LACTOBACILLUS RHAMNOSUS RHT-3201, КОНЪЮГИРОВАННЫЕ С ПОЛИСАХАРИДНЫМ ПОЛИМЕРНЫМ СВЯЗУЮЩИМ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ АТОПИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
LACTOBACILLUS RHAMNOSUS RHT-3201 CONJUGATED WITH POLYSACCHARIDE POLYMER BINDER, AND USE THEREOF FOR PREVENTION OR TREATMENT OF ATOPIC DISEASES

Для данной заявки испрашивается приоритет по корейской патентной заявке № 10-2014-0054237, поданной 7 мая 2014, которая включена в данное описание посредством ссылки в полном объеме.
Настоящее изобретение относится к инактивированным нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированным с полимерным полисахаридным связующим, способу их получения и их применению и, в частности, к способу получения инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, инактивированным нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированным с полимерным полисахаридным связующим, полученным этим способом, и фармацевтической композиции и композиции пищевого продукта для профилактики и лечения атопических заболеваний, содержащей инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, в качестве активного ингредиента.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Атопический дерматит (AD) относится к хроническому и рецидивному воспалительному кожному проявлению, сопровождающемуся кожным зудом, и главным образом, наблюдающемуся у детей младшего и среднего возраста. Атопическое заболевание является самым типичным аллергическим заболеванием вместе с аллергическими ринитами и бронхиальной астмой, при этом известный показатель распространенности атопических заболеваний составляет 10-30% у детей и 1-3% у взрослых.
Атопический дерматит проявляется из-за гиперчувствительной реакции иммунной системы на антигены, такие как частицы пылевого клеща, попавшие на тело человека. Макрофаги представляют антигены T клеткам, при и этом T клетки дифференцируются на Th1 или Th2 клетки согласно типу антигенов или рецепторов, с которыми они реагируют. Th2 клетки активируют гуморальный иммунитет через цитокины, такие как IL-4, IL-5, и IL-10, и активируют B клетки, приводя к повышению продуцирования IgE и, таким образом, вызывая атопический дерматит. В то время как Th1 клетки активируют клеточный иммунитет через IL-12 и IFN-γ, и IFN-γ, ингибируя продуцирование IgE. Следовательно, для облегчения симптомов атопических заболеваний поддерживается баланс иммунной регуляции Th1 клеток и Th2 клеток.
Несмотря на то, что до сих пор отсутствует основной эффективный метод лечения атопического дерматита, для этого используют противоаллергические лекарственные средства, антигистаминные лекарственные средства, стероиды и другие медикаменты. Наиболее часто назначаемыми из них для лечения атопического дерматита являются стероиды в форме мази, которые снижают иммунологическую реактивность, снижая воспаление, при этом сообщается о возникновении различных типов побочных эффектов при их длительном применение.
В тоже время на рынке в качестве пищевых материалов представлены многие молочнокислые бактерии или молочные продукты, содержащие молочно-кислые бактерии, которые обладают иммунорегулирующим действием. Примеры молочнокислых бактерий могут включать род Lactobacillus, род Lactococcus, род Streptococcus, род Pediococcus, род Enterococcus и аналогичное им, также известно, что эти молочнокислые бактерии обладают иммуностимулирующим или противоаллергическим действием. Авторы настоящего изобретения получили патентные права на Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201, обладающие сбалансированной иммунорегулирующей функцией Th1 и Th2 клеток, которые являются новым штаммовым материалом, не имеющим побочных эффектов при использовании в течение длительного периода времени и позволяющим по существу проводить лечение атопического дерматита (зарегистрированный в Корее патент № 1007429000000 (Korean Patent Registration No. 1007429000000)).
Однако в качестве резидентной флоры в кишечнике человека живут 100 триллионов или более энтеробактерий, относящихся к около 500 различным типам, при этом вредные бактерии, такие как E. coli, и полезные бактерии, такие как молочнокислые бактерии, сбалансированы. Следовательно, введенные пробиотические молочнокислые бактерии имеют ограниченную способность конкурентной адгезии к слизистой кишечника и, следовательно, их влияние варьируется в зависимости от скорости их адгезии. Дополнительно, определенное количество пробиотических молочнокислых бактерий погибает при прохождении желудочно-кишечного тракта или выходит из конкурентной адгезии при дефекации. Следовательно, пробиотические молочнокислые бактерии ограничены в своем вкладе в лечение тяжелых атопических заболеваний.
Дополнительно, пробиотики необходимо вводить в избыточном количестве по сравнению с их стандартным количеством для улучшения эффективности их адгезии к слизистой кишечника, поскольку во время прохождения желудочно-кишечного тракта им приходится преодолевать множество препятствий до момента достижения кишечника. Следовательно, трудно прогнозировать потребленное количество микроорганизмов и эффективность лечения атопического заболевания. В виду этих проблем существует несколько молочнокислых бактерий, которые демонстрируют тот же уровень или эффективность лечения, как и лекарственные средства на основе стероидов. Несмотря на усилия по улучшению эффективности пробиотиков в составе формулы, продолжают существовать проблемы, состоящие в невозможности установления нормализованного уровня влияния пробиотиков из-за гибели штаммов пробиотических бактерий, в норме происходящей во время их хранения.
В виду произошедшего в последнее время прогресса в исследованиях иммунной системы слизистой оболочки кишечника человека сообщается о взаимодействии и прочности адгезии между иммунными клетками слизистой оболочки кишечника человека, являющегося хозяином, и компонентами клеточных стенок молочнокислых бактерий. Из них toll-подобный рецептор-2 (TLR-2) дендритных клеток (DC) связывается с липотейхоевой кислотой и пептидогликаном, находящимся в клеточных стенках указанных бактерий, для доставки иммунных сигналов.
Дополнительно, молочнокислые бактерии с иммунорегулирующими функциями позволяют внеклеточное продуцирование короткоцепочечной жирной кислоты (SCFA) и иммунопротеинов при ферментации в специфических и различных средах, способствуя, таким образом, секреции IFN-γ и IL-12 из Th1 клеток и, таким образом, приводя к снижению выраженности атопического дерматита. Однако хотя большинство продуктов ферментации молочнокислыми бактериями не приводят к снижению выраженности атопического дерматита, только некоторые селективные молочнокислые бактерии продуцируют такие вещества и, следовательно, значение разработки таких бактерий очень высоко.
Такие предпосылки привели к разработке композиции, требуемой для использования при лечении атопического дерматита по существу с преодолением побочных эффектов лекарственных средств на основе стероидов, используемых для лечения атопического дерматита, и ограничения пробиотических молочнокислых бактерий при лечении атопического дерматита из-за их скорости адгезии.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА
Авторы настоящего изобретения во время исследования по разработке материала для лечения атопического дерматита без побочных эффектов с высоким уровнем эффективности, эквивалетным таковому у лекарственных средств на основе стероидов, подтвердили, что конъюгат инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus и связующего, полученный смешиванием полимерного полисахарида с культуральным фильтратом, имеет превосходную способность к адгезии с иммунными клетками слизистой кишечника и терапевтически эффективен при тяжелом атопическом дерматите без побочных эффектов, и достигается настоящим изобретением. Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, способ включает: (a) разделение ферментационной культуральной среды, полученной культивированием Lactobacillus rhamnosus, на бактерии и ферментационный фильтрат; (b) смешивание ферментационного фильтрата со стадии (a) и полимерного полисахарида с получением полимерного полисахаридного связующего; (c) инактивацию нагреванием бактерий, отделенных на стадии (a); и (d) конъюгирование инактивированных нагреванием бактерий на стадии (c) со связующим, полученным на стадии (b).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к инактивированным нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированным с полимерным полисахаридным связующим, полученным указанным выше способом.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики и лечения атопических заболеваний, где композиция содержит в качестве активного ингредиента инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, для получения агента для лечения атопического дерматита.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения атопического заболевания, где способ включает введение эффективного количества инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, субъекту, нуждающемуся в профилактике или лечение атопического заболевания.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции пищевого продукта для профилактики и снижения выраженности атопического дерматита, где композиция содержит в качестве активного ингредиента инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, для получения пищевого продукта для профилактики и снижения выраженности атопического дерматита.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или снижения выраженности атопического заболевания, где способ включает употребление в пищу пищевого продукта, содержащего в качестве активного ингредиента эффективное количество инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, субъекту, нуждающемуся в профилактике или снижение выраженности атопического заболевания.
РЕШЕНИЕ ТЕХНИЧЕСКОЙ ПРОБЛЕМЫ
Согласно одному из аспектов настоящее изобретение относится к способу получения инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, где способ включает: (a) разделение ферментационной культуральной среды, полученной культивированием Lactobacillus rhamnosus, на бактерии и ферментационный фильтрат; (b) смешивание ферментационного фильтрата со стадии (a) и полимерного полисахарида с получением полимерного полисахаридного связующего; (c) инактивацию нагреванием бактерий, отделенных на стадии (a); и (d) конъюгирование инактивированных нагреванием бактерий на стадии (c) со связующим, полученным на стадии (b).
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к инактивированным нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированным с полимерным полисахаридным связующим, полученных указанным выше способом.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики и лечения атопических заболеваний, где композиция содержит в качестве активного ингредиента инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применениям инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, для получения агента для лечения атопического дерматита.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения атопического заболевания, где способ включает введение эффективного количества инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, субъекту, нуждающемуся в профилактике или лечении атопического заболевания.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к композиции пищевого продукта для профилактики или снижения выраженности атопического дерматита, где композиция содержит в качестве активного ингредиента инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к применению инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, для получения пищевого продукта для профилактики и снижения выраженности атопического дерматита.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу профилактики или снижения выраженности атопического заболевания, где способ включает употребление в пищу пищевого продукта, содержащего в качестве активного ингредиента эффективное количество инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, субъекту, нуждающемуся в профилактике или снижении выраженности атопического заболевания.
