ПРИМЕНЕНИЕ АГЕНТА, ОБЛАДАЮЩЕГО МОДИФИЦИРУЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ В ОТНОШЕНИИ ГОРМОНОВ НАДПОЧЕЧНИКОВ
APPLICATION OF AGENT WITH MODIFYING PROPERTIES IN RELATION TO HORMONES OF ADRENAL GLANDS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к применению соединения, обладающего модифицирующими свойствами в отношении гормонов надпочечников, при болезненных состояниях, характеризующихся повышенными уровнями гормонов стресса и/или пониженными уровнями андрогенных гормонов.
Предпосылки к созданию изобретения
Образование стероидов в надпочечниках происходит при посредстве в большой степени родственных и контролируемых ферментов цитохром-Р450. Ингибирование альдостеронсинтазы или фермента цитохром Р45011 B2 (CYP11 B2) представляет собой новую фармакологическую стратегию понижения избыточных уровней альдостерона. Альдостерон представляет собой минералокортикоид, синтезируемый в основном в надпочечниках и выделяемый в систему кровообращения с целью контроля в эпителии почек натрий-калиевого баланса и, тем самым, гомеостаза воды и кровяного давления, а также, в неэпителиальной ткани сердца и почек, образования внеклеточного матрикса и ремоделирования органов. Альдостеронсинтаза опосредует в надпочечниках терминальное и лимитирующее скорость превращение 11-дезоксикортикостерона в кортикостерон через гидроксилирование по 11-бета-положению, превращение кортикостерона в 18-гидроксикортикостерон посредством гидроксилирования метильной группы в положении 18 и, наконец, превращение 18-гидроксикортикостерона в альдостерон посредством образования оксометильной группы в положении 18. Активность и экспрессия фермента преимущественно регулируются ангиотензинном II, калием и адренокортикотропином. Данные регуляторы альдостеронсинтазы чувствительны к действиям альдостерона и физиологическому циркадному ритму, создавая благодаря этому петлю эндокринной обратной связи. Ангиотензин II вырабатывается в результате стимуляции активности ренина, инициируемой потерей натрия и снижением кровяного давления вследствие гипоальдостеронемических состояний. Калий удерживается в обмен на потерю натрия при гипоальдостеронемических состояниях. Наконец, адренокортикотропин выделяется гипофизом в ответ на низкие уровни глюкокортикоидов и циркадный ритм. Таким образом, селективному ингибированию альдостеронсинтазы и снижению секреции альдостерона противодействуют стимуляция ренина и генерация ангиотензина II, равно как и удерживание калия, причем повышенные уровни как ангиотензина II, так и калия являются действенными стимуляторами активности альдостеронсинтазы и, таким образом, секреции альдостерона. При ингибировании альдостеронсинтазы циркадный ритм притупляется в отношении альдостерона, но уровни адренокортикотропина не претерпевают существенных изменений, поскольку главными регуляторами секреции адренокортикотропина являются глюкокортикоиды. Лимитирующим скорость секреции кортизола ферментом является надпочечниковый фермент 11-бетагидроксилаза или цитохром Р45011 B1 (CYP11 B1), преобразующий 11-дезоксикортизол в кортизол. Уровни кортизола контролируются с помощью гипоталамическо-гипофизарно-надпочечниковой петли обратной связи посредством контроля высвобождения адренокортикотропина (АСТН). Адренокортикотропин стимулирует в надпочечниках ранние и поздние стероидогенные реакции, приводящие к синтезу кортизола, но также и дегидроэпиандростерон и андростендион (см. Фиг.1 - диаграмма стероидогенеза в надпочечниках). Ответственный за выработку кортизола фермент CYP11 B1 демонстрирует высокую гомологичность последовательности, составляющую 95%, на уровне аминокислот по отношению к ответственному за выработку альдостерона ферменту CYP11 B2. Таким образом, соединение, мишенью которого будет являться альдостеронсинтаза с целью снижения избыточной секреции альдостерона, должно быть проверено на селективность в отношении ферментов.
Краткое описание изобретения
В одном из вариантов осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или расстройства, характеризующегося повышенными уровнями гормонов стресса и/или пониженными уровнями андрогенных гормонов у пациента, который включает введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу лечения сердечной недостаточности, кахексии, острого коронарного синдрома, хронического стрессового синдрома, синдрома Кушинга или метаболического синдрома, который включает введение пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.
В еще одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления фармацевтической композиции для лечения расстройства или заболевания, характеризующегося повышенными уровнями гормонов стресса и/или пониженными уровнями андрогенных гормонов у пациента.
В еще одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для лечения расстройства или заболевания, характеризуемого повышенными уровнями гормонов стресса и/или пониженными уровнями андрогенных гормонов у пациента.
В еще одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления фармацевтической композиции для лечения расстройства или заболевания, выбранного из сердечной недостаточности, кахексии, острого коронарного синдрома, хронического стрессового синдрома, синдрома Кушинга или метаболического синдрома.
В еще одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к применению соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли для лечения расстройства или заболевания, выбранного из сердечной недостаточности, кахексии, острого коронарного синдрома, хронического стрессового синдрома, синдрома Кушинга или метаболического синдрома.
Подробное описание изобретения
Соединения, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, имеют следующую формулу (I)
,
в которой:
n равно 1 или 3;
a
b
a
b
1
4
1
4
5
7
a
b
1
4
R представляет собой водород или -C(O)N(R)(R), где R и R независимо представляют собой -(С-С)алкил или -(С-С)алкил(С-С)арил, причем каждый из R и R может быть необязательно замещен -(С-С)алкоксигруппой;
1
2
3
6
10
6
10
1
2
3
R, R и R независимо представляют собой водород, галоген, цианогруппу или -(С-С)арил, где указанный -(С-С)арил может быть необязательно замещен галогеном при условии, что не более чем один из R, R и R обозначает водород; и
4
5
R и R представляют собой водород; или их фармацевтически приемлемая соль.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, соединение формулы (I) представляет собой 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрил формулы (II).
При использовании в настоящем изобретении, термин «алкил» относится к полностью насыщенному разветвленному или неразветвленному углеводородному остатку. Алкил предпочтительно включает от 1 до 6 атомов углерода, более предпочтительно от 1 до 16 атомов углерода, от 1 до 10 атомов углерода, от 1 до 7 атомов углерода или от 1 до 4 атомов углерода. Типичные примеры алкилов включают, не ограничиваясь перечисленным, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, н-пентил, изопентил, неопентил, н-гексил, 3-метилгексил, 2,2-диметилпентил, 2,3-диметилпентил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил и им подобные.
При использовании в настоящем изобретении, термин «алкоксигруппа» относится к остатку алкил-O-, в котором алкил отвечает вышеприведенному определению. Типичные примеры алкоксигрупп включают, не ограничиваясь перечисленным, метоксигруппу, этоксигруппу, пропоксигруппу, 2-пропоксигруппу, бутоксигруппу, трет-бутоксигруппу, пентилоксигруппу, гексилкосигруппу, циклопропилоксигруппу, циклогексилоксигруппу и им подобные. При использовании в настоящем изобретении, термин «низшая алкоксигруппа» относится к алкоксигруппам, содержащим примерно 1-7, предпочтительно примерно 1-4, атомов углерода.
6
10
Термин «арил» относится к моноциклическим или бициклическим ароматическим углеводородным группам, содержащим 6-20 атомов углерода в своей циклической части. Арил предпочтительно представляет собой (С-С)арил. Примеры, не являющиеся ограничивающими, включают фенил, бифенил, нафтил или тетрагидронафтил, каждый из которых может быть необязательно замещен 1-4 заместителями, такими как алкил, трифторметил, циклоалкил, галоген, гидроксигруппа, алкоксигруппа, ацил, алкил-С(O)-O-, арил-O-, гетероарил-O-, аминогруппа, HS-, алкил-S-, арил-S-, нитрогруппа, цианогруппа, карбоксигруппа, алкил-О-С(О)-, карбамоил, алкил-S(O)-, сульфонил, сульфонамидная группа, гетероциклил и им подобные, где R независимо от других представляет собой водород, алкил, арил, гетероарил, арилалкил-, гетероарилалкил- и им подобные.
Кроме того, термин «арил», как он употребляется в контексте, относится к ароматическому заместителю, который может представлять собой одиночный ароматический цикл или несколько ароматических циклов, конденсированных, связанных ковалентно или связанных с общей группой, такой как метиленовый или этиленовый остаток. Общая связующая группа также может представлять собой карбонил, как в бензофеноне, или кислород, как в дифениловом эфире, или азот, как в дифениламине.
При использовании в настоящем изобретении, термин «галоген» или «гало» относится к фтору, хлору, брому и йоду.
