ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ КОМПЛЕКСЫ АЛЛОФЕРОНА С ЦИНКОМ, И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE ALLOFERON AND ZINC COMPLEXES AND METHOD OF PRODUCTION THEREOF

Изобретение относится к фармацевтической сфере и касается оптимизации состава композиции, содержащей биологически активный комплекс цинка с пептидом аллоферон.
Известен патент RU2470031 (Киселев О.И., Ершов Ф.И., опубл.: 20.12.2012.) описывающий цинксодержащие пептидные комплексы вида
обладающие противовирусной и иммуномодулирующую активностью.
Данное решение выбрано как прототип.
Комплексные соединения пептидов с цинком данного вида являются основным содержанием патента RU2470031. Однако предложенная авторами патента структурная формула  комплексов, базируется исключительно на общих положениях о свойствах цинка и гистидин-содержащих пептидов, а также данных  компьютерного моделирования, являясь по существу сугубо теоретической. Заявленные авторами комплексы относятся к широкому кругу пептидов, молекулы которых содержат несколько (не менее трех) остатков гистидина.
Основным объектом рассмотрения авторов является олигопептид Аллоферон (аллоферон-1 патента RU2172322 «Аллофероны – иммуномодулирующие пептиды» Черныш С.И., Ким Су Ин, Беккер Г.П. и др.). Однако свои выводы авторы распространили не только на все обширное семейство аллоферонов, но и на другие пептиды, обогащенные гистидином. Авторы патента предположили, что гистидин-содержащие пептиды образуют с цинком комплексы хелатного типа, в которых цинк координационно связан с остатками гистидина. Однако структурную формулу комплексов, являющуюся основным содержанием изобретения, авторы никакими экспериментальными доказательствами не подтвердили. Правомерность структурной формулы без ее обоснования вызывает большие сомнения. Сомнение вызывает и априорное распространение формулы комплексов и выводов об их биологической активности на широкий круг не исследованных пептидов.
Из текста патента следует, что для оценки биологических свойств комплексов использовались водные растворы. Однако известно, что в водной среде поведение комплексных соединений носит сложный характер (О.В. Сергеева. Реакции в водных растворах. Сложные ионные равновесия. Минск, 2009). Это обстоятельство не позволяет делать однозначных выводов о структуре и составе комплексов на основе лишь теоретических предпосылок. Комплексные соединения являются веществами с в принципе нестабильной структурой (Гринберг А. А., Введение в химию комплексных соединении, 4 изд., Л., 1971). В водных растворах они всегда представляют собой смесь разных форм, равновесие между которыми характеризуется константами устойчивости (нестойкости).   Для комплексов пептидов или белков, как слабых лигандов, это выражено в еще большей степени («Неорганическая биохимия» Мир, М., 1978, т.1, с.152 – 162, раздел «Комплексы металлов с аминокислотами и пептидами»). Для системы аллоферон – цинк это усугубляется тем что, во-первых, цинк является слабым комплексообразователем, во-вторых, аллоферон обладает, на ряду с гистидином, другими функциональными группами способными к координации.
Авторами патента RU2470031 показано, что биологическая активность комплексов аллоферона с цинком превышает активность исходного пептида. Однако, приведя данные о биологических свойствах комплексов, авторы патента не привели никаких данных о способе их получения. В описании не указано, какие соли цинка были использованы для получения комплексов, не приведена методика их получения и допустимые условия (рН, растворители, ионная сила, дополнительные компоненты), при которых эти комплексы существуют.
Таким образом, патент  RU2470031 носит  сугубо теоретический характер, он не может быть воспроизведен и  использован в практических целях.
С практической точки зрения необходимо установить, во-первых, факт наличия комплексов аллоферона с цинком в водном растворе, во-вторых, найти условия их существования.
Комплексные соединения являются продуктами взаимодействия веществ, одно из которых обладает свойствами акцептора электронов – комплексообразователь, второе является донором электронов - лиганд. При смешивании двух растворов, содержащих ионы металла (комплексообразователь) и лиганд  (в данном случае лигандом является аллоферон), начнется процесс комплексообразования, т.е. присоединение лиганда к иону металла. Присоединение лиганда к металлу происходит ступенчато до тех пор, пока количество лиганда не станет равным координационному числу комплексообразователя (для цинка оно, в основном, равно 4). Устанавливается динамическое равновесие, при котором происходит как образование комплекса, так и его распад. Таким образом, в растворе, как правило, одновременно содержатся все формы комплексов, образовавшиеся на различных стадиях комплексообразования, а также исходные вещества. Пропорция их зависит от прочности образующихся соединений (Гринберг А. А., Введение в химию комплексных соединении, 4 изд., Л., 1971).
