Валидация молекулярно- биологических методов лабораторной диагностики

Валидация молекулярно-Ш \ биологических методов

лабораторной диагностики

Костюк С.А., доктор медицинских наук, доцент, ' главный научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории

Белорусской медицинской академии последипломного образования, Минск

Kastiuk S.A.

Belarusian Medical Academy of Post-Graduate Education, Minsk

Molecular-biological laboratory diagnostics methods validation

Резюме: Проведение процедуры валидации аналитической методики направлено на экспериментальное доказательство того, что данная методика пригодна для достижения тех целей, для которых она предназначена. Для молекулярно-биологических методов диагностики, применяемых в лабораторной практике, оценка надежности, аналитической и диагностической пригодности метода включает определение следующих показателей: специфичность, чувствительность, диапазон применения, прецизионность, правильность, линейность, диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, диагностическая эффективность, прогностическая значимость положительного и отрицательного результатов.

Ключевые слова: валидация, аналитический метод, специфичность, чувствительность, диапазон применения, прецизионность, правильность, линейность.

Summary: Validation of analytical procedure has to prove in experiment that the given assay is suitable for those purposes achievement for which it is intended. For molecular-biological diagnostic methods used in laboratory practice, we need to estimate such factors as specifictty, sensitivity, range, precision, accuracy, linearity, diagnostic sensitivity, diagnostic specificity, diagnostic efficacy, prognostic significance of positive and negative results. Keywords: validation, analytical procedure, spedficity, sensitivity, range, precision, accuracy, linearity.

В современных специализированных лабораториях выполняются сложные анализы, для которых необходимо использование дорогостоящего оборудования и реактивов. Актуальной задачей организации службы клинической лабораторной диагностики является совершенствование технологий, повышение качества выполнения клинических лабораторных исследований, улучшение обеспечения службы современным лабораторным оборудованием и качественными расходными материалами [2].

Молекулярно-биологические лаборатории, в том числе применяющие различные модификации метода полимераз-ной цепной реакции (ПЦР), используют амплификационные технологии, однако оснащенность лабораторий и перечень используемых реактивов варьируют в широких пределах, что обусловливает необходимость стандартизации исследований для гарантии достоверности получаемых результатов [3, 8, 9].

Все аналитические методы подлежат валидации. Главная задача валидации аналитической методики - экспериментальное доказательство того, что данная методика пригодна для достижения тех целей, для которых она предназначена [13, 16].

Результат лабораторных исследований и степень его достоверности

зависят от надежности и аналитической пригодности используемого метода анализа, а также от качества используемых реактивов (тест-систем) [1, 11, 14]. Обязательным требованием к диагностическим лабораторным исследованиям является достоверность получаемых результатов. На мировом рынке существует большое количество наборов реагентов от разных фирм-производи телей, поэтому обеспечение определенного уровня унификации исследований становится необходимым [1, 9, 12].

Все тест-системы, используемые в диагностических лабораториях, можно разделить на два класса: качественные и количественные. При использовании качественных ПЦР-тест-систем для принятия диагностического решения достаточно оценить наличие/отсутствие специфического участка нуклеиновой кислоты в биологическом материале. Количественные тест-системы регистрируют накопления продуктов реакции амплификации в реальном времени, интенсивность сигнала пропорциональна концентрации конечного продукта, что позволяет оценить содержание специфического фрагмента (количество копий) [7].

В зависимости от класса аналитических методик рекомендуется конкретный перечень оценки валидационных параметров [17]. Общие критерии валидации

всех тест-систем: чувствительность, правильность, воспроизводимость, специфичность [10, 15, 17].

С целью стандартизации проводимых молекулярно-биологических исследований и для оценки достоверности получаемых результатов в международной практике предусмотрено использование диагностических панелей, которые позволяют оценить валидационные характеристики применяемых ПЦР-наборов, а также дают возможность проводить в диагностических лабораториях контроль качества [8]. Организация системы внешнего и внутреннего контроля качества работы молекулярно-биологических лабораторий и стандартизация проводимых ими исследований представляют собой проблему ввиду отсутствия на отечественном рынке контрольных материалов.

