Иммунологические методы в диагностике диссеминированных поражений легких

УДК 577.156.6+616-002.5

Т. Ю. Салина

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ДИАГНОСТИКЕ ДИССЕМИНИРОВАННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ЛЕГКИХ

Аннотация. С целью повышения эффективности диагностики диссеминированного туберкулеза легких у 43 больных с трудностями верификации диагноза туберкулеза легких определяли спонтанную и индуцированную антигеном M. bovis (BCG) продукцию фактора некроза опухолей-а (ФНО-а) периферическими мононуклеарными клетками крови и уровень антител к M. tuberculosis в сыворотке крови. Установлено достоверное повышение стимулированной M. bovis (BCG) продукции ФНО-а и увеличение уровня антимикобактериаль-ных антител у больных туберкулезом по сравнению с пациентами с саркоидо-зом и другими интерстициальными заболеваниями легких. Это может служить дополнительными критериями, подтверждающими туберкулезную этиологию патологического процесса.

Ключевые слова: туберкулез, саркоидоз, фактор некроза опухолей-альфа, антитела, диагностика.

Abstract. Increase of efficiency of diagnostics of disseminated pulmonary tuberculosis. We researched 43 patients with difficulties of verification of the diagnosis. We studied the production of tumour necrosis factor-alpha (TNF-а) by peripheral mononuclear blood cells (spontaneous and in response to M. bovis /BCG/) and level of antibodies against M. tuberculosis in serum. It was found increase of production TNF-а, in vitro in response to M. bovis (BCG) and increase of antibodies level against M. tuberculosis from patients with pulmonary tuberculosis in comparison with patients with sarcoidosis and others disseminated pulmonary diseases. This can serve as additional criteria confirming a tubercular etiology of pathological process. Keywords: a tuberculosis, sarcoidosis, tumor necrosis factor-а, an antibody, diagnostics.

В последние годы отмечается увеличение числа больных с диссеминированными (интерстициальными) заболеваниями легких. Это связано не только с улучшением качества диагностики, но и с истинным ростом заболеваемости [1, 2]. По-прежнему сохраняется высокий процент диагностических ошибок при диссеминированных процессах в легких [3]. Атипичность клинико-рентгенологической картины, отсутствие микобактерий туберкулеза, нор-мергические и отрицательные результаты туберкулиновых проб, невозможность в ряде случаев использования морфологических методов верификации диагноза приводят к трудностям дифференциальной диагностики диссеминированного туберкулеза легких с другой легочной патологией [4]. Это заставляет исследователей искать новые подходы к диагностике этих заболеваний.

В противоинфекционной защите организма от внутриклеточной инфекции велика роль провоспалительных цитокинов, в том числе фактора некроза опухолей-а (ФНО-а) [5]. Он имеет значение в формировании гранулем и индукции макрофагальной активности [6, 7], ограничении размножающейся ми-кобактериальной популяции на ранних стадиях иммунного ответа [5]. С нарушением продукции этого цитокина связывают такие клинические проявления туберкулезной инфекции, как лихорадка, потеря в весе, тканевые повреждения, формирование геморрагического некроза и др. [8].

Целью исследования было выявление дополнительных критериев дифференциальной диагностики диссеминированного туберкулеза с другими интерстициальными заболеваниями легких на основе использования иммунологических методов, а именно определения продукции ФНО-а и уровня специфических антител к M. tuberculosis.

Материалы и методы исследования

Под наблюдением находились 43 больных с интерстициальными заболеваниями легких различной этиологии, имевших трудности в верификации диагноза. Из них мужчин - 14, женщин - 29, возраст от 22 до 60 лет. После комплексного клинико-рентгенологического, микробиологического и, в ряде случаев, гистологического обследования диагноз диссеминированного туберкулеза легких установлен у 13 человек (группа 1), саркоидоза легких - у 12 (группа 2), диссеминации другой этиологии (фиброзирующий альвеолит, метастатические поражения легких, пневмокониозы, двусторонние пневмонии) -у 18 человек (группа 3). В качестве контроля обследовано 16 здоровых лиц.

У пациентов групп 1 и 2 проводили определение спонтанной (не стимулированной) и индуцированной антигеном M. bovis (BCG) продукции фактора некроза опухолей-а (ФНО-а) в супернатантах культур периферических мононуклеарных клеток крови. ФНО-а определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием двух моноклональных антител (тест-система Белорусского НИИ гематологии и переливания крови). Супернатанты культур мононуклеарных клеток получали путем краткосрочного (24 ч) культивирования мононуклеаров, выделенных из периферической венозной крови на градиенте плотности фиколл-урографин (р = 1,114 г/см при 200g). Культивирование клеток осуществляли в среде RPMI (Flow Laboratories), содержащей 10 % инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки, 2 тМ глютамина и по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина при t = 37 °С в атмосфере повышенной влажности и СО2. В качестве специфического стимулятора использовали М. bovis (BCG), предварительно культивированные на среде Левенштейна-Иенсена, в рабочей концентрации 50 мкг/мл. Концентрацию ФНО-а вычисляли путем построения калибровочной кривой по результатам титрования рекомбинантного ФНО-а и выражали в пг/мл. Рассчитывали разность между индуцированной и спонтанной продукцией ФНО-а (A BCG).

