СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОСТОВЕРНОСТИ ПРОИСХОЖДЕНИЯ И ЧИСТОПОРОДНОСТИ СВИНЕЙ
METHOD FOR DETERMINATION OF ORIGIN AND GENUINENESS OF STRAIN OF PIGS

Изобретение относится к молекулярной генетике и разведению сельскохозяйственных животных, в частности к способу определения достоверности происхождения и чистопородности свиней основанного на выявлении генотипов животных посредством одновременной мультиплексной амплификации 10 микросателлитных локусов свиней (SW24, S0155, SO005, SW72, SW951, S0386, S0355, SW240, SW857, S0101), с использованием тест-системы ДНК-экспертизы свиней, обладающей всеми оптимальными техническими и функциональными характеристиками. Спектр локусов для включения в тест-систему был основан на рекомендациях Международного общества генетиков (ISAG) для контроля достоверности происхождения свиней и, тем самым, характеризуется возможностью сравнения результатов, полученных в лабораториях разных стран. Данный способ позволяет детектировать несовпадение происхождения животных с данными племенного учета с точностью 99,9%, а также выявлять чистопородных животных без предварительной информации о принадлежности особи к той или иной породе с помощью анализа фракционального членства каждой особи в кластере на основе значений Q-критерия (коэффициента подобия), в качестве порогового значения которого выбран 85% уровень исключения.
Проведение генетической экспертизы во всех отраслях племенного животноводства закреплено в законодательных и нормативно-правовых документах. В соответствии с Федеральным законом "О племенном животноводстве" (1995) и приказами Минсельхоза России №402 от 17 ноября 2006 г. и №431 от 17 ноября 2011 г. племенные животные подлежат генетической сертификации и получение статуса «племенной завод», «генофондное хозяйство», а также «селекционно-генетический центр» предусматривает проведение генетической экспертизы племенной продукции. Одним из первых методов оценки сельскохозяйственных животных по происхождению была родословная, особое значение ведению которой придавалось в XVIII и XIX вв., когда ускорился процесс создания новых ценных пород животных всех видов [Танана Л.А., Епишко О.А., Глинская Н.А. STR-локусы в контроле происхождения крупного рогатого скота белорусской черно-пестрой породы // Сборник научных трудов Всероссийского научно-исследовательского института овцеводства и козоводства. 2014. В. №7. Т.2. С.204-207]. С развитием методов молекулярно-генетического анализа, экспертиза контроля достоверности происхождения стала осуществляться посредством иммуногенетического метода, в частности у свиней реакцией агглютинации, однако подобное тестирование характеризуется большой трудоемкостью, относительно низкой производительностью и визуальной оценкой результатов реакций [Филимонов А.Ю., Усовершенствование системы иммуногенетического исследования свиней на основе полуавтоматического анализа групп крови с применением мультисканирования. Автореф. канд.дис, 2007].
Генотипирование животных данным методом использовалось повсеместно вплоть до конца XX века. Благодаря открытию 90-х гг. XX в. метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей получать многочисленные копии специфичных участков ДНК, были созданы современные передовые технологии генотипирования животных. На смену полиморфным системам крови пришли более эффективные ДНК-маркеры. В настоящее время наиболее удобным инструментом для проведения генетических экспертиз по индивидуальной идентификации, контролю достоверности происхождения и выявлению чистопородных животных, считаются микросателлиты или STR-маркеры (Short Tandem Repeats-короткие тандемные повторы) [Калинкова Л.В. Эффективность дополнительных микросателлитных маркеров при тестировании чистокровных арабских лошадей на достоверность происхождения // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2017. Т. 12. С.51-57].
