Экзосомы: от биологии к клинике

ОБЗОРЫ

DOI: 10.23868/201707024

ЭКЗОСОМЫ: ОТ БИОЛОГИИ К КЛИНИКЕ

Е.М. Самойлова, В.А. Кальсин, В.А. Беспалова, В.М. Девиченский, В.П. Баклаушев

Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи ФМБА России, Москва, Россия

Exosomes: from biology to clinics

E.M. Samoylova, VA. Kalsin, VA. Bespalova, V.M. Devichensky, V.P. Baklaushev Federal Research Clinical Center, FMBA of Russia, Moscow, Russia

Экзосомы — внеклеточные везикулы 30—120 нм в диаметре, происходящие из ранних эндосом. В последнее десятилетие экзосомы стали активно изучаться, появилось множество данных об их природе и роли в межклеточном транспорте и сигналинге как в норме, так и при патологии. Особый интерес в клинической практике к эк-зосомам возник после того, как стало возможно выделение их циркулирующей фракции из крови и исследование в них опухолевых генетических маркеров — так называемая «жидкая биопсия». Задача данного обзора: познакомить специалистов-клиницистов с основными понятиями биологии и физиологии экзосом и основными достижениями по их практическому применению в медицине: в качестве естественной системы адресной доставки лекарств, а также для высокоточной, ранней и неинвазивной дифференциальной диагностики заболеваний.

Ключевые слова: экзосомы, жидкая биопсия, адресная доставка лекарств, интернализация, секреция.

Ведение

Необходимым условием жизнедеятельности любого многоклеточного организма являются межклеточные взаимодействия, позволяющие скоординировать биохимические процессы, протекающие в его клетках. Известно, что координирующие сигналы передаются с помощью гормонов, цитокинов, факторов роста, нейромедиаторов, метаболитов, ионов, РНК и ДНК. Передача сигналов может осуществляться разными путями: путем секреции биологически активных молекул во внеклеточное пространство, через щелевые контакты напрямую между клетками, с помощью вторичных мессендже-ров, а также посредством микровезикулярного транспорта — через экзосомы. Нарушение экзосомального межклеточного сигналинга, по всей вероятности, имеет место в патогенезе самых различных заболеваний: от нарушений гемокоагуляции до опухолевой трансформации клеток [1]; экзосомы могут передавать не только межклеточные сигналы, но и, например, распространять микроРНК вируса Эпштейна — Барр от заражённых клеток к здоровым, участвуя таким образом в развитии герпес-ассоциированных заболеваний и медленных нейроинфекций [2].

Впервые экзосомы наблюдали в 1946 г. E. Chargaff и R. West в качестве прокоагулянтных тромбоци-тарных частиц [3]. В дальнейшем их обнаружил P. Wolf в 1967 г. и назвал «тромбоцитарной пылью» [4], а в 1969 г. в ходе исследования костной кальцификации их выявил H.C. Anderson [5]. Но как внеклеточные микровезикулы экзосомы были впер-

e-mail: samoyket@gmail.com

Exosomes are extracellular vesicles with the diameter of 30—120 nm, originating from early endosomes. Exosomes have been actively studied in the last decade, and a great amount of data has appeared on their nature and role in the intercellular transport and signaling both in the normal and pathological conditions. A particular interest to exosomes in the clinical practice emerged after the separation of their circulating fraction from the blood and the study of tumor genetic markers in them became possible (so called "liquid biopsy"). The objective of this review is to familiarize clinical specialists with the fundamentals of exosomes' biology and physiology and with the main achievements on their practical application in the medicine, as a natural drug delivery system, as well as for high-precision, early non-invasive differential diagnostics of diseases.

Keywords: exosomes, liquid biopsy, targeted drug delivery, internalization, secretion.

вые описаны только в середине 1980-х годов научной группой R.M. Johnstone, которая выявила, что, в период созревания ретикулоцитов млекопитающих, рецептор трансферрина и некоторые другие мембрано-ассоциированные элементы избирательно секретируются клеткой во внеклеточных пузырьках, разносимых кровотоком по всему организму, которые впоследствии были названы экзосомами [6]. В 2007 г. H. Valadi с соавт. обнаружил, что эк-зосомы могут переносить нуклеиновые кислоты, в частности РНК [7]. С того момента экзосомальный транспорт начал активно изучаться, и уже в 2013 г. Нобелевскую премию по физиологии или медицине вручили Джеймсу Ротману, Рэнди Шекману и Томасу Зюдофу — «за открытие системы везикулярного транспорта — основной транспортной системы в наших клетках». С тех пор стало известно, что экзосомы могут нести в себе самые разные составляющие донорской клетки, в том числе белки, липиды, мРНК, микроРНК, малые интерферирующие РНК (миРНК) и ДНК [8].

Экзосомы секретируются практически всеми клетками организма и несут самые разные сигналы к клеткам-адресатам. Например, экзосомы являются переносчиками нейромедиаторов при передаче нервного импульса; также они осуществляют презентирование антигенов при формировании иммунного ответа [9]. Помимо переноса информации экзосомы могут доставлять готовые белки, необходимые клетке-адресату. Так, они переправляют от нейронов к мышечным клеткам мембранный белок

синаптотагмин-4, который нужен для формирования нервно-мышечного соединения, через которое передаются электрические сигналы от нейронов к мышечным клеткам [9].

Внутреннее содержимое, размер и мембранный состав внеклеточных пузырьков весьма неоднородны и зависят от типа донорской клетки, ее функционального состояния и условий окружающей среды. В настоящее время выделяют три основные подгруппы внеклеточных везикул: апоптотические тельца, клеточные микрочастицы/микровезикулы/эктосомы и экзосомы [10] (рис. А). Кроме экзосом, огромную роль в координации межклеточных взаимодействий играют микровезикулы и эктосомы, регулирующие процессы ангиогенеза, свертывания крови, защиты от апоптоза и некоторые другие [11].

Биология и молекулярный состав экзосом

Экзосомы имеют размер 30—120 нм и формируются из ранних эндосом, от которых они получают ряд мембранных белков, таких как белки главного комплекса гистосовместимости, рецепторы, тетра-

Мембранные везикулы

Апоптотические тельца

Б

Трансмембранные белки: МНС класс I, МНС класс II, Транспортёры, флотиллины, аннексины, белки RAB, ARF, тетраспанины,. интегрины и др. адгез. белки, LAMP, TYR

О о

В

О О PLP

О •

> О Syntenin Syndecan

op

TSG101 CD63

спанины и пр. Другие же белки, РНК и ДНК попадают внутрь экзосом из цитоплазмы материнской клетки, в том числе и с помощью АТФ-зависимого направленного транспорта [12]. Дальнейшая судьба экзосомы зависит от липидного состава мембранных белков эндосомы: если мембрана эндосомы содержит лизо-бисфосфатидиловую кислоту (фосфатидилинозитол-3-фосфат) и убиквитинированные белки, то ее содержимое будет уничтожено посредством слияния с лизосомой. Если же мембрана эндосомы содержит церамиды, эндосома сливается с поверхностной мембраной донорской клетки, и уже в виде множества экзосом секретируется во внеклеточную среду [13]. Эти процессы находятся под контролем ГТФаз семейства Rab. Rab5 контролирует образование эндосом, Rab7 заведует слиянием эндосомы с лизосомой и деградацией её содержимого, а Rabil, Rab27 и Rab35 координируют секрецию экзосом во внеклеточное пространство (см. рис. Б, В).

Белки и белок-связывающие молекулы. Считается, что белковый состав экзосом в целом отражает белковый состав мембраны и цитоплазмы донорской клетки и формируется еще на уровне эндосомы. Эк-зосомы содержат как белки, являющиеся общими белками экзосом, так и белки, отражающие конкретную локализацию везикул, клеточное происхождение и механизм секреции [14—16]. Экзосомы содержат цитоплазматические, мембранные белки и белки теплового шока. Однако не найдено пока ни одного маркерного белка, по которому с уверенностью можно было бы идентифицировать экзосомы. Усложняет идентификацию экзосом и то, что протеомные профили в значительной степени зависят от способа выделения экзосом. Кроме того, один и тот же тип клеток может секретировать экзосомы с разным белковым составом, который зависит от факторов окружающей среды (например, парциального давления кислорода), топографических факторов (поверхность клетки базо-латеральная или апикальная) и др. [17].

Рис. Разновидности, состав и механизмы образования экзосом:

А — разновидности внеклеточных везикул (слева-направо): крупные мембранные везикулы — 1GG—2GGG нм; апоптотические тельца — фрагменты распадающейся клетки с лизированным ядром размером 1—4 мкм; собственно экзосомы — мембранные везикулы размером до 12G НМ;

Б — молекулярный состав экзосом: трансмембранные белки: главный комплекс гистосовместимости (MHCI, II), молекулы клеточной адгезии: тетраспанины (CD63, CD81, CD9), интегрины; белки транспортёры: аннексины, флотиллины, RABs ARFs. Цитоплазматические белки: ферменты, сигнальные белки (G-белки, белки семейства 14-3-3, синтенин и др.). Сокращения: ARF6 — АДФ рибозилирующий фактор 6; ESCRT — эндосомальный сортировочный комплекс; LAMP — лизосом-ассоциированный мембранный белок; MHC — главный комплекс гистосовместимости; RAB — Ras-связанные белки в головном мозге; ТФР — рецептор трансферрина. В — механизмы образования экзосом: под воздействием Rab7 эндосома сливается с лизосомой, что приводит к деградации её содержимого. Rab11, Rab27 и Rab35 координируют секрецию экзосом во внеклеточное пространство путем слияния мультивезикулярных эндосом (MVB) с плазматической мембраной. ARF6 и также некоторые компоненты ESCRT также участвуют в процессах биогенеза экзосом. А — по [77] с изм., В — по [12] с изм.

Вне зависимости от происхождения, все экзосо-мы несут на своей поверхности аннексины, регулирующие процессы слияния ее мембраны с мембраной клетки-адресата, ГТФазы Rab, молекулы адгезии и рецепторы, белки CD63, CD81, CD82 и CD9 из семейства тетраспанинов, белки Alix, белки сортировки ESCRT, а также белки главного комплекса гистосов-местимости (МНС), такие же, как у клетки-продуцента [18, 19]. Облигатным внутренним компонентом всех экзосом также, по всей вероятности, являются белки теплового шока (HSP60, HSP70, HSP90) [20]. Белки CD63, CD81, CD82, CD9 и Alix ранее считали главными маркерами экзосом, однако позже они были найдены на поверхности апоптотиче-ских телец и микропузырьков [17, 21]. Более того было показано, что маркер CD63 присутствует только на некоторых подтипах экзосом [22].

На мембране экзосом широко представлены различные гликопротеины, в частности, лектины, состав которых сильно разнится, например, у экзосом и апоптотических телец [14] и меняется при патологических состояниях [14, 23—26]. Интересно, что состав лектинов экзосом может отличаться от такового на мембране материнской клетки [27].

