ГИДРОЛИЗАТ КОЛЛАГЕНА И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
COLLAGEN HYDROLYSATE AND ITS APPLICATION

Настоящее изобретение относится к гидролизату коллагена и к его применению для лечения и/или предупреждения целлюлита.
Целлюлит представляет собой нежелательное изменение свойств кожи, которое внешне проявляется образованием углублений на поверхности кожи. Он поражает почти исключительно женщин, однако из них от 80 до 98% являются женщины старшего возраста. Прежде всего, целлюлит появляется в областях с ярко выраженной подкожной жировой тканью, т.е. на тазобедренной части, ягодицах, животе, бедрах и плечах.
Согласно уровню исследований причиной целлюлита являются определенные изменения в дерме и подкожной соединительной ткани, в частности сокращение образованных из коллагеновых волокон перегородок, которые соединяют сетчатый слой дермы с мышцами, находящимися под подкожной жировой тканью. Это приводит к общему снижению эластичности кожи.
Известные способы лечения целлюлита включают, в частности физические методы, такие как лимфодренаж, ультразвук или вакуум, но, как правило, они не приносят никакого успеха, или по меньшей мере от них нет никакого длительного результата. Местное применение косметических средств, таких как кремы или мази, также не способствует причинному лечению целлюлита, так как верхние слои эпидермиса не принимают непосредственного участия в этом явлении.
Уже известно, что положительные эффекты могут быть достигнуты в отношении здоровья кожи у людей посредством перорального приема гидролизата коллагена (см. V. Zague: "A new view concerning the effects of collagen hydrolysate intake on skin properties" in Arch. Dermatol. Res. 2008 (9) 479). За счет способности к всасыванию соразмерной низкомолекулярным пептидам коллагена и хорошего кровоснабжения кожи, там в наибольшей степени происходит накопление перорально введенного гидролизата коллагена, причем концентрация является самой высокой в пределах от примерно 12 до 24 часов после приема (см. М. Watanabe-Kamiyama et al.: "Absorption and effectiveness of orally administered low molecular weight collagen hydrolysate in rats", в J. Agric. FoodChem. 2010 (58) 835).
В свете вышеизложенного настоящее изобретение предлагает новый подход для причинного лечения и/или предупреждения целлюлита, причем этот подход состоит в применении гидролизата коллагена.
Таким образом, один аспект изобретения относится к гидролизату коллагена в качестве действующего вещества для лечения и/или предупреждения целлюлита.
В ходе клинических исследованиях действительно можно было обнаружить, что благодаря введению гидролизата коллагена заметно увеличивается эластичность кожи. Этот эффект выражен особенно ярко у женщин в возрасте старше 50 лет. Более высокая эластичность кожи означает меньшее проявление целлюлита.
Кроме того, различные эксперименты in vitro подтверждают, что синтез внеклеточных матричных белков дермальной соединительной ткани стимулируется гидролизатом коллагена. Эти, образованные из клеток кожи (дермальные фибробласты) белки включают коллаген (в особенности типа I), эластин и протеогликаны (такие как бигликан, версикан и декорин). Синтез этих белков в достаточном количестве является решающим для строения соответственно регенерации внеклеточной матрицы кожи, который в свою очередь является в значительной степени определяющим для свойств дермы, таких как эластичность, упругость и баланс влажности.
Применяемый в контексте изобретения гидролизат коллагена выгодным образом имеет относительно низкий молекулярный вес. Предпочтительно по меньшей мере 90 мас. % гидролизата коллагена имеют молекулярный вес менее чем 3.500 Да, и более предпочтительно по меньшей мере 45 мас. % молекулярный вес менее чем 1.500 Да. Оказалось, что благодаря таким, особенно низкомолекулярным долям могут быть достигнуты отчетливые эффекты. Молекулярно-весовое распределение гидролизата коллагена, которое лежит в основе соответствующих предельных значений, может быть определено очень точно и пригодным для воспроизведения, например, с помощью гель-проникающей хроматографии с использованием калибровочного стандарта из определенных фрагментов коллагена.