При использовании в настоящем изобретении, термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к солям, сохраняющим биологическую эффективность и свойства соединений по настоящему изобретению и не являющимся нежелательными биологически или в иных отношениях. Во многих случаях, соединения по настоящему изобретению способны образовывать соли с кислотами и/или основаниями, благодаря присутствию аминогрупп и/или карбоксильных групп, или же сходных с ними групп. Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли могут быть образованы с неорганическими кислотами и органическими кислотами. Неорганические кислоты, с участием которых могут быть получены соли, включают, например, соляную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и им подобные. Органические кислоты, с участием которых могут быть получены соли, включают, например, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, малеиновую кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфокислоту, этансульфокислоту, n-толуолсульфокислоту, салициловую кислоту и им подобные. Фармацевтически приемлемые соли с основаниями могут быть образованы с неорганическими и органическими основаниями. Неорганические основания, с участием которых могут быть получены соли, включают, например, основные соединения натрия, калия, лития, аммония, кальция, магния, железа, цинка, меди, марганца, алюминия и им подобных. Особенно предпочтительными являются соли аммония, калия, натрия, кальция и магния. Органические основания, с участием которых могут быть получены соли, включают, например, первичные, вторичные и третичные амины, замещенные амины, включая встречающиеся в природе замещенные амины, циклические амины, основные ионообменные смолы и им подобные, такие как, в частности, изопропиламин, триметиламин, диэтиламин, триэтиламин, трипроиламин и этаноламин. Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению могут быть синтезированы из исходного соединения, основного или кислотного остатка, с помощью общепринятых химических способов. Как правило, такие соли могут быть получены посредством взаимодействия этих соединений в свободной кислотной форме со стехиометрическим количеством подходящего основания (такого как гидроксид, карбонат, гидрокарбонат натрия, кальция, магния или калия или им подобные), или же посредством взаимодействия этих соединений в свободной основной форме со стехиометрическим количеством подходящей кислоты. Подобные взаимодействия, как правило, осуществляют в воде или в органическом растворителе, или же в смеси двух растворителей. Как правило, предпочтительными являются, если они употребимы, неводные среды, такие как диэтиловый эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Списки других подходящих солей могут быть найдены, например, в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, издание 20-е, Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985), содержание которого включено в настоящую заявку в качестве ссылки.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения соединение формулы (I) представляет собой дигидрофосфатную соль 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила.
При использовании в настоящем изобретении, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и всевозможные растворители, диспергирующие среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные средства, противогрибковые средства), изотонические агенты, средства, замедляющие всасывание, соли, консерванты, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, связующие вещества, наполнители, дезинтегранты, скользящие вещества, подсластители, ароматизаторы, красители, такие как вещества и их комбинации, как то должно быть известно специалисту, располагающему стандартными знаниями в соответствующей области (см., например, справочник. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18-е издание. Mack Printing Company, 1990, стр.1289-1329, содержание которого включено в настоящую заявку в качестве ссылки). За исключением несовместимости в какой-либо мере с активным ингредиентом какого-либо общепринятого носителя, подразумевается его применение в терапевтических или фармацевтических композициях.
Термин «терапевтически эффективное количество» соединения по настоящему изобретению относится к такому количеству соединения по настоящему изобретению, которое вызывает у пациента биологический или медицинский ответ, или улучшает симптомы, замедляет или задерживает развитие заболевания, или предотвращает заболевание и т.п. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, не ограничивающем его, термин «терапевтически эффективное количество» относится к такому количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении пациенту достаточно эффективно для:
(1) по крайней мере, частичного облегчения, ингибирования, предотвращения и/или улучшения состояния, или расстройства, или заболевания, (i) характеризующегося избыточными уровнями гормонов стресса и/или недостаточными уровнями андрогенных гормонов, или (ii) связанного с действиями избыточных уровней гормонов стресса и/или недостаточных уровней андрогенных гормонов, или (iii) характеризующегося анормальной активностью избыточных уровней гормонов стресса и/или недостаточных уровней андрогенных гормонов; или
(2) понижения или ингибирования активности избыточных уровней гормонов стресса и/или снижения или ингибирования активности стероидогенных ферментов, косвенно приводящей к недостаточным уровням андрогенных гормонов; или
(3) понижения или ингибирования синтеза избыточно вырабатываемых уровней гормонов стресса и/или повышения уровней андрогенных гормонов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, не являющемся ограничивающим, термин «терапевтически эффективное количество» относится к такому количеству соединения по настоящему изобретению, которое при введении в клетку, или в ткань, или в неклеточный биологический материал, или в среду достаточно эффективно для по крайней мере частичного понижения или ингибирования действий избыточных уровней гормонов стресса и/или повышения уровней андрогенных гормонов, или для по крайней мере частичного понижения или ингибирования синтеза избыточно вырабатываемых уровней гормонов стресса и/или повышения уровней андрогенных гормонов.
При использовании в настоящем изобретении, термин «пациент» относится к животному. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения животное является млекопитающим. Термин «пациент» также относится, например, к приматам (например, людям), коровам, овцам, козам, лошадям, собакам, кошкам, кроликам, крысам, мышам, рыбам, птицам и им подобным. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пациент является человеком.
Как это подразумевается в настоящей патентной заявке, уровни гормонов, измеряемые у пациента, могут находиться в любом образце, полученном от данного пациента. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, уровни измеряют в образце крови. В другом варианте осуществления настоящего изобретения уровни определяют в образце плазмы.
При использовании в настоящем изобретении, термин «расстройство» или «заболевание» относится к любому нарушению или патологии функции, болезненному физическому или психическому состоянию. См. справочник Borland's Illustrated Medical Dictionary (W.B. Saunders Co., 27-е издание, 1988).
При использовании в настоящем изобретении, термин «лечить» или «лечение» какого-либо заболевания или расстройства относится в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения к частичному или полному облегчению течения заболевания или расстройства (т.е. остановки или снижения развития заболевания или по крайней мере одного из его клинических симптомов). В другом варианте осуществления настоящего изобретения, термин «лечить» или «лечение» относится к частичному или полному улучшению по крайней мере одного физического параметра, который может не ощущаться пациентом. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, термин «лечить» или «лечение» относится к физической (например, стабилизации ощущаемого симптома), физиологической (например, стабилизации физического параметра) модуляции заболевания, или расстройства, или их обоих. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, термин «лечить» или «лечение» относится к предотвращению или задержке начала, или развития, или прогресса заболевания или расстройства.
При использовании в настоящем изобретении, формы единственного числа и схожие термины, используемые здесь (в особенности, в формуле изобретения), следует понимать как охватывающие и единственное, и множественное число, если только иное не указано или не вызывает явных противоречий. Перечисление диапазонов величин предназначено лишь служить способом краткой ссылки по отдельности на каждое отдельное значение, попадающее в указанный диапазон. Если иное не указано, каждое отдельное значение включено в настоящее описание, как если бы оно было отдельно упомянуто здесь. Все описываемые способы могут быть осуществлены в любом подходящем порядке, если иное не указано или не вызывает явных противоречий. Присутствующее использование любого и всевозможных примеров или же выражений, подразумевающих примеры (например, «такой как»), предназначено лишь для лучшего освещения настоящего изобретения и не устанавливает ограничений на объем изобретения, помимо содержащихся в формуле изобретения. Никакие выражения в настоящей заявке не должны истолковываться как указывающие на какой-либо не охватываемый формулой изобретения элемент, существенный для практического осуществления изобретения.
Любой асимметрический атом углерода соединений по настоящему изобретению может присутствовать в (R)-, (S)- или (R,S)-конфигурации, предпочтительно в (R)- или (S)-конфигурации. Заместители при атомах, образующих ненасыщенные связи, могут, если это возможно, находиться в цис (Z)- или транс (E)-форме. Таким образом, соединения по настоящему изобретению могут находиться в форме одного из возможных изомеров или их смей, например в виде химически чистых геометрических (цис или транс) изомеров, диастереомеров, оптических изомеров (антиподов), рацематов или их смесей.
Любые получаемые смеси изомеров могут быть разделены на основании физико-химических различий составляющих на чистые геометрические или оптические изомеры, диастереомеры, рацематы, например, с помощью хроматографии и/или дробной кристаллизации.
Любые получаемые рацематы конечных продуктов или промежуточных соединений могут быть разделены на оптические антиподы с помощью известных способов, например, посредством разделения их диастереомерных солей, получаемых с оптически активной кислотой или основанием, и высвобождения оптически активного кислотного или основного соединения. В частности, для разделения соединений по настоящему изобретению на их оптические антиподы может подобным образом быть задействован имидазолильный остаток, например, посредством дробной кристаллизации соли, образуемой с оптически активной кислотой, например с винной кислотой, диацетилвинной кислотой ди-O,O'-n-толилвинной кислотой, миндальной кислотой, яблочной кислотой или камфор-10-сульфокислотой. Рацемические продукты могут также быть разделены с помощью хиральной хроматографии, например высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), использующей хиральный адсорбент.
Помимо этого, настоящее изобретение подразумевает, что соединения формулы (I) включают свободную форму, солевую форму или их пролекарственные производные. Соединения могут быть получены в форме гидратов или включать растворители, примененные для их кристаллизации.
Соединения по настоящему изобретению могут быть синтезированы или изготовлены и охарактеризованы с помощью способов, описанных в WO 2007/024945, содержание которой включено в настоящую заявку в качестве ссылки во всей своей полноте и составляет ее часть.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, способы включают применение соединений формулы (I) для лечения описанных выше заболеваний или расстройств, где соединения, включая изомеры, оптические изомеры или их фармацевтически приемлемые соли, предпочтительно включая изомеры, оптические изомеры, выбраны из:
4'-фтор-6-(6,7,8,9-тетрагидро-5H-имидазо[1,5-а]азепин-5-ил)бифенил-3-карбонитрила,
3-бром-4-(6,7,8,9-тетрагидро-5Н-имидазо[1,5-а]азепин-5-ил)бензонитрила,
5-(2-хлор-4-цианофенил)-N-(4-метоксибензил)-N-метил-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-карбоксамида,
(4-фторбензил)метиламида 5-(4-циано-2-метоксифенил)-6,7-дигидро-5H-пирроло[1,2-с]имидазол-5-карбоновой кислоты,
4-(6,7-Дигидро-5H-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил)-3-фторбензонитрила,
5-(3-фтор-4-метоксифенил)-6,7-дигидро-5H-пирроло[1,2-с]имидазола,
4-фторбензилового эфира 5-(2-хлор-4-цианофенил)-6,7-дигидро-5H-пирроло[1,2-с]имидазол-5-карбоновой кислоты,
5-(2-бром-4-фторфенил)-6,7,8,9-тетрагидро-5H-имидазо[1,5-а]азепина,
2-бром-4-(6,7,8,9-тетрагидро-5H-имидазо[1,5-a]азепин-5-ил)бензонитрила,
3-пиридин-3-ил-4-(6,7,8,9-тетрагидро-5H-имидазо[1,5-а]азепин-5-ил)бензонитрила и
3-хлор-4-(6,7,8,9-тетрагидро-5H-имидазо[1,5-a]азепин-5-ил)бензонитрила,
в частности, выбраны из
4'-фтор-6-(6,7,8,9-тетрагидро-5H-имидазо[1,5-а]азепин-5-ил)бифенил-3-карбонитрила,
3-бром-4-(6,7,8,9-тетрагидро-5Н-имидазо[1,5-а]азепин-5-ил)бензонитрила,
5-(2-хлор-4-цианофенил)-N-(4-метоксибензил)-N-метил-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-карбоксамида и
4-(6,7-дигидро-5H-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил)-3-фторбензонитрила.
