Целенаправленная регуляция электроосмотического потока в кварцевом капилляре прибора нанофор 01

ЦЕЛЕНАПРАВЛЕННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭЛЕКТРООСМОТИЧЕСКОГО ПОТОКА В КВАРЦЕВОМ КАПИЛЛЯРЕ ПРИБОРА НАНОФОР 01

В.Е. Курочкин, В.Г. Мальцев, А.Ю. Шмыков, А.А. Щеглов

Метод капиллярного электрофореза (КЭ) успешно развивается в течение последних 25 лет. В настоящее время он широко используется для разделения и анализа органических и неорганических катионов и анионов, лекарственных препаратов, биополимеров и их фрагментов и других классов веществ.

Однако при КЭ сложных составов веществ, особенно белков, существует ряд осложняющих проблем, которые до сих пор не нашли удовлетворительного и универсального разрешения. На внутренней поверхности кварцевого капилляра для КЭ (в зависимости от его предыстории) могут располагаться различные комбинации ионизируемых силаноль-ных групп (одиночные и двойные силанольные и водородно-связанные гидроксилы) и гидрофобных силоксановых групп. Каждый из перечисленных типов силанолов имеет свою константу ионизации [1], адсорбционную активность. Соотношение между различными типами силанолов на поверхности кремнезема зависит от многих факторов, так, например, на зависимости электро-осмотического потока (ЭОП) от рН обнаруживается петля гистерезиса [2-4] в зависимости от того, как происходит изменение рН - путем увеличения или уменьшения. Все это приводит к нестабильности электроповерхностных свойств капилляра и их зависимости от предыстории промывок различными растворами. Такая неоднородность силанольных групп по их адсорбционной активности и степени ионизации является серьезным недостатком кремнеземной поверхности используемой при КЭ.

Как показано в [5], даже маленькая степень адсорбции приводит к серьезному ухудшению в разделении веществ, особенно это видно при анализе более крупных молекул. Белки имеют способность больше и прочнее сорбироваться, оставаясь на стенке капилляра, чем маленькие молекулы, поскольку молекула белка может взаимодействовать сразу с несколькими активными адсорбционными центрами, что приводит к снижению эффективности, асимметрии пиков, накоплению необратимо адсорбированного белка на стенке капилляра и, как следствие этого, к плохой воспроизводимости результатов последовательных измерений. Наряду с этим, заряд на стенке дает и положительный эффект, проявляющийся в электроосмотическом потоке по направлению к катоду. Накладывающийся на электрофоретическую подвижность электроосмотический поток существенно ускоряет движение зоны белка от точки ввода пробы до окна детектора, что позволяет (в благоприятных условиях) сокращать время анализа до нескольких минут, не используя при этом таких высоких напряжений, которые приводят к разогреву электролита с падением эффективности разделения.

В настоящее время разработаны многие химические методы модификации внутренней поверхности капилляра путем ковалентной прививки адсорбционно-инертных покрытий метилцеллюлозы, полиакриламида, поливинилового спирта, полиэтиленглико-ля и т. д. [6-11]. Показано, что такие покрытия подавляют адсорбционную активность силанольных групп, но также уменьшают до очень малой величины ЭОП. Таким образом, хотя и имеется преимущество адсорбционной инертности, но катионные и анионные разделяемые вещества не могут быть проанализированы в ходе одного анализа, а сам анализ (также как при рН2 на не модифицированном капилляре) требует значительного времени. Поэтому представляет интерес такая химическая модификация поверхности капилляра, в которой силанольные группы, трудно поддающиеся контролю, по степени ионизации заменялись бы на сильные кислотные группы, ионизируемые нацело во всем диапазоне значений рН. Такой капилляр обладал бы всеми преимуществами немодифи-цированного капилляра в боратной системе при дополнительном преимуществе высокой стабильности ЭОП и, следовательно, воспроизводимости и надежности анализа.