Дополнительно у всех пациентов проводили определение суммарных (Ig А, М, G) антител к антигенам M. tuberculosis в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа с применением тест-систем АТ-Туб-Бест-стрип (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Учет результатов осуществляли путем измерения оптической плотности на многоканальном иммуноферментном анализаторе марки «Линкэй» (г. Санкт-Петербург, НПО «Научные приборы»).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием компьютерных программ Microsoft  Excel для Windowsxp  и Statistica-6. Использовали методики описательной статистики (среднее арифметическое (М), ошибка средней арифметической (m), интервал колебаний, медиана) и специальные статистические методики (метод корреляции Спирмена). Сравнение двух независимых групп, подчиняющихся нормальному распределению, проводили с помощью t-критерия Стьюдента, а не подчи-

няющихся нормальному распределению - с помощью теста Вилкоксона. В качестве критического уровня достоверности был принят критерий 0,05.

Результаты и обсуждение

В ходе проведенных исследований установлен достоверно более высокий уровень индуцированной антигеном M. bovis (BCG) продукции фактора некроза опухолей-а периферическими мононуклеарными клетками крови у больных диссеминированным туберкулезом легких (группа 1) (среднее значение A BCG составило 1129,0 ± 389 пг/мл, интервал колебаний 0-3500 пг/мл, медиана - 500) по сравнению с больными саркоидозом легких (группа 2) (среднее значение A BCG - 266,2 ± 99,4 пг/мл, интервал колебаний от 0 до 1230 пг/мл, медиана - 138), р1-2 = 0,0500. Спонтанная (не индуцированная антигеном) продукция ФНО-а также была выше у больных диссеминированным туберкулезом легких 927,8 ± 345 пг/мл (интервал колебаний 100-4666 пг/мл, медиана - 500) по сравнению с больными саркоидозом легких 581,5 ± 255 пг/мл (интервал колебаний 60-2550 пг/мл, медиана - 150). Однако из-за большого размаха индивидуальных значений спонтанной продукции ФНО-а различия в группах 1 и 2 недостоверны (р^ = 0,44), но в обеих группах спонтанная продукция ФНО-а была достоверно выше 927,8 ± 345 пг/мл (группа 1) и 581,5 ± 255 пг/мл (группа 2), чем у здоровых (176,8 ± 52 пг/мл, интервал колебаний 0-710 пг/мл, медиана - 106), р1-3 = 0,038 и р2-3 = 0,0038 (табл. 1).

Таблица 1

Средние статистические значения уровня продукции ФНО-а у больных диссеминированным туберкулезом, саркоидозом легких и здоровых

Показатели (М ± т) Диссеминированный туберкулез легких (группа 1) n = 13 Саркоидоз легких (группа 2) n = 12 Здоровые n = 16 Р

Спонтанная продукция ФНО-а (пг/мл) 927,8 ± 345 581,5 ± 255 176,8 ± 52 p1-2 = 0,44 р1-3 = 0,038 р2-3 = 0,0038

Индуцированная M. bovis продукция ФНО-а (A BCG) 1129±389 266,2 ± 99,4 435,7 ± 124 Рі-2 = 0,050 р1-3 = 0,18 V2-3 = 0,11

При анализе клинико-лабораторных данных создалось впечатление, что уровень спонтанной продукции ФНО-а периферическими мононуклеарными клетками крови зависит от степени активности патологического процесса и выраженности симптомов интоксикации. В связи с этим авторами дополнительно проведено изучение корреляционной зависимости спонтанной продукции ФНО-а и выраженности лихорадочной реакции, а также взаимосвязи продукции ФНО-а с некоторыми гематологическими показателями (величина СОЭ и процент лимфоцитов). Так, лихорадочная реакция на момент обследо-

вания отмечалась у девяти из 13 (69,2 %) больных диссеминированным туберкулезом и у двух из 12 (16,6 %) больных саркоидозом легких. У больных диссеминированным туберкулезом легких установлена прямая, высокой тесноты корреляционная связь между уровнем спонтанной продукции ФНО-а и выраженностью лихорадочной реакции с коэффициентом корреляции r = 0,81 (p < 0,01), скоростью оседания эритроцитов с коэффициентом корреляции r = 0,77 (p < 0,05) и обратная средней степени связь с относительным содержанием лимфоцитов в периферической крови r = -0,69 (p < 0,05). При этом у больных саркоидозом не установлено достоверной корреляционной зависимости между величиной спонтанной продукции ФНО-а и гематологическими показателями (процент лимфоцитов и СОЭ) в капиллярной крови. Изучение корреляционной зависимости продукции ФНО-а с уровнем лихорадки у больных саркоидозом не проводилось в связи с ее отсутствием у большинства больных. Полученные данные подтверждают предположение [9], что, несмотря на сходную макрофагальную активацию, наблюдающуюся при обоих гранулематозных заболеваниях (туберкулез и саркоидоз), освобождение ФНО-а только при туберкулезе является причиной тканевых повреждений. Микобактерии туберкулеза не только запускают освобождение ФНО-а макрофагами, но и делают клетки организма более чувствительными к токсическому эффекту цитокинов [9].