Предпочтительно, соединение формулы (I), как описано здесь, имеет формулу 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила или является его фармацевтически приемлемой солью, в частности дигидрофосфатом (4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила. Соль соединения формулы (I), как описано здесь, предпочтительно фосфатная соль, такая как дигидрофосфат, может быть получена с помощью стандартных способов, известных специалисту в соответствующей области технике, например, см. Chem. Commun., 2007, 419-421 (2007); в Development of a pharmaceutical cocrystal of a monophosphate salt with phosphoric acid (Разработка фармацевтического сокристалла монофосфатной соли с фосфорной кислотой) Alex M. Chen, Martha E. Ellison, Andrey Peresypkin, Robert M. Wenslow, Narayan Variankaval, Cecile G. Savarin, Theresa K. Natishan, David J. Mathre, Peter G. Dormer, Danielle H. Euler, Richard G. Ball, Zhixiong Ye, Yaling Wang и Ivan Santos; в Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use (Справочник по фармацевтическим солям: свойства, выбор и применение) под ред. Р. Heinrich Stahl и Camile G. Wermuth. VHCA, Verlag Helvetica Chimica Acta, Цюрих, Швейцария, и Wiley-VCH, Вайнхайм, Германия, 2002; в Organic Process Research & Development, 2000, 4, 427-435, Salt Selection and Optimisation Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities (Методики выбора и оптимизации солей для новых фармацевтических химических веществ) Richard J. Bastin, Michael J. Bowker и Bryan J. Slater; в Advanced Drug Delivery Reviews 56 (2004) 275-300, High-throughput crystallization: polymorphs, salts, co-crystals and solvates of pharmaceutical solids Sherry L. Morissette, Orn Almarsson, Matthew L. Peterson, Julius F. Remenar, Michael J. Read, Anthony V. Lemmo, Steve Ellis, Michael J. Cima, Colin R. Gardner; и в Journal of Pharmaceutical Sciences, т.96, №.5, май 2007, Structure, Solubility, Screening, and Synthesis of Molecular Salts (Структура, растворимость, скрининг и синтез молекулярных солей). Black, S.N., Collier, E.A., Davey, R.J. и Roberts, R.J.
Согласно настоящему изобретению, соединение формулы (I) и/или его фармацевтически приемлемая соль представляет собой при введении пациенту плейотропный модификатор стероидогенеза в надпочечниках. Соединение формулы (I) поддерживает или понижает уровни кортизола при введении пациенту. Соединение формулы (I) повышает уровни 11-дезоксикортизола при введении пациенту. Соединение формулы (I) повышает уровни адренокортикотропина при введении пациенту. Соединение формулы (I) повышает уровни 11-дезоксикортикостерона. Соединение формулы (I) повышает уровни надпочечниковых андрогенов при введении пациенту.
В примере 1 показано, что соединение формулы (I), а именно дигидрофосфат (4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила, представляет собой при введении пациенту плейотропный модификатор стероидогенеза в надпочечниках. На Фиг.1 показано, что дигидрофосфат 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила поддерживает или понижает уровни кортизола при введении пациенту. Также показано, что дигидрофосфат 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила повышает уровни 11-дезоксикортизола при введении пациенту. Дигидрофосфат 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила повышает уровни адренокортикотропина при введении пациенту. Дигидрофосфат 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила повышает уровни 11-дезоксикортикостерона. Дигидрофосфат 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила повышает уровни надпочечниковых андрогенов при введении пациенту.
Клиническая значимость повышенных уровней гормонов стресса и/или пониженных уровней андрогенных гормонов была продемонстрирована для нижеследующих состояний:
(i) хроническая сердечная недостаточность;
(ii) хроническая сердечная недостаточность с пониженной переносимостью физической нагрузки;
(iii) хроническая сердечная недостаточность с мышечной слабостью;
(iv) сердечная кахексия;
(v) кахексия, вызванная хроническим обструктивным заболеванием легких (ХОЗЛ);
(vi) кахексия, вызванная циррозом;
(vii) кахексия, вызванная опухолью;
(viii) кахексия, вызванная вирусом (ВИЧ);
(ix) острая сердечная недостаточность;
(x) острая декомпенсированная сердечная недостаточность;
(xi) острый коронарный синдром;
(xii) хронический стрессовый синдром;
(xiii) синдром Кушинга;
(xiv) метаболический синдром;
(xv) гиперкортизолемия.
(i) Хроническая сердечная недостаточность, равно как и состояния хронической сердечной недостаточности с пониженной переносимостью физической нагрузки (ii) и мышечной слабостью (iii), характеризуется повышенными уровнями альдостерона в плазме, как было показано Bolger и др., Circulation 2002; 106: 92-99. Повышенное соотношение плазмы к дегидроэпиандростерону было также продемонстрировано Anker и др., European Heart Journal 1999; 20: 683-693, а пониженные уровни андрогенов были продемонстрированы Jankowaska и др., Circulation 2006; 114: 1829-1837.
(iv) Сердечная кахексия представляет собой серьезное осложнение хронической сердечной недостаточности, поскольку пациенты страдают от общей потери жировой ткани, мышечной ткани и костной ткани. Пациенты, страдающие сердечной кахексией, демонстрируют повышенные уровни альдостерона и кортизола в плазме, равно как и пониженные уровни дегидроэпиандростерона, как это описано Anker и др., Circulation 1997; 96: 526-534 и проиллюстрировано в международной заявке на изобретение WO 2000/21509 и заявке на изобретение США US 2009/0023639.
(v) Кахексия, вызванная ХОЗЛ, кахексия вызванная циррозом (vi), кахексия, вызванная опухолью (vii), и кахексия, вызванная вирусом (ВИЧ) (viii), характеризуются повышенными уровнями альдостерона в плазме, как это описано в документах WO 2000/21509 или US 2009/0023639, и подвергаются лечению анаболическим андрогеном или производными андрогенов, как сообщалось в Yeh и др., Chest 2002; 122: 421-428 и в Cuerda и др., Nutrition Clinical Practice 2005 20; 93-97.
(ix-x) Кортизол в плазме позволяет предсказывать события, связанные с сердечной деятельностью, такие как смерть и госпитализация, у пациентов с сердечной недостаточностью согласно Yamaji и др.. Circulation Heart Failure 2009; 2: 608-613.
(xi) Инфаркт миокарда повышает уровни кортизола, влияющие на сердечное ремоделирование, как указывается Mihailidu и др., Hypertension 2009, в печати. Сила кортизолового ответа связана с размером произошедшего инфаркта, как показано Bain и др., International Journal of Cardiology 1992; 27: 145-150.
(xii) Хронические стрессовые расстройства с их физическими и психологическими последствиями оказались связаны с избыточными уровнями альдостерона и кортизола согласно Kubzansky и Adier, Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 2009; 5: 1-7. В частности, избыточная и незатухающая секреция кортизола может приводить к депрессии, гипергликемии и подавлению иммунной системы.
(xiii) Термин «синдром Кушинга» описывает состояния хронически избыточной выработки кортизола. Избыток кортизола может являться прямым следствием опухоли коры надпочечников или вторичным следствием опухоли гипофиза (болезнь Кушинга) или эктопической опухоли, выделяющей адренокортикотропин, как было проиллюстрировано в Boscaro и Arnaldi, Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2009; 94: 3121-3131.
(xiv) Термин «метаболический синдром» определяет состояние метаболической дерегуляции, характеризуемой резистентностью к инсулину и предрасположенностью к диабету типа 2, центральному и висцеральному ожирению, гипертензии и дислипидемии. Метаболическая дерегуляция может быть вызвана лежащим в ее основе эндокринным дисбалансом, опосредованным надпочечниковыми стероидами альдостероном и кортизолом, как сообщалось Kidamby и др., Hypertension 2007, 49: 704-711.
(xv) Термин «гиперкортизолемия» относится к состояниям, характеризуемым высокими уровнями кортизола в кровообращении. Высокие уровни кортизола в плазме могут вносить непосредственный вклад в патологическое состояние, представлять собой признак патологического состояния или же иметь непатологическую природу.
Объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы (I) и/или его фармацевтически приемлемой соли, или же любой другой его формы, как то обсуждалось выше, с модифицирующими свойствами в отношении гормонов надпочечников для лечения состояний, характеризующихся избыточными уровнями гормонов стресса и/или недостаточными уровнями андрогенных гормонов, таких как сердечная недостаточность, кахексия, острый коронарный синдром, хронический стрессовый синдром, гиперкортизолемия, синдром Кушинга или метаболический синдром, в частности, сердечной недостаточности кахексии, острого коронарного синдрома, хронического стрессового синдрома, синдрома Кушинга или метаболического синдрома. Сердечная недостаточность может представлять собой острую сердечную недостаточность и хроническую сердечную недостаточность. Острая сердечная недостаточность может представлять собой острую декомпенсированную сердечную недостаточность. Хроническая сердечная недостаточность может быть связана с пониженной переносимостью физической нагрузки и/или с мышечной слабостью. Кахексия может представлять собой сердечную кахексию, кахексию, вызванную ХОЗЛ, кахексию, вызванную циррозом, кахексию, вызванную опухолью, или кахексию, вызванную вирусом (ВИЧ). Хронический стрессовый синдром может включать депрессию, гипергликемию и подавление иммунитета. Синдром Кушинга может включать гиперкортизолизм вследствие опухоли коры надпочечников, гипофиза или эктопической опухоли. Метаболический синдром может включать ожирение, диабет, гипертензию, дислипидемию и атеросклероз. Соединения формулы (I) обладают модифицирующими свойствами в отношении гормонов надпочечников при заболеваниях или состояниях, характеризующихся повышенными уровнями гормонов стресса и/или пониженными уровнями андрогенных гормонов, как это показано в экспериментальной части.
Объектом настоящего изобретения является способ понижения или поддержания уровней кортизола у пациента посредством введения терапевтически эффективной дозы соединения формулы (I).
Объектом настоящего изобретения является способ лечения расстройства, заболевания или состояния, характеризуемого пониженными или недостаточными уровнями андрогенных гормонов у пациента, посредством введения терапевтически эффективной дозы соединения формулы (I).
Объектом настоящего изобретения является соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении расстройства, заболевания или состояния, характеризуемого пониженными или недостаточными уровнями андрогенных гормонов.
Объектом настоящего изобретения является способ лечения расстройства, заболевания или состояния, характеризующегося избыточными уровнями гормонов стресса, такими как уровни альдостерона и кортизола, у пациента, посредством введения терапевтически эффективной дозы соединения формулы (I).
Объектом настоящего изобретения является соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении расстройства, заболевания или состояния, характеризующегося избыточными уровнями гормонов стресса, такими как уровни альдостерона и кортизола.
Объектом настоящего изобретения является способ повышения или поддержания уровней 11-дезоксикортизола у пациента посредством введения терапевтически эффективной дозы соединения формулы (I).
Объектом настоящего изобретения является способ повышения или поддержания уровней адренокортикотропина у пациента посредством введения терапевтически эффективной дозы соединения формулы (I).
Объектом настоящего изобретения является способ повышения или поддержания уровней 11-дезоксикортикостерона у пациента посредством введения терапевтически эффективной дозы соединения формулы (I).
Объектом настоящего изобретения является способ повышения или поддержания уровней надпочечниковых андрогенов у пациента посредством введения терапевтически эффективной дозы соединения формулы (I).
Объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы (I) в качестве плейотропного модификатора стероидогенеза в надпочечниках у пациента.
Объектом настоящего изобретения также является применение соединения согласно формуле (I) для изготовления фармацевтической композиции для лечения расстройства, заболевания или состояния, характеризующегося избыточными уровнями гормонов стресса и/или недостаточными уровнями андрогенных гормонов.
Объектом настоящего изобретения также является фармацевтическая композиция, содержащая соединение согласно формуле (I) для применения для лечения расстройства, заболевания или состояния, характеризующегося избыточными уровнями гормонов стресса и/или недостаточными уровнями андрогенных гормонов. Подобные заболевания или расстройства могут представлять собой сердечную недостаточность, кахексию, острый коронарный синдром, хронический стрессовый синдром, гиперкортизолемию, синдром Кушинга или метаболический синдром.
Объектом настоящего изобретения также является применение соединения по настоящему изобретению для изготовления фармацевтической композиции для лечения расстройства, заболевания или состояния, характеризующегося избыточными уровнями гормонов стресса и/или недостаточными уровнями андрогенных гормонов, такого как сердечная недостаточность, кахексия, острый коронарный синдром, хронический стрессовый синдром, гиперкортизолемия, синдром Кушинга или метаболический синдром.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения его объектом являются способы лечения заболеваний или расстройств, характеризующихся избыточными уровнями гормонов стресса и/или недостаточными уровнями андрогенных гормонов, посредством введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) и фармацевтически приемлемый носитель. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения подобные заболевания или расстройства могут представлять собой сердечную недостаточность, кахексию, острый коронарный синдром, хронический стрессовый синдром, гиперкортизолемию, синдром Кушинга или метаболический синдром.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, его объектом являются способы введения пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей соединение формулы (I) и фармацевтически приемлемый носитель, для лечения заболеваний или расстройств, характеризующихся избыточными уровнями гормонов стресса и/или недостаточными уровнями андрогенных гормонов. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, подобные заболевания или расстройства могут представлять собой сердечную недостаточность, кахексию, острый коронарный синдром, хронический стрессовый синдром, гиперкортизолемию, синдром Кушинга или метаболический синдром, в частности сердечную недостаточность, кахексию, острый коронарный синдром, хронический стрессовый синдром, синдром Кушинга или метаболический синдром.
Везде, где это упоминалось выше, сердечная недостаточность может представлять собой острую сердечную недостаточность и хроническую сердечную недостаточность. Острая сердечная недостаточность может представлять собой острую декомпенсированную сердечную недостаточность. Хроническая сердечная недостаточность может быть связана с пониженной переносимостью физической нагрузки и/или с мышечной слабостью. Кахексия может представлять собой сердечную кахексию, кахексию, вызванную ХОЗЛ, кахексию, вызванную циррозом, кахексию, вызванную опухолью, или кахексию, вызванную вирусом (ВИЧ). Хронический стрессовый синдром может включать депрессию, гипергликемию и подавление иммунитета. Синдром Кушинга может включать гиперкортизолизм вследствие опухоли коры надпочечников, гипофиза или эктопической опухоли. Метаболический синдром может включать ожирение, диабет, гипертензию, дислипидемию и атеросклероз. Соединения формулы (I) обладают модифицирующими свойствами в отношении гормонов надпочечников при заболеваниях или состояниях, характеризующихся повышенными уровнями гормонов стресса и/или пониженными уровнями андрогенных гормонов, как это показано в экспериментальной части.
Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по настоящему изобретению, может быть изготовлена с помощью хорошо известных в соответствующей области технике методик. Фармацевтическая композиция может быть изготовлена для конкретных путей введения, таких как пероральное введение, парентеральное введение и ректальное введение и т.п. Кроме того, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть изготовлены в твердой форме, включая капсулы, таблетки, пилюли, гранулы, порошки или суппозитории, или же в жидкой форме, включая растворы, суспензии или эмульсии. Фармацевтические композиции могут быть подвергнуты общепринятым фармацевтическим операциям, таким как стерилизация, и/или могут содержать общепринятые инертные разбавители, скользящие вещества или буферные вещества, равно как и адъюванты, такие как консерванты, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы и буферы и т.п.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может находиться в стандартной дозировке, составляющей по крайней мере 0,05, или 1 мг, или более описываемых здесь в качестве активного ингредиента соединений, например от 0,01 мг до 1000 мг, от 0,01 мг до 500 мг, от 0,01 до 50 мг, от 0,01 мг до 5 мг, от 0,01 до 2 мг или от 0,1 мг до 2 мг активного ингредиента. Например, она может находиться в стандартной дозировке, составляющей, по крайней мере, 0,05, или 1 мг, или от 4 мг до 100 мг, например, от 2 мг до 50 мг, соединений, описываемых в контексте в качестве активного ингредиента, для пациента массой около 50-70 кг. Например, стандартная дозировка может содержать 1-1000 мг активного ингредиента для пациента массой около 50-70 кг, приблизительно 1-500 мг, приблизительно 1-50 мг, приблизительно 0,5-5 мг, 0,1-1 мг или приблизительно 0,05-0,5 мг активного ингредиента. Режим дозировки, задействующий описываемые здесь соединения, может быть выбран в соответствии с разнообразными факторами, включая тип, биологические виды, возраст, массу, пол, тип заболевания или расстройства, подвергаемого лечению, тяжесть заболевания или расстройства, подвергаемого лечению, путь введения и конкретное используемое соединение или соль. Лечащий врач, клиницист или ветеринар, обладающий стандартными знаниями, может легко определить эффективное количество каждого из активных ингредиентов, необходимое для профилактики, лечения или ингибирования развития расстройства или заболевания.
-3
-9
Цитированные выше дозировочные свойства могут быть продемонстрированы в тестах in vitro (см. заявки на изобретения PCT/US2007/018660 и WO 2007/065942 A2) и в тестах in vivo (см. нижеприведенный пример 1), причем использование млекопитающих, например мышей, крыс, собак, обезьян или их отдельных органов, тканей или препаратов, является преимущественным. Соединения по настоящему изобретению могут применяться in vitro в форме растворов, например предпочтительно водных растворов, а также in vivo, как энтерально, так и парэнтерально, причем внутривенное введение, например в виде суспензии или в водном растворе, является преимущественным. Дозировка in vitro может находиться в пределах между приблизительно мольной концентрацией 10 и мольной концентрацией 10. Терапевтически эффективное количество in vivo может находиться в пределах между 0,001 и 15 мг/кг, предпочтительно между 0,003 и 0,05 мг/кг в зависимости от пути введения.
Ниже перечислены определения различных терминов, употребляемых в описании настоящей заявки.
