СТАБИЛИЗИРОВАННЫЙ КАРДИОЛИПИНОВЫЙ АНТИГЕН ДЛЯ РЕАКЦИИ МИКРОПРЕЦИПИТАЦИИ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ СИФИЛИСА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
STABILIZED CARDIOLYPINE ANTIGEN FOR THE REACTION OF MICROPRECIPITATION WITH SYPHILISIS DIAGNOSIS AND THE METHOD OF ITS RECEPTION

Изобретение относится к медицине и касается диагностических реагентов для клинической лабораторной диагностики сифилитической инфекции.
В соответствии с действующими Национальными стандартами и клиническими рекомендациями при обследовании населения с целью выявления больных сифилисом, а также при установлении клинической формы этого заболевания и оценке динамики гуморального иммунитета после проведенной антибактериальной терапии в учреждениях здравоохранения большинства стран мира широко применяются лабораторные тесты, оценивающие качественное и полуколичественное содержание антител к кардиолипиновому антигену (в крови у больных сифилисом или в ликворе у больных нейросифилисом).
Приоритет в разработке кардиолипинового антигена (Аг Кл), используемого в современных иммунохимических лабораторных исследованиях, принадлежит шведской исследовательнице Margaret С. Pangborn (1941) [1], несколько позже оригинальная методика получения этого антигена для реакции микропреципитации (РМП) была предложена в СССР профессором Л.С. Резниковой (1951) [2]. Кроме этого в Лабораториях по изучению венерических заболеваний (Venereal Diseases Research Laboratories) американского Центра по контролю заболеваемости (Center Diseases Control - CDC) также была создана оригинальная пропись этого реагента и особая методика проведения лабораторного исследования - VDRL тест [3, 4].
По своей сути современные иммунохимические исследования с Аг Кл являются нетрепонемными тестами, так как применяемый антиген по своему происхождению не имеют прямого отношения к возбудителю сифилиса (Treponema pallidum). При разработке состава Аг Кл отдельные его компоненты первоначально получали из сырьевых материалов животного происхождения: водных, водно-спиртовых, ацетоновых или эфирных экстрактов ткани сердечной мышцы крупного рогатого скота и из куриных яиц. Позднее в качестве антигена для лабораторных целей стали применять сложную пропись очищенных липоидных субстанций производственного выпуска: кардиолипин - 0,033%, лецитин - 0,27% и холестерин - 0,9%, растворенных в абсолютизированном этиловом спирте.
При определении содержания гуморальных антител в иммунохимических реакциях (РМП и VDRL) кардиолипиновый антиген применяют в виде рабочей эмульсии Аг Кл; для ее получении перед началом исследования в клинических лабораториях медицинских учреждений кардиолипиновый антиген переводят из спиртового раствора в водную фазу (10% раствор холина хлорида на основе 0,89-0,9% раствора натрия хлорида). Смесь липоидов в водной среде представлена в мелкодиспергированном эмульгированном состоянии, даже при кратковременном хранении в спокойном состоянии эмульсия расслаивается с образованием осадка белого цвета и бесцветной надосадочной жидкости [5, 6].
Технология приготовления рабочей эмульсии Аг Кл, которая является наиболее близким по осуществлению аналогом (прототипом), включает несколько этапов:
- смешивание спиртового концентрата кардиолипинового антигена с равным объемом физиологического раствора с целью «высаливания» активных компонентов антигена и созревание смеси;
- осаждение кардиолипинового антигена при мягком центрифугировании;
- удаление надосадочной жидкости;
- ресуспендирование кардиолипинового антигена путем осторожного размывания осадка 10% раствором холина хлорида, приготовленным на основе 0,9% раствора натрия хлорида (при наличии - с добавлением 0,01% раствора метриолята до конечной концентрации 1:10000).
При этом свежеприготовленная в разных лабораториях рабочая эмульсия Аг Кл может существенно различаться по своей специфической активности в РМП, что зависит от особенностей ее приготовления (использование разных вариантов получения 0,9% раствора натрия хлорида, точность соблюдения лабораторными специалистами инструкции по приготовлению реагента). Свежеприготовленная рабочая эмульсия Аг Кл сохраняет свою специфическую активность и пригодна для использования в РМП только в течение 7 дней, а при добавлении мертиолята (1:10000) - 14 дней; в эти сроки реагент должен сохраняться при температуре +4-8°C в посуде темного стекла или иным способом должна обеспечиваться его защита от нагревания и прямого воздействия солнечного света, которые снижают активность суспензии Аг Кл [6].