Валидация используемых в молеку-лярно-биологической диагностике методов является неотъемлемой частью системы контроля качества, которая наряду с использованием статистических методов анализа должна включать оценку пригодности метода для диагностики конкретной патологии, а также учитывать квалификацию сотрудников, качество используемых реактивов, уровень работы оборудования, контроль проведения пре- и постаналитического этапов [6, 8, 9].

Для методов, применяемых в лабораторной диагностике, необходимо оценивать их надежность и аналитическую пригодность, которые характеризуют достоверность результатов, получаемых в результате выполнения исследования. Для оценки используют следующие критерии: специфичность, чувствительность, диапазон применения, прецизионность (сходимость, внутрилабораторная прецизионность, воспроизводимость), правильность (точность), линейность результатов исследования [10, 13, 15].

Специфичность метода характеризует его способность выявлять именно то вещество, для определения которого данный метод исследования предназначен, в определенном материале, в присутствии других компонентов [5, 15]. Для метода ПЦР специфичность основана на том, что с его помощью можно установить наличие определенных (специфических) фрагментов ДНК выбранного объекта (микроорганизм, генетически модифицированные соединения, человек) в исследуемом образце. Специфичность в данном случае позволяет доказать, что идентифицирован именно искомый объект.

Для количественной ПЦР специфичность позволяет доказать, что с использованием методики можно точно и правильно определить содержание именно анализируемого участка нуклеиновой кислоты в образце.

Чувствительность метода в широком смысле определяется как возможность с применением данного метода регистрировать небольшие изменения концентрации исследуемого вещества [4, 5, 13]. Для метода качественной ПЦР чувствительность равноценна пределу обнаружения, т.е. минимальной концентрации ДНК в образце, которую можно обнаружить. Для количественной ПЦР чувствительность метода сопоставима с пределом количественного определения, т.е. с минимальной концентрацией ДНК в образце, которая может быть определена с требуемой правильностью и прецизионностью при выполнении анализа. Необходимо учитывать, что на предел обнаружения, как при качественной, так и при количественной ПЦР3 оказывают влияние способ и эффективность применяемой методики выделения ДНК, чувствительность ПЦР-тест-системы, способ идентификации результата амплификации [18].

Диапазон применения метода (интервал метода) определяется как интервал между минимальной и максимальной концентрациями (количествами) анализируемого вещества в образце (включая

эти концентрации), для которого показано, что аналитическая методика имеет требуемую прецизионность, правильность и линейность [5, 13, 14]. Для метода ПЦР интервал определяется в ходе проведения испытаний по каждому из параметров (прецизионность, правильность, линейность) и выражается в тех же единицах, что и результаты самого аналитического метода.

Прецизионность аналитической методики выражает степень близости (или степень разброса) результатов для серии измерений, выполненных по данной методике на различных пробах одного и того же однородного образца. Прецизионность может рассматриваться на трех уровнях: сходимость, внутрилаборатор-ная прецизионность и воспроизводимость [17]. Прецизионность необходимо изучать на достоверно однородных образцах. Однако если однородный образец получить невозможно, то можно использовать его раствор или модельные смеси [13, 15]. Прецизионность аналитической методики обычно характеризуют дисперсией, стандартным отклонением или относительным стандартным отклонением для серии измерений [18].

Сходимость характеризует прецизионность методики при ее выполнении в одних и тех же условиях (в частности, одним и тем же исследователем или группой) в течение небольшого промежутка времени.

Внутрилабораторная прецизионность характеризует влияние на получаемый результат внутрилабораторных вариаций: различные дни, различные исследователи, различное оборудование и т. д. [11, 15].

