АНТИТЕЛО-ПОДОБНЫЕ СВЯЗЫВАЮЩИЕ БЕЛКИ С ДВОЙНЫМИ ВАРИАБЕЛЬНЫМИ ОБЛАСТЯМИ, ИМЕЮЩИЕ ОРИЕНТАЦИЮ СВЯЗЫВАЮЩИХ ОБЛАСТЕЙ КРЕСТ-НАКРЕСТ

1. Антитело-подобный связывающий белок, содержащий четыре полипептидных цепи, которые образуют четыре антигенсвязывающих участка, при этом две полипептидные цепи имеют структуру, представленную формулой:
и две полипептидные цепи имеют структуру, представленную формулой:
где:
VL1 означает первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL2 означает второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VH1 означает первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH2 означает второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
CL означает константный домен легкой цепи иммуноглобулина;
СН1 означает константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина СН1;
Fc означает шарнирную область иммуноглобулина и константные домены тяжелой цепи иммуноглобулина СН2, СН3; и
L1, L2, L3 и L4 означают аминокислотные линкеры;
и где полипептиды формулы I и полипептиды формулы II образуют пару легкая цепь - тяжелая цепь в ориентации крест-накрест.
2. Антитело-подобный связывающий белок по п. 1, в котором: L1 имеет длину от 3 до 12 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину от 3 до 14 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину от 1 до 8 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину от 1 до 3 аминокислотных остатков.
3. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 1 или 2, в котором:
L1 имеет длину от 5 до 10 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину от 5 до 8 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину от 1 до 5 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину от 1 до 2 аминокислотных остатков.
4. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 1 или 2, в котором:
L1 имеет длину 7 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину 5 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину 1 аминокислотный остаток; и
L4 имеет длину 2 аминокислотных остатка.
5. Антитело-подобный связывающий белок по п. 1, в котором:
L1 имеет длину от 1 до 3 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину от 1 до 4 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину от 2 до 15 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину от 2 до 15 аминокислотных остатков.
6. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 1 или 5, в котором:
L1 имеет длину от 1 до 2 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину от 1 до 2 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину от 4 до 12 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину от 2 до 12 аминокислотных остатков.
7. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 1 или 5, в котором:
L1 имеет длину 1 аминокислотный остаток;
L2 имеет длину 2 аминокислотных остатка;
L3 имеет длину 7 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину 5 аминокислотных остатков.
8. Антитело-подобный связывающий белок по п. 1, в котором L1 имеет длину 0 аминокислотных остатков, и L3 имеет длину 2 или больше аминокислотных остатков.
9. Антитело-подобный связывающий белок по п. 1, в котором L3 имеет длину 0 аминокислотных остатков, и L1 имеет длину 1 или больше аминокислотных остатков.
10. Антитело-подобный связывающий белок по п. 1, в котором L4 имеет длину 0 аминокислотных остатков, и L2 имеет длину 3 или больше аминокислотных остатков.
11. Антитело-подобный связывающий белок по п. 1, в котором связывающий белок способен специфично связывать один или несколько антигенов-мишеней.
12. Антитело-подобный связывающий белок по пп. 11, в котором один или несколько антигенов-мишеней выбраны из группы, состоящей из В7.1, В7.2, BAFF, BlyS, С3, С5, CCL11 (эотаксина), CCL15 (MIP-1d), CCL17 (TARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (МСР-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), SLC, CCL24 (MPIF-2/эотаксина-2), CCL25 (TECK), CCL26 (эотаксина-3), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (MCP-2), CD3, CD19, CD20, CD24, CD40, CD40L, CD80, CD86, CDH1 (Е-кадгерина), хитиназы,
CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CX3CL1 (SCYD1), CXGL12 (SDF1), CXCL13, EGFR, FCER1A, FCER2, HER2, IGF1R, IL-1, IL-12, IL13, IL15, IL17, IL18, IL1A, IL1B, IL1F10, IL1β, IL2, IL4, IL6, IL7, IL8, IL9, IL12/23, IL22, IL23, IL25, IL27, IL35, ITGB4 (интегрина b4), LEP (лептина), МНС класса II, TLR2, TLR4, TLR5, TNF, TNF-α, TNFSF4 (лиганда OX40), TNFSF5 (лиганда CD40), Toll-подобных рецепторов, TREM1, TSLP, TWEAK, XCR1 (GPR5/CCXCR1), DNGR-1(CLEC91) mHMGBI.
13. Антитело-подобный связывающий белок по п. 1, в котором связывающий белок является биспецифичным и способен связывать два разных антигена-мишени.
14. Антитело-подобный связывающий белок по п. 13, в котором два разных антигена-мишени выбраны из группы, состоящей из IL4 и IL13, IGF1R и HER2, IGF1R и EGFR, EGFR и HER2, BK и IL13, PDL-1 и CTLA-4, CTLA4 и MHC класса II, IL-12 и IL-18, IL-1α и IL-1β, TNFα и IL12/23, TNFα и IL-12p40, TNFα и IL-23, TNFα и IL-23, и IL17 и IL23.