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
Настоящее изобретение относится к способу получения инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, где способ включает:
(a) разделение ферментационной культуральной среды, полученной культивированием Lactobacillus rhamnosus, на бактерии и ферментационный фильтрат;
(b) смешивание ферментационного фильтрата со стадии (a) и полимерного полисахарида с получением полимерного полисахаридного связующего;
(c) инактивацию нагреванием бактерий, отделенных на стадии (a); и
(d) конъюгирование инактивированных нагреванием бактерий на стадии (c) со связующим, полученным на стадии (b).
Стадия (a) представляет процесс разделения ферментационной культуральной среды, которая представляет продукт культивирования Lactobacillus rhamnosus, на бактерии и ферментационный фильтрат.
Молочнокислые бактерии Lactobacillus rhamnosus по настоящему изобретению включают все штаммы Lactobacillus rhamnosus и могут предпочтительно представлять Lactobacillus rhamnosus KCTC 10833 BP.
Lactobacillus rhamnosus KCTC 10833 BP назван как «Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201» в более ранней корейской патентной заявке (No. 10-2006-0038066), поданной заявителем настоящей патентной заявки, и в описании настоящей патентной заявки названия могут быть взаимозаменяемы.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «культивирование» включает в объем понятия ферментацию. Указанное культивирование может быть проведено при использовании известных способов культивирования молочнокислых бактерий. Примеры культивирования могут включать без ограничения способ, в котором бактерии инокулируют в культуральную среду или культуральный субстрат и затем оставляют на определенный период времени, поддерживая при этом заранее заданную температуру роста при аэробных или анаэробных условиях.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «культуральная среда» относится к твердому или жидкому культуральному субстрату, содержащему нутриенты, необходимые для роста животных клеток, растительных клеток или микроорганизмов. Указанная культуральная среда может включать известную культуральную среду для молочнокислых бактерий. Примеры культуральной среды могут включать без ограничения жидкую среду deMan Rogosa Sharpe (MRS), многоцелевую среду с Tween (APT) и бульонную среду с сердечно-мозговым экстрактом (BHI), и предпочтительно может представлять жидкую среду MRS. Среда может быть использована в форме модифицированной среды (например, модифицированная MRS среда) селективным регулированием композиции материалов, составляющих среду, согласно требованиям специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Культуральная среда по настоящему изобретению содержит в качестве культуральных субстратов источники углерода, источники азота, минеральные вещества и ростовые элементы, необходимые для роста молочнокислых бактерий. Типы источников углерода, источников азота, минеральных веществ и ростовые элементы не ограничиваются при условии, что эти материалы стимулируют синергетическое действие на рост молочнокислых бактерий, при этом эти материалы являются известными из области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, в качестве источника углерода могут быть использованы различные углеводы. Источник углерода предпочтительно может представлять глюкозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, лактозу, ксилозу, галактозу или арабинозу. Дополнительно, в качестве источника азота могут быть использованы различные органические источники азота. Источник азота предпочтительно может представлять дрожжевой экстракт, сойтон (soytone), пептон, экстракт говядины, триптон или казитон. Тип источника минеральных веществ не ограничен при условии, что источник минеральных веществ известен из области техники, к которой относится настоящее изобретение, для выращивания молочнокислых бактерий. Примеры источников минеральных веществ могут включать сульфат магния (MgSO4), сульфат марганца (MnSO4), вторичный кислый фосфат калия (K2HPO4), хлорид аммония (NH4Cl), карбонат кальция (CaCO3), и ацетат натрия (CH3COONa). Дополнительно, различные порошкообразные сырьевые пищевые материалы или экстракты могут быть добавлены в культуральную среду согласно требованиям специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение, при этом их примеры могут включать без ограничения порошкообразную кукурузу или экстракт, сухую сыворотку или экстракт, сухое обезжиренное молоко или экстракт, порошкообразный зеленый чай или экстракт, или порошкообразные грибы или экстракт.
В процессе культивирования температура может быть изменена в зависимости от типа молочнокислых бактерий специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, температура может составлять 30-45° без ограничения. Предпочтительно температура может составлять 33-40°, и наиболее предпочтительно 35-39°.
В процессе культивирования время культивирования может быть изменено в зависимости от заданной производительности специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, оно может составлять 12-96 часов без ограничения.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «ферментационная культуральная среда» относится к таковой, полученной инокулированием и ферментацией (или культивированием) штамма в жидкой среде, при этом термин «ферментационный фильтрат» относится к культуральному фильтрату, полученному удалением штамма из ферментированной культуральной жидкости.
Отделение бактерий и ферментационного фильтрата может быть проведено при использовании известных способов отделения бактерий (например, центрифугирование или ультрафильтрация) без ограничения.
Стадия (b) представляет процесс смешивания ферментационного фильтрата, отделенного на стадии (a), с полимерным полисахаридным материалом с получением полимерного полисахаридного связующего.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «полимерное полисахаридное связующее» относится к смеси из ферментационного фильтрата и полимерного полисахаридного материала или концентрата смеси. В зависимости от композиции и процедуры получения связующего, способность к адгезии со слизистой кишечника и способность продуцирования различных цитокинов в иммунных клетках может регулироваться.
Тип полимерного полисахаридного материала на стадии (b) не ограничивается при условии, что полимерный полисахаридный материал известен в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Примеры полимерного полисахаридного материала могут включать гиалуроновую кислоту, альгинат, мальтодекстрин, хитозан, каррагенан, галактоманнан, глюкоманнан, декстран, фукоидан, агар, порфиран, хитин и аналогичное им. Полимерный полисахарид по настоящему изобретению предпочтительно может представлять гиалуроновую кислоту, альгинат, мальтодекстрин или хитозан.
Процент добавленного полимерного полисахаридного материала может быть селективно изменен в зависимости от требуемой вязкости или прочности адгезии, заданной специалистом в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, полимерный полисахаридный материал может быть добавлен в ферментационный фильтрат в соотношении 0,0001-10%(масса/объем), без ограничения.
В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения стадия (b) может включать добавление гиалуроновой кислоты в качестве полимерного полисахаридного материала в ферментационный фильтрат в соотношении 0,0001-10%(масса/объем), и наиболее предпочтительно добавление гиалуроновой кислоты в ферментационный фильтрат в соотношении 0,0001-0,01%(масса/объем).
Гиалуроновая кислота представляет один из комплексных полисахаридов, состоящий из аминокислот и уроновых кислот, и представляет полимерное соединение, состоящее из N-ацетилглюкозамина и глюкуроновой кислоты. Молекулярная масса гиалуроновой кислоты по настоящему изобретению не ограничена. Например, гиалуроновая кислота включает гиалуроновые кислоты с молекулярной массой 1,000,000, 2,000,000, 3,000,000, 4,000,000, и 4,500,000, предпочтительна гиалуроновая кислота с молекулярной массой 1,000,000 или 2,000,000, и наиболее предпочтительна гиалуроновая кислота с молекулярной массой 1,000,000.
Стадия (b) дополнительно может включать процесс концентрирования с получением высоко концентрированного полимерного полисахаридного связующего.
Указанное концентрирование может быть проведено при использовании устройств для концентрирования или способов, известных из области техники, к которой относится настоящее изобретение. Примеры концентрирования могут включать без ограничения концентрирование осаждением, концентрирование выпариванием, концентрирование при пониженном давлении, ультрафильтрацию, обратный осмос и центрифугирование, предпочтительно концентрирование при пониженном давлении.
Стадия (c) представляет процесс инактивации нагреванием бактерий, отделенных на стадии (a).
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «инактивация нагреванием» относится к инактивации пробиотических бактерий термической обработкой в течение заданного периода времени, при этом инактивация нагреванием влияет на композицию активных ингредиентов, содержащихся в бактериях, структуру бактерий и способность к адгезии в кишечнике в зависимости от условий инактивации нагреванием. Самой важной целью инактивации нагреванием пробиотических бактерий является формирование структуры, которая способствует адгезии с иммунными клетками слизистой кишечника индуцированием липотейхоевой кислотой и пептидогликаном, которые являются типичными ингредиентами, содержащимися в клеточной структуре Lactobacillus rhamnosus. То есть, липотейхоевая кислота и пептидогликан, образующие клеточную структуру, скомбинированы с TRL-2 дендритных клеток слизистой кишечника для способствования продуцирования иммунных цитокинов и, следовательно, очень важно, чтобы структура была получена в такой форме, чтобы иметь самую благоприятную эффективность адгезии.
Температура инактивации нагреванием в настоящем изобретении не ограничена при условии, что она находится в температурных пределах, в которых функциональные ингредиенты бактерий не денатурируют. Температура может составлять, например, 60-100°, предпочтительно 70-90° и наиболее предпочтительно 75-85°.
Время инактивации нагреванием не ограничивается при условии, что оно находится во временных пределах, в которых функциональные ингредиенты бактерий не денатурируют. Время может составлять, например, 10-120 минут, предпочтительно 30-90 минут и наиболее предпочтительно 50-70 минут.
После процесса инактивации нагреванием необязательно может быть добавлен процесс охлаждения согласно требованиям специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Процесс охлаждения может быть проведен при использовании известных способов, и температура охлаждения может быть селективно изменена согласно требованиям специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Процесс охлаждения может быть проведен при температурных пределах, например, 10-40° и предпочтительно 25-35°.
Стадия (d) представляет процесс конъюгирования инактивированных нагреванием бактерий со стадии (c) со связующим, полученным на стадии (b).
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «конъюгирование» относится к образованию единого блока соединением двух или более материалов. На стадии (d) связующее и инактивированные нагреванием бактерии конъюгируют проведением серий реакций, индуцированных проникновением инактивированных нагреванием бактерий стадии (c) в связующее, полученное на стадии (b), или смешиванием инактивированных нагреванием бактерий и связующего.
