Исследование влияния некоторых факторов на каллусообразование у мелиссы ( Melissa offi с inalis L. ) в культуре in vitro

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

39

УДК 633.81:57.085.2 О.В. Якимова, Н.А. Егорова

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НЕКОТОРЫХ ФАКТОРОВ НА КАЛЛУСООБРАЗОВАНИЕ У МЕЛИССЫ (MELISSA OFFIdNALIS L.) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

Исследована роль некоторых факторов в процессе индукции каллусогенеза у мелиссы лекарственной (Melissa officinalis L.). Подобраны режимы получения асептической культуры из различных типов эксплантов (семян, сегментов листа, стебля и черешка). Выявлены особенности влияния гормонального состава питательной среды, условий получения донорного растения и типа экспланта на образование каллуса в культуре in vitro. Показано, что максимальная частота индукции каллуса (до 70-93 % в зависимости от типа экспланта), обладающего хорошим приростом, была при использовании среды Мурасиге и Скуга с добавлением 1,0 мг/л НУК (или 2,4-Д) и 0,5 мг/л БАП. Более интенсивное каллусообразование на большинстве испытанных питательных сред наблюдалось при использовании сегментов черешка и листа по сравнению со стеблевыми эксплантами. Установлено, что для эксплантов растений, полученных in vitro, в большинстве вариантов опыта показатели каллусообразо-вания были в 2-2,5 раза выше, чем у эксплантов, выделенных из растений in situ.

Ключевые слова: Melissa officinalis L., каллусогенез, эксплант, in vitro.

Мелисса лекарственная (Melissa officinalis L.) является ценным эфиромасличным, лекарственным и пряно-ароматическим растением, возделываемым во многих странах мира - России, Украине, Болгарии, Италии, Сирии, Иране и других [1]. Это растение широко используется в медицине при лечении неврозов, ишемической болезни сердца, артериальной гипертензии, иммунодефицита, желудочно-кишечных и других заболеваний [2; 3]. Мелисса выращивается чаще как лекарственное растение, так как содержание эфирного масла в сырье невелико (0,02-0,30 % в пересчете на сухой вес) и его получение затруднено вследствие частичной растворимости в дистилляте [3; 4]. В связи с этим в Институте сельского хозяйства Крыма ведутся исследования по селекции M. officinalis с целью получения высокомасличных и высокопродуктивных генотипов [5]. Для проведения селекционных работ на современном уровне весьма эффективно привлечение биотехнологических методов, которые позволяют создавать новый исходный селекционный материал, применяемый при выведении сортов с повышенной урожайностью, качеством продукции и устойчивостью к абиотическим и биотическим стрессам. Достаточно распространенными клеточными технологиями, позволяющими расширить генетическое разнообразие, являются использование сомаклональной изменчивости, клеточная селекция и мутагенез in vitro [6]. Однако для разработки таких биотехнологических методов прежде всего необходимо подобрать условия для получения каллусных тканей.

Клеточные технологии создания исходного селекционного материала для мелиссы практически не разработаны. В литературе встречаются отдельные данные по культуре изолированных тканей и органов M. officinalis [7-9]. В основном это исследования, касающиеся клонального микроразмножения в культуре меристем или сегментов стебля с узлом [10-12] или использования культивируемых органов для получения эфирного масла [4]. В большинстве анализируемых работ почти не затрагивались вопросы индукции каллусных тканей или влияния различных факторов на их развитие. В задачи нашего исследования входили отработка условий стерилизации эксплантов и изучение влияния некоторых факторов (состава питательной среды, типа экспланта, условий получения донорного растения) на индукцию каллусогенеза у мелиссы.

