Способ тестирования биологической активности аэрозольных препаратов
METHOD FOR TESTING THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF AEROSOL PREPARATIONS

Настоящее изобретение относится к медицине. Изобретение раскрывает способ, который позволяет исследовать аэрозольные препараты активных веществ медицинского применения, после их аэрозольного распыления с помощью систем с принудительной выталкивающей силой в устройствах пропеллентного, механического, ультразвукового мембранного типов. Разработанный способ основан на конденсации жидкой водосодержащей фазы генерируемого аэрозольного облака в открытой емкости с последующим испытанием биологической активности фармацевтических и других активных веществ, находящихся в исходном аэрозольном составе в устройстве для генерации аэрозоля.
Известны аэрозольные системы, в которых движущей выталкивающей силой служит пропеллент, находящийся под давлением в устройстве с клапаном [1, 2], и аэрозольные устройства (небулайзеры) с механическим или ультразвуковым возбуждением и мембранным распылителем, такие как настольные небулайзеры эжекторного или ультразвукового типов и ручные ингаляторы механического типа «респимат» или ручной ингалятор мембранного типа Micro-Air «Омрон» [3]. При открытии клапана или при запуске аэрозольного возбуждения происходит выталкивание аэрозольного состава и его распыление, так называемое генерирование аэрозоля.
Известен способ оценки физических свойств генерируемого аэрозоля, таких как дисперсность частиц генерируемого аэрозоля либо стабильность аэрозольных частиц на различном удалении от распыляющего устройства после выпуска аэрозольного облака [4]. Такие измерения дисперсности или дистанционной стабильности аэрозоля проводят либо автоматически по рассеиванию лазерного луча облаком аэрозоля на лазерном детекторе частиц (ряда фирм: "Horiba", "Malvern", "Shimadzu", "Sympatec Helos"), работающем на принципе лазерной дифракции и оптического контроллера [4, 5], либо с помощью светового или электронного микроскопа при исследовании аэрозольных капель, выпавших на стекле или подложке, размещенных на различном расстоянии от аэрозольного устройства (небулайзера) [6]. Однако данные способы не позволяют оценить структурную и биологическую сохранность фармацевтических и других биологически активных веществ, включенных в аэрозольный состав, после их распыления в результирующем аэрозольном облаке.
Нами разработан простой и удобный способ, позволяющий исследовать структурную стабильность и биологическую активность фармацевтических, дезинфицирующих и других биологически активных веществ в результирующем аэрозольном облаке, генерируемом из аэрозольного состава в устройстве с пропеллентной системой или других типов устройств с принудительным аэрозолированием. Сущность метода состоит в конденсации жидкой водосодержащей фазы аэрозольного облака в открытую емкость, позволяющую собрать результирующий конденсат и осуществить естественное испарение пропеллента и других летучих веществ аэрозольного состава. Разработанный способ применим как для водносодержащих аэрозолей (так называемые аэрозоли влажного типа), так и для пропеллентных составов с микронизированными активными веществами (так называемые сухие аэрозоли). После сбора конденсата производят определение концентрации, структуры и биологической активности содержащихся фармацевтических и других биологически активных субстанций и их перерасчет на исходный аэрозольный состав. Для более эффективного растворения и предотвращения агрегации и денатурации исследуемых активных веществ в результирующем конденсате, в емкость аэрозоля вносят дополнительное количество деионизованной воды или буферного раствора с рН 2,0-12,0, содержащих поверхностно-активные вещества из группы сурфактантов или органических растворителей, таких как твин-20, твин-80, спан-20, спан-80, додецил сульфат натрия, нонидет-Р40, тритон Х-100, бета-октилглюкозид, диметилсульфоксид, формамид, ацетонитрил и другие.
Достоинство разработанного метода состоит в том, что он позволяет тестировать структуру и активность фармацевтических и других биологически активных веществ аэрозольного состава после его аэрозольного распыления (генерирование аэрозоля), т.е. в результирующем аэрозольном облаке. Таким образом, способ позволяет оценить влияние процесса аэрозолирования на свойства биологически активных веществ и их структурно-функциональную стабильность в аэрозольном облаке. Полученный по представленному способу конденсат, лишенный газообразных компонентов аэрозольного состава, дает возможность определения биологической активности фармацевтических, дезинфицирующих и других веществ прямыми методами оценки соответствующих ферментативных активностей или оценки различных физиологических активностей, таких как противовирусной, антимикробной или метаболической активностей в клеточных культурах, органных культурах, питательных средах, на животных и т.п.
