СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНА ГЕПАТИТА С В РЕАКЦИИ АГЛОМЕРАЦИИ ОБЪЕМНОЙ (РАО)

Способ получения диагностикума для обнаружения антигена гепатита С в реакции агломерации объемной (РАО), включающий следующие стадии:
6
50
а) получают сыворотку крови путем иммунизации кроликов штаммом Virus hepatitis С N ГКВ-963 в дозе 5·10 ЛД, МИЦ (100) в четыре этапа:
I - в течение 3-х дней препарат вводят внутривенно в объеме 0,5 мл;
II - на 8, 9 и 10 дни после первой иммунизации препарат (ГВК-963) суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в объеме 0,5 мл и вводят подкожно в холку животного;
III - на 14, 15 и 16 сутки повторяют внутривенное введение препарата в количестве 0,5 мл;
IV этап - на 20 день препарат (ГКВ-963) суспендируют в полном адьюванте Фрейда в отношении 1:1 и в количестве 1,0 мл вводят подкожно в холку животного, затем на 30 день от начала иммунизации проводят обескровливание животных;
б) выделяют из полученной иммунной сыворотки методом Duberta антитела вируса гепатита С (ВГС);
в) готовят предварительно полимерный носитель, который получают путем растворения в 250 мл дистиллированной воды 1,5 г поливинилпирролидона и 75 мл акролеина, затем к охлажденному до 12°С раствору при перемешивании добавляют раствор 0,3 сафронина в 20 мл 0,1 М натрий хлор, после прекращения подъема температуры охлаждение убирают, реакционную смесь перемешивают 1 ч, затем добавляют 2 г персульфата калия, раствор продувают азотом и полимеризацию проводят еще 2 ч при температуре 70°С, после этого полученные микросферы диаметром 1,1 мкм отмывают водой осаждением в центрифуге;
г) проводят иммобилизацию на полимерный носитель анти-ВГС гепатита С, которые ковалентно связывают с полимерными микросферами носителя, для этого 100 мг последнего дважды отмывают в 0,1 М фосфатно-буферного раствора рН 7,0, разливают в емкости по 10 мл и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин, после деконтируют надосадочную жидкость, а осадок суспендируют в 1,5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора с добавлением 200 мкг/мл анти-ВГС из кроличьей сыворотки, перемешивают, оставляют для контакта в течение 2 ч при температуре 20°С;
д) получают суспензию диагностикума, которую центрифугируют и трижды отмывают 0,9%=ным раствором хлорида натрия при 3000 об/мин по 5 мин, полученный осадок повторно суспендируют в 8 мл 0,1%=ного раствора желатозы на 0,9%=ном растворе хлорида натрия, определяют специфическую активность полученного препарата, который затем разливают в ампулы и лиофилизируют;
е) проводят предварительную подготовку исследуемой сыворотки для РАО для этого берут сыворотку в количестве 0,1 мл разводят в 0,9 мл 0,9%=ного раствора хлорида натрия, после ее прогревают в течение 30 мин в водяной бане при температуре 56°С и оставляют при 20°С на 10 мин, после этого проводят исследования в РАО;
ж) осуществляют реакцию агломерации объемную в планшетах путем внесения в лунки 50 мкл 1%=ной нормальной кроличьей сыворотки, 50 мкл взвеси исследуемой культуры и 25 мкл диагностикума с последующим перемешиванием в течение 1 мин и контактированием при температуре 20°С в течение 2,5 ч.