Милиацин предотвращает депрессию иммунитета к столбнячному анатоксину, индуцированную метотрексатом

results of a clinical trial of trivalent live attenuated influenza virus vaccine //Vaccine. 2003. V. 21. P. 2207 - 2217.

11. Rudenko L.G., Slepushkin A.N., Monto A.S. et al. Efficacy of live attenuated and inactivated influenza vaccines in schoolchildren and their unvaccinated contacts in Novgorod, Russia //The Journal of Infect. Dis. 1993. V. 168. R 881 - 887.

12. Rudenko L.G., Lonskaya N.I., Klimov A.I. etal. Clinical and epidemiological evaluation of a live, cold-adapted influenza vaccine for 3 - 14-year-olds // Bulletin WHO. 1996. № 1. P. 77 - 84.

13. Rudenko L.G., Alexandrova G.l. Current strategies for the prevention of influenza by the Russian cold-adapted live influenza vaccine among different populations // Proceedings of the World Congress on Options for the Control of Influenza IV held in Crete, Greece, 23rd - 28th September, 2000. - Amsterdam-London-New-York-Oxford-Paris-Shannon-Singapore-Tokyo: Excerpta Medica, 2001. P. 945 - 950.

14. Rudenko L.G. Fifty years experience with live attenuated influenza vaccines in Russia // World Health Organization. Options for live attenuated influenza vaccines (LAIV) in the control of epidemic and pandemic, 12 - 13 June 2007 (http:www.who.int/vaccine_research/diseases/in-fluenza/Rudenko_50_years_exper ience.pdf).

15. Whitaker-Dowling P, Maassab H.F., Younger J.S. Dominant-negative mutants as antiviral agents: simultaneous infection with the cold-adapted live-virus vaccine for influenza A protects ferrets from disease produced by wild-type influenza A // The Journal of Infect. Dis. 1991. V. 164. P 1200-1202.

16. Younger J.S., Treanor J.J., Whitaker-Dowling P. et al. Effect of simultaneous administration of cold-adapted and wild-type influenza a viruses on experimental wild type influenza in humans // Journal of Clinical Microbiology. 1994. V. 32. P. 750 - 754.

Милиацин предотвращает депрессию иммунитета к столбнячному анатоксину, индуцированную метотрексатом

А.Д. Железнова1, Т.В. Панфилова1, М.В. Скачков1, О.В. Калинина1,

С.Д. Борисов2, Б.А. Фролов1

Оренбургская государственная медицинская академия 2 ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Оренбургской области»

Введение

Ухудшение экологической обстановки приводит к нарушениям в системе иммунитета [13, 16], которые, затрагивая различные звенья клеточного и гуморального иммунитета, обуславливают снижение резистентности организма к инфекциям [20, 21]. отрицательно сказываются на иммунологической и эпидемиологической эффективности вакцинопро-филактики [5, 11, 12]. Это обстоятельство предопределяет необходимость разработки подходов к предупреждению и (или) ограничению последствий иммунодепрессивных воздействий на состояние антиинфекционной резистентности организма, и прежде всего поствакцинального иммунитета.

Сегодня среди иммунокорригирующих средств значительное внимание уделяется химическим соединениям естественного происхождения, обладающим тропностью к иммунной системе [14, 15]. Среди последних все более заметное место занимают природные тритерпеноиды - нетоксичные вещества растительного происхождения, обладающие широким спектром биологического воздействия, включая иммуностимуляцию [4]. Такое иммуностимулирующее воздействие было установлено нами у милиацина - тритерпеноида, полученного из просяного масла [7], который обеспечивал более интенсивный иммунный ответ у животных как на первичное, так и на повторное введение столбнячного анатоксина [6]. В последующем была показана способность милиацина ограничивать гормон-индуцированный апоптоз лимфоцитов [8] и оказывать протективное действие при структурных нарушениях центральных и периферических орга-

нов иммуногенеза, вызванных цитостатиком метотрексатом (МТ) [2].