Разработанный способ имеет особую ценность для тестирования аэрозольных составов, содержащих лабильные вещества, такие как белковые, олигопептидные или мультикомпонентные вещества, которые могут инактивироваться при фазовых переходах из жидкой фазы в газообразную в процессе аэрозолирования. Создание белок содержащих аэрозольных составов с применением методов генетической инженерии представляет быстро развивающееся направление в современной медицинской аэрозольной биотехнологии и других областей промышленной и бытовой техники. Этот этап в аэрозольной биотехнологии ставит новые проблемы, одна из которых решена в настоящем изобретении, что повышает актуальность изобретения.
Для осуществления поставленной задачи предлагается следующий способ и подходы для ее решения, а именно:
• Способ тестирования биологической активности аэрозольных препаратов, в котором аэрозольные препараты являются медицинскими или техническими, отличающийся тем, что аэрозоль, генерируемый под действием принудительной выталкивающей силы выпускают в открытую емкость и инкубируют в течение 0,01 мин или более для конденсирования жидкой фазы аэрозольного облака и испарения летучих компонентов аэрозольного состава, определяют количественный выход аэрозольного состава, концентрацию активных веществ, их биологическую активность, при этом для предотвращения агрегации и денатурации исследуемых активных веществ в емкость добавляют 10 мкл или более деионизованной воды или буферного раствора с диапазоном рН от 2,0 до 13.0.
• Для более эффективного растворения и предотвращения агрегации и денатурации исследуемых активных веществ в результирующем конденсате в емкость добавляют 10 мкл или более деионизованной воды или буферного раствора с рН в диапазоне 2,0-13,0, содержащих 0,01 - 99% поверхностно-активных веществ и сорастворителей, преимущественно твин-20, твин-80, спан-20, спан-80, додецил сульфат натрия, нонидет-Р40, тритон Х-100, бета-октилглюкозид, диметилсульфоксид, формамид, ацетонитрил.
Описание рисунков
Рис. 1. Электрофоретический профиль апротинина после аэрозольного распыления и белковых маркеров
Дорожки показывают профиль апротинина из препарата после хранения в течение 1 года (дорожка 3) и 7 лет (4) в составе аэрозольного состава в устройстве с клапаном при комнатной температуре) и стандартный апротинин (Sigma; дорожка 2). Дорожка 1-белковые маркеры молекулярных весов. Квадратами выделены зоны полиакриламидного геля, соответствующие нативному апротинину с м.м. 6кД и высокомолекулярной зоне с м.м. 60-250 кД (ВМЗ) для количественного сканирования. Высокомолекулярная зона содержит менее 5% массы белков в зоне апротинина.
Рис. 2. Титрование стандартного апротинина Sigma
Доза около 0,3 КИЕ апротинина (показана пунктирной линией) вызывала 50% ингибирование трипсина в условиях реакции.
Рис. 3. Титрование испытуемого конденсата аэрозольного апротинина.
Рис. 4. Тестирование антивирусной активности апротинина в генерируемом аэрозоле с помощью разработанного способа с использованием культуры клеток
Окрашенные с помощью антивирусных антител клеточные культуры фотографировали в световом микроскопе под увеличением ×80. Лунки 1, 2, 3 - показывают клеточные пробы, инкубированные без конденсата (1), с 30 мкл конденсата, полученного распылением из устройства, хранившегося с аэрозольным составом 1 год (2) и с 30 мкл конденсата, полученного распылением из аэрозольного устройства, хранившегося с аэрозольным составом в течение 7 лет, соответственно.
Рис. 5. Тестирование анти-трипсиновой активности испытуемого конденсата аэрозольного леупептина.
Рис. 6. Тестирование конденсата аэрозольного апротинина.
Рис. 7. Определение содержания рибавирина в аэрозольном облаке
Оптическую плотность контрольных растворов и проб конденсата аэрозольного рибавирина измеряли при 270 нм. Столбцы: 1 - проба 30% глицерина в деионизованной воде; 2 - проба 75% раствора глицерина; 3 - проба 30 мкл конденсата аэрозольного рибавирина в 500 мкл деионизованной воды; 4 - проба 70 мкл конденсата аэрозольного рибавирина в 500 мкл деионизованной воды.
