Экспрессия генов Toll-подобных рецепторов слизистой цервикального канала при нормальной и патологически протекающей беременности

акушерство. патология беременности и родов

Экспрессия генов Toll-подобных рецепторов слизистой цервикального канала при нормальной и патологически протекающей беременности

Л.В.Ганковская2, Л.В.Ковальчук2, И.В.Бахарева1, П.А.Кузнецов1, О.А.Ганковская3, В.В.Романовская1, Д.Д.Карташов2, О.В.Макаров1

'Российский государственный медицинский университет, кафедра акушерства и гинекологии лечебного факультета, Москва

Целью исследования была оценка состояния врожденного иммунитета слизистой цервикального канала у беременных женщин по сравнению с небеременными и определение прогностической ценности этих показателей в плане развития преждевременных родов. Нами были обследованы 59 пациенток: 31 - с угрозой преждевременных родов, 14 пациенток с физиологическим течением беременности и 14 здоровых небеременных пациенток репродуктивного возраста во второй фазе менструального цикла. Уровень экспрессии генов Toll-подобных рецепторов (TLRs) определялся методом обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени. Выявлено, что экспрессия TLR1, TLR2 и TLR6 на фоне беременности значительно возрастает. Гиперэкспрессия TLR2 и TLR6 предшествовала преждевременным родам. Ключевые слова: преждевременные роды, врожденный иммунитет, Toll-подобные рецепторы

Expression of genes Toll-like receptors in the mucosa of cervical canal at normal and pathological pregnancy

L.V.Gankovskaya2, L.V.Kovalchuk2, I.V.Bakhareva1, P.A.Kuznetsov1, O.A.Gankovskaya3, V.V.Romanovskaya1, D.D.Kartashov2, O.V.Makarov1

'Russian State Medical University, Department of Obstetrics and Gynecology of Medical Faculty, Moscow (Head of the Department - Prof. O.V.Makarov);

2Russian State Medical University, Department of Immunology, Moscow

Nature immunity is a system of protective mechanisms which exists in the organism before it meets any allogenic substance. The aim of our research was to evaluate cervical mucous nature immunity status in pregnant and non-pregnant women and to determine the predictive value of these measures for preterm labor. 59 women were examined: 31 with threatening preterm labor, 14 with normal pregnancy and 14 healthy non-pregnant women in luteal phase of menstrual cycle. The expression of TLR genes was assessed by means of reverse transcription and real time PCR. Expression of TLR2 increases significantly during pregnancy. Hyperexpression of TLRs precedes preterm labor. Key words: Toll-like receptors (TLR), nature immunity, cervical mucous, preterm labor

Для корреспонденции:

Кузнецов Павел Андреевич, аспирант кафедры акушерства

и гинекологии лечебного факультета

Российского государственного медицинского университета

Адрес: 103287, Москва, 4-й Вятский пер., 39

Телефон: (499) 613-0957

E-mail: poohsmith@mail.ru

Статья поступила 02.02.2009 г., принята к печати 08.04.2009 г.

Знания об изменениях иммунного статуса женщины во время беременности важны не только с теоретической точки зрения. Иммунные сдвиги являются центральным звеном патогенеза многих осложнений гестационного процесса [1, 2].

Считается, что состояние иммунной системы во многом определяет исход беременности. В частности, показано,

что повышение уровней провоспалительных цитокинов в плазме интерлейкина 1р (ИЛ-1Р), фактора некроза опухоли а (ФНОа), интерферона у (ИФу) в плазме предшествует прерыванию беременности [3].

В недалеком прошлом широко было распространено мнение об общей иммуносупрессии во время беременности. На современном этапе основная роль в иммунной защите организма беременной женщины отводится механизмам врожденного иммунитета.

Открытия в области врожденного иммунитета позволили с новой стороны посмотреть на иммунный «парадокс» беременности. Биологически активные вещества, вырабатываемые плацентой, смещают равновесие между звеньями иммунной системы матери, снижая активность адаптивного иммунитета и активируя врожденный иммунитет [3, 4].

Врожденный иммунитет является системой защитных механизмов, присутствующих в организме до встречи с каким-либо болезнетворным агентом или чужеродной молекулой. Механизмы врожденного иммунитета действуют немедленно и являются наиболее ранним ответом на инфекцию. Основными клетками, реализующими механизмы врожденного иммунитета, являются макрофаги, нейтро-филы, а также натуральные (или естественные) киллеры. Неспецифическую защиту организма обеспечивают также многочисленные молекулы, продуцируемые и секретируе-мые вышеназванными клетками, эпителиальными клетками и клетками печени (белки системы комплемента, цито-кины, противомикробные пептиды и т.д.) [5].

В последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в понимании процессов взаимодействия между системами врожденного и адаптивного иммунитета. Значительным шагом в этом направлении послужило открытие То11-подобных рецепторов (Toll-like receptors - TLRs) [6, 7]. TLRs экспрессируются на макрофагах, нейтрофилах, естественных киллерах, дендритных клетках и др. и распознают высококонсервативные типовые молекулы, свойственные целым группам микроорганизмов. После описания первого TLR идентифицировано множество лигандов этих рецепторов.

Активность TLR2 обусловливается воздействием разнообразных, структурно несвязанных лигандов, таких как ли-потейхоевая кислота, пептидогликаны или липопептиды грамположительных бактерий, спирохет и микобактерий. Эта способность частично объясняется образованием функциональных гетеродимеров TLR2 и других членов семейства TLRs (TLR1 и TLR6) [8].

Считается, что экспрессия TLRs возрастает на фоне локального внедрения патогенов [9, 10].

Целью нашего исследования была оценка экспрессии TLR1, TLR2 и TLR6 слизистой цервикального канала у беременных женщин по сравнению с небеременными и определение прогностической ценности этого показателя в плане развития преждевременных родов.

Нами были обследованы 59 пациенток, разделенных на 3 группы. В основную группу вошли пациентки (31) в сроке беременности 26-32 нед с диагнозом: «угроза преждевременных родов». Критерий включения - наличие уроге-нитальных инфекций, выявленных методом ПЦР. Критериями исключения были: кровянистые выделения из поло-

вых путей, патология щитовидной железы, гиперандроге-ния, острые инфекционные, воспалительные или аутоиммунные заболевания в течение менее 4 нед после наступления полной клинической и лабораторной ремиссии. Кроме того из исследования были исключены пациентки с выявленным бактериальным вагинозом. У данной категории больных экспрессия ИЯв была запредельно высокой.

В группу сравнения были включены 14 пациенток с физиологическим течением беременности в сроке 26-32 нед без урогенитальных инфекций.

Контрольную группу составили 14 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста во второй фазе менструального цикла.

Взятие материала осуществляли при помощи церви-кальных цитощеток «Юнона» путем однократного циркулярного движения в цервикальном канале. Из полученного материала выделяли общую РНК методом кислофе-нольной экстракции. После чего проводили реакцию обратной транскрипции кДНК интересовавших нас генов (Т1_Я2 и Т1_Я6) на матрице мРНК с последующим определением количества копий кДНК при помощи ПЦР в реальном времени относительно 106 копий р-актина [11]. Таким образом, оценивали экспрессию генов Т1_Я1, Т1_Я2 и Т1_Я6. Статистическую обработку ввиду неодинаковой дисперсии проводили с применением критерия Ман-на-Уитни при помощи программы «Биостат» издательства «Практика».

При оценке показателей беременных и небеременных женщин было выявлено, что экспрессия Т1_Я2 на фоне беременности значительно возрастает. Аналогичным образом менялась экспрессия Т1_Я1 и Т1_Я6 (табл. 1). Эти показатели полностью подтверждают мнение о том, что физиологическая беременность протекает на фоне активации врожденного иммунитета. Данные изменения локального иммунитета создают барьер для инфекционных агентов между влагалищем и маткой.

Сравнивая показатели врожденного иммунитета беременных с физиологически протекающей беременностью и беременных с угрозой преждевременных родов, мы обнаружили, что средний уровень экспрессии генов ТЬЯэ в ос-

Таблица 1. Показатели экспрессии генов TLR1, TLR2 и TLR6 в слизистой цервикального канала у обследованных женщин

Исследуемые группы Показатели (количество копий кДНК по отношению к 106 копий р (актина) Т1_т Т1_В2 Т1_В6

Здоровые (1,2 ± 0,63) х 104 (0,04 ± 0,012) х 106 (4,1 ± 1,1) х 104 небеременные, п = 14

Здоровые (9,7 ± 1,2) х 104* (1,21 ± 0,48) х 106* (11,0 ± 2,73) х 104 *

беременные,

п= 14

Беременные (96,9 ± 12,3) х 104** (7,01 ± 4,02) х 106** (7.4 ± 4,8) х 104

с УГИ, п = 31

Беременные (11,9 ± 5,18) х 106** (9,95 ± ,44) х 104***

с УГИ: прежде-

временные

роды, п = 13

Беременные (3,17 ± 2,18) х 106 ** (2,39 ± 0,06) х 104

с УГИ: срочные

роды, п = 18

*р < 0,05, по сравнению со здоровыми небеременными женщинами;

