КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ БОРЬБЫ С КЛЕЩАМИ ВАРРОА У ПЧЕЛ
COMPOSITIONS FOR CONTROLLING VARROA MITES IN BEES

Область техники
Настоящее изобретение согласно некоторым его вариантам осуществления относится к композиции для борьбы с заражением клещом варроа у пчел.
Уровень техники
Медоносные пчелы, Apis mellifera, необходимы для эффективного опыления сельскохозяйственных культур и, следовательно, критически важны для мирового сельского хозяйства. Медоносные пчелы также производят экономически важные продукты, включая в себя мед и пчелиный воск. Медоносные пчелы подвержены ряду паразитов и патогенов, включая в себя клеща-эктопаразита, Varroa destructor.
Синдром разрушения колоний (CCD) медоносных пчел грозит уничтожением сельского хозяйства США и всего мира. В действительности, в последней вспышке CCD в США зимой 2006-2007 гг., по оценкам 25% или больше 2,4 млн. ульев медоносных пчел было потеряно вследствие CCD. По оценкам 23% пчеловодных хозяйств в США пострадали от CCD в течение зимы 2006-2007 гг., затронув в среднем 45% пчеловодных хозяйств. Зимой 2007-2008 гг. инициативная группа по CCD USDA-ARS оценила, что в общем 36% всех ульев из коммерческих хозяйств были разрушены CCD.
CCD характеризуется быстрой потерей популяции взрослых пчел колонии, при этом мертвых взрослых пчел, как правило, обнаруживают на расстоянии от колонии. На последних стадиях разрушения, матку обслуживают только несколько вновь появившихся взрослых пчел. Разрушенные колонии часто характеризуются существенным запечатанным расплодом и пищевыми запасами. Явление CCD было впервые описано в 2006 г.; тем не менее, пчеловоды отмечали разрушения уникальных колоний, соответствующие CCD, еще в 2004 г. Различные факторы, такие как клещи и инфекционные средства, погодные условия, электромагнитное излучение (антенны сотовой связи), пестициды, плохое питание и стресс, были предложены в качестве причин. В настоящее время борьба с CCD сфокусировалась на борьбе с клещом варроа, санации и удалении пораженных ульев, лечении оппортунистических инфекций (таких как Nosema) и улучшенном питании. Эффективные превентивные меры не были разработаны к настоящему времени.
Клещи варроа паразитируют на куколках и взрослых пчелах и размножаются в гони днях куколок. Клещи используют свои ротовые органы для прокола экзоскелета и питания гемолимфой пчел. В этих местах повреждения в экзоскелете скапливаются такие бактериальные инфекции, как Melissococcus pluton, которая вызывает европейский гнилец пчелиного расплода. В дополнение к их паразитическим эффектам, предполагают, что клещи варроа действуют в качестве переносчиков ряда патогенов медоносных пчел, включая в себя вирус деформации крыла (DWV), вирус Кашмира (KBV), вирус острого паралича пчел (ABPV) и вирус черных маточников (BQCV), и могут ослаблять иммунные системы своих хозяев, делая их подверженными инфекциям. Если оставить необработанными заражения варроа, как правило, приводят к смертности на уровне колонии.
Существующие способы лечения заражений варроа оказались неэффективными, поскольку клещи развивают устойчивость к существующим акарицидам. Кроме того, применение таких акарицидов может вводить вредные химические соединения в мед, который предназначен для потребления человеком.
Заявка на выдачу патента США №20090118214 раскрывает применение дсРНК для профилактики и лечения вирусных инфекций у медоносных пчел.
Сущность изобретения
Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрено выделенное нуклеиновокислотное средство, содержащее последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO. 93-105 и 106.
Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую раскрытое в настоящем документе выделенное нуклеиновокислотное средство.
Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрена проглатываемая пчелой композиция, содержащая по меньшей мере одно нуклеиновокислотное средство, раскрытое в настоящем документе.
Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ профилактики или лечения заражения улья клещом Varroa destructor, включающий введение пчеле из улья эффективного количества по меньшей мере одного нуклеиновокислотного средства, характеризующегося последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 93-105 и 106, тем самым обеспечивая профилактику или лечение заражения улья клещом Varroa destructor.
Согласно аспекту некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ снижения подверженности медоносной пчелы синдрому разрушения колоний (CCD), включающий введение медоносной пчеле эффективного количества по меньшей мере одного нуклеиновокислотного средства, выбранного из группы, состоящей из последовательностей нуклеиновых кислот, представленных в SEQ ID NO: 93-95 и 106, тем самым снижая подверженность медоносных пчел синдрому разрушения колоний (CCD).
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит по меньшей мере пять нуклеиновокислотных средств, причем каждое из нуклеиновокислотных средств характеризуется различной последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 93-105 и 106.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит по меньшей мере одно из нуклеиновокислотных средств, характеризующееся последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит каждое из нуклеиновокислотных средств, характеризующееся последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция находится в форме, выбранной из группы, состоящей из твердой формы и жидкой формы.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция дополнительно содержит белок.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения белок находится в форме пыльцы и/или соевых лепешек.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения жидкая форма выбрана из группы, состоящей из раствора сахарозы и раствора кукурузной патоки.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения медоносная пчела представляет собой пчелу колонии, и при этом введение снижает подверженность колонии пчел синдрому разрушения колоний.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения введение осуществляют путем кормления.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения нуклеиновокислотное средство предусмотрено в проглатываемой пчелой композиции, выбранной из группы, состоящей из жидкой проглатываемой пчелой композиции и твердой проглатываемой пчелой композиции.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит по меньшей мере одно из нуклеиновокислотных средств, характеризующееся последовательностью нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения проглатываемая пчелой композиция содержит по меньшей мере пять нуклеиновокислотных средств, причем каждое средство характеризуется различной последовательностью нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 93-106.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения нуклеиновокислотное средство вводят в виде конструкта нуклеиновой кислоты.
Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения нуклеиновокислотные средства представлены в SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.
Если не определено другое, все использованные в настоящем документе технические и/или научные термины имеют те же значения, которые обычно подразумеваются под ними специалистом в настоящей области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут использоваться в практическом осуществлении или испытании вариантов осуществления настоящего изобретения, примеры способов и/или материалов описаны ниже. В случае конфликта описание настоящего патента, включая в себя определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными, и не предусмотрено, что они являются обязательно ограничивающими.
Краткое описание чертежей
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения описаны в настоящем документе, только в качестве примера, со ссылкой на прилагаемые графические материалы. Специально ссылаясь на графические материалы в деталях, акцентируют на том, что проиллюстрированные подробные данные представлены исключительно в качестве примера и для целей иллюстративного обсуждения вариантов осуществления настоящего изобретения. В связи с этим, описание настоящего изобретения, рассматриваемое вместе с графическими материалами, делает очевидным для специалистов в настоящей области техники то, как можно осуществить на практике варианты осуществления настоящего изобретения.
На графических материалах:
На фиг. 1 представлено схематическое представление временной динамики различных экспериментов для переноса дсРНК в клещи варроа.
На фиг. 2А-Е представлены фотографии результатов слот-блот анализа присутствия дсРНК-GFP у проглотивших дсРНК-GFP пчел (фигура 2А), у личинок, которых кормят взрослые пчелы (фигура 2 В), у куколок (фигура 2С) и у вновь появившихся пчел (фигура 2D). Присутствие дсРНК-GFP и миРНК, полученной из нее, анализировали с помощью нозерн-блоттинга (фигура 2Е). D=дни после введения дсРНК-GFP в улей.
На фиг. 3 представлена фотография, иллюстрирующая результаты анализа ОТ-ПЦР экстрагированной из варроа РНК в дни, указанные в верхнем ряду (время, как указано на фигуре 1). Числа зеленым (верхний ряд) указывают на особи варроа, которых поместили на проглотивших дсРНК-GFP пчел и числа черным указывают на РНК от варроа, помещенных на контрольных пчел. + = положительный контроль (несущая GFP плазмида).
На фиг. 4 представлена фотография, иллюстрирующая ОТ-ПЦР РНК варроа с праймерами для белка - ингибитора апоптоза (IAP; последовательность 27). М: маркеры размера. Полосы 1-3: матричная РНК варроа из ульев, обработанных дсРНК последовательностей 27. Полоса 4: матричная РНК варроа из контрольных ульев. Полоса 5: положительный контроль (несущая IAP плазмида). Полоса 6: отрицательный контроль (нет матрицы).
На фиг. 5 представлена гистограмма, иллюстрирующая количество варроа на каждую пчелу (взрослые пчелы вместе с личинками внутри запечатанных ячеек) в контрольных ульях и в ульях, обработанных смесью дсРНК I (минимальная обработка) и смесью дсРНК II (максимальная обработка).
