Количественный эффект повышения остеоиндуктивности материала за счет включения в него рекомбинантного морфогенетического белка кости rhвмр!2

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Количественный эффект повышения остеоиндуктивности материала за счет включения в него рекомбинантного морфогенетического белка кости rhBMP-2

А.В. Чеканов 12, И.С. Фадеева 12, В.С. Акатов 12, М.Е. Соловьева 12,

Н.В. Вежнина 12, М.В. Лекишвили3

1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино

2 Пущинский государственный естественно-научный институт, Пущино

3 Центральный институт травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова, Москва

Quantative effect of improving osteoinductive property of a material due to application of recombinant morphogenetic bone protein ^ВМР-2

A.V. Chekanov12,1.S. Fadeeva 12, VS. Akatov12, M.ESolovieva 12, N.V. Vezhnina 12, M.V. Lekishvili3 11nstitute of Theoretical and Experimental Biophysics of RAS, Pushchino

2 Pushchino Institute of Natural Sciences, Pushchino

3 Central Institute of Traumatology and Orthopedics, Moscow

В настоящее время для «регенеративной медицины», травматологии и ортопедии активно разрабатываются осте-оиндуктивные материалы с применением рекомбинантных морфогенетических белков кости (rhBMP). Для оценки эффективности включения rhBMP в материалы большое значение имеет изучение их остеоиндуктивных свойств в экспериментальных моделях in vivo. В настоящей работе показано, что включение морфогенетического костного белка rhBMP-2 в блоки деминерализованной губчатой кости обеспечивает выраженное повышение остеоиндуктивности материала в гетеротопической модели подкожной имплантации крысам, что выражается в многократном ускорении минерализации материала и в индукции формирования в нем структурированного неоколлагена. Модель гетеротопи-ческой подкожной имплантации крысам является удобной тест-системой для выявления степени остеоиндуктивности материалов, содержащих rhВМР-2, а также для выявления особенностей гетеротопического остеогенеза в таких материалах.

Ключевые слова: деминерализованная губчатая кость, композитный материал, рекомбинантный морфогенетический белок rhBMP-2, остеоиндуктивность, гетеротопиче-ская имплантация.

At present, novel osteoinductive materials containing recombinant bone morphogenetic proteins (rhBMPs) are actively being developed for «regenerative medicine», traumatology and orthopedics. To evaluate the effect of rhBMPs in materials, the great interest is to study osteoinductive properties of the materials in experimental models in vivo. In this paper we show that application of bone morphogenetic protein rhBMP-2 in demineralized cancellous bone blocks provides great improving osteoinductivity of the material in the ectopic model subcutaneous implantation in rats. This improvement was reflected in multifold acceleration of mineralization and in active forming a new structured collagen matrix in the material. The model of ectopic subcutaneous implantation to rats is very convenience test system to detect increase in osteoinductivity of materials caused by application of rhBMP-2, and to identify features of ectopic bone formation in these materials.

Key words: demineralized cancellous bone, recombinant morphogenetic protein rhBMP-2, osteoinductivity, ectopic implantation.

В настоящее время в мире активно проводятся работы, направленные на создание остеоиндуктивных материалов нового поколения, в которых применяются рекомбинантные морфогенетические белки кости (гЬВМРэ), в первую очередь пЬВМР-2 [1—3]. Белки семейства ВМР являются одними из ключевых факторов в ремоделировании и регенерации костной ткани [4, 5]. Эти белки обладают мощным остеоиндуктивным действием и способны стимулировать образование новой костной ткани путем индукции дифференцировки мезенхимальных клеток в функционально активные остеобласты [6]. Указанное

e-mail: fis82@rambler.ru

свойство белков ВМР послужило основой для их применения в медицине с целью повышения эффективности регенерации костной ткани [3, 6—8]. С 2002 г. в США и Европе началось использование в клинической практике материала, содержащего коллаген и рекомбинантный человеческий белок rhBMP-2 под коммерческим названием «Infuse» (Medtronic, USA] [9, 10]. Однако до сих пор неясно в какой степени эти белки, добавленные к конкретному остеокондуктору, повышают эффективность регенерации костной ткани. Дело в том, что используемые в настоящее время остеокондуктивные материалы обеспечивают

