СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕЛАСТРОЛА И ПЕНТАЦИКЛИЧЕСКИХ ТРИТЕРПЕНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
METHOD FOR PRODUCING CELASTROL AND PENTACYCLIC TRITERPENE DERIVATIVES

Настоящее изобретение касается способа получения неочищенного экстракта, обогащенного пентациклическими тритерпенами, а именно целастролом, из суспензионной культуры растительных клеток (РСС) растения семейства Cetastraceae.
Tripterygium wilfordii представляет собой лекарственное растение семейства Cetastraceae, которое в течение столетий использовали в Юго-Восточной Азии (включая Китай) для лечения воспалительных расстройств, аутоиммунных заболеваний и, совсем недавно, рака. Терпены находятся среди самых активных компонентов растения, и они расположены, главным образом, в корнях растений. Среди них пентациклический тритерпен типа норфриделана - целастрол - оценивается на его эффективность в лечении ожирения, ревматоидного артрита, болезни Крона и рака предстательной железы. Спрос на поставки целастрола, следовательно, постоянно возрастает.
Воспалительный дерматоз, а именно псориаз или атопический дерматит, имеет многофакторное происхождение или причины. Причины данных так называемых аутоиммунных заболеваний еще полностью не объяснены, но считается то, что они связаны с неправильной регуляцией иммунной системы, в частности, в показателях клеточных ответов. Клеточные ответы можно классифицировать на 3 категории: Th1, Th2 и, недавно, Th17. Хотя псориаз и атопический дерматит и имеют различия в клинических признаках, считается, что они имеют сходства, в частности, в показателях характеристики экспрессии IL17 (интерлейкин 17) и IL22 ответа Th17 (Miyagaki et al., 2015). IL17 и IL22, следовательно, были бы привлекательными мишенями для лечения данных заболеваний. Таким образом, были разработаны моноклональные антитела против IL17, IL17R (рецептор интерлейкина 17), IL22, IL23, TNF-альфа (фактор некроза опухолей-альфа) для блокирования пути Th17 (Lowes et al., 2014). Данные молекулы являются эффективными для лечения псориаза, но имеют много побочных эффектов и приводят к чрезмерной стоимости лечения.
Кроме того, также известно то, что путь Th17 сильно активируется в поражениях пациентов с угрями (Kelhala et al., 2014).
Целастрол обычно получают способами экстракции растений на основе растворителей из растений семейства Celastraceae. Данные способы биосинтеза включают циклы восьми-десяти лет для достижения зрелости молодым побегом растения, который необходимо умертвить. Кроме того, применение продуктов защиты растений делает данный способ затратным: могут накапливаться внешние загрязнители (тяжелые металлы), и полученный неочищенный экстракт содержит целый ряд метаболитов, которые требуют того, чтобы данный растительный экстракт был подвергнут нескольким этапам очистки для выделения тритерпеновой фракции. Кроме того, данные способы дают низкие выходы целастрола.
Возможен полный химический синтез целастрола (Camelio et al., 2015), но для него требуется двадцать или около того стадий, что существенно увеличивает конечную стоимость получения продукта.
Альтернативным решением было получение целастрола из суспензионных культур клеток из стволовых клеток, полученных из корней или листьев растений. Недавно группа Coppede (Coppede et al., 2014) смогла получить из культуры клеток М. ilicifolia большее количество целастрола, чем количество, полученное традиционной экстракцией из растения (0,304 мг целастрола на г сухой массы, максимальная концентрация, полученная после 8 суток культуры, т.е. в 8,85 раз лучше, чем посредством традиционного способа экстракции). Группа Liu et al. (Liu et al., 2016) также продемонстрировала то, что посредством добавления MeJa (метилжасмонат) (порядка 50 мкМ) в культуру растительных клеток T. wilfordii количество целастрола увеличивается в 4,82 раза относительно культуры без MeJa: концентрация целастрола в мг на г сухой массы составляет 0,752 мг/г (культура с MeJa) относительно 0,154 мг/г (культура без MeJa).
Данные способы обеспечивают улучшенные выходы целастрола. Однако все еще существует подлинная потребность в экономически оправданных способах быстрого получения больших количеств целастрола.
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения неочищенного экстракта, обогащенного целастролом, из растительных клеток растения семейства Cetastraceae.
В самом деле, авторы изобретения неожиданным образом разработали способ увеличения выхода целастрола в культурах растительных клеток из линии T. wilfordii посредством применения и сравнения разных комбинаций элиситоров. В частности, авторы изобретения наблюдали то, что деление клеток и продукция целастрола не являются сопутствующими. Неожиданно, они даже являются несовместимыми. Для решения этой проблемы авторы изобретения разработали способ, который включает стадию пролиферации клеток и стадию элиситации смесью элиситоров, которые останавливают деление клеток. Авторы изобретения также продемонстрировали то, что применение пар элиситоров, а именно: метилжасмоната (MeJa) и хитина, делает возможным получение концентрации целастрола 16,6 мг/г на сухую массу в конце культуры. Выход целастрола в данной подвергнутой воздействию элиситоров культуре, таким образом, в 22 раза больше, чем выход, полученный Liu et al. (в цит. работе). Кроме того, выход посредством способа согласно изобретению в 57 раз больше, чем выход, полученный Coppede et al. (в цит. работе) без элиситации. Способ согласно данному изобретению также делает возможным обогащение производными целастрола, а именно пентациклического тритерпенового типа, такими как тингенин А (также именуемый тингенон или майтенин), тингенин В (также именуемый 22бета-гидрокси-тингенон), пристимерин и триптеригон.
Кроме того, авторы данного изобретения неожиданно показали то, что неочищенный экстракт, обогащенный пентациклическими тритерпенами, полученный данным способом, ингибирует, с эффектом дозы, Th17-специфичные интерлейкины, индуцированные в человеческих Т-клетках CD4+.
Настоящее изобретение, таким образом, касается способа получения неочищенного экстракта, обогащенного пентациклическими тритерпенами, включающего следующие стадии:
(i) фаза пролиферации клеток растения семейства Celastraceae в пролиферационной среде,
(ii) фаза элиситации посредством добавления элиситирующей смеси в культуру клеток, полученную на стадии (i), причем указанная элиситирующая смесь содержит по меньшей мере один элиситор типа монокарбоксильного соединения и по меньшей мере один биотический элиситор, и
(iii) получение неочищенного экстракта, обогащенного пентациклическими тритерпенами, из культуры клеток, полученной на стадии (ii).
Кроме того, настоящее изобретение касается экстракта, получаемого способом согласно изобретению, а также его применений.
Согласно данному изобретению термин «пентациклические тритерпены» означает пентациклические тритерпены, продуцируемые в природе клетками растения семейства Cetastraceae, а именно целастрол (формулы I), тингенин А (также именуемый тингенон или майтенин) (формулы II), тингенин В (также именуемый 22бета-гидрокси-тингенон) (формулы III), пристимерин (формулы IV) и триптеригон (формулы V), а именно: целастрол, тингенин А и тингенин В, а именно: целастрол.
Согласно данному изобретению фраза «неочищенный экстракт, обогащенный пентациклическими тритерпенами)), означает обогащенный неочищенный экстракт, содержащий количество пентациклических тритерпенов, по меньшей мере в 2 раза, а именно - по меньшей мере в 5 раз, а именно - по меньшей мере в 10 раз, а именно - от 10 до 100 раз большее, чем количество, полученное способом в отсутствие фазы элиситации согласно изобретению.
Согласно данному изобретению фраза «неочищенный экстракт, обогащенный целастролами означает обогащенный неочищенный экстракт, содержащий количество целастрола, по меньшей мере в 2 раза, а именно - по меньшей мере в 5 раз, а именно - по меньшей мере в 10 раз, а именно - от 10 до 60 раз, а именно - от 10 до 20 раз большее, чем количество, полученное способом в отсутствие фазы элиситации согласно изобретению.
Согласно данному изобретению фраза «растение семейства Celastraceae» означает все растения, принадлежащие к данному семейству, а именно: растения родов Tripterygium, Bhtsa, Kokkona, Catha, Euonymus, Orthosphenia, Dicarpellum, Celastrus, Maytenus, Petitassa и Rzedowskia, а именно: Tripterygium и Celastrus. Среди рода Tripterygium, можно конкретно упомянуть виды Tripterygium wilfordii, Tripterygium regelii, Tripterygium hypoglaucum и Tripterygium articulara, а именно - Tripterygium wilfordii.
Согласно данному изобретению фраза «клетки растения семейства Celastraceae» означает клетки из любой части растения: семян, корней, воздушных частей, а именно - воздушных частей.