При исследовании уровня антител к M. tuberculosis установлено, что у 92,3 % больных группы 1 наблюдается повышенный уровень антимикобакте-риальных антител. Среднее значение оптической плотности (ОП) образцов сыворотки крови пациентов с диссеминированным туберкулезом составило

0,398 ± 0,088 (интервал колебаний 0,01-1,24, медиана - 0,35). В то же время у больных саркоидозом легких (группа 2) и диссеминациями другой этиологии (группа 3) обнаружен низкий уровень антител к M. tuberculosis. Среднее значение ОП у пациентов группы 2 составило 0,012 ± 0,006 (интервал колебаний 0-0,28, медиана - 0), в группе 3 - 0,063 ± 0,03 (интервал колебаний 0-0,4, медиана - 0,04), что достоверно ниже, чем у больных диссеминированным туберкулезом легких 0,398 ± 0,088, медиана - 0,35 (pi-2 = 0,0058; р1-3 = 0,0033) и не отличается от уровня ОП у здоровых 0,058 ± 0,01, медиана - 0 (р > 0,05) (табл. 2).

Таблица 2

Уровень антител к M. tuberculosis в сыворотке крови больных с диссеминированными заболеваниями легких

Группы обследованных Число наблюдений, n Уровень антител к M. tuberculosis

(М ± т) Интервал Медиана Р

Диссеминированный туберкулез легких (группа 1) 13 0,398 ± 0,088 0,01-1,24 0,35 р1-2 = = 0,0058

Саркоидоз легких (группа 2) 12 0,012 ± 0,006 0-0,28 0

Диссеминации другой этиологии (группа 3) 18 0,063±0,03 0-0,4 0,04 р1-3 = = 0,0033

Таким образом, повышение индуцированной специфическим антигеном M. bovis (BCG) продукции ФНО-а периферическими мононуклеарными клетками крови и увеличение уровня антимикобактериальных антител у больных диссеминированным туберкулезом легких могут служить дополнительными критериями, подтверждающими туберкулезную этиологию патологического процесса в трудных случаях диагностики интерстициальных заболеваний легких.

Список литературы

1. Ильченко, В. А. Диссеминированные (диффузные) процессы в легких / В. А. Ильченко // Диагностика и лечение внутренних болезней / под ред. Ф. И. Комарова. - М. : Медицина, 1991. - Т. 2. - С. 229-250.

2. Абумуслимова, Е. А. Структура и причины инвалидности больных интерстициальными заболеваниями легких / Е. А. Абумуслимова, Н. О. Григорьева // Актуальные проблемы медицинской науки и образования : труды II межрегиональной научной конференции (24-25 апреля 2009 г.). - Пенза : Информационноиздательский центр ПензГУ, 2009. - С. 5-6.

3. Мишин, В. Ю. Диагностика и дифференциальная диагностика гематогеннодиссеминированного туберкулеза легких / В. Ю. Мишин, О. В. Демихова, Н. В. Кузьмина // Consilium medicum. - 2002. - Т. 4. - № 9. - С. 498-506.

4. Николаева, Г. М. Диагностика диссеминированного туберкулеза и других гранулематозных заболеваний легких (клинико-лабораторное исследование) : ав-тореф. дис. ... д-ра. мед. наук / Г. М. Николаева. - М., 2004. - 44 с.

5. Bekker, L. G. TNF-б controls intracellular mycobacterial growth by both inducible nitric oxide synthase-dependent and inducible nitric oxide synthase -independent pathways / L. G. Bekker, S. Freeman, P. J. Murray [et al.] // J. Immunol. - 2001. - V. 166. -P. 6728.

6. Dinarello, C. A. Proinflammatory cytokines / C. A. Dinarello // Chest. - 2000. -V.118. - P. 503-508

7. Kaufmann, S. H. E. Protection against tuberculosis: cytokines, T cells and macrophages / S. H. E. Kaufmann // Ann. Rheum. Dis. - 2002. - V. 61 (suppl. 2). - P. 1154-1158.

8. Rook, G. A. W. The role of cytokine in the immunopathology of tuberculosis and the regulation of agalactasyl Ig G / G. A. W. Rook, R. Al. Attivan // Lymphokine Res. -1989. - V.8. - P. 323-332

9. Rook, G. A. W. Cytocines and the Koch phenomenon / G. A. W. Rook, R. Al. Attivan // Tubercle. - 1991. - V. 72. - P. 13-20

Салина Татьяна Юрьевна

доктор медицинских наук, доцент, кафедра фтизиатрии ФПК и ППС, Саратовский государственный медицинский университет

E-mail: SalinaTU@rambler.ru

Salina Tatyana Yuryevna Doctor of medical sciences, associate professor, sub-department of phthisiology, department of advanced education and professional retraining,

Saratov State Medical University

УДК 577.156.6+616-002.5 Салина, Т. Ю.

Иммунологические методы в диагностике диссеминированных поражений легких / Т. Ю. Салина // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2010. - № 3 (15). - С. 86-90.