На фиг. 6 представлена фотография, иллюстрирующая передачу дсРНК от взрослых пчел клещам варроа. ОТ-ПЦР проводили на РНК от пчел, которых кормили GFP-специфической дсРНК, и необработанных контрольных пчел (полосы В+, В-, соответственно) и РНК от клещей варроа, паразитирующих на обработанных или необработанных контрольных пчелах (полосы V+ и V-, соответственно). Полоса С: положительный контроль (несущая GFP плазмида). М = маркеры размера;
На фиг. 7 представлена фотография, иллюстрирующая передачу дсРНК от взрослых пчел клещам варроа и варроа обратно пчелам. Пчел заражали или клещами варроа, несущими GFP дсРНК или миРНК (V+), или контрольными клещами (V), свободными от GFP-специфической дсРНК или миРНК. В+ представляет собой РНК, амплифицированную из пчел, зараженных получившими GFP-дсРНК или миРНК клещами, В- представляет собой РНК, амплифицированную из пчел, зараженных контрольными клещами, свободными от GFP-специфической дсРНК или миРНК. Полоса С: положительный контроль (несущая GFP плазмида). М = маркеры размера;
На фиг. 8 представлено схематическое представление 60-дневного эксперимента по кормлению специфической для варроа дсРНК, включая в себя схему кормления медоносных пчел и график испытания для экспрессии гена варроа (внизу) и жизненный цикл медоносной пчелы, которой питается клещ варроа;
На фиг. 9A-9F проиллюстрирован сайленсинг экспрессии гена варроа после горизонтального переноса специфической для варроа дсРНК от пчелы клещу варроа. На фиг. 9А-9С представлены графики, представляющие средние значения (±SE) результатов ОТ-ПЦР в реальном времени РНК варроа с зондами в отношении мРНК гена варроа: РНК полимераза III (9А, зонды SEQ ID NO. 137 и 138), IAP1 и IAP2 (9В, зонды SEQ ID NO. 141 и 142) и вакуолярная протонная АТФаза (9С, зонды SEQ ID NO. 139 и 140), соответственно. РНК варроа экстрагировали из клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью 5 специфических для варроа дсРНК (смесь I), или из клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью 14 специфических для варроа дсРНК (смесь II). Контроли представляют РНК варроа, экстрагированную из клещей, заражающих необработанных пчел, или клещей, заражающих пчел, которых кормили нерелевантной (GFP) дсРНК. На фиг. 9D-9F представлены фотографии, на которых показана полуколичественная ОТ-ПЦР РНК варроа, иллюстрирующая специфический сайленсинг экспрессии гена FAS варроа - ингибитора апоптоза в клещах, заражающих пчел, которых кормили специфической для варроа дсРНК. РНК FAS ингибитора апоптоза амплифицировали (с применением праймеров SEQ ID NO. 145 и 146) в РНК варроа, экстрагированной из клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью 5 специфических для варроа дсРНК (9D, смесь I), или из клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью 14 специфических для варроа дсРНК (9D, смесь II). Контроли представляют амплификацию РНК FAS ингибитора апоптоза в РНК варроа, экстрагированной из клещей, заражающих необработанных пчел (9Е, необработанный), или клещей, заражающих пчел, которых кормили нерелевантной (9Е, дсРНК-GFP) дсРНК. На фиг. 9F представлен контроль, показывающий амплификацию конститутивного гена актина (с применением праймеров SEQ ID NO. 147 и 148). Числа указывают на число циклов амплификации. - ОТ реакции служат в качестве контролей для примесей ДНК. Отмечают сильный сайленсинг экспрессии FAS ингибитора апоптоза у клещей, заражающих пчел, которых кормили смесью I или смесью II (фиг. 9D);
На фиг. 10 представлен график, показывающий среднее (±SE) общего количества пчел (запечатанный расплод и взрослые особи) у пчел, которых кормили смесью 5 специфических для варроа дсРНК (смесь I) или смесью 14 специфических для варроа дсРНК (смесь II), или контрольных пчел, которых кормили нерелевантной (dsGFP) дсРНК или необработанных пчел (необработанные). Не обнаружили никаких существенных различий;
На фиг. 11 представлен график, показывающий заражение варроа (количество клещей) у обработанных пчел и контролей (как на фиг. 10), показывая значительное снижение подверженности заражению варроа после кормления пчел смесью I или смесью II.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение согласно некоторым его вариантам осуществления относится к способам и композициям для снижения подверженности пчел заражению клещом варроа.
Перед подробным объяснением по меньшей мере одного варианта осуществления настоящего изобретения, следует понимать, что настоящее изобретение не обязательно ограничено в своем применении деталями, представленными в следующем описании или проиллюстрированными примерами. Согласно настоящему изобретению возможны другие варианты осуществления или его можно осуществить на практике или выполнить различными путями.
Пчелы подвержены множеству различных вирусных инфекций. Было показано, что лечение таких инфекций отрицательной регуляцией конкретного вирусного генного продукта успешно в устранении индуцированных вирусами инфекций у пчелы (смотрите заявку на выдачу патента США №20090118214).
Авторы настоящего изобретения в настоящем документе предлагают лечение заражений клещом варроа у пчел путем отрицательной регуляции конкретных генных продуктов клеща варроа.
Клещи варроа паразитируют на куколках и взрослых пчелах и размножаются в гонидиях куколок. Клещи используют свои ротовые органы для прокола экзоскелета и питаются гемолимфой пчел. Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что полинуклеотидные средства, введенные пчелам для лечения заражений клещом варроа, присутствовали в гемолимфе пчел, тем самым становясь доступными клещу.
Авторы настоящего изобретения показали, что последовательности дсРНК могут успешно передаваться клещам варроа (фигуры 6 и 7), что дсРНК может служить для отрицательной регуляции экспрессии конкретного гена у клеща варроа (9А-9Е) и дополнительно, что нацеленное воздействие на конкретные гены для отрицательной регуляции может привести к снижению числа клещей варроа (фигура 11). Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что последовательности РНК, переданные клещам от пчел, которых кормили дсРНК, могли передаваться обратно необработанным, "нативным" пчелам посредством заражения варроа (фигура 7).
Таким образом, согласно одному аспекту настоящего изобретения предусмотрен способ профилактики или лечения заражения пчелы клещом Varroa destructor, включающий введение пчеле из улья эффективного количества по меньшей мере одного нуклеиновокислотного средства, характеризующегося последовательностью, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 93-105 и 106, тем самым обеспечивая профилактику или лечение заражения пчелы клещом Varroa destructor.
Используемый в настоящем документе термин "пчела" относится как к взрослой пчеле, так и ее ячейкам с куколками. Согласно одному варианту осуществления пчела находится в улье.
Взрослую пчелу определяют как любое из насекомых с несколькими крыльями, волосатым брюшком, как правило, с жалом надсемейства Apoidea в отряде Hymenoptera, включая в себя как ведущие одиночный образ жизни виды, так социальные виды, и характеризующихся сосательными и жевательными ротовыми аппаратами для сбора нектара и пыльцы. Примеры видов пчел включают в себя без ограничения Apis, Bombus, Trigona, Osmia и подобное. Согласно одному варианту осуществления пчелы включают в себя без ограничения шмелей (Bombus terrestris), медоносных пчел (Apis mellifera) (включая в себя пчел-сборщиц и ульевых пчел) и Apis cerana.
Согласно одному варианту осуществления пчела представляет собой часть колонии.
Термин "колония" относится к популяции пчел, содержащей десятки, как правило, до нескольких десятков тысяч пчел, которые кооперируются для построения гнезд, сбора пищи и вывода расплода. Колония в норме содержит одну матку, при этом остальные пчелы являются либо "рабочими" (самки), либо "трутнями" (самцы). Социальная структура колонии поддерживается маткой и рабочими пчелами и зависит от эффективной системы коммуникации. Разделение труда сред касты рабочих пчел в первую очередь зависит от возраста пчелы, но варьирует в зависимости от потребностей колонии. Размножение и сила колонии зависят от матки, количества пищевых запасов и размера рабочей силы. Медоносные пчелы также могут быть разделены на категории: "ульевые пчелы", как правило, в течение первой части жизненного цикла рабочих пчел, в течение которой "ульевая пчела" выполняет задачи в пределах улья, и "пчела-сборщица", в течение последней части жизненного цикла пчелы, в ходе которой "сборщица" определяет местонахождение и собирает пыльцу и нектар снаружи улья и приносит нектар или пыльцу в улей для потребления и запасания.
