Измерительная камера микросистемы оптического анализа биожидкости

Полезная модель измерительной камеры является техническим решением, относящимся к микросистемам полного анализа, а именно к lab-on-a-chip системе оптического анализа компонентного состава жидкостей, и может быть использована, в частности, для анализа химического состава биожидкостей организма человека при решении задач диагностики различных патологических состояний, таких как онкологические заболевания, а также в приборостроении при изготовлении микросистем полного анализа.
Патологическое состояние организма провоцирует изменение гомеостаза биожидкостей, поэтому можно использовать анализ компонентного состава урины, крови, слюны и других биожидкостей для выявления таких патологий, как например рак (Peedell С.Concise Clinical Oncology. // Elsevier Health Sciences, 2005. - 395 p.). В настоящее время для диагностики различных патологических состояний организма по биожидкостям широко применяют общие анализы (Marshall W.J. et al. Clinical Biochemistry: Metabolic and Clinical Aspects. // Elsevier Health Sciences, 2014.), биохимические анализы (Mishra S. et al. Studies of biochemical parameters in breast cancer with and without metastasis. // Indian Journal of Clinical Biochemistry, 2004. - 19(1). - P. 71-75.) и анализы на онкомаркеры (при наличии подозрений на онкопатологию) ( F. et al. Serum Tumor Markers in Pancreatic Cancer-Recent Discoveries. // J Cancers, 2010. - 2(2). - P. 1107-1124.). Перечисленные методы анализа биожидкостей могут быть реализованы в lab-on-a-chip (LOC) системах. Преимуществами таких систем являются портативность, небольшое количество тестируемого образца и высокая эффективность.
Известна LOC система для определения лития, магния, натрия и кальция в исследуемых образцах крови (A. van den Berg. Labs on chips for biomedical applications. // Proceedings of IEЕЕ 26th International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS), 2013. - P. 149-152.). Методологической основой этой системы является капиллярный электрофорез. Преимуществом такой системы является относительная простота реализации.
В работе (Cardoso V.F. et al. Lab-on-a-chip using acoustic streaming for mixing and pumping fluids. // Bioengineering (ENBENG), Proceedings of 1st Portuguese Meeting in ENBENG, 2011. - P. 1-4.) описана LOC система на основе акустической потоковой передачи с применением пьезоэлектрического полимера β-PVDF, позволяющая количественно определять концентрацию мочевой кислоты.
Среди недостатков этих систем можно отметить то, что они предназначены для одноразового использования. Поэтому такие системы менее экономически доступны, если говорить о выгодном портативном приборе для клинических применений. Кроме того, исследуемые при таких анализах компоненты биожидкостей обладают малой специфичностью для выявления патологий определенной локализации, и возможности применения большинства биохимических маркеров для скрининговых исследований так же ограничены низкой специфичностью и чаще всего их используют для мониторинга течения заболевания.
Альтернативой этим методам лабораторного анализа могут стать оптические методы анализа биожидкостей. Рамановская спектроскопия (PC) и автофлуоресцентный анализ (АФ) (Tuchin V.V. Handbook of Optical Biomedical Diagnostics // SPIE Press Book, 2002.) позволяют обнаружить изменения гомеостаза биожидкостей организма на молекулярном уровне и успешно применяются в различных областях клинической медицины и в экспериментальных исследованиях при определении особенностей состава биожидкостей для выявления рака различной локализации. Например, применение PC при мониторинге состава крови у больных раком полости рта (Rekha P. et al. Raman spectroscopic characterization of blood plasma of oral cancer. // IEEE International Conference on Photonics, 2013. - P. 135-137.), раком желудка (Feng S. et al. Study on gastric cancer blood plasma based on surface-enhanced Raman spectroscopy combined with multivariate analysis. // Sci. China Life Sci., 2011. - 54(9). - P. 828-834.) и колоректальным раком (Feng S. et al, Label-free surface-enhanced Raman spectroscopy for detection of colorectal cancer and precursor lesions using blood plasma. // Biomed Opt Express, 2015. - 6(9). - P. 3494-3502.) позволило добиться чувствительности на уровне 92,3%, 79,5%, 86,4% и специфичности на уровне 85,7%, 91,0%, 80,0% соответственно. PC урины позволила выявлять рак простаты (Del Mistro G. et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy of urine for prostate cancer detection: a preliminary study. // Anal. Bioanal Chem., 2015. - 407(12). - P. 3271-3275.) с чувствительностью 100% и специфичностью 89%. Более того, возможно повысить диагностическую точность выявления онкопатологии при совместном исследовании нескольких биожидкостей. Так использование совместного АФ анализа нескольких биожидкостей организма таких, как кровь, ацетоновый экстракт клеточных компонентов, урина и мокрота, позволило добиться точности выявления рака легкого на уровне 90% (Аl-Salhi М. et al. Lung cancer detection by native fluorescence spectra of body fluids-a preliminary study. // J Fluoresc, 2011. - 21(2). - P. 637-645.). Кроме того, достоинствами рамановского и АФ анализа являются простота пробоподготовки, широкий динамический диапазон и большая универсальность по сравнению с химическими методами анализа.
Рамановское рассеяние представляет собой неупругое рассеяние фотонов на молекулах вещества, автофлуоресценция обусловлена безызлучательными релаксационными процессами. Поэтому форма спектра биожидкости и его интенсивность на определенных спектральных полосах обусловлена вкладом колебаний молекул нескольких соединений, определяющих химический состав биожидкости. Следовательно, анализ соотношений интенсивности отдельных полос спектра биожидкости позволяет оценить изменения гомеостаза и получить информацию о функциональном состоянии и возможных патологиях внутренних органов. Применение совместного PC и АФ анализа биожидкостей возможно в системах LOC.
