca ggagtcccct   1200
gcattttcta cgaccacatg ttcgactgga acctgaagca ggagatatcc acgctgtctg   1260
ccatcagggc gcggaacggc atccgcgccg ggagcaagct gcggatcctc gtggcggacg   1320
cggacgcgta cgtggccgtc gtcgacgaga aggtcatggt gaagatcggg acaaggtacg   1380
gcgtgagcag cgtggtcccg tcggatttcc acccggcggc gcacggcaag gactactgcg   1440
tctgggagaa agcgagcctc cgcgtcccgg cggggcgcca cctctag                 1487
<210>  26
<211>  2736
<212>  DNA
<213>  Zea mays
<400>  26
tgcaccggac actgtctggt ggcataccag acagtccggt gtgccagatc agggcaccct     60
tcggttcctt tgctcctttg cttttgaacc ctaactttga tcgtttattg gtttgtgttg    120
aacctttatg cacctgtgga atatataatc tagaacaaac tagttagtcc aatcatttgt    180
gttgggcatt caaccaccaa aattatttat aggaaaaggt taaaccttat ttccctttca    240
atctccccct ttttggtgat tgatgccaac acaaaccaaa gaaaatatat aagtgcagaa    300
ttgaactagt ttgcataagg taagtgcata ggttacttag aattaaatca atttatactt    360
ttacttgata tgcatggttg ctttctttta ttttaacatt ttggaccaca tttgcaccac    420
ttgttttgtt ttttgcaaat ctttttggaa attctttttc aaagtctttt gcaaatagtc    480
aaaggtatat gaataagatt gtaagaagca ttttcaagat ttgaaatttc tccccctgtt    540
tcaaatgctt ttcctttgac taaacaaaac tccccctgaa taaaattctc ctcttagctt    600
tcaagagggt tttaaataga tatcaattgg aaatatattt agatgctaat tttgaaaata    660
taccaattga aaatcaacat accaatttga aattaaacat accaatttaa aaaatttcaa    720
aaagtggtgg tgcggtcctt ttgctttggg cttaatattt ctcccccttt ggcattaatc    780
gccaaaaacg gagactttgt gagccattta tactttctcc ccattggtaa atgaaatatg    840
agtgaaagat tataccaaat ttggacagtg atgcggagtg acggcgaagg ataaacgata    900
ccgttagagt ggagtggaag ccttgtcttc gccgaagact ccatttccct ttcaatctac    960
gacttagcat agaaatacac ttgaaaacac attagtcgta gccacgaaag agatatgatc   1020
aaaggtatac aaatgagcta tgtgtgtaat gtttcaatca aagtttcgag aatcaagaat   1080
atttagctca ttcctaagtt tgctaaaggt tttatcatct aatggtttgg taaagatatc   1140
gactaattgt tctttggtgc taacataagc aatctcgata tcaccccttt gttggtgatc   1200
cctcaaaaag tgataccgaa tgtctatgtg cttagtgcgg ctgtgttcaa cgggattatc   1260
cgccatgcag atagcactct cattgtcaca taggagaggg actttgctca atttgtagcc   1320
atagtcccta aggttttgcc tcatccaaag taattgcaca caacaatgtc ctgcggcaat   1380
atacttggct tcggcggtag aaagagctat tgagttttgt ttctttgaag tccaagacac   1440
cagggatctc cctagaaact gacaagtccc tgatgtgctc ttcctatcaa ttttacaccc   1500
tgcccaatcg gcatctgaat atcctattaa atcaaaggtg gatcccttgg ggtaccaaag   1560
accaaattta ggagtgtaaa ctaaatatct catgattctt ttcacggccc taaggtgaac   1620
ttccttagga tcggcttgga atcttgcaca catgcatata gaaagcatac tatctggtcg   1680
agatgcacat aaatagagta aagatcctat catcgaccgg tatacctttt ggtctacgga   1740
tttacctccc gtgtcgaggt cgagatgccc attagttccc atgggtgtcc tgatgggctt   1800
ggcatccttc attccaaact tgttgagtat gtcttgaatg tactttgttt ggctgatgaa   1860
ggtgccatct tggagttgct tgacttgaaa tcctagaaaa tatttcaact tccccatcat   1920
agacatctcg aatttcggaa tcatgatcct actaaactct tcacaagtag atttgttagt   1980
agacccaaat ataatatcat caacataaat ttggcataca aacaaaactt ttgaaatggt   2040
tttagtaaag agagtaggat cggctttact gactctgaag ccattagtga taagaaaatc   2100
tcttaggcat tcataccatg ctgttggggc ttgcttgagc ccataaagcg cctttgagag   2160
tttataaaca tggttagggt actcactatc ttcaaagccg agaggttgct caacatagac   2220
ctattcaccc catttgatca cttttttggt ccttcaggat ctaatagtta tgtataattt   2280
agagtctctt gtttaatggc cagatatttc taattaatct aagaatttat gatatttttt   2340
aattttttat catgtctgat gagaattaac ataaaggctc aattgggtcc tgaattaata   2400
atagagtgaa aattaatcca gaggctctat tagaaccttc aattagtaat accaagatat   2460
atataagata gtagagtata gtttaaatgt tggcattgtt cattctttct tttgttattt   2520
aatttatgct ttccacggtg gttagtggtt acttctgaag ggtccaaata atgcatgaag   2580
agtttgagga caagaagtct gccctaaaaa tagcgatgca aaggcatggt gtccaagcca   2640
tacatatagc gcactaattt tatcagcaga acaatggtat ttataggtcc tagtgcccag   2700