Устойчивость комплексов определяется как фундаментальными факторами (природой комплексообразователя и лигандов), так и внешними условиями (температурой, природой растворителя, ионной силой, составом раствора). Среди фундаментальных факторов, влияющих на устойчивость комплексов, следует выделить природу центрального атома и лиганда, структуру лиганда и стерические факторы. Лиганды имеющие несколько сайтов связывания (полидентантные лиганды) могут образовывать циклические комплексы - хелаты, которые обладают большей устойчивостью.
Пептиды, как лиганды, имеют несколько сайтов связывания с металлами, т. е. являются полидентантными лигандами. Такими сайтами могут быть: концевые амино- и карбоксильная группы, амидный атом азота пептидной связи, а также боковые функциональные группы аминокислотных остатков. Поэтому для пептидов характерно образование комплексов хелатного типа.
Аллоферон, наряду с указанными выше активными группами, имеет в своем составе 4 остатка гистидина – аминокислоты, содержащей имидазольное кольцо, которое обладает склонностью к образованию комплексов. Это придает аллоферону свойства активного лиганда. Данное обстоятельство использовано в вышеуказанном патенте RU2470031. Поскольку координационное число цинка обычно равно 4, а в молекуле аллоферона присутствует 4 остатка гистидина, формула хелатного комплекса, предложенная авторами патента RU2470031 кажется очевидной. Однако наличие в составе молекулы аллоферона других функциональных групп, способных координироваться с ионами металлов, предполагает возможность существования иных структур. Особенности комплексообразования в водной среде также должны влиять на состав и структуру образующихся соединений.
Комплексные соединения аллоферона и его производных с ионами меди, образующиеся в водных растворах, тщательно изучены группой польских ученых и описаны в ряде статей. В работе T.Kowalik-Jankowsca, L. Biega, М. Kuzer, D.Konopinska. Mononuclear Copper (II) complexes of alloferon 1 and 2: A combined potentiometric and spectroscopic studies. J. Inorg. Biochem. 103, 2009, 135 – 142 авторы проводят детальный анализ равновесия в системе аллоферон – медь (при их эквимолекулярных соотношениях), основывающийся на данных потенциометрического титрования и спектрометрии. Медь и цинк как комплексообразователи обладают схожими свойствами, поэтому данные, полученные для меди, могут быть приняты во внимание при изучении комплексов аллоферона с цинком.
Работы польских исследователей показали, что в системе аллоферон – медь в водных растворах образуется множество соединений хелатного типа, состав и количество которых очень сильно зависит от рН среды. Было показано, что при всех значениях рН ионы меди и аллоферон образуют комплексы, находящиеся в равновесии с исходными компонентами. Установлено, что ион меди образует связь с остатками гистидина и непременно с концевой аминогруппой аллоферона. Число связей меди с азотом гистидина зависит от рН среды и растет с повышением ее величины.  Она может быть связана с  одним,  двумя  или тремя остатками гистидина. Важно то, что один из четырех остатков гистидина всегда остается свободным не связанным с ионом металла. Такая структура  комплексов отличается от формулы, приведенной в патенте RU2470031, в которой рассматривается связывание  именно по 4 остаткам гистидина. Авторами польской статьи показано, что связывание по 4 гистидинам возможно, но только в случае блокирования концевой аминогруппы, например, путем ее ацетилирования.
Важным обстоятельством, обнаруженным авторами статьи, является то, что в системе аллоферон – медь одновременно присутствуют комплексные соединения разного состава и строения. Так в ней найдены полиядерные комплексы, в которых с одной молекулой аллоферона координировано несколько ионов металла.  Таким образом, система аллоферон – медь в водном растворе имеет сложный состав, в ней одновременно присутствуют как комплексные соединения различного состава, так и исходные вещества - аллоферон и соль меди.
Близкие закономерности должны наблюдаться и для водных растворов системы аллоферон - цинк. Однако, важно иметь в виду то, что цинк в ряду Ирвинга – Уильямса по комплексообразующей активности уступает меди (О. В. Сергеева. Реакции в водных растворах. Сложные ионные равновесия. Минск, 2009, 70 с). Поэтому комплексные соединения цинка, как правило, менее устойчивы, чем медные. Однако можно предположить, что природа и закономерности существования комплексных соединений в системе аллоферон – цинк будут близкими к  описанным выше для меди.
