Экспериментальные модели для изучения регенерации поперечнополосатой скелетной мышечной ткани

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

экспериментальные модели для изучения регенерации

поперечнополосатой скелетной мышечной ткани

О.Н. Чернова 1, И.Н. Корсаков2, Д.П. Самчук 2, А.А., Пулин 2, М.О. Мавликеев1, Р.В. Деев 13, И.И. Еремин 2

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия

2 Центральная клиническая больница с поликлиникой, Москва, Россия

3 Институт стволовых клеток человека, Москва, Россия

Experimental models for studying of skeletal muscles regeneration

O.N. Chernova 1, I.N. Korsakov 2, D.P. Samchuk 2, A.A. Pulin 2, M.O.Mavlikeev1, R.V. Deev13, I.I. Eremin 2

1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia

2 Central Clinical Hospital with Outpatient Health Center of the Business Administration for the President of the Russian Federation, Moscow, Russia

3 Human Stem Cells Institute, Moscow, Russia

Известно, что поперечнополосатая мышечная ткань участвует в локомоции, в обеспечении внешнего дыхания, механической защиты, поддержании внутренних органов, в общей системе энергообмена и др . Скелетная мускулатура подвержена воздействию многих факторов, влияние которых часто приводит к повреждению мышц в результате механической травмы (ушиб, компрессия, разрыв), воспаления вследствие воздействия инфекционных агентов и аутоиммунных процессов, токсического воздействия различных химических веществ . Помимо экзогенных факторов на мышечную ткань оказывают влияние и дефекты в генах, кодирующих белки — компоненты мышечного волокна, приводящие к мышечным дистрофиям (мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера, дисферлинопатии, кальпаинопатии и т . д . ). При серьезных повреждениях камбиальный резерв в виде миосателлитоцитов и иных миогенных клеток, как правило, не обеспечивает гисто- и органотипической регенерации скелетных мышц, что обуславливает актуальность разработки новых методов индукции регенерации поперечнополосатой мышечной ткани и, в свою очередь, применение экспериментальных моделей повреждения мышечной ткани для изучения ее регенерации

Цель данного обзора — сравнительное описание экспериментальных моделей, используемых для изучения регенерации поврежденной скелетной мышечной ткани

Ключевые слова: мышцы, регенерация, модели повреждения, исследования in vivo, исследования in vitro .

Striated muscles play an important role in the maintenance in the maintenance of locomotion, ventilation, mechanical protection, the inner organs support, a common system of energy exchange etc . Skeletal muscle tissue is exposed to various external factors which cause notable damage to skeletal tissue as a result of mechanical injury (contusion, compression, laceration), inflammation as an implication of infectious agents and autoimmune process, toxic effects of various chemical substances . Besides the external causes, genes' defects that code muscle protein components have influence on the muscles too . These defects lead to muscular dystrophies (Duchenne Becker muscular dystrophy, dysferlinopathy, calpainopathy etc . ). In condition of serious injuries the cambial reserve by means of myosatellite cells and other myogenic cells usually does not provides hysto-and organotypic skeletal muscles regeneration . This fact determines development of new methods for induction of regeneration striated muscles and, in turn, requires amplification of using experimental models of muscles injury for studying regeneration of skeletal muscles The aim of this review is comparative description of experimental models applied for studying of skeletal muscles regeneration after its damage

Keywords: muscles, regeneration, injury models, in vivo assays, in vitro assays .

Введение

Поперечнополосатая скелетная мышечная ткань выполняет множество функций, что диктует необходимость подробного изучения патогенеза её поражения [1]. Уже длительное время исследователей интересуют возможности регенерации поперечнополосатой скелетной мышечной ткани в различных условиях . Классическими считаются опыты Александра Николаевича Студитского, проведенные в 40-50-е годы прошлого века на различных животных (птицы, крысы, кролики, собаки), которым удаляли большие объемы мышц — от трети до половины двуглавой мышцы плеча . Было установлено, что даже при такой значительной травме через 2 недели сократительная способность поврежденного органа восстанавливалась . Более сложные его эксперименты включали выделение мышцы, её механическое измельчение и помещение обратно в фасциальный

e-mail: olgachernova92@yandex. ru

футляр . А. Н . Студицкий обнаружил, что фрагменти-рованные элементы мышечной ткани участвовали в регенерации [2, 3].

Одним из непременных условий достижения прогресса в изучении вопроса о регенерации поперечнополосатой скелетной мышечной ткани является создание адекватных экспериментальных моделей in vivo и in vitro . Первые, исходя из природы воздействующих на мышцы факторов, целесообразно разделить на три группы: физические модели (механические, огнестрельные и термические), химические модели (с использованием фармакологических агентов и других химических веществ) и биологические модели (инфекционные, генетические и модели, основанные на ишемическом и денервационном повреждении мышцы) . В свою очередь, действие физических факторов может моделироваться как с нарушением анатомической целостности (рассечение, резекция),

так и без неё (ушиб, сдавление, компартмент-син-дром, растяжение) . Среди химических препаратов часто применяют внутримышечное введение местных анестетиков, таких как новокаин, лидокаин, бупивака-ин и др . [4—7]. Биологические модели повреждения мышечной ткани предусматривают изучение влияния инфекционных агентов, ишемии-реперфузии и денер-вации на мышцы, либо моделирование той или иной генетически обусловленной патологии у животных с помощью генетической трансформации [8].

1. Модели повреждений скелетной мышечной ткани in vivo

1.1. Физические модели

1.1.1. Модели повреждения без нарушения анатомической целостности

Контузионная модель (ушиб). Контузия (лат . contusio — ушиб) — патологическое состояние, возникающее в результате резкого механического воздействия на всю поверхность тела или большую ее часть, независимо от наличия или отсутствия при этом видимого повреждения [9]. Патоморфологиче-ские аспекты контузии мышц изучают, как правило, на задних конечностях мышей и крыс, наиболее часто исследуемыми мышцами являются икроножная, камбаловидная и передняя большеберцовая [10]. В экспериментальных целях для создания стандартного ушиба в большинстве случаев на место проекции мышцы сбрасывают груз, при этом сила механического воздействия контролируется путем подбора массы объекта и высоты, с которой он сбрасывается . Вышеперечисленные параметры могут значительно варьировать К примеру, ушиб передней большеберцо-вой мышцы мышей (возраст 6—8 нед . , вес 15—17 г) моделируется падением стального шарика весом 16,2 г с высоты 1 м . Контузия мышц задних конечностей крыс достигается падением на них груза весом 267 г с высоты от 40 до 70 см, при этом степень повреждения коррелирует с высотой падения [11—15], что связано с передачей тканям кинетической энергии, значение которой рассчитывается по формуле:

mv2

_ mv2 Ек _ 2

где Ек — кинетическая энергия движущегося тела; т — его масса; V — скорость его движения .

Подобное воздействие приводит к разрушению миофибрилл, повреждению мембраны мышечного волокна, развитию воспалительного процесса, разрыву капилляров и формированию внутримышечной гематомы [16, 17].

Выраженность повреждения мышечной ткани зависит не только от величины кинетической энергии, но и от формы, рельефа и площади поверхности травмирующего объекта . Удар объекта с неограниченной площадью травмирующей поверхности, приводит к относительно равномерному повреждению мышечной ткани, в то время как объекты с ограниченной площадью травмирующей поверхности вызывают более тяжелое повреждение в центре области удара [15]. По мнению некоторых авторов, на тяжесть ушиба также влияет функциональное состояние мышцы в момент контузии [10]. Так как ушиб является наиболее часто встречающейся травмой опорно-двигательного аппарата, то его моделирование широко применяют для изучения эф-

фективности различных подходов к терапии [11, 14, 18—22]. Вместе с тем, существуют сложности со стандартизацией результатов, полученных при моделировании контузии, которые заключаются в комплексности и значительной вариабельности степени травмы, вовлеченности в нее различных анатомических образований (кровеносных сосудов, нервов, костей), наличия и объема гематомы и т . д .

Сдавление мышц (компрессионные модели). Другой неинвазивной моделью тупой травмы мышцы является сдавление — процесс, при котором на тело или часть тела воздействуют два или более травмирующих предмета при центростремительном действии сил [9]. При этом время воздействия может варьировать, но наиболее часто используют временной интервал от 2 до 6 ч Продолжительным сдавлением (более 6 ч . ) моделируется тяжелое повреждение мышечной ткани, которое применяют для изучения патоморфогенеза и эффективности способов профилактики и лечения краш-синдрома Описана методика действия груза весом 3 кг на задние конечности крыс в течение 6 ч . с последующей оценкой уровней молочной кислоты, калия, креатинфосфокиназы, аспарагиновой трансферазы, лактатдегидрогеназы в сыворотке крови и оценкой функции почек и мышц [23, 24]. Модель сдавле-ния воспроизводилась на задних конечностях крыс, кроликов, собак [25—28]. Описанные методики позволили внести вклад не только в изучение мышечной патологии, но и оценить системные проявления краш-синдрома

В большинстве случаев компрессионная модель повреждения мышечной ткани не предполагает нарушения целостности кожного покрова, однако в некоторых экспериментах во избежание эффекта экранирования кожей, давление оказывают на выделенную хирургическим путем мышцу в своем фасциальном футляре [29—31]. Более точное приложение усилия, а также отсутствие в большинстве случаев условий для формирования крупных гематом, повышают достоверность результатов, полученных с использованием данной модели. Ее недостатком считается необходимость рассечения кожи и подлежащих тканей с их последующим ушиванием, а также хирургического выделения мышцы, которые могут оказать существенное влияние на течение патологического процесса. Описанную экспериментальную модель чаще всего используют для изучения тканевого и системного ответа на повреждение мышечной ткани, механизмов регенерации, а также для апробации способов лечения травм скелетной мускулатуры [29, 32]

Модели компартмент-синдрома. В ряде исследований экспериментально воспроизводят ком-партмент-синдром — патологическое состояние, связанное с повышением давления в фасциальных футлярах, сопровождающееся ишемией и некрозом мышечной ткани и развитием воспаления [33]. В настоящее время используют две принципиально отличающиеся друг от друга модели данного состояния: 1) создание повышенного давления в мышцах путем внешнего сдавления конечности [34]; 2) нагнетание изотонического раствора хлорида натрия в фасциальный футляр [35] Приложение давления в 120—140 мм рт . ст . (при норме 100 мм рт . ст . для крыс линии Вистар) в течение 3 ч . оказывается достаточным для индукции характерного повреждения мышечной ткани Для индукции синдрома

достаточно повысить внутрикомпартментное давление до 30—40 мм рт . ст . в течение 45 мин . путем нагнетания изотонического раствора в фасциальный футляр, после чего выполняют фасциотомию [36—38].