Способ получения, включающий стадии (a) - (d), может необязательно дополнительно включать процесс добавления наполнителя, процесс сушки и процесс распыления для облегчения транспортной обработки, хранения и аналогичного им в процессе получения инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, согласно требованиям специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
Тип наполнителя не ограничивается при условии, что он представляет таковой, известный из области техники, к которой относится настоящее изобретение. Примеры наполнителя могут включать крахмал.
Процесс сушки может быть проведен при использовании известных способов сушки. Примеры процессов сушки могут включать лиофильную сушку, распылительную сушку и сушку горячим воздухом без ограничения.
Настоящее изобретение относится к инактивированным нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированным с полимерным полисахаридным связующим, полученным указанным выше способом.
Инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению характеризуются получением способом, включающим стадии (a) - (d). Инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, названные «RHT-3201» авторами настоящего изобретения, и используемые в описании настоящей патентной заявки термины могут быть взаимозаменяемы.
Инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению продемонстрировали превосходный терапевтический эффект в лечении атопических заболеваний вместе со значительно улучшенной конкурентной адгезией к слизистой кишечника по сравнению с существующими препаратами молочнокислых бактерий (смотрите, Пример 6), и эффекты профилактики, снижения выраженности или лечения атопического дерматита при эквивалентном уровне для существующих лекарственных средств на основе стероидов (например, дексаметазон) (смотрите, Примеры 9 и 10).
Дополнительно, относительно стабильности в среде желудочно-кишечного тракта, что является проблемой при оральном потреблении молочнокислых пробиотиков, инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению сохраняют свои функциональные свойства (эффективность) на более высоком уровне, чем у традиционных молочнокислых пробиотиков. В частности, несмотря на воздействие искусственного желудочного сока (желудочные кислоты) и искусственного кишечного сока (желчные кислоты), инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению сохраняют эффективность адгезии к слизистой кишечника на высоком уровне (смотрите, Пример 7), при этом также подтверждена стабильности при хранении при различных температурах (смотрите, Пример 8).
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «атопическое заболевание» относится к сериям аллергических симптомов, проявленных на коже, слизистой дыхательных путей, слизистой глаз, слизистой кишечника или аналогичного им у индивидуумов со склонностью к атопическим заболеваниям, и такая склонность к атопическим заболеваниям (предрасположенность) передается по наследству, демонстрируя семейный характер. Аллергические заболевания, вызываемые склонностью к атопическим заболеваниям, могут включать атопические дерматиты, аллергические риниты, астму, аллергические конъюктивиты, атопические высыпания и аналогичное им, и эти заболевания могут протекать, как таковые по отдельности или несколько вместе одновременно. Атопический дерматит, который является одним из типичных кожных заболеваний, проявленных у персон с атопическими аллергиями, часто называемый врожденной лихорадкой (congenital fever). При атопическом дерматите кожа сухая и основным симптомом является кожный зуд, хотя в некоторых случаях он сопровождается другими аллергическими заболеваниями (такими как высыпания, аллергия на металл, астма и аллергический ринит) через свои иммунологические характеристики и семейную склонность.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «атопический дерматит (AD)» относится к хроническому и рецидивирующему воспалительному кожному заболеванию с кожным зудом, и демонстрирует реакцию гиперчувствительности иммунной системы на антигены, такие как частицы пылевого клеща, попавшие на тело человека. Проникшие в тело антигены макрофаги представляют T клеткам, при и этом T клетки дифференцируются на Th1 или Th2 клетки согласно типу антигенов или рецепторов, с которыми они реагируют. Затем Th2 клетки активируют гуморальный иммунитет через цитокины, такие как IL-4, IL-5 и IL-10, и активируют B клетки, приводя к повышению продуцирования IgE и, таким образом, вызывая атопический дерматит. То есть, из-за иммунного нарушения при атопическом дерматите, в то время как иммуноглобулин IgE адгезируется на поверхности тучных клеток вокруг кровеносных сосудов в теле или в коже, антигены снова проникают в тело человека, связываясь с иммуноглобулинами для активации тучных клеток, позволяя, таким образом, тучным клеткам секретировать такие химические вещества, как гистамин. Эти химические вещества стимулируют кровеносные сосуды и клетки, вызывая на коже красные пятна, отечность и кожный зуд, в свою очередь таким образом вызывая или осложняя атопический дерматит.
В противоположность Th1 клетки активируют клеточный иммунитет через IL-12 и IFN-γ, и IFN-γ ингибирует продуцирование IgE.
Следовательно, считается, что сбалансированная иммунная регуляция Th1 клеток и Th2 клеток является основным ключом в профилактике или лечению симптомов атопических заболеваний, было обнаружено, что инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению превосходно балансируют иммунную регуляцию Th1 и Th2 клеток, по существу достигая сбалансированной иммунной регуляции между Th1 типом цитокинов и Th2 типом цитокинов через различные иммунорегулирующие механизмы согласно тяжести атопического дерматита (смотрите, Примеры 9 и 10). То есть в случае легкого атопического дерматита, инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению регулируют и поддерживают иммунологический баланс Th1 и Th2 клеток, в то время как в случае тяжелого атопического дерматита они ингибируют активность Th1 и Th2 клеток через стимуляцию регулировки T клеток, таким образом осуществляя терапию и снижая выраженность тяжелого атопического дерматита.
Следовательно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики и лечения атопических заболеваний, где композиция содержит в качестве активного ингредиента инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим. Дополнительно, настоящее изобретение относится к: применению инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, для получения агента для лечения атопического дерматита; и способу лечения или профилактики атопического заболевания, где способ включает введение эффективного количества инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, субъекту, нуждающемуся в лечении или профилактике атопического заболевания.
Указанный в описании настоящей патентной заявки атопический дерматит классифицируется на легкий, средний и тяжелый типы в зависимости от прогрессирования симптомов заболевания. Атопический дерматит по настоящему изобретению предпочтительно может представлять тяжелый атопический дерматит.
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «субъект» может относится к животному, предпочтительно млекопитающему и, в частности, животному, представляющему человека.
Сообщается о множестве шкал для оценки клинических курсов и терапевтической эффективности относительно атопического дерматита. В качестве эталонной шкалы оценки известны: индекс распространенности и тяжести экземы (Eczema Area and Severity Index) (EASI), Шкала оценки атопического дерматита (SCORing Atopic dermatitis) (SCORAD), пациент-ориентированное измерение экземы (Patient Oriented Eczema Measure) (POEM), и три степени тяжести (Three Item Severity) (TIS). Предпочтительно тяжесть атопического дерматита по настоящему изобретению классифицируется согласно шкале оценки атопического дерматита (SCORAD).
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать фармацевтически эффективное количество инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, как таковых или может дополнительно содержать по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена пациенту, как однократная доза или может вводиться, как многократная доза при дробном протоколе лечения в течение длительного периода времени. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, требуемому для демонстрации более выраженного ответа по сравнению с отрицательным контролем, и предпочтительно количество достаточно для лечения или профилактики атопического дерматита. Эффективное количество инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению может составлять 0,001-1000 мг/кг массы тела/день, и предпочтительно 0,055-16,65 мг/кг массы тела/день, без ограничения. Однако, фармацевтически эффективное количество может подходящим образом варьировать в зависимости от различных факторов, таких как тип заболевания и его тяжесть, возраст, масса тела, физическое состояние и пол пациента, способ введения и период лечения.
Композиция по настоящему изобретению может быть по разному составлена вместе с фармацевтически приемлемым носителем в зависимости от способа введения при использовании способов, известных из области техники, к которой относится настоящее изобретение. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «фармацевтически приемлемая» композиция относится к нетоксичной композиции, которая физиологически приемлема, не ингибирует действие активного ингредиента при введении людям и, как правило, не индуцирует аллергическую реакцию или аналогичные реакции, такие как проблемы с желудочно-кишечным трактом и головокружение. Композиция по настоящему изобретению может быть по разному составлена вместе с фармацевтически приемлемым носителем в зависимости от способа введения при использовании способов, известных из области техники, к которой относится настоящее изобретение. Способ введения может представлять без ограничения оральный или парентеральный и предпочтительным является оральный способ введения.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению для орального введения может быть составлена вместе с подходящим носителем для орального введения в форме порошка, гранул, таблеток, пилюль, таблеток, покрытых сахарной оболочкой, капсул, жидкости, геля, сиропа, суспензии, воды или аналогичного им при использовании способов, известных из области техники, к которой относится настоящее изобретение. Например, таблетки или таблетки, покрытые сахарной оболочкой, для орального введения могут быть получены смешиванием активного ингредиента с твердым наполнителем, распылением смеси, добавлением в нее подходящего адъюванта и последующей технологической обработкой смеси в смесь в виде гранул. Примеры подходящего наполнителя могут включать: сахара, включая лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит и мальтит; крахмалы, включая кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу, включая метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрия и гидроксипропилметилцеллюлозу; и наполнитель, такой как желатин или поливинилпирролидон. В некоторых случаях в качестве разрыхлителя может быть добавлен перекрестно сшитый поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или альгинат натрия. Дополнительно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать антикоагулянт, лубрикант, увлажнитель, эмульгатор и консервант.
Дополнительно, для парентерального введения фармацевтическая композиция по настоящему изобретению вместе с подходящим носителем для парентерального введения может быть составлена при использовании способов, известных из области техники, к которой относится настоящее изобретение. Другими фармацевтически приемлемый носители являются, таковые описанные в следующем литературном источнике (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA).
Дополнительно фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть введена вместе с соединениями, известными, как эффективные для профилактики и лечения атопических заболеваний или атопического дерматита.
