КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ФИНОМЕР
ANTIBODY-FYNOMER CONJUGATES

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Настоящая заявка исправшивает приоритет по предварительной заявке, поданной 16 марта 2014 года, которой присвоен № 61/954437. Полное содержание предварительной заявки включено в данное описание ссылкой.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к слитому белку, который может связываться с как с интерлейкином-17A (IL-17а), так и с рецептором интерлейкина-6-(IL-6R). Настоящее изобретение также относится к трансформированной клетке, которая продуцирует слитый полипептид, композиции, содержащей слитый полипептид, и к способу лечения заболевания или расстройства, с использованием слитого полипептида.
Предшествующий уровень техники
Клетки Th17 являются центральными медиаторами при хронических воспалительных процессах и основными патогенными эффекторами в нескольких типах аутоиммунных состояний, которые ранее считались Th1-опосредованными (Weaver T. et al.(2008) Annu. Rev. Immunol., 25, p. 821-852). Провоспалительный цитокин IL-17 в основном экспрессируется клетками Th17 и присутствует при повышенных уровнях в синовиальной жидкости пациентов с ревматоидным артритом (РА), и, как было показано, участвует в развитии раннего РА. Кроме того, IL-17 является мощным индуктором TNF-альфа и IL-1, причем последний, в основном, ответственен за эрозию кости и очень болезненные последствия для пострадавших пациентов (Lubberts E. (2008) Cytokine, 41, p. 84-91). Кроме того, неправильная или чрезмерная выработка IL-17 связана с патологией различных других заболеваний и расстройств, таких как остеоартрит, разрыхление костных имплантатов, острое отторжение трансплантата (Antonysamy et al., (1999) J. Immunol, 162, p. 577-584; van Kooten et al. (1998) J. Am. Soc. Nephrol., 9, p.1526-1534), сепсис, септический или эндотоксический шок, аллергия, астма (Molet et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol., 108, p. 430-438), потеря костной ткани, псориаз (Teunissen et al. (1998) J. Invest. Dermatol, 111, p. 645-649), ишемия, системный склероз (Kurasawa et al. (2000) Arthritis Rheum., 43, p. 2455-2463), инсульт и другие воспалительные расстройства. Следовательно, существует потребность в терапии, которая модулирует биологические активности IL-17.
Ранняя нейтрализация эндогенного IL-17 с помощью слитого белка рецептор IL-17-IgG1-Fc, которая начинается с протокола иммунизации во время начальной фазы артрита, подавляет возникновение экспериментального артрита (Lubberts et al. (2001) J. Immunol., 167, p. 1004-1013). Кроме того, обработка нейтрализующим анти-IL-17 антителом в животной модели после начала коллаген-индуцированного артрита уменьшает воспаление суставов, разрушение хряща и костную эрозию (Lubberts et al. (2004) Arthritis and Rheumatism, 50; 650-659). Гистологический анализ подтвердил, что подавление воспаления суставов, и системные концентрации IL-6 значительно уменьшились после обработки анти-IL-17 антителами. В противоположность этому, системная и местная избыточная экспрессия IL-17 с использованием аденовирусного вектора, экспрессирующего мышиный IL-17, ускоряет начало коллаген-индуцированного артрита (CIA) и усугубляет местное синовиальное воспаление (Lubberts et al. (2001) J. Immunol.,167, p. 1004-1013 и Lubberts et al. (2002), Inflamm. Res. 51, p102-104). Совсем недавно было продемонстрировано, что применение анти-IL-17 антител улучшило клинические симптомы псориаза, ревматоидного артрита и неинфекционного увеита (Leonardi C. et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366, p. 1190-1199; Hueber W. et al. (2010) Sci Transl Med. 2(52):52ra72).
Интерлейкин 6 (IL-6) является мощным цитокином, который регулирует рост и дифференцировку клеток, а также является важным медиатором острых воспалительных реакций. IL-6 действует через рецепторный комплекс, состоящий из специфического рецептора интерлейкина-6 (IL-6R), и субъединицы трансдукции сигнала (gp130). Нарушение регуляции передачи сигналов IL-6 вовлечено в патогенез многих заболеваний, таких как множественная миелома, аутоиммунные заболевания и рак предстательной железы. Соответственно, существует потребность в терапии, модулирующей биологическую активность IL-6 и/или IL-6R.
Сущность изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание слитого полипептида, который может связываться как с интерлейкином-17A (в дальнейшем «IL-17а»), так и с рецептором интерлейкина-6 (в дальнейшем «»). Другой задачей настоящего изобретения является создание слитого полипептида, который может подавлять, уменьшить, снизить, ингибировать или блокировать как IL-17а, так и IL-16R активности. Еще одной задачей настоящего изобретения является создание трансформированной клетки, которая продуцирует слитый полипептид. Дополнительной задачей настоящего изобретения является создание композиции, содержащей слитый полипептид для лечения заболевания или расстройства. Еще одной задачей настоящего изобретения является создание способа лечения заболевания или расстройства, с использованием слитого полипептида.
Авторы настоящего изобретения предоставляют данные, демонстрирующие, что слитые полипептиды, а именно FynomAb, содержащие последовательность финомера («fyno», также указанную как Fynomer™), который связывается с интерлейкином-17A (IL-17а) и конъюгирован с антителом или субпоследовательностью антитела («mAb»), которые связываются с рецептором интерлейкина-6 (IL-6R), могут связывать и подавлять, уменьшить, снижать, ингибировать или блокировать функцию или активность как IL-17а, так и IL-6R. Данные также показывают, что различные партии образцов FynomAb, полученных в разное время и из разных клеток, вели себя одинаково во всем множестве партий. Конструкции примерных 8 FynomAb имели очень сходные аффинности к IL-17а и IL-6R и имели одинаковую функциональную активность в клеточных анализах. Слитые белки легких цепей (COVA802, COVA804, COVA806 и COVA808) имели лучшие профили эксклюзионной хроматографии и были менее склонны к агрегации.
В одном воплощении предлагается биспецифичный слитый полипептид, содержащий последовательность финомера, который связывается с интерлейкином-17A (IL-17а) и конъюгирована с антителом, которое связывается с рецептором интерлейкина-6 (IL-6R), или субпоследовательностью антитела. Биспецифичный слитый полипептид может представлять собой слитый полипептид, который связывается одновременно с IL-17а и с IL-6R.
В одном из воплощений последовательность финомера может быть конъюгирована с последовательностью тяжелой или легкой цепи антитела, которая связывается с IL-6R или субпоследовательностью последовательности тяжелой или легкой цепи. Последовательность финомера может быть конъюгирована с амино- или карбоксильным концом последовательности тяжелой цепи антитела или ее субпоследовательности. Последовательность финомера может быть конъюгирована с амино- или карбоксильным концом последовательности легкой цепи антитела или ее субпоследовательностью.
Биспецифичный слитый полипептид может включать один или несколько из числа IL-17а связывающих последовательностей, конъюгированных с антителом, которое связывается с IL-6R, или субпоследовательностью антитела. В конкретных воплощениях биспецифичный слитый полипептид может включать два или более, например, три, четыре, пять, шесть, семь или восемь последовательностей IL-17а-связывающих финомеров, которые конъюгированы с антителом, связывающим IL-6R, или его субпоследовательностью.
Последовательностью финомера, связывающего IL-17а, может иметь различную длину. В одном из воплощений последовательность финомера имеет длину от около 10 до 80 аминокислот.
d
d
d
d
-9
-13
Последовательность финомера, связывающего IL-17а может иметь различные аффинности к IL-17а. В одном из воплощений последовательность финомера может иметь аффинность связывания (K) для связывания с IL-17а от около 10 М до около 10 М. В предпочтительном воплощении последовательность финомера может иметь аффинность связывания (K) для связывания с гликозилированным IL-17а от около 1 до около 200 нМ. В еще одном предпочтительном воплощении последовательность финомера может иметь аффинность связывания (K) в отношении связывания с гликозилированным человеческим IL-17а от около 1 до около 200 нМ, или от около 5 до около 50 нМ. Последовательность финомера может иметь сравнимую или большую аффинность связывания (K или KD) для гликозилированного IL-17а, чем аффинность связывания последовательности финомера SEQ ID NO: 1 для гликозилированного IL-17а.
Последовательность финомера, связывающего IL-17а, может быть идентичной эталонным последовательностям финомера. В конкретных воплощениях последовательность финомера может быть последовательностью, по меньшей мере, на 90% или более (например, по меньшей мере, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичной любой из эталонных последовательностей, представленных ниже: GVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (иначе называемой 11L0-С6) (SEQ ID NO: 2);
GVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (иначе называемой 11L5-B06) (SEQ ID NO: 3);
GVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (иначе называемой 11L9-С09) (SEQ ID NO: 5);
GVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (иначе называемой 11L10-А05) (SEQ ID NO: 6);
GVTLFVALYDYANHGNRDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (иначе называемой 1L3-В9) (SEQ ID NO: 1);
GVTLFVALYDYDKLSALDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (иначе называемой 11L6-F03) (SEQ ID NO: 4);
и GVTLFVALYDYSRKSNLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (иначе называемой 11L11-А09) (SEQ ID NO: 7).
Последовательность финомера, связывающего IL-17а, может иметь аминокислотную замену, вставку, добавление или делецию в приведенных выше эталонных последовательностях финомера. В одном из воплощений последовательность финомера может быть любой из следующих последовательностей:
GVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 2);
GVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 3);
GVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 5);
GVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 6);
GVTLFVALYDYANHGNRDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 1);
GVTLFVALYDYDKLSALDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 4); и
GVTLFVALYDYSRKSNLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 7),
или любой из указанных выше последовательностей с 1-2, 2-3, 3-4, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 консервативными, неконсервативными, или консервативными и неконсервативными аминокислотными заменами, или любой из указанных выше последовательностей с 1-2, 2-3, 3-4, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 аминокислотными делециями или вставками.
В одном воплощении последовательность финомера, связывающего IL-17а, может содержать последовательность определенного мотива, идентичного содержащемуся в эталонных последовательностях финомера. В одном воплощении один или несколько из числа мотивов GVTLFVALYDY, DLSFHKGEKFQIL, STHEYE, STHEYED, WWEAR, DWWEAR и SLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ включены в последовательность финомера связывающего IL-17а, используемого в настоящем изобретении. В конкретном воплощении последовательность финомера может включать последовательность STHEYE из аминокислотных положений 31-36 последовательности или последовательность QILSTHEYEDWWEAR из аминокислотных положений 28-42 последовательности.
Последовательность финомера, связывающего IL-17а, может иметь определенный аминокислотный остаток в указанном положении или месте. В частности, последовательность финомера может иметь остаток E, расположенный непосредственно после последовательности src-петли, и/или остаток Е, расположенный сразу после последовательности src-петли, STHEY.
50
Последовательность финомера, связывающего IL-17а, может иметь особые активности или функции. В одном из воплощений последовательность финомера может связывать IL-17а и ингибировать, понижать или подавлять функцию или сигнал рецептора IL-17. В еще одном воплощении последовательность финомера может связываться с гликозилированным IL-17а и ингибировать, снижать или подавлять функцию или сигнал рецептора IL-17. В еще одном воплощении последовательность финомера может связываться с гликозилированным IL-17а и ингибировать, снижать или подавлять выработку IL-6 фибробластами. Например, последовательность финомера может иметь IC для ингибирования, снижения или супрессии образования IL-6 фибробластами от около 10 до около 250 нМ, или от около 10 до около 100 нМ.
d
-5
-13
Биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению включает антитело, которое связывается с IL-6R, или субпоследовательность антитела, такую как VH-или VL-цепи, которые связываются с IL-6R. В одном воплощении изобретения антитело или субпоследовательности могут иметь аффинность связывания (K) для связывания с IL-6R, около от 10 М до около 10 М.
2,
L
H
L
H
2
H
L
2
V
H
2
2
IL-6R-связывающее антитело или его субпоследовательность, такая как VH- или VL-цепь, могут иметь различную длину. В частности, последовательность может иметь от около 50 до 100 аминокислот в длину. В конкретных воплощениях изобретения антитело или его субпоследовательность может представлять собой Fab, Fab ', F(аb') Fv, Fd, одноцепочечное Fv (ScFv), связанное дисульфидами Fvs (sdFv), V, V, диатело ((V-V) или (V -V)), триатело (трехвалентное), тетратело (четырехвалентное), минитело ((SCF-С3)), IgGdeltaCH2, ScFv-Fc или (ScFv)-Fc-фрагмент.
IL-6R-связывающее антитело или его субпоследовательность могут иметь различные изотипы. В одном из воплощений антитело может иметь изотип IgG, IgA, IgE, IgM или IgD.
IL-6R-связывающее антитело или его субпоследовательность могут иметь существенную идентичность с эталонной последовательностью, представленной ниже. В конкретных воплощениях изобретения антитело или субпоследовательность могут иметь последовательность, по меньшей мере, на 90% или более (например, по меньшей мере, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную любой из следующих последовательностей тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC):
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 8);
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO: 9).
IL-6R-связывающее антитело или его субпоследовательность могут иметь одну или несколько аминокислотных замен, вставок, добавлений или делеций в одной из эталонных последовательностей. В конкретных воплощениях изобретения антитело или субпоследовательность может быть любой из следующих последовательностей тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC):
(НС)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 8);
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9), или теми, которые имеют 1-2, 2-3, 3-4, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30 консервативных, неконсервативных, или консервативных и неконсервативных аминокислотных замен или вставок аминокислот или делеции в пределах или за пределами вариабельной последовательности цепи любой из вышеприведенных последовательностей тяжелой цепи (HC) или (LC) легкой цепи.
IL-6R-связывающее антитело или его субпоследовательность может быть любой из следующих представленных последовательностей тяжелой цепи (HC) и/или легкой цепи (LC):
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQI LSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 14);
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9) (иначе называемой COVA 801);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO: 8);
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYKQKG HLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 17)(иначе называемой COVA 802);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQI LSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ(SEQ ID NO: 18);
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9) (иначе называемой COVA 803);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO: 8;
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSARGQ LDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 21) (иначе называемой COVA 804);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQI LSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 22);
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9) (иначе называемой COVA 805);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO: 8);
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA  DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYESVSW SDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 25) (иначе называемой COVA 806);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQI LSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 26);
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 9) (иначе называемой COVA 807);
(HC)QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYSITSDHAWSWVRQPPGRGLEWIGYISYS GITTYNPSLKSRVTMLRDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCARSLARTTAMDYWGQGSLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO: 8);
(LC)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLHS GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGNTLPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKA DYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGVTLFVALYDYSSRGV LDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 29) (иначе называемой COVA 808),
или той, которая имеет 1-2, 2-3, 3-4, 5-6, 6-7, 7-8, 8-9, 9- 10, 10-15, 15-20, 20-25 или 25-30 консервативных, неконсервативных, или консервативных и неконсервативных аминокислотных замен, или аминокислотных вставок или делеций в пределах или за пределами вариабельной последовательности цепи любой из вышеприведенных последовательностей тяжелой цепи (HC) или (LC) легкой цепи.
Связывающее IL-6R антитело может быть известным IL-6R-антителом, таким как тоцилизумаб. Субпоследовательность антитела может быть тяжелой или легкой цепью антитела, или последовательностью, которая имеют аминокислотные замены, вставки или делеции в пределах или вне последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи. Субпоследовательность также может иметь аминокислотные замены, вставки или делеции внутри или вне гипервариабельного участка (CDR) последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела. Субпоследовательность также может включать аминокислотные замены, вставки или делеции внутри или вне каркасного участка (FR) последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела известного IL-6R-связывающего антитела.
IL-6R-связывающая последовательность может иметь особые активности или функции. В одном из воплощений IL-6R-связывающая последовательность связывается с IL-6R и ингибирует, уменьшает или подавляет функцию IL-6R или его сигнальный путь.
Х
В соответствии с настоящим изобретением, связывающее IL-6R антитело, его субпоследовательности, или кго VH- или VL-цепи, и последовательность финомера могут быть конъюгированы непосредственно или посредством линкера. В одном из воплощений конъюгация может быть ковалентной связью или амидной связью. В другом воплощении конъюгация может быть осуществлена с помощь линкера. Не ограничивающие примеры линкеров могут включать пептиды и углеродные последовательности. В одном воплощении пептид имеет последовательность длиной около 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-50 или 50-100 аминокислотных остатков; и углеродную цепь, имеющую длину около 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-50 или 50-100 атомов углерода, могут быть использованы в качестве линкера. Примеры линкеров пептидов могут включать или состоять из мотива (GGGGS) (Х = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) или GGGGSGGGGSGGGGS.
Целевые последовательности, с которыми связывается биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению, включают IL-17а и IL-6R млекопитающих. В конкретном воплощении изобретения мишень может быть человеческим IL-17а и/или IL-6R.
Биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению может быть предоставлен в виде выделенного и/или очищенного полипептида. Настоящее изобретение также относится к композиции, такой как фармацевтическая композиция, содержащей биспецифичный слитый полипептид по изобретению. Композиция может быть стерильной фармацевтической композицией или составом.
В соответствии с настоящим изобретением также предлагаются трансформированные клетки, которые продуцируют биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению. Клетка может быть прокариотической или эукариотической клеткой.
Биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению, может быть использован для лечения заболевания или состояния у объекта, такого как человек. Болезнь или состояние, подлежащее лечению по настоящему изобретению, могут включать, без ограничения перечисленным, аутоиммунные заболевания или нарушения, и воспаление, связанное с или вызванное аномальным или нежелательным иммунным ответом. В одном из воплощений биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению вводят объекту, нуждающемуся в лечении аутоиммунного заболевания или расстройства или воспаления. Аутоиммунные заболевания, расстройства и воспаления могут затрагивать любые клетки, ткани или органы у объекта. Аутоиммунное заболевание, расстройство или воспаление, подвергаемое лечению биспецифичным слитым полипептидом, могут затрагивать мышцы, скелет, нервную систему, соединительную ткань, эндокринную систему, кожу, дыхательные пути или дыхательную систему, желудочно-кишечный тракт, глазную систему или сердечнососудистую систему.
Биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению может быть введен отдельно или совместно со вторым или дополнительным агентом, который является полезным для лечения аутоиммунного заболевания или расстройства, или воспаления, подлежащего лечению с помощью биспецифичного слитого полипептида. В одном из воплощений биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению может быть введен до, одновременно с или после введения второго агента.
В соответствии с настоящим изобретением также предлагается фармацевтическая композиция для лечения заболевания или расстройства, такого как аутоиммунное заболевание или расстройство или воспаление, подвергаемые лечению биспецифичным слитым полипептидом, которая включает биспецифичный слитый полипептид и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. Композиция может дополнительно включать второй или дополнительный агент, который является полезным при лечении заболевания или состояния, подлежащего лечению с помощью биспецифичного слитого полипептида.
В соответствии с настоящим изобретением, также предлагается применение биспецифичного слитого полипептида для изготовления фармацевтической композиции для лечения заболевания или расстройства, такого как аутоиммунное заболевание или расстройство или воспаление.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показан анализ в ДСН-ПААГ транзиторного материала CHO FynomAb.
На фигуре 2 показан анализ в ДСН-ПААГ стабильного материала CHO FynomAb, изготовленного для фармакокинетического исследования на мышах.
На фигуре 3 показан анализ в ДСН-ПААГ стабильного материала CHO FynomAb, изготовленного для фармакокинетического исследования на яванских макаках (cyno).
На фигуре 4 показан анализ кинетики связывания взаимодействия FynomAb с рекомбинантным человеческим IL-17а.
На фигуре 5 показан IL-17а ELISA для COVA804 и COVA806.
На фигуре 6 показан анализ кинетики связывания для взаимодействия FynomAb с рекомбинантным человеческим IL-6R.
На фигуре 7 показан анализ HT-29 IL-17а с транзиторным материалом CHO FynomAb.
На фигуре 8 показан анализ HT-29 IL-17а со стабильным материалом CHO пула FynomAb, изготовленного для фармакокинетического исследования на мышах.
На фигуре 9 показан анализ HT-29 IL-17а со стабильным материалом CHO пула FynomAb, изготовленным для фармакокинетического исследования на яванских макаках.
На фигуре 10 показан анализ ингибирования в НЕК-Blue IL-6R с транзиторным материалом CHO FynomAb.
На фигуре 11 показан анализ ингибирования в НЕК-Blue IL-6R со стабильным материалом CHO пула FynomAb, полученного для фармакокинетического исследования на мышах.
На фигуре 12 показан анализ НЕК-Blue IL-6R ингибированию со стабильным материалом CHO пула FynomAb, полученным для фармакокинетического исследования на яванских макаках (cyno).
На фигуре 13 показана стабильность сыворотки набора ELISA двойного связывания.
На фигуре 14 показана оценка стабильности сыворотки FynomAb, упоминаемых как COVA801-808.
На фигуре 15 показана оценка двойного связывания FynomAb, упоминаемых как COVA804 и 806, в присутствии сыворотки человека.
На фигуре 16 показано одновременное связывание экспрессируемого на клеточной поверхности IL-6R и растворимого IL-17а.
На фигуре 17 показан HT-29 IL-17а функциональный анализ в присутствии растворимого IL-6R.
На фигуре 18 показано ингибирование IL-6R в присутствии IL-17а.
На фигуре 19 показано дозозависимое ингибирование in vitro гликозилированного и не гликозилированного IL-17а указанными финомерными полипептидами. A) 1L3-B09, (B) 11L0-C6, (C) 11L5-B06, (D) 11L6-F03, (E) 11L9-C09, (F) 11L10-A05.
На фигуре 20 показано дозозависимое ингибирование гликозилированного и не гликозилированного IL-17а с помощью полипептидов полученных из Fyn SH3, описанных в WO2011/023685: (А) полученный из Fyn SH3 IL-17-связующий белок 2C1 (SEQ ID NO: 30) (SEQ ID NO: 107 в WO2011/023685). (B) полученный из Fyn SH3 IL-17-связывающий белок A1_2 («А1») (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 53 в WO2011/023685). (С) полученный из Fyn SH3, IL-17-связывающий белок B1_2 («В1») (SEQ ID: 32) (SEQ ID NO: 39 в WO2011/023685).
На фигуре 21 показаны результаты дозозависимого ингибирования гликозилированного и не гликозилированного IL-17а с помощью финомерного полипептида 11L11-A09.
На фигуре 22 показаны средние сывороточные концентрации, представленные на графики в зависимости от времени для FynomAb, обозначенных как COVA801 и COVA802.
На фигуре 23 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для FynomAb, обозначенных как COVA803 и COVA804.
На фигуре 24 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для FynomAb, обозначенных как COVA805 и COVA806.
На фигуре 25 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для FynomAb, обозначенных как COVA807 и COVA808.
На фигуре 26 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для FynomAb, обозначенных как COVA801 и COVA802 в яванских макаках.
На фигуре 27 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для FynomAb, обозначенных как COVA803 и COVA804 в яванских макаках.
На фигуре 28 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для FynomAb, обозначенного как COVA806 в яванских макаках.
На фигуре 29 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для FynomAb, обозначенного как COVA808 в яванских макаках.
Подробное описание
Термин «финомер» относится к неиммуноглобулиновому связывающему (поли)пептиду, смоделированному на основе или полученному из человеческого домена SH3 киназы Fyn, так называемого каркаса, описанного в Gebauer and Skerra (2009) Curr Opinion in Chemical Biology 13:245-255). Домен SH3 человеческой киназы Fyn может быть использован в качестве каркаса для конструирования белков (называемых финомеры), которые связываются с высоким сродством и специфичностью с различными мишенями, такими как белки (WO 2008/022759, WO 2011/023685, Grabulovski D. et al., (2007) J Biol Chem 282, p. 3196-3204, Bertschinger J. et al. (2007) Protein Eng Des Sel, 20, p.57-68, и Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50). Последовательность последовательности Fyn3, с соответствующими подчеркнутыми участками RT-петли (EARTED) и src-петли (NSSE):
GVTLFVALYDYEARTEDDLSFHKGEKFQILNSSEGDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ
RT-петля SRC-петля
Термин «IL-17а финомер» или «анти-IL-17а финомер» и их грамматические варианты, означают последовательность финомера, которая связывается с белком интерлейкина 17а (IL-17а). Аминокислоты в RT-петле и src-петле, как предполагается, определяют специфичность связывания с гликозилированным IL-17а. Ниже представлены репрезентативные последовательности IL-17а-связывающих финомеров (SEQ ID NO: 1-7):
RT-петля src-петля
SEQ ID NO 1:
GVTLFVALYDYANHGNRDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO 2:
GVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO 3:
GVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO 4:
GVTLFVALYDYDKLSALDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO 5:
GVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO 6:
GVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ; и
SEQ ID NO 7:
GVTLFVALYDYSRKSNLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ.
Термин «IL-6R антитело» или «анти-IL-6R антитело» и его грамматические варианты, означает поликлональное или моноклональное антитело, которое связывается с рецептором интерлейкина 6 (IL-6R). Последовательностями тяжелой и легкой цепи репрезентативных IL-6R-связывающих антител (SEQ ID NO: 8 и 9), являются следующие:
Последовательность тяжелой цепи тоцилизумаба (SEQ ID NO: 8), CDR подчеркнуты
1 QVQLQESGPG LVRPSQTLSL TCTVSGYSIT SDHAWSWVRQ PPGRGLEWIG
51 YISYSGITTY NPSLKSRVTM LRDTSKNQFS LRLSSVTAAD TAVYYCARSL
101 ARTTAMDYWG QGSLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
151 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY
201 ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK
251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG*
Последовательность легкой цепи тоцилизумаба (SEQ ID NO: 9), CDR подчеркнуты
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPYTFGQ
101 GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201 LSSPVTKSFN RGEC*
Дополнительные примеры IL-6R-связывающих антител, и/или тяжелой цепи и легкой цепи антител, которые связываются с IL-6R, описаны в патентах US 20130122012; US 20120225060; US 20120128626; и US 20120077731. Нанотела, которые связываются с IL-6R, описаны в WO/2008/020079.
В данном описании термины «IL-17а», «белок IL-17а», «последовательность IL-17а», и «домен IL-17а» относятся ко всей или части последовательности белка IL-17а (например, субпоследовательности, такой как антигенная область или эпитоп), выделенной из, основанной на, или присутствующей в любом природном контексте, или полученном искусственно (например, с помощью генной инженерии) из IL-17а. Таким образом, термин IL-17а и т.п., включает клеточные, а также рекомбинантно или синтетически полученные последовательности IL-17а.