Растяжение мышц. По некоторым данным, растяжения мышц составляют до 30% всех обращений в больницу с травмами мышц [39]. Для изучения регенерации поперечнополосатой скелетной мышечной ткани проводят эксперименты по растяжению мышц, которое может быть достигнуто двумя путями: электрической стимуляцией мышцы и механическим растяжением её сухожилия . В первом случае электрической стимуляцией с одновременным приложением усилия на сустав вызывается эксцентрическое сокращение мышцы, приводящее к ее повреждению Сокращение мышцы вызывают как ее чрескожной электрической стимуляцией, так и стимуляцией иннервирующего мышцу нерва [10, 40—45]. Эксперименты второго типа подразумевают выделение мышцы и (или) ее сухожилия, прикрепление к ним лигатуры, на которую прилагается тянущее усилие в том же направлении, что и ход мышечных волокон Подобное исследование описано на модели крыс, у которых выделяли сухожилие икроножной мышцы, привязывали к нему шелковую лигатуру и под контролем компьютера оказывали тянущее действие со скоростью 6 см/мин . до тех пор, пока не было достигнуто горизонтальное плато записываемой кривой зависимости удлинения от нагрузки [39, 46—48]. Для стандартизации модели применяют как степень удлинения мышцы, так и прилагаемую к ней силу Перечисленные методики растяжения мышц имеют недостатки: исследования, предполагающие электрическую стимуляцию иннервирующих мышцы нервов, требуют препарирования прилежащих к мышце тканей, а электрическая стимуляция вызывает максимальное сокращение всех мышечных волокон мышцы . Чрескожная стимуляция не обеспечивает воспроизводимость результатов в связи с изменением параметров силы тока, непосредственно влияющего на мышцу (т к помимо последней ток влияет на кожу и подкожную клетчатку) . Кроме того, при использовании неинвазивной методики наблюдается неоднородное сокращение мышечных волокон, когда более поверхностные отделы мышцы сокращаются сильнее глубоких . Во всех случаях моделирования растяжения мышцы повреждение происходит вблизи места ее прикрепления к сухожилию, одновременно может повреждаться сухожилие и (или) область его прикрепления к кости . Повреждение мышцы характеризуется разрывом сарколеммы, что приводит к развитию воспалительного процесса [42, 48, 49].

Модели термического повреждения. Действие высоких и низких температур также способно вызвать повреждение мышц Моделирование данного физического воздействия производят путем приложения к коже или непосредственно к мышце нагретого или охлажденного до экстремальных температур металлического предмета Чаще всего используется криоповреждение тканей Описана методика резекции мышцы, её заморозки, оттаивания с последующей реимплантацией [50]. В другом исследовании описана патогистологическая и ультраструктурная картина мышц сразу после разморозки: наблюдали дилатацию митохондрий и саркоплаз-матического ретикулума, потерю гликогена, разрыв миофиламентов, пикнотические изменения в ядрах . Все это отчасти характерно и для других повреж-

дений мышц, однако после оттаивания изменения в мышцах длительно прогрессируют, что связывают с повреждением ткани кристаллами льда [51]. Исследователи приводят суждение о том, что потенциальным преимуществом модели термического повреждения является то, что криоповреждение мышц применимо для изучения врожденных миопатий, в т . ч . митохондриальных и болезней накопления, так как существуют гистохимические красители и антитела, применение которых возможно лишь на замороженных тканях [52].

1.1.2. Механическое повреждение с нарушением

анатомической целостности

Модель с рассечением мышцы или «рассе-чение-сшивание». Рассечение мышцы является одним из наиболее простых и воспроизводимых инвазивных видов повреждения мышечной ткани, который воспроизводит нарушения целостности органа, происходящие при бытовых, криминальных, техногенных, некоторых боевых травмах и хирургических вмешательствах В то же время, учитывая относительную простоту и высокую воспроизводимость модели, она может быть использована для изучения механизмов регенерации скелетной мускулатуры и создания условий, необходимых для её оптимизации . В экспериментальных целях используют полное и неполное рассечение камбаловидной и (или) икроножной мышц крыс, кроликов и мышей, при этом существенное влияние на течение патологического процесса оказывает сохранность иннервации и кровоснабжения, что чрезвычайно важно для восстановления мышечного органа, но не всегда воспроизводит реальную травму, особенно сопровождающуюся разрывом сосудисто-нервных пучков [53—55]. Сроки регенерации мышц отличаются у разных видов животных Показано, что формирование рубцовой ткани с множеством регенерирующих мышечных волокон, восстанавливающих целостность, у крыс завершается к 25 сут . [53], у мышей — к 28 сут . [55]. В одном из исследований на рассеченную камбаловидную мышцу мышей на 7, 14, 21 и 28 сут действовали низкочастотным ультразвуком по 20 мин /сут В результате у данной группы обнаружили более высокую пролиферативную активность миогенных предшественников по сравнению с контрольной группой [56]

Другой моделью повреждения является рассечение мышцы с последующим её сшиванием . В 1984 г . была описана модель рассечения длинного разгибателя пальцев кролика, мышцу рассекали полностью и частично, через 8 нед . после повреждения способность к сокращению вернулась на 80% у животных с полностью рассеченной мышцей и на 100% — к мышцам, которые были рассечены частично [57].

Известен другой эксперимент по рассечению-сшиванию мышц у мышей: изучаемых животных разделили на 4 группы: животным одной группы рассекали икроножную мышцу и иммобилизировали конечность на 5 дней, другой накладывали шелковую лигатуру на рассеченную мышцу, третьей накладывали лигатуру и иммобилизировали заднюю конечность, а четвертая была контрольной . Группа мышей, которым иммобилизировали и сшили поврежденную мышцу, показала наилучший результат восстановления с наименьшей глубиной образовавшегося рубца [55] Подобную методику воспроизвели на крысах,

когда им нанесли поперечный разрез икроножной мышцы, наложили лигатуру, иммобилизировали на 7 сут . Состояние мышцы оценивали на 2, 5, 7, 10, 14 и 25 сут . с последующей оценкой величины рубца и регенерации мышечной ткани [53].

Модели с резекцией мышц. Потеря мышечной ткани является частым следствием тяжелой травмы, хирургического лечения новообразований или дегенеративных заболеваний. Экспериментальное моделирование потери мышечной ткани основано на хирургическом создании значительного по размерам дефекта мышцы путем ее резекции . Например, крысам такой дефект создавали удалением средней трети передней большеберцовой мышцы, где протяженность резецированной мышцы составляла около 10 мм . Мышам же вырезали лоскут напрягателя широкой фасции бедра размером 3x4 мм [58—60]. У собак резецировали дистальную треть четырехглавой мышцы бедра с замещением участка биологическим каркасом, представляющим собой внеклеточный матрикс, который получили из слизистой тонкой кишки свиней [61]. Результаты исследований находят место в изучении эффективности методов замещения дефектов тканеинженерными конструкциями [58—62].

1.1.3. Модели огнестрельного повреждения

мышечной ткани

Особенности патоморфогенеза огнестрельной раны (сложная конфигурация раневого канала, первичные и вторичные его девиации, наличие зоны вторичного некроза, обязательное инфицирование, большие по объему первичные и вторичные дефекты тканей и др . ) предопределяют своеобразие регене-рационного гистогенеза, который может быть изучен только в соответствующей модели [63]

В качестве модельных объектов в данном случае могут быть использованы как мелкие, так и крупные лабораторные животные — крысы, кролики, собаки [63] Моделирование огнестрельного ранения на данных животных следует разделить на: 1) ранения, наносимые мелкокалиберным огнестрельным оружием; 2) ранения, имитирующие огнестрельное повреждение

Модели с непосредственно огнестрельным ранением. С целью изучения регенеративных способностей кожно-мышечной раны была предложена следующая модель: кроликам в область средней трети бедра наносили огнестрельную рану из мелкокалиберного оружия (например, пистолет системы Марго-лина, калибр 5,6 мм) с фиксированного расстояния 20 см через 8 слоев марли для защиты кожи [63] При этом ткани получают высокоэнергетическое повреждение, кинетическая энергия пули определяется по формуле 1 и составляет 146,7648 Нхм .

С помощью данной методики на крупных экспериментальных животных (кролики, собаки) удается получить огнестрельное ранение конечности с точечным входным отверстием размерами 0,3x0,3 см, выходным отверстием с рваными краями и размерами 1,4x1,4 см, стенки раны при этом представлены обильно кровоточащими мышцами, а дно — краями костных отломков и множеством костных отломков различной величины [64]. Однако на мелких экспериментальных животных ранение пулей калибра 5,6 мм приводит к отделению конечности, что диктует необходимость моделирования условий, равно-

сильных по передаче кинетической энергии травмируемым тканям при огнестрельном ранении, с помощью специальной экспериментальной установки

Модели с имитацией огнестрельного ранения.

Для применения данной методики использовали специальное устройство, состоящее из трубки со свободно падающим грузом, который попадает на ударник аналогичной пуле формы для нанесения раны с дозированной передачей кинетической энергии снаряда [65]. При этом ударник имеет диаметр 3 мм для уменьшения размера раны, поскольку рана диаметром 5 мм может привести к отсечению конечности . Травма, наносимая такой установкой, должна быть эквивалентна удару пули калибра 5,6 мм, описанному выше Эквивалентности удается добиться за счет модулирования массой падающего объекта Согласно закону сохранения механической энергии, энергия падающего объекта (в нашем случае ударника) складывается из потенциальной энергии Е

м ^ г- потенц

и кинетической энергии Е , в процессе падения

^ кинетич г- ^

нарастает кинетическая энергия и убывает потенциальная, а сумма их постоянна До начала свободного падения кинетическая энергия равна нулю, а потенциальная энергия максимальна и вычисляется по формуле:

Е = mgh .