миграцию в зону повреждения клеток реципиента, которые секретируют различные цитокины. Эти цитокины, включая BMPs, вызывают, в частности, остеобластическую дифференцировку клеток, и, соответственно, обеспечивают регенерацию костной ткани. Именно поэтому для оценки эффекта применения рекомбинантных морфогенетических костных белков в имплантируемых материалах необходимы экспериментальные исследования in vivo, которые позволили бы ответить на вопрос, в какой степени применение rhBMPs в конкретном материале способно улучшить его остеоиндуктивность [11].

В ИТЭБ РАН разработана технология получения рекомбинантного морфогенетического белка кости rhBMP-2 [12, 13]. В настоящей работе показано, что включение этого белка в деминерализованный костный матрикс позволяет в десятки раз повысить эффективность его минерализации в модели гетеро-топической имплантации под кожу крысам, а также способствует формированию в нем структурированного неоколлагена.

Материал и методы

Получение rhBMP-2. Рекомбинантный человеческий морфогенетический белок rhBMP-2 получали в бактериальной системе экспрессии по технологии, разработанной в ИТЭБ РАН [12, 13].

Материалы. В работе использовали ксеногенную (крупный рогатый скот) деминерализованную губчатую кость (ДГК) в виде стерилизованных гамма облучением (доза 25 кГр) фрагментов размером 7x5x4 мм, предоставленных тканевым банком Центрального института травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова. Фрагменты предварительно трижды отмывали физиологическим раствором (рН 7,4) и высушивали при комнатной температуре в условиях вакуума (1 мм рт. ст.) (группа 1, контроль 1). Часть фрагментов группы 1 обрабатывали 6М раствором гуанидин хлорида в деионизованной воде, отмывали и высушивали, как описано выше. Затем, часть обработанных гуанидин хлоридом фрагментов ДГК заполняли в условиях вакуума (1 мм рт. ст.) раствором альгината натрия (1%) с 30 mM HEPES, pH 7,4, содержащим 0,5 мкг/мл rhBMP-2 и 400 мкг/мл гентамицина. После этого фрагменты переносили в раствор хлористого кальция (100 мМ) на 1 ч для формирования геля альгината натрия, отмывали их в фосфатно-солевом буфере рН 7,4 и хранили при + 4°С (группа 2, опыт). Такая процедура позволяла полностью заполнять все пустоты ДГК, включая меж-трабекулярное пространство, альгинатным гелем. Об этом можно было судить, в частности, по прозрачности полученного композитного материала. Часть фрагментов группы 1 также заполняли по описанной выше методике альгинатным гелем, но без rhBMP-2 (группа 3, контроль 2). Часть фрагментов, обработанных раствором гуанидин хлорида, также заполняли альгинатным гелем без rhBMP-2 (группа 4, контроль 3). Все операции проводили в стерильных условиях, используя стерильные растворы. Гель альгината натрия применяли для удержания белка в матриксе [14].

Модель гетеротопической имплантации под кожу крысам. Для изучения кальцификации материалов in vivo применяли известный метод подкожной имплантации крысам [15—17]. Фрагменты ДГК имплантировали крысам линии Wistar под кожу в область

спины, используя тиопенталовый наркоз (3 мг/100 г веса]. Опытные и контрольные группы животных состояли из молодых самцов весом 180±10 г. и содержались в стандартных условиях вивария. Через 6 нед. после имплантации материалы экс-плантировали и использовали для количественного определения минерализованного кальция и гистологического анализа. Цель исследования и экспериментальный протокол работы с животными были одобрены этическим комитетом Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Количественное определение степени минерализации имплантатов. Фрагменты ткани после эксплантации отмывали в течение 4 ч в дистиллированной воде, высушивали в течение 2 ч при 100°С и измеряли сухой вес образцов. Затем фрагменты помещали в 0,1М HCl на 24 ч для растворения минерализованного кальция, после чего проводили измерение количества минерализованного кальция, используя тест истему AS FS Arsenazo III (DiaSys, Германия]. Удельное количество минерализованного кальция (мг/г сухого веса материала] определяли для каждого фрагмента, затем усредняли полученные значения по всем образцам группы, имплантированным разным крысам, и определяли стандартную ошибку.