Цель настоящей работы - оценка влияния милиацина на нарушение поствакцинального иммунитета к столбнячному анатоксину, индуцированное применением цитостатика метотрексата.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на 170 мышах-самцах (СВА х С^вур^ разделенных на четыре группы (рис. 1):

• I (положительная группа сравнения) - иммунизированные столбнячным анатоксином мыши -20 животных;

Рисунок 1.

Схема постановки эксперимента по изучению влияния милиацина на нарушение поствакцинального иммунитета к столбнячному анатоксину, индуцированное метотрексатом

1 28 10 11 12 1314 31

t t

II 1 28 10 11 12 1314 3*1

t

1 1 23 10 11 12 13 14 3*1

III t К à. *

IV 1 28 10 11 12 1314 3*1

t ft

Примечание. Сроки иммунизации (ф), реиммунизации (£?•), введения метотрексата (£), растворителя (А), милиацина (•) и забора сыворотки (*) для определения титра антител

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

• I! (отрицательная группа сравнения) - мыши, получавшие на 10-е сутки после повторной иммунизации метотрексат, - 50 животных;

• II! (контрольная группа) - мыши, получавшие на 10-е сутки после повторной иммунизации МТ с последующим введением растворителя милиацина - твина-21 в 0,9% растворе хлорида натрия (1,6 х 10 7 моль/кг), - 50 животных;

• IV (опытная группа) - мыши, получавшие на 10-е сутки после повторной иммунизации МТ с последующим введением милиацина, -50 животных.

Для иммунизации животных использовали обогащенный столбнячный жидкий анатоксин (АС), сорбированный на гидроокиси алюминия, производства ФГУП «НПО «Микроген» МЗиСР РФ (серия 197-5; контрольный номер 2421; срок годности -до августа 2008 г.). Мышей иммунизировали подкожно в надлопаточную область разовой дозой 0,5 мл, содержащей 10 ЕС столбнячного анатоксина, с повторным введением антигена в той же дозе на 28-е сутки после первичной иммунизации. Оценка иммунного ответа у животных всех четырех групп проводилась на 14-е и 31-е сутки после реиммунизации (соответственно на 4-е и 21-е сутки после введения МТ) путем определения титра антител микрометодом РИГА с использованием диагностикума эритроцитарного столбнячного антигенного жидкого - комплект № 1 (предприятие-изготовитель - АООТ «Биомед» им. И.И. Мечникова; активность 1:1280; серия 2; дата изготовления -сентябрь 2007 г.).

Для воспроизведения супрессивного воздействия на поствакцинальный иммунитет использовали МТ австрийской фирмы «Эбеве» (серия 700045; срок годности - до декабря 2009 г.). Препарат вводили на 10-е сутки после повторной иммунизации однократно внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг массы тела. Основанием для выбора дозы и способа введения МТ послужили данные авторов [18, 19], использовавших однократное внутрибрюшинное введение 20 мг/кг цитостатика при воспроизведении токсического поражения печени у крыс. Однако проведенное нами предварительное испытание этой дозы на мышах (СВА х СуВТ^ в двух сериях опытов (рис. 2; серии I и II) показало высокую летальность животных, составившую на протяжении 14 дней 85 и 65%. Аналогичный способ применения МТ в дозе 10 мг/кг массы тела приводил к ослаблению летального эффекта - от 20 до 8,3% (см. рис. 2; серии III и IV), в связи с чем эта доза цитостатика (10 мг/кг) и была выбрана для проведения дальнейших экспериментов.

Для оценки влияния милиацина на супрессию поствакцинального иммунитета под действием МТ тритерпеноид вводили трехкратно внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг массы тела: через час после введения МТ и в последующие два дня. Доза три-терпеноида и кратность его введения соответствовали тем, при которых в ранее проведенных исследованиях достигался положительный эффект, в том числе снижение выраженности морфологических нарушений в органах иммуногенеза на фоне применения МТ [2].

Рисунок 2.