потенц

При этом необходимо учесть, что энергия пули и энергия ударника передаются на разные по площади поверхности, и энергия ударника будет зависеть от отношения площадей соприкосновения пули и ударника с поверхностью тела, площадь соприкосновения S вычисляется исходя из радиуса пули или ударника:

Еударника = Е пулн х пг2ударннка = 42,^ ^ (3) пг2пулн

С учетом того, что энергия падающего объекта 42,12 Нхм, длина трубки 1 м, то масса объекта составит:

т =Еударннка = 4,29

объекта д х h

Эксперимент проводился на голени крысы, точка удара находилась на середине диафиза большебер-цовой кости [63]

1.2. Модели химического повреждения

мышечной ткани

Химические повреждения, оказываемые на мышечную ткань, целесообразно разделить на две группы в зависимости от природы действующего вещества: фармакологические препараты и другие группы химических веществ . Использование токсичных для мышц веществ нашло широкое применение в моделировании системных и локальных повреждений скелетной мускулатуры .

1.2.1. Повреждения, наносимые

фармакологическими препаратами

Наиболее яркими представителями этой группы являются ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (статины) и местные анестетики Миотоксичность является известным побочным эффектом статинов, наиболее ярко проявляющимся у цервастатина, который был отозван с рынка в связи с развившимися вследствие его применения случаями рабдомиолиза [66].

До настоящего времени точные механизмы, ответственные за вызванную применением статинов миопатию, неизвестны, предполагается, что статины провоцируют прекращение синтеза мышечных белков [67] кроме очевидного применения цервастатина для изучения механизмов патологического влияния статинов на мышечные ткани, данная модель нашла применение в поиске маркеров повреждения скелетной мускулатуры [68]. Местные анестетики (прокаин, тетракаин, лидокаин, бупивакаин, хлоропрокаин и др . ) также оказывают повреждающее действие на мышцы, не оказывая при этом влияния на миосателлитоциты [69]. Одним из анестетиков, способным вызывать некроз мышц, является бупивакаин Так, в одном из исследований в переднюю большеберцовую мышцу мышей вводили 1 мл 0,5% раствора бупивакаина и оценивали состояние мышцы через 3, 5, 7 и 14 сут после инъекции к 7 и 14 сут наблюдали замещение повреждённой ткани молодыми регенерирующими волокнами [70]. Бупивакаин также вводили крысам в длинный разгибатель пальцев и оценивали состояние мышечной ткани через 4 ч . и 3 нед . [71]. Регенерацию камбаловидной мышцы крыс оценивали через 1, 2, 3, 5, 7, 14 и 21 сут после введения 1 мл 0,5% раствора бупивакаина . К 21 сут . архитектоника восстановленных мышечных волокон полностью соответствовала таковой в контрольной группе [72]. Также изучалась сравнительная характеристика повреждающего действия бупивакаина, ропивакаина и левобупивакаина: 0,5% растворы всех трех препаратов вводились внутримышечно крысам, оценка состояния мышечной ткани проводилась на 2, 10 и 20 сут после инъекции Если на 2 сут минимальное повреждение наблюдалось после введения левобупивакаина, а максимальное — после введения бупивакаина, то на 20 сут во всех трёх экспериментальных группах наблюдалась полная регенерация мышечной ткани [73]. Прокаин является одним из часто применяемых анестетиков для изучения миотоксичности Известны модели введения 0,1 мл 2% раствора и 0,2 мл 1% раствора прокаина в переднюю большеберцовую мышцу крыс [69, 74]. Важными недостатками использования местных анестетиков в качестве миотоксичных агентов является вариабельность размеров участка повреждения мышцы и невозможность повреждения абсолютно всех мышечных волокон в мышце . Кроме того, местные анестетики имеют видоспецифичную миотоксичность: так, бупивакаин высокотоксичен для скелетных мышц крысы, менее токсичен для приматов и еще менее — для мышей, что диктует необходимость использования в моделях на данных видах других миотоксичных агентов [50].

1.2.2. Модели с применением других химических

веществ

Одной из наиболее широко применяемых экспериментальных моделей этого типа является применение локальной или системной инъекции ядов змей, в частности кардиотоксина — пептида, выделенного из яда кобры . Его токсическое действие связано со способностью угнетать активность протеинкиназы С, вызывать деполяризацию мембран и чрезмерное сокращение мышц, приводящее к их некрозу [75]. Внутримышечные инъекции кардиотоксина вызывают некроз мышечной ткани с массивной инфильтрацией некротизированных тканей мононуклеарными

лейкоцитами, оставляя при этом интактными нервы, кровеносные сосуды и миосателлитоциты [76, 77]. Также описана методика введения 50 мкл глицерина и 50 мкл кардиотоксина в переднюю большеберцо-вую мышцу мышей . Мышцу забирали на 4, 7, 10 и 14 сут . после инъекций. Появление центрально расположенных ядер обнаруживали в обеих моделях на 7 сут . На 10 сут . плотность миотуб была выше в мышцах, куда вводили кардиотоксин, а на 14 сут . количество миотуб в этих мышцах было больше по сравнению с мышцами, в которые вводили глицерин [78]. Важно отметить, что применение некоторых ядов способно привести к преимущественному повреждению конкретного типа мышечных волокон . Так, мышечные волокна медленного типа более чувствительны к повреждающему действию яда но-тексина Также известно, что пестициды способны вызывать некроз мышечной ткани, что изучали на мышцах крыс [79].

Важным свойством другого миотоксичного агента, летального токсина бактерии Clostridium sordellii, является способность вызывать повреждение нейро-мышечного синапса, что позволяет использовать его для моделирования более широкого спектра мышечных заболеваний .

В качестве миотоксичных агентов использовались и другие фармакологические препараты и химические вещества (противовоспалительные препараты, нейролептики, формокрезол, кленбутерол [50]), однако они не применяются в качестве стандартизированной модели ввиду большой вариабельности повреждения

1.3. Модели повреждения мышц факторами

биологической природы

1.3.1. Модели ишемии-реперфузии

Данные модели применяют для создания временной или постоянной гипооксигенации целевой мышцы . Обычно лигируют или производят компрессию магистральной артерии, кровоснабжающей конечность . Изменения в мышцах зависят от длительности и степени ограничения кровотока и выбора артерии для перевязки [50] и варьируют от незначительных до наступления массивного рабдомиолиза с последующим воспалением и репаративным процессом . Кроме того, степень искусственной ишемии зависит от строения кровеносного русла (в частности от степени развития коллатералей) конечности и варьирует между видами Модель ишемии-реперфу-зии широко применяют на мышах и крысах, как правило, используют перевязку подвздошных и (или) бедренной артерий и их ветвей на различных уровнях, достигая при этом различной степени ишемии . Высокая пластичность сосудистого русла, особенно у мелких животных, является важным ограничением этого экспериментального подхода, что обусловливает важность точного определения моделирования уровня окклюзии в зависимости от цели работы Так, у мышей перевязка бедренной артерии сразу после отхождения глубокой артерии бедра приводит к полному восстановлению кровотока уже на 7 сут . [80], наложение второй лигатуры на 5 мм ниже первой с иссечением сегмента бедренной артерии приводит к восстановлению кровотока на 7 сут лишь на треть от исходного [81], а иссечение наружных подвздошных артерии и вены с одновременным иссечением бедренных артерии и вен и их ветвей приводит

к быстрому некрозу и мутиляции дистальных сегментов конечности [82]. В случае необходимости полного прекращения кровотока в микроциркуляторном русле оказывают давление, превышающее 220 мм рт ст

Помимо одномоментного лигирования магистральных артерий также применяется градиентная окклюзия с помощью амероидных констрикторов, покрытых изнутри материалом, постепенно набухающим во влажной среде [83]. С использованием этих приспособлений моделируется хроническое ише-мическое повреждение скелетных мышц, характерное для хронических облитерирующих заболеваний артерий нижних конечностей В тканях при этом регистрируют преимущественно атрофию мышечных волокон и фиброзные изменения

1.3.2. Модели денервации мышц

классической моделью денервации считается рассечение седалищного нерва, удаление его участка для предотвращения реиннервации, а затем повреждение (например, измельчение) мышцы задней конечности . На начальных этапах мышца регенерирует как обычно после повреждения, но затем начинают проявляться последствия денервации [50]. Описан эксперимент, в котором мышам измельчали удаленную икроножную мышцу, полученную массу возвращали в мышечное ложе Одновременно с этим все нервы, иннервирующие мышцу, были удалены Первые дегенеративные изменения, характерные для денервированной мышцы, наблюдали с 6 сут [84] Аналогичную технику денервации применяли на лягушках В вышеперечисленных экспериментах, проводимых на мышах и лягушках, выраженные дегенеративные изменения мышечной ткани начали проявляться на 3 нед , а к концу этой недели почти все регенерирующие волокна исчезали [50, 85]. Подобное исследование проводили на крысах, у которых также к третьей недели наблюдали выраженную дегенерацию мышц [50]. Описана модель иссечения 2/3 большеберцового нерва у крыс, через 8 нед . оценивали изометрическое сокращение мышц обеих голеней, при этом слабее в опытной группе оказалась только икроножная мышца, что свидетельствует о регенеративной способности мышечной ткани в условиях денервации [85].

1.3.3. Инфекционные агенты

Среди возбудителей инфекционных заболеваний некоторые вирусы способны повреждать мышечную ткань: альфавирусы (вирусы Чикунгунья, о'Нъонг-нъонг, Росс-Ривер) и вирусы гриппа, способные в естественных условиях и в модели вызывать лихорадочный синдром с поражением мышц и суставов [86, 87] Описана экспериментальная модель, воспроизводящаяся при инокуляции вируса гриппа типа В в четырёхглавую мышцу бедра мыши с последующим развитием воспалительного процесса, исходом которого являются дегенерация или некроз мышцы [86] Метициллин-резистентный золотистый стафилококк способен вызывать миозит и некротический фасциит, патоморфогенез этих процессов изучают у мышей [88]. Лейшмании приводят к генерализованному поражению различных тканей, включая мышечную (в частности, жевательных мышц и мышц конечностей), где процесс проявляется инфильтрацией мононуклеарными клетками, некрозом и фи-

брозом . Поражение скелетных мышц изучали на собаках породы Бигль с подтвержденным диагнозом лейшманиоза [89].