Термин «гормон стресса», как здесь описано, относится к гормону, секретируемому в ответ на необычную жизненную ситуацию. Стрессовый ответ включает активацию как симпатической адреномедуллярной системы с секрецией эпинефрина и норэпинефрина, так и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (НРА) с секрецией кортизола. Примеры гормонов стресса представлены, например, в Таблице 1 WO 2007/105203, которая включена в настоящую заявку в качестве ссылки и составляет ее часть. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, гормон стресса представляет собой альдостерон или кортизол, предпочтительно кортизол.
Термин «повышенные уровни гормонов стресса» или «избыточные уровни гормонов стресса» употребляется здесь для указания на то, что порог уровней гормонов статистически значимо повышен по сравнению с уровнем других параметров, таких как активность альдостерона по сравнению с активностью ренина в плазме, или же статистически значимо повышен по сравнению с нормальными клиническими стандартными значениями. Например, уровни гормонов стресса считаются повышенными, если уровень альдостерона превышает 277 пМ во время отдыха или если уровень кортизола превышает 552 нМ в утреннее время, как это описано, например, в монографии Endocrinology (Эндокринология), 9-е издание (под ред. J.D. Wilson, D.W. Foster, Н.М. Kronenberg, P.R. Larsen), W.В. Saunders Co., Philadelphia, 1988.
Термин «понижение или ингибирование действий избыточных уровней гормонов стресса», как здесь описано, означает какое-либо улучшение в профилактике, контроле, задержке, ослаблении или смягчении относительно и/или абсолютно повышенных или избыточных дисбалансов гормонов стресса, имеющих патофизиологические последствия. Хотя здесь не подразумевается, что термин «ингибирование» ограничен нормализацией уровней гормонов стресса, он также включает возможность полной нормализации уровней гормонов стресса к стандартным клиническим значениям.
Термин «понижение или ингибирование синтеза избыточно вырабатываемых уровней гормонов стресса», как здесь описано, означает какое-либо улучшение в профилактике, контроле, задержке, ослаблении или смягчении относительно и/или абсолютно повышенных или избыточных дисбалансов гормонов стресса, имеющих патофизиологические последствия. Хотя здесь не подразумевается, что термин «ингибирование» ограничен нормализацией уровней гормонов стресса, он также включает возможность полной нормализации уровней гормонов стресса к стандартным клиническим значениям.
Термин «андрогенный гормон», как здесь описано, относится к мужским половым гормонам и включает, например, дегидроэпиандростерон-сульфат (DHEAS), дегидроэпиандростерон (DHEA), андростендион (А), тестостерон (Т) и дигидротестостерон (DHT).
Термины «пониженные уровни андрогенных гормонов» или «недостаточные уровни андрогенных гормонов», как здесь описано, указывают на то, что уровень уровней андрогенов статистически значимо понижен по сравнению с уровнем других параметров или статистически значимо понижен по сравнению с нормальными клиническими стандартными значениями. Например, уровни андрогенных гормонов считаются пониженными или недостаточными, если уровень андростендиона оказывается, например, ниже 2619 пМ или если уровень дегидроандростерона оказывается, например, ниже 6,94 нМ, как это описано, например, в монографии Endocrinology (Эндокринология), 9-е издание (под ред. J.D. Wilson, D.W. Foster, H.M. Kronenberg, P.R. Larsen), W.В. Saunders Co., Philadelphia, 1988.
Термин «понижение или ингибирование активности стероидогенных ферментов, косвенно приводящей к недостаточным уровням андрогенных гормонов», как здесь описано, означает какое-либо улучшение в профилактике, контроле, задержке, ослаблении или смягчении относительно и/или абсолютно пониженных или недостаточных дисбалансов андрогенных гормонов, имеющих патофизиологические последствия. Хотя здесь не подразумевается, что термин «ингибирование» ограничен нормализацией уровней андрогенных гормонов, он также включает возможность полной нормализации уровней андрогенных гормонов к стандартным клиническим значениям.
Термин «поддерживать» или «поддержание» в отношении уровней гормонов, как здесь описано, означает улучшение в профилактике, контроле или задержке относительно и/или абсолютно пониженных/недостаточных уровней андрогенных гормонов и/или относительно и/или абсолютно повышенных/избыточных уровней гормонов стресса.
Термин «понижать» или «понижение» в отношении уровней гормонов стресса, как здесь описано, означает какое-либо улучшение в ослаблении относительно и/или абсолютно повышенных/избыточных уровней гормонов стресса.
Термин «повышать» или «повышение» в отношении уровней андрогенных гормонов, как здесь описано, означает какое-либо улучшение в смягчении относительно и/или абсолютно пониженных/недостаточных уровней андрогенных гормонов.
Как здесь описано, термин «анормальный» относится к активности или свойству, отличающимся от нормальной активности или свойства.
Термин «анормальная активность», как здесь описано, относится к любому нарушению нормальной функции. Патологическая активность может быть сильнее или слабее нормальной активности. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, термин «аномальная активность» относится к избыточной или недостаточной активности, например гормона, как здесь описано.
Термин «активность», как здесь описано, относится к любой специфической активности, которую способна осуществлять или кодировать молекула. Например, активность может состоять в способности молекулы к связыванию с определенным партнером по связыванию с определенным сродством, в способности к катализу определенной реакции или в способности к инициированию определенного клеточного ответа.
Термин «экспрессия», как здесь описано, следует понимать таким образом, как он определен например, в Maniatis и др., «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» (Молекулярное клонирование: лабораторное руководство). Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2-е издание, 1989. Например, он относится к накоплению молекулы, такой как гормон, как он определен в контексте.
Термин «плейотропный агент, обладающий модифицирующими свойствами в отношении гормонов надпочечников», как здесь описано, следует понимать как означающий молекулу, такую как соединение формулы (I), как оно определено в контексте, которая ингибирует синтез как альдостерона, так и кортизола, повышая при этом уровни АСТН, 11-дезоксикортикостерона, и синтез надпочечниковых андрогенов, андростендиона и дегидроэпиандростерона.
Термин «замещенный», как здесь описано, относится к одному или более заместителям, например к одному или двум заместителям, например к заместителям, как они определены здесь для соединения формулы (I).
Термин «синдром Кушинга» может также обозначать гиперадренокортицизм или гиперкортицизм. Синдром Кушинга может включать гиперкортизолизм вследствие опухоли коры надпочечников, гипофиза или эктопической опухоли.
Для целей настоящего изобретения термин «соединение формулы (I)», как здесь описано, относится как к свободной форме, так и к любой ее фармацевтически приемлемой соли.
Экспериментальная часть
Нижеследующие примеры иллюстрируют вышеописанное изобретение. Они, однако, не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом. Специалисту в соответствующей области при прочтении вышеизложенного подробного описания должны быть очевидны и другие варианты осуществления настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения не ограничивается приведенными примерами, но охватывается изложенной ниже формулой изобретения.
Пример 1. Анализ крысиного CYP11 B1 in vitro
3
Полностью свободные от этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) таблетки ингибитора протеазы получают от компании Roche Applied Science (Индианаполис, Индиана). Модифицированная Дюльбекко среда Игла (DMEM), антибиотик, генетицин, гигромицин и околоплодная телячья сыворотка (FBS) являются продуктами компании Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). Раствор A и раствор B для регенерации восстановленного никотинамидадениндинуклеотид фосфата (NADPH) приобретают у компании BD Biosciences Clontech (Пало Альто, Калифорния). Поливинилтолуольные гранулы для сцинтилляционного анализа по близости (PVT SPA) с противоовечьим антителом и [1,2,6,7-H(N)]кортикостерон приобретают у компаний Amersham (Пискатавэй, Нью-Джерси) и PerkinElmer (Бостон, Массачусетс) соответственно.
2
Клеточную линию V79-4 CYP11 B1-адренодоксин-адренодоксинредуктаза #259 выдерживают в DMEM, с добавками 10% FBS, 0,5× антибиотика, 800 мкг/мл генетицина и 250 мкг/мл гигромицина (среда двойной селективности). Для получения фермента осуществляют посев клеток #259 в 150 мм чашки в среде двойной селективности. По прошествии 2 суток роста клетки однократно промывают забуференным фосфатом солевым раствором (PBS), соскабливают, собирают в PBS и центрифугируют при 1300 об/мин в течение 6 минут. Каждую гранулу (представляющую 10 чашек с клетками) ресуспендируют в 3 мл ледяного буферного раствора для гомогенизации (8,5 мМ MgCl, 3,13 мМ KCl, 7,59 мМ NaCl, 50 мМ Трис/HCl, pH 7,4, и одна таблетка полностью свободного от ЭДТК ингибитора протеазы на 100 мл буфера), подвергают ультразвуковой обработке с помощью ультразвукового дезинтегратора Branson Sonifier 450 с 6 импульсами, после чего помещают на лед на 5 минут. Процедуру ультразвуковой обработки повторяют еще 3 раза с выдерживанием по 5 минут на льду между обработками. После этого обработанный ультразвуком материал центрифугируют при 500 g в течение 4 минут для удаления неразрушенных клеток. Надосадочный раствор доводят до конечной концентрации глицерина 5%, подвергают мгновенной заморозке в жидком азоте и хранят при температуре -80°С.
