СПОСОБ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭУБИОТИКОВ, ОСНОВНЫМ ДЕЙСТВУЮЩИМ НАЧАЛОМ КОТОРЫХ ЯВЛЯЕТСЯ ШТАММ BACILLUS CEREUS IP 5832 (ATCC 14893), В ОТНОШЕНИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ НА ДИСБАКТЕРИОЗ КИШЕЧНИКА
METHOD OF ESTIMATING INDIVIDUAL THERAPEUTIC RESPONSE EUBIOTICS WITH BACILLUS CEREUS STRAIN IP 5832 (ATSS 14893) AS PRIMARY ACTIVE PRINCIPLE WITH RESPECT TO OPPORTUNISTIC PATHOGENS RECOVERED FROM PATIENT EXAMINED FOR INTESTINAL DYSBACTERIOSIS

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии, и может использоваться в бактериологических лабораториях для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) с целью индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Изобретение может быть использовано также в гастроэнтерологии для индивидуального подбора эубиотиков, основным действующим началом которых является штамм Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893), при лечении дисбактериоза кишечника.
Среди препаратов для коррекции измененного микробиоценоза кишечника важное место занимают эубиотики, предназначенные для подавления патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Наиболее часто в состав эубиотиков входят представители рода Bacillus, которые не являются представителями нормальной микрофлоры кишечника, элиминируются вскоре после отмены и являются мощными антагонистами неродственных микроорганизмов за счет продукции лизоцима, протеолитических ферментов и бактериоцинов [1]. Известно, что наиболее эффективно бациллы подавляют патогенные энтеробактерии и некоторые условно-патогенные микроорганизмы, колонизирующие кишечный биотоп: S. aureus, Candida spp., E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae и другие условно-патогенные энтеробактерии [2, 3, 4, 5].
Одним из наиболее широко применяемых эубиотических препаратов во многих странах является препарат «Бактисубтил» (Франция), основным действующим началом которого является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) [6]. Известен также эубиотик «Флонивин», основным действующим началом которого также является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), БС Производитель Galenika, A.D., Serbia.
Производственные штаммы рода Bacillus не формируют биопленок, поскольку их адгезивные свойства к эпителиальным клеткам кишечника слабо выражены. Исходя из того, что активность штамма Bacillus cereus осуществляется в просвете кишечника и связана, прежде всего, с высокой антагонистической активностью данного штамма, а не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой [7], то об эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при диагностике дисбактериоза кишечника, можно судить по наличию или отсутствию антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893).
Бактериоцины или бактериоциноподобные субстанции продуцируются бациллами преимущественно экстрацеллюлярно и способны накапливаться в питательной среде [8]. Благодаря этому, теоретически антагонистическую активность бацилл можно выявить с использованием различных модификаций методов прямого или отсроченного антагонизма, традиционно используемых лишь для выявления антагонизма пробиотических лакто- и бифидобактерий: методом штрихов [9], методом отсроченного антагонизма по Фредерику с промежуточной убивкой штамма-продуцента хлороформом [10, 11, 8], методом двуслойного агара [12].
Для выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) нами использовались вышеперечисленные методики.
9
Для оценки антагонистической активности бацилл методом прямого антагонизма по диаметру чашки Петри с питательным агаром штрихом засевали суспензию суточной культуры B.cereus в концентрации 1×10 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Перпендикулярно подсевали культуры условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника. Инкубировали при 37°С 24 часа. Наличие антагонистической активности учитывали по наличию задержки роста тест-штаммов.
При оценке антагонистической активности бацилл методом отсроченного антагонизма тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов засевали через 24 и 48 ч после посева бацилл.
В рассмотренных вариантах оценки антагонизма штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), по собственным данным, штамм не проявлял антагонистической активности в отношении тест-культур условно-патогенных микроорганизмов (80 штаммов). Некоторые активно подвижные штаммы условно-патогенных микроорганизмов (P. aeruginosa, E. coli) росли на поверхности бациллярных колоний.
8
Считается, что метаболиты бацилл оказывают более мощное антагонистическое действие, нежели живые культуры [13]. Поэтому нами была также использована методика отсроченного антагонизма с промежуточной убивкой штамма-продуцента хлороформом [3, 4, 5]. Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) засевали уколом в застывший 1,5% питательный агар, разлитый в чашки Петри, выращивали 48 часов при 37°С. После инкубации полученную культуру убивали парами хлороформа и наслаивали суспензию тест-культуры условно-патогенного микроорганизма. Для этого смешивали 0,1 мл культуры в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности с 2,5-3 мл растопленного и остуженного до температуры 46-48°С 0,7% полужидкого агара. При наличии способности продуцировать бактериоцины должна наблюдаться зона ингибиции роста тест-штамма вокруг колонии штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Антагонистическая активность бацилл не выявлена, т.к. отмечался рост тест-культур УПМ «газоном» на поверхности среды с предполагаемыми бактериоцинами.