15. Антитело-подобный связывающий белок по п. 14, в котором связывающий белок способен ингибировать функцию одного или нескольких антигенов-мишеней.
16. Антитело-подобный связывающий белок по пп. 1 или 2, в котором, по меньшей мере, один из линкеров, выбранный из группы, состоящей из L1, L2, L3 и L4, содержит, по меньшей мере, один остаток цистеина.
17. Антитело-подобный связывающий белок, содержащий две полипептидных цепи, которые образуют два антигенсвязывающих участка, в которых первая полипептидная цепь имеет структуру,
представленную формулой:
и вторая полипептидная цепь имеют структуру, представленную формулой:
где:
VL1 означает первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL2 означает второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VH1 означает первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH2 означает второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
CL означает константный домен легкой цепи иммуноглобулина;
СН1 означает константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина СН1; и
L1, L2, L3 и L4 означают аминокислотные линкеры; и где первый и второй полипептиды образуют пару легкая цепь - тяжелая цепь в ориентации крест-накрест.
18. Антитело-подобный связывающий белок по п. 17, в котором:
L1 имеет длину от 3 до 12 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину от 3 до 14 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину от 1 до 8 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину от 1 до 3 аминокислотных остатков.
19. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 17 или 18, в котором:
L1 имеет длину от 5 до 10 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину от 5 до 8 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину от 1 до 5 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину от 1 до 2 аминокислотных остатков.
20. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 17 или 18, в котором:
L1 имеет длину 7 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину 5 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину 1 аминокислотный остаток; и
L4 имеет длину 2 аминокислотных остатка.
21. Антитело-подобный связывающий белок по п. 17, в котором:
L1 имеет длину от 1 до 3 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину от 1 до 4 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину от 2 до 15 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину от 2 до 15 аминокислотных остатков.
22. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 17 или 21, в котором:
L1 имеет длину от 1 до 2 аминокислотных остатков;
L2 имеет длину от 1 до 2 аминокислотных остатков;
L3 имеет длину от 4 до 12 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину от 2 до 12 аминокислотных остатков.
23. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 17 или 21, в котором:
L1 имеет длину 1 аминокислотный остаток;
L2 имеет длину 2 аминокислотных остатка;
L3 имеет длину 7 аминокислотных остатков; и
L4 имеет длину 5 аминокислотных остатков.
24. Антитело-подобный связывающий белок по п. 17, в котором L1 имеет длину 0 аминокислотных остатков, и L3 имеет длину 2 или больше аминокислотных остатков.
25. Антитело-подобный связывающий белок по п. 17, в котором L3 имеет длину 0 аминокислотных остатков, и L1 имеет длину 1 или больше аминокислотных остатков.
26. Антитело-подобный связывающий белок по п. 17, в котором L4 имеет длину 0 аминокислотных остатков, и L2 имеет длину 3 или больше аминокислотных остатков.
27. Антитело-подобный связывающий белок по п. 17, в котором связывающий белок способен специфично связывать один или несколько антигенов-мишеней.
28. Антитело-подобный связывающий белок по п. 27, в котором один или несколько антигенов-мишеней выбраны из группы, состоящей из В7.1, В7.2, BAFF, BlyS, С3, С5, CCL11 (эотаксина), CCL15 (MIP-1d), CCL17 (TARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (МСР-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), SLC, CCL24 (MP1F-2/эотаксина-2), CCL25 (TECK), CCL26 (эотаксина-3), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CD3, CD19, CD20, CD24, CD40, CD40L, CD80, CD86, CDH1 (Е-кадгерина), хитиназы, CSF1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CX3CL1 (SCYD1), CXCL12 (SDF1), CXCL13, EGFR, FCER1A, FCER2, HER2, IGF1R, IL-1, IL-12, IL13, IL15, IL17, IL18, ILIA, IL1B, IL1F10, IL1β, IL2, IL4, IL6, IL7, IL8, IL9, IL12/23, IL22, IL23, IL25, IL27, IL35, ITGB4 (интегрина b4), LEP (лептина), МНС класса II, TLR2, TLR4, TLR5, TNF, TNF-α, TNFSF4 (лиганда ОХ40), TNFSF5 (лиганда CD40), Toll-подобных рецепторов, TREM1, TSLP, TWEAK, XCR1
(GPR5/CCXCR1), DNGR-1(CLEC91) и HMGB1.
29. Антитело-подобный связывающий белок по п. 17, в котором связывающий белок является биспецифичным и способен связывать два разных антигена-мишени.
30. Антитело-подобный связывающий белок по п. 29, в котором два разных антигена-мишени выбраны из группы, состоящей из IL4 и IL13, IGF1R и HER2, IGF1R и EGFR, EGFR и HER2, ВК и IL13, PDL-1 и CTLA-4, CTLA4 и МНС класса II, IL-12 и IL-18, IL-1α и IL-Ιβ, TNFα и IL12/23, TNFα и IL-12p40, TNFα и IL1β, TNFα и IL-23, и IL17 и IL23.
