Особенности оценки экспрессии ZAP-70 в опухолевых клетках при В-клеточном хроническом лимфолейкозе методом проточной цитофлюориметрии

ток будет экспрессировать CD3 (маркер Т-лимфоцитов). Тем не менее наличие небольшой моноклональной популяции В-лимфоцитов позволяет исключить Т-клеточную лимфому;

• АКЛ следует дифференцировать с диффузной В-кле-точной лимфомой и лимфомой Ходжкина. При АКЛ опухолевые клетки в большинстве случаев будут экспрессировать Т-клеточные антигены и анапластическую лимфомную ки-назу (ALK).

Таким образом, комбинация цитологического исследования с иммуноцитохимическим и методом проточной цитоф-люориметрии имеет ряд преимуществ, позволяющих повысить роль цитологического исследования в диагностике не-ходжкинских злокачественных лимфом.

Внедрение таких высокотехнологичных методов, как проточная цитофлюориметрия и иммуноцитохимия, позволяет пересмотреть роль цитологического метода в диагностике лимфом.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гранов А. М., ИльинН. В. Лимфомы. - СПб., 2010.

2. Ковригина А. М., Пробатова Н. А. // Тезисы докл. IV конф. Рос. об-ва патологоанатомов "Новые методы и разработки в онкомор-фологии", посвящ. 100-летию со дня рождения академика АМН СССР Н. А. Краевского. - М., 2005. - С. 15.

3. Ковригина А. М., Пробатова Н. А. Лимфома Ходжкина и крупноклеточные лимфомы. - М., 2007.

4. КриволаповЮ. А., Леенман Е. Е. Морфологическая диагностика неходжкинских лимфом. - Алмата, 2005.

5. Луговская С. А., ПочтарьМ. Е. Гематологический атлас. - Тверь, 2004.

6. Луговская С. А., Почтарь М. Е., Тупицин Н. Н. Иммунофеноти-пирование в диагностике гемобластозов. - М., 2005.

7. Петров С. В., Райхлин Н. Т. Руководство по иммуногистохими-ческой диагностике опухолей человека. - Казань, 2004.

8. Райт Д., Леонг Э., Эддис Б. Морфологическая диагностика патологии лимфатических узлов. - М., 2008.

9. AielloA., DeliaD, GiardiniR. et al. // Mol. Pathol. - 2003. - Vol. 6, N 3. - P. 154-160.

10. Clatch R. J., Foreman J. R., Walloch J. L. // Cytometry. - 2008. - Vol. 34. - P. 3-16.

11. DabbsD. J. Diagnostic immunohistochemistry. - New York, 2002.

12. Davey D. D., KamarD, Zaleski S. et al. // Acta Cytol. - 2001. - Vol. 33. - P. 583-590.

13. Dunphy C. H., RamosR. // Diagn. Cytopathol. - 2004. - Vol. 16, N 3. - P. 200-206.

14. Frable W. J., Kardos T. F. // Am. J. Surg. Pathol. - 2004. - Vol. 12. -P. 62-72.

15. Gerders J., Schwab U., LemkeH., Stein H. // Int. J. Cancer. - 2001. -Vol. 31. - P. 13-20.

16. Jaffe E. S., Harris N. L., Stein H., Vardiman J. W. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. - Lyon, 2001.

17. Jeffers M. D., McCorristion J., Farquharson M. A. et al. // Cytopathology. - 2003. - Vol. 8, N 2. - P. 114-120.

18. Orell S. R., SkinnerJ. M. // Pathology. - 2001. - Vol. 14. - P. 389-394.

19. Saddik M., ei Dabbagh L., Mourad W. A. // Diagn. Cytopathol. -2004. - Vol. 16, N 2. - P. 126-131.

20. Tani E., Lowhaagen T., NasiellK. et al. // Acta Cytol. - 2001. - Vol. 331. - P. 359-362.

21. Vianello F., Tison T., Radossi P. et al. // Leuk. Lymphoma. - 2004. -Vol. 29, N 1. - P. 179-185.

22. WHO. Classification of tumours of hematopoietic and lymphoid tissues / Steven H. Swerdlow, Elias Campo, Nancy Lee Harris et al.

- Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2008.

23. Young N. A., Ai-Salem T. I., Ehya H., Smith M. R. // Cancer. - 2002.

- Vol. 84. - P. 252-261.

