Нарушения гена TP53 у больных хроническим лимфолейкозом

ТОМ 5

НОМЕР 4

201 2

КЛИНИЧЕСКАЯ

ОНКО ГЕМАТОЛОГИЯ

КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ЛИМФОИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ

TP53 gene abnormalities in patients with chronic lymphocytic leukemia

Е.А. Nikitin* 1, N.A. Severina1, T.N. Obukhova1, B.V. Biderman1,

D. G. Kisilichina2, ЕМ. Naumova2, SA. Lugovskaya2,

E. Yu. Varlamova1, I.B. Kaplanskaya1, Yu.V. Sidorova1,

М.Е. Pochtar2, Е.У. Domracheva1, V.L. Ivanova3,

L.G. Kovaleva1, V.V. Ptushkin4, A.B. Sudarikov1

SUMMARY

Currently FCR regimen (fludarabine, cyclophosphamide, rituximab) is the standard in the treatment of somatically intact patients with chronic lymphocytic leukemia. The efficacy and tolerability of this regimen have been demonstrated in several clinical trials. However, a significant proportion of patients have insufficient or very short response after FCR. Here we present the data concerning cases refractory to FCR. The study included 260 patients treated according to MLSG08 (Moscow Lymphoma Study Group) research protocol. Under this protocol young patients received FCR treatment while elderly patients were randomized between FCR-Lite and LR (chlorambucil + rituximab) arms. All patients were tested for 17p deletion by FISH. 40 patients were additionally subjected to TP53 mutation analysis with FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast). TP53 lesions were identified in 22 of 260 patients: 17 patients with 17p deletion and 5 patients with TP53 mutations (without deletion). Prognosis in patients with impaired TP53 was significantly worse: the median survival in this group was 27 months (818 days); median survival in the group with normal TP53 not achieved yet (p < 0,0001). Analysis of the clinical course in patients with TP53 mutations only (no deletion) showed that all of them should be classified as the high risk CLL. More observations are still required to recommend FASAY as a screening method to predict response to FCR therapy.

Keywords: CLL (chronic lymphocytic leukemia), FCR (fludarabine, cyclophosphamide, rituximab), deletion 17p, TP53.

1 Hematological Research Center Russian Ministry of Health, Moscow

2 Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow

3 S.P. Botkin Municipal Clinical Hospital, Moscow

4 D. Rogachev Federal Research Center of Pediatric Oncology, Immunology and Hematology Russian Ministry of Health, Moscow

Контакты: eugene_nikitin@mail.ru

Принято в печать: 13 ноября 2012 г.

Нарушения гена TP53 у больных хроническим лимфолейкозом

Е.А. Никитин', Н.А. Северина', Т.Н. Обухова', Б.В. Бидерман',

Д.Г. Кисиличина2, Е.В. Наумова2, С.А. Луговская2, Е.Ю. Варламова',

И.Б. Капланская', Ю.В. Сидорова', М.Е. Почтарь2, Е.В. Домрачева',

В.Л. Иванова3, Л.Г. Ковалева', В.В. Птушкин4, А.Б. Судариков'

_____________________РЕФЕРАТ____________________________

В настоящее время стандартом лечения больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) с удовлетворительным соматическим статусом является режим FCR (флударабин, циклофосфамид, ритуксимаб). Эффективность и хорошая переносимость этого режима продемонстрированы в нескольких клинических исследованиях. Тем не менее значительная часть пациентов имеет недостаточный или непродолжительный ответ после FCR. Настоящая работа посвящена изучению причин рефрактерности к FCR. В исследование включено 260 пациентов, получавших лечение в рамках протокола MLSG08. Молодые пациенты получали режим FCR, а пожилых рандомизировали в группы FCR-Lite и LR (хлорамбуцил + ритуксимаб). Всем пациентам была проведена флюоресцентная гибридизация in situ с зондами на деле-цию 17p. У 40 пациентов выполнено исследование мутаций гена TP53 методом FASAY — функционального анализа разделенных аллелей в дрожжах. Нарушения TP53 были обнаружены у 22 из 260 больных. У 17 пациентов была выявлена делеция 17p и у 5 — только мутации гена TP53. Прогноз у больных с нарушениями TP53 был значительно хуже: медиана общей выживаемости в группе c изменениями TP53 составила 27 мес. (818 дней), а в группе без нарушений TP53 не достигнута (p < 0,0001). Анализ клинического течения заболевания у пациентов только с мутациями гена TP53 показал, что все они могли быть отнесены к категории ХЛЛ высокого риска. При подтверждении полученных закономерностей на большей выборке больных оценка мутаций гена TP53 с помощью FASAY может быть рекомендована в качестве скринингового метода, позволяющего предсказывать реф-рактерность к терапии.

Ключевые слова:

хронический лимфолейкоз, FCR (флударабин, циклофосфамид, ритуксимаб), делеция 17p, ген ТР53.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время стандартом лечения больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) с удовлетворительным соматическим статусом является режим FCR (флударабин, циклофосфамид, ритуксимаб). Эф-

фективность и хорошая переносимость этого режима продемонстрированы в нескольких клинических исследованиях [1—3]. Однако значительная часть пациентов имеет недостаточный или непродолжительный ответ после FCR. Сегодня эти пациенты отнесены к категории

1 ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России, Москва

2 Кафедра клинической лабораторной диагностики Российской медицинской академии последипломного образования, Москва

3 Московский городской гематологический центр при ГКБ им. С.П. Боткина, Москва

4 ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздравсоцразвития России, Москва

316

Ген TP53 при ХЛЛ

ХЛЛ высокого риска, поскольку продолжительность их жизни составляет около 3 лет, что существенно меньше, чем у больных с хорошим противоопухолевым ответом на FCR [4]. Режим FCR выступает в качестве фактора стратификации больных на терапевтические группы. Очевидно, что у этой рефрактерной группы пациентов режим FCR неэффективен и им необходимы другие, альтернативные, варианты терапии первой линии. В этой связи принципиально важно научиться выделять группу больных с ожидаемой рефрактерностью к FCR.

