СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРЕБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ
AGENT WITH PREBIOTIC ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средства, способного оказывать благоприятное действие на организм человека через стимуляцию роста представителей симбионтной микрофлоры кишечника, снижать численность патогенной микрофлоры.
Известны препараты, проявляющие пребиотические свойства - лактулоза (дюфалак), хилак-форте, эубикор, свойствам пребиотиков отвечают инулин, лактилол, галактоолигосахариды, фруктоолигосахариды [1, 3, 4].
Наиболее близким (прототипом) является лекарственное средство - эубикор, обладающее как пребиотическим, так и энтеросорбционным действием. Эубикор позволяет в более ранние сроки добиться снижения выраженности клинических симптомов дисбактериоза, обладает антиаллергическим эффектом, антиоксидантной активностью [4].
Задачей изобретения является расширение арсенала пребиотических средств, способных оказывать не только благоприятное действие на организм человека через стимуляцию роста представителей симбионтной микрофлоры кишечника, создания условий для собственно пробиотиков, но и одновременного снижения численности патогенной микрофлоры. Доказано, что известные бифидогенные факторы (галактоолигосахариды, фруктоолигосахариды и т.д.) в основном метаболизируются лактобактериями и бифидобактериями, что является оптимальным подходом к коррекции дисбиозов. Но, при известных условиях (прием антибиотиков, вирусные и антибактериальные инфекции, стресс и т.д.) происходят нарушения в составе и функциях нормальной и сапрофитной микрофлоры, индуцируемые возбудителями кишечных заболеваний и ростом условно-патогенных микроорганизмов. Поэтому создание адекватного пребиотика для разных клинических ситуаций (лучевая болезнь, применение химиотерапии и антибиотиков, хронические воспалительные и аллергические заболевания) является насущным и перспективным направлением для отечественной фармацевтической промышленности. Кроме того, необходимо отметить отсутствие отечественных лекарственных препаратов с таким комплексным действием (пребиотическим и бактериостатическим), а в составе БАД встречаются, главным образом, нестандартизованные полисахариды.
Поставленная задача достигается использованием в качестве пребиотического средства низкоэтерифицированного некрахмального полисахарида со степенью этерификации - 1,2%, молекулярной массой - 39,3 кДа - пектата кальция, полученного из коммерческого цитрусового высокоэтерифицированного пектина (Copenhagen Pectin A/S, Lille Scensved, Дания). Пектат кальция представляет собой сухой белый порошок и имеет следующие физико-химические характеристики: содержание ангидрогалактуроновой кислоты - 67,3% и кальция - 38 мг/г образца, степень этерификации - 1,2%, молекулярная масса - 39,3 кДа.
Пектат кальция получали из коммерческого пищевого цитрусового пектина методом ионного обмена в неводной среде. На первом этапе проводили щелочную деэтерификацию пектина. Для этого 100 г пектина суспендировали в 500 мл 50 об.% этанола, нагретого до 40°С. Смесь перемешивали при данной температуре в течение 25-30 мин и фильтровали через бязевый фильтр под вакуумом. Пектин на фильтре промывали 400 мл 50 об.% этанола. Промытый пектин суспендировали в 500 мл 50 об.% этанола и термостатировали при температуре 10-15°С. Затем к смеси добавляли 0,02 г индикатора тимолфталеина и при постоянном перемешивании, постепенно, порциями по 50 мл добавляли 1 М раствор NaOH в 50 об.% этаноле. Каждую последующую порцию NaOH добавляли только после обесцвечивания окраски индикатора. Температуру смеси поддерживали в диапазоне 10-15°С. Процесс заканчивали, когда после добавления очередной порции NaOH не происходило изменение окраски индикатора в течение 1 часа. По окончании процесса полученную смесь нейтрализовали добавлением 100 мл 1 М раствора HCl в 50 об.% этаноле, фильтровали через бязевый фильтр под вакуумом и затем промывали 400 мл 50 об.% этанола.
На втором этапе промытый пектин суспендировали в 500 мл 50 об.% этанола и при непрерывном перемешивании постепенно добавляли 20 г хлористого кальция, растворенного в 200 мл 50 об.% этанола. Смесь перемешивали еще в течение 20 минут и фильтровали через бязевый фильтр под вакуумом. Образовавшийся пектат кальция промывали на фильтре последовательно 400 мл 50 об.% этанола, 200 мл 70 об.% этанола и 200 мл 95 об.% этанола. Промытый пектат кальция сушили при 80°С до остаточной влажности не более 6%.