1.3.4. Генетические модели

Помимо вышеописанных повреждений мышечной ткани извне, поражение мышц обуславливается и генетическими нарушениями . К настоящему времени разработано значительное количество моделей наследственных миодистрофий [90—93]. Данные заболевания изучаются на таких животных, как мыши, хомячки, крысы, собаки и др [8]

Существуют животные, у которых нейромышеч-ные заболевания развиваются в результате спонтанного мутагенеза (например, мыши A/J, SJL, mdx, собаки пород золотистый ретривер, бигль), либо моделируются лабораторно — такие животные именуются нокаутными (например, мыши линий Dysf/-B6;129S6-Dysftm2 -1kcam/j) . В целом, у этих животных описываются те же морфофизиологические изменения, что наблюдаются у людей при эквивалентных заболеваниях, и, соответственно, данные модели дают ценный материал для генетических, клинических и патогистологических исследований [8].

Наибольшее число генетических моделей существует для воспроизведения мышечной дистрофии Дюшенна — около 60 видов, среди которых есть как беспозвоночные (свободноживущая нематода, дрозофила обыкновенная и др ), так и позвоночные животные (мыши, крысы, кошки, собаки пород золотистый ретривер, ротвейлер, бигль, свиньи, обезьяны) [94, 95]. Описано более 30 моделей мышей с мутациями дистрофина с дебютом заболевания в разные возрастные периоды, например, с момента рождения у mdx-мышей, в 14 недель у фукутин-де-фицитных мышей [96].

Mdx-мыши — линия мышей, полученная в результате спонтанного мутагенеза и представляющая собой результат скрещивания многих линий: Albino mdx, BALB/c, C3H, C57BL/6, DBA/2, FVB и некоторых иммунодефицитных линий [85]. Линия впервые описана в 1984 году, когда в ходе наблюдений за лабораторными мышами было выявлено повышение уровней мышечной креатинфосфокиназы и пируват-киназы, а также патогистологические изменения, характерные для мышечной дистрофии [8], однако клиническая картина заболевания у мышей выражена слабо, а продолжительность жизни снижена на 25%, в то время как у людей, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, этот показатель достигает 75% Такие недостатки подтолкнули ученых к созданию новых моделей с целью коррекции продолжительности жизни: mdx-мышей скрестили с мышами, дефицитными по гену утрофина, а7-интегрина, дисферлина и др , в результате получили двойных нокаутных животных (dko), например, mdx:utrophin-/- мыши (с дефицитом утрофина и дистрофина), mdx/a7-/-мыши (дефицит а7-интегрина и дистрофина) и т д При таком генетическом повреждении клиническая картина заболевания у мышей соответствовала клинической картине у больных людей Однако продолжительность жизни у 1т^х:и^орЫп-/-мышей составила всего 3 месяца, у mdx/a7-/- мышей лишь месяц при нормальной продолжительности жизни у мышей 27 мес [94]

Мышечная дистрофия Дюшенна также описана у собак, кошек, крыс, свиней [94, 97]

Таблица 1. Генетические модели повреждения скелетных мышц

Ссылки Животное Характеристика Ссылки Животное Характеристика

Спонтанный мутагенез Нокаут

Модели мышечной дистрофии Дюшенна

8, 94, 98 т^х-мыши Массивный некроз мышц происходит с 2 до 8 нед. жизни (в среднем - в 4 нед.); миокард почти не вовлекается; с течением времени заболевание не прогрессирует, отмечается лишь незначительный фиброз скелетных мышц. Одной из наиболее поражаемых мышц является диафрагма, поэтому часто именно ее используют для изучения прогрессирования заболевания. Продолжительность жизни снижена на 25% от нормы (в то время как у людей с данным заболеванием она снижена на 75%) 94 Дистрофин-нулевые мыши (DMD-null) Недостатки: высокая продолжительность жизни, невыраженная клиническая картина, первые симптомы появляются во взрослом возрасте; с течением времени заболевание не прогрессирует, отмечается лишь незначительный фиброз скелетных мышц

94, 99 Кошки Описаны единичные случаи. Заболевание сопровождается гипертрофией мышц языка, шеи, плечевого пояса и многими проявлениями со стороны внутренних органов (кардиомиопатия, гепатоспленомегалия, почечная недостаточность) 8, 94 Двойные нокаутные мыши (dko) (по генам утрофина, а7-интегрина, а-дистобревина, дисферлина, десмина, а-саркогликана, ламинина и др.) Были выведены для того, чтобы усилить клинические проявления болезни. В результате у мышей наблюдается выраженная мышечная атрофия, контрактуры суставов, замедленный рост, кардиомиопатия. Продолжительность жизни варьирует от нескольких недель до нескольких месяцев в зависимости от нокаутного гена

94, 98 Собаки (бигль, золотистый ретривер, ротвейлер, немецкий пойнтер, кавалер- кинг-чарльз- спаниель) Течение заболевания сходное с течением у человека (манифестация, клиника и гистологические изменения, продолжительность жизни) 98 Собаки (линия CXMDJ -скрещенный с больным золотистым ретривером бигль - форма Х-сцепленной миодистрофии) Высокая смертность в перинатальном возрасте (32,3%), вскоре после рождения поражается диафрагма, в 2-3 мес. появляется прогрессирующая мышечная слабость, в 4 мес. - контрактуры суставов. Заболевание прогрессирует до 10 мес., после чего процесс стабилизируется

94, 100 Крысы: DMD rat #1, DMD rat #2 Фиброз скелетных мышц и миокарда более выражен по сравнению с т^х-мышами

94, 101 DMD - свиньи Вовлечение миокарда не наблюдается. Наиболее поражаются диафрагма, межреберные мышцы, мышцы гортани и трехглавая мышца плеча. Прогрессирование мышечной дистрофии протекает в более быстром ритме, нежели у человека. Обнаружено, что чем выше вес новорожденного поросенка, тем тяжелее протекает заболевание вплоть до смерти через несколько дней после рождения

94 ВМЮ - свиньи Выработка дистрофина на 30% ниже нормы. Симптомы дистрофии практически не наблюдаются. Характерна стресс-индуцированная внезапная смерть

Модели других генетических заболеваний

Модели дисферлинопатий

102, 103 A/J мыши Нет экспрессии дисферлина. Гистологические изменения с 4-5 мес., тогда же происходит дебют; активный процесс длится до 1 года, прежде всего поражается четырехглавая мышца бедра. Часто развивается рабдомиосаркома (у особей старше 20 мес.), Креатин-фосфокиназа выше нормы в 5 раз 103 B10.SJL- Dysfm/AwaJ (C57/BL10.SJL-Dysf) мыши Начало и течение заболевания схожи с мышами линии SJL/J

Продолжение таблицы 1

Ссылки Животное Характеристика Ссылки Животное Характеристика

103 B6A-Dysf>"md/ GeneJ (В1_А^) мыши Дисферлин не вырабатывается. Начало заболевания констатируется с 2 мес., чаще поражается большая поясничная мышца 103 Линии мышей 129-Dysftm1Kcam/J и B6.129-Dysftm1Kcam/J Дисферлин не синтезируется. Дебют заболевания в 2 мес., максимальная активность процесса деградации мышечной ткани - в 8 мес. В большей степени поражаются четырехглавая мышца бедра и подзвдошно-поясничная; креатинфосфокиназа выше нормы в 5-6 раз

103 SJ_/J мыши Наблюдается выработка дисферлина в объеме до 15% от нормы. Начало заболевания с 3-4 нед. жизни, выраженная миодистрофия с 6-8 мес., в большей степени поражаются четырехглавая мышца бедра и трехглавая мышца плеча; характерно агрессивное поведение; КФК превышает норму в 4 раза 103 Мыши линии Dysf-/- Экспрессии дисферлина нет, дебют заболевания в 2 мес., наибольшая активность -в 5-6 мес. Патогистологическая картина сходна с линией SJ_/J

Модели саркогликанопатий

8, 104 Хомяки линии ВЮ14.6 (мутация в гене S-SG) Кардиомиопатия более выражена, чем поражение скелетной мускулатуры, модель применяется редко, т.к. есть нокаутные мыши с отдельным дефицитом каждого из саркогликанов (а, р, у, S) 8, 104, 105 Мыши линии SGCa-/-(а-саркогликан нулевые) Умеренная дистрофия скелетных мышц, в отличие от остальных нокаутных мышей, у этой линии не отмечена кардиомиопатия

8, 104 Собаки (бостон-терьер, кокер-спаниель, чихуахуа) Отмечается отсутствие прибавки в весе с первых месяцев жизни, непереносимость физических нагрузок, повышение уровня креатинфосфокиназы 8, 104, 105 Мыши линии SGCb-/-(р-саркогликан нулевые) Продолжительность жизни снижена, выраженная кардиомиопатия и скелетно-мышечная дистрофия, гистологически обнаруживают большие зоны некроза и фиброза

8, 104, 105 Мыши линии SGCg-/-(у-саркогликан нулевые) Выраженная кардиомиопатия и миодистрофия при продолжительности жизни около 20 нед.

8, 104, 105 Мыши линии SGCd-/-^-саркогликан нулевые) Аналогичны мышам линии SGCb-/-

Модели ламининопатий

8, 104, 105 Dy/dy мыши (дефицит а2-ламинина) Продолжительность жизни 6 мес., значительная дистрофия скелетных мышц. Дебют заболевания в 3,5 нед.; манифестация с вовлечения задних конечностей 105, 106 dy3K мыши (нулевые по а 2-ламинину) Значительная мышечная дистрофия, замедленный рост, заболевание начинается с первых дней жизни, продолжительность жизни не более 5 мес.

