Устройство для культивирования клеток млекопитающих на тканеинженерных конструкциях с изменяемыми условиями культивирования
APPARATUS FOR CULTURING CELLS OF MAMMALS ON FABRIC ENGINEERING STRUCTURES WITH VARIABLE CULTIVATION CONDITIONS

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к устройствам для выращивания клеток млекопитающих, и может найти применение в биотехнологии, фармакологии и тканевой инженерии.
Физиологические условия для роста и пролиферации культивируемых клеток создает для них постоянная циркуляция жидкости в области образца /Wang, L., Hu, Н., Yang, J., Wang, F., Kaisermayer, С., & Zhou, P. High yield of human monoclonal antibody produced by stably transfected Drosophila Schneider 2 cells in perfusion culture using wave bioreactor. Molecular biotechnology, vol. 52 no. 2, pp. 170-179. 2012/. Специальные устройства - биореакторы, и обеспечивают циркуляцию питательной среды и создание условий для роста клеток приближенных к живому организму /М. Sladkova and G. de Peppo, "Bioreactor Systems for Human Bone Tissue Engineering," Processes, vol. 2, no. 2, pp. 494-525, Jun. 2014/.
В результате проведенного патентно-информационного поиска были выявлены два основных аналога предлагаемого устройства.
Биореактор 3DKUBE, производимый компанией Biotek, США, представляет собой камеру кубической формы, из прозрачного пластика, внутри которого расположена круглая полость, куда помещается тканеинженерная конструкция с клетками. По противоположным концам камеры присоединены трубки, одна из которых соединяется со шприцом, заполненным питательной средой, а другая со стерильным полиэтиленовым мешочком для слива питательной среды. Прозрачность камеры позволяет осуществлять световую микроскопию образцов, находящихся внутри устройства /1,2/.
Важными недостатками данного устройства для культивирования клеток являются необходимость наличия инфузоматора, для обеспечения работы устройства, и невозможность изменения газового состава среды, а
также отсутствие рециркуляции питательной среды, которая протекает насквозь и сливается в мешочек. Данные недостатки существенно ограничивают использование данного устройства.
Ближайшим аналогом устройства является биореакторная система U-CUP, производимая в Швейцарии, представляет из себя две пластиковые, прозрачные трубки, соединенные по типу сообщающихся сосудов, которые заполняются питательной средой. В одной трубке закрепляется тканеинжерная конструкция, а другая трубка соединяется со шприцом посредством силиконовой трубки, шприц заполнен воздухом и устанавливается в инфузоматор с двунаправленным ходом. Трубка подвешивается внутрь инкубатора на специальной подставке. Движение среды осуществляется за счет изгнания и всасывания воздуха шприцом в одной из трубок /3,4/.
Известное устройство работает лишь с тканеинженерными контрукциями, размер и форма которых определена трубкой, а для обеспечения работы необходим отдельный клеточный инкубатор и инфузоматор. Так же конструкция данного биорекатора не предусматривает возможность оценки тканеинженерной конструкции с помощью инвертированого светового микроскопа. Конструкция данного биореактора не предусматривает возможности мультиклеточного культивирования и создания на его основе системы «орган на чипе». Совокупность данных недостатков может вызвать затруднение при работе с 3D культурами с помощью данного устройства, ограничивает спектр применения, что, в свою очередь, негативно сказывается на качестве работы и проводимых исследований с помощью данного биореактора.
Технической проблемой, решаемой данным изобретением, является создание биореактора, позволяющего культивировать клетки млекопитающих в условиях 3D-культивирования, которые бы приближали метаболизм, пролиферацию и поведение клеток к таковому в живом организме, с возможностью изменения условий роста клеточных культур и
визуального наблюдения за клеточными культурами в реальном времени. Так же устройство должно позволять регулировать состав газовой среды, скорость движения жидкости и температуру, и осуществлять контроль над культурой с помощью инвертированного светового микроскопа или визуальным методом.
Сущность изобретения заключается в том, что устройство для культивирования клеток млекопитающих на тканеинженерных конструкциях, включает герметичный пластиковый корпус с крышкой, на которой установлен жидкокристаллический дисплей, а внутри корпуса -перистальтический насос, связанный с микропроцессором, который, в свою очередь, связан с жидкокристаллическим дисплеем и выключателем, расположенным на передней стенке корпуса и соединяющийся с USB выходом снаружи корпуса, который предназначен для соединения с компьютером или источником питания, при этом микропроцессор также соединен с электромагнитным клапаном, расположенным на части трубки поступления углекислого газа, расположенной внутри корпуса, от передней до задней стенки, которая, выходя из корпуса, соединяет его с прямоугольной прозрачной камерой биореактора, с расположенным внутри последнего датчика концентрации углекислого газа под герметичной крышкой, который так же связан с микропроцессором, при этом входная и выходная трубки, с установленными на них стыковочными клапанами, соединяют нижние части соответствующих торцев биореактора в продольном направлении с перистальтическим насосом.
Изобретение представлено на фиг. 1 - общий вид в разрезе.