Среди гликопротеинов экзосом выделяют несколько, ответственных за связывание экзосом с клетками-мишенями, например, С- и Р-селектины (CD62) позволяют экзосомам, секретируемым тромбоцитами, связываться с клетками-мишенями через его классический Р-селектиновый лиганд-1 (PSGL-1) [28]. Из В-лимфоцитов были получены экзосомы, обогащенные а2,3-сиаловой кислотой, связывающейся с CD169 на макрофагах [29]. С помощью протеомного анализа экзосом, выделенных из плазмы крови, было обнаружено 9 основных эк-зосомальных лектинов, в том числе C0LEC10, фи-колин 1, 2 и 3, манноза-связывающий лектин сери-новых протеаз 1 и 2 [24]. Также в ряде недавних исследований была показана важность лектинов для сортировки экзосом и их взаимодействия с клеткой-мишенью [30—32].

Интересно, что топографическое расположение белков на поверхности экзосомы неслучайно. Белки, входящие в мембрану, способны более-менее свободно перемещаться в горизонтальной плоскости в направлении энергетически выгодных регионов, формируя локальную композицию оболочки и форму экзосомы [33]. Этот самосогласованный неспецифический механизм перемещения беков и белковых комплексов в мембране начинает реализовываться еще в материнской клетке во время формирования эндосомы [34]. Он во многом определяет форму, размер и состав экзосомы, что, в свою очередь, влияет на её физиологические свойства. Важную роль в композиции белковых компонентов мембраны играют лектины [27] и тетраспанины [35, 36], обогащенные микродоменами. Последние, как было показано, не только влияют на форму экзосомы, но и участвуют в формировании мембранных рецепторов, обеспечивающих, в т.ч., адресную доставку экзосом к клеткам-мишеням [35]. Также среди молекул, определяющих форму мембраны, выделяют BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) домены, в которых содержатся белки, отвечающие за формирование трубчатых мембранных структур [37, 38]. Белки сортировки ESCRT преимущественно перемещаются в область «шеи» отпочковывающихся эндосом, где и выполняют свою основную функцию [39]. Помимо своего

топографического положения на мембране, которое определяет отделение эндосомы от мембраны материнской клетки, белки ESCRT могут образовывать комплекс с будущим содержимым экзосомы через связывание с убиквитинилированными белками. Включение такого белка в экзосому может зависеть от места генерации везикулы и идти по ESCRT-зависимому или ESCRT-независимому пути. Белки семейства ERM (Ezrin, Radixin and Moesin) хорошо представлены в мембранах экзосом за счет их связи с различными компонентами микродоменов те-траспанинов, что также может в некоторой степени определять «адресность» экзосомы [35].

Экзосомы могут взаимодействовать с клетками-мишенями посредством связи их трансмембранных и «внутренних» белков с соответствующими рецепторами на поверхности клетки. Чаще всего в таком взаимодействии со стороны экзосомы принимают участия МНС I и II типов [20], тетраспанины [35], рецепторы трансферрина [40]. Также в лиганд-ре-цепторном взаимодействии участвуют «внутренние» белки экзосом — белки теплового шока HSP60 и HSP70. Кроме некоторых «общих» белков экзосом по этому типу с клеткой-мишенью взаимодействуют и специфические белки, характерные для клетки-донора и определяющие функциональный статус эк-зосомы, например, белки иммунных клеток: CD14, CD91, CD94/CD56 [41], TLR-2 и TLR-4 [42]; маркеры НК и их цитотоксические белки — FasL и перфо-рин [43].

Кроме того, экзосомы являются переносчиками целого ряда медиаторов, в том числе цитокинов. Чаще всего в экзосомах обнаруживают ИЛ-1р [44], ИЛ-1 а [45], ФНО [46], ИЛ-6 [47] и фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) [48]. Также экзосомы переносят хемокины, например, ИЛ-8 (CXCL8) и фрак-талкин (CX3CL1) в норме [49] и CCL2, CCL3, CCL4, CCL5 и CCL20 при онкологической патологии [50].

Липидный состав экзосом. Несмотря на то, что экзосомы из разных источников отличаются по липидному составу, исследования показали, что обычно их мембраны обогащены сфингомиелином, холестерином и гликосфинголипидами [51], а соотношение сфингомиелин/фосфатидилхолин в эк-зосомах 3:1 по сравнению с клетками-донорами, в которых это соотношение примерно 1:2,5 [52]. Из этого можно сделать вывод, что липиды, как и другие компоненты, включаются в состав экзосом не случайным образом, а подвергаются сортировке. Высокое содержание в экзосомах сфинголипидов и холестерина обеспечивает структурную жесткость мембраны за счет более плотной упаковки липидов и, как следствие, большую её стабильность. Кроме того, липиды участвуют в механизмах выделения экзосом клеткой-донором и механизмах поглощения — клеткой-мишенью. Также именно к сфинголипидам относятся церамиды, которые обеспечивают секрецию экзосом материнской клеткой.

РНК в экзосомах. Экзосомы содержат мРНК, длинные некодирующие РНК, миРНК, рРНК, фрагменты тРНК, микроРНК и некоторые другие. Содержание тех или иных видов РНК может меняться в зависимости от источника экзосомы. Первым экспериментальным доказательством того, что экзо-сомы могут переносить мРНК, стали исследования J. Ratajczak (2006) [53], который обработал мышиные мононуклеары костного мозга экзосомами из эмбриональных стволовых клеток, в цитоплазме

которых много мРНК транскрипционного фактора Oct4, что привело к перепрограммированию гемо-поэтических мононуклеаров и повышенному синтезу в них белка Oct4. Позднее было показано, что перенос экзосомами мРНК и микроРНК к клеткам-мишеням, способствует регенерации тканей после стрессовых воздействий [54], поддержанию гомеостаза и сохранению функционального состояния клеток. Например, экзосомы, производимые тучными клетками в условиях оксидативного стресса, содержат РНК, которые усиливают способность тучных клеток к утилизации H2O2 [55], а экзосомы, выделяемые крупными адипоцитами, переносят специфические мРНК, участвующие в этерификации жирных кислот и липидов [56].

В состав экзосом, как уже было сказано ранее, также входят миРНК и микроРНК. МикроРНК — малые некодирующие молекулы РНК длиной от 18 до 25 нт, которые принимают участие в транскрипционной и посттранскрипционной регуляции экспрессии генов за счет РНК-интерференции, то есть комплементарного связывания РНК-индуцируемого комплекса выключения гена (RISC) c мРНК, обеспечивающего её «глушение» или разрезание в зависимости от степени комплементарности микроРНК с мРНК [57]. Такие микроРНК секретируются целым рядом клеток: клетками иммунной системы [58], клетками крови [59], стволовыми [60] и многими другими. Все они секретируют экзосомы с разным содержанием микроРНК, соответствующим физиологическим задачам конкретных экзосом. Так, было описано, что экзосомы разных субпопуляций Т-клеток содержат разные микроРНК [61]. А при атеросклерозе экзосомы, обогащенные микроРНК-126, генерируют и передают паракринные сигналы тревоги клеткам-мишеням сосудов, индуцируя CXCL12-зависимую сосудистую защиту [62]. Также есть исследования, показывающие важную роль микроРНК в передаче сигналов от нейронов к астроцитам в ЦНС [63], при дифференцировке мышечных клеток [64], мезенхи-мальных стволовых клеток [65] и при фолликулярном созревании [66].

Довольно подробно описан механизм сортировки РНК из клетки-донора в экзосомы. Было показано, что этот процесс контролируется гетерогенным ядерным рибонуклеопротеином (hnRNP) A2B1 [67]: hnRNPA2B1, связанный с белком SUMO (сумолиро-ванный), распознает экзомотив (GGAG тетрануклео-тид) в 3'-НТО микроРНК и перемещает её в экзосо-му. У мРНК похожий механизм отбора, где аналогом экзомотива в 3'-НТО является последовательность Zipcode, состоящая из 25 нуклеотидов, содержащая короткий серединный домен CTGCC и несущая сайт связывания микроРНК-1289 [68].

ДНК в экзосомах. Экзосомальный состав ДНК до сих пор изучен гораздо меньше, чем состав РНК; известно, что в экзосомах находятся митохондри-альная ДНК, одноцепочечная и двухцепочечная ДНК [69-73]. В отличие от РНК, наличие ДНК в экзосо-мах обычно указывает на патологические состояния, такие как онкологические заболевания, генетические нарушения и пр.

Механизмы интернализации экзосом

Биораспределение экзосом зависит во многом от природы их донорской клетки, наличия соответствующих им клеток-мишеней с нужными рецепторами,

от белкового и липидного состава экзосом. Эти же факторы определяют и механизм поглощения экзосом клеткой-мишенью.

Различные механизмы поглощения экзосом клеткой-мишенью включают в себя клатрин-опосредо-ванный эндоцитоз, кавеолин-зависимый эндоцитоз, фагоцитоз, макропиноцитоз и эндосомальное слияние мембран.

В литературе хорошо описаны механизмы поглощения экзосом клеткой-мишенью за счет их белок-белковых взаимодействий [36, 74—77], в частности, рецептор-опосредованные механизмы взаимодействия, такие как тетраспаниновый механизм и инте-гриновый механизм, а также механизм взаимодействия с участием протеогликанов и лектинов.

Тетраспанины выполняют многочисленные функции, в том числе участвуют в процессе клеточной адгезии, подвижности, активации и пролиферации [74, 75]. Например, CD9 и CD81 участвуют в оо-цит-сперматозоидном и фагоцитарном слиянии [74, 78, 79]. Кроме того, именно с белками семейства тетраспанинов связываются многие вирусы и паразиты для проникновения в клетку [80]. Вероятно, поглощение экзосом через связь тетраспанинов с клеткой-мишенью происходит по аналогичному механизму [81]. Тетраспанины, обогащенные микродоменами (TEMS), представляют собой кластеры из тетраспанинов, молекул адгезии и рецепторных белков, расположенных в трансмембранных плото-подобных структурах [75]. Эти кластеры и принимают участие в процессе везикулярно-клеточного слияния. Дополнительные факты, подтверждающие роль тетраспанинов в процессах поглощения экзо-сом, были получены в результате исследований, в которых CD81 или CD9 блокировались антителами, что затрудняло поглощение экзосом дендритными клетками [82], а наличие на поверхности экзосом комплекса из двух тетраспаниновых белков Tspan8-CD49d, образующих прочные связи с интегринами, увеличивало степень поглощения этих экзосом клетками, мембрана которых была обогащена рецепторами ICAM-1(CD54) [81].