Согласно данному изобретению фраза «воздушные части» означает части растения, расположенные выше земли, например листья, побеги, черешки и/или соцветия, а именно - листья.
Согласно данному изобретению фраза «фаза пролиферации клеток растения семейства Celastraceae» означает фазу, в которой клетки растения семейства Cetastraceae суспендируются в пролиферационной среде и при подходящих условиях для их пролиферации. А именно, данные клетки могут быть получены из каллусов перед суспендированием. При необходимости суспензии клеток можно регулярно пересевать для поддержания их при условиях пролиферации.
Согласно данному изобретению термин «каллус» означает кластер дедифференцированных клеток, также именуемых стволовыми клетками или меристематическими клетками.
Индукция каллуса может достигаться любым способом, известным специалисту. А именно, каллусы согласно изобретению могут быть получены описанным ниже способом.
Индукция каллусов из тканевого экспланта из части, а именно - воздушной части растения семейства Cetastraceae - хорошо известно специалисту.
А именно, индукция каллусов может проводиться посредством:
2
- получения экспланта ткани из растения, например, куска листа размером примерно 1 см,
- культивирования данного экспланта на пролиферационной среде с агаром согласно изобретению (например, посредством добавления от 4 до 12 г/л агара, например, примерно 8 г/л агара, в пролиферационную среду согласно изобретению),
- инкубирования, а именно в темноте, при температуре примерно 25-30°С, например, примерно от 27°С до 28°С.
Стадия (i): Фаза пролиферации клеток
Специалист, знакомый с культурами клеток растения семейства Celastraceae, легко сможет определить состав пролиферационной среды, необходимой для их пролиферации. Предпочтительно данная пролиферационная среда будет обеспечивать пролиферацию клеток в дедифференцированных, т.е. тотипотнтных формах. А именно, поддержание в дедифференцированной форме может достигаться посредством применения конкретных отношений цитокинин/ауксин в пролиферационной среде.
А именно, «пролиферационная среда» согласно изобретению может содержать:
4
3
3
2
2
4
2
2
4
- по меньшей мере один макроэлемент, а именно: выбранный из  NHNO, KNO, CaCl.2HO, MgSO.7HO, KHPO и их смеси, например, при общей концентрации макроэлементов, составляющей от 1000 до 9000 мг/л, например, от 3000 до 8000 мг/л пролиферационной среды: а именно, во время фазы пролиферации общая концентрация макроэлементов пролиферационной среды будет составлять от 3000 до 5500 мг/л пролиферационной среды;
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
- по меньшей мере один микроэлемент, а именно: выбранный из KI, НВО, MnSO.4HO, ZnSO.HO, NaMoO.HO, CuSO.5HO, CoCl.6НО, FeSO.7HO, NaEDTA.2HO и их смеси, например, при общей концентрации микроэлементов, составляющей от 10 до 200 мг/л, а именно - от 50 до 150 мг/л пролиферационной среды;
- по меньшей мере один витамин, а именно: выбранный из мио-инозитола, никотиновой кислоты, пиридоксин-HCl, тиамин-HCl и их смеси, например, при общей концентрации витаминов, варьирующей от 0,01 до 3 г/л, а именно - от 0,05 до 1 г/л пролиферационной среды;
- по меньшей мере одну аминокислоту, а именно глицин, например, при общей концентрации аминокислоты, варьирующей от 0,15 до 5 мг/л, а именно - от 1 до 4 мг/л пролиферационной среды: а именно, во время фазы пролиферации концентрация аминокислот пролиферационной среды будет составлять от 1 до 2,5 мг/л пролиферационной среды;
- по меньшей мере один источник углерода, а именно сахарозу, например, при общей концентрации источника углерода от 10 до 70 г/л пролиферационной среды, например, примерно 30 г/л;
- по меньшей мере один растительный гормон (также именуемый гормоном роста растений или фактором роста растений, или регулятором роста растений), а именно: выбранный из одного или более чем одного цитокинина, а именно кинетина и/или 6-фурфуриламинопурина, одного или более чем одного ауксина, а именно 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) и/или нафталинуксусной кислоты (NAA) и их смеси. А именно, во время фазы пролиферации пролиферационная среда будет содержать по меньшей мере один цитокинин и по меньшей мере один ауксин.
А именно, гормоны роста растений будут добавляться в пролиферационную среду в концентрации и соотношении, обеспечивающих пролиферацию клеток в дедифференцированных формах. А именно, они будут выбраны из кинетина, 6-фурфуриламинопурина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), нафталинуксусной кислоты (NAA) и их смеси; а именно: выбраны из кинетина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D), нафталинуксусной кислоты (NAA) и их смеси. В частности, она может представлять собой смесь кинетина, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) и нафталинуксусной кислоты.
А именно, концентрация ауксинов согласно изобретению будет составлять от 0,001 до 10 мг/л пролиферационной среды, например, от 0,1 до 3 мг/л пролиферационной среды.
А именно, концентрация цитокининов согласно изобретению будет составлять от 0,01 до 0,5 мг/л пролиферационной среды, а именно - от 0,05 до 0,15 мг/л.
В одном воплощении отношение гормонов ауксин / цитокинин будет составлять от 0,2 до 2,5 / от 0,01 до 0,5, а именно - от 1 до 2 / от 0,05 до 0,2, и, в частности, будет составлять около 1,5 / 0,1.
А именно, пролиферационная среда согласно изобретению может содержать 1,5 мг/л ауксина, а именно: 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) и нафталинуксусной кислоты (NAA), и 0,1 мг/л цитокинина, а именно кинетина.
Данная пролиферационная среда будет стерильной и предпочтительно с рН, близким к нейтральному.
А именно, типичная пролиферационная среда, подходящая для пролиферации клеток растения семейства Celastraceae согласно изобретению описана Murashige и Skoog (1962) или в примерах в настоящей заявке.
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
Данная пролиферационная среда, например, может иметь следующий состав (концентрации выражаются по отношению к объему бесклеточной пролиферационной среды): макроэлементы:  NHNO - 1650 мг/л, KNO - 1900 мг/л, CaCl.2HO - 440 мг/л, MgSO.7HO - 370 мг/л, KHPO - 170 мг/л; микроэлементы: KI - 0,83 мг/л, НВО - 6,2 мг/л, MnSO.4HO - 22,3 мг/л, ZnSO.HO - 6,6 мг/л, NaMoO.2HO - 0,25 мг/л, CuSO.5HO - 0,025 мг/л, CoCl.6HO - 0,025 мг/л, FeSO.7HO - 27,8 мг/л, NaEDTA.2HO - 37,3 мг/л; витамины: мио-инозитол - 100 мг/л, никотиновая кислота - 0,5 мг/л, пиридоксин-HCl - 0,5 мг/л, тиамин-HCl - 0,5 мг/л; аминокислоты: глицин - 2 мг/л; источник углерода: сахароза - 30 г/л; и гормоны растений: нафталинуксусная кислота - 1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 0,5 мг/л, кинетин - 0,1 мг/л, все доводится до рН 6 перед стерилизацией (например, автоклавированием при 121°С в течение 20 мин или посредством фильтрования через 0,2 мкм фильтр).
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
В качестве альтернативы, пролиферационная среда может иметь следующий состав: (концентрации выражаются по отношению к объему бесклеточной пролиферационной среды): макроэлементы:  NHNO - 1650 мг/л, KNO - 2500 мг/л, CaCl.2HO - 440 мг/л, MgSO.7HO - 370 мг/л, KHPO - 130 мг/л; микроэлементы: KI - 0,41 мг/л, НВО - 6,2 мг/л, MnSO.4HO - 22,3 мг/л, ZnSO.HO - 7,5 мг/л, NaMoO.2HO - 0,25 мг/л, CuSO.5HO - 0,025 мг/л, CoCl.6НО - 0,025 мг/л, FeSO.7HO - 19,85 мг/л, NaEDTA.2HO - 26,64 мг/л; витамины: мио-инозитол - 50 мг/л, никотиновая кислота - 0,25 мг/л, пиридоксин-HCl - 0,25 мг/л, тиамин-HCl - 0,25 мг/л; источник углерода: сахароза - 30 г/л и гормоны растений: кинетин - 0,083 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) - 0,575 мг/л, нафталинуксусная кислота (NAA) - 0,350 мг/л.
