КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕПАТИТА С И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ГЕПАТИТА С
COMPOSITION FOR TREATING HEPATITIS C AND METHOD OF TREATING HEPATITIS C

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Группа изобретения относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использована для лечения вирусного гепатита С, особенно в тех случаях, когда обычное лечение неэффективно.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Вирусный гепатит С (HCV), вызываемый вирусом гепатита С, является очень распространенным вирусным заболеванием.
19 мая ежегодно отмечается Международный день борьбы с гепатитом.
Около 170 миллионов человек в мире инфицировано вирусом гепатита С, причем в 80% случаев заболеваний вирусным гепатитом С развивается хроническая инфекция, приводящая к циррозу печени и гепатоклеточной карциноме, Liang TJ, Rehermann В, Seeff LB, Hoofnagle JH. 2000. Pathogenesis, natural history, treatment, and prevention of hepatitis C. Ann Intern Med 132:296-305.
Заболеваемость вирусными гепатитами В и С - одна из наиболее серьезных проблем и российского здравоохранения. По приблизительным оценкам в стране насчитывается несколько миллионов носителей этих инфекций, число же получающих необходимое лечение составляет несколько тысяч, http://medportal.ru/mednovosti/main/2010/05/19/hepday/.
В настоящее время общепризнано, что пока не существует универсальных высокоэффективных средств для лечения вирусного гепатита С (хронической HCV-инфекции).
Известны способы лечения гепатита интерфероном и рибавирином (ribavirin). В частности, известен способ лечения хронических вирусных гепатитов, заключающийся во введении противовирусного препарата, согласно которого через катетер в круглой связке печени вводится интерферон в дозе 3000000 ЕД через день в течение двух недель, курс лечения повторяют 3 раза с интервалом в 3 месяца [RU 99125410].
Способы лечения гепатита С с помощью пегилированного интерферона альфа (pegylated-interferon-a) и рибавирина являются в настоящее время наиболее эффективными из известных, но они дают положительные результаты лишь в 50% случаев [Booth JC, O'Grady J, Neuberger J. 2001. Clinical guidelines on the management of hepatitis C. Gut 49:11-21; Craxi A, Licata A. Clinical trial results of peginterferons in combination with ribavirin. Semin Liver Dis 2003; 23 (Suppl 1):35-46].
Известен способ лечения хронического вирусного гепатита С путем назначения больному витаминов группы В, гепатопротекторов и циклоферона, отличающийся тем, что дополнительно до приема циклоферона больному назначают реаферон внутримышечно в дозе 3000000 ME 3 раза в неделю в течение 18-20 дней, а курс лечения циклофероном продлевают до 7-9 недель с кратностью приема циклоферона 1 раз в 5 дней в дозе 600 мг, причем проводят от 2 до 4 курсов комбинированной терапии реафероном и циклофероном [RU 2002102025].
Известен способ лечения хронического гепатита, заключающийся в назначении эссенциале по 1 капсуле 2 раза в день; дополнительно назначают прием гепатопротектора липроксола в дозе 2 г 2 раза в день в течение 21-28 дней [RU 2005106133].
Недостатками указанных выше и иных известных препаративных способов лечения гепатита являются их невысокая эффективность, особенно для хронических форм гепатита С.
В настоящее время интенсивно разрабатываются способы лечения посредством иммунотерапии, которые потенциально могут быть менее токсичными и более действенными на разных стадиях заболевания.
Иммунная система способна отличать "свое" от "чужого" и в нормальных условиях может вызывать иммунную реакцию против чужеродных или "не своих" антигенов. Пораженные вирусами клетки распознаются иммунной системой как чужеродные. Однако такая естественная иммунная реакция часто является недостаточно сильной, чтобы блокировать развитие вирусов.
Задача иммунотерапии состоит в том, чтобы усилить способность иммунной системы распознавать пораженные вирусами клетки и создавать эффективные механизмы снижения вирусной нагрузки. Важными вопросами, возникающими в случае любой специфической иммунотерапии, являются выбор антигенов для направленного воздействия и оптимальное представление антигенов иммунной системе.
Ограничением применения иммунологических методов может быть избыточное поражение печеночных клеток эффекторными компонентами иммунной системы, что может приводить к циррозу печени.
6
6
Известен способ лечения путем иммунотерапии хронического гепатита или цирроза печени, включающий введение в кровь больного таких мононуклеарных клеток пуповинной крови донора, которые имеют набор антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR, отличный от набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR реципиента не менее, чем по четырем антигенам, причем количество вводимых клеток составляет от 2,5×10 до 10×10 клеток на кг массы тела в сутки, курс введения мононуклеарных клеток пуповинной крови донора составляет от 2 до 10 раз с интервалом 10-60 дней [RU 2295351].
Однако известно, что даже в случае успешной репопуляции клеток донора, чужие пересаженные клетки могут вызвать тяжелые иммунопатологические явления, в частности реакцию «трансплантат против хозяина», причем даже у идентичных по HLA типу людей могут возникать аутоиммунные осложнения.
Известен способ лечения заболеваний, в частности злокачественных опухолей, путем иммунотерапии, при которой выделяют из периферической крови больного моноциты, культивируют их с ростовыми факторами на питательной среде с получением дендритных клеток, в среду к полученным их моноцитов дендритных клеток, а также путем электрокорпорации внутрь дендритных клеток добавляют антигенный материал, после чего дендритные клетки вводят больному путем инъекции, при этом дополнительно проводят иммуномодуляцию путем инъекции активированных Т-лимфоцитов больного; в качестве антигенного материала используют смесь белков патогенных клеток, взятых из патологического очага [RU 2192263].
Данный способ создавался применительно к иммунотерапии злокачественных опухолей мозга, однако может быть применен для лечения инфекционных заболеваний, в том числе гепатита С при условии использования соответствующего антигенного материала.