На мембране экзосомы находятся не только рецепторы к интегринам, но и сами интегрины, в частности гликопротеин CD11a, который взаимодействует с ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 и ICAM-4. Согласно литературным данным, добавление in vitro анти-CDIIa антител уменьшало поглощение экзосом дендритными клетками мыши [82]. CD11a участвует в ряде иммунных процессов, включая взаимодействие между лейкоцитами и эндотелиальными клетками, опосредуют цитотоксическое действие T-лимфоцитов и антитело-зависимое цитотокси-ческое действие гранулоцитов и моноцитов за счет взаимодействия с интегрином р2, образуя интегрин LFA-1. Исследование E.N. Nolte-'t Hoen (2009) показало, что обработка Т-лимфоцитов хлористым марганцем увеличивает уровень поглощения экзосом за счет усиления интегринового взаимодействия [83]. В интегриновых взаимодействиях принимают участие и иммуноглобулины. В частности, экзосомы дендритных клеток взаимодействуют с CD4+ лимфоцитами через комплекс рецепторов MHC и LFA-1-ICAM-1 [84], а для поглощения дендритными клетками экзосом от CD8+ лимфоцитов необходимы комплексы рецепторов pMHC I/TCR и LFA-1-ICAM-1 [85].

Протеогликаны и лектины также активно участвуют во взаимодействии экзосом с клеткой-мишенью.

Например, клетки с недостаточной секрецией ге-парансульфат протеогликана (НБРСэ) на мембране проявляют сниженную способность к интернали-зации экзосом [86]. Среди лектинов важную роль в интернализации экзосом играют лектины С-типа, такие как йС-Б^Ы [87] и йЕС-205 [84]. Хелаты кальция с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА), связывающие кальций, от которого зависит взаимодействие лектинов С-типа, значительно уменьшают интернализацию экзосом дендритными клетками [84] и макрофагами [30]. Это подтверждает гипотезу о том, что поглощению экзосом способствуют рецепторные взаимодействия лектин С-типа/лектин С-типа.

Наиболее распространенным механизмом интернализации экзосом является эндоцитоз. Он может быть опосредован как белок-белковым взаимодействием мембран экзосом и клетки-мишени, так и специфическими механизмами эндоцитоза. Эндоцитоз — энергозависимый механизм, что подтверждается экспериментом, в котором снижение температуры инкубации клеток до 4°С, привело к замедлению процесса поглощения экзосом клетками [88]. Но полностью ингибировать процессы эндоцитоза невозможно, потому что проходят они по разным механизмам. Далее мы рассмотрим некоторые из них.

Макропиноцитоз — механизм поглощения, включающий в себя формирование инвагинирующей мембранной складки, от которой потом отпочковываются пузырьки во внутриклеточное пространство. Пузырьки несут в себе жидкость и различные компоненты, например, экзосомы, которые попадают в эту складчатую структуру. Сами пузырьки формируются за счет слияния мембран складок, при этом не требуется непосредственный контакт мембраны клетки с поглощаемым материалом [88]. Этот механизм Пас1-, актин-и холестерин-зависимый, кроме того требует работы 1\1а+/Н+-ионных каналов [89]. Холестерин необходим для отбора активированных белков Пас 1 [90], а они, в свою очередь, относятся к суперсемейству ГТФ-азных белков, регулирующих не только эндоцитоз [91], но и клеточный рост, реорганизацию цитоскеле-та, активацию протеинкиназ [92] и пр.

Фагоцитоз. Фагоцитоз является рецептор-зависимым механизмом поглощения опсонизированных твердых частиц, при котором, после рецепторного взаимодействия формируется инвагинация клеточной мембраны, которая окружает и интернализует поглощаемые компоненты [93]. Обычно механизм фагоцитоза срабатывает на достаточно крупные объекты, однако было показано, что с помощью него внутрь клетки могут проникать частицы в диаметре до 85 нм, что вполне совпадает с размером экзосом [94]. В механизме фагоцитоза большую роль играет фосфатидилинозитол-3-киназа (Р13К) [95]. Это подтверждается экспериментом с ингибированием Р13К вортманнином и [_У294002, что приводило к снижению активности фагоцитоза в зависимости от дозы ингибиторов [96]. Интересно, что фосфатидилсерин, вероятно, играет не последнюю роль в фагоцитозе эк-зосом. Так экзосомы, мембраны которых обогащены фосфатидилсерином, интернализуются более активно [97]. Если инкубировать экзосомы с аннексином 5, который связывает фосфатидилсерин на поверхности экзосомальной мембраны, это уменьшает фагоцитоз экзосом макрофагами [98] и НК [83].

Рафт-опосредованный эндоцитоз. Липидные рафты — микродомены мембраны, обогащенные хо-

лестерином и гликосфинголипидами. Они влияют на текучесть мембраны, участвуют в клеточных процессах, являются центрами сборки сигнальных молекул, регулируют перемещение мембранных белков и рецепторов [99]. Компоненты липидных рафтов обладают более жесткой структурой чем обычный липидный бислой, не теряя при этом способности к свободному перемещению в плазматической мембране [100]. Клатрин- и кавеолин-зависимые механизмы также в значительной степени связаны с липидными рафтами. Кроме того, с липидными рафтами взаимодействует семейство белков, называемых флотилинами [101]. Флотилины связываются с липидными рафтами и опосредуют эндоцитоз, независимый от клатрина и кавеолина [102—105]. Флотилины связываются с гликозилфосфатидили-нозитолами (ГФИ) — трансмембранными белками во время их интернализации [102, 105]. Вероятно, именно таким способом проникают в клетку экзосо-мы через липидные рафты. Чтобы проверить роль липидных рафтов в поглощении экзосом использовали ряд ингибиторов, например, фумонизин B1, соединение, которое предотвращает биосинтез гли-косфинголипидов в дендритных клетках [106], ме-тил-бета-циклодекстрин (MßCD) [107, 108], фили-пин [107] и симвастатин [107]. Эти ингибиторы по разным механизмам разрушают липидные рафты, и, как следствие, нарушают рафт-опосредованный эндоцитоз, а также могут повлиять на целостность экзосомальной мембраны, что уменьшает интерна-лизацию экзосом. Кроме того, найдены белки, которые способствуют интернализации экзосом через липидные рафты. Например, аннексин II играет определенную роль в закреплении экзосом на липидных рафтах, в то время как аннексин-VI может способствовать транспорту экзосом внутри клетки [108].

Клатрин-зависимый эндоцитоз. Механизм кла-трин-зависимой интернализации заключается в последовательной сборке клатриновых везикул, содержащих ряд трансмембранных рецепторов и их лигандов. Клатриновые пузырьки таким образом деформируют мембрану, что она формирует инвагинацию, которая в дальнейшем образует мембранный пузырек, покрытый с внешней поверхности клатрином, и отпочковывается внутрь клетки. Впоследствии этот пузырек сбрасывает клатриновое покрытие и сливается с эндосомой, куда перемещается содержимое пузырька [109]. Многие исследователи отмечают важную роль этого механизма в интернализации экзосом. Инкубирование клеток с хлорпромазином, предотвращающим образование клатриновых инвагинаций на плазматической мембране, ингибирует поглощение экзосом этими клетками [14]. Также для функционирования клатрин-зависимого механизма эндоцитоза необходимо наличие ГТФ-связывающего белка динамина 2 [110]. Динамин 2 накапливается в клатриновых инвагинациях, где изменения в его конформации приводят к высвобождению пузырьков [111]. В фагоцитирующих клетках, ингибирование динамина 2 предотвращает почти всю экзосомаль-ную интернализацию по этому пути [96, 112]. Кроме динамина 2, на клатрин-зависимый эндоцитоз влияет наличие субстратного рецептора эпидермального фактора роста 15 (EPS15), являющегося составной частью клатриновых инвагинаций и связанного с адаптером комплекса AP-2 [113]. Наличие мутаций в гене EPS15 ингибирует клатрин-зависимый эндоцитоз и приводит к снижению интернализации экзосом [96].

Кавеолин-зависимый эндоцитоз. Белок кавео-лин-1 образует небольшие колбообразные выпячивания плазматической мембраны, называемые кавеолами [93]. Кавеолы богаты холестерином, сфинголипидами и кавеолином, следовательно, чувствительны к таким ингибиторам холестерина как филипин и MpCD [99]. Олигомеризация кавеолинов опосредует образование кавеолин-богатых рафтов на плазматической мембране. Динамин 2 так же, как и в случае клатрин-зависимого эндоцитоза участвует в механизме образования кавеолиновых инвагинаций [114]. Ингибирование динамина 2 снижает интернализацию экзосом, но поскольку этот белок участвует сразу в двух механизмах поглощения, эксперименты с его ингибированием не информативны. Нокаут гена CAV1 приводит к снижению экспрессии кавеолина-1 и значительно нарушает интернализа-цию экзосом [115]. В то же время, есть сведения, что нокаут гена CAV1 в мышиных эмбриональных фибробластах приводит к увеличению поглощения экзосом [107]. У CAV1 нокаутированных мышей фиксировали фенотипические изменения в сосудистой системе, но это никак не влияло на жизнеспособность животных [116], что либо свидетельствует о недостаточности нокаута только одного гена ка-веолина для полного прекращения интернализации экзосом по этому механизму, либо говорит о том, что поглощение экзосом по этому механизму не является жизненно важным.

Слияние мембраны клетки-мишени с мембраной экзосомы. Кроме эндоцитоза существуют и другие механизмы интернализации экзосом, например прямое слияние мембран клетки-мишени и экзосомы [117]. Происходит это в тех случаях, когда мембраны оказываются в непосредственной близости друг с другом и внешние слои бислоев вступают в контакт, превращаясь в монослой-«перемычку». Далее моно-слойный участок перестраивается, две бислойные мембраны объединяются, и внутреннее содержимое экзосомы оказывается в цитоплазме. В этом процессе принимают участие белки семейств SNAREs, Rab и Sec1/Munc-18 [118, 119]. Слияние мембран может быть нарушено при кислых значениях рН [117].

В различных условиях тот или иной механизм ин-тернализации экзосом может доминировать.

Роль экзосом в развитии патологических

состояний

Экзосомы играют важную роль в развитии патологических состояний. Например, известно, что для прогрессирования и метастазирования опухоли необходимо прямое взаимодействие между опухолевыми клетками и их микроокружением. В этом, как и во многих других случаях, межклеточная коммуникация осуществляется, в т.ч., и с помощью эк-зосом, которые могут участвовать в формировании «про-опухолевой» микросреды. В частности, показана роль экзосом в ремоделировании внеклеточного матрикса и стимуляции ангиогенеза и пролиферации опухолевых клеток [120]. Например, экзосомы гли-областомы переносят фактор VEGF, фактор роста фибробластов (FGF), IL-6, IL-8, микроРНК-29a и микроРНК-30е, стимулирующие ангиогенез, эпи-дермальный фактор роста EGF и его рецепторы EGFR и EGFR2, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), которые усиливают пролиферацию клеток глиомы через сигнальные пути MAPK, PI3K/Akt и JAK/STAT,

и многие другие [121]. Также, благодаря своей стабильности и способности переносить микро или мРНК и мутантные белки в клетки-реципиенты, экзосомы могут провоцировать формирование очагов метастазирования [122]. Так, некоторые переносимые в экзосомах микроРНК стимулируют в донорских клетках синтез гепарансульфата, что усиливает интернализацию опухолевых экзосом [121]. Также активному метастазированию опухоли способствуют поверхностные молекулы адгезии экзосом, например, белок адгезии CD171 нервных клеток повышает инвазивность опухолей головного мозга [121].