В данной работе исследованы генетические маркеры рефрактерности к FCR — делеции и мутации гена TP53 (Tumor Suppressor Protein p53). Показано, что пациенты с делецией 17p или мутациями гена TP53 представляют собой биологически обособленную группу, которая характеризуется рефрактерностью к стандартной терапии и плохим прогнозом.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

С 1 ноября 2008 г. в Москве проводится два исследовательских протокола MLSG08 (Moscow Lymphoma Study Group). В протокол MLSG08_01 включаются пациенты с В-ХЛЛ моложе 60 лет, а также больные в возрасте 60—70 лет с индексом коморбидности (сопутствующие заболевания) 6 и менее. В рамках этого протокола исследуется эффективность и токсичность режима FCR. В протокол MLSG08_02 включаются первичные больные В-ХЛЛ старше 70 лет, а также пациенты в возрасте 60—70 лет с индексом коморбидности 7 и более. Пожилых пациентов рандомизируют на группы LR (хлорамбуцил + ритуксимаб) и FCR-Lite (вариант FCR с редукцией доз флударабина и циклофосфамида). Схемы лечения представлены в табл. 1. В большинстве случаев лечение проводилось амбулаторно. Качество ремиссии оценивалось в соответствии с критериями рабочей группы по изучению ХЛЛ 2008 г. [5].

Таблица 1. Режимы терапии FCR

Циклофосфамид (Эндоксан) — 250 мг/м2 внутрь после завтрака с 1-го по 3-й день Флударабин — 40 мг/м2 внутрь после обеда с 1-го по 3-й день Ритуксимаб — 375 мг/м2 в/в капельно в 0-й или 1-й день 1-го курса; 500 мг/м2 в 0-й или 1-й день 2-6-го курса

FCR-Lite

Циклофосфамид (Эндоксан) — 150 мг/м2 в сутки внутрь после завтрака с 1-го по 3-й день

Флударабин — 32 мг/м2 в сутки внутрь после обеда с 1-го по 3-й день Ритуксимаб — 375 мг/м2 в/в капельно в 0-й или 1-й день 1-го курса; 500 мг/м2 в 0-й или 1-й день 2-6-го курса

LR

Хлорамбуцил — 10 мг/м2 внутрь в 1-7-й день

Ритуксимаб — 375 мг/м2 в/в капельно в 0-й или 1-й день 1-го курса; 500 мг/м2 в 0-й или 1-й день 2-6-го курса

Цель данной работы состояла в характеристике клинических особенностей группы больных с делецией 17p. В связи с этим в исследование включена вся группа больных (п = 260) независимо от протоколов (MLSG08_1 или MLSG08_2) лечения.

В рамках исследования проводилась оценка следующих прогностических маркеров: цитогенетические аберрации методом FISH (флюоресцентная гибридизация in situ), мутационный статус генов вариабельного региона иммуноглобулинов (IgVH), уровень ^2-микроглобулина, секреция свободных легких цепей, а также оценка минимальной остаточной болезни методом многопараметрической 4-цветной проточной цитофлюориметрии.

FISH осуществлялась с использованием наборов зондов LSI p53/LSI ATM и LSI D13S319/LSI13q34/CEP 12 (Vysis). Мутационный статус генов IgVH исследовали по методике, описанной в статье Е.А. Никитина и соавт. [6]. Уровень иммуноглобулинов, моноклональную секрецию белка Бенс-Джонса оценивали с помощью электрофореза сыворотки и мочи с последующей денситометрией электрофореграмм. Концентрацию легких цепей иммуноглобулинов в сыворотке определяли с помощью наборов реагентов FreeLite (Binding Site, Великобритания). Анализ мутаций гена ТР53 проводили методом FASAY (Functional Analysis of Separated Allele in Yeast — функциональный анализ разделенных аллелей в дрожжах) [7].

Функциональный анализ разделенных аллелей TP53 в дрожжах

Исследование было проведено у 40 пациентов (13 женщин и 27 мужчин), у которых, по мнению исследователей, ХЛЛ имел неблагоприятное течение. Моно-нуклеары периферической крови выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте Ficoll-Hypaque. После выделения их мгновенно замораживали в жидком азоте и помещали на хранение при температуре —70 °С. Из замороженных образцов клеток мРНК выделяли модифицированным методом экстракции с применением гуанидин тиоцината фенола и хлороформа [8]. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. В реакцию обратной транскрипции добавляли по 2 мкг РНК каждого образца и синтезировали кДНК в течение 1 ч при температуре +37 °С с использованием случайных праймеров в качестве затравки и обратной транскриптазы M-MLV (Promega). На полученной кДНК была амплифицирована последовательность между экзонами 4 и 10 гена TP53.