gcaacaagag acacgaataa agcatcgatc acgaca                             2736
<210>  27
<211>  344
<212>  DNA
<213>  Zea mays
<400>  27
tgacaaagca gcattagtcc gttgatcggt ggaagaccac tcgtcagtgt tgagttgaat     60
gtttgatcaa taaaatacgg caatgctgta agggttgttt tttatgccat tgataataca    120
ctgtactgtt cagttgttga actctatttc ttagccatgc caagtgcttt tcttattttg    180
aataacatta cagcaaaaag ttgaaagaca aaaaaaaaaa cccccgaaca gagtgctttg    240
ggtcccaagc tactttagac tgtgttcggc gttcccccta aatttctccc cctatatctc    300
actcacttgt cacatcagcg ttctctttcc cctatatctc cacg                     344
<210>  28
<211>  711
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  28
atggtgtcca agggcgagga ggacaacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag     60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc    120
cgcccctacg agggcaccca aaccgccaag ctcaaggtga ccaagggtgg ccccctcccc    180
ttcgcctggg acatcctctc cccacaattc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac    240
cccgccgaca tccccgacta cctcaagctc tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc    300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aagactcctc cctccaagac    360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctccgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta    420
atgcaaaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc    480
gccctcaagg gcgagatcaa gcaaaggctc aagctcaagg acggcggcca ctacgacgcc    540
gaggtgaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcaac tccccggcgc ctacaacgtg    600
aacatcaagc tcgacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga gcaatacgag    660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg a             711
<210>  29
<211>  1149
<212>  DNA
<213>  Artificial Synthesis
<400>  29
cgtcaacatg gtggagcacg acacgcttgt ctactccaaa aatatcaaag atacagtctc     60
agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa acctcctcgg    120
attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc    180
ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag    240
tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac    300
cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tgaattcaac cgtctcttcg tgagaataac    360
cgtggcctaa aaataagccg atgaggataa ataaaatgtg gtggtacagt acttcaagag    420
gtttactcat caagaggatg cttttccgat gagctctagt agtacatcgg acctcacata    480
cctccattgt ggtgaaatat tttgtgctca tttagtgatg ggtaaatttt gtttatgtca    540
ctctaggttt tgacatttca gttttgccac tcttaggttt tgacaaataa tttccattcc    600
gcggcaaaag caaaacaatt ttattttact tttaccactc ttagctttca caatgtatca    660
caaatgccac tctagaaatt ctgtttatgc cacagaatgt gaaaaaaaac actcacttat    720
ttgaagccaa ggtgttcatg gcatggaaat gtgacataaa gtaacgttcg tgtataagaa    780
aaaattgtac tcctcgtaac aagagacgga aacatcatga gacaatcgcg tttggaaggc    840
tttgcatcac ctttggatga tgcgcatgaa tggagtcgtc tgcttgctag ccttcgccta    900
ccgcccactg agtccgggcg gcaactacca tcggcgaacg acccagctga cctctaccga    960
ccggacttga atgcgctacc ttcgtcagcg acgatggccg cgtacgctgg cgacgtgccc   1020
ccgcatgcat ggcggcacat ggcgagctca gaccgtgcgt ggctggctac aaatacgtac   1080
cccgtgagtg ccctagctag aaacttacac ctgcaactgc gagagcgagc gtgtgagtgt   1140
agccgagta                                                           1149
<210>  30
<211>  310
<212>  DNA
<213>  Solanum tuberosum
<400>  30
ctagacttgt ccatcttctg gattggccaa cttaattaat gtatgaaata aaaggatgca     60
cacatagtga catgctaatc actataatgt gggcatcaaa gttgtgtgtt atgtgtaatt    120
actagttatc tgaataaaag agaaagagat catccatatt tcttatccta aatgaatgtc    180
acgtgtcttt ataattcttt gatgaaccag atgcatttca ttaaccaaat ccatatacat    240
ataaatatta atcatatata attaatatca attgggttag caaaacaaat ctagtctagg    300
tgtgttttgc                                                           310
<---