Поступила 20.12.11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012

УДК 616.155.392.2-036.12-076.5-073.537

Д. Г. Кисиличина1, С. А. Луговская1, М. Е. Почтарь1, Е. В. Наумова1, Б. В. Бидерман2, А. Б. Судариков2, Е. А. Никитин2, В. В. Долгов1

ОСОБЕННОСТИ ОЦЕНКИ ЭКСПРЕССИИ ZAP-70 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ ПРИ В-КЛЕТОЧНОМ ХРОНИЧЕСКОМ ЛИМФОЛЕЙКОЗЕ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИИ

1Кафедра клинической лабораторной диагностики ГБОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования Минздравсоцразвития РФ, 2ФГБУ Гематологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, Москва

Среди всех лимфопролиферативных заболеваний В-клеточный хронический лимфолейкоз (В-ХЛЛ) является самым распространенным и характеризуется значительной вариабельностью клинического течения. Наиболее надежным прогностическим фактором, предсказывающим время до начала терапии при В-ХЛЛ, является мутационный статус генов вариабельного региона тяжелый: цепей иммуноглобулинов (1%¥П'), однако его определение на сегодняшний день остается недоступным для рутинной диагностики. Среди суррогатных маркеров мутационного статуса предлагается использовать показатель экспрессии 1АР-70 опухолевыми клетками В-ХЛЛ, оцениваемый с помощью проточной цитофлюориметрии. В литературе, однако, встречаются разные рекомендации к методике определения указанного маркера. С целью установления оптимального подхода для оценки экспрессии 1АР-70 быти исследованы образцы периферической крови 51 больного В-ХЛЛ и 10 условно здоровых лиц. Сопоставление с результатами определения мутационного статуса 1%УН-генов выявило преимущество использования метода вычисления соотношений МЕ1 при интерпретации данных экспрессии 1АР-70, полученный: с помощью проточной цитофлюориметрии. С использованием указанного подхода показатель экспрессии 1АР-70 можно применять для прогнозирования течения заболевания и времени до начала терапии В-ХЛЛ.

Ключевые слова: В-клеточный хронический лимфолейкоз, прогностические маркеры СБ38 и 1АР-70, проточная цитофлюориметрия

D.G. Kysylytchina, S.A. Lugovskaya, M.Ye. Pochtar, Ye.V. Naumova, B.V. Biderman, A.B. Sudarikov, Ye.A. Nikitin, V.V. Dolgov THE CHARACTERISTICS OF EVALUATION OF EXPRESSION OF ZAP-70 IN TUMOR CELLS UNDER B-CELL CHRONIC LYMPHATIC LEUKEMIA USING THE FLOW CYTOFLUOROMETRY TECHNIQUE The b-cell chronic lymphatic leukemia is the most common among all lymphatic proliferative diseases and is characterized by .significant variability of its clinical course. The mutation status of genes of variable region of heavy chains of immun-noglobulins (IgVH) is the most reliable prognostic factor forecasting time until beginning of treatment in case of b-cell chronic lymphatic leukemia. However, its detection nowadays is inaccessible for routine diagnostics. Among surrogate mark-ers of mutation status the indicator of expression of ZAP-70 by tumor cells esti-mated using flow cytofluorometry. However, in publications there are different guidelines concerning the technique of mentioned marker. To establish the optimal approach to evaluation of expression of ZAP-70 the peripheral blood samples of 51 patients with b-cell chronic lymphatic leukemia and 10 healthy persons were ana-lyzed. The comparison with the results of detection of mutation status of IgVH-genes revealed the advantage of applying the technique of calculation of MFI ratio during interpretation of data of expression of ZAP-70 obtained with flow cytofluo-rometry. In this framework, the indicator of expression of ZAP-70 can be applied in assessing the course of disease and time until the beginning of treatment of b-cell chronic lymphatic leukemia.

Key words: b-cell chronic lymphatic leukemia, prognostic marker CD38 and ZAP-70, flow cytofluorometry

Среди всех лимфопролиферативных заболеваний B-кле-точный хронический лимфолейкоз (B-ХЛЛ) является самым распространенным и характеризуется наибольшей вариабельностью клинического течения: выживаемость после установления диагноза может варьировать от нескольких месяцев до десятилетий [2, 19]. В большинстве случаев B-ХЛЛ выявляют еще в начальной стадии, а лечение, согласно современным стандартам, начинают проводить при появлении признаков прогрессии или на поздних клинических стадиях. В связи с этим при первичной диагностике B-ХЛЛ важным становится определение индивидуального прогноза [4, 28].