Праймеры: Р3 (5-ATT-TGA-TGC-TGT-CCC-CGG-ACG-ATA-TTG-AA(S)C-3) и Р4 (5-ACC-CTT-TTT-GGA-CTT-CAG-GTG-GCT-GGA-GT(S)G), где S — тиофос-фатная связь, предохраняющая праймер от деградации полимеразой, обладающей 3'-5'-экзонуклеазной активностью [7]. Реакция осуществлялась в двух вариантах: с полимеразой Tag (Promega) и Pfu (Promega). Реакцию с использованием Tag проводили в объеме 50 мкл: 5 мкл кДНК, разведенной в 5 раз, 2 мкл 10 ммоль/л специфичных праймеров, 25 мкл разведенной в 2 раза смеси для полимеразной цепной реакции (Promega). Условия реакции включали в себя первоначальную денатурацию (92 °С, 300 c) и последующие 35 циклов: 92 °С — 30 с, 60 °С — 60 с, 72 °С — 30 с, 72 °С — 300 с. Реакцию с использованием Pfu проводили в объеме 25 мкл: 2,5 мкл разведенной в 5 раз кДНК, 0,75U Pfu полимеразы, 1 мкл 10 ммоль/л смеси нуклеотидов, по 1 мкл 10 ммоль/л специфичных праймеров, 2,5 мкл стандартного буфера (Promega). Реакцию готовили на льду, пробирки ставили в предварительно прогретый до 95 °С амплификатор. Условия реакции включали в себя первоначальную денатурацию (92 °С, 150 с) и последующие 35 циклов: 92 °С — 30 с, 57 °С — 30 с, 72 °С — 240 с, 72 °С — 900 c. При работе в оптимальных условиях полимераза Pfu допускает минимальное количество ошибок по сравнения с другими термостабильными полимеразами.

Культивацию дрожжей S. cerevisiae штамма ylG397 проводили на среде YPD с добавлением аденина до 200 мкг/мл во избежание отбора спонтанных ревер-

www.medprint.ru

317

Е.А. Никитин и др.

тантов к прототрофности по аденину. Трансформацию осуществляли с помощью линейного вектора pSS 16, содержащего LEU2 — маркер положительной селекции по лейцину, методом литий-ацетатной трансформации. После трансфекции дрожжевые клетки встраивают амплифицированную кДНК TP53 в вектор, содержащий в себе обе концевые последовательности гена TP53 в результате гомологичной рекомбинации. Клетки 2—3 дня культивировали при температуре 30 °С на среде YNB с добавлением гистидина, триптофана, урацила 20 мкг/мл и аденина 5 мкг/мл. Экспрессия в дрожжевых клетках функционально-активного TP53 приводит к активации транскрипции гена ADE2. Соответствующие дрожжевые колонии в этом случае бесцветны. Экспрессия мутантного TP53 приводит к окрашиванию колоний в красный цвет. Соотношение бесцветных и красных колоний позволяет оценить долю мутантных мРНК гена TP53 в образце опухолевых клеток. Красные клетки хорошо отличимы от белых колоний, но максимум насыщенности приобретают после дополнительных 2 дней при температуре 4 °С. Выделение ДНК из трансформированных колоний проводили с помощью хлороформа, методом, описанным ранее [9]. ДНК амплифицировали с использованием Pfu и секвенировали на приборе Applied Biosystem 3130 Genetic Analyzer.

Статистика

Выживаемость анализировали с помощью метода Каплана—Мейера и лог-рангового критерия. Непараметрические данные сравнивали с помощью критерия ^2. Количественные признаки сравнивали с помощью коэффициента Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В исследование включено 260 пациентов, получавших лечение в рамках протокола MLSG08 (табл. 2). Медиана возраста больных составила 61 год (диапазон 27—84 года); было 63 % мужчин и 37 % женщин. Распределение основных прогностических параметров соответствует выборке первичных больных, имеющих показания к началу лечения. Стадия А была установлена у 13 % больных, стадия B — у 71 %, стадия С — у 16 %. Распределение хромосомных нарушений типично для ХЛЛ (делеция 13q — 51 %, трисомия хромосомы 12 — 14 %, делеция 11q — 20 % и делеция 17p — 6 %). Вариант без мутаций вариабельного региона имело 70 % больных. Высокий уровень ^2-микроглобулина (> 4 мг/л) был выявлен у 62 % пациентов.

Частота выявления делеций и мутаций гена TP53

При исследовании мутаций гена ТР53 методом FASAY в качестве границы, разделяющей положительный или отрицательный результат, использовали 30 % красных колоний. Пороговое значение было получено экспериментально при сравнении действия различных ДНК-полимераз (Н.А. Северина, неопубликованные данные). Клиническое значение этой границы ранее не исследовалось. Таким образом, случай считали мутированным, если число красных колоний было 30 % и более, а немутированным — при 29 % и менее. Медиана относительного количества красных колоний у пациентов без мутаций гена TP53 составила 9 % (диапазон 2—29 %), у пациентов с мутациями — 70 % (диапазон 33 % — 96 %). C исполь-

Таблица 2. Характеристика больных

Число больных

Признак абс. %

Медиана(диапазон)возраста, годы 61 (27-84) —

Мужчины/женщины 167/101 63/37

CIRS (диапазон) 5(0-18) —

Стадия по Binet

A 34 13

B 187 71

C 41 16

Цитогенетика

Нормальный кариотип 66 26

Моноаллельная делеция 13q14 112 44

Биаллельная делеция 13q14 18 7

Трисомия хромосомы 12 35 14

Делеция11q23 52 20

Делеция17p13 17 6,5

IgVH без мутаций (n = 213) 148 69

Д,-микроглобулин > 4 мг/л (n = 238) 148 62,00

CIRS — кумулятивный индекс коморбидности (сопутствующие заболевания).