Рис. 8. Электрофоретический профиль апротинина после аэрозольного распыления и конденсации при рН 11,5 в присутствии ДМСО
Дорожки показывают профиль апротинина из препарата после хранения в течение 1 года (дорожка 2) и 7 лет (3) в составе аэрозольного состава в устройстве с клапаном при комнатной температуре) и исходный апротинин (Sigma; дорожка 1). Слева показаны позиции маркерных белков с известной молекулярной массой.
Рис. 9. Тестирование конденсата аэрозольного апротинина после распыления «в мягком облаке»
Столбцы: 1 - контрольная проба с буфером без трипсина и без конденсата (нулевой контроль); 2 - проба с трипсином без добавления конденсата (100% контроль); 3 - проба, содержащая трипсин и 10 мкл исследуемого аэрозольного конденсата с апротинином.
Рис. 10. Тестирование конденсата аэрозольного фавипиравира после распыления «в мягком облаке»
Оптическую плотность контрольных растворов и проб конденсата аэрозольного фавипиравира измеряли при 360 нм в кюветах 0,5 мл. Столбцы: 1 - проба деионизованной воды; 2 - проба контрольного препарата без фавипиравира; 3 - проба 25 мкл конденсата аэрозольного фавипиравира в 500 мкл деионизованной воды; 4 - проба 60 мкл конденсата аэрозольного фавипиравира в 500 мкл деионизованной воды.
Примеры реализации изобретения
Пример 1. Оценка общей водо-содержавшей жидкой фракции генерируемого аэрозольного облака
Разработанный способ позволяет оценить общее содержание активной жидкой аэрозольной фракции после распыления пропеллентного аэрозольного состава. С этой целью производят выпуск аэрозольного состава разработанным способом в емкость и после испарения летучих компонентов состава определяют весовое и объемное количество сформировавшегося конденсата. Параллельно определяют количество распыленного состава взвешиванием аэрозольного баллона (или другого устройства с клапаном) до и после генерации аэрозоля. Результаты полученных измерений представлены в таблице 1.
1) Аэрозольный состав готовили в устройстве весом 297,165 г с дозированным клапаном, позволяющим выпуск за одно нажатие около 55 мкл аэрозольного состава.
2) Аэрозольный состав готовили по следующей прописи из расчета на одну дозу (выпуск): пропеллент А134 (0,047 мл); этанол (0,0075 мл), глицерол (0,0035 мл), апротинин (0,0005 мл; 95 КИЕ).
3) Проводили три серии испытаний, в каждом испытании делали по 10 выпусков в коническую пробирку объемом 10 мл. После выпуска аэрозоля конденсат со стенок собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 2 минут. Полученный конденсат инкубировали 30 мин при постоянном помешивании для испарения летучих компонентов и исследовали, как указано в таблице. Стандартное отклонение показывает средний разброс меду значениями по прописи и в опытном определении, выраженное в % от значения по прописи приготовления аэрозольного состава.
Пример 2. Оценка нативной структуры активного фармацевтического вещества в генерируемом аэрозоле
Для исследования сохранения нативных свойств активного вещества белковой природы использовали аэрозольный состав, приготовленный с водным раствором природного ингибитора протеаз (апротинина), выделенного из легких коров, смешанного с пропеллентом 134А, глицерином и спиртом в соотношении веществ: пропеллент А134 (0,047 мл); этанол (0,0075 мл), глицерол (0,0035 мл), апротинин (0,0005 мл; 95 КИЕ). Содержимое баллончика выпускали в коническую пробирку объемом 10 мл посредством 25 выпусков и конденсат собирали на дно пробирки центрифугированием при 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 20°С с открытой крышкой, при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта), затем объем конденсата доводили до 350 мкл раствором 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). Структуру апротинина определяют по подвижности в геле в высокоразрешающем электрофорезе в полиакриламидном геле (ПАГе), содержащем додецил-сульфат натрия (ДСН), в Трис-глициновой буферной системе Laemmli (1970). Для анализа берут 2, 5 и 10 мкл испытуемого раствора в пробы прибавляют 13, 10 и 5 мкл деионизованной воды, соответственно, прибавляют по 6 мкл диссоциирующего буферного раствора, содержащего 10% додецил сульфата натрия и 5% меркаптоэтанола, для полного раскручивания молекулы апротинина и разрыва всех дисульфидных связей. Полученные образцы прогревают при температуре 75°С в течение 10 мин для лучшей диссоциации молекул апротинина. Пробы наносят в лунки из 3,5% фокусирующего полиакриламидного геля, приготовленного над 12% полиакриламидным разделительным гелем, и проводят электрофорез в электрическом поле при 50V на гель в течение 3 часов.
