Способ получения ферментативных гидролизатов бактерий Methylococcus capsulatus
METHOD FOR OBTAINING ENZYMATIC HYDROLYSATES OF BACTERIA METHYLOCOCCUS CAPSULATUS

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в промышленности для получения кормовой добавки, содержащей белок, аминокислоты, пептиды, витамины, микроэлементы, полисахариды.
Биомассу бактерий Methylococcus capsulatus используют в качестве белково-витаминной добавки при производстве комбикормов для с/х животных. Следует отметить, что усвоение питательных веществ моногастричными животными из биомассы Methylococcus capsulatus затруднено из-за наличия в них прочной бактериальной клеточной стенки. Ультраструктурные исследования показали, что Methylococcus capsulatus имеет грамотрицательную трехслойную клеточную оболочку с внутренней цитоплазматической мембраной, покрытой слоем пептидогликана и внешней мембраной (Smith, Una, Douglas W. Ribbons, and David S. Smith. "The fine structure of Methylococcus capsulatus." Tissue and Cell 2.4 (1970), c. 513-520). Однако внешняя мембрана Methylococcus capsulatus отличается от других грамотрицательных бактерий, т.к. содержит в своем составе как гопаноиды, так и стерины (Ourisson, Guy, Michel Rohmer, and Karl Poralla. "Prokaryotic hopanoids and other polyterpenoid sterol surrogates." Annual Reviews in Microbiology 41.1 (1987), c. 301-333). Эти необычные виды липидов сосуществуют с липополисахаридами и фосфолипидами в наружной мембране, и их присутствие может быть объяснено проблемами, связанными с ростом на гидрофобных соединениях (Jahnke, Linda L., et al. "Presence of methyl sterol and bacteriohopanepolyol in an outer-membrane preparation from Methylococcus capsulatus (Bath)." Microbiology 138.8 (1992), c. 1759-1766).
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату (прототипом) является способ получения ферментолизатов бактерий Methylococcus capsulatus (патент РФ №2700079, A23J 3/20, опубл. 12.09.2019), характеризующийся тем, что суспензию бактерий Methylococcus capsulatus помещают в реактор и добавляют ферментный препарат. В качестве ферментного препарата используют протосубтилин в количестве 4500-6000 единиц активности на 1 кг абсолютно сухой биомассы бактерий. Процесс ферментолиза ведут при температуре 55-60°С в течение 2 часов.
К недостаткам данного способа можно отнести низкий уровень ферментного гидролиза и высокие затраты на нагрев и термостатирование культуры на стадии гидролиза. Максимальная активность протосубтилина проявляется в температурном диапазоне от 30°С до 45°С, и рН в пределах 5,5-6,5. Таким образом, оптимальная температура действия ферментного препарата лежит в значительно более низкой области, а при температуре 55-60°С протосубтилин обладает низкой удельной активностью. Из чего можно сделать вывод, что по известному способу основной гидролиз клеток Methylococcus capsulatus происходит за счет нагревания и выдерживания при 60°С, а протосубтилин воздействует лишь в незначительной степени, что приводит к большим энергозатратам. Кроме того, ферментный препарат протосубтилин содержит несколько ферментов: щелочные и нейтральные протеиназы, ксиланаза, альфа-амилаза, целлюлаза и другие. Следовательно, под воздействием протосубтилина не происходит разжижения липидного слоя внешней мембранной оболочки Methylococcus capsulatus, т.к. в состав ферментного препарата не входит липаза.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа, обеспечивающего ферментативный гидролиз липидного слоя внешней мембранной оболочки Methylococcus capsulatus.
Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является повышение эффективности ферментативного гидролиза бактерий Methylococcus capsulatus за счет разжижения липидного слоя внешней мембранной оболочки бактерий, а также за счет снижения затрат на нагрев и термостатирование культуры на стадии гидролиза.
Указанный технический результат достигается за счет того, что в способе получения ферментативных гидролизатов бактерий Methylococcus capsulatus, включающем ферментативный гидролиз суспензии бактерий Methylococcus capsulatus в присутствии протосубтилина, протосубтилин используют совместно с липазой. При этом протосубтилин используют в количестве 1500-2000 единиц активности на 1 кг абсолютно сухой биомассы бактерий, липазу - в количестве 5000-6000 единиц активности на 1 кг абсолютно сухой биомассы бактерий. Процесс ферментативного гидролиза осуществляют при температуре 37-45°С в течение 1 часа.
Использование липазы позволяет эффективнее расщепить внешнюю мембранную оболочку. Оптимум действия липазы лежит в области рН 6,0-8,0 ед. Протосубтилин позволяет расщепить внутриклеточный белок бактерий до водорастворимых пептидов и аминокислот, которые эффективнее усваиваются моногастричными животными. Оптимальная температура действия ферментов липазы и протосубтилина соответствует температуре кишечно-желудочного тракта моногастричных животных (37-45°С).
