СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Listeria monocytogenes НА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЕ, ПРИГОТОВЛЕННОЙ НА ОСНОВЕ ЛИСТОВОГО САЛАТА (Lactuca sativa)
METHOD OF CULTURING Listeria monocytogenes ON NUTRIENT MEDIUM PREPARED ON BASIS LEAF LETTUCE (Lactuca sativa)

Изобретение относится к микробиологии, а именно к санитарно-гигиеническому контролю за инфицированностью растений, употребляемых в пищу человеком, как фактора передачи возбудителя листериоза.
Одной из важных особенностей листериоза является то, что он относится к возбудителям сапрозоонозов, обладающим сапрофитной и паразитической природой, способными существовать как в организме человека и животных, вызывая инфекционный процесс, так и в объектах окружающей среды (почва, вода, растения и т.д.). Употребляемые в пищу человеком растения являются одним из важных факторов передачи Listeria monocytogenes (Г.П. Сомов, Л.С. Бузолева. Адаптация патогенных бактерий к абиотическим факторам окружающей среды./ Изд-во ОАО "Примполиграфкомбинат", г. Владивосток, 2004 г., с. 13).
Индикация L. monocytogenes из объектов внешней среды, в том числе из растений, вызывает определенные трудности, в основном из-за некорректного употребления в способах диагностики необходимых питательных сред и температуры культивирования на этих средах.
Известен способ культивирования иерсиний и листерий среды накопления листериозного микроба - среды Хоттингера (Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования, Москва, 1967, с. 53-54). Среду готовят на основе гидролизата мяса или рыбы, которые варят, затем к отвару добавляют либо свежую перемолотую поджелудочную железу, либо сухой панкреатин, перемешивают, доводят до pH 7,8 - 8,0. Добавляют хлороформ и оставляют смесь для переваривания на 7-16 дней.
Недостатками среды Хотингера как диагностической среды для выявления листерий из растительных субстратов являются: неадаптированность к растительным субстратам (среда готовится на рыбном гидролизате), в связи с этим неполное выявление внеорганизменных популяций из смывов с овощей. Известно, что смена сред обитания (с растения на мясо) способствует формированию стресса у микроорганизмов (Работнова И.Л., Позмогова И.Н. Некоторые вопросы общей физиологии микроорганизмов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. 1994. № 4. С. 116-120), что, в свою очередь, приводит к модификационным изменениям биологических свойств листерий, а следовательно, к некорректной диагностике. Кроме того, приготовление среды трудоемко и в качестве компонентов используются дорогостоящие пищевые продукты.
Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ культивирования и количественного учета иерсиний и листерий в объектах внешней среды на питательной среде, включающей продукты растительного происхождения. В качестве продуктов растительного происхождения используют отвары отрубей ржаных, капусты и моркови. Для приготовления 1 л питательной среды берут: 5-20 мл отвара отрубей ржаных, 10-30 мл отвара капусты, 5-20 мл отвара моркови, 10-15 г агара микробиологического и доводят до 1 л фосфатным буфером pH 7,4. Культивирование иерсиний и листерий на питательной среде ведут при температуре 37°С среды (Патент РФ № 2161655, МПК C12Q 1/04, C12N 1/20, опубл. 10.01.2001).
Недостатком данного способа является использование для культивирования листерий многокомпонентной среды на основе отвара капусты, моркови и отрубей. Многокомпонентность питательной среды в микробиологии считается отрицательным фактором из-за трудности сохранения состава среды, к тому же осложняется процесс способа культивирования, поскольку отвары для приготовления питательной среды готовятся в раздельных емкостях, при кипячении, далее полученные отвары требуют раздельной фильтрации и стерилизации. Однако основным недостатком данного способа следует считать невысокую корректность диагностики, связанную, в частности, с культивированием листерий при стандартной температуре 36-37°C, которая не обеспечивает получение листерий в устойчивой форме на этой среде (колонии имеют R-форму), а также с проявлением угнетающего действия моркови на рост листерий.
Задача, решаемая изобретением, разработка простого, нетрудоемкого способа культивирования Listeria monocytogenes, обеспечивающего точность и корректность диагностики листериоза, за счет получения листериозного микроба в устойчивой форме, а также расширение сырьевой базы для приготовления питательных сред, способствующих улучшению дифференциально-диагностических свойств в отношении количественного и качественного роста колоний листерий.