Аналогичные данные нами были получены методом модифицированного двуслойного агара с посевом бацилл газоном с последующей убивкой и наслаиванием тест-культуры УПМ.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является метод перевернутого агара, который описан для выявления антагонистической активности пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli, в отношении оппортунистических дрожжей [14]. Для этого штаммы Bacillus subtilis и Escherichia coli засевают газоном на плотную питательную среду, через 2 суток агар переворачивают и на его обратную сторону засевают предварительно оттитрованную посевную дозу дрожжей. Инкубируют 24 ч в аэробных условиях при 37°С. Наличие антагонизма выявляют количественно по подавлению роста дрожжей по сравнению с аналогичным посевом без пробиотических штаммов.
Метод перевернутого агара описан и протестирован для оценки антифунгального действия пробиотиков, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli. Но оценка антагонистического влияния на другие условно-патогенные микроорганизмы (не оппортунистические дрожжи) не производилась. Кроме этого, оригинальная методика подразумевает подбор посевной дозы дрожжей, при которой на агаре вырастало бы не более 70 колоний. Это требует подтитровки и дополнительных исследований при тестировании каждого штамма. Проверка данной методики с использованием эубиотического штамма-продуцента Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и 80 тест-культур условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника, не позволила нам выявить ни одного случая антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893).
Для оценки антагонистической активности лакто- и бифидосодержащих пробиотиков также описаны методики совместного культивирования в жидкой среде с различными косвенными способами оценки [15, 16], не подразумевающими последующий высев на плотную питательную среду для определения количества подавляемых УПМ.
Таким образом, ни один из известных способов выявления антагонистической активности пробиотических лакто- и бифидобактерий, по данным авторов, не позволил выявить антагонистическую активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
В литературных источниках нами также не обнаружен способ индивидуальной оценки эффективности препарата «Бактисубтил» или других эубиотических препаратов, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от конкретного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Задачей изобретения является выявление антагонистической активности Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных у конкретного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Техническим результатом изобретения является подавление эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур.
Технический результат достигается тем, что выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого, затем выделяют Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) в чистой культуре, после чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе с последующим высевом по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него, и при выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, при этом эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Способ осуществляется следующим образом:
9
Стандартными способами выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий пациента и Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) в чистой культуре, являющийся основным действующим началом эубиотика. Нами выделялась чистая культура Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), из эубиотика «Бактисубтил». 1 мл суспензии тест-культуры условно-патогенного микроорганизма в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности смешивают с 1 мл суспензии Bacillus cereus в такой же концентрации. Смесь инкубируют 48 ч при 37°С. Затем осуществляют высев по Gold. Для этого проводят количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводят контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях. Количество выросших микроорганизмов подсчитывают по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости. При выявлении более одного УПМ из фекалий больного описанную процедуру осуществляют с каждым из УПМ. При выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с контрольным высевом определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. Наличие или отсутствие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) является оценочным критерием для определения эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника. При наличии антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются:
- выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого;
- выделяют чистую культуру Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), являющуюся основным действующим началом эубиотика;
- после чего осуществляют совместную инкубацию штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) с каждым из штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе;
- последующий высев смеси на питательную среду по Gold;
- Высев осуществляют на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл и без него;
- при выявлении снижения количества условно-патогенных микроорганизмов на среде с пенициллином по сравнению с количеством условно-патогенных микроорганизмов на среде без пенициллина определяют наличие антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов;
- при наличии антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом:
- Индивидуальность выявления антагонистической активности штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, а в свою очередь, и индивидуальность оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, обеспечивается выделением условно-патогенных микроорганизмов в чистой культуре из фекалий обследуемого и выделением чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893) с последующей совместной инкубацией в физиологическом растворе и высевом по Gold на питательную среду.
- Высев по Gold на питательную среду необходим для определения количества подавляемых УПМ.
- Питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл позволяет подавлять эубиотический штамм Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893), без ущерба для всхожести тест-культур, что позволяет выявлять антагонистическую активность B. cereus в отношении условно-патогенных микроорганизмов.
В качестве тест-культур изучали штаммы условно-патогенных микроорганизмов, изолированные от пациентов с дисбактериозом кишечника - по 20 изолятов S. aureus, S. epidermidis, Klebsiella spp., E. coli с типичными свойствами, E. coli с измененной ферментативной активностью, Enterobacter spp., Citrobacter spp., P. aeruginosa.