Задачей данного изобретения является создание фармацевтической композиции обладающей повышенной биологической активностью, содержащей активные комплексы аллоферона с цинком в  оптимальном составе, а также условий, которые позволяют получить раствор, содержащий максимальную концентрацию этих соединений.
Техническим результатом изобретения является композиция, состав и свойства которой позволяют достигнуть в растворе высокой концентрации комплексных соединений, образуемых взаимодействием аллоферона с ионами цинка, которая обладает биологической активностью, причем противовирусная активность композиции превышает противовирусную активность самого аллоферона.
Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлена фармацевтическая композиция, обладающая противовирусной и иммуномодулирующей активностью, содержащей в качестве активных веществ аллоферон и цинк, отличающаяся тем, что ее активным началом является смесь биологически активных комплексных соединений, образуемых взаимодействием олигопептида аллоферон с ионами цинка в водной среде, причем цинк и аллоферон в растворе образуют комплексные соединения различного состава, а концентрация растворов аллоферона и соли цинка подобрана таким образом, что мольное соотношение компонентов аллоферона и соли цинка составляет от 1 : 1 до 1 : 2.
Допустимо, что состав композиции образуют аллоферон, соль цинка, взятая в эквимолекулярном или большем количестве; в качестве среды используется 0,9% раствор натрия хлорида или натрия ацетата, а рН раствора находится в пределах от 6,5 до 8,0 (преимущественно 7,5).
Допустимо, что в качестве соли цинка используют его ацетат или хлорид.
Допустимо, что при приготовлении композиции сначала готовят первый раствор, который получают растворением 100 мг аллоферона в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата, параллельно готовят второй раствор, который получают растворением 17,4 мг ацетата цинка дигидрата или 10,8 мг хлорида цинка безводного в 50 мл  0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата; после чего в первый раствор постепенно при перемешивании вводят второй раствор; через 30 минут контролируют рН раствора и доводят его до величины 6,5 – 8,0 с помощью 0,1 М раствора гидроксида натрия или кислоты хлористоводородной; полученный раствор стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,2 мкм, дозируют в ампулы или флаконы, которые герметизируют.
Допустимо,  что обеспечивают конечные концентрации компонентов композиции: аллоферон – 1 мг/мл, соль цинка от 0,052 до 0,104 мг цинка /мл.
Допустимо, что при приготовлении композиции сначала готовят первый раствор, который получают растворением 100 мг аллоферона в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата, параллельно готовят второй раствор, который получают растворением 34,8 мг ацетата цинка дигидрата или 21,6 мг хлорида цинка безводного в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата; после чего в первый раствор постепенно при перемешивании вводят второй раствор; через 30 минут контролируют рН раствора и доводят его до величины 6,5 – 8,0 с помощью 0,1 М раствора гидроксида натрия или кислоты хлористоводородной; полученный раствор стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,2 мкм, дозируют в ампулы или флаконы, которые затем герметизируют.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1 показан масс-спектр 0,001 М раствора аллоферона в воде.
На Фиг 2 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком в воде при мольном соотношении аллоферон – цинк 1 : 1.
На Фиг 3 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком в воде при соотно-шении аллоферон – цинк 1 : 2.
На Фиг 4 показан фрагмент масс-спектра комплекса аллоферона с цинком. Трехзарядный ион m/z 443,1721. Экспериментальные данные.
На Фиг 5 показан фрагмент теоретически рассчитанного масс-спектра комплекса аллоферона с цинком, m/z 443,1721.
На Фиг 6 показан масс-спектр системы аллоферон + цинк в 0,9% растворе натрия хлорида
На Фиг 7 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком при рН 4,0.
На Фиг 8 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком при рН 6,0.
На Фиг 9 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком при рН 8,0.
На Фиг.10 показаны кривые титрирования растворов.
На Фиг.11 показаны дифференциальные кривые титрирования растворов.
На Фиг.12 показаны дифференциальные кривые титрирования растворов.
Осуществление изобретения
При осуществлении разработки в качестве солей цинка были использованы ацетат цинка и хлорид цинка. Только эти соли цинка входят в состав лекарственных препаратов для парентерального введения, прежде всего в различные формы инсулина. В качестве растворителя были использованы 0,9% растворы натрия хлорида и натрия ацетата в воде. Другие изотонические растворы (раствор Рингера и т.д.) в данном случае не применимы, т.к. содержат дополнительно ионы кальция, а также фосфаты и карбонаты, образующие с цинком нерастворимые соединения.