Воспроизводимость характеризует прецизионность в межлабораторном эксперименте (совместные исследования, обычно применяемые для стандартизации метода) [10].

Правильность или точность метода характеризует степень соответствия между известным истинным значением или справочной величиной и значением, полученным при использовании данной методики [13, 14].

Линейность характеризует возможность с использованием данной методики, в пределах диапазона ее применения, получать результаты испытаний, прямо пропорциональные концентрации анализируемого вещества в образце [11, 14]. Для ПЦР-методик линейность определяется путем анализа четырех или более образцов, с повторными исследованиями (3-6 раз). Далее выполняется построение линии регрессии с использованием метода наименьших квадратов для ре-

зультатов с различными концентрациями анализируемого вещества от 50 до 150% от планируемых (от 80 до 120% по FDA). Наклон регрессионной линии и коэффициент его вариации позволяют определить степень линейности, для оценки которой необходимо также рассчитать коэффициент корреляции, наклон регрессионной линии и остаточную сумму отклонений. Поскольку отклонения от линейности трудно обнаружить, можно использовать две дополнительные графические процедуры [3, 18].

Первый график должен изобразить взаимосвязь отклонений от линии регрессии и концентрации или логарифмов концентрации, если концентрационный интервал перекрывает несколько десятичных знаков. Для линейных интервалов отклонения должны быть равномерно распределены между положительными и отрицательными значениями. Второй график должен отражать зависимость относительных откликов (отношение сигнала или оптической плотности к соответствующим концентрациям) от концентрации. Полученная линия - линия постоянного ответа - должна быть горизонтальна (нулевой наклон) по полному линейному диапазону, т.е. до точек пересечения с параллельными линиями, соответствующими 95 и 105% значимости. Уравнение линейной регрессии, примененное к результатам, должно иметь отрезок, отсекаемый на координатной оси, близкий к нулю, либо точка пересечения не должна статистически значимо отличаться от нуля [10, 14, 18].

При использовании метода ПЦР в диагностических лабораториях необходимо выявлять и оценивать систематические и случайные погрешности результатов исследований. Источниками погрешностей могут быть внутренние и внешние факторы: несоблюдение условий методики (температура, объем, время), правил приготовления, хранения реактивов, принципа аналитического метода, низкое качество реактивов, калибровочных средств.

Результаты, полученные при оценке вышеперечисленных валидационных показателей, подвергаются статистической обработке с использованием общепринятых статистических критериев. При выборе критерия необходимо учитывать объем выборки и нормальность распределения поученных результатов. Для выборок достаточного объема (>30) с нормальным распределением результатов используют параметрические методы, а для выборок малого объема, с распределением результатов, отличным от нормального, не-

обходимо применять непараметрические методы статистического анализа [13].

Для оценки степени разброса результатов, получаемых с применением методики используют такие статистические показатели, как среднеквадратичное отклонение и относительный показатель разброса результатов - коэффициент вариации. Данные показатели служат характеристикой случайных погрешностей и используются для оценки сходимости и воспроизводимости измерений. При этом чем меньше коэффициент вариации, тем выше воспроизводимость [1, 14].

При сравнении сходимости и воспроизводимости двух методов (рефе-ренс-метод и тестируемый метод) можно использовать и другие статистические критерии ^-критерий, критерий Манна-Уитни, критерий Фишера и др.), которые позволяют сравнить две независимые выборки и сделать вывод о достоверности различий [1, 6, 7, 17].

Для соотнесения данных анализа, полученных в одной лаборатории, с данными, полученными в другой лаборатории и на другой тест-системе, используется коэффициент корреляции и метод линейной регрессии. Метод линейной регрессии более информативен, чем подсчет коэффициента корреляции [14]. Коэффициенты корреляции могут колебаться от 0 до +1 при положительной корреляции и от 0 до -1 при отрицательной корреляции. Если корреляция указывает на степень связи, то регрессия позволяет определить, как количественно меняется один результат по мере изменения другого. Коэффициент регрессии отражает связь между результатами референс-метода и разработанного метода: чем ближе коэффициент регрессии к 1, тем сильнее связь [16].