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
В качестве альтернативы, пролиферационная среда согласно изобретению может иметь следующий состав (концентрации выражаются по отношению к объему бесклеточной пролиферационной среды): NHNO - 20 мМ, KNO - 19 мМ, CaCl.2HO - 3 мМ, MgSO.7HO - 1,50 мМ, KHPO - 1,2 мМ, Kl - 0,005 мМ, НВО - 0,1 мМ, MnSO.4HO - 0,1 мМ, ZnSO.HO - 0,04 мМ, NaMoO.2HO - 0,001 мМ, CuSO.5HO - 0,0001 мМ, CoCl.6HO - 0,0001 мМ, FeSO.7HO - 0,1 мМ, NaEDTA.2HO - 0,1 мМ, мио-инозитол 0,5 мМ, никотиновая кислота - 0,004 мМ, пиридоксин-HCl - 0,002 мМ, тиамин-HCl - 0,0015 мМ, глицин - 0,03 мМ, сахароза - 87,6 мМ, нафталинуксусная кислота - 0,005 мМ, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 0,002 мМ и кинетин - 0,0005 мМ.
Осуществление посева на пролиферационную среду может проводиться суспендированием каллусных клеток в концентрации, составляющей от 20 до 300 г в 1 л пролиферационной среды, и предпочтительно от 100 до 200 г в 1 л пролиферационной среды, например, примерно 150 г в 1 л пролиферационной среды.
Фаза пролиферации будет происходить при условиях наращивания биомассы. Согласно изобретению «условия наращивания биомассы» означают, в частности, температуру, продолжительность, встряхивание и условия освещения, необходимые для пролиферации суспендированных клеток. Специалист, знакомый с культурами клеток растения семейства Celastraceae сможет легко определить условия наращивания биомассы. В одном воплощении согласно изобретению стадия пролиферации биомассы будет происходить в темноте, при температуре, составляющей от 20 до 35°С, а именно - от 27 до 28°С, а именно - примерно при 27 или 28°С, а именно - со встряхиванием при 100-200 об/мин, а именно - при примерно 125 об/мин (22,5 мм, орбитальное) и в течение времени, составляющего от 10 до 30 суток, а именно - 15 суток культуры.
На протяжении данной стадии клетки можно «субкультивировать» или размножать, например, каждые 7-15 суток. Субкультивирование клеток хорошо известно специалисту: а именно, оно может заключаться в разведении части клеточной культуры в концентрированной свежей среде. Например, 1/5-ю культуры ресуспендируют в объеме свежей среды, соответствующем объему исходной культуры. Это делает возможным поддержание линии клеток в жидкой среде в состоянии пролиферации.
Стадия (ii) - фаза элиситации
После фазы пролиферации клетки, полученные на фазе (i), подвергают воздействию элиситоров посредством добавления элиситирующей смеси. Пролиферационная среда, в которую была добавлена элиситирующая смесь, будет называться «элиситирующей средой» согласно настоящему изобретению.
Фаза элиситации представляет собой фазу, в которой клетки поддерживаются в физиологическом состоянии, стимулирующем биосинтез вторичных метаболитов, таких как пентациклические тритерпены.
Продукция пентациклических тритерпенов, а именно целастрола, происходит во время фазы элиситации в цитозоле клетки, и он может частично диффундировать в элиситирующую среду. Фаза элиситации в пределах значения по настоящему изобретению, следовательно, соответствует фазе продукции (биосинтеза) целастрола и его производных (пентациклические тритерпены).
Элиситация предпочтительно будет проводиться после фазы пролиферации, продолжающейся от 7 до 21 суток, а именно - от 12 до 20 суток, а именно - 15, 16 или 17 суток (а именно, без субкультивирования). В качестве альтернативы, элиситирующую смесь можно добавлять, когда концентрация клеток, полученная во время фазы пролиферации, удваивается, а именно более чем удваивается по отношению к исходной концентрации клеток в пролиферационной среде. А именно, элиситирующую смесь можно добавлять, когда концентрация клеток больше, чем 200 г/л, например, от 200 до 400 г/л, а именно - примерно 300 г/л (по массе клеток на литр пролиферационной среды). В одном воплощении элиситирующая смесь будет добавляться у культуры, концентрация клеток которой увеличилась от 150-200 г/л в начале пролиферационной фазы до концентрации, составляющей от 300 до 400 г/л в конце пролиферационной фазы.
После пролиферационной фазы растительные клетки потребили большую часть или все элементы, содержащиеся в пролиферационной среде, и, в частности, источники углерода, такие как сахароза. Следовательно, может быть необходимым восстановление состава среды до или во время добавления элиситирующей смеси.
А именно, для восстановления состава среды культуру клеток, полученную после стадии пролиферации, можно концентрировать, например, посредством отстаивания или фильтрования, затем к клеткам, полученным таким образом, добавляют свежую пролиферационную среду. В данном случае клетки будут ресуспендированы в свежей пролиферационной среде таким образом, чтобы получать концентрацию, составляющую от 200 г/л до 400 г/л, например, от 250 до 350 г/л, а именно - примерно 300 г/л (по массе клеток на литр пролиферационной среды).
В качестве альтернативы, в культуру клеток можно добавлять концентрированную смесь для восстановления концентраций элементов в пролиферационной среде. А именно, концентрированная смесь будет добавлена непосредственно до, непосредственно после или в то же самое время, что и элиситирующая смесь. Например, 1/5-я культуры клеток может быть заменена эквивалентным объемом пролиферационной среды, сконцентрированной в 5 раз.
Концентрация элементов в пролиферационной среде считается близкой или эквивалентной нулю после 14, 15 или 16 суток фазы пролиферации. В частности, концентрация минеральных элементов (более конкретно макроэлементов и микроэлементов) и углеродных элементов (более конкретно источников углерода) считается близкой или эквивалентной нулю после 14, 15 или 16 суток фазы пролиферации.
В одном воплощении пролиферационная среда согласно изобретению в начале фазы элиситации будет содержать, помимо других вещей:
4
3
3
2
2
4
2
2
4
- по меньшей мере один макроэлемент, а именно - выбранный из NHNO, KNO, CaCl.2HO, MgSO.7HO, KHPO и их смеси, например, при общей концентрации макроэлементов, составляющей от 5000 до 8000 мг/л, предпочтительно больше, чем 6000 мг/л пролиферационной среды, преимущественно от 6000 до 8000 мг/л;
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
- по меньшей мере один микроэлемент, а именно - выбранный из KI, НВО, MnSO.4HO, ZnSO.HO, NaMoO.HO, CuSO.5HO, CoCl.6НО, FeSO.7HO, NaEDTA.2HO и их смеси, например, при общей концентрации микроэлементов, составляющей от 10 до 200 мг/л, а именно - от 50 до 150 мг/л пролиферационной среды;
- по меньшей мере один витамин, а именно - выбранный из мио-инозитола, никотиновой кислоты, пиридоксина-HCl, тиамина-HCl и их смеси, например, при общей концентрации витаминов, варьирующей от 0,01 до 3 г/л, а именно - от 0,05 до 1 г/л пролиферационной среды;
- по меньшей мере одну аминокислоту, а именно глицин, например, в концентрации в пролиферационной среде, составляющей от 3 до 4 мг/л пролиферационной среды;
- по меньшей мере один источник углерода, а именно сахарозу, например, при общей концентрации источника углерода от 10 до 70 г/л пролиферационной среды, например, примерно 30 г/л.
В одном воплощении пролиферационная среда в начале фазы элиситации не будет содержать или будет содержать пренебрежимо малое количество, а именно - меньше, чем 0,001 г/мл цитокинина и ауксина.
Пролиферационная среда во время фазы элиситации преимущественно будет стерильной и предпочтительно при рН, близком к нейтральному.
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
А именно, пролиферационная среда во время фазы элиситации может иметь следующий состав: макроэлементы: NHNO - 2,8 г/л, KNO - 3 г/л, CaCl.2HO - 0,45 г/л, MgSO.7HO - 74 мг/л, KHPO - 34 мг/л; микроэлементы: KI - 0,16 мг/л, НВО - 6,2 мг/л, MnSO.4HO - 18,5 мг/л, ZnSO.HO - 6,6 мг/л, NaMoO.2HO - 0,25 мг/л, CuSO.5HO - 0,025 мг/л, CoCl.6HO - 0,025 мг/л, FeSO.7HO - 28 мг/л, NaEDTA.2HO - 37 мг/л; витамины: мио-инозитол - 250 мг/л, никотиновая кислота - 1,7 мг/л, пиридоксин-HCl - 1 мг/л, тиамин-HCl - 1 мг/л; аминокислота: глицин - 4 мг/л; источник углерода: сахароза 30 г/л.
