ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ ПЕРИОДИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС IN VITRO С ПОДПИТКОЙ

in vitro
1. Способ определения процента (%) потребления нуклеозидтрифосфатов (NTP) в реакции транскрипции (IVT) , включающий:
(а) проведение реакции IVT с реакционной смесью, которая содержит известные исходные концентрации NTP, дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), кодирующей рибонуклеиновую кислоту (РНК), представляющую интерес, и РНК-полимеразу;
(b) измерение концентраций отдельных NTP через дискретные интервалы в течение периода времени; а также
(c) расчет значения потребления в процентах (%) для каждого NTP в реакционной смеси.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что NTP включают аденозинтрифосфат (ATP), цитидинтрифосфат (CTP), уридинтрифосфат (UTP) и гуанозинтрифосфат (GTP).
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что этап (b) включает (i) деление скорости потребления отдельного NTP на общую скорость потребления NTP.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что скорость потребления отдельного NTP рассчитывается путем измерения концентраций отдельных NTP через дискретные интервалы в течение определенного периода времени; и общая скорость потребления NTP рассчитывается путем измерения общей концентрации NTP через дискретные интервалы в течение определенного периода времени.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что измерения концентрации отдельного NTP и общей концентрации NTP собирают до тех пор, пока концентрация по меньшей мере одного из NTP не упадет ниже пороговой концентрации.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что пороговая концентрация является выше нулевой (0) миллимолярной (мМ) концентрации, необязательно при этом пороговая концентрация составляет от 5 до 20 мМ, и необязательно при этом пороговая концентрация находится в пределах 5-75% от исходной концентрации NTP.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что известные исходные концентрации NTP включают эквимолярные концентрации NTP каждого из [ATP], [CTP], [UTP] и [GTP].
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что известные исходные концентрации NTP включают соотношение [ATP]:[UTP] от 1:1 до 4:1, необязательно от 1:1 до 2:1, и/или соотношение [GTP]:[CTP] от 1:1 до 4:1.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что известные исходные концентрации NTP включают соотношение [ATP]:[UTP]:[CTP]:[GTP], составляющее 2:1:1:4.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что NTP представляет собой химически модифицированный NTP, встречающийся в природе NTP или синтетический NTP.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что реакцию IVT проводят в течение интервала времени от 20 до 40 минут.
in vitro
12. Способ периодической реакции транскрипции  (IVT) с подпиткой для представляющей интерес рибонуклеиновой кислоты (РНК), включающий:
(а) проведение реакции IVT с исходной реакционной смесью, которая содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), кодирующую представляющую интерес РНК, РНК-полимеразу, нуклеозидтрифосфаты (NTP); а также
(b) подача в текущую реакционную смесь IVT смеси сырья для подпитки с течением времени, которая содержит NTP, при этом каждый NTP присутствует в смеси сырья для подпитки в молярном соотношении, основанном на процентном значении потребления, рассчитанном отдельно для каждого NTP, при этом процентные значения потребления специфичны для представляющей интерес РНК, и при этом смесь сырья для подпитки доставляется в количестве, которое поддерживает общую концентрацию NTP в реакционной смеси выше нуля мМ,
тем самым продуцируя представляющую интерес транскрибированную РНК.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что NTP включают аденозинтрифосфат (ATP), цитидинтрифосфат (CTP), уридинтрифосфат (UTP) и гуанозинтрифосфат (GTP).
14. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходная реакционная смесь (а) содержит соотношение [ATP]:[UTP] от 1:1 до 4:1, необязательно от 1:1 до 2:1, и/или соотношение [GTP]:[CTP] от 1:1 до 4:1.
15. Способ по п.12, отличающийся тем, что исходная реакционная смесь (а) содержит соотношение [ATP]:[UTP]:[CTP]:[GTP], составляющее 2:1:1:4.
16. Способ по п. 12, отличающийся тем, что каждый NTP в исходной реакционной смеси (a) присутствует в эквивалентном молярном соотношении, которое отличается от значения потребления в процентах (%), рассчитанного для каждого NTP.
17. Способ по п. 12, отличающийся тем, что каждый NTP в исходной реакционной смеси (a) присутствует в эквимолярной концентрации для каждого NTP.
18. Способ по п. 12, отличающийся тем, что каждый NTP в исходной реакционной смеси (a) присутствует в концентрации 1-10 мМ, 1-6 мМ, 2-6 мМ или 3-6 мМ.
19. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация каждого NTP в текущей реакционной смеси IVT поддерживается в диапазоне от 5% до 200%, 5-100%, 5-75%, 20-100%, 20-75% или 25-50% от соответствующей исходной концентрации NTP.
20. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходную реакционную смесь поддерживают при соотношении [ATP]:[UTP] от 1:1 до 4:1, необязательно от 1:1 до 2:1, и/или при соотношении [GTP]:[CTP] от 1:1 до 4:1.
21. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходную реакционную смесь поддерживают при соотношении [ATP]:[UTP]:[CTP]:[GTP], составляющем 2:1:1:4.
in vitro
22. Способ периодической реакции транскрипции  (IVT) с подпиткой для представляющей интерес рибонуклеиновой кислоты (РНК), включающий:
(а) проведение реакции IVT с исходной реакционной смесью, которая содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), кодирующую представляющую интерес РНК, РНК-полимеразу и нуклеозидтрифосфаты (NTP), при этом NTP находятся в соотношении [ATP]:[UTP] 2:1 и в соотношении [GTP]:[CTP] 4:1; а также
(b) подачу в текущую реакционную смесь IVT смеси сырья для подпитки с течением времени, которая содержит NTP, при этом каждый NTP присутствует в смеси сырья для подпитки в молярном соотношении, основанном на процентном значении потребления, рассчитанном отдельно для каждого NTP, при этом процентные значения потребления специфичны для представляющей интерес РНК, и при этом смесь сырья для подпитки доставляется в количестве, которое поддерживает соотношение [ATP]:[UTP], составляющее 2:1, и соотношение [GTP]:[CTP] составляющее 4:1,
тем самым продуцируя представляющую интерес транскрибированную РНК.
23. Способ по п. 12, отличающийся тем, что NTP представляют собой химически модифицированные NTP, встречающиеся в природе NTP или синтетические NTP.
24. Способ по п. 12, отличающийся тем, что смесь сырья для подпитки доставляют в текущую реакционную смесь IVT с применением непрерывной подпитки с течением времени.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что смесь сырья для подпитки доставляют в текущую реакционную смесь IVT каждые 10-250 минут, необязательно каждые 20-200 минут.
26. Способ по п. 12, отличающийся тем, что смесь сырья для подпитки доставляют в текущую реакционную смесь IVT с применением непрерывной подпитки с течением времени.
27. Способ по п. 26, отличающийся тем, что смесь сырья для подпитки доставляют в текущую реакционную смесь IVT при постоянной скорости потока
(i) 2-8 мл/мин, необязательно 4-6 мл/мин; или
(ii) 0,0030-0,007 мл/мин на мл исходного объема, необязательно 0,0040-0,0060 мл/мин на мл исходного объема.
28. Способ по п. 12, отличающийся тем, что каждый NTP в исходной реакционной смеси (a) присутствует в молярном соотношении, эквивалентном значению расхода в процентах (%), рассчитанному для каждого NTP.
29. Способ по п. 12, отличающийся тем, что общая концентрация NTP в текущей реакционной смеси IVT поддерживается выше нижнего предела 0,5 мМ, необязательно от 10 мМ до 20 мМ.
30. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходные и/или текущие реакционные смеси IVT дополнительно содержат аналог кэпа РНК.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК представляет собой химически модифицированный аналог кэпа РНК, встречающийся в природе аналог кэпа РНК или синтетический аналог кэпа РНК.
32. Способ по п. 30, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК представляет собой (i) аналог тринуклеотидного кэпа РНК, необязательно выбранный из аналогов тринуклеотидного кэпа, содержащих структуру Кэп 1, Кэп 2, Кэп 3 или Кэп 4, или (ii) аналог тетрануклеотидной кэпа РНК, необязательно выбранный из аналогов тринуклеотидного кэпа, содержащих структуру Кэп 5, Кэп 6, Кэп 7 или Кэп 8.
33. Способ по п. 30, отличающийся тем, что исходная и текущая реакционные смеси IVT содержат соотношение [аналог кэпа РНК]:[пурин] от 1:1 до 20:1, от 1:1 до 15:1, от 1:1 до 10:1, от1:1 до 5:1, от 1:1 до 3:1 или от 1:1 до 2:1.
34. Способ по п. 12, отличающийся тем, что выход транскрибированной РНК, представляющей интерес, больше, чем выход РНК, транскрибированной с помощью периодической реакции IVT.
35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что выход транскрибированной РНК, представляющей интерес, по меньшей мере на 100% больше, чем выход РНК, транскрибированной с помощью периодической реакции IVT.
36. Способ по п. 12, отличающийся тем, что выход транскрибированной РНК, представляющей интерес, превышает исходный реакционный объем больше чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30 мг/мл.
37. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходные и/или текущие реакционные смеси IVT дополнительно содержат буфер и/или магний.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что буфер представляет собой трис-HCl, необязательно при этом буфер представляет собой от 20 до 60 мМ трис-HCl, необязательно при этом буфер представляет собой 40 мМ трис-HCl.
39. Способ по п. 30, отличающийся тем, что по меньшей мере 90%, необязательно по меньшей мере 95% представляющей интерес транскрибированной РНК содержит аналог кэпа РНК.
40. Способ по п. 30, отличающийся тем, что соотношение аналога кэпа к ATP или соотношение аналога кэпа к GTP больше 0,6, и по меньшей мере 90% представляющей интерес транскрибированной РНК содержит аналог кэпа.
41. Способ по п. 39, отличающийся тем, что транскрибированная РНК, представляющая интерес, имеет длину по меньшей мере 2000 нуклеотидов.
42. Способ по п. 30, отличающийся тем, что по меньшей мере 90% транскрибированной РНК, представляющей интерес, содержит аналог кэпа РНК на 180-й минуте и/или на 360-й минуте реакции IVT.
43. Способ по п. 12, отличающийся тем, что исходные и/или текущие реакционные смеси IVT не дополняются аналогом кэпа РНК во время реакции IVT.
44. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация ДНК в исходной реакционной смеси составляет 0,025-0,075 мг/мл, необязательно 0,05 мг/мл.
45. Способ по п. 12, отличающийся тем, что концентрация ДНК поддерживается на уровне выше 0,01 мг/мл во время реакции IVT, необязательно 0,01-0,05 мг/мл.
46. Способ по п. 12, отличающийся тем, что молярное соотношение транскрибированной РНК, представляющей интерес, к ДНК в реакции IVT, по меньшей мере в 2 раза или по меньшей мере в 3 раза больше, чем молярное соотношение транскрибированной РНК к ДНК в контрольном периодическом способе без подпитки.
47. Способ по п. 23, отличающийся тем, что UTP представляет собой модифицированный UTP, выбранный из 1-метилпсевдоуридина и 1-этилпсевдоуридина.
48. Способ по п. 12, отличающийся тем, что транскрибированная РНК, представляющая интерес, представляет собой информационную РНК (мРНК).
49. Способ по п. 12, отличающийся тем, что транскрибированная РНК, представляющая интерес, имеет длину более 100 нуклеотидов.
50. Способ по п. 12, отличающийся тем, что общее время реакции IVT составляет 150-1000 минут.
51. Способ по п. 12, отличающийся тем, что по меньшей мере 50% или по меньшей мере 70% транскрибированной РНК, представляющей интерес, содержит полиА-хвост на 420-й минуте реакции IVT.
100
52. Способ по п. 51, отличающийся тем, что полиА хвост представляет собой AполиА хвост.
53. Способ по п. 30, отличающийся тем, что исходная реакционная смесь включает концентрацию аналога кэпа РНК, которая по меньшей мере на 10% или по меньшей мере на 20% превышает концентрацию NTP, присутствующего в первом кодирующем положении РНК, представляющей интерес.
54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что NTP, присутствующий в первом кодирующем положении РНК, представляющей интерес, представляет собой ATP или GTP.
55. Способ по п. 12, отличающийся тем, что РНК-полимераза представляет собой РНК-полимеразу T7.
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что РНК-полимераза Т7 содержит дополнительный глицин на С-конце относительно РНК-полимеразы Т7 дикого типа.
57. Способ по п. 55, отличающийся тем, что РНК-полимераза Т7 содержит замену G47A относительно РНК-полимеразы Т7 дикого типа.
58. Способ по п. 55, отличающийся тем, что РНК-полимераза Т7 содержит замену G47A и дополнительный глицин на С-конце относительно РНК-полимеразы Т7 дикого типа.
59. Способ по п. 30, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК представляет собой динуклеотидный кэп, тринуклеотидный кэп или тетрануклеотидный кэп.
2
Ome
60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК содержит тринуклеотидную последовательность GAG, необязательно GpppAʽpG.
61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что аналог кэпа РНК содержит тетрануклеотидную последовательность GGAG.
62. Способ по п. 12, дополнительно включающий выделение транскрибированной РНК, представляющей интерес.
63. Представляющая интерес РНК, выделенная посредством способа по п. 62.
64. Рибонуклеиновая кислота (РНК), полученная посредством способа по п. 12.
65. РНК по п. 63, составленная в виде наночастицы катионного липида, необязательно, при этом указанная наночастица катионного липида содержит молярное соотношение 20-60% ионизируемого катионного липида, 5-25% некатионного липида, 25-55% стерола и 0,5-15% PEG-модифицированных липидов.