В Институте аналитического приборостроения (ИАнП РАН) совместно с Государственным университетом аэрокосмического приборостроения (СПбГУАП) разработан такой способ химической модификации внутренней поверхности капилляра с прививкой сильнокислых сульфопропильных групп, осуществляемых путем последовательной «промывки капилляра» (пропускания через капилляр) оригинальными растворами реагентов (поли-сульфопропилметакрилатом и др.). Для измерения электроосмотического потока использовался прибор капиллярного электрофореза НАНОФОР 01 (ИАнП РАН) (рис.1).

В ходе выполнения работы была исследована зависимость электро-осмотической подвижности от рН рабочего электролита на обычном кварцевом капилляре и на капилляре с привитым полисульфопропилметакрилатом. Характер зависимости для не-модифицированного капилляра и величины электроосмотической подвижности при разных рН в целом соответствуют известным литературным данным [12, 13]. Характерно, что для этих измерений, полученных в различных лабораториях, величины электроосмотической подвижности все же варьируют в пределах 30%, что объясняется использованием капилляров от различных поставщиков и, соответственно, вариациями в физико-химических свойствах плавленного кварца, т.е. материала капилляра. На поверхности немодифицированного кремнезема при рН, близких к точке нулевого заряда (рН2), электро-осмотический поток падает почти до нуля, а в области высоких рН

(рН10-12) зависимость электроосмотической подвижности от рН выхолаживается, ЭОП достигает своей предельной величины.

В соответствии с уже описанными ранее наблюдениями [11] на зависимости электроосмотической подвижности от рН наблюдается петля гистерезиса. На рис. 2 также показаны соответствующие зависимости электроосмотической подвижности от рН для капилляра с привитым полисульфопропилметакрилатом. Видно, что замена неоднородных по степени ионизации слабокислых силанольных групп на сильнокислые сульфо-группы обеспечивает постоянный заряд поверхности во всем исследуемом диапазоне рН. В то же время проведённые исследования зависимости электроосмотической подвижности от рН для капилляра с привитым полисульфопропилметакрилатом показали, что замена неоднородных по степени ионизации слабокислых силанольных групп на сильнокислые сульфогруппы обеспечивает постоянный заряд поверхности во всем исследуемом диапазоне рН. Сульфокислоты как сильные электролиты нацело ионизируются при любых рН, и поэтому на таком модифицированном капилляре ЭОП уже не зависит от рН рабочего электролита.

Важным преимуществом предложенного полимерного сульфопокрытия является полное устранение эффекта гистерезиса. Для практики КЭ этот результат является очень важным, так как на полученном стабилизированном капилляре устраняется зави-

Рис.1. Прибор капиллярного электрофореза НАНОФОР 01

симость времен удерживания пиков от предыстории промывок капилляра различными растворами электролитов, характерная для обычных кварцевых капилляров и приводящая к неудовлетворительной воспроизводимости анализов.

0 2 А 6 8 10 рН

Рис.2. Зависимость электроосмотического потока от рН на модифицированном (1 - в сторону увеличения рН, 2 - в сторону уменьшения рН) и немодифи-цированном капиллярах (3 - в сторону увеличения рН, 4 - в сторону уменьшения рН (петля гистерезиса)).

Рис.3. Электрофореграмма белков сыворотки крови. 1- Y-глобулин (15,35 %), 2 - р-глобулин (8,15 %); 3 - а2-глобулин (9,3 %), 4 - а 1-глобулин (4,9 %), 5 - альбумин (60,5 %), 6 - низкомолекулярная фракция (1,8 %).

Предложенное в настоящей работе стабилизированное сульфопокрытие было испытано в режиме наиболее распространенного биомедицинского анализа, который осуществляется на приборах КЭ, а именно при анализе белков сыворотки крови (рис.3). Белки как соединения, наиболее чувствительные к взаимодействиям с поверхностью капилляра, позволяют быстро и надежно оценить пригодность поверхности для практического КЭ. Было продемонстрировано, что полученное покрытие позволяет разделить белки сыворотки крови не на 5 (как на немодифицированном капилляре), а на 9 основных белковых фракций. При этом благодаря высокой скорости ЭОП время анализа не превышает 6 мин. Поскольку сульфопокрытия стабилизированы по ЭОП, то в

промежутке между анализами теряется необходимость промывки раствором щелочи и достаточно только промывки рабочим электролитом.