Недостатком этого способа, принятого в качестве прототипа заявленного способа, является его неэффективность при лечении гепатита С, что обусловлено неадекватностью используемого антигенного материала.
Выбор подходящего антигенного материала вируса гепатита С может быть ключевым моментом в получении эффективной противовирусной композиции. Разработка вакцинной композиции против вирусного гепатита С (HCV) осложнена не только значительной гетерогенностью изоляторов HBV и HCV, но также смесью гетерогенных геномов в пределах изолята [Martell, et al., J. Virol., 1992, 66, 3225].
Известны различные, в основном профилактические композиции (вакцины) против гепатита (Вирусный гепатит и заболевания печени [Vyas B.N., Dienstag, J.L., and Hoofnagle, J.H.), ред. Грун энд Стратон, Инк., 1984; Вирусный гепатит и заболевания печени. Труды Международного симпозиума, ред. F.B.Hollinger, S.M.Lemon and H.Margolis, публ. Вильяме энд Вилкинс, 1990 г.], однако терапевтические вакцины для лечения вирусного гепатита С, особенно в хронической форме, пока практически отсутствуют.
Известна вакцина для защиты против вирусов гепатита В и/или гепатита С, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, которая содержит неполный геном слитых вирусов гепатита С и гепатита В или неполный геном вируса гепатита С, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую полный коровый белок гепатита С и S-генный белок гепатита В, или неполный вирусный геном гепатита С, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую полный коровый белок гепатита С, соединенную с регуляторными элементами, функциональными в человеческих клетках, а также иные фармацевтические композиции, содержащие такие конструкции [RU 2189254, WO 96/10997].
Однако упомянутые вакцины и способы вакцинации могут иметь лишь профилактическое значение, терапевтический эффект от их использования крайне незначителен или отсутствует.
На мышиной модели убедительно продемонстрирована возможность индукции гуморального и клеточного иммунного ответа при вакцинации композицией, содержащей коровый рекомбинантный белок и изогенные дендритные клетки, нагруженные коровым белком вируса гепатита С и его пептидами [Encke J., Findeklee J., Geib J., Pfaff E. and Stremmel W. Prophylactic and therapeutic vaccination with dendritic cells against hepatitis С virus infection. British Society for Immunology, Clinical and Experimental Immunology (2005), 142:362-369].
Показано при этом, что рост привитой иммунизированным мышам изогенной миеломной клеточной линии, экспрессирующей использованный для иммунизации коровый белок, тормозится, и эффективность образования опухолей снижается.
По-существу данная работа демонстрирует принципиальную возможность вызвать гуморальный и клеточный иммунный ответ на чужеродный белок, каким является коровый белок вируса гепатита С.
Это утверждение не представляет из себя открытия, так как подтверждает ранее установленный факт, что подтверждается, в частности, публикациями, цитируемыми самими авторами [Encke J, zu Putlitz J, Geissler M, Wands JR. Genetic immunization generates cellular and humoral immune responses against the nonstructural proteins of the hepatitis С virus in a murine model. J Immunol 1998; 161:4917-23; Satoi J, Murata K, Lechmann M, et al. Genetic immunization of wild-type and hepatitis С vims transgenic mice reveals a hierarchy of cellular immune response and tolerance induction against hepatitis С virus structural proteins. J Virol 2001; 75:12121-7; Lechmann M, Murata K, Satoi J, Vergalla J, Baumert TF, Liang TJ. Hepatitis С virus-like particles induce virus-specific humoral and cellular immune responses in mice. Hepatology 2001; 34:417-23; Wedemeyer H, Gagneten S, Davis A, Bartenschlager R, Feinstone S, Rehermann B. Oral immunization with HCV-NS3-transformed Salmonella: induction of HCV-specific CTL in a transgenic mouse model. Gastroenterology 2001; 121:1158-66].
Таким образом, требуется достижение иного технического результата - не просто вызвать иммунный ответ против компонентов вируса, но и добиться того, чтобы этот ответ действительно предотвращал размножение вируса в организме и связанные с этим патологические процессы, что не позволяют сделать известные вакцины и известные способы лечения гепатита С. Требуется, чтобы вакцинация помогала пациентам, чья иммунная система не способна самостоятельно поставить под контроль распространение вируса (а их около половины от всех зараженных), выполнить эту функцию, несмотря на способность вируса гепатита С подавлять эффективное функционирование иммунной системы и уклоняться от иммунного контроля.
Такая задача в принципе не может быть решена на мышиной модели, так как мыши не болеют гепатитом С и не могут служить адекватной моделью.
Наиболее близкой к заявленной является композиция для лечения гепатита С, содержащая полученные из моноцитов крови больного дендритные клетки, US 2010/0143405 A1 (прототип), в котором в качестве антигена, вводимого в дендритные клетки, использован ряд липопротеидных соединений, представляющих собой химические соединения коротких (9-11 аминокислот) пептидов, соответствующих, по представлениям авторов, иммуногенным эпитопам вирусных белков (Core, NS3 и NS4) с липидным хвостом (S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-propyl}-cysteine. Однако, несмотря на ожидания авторов, реализация этой композиции не позволила достичь сколько-нибудь значительных клинических результатов.
Результаты проведенных самими авторами клинических испытании дали негативный результат [Gowans EJ, Roberts S, Jones К, Dinatale I, Latour PA, Chua B, Eriksson EM, Chin R, Li S, Wall DM, Sparrow RL, Moloney J, Loudovaris M, Ffrench R, Prince HM, Hart D, Zeng W, Torresi J, Brown LE, Jackson DC. A phase I clinical trial of dendritic cell immunotherapy in HCV-infected individuals. J Hepatol. 2010 Oct; 53(4):599-607. Epub 2010 Jun 20. Virology Program, Burnet Institute, G.P.O. Box 2284, Melbourne, Vie. 3001, Australia, gowans@burnet.edu.au].