В данном описании термины «IL-6R», «белок IL-6R», «последовательность IL-6R», и «домен IL-6R» относятся ко всей или части последовательности белка IL-6R (например, субпоследовательности, такой как антигенная область или эпитоп), выделенной из, основанной на, или присутствующей в любом природном контексте, или полученном искусственно (например, с помощью генной инженерии) из IL-6R. Таким образом, термин IL-6R, и т.п., включают клеточный, а также рекомбинантно или синтетически полученные последовательности IL-6R.
Последовательности IL-17а и IL-6R млекопитающих известны специалистам в данной области. Репрезентативным неограничивающим примером последовательности белка человеческого IL-17а (SEQ ID NO: 10) является:
MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA.
Репрезентативным неограничивающим примером последовательности белка человеческого IL-6R (SEQ ID NO: 11) является:
MLAVGCALLAALLAAPGAALAPRRCPAQEVARGVLTSLPGDSVTLTCPGVEPEDNATVHWVLRKPAAGSHPSRWAGMGRRLLLRSVQLHDSGNYSCYRAGRPAGTVHLLVDVPPEEPQLSCFRKSPLSNVVCEWGPRSTPSLTTKAVLLVRKFQNSPAEDFQEPCQYSQESQKFSCQLAVPEGDSSFYIVSMCVASSVGSKFSKTQTFQGCGILQPDPPANITVTAVARNPRWLSVTWQDPHSWNSSFYRLRFELRYRAERSKTFTTWMVKDLQHHCVIHDAWSGLRHVVQLRAQEEFGQGEWSEWSPEAMGTPWTESRSPPAENEVSTPMQLTTNKDDDNILFRDSANATSLPVQDSSSVPLPTFLVAGGSLAFGTLLCIAIVLRFKKTWKLRALKEGKTSMHPPYSLGQLVPERPRPTPVLVPLISPPVSPSSLGSDNTSSHNRPDARDPRSPYDISNTDYFFPR.
H
L
1,
2,
3
4
Термин «антитело» относится к белку, который связывается с другой молекулой (антигена) с помощью вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи, обозначаемых как V и V, соответственно. «Антитело» относится к любой, поликлональной или моноклональной, молекуле иммуноглобулина, или их смеси, такой как IgM, IgG, IgA, IgE, IgD. Антитела относятся к любому классу или подклассу антител. Примерными подклассами IgG являются IgG IgG IgG и IgG.
Термин «моноклональное» при использовании в отношении антитела, относится к антителу, которое основано на, полученной из или извлеченному из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон. Поэтому в данном документе структурно определено «моноклональное» антитело, а не способ, с помощью которого оно производится.
Антитела включают антитела, имеющие последовательности каппа или лямбда легкой цепи, полноразмерные, как в природных антителах, их смеси (т.е. слитые последовательности-каппа и лямбда цепей) и субпоследовательности/фрагменты. Встречающиеся в природе молекулы антитела содержат две каппа- и две лямбда легкие цепи. Основное различие между-каппа и лямбда легкими цепями находится в последовательностях константной области.
Антитело, которое включает или состоит из тяжелой (Н) цепи и/или легкой (L) цепи или фрагмента тяжелой (Н) цепи или легкой (L) цепи может включать одну Н- или L-цепь или один фрагмент H- или L-цепи, или множество (2, 3, 4 или более) тяжелых (Н) цепей и/или легких (L) цепей, или множество фрагментов тяжелых (Н) цепей и/или легких (L) цепей. Слитый полипептид (FynomAb), который включает тяжелую (Н) цепь и/или легкую (L) цепь антитела или их фрагменты, не обязательно может включать 2 тяжелых (Н) цепи и 2 легких (L) цепи и, следовательно, слитые полипептиды (FynomAb), описанные в настоящем документе. Антитело или его фрагмент может быть олигомерной (более высокого порядка или валентности) формой, такой как тример, тетрамер, пентамер, гексамер, гептамер, и так далее, с другими антителами, их фрагментами, тяжелыми (Н) цепями, легкими (L) цепи, или полипептидами, отличными от тяжелых (Н) или Легких (L) цепей антитела.
При использовании в данном описании, термин «биспецифичный» и его грамматические варианты, при использовании в отношении последовательности слитого полипептида, означает, что слитый полипептид связывается с двумя различными мишенями. Полипептидные мишени считаются разными, если они имеют различные аминокислотные последовательности. Биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению связывается с рецептором интерлейкина-6 (IL-6R) и интерлейкином-17A (IL-17а).
При использовании в данном описании, термин «слитый» или «химера» и их грамматические варианты, при использовании в отношении последовательности, означает, что последовательность содержит одну или несколько частей, которые основаны на, полученные из, или полученные или выделены из, двух или более различных белков. То есть, к примеру, часть последовательности может быть основана на или получена из одного конкретного белка, а другая часть последовательности может быть основана на или получена из другого конкретного белка. Таким образом, слитый или химерный полипептид представляет собой молекулу, в которой различные части полипептида имеют происхождение из различных белков.
Термины «белок», «полипептид» и «пептид» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения двух или более аминокислот, или «остатков», ковалентно связанных амидной связью или эквивалентом. Аминокислотные последовательности, могут быть связаны с помощью неприродных и не амидных химических связей, включая, например связи, образованные с помощью глутаральдегида, эфиров N-гидроксисукцинимида, бифункциональных малеимидов, или N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC). Неамидные связи включают, например, кетометилен, аминометилен, олефин, эфир, тиоэфир и т.п. (см., например, Spatola in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357 (1983), «Peptide and Backbone Modifications», Marcel Decker, NY).
Настоящее изобретение обеспечивает слитый полипептид (FynomAb), содержащий последовательность финомера, который связывается с интерлейкином-17A (IL-17а), и конъюгирована с антителом, которое связывается с рецептором интерлейкина-6 (IL-6R) или с субпоследовательностью, которая связывается с IL-6R. Последовательность финомера может быть связана с амино- или карбоксильным концом IL-6R-связывающего антитела или его субпоследовательности. Точно так же, амино- или карбокси-концевая последовательность финомера может быть связана с амино- или карбокси-концом антитела или его субпоследовательности. Несколько финомеров могут быть связаны через амино- или карбоксильный конец последовательности финомера, с множеством амино- или карбоксильных концов антитела или его субпоследовательности. Кроме того, соединенные конец-в-конец или последовательные единицы финомеров могут быть связаны с амино- или карбокси-концом антитела или его субпоследовательности.
Термин «связывать» или «связывание» при использовании по отношению к финомеру, антителу или его субпоследовательности, или слитому полипептиду (например, FynomAb), означает, что финомер, антитело или его субпоследовательность, или слитый полипептид специфически связывается со всей или частью мишени. Финомер, антитело или их субпоследовательность, или слитый полипептид (FynomAb) специфически или селективно связывающиеся с белком IL-17а и/или IL-6R, являются селективными для эпитопа или антигенной детерминанты, присутствующей в белке IL-17а или IL-6R. Избирательное связывание относится к связыванию с белком-мишенью. Связывание с нецелевым белком, который не оказывает значительного влияния на связывание с белком-мишенью, также считается селективным. Избирательное связывание можно отличить от неселективного связывания с помощью тестов специфичности, аффинности и конкурентного и неконкурентного связывания, описанных в данном документе или известных в данной области.
Слитые полипептиды финомер/антитело (FynomAb) по настоящему изобретению могут иметь одинаковую или по существу одинаковую специфичность связывания с примерными финомерами, антителами и их субпоследовательностями. Аффинность к мишени может быть большей или меньшей, чем у эталонного финомера, антитела или их субпоследовательности или эталонного слитого полипептида финомер/антитело (FynomAb). Данный FynomAb может детектируемо конкурировать или не конкурировать с или ингибировать связывание другого финомера, антитела, субпоследовательности или FynomAb с участками на мишени, которые не мешают друг другу.
Слитый полипептид финомер/антитело (FynomAb), который специфически связывается со всей или частью последовательности мишени, может также связываться с другими белками, которые имеют такой же или аналогичный эпитоп в качестве мишени. Слитые полипептиды (FynomAb), которые связываются с одинаковыми последовательностями или эпитопами или частью эпитопа, могут иметь большую или меньшую относительную аффинность связывания или специфичность к мишени, чем эталонные финомер или антитело или их химера.
Финомеры и антитела, и слитые полипептиды (FynomAb), также включают последовательности, которые конкурируют за связывание с соответствующими им мишенями. Так, например, данный финомер, антитело, субпоследовательность или FynomAb могут ингибировать или конкурировать за связывание с другим финомером, антителом, субпоследовательностью или FynomAb с IL-17а и/или IL-6R. В конкретном неограничивающем примере финомер, антитело, субпоследовательность или FynomAb могут ингибировать связывание с IL-17а и/или IL-6R, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, 35%, по меньшей мере, 40%, по меньшей мере, 45%, по меньшей мере, 50%, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, или, по меньшей мере, 95% или более любого из COVA801-808. Соответственно, финомер может быть финомером, который конкурирует за связывание с любым из финомеров, обозначенных как SEQ ID NO: 1-7, за связывание с IL-17а (например, гликозилированным IL-17а), и антитело или его субпоследовательность может быть тем, которое конкурирует за связывание антитела, включающего SEQ ID NO: 8 и 9, за связывание с IL-6R.
FynomAb по настоящему изобретению могут включать финомер/антитело или его субпоследовательность или слитый полипептид (FynomAb) с большим или меньшим сродством к мишени (например, IL-17а или IL-6R), чем эталонные финомер/антитело или субпоследовательность или слитый полипептид (FynomAb). Например, FynomAb по настоящему изобретению, могут иметь большую или меньшую аффинность к IL-17а (например, гликозилированному IL-17а) и/или к IL-6R и иметь последовательность, по меньшей мере, на 60% или более (например, по меньшей мере, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) идентичную последовательности финомера, представленной в SEQ ID NO: 1-7, или последовательность, по меньшей мере, на 60% или более (например, по меньшей мере, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%), идентичную последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи, указанных в SEQ ID NO: 8 или 9. В конкретном воплощении слитый полипептид (FynomAb) по изобретению имеет более высокую аффинность к гликозилированному IL-17а, чем последовательность финомера, представленная в SEQ ID NO: 1.
FynomAb согласно изобретению, следовательно, включают последовательности, имеющие одинаковую или отличающуюся аффинность связывания с IL-17а (например, гликозилированным IL-17а) и/или IL-6R. Например, FynomAb согласно изобретению может иметь аффинность к мишени (например, гликозилированному IL-17а и/или IL-6R), которая больше или меньше, чем в 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000 или 1000-10,000 раз аффинности или иметь любое численное значение или диапазон или значение в пределах таких диапазонов, чем другой FynomAb, например, COVA801-808.
а
d
а
d
d
d
d
-2
-2
-3
-3
-4
-4
-5
-5
-6
-6
-7
-7
-8
-8
-9
-9
-10
-10
-11
-11
-12
-12
-13
-13
-14
-14
-15
-15
-7
-8
-8
-9
-9
-10
-10
-11
-11
-12
-12
Аффинность связывания может быть определена по скорости ассоциации (К) и диссоциации (K). Равновесная константа аффинности, KD, является отношением К/K.Финомер или антитело, имеющее ту же самую аффинность связывания, что и другие финомер или антитело, означает, что константа диссоциации (K) каждого антитела отличается в пределах от около 1 до 10 раз (обладает в 1-10 раз более высокой аффинностью или 1-10 раз меньшей аффинностью, или любым числовым значением или диапазоном или значением в пределах таких диапазонов, чем эталонный финомер или антитело). Примеры аффинности для антигена-мишени (например, IL-17а, такого как гликозилированный IL-17а, или IL-6R) имеют константу диссоциации (K) меньше, чем 5x10 М, 10  М, 5x10 М, 10  М, 5х10  М, 10  М, 5x10 М, 10 М, 5x10 М, 10 М, 5x10 М, 10  М, 5x10 М, 10 М, 5х10 М, 10 М, 5х10 М, 10 М, 5х10 М, 10 М, 5х10 М, 10 М, 5х10 М, 10 М, 5х10 М, 10 М, 5х10 М, и 10 М. Как правило, аффинности связывания (K) для мишени могут быть меньше, чем 10 м, 5х10 М, 10 М, 5х10 М, 10 М, 5x10 М, 10 М, 5x10 М, 10 М, 5x10 М, или 10 М.
Более конкретно аффинности примерного финомера или слитого полипептида (FynomAb) к антигену-мишени IL-17а (например, гликозилированного IL-17а) имеют KD от около 0,01 нМ до около 0,50 нМ или около 0,02 нМ до около 0,40 нМ. Более конкретно аффинности примерного антитела или его субпоследовательности или слитого полипептида (FynomAb) к антигену-мишени IL-6R имеют KD от около 0,20 нМ до около 1,25 нМ или около 0,30 нМ до около 1,10 нМ.
d
Финомеры и антитела, а также слитые полипептиды (FynomAb) могут включать те, которые обладают, по меньшей мере, частью «активности» или «функции» эталонного финомера, антитела или химеры, включая FynomAb. Активность или функция может быть аффинностью связывания (например, K, KD), специфичностью связывания, или активностью, например, антагонистической активностью. Термин «по меньшей мере, часть» означает, что финомер, антитело или слитый полипептид (FynomAb) сохраняет, по меньшей мере, измеримое или обнаруживаемое количество активности или функции эталонного финомера, антитела или слитого полипептида (FynomAb), приведенных в качестве примера в данном описании, Финомер, антитело или слитый полипептид (FynomAb) по настоящему изобретению, может иметь большую или меньшую активность или функцию, чем у эталонного финомера, антитела или слитого полипептида (FynomAb).
Финомер, антитело или слитый полипептид (FynomAb) может иметь антогонистичную или агонистичную активность или функцию. В одном из воплощений финомер, антитело или слитый полипептид (FynomAb) могут иметь антогонистичную или агонистичную активность или функцию относительно IL-17а и/или IL-6R.
«Антагонист» способен снижать, уменьшать или ингибировать одну или несколько активностей молекулы-мишени, такие как передача сигналов с помощью IL-17а или IL-6R. Антагонист может препятствовать связыванию IL-17а с рецептором или IL-6R в качестве лиганда, и парализовать или убивать клетки, активированные лигандом, и/или мешать передаче сигнала. Антагонист может полностью блокировать, существенно снижать, уменьшать или ингибировать взаимодействие между лигандом и рецептором.
Термин «агонист» способен повышать, индуцировать или активировать одну или несколько активностей молекулы-мишени, такие как передача сигналов с помощью IL-17а или IL-6R. Агонисты могут увеличивать, индуцировать или способствовать связывания рецептора с лигандом (или наоборот), или могут действовать непосредственно на рецептор или лиганд для увеличения, индукции, стимуляции или активации передачи сигнала.
Финомеры, антитела или слитые полипептиды (FynomAb), обладающие активностью или функцией эталонного финомера, антитела или слитого полипептида (FynomAb), могут быть идентифицированы с помощью различных способов, описанных в данном описании или известных в данной области. Например, могут быть использованы анализы связывания против IL-17а (например, гликозилированного IL-17а) или IL-6R на планшетах (ELISA), или на клетках (клеточный ELISA). Специфическое ингибирование связывания с IL-17а или IL-6R может быть использовано в качестве меры специфичности связывания, а также аффинности. Примерами анализов являются те, могут определить функцию или активность, например, активность IL-17а или IL-6R, например, сигнальную активность.
d
Как указано в настоящем описании, антитело, финомер или слитый полипептид (FynomAb) по настоящему изобретению, могут иметь одну или несколько модификаций в эталонной последовательности. Не ограничивающие примеры модификаций, могут включать одну или несколько аминокислотных замен (например, 1-3, 3-5, 5-10 или более остатков), дополнений (например, 1-3, 3-5, 5-10 или более остатков) или делеций (например, субпоследовательностей или фрагментов) эталонного финомера, эталонного антитела (тяжелой или легкой цепи), или слитого полипептида (FynomAb). В конкретных воплощениях, модифицированный финомер, антитело или слитый полипептид (FynomAb) сохраняет, по меньшей мере, часть функции или активности немодифицированного эталонного антитела, финомера или слитого полипептида (FynomAb), например, аффинность связывания (например, K, KD) или специфичность связывания с IL-6R или IL-17а (например, гликозилированного IL-17а), in vitro или in vivo или в или на клетке (например, в культуре), или in vivo.
Финомер, антитело или их субпоследовательность или FynomAb могут включать те, которые, по меньшей мере, частично идентичны последовательности (менее 100%) родительскому или эталонному финомеру, или последовательности вариабельного участка тяжелой или легкой цепи антитела или слитому полипептиду (FynomAb), изложенных, соответственно, в данном описании. Примером являются финомеры, изложенные в настоящем документе (SEQ ID NO: 1-7), и/или последовательности тяжелой и легкой цепи тоцилизумаба (SEQ ID NO: 8-9). Процент идентичности такого финомера, антитела, их субпоследовательности или слитого полипептида (FynomAb) может составлять всего лишь 60%, или может быть более (например, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%). Процент идентичности может распространяться на всю длину последовательности, представленную в SEQ ID NO: 1-9, или на смежную область или область в любой из SEQ ID NO: 1-9. В одном аспекте, длина последовательности, имеющей общий процент идентичности, составляет 5 или более смежных аминокислот, например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 смежных аминокислот. В другом аспекте, длина последовательности, имеющей общий процент идентичности составляет 20 или более смежных аминокислот, например, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 смежных аминокислот. В другом аспекте, длина последовательности, имеющей общий процент идентичности, составляет 35 или более смежных аминокислот, например, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 45, 47, 48, 49 или 50 смежных аминокислот. В еще одном аспекте, длина последовательности, имеющей общий процент идентичности, составляет 50 или более смежных аминокислот, например, 50-55, 55-60, 60-65, 65-70, 70-75, 75-80, 80- 85, 85-90, 90-95, 95-100 или 100-110 смежных аминокислот.
В соответствии с настоящим изобретением, предусмотрены слитые полипептиды (FynomAb), имеющие любую последовательность финомера, вариабельную области тяжелой или легкой цепей антитела, указанную в SEQ ID NO: 1-9, или последовательность, содержащую одну или несколько замен аминокислот в последовательностях SEQ ID NO: 1-9. В одном из воплощений замещенный финомер и/или последовательность, тяжелой и/или легкой цепи антитела может сохранять, по меньшей мере, частичную аффинность связывания и/или специфичность по отношению к мишени IL-17а (например, гликозилированному IL-17а) и/или IL-6R.
В одном воплощении последовательность финомера может иметь 1-15, 1-12, 1-8, 1-5, 1-3 или меньше (например, 1 или 2), замен аминокислот. В частности, замена будет аминокислотой в пределах последовательности финомера (SEQ ID NO: 1-7).
В другом воплощении любая замена не находится в мотиве GVTLFVALYDY, DLSFHKGEKFQIL, STHEY, STHEYE, STHEYED, WWEAR, DWWEAR, SLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ или QILSTHEYEDWWEAR в последовательности финомера. В другом воплощении остаток аминокислоты Е, расположенный сразу после последовательности src-петли в последовательности финомера, не замещен.
Антитело или слитый полипептид (FynomAb) может иметь одну или несколько замен в константной или вариабельной (например, гипервариабельной, такой как CDR или FR) области. Одна или несколько аминокислотных замен в константных или вариабельных областях, вероятно, будут допустимы. Неконсервативные замены нескольких аминокислот в одном или нескольких гипервариабельных участках, скорее всего, повлияют на активность связывания, специфичность антитела или слитого полипептида (FynomAb).
Таким образом, модификации могут включать удаление мелких и крупных областей аминокислотных последовательностей из эталонного антитела, финомера или слитого полипептида (FynomAb). Удаленный участок может быть необязательно замещен другой аминокислотной последовательностью. Длина замещенной последовательности может быть такой же, или более длинной или более короткой, чем длина удаленной области.
Конкретный пример модификации антитела или слитого полипептида (FynomAb) представляет собой изменение для превращения в другой изотип или подкласс, например, путем замены константной области тяжелой или легкой цепи. Изменение Ig подкласса может привести к изменению или улучшению функции или активности (например, активности анти-IL-6R, стабильности). Другим примером является изменение, которое приводит к улучшению характеристики, такой как повышенная стабильность в сыворотке крови и/или период полужизни in vivo или фармакокинетика. (например, как описано в Antibody Engineering Vol. 1, Konterman R and Duebel S, eds., 2010, Springer, WO 2006/130834 and Horton et al., Cancer Res 68:8049 (2008)). Не ограничивающие примеры замен в Fc включают I253A, H310A, H435 R, H435Q, G236R, L328 R, S239D, I332E. Не ограничивающие примеры замен в IgG1 могут быть проведены в остатках 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 289, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 439 и/или 477 Fc-области.
В одном воплощении, CDR тяжелой или легкой цепи (CDR1, CDR2 или CDR3) или FR могут иметь 1-15, 1-12, 1-8, 1-5, 1-3 или меньше (например, 1 или 2) аминокислотных замен. В одном воплощении, замена в последовательности вариабельной области может быть консервативной заменой аминокислоты, например, в CDR или FR. В другом воплощении замена в вариабельной области не может быть в пределах CDR. В другом воплощении замена может быть в пределах FR. В другом воплощении замена в вариабельной области не может быть осуществлена в пределах FR. Примеры последовательностей CDR вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи, которые придают особенность связывания с IL-6R, приведены в SEQ ID NO: 8 и 9, а именно, CDR 1-3 вариабельной области тяжелой цепи представляют собой: SDHAWS; YISYSGITTYNPSLKS; и SLARTTAMDY; и CDR 1-3 вариабельной области легкой цепи представляют собой: RASQDISSYLN; YTSRLHS; и QQGNTLPYT.
Структурные детерминанты, которые вносят вклад в связывание антигена с антителом, такие как гипервариабельные участки (CDR) и каркасные участки (FR) в пределах гипервариабельных участков, известны в данной области. Расположение, структура и функция дополнительных областей, таких как D- и J-области, также известны. Антитело, его субпоследовательность или слитый полипептид (FynomAb), которые связываются с данной мишенью (например, IL-6R), как правило, могут иметь одну или несколько последовательностей CDR и FR с достаточной идентичностью с последовательностями тяжелой или легкой цепей, которые связывается с IL-6R, тем самым сохраняя, по меньшей мере, частичную функцию или активность связывания IL-6R. Например, в качестве примера в данном описании, одна или несколько последовательностей CDR тяжелой или легкой цепи, изложенных в SEQ ID NO: 8-9, могут сохранить, по меньшей мере, частичную функцию или активность антитела, которое имеет связывающую специфичность по отношению к IL-6R.
Анализ региональной частоты мутирования может быть использован для прогнозирования влияния конкретных замен в гипервариабельных участках (CDR) и каркасных участках (FR) (Shapiro et al., J Immunol. 163:259 (1999)). Вкратце, сравнение последовательностей указывает иерархию частоты мутирования среди двух- и трехнуклеотидных последовательностей, расположенных в пределах интронной ДНК Ig, которая прогнозирует участки, которые являются более или менее мутабельными. Количественное отношение структуры-активности (QSAR), может быть использовано для определения природы домена распознавания антитела и, следовательно, аминокислот, которые участвуют в связывании лиганда. Предиктивные модели, основанные на QSAR в свою очередь могут быть использованы для прогнозирования влияния замен (мутаций). Например, влияние мутаций на ассоциации и диссоциации скорости антитела, взаимодействующего с антигеном было использовано для построения количественных моделей прогнозирования, для обоих кинетических (Ka и Kd) констант, что в свою очередь может быть использовано для прогнозирования влияния других мутаций на антитело (De Genst et al., J Biol. Chem. 277:29897 (2002)). Таким образом, специалист в данной области может использовать такой анализ для прогнозирования аминокислотных замен, которые могут привести к получению антитела или субпоследовательности, которые сохраняют, по меньшей мере, частичную активность или функцию незамещенного антитела, субпоследовательности или слитого полипептида (FynomAb), например, сохраняют, по меньшей мере, частичное связывание с IL-6R.
Эффект данного замещения может быть проанализирован с целью выявления антител и слитых полипептидов (FynomAb), сохранивших, по меньшей мере, часть активности связывания, специфичности или функции антитела, или активности незамещенного эталонного антитела или слитого полипептида (FynomAb). Например, замену аминокислоты, добавление, удаление или вставку в гипервариабельной области антитела или слитого полипептида (FynomAb), которые связываются с IL-6R, можно проанализировать по активности связывания или специфичности связывания IL-6R. Соответственно, антитела и слитые полипептиды (FynomAb), имеющие аминокислотные замены, а также добавления, удаления и вставки включены поскольку, по меньшей мере, частично сохраняется часть функции или активности, такие как аффинность связывания, специфичность связывания, связывание с мишенью (например, с IL-6R) на клетке in vitro (например, в культуре), или in vivo.
Термин «идентичность» и его грамматические вариации означает, что две или более указанных сущностей одинаковы. Таким образом, когда две аминокислотные последовательности идентичны, они имеют одну и ту же аминокислотную последовательность. Идентичность может быть по всей определенной области (участку или домену) последовательности. «Области, участки или домены» гомологии или идентичности означает, что часть двух или более указанных сущностей имеют гомологию или являются одинаковыми. Таким образом, когда две последовательности идентичны по одному или нескольким участкам последовательности они имеют идентичность в этих участках.
Аминокислотные замены могут быть консервативными или неконсервативными. «Консервативная замена» означает замену одной аминокислоты биологически, химически или структурно подобным остатком. Биологически подобный означает, что замена является совместимой с биологической активностью, например, сохраняет связывание с IL-17а или IL-6R. Структурно подобный означает, что аминокислоты имеют боковые цепи одинаковой длины, такие как аланин, глицин и серин, или имеют аналогичный размер. Химически подобный означает, что остатки имеют один и тот же заряд или оба являются гидрофильными или гидрофобными. Конкретные не ограничивающие примеры включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин на другой, или замену одного полярного остатка на другой, например, замену лизина на аргинин, глютаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, или глутамин на аспарагин, серин на треонин и тому подобное.