8, 104 Собаки (английский спрингер-спаниель) Клиническая картина развивается с 8 нед., начало с мышечной слабости и отсутствия прибавки в весе. Повышен уровень креатинфосфокиназы

8, 104 Кошки (сиамская кошка, мейн-кун) Клинические симптомы варьируют от мышечной слабости и атрофии до контрактур. Повышен уровень креатинфосфокиназы

Модели дистрофий-дистрогликанопатий

104, 107 - мыши Отставание в развитии, дефицит веса, повышение креатинфосфокиназы. Гистологически прогрессирующая мышечная дистрофия (очаги некроза и участки регенерирующих волокон), помимо поражения мышц характерна сенсоневральная тугоухость, снижение продолжительности жизни 104, 108 Dag1-нулевые мыши Смерть наступает еще в период гестации, дефекты развития отмечают с 6 сут. внутриутробного развития

104, 105, 109 Dg-химерные мыши (недостаток дистрогликана) Прогрессирующая мышечная дистрофия до умеренной степени, выраженная кардиомиопатия. Продолжительность жизни снижена

Окончание таблицы 1

Ссылки Животное Характеристика Ссылки Животное Характеристика

Модели кавеолинопатий

Не описаны 104, 105, 110 Cav-3-/- мыши Патологический процесс начинается с поражения камбаловидной мышцы в 8 нед., тогда же присоединяется поражение диафрагмы, выраженная кардиомиопатия. Продолжительность жизни более 30 нед. У гетерозигот (Cav-3+/-) поражения мышечной ткани не происходит

Cav-1/Cav-3 (двойные нокаутные) мыши Не вырабатывается ни один из 3 типов кавеолинов (т.к. при отсутствии кавеолина 1 типа, кавеолин 2 типа не синтезируется). Животные жизнеспособны и фертильны, но с 2 мес.начинается прогрессирующая кардиомиопатия

Модели повреждения гена, кодирующего дистробревин

Не описаны 105 АйЬп-/- (отсутствие а-дистробревина) Продолжительность жизни более года, невыраженная мышечная дистрофия и кардиомиопатия

105 АйЬп-/-/тйх мыши (отсутствие а-дистробревина и дистрофина) Продолжительность жизни 8-10 мес., умеренное поражение скелетной и сердечной мышечной ткани

Шт-/-/тйх/айЬп-/-мыши (отсутствие утрофина, дистрофина и а-дистробревина) Продолжительность жизни не превышает 11 нед., характерно тяжелое течение с выраженным поражением скелетной мускулатуры и развитием тяжелой кардиомиопатии

Модели интегринопатий

Не описаны 105, 111 Кда7 - нулевые мыши Легкая миодистрофия, которая гистологически выявляется после рождения. Животные жизнеспособны и фертильны

Модели с повреждением гена, кодирующего утрофин

Не описаны 105 Шгпг/_ мыши Продолжительность жизни снижена, развитие миодистрофии и кардиомиопатии не характерно

Штл'УтсЫ мыши Продолжительность жизни до 20 нед., выраженная миодистрофия и кардиомиопатия

Модели с повреждением гена, кодирующего миостатин

8, 112 Крупный рогатый скот (бельгийская голубая корова, пьемонтская корова) Объем мышечной ткани увеличен на 20%, объем жировой ткани снижен. Описывают преждевременное истощение, случаи острого рабдомиолиза, высокий уровень креатинфосфокиназы 113 Миостатин-нокаутные мыши (МЫпКО) С 2 мес. объем мышечной ткани увеличивается на 30% по сравнению с диким типом, особенно выражена гипертрофия больших грудных мышц; процесс роста мышечной ткани происходит: внутриутробно за счет гиперплазии, а постнатально -за счет гипертрофии

8, 114 Собаки (уиппет) Повышенный объем мышечной ткани 113 Myostatin/mdx мыши Мышечная масса и мышечная сила больше по сравнению с т^х-мышами, сила тоже выше; диаметр мышечных волокон больше, объем фиброза меньше

Одной из групп заболеваний, моделируемых на животных, являются дисферлинопатии . Гены дисферлина мышей и человека имеют схожую последовательность аминокислот, в связи с чем некоторые дисферлин-дефицитные мыши (например, линии мышей со спонтанным мутагенезом SJL и A/J) используются в качестве моделей для изучения дис-ферлинопатий [94]. Следовательно, эти линии пригодны для экспериментов по контролю новых методов лечения и определения факторов, которые влияют на дистрофические изменения в скелетных мышцах [115]. С трёхнедельного возраста у SJL мышей с частичным дефицитом дисферлина наблюдается «воспалительная миопатия», сопровождающаяся мышечной слабостью . Для этой линии мышей характерна невыраженная дистрофия проксимальных мышц . У A/J заболевание дебютирует в возрасте 4—5 мес . с преимущественным поражением мышц задних конечностей, у этой линии сохранена сила хватки передних конечностей, но значительно снижена активность при проведении теста «открытое поле» [103, 116].

Мутации в генах, кодирующих мышечные белки, приводят не только к мышечным дистрофиям, но и, наоборот, к увеличению объема мышечной ткани при мутации гена, кодирующего белок миостатин Примером этого может быть крупный рогатый скот (бельгийская голубая корова, пьемонтская корова), собаки (порода уиппет), мыши [8, 112]. У бельгийской голубой коровы наблюдается меньший объем подкожной жировой клетчатки, объем мышечной ткани в среднем на 20% выше нормы вследствие гиперплазии и гипертрофии Однако повышенная физическая нагрузка у них приводит к преждевременному истощению, острому рабдомиолизу и повышению уровня сывороточной креатинфосфокиназы [8]

2. Модели повреждений мышечной ткани

(мышечных волокон) in vitro

2.1. Культуры мышечных клеток

и мышечных волокон

Клеточные культуры позволяют исследовать молекулярные механизмы регенерации и гомеостаза скелетной мускулатуры, патогенез заболеваний, проводить широкий спектр биохимических, иммунологических, токсикологических исследований, оценивать действие лекарств и т д Помимо этого, клеточные культуры являются ключевым субстратом для создания скелетной мускулатуры de novo .

Работы, посвященные регенерации скелетной мускулатуры взрослых млекопитающих с использованием гистологических срезов, проводятся с середины XIX века . В свою очередь, первые опыты с живыми клетками восходят к применению эмбриональной скелетной мускулатуры, которые были выполнены в 1915-1916 гг . [117, 118]. Однако так как многие исследователи подвергали сомнениям полное соответствие процессов регенерации у эмбриона и полностью дифференцированной скелетной мускулатуры, в 1945 г . на основе метода тканевых культур Александра Александровича Максимова [119] было проведено выделение и далее поддержание in vitro эксплантов мышечной ткани взрослого человека и крысы, причем отмечалась также способность исчерченных мышечных волокон к спонтанному сокращению [120, 121]. В дальнейшем было достаточно широко представлено мнение, что новые

волокна формируются путем прорастания миотуб из миофибрилл [122]. Однако исследования в 60-х годах показали, что восстановление происходит за счет слияния мононуклеарных клеток-предшественниц, расположенных между базальной мембраной и окружающей сарколеммой дифференцированного волокна Впоследствии эти клетки получили название миосателлитных [123]. В 1975 г . была наглядно продемонстрирована способность миосателлитных клеток к делению с последующим слиянием и образованием многоядерных миотуб [124].

В дальнейшем, стремление к исследованию ранних стимулов, активирующих миосателлитные клетки, привело к опытам по культивированию миосатте-литных клеток на живом мышечном волокне крысы в 1986 г . [125], на основе более ранних методик по оценке сократительной способности мышечного волокна [126]. В 1995 г . модификация первоначальной методики [125] позволила использовать биоптаты уже человеческих тканей с целью выделения отдельных живых мышечных волокон, что было недоступно ранее в силу разных причин [127].

В настоящий момент используется широкий спектр протоколов выделения, экспансии и диф-ференцировки миогенных клеток, специфика которых может варьировать в различных лабораториях [128-131]. На особенности каждой описанной методики во многом влияют экспериментальные задачи, выбранные для исследования клеточные культуры и другие условия . Так, в эксперименте, посвященном стадийности процессов миогенеза, использовали 20% фетальную бычью сыворотку на стадии пролиферации и 2% лошадиную сыворотку на стадии дифференцировки мышиных скелетных миобластов С2С12 [132]. На аналогичной клеточной популяции вполне успешно применяли комбинацию 10% фе-тальной бычьей и 10% лошадиной сыворотки, вместе с 0,5% экстрактом курного эмбриона на стадии культивирования, в то время как дифференцировка достигалась с использованием среды DMEM с добавлением 8% лошадиной сыворотки . Более того, добавление электромеханической стимуляции приводило к увеличению на 15% количества поперечно-исчерченных миотуб с одновременным повышением экспрессии альфа-актинина и тяжелых цепей миозина в них [133]. Схожий протокол с электростимуляцией миотуб С2С12 успешно применялся при оценке хемотаксиса моноцитов на модели посттренировочного мышечного воспаления [134]. Наконец, возможна рабдомиогенная дифференци-ровка на полностью бессывороточных средах, лежащих в основе многоступенчатого протокола с последовательным применением различных факторов роста, как было продемонстрировано in vitro на примере эмбриональных клеток крыс [135].

Развитие тканевой инженерии изменило парадигму, сместив взгляд с изучения процессов миогенеза к попыткам воспроизвести их in vitro с получением мышечного органа [136]. Следует отметить, что благодаря таким попыткам открываются ранее неизвестные детали о действии тех или иных дифференцировочных факторов [137]. К примеру, было установлено, что использование импульсных электрических стимулов (20 В, 10 мс, 1 Гц, продолжительностью 1 ч с 5 часовыми перерывами) до 7 сут культивирования, приводило к резкому снижению выхода дифференцированных миотуб (снижение поперечной исчерченности с 75% до 10%,

если стимуляция применялись сразу) . В то же время, использование аналогичного протокола на модели L6-E9 миогенного субклона с приложением статичного магнитного поля 80 мкТл с самого начала культивирования сопровождалось увеличением частоты слияния миобластов с 45%±6,7% до 65%±3,6% [138]. Описана техника надрезания сарколеммы в культуре мышечных волокон с целью изучения ее участия в регенерации [139].

Разработанные in vitro модели могут впоследствии служить основой для создания других моделей . Например, использование мышиных миотуб в трехмерном гидрогеле для оценки различий влияния компрессии или гипоксии в патогенезе трофических некрозов [140], или же модели критической ишемии на культуре C2C12 [141].