Сравнение методов позволяет определить общую систематическую погрешность разработанного или тестируемого метода [17]. При сравнении результатов, полученных с использованием референс-метода и разработанного или тестируемого метода, определяют, приводит ли применение нового метода к получению правильных результатов. Статистическая обработка результатов проводится путем оценки степени совпадения результатов с определением значимости различий [5, 16].

Для оценки диагностической значимости результатов молекулярно-био-логических исследований необходимо рассчитывать диагностическую чувствительность (ДЧ), диагностическую специфичность (ДС), диагностическую эффективность (ДЭ), прогностическую

значимость положительного (ПЦ+) и отрицательного (ПЦ-) результатов.

Диагностическая чувствительность -вероятность того, что у пациента будет получен положительный результат теста [9]. Данный показатель является процентным выражением частоты только истинно положительных результатов теста у пациентов с конкретным заболеванием. Диагностическая чувствительность рассчитывается по формуле:

ДЧ = ИП / (ИП+ЛО) х 100%, где ДЧ - диагностическая чувствительность, ИП - истинноположительные результаты теста, ЛО - ложноотрицатель-ные результаты теста.

Диагностическая специфичность теста - это процентное выражение частоты истинно отрицательных результатов теста у лиц, не страдающих конкретным заболеванием [9]. Данный показатель отражает вероятность того, что у здорового человека при исследовании будет получен отрицательный результат. Диагностическая специфичность рассчитывается по формуле:

ДС = ИО / (ИО+ЛП) х 100%, где ДС - диагностическая специфичность, ИО - истинноотрицательные результаты теста, ЛП - ложноположитель-ные результаты теста.

Диагностическая эффективность теста выражается процентным отношением истинных (и положительных, и отрицательных) результатов теста к общему числу полученных результатов [9]. Данный показатель рассчитывается по формуле: ДЭ = ИП+ИО / (ИП+ЛП+ИО+ЛО) х 100%, где ДЭ - диагностическая эффективность, ИП - истинноположительные результаты теста, ИО - истинноотрица-тельные результаты теста, ЛП - ложнопо-ложительные результаты теста, ЛО - лож-ноотрицательные результаты теста.

Прогностическая ценность теста - вероятность наличия (отсутствия) заболевания при известном результате исследования. Прогностическая ценность зависит от чувствительности и специфичности метода диагностики, а также от распространенности заболевания в исследуемой популяции [4, 5].

Распространенность определяется как отношение числа лиц с наличием заболевания (или любого другого состояния) ко всей исследуемой популяции. Распространенность называется априорной (претестовой) вероятностью, т.е. это вероятность выявления болезни до того как стали известны результаты теста. Прогностическая ценность называется апостериорной (посттестовой) вероятностью

заболевания. Чем чувствительнее тест, тем выше прогностическая ценность его отрицательного результата (т.е. возрастает вероятность того, что отрицательные результаты теста отвергают наличие заболевания). Наоборот, чем специфичнее тест, тем выше прогностическая ценность его положительного результата (т.е. возрастает вероятность того, что положительные результаты теста подтверждают предполагаемый диагноз) [5].

Интерпретация прогностической ценности положительного или отрицательного результата теста меняется в зависимости от распространенности заболевания. Если положительные результаты даже высокоспецифичного теста получены в популяции с низкой вероятностью заболевания, то они окажутся преимущественно ложноположительными. В популяции, в которой нет изучаемого заболевания, все положительные результаты будут ложноположительными. Таким образом, когда распространенность заболевания стремится к нулю, прогностическая ценность положительного результата тоже стремится к нулю. Отрицательные результаты высокочувствительного теста, полученные в популяции с высокой вероятностью наличия заболевания, скорее всего, будут ложноотрицательны-ми. В популяции, где заболевание есть у каждого, все отрицательные результаты даже высокочувствительного теста окажутся ложноотрицательными. Когда распространенность стремится к 100%, прогностическая ценность отрицательного результата стремится к нулю [1, 5, 12].