После электрофореза пластину геля фиксируют в течение 1 часа в водном растворе, содержащем 50% этанола и 10% уксусной кислоты. После фиксации гель окрашивают в течение 2 часов в 0,02% растворе Кумаси голубого G-250, приготовленного на растворе, содержащем 40% этанола и 10% уксусной кислоты. На рисунке 1 показаны результаты тестирования.
Результат анализа в ПАГе показывает, что после распыления апротинин сохраняет свои нативные свойства и имеет подвижность, соответствующую белку с м.м. 6кД, не имеет продуктов деградации и высокомолекулярных продуктов агрегации.
Пример 3. Оценка специфической антипротеазной активности апротинина в генерируемом аэрозоле
Для тестирования сохранения специфических ферментативных свойств активного вещества белковой природы использовали аэрозольный состав, приготовленный с водным раствором природного ингибитора протеаз (апротинина), выделенного из легких коров. Приготовление пропеллентного аэрозольного состава апротинина и получение конденсата способом согласно изобретению приведено выше в примере 2. Специфическую активность ингибитора протеаз (апротинина) анализировали методом ингибирования расщепления хромогенного субстрата протеолитическим ферментом - трипсином. Метод основан на ингибировании катализированного трипсином расщепления хромогенного субстрата - N-а-бензоил-DL-арганин-4-нитроанилида (БАПНА), который при расщеплении приобретает окраску. Определяется разность активности трипсина и трипсина, инактивированного апротинином, по интенсивности цветного окрашивания, которое регистрируется при длине волны 405 нм. Одна единица ингибитора протеаз (ЕИТ) тормозит активность двух протеазных единиц трипсина на 50%. Известно, что одна ЕИТ соответствует 1330 КИЕ (Калликреин Ингибирующая Единица). 1 КИЕ - это единица активности ингибитора протеаз, которая ингибирует 2 калликреиновые единицы протеазы на 50% при оптимальных условиях). Использовали кристаллический трипсин (Sigma), гидрохлорид N-а-бензоил-DL-аргинин-п-нитроанилида (БАПНА) (Sigma), в качестве стандарта использовали апротинин (фирма MERK) со специфической активностью 4500-7000 КИЕ/мг (согласно сертификату).
На первом этапе готовят двукратные разведения стандартного трипсина на буфере, содержащем 25 мМ трис-HCl (рН 7,8) и 250 мМ натрия хлорида, и по 50 мкл каждого разведения вносят в лунки 96-луночного планшета. 2-кратные разведения трипсина готовят, начиная с концентрации 160 мкг/мл и заканчивая концентрацией 1,25 мкг/мл. Далее последовательно прибавляют воду, хромогенный субстрат БАПНА (0,8 мг/мл готовят разведением исходного раствора в воде) и инкубируют в течение часа при 35°С. Реакцию останавливают прибавлением 35% уксусной кислоты и определяют оптическую плотность (ОП) при 405 нм на спектрофотометре для микропланшет (BioRad Model 550). На основании полученных значений определяют разведение трипсина, индуцирующее OD405 (оптимальный в диапазон 0,5-1,5), которое используют в титровании апротинина в исследуемом аэрозольном конденсате. Согласно данным тестирования такой дозой 50% ингибирования служила 0,3 мкг трипсина на пробу.
Для построения калибровочной кривой апротинина готовят двукратные разведения стандартного раствора апротинина, начиная с концентрации 50 мкг/мл и заканчивая 0,25 мкг/мл. Аналогичным образом готовят двукратные разведения испытуемого конденсата в объеме 50 мкл, начиная с разведения 1/20, путем двукратных разведений. Калибровочные кривые для определения специфической анти-трипсиновой активности стандартного и исследуемого препаратов апротинина приведены на рисунках 2 и 3. Протокол проведения тестирования антипротеазной активности с трипсином приведен в таблице 2.
