Индукция гибели Т-клеточной гибридомы 2В4 ингибиторами митохондриальных функций. Защитный эффект онкобелка bcl-2

Иммунный статус пациентов с поздними лучевыми повреждениями, развившимися в отдаленные сроки после комбинированного лечения

Кузьмина Е. Г., Пантелеева Е.С., Непрнаа Г.С.,

Ватнп О.Е., Снроткнна Н.П., Полнтюкова Н.А., Дорошенко JT.H.

Медицинский радиологический научный центр РАМН Обнинск, Россия

Как известно, применение лучевого лечения самостоятельно и в различных комбинациях с химиотерапией и оперативным вмешательством приводит к развитию дисбаланса в иммунной системе с преобладанием иммунодепрессии. При благоприятном течении постлучевого и постоперационного периодов в течение 2-5 лет происходит значительное восстановление иммунитета, которое, однако, не всегда бывает полным. При превышении индивидуальной толерантности к облучению в здоровых тканях, находящихся в непосредственной близости от опухоли и подвергшихся лучевому воздействию, развиваются воспалительные процессы, в ряде случаев приводящие к формированию поздних лучевых повреждений (ПЛП).

В настоящей работе выполнена оценка состояния иммунитета у больных с ПЛП, развившимися в отдаленные сроки после комбинированного лечения злокачественных новообразований различной нозологии (рак легких, ЖКТ и гинекологической сферы).

Наблюдали 82 человека, проходивших лечение по поводу ПЛП в МРНЦРАМН в 1992-1998 гг., получивших программы комбинированного лечения онкозаболеваний 3-27 лет назад. Среди них: больные с дерматитами - 5, лучевыми язвами конечностей -30, лучевыми отеками и слоновостью -11, нневмосклерозом и пневмофиброзом - 18, циститами и ректитам и -9. тазовым фиброзом — 7, проч ие — 4.

В иммунном статусе изучены количественные и функциональные характеристики основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток с использованием проточной цитофлуориметрии (FACScan) и моноклональных антител фирмы BECTON DICKINSON и других методов. Изучали численность и функцию Т-, В-, НК- и фагоцитирующих клеток.

В общей группе больных выявлены значительные изменения в иммунной системе. По сравнению с данными группы здоровых доноров - отмечена значительно более высокая дисперсия показателей, наиболее часто, в сторону их снижения. Более глубоко изменения выражены в популяциях Т- и НК-клеток. В системе Т-клеток снижены: относительное и абсолютное содержание Т-общих (CDS*, CD5*) и Т-хелперов (CD4') в 1,5 раза, в том числе клеток, имеющих маркеры активации (антигены главного комплекса гистосовместимости II типа, CD3’HLADR* и рецепторы для ИЛ-2, CD25+), атаюке пролиферация Т-клеток, оцениваемая по ФГА- индуцированной РБТЛ, и цитотоксичность лимфоцитов (лизис клеток линии MOLT-4 в соотношении эффектор: мишень 25:1, 12:1 и 6:1). Численность

НК-клеток также снижена в 1,5 раза. В системе В-клеток нарушения выражены менее резко: у 30-35% больных повышено число В-клеток (CD 19') и уровень сывороточного IgG. Фагоцитоз - в пределах нормы, хотя вариация индивидуальных показателей значительно превышает ее.

Сравнение состояния иммунной защиты при различных типах ПЛП выявило большую глубину нарушений при развитии лучевых повреждений тазовых органов: при тазовом фиброзе, ректитах и циститах. У этих больных выявляются признаки хронического воспаления - лейкоцитоз за счет повышения относительного и абсолютного содержания нейтрофилов (в среднем, в 1,5-2 раза), снижение относительного уровня лимфоцитов до нижней границы нормы (22-24%), их абсолютного числа - до 2/3 нормы и большая степень снижения числа Т-клеток (общих, хелперов и активированных форм снижено в 2-2,5 раза, CD47CD8' — в 1,5 раза) и НК-клеток (снижено в 2 раза). При средней нормальной численности В-клеток уровень сывороточного IgG снижен. При слоновости, напротив, чаще развивается относительный лимфоцитоз (среднее — 44,3%) и отмечается высокий разброс показателей функционального состояния лимфоцитов (повышение спонтанной РБТЛ и уровня сывороточного IgG). При развитии дерматита, лучевых язв и пиевмосклероза нарушения совпадают с отмечавшимися в общей группе больных с ПЛП.

Т.о., при ПЛП часто развиваются вторичные имму-нодефицитные состояния, затрагивающие преимущественно Т- и НК-клетки., что требует принятия мер по иммунореабилитации этих больных.

Индукция гибели Т-клеточной гибридомы 2В4 ингибиторами митохондриальных функций. Защитный эффект онкобелка BCL-2

ЛысюкЕ.Ю.1,2, Полосухина Е.Р.2, Барышников АЛО.,2 Черняк Б.В.1

НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского МГУ, Москва Российский онкологический научный центр им.Н.Н.Блохина РАМН. Москва

Снижение концентрации АТФ в клетке является одной из основных причин ее гибели. Механизм гибели и участие в этом программированной клеточной смерти в настоящее время плохо изучен. Онкобелок Вс1-2 защищает клетку от апоптоза, вызванного различными факторами.

Целью работы было изучение механизма гибели клеток под действием ингибиторов митохондриальных функций.