2
Материал из замороженных препаратов CYP11 B1 оттаивают на льду в день опыта, а затем разбавляют ледяным буфером для анализа, содержащим 8,5 мМ MgCl, 3,13 мМ KCl, 7,59 мМ NaCl и 50 мМ Трис/HCl, pH 7,4, до концентрации белка 0,5-6 мг/мл. Анализы CYP11 B1 осуществляют в 96-ячеечных планшетах с U-образным дном, не обработанных тканевыми культурами. В зависимости от опыта, от 50 до 300 мкг белка в 35 мкл инкубируют с 75 мкл буфера для анализа или с соединением в требуемой концентрации и 20 мкл субстратной смеси (1,08× раствора A для регенерации NADPH, 6.5× раствора B для регенерации NADPH, 811 мкМ NADPH и 3,25 мкМ 11-дезоксикортикостерона в буфере для анализа) на время до 4 часов при температуре 25°C во встряхиваемом инкубаторе. Взаимодействие останавливают посредством добавления 10 мкл 1,4% ПАВ Тритон Х-100 и кратковременного встряхивания планшетов. После этого планшеты центрифугируют при 2400 об/мин в течение 6 минут и удаляют 50 мкл надосадочного раствора для измерения содержания кортикостерона с помощью сцинтилляционного анализа по близости (SPA).
3
Измерение кортикостерона осуществляют в формате 96-ячеечных планшетов. Каждый испытуемый образец (50 мкл) инкубируют с [1,2,6,7-H(N)]кортикостероном с активностью 0,02 мкКи и 0,3 мкг противокортикостеронового антитела в PBS, содержащем 0,1% Тритона Х-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 12% глицерина в общем объеме 200 мкл при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого добавляют в каждую ячейку гранулы PVT SPA с противоовечьим антителом (50 мкл) и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре, после чего осуществляют измерения с помощью детектора для планшетов Microbeta. Количество кортикостерона в каждом образце рассчитывают посредством сравнения со стандартной кривой, полученной с использованием известных количеств гормона.
50
Полное построение кривых концентрация-отклик для ингибитора осуществляют, по крайней мере, 3 раза. Значения концентрации, обеспечивающей пятидесятипроцентное ингибирование (IC), определяют с помощью программы для нелинейной аппроксимации кривых методом наименьших квадратов из пакета IDBS XLfit. Было обнаружено, что соединения, входящие в объем настоящего изобретения, в частности, конкретные соединения, описываемые здесь, являются активными ингибиторами CYP11 B1, характеризуемыми величинами 1С5о в диапазоне от 0,3 нМ до 600 нМ.
Пример 2. Анализ крысиного CYP11 B2 in vitro
2
Клеточную линию V79-4 CYP11 В2-адренодоксин-адренодоксинредуктаза #305 выдерживают в DMEM, с добавками 10% FBS, 0,5× антибиотика, 800 мкг/мл генетицина и 250 мкг/мл гигромицина (среда двойной селективности). Для получения фермента осуществляют посев клеток #305 в 150 мм чашки (среда двойной селективности) с примерным распределением площади поверхности в соотношении 1:15 на выращиваемых в колбе культурах Т-185, выращиваемых при степени слияния 75-85%. По прошествии 2 суток роста клетки однократно промывают PBS, соскабливают, собирают в PBS и центрифугируют при 1300 об/мин в течение 6 минут. Каждую гранулу (представляющую 10 чашек с клетками) ресуспендируют в 3 мл ледяного буферного раствора для гомогенизации (8,5 мМ MgCl, 3,13 мМ KCl, 7,59 мМ NaCl, 50 мМ Трис/HCl, pH 7,4, и одна таблетка полностью свободного от ЭДТК ингибитора протеазы на 100 мл буфера), подвергают ультразвуковой обработке с помощью ультразвукового дезинтегратора Branson Sonifier 450 с 6 импульсами, после чего помещают на лед на 5 минут. Процедуру ультразвуковой обработки повторяют еще 3 раза с выдерживанием по 5 минут на льду между обработками. После этого обработанный ультразвуком материал центрифугируют при 500 g в течение 4 минут для удаления неразрушенных клеток. Надосадочный раствор доводят до конечной концентрации глицерина 5%, подвергают мгновенной заморозке в жидком азоте и хранят при температуре -80°C.
2
Материал из замороженных препаратов CYP11 B2 оттаивают на льду в день опыта, а затем разбавляют ледяным буфером для анализа, содержащим 8,5 мМ MgCl, 3,13 мМ KCl, 7,59 мМ NaCl и 50 мМ Трис/HCl, pH 7,4, до концентрации белка 0,25-1,5 мг/мл. Анализы CYP11 B2 осуществляют в 96-ячеечных планшетах с U-образным дном, не обработанных тканевыми культурами. В зависимости от опыта, от 14 до 84 мкг белка в 55 мкл инкубируют с 75 мкл буфера для анализа или с соединением в требуемой концентрации и 20 мкл субстратной смеси (1,25× раствора A для регенерации NADPH, 7.5× раствора B для регенерации NADPH, 935,75 мкМ NADPH и 15 мкМ 11-дезоксикортикостерона в буфере для анализа) на время до 5 часов при температуре 25°C во встряхиваемом инкубаторе. Взаимодействие останавливают посредством добавления 10 мкл 1,4% ПАВ Тритон Х-100 и кратковременного встряхивания планшетов. После этого планшеты центрифугируют при 2400 об/мин в течение 6 минут и удаляют 100 мкл надосадочного раствора для измерения содержания альдостерона с помощью сцинтилляционного анализа по близости (SPA).
3
Измерение альдостерона осуществляют в формате 96-ячеечных планшетов. Каждый испытуемый образец (2-10 мкл клеточной культуральной среды или 10 мкл клеточного гомогенизата) инкубируют с [1,2,6,7-Н(N)]альдостероном с активностью 0,02 мкКи и 0,3 мкг противоальдостеронового антитела в PBS, содержащем 0,1% Тритона Х-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 12% глицерина в общем объеме 200 мкл при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого добавляют в каждую ячейку гранулы PVT SPA с противомышиным антителом (50 мкл) и инкубируют в течение 4 часов при комнатной температуре, после чего осуществляют измерения с помощью детектора для планшетов Microbeta. Количество альдостерона в каждом образце рассчитывают посредством сравнения со стандартной кривой, полученной с использованием известных количеств гормона.
50
Полное построение кривых концентрация-отклик для ингибитора осуществляют, по крайней мере, 3 раза. Значения IC определяют с помощью программы для нелинейной аппроксимации кривых методом наименьших квадратов из пакета IDBS XLfit.
Пример 3. Анализ человеческого CYP11 B1 in vitro
3
Полностью свободные от ЭДТК таблетки ингибитора протеазы получают от компании Roche Applied Science (Индианаполис, Индиана). Модифицированная Дюльбекко среда Игла (DMEM), антибиотик, генетицин, гигромицин и околоплодная телячья сыворотка (FBS) являются продуктами компании Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). Раствор A и раствор B регенерации NADPH приобретают у компании BD Biosciences Clontech (Пало Альто, Калифорния). Гранулы PVT SPA с противомышиным антителом и [1,2,6,7-Н(N)]гидрокортизон приобретают у компаний Amersham (Пискатавэй, Нью-Джерси) и PerkinElmer (Бостон, Массачусетс) соответственно.
2
Клеточную линию V79-4 CYP11 B1-адренодоксин-адренодоксинредуктаза #618 выдерживают в DMEM, с добавками 10% FBS, 0,5× антибиотика, 800 мкг/мл генетицина и 250 мкг/мл гигромицина (среда двойной селективности). Для получения фермента осуществляют посев клеток #618 в 150 мм чашки с плотностью 6,75×10 клеток на чашку в среде двойной селективности. По прошествии 4 суток роста клетки однократно промывают забуференным фосфатом солевым раствором (PBS), соскабливают, собирают в PBS и центрифугируют при 1300 об/мин в течение 6 минут. Каждую гранулу (представляющую 10 чашек с клетками) ресуспендируют в 3 мл ледяного буферного раствора для гомогенизации (8,5 мМ MgCl, 3,13 мМ KCl, 7,59 мМ NaCl, 50 мМ Трис/HCl, pH 7,4, и одна таблетка полностью свободного от ЭДТК ингибитора протеазы на 100 мл буфера), подвергают ультразвуковой обработке с помощью ультразвукового дезинтегратора Branson Sonifier 450 с 6 импульсами, после чего помещают на лед на 5 минут. Процедуру ультразвуковой обработки повторяют еще 3 раза с выдерживанием по 5 минут на льду между обработками.
После этого обработанный ультразвуком материал центрифугируют при 500 g в течение 4 минут для удаления неразрушенных клеток. Надосадочный раствор доводят до конечной концентрации глицерина 5%, подвергают мгновенной заморозке в жидком азоте и хранят при температуре -80°С.