Согласно данному изобретению термин «элиситирующая смесь» означает смесь, которая останавливает клеточное деление. Данная элиситирующая смесь содержит по меньшей мере один элиситор типа монокарбоксильного соединения и по меньшей мере один биотический элиситор. Элиситирующая смесь вводится в культуральную среду, например, с использованием концентрированных маточных растворов.
Согласно данному изобретению термин «элиситор типа монокарбоксильного соединения» означает более конкретно элиситор, выбранный из группы, содержащей, предпочтительно состоящей из 5-хлорсалициловой кислоты (5-хлор-СК), салициловой кислоты (СК), ацетилсалициловой кислоты (АСК), сложного метилового эфира, а именно метилжасмоната (MeJa), и их смеси. В одном воплощении согласно изобретению элиситор типа монокарбоксильного соединения представляет собой метилжасмонат, салициловую кислоту и/или 5-хлорсалициловую кислоту, а именно - метилжасмонат. А именно, элиситор типа монокарбоксильного соединения будет добавлен таким образом, чтобы получать конечную концентрацию, составляющую от 0,005 до 0,1 г/л, а именно - от 0,01 до 0,05 г/л элиситирующей среды, а именно - от 0,002 до 0,004 г/л элиситирующей среды.
Согласно данному изобретению термин «биотический элиситор» означает более конкретно биотический элиситор, выбранный из группы, содержащей, предпочтительно состоящей из N-ацетиламиноглюкозамина, а именно: хитина, хитозана, экстрактов микроорганизмов или грибов, олигосахаридов (полисахаридов, пектинов, целлюлозы). В одном воплощении биотический элиситор представляет собой хитин. Хитин представляет собой линейный полимер с повторяющимся звеном бета-1,4-N-ацетил-D-глюкозамина. А именно, биотический элиситор будет добавляться таким образом, чтобы получать конечную концентрацию, составляющую от 0,05 до 50 г/л элиситирующей среды, например, от 0,1 до 10 г/л, например, от 0,5 до 7 г/л, а именно - от 1 до 5 г/л элиситирующей среды.
В одном воплощении элиситирующая смесь содержит метилжасмонат, а именно - в конечной концентрации в элиситирующей смеси от 0,002 до 0,005 г/л, и хитин, а именно - в конечной концентрации от 1 до 4 г/л в элиситирующей смеси.
В одном воплощении элиситирующая смесь согласно изобретению будет дополнительно содержать по меньшей мере один фактор дифференциации клеток для растительных клеток и/или по меньшей мере один предшественник пути синтеза терпенов.
А именно, «фактор дифференциации клеток для растительных клеток» согласно изобретению может быть выбран из группы, содержащей, предпочтительно состоящей из цитокинина, а именно: бензиламинопурина (ВАР), абсцизовой кислоты, кинетина, тидиазурона, 6-γ,γ-диметилаллиламинопурина (2iP или изопентениладенин) или зеатина, гиббереллина и их смеси, а именно - ВАР и/или 2iP, в частности, 2iP.
А именно, «предшественник синтеза терпенов» согласно данному изобретению может быть выбран из группы, содержащей, предпочтительно состоящей из пирувата натрия; пирофосфата калия; мевалоновой кислоты; гераниола; фарнезола; изопентенила, диметилаллила, включая его пирофосфатные формы; ацетата натрия; пировиноградной кислоты и ее смесей, а именно: гераниола, фарнезола, пирувата натрия, пирофосфата калия и их смесей, таких как пируват натрия и/или пирофосфат калия.
А именно, ВАР может использоваться в конечной концентрации в элиситирующей среде, составляющей от 0,01 до 5 мг/л, например, от 0,5 до 5 мг/л элиситирующей среды.
А именно, 5-хлорсалициловая кислота (5-хлор-СК) может использоваться в конечной концентрации в элиситирующей среде, составляющей от 0,1 до 15 мг/л.
А именно, салициловая кислота может использоваться в конечной концентрации в элиситирующей среде, составляющей от 0,1 до 100 мг/л, например, от 20 до 60 мг/л, например, примерно 45 мг/л.
А именно, фарнезол может использоваться в конечной концентрации в элиситирующей среде от 1 до 100 мг/л, например, от 15 до 30 мг/л, например, примерно 30 мг/л.
А именно, гераниол может использоваться в конечной концентрации в элиситирующей среде от 1 до 100 мг/л, например, от 20 до 30 мг/л.
А именно, пируват натрия может использоваться в конечной концентрации в элиситирующей среде от 100 до 5000 мг/л, например, от 500 до 2000 мг/л.
А именно, пирофосфат калия может использоваться в конечной концентрации в элиситирующей среде от 1 до 2000 мг/л, например, от 100 до 1000 мг/л элиситирующей среды.
А именно, 2iP может использоваться в конечной концентрации в элиситирующей среде от 0,005 до 10 мг/л, например, от 0,01 мг/л до 3 мг/л, например, от 0,1 до 2 мг/л.
В одном воплощении согласно изобретению элиситирующая смесь содержит метилжасмонат, хитин, пируват натрия, пирофосфат калия или их смесь.
В одном воплощении согласно изобретению элиситирующая смесь содержит метилжасмонат, хитин, пируват натрия, пирофосфат калия и, возможно, ВАР и/или 2iP.
В одном воплощении согласно изобретению элиситирующая смесь содержит или состоит из (концентрации, приведенные между скобками, соответствуют концентрации в элиситирующей среде - исходной смеси, которая может быть более или менее концентрированной как функция намеченного разведения) пирувата натрия (от 500 до 2000 мг/л), пирофосфата калия (от 100 до 1000 мг/л), 2iP (от 0,1 до 2 мг/л), метилжасмоната (от 0,002 до 0,005 г/л) и хитина (от 1 до 4 г/л).
В другом воплощении элиситирующая смесь содержит или состоит из (концентрации, приведенные между скобками, соответствуют концентрации в элиситирующей среде - исходной смеси, которая может быть более или менее концентрированной как функция намеченного разведения) бензиламинопурина (ВАР) (от 0,5 до 5 мг/л, а именно - от 0,5 до 3 мг/л); 5-хлорсалициловой кислоты (5-хлор-СК) (от 2 до 6 мг/л, а именно - от 3 до 5 мг/л, например, примерно 3 или примерно 5 мг/л), ацетилсалициловой кислоты (АСК) и/или салициловой кислоты (СК) (от 20 до 60 мг/л, а именно - от 30 до 50 мг/л, а именно - от 33 до 45 мг/л); метилжасмоната (MeJa) (от 0,002 до 0,005 г/л, а именно - от 10 до 40 мг/л); хитина (от 1 до 4 г/л); фарнезола (F-OH) (от 19 до 40 мг/л) и/или гераниола (от 20 до 30 мг/л).
В другом воплощении элиситирующая смесь содержит или состоит из (концентрации, приведенные между скобками, соответствуют концентрации в элиситирующей среде - исходной смеси, которая может быть более или менее концентрированной как функция намеченного разведения) пирувата натрия (от 500 до 2000 мг/л), пирофосфата калия (от 100 до 1000 мг/л), 2iP (от 0,1 до 1 мг/л), метилжасмоната (MeJa) (от 0,002 до 0,005 г/л, а именно - от 10 до 40 мг/л) и хитина (от 1 до 4 г/л).
В другом воплощении элиситирующая смесь содержит или состоит из (концентрации, приведенные между скобками, соответствуют концентрации в элиситирующей среде, данная смесь может быть более или менее концентрированной как функция намеченного разведения) пирувата натрия (примерно 1,5 г/л), пирофосфата калия (примерно 0,4 г/л), 2iP (примерно 0,4 мг/л), метилжасмоната (MeJa) (примерно 0,03 мг/л), хитина (примерно 2 г/л).
Во время фазы элиситации - после добавления элиситирующая смеси - культура поддерживается при встряхивании, а именно - при 50-200 об./мин, а именно - при примерно 125 об./мин, в течение периода составляющего от 3 до 30 суток, а именно - от 10 до 25 суток, а именно - от 12 до 15 суток, в частности, при температуре, составляющей от 20 до 35°С, а именно - при примерно 27°С и, преимущественно, с уровнем растворенного кислорода в культуральной среде от 2 до 40%, преимущественно - примерно 16%. При необходимости может быть предоставлена подача стерильного воздуха, достаточно обогащенного кислородом, а именно, в находящееся над культурой пространство биореактора или посредством диффузии в среду. Предпочтительно фаза элиситации (iii) проводится в темноте. Во время фазы элиситации культуру клеток предпочтительно не субкультивируют.
Стадия (iii) - Фаза получения неочищенного экстракта, обогащенного пентациклическими тритерпенами
После фазы элиситации способ по изобретению включает стадию получения неочищенного экстракта, обогащенного пентациклическими тритерпенами, а именно целастролом.