Традиционные схемы клинического стадирования (K. Rai, J. Binet) хорошо предсказывают прогноз, но в пределах одной и той же стадии наблюдается значительная гетерогенность клинического течения [20]. Все больше данных свидетельствуют о том, что современная терапия нивелирует прогностическое значение стадий [13]. Наиболее надежным прогностическим фактором, предсказывающим время до начала терапии, срок ремиссии и продолжительность жизни больных B-ХЛЛ, является мутационный статус генов вариабельного региона тяжелых цепей иммуноглобулинов (IgVH). В случае прошедшей в IgVH-генах соматической гипермутации (IgVH+) заболевание характеризуется благоприятным прогнозом, при отсутствии таковой (IgVH-) - быстрым прогрессированием [3, 26]. Вместе с тем определение этого параметра с помощью методов молекулярной генетики на сегодняшний день остается трудоемким и длительным анализом, что ограничивает его применение в рутинной диагностике [22]. Интерес представляет поиск более доступных для широкого внедрения суррогатных маркеров мутационного статуса. Предложенный ранее в качестве прогностического фактора маркер CD38 не обеспечивает высокой корреляции с наличием мутаций IgVH-генов (не более 70% по разным данным литературы), и, кроме того, уровень экспрессии CD38 может изменяться с течением заболевания [14, 24]. Таким образом, использование этого показателя для выделения вариантов IgVH+ и IgVH- B-ХЛЛ затруднено, хотя при этом не отрицается значимость CD38 в качестве самостоятельного прогностического маркера.

Сравнение профилей экспрессии генов при B-ХЛЛ выявило наличие тирозинкиназы ZAP-70 в опухолевых клетках только при отсутствии IgVH- гипермутации, в связи с чем параметр экспрессии ZAP-70 клетками B-ХЛЛ был предложен в качестве суррогатного маркера мутационного статуса [29]. Тирозинкиназа ZAP-70 в норме представлена в Т- и NK-лимфоцитах, эозинофилах и тучных клетках. Она участвует в

Для корреспонденции: Кисиличина Дарья Григорьевна, ст. лаборант Адрес: 123995, Москва, ул. Баррикадная, 2/1 Телефон: 945-82-22 Е-таП:к18ШеЫпа@таП.ги

проведении сигналов с Т-клеточного рецептора (ТСЯ), будучи ассоциированной с ^-цепью рецепторного комплекса [6, 8, 12]. Так, при стимуляции ТСЯ соответствующими лигандами происходит фосфорилирование тирозиновых остатков в составе мотивов тирозинзависимой активации иммунорецеп-торов (так называемых 1ТАМз), с которыми начинает специфически взаимодействовать 2АР-70, в результате чего 2АР-70 фосфорилирует свои субстраты: 2 адаптерных протеина ЬАТ, которые опосредуют дальнейшее проведение сигнала и в конечном счете транскрипцию с определенных генов (рис. 1) [5, 7]. 2АР-70 не экспрессируется в нормальных циркулирующих В-лимфоцитах, основные этапы активации которых связаны с киназой 8ук. При этом сообщается о выявлении 2АР-70 на ранних стадиях В-клеточного развития [15, 27]. Экспрессия 2АР-70 при В-ХЛЛ ассоциируется с усилением передачи сигналов от В-клеточного рецептора (ВСЯ), что в свою очередь может способствовать более тяжелому клиническому течению заболевания [11, 16]. 2АР-70 в отличие от СБ38 демонстрирует стабильность экспрессии с течением времени [22].