Устройство для культивирования клеток млекопитающих на тканеинженерных конструкциях состоит из герметичного пластикового корпуса 1 с крышкой, на которой расположен ЖК-дисплей 9, а внутри корпуса установлен перистальтический насос 10, связанный с микропроцессором 13, который, в свою очередь, связан с выключателем 4, расположенным на передней стенке корпуса и соединяющийся с USB выходом 5 снаружи корпуса. Микропроцессор 13 так же соединен с электромагнитным клапаном 11, расположенным на части трубки поступления углекислого газа 3, которая проходит внутри корпуса от передней до задней стенки и, выходя из корпуса, соединяет его с прямоугольной прозрачной камерой биореактора 2 с герметичной крышкой. Входная трубка 6 и выходная трубка 7, с установленными на них стыковочными клапанами 8, соединяют перистальтический насос 10 с биореактором 2. Внутри биореактора 2 установлен датчик концентрации углекислого газа 12, работающий от микропроцессора 13.
Работа устройства осуществляется следующим образом. В стерильную камеру биореактора 2 устанавливается подложка, с закрепленной на ней тканеинженерной конструкцией, заселенной клетками. После чего камера биореактора заполняется питательной средой, так, что бы питательная среда полностью покрывала тканеинженерную конструкцию. Затем все устройство стерилизуется снаружи, и помещается в условия клеточного инкубатора (37°С). После чего устройство подсоединяется к трубке поступления углекислого газа 3, а с помощью компьютера, подключающегося через USB, устанавливается необходимая концентрация углекислого газа, уровень которого поддерживается совместной работой датчика концентрации углекислого газа 12, микропроцессора 13 и электромагнитного клапана 11. Концентрация кислорода в камере биореактора 2 контролируется и рассчитывается косвенно. Далее, USB выход 5, соединенный с перистальтическим насосом и кнопкой включения/выключения, отключается от компьютера и подключается к электрической сети или портативному источнику питания, обеспечивая работу устройства. Включаем устройство с помощью кнопки включения/выключения 4. Дальнейшая циркуляция жидкости обеспечивается с помощью перистальтического насоса 10, находящегося в изолированном герметичном корпусе 1 с крышкой. Корпус 1 соединен с торцами камеры биореактора 2 при помощи входной 6 и выходной 7 трубок, посредством которых питательная среда циркулирует в камере. Трубки выходят от насоса 10 и соединяются продольно с торцами камеры биореактора, в их нижней части, с помощью стыковочных клапанов 8. Отсоединение трубок осуществляется при помощи перекрытия стыковочных клапанов.
2
2
Необходимость герметичности корпуса биореактора опосредована тем, что устройство с заселенными тканеинженерными конструкциями может перемещаться из СO-инкубатора в ламинарный шкаф для проведения рутинных манипуляций, или к инвертированному микроскопу, что требует сохранения стерильности его внутренней среды. В отсутствие герметичности корпуса развивается контаминация тканеинженерных конструкций с клетками бактериальных и вирусных микроорганизмов из окружающей среды, что не позволяет добиться технического результата. Выбор пластика в качестве материала корпуса влияет на технический результат, так как высокая влажность и повышенная концентрация углекислого газа в СO инкубаторе, в котором находится биореактор, создают условия для коррозии металлических изделий, в связи с чем, они не могут быть использованы.
Камера биореактора имеет размеры 10×5×3 см, что позволяет помещать ее на предметный столик инвертированного микроскопа. Средняя величина хода источника света в подобных микроскопах 5-6 см, что позволяет наблюдать за культивируемыми клетками, не извлекая образцы из камеры биореактора.
Для подтверждения эффективности 3D-культивирования заявляемого устройства для культивирования клеток млекопитающих на тканеинженерных конструкциях был проведен ряд научно-исследовательских работ с применением первичных культур дермальных крысиных фибробластов.
Адгезия и пролиферация клеточных культур, помещенных на 3D-клеточный скаффолд, анализировалась путем их трехмерного культивирования на протяжении 7 и 14 суток. Для анализа адгезии и пролиферации использовали подсчет клеток в динамике с помощью гемоцитометра (таблица 1). Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования устройства для 3D-культивирования клеток млекопитающих на тканеинженерных конструкциях. Клетки культивировались в стандартных условиях в среде DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой. Режим работы перистальтического насоса - 3 мл в минуту. Температура культивирования - 37°С, концентрация углекислоты - 5%.
Подсчет клеток производился в динамике. Перед подсчетом, скаффолд отмывался стерильным раствором IX Фосфатно-солевого буфера для удаления неадгезированных клеток. Подсчет клеток проводился с помощью гемоцитометра, после их отделения трипсином по стандартному протоколу. Результаты показывают достоверное увеличение числа клеток при 3D-культивировании при р>0,001.
Технический результат использования изобретения заключается в том, что возможно культивировать клетки млекопитающих в условиях 3D-модели, близких к физиологическим, с возможностью наблюдения за поведением клеточной культуры на тканеинженерной конструкции с помощью инвертированного светового микроскопа или визуальным методом, так как размер и форма камеры биореактора позволяют поместить его в инвертированный световой микроскоп. Ввиду того, что конструкция устройства небольшая и компактная, его можно использовать в научных целях, а не в условиях промышленного культивирования массы. Конструкция, и инженерные решения устройства позволяют использовать его как полноценную основу для создания системы «орган на чипе».
Информационные источники:
1. http://3dbiotek.com/prod_3dkube.aspx.
2. https://www.sigmaaldrich.com/labware/labware-products.html?TablePage=9572935.
3. http://www.cellecbiotek.com/pages.aspx?lang=en&id=83.
4.http://www.biovitrum.ru/product/kletochnaya_i_molekulyarnaya_biologiya/kletochnoe_kultivirovanie/3dkultivirovanie/perfuzionnyj_bioreaktor_ucup/, доступ на 22.01.2020.