По предлагаемому способу процесс ферментативного гидролиза осуществляют следующим образом: в терморегулируемый реактор помещают суспензию бактерий Methylococcus capsulatus, ферменты липазу 5000-6000 ед. активности на 1 кг АСБ и протосубтилин 1500-2000 ед. активности на 1 кг АСБ. Ферментативный гидролиз бактериальной биомассы сопровождается увеличением вязкости получаемой суспензии. Во избежание дополнительного разбавления ферментолизата перед высушиванием на распылительной сушилке, концентрацию исходной бактериальной суспензии берут 10-15 мас. % по АСБ. Смесь перемешивают при температуре 37-45°С и рН 6,0-6,5 в течение 1 часа. После проведения гидролиза биомассу направляют на распылительную сушку. После высушивания остаточные количества ферментов в высушенном белково-витаминном препарате проявляют свою активность при использовании препаратов в кормлении с/х животных.
Осуществление предлагаемого изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1.
3
К 15 литрам суспензии бактерий Methylococcus capsulatus ВКПМ В-13479 с массовой долей сухих веществ 10-15% в слабо кислой среде с рН 6,0-6,5 ед. добавили протосубтилин в количестве 6000 ед. активности на 1 кг АСБ. Процесс ферментативного гидролиза проводили при температуре 37°С, в течение 3 часов. При этом каждый час отбирали 5 литров суспензии и высушивали ее на распылительной сушилке. Сушку проводили при температуре входящего воздуха 120°С со скоростью 30 м/час. В результате были получены 3 гидролизата (п. 1 Таблицы).
Пример 2.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 37°С как описано в примере 1, но в качестве фермента использовали протосубтилин в количестве 1500 ед. активности на 1 кг АСБ.
Пример 3.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 45°С как описано в примере 1, но в качестве фермента использовали протосубтилин в количестве 2000 ед. активности на 1 кг АСБ.
Пример 4.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 40°С как описано в примере 1, но в качестве ферментов использовали совместно протосубтилин в количестве 1000 ед. активности и липазу в количестве 4500 ед. активности на 1 кг АСБ.
Пример 5.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 42°С как описано в примере 1, но в качестве ферментов использовали совместно протосубтилин в количестве 1500 ед. активности и липазу в количестве 5000 ед. активности на 1 кг АСБ.
Пример 6.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 45°С как описано в примере 1, но в качестве ферментов использовали совместно протосубтилин в количестве 1500 ед. активности и липазу в количестве 6000 ед. активности на 1 кг АСБ.
Пример 7.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 45°С как описано в примере 1, но в качестве фермента использовали совместно протосубтилин в количестве 1500 ед. активности и липазу в количестве 6500 ед. активности на 1 кг АСБ.
Пример 8.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 45°С как описано в примере 1, но в качестве фермента использовали совместно протосубтилин в количестве 2000 ед. активности и липазу в количестве 4500 ед. активности на 1 кг АСБ.
Пример 9.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 37°С как описано в примере 1, но в качестве фермента использовали совместно протосубтилин в количестве 2000 ед. активности и липазу в количестве 5000 ед. активности на 1 кг АСБ.
Пример 10.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 40°С как описано в примере 1, но в качестве фермента использовали совместно протосубтилин в количестве 2000 ед. активности и липазу в количестве 6000 ед. активности на 1 кг АСБ.
Пример 11.
Ферментативный гидролиз проводили при температуре 45°С как описано в примере 1, но в качестве фермента использовали совместно протосубтилин в количестве 2500 ед. активности и липазу в количестве 6500 ед. активности на 1 кг АСБ.
Сравнительные показатели процесса ферментативного гидролиза бактерий Methylococcus capsulatus приведены в таблице.
Как видно из таблицы, ферментативный гидролиз при оптимальной температуре 37-45°С и рН среды 6,0-6,5 ед. проходит эффективно, как при количестве протосубтилина 6000 ед. активности на 1 кг АСБ, так и при меньшем количестве (1500-2000 ед. активности на 1 кг АСБ). При этом содержание аминного азота в ферментолизате сопоставимо с данными, приведенными в прототипе. Использование высокой концентрации протосубтилина не обеспечивает значительного увеличения целевых показателей, а приводит к повышению затрат на нагрев и термостатирование культуры на стадии гидролиза.
Необходимо отметить, что увеличение времени обработки более 1 часа не оказывает существенного влияния на выход водорастворимых веществ и аминного азота в ферментализате.
Совместное использование ферментов протосубтилина и липазы позволяет с большей эффективностью проводить ферментативный гидролиз.
Так, использование совместно ферментов липазы и протосубтилина в количестве 5000-6000 ед. активности и 1500-2000 ед. активности на 1 кг АСБ, соответственно, позволяет расщепить липидный слой внешней мембранной оболочки бактерий Methylococcus capsulatus в довольно мягких условиях (37-45°С) в течение 1 часа и повысить выход водорастворимых веществ до 88 мас. %, а аминного азота до 2,77 мас. %, в результате чего улучшается нутриентный состав белково-витаминной добавки для комбикормов и степень его усвояемости.