Гистологический анализ. После 6 нед. имплантации контрольные и опытные образцы материалов извлекали из крыс, фиксировали в 10% нейтральном формалине 18 ч при 4°С, отмывали от фиксатора в фосфатно-солевом буфере без кальция и магния в течение 24 ч, помещали в заливочную среду Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura), инкубировали 12 ч и делали криосрезы толщиной 11 мкм при -16°С, используя криотом Shandon E620 (Thermo). Для выявления изменений в структуре имплантированной ткани наряду со стандартными гистологическими окрасками использовали флуоресцентные красители. Для световой микроскопии применяли окраску криосрезов трихром по Касону для выявления клеток и коллагена, либо ализариновым красным S для выявления минерализованного кальция [18, 19]. Для флуоресцентной микроскопии криосрезы окрашивали ядерным красителем этидия бромидом. Ядра клеток флуоресцировали красным цветом, коллаген синим, гель альгината натрия — однородным синим цветом. Гистологический анализ выполняли на микроскопе Leica DM3000, флуоресцентный анализ — на конфокальном сканирующем микроскопе Leica TCS SP5 (Германия).

Статистика. Статистическую значимость различий средних значений для разных групп оценивали с использованием U-критерия Манна — Уитни (р < 0,05).

Результаты

Гистологический анализ материалов

после имплантации

На рис. 1 представлена микрофотография криосреза фрагмента ДГК, обработанного гуанидин хлоридом и заполненного гелем альгината натрия с rhBMP-2, извлеченного после 6 нед. имплантации под кожу крысам. Видно (рис. 1А), что в имплантированный материал мигрировали клетки реципиента (до имплантации клетки в материале отсутствовали), и эти мигрировавшие клетки не проникали в альгинатный гель (равномерно окрашенные участки темно-сиреневого или темно-синего цвета). Фото-

графии препарата при большем увеличении показывают, что по всему материалу выявляется резорбция коллагена ДГК. Следует отметить, что резорбция коллагена была лишь частичной (области 2, рис. 1Б). Практически по всему материалу наряду с деградацией «старого» коллагена ДГК выявлено формирование «нового» структурированного коллагена, расположенного слоем (рис. 1А, Б) вблизи поверхности альгинатного геля, содержащего гЬВМР-2, причем клетки локализованы, в основном, именно в этих слоях «нового» коллагена. То, что в областях частично резорбированного коллагена ДГК отсутствовали клетки реципиента, подтверждается также данными флуоресцентной микроскопии. На рис. 1В видно, что клетки (ядра клеток флуоресцируют красным цветом] отсутствовали и в альгинатном геле (равномерно флуоресцирующие синим цветом области препарата] и в области резорбируемого коллагена ДГК, однако в большом количестве обнаруживались в структури-рованом неоколлагене, обращенном к альгинатному гелю. Это хорошо заметно при большом увеличении на микрофотографии криосреза, окрашенного эти-диум бромидом (рис. 1Г). На рисунке определяются волокна неоколлагена (синий цвет), располагающиеся параллельно поверхности альгинатного геля (однородная синяя флуоресценция], в которых локализованы клетки реципиента (рис. 1Г). При этом

в частично разрушенном коллагене ДГК практически не наблюдалось ядер клеток (рис. 1В, Г). На препарате, окрашенном трехцветным методом Касона, слой структурированного неоколлагена достаточно регулярно находится на некотором удалении от альгинатного геля (рис. 1А, Б), однако во многих местах он плотно прилегает к гелю. Флуоресцентная микроскопия также показывает, что есть участки препарата, где структурированный неоколлаген плотно прилегает к альгинатному гелю, но есть области между неоколлагеном и альгинатным гелем свободные от клеток и коллагенового матрикса (рис. 1В, Г).