Данное исследование имело целью проверить безопасность и эффективность композиции, содержащей дендритные клетки, нагруженные иммуногенными пептидами белков вируса гепатита С у пациентов, устойчивых к обычной (интерферон-а+рибавирин) терапии. Несмотря на то, что было обнаружено появление специфичных к белкам вируса гепатита С цитотоксических Т лимфоцитов (CD8+), иммунный ответ не был устойчивым и не был способен снизить вирусную нагрузку ни в одном случае.
Поэтому авторы указанной композиции заключили, что: «терапия, использующая аутологичные дендритные клетки, нагруженные липопротеидами, была безопасна, но не способна изменить ход болезни» [см. вышеприведенные ссылки].
ЗАДАЧА И ДОСТИГАЕМЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ РЕЗУЛЬТАТ
Задачей настоящей группы изобретений является создание способа лечения и композиции для его реализации, обеспечивающих повышение эффективности терапии гепатита С в хронической форме, в частности для случаев, когда лечение обычной комбинацией интерферона и рибаверина оказывается недейственным, с измеряемым результатом в виде радикального снижения концентрации вируса в крови.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Поставленные задачи решаются и требуемый технический результат достигается тем, что композиция для лечения гепатита С согласно изобретению содержит полученные из моноцитов крови больного дендритные клетки с фрагментами белка вируса гепатита С, например в виде фрагментов корового белка вируса гепатита С или преимущественно в виде фрагментов NS3 белка вируса гепатита С (192 аминокислотный фрагмент с 1027 по 1218 аминокислоты). При этом композиция может быть дополнительно усилена использованием дендритных клеток с подавленной экспрессией генов SOCS-1 и/или FAS, а также дополнительно содержать активированные для реализации Тh1 ответа Т-лимфоциты, в том числе и с подавленной экспрессией генов CTLA4 и/или FAS и/или FOXP3.
Технический результат достигается также тем, что композиция для лечения гепатита С согласно изобретению содержит дендритные клетки с фрагментами белка вируса гепатита С и активированные для реализации Тh1 ответа Т-лимфоциты, преимущественно полученные из моноцитов крови больного.
Композиция для лечения гепатита С согласно изобретению может также содержать полученные из моноцитов крови больного дендритные клетки с фрагментами белка вируса гепатита С и временно подавленной экспрессией генов SOCS1, FAS или их комбинацией и активированные для реализации Тh1 ответа Т-лимфоциты с временно подавленной экспрессией генов FAS, CTLA4 и FOXP3 или их комбинацией посредством введения в клетки соответствующих этим генам коротких двунитевых интерференционных РНК.
Технический результат достигается также тем, что по способу лечения вирусного гепатита С используют описанную выше композицию, содержащую дендритные клетки с фрагментами белка вируса гепатита С отдельно или совместно с обычными методами лечения вирусного гепатита С.
Технический результат достигается также тем, что по способу лечения вирусного гепатита С используют описанную выше композицию, содержащую дендритные клетки с фрагментами белка вируса гепатита С и активированные для реализации Тh1 ответа Т-лимфоциты отдельно или совместно с обычными методами лечения вирусного гепатита С.
Технический результат достигается также тем, что по способу лечения вирусного гепатита С используют описанную выше композицию, содержащую дендритные клетки, которым представляются в качестве антигена участки корового белка вируса гепатита С, белка NS3 или их комбинация, или содержащую дендритные клетки, которым представляется в качестве антигена аминокислотный фрагмент 192 (а.а. 1027-1218) NS3 HCV.
Технический результат достигается также тем, что по способу лечения вирусного гепатита С используют описанную выше композицию, содержащую дендритные клетки с подавленной экспрессией генов SOCS-1 и/или FAS и Т-лимфоциты с подавленной экспрессией генов CTLA4 и/или FAS, и/или FOXP3 отдельно или совместно с обычными методами лечения вирусного гепатита С.
Технический результат достигается также тем, что по способу лечения вирусного гепатита С используют описанную выше композицию содержащую полученные из моноцитов крови больного дендритные клетки с фрагментами белка вируса гепатита С и с временно подавленной экспрессией генов SOCS1, FAS или их комбинацией и активированные для реализации Тh1 ответа Т-лимфоциты с временно подавленной экспрессией генов FAS, CTLA4 и FOXP3 или их комбинацией посредством введения в клетки соответствующих этим генам коротких двунитевых интерференционных РНК.
Таким образом, характерными особенностями изобретения является нагрузка получаемых из моноцитов крови больного антиген-представляющих дендритных клеток практически универсальными вирусными антигенами в виде иммуногенных фрагментов белка вируса гепатита С, преимущественно в виде фрагментов белков NS3 и использование активированных для реализации Тh1 ответа Т-лимфоцитов отдельно или в сочетании с временным выключением в используемых дендритных клетках и Т-лимфоцитах экспрессии генов SOCS1, FAS, CTLA4 и FOXP3 с помощью введения в клетки соответствующей этим генам короткой двухцепочечной интерференционной РНК (siRNA).
5
7
7
При этом преимущественный вариант композиция содержит дендритные клетки с фрагментами NS3 вирусного белка гепатита С в количестве 5×10-10 клеток/мл и активированные Т-лимфоциты больного в количестве 10 клеток/мл.
Наиболее простая и эффективная схема достижения результата при лечении гепатита С путем иммунотерапии достигается тем, что из периферической крови больного выделяют моноциты, культивируют их в питательной среде с ростовыми факторами с получением дендритных клеток, в которые путем электропорации вводят фрагменты NS3 белка вируса гепатита С, приготавливают активированные Т-лимфоцитов больного, а затем полученные из моноцитов крови больного дендритные клети с фрагментами белка вируса гепатита С и активированные Т-лимфоцитов больного внутрикожной инъекцией вводят больному.