Вопреки тому, что геномные и молекулярные исследования шагнули далеко вперед на протяжении текущего десятилетия, основным источником материла для диагностики миопатий различного ге-неза до сих пор остается биопсия мышечной ткани Объем получаемого материала при ее выполнении весьма ограничен, поэтому недавно опубликованный протокол иммортализации клеточных линий, по заявлению его создателей, окажет значимую поддержку в диагностических и трансляционных исследованиях [142].

2.2. «Человек на чипе»

В связи с разработкой новых лекарственных средств актуальным становится создание новых моделей in vitro, позволяющих исследовать побочные эффекты препаратов, подбирать дозировку и т . д . В последние годы широкое развитие получает так называемая модель «человек на чипе» («орган на чипе»), подразумевающая имитацию одного и (или) более человеческих органов на специальном микроустройстве. Данная технология поможет сократить количество экспериментальных животных,

ЛИТЕРАТУРА:

I. Fu X . , Wang H ., Hu P . Stem cell activation in skeletal muscle regeneration . Cellular and Molecular Life Sciences 2015; 72(9): 1663-1677 .

2 . Студитский А . Н . Восстановление органов и тканей живого организма . Стенограмма публичной лекции . Изд . «Знание», Москва . 1952; 40 с .

3 . Студитский А. Н . Трансплантация мышц у животных. М . :Медицина, 1977: 248 .

4 . DeSouza A ., Cornwell P ., Dai X . et al . Agonists of the peroxisome proliferator-activated receptor alpha induce a fiber-type-selective transcriptional response in rat skeletal muscle . Toxicol . Sci . 2006; 92: 578-586

5 . Ng Y., Goldspink D . F., Burniston J . G . et al . Characterization of isoprenaline myotoxicity on slow-twitch skeletal versus cardiac muscle . Int . J . Cardiol . 2002; 86(2-3): 299-309 .

6 . Schaefer W . H ., Lawrence J .W ., Loughlin A. F . et al . Evaluation of ubiquinone concentration and mitochondrial function relative to cerivastatin-induced skeletal myopathy in rats . Toxicol . Appl . Pharmacol . 2004; 194: 10-23 .

7 . Braunstein P .W. , De Girolami U . Experimental corticosteroid myopathy . Acta Neuropathol . 1981; 55: 167-172 .

8 . Vainzof M ., Ayub-Guerrieri D ., Onofre P . C . et al . Animal Models for Genetic Neuromuscular Diseases . J . Mol . Neurosci . 2008; 34: 241-248 .

9 . Пиголкин Ю . И . Судебная медицина . 3-е издание . «ГЭОТАР-Медиа»; 2012 . c . 475-476, 488 .

10 . Smith C ., Kruger M . J ., Smith R . M . et al . The inflammatory response to skeletal muscle injury illuminating complexities . Sports Med . 2008; 38 (11): 947-969 .

II. Ambrosio F ., Ferrari R . J . , Distefano G . et al . The synergistic effect of treadmill running on stem-cell transplantation to heal injured skeletal muscle . Tissue Eng . Part A 2010; 16: 839-49 .

проводить длительные испытания, а также позволит подобрать такие дозировки изучаемых препаратов, которые будут сразу приемлемы для человеческого организма [143—144]. Методика включает не только исследование лекарственных препаратов, но и любых других химических веществ, косметоло-гических средств — всего, что способно воздействовать на клетки и ткани человека [145]. Таким способом уже разработаны модели эпителиальных барьеров (кожи, легких, кишечника) [146], созданы чипы, на которых совместно культивированы клетки кожи и кишечника [147, 148], и даже клетки четырех органов (кожи, кишечника, печени и почек) [149].

Заключение

Растущий интерес к патологии скелетной мышечной ткани обуславливает рост числа экспериментальных моделей и разнообразие их модификаций . Разрабатываются все новые технологии по изучению тканей in vitro, замещая исследования на животных . В распоряжении исследователей существует широкий спектр моделей для изучения регенерации мышечной ткани, которые отражают различные механизмы повреждения мышечных тканей, что позволяет подобрать методику, наилучшим образом отвечающую задачам проводимого исследования Тем не менее, в связи с вариабельностью повреждений мышечной ткани, пожалуй, невозможно найти идеальную модель, которая позволила бы провести унификацию полученных результатов, избежать осложнений, с уверенностью соотнести данные исследования с человеческим организмом и вовсе исключить из экспериментов модели in vivo .

Благодарности

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект №14-25-00166).

12 . Crisco J . J ., Hentel K . D ., Jackson W . O . et al . Maximal contraction lessens impact response in a muscle contusion model . J . Biomech . 1996; 29: 1291-6 .

13 . Minamoto V . B ., Grazziano C . R ., Salvini T . F . Effect of single and periodic contusion on the rat soleus muscle at different stages of regeneration . Anat . Rec . 1999; 254: 281-7 .

14 . Puntel G . O ., Carvalho N . R . , Amaral G . P . et al . Therapeutic cold: an effective kind to modulate the oxidative damage resulting of a skeletal muscle contusion . Free Radic . Res . 2011; 45:125-38 .

15 . Souza J ., Gottfried C . Muscle injury: Review of experimental models . J . Electromyogr . Kinesiol . 2013; 23(6): 1253-60 .

16 Minamoto V B , Bunho S R , Salvini T F Regenerated rat skeletal muscle after periodic contusions Braz J Med Biol Res 2001; 34: 1447-52 .

17 . Nozaki M ., Li Y ., Zhu J . et al . Improved muscle healing after contusion injury by the inhibitory effect of suramin on myostatin, a negative regulator of muscle growth Am J Sports Med 2008; 36: 2354-62

18 McBrier N M , Lekan J M , Druhan L J et al Therapeutic ultrasound decreases mechano-growth factor messenger ribonucleic acid expression after muscle contusion injury Arch Phys Med Rehabil 2007; 88: 936-40

19 . Shu B ., Yang Z ., Li X ., Zhang L . Q . Effect of different intensity pulsed ultrasound on the restoration of rat skeletal muscle contusion Cell . Biochem . Biophys . 2012; 62: 329-36 .

20 Silveira P C , Victor E G , Schefer et al Effects of therapeutic pulsed ultrasound and dimethylsulfoxide (DMSO) phonophoresis on parameters of oxidative stress in traumatized muscle . Ultrasound Med . Biol . 2010; 36: 44-50 .

21 Luo L , Sun Z , Zhang L et al Effects of low-level laser therapy on ROS homeostasis and expression of IGF-1 and TGF-beta1 in skeletal muscle during the repair process . Lasers Med . Sci . 2012; 28(3): 725-34

22 . Filippin L . I . , Cuevas M . J ., Lima E . et al . Nitric oxide regulates the repair of injured skeletal muscle . Nitric Oxide 2011; 24: 43-9 .

23 . Akimau P ., Yoshiya K ., Hosotsubo H . et al . New experimental model of crush injury of the hindlimbs in rats . J . Trauma 2005; 58(1): 51-8 .

24 . Rubinstein I ., Abassi Z., Coleman R . et al . Involvement of nitric oxide system in experimental muscle crush injury J Clin Invest 1998; 101(6): 1325-33 .

25 . Dobek G . L ., Fulkerson N . D ., Nicholas J . et al . Mouse Model of Muscle Crush Injury of the Legs . Comparative Medicine 2013; 63(3): 227-232 .

26 . Chen X ., Liu Y ., Xu W . et al . Experimental study on establishment of a simple model of rats crush injury-crush syndrome Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi 2013; 27(1): 77-82 .

27 Kong D Y , Hao L R , Zhang L et al Comparison of two fluid solutions for resuscitation in a rabbit model of crush syndrome Clin Exp . Nephrol . 2015; 19 (6): 1015-1023 .

28 . Song J ., Ding H ., Fan H .J . et al . Canine model of crush syndrome established by a digital crush injury device platform Int J Clin . Exp . Pathol . 2015; 8(6): 6117-6125 .

29 Ghaly A , Marsh D R Aging-associated oxidative stress modulates the acute inflammatory response in skeletal muscle after contusion injury . Exp . Gerontol . 2010; 45: 381-8 .

30 Rantanen J , Thorsson O , Wollmer P et al Effects of therapeutic ultrasound on the regeneration of skeletal myofibers after experimental muscle injury . Am . J . Sports Med . 1999; 27: 54-9 .

31. Winkler T ., von Roth P ., Matziolis G . et al . Time course of skeletal muscle regeneration after severe trauma . Acta Orthop . 2011; 82: 102-11.

32 Takagi R , Fujita N , Arakawa T et al Influence of icing on muscle regeneration after crush injury to skeletal muscles in rats J Appl . Physiol . 2011; 110: 382-8 .

33 . Via A. G ., Oliva F ., Spoliti M . et al . Acute compartment syndrome . Muscles Ligaments Tendons J . 2015; 5(1): 18-22 .

34 . Criswell T . L., Corona B .T ., Ward C . L . et al . Compression-induced muscle injury in rats that mimics compartment syndrome in humans . Am . J . Pathol . 2012; 180: 787-797 .

35 Lawendy A R , Sanders D W , Bihari A et al Compartment syndrome-induced microvascular dysfunction: an experimental rodent model . Can . J . Surg . 2011; 54(3): 194-200 .

36 Walters T J , Kragh J F , Kauvar D S et al The combined influence of hemorrhage and tourniquet application on the recovery of muscle function in rats . J . Orthop . Trauma 2008; 22: 47—51.

37 Hakaim A G , Corsetti R , Cho S I The pentafraction of hydroxyethyl starch inhibits ischemia-induced compartment syndrome J . Trauma 1994; 37(1): 18-21.

38 Kim J G , Lee J , Roe J et al Hemodynamic changes in rat leg muscles during tourniquet-induced ischemia-reperfusion injury observed by near-infrared spectroscopy Physiol Meas 2009; 30: 529-540

39 He L , Li G , Feng X et al Effect of energy compound on skeletal muscle strain injury and regeneration in rats Ind Health 2008; 46: 506-12 .

40 Song H , Nakazato K , Nakajima H Effect of increased excursion of the ankle on the severity of acute eccentric contraction-induced strain injury in the gastrocnemius: an in vivo rat study Am J Sports Med . 2004; 32: 1263-9 .

41. Toumi H ., F'Guyer S ., Best T . M . The role of neutrophils in injury and repair following muscle stretch . J . Anat . 2006; 208: 459-70 .

