Нанокапсулированный биологически активный препарат и его использование с целью коррекции функциональной активности печени у собак

НАНОКАПСУЛИРОВАННЫИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРЕПАРАТ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ С ЦЕЛЬЮ КОРРЕКЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕЧЕНИ У СОБАК

О.Б. Сеин, А.А. Кролевец, М.Ю. Смахтин, В.А. Стариков

Аннотация. Приводятся результаты апробации нового нанокапсулированного комплексного биологически активного препарата с целью коррекции функционального состояния печени у собак. Показано, что изготовленный препарат обладает выраженным гепатокор-ректорным действием. Использование препарата при нарушении функциональной активности печени, вызванного экспериментальной антибиотиконагрузкой, позволило нормализовать у собак клинический и биохимический статус и морфологическую структуру печени. Даны рекомендации по применению изготовленного нанокапсулированного препарата в практике ветеринарной медицины.

Ключевые слова: биохимические показатели, гисто-препараты, гепатокорректорное действие, кишечник, кровь, клинические показатели, нанокапсулированный препарат, печень, собаки, функциональная активность.

Печень - орган, с которым в организме связаны прямо или косвенно все процессы метаболизма. Печень принимает участие в обмене белков, углеводов, липи-дов, витаминов, пигментов, она оказывает существенное влияние на водно-солевой обмен и кислотно-щелочное равновесие. Поэтому при нарушении функциональной активности печени в организме животных происходят существенные изменения деятельности многих органов и систем.

В последние годы заболевания печени у мелких домашних животных, в частности собак, приобретают массовый характер. Это связано с несбалансированным кормлением, воздействием гепатотропных ядов, бессистемным применением антибактериальных препаратов и других факторов.

Указанное даёт основание полагать, что разработка и совершенствование новых гепатотропных препаратов является актуальной проблемой для ветеринарной медицины.

Исходя из этого, для коррекции функционального состояния печени у животных на кафедре органической и аналитической химии Юго-Западного государственного университета был изготовлен нанокапсулирован-ный биологически активный препарат по технологии, разработанной профессором А.А. Кролевцом. Условно изготовленный препарат был маркирован как «БиаП-1».

Важной особенностью изготовленного препарата являются малые размеры нанокапсул - от 25 нм до нескольких мкм, что позволяет им легко проникать в клетки и ткани, перенося в них своё содержимое. В свою очередь, несмотря на свои микроразмеры, нано-капсулы способны создавать огромную рабочую поверхность, что значительно повышает биологические свойства препарата. Второй особенностью нанокапсул является то, что они не воспринимаются иммунной системой организма в качестве чужеродных образований. Это позволяет использовать изготовленный препарат в широких пределах.

Нанокапсулы способны создавать самоорганизующиеся структуры. После растворения в воде изготовленного препарата инкапсулированного биополимером с последующим выпариванием, образуется фрактальная композиция из раствора препарата. Результаты сканирования данной композиции на микроспектрометре Omega Scope (AIST-NT), совмещённом с конфокальным микроскопом, представлены на микрофотографии (рисунок 1), из которой следует, что исследуемые

структуры являются фрактальными и обладают самоорганизацией. Следовательно, нанокапсулированному препарату присущи супрамолекулярные свойства.

Рисунок 1 - Конфокальное изображение фронтальной композиции из раствора нанокапсулированного препарата, увел. 2830 р.

Рисунок 2 - Гистологический препарат печени собаки контрольной группы. Микроциркуляторное нарушение вследствие сдавливания сосуда, увеличенное в объёме, гепатоцитами. Окраска гематоксилин-эозином, увел. 40 х 10.

С целью выяснения биологических свойств нанокапсулированного препарата «БиаП-1» при перораль-ном применении в ходе продвижения по желудочно-кишечному тракту, нами были выполнены эксперименты на модели in vitro, имитирующей условия пищеварения в организме животных, в частности собак.

Были приготовлены модельные растворы, близкие по своему составу желудочному и кишечному сокам собак. Для этого использовали синтетические и натуральные препараты желудочного сока, панкреатина и желчи (производства «НПО Микроген», г.Москва; ЗАО «Фармпроект», г.С.-Петербург; ОАО «Биосинтез», г.Пенза).