Среди доступных технологий определения 2АР-70 проточная цитофлюориметрия наиболее предпочтительна, так как позволяет одновременно измерять экспрессию 2АР-70 в опухолевых клетках и нормальных лимфоцитах одного и того же образца и, что важно, широко применяется в рутинной диагностике В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний [10]. Ряд исследований, проведенных с помощью указанного метода, демонстрирует достоверные различия в уровне экспрессии 2АР-70 опухолевыми клетками для двух вариантов В-ХЛЛ: наличие 2АР-70 при IgVH+ (быстрое про-грессирование, плохой прогноз) и отсутствие тирозинкиназы при IgVH- (индолентное течение, благоприятный прогноз) [16, 17]. В то же время сообщается о расхождении данных экспрессии 2АР-70 и мутационного статуса; при этом процент несоответствия значительно варьирует, составляя 5-25% случаев, по данным разных авторов [9, 21]. Причиной различия результатов оценки экспрессии 2АР-70, вероятнее всего, являются внутриклеточная локализация маркера и его слабая экспрессия при В-ХЛЛ по сравнению с уровнем нормальных Т- и КК-лимфоцитов, а также отсутствие стандартизации методики определения указанного параметра [23]. В оценке 2АР-70 важное значение имеют клон используемых моноклональных антител (МКА) и тип флюорохрома, метод пермеабилизации клеток, стратегия гейтирования и способ представления результатов, в связи с чем интерес представляет сравнение различных методических подходов в определении экспрессии 2АР-70 при В-ХЛЛ [9, 18].

Цель исследования - сравнение результатов оценки экспрессии 2АР-70 опухолевыми клетками В-ХЛЛ при различных вариантах интерпретации данных, полученных с помощью метода проточной цитофлюориметрии.

Исследование проведено у 51 больного В-ХЛЛ (33 мужчины и 18 женщин) в возрасте от 33 до 80 лет (медиана воз-

Рис. 1. Опосредованное 2АР-70 проведение сигнала с ТСЯ [6]. В результате активации тирозинсодержащих последовательностей иммунорецепторов (1ТАМ8) происходит фосфорилирование киназы 2АР-70, которая начинает взаимодействовать с адаптерными протеинами ЬАТ, что опосредует дальнейшее проведение сигнала, транскрипцию с генов и активацию Т-лимфоцитов.

раста составила 62 года). На момент установления диагноза стадия заболевания определялась по системе J. Binet. Стадия А наблюдалась у 7 больных, стадия В - у 38 и стадия С - у 6. Верификация диагноза В-ХЛЛ осуществлялась в соответствии с критериями ВОЗ на основании данных общего анализа крови и иммунофенотипирования лимфоцитов периферической крови. Анализ выполняли при первичной диагностике до получения специфической терапии. Группа сравнения представлена 10 донорами (условно здоровые лица), среди которых 7 мужчин и 3 женщины в возрасте от 18 до 28 лет (медиана возраста составила 22 года).

Материалы и методы. Исследование проводили на проточных цитофлюориметрах FACSCalibur и FACSCanto II (Becton & Dickinson, США - BD) с использованием программного обеспечения CellQuest (BD) и FACSDiva (BD). Первичное иммунофенотипирование осуществляли с применением стандартной методики пробоподготовки [3] и набора МКА (табл. 1), в соответствии с которым опухолевые клетки В-ХЛЛ характеризовались следующим иммунофенотипом: CD45+, CD14-, CD3-, CD16-, CD56-, CD19+, CD5+, CD10-, CD20dim, CD23+, CD43+, CD22dim, CD79bdim, FMC7-, Kappa+ или Lambda+. Позитивной по какому-либо из указанных маркеров считали популяцию, содержащую не менее 20% экспрессирующих антиген клеток.

Оценку экспрессии ZAP-70 производили в течение 24 ч с момента взятия периферической крови, стабилизированной антикоагулянтом К2-ЭДТА или К3-ЭДТА. Подготовка образцов к исследованию включала инкубацию клеток с МКА к мембранным антигенам (CD45, CD5, CD19), лизис эритроцитов (FACSLysing solution, BD), отмывку фосфат-но-солевым буфером (CellWash, BD), премеабилизацию клеток (FACSPermeabilizing Solution 2, BD). После обработки клеток пермеабилизирующим раствором окрашивали внутриклеточный маркер ZAP-70 с помощью МКА FITC-конъюгированных производства BC (клон SBZAP).

Для определения процента экспрессирующих ZAP-70 клеток при В-ХЛЛ параллельно применяли различные стра-

тегии гейтирования. В первом варианте экспрессию ZAP-70 опухолевыми В-клетками сравнивали с экспрессией указанного маркера Т- и NK-лимфоцитами в том же образце крови, выставляя разделитель квадрантов таким образом, чтобы большая часть популяции нормальных Т- и NK-лимфоцитов (положительный контроль) оказалась в позитивной по экспрессии ZAP-70 области. При применении этого подхода возможно получение разных результатов для одной и той же пробы в зависимости от расположения разделителя квадрантов (рис. 2). Для "процентного" метода позитивный по ZAP-70 статус устанавливали при наличии более 20% клеток опухолевого клона, экспрессирующих указанный антиген.