Предсказательная ценность положительного результата теста отражает вероятность того, что у обследованного пациента с положительным результатом теста есть данное заболевание [4]. Данный показатель выражается процентным отношением количества истинно положительных результатов к общему числу положительных результатов, включающему также и ложноположительные. Предсказательная ценность положительного результата теста рассчитывается по формуле:

ПЦ+= ИП / (ИП+ЛП) х 100%, где ПЦ+ - предсказательная ценность положительного результата теста, ИП -истинноположительные результаты теста, ЛП - ложноположительные результаты теста.

Предсказательная ценность отрицательного результата теста отражает вероятность того, что у обследованного пациента с отрицательным результатом теста нет конкретного заболевания, т.е. это процентное отношение истинноотри-

цательных результатов к общему числу отрицательных результатов [9]. Предсказательная ценность отрицательного результата теста рассчитывается по формуле:

ПЦ = ИО / (ИО+ЛО) х 100%, где ПЦ- - предсказательная ценность отрицательного результата теста, ИО -истинноотрицательные результаты теста, ЛО - ложноположительные результаты теста.

Для практического использования в клинической лабораторной диагностике оптимальным является соотношение высокой чувствительности теста (80% и более) с высокой специфичностью (80% и более). Внедрение современных моле-кулярно-генетических методов позволяет решить данную проблему, но требует тщательного подхода к оптимизации методик и актуализирует формирование в молекулярно-генетических лабораториях системы контроля качества, которая отвечала бы международным стандартам. Разработка процедур валидации и системы контроля качества в области молекулярно-биологических методов лабораторной диагностики дадут возможность унифицировать методики для

всех лабораторий на уровне страны, а также помогут оптимизировать систему преемственности ведения пациентов в различных лечебных учреждениях.

Л И Т Е Р А Т У Р А

1. Жданова, В.В. Критерии оценки методов исследования / В.В. Жданова // Совершенствование качества работы клинико-диагностических лабораторий: метод. пособие ЗАО «Вектор-Бест». - Коль-цово, 1999. - С. 1-5.

2. Камышников, В.С. Стратегия и тактика развития национальной службы клинической лабораторной диагностики / В.С. Камышников // Мед. новости. -2008. - №7. - С. 9-11.

3. Кишкун, A.A. Современные технологии повышения качества и эффективности клинической и лабораторной диагностики. - Москва: РАМЛД, 2005. - 527 с.

4. Кишкун, A.A. Руководство по лабораторным методам диагностики. - М: ГЭОТАР-Медиа, 2007. -800 с.

5. Клиническая лабораторная аналитика: в 5 томах / под ред. В.В. Меньшикова. - М: Агат-Мед, 2002.

6. Контроль качества клинических лабораторных исследований: практ. рук-во / Е.Т. Зубовская, Н.Л. Сергейчик, С.Г. Светлицкая, А.Б. Ходюкова. -Минск: БГУФК, 2009. - 119 с.

7. Масяго, А.В. Особенности количественных тест-систем / А.В. Масяго // Новости «Вектор-Бест». -2004. - № 1.

8. Меньшиков, В.В. Качество клинических лабораторных исследований / В.В. Меньшиков. - М., 2002. - 304 с.

9. Меньшиков, В.В. Стандартизация в клинической лабораторной медицине. Организационные и

метрологические аспекты / В.В. Меньшиков - М., 2005. - 251 с.

10. Методические указания. Производство лекарственных средств. Валидация. Основные положения.- М., 2001. - 16 с.