Другим вариантом обеспечения возможности длительного сохранения активности кардиолипинового антигена (вариант VDRL) является внесение в свежеприготовленный реагент 1,0% спиртового раствора бензойной кислоты до конечной концентрации 0,01% [3].
Технической задачей изобретения является разработка раствора стабилизированного кардиолипинового антигена и способа получения готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена с длительным сроком годности и контролируемым уровнем его специфической активности в реакции микропреципитации (РМП).
Эта задача достигается за счет изменения состава водной фазы и технологии приготовления рабочей суспензии Аг Кл, а также включения в ее состав стабилизирующих и консервирующих добавок. В качестве водной используется фосфатный буфер стандартной прописи.
Новый состав и технология получения рабочей суспензии Аг Кл предполагает дробное поэтапное внесение спиртовых растворов липидов, входящих в состав Аг Кл, в фосфатный буферный раствор с добавлением в качестве стабилизатора этилен-дитетрамина ацетата (ЭДТА) и консерванта мертиолята (тимеросала) при постоянном активном перемешивании всего объема изготавливаемой серии реагента.
Состав готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена отличается от прототипа сохранением всего количества этилового спирта (в прототипе подавляющая его часть удалялась после центрифугирования в составе супернатанта), использованием буферного раствора вместо физиологического раствора и добавлением стабилизатора ЭДТА и консерванта мертиолята (тимеросала).
Техническими результатами группы изобретений является
- законченный цикл получения готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена на производственном предприятии,
- контроль качества и обеспечение длительной специфической активности приготовленного реагента в реакции микропреципитации при диагностике сифилиса с исключением этапа лабораторного приготовления рабочей эмульсии Аг Кл.
Также преимуществами предлагаемого способа получения суспензии Аг Кл заключается в:
- замене лабораторного кустарного процесса получения рабочей эмульсии Аг Кл производственным, контроль осуществления которого на всех этапах централизованно осуществляется специалистами-технологами ОБТК предприятия и средствами автоматического слежения; обеспечении стабильности и сохранении специфических свойств готового реагента Аг Кл путем внесения в его состав стабилизирующих и консервирующих добавок и фасовке готового продукта во флаконы темного стекла;
- обеспечении выпускающего и текущего контроля качества специфической активности полученного реагента в РМП сотрудниками ОБТК предприятия на всех этапах производства и при хранении музейных образцов в период срока годности набора реагентов;
- экономии затрат рабочего времени специалистами лабораторной медицины за счет исключения этапа приготовления рабочей суспензии реагента Аг Кл при проведении лабораторного исследования методом РМП;
- переводе РМП в разряд лабораторных исследований, которые позволяют оперативно обеспечивать обследование пациентов.
Таким образом, нами разработан стабилизированный кардиолипиновый антиген, содержащий кардиолипин, лецитин, холестерин, спирт этиловый абсолютированный, ЭДТА динатриевая соль, натрий фосфорнокислый 2-замещенный, калий фосфорнокислый 1-замещенный, холин-хлорид, тимеросал (мертиолят), воду очищенную при следующем количественном соотношении ингредиентов, мас %:
кардиолипин
0,0029-0,0033
лецитин
0,021-0,027
холестерин
0,069-0,090
спирт этиловый абсолютированный
6,03-7,83
ЭДТА динатриевая соль
0,32-0,42
натрий фосфорнокислый 2-замещенный
0,086-0,11
калий фосфорнокислый 1-замещенный
0,094-0,12
холин-хлорид
6,92-9,00
тимеросал (мертиолят)
0,069-0,090
вода очищенная
остальное
Кроме того, нами разработан способ получения стабилизированного кардиолипинового антигена, включающий приготовление буферного раствора с последовательным добавлением друг к другу ЭДТА динатриевой соли, натрия фосфорнокислого 2-замещенного, калия фосфорнокислого 1-замещенного, холин-хлорида, тимеросала (мертиолята), воды очищенной, далее получившийся раствор перемешивают и фильтруют, после чего приготавливают спиртовой раствор липидов, для этого смешивают кардиолипин, лецитин, холестерин и спирт этиловый абсолютированный, затем осуществляют смешение буферного раствора и спиртового раствора.