Растворы, содержащие аллоферон и соли цинка, были изучены с помощью потенциометрического титрования и масс-спектрометрии.
Установлено, что в системе аллоферон - соль цинка в водной среде происходит процесс комплексообразования. При этом в растворе всегда присутствует равновесная смесь исходных компонентов - аллоферона и соли цинка, а также образуемых ими комплексных соединений. Найдено, что цинк и аллоферон в растворе образуют комплексные соединения различного состава. Преимущественно образуются комплексы, в которых молекула аллоферона связана с одним ионом цинка. Однако наряду с ними, в растворе присутствуют комплексы, в которых с молекулой аллоферона связаны сразу два иона цинка, а также димеры, в которых один ион цинка связывается с двумя молекулами аллоферона. Таким образом, в системе аллоферон – цинк в водном растворе присутствует сложная смесь веществ, включающая исходные компоненты и комплексы различных структур и составов. При этом очевидно, что состав и структура этих комплексов, существенно отличаются от формулы, данной в патенте RU2470031.
Найдено, что состав и концентрация образующихся комплексов зависит от рН, соотношения аллоферон : цинк и ионной силы раствора. Увеличение величины рН повышает концентрацию комплексов. Такой же эффект дает увеличение количества соли цинка выше эквимолекулярного. Использование в качестве среды 0,9% растворов натрия хлорида или натрия ацетата имеющих рН в пределах от 6,5 до 8,0 позволило получить композицию, в которой степень комплексообразования близка к количественной.
В итоге разработанная композиция включает комплексные соединения аллоферона и цинка различного строения, исходные аллоферон и соль цинка (ацетат или хлорид), 0,9% раствор натрия хлорида или натрия ацетата и имеет рН в диапазоне от 6,5 до 8,0, преимущественно 7,5. При этом для приготовления композиции берут аллоферон и эквивалентное ему или большее количество соли цинка.  Композиция получается путем смешения равных объемов растворов ацетата или хлорида цинка и аллоферона в 0,9% растворе натрия хлорида или натрия ацетата, с последующей корректировкой рН до указанной величины 6,5 – 8,0 (предпочтительно 7,5).
Биологическая активность заявляемых композиций была подтверждена экспериментами. В качестве препаратов сравнения использовали лекарственное средство «Аллокин-альфа, лиофлизат для приготовления раствора для подкожного введения», содержащее 1 мг чистого аллоферона без вспомогательных веществ, а также стандартный противогерпетический препарат «Ацикловир». Противовирусная активность разработанной композиции, показанная ранее (патент RU2470031) на примере вируса гриппа, проверена испытаниями с вирусом герпеса. Результат испытаний подтвердил данные патента RU2470031, показав более высокую противовирусную активность композиции в сравнении с аллофероном. Иммуномодулирующие свойства разработанной композиции, показанные на примере индукции интерферона-гамма и интерлейкина-18, также выше, чем у чистого пептида аллоферона.
Выводы подтверждены примерами.
Пример 1. Масс-спектрометрические исследования.
В силу методических требований к оборудованию, в растворах для масс-спектрометрии ESI-MS нежелательно присутствие неорганических солей, поэтому большая часть растворов готовились на воде дистиллированной. Растворы с различными значениями рН готовили, используя формиатный буфер (рН 4 и 6) и трис-буфер (рН 8,0). Концентрация растворов аллоферона и соли цинка составляла 0,001 М, мольное соотношение компонентов составляло 1 : 1 и 1 : 2. В качестве соли цинка использовали ацетат цинка.
Для работы использован масс-спектрометрический детектор – LTQ OrbiTrap Velos с электрораспылительной ионизацией при атмосферном давлении и программным обеспечением для управления и обработки данных «Xcalibur».
Условия работы масс-спектрометрического детектора:
- Поток газа-осушителя - 10 у.е.
- Поток вспомогательного газа - 5 у.е.
- Температура газа-осушителя - 80°С;
- Температура вспомогательного потока - 280°С;
- Напряжение на капилляре - 3500В;
- Прямой ввод образца с помощью шприца объемом 500 мкл и скоростью потока 5 мкл/мин
- Детектирование в режиме сканирования по полному ионному току (SCAN): регистрация ионов в диапазоне m/z от 300 до 1500 (при положительной ионизации).