В контрольных фрагментах ДГК, обработанных гуанидин хлоридом и заполненных гелем альгината натрия без пЬВМР-2, после 6 нед. имплантации наблюдается принципиально иная картина (рис. 2). В этом случае клетки также, как в опыте, мигрировали в материал и не проникали в альгинатный гель. Однако, в отличие от группы опыта, клетки при этом формировали неорганизованный фиброзный коллагеновый матрикс (рубец). Наблюдаются области-пустоты (рис. 2А, Б, В) рядом с фиброзным матриксом, в которых отсутствует коллаген, но имеются продолговатые структуры. При этом не обнаружены бесклеточные области полуразрушенного коллагенового матрикса, подобные тем, что выявлены в материале, содержащем пЬВМР-2 (рис. 2А, Б).

Рис. 1. Остеопластический материал, модифицированный альгинатным гелем с гЬБМР-2 через 6 нед. после имплантации: 1 - структурированный неоколлаген; 2 - полуразрушенный коллаген ДГК; 3 - альгинатный гель.

А, Б - окраска трехцветным методом по Касону; В, Г - флуоресцентная микроскопия, ядра, окрашенные этидия бромидом, флуоресцируют красным цветом

Рис. 2.

Остеопластический материал, модифицированный альгинатным гелем без гЬБМР-2 через 6 нед. после имплантации:

1 - реактивно измененная рыхлая волокнистая соединительная ткань (рубец);

2 - альгинатный гель.

А, Б - окраска по Касону;

В - флуоресцентная микроскопия, ядра, окрашенные этидия бромидом, флуоресцируют красным цветом

В

500 ргг

Рис. 3.

Остеопластический материал, модифицированный альгинатным гелем с гЬБМР-2 (А, Б] и без гЬБМР-2 (В] через 6 нед.:

1 - минерализация в альгинатном геле;

2 - отложения кальция вблизи геля;

3 - минерализация вдали от геля альгината натрия. Окраска: ализариновый красный Б

Анализ локализации кальциевых депозитов во фрагментах ДГК, заполненных альгинатным гелем с пЬВМР-2, показал активную минерализацию краевой зоны фрагментов (не более 1—1,5 мм) после 6 нед. имплантации (рис. 3А). Внутренняя область фрагментов не подвергалась минерализации, хотя, как было отмечено выше, в нее активно мигрировали клетки реципиента, наблюдалась резорбция коллагена ДГК и активное формирование структурированного неоколлагена. Другая особенность минерализации опытных фрагментов под кожей у крыс состояла в том, что отложение депозитов кальция в значительной части материала было солокализовано с альгинатным гелем (рис. 3А, Б), куда не мигрировали клетки реципиента (рис. 1А, Б). Минерализация наблюдалась также вблизи и вдали от альгинатного геля (рис. 3А, Б). Большие участки минерализации, локализованные вне альгинатного геля, были приближены к поверхности имплантированных фрагментов и имели характерную зернистую структуру (рис. 3А). В контроле мы практически не обнаружили депозитов кальция. Редким исключением были небольшие участки, окрашенные ализариновым красным и солокализованные с альгинатным гелем на краях фрагментов (рис. 3В). Отсутствие депозитов кальция в контроле показывает, что отложение кальция в альгинатном геле в опыте определяется не гелеобразующим материалом, а содержащимся в нем белком пЬВМР-2.