Микросателлитная ДНК представляет собой фрагменты ДНК с большим количеством - до сотни и более - тандемно повторяющихся идентичных "мотивов", обычно называемых "повторами": короткими последовательностями из нескольких (как обычно принято считать, от 1 до 6) пар нуклеотидов. Аллели микросателлитного локуса отличаются друг от друга длиной в основном за счет разного числа содержащихся в них повторов. Микросателлиты в большом количестве распределены по всему геному эукариот и локализованы как в некодирующих, так и в кодирующих (значительно реже) участках генома [Toth G., Gaspari Z., Jurka J. Microsatellites in different eukaryotic genomes: survey and analysis // Genome Res. 2000. V. 10. №7. P. 967-9812; Bhargava A., Fuentes F.F. Mutational dynamics of microsatellites // Mol. Biotechnol. 2010. V. 44. №3. P. 250-266; Li Y., Korol A.B., Fahima T. et al. Microsatellites: genomic distribution, putative functions, and mutational mechanisms: a review // Mol. Ecol. 2002. V. 11. №12. P. 2453-2465]. Подавляющая доля мутаций в микросателлитных локусах возникает за счет специфической ошибки репликации ДНК в районе микросателлита - проскальзывания (англ. "slippage") ДНК-полимеразы вдоль гомополимерной последовательности на число нуклеотидов, кратное длине повтора [Шайхаев Е.Г., Животовский Л.А. Эволюция микросателлитных локусов лососевых рыб // Генетика. 2014. Т. 50. №8. С.967-974]. Кроме того, помимо изменений количества повторов, происходящих в результате проскальзывания цепей во время репликации, внутри микросателлитов также возможны точковые мутации и делеции/инсерции (не кратные количеству нуклеотидов в повторе) [Zhu Y., Strassmann J.E., Queller D.C. Insertions, substitutions, and the origin of microsatellites // Genet. Res. 2000. V. 76. №3. P. 227-236]. Микросателлитные локусы высокополиморфны, так при анализе генотипов по 10 микросателитам крупной белой породы свиней Чехии, было выявлено 63 аллеля и число аллелей на локус варьировало от 3 до 10 [Putnova L., Knoll A., Dvorak V., Dvorak J. A novel porcine microsatellite panel for the identification of individuals and parentage control in the Czech Republic // Czech J. Anim. Sci. 2003. №48 (8). P. 307-314], у свиней белорусской селекции было детектировано 74 аллеля с ранжированием от 4 до 16 [Харзинова В.Р., Лобан Н.А., Карпушкина Т.В., Костюнина О.В., Пищелко Е.В., Лобан Е.Н., Зиновьева Н.А. генетическая характеристика свиней белорусской селекции с использованием ДНК-маркеров // Свиноводство. 2018. №8. С.63-66].
Такая высокая вариабельность микросателлитов объясняется их более высокими темпами мутирования по сравнению с изменчивостью остальной геномной ДНК [Bhargava A., Fuentes F.F. Mutational dynamics of microsatellites // Mol. Biotechnol. 2010. V. 44. №3. P. 250-266; Schlotterer C. Evolutionary dynamics of microsatellite DNA // Chromosoma. 2000. V. 109. P. 365-371]. В связи с высокой полиморфностью использование микросателлитной типизации для контроля происхождения и решения проблем сомнительного отцовства было показано почти для всех видов домашних животных [Behl et al. 2007, Souza et al. 2012, Храброва Л.А. и др. 2015; Гладырь Е.А. и др., 2011; Brenig and Schulz 2016].
Имеется тест-система анализа 22 микросателлитов включающих три- и тетрануклеотиды [Cherel P., Glenisson J., Pires J. Tetranucleotide microsatellites contribute to a highly discriminating parentage test panel in pig // Anim Genet. 2011 Dec; 42(6):659-61. doi: 10.1111/j.1365-2052.2011.02187.x.]. Данный способ отличается трудоемкостью и включает в себя только анализ достоверности происхождения.
Имеется тест-система анализа микросателлитов [KR 20170069606 A Method for individualization and Parentage test in pig using microsatellite marker] с использованием hot-start Taq полимеразы для идентификации свиней. Однако, спектр локусов не основан на рекомендациях Международного общества генетиков и не предусмотрен для идентификации достоверности происхождения и чистопородности.
Наиболее важным критерием использования молекулярных маркеров, в частности микросателлитов, для контроля достоверности происхождения является анализ точности подтверждения происхождения по обоим родителям (РХ1), точность подтверждения происхождения по одному родителю (РХ2) и точность исключения родителей (РХ3), или так называемая вероятность исключения (probability of exclusion, РЕ) - это вероятность того, что заявленный индивид исключается в качестве родителя [Behl R., Behl J., Tantia M.S., Nahardeka N., Das G.C., Kumar S., Vijh R.K. Evaluation of 24 microsatellite markers for parentage exclusion in three indigenous pig types of India // Indian Journal of Animal Sciences. 2017. №87 (4). P. 443-446].
