НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ, КОДИРУЮЩИЕ ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, ПОЛИПЕПТИДНЫЕ ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, КОДИРУЕМЫЕ ИМИ, ВЕКТОРЫ ЭКСПРЕССИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ, ВЫДЕЛЕННЫЕ КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ВЫДЕЛЕННЫЕ КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА, А ТАКЖЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫДЕЛЕННЫХ КЛЕТОК-ХОЗЯЕВ IN VITRO, СПОСОБЫ ВЫБОРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, КОДИРУЮЩИХ ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, IN VITRO И СПОСОБЫ ПРОВЕДЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ У СУБЪЕКТА, ИМЕЮЩЕГО ОПУХОЛЬ

1. Нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, при этом нуклеиновая кислота содержит
(a) полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с ROR1;
(b) полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен;
(c) полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, расположенный между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и трансмембранным доменом, где длина полипептидного спейсера составляет приблизительно 15 аминокислот или меньше; и
(d) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, который содержит сигнальный домен CD3ζ и костимулирующий домен.
2. Нуклеиновая кислота по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с эпитопом ROR1, расположенным дистально по отношению к мембране.
3. Нуклеиновая кислота по п. 1 или п. 2, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент связываются с эпитопом в Ig-подобном/Frizzled-домене ROR1.
4. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-3, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат
вариабельный участок легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с VL-участком антитела к ROR1 R12; и вариабельный участок тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью с VH-участком антитела к ROR1 R12; и/или
вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3 антитела к ROR1 R12, и вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела к ROR1 R12; или
вариабельный участок легкой цепи (VL) антитела к ROR1 2A2 и вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела к ROR1 2A2.
5. Нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, при этом нуклеиновая кислота содержит
(a) полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с опухолеассоциированным антигеном;
(b) полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен;
(c) полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, расположенный между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и трансмембранным доменом, где длина полипептидного спейсера составляет от приблизительно 229 аминокислот или меньше до более приблизительно 119 аминокислот; и
(d) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, который содержит сигнальный домен CD3ζ и костимулирующий домен.
6. Нуклеиновая кислота по п. 5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с эпитопом опухолеассоциированного антигена, расположенным проксимально по отношению к мембране.
7. Нуклеиновая кислота по п. 5 или 6, где опухолеассоциированный антиген представляет собой ROR1, и антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связываются с эпитопом в крингл-домене ROR1.
8. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 5-7, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат
вариабельный участок легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с VL-участком антитела к ROR1 R11; и вариабельный участок тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью с VH-участком антитела к ROR1 R11; и/или
вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3 антитела к ROR1 R11, и вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела к ROR1 R11.
9. Нуклеиновая кислота по п. 5 или 6, где опухолеассоциированный антиген представляет собой HER2.
10. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 5, 6 и 9, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат
вариабельный участок легкой цепи (VL), характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с VL-участком антитела к HER2 герцептина; и вариабельный участок тяжелой цепи (VH), характеризующийся по меньшей мере 90% идентичностью с VH-участком антитела к HER2 герцептина; и/или
вариабельный участок легкой цепи (VL), содержащий CDRL1, CDRL2 и CDRL3 антитела к HER2 герцептина, и вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDRH1, CDRH2 и CDRH3 антитела к HER2 герцептина.
11. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-10, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат scFv.
1
2
1
2
12. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-11, где полипептидный спейсер содержит аминокислотную последовательность XPPXP, где X представляет собой цистеин, глицин или аргинин, и X представляет собой цистеин или треонин (SEQ ID NO:1).
13. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-12, где полипептидный спейсер содержит шарнирный участок IgG1, IgG2 или IgG4 человека или его модифицированный вариант.
14. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-13, где полипептидный спейсер содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:17, 18, 20, 21, 51, 52 или 53.
15. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-4 и пп. 11-14, где длина полипептидного спейсера составляет приблизительно 12 аминокислот.
16. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-4 и пп. 11-15, где полипептидный спейсер состоит из аминокислотной последовательности, изложенной под SEQ ID NO:21.
17. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 5-14, где полипептидный спейсер содержит шарнирный участок молекулы иммуноглобулина или его модифицированный вариант и по меньшей мере один другой домен константного участка иммуноглобулина, выбранный из группы, состоящей из CH1, CH2, CH3, варианта любого из вышеперечисленных и их комбинаций.
18. Нуклеиновая кислота по п. 17, где полипептидный спейсер содержит шарнирный участок из IgG1, IgG2 или IgG4 или его модифицированный вариант в комбинации со всем участком СН2 или его вариантом или частью таковых и со всем участком СН3 или его вариантом или частью таковых.
19. Нуклеиновая кислота по п. 17 или п. 18, где полипептидный спейсер содержит шарнирный участок IgG4 человека или его модифицированный вариант, домен CH2 IgG4 человека и домен CH3 IgG4 человека.
20. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 5-14 и пп. 17-19, где длина полипептидного спейсера составляет приблизительно 229 аминокислот.
21. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 5-14 и пп. 17-20, где полипептидный спейсер содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO:50.
22. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-21, где трансмембранный домен предусматривает трансмембранный домен CD8 или CD28.
23. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-22, где трансмембранный домен предусматривает трансмембранный домен CD28, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:5 или кодируемую последовательностью нуклеотидов atgttctgggtgctggtggt ggtgggcggggtgctggcctgctac agcctgctggtgaca gtggccttcatcatcttttgggtg, или содержащий аминокислотную последовательность MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV.
24. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-23, где костимулирующий домен содержит
сигнальный домен 4-1BB или его модифицированный вариант, где необязательно сигнальный домен 4-1BB содержит аминокислоты 214-255 из SEQ ID NO:15 или содержит аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:6; или
сигнальный домен CD28 или его модифицированный вариант, где необязательно сигнальный домен CD28 содержит аминокислоты 180-220 из SEQ ID NO:14 или предусматривает его модифицированный вариант, содержащий замену LL → GG, находящуюся в положениях 186-187 SEQ ID NO:14.
25. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-24, где сигнальный домен CD3ζ содержит аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:7.
26. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-4, пп. 11-15 и пп. 22-25, где
антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой scFv, содержащий вариабельный участок легкой цепи (VL) антитела к ROR1 R12 и вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела к ROR1 R12 или последовательность QEQLVESGGRLVTPGG SLTLSCKASGFDFSAY YMSWVRQAPG KGLEWIATIYPSSGK TYYATWVNGRFTISSD NAQNTVDLQMNSLTAA DRATYFCARDSYADDG ALFNIWGPGTLVTISS GGGGSGGGGSGGGGSE LVLTQSPSVSAALGSP AKITCTLSSAHKTDTI DWYQQLQGEAPRYLMQ VQSDGSYTKRPGVPDR FSGSSSGADRYLIIPS VQADDEADYYCGADYI GGYVFGGGTQLTVTG;
полипептидный спейсер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:21;
трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:5; и
внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен 4-1BB, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:6, и сигнальный домен CD3ζ, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:7.
27. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 1-4, пп. 11-16 и пп. 22-26, где нуклеиновая кислота кодирует химерный рецептор, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность под SEQ ID NO:41 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO:41.
28. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 5-8, пп. 11-14 и пп. 17-25, где
антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой scFv, содержащий вариабельный участок легкой цепи (VL) антитела к ROR1 R11 и вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела к ROR1 R11 или последовательность QSVKESEGDLVTPAGN LTLTCTASGSDINDYP  ISWVRQAPGKGLEWIG FINSGGSTWYASWVKG RFTISRTSTTVDLKMT SLTTDDTATYFCARGY STYYGDFNIWGPGTLV TISSGGGGSGGGGSGG GGSELVMTQTPSSTSGA VGGTVTINCQASQSID SNLAWFQQKPGQPPTL LIYRASNLASGVPSRF SGSRSGTEYTLTISGV QREDAATYYCLGGVGN VSYRTSFGGGTEVVVK;
полипептидный спейсер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50;
трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:5; и
внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен 4-1BB, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:6, и сигнальный домен CD3ζ, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:7.
29. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 5-8, пп. 11-14, пп. 17-25 и п. 28, где нуклеиновая кислота кодирует химерный рецептор, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность под SEQ ID NO:43 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO:43.
30. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 5, 6, пп. 9-14 и пп. 17-25, где
антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой scFv, содержащий вариабельный участок легкой цепи (VL) антитела к HER герцептина и вариабельный участок тяжелой цепи (VH) антитела к HER2 герцептина или аминокислотную последовательность, кодируемую Gcattcctcctgatccc agatatccagatgacc cagtccccgagctccc tgtccgcctctgtggg cgatagggtcaccatca cctgccgtgccagtcagga tgtgaatactgctgtagcc tggtatcaacagaaacca ggaaaagctccgaaactac tgatttactcggcatcctt cctctactctggagtccctt ctcgcttctctggttccaga tctgggacggatttcactc tgaccatcagcagtctgca gccggaagacttcgcaact tattactgtcagcaacatt atactactcctcccacgtt cggacagggtaccaaggtg gagatcaaaggcagtacta gcggcggtggctccggggg cggatccggtgggggcggc agcagcgaggttcagctgg tggagtctggcggtggcct ggtgcagccagggggctca ctccgtttgtcctgtgcag cttctggcttcaacattaa agacacctatatacactgg gtgcgtcaggccccgggta agggcctggaatgggttgc aaggatttatcctacgaat ggttatactagatatgccg atagcgtcaagggccgttt cactataagcgcagacaca tccaaaaacacagcctacc tgcagatgaacagcctgcg tgctgaggacactgccgtc tattattgttctagatgggg aggggacggcttctatgcta tggactactggggtcaa ggaaccctggtcaccgtctcgagt;
полипептидный спейсер содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:50;
трансмембранный домен содержит аминокислотную последовательность, кодируемую atgttctgggtgctggt ggtggtgggcggggtgct ggcctgctacagcctgct ggtgacagtggccttcatc atcttttgggtg; и
внутриклеточный сигнальный домен содержит сигнальный домен 4-1BB, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:6, и сигнальный домен CD3ζ, содержащий аминокислотную последовательность, кодируемую SEQ ID NO:7.