А именно, обогащенный неочищенный экстракт может быть получен разделением биомассы и супернатанта культуры. А именно, разделение может проводиться прямым фильтрованием (0-50 мкм), центрифугированием или осаждением клеток.
В одном воплощении обогащенный неочищенный экстракт по изобретению может состоять из супернатанта культуры, выделенного таким образом.
Обогащенный неочищенный экстракт согласно изобретению также может быть получен после лизиса биомассы. Например, клетки, содержащиеся в выделенной биомассе, могут быть лизированы физическим (обработка ультразвуком или растирание) или химическим (кислотный лизис) способом, затем данный лизат будет подвергаться экстракции растворителем. Органическая фаза, а именно - содержащая тритерпены из цитозоля, затем выделяется, а именно - посредством осаждения или центрифугирования. А именно, растворитель будет растворителем типа сложного эфира и, более конкретно, алкилацетата, причем алкил более конкретно является линейным или разветвленым с 1-6 атомами углерода, а именно - этилацетатом или изопропилацетатом. Объем использованного растворителя будет составлять 2 объема на массу биомассы.
Предпочтительно обогащенный неочищенный экстракт согласно изобретению будет соответствовать органической фазе, полученной таким образом.
В качестве альтернативы, обогащенный неочищенный экстракт согласно изобретению может быть получен после выпаривания растворителя и, в частности, он может быть заменен носителем, подходящим для области применения данного экстракта (косметические средства, фармацевтические препараты), и, в частности, растительными маслами.
Обогащенный неочищенный экстракт согласно изобретению не очищается. Обогащенный неочищенный экстракт возможно может быть очищен на следующей стадии.
При очистке обогащенного неочищенного экстракта с получением очищенного экстракта способ согласно изобретению дополнительно включает стадию (iv) получения очищенного экстракта одного или более чем одного пентациклического тритерпена из обогащенного неочищенного экстракта, полученного на стадии (iii).
Очищенный экстракт согласно изобретению тогда будет содержать больше, чем 90%, а именно - больше, чем 95%, а именно - больше, чем 98% одного или более чем одного пентациклического тритерпена согласно изобретению. В одном воплощении очищенный экстракт согласно изобретению содержит больше, чем 90%, а именно - больше, чем 95%, а именно - больше, чем 98% целастрола, а именно - 100% целастрола.
А именно, очистка обогащенного экстракта согласно изобретению может проводиться посредством фазы отделения пентациклического(ких) тритерпена(нов), а именно - целастрола, тингенина А и тингенина В, а именно -посредством фракционирования ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), в частности, пики при 426 нм, содержащие целастрол, тингенин А и тингенин В, элюируются в 10,5 мин, 8,2 мин и 6,5 мин соответственно. А именно, очистка целастрола может проводиться, как описано в примерах в настоящей заявке.
Настоящее изобретение дополнительно относится к обогащенному неочищенному экстракту, получаемому способом согласно изобретению.
Другой предмет изобретения касается фармацевтической, такой как дерматологическая или дермо-косметическая, композиции, содержащей обогащенный неочищенный экстракт, получаемый способом согласно изобретению, и один или более чем один фармацевтически или дермокосметически приемлемый эксципиент.
Фармацевтически или дермокосметически приемлемые эксципиенты могут представлять собой любой эксципиент среди эксципиентов, известных специалисту в данной области. А именно, композиция согласно изобретению будет представлять собой местную композицию, а именно - в виде крема, лосьона, геля, мази, эмульсии, микроэмульсии, спрея и т.д.
Фармацевтическая, такая как дерматологическая или дермо-косметическая, композиция согласно изобретению, в частности, может содержать добавки и вспомогательные вещества для приготовления композиции, такие как эмульгаторы, загустители, гелеобразующие агенты, водные фиксаторы, растекатели, стабилизаторы, красители, отдушки и консерванты.
Другим предметом согласно изобретению является обогащенный неочищенный экстракт, получаемый способом по изобретению, для применения в качестве медицинского продукта, а именно - при лечении или предупреждении воспалительного дерматоза, индуцирующего ТН17-опосредованный клеточный ответ.
Специалист легко сможет определить воспалительные дерматозы, которые индуцируют ТН17-опосредованный клеточный ответ. А именно, специалист сможет измерить уровень экспрессии IL-22 (интерлейкин-22), IL-17 и/или TNF-α (фактор некроза опухолей-альфа) пораженной области относительно контрольного образца.
А именно, воспалительный дерматоз согласно изобретению может быть выбран из группы, включающей, предпочтительно состоящей из псориаза, атопического дерматита и угрей.
Настоящее изобретение иллюстрируется неограничивающими графическими материалами и примерами, подробно описанными ниже.
ГРАФИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ
ФИГ. 1: кривая роста (сплошная линия) культуры клеток Tripterygium wilfordii в г/л сырой биомассы (FW) как функция времени в сутках, и концентрация целастрола (пунктирная линия) в мг целастрола на л суспензии клеток как функция времени в сутках.
ФИГ. 2: хроматограмма ВЭЖХ (λ равна 426 нм) обогащенного неочищенного экстракта Tripterygium wilfordii, полученного в сутки 33.
***
ФИГ. 3: процентная доля индукции синтеза IL-17A Т-лимфоцитами CD4+ после инкубации с образцами 2, 3, 4 и 5, по сравнению с негативным контролем, инкубируемым с образцом 1, с последующей стимуляцией антителами против CD3 и против CD28 ( значение р меньше 0,001).
***
ФИГ. 4: процентная доля индукции синтеза IFN-γ (интерферон-гамма) Т-лимфоцитами CD4+ после инкубации с образцами 2, 3, 4 и 5, по сравнению с негативным контролем, инкубируемым с образцом 1, с последующей стимуляцией антителами против CD3 и против CD28 ( значение p меньше 0,001).
***
ФИГ. 5: процентная доля индукции синтеза IL-22 Т-лимфоцитами CD4+ после инкубации с образцами 2, 3, 4 и 5, по сравнению с негативным контролем, инкубируемым с образцом 1, с последующей стимуляцией антителами против CD3 и против CD28 ( значение p меньше 0,001).
***
ФИГ. 6: процентная доля индукции синтеза TNF-α Т-лимфоцитами CD4+ после инкубации с образцами 2, 3, 4 и 5, по сравнению с негативным контролем, инкубируемым с образцом 1, с последующей стимуляцией антителами против CD3 и против CD28 ( значение р меньше 0,001).
***
ФИГ. 7: процентная доля индукции синтеза IL-6 Т-лимфоцитами CD4+ после инкубации с образцами 2, 3, 4 и 5, по сравнению с негативным контролем, инкубируемым с образцом 1, с последующей стимуляцией антителами против CD3 и против CD28 ( значение p меньше 0,001).
ПРИМЕРЫ
Пример 1: протокол дедифференциации клеток
Каллусы получают из эксплантов листьев Tripterygium wilfordii.
Экспланты стерилизуют 70%-ным этанолом, затем гипохлоритом натрия с содержанием активного хлора 2,5%, затем промывают стерильной деминерализованной водой. В качестве опции, возможна промывка 7%-ным пероксидом водорода перед промывкой стерильной деминерализованной водой.
Листья нарезают на кусочки, например, на квадраты со стороной 8-10 мм. Экспланты листьев вносят на пролиферационную среду с агаром.
Состав пролиферационной среды является следующим:
4
3
3
2
2
4
2
2
4
макроэлементы: NHNO - 1650 мг/л, KNO - 1900 мг/л, CaCl.HO - 440 мг/л, MgSO.7HO - 370 мг/л, KHPO - 170 мг/л,
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
микроэлементы: KI - 0,83 мг/л, НВО - 6,2 мг/л, MnSO.4HO - 22,3 мг/л, ZnSO.HO - 6,61 мг/л, NaMoO.2HO - 0,25 мг/л, CuSO.5HO - 0,025 мг/л, CoCl.6НО - 0,025 мг/л, FeSO.7HO - 27,8 мг/л, NaEDTA.2HO - 37,3 мг/л,
витамины: мио-инозитол - 100 мг/л, никотиновая кислота - 0,5 мг/л, пиридоксин-HCl - 0,5 мг/л, тиамин-HCl - 0,5 мг/л,
аминокислота: глицин - 2 г/л,
источник углерода: сахароза - 30 г/л,
растительные гормоны: кинетин - 0,1 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) - 0,5 мг/л, нафталинуксусная кислота (NAA) - 1 мг/л.