W
Средний молекулярный вес (среднее весовое значение M) применяемого в соответствии с изобретением гидролизата коллагена обычно находится в пределах от прибл. 1.700 до прибл. 2.300 Да.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения гидролизат коллагена охватывает по меньшей мере четыре характерные пептида с молекулярным весом от 600 до 1.200 Да. Гидролизаты коллагена содержат пептиды с различной длиной цепи, соответственно молекулярным весом, которые образуются при расщеплении белковых цепей коллагена, причем молекулярно-весовые распределения этих пептидов могут явно отличаться в зависимости от условия получения гидролизата. Неожиданным образом оказалось, что гидролизат коллагена с указанными выше свойствами оказывает особенно благоприятное влияние на синтез матричных белков, т.е. показывает явно улучшенные результаты, чем гидролизаты коллагена, которые не содержат характерные пептиды.
Наличие характерных пептидов гидролизата коллагена может быть в особенности определено с помощью масс-спектроскопии MALDI (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация), причем характерные пептиды в масс-спектре появляются в виде пиков. Предпочтительно, по меньшей мере четыре характерные пептида в определенном с помощью масс-спектроскопии MALDI молекулярно-весовом распределении имеют по меньшей мере удвоенную интенсивность, более предпочтительно по меньшей мере четырехкратную интенсивность по сравнению с их окружением.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения гидролизат коллагена включает пептид от 620 до 690 Да, пептид от 790 до 860 Да, пептид от 980 до 1.050 Да и пептид от 1.175 до 1.245 Да. Также дополнительно гидролизат коллагена может иметь характерные пептиды от 1.500 до 3.500 Да.
Предпочтительно гидролизат коллагена имеет долю гидроксипролина в 12 мас. % или более. Образованная вследствие посттрансляционного гидроксилирования пролина аминокислота гидроксипролин встречается исключительно в коллагене, так что более высокая доля гидроксипролина в гидролизате коллагена представляет собой меру для существенного отсутствия других белков соединительной ткани (например, эластин и протеогликаны), фрагменты которого в зависимости от способа получения в определенных количествах равным образом могут содержаться в гидролизатах коллагена.
Является благоприятным, если гидролизат коллагена получают посредством ферментативного гидролиза желатина. Желатин содержит денатурированный коллаген и его выделяют с помощью различных известных специалисту в данной области техники способов из соединительной ткани или из костей различных пород животных. В контексте настоящего изобретения желатин, используемый в качестве исходного вещества для гидролизата коллагена, преимущественно выделяют из кожи млекопитающих, в особенности свиней или крупного рогатого скота, однако при этом также не исключают применение желатина из сельскохозяйственной птицы. Особенно предпочтительным является свиной желатин, в особенности желатин из свиных шкур с остатками жира.
Ферментативный гидролиз желатина, как правило, осуществляют с помощью по меньшей мере одной эндопротеазы, причем в рамках изобретения предпочтительно использовать большее количество эндопротеаз (т.е. по меньшей мере две различные эндопротеазы), чтобы тем самым оказать соответствующее влияние на аминокислотный профиль полученного гидролизата коллагена и повысить положительное действие гидролизата.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения гидролизат коллагена получают посредством следующих друг за другом воздействий по меньшей мере двух эндопротеаз с различной специфичностью, в особенности по меньшей мере двух различных металлопротеаз и/или сериновых протеаз, т.е. протеаз, которые расщепляют последовательность аминокислот молекулы коллагена в каждом случае перед соответственно за определенными аминокислотами. Благоприятно металлопротеазы и/или сериновые протеазы представляют собой ферменты из микроорганизмов Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Aspergillus oryzae и Aspergillus melleus.