Группа изобретений в частных случаях осуществления поясняется следующими примерами.
Пример приготовления стабилизированного Аг Кл осуществляют следующим образом.
1. Приготовление буферного раствора.
1.1. Сделать на электронных весах навески необходимых реактивов. Для приготовления 10 л буферного раствора:
ЭДТА динатриевая соль
46,5 г
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный
14,2 г
Калий фосфорнокислый 1-замещенный
13,6 г
Холин-хлорид
1000 г
Тимеросал (мертиолят)
10 г
Вода очищенная
до 10000 мл
1.2. Последовательно перенести навески в чистую промаркированную емкость и добавить до необходимого объема воды очищенной.
1.3. Включить магнитную мешалку и тщательно перемешать приготовленный раствор до полного растворения солей.
При необходимости довести pH приготовленного буферного раствора до 6,9±0,2 путем добавления 0,1 моль/л раствора гидроокиси натрия.
1.4. Провести фильтрацию буферного раствора с помощью перистальтического насоса через фильтр мембранный ФМАЦ-0,45 в чистую маркированную емкость. Допускается хранение при температуре 2- 8°C.
2. Приготовление спиртового раствора липидов
2.1. Сделать навески липидов исходя из следующего расчета:
Кардиолипин
0,33 г
Лецитин
2,7 г
Холестерин
9,0 г
Спирт этиловый абсолютированный
до 1000 мл
2.2. Перенести навеску кардиолипина в чистую сухую мерную колбу и добавить немного спирта этилового абсолютированного, затем добавить навеску лецитина в ту же мерную колбу и вновь добавить немного спирта, внести навеску холестерина и довести общий объем до метки 1000 мл.
2.3. Перемешивать содержимое на магнитной мешалке не менее одного часа до полного растворения компонентов. Емкость с раствором плотно укупорить. Наклеить этикетки утвержденного образца.
Раствор выдержать при комнатной температуре не менее 15 часов.
3. Приготовление взвеси стабилизированного Аг Кл
3.1. В чистую сухую емкость вносят 1 часть общего объема буфера и частями при непрерывном перемешивании добавляют приготовленный спиртовой раствор липидов (приготовление взвеси стабилизированного Аг Кл осуществляют из расчета: на 1 часть раствора липидов - 9 частей буферного раствора).
3.2. Перемешивают в течение 10-15 минут и добавляют оставшийся буфер; взвесь перемешать еще в течение 30 минут.
3.3. Емкость плотно укупоривают. Наклеивают этикетки утвержденного образца. Взвесь стабилизированного Аг Кл выдерживают в холодной комнате при температуре 2-8°C не менее 24 часов (допускается хранение в течение 1 месяца).
4. Контроль качества и специфической активности взвеси стабилизированного Аг Кл.
4.1. Контроль осуществляют с использованием проверенной серии Набора реагентов «Сифилис - АгКл-РМП» и охарактеризованных образцjd положительных и отрицательных сывороток (содержащих и не содержащих антитела к кардиолипиновому антигену).
4.2. При получении нормированных результатов контроля приготовленную серию взвеси стабилизированного Аг Кл передают на розлив с маршрутной картой за подписью ответственного микробиолога.
5. Розлив взвеси стабилизированного Аг Кл в первичную упаковку.
5.1. Взвесь стабилизированного Аг Кл разливают с помощью дозатора в предварительно подготовленные флаконы из темного стекла вместимостью 5 мл по 5,0±0,05 мл; в процессе розлива контролируют точность дозирования.
5.2. Флаконы укупоривают крышками.
5.3. На флаконы наклеивают этикетки и передают их на участок комплектации наборов.
Эффективность разработанного способа иллюстрируются примерами выпуска опытно-экспериментальных серий реагента стабилизированного Аг Кл и проведения исследований его специфической активности в натурных испытаниях с целью определения возможного срока годности.