Материалы и методы исследований

Материалом для исследований служили растения мелиссы лекарственной (Melissa officinalis L.) сорта «Цитронелла». В качестве эксплантов использовали семена, сегменты стебля, листа и черешка листа размером 5-6 мм. Экспланты вычленяли из проростков, полученных из семян in vitro (растения in vitro), и из растений закрытого грунта (растения in situ). Стерилизацию растительного материала проводили с применением 70 %-го этанола и 50 %-го раствора препарата «Брадофен» в различных сочетаниях и экспозициях. Работу в асептических условиях осуществляли согласно стандартным методикам [13]. Экспланты культивировали на нескольких модификациях питательной среды Мурасиге и Скуга (МС) с добавлением регуляторов роста растений различного типа действия - 2,4-Д, ИУК,

2014. Вып. 4

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

НУК, БАП, кинетин (кин), гибберелловая кислота (ГК). Культивирование проводили в пробирках в культуральной комнате при температуре 26 °С, относительной влажности воздуха 70 % и освещенности 2-3 тысячи люкс с фотопериодом 16 часов. Через 30-40 суток определяли частоту каллусогенеза в процентах и прирост каллуса в баллах. При этом 1 балл соответствовал массе каллуса 150-250 мг, 2 балла - 300-400 мг, 3 балла - более 450 мг. В каждом варианте опыта анализировали не менее 20-ти эксплантов, повторность опыта 2-3 кратная. Статистическую обработку данных проводили согласно общепринятым методам [14].

Результаты и их обсуждение

Важным условием для успешного культивирования изолированных тканей и органов in vitro является получение асептической культуры из исходного растительного материала [6; 7]. Для стерилизации различных типов эксплантов (листьев, стеблей, черешков листа, семян) мелиссы было испытано 8 режимов. Установлено, что для сегментов листа, стебля и черешка максимальная частота асептических эксплантов (90 %) была получена при последовательном использовании 70 %-го этанола (1 мин) и 50 %-го «Брадофена» (4 мин). Для стерилизации семян лучший результат (95 % асептических эксплантов) был при обработке 70 % этанолом в течение 1 мин и 50 % «Брадофеном» в течение 4 мин.

При анализе культивируемых эксплантов было установлено, что на 14 сутки на большинстве сред начиналась индукция каллусной ткани. Каллус, полученный из разных типов эксплантов, отличался по морфологическим характеристикам (рис. 1). Из сегментов стебля обычно формировался плотный бежевый, иногда с белыми вкраплениями каллус. Каллусная ткань, развивающаяся из экс-плантов черешка и листа, также была довольно плотной и имела зеленую либо светло-зеленую с бежевыми участками окраску. Морфологическая характеристика каллуса мелиссы не зависела от испытанных нами вариантов питательной среды МС.

Рис. 1. Каллус, полученный из эксплантов листа (А) и стебля (Б) мелиссы лекарственной в культуре

in vitro

Изучено влияние гормонального состава питательной среды на процесс индукции каллусогенеза. При проведении эксперимента было проанализировано 16 вариантов среды МС, дополненной ауксинами, цитокининами и ГК, большая часть из которых представлена на рис. 2. На безгормональной питательной среде, а также при введении в состав среды только ауксинов (НУК, ИУК, 2,4-Д) или цитокини-нов (БАП, кинетин) не наблюдали индукции каллусогенеза или отмечали начало образования каллуса с частотой до 5-17 %. Как видно из полученных данных, лучшие результаты были при использовании ауксинов в сочетании с цитокининами. Максимальная частота индукции каллуса (до 69,8-92,9 % в зависимости от типа экспланта) была на средах МС6, МС15, МС16, которые содержали в качестве регуляторов роста ИУК, НУК, 2,4-Д и БАП. При анализе прироста формирующегося каллуса отмечено, что лучшая его пролиферация (до 1,5 балла) была на средах МС6 и МС15, содержащих 1,0 мг/л НУК или 2,4-Д и 0,5 мг/л БАП. На отдельных вариантах сред (МС3, МС5, МС9, МС11, МС14, МС22) наблюдали

индукцию каллусогенеза, однако каллус был небольшого размера (0,1-0,5 балла) и в дальнейшем почти не развивался.