Дополнительно, настоящее изобретение относится к композиции пищевого продукта для профилактики и снижения выраженности атопического дерматита, где композиция содержит в качестве активного ингредиента инактивированные Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим. Дополнительно, настоящее изобретение относится к: применению инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, для получения пищевого продукта для профилактики и снижения выраженности атопического дерматита; и способу профилактики или снижения выраженности атопического заболевания употреблением в пищу пищевого продукта, содержащего в качестве активного ингредиента инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, субъекту, нуждающемуся в профилактике или снижении выраженности атопического заболевания
Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «субъект» может относится к животному, предпочтительно млекопитающему и в частности, животному, представляющему человека.
Композиция пищевого продукта по настоящему изобретению включает все типы, включая функциональный пищевой продукт, нутритивные пищевые добавки, диетический пищевой продукт, пищевую добавку, питьевое и ферментированное молоко. Указанные выше типы композиций пищевых продуктов могут быть получены в различных формах при использовании способов, известных из области техники, к которой относится настоящее изобретение. Предпочтительно пищевой продукт по настоящему изобретению может представлять ферментированное молоко, йогурт, напиток, молочный напиток, пищевую добавку и диетический функциональный пищевой продукт.
Например, для диетического пищевого продукта инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению могут быть получены для питья в форме питьевого йогурта, ферментированного молока, чая, сока, и напитка, и могут быть гранулированы, капсулированы или находиться в порошкообразной форме для потребления. Дополнительно, инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению могут быть смешаны с известным материалом или активным ингредиентом, который известен, как эффективный для снижения выраженности атопического заболевания (в частности, атопического дерматита), получают в форме композиции.
Также для функционального пищевого продукта инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению могут быть добавлены в напитки (включая алкогольные напитки), фрукты и прошедшие технологическую обработку продукты из них (например, консервированные в жестяной таре фрукты, консервированные в стеклянной таре фрукты, джемы, мармелады), рыба, мясо и прошедшие технологическую обработку продукты из них (например, ветчина, сосиски, консервированная говядина), кондитерские изделия и лапша (например, удон, гречневая лапша, рамен, спагетти, макароны), фруктовый сок, напитки, печенье, ирис, молочные продукты (например, сливочное масло, сыр), растительные масла, маргарин, растительные белки, пищевые продукты в реторт-упаковке, замороженные пищевые продукты, различные приправы (например, соевая паста, соевый соус, соус) или аналогичное им.
В композиции пищевого продукта по настоящему изобретению, содержание инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, предпочтительно составляет 0,001-50 масс.% готового прошедшего технологическую обработку пищевого продукта без ограничения.
Дополнительно, для применения инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, в форме пищевой добавки, инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению могут быть получены в форме порошка или концентрированной жидкости.
8
10
В фармацевтических и композициях пищевого продукта по настоящему изобретению количество смешанного активного ингредиента может быть подходящим образом определено согласно целей их использования (профилактика, поддержание состояния здоровья или снижение выраженности симптомов), и, например, инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированным с полимерным полисахаридным связующим, могут содержаться в концентрации 10-10 КОЕ/г. Эффективная доза инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению может быть определена согласно указанным выше пределам концентрации, но может составлять менее указанных выше пределов для целей поддержания состояния здоровья и гигиены или для долгосрочного потребления для контроля состояния здоровья. Активный ингредиент безопасен и, следовательно, может быть использован в избыточном количестве, превышающем таковые указанные выше пределы.
ПОЛЕЗНЫЙ ЭФФЕКТ
Инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению являются превосходными для лечения атопического заболевания, значительно улучшая конкурентную адгезию со слизистой кишечника по сравнению с существующими препаратами молочнокислых бактерий и демонстрируя эффект профилактики, снижения выраженности или лечения атопического дерматита при эквивалентном уровне для существующих лекарственных средств на основе стероидов. Дополнительно, инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению превосходно балансируют иммунную регуляцию Th1 и Th2 клеток, и по существу достигают сбалансированной иммунной регуляции между Th1 типом цитокинов и Th2 типом цитокинов через различные иммунорегулирующие механизмы согласно тяжести атопического дерматита.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ. 1 - изображение под электронным микроскопом, демонстрирующее структуру гиалуроновой кислоты.
ФИГ. 2 - изображение под электронным микроскопом, демонстрирующее структуру гиалуроновой кислоты концентрированного связующего.
ФИГ. 3 - изображение под электронным микроскопом, демонстрирующее структуру Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 перед проведением инактивации нагреванием.
ФИГ. 4 - изображение под электронным микроскопом, демонстрирующее структуру Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 после проведения инактивации нагреванием.
ФИГ. 5 - изображение под электронным микроскопом, демонстрирующее структуру RHT-3201.
ФИГ. 6 - индекс шкалы оценки SCORAD терапевтического эффекта RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 7 - результаты наблюдения не вооруженным глазом эффекта лечения RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 8 - изменение в расчесывании при введении RHT-3201 по настоящему изобретению.
ФИГ. 9 - изменение массы тела при введении RHT-3201 по настоящему изобретению.
ФИГ. 10 - изменение уровня IgE в крови при введении RHT-3201 по настоящему изобретению.
ФИГ. 11 - результаты наблюдения не вооруженным глазом изменения в лимфатических узлах мышей при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 12 -изменение размера лимфатических узлов мышей при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 13 - изменение массы лимфатических узлов мышей при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 14 - изменение продуцирования IFN-γ при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 15 - изменение продуцирования IL-12 при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 16 - изменение продуцирования IL-4 при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 17 - изменение продуцирования IL-10 при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 18 - соотношение IL-4/ IFN-γ при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 19 - соотношение IFN-γ/IL-10 при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 20 - соотношение IL-4/IL-10 при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 21 - соотношение IL-12/IL-10 при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 22 - результаты наблюдения не вооруженным глазом патологических характеристик кожных тканей спинки при введении RHT-3201 по настоящему изобретению (верх) и результаты наблюдения под микроскопом кожных тканей, окрашенных H&E (низ) у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 23 - толщина эпидермиса кожных тканей спинки при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 24 - толщина дермы кожных тканей спинки при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 25 - результаты наблюдения инфильтрации тучных клеток в кожных тканях спинки при окрашивании толуидиновым синим при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
ФИГ. 26 - изменение числа тучных клеток в кожных тканях спинки при введении RHT-3201 по настоящему изобретению у моделей с тяжелым атопическим дерматитом.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
Однако следующие примеры приведены только для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения.
<Пример 1>
Оценка влияния типа связующего
<1-1> Получение образцов различных типов связующих
Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 (KCTC 10833BP) культивировали в MRS среде, содержащей 0,1-1% сухой сыворотки при температуре 37° в течение 24 часов. После культивирования бактерии и культуральный фильтрат разделили проведением центрифугирования. Затем в культуральный фильтрат добавили гиалуроновую кислоту, альгинат, мальтодекстрин, хитозан и полиэтиленгликоль в концентрации 0,1%(масса/объем) с последующим перемешиванием в течение 1 часа и коцентрированием после этого, с получением таким образом связующих, которые затем подвергли лиофильной сушке. Каждый образец развели раствором фосфатного буфера с получением конечного образца 1 мкг/мл. В качестве контроля использовали обезжиренное сухое молоко.
<1-2> Получение клеток селезенки
5-недельных самцов мышей BALB/c стимулировали 2 мг гидроксида алюминия и 1 мг яичного альбумина проведением интраперитонеальной инъекции и стимулировали второй раз аналогичным образом по прошествии шести дней. На 13 день провели сбор селезенок у каждой мыши, клетки селезенки экстрагировали с получением, таким образом, жидких клеток селезенки.
Предпочтительно клетки селезенки получили при использовании следующего способа.
6
Провели асептический сбор селезенок мышей и капельно добавили 10 μл сбалансированного солевого раствора Ненкса (HBSS). Провели разрыв при использовании пинцета над ситом с размером ячеек 60-mesh для сбора клеточной суспензии и затем сверху добавили 2,5 μл фетальной бычьей сыворотки, с последующим окрашиванием в течение 10 минут, с осаждением, таким образом, больших масс. Большие массы суспендировали в растворе NH4Cl (pH 7,0) в течение 3-4 минут с достижением гемолиза красных кровяных клеток. затем суспензию смешали с 2,5 μл фетальной бычьей сыворотки с последующим центрифугированием при 1,500 оборотах в минуту в течение 5 минут. Осадок промыли дважды HBSS и затем диспергировали в DMEM среде, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1 мг/мл яичного альбумина в концентрации 5×10 клетки/мл, с получением, таким образом, клеток селезенки.
<1-3> Культивирование клеток селезенки и измерение цитокинов
6
200 μл суспензии клеток селезенки (5×10 клетки/мл) и 10 μл (1 μг/μл) каждого жидкого образца, полученного по Примеру <1-1>, добавили в каждую лунку 96-лунучного планшета с последующим культивированием в 5% CO2 инкубаторе в течение 7 дней. По окончанию культивирования в культуральной жидкости измерили уровни IL-4 и IL-12 при использовании набора Cytoset (Biosource). Уровни продуцирования IL-4 и IL-12 каждого образца выразили как показатель роста по сравнению с контролем, как приведено в Таблице 1.
[Таблица 1]
Определение связующих
Тип связующего
Увеличение (%) по сравнению с контролем
Соотношение IL-4/IL-12
IL-4
IL-12
Гиалуроновая кислота
5
52
0,09
Альгинат
15
29
0,51
Мальтодекстрин
9
36
0,25
Хитозан
17
38
0,44
Полиэтиленгликоль
13
22
0,59
По результатам теста связующее из гиалуроновой кислоты показало 5% увеличение продуцирования IL-4 и 52% увеличение продуцирования IL-12. Связующее из альгината показало 15% увеличение продуцирования IL-4 и 29% увеличение продуцирования IL-12. Связующее из мальтодекстрина показало 9% увеличение продуцирования IL-4 и 36% увеличение продуцирования IL-12. Связующее из хитозана показало 17% увеличение продуцирования IL-4 и 38% увеличение продуцирования IL-12. Связующее из полиэтиленгликоля показало 13% увеличение продуцирования IL-4 и 22% увеличение продуцирования IL-12. Следовательно, когда связующее получено при использовании полимерного полисахарида, показатель увеличения IL-12 был относительно высок, при этом показатель увеличения IL-4 был относительно низок. Из них гиалуроновая кислота показала самый высокий показатель увеличения IL-12 и относительно низкий показатель увеличения IL-4. После гиалуроновой кислоты хорошие результаты показали: мальтодекстрин, хитозан и альгинат.