"р < 0,05 по сравнению со здоровыми беременными;

***р < 0,05 по сравнению с носителями УГИ, родившими в срок.

Л.В.Ганковская и др. / Вестник РГМУ, 2009, №4, с. 34-37

новной группе был выше, чем у здоровых беременных женщин. Экспрессия гена Т1_Я2 возрастала примерно в 6 раз, Т1_Я1 приблизительно в 9 раз. Экспрессия Т1_Я6 практически не менялась. Вполне вероятно, повышение экспрессии Т1_Я1 и Т1_Я2 в ответ на внедрение инфекционных агентов и активация цитокинового каскада являются одним из звеньев патогенеза повышения тонуса миометрия при угрозе преждевременных родов.

Все пациентки основной группы получали стандартное комплексное лечение, направленное на пролонгирование беременности (токолиз в-миметиками, магнезиальная терапия). Несмотря на это у 13 женщин из 31 (41,94%) беременность закончилась преждевременными родами в сроках 29-37 нед, остальные 18 (58,06%) родили в срок. При сравнении показателей врожденного иммунитета слизистой цер-викального канала пациенток этих двух групп было выявлено, что у женщин, родивших преждевременно, в среднем была повышена экспрессия Т1_Я2 ((11,907 ± 5,178) х 106 копий кДНК по сравнению с (3,168 ± 2,18) х 106 копий у родивших в срок, р = 0,1)), также повышалась и экспрессия Т1_Я6 ((9,95 ± 0,44) х 104 и (2,39 ± 0,06) х 104 копий кДНК, р < 0,05)). Данные показатели свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия ТЬЯэ в ответ на проникновение инфекционного агента приводит к преждевременному прерыванию беременности.

При сравнении показателей врожденного иммунитета слизистой цервикального канала беременных с урогени-тальными инфекциями, родивших в срок, и здоровых беременных было показано, что уровень Т1_Я2 был практически идентичен ((3,17 ± 2,18) х 106 по сравнению с (1,2 ± ± 0,48) х 106 копий кДНК). Таким образом, беременность пролонгируется, если в ответ на внедрение инфекционного агента уровень Т1_Я2 остается неизменным, препятствуя проникновению возбудителя в матку, но не приводя к гиперактивации иммунных механизмов.

Сводные данные об изменении экспрессии Т1_Я2 в слизистой цервикального канала представлены на рисунке. Цифровые значения показателей приведены в табл. 1. Как видно из рисунка, при наличии урогенитальных инфекций

12 г

10

Небеременные Здоровые беременные

Беременные

с УГИ, срочные роды

Преждевременные роды

Таблица 2. Коэффициенты корреляции уровней экспрессии генов и и в группах исследования

Группы П-В2/Т1.т Уровень Т-ИаТ!^ Уровень

значимости а значимости а

Здоровые небеременные Я = 0,9445 0,001 Я = 0,830 0,005 Здоровые беременные Я = 0,9996 0,001 Я = 0,982 0,005 Беременные с УГИ Я = 0,9648 0,001 Я = 0,826 0,001

Таблица 3. Коэффициенты детерминации уровней экспрессии генов TLR1 и и в группах исследования

Группы TLR2^LR1 Здоровые небеременные 0,8921 TLR2^LR6 0,6889 0,9643

Беременные с УГИ 0,9308 0,6823

Рисунок. Экспрессия TLR2 в слизистой цервикального канала

(по оси ординат - количество копий кДНК х 106 по отношению к 106 копий в-актина).

отмечается незначительное повышение экспресии гена TLR2, что создает достаточный барьер для восходящего инфицирования. В случае же гиперэкспрессии гена TLR2 в ответ на проникновение инфекции, вероятно, запускается цитокиновый каскад, приводящий к разворачиванию родовой деятельности.

При статистической обработке данных была установлена статистически значимая корреляция между уровнем экспрессии TLR2 и TLR1, TLR2 и TLR6 для трех исследуемых групп (значения коэффициентов корреляции по Пирсону и уровней значимости а приведены в табл. 2), что доказывает наличие практически прямолинейной зависимости между изменением экспрессии TLR2 и TLR1, TLR6 и TLR2 является косвенным подтверждением димеризации указанных рецепторов.

Для анализа силы линейной связи между переменными были вычислены коэффициенты детерминации (табл. 3). Как видно из табл. 3, наиболее тесная зависимость наблюдалась между изменением уровня экспрессии TLR2 и TLR1 (чем ближе значение коэффициента детерминации к 1, тем сильнее связь между переменными).