Полученные нами данные отличаются от результатов работы греческих исследователей, которые максимальную частоту образования каллуса (65 %) у мелиссы отмечали на среде МС с 2 мг/л НУК [10]. Наряду с этим H. Meftahizade и соавторы [9] сообщали о целесообразности использования для индукции каллуса в составе среды двух ауксинов и одного цитокинина. В этих исследованиях максимальная частота каллусогенеза (до 80 % из эксплантов гипокотиля) была достигнута на среде МС, дополненной 1 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л НУК и 0,5 мг/л кинетина. В другой работе [8] при получении каллуса из междоузлия и листа мелиссы указывалось на эффективность использования в среде МС 0,5-2,0 мг/л 2,4-Д и 1 мг/л БАП.

100

(U К

о о

>у

ч ч

се W се H О H о св

60

40

20

I лист  стебель И черешок

МС1 МС9 МС10 МС11 МС4 МС3 МС5 МС12 МС6 МС13 МС14 МС15 МС16 МС22

ч

се ю

се о

ч «

H о о ft s

£

2,5 2 1,5 1

0,5 0

МС1 МС9 МС10 МС11 МС4 МС3 МС5 МС12 МС6 МС13 МС14 МС15 МС16 МС22

0

Питательная среда

Рис. 2. Влияние гормонального состава питательной среды и типа экспланта на частоту индукции каллусогенеза (вверху) и прирост каллуса (внизу) у мелиссы. Концентрации гормонов в составе питательной среды МС (мг/л): МС1 - без гормонов; МС9 - НУК (1,0); МС10 -2,4-Д (1,0); МС11 - ИУК (1,0); МС 4 - кин (1,0); МС3 - БАП (1,0); МС5 - БАП (1,0), ГК (0,5), ИУК (0,5); МС 12 -ИУК (1,0), БАП (0,5); МС6 - НУК (1,0), БАП (0,5); МС13 - НУК (1,0), кин (0,5); МС14 - НУК (2,0), кин (0,5); МС15 - 2,4-Д (1,0), БАП (0,5); МС16 - НУК (1,0), ИУК (1,0), БАП (0,5); МС22 - 2,4-Д (1,0), кин (0,5).

Установлено, что на индукцию каллусогенеза у мелиссы оказывал влияние тип экспланта. Была проанализирована способность к индукции каллуса при культивировании на разных питательных средах сегментов листа, стебля и черешка (рис. 2). Лучшие показатели каллусообразования на большинстве испытанных питательных сред были отмечены при использовании в качестве эксплантов сегментов черешка и листа, у которых частота образования каллуса и его прирост были в 1,5 раза выше, чем из стебля. В то же время румынские исследователи [8] более интенсивную пролиферацию

2014. Вып. 4

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

каллуса мелиссы наблюдали при использовании сегментов стебля по сравнению с эксплантами листа и корня.

Исследовано влияние на формирование каллуса из трех типов эксплантов условий получения донорных растений, в качестве которых использовали растения, выращенные в теплице, а также пробирочные растения, полученные из семян in vitro. Из представленных данных видно, что для эксплантов растений, полученных in vitro, на большинстве испытанных питательных сред показатели каллусообразования были в 2-2,5 раза выше, чем у эксплантов, выделенных из растений in situ (см. табл.). На среде МС10 у всех типов эксплантов из растений закрытого грунта не отмечено образования каллуса, тогда как у эксплантов из растений in vitro наблюдали начало каллусогенеза. В то же время на среде МС15 из сегментов листа и стебля, наоборот, при использовании в качестве донорных растений in vitro частота образования каллуса и его прирост были в 1,2-2,5 раза ниже, чем у таковых, полученных in situ. Для ряда видов эфиромасличных растений, в том числе и мелиссы, в качестве эксплантов исследователи часто использовали различные органы проростков, развившихся из семян in vitro [8; 15; 16]. Получение исходного растительного материала из проростков in vitro более удобно и доступно круглый год, а кроме того, в некоторых случаях способствует лучшей индукции каллусо-генеза и морфогенеза по сравнению с растениями, выращиваемыми в обычных условиях, что может быть обусловлено разным уровнем эндогенных фитогормонов.