<Пример 2>
Оценка влияния концентрации связующего
<2-1> Получение образцов концентрированием
Провели оценку влияния концентрации связующего, при этом среди полимерных полисахаридных материалов гиалуроновую кислоту, как показавшую наилучший эффект в Пример 1, использовали в качестве типичного материала. Гиалуроновую кислоту добавили в количестве 0,0001-1%(масса/объем) в культуральный фильтрат с последующим перемешиванием в течение 1 часа, и затем смесь концентрировали при пониженном давлении, с получением, таким образом, связующих из гиалуроновой кислоты с различными концентрациями, соответственно, и эти связующие подвергли лиофильной сушке. Каждый образец развели фосфатным буфером с получением конечного образца 1 μг/μл. В качестве контроля использовали сухое обезжиренное молоко.
<2-2> Тест на продуцирование цитокина
Показатель продуцирования цитокинов в клетках селезенки измерили для образцов связующих, полученных в Примере <2-1>, при использовании способа по Примеру <1-3>. Результаты приведены в Таблице 2 ниже.
[Таблица 2]
Определение концентрации добавленной гиалуроновой кислоты
Концентрация гиалуроновой кислоты (масса/объем)
Увеличение (%) по сравнению с контролем
Соотношение IL-4/IL-12
IL-4
IL-12
0,0001
9
46
0,19
0,001
7
52
0,13
0,01
10
37
0,27
0,1
12
33
0,36
1
15
25
0,60
По результатам теста, как показано в Таблице 2 выше, оптимальная концентрация гиалуроновой кислоты для получения связующего из гиалуроновой кислоты составила 0,001% (масса/объем), продуцирование IL-4 было снижено по сравнению с таковым контроля, и продуцирование IL-12 было повышено по сравнению с таковым в контроле.
<Пример 3>
Оценка влияния условий инактивации нагреванием на бактерии
Для определения оптимальных условий инактивации бактерий нагреванием оптимизировали условия инактивации нагреванием по температуре и времени и оценили адгезионную способность Caco-2 клеток, выбирая, таким образом, оптимальные условия. Далее приведено более подробное описание теста.
<3-1> Получение образцов инактивированных нагреванием бактерий
8
Бактерии Lactobacillus rhamnosus инактивировали нагреванием при температуре 60-120℃ в течение 10, 20, 30, 40, 50 и 60 минут (Heater, EYELA OSB-2100, China) и охладили до температуры 30℃ перед использованием их в качестве тестируемого образца. Каждый образец промыли дважды раствором фосфатного буфера, ресуспендировали в 1 μл того же раствора буфера и развели до 1×10 клеток/мл в свободной от сыворотки среде DMEM, перед использованием его в тесте.
<3-2> Оценка адгезивной способности к слизистой кишечника
5
Монослой клеток Caco-2 получили инокулированием Caco-2 клеток (Корейский банк линий клеток (Korean Cell Line Bank)) в концентрации 1,2×10 клеток/мл в модифицированной по способу Дульбекко среде Игл (DMEM, Hyclone, USA), обогащенной 10%(объем/объем) фетальной телячьей сыворотки и 20 мкл /мл гентамицина, диспергировали 1 мкл полученной в результате среды в каждую лунку 6-луночного планшета для культивирования тканей, культивирование клеток провели в течение 7 дней и дважды промыли раствором фосфатного буфера.
1 мкл жидкого образца, полученного по Примеру <3-1>, поместили в каждую лунку, в которой сформировался монослой клеток Caco-2, с последующим проведением реакции в течение 90 минут. В качестве контроля использовали 1 μл DMEM вместо инактивированных нагреванием молочнокислых бактерий. После проведения реакции удалили супернатант и добавили 1 μл 0,04%(масса/объем) Tween 80 для извлечения инактивированных нагреванием молочнокислых бактерий, адгезировавшихся на Caco-2 клетках, и провели подсчет количества бактерий при использовании гемоцитометра. Эффективность адгезии рассчитали, как показатель адгезировавшегося числа бактерий по сравнению с начальным числом бактерий (смотрите, Таблицу 3).
[Таблица 3]
Показатель адгезии бактерий по условиям инактивации бактерий нагреванием
Показатель адгезии (%) с клетками Caco-2
Время инактивации нагреванием (минуты)
60
70
80
90
10
44
50
56
45
20
48
53
68
49
30
56
63
71
54
40
60
66
76
42
50
62
71
80
35
60
63
72
85
32
Как показано в Таблице 3, эффективность адгезии была самой хорошей, когда примененные условия инактивации нагреванием были следующими: 80 и 60 минут. Составляющие элементы, такие как липотейхоевая кислота, присутствующие на клеточных стенках молочнокислых бактерий, ингибируют адгезию болезнетворных бактерий, таких как E. coli и Salmonella, к поверхности слизистой кишечника, и связываются с TLR-2, который является одним из рецепторов дендритных клеток среди клеток слизистой кишечника, вовлеченных в активацию иммунитета желудочно-кишечного тракта человека. Следовательно, предполагается, что оптимальные условия инактивации бактерий нагреванием созданы для облегчения выхода сопряженных факторов, присутствующих на клеточной стенке, таким образом, инактивированные нагреванием молочнокислые бактерии адгезируются в желудочно-кишечном тракте, при этом конкурируя с резидентной флорой желудочно-кишечного тракта, и таким образом, в итоге активируя иммунитет желудочно-кишечного тракта.
<Пример 4>
Получение инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим
Бактерии, инактивированные нагреванием при температуре 80℃ в течение 60 минут в Примере 3, смешали с 0,001% связующего из гиалуроновой кислоты, полученным в Примере 2, в котором культуральный фильтрат Lactobacillus rhamnosus концентрировали после проведения реакции. В качестве носителя использовали такой носитель, как крахмал, который смешали с полученным в результате реакции материалом, с последующим проведением процесса сушки, с получением, таким образом, инактивированных нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированных с полимерным полисахаридным связующим (указанные в описании настоящей патентной заявки, как «RHT-3201»). Был сопоставлен эффект промотирования иммунитета RHT-3201, полученного, как указано выше, и Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 в качестве пробиотика, при использовании способа по Примеру <1-3> (смотрите, Таблицу 4).
[Таблица 4]
Сравнение эффекта промотирования иммунитета традиционных пробиотических бактерий и RHT-3201 по настоящему изобретению
RHT-3201
Пробиотическийпрепарат
Увеличение IL-4 (%) по сравнению с контролем
3
20
Увеличение IL-12 (%) по сравнению с контролем
67
29
Соотношение IL-4/IL-12
0,04
0,68
Как показано в Таблице 4, был подтвержден регулирующий эффект цитокинов, вовлеченных в Th1/Th2, и был в 17 раз выше у молочнокислых бактерий RHT-3201 по настоящему изобретению, по сравнению с существующими пробиотиками. Предполагается, что RHT-3201 был получен в процессе получения в такой форме, которая способствует связыванию с соответствующим рецептором слизистой кишечника, таким как TLR-2.
<Пример 5>
Структурный анализ при использовании электронного микроскопа (FE-SEM)
Структурный анализ фазы RHT-3201, полученной в Примере 4, провели фотографированием при использовании электронного микроскопа (FE-SEM, Model: LEO SUPRA 55, GENESIS 2000 (Carl Zeiss, EDAX)) согласно каждому способу получения. Результаты анализа, полученного при использовании электронного микроскопа согласно стадиям получения RHT-3201, приведены на Фигурах 1-5.
Как показано на Фигурах 1 и 2, видно, что в процессе получения связующего культуральный фильтрат Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 смешали с гиалуроновой кислотой, с последующим концентрированием, таким образом, частицы гиалуроновой кислоты становятся плотнее, формируя структуру связующего (смотрите, ФИГ. 2). Как показано на Фигурах 3 и 4, клеточные стенки молочнокислых бактерий не фрагментированы инактивацией нагреванием бактерий при специфических условиях, но подвергшаяся воздействию структура позволяет легко адгезироваться на слизистой кишечника (смотрите, ФИГ. 4). Наконец, инактивированные нагреванием бактерии были смешаны со связующим из гиалуроновой кислоты для облегчения адгезии со слизистой кишечника (смотрите, ФИГ. 5).
<Пример 6>
Получение массы из RHT-3201
Для исследования воспроизводимости при получении массы RHT-3201 способом по Примеру 4 выше показатель адгезии в желудочно-кишечном тракте сравнили с пробиотиками и полученной массой RHT-3201 (смотрите, Таблицу 5).
В частности, Lactobacillus rhamnosus IDCC культивировали при температуре 37℃ в течение ночи в ферментационном танке с получением 1 тонны. Культуральный фильтрат и бактерии разделили проведением центрифугирования и добавили в культуральный фильтрат культуральную жидкость с объемом гиалуроновой кислоты 0,001% (масса/объем), затем провели концентрирование при пониженном давлении при температуре 50°, с получением, таким образом, связующего, которое конъюгируется с поверхностью инактивированных нагреванием бактерий. Бактерии подвергли термической обработке при температуре 80° в течение 60 минут, с получением, таким образом, инактивированных нагреванием бактерий. Дополнительно, связующее и инактивированные нагреванием бактерии смешали, гомогенизировали и высушили с получением, таким образом, RHT-3201. В качестве контроля использовали пробиотики Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201, полученные согласно традиционному способу получения пробиотических сырьевых материалов. В частности, бактерии, полученные из той же самой культуральной жидкости, суспендированные в 20 мкл раствора фосфатного буфера, и прошедшие лиофильную сушку, с получением, таким образом, бактерий в порошкообразной форме.