Моноизотопные массы некоторых возможных ионов аллоферона представлены ниже:
52
76
22
16
Аллоферон: Брутто формула CHNO, моноизотопная молекулярная масса M.W.=1264.58096
+
Однозарядный ион m/z [M+H]=1265.58824
2+
Двухзарядный ион m/z [M+2H]=633.29776
2+
Двухзарядный ион с натрием m/z [M+2Na]=644.28873
3+
Трехзарядный ион m/z [M+3H]=422.53426
2+
3+
На Фиг. 1 показан масс-спектр 0,001М раствора аллоферона в воде. Хорошо определяются несколько характерных для пептида ионов. Ион с m/z 1265,5896 – однозарядный ион, ион с m/z 633,2992 является двухзарядным ионом [M+2H]и трехзарядный ион [M+3H]с m/z 422,5351.
На Фиг. 2 показан масс-спектр 0,001 М раствора содержащего аллоферон и соль цинка  при мольном соотношении аллоферон – цинк 1 : 1. Сравнение спектров Фиг. 1 (аллоферон) и Фиг.2 (композиция) показывает, что в системе появились сигналы новых ионов, наличие которых может быть объяснено только образованием комплексных соединений аллоферона с цинком. Малая интенсивности сигналов новых ионов свидетельствует, что содержание в растворе свободного аллоферона значительно выше, чем концентрация комплекса.
3+
2+
52
76
22
16
Спектр Фиг. 2 содержит сигнал с m/z 443,1731, соответствующий трехзарядному иону цинкового комплекса [M+Zn+H] , а также сигнал с m/z 664,2556, который соответствует двухзарядному иону комплекса [M+Zn]. Оба сигнала соответствуют  комплексу  с брутто формулой CHNOZn.
На фиг. 3 показан масс-спектр 0,001 М раствора комплекса аллоферона с цинком в воде при мольном соотношении аллоферон – цинк 1 : 2. Он показывает, что увеличение содержания цинка ведет к существенному росту концентрации комплекса в растворе. Композиции с отношением аллоферон : цинк большим, чем 1 : 2 не исследовались.
52
76
22
16
Представленные на Фиг. 4 и Фиг. 5 реальный и теоретический масс-спектры трехзарядного иона комплекса практически совпадают, что свидетельствует о правильности  интерпретации этого сигнала в масс-спектре как соответствующего комплексу с брутто-формулой CHNOZn. Такое же совпадение теории и практики было получено и для двухзарядного иона.
52
72
22
16
2
104
152
44
32
Кроме того в спектрах имеются сигналы с m/z 465,1425 и 697,2097. Они соответствуют комплексу с брутто формулой CHNOZn, в котором аллоферон связан сразу с 2 атомами цинка. Выполненное сравнение реального и теоретически рассчитанного масс-спектра трехзарядного иона с m/z 465,1425  подтверждает это отождествление. Также наблюдается наличие трехзарядного иона с m/z 886,6705, соответствующего димеру аллоферона с цинком CHNOZn.
Таким образом, масс-спектрометрическое исследование показывает, что в водной среде алллоферон в сочетании с солями цинка образует комплексные соединения различных форм и составов.
52
76
22
16
Несмотря на имеющиеся технические ограничения, были  получены масс-спектр системы аллоферон – цинк в солевых растворах. На  Фиг.6 приведен масс-спектр композиции в 0,9% растворе натрия хлорида. Интенсивность двух- и трехзарядного сигналов с m/z 664,2558  и 443,1728 показывает, что в изотоническом растворе достигается высокое содержание комплексов  аллоферона с цинком состава CHNOZn. Интенсивность сигналов двухзарядного иона комплекса с m/z 664,2558 в спектре Фиг. 6 существенно выше, чем для иона аллоферона m/z 633.29776, а трехзарядного m/z 443,1721 на его уровне (m/z 422.53426). Масс-спектр композиции в растворе ацетата натрия аналогичен Фиг.6.
Была исследована зависимость содержания комплексных соединений в растворе аллоферона с цинком от величины рН раствора.
Результаты (Фиг.7 - 9) показывают, что содержание комплексных соединений аллоферона с цинком зависит от величины рН.  При увеличении значения рН в интервале от 4 до 8 наблюдается увеличение интенсивности соответствующих сигналов в масс-спектрах водных растворов комплексных соединений цинка и аллоферона, что может свидетельствовать об увеличении их концентрации в растворе вследствие изменения рН.