Согласно настоящему аспекту настоящего изобретения средства согласно настоящему изобретению используют для предотвращения существования клеща Varroa destructor в качестве паразита на пчеле или ее личинках.
Фраза "клещ Varroa destructor " относится к наружному паразитическому клещу, который поражает медоносных пчел Apis cerana и Apis mellifera. Клещ может присутствовать на стадии взрослой особи, питаясь на пчеле, или на стадии личинки, внутри гонидия медоносной пчелы.
Как упоминалось, средства настоящего изобретения способны отрицательно регулировать экспрессию генного продукта клеща Varroa destructor.
Используемая в настоящем документе фраза "генный продукт" относится к молекуле РНК или белку.
Примеры последовательностей, представляющих целевые сегменты гена варроа, которые могут находиться под направленным воздействием, включают в себя без ограничения последовательности нуклеиновых кислот генов варроа, фланкированные последовательностями промотора Т7 в следующих последовательностях (длина специфической для варроа последовательности указана в скобках):
SEQ ID NO: 93 - ген варроа, гомологичный α-тубулину (411 оснований); SEQ ID NO: 94 - ген варроа, гомологичный α-тубулину (277 оснований); SEQ ID NO: 95 - ген варроа, гомологичный α-тубулину (329 оснований); SEQ ID NO: 96 - ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (380 оснований); SEQ ID NO: 97 - ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (426 оснований); SEQ ID NO: 98 - ген варроа, гомологичный РНК полимеразе II (366 оснований); SEQ ID NO: 99 - ген варроа, гомологичный РНК полимеразе I (324 основания); SEQ ID NO: 100 - ген варроа, гомологичный вакуолярной транслоцирующей АТФазе (311 оснований); SEQ ID NO: 101 - ген варроа, гомологичный вакуолярной протонной АТФазе (210 оснований); SEQ ID NO: 102 - ген варроа, гомологичный Na+/K+ АТФазе (307 оснований); SEQ ID NO: 103 - ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза IAP (263 основания); SEQ ID NO: 104 - ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза FAS (277 оснований); SEQ ID NO: 105 - ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза IAP 1 и IAP2 (263 основания); SEQ ID NO: 106 - ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза IAP 1 и IAP2, обратная ориентация (282 основания).
Дополнительные генные продукты, которые могут отрицательно регулироваться согласно настоящему аспекту настоящего изобретения, включают в себя без ограничения субъединицу 2 НАДФ дегидрогеназы; - регистрационный номер Genbank NC 004454; АТФ субъединицу 8 синтетазы; - NC_004454; субъединицу 6 АТФ синтетазы; - NC 004454; ген натриевого канала - регистрационный номер Genbank FJ216963; субъединицу I цитохромоксидазы - регистрационный номер Genbank EF025469.
SEQ ID NO: 1. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 1); SEQ ID NO: 2. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 2); SEQ ID NO: 3. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 3); SEQ ID NO: 4. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 4); SEQ ID NO: 5. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 5); SEQ ID NO: 6. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 6); SEQ ID NO: 7. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 7); SEQ ID NO: 8. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 8); SEQ ID NO: 9. Ген варроа, гомологичный субъединице А АТФазы (сегмент 9); SEQ ID NO: 10. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе I (сегмент 1); SEQ ID NO: 11. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе I (сегмент 2); SEQ ID NO: 12. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе I (сегмент 3); SEQ ID NO: 13. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 1); SEQ ID NO: 14. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 2); SEQ ID NO: 15. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 3); SEQ ID NO: 16. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 4); SEQ ID NO: 17. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 5); SEQ ID NO: 18. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 6); SEQ ID NO: 19. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 7) SEQ ID NO: 20. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 8); SEQ ID NO: 21. Ген варроа, гомологичный РНК полимеразе III (сегмент 9); SEQ ID NO: 22. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 1); SEQ ID NO: 23. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 2); SEQ ID NO: 24. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 3); SEQ ID NO: 25. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 4); SEQ ID NO: 26. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 5); SEQ ID NO: 27. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 6); SEQ ID NO: 28. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 7); SEQ ID NO: 29. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза (IAP; сегмент 8); SEQ ID NO: 30. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза FAS (сегмент 1); SEQ ID NO: 31. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза FAS (сегмент 2); SEQ ID NO: 32. Ген варроа, гомологичный ингибитору апоптоза FAS (сегмент 3); SEQ ID NO: 33. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 1); SEQ ID NO: 34. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 2); SEQ ID NO: 35. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 3); SEQ ID NO: 36. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 4); SEQ ID NO: 37. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 5); SEQ ID NO: 38. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 6); SEQ ID NO: 39. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 7); SEQ ID NO: 40. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 8); SEQ ID NO: 41. Ген варроа, гомологичный α-тубулину (сегмент 9); SEQ ID NO: 42. субъединица 2 НАДФ дегидрогеназы; (NC_004454): основания 709-974; SEQ ID NO: 43. субъединица 8 АТФ синтетазы; (NC_004454): основания 3545-3643; SEQ ID NO: 44. Белок натриевого канала (AY259834): основания 3336-3836.
Согласно варианту осуществления настоящего изобретения полинуклеотидное средство является специфическим для целевой РНК и перекрестно не ингибирует или подвергает сайленсингу ген или сплайс-вариант, который проявляет 99% или меньше глобальной гомологии относительно целевого гена, например, меньше чем 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% глобальной гомологии относительно целевого гена.
Полинуклеотидное средство предпочтительно содержит последовательность, по меньшей мере на 90% гомологичную SEQ ID NO: 93-105 и 106, более предпочтительно по меньшей мере на 91% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 91% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 92% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 93% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 94% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 96% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 97% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 98% гомологичную, более предпочтительно по меньшей мере на 99% гомологичную SEQ ID NO: 93-105 и 106.
Следует понимать, что нацеленному воздействию может подвергаться больше одного гена, чтобы сделать максимальным цитотоксический эффект на клещей варроа.
Таким образом, согласно одному варианту осуществления следующая группа генов подвергается нацеленному воздействию - субъединица А АТФазы, РНК полимераза III, ингибитор апоптоза (IAP), ингибитор апоптоза FAS и α-тубулин (например с применением средств нуклеиновой кислоты, характеризующихся последовательностью, представленной в SEQ ID NO. 1, 13, 27, 30 и 39, или средств нуклеиновой кислоты, характеризующихся последовательностью, представленной в SEQ ID NO. 93, 96, 100, 104 и 106).
Согласно другому варианту осуществления следующая группа генов подвергается нацеленному воздействию - субъединица А АТФазы, РНК полимераза I, РНК полимераза III, ингибитор апоптоза (IAP), ингибитор апоптоза FAS и α-тубулин.
Следует понимать, что наряду с отрицательной регуляцией ряда генов, настоящее изобретение дополнительно включает применение ряда средств для отрицательной регуляции одного и того же гена (например, ряд дсРНК, каждая из которых гибридизируется с различным сегментом одного и того же гена).
Согласно одному варианту осуществления используют два полинуклеотидных средства из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют три полинуклеотидных средства из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют четыре полинуклеотидных средства из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют пять полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют шесть полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют семь полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют восемь полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют девять полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют десять полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют одиннадцать полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют двенадцать полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют тринадцать полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют каждое из полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106.
Согласно одному варианту осуществления используют пять полинуклеотидных средств из группы SEQ ID NO: 93-106 - например, SEQ ID NO: 93, 96, 100, 104 и 106.
Инструменты, которые способны идентифицировать видоспецифические последовательности, могут использоваться с этой целью - например, BLASTN и другие подобные компьютерные программы.
Используемый в настоящем документе термин "отрицательная регуляция экспрессии" относится к индукции, прямо или опосредованно, снижения транскрипции требуемого гена, снижения количества, стабильности или транслируемости продуктов транскрипции (например, РНК) гена и/или снижения трансляции полипептида(ов), кодируемого(ых) требуемым геном.
Отрицательная регуляция экспрессии генного продукта клеща Varroa destructor может подвергаться мониторингу, например, путем прямого обнаружения генных транскриптов (например, с помощью ПЦР), путем обнаружения полипептида(ов), кодируемого(ых) геном или патогенной РНК пчелы (например, с помощью вестерн-блоттинга или иммунопреципитации), путем обнаружения биологической активности полипептидов, кодируемых геном (например, каталитическая активность, связывание с лигандом и подобное) или путем мониторинга изменений у клеща Varroa destructor (например, сниженная пролиферация клеща, сниженная вирулентность клеща, сниженная подвижность клеща и т.д.) и путем исследования инфекционности/патогенности пчелы.