-10
-11
-16
-18
Поскольку в свиноводстве используют, например, осеменения смешанной спермой, а также покрывают свиноматку повторно различными хряками, то подобный анализ в данной отрасли, является особенно необходимым. Так, анализ полиморфизма 24 микросателлитов в аборигенных популяциях свиней Индии показал, что точность подтверждения происхождения по обоим родителям варьировала от 1-2.07×10 у северных особей до 1-3.95×10 у свиней породы анкамали. Точность подтверждения происхождения по одному родителю варьировала от 1-4.57×10 у ассамских свиней до 1-3.17×10 у свиней породы анкамали. Аналогичным образом, распределились кумулятивные значения по точности исключения родителей: от 0,999999 для свиней породы ассам и до 0,99999955 для свиней породы анкамали [Behl R., Behl J., Tantia M.S., Nahardeka N., Das G.C., Kumar S., Vijh R.K. Evaluation of 24 microsatellite markers for parentage exclusion in three indigenous pig types of India // Indian Journal of Animal Sciences. 2017. №87 (4). P. 443-446].
При использовании 10 микросателлитов в популяциях свиней крупная белая и ландрас, разводимых в Чехии, точность исключения родителей составила 0,999 и 0,995 соответственно [Putnova L., Knoll A., Dvorak V., Dvorak J. A novel porcine microsatellite panel for the identification of individuals and parentage control in the Czech Republic // Czech J. Anim. Sci. 2003. №48. P. 307-314].
Таким образом, полученные значения точности исключения родителей с использованием разного набора микросателлитов, однозначно превышали общепринятые значения вероятности исключения равные 0,9995 [Luikart G., et al. 1999; Cho G. J. and Cho B. W., 2004].
Кроме того, проведенный сравнительный анализ групп крови и микросателлитов в качестве критериев генетической экспертизы происхождения четырех пород свиней показал, что вероятность совпадения генотипов по 20 ЭА 10 систем групп крови составило 0,0005, то есть у одного животного из каждых 2000 проанализированных возможно появление идентичного генотипа по всем протестированным ЭА. При этом вероятность совпадения генотипов по микросателлитам составила 10"13, то есть практически исключена [Зиновьева Н.А., Сизарева Е.И., Гладырь Е.А., Проскурина Н.В., Шавырина К.М. Некоторые аспекты использования микросателлитов в свиноводстве // Достижения науки и техники АПК. 2009. №8. С.38-41].
Наряду с контролем достоверности происхождения, еще одним важным аспектом развития отрасли свиноводства является чистопородное разведение, особенность которого заключается в передаче породных свойств, закрепленных отбором и длительным относительно однородным подбором. Каждая порода - большая народнохозяйственная ценность, а сохранение и совершенствование породных качеств является главной задачей чистопородного разведения. Для определения принадлежности животного к породе принято использовать метод, основанный на анализе племенных записей [Борисенко Е.Я. Разведение сельскохозяйственных животных, М.: Колос, 1967. 415 с]. Однако данный метод характеризуется недостатками, вызванными искажениями идентификационной информации и накоплением ошибок идентификации племенных животных.
В качестве прототипа заявленного способа, наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату, можно считать использование однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) или панелей SNP для тестирования происхождения животных, включая свиней [Fernandez et al. 2013, McClure et al. 2013, Yu et al. 2015], однако их абсолютная потребность в дорогостоящем оборудовании, в частности ДНК-секвенаторе, снижает их экономическую эффективность. Также наш способ менее трудоемкий и характеризуется возможностью использования реагентов отечественных производителей, тем самым обеспечивая относительно невысокую стоимость разрабатываемого способа.
Задача изобретения заключалась в разработке тест-системы одновременной мультиплексной амплификации 10 микросателлитов свиней, позволяющей не только осуществлять контроль достоверности происхождения и детектировать несовпадение происхождения животных с данными племенного учета с точностью 99,9%, а также выявлять чистопородных животных без предварительной информации о принадлежности особи к той или иной породе с помощью анализа фракционального членства каждой особи в кластере на основе значений Q-критерия (коэффициента подобия), в качестве порогового значения которого выбран 85% уровень исключения.