2
50
50
3
Материал из замороженных препаратов CYP11 B1 оттаивают на льду в день опыта, а затем разбавляют ледяным буфером для анализа, содержащим 8,5 мМ MgCl, 3,13 мМ KCl, 7,59 мМ NaCl и 50 мМ Трис/HCl, pH 7,4, до концентрации белка 0,5-6 мг/мл. Анализы CYP11 B1 осуществляют в 96-ячеечных планшетах с U-образным дном, не обработанных тканевыми культурами. В зависимости от опыта, от 50 до 300 мкг белка в 35 мкл инкубируют с 75 мкл буфера для анализа или с соединением в требуемой концентрации и 20 мкл субстратной смеси (1,08× раствора A для регенерации NADPH, 6.5× раствора B для регенерации NADPH, 811 мкМ NADPH и 3,25 мкМ 11-дезоксикортизола в буфере для анализа) на время до 4 часов при температуре 25°C во встряхиваемом инкубаторе. Взаимодействие останавливают посредством добавления 10 мкл 1,4% ПАВ Тритон Х-100 и кратковременного встряхивания планшетов. После этого планшеты центрифугируют при 2400 об/мин в течение 6 минут и удаляют 50 мкл надосадочного раствора для измерения содержания кортикостерона с помощью сцинтилляционного анализа по близости (SPA). Измерение кортизола осуществляют в формате 96-ячеечных планшетов. Каждый испытуемый образец (50 мкл) инкубируют с [1,2,6,7-Н(N)]гидрокортизоном с активностью 0,02 мкКи и 0,3 мкг противокортизолового антитела в PBS, содержащем 0,1% Тритона X-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 12% глицерина в общем объеме 200 мкл при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого добавляют в каждую ячейку гранулы PVT SPA с противомышиным антителом (50 мкл) и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре, после чего осуществляют измерения с помощью детектора для планшетов Microbeta. Количество кортизола в каждом образце рассчитывают посредством сравнения со стандартной кривой, полученной с использованием известных количеств гормона. Полное построение кривых концентрация-отклик для ингибитора осуществляют, по крайней мере, 3 раза. Значения IC определяют с помощью программы для нелинейной аппроксимации кривых методом наименьших квадратов из пакета IDBS XLfit. Было обнаружено, что соединения, входящие в объем настоящего изобретения, в частности конкретные соединения, описываемые здесь, являются активными ингибиторами CYP11 B1, характеризуемыми величинами IC в диапазоне от 0,2 нМ до 200 нМ.
Пример 4. Анализ человеческого CYP11 B2 (альдостерона) in vitro
3
Клеточную линию карциномы коры надпочечников человека NCI-H295R получают от Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния). Инсулин/трансферрин/селеновую (ITS)-A добавку (100×), DMEM/F-12, антибиотик/противогрибковое средство (100×) и околоплодную телячью сыворотку (FBS) приобретают у компании Invitrogen (Карлсбад, Калифорнию). PVT-гранулы для сцинтилляционного анализа по близости (SPA) с противомышиным антителом и 96-ячеечные планшеты с несвязывающей поверхностью (NBS) получают от компаний GE Health Sciences (Пискатавэй, Нью-Джерси) и Corning (Эктон, Массачусетс) соответственно. Черные непрозрачные 96-ячеечные планшеты с плоским дном приобретают у компании Costar (Корнинг, Нью-Йорк). Альдостерон и ангиотензин (Ang II) приобретают у компании Sigma (Сент-Луис, Миннесота). D-[1,2,6,7-Н(N)]альдостерон приобретают у компании PerkinElmer (Бостон, Массачусетс). Nu-сыворотка является продуктом компании BD Biosciences (Франклин Лэйкс, Нью-Джерси).
2
Для измерения активности альдостерона in vitro клетки карциномы коры надпочечников человека NCI-H295R засевают в 96-ячеечные планшеты NBS с плотностью 25000 клеток на ячейку в 100 мкл среды для роста, содержащей DMEM/F12 с добавками 10% FBS, 2,5% Nu-сыворотки, 1 мкг/мл ITS и 1× антибиотика/противогрибкового средства. После культивирования в течение 3 суток при температуре 37°C в атмосфере, представляющей собой 5% CO/95% воздуха, среду заменяют. На следующий день промывают клетки 100 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS) и инкубируют со 100 мкл среды для обработки, содержащей 1 мкМ ангиотензина II и соединение в различных концентрациях в четыре параллельных серии ячеек при температуре 37°C в течение 24 часов. По окончании инкубирования удаляют из каждой ячейки по 50 мкл среды для измерения выработки альдостерона с помощью SPA, использующего мышиные противоальдостероновые моноклональные антитела.
3
Измерение активности альдостерона может также быть осуществлено в формате 96-ячеечных планшетов. Каждый испытуемый образец (2-10 мкл клеточной культуральной среды или 10 мкл клеточного гомогенизата) инкубируют с [1,2,6,7-Н(N)]альдостероном с активностью 0,02 мкКи и 0,3 мкг противоальдостеронового антитела в PBS, содержащем 0,1% Тритона Х-100, 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 12% глицерина в общем объеме 200 мкл при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого добавляют в каждую ячейку гранулы PVT SPA с противомышиным антителом (50 мкл) и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре, после чего осуществляют измерения с помощью детектора для планшетов Microbeta. Количество альдостерона в каждом образце рассчитывают посредством сравнения со стандартной кривой, полученной с использованием известных количеств гормона.
50
Пример 5. Определение величин IC для CYP11 B1 и CYP11 B2
50
50
Выделение альдостерона, кортизола, кортикостерона и эстрадиола/эстрона в культуральную среду может быть обнаружено и охарактеризовано количественно с помощью коммерчески доступных специфичных моноклональных антител в радиоиммунологических анализах в соответствии с инструкциями производителя. Ингибирование высвобождения определенных стероидов может быть использовано в качестве меры ингибирования соответствующих ферментов добавляемыми испытуемыми соединениями. Зависящее от дозы ингибирование ферментативной активности соединения рассчитывают с помощью графика ингибирования, характеризуемого величиной IC. Величины IC для активных испытуемых соединений выясняют с помощью простого линейного регрессионного анализа с целью построения графиков ингибирования без приписывания данным весовых коэффициентов. График ингибирования рассчитывают посредством аппроксимации непосредственных данных 4-параметрической логистической функцией с помощью метода наименьших квадратов. Уравнение 4-параметрической логистической функции имеет вид Y=(d-a)/((1+(x/c)^b))+а, где а представляет собой минимальный уровень данных, b - градиент, с - точку перегиба, d - максимальный уровень данных, x - концентрацию ингибитора.
Активность ингибирования выработки альдостерона может также быть выражена в проценте ингибирования (% ингибирования) при данной концентрации (например, % ингибирования при 1 мкМ), который представляет собой отношение уровня альдостерона при обработке клетки указанной концентрацией соединения по настоящему изобретению (например, концентрацией 1 мкМ) к выделению альдостерона в том случае, когда в клетке нет соединения по настоящему изобретению:
% ингибирования выработки альдостерона = [(Y-X)/Y]×100,
где Х представляет собой уровень альдостерона в случае обработки клетки соединением согласно любой из формул I-IVB или его фармацевтически приемлемой солью, a Y представляет собой уровень альдостерона в том случае, когда в клетке нет соединения согласно любой из формул I-IVB или его фармацевтически приемлемой соли.
Активность ингибирования выработки CYP11 B1 может также быть выражена в проценте ингибирования (% ингибирования) при данной концентрации (например, % ингибирования при 1 мкМ), который представляет собой отношение уровня кортизола при обработке клетки указанной концентрацией соединения по настоящему изобретению (например, концентрацией 1 мкМ) к выделению кортизола в том случае, когда в клетке нет соединения по настоящему изобретению:
% ингибирования выработки кортизола = [(Y'-X')/Y']×100,
где X' представляет собой уровень кортизола в случае обработки клетки соединением согласно формулам I-IVB, a Y' представляет собой уровень кортизола в том случае, когда в клетке нет соединения согласно формулам I-IVB.
В результате тестовых анализов для измерения CYP11 B1 (кортизола) и CYP11 B2 (альдостерона), как это описано выше, соединения по настоящему изобретению проявили эффективность ингибирования, представленную в Таблице 1.
Таблица 1
Данные из примеров 1, 2, 3 и 4
Соединение
Человеческий CYP11 B1 нМ
Человеческий CYP11 B2 нМ
Крысиный CYP11 B1 нМ
Крысиный CYP11 B2 нМ
4'-фтор-6-(6,7,8,9-тетрагидро-5H-имидазо[1,5-a]азепин-5-ил)бифенил-3-карбонитрил, энантиомер A** (пример 25, как он описан в WO 2007/024945)
0,3
0,4
0,3
1,0
3-бром-4-(6,7,8,9-тетрагидро-5Н-имидазо[1,5-а]азепин-5-ил)бензонитрил, рацемат** (пример 23, как он описан в WO 2007/024945)
0,2
1,2
1,0
1,0
5-(2-хлор-4-цианофенил)-N-(4-метоксибензил)-N-метил-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-карбоксамид, энантиомер B** (пример 9-9, как он описан в WO 2007/024945)
0,8
2,7
2,0
5,0
4-(6,7-Дигидро-5H-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил)-3-фторбензонитрил, энантиомер В** ((R)-энантиомер, как описано в примере 3 в WO 2007/024945)
1,8
0,7
495
110
** подробности приведены в WO 2007/024945
Пример 6: анализ CYP11 B1 in vivo
Влияние соединений на концентрацию альдостерона в плазме (КАП) и концентрацию глюкокортикоида (кортикостерона) в плазме (ККП) т vivo оценивают на бодрствующих крысах.
Самцов крыс породы Спрэг-Доули (масса тела - 400-600 г) хирургическим путем снабжают бедренным артериальным и венозным катетером. Катетеры выводят из нижнего отдела спины через пружины из нержавеющей стали и шарнирную системы, позволяющую крысам свободно двигаться в любое время. Крысам давали, по крайней мере, одну неделю перед началом эксперимента на восстановление после хирургического вмешательства.