Количественная оценка минерализации

имплантированных материалов

Определение степени минерализации материалов после 6 нед. имплантации крысам под кожу показало, что содержание минерализованного кальция во фрагментах ДГК, не заполненных альгинатом натрия (контроль 1), составляло 5±3 мг/г сухого веса материала. Содержание минерализованного кальция во фрагментах ДГК, заполненных альгинатным гелем (контроль 2), составляло 8±3 мг/г сухого веса фрагмента. Если фрагменты ДГК перед заполнением альгинатным гелем без пЬВМР-2 были предварительно обработаны 6М раствором гуанидин хлорида (контроль 3), то минерализованного кальция в них после 6 нед. имплантации не обнаруживалось (0,5±0,5 мг/г сухого веса). Это может объясняться тем, что удаление гуанидин хлоридом собственных морфогенетических белков ДГК способно полностью предотвратить их кальцификацию в модели подкожной имплантации крысам. Если фрагменты обрабатывали 6М раствором гуанидин хлорида и затем заполняли альгинатным гелем с белком пЬВМР-2 (опыт), то содержание минерализованного кальция в них после 6 нед. имплантации составляло 191 ±22 мг/г сухого веса материала (рис. 4). Отличие в количестве минерализованного кальция в материалах, содержащих и не содержащих пЬВМР-2, статистически значимо (р<0,01). До имплантации минерализованный кальций не обнаруживался во всех имплантированных материалах (1,2±0,9 мг/г сухого веса). Полученные результаты убедительно показали, что включение в композитный материал рекомбинантных морфогенетических белков пЬВМР-2 радикально увеличивало их минерализацию в модели гетеротопической имплантации под кожу крысам.

Рис. 4. Содержание минерализованного кальция во фрагментах ДГК после 6 нед. имплантации под кожу крысам: ДГК - необработанные фрагменты,

ДГКг и ДГКг +гЬБМР-2 - фрагменты ДГК, обработаные раствором гуанидин хлорида и заполненные альгинатным гелем без гИБМР-2 и с гИБМР-2, соответственно. По оси ординат - содержание кальция, мг/г сухого веса эксплантированных материалов

Обсуждение

Присутствие гЬВМР-2 в альгинатном геле существенно изменяло характер реорганизации коллагенового матрикса в имплантированном материале. В материалах, содержащих гЬВМР-2, клетки реципиента располагаются в слое неоколлагена, формируемого вблизи альгинатного геля, то есть вблизи области, в которую включен рекомбинантный белок. Слой разрушающегося коллагена в этом случае отделен от альгинатного геля слоем структурированного неоколлагена и в нем не содержатся клетки. Возникает вопрос, почему в области разрушающегося коллагена выявляются только единичные клетки? Почему клетки располагаются только в структурированном слое неоколлагена и не мигрируют в расположенные рядом области разрушения коллагена? По всей видимости, это связано с локализацией гЬВМР-2 в альгинатном геле, с дифференцировкой клеток в зоне, прилегающей к гелю. Разрушение коллагенового матрикса вдали от геля может быть связано с секрецией клетками протеаз и сопровождаться снижением адгезивности полуразрушенного матрикса для клеток. Возможно, именно высокая адгезив-ность для клеток структурированного неоколлагена и низкая адгезивность разрушаемого коллагена были одной из причин обнаруженного распределения клеток в композитном материале.

В материалах без гЬВМР-2 область ремоделирования коллагенового матрикса, содержащая клетки, располагается как вблизи альгинатного геля, так и вдали от него. При этом структура коллагенового матрикса характерна для фиброзной ткани. Таким образом, добавление гЬВМР в материал изменило реорганизацию коллагенового матрикса ДГК с фиброзного на структурированный тип, и локализация

структурированного неоколлагена по всей видимости связана с локализацией рекомбинантного белка в материале.

Радикальное ускорение кальцификации материалов во фрагментах, содержащих гЬВМР-2, прямо указывает на исключительную роль рекомбинантного белка в этом процессе в тестируемых материалах. Вместе с тем имеются вопросы относительно локализации депозитов кальция.