При этом из периферической крови больного выделяют моноциты, культивируют их в питательной среде с ростовыми факторами с получением дендритных клеток, в которые путем электропорации вводят фрагменты NS3 белка вируса гепатита С, состоящие из 192 аминокислот с 1027 по 1218, приготавливают активированные фитогемагглютинином Т-лимфоцитов больного, а затем полученные из моноцитов крови больного дендритные клети с фрагментами белка вируса гепатита С и активированные Т-лимфоцитов больного инъекцией вводят больному.
5
7
7
Полученные из моноцитов крови больного дендритные клети с фрагментами белка вируса гепатита С вводят в количестве 5×10-10 клеток/мл, а активированные Т-лимфоциты больного - в количестве 10 клеток/мл.
При этом преимущественно используют описанную выше композицию, содержащую дендритные клетки с фрагментами белка вируса гепатита С и активированными Т-лимфоцитами, совместно с обычными методами лечения вирусного гепатита С.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕРМИНОВ И ПОНЯТИЙ
В настоящей заявке использованы следующие термины и понятия:
Вирусный белок NS3 - продукт NS3 участка генома вируса гепатита С молекулярным весом 70 кDа. Содержит два различных домена с отдельными функциями. N-концевая часть представляет собой сериновую протеазу, ответственную за процессинг С-концевой части полипротеина-предшественника. С-концевая часть NS3 выполняет функции РНК-геликазы. Предполагается, что NS3-геликаза расплетает вирусную РНК на ранних стадиях геномной репликации.
Дендритные клетки (Dendritic cells (DCs)) - гетерогенная популяция антиген-презентирующих клеток костномозгового происхождения. Морфологически дендритные клетки - крупные клетки (15-20 мкм) круглой, овальной или полигональной формы, с экцентрически расположенным ядром, многочисленными разветвленными отростками мембраны. Дендритные клетки экспрессируют набор поверхностных молекул, характерных для других антиген-представляющих клеток: рецепторы для компонентов клеточной стенки и нуклеиновых кислот микроорганизмов, в том числе рецепторы к компонентам комплемента и toll-like рецепторы; молекулы II класса гистосовместимости (ГКС, МНС); костимуляторные молекулы CD40, В7-1/2 (CD80, CD86), B7-DC, В7-Н1; молекулы межклеточной адгезии (ICAM-1). В последнее десятилетие дендритные клетки вызывают повышенный интерес исследователей благодаря легкости их получения из моноцитов периферической крови и способности эффективно представлять антиген Т-лимфоцитам. К настоящему времени проведено множество исследований по модуляции иммунного ответа у больных хроническими инфекционными и онкологическими заболеваниями с использованием праймированных антигеном дендритных клеток.
Антиген (antigen) - вещества, которые вызывают специфический для них клеточный или гуморальный иммунный ответ.
Моноциты (греч. Movoς - «один» и  - «вместилище», «клетка») - крупный зрелый одноядерный лейкоцит группы агранулоцитов диаметром 12-20 мкм с эксцентрично расположенным полиморфным ядром, имеющим рыхлую хроматиновую сеть, и азурофильной зернистостью в цитоплазме. Моноциты имеют несегментированное ядро. Моноцит - наиболее активный фагоцит периферической крови. Имеет форму клетки овальной формы с крупным бобовидным, богатым хроматином ядром и большим количеством цитоплазмы, в которой имеется множество лизосом. В норме моноциты составляют от 3 до 11% общего количества лейкоцитов крови. Абсолютное их содержание составляет приблизительно 450 клеток в 1 мкл. Моноциты находятся в крови 2-3 дня, затем они выходят в окружающие ткани, где, достигнув зрелости, превращаются в тканевые макрофаги или дендритные клетки.
Т-лимфоциты или Т-клетки (Т от лат. Thymus - тимус) - лимфоциты, развивающиеся у млекопитающих в тимусе из предшественников - претимоцитов, поступающих в него из красного костного мозга. В тимусе Т-лимфоциты дифференцируются, приобретая Т-клеточные рецепторы (TCR) и поверхностные маркеры. Играют важную роль в адаптивном, то есть приобретенном, иммунном ответе. Обеспечивают распознавание и уничтожение клеток, несущих чужеродные антигены, усиливают действие моноцитов, NK-клеток, а также принимают участие в переключении изотипов иммуноглобулинов, то есть в изменении продукции ранних иммуноглобулинов IgM, на поздние IgG, IgE, IgA B-клетками.
Активированные Т-лимфоциты - Т-лимфоциты, подвергнутые действию цитокинов и агентов, стимулирующих их пролиферацию (фитогемагглютинин) для реализации Тh1 ответа, а также таким же образом полученные Т-лимфоциты с подавленной экспрессией генов CTLA4 и/или FAS, и/или FOXP3.
Иммуносупрессия - угнетение иммунитета по той или иной причине.
Электропорация - способ введения внутрь клеток добавленных к ним макромолекул, заключающийся в воздействии на них кратким электрическим разрядом, вызывающим обратимое образование пор в наружной клеточной мембране.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Иными словами поставленная задача решается и требуемый технический результат достигается за счет того, что из периферической крови больного выделяют моноциты, культивируют их с ростовыми факторами на питательной среде с получением дендритных клеток, в среду к полученным из моноцитов дендритным клеткам, а также путем электропорации внутрь дендритных клеток добавляют антигенный материал патогенного белка, после чего дендритные клетки вводят больному путем инъекции, в качестве антигенного материала, вводимого в дендритные клетки, используют фрагмент белка NS3 вируса гепатита С, состоящий из 192 аминокислот с 1027 по 1218. Дополнительно проводят иммуномодуляцию путем инъекции аутологичных активированных Т-лимфоцитов больного; Т-лимфоциты активируют с помощью фитогемагглютинина.