42 Brickson S , Hollander J , Corr D T et al Oxidant production and immune response after stretch injury in skeletal muscle Med Sci Sports Exerc . 2001; 33: 2010-5 .

43 Butterfield T A , Herzog W Effect of altering starting length and activation timing of muscle on fiber strain and muscle damage J Appl . Physiol . 2006; 100: 1489-98 .

44 . Hammond J .W . , Hinton R .Y ., Curl L .A . et al . Use of autologous platelet-rich plasma to treat muscle strain injuries Am J Sports Med . 2009; 37: 1135-42 .

45 Pratt S J , Lawlor M W , Shah S B et al An in vivo rodent model of contraction induced injury in the quadriceps muscle Injury 2012; 43: 788-93 .

46 Carvalho N , Puntel G , Correa P et al Protective effects of therapeutic cold and heat against the oxidative damage induced by a muscle strain injury in rats . J . Sports Sci . 2010; 28: 923-35 .

47 . Ramos L ., Leal Junior E . C ., Pallotta R . C . et al . Infrared (810 nm) low-level laser therapy in experimental model of strain induced skeletal muscle injury in rats: effects on functional outcomes Photochem . Photobiol . 2012; 88: 154-60 .

48 Banks G B , Combs A C , Chamberlain J R et al Molecular and cellular adaptations to chronic myotendinous strain injury in mdx mice expressing a truncated dystrophin Hum Mol Genet 2008; 17: 3975-86

49 . Stauber W . T . Factors involved in strain-induced injury in skeletal muscles and outcomes of prolonged exposures J Electromyogr Kinesiol . 2004; 14: 61-70 .

50 Schiaffino S , Partridge T Skeletal muscle repair and regeneration Advances in muscle research Vol 3 Dordrecht, The Netherlands: Springer; 2008 . p . 169-172 .

51. Whittaker D . К . Ultrastructural changes in muscle following freezing in situ by a surface applied cold probe . J . Pathol . 1975; 115(3): 139-45 .

52 . Meng H ., Janssen P . M ., Grange R .W . et al . Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease . J . Vis . Exp . 2014; 89: 51586 .

53 . Aarimaa V ., Kaariainen M ., Vaittinen S . et al . Restoration of myofiber continuity after transection injury in the rat soleus . Neuromuscul . Disord . 2004; 14: 421-8 .

54 . Hwang J . H . , Ra Y. J ., Lee К . M . et al . Therapeutic effect of passive mobilization exercise on improvement of muscle regeneration and prevention of fibrosis after laceration injury of rat Arch Phys Med . Rehabil . 2006; 87: 20-6 .

55 . Menetrey J ., Kasemkijwattana C ., Fu F . H . et al . Suturing versus immobilization of a muscle laceration A morphological and functional study in a mouse model . Am . J . Sports Med . 1999; 27: 222-9

56 . Chan Y . S ., Hsu К .Y ., Kuo C . H . et al . Using low-intensity pulsed ultrasound to improve muscle healing after laceration injury: an in vitro and in vivo study . Ultrasound Med . Biol . 2010; 36: 743-751.

57 Garrett W E Jr , Seaber A V , Boswick J et al Recovery of skeletal muscle after laceration and repair . J . Hand Surg . Am . 1984; 9(5): 683-92

58 . Wu X ., Corona B . T ., Chen X . et al . A standardized rat model of volumetric muscle loss injury for the development of tissue engineering therapies . Biores . Open Access 2012; 1(6): 280-90 .

59 Sicari B M , Agrawal V , Siu B F et al A murine model of volumetric muscle loss and a regenerative medicine approach for tissue replacement . Tissue Eng . Part A 2012; 18(19-20): 1941-8 .

60 . Ma J ., Sahoo S ., Baker A. R . et al . Investigating muscle regeneration with a dermis/small intestinal submucosa scaffold in a rat full-thickness abdominal wall defect model J Biomed Mater Res B Appl . Biomater . 2015; 103(2): 355-64 .

61 Turner N J , Badylak J S , Weber D J et al Biologic Scaffold remodeling in a dog model of complex musculoskeletal injury J Surg Res . 2012; 176: 490-502 .

62 Pilia M , McDaniel J S , Guda T et al Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury . Eur . Cell . Mater . 2014; 28: 11-2 .

63 . Данилов Р . К . Раневой процесс: гистогенетические основы . СПб: ВМедА им . С . М . Кирова, 2007; 380 с .; ил .

64 . Михайлов С . В . Экспериментально-клиническое обоснование возможности сохранения жизнеспособности тканей при огнестрельных переломах [диссертация]. Санкт-Петербург: ВМедА; 1997 .

65 . Мурзабаев Х . Х . , Кашапов И . Г . Способ дозированной передачи кинетической энергии снаряда повреждаемым тканям . Морфология 2001; 120(6): 83-84 .

66 . Thompson P . D ., Clarkson P ., Karas R . H . Statin-associated myopathy . JAMA 2003; 289(13): 1681-90 .

67 . MoUhammer D ., Schaeffeler E ., Schwab M . et al . Mechanisms and assessment of statin-related muscular adverse effects British Journal of Clinical Pharmacology 2014; 78(3): 454-466 .

68 Vassallo J D , Janovitz E B , Wescott D M et al Biomarkers of drug-induced skeletal muscle injury in the rat: troponin I and myoglobin Toxicol . Sci . 2009; 111(2): 402-12 .

69 Foster A H , Carlson B M Myotoxicity of local anesthetics and regeneration of the damaged muscle fibers . Anesth . Analg . 1980; 59(10): 727-36 .

70 Ikutomo M , Sakakima H , Matsuda F et al Midkine-deficient mice delayed degeneration and regeneration after skeletal muscle injury . Acta Histochemica 2014; 116: 319-326 .

71. Nishizawa T ., Tamaki H ., Kasuga N . et al . Degeneration and regeneration of neuromuscular junction architecture in rat skeletal muscle fibers damaged by bupivacaine hydrochloride J Muscle Res Cell . Motil . 2003; 24(8): 527-37 .

72 . Politi P . K ., Havaki S ., Manta P . et al . Bupivacaine-induced regeneration of rat soleus muscle: ultrastructural and immunohistochemical aspects Ultrastruct Pathol 2006; 30(6): 461-9 .

73 . Yildiz K . , Efesoy S . N ., Ozdamar S . et al . Myotoxic effects of levobupivacaine, bupivacaine and ropivacaine in a rat model Clin Invest . Med . 2011; 34(5): E273 .

74 . Grim M ., Rerâbkovâ L ., Carlson B . M . A test for muscle lesions and their regeneration following intramuscular drug application Toxicol Pathol . 1988; 16(4): 432-42 .

75 . Chargé S . B ., Rudnicki M .A . Cellular and molecular regulation of muscle regeneration . Physiol . Rev . 2004; 84(1): 209-38 .

76 Hirata A , Masuda S , Tamura T et al Expression profiling of cytokines and related genes in regenerating skeletal muscle after cardiotoxin injection: a role for osteopontin The American Journal of Pathology 2003; 163(1): 203-215 .

77 . Couteaux R ., Mira J . C ., d'Albis A . Regeneration of muscles after cardiotoxin injury . I . Cytological aspects . Biol . Cell . 1988; 62(2): 171-82 .

78 Mahdy M A , Lei H Y , Wakamatsu J et al Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury Annals of Anatomy-Anatomischer . Anzeiger. 2015; 202: 18-27 .

79 . Dettbarn W . D . Pesticide induced muscle necrosis: Mechanisms and prevention . Fundamen . Appl . Toxicol . 1984; 4: 18-26 .

80 . Limbourg A ., Korff T ., Napp L . C . et al . Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia Nat . Protoc . 2009; 4(12): 1737-46 .

81. Hellingman A .A ., Bastiaansen A . J ., de Vries M . R . et al . Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation . Eur . J . Vasc . Endovasc . Surg .: Off J . Eur . Soc . Vasc . Surg . 2010; 40(6): 796-803 .

82 . Masaki I ., Yonemitsu Y . , Yamashita A . et al . Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2 . Circ . Res . 2002; 90(9): 966-73 .

83 . Yang Y ., Tang G ., Yan J . et al . Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse . J . Vasc . Surg . 2008; 48(6): 1546-58 .

84 Mufti S A Regeneration following denervation of minced gastrocnemius muscles in mice . J . Neurol . Sci . 1977; 33(1-2): 251-66 .

85 Mufti, Hsu L The role of nerves in the regeneration of minced skeletal muscle in adult anurans . Anat . Rec . 1974; 179(1): 119-35 .

86 . Larry E . Davis, Mario Kornfeld . Experimental influenza B viral myositis . Journal of the Neurological Sciences 2001; 187: 61-67 .

87 . Zaid A., Rulli N . E ., Rolph M . S . et al . Disease exacerbation by etanercept in a mouse model of alphaviral arthritis and myositis Arthritis Rheum . 2011; 63(2): 488-91.

88 Tseng C W , Kyme P , Low J et al Staphylococcus aureus Panton-Valentine Leukocidin Contributes to Inflammation and Muscle Tissue Injury . PLoS One . 2009; 4(7): e6387 .

89 Pacielloa O , Olivab G , Gradonic L et al Canine inflammatory myopathy associated with Leishmania Infantum infection Neuromuscular Disorders 2009; 19(2): 124-130 .

90 . Shin J . , Tajrishi M . M ., Ogura Y . et al . Wasting mechanisms in muscular dystrophy . Int . J . Biochem . Cell . Biol . 2013;45(10):2266-79 .

91 Partridge T A The mdx mouse model as a surrogate for Duchenne muscular dystrophy . FEBS J . 2013; 280(17): 4177-86 .

92 Zhang H , Kieckhaefer J E , Cao K Mouse models of laminopathies . Aging . Cell . 2013; 12(1): 2-10 .

93 Rahimov F , Kunkel L M The cell biology of disease: cellular and molecular mechanisms underlying muscular dystrophy J Cell Biol 2013; 201(4): 499-510 .

94 . McGreevy J .W ., Hakim C . H ., McIntosh M .A. et al . Animal models of Duchenne muscular dystrophy: from basic mechanisms to gene therapy . Dis . Model . Mech . 2015; 8(3): 195-21.