Благодаря выбору пригодных эндопротеаз можно не только получить характерное молекулярно-весовое распределение гидролизата коллагена, но и также оказать влияние на вид аминокислот на концах содержащихся в гидролизате пептидов. В этом отношении является, например, предпочтительным, если по меньшей мере 50% N-концевых аминокислот гидролизата коллагена являются гидрофобными аминокислотами, в особенности аланин, лейцин и изолейцин.
В соответствии с одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения гидролизат коллагена предусмотрен для энтерального введения, в особенности в виде перорального приема. При пероральном приеме более эффективным оказывается перенос гидролизата коллагена через кровообращение к месту действия, т.е. в особенности к дермальным фибробластам, чем при местном применении. К тому же для потребителя эта форма применения, как правило, связана с гораздо меньшими расходами.
Так как гидролизат коллагена получают из разрешенных пищевым законодательством исходных материалов, то в рамках настоящего изобретения он может использоваться для лечения и/или предупреждения целлюлита предпочтительно в качестве пищевой добавки. Такие биологически активные добавки могут быть обозначены как «нутрицевтики» или «нутрикосметические средства».
Биологически активная добавка может быть предложена почти в любом виде, например в виде таблеток, капсул, драже, пастилок, пакетиков или также геля или раствора (например, в отдельных ампулах или в виде напитков).
Альтернативно гидролизат коллагена также может содержаться в продуктах питания или пищевкусовых продуктах, например, в кондитерских изделиях или в быстрорастворимом порошке для приготовления напитков. Таким образом, гидролизат может употребляться потребителем без дополнительных расходов в рамках нормального питания (так называемое «функциональное питание»). В связи с этим является особенно предпочтительным, если гидролизат коллагена в основном является нейтральным на вкус.
Является благоприятным, если суточная доза гидролизата коллагена предусматривает от прибл. 2 до 3 г, более предпочтительно прибл. от 2,3 до 2,7 г гидролизата коллагена. Оказалось, что благодаря пероральному приему этого количества гидролизата уже может быть достигнут заметный эффект, который больше невозможно повысить за счет увеличения суточной дозы.
В рамках применения в соответствии с изобретением гидролизаа коллагена можно комбинировать с другими действующими веществами, оказывающими благоприятное действие на здоровье и в особенности на здоровье кожи, в том числе с действующими веществами с антиокислительным действием. Такие действующие вещества предпочтительно выбирают из витаминов, в особенности витамина С и Е, минералов, омега-3-жирных кислот, омега-6-жирных кислот, омега-9-жирных кислот, биотин, лютеин, ликопин, кофеин, глюкозамин, хондроитин, гилауроновая кислота, фолиевая кислота, аминокислоты, убихинон-10, супероксид-дисмутаза, а также растительные экстракты из плодов шиповника, лимонной вербены или зеленого чая.
В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения введение гидролизата коллагена предусмотрено для лечения и/или предупреждения целлюлита в особенности у женщин в возрасте старше 50 лет, которые большей частью находятся в постменопаузальном возрасте. В этой возрастной группе, которую, в общем, очень сильно поражает целлюлит, эффекты являются особенно явными, как было показано в дальнейшем под описанным клиническим исследованием.
Далее изобретение относится к способу лечения и/или предупреждения целлюлита у пациента, причем способ включает введение пациентам гидролизата коллагена, в особенности в виде перорального введения.
Предпочтительные варианты осуществления способа, в особенности принимая во внимание свойства гидролизата коллагена и подлежащую введению дозу, уже были пояснены в связи с применением в соответствии с изобретением.
Кроме того, изобретение также относится к применению гидролизата коллагена для лечения и/или предупреждения стрий, который в особенности появляются в виде так называемых растяжек беременных (Striae gravidarum) у беременных женщин. Причиной таких растяжек являются микротрещины в подкожной соединительной ткани по причине сильного растяжения кожи. Подобно, как и при целлюлите можно также противодействовать появлению таких трещин благодаря повышению эластичности кожи с помощью введения гидролизата коллагена.