Полинуклеотидные отрицательно регулирующие средства согласно настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с любым способом синтеза полинуклеотидов, известным в настоящей области техники, таким как ферментативный синтез или твердофазный синтез. Устройство и реагенты для проведения твердофазного синтеза коммерчески доступны, например, от Applied Biosystems. Также можно использовать любые другие средства для такого синтеза; фактический синтез полинуклеотидов находится в компетенции специалиста в настоящей области техники и может быть осуществлен посредством общепринятых методик, подробно изложенных, например, в "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988) и "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984) с использованием твердофазной химии, например, цианоэтилфосфорамидита с последующим снятием защитных групп, деминерализацией и очищением, например, с помощью автоматизированного способа с применением тритил-она или ВЭЖХ.
Полинуклеотидные средства согласно настоящему изобретению могут содержать гетероциклические нуклеозиды, состоящие из пуриновых и пиримидиновых оснований, связанных в направлении 3' - 5' фосфодиэфирной связью.
Предпочтительно используемые полинуклеотидные средства представляют собой средства с модифицированным каркасом, межнуклеозидными связями или основаниями, как в широком смысле описано в настоящем документе ниже.
Конкретные примеры предпочтительных полинуклеотидных средств, применимых согласно настоящему аспекту настоящего изобретения, включают в себя полинуклеотидные средства, содержащие модифицированные каркасы или не встречающиеся в природе межнуклеозидные связи. Полинуклеотидные средства, характеризующиеся модифицированными каркасами, включают в себя средства, которые сохраняют атом фосфора в каркасе, как раскрыто в патентах США №№:4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306;5550111;5563253; 5571799; 5587361 и 5625050.
Предпочтительные модифицированные полинуклеотидные каркасы включают в себя, например, фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфотриэфиры, сложные аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая в себя 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая в себя 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры и боранофосфаты, характеризующиеся нормальными 3-5' связями, их 2-5' связанные аналоги, и соединения, характеризующиеся инвертированной полярностью, причем соседние пары нуклеозидных звеньев связаны 3'-5' - 5'-3' или 2'-5' - 5'-2'. Также можно использовать различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.
Альтернативно, модифицированные полинуклеотидные каркасы, которые не включают в себя атом фосфора, характеризуются каркасами, которые образованы короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают в себя каркасы, характеризующиеся морфолино связями (образованными частично из части сахара нуклеозида); силоксановые каркасы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые каркасы; формацетильные и тиоформацетильные каркасы; метиленформацетильные и тиоформацетильные каркасы; содержащие алкен каркасы; сульфаматные каркасы; метилениминовые и метиленгидразиновые каркасы; сульфонатные и сульфонамидные каркасы; амидные каркасы; и другие, характеризующиеся смешанными N, О, S и СН2 составными частями, раскрытыми в патентах США №№5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439.
Другие полинуклеотидные средства, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, представляют собой полинуклеотидные средства, модифицированные как в отношении сахара, так и в отношении межнуклеозидной связи, т.е. каркас нуклеотидных звеньев заменен новыми группами. Основные звенья сохраняют для комплементарности с соответствующей полинуклеотидной мишенью. Пример такого полинуклеотидного миметика включает в себя пептидную нуклеиновую кислоту (PNA). Полинуклеотид PNA относится к полинуклеотиду, в котором сахарный каркас замещен содержащим амид каркасом, в частности, аминоэтилглициновым каркасом. Основания сохраняются и связываются напрямую или опосредовано с аза-атомами азота амидной части каркаса. Патенты США, которые раскрывают получение соединений PNA, включают в себя без ограничения патенты США №№5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен посредством ссылки в настоящий документ. Другие модификации каркасов, которые можно использовать в настоящем изобретении, раскрыты в патенте США №6303374.
Полинуклеотидные средства согласно настоящему изобретению также могут включать в себя модификации или замещения оснований. Используемый в настоящем документе термин "немодифицированные" или "природные" основания включают в себя пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные основания включают в себя без ограничения другие синтетические и природные основания, такие как 5-метилцитозин (5-me-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галоурацил и цитозин, 5-пропинил-урацил и -цитозин, 6-азо-урацил, -цитозин и -тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-гало, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-гало, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные основания включают в себя основания, раскрытые в патенте США №3687808, основания, раскрытые в The Concise Encyclopedia Of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990, основания, раскрытые Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, и основания, раскрытые Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research и Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, Β., éd., CRC Press, 1993. Такие основания особенно применимы для увеличения аффинности связывания олигомерных соединений согласно настоящему изобретению. Они включают в себя 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, включая в себя 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что 5-метилцитозиновые замещения увеличивают стабильность двойной спирали нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С. [Sanghvi YS et al. (1993) Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton 276-278] и в настоящее время представляют собой предпочтительные замещения оснований, даже более конкретно в комбинации с 2-О-метоксиэтильными модификациями сахара.
После синтеза полинуклеотидные средства согласно настоящему изобретению можно необязательно очистить. Например, полинуклеотиды можно очистить из смеси экстракцией с растворителем или смолой, осаждением, электрофорезом, хроматографией или их комбинацией. Альтернативно, полинуклеотиды можно использовать без очистки или с минимальной очисткой во избежание потерь вследствие обработки образца. Полинуклеотиды можно высушить для хранения или растворить в водном растворе. Раствор может содержать буферы или соли для стимуляции отжига и/или стабилизации цепей двойной спирали.
Следует понимать, что полинуклеотидное средство согласно настоящему изобретению может быть предоставлено per se, или в виде конструкта нуклеиновой кислоты, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полинуклеотидное средство.
Как правило, конструкт нуклеиновой кислоты содержит последовательность промотора, который является функциональным в клетке-хозяине, как описано в настоящем документе ниже.
Полинуклеотидные последовательности согласно настоящему изобретению под контролем функционально связанной промоторной последовательности, могут дополнительно быть фланкированы дополнительными последовательностями, которые преимущественно влияют на их транскрипцию и/или стабильность полученного транскрипта. Такие последовательности, как правило, расположены выше против хода транскрипции промотора и/или ниже по ходу транскрипции 3' конца конструкта экспрессии.
Термин "функционально связанный", используемый со ссылкой на регуляторную последовательность и структурную нуклеотидную последовательность, означает, что регуляторная последовательность вызывает регулируемую экспрессию связанной с ней структурной нуклеотидной последовательности. "Регуляторные последовательности" или "элементы контроля" относятся к нуклеотидным последовательностям, расположенным выше против хода транскрипции, в пределах или ниже по ходу транскрипции структурной нуклеотидной последовательности, и которые оказывают влияние на временные характеристики и уровень или количество транскрипции, процессинг или стабильность РНК или трансляцию связанной структурной нуклеотидной последовательности. Регуляторные последовательности могут включать в себя промоторы, трансляционные лидерные последовательности, интроны, энхансеры, структуры типа "петля-на-стебле", связывающие последовательности-репрессоры, терминирующие последовательности, последовательности паузы, последовательности распознавания полиаденилирования и подобное.
Следует понимать, что нуклеиновокислотные средства могут быть доставлены клещам варроа разнообразными путями.
Согласно одному варианту осуществления нуклеиновокислотные средства могут быть доставлены напрямую клещам (например, путем опрыскивания зараженного улья). Нуклеиновокислотные средства или конструкты, кодирующие их, могут проникать в организмы клещей путем диффузии. Согласно указанному варианту осуществления промотор конструкта нуклеиновой кислоты, как правило, является функциональным в клетках клеща.
Следует понимать, что поскольку клещи варроа используют свои ротовые органы для прокола пчелиного экзоскелета и питаются гемолимфой пчелы, настоящее изобретение включает доставку полинуклеотидных средств согласно настоящему изобретению пчелам, за счет чего они начинают присутствовать в гемолимфе пчелы, тем самым становясь доступными клещу. Таким образом, согласно другому варианту осуществления нуклеиновокислотные средства доставляются опосредованно клещам (например, через пчелу). Согласно указанному варианту осуществления промотор конструкта нуклеиновой кислоты, как правило, является функциональным в клетках пчелы.
Согласно одному варианту осуществления нуклеиновокислотные средства доставляют пчелам путем опрыскивания. Нуклеиновокислотные средства или кодирующие их конструкты могут проникать в организмы пчел путем диффузии.
Согласно другому варианту осуществления нуклеиновокислотные средства доставляют пчелам через их еду. Авторы настоящего изобретения считают, что после проглатывания средств нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению средства будут присутствовать в гемолимфе пчелы, за счет чего они становятся доступными клещу варроа.