Таблица

Влияние условий получения донорного растения, состава питательной среды и типа экспланта

на индукцию каллусогенеза у Melissa officinalis

№ питательной среды* Тип экспланта Растения in situ Растения in vitro

частота образования каллуса, % прирост каллуса, балл частота образования каллуса, % прирост каллуса, балл

МС5 лист 25,0 ± 4,5 0,15 ± 0,03 26,5 ± 6,5 0,15 ± 0,05

стебель 21,0 ± 7,0 0,86 ± 0,07 55,0 ± 5,0 1,04 ± 0,12

черешок 45,0 ± 5,0 0,55 ± 0,05 65,0 ± 5,0 0,78 ± 0,09

МС6 лист 46,4 ± 3,5 1,35 ± 0,04 80,0 ± 10,0 1,05 ± 0,04

стебель 25,0± 2,0 1,04 ±0,17 85,0 ± 5,0 1,46 ± 0,03

черешок 71,5 ± 10,2 1,05± 0,03 85,0 ± 5,0 1,04 ± 0,17

МС10 лист 0 - 20,6 ± 9,5 0,25 ± 0,05

стебель 0 - 50,0 ± 10,0 0,15 ± 0,03

черешок 0 - 25,0 ± 5,0 0,25 ± 0,03

МС15 лист 69,8 ± 8,4 1,47 ± 0,06 25,0 ± 5,0 0,90 ± 0,01

стебель 23,5 ± 3,5 1,82 ± 0,13 9,5 ± 0,5 0,75 ± 0,25

черешок 52,8 ± 5,5 1,86 ± 0,05 50,0 ± 8,2 0,94 ± 0,11

Примечание. *Состав питательных сред см. на рис. 2

Заключение

В результате исследований установлены оптимальные режимы получения асептической культуры из различных типов эксплантов Melissa officinalis. Выявлено влияние условий получения донор-ного растения, гормонального состава питательной среды и типа экспланта (лист, стебель, черешок) на индукцию каллусогенеза. Максимальная частота образования каллуса с хорошим приростом была при использовании среды МС с добавлением 1,0 мг/л НУК (или 2,4-Д) и 0,5мг/л БАП. Более интенсивное каллусообразование на большинстве питательных сред наблюдали при использовании сегментов черешка и листа по сравнению со стеблевыми эксплантами.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Назаренко Л.Г., Афонин А.В. Эфироносы Украины. Симферополь: Таврия, 2008. 144 с.

2. Дудченко Л. Ароматы здоровья. Киев: Глобус, 1997. 152 с.

3. Moradkhani H., Sargsyan E., Bibak H., Naseri B., Sadat-Hosseini M., Fayazi-Barjin A., Meftahizade H. Melissa officinalis L., a valuable medicine plant: A review // J. of Medicinal Plants Research. 2010. Vol. 4, N 25. P. 2753-2759.

4. Sato A., Dasilva S., Celso L.S.L., Rosane A.S.S.G., Maria A.E. Essential Oil Composition of Melissa officinalis L. in vitro Produced under the Influence of Growth Regulators // J. Braz. Chem. 2005. N 16. P. 1387-1390.

5. Невкрытая Н.В., Скопинцева Н.К., Черняк М.С. Сравнительная характеристика перспективных сортообраз-цов Melissa officinalis L. // Виноградарство и виноделие. 2012. № 1. С. 22-24.

6. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с.

