АТТЕНУИРОВАННЫЙ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А/КРАСНОДАР/101/59/35 (H2N2) ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММОВ ЖИВОЙ ИНТРАНАЗАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ
ATTENUATED COLD-ADAPTED STRAIN OF INFLUENZA VIRUS A/KRASNODAR/101/59/35(H2N2) FOR OBTAINING STRAINS OF LIVE INTRANASAL INFLUENZA VACCINE

Холодоадаптированный штамм вируса гриппа A/H2N2 Краснодар/101/59/35, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантных холодоадаптированных вакцинных штаммов для живой гриппозной вакцины, изготавливают при использовании в качестве субстрата как куриных эмбрионов, так и линии клеток MDCK.
Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа.
Наиболее близким к заявленному изобретению является холодоадаптированный штамм - донор А/Ленинград/14/17/57, используемый для получения реассортантных штаммов для изготовления холодоадаптированной живой гриппозной вакцины в России. Этот штамм был получен путем пассажей исходного вирулентного вируса А/Ленинград /134/57 (H2N2) в куриных эмбрионах при пониженной температуре (20 пассажей при 32°С и 17 пассажей при 25°С). Этот холодоадаптированный штамм вируса имел 10 мутаций, из которых 8 являются кодирующими: одна в гене РВ2 (Val-Leu), две в гене РВ1 (Val-Leu и Lys-Asp), две в гене PA (Leu-Pro и Val-Leu), две в гене М (Ile-Val и Ala-Thr) и одна в гене NS (Met-Ile).
Задачей данного исследования является получение холодоадаптированного генетически однородного штамма-донора аттенуации вируса гриппа, используемого для приготовления живой гриппозной вакцины.
Сущность изобретения: холодоадаптированный штамм вируса гриппа А/Краснодар/101/59/3 5 (H2N2) получен методом серийных пассажей в куриных эмбрионах и культуре клеток MDCK при постепенно снижающейся температуре инкубации с последующим трехкратным клонированием методом бляшек на культуре клеток MDCK, что обеспечивает генетическую гомогенность штамма. Полученный штамм обладает хорошей продуктивной активностью в куриных эмбрионах и клетках MDCK при пониженных температурах и не размножается при повышенных температурах. Полученный вариант вируса обладает уникальными мутациями нуклеотидов и аминокислот в генах, кодирующих белки РВ2, РВ1, PA, NP и М.
Штамм зарегистрирован в коллекции депозитария НИИ вирусологии им.Д.И. Ивановского РАМН под номером… 2439 от 09.06.2008.
В связи с тем что антигенная специфичность вирусов гриппа весьма изменчива, вакцинные штаммы этого вируса приходится заменять на новые почти каждый год в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения. При получении таких новых штаммов для живой гриппозной вакцины производят реассортацию (рекомбинацию) холодоадаптированного штамма-донора с рекомендованными ВОЗ эпидемическими штаммами вируса гриппа и эти холодоадаптированные реассортанты используют для приготовления живой холодоадаптированной гриппозной вакцины. В России для получения таких реассортантов используют штамм-донор А/ Ленинград/14/57 [1]. Однако холодоадаптированный штамм-донор А/Ленинград/14/17/57 обладает рядом недостатков. Во-первых холодоадаптированная живая гриппозные вакцина, приготовленная на основе этого штамма, оказалась реактогенной при вакцинации маленьких детей [2]. Во-вторых серьезным недостатком этого штамма-донора является генетическая гетерогенность популяции вирионов этого штамма [4].
Полученные при использовании данного донора вакцинные холодоадаптированные реассортантные штаммы не стандартны и отличаются по количеству и расположению мутаций в геноме [7], что может отрицательно отразиться на реактогенности и иммуногенности живой гриппозной вакцины, приготовляемой при использовании реассортантов на основе данного штамма-донора.
В США в качестве штамма-донора аттенуации используют холодоадалтированный штамм А/ Энн Арбор/6/60 (H2N2) [5]. Однако применение холодоадаптированной живой гриппозной вакцины в США разрешается лишь при вакцинации детей от 5 лет и взрослых до 50 лет из-за опасности возникновения неблагоприятных реакций у маленьких детей и пожилых лиц [6].