Известно, что экзосомы играют важную роль и в адаптации организма к сердечно-сосудистым заболеваниям. И хотя X. Yu и соавт. (2012) показали, что экзосомы, переносящие TNF-a во время гипоксии, активно участвуют в воспалении и ремоде-лирования сердца [123], во многих исследованиях доказано, что экзосомы обладают про-ангиогенным, про-коагулянтным и противовоспалительным действием, а также регулируют тонус сосудов [124].

Экзосомы играют важную роль в нормальном функционировании нервной системы [125, 126]. Однако экзосомы же являются посредниками в развитии нейродегенеративных заболеваний за счет переноса неправильно свернутых белков [127, 128], как, например, при болезни Паркинсона [129], болезни Альцгеймера [130] и прионных инфекциях [131].

Во время беременности синцитиотрофобласт секретирует экзосомы с иммуносупрессивной активностью, которые ингибируют функцию материнской иммунной системы и способствуют выживанию плода [132]. Также известно, что экзосомы цитотро-фобласта содержат биологически активные белки, которые могут взаимодействовать с материнским эндотелием и регулируют его функции [133]. Нарушение этих процессов приводит к патологии беременности, в отношении которых роль экзосом ещё предстоит выяснить.

Еще одним примером роли экзосом в развитии болезней является распространение инфекционных агентов. К этой категории относится развитие и упомянутых выше прионных инфекций [131], и вирусных инфекций, например ВИЧ-1 [134] или человеческого Т-лимфотропного вируса типа 1

[135]. Последние данные свидетельствуют о том, что вирусы гепатита В, С, Е (HBV, HCV, и HEV) также используют экзосомальный транспорт в качестве альтернативного пути распространения вируса

[136]. Эти же пути используют и некоторые другие вирусы, а также бактерии, например, Mycobacterium tuberculosis [137], грибы Cryptococcus neoformans и даже паразиты [138].

«Жидкая биопсия». Использование экзосом

в клинической лабораторной диагностике

Учитывая свойства экзосом, отражающие свойства продуцирующих их клеток, а также то, что эк-зосомы могут быть выделены практически из любой биологической жидкости организма, возникло новое направление лабораторной диагностики, связанное с выделением и анализом экзосом, названное «жидкая биопсия».

Основное направление применения «жидкой биопсии» — неинвазивная диагностика опухолей. Опухолевые клетки продуцируют экзосомы, несущие патологические РНК и белки, которые можно использовать

для диагностики заболевания даже на ранних стадиях [138, 139]. Кроме того в этом помогает анализ уровня экспрессии экзосомального маркера Сй63, который резко повышен у опухолевых экзосом [22]. Опухолевые микроРНК и мРНК, выделенные из эк-зосом, могут успешно использоваться для ранней диагностики рака молочной железы [140], для диагностики рака простаты [140, 141-143], рака мочевого пузыря [144], колоректального рака [145, 146], опухолей головного мозга [147], рака легких [148], рака поджелудочной железы [149]. Интересно, что микроРНК экзосом можно применять для дифференциальной диагностики рака. Например, при фолликулярном раке щитовидной железы в экзосомах определяется повышенная концентрация микроРНК-21, в то время как при папиллярном раке щитовидной железы повышена концентрация микроРНК-31 [150]. Анализ содержимого экзосом позволяет проводить дифференциальную диагностику доброкачественных и злокачественных опухолей яичников [151].

Помимо диагностики новообразований, экзосо-мальные белки и РНК могут выступать маркерами сердечно-сосудистых заболеваний [152, 153], в том числе инфаркта миокарда [154] и атеросклероза [155, 156].

Накоплено немало сведений о возможности использования диагностического потенциала экзосом при нейродегенеративных заболеваниях. Специфические кольцевые некодирующие РНК и микроРНК, переносимые в экзосомах, участвуют в развитии целого ряда патологических состояний нервной системы и, как следствие, являются устойчивыми биомаркерами для дифференциальной диагностики

[157]. Обнаружение в экзосомах альфа-синуклеи-на может свидетельствовать о болезни Паркинсона

[158], а бета-амилоида — о болезни Альцгеймера

[159]. Болезнь Альцгеймера можно также диагностировать и по наличию патологических экзосомаль-ных микроРНК [160]. И, как уже упоминалось ранее, экзосомальный транспорт задействован в развитии трансмиссивных нейродегенеративных заболеваний, вызываемых прионами [161].

С помощью анализа экзосомальных микроРНК можно диагностировать опухоли печени, вирусные поражения печени [162], после ряда доработок — неалкогольный жировой гепатоз, что особенно важно, учитывая отсутствие надежного метода диагностики этого заболевания [163].

Как надежные биомаркеры, экзосомы предполагают использовать при диагностике заболеваний почек [164]. Рассматривают их и для оптимизации диагностики метаболического синдрома [165], а экзосомы тучных клеток — для диагностики хронической легочной недостаточности недоношенных детей [166]. По состоянию экзосом из адипоцитов можно судить о патологии жировой ткани [167].

Большой потенциал имеет анализ экзосом при диагностике патологии беременности. Конкретные плацентарные микроРНК несут информацию о нормальном или осложненном протекании беременности, а также о состоянии плаценты [133, 168—170].

Важную роль для разработки новых диагностических подходов экзосомы играют и при инфекционных заболеваниях, так как являются альтернативными путями распространения инфекции и носителями вирусных или бактериальных РНК и белков [137, 171].

Используются экзосомы и в диагностике паразитических заболеваний. Обнаружение специфических

микроРНК в экзосомах, секретируемых зараженными клетками, позволяет уверенно предположить наличие паразитической инфекции, как, например, в случае с шистосомозом и рядом других паразитарных инфекций [172].

Анализ экзосом помогает диагностировать нарушения иммунитета различного генеза: от иммуносу-прессии, зачастую приводящей к развитию опухолей [173], до системных аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка [174].

В заключение стоит отметить перспективность «жидкой биопсии», как неинвазивного доступа к генетическому материалу — генетическим мутациям, эпигенетическим нарушениям и пр. в условиях сложности или невозможности получения этой информации иным путем. Некоторые исследователи предполагают, что «жидкая биопсия» станет еще одним методом диагностики и анализа генетический болезней человека [175].

Экзосомы - как потенциальные средства

внутриклеточной доставки биологически

активных молекул

Одним из факторов, ограничивающих эффективность фармакотерапии многих заболеваний, является недостаточная точность адресной доставки лекарственных средств. В особенности это касается заболеваний ЦНС, при которых клетки-мишени расположены внутри гематоэнцефалического барьера, и всех опухолевых заболеваний, требующих применения высокотоксичных цитостатических препаратов. В настоящее время наиболее распространенными системами адресной доставки являются липосомы и полимерные наночастицы [176, 177].

Обе эти системы используются для доставки различных лекарственых средств: от анальгетиков до противоопухолевых препаратов. Тем не менее, эти системы имеют свои недостатки: липосомы при всей их биосовместимости довольно нестабильны, а полимерные наночастицы, обладая большей стабильностью, не всегда удовлетворяют стандартам безопасности и неиммуногенности. Экзосомы имеют преимущества как перед липосомами, так и полимерными наночастицами при доставке лекарственных средств, благодаря длительному периоду полураспада, который обеспечивает их стабильность, и биосовместимости, неиммуногенности и потенциально контролируемой адресной доставке. Перспективность применения экзосом, как носителей лекарственных средств, связана с их биологическими характеристиками. Кроме неиммуногенности за счет своего естественного происхождения, стабильности за счет морфологических характеристик и способности к интернализации за счет биохимических свойств, преимуществами экзосом также являются размер и поверхностный заряд мембраны. По размеру (30—120 нм) экзосомы достаточно велики, чтобы избежать быстрого удаления через почечный фильтр, но при этом слишком малы, чтобы быть поглощенными макрофагами. Кроме того, сейчас известно, что частицы с таким размером более эффективно накапливаются в солидных опухолях из-за дефектов развития там сосудистой и лимфодре-нажной систем [178]. Дзета-потенциал мембран эк-зосом определяет их стабильность и взаимодействие с биологическими системами. Отрицательный поверхностный заряд стабильных экзосом, колеблющийся

в диапазоне от -14,8±1,55 до -12,0±0,15 мВ, не только снижает их клиренс, но и облегчает проникновение в опухоль [178]. Такой поверхностный заряд, вероятно, связан с преимущественным содержанием сиаловых кислот в мембранах экзосом, по сравнению с мембранами клеток [178].

Как уже было описано в предыдущих разделах, экзосомы несут в себе различные РНК, в том числе микроРНК и миРНК, которые сейчас используются как терапевтические агенты при целом ряде заболеваний. Особенно это ценно, учитывая крайнюю нестабильность РНК во внеклеточном пространстве. Так, многие исследователи подтвердили возможность использования экзосом для доставки определенных микроРНК в клетки мишени и, как следствие, запуска в них РНК-интерференции [179, 180]. Например, экзосомы, выделенные из линии клеток НЕК293, были трансфицированы микроРНК семейства let-7a, относящимися к опухолевым су-прессорам, а для усиления адресности экзосомы модифицировали добавлением на их поверхность лиганда к EGFR-рецептору на поверхности опухолевых клеток. Это привело к повышенному накоплению EGF-модифицированных экзосом в опухоли и, как следствие, терапевтическому воздействию на неё [179]. Исследованием, наглядно показавшим возможность использования экзосом для генной терапии, была работа J. Wahlgren (2012) [181]. В ней плазменные экзосомы трансфицировали Alexa Fluor 488-меченными миРНК против митоген-активируе-мой протеинкиназы 1 (МАРК-1) и затем совместно культивировали с моноцитами и лимфоцитами, выделенными из периферической крови здоровых доноров, после чего методом проточной цитометрии подтвердили доставку меченых миРНК в клетки-мишени.