Аминокислотные замены могут быть осуществлены на ту же аминокислоту, за исключением того, L-аминокислоты природного происхождения могут быть заменены на D-аминокислоты. Поэтому модификации включают одну или несколько D-аминокислот, замещенных на L-аминокислоты, или смеси D-аминокислот, замещенные на L-аминокислоты.
Степень идентичности между двумя последовательностями может быть установлена с помощью компьютерной программы и математического алгоритма, известного в данной области. Такие алгоритмы, которые вычисляют процент идентичности последовательностей (гомологии), в целом учитывают разрывы и несовпадения по всему сравниваемому участку или области. Например, BLAST (например, алгоритм поиска BLAST 2.0) (см., например, Altschul et al., J. Mol. Biol . 215: 403 (1990), публично доступен на сайте NCBI) имеет следующие примерные параметры поиска: несовпадение-2; разрыв-5; продолжение разрыва-2. Для сравнения полипептидных последовательностей, как правило, используется алгоритм BLASTP, в комбинации с балльной матрицей, такой как PAM100, РАМ 250, BLOSUM 62 или BLOSUM 50. Программы сравнения последовательностей FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) и SSEARCH также используются для количественной оценки степени идентичности (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185 (2000); и Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195 (1981)). Также были разработаны программы для количественного анализа структурного сходства белков с использованием топологического картирования Делоне (Bostick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:320 (2003)).
Изменения включают изменения в деятельности или функции эталонной композиции (например, аффинность или специфическое связывание с IL-17а или IL-6R). Модифицированные финомеры, антитела и слитые полипептиды (FynomAb), имеющие измененные характеристики, такие как повышенная аффинность связывания, повышенная антагонистическая активность, могут быть получены с помощью способа, известного в данной области. Например, методы созревания аффинности могут быть использованы для улучшения аффинности связывания антитела (US 2004/0162413 А1, пат. США № 6656467, 6531580, 6590079 и 5,955,358; Fiedler et al., Protein Eng. 15:931 (2002); Pancook et al., Hybrid. Hybridomics 20:383 (2001); Daugherty et al., Protein Eng. 11:825 (1998); Wu et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:6037 (1998); and Osbourn et al., Immunotechnology 2:181 (1996)).
2,
L
H
L
H
2
H
L
2
V
H
2
2
2,
L
H
L
2
H
2),
V
H
2
2
Финомеры, антитела и слитые полипептиды (FynomAb) включают субпоследовательности (например, фрагменты) и модифицированные формы (например, варианты последовательности), описанные в настоящем документе. Субпоследовательность финомера относится к функциональному фрагменту или субпоследовательности эталонного финомера, например, последовательности, имеющей делеции одной или нескольких аминокислот любой из SEQ ID NO: 1-7. Субпоследовательность «антитела» относится к функциональному фрагменту или субпоследовательности иммуноглобулина. Не ограничивающие примеры субпоследовательностей антител могут включать Fab, Fab', F(Ab') Fv, Fd, одноцепочечные Fv (ScFv), Fvs с дисульфидными связями (sdFv), V,V, диатело ((V-V) или (V-V)), триатело (трехвалентное), тетратело (четырехвалентное), минитело ((scF-C3)), IgGdeltaCH2, ScFv-Fc или (ScFv)-Fc-фрагмент. В конкретных аспектах, An Fab, Fab', F(аb') Fv, Fd, одноцепочечное Fv (ScFv), Fvs с дисульфидными связями (sdFv), V, V, диатело ((V  -V H)  или (V  -V L)  триатело (трехвалентное), тетратело (четырехвалентное), минитело ((scF-C3)), IgGdeltaCH2, ScFv-Fc и (ScFv)-Fc субпоследовательность. Такие субпоследовательности и слитые полипептиды (FynomAb) могут иметь, по меньшей мере, часть последовательности, представленной в любой из SEQ ID NO: 8 или 9 (например, один или несколько CDR (CDR1-CDR3 вариабельной области тяжелой или легкой цепи) и/или FR из SEQ ID NO: 8-9).
В конкретных аспектах субпоследовательность имеет по существу такую же или имеет схожую аффинность связывания с IL-17а или IL-6R, или специфичность связывания с IL-17а или IL-6R, или одну или несколько функций или активностей IL-17а-связывающего финомера, или IL-6R-связывающего антитела in vitro или in vivo, на клетке in vitro или in vivo. Термины «функциональная субпоследовательность» и «функциональный фрагмент» при упоминании финомера, антитела или слитого полипептида (FynomAb) относится к части финомера или антитела или слитого полипептида (FynomAb), которая сохраняет, по меньшей мере, часть одной или нескольких функций или активностей как у интактного эталонного финомера или антитела или слитого полипептида (FynomAb), например, финомера, который связывается с IL-17а, антитела, которое связывается с IL-6R или слитого полипептида (FynomAb), который связывается с IL-17а и IL-6R.
Субпоследовательности антитела, в том числе одноцепочечные антитела, могут включать все или часть вариабельной области(ей) тяжелой или легкой цепей (например, CDR1, CDR2 или CDR3) в отдельно или в сочетании со всеми или частью одного или нескольких из следующего: шарнирной области, доменов CH1, CH2 и CH3. Также включены антигенсвязывающие субпоследовательности любой комбинации вариабельной области(ей) тяжелой или легкой цепей (например, CDR1, CDR2 или CDR3) с шарнирной областью, доменами CH1, CH2 и CH3.
Дополнительные модификации би- специфических слитых полипептидов (FynomAb), включенных в изобретение, являются добавлениями(производными)/вставками. Примеры добавлений могут включать добавление последовательности полипептида, которая представляет собой аминокислотную последовательность, имеющую одну или несколько молекул, которые как правило, не присутствуют в эталонной нативной последовательности (дикого типа), которая ковалентно присоединена к последовательности. Конкретным примером пептидного добавления является добавление, в котором присоединяется вторая гетерологичная последовательность, т.е. гетерологичный функциональный домен (ковалентно или нековалентно связанный), который придает отчетливую или дополнительную функцию биспецифичного слитого полипептида (FynomAb). Таким образом, биспецифичный слитый полипептид (FynomAb) может включать гетерологичный домен, где домен придает определенную функцию, т.е. гетерологичный функциональный домен. Например, Fc-область может быть химерой, которая включает части Fc-области человеческих IgG1 и IgG3.
Гетерологичные функциональные домены, которые могут быть использованы в данном изобретении, не ограничивается аминокислотными остатками, или доменами. Таким образом, гетерологичный функциональный домен может состоять из любого из множества различных типов малых или больших функциональных фрагментов. Такие фрагменты могут включать нуклеиновую кислоту, пептид, углевод, липиды, небольшие органические молекулы/соединения, такие как лекарственное средство (например, лекарственное средство, препятствующее пролиферации клеток), металл (золото, серебро), или радиоактивный изотоп. Таким образом, в другом воплощении, в данном документе предлагается FynomAb, которое детектируемо помечено.
14
35
32
33
3
125
131
Не ограничивающие примеры гетерологичных доменов могут включать маркеры и детектируемые метки. Конкретные примеры меток для очистки и детекции (обнаружения) могут включать ферменты (пероксидазу хрена, уреазу, каталазу, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу, хлорамфеникол-трансферазу); субстраты ферментов; лиганды (например, биотин); рецепторы (авидин); радиоактивные изотопы/радионуклиды (например, C, S, P, P, H, I, I, галлий-67 и 68, скандий-47 индий-111, и радий-223); T7-, полигистидин, His-, myc-, HA- и FLAG-метки; электронно-плотные реагенты; молекулы переноса энергии; парамагнитные метки; флуорофоры (флуоресцеин, родамин, фикоэритрин); хромофоры; хемилюминесцентный агент (имидазол, люциферазы); био-люминесцентные агенты; контрастные агенты (например, гадолиний; марганец; сульфат бария; иодированный или неиодированный агент); ионный агент или неионный агент; магнитные и парамагнитные вещества (например, хелат оксида железа); наночастицы; простетическую группу (например, стрептавидин/биотин и авидин/биотин); флуоресцентный материал (например, умбеллиферон, флуоресцеин, изотиоцианат флуоресцеина, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин); люминесцентный материал (например, люминол); или биолюминесцентный материал (например, люцифераза, люциферин, экворин). Ферменты обычно обнаруживаются по их активности. Например, пероксидазу хрена обычно обнаруживают по ее способности превращать субстрат, такой как 3,3-’,5,5-’-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, который может быть количественно оценен. Лиганды могут связывать другие молекулы, такие как биотин, которые могут связывать авидин или стрептавидин, и IgG, которые могут связываться протеином А.
3
10
18
11
14
13
18
15
32
33
35
35
45
46
47
51
52
59
.57
60
61
62
64
67
67
68
72
76
77
81m
82
85
89
86
90
95
94m
99m
97
103
105
109
111
113
113m
114
125
131
140
141
149
153
157
153
161
166
166
169
169
175
177
186
188
201
203
211
212
225
Дополнительные не ограничивающие примеры детектируемых меток могут включать радиоактивный материал, такой как радиоизотоп, металл или оксид металла. Радиоактивные изотопы включают радионуклиды, испускающие альфа, бета или гамма-излучение, такие, как один или несколько из числа: H, B, F,C, C, N, O, O, P, P, S, Cl,Ti,Sc, Sc, Cr, Fe,Fe,Co, Cu, Cu, Cu, Cu, Cu, Ga, Ga,As Br, Br, Kr, Rb, Sr, Sr, Y, Y, Nb, Tc, Tc, Ru, Ru,Rh, Cd, In, Sn, In, In, I, I, La, Ce, Pm,Gd, Gd, Sm, Tb, Dy, Ho, Er, Yb, Yb, Lu, Re, Re, Tl, Pb, At, Bi или Ac.
Дополнительные неограничивающие примеры детектируемых меток могут включать металл или оксид металла, такого как золото, серебро, медь, бор, марганец, гадолиний, железо, хром, барий, европий, эрбий, празеодим, индий или технеций.
Лекарственное средство, которое может быть использовано в качестве гетерологичного домена, который присоединен к антителу слитого полипептида (FynomAb), может быть цитотоксичным агентом. Термин «цитотоксичный агент», используемый в данном контексте, относится к веществу, которое снижает, угнетает, подавляет, уменьшает, препятствует или блокирует функцию, или рост клеток и/или вещество, которое вызывает разрушение клеток. Цитотоксический агент может быть использован, чтобы убить или ингибировать пролиферацию или репликацию клеток-мишеней.
Примеры цитотоксических агентов могут включать дифтерийный токсин, холерный токсин, рицин и митомицин C. Дополнительные примеры включают Калихеамицин, дуокармицин, PBD, ауристатины и доластатины (пат. США № 5635483 и 5780588); калихеамицин (пат. США № 5712374, 5714586, 5739116, 5767285, 5770701, 5770710, 5773001 и 5877296), гемцитабин, цисплатин, доксорубицин, иринотекан, BCNU, стрептозоцин, винкристин и 5-фторурацил (пат. США № 5770710. См. также, например, пат. США № 4362663; 4371533; 5475092; 5585499; 5846545; и 6333410).
Другие примеры цитостатических агентов могут включать таксаны (например, таксол), и майтансиноиды. Примеры мейтансиноидов, которые ингибируют образование микротрубочек в клетках млекопитающих, могут включать мейтанзинол и аналоги мейтанзинола. Примеры аналогов мейтанзинола включают те, которые имеют модифицированное ароматическое кольцо, и те, которые имеют модификации в других положениях (см., например, Майтанзин и майтанзиноиды, такие как мейтанзинол и C-3 мейтанзиноловые эфиры (пат. США № 4151042). Синтетический мейтансинола и производные и их аналоги (пат. США № 4137230;.. 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4308269; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; и 4371533).
Биспецифичный слитый полипептид FynomAb может иметь добавление или может быть производным. Например, полипептид может включать остаток сахара, фосфатную группу, убиквитин, жирную кислоту или липид, или может быть гликозилирован, фосфорилирован, ацетилирован, амидирован или формилирован. Полипептид может быть дериватизирован защитной/блокирующей группой или любой из числа многочисленных химических модификаций. Модификация полипептида также может быть внутри- или межмолекулярной дисульфидной связью(ями).
2
Линкеры, такие как аминокислотные или пептидомиметические последовательности могут быть вставлены между финомером и/или последовательностью антитела и гетерологичным функциональным доменом таким образом, чтобы два объекта сохраняли, по меньшей мере, частично, различную функцию или активность. В одном воплощении домен финомера присоединяется к тяжелой (Н) цепи или легкой (L) цепи сразу после последней аминокислоты на амино (NH)-конце или карбокси (C)-конце тяжелой (Н) цепи или легкой (L) цепи. Линкеры могут иметь одно или несколько свойств, которые включают гибкую конформацию, неспособность сформировать упорядоченную вторичную структуру или гидрофобный или заряженный характер, которые могли бы активировать или взаимодействовать с любым доменом. Примеры аминокислот, которые обычно встречаются в гибких областях белка, представляют собой Gly, Asn и Ser. Другие близкие к нейтральным аминокислоты, такие как Thr и Ala, также могут быть использованы в линкерной последовательности. Длина последовательности линкера может изменяться без существенного влияния на функцию или активность слитого белка (см., например, пат. США № 6087329). В конкретном аспекте, финомер и тяжелая или легкая цепи антитела соединены пептидной последовательностью, имеющей от 1 до 25 аминокислотных остатков.
N
Примеры линкеров также могут включать химические группы и конъюгирующие агенты, такие как производные сульфосукцинимидила (сульфо-SMCC, сульфо-SMPB), дисукцинимидилсуберат (DSS), дисукцинимидил глютарат (DSG) и дисукцинимидил тартрат (DST). Линкер дополнительно включать линейную углеводородную цепь, такую как C (где атомы N = 1-100 углерода, например, C, CC, CCC, CCCC, CCCCC, CCCCCC, CCCCCCC, CCCCCCCC).
125
Понятно, что финомер, антитело или субпоследовательность могут иметь несколько (например, два или более) изменения, модификации или метки. Например, последовательности тяжелой или легкой цепи антитела могут быть соединены с биотином таким образом, чтобы его можно обнаружить с помощью авидина, а также помечены I так, чтобы он обеспечил обнаруживаемый сигнал. Другие преобразования и возможности очевидны специалистам в данной области техники, и, как предполагается, находятся в пределах объема настоящего изобретения.
H
H
L
Примеры антител и слитых полипептидов (FynomAb) может включать последовательности млекопитающих, человеческие, гуманизированные и приматизированные последовательности. Термин «человеческий» в отношении антитела означает, что аминокислотная последовательность имеет полностью человеческое происхождение. «Человеческое антитело», таким образом, относится к антителу, имеющему аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека, т.е. вариабельные и константные участки тяжелой и легкой цепи, которые специфически связываются с мишенью. «Человеческое IL-6R антитело» или «человеческое анти-IL-6R антитело», следовательно, относится к антителу, которое имеет аминокислотную последовательность иммуноглобулина человека и связывается с IL-6R. То есть, все аминокислоты антитела являются человеческими или могут или существуют в антителе человека. Так, например, антитело, которое не является человеческим, может быть сделано в полной мере человеческим, путем замены нечеловеческих аминокислотных остатков на аминокислотные остатки, которые могут или существуют в антителе человека. Аминокислотные остатки, присутствующие в человеческих антител, карта участков CDR и консенсусные остатки человеческого антитела известны в данной области (см., например, Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed.US Department of Health and Human Services. Public Health Service (1987); и Chothia and Lesk J. Mol. Biol.186:651 (1987)). Консенсусная последовательность человеческого V подгруппы III, на основании обзора 22 известных человеческих последовательностей V III и консенсусная последовательность человеческого V каппа-цепи подгруппы I, на основании обзора 30 известных человеческих каппа I последовательностей, описывается в Padlan Mol.Immunol. 31:169 (1994); и Padlan Mol. Immunol.28:489 (1991)). Поэтому человеческие антитела включают антитела, в которых один или несколько аминокислотных остатков были замещены одной или несколькими аминокислотами, присутствующими в другом антитела человека.
Термин «гуманизированные» при использовании в отношении антитела, означает, что аминокислотная последовательность антитела имеет нечеловеческие аминокислотные остатки (например, мыши, крысы, козы, кролика, не являющегося человеком примата и т.п.) в одном или нескольких гипервариабельных участках (CDR), которые специфически связываются с искомой мишенью (например, IL-6R) в акцепторной молекуле иммуноглобулина человека, и один или несколько аминокислотных остатков человека в каркасной области Fv (FR), которые являются аминокислотными остатками, фланкирующими CDR. Человеческие остатки каркасной области иммуноглобулина могут быть заменены соответствующими нечеловеческими остатками. Таким образом, остатки в каркасных участках человека, могут быть замещены соответствующими остатками из нечеловеческого CDR донорного антитела для изменения, как правило, для улучшения, например, антигенной аффинности или специфичности. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаруживаются ни в человеческом антителе, ни в донорском CDR или каркасных последовательностях. Например, замена каркаса в определенном положении, которое не находится в антителе человека или донорном нечеловеческом антителе, может быть спрогнозирована для улучшения аффинности связывания или специфичности человеческого антитела в этом положении.
Замены в каркасе и CDR антитела, основанные на молекулярном моделировании, известны в данной области, например, путем моделирования взаимодействий остатков CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, важных для связывания антигена и путем сравнения последовательностей для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях (см., например, пат. США № 5585089 и Riechmann et al., Nature 332:. 323 (1988)). Антитела, называемые «приматизированными», находятся в пределах значения «гуманизированные», используемого в данном документе, за исключением того, что аминокислотные остатки акцептора молекулы человеческого иммуноглобулина и каркасной области могут представлять собой любой аминокислотный остаток примата (например, человекообразной обезьяны, гиббона, гориллы, шимпанзе орангутанга, макаки), в дополнение к любому человеческому остатку.
Финомер и субпоследовательности антител могут быть получены с помощью методов генной экспрессии, включая экспрессию всего или части кодирующей последовательности финомера или антитела в клетке-хозяине. IL-6R-связывающие антитела могут быть получены с использованием методов, включающих обычную гибридомную технологию, рекомбинантную технологию и технологию фаговых дисплеев или их комбинации (см. пат. США № 4,902,614, 4,543,439 и 4,411,993; см., также Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn, and Bechtol (eds.), 1980, and Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988). IL-6R-связывающие моноклональные антитела также могут быть получены путем прямого клонирования иммуноглобулиновых последовательностей из животных, в том числе приматов или человека.
Животное, такое как мышь, кролик, крыса, овца, корова или вол, овца, коза, свинья, лошадь, морская свинка и приматы, включая человека, могут быть иммунизированы с помощью IL-6R, с тем, чтобы получить антитела, которое связывается с IL-6R. Такое животное может быть генетически модифицированым не являющимся человеком животным, имеющим локус человеческих генов IgG (например, лямбда или каппа легкой цепи), которое способно экспрессировать антитела человека. Трансгенные животные с одним или несколькими генами иммуноглобулина человека (каппа или лямбда), которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины, описаны, например, в пат. США № 5,939,598. Поэтому такие животные могут быть использованы для получения антител человека. Не ограничивающие примеры животных могут включать трансхромосомных по человеку мышей «KM mice™» (Tomizuka et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 97:722 (2000); and Ishida et al., Cloning Stem Cells 4:91 (2004)), которые могут продуцировать гены человеческих иммуноглобулинов (WO02/43478) и мышей HAC (WO02/092812). Обычные гибридомные технологии с использованием спленоцитов, выделенных из иммунизированных животных, которые отвечают на антиген и которые сливают с миеломными клетками, могут быть использованы для получения моноклональных антител человека. Описаны дополнительные способы получения поликлональных антител человека и моноклональных антител человека (см, например, Kuroiwa et al., Nat. Biotechnol. 20: 889 (2002); WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; пат. США № 5413923. 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771; и 5939598). Обзор технологии получения антител человека представлен в Lonberg and Huszar (Int. Rev. Immunol.13:65 (1995)).
2
Финомер и субпоследовательности антител могут быть также получены путем протеолитического гидролиза. Антитело, например, может быть гидролизовано пепсином или папаином. Фрагменты антитела, полученные путем ферментативного расщепления пепсином, дают 5S-фрагмент, называемый F(аb'). Этот фрагмент может быть дополнительно расщеплен с использованием тиольного восстановителя для получения 3,5S моновалентных Fab'-фрагментов. В ином случае, ферментативное расщепление с помощью пепсина непосредственно дает два фрагмента моновалентных Fab'-фрагментов и фрагмент Fc (см., например, пат. США № 4,036,945 и 4,331,647, и Edelman et al., Methods Enymol. 1:422 (1967)). Также могут быть использованы и другие способы расщепления антител, такие как разделение тяжелых цепей с образованием моновалентных фрагментов легких-тяжелых цепей, дополнительное расщепление фрагментов или другое ферментативное или химическое расщепление. Одноцепочечные Fv, и антитела могут быть получены, как описано пат. США №N 4946778 и 5,258,498; Huston et al., Methods Enzymol.203:46 (1991); Shu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995 (1993); и Skerra et al., Science 240:1038 (1988).
Антитела могут быть гуманизированы с использованием различных методов, известных в данной области, включая, например, прививание CDR (ЕР 239400; W091/09967; пат. США № 5225539;. 5530101; и 5585089), перестройку или изменение поверхности (ЕР 592106 ЕР 519596; Padlan, Molecular Immunol. 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); Roguska. et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 91:969 (1994)), и шаффлинг цепей (U.S. Patent No. 5,565,332). Человеческие консенсусные последовательности (Padlan, Mol.Immunol.31:169 (1994); и Padlan, Mol. Immunol. 28:489 (1991)) могут быть использованы для гуманизации антител (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); и Presta et al., J. Immunol.151:2623 (1993)).
Способы получения химерных антител известны в данной области (например, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J. Immunol. Methods 125:191 (1989); и Пат. США № 5,807,715; 4,816,567; и 4,816,397). Химерные антитела, в которых вариабельный домен из антитела одного вида заменяют вариабельным доменом другого вида, описаны, например, в Munro, Nature 312:597 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604 (1984); Sharon et al., Nature 309:364 (1984); Morrison et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984); Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Capon et al., Nature 337:525 (1989); и Traunecker et al., Nature 339:68 (1989).
Также предлагаются нуклеиновые кислоты, кодирующие финомеры, антитела и слитые полипептиды (FynomAb). В одном воплощении нуклеиновая кислота кодирует последовательность, по меньшей мере, на 60% или более (например, по меньшей мере, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичную любой последовательности финомера, которая связывается с IL-17а, например, на 60% или более идентичную последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, указанный в SEQ ID NO: 1-7.
В другом воплощении нуклеиновая кислота кодирует последовательность, по меньшей мере, на 60% или более (например, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% или 100%) идентичную любой вариабельной области тяжелой или легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 8 или 9. В дополнительном воплощении нуклеиновая кислота кодирует последовательность, по меньшей мере, на 60% или более (например, по меньшей мере, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% или 100%) идентичную любой последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела, которое связывается с IL-6R, такой как последовательности тяжелой или легкой цепи, указанные в SEQ ID NO: 8 или 9, которая слиты или конъюгированы с любой последовательностью финомера, которая связывается с IL-17а, например, последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1-7. В еще одном воплощении нуклеиновая кислота кодирует последовательность, имеющую одну или несколько аминокислотных добавлений, делеций или замен в SEQ ID NO: 1-7, или SEQ ID NO: 8, или 9, или слитый полипептид, содержащий любую из SEQ ID NO: 1-7, слитую с любой из SEQ ID NO: 8 или 9.
Термины «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» и т.п. относятся, по меньшей мере, к двум или более парам оснований рибо- или дезоксирибонуклеиновой кислоты (нуклеотидам), которые связаны через фосфодиэфирную связь или ее эквивалент. Нуклеиновые кислоты включают полинуклеотиды и полинуклеозиды. Нуклеиновые кислоты включают одно-, двух- или трехсоставные, кольцевые или линейные, молекулы. Примеры нуклеиновых кислот включают, без ограничения перечисленным: РНК, ДНК, кДНК, встречающиеся в природе и не встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, например, синтетическую нуклеиновую кислоту.
Нуклеиновые кислоты могут быть различной длины. Длины нуклеиновых кислот, как правило, находятся в диапазоне от около 20 нуклеотидов до 20 тыс. оснований или имеют любое числовое значение или диапазон в пределах или охватывающие такие длины, от 10 нуклеотидов до 10 тыс. оснований, от 1 до 5 тыс. оснований или менее, от 1000 до около 500 нуклеотидов или менее в длину. Нуклеиновые кислоты также могут быть короче, например, от 100 до около 500 нуклеотидов, или примерно от 12 до 25, от 25 до 50, от 50 до 100, от 100 до 250, или около от 250 до 500 нуклеотидов в длину, или иметь любое цифровое значение или диапазон или значение в пределах или охватывающих такие длины. В конкретных аспектах, последовательность нуклеиновой кислоты имеет длину около 10-20, 20-30, 30-50, 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400- 500, 500-1000 или 1000-2000 нуклеотидов, или любое численное значение или диапазон, в пределах или охватывающих такие длины. Более короткие полинуклеотиды обычно называют «олигонуклеотиды» или «зонды», одно- или двухцепочечной ДНК. Тем не менее, не существует верхнего предела длины таких олигонуклеотидов.
Термин «выделенный» при использовании относительно компонентов (например, финомеров, антител, последовательностей тяжелой или легкой цепей, слитые полипептиды (FynomAb), нуклеиновые кислоты, кодирующие это же, и т.д.), означает, что компонент получен вручную человеком или выделен, полностью или, по меньшей мере, частично, из их природной среды in vivo. Как правило, выделенный компонент по существу свободен от одного или нескольких материалов, с которыми они обычно ассоциируются в природе, например, одного или нескольких белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, клеточных мембран. Термин «выделенный» не исключает альтернативные физические формы компонентов, такие как мультимеры/олигомеры, варианты, модификации или дериватизированные формы или формы, экспрессируемые в клетках-хозяевах, полученные человеком вручную. Термин «выделенный» также не исключает композиции или состава, содержащих компонент, которые получены человеком вручную.