Во втором варианте анализа интерпретация данных основывалась на вычислении соотношений значений средней интенсивности флюоресценции MFI (Mean Fluorescence Intensity) ZAP-70 Т-лимфоцитов к значениям MFI ZAP-70 клеток В-ХЛЛ (рис. 3). Пороговой величиной при оценке этого показателя служило среднее значение соотношений MFI ZAP-70 Т-лимфоцитов к значениям MFI ZAP-70 В-лимфоцитов, определенное для группы доноров (нормальные В-клетки которых не экспрессируют ZAP-70). Величины

Таблица 1

Набор МКА

Флюо-рохром МКА

FITC CD45, CD3, CD20, CD43, CD22, Kappa* Lambda**, FMC7*

PE CD14, CD16+, CD56, CD23, CD10** CD38, CD79b*

PE-Cy5 CD19

PE-Cy7 CD5, CD19

Примечание. Все антитела, если это не указано специально, произведены Beckman Coulter - BC (США); * - антитела производства BD (США); ** - антитела производства Dako (Дания).

Рис. 2. Различие результатов оценки экспрессии 2АР-70 при применении "процентного" метода. а - 1,3% клеток В-ХЛЛ 2АР-70+; б - 13,5% клеток В-ХЛЛ 2АР-70+; с - 46,3% клеток В-ХЛЛ 2АР-70+.

Рис. 3. Оценка экспрессии ZAP-70 при В-ХЛЛ методом вычисления соотношений MFI.

соотношений МИ сравнивали только при условии использования одного вида МКА (постоянство клона антител и типа флюорохрома). Для каждого проточного цитофлюориметра вычисляли индивидуальное значение пороговой величины по результатам исследования контрольной группы. 2АР-70-положительными считали образцы, в которых измеренная величина соотношений МИ 2АР-70 превышала пороговую.

Оценку мутационного статуса ]^УН-генов для 51 больного В-ХЛЛ проводили в лаборатории молекулярной гематологии (зав. - канд. биол. наук А. Б. Судариков) ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России. Из мононуклеаров периферической крови выделяли РНК или ДНК. Из РНК получали кДНК с помощью реакции обратной транскрипции. ДНК или кДНК амплифицировали с использованием праймеров, специфичных к семействам генов тяжелых цепей иммуноглобулинов, указанных в табл. 2. Продуцкт полимеразной цепной реакции после очистки секвенировали с прайме-

ра, специфичного семейству перестроенного VH-гена, или с JHcons с использованием набора Big Dye Terminator 3.1 на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Полученные последовательности анализировали в базе данных IgBlast (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/igblast) [1, 24].

Определение оптимального подхода к оценке экспрессии ZAP-70 проводили путем сопоставления результатов исследования с показателями мутационного статуса. Согласующимися данными считали такие, для которых при варианте IgVH+ экспрессия ZAP-70 в опухолевых клетках не выявлялась, а соответственно при отсутствии мутаций (IgVH-) клетки В-ХЛЛ характеризовались наличием ZAP-70.

Результаты и обсуждение. С помощью метода проточной цитофлюориметрии проведена оценка экспрессии ZAP-70 в лимфоцитах доноров и опухолевых В-клетках 51 больного В-ХЛЛ. Результаты значительно варьировали в за-

Таблица 2

Последовательности праймеров для определения мутационного статуса генов Т§УИ

Таблица 3

Сопоставление методов оценки экспрессии ZAP-70 с показателями мутационного статуса

Источник Праймер Последовательность

VH1.7 5'-CTCACCATGGACTGGACCTGGAG-3'

VH2 5'-

VH3 5'-CCATGGAGTTTGGGCTGAGCTGG-3'

[Campbell] VH4 5'-ACATGAAACA(C\T)CTGTGGTTCTTCC-3'

VH5 5'-ATGGGGTCAACCGCCATCCT(C\T)G-3'

VH6 5'-ATGTCTGTCBCCTTCCTCATCTTC-3'

JHcons 5'-CTTACCTGAGGAGACGGTGAC-3'