Другой аспект изобретения относится к применению гидролизата коллагена для лечения и/или предупреждения местных повреждений кожи как следствие долгого лежания больного (Dekubitus), таких как, например, возникновение пролежней. В этом случае кожа подвергается нагрузке давлением извне, негативные последствия которой равным образом можно уменьшить за счет увеличения эластичности кожи.
Эти и другие преимущества изобретения подробнее описаны при помощи нижеследующих примеров со ссылкой на фигуры. В частности показано:
На фигурах с 1А по 1С: диаграммы, касающиеся стимулирования синтеза коллагена I типа, бигликана соответственно версикана;
На фигурах 2А и 2B: диаграммы, касающиеся повышения увлажнения кожи у бесшерстных мышей;
На фигуре 3: диаграмма, касающаяся стимулирования синтеза белков рогового конверта;
На фигурах с 4А по 4С: MALDI масс-спектры различных гидролизатов коллагена; и
На фигурах 5А и 5B: диаграммы, касающиеся стимулирования синтеза коллагена I типа, декорина и версикана. Примеры
1. Получение и свойства гидролизата коллагена
Для получения гидролизата коллагена для применения в соответствии с изобретением в качестве исходного вещества используют водный раствор желатина из свиной шкуры (тип А, от 200 до 250 г по Блуму) с концентрацией от 20 до 40 мас. % (сухое вещество). Желатин подвергают ферментативному гидролизу посредством следующего друг за другом воздействия двух различных эндопротеаз микробиологического происхождения при от 50 до 60°C в течение от 120 до 180 мин, причем в качестве первого фермента применяют эндопротеазу из Bacillus subtilis или из Bacillus amyloliquefaciens и в качестве второго фермента эндопротеазу из Bacillus licheniformis. Затем ферменты термически дезактивируют, и раствор подвергают распылительной сушке.
Молекулярно-весовое распределение полученного гидролизата коллагена может быть определено с помощью гель-проникающей хроматографии с применением следующих параметров:
неподвижная фаза
TSK 2000 SW XL (Tosoh Bioscience GmbH)
подвижная фаза
0,4 моль/л дигидрофосфата натрия рН 5,3
скорость потока
0,5 мл/мин
калибровочный стандарт
определенные фрагменты коллагена
I типа (FILK, Фрайберг)
обнаружение
УФ детектор Knauer К-2501 при 214 нм
Определение давало молекулярно-весовое распределение гидролизата коллагена в соответствии с изобретением (в дальнейшем обозначается как низкомолекулярный гидролизат) в соответствии с нижеследующей таблицей 1. Для сравнения в таблице 1 также указывается молекулярно-весовое распределение коммерчески доступного гидролизата коллагена, которое было определено с помощью того же самого метода (в дальнейшем обозначается как высокомолекулярный гидролизат):
Содержание гидроксипролина этого низкомолекулярного гидролизата составляет прибл. от 12 до 13 мас. % и может быть определено фотометрически после окисления хлорамином Т и взаимодействия с n-диметиламино-бензальдегидом. Более чем 50% N-концевых аминокислот гидролизата представляют собой гидрофобные аминокислоты, в особенности аланин, лейцин и изолейцин.
2. Клиническое исследование действенности гидролизата коллагена при целлюлите
В двойном слепом рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании проверяли действенность низкомолекулярного гидролизата, полученного в соответствии с примером 1 при лечении и/или предупреждении целлюлита. Участники исследования представляли собой 69 здоровых женщин в возрасте от 35,3 до 55,4 лет, которые были разделены на три группы с 23 участниками исследования в каждом случае. 68 участников исследования успешно завершили исследование.
За шесть недель до начала исследования не следовало применять никаких дерматологических терапевтических средств, к тому же участники исследования перед и во время исследования не должны изменять их привычный образ жизни и рацион питания, не должны принимать никаких дополнительных пищевых добавок или витаминных препаратов и не подвергать свою кожу интенсивному УФ излучению. На ладонной поверхности предплечья, на которой должны были исследовать воздействия гидролизата коллагена на свойства кожи, не следовало применять никаких косметических средств.