Максимальная интенсивность двухзарядного цинкового комплекса m/z  664,2558 наблюдается при рН 8. Сигнал  трехзарядного иона комплекса при этом рН отсутствует.
Приведенные выше результаты масс-спектрометрических исследований с большой вероятностью показали, что:
• аллоферон с солями цинка в водном растворе образует комплексные соединения;
• в водном растворе одновременно присутствуют комплексы аллоферона с цинком различного состава и строения, а также свободный аллоферон.
• концентрация комплексов зависит от рН раствора, с его ростом их концентрация увеличивается с максимумом при рН 8,0;
• концентрация комплексов зависит от соотношения аллоферон - цинк и ионной си-лы раствора;
Вывод:  композиция с максимальной концентрацией комплексных соединений включает аллоферон, соль цинка в количестве равном или большем эквимолекулярного в 0,9% растворе натрия хлорида или натрия ацетата с рН от 6,0 до 8,0.
Пример 2. Потенциометрическое титрование.
3
2
2
2
Исследуемые растворы имели концентрацию 0,001 М по аллоферону и цинку при моль-ном соотношение 1 : 1. Растворитель – 0,9% раствор натрия хлорида. Объем титруемых растворов составлял 30 мл. Для приготовления растворов использовали дигидрат ацетата цинка Zn(CHCOO)*2HO и безводный хлорид цинка ZnCl.
Для работы использовался титратор потенциометрический автоматический АТП-02, позволяющий получать кривую титрования в интегральной и дифференциальной формах.
Были выполнены титрования как композиции аллоферона с солями цинка, так и растворов исходных компонентов - аллоферона, ацетата и хлорида цинка. Титрование проводилось раздельно в кислую и щелочную область раздельно. Каждое титрование проводилось трижды. Усредненные данные титрований приведены в интегральной (Фиг.10) и дифференциальной (Фиг.11) форме.
Кривая титрования аллоферона имеет два четко выраженных скачка при рН 4,75 и 9,4, которые количественно точно соответствуют присутствию 4-х остатков гистидина и одной концевой СООН-группы.
Кривые титрования смесей аллоферон + соль цинка носят существенно иной характер. Во-первых, введение соли цинка в раствор аллоферона существенно (с 7,5 до 6,5) меняет величину рН раствора. Уже это обстоятельство позволяет предположить наличие взаимодействия между компонентами в изучаемой системе.
Во-вторых, скачки титрования растворов композиций в сравнении с кривой для аллоферона сильно размыты (амплитуда скачка dE/dV на дифференциальных кривых резко уменьшена). В-третьих, на кривых присутствуют новые скачки титрования. Данные  отличия невозможно описать путем простого сложения кривых титрования чистого аллоферона и чистых растворов солей цинка (Фиг.10). Дифференциальные кривые (Фиг.11 и более подробно Фиг. 12) показывают это более четко. Эти обстоятельства однозначно свидетельствуют о наличии взаимодействия между аллофероном и солями цинка. Таким взаимодействием может быть только комплексообразование. Однако малая амплитуда скачков титрования свидетельствует о слабой связанности аллоферона с цинком.
В кислой области наблюдается исчезновение скачка при рН 4,75, характерного для алло-ферона, и возникновение скачка при рН 4,25. Имеется также новый, но очень слабый, ска-чок при рН 6,5, более выраженный в случае ацетата цинка.
Наиболее важные изменения имеют место в щелочной области. Так практически отсутствует скачок при рН 9,4, характерный как для аллоферона, так и для солей цинка. Это свидетельствует о том, что содержание свободных аллоферона и ионов цинка в растворе в щелочной области не велико. Следовательно, они в основном находятся в составе комплексного соединения друг с другом. При этом возникает два новых скачка: один при рН 8,0, второй около 10,0, которые могут быть интерпретированы как скачки титрования различных форм комплекса. В щелочной области при больших значениях рН (выше 8,0) возможно наличие комплексов с депротонированными формами аллоферона.
Наиболее интересной является узкая область между скачками при рН 6,5 и 8,0. В этой области для незаряженной молекулы аллоферона возможно взаимодействие с солями цинка с образованием структуры хелатного типа.
Полученные данные показывают, что:
• аллоферон и соль цинка в растворе вступают во взаимодействие друг с другом,
• взаимодействие аллоферона и солью цинка с образованием комплексных соединений наблюдается во всем диапазоне рН от 4,0 до 10,0,
• область рН от 6,5 до 8,0 является предпочтительной для фармацевтических целей,
• данные потенциометрического титрования подтверждают закономерности, выявленные при масс-спектрометрических исследованиях (пример 1) системы аллоферон - цинк.