FISH, мутационной статус и уровень Д2-микроглобулина исследованы не у всех пациентов (число больных указано в скобках в каждой графе).

зованием указанного порогового значения мутации гена TP53 идентифицированы у 12 из 40 протестированных больных.

Наличие делеции 17p констатировали, если она выявлялась в 10 % ядер и более. Делеция 17p менее чем в 10 % ядер была обнаружена у 5 больных (7, 7, 9, 9 и 10 % соответственно). Делеция 17p более чем в 10 % ядер выявлена у 17 пациентов. Медиана числа ядер с делецией 17p составила 90,5 % (диапазон 13—95 %); делеция в 20 % ядер обнаружена только у 2 пациентов, у остальных она выявлена в большей части клеток клона.

В группе больных с делецией 17p (n = 17) мутации гена ТР53 исследовали у 9 пациентов и были выявлены у 7 из них; 2 больных имели только делецию, без мутации. Кроме того, выделены 5 пациентов, у которых имелись только мутации гена TP53, без делеции 17p. Таким образом, суммарно было идентифицировано 22 пациента с нарушениями гена TP53 (8 %). Результаты представлены в табл. 3.

Мутационный статус генов IgVH был определен у 213 пациентов. Нарушения гена TP53 были выявлены у 12 (8 %) из 150 больных с вариантом ХЛЛ без мутаций IgVH и у 6 (9,5 %) из 63 больных с мутациями IgVH. Данные по мутационному статусу у больных с нарушениями гена TP53 также представлены в табл. 3.

Особенности клинического течения у больных с нарушениями пути TP53

Сравнение клинико-лабораторных данных 22 пациентов с нарушениями гена TP53 и остальной группы больных приведено в табл. 4. Различий между выборками по полу и возрасту не было. В группе больных с нарушениями гена TP53 не было пациентов со стадией А, 40 % больных имели стадию С. Высокий уровень ^2-микроглобулина (> 4 мг/л) был у 95 % больных с нарушениями гена TP53, в то время как у больных без нарушений гена TP53 он был выявлен только в 60 % случаев. Доля больных, у которых гены иммуноглобулинов не содержали мутаций, была одинаковой в группах с аномалиями гена TP53 и без них. Интересно распределение пациентов по другим цитогенетическим нарушениям. Распределение

318

Клиническая онкогематология

Ген TP53 при ХЛЛ

Таблица 3. Характеристика больных с нарушениями гена TP53

Пациент, Ф.И.О. Пол Возраст, лет Стадия МС FASAY, % красных колоний -17p, % -13q, % -11q,% +12, % Ответ Исход

МЭВ М 65 С — нд 93 0 0 0 ПЗ Умер

ТАН М 64 С U НД 90 0 0 0 ПЗ Умер

БИВ М 50 С U НД 91 0 0 0 ПЗ Умер

САВ М 65 С — НД 95 0 0 0 ПЗ Набл.

ПЮВ М 73 B M НД 73 0 0 0 СЗ Набл.

ПЕМ М 66 С U НД 90 0 0 0 ЧР Набл.

ВТС Ж 73 B M НД 86 0 0 0 ЧР Набл.

ГИВ М 62 B U НД 92 0 0 0 ЧР Умер

РАФ М 44 C U 94 92 92 0 0 ПЗ Умер

НВП М 47 B — 88 91 91 0 0 ПЗ Умер

АВВ М 47 B U 78 81 49 0 0 СЗ Умер

БАВ М 50 С U 73 84 0 0 0 ПЗ Умер

ЦЯА М 76 B — 66 56 34 0 0 ПЗ Умер

ПЛГ Ж 65 B U 65 93 0 28 0 ЧР Умерла

ПМЛ М 68 B U 33 13 79 0 0 ЧР Набл.

ИГС М 54 С M 9 23 0 0 0 ЧР Набл.

ПАТ Ж 84 B M 23 95 0 0 0 ПЗ Умерла

ПНВ Ж 59 С U 97 0 0 0 0 ЧР Набл.

ЯАА М 62 B M 57 0 0 0 0 ЧР Набл.

ЛЕН Ж 79 B U 48 0 0 0 0 ЧР Набл.

ГЗН Ж 74 B M 47 0 51 0 0 СЗ Набл.

ЛЕГ М 55 B U 36 0 0 25 59 СЗ Набл.

НД — нет данных; MC — мутационный статус; U — вариант без мутаций IgVH; M — вариант с мутациями IgVH; —17p — делеция 17p; —13q — делеция 13q; —11q — делеция 11q; +12 — трисомия хромосомы 12; ПЗ — прогрессирование; СЗ — стабилизация; ЧР — частичная ремиссия; Набл. — больной остается под наблюдением.

В колонках «-17p», «-13q», «-11q», «+12» указан процент ядер с данным цитогенетическим нарушением.

хромосомных аберраций у пациентов без нарушений гена TP53 не имело особенностей по сравнению с ХЛЛ в целом. У пациентов с нарушениями гена TP53 вдвое реже выявлялись делеции 13q и 11q, втрое реже — трисомия хромосомы 12.