95 . Yu X ., Bao B . , Echigoya Y. et al . Dystrophin-deficient large animal models: translational research and exon skipping . Am . J . Transl . Res . 2015; 7(8): 1314-31.

96 Whitmore C , Morgan J What do mouse models of muscular dystrophy tell us about the DAPC and its components? Int . J . Exp . Path . 2014; 95: 365-377 .

97 Dubowitz V The muscular dystrophies Postgrad Med J 1992; 68: 500-506

98 Nakamura A , Takeda S Mammalian models of Duchenne Muscular Dystrophy: pathological characteristics and therapeutic applications . J . Biomed . Biotechnol . 2011; 2011: 184393 .

99 Gambino A N , Mouser P J , Shelton G D et al Emergent presentation of a cat with dystrophin-deficient muscular dystrophy J Am . Anim . Hosp . Assoc . 2014; 50(2): 130-5 .

100 . Nakamura K ., Fujii W . , Tsuboi M . et al . Generation of muscular dystrophy model rats with a CRISPR/Cas system . Sci . Rep . 2014; 4: 5635

101. Klymiuk N ., Blutke A ., Graf A . Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle . Hum . Mol . Genet . 2013; 22(21): 4368-82 .

102 . Kobayashi K ., Izawa T ., Kuwamura M . et al . The distribution and characterization of skeletal muscle lesions in dysferlin-deficient SJL and A/J mice . Exp . Toxicol . Pathol . 2010; 62(5): 509-17 .

103 . Hornsey M . A ., Laval S . H ., Barresi R . et al . Muscular dystrophy in dysferlin-deficient mouse models . Neuromuscular Disorders 2013; 23(5): 377-387 .

104 . Shelton G . D ., Engvall E . Canine and feline models of human inherited muscle diseases . Neuromuscul . Disord . 2005; 15(2): 127-38 .

105 . Durbeej M ., Campbell K . P . Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models . Curr . Opin . Genet . Dev . 2002; 12(3): 349-61.

106 . Miyagoe Y ., Hanaoka K ., Nonaka I . et al . Laminin alpha2 chain-null mutant mice by targeted disruption of the Lam2 gene: a new model of merosin (laminin 2)-deficient congenital muscular dystrophy FEBS Lett . 1997; 415: 33-39 .

107 . Grewal P . K ., Holzfeind P .J ., Bittner R . E . et al . Mutant glycosyltransferase and altered glycosylation of alpha-dystroglycan in the myodystrophy mouse . Nat . Genet . 2001; 28: 151-154 .

108 . Williamson R .A ., Henry M . D ., Daniels K . J . et al . Dystroglycan is essential for early embryonic development: disruption of Reichert's membrane in Dag1-null mice . Hum . Mol . Genet . 1997; 6: 831-841.

109 . Côté P . D . , Moukhles H ., Lindenbaum M . et al . Chimeric mice deficient in dystroglycans develop muscular dystrophy and have disrupted monaural synapses . Nat . Genet . 1999; 23: 338-342 .

110 . Hnasko R . , Lisanti M . P . The biology of caveolae: lessons from caveolin knockout mice and implications for human disease Mol Intervent . 2003; 3: 445-464.

111. Mayer U . , Saher G ., Fassler R . et al . Absence of integrin a7 causes a novel form of muscular dystrophy . Nat . Genet . 1997; 17: 318-323 .

112 . Kambadur R ., Sharma M ., Smith T . P . et al . Mutations in myostatin (GDF8) in double-muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle . Genome Res . 1997; 7:910-6 .

113 . Patel K ., Amthor H . The function of Myostatin and strategies of Myostatin blockade-new hope for therapies aimed at promoting growth of skeletal muscle . Neuromuscul . Disord . 2005; 15(2): 117-26

114 . Mosher D . S ., Quignon P ., Bustamante C . D . et al . A mutation in the myostatin gene increases muscle mass and enhances racing performance in heterozygote dogs . PLoS Genet . 2007; 3(5): e79 .

115 Kobayashi K , Izawa T , Kuwamura M et al Dysferlin and animal models for dysferlinopathy . J . Toxicol . Pathol . 2012; 25: 135-47 .

116 . Goebel H . H ., Sewry C .A., Weller R . O . Muscle Disease: Pathology and Genetics . Second edition 2013; 111.

117 . Lewis M . R . Rhythmical contraction of the skeletal mauscle tissue observed in tissue cultures . Am . J . Physiol . 1915; 38: 153-61

118 Levi G Migrazione di elementi specifici differenziati in colture di miocardio e di muscoli scheletrici . Arch per le Sci Medichi 1916; 40:1

119 . Максимов А . А . О культивировании «ин витро» соединительной ткани взрослых млекопитающих . Петроград; 1916 .

120 . Pogogeff I .A ., Murray M . R . Regeneration of adult mammalian skeletal muscle in vitro . Science 1945; 101(2616): 174 .

121. Pogogeff I .A ., Murray M . R . Form and behavior of adult mammalian skeletal muscle in vitro . Anat . Rec . 1946; 95(3): 321-35 .

122 . LeGros Clark W . An experimental study of the regeneration of mammalian striped muscle . J . Anat . 1946; 80: 24-36 .

123 . Mauro A . Satellite cell of skeletal muscle fibers . J . Biophys . Biochem . Cytol . 1961; 9: 493-5 .

124 . Bischoff R . Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro . Anat . Rec . 1975; 182(2): 215-35 .

125 . Bischoff R . Proliferation of muscle satellite cells on intact myofibers in culture . Dev . Biol . 1986; 115(1): 129-39 .

126 . Bekoff A ., Betz W . Properties of isolated adult rat muscle fibers maintained in tissue culture . J . Physiol . 1977; 271(2): 537-47 .

127 . Rosenblatt J . D ., Lunt A. I ., Parry D . J., Partridge T . A. Culturing satellite cells from living single muscle fiber explants . In Vitro Cell Dev . Biol . Anim . 1995; 31(10): 773-9 .

128 . Pasut A ., Jones A . E ., Rudnicki M .A . Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle . J . Vis . Exp . 2013; (73): e50074 .

129 . Di Foggia V ., Robson L . Isolation of satellite cells from single muscle fibers from young, aged, or dystrophic muscles Methods Mol Biol . 2012; 916: 3-14 .

130 . Keire P . , Shearer A ., Shefer G . et al . Isolation and Culture of Skeletal Muscle Myofibers as a Means to Analyze Satellite Cells In 2013 . p . 431-68 .

131. Freshney R . I . Culture of Animal Cells . Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc .; 2010 .

132 . Andrés V ., Walsh K . Myogenin expression, cell cycle withdrawal, and phenotypic differentiation are temporally separable events that precede cell fusion upon myogenesis . J . Cell . Biol . 1996; 132(4): 657-66 .

133 . Liao I . -C ., Liu J . B ., Bursac N . et al . Effect of Electromechanical Stimulation on the Maturation of Myotubes on Aligned Electrospun Fibers . Cell . Mol . Bioeng . 2008; 1(2-3): 133-45 .

134 . Miyatake S . , Bilan P . J ., Pillon N . J . et al . Contracting C2C12 myotubes release CCL2 in an NF-KB-dependent manner to induce monocyte chemoattraction Am J Physiol Endocrinol Metab 2015; ajpendo . 00325 . 2015 .

135 . Das M ., Rumsey J .W . , Bhargava N . et al . Developing a novel serum-free cell culture model of skeletal muscle differentiation by systematically studying the role of different growth factors in myotube formation . In Vitro Cell Dev . Biol . Anim . 2009; 45(7): 378-87 .

136 . Ostrovidov S ., Hosseini V ., Ahadian S . et al . Skeletal Muscle Tissue Engineering: Methods to Form Skeletal Myotubes and Their Applications . Tissue Eng . Part B Rev . 2014; 1-129 .

137 . Rangarajan S . , Madden L ., Bursac N . Use of flow, electrical, and mechanical stimulation to promote engineering of striated muscles Ann . Biomed . Eng . 2014; 42(7): 1391-405 .

138 . Coletti D ., Teodori L. , Albertini M . C . et al . Static magnetic fields enhance skeletal muscle differentiation in vitro by improving myoblast alignment . Cytometry Part A 2007; 71(10), 846-856 .

139 . Marg A . , Schoewel V, Timmel T . et al . Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2 . Traffic 2012; 13(9): 1286-94 .

140 . Gawlitta D ., Li W. , Oomens C .W.J . et al . The relative contributions of compression and hypoxia to development of muscle tissue damage: an in vitro study . Ann . Biomed . Eng . 2007; 35(2): 273-84 .

141. Joshi D ., Patel H ., Baker D . M . et al . Development of an in vitro model of myotube ischemia . Lab . Investig . 2011; 91(8): 1241-52 .

142 . Robin J . D ., Wright W . E ., Zou Y. et al . Isolation and immortalization of patient-derived cell lines from muscle biopsy for disease modeling . J . Vis . Exp . 2015; (95): 52307

143 . Marx U . , Walles H ., Hoffmann S . et al . 'Human-on-a-chip' developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? Altern . Lab . Anim . 2012; 40(5): 235-57 .

144 . Marx U . Organotypic tissue culture for substance testing . J . Biotechnol . 2010; 148(1): 1-2 .

145 . Giese C ., Marx U . Human immunity in vitro — solving immunogenicity and more . Adv . Drug . Deliv . Rev . 2014; 69-70: 103-22 .

146 . Materne E . M ., Maschmeyer I . , Lorenz A. К . et al . The multiorgan chip-a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture . J . Vis . Exp . 2015; (98): e52526 .

147 . Gordon S ., Daneshian M ., Bouwstra J . et al . Non-animal models of epithelial barriers (skin, intestine and lung) in research, industrial applications and regulatory toxicology . ALTEX . 2015; 32(4): 327-78

148 . Wagner I ., Materne E . M . , Brincker S . et al . A dynamic multiorgan-chip for long-term cultivation and substance testing proven by 3D human liver and skin tissue co-culture . Lab . Chip . 2013; 13(18): 3538-47

149 . Maschmeyer I ., Lorenz A . К ., Schimek К . et al . A four-organ-chip for interconnected long-term co-culture of human intestine, liver, skin and kidney equivalents . Lab . Chip . 2015; 15(12): 2688-99 .

Поступила: 01.11.2015