31. Антитело-подобный связывающий белок по п. 17, в котором связывающий белок способен ингибировать функцию одного или нескольких антигенов-мишеней.
32. Антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 17 или 18, в котором, по меньшей мере, один из линкеров, выбранный из группы, состоящей из L1, L2, L3 и L4, содержит, по меньшей мере, один остаток цистеина.
33. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело-подобный связывающий белок по любому из пп. 1-32.
34. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 33.
35. Выделенная клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 33 или экспрессирующий вектор по п. 34.
36. Клетка-хозяин по п. 35, в котором клетка-хозяин является клеткой млекопитающего или клеткой насекомого.
37. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически
приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество антитело-подобного связывающего белка по любому из пп. 1-32.
38. Способ получения антитело-подобного связывающего белка по любому из пп. 1-16, включающий экспрессию в клетке одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептиды, имеющие структуры, представленные формулами [1] и [11], приведенными ниже:
где:
VL1 означает первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL2 означает второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VH1 означает первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH2 означает второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
CL означает константный домен легкой цепи иммуноглобулина;
СН1 означает константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина СН1;
Fc означает шарнирную область иммуноглобулина и константные домены тяжелой цепи иммуноглобулина СН2, СН3; и
L1, L2, L3 и L4 означают аминокислотные линкеры;
и где полипептиды формулы I и полипептиды формулы II образуют пару легкая цепь - тяжелая цепь в ориентации крест-накрест.
39. Способ получения антитело-подобного связывающего белка по любому из пп. 17-32, включающий экспрессию в клетке одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих полипептиды, имеющие структуры, представленные формулами [I] и [II], приведенными ниже:
где:
VL1 означает первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL2 означает второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VH1 означает первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH2 означает второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
CL означает константный домен легкой цепи иммуноглобулина;
СН1 означает константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина СН1; и
L1, L2, L3 и L4 означают аминокислотные линкеры;
и где полипептид формулы I и полипептид формулы II образуют пару легкая цепь - тяжелая цепь в ориентации крест-накрест.
40. Способ получения антитело-подобного связывающего белка, содержащего четыре полипептидных цепи, которые образуют четыре антигенсвязывающих участка, включающий:
(a) идентификацию первого вариабельного домена антитела, который связывает первый антиген-мишень, и второго вариабельного домена антитела, который связывает второй антиген-мишень, при этом каждый из них содержит VL и VH;
(b) определение либо легкой цепи, либо тяжелой цепи в качестве матричной цепи;
(c) определение VL первого вариабельного домена антитела или второго вариабельного домена антитела в качестве VL1;
(d) определение VL2, VH1 и VH2 согласно формулам [1] и [11], приведенным ниже:
(e) определение максимальной и минимальной длины L1, L2, L3 и L4;
(f) создание полипептидных структур формул I и II;
(g) отбор полипептидных структур формул I и II, которые связывают первый антиген-мишень и второй антиген-мишень при объединении с образованием антитело-подобного связывающего белка;
где:
VL1 означает первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL2 означает второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VH1 означает первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH2 означает второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
CL означает константный домен легкой цепи иммуноглобулина; СН1 означает константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина СН1;
Fc означает шарнирную область иммуноглобулина и константные домены тяжелой цепи иммуноглобулина СН2, СН3; и
L1, L2, L3 и L4 означают аминокислотные линкеры;
и при этом полипептиды формулы I и полипептиды формулы II образуют пару легкая цепь - тяжелая цепь в ориентации крест-накрест.
41. Способ по п. 40, в котором первый вариабельный домен антитела и второй вариабельный домен антитела являются одинаковыми.
42. Способ получения антитело-подобного связывающего белка, содержащего четыре полипептидных цепи, которые образуют четыре антигенсвязывающих участка, включающий:
(а) идентификацию первого вариабельного домена антитела, который связывает первый антиген-мишень, и второго вариабельного домена антитела, который связывает второй антиген-мишень, при этом каждый из них содержит VL и VH;
(о) определение либо легкой цепи, либо тяжелой цепи в качестве матричной цепи;
(c) определение VL первого вариабельного домена антитела или второго вариабельного домена антитела в качестве VL1;
(d) определение VL2, VH1 и VH2 согласно формулам [I] и [II], приведенным ниже:
1
2
3
4
(e) определение максимальной и минимальной длины L, L, L и L;
(f) создание полипептидных структур формул I и II;
(g) отбор полипептидных структур формул I и II, которые связывают первый антиген-мишень и второй антиген-мишень при объединении с образованием антитело-подобного связывающего белка;
где:
VL1 означает первый вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VL2 означает второй вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина;
VH1 означает первый вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
VH2 означает второй вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина;
CL означает константный домен легкой цепи иммуноглобулина;
СН1 означает константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина СН1; и
L1, L2, L3 и L4 означают аминокислотные линкеры;
и при этом полипептиды формулы I и полипептиды формулы II образуют пару легкая цепь - тяжелая цепь в ориентации крест-накрест.
43. Способ по п. 42, в котором первый вариабельный домен антитела и второй вариабельный домен антитела являются одинаковыми.