Клиническая картина также имела особенности. У пациентов с дефектами гена TP53 в 2 раза чаще выявлялась массивная лимфаденопатия. У 2 пациентов в этой группе было клинически манифестное специфическое поражение ЖКТ, в то время как в группе без нарушений

Таблица 4. Клинико-лабораторные данные больных с нарушениями гена TP53 и без них

Параметр Нарушения TP53 (n = 22) Нет нарушений TP53 (n = 238) Р

Медиана (диапазон) возраста, годы 62 (44-84) 61 (27-83) —

Пол, M/Ж 15/6 153/94 0,38

Стадия А,n 0 33 (14 %) 0,12

Стадия B,n 13 (60 %) 173 (71 %) 0,30

Стадия C, n 9 (40 %) 36 (15 %) 0,0

Цитогенетические нарушения

Делеция 13q, n 6 (27 %) 127 (51 %) 0,95

Делеция 11q, n 2 (9 %) 50 (21 %) *

Трисомия 12,n 1 (4,5 %) 35 (15 %) *

Д2-микроглобулин > 4 мг/л, n Мутационный статус генов IgVH, n 21 (95 %) 11/16 (69 %) 131 (60 %) 134/194 (69 %) 0,0006 0,79

Массивная лимфаденопатия, n 9 (43 %) 49 (20 %) 0,028

Клинически манифестное поражение ЖКТ, n 2 (10 %) 0 *

Пролимфоцитарный вариант, n 1 (4,5 %) 1 (0,4 %) *

Медиана (диапазон) гемоглобина до начала лечения, г/л 119 (52-157) 134 (77-164) 0,018

Медиана (диапазон) тромбоцитов до начала лечения, х109/л 145 (13-297) 178 (5-419) 0,78

Медиана (диапазон) лейкоцитов до начала лечения, х109/л 44 (21,7-300) 52,5 (9-398) 0,08

* Статистический анализ неприменим, поскольку число пациентов в одной (всех) подгруппе меньше 5.

гена TP53 поражения ЖКТ не наблюдались. У 1 (4,5 %) пациента отмечена пролимфоцитарная трансформация. Выявлены статистически значимые отличия в уровне лейкоцитов до начала терапии, а также в уровне гемоглобина (ниже в группе с нарушениями гена TP53).

Результаты лечения и прогноз у пациентов с нарушениями гена TP53

Эффективность содержащих ритуксимаб режимов в группе больных с нарушениями TP53 была значительно ниже по сравнению с пациентами без нарушений гена TP53 (табл. 5).

В группе больных с нарушениями TP53 полных ремиссий не получено. Частичные ремиссии констатированы у 9 (40 %) пациентов. Прогрессирование или стабилизация наблюдались у 13 (60 %) больных. В группе без нарушений TP53 полные ремиссии были получены у 80 (36 %) больных, частичные — у 118 (54 %), отсутствие эффекта констатировано у 22 (10 %) пациентов. Различия по частоте отрицательных ответов (р < 0,0001) и частоте полных ремиссий (р = 0,001) оказались статистически значимыми.

Проведен анализ качества ответа на лечение в группе больных с дефектами гена TP53 (табл. 6). Отдельно исследовали эффективность лечения у больных с делецией 17p и только с мутациями TP53, а также у пациентов с

Таблица 5. Результаты лечения больных с нарушениями гена TP53 и без них

Больные с Больные без

нарушениями делеции 17p

Результаты лечения TP53 (n = 22) (n = 220) Р

Отрицательный ответ(прогрессирование, стабилизация), n 13 (60 %) 22 (10 %) < 0,0001

Частичная ремиссия, n 9 (40 %) 118 (54 %) 0,35

Полная ремиссия,n 0 80 (36 %) 0,001

www.medprint.ru

319

Е.А. Никитин и др.

Таблица 6. Результаты лечения больных с нарушениями гена TP53

Группы больных Только больные с мутациями гена TP53

Прогрессирование,n — 9 4 1 9

Стабилизация,n 2 2 2 2 4

Отрицательный ответ

Положительный ответ

разным мутационным статусом генов IgVH. Полных ремиссий в группе с дефектами гена ТР53 не получено, сравнивались группы больных с частичной ремиссией, стабилизацией и прогрессированием.

При стабилизации к третьему циклу терапии сокращение массы опухоли составило менее 50 % от исходной, при двукратной оценке ответа с интервалом 1 и 3 мес. после завершения всей программы терапии наблюдалось увеличение одного или группы лимфоузлов. Степень увеличения лимфоузлов не превышала 50 % от исходного, или прирост лимфоцитоза составлял менее чем 50 %. Прогрессирование констатировалось при увеличении лимфоузлов/селезенки во время лечения (оценка после 3-го цикла), либо увеличении лимфоузлов/селезенки/ лимфоцитоза более 50 %, либо появлении цитопении при повторной оценке эффекта через 3 мес.

У пациентов только с мутациями гена TP53 противоопухолевый ответ был лучше: в 3 наблюдениях достигнута частичная ремиссия, в 2 — имела место стабилизация опухоли, которая квалифицировалась как отрицательный ответ. У всех пациентов с мутациями гена TP53 ко времени публикации работы развились рецидивы. В группе больных с делецией 17p отрицательный ответ наблюдался у 11 (65 %) пациентов, причем в 9 случаях это было прогрессирование. Мутационный статус генов IgVH не влиял на качество противоопухолевого ответа: частичные ремиссии были получены у половины больных в каждой из этих подгрупп. У больных без мутаций генов IgVH прогрессирование выявлялось чаще. В связи с небольшим числом наблюдений эти различия не могут быть статистически значимыми, однако они показывают выявленную тенденцию: у пациентов только с мутациями

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Время, дни

Рис. 1. Общая выживаемость больных с нарушениями гена TP53 и без них. Верхняя кривая — пациенты без нарушений гена TP53

гена TP53 непосредственные результаты лечения лучше, чем у пациентов с делецией 17p.