Из трех групп первая группа ежедневно в течение периода времени в восемь недель получала 2,5 г гидролизат коллагена (в каждом случае по утрам), вторая группа ежедневно - 5 г гидролизата коллагена (в каждом случае 2,5 г по утрам и в обеденное время) и третья - плацебо. Для перорального приема можно было гидролизат растворить в воде или в холодном напитке (за исключением молока).
Перед первым приемом, через четыре недели и через восемь недель измеряли следующие параметры кожи на ладонной стороне левого плеча участников исследования:
- эластичность кожи с помощью Cutometer SEM 575
(в каждом случае среднее значение из трех измерений)
- чрескожная потеря воды (TEWL) с помощью прибора DermaLab
(в каждом случае среднее значение из трех измерений)
- влажность кожи с помощью Corneometer СМ 825
(в каждом случае среднее значение из десяти измерений)
Все измерения осуществляли после 30-минутной акклиматизаций в камере с кондиционированным воздухом при температуре в 21,5°C (±1°C) и относительной влажности воздуха в 50% (±5%).
Все три параметра были существенно повышены в группах, которые проходили лечение гидролизатом коллагена, как через четыре, так и через восемь недель. Измеренные через восемь недель значения приведены в нижеследующей таблице 2, а именно как процентное повышение по сравнению с группой, получавшей плацебо:
В особенности повышение эластичности кожи подтверждает действенность перорального применения гидролизата коллагена для лечения и/или предупреждения целлюлита. Улучшение TEWL и влажность кожи представляют другие благоприятные эффекты гидролизата на здоровье кожи и в особенности приводят к повышению эпидермальной защитной функции.
В дифференцированном по возрастным группам наблюдении повышения эластичности кожи получили представленный в таблице 3 результат, причем сопоставляли женщин младше 50 лет (средний возраст 44,1 года) и женщин старше 50 лет (средний возраст 53,0 года):
Примечательным является особенно явное улучшение эластичности кожие у женщин в возрасте старше 50 лет, которые тем самым представляют собой предпочтительную целевую группу для применения гидролизата коллагена в соответствии с изобретением.
Эластичность кожи измеряли еще раз через четыре недели после окончания восьминедельного периода применения. При этом были получены еще примерно от 92 до 98% измеренных через восемь недель повышений, что указывает на более длительное действие гидролизата коллагена.
3. Стимулирование синтеза внеклеточных матричных белков in vitro
Стимулирование синтеза коллагена (тип I), а также протеогликанов бигликан и версикан исследовали in vitro на дермальных фибробластах человека (клетки кожи). Для этого клетки инкубировали в течение 24 часов каждый раз с 0,5 мг/мл низкомолекулярного соответственно высокомолекулярного гидролизата и затем определяли экспрессию РНК коллагена, РНК бигликана и РНК версикана с помощью ПЦР в реальном времени и представляли в полуколичественной форме (в пересчете на контроль без гидролизата).
Результаты представлены в виде столбиковых диаграмм для коллагена типа I на фигуре 1А, для бигликана на фигуре 1B и для версикана на фигуре 1С, причем диаграммы каждый раз показывают среднее значение из по меньшей мере 18 измерений. На абсциссе представлена экспрессия РНК относительно контроля (=1). Левый заполненный столбик каждый раз означает контроль, средний заштрихованный столбик означает высокомолекулярный гидролизат и правый столбик в точку означает низкомолекулярный гидролизат.
Оказалось, что синтез всех трех матричных белков стимулируется обоими гидролизатами коллагена, причем положительный эффект низкомолекулярного гидролизата каждый раз выражается сильнее, чем положительный эффект высокомолекулярного гидролизата. У коллагена, который наряду с эластином несет главную ответственность за упругость и эластичность кожи, а также у версикана, который имеет важное значение для баланса влажности кожи, усиленный эффект низкомолекулярного гидролизата оказывается особенно отчетливым.
