Улучшенный способ получения конъюгата физиологически активного полипептида с высоким выходом

1. Способ получения комплекса физиологически активный полипептид - непептидильный полимер - константная область иммуноглобулина, включающий стадии:
(1) взаимодействия непептидильного полимера с одним из следующего: физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина; и
(2) взаимодействия реакционной смеси со стадии (1) с другим из следующего: физиологически активного полипептида или константной области иммуноглобулина в присутствии соли.
2. Способ по п. 1, где непептидильный полимер имеет каждый независимо функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из альдегидного производного, малеимидного производного и сукцинимидного производного на обоих своих концах.
3. Способ по п. 2, при котором непептидильный полимер связывают с физиологически активным полипептидом и константной областью иммуноглобулина посредством функциональных групп на обоих его концах с образованием ковалентной связи.
4. Способ по п. 1, дополнительно включающий стадию отделения конъюгата физиологически активный полипептид - непептидильный полимер или конъюгата константная область иммуноглобулина - непептидильный полимер от реакционной смеси после стадии (1).
5. Способ по п. 1, где соль выбрана из группы, состоящей из хлорида натрия, ацетата натрия, сульфата натрия, фосфата натрия, карбоната натрия, цианида натрия, цитрата натрия, нитрата натрия, хлорида калия, ацетата калия, сульфата калия, фосфата калия, карбоната калия, цианида калия, цитрата калия, нитрата калия, хлорида магния, ацетата магния, сульфата магния, фосфата магния, карбоната магния, цианида магния, цитрата магния, нитрата магния, хлорида аммония, ацетата аммония, сульфата аммония, фосфата аммония, карбоната аммония, цианида аммония, цитрата аммония, нитрата аммония, хлорида кальция, ацетата кальция, сульфата кальция, фосфата кальция, карбоната кальция, цианида кальция, цитрата кальция и нитрата кальция.
6. Способ по п. 5, где соль выбрана из группы, состоящей из хлорида натрия, ацетата натрия, сульфата натрия, фосфата натрия и хлорида калия.
7. Способ по п. 1, при котором соль добавляют до конечной концентрации от 0,1 до 3,0 М.
8. Способ по п. 7, при котором соль добавляют до конечной концентрации от 0,3 до 2,5 М.
9. Способ по п. 6, при котором, если соль представляет собой хлорид натрия, то ее добавляют до конечной концентрации меньше чем 3,0 М; если соль представляет собой ацетат натрия, то ее добавляют до конечной концентрации меньше чем 2,5 М; если соль представляет собой сульфат натрия, то ее добавляют до конечной концентрации меньше чем 0,7 М; если соль представляет собой фосфат натрия, то ее добавляют до конечной концентрации меньше чем 0,8 М; или если соль представляет собой хлорид калия, то ее добавляют до конечной концентрации 1,0 М или меньше.
10. Способ по п. 1, при котором время реакции на стадии (2) составляет от 4 до 18 часов.
11. Способ по п. 1, при котором температура реакции на стадии (2) составляет от 0 до 25°С.
12. Способ по п. 2, где, если непептидильный полимер имеет одно или более альдегидных производных в качестве функциональных групп, то реакционная смесь дополнительно содержит восстановитель с конечной концентрацией от 1 до 100 мМ.
13. Способ по п. 1, при котором стадию (1) осуществляют при рН от 5,0 до 6,5 и стадию (2) осуществляют при рН от 6,0 до 8,5.
14. Способ по п. 1, при котором на стадии (1) непептидильный полимер взаимодействует с физиологически активным полипептидом, а на стадии (2) реакционная смесь со стадии (1) взаимодействует с константной областью иммуноглобулина.
15. Способ по п. 14, при котором на стадии (1) физиологически активный полипептид и непептидильный полимер взаимодействуют друг с другом при мольном отношении от 1:1 до 1:20, а на стадии (2) продукт со стадии (1) и константная область иммуноглобулина взаимодействуют друг с другом при мольном отношении от 1:0,5 до 1:10.
16. Способ по п. 15, при котором стадию (2) осуществляют в присутствии хлорида натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 3,0 М, ацетата натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 2,5 М, сульфата натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 0,7 М, фосфата натрия, добавленного до конечной концентрации меньше чем 0,8 М, или хлорида калия, добавленного до конечной концентрации 1,0 М или меньше.