Анализ выживаемости

Показатели выживаемости больных с нарушениями гена TP53 были статистически значимо хуже, чем у остальных пациентов. При медиане наблюдения 24 мес. в группе больных с нарушениями гена TP53 умерло 11 (50 %) из 22 пациентов, а в группе без нарушений гена TP53 — 8 (3,4 %) из 238. Смерть всех больных с нарушениями гена TP53 наступила при прогрессировании ХЛЛ. Медиана общей выживаемости в группе c нарушениями гена TP53 составила 27 мес. (818 дней). Медиана общей выживаемости в группе без нарушений гена TP53 не достигнута (р < 0,0001) (рис. 1). У пациентов только с мутациями гена TP53 (без делеции 17p) прогноз оказался лучше. В группе больных только с мутациями гена TP53 летальных исходов не наблюдалось. У больных с деле-циями 17p медиана выживаемости составила 19,7 мес. (593 дня) (р = 0,0049) (рис. 2). Отсутствие летальных исходов в подгруппе больных только с мутациями гена TP53 можно объяснить большей химиочувствительностью клеток ХЛЛ к терапии второй и последующих линий.

ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе исследовано клиническое течение ХЛЛ у больных с различными дефектами гена TP53. Связь мутаций TP53 с развитием рефрактерности к химиотерапии изучена меньше, нежели делеции 17p13 [10—14]. Накопленный к настоящему времени опыт свидетельствует о том, что 95 % мутаций гена TP53 при ХЛЛ расположены в пределах центрального ДНК-связывающего домена, что

Время, дни

Рис. 2. Общая выживаемость больных с мутациями гена TP53 и делецией 17p. Верхняя кривая — пациенты только с мутациями TP53

320

Клиническая онкогематология

Ген TP53 при ХЛЛ

ослабляет связывание p53 с ДНК и уменьшает трансактивацию генов-мишеней [15]. Изучение делеции 17p проводилось методом FISH, мутаций гена TP53 — методом FASAY. Для идентификации мутаций TP53 могут быть использованы прямое секвенирование, жидкостная хроматография, анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК, функциональный анализ разделенных аллелей в дрожжах, микрочипы (GeneChip p53 Affymetrix, Roche p53 AmpliChip) и глубокое секвенирование [10—14, 16—18]. Общепризнанного лучшего метода для выявления мутаций гена TP53 нет. В настоящей работе был выбран метод FASAY, т. к. он имеет высокую чувствительность и позволяет идентифицировать функционально значимые мутации, не требует специального оборудования. Принцип описан в разделе «Пациенты и методы». В данной работе нами показано, что метод FASAY позволяет выделить группу больных с рефрактерностью к терапии, имеющих только мутации гена ТР53, без делеции 17р.

Полученные данные свидетельствуют о том, что утрата функции TP53 происходит по аналогии с классической двухударной моделью Кнудсона [19]. Так, у большинства пациентов утрата функции p53 происходит за счет мутации на одном аллеле и делеции — на другом. Однако существует категория больных, у которых выявляются только мутации гена ТР53 без делеции. FASAY позволяет надежно идентифицировать эту группу больных с рефрактерностью к терапии: у этих пациентов не бывает полных ремиссий. Они составляют группу высокого риска ХЛЛ, поскольку клинически манифестный рецидив развивается относительно рано, в течение 2 лет после завершения терапии. Тем не менее при сравнении групп больных с делецией 17p и только с мутацией TP53 очевидно, что качество ответа во втором случае лучше: большее число пациентов достигают частичной ремиссии, а отсутствие эффекта терапии характеризуется стабилизацией, но не прогрессированием. Общая выживаемость у этих больных лучше. Это означает, что терапия второй и последующих линий эффективна, поскольку клетки ХЛЛ сохраняют чувствительность к терапии. По видимому, это объясняется тем, что несмотря на мутацию, функция гена ТР53 частично сохранена. Утрата функции TP53 при мутации одного из аллелей объясняется несколькими феноменами: доминантным негативным эффектом, приобретенной однородительской дисомией, гаплонедоста-точностью. Доминантный негативный эффект обусловлен тем, что белок p53 представляет собой тетрамер, состоящий из 4 идентичных цепей. При мутации одного аллеля большинство образующихся тетрамеров, содержащих хотя бы одну мутантную цепь, не обладают функциональной активностью.

Учитывая лучший ответ на лечение в группе больных с мутациями ТР53, небольшого количества сохранного p53, по-видимому, достаточно для реализации p53-зависимого апоптоза в ответ на повреждение ДНК. Явление однородительской дисомии заключается в том, что из-за митотической ошибки в дочерних клетках оказываются две материнских или две отцовских хромосомы. Таким образом, если в клетке-предшественнице имелись отцовская и материнская хромосомы и, соответственно, два аллеля TP53 (дефектный и нормальный), а функция p53 не была утрачена полностью, то в дочерней клетке оказывается два поврежденных аллеля при нормальном

числе хромосом. Приобретенная однородительская дисомия не может быть выявлена с помощью классической цитогенетики, FISH, сравнительной геномной гибридизации. Этот феномен был выявлен только с помощью анализа однонуклеотидного полиморфизма (SNP) с помощью микрочипов [20—22]. Он описан и при ХЛЛ [10], но, по-видимому, выявляется значительно реже, нежели при солидных опухолях, при которых частота однородительской дисомии как механизма канцерогенеза достигает 80 % [20—22].