Таким образом, полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы in vitro и добавлены в пищу. Например, двухцепочечная РНК может быть синтезирована путем добавления двух противоположно направленных промоторов (например, промоторов Т7; SEQ ID NO: 48 и 49) к концам генных сегментов, причем SEQ ID NO: 48 помещают непосредственно 5' относительно гена и SEQ ID NO: 49 помещают непосредственно 3' относительно генного сегмента. дсРНК могут затем транскрибировать in vitro с помощью РНК полимеразы Т7.
Примеры последовательностей для синтеза дсРНК согласно вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены в SEQ ID NO: 50-91 и 93-106.
Примеры праймеров для синтеза дсРНК согласно вариантам осуществления настоящего изобретения предусмотрены в SEQ ID NO: 107-134 (каждая пара представляет прямой и обратный праймер, смотрите таблицу 1 в разделе примеров).
Согласно некоторым вариантам осуществления нуклеиновокислотные средства, предусмотренные в настоящем документе, могут быть функционально связаны с проникающим в клетку пептидом. Используемый в настоящем документе термин "проникающий в клетку пептид" представляет собой пептид, который содержит короткую (приблизительно 12-30 остатков) аминокислотную последовательность или функциональный мотив, который обеспечивает свойства энергонезависимого (т.е. не эндоцитозного) переноса, связанные с транспортом проникающего через мембрану комплекса через плазматическую и/или ядерную мембраны клетки. Проникающий в клетку пептид, используемый в проникающем через мембрану комплексе согласно настоящему изобретению, предпочтительно содержит по меньшей мере один нефункциональный остаток цистеина, который либо является свободным, либо дериватизирован для образования дисульфидной связи с двухцепочечной рибонуклеиновой кислотой, которая была модифицирована для такого связывания. Репрезентативные аминокислотные мотивы, придающие такие свойства, перечислены в патенте США №6348185, содержание которого полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Проникающие в клетку пептиды согласно настоящему изобретению предпочтительно включают в себя без ограничения пенетратин, транспортан, plsl, ТАТ(48-60), pVEC, MTS и MAP.
Как подробно описано в настоящем документе кормление пчел представляет собой общепринятую практику среди пчеловодов для обеспечения как пищевых, так и других, например, относящихся к подкормкам нужд. Пчелы, как правило, питаются медом и пыльцой, но было установлено, что они также питаются искусственными пищевыми продуктами. Пчел можно кормить различными кормами, включая в себя без ограничения Wheast (молочные дрожжи, растущие на зернистом твороге), соевую муку, дрожжи (например, пивные дрожжи, дрожжи торула) и дрожжевые продукты, продукты, потребляемые отдельно или в комбинации и соевую муку, потребляемую в качестве сухой смеси или влажной лепешки внутри улья или в виде сухой смеси в открытых кормушках за пределами улья. Также применим сахар или сахарный сироп. Добавление 10-12 процентов пыльцы к добавке, которой кормят пчел, улучшает поедаемость. Добавление 25-30 процентов пыльцы улучшает качество и количество незаменимых питательных веществ, которые необходимы пчелам для жизненной активности.
Тростниковый или свекольный сахар, изомеризованная кукурузная патока, и сахарный сироп 50 типа представляют собой удовлетворительные заменители меда в естественной диете медоносных пчел. Последние два могут быть поставлены пчелам только в виде жидкости.
Жидкий корм может быть доставлен пчелам внутрь улья, например, любым из следующих способов: контейнер с фрикционной крышкой, соты внутри гнездовой секции, кормушка на разделительном дне, летковая кормушка и т.д. Сухой сахар можно давать, помещая один или два фунта на перевернутый внутренний колпачок. Подача воды должна быть доступна пчелам все время. Согласно одному варианту осуществления предусмотрены поддон или лотки, в которых находятся не тонущие опоры - такие как древесные стружки, кора пробкового дерева или пластиковая губка. Подробные описания подкормок для пчел можно найти, например, в публикации USDA Standifer, et al 1977, имеющей название "Supplemental Feeding of Honey Bee Colonies" (USDA, Agriculture Information Bulletin No. 413).
Следует понимать, что клещи варроа являются причиной появления ран в экзоскелете пчел. В таких поврежденных местах скапливаются такие бактериальные инфекции, как Melissococcus pluton, которая вызывает европейский гнилец пчелиного расплода. В дополнение к их паразитическим эффектам, предполагают, что клещи варроа действуют в качестве переносчиков ряда патогенов медоносных пчел, включая в себя вирус деформации крыла (DWV), вирус Кашмира (KBV), вирус острого паралича пчел (ABPV) и вирус черных маточников (BQCV), и могут ослаблять иммунные системы своих хозяев, делая их подверженными инфекциям.
Таким образом, уничтожая клещей (или предотвращая их размножение), средства согласно настоящему изобретению могут применяться для профилактики и/или лечения таких бактериальных инфекций, как Melissococcus pluton, и вирусных инфекций, вызванных перечисленными выше вирусами.
Поскольку считают, что заражение клещом варроа и вирусными инфекциями отвечает за синдром разрушения колоний (CCD), настоящие средства также могут использоваться для профилактики или снижения подверженности колонии пчел CCD.
Следует понимать, что в дополнение к кормлению олигонуклеотидами и/или полинуклеотидами для снижения инфекции и заражения пчел патогенами, осуществление правильной санации (например, воздержание от повторного использования зараженных ульев) может усиливать эффективность лечения и профилактики инфекций.
Используемый в настоящем документе термин "приблизительно" относится к ± 10%.
Термины "содержит", "содержащий", "включает в себя", "включая в себя", "характеризующийся" и их сочетания означают "включая в себя без ограничения". Этот термин охватывает термины "состоящий из" и "состоящий по существу из".
Фраза "состоящий по существу из" означает, что композиция или способ может включать в себя дополнительные ингредиенты и/или стадии, но только если дополнительные ингредиенты и/или стадии существенно не изменяют основные и новые характеристики заявленной композиции или способа.
Используемые в настоящем документе формы единственного числа включают в себя ссылки на формы множественного числа, если контекст ясно не диктует иное. Например, термин "соединение" или "по меньшей мере одно соединение" может включать в себя множество соединений, включая в себя их смеси.
Используемый в настоящем документе термин "способ" относится к методам, средствам, техникам и процедурам для осуществления поставленной задачи, включая в себя без ограничения такие методы, средства, техники и процедуры, которые либо являются известными, либо легко разрабатываются из известных методов, средств, техник и процедур специалистами в химической, фармакологической, биологической, биохимической и медицинской областях техники.
Используемый в настоящем документе термин "лечение" включает в себя устранение, существенное ингибирование, замедление или изменение на противоположное прогрессирование состояния, существенное улучшение клинических или эстетических симптомов состояния или существенную профилактику появления клинических или эстетических симптомов состояния.
Следует понимать, что определенные признаки настоящего изобретения, которые, для ясности, описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть предусмотрены в комбинации в одном варианте осуществления. Напротив, различные признаки настоящего изобретения, которые, для краткости, описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предусмотрены отдельно или в любой приемлемой подкомбинации или приемлемым образом в любом другом описанном варианте осуществления настоящего изобретения. Определенные признаки, описанные в контексте различных вариантов осуществления, не должны рассматриваться в качестве основных признаков указанных вариантов осуществления, если только вариант осуществления не является функциональным без указанных элементов.
Различные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения, изложенные выше в настоящем документе и заявленные в формуле изобретения ниже, находят экспериментальную поддержку в следующих примерах.
ПРИМЕРЫ
Теперб будут рассмотрены следующие примеры, которые вместе с вышеприведенными описаниями иллюстрируют некоторые варианты осуществления настоящего изобретения неограничивающим образом.
Как правило, используемая в настоящем документе номенклатура и используемые в настоящем изобретении лабораторные процедуры включают в себя молекулярные, биохимические, микробиологические техники и техники рекомбинантной ДНК. Такие техники подробно объясняются в литературе. Смотрите, например, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методики, представленные в патентах США №№4666828; 4683202; 4801531; 5192659 и 5272057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980); доступные иммуноанализы подробно описаны патентной и научной литературе, смотрите, например, патенты США №№3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; " Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R.I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, В., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все из которых включены посредством ссылки, как если бы они быть полностью представлены в настоящем документе. Другие общие ссылки предусмотрены по всему настоящему документу. Считается, что изложенные в них процедуры хорошо известны в настоящей области техники и предусмотрены для удобства читателя. Вся содержащаяся в них информация включена в настоящий документ посредством ссылки.