17. Способ по п. 1, при котором функциональные группы непептидильного полимера связывают с аминной группой, присутствующей на N-конце или в боковой цепи Lys остатка физиологически активного полипептида и константной области иммуноглобулина.
18. Способ по п. 1, где непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликолей, полипропиленгликолей, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированных полиолов, поливиниловых спиртов, полисахаридов, декстранов, поливинилэтиловых эфиров, полимолочной кислоты (PLA), сополимера молочной и гликолевой кислот (PLGA), липидных полимеров, хитинов, гиалуроновой кислоты и их комбинации.
19. Способ по п. 1, где непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
20. Способ по п. 1, где непептидильный полимер имеет молекулярную массу в диапазоне от 1 до 100 кДа.
21. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина агликозилирована.
22. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина состоит из от одного до четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из доменов СН1, СН2, СН3 и СН4.
23. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина дополнительно содержит шарнирную область.
24. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из константных областей, происходящих из IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, их комбинаций и их гибридов.
25. Способ по п. 1, где константная область иммуноглобулина выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, их комбинаций и их гибридов.
26. Способ по п. 25, где константная область иммуноглобулина представляет собой Fc область IgG4.
27. Способ по п. 26, где константная область иммуноглобулина представляет собой агликозилированную Fc область IgG4 человека.
28. Способ по п. 1, где физиологически активный полипептид выбран из группы, состоящей из гормона роста человека, высвобождающих гормон роста гормонов, высвобождающих гормон роста пептидов, интерферона, рецепторов интерферона, колониестимулирующих факторов, глюкагоноподобных пептидов (GLP-1 и так далее), оксинтомодулина, рецепторов, связанных с белком G, интерлейкинов, рецепторов интерлейкинов, ферментов, интерлейкин-связывающих белков, цитокин-связывающих белков, факторов активации макрофагов, макрофагальных пептидов, В-клеточных факторов, Т-клеточных факторов, белка А, ингибиторов аллергии, гликопротеинов некроза клеток, иммунотоксинов, лимфотоксинов, фактора некроза опухоли, опухолевых супрессоров, трансформирующего фактора роста, альфа-1 антитрипсина, альбумина, α-лактальбумина, аполипопротеина-Е, эритропоэтина, гликозилированного эритропоэтина, ангиопоэтинов, гемоглобина, тромбина, активирующих рецептор тромбина пептидов, тромбомодулина, фактора крови VII, VIIa, VIII, IX и XIII, активаторов плазминогена, фибрин-связывающих пептидов, урокиназы, стрептокиназы, гирудина, белка С, С-реактивного белка, ингибитора ренина, ингибитора коллагеназы, супероксиддисмутазы, лептина, тромбоцитарного фактора роста, эпителиального фактора роста, эпидермального фактора роста, ангиостатина, ангиотензина, фактора роста костей, белка, стимулирующего рост костей, кальцитонина, инсулина, атриопептина, фактора, индуцирующего образование хряща, элкатонина, фактора активации соединительной ткани, ингибитора пути тканевого фактора, фолликуло-стимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, рилизинг-фактора лютеинизирующего гормона, факторов роста нервной ткани, паратиреоидного гормона, релаксина, секретина, соматомедина, инсулиноподобного фактора роста, гормона коры надпочечников, глюкагона, холецистокинина, панкреатического полипептида, пептида, высвобождающего гастрин, рилизинг-фактора кортикотропина, тиреоидстимулирующего гормона, аутотаксина, лактоферрина, миостатина, антигенов клеточной поверхности, вирусных вакцинных антигенов, моноклональных антител, поликлональных антител и фрагментов антител.
29. Способ по п. 28, где физиологически активный полипептид представляет собой инсулин.
30. Способ по п. 1, при котором на стадии (1) физиологически активный полипептид и непептидильный полимер взаимодействуют друг с другом при мольном отношении от 1:1 до 1:20 в условиях рН от 5,0 до 6,5, а на стадии (2) реакционная смесь со стадии (1) и константная область иммуноглобулина взаимодействуют друг с другом при мольном отношении от 1:0,5 до 1:10 в условиях рН от 6,0 до 8,5 в присутствии соли, и если соль представляет собой хлорид натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 3,0 М, если соль представляет собой ацетат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 2,5 М, если соль представляет собой сульфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,7 М, если соль представляет собой фосфат натрия, то она может быть добавлена до конечной концентрации меньше чем 0,8 М, или если соль представляет собой хлорид калия, то она может быть добавлена до конечной концентрации 1,0 М или меньше.