В итоговую композицию для лечения гепатита С согласно изобретению входят полученные из моноцитов крови больного дендритные клетки с введенным внутрь них антигенным материалом. В качестве антигенного материала использован фрагмент белка NS3 вируса гепатита С. Кроме того, в композицию включены аутологичные активированные с помощью фитогемагглютинина Т-лимфоциты.
Существенным моментом предлагаемой композиции является использование большого фрагмента NS3 белка, который с одной стороны несет множественные иммуногенные детерминанты, а с другой не обладает свойствами, препятствующими развитию эффективного противовирусного иммунитета, как это обнаружено для многих белков вируса гепатита С.
Следует отметить, что различные консервативные белки вируса гепатита С, к которым относится белок NS3, могут представлять собой мишени для иммунологического контроля над инфекцией и служить основой для создания новых эффективных противовирусных вакцин. Однако особенно перспективным антигеном для индукции противовирусного иммунитета представляется эндогенный вирусный белок NS3. У пациентов, чья иммунная система способна держать под контролем распространение вируса гепатита С, наблюдается наиболее сильный и устойчивый Т-клеточный иммунный ответ к эпитопам вирусного белка NS3 [Bronowicki JP, Vetter D, Uh1 G, Hudziak H, Uhrlacher A, Vetter JM, Doffoel M. 1997; Lymphocyte reactivity to hepatitis С virus (HCV) antigens shows evidence for exposure to HCV in HCV-seronegative. spouses of HCV-infected patients. J Infect Dis 176, 2:518-522; Diepolder HM, Gerlach JT, Zachoval R, Hoffmann RM, Jung MC, Wierenga EA, Scholz S, Santantonio T, Houghton M, Southwood S, Sette A, Pape GR. 1997. Immunodominant CD4. T-cell epitope within nonstructural protein 3 in acute hepatitis С virus infection. J Virol 71:6011-6019; Rosen HR, Miner C, Lewinsohn D, Sasaki AW, Conrad AJ, Bakke A, Bouwer A. 2002. Determination of Hepatitis С virus-specific effector CD4. T cell by flow cytometry: Correlation with clinical disease stages. Hepatology 35:190-19].
NS3 содержит ряд эпитопов, эффективно представляемых главным комплексом гистосовместимости 1-го типа (HLA1) [Cerny A, McHutchison JG, Pasquinelli С, Brown ME, Brothers MA, GrabscheidB, Fowler P, Houghton M, Chisari FV. 1995; CytotoxicT lymphocyte response to hepatitis С virus-derived peptides containing the HLA A2.1 binding motif. J Clin Invest 95:521-53; Kurokohchi K, Akatsuka T, Pendleton CD, Takamizawa A, Nishioka M, Battegay M, Feinstone SM, Berzofsky JA. 1996. Use of recombinant protein to identify a motif-negative human cytotoxic T-cell epitope presented by HLA-A2 in the hepatitis С virus NS3 region. J Virol 70:232-240, He XS, Rehermann B, Lopez-Labrador FX. 1999. Quantitative analysis of hepatitis С virus-specific CD8. Т cells in peripheral blood and liver using peptide-MHC tetramers. Proc Natl Acad Sci USA 96:5692-569].
Пациенты, отвечающие на терапию интерфероном-альфа, обнаруживают сильную цитотоксическую Т-клеточную активность, специфичную к эпитопам NS3 [Vertuani S, Bazzaro M, Gualandi G, Micheletti F, Marastoni M, Fortini C, Canella A, Marino M, Tomatis R, Traniello S, Gavioli R. 2002; Effect of interferon-alpha therapy on epitope-specific cytotoxic Т lymphocyte responses in hepatitisCvirus-infected individuals. Eur J Immunol 32:144-154].
Значительная часть известных специфических для вирусов гепатита С эпитопов локализуется на белке NS3 [Ward S, Lauer G, Isba R, Walker B, Klenerman P. 2002; Cellular immune responses against hepatitis С virus: The evidence base 2002. Clin Exp Immunol 128:195-203].
Существуют убедительные доказательства того, что результат развития инфекции вирусом гепатита С определяется специфическим иммунным ответом, вызванным CD8 и CD4 Т-лимфоцитами [Missale G, Bertoni R, Lamonaca V, Valli A, Massari M, More C, Rumi MG, Houghton M, Fiaccadori F, Ferrari C. 1996. Different clinical behaviors of acute hepatitis C virus infection are associated with different vigor of the anti-viral cell-mediated immune response; J Clin Invest 98:706-714; Diepolder HM, Gerlach JT, Zachoval R, Hoffmann RM, Jung MC, Wierenga EA, Scholz S, Santantonio T, Houghton M, Southwood S, Sette A, Pape GR. 199; Immunodominant CD4. T-cell epitope within nonstructural protein 3 in acute hepatitis C virus infection; J Virol 71:6011-6019; Gerlach JT, Diepolder HM, Jung MC, Gruener NH, Schraut WW, Zachoval R, Hoffmann RM, Schirren CA, Santantonio T, Pape GR. 1999. Recurrence of hepatitis C virus after loss of virus-specific CD4. T-cell response in acute hepatitis C. Gastroenterology 117:933-941; Lechner F, Wong DK, Dunbar PR, Chapman RT, Chung RT, Dohrenwend P, Robbins G, Philips R, Klenerman P, Walker BD. 2000b. Analysis of successful immune responses in persons infected with hepatitis C virus. J Exp Med 191:1499-1512; Chang KM, Thimme R, Melpolder JJ, Oldach D, Pemberton J, Moorhead-Loudis J, McHutchison JG, Alter HJ, Chisari FV. 2001. Differential CD4. and CD8. T-cell responsiveness in hepatitis C virus infection. Hepatology 33:267-276; Thimme R, Oldach D, Chang KM, Steiger C, Ray SC, Chisari FV. 2001. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection. J Exp Med 194:1395-1406; Ward S, Lauer G, Isba R, Walker B, Klenerman P.2002; Cellular immune responses against hepatitis С virus: The evidence base 2002. Clin Exp Immunol 128:195-203; Racanelli V, Rehermann B. 2003. Hepatitis С virus infection: When silence is deception. Trends Immunol 24:456-464].