Пример 1
Кормление специфической для варроа дсРНК предотвращает заражение клещом варроа
Для определения эффективности проглоченной дсРНК на заражение клещом варроа медоносных пчел обеспечивают специфической для клеща варроа и контрольной дсРНК в корме в течение 7 дней перед и 2 дней после контакта с клещом варроа, как проиллюстрировано на фигуре 1. Подсчитывают количества мертвых клещей варроа на экспериментальный улей, и образцы живых и мертвых варроа собирают для молекулярного анализа.
Материалы и способы
Организация колоний в мини-улье: Молодых, возрастом приблизительно 2 месяца маток, вместе с приблизительно 200 рабочими пчелами собирают из ульев на местной пасеке. Пчел переносят в мини-ульи, оснащенные одним мини-сотом, который был ранее построены регулярным ульем. Все мини-ульи закрывают и помещают в помещение с контролируемой температурой (30°С).
Получение дсРНК: Последовательности клеща варроа клонируют в плазмиду между двумя противоположно направленными промоторами Т7. После размножения плазмидной ДНК вирусные фрагменты, включая в себя промоторы Т7, вырезают и очищают гель-фильтрацией. Они служат в качестве матриц для Т7-направленной in vitro транскрипции (MEGAscript™, Ambion, Austin TX). Продукт реакции подвергают обработке ДНазой с последующей фенольной экстракцией и осаждением в этаноле. Конечный препарат растворяют в не содержащей нуклеазы воде.
Кормление дсРНК в мини-ульях: 5 г лепешки пыльцевой подкормки помещают сверху каждого сота и 10 мл 50% раствор сахарозы вводят в улей в стерильной чашке Петри каждую ночь. Кормление продолжают в течение 9 дней и впоследствии только те ульи, в которых матки начали откладывать яйца, включают в испытание.
После организации активных ульев (матки, откладывающие яйца), некоторые из мини-ульев дополнительно снабжают специфической для клеща варроа (ген ингибитора апоптоза (IAP) (SEQ ID NO: 27) или неспецифической контрольной (например, GFP SEQ ID NO: 91) дсРНК, которую добавляют к 10 мл 50% раствора сахара, доставленного в ульи, доводя до приблизительно 1 мкг дсРНК на корм на одну пчелу, предполагая, что все пчелы потребляют одинаковое количество раствора сахарозы. Кормление дсРНК продолжают в течение шести дней.
Заражение мини-ульев клещом варроа: Через 7 дней после кормления в активных ульях некоторые колонии приводят в контакт с популяцией клещей варроа. После этого лечение с помощью дсРНК продолжают в течение дополнительных 2 дней. Образцы живых и мертвых пчел (личинки и взрослые особи) собирают ежедневно из каждого мини-улья после введения популяции клеща варроа в течение 32 последующих дней. Каждую собранную пчелу замораживают в жидком азоте и хранят при -70°С до проведения молекулярного анализа. Жизнеспособность колоний подвергают мониторингу, открывая ульи (без окуривания), вынимая мини-соты и фотографируя мини-соты с обеих сторон. Соты улья фотографируют ежедневно и количества оставшихся живых пчел подвергают мониторингу. Фотографии загружают в компьютер и подсчитывают общее количество пчел для каждого мини-улья.
Для исследования токсичности дсРНК другую группу ульев обеспечивают специфической для клеща варроа дсРНК, но ее не приводят в контакт с популяцией клеща варроа. Два набора ульев служат в качестве дополнительных контролей: ульи, которые не обрабатывают с помощью дсРНК и не инокулируют клещами варроа, и ульи, которые не обрабатывают с помощью дсРНК, но инокулируют клещами варроа.
Анализ ОТ-ПЦР:
Экстракция нуклеиновых кислот: Общую РНК экстрагируют из сохраненных пчел с применением способа TRIREAGENT (Sigma, St. Louis МО, USA). Кратко, РНК экстрагируют путем осаждения и разделения путем центрифугирования, затем ресуспендируют в растворе RNAsecure.
ОТ-ПЦР в реальном времени: Измеренные количества РНК (100 нг для анализов вирусной экспрессии и 100 пг для внутренних контролей 18S рРНК) подвергают одностадийной ОТ-ПЦР с применением мастер-микса SYBR Green PCR с обратной транскриптазой Taqman (Applied Biosystems, Foster City, CA). ОТ-ПЦР в реальном времени проводят в GeneAmp PCR System 5700 (Applied Biosystems). Реакции, проведенные без обратной транскриптазы или без матрицы, не должны давать в результате какой-либо продукт.
Анализ нозерн-блоттинг: Общую РНК экстрагируют из обработанных и контрольных пчел. Формальдегид добавляют к РНК до 1,8% и нагревают до 65°С. РНК, 15 мкг на полосу подвергают электрофорезу на 1,2% агарозном геле при 70 В, 4°С с перемешиванием. Описанный ранее амплифицированный продукт РНК клеща варроа метят дигоксигенином, и он служит в качестве зонда для гибридизации. Обнаружение проводят с помощью набора для люминесцентного обнаружения DIG (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Размеры РНК оценивают путем сравнения с подвергнутыми электрофорезу маркерами молекулярной массы РНК I (Roche). Гибридизацию проводят в условиях высокой жесткости (0,1x SSC; 65°С).
Поведение проглоченной специфической для клеща варроа дсРНК в медоносных пчелах: Для лучшего понимания механизмов действия, с помощью которых клещ варроа с дсРНК с защищает пчел от заражения клещом варроа и последствий этого, общую РНК экстрагируют из обработанных клещом варроа с дсРНК и необработанных контрольных пчел, подвергают обработке панели нуклеаз и разделяют на PAGE.
Результаты
Присутствие дсРНК в организме взрослой пчелы в личинках пчелы (которых кормили взрослые пчелы), в пчелиной куколке определяли с помощью слот-блот гибридизации с зондом для GFP. Процессинг дсРНК до миРНК определяли с помощью нозерн-блотов, обнаруживающих малые РНК (фигуры 2А-Е).
Особей варроа помещали на взрослых пчел, которых кормили в течение 7 дней дсРНК-GFP и на контрольных (которых не кормили дсРНК-GFP) пчел. РНК экстрагировали из варроа в указанные моменты времени (фигура 1) и подвергали ОТ-ПЦР с праймерами GFP. Результаты показаны на фигуре 3.
Пчел кормили сегментом дсРНК для гена ингибитора апоптоза (IAP) (SEQ ID NO: 27). Клещей варроа, собранных из этого улья, анализировали с помощью ОТ-ПЦР в отношении экспрессии гена IAP (фигура 4).
Пример 2
Материалы и способы
Ульи кормили двумя различными смесями дсРНК, соответствующими генным сегментам варроа. Все дсРНК соответствовали генным сегментам, которые не являются гомологичными пчелиным или человеческим последовательностям (не несут участков гомологичных последовательностей, длиннее 19 оснований). Смесь I (минимальная обработка) содержала SEQ ID NO: 1,13, 27, 30 и 39. Смесь II (максимальная обработка) содержала SEQ ID NO: 1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 27, 30, 33, 36 и 39. 30 особей варроа помещали в каждый улей и через 2 месяца варроа и пчел подсчитывали в каждом улье. Каждую обработку повторяли 3 раза.
Результаты
Не обнаружили никаких видимых нарушений прочности улья среди различных ульев. На фигуре 5 продемонстрировано снижение популяции варроа после обработки с помощью дсРНК генных последовательностей варроа.
Пример 3
Крупномасштабные полевые испытания специфической для варроа дсРНК для профилактики связанного с клещом варроа заболевания медоносных пчел
Для определения эффективности проглоченной дсРНК клеща варроа на заражение клещом варроа в действительных полевых условиях и для оценки эффектов на важные параметры здоровья колонии, пчел в служащих образцом полноразмерных ульях обеспечивали специфической для клеща варроа дсРНК в корме в течение 5 дней перед и 4 дней после заражения клещом варроа.
Материалы и способы
Материал насекомых:
Пулы пяти пчел из групп после обработок; дистанционный контроль, только дсРНК клеща варроа, только клещ варроа и специфическая для клеща варроа дсРНК +клещ варроа в каждый момент времени в день 0-(день нанесения вируса), день 7 и день окончания (день 42). Испытание повторяли несколько раз.
Экстракция РНК:
РНК экстрагируют с применением Tri-Reagent (Sigma, USA) согласно протоколу, предусмотренному производителем. Все образцы обрабатывают DNasel и ресуспендируют с буфером загрузки (90% формамид, 0,05 бромфенолового синего, 0,05% ксиленцианола) перед загрузкой на гель.
Гель-электрофорез и блот-анализ:
10 мкг свежеприготовленной РНК измеряют с применением нанокапельного спектрофотометра и загружают на 12% акриламидный гель (соотношение акриламида к бис-акриламиду составляет 1:19) в денатурирующих условиях окружающей среды (гель содержит 7М мочевину). После электрофореза образцы переносят на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Roch, USA) с применением способа электроблоттинга.