Применение экзосом для доставки различных РНК является, по сути, контролируемым воспроизведением естественной функции экзосом. Помимо этого, вполне возможно применение экзосом и для доставки экзогенных лекарственных средств. Так крайне интересным примером этого является использование экзосом для доставки в опухолевый очаг куркумина — естественного полифенола, содержащегося в корневищах куркумы и обладающего противовоспалительными, противоопухолевыми, антиоксидантными и химио-профилактическими свойствами, безопасного и эффективного противоопухолевого агента, но обладающего в естественном виде низкой биодоступностью из-за гидрофобной природы [182, 183]. Помимо увеличения биодоступности лекарственных средств, экзосомы также используются для доставки лекарственных препаратов через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что очень важно, так как 98% существующих фармпрепаратов самостоятельно не проникают через ГЭБ [182, 184]. В частности, показана эффективность доставки лекарственного препарата через ГЭБ при интерназальном введении экзосом [178]. При этом процесс транслокации экзосом в микроглию занял всего 30 мин., что с учётом неинвазивности интра-назального введения весьма перспективно для разработки новых методов доставки лекарств в мозг. Кроме того, были проведены исследования по доставке химиотерапевтических препаратов паклитак-села и доксорубицина в экзосомах через ГЭБ [182, 185]. В этих работах на модели первичной опухоли мозга у эмбрионов Danio rerio экзосомы, выделен-

ные из различных клеточных линий, инкубировали с родамином 123 и паклитакселом или доксоруби-цином. Ткань головного мозга анализировали на наличие флуоресценции родамина 123, и результаты доказали, что лекарственные вещества эффективно накапливаются в опухоли, что с одной стороны свидетельствовало о способности экзосом доставлять лекарства через ГЭБ, а с другой — показало значительную терапевтическую эффективность химиопре-паратов при таком способе доставки по сравнению с внутривенным введением лекарств.

Похожее исследование проводили по доставке экзосомами доксорубицина на мышиной модели рака молочной железы [182, 186]. Принципиальное отличие этого эксперимента от выше описанного было в том, что экзосомы в данном случае были адресными с наличием лиганда к EGFP, связанного с поверхностным белком Lamp2b. Результаты работы показали, что адресность экзосом усиливает их накопление в тканях опухоли и, как следствие, увеличивает терапевтический эффект доксорубицина.

Кроме малых молекул, экзосомы также могут транспортировать крупные полипептиды. Недавнее исследование продемонстрировало, что экзосомы, нагруженные антиоксидантным белком каталазой, успешно проходили ГЭБ, что приводило к улучшению состояния больного при болезни Паркинсона [182, 187], патологические процессы при которой связаны, в том числе, с секрецией активных форм кислорода и пониженным уровнем антиоксидантных ферментов, таких как каталазы и супероксиддисмутазы.

Экзосомы, полученные из зрелых дендритных клеток (декзосомы), несут на своей поверхности большое количество молекул MHC I и II, ICAM-1, те-траспанинов и лигандов, активирующих НК-клетки, что обусловило исследования по их применению для иммунотерапии опухолей [180]. Использование эк-зосом, несущих опухолевые антигены, провоцирует гораздо более сильный и обширный иммунный ответ, чем экзосомы из других типов иммунных клеток. Опухолевые антигены на экзосомах стимулируют созревание дендритных клеток, что, в конечном счете, приводит к активации Т-лимфоцитов и секреции ци-токинов. Кроме того, декзосомы участвуют в репро-граммировании Т-хелперов, стимулируя экспрессию CD86, и активируют В-клеточный иммунитет [180]. Перитонеальная асцитическая жидкость может служить источником экзосом для противоопухолевого иммунитета, например при раке яичников [188]. Таким образом, декзосомы могут стать не только дополнением, но и вполне рабочей альтернативой для дендрито-клеточных вакцин.

Выбор источника клеток для производства эк-зосом является важным этапом при планировании использовать их для доставки лекарств. От типа донорских клеток будут зависеть многие свойства выделяемых экзосом, как уже было описано в предыдущих разделах. Кроме того, от этого этапа может сильно зависеть конечная стоимость препарата. Наибольшее внимание в этом вопросе обращено на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) — клетки-предшественницы, выделяемые из разных типов тканей, и считающиеся «аптечкой» организма за счет своей доступности, функциональной и дифференциальной пластичности. ММСК довольно легко выделить и нарастить в условиях ex vivo, они производят наибольшее количество экзосом, кроме того такие экзосомы наи-

более эффективны в регенеративной медицине и в лечении опухолей [175]. Еще одним немаловажным фактом, говорящим в пользу именно такого выбора донорских клеток, является то, что при очень высокой пролиферативной активности, у ММСК очень низок риск туморогенности, следовательно их экзосомы наиболее соответствуют стандартам безопасности [175].

Не менее важен выбор способа загрузки экзосом. Выше были описаны несколько механизмов перемещения внутреннего содержимого из клетки в экзо-сому, это касалось РНК, белков и липидов. Однако когда речь идёт об экзогенном материале, необходимы дополнительные технологии. Наиболее распространенными на данный момент являются in vitro электропорация для различных видов РНК и ДНК, слияние с липосомой, уже несущей груз, и простая инкубация [175]. Однако эффективность всех этих методов невысока по ряду физиологических и технических причин [175]. В связи с этим разрабатывают альтернативные стратегии загрузки экзосом. Например, каталаза в экзосомы может быть загружена с помощью последовательных циклов инкубации при комнатной температуре с пермеабилизацией сапонином, замораживанием-размораживанием, обработкой ультразвуком и последующей экструзией, аналогично тому, как вещества загружают в липосомы [175].

Место экзосом в клеточной терапии

На сегодняшний день в клеточной терапии выделяют два принципиальных подхода: заместительная клеточная терапия, когда трансплантированные клетки непосредственно должны участвовать в восстановлении утраченных функций, как, например, в случае церебрального инсульта или травмы спинного мозга [189], и терапия, основанная на паракрин-ном эффекте, обусловленном синтезом ряда биологически активных молекул, передаваемых, в том числе и посредством экзосом [190]. Так, паракрин-ный эффект при введении ММСК используется при лечении сердечно-сосудистых заболеваний [191], при лечении поражения почек [192], печени [193], ишемии нижних конечностей [194] и пр. В последнее время появилась тенденция перехода от клеточной терапии к бесклеточной, использующей потенциал внеклеточных везикул, в том числе экзосом. Такой подход исключает риски, связанные с использованием клеток для терапии, например, тератогенность, как в случае со стволовыми клетками, но сохраняет паракринный эффект, так как экзосомы являются переносчиками необходимых биологически активных

молекул. Однако пока такая терапия ограничена технологическими проблемами выделения экзосом — на данный момент это дорогостоящий и трудоемкий процесс [190]. Оптимизация этого процесса позволит существенно расширить возможности клеточной терапии и сделает её более безопасной.

Заключение

Накопленные данные демонстрируют важную роль экзосом в межклеточной коммуникации и транспорте, обусловленную их уникальными биохимическими, физическими и физиологическими свойствами. С момента начала активных исследований биологии экзосом ученые значительно продвинулись в понимании их функций, а также возможностей их применения для диагностики и терапии различных заболеваний. Присутствие экзосом во всех без исключения биологических жидкостях предоставляет уникальную возможность неинвазивной диагностики с помощью «жидкой биопсии» — путём получения информации о внутриклеточных компонентах тех или иных тканей с помощью анализа состава экзосом. Специфичность, распространенность, стабильность и биодоступность экзосом делают их привлекательными и экономически выгодными биомаркерами для использования в клинической лабораторной диагностике различных заболеваний.

Биологические функции экзосом по доставке РНК, белков и сигнальных молекул в различные типы клеток обуславливают их высокий потенциал по применению в качестве терапевтических агентов. Природные преимущества экзосом перед искусственными наноконтейнерами обуславливают фундаментальные и прикладные исследования по применению экзосом в качестве естественных систем адресной доставки лекарств в клетки-мишени. Наиболее перспективно применение экзосом для разработки систем доставки в опухолевые клетки, а также для направленного транспорта лекарств через гемато-энцефалический барьер — в клетки нервной ткани.

Создание адресных экзосом с заданным составом биологически активных компонентов с помощью генно-инженерных клеточных «фабрик» в будущем может позволить решить проблемы излечения различных заболеваний: от опухолей до наследственной патологии.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ 15-29-01338

ЛИТЕРАТУРА:

1. Ge R., Tan E., Sharghi-Namini S. et al. Exosomes in Cancer Microenvironment and Beyond: have we Overlooked these Extracellular Messengers? Cancer Microenviron. 2012; 5(3): 323-32.

2. Pegtel D.M., van de Garde M.D., Middeldorp J.M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular crosstalk and immune evasion. Bioch. Biophys. Acta 2011; 1809(11-12): 715-21.

3. Chargaff E., West R. The biological significance of the thromboplastic protein of blood. J. Biol. Chem.1946; 166: 189-97.

4. Wolf P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br. J. Haematol. 1967; 13: 269-88.

5. Anderson H.C. Vesicles associated with calcification in the matrix of epiphyseal cartilage. J. Cell Biol. 1969; 41: 59-72.

6. Johnstone R.M. The Jeanne Manery-Fisher Memorial Lecture 1991. Maturation of reticulocytes: formation of exosomes as a

mechanism for shedding membrane proteins. Biochemistry and Cell Biology 1992; 70(3-4): 179-90.

7. Valadi H., Ekstrom K., Bossios A. et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology 2007; 9(6): 654-9.

8. Yanez-Mo M., Siljander P.R., Andreu Z. et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J. Extracell. Vesicles 2015; 4: 27066.

9. Thery C., Zitvogel L., Amigorena S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews Immunology 2002; 2(8): 569-79.

10. Gould S.J., Raposo G. As we wait: coping with an imperfect nomenclature for extracellular vesicles. J. Extracell. Vesicles 2013; 2: 20389.

11. Гомзикова М.О., Гайфуллина Р.Ф., Мустафин И.Г. и др. Мембранные мировезикулы: биологические свойства и участие

в патогенезе заболеваний. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; 8(1): 6-11.

12. Colombo M., Raposo G., Théry C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2014; 30: 255-89.

13. Mathivanan S., Ji H., Simpson R.J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics 2010; 73(10): 1907-20.

14. Escrevente C., Keller S., Altevogt P. et al. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer 2011; 11: 108.

15. Jeppesen D.K., Nawrocki A., Jensen S.G. et al. Quantitative proteomics of fractionated membrane and lumen exosome proteins from isogenic metastatic and non-metastatic bladder cancer cells reveal differential expression of EMT factors. Proteomics 2014; 14: 699-712.

16. Ostergaard O., Nielsen C.T., Iversen L.V. et al. Quantitative proteome profiling of normal human circulating microparticles. J. Proteome Res. 2012; 11: 2154-63.

17. Tauro B.J., Greening D.W., Mathias R.A. et al. Two distinct populations of exosomes are released from LIM1863 colon carcinoma cell-derived organoids. Mol. Cell Proteomics 2013; 12: 587-98.

18. Bang C., Thum T. Exosomes: new players in cell-cell communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2012; 44(11): 2060-4.