Пролиферационную среду переводят в гель добавлением агара в содержании 8-12 г/л, ее рН доводят до рН 6 плюс/минус 0,5 (с использованием KOH, 1М) перед автоклавированием в течение 20 мин при 121°С. Чашки Петри, содержащие экспланты, инкубируют в темноте при 27-28°С.
Каллусы субкультивируют каждый месяц на такой же среде с агаром. Для этого полученные каллусы отделяют от эспланта листа и вносят на свежую пролиферационную среду с агаром.
Пример 2: приготовление культуры и среды для размножения (фаза пролиферации)
После нескольких месяцев субкультивирования получают хрупкие каллусы, и переносят их на жидкую пролиферационную среду.
Данная пролиферационная среда, например, имеет следующий состав, указанный ниже:
4
3
3
2
2
4
2
2
4
макроэлементы: NHNO - 1650 мг/л, KNO - 2500 мг/л, CaCl.2HO - 440 мг/л, MgSO.7HO - 370 мг/л, KHPO - 130 мг/л,
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
микроэлементы: KI - 0,41 мг/л, НВО - 6,2 мг/л, MnSO.4HO - 22,3 мг/л, ZnSO.HO - 7,5 мг/л, NaMoO.2HO - 0,25 мг/л, CuSO.5HO - 0,025 мг/л, CoCl.6HO - 0,025 мг/л, FeSO.7HO - 19,85 мг/л, NaEDTA.2HO - 26,64 мг/л,
витамины: мио-инозитол - 50 мг/л, никотиновая кислота - 0,25 мг/л, пиридоксин-HCl - 0,25 мг/л, тиамин-HCl - 0,25 мг/л,
Источники углерода: сахароза - 30 г/л
Растительные гормоны: кинетин - 0,083 мг/л, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) - 0,575 мг/л, нафталинуксусная кислота (NAA) - 0,350 мг/л.
рН среды доводится до рН 6 плюс/минус 0,5 (посредством добавления KOH, 1М) перед подходящей стерилизующей обработкой, например, автоклавированием при 121°С в течение минимальной продолжительности 20 минут или посредством стерилизующего фильтрования через 0,2 мкм фильтр.
Суспендирование клеток достигается посредством внесения примерно 40 г рассыпчатого каллуса в 200 мл колбу Эрленмейера, содержащую среду для размножения, инкубирования в течение одной недели на столе шейкера при 100 об/мин (оборотов в минуту) в темноте при 27-28°С. Супернатант клеток отбирают пипеткой, оставляя остаточные скопления каллуса. Полученную суспензию клеток культивируют в течение 15 суток, затем размножают посредством разведения до 1/5-й в свежей среде каждые 15 суток.
Колбы Эрленмейера заполняют до 40% (80 мл), и скорость инокуляции посредством переноса суспензии клеток составляет 20-25% объема или примерно 160 г/л сырой биомассы. Культивирование затем проводится в течение 15 суток в темноте при 27-28°C с орбитальным встряхиванием при 110-120 об./мин. На данной стадии биомасса присутствует в концентрации примерно 300 г/л сырой биомассы на литр суспензии.
Пример 3: получение тритерпенов в колбе Эрленмейера (фаза элиситации и получения обогащеного неочищенного экстракта)
Фаза элиситации:
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
После 15 суток культуры 1/5-ую культуры клеток удаляют из колбы Эрленмейера, и добавляют в колбу Эрленмейера 20 мл концентрированной пролиферационной среды. Состав концентрированной среды является следующим: макроэлементы: NHNO - 13,9 г/л, KNO - 15,2 г/л, CaCl.2HO - 2,2 г/л, MgSO.7HO - 370 мг/л, KHPO - 170 мг/л; микроэлементы: KI - 0,83 мг/л, НВО - 31,2 мг/л, MnSO.4HO - 91,5 мг/л, ZnSO.HO - 33,05 мг/л, NaMoO.2HO - 1,25 мг/л, CuSO.5HO - 0,125 мг/л, CoCl.6НО - 0,125 мг/л, FeSO.HO - 139 мг/л, NaEDTA.2HO - 186,5 мг/л; витамины: мио-инозитол - 1250 мг/л, никотиновая кислота - 8,5 мг/л, пиридоксин-HCl - 5 мг/л, тиамин-HCl - 5 мг/л; аминокислота: глицин - 20 мг/л; источник углерода: сахароза - 150 г/л (растворенная в деминерализованной воде).
Элиситирующую смесь затем добавляют в пролиферационную среду в колбе Эрленмейера с использованием маточных растворов, приготовленных в диметилсульфоксиде. Состав элиситирующей смеси дает следующие концентрации в элиситирующей смеси (плюс клетки): 1,5 г/л пирувата натрия, 0,440 г/л пирофосфата калия, 0,0004 г/л 2iP, 0,036 г/л метилжасмоната и 2 г/л хитина.
Получение целастрола и его производных проводится в течение 12 суток в темноте при 27-28°C с круговым встряхиванием при 120 об/мин.
Отбор биомассы для экстракции:
При завершении культивирования среду фильтруют для выделения полной совокупности биомассы, содержащей большую часть целастрола.
После отделения биомассы посредством фильтрования через 0-50 мкм фильтр, смешивают с одной частью биомассы по массе 2 объема растворителя типа сложного эфира и, более конкретно, алкилацетата, а именно - этилацетата (или изопропилацетата). Данную смесь экстрагируют посредством обработки ультразвуком для лизирования клеток и получения цитозольных компонентов в доступной форме. После центрифугирования данной смеси выделяют органическую фазу, содержащую фракцию тритерпенов.
Измеряется концентрация целастрола в органической фазе. Концентрация целастрола на литр суспензии оценивается на уровне 553 мг, что соответствует массе 0,0166 г целастрола на грамм сухой массы клетки.
Пример 4: продукция тритерпенов (целастрола и производных) в одноразовых мешках для биореактора типа Wave
Проиллюстрированный пример описывается для реакторов типа Wave, например, бренда Sartorius, для объемов 5 л или 10 л, или 2×5 л, но данный способ может быть адапирован и применен к большим объемам и к оборудованию от других изготовителей.
Бинарная система, описанная ранее для традиционных лабораторных биореакторов, сделанных из стекла, или промышленных биореакторов, сделанных из нержавеющей стали, применяется таким же способом с использованием 2 мешков Wave.
Пролиферация:
Биореактор Wave А (5 л), размещенный на его платформе, заполняют пролиферационной средой посредством встроенного в линию стерилизующего фильтрования и накачивают воздухом.
Предкультуру Tripterygium wilfordii получают в течение 15 суток в колбе Эрленмейера, как описано в Примере 2. Пролиферационную среду биореактора затем засевают данной предкультурой в концентрации 160 г/л (мешок А).
Биореактор инкубируют согласно следующим условиям:
- угол качания: 5-8°;
- частота качания: 16-30 об/мин;
- скорость аэрации: 0,1-0,5 л/мин воздуха, обогащенного 50% чистого кислорода;
- температура: 27°С;
- продолжительность: 17 суток.
Во время данной фазы пролиферации рост клеток измеряется ежесуточно (Фиг. 1).
Элиситаиия и продукция тритерпенов (целастрола и производных):
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
Объем культуры примерно 1000 мл из мешка А (5 л) переносится в мешок В, расположенный рядом с мешком А на той же самой платформе. Среду мешка А дополняют 1000 мл концентрированной среды в деминерализованной воде, имеющей следующий состав: макроэлементы: NHNO - 13,9 г/л, KNO - 15,2 г/л, CaCl.2HO - 2,2 г/л, MgSO.7HO - 370 мг/л, KHPO - 170 мг/л; микроэлементы: KI - 0,83 мг/л, НВО - 31,2 мг/л, MnSO.4HO - 91,5 мг/л, ZnSO.HO - 33,05 мг/л, NaMoO.2HO - 1,25 мг/л, CuSO.5HO - 0,125 мг/л, CoCl.6HO - 0,125 мг/л, FeSO.7HO - 139 мг/л, NaEDTA.2HO - 186,5 мг/л; витамины: мио-инозитол - 1250 мг/л, никотиновая кислота - 8,5 мг/л, пиридоксин-HCl - 5 мг/л, тиамин-HCl - 5 мг/л; аминокислота: глицин - 20 мг/л; источник углерода: сахароза - 150 г/л; к которой добавляют следующую элиситирующую смесь: 7,5 г/л пирувата натрия, 2,2 г/л пирофосфата калия, 0,002 г/л 2iP, 1,8 г/л метилжасмоната и 10 г/л хитина.
Содержимое мешка А затем подвергают воздействию элиситоров со встряхиванием при температуре 27°С.