Техническим результатом заявленного изобретения является создание аттенуированного холодоадаптированного штамма-донора вируса гриппа, обладающего высокой степенью генетической однородности и способного хорошо размножаться как на куриных эмбрионах, так и в культурах клеток, в частности в культуре клеток MDCK.
При использовании полученного штамма изготовление холодоадаптированной аттенуированной живой гриппозной вакцины возможно при использовании в качестве субстрата как куриных эмбрионов, так и линии клеток MDCK.
Примеры получения холодоадаптированного варианта вируса гриппа.
S40
26
Пример 1. Получение холодоадаптированного варианта. Эпидемический штамм вируса гриппа А/Краснодар/101/59 (H2N2), хорошо размножающийся при 32-34°C, а также при повышенной температуре 40°С (t+ признак) и не размножающийся при пониженной температуре 26°С (са- признак) прошел на куриных эмбрионах при 30°С 5 пассажей и при 26°С 25 пассажей, а затем на линии клеток MDCK при 26°С 5 пассажей.
26
40
26
S40
Полученный вариант вируса в отличие от родительского штамма хорошо размножался при 26°С (са+ признак), размножался при 32 и 34°С, но не размножался при 40°С (ts- признак). Для получения генетически однородного ха варианта этот вирус был трижды клонирован методом бляшек на линии клеток MDCK и полученный клонированный вариант характеризовался са+ и t- признаками. Пассажи клонированного варианта в куриных эмбрионах при 32°С не изменили фенотип вируса, что свидетельствует о его генетической гомогенности.
6.5
7.0
4.0
4.5
8.0
8.5
5.0
5.5
50
50
50
50
26+
40
Пример 2. Размножение холодоадаптированного варианта в куриных эмбрионах. При заражении куриных эмбрионов родительским штаммом вируса гриппа титры при 32°С составляли 256-512 ГАЕ /мл и 10-10 ЭИД/0,1 мл, титры при 40°С составляли 128-256 ГАЕ/мл и 10-10 ЭИД/0,1 мл. При 26°С этот вирус не размножался. При заражении куриных эмбрионов ха вариантом вируса гриппа титры при 32°С составляли 1024-2048 ГАЕ/мл и 10-10 ЭИД/0,1 мл, при 26°С титры вируса составляли 512-1024 ГАЕ/мл и 10-10 ЭИД/0,1 мл. При 40°С ха вариант не размножался, т.е. обладал са и ts- признаками.
Пример 3. Размножение холодоадаптированного варианта в линиях клеток, в частности в линии клеток MDCK.
7.0
7.5
3.5
4.0
7.0
7.5
5.0
5.5
50
50
50
50
26
40
При заражении линии клеток MDCK эпидемическим штаммом вируса гриппа А/Краснодар/101/59 (H2N2) титры при 32°С составляли 256-512 ГАЕ/мл и 10-10ТЦД/0,1 мл, при 40°С - 128 ГАЕ/мл и 10-10 ТЦД/0,1 мл. При 26°С этот штамм не размножался. Ха штамм А/Краснодар/101/59/35 при размножении в линии клеток MDCK имел титры при 32°С 512-1024 ГАЕ/мл и 10-10 ТЦД/0,1 мл, при 26°С - 256-512 ГАЕ/мл и 10-10 ТЦД/0,1 мл. При 40°С ха вариант не размножался. Таким образом, и на этой системе клеток ха вариант обладал са+ и ts- признаками.
Пример 4. Анализ наличия ts мутаций в генах холодоадаптированного варианта А/Краснодар/101/59/35.
При применении комплементационно-рекомбинационного метода с использованием ts мутантов вируса чумы птиц, имеющих ts мутации в отдельных генах (7), были получены данные, свидетельствующие о наличии ts мутаций в генах, кодирующих белки РВ1, PA, NP.
Пример 5. Анализ мутаций в геноме холодоадаптированного варианта.
Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности генов родительского штамма А/Краснодар/101/59 (H2N2) и холодоадаптированного варианта А/Краснодар /101/59/35 выявил 13 мутаций в нуклеотидной последовательности 6-ти внутренних генов ха варианта. Из обнаруженных 13 мутаций 8 мутаций сопровождались аминокислотными заменами. Три мутации обнаружены в гене, кодирующем белок РВ2 в позициях 841 (GUA-UUA), 1494 (UCC-UCU) и 1500 (GCG-GCA). Мутация в позиции 841 сопровождается аминокислотной заменой в позиции 290 (Val-Leu). Две мутации обнаружены в гене, кодирующем белок РВ1, в позициях 464 (AUA-ACA) и 1983(ААА-AAG). Мутация в позиции 464 вызывает аминокислотную замену в белке в позиции 147 (Ile-Thr). Три мутации, обнаруженные в гене, кодирующем белок РА, расположены в позициях 597 (UUU-UUC), 927 (GGG-GGA) и 2145 (UUC-UUA), причем последняя мутация приводит к аминокислотной замене в позиции 707 (Phe-Leu) белка РА. Две мутации в гене, кодирующем белок NP, расположены в позициях 1151 (GAA-GUA) и 1343 (UGC-UGU). Обе мутации являются кодирующими: первая приводит к аминокислотной замене в позиции 369 (Glu-Val), вторая - к аминокислотной замене в позиции 433 (Ala-Val).
Остальные три кодирующие мутации локализованы в РНК-сегменте 7 генома холодоадаптированного варианта, кодирующего белки Ml и М2. Мутация, расположенная в позиции 332 (CUU-AUU), приводит к аминокислотному замещению в позиции 103 белка Ml (Leu-Ile),
мутация в позиции 413 (CUC-AUC) сопровождается аминокислотной заменой в позиции 130 (Leu-Ile) белка Ml, последняя мутация в позиции 837 (AUU-GUU) вызывает замену 42 Ile-Val в белке М2.
Сравнение мутаций, обнаруженных в холодоадаптированном варианте А/Краснодар/101/59/35 с мутациями, описанными в геноме ха штамма А /Ленинград/13 4/17/57 [3], и мутациями, обнаруженными в геноме американского холодоадаптированного варианта А/Энн Арбор/6/60 [8], показало, что мутации, выявленные нами в геноме ха варианте А/Краснодар/101/59/35, являются уникальными и отличаются от мутаций, обнаруженных в штамме А/Ленинград/134/17/57 и штамме А/Энн Арбор/6/60 (см.таблицу 1).
Пример 6. Получение реассортантного холодоадаптированного вакцинного штамма для живой холодоадаптированной гриппозной вакцины методом реассортации холодоадаптированного штамма А/Краснодар /101/59/35 (H2N2) и эпидемического штамма А/ Хумамото /102/2 (H3N2).
7.0
50
50
7.0
50
50
50
В 9-дневные куриные эмбрионы вносили 10 ЭИД эпидемического штамма А/Хумамото/102/2 (H3N2), облученного УФ-летом (инфекционный титр в результате облучения снижался на 6 lg ЭИД) и 10 ЭИД холодоадаптированного штамма А/Краснодар/101/59/35. Инфицированные эмбрионы инкубировали при 32°С в течение 18 час. Затем аллантоисную жидкость отсасывали и проводили 2 пассажа в куриных эмбрионах при 26°С в присутствии антисыворотки к вирусу H2N2 (200 ЕД/эмбрион). На последнем этапе индивидуальные клоны выделяли методом предельных разведений в куриных эмбрионах в присутствии антисыворотки к вирусу H2N2 при 32°С. Отобранные клоны исследовали в РТГА. Клоны R1 и К2 при взаимодействии с антисывороткой к вирусу H3N2 показывали титр 1:640, при взаимодействии с антисывороткой к вирусу H2N2 титр равнялся <1:2. У полученных клонов исследовали ts-фенотип при температурах 26°С, 34°С, 40°С. Клон R3 имел инфекционный титр при 26°С - 5.5 lg ЭИД/0.1 мл, при 34°С - 7.5 lg ЭИД/0.1 мл, при 40°С - 0. Анализ генома с помощью ПЦР-рестрикционного метода выявил в геноме реассортанта R3 наличие 6 "внутренних" генов от холодоадаптированного штамма А/Краснодар /101/59/35 (H2N2), а гены, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу, - от эпидемического штамма А/Хумамото/102/2 (H3N2).