19. Vlassov A.V., Magdaleno S., Setterquist R. et al. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochimica et Biophysica Acta: General Subjects 2012; 1820(7): 940-8.

20. Simons M., Raposo G. Exosomes — vesicular carriers for intercellular communication. Curr. Opin. Cell Biol. 2009; 21: 575-81.

21. Crescitelli R., Lässer C., Szabô T.G. et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. J. Extracell. Vesicles 2013; 2: 20677.

22. Yoshioka Y., Konishi Y., Kosaka N. et al. Comparative marker analysis of extracellular vesicles in different human cancer types. J. Extracell. Vesicles 2013; 2: 20424.

23. Staubach S., Schadewaldt P., Wendel U. et al. Differential glycomics of epithelial membrane glycoproteins from urinary exovesicles reveals shifts toward complex-type N-glycosylation in classical galactosemia. J. Proteome Res. 2012; 11: 906-16.

24. Looze C., Yui D., Leung L. et al. Proteomic profiling of human plasma exosomes identifies PPARgamma as an exosome-associated protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2009; 378: 433-8.

25. Hosseini-Beheshti E., Pham S., Adomat H. et al. Exosomes as biomarker enriched microvesicles: characterization of exosomal proteins derived from a panel of prostate cell lines with distinct AR phenotypes. Mol. Cell Proteomics 2012; 11: 863-85.

26. Escrevente C., Grammel N., Kandzia S. et al. Sialoglycoproteins and N-glycans from secreted exosomes of ovarian carcinoma cells. PLoS One 2013; 8(10): e78631.

27. Batista B.S., Eng W.S., Pilobello K.T. et al. Identification of a conserved glycan signature for microvesicles. J. Proteome Res. 2011; 10: 4624-33.

28. Heijnen H.F., Schiel A.E., Fijnheer R. et al. Activated platelets release two types of membrane vesicles: microvesicles by surface shedding and exosomes derived from exocytosis of multivesicular bodies and alpha-granules. Blood 1999; 94: 3791-9.

29. Saunderson S.C., Dunn A.C., Crocker P.R. et al. CD169 mediates the capture of exosomes in spleen and lymph node. Blood 2014; 123: 208-16.

30. Barres C., Blanc L., Bette-Bobillo P. et al. Galectin-5 is bound onto the surface of rat reticulocyte exosomes and modulates vesicle uptake by macrophages. Blood 2010; 115: 696-705.

31. Liang Y., Eng W.S., Colquhoun D.R. et al. Complex N-linked glycans serve as a determinant for exosome/microvesicle cargo recruitment. J. Biol. Chem. 2014; 289: 32526-37.

32. Menck K., Scharf C., Bleckmann A. et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J. Mol. Cell Biol. 2015; 7: 143-53.

33. Kralj-Iglic V. Stability of membranous nanostructures: a possible key mechanism in cancer progression. Int. J. Nanomedicine 2012; 7: 3579-96.

34. Kralj-Iglic V., Veranic P. Curvature-induced sorting of bilayer membrane constituents and formation of membrane rafts. Adv. Planar Lipid Bilayers Liposomes 2006; 5: 129-49.

35. Perez-Hernandez D., Gutierrez-Vazquez C., Jorge I. et al. The intracellular interactome of tetraspanin-enriched microdomains reveals their function as sorting machineries toward exosomes. J. Biol. Chem. 2013; 288: 11649-61.

36. Andreu Z., Yanez-Mo M. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. Front. Immunol. 2014; 5: 442.

37. Arkhipov A., Yin Y., Schulten K. Four-scale description of membrane sculpting by BAR domains. Biophys. J. 2008; 95: 2806-21.

38. Yin Y., Arkhipov A., Schulten K. Simulations of membrane tubulation by lattices of amphiphysin N-BAR domains. Structure 2009; 17: 882-92.

39. Metcalf D., Isaacs A.M. The role of ESCRT proteins in fusion events involving lysosomes, endosomes and autophagosomes. Biochem. Soc. Trans. 2010; 38: 1469-73.

40. Calzolari A., Raggi C., Deaglio S. et al. TfR2 localizes in lipid raft domains and is released in exosomes to activate signal transduction along the MAPK pathway. J. Cell Sci. 2006; 119: 4486-98.

41. Gross C., Schmidt-Wolf I.G., Nagaraj S. et al. Heat shock protein 70-reactivity is associated with increased cell surface density of CD94/CD56 on primary natural killer cells. Cell Stress Chaperones 2003; 8: 348-60.

42. Macario A.J., Cappello F., Zummo G. et al. Chaperonopathies of senescence and the scrambling of interactions between the chaperoning and the immune systems. Ann. NY Acad. Sci. 2010; 1197: 85-93.

43. Lugini L., Cecchetti S., Huber V. et al. Immune surveillance properties of human NK cell-derived exosomes. J. Immunol. 2012; 189: 2833-42.

44. Qu Y., Franchi L., Nunez G. et al. Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages. J. Immunol. 2007; 179: 1913-25.

45. Berda-Haddad Y., Robert S., Salers P. et al. Sterile inflammation of endothelial cell-derived apoptotic bodies is mediated by interleukin-1 alpha. PNAS USA 2011; 108: 20684-9.

46. Zhang H.G., Liu C., Su K. et al. A membrane form of TNF-alpha presented by exosomes delays T cell activation-induced cell death. J. Immunol. 2006; 176: 7385-93.

47. Kandere-Grzybowska K., Letourneau R., Kempuraj D. et al. IL-1 induces vesicular secretion of IL-6 without degranulation from human mast cells. J. Immunol. 2003; 171: 4830-6.

48. Kim H.K., Song K.S., Chung J.H. et al. Platelet microparticles induce angiogenesis in vitro. Br. J. Haematol. 2004; 124: 376-84.

49. Baj-Krzyworzeka M., Weglarczyk K., Mytar B. et al. Tumour-derived microvesicles contain interleukin-8 and modulate production of chemokines by human monocytes. Anticancer Res. 2011; 31: 1329-35.

50. Chen T., Guo J., Yang M. et al. Chemokine-containing exosomes are released from heat-stressed tumor cells via lipid raft-dependent pathway and act as efficient tumor vaccine. J. Immunol. 2011; 186: 2219-28.

51. Record M., Carayon K., Poirot M. et al. Exosomes as new vesicular lipid transporters involved in cell-cell communication and various pathophysiologies. Biochim. Biophys. Acta 2014; 1841: 108-20.

52. Baig S., Lim J.Y., Fernandis A.Z. et al. Lipidomic analysis of human placental syncytiotrophoblast microvesicles in adverse pregnancy outcomes. Placenta 2013; 34: 436-42.

53. Ratajczak J., Miekus K., Kucia M. et al. Embryonic stem cell-derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery. Leukemia 2006; 20: 847-56.

54. Bruno S., Grange C., Collino F. et al. Microvesicles derived from mesenchymal stem cells enhance survival in a lethal model of acute kidney injury. PLoS One 2012; 7: e33115.

55. Eldh M., Ekstrom K., Valadi H. et al. Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA. PLoS One 2010; 5: e15353.

56. Muller G., Schneider M., Biemer-Daub G. et al. Microvesicles released from rat adipocytes and harboring glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins transfer RNA stimulating lipid synthesis. Cell Signal. 2011; 23: 1207-23.

57. Saurabh S., Vidyarthi A.S., Prasad D. RNA interference: concept to reality in crop improvement. Planta 2014; 239(3): 543564.

58. Mittelbrunn M., Gutierrez-Vazquez C., Villarroya-Beltri C. et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2011; 2: 282.

59. Hunter M.P., Ismail N., Zhang X. et al. Detection of microRNA expression in human peripheral blood microvesicles. PLoS One 2008; 3: e3694.

60. Collino F., Deregibus M.C., Bruno S. et al. Microvesicles derived from adult human bone marrow and tissue specific mesenchymal stem cells shuttle selected pattern of miRNAs. PLoS One 2010; 5: e11803.

61. Okoye I.S., Coomes S.M., Pelly V.S. et al. MicroRNA-containing T-regulatory-cell-derived exosomes suppress pathogenic T helper 1 cells. Immunity 2014; 41: 89-103.

62. Zernecke A., Bidzhekov K., Noels H. et al. Delivery of microRNA-126 by apoptotic bodies induces CXCL12-dependent vascular protection. Sci. Signal. 2009; 2: ra81.

63. Morel L., Regan M., Higashimori H. et al. Neuronal exosomal miRNA-dependent translational regulation of astroglial glutamate transporter GLT1. J. Biol. Chem. 2013; 288: 7105-16.

64. Forterre A., Jalabert A., Chikh K. et al. Myotube-derived exosomal miRNAs downregulate Sirtuin1 in myoblasts during muscle cell differentiation. Cell Cycle 2014; 13: 78-89.

65. Xu J.F., Yang G.H., Pan X.H. et al. Altered microRNA expression profile in exosomes during osteogenic differentiation

of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. PLoS One 2014; 9: e114627.

66. Santonocito M., Vento M., Guglielmino M.R. et al. Molecular characterization of exosomes and their microRNA cargo in human follicular fluid: bioinformatic analysis reveals that exosomal microRNAs control pathways involved in follicular maturation. Fertil. Steril. 2014; 102: 1751-61.

67. Villarroya-Beltri C., Gutierrez-Vazquez C., Sanchez-Cabo F. et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nat. Commun. 2013; 4: 2980.

68. Bolukbasi M.F., Mizrak A., Ozdener G.B. et al. miR-1289 and "Zipcode"-like Sequence Enrich mRNAs in Microvesicles. Mol. Ther. Nucleic Acids 2012; 1: e10.

69. Balaj L., Lessard R., Dai L. et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat. Commun. 2011; 2: 180.

70. Guescini M., Genedani S., Stocchi V. et al. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J. Neural Transm. 2010; 117: 1-4.

71. Thakur B.K., Zhang H., Becker A. et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Res. 2014; 24: 766-9.

72. Waldenstrom A., Genneback N., Hellman U. et al. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PLoS One 2012; 7: e34653.

73. Lee T.H., Chennakrishnaiah S., Audemard E. et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014; 451: 295-301.

74. Mulcahy L.A., Pink R.C., Carter D.R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. J. Extracell. Vesicles 2014; 3.

75. Hemler M.E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005; 6: 801-11.

76. Prada I., Meldolesi J. Binding and Fusion of Extracellular Vesicles to the Plasma Membrane of Their Cell Targets. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17(8): 1296

77. Turturici G., Tinnirello R., Sconzo G. et al. Extracellular membrane vesicles as a mechanism of cell-to-cell communication: advantages and disadvantages. American Journal of Physiology — Cell Physiology 2014; 306(7): C621-33.