Катион-связывающая способность пектинов обусловлена наличием в их структуре неэтерифицированных карбоксильных групп остатков галактуроновой кислоты [6]. Деметилированные пектины формируют гель в присутствии кальция благодаря образованию ионных поперечных связей между цепями гомогалактурононана. Механизм гелеобразования до конца не ясен, хотя одна из возможных моделей ("egg-box") заслуживает внимания. Согласно данной модели поперечно-сшитые контактные зоны предположительно формируются между кальцием и, как минимум, шестью смежными неэтерифицированными остатками галактуроновой кислоты. В результате образуется полимерная сеть, обладающая способностью удерживать молекулы воды. Гелеобразующая способность пектинов и его физико-химические свойства определяются степенью этерификации карбоксильных групп галактуроновой кислоты и их взаимодействием с двухвалентными электронами, преимущественно с кальцием.
Низкая степень этерификации (1,2%) и молекулярная масса (39,3 кДа) пектата кальция, полученного в результате направленной химической трансформации, позволили получить выраженный пребиотический эффект на штаммах Escherichia coli (непатогенный), бифидо- и лактобактерий. Вышесказанное вполне вписывается в рамки существующей концепции о преимущественной активности в качестве пребиотиков полисахаридов с короткой цепью. Сравнительное изучение этой группы веществ показало, что чем короче цепь полисахаридов, тем меньше специфичность, а соответственно, эффективность ферментации определенными микроорганизмами кишечника.
Известны экспериментальные данные по оценке сорбционной активности пектата кальция, которые позволяют рекомендовать препараты на его основе для клинических исследований с целью создания новых средств профилактики и фармакотерапии хронических отравлений тяжелыми металлами [5, 6]. Пектат кальция проявляет максимальную металлосвязывающую активность, сравнимую с полифепаном и активированным углем. Препараты на его основе могут применяться энтерально в течение длительного периода времени без риска возникновения нежелательных эффектов для фармакологической коррекции функциональных нарушений внутренних органов, вызванных неблагоприятной экологической обстановкой. Резюмируя вышеприведенные данные можно утверждать о сходных с эубикором фармакологических эффектах: энтеросорбционным, антиаллергическим, антиоксидантным.
Стандартизованный пектат кальция повышает резистентность слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки животных к агрессивным факторам ульцерогенеза при лечебно-профилактическом внутрижелудочном введении [2, 5]. При этом гастрозащитная активность пектата кальция была сопоставима или превосходила эффекты препаратов сравнения: фамотидина, масла облепихового, маалокса на различных модельных системах. Показано, что пектат кальция физиологически оптимально стимулирует моторно-эвакуаторную функцию желудочно-кишечного тракта животных в норме и при язвенной патологии, обладает умеренным спазмолитическим эффектом, сравнимым с действием дротаверина.
Принципиально новым в предлагаемом изобретении является то, что низкоэтерифицированный пектат кальция (степень этерификации - 1,2%, молекулярная масса - 39,3 кДа) применяется в качестве средства, не содержащего живых микроорганизмов, способного не только стимулировать рост представителей симбионтной микрофлоры кишечника, подавлять численность патогенной микрофлоры in vitro.
Использование некрахмального полисахарида пектата кальция как пребиотического средства в литературе не описано. Эти новые свойства пектата кальция явным образом не вытекают из уровня техники и не очевидны для специалиста. Низкоэтерифицированный пектат кальция может быть использован в терапии дисбактериоза кишечника - клинико-лабораторного синдрома, возникающего при целом ряде патологических состояний и факторов риска, назначаться как в сочетании с собственно пробиотиками, так и в виде монотерапии. Препарат может выпускаться в лекарственной форме и в виде биологически активных добавок.
Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленно применимо».
Новые свойства препарата были найдены экспериментальным путем. Изобретение будет понятно из следующего описания.
В качестве тест-объектов использованы музейные штаммы Escherichia coli (непатогенный), Candida albicans, полученные из музея культур кафедры микробиологии СибГМУ, обладающие всеми типичными свойствами для данного вида микроорганизмов. Штаммы бифидо- и лактобактерий получены из сухого стандартизованного порошка производства НПО «Вирион» (г.Томск) путем разведения и трехкратного пересева с последующей окраской по Граму и идентификацией под микроскопом.
Для посева культур были использованы стандартизованные питательные среды: бифидоагар, мясопептонный агар и бульон, среда Сабуро. Питательные среды готовили в соответствии с прилагающимися инструкциями.
Постановка экспериментов по изучению влияния пектата кальция на рост штаммов Esherichia coli и Candida albicans
2
Для посева были использованы суточные культуры микроорганизмов в разведении 500 микробных тел (по стандарту мутности), которые контролировали микроскопически. К взвеси микроорганизмов в мясопептонном бульоне был добавлен стерильный физиологический раствор (контрольные пробирки) или раствор пектата кальция (на физ. растворе) в концентрации 2% и 4%. Для достоверности результатов пробирки дублировались. Через 4, 24 и 48 ч производили посев культур из пробирок на чашки Петри в количестве 0,05 мл, стеклянным стерильным шпателем равномерно распределяя по поверхности питательной среды (для Е. coli - мясопептонный агар, для С. albicans - среда Сабуро), посев помещали в термостат с температурой 37°С на 24 ч. По истечении суток подсчитывали количество выросших колоний на 1 см(по 4 измерения на чашку) и пересчитывали на площадь чашки (×78,5). Чистоту культур микроорганизмов контролировали под микроскопом.