«Выделенный» компонент может также быть «очищенным», когда он свободен от большей части или всех материалов, с которыми он обычно связан в природе. Таким образом, выделенный слитый полипептид (FynomAb), который также является, по существу, чистым или очищенным, не включает полипептиды или полинуклеотиды, присутствующие среди миллионов других последовательностей, например, в полипептидной библиотеке или не включает нуклеиновые кислоты в геномной или кДНК-библиотеке. А «очищенный» компонент может быть объединен с одной или несколькими другими молекулами. Таким образом, «очищенный» не исключает комбинации компонентов, таких как комбинации FynomAb (множественные FynomAb) и FynomAb в сочетании с другими активными агентами или лекарственными средствами.
Нуклеиновые кислоты могут быть получены с использованием различных стандартных способов клонирования и химического синтеза. Методы включают, без ограничения перечисленным, амплификацию нуклеиновых кислот, например, полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с помощью геномной ДНК или кДНК, мишеней с использованием праймеров (например, смеси вырожденных праймеров), способных отжигаться на последовательности, кодирующей антитело. Нуклеиновые кислоты могут быть также получены путем химического синтеза (например, твердофазного синтеза с фосфорамидитами) или транскрипцией из гена. Последовательности, полученные далее, могут быть транслированы in vitro, или клонированы в плазмиду и размножены, а затем экспрессированы в клетке (например, клетке-хозяине, такой как эукариотическая клетка или клетка млекопитающих, дрожжей или бактерий, в организме животного или в растении).
Нуклеиновые кислоты могут быть введены в нуклеотидные конструкции, в которых экспрессия нуклеиновой кислоты находится под влиянием или регулируется «элементом контроля экспрессии». «Элемент контроля экспрессии» относится к элементу нуклеиновой кислоты, который регулирует или делает возможной экспрессию последовательности нуклеиновой кислоты, с которой он функционально связан. Элементы, контролирующие экспрессию, включают, в зависимости от обстоятельств, промоторы, энхансеры, терминаторы транскрипции, генные сайленсеры, старт-кодон (например, ATG) перед белок-кодирующим геном, и т.п.
Элементы контроля экспрессии, функционально связанные с последовательностью нуклеиновой кислоты, контролируют транскрипцию и, в случае необходимости, трансляцию последовательности нуклеиновой кислоты. Элементы контроля экспрессии включают элементы, которые активируют транскрипцию конститутивно, которые являются индуцируемыми (т.е. требуется сигнал для включения транскрипции или дерепрессируемыми (т.е. требуют внешнего сигнала для выключения транскрипции; когда сигнал отсутствует, транскрипция активируется или «дерепрессируется»), или специфическими по типу клеток или тканей (т.е. тканеспецифические элементы контроля).
Нуклеиновая кислота может быть вставлена в плазмиду для распространения в клетку-хозяина, и для последующих генетических манипуляций. Плазмида представляет собой нуклеиновую кислоту, которая может быть размножена в клетке-хозяине; плазмиды могут содержать элементы, контролирующие экспрессию, чтобы управлять экспрессией нуклеиновой кислоты, кодирующей финомер, антитело (тяжелые или легкие цепи) или слитый полипептид (FynomAb) в клетке-хозяине. Вектор, используемый в данном документе в качестве синонима плазмиды, также может включать элемент контроля экспрессии для экспрессии в клетке-хозяине (например, экспрессирующий вектор). Плазмиды и векторы обычно содержат, по меньшей мере, точку начала репликации для размножения в клетке и промотор. Плазмиды и векторы, следовательно, полезны для генетических манипуляций и экспрессии финомера, антитела (тяжелой или легкой цепи) или слитого полипептида (FynomAb).
Нуклеиновые кислоты, кодирующие финомер, антитело (тяжелую или легкую цепь) или слитый полипептид (FynomAb), могут быть получены синтетическим путем или с использованием рекомбинантных способов, или выделенные из клеток, таких как гибридомы. Выделенные нуклеиновые кислоты могут быть вставлены в соответствующий экспрессирующий вектор, и введены в подходящие клетки-хозяева (например, СНО, растительные клетки и другие клетки), которые могут культивироваться для продуцирования финомера, антитела (тяжелой или легкой цепи) или слитого полипептида (FynomAb).
В соответствии с настоящим изобретением, предусмотрены клетки-хозяева, которые экспрессируют или трансформированы нуклеиновой кислотой, которая кодирует финомер, антитело (тяжелые или легкие цепи) или слитый полипептид (FynomAb) по настоящему изобретению. Клетки-хозяева и их потомство могут быть стабильно или транзиторно трансфицированы для экспрессии финомера, антитела (тяжелой или легкой цепи) или слитого полипептида (FynomAb).
Клетки-хозяева могут включать, без ограничения перечисленным, прокариотические и эукариотические клетки, такие как клетки бактерий, грибов (дрожжи), растений, насекомых и животных (например, млекопитающих, в том числе приматов и человека). Например, бактерии, трансформированные рекомбинантной нуклеиновой кислотой бактериофага, плазмидной нуклеиновой кислотой или космидными нуклеотидными экспрессирующими векторами; дрожжи, трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессирующими векторами; растительные системы клеток, инфицированные экспрессирующими векторами на основе рекомбинантных вирусов (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV; вируса табачной мозаики, TMV) или трансформированные экспрессирующими векторами на основе рекомбинантных плазмид (например, Ti-плазмиды); системы клеток насекомых, инфицированные экспрессирующими векторами на основе рекомбинантных вирусов (например, бакуловируса); и системы клеток животных, инфицированные рекомбинантными экспрессирующими векторами на основе вируса (например, ретровирусов, аденовирусов, вируса осповакцины), или системы трансформированных животных клеток, спроектированные для стабильной экспрессии.
Термин «трансформированный» или «трансфецированный» при использовании относительно клетки (например, клетки-хозяина) или организма, означает генетическое изменение в клетке после введения экзогенной молекулы, например, белка или нуклеиновой кислоты (например, трансгена) в клетку. Таким образом, «трансфецированная» или «трансформированная» клетка представляет собой клетку, в которую, или потомство которой, экзогенная молекула была введена вручную человеком, например, с помощью методов рекомбинантных ДНК.
Клетка(и) может быть размножена так, что продуцировался нужный полипептид. Потомство трансфецированной или трансформированной клетки может быть не идентичным родительской клетке, так как возможны мутации, которые происходят во время репликации.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей биспецифичный слитый полипептид по изобретению и фармацевтически или физиологически приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. Используемый в данном описании термин «фармацевтически приемлемый» и «физиологически приемлемый», когда речь идет о носителе, разбавителе или наполнителе, может быть растворителем (водным или неводным), детергентом, раствором, эмульсией, дисперсионными средами, покрытием или изотоническим и стимулирующим поглощение или замедляющим агентом, которые совместимы с фармацевтическим введением и с другими компонентами в композиции. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть представлена в виде таблетки (с покрытием или без), капсулы (твердой или мягкой), микрогранулы, эмульсии, порошка, гранулы, кристалла, суспензии, сиропа или эликсира.
Фармацевтическая композиция может быть составлена таким образом, что она была совместима с конкретным способом введения или применения. Фармацевтическая композиция для парентерального, внутрикожного или подкожного введения, может содержать стерильный разбавитель, такой как вода, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители. Композиция может дополнительно содержать один или несколько консервантов, для предотвращения роста микроорганизмов (например, антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза).
Фармацевтическая композиция для инъекций может быть в форме стерильного водного раствора (водорастворимой) или препаратом для немедленного приготовления для стерильного инъекционного раствора или дисперсии, состоящей из дисперсной среды и стерильных порошков. Примеры подходящих носителей для внутривенного введения могут включать физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF, Парсиппани, Нью-Джерси) и фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль) или их подходящие смеси. Текучесть может поддерживаться, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, или с использованием поверхностно-активных веществ. Примеры антибактериальные и противогрибковых агентов могут включать парабены, хлорбутанол, фенол, аскорбиновую кислоту и тимеросал. Агенты, которые замедляют абсорбцию, например, моностеарат алюминия и желатин, могут увеличивать всасывание инъекционных композиций. Полисорбат 20 или полисорбат 80, могут быть добавлены в композицию, например, до 1%. Другие неограничивающие примеры добавок могут включать гистидин HCl, дегидрат α,α-трегалозы.
Дополнительные фармацевтические составы и системы доставки известны специалистам в данной области и применимы к способам по настоящему изобретению (см., например, Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993); and Poznansky, et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315).
Настоящее изобретение обеспечивает способ и применение биспецифического слитого полипептида для модуляции или лечения ответа, расстройства или заболевания, связанного с функцией или активностью IL-17а и/или IL-6R. Примеры ответных реакций, расстройств и заболеваний могут включать, без ограничения перечисленным, иммунные реакции, расстройства и заболевания, воспалительные реакции, расстройства и заболевания, а также воспаление. Примеры ответов, расстройств и заболеваний, также включают, без ограничения перечисленным, аутоиммунные ответы, расстройства и заболевания. Примеры ответов могут дополнительно включать ответы, расстройства и заболевания Т-клеток и/или В-клеток.
В одном воплощении предлагается способ или применение, в котором биспецифичный слитый полипептид или фармацевтическая композиция, описанные в настоящем документе, вводят объекту, нуждающемуся в лечении иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, или воспаления. В другом воплощении предлагается способ или применение для лечения аутоиммунного расстройства или заболевания. В дополнительном воплощении предлагается способ или применение для модуляции ответа Т-клеток и/или В-клеток, или для лечения расстройства и заболевания, связанного с ответом Т-клеток и/или В-клеток. В еще одном воплощении предлагается способ или применение для модуляции функции или активности IL-17а и/или IL-6R.
Примеры ответных реакций, расстройств и заболеваний, которые могут модулироваться или обрабатываться в соответствии с изобретением, могут включать, без ограничения перечисленным, острые и хронические нежелательные или аберрантные иммунные ответы, расстройства, или заболевания, воспалительные ответы, расстройства или заболевания, или воспаление. Примеры ответных реакций, расстройств и заболеваний, могут также включать, без ограничения перечисленным, острые и хронические аутоиммунные ответы, расстройства и заболевания. Ответные реакции, расстройства и заболевания могут быть опосредованы антителом или клеткой, или комбинацией антитела и клетки. Кроме того, Ответные реакции, расстройства и заболевания могут быть опосредованы функцией или активностью IL-17а и/или IL-6R. Кроме того, ответные реакции, расстройства и заболевания могут поддаваться лечению путем модуляции функции или активности IL-17а и/или IL-6R.
В одном воплощении предлагается способ или применение биспецифичного слитого полипептида для снижения, уменьшения, ингибирования, супрессии, ограничения или контроля острого или хронического, нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания или воспаления у объекта. В одном воплощении предлагается способ или применение для снижения, уменьшения, ингибирования, супрессии, ограничения или контроля острого или хронического аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания у объекта. В еще одном воплощении, предлагается способ или применение для снижения, уменьшения, ингибирования, супрессии, ограничения или контроля острого или хронического опосредованного антителом и/или клеточноопосредованного ответа, расстройства или заболевания у объекта. В еще одном воплощении предлагается способ или применение для снижения, уменьшения, ингибирования, супрессии, ограничения или контроля острого или хронического ответа, расстройства или заболевания, которые, опосредованы функцией или активностью IL-17а и/или IL-6R. В еще одном воплощении предлагается способ или применение для снижения, уменьшения, ингибирования, супрессии, ограничения или контроля острого или хронического ответа, расстройства или заболевания, которое поддается лечению путем модуляции функции или активности IL-17а и/или IL-6R.
Термин «иммунное расстройство» и «иммунное заболевание» означает иммунную функцию или активность, которые характеризуются различными физиологическими симптомами или аномалиями, в зависимости от расстройства или заболевания. «Нежелательный иммунный ответ» или «аберрантный иммунный ответ», при использовании в данном документе, относится к любому иммунному ответу, активности или функции, которые являются активностью или функцией, которые больше или меньше, чем хотелось бы или больше или меньше физиологически нормальной реакции. Примеры включают острые или хронические иммунные ответы, активности или функции. «Нежелательный иммунный ответ», как правило, характеризуется как нежелательные или аберрантные, повышенные или неадекватные ответ, активность или функция иммунной системы. Тем не менее, нежелательный иммунный ответ, функция или активность, могут быть, например, нормальной реакцией, функцией или активностью. Таким образом, нормальные иммунные реакции, если они являются нежелательными, даже если они не считаются аберрантными, включены в значении этих терминов. Нежелательные иммунный ответ, функция или активность, также может быть ненормальными ответом, функцией или активностью. Аномальный (аберрантный) иммунный ответ, функция или активность отклоняются от нормы.
Один неограничивающий пример нежелательной или аномальной иммунной реакции, имеет место тогда, когда иммунный ответ является гиперреспонсивным, например, в случае аутоиммунного расстройства или заболевания. Другой неограничивающий пример нежелательного или аномального иммунного ответа имеет место тогда, когда иммунный ответ приводит к острому или хроническому воспалительному ответу или воспалению в любом органе или ткани, например, в скелетных суставах (ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит), легких или дыхательных путях (аллергия), или кишечнике или желудочно-кишечном тракте (болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника (IBD) или неспецифический язвенный колит).
Нежелательные или аберрантные иммунные ответы, воспалительные ответы, воспаление характеризуются различными физиологическими неблагоприятными симптомами или осложнениями, которые могут быть гуморальными, клеточноопосредованными или их комбинацией. Ответы, расстройства и заболевания, которые можно лечить в соответствии с изобретением, включают, без ограничения перечисленным, те, которые прямо или косвенно приводят к или вызывают повреждение клетки или ткани/органа у объекта. Во всем организме, на региональном или местном уровне, иммунный ответ, воспалительный ответ, или воспаление может характеризоваться отеком, болью, головной болью, лихорадкой, тошнотой, скелетной болью в суставах, отеками, скованностью или отсутствием подвижности, сыпью, покраснением или другими изменениями окраски. На клеточном уровне, иммунный ответ, воспалительный ответ, или воспаление могут быть охарактеризованы одним или несколькими из числа активации/или дифференцировки Т-клеток, клеточной инфильтрации в область макрофагами, моноцитами и т.д., выработкой антител, цитокинов, лимфокинов, хемокинов, интерферонов и интерлейкинов, клеточным ростом и факторами созревания (например, факторами пролиферации и дифференцировки), накоплением или миграцией клеток и повреждением клеток, тканей или органов. Таким образом, способы и применения согласно изобретению включают обработку и мелиоративное воздействие на любые такие физиологические симптомы или клеточные или биологические ответы, характерные для иммунных ответов, воспалительного ответа или воспаления.
Аутоиммунные ответы, нарушения и заболевания, как правило, характеризуются нежелательными или аберрантными ответом, активностью или функцией иммунной системы, которые характеризуются повышенным или нежелательным гуморальным или клеточным иммунным ответом или памятью, или сниженной или недостаточной толерантностью к собственным антигенам. Аутоиммунные ответы, расстройства и заболевания, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают, без ограничения перечисленным, ответы, расстройства и заболевания, которые вызывают повреждение клеток или ткани/органа в объекте.
В одном воплощении предлагается способ или применение для снижения, уменьшения, ингибирования, супрессии, ограничения или контроля нежелательных или аномальных иммунного ответа, иммунного расстройства, воспалительного ответа или воспаления у объекта. В другом воплощении предлагается способ или применение для снижения, уменьшения, ингибирования, супрессии, ограничения или контроля аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания у объекта. В еще одном воплощении предлагается способ или применение для снижения, уменьшения, ингибирования, супрессии, ограничения или контроля неблагоприятного симптома нежелательной или аберрантной иммунного ответа, иммунного расстройства, воспалительного ответа, или воспаления, или неблагоприятного симптома аутоиммунного ответа, расстройства или болезни.
В одном из аспектов способ или применение в соответствии с настоящим изобретением, может привести к снижению возникновения, частоты, тяжести, прогрессии или длительности симптомов состояния (например, нежелательного или аберрантного иммунного ответа, иммунного расстройства, воспалительного ответа, или воспаления). Например, способ или применение по настоящему изобретению может защитить объект от прогрессии или уменьшить, снизить, ингибировать, подавить, ограничить или контролировать, тяжесть, частоту, длительность или вероятность неблагоприятного симптома нежелательного или аберрантного иммунного ответа, иммунного расстройства, воспалительного ответа, или воспаления, или аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания.
Примеры неблагоприятных симптомов нежелательного или аномального иммунного ответа, иммунного расстройства, воспалительного ответа, или воспаления, или неблагоприятных симптомов аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания могут включать отек, боль, сыпь, изменение цвета, головную боль, лихорадку, тошноту, диарею, вздутие, вялость, тугоподвижность скелетных суставов или уменьшение подвижность, трудности с дыханием, снижение подвижности мышц или конечностей, паралич, сенсорные нарушения, например, зрения или повреждение ткани или клеток. Неблагоприятный симптом может возникнуть, в определенной ткани или органе или области или участке тела, таком как в кожа, эпидермальная или слизистая ткань, пищеварительная система, желудочно-кишечный, кишечник, мочеполовые пути, поджелудочная железа, тимус, легкие, печень, почки, мышцы, центральные или периферические нервы, селезенка, кожа, скелетный сустав (например, коленные, голеностопные, бедренные, плечевые суставы, суставы запястья, пальцев, ног, или локтей), кровь или лимфатический сосуд, или сердечно-легочная ткань или орган. Дополнительные примеры неблагоприятных симптомов аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания могут включать выработку, выживание, пролиферацию, активацию или дифференцировку Т-клеток, и/или выработку аутоантител, или провоспалительных цитокинов или хемокинов (например, IL-17а и IL-6).
Не ограничивающие примеры аберрантных или нежелательных иммунных ответов, расстройств и заболеваний, могут включать воспалительные ответы, расстройства и заболевания, воспалительные заболевания, аутоиммунные ответы, расстройства и заболевания, поддающиеся лечению в соответствии с настоящим изобретением, которые включают: полимиозит, васкулит, гигантоклеточный артериит, артериит Такуюсу, рецидивирующий, полихондрит, приобретенную гемофилию А, болезнь Стилла, болезнь Стилла, приобретенную во взрослом возрасте, амилоидный амилоидоз, ревматическую полимиалгию, спондилоартрит, легочную артериальную гипертензию, реакция «трансплантат против хозяина», аутоиммунный миокардит, контактную гиперчувствительность (контактный дерматит), желудочно-пищеводный рефлюкс, эритродермию, болезнь Бехчета, боковой амиотрофический склероз, трансплантацию, оптиконевромиелит, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, злокачественный ревматоидный артрит, фармакорезистентный ревматоидный артрит, оптиконевромиелит, болезнь Кавасаки, полиартрит или системный ювенильный идиопатический артрит, псориаз, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), болезнь Кастлмана, астму, аллергическую астму, аллергический энцефаломиелит, артрит, хронический прогрессирующий артрит, реактивный артрит, псориатический артрит, энтеропатический артрит, деформирующий артрит, ревматизм, спондилоартропатию, анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера, гиперчувствительность (включая как гиперчувствительность дыхательных путей, так и кожную гиперчувствительность), аллергию, системную красную волчанку (СКВ), кожную красную волчанку, лепрозную узелковую эритему, синдром Шегрена, воспалительные заболевания мышц, полихондрит, гранулематоз Вегенера, дерматомиозит, синдром Стивенса-Джонсона, хронический активный гепатит, миастению, идиопатическую спру, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника, эндокринной офтальмопатии, склеродермия, болезнь Грейвса, саркоидоз, множественный склероз, первичный билиарный цирроз печени, вагинит, проктит, инсулин-зависимый сахарный диабет, инсулин-резистентный сахарный диабет, ювенильный диабет (сахарный диабет типа I), аутоиммунные гематологические расстройства, гемолитическую анемию, апластическую анемию, анемию эритроцитов, идиопатическую тромбоцитопению (ИТП), аутоиммунный увеит, увеит (передний и задний), сухой кератоконъюнктивит, весенний кератоконъюнктивит, интерстициальный фиброз легкого, гломерулонефрит (с и без нефротического синдрома), идиопатический нефротический синдром или нефропатию минимальных изменений, воспалительное заболевание кожи, воспаление роговой оболочки, миозит, расшатывание костных имплантатов, нарушение обмена веществ, атеросклероз, дислипидемию, потерю костной ткани, остеоартрит, остеопороз, заболевания периодонта обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей, бронхит, пневмокониоз, эмфизему легких, острые и сверхострые воспалительные реакции, острые инфекции, септический шок, эндотоксический шок, синдром расстройства дыхания у взрослых, менингит, пневмонию, кахексию синдром изнурения, инсульт, герпетический стромальный кератит, заболевание сухого глаза, ирит, конъюнктивит, кератоконъюнктивит, синдром Гийена-Барре, синдром скованного человека, тиреоидит Хашимото, аутоиммунный тиреоидит, энцефаломиелит, острую ревматическую лихорадку, симпатическую офтальмию, синдром Гудпасчера, системный некротизирующий васкулит, антифосфолипидный синдром, болезнь Аддисона, обыкновенную пузырчатку, эксфолиативную пузырчатку, герпетиформный дерматит, атопический дерматит, экзематозные дерматиты, афтозную язву, красный плоский лишай, аутоиммунную алопецию, Витилиго, аутоиммунную гемолитическую анемию, тромбопеническую идиопатическую кровоточивость, пернициозную анемию, нейросенсорную потерю слуха, идиопатическую двустороннюю прогрессирующую нейросенсорную потерю слуха, аутоиммунный плюригландулярный синдром типа I или типа II, иммунное бесплодие и иммуно-обусловленное бесплодие.
Термин «контакт» означает прямое или косвенное взаимодействие между двумя или более объектами (например, между слитым полипептидом (FynomAb) и мишенью, такой как IL-17а и/или IL-6R). Конкретным примером прямого взаимодействия является связывание. Контакт, при использовании в данном документе, может быть взаимодействием в растворе, в твердой фазе, in vitro, ex vivo в клетке или in vivo. Контакт in vivo может упоминаться как введение, вводить, доставлять или доставка объекту или пациенту.
В способе или применении по настоящему изобретению слитый полипептид или композиция, указанные в данном документе, могут быть введены до, по существу, одновременно с, или после наступления нежелательного или аберрантного иммунного ответа, иммунных расстройств, воспалительного ответа, или воспаления, или аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания, или одного или нескольких неблагоприятных симптомов, расстройств, болезней, патологий, заболеваний или осложнений, вызванных или связанных с вышесказанным. Таким образом, способ или применение по настоящему изобретению может быть осуществлено на практике до (т.е. профилактика), одновременно с или после фактов начала ответной реакции, расстройства или заболевания, или одного или нескольких неблагоприятных симптомов, расстройств, болезней, патологий, заболеваний, или осложнений, вызванных или связанных с нежелательным или аномальным иммунным ответом, иммунным расстройством, воспалительным ответом, воспалением или аутоиммунным ответом, расстройством или заболеванием. Введение слитого полипептида или композиции, как описано в данном документе, перед, одновременно или сразу же после развития неблагоприятного симптома может снизить, уменьшить, ингибировать, подавлять, ограничить или контролировать возникновение, частоту, тяжесть, прогресс или длительность одного или нескольких неблагоприятных симптомов, расстройств, болезней, патологий, заболеваний или осложнений, вызванных или связанных с нежелательным или аномальным иммунным ответом, иммунным расстройством, воспалительным ответом, воспалением или аутоиммунным ответом, расстройством или заболеванием.
В соответствии со способом или применением настоящего изобретения, биспецифичный слитый полипептид по настоящему изобретению может быть приготовлен и/или введен в комбинации со вторым агентом, таким как иммуносупрессивный, противовоспалительный, или паллиативный агент. Слитый полипептид по настоящему изобретению может быть введен до, по существу, одновременно с или после введения второго агента, такого как иммуносупрессивный, противовоспалительный, или паллиативный агент. Слитый полипептид по настоящему изобретению могут быть приготовлен в сочетании со вторым агентом, таким как иммуносупрессивный, противовоспалительный, или паллиативный агент.
Не ограничивающие примеры вторых агентов могут включать противовоспалительные агенты, такие как стероидные и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) и противовоспалительные биопрепараты, такие как антитела, которые ограничивают или контролируют воспалительные реакции или симптомы. Вторые агенты и лекарственные средства включают иммуносупрессивные кортикостероиды (агонисты стероидных рецепторов), такие как будесонид, преднизолон, флунизолид; противовоспалительные агенты, такие как флунизолид гидрофторалкан, эстроген, прогестерон, дексаметазон и лотепреднол; бета-агонисты (например, короткие или длительного действия), такие как бамбутерол, формотерол, сальметерол, сальбутамол; антихолинергетики, такие как бромид ипратропия, бромид окситропия, кромолин и агенты-блокаторы кальциевых каналов; антигистаминные препараты, такие как терфенадин, астемизол, гидроксизин, хлорфенирамин, трипеленнамин, цетиризин, дезлоратадин, мизоластин, фексофенадина, олопатадин гидрохлорид, норастемизол, левоцетиризин, левокабастин, азеластин, эбастин и лоратадин; антилейкотриены, (например, анти-цистеиниловые лейкотриены (CysLTs)), такие как оксатомид, монтелукаст, зафирлукаст и зилейтон; ингибиторы фосфодиэстеразы (например, PDE4 подтипа), такие как ибудиласт, циломиласт, BAY 19-8004, теофиллин (например, с замедленным высвобождением) и другие производные ксантина (например, доксофиллин); антагонисты тромбоксана, такие как сератодаст, озагрел гидрохлорид и раматробан; антагонисты простагландина, такие как СОХ-1 и ингибиторы COX-2 (например, целекоксиб и рофекоксиб), аспирин; и вещества, открывающие калиевые каналы. Дополнительные не ограничивающие примеры классов других агентов и лекарственных средств включают противовоспалительные агенты, которые являются иммуномодулирующими терапиями, такими как провоспалительные антагонисты цитокинов, такие как антагонисты TNFα (например, этанерцепт, также известный как Энбрел™); антагонисты иммунных клеток, такие как ритуксимаб, агент, истощающий В-клетки и абатацепт, блокатор костимуляции Т-клеток, которые использовались для лечения ревматоидного артрита, и противовоспалительные антитела, которые связывают цитокины, такие как анти-IgE (например, rhuMAb- E25 Омализумаб), и анти-TNF-альфа, IIFNγ, IL-1, IL-2, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13, IL-16, а также факторы роста, такие как гранулоцитарный/макрофагальный колониестимулирующий фактор.