78. Rubinstein E., Ziyyat A., Prenant M. et al. Reduced fertility of female mice lacking CD81. Dev. Biol. 2006; 290: 351-8

79. Zhu G.Z., Miller B.J., Boucheix C. et al. Residues SFQ (173175) in the large extracellular loop of CD9 are required for gamete fusion. Development 2002; 129: 1995-2002.

80. Thali M. The roles of tetraspanins in HIV-1 replication. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2009; 339: 85-102.

81. Rana S., Yue S., Stadel D. et al. Toward tailored exosomes: the exosomal tetraspanin web contributes to target cell selection. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2012; 44: 1574-84.

82. Morelli A.E., Larregina A.T., Shufesky W.J. et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood 2004; 104: 3257-66.

83. Nolte-'t Hoen E.N., Buschow S.I., Anderton S.M. et al. Activated T cells recruit exosomes secreted by dendritic cells via LFA-1. Blood 2009; 113: 1977-81.

84. Hao S., Bai O., Li F. et al. Mature dendritic cells pulsed with exosomes stimulate efficient cytotoxic T-lymphocyte responses and antitumour immunity. Immunology 2007; 120: 90-102.

85. Xie Y., Zhang H., Li W. et al. Dendritic cells recruit T cell exosomes via exosomal LFA-1 leading to inhibition of CD8+CTL responses through downregulation of peptide/MHC class I and Fas ligand-mediated cytotoxicity. J. Immunol. 2010; 185: 5268-78.

86. Christianson H.C., Svensson K.J., van Kuppevelt T.H. et al. Cancer cell exosomes depend on cell-surface heparan sulfate proteoglycans for their internalization and functional activity. PNAS USA 2013; 110: 17380-5.

87. Näslund T.I., Paquin-Proulx D., Paredes P.T. et al. Exosomes from breast milk inhibit HIV-1 infection of dendritic cells and subsequent viral transfer to CD4+T cells. AIDS 2014; 28: 171-80.

88. Swanson J.A. Shaping cups into phagosomes and macropinosomes. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2008; 9: 639-49.

89. Kerr M.C., Teasdale R.D. Defining macropinocytosis. Traffic 2009; 10: 364-71.

90. Grimmer S., van Deurs B., Sandvig K. Membrane ruffling and macropinocytosis in A431 cells require cholesterol. J. Cell Sci. 2002; 115: 2953-62.

91. Ahram M., Sameni M., Qiu R.G. et al. Rac1-induced endocytosis is associated with intracellular proteolysis during migration through a three-dimensional matrix. Exp. Cell Res. 2000; 260: 292-303.

92. Ridley A.J. Rho GTPases and actin dynamics in membrane protrusions and vesicle trafficking. Trends Cell Biol. 2006; 16: 522-9.

93. Doherty G.J., McMahon H.T. Mechanisms of endocytosis. Annu. Rev. Biochem. 2009; 78: 857-902.

94. Rudt S., Müller R.H. In vitro phagocytosis assay of nano- and microparticles by chemiluminescence. III. Uptake of differently sized

surface-modified particles, and its correlation to particle properties and in vivo distribution. Eur. J. Pharm. Sci. 1993; 1: 31-9.

95. Stephens L., Ellson C., Hawkins P. Roles of PI3Ks in leukocyte chemotaxis and phagocytosis. Curr. Opin. Cell Biol. 2002; 14: 203-13.

96. Feng D., Zhao W.L., Ye Y.Y. et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic 2010; 11: 675-87.

97. Fomina A.F., Deerinck T.J., Ellisman M.H. et al. Regulation of membrane trafficking and subcellular organization of endocytic compartments revealed with FM1-43 in resting and activated human T cells. Exp. Cell Res. 2003; 291: 150-66.

98. Yuyama K., Sun H., Mitsutake S. et al. Sphingolipid-modulated exosome secretion promotes clearance of amyloid-ß by microglia. J. Biol. Chem. 2012; 287: 10977-89.

99. Nabi I.R., Le P.U. Caveolae/raft-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 2003; 161: 673-7.

100. Simons K., Ehehalt R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 2002; 110: 597-603.

101. Palecek S.P., Schmidt C.E., Lauffenburger D.A. et al. Integrin dynamics on the tail region of migrating fibroblasts. J. Cell Sci. 1996; 109: 941-52.

102. Glebov O.O., Bright N.A., Nichols B.J. Flotillin-1 defines a clathrin-independent endocytic pathway in mammalian cells. Nat. Cell Biol. 2006; 8: 46-54.

103. Frick M., Bright N.A., Riento K. et al. Coassembly of flotillins induces formation of membrane microdomains, membrane curvature, and vesicle budding. Curr. Biol. 2007; 17: 1151-6.

104. Volonte D., Galbiati F., Li S. et al. Flotillins/cavatellins are differentially expressed in cells and tissues and form a hetero-oligomeric complex with caveolins in vivo. Characterization and epitope-mapping of a novel flotillin-1 monoclonal antibody probe. J. Biol. Chem. 1999; 274: 12702-9.

105. Otto G.P., Nichols B.J. The roles of flotillin microdomains — endocytosis and beyond. J. Cell Sci. 2011; 124: 3933-40.

106. Wang E., Norred W.P., Bacon C.W. et al. Inhibition of sphingolipid biosynthesis by fumonisins. Implications for diseases associated with Fusarium moniliforme. J. Biol. Chem. 1991; 266: 14486-90.

107. Svensson K.J., Christianson H.C., Wittrup A. et al. Exosome uptake depends on ERK1/2-heat shock protein 27 signalling and lipid raft-mediated endocytosis negatively regulated by caveolin-1. J. Biol. Chem. 2013; 288: 17713-24.

108. Koumangoye R.B., Sakwe A.M., Goodwin J.S. et al. Detachment of breast tumor cells induces rapid secretion of exosomes which subsequently mediate cellular adhesion and spreading. PLoS One 2011; 6: e24234.

109. Kirchhausen T. Clathrin. Annu. Rev. Biochem. 2000; 69: 699-727.

110. Vallee R.B., Herskovits J.S., Aghajanian J.G. et al. Dynamin, a GTPase involved in the initial stages of endocytosis. Ciba Found. Symp. 1993; 176: 185-93.

111. Chappie J.S., Acharya S., Leonard M. et al. G domain dimerization controls dynamin's assembly-stimulated GTPase activity. Nature 2010; 465: 435-40.

112. Fitzner D., Schnaars M., van Rossum D. et al. Selective transfer of exosomes from oligodendrocytes to microglia by macropinocytosis. J. Cell Sci. 2011; 124: 447-58.

113. Benmerah A., Bayrou M., Cerf-Bensussan N. et al. Inhibition of clathrin-coated pit assembly by an Eps15 mutant. J. Cell Sci. 1999; 112: 1303-11.

114. Parton R.G., Simons K. The multiple faces of caveolae. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8: 185-94.

115. Nanbo A., Kawanishi E., Yoshida R. et al. Exosomes derived from Epstein-Barr virus-infected cells are internalized via caveola-dependent endocytosis and promote phenotypic modulation in target cells. J. Virol. 2013; 87: 10334-47.

116. Razani B., Engelman J.A., Wang X.B. et al. Caveolin-1 null mice are viable but show evidence of hyperproliferative and vascular abnormalities. J. Biol. Chem. 2001; 276: 38121-38.

117. Parolini I., Federici C., Raggi C. et al. Microenvironmental pH is a key factor for exosome traffic in tumor cells. J. Biol. Chem. 2009; 284: 34211-22.

118. Chernomordik L.V., Kozlov M.M. Mechanics of membrane fusion. Nat. Struct. Mol. Biol. 2008; 15: 675-83.

119. Jahn R., Südhof T.C. Membrane fusion and exocytosis. Annu. Rev. Biochem. 1999; 68: 863-911.

120. Kucharzewska P., Christianson H.C., Welch J.E. et al. Exosomes reflect the hypoxic status of glioma cells and mediate hypoxia-dependent activation of vascular cells during tumor development. PNAS USA 2013; 110: 7312-7.

121. Chistiakov D.A., Chekhonin V.P. Extracellular vesicles shed by glioma cells: pathogenic role and clinical value. Tumour Biol. 2014; 35(9): 8425-38.

122. Rana S., Malinowska K., Zöller M. Exosomal tumor microRNA modulates premetastatic organ cells. Neoplasia 2013; 15: 281-95.

123. Yu X., Deng L., Wang D. et al. Mechanism of TNF-a autocrine effects in hypoxic cardiomyocytes: initiated by hypoxia inducible factor 1a, presented by exosomes. J. Mol. Cell Cardiol. 2012; 53: 848-57.

124. Amabile N., Rautou P.E., Tedgui A. et al. Microparticles: key protagonists in cardiovascular disorders. Semin. Thromb. Hemost. 2010; 36: 907-16.

125. Lachenal G., Pernet-Gallay K., Chivet M. et al. Release of exosomes from differentiated neurons and its regulation by synaptic glutamatergic activity. Mol. Cell Neurosci. 2011; 46: 409-18.

126. Frühbeis C., Fröhlich D., Kuo W.P. et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biol. 2013; 11: e1001604.

127. Frühbeis C., Fröhlich D., Kuo W.P. et al. Extracellular vesicles as mediators of neuron-glia communication. Front. Cell. Neurosci. 2013; 7: 182.

128. Ghidoni R., Benussi L., Binetti G. Exosomes: the Trojan horses of neurodegeneration. Med. Hypotheses 2008; 70(6): 1226-7.

129. Danzer K.M., Kranich L.R., Ruf W.P. et al. Exosomal cell-to-cell transmission of alpha synuclein oligomers. Mol. Neurodegener. 2012; 7: 42.

130. Baixauli F., López-Otín C., Mittelbrunn M. Exosomes and autophagy: coordinated mechanisms for the maintenance of cellular fitness. Front. Immunol. 2014; 5: 403.

131. Coleman B.M., Hanssen E., Lawson V.A. et al. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB J. 2012; 26: 4160-73.

132. Salomon C., Torres M.J., Kobayashi M. et al. A gestational profile of placental exosomes in maternal plasma and their effects on endothelial cell migration. PLoS One 2014; 9: e98667.

133. Toth B., Lok C.A., Böing A. et al. Microparticles and exosomes: impact on normal and complicated pregnancy. Am. J. Reprod. Immunol. 2007; 58: 389-402.

134. Izquierdo-Useros N., Naranjo-Gómez M., Erkizia I. et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse? PLoS Pathog. 2010; 6: e1000740.

135. Jaworski E., Narayanan A., Van Duyne R. et al. Human T-lymphotropic virus type 1 infected cells secrete exosomes that contain tax protein. J. Biol. Chem. 2014; 289(32): 22284-305.

136. Bukong T.N., Momen-Heravi F., Kodys K. et al. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathog. 2014; 10: e1004424.