11. Методы клинических лабораторных исследований: Учебник / В.С. Камышников, О.А. Волотовская, А.Б. Ходюкова и др.; под ред. В.С. Камышникова / 3-е изд., перераб. и доп. - М.: МЕДпресс-информ», 2009. - 752 с.

12. Организация клинической лабораторной службы: практ. рук-во / В.С. Камышников, Н.Л. Сергейчик, Е.Т. Зубовская. - Минск: БГУФК. - 2009. - 139 с.

13. Практикум по GMP. Валидация аналитических методик: теория и практика. Часть 1. / П. Носырев, М. Носырева, Т. Рассказова, Н. Корнеева // Ремедиум. - 2003. - №10. - С. 69-71.

14. Производство лекарственных средств. Валида-ция. Основные положения: метод. указания. - М., 2001.

15. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств / В.П. Юргель, А.Л. Мла-денцева, А.В. Бурдейна, М.А. Гетьмана // Ассоциация Рос. фарм. производителей. - М., 2007. - 58 с.

16. Green, J.M. Practical guides to analytical method validation / I.M. Green // Anal. Chem. News and Features. - 1996. - May, 1. - P. 305A-309A.

17. Validation of Analytical Procedures: Methodology // VICH GL2 (Validation Methodology). - October 1998. -P. 1-10.

18. Vovelgesang, J. Limit of detection, identification and determination: a statistical approach for practitioners / J. Vovelgesang, J. Hadrich // Accred. Qual. Assur. -1998. - Vol. 3. - P. 242-255.

Поступила 11.01.2012 г.

К СВЕДЕНИЮ АВТОРОВ И РЕКЛАМОДАТЕЛЕЙ

Среди основных задач журнала «Медицинские новости» - целенаправленное и гарантированное продвижение статей, авторов, идей, новых технологий, лекарственных препаратов и медицинской техники; повышение цитируемости статей и их авторов посредством возможностей научного периодического издания и сайта www.mednovosti.by, использующих современные информационные PR-технологии.

Продвижение информационных материалов осуществляется следующим образом:

1. Ваши статьи и информационные материалы размещаются в базе данных Научной электронной библиотеки eLIBRARYru (Москва), единственной в странах СНГ, анализирующей цитируемость включенных в нее журналов и статей.

По данным этой библиотеки, журнал «Медицинские новости» - самое высокоцитируемое периодическое издание среди журналов медицинского профиля в Беларуси. Таким образом, публикуясь в журнале «Медицинские новости», Вы автоматически становитесь автором крупнейшего научного информационного ресурса сети Интернет и, как следствие, повышаете свою цитируемость и читаемость в зарубежных странах (услуга бесплатная).

2. Тексты Ваших статей в полном объеме и информационные материалы как из текущего номера, так и опубликованные в номерах предыдущих лет, могут быть размещены на сайте www.mednovosti.by в разделе «Архив МН». По данным Google Analitics, только в марте 2012 года наш сайт посетили более 98 600 уникальных пользователей из 100 стран мира (услуга платная, тексты размещаются для постоянного доступа).

3. В разделе «Новости» на главной странице сайта www.mednovosti.by дважды в квартал может быть размещен PR-реферат статьи или информационного материала, опубликованного в любом номере журнала, с активной ссылкой на полный текст статьи или информационного материала, размещенных в «Архиве МН» на сайте www.mednovosti.by (услуга платная).

4. Информация о Ваших монографиях, статьях, патентах, зарегистрированных в РБ лекарственных препаратах и медицинской технике, об учреждениях, фирмах и предприятиях может стать доступной любому посетителю сайта www. mednovosti.by с помощью баннеров, обеспечивающих выход на развернутый рекламный текст (услуга платная).

Подробнее об этих и других услугах - на сайте www.mednovosti.by.

Заявки присылайте на адрес e-mail: redakcia@tut.by или звоните: (017) 226-03-95; (029) 695-94-19.