31. Нуклеиновая кислота по любому из пп. 5, 6, пп. 9-14, пп. 17-25 и п. 30, где нуклеиновая кислота кодирует химерный рецептор, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность под SEQ ID NO:56 или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 90% идентичностью с последовательностью под SEQ ID NO:56.
32. Полипептидный химерный рецептор, кодируемый нуклеиновой кислотой по любому из пп. 1-31.
33. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-31.
34. Вектор экспрессии по п. 33, дополнительно содержащий полинуклеотид, кодирующий маркерную последовательность, где полинуклеотид, кодирующий маркерную последовательность, функционально связан в рамке считывания с нуклеиновой кислотой, кодирующей химерный рецептор, где необязательно нуклеиновая кислота, кодирующая химерный рецептор, и полинуклеотид, кодирующий маркерную последовательность, разделены последовательностью, кодирующей расщепляемый линкер.
35. Вектор экспрессии по п. 34, где маркерная последовательность представляет собой усеченную последовательность EGFR.
36. Вектор экспрессии по п. 34 или 35, где расщепляемый линкер содержит пептид T2A.
37. Вектор экспрессии, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:42 или 44.
38. Вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:41, 43 или 56.
39. Способ получения выделенной клетки-хозяина in vitro, включающий
введение нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-31 в клетки популяции лимфоцитов и культивирование клеток в присутствии антитела к CD3 или антитела к CD28 или обоих и по меньшей мере одного гомеостатического цитокина.
40. Способ получения выделенной клетки-хозяина in vitro, включающий
введение вектора экспрессии по любому из пп. 33-38 в клетки популяции лимфоцитов и культивирование клеток в присутствии антитела к CD3 или антитела к CD28 или обоих и по меньшей мере одного гомеостатического цитокина.
41. Способ выбора нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный рецептор, in vitro, при этом способ включает
a) обеспечение наличия библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих химерный рецептор, где каждая из множества нуклеиновых кислот кодирует химерный рецептор, отличающийся по длине, и содержит
i) полинуклеотид, кодирующий лиганд-связывающий домен, где лиганд-связывающий домен связывается с лигандом, где лиганд представляет собой опухолеспецифическую молекулу;
ii) полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, имеющий длину, которая независимо соответствует длине от 10 до 229 аминокислот;
iii) полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и
iv) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, который содержит сигнальный домен CD3ζ и костимулирующий домен;
b) введение каждой из множества нуклеиновых кислот или вектора экспрессии, содержащего нуклеиновую кислоту, в отдельную выделенную популяцию Т-лимфоцитов и культивирование клеток in vitro в условиях, обеспечивающих размножение клеток;
c) введение каждой генетически модифицированной популяции T-лимфоцитов опухоленосителю в животной модели и определение того, обладает ли генетически модифицированная популяция Т-лимфоцитов противоопухолевой эффективностью; и
d) осуществление выбора нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный рецептор, который обеспечивает противоопухолевую эффективность in vitro или в животной модели.
42. Способ получения выделенной клетки-хозяина in vitro, при этом способ включает
a) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный рецептор, в популяцию лимфоцитов, которая имеет фенотип CD45RA-, CD45RO+ и CD62L+, где нуклеиновая кислота содержит
i) полинуклеотид, кодирующий лиганд-связывающий домен, где лиганд-связывающий домен связывается с лигандом, где лиганд представляет собой опухолеспецифическую молекулу;
ii) полинуклеотид, кодирующий полипептидный спейсер, имеющий длину, специфичную для лиганда, где спейсер обеспечивает повышенные пролиферацию Т-клеток или выработку цитокинов в ответ на воздействие лиганда по сравнению с эталонным химерным рецептором;
iii) полинуклеотид, кодирующий трансмембранный домен; и
iv) полинуклеотид, кодирующий внутриклеточный сигнальный домен, который содержит сигнальный домен CD3ζ и костимулирующий домен; и
b) культивирование клеток до получения количества размножившихся клеток, достаточного для применения в инфузии клеток.
43. Выделенная клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-31.
44. Выделенная клетка-хозяин, содержащая химерный рецептор по п. 32.
45. Выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по любому из пп. 33-38.
46. Выделенная клетка-хозяин, полученная с помощью способа по любому из пп. 39, 40 или 42.
47. Выделенная клетка-хозяин по любому из пп. 43-46, где выделенной клеткой-хозяином является цитотоксический Т-лимфоцит CD8+ или лимфоцит CD4+.
48. Композиция, содержащая выделенную клетку-хозяина по любому из пп. 43-47 в фармацевтически приемлемом наполнителе.
49. Способ проведения клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего опухоль, при этом способ включает введение субъекту химерного рецептора по п. 32.
50. Способ проведения клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего опухоль, при этом способ включает введение субъекту выделенной клетки-хозяина по любому из пп. 43-47.
51. Способ проведения клеточной иммунотерапии у субъекта, имеющего опухоль, при этом способ включает введение субъекту композиции по п. 48.
52. Способ по любому из пп. 49-51, где опухоль представляет собой солидную опухоль или гематологическую злокачественную опухоль.