Гибридизация и обнаружение сигнала:
Мембрану гибридизируют со свежеприготовленным ДНК зондом сегмента клеща варроа, взятого из участка, который не соответствует дсРНК специфической для клеща варроа дсРНК. Это делают с применением набора для получения зондов для ПЦР DIG (Roch, USA) в течение ночи при 42°С в растворе DIG easyhyb (Roch, USA) в соответствии с протоколом производителя. Мембрану отмывают дважды с помощью 2 X SSC/0,1% SDS, затем отмывают для жесткости с помощью 0,1XSSC/0,1% SDS в 65°С. Мембраны дополнительно отмывают с применением набора DIG Wash and Block Kit (Roch, USA) в соответствии с протоколом производителя. Обнаружение проводят с применением субстрата CSPD-star (Roch, USA). Положительный контроль представляет собой 21nt ДНК праймеры, соответствующие гибризированной последовательности.
Сигнал обнаруживают с применением экспозиции мембраны в течение 2-12 часов в хемилюминометре, произведенном Kodak.
Основные параметры здоровья колонии пчел (количества запечатанного расплода, количества пчел в улье, возвращение сборщиц и производство меда) оценивают в ульях, в которые поставляли дсРНК клеща варроа, и контрольных ульях, при отсутствии заражения клещом варроа.
Пример 4
Двусторонняя передача проглоченной пчелой дсРНК от пчелы к клещу варроа и обратно пчеле посредством заражения варроа
В примерах 1 и 2 показали, что дсРНК можно передать от пчел клещам варроа напрямую в клещах, заражающих пчел, проглотивших дсРНК, или опосредованно в клещах, заражающих личинку, которую кормят пчелы, которые проглотили дсРНК. Для понимания того, могут ли клещи дополнительно служить в качестве дополнительного вектора, переносящего дсРНК или миРНК от клеща обратно "нативной" пчеле посредством паразитирования, "нативных" пчел заражали варроа после заражения проглотивших дсРНК пчел.
Материалы и способы
Получение дсРНК: Специфическую для варроа и GFP дсРНК получали из последовательностей, клонированных в плазмиды между противоположно направленными промоторами Т7, как описано в примере 1. Сегменты выбранных генов варроа длиной 200-450 п. н., которые не соответствовали последовательности каких-либо пчелиных или человеческих генов (идентичность меньше чем 21 последовательных оснований), выбирали для получения дсРНК варроа. На таблице I ниже подробно представлены последовательности праймеров, использованных для получения дсРНК, и длина ампликона, за исключением последовательности промотора Т7.
Экстракция и анализ РНК: Общую РНК для экспериментов по обнаружению дсРНК-GFP выделяли из одной медоносной пчелы или из 10 клещей варроа, с применением фенол-хлороформенной экстракции (peqGOLD Trifast™, Peqlab). Общую РНК для экспериментов по дсРНК варроа выделяли из 5 клещей варроа путем гомогенизации тканей, совместно с мини-колонкой, удалением ДНК и элюированием РНК (ZR Tissue & Insect RNA MicroPrep, Zymo Research, Irvine CA). ДНК обрабатывали в элюированной РНК с помощью нуклеаз (не содержащий ДНК набор TURBO, Ambion, Austin, ТХ, USA) и РНК исследовали в отношении примесей ДНК. РНК варроа затем совместно осаждали с гликогеном и 3 М ацетата натрия в 70% этаноле и ресуспендировали в 20 мкл не содержащей РНКазу воды. Количество и качество РНК определяли спектрофотометрически с применением нанокапельного способа (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).
Обнаружение дсРНК-GFP с помощью ОТ-ПЦР: дсРНК-GFP обнаруживали с помощью ОТ-ПЦР с применением 1-этапной ОТ-ПЦР Verso (Thermo Scientific) со специфическими праймерами GFP (SEQ ID NO. 135 и 136) с применением общей РНК, экстрагированной из 10 варроа или 1 медоносной пчелы в качестве матрицы.
Экспрессия генов: ОТ-ПЦР в реальном времени и полуколичественная ОТ-ПЦР: РНК (400 нг) подвергали обратной транскрипции со случайными гексамерами (набор кДНК Verso, Thermo Scientific, Waltham MA). Каждый образец полученной кДНК разводили 1:50 перед амплификацией. Количественную ПЦР в реальном времени проводили с помощью LightCycler 480 (Roche, Indianapolis, IN) и результаты анализировали с помощью программного обеспечения прибора. Праймеры и зонды подробно представлены в таблице II.
Программа ПЦР в реальном времени была следующей: 95°С в течение 10 мин, с последующими 45 циклами при 95°С в течение 10 секунд и 60°С в течение 30 секунд и в конце при 40°С в течение 30 секунд. 18S рРНК использовали в качестве внутреннего контроля для стандартизации содержания РНК.
Программа полуколичественной ПЦР была следующей: 95°С в течение 10 мин, с последующими 40 циклами, каждый из которых состоял из 95°С в течение 10 секунд и 65°С и 55°С в течение 30 секунд для ингибитора апоптоза (FAS, праймеры представляли собой SEQ ID NO. 145 и 146) и его внутренний контроль для стандартизации (актин, праймеры представляли собой SEQ ID NO. 147 и 148), соответственно, с последующими 72°С в течение 30 секунд. Продукты реакции собирали каждые три цикла, начиная с цикла 31 для FAS и с цикла 29 для актина, образец инкубировали в течение 5 мин при 72°С и хранили при -20°С. Образцы анализировали на 1,2% агарозном геле. Каждый эксперимент полуколичественной ПЦР повторяли три раза.
Режим кормления дсРНК-GFP: 1 дневных пчел помещали в четыре пластиковых контейнера (30 пчел на контейнер). Два контейнера кормили 30 мкг дсРНК-GFP в 200 мкл 50% раствора сахарозы в течение 8 дней, а другие два контрольных контейнера кормили 50% раствором сахарозы без дсРНК. Заражение клещом инициировали путем введения взрослых самок варроа (n=30) в каждый контейнер на 5 день. Через 3 дня варроа, которые прикрепились к пчелам, удаляли и собирали и их РНК выделяли для анализа дсРНК-GFP. Для исследования в отношении двухстороннего переноса дсРНК-GFP от пчелы к клещу и на другую пчелу, вновь появившихся, необработанных пчел заражали некоторым количеством варроа, которых открепили от проглотивших дсРНК пчел в течение 4 дней и РНК пчел выделяли для анализа дсРНК-GFP. Каждый день пчелам во всех контейнерах давали дополнительный 1 мл раствора сахарозы после окончания их обработки. Кроме того, пчелы имели свободный доступ к пыльцевой лепешке, состоящей из 70% пыльцы, смешанной с сахарной пудрой.
Для исследования непрямого переноса дсРНК-GFP от взрослой пчелы к пчелиной личинке и на клеща, который питается гемолимфой развившейся пчелы в запечатанной ячейке, чашку пчел (приблизительно 250) и плодоносящую матку вводили в каждый мини-улей (два повтора в каждом из двух огороженных участков). дсРНК-GFP (200 мкг на улей) обеспечивали ежедневно в 5 мл 50% раствора сахарозы в течение 8 дней. 30 клещей варроа вводили в ульи на пятый день. Взрослых самок варроа собирали из запечатанных ячеек с 11 дня до 30 дня и их РНК выделяли для анализа дсРНК-GFP.
Кормление специфической для варроа последовательностями дсРНК: Эксперимент с дсРНК варроа проводили в мини-ульях по 12 мини-ульев на повтор, для тех повторов. В каждом повторе чашку пчел и плодоносящую матку помещали в каждый мини-улей. Три мини-улья случайным образом закрепляли за одним из четырех огороженных сеткой участков, каждых из которых представляет различную обработку кормлением, пчел кормили 5 мл 50% раствора сахарозы в кормушках, помещенный в каждый мини-улей. Четыре обработки представляли собой: 1) только раствор сахарозы (необработанный контроль), 2) смесь I (200 мкг каждой из пяти дсРНК, добавленные в раствор сахара), 3) смесь II (200 мкг каждой из 14 дсРНК, добавленные в раствор сахара), и 4) дсРНК-GFP (200 мкг дсРНК), служащий в качестве положительного в отношении дсРНК контроля. Пчел, которые полностью потребили растворы обработки, дополнительно прикармливали леденцом (67% сахарной пудры и 33% меда). Кроме того, пчелы рутинно кормили пыльцевыми лепешками (70% пыльцы и 30% сахарной пудры). Каждый повтор эксперимента длился в течение 60 дней (фигура 8). Пчел в каждой обработке кормили соответствующим раствором ежедневно в течение первых 10 дней и в течение последних 14 дней, и дважды в неделю в промежутке. Заражение клещами варроа инициировали путем введения клещей в каждый мини-улей с 7 дня до 14 дня. В первом повторе 30 клещей вводили в каждый мини-улей; в последних двух повторах 100 клещей вводили в каждый мини-улей. На 60 день всех зрелых пчел собирали, подсчитывали и встряхивали с 70% этанолом в течение ночи для сбора и подсчета клещей варроа, упавших с пчел. Все запечатанные ячейки с расплодом открывали для сбора и подсчета клещей варроа. Количество клещей на пчелу включало в себя зрелых и развивающихся (запечатанный расплод) пчел. Клещей варроа, взрослых пчел, появляющихся пчел и куколки сохраняли для молекулярных анализов.