ХЛЛ — гетерогенная опухоль и, возможно, представлена болезнями, отличающимися по патогенезу. Абсолютный биологический маркер, определяющий варианты ХЛЛ, не найден. В настоящее время они дифференцируются с помощью мутационного статуса генов IgVH или суррогатных маркеров [23, 24]. Различия в патогенезе проявляются, в частности, разным распределением хромосомных нарушений. По литературным данным, нарушения TP53 редко выявляются в случаях с мутированными VH-генами [25]. Мы не нашли такой закономерности: нарушения TP53 были выявлены в 9,5 % случаев с мутациями VH-генов и в 8 % — без них. Возможно, это объясняется универсальностью онкогенного потенциала TP53: утрата его функции приводит к развитию опухоли в клетках любой дифференцировки на любых стадиях развития. Этого нельзя сказать в отношении других хромосомных нарушений: их распределение у больных с разным мутационным статусом неодинаково. Интересно, что прогноз и клиническое течение ХЛЛ с утратой функции p53 и мутациями VH-генов лучше, чем в случаях без мутаций VH-генов. Анализ собственных данных не выявил значимых различий в качестве ответа, однако при сходных сроках наблюдения в группе с мутациями IgVH умер 1 (16 %) из 6 пациентов, в группе без мутаций — 6 (50 %) из 12. Это объясняется тем, что рецидив у таких пациентов развивается позже и они сохраняют большую чувствительность к химиотерапии.

Еще один важный тезис касается связи делеции 11q с нарушениями гена TP53, которая отмечалась ранее [25]. Такая ассоциация весьма логична, поскольку ген ATM, расположенный в часто утрачиваемом у больных ХЛЛ регионе 11 q, принимает участие в совместном с TP53 сигнальном пути при повреждении ДНК. Сочетанная утрата этих генов могла бы способствовать большей рефрактерности и автономности субклонов клеток ХЛЛ. Наши данные не подтверждают эту гипотезу: делеция 11q редко выявляется у больных с нарушениями пути TP53.

ХЛЛ с функциональной несостоятельностью TP53 характеризуется не только рефрактерностью к терапии и непродолжительными ремиссиями, но и клиническими признаками, которые выделяют его из многих других случаев. К таким признакам относятся массивная лимфаденопатия и клинически манифестное поражение ЖКТ. По нашему опыту, органные инфильтраты при ХЛЛ редко манифестируют клинически. Случайные биопсии или пункции нередко позволяют видеть клетки ХЛЛ в других органах (почки, легкие), а также в плевральной и спинномозговой жидкостях. В таких случаях бывает тяжело решить, связана ли данная клиническая проблема с ХЛЛ или другой болезнью. Как правило, клинический эффект достигается при назначении лечения, не имеющего отношения к лейкозу. Нередко кожные высыпания, субстратом которых

www.medprint.ru

321

Е.А. Никитин и др.

является морфологически и иммуногистохимически доказанная инфильтрация клетками ХЛЛ, носят тран-зиторный характер, не связаны с прогрессированием и плохим прогнозом. По данным аутопсий, инфильтрация клетками ХЛЛ может быть обнаружена практически в любом органе, причем чаще всего помимо лимфоузлов, костного мозга, селезенки и печени поражаются почки (60—70 %) [26]. В настоящем исследовании речь идет о пациентах, у которых специфическая инфильтрация клетками ХЛЛ проявлялась клинически (в 1 случае желудочно-кишечным кровотечением). Эта манифестация нетипична для ХЛЛ в целом. Она может говорить о том, что TP53 контролирует «инстинкт дома» В-лимфоцитов. С практической точки зрения важно, что при выявлении клинически манифестных органных поражений следует обязательно исследовать статус TP53.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование показывает, что рефрактерное течение ХЛЛ наблюдается не только у больных с делецией 17p, но и у пациентов с мутациями гена TP53. Исследование не позволяет установить, какую долю пациентов с рефрактерностью составляют больные с мутациями TP53, поскольку анализ мутаций проведен только у 40 пациентов и обнаружены в 12 случаях. Однако 5 больных, у которых были выявлены только мутации гена TP53, соответствуют категории ХЛЛ высокого риска: у этих пациентов ответ на лечение не полный, а рецидив развивается рано. При подтверждении полученных закономерностей на большей выборке больных оценка мутаций TP53 методом FASAY может быть рекомендована в качестве скринингового, позволяющего предсказывать рефрактерность к терапии. Прогноз у больных с нарушениями гена TP53 значительно хуже, чем у пациентов с ХЛЛ в целом. Полученный в рамках московского протокола MLSG08 опыт убедительно свидетельствует о необходимости выделения больных с нарушениями гена TP53 до начала лечения и проведения им альтернативных терапевтических режимов.

Благодарности

Мы выражаем благодарность Яне Шмардовой (Jana Smardova, Masaryk University, Brno Czech Republic) и Ричарду Игго (Richard Iggo, Bergonie Cancer Institute, University of Bordeaux, France) за подаренные штаммы дрожжей и плазмидные векторы.