Технический результат изобретения достигается тем, что спектр локусов для включения в тест-систему, был основан на рекомендациях Международного общества генетиков (ISAG) для контроля достоверности происхождения свиней, и тем самым характеризуется возможностью сравнения результатов, полученных в лабораториях разных стран. Также тест-система предусматривает выделение ДНК из биологического материала животных, проведение мультиплексной ПНР амплификации, фрагментный анализ с последующей детекцией ампликонов на генетическом анализаторе всех десяти микросаталлитов, выявление несовпадения происхождения животных с точностью 99,9%, а также определение чистопородных животных без предварительной информации о принадлежности особи к той или иной породе на основании значений Q-критерия в качестве порогового значения которого выбран 85% уровень исключения. Это обеспечит снижение трудоемкости, увеличение производительности, возможности использования реагентов отечественного производства, относительно невысокую стоимость разрабатываемого способа.
Сущность изобретения - определение генотипов животных посредством одновременной мультиплексной амплификации 10 микросателлитов свиней (SW24, SO155, SO005, SW72, SW951, S0386, S0355, SW240, SW857, S0101), для контроля достоверности происхождения свиней, а также применение предложенного способа для определения чистопородных животных без предварительной информации о принадлежности особи к той или иной породе.
Разрабатываемый способ базируется на определении спектра локусов микросателлитов, включенных в тест-систему: SW24, SO155, SO005, SW72, SW951, S0386, S0355, SW240, SW857, S0101, рекомендованных Международным обществом генетиков (ISAG) для контроля достоверности происхождения свиней, а также его использование для определения чистопородности животных. Амплификацию фрагментов, выбранных микросателлитных локусов выполняли в одной мультиплексной реакции с использованием флуоресцентно-меченных праймеров. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в конечном объеме 15 мкл с 1×ПЦР буфером (16,6 мМ (NH4)2SO4, 67,7 мМ Трис- НСl, рН=8,8, 0,1% (v/v) Tween 20), 1,5 мМ MgCl2, 200 мкМ динуклеотидтрифосфатов, 10 пмоль каждого из праймеров и 1 Ед Tag-полимеразы («Диалат Лтд.», Россия), 8,01 мкл бидистиллированной воды и добавляли 1 мкл (50-100 нг) исследуемой геномной ДНК. После начальной денатурации (94 С, 5 мин) выполняли 29 циклов амплификации (95 С, 1 мин; 60 С, 30 с; 72 С, 1 мин). Режим отжига рассчитывали с учетом температуры плавления олигонуклеотидов. Разделение и детекцию образующихся фрагментов выполняли на генетическом анализаторе ABI3130×1 («Applied Biosystems», США). Размеры аллелей определяли с помощью программного обеспечения Gene Mapper v. 4 («Applied Biosystems», США). Для обработки результатов анализа формировали матрицу генотипов в формате Microsoft Excel.
Информативность разработанной тест-системы для контроля достоверности происхождения оценивали на основе анализа точности подтверждения происхождения по обоим родителям (РХ1), точности подтверждения происхождения по одному родителю (РХ2) и точности исключения родителей (РХ3), или вероятности исключения (probability of exclusion, РЕ). Для определения чистопородности животных был использован программный алгоритм, описанный Pritchard J.K. [Pritchard J.K. Inference of population structure using multilocus genotype data // Genetics. 2000. Vol.155. P. 945-959], без введения предварительной информации о породной принадлежности индивидуумов, с указанием потенциально возможного числа популяций (К=1 и более). Для каждой из групп рассчитывали среднее значение Q-критерия и в качестве, порогового значения которого, был выбран 85% уровень исключения (Q≥0,85).
Пример. Контрольное использование предложенного способа определения достоверности и чистопородности было апробировано на 1026 животных трех пород: крупная белая (n=367), ландрас (n=269), дюрок (n=390). Пример представлен для 48 животных каждой породы.
Достоверность происхождения и чистопородность животных была предварительно подтверждена результатами анализа их родословных.
1. ДНК выделяли из проб ткани с использованием набора ДНК-Экстран-2 (ЗАО ((Синтол», Россия) согласно протоколу фирмы-производителя.