Динамика гибели мышей (СВА х С5/В1г)Рг при однократном внутрибрюшинном введении метотрексата в дозах 20 мг/кг и 10 мг/кг массы тела

Ф

3

.о

э

ю

о

с

I серия, введение метотрексата 20 мг/кг

Рисунок 3,

Lg титров антител в сыворотке крови мышей

Группы ЖИВОТНЫХ

Количество ЖИВОТНЫХ

* - достоверность по отношению к группе I А- достоверность между группами N и IV О- достоверность между группами III и IV

Статистический анализ полученных данных проводили стандартными методами вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Полученные результаты представлены на рисунках 3 и 4, отражающих средние значения десятичных логарифмов титров антител, выявленных

Рисунок 4.

Lg титров антител в сыворотке крови мышей

Группы ЖИВОТНЫХ

Количество ЖИВОТНЫХ

* - достоверность по отношению к группе I А - достоверность между группами II и IV О- достоверность между группами III и IV  - достоверность с предшествующим сроком внутри группы

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

Рисунок 5.

Влияние милиацина на показатели массы и индекса массы селезенки, тимуса и печени у мышей

Масса тела

Количество животных

Масса селезенки

35

Количество животных

Индекс массы селезенки

Количество животных

Масса тимуса

Количество животных

Индекс массы тимуса

Количество животных

Масса печени

Количество животных

Индекс массы печени

И Интактные

МТ

Растворитель для милиацина у животных, получавших МТ

* - достоверность по отношению к группе I:

Д - достоверность между группами II и IV;

О - достоверность с предшествующим сроком внутри группы

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009

у животных исследуемых групп в различные сроки (14-е и 31-е сутки) после повторной иммунизации. Как следует из представленных данных, применение МТ на 10-е сутки после реиммунизации (рис. 3; группа II) сопровождалось значительным снижением титра антител по сравнению с группой повторно иммунизированных животных (см. рис. 3; группа I), не получавших цитостатик. Обращает на себя внимание тот факт, что это снижение регистрировалось не только на ранних сроках после введения МТ - 4-е сутки (14-е сутки после повторной иммунизации), но и в более отдаленном периоде после его применения (рис. 4; группа II) - на 21-е сутки (31-е сутки после повторной иммунизации). Использование растворителя для ми-лиацина не ослабляло выраженности иммуносупрессии под воздействием МТ в указанные сроки наблюдения (см. рис. 3 и 4; группа III). В противоположность этому милиацин практически отменял эффект подавления поствакцинального иммунитета метотрексатом на 4-е сутки после его применения (14-е сутки после повторной иммунизации; см. рис. 3, группа IV). Введение тритерпеноида обеспечивало у мышей опытной группы поддержание более высокого уровня поствакцинального иммунитета и на 21-е сутки после применения МТ (31-е сутки после повторной иммунизации). Более того, уровень антител у животных опытной группы на данном сроке наблюдения (см. рис. 4; группа IV) превосходил и таковой, регистрируемый у повторно иммунизированных животных без какого-либо последующего воздействия (см. рис. 4; группа I).

Обсуждая полученные результаты, следует отметить, что негативные последствия МТ на 4-е сутки после его применения в отношении поствакцинального иммунитета могли быть обусловлены общетоксическим действием препарата, сопровождающимся катаболическим эффектом. Основанием для такого предположения служат полученные нами ранее данные о снижении массы животных, а также показателей массы печени, селезенки, тимуса (и соответствующих индексов) к указанному сроку наблюдения под действием цитостатика (рис. 5; группа II) [1]. Применение растворителя для ми-лиацина не отражалось на степени депрессии исследуемых показателей (см. рис. 5; группа III), тогда как милиацин значительно ограничивал эти сдвиги (см. рис. 5; группа IV). Следует отметить, что роль активации катаболических процессов в снижении гуморального иммунитета при экстремальных воздействиях обсуждалась и ранее [9, 10]. По мнению авторов, механизм такого снижения обусловлен как прямой деградацией белковых молекул, включая молекулы иммуноглобулинов, так и неспецифическим связыванием последних продуктами тканевого распада. Факт предотвращения милиаци-ном снижения уровня антител в крови животных

на 4-е сутки после применения МТ, сопровождавшегося ограничением падения показателей массы тела и органов животных, свидетельствует в пользу представления о том, что антикатаболическое действие тритерпеноида служит основным механизмом поддержания поствакцинального иммунитета в указанный период.