Постановка экспериментов по изучению влияния пектата кальция на рост штаммов бифидо- и лактобактерий
Для посева были использованы суточные культуры микроорганизмов в разведениях (по стандарту мутности): 500000, 50000, 5000, 500, 50 и 5 микробных тел (для бифидокультуры) и 5000, 500, 50 и 5 микробных тел (для лактокультуры), помещенные в пробирки с 9 мл полужидкой бифидум-среды, к которым был добавлен физ. раствор или раствор пектата кальция в концентрации 2 и 4%. Для достоверности результатов пробирки дублировались. Затем через 4, 24 и 48 ч бактериологической петлей производили посев культур в стерильные пробирки с бифидум-средой однократным прокалыванием от уровня среды до дна пробирки. Посев помещали в термостат с температурой 37°С на 24 ч. По истечении суток производили визуальную оценку роста, фиксируя его наличие/отсутствие и степень выраженности (в «+» от 1 до 5). Чистоту культур микроорганизмов контролировали под микроскопом.
Результаты исследований представлены в примерах 1-4.
Пример 1. Для определения действия пектата кальция на рост нормальной микрофлоры исследовали влияние полисахарида на рост непатогенного штамма Escherichia coli.
В результате эксперимента выявлено повышение количества выросших колоний кишечной палочки в чашке Петри при использовании пектата кальция. Так, разведение полисахарида в концентрациях 2 и 4% через 4 ч экспозиции приводило к достоверному увеличению числа колоний в 1,97 и 1,83 раза соответственно, через 24 ч - в 1,94 и 1,81 раза соответственно, а через 48 ч наблюдалось увеличение числа колоний в 3,5 и 1,2 раза соответственно относительно контрольных значений (табл.1).
Таблица 1
Изучение влияния пектата кальция на рост культуры Esherichia coli
Название группы, концентрация, %
Количество колоний Esherichia coli в чашке Петри
Время экспозиции, ч
4
24
48
1. Контроль
1864,38±341,13
3434,38±579,47
57,57±14,26
2. Пектат кальция,2
3679,69±617,83P<sub>1-2</sub><0,05
6672,50±177,03P<sub>1-2</sub><0,01
201,86±19,54P<sub>1-2</sub><0,01
3. Пектат кальция,4
3404,94±267,01P<sub>1-3</sub><0,01
6211,97±287,85P<sub>1-3</sub><0,01
68,03±18,56
Таким образом, в результате эксперимента выявлена стимуляция роста нормальной микрофлоры через 4, 24 и 48 ч экспозиции, более выраженная при использовании пектата кальция в концентрации 2%.
Пример 2. Для определения наличия пребиотического действия было исследовано влияние пектата кальция на рост культур бифидобактерий.
В результате эксперимента было показано стимулирующее действие пектата кальция на рост колоний бифидобактерий. Так, добавление пектата кальция в концентрации 2% в пробирки с кратными разведениями бифидокультуры стимулировало рост микроорганизмов в концентрациях 50000 «++» и 5000 «++» микробных тел через 24 ч, в концентрациях 5000 «++» и 500 «++» микробных тел - через 48 ч экспозиции по сравнению с « - » контроля. При использовании 4% пектата кальция отмечалась степень роста микроорганизмов «++» в концентрациях 50000 и 5000 микробных тел через 24 ч и 5000 «++», 500 «++», 50 «+» и 5 «+» микробных тел - через 48 ч по сравнению со степенью роста « - » контроля (табл.2).
Таблица 2
Изучение влияние пектата кальция на рост культуры бифидобактерий
Группа, концентрация, %
500000 микробных тел
50000 микробных тел
5000 микробных тел
500 микробных тел
50 микробных тел
5 микробных тел
4 ч экспозиции
1. Контроль
++
-
-
-
-
-
2. Пектат кальция,2
++
-
-
-
-
-
3. Пектат кальция,4
++
-
-
-
-
-
24 ч экспозиции
1. Контроль
+++
-
-
-
-
-
2. Пектат кальция, 2
+++
++
++
-
3. Пектат кальция,4
+++
++
++
-
-
-
48 ч экспозиции
1. Контроль
+++
++
-
-
-
-
2. Пектат кальция,2
+++
++
++
++
-
-
3. Пектат кальция,4
+++
++
++
++
+
+
Примечание: здесь и в табл.3 «+» от 1-5 - степень роста микроорганизмов, «-» - отсутствие роста микроорганизмов.