2. Амплификацию фрагментов выбранных микросателлитных локусов выполняли в одной мультиплексной реакции с использованием 10 пар праймеров в которых один из пары флуоресцентно-мечен на 5' конце: SW24, S0155, SO005, SW72, SW951, S0386, S0355, SW240, SW857, S0101, в конечном объеме 15 мкл.
3. Разделение и детекцию образующихся фрагментов выполняли на генетическом анализаторе ABI3130×1 («Applied Biosystems», США).
4. Для обработки результатов анализа формировали матрицу генотипов в формате Microsoft Excel.
5. Информативность разработанной тест-системы для контроля достоверности происхождения оценивали по показателям доли полиморфных локусов, среднего числа аллелей на локус и на основе анализа вероятности совпадения генотипов индивидуумов (PI), точности подтверждения происхождения по обоим родителям (РХ1), точности подтверждения происхождения по одному родителю (РХ2) и точности исключения родителей (РХ3), или вероятности исключения в качестве родителей (probability of exclusion, РЕ).
5.1. Анализ полученных матриц показал:
Все микросателлитные локусы, включенные в тест-систему, оказались полиморфны и число аллелей на локус варьировало от 4 (локус SW72) до 16 (локус SO005). Всего было детектировано 64 аллеля и среднее число аллелей на локус составило 6,222±0,558.
-6
-7
-8
-6
Вероятность совпадения генотипов (PI) исследуемых пород свиней была практически исключена: значения PI распределились следующим образом: 7,8*10 (порода дюрок), 5,1*10 порода ландрас и 1,5*10 породы крупная белая. Вероятность совпадения генотипов (PI) в среднем составила 2,8* 10.
Точность подтверждения происхождения по обоим родителям (РХ1) в среднем составила 99%: РХ1=99,6%, 98,6% и 98,8% для пород свиней крупная белая, дюрок и ландрас соответственно.
Точность подтверждения происхождения по одному родителю (РХ2) в среднем составила 93,3%: РХ2=96,4%, 93% и 90,5% для пород свиней крупная белая, дюрок и ландрас соответственно.
Точности исключения родителей (РХ3) для всех пород была выше 99,9%: РХ3=99,99%, 99,79% и 99,95% для пород свиней крупная белая, дюрок и ландрас, соответственно.
Таким образом, предложенный нами способ анализа десяти микросателлитов обладает всеми необходимыми оптимальными техническими и функциональными характеристиками для оценки достоверности происхождения свиней.
6. Определение достоверности происхождения было основано на анализе микросателлитных генотипов триад свиней (отце-мать-потомок) пород свиней крупная белая (Фиг. 1), ландрас (Фиг. 2) и дюрок (Фиг. 3). Идентификацию триад проводили путем сверки номера татуировки потомка, отца и матери с записями племенного учета.
6.1. Анализ полученных микросателлитных генотипов показал: При исследовании триад отец-мать-потомок каждой породы свиней, было выявлено совпадение наследуемых аллелей по всем 10 локусам. У потомков были детектированы аллели, присутствующие в генотипах отца и матери.
Таким образом, полученные результаты были идентичны данным записей племенного учета с достоверностью 99,9% и предложенный нами способ может использоваться в качестве инструмента контроля достоверности происхождения свиней.
7. Определение чистопородности животных выполняли посредством расчета значений Q-критерия без введения предварительной информации о породной принадлежности индивидуумов. Для каждой из групп были рассчитаны средние значения Q-критерия, а в качестве порогового значения был выбран 85% уровень исключения (Q≥0,85) (Фиг. 4-6).
7.1. Расчет значений Q-критерия у индивидуумов показал: Все особи были отнесены к различным популяциям (кластерам), с ранжированием значений Q-критерия от 0,897 до 0,996 и в среднем составили 0,986±0,001.
Таким образом, предложенный нами способ на основании расчета значений Q-критерия показал возможность отнесения индивидуумов свиней трех пород к трем различным популяциям (кластерам) в соответствии с их породной принадлежностью и без введения предварительной информации о происхождении. В качестве порогового значения Q-критерия был выбран 85% уровень исключения (Q≥0,85), при этом данные значения были выше уровня исключения в 100% случаях.
Предложенный способ может быть использован в молекулярной генетике и разведении сельскохозяйственных животных в качестве контроля достоверности происхождения и определения чистопородности различных пород племенных свиней.