Эти стимулирующие свойства гидролизата коллагена на различные матричные белки наряду с лечением и/или предупреждением целлюлита в соответствии с изобретением также предлагают отправную точку при заболеваниях, таких как, например, чешуйчатый лишай (псориаз), при которых нарушается естественная функциональность кожи.
4. Повышение содержания влаги в экспериментах на животных
Влияние гидролизата коллагена на влажность кожи непосредственно исследовали на бесшерстных мышах. Бесшерстные мыши представляют собой общепризнанную систему модели, которую часто используют в дерматологических целях, и полученные из этого результаты, в принципе могут быть применимы к коже человека (см., например, Т. Fujimura et al.; J. Dermatol. Sci. 2000 (24) 105-111 and Y. Nishimori et al.; J. Invest. Dermatol. 2001 (117) 1458-1463).
2
Животных ежедневно кормили в течение промежутка времени в три недели 150 мкг гидролизата коллагена на кг массы тела, контрольная группа вместо этого получала БСА. Одновременно все животные получали еженедельную дозу УФ-Б излучения 18 мДж/см поверхности кожи, вследствие чего оказывается негативное влияние на влажность кожи.
Содержание влаги в коже измеряли через одну неделю и через три недели с помощью корнеометра СМ 825 (производитель: Courage & Khazaka). При этом принцип измерения основывается на изменении способности измерительного конденсатора посредством диэлектрической проницаемости воды, связанной в верхних слоях кожи, которая явно отличается от диэлектрической проницаемости большинства других веществ.
Результаты представлены в виде столбиковых диаграмм для измерения через неделю на фигуре 2А и для измерения через три недели на фигуре 2B, причем диаграммы каждый раз показывают среднее значение и нормированную ошибку 7 измерений. На абсциссе представлена влажность кожи относительно контроля (=1). Левый заполненный столбик каждый раз означает контроль, средний заштрихованный столбик означает высокомолекулярный гидролизат и правый столбик в точку означает низкомолекулярный гидролизат.
Оказывается, что повышение влажности кожи под влиянием низкомолекулярного гидролизата как через неделю, так и через три недели каждый раз усиливается, нежели под влиянием высокомолекулярного гидролизата.
5. Стимулирование синтеза белков рогового конверта in vitro
Так называемые белки «рогового конверта» играют важную роль важную роль для защитной функции кожи против проникновения патогенных микроорганизмов и токсических веществ. Синтез белков рогового конверта инволюкрина, лорикрина и филаггрина определяли у бесшерстных мышей, которых перед этим в течение пяти недель ежедневно кормили 150 мкг гидролизата коллагена на кг массы тела (как описано выше). Количественное выражение белков относительно контрольной группы (кормление посредством БСА) осуществляли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS) и вестерн-блоттинга со специфическими антителами после извлечения белков из кожи.
Результаты представлены в виде столбиковой диаграммы на фигуре 3, причем диаграмма каждый раз показывает среднее значение и нормированную ошибку из 7 измерений. На абсциссе представлено количество белков рогового конверта после кормления низкомолекулярным гидролизатом относительно контроля (=1). Левый столбик означает инволюкрин, средний столбик означает лорикрин и правый столбик означает филаггрин.
Оказалось, что синтез всех трех исследуемых белков рогового конверта стимулируется посредством перорального применения гидролизата коллагена, применяемого в соответствии с изобретением, в случае инволюкрина даже более чем в троекратном количестве.
6. Анализ молекулярно-весового распределения с помощью МС MALDI
Полученный в соответствии с примером 1 низкомолекулярный гидролизат коллагена в соответствии с изобретением, который имеет средний молекулярный вес в прибл. 2.000 Да (в дальнейшем гидролизат А), был противопоставлен двум коммерчески доступным гидролизатам коллагена со средним молекулярным весом в прибл. 2.100 Да (в дальнейшем гидролизат В) и прибл. 2.900 Да (в дальнейшем гидролизат С).