Как описано в данном документе, способ или применение по настоящему изобретению с использованием биспецифичного слитого полипептида может обеспечивать обнаруживаемый или измеримый терапевтический эффект или улучшение у объекта.
Терапевтические польза или улучшение могут быть любой измеримой или детектируемой, объективной или субъективной, транзиторной, временной или длительной пользой для объекта или улучшения ответа, расстройства или заболевания, или одного или нескольких неблагоприятных симптомов, расстройств, болезней, патологий, заболеваний или осложнений, вызванных или связанных с нежелательным или аномальным ответом, расстройством или заболеванием. Терапевтические польза и улучшения могут включать, без ограничения перечисленным, уменьшение, снижение, ингибирование, супрессирование, ограничение или контроль возникновения, частоты, тяжести, прогрессии или продолжительности неблагоприятного симптома нежелательных или аберрантных ответа, расстройства или заболевания. Терапевтические польза и улучшение могут также включать, без ограничения перечисленным, уменьшение, снижение, ингибирование, супрессирование, ограничение или контроль количества или активности воспаления и воспалительных ответов, таких как Т-клетки, В-клетки, аутоантитела, инфильтрация или мобилизация иммунные клеток, провоспалительных цитокинов, лимфокинов или хемокинов.
В соответствии с настоящим изобретением объекту вводят эффективное или достаточное количество биспецифичного слитого полипептида. Термин «эффективное количество» или «достаточное количество» относится к количеству, которое обеспечивает, в одной или нескольких дозах, по отдельности или в комбинации с одним или несколькими другими компонентами (терапевтическими агентами, такими как лекарственное средство), обработками, протоколами или агентами терапевтических схем, детектируемый ответ любой длительности по времени (долгосрочный или краткосрочный), ожидаемый или искомый результат или пользу у объекта любой измеряемой или детектируемой степени или в течение любого периода времени (например, в течение минут, часов, дней, месяцев, годов, или времени лечения).
Термин «эффективное количество» или «достаточное количество» для лечения (например, для смягчения или для обеспечения терапевтического эффекта или улучшения), как правило, относится к количеству, которое эффективно для обеспечения ответа, расстройства или заболевания, одного, нескольких или всех неблагоприятных симптомов, последствий или осложнений ответа, расстройства или заболевания, одного, или нескольких неблагоприятных симптомов, расстройств, болезней, патологий, заболеваний или осложнений, например, тех, которые вызваны или связаны с нежелательным или нежелательным или аберрантным иммунным ответом, расстройством или заболеванием, воспалительным ответом, расстройством или заболеванием, воспалением, аутоиммунным ответом, расстройством или заболеванием, в измеримой степени, хотя уменьшение, снижение, ингибирование, супрессия, ограничение или контроль прогресса или усугубления ответа, расстройства или заболевания клетки, ткани или органа, или их неблагоприятных симптомов, является удовлетворительным результатом.
Эффективное количество или достаточное количество может быть, но не обязательно должно, предусмотрено в одном введении, и может потребовать многократного введения, и может быть, но не должно, вводиться отдельно или в комбинации с другой композицией (например, агентом), обработкой, протоколом или терапевтическим режимом. Например, количество может быть увеличено пропорционально, в соответствии с потребностями объекта, типа, состояния и тяжести ответа, расстройства или подвергаемого лечению заболевания или побочных эффектов (если таковые имеются) лечения. Кроме того, эффективное количество или достаточное количество не должно быть эффективным или достаточным, если дано в одной или нескольких дозах без второй композиции (например, другого лекарственного средства или агента), терапии, протокола или терапевтического режима, поскольку дополнительные дозы, количества или длительности выше, и за пределами таких доз, или дополнительные композиции (например, лекарственные средства или агенты, обработки, протоколы или терапевтические режимы) могут быть включены, если считаются эффективными или достаточными для данного объекта. Количества, которые считаются эффективными, также включают количества, которые приводят к снижению применения другой терапии, терапевтического режима или протокола.
Для терапии типично, когда некоторые объекты могут демонстрировать больший ответ, или меньший ответ или отсутствие ответа на данный тип терапии. Поэтому эффективное количество или достаточное количество не обязательно должно быть эффективным ни в каждом подвергнутом профилактической или терапевтической обработке объекте, ни в большинстве подвергнутых терапии объектов в данной группе или популяции. Эффективное количество или достаточное количество означает эффективность или достаточность в конкретном объекте, а не в группе или популяции в целом. Соответственно, подходящие количества будут зависеть от состояния пациента или животного, искомого терапевтического эффекта, а также индивидуального объекта (например, биологическая доступность в объекте, пола или возраста).
Термин «улучшающий» относится к детектируемому или измеримому улучшению состояния объекта или лежащего в основе клеточного ответа. Детектируемое или измеримое улучшение включает субъективное или объективное уменьшение, снижение, ингибирование, подавление, ограничение или контроль возникновения, частоты, тяжести, прогрессии, или продолжительности ответа, расстройства или заболевания, например, нежелательного или нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунных ответа, расстройства или заболевания, или одного или нескольких неблагоприятные симптомов, расстройств, болезней, патологий, заболеваний или осложнений, вызванных или связанных с ответом, расстройством или заболеванием, таким как нежелательный или аберрантный иммунный ответ, расстройство или заболевание, воспалительный ответ, расстройство или заболевание, воспаление, аутоиммунный ответ, расстройство или заболевание, или реверсирование ответа, расстройства или заболевания, таких как нежелательный или аберрантный иммунный ответ, расстройство или заболевание, воспалительный ответ, расстройство или заболевание, воспаление, аутоиммунный ответ, расстройство или заболевание. Такие улучшения могут также происходить на клеточном уровне.
Таким образом, успешный исход лечения может привести к «терапевтическому эффекту» или «пользе» посредством снижения, уменьшения, ингибирования, супрессии, ограничения, контроля или предотвращения возникновения, частоты, тяжести прогрессии, или продолжительности нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания, или одного или нескольких нежелательных симптомов или лежащих в основе причин или последствий нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания у объекта. Поэтому способы лечения, влияющие на одну или несколько первопричин ответа, расстройства или заболевания или неблагоприятного симптома, считаются благоприятными. Снижение или уменьшение усугубления, например, стабилизация нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания, также является успешным исходом лечения.
Поэтому терапевтические польза или улучшение не должны быть полным устранением нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания, или любого, большинства или всех неблагоприятных симптомов, осложнений последствий или лежащих в основе причин, связанных с нежелательным или аберрантным иммунным ответом, расстройством или заболеванием, воспалительным ответом, расстройством или заболеванием, воспалением, аутоиммунным ответом, расстройством или заболеванием. Таким образом, удовлетворительная конечная точка может быть достигнута, при наличии постепенного улучшения у объекта ответа, расстройства или заболевания, или частичного уменьшения, снижения, ингибирования, супрессии, ограничения, контроля или предотвращения распространения, частоты, тяжести, прогрессии, или продолжительности, или ингибирования или реверсии ответа, расстройства или заболевания (например, стабилизации одного или нескольких симптомов или осложнений), таких как нежелательный или аберрантный иммунный ответ, расстройство или заболевание, воспалительный ответ, расстройство или заболевание, воспаление, аутоиммунный ответ, расстройство или заболевание, или одного или нескольких неблагоприятных симптомов, расстройств, болезней, патологий, заболеваний или осложнений, вызванных или связанных с нежелательным или аберрантным иммунным ответом, расстройством или заболеванием, воспалительным ответом, расстройством или заболеванием, воспалением, аутоиммунным ответом, расстройством или заболеванием, в течение короткого или длительного периода времени (часы, дни, недели или месяцы).
Эффективность способа или применения, таких как обработка, которая обеспечивает потенциальный терапевтический эффект или улучшение ответа, расстройства или заболевания, таких как нежелательный или аберрантный иммунный ответ, расстройство или заболевание, воспалительный ответ, расстройство или заболевание, воспаление, аутоиммунный ответ, расстройство или заболевание, могут быть установлены с помощью различных способов. Такие способы включают, например, балльные оценки отека, боли, сыпи, головной боли, лихорадки, тошноты, поноса, вздутия, вялости, тугоподвижности скелетных суставов, отсутствие подвижности, сыпи или повреждения тканей или клеток. Измерение активации и/или дифференцировки Т- или В-клеток, клеточной инфильтрации в область, накопления клеток или миграции в область, выработки антител, цитокинов, лимфокинов, хемокинов, интерферонов и интерлейкинов, факторов роста и созревания клеток, проводится с использованием различных иммунологических анализов, таких как, например, ELISA. Определение степени повреждения клеток, тканей или органа может быть установлено путем КТ-сканирования, МРТ, УЗИ, контрастной визуализации, молекулярной или молекулярной ультразвуковой контрастной визуализации. Для скелетных суставов воспаление может быть оценено с помощью самооценки пациента, подсчета болезненных и опухших суставов, скорости оседания эритроцитов (СОЭ) или по С-реактивному белку (CRP). Для желудочно-кишечного тракта, воспаление может быть оценено, например, с помощью эндоскопии (колоноскопии, гастроскопии, ERCP). Воспаление центральной нервной системы (ЦНС) отражают, например, клетки и цитокины в спинномозговой пункции.
Термин «объект» относится к животному, обычно животному-млекопитающему, такому как человек, не являющийся человеком примат (например, человекообразная обезьяна, гиббон, шимпанзе, орангутанг или макака), животное-компаньон (например, собака и кошка), сельскохозяйственное животное (например, лошадь, корова, коза, овца или свинья) или экспериментальное животное (например, мышь, крыса, кролик или морская свинка). Примеры объектов могут включать животные модели заболеваний, например, животные модели нежелательного или аномального иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания (например, мыши CIA, BXSB, EAE и SCID), для анализа in vivo.
Примеры объектов, подходящих для обработки, могут включать те, которые имеют нежелательный или аберрантный иммунный ответ, расстройство или заболевание, воспалительный ответ, расстройство или заболевание, воспаление, аутоиммунный ответ, расстройство или заболевания, те, которые проходят лечение из-за нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания, а также те, которые подверглись лечению или терапии из-за нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания, в том числе объекты, у которых нежелательный или аберрантный иммунный ответ, расстройство или заболевание, воспалительный ответ, расстройство или заболевание, воспаление, аутоиммунный ответ, расстройство или заболевание, находится в стадии ремиссии.
Примеры объектов могут включать те, у которых имеется или есть риск развития любого заболевания из группы, включающей: полимиозит, васкулит, гигантоклеточный артериит, артериит Такуюсу, рецидивирующий, полихондрит, приобретенную гемофилию А, болезнь Стилла, болезнь Стилла, приобретенную во взрослом возрасте, амилоидный амилоидоз, ревматическую полимиалгию, спондилоартрит, легочную артериальную гипертензию, реакция «трансплантат против хозяина», аутоиммунный миокардит, контактную гиперчувствительность (контактный дерматит), желудочно-пищеводный рефлюкс, эритродермию, болезнь Бехчета, боковой амиотрофический склероз, трансплантацию, оптиконевромиелит, ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит, злокачественный ревматоидный артрит, фармакорезистентный ревматоидный артрит, оптиконевромиелит, болезнь Кавасаки, полиартрит или системный ювенильный идиопатический артрит, псориаз, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), болезнь Кастлмана, астму, аллергическую астму, аллергический энцефаломиелит, артрит, хронический прогрессирующий артрит, реактивный артрит, псориатический артрит, энтеропатический артрит, деформирующий артрит, ревматизм, спондилоартропатию, анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера, гиперчувствительность (включая как гиперчувствительность дыхательных путей, так и кожную гиперчувствительность), аллергию, системную красную волчанку (СКВ), кожную красную волчанку, лепрозную узелковую эритему, синдром Шегрена, воспалительные заболевания мышц, полихондрит, гранулематоз Вегенера, дерматомиозит, синдром Стивенса-Джонсона, хронический активный гепатит, миастению, идиопатическую спру, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, синдром раздраженного кишечника, эндокринной офтальмопатии, склеродермия, болезнь Грейвса, саркоидоз, множественный склероз, первичный билиарный цирроз печени, вагинит, проктит, инсулин-зависимый сахарный диабет, инсулин-резистентный сахарный диабет, ювенильный диабет (сахарный диабет типа I), аутоиммунные гематологические расстройства, гемолитическую анемию, апластическую анемию, анемию эритроцитов, идиопатическую тромбоцитопению (ИТП), аутоиммунный увеит, увеит (передний и задний), сухой кератоконъюнктивит, весенний кератоконъюнктивит, интерстициальный фиброз легкого, гломерулонефрит (с и без нефротического синдрома), идиопатический нефротический синдром или нефропатию минимальных изменений, воспалительное заболевание кожи, воспаление роговой оболочки, миозит, расшатывание костных имплантатов, нарушение обмена веществ, атеросклероз, дислипидемию, потерю костной ткани, остеоартрит, остеопороз, заболевания периодонта обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей, бронхит, пневмокониоз, эмфизему легких, острые и сверхострые воспалительные реакции, острые инфекции, септический шок, эндотоксический шок, синдром расстройства дыхания у взрослых, менингит, пневмонию, кахексию синдром изнурения, инсульт, герпетический стромальный кератит, заболевание сухого глаза, ирит, конъюнктивит, кератоконъюнктивит, синдром Гийена-Барре, синдром скованного человека, тиреоидит Хашимото, аутоиммунный тиреоидит, энцефаломиелит, острую ревматическую лихорадку, симпатическую офтальмию, синдром Гудпасчера, системный некротизирующий васкулит, антифосфолипидный синдром, болезнь Аддисона, обыкновенную пузырчатку, эксфолиативную пузырчатку, герпетиформный дерматит, атопический дерматит, экзематозные дерматиты, афтозную язву, красный плоский лишай, аутоиммунную алопецию, Витилиго, аутоиммунную гемолитическую анемию, тромбопеническую идиопатическую кровоточивость, пернициозную анемию, нейросенсорную потерю слуха, идиопатическую двустороннюю прогрессирующую нейросенсорную потерю слуха, аутоиммунный плюригландулярный синдром типа I или типа II, иммунное бесплодие и иммуно-обусловленное бесплодие.
Примеры объектов могут дополнительно включать те, которые подвергаются повышенному риску нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания. Объект-кандидат, например, имеет нежелательный или аберрантный иммунный ответ, расстройство или заболевание, воспалительный ответ, расстройство или заболевание, воспаление, аутоиммунный ответ, расстройство или заболевание, или лечится с помощью терапии или лекарственного средства от нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания. Объекты-кандидаты также включают объекты, которые получат пользу от или нуждаются в лечении нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания.
Объект «подверженный риску развития» имеет, как правило, факторы риска нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания. Конкретные примеры объектов, подверженных риску развития могут включать те, которые имели нежелательный или аберрантный иммунный ответ, расстройство или заболевание, воспалительный ответ, расстройство или заболевание, воспаление, аутоиммунный ответ, расстройство или заболевание. Примеры объектов, подверженных риску развития, могут также включать, тех, кому прописано лечение или терапия из-за нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания. Примеры объектов, подверженных риску развития, могут включать также тех, у которых есть факторы риска, такие как семейная история (например, генетическая предрасположенность), пол, образ жизни (диета, курение), род занятий (медицинский и клинический персонал, сельскохозяйственный и животноводческий персонал) или факторы окружающей среды (воздействие аллергенов).
В соответствии с настоящим изобретением композиция, содержащая слитый полипептид, может быть упакована в единичную дозированную форму для простоты введения и однородности дозировки. «Единичная лекарственная форма», используемая в данном документе, относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве стандартных дозировок для лечения; причем каждая единица содержит некоторое количество композиции в сочетании с эксцепиентом, наполнителем, разбавителем или носителем, рассчитанным для получения искомого лечения или терапевтического (например, положительного) эффекта. Единичные дозированные формы могут варьировать в зависимости от факторов, в том числе, без ограничения указанным, конкретную используемую композицию, расстройство или заболевание, подвергаемые лечению, эффект, который должен быть достигнут, и индивидуума, подвергаемого лечению. Типичные единичные дозы находятся в диапазона около 25-250, 250-500, 500-1000, 1,000-2,500, 2500-5000, 5,000-25,000 или 5,000-50,000 пг; около 50-500, 500-5,000, 5,000-25,000 или 25000-50000 нг; около 50-500, 500-5,000, 5,000-25,000 или 25000-50000 мкг; около 25-250, 250-500, 500-1000, 2500-5000, 1,000-2,500, 5,000-25,000 или 5,000-50,000 мг; и около 1-5, 5-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-250, 250-500, 500-1000, 1,000-2,500, или 2500-5000 грамм.
Как указано в настоящем документе, слитые полипептиды и композиции на их основе могут контактировать или предоставляться in vitro, ex vivo или вводиться или доставляться in vivo объекту или пациенту в различных дозах и количествах, и с различной частотой. Например, слитый полипептид или его композиции могут быть введены или доставлены для обеспечения искомого эффекта, в виде одной или в виде нескольких доз, например, в эффективном или достаточном количестве. Примерные дозы находятся в диапазоне около 25-250, 250-500, 500-1000, 2500-5000, 1,000-2,500, 5,000-25,000 или 5,000-50,000 мкг/кг; от около 50-500, 500-5,000, 5,000-25,000 или 25000-50000 нг/кг; от около 50-500, 500-5,000, 5,000-25,000 или 25000-50000 мкг/кг; и от около 25-250, 250-500, 500-1000, 1,000-2,500, 2500-5000, 5,000-25,000, или 5,000-50,000 мг/кг, в следующие друг за другом дни, через день или с перерывами.
Одно или несколько (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз) введений или доз композиции можно вводить в те же или последовательные дни, через день или с перерывами. Например, композицию, содержащую слитый полипептид, можно вводить один, два, три, четыре или более раз в день, через день, два раза в неделю, еженедельно, ежемесячно, раз в два месяца, или ежегодно. Композицию, содержащую слитый полипептид можно вводить в любой соответствующей продолжительности, например, в течение периода 1 час или менее, например, 30 минут или менее, в пределах 15 минут, 5 минут или менее, или 1 минуты или менее.
Композицию, содержащую слитый полипептид можно вводить объекту до, по существу одновременно с, или в пределах около 1-60 минут, часов (например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 24 часов) или дней (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7-14, 14-21, 21-28, 28-45, 45-60 или 60-90 дней) симптомами или возникновением нежелательного или аберрантного иммунного ответа, расстройства или заболевания, воспалительного ответа, расстройства или заболевания, воспаления, аутоиммунного ответа, расстройства или заболевания.
Композицию, содержащую слитый полипептид можно вводить с помощью системного, регионального или местного введения, любым путем. Например, композицию, содержащую слитый полипептид можно вводить системно, регионально или на местном уровне, с помощью инъекции, инфузии, перорально (например, приемом внутрь или ингаляцией), местно, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, внутрь полости, интракраниально, трансдермально (местно), парентерально, например, через слизистую оболочку или ректально (клизмой) катетером, или через глаз. Слитые полипептиды, композиции, способы и применения изобретения, включая фармацевтические препараты, вводятся через (микро) инкапсулированую систему доставки или упакованными в имплант для введения.
Настоящее изобретение также обеспечивает набор, включающий слитый полипептид (FynomAb) по настоящему изобретению, упакованный в подходящий упаковочный материал. Набор может включать этикетку или упаковочный вкладыш, включающие описание компонентов или инструкций для применения компонентов in vitro, in vivo, или ex vivo. Примерные инструкции включают инструкции для способа, протокола лечения или терапевтического режима.
Набор может содержать набор компонентов, например, две или несколько композиций, каждая из которых содержит разные биспецифичные слитые полипептиды, или композицию, содержащую биспецифичный слитый полипептид, и композицию, содержащую другую терапевтически полезную композицию (например, антипролиферативное или иммуностимулирующее лекарственное средство). Термин «упаковочный материал» относится к физической структуре, вмещающей компоненты набора. Упаковочный материал может содержать компоненты стерильно, и может быть изготовлен из материала, обычно используемого для таких целей (например, бумаги, гофрированного волокна, стекла, пластика, фольги, ампул, флаконов, или пробирок).
Набор может включать этикетку или вкладыш. Этикетка или вкладыш может быть «печатной продукцией», например, бумагой или картоном, или отдельной или прикрепленной к компоненту, набору или упаковочному материалу (например, коробке), или присоединенной к ампуле, пробирке или флакону, содержащему компонент набора. Этикетка или вкладыш может представлять собой машиночитаемый носитель, оптический диск, такой как CD- или DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, магнитная лента или электрический носитель информации, такой как RAM и ROM или их гибриды, такие как магнитные/оптические носители, флэш-носители или карты памяти.
Этикетка или вкладыш может включать идентификационную информацию для одного или нескольких компонентов в нем, количество доз, клиническую фармакологию активного ингредиента(ов), включая механизм действия, фармакокинетику (PK) и фармакодинамику (PD). Этикетки или вкладыши могут включать информацию, идентифицирующую информацию производителя, номера лота, местоположение производителя и дату.
Этикетка или вкладыш может включать информацию о состоянии, расстройстве, болезни или симптомах, для которых может быть использован компонент набора. Этикетки или вкладыши могут включать инструкции для клинического врача или для объекта о применении одного или нескольких компонентов набора в способе, протоколе лечения или терапевтическом режиме. Инструкции могут включать дозировки, продолжительности и частоты, а также инструкции для практического осуществления любого из способов, протоколов лечения или терапевтических режимов, указанных в настоящем документе. Наборы по настоящему изобретению, следовательно, могут дополнительно включать этикетку или инструкцию для практического осуществления любого из способов и применений данного изобретения, описанных в настоящем документе.
Этикетка или вкладыш может включать информацию о какой-либо пользе, которую может обеспечить компонент, например, в виде профилактической или терапевтической пользы. Этикетка или вкладыш может включать информацию о потенциальных негативных побочных эффектах, например, предупреждения объекта или клинического врача относительно ситуации, при которой может быть нецелесообразно использовать конкретную композицию. Нежелательные побочные эффекты могут также возникать, когда объект имеет, будет или в настоящее время принимает одно или несколько других лекарств, которые могут быть несовместимы с композицией, или объект имеет, будет использовать или в настоящее время проходит другой протокол лечения или терапевтический режим, который может быть несовместимым с композицией, и, следовательно, инструкции могут включать информацию относительно таких несовместимостей.
Набор может дополнительно включать другие компоненты. Каждый компонент набора может быть заключен в отдельном контейнере, и все различные контейнеры могут находиться в одной упаковке. Наборы изобретения, могут быть разработаны для хранения на холоде. Наборы изобретения могут дополнительно быть разработаны для того, чтобы содержать клетки-хозяева, экспрессирующие слитые полипептиды по изобретению, или которые содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые полипептиды. Клетки в наборе могут поддерживаться в соответствующих условиях хранения до тех пор, пока клетки не будут готовы к использованию. Например, набор, включающий одну или несколько клеток, может содержать соответствующий носитель для хранения клеток, с тем, чтобы клетки можно было разморозить и вырастить.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, что и обычно понимаемые специалистом в области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть использованы в практике или при тестировании настоящего изобретения, подходящие способы и материалы описаны в настоящем документе.
Все заявки, публикации, патенты и другие ссылки, упоминания GenBank и АТСС, процитированные в данном документе, включены ссылкой во всей их полноте. В случае конфликта, описание, включая определения, будет превалировать.
В данном описании изобретения все слова указанные в единственном числе включают множественное число, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылка на «слитый полипептид (FynomAb)» или «мишень (например, IL-17а или IL-6R),» может включать одиночный или множество таких слитых полипептидов, мишеней, и так далее.
В данном описании численные значения часто представлены в формате диапазона по всему этому документу. Формат диапазона используется просто для удобства и краткости и не должен быть истолкован как негибкое ограничение объема изобретения, если в контексте явно не указано иное. Соответственно, диапазон явно включает все возможные поддиапазоны, все отдельные числовые значения в пределах этого диапазона, и все числовые значения или числовые диапазоны, включая целые числа в пределах таких диапазонов и доли значений или целых чисел в пределах диапазонов, если в контексте явно не указано иное. Эта конструкция применяется независимо от ширины диапазона и во всех контекстах на протяжении всего этого патентного документа. Таким образом, например, ссылка на диапазон 90-100% состоит из 91-99%, 92-98%, 93-95%, 91-98%, 91-97%, 91-96%, 91-95%, 91-94%, 91-93%, и так далее. Ссылка на диапазон 90-100% также включает 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95%, 97% и т.д., а также 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5% и т.д., 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5%, и так далее.
-5
-13
Кроме того, ссылка на диапазон кратный от 1-5,000 включает кратность 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и т.д., а также кратность 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, и т.д., кратность 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, и т.д., и любой числовой диапазон, в пределах такого диапазона, такой как 1-2, 5-10, 10-50, 50-100, 100-500, 100-1000, 500-1000, 1000-2000, 1000-5000 и т.д. В другом примере, ссылка на диапазон от KD 10M до около KD 10M включает любое числовое значение или диапазон в пределах или охватывающее такие значения.
Также в данном документе ряд диапазонов раскрыт по всему документу. Использование серии диапазонов включает комбинации верхних и нижних диапазонов для обеспечения другого диапазона. Эта конструкция применяется независимо от ширины диапазона и во всех контекстах по всему этому патентному документу. Таким образом, например, ссылка на ряд диапазонов, таких как 5-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200, и т.д., включает такие диапазоны, как 5-20, 5-30, 5-40, 5-50, 5-75, 5-100, 5-150, 5-200, и, 10-30, 10-40 10-50, 10-75, 10-100, 10-150, 10-171 и 20-40, 20-50, 20-75, 20-100, 20-150, 20-200 и так далее.
Настоящее изобретение в целом описано в данном документе с использованием утвердительной формулировки для описания самые разных воплощений. Кроме того, изобретение включает воплощения, в которых конкретный объект изобретения исключается, в полном объеме или частично, например, вещества или материалы, стадии способа и условия, протоколы, процедуры, тесты или анализы. Таким образом, несмотря на то, что изобретение в целом не отображено в данном документе в том смысле, что данное изобретение не включает аспекты, которые прямо не включены в изобретение, тем не менее оно является раскрытым в данном документе.
