Способ прижизненной диагностики микобактериозов крупного рогатого скота
METHOD OF LIFE-TIME DIAGNOSTICS OF MYCOBACTERIOSIS OF LARGE CATTLE

Изобретение относится медицине и ветеринарии, а именно к разделу иммунологии, для прижизненной диагностики микобактериозов и дифференциальной диагностики парааллергических реакций у крупного рогатого скота на ППД-туберкулин для млекопитающих. М.И. Гулюкин, А.Х. Найманов, Г.И. Устинова и др. разработали аллерген из атипичных микобактерий. Способ включает выращивание культур атипичных микобактерий на жидкой питательной среде, инактивацию культур автоклавированием при 120° в течение 30 минут, осаждение белка из культурального фильтрата каждого штамма в отдельности трихлоруксусной кислотой до конечной 4% концентрации, переосаждение его сернокислым аммонием при 50% насыщении, диализ раствора белка через целлофановую оболочку против обессоленной воды для удаления солей, определение активности раствора белка каждой культуры атипичных микобактерий, смешивание растворов белка в равных долях по содержанию ЕД, стерилизирующую фильтрацию раствора, расфасовку и лиофилизацию. При этом в качестве культур микобактерий используют М. intracellularae, М. scrofulaceum, M. fortuitum и M. smegmatis, а выращивание культур атипичных микобактерий на жидкой питательной среде осуществляют в течение 2-3 недель (патент 2443428, Россия, МПК, A61K 39/04, A61K 39/35, ВИЭВ).
Разработанный аллерген из атипичных микобактерий применяется in vivo в симультанной пробе с ППД-туберкулином для млекопитающих для диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота при первичной постановке диагноза, а также для контроля за благополучием животных по туберкулезу в хозяйствах, где реакции на туберкулин обусловлены сенсибилизацией атипичными микобактериями. Проба является групповой и дает возможность ориентироваться в ситуации по туберкулезу лишь в целом по стаду или группе (не менее 6 голов) исследуемых животных (Наставление по диагностике туберкулеза животных, 2002).
Классические культуральные и биохимические исследования на плотных питательных средах с оценкой скорости роста, морфологии колоний, пигментообразования, ферментативной активности и др. были единственными в течение многих лет для определения видов нетуберкулезных (атипичных) микобактерий (Макаревич Н.М., Рудой Н.М., Лотоцкая Р.А. и др. Диагностика заболеваний легких, вызванных нетуберкулезными микобактериями //10-й Всесоюзный съезд фтизиатров: Тезисы докладов. - Киев, 1986. - С. 85).
Для ускорения получения результатов бактериологического исследования и выделения большего числа культур микобактерий также используют методы культивирования микобактерий на жидких средах в системах Bactec MGIT и MB-bact (Heifets L. Mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacteria // Semin. Respir. Car Med. - 2004 - Vol. 25. - P. 283-295).
Известен комбинированный метод ускоренной бактериологической диагностики микобактериозов и туберкулеза с использованием модифицированных питательных сред и ПЦР (культурально-генетический метод), авторы Таллер Л.А., Ощепков В.Г., Секин Е.Ю., Янченко Т.А. Микобактерии высевали на модифицированные питательные среды СФД-1 и СФД-2, содержащие фитостимуляторы роста атипичных и патогенных микобактерий, на 5-й день после посева делали смывы и исследовали их в ПЦР. Производственное испытание проводили в сопоставлении с традиционными послеубойными методами диагностики: патологоанатомическим, бактериологическим и биологическим, предусмотренными в Наставлении по диагностике туберкулеза животных (2002). Применение данного метода позволяет сократить сроки постановки диагноза в сравнении с традиционными культуральным и биологическим методами в 6-20 раз (Таллер Л.А., Ошепков В.Г., Секин Е.Ю., Янченко Т.А., Слепченко А.Д. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота // Достижения науки и техники АПК. - 2011. - №9.  -С. 67-69). Недостатком этого способа является затратность для изготовления специфических (моновидовых) праймеров и применение культурально-генетического способа с ПЦР только для посмертной диагностики.