Точные молекулярно-весовые распределения этих трех гидролизатов были проанализированы с помощью масс-спектроскопии MALDI (МС MALDI). Для этого образцы в 0,1%-ой трифторуксусной кислоте устанавливали до конечной концентрации в 10 мкг/мкл и затем очищали с применением μС18-материала. Образцы препарировали с матрицей НССА на мишени MALDI, и масс-спектры определяли с применением масс-спектрометра Ultraflex-III-TOF/TOF (производитель: Bruker Daltonics).
Фигуры с 4А по 4С показывают соответствующие масс-спектры соответственно молекулярно-весовые распределения гидролизатов коллагена А, В соответственно С, причем на ординате представлен молекулярный вес соответственно массовое число и на абсциссе - интенсивность. Сравнение трех спектров показывает, что гидролизат А в соответствии с изобретением содержит следующие характерные пептиды согласно таблице 2, причем соответствующие пики имеют от двукратную до четырехкратную интенсивность по сравнению с их средой:
В частности, четыре пептида между 600 и 1.500 Да не имеют никаких соответствий у обоих коммерческих гидролизатов В и С, и таким образом являются особенно характерными для гидролизата А.
7. Стимулирование синтеза внеклеточных матричных белков in vitro
Стимулирование синтеза коллагена (тип I), а также протеогликанов декорин и версикан исследовали in vitro на дермальных фибробластах человека (клетки кожи). Для этого клетки в течение 24 часов инкубировали каждый раз с 0,5 мг/мл гидролизатов А, В соответственно С и затем определяли экспрессию РНК коллагена, РНК декорина и РНК версикана с помощью ПЦР в реальном времени и представляли в полуколичественной форме. Декорин имеет важное значение для образования коллагеновых волокон в коже.
Результаты представлены в виде столбиковой диаграммы для гидролизата В на фигуре 5А и для гидролизата С на фигуре 5B, причем на абсциссе каждый раз нанесена экспрессия РНК у коммерческих гидролизатов В соответственно С относительно экспрессии РНК у гидролизата А (=1) в соответствии с изобретением. Левый столбик в каждом случае означает коллаген типа-I, средний столбик означает декорин и правый столбик означает версикан. В каждом случае представлено среднее значение из по меньшей мере 7 измерений, а также нормированных ошибок.
Удивительным образом данные показывают, что у всех трех матричных белков по сравнению с гидролизатом А происходит явно более низкое стимулирование синтеза РНК посредством обоих гидролизатов В и С, средний молекулярный вес которых является только незначительно выше. Таким образом, типичные пептиды гидролизата А видимо играют решающую роль для их благоприятного действия.
Таким образом, характерные пептиды гидролизата А по-видимому имею решающее значение для его благоприятного действия.
8. Примерные рецептуры для биологически активных (пищевых) добавок и косметических средств
В дальнейшем указаны некоторые примерные рецептуры для применения гидролизата коллагена в соответствии с изобретением, которые само собой разумеется, могут быть изменены различным образом:
Капсетты (биологически активная добавка)
глицерин
53,67 мас. %
гидролизат коллагена
21,95 мас. %
желатин
10,08 мас. %
гуаровая камедь
6,00 мас. %
лецитин
5,00 мас. %
лимонная кислота
2,00 мас. %
ароматизатор (черн. смородина)
0,50 мас. %
апельсиновое масло
0,50 мас. %
ацесульфам-K
0,30 мас. %
Шоколад
тертое какао
51,0 мас. %
сахароза
22,4 мас. %
масло какао
16,6 мас. %
гидролизат коллагена
10,0 мас. %
Напиток
вода
63,00 мас. %
концентрат алоэ-вера
31,00 мас. %
гидролизат коллагена
4,00 мас. %
сахароза
1,50 мас. %
лимонная кислота
0,26 мас. %
ароматизаторы и красители
0,24 мас. %
сукралоза
0,0031 мас. %