Материалы н методы. Для исследований использовались линия клеток Т-клеточной гибридомы 2В4, трансформированная вектором, содержащим ген bcl-2 (2В4/ Ьс12), и контрольной плазмидой (2В4), любезно предоставленные Dr. Ch. Zacharchuk (USA). Экспрессию белка bcl-2 изучали с помощью реакции иммунофлуоресценции с моноклональными антителами Bcl-2/FITC (clone 124, DAKO) на проточном цитофлуориметре FACScan

(BECTON DICKINSON). Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию трлпановым синим. Для оценки апоптоза клетки окрашивали флуоресцентным красителем Hoehst 33342 (Sigma) и бромистым этидием и анализировали на флуоресцентном микроскопе Opton.

Результаты. Было показано, что экспрессия белка Вс1-2 в линии 2В4/Ьс12 составляет 76,6±2,9% против 2,7±0,1% в линии 2В4.

Ингибиторы дыхания ротенон (2 |.iM) и антимицин А (2 |iM), ингибитор митохондриального синтеза АТФ оли-гомицин (5 мкг/мл), и разобщитель окислительного фос-форилирования 2,4-динитрофенол (ДНФ, 0.4 мМ) вызывают гибель клеток линии 2В4 (~90% за 25 часов). У 40-50% клеток наблюдаются характерные морфологические признаки апоптоза (конденсация хроматина и образование апоптотических телец). Вс1-2 практически полностью защищает клетки от гибели.

Подавление гликолиза2-дезоксиглюкозой (ДОГ) вызывает практически полную гибель клеток (25 часов) без признаков апоптоза. Вс1-2 защищает от гибели -50% клеток. Комбинация ДОГ с митохондриальными ингибиторами не ускоряет гибелыслеток (30-40% за 10 часов), но предотвращает защитный эффект Вс1-2.

Заключение. Показано, что снижение уровня АТФ в клетке под действием митохондриальных ингибиторов вызывает чувствительные к Вс1-2 апоптоз и некроз. Более эффективное снижение АТФ при совместном торможении гликолиза и окислительного фосфорнлировання вызывает некротическую гибель и предотвращает защитное действие Вс!-2.

Анализ специфичности антител в сыворотках пациентов, получающих терапию экстрактами омелы белой

Малючепко Н.В., Солопова О.Н, Егорова С.Г.

Московский Государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия

Экстракты омелы белой получили широкое распространение в терапии опухолевых заболеваний в Европе. Противоопухолевую активность экстрактов связываютс 1) цитотоксической активностью экстрактов по отношению к опухолевым клеткам, 2) активацией звеньев иммунной системы, участвующих в защите против опухоли, 3) возможной индукцией днфференцнровки трансформированных клеток, следствием которой является снижение пролиферативной активности и повышение чувствительности к апоптозу. В отношении иммунномодуляторной активности было показано, что под действием экстрактов происходит активация макрофагов, естественных киллеров, CD4+ клеток, а также индукция синтеза IL-1 a, 1L-1 р, IL-6, IL-10, TNF-а и др. Во время терапии экстрактами, через 3-4 недели после начала, в сыворотках пациентов появляются антитела, направленные против основного белка омелы - вискумина (MLI) и его изоформ (MLII и MLIII). В основном, антитела - IgG класса, однако наблюдали также продукцию специфичных антител IgA

и класса. В настоящий момент антитела, образующиеся в ответ на введение экстрактов омелы, недостаточно полно охарактеризованы. Хотя известно, что специфичные к белкам омелы антитела оказывают модулирующие действие на активность экс фактов 1п V

В данной работе проводилось изучение специфичности антител в сыворотках опухолевых пациентов, которое получали терапию экстрактами омелы белой.

Для реализации данной задачи были разработаны различные сэндвич-тест-системы на основе иммунноферментного анализа. Эти системы созданы на основе полученных ранее мышиных моноклональных антител, направленных против различных участков как А-, так и В-субъединицы вискумина. Данные системы различают конформационные состояния субъединиц вискумина.

В результате анализа образцов сывороток, взятых от опухолевых больных, принимающих терапию экстрактами омелы, нами было показано, что антитела и сыворотках активно взаимодействовали как с нативной, так с денатурированной формой А-субъединицы вискумина. Также мы обнаружили, что антитела в сыворотках практически не реагировали с нативной формой, а были, в основном, направлены к денатурированной форме В-субъединицы вискумина. Данный результат можно объяснить способностью В-субьединицы токсина вызывать апоптоз. Предполагается, что в организме, при попадании антигена (вискумина), происходит своеобразная отрицательная селекция клонов В-лимфоцитов, специфичных к нативной форме В-субъединицы белка.

Крометого, было показано, что человеческие антитела в сыворотках имеют общие с мышиными антителами антигенные детерминанты. Некоторые из данных детерминант картированы с помощью пептидного сканирования.

В заключение необходимо отметить, что благодаря полученной ранее в нашей группе панели мышиных моноклональных антител, стало возможным создание различ-пыхтест-систем и получение более полной информации о специфичности антител, продуцируемых в ответ на введение вискумина. Таким образом, можно проводить частичную оценку презентации антигена в организме пациентов, а именно: к каким формам вискумина и к каким из известных антигенных детерминант направлен иммунный ответ при терапии экстрактами омелы белой.

Моноклональные антитела против высокомолекулярного меланомо-ассоциированного антигена как вектор для синтеза иммунотоксинов

Новиков К.Н., Малючепко Н.В.,Мойсенович М.М., Егорова С.Г.

Московский Государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия

Иммунотоксины являются препаратами направленного действия и предназначены для избирательной элиминации клеточных популяций. ИТ состоят из векторной