Оптическая плотность для испытуемой пробы апротинина должна составлять 50% от оптической плотности трипсиновой пробы. Вычисление общей активности апротинина X (в КИЕ), содержащейся в конденсате в пересчете на исходный аэрозольный состав, проводят по формуле
ст
А - активность стандартного апротинина в точке 50% ингибирования на калибровочной кривой (КИЕ) с учетом специфической активности по сертификату (показана на рис. 2);
o
V - общий объем исходного испытуемого раствора (конденсата) апротинина в 10 выпусках (таблица 1);
р
К - фактор разведения испытуемого раствора апротинина в точке 50% ингибирования трипсина на кривой испытуемого раствора (показан на рис. 3);
пp
V - объем испытуемого раствора апротинина в пробе (0,05 мл);
п
К - поправочный коэффициент, обусловленный частичной потерей препарата при сборе аэрозольного конденсата из баллончика (величина равна 1,2).
Испытуемый раствор вызывал 50% ингибирование трипсина при разведении около 1/750 в условиях реакции (показано пунктирной линией на рис. 3). Согласно формуле расчета активности апротинина в препарате:
С учетом полученных значений Аст=0,3 КИЕ и Кр ≈ 750 (показано на рисунках 2 и 3), общая активность апротинина в конденсате аэрозольного апротинина в количестве 20 выпусков составила 1720 КИЕ, что составляло около 90% от расчетного значения по прописи приготовления состава.
Пример 4. Оценка противовирусной активности апротинина в генерируемом аэрозоле разработанным способом с использованием культуры клеток
Для тестирования противовирусной активности вещества белковой природы использовали аэрозольный состав, приготовленный с водным раствором природного ингибитора протеаз (апротинина), выделенного из легких коров. Приготовление пропеллентного аэрозольного состава апротинина и получение конденсата способом согласно изобретения приведено выше в примере 2. Специфическую противовирусную активность полученного аэрозольного конденсата ингибитора протеаз (апротинина) тестировали методом редукции фокусов вируса гриппа типа А человека, штамм A/Aichi/2/68 (H3N2), которые он формировал при размножении в культуре клеток из легких человека (линия Calu-3).
Клетки Calu-3 выращивали на 24-луночных планшетах в среде ДМЕМ, содержащей антибиотики и 10% фетальной бычьей сыворотки. Далее после формирования клеточного монослоя вносили питательную среду ДМЕМ без сыворотки, содержащую вирус гриппа A/Aichi/2/68 из расчета около 100 фокус образующих единиц на одну клеточную лунку, и инкубировали 1 час для заражения клеток вирусом. Затем среду удаляли и вносили новую порцию среды ДМЕМ (1,3 мл на одну лунку), содержащую различные количества исследуемого аэрозольного конденсата апротинина, и инкубировали в течение 30 часов при 37°С в CO2 термостате для формирования вирусных фокусов в клеточной культуре.
Клеточную культуру фиксировали 4%-ым раствором параформальдегида и вирусные фокусы окрашивали с помощью специфических противовирусных антител (субтип анти-Н3) и пероксидазных конъюгатов, используя в качестве хромогенного субстрата препарат "True Blue". Результаты показаны на рисунке 4.
Как показано на рисунке 4, в контрольных клеточных пробах, инкубируемых в среде без конденсата, наблюдалось формирование отчетливых вирусных фокусов с диаметром от 1,5 до 4,0 мм. В пробах, содержащих 50 мкл конденсата, фокусы были меньшего размера с диаметром 0,3-1,0 мм и их количество было более чем в 5 раз ниже, чем в контрольной пробе. Накопление инфекционного вируса в клеточной среде снижалось в присутствии конденсата более чем в 100 по сравнению с контролем. Этот результат говорил о том, что апротинин после распыления из аэрозольного устройства, хранившегося с аэрозольным составом в течение 1 года и 7 лет, сохранял свою биологическую антивирусную активность.