Также известен пальпебральный метод туберкулинизации крупного рогатого скота. Этот метод применяют одновременно с внутрикожной туберкулиновой пробой для дифференциации специфических и параспецифических реакций при первичной постановке диагноза. Крупному рогатому скоту туберкулин вводят пальпебрально (в толщу века) в дозе 0,2 мл в нижнее веко, отступив от его края на 1,5-2 см. Учет и оценку реакции проводят через 72 часа после введения препарата. Оценку реакции проводят визуально, сравнивают веки в месте введения туберкулина и без введения туберкулина. Животных считают реагирующими на туберкулин при образовании ощутимой припухлости в месте введения препарата. На пальпебральную пробу реагирует только крупный рогатый скот, зараженный возбудителем бычьего или человеческого видов. Животные, инфицированные атипичными микобактериями, на пальпебральную пробу не реагируют (Наставление по диагностике туберкулеза животных, Москва, 2002).
Известен «Способ прижизненной диагностики туберкулеза» (см. патент РФ №2563617 от 25 августа 2015 г., G01N 33/49, G 21/76). Способ прижизненной диагностики туберкулеза включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, в качестве объекта исследований используется сыворотка от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, а инактивированную вакцину БЦЖ используют в качестве основного индуктора.
Данный способ применяется для диагностики туберкулеза, поэтому он не позволяет с высокой степенью эффективности дифференцировать сенсибилизированных нетуберкулезными микобактериями от больных туберкулезом животных.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности прижизненной диагностики микобактериозов, предотвращение необоснованного убоя продуктивных животных в хозяйствах различных форм собственности, в том числе фермерских и личных подсобных.
Заявленный технический результат способа прижизненной диагностики микобактериозов крупного рогатого скота включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ), в качестве объекта исследований используют сыворотку от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, в качестве основного индуктора используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий.
Способ осуществляют следующим образом: проводят забор крови от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств; получают сыворотку стандартным способом путем отстаивания крови в термостате, обводки образовавшегося сгустка и дальнейшего центрифугирования образовавшейся сыворотки. В качестве основного индуктора ХЛ используют комплексный аллерген из атипичных микобактерий (КАМ).
В плоскодонный 96-луночный планшет последовательно добавляли: 20 мкл раствор люминола, 50 мкл сыворотки, 50 мкл специфического индуктора (аллерген КАМ), стабилизирующий раствор для отрицательного контроля антигена 50 мкл, с последующей регистрацией спонтанной и индуцированной ХЛ.
Приготовление люминола - люминол-гидразид - 3 - фталевой кислоты, 40 мг люминола растворяли горячим (~95-98°С) раствором 0, 01 Н NaOH на дезинтеграторе MSE при амплитуде 16 microns до получения прозрачного раствора, в течение 7-10 мин. Определяли рН 7,2 и доводили общий объем до 20 мл 1-кратным раствором Хэнкса без фенолового красного.
Приготовление основного индуктора - комплексного аллергена из атипичных микобактерий (разведения).
Готовили разведения 1:50, 1:100 согласно «Схеме последовательного разведения сыворотки» (Ветеринарная лабораторная практика, 1963, Москва).
Для регистрации спонтанной и индуцированной хемилюминесценции использовали иммунохимический анализатор «Флюорофот» (ООО «СКБ «ПРОБАНАУЧПРРГБОР», Россия, г. Санкт-Петербург). Функционирование осуществляли под управлением подключаемой к анализатору ПЭВМ с программным управлением. Измеряли ХЛ монохроматического излучения находящейся в лунке жидкости (опытные и контрольные образцы), возникающего в результате химической реакции с участием люминофора фотоэлектронным умножителем (ФЭУ) в режиме значений интенсивности хемилюминесценции.
Регистрацию проводили в цифровых показателях - единицы счета числа фотонов (условные единицы, у.е.) при длине волны А, 460, 545, 642 нм. При интерпретации полученных результатов учитывали степень превышения уровня свечения опытной исследуемой пробы по сравнению с отрицательным контролем антигена.
При проведении экспериментов лабораторных животных содержали в условиях вивария, кормление осуществляли согласно «Правилам работы с использованием лабораторных животных» №755 от 12.08.1977 г.
Для изучения специфичности показаний ХЛ сыворотки крови с индуктором-антигеном КАМ проведена серия экспериментов на морских свинках, подобранных по принципу аналогов, зараженных музейными культурами атипичных микобактерий III (M.intracellularae) и IV (M. smegmatis+M. phlei) групп по классификации Раньона, как наиболее часто выделяемые в регионе Западной Сибири.