Выводы

На зависимости электроосмотической подвижности от рН обнаруживается петля гистерезиса, которая, по-видимому, обусловлена неравновесным состоянием форм кремнезема. Наличие гистерезиса или «памяти» поверхности капилляра о предыдущих промывках затрудняет стабилизацию ЭОП в КЭ и ухудшает воспроизводимость метода.

Предложен способ химической модификации внутренней поверхности капилляра путем замены неоднородных и трудно ионизируемых силанольных групп на однородные сильнокислые сульфогруппы, ионизируемые в интервале рН2-10. Метод прививки сульфогрупп основан на силинировании поверхности метакрилоилоксипропил-триметоксисиланом с последующей радикальной сополимеризацией сульфопропилме-такрилата. Способ модификации отличается простотой, и все необходимые стадии обработки в капилляре могут быть проведены автоматически на приборе НАНОФОР 01.

Показано, что в капилляре с привитыми сульфогруппами ЭОП имеет достаточно большую и постоянную величину во всем диапазоне изменения рН. Эффект гистерезиса отсутствует, что свидетельствует о быстром установлении равновесия. Таким образом, переход на капилляры с привитым сульфопропилметакрилатом представляется перспективным способом преодоления недостатков кремнеземного материала.

В анализе белков сыворотки крови на капилляре с привитыми сульфогруппами было продемонстрировано, что предложенное покрытие позволяет улучшить разрешающую способность КЭ и упростить методику за счет отказа от ряда промежуточных промывок капилляра, необходимых при работе на немодифицированном капилляре.

Работа выполнена при частичной поддержке ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России на 2002-2006 годы».

Литература

1. Chiari M., Nesi M., Righetti P.G. // Capillary Electrophoresis in Analytical Biotechnology / Ed. by Righetti P.G. Boca Raton: CRC Press, 1996. P. 1.

2. McCormick R.M. // Anal. Chem. 1988. V. 60. P. 2322-2338.

3. Lukacs K.D., Jorgenson J.W. // J. High Resolut. Chromatogr. Chromatogr. Commun. 1985. V. 8. P. 407-411.

4. Altria K. D., Simpson C.F. // Chromatographia. 1987. V. 24. P. 527-532.

5. Hjerten S. High-performance electrophoresis: Elimination of electroendosmosis and solute adsorption // J. Chromatogr. 1985, V. 347. P. 191.

6. Jorgenson J.W., Lukacs K.D. Capillary zone electrophoresis // Science. 1983. V. 222. P. 266.

7. McCormick R.M. Capillary zone electrophoresis separation of peptides and proteins using low pH buffers in modified silica capillaries // Anal. Chem. 1988 V. 60. P. 2322.

8. Bruin G.J.M., Huisen R., Kraak J.C., Poppe H. Performance of carbohydrate- modified fused-silica capillaries for the separation of proteins by zone electropforesis // J. Chroma-togr. 1989. V. 480. P. 339.

9. Cobb K.A., Dolnik V., Novotny M. Electrophoretic separations of proteins in capillaries with hydrolytically stable surface structures // Anal. Chem. 1990. V. 62. P. 2478.

10. Swedberg S.A. Characterization of protein behavior in high-performance capillary electrophoresis using a novel capillary system // Anal. Biochem. 1990. V. 185. P. 51.

11. Jorgenson, J.W., Lukacs K.D. Capillary zone electrophoresis // Science. 1983. V. 222. P. 266.

12. Hjerten S. High-performance electrophoresis: Elimination of electroendosmosis and solute adsorption // J. Chromatogr. 1985. V. 347. P. 191.

13. Айлер Р. Химия кремнезема. М., 1982. 919 с.