Состояние иммунитета в более отдаленном периоде после применения МТ (21-е сутки; 31-е сутки после повторной иммунизации) характеризуется снижением титра антител по отношению к предшествующему сроку как в группе только иммунизированных животных (см. рис. 3 и 4; группа I), так и в группах животных, получавших МТ (см. рис. 3 и 4; группа II) или МТ с последующим введением растворителя (см. рис. 3 и 4; группа III). Исключение составила опытная группа мышей, получавших на фоне введения МТ милиацин (см. рис. 3 и 4; группа IV), где такое снижение было выражено минимально. При оценке этих результатов представляется важной особенность милиацина не только ограничивать индуцированное МТ угнетение способности спле-ноцитов к продукции цитокинов: у-ИФН, ИЛ-12, ИЛ-4, - но и оказывать стимулирующее влияние на продукцию последнего в поздние сроки (21-е сутки) после применения цитостатика [3]. Очевидно, что такая стимуляция, свидетельствующая об активации Тх2-клеток [17], может иметь существенное значение в поддержании напряженности иммунитета у мышей опытной группы в этом отдаленном периоде.

Выводы

1 Установлено, что однократное введение метотрексата (10 мг/кг) оказывает угнетающее воздействие на состояние гуморального иммунитета, сформировавшегося у животных в ответ на повторную иммунизацию столбнячным анатоксином.

2. Депрессия сформировавшегося иммунитета к столбнячному анатоксину под влиянием метотрексата проявляется уже в раннем периоде после его применения (4-е сутки) и носит продолжительный характер, удерживаясь на протяжении трех недель.

3 Трехкратное (на протяжении трех дней) введение милиацина после применения метотрексата предотвращает иммунодепрессивный эффект цитостатика как в раннем (4-е сутки), так и в отдаленном (21-е сутки) периоде наблюдения.

4 Полученные данные обуславливают перспективность использования милиацина как средства поддержания иммунологической и эпидемиологической эффективности вакцинопрофилактики в условиях воздействия на организм дестабилизирующих факторов.

Резюме

В статье показана перспективность использования милиацина как средства поддержания иммунологической и эпидемиологической эффективности вакцинопрофилактики в условиях воздействия на организм дестабилизирующих факторов.

Summary

The article researches the promising future use of Miliacin for support of immunological and epidemiological effectiveness of vaccines in the conditions of influence on an organism of destabilising factors are present.

Литература

1. Железнова А.Д., Калинина О.В. Экспериментальная оценка милиацина как средства реабилитации при вторичном иммунодефиците, индуцированном метотрексатом // Вестник уральской медицинской академической науки. № 3 - 1 (14). 2006. С. 63 - 66.

2. Железнова А.Д., Железнов Л.М., Штиль A.A. и др. Морфологические проявления защитного влияния милиацина в органах иммуногенеза при действии метотрексата // Бюл. эксперт, биол. и медицины. 2007. Т. 144. № 10. С. 458 - 463.

3. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Смолягин А.И. и др. Влияние милиацина на продукцию цитокинов спленоцитами мышей (СВА х C57BI6)F1, подвергнутых воздействию метотрексата // Российский иммунологический журнал. 2008. Т. 2 (11). № 2 - 3. С. 313.

4. Ильичова Т.Н., Проняева T.R, Шульц Э.Э. и др. Иммуномодулирующая активность тритерпеноидов растительного происхождения и их производных //Журн. микробиол. 2001. № 2. С. 5 - 56.

5. Каральник Б.В., Маркова С.Г. Экологические аспекты АКДС-вакцинации // ЖМЭИ. 1991. № 12. С. 34 - 38.

6. Кириллова A.B., Скачков М.В., Панфилова Т.В. и др. Стимуляция иммунитета к столбнячному анатоксину милиацином // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003. № 6 (13). С. 36 - 38.