9
1 мл суспензии тест-культур УПМ в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), в такой же концентрации. Во избежание размножения бацилл или условно-патогенных бактерий использование любых жидких питательных сред для совместной инкубации сочли нецелесообразным. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Предполагалось, что в течение этого времени происходило отмирание УПМ под влиянием метаболитов бацилл. Проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold. Высевали на питательный агар с антибиотиками для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводили контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости 1 [17].
9
9
4
Для подавления роста бацилл на среде высева предварительно подобрали селективную добавку - антибиотик в концентрации подавляющей бациллы, но не угнетающей рост микроорганизмов, исходя из данных о распространенной среди тестируемых условно-патогенных бактерий (особенно энтеробактерий) устойчивости к пенициллину и стрептомицину [18]. В растопленный и остуженный до 46-48°С питательный агар вносили разные концентрации антибиотиков. При тестировании сред со стрептомицином препарат вносили в концентрациях 1,0 ЕД/мл, 0,5 ЕД/мл, 0,25 ЕД/мл среды. Засевали 25 культур УПМ и Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) в концентрации 10 клеток/мл на среды с антибиотиками и без них. Однако рост бацилл подавлялся не полностью - с 10 до 10 клеток/мл при максимальной концентрации стрептомицина 1,0 ЕД/мл среды. В то же время выделенные при диагностике дисбактериоза культуры УПМ (Klebsiella spp., Enterobacter spp., атипичные E. coli, Citrobacter spp., S. aureus) в разной степени подавлялись стрептомицином в 74 (96%) тестах (Таб.2 - Подбор антибиотика для подавления Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов).
При тестировании сред с пенициллином добавляли препарат в концентрациях 0,001 ЕД/мл, 0,01 ЕД/ мл, 0,1 ЕД/мл, 1,0 ЕД/мл среды. Посев и учет результатов проводили аналогично. Условно-патогенные энтеробактерии не подавлялись даже максимальной концентрацией пенициллина 1,0 ЕД/мл среды. Отмечалось более интенсивное подавление S. aureus. Приемлемый уровень всхожести условно-патогенных бактерий, включая S. aureus, при одновременном полном подавлении штамма Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893) отмечался при концентрации пенициллина 0,01 ЕД/ мл питательной среды (Табл.2 - Подбор антибиотика для подавления штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов).
При наличии антагонистической активности Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов эубиотик оценивают как эффективный в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Оценочным критерием для индивидуальной оценки эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (АТСС 14893), в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника, нами выбрана антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893). Это объясняется тем, что активность штамма Bacillus cereus осуществляется в просвете кишечника и связана, прежде всего, с высокой антагонистической активностью данного штамма, а не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой.
Совокупность существенных отличительных признаков заявляемого способа является новой и позволяет подавлять эубиотический Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур, что, в свою очередь, обеспечивает выявление антагонистической активности эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при исследовании на дисбактериоз кишечника от пациента, что может быть использовано при индивидуальной оценке эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Примеры конкретного выполнения:
Пример 1.
6
При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№247) выявлен Citrobacter freundii в количестве 5×10 КОЕ/г.
1 мл суспензии чистой культуры Citrobacter freundii, выделенной из фекалий пациента, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), выделенной из эубиотика "Бактистатин", в такой же концентрации. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.
8
В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г. Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii (№247). Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Citrobacter freundii, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Пример 2.
6
При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№512) выявлен S aureus в количестве 10 КОЕ/г.
9
1 мл суспензии чистой культуры S aureus, выделенной из фекалий пациента, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток/мл по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (ATCC 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Смесь инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.
6
6
В контрольном варианте концентрация S aureus составила 5×10 КОЕ/г, в опытном варианте - 10КОЕ/г. Антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма S aureus не выявлена (№512). Препарат «Бактисубтил» определяют как неэффективный в отношении штамма S aureus, выделенного от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Пример 3.
4
6
6
4
При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№429) выявлены Klebsiella pneumoniae в количестве 10 КОЕ/г, Enterobacter agglomerans в количестве 10 КОЕ/г, Citrobacter freundii в количестве 10 КОЕ/г, Staphylococcus aureus в количестве 10 КОЕ/г.
9
1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных от пациента штаммов условно-патогенных микроорганизмов, в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 4 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста каждой из выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.
8
6
7
5
8
6
7
6
В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 10 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Enterobacter agglomerans составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 10 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Staphylococcus aureus составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 10 КОЕ/г.
Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении данных штаммов, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.
Пример 4.
6
4
6
При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№449) выявлены Enterobacter agglomerans в количестве 10 КОЕ/г, Klebsiella pneumoniae в количестве 5×10 КОЕ/г, Citrobacter freundii в количестве 10 КОЕ/г.
9
1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 3 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/ мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста каждой из выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.
8
7
7
6
7
5
В контрольном варианте концентрация Enterobacter agglomerans составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г.
Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii, не выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штаммов Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Citrobacter freundii и неэффективный в отношении штаммов Enterobacter agglomerans и Klebsiella pneumoniae, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.
Пример 5.
6
6
При бактериологическом исследовании кала на дисбактериоз кишечника (№461) выявлены Klebsiella pneumoniae в количестве 10 КОЕ/г и Citrobacter freundii в количестве 10 КОЕ/г.
9
1 мл суспензии чистой культуры каждого из выделенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов в физиологическом растворе в конечной концентрации 10 клеток по оптическому стандарту мутности смешивали с 1 мл суспензии чистой культуры Bacillus cereus штамма IP 5832 (АТСС 14893), выделенного из эубиотика «Бактисубтил», в такой же концентрации. Таким образом получили 2 смеси штаммов условно-патогенных микроорганизмов и бацилл. Смеси инкубировали 48 ч при 37°С. Затем проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold на питательный агар с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/ мл для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста всех выделенных культур. Количество выросших микроорганизмов подсчитывали по таблице 1 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости.
7
5
8
7
В контрольном варианте концентрация Klebsiella pneumoniae составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г. В контрольном варианте концентрация Citrobacter freundii составила 10 КОЕ/г, в опытном варианте 5×10 КОЕ/г.
Выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Klebsiella pneumoniae и не выявлена антагонистическая активность штамма Bacillus cereus IP 5832 (АТСС 14893) в отношении штамма Citrobacter freundii. Препарат «Бактисубтил» определяют как эффективный в отношении штамма Klebsiella pneumoniae и неэффективный в отношении штамма Citrobacter freundii, выделенных от данного пациента при исследовании на дисбактериоз.
С использованием разработанной среды с пенициллином в концентрации 0,01 ЕД/мл изучали антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) Да и 96 культур УПМ, выделенных в значимом количестве при исследовании на дисбактериоз кишечника: Citrobacter spp. (16 штаммов), Klebsiella spp. (17), S. aureus (18), Enterobacter spp. (15), типичная E. coli (15), E. coli с атипичными свойствами (15). Антагонистическую активность эубиотика оценивали по числу подавляемых им штаммов тестируемых микроорганизмов (в %) (Табл. 3 - Антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и условно-патогенных микроорганизмов).
Исследования показали, что изучаемый штамм Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) подавляет 17,7% (17 изолятов) испытуемых штаммов УПМ.
Однако снижение количества условно-патогенных микроорганизмов было незначительным - на 0,5-2 lg. Устойчивыми и даже способными к размножению в присутствии эубиотика оказались 79,0% (81 изолят) испытуемых штаммов.
Заявляемый способ позволяет подавлять эубиотический штамм Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893) без ущерба для всхожести тест-культур, что, в свою очередь, обеспечивает выявление антагонистической активности эубиотического штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) в отношении штамма условно-патогенного микроорганизма, выделенного при диагностике дисбактериоза кишечника у пациента, что может быть использовано при индивидуальной оценке эффективности эубиотиков, основным действующим началом которых является Bacillus cereus штамм IP 5832 (ATCC 14893), в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от пациента при исследовании на дисбактериоз кишечника.
Таблица 1
Расчетная таблица для определения количества бактерий в 1 мл жидкости
А
I
II
III
К-во в 1 мл
1-6
-
-
<1000
8-20
-
-
-
3000
20-30
-
-
-
5000
30-60
-
-
-
10000
70-80
-
-
-
50000
100-150
5-10
-
-
100000
не сосч.
20-30
-
-
500000
-"-
40-60
-
-
1 млн.
-"-
100-150
10-20
-
5 млн.
-"-
не сосч.
30-40
-
10 млн.
-"-
-"-
60-80
Единичные колонии
100 млн.