В утро эксперимента из артериального катетера отбирают образец крови, предшествующий обработке, в среду с гепарином. Образцы крови центрифугируют на охлаждаемой центрифуге с целью получения плазмы. Плазму хранят при температуре -70°C до последнего измерения КАП и ККП (с помощью радиоиммунологического анализа). После этого вводят адренокортикотропный гормон (АСТН(1-24), именуемый в контексте АСТН) в виде внутривенного болюса (100 нг/кг), после чего проводят непрерывное внутривенное вливание (30 нг/кг/мин) в течение 9 часов. По прошествии часа вливания отбирают из артериального катетера образец крови, соответствующий базовому уровню (время 0) и обрабатывают и хранят его так, как было описано выше. После этого крысам вводят испытуемое соединение (как правило, от 0,01 до 100 мг/кг) перорально через пероральный зонд или парэнтерально через артериальный катетер (внутриартериально). Препараты соединений изготавливают с подходящим носителем (например, водой (перорально) или солевым раствором (внутриартериально)) в физиологически совместимом объеме (как правило, 1-2 мл/кг). Дополнительные образцы крови отбирают через 0,083 (только внутриартериально), 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 24 часа после введения соединения, обрабатывают и хранят согласно описанному выше для того, чтобы впоследствии определить КАП, ККП и концентрацию соединения в плазме (с помощью жидкостной тандемной хроматомасс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС)). Биодоступность при пероральном введении и традиционные фармакокинетические (ФК) параметры определяют исходя из концентраций соединения в плазме.
У контрольной группы крыс введение АСТН приводит к устойчивому увеличению КАП примерно в 10 раз (от -0,26 нМ до -2,5 нМ) и КПП примерно в 4-5 раз (от -300 нМ до -1340 нМ) в течение девятичасового опыта. Напротив, введение испытуемого соединения понижает КАП и КПП в зависимости от времени и дозы на величину от 0 до 97% в зависимости от присущих соединению способностей к ингибированию CYP11 B2 и CYP11 B1 и его свойств в отношении всасывания, распределения, метаболизма и выведения (ADME). Исходя из концентрации соединения в плазме, для каждой дозы определяют фармакокинетические/фармакодинамические (ФК/ФД) профили (снижение КАП и КПП) для каждого соединения. В нижеприведенной Таблице 2 приведены данные по активности ингибирования CYP11 B1 и CYP11 B2 конкретными соединениями.
Таблица 2
Соединение
Доза (мг/кг)
% понижения относительно базового уровня
t=1ч
8ч
4'-фтор-6-(6,7,8,9-тетрагидро-5H-имидазо[1,5-а]азепин-5-ил)бифенил-3-карбонитрил, энантиомер A** (пример 25, как описано в WO 2007/024945)
3 (внутри-артериально)
КПП
89
43
КАП
83
76
3-бром-4-(6,7,8,9-тетрагидро-5Н-имидазо[1,5-а]азепин-5-ил)бензонитрил, рацемат** (пример 23, как описано в WO 2007/024945)
10 (перорально)
КПП
70
87
КАП
79
89
5-(2-хлор-4-цианофенил)-N-(4-метоксибензил)-N-метил-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-карбоксамид, энантиомер В** (пример 9-9 в W0O 007/024945)
30 (внутри-артериально)
КПП
76
78
КАП
23
59
4-(6,7-Дигидро-5H-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил)-3-фторбензонитрил, энантиомер В** ((R)-энантиомер, (примере 3 в WO 2007/024945)
10 (перорально)
КПП
24
30
КАП
65
72
** подробности приведены в WO 2007/024945
Пример 7
Для оценки гормонального эффекта соединения формулы (I), дигидрофосфата 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила у пациентов с диагностированным первичным гиперальдостеронизмом было проведено пилотное простое слепое исследование с принудительным подбором дозы. Клиническое исследование было спланировано, осуществлено и задокументировано в соответствии с согласованным трехсторонним руководством международной конференции по гармонизации по надлежащей клинической практике с учетом соответствующих местных правил. Каждый пациент участвовал в периоде скрининга/отмывания, двухнедельном вводном периоде с приемом плацебо, четырехнедельном периоде лечения и недельном периоде отмывания с плацебо. Период лечения состоял из перорального введения соединения формулы (I) дважды в сутки в дозе 0,5 мг в течение двух недель с последующим увеличением дозы до 1,0 дважды в сутки в течение двух последующих недель. Образцы крови отбирались перед лечением, в 1 и 2 день, 8 день, 15 день, 22 день, 29 и 30 день (все перед введением очередной дозы, т.е. через 12 часов после последней дозы), и в 36 день, последний день исследования. Каждый образец анализировали на содержание альдостерона и иммунореактивного активного ренина, 11-дезоксикортикостерона, кортизола, 11-дезоксикортизола и адренокортикотропина (АСТН), после того, как пациенты находились в состоянии покоя, по крайней мере, 60 минут, чтобы исключить какие-либо изменения величин вследствие положения тела или стресса. Концентрации альдостерона в плазме измеряли с помощью коммерческого набора для радиоиммунологического анализа (DPC, Франция). Активный ренин плазмы измеряли с помощью двух моноклональных антител, 3Е8 и 125I-4G1, в коммерчески доступном наборе для иммунорадиометрического анализа (CisBio, Франция). Уровни в плазме 11-дезоксикортикостерона, кортизола и 11-дезоксикортизола измеряли с помощью стандартизированного ЖХ-МС/МС-метода. АСТН плазмы измеряли с помощью коммерчески доступного набора для иммунорадиометрического анализа (CisBio, Франция).
Статистический анализ фармакодинамического биомаркера был подытожен с использованием описательной статистики, равно как и графических и/или регрессионных методов. Введение соединения формулы (I), дигидрофосфата 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила, пациентам с первичным гиперальдостеронизмом в течение двукратного двухнедельного периода представлено на фигуре 2 и позволяет сделать вывод об ожидавшемся действенном подавлении альдостерона, отражаемом повышенным уровнем активного ренина, но также и неожиданно высоким накоплением стероида-предшественника 11-дезоксикортикостерона. Накопление 11-дезоксикортикостерона (11 DOCS) стимулировалось повышенными уровнями АСТН. Повышенные уровни адренокортикотропина явились следствием ингибирования синтеза кортизола через посредство 11-бета-гидроксилазы, что нашло отражение в падении уровней кортизола и накоплении субстрата фермента 11-дезоксикортизола (11 DOC). Повышенные уровни 11-дезоксикортикостерона в сочетании с ингибированием синтеза гормонов стресса обеспечили сдвиг в сторону роста синтеза надпочечниковых андрогенов андростендиона и дегидроэпиандростерона (см. Фиг.1 - диаграмма стероидогенеза в надпочечниках). Таким образом, соединение формулы (I) продемонстрировало фармакологический профиль плейотропного средства с модифицирующими свойствами в отношении гормонов надпочечников, поскольку оно ингибирует синтез и уровни АСТН, 11-дезоксикортикостерона и, в конечном итоге, синтез надпочечниковых андрогенов, андростендиона и дегидроэпиандростерона.
Пример 8
Осуществляют открытое неконтролируемое многоцентровое исследование с постепенным наращиванием дозы на пациентах, страдающих болезнью Кушинга, как это описано ниже.
Исследование включает 10-14-дневный контрольный период, десятинедельный период лечения, состоящий в лечении повышаемыми каждые две недели дозами, и 14-дневный период отмывания с последующей итоговой оценкой исследования через 14 дней после последнего введения лекарственного средства. Исследуемое лекарственное средство вводят в нарастающих дозах, составляющих 2 мг, 5 мг, 10 мг, 20 мг и 50 мг дважды в сутки, каждую в течение двухнедельного периода (см. график исследования ниже). Оптимальная терапевтическая доза зависит от тяжести и восприимчивости лежащего в основе патологического состояния.
Популяция: задействуемая в исследовании популяция состоит из пациентов мужского и женского пола с эндогенным гиперкортиколизмом вследствие повышенной выработки АСТН [адренокортикотропный гормон] из гипофиза (болезнь Кушинга). Возраст пациентов мужского или женского пола 18-75 лет. Пациенты страдают подтвержденной болезнью Кушинга, о наличии которой свидетельствуют:
1) свободный кортизол в моче (СКМ) превышает верхнюю границу нормы (ВГН) более чем в 1, 5 раза (среднее значение по трем 24-часовым образцам мочи, собранным в пределах 14 суток);
2) утренний уровень АСТН в плазме свыше 10 пг/мл.
Для удовлетворения данным критериям участия пациентам разрешают осуществить отмывание от текущей лекарственной терапии, если известно, что у них диагностирована болезнь Кушинга.
Терапия: пациенты начинают с дозы дигидрофосфата 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила, составляющей 2 мг дважды в сутки, и наращивают свою дозу каждые две недели. Оптимальную терапевтическую дозу определяют по эффекту лечения и переносимости воздействия.
Оценка эффективности/фармакодинамики: оценки эффективности включают свободный кортизол в моче, АСТН в плазме, кортизол и ренин, альдостерон в плазме и в моче, натрий и калий в плазме и в моче, кортизол и альдостерон в слюне и инсулин в плазме.
Оценка безопасности: оценка безопасности включает объективные обследования, ЭКГ (электрокардиограммы), показатели жизнедеятельности, стандартные клинические лабораторные исследования (гематология, биохимический анализ крови, анализ мочи) побочные явления и мониторинг существенных побочных эффектов.
Анализ данных: первичный показатель эффективности определяют как долю демонстрирующих реакцию на дигидрофосфат 4-[(5R)-6,7-дигидро-5Н-пирроло[1,2-с]имидазол-5-ил]-3-фторбензонитрила. Считается, что пациент демонстрирует реакцию, если средний уровень СКМ в 24-часовых образцах мочи десятой недели не превышает ВГН. Пациенты, прервавшие лечение по связанной с заболеванием или лечением причине (например, смерть, побочное явление, клиническое развитие заболевания и т.п.), или те, чьи средние уровни СКМ в 24-часовых образцах мочи десятой недели выше предела нормы, считаются не проявляющими реакцию. Те пациенты, для которых наличествует лишь одно 24-часовое измерение СКМ в контрольный период или после него, не включаются в анализы первичной эффективности.