[Таблица 5]
Сравнение показателей адгезии традиционного пробиотического препарата и RHT-3201 по настоящему изобретению
RHT-3201
Пробиотический препарат
Показатель адгезии (%)
85
54
Как видно из Таблицы 5, было подтверждено, что показатель адгезии RHT-3201 показал 57% улучшение по сравнению с пробиотическим препаратом Lactobacillus rhamnosus.
<Пример 7>
Оценка стабильности при потреблении <7-1>
Стабильность при воздействии кислоты
Препарат молочнокислых бактерий подвергли воздействию желудочных кислот, которые воздействуют при прохождении через желудок и пищеварительный тракт. Провели сравнение стабильности при воздействии кислоты между пробиотическими бактериями и RHT-3201 по настоящему изобретению в среде, воспроизведенной in vitro. В частности, 10% HCl капельно добавили в MRS среду для регулирования pH до 2,3 и 2,5, и затем MRS стерилизовали для использования. 1 г пробиотиков и образцы RHT-3201, соответственно, поместили в pH-отрегулированную среду, затем провели реакцию в течение 0, 1 и 2 часов. Показатель адгезии проанализировали измерением числа бактерий, адгезировавшихся на клетки Caco-2 при использовании способа по Примеру <3-2>. Использовавшиеся в тесте молочнокислые бактерии представляли Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201. Также в тесте использовали RHT-3201, полученные способом получения по Примеру 6, и пробитики.
[Таблица 6]
Результаты измерения стабильности при воздействии кислоты на RHT-3201 по настоящему изобретению
Тести-руемый образец
pH 2,3(x10<sup>8</sup>КОЕ/мл)
Пока-затель адгезии (%)
pH 2,5(x10<sup>8</sup>КОЕ/мл)
Пока-затель адгезии (%)
0
1 ч
2 ч
0
1 ч
2 ч
Пробио-тические бактерии
1
0,1
0,04
4
1
0,19
0,07
7
RHT-3201
1
0,7
0,34
34
1
0,83
0,48
48
Как видно из Таблицы 6, подтверждено, что по сравнению с пробиотическими бактериями эффективность адгезии RHT-3201 по настоящему изобретению остается стабильной даже при 2 часовом воздействии кислоты.
<7-2> Стабильность при воздействии желчи
Кишечно-печеночная рециркуляция желчных кислот достигается таким образом, что желчные кислоты, продуцированные в печени, выходят через желчевыводящие пути, поступают в тонкий кишечник, затем 95% абсорбируется в подвздошной кишке, которая является конечным участком тонкой кишки, и снова поступают в печень. Желчные кислоты оказывают влияние на способность к адгезии молочнокислых бактерий, поселившиеся в тонкой кишке. Следовательно, различия в показателях адгезии, полученные при проведении сравнения между пробиотическими бактериями и RHT-3201 по настоящему изобретению, вызваны воздействием желчи. В частности, после стерилизации добавили MRS среду с и без 0,3% желчных кислот. Затем 1 г пробиотических бактерий и RHT-3201 по настоящему изобретению инокулировали в среде, соответственно, с последующим проведением реакции в течение 2 часов. Затем провели анализ показателей адгезии измерением числа бактерий, адгезировавшихся на клетки Caco-2, при использовании способа по Примеру <3-2>.
Использовавшиеся в тесте молочнокислые бактерии представляли Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201. Также в тесте использовали RHT-3201, полученные способом получения по Примеру 6, и пробитики.
[Таблица 7]
Результаты стабильности при воздействии желчи на RHT-3201 по настоящему изобретению
Тестируемый образец
MRS (x108КОЕ/ml)
MRS+0,3% bile(x108КОЕ/ml)
Показатель адгезии (%)
Пробиотические бактерии
1
0,23
23
RHT-3201
1
0,57
57
Как видно из Таблицы 7, подтверждено, что при воздействии желчных кислот в течение 2 часов эффективность адгезии RHT-3201 сохраняется при значении 57%, что в около 2,5 раза выше, чем таковой у пробиотических бактерий.
<Пример 8>
Оценка стабильности при воздействии температуры с течением времени
<8-1> Сравнительный тест на стабильность в течение времени при температуре 4° между RHT-3201 и пробиотическими бактериями
RHT-3201 по настоящему изобретению, полученные по Примеру 6 выше, и пробиотические бактерии хранили в холодильнике при температуре 4° в течение 365 дней, и затем провели измерение по времени числа адгезировавшихся бактерий на 1 г сырьевого материала. Результаты приведены в Таблице 8. Число адгезировавшихся бактерий измерили при использовании способа по Примеру <3-2>. Провели анализ показателя адгезии измерением числа бактерий, адгезировавшихся на клетки Caco-2.
[ТАБЛИЦА 8]
Сравнительный тест на стабильность в течение времени при температуре 4° между RHT-3201 по настоящему изобретению и пробиотическими бактериями
Тестируемый образец
Стабильность с течением временим при температуре 4°
Показатель остаточной адгезии (%)
0 дней
60 дней
180 дней
365 дней
Пробиотические бактерии
65%
52%
34%
19%
29,2
RHT-3201
82%
71%
52%
45%
54,8
<8-2> Сравнительный тест на стабильность при температуре 15℃ с течением времени между RHT-3201 и пробиотиками
RHT-3201 по настоящему изобретению, полученные по Примеру 6 выше, и пробиотики хранили в холодильнике при температуре 15°С в течение 365 дней, и затем провели измерение по времени числа адгезировавшихся бактерий на 1 г сырьевого материала. Результаты приведены в Таблице 9. Число адгезировавшихся бактерий измерили при использовании способа по Примеру <3-2>. Провели анализ показателя адгезии измерением числа бактерий, адгезировавшихся на клетки Caco-2.
[Таблица 9]
Сравнительный тест на стабильность в течение времени при температуре 15° между RHT-3201 по настоящему изобретению и пробиотическими бактериями
Тестируемый образец
Стабильность с течением временим при температуре 15°
Показатель остаточной адгезии (%)
0 дней
60 дней
180 дней
365 дней
Пробиотические бактерии
65%
46%
29%
15%
23,1
RHT-3201
82%
66%
59%
38%
46,3
<8-3> Сравнительный тест на стабильность при температуре 25° с течением времени между RHT-3201 и пробиотиками
RHT-3201 по настоящему изобретению, полученные по Примеру 6 выше, и пробиотики хранили в холодильнике при температуре 25℃ в течение 365 дней, и затем провели измерение по времени числа адгезировавшихся бактерий на 1 г сырьевого материала. Результаты приведены в Таблице 10. Число адгезировавшихся бактерий измерили при использовании способа по Примеру <3-2>. Провели анализ показателя адгезии измерением числа бактерий, адгезировавшихся на клетки Caco-2.
[Таблица 10]
Сравнительный тест на стабильность в течение времени при температуре 25℃ между RHT-3201 по настоящему изобретению и пробиотическими бактериями
Тестируемый образец
Стабильность с течением временим при температуре 4°
Показатель остаточной адгезии (%)
0 дней
60 дней
180 дней
365 дней
Пробиотические бактерии
65%
39%
25%
12%
18,4
RHT-3201
82%
56%
49%
35%
42,6
<8-4> Сравнительный тест на стабильности при температуре 37° с течением времени между RHT-3201 и пробиотиками
RHT-3201 по настоящему изобретению, полученные по Примеру 6 выше, и пробиотики хранили в холодильнике при температуре 7℃ в течение 365 дней, и затем провели измерение по времени числа адгезировавшихся бактерий на 1 г сырьевого материала. Результаты приведены в Таблице 11. Число адгезировавшихся бактерий измерили при использовании способа по Примеру <3-2>. Провели анализ показателя адгезии измерением числа бактерий, адгезировавшихся на клетки Caco-2.
[Таблица 11]
Сравнительный тест на стабильность в течение времени при температуре 37℃ между RHT-3201 по настоящему изобретению и пробиотическими бактериями
Тестируемый образец
Стабильность с течением временим при температуре 37°
Показатель остаточной адгезии (%)
0 дней
60 дней
180 дней
365 дней
Пробиотические бактерии
65%
29%
15%
8%
12,3
RHT-3201
82%
46%
44%
32%
39,0
<Пример 9>
Регуляция продуцирования цитокинов RHT-3201 у in vitro моделей с индуцированным легким атопическим дерматитом
Провели оценку влияния RHT-3201 по настоящему изобретению, пробиотиков и препарата инактивированных бактерий, полученных из одних и тех же молочнокислых бактерий, на мышиные модели с индуцированным легким атопическим дерматитом при использовании следующего специфического способа тестирования.
<9-1> Получение образцов
RHT-3201 по настоящему изобретению и пробиотический препарат получили при использовании способа по Примеру 6 выше, при использовании культуральной жидкости, полученной культивированием Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 в MRS среде, содержащей 0,1-1% сухой сыворотки при температуре 37° в течение 24 часов.
Для инактивированных бактерий бактерии, полученные из культуральной жидкости, суспендировали в 500 мкл раствора фоосфатного буфера и подвергли сушке проведением лиофильной сушки. Сухие бактерии взвесили и суспендировали в стерильном фосфатном буфере до получения 300 мг/мл. Суспензию подвергли инактивации нагреванием при температуре 100°С в течение 30 минут, с получением, таким образом инактивированных бактерий. Три типа образцов развели раствором фосфатного буфера с получением 1 мкг/мл конечных образцов, соответственно. В качестве контроля использовали сухое обезжиренное молоко.