Пример 5. Оценка антипротеазной активности леупептина в генерируемом аэрозоле
Леупептин представляет собой трипептид (ацетил-Leu-Leu-Arg-альдегид), обладающий антипротезной активностью в отношении широкого спектра сериновых протеаз. Аэрозольный состав готовили с водным раствором леупептина, смешанного с пропеллентом 134А, глицерином и спиртом в соотношении веществ: пропеллент А134 (13 мл); этанол (1,35 мл), глицерол (2,5 мл), леупептин (1,5 мг; 0,8 мл водного раствора). Суспензию готовили в устройстве с дозирующим клапаном (60 мкл в одном выпуске) с распыляющим отверстием 0,3 мм. Специфическую активность леупептина тестировали методом ингибирования расщепления хромогенного субстрата протеолитическим ферментом - трипсином. Метод основан на ингибировании катализированного трипсином расщепления хромогенного субстрата - N-а-бензоил-DL-аргинин-4-нитроанилида (БАПНА), который при расщеплении приобретает окраску. Определяется разность активности трипсина и трипсина, инактивированного леупептином, по интенсивности цветного окрашивания, которое регистрируется при длине волны 405 нм.
Содержимое аэрозольного баллончика выпускали в емкость посредством 25 выпусков и конденсат собирали на дно пробирки центрифугированием при 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 20°С при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта), затем объем конденсата доводили до 200 мкл раствором 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). Для построения калибровочной кривой активности антипротеазной леупетина готовили двукратные разведения исследуемого конденсата в объеме 50 мкл, начиная с разведения 1/40, путем двукратных разведений в 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). В каждую лунку вносили 50 мкл буфера, содержащего 0,3 мкг трипсина. Это количество трипсина определено на основании полученных значений для разведений трипсина, индуцирующее ОП405 (в оптимальном диапазоне 0,5-1,5). Далее согласно протоколу (таблица 2) последовательно прибавляют воду, хромогенный субстрат БАПНА и инкубируют в течение часа при 35°С. Реакцию останавливают прибавлением 35% уксусной кислоты и определяют оптическую плотность (ОП) при 405 нм на спектрофотометре BioRad Model 550. Результаты показаны на рис. 5.
50% ингибирование трипсина наблюдалось при содержании леупептина около 0,003-0,0017 мкгр. Таким образом, леупептин после распыления сохранял ферментативную активность, близкую начальному уровню в исходном аэрозольном составе.
Пример 6. Оценка анти-протеазной активности апротинина в генерируемом аэрозоле при сборе в присутствии поверхностно-активных соединений
При тестировании ряда фармацевтических веществ возможна их агрегация в процессе конденсирования аэрозольного препарата. С этой целю в емкость для сбора конденсата потребуется добавление поверхностно активных соединений. С этой целью в пробирку объемом 10 мл вносили 150 мкл буфера, содержащего 0,03 М Трис-HCl (рН 7,5), 50% диметилсульфоксида, 20% твин-20. Аэрозольный состав апротинина готовился по прописи в разделе 2. Содержимое аэрозольного баллончика выпускали в приготовленную емкость посредством 25 выпусков и конденсат собирали на дно пробирки центрифугированием при 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 20°С при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта), затем объем конденсата доводили до 350 мкл раствором 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5).
Для построения калибровочной кривой апротинина готовили двукратные разведения исследуемого конденсата в объеме 50 мкл, начиная с разведения 1/40, путем двукратных разведений в 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). В каждую лунку вносили 50 мкл буфера, содержащего 0,3 мкг трипсина. Это количество трипсина определено на основании полученных значений для разведений трипсина, индуцирующее ОП405 (в оптимальном диапазоне 0,5-1,5). Согласно данным тестирования такой дозой 50% ингибирования в условиях протокола реакции служила доза 0,3 мкг трипсина на пробу. Далее согласно протоколу (таблица 2) последовательно прибавляют воду, хромогенный субстрат БАПНА и инкубируют в течение часа при 35°С. Реакцию останавливают прибавлением 35% уксусной кислоты и определяют оптическую плотность (ОП) при 405 нм на спектрофотометре BioRad Model 550. Результаты показаны на рис. 6.