Опыт. Две опытные группы морских свинок по 5 гол., на 4 срока взятия крови, заражали атипичными микобактериями M. intracellularae и M. smegmatis подкожно в дозе 40 мг /гол. в 1 мл растворителя, контрольной группе (5 здоровых морских свинок) вводили физиологический раствор в дозе 1 мл подкожно.
На 14-е, 28-е, 45-е, 60-е сутки после заражения от каждой опытной группы брали пробы крови, получали из нее сыворотку, определяли показатели ХЛ сыворотки крови опытных животных при взаимодействии со специфическим индуктором КАМ, взятым в разведениях 1:50, 1:100.
Установлено, что на 14-й день после заражения у животных обеих групп наблюдали всплеск уровня свечения ХЛ:
1-я опытная группа М. intracellularae у 2-х голов из 5 (40%), К ст. (Коэффициент стимуляции) 40,0;
2-я опытная группа M.smegmatis у 4-х из 5 (80%), К ст.от 2,2 до 44,2.
При патологоанатомической экспертизе во внутренних органах в месте введения - уплотнение, кровоизлияния, увеличен регионарный лимфоузел у животных в обеих группах. При бактериологическом исследовании - рост заражающей культуры М. intracellularae в виде белых беспигментных колоний;
M.smegmatis- роста нет.
На 28-й день после заражения: ХЛ:
1-я опытная группа M. intracellularae у 4-х из 5 (80%), К ст. 12,5;
2-я опытная группа M. smegmatis у 4-х из 5 (80%), К ст. 44,2.
У опытных свинок, зараженных М. intracellularae, в месте введения суспензии - кровоизлияния, во внутренних органах - лимфатические узлы увеличены, в печени - единичные или множественные туберкулезоподобные очажки, селезенка кровенаполнена.
При бактериологическом исследовании биоматериала от опытных животных - рост заражающей культуры М. intracellularae в виде белых беспигментных колоний. У опытных свинок, зараженных M. smegmatis, в месте введения и внутренних органах нет изменений; при бактериологическом исследовании - роста нет.
На 45-й день после заражения: ХЛ:
1- я опытная группа М. intracellularae у 4-х из 4 (100%), К ст. 8,6;
2- я опытная группа M. smegmatis у 3-х из 3 (100%), К ст. 18,7.
У опытных свинок, зараженных М. intracellularae, в месте введения суспензии - язвы, лимфатические узлы увеличены, в печени - единичные или множественные туберкулезоподобные очажки.
При бактериологическом исследовании биоматериала от опытных животных - рост заражающей культуры М. intracellularae в виде белых беспигментных колоний.
У опытных свинок, зараженных M. smegmatis, в месте введения и внутренних органах практически нет изменений; при бактериологическом исследовании - роста нет.
На 60-й день после заражения: ХЛ:
1-я опытная группа M. intracellularae у 5-х из 5 (100%), К ст. 13,5;
2-я опытная группа M. smegmatis у 5-х из 5 (100%), К ст. 9,0.
У опытных свинок, зараженных М. intracellularae, в месте введения суспензии - струп, селезенка рыхлая, но не увеличена. При бактериологическом исследовании биоматериала от опытных животных - рост заражающей культуры М. intracellularae в виде белых беспигментных колоний.
У опытных свинок, зараженных M. smegmatis, в месте введения и внутренних органах практически нет изменений; при бактериологическом исследовании - роста нет.
В результате ХЛ исследований сыворотки крови морских свинок, экспериментально зараженных атипичными микобактериями III-IV групп по Раньону, установлено превышение уровня сверхслабого свечения опытных проб с КАМ над отрицательным контролем антигена в 2,2-9 и более раз с 14-го дня заражения.
Также положительный контроль с БЦЖ находился на уровне отрицательного контроля.
У здоровых животных в контрольной группе во все сроки исследований результат отрицательный.
Таким образом, аллерген КАМ при использовании in vitro в ХЛ реакции с сывороткой крови морских свинок, экспериментально зараженных атипичными микобактериями, является специфичным. Способ позволяет сократить сроки постановки диагноза до 3-4 часов с момента доставки проб крови для исследований вместо 3 мес (Наставление по диагностике туберкулеза животных, Москва, 2002).