Статистический анализ: Статистические анализы проводили с помощью статистического программного обеспечения JMP версии 9 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Статистическую достоверность устанавливали на Ρ<0,05. Для исследования достоверных различий в относительной экспрессии, однофакторный дисперсионный анализ проводили на значениях ddCt. Обработка представляла собой основной фактор. Для исследования различий в популяции клеща варроа, двухфакторный дисперсионный анализ проводили на количествах особей варроа на пчелу в блочной схеме с обработкой в качестве основного эффекта и экспериментальной повторностью в качестве блока. Для исследования различий в общей пчелиной популяции аналогичный двухфакторный дисперсионный анализ проводили на общем количестве пчел (запечатанный расплод и взрослые особи). Достоверные различия между обработками исследовали с помощью критерия Тьюки-Крамера (HSD).
Результаты
Прямой и непрямой горизонтальный перенос дсРНК между пчелами и клещами варроа: Как показано в примерах 1 и 2, пчелы, которых кормили дсРНК, могут переносить последовательности дсРНК клещам варроа посредством заражения, и пчелиным личинкам и куколкам посредством кормления с помощью несущих дсРНК пчел.
Прямой перенос GFP-специфических последовательностей от взрослых пчел, которых кормили дсРНК-GFP в 50% растворе сахарозы в течение 8 дней, клещам варроа посредством заражения на пятый день кормления подтверждали с помощью ОТ-ПЦР РНК клеща через 3 дня заражения (фигура 6, смотрите полосы В+ и V+).
Непрямой горизонтальный перенос GFP-специфических последовательностей от пчел клещам посредством личинок/куколок подтверждали путем обнаружения, путем ПЦР, GFP-специфических последовательностей в РНК варроа, собранной от клещей, питающихся на личинках/куколках, которых кормят пчелы-кормилицы, проглотившие содержащий GFP-специфическую дсРНК раствор сахара (результаты не показаны).
Для исследования двухстороннего горизонтального переноса клещей, которые питаются на пчелах, проглотивших GFP-специфическую дсРНК, удаляли от пчел через 3 дня и вводили в контейнер с необработанными, "нативными" пчелами на 4 дня. ОТ-ПЦР варроа и пчелиной РНК выявила, что GFP-специфические последовательности РНК обнаружили в экстрактах РНК "нативных" пчел, на которых паразитировали клещи варроа, предварительно заразившие пчел, несущих GFP-дсРНК (смотрите фигуру 7, полосы В- и В+). Присутствие GFP-специфических последовательностей у зараженных "нативных" пчел указывает на реципрокный, двухсторонний перенос GFP-специфических последовательностей, происходящих от дсРНК, от пчелы клещу варроа и затем другой пчеле путем заражения клещом.
Указанные результаты ясно указывают на удивительные дополнительные средства для передачи, от пчел, которых кормили дсРНК, клещам и обратно "нативным" пчелам, последовательностей РНКи, происходящих от дсРНК. Такая двухсторонняя передача может быть эффективной в дополнительной диссеминации эффекта сайленсинга специфической для эктопаразита (например, клеща) дсРНК, которой кормят пчел.
Пример 5
Сайленсинг экспрессии гена варроа, опосредованный пчелами, проглотившими дсРНК
Специфический сайленсинг экспрессии гена варроа посредством кормления дсРНК пчел исследовали в мини-ульях, состоящих из приблизительно 250 рабочих пчел и плодоносящей матки. Мини-ульи обеспечивали пчелиным кормом (раствором сахарозы) с любой одной из двух смесей дсРНК варроа: Смесь I содержала последовательности, происходящие от пяти последовательностей гена варроа (SEQ ID NO. 93, 96, 100, 104 и 106) или смесь II содержала 14 последовательностей гена варроа (SEQ ID NO. 93-106). Следует отметить, что последовательность, представленная SEQ ID NO: 101, не присутствует в смеси I. Контроли представляли собой мини-ульи, которые кормили нерелевантной дсРНК (dsGFP) или только раствором сахарозы.
Клещей варроа вводили через 1 неделю кормления, клещей добавляли каждый день в течение недели (смотрите протокол на фигуре 8). В конце 60 дней клещей варроа отбирали для получения образцов для всех четырех групп обработки и уровни транскрипции четырех выбранных генов варроа определяли ОТ-ПЦР в реальном времени или полуколичественной ОТ-ПЦР, как описано в примере 4.
Результаты
ПЦР в реальном времени РНК варроа (фигуры 9А-9С) ясно указывает на приблизительно 35-60% снижение в экспрессии трех репрезентативных специфических для варроа генов (РНК полимераза III, 9А; IAP1 и IAP2, 9В и вакуолярная протонная АТФаза, 9С), что является результатом кормления пчел специфической для варроа дсРНК. Полуколичественная ПЦР РНК варроа (фигура 9D) иллюстрирует даже более сильный, потенциально разрушительный сайленсинг экспрессии гена ингибитора апоптоза FAS варроа путем кормления пчел специфической для варроа дсРНК, очень специфическим образом (сравните с фигурами 9Е и 9F).
Эффект генного сайленсинга экспрессии гена варроа на заражение варроа в ульях: После обнаружения сайленсинга некоторых генов варроа исследовали эффект на заражение клещами.
3,29
Для определения того, воздействует ли кормление смесями дсРНК на выживаемость пчел, подсчитывали всех зрелых пчел и запечатанный расплод в мини-ульях при завершении протокола (смотрите фигуру 8). Размер пчелиной популяции не различался между контрольными и обработанными дсРНК мини-ульями (F=0,62, Ρ=0,608; фигура 10). Результаты были сходными, когда расплод и взрослых пчел анализировали отдельно (не показано). Таким образом, кормление смесями дсРНК не является вредным для пчел, указывая на отсутствие нецелевого эффекта кормления.
Для определения того, можно ли использовать опосредованный пчелами сайленсинг генов варроа для контроля заражения клещами в ульях, количество особей варроа на пчелу определяли с помощью фактического изучения популяции клещей на зрелых пчелах и в запечатанных гонидиях при завершении протокола.
3,29
Заражение варроа снижалось у пчел в мини-ульях, которых кормили дсРНК варроа, по сравнению с контролями (F=5,65, Ρ=0,0035; фигура 11). Эффект был даже более значительным у пчел из ульев, которые получали смесь II, которая нацеленно воздействовала на большее количество генов, чем смесь I, снижая заражение варроа в среднем на 53% по сравнению с контрольными ульями, которые кормили дсРНК-GFP контролем, и на 61% по сравнению с ульями, не получающими дсРНК контроль.
Обобщая, указанные результаты указывают на то, что кормление пчел специфической для варроа дсРНК приводят как прямой, так и непрямой передаче специфической для клеща дсРНК и миРНК клещам, которые питаются на пчелах и личинках/куколках в ульях, а также к двухсторонней передаче специфических для варроа последовательностей РНК от паразитирующих клещей обратно "нативным" пчелам, и что кормление специфической для варроа дсРНК представляет собой эффективный и безопасный способ снижения заражения ульев клещом.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в связи с его конкретными вариантами осуществления, следует понимать, что многие альтернативы, модификации и варианты будут очевидны специалистам в настоящей области техники. Соответственно, предусмотрено, что все такие альтернативы, модификации и варианты, подпадают под сущность и широкий объем прилагаемой формулы изобретения.
Все упомянутые в настоящем описании изобретения публикации, патенты и патентные заявки полностью включены в настоящий документ посредством ссылки в настоящем описании изобретения, в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была конкретно и отдельно предусмотрена для включения в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, цитирование или указание любой ссылки в настоящей заявке не должно рассматриваться как допущение того, что такая ссылка доступна в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения. В той степени, в которой используют названия разделов, они не должны рассматриваться как обязательно ограничивающие.