Таким образом, можно сказать, что патогены взаимодействуют с клетками слизистой с участием различных комбинаций TLRs. В результате стимуляции индуцируется уникальный вариант клеточной активации, приводящий к различным эффектам: выработке цитокинов и противоми-кробных пептидов, апоптозу. Механизмы патоген-специфической активации требуют дальнейшего изучения.

На фоне беременности экспрессия TLR1, TLR2 и TLR6 значительно возрастает. Гиперэкспрессия TLR2 и TLR6 предшествует преждевременным родам. Статистически значимая корреляция между экспрессией TLR1 и TLR2, а такжеTLR2 и TLR6 косвенно подтверждает димеризацию этих рецепторов.

Продолжение исследований показателей врожденного иммунитета при нормальной и патологически протекающей беременности позволит открыть возможности для прогнозирования преждевременных родов и проведения своевременной патогенетической терапии.

Литература

1. Кулаков В.И., Мурашко Л.Е. Преждевременные роды. - М.: Медицина, 2002.

2. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Бахарева И.В., Ганковская О.А. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет. - М.: Гэ-отар-медиа, 2007.

8

6

4

2

0

3. Павлов О.В., Сельков С.А. Иммунология репродукции: старые догмы и новые представления // Журн. акуш. и женск. бол. - 2004. - Т.53. - Вып . 1. - С.89-9.7

4. Сидельникова В. М. Актуальные проблемы невынашивания беременности. -М., 2001. - 168.

5. Patni S., Flynn P., Wynen L.P., Seager A.L., Morgan G., White J.O., Thornton C.A. An introduction to Toll-like receptors and their possible role in the initiation of labour // BJOG. - V.114 (11). - P.1326-1334.

6. Ilievski V., Lu S.J., Hirsch E. Activation of Toll-like Receptors 2 or 3 and Preterm Delivery in the Mouse // Reproductive Sciences. - 2007. - V.14. - №4. -P.315-320.

7. Kim Y., Romero R., Chaiworapongsa T., Kim G., Kim M., Kuivaniemi M., Tromp G., Espinoza J., Bujold E., Abrahams V. Toll-like receptor-2 and -4 in the chorioamni-otic membranes in spontaneous labor at term and in preterm parturition that are associated with chorioamnionitis // American Journal of Obstetrics and Gynecology. - 2004. - V.191. - Issue 4. - P.1346-1355.

8. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. Врождённые компоненты иммунитета: ТоН-подобные рецепторы в норме и при патологии // ЖМИ. - 2005. -№4. - С.96-104.

9. Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Ганковская О.А., Макаров О.В., Лавров В.Ф., Карташов Д.Д., Кузнецов П.А. Экспрессия противомикробных пептидов клетками слизистой оболочки цервикального канала и нейтрофилами периферической крови у беременных с урогенитальной инфекцией // Вестник РГМУ. -2008. - №5. - С.26-29.

10. Peltier M.R. Immunology of term and preterm labor // Reprod. Biol. Endocrinol. -2003. - Dec. - V.2. - P.122.

11. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. - М.: Мир, 1999.

Информация об авторах:

Ганковская Людмила Викторовна, доктор медицинских наук, профессор

кафедры иммунологии медико-биологического факультета

Российского государственного медицинского университета

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-9000

Б-таИ: gan@rsmu.ru

Макаров Олег Васильевич, доктор медицинских наук,

профессор, заведующий кафедрой акушерства и гинекологии лечебного

факультета Российского государственного медицинского университета

Адрес: 117303, Москва, ул. Азовская, 22

Телефон: (499) 613-5640

Б-таИ: profmakarov@gmail.com

Ковальчук Леонид Васильевич, доктор медицинских наук,

профессор, заведующий кафедрой иммунологии медико-биологического

факультета Российского государственного медицинского университета

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-8047

E-mail: lkov@rsmu.ru

Бахарева Ирина Викторовна, кандидат медицинских наук,

доцент кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета РГМУ

Адрес: 103287, Москва, 4-й Вятский пер., 39

Телефон:(499) 613-6308

E-mail: iribahareva@mail.ru

Карташов Дмитрий Дмитриевич, аспирант кафедры иммунологии

медико-биологического факультета РГМУ

Адрес: 117997, Москв. ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-9000

E-mail: dmkartashov@ya.ru

Ганковская Оксана Анатольевна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РаМн Адрес:11508, Москва, ул. 1-я Дубровская, 15 Телефон: (495) 674-8145 E-mail: oksgan@yandex.ru

Романовская Валентина Валерьевна, ассистент кафедры акушерства

и гинекологии лечебного факультета РГМУ

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (499) 613-6308

E-mail: valentinaromano2005@yandex.ru