Таблица 1 - Содержание пробиотических бактерий в модельных растворах после внесения нанокапсулированного препарата «БиаП-1» и инкубации (КОЕ*мл1)__

Модельный раствор Время инкубации

0 30 мин 1 час 2 час 3 час 4 час 5 час 6 час

Желудочный сок, рН- 0 0 0 0 0 0 0 1,0*102

Кишечный сок, рН- 0 1,0*103 1,4*107 2,0*107 2,5*107 3,0*107 2,5*107 2,2*107

При внесении в пробирки с модельными растворами одной дозы препарата «БиаП-1» и последующей инкубацией в термостате при 370С в течение 6 часов показало, что в желудочном соке пробиотические бактерии обнаруживались, относительно в небольшом количестве, только через 6 часов инкубации, тогда как в кишечном соке они были выявлены уже через первые 30 мин после нахождения в термостате и максимума их количества достигало через 4 часа (таблица 1).

Результаты проведённого эксперимента свидетельствуют о том, что нанокапсулы предохраняют их содержимое, в частности пробиотические бактерии, от «агрессивной» кислой среды желудочного сока. По крайней мере 5-часовое предохранение бифидо- и лак-тобактерий, входящих в состав лактобифадола, вполне достаточно, чтобы значительная их часть транспортировалась в кишечник собаки. В то же время быстрое разрушение нанокапсул в кишечном соке под действием щелочной среды позволяет в минимально короткий промежуток времени «заселить» кишечник пробиоти-ческими бактериями.

Во втором эксперименте мы использовали изготовленный нанокапсулированный препарат «БиаП-1» с целью коррекции функционального состояния печени у собак.

Эксперимент проводили в условиях ветеринарной клиники «У охоты» (г. Мурманск). Объектом исследований являлись беспородные собаки, из которых было сформировано две группы по 5 голов в каждой. Собакам обеих групп в течение 10 дней внутримышечно вводили антибиотик гентамицин в завышенной дозе.

С 11 дня собакам 1 опытной группы с кормом индивидуально давали нанокапсулированный препарат в течение 10 дней в дозе 0,5 г/кг.

При постановке на эксперимент и в процессе эксперимента у подопытных собак определяли клинический статус. Для этого учитывали упитанность, состояние кожного и волосяного покрова, наличие болезненности печени при пальпации и изменения её границ, состояние желудочно-кишечного тракта, характер стула.

У собак обеих групп брали кровь при постановке на эксперимент, на 10 день, 20 и 30 дни эксперимента. Лабораторный анализ крови предусматривал определение общих гематологических показателей (СОЭ, гема-токрит, эритроциты, лейкоциты, гемоглобин) общепринятыми методами. Содержание общего белка и его фракций, глюкозы, билирубина, ферментативную активность аминотрансфераз (АСТ, АЛТ) определяли с использованием наборов стандартных реактивов «Био-Ла-Тест» (фирма Лахема) и «Клини-Тест», а также с применением биохимического анализатора ILAB-650.

С целью оценки морфологического состояния печени у подопытных собак проводили биопсию печени на 30 день эксперимента. Гистопрепараты готовили по общепринятой схеме: фиксация в растворе Буэна, проводка в спиртах возрастающей концентрации, заливка в парафиновые блоки, окраска гематоксилин-эозином (Г.А. Меркулов, 1969; Д.С. Саркисов и др., 1996). Фотоснимки гистологических препаратов проводили с использованием микроскопа Penta View44348.

Результаты клинического обследования и общего гематологического анализа показали, что собаки, включённые в эксперимент, были здоровы.

На 10 день эксперимента клинико-физиологическое состояние подопытных собак характеризовалось снижением аппетита, температура тела, частота пульса и количество дыхательных движений были в пределах физиологических норм. Слизистые оболочки без изменений. Пальпация печени безболезненная, границы в норме. При исследовании кишечника изменений не выявлено, за исключением двух случаев диареи у собак 1 опытной группы.

Результаты гематологических исследований показали, что у собак обеих групп СОЭ находилась в границах 1,0-1,8 мм/час, гематокритная величина - 40,7042,0%, содержание эритроцитов - 6,1-6,4*1012/л, лейкоцитов - 9,5-11,0*109/л, гемоглобина - 110,5-116,0 г/л.

Биохимические параметры крови у собак на 10 день эксперимента характеризовались уменьшением содержания глюкозы (2,0±0,05-2,2±0,07 ммоль/л), повышением содержания общего билирубина (5,0±0,21-7,4±0,20 мкмоль/л) к относительно высокой ферментативной активности АСТ (0,89±0,07-1,04±0,08 мкмоль/л) и АЛТ (0,67±0,05-0,85±0,09 мкмоль/л). Что касается белкового спектра крови, то содержание общего белка и альбуминов у собак обеих групп по сравнению с фоновыми значениями повысилось соответственно на 7,3 и 6,4%. В то же время содержание гамма-глобулинов, наоборот, уменьшилось на 2,1%.