VH1-FR1 5'-GGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAG-3'

VH2-FR1 5'-GTCTGGTCCTACGCTGGTGAAACCC-

BIOMED-2 VH3-FR1 5'-CTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTG-

[van Dongen] VH4-FR1 5'-CTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTG-3'

VH5-FR1 5'-CGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGT-3'

VH6-FR1 5'-TCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTG-3'

JHcons 5'-CTTACCTGAGGAGACGGTGACC-3'

Методы оценки статуса гАР-70- IgVH+

"Процентный" метод:

гАР-70+ 4

гАР-70- 6 (12) 12 (23) р = 0,06

Метод соотношений МБ1:

гАР-70+ 4

гАР-70- 11(21) 2 (4) р = 0,001*

Таблица 4

Сопоставление групп больных В-ХЛЛ ^АР-70+ и ZAP-70-) с другими параметрами

Статус по ZAP-70 Число больных Мужчины Возраст, годы Стадия А WBC,  109/л CD38+ B-клетки, %

ZAP-70+ ZAP-70- 38 13 22 (58) 6 (46) 64,4 57,9 4(10,5) 3 (23) 104 68,4 22,8 ± 14 0,4 ± 0,2

висимости от используемого способа представления данных. Полученные с помощью "процентного" метода результаты свидетельствовали об отсутствии экспрессии 2АР-70 в опухолевых клетках у 18 (35%) больных В-ХЛЛ (средний процент 2АР-70+ клеток составлял 6 ± 4%) и наличии маркера в 33 (65%) случаях (41 ± 21% позитивных по 2АР-70 клеток). Сопоставление с показателями мутационного статуса выявило согласующиеся результаты для 35 (69%) случаев при использовании указанного подхода (табл. 3).

Для метода соотношений значений МИ пороговая величина в группе доноров составляла 0,18 ± 0,01 усл. ед. для прибора БАС8СаНЬиг и 0,20 ± 0,01 усл. ед. для прибора РАС8Сап1;о II (во всех случаях соблюдались условия постоянства вида используемых МКА и способа пробоподготов-ки). 2АР-70+ статус определяли у 38 (75%) пациентов при величине соотношений МИ, составляющей 0,34 ± 0,08. В 13 (25%) случаях экспрессия 2АР-70 отсутствовала - величина соотношений МИ составляла 0,16 ± 0,03. При таком подходе согласующиеся с мутационным статусом данные выявляли в 45 (88%) случаях (см. табл. 3).

Сравнение двух вариантов оценки экспрессии 2АР-70 выявило преимущество использования метода вычислений соотношений МИ, обеспечивающего наибольшую корреляцию результатов с показателями мутационного статуса ^УН-генов. Использование значений средней интенсивности флюоресценции предполагает большую объективность подхода, чем визуальное определение границ позитивности относительно популяций нормальных лимфоцитов. Метод обеспечивает достоверно (р = 0,001) различающиеся уровни соотношений МИ для двух групп больных В-ХЛЛ (^УН+ и ^УН-). Диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность метода составили соответственно 94 и 73% в отношении способности предсказывать мутационный статус ^УН- генов.

Примечание. * - р < 0,01. Тест х2 с поправкой Йейтса. Здесь и в табл. 4 в скобках указан процент.

По результатам использования метода вычислений соотношений МИ в 6 (12%) случаях определялось расхождение данных 2АР-70 и показателей статуса ^УН-генов: в 2 случаях экспрессия 2АР-70 выявлялась при варианте ^УН+, а в 2 случаях без соматической гипермутации исследуемая тирозинкиназа в опухолевых клетках отсутствовала. При этом для дискордант-ных наблюдений, характеризовавшихся положительной экспрессией 2АР-70, значения соотношений МИ находились на нижней границе позитивного интервала (0,26 ± 0,02). Таким образом, получение результатов соотношений МИ, близких к пороговой величине, нуждается в более внимательном их рассмотрении. Дальнейшие исследования должны способствовать разрешению вопроса о необходимости выделения, помимо групп 2АР-70+ и 2АР-70-, третьей, промежуточной по экспрессии этого маркера группы как наиболее гетерогенной по прогнозу течения заболевания.