Поставленная задача решается тем, что в известном способе культивирования листериозного микроба (Listeria monocytogenes) на питательной среде, включающей продукт растительного происхождения, агар и фосфатный буфер, согласно изобретению, в качестве продукта растительного происхождения берут маточный раствор сока листового салата.      Компоненты смешивают при следующем соотношении:
Маточный раствор сока листового салата, содержащего сухое вещество
6-9 г
Агар
100 г
Фосфатный буфер
до 1 л
Затем в подготовленную среду вносят исследуемый материал и инкубируют для накопления листериозного микроба (Listeria monocytogenes) при температуре 20-22°C не менее 24 часов.
Использование в составе питательной среды в качестве продукта растительного происхождения маточного сока листового салата не только значительно упрощает и удешевляет процесс приготовления питательной среды, но и обеспечивает, в конечном результате, повышение точности диагностики очень опасного для человека заболевания - листериоза.
На основе данных литературы (базы данных SCOPUS, WEB of Science, РИНЦ) основным фактором передачи листерий является салат листовой, по сравнению с другими видами культурных растений (Koch, Stark, 2006; Doorduyh et al., 2007). На фиг. 1 представлено распределение количества случаев контаминации растений, как факторов передачи возбудителя Listeria monocytogenes по данным доступной литературы, где самый большой - столбик 2 - относится к листовому салату.
Однако по результатам поиска по научно-технической и патентной документации и питательных сред на основе листового салата не выявлено. На основании этого заявитель считает, что заявленное техническое решение соответствует критериям новизна и изобретательский уровень.
Листовой салат (Lactuca sativa) является одной из наиболее распространенных и любимых потребителями культур, поскольку он очень полезен - в нем много витаминов и минералов. Существует более ста видов салатов: самых разных форм и расцветок - от нежно-зеленых до темно-бордовых, и все удивительно вкусные. Для приготовления питательной среды может быть использован маточный раствор следующих видов листового салата: рукола, изумрудный, московский парниковый, одесский кучерявец, эндивий нежный, хрустящий витаминный, дубочек МС, энергия лета и др.
Для приготовления маточного раствора сока листового салата его промывают последовательно водопроводной и стерильной водой, высушивают при комнатной температуре, измельчают, и из полученной массы отжимают сок, и определяют содержание сухого вещества в 1 мл маточного раствора сока.
В питательную среду вводят маточный раствора сока, содержащий 6-9 г сухого вещества, именно данное количество необходимо для получения питательной среды, содержащей достаточное количество органического и минерального питания, а также витаминов для культивирования листериозного микроба.
Применение фосфатного буфера в заявляемом количестве позволяет получить бактериям необходимое минеральное питание, особенно фосфор, а также фосфатный буфер стабилизирует растительную среду, поддерживая значение pH постоянным 7,4.
Применение агара в количестве 100 г/л обеспечивает плотную основу для формирования колоний.
Выход за пределы заявленных значений компонентов среды приводит либо к перерасходу используемых реактивов, либо к снижению ростовых показателей среды и появлению нежелательной изменчивости листериозного микроба, и, как следствие, к некорректности определения количества Listeria monocytogenes.
Экспериментально установлено, что проведение процесса культивирования при температуре 20-22 МПК C12Q 1/04, C12N 1/20
Способ культивирования Listeria monocytogenes на питательной среде, приготовленной на основе листового салата (Lactuca sativa)
C позволяет получить листериозный микроб Listeria monocytogenes в наиболее устойчивой S-форме, вследствие чего, значительно повышается точность и корректность диагностики листериоза. Кроме того, это позволяет избежать изменения биологических свойств листерий, изначально обитающих на растениях при этой температуре, и увеличивает вероятность обнаружения листериозного микроба.
Накопление листериозного микроба при разных температурах в различных формах наглядно подтверждается результатами морфологических исследований, представленных на фиг. 2 и фиг. 3. Морфологическое изучение структуры колоний выявило, что при 37°C бактерии на растительных средах находились в R-форме (Фиг. 2), а при 20-22°C - в S-форме (Фиг. 3). Известно, что R-форма или шероховатые колонии листерий образуются за счет клеток, имеющих измененные поверхностные структуры, что сказывается при идентификации листерий. Так, например, при постановке биохимических рядов Гиса не ферментируются L-сорбоза, D-маннитол, D-раффиноза D-мелезидоза, являющиеся ключевыми диагностическими признаками для идентификации Listeria monocytogenes. Это проявляется в возможной неточности и замедленности проявления реакции агглютинации.
При температуре ниже 20°C культура растет медленно (2-3 суток), а при повышении температуры культивирования более 22°C большая часть колоний переходит в R-форму. Это, в конечном результате, приводит к получению некорректных результатов диагностики листериоза, а также к ухудшению дифференциально-диагностических свойств в отношении количественного и качественного роста колоний листерий.