<9-2> Культура клеток селезенки и измерение цитокинов
6
Клетки селезенки получили при использовании способа по Примеру <1-2>. 200 μл суспензии клеток селезенки (5×10 клеток/мл) и 10 мкл (1 мкг/мл) каждого жидкого образца, полученного по Примеру <9-1>, добавили в каждую лунку 96-лунучного планшета, с последующим культивированием в 5% CO2 инкубаторе в течение 7 дней. По окончанию культивирования в культуральной жидкости измерили уровни IL-4 и IL-12 при использовании набора Cytoset (Biosource). Уровни продуцирования IL-4 и IL-12 каждого образца выразили, как показатель роста по сравнению с контролем, как приведено в Таблице 12.
[Таблица 12]
Увеличение показателя цитокинов в клетках селезенки при добавлении образца молочнокислых бактерий
образец
Увеличение (%) по сравнению с контролем
Соотношение IL-4/IL-12
IL-4
IL-12
Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 (пробиотические бактерии)
20
29
0,68
Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201 (инактиви-рованные бактерии)
12
34
0,35
RHT-3201
3
67
0,04
По результатам теста наблюдалось 20% увеличение продуцирования IL-4 и 29% увеличение продуцирования IL-12 у пробиотических бактерий Lactobacillus rhamnosus IDCC 3201. Инактивированные бактерии показали 12% увеличение продуцирования IL-4 и 34% увеличение продуцирования IL-12. RHT-3201 показали 3% увеличение продуцирования IL-4 и 67% увеличение продуцирования IL-12. Следовательно, подтверждается, что RHT-3201 по настоящему изобретению, которые показали значительное увеличение продуцирования IL-12 и относительно небольшое увеличение продуцирования IL-4, имеют самый наилучший эффект регулирования продуцирования цитокинов.
<Пример 10>
Терапевтический эффект RHT-3201 по настоящему изобретению у in vivo моделей с индуцированным тяжелым атопическим дерматитом
<10-1> Получение тестируемого материала и индуцирующего антигена
В качестве тестируемого материала использовали RHT-3201 по настоящему изобретению, при этом дексаметазон на основе стероида (Sigma Co. Ltd), который используют в качестве основного терапевтического агента при тяжелом атопическом дерматите, использовали в качестве положительного контроля. Экстракт Dermatophagoides farina, который является основным видом домашнего пылевого клеща, использовали в качестве материала, индуцирующего атопическое заболевание. Экстракт был приобретен в в форме мази у Central Lab. Animal Inc.
8
9
Дексаметазон получили растворением в этаноле в концентрации 0,1% (масса/объем), и RHT-3201 по настоящему изобретению получили растворением в дистиллированной воде с дозировкой 1×10 КОЕ/0,5 мл/мышь, 1×10 КОЕ/0,5 мл/мышь, и 1×1010 КОЕ/0,5 мл/мышь, соответственно. Все образцы были получены в день тестирования. Дексаметазон нанесли на кожу тестируемого субъекта в концентрации 100 μл для каждого субъекта дважды в неделю, при этом RHT-3201 по настоящему изобретению вводили орально в концентрации 0,5 μл для каждого субъекта при использовании зонда для мышей один раз в день. Дистиллированную воду вводили нормальной группе и контрольной группе с атопическим заболеванием. Введение проводили в течение 8 недель во всех тестируемых группах.
<10-2> Получение и размножение участвующих в тесте животных
Самок мышей NC/Nga (6 недельного возраста) приобрели у Central Lab. Animal Inc., и акклиматизировали в течение 1 недели перед использованием. Среда для размножения была следующей: поддерживали постоянную температуру (22±2 ℃) и постоянную влажность (50-60%), при этом цикл света (08:00~20:00) и темноты (20:00~08:00) контролировали с 12 часовым интервалом. В каждую полисульфоновую клетку поместили по три животных и провели их размножение, корм, представляющий рацион для теста, и вода находились в свободном доступе в течение 24 часов.
<10-3> Индуцирование тяжелого атопического дерматита
Полностью побрили верхнюю часть ушных раковин в областях нанесения 7 недельных мышей Th7 NC/Nga, и затем распылили на побритые участки 150 μл водного раствора 4% натрий додецилсульфата (SDS). После полного высыхания побритые места равномерно покрыли 100 мг мази с домашним пылевым клещом (экстракт домашнего пылевого клеща). Мазь с домашним пылевым клещом (экстракт домашнего пылевого клеща) наносили дважды в неделю в течении трех недель, всего шесть раз для индуцирования среднего или тяжелого дерматита. Далее мазь наносили один раз в неделю в течение периода введения тестируемым группам (8 недель), поддерживая, таким образом, тяжелый атопический дерматит.
[Таблица 13]
Оценка индуцированного тяжелого атопического дерматита у каждой модели перед обработкой тестируемыми материалами
Оценка тяжелого атопического дерматитаСреднее ± SE (n=6)
Нормальная группа
0
Контроль - атопическое заболевание (Носитель)
11,0 ± 0,4
Дексаметазон (Положительный контроль)
10,8 ± 0,4
RHT-3201
1×10<sup>8</sup>КОЕ/мышь
10,8 ± 0,4
1×10<sup>9</sup>КОЕ/мышь
10,7 ± 0,3
1×10<sup>10</sup>КОЕ/мышь
10,7 ± 0,3
Как видно из Таблицы 13, результат индуцирования тяжелого атопического дерматита нанесением мази с домашним пылевым клещом (экстракт домашнего пылевого клеща) NC/Nga мышам в течение трех недель, средняя оценка каждой группы составила 10 или выше, таким образом, были получены NC/Nga мыши с тяжелым атопическим дерматитом.
<10-4> Оценка атопического дерматита
В настоящей оценке тяжесть атопического дерматита выразили, как общее оценок пяти признаков, при использовании SCORAD Шкалы оценки атопического дерматита (SCORing Atopic dermatitis), которую, как правило, используют в качестве метода оценки при клинических исследованиях с проведением оценки не вооруженным глазом. Признаками для оценки были: эритема, сухая кожа, отек, расчесы и лихенификация. Оценки пяти признаков (отсутствие симптомов (оценка 0), слабовыраженные симптомы (оценка 1), умеренно выраженные симптомы (оценка 2), сильно выраженные симптомы (оценка 3) для каждого признака) сложили вместе, при этом оценочные значения детерминировали от самой низкой оценки 0 (состояние, при котором симптомы отсутствуют) до самой высокой оценки 15 (состояние, при котором симптомы всех пяти признаков - тяжелые). Тяжесть поражения кожного покрова мышей оценивали каждую неделю (смотрите, ФИГ. 6).
8
9
10
8
8
9
9
10
10
На ФИГ. 6, носитель - результаты групп мышей с тяжелым, индуцированным домашним пылевым клещом атопическим дерматитом, и дексаметазон - результаты групп мышей, на кожный покров которых наносили лекарственное средство с использованием дексаметазон, в качестве положительного контроля в течение 8 недель. RHT-3201 10, RHT-3201 10, и RHT-3201 10 - результаты групп мышей с тяжелым, индуцированным домашним пылевым клещом атопическим дерматитом, которым вводили RHT-3201 по настоящему изобретению в различных концентрациях: RHT-3201 10 - результаты группы получавших терапию мышей с оральным введением 1×10 КОЕ/мышь в течение 8 недель; RHT-3201 10 -результаты группы получавших терапию мышей с оральным введением 1×10 КОЕ/мышь в течение 8 недель; и RHT-3201 10 - результаты группы получавших терапию мышей с оральным введением 1×10 КОЕ/мышь в течение 8 недель.
8
9
10
8
9
10
Результат исследования эффекта снижения выраженности тяжелого атопического дерматита после 8 недельной экспериментальной терапии подтвердил, как показано на ФИГ. 6, что оценка тяжелого атопического дерматита у группы с носителем без какой-либо терапии лекарственным средством имела среднее, равное 8,0, указывая на сохранение начального тяжелого состояния. При сравнении с группой мышей с тяжелым, индуцированным домашним пылевым клещом атопическим дерматитом (группа носителя) оценка тяжести поражения кожного покрова мышей была значительно ниже во всех группах, получавших терапию RHT-3201 10, RHT-3201 10, и RHT-3201 10, соответственно. В частности, группа, которой вводили RHT-3201 10, показала оценку тяжелого атопического дерматита, равную 4,2, что в результате указывает на эффективность снижения выраженности тяжелого атопического дерматита на 47,5%. Группа, которой вводили RHT-3201 10, показала оценку тяжелого атопического дерматита, равную 2,3, что в результате указывает на эффективность снижения выраженности тяжелого атопического дерматита на 71,25%. Группа, которой вводили RHT-3201 10, показала оценку тяжелого атопического дерматита, равную 2,7, что в результате указывает на эффективность снижения выраженности тяжелого атопического дерматита на 66,25%.
9
10
Общеизвестно, что препараты молочнокислых бактерий необходимо потреблять в больших количествах, отсутствуют данные об оптимальных концентрациях таких препаратов для достижения эффекта снижения выраженности тяжелого атопического дерматита. Причина состоит в том, что, как и молочнокислые пробиотики, молочнокислые бактерии погибают в больших количествах в желудочно-кишечном тракте под воздействием желчных кислот, проходя через желудочно-кишечный тракт, что вызывает снижение эффективности адгезии к слизистой кишечника, способной демонстрировать иммунную активность, и таким образом выводятся из тела. В отличие от этого, RHT-3201 по настоящему изобретению ясно показал обладание терапевтическим эффектом в различных концентрациях. Потребление x10 и x10 единиц показало сходство в диапазоне значения ошибок относительно эффективности и снижения выраженности тяжелого атопического дерматита. Причина состоит в том, что комбинация с toll-подобным рецептором, расположенным в дендритных клетках слизистой кишечника, имеет порог насыщения.
ФИГ. 7 - результаты наблюдения не вооруженным глазом терапевтического эффекта Lactobacillus RHT-3201 при оральном введении при тяжелом атопическом дерматите. В очагах поражения кожного покрова группы носителя ясно наблюдалась сухая кожа, эритема, отек, лихенификация и расчесы, вызванные кожным зудом, индуцированным постоянным расчесыванием. При исследовании не вооруженным глазом было установлено, что тяжесть атопического дерматита снизилась в группах, получавших RHT-3201 во всех концентрациях.