Хроническая инфекция гепатита С характеризуется отсутствием эффективного антивирусного Т-клеточного иммунного ответа. Предполагается, что вакцинация, вызывающая Т-клеточный ответ против гепатита С, может являться сильным профилактическим и терапевтическим средством (Aintzane Zabaleta, Diana Llopiz, Laura Arribillaga, Leyre Silva, Jose Ignacio Riezu-Boj, Juan Jose Lasarte, Francisco Borras-Cuesta, Jesus Prieto and Pablo Sarobe Vaccination Against Hepatitis С Virus With Dendritic Cells Transduced With an Adenovirus Encoding NS3 Protein Molecular Therapy vol. 16 no. 1 jan. 2008 210-217), однако до настоящего времени это не было реализовано практически.
Развитие хронической инфекции обычно сопряжено с недостаточностью литической активности Т-лимфоцитов и сниженной способностью к секреции интерферона - гамма (IFNγ) [Thimme R, Oldach D, Chang KM, Steiger C, Ray SC, Chisari FV. 2001. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis С virus infection. J Exp Med 194:1395-1406; Wedemeyer H, He XS, Nascimbeni M, Davis AR, Greenberg HB, Hoofnagle JH, Liang TJ, Alter H, Rehermann B. 2002. Impaired effector function of hepatitisCvirus-specificCD8. Tcells in chronic hepatitis С virus infection. J Immunol 169:3447-3458].
Дендритные клетки представляют собой наиболее эффективные антиген-представляющие клетки, поэтому иммунизация этими клетками, нагруженными вирусными антигенами, согласно данному изобретению дает новый эффективный подход к терапии гепатита С.
Дендритные клетки являются гетерогенной клеточной популяцией с характерной морфологией и широко распространенным распределением в тканях, в том числе в крови.
-
+
-
+
+
+
Клеточная поверхность дендритных клеток является необычной, с характерными вуалеподобными выступами. Зрелые дендритные клетки обычно идентифицируют как CD3, CD11c, CD19, CD83, CD86 и HLA-DR.
Дендритные клетки процессируют и презентируют антигены и стимулируют активацию Т-клеток и Т-клеток памяти.
Заявленные изобретения реализуются следующим образом.
Перед каждым раундом лечения гепатита С для изготовления вводимой при реализации способа композиции производят забор 40-60 мл периферической крови больного в шприц, содержащий раствор гепарина из расчета 50 Ед/мл или вакуумные пробирки (вакутейнеры). Кровь должна поступить на обработку не позднее 36 часов после забора. Из взятой крови известными методами выделяют мононуклеарные лейкоциты, которые культивируют при 37°С в среде RPMI1640 с добавлением 10% человеческой сыворотки, полученной от доноров с 4-й группой крови.
7
Выделение моноцитов и лимфоцитов осуществляют путем центрифугирования на ступенчатом градиенте фикол-урографина (плотность раствора 1,077 г на мл) с последующим прикреплением моноцитов к поверхности культуральных флаконов. Обычно, в зависимости от пациента, получается 0,5-1×10 моноцитов.
Для индукции образования дендритных клеток во флаконы с питательной средой, в которой культивируются полученные моноциты, добавляют ростовые факторы: 1) гранулоцит-макрофаг колоний-стимулирующий фактор (GM-CSF) в концентрации 3000 ед./мл (в качестве которого можно использовать фармакологические препараты «Лейкомакс» и «Сарграмостим») и 2) интерлейкин 4 (IL4) в концентрации 500 ед./мл, который может быть заменен на интерлейкин 15 (IL15) или интерферон альфа (роферон, интрон-А).
После этого на 4-5 день в среду к полученным дендритным клеткам добавляют (в конечной концентрации 3 микрограмма на мл), а также принудительно с помощью электропорации вводят внутрь клеток антигенный материал патогенного белка, в качестве которого используют фрагмент белка NS3 вируса гепатита С, состоящий из 192 аминокислот с 1027 по 1218. Принудительное введение в клетки осуществляется с помощью прибора для электропорации фирмы “Eppendorf” или другой аналогичной техники. Для реализации электропорации в стандартную кювету, имеющую расстояние между плоскими электродами 0,5 см, наливается 0,4 мл суспензии клеток в физиологическом растворе с добавлением белка NS3 (10 микрограмм в мл). Электропорация осуществляется при напряжении 300 вольт и времени импульса 250 микросекунд.
Для индукции полного созревания дендритных клеток после введения антигена их в течение 1 суток культивируют в питательной среде с добавлением провоспалительных сигналов: либо кондиционированную среду, полученную от культивировния аутологичных мононуклеаров, либо бактериальный липополисахарид в количестве 0,1-0,3 мкг/мл, либо смесь цитокинов TNFa+IL1b (по 500 ед./мл каждого).
Подтверждением получения в результате приготовления истинных дендритных клеток могут служить следующие критерии:
а) рост в не прикрепленном к субстрату состоянии (в отличие от макрофагов, которые плотно прикрепляются к субстрату);
б) наличие характерной морфологии дендритных клеток, несущих множественные отростки;
в) появление значительного количества поверхностных маркеров, свойственных дендритным клеткам (HLA-DR, HLA-ABC, CD80, CD83) определяют с помощью флуоресцентного микроскопа или техники проточной цитометрии.