Пример 1:
В лаборатории перспективных разработок ЗАО «ЭКОлаб» в период с 27 по 31 января 2010 г. были приготовлены 3 опытно-экспериментальные серии нового разработанного реагента «стабилизированный Аг Кл для РМП» в соответствии с последовательностью действий и количественными показателями, описанныvb выше. А 31 января 2010 г. на основе 3 производственных серий набора реагентов «Сифилис АгКл-РМП» (производства ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск Московской обл.) были приготовлены 3 лабораторные серии рабочей суспензии кардиолипинового антигена.
Проведена серия сравнительных испытаний специфической активности приготовленных вариантов Аг Кл с использованием панели охарактеризованных стандартных образцов (ОСО) предприятия - контрольных сывороток крови, полученных от пациентов со вторичным сифилисом (n=3) и от здоровых доноров крови (n=2).
Исследования в РМП выполнялись 2 разными специалистами. При этом показано полное совпадение результатов определения антител к кардиолипину в реакции микропреципитации и оценки их полуколичественного содержания при исследовании серии 2-кратных разведений образцов (титрования антител).
Результаты примера подтверждали тождественную активность в РМП образцов рабочей суспензии кардиолипинового антигена, приготовленных по способу, описанному в инструкции по применению компонентов набора реагентов «Сифилис АгКл-РМП», и по вновь разработанному способу.
Пример 2:
Специфическую активность 3 опытно-экспериментальных серий готового к применению жидкого реагента Аг Кл (приготовленных, как описано в примере 1, в лаборатории перспективных разработок ЗАО «ЭКОлаб» с 27 по 31 января 2010 г.) оценивали в РМП при их длительном хранении.
Флаконы с готовым к применению Кл Аг сохраняли в условиях бытового холодильника при температуре 4-8°C на протяжении 1,75-1,8 лет. Исследование специфической активности проверяли в РМП через каждые 10-14 дней разными лабораторными специалистами. Исследованию в РМП подвергали образцы панели ОСО предприятия (полученных от пациентов со вторичным сифилисом и содержавших антикардиолипиновые антитела (n=3) и от здоровых доноров крови (n=2), не содержавших указанные антитела).
Сопоставление полученных данных позволило установить, что специфическая активность 2-х серий реагентов за 1,5-летний период времени их сохранения не претерпела изменений, а в 1 серии через 14 месяцев понизилась на одну степень разведения (с титра 1:8 до титра 1:4), что в соответствии с существующими требованиями к воспроизводимости результатов исследования в РМП не является ошибкой полуколичественного измерения этим методом.
Таким образом, приведенные примеры 1 и 2 демонстрируют:
- возможность успешного воспроизведения технологии получения готовой к применению суспензии кардиолипинового антигена по новому предлагаемому способу и его специфической активности для реакции микропреципитации (подтверждено в сравнительных испытаниях с реагентом, приготовленным по способу-прототипу);
- возможность длительного сохранения специфической активности готовой к использованию суспензии кардиолипинового антигена для РМП, приготовленной по предлагаемому способу, при условии соблюдения рекомендуемых условий хранения: обеспечения температуры плюс 4…8°C и первичной упаковки в стеклянные флаконы темного цвета с завинчивающейся крышкой (что явилось обоснованием выбора сроков годности реагента); - достоверность полученных результатов подтверждается результатами исследований в РМП, которые выполнялись в течение длительного периода времени разными специалистами лабораторной медицины.
Список источников информации
1. Pangborn М.С. Cardiolipin and its application in a chemically purified antigen for the serodiagnosis of syphilis. // Proc NY State Assoc Public Health Lab. 1946; 26(1): 26-9.
2. Резникова Л.С. Кардиолипиновые антигены в серодиагностике сифилиса. // Советская медицина, 1953; 1: 40-42.
3. Serologic tests for syphilis: 1959 Manual. Public Health Service Publication No 411. // United States Government Printing Office, Washington, 1959.
-th
4. Larsen S.A., Pope V., Johnson R.E., Kennedy E.J. [Eds]. Manual of tests for syphilis. 9  Ed. // Washington: DC, 1998.
5. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации №87 от 26 марта 2001 года «О совершенствовании серологической диагностики сифилиса» (Приложение №1. «Постановка отборочных и диагностических тестов на сифилис»).
6. Приказ Председателя Комитета контроля медицинской и фармацевтической деятельности МЗ РК от 27 июня 2011 года №350 (Инструкциия по применению изделия медицинского назначения для потребителя).