Испытуемый раствор вызывал 50% ингибирование трипсина при разведении около 1/800 в условиях реакции (показана стрелкой). Согласно формуле расчета активности апротинина в препарате, как описано в разделе 2, общая активность апротинина в конденсате аэрозольного апротинина в количестве 40 выпусков составила 3640 КИЕ, что составляло около 93% от расчетного значения по прописи приготовления состава.
Пример 7. Оценка содержания рибавирина в генерируемом пропеллентном аэрозоле
Рибавирин (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-1Н-1,2,4-триазол-3-карбоксамид) обладает антивирусной активностью в отношении широкого спектра вирусов. Аэрозольный состав готовили с водным раствором рибавирина, смешанного с пропеллентом 134А, глицерином и спиртом в соотношении веществ: пропеллент А134 (13 мл); этанол (1,35 мл), глицерин (2,5 мл), рибавирин (10,0 мг; 0,8 мл водного раствора). Аэрозольный состав готовили в устройстве с дозирующим клапаном (60 мкл в одном выпуске) с распыляющим отверстием 0,3 мм. Содержание рибавирина в аэрозольном конденсате по интенсивности поглощения в ультрафиолетовом диапазоне при длине волны 270 нм. Нулевым стандартом сравнения служил водный раствор 75% глицерола и деионизованная вода.
Содержимое аэрозольного баллончика выпускали в емкость посредством 25 выпусков и конденсат собирали на дно пробирки центрифугированием при 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 20°С при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта), затем объем конденсата доводили до 200 мкл деионизованной водой. Для построения количественной калибровочной кривой готовили растворы с различной концентрацией рибавирина в диапазоне 0,005-5,0 мг на мл. Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре ULTRASPEC II (LKB) при 270 нм в кюветах 0,5 мл. Результаты показаны на рис. 7.
На основании сравнения с калибровочной кривой, полученной для маркерных растворов рибавирина, установлено, что концентрация рибавирина в конденсате составляла около 91% от его содержания, полученного расчетным способом согласно прописи приготовления аэрозольного состава и распыляемого объема в одном выпуске.
Пример 8. Оценка структуры апротинина в генерируемом аэрозоле при сборе в присутствии поверхностно-активных соединений при рН 11,5
Для исследования структуры вещества белковой природы использовали аэрозольный состав, приготовленный с водным раствором природного ингибитора протеаз (апротинина), смешанного с пропеллентом 134А, глицерином и спиртом в соотношении веществ: пропеллент А134 (0,047 мл); этанол (0,0075 мл), глицерол (0,0035 мл), апротинин (0,0005 мл; 95 КИЕ). Содержимое баллончика в объеме 40 аэрозольных порций выпускали в коническую пробирку объемом 10 мл, содержащую 200 мкл 0,04 М Трис-HCl (рН 11,5) и 50% ДМСО, сформировавшийся конденсат собирали на дно пробирки при центрифугировании 1500 об в минуту в течение 2 минут. Далее конденсат инкубировали в течение 30 мин, при температуре 37°С при постоянном встряхивании (для испарения остатков пропеллента и спирта). Структуру апротинина тестировали по подвижности в геле в высокоразрешающем электрофорезе в полиакриламидном геле (ПАГе), содержащем додецил-сульфат натрия (ДСН), в Трис-глициновой буферной системе Laemmli (1970) [7]. Для анализа на гель наносили 10 мкл испытуемого конденсата, в который вносили 6 мкл диссоциирующего буферного раствора, содержащего 10% додецил сульфата натрия и 5% меркаптоэтанола, для полной диссоциации молекул апротинина и разрыва всех дисульфидных связей. Полученные образцы прогревали при температуре 75°С в течение 10 мин для лучшей диссоциации молекул апротинина. Пробы наносили в лунки из 3,5% фокусирующего полиакриламидного геля, расположенного над 12% разделительным гелем, и проводили электрофорез в электрическом поле при 50V на гель в течение 3 часов.
После электрофореза пластину геля фиксировали в водном растворе, содержащем 50% этанола и 10% уксусной кислоты. После фиксации гель окрашивали в течение 2 часов в 0,02% растворе Кумаси голубого G-250, приготовленного на растворе, содержащем 40% этанола и 10% уксусной кислоты. На рисунке 8 показаны результаты тестирования.