ЛИТЕРАТУРА

1. HallekM, FischerK, Fingerle-Rowson G. et al. Addition of rituximab to fluda-rabine and cyclophosphamide in patients with chronic lymphocytic leukaemia: a randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet 2010; 376(9747): 1164-74.

2. Keating M.J., O’Brien S, Albitar M. et al. Early results of a chemoimmu-notherapy regimen of fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab as initial therapy for chronic lymphocytic leukemia. J. Clin. Oncol. 2005; 23(18): 4079-88.

3. Tam C.S., O’Brien S., Wierda W. et al. Long-term results of the fludarabine, cyclophosphamide, and rituximab regimen as initial therapy of chronic lymphocytic leukemia. Blood 2008; 112(4): 975-80.

4. Zenz T., Gribben J.G., Hallek M. et al. Risk categories and refractory CLL in the era of chemoimmunotherapy. Blood 2012; 119(18): 4101-7.

5. Hallek M., Cheson B.D., Catovsky D. et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines. Blood 2008; 111(12): 5446-56.

6. Никитин Е.А., Пивник А.В., Судариков А.Б. и др. Сравнение форм хронического лимфолейкоза в зависимости от мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов. Тер. арх. 2000; 72(7): 52-6.

7. Flaman J.M., Frebourg T., Moreau V. et al. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995; 92(9): 3963-7.

8. Chomczynski P., Sacchi N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 1987; 162(1): 156-9.

9. Ruiz-Barbara J.L., Maldonado A, Jimenez-Diaz R. Small-scale total DNA extraction from bacteria and yeast for PCR applications. Anal. Biochem. 2005; 347(2): 333-5.

10. Zenz T., Krober A, Scherer K. et al. Monoallelic TP53 inactivation is associated with poor prognosis in chronic lymphocytic leukemia: results from a detailed genetic characterization with long-term follow-up. Blood 2008; 112(8): 3322-9.

11. Malcikova J., Smardova J., Rocnova L. et al. Monoallelic and biallelic inactivation of TP53 gene in chronic lymphocytic leukemia: selection, impact on survival, and response to DNA damage. Blood 2009; 114(26): 5307-14.

12. Grever M.R., Lucas D.M., Dewald G.W. et al. Comprehensive assessment of genetic and molecular features predicting outcome in patients with chronic lymphocytic leukemia: results from the US Intergroup Phase III Trial E2997. J. Clin. Oncol. 2007; 25(7): 799-804.

13. Dicker F., Herholz H., Schnittger S. et al. The detection of TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia independently predicts rapid disease progression and is highly correlated with a complex aberrant karyotype. Leukemia 2009; 23(1): 117-24.

14. Rossi D., Cerri M., Deambrogi C. et al. The prognostic value of TP53 mutations in chronic lymphocytic leukemia is independent of del17p13: implications for overall survival and chemorefractoriness. Clin. Cancer Res. 2009; 15(3): 995-1004.

15. Zenz T., Vollmer D., Trbusek M. et al. TP53 mutation profile in chronic lymphocytic leukemia: evidence for a disease specific profile from a comprehensive analysis of 268 mutations. Leukemia 2010; 24(12): 2072-9.

16. Trbusek M., Smardova J., Malcikova J. et al. Missense mutations located in structural p53 DNA-binding motifs are associated with extremely poor survival in chronic lymphocytic leukemia. J. Clin. Oncol. 2011; 29(19): 2703-8.

17. Kringen P., Bergamaschi A, Due E.U. et al. Evaluation of arrayed primer extension for TP53 mutation detection in breast and ovarian carcinomas. Biotechniques 2005; 39(5): 755-61.

18. Tonisson N., Zernant J., Kurg A. et al. Evaluating the arrayed primer extension resequencing assay of TP53 tumor suppressor gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99(8): 5503-8.

19. Knudson A.G. Jr Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1971; 68(4): 820-3.

20. Gondek L.P., Tiu R., O’Keefe C.L. et al. Chromosomal lesions and uniparental disomy detected by SNP arrays in MDS, MDS/MPD, and MDS-derived AML. Blood 2008; 111(3): 1534-42.

21. Beroukhim R., Lin M., Park Y. et al. Inferring loss-of-heterozygosity from unpaired tumors using high-density oligonucleotide SNP arrays. PLoS Comput. Biol. 2006; 2(5): e41.

22. Ishikawa S., Komura D., Tsuji S. et al. Allelic dosage analysis with geno-typing microarrays. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 333(4): 1309-14.

23. Никитин Е.А., Стадник Е.А., Лорие Ю.Ю. и др. Прогностическое значение мутационного статуса генов вариабельного региона иммуноглобулинов у больных хроническим лимфолейкозом, получавших комбинированную терапию флударабином и циклофосфаном. Тер. арх. 2007; 79(7): 66-70.

24. Nikitin EA., Malakho S.G., Biderman B.V. et al. Expression level of lipoprotein lipase and dystrophin genes predict survival in B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leuk. Lymphoma 2007; 48(5): 912-22.

25. Stilgenbauer S., Bullinger L., Lichter P. et al. Genetics of chronic lymphocytic leukemia: genomic aberrations and V(H) gene mutation status in pathogenesis and clinical course. Leukemia 2002; 16(6): 993-1007.

26. Barcos M., Lane W., Gomez GA. et al. An autopsy study of 1206 acute and chronic leukemias (1958 to 1982). Cancer 1987; 60(4): 827-37.

322

Клиническая онкогематология