Способ определения количества белков Всl-2 и Вах в сосудистой стенке у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей
METHOD FOR DETERMINING AMOUNT OF Bel-2 AND Bax PROTEINS IN VASCULAR WALL IN PATIENTS WITH OBLITERATING ATHEROSCLEROSIS OF ARTERIES OF LOWER EXTREMITIES

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и может быть использовано при лабораторной диагностике показателей апоптоза в сосудистой стенке при облитерирующем атеросклерозе артерий нижних конечностей (ОААНК).
ОААНК является глобальной проблемой здравоохранения, которая становится все более распространенной среди стареющего населения мира [1].
Согласно современным представлениям система апоптоза играет важную роль в патогенезе атеросклеротического поражения [2, 3].  В норме клетки сосудов мало подвергаются апоптотической гибели, которая представляет собой возможность удаления инфильтрирующих лейкоцитов и поврежденных клеток без развития воспаления [4]. Надлежащим образом это функционирует на ранних стадиях атеросклероза, а повышение скорости апоптоза на более поздней стадии поражении связано с недостаточным удалением гибнущих клеток, развитием вторичного некроза, обострением воспаления в атеросклеротической бляшке [5].
Семейство белков Bcl-2 является главным регулятором внутреннего пути апоптоза, состоящим из антиапоптотических и проапоптотических членов. Антиапоптотические белки, такие как белок Bcl-2 (B-cell lymphoma 2), ингибируют апоптоз путем предотвращения высвобождения митохондриальных апоптогенных факторов, таких как как цитохром С в цитоплазму. Напротив, проапоптотические белки, такие как белок Bax (Bcl-2-associated X protein), индуцируют апоптоз посредством воздействия на поры митохондриальной мембраны, тем самым приводя к активации каспаз. Таким образом, семейство белков Bcl-2 действует как критическая точка принятия решения о жизни или смерти в рамках общего пути апоптоза [6, 7].
По динамике количества этих белков и их соотношения в атеросклеротической бляшке и сыворотке крови можно судить о течении ОААНК и риска развития его осложнений, таких как рестеноза и тромбоза зоны реконструкции [8].
Уровень техники
Основные методами диагностики содержания белков Всl-2 и Вах в атеросклеротических бляшка являются: 1. окрашивание клеток с помощью аннексина V и красителей ДНК; 2. TUNEL (TDT-mediated dUTP nick-end labeling); 3. иммуногистохимический метод; 4. вестерн-блоттинг [9].
Однако данные методы позволяют оценить апоптоз только в определенный момент времени (период забора материала), и не дают возможность оценить изменения показателей в динамике.
В отечественной и зарубежной литературе мы не встретили исследований по определению белков Вcl-2 и Вах и в сыворотке крови, и в гомогенате артериальной стенки, полученной интраоперационно у пациентов с облитерирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей.
Техническим результатом настоящего изобретения является разработка способа определения количества белков Всl-2 и Вах в гомогенате сосудистой стенки по их количеству в сыворотке крови у пациентов с ОААНК.
Осуществление изобретения
В исследование были включены пациенты с ОААНК, которые поступали в стационар для выполнения реконструктивно-восстановительных вмешательств на магистральных артериях нижних конечностей.
Исходно до проведения операции в сыворотке крови определи количество белков Вcl-2 и Вах с помощью метода ИФА коммерческими наборами Всl-2 (Human Bcl-2 ELISA Kit, «ThermoFisherScientific», Китай) и Bax (Enzyme –Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit For Bcl-2 Associated X Protein (Bax) «Сloud –Clone Corp», Китай). Для определения рефентных значений белков Всl-2 и Вах в исследование были включены здоровые добровольцы.
После подписания информированного согласия у пациентов забирался интраоперацинный материал, представляющий собой все три слоя сосудистой стенки в области атеросклеротической бляшки (АТБ). Образец сосуда измельчали и готовили гомогенат с помощью набора Ready Prep Protein Extraction Kit («Bio-Rad»). В качестве контроля артерий использовали образцы без видимых признаков атеросклероза у пациентов, которым выполняли реконструктивно-восстановительные операции на артериях нижних конечностей (контрольный образец).
Полученные результаты обрабатывали с помощью пакета статистических программ STATISTICA 10.0. В связи с отклонением от нормального распределения данных (использовался критерий Шапиро-Уилка, р˂0.05) для дальнейшего анализа применялись непараметрические тесты: для сравнения двух независимых групп - U-критерий Манна-Уитни, в качестве корреляционного анализа использовался тест Спирмена. С помощью программы IBM SPSS Statistics 26 был проведен нелинейный однофакторный регрессионный анализ. Принятый уровень статистической значимости р˂0.05.