7. Олифсон Л.E., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др. Химическая природа и биологическая активность милиацина // Вопр. питания. 1991. № 2. С. 57 - 59.

8. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Полосухина E.R и др. Влияние тритерпено-ида милиацина на чувствительность лимфоцитов тимуса и селезенки капоптозу, индуцированномудексаметазоном // Бюл. эксперт, биол. и медицины. 2003. Т. 136. № 10. С. 382 - 385.

9. Першин Б.Б., Емельянов Б.А., Соколов Я.А. и др. Изучение механизма феномена исчезающих иммуноглобулинов при стрессе в эксперименте // Патол. физиол. и эксперим. терапия. 1987. № 5. С. 41 - 44.

10. Першин Б.Б., Гелиев А.Б., Толстов Д.В. и др. Реакции иммунной системы на физические нагрузки // Русский журнал иммунологии. 2002. Т. 7. № 1. С. 1 - 24.

11. Савилов Е.Д. Теоретические аспекты управления инфекционной заболеваемостью в условиях техногенного загрязнения окружающей среды // Бюл. СО РАМН. 2008. № 1. С. 43 - 46.

12. Скачкова М.А., Скачков М.В., Смолягин А.И. и др. Иммунный статус и состояние интерфероновой системы у школьников, проживающих в городах с различной антропогенной нагрузкой // Бюл. эксперт, биол. и медицины. 2001. Т. 131. № 4. С. 442 - 444.

13. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М.: Изд-во ВНИРО, 1995. - 219 с.

14. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные представления об иммунотроп-ных лекарственных средствах // Иммунология. 1996. № 6. С. 4 - 9.

15. Хаитов P.M., Пинегин Б. В. Современные и ммуно модуляторы. Основные принципы их применения // Иммунология. 2000. № 5. С. 4 - 7.

16. Черешнев В.А., Кеворков Н.Н., Бахметьев Б.А. и др. Экология и иммунитет - патофизиологические аспекты // Второй Российский симпозиум по патофизиологии с международным участием. 9-12.10. - М., 2000. С. 158.

17. Ярилин А.А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999. - 608 с.

18. Cetiner М., Sener G., Sehirli А.О. et al. Taurine protects against methotrexate - induced toxicity and inhibits leukocyte death //Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005. V. 209. № 1. P. 39 - 50.

19. Cetinkaya A., Bulbuloglu E., Kuratas E. et al. N-acetyl cyste in ameliorates methotrexate - induced oxidative liver damage in rats // Med. Sei. Monit. 2006. V. 12. № 8. P. 274 - 278.

20. Ruiz M.R., Quinones A.G., Diaz N.L. etal. Acute immobilization stress induces clinical and neuroimmunological alterations in experimental murine cu-taneosus leishmaniasis // Br. Dermatol. 2003. V. 149. № 4. P 731 - 738.

21. Sarid 0., Anson 0., Yaari A., Margalith M. Epstein-Barr virus specific salivary antibodies as related to stress caused by examinations // J. Med. Virul. 2001. № 64 (2). P. 149 - 156.

lgG-антитела против БТШ-65 Mycobacterium bovis и БТШ-70 человека в сыворотках крови кроликов, иммунизированных Escherichia coli

И.А. Баснакьян, А.О. Арзуманян, А.Э. Аваков, Н.П. Ванеева, Н.Е. Ястребова ГУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва

Введение

Гомология стрессовых белков, в том числе белков теплового шока (БТШ), - один из факторов, определяющих перекрестные иммунологические реакции как между отдельными видами бактерий, так и между БТШ бактерий и антигенами человека [8, 9, 12, 14 - 17]. Ввиду гомологии БТШ различных видов бактерий эти белки перспективны в разработках будущих вакцин [4].

Однако лишь единичные исследования посвящены изучению связи перекрестных иммунологических реакций с фазами роста культуры, различающихся, как известно, по степени влияния стрессорных факторов на популяцию и являющихся основой биотехнологии иммунобиологических препаратов [2].

Нами ранее изучены перекрестные иммунологические реакции вакцинных штаммов В. pertussis

Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 1 (44)/2009