Таблица 2
Подбор антибиотика для подавления штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и одновременного роста условно-патогенных микроорганизмов
Рост УПМ при данной концентрации антибиотика, КОЕ/мл
Количество штаммов УПМ, выросших при данной концентрации антибиотика, абс (%)
Стрептомицин, ЕД/мл среды
Пенициллин, ЕД/мл среды
1,0
0,5
0,25
1,0
0,01
0,01
0,001
10<sup>8 </sup>(идентично контролю)
1 (4)
8 (32)
10 (40)
16 (64)
19 (76)
22 (88)
23 (92)
10<sup>6</sup>
4 (16)
2 (8)
0
4 (16)
3 (12)
3 (12)
2 (8)
10<sup>5</sup>
15 (60)
12 (48)
15 (60)
5 (20)
3 (12)
0
0
10<sup>4</sup>
3 (12)
3(12)
0
0
0
0
0
<10<sup>4</sup>
2 (8)
0
0
0
0
0
0
Рост Bacillus cereus при данной концентрации антибиотика, КОЕ/мл
10<sup>4</sup>
10<sup>4</sup>
10<sup>4</sup>
Отс.
Отс.
Отс.
10<sup>4</sup>
Таблица 3
Антагонизм штамма Bacillus cereus IP 5832 (ATCC 14893) и условно-патогенных микроорганизмов
Тест-культуры УПМ
Кол-во штаммов
Чувствительные штаммы абс (%)
Устойчивые штаммы абс (%)*
Снижение на 1 lg
Снижение на 2 lg
Всего устойчивых штаммов
Из них способны к росту в присутствии эубиотика**
Klebsiella spp
17
1 (5,9)
0
16(94,1)
1 (6.25)
Enterobacter spp
15
4 (26,7)
1 (6,6)
10 (66,7)
1(10)
Citrobacter spp
16
5(31,3)
0
11 (68,7)
1 (9,1)
типичная E. coli
15
1 (6,7)
0
14 (93,3)
0
атипичная E. coli
15
2(13,3)
0
13 (86,7)
1 (7,7)
S. aureus
20
3 (15,0)
0
17 (85,0)
6 (35,3)
* - количество УПМ по сравнению с контролем не изменилось или изменилось не более, чем на 0,5 lg** - количество УПМ по сравнению с контролем увеличилось
Источники информации
1. Осипова И.Г., Михайлова Р.А., Сорокулова И.Б., Васильева Е.А., Гайдеров А.А. Споровые пробиотики // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - №3. - С.113-119.
2. Блинкова Л.П., Семенова С.А., Бутова Л.Г. и др. Антагонистическая активность свежевыделенных штаммов бактерий рода Bacillus // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 1994. - №5. - С.71-75.
3. Штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций, и препарат на основе этих штаммов. / Патент RU 2142287, опубл. 10.12.99. - Бюл. N20.
4. Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий широким спектром антагонистической активности. / Патент RU N2182172, опубл. 10.05.02.
5. Гатауллин А.Г., Михайлова Н.А., Блинкова Л.П., Романенко Э.Е., Елкина С.И., Гайдеров А.А., Калина Н.Г. Свойства выделенных штаммов Bacillus subtilis и их влияние на интестинальную микрофлору экспериментальных мышей // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - №2. - С.91-94.
6. Давыдов Д.С., Мефед К.М., Осипова И.Г., Васильева Е.А. Мировое применение споровых пробиотиков в практике здравоохранения // Клиническое питание. - 2007. - №1-2. - С.А36.
7. Сорокулова И.Б. Влияние пробиотиков из бацилл на функциональную активность макрофагов // Антибиотики и химиотерапия. - 1998. - №2. - С.20-23.
8. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - №3. - С.109-113.
9. Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2004. - №2. С.64-69.
10. Gratia A., Fredericq P. Deversite des souches antibiotiques de Escherichia coli et etendue varibile de leur champ d'action. Ibid: 1031-1033.
11. Fredericq P. Actions antibiotiques reciproques chez les Enterobacteriaceae. REV. Belge Pathol. Med. Exp.1948, 19 (Suppl. 4): 1-107.
12. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - №5. - С.94-98.
13.Ушакова Н.А., Чернуха Б.А. Влияние температурного шока на биологическую эффективность пробиотика Bacillus subtilis 8130 // Клиническое питание. - 2007. - №1-2. - С.А70.
14. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакьян И.А., Осипова И.Г. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №5. С.53-54.
15. Способ определения антагонистической активности пробиотиков. / RU Патент №2187801, опубл. 20.08.2002.
16. Зыкова Н.А., Молокеева Н.В. Новый пробиотический препарат «Трилакт» // Клиническое питание. - 2007. - №1-2. - С.А42.
17. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях: приложение 1 к приказу Минздрава СССР №535. - 1986.
18. Sanford Jay P., Gilbert David N., Moeliering Robert C. Jr., Sande Merle A. Twenty-ninth edition The Sanford Guid to antimicrobial therapy, 1999.