ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНАЯ ЗАГРУЗКА МНОЖЕСТВА ВЕКТОРОВ ДЛЯ ДОСТАВКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОДНОГО СЕЛЕКТИВНОГО МАРКЕРА

1. Способ последовательной загрузки множества векторов для доставки в автономно реплицирующуюся нуклеиновую кислоту в клетке с использованием одного селективного маркера, включающий:
интеграцию первого вектора для доставки, содержащего маркерный ген и ген устойчивости к лекарственному средству, и первую представляющую интерес нуклеиновую кислоту, в автономно реплицирующуюся нуклеиновую кислоту с использованием первой системы рекомбинации;
вырезание маркерного гена и гена устойчивости к лекарственному средству из автономно реплицирующейся нуклеиновой кислоты с использованием второй системы рекомбинации с сигнальными участками альфа, где первая представляющая интерес нуклеиновая кислота остается в автономно реплицирующейся нуклеиновой кислоте;
интеграцию второго вектора для доставки, содержащего маркерный ген и ген устойчивости к лекарственному средству, и вторую представляющую интерес нуклеиновую кислоту, в автономно реплицирующуюся нуклеиновую кислоту с использованием первой системы рекомбинации; и
вырезание маркерного гена и гена устойчивости к лекарственному средству из автономно реплицирующейся нуклеиновой кислоты с использованием второй системы рекомбинации с сигнальными участками бета, где вторая представляющая интерес нуклеиновая кислота остается в автономно реплицирующейся нуклеиновой кислоте.
2. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадии
интеграции третьего вектора для доставки, содержащего маркерный ген и ген устойчивости к лекарственному средству, и третью представляющую интерес нуклеиновую кислоту, в автономно реплицирующуюся нуклеиновую кислоту с использованием первой системы рекомбинации; и
вырезания маркерного гена и гена устойчивости к лекарственному средству из автономно реплицирующейся нуклеиновой кислоты с использованием второй системы рекомбинации с сигнальными участками гамма, где третья представляющая интерес нуклеиновая кислота остается в автономно реплицирующейся нуклеиновой кислоте.
3. Способ по п. 1, где автономно реплицирующаяся нуклеиновая кислота представляет собой эндогенную хромосому.
4. Способ по п. 1, где автономно реплицирующаяся нуклеиновая кислота представляет собой синтетическую хромосому.
5. Способ по п. 4, где синтетическая хромосома представляет собой синтетическую хромосому млекопитающего.
6. Способ по п. 5, где синтетическая хромосома представляет собой синтетическую хромосому человека.
7. Способ по п. 1, где первая система рекомбинации представляет собой систему интегразы лямбда.
8. Способ по п. 1, где вторая система рекомбинации представляет собой систему рекомбинации Cre/lox.
9. Способ по п. 1, где сигнальные участки альфа и сигнальные участки бета выбраны из Lox2272, Lox5171, LoxM2 и LoxP, но сигнальные участки альфа и сигнальные участки бета не являются одинаковыми.
10. Способ по п. 1, где маркерный ген представляет собой ген флуоресцентного белка.
11. Способ последовательной загрузки множества векторов для доставки в автономно реплицирующуюся синтетическую хромосому в клетке с использованием одного селективного маркера, включающий:
интеграцию первого вектора для доставки, содержащего маркерный ген и ген устойчивости к лекарственному средству, и первую представляющую интерес нуклеиновую кислоту, в автономно реплицирующуюся синтетическую хромосому с использованием первой системы рекомбинации;
вырезание маркерного гена и гена устойчивости к лекарственному средству из автономно реплицирующейся синтетической хромосомы с использованием второй системы рекомбинации с сигнальными участками альфа, где первая представляющая интерес нуклеиновая кислота остается в автономно реплицирующейся синтетической хромосоме;
интеграцию второго вектора для доставки, содержащего маркерный ген и ген устойчивости к лекарственному средству, и вторую представляющую интерес нуклеиновую кислоту, в автономно реплицирующуюся синтетическую хромосому с использованием первой системы рекомбинации;
вырезание маркерного гена и гена устойчивости к лекарственному средству из автономно реплицирующейся синтетической хромосомы с использованием второй системы рекомбинации с сигнальными участками бета, где вторая представляющая интерес нуклеиновая кислота остается в автономно реплицирующейся синтетической хромосоме;
интеграцию третьего вектора для доставки, содержащего маркерный ген и ген устойчивости к лекарственному средству, и третью представляющую интерес нуклеиновую кислоту, в автономно реплицирующуюся синтетическую хромосому с использованием первой системы рекомбинации; и
вырезание маркерного гена и гена устойчивости к лекарственному средству из автономно реплицирующейся синтетической хромосомы с использованием второй системы рекомбинации с сигнальными участками гамма, где третья представляющая интерес нуклеиновая кислота остается в автономно реплицирующейся синтетической хромосоме.
12. Способ по п. 11, где синтетическая хромосома представляет собой синтетическую хромосому человека.
13. Способ по п. 11, где первая система рекомбинации представляет собой систему интегразы лямбда.
14. Способ по п. 11, где вторая система рекомбинации представляет собой систему рекомбинации Cre/lox.
15. Способ по п. 11, где сигнальные участки альфа, сигнальные участки бета и сигнальные участки гамма выбраны из Lox2272, Lox5171, LoxM2 и LoxP, но никакие из сигнальных участков альфа, бета и гамма не являются одинаковыми.
16. Синтетическая хромосома, содержащая первую, вторую и третью представляющую интерес нуклеиновую кислоту, полученная способом по п. 11.
17. Способ по п. 11, где стадии вырезания осуществляют посредством введения нуклеиновой кислоты вектора, кодирующего вторую рекомбиназу, в клетку, введения второй рекомбиназы в клетку или посредством доставки инкапсулированной второй рекомбиназы в клетку.
18. Способ по п. 17, где стадии вырезания осуществляют посредством введения нуклеиновой кислоты вектора, кодирующего вторую рекомбиназу, в клетку.
19. Способ по п. 11, дополнительно включающий определение того, вырезаны ли маркерный ген и ген устойчивости к лекарственному средству из автономно реплицирующейся синтетической хромосомы посредством сортировки клеток FACS после стадии вырезания.
20. Способ по п. 11, дополнительно включающий стадии
интеграции четвертого вектора для доставки, содержащего маркерный ген и ген устойчивости к лекарственному средству, и четвертую представляющую интерес нуклеиновую кислоту, в автономно реплицирующуюся синтетическую хромосому с использованием первой системы рекомбинации; и
вырезания маркерного гена и гена устойчивости к лекарственному средству из автономно реплицирующейся синтетической хромосомы с использованием второй системы рекомбинации с сигнальными участками дельта, где четвертая представляющая интерес нуклеиновая кислота остается в автономно реплицирующейся нуклеиновой кислоте.
21. Клетка, содержащая синтетическую хромосому по п. 16.