Был описан ряд воплощений изобретения. Тем не менее, следует понимать, что могут быть сделаны различные модификации без отхода от сущности и объема настоящего изобретения. Соответственно, следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения объема изобретения, описанного в формуле изобретения.
Примеры
Пример 1
Полученные из Fyn SH3 полипептиды по изобретению связывают IL-17а, что установлено с помощью ELISA на моноклональном лизате.
Способ
Способ получения финомеров, которые связывают IL-17а, описан в PCT/EP2013/069481. Вкратце, связывающие белки, полученные из Fyn SH3, специфичные к IL-17а, были выделены с использованием рекомбинантного IL-17а (R & D Systems) в качестве антигена, и стандартного фагового дисплея в качестве технологии отбора (Grabulovski D. et al., (2007) J Biol Chem 282, p. 3196-3204, Viti, F. et al. (2000) Methods Enzymol. 326, 480-505). Полученный из Fyn SH3 полипептид по изобретению, 1L3-B09, несущий последовательность n-Src-петли «STHEYE», обогащали ходе процесса отбора. 1L3-B09 связывает IL-17а и было обнаружено, что он ингибирует гликозилированный IL-17а также хорошо, как и негликозилированный IL-17а. Для получения Fyn SH3-белков, связывающих IL-17а с более высокой аффинностью, 1L3-B09 использовали в качестве матрицы для созревания аффинности. Последовательность n-src-петли «STHEYE» сохраняли константной и объединяли с рандомизированном репертуаром RT-петли (6 аминокислотных остатков, обозначенных как (X1) (X2) (X3) (Х4) (Х5) (Х6)). Процесс получения библиотеки для созревания аффинности была по существу таким же, что и описанный для клонирования наивной библиотеки с рандомизированной RT-петлей («библиотека 0» в Schlatter et al. (2012) mAbs, 4(4) p. 497-50).
После наивного отбора и отбора для созревания аффинности, обогащенные Fyn SH3-полипептиды подвергали скринингу на связывание с IL-17а с использованием ELISA на лизате. ДНК, кодирующую связывающие Fyn SH3-белки, клонировали в бактериальный экспрессирующий вектор pQE12 (Qiagen) таким образом, чтобы полученные конструкции несли С-концевую Мус-гексагистидиновую метку, как описано в Grabulovski et al.(Grabulovski et al. (2007) JBC, 282, p. 3196-3204). Полипептиды экспрессировали в цитозоле бактерий E.coli в 96-луночного формате и получали 200 мкл очищенного лизата на лунку, как описано в Bertschinger et al. (Bertschinger et al. (2007) Protein Eng Des Sel 20(2): p. 57-68). Вкратце, трансформированные бактериальные колонии отбирали из чашки с агаром и выращивали в круглодонных 96-луночных планшетах (Nunc, кат. номер 163320) в 200 мкл среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% (масс./объем) глюкозы. Экспрессию белка индуцировали после роста в течение 3 ч при 37°С и перемешивания при 200 оборотах в минуту путем добавления 1 мМ IPTG (AppliChem, Германия). Белки экспрессировали в течение ночи в ротационном шейкере (200 оборотов в минуту, 30°C). Далее 96-луночный планшет центрифугировали при 1800 x g в течение 10 мин и сливали надосадочную жидкость. Бактериальные осадки ресуспендировали в 200 мкл буфера для лизиса (50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, рН 8,0), содержащего 1 мг/мл лизоцима и оставляли на 30 мин на льду. После этого бактериальные клетки подвергали лизису путем обработки ультразвуком в водяной бане (шесть импульсов в течение 10 с), а затем центрифугировали при 1800 x g в течение 10 мин. Для ELISA использовали моноклональные бактериальные лизаты: биотинилированный IL-17а (произведенный самостоятельно в клетках НЕК EBNA, биотинилирование проводили с помощью NHS-PEO4-биотина (Pierce) в соответствии с инструкциями изготовителя), иммобилизовали на покрытых стрептавидином лунках (StreptaWells, High Bind, Roche), и после блокирования 2% молоком в PBS (Rapilait, Migros, Швейцария), наносили 50 мкл PBS с 4% молока, содержащего 6 мкг/мл анти-Myc антитела 9E10 (конечная концентрация 3 мкг/мл) и 50 мкл бактериального лизата. После инкубации в течение 1 ч и промывки, связанные Fyn SH3-полипептиды детектировали с помощью антительного конъюгата анти-мышь-HRP (Sigma). Обнаружение активности пероксидазы осуществляли путем добавления субстрата BM blue POD (Roche) и реакцию останавливали добавлением 1 М H2SO4. Последовательность ДНК специфических связующих белков подтверждали секвенированием ДНК.
Результаты
Последовательности семи репрезентативных IL-17а-связывающих финомеров (SEQ ID NO: 1-7) представлены ниже:
SEQ ID NO:1 (1L3-B9):
GVTLFVALYDYANHGNRDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO:2 (11L0-C06):
GVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO:3 (11L5-B06):
GVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO:4 (11L6-F03):
GVTLFVALYDYDKLSALDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO:5 (11L9-C09):
GVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ;
SEQ ID NO:6 (11L10-A05):
GVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ; and
SEQ ID NO:7 (11L11-A09):
GVTLFVALYDYSRKSNLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ.
Восемь (8) различных слияний финомер-антитело (FynomAb) получали путем слияния четырех (4) отдельных анти-IL-17а связывающих финомеров либо с С-концом тяжелой цепи (COVA801, COVA803, COVA805, COVA807), либо с С-концом легкой цепи (COVA802, COVA804, COVA806, COVA808) из IL-6R-связывающего антитела, тоцилизумаба (см. таблицу 1).
Таблица 1. Описание FynomAb.
FynomAb
Финомер
Формат
ММ (кДа)
pI
Актемра
-
родительский
145,0
8,62
COVA801
11L0-C06
HC, C -конц
161,6
8,23
COVA802
11L0-C06
LC, C-конц
161,6
8,23
COVA803
11L5-B06
HC, C-конц
161,5
8,09
COVA804
11L5-C06
LC, C-конц
161,5
8,09
COVA805
11L9-C09
HC, C-конц
161,6
7,65
COVA806
11L9-C09
LC, C-term
161,6
7,65
COVA807
11L10-A05
HC, C-конц
161,4
8,09
COVA808
11L10-A05
LC, C-конц
161,4
8,09
HC: тяжелая цепь; LC: легкая цепь; pI: Изоэлектрическая точка; ММ: молекулярная масса; кДа: килодальтон
Исследования оценки биохимических и функциональных характеристик, а также фармакокинетических свойств различных FynomAb. Оценивали несколько различных лотов COVA801-808 FynomAb. FynomAb получали либо из транзиторной, либо стабильной трансфекций клеток СНО. FynomAb для фармакокинетического исследования на мышах и яванских макаках (cyno) получали из стабильных клеточных линий СНО.
Пример 2
Экспрессия и очистка белка
Четыре отдельных лота FynomAb получали и оценивали в исследованиях, документально подтвержденных ниже. Два лота материала получали из транзиторно трансфицированных клеток СНО. Лоты материала собственного изготовления получали из пулов стабильных CHO с помощью экспрессирующих векторов Lonza, как описано ниже.
Тяжелую и легкую цепи последовательности Актемра (тоцилизумаба) получили из базы данных CAS, и также подтвердили как последовательность #15 в US 2011/0076275 A1. Последовательность модифицировали для мутации аминокислот 356-358, DEL в EEM. Это мутация из аллотипа G1m1 в nG1m1, который потенциально может снизить иммуногенность.
Последовательность тяжелой цепи Актемра (тоцилизумаба) (SEQ ID NO: 8) (CDR выделен жирным шрифтом)
1 QVQLQESGPG LVRPSQTLSL TCTVSGYSIT SDHAWSWVRQ PPGRGLEWIG
51 YISYSGITTY NPSLKSRVTM LRDTSKNQFS LRLSSVTAAD TAVYYCARSL
101 ARTTAMDYWG QGSLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD
151 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY
201 ICNVNHKPSN TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK
251 DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS
301 TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV
351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL
401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG*
Последовательность легкой цепи Актемра (тоцилизумаба) (SEQ ID NO: 9) (CDR выделен жирным шрифтом)
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYYCQQ GNTLPYTFGQ
101 GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
151 DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
201 LSSPVTKSFN RGEC*
Эти последовательности тяжелой и легкой цепей тоцилизумаба оптимизировали по кодонам для экспрессии в CHO и синтезировали гены. Сигнальные последовательности, добавляли к 5'-концам каждого гена (Hc ss = MEWSWVFLFFLSVTTGVHS; Lc ss = MSVPTQVLGLLLLWLTDARC). Конструировали слитые белки FynomAb, помещая каждую из четырех последовательностей финомера на С-конце либо тяжелой, либо легкой цепи тоцилизумаба, с помощью линкера из 15 аминокислот (GGGGSx3). Получали гены, необходимые для получения восьми FynomAb. Синтезированные гены клонировали в векторы Lonza Pee 12.4 (тяжелая цепь) и 6.4 (легкой цепи). Эти векторы затем объединяли для получения единого экспрессирующего вектора для экспрессии комбинации тяжелой и легкой цепей для тоцилизумаба и всех восьми молекул FynomAb.
Таблица 2. Описание FynomAb с последовательностями финомеров
Молекула
Описание
Последовательность финомера
COVA801
тоцилизумаб с C-концевым финомером 11L0_C06 на тяжелой цепи
GVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 2)
COVA802
тоцилизумаб с C-концевым финомером 11L0_C06 на легкой цепи
GVTLFVALYDYKQKGHLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 2)
COVA803
тоцилизумаб с C-концевым финомером 11L5_B06 на тяжелой цепи
GVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 3)
COVA804
тоцилизумаб с C-концевым финомером 11L5_B06 на легкой цепи
GVTLFVALYDYSARGQLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 3)
COVA805
тоцилизумаб с C-концевым финомером 11L9_C09 на тяжелой цепи
GVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 5)
COVA806
тоцилизумаб с C-концевым финомером 11L9_C09 на легкой цепи
GVTLFVALYDYESVSWSDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 5)
COVA807
тоцилизумаб с C-концевым финомером 11L10_A05 на тяжелой цепи
GVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 6);
COVA808
тоцилизумаб с C-концевым финомером 11L10_A05 на легкой цепи
GVTLFVALYDYSSRGVLDLSFHKGEKFQILSTHEYEDWWEARSLTTGETGYIPSNYVAPVDSIQ (SEQ ID NO: 6)
Клетки СНО-К1-SV нуклеофицировали (Amaxa) линеаризованной ДНК каждого из восьми векторов FynomAb и тоцилизумаба. Эти клетки помещали в селекционную среду MSX и культивировали попарно в статичных колбах до извлечения культур. После извлечения клеток, их переносили в перемешиваемые колбы и либо сразу же замораживали, либо размножали для получения колб для крупномасштабной экспрессии белка.
Первые раунды колб для выработки очищали для получения материала для фармакокинетического исследования собственной разработки на мышах и для применения в анализах in vitro. Замороженные культуры этих же пулов позже размораживали и размножали, если для фармакокинетического исследования на яванских макаках требовалось больше белка.
Уровни экспрессии количественно оценивали с помощью AlphaLISA и вестерн-блоттинга. Уровни экспрессии стабильных пулов находились в диапазоне около 100-500 мг/л. Колбы для выработки культивировали в течение десяти дней до сбора, фильтрации и замораживания с ингибиторами протеаз. Некоторые пулы с низкой экспрессией были «захвачены на холоду» и отсортированы: антитело на поверхности клеток окрашивали, а затем клетки сортировали при помощи проточной цитометрии для захвата самых высокопродуктивных клетки для культивирования и продуцирования. Надосадочные жидкости из стабильных пулов (0,5-8,0 л) после сбора фильтровали через 0,2 мкм вакуум-фильтр и добавляли таблетки ингибиторов протеаз (Sigma, Cat # P2714, 1 таблетка/100 мл надосадочной жидкости) до замораживания или хранения при 4°С.
Надосадочные жидкости для всех клеточных линий, продуцирующих FynomAb, изначально очищали в асептических условиях с использованием колонок HiTrap MabSelect SuRe (1 или 5 мл колонки, иногда кратные в тандеме), загруженных при скорости потока 5-20 мл/мин. Колонки отмывали PBS до достижения базового уровня сигнала при А280, с последующим элюированием глицином, рН 3,0.
Различные лоты стабильного материала CHO, полученные для каждого FynomAb, вместе с выходом белка приведены в таблице 3.
Таблица 3. Выходы продуцируемых FynomAb и тоцилизумаба
Конструкция
Хозяин/Экспрессия
Выход (мг)
Конц. мг/мл (мкМ)
Объем (мл)
Выход (мг/л над. жидк.)
тоцилизумаб
CHO-S/транзиторная
1,31
5,0(35,5)
0,26
2,6
тоцилизумаб
CHO-K1SV /стабильная
2,9
4,40(30,3)
0,66
1,2
тоцилизумаб
CHO-K1SV /стабильная (после сортировки)
291
2,75(19,0)
105,8
36,4
COVA801
CHO-K1SV /стабильная
36,0
4,0(24,7)
9,0
> 72
COVA801
CHO-K1SV /стабильная
410
1,35(8,3)
303,7
205
COVA802
CHO-K1SV /стабильная
1,43
3,96(24,4)
0,36
3,0
COVA802
CHO-K1SV /стабильная
7,1
1,68(10,3)
4,3
1,6
COVA802
CHO-K1SV /стабильная
252
0,91(5,6)
276,9
45,8
COVA803
CHO-K1SV /стабильная
26,1
3,86(23,8)
6,8
> 50
COVA803
CHO-K1SV /стабильная
330
1,27(7,8)
259,8
110,0
COVA804
CHO-K1SV /стабильная
32,2
4,81(29,7)
6,7
> 72
COVA804
CHO-K1SV /стабильная
337
0,96(5,9)
351,0
112,3
COVA805
CHO-K1SV /стабильная
19,5
2,78(17,2)
7,0
> 41
COVA806
CHO-K1SV /стабильная
47,9
5,1(31,5)
9,4
> 90
COVA806
CHO-K1SV /стабильная
428
2,74(16,9)
156,2
142,7
COVA807
CHO-K1SV /стабильная
59,7
6,63(40,9)
9,0
> 120
COVA807
CHO-K1SV /стабильная
59,7
6,63(40,9)
9,0
> 120
COVA808
CHO-K1SV /стабильная
22,8
3,35(20,7)
6,8
> 48
COVA808
CHO-K1SV /стабильная (после сортировки)
245
1,41(8,7)
173,8
54,4
Пример 3
Анализ ДСН-ПААГ
Анализ ДСН-ПААГ проводили на трех отдельных лотах каждого FynomAb и тоцилизумаба. Пять микрограмм каждого белка подвергали электрофорезу как в восстанавливающих, так и в невосстанавливающих условиях в градиентных гелях с 4-20% Трис-глицина с использованием образца с трис-глициновым SDS и подвижных буферов. Гели окрашивали в течение ночи кумасси бриллиантовым синим (SimplyBlue SafeStain, Invitrogen) и удаляли краситель до достаточной прозрачности дистиллированной воды. Результаты показаны на фигуре 1 (анализ ДСН-ПААГ материала транзиторно трансфицированных CHO), фигуре 2 и (анализ ДСН-ПААГ материала стабильно трансфицированных CHO, полученного для фармакокинетического исследования на мышах).
Пример 4
Аналитическая эксклюзионная ВЭЖХ
Три отдельных лота FynomAb оценивали с помощью аналитической эксклюзионной ВЭЖХ. Один лот материала представлял собой транзиторно трансфецированные CHO, а два других лота получали из стабильной трансфицированных клеточных линий СНО. Десять микрограммов каждого белка FynomAb вводили в колонку Zenix-С SEC-300 (Sepax Technologies) с использованием PBS в качестве подвижной фазы со скоростью потока 1 мл/мин. Абсорбцию контролировали при A280. Присутствие финомер задерживает элюцию FynomAb по сравнению с Актемра в той или иной степени, по-видимому, из-за вторичного взаимодействия между твердой фазой и финомерами. Растворимая агрегация наблюдалась в виде пиков, элюированных до главного пика FynomAb, и наиболее ярко проявлялась в конструкциях слияния тяжелой цепи COVA801, COVA803, COVA805 и COVA807.
Химеры легкой цепи (COVA802, COVA804, COVA806 и COVA808 FynomAb) имели гораздо более чистые профили эксклюзионной хроматографии, без агрегации, наблюдаемой для COVA804 или COVA806 FynomAb. Эти данные согласуются с ранее полученными данными, которые также показали, что химеры легких цепей имели более чистые профили эксклюзионной хроматографии с менее очевидной растворимой агрегацией.
Пример 5
Измерения аффинности к человеческому IL-17а и человеческому IL-6R
Для определения аффинности и кинетических параметров связывания FynomAb с человеческим IL-17а и человеческим IL-6R, антитело против человеческих антител соединяли через амин с чипом GLM. COVA801-808 FynomAb или контрольные антитела затем захватывались как лиганды, и либо IL-17а, либо IL-6R, пропускали в качестве аналита. PBST использовали в качестве подвижной фазы, а регенерацию осуществляли двумя 15-секундными инъекции 100 мМ HCl. Секукинумаб использовали в качестве положительного контроля для связывания IL-17а и в качестве отрицательного контроля для связывания IL-6R. Тоцилизумаб и/или Актемра использовали в качестве положительного контроля для связывания IL-6R и в качестве отрицательного контроля для связывания IL-17-A.
Секукинумаб использовали в качестве положительного контроля для связывания IL-17а и в качестве отрицательного контроля для связывания IL-6R. Цепи VH и VL секукинумаба представлены ниже:
Вариабельная легкая цепь (SEQ ID NO: 33)
Сигнальная последовательность (подчеркнута), вариабельный домен (каппа) (выделено жирным шрифтом)
MSVPTQVLGLLLLWLTDARCEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPCTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*
Вариабельная тяжелая цепь (SEQ ID NO: 34)
Сигнальная последовательность (подчеркнута), вариабельный домен (каппа) (выделено жирным шрифтом)
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMNWVRQAPGKGLEWVAAINQDGSEKYYVGSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTAVYYCVRDYYDILTDYYIHYWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG*
Тоцилизумаб и/или Актемра использовались в качестве положительного контроля для связывания IL-6R, и в качестве отрицательного контроля для связывания IL-17а.
Связывание IL-17а
Репрезентативные сенсограммы связывания IL-17а для COVA801-808 FynomAb, а также для секукинумаба (положительного контроля и эталона) и тоцилизумаба или Актемра (отрицательных контролей) показаны на фигуре 4. Сводка данных кинетического связывания из множества исследований для множества лотов каждого из FynomAb и секукинумаба сведены в таблице 4. Показаны сенсограммы для COVA801-808, отдельных лотов тоцилизумаба (toc), коммерческой Актемра и секукинумаба (sec).
Совпадение кинетики довольно хорошо согласуется со значениями других данных, и большинство конструкций имеют очевидное значение KD схожее с секукинумабом. Оценка связывания с IL-17а искажается сложной ассоциацией с FynomAb, по значительному отклонению от соотношения связывания 1:1 в наборах данных FynomAb, но не в наборе данных для секукинумаба. По-видимому, происходит значимое повторное связывание IL-17а, что легче наблюдать при длительной фазе диссоциации. Таким образом, заявленные кинетические и аффинные значения для взаимодействия FynomAb/IL-17а следует интерпретировать с осторожностью. Хотя COVA807 и COVA808 имели более низкие значения KD, значительное отклонение от 1:1 связывания с IL-17а этими двумя FynomAb можно объяснить их кажущимся более высоким сродством. Мы наблюдали худшую функциональную активность COVA807 FynomAb в функциональном анализе с IL-17а (см. данные функционального анализа НТ29 IL-17а ниже).
Таблица 4. Сводка данных SPR для связывания FynomAb с человеческим IL-17а
FynomAb
средн. ka (1/Ms)
средн. kd (1/s)
средн. KD (нM)
ст. откл. KD (M)
Кол-во экспериментов
COVA801
6,17E+06
4,11E-04
4,86E-11
±6,61E-10
4
COVA802
3,26E+06
2,53E-04
7,82E-11
±1,14E-10
4
COVA803
4,96E+06
3,57E-04
6,89E-11
±1,26E-10
5
COVA804
2,42E+06
1,29E-04
4,68E-11
±6,78E-11
8
COVA805
3,53E+06
5,81E-04
1,43E-10
±1,92E-10
2
COVA806
2,01E+06
2,33E-04
9,98E-11
±1,27E-10
5
COVA807
4,34E+06
9,66E-05
2,23E-11
±7,07E-14
2
COVA808
2,95E+06
7,97E-05
3,11E-11
±1,74E-11
5
секукинумаб
6,46E+05
1,01E-04
4,47E-10
±3,97E-10
4
Из-за сложной ассоциации конструкций FynomAb с рекомбинантным гомодимером IL-17а, ELISA с простым связыванием проводили для изучения специфичности и относительной аффинности COVA804 и COVA806 по отношению к человеческому IL-17а. Вкратце, 1 мкг/мл рекомбинантного человеческого IL-17а в PBS наносили на планшет для ELISA, с последующим блокированием с помощью БСА и инкубацией с 0-10 мкг/мл тестируемого антитела или FynomAb. Козье антитело против человеческих антител, конъюгированное с пероксидазой хрена, использовали для обнаружения связывания с использованием TMB. Результаты ответа от концентрации по связыванию с IL-17а были высоко воспроизводимыми в ходе четырех исследований, с репрезентативным исследованием, показанным на фигуре 5. Связывание с человеческим IL-17а оценивали с помощью ELISA для COVA804 (804), COVA806 (806) и секукинумаба (sec). Актемра использовали в качестве отрицательного контроля для связывания с IL-17а. Величины EC50 для различных конструкций, были следующими: секукинумаб = 0,36 ± 0,12 нМ; COVA804 = 1,02 ± 0,24 нМ; COVA806 = 0,98 ± 0,23 нМ. Таким образом, эти данные подтверждают данные SPR, которые демонстрируют, что FynomAb COVA804 и COVA806 имеют аналогичную секукинумабу аффинность по отношению к IL-17а.
Связывание IL-6R
Репрезентативные сенсограммы связывания с IL-6R для COVA801-808 FynomAb, а также для тоцилизумаба и Актемра (положительного контроля и эталона) и секукинумаба (отрицательного контроля) показаны на фигуре 6. Оценка взаимодействия FynomAb/IL6R с помощью SPR хорошо воспроизводима, и взаимодействие может быть легко смоделировано классической подгонкой по Ленгмюру, как показано на фигуре 6. Сенсограммы представлены для COVA801-808, отдельных лотов тоцилизумаба (toc), коммерческих Актемра и секукинумаба (sec). Сводка кинетических данных по связыванию из нескольких исследований для нескольких лотов каждого FynomAb и тоцилизумаба, представлены в таблице 5. Эти данные показывают, что присутствие финомеров на C-концах либо легкой, либо тяжелой цепей не влияет на связывание IL-6R с родительским антителом. Все FynomAb демонстрируют очень близкие кинетики связывания друг с другом и с родительским антителом тоцилизумабом.
Таблица 5. Сводка данных SPR для связывания FynomAb с человеческим IL-6R
FynomAb
средн. ka (1/Ms)
средн. kd (1/s)
средн. KD (нМ)
станд. откл. KD (M)
Количество экспериментов
COVA801
4,99E+05
1,50E-04
2,97E-10
±0,29E-10
4
COVA802
4,72E+05
1,68E-04
3,95E-10
±1,45E-10
6
COVA803
3,63E+05
2,19E-04
6,04E-10
±3,31E-10
6
COVA804
4,08E+05
2,01E-04
6,32E-10
±3,71E-10
9
COVA805
6,13E+05
1,78E-04
3,14E-10
±1,49E-10
2
COVA806
4,34E+05
1,72E-04
5,14E-10
±3,20E-10
5
COVA807
6,92E+05
1,89E-04
3,07E-10
±1,53E-10
2
COVA808
4,25E+05
1,70E-04
5,46E-10
±3,04E-10
4
тоцилизумаб
4,73E+05
1,86E-04
4,17E-10
±1,06E-10
4
Актемра
4,13E+05
1,91E-04
4,99E-10
±1,42E-10
6
Пример 6
Анализ ингибирования НТ-29 IL-17а
Для оценки биоактивности COVA801-808 FynomAb против человеческого IL-17а, клетки НТ-29 (АТСС, #HTB-38) стимулировали IL-17а (1,9 нМ) в присутствии различных концентраций каждого FynomAb, начиная от 100 нМ до 6 pM. Секукинумаб использовали в качестве положительного контроля для блокирования функции IL-17а. Для каждого условия добавляли 20000 жизнеспособных клеток и инкубировали в течение 48 часов в плоскодонном 96-луночном планшете при 37°С и 5% СО2. Каждое условие тестировали в двух повторах.
Стимуляция клеток НТ29 с IL17A привела к выработке и высвобождению GROα в клеточную надосадочную жидкость. Концентрации GROα в надосадочной жидкости затем измеряли с помощью ELISA, с использованием набора «DuoSet ELISA» от R&D Systems (DY275). ELISA проводили в соответствии с инструкцией изготовителя (за исключением того, что все антитела использовали в разведении 1: 200).
Средние дублированных результатов помещали на график со стандартными отклонениями, и рассчитывали в GraphPad Prism значения IC50 с использованием четырехпараметрической функции дозозависимого ингибирования. Типичные данные нескольких исследований с использованием трех различных лотов COVA801-808 FynomAb представлены на фигурах 7-9. Величины IC50, рассчитанные из репрезентативных данных, приведены в таблице 6. Все FynomAb показали одинаковую активность по отношению к IL-17а относительно эталонного секукинумаба, и все FynomAb смогли достичь полной блокады при более высоких концентрациях. COVA806 неизменно демонстрировал наиболее высокую активность против IL-17а и был стабильно более мощным, чем секукинумаб.