Сопоставление гАР-70+ и гАР-70- больных В-ХЛЛ, выделенных с помощью метода соотношений МИ по таким параметрам, как пол, возраст, стадия I. Вте1;, уровень лейкоцитоза и экспрессия СБ38, выявило различие между группами только по показателю экспрессии СБ38. Этот маркер определялся как позитивный в опухолевых клетках при 2АР-70+ достоверно чаще (р = 0,01), чем при 2АР-70- (табл. 4). При этом экспрессия СБ38 соответствовала показателям мутационного статуса (СБ38+ при ^УН- и СБ38- при ^УН+) лишь у 25 (49%) больных, что подтверждает преимущество использования 2АР-70 по сравнению с СБ38 в прогнозировании мутационного статуса ^УН-генов при В-ХЛЛ.

Выводы. Учитывая определенные особенности экспрессии тирозинкиназы 2АР-70 опухолевыми клетками В-ХЛЛ, оценку этого параметра можно проводить с помощью метода проточной цитофлюориметрии. Наибольшая корреляция 2АР-70 с мутационным статусом ^УН-генов обеспечивается при интерпретации данных путем вычисления соотношений МИ. С использованием указанного подхода показатель экспрессии 2АР-70 можно применять в качестве суррогатного маркера мутационного статуса ^УН- генов для прогнозирования течения заболевания и времени до начала терапии В-ХЛЛ.

Наличие случаев, дискордантных по сочетанию анализируемых факторов, предполагает дальнейшее изучение индивидуальной прогностической значимости экспрессии 2АР-70 опухолевыми клетками при В-ХЛЛ. В связи с участием тирозинкиназы 2АР-70 в передаче сигнала с В-клеточного рецептора (ВСЯ) исследование указанного маркера представляет интерес и с точки зрения поиска мишени для терапии: блокада 2АР-70 может останавливать пролиферацию клеток, экспрессирующих этот маркер.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бидерман Б. В., Никитин Е. А., Судариков А. Б. // Гематол. и трансфузиол. - 2008. - Т. 53, № 5. - С. 67-71.

2. Богданов А. Н., Криволапов Ю. А., Зайцев К. А. и др. // Вопр. онкол. - 2008. - Т. 54, № 1. - С. 7-18.

3. Луговская С. А., Почтарь М. Е., Тупицын Н. Н. Иммунофеноти-пирование в диагностике гемобластозов. - М.: Триада, 2005.

4. СтадникЕ. А., Никитин Е. А., АлексееваЮ. А. и др. // Бюл. сиб. мед. - 2008. - Приложение 3. - С. 41-52.

5. Хаитов Р. М., Игнатьева Г. А., Сидорович И. Г. Иммунология. -М.: Медицина, 2002.

6. Ярилин А. А. Иммунология. - М.: ГЭОТАР-Медия, 2010.

7. Au-YeungB., DeindlS., Hsu L. // Immunol. Rev. - 2009. - Vol. 228. - P. 41-57.

8. Bene M. C. // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2006. - Vol. 70B. - P. 204-208.

9. Best O. // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2006. - Vol. 70B. - P. 235241.

10. Bosch F., Muntanola A., Gine E. // Cytometry B. Clin. Cytom. -2006. - Vol. 70B. - P. 214-217.

11. Chen L., Huynh L., Apgar J. // Blood. - 2008. - Vol. 111. - P. 26852692.

12. Corcoran M., Parker A., Orchard J. // Haematologica. - 2005. - Vol. 90. - P. 1078-1088.

13. Cramer P., HallekM. // Nat. Rev. Clin. Oncol. - 2011. - Vol. 8. - P. 38-47.

14. Crespo M., Villamor N., Gine E. // N. Engl. J. Med. - 2003. - Vol. 348. - P. 1764-1775.

15. Crespo M., Villamor N., Gine E. // Clin. Cancer Res. - 2006. - Vol. 12, N 3. - P. 726-734.

16. Dal-Bo M., Bertoni F., Forconi F. // J. Translational Med. - 2009. -Vol. 7, N 76. - P. 1-14.

17. GachardN., Salviat A., Boutet C. // Haematologica. - 2008. - Vol. 93, N 2. - P. 215-223.

18. Gibbs G. // Clin. Lab. Haematol. - 2005. - Vol. 27. - P. 258-266.

19. HallekM., ChesonB., CatovskyD. et al. // Blood. - 2008. - Vol. 111, N 15. - P. 5446-5456.

20. Hauswirth A. W., Jager U. // Haematologica. - 2008. - Vol. 93, N 1. - P. 14-19.

21. Krober A., Bloehdorn J., Hafner S. // J. Clin. Oncol. - 2006. - Vol. 24. - P. 969-975.

22. Letestu R. // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2006. - Vol. 70B. - P. 309-314.

23. Marti G., Orfao A., Goolsby B. // Cytometry B. Clin. Cytom. - 2006.

- Vol. 70B. - P. 197-200.