После культивирования в фазе элиситации следует измерение роста клеток и концентрации целастрола в культуре в течение 16 суток (Фиг. 1).
Можно видеть то, что концентрация целастрола в мешке А постоянно возрастает вплоть до суток 32 и находится на максимуме - 553 мг на литр элиситирующей среды после 15 суток инкубации.
Скорость продукции целастрола составляет примерно 46 мг/л суспензии клеток в сутки в течение 15 суток после элиситации вплоть до суток 32.
Кинетика продукции целастрола начинает слегка сдвигаться после потребления почти всей доступной сахарозы (Фиг. 1).
Пример 5: получение экстракта, обогащенного целастролом, посредством твердой/жидкой экстракции биомассы из суспензии клеток Tripterygium wilfordii (TW08)
В 15 суток после элиситации (32 суток после инокуляции) большая часть биомассы выделяется посредством фильтрования суспензии клеток с использованием нейлонового фильтра (20-50 мкМ) (TW08).
Из 5 л суспензии выделяют примерно 1925 г биомассы. Данная биомасса экстрагируется этилацетатом (или изопропилацетатом) в соотношении 2:1 (объем:масса) на основе массы биомассы (здесь 3850 мл растворителя для 1925 г биомассы). Смесь биомассы/растворителя затем подвергается физической экстракции - посредством обработки ультразвуком. Органическую фазу затем выделяют после мацерации с использованием встряхивания. Добавление растворителя (с последующей мацерацией с использованием встряхивания и выделения органической фазы) повторяют 2 раза.
Концентрация целастрола и производных в органической фазе измеряется посредством анализа ВЭЖХ (количественное измерение целастрола, производных тингенина) (см. Фиг. 2). Экспериментальные условия: колонка Waters Atlantis dC18, 4,6×150 мм - 5 мкм, оснащенная защитной колонкой Atlantis dC18 5 мкм 4,6×20 мм Gd колонка - 5 мкм. Подвижные фазы: (А) ацетат аммония - 0,1 мМ, рН 4,0; (Б) ацетат аммония - 0,1 мМ, рН 4,0 в 99,8% ацетонитриле. Градиент: исходный 25%(А)/75%(Б) - 20 мин, 0%(А)/100%(Б) - 24,5 мин, 0%(А)/100%(Б) - 25 мин, 25%(А)/75%(Б) - 30 мин, 25%(А)/75%(Б). Скорость тока: 1 мл/мин. Выявление при 426 нм: пики удерживания (мин): тингенин В (6,5), тингенин А (8,2), целастрол (10,5).
Пример 6: очистка целастрола из культуры Tripterygium wilfordii
2
2
Этилацетат (или изопропилацетат) выпаривается при пониженом давлении из экстракта, полученного в Примере 5, с получением сухого экстракта. Часть эксракта, полученного таким образом, сначала очищают посредством жидкостной хроматографии среднего давления (MPLC) на диоксиде кремния (40 г, 125×25 мм, 30 мкм) с градиентом элюции CHCl/МеОН (от 100/0 до 0/100). Все полученные фракции анализируются тонкослойной хроматографией (ТСХ - неподвижная фаза: 60  диоксид кремния; подвижная фаза: 70:33:3 толуол / этилацетат / уксусная кислота), и отбираются фракции, содержащие, главным образом, целастрол и его тингениновые производные (А и В). На второй стадии фракция, содержащая интересующие продукты (целастрол и производные), очищается высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) в режиме обращенной фазы (LiChrospher 100RP18, 250×25 мм, 5 мкм) с линейным градиентом вода/ацетонитрил/0,1%-ная муравьиная кислота (от 80/20 до 0/100). Пик целастрола отбирается и концентрируется при пониженном давлении; примерно от 2,5 до 3 г целастрола получают из 5 л исходной суспензии культуры. Возможно, он может быть закристаллизован для того, чтобы иметь абсолютную чистоту.
Параллельно часть полученного сухого экстракта отбирают в буфер с получением экстракта R003034, который будет оцениваться на фармакологическую активность против Th17.
Пример 7: активность против Th17 экстракта РСС, обогащенного целастролом, на человеческих клетках CD4+
Известно то, что при воспалительных дерматозах (а именно, при псориазе) Т-клетки CD4+ сверхэкспрессируют интерлейкины IL17, IL6 и IL22, а также IFN-гамма и TNF-альфа. В случае атопического дерматита IL17 сверхэкспрессируется в определенной фазе заболевания. Кроме того, путь Th17 сильно активируется при угрях. Тестировали силу ингибирования обогащенного экстракта согласно изобретению на сверхэкспрессию данных молекул.
Человеческие клетки CD4+ выделяли из одноядерных клеток крови 2 доноров на Focoll Paque Plus согласно протоколу, рекомендованному изготовителем (GE Healthcare). Лимфоциты CD4+ выделяются посредством позитивной сортировки с использованием набора Miltenyi Biotec (CD4) и колонки LS, и ресуспендируются в культуральной среде RPMI (Sigma-Aldrich: содержащая L-глутамин и 10% фетальной телячьей сыворотки), дополненной 100 мкг/мл стрептомицина и 100 U/мл пенициллина. Суспендированные лимфоциты распределяются в лунках микропланшета. Затем в данные лунки добавляют разные экстракты или контроли:
1. негативный контроль (добавляют такой же объем буфера без реактива);
2. экстракт R003034 - 0,06 мг/мл (титр целастрола 9 нг/мл) (конечная концентрация в лунке);
3. экстракт R003034 - 0,2 мг/мл (титр целастрола 30 нг/мл) (конечная концентрация в лунке);
4. экстракт R003034 - 0,6 мг/мл (титр целастрола 90 нг/мл) (конечная концентрация в лунке);
5. 2 мкМ дексаметазон (позитивный контроль) (конечная концентрация в лунке).
После 2 часов инкубации при комнатной температуре лимфоциты CD4+ активируются при 37°С в течение 20 часов с использованием антител против CD3 и против CD28 в конечной концентрации 300 нг/мл и 400 нг/мл соответственно. Известно то, что антитела против CD3 и против CD28 индуцируют ответ типа Th17.
Цитокины IL-17A, IFN-гамма, IL-22, TNF-альфа и IL-6 количественно измеряли в супернатанте каждой пробирки способом мультиплексного иммуноанализа (Jager et al., 2003). Полученные результаты основываются на 2 экспериментах с лимфоцитами от 2 разных доноров. Результаты представлены на Фиг. 3-7 в виде процентной доли индукции по сравнению с негативным контролем (1). Можно наблюдать то, что:
- позитивный контроль 5 (2 мкМ дексаметазон) ингибирует сверхэкспрессию всех цитокинов: IL-17A, IFN-гамма, IL-22, TNF-альфа и IL-6;
- экстракт согласно изобретению (2, 3 и 4) сильно ингибирует сверхэкспрессию цитокинов IL-17A, IFN-гамма, IL-22, TNF-альфа и IL-6. Ингибирование сверхэкспрессии IL-17A и TNF-альфа является дозозависимым. При наименьшей дозе - титре целастрола 9 нг/мл - имеется 75%-ное ингибирование сверхэкспрессии IL-17A, 80%-ное ингибирование сверхэкспрессии TNF-альфа и почти полное ингибирование сверхэкспрессии IFN-гамма, IL-22 и IL-6.
Это показывает то, что экстракт R003034 имеет очень сильную активность против Th17, сравнимую или даже превосходящую активность дексаметазона (2 мкМ), который дает замечательную активность при лечении Th17-зависимых заболеваний, таких как псориаз, угри и атопический дерматит.
Пример 8: сравнение выходов целастрола, полученных из культур растительных клеток Tripterygium wilfordii
Десять культивирований в колбах Эрленмейера (объем 50 мл) проводили параллельно из той же самой линии клеток Tripterygium wilford в двойных повторностях при таких же условиях встряхивания, аэрации и температуры. В конце фазы роста плотность суспензии является максимальной, количество взвешенной сырой биомассы (средняя масса 340 г сырой биомассы/л) в каждой из колб Эрленмейера было эквивалентным. В данный момент в культуральную среду десяти колб Эрленмейера добавляли элиситоры в концентрациях, указанных в таблице, приведенной ниже, в которой выход выражается в мг целастрола/кг сырой биомассы.
Анализ суспендированного целастрола проводили посредством ВЭЖХ согласно Примеру 5, с калибровочной кривой, полученной с контрольными продуктами.