Таблица 6A
Фигура 7AIC50
801
802
Секукинумаб
1,362
1,148
1,542
Фигура 7BIC50
803
804
Секукинумаб
1,476
1,104
1,457
Фигура 7CIC50
805
806
Секукинумаб
0,8135
0,8537
1,155
Фигура 7DIC50
807
808
Секукинумаб
1,929
1,702
1,597
Таблица 6В
Фигура 8AIC50
801 собственного изготовления
802 собственного изготовления
Секукинумаб
1,599
1,783
2,395
Фигура 8BIC50
803 собственного изготовления
804 собственного изготовления
Секукинумаб
2,625
2,317
2,560
Фигура 8CLogIC50
805 собственного изготовления
806 собственного изготовления
Секукинумаб
0,2796
0,07429
0,2138
Фигура 8DLogIC50
807 собственного изготовления
808 собственного изготовления
Секукинумаб
0,6443
0,4065
0,3166
Таблица 6C
Фигура 9AIC50
801
802
Секукинумаб
1,520
0,9410
1,259
Фигура 9BIC50
803
804
Секукинумаб
12,118
1,507
1,960
Фигура 9CIC50
806
808
Секукинумаб
1,132
2,036
2,070
Пример 7
Анализ ингибирования НЕК-Blue™ IL-6R
Для оценки биоактивности анти-IL-6R части конструкций COVA801-808, клетки HEK Blue IL-6 (Invivogen, НКВ-IL6) стимулировали IL-6 (15 пМ) в присутствии различных концентраций FynomAb, в пределах от 500 нМ до 0,2 нМ. Ингибиторы предварительно инкубировали с клетками в течение 30 минут перед добавлением IL-6. В качестве контроля использовали среду отдельно, или среду, содержащую IL-6 (15 пМ). Кроме того, тоцилизумаб или Актемра использовали в качестве положительного контроля для блокады IL-6R. Для каждого образца добавляли 50000 жизнеспособных клеток, и инкубировали в течение 20-24 часов в лунке 96-луночного планшета при 37°С, 5% СО2. Каждое условие было испытано в трех повторах.
Добавление IL-6 к клеткам приводило к стимуляции сигнального пути IL-6R, который активировал STAT3-индуцируемый репортер SEAP. SEAP в надосадочной жидкости измеряли с использованием детектирующего реактива НЕК-BlueTM (Invivogen, hb-det2), используемого в соответствии с инструкцией изготовителя.
Средние результатов в трех повторах наносили на график со стандартным отклонением. IC50-величины вычисляли в GraphPad Prism с использованием четырехпараметрической функции дозозависимого ингибирования. Типичные данные из нескольких исследований с использованием трех различных лотов COVA801-808 FynomAb показаны на фигурах 10-12 ниже. Величины IC50, рассчитанные из репрезентативных данных, приведены в таблице 7. Все FynomAb из всех трех лотов показали схожую с коммерческими Актемра и тоцилизумабом блокаду IL-6R. Эти данные похожи на другие данные, и указывают на то, что присутствие связывающих IL-17а финомеров на антительном каркасе тоцилизумаба не влияет на активность блокирования IL-6R этих FynomAb.
Таблица 7A
Фигура 10AIC50
Актемра
COVA801
19,96
22,28
Фигура 10BIC50
Актемра
COVA802
19,96
21,29
Фигура 10CIC50
Актемра
COVA803
19,96
25,52
Фигура 10DIC50
Актемра
COVA804
19,09
20,84
Фигура 10EIC50
Актемра
COVA805
19,09
21,14
Фигура 10FIC50
Актемра
COVA806
19,09
22,80
Фигура 10GIC50
Актемра
COVA807
14,37
26,18
Фигура 10HIC50
Актемра
COVA808
14,37
21,45
Фигура 10IIC50
Актемра
Tocilizumab
14,37
19,23
Таблица 7В
Фигура 11AIC50
Актемра
COVA801
7,869
8,214
Фигура 11BIC50
Актемра
COVA802
7,869
8,526
Фигура 11CIC50
Актемра
COVA803
7,869
11,63
Фигура 11DIC50
Актемра
COVA804
10,55
12,29
Фигура 11EIC50
Актемра
COVA805
10,55
12,38
Фигура 11FIC50
Актемра
COVA806
10,55
14,76
Фигура 11GIC50
Актемра
COVA807
17,05
19,32
Фигура 11HIC50
Актемра
COVA808
17,05
14,69
Фигура 11IIC50
Актемра
Tocilizumab
17,05
12,35
Таблица 7C
Фигура 12AIC50
801
802
Тоцилизумаб
Актемра
12,26
13,40
13,29
6,903
Фигура 12BIC50
803
804
Тоцилизумаб
Актемра
10,75
9,108
9,176
8,406
Фигура 12CIC50
806
808
Тоцилизумаб
Актемра
8,957
11,79
11,15
8,142
Пример 8
Тест стабильности в сыворотке
Для того, чтобы оценить стабильность каждого FynomAb в сыворотке крови человека, каждый из COVA801-808 FynomAb инкубировали в 90% сыворотки человека (Sigma # H4522) в течение 6 дней при 37°С в концентрации 10 мкг/мл, а затем тестировали в сендвич-ELISA для оценки сохранения способности FynomAb связываться как IL-17а, так и с IL-6R. Сэндвич-ELISA использовали для одновременной оценки связывания FynomAb после инкубации в PBS или сыворотке крови человека. Структура сэндвич-ELISA показана на фигуре 13.
Если коротко, то человеческий IL-17а наносили на 96-луночный планшет Maxisorp при 5 мкг/мл в PBS, образцы FynomAb разбавляли 5 раз в 1% BSA/PBST от 50 нМ до 0,003 нМ и добавляли в планшеты. Затем в каждую лунку добавляли His-меченный человеческий IL-6R, содержащий FynomAb и обрабатывали анти-His-HRP МАТ. Планшет затем промывали, проявляли с использованием субстрата ТМВ (Sigma #T0440) и останавливали процесс кислотой. Средние трех повторов наносили на график вместе со стандартными отклонениями (см. фигуру 14).
Более подробно, COVA801-808 FynomAb инкубировали в следующих условиях (a-d), а затем оценивали сохранение активности двойного связывания в ELISA как представлено на фигуре 10: а) разбавление в PBS немедленно анализировали (PBS, день 0), b) разбавление в PBS и хранение в течение 6 дней при температуре 4°С (PBS 6-й день), c) разбавление в 90% сыворотке человека немедленно анализировали (сыворотка человека день 0), d) разбавление в 90% сыворотке человека и инкубация в течение 6 дней при 37°C (сыворотка человека 6-й день).
Отдельный набор контрольных образцов инкубировали в течение 6 дней при температуре 4°С в PBS (PBS день 6). Другой набор контрольных образцов разводили в сыворотке человека и немедленно использовали в анализе (сыворотка человека день 0). Цель анализа образцов сыворотки человека день 0 заключалась в оценке влияния сыворотки человека на способность FynomAb связывать обе своих мишени одновременно. Как показано на фигуре 14, хранение FynomAb в сыворотке человека в течение 6 дней не снижает их активность связывания (сравните с сыворотка человека день 0), что свидетельствует о том, что все 8 FynomAb стабильны в сыворотке человека. Как показано на фигуре 15, бинарная связывающая активность COVA804 и COVA806 не была нарушена в присутствии сыворотки человека.
Пример 9
Одновременное связывание IL-6R и IL-17а
Данные показали, что все COVA801-808 FynomAb были способны одновременно связываться с человеческим IL-17а и человеческим IL-6R.
Клеточный проточно-цитометрический анализ проводили с целью демонстрации того, что COVA801-808 FynomAb могут связываться одновременно с IL-6R на клеточной поверхности, и с растворимым IL-17а. В этом анализе использовали клетки HEK Blue IL-6, экспрессирующие человеческий IL-6R на поверхности (Invivogen НКВ-IL6). Вкратце, COVA801-808 FynomAb (или контрольные образцы) инкубировали в течение 60 минут с клетками НЕК-Blue IL-6 (или клетками НЕК-293 в качестве отрицательного контроля) при различных концентрациях в диапазоне от 300 нМ до 5 мкМ. После этой первичной инкубации связывание конструкций с IL-6R выявлялось с помощью антитела против человеческого IgG, конъюгированного с Alexa488 флуорофором (Invitrogen A11013).
Результаты показаны на фигуре 16. Клетки HEK-Blue-IL6 (IL6R+) или клетки НЕК-293 (IL6R-) инкубировали с указанными FynomAb с последующей инкубацией с любым Alexa488 против IgG человека для обнаружения FynomAb, присоединенных к поверхности клетки или биотинилированным IL-17а плюс стрептавидин APC для оценки одновременного связывания. Тоцилизумаб использовался в качестве положительного контроля для связывания IL-6R и в качестве отрицательного контроля для связывания IL-17а.
Данные на фигурах 16 A, C, E, G, I, K, M и O показывают, что все 8 конструкций FynomAb, а также тоцилизумаб, связываются с клетками НЕК-Blue IL-6, которые экспрессируют человеческий IL-6R на клеточной поверхности, но ни одна из конструкций не связываются с контрольными клетками НЕК-293, которые не экспрессируют человеческий IL-6R на клеточной поверхности. Для того чтобы обнаружить одновременное связывание IL-6R клеточной поверхности и растворимого человеческого IL-17а, провели отдельное исследование, в котором после первичной инкубации с каждой из конструкций следовала вторичная инкубация с биотинилированным IL-17а (R & D 317-ILB), а затем инкубация со стрептавидин-аллофикоцианином (APC; eBioscience 17-4317). Как продемонстрировано на фигурах 16, B, D, F, H, J, L и P все 8 FynomAb показали одновременное связывание с IL-6R клеточной поверхности и растворимым о IL-17а. Как и ожидалось, тоцилизумаб был способен связывать IL-6R, экспрессируемый на поверхности клеток HEK Blue IL-6, но не связывался с растворимым IL-17а.
Пример 10
Функциональная активность биспецифических FynomAb в присутствии как IL-17а, так и IL-6R
Данные, приведенные на фигурах 15 и 16 показывают, что FynomAb могут одновременно связываться с человеческим IL-17а и человеческим IL-6R. Тем не менее, не ясно, влияет ли на связывание часть IL-6R МАТ из FynomAb на способность финомера связывать и ингибировать его лиганд IL-17а. Для решения этой проблемы, мы осуществили функциональный анализ на HT-29 IL-17а в присутствии растворимого IL-6R для того, чтобы увидеть, будет ли связывание FynomAb с IL-6R снижать связывание и функциональную активность против IL-17а. Анализ на HT-29 IL-17а проводили точно так, как описано выше, за исключением того, что его осуществляли как в присутствии, так и в отсутствие избытка растворимого IL-6R. Вкратце, титрованное количество COVA804 или COVA806 смешивали с IL-17а (1,9 нМ) в присутствии или в отсутствие избытка растворимого IL-6R (20 нМ), а затем эти смеси добавляли к IL-17а-респонсивной клеточной линии HT-29. Затем через 48 часов с помощью ELISA измеряли высвобождение GROα, как описано выше. Секукинумаб использовали в качестве положительного контроля для блокады IL-17а.
Результаты показаны на фигуре 17. Клетки НТ-29 стимулировали рекомбинантным человеческим IL-17а отдельно (верхняя панель) или человеческим IL-17а и растворимым человеческим IL-6R (нижняя панель) в присутствии титруемых количеств COVA804 или COVA806, и оценивали продуцирование GROα с помощью ELISA. Секукинумаб использовался в качестве положительного контроля для блокады IL-17а.
Как показано на фигуре 17 и в таблице 8, COVA804 и COVA806 оба продемонстрировали блокаду IL-17а-индуцированного продуцирования GROα в присутствии избыточного количества растворимого IL-6R, и схожие величины IC50 наблюдали в присутствие и в отсутствие IL -6R. Эти данные свидетельствуют о том, что связывание IL-6R не влияет на способность финомерной части FynomAb связывать и ингибировать IL-17а.
Таблица 8
Фигура 17AIC50
804
806
Секукинумаб
1,077
0,6264
1,283
Фигура 17BIC50
804
806
Секукинумаб
1,112
0,6472
1,766
Аналогичное исследование было проведено с целью оценки блокады IL-6R со стороны FynomAb в присутствии IL-17а (см. фигуру 18).Анализ ингибирования на основе HEK-Blue IL-6R проводили точно так, как описано выше, за исключением того, что его осуществляли как в присутствие, так и в отсутствие 20 нМ рекомбинантного человеческого IL-17а. Концентрация 20 нМ используют потому, что более высокие концентрации IL-17а привели к сильной активации STAT3-индуцируемого гена-репортера SEAP, возможно, из-за того, что IL-17а индуцирует IL-6 в этой клеточной линии. Если коротко, то клетки HEK Blue IL-6 стимулировали с помощью IL-6 (15 мкМ) в присутствие различных концентраций FynomAb COVA803 или COVA804. Ингибиторы предварительно инкубировали с клетками в присутствии или в отсутствие 20 нМ IL-17а за 30 минут до добавления IL-6. COVA803 и COVA804 использовали, потому что эти FynomAb содержат один и тот же финомер, слитый либо с тяжелой, либо с легкой цепью. COVA803 и COVA804 сравнивали с тоцилизумабом (собственного изготовления) по их способности блокировать сигналы IL-6 в присутствие или в отсутствие IL-17а.
Как показано на фигуре 18 и в таблице 9, способность FynomAb и тоцилизумаба блокировать передачу сигнала через IL-6R не зависит от присутствия IL-17а. Схожие величины IC50 получали как в присутствие, так и в отсутствие IL-17а. Эти данные свидетельствуют о том, что связывание IL-17а финомерной частью FynomAb (присоединенной либо к тяжелой, либо к легкой цепи родительского АТ) не влияет на способность FynomAb связывать и ингибировать IL-6R.
Таблица 9
Фигура 18AIC50
803
803+IL-17A
41,73
37,67
Фигура 18BIC50
804
804+ IL-17A
31,19
44,84
Фигура 18CIC50
Тоцилизумаб
Tocil +IL-17A
30,38
27,18
Пример 11
Финомерные полипептиды связываются с гликозилированным человеческим IL-17а с высокой аффинностью
В этом примере показаны выходы экспрессии IL-17а-связывающих финомерных полипептидов и описание этих полипептидов с помощью эксклюзионной хроматографии и поверхностного плазмонного резонанса.
Измерения аффинности
Измерения аффинности проводили с использованием прибора BIAcore T200 (GE Healthcare). Для анализа взаимодействия между гликозилированным IL-17а (собственного изготовления в клетках НЕК EBNA) и мономерных IL-17а-связывающих финомерных полипептидов, чип Series S CM5 (GE Healthcare) использовали с 2000 RU IL-17а иммобилизованным с помощью набора для аминного слияния (GE Healthcare). Подвижным буфером был PBS, содержащий 0,05% Tween 20. Взаимодействия были измерены при расходе 30 мкл/мин. и инъекции различных концентраций IL-17а-связывающих финомерных полипептидов. Все кинетические данные взаимодействия были оценены с использованием программного обеспечения для оценки BIAcore T200.
Свойства связывания
Связующие свойства были проанализированы с помощью анализа взаимодействия в режиме реального времени на чипе BIAcore, выявляющем константы диссоциации (KD) для выбранных IL-17а-связывающих финомерных полипептидов:
Таблица 10. Кинетические константы связывания финомерных IL-17а-связывающих полипептидов с рекомбинантным человеческим гликозилированным IL-17а (полученным в клетках НЕК EBNA).
ФИНОМЕР
SEQ ID NO.
KD (нМ)
1L3-B09
1
245
11L0-C06
2
7
11L5-B06
3
12
11L6-F03
4
11
11L9-C09
5
11
11L10-A05
6
7
11L11-A09
7
24
Данные Примера 11 была раскрыты в WO2014/044758 (РСТ/EP2013/069481).
Пример 12
Финомерные полипептиды ингибируют гликозилированный IL-17а
Клон 1L3-B09 (SEQ ID NO: 1) и пять финомерных полипептидов с наибольшим сродством к IL-17а (11L0-С06, 11L5-B06, 11L6-F03, 11L9-C09, 11L10-A05, SEQ ID NO: 2-6) тестировали на их способность ингибировать IL-17а. Ингибирующую активность указанных IL-17а-связывающих финомерных полипептидов испытывали путем стимуляции фибробластов дермы человека рекомбинантным гликозилированным IL-17а (собственного производства в клетках НЕК EBNA) и рекомбинантного TNFα (Thermo Fisher Scientific) в отсутствие или в присутствие различных концентраций IL-17а-связывающих финомерных полипептидов. Надосадочные жидкости клеточной культуры отбирали через 24 ч после стимуляции и определяли с помощью ELISA в надосадочной жидкости концентрации IL-6. Результаты показывают, что IL-17а-связывающие финомерные полипептиды были способны специфически ингибировать гликозилированный IL-17а.
Методы
Для удаления эндотоксинов белковые растворы фильтровали три раза через мембрану Acrodisc Mustang E (VWR). После фильтрации уровни эндотоксина в белковых растворах, содержащих ингибирующие IL-17а-связывающие финомерные полипептиды составляли менее 0,1 КОЕ/мл, что было определено с помощью теста лизата амебоцитов Limulus (LAL) (PYROGENT Single test Gel Clot LAL Assay (Lonza)). По 100 мкл клеточной суспензии, содержащей около 3900 нормальных человеческих фибробластов дермы (PromoCell, NHDF-с, C12300) распределяли по лункам (96-луночный планшет, TPP или Corning) и культивировали в течение 24 часов при 37°C (среда: ростовая среда для фибробластов C-23010, PromoCell). Надосадочную жидкость аспирировали и после смешивания различных концентраций IL-17а-связывающих финомерных полипептидов со средой, содержащей IL-17A т TNFα (конечные концентрации 1 нг/мл и 50 мкг/мл соответственно), добавляли 100 мкл соответствующего раствора на лунку. В качестве контроля PBS смешивали со средой содержащей IL-17а/TNF (положительный контроль = «без ингибитора») и средой с одиночными цитокинами IL-17а или TNF α по отдельности (последний также является «TNFα-контролем»). В качестве отрицательного контроля PBS смешивали только со средой. Для сравнения анализ также проводили с использованием негликозилированного IL-17а (R & D Systems) в тех же условиях. После 24 часов инкубации при 37°С надосадочную жидкость исследовали в ELISA для определения концентрации IL-6 с использованием набора IL-6 ELISA в соответствии с инструкциями изготовителя (набор IL-6 ELISA, R & D Systems). Процент ингибирования наносили на график и с помощью программного обеспечения Prism 5 рассчитывали величины IC50. Процент ингибирования IL-17а определяли по следующей формуле:
Результаты
Нормальные дермальные фибробласты человека инкубировали с IL-17а/TNFα и различными концентрациями указанных IL-17а-связывающих финомерных полипептидов. Было отмечено, что финомерные полипептиды ингибировали гликозилированный IL-17а. Значения IC50 приведены в таблице 11.
Таблица 11. Значения IC50 для ингибирования гликозилированного IL-17а, полученные для IL-17а-связывающих финомерных полипептидов.
финомер
SEQ ID NO.
Значение IC 50 (нМ)
1L3-B09
1
300
11L0-C06
2
35
11L5-B06
3
43
11L6-F03
4
63
11L9-C09
5
32
11L10-A05
6
28
Дозозависимые кривые ингибирования указанных IL-17а-связывающих финомерных полипептидов, ингибирующих как гликозилированный, так и негликозилированный IL-17а, показаны на фигуре 19.
Было обнаружено, что IL-17а-связывающие финомерные полипептиды способны полностью ингибировать гликозилированный IL-17а с эффективностью, аналогичной негликозилированному IL-17а. Это выгодное свойство по сравнению с IL-17а-связывающими полипептидами из Fyn SH3, описанными ранее в WO2011/023685.
На фигуре 20 показаны три примера IL-17а-связывающих полипептидов из Fyn SH3, описанных в WO2011/023685.
Полученный из Fyn SH3 IL-17-связывающий полипептид 2C1 (SEQ ID No: 107 в WO2011/023685), полученный из Fyn SH3 IL-17-связывающий полипептид A1_2 (SEQ ID NO: 53 в WO2011/023685) и полученный из Fyn SH3 IL-17-связывающий полипептид B1_2 («В1») (SEQ ID NO: 39 в WO2011/023685), или не ингибируют гликозилированный IL-17а полностью даже при высоких концентрациях и/или показывают большие различия в ингибирующей активности (значения IC50) между гликозилированным и негликозилированным IL -17A.
Пример 13
Данные Примера 13 раскрыты в WO2014/044758 (РСТ/EP2013/069481).
Финомерный полипептид 11L11-A09 ингибирует гликозилированный IL-17а
Методы
Финомер 11L11-A09 тестировали на его способность ингибировать IL-17а. Условия исследования были такими же, как описано выше для других финомерных полипептидов.
Результаты
Нормальные дермальные фибробласты человека инкубировали с IL-17а/TNFα и различными концентрациями финомерного полипептида 11L11-A09. Было отмечено, что 11L11-А09 ингибирует гликозилированный IL-17а с IC50, равным 66 нМ (таблица 12).
Таблица 12. Значение IC50 ингибирования гликозилированного IL-17а, полученные для IL-17а-связывающего финомерного полипептида 11L11-A09.
ФИНОМЕР
SEQ ID NO.
Значение IC 50 (нМ)
11L11-A09
7
66
На фигуре 21 показана кривая дозозависимого ингибирования финомерным полипептидом 11L11-A09. 11L11-A09 ингибирует гликозилированный и не гликозилированный IL-17а с сопоставимой активностью и эффективностью.
Пример 14
Фармакокинетические исследования на мышах C57BL/6
Для ранжирования COVA801-808 FynomAb, фармакокинетический профиль всех 8 FynomAb оценивали на мышах C57BL/6.
Введение доз и забор крови
Определение фармакокинетических свойств FynomAb, обозначенных как COVA801, COVA802, COVA803, COVA804, COVA805, COVA806, COVA807, COVA808, и тоцилизумаба осуществляли измерением концентраций с помощью ELISA в сыворотке мышей, взятой в различные моменты времени после однократной ретроорбитальной инъекции. 6-8 недельным самкам мышей C56BL/6 (Charles River, США) внутривенно вводили 10 мг/кг на основании индивидуальной массы. Каждая группа состояла из 5 мышей. Кровь отбирали из каудальной вены (хвостовой вены) через 30 минут, 6, 24, 48, 96, 144, 192, 240 и 288 часов после ретроорбитальной инъекции. Кровь собирали в микроветы с активатором свертывания (CB300, Sarstedt) и сыворотку получали центрифугированием в течение 10 мин. при 10000 оборотах в минуту. Сыворотку хранили при -20°С до анализа.
IL-6R и IL-17а ELISA
Концентрации тестируемых FynomAb и тоцилизумаба в сыворотке определяли с помощью ELISA с использованием иммобилизованного человеческого IL-17 альфа (Cell Signaling Technologies, 8928BF) и рекомбинантного человеческого альфа-IL-6R (R & D Systems, Inc. 227-SR/CF) в планшетах для ELISA с высокой связывающей способностью Nunc (Thermo Scientific, 456537), соответственно. Оба наносили в виде покрытия при 5 мг/мл при 4°С в PBS в течение ночи. Планшеты промывали в PBS + 0,05% Tween (PBST) и блокировали в течение 2 часов BSA (Fischer Scientific, 37525), разбавленным до 1% в PBST. Для каждой мыши и временной точки, разведения сыворотки в 800, 4000 и 20000 раз готовили в блокирующем разбавителе. Соответствующий стандарт для каждого FynomAb готовили путем серийных разведений в блокирующем разбавителе, начиная с 4 нМ с 2 кратным титрованиями (4 нМ-0,03125 нМ). Пятьдесят мкл стандартов (в двух повторах) и разведений сыворотки (в трех повторах) добавляли к планшетам и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза PBST и инкубировали с 50 мкл пероксидазы-AffiniPure козьего антитела против человеческого IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch, 109-035-003), разбавленного в соотношении 1: 5000 в течение 1 часа при комнатной температуре. Планшеты промывали 3 раза PBST. Во все лунки добавляли 50 μл жидкого субстрата ТМВ (Sigma-Aldrich Inc., T0440-1L). Планшеты инкубировали в течение 3 мин. и останавливали реакцию с помощью 50 мкл стоп-раствора. Значения оптической плотности регистрировали при длине волны 405 нм (PHERAstar Plus).
Анализ данных
Сывороточные концентрации для каждой мыши рассчитывали с использованием стандартной кривой и 4 параметрического анализа соответствия (Х значение логарифмическое, Y значение линейное). Для каждой временной точки и мыши, среднюю концентрацию в нM в сыворотке в трех повторах умножали на соответствующий коэффициент разбавления, а затем преобразовали в концентрацию в мкг/мл. Стандартное отклонение и %CV рассчитывали для каждой временной точки и для 3 факторов разбавления. Одно значение с самым низким %CV, которое лучше всего представляет линейную часть стандартной кривой, выбирали в качестве значения для каждой временной точки. Эти величины были подвергнуты фармакокинетическому параметрическому анализу (Phoenix 64, WinNonlin 6.3). Период полужизни (ч), площадь под кривой (AUC; ч * мкг/мл), объем распределения (Vz; мл) и клиренс (Cl, мл/ч) рассчитывали с использованием некомпартментного фармакокинетического анализа, тип модели: Плазма (200-202), метод расчета: Линейная Трапециеидальная Линейная Интерполяция. Стандартные кривые для каждой мыши, основанные на равномерном взвешивании и на расчете лучшего соответствия лямбда Z, требовали не менее 3 точек данных в регрессии, и не включали Cmax.
Результаты
Концентрации в сыворотке и фармакокинетические параметры каждого FynomAb и тоцилизумаба приведены в таблицах 13-21. Несмотря на то, что IL-6R и IL-17а ELISA использовали для расчета сывороточные концентрации крови и фармакокинетических параметров, только данные по IL-6R представлены в данном документе. Однако аналогичные сывороточные концентрации крови и фармакокинетические параметры определялись из данных IL-17а ELISA. Таким образом, концентрация в сыворотке крови в зависимости от времени для двух различных способов ELISA очень похожи для каждого FynomAb (см. фигуры 22-25). Эти данные демонстрируют, что FynomAb стабильны in vivo, и что сохраняется их способность связывать как IL-6R, так и IL-17а. В целом, результаты данного фармакокинетического исследования согласуются с ранее полученными данными в той же линии мышей.
Таблицы 13А и 13В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры тоцилизумаба.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площадь под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А.