Результат анализа в ПАГе показывают, что после аэрозольного распыления и конденсирования в растворе с рН 11,5, содержащем 50% ДМСО, апротинин сохранял свои нативные свойства и имел подвижность стандартного апротинин, при этом не наблюдалось побочных продуктов деградации и высокомолекулярных продуктов агрегации.
Пример 9. Оценка антипротеазной активности апротинина в генерируемом аэрозоле «мягкого облака» (система «Респимат»)
Устройство респимат заполняли через картридж водным раствором, содержащим 7000 КИЕ/мл апротинина, 3% глицерина, 3% этанола, согласно инструкции к устройству респимат (Boehringer Inhelheim, Германия). Полученный аэрозольный препарат выпускали в пробирку объемом 50 мл в количестве 30 пусков и собирали при центрифугировании 1500 об/мин в течение 2 мин, Аэрозольный конденсат инкубировали в течение 15 мин, при температуре 25°С при периодическом встряхивании (для испарения остатков этанола) и добавляли 150 мкл раствора 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). Для тестирования антипротеазной активности полученного конденсата готовили двукратные разведения в объеме 50 мкл, начиная с разведения 1/10. В каждую лунку вносили 50 мкл буфера, содержащего 0,3 мкг трипсина. Далее согласно протоколу (таблица 2) последовательно прибавляли воду, хромогенный субстрат БАПНА и инкубировали в течение часа при 35°С. Реакцию останавливали прибавлением 35% уксусной кислоты и определяли оптическую плотность (ОП) при 405 нм на спектрофотометре BioRad Model 550. Результаты показаны на рис. 9.
Как видно на рисунке, апротинин в аэрозольном конденсате сохранял свою антипротеазную активность и на 96% ингибировал активность трипсина.
Пример 10. Оценка содержания фавипиравира в генерируемом аэрозоле «мягкого облака» (система «Респимат»)
Устройство респимат заполняли через картридж водным раствором, содержащим 3 мг/мл фавипиравира (6-флюоро-3-гидроксипиразин-2-карбоксамид), 3% глицерина, 3% этанола, 0,5% ДМСО, согласно инструкции к устройству респимат (Boehringer Inhelheim, Германия). Полученный аэрозольный состав выпускали в пробирку объемом 50 мл в количестве 25 пусков и собирали центрифугированием. Аэрозольный конденсат инкубировали в течение 20 мин, при температуре 25°С при периодическом встряхивании (для испарения остатков этанола) и добавляли 150 мкл 0,02 М Трис-HCl (рН 7,5). Для построения количественной калибровочной кривой готовили растворы с различной концентрацией фавипиравира в диапазоне 0,005-15,0 мг/мл. Оптическую плотность (ОП) измеряли на спектрофотометре ULTRASPEC II (LKB) при длине максимального поглощения 360 нм. Результаты показаны на рис. 10.
На основании сравнения с калибровочной кривой, полученной для маркерных растворов фавипиравира, установлено, что концентрация рибавирина в конденсате составляла около 94% от его содержания, полученного расчетным способом на основании прописи приготовления аэрозольного состава и распыляемого объема в одном выпуске.
Источники литературы
1. Ganderton D, Lewis D, Davies R, Meakin B, Brambilla G, Church T. 2002. Modulite: a means of designing the aerosols generated by pressurized metered dose inhalers. Respir Med. 96 Suppl D: S3-8.
2. Мещерякова H.H. 2006. Модулит - новая технология в дозированных аэрозольных ингаляторах. Ингаляционная терапия. Атмосфера. Пульмонология и аллергология. №2, 40-42.
3. Терехова Е.П. 2014. Ингаляционные устройства, применяемые для лечения бронхиальной астмы. Практическая Пульмонология. №4, стр. 45-52.
4. Black D.L., McQuay M.Q., M.P.Bonin. 1996. Laser-based techniques for particle-size measurement: A review of sizing methods and their industrial applications. Progress in Energy and Combustion Science. Vol. 22 (3), pages 267-306.
5. Davies, N.M. and M.R. Feddah, 2003. A novel method for assessing dissolution of aerosol inhaler products. Int. J. Pharm., 255: 175-187.
6. Dolovich, M., 1991. Measurement of particle size characteristics of metered dose inhaler (MDI) aerosols. J. Aerosol Med., 4: 251-263.
7. Laemmli U. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680-685 (1970). https://doi.org/10.1038/227680a0