Суспензии, содержащиеся в колбах Эрленмейера Е1, Е2, Е3, подвергали воздействию контрольного раствора без какого-либо элиситора для Е1, с одним хитином (2 г/л) для Е2 и с одним MeJa (64 мкМ) для Е3. Концентрация MeJa в Е3 является эквивалентной концентрации, описанной Liu et al. 2016, т.е. 64 мкМ.
Суспензии, содержащиеся в колбах Эрленмейера Е4-Е10, подвергали воздействию элиситоров - в трех разных концентрациях MeJa (36, 64 и 92 мкМ) и пяти разных концентрациях хитина (1,3; 2; 2,5; 3,1 и 4,2 г/л).
Отмечается то, что выходы целастрола, полученные для Е6, Е7 и Е8, возрастали на 204%, 233% и 274%, соответственно, по сравнению с ЕЗ, причем концентрация MeJa является одинаковой в данных четырех колбах Эрленмейера. Даже лучший выход наблюдается для Е5, в которой концентрация MeJa является отличной.
Пример 9: ингибирующая активность против NFκB
Фактор транскрипции NFκB контролирует экспрессию большого числа генов, участвующих в регуляции воспалительного ответа. В неактивном состоянии NFκB секвестрируется в цитоплазме белком IKB. Некоторые провоспалительные стимулы, такие как TNF-альфа и IL-1-бета, приводят к активации NFκB, т.е. его ядерной локализации. При нахождении в ядре NFκB будет индуцировать транскрипцию провоспалительных генов, кодирующих цитокины, хемокины, молекулы адгезии, факторы роста и индуцибельные ферменты.
Противовоспалительные активности экстрактов, полученных из суспензий, содержащихся в колбах Эрленмейера Е1, Е2, Е3 и Е6 Примера 8 оценивали in vitro на человеческих кератиноцитах НаСаТ согласно способу, описанному Albanesi et al. Экстракты, взвешенные по сухой массе, отбирали в буфер и вводили в раствор культуры клеток НаСаТ в эквивалентных конечных концентрациях (нг/мл) для каждого экстракта и инкубировали в течение 1 часа. Экспрессия NFκB затем индуцируется посредством стимуляции TNF-альфа (0,3 нг/мл).
% инг.: % ингибирования экспрессии NFκB по отношению к индукции TNF-альфа; sem: стандартная ошибка среднего.
Дексаметазон в концентрации 2 мкМ, использованный в качестве позитивного контроля, ингибирует экспрессию NFκB больше, чем на 40%.
Экстракт согласно настоящему изобретению (полученный из Е6, с парой элиситоров - MeJa и хитином), оцениваемый в концентрациях 0,19 и 0,58 нг/мл, ингибирует экспрессию NFκB на 20% и 70% соответственно.
Экстракт, полученный согласно Liu et al. (из Е3, с MeJa в качестве единственного элиситора), оцениваемый в таких же концентрациях, не индуцирует какого-либо ощутимого ингибирования экспрессии NFκB. Аналогичным образом, экстракты, полученные из Е2 (с хитином в качестве единственного элиситора) и из контроля Е1, не имеют влияния на экспрессию NFκB.
Только экстракт, полученный из культуры, подвергавшейся воздействию элиситоров согласно настоящему изобретению, сильно ингибирует NFκB и зависимым от концентрации образом.
Пример 10: противомикробная активность против Propionibacterium acnes экстракта, полученного согласно способу по настоящему изобретению, по сравнению с активностью других соединений
8
Активность оценивается на Propionibacterium acnes (СIР 53117Т) с инокуляцией суспензии в концентрации 10 КОЕ (колониеобразующая единица)/мл. Поддерживающей средой является агар Columbia плюс 5% крови овцы с инкубацией в течение 24 часов при 36 плюс/минус 1°С при анаэробных условиях. Опытная среда состоит из бульона Мюллера Хинтона плюс 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) и агара Columbia плюс 5% крови овцы с инкубацией в течение 24 ч при 36 плюс/минус 1°С при анаэробных условиях. Определение минимальных ингибирующих концентраций (MIC) проводится микроспособом в жидкой среде. 100 мкл жидкой культуральной среды вносят в каждую лунку стерильного 96-луночного микропланшета. 100 мкл продукта, подлежащего тестированию, вносится к первую лунку ряда. Затем делаются разведения в два раза от лунки 1 до 10. Тестируемые суспензии Propionibacterium acnes готовят для немедленного применения в соли триптона. 100 мкл вносят в каждую лунку второго микропланшета, за исключением вертикального ряда 11. Весь первый микропланшет инокулируют с использованием многоточечного инокулятора Denley из второго микропланшета. После инкубации MIC определяется как наивысшее разведение без видимого роста. Вертикальные ряды 11 и 12 служат в качестве негативного и позитивного ростового контроля соответственно. Два контроля анализировали параллельно. Определение минимальных бактерицидных концентраций (МВС) осуществляется посредством субкультивирования микропланшетов MIC на агаризованной среде с использованием многоточечного инокулятора Denley. После инкубации МВС определяется как наивысшее разведение без видимого роста. Все анализы проводятся в двойной повторности.
Тестируемыми соединениями являются:
- очищенный целастрол в DMSO (диметилсульфоксид) (маточный раствор - 150 мкг/мл/10% DMSO)
- экстракт, полученный согласно способу по настоящему изобретению, в пентиленгликоле (маточный раствор - 2% / 2% пентиленгликоля)
- тингенин А в DMSO (маточный раствор - 150 мкг/мл / 10% DMSO)
- тингенин В в DMSO (маточный раствор - 150 мкг/мл / 10% DMSO)
- контролями являются амоксициллин, DMSO (маточный раствор - 100%) и пентиленгликоль (маточный раствор - 2%).
Полученные результаты обобщаются в таблице, приведенной ниже, в которой показаны значения MIC и МВС для 4 образцов и обоих эксципиентов. Максимальная опытная концентрация соответствует концентрации маточного раствора / 2.
В заключение, целастрол имеет довольно привлекательную антибактериальную активность на Propionibacterium acnes, но, по-видимому, именно экстракт, полученный согласно способу по изобретению, имеет наивысший уровень антибактериальной активности на Propionibacterium acnes. Тингенин В имеет более высокую антибактериальную активность, чем активность, наблюдаемая с тингенином А.
Пример 11: противомикробная активность против Staphylococcus aureus экстракта, полученного согласно способу по настоящему изобретению, по сравнению с активностью других соединений
Известно то, что S. aureus представляет собой патоген, который заселяет поражения пациентов с атопическим дерматитом, и который также присутствует у пациентов с псориазом (Tomi et al. 2005).
Оценивали противобактериальную активность против S. aureus экстракта, полученного согласно способу по настоящему изобретению. Эксперимент проводили, как описано в Примере 10, с патогенным штаммом S. aureus CIP 4.83, поддерживающей средой Trypticase Soya Agar, опытной средой - смесью MIC/МВС, и агаром Мюллера Хинтона и инкубацией при 36°С в течение 24 ч.
Полученные результаты обобщаются в таблице, приведенной ниже. Можно видеть то, что в то время как целастрол имеет высокую антибактерильную активность, активность против S. aureus экстракта, полученного согласно способу по настоящему изобретению, титрованного в целастроловых эквивалентах, даже лучше. Кроме того, молекула тингенина В имеет лучшую активность, чем тингенина А.
В заключение, данный экстракт имеет не только привлекательную фармакологическую активность против Th17, но, неожиданно, сильную активность против S. aureus, которая делает его очень привлекательным в качестве активного агента в местном лечении атопического дерматита и псориаза.
Пример 12: крем для местного применения
Экстракт Tripterygium wilfordii получают согласно настоящему изобретению, его концентрация выражается как масса сухого экстракта в растворителе, совместимая с препаратом, таким как оливковое масло, пентиленгликоль или миритол 318, или другие.
Этот типичный препарат ни в коей мере не является ограничивающим и может быть адаптирован согласно лечению.
Таким образом, для лечения волосистой части кожи головы может быть приготовлен шампунь посредством обращения к знанию специалиста в данной области.
ССЫЛКИ
Camelio et al. JACS 2015, 137:11864-67
Coppede et al. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 2014, 118:33-43
Jager et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003, 10(1):133-9
Kelhala et al. PLOS One 2014, 9(8):e105238
Liu et al. J. Asian Nat. Prod. Res. 2016, 19:1-10
Lowes et al. Annu. Rev. Immunol. 2014, 32:227
Miyagaki et al. J. Derm. Science 2015, 78:89
Murashige & Skoog Physiol. 1962, 15:473-497
Albanesi et al. Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 2005, 4(3):329-334
Tomi et al. J. Am. Acad. Dermatol. 2005, 53(1):67-72.