Параллельно с приготовлением дендритных клеток из той же порции крови получают активированные Т-лимфоциты, для чего из 20 мл крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности по стандартной методике выделяют мононуклеарные лейкоциты и с помощью фитогемагглютинина (20 микрограмм/мл) активируют к пролиферации содержащиеся в этой клеточной смеси Т-лимфоциты в соответствии с известной процедурой [Martin-Chouly С, Morzadec С, Bonvalet M, Galibert MD, Fardel О, Vernhet L.; Inorganic arsenic alters expression of immune and stress response genes in activated primary human Т lymphocytes; Mol Immunol. 2011 Mar; 48(6-7):956-65; Santos Mello R., Kwan D., and Norman A. Chromosome Aberrations and T-Cell; Survival in Human Lymphocytes. Radiat. Res. 60, 482-488 (1974)].
7
7
Активирование Т-лимфоцитов осуществляют путем их обработки фитогемагглютинином (в концентрации 1 мкг на мл) стандартным способом за исключением того, что для преимущественной стимуляции Тh1-клеточного пути иммунного ответа к клеткам добавляется бактериальный липополисахарид (0,2 мкг на мл). Согласно изобретению полученные активированные лимфоциты (3-5×10 клеток) и дендритные клетки (0,5-1×10 клеток), несущие вирусный антиген, смешиваются для получения заявляемой композиции. Полученная смесь клеток вводится больному путем внутрикожной инъекции.
Преимущественный курс лечения хронического гепатита продолжается 5-10 недель с еженедельным забором крови и приготовлением порций заявленной композиции.
Параллельно проводимой иммунотерапии может проводиться стандартное лечение гепатита, например, с использованием интерферона и рибавирина.
По завершении курса оценивают титр вируса в крови известным методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
При необходимости курс лечения повторяют.
Аналогичный подход, в принципе, может быть также использован для лечения других вирусных инфекций, в частности гепатита В, герпетических и папиломных инфекций. В этих случаях в качестве антигена используются стандартные профилактические вакцины против соответствующих вирусов.
Используемый по изобретению фрагмент белка NS3 вируса гепатита С получали методом клонирования синтетического Е.соli-кодон-оптимизированного фрагмента ДНК, кодирующего полипептид 192 а.а. (а.а. 1027-1218 HCV COR protein NS3), клонирование осуществлялось по сайтам NdeI-XhoI в прокариотический экспрессионный вектор рЕТ28а(+) (Novagen).
Экспрессионный вектор совместим с бактериальными (E.coli) штаммами BL21 (DEЗ):
Индукция экспрессии достигается путем добавления в среду IPTG (см. рЕТ Manual).
Экспрессирующийся рекомбинантный белок содержал с N-конца двадцатиаминокислотный фрагмент (His-Tag для аффинной очистки+сайт для протеазы “trombin” (это позволяет получить белок в «чистом» виде)), слитый с 192-аминокислотным фрагментом (а.а. 1027-1218) NS3 HCV.
Ниже приведены результаты стандартного сиквенирования экспрессионного вектора рЕТ28а HCV_NS3 1027-1218:
Возможность реализации группы изобретений и использования их в медицине и уверенное достижение требуемого технического результата иллюстрируются примерами практического использования изобретений.
6
7
ПРИМЕР 1. Больной К. с высоким титром вируса гепатита С (тип вируса 1в) в крови (10-10 вирусных частиц на мл) в течение 3 лет предпринимал попытки терапии с использованием стандартного подхода, основанного на применении пегилированного интерферона-альфа и рибавирина в различных специализированных клиниках. Однако титр вируса при этом оставался высоким, наблюдались появление в крови печеночных ферментов и появление признаков фиброза печени.
С 2008 г. наблюдение и лечение пациента проводились в клинике профессора Ульриха Люшнера (Prof. Dr. Ulrich Leuschner) во Франкфурте на Майне (Internistisches Facharztzentrum Internist, Gastroenterologe, Hepatologe, Schaubstraβe 16, 60596 Frankfurt/Main).
6
Предшествующая попытка лечения интерфероном и рибавирином была неуспешна. Уровень АЛТ (аланин-аминотрансфераза) в крови вырос до 350 единиц на литр, ACT (аспартат-аминтрансфераза) до 150 единиц на литр. Титр вируса 1,8×10 МЕ на мл. Биопсия печени подтвердила наличие хронического гепатита С со значительным портальным и лобулярным воспалением и фиброзом. Фибросканирование выявило фиброз F4. Концентрация опухолевого маркера альфа-фетопротеина была увеличена до 74 мг на мл и имела тенденцию к росту. Выполненное с применением контраста ЯМР исследование обнаружило цирроз 1-й степени и 3 очага гепатоклеточной карциномы размерами от 4 до 21 мм. Признаков аутоиммунного гепатита не было выявлено.
По причине невозможности одновременного проведения стандартной антивирусной терапии и удаления опухолей сначала профессором Фоглем (Professor Dr. Vogl Head of the Center of Ra-diology, University Hospital, Frankfurt) была проведена деструкция очагов злокачественного роста с использованием трансартериальной хемо-эмболизации в сочетании с микроволновой абляцией.
6
7
Одновременно с этим в перерывах между раундами хемо-эмболизации была начата терапия согласно настоящей группе изобретений. Больному вводилось 1,5 мл композиции, содержащей 10 аутологичных дендритных клеток, нагруженных фрагментом NS3 белка вируса гепатита С (10 мкг белка), и 10 активированных лимфоцитов. Всего, на этом этапе, были сделаны 3 раунда терапии в соответствии с предлагаемым изобретением.
Вслед за этим была предпринята еще одна попытка подавления размножения вируса с помощью обычно применяемого пегилированного интерферона (50 микрограмм в неделю) и рибавирина (800 мг в день). Начало лечения датировано январем 2009 г. Параллельно с этим была продолжена терапия с использованием предлагаемой здесь композиции.
Уже после первого курса, состоящего из 5 раундов, проводимого на фоне стандартного лечения, титр вируса снизился до 400 МЕ/мл, что близко к порогу его определения обычным методом ПЦР. Общий срок проведения предлагаемого нами лечения составил около 2-х месяцев.