137. Kruh-Garcia N.A., Wolfe L.M., Dobos K.M. Deciphering the role of exosomes in tuberculosis. Tuberculosis (Edinb.) 2015; 95: 26-30.

138. Regev-Rudzki N., Wilson D.W., Carvalho T.G. et al. Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles. Cell 2013; 153: 1120-33.

139. Yang H., Fu H., Xu W. et al. Exosomal non-coding RNAs: a promising cancer biomarker. Clin. Chem. Lab. Med. 2016; 54(12): 1871-9.

140. Joyce D.P., Kerin M.J., Dwyer R.M. Exosome-encapsulated microRNAs as circulating biomarkers for breast cancer. Int. J. Cancer 2016; 139(7): 1443-8.

141. Kharmate G., Hosseini-Beheshti E., Caradec J. et al. Epidermal Growth Factor Receptor in Prostate Cancer Derived Exosomes. PLoS One 2016; 11(5): e0154967.

142. Motamedinia P., Scott A.N., Bate K.L. et al. Urine Exosomes for Non-Invasive Assessment of Gene Expression and Mutations of Prostate Cancer. PLoS One 2016; 11(5): e0154507.

143. Saini S. PSA and beyond: alternative prostate cancer biomarkers. Cell Oncol. (Dordr). 2016; 39(2): 97-106.

144. Junker K., Heinzelmann J., Beckham C. et al. Extracellular Vesicles and Their Role in Urologic Malignancies. Eur. Urol. 2016; 70(2): 323-31.

145. Tovar-Camargo O.A., Toden S., Goel A. Exosomal microRNA Biomarkers: Emerging Frontiers in Colorectal and Other Human Cancers. Expert Rev. Mol. Diagn. 2016; 16(5): 553-67.

146. Belov L., Matic K.J., Hallal S. et al. Extensive surface protein profiles of extracellular vesicles from cancer cells may provide diagnostic signatures from blood samples. J. Extracell. Vesicles 2016; 5: 25355.

147. D'Asti E., Chennakrishnaiah S., Lee T.H. et al. Extracellular Vesicles in Brain Tumor Progression. Cell Mol. Neurobiol. 2016; 36(3): 383-407.

148. Munagala R., Aqil F., Gupta R.C. Exosomal miRNAs as biomarkers of recurrent lung cancer. Tumour. Biol. 2016; 37(8): 10703-14.

149. Lu L., Risch H.A. Exosomes: potential for early detection in pancreatic cancer. Future Oncol. 2016; 12(8): 1081-90.

150. Samsonov R., Burdakov V., Shtam T. et al. Plasma exosomal miR-21 and miR-181a differentiates follicular from papillary thyroid cancer. Tumour Biol. 2016; 37(9): 12011-21.

151. Meng X., Müller V., Milde-Langosch K. et al. Diagnostic and prognostic relevance of circulating exosomal miR-373, miR-200a, miR-200b and miR-200c in patients with epithelial ovarian cancer. Oncotarget 2016; 7(13): 16923-35.

152. Min P.K., Chan S.Y. The biology of circulating microRNAs in cardiovascular disease. Eur. J. Clin. Invest. 2015; 45(8): 860-74.

153. Nouraee N., Mowla S.J. miRNA therapeutics in cardiovascular diseases: promises and problems. Front. Genet. 2015; 6: 232.

154. Chistiakov D.A., Orekhov A.N., Bobryshev Y.V. Cardiac Extracellular Vesicles in Normal and Infarcted Heart. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17(1): 63.

155. Yuan M.J., Maghsoudi T., Wang T. Exosomes Mediate the Intercellular Communication after Myocardial Infarction. Int. J. Med. Sci. 2016; 13(2): 113-6.

156. Hoefer I.E., Steffens S., Ala-Korpela M. et al. Novel methodologies for biomarker discovery in atherosclerosis. Eur. Heart J. 2015; 36(39): 2635-42.

157. Lu D., Xu A.D. Mini Review: Circular RNAs as Potential Clinical Biomarkers for Disorders in the Central Nervous System. Front. Genet. 2016; 7: 53.

158. Lööv C., Scherzer C.R., Hyman B.T. et al. a-Synuclein in Extracellular Vesicles: Functional Implications and Diagnostic Opportunities. Cell Mol. Neurobiol. 2016; 36(3): 437-48.

159. Vella L.J., Hill A.F., Cheng L. Focus on Extracellular Vesicles: Exosomes and Their Role in Protein Trafficking and Biomarker Potential in Alzheimer's and Parkinson's Disease. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17(2): 173.

160. Van Giau V., An S.S. Emergence of exosomal miRNAs as a diagnostic biomarker for Alzheimer's disease. J. Neurol. Sci. 2016; 360: 141-52.

161. Coleman B.M., Hill A.F. Extracellular vesicles - Their role in the packaging and spread of misfolded proteins associated with neurodegenerative diseases. Semin. Cell Dev. Biol. 2015; 40: 89-96.

162. Sato K., Meng F., Glaser S. et al. Exosomes in liver pathology. J. Hepatol. 2016; 65(1): 213-21.

163. Ban L.A., Shackel N.A., McLennan S.V. Extracellular Vesicles: A New Frontier in Biomarker Discovery for Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17(3): 376.

164. Krause M., Samoylenko A., Vainio S.J. Exosomes as renal inductive signals in health and disease, and their application as diagnostic markers and therapeutic agents. Front. Cell Dev. Biol. 2015; 3: 65.

165. O'Neill S., Bohl M., Gregersen S. et al. Blood-Based Biomarkers for Metabolic Syndrome. Trends Endocrinol. Metab. 2016; 27(6): 363-74.

166. Veerappan A., Thompson M., Savage A. et al. Mast cells and exosomes in hyperoxia-induced neonatal lung disease. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2016; 310(11): L1218-32.

167. Zhang Y., Yu M., Tian W. Physiological and pathological impact of exosomes of adipose tissue. Cell Prolif. 2016; 49(1): 3-13.

168. Tsochandaridis M., Nasca L., Toga C. et al. Circulating MicroRNAs as Clinical Biomarkers in the Predictions of Pregnancy Complications. Biomed. Res. Int. 2015; 2015: 294954.

169. Mouillet J.F., Ouyang Y., Coyne C.B. et al. MicroRNAs in placental health and disease. Am. J. Obstet. Gynecol. 2015; 213 Suppl 4: S163-72.

170. Mitchell M.D., Peiris H.N., Kobayashi M. et al. Placental exosomes in normal and complicated pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol. 2015; 213 Suppl 4: S173-81.

171. Schorey J.S., Harding C.V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J. Clin. Invest. 2016; 126(4): 1181-9.

172. Britton C., Winter A.D., Marks N.D. et al. Application of small RNA technology for improved control of parasitic helminths. Vet. Parasitol. 2015; 212(1-2): 47-53.

173. Greening D.W., Gopal S.K., Xu R. et al. Exosomes and their roles in immune regulation and cancer. Semin. Cell Dev. Biol. 2015; 40: 72-81.

174. Perez-Hernandez J., Cortes R. Extracellular Vesicles as Biomarkers of Systemic Lupus Erythematosus. Dis. Markers 2015; 2015: 613536.

175. Cai X., Janku F., Zhan Q. et al. Accessing Genetic Information with Liquid Biopsies. Trends Genet. 2015; 31(10): 564-75.

176. Mel'nikov P.A., Baklaushev V.P., Gabashvili A.N. et al. Internalization of Vectorized Liposomes Loaded with Plasmid DNA in C6 Glioma Cells. Bull. Exp. Biol. Med. 2017; 163(1): 114-22.

177. Nukolova N.V., Baklaushev V.P., Abakumova T.O. et al. Targeted delivery of cisplatin by connexin 43 vector nanogels to the focus of experimental glioma C6. Bull. Exp. Biol. Med. 2014; 157(4): 524-9.

178. Ren J., He W., Zhenga L. et al. From structures to functions: insights into exosomes as promising drug delivery vehicles. Biomater. Sci. 2016; 4(6): 910-21.

179. Ohno S., Takanashi M., Sudo K. et al. Systemically injected exosomes targetedto EGFR deliver antitumor microRNA to breast cancer cells. Mol. Ther. 2013; 21(1): 185-91.

180. Srivastava A., Babu A., Filant J. et al. Exploitation of Exosomes as Nanocarriers for Gene-, Chemo-, and Immune-Therapy of Cancer. J. Biomed. Nanotechnol. 2016; 12(6): 1159-73.

181. Wahlgren J., De L. Karlson T., Brisslert M. et al. Plasma exosomes can deliver exogenous short interfering RNA to monocytes and lymphocytes. Nucleic Acids Res. 2012; 40: e130.

182. Ha D., Yang N., Nadithe V. Exosomes as therapeutic drug carriers and delivery vehicles across biological membranes: current perspectives and future challenges. Acta Pharm. Sin. B 2016; 6(4): 287-96.

183. Sun D.M., Zhuang X.Y., Xiang X.Y. et al. A novel nanoparticle drug delivery system: the anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Mol. Ther. 2010; 18: 1606-14.

184. Pardridge W.M. Drug transport across the blood—brain barrier. J. Cereb. Blood Flow Metab. 2012; 32: 1959-72.

185. Yang T.Z., Martin P., Fogarty B. et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood—brain barrier for brain cancer therapy in Danio Rerio. Pharm. Res. 2015; 32: 2003-14.

186. Tian Y.H., Li S.P., Song J. et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials 2014; 35: 2383-90.

187. Haney M.J., Klyachko N.L., Zhao Y.L. et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. J. Control. Release 2015; 207: 18-30.

188. Andre F., Schartz N.E., Movassagh M. et al. Malignant effusions and immunogenic tumour-derived exosomes. Lancet 2002; 360(9329): 295-305.

189. Butts J.C., McCreedy D.A., Martinez-Vargas J .A. et al. Differentiation of V2a interneurons from human pluripotent stem cells. PNAS USA 2017; 114(19): 4969-74.

190. Gomzikova M.O., Rizvanov A.A. Current Trends in Regenerative Medicine: From Cell to Cell-Free Therapy. Bionanoscience 2017; 7(1): 240-5.

191. Teng X., Chen L., Chen W. et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes improve the microenvironment of infarcted myocardium contributing to angiogenesis and anti-inflammation. Cell. Physiol. Biochem. 2015; 37: 2415-24.

192. Zhou Y., Xu H., Xu W. et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Res. Ther. 2013; 4: 34.

193. Tan C.Y., Lai R.C., Wong W. et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes promote hepatic regeneration in drug-induced liver injury models. Stem Cell Res. Ther. 2014; 5: 76.

194. Hu G.W., Li Q., Niu X. et al. Exosomes secreted by human-induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells attenuate limb ischemia by promoting angiogenesis in mice. Stem Cell Res. Ther. 2015; 6: 10.

Поступила: 28.03.2017