<10-5> Расчесывание и измерение массы тела
Проводили подсчет числа расчесываний за 15 минут один раз в неделю с 1 недели введения тестируемого лекарственного средства. Проводили подсчет только расчесываний, производившихся задней конечностью, во избежание подсчета расчесываний, вызванных другими причинами помимо расчесываний из-за кожного зуда. При этом имеет место тенденция потери массы тела из-за побочных эффектов лекарственных средств и стресса во время индуцирования тяжелого атопического дерматита. Для исследования существования наличия потери массы тела, вызванного тестируемыми материалами, по настоящему изобретению проводили взвешивание участвовавших в тестах животных в течение периода введения.
Как показано на ФИГ. 8, измеренное число расчесов составило 100/час или менее во всех группах, получавших тестируемые материалы, в течение восьми недель, при этом наблюдалась тенденция снижения числа расчесов каждую неделю по сравнению с группой носителя. На 3, 6 и 8 неделях наблюдались значительные статистически значимые улучшения в группах, получавших RHT-3201 во всех концентрациях, по сравнению с группой носителя.
Дополнительно, как показано на ФИГ. 9, трансдермальное введение дексаметазона в качестве положительного контроля во время восьми недель вызвало потерю массы тела в течение 4 недель, в то время как введение RHT-3201 по настоящему изобретению показало прирост массы тела, также как и в нормальной группе; не было вызвано побочного эффекта потери массы тела, и таким образом была подтверждена безопасность RHT-3201 по настоящему изобретению.
<10-6> Измерение уровня IgE в сыворотке
После введения тестируемых лекарственных средств в течение восьми недель провели забор крови через ретро-орбитальное венозное сплетение и центрифугировали при 12,000 оборотах в минуту в течение 10 минут для отделения сыворотки. Уровень IgE в сыворотке измерили при использовании набора ELISA (SHIBAYAGI, Japan).
9
Как показано на ФИГ. 10 касательно IgE, в частности, известно, что во время индуцирования тяжелого атопического дерматита его уровень повышается, в группах, получавших RHT-3201, по настоящему изобретению наблюдались значительные ингибирующие эффекты, при этом, в частности, при сравнительной оценке различных концентраций, потребление x 10 единиц показало наивысший ингибирующий эффект.
<10-7> Способность продуцировать цитокины клетками лимфатического узла
6
0
2
После окончания введения тестируемых материалов каждую мышь NC/Nga с индуцированным тяжелым атопическим дерматитом умертвили. Провели измерение размера и массы подмышечных лимфатических узлов. Дополнительно, клеточные суспензии, полученные из подмышечных лимфатических узлов, диспергировали в RPMI-1640 среде (содержащей 10% FBS, 1% пенициллина и 1% стрептомицина) до концентрации 5×10 клеток/мл. Добавили экстракт домашнего пылевого клеща (D. farina) до получения конечной концентрации 10 мкг/мл, и культивировали в течение 48 часов в инкубаторе с 5% CO при температуре 37C. Собрали супернатант для измерения уровней продуцирования IFN- γ, IL-4, IL-10 и IL-12 при использовании набора ELISA (производитель IFN- γ & IL-4: R&D SYSTEMS, USA; и производитель IL-10 & IL-12: SIGMA ALDRICH, USA).
3
Как показано на ФИГ. 11, подмышечные лимфатические узлы участвуют в иммунном ответе кожного покрова спинки мыши NC/Nga, в то время как лимфатические узлы группы носителя были увеличены из-за воздействия антигена домашнего пылевого клеща (экстракт домашнего пылевого клеща). Как показано на Фигурах 12 и 13, показатели измерения объема и массы лимфатических узлов составили 70 мм и 35 мг, соответственно, что было в 5 или 7 раз больше по сравнению с нормальной группой. При этом размер подмышечных лимфатических узлов у мышей NC/Nga с тяжелым индуцированным атопическим дерматитом был значительно уменьшен в группах, получавших RHT-3201.
Для подтверждения способности продуцировать цитокины при введении RHT-3201 подмышечный лимфатический узел у мышей NC/Nga с индуцированным тяжелым атопическим дерматитом подвергли воздействию антигена домашнего пылевого клеща и затем измерили уровень цитокинов, вовлеченных в иммунный ответ. Результаты приведены на Фигурах 14-21. Было подтверждено, что введение RHT-3201 по настоящему изобретению значительно снизило цитокин IFN-γ типа Th1 (смотрите, ФИГ. 14) и его индуктор, IL-12 (смотрите, ФИГ. 15), по сравнению с носителем. Также было подтверждено, что введение RHT-3201 по настоящему изобретению значительно снизило цитокин IL-4 типа Th2 (смотрите, ФИГ. 16), по сравнению с носителем. Основные секреторные клетки IL-10 в лимфатических узлах, то есть, регуляторные T клетки, оказали иммуносупрессивное действие, ингибирующее Th1 и Th2 реакцию. Также было подтверждено, что введение RHT-3201 значительно снизило IL-10 (смотрите, ФИГ. 17) по сравнению с носителем.
Для сравнения механизма действия RHT-3201 на тяжелый атопический дерматит было показано соотношение цитокин типа Th1/цитокин типа Th2 для уровней цитокинов, экспрессировавшихся в каждой группе введения. Из приведенного на ФИГ. 18 результата видно, что соотношение IL-4/IFN-γ в группах, получавших RHT-3201, не отличалось по сравнению с группой носителя. Эти результаты отличаются от регуляторной реакции цитокин типа Th1/ цитокин типа Th2 при введении RHT-3201 по настоящему изобретению при среднем атопическом дерматите в Примере 9, указывая на то, что RHT-3201 по настоящему изобретению имеет отличающийся механизм действия на тяжелый атопический дерматит. То есть, было подтверждено, что механизм действия RHT-3201 по настоящему изобретению варьирует в зависимости от тяжести атопического дерматита.
Для подтверждения того, что цитокин IL-10 является фактором действия, вовлеченным в ингибирование регулировки T клеток (Treg) в качестве другого механизма действия на тяжелый атопический дерматит при приеме RHT-3201 по настоящему изобретению, сравнили и проанализировали соотношение IFN-γ/IL-10 (смотрите, ФИГ. 19), соотношение IL-4/IL-10 (смотрите, ФИГ. 20), и соотношение IL-12/IL-10 (смотрите, ФИГ. 21). В результате было подтверждено, что показатели соотношений были значительно снижены у групп, получавших RHT-3201 по настоящему изобретению. Следовательно, было показано, IL-10 является фактором действия, вовлеченным в лечение тяжелого атопического дерматита, и цитокин повышает активность Treg, таким образом, демонстрируя терапевтический эффект при тяжелом атопическом дерматите.
<10-8> Гистопатологическое исследование
Провели сбор кожного покрова спинок мышей NC/Nga, зафиксировали в 10% формалине и залили парафином, провели тонкую нарезку толщиной 4 мм, с получением, таким образом, препарата. Затем провели окрашивание гематоксилином & эозином (H&E) для исследования изменений толщины эпидермиса, при этом тучные клетки были подтверждены окрашиванием толуидином синим. Толщину кожного покрова и число тучных клеток рассчитали при использовании оптического микроскопа с увеличением 100 и 400.
В результате исследования окрашенных H&E кожных тканей спинки мышей NC/Nga, как показано на ФИГ. 22, группа носителя с атопическим дерматитом, индуцированным воздействием домашнего пылевого клеща, показала, что полученные гистопатологические результаты повышенного утолщения вызваны утолщением эпидермального слоя относительно дермального слоя по сравнению с нормальной группой и повышенной инфильтрацией воспалительных клеток. При микроскопическом исследовании группы, получавшие RHT-3201, по настоящему изобретению показали пониженную инфильтрацию воспалительных клеток; значительное ингибирование увеличения толщины эпидермиса (смотрите, ФИГ. 23) и повышение толщины дермы (смотрите, ФИГ. 24), что наблюдалось при индуцировании атопического дерматита по сравнению с группой носителя.
В результате исследования окрашенных толуидином синим кожных тканей спинки мышей NC/Nga было подтверждено, что тучные клетки дополнительно проникли в кожные ткани группы носителя с атопическим дерматитом, индуцированным воздействием домашнего пылевого клеща, который представляет антигенный материал, индуцирующий атопический дерматит, по сравнению с нормальной группой (смотрите, ФИГ. 25). При тяжелом атопическом дерматите число тучных клеток, как правило, возрастает в соответствии с его периодом. Как показано на ФИГ. 26, было подтверждено, что число тучных клеток повысилось в кожных тканях мышей (носитель), подвергшихся воздействию домашнего пылевого клеща, в течение 11 недель, при этом число тучных клеток у мышей с индуцированным тяжелом атопическим дерматитом было значительно снижено в группах, получавших RHT-3201, в течение восьми недель. Следовательно, RHT-3201 по настоящему изобретению оказывает значительное воздействие по снижению выраженности тяжелого атопического дерматита.
Промышленная применимость
Как указано выше, настоящее изобретение относится к инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированным с полимерным полисахаридным связующим, способу их получения, и их применению. Инактивированные нагреванием Lactobacillus rhamnosus, конъюгированные с полимерным полисахаридным связующим, по настоящему изобретению обладают превосходным терапевтическим эффектом при атопических заболеваниях, по существу значительно улучшают конкурентную адгезию к слизистой кишечника препаратов из традиционных молочнокислых бактерий и демонстрируют профилактический, снижающий выраженность или терапевтический эффект при атопическом дерматите на уровне, эквивалентном таковому у лекарственного средства на основе стероидов. Следовательно, настоящее изобретение имеет высокую промышленную применимость.