Исследование показало, что в гомогенате артериальной стенки в области атеросклеротической бляшки у пациентов с ОААНК количество проапоптического белка Вах (p=0.033) было повышено в сравнении с его количеством в контрольных образцах и составило 6.54 нг/мл. Уровень антиапоптического белка Всl-2 достоверно не отличился от его уровня в контрольных образцах и составил 1,4 нг/мл (p=0.504). Проапоптический индекс (соотношение Всl-2 к Вах) был снижен в гомогенате артериальной стенки в области атеросклеротического поражения, без статистически значимой разницы по сравнению с его уровнем в контрольных образцах (p=0.07).
В сыворотке крови у пациентов с ОААНК уровень антиапоптического белка Вах (p=0.009) был повышен, а соотношение Всl-2/Вах (р=0.033) снижено в сравнение со значениями здоровых добровольцев и составили 26.7 нг/мл и 0.18, соответственно. Уровень белка Всl-2 у пациентов с ОААНК составил 4.96 нг/мл и достоверно не отличался от значений здоровых добровольцев (p=0.761).
При проведении корреляционного анализа были выявлены прямые взаимосвязи между количеством белков Всl-2 (r=+0.806), Вах (r=+0.699), Вах/Всl-2 (r=+0.642) в гомогенате сосудистой стенки и их количеством в сыворотке крови у пациентов с ОААНК.
Проведённый нелинейный однофакторный регрессионный анализ позволил вывести формулы уравнения регрессии: Х - количество белка Всl-2 в сосудистой стенке, У - количество белка Всl-2 в сыворотке крови, К - количество белка Вах в сосудистой стенке, М - количество белка Вах в сыворотке крови.
2
3
X= 0.802 – 0.633*У + 0.224* У – 0.015* У
2
К = 12.46 – 0.875*М + 0.025* М
Таким образом, выявлены прямые корреляционные связи между количеством белков Всl-2 и Вах в гомогенате сосудистой стенке с их количеством в сыворотке крови, позволили создать формулу для расчёта количества белков Всl-2 и Вах в гомогенате сосудистой стенки по их количеству в сыворотке. Учитывая результаты, полученные в этом исследовании, существует возможность для определения белков Всl-2 и Вах в сыворотке крови у пациентов с ОААНК для возможной оценки в динамике их содержания и соотношения в атеросклеротической бляшке.
Источники информации, принятые во внимание
1. Dua A, Lee CJ. Epidemiology of Peripheral Arterial Disease and Critical Limb Ischemia. Tech Vasc Interv Radiol. 2016 Jun;19(2):91-5. doi: 10.1053/j.tvir.2016.04.001. Epub 2016 Apr 22. PMID: 27423989.
2. Paone S, Baxter AA, Hulett MD, Poon IKH. Endothelial cell apoptosis and the role of endothelial cell-derived extracellular vesicles in the progression of atherosclerosis. Cell Mol Life Sci. 2019 Mar;76(6):1093-1106. doi: 10.1007/s00018-018-2983-9. Epub 2018 Dec 19. PMID: 30569278.
3. Егорова И.Э., Бахтаирова В.И., Суслова А.И.  Молекулярные механизмы апоптоза, вовлеченные в развитие различных патологических процессов. Инновационные технологии в фармации. 2019; 6: 108-114.
4. Kockx MM, De Meyer GR, Muhring J, Jacob W, Bult H, Herman AG. Apoptosis and related proteins in different stages of human atherosclerotic plaques. Circulation. 1998 Jun 16;97(23):2307-15. doi: 10.1161/01.cir.97.23.2307. PMID: 9639374.
5. Singh R, Letai A, Sarosiek K. Regulation of apoptosis in health and disease: the balancing act of BCL-2 family proteins. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019 Mar; 20(3):175-193. doi: 10.1038/s41580-018-0089-8. PMID: 30655609; PMCID: PMC7325303.
6. Калинин Р.Е., Сучков И.А., Климентова Э.А., Егоров А.А. К вопросу о роли апоптоза в развитии атеросклероза и рестеноза зоны реконструкции. Новости хирургии. 2020. Т. 28. № 4. С. 418-427.
7. Peña-Blanco A, García-Sáez AJ. Bax, Bak and beyond - mitochondrial performance in apoptosis. FEBS J. 2018 Feb;285(3):416-431. doi: 10.1111/febs.14186. Epub 2017 Sep 4. PMID: 28755482.
8. Isner JM, Kearney M, Bortman S, Passeri J. Apoptosis in human atherosclerosis and restenosis. Circulation. 1995 Jun 1;91(11):2703-11. doi: 10.1161/01.cir.91.11.2703. PMID: 7758173.
9. Кудрявцев И.В., Головкин А.С., Зурочка А.В., Хайдуков С.В. Современные методы и подходы к изучению апоптоза в экспериментальной биологии. Медицинская иммунология 2012, Т. 14, № 6, стр. 461-482.