Особенно результативны показатели ХЛ в эксперименте на морских свинках, зараженных атипичными микобактериями IV группы по Раньону - пробы сыворотки опытных животных дали положительный результат в ХЛ от 80% до 100%, хотя при патологоанатомической экспертизе во внутренних органах не наблюдали выраженных туберкулезоподобных изменений, и не выделена исходная заражающая культура (в поздние сроки). Отсутствие роста при посеве органов подтверждает неспособность атипичных микобактерий именно IV группы, как условных сапрофитов, размножаться в организме животного, заражающая культура выделялась до 14-го дня после заражения.
Достоверность результатов ХЛ исследований в опытах подтверждена результатами бактериологических исследований - из биоматериала опытных морских свинок выделяли исходную заражающую культуру до 14-го дня после заражения. При патологоанатомической экспертизе у опытных животных наблюдали в месте введения суспензии уплотнение или изъязвление с последующим заживлением и образованием струпа; во внутренних органах (селезенка, печень, легкие) наблюдали мелкие и средние туберкулезоподобные очаги без последующего прогрессирования.
Пример. Научно-производственный опыт на крупном рогатом скоте, в котором была проверена специфичность показаний ХЛ сыворотки с КАМ.
Работа проведена в благополучном по туберкулезу хозяйстве, где регулярно выявляются положительно реагирующие на ППД-туберкулин коровы и нетели. В таблице представлены результаты комплексных исследований на туберкулез и микобактериозы поголовья крупного рогатого скота ООО «Булатовское» Куйбышевского района Новосибирской области.
Из таблицы следует, что в данном хозяйстве в январе и июне 2012 г. проведено 1346 исследований крупного рогатого скота внутрикожной пробой ППД для млекопитающих. Положительно прореагировали на внутрикожную пробу 147 гол., из них дополнительно на пальпебральную пробу ППД - туберкулином - 21 гол. При контрольно-диагностическом убое и патологоанатомической экспертизе внутренних органов этих 21 гол. туберкулезных изменений не обнаружено.
Отсутствие туберкулеза в данном хозяйстве также подтверждено отрицательными результатами биологической пробы на морских свинках и бактериологическими исследованиями 21 пробы послеубойного биоматериала - при посеве на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Фаст-3Л культур патогенных микобактерий бычьего, человеческого, птичьего не выделено. Выделены атипичные микобактерии 3 и 4 групп по классификации Раньона. Также атипичные микобактерии выделены из проб кормов и от голубей, постоянно присутствующих на фермах.
Дополнительно, при исследовании ХЛ методом с индуктором КАМ 147 пробы сыворотки крови - индуцированная ХЛ составила 53,62 у.е., что более чем в 100 раз превышала интенсивность спонтанной ХЛ (отрицательный контроль) - 0,48 у.е., положительный контроль с БЦЖ - 0,17 у.е. (Р<0,001 уровень достоверно значимых различий между индуцированной ХЛ исследуемых проб и спонтанной ХЛ отрицательного контроля).
На основании проведенных комплексных ветеринарно-диагностических исследований в 2012 г. в ООО «Булатовское» Куйбышевского района Новосибирской области туберкулез крупного рогатого скота исключен. Установлена сенсибилизация крупного рогатого скота факторами нетуберкулезной этиологии, в частности атипичными микобактериями. Перманентная персистенция атипичных микобактерий, воспалительные процессы у животных вызывают сенсибилизацию и аллергизацию макроорганизма с последующей повышенной чувствительностью к ГТЛД-туберкулину (Ощепков В.Г. и др., Динамика возможного проявления неспецифических реакций на туберкулез у крупного рогатого скота в хозяйствах, благополучных по туберкулезу // Инфекционная патология животных: сборник трудов, Омск - 2001 - С. 211-215).
Из 139 голов, потенциально подлежащих убою, согласно Наставлению по диагностике туберкулеза (2002), 119 сохранены для дальнейшего хозяйственного использования.
Анализ показал, что в отличие от известного способа, использование в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий предлагаемого способа прижизненной диагностики микобактериозов позволяет повысить точность диагностики микобактериозов и туберкулеза у крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах, предотвратить необоснованный убой продуктивных животных в хозяйствах различных форм собственности, в том числе фермерских и личных подсобных.