Экспериментально установлено, что культивирование листериозного микроба целесообразно вести не менее 24 часов, если проводить культивирование меньше по времени, то колонии формируются в недостаточном количестве, что осложняет впоследствии их характеристику как качественного, так и количественного состава. Таким образом, суток вполне достаточно для накопления листериозного микроба, обеспечивающего корректность выявления листериоза, а также очень удобно с практической стороны работы.
Описание чертежей: на фиг. 1 представлено количество случаев контаминации растений, как факторов передачи возбудителя Listeria monocytogenes по данным доступной литературы, где столбец 1 картофель, столбец 2 - салат листовой, столбец 3 - другие овощи; на фиг. 2 - рост колоний Listeria monocytogenes на питательной среде на основе салата листового при культивировании при 37°C (R-форма); на фиг. 3 - рост колоний Listeria monocytogenes на питательной среде на основе салата листового при культивировании при 20-22°C (S-форма).
Для реализации способа культивирования Listeria monocytogenes предварительно готовят маточный раствор салата, фосфатный буфер и питательную среду.
Маточный раствор сока салата готовят следующим образом: берут 100-150 г листового салата определенного вида, промывают водопроводной и стерильной водой последовательно, высушивают при комнатной температуре и измельчают, затем получают сок при помощи соковыжималки. Сок можно готовить впрок, хранить в холодильнике, использовать по мере необходимости.
Буфер фосфатный готовят на основе стерильной воды. Для приготовления фосфатного буфера берут натрий фосфорнокислый двузамещенный - 8,7 г/л, калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,7 г/л, до 1 л - дистиллированная вода, устанавливают pH 7,4, стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 30 мин.
Осуществление способа демонстрируется следующими примерами.
Пример 1.
К 100 мл маточного раствора сока листового салата «Рукола», содержащего 6 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.
2
На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10 КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час термостатируют 5 проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.
Полученные результаты отражены в табл. 1.
Пример 2.
К 150 мл маточного раствора сока листового салата «Рукола», содержащего 9 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.
2
На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10 КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 часов 10 минут термостатируют 5 проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.
Полученные результаты отражены в табл. 1.
Пример 3.
К 100 мл маточного раствора сока листового салата «Кучерявец одесский», содержащего 6 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.
2
На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10 КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час термостатируют 5 проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.
Полученные результаты отражены в табл. 1.
Пример 4.
К 100 мл маточного раствора сока листового салата «Эндивий нежный», содержащего 6 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.
2
На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10 КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час термостатируют пять проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.
Полученные результаты отражены в табл. 1.
Пример 5.
К 100 мл маточного раствора сока листового салата «Лоло-росса», содержащего 6 г сухого вещества, добавляют 100 г агара микробиологического и доводят стерильным буфером фосфатным до 1 л (установленного pH 7,4). Полученная питательная среда прозрачная, зеленоватого цвета, не имеет запаха, pH среды 7,4.
2
На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10 КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час 30 минут термостатируют пять проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.
Полученные результаты отражены в табл. 1.
Пример 6 (используется питательная среда из способа прототипа).
2
Для приготовления 1 л питательной среды берут: 10 мл отвара отрубей ржаных, 15 мл отвара капусты, 10 мл отвара моркови, 15 г агара микробиологического и доводят до 1 л фосфатным буфером pH 7,4. На приготовленную среду высевают листерий в физиологическом растворе в количестве 10 КОЕ/мл. На культивирование в течение 24 час термостатируют пять проб при различных температурах: 19°C, 20°C, 21°C, 22°C и для контроля одну из проб при 37°C - стандартной, широко используемой температуре культивирования бактерий Listeria monocytogenes.
Полученные результаты отражены в табл. 1.
Из приведенных в таблице 1 данных видно, что прирост листерий в заявляемой питательной среде, в заявляемых режимных параметрах, значительно выше по сравнению с прототипом.
Таким образом, заявляемое техническое решение позволяет получить достаточно высокую численность листерий в устойчивой S-форме, что обеспечивает более полное выявление и учет внеорганизменных популяций неизмененных форм листерий, обитающих на растениях, являющихся факторами передачи инфекции.
Дополнительными преимуществами разработанного способа учета являются расширение сырьевой базы, а также улучшение ее дифференциально-диагностических свойств в отношении количественного и качественного роста колоний листерий. Способ прост в осуществлении, не требует использования специального оборудования и химических реактивов.