Пример 7. Получение реассортантного холодоадаптированного вакцинного штамма для холодоадаптированной живой гриппозной вакцины методом реассортации холодоадаптированного штамма А/Краснодар/101/59/35 (H2N2) и эпидемического штамма А/Берн/07/95 (H1N1).
7.0
7.0
50
50
50
В 9-дневные куриные эмбрионы вносили 10 ЭИД эпидемического штамма А/Берн /07/95 (H1N1), облученного УФ (инфекционный титр в результате облучения снижался на 6 lg ЭИД) и холодоадаптированный штамм А/Краснодар/101/59/35 также в концентрации 10 ЭИД. Инфицированные эмбрионы инкубировали при 32°С в течение 18 часов. Затем отсасывали вируссодержащую аллантоисную жидкость из эмбрионов и проводили еще 2 пассажа в куриных эмбрионах при 26°С в присутствии антисыворотки к вирусу H2N2 при 32°С. (200 ЕД/эмбрион).
50
50
Индивидуальные клоны получали методом предельных разведении в куриных эмбрионах при 32°С в присутствии антисыворотки к вирусу H2N2. Полученные клоны исследовали в РТГА. Антисыворотка к вирусу H1N1 при взаимодействии с клоном R3 ингибировала его в титре 1:1280, а антисыворотка к вирусу H2N2 ингибировала данный клон в титре <1:10. При исследовании ts-фенотипа данного клона было обнаружено, что клон R3 имел инфекционный титр при 38°С - 0, при 34°С - 6,5 lg ЭИД/0.1 мл, при 26°С - 4,5 lg ЭИД/0,1 мл. Анализ генома с помощью ПЦР-рестрикционного метода выявил в геноме реассортанта R3 наличие 6 "внутренних" генов холодоадаптированного штамма А/Краснодар /101/59/35(H2N2), а гены, кодирующие гемагглютинин и нейраминидазу, - от эпидемического щтамма А/Берн/07/95 (H1N1).
Литература
1. Патент №92006182 (1995.10.27) Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) для получения штаммов живой интраназальной гриппозной вакцины.
2. Alexandrova G.B., Smorodintsev A. Obtaining of an additionally attenuated vaccinating cryophilic influenza strain. Rev. Rom. Inframicr. 1995,2: 179-189.
3. Klimov A.I., Cox N.J., Yotov W., Rocha E., Alexandrova G.I., Kendal A.P. Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A /Leningrad/I 34/57 (H2N2) virus. Virology, 1992, 186(2): 795-797.
4. Киселева И., Климов А., Григорьева E., Ларионова Н., Александрова Г., Руденко Л. Генетический и фенотипический анализ гетерогенной популяции холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и реассортантных гриппозных вакцинных штаммов, подготовленных на его основе. Вопросы вирусологии, 2005, №2: 14-18.
5. Keitel W.A., Piedra P.A. Live cold-adapted, reassortant influenza vaccines (USA).In: Textbook of influenza, editors K.G. Nicholson, R.G. Webster, A.J. Hay, 1998. Blackwell science, 373-390.
6. CDC. Using live attenuated influenza vaccine for prevention and control influenza: supplemental recommendations of the Advisory Committee in immunization practics MMWR. 2003,52: 1-8.
7. Ghenkina D., Ghendon Y. Recombination and complementation of orthomyxoviruses in the conditions of abortive infection. Acta virol. 1979, 23(2): 97-106.
8. N. Cox, F. Kitame, A. Kendal, H.F. Maassab and C. Naeve. Identification of sequence changes in the cold-adapted live attenuated influenza vaccine strain A/Ann Arbor/6/60 (H2N2). Virology, 1988, 167(2): 554-567.