Таблица 13А
Тоцилизумаб (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Мышь 1
Мышь 2
Мышь 3
Мышь 4
Мышь 5
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,5
319,00
299,66
270,66
261,00
309,33
291,93
25,02
6
435,00
222,33
251,33
328,66
270,66
301,60
84,10
24
232,00
232,00
222,33
261,00
174,00
224,27
31,62
48
251,33
183,67
164,33
232,00
145,00
195,27
45,03
96
174,00
133,40
116,00
174,00
87,00
136,88
37,72
144
143,07
116,00
106,33
222,33
106,33
138,81
49,05
192
116,00
87,00
104,40
145,00
75,40
105,56
27,02
240
58,00
63,80
58,00
87,00
50,27
63,41
14,03
Таблица 13B
Фармакокинетические параметры
Тоцилизумаб (IL-6R)
Мышь ID
Период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
99,67
0,028
0,00020
42167,16
2
111,30
0,037
0,00023
32673,59
3
126,63
0,043
0,00024
31425,15
4
70,92
0,018
0,00018
46549,51
5
88,81
0,038
0,00030
27087,75
Среднее
99,47
0,033
0,00023
35980,63
СТАНДОТКЛ
21,25
0,010
0,00005
8073,83
Таблицы 14А и 14В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA801.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 14А
COVA801 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Мышь 1
Мышь 2
Мышь 3
Мышь 4
Мышь 5
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,5
355,56
355,56
204,72
422,36
430,98
353,83
90,68
6
258,59
409,43
196,10
275,83
284,45
284,88
77,73
24
159,46
209,02
135,76
161,62
183,17
169,81
27,61
48
96,97
144,38
96,97
129,29
118,52
117,23
20,65
96
64,65
96,97
75,42
96,97
84,04
83,61
14,00
144
38,79
103,43
114,21
90,51
120,67
93,52
32,67
192
51,72
64,65
58,18
45,25
58,18
55,60
7,37
240
38,79
38,79
43,10
38,79
45,25
40,94
3,05
Таблица 14В
Фармакокинетические параметры
COVA 801 (IL-6R)
Мышь ID
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
94,41
0,055
0,00041
19322,94
2
67,84
0,030
0,00030
29118,09
3
68,28
0,037
0,00038
22189,49
4
104,49
0,049
0,00033
24658,46
5
67,84
0,032
0,00032
26453,49
Среднее
80,57
0,041
0,00035
24348,49
СТАНДОТКЛ
17,60
0,011
0,00004
3781,32
Таблицы 15А и 15В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA802.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 15А
COVA802(IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Мышь 1
Мышь 2
Мышь 3
Мышь 4
Мышь 5
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,5
193,94
258,59
340,47
297,38
269,36
271,95
53,88
6
131,45
247,81
226,26
258,59
193,94
211,61
51,16
24
129,29
161,62
129,29
161,62
122,83
140,93
19,07
48
96,97
140,07
88,35
129,29
120,67
115,07
21,80
96
64,65
88,35
62,49
109,90
84,04
81,89
19,39
144
45,25
77,58
56,03
99,13
25,86
60,77
28,44
192
30,17
53,87
43,10
64,65
30,60
44,48
14,95
240
16,81
45,25
32,32
23,27
20,26
27,58
11,44
Таблица 15В
Фармакокинетические параметры
COVA 802 (IL-6R)
Мышь ID
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
77,02
0,064
0,00058
15459,11
2
116,06
0,053
0,00032
23760,41
3
120,98
0,073
0,00042
18109,20
4
45,92
0,024
0,00037
25673,85
5
71,45
0,053
0,00052
17240,67
Среднее
86,28
0,054
0,00044
20048,64
СТАНДОТКЛ
31,72
0,018
0,00011
4419,56
Таблицы 16А и 16В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA803.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 16А
COVA803 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Мышь 1
Мышь 2
Мышь 3
Мышь 4
Мышь 5
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,5
355,21
430,56
441,32
402,57
376,74
401,28
36,01
6
236,81
236,81
230,35
236,81
245,42
237,24
5,36
24
129,17
129,17
135,63
122,71
157,15
134,76
13,32
48
90,42
81,81
127,01
129,17
114,10
108,50
21,45
96
71,04
64,58
83,96
81,81
79,65
76,21
8,14
144
64,58
58,13
73,19
68,89
73,19
67,60
6,39
192
47,36
31,43
49,51
49,51
45,21
44,61
7,58
240
38,75
25,83
30,14
36,60
38,75
34,01
5,78
Таблица 16В
Фармакокинетические параметры
COVA 803 (IL-6R)
Мышь ID
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
158,43
0,081
0,00035
19528,98
2
99,28
0,067
0,00047
17750,35
3
74,99
0,043
0,00039
22094,56
4
105,20
0,056
0,00037
21705,44
5
110,88
0,057
0,00036
21858,29
Среднее
109,76
0,061
0,00039
20587,53
СТАНДОТКЛ
30,45
0,014
0,00005
1891,15
Таблицы 17А и 17В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA804.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 17А
COVA804 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Мышь 1
Мышь 2
Мышь 3
Мышь 4
Мышь 5
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,5
441,32
419,79
387,50
376,74
398,27
404,72
25,92
6
419,79
312,15
292,78
262,64
226,04
302,68
73,11
24
215,28
202,36
167,92
144,24
161,46
178,25
29,57
48
178,68
176,53
142,08
129,17
129,17
151,13
24,75
96
129,17
142,08
129,17
92,57
122,71
123,14
18,48
144
96,88
124,86
131,32
103,33
116,25
114,53
14,39
192
66,74
101,18
94,72
96,88
73,19
86,54
15,48
240
24,54
75,35
75,35
53,82
64,58
58,73
21,09
Таблица 17B
Фармакокинетические параметры
COVA 804 (IL-6R)
Мышь ID
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
69,55
0,029
0,00029
31852,27
2
160,73
0,044
0,00019
35010,19
3
119,78
0,038
0,00022
32102,31
4
190,81
0,065
0,00024
27240,23
5
171,03
0,056
0,00023
28424,82
Среднее
142,38
0,047
0,00023
30925,96
СТАНДОТКЛ
48,26
0,014
0,00004
3113,00
Таблицы 18А и 18В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA805.
(А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 18А
COVA805 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Мышь 1
Мышь 2
Мышь 3
Мышь 4
Мышь 5
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,5
336,10
323,17
463,21
264,78
290,85
335,62
76,58
6
185,28
165,89
193,90
172,36
159,43
175,37
14,09
24
99,11
86,18
96,95
95,87
92,64
94,15
5,03
48
84,02
73,25
66,79
58,82
73,25
71,23
9,30
96
64,63
45,24
48,69
43,95
58,17
52,14
8,93
144
51,71
40,50
0,00
43,74
45,24
36,24
20,66
192
25,42
32,32
32,32
32,32
32,32
30,94
3,08
240
19,82
25,85
26,28
19,35
23,70
23,00
3,27
Таблица 18B
Фармакокинетические параметры
COVA 805 (IL-6R)
Мышь ID
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
90,72
0,072
0,00055
15571,82
2
148,22
0,111
0,00052
13653,16
3
161,96
0,113
0,00048
14571,72
4
81,58
0,076
0,00065
13174,81
5
102,91
0,083
0,00056
14412,29
Среднее
117,08
0,091
0,00055
14276,76
СТАНДОТКЛ
35,84
0,020
0,00006
920,02
Таблицы 19А и 19В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA806.
(А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 19А
COVA806 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Мышь 1
Мышь 2
Мышь 3
Мышь 4
Мышь 5
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,5
258,54
321,02
312,40
355,49
333,94
316,28
36,13
6
183,13
215,45
185,28
226,22
226,22
207,26
21,51
24
96,95
129,27
129,27
109,88
124,96
118,06
14,24
48
68,94
105,57
105,57
88,33
94,80
92,64
15,16
96
62,48
79,72
77,56
66,79
86,18
74,54
9,71
144
51,71
71,10
68,94
73,25
58,17
64,63
9,27
192
43,09
51,71
58,17
51,71
40,93
49,12
7,05
240
38,78
38,78
38,78
45,24
21,54
36,63
8,88
Таблица 19В
Фармакокинетические параметры
COVA 806 (IL-6R)
Мышь ID
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч*мкг/мл)
1
218,56
0,112
0,00036
15925,26
2
109,78
0,059
0,00037
20661,31
3
137,35
0,071
0,00036
20384,46
4
184,33
0,084
0,00032
19501,67
5
73,77
0,050
0,00047
19107,40
Среднее
144,76
0,075
0,00037
19116,02
СТАНДОТКЛ
57,73
0,024
0,00006
1892,53
Таблицы 20А и 20В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA807.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 20А
COVA807 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Мышь 1
Мышь 2
Мышь 3
Мышь 4
Мышь 5
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,5
505,82
404,66
441,25
368,07
374,52
418,86
56,59
6
320,71
355,15
245,38
226,01
192,43
267,94
67,75
24
222,78
234,62
154,98
129,15
127,21
173,74
51,52
48
204,48
139,91
137,76
187,26
106,76
155,23
39,82
96
161,43
161,43
120,54
94,71
92,34
126,09
34,11
144
129,15
152,82
109,77
109,77
70,17
114,34
30,38
192
71,03
103,32
75,34
79,64
72,32
80,33
13,27
240
66,73
55,96
71,03
64,57
53,17
62,29
7,49
Таблица 20B
Фармакокинетические параметры
COVA 807 (IL-6R)
Мышь ID
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
106,59
0,033
0,00021
36284,17
2
66,24
0,023
0,00024
36737,27
3
186,18
0,056
0,00021
28796,38
4
125,40
0,045
0,00025
28400,87
5
187,97
0,074
0,00027
22447,23
Среднее
134,48
0,046
0,00024
30533,18
СТАНДОТКЛ
52,56
0,020
0,00003
6010,62
Таблицы 21А и 21В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA808.
A) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 21А
COVA808 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Мышь 1
Мышь 2
Мышь 3
Мышь 4
Мышь 5
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,5
226,01
256,14
290,58
408,96
279,82
292,30
69,77
6
172,20
191,57
163,59
288,43
204,48
204,05
49,82
24
129,15
161,43
96,86
129,15
126,99
128,72
22,85
48
90,40
124,84
77,49
126,99
161,43
116,23
33,17
96
77,49
90,40
66,73
96,86
109,77
88,25
16,74
144
77,49
96,86
64,57
105,47
96,86
88,25
16,74
192
51,66
58,12
49,51
73,18
75,34
61,56
12,04
240
45,20
21,09
40,90
66,73
27,98
40,38
17,63
Таблица 21В
Фармакокинетические параметры
COVA 808 (IL-6R)
Мышь ID
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
158,86
0,076
0,00033
19671,12
2
43,65
0,026
0,00041
23188,10
3
145,68
0,081
0,00039
17277,61
4
220,91
0,066
0,00021
26725,74
5
85,72
0,042
0,00034
25926,65
Среднее
130,96
0,058
0,00034
22557,84
СТАНДОТКЛ
68,48
0,024
0,00008
4041,39
На фигуре 22 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для COVA801 и COVA802.
Средние сывороточные концентрации +/- стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ), определенные либо с помощью IL6R ELISA, либо с помощью IL-17а ELISA, показаны для COVA801 и COVA802 с тоцилизумабом (IL-6R ELISA) в качестве сравнения.
На фигуре 23 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для COVA803 и COVA804.
Средние сывороточные концентрации +/- стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ), определенные либо с помощью IL6R ELISA, либо IL-17а ELISA, показаны для COVA803 и COVA804 с тоцилизумабом (IL-6R ELISA) в качестве сравнения.
На фигуре 24 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для COVA805 и COVA806.
Средние сывороточные концентрации +/- стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ), определенные либо с помощью IL6R ELISA, либо с помощью IL-17а ELISA, показаны для COVA805 и COVA806 с тоцилизумабом (IL-6R ELISA) в качестве сравнения.
На фигуре 25 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для COVA807 и COVA808.
Средние сывороточные концентрации +/- стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ), определенные либо с помощью IL6R ELISA, либо с помощью IL-17а ELISA, показаны для COVA807 и COVA808 с тоцилизумабом (IL-6R ELISA) в качестве сравнения.
Пример 15
Фармакокинетические исследования на яванских макаках
Введение доз, отбор проб крови
Определение фармакокинетических свойств FynomAb, обозначенных как COVA801, COVA802, COVA803, COVA804, COVA806, COVA808, и тоцилизумаба, проводили путем измерения концентрации с помощью ELISA в сыворотке макак, взятой в различные моменты времени после однократной инъекции. Самцам и самкам обезьян внутривенно вводили 5 мг/кг дозы на основании индивидуальной массы. Каждая группа состояла из 4-х обезьян. Кровь отбирали через 5 мин., 30 мин., 2 ч., 6 ч., 24 ч., 3 дня, 4 дня, 5 дней, 7 дней, 10 дней, 13 дней, 17 дней, 22 дня и 27 дней после инъекции. Кровь собирали в пробирки без каких-либо антикоагулянтов и получали сыворотку центрифугированием в течение 1-2 мин. при 10000 оборотах в минуту. Сыворотку хранили при -80°С до анализа.
IL-6R и IL-17а ELISA
Сывороточные концентрации тестируемых FynomAb и Тоцилизумаба определяли с помощью ELISA в соответствии с протоколом, изложенным выше для фармакокинетических исследований на мышах.
Анализ данных
Сывороточные концентрации для каждой обезьяны рассчитывали с использованием стандартной кривой и 4 параметрического анализа соответствия (X значение логарифмическое, Y значение линейное). Для каждой временной точки и обезьяны, среднюю концентрацию в нМ в сыворотке двух повторов умножали на соответствующий коэффициент разбавления, а затем преобразовывали в мкг/мл. СТАНДОТКЛ и %CV вычисляли для каждой временной точки и для 3-х факторов разбавления. Одно значение с самым низким %CV, которое лучше всего представляет линейную часть стандартной кривой, выбирали в качестве значения для каждой временной точки. Эти величины были подвергнуты фармакокинетическому параметрическому анализу (Phoenix 64, WinNonlin 6.3). Период полужизни (ч), площадь под кривой (AUC; ч * мкг/мл), объем распределения (Vz; мл) и клиренс (Cl, мл/ч) рассчитывали с использованием некомпартментного фармакокинетического анализа, тип модели: Плазма (200-202), метод расчета: Линейная Трапециеидальная Линейная Интерполяция. Стандартные кривые для каждой обезьяны, основанные на равномерном взвешивании и на расчете лучшего соответствия лямбда Z, требовали не менее 3 точек данных в регрессии, и не включали Cmax.
Результаты
Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры каждого FynomAb и тоцилизумаба приведены в таблицах 22-28. Несмотря на то, что как IL-6R ELISA, так и IL-17а ELISA использовали для расчета сывороточных концентраций и фармакокинетических параметров, в данном документе представлены только данные по IL-6R. Однако аналогичные сывороточные концентрации крови и фармакокинетические параметры определялись из данных IL-17а ELISA. Таким образом, сывороточная концентрация в зависимости от времени для двух различных методов ELISA очень похожи для каждого FynomAb (см. фигуры 26-29). Эти данные демонстрируют, что FynomAb стабильны in vivo, и что сохраняется их способность связывать как IL-6R, так и IL-17а.
В общем, все FynomAb показали благоприятные фармакокинетические профили, и ни один из FynomAb не были быстро выведен из кровообращения. COVA804 по-видимому, имеет наиболее благоприятный фармакокинетический профиль PK с лучшим значением AUC, которое очень похоже на значение для тоцилизумаба.
Таблицы 22А-22В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры тоцилизумаба в яванских макаках.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А.
Таблица 22А
Тоцилизумаб (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Обезьяна 1
Обезьяна 2
Обезьяна 3
Обезьяна 4
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,083
141,52
168,20
121,51
129,05
140,07
20,49
0,5
139,20
131,37
91,35
116,29
119,55
21,07
6
95,70
118,90
88,45
109,04
103,02
13,59
24
76,85
88,45
76,85
100,05
85,55
11,11
72
62,35
65,83
46,40
92,80
66,84
19,26
120
40,60
40,89
37,70
69,60
47,20
15,00
168
27,84
33,06
25,81
63,80
37,63
17,71
240
22,62
22,91
21,17
32,19
24,72
5,04
312
11,54
14,67
7,02
21,46
13,67
6,07
408
5,10
3,31
8,64
5,68
2,71
528
2,44
2,44
Таблица 22В
Фармакокинетические параметры
Тоцилизумаб (IL-6R)
ID Обезьяны
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
68,09
0,035
0,00036
13880,12
2
86,91
0,041
0,00033
14893,51
3
92,55
0,055
0,00041
11238,18
4
68,68
0,022
0,00023
21782,04
Среднее
79,05
0,038
0,00033
15448,47
СТАНДОТКЛ
12,54
0,013
0,00008
4494,75
Таблицы 23А-23B.Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA801 в яванских макаках.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 23А
COVA801 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Обезьяна 1
Обезьяна 2
Обезьяна 3
Обезьяна 4
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,083
177,78
119,60
161,62
174,55
158,38
26,78
0,5
189,09
112,16
132,53
126,06
139,96
33,84
6
136,08
84,04
109,90
106,67
109,17
21,31
24
83,72
66,59
74,34
67,88
73,13
7,83
72
48,81
52,04
58,18
58,18
54,30
4,67
120
36,53
27,54
32,32
38,79
33,79
4,96
168
21,66
19,59
25,86
19,39
21,62
3,00
240
10,67
9,37
12,93
8,40
10,34
1,96
312
4,27
2,91
0,16
408
528
Таблица 23В
Фармакокинетические параметры
COVA 801 (IL-6R)
ID Обезьяны
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
62,71
0,039
0,00043
11282,55
2
64,86
0,049
0,00052
9321,33
3
84,64
0,050
0,00041
10538,40
4
54,77
0,037
0,00047
10030,71
Среднее
66,74
0,044
0,00046
10293,25
СТАНДОТКЛ
12,70
0,007
0,00005
827,12
Таблицы 24A-24B. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA802 в яванских макаках.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 24А
COVA802 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Обезьяна 1
Обезьяна 2
Обезьяна 3
Обезьяна 4
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,083
131,88
118,63
103,43
129,29
120,81
12,93
0,5
110,22
115,07
96,97
109,90
108,04
7,75
6
91,48
74,34
54,95
96,97
79,43
18,96
24
56,57
53,98
51,72
77,58
59,96
11,91
72
40,73
43,31
42,02
51,72
44,44
4,96
120
22,30
21,92
32,32
38,79
28,83
8,20
168
11,64
15,84
19,39
21,98
17,21
4,49
240
6,53
10,54
12,93
14,87
11,22
3,59
312
2,72
5,82
408
528
Таблица 24B
Фармакокинетические параметры
COVA 802 (IL-6R)
ID Обезьяны
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
66,00
0,060
0,00063
7259,29
2
70,05
0,061
0,00061
7962,71
3
103,17
0,076
0,00051
7862,69
4
78,34
0,048
0,00043
10999,95
Среднее
79,39
0,062
0,00055
8521,16
СТАНДОТКЛ
16,66
0,011
0,00009
1681,48
Таблицы 25A-25B. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA803 в яванских макаках.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 25А
COVA803 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Обезьяна 1
Обезьяна 2
Обезьяна 3
Обезьяна 4
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,083
125,94
129,29
129,29
142,22
131,69
7,20
0,5
132,40
117,98
106,67
135,76
123,20
13,45
6
119,48
83,07
67,88
119,60
97,51
26,18
24
83,96
59,48
58,18
84,04
71,41
14,54
72
54,90
44,61
45,25
54,95
49,93
5,78
120
32,29
25,86
32,32
38,79
32,32
5,28
168
9,69
19,07
20,04
25,86
18,66
6,69
240
10,86
11,64
12,93
11,81
1,05
312
2,91
3,23
6,46
408
528
Таблица 25B
Фармакокинетические параметры
COVA 803 (IL-6R)
ID Обезьяны
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
48,48
0,036
0,00052
9015,21
2
51,32
0,032
0,00043
11191,67
3
67,61
0,037
0,00038
12088,07
4
45,28
0,055
0,00084
5844,74
Среднее
53,17
0,040
0,00054
9534,92
СТАНДОТКЛ
9,93
0,010
0,00021
2777,94
Таблицы 26А-26В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA804 в яванских макаках.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких, как период полужизни, объем распределения (Vz), клиренс (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 26А
COVA804 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Обезьяна 1
Обезьяна 2
Обезьяна 3
Обезьяна 4
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,083
226,04
309,36
238,96
263,50
259,46
36,71
0,5
203,44
269,64
227,66
201,82
225,64
31,62
6
177,60
140,47
157,91
205,70
170,42
27,99
24
116,25
158,23
115,28
125,61
128,84
20,14
72
83,96
77,50
96,23
82,99
85,17
7,90
120
61,35
50,38
54,90
49,73
54,09
5,36
168
38,75
31,65
29,06
26,80
31,57
5,18
240
23,90
19,83
17,05
20,26
3,44
312
12,92
2,52
408
4,52
528
Таблица 26В
Фармакокинетические параметры
COVA 804 (IL-6R)
ID Обезьяны
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
69,55
0,026
0,00026
18904,03
2
74,29
0,030
0,00028
14644,67
3
76,60
0,030
0,00027
16104,51
4
54,49
0,024
0,00030
16522,15
Среднее
68,73
0,027
0,00028
16543,84
СТАНДОТКЛ
9,94
0,003
0,00002
1767,38
Таблицы 27A-27B. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA806 в яванских макаках.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких как период полураспада, объем распределения (Vz), клиренса (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 27А
COVA806 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Обезьяна 1
Обезьяна 2
Обезьяна 3
Обезьяна 4
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,083
182,27
156,74
193,90
185,82
179,68
16,05
0,5
166,11
141,23
190,67
168,05
166,51
20,21
6
124,42
121,19
161,58
118,60
131,45
20,23
24
70,45
74,33
96,95
53,65
73,84
17,83
72
52,03
63,02
64,63
42,01
55,42
10,55
120
33,29
34,26
38,78
24,24
32,64
6,09
168
25,85
29,09
32,32
14,87
25,53
7,58
240
10,73
16,80
13,57
13,70
3,04
312
6,92
408
528
Таблица 27В
Фармакокинетические параметры
COVA 806 (IL-6R)
ID Обезьяны
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
81,01
0,050
0,00043
10356,49
2
81,60
0,045
0,00038
12207,01
3
78,52
0,039
0,00034
13102,11
4
64,05
0,054
0,00058
7244,31
Среднее
76,29
0,047
0,00043
10727,48
СТАНДОТКЛ
8,27
0,007
0,00010
2588,31
Таблицы 28А-28В. Сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры COVA808 в яванских макаках.
А) Показаны сывороточные концентрации для каждой временной точки, определенные с помощью ELISA (IL-6R). Также отображены средние значения и стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ). (B) Сводка важных фармакокинетических параметров, таких как период полураспада, объем распределения (Vz), клиренса (Cl) и площади под кривой (AUC). Эти параметры рассчитывали с использованием сывороточных концентраций, представленных в А. Схожие сывороточные концентрации и фармакокинетические параметры определяли с помощью IL-17а ELISA.
Таблица 28А
COVA808 (IL-6R)
Концентрация (мкг/мл)
Время (ч)
Обезьяна 1
Обезьяна 2
Обезьяна 3
Обезьяна 4
Среднее (мкг/мл)
СТАНДОТКЛ
0,083
200,18
175,96
129,15
163,05
167,08
29,61
0,5
217,61
172,41
109,77
164,02
165,95
44,23
6
151,75
109,77
96,86
106,55
116,23
24,30
24
79,10
80,39
61,34
71,03
72,97
8,79
72
77,49
65,54
45,20
54,56
60,70
13,94
120
36,16
37,13
32,29
31,32
34,22
2,85
168
22,02
36,81
32,29
17,37
27,12
8,97
240
14,53
20,34
12,91
5,29
13,27
6,20
312
408
528
Таблица 28B
Фармакокинетические параметры
COVA 808 (IL-6R)
ID Обезьяны
период полужизни (ч)
Vz (мл)
Cl (мл/ч)
AUC (ч * мкг/мл)
1
92,98
0,047
0,00035
12386,59
2
102,19
0,048
0,00033
12365,78
3
87,98
0,056
0,00044
9641,05
4
46,38
0,034
0,00051
9477,10
Среднее
82,38
0,046
0,00041
10967,63
СТАНДОТКЛ
24,71
0,009
0,00008
1627,86
На фигуре 26 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для COVA801 и COVA802 в яванских макаках. На фигуре 26, средние сывороточные концентрации +/- стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ), определенные либо с помощью IL6R ELISA, либо с помощью IL-17а ELISA, показаны для COVA801 и COVA802 с тоцилизумабом (IL-6R ELISA) в качестве сравнения.
На фигуре 27 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для COVA803 и COVA804 в яванских макаках. На фигуре 27, средние сывороточные концентрации +/- стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ), определенные либо с помощью IL6R ELISA, либо с помощью IL-17а ELISA, показаны для COVA803 и COVA804 с тоцилизумабом (IL-6R ELISA) в качестве сравнения.
На фигуре 28 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для COVA806 в яванских макаках. На фигуре 28, средние сывороточные концентрации +/- стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ), определенные либо с помощью IL6R ELISA, либо с помощью IL-17а ELISA, показаны для COVA806 с тоцилизумабом (IL-6R ELISA) в качестве сравнения.
На фигуре 29 показаны средние сывороточные концентрации, нанесенные на график в зависимости от времени для COVA808 в яванских макаках. На фигуре 29, средние сывороточные концентрации +/- стандартное отклонение (СТАНДОТКЛ), определенные либо с помощью IL6R ELISA, либо с помощью IL-17а ELISA, показаны для COVA808 с тоцилизумабом (IL-6R ELISA) в качестве сравнения.
Сводка примеров
Данные, представленные в данном документе, показывают, что все 8 FynomAb могут связывать и функционально блокировать как IL-17а, так и IL-6R. Все 8 конструкций имели весьма сходные аффинности к IL-17а и IL-6R, и имели похожую функциональную активность в клеточных анализах, а слияние легкой цепи и финомера (FynomAb, обозначенные как COVA802, COVA804, COVA806 и COVA808) имели лучшие профили эксклюзионной хроматографии и были менее склонны к агрегации.