Вывод: аллоферон с цинком в 0,9% растворе натрия хлорида с рН от 6,5 до 8,0 образуют  композицию, содержащую максимальную концентрацию комплексных соединений
Пример 3. Приготовление композиций.
Композиция 1 (мольное соотношение 1:1).
100 мг аллоферона растворяют в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата – раствор 1. Параллельно готовят раствор 17,4 мг ацетата цинка дигидрата (или 10,8 мг хлорида цинка безводного) цинка в 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида или натрия ацетата – раствор 2. В раствор 1 постепенно при перемешивании вводят раствор 2. Через 30 минут контролируют рН раствора и доводят его до величины 7,5 с помощью 0,1 М раствора гидроксида натрия или кислоты хлористоводородной. Полученный раствор стерилизуют фильтрацией через фильтр с порами 0,2 мкм, дозируют в ампулы, которые затем запаивают или флаконы, которые герметизируют пробками и колпачками.
Солевые растворы для приготовления композиций получают растворением 9,0 г натрия хлорида или 14,75 г натрия ацетата тригидрата в 1 литре воды очищенной. Растворы стерилизуют автоклавированием и  до применения хранят при температуре +4 – 8°С.
Композиция 2 (мольное соотношение 1:2).
Приготовление аналогично композиции 1, но берут 34,8 мг ацетата цинка дигидрата (или 21,6 мг хлорида цинка безводного).
Пример 4. Индукция интерферона-гамма (IFN-γ) и интерлейкина-18 (IL-18)
С целью оценки иммуномодулирующей активности (ИА) заявляемых композиций, а также выявления вклада содержащихся в них комплексных соединений, проведено определение уровня индукции цитокинов (IFN-γ  и IL-18)  как композициями, так и исходными компонентами – аллофероном и солью цинка (ацетатом).  Кроме того была определена индукция цитокинов вызываемая при использовании обоих компонентов (аллоферон и соль цинка), введенных в организм раздельно во времени.  Испытанию были подвергнуты 6 образцов:
1. Аллоферон («Аллокин-альфа, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введеня») - препарат сравнения,
2. Композиция 1,
3. Композиция 2,
4. Цинка ацетат
5. Аллоферон и ацетат цинка, введенные раздельно с интервалом 15 мин,
6. 0,9% раствор натрия хлорида – контроль.
Образцы 1, 2, 3, и 5 имели концентрацию аллоферона 1 мг/мл. Раствор аллоферона в образцах 1 и 5 получали растворением содержимого ампулы препарата «Аллокин-альфа» (1 мг аллоферона) в 1 мл раствора натрия хлорида 0,9%.  Раствор ацетата цинка в примерах 4 и 5  имел концентрацию 0,17 мг/мл (соответственно концентрации в композиции 1). Для определения фонового количества IFN-γ  и IL-18 в сыворотке крови исследуемых животных использовался раствор натрия хлорида 0,9%.
Для экспериментов использовались мыши линии BALB/C, самки, массой 16 – 22 грамма, возраста 18 недель,  разбитые на 6 групп по 15 особей в каждой. Образцы вводили однократно подкожно в дозе из расчета 1 мг аллоферона на 1 кг тела лабораторного животного.  Компоненты образца 5 вводили раздельно с интервалом 15 мин. Количество вводимого ацетата цинка (образцы 4 и 5) соответствовало его количеству в композиции 1.
Уровень интерферона-гамма в сыворотке крови определялся путем твердофазного гетерогенного иммунного анализа с использованием специфических антител через 3 часа после введения образца, когда наблюдается максимальный уровень индукции IFN-γ.
Для определения индукции интерлейкина-18 была использована методика, описанная в патенте RU 2482866, временной точкой определения уровня IL-18 исходя из данных этой работы выбрано 36 часов после введения образца. В случае контрольной группы доверительный интервал рассчитывался по измерениям разведения одного и того же образца. В опытных группах доверительный интервал вычислялся относительно трех образцов от трех животных на каждую измеряемую точку.  Результаты тестирования исследуемых образцов приведены в таблице 1
Таблица 1. Концентрация интерферона-гамма и интерлейкина-18 в сыворотке крови
№
Образец
Гамма-интерферончерез 3 часа(пг/мл сыворотки)
Интерлейкин-18через 36 часов(пг/мл сыворотки)
1
Аллоферон
95±16
360±20
2
Композиция 1
140±20
402±20
3
Композиция 2
148±20
422±25
4
Аллоферон + цинк (раздельное введение)
120±15
354±15
5
Цинка ацетат
82±8
194±12
6
0,9% раствор натрия хлорида, контроль
32±8
186±12
Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы.
