ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В ОДНОГОРМОНАЛЬНЫЕ ИНСУЛИНПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ КЛЕТКИ

1. Дифференцированная популяция клеток панкреатической энтодермы in vitro, полученная пошаговой дифференцировкой плюрипотентных клеток, при этом клетки на каждом этапе дифференцировки культивируют в среде, содержащей от 5 до 20 мМ глюкозы.
2. Дифференцированная популяция клеток панкреатической энтодермы по п. 1, в которой более чем 30% дифференцированных клеток панкреатической энтодермы представляют собой PDX-1+,NKX6.1+, SOX2- и CDX2-.
3. Дифференцированная популяция клеток панкреатической энтодермы по п. 1, в которой более чем 10% клеток в дифференцированной популяции являются единичными гормональными инсулинположительными клетками.
4. Дифференцированная популяция клеток панкреатической энтодермы по п. 1, где пошаговая дифференцировка включает культивирование недифференцированных человеческих эмбриональных стволовых клеток в среде, дополнительно обогащенной лигандом TGF-B.
5. Дифференцированная популяция клеток панкреатической энтодермы по п. 1, где пошаговая дифференцировка включает культивирование недифференцированных человеческих эмбриональных стволовых клеток в среде, дополнительно обогащенной активатором WNT.
6. Дифференцированная популяция клеток панкреатической энтодермы по п. 1, в которой пошаговая дифференцировка включает культивирование сформированных энтодермных клеток в среде, дополнительно обогащенной лигандом FGF.
7. Дифференцированная популяция клеток панкреатической энтодермы по п. 1, где пошаговая дифференцировка включает культивирование клеток первичной кишечной трубки в среде, дополнительно обогащенной ингибитором shh, лигандом FGF, активатором РКС, лигандом TGF-B, ретиноидом и градиентом ингибитора BMP.
8. Дифференцированная популяция клеток панкреатической энтодермы по п. 5, в которой пошаговая дифференцировка включает культивирование клеток заднего отдела передней кишки в среде, дополнительно обогащенной активатором РКС, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP.
9. Дифференцированная популяция клеток панкреатической энтодермы по п. 1, где пошаговая дифференцировка включает культивирование клеток в среде, дополнительно обогащенной аскорбиновой кислотой.
10. Способ in vitro пошаговой дифференцировки плюрипотентных клеток в популяцию клеток линии панкреатической энтодермы, который включает культивирование клеток на каждой стадии дифференцировки в среде, содержащей от 5 до 20 мМ глюкозы.
11. Способ in vitro по п. 10, дополнительно включающий дифференцировку плюрипотентных клеток в клетки сформированной энтодермы (DE) путем культивирования плюрипотентных клеток в среде, обогащенной лигандом TGF-B и активатором WNT.
12. Способ in vitro по п. 11, дополнительно включающий дифференцировку клеток DE в клетки первичной кишечной трубки путем культивирования клеток DE в среде, обогащенной лигандом FGF.
13. Способ in vitro по п. 12, дополнительно включающий дифференцировку клетки первичной кишечной трубки в клетки энтодермы заднего отдела передней кишки путем культивирования клеток первичной кишечной трубки в среде, обогащенной ингибитором shh, лигандом FGF, активатором РКС, лигандом TGF-B, ретиноидом и ингибитором BMP.
14. Способ in vitro по п. 13, дополнительно включающий дифференцировку клеток энтодермы заднего отдела передней кишки в панкреатические клетки передней кишки путем культивирования клеток энтодермы заднего отдела передней кишки в среде, обогащенной активатором РКС, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP.
15. Способ in vitro по п. 14, дополнительно включающий дифференцировку панкреатических клеток передней кишки в клетки панкреатической энтодермы путем культивирования панкреатических клеток передней кишки в среде, обогащенной ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом.
16. Способ in vitro по п. 15, дополнительно включающий дифференцировку клеток панкреатической энтодермы в популяцию панкреатических бета-клеток.
17. Способ in vitro по п. 10-16, в котором по меньшей мере на одной стадии среду также дополняют аскорбиновой кислотой.
18. Способ in vitro по п. 10-16, в котором более чем 10% клеток в дифференцированной популяции являются единичными гормональными инсулинположительными клетками.
19. Способ in vitro по п. 18, в котором более чем 30% клеток панкреатической энтодермы в культуре представляют собой PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- и CDX2-.
20. Способ in vitro дифференцировки человеческих эмбриональных стволовых клеток в панкреатические бета-клетки, включающий:
a) культивирование недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека в среде, дополненной глюкозой, лигандом TGF-B и активатором WNT, для генерирования группы клеток дефинитивной энтодермы (DE);
b) культивирование клеток DE в среде, дополненной глюкозой и лигандом FGF, для генерирования группы клеток кишечной трубки;
c) культивирование клеток кишечной трубки в среде, дополненной глюкозой, ингибитором shh, лигандом FGF, активатором РКС, лигандом TGF-B, ретиноидом и градиентом ингибитора ВИР, для генерирования группы задних клеток энтодермы передней кишки, экспрессирующих PDX-1 и SOX2;
d) культивирование клеток передней кишки в среде, дополненной глюкозой, активатором РКС, ингибитором shh, ретиноидом и ингибитором BMP, для генерирования группы клеток передней кишки поджелудочной железы, экспрессирующих PDX-1 и NKX6.1 и экспрессирующих более низкий уровень SOX2 по сравнению с задними клетками передней кишки;
e) культивирование клеток поджелудочной железы передней кишки в среде, дополненной глюкозой, ингибитором shh, ингибитором TGF-B и ретиноидом, для получения группы клеток энтодермы поджелудочной железы, экспрессирующих PDX-1, более высокий уровень NKX6.1 и более низкий уровень S0X2 по сравнению с клетками поджелудочной железы передней кишки;
f) дифференцировка клеток панкреатической энтодермы в популяцию панкреатических бета-клеток.
21. Способ по п. 20, в котором популяция панкреатических бета-клеток представляет собой PDX-1+, NKX6.1+, SOX2- и CDX2-.
22. Способ по п. 20 или 21, в котором по меньшей мере на одной стадии среду также дополняют аскорбиновой кислотой.
23. Способ по п. 22, в котором панкреатические бета-клетки являются одногормональными инсулинпроизводящими клетками, которые также представляют собой NKX6.1+ и PDX-1+.