Обращает внимание солокализация отложений минерализованного кальция в значительной части материала с альгинатным гелем, в который не мигрировали клетки реципиента. Эта минерализация не связана с самим альгинатным гелем, поскольку в материале без гЬВМР-2 не происходит отложение кальция. Следовательно, есть основание предполагать, что солоколизация отложений кальция с альгинатным гелем определяется присутствием в нем гЬВМР-2 и остеобластической дифференцировкой клеток вблизи геля. Можно предположить, что эти остеобласты секретируют везикулы с фософолипи-дами, фосфопротеинами и щелочной фосфатазой в альгинатный гель, после чего происходит формирование в везикулах частиц гидроксиаппатита, их высвобождение из везикул под воздействием протеаз и фосфолипаз, как это происходит при эндесмальном остеогенезе, осуществляется диффузия везикул и частиц гидроксиаппатита в альгинатный гель и фиксация частиц гидроксиаппатита в геле. Возможны и другие механизмы, но в любом случае солокали-зация депозитов кальция с альгинатным гелем указывает на высокое сродство альгината к частицам гидроксиаппатита, формируемым в результате функциональной активности остеобластов вблизи геля. В результате этого после 6 нед. имплантации мы видим фиксацию минерализованного кальция в геле альгината натрия, в которые клетки не проникают.

Возникает также вопрос, почему минерализация осуществлялась только в зоне около 1 мм вблизи края имплантированных фрагментов, а участки минерализации вне альгинатного геля локализованы еще ближе к поверхности фрагментов? Почему в центральной области материалов не наблюдалось отложения депозитов кальция? Этот феномен нельзя объяснить неблагоприятными условиями для клеток в областях, удаленных от края фрагментов, поскольку клетки мигрировали в центр фрагментов, перестраивали коллагеновый матрикс, формировали структурированный неоколлаген. Все это указывает на благоприятные условия для жизнедеятельности клеток и на высокую функциональную активность клеток во всем объеме материала. Возможно, отмеченная локализация кальциевых депозитов в имплантатах отражает тот факт, что миграция клеток в материал начинается с края имплантатов. В со-

ЛИТЕРАТУРА:

1. Bessa P.C., Casal M., Reis R.L. Bone morphogenetic proteins in tissue engeneering: the road from the laboratory to the clinic, parti [basic principles). J. Tissue Eng. Regen. Med. 2008; 2: 1—13.

2. Bessa P.C., Casal M., Reis R.L. Bone morphogenetic proteins in tissue engineering: the road from laboratory to clinic, part II [BMP delivery). Review. J Tissue Eng. Regen. Med. 2008; 2: 81—96.

3. Blokhuis T.J., Lindner T. Allograft and bone morphogenetic proteins: an overview. Injury, Int. J. Care Injured. 2008; 39(S2): 33—6.

4. Urist M.R. Bone: formation by autoinduction. Science 1965; 150: 893-9.

ответствии с этим, остеогенная дифференцировка и ремоделирование матрикса будет начинаться на краю имплантата и захватывать внутренние области по мере миграции клеток. По этой же причине условия, необходимые для минерализации, также должны раньше формироваться на краях материала, и, в первую очередь, вблизи локализации повышенной активности индуктора остеогенной дифференциров-ки (rhBMP-2), то есть вблизи альгинатного геля.

Представленные результаты показывают, что гете-ротопическая модель имплантации под кожу крысам может служить хорошим тестом для оценки остеоиндуктивности материалов при включении в них морфогенетических белков кости. Время, необходимое для тестирования (6 нед.), превышает характерные времена дифференцировки клеток in vitro, которые составляют в среднем, по данным различных авторов, 1—3 нед. [21—23]. Однако оценка остеоиндуктивности материалов, содержащих белки rhBMPs, в модели гетеротопической имплантации в большей степени приближена к условиям in vivo и дает больше возможностей прогнозировать его применение в ортотопической имплантации, чем тестирование на культурах клеток. Значимость результатов, полученных в модели гетеротопической имплантации под кожу крысам, определяется тем, что они позволяют оценить остеоиндуктивность материала в целом. Такая оценка важна для выяснения перспективы применения материала, поскольку учитывает влияние на остеогенез не только активности самого белка, но и роль остокондуктивного материала, способа фиксации белка в материале и ряда других факторов.