Выводы:
1. Изученные композиции обладают специфической способностью к индукции IFN-γ и IL-18.
2. Композиции, содержащие комплексы аллоферона с цинком вызывают индукцию цитокинов, существенно превышающую уровень цитокинов, вызываемый аллофероном.
3. Максимальный уровень индукции цитокинов вызывает композиция 2 с соотношением аллофенон : цинк 1: 2.
4. Иммуностимулирующая активность композиций не является результатом сложения активностей исходных компонентов, что свидетельствует о вкладе образующихся комплексных соединений в активацию иммунной системы.
Пример 5. Противовирусная активность  композиций на модели герпетической  инфекции у мышей
Проведена оценка защитного действия разработанных композиций на модели герпетической  инфекции. В качестве препаратов сравнении использованы: 1/  «Аллокин-альфа, лиофилизат для приготовления раствора для подкожного введения» - лекарственный препарат, используемый в терапии генитального герпеса, содержащий 1 мг аллоферона на ампулу, 2/  «Ацикловир» - лекарственный препарат, используемый при стандартной терапии герпеса.
Белых беспородных мышей (самки) массой 16-20 г получали из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.) и содержали на стандартном рационе в регламентированных условиях вивария. Подбор животных в группы опыта проводили методом случайной выборки. Животные были разделены на 5 групп по 20 животных: четыре опытные, в которых животные получали инъекции  композиции 1, композиции 2, препарата «Аллокин-альфа», препарата «Ацикловир», соответственно, и одна контрольная, в которой животные получали инъекции 0,9% раствора натрия хлорида.
5
50
В исследовании использован вирус простого герпеса 2 типа (HSV-2) штамм G (ATCC VR-734). Инфицирование производилось вагинально. Повреждение вагинального эпителия осуществляли при помощи скарификатора для влагалищных мазков, после чего животных инфицировали вирусом в дозе 1,7×10TCID в объеме 30 мкл.
«Аллокин-альфа» и композиции 1 и 2 вводили животным внутрибрюшинно в дозе 1.25 мг/кг один раз в сутки в течение 3 дней после заражения по лечебной схеме: через 1, 2 и 3 суток после заражения. «Ацикловир» вводили по той же схеме в дозе 50 мг/кг. Контрольная группа животных получала инъекцию 0,9% раствора натрия хлорида.
Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. Ежедневно фиксировали смертность животных в контрольной и опытных группах. На основании полученных данных в каждой группе рассчитывали процент смертности М (отношение числа павших за 14 дней животных к общему числу зараженных животных в группе)  и индекс защиты IP (отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту летальности в контрольной группе).
14
М=N/N×100%,
Где:
14
N – число животных, павших в группе на 14 день после заражения,
N  -  общее число животных в группе;
IP = Мc-Мe/Мc×100%,
где Мc и Мe –летальность, выраженная в процентах в опытной и контрольной группах.
Данные, полученные в эксперименте, представлены в таблице 2.
Табл.2 Протективный эффект изученных препаратов на модели герпетической  инфекции у мышей
Препарат
N
Результаты эксперимента
N<sub>14</sub>
M (%)
IP (%)
Композиция 1
20
3
15,0
75,0
Композиция 2
20
2
10,0
83,3
Аллокин-альфа
20
4
20,0
66,7
Ацикловир
20
3
15,0
75,0
Контроль
20
12
60,0
-
Вывод:
Заявляемые композиции, содержащие комплексные соединения аллоферона с цинком, где концентрация растворов аллоферона и соли цинка подобрана таким образом, что мольное соотношение компонентов аллоферона и соли цинка составляет от 1 : 1 до 1 : 2, демонстрируют высокую противовирусную активность, обеспечивая по отношению к вирусу герпеса защитное действие, превосходящее эффект исходного аллоферона (препарат «Аллокин-альфа»).
Протективное действие композиций, применяемых в дозе 1,25 мг/кг   равно (композиция 1) или превышает (композиция 2) эффективность стандартного противогерпетического  препарата «Ацикловир» в дозе 50 мг/кг.