Известны экспериментальные образцы LOC систем анализа биожидкостей на основе PC. Наиболее близким техническим решением является система, представленная в статье (Ashok Р.С. et al. Fiber probe based microfluidic Raman spectroscopy // J. Opt Express., 2010. - v. 18(8). - P. 7642-7649). Описанная система реализована на основе волоконного зонда и микрофлюидной платформы, где рамановский зонд непосредственно встроен в микросхему полидиметилсилоксана (PDMS). Разъемный волоконный зонд, используемый в этой системе, позволяет уменьшить габаритные размеры и обеспечивает гибкость регулировки геометрии системы. Предложенная система позволяет определять биологические аналиты с помощью рамановской спектроскопии. Недостатком этой системы является недостаточная чувствительность анализа при исследовании многокомпонентных сред.
Техническим результатом разработанной полезной модели измерительной камеры является повышение качества рамановского сигнала и, как следствие, улучшение информативности проводимого анализа компонентного состава исследуемого образца, а также упрощение конструкции экспериментальной системы.
Указанный технический результат достигается за счет создания в зондируемой области микроструктурированной серебряной поверхности с кривизной, позволяющей возбуждать плазмонный резонанс и, как следствие, создавать поверхностное усиление рамановского сигнала исследуемой биожидкости. Улучшение качества рамановского сигнала и более подробный анализ компонентного состава биожидкости возможны с помощью поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (SERS). Так, использование SERS плазмы крови и многофакторного анализа позволило достичь высокой чувствительности (0,91) и специфичности (1,0) дискриминации здоровой группы и группы с онкопатологиями носоглотки, а также выявить в образцах крови пациентов, страдающих раком носоглотки, специфические биомолекулярные различия, такие как: увеличение относительного количества нуклеиновой кислоты, коллагена, фосфолипидов, фенилаланина и уменьшение процента аминокислот и содержания сахаридов. (Feng S. et al. Nasopharyngeal cancer detection based on blood plasma surface-enhanced Raman spectroscopy and multivariate analysis. // J Biosens Bioelectron., 2010. - 25(11). - P. 2414-2419). Применение SERS технологии демонстрирует высокую точность анализа компонентного состава биожидкостей и дискриминации групп с различными заболеваниями. SERS позволяет добиться усиления регистрируемого сигнала на несколько порядков и имеет потенциал для успешного применения при анализе микродоз различных биологических материалов. Таким образом, система LOC на основе оптических методов, включающая технологию SERS, может упростить используемую экспериментальную установку и заменить дорогостоящий спектрометр с охлаждаемой камерой менее дорогостоящим портативным спектрометром, улучшить качество полученных спектров и повысит информативность анализа.
Схема оптического стенда, в состав которого включена измерительная камера LOC системы, представлена на рисунке. Оптический стенд включает в себя:
1 - лазерный модуль;
2 - рамановский пробник с фильтрующей системой;
3 - измерительная камера LOC системы, содержащая жидкостный канал 4, капилляры прокачки жидкости 5 и 6, углубление зондируемой области 7, канал с передающим волокном 8 и канал с собирающим волокном 9;
10 - фильтрующая система;
11 - спектрометрическая система;
ПК - персональный компьютер.
В разработанном техническом решении использована разъемная конструкция измерительной камеры 3, что обеспечивает удобство при процедурах промывки и просушки при многоразовом использовании. Пластины измерительной камеры изготовлены из силикона. Выбор материала обусловлен необходимостью герметичного соединения пластин измерительной камеры.
Возбуждение поверхностного плазмона, необходимого для усиления рамановского сигнала с помощью SERS технологии, требует использования нано- или микроструктурированной металлической поверхности (Sivanesan А. et al. Nanostructured silver-gold bimetallic SERS substrates for selective identification of bacteria in human blood. // J Analyst, 2014. - 139. - P. 1037-1043.). Объемные оптические свойства различных металлов и геометрия наноструктурированной поверхности определяют характеристики плазмонного резонанса. Вследствие того, что возбуждение спектров осуществляется излучением с длиной волны 785 нм, и спектры регистрируются в ближнем ИК диапазоне, наиболее целесообразно использовать покрытие из серебра (Sharma В. et al. SERS: Materials, applications, and the future. // Materials Today, 2012. - ISSN: 1369-7021. - 15(1). - P. 16-25.). Кроме того, этот металл имеет высокую инертность, что обуславливает его применение при исследовании биожидкостей. Поэтому с целью возбуждения плазмонного резонанса, в зондируемой области измерительной камеры LOC системы напылено серебряное покрытие с шероховатость поверхности порядка 1 мкм.
Устройство работает следующим образом. По жидкостному каналу 4 через подающий капилляр 5 в углубление зондируемой области 7 прокачивается исследуемая жидкость. Возбуждение регистрируемых спектров производится излучением лазерного модуля 1 (центральная длина волны 785 нм). Фильтрация зондирующего сигнала осуществлялись с использованием рамановского пробника 2. Фильтрованное лазерное излучение распространяется по облучающему волокну 8 и фокусируется на микроструктурированной металлической поверхности углубления зондируемой области 7. Излучение вызывает плазмонный резонанс и рассеивается на молекулах исследуемой жидкости. Рассеянное излучение падает на торец собирающего волокна 9, фильтруется в системе 10 и передается в спектрометрическую систему 11, где раскладывается в спектр. Результат передается на персональный компьютер ПК. Жидкость выводится из системы через капилляр 8.