7. Лешина Г.Л., Булко О.В., Дорошенко В.А., Галкин А.П. Оптимизация условий культивирования in vitro ряда лекарственных растений // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: тез. докл. 9 Междунар. конф. М., 2008. С. 224 -225.

8. Gogu I. Ghiorghita, Maftei D.E.St, Nicuta D.N. Investigations on the in vitro morphogenetic reaction of Melissa officinalis L. species // Anal. stiintifice ale Universitatii „Alexandra loan Cuza", Genetica si Biologie Moleculara. 2005. Vol. 5. P. 119-126.

9. Meftahizade H., Lotfi M., Moradkhani H. Optimization of micropropagation and establishment of cell suspension culture in Melissa officinalis L. // African J. of Biotechnology. 2010. Vol. 9, N 28. P. 4314-4321.

10. Gale§ R., Ana Preotu, Toma С. Aspects of floral structure and morphogenesis in Melissa officinalis // Biology vegetable. 2010. N 2. P.15-17.

11. Meftahizade H., Moradkhani H., Naseri B., Lofti M., Naseri A. Improved in vitro culture and micropropagation of different Melissa officinalis L. genotypes // J. of Medicinal Plants Research. 2010. Vol. 4, N 3. P. 240-246.

12. Tavares A.C., Pimenta M.C., Gonsalves M.T. Micropropagation of Melissa officinalis L. through proliferation of axilary shoots // Plant Cell Repts. 1986. Vol. 15, N 6. P. 441-444.

13. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук Е.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наук. Думка, 1980. 488 с.

14. Лакин Г.Ф. Биометрия: уч. пособие. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

15. Егорова Н.А. Некоторые аспекты биотехнологии эфиромасличных растений: индукция каллюсо- и морфогенеза, использование сомаклональной вариабельности // Физиология растений и генетика. 2014. Т. 46, № 2. С. 108-120.

16. Iola-Boldura O.M., Radu F., Popescu S., Borozan A. Regeneration, micropropagation, callus cultures and somatic embryogenesis of common sage (Salvia officinalis L.) // Bull. UASVM Hort. 2010. Vol. 67, N 1. Р. 308-313.

Поступила в редакцию 15.09.14

O. V. Yakimova, N.A. Yegorova

INFLUENCE OF SOME FACTORS ON THE CALLUSOGENESIS OF MELISSA OFFKINALIS L. IN VITRO

The role of some factors in the induction of callusogenesis of мelissa (Melissa officinalis L.) was investigated. The regimes of obtaining aseptic culture from different types of explants (seeds, segments of leaf, stem and petiole) have been chosen. The influence of hormonal composition of the nutrient medium as well as the influence of conditions of donor plant receiving and the explant type on callus formation in vitro has been revealed. It was shown that the maximum frequency of callus formation (up to 70-93%, depending on the explant type) with good growth was achieved by using Murashige and Skoog medium supplemented with 1.0 mg / l NAA (or 2,4-D) and 0.5 mg / l BAP. More intensive callus formation at most tested nutrient media was observed when the segments of petiole or leaf was used rather than stem explants. It was found that for the plant explants obtained in vitro the callus formation was 2-2.5 times higher than for the explants isolated from plants in situ.

Keywords: Melissa officinalis L., callusogenesis, explant, in vitro.

Якимова Ольга Валерьевна, аспирант E-mail: olyyakimova@yandex.ru

Егорова Наталья Алексеевна, доктор биологических наук, заведующая лабораторией биотехнологии E-mail: yegorova.na@mail.ru

Институт сельского хозяйства Крыма

295493, Россия, г. Симферополь, ул. Киевская, 150

Yakimova O.V., postgraduate student E-mail: olyyakimova@yandex.ru

Yegorova N.A.,

Doctor of Biology, Head of laboratory

of biotechnology

E-mail: yegorova.na@mail.ru

Institute of Agriculture of the Crimea Kievskaya st., 150, Simferopol, Russia, 295493