Заключение

Суммируя полученные результаты можно сделать вывод, что введение морфогенетического костного белка в составе альгинатного геля в ДГК обеспечивает выраженное повышение остеоиндуктивности композитного материала в гетеротопической модели подкожной имплантации крысам, что проявляется в формировании структурированного коллагена и в активации отложения депозитов кальция. Гетерото-пическая модель подкожной имплантации крысам является удобной тест системой для выявления степени остеоиндуктивности материалов, содержащих rhBMP-2, а также для оценки особенностей остеогенеза в таких материалах.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013 гг. ГК № П609 и № 02.740.11.0710, и в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» ГК № 16.512.11.2261 с использованием приборов ЦКП ИТЭБ РАН и ЦКП ИБК РАН.

5. Nikolaou V.S., Tsiridis E. Pathways and signalling molecules. Current Orthopaedic 2007; 21: 249—57.

6. Reddi A.H. Bone Morphogenetic Proteins: from basic science to clinical applications. J. Bone Joint Surg. Am. 2001; 83: 1—6.

7. Gautschi O.P., Frey S.P., Zellweger R. Bone morphogenetic proteins in clinical application. Anz J. Surg. 2007; 77: 626—31.

8. Nakashima M., Reddi A.H. The application of bone morphogenetic proteins to dental tissue engineering. Nat. Biotechnol. 2003; 21: 1025-32.

9. Carlisle E., Fischgrund J.S. Bone morphogenetic proteins for spinal fusion. Spine J. 2005; 5: 240-9.

10. McKay W.F., Peckham S.M., Badura J.M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). Int. Orthop. 2007; 31(6): 729-34.

11. Arosarena O.A., Collins W.L. Bone regeneration in the rat mandible with bone morphogenetic protein-2: a comparison of two carriers. Otolaryngol. Head Neck. Surg. 2005; 132: 592-7.

12. Чеканов А.В., Фадеева И.С., Лекишвили М.В. и др. Создание остеоиндуктивных материалов нового поколения для регенерации костной ткани на основе рекомбинантных морфогенетических белков семейства ВМР. Тез. докл. IV Всероссийского симпозиума с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии»; 2010 апр. 21-22; Санкт Петербург.

13. Akatov V., Chekanov A., Lekishvili M. et al. Test system

for osteoinductive activity of materials containing recombinant

morphogenetic protein rhBMP-2, 6th World Congress of tissue banking, 2011 Nov 9-11; Barcelona; 2011.

14. Wegman F., Bijenhof A., Schuijff A. et al. Oosteogenic

differentiation as a result of bmp-2 plasmid dna based gene therapy in vitro and in vivo. Euro. Cells Mater. 2011; 21: 230-42.

15. Lee C.H., Vyavahare N., Zand R. et al. Inhibition of aortic wall calcification in bioprosthetic heart valves by ethanol pretreatment: biochemical and biophysical mechanisms. J. Biomed. Mater. Res. 1998; 42(1): 30-7.

16. Розанова И.Б., Васин С.Л. Кальцификация имплантатов. В: Севастьянов В.И., редактор. Биосовместимость. М., 1999. С. 246-24.

17. Акатов В.С., Соловьев В.В., Рындина Н.И. и др. Кальцификация бесклеточных ксенотрансплантатов клапанов сердца. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2002; 4: 39-42.

18. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969.

19. Роскин Г.И. Микроскопическая техника. М.: Советская наука, 1957.

20. Erlebacher A., Filvaroff E.H., Gitelman S.E. et al. Toward a molecular understanding of skeletal development. Cell 1995; 80: 371-8.

21. French D.M., Kaul R.J., D'Souza A.L. et al. WISP-1 is an osteoblastic regulator expressed during skeletal development and fracture repair. American J. Path. 2004; 165: 855-67.

22. Mikami Y., Asano M., Honda M.J. et al. Bone morphogenetic protein 2 and dexamethasone synergistically increase alkaline phosphatase levels through JAK/STAT signaling in C3H10T1/2 cells. J. Cell. Physiol. 2010; 223: 123-33.

23. Song I., Kim B.-S., Kim C.-S. et al. Effects of BMP-2 and vitamin D3 on the osteogenic differentiation of adipose stem cells. Biochem. Biophys. Res. Com. 2011; 408: 126-31.

Поступила 25.04.2012