Стандартное лечение было продолжено до положенных по регламенту 48 недель.
В течение последующего срока наблюдения (более 2 лет) титр вируса продолжал оставаться на уровне порога определения, рецидивирования злокачественных новообразований печени не наблюдается. Сопоставление со стандартными сроками лечения пегелированным интерфероном и рибаверином - 48 недель, позволяет сделать вывод не только о способности предлагаемого способа добиваться результата в тех случаях, когда стандартное лечение неэффективно, но и делать это за радикально более короткие сроки.
Уровень АЛТ и ACT и альфа-фетопротеина понизился до соответствующего приемлемой норме (менее 50 единиц на литр) к ноябрю 2009 года (более ранние исследования не проводились) и продолжает сохраняться на этом уровне.
ПРИМЕР 2. Больной М. с высоким титром вируса гепатита С (тип вируса 3а) в крови (более 1000000 МЕ/мл и связанным с этим поражением печени (АЛТ 300 ед./л, ACT 220 ед./л) в течение года получал стандартное лечение сочетанием интерферона и рибавирина (пегасис 180 мкг/неделю, рибавирин 1000 мг/день). В результате лечения наблюдалось снижение уровня печеночных ферментов в крови, а титр вируса снизился до минимального уровня. Однако при прекращении лечения наблюдалось резкое возрастание титра вируса до 380000 МЕ/мл.
Наблюдалось также параллельное возрастание концентрации печеночных ферментов (АЛТ 150 ед./л, ACT 100 ед./л).
6
7
Проведение повторного курса терапии (пегасис+рибавирин) в сочетании с предлагаемой в данной заявке композицией привело к снижению титра вируса до уровня ниже порога определения (менее 750 МЕ/мл) и снижению концентрации печеночных ферментов в крови (АЛТ 54 Ед/л, ACT 43 Ед/л). Больному еженедельно, в течение 3 месяцев, вводилось 1,5 мл композиции, содержащей 10 аутологичных дендритных клеток, нагруженных предложенным нами фрагментом NS3 белка вируса гепатита С (10 мкг белка) и 10 активированных лимфоцитов. Однако снижение титра вируса до уровня ниже определяемого было достигнуто уже в течение месяца.
Наблюдение в течение более полугода не обнаружило повторного повышения титра вируса.
6
6
ПРИМЕР 3. Больной Н. с высоким титром (более 10 МЕ/мл) вируса гепатита С (тип вируса 1b) и повышенным содержанием печеночных ферментов в крови (АЛТ 126 ед. на литр, ACT 87 ед. на литр) в течение полугода получал терапию сочетанием интерферона и рибавирина (пегасис 180 мкг/неделю, рибавирин 1200 мг/день), которая оказалась безуспешной, титр вируса практически не снижался (последнее измерение 5800000 МЕ/мл). Инициирование нового курса терапии, заключающегося в сочетании стандартной терапии с предлагаемой нами композицией, привело в течение 6 месяцев к радикальному снижению титра вируса, который составил при последнем измерении 2000 МЕ/мл. Произошло также снижение уровня АЛТ до 54 ед. на литр и ACT до 53 ед. на литр. Больному еженедельно вводилось 1,5 мл композиции, содержащей 10 аутологичных дендритных клеток, нагруженных предложенным нами фрагментом NS3 белка вируса гепатита С (10 мкг белка).
6
7
ПРИМЕР 4. Больной Б. с высоким титром (1050000 МЕ/мл) вируса гепатита С (тип вируса 1в) и повышенным содержанием печеночных ферментов в крови (АЛТ 143 ед. на литр, ACT 84 ед. на литр), сохранявшимся в течение долгого времени, несмотря на попытки терапии, был подвергнут раунду лечения, представляющего собой сочетание стандартной терапии (пегасис 180 мкг/неделю, рибавирин 1200 мг/день) и предлагаемой нами композиции. Больному еженедельно вводилось 1,5 мл композиции, содержащей 10 аутологичных дендритных клеток, нагруженных предложенным нами фрагментом NS3 белка вируса гепатита С (10 мкг белка), и 10 активированных лимфоцитов. По истечении 4 месяцев титр вируса снизился до уровня ниже порога определения (менее 750 МЕ/мл). Уровень печеночных ферментов также снизился до нормальных значений (АЛТ 57 ед. на литр, ACT 58 ед. на литр).
7
6
7
5
ПРИМЕР 5. Молодой человек (21 год) с раннего детского возраста (с 2-х лет) имел высокий титр вируса гепатита С (тип вируса 1в) в крови. Последние измерения показали 10 МЕ/мл. Каких-либо иных проявлений заболевания не обнаруживалось. В связи с субъективными признаками ухудшения самочувствия был начат курс стандартной терапии с применением пегилированного интерферона (100 микрограмм в неделю) и рибавирина (1000 мг в день). Стандартный курс рассчитан на 48 недель. Для увеличения эффективности лечения и ускорения процесса параллельно в течение 2 месяцев проводилось лечение с использованием предлагаемой композиции. Больному еженедельно вводилось 1,5 мл композиции, содержащей 10 аутологичных дендритных клеток, нагруженных предложенным нами фрагментом NS3 белка вируса гепатита С (10 мкг белка), и 10 активированных лимфоцитов. Уже после 4 недель титр вируса снизился до 10 МЕ/мл. А после 8 недель опустился ниже порога определения (менее 750 МЕ/мл).
Таким образом, заявляемая группа изобретений обеспечивает решение поставленной задачи и достижение требуемого технического результата, а именно обеспечивают повышение эффективности терапии гепатита С в хронической форме, в частности для случаев, когда лечение обычной комбинацией интерферона и рибаверина оказывается недейственным, с измеряемым результатом в виде радикального снижения концентрации вируса в крови.