24. Montserrat E. // Hematology: Educ. Program of the Am. Soc. Hematol. - 2006. - P. 279-284.

25. NikitinE.A.,MalakhoS. G., BidermanB. V. et al. // Leuk. Lymphoma.

- 2007. - Vol. 48, N 5. - P. 912-922.

26. Principe M. I., Poeta G., Buccisano F. // Blood. - 2005. - Vol. 108, N 3. - P. 853-861.

27. Schweighoffer E., Vanes L., Mathiot A. // Immunity. - 2003. - Vol. 18. - P. 523-533.

28. Shanafelt T. D., Kay N. E. // Hematology: Educ. Program of the Am. Soc. Hematol. - 2007. - P. 324-331.

29. WiestnerA. // Blood. - 2003. - Vol. 101. - P. 4944-4951.

nocTynuna 20.12.11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616-018-006.04-076.5

Т. М. Ярощук, Л. С. Болгова, Т. Н. Туганова, С. В. Мариненко, О. И. Рудая

ЦИТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕЙ МЯГКИХ ТКАНЕЙ ПО ПУНКЦИОННОМУ МАТЕРИАЛУ

Национальный институт рака Минздрава Украины, Киев

Ретроспективный анализ цито- и гистологического сопоставления пункционного материала опухолей мягких тканей выявил совпадение по характеру патологического процесса в 78,72% наблюдений и по генезу новообразований - в 70,21%. Сложность цитологической диагностики обусловлена многообразием гистологических вариантов новообразований и их клеточным сходством. Ошибочная интерпретация, гиподиагностика цитограмм опухолей мягких тканей чаще связана с недостаточной информативностью пункционного материала, а также с недооценкой в ряде случаев характерных морфофункцио-нальных, структурных и фоновых признаков.

Ключевые слова: опухоли мягких тканей, цитологическая диагностика, пункционный материал

T.M. Yaroschyuk, L.S. Bolgova, T.N. Tuganova, S.V. Marinenko, O.I. Rudaya THE CYTOMORPHOLOGIC CHARACTERISTICS OF DIAGNOSTICS OF TUMORS OF SOFT TISSUES ON

PA-RACENTETIC MATERIAL

The retrospective analysis of cytological and histological comparison of paracen-tetic material of tumors of soft tissues revealed matching in character ofpathologic process in 78.72%% of findings and in genesis of neoplasms in 70.21% of findings. The complexity of cytological diagnostics is determined by variety of histologic alternatives of neoplasms and their cell similarity. The erroneous interpretation, hipodiagnostics of cytograms of tumors of soft tissues more often is related to in-adequate informativity ofparacentetic material. In certain cases, this due to under-estimation of distinctive morphofunctional, structural and background indications.

Key words: tumors of soft tissues, cytological diagnostics, paracentetic material

Введение. Большое разнообразие опухолей мягких тканей (ОМТ) часто вызывает значительные затруднения в идентификации определенных морфологических типов по цитологическим препаратам. Современная гистологическая классификация (Лион, 2002) [13] включает в себя 100 типов

Для корреспонденции:

Болгова Лидия Севастьяновна, д-р мед. наук, проф., рук. НИЛ клин. цитологии

Адрес: 03022, Киев-22, ул. Ломоносова, 33/43 Телефон: (044) 257-51-59

доброкачественных поражений, более 50 типов сарком и многочисленные пограничные процессы.

Как правило, комплексное обследование больных с ОМТ основывается на клинических данных, результатах лучевых методов исследования (рентгенологического и ультразвукового исследования, компьютерной томографии, магнитно-резонансной томографии, ПЕТ), позволяющих определить локализацию, размер опухоли, соотношение с окружающими тканями. Названные методы, однако, не позволяют с достоверностью распознать характер опухолевого процесса, его гистогенез и морфологический тип. Эти вопросы можно решить только с помощью