Пример 3. Для подтверждения наличия пребиотического действия было исследовано влияние пектата кальция на рост культур лактобактерий.
Добавление 2% пектата кальция в пробирки с кратными разведениями лактобактерий также приводило к стимуляции роста штамма в концентрации 5 микробных тел через 24 ч экспозициии, когда отмечалось отсутствие роста микроорганизмов в контроле (табл.3). При использовании 4% пектата кальция наблюдалась стимуляция роста колоний «+» в концентрациях 500 и 50 микробных тел через 4 ч и в концентрациях 5000 «+++++» против «+++», 500 «++++» против «+++», 50 «++++» против «++» и 5 «+++» против «+» микробных тел, «++» на фоне « - » контрольных значений - через 24 ч экспозиции. Аналогичная картина наблюдалась при использовании 4% пектата кальция через 48 ч экспозиции.
Таблица 3
Изучение влияние пектата кальция на рост культуры лактобактерий
Группа, концентрация, %
5000 микробных тел
500 микробных тел
50 микробных тел
5 микробных тел
Нет роста
4 ч экспозиции
1. Контроль
+++
-
-
-
-
2. Пектат, 2
+++
-
-
-
-
3. Пектат, 4
+++
+
+
-
-
24 ч экспозиции
1. Контроль
+++
+++
++
+
-
2. Пектат, 2
+++
+++
+++
+
+
3. Пектат, 4
+++++
++++
++++
+++
++
48 ч экспозиции
1. Контроль
++++
+++
+++
++
+
2. Пектат, 2
+++
++
++
++
++
3. Пектат, 4
+++
+++
+++
+++
++
Таким образом, пектат кальция обладает пребиотическим действием, причем с увеличением концентрации степень выраженности эффекта увеличивается.
Пример 4. С целью изучения влияния пектата кальция на рост патогенной микрофлоры кишечника исследовано действие полисахарида на рост культуры Candida albicans.
В результате эксперимента было показано бактериостатическое действие пектата кальция, проявившееся в снижении количества выросших колоний в чашке Петри со средой Сабуро. Так, при использовании полисахарида в концентрации 2% количество колоний через 24 ч экспозиции достоверно снижалось в 1,3 раза (табл.4). Применение пектата кальция в концентрации 4% приводило к уменьшению числа колоний в 1,7 раза через 24 ч и в 1,6 раза - через 48 ч экспозиции.
Таблица 4
Изучение влияния пектата кальция на рост культуры Candida albicans
Название группы, концентрация, %
Количество колоний Candida albicans в чашке Петри
Время экспозиции, ч
4
24
48
1. Контроль
3738,56±572,44
8811,63±633,19
4474,50±739,23
2. Пектат, 2%
3738,56±409,74
6780,44±360,32Р<sub>1-2</sub><0,01
4170,31±454,70
3.Пектат, 4%
4101,63±557,99
5308,56±410,30P<sub>1-3</sub><0,01
2828,56±420,12P<sub>1-3</sub><0,05
Таким образом, выявлено бактериостатическое действие пектата кальция на рост патогенной микрофлоры на примере Candida albicans, более выраженное при использовании концентрации 4%.
Резюмируя вышесказанное, можно сделать вывод о возможности расширения арсенала пребиотических средств за счет применения низкоэтерифицированного пектата кальция, способного стимулировать рост симбиотической микрофлоры кишечника, подавлять численность патогенной микрофлоры in vitro.
Литература
1. Bengmark S. Colonic food: pre- and probiotics. // Am. J. Gastroenterol. - 2000. - T.95. - V.1. - P.55-57.
2. Khotimchenko M., Zueva E., Krylova S., Lopatina K., Khotimchenko Y., Rasina T. Gastroprotective activity of pectins against acute indomethacine-induced gastric mucosal injury in rats // Acta Pharmacologica Sinica (The 15-th World Congress of Pharmacology - China, 2006) - P.242.
3. Гребнев А.Л., Мягкова Л.П. Кишечный дисбактериоз. // Руководство по гастроэнтерологии. - M.: Медицина. - 1996. Т.3. - С.324-332.
4. Гриневич В.Б., Иванников И.О., Добрынин В.М. и др. Пребиотики в лечении заболеваний внутренних органов. // Рос. мед. журн. - 2003. - №5. - С.53-56.
5. Крылова С.Г., Хотимченко Ю.С., Зуева Е.П., Амосова Е.Н., Разина Т.Г., Ефимова Л.А., Хотимченко М.Ю., Ковалев В.В. Гастрозащитное действие некрахмальных полисахаридов природного происхождения // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 2006. - Т.142. - №10. - С.437-441.
6. Сергущенко И.С. Сравнительная оценка металлсвязывающей активности некрахмальных полисахаридов: Автореферат дис. … канд. мед. наук. - Владивосток, 2004. - 24 с.