На 20 день эксперимента клинико-физиологическое состояние у собак опытной группы характеризовалось изменением в «лучшую сторону». Аппетит у собак восстановился, поведение стало более активным. Слизистые оболочки бледно-розового цвета. Пальпация печени безболезненная. Признаки расстройства кишечника у собак отсутствовали.

Результаты общего гематологического анализа крови показали, что у собак, получавших нанокапсулирован-ный препарат, СОЭ составляла 1,5±0,02 мм/час, гематок-ритная величина - 42,5±1,04%, содержание эритроцитов

- 6,5±0,44*1012/л, лейкоцитов - 7,8±0,53*1012/л, гемоглобина - 107,5±4,3г/л. Содержание глюкозы (3,25±0,73 ммоль/л) приблизилось к физиологическим нормам. В то же время общий билирубин (5,4±0,50 мкмоль/л) и ферментативная активность АСТ (0,70±0,09 мкмоль/л) и АЛТ (0,64±0,07 мкмоль/л) находились на относительно высоком уровне.

Содержание общего белка и альбуминов в крови собак 1 опытной группы несколько уменьшилось (68,8±0,89 г/л; 46,5±0,74%), однако выявленные различия были статистически недостоверными (Р>0,05).

У собак контрольной группы на 20 день эксперимента аппетит ухудшился, общее состояние вялое, реакция на внешние раздражители адекватная. Температура тела, частота пульса и дыхательных движений в пределах нормы. Слизистые оболочки бледные. У двух собак отмечалась болезненность печени при пальпации. Границы печени без изменений. Пальпация кишечника безболезненная, у трёх собак выявлена диарея. Фекалии с примесью слизи, светло-бурого цвета, с гнилостным запахом.

СОЭ у собак контрольной группы составляла 0,8±0,07 мм/час, гематокритная величина - 40,0±1,75%, содержание эритроцитов - 6,6-0,20*1012/л, лейкоцитов

- 11,8-0,56*10/л, гемоглобина - 102,5±4,3г/л.

Гамма-глобулины, % 10-14 15,3±0,74* 8,8±0,56

Общий билирубин, мкмоль/л 2,0-2,4 2,4±0,11* 3,7±0,15

АСТ, мкмоль/л 0,20-0,25 0,37±0,06 0,49±0,07

АЛТ, мкмоль/л 0,30-0,35 0,43±0,08* 0,66±0,08

Биохимический анализ крови у контрольных животных показал, что по сравнению с предыдущим исследованием содержание глюкозы уменьшилось в среднем на 0,6 ммоль/л, содержание общего билирубина повысилось на 2,1 ммоль/л, ферментативная активность АСТ увеличилась на 0,24 мкмоль/л, АЛТ - на 0,18 мкмоль/л.

В белковом спектре существенных изменений выявлено не было, за исключением уменьшения содержания гамма-глобулиновой фракции в среднем на 2,4%.

На 30 день эксперимента общее состояние собак опытной группы заметно улучшилось. Аппетит восстановился, поведение было активное, слизистые оболочки бледно-розового цвета. Пальпация печени безболезненная, симптомы диареи отсутствовали.

В то же время у собак контрольной группы аппетит значительно ухудшился, отмечалась общая слабость, поведенческие реакции замедленные, реакции на внешние раздражители не изменены. Температура тела, частота пульса и дыхательных движений находились на верхней границе физиологических параметров. Слизистые оболочки у всех собак анемичные. У трёх собак пальпация печени болезненная, перкуторные границы без изменений. У четырёх животных отмечалась выраженная диарея, фекалии с большим количеством слизи и гнилостного запаха.

Результаты гематологических исследований представлены в таблице 2, из которой следует, что у собак опытной группы изучаемые параметры нормализовались и находились в пределах фоновых значений. Напротив, у собак контрольной группы отмечалось уменьшение содержания эритроцитов и гемоглобина. Содержание лейкоцитов было несколько повышено. Концентрация глюкозы в крови находилась на относительно низком, а общего билирубина - на повышенном уровне. Содержание общего белка и альбуминов по сравнению с фоновыми показателями изменилось незначительно, а по сравнению с данными, полученными на 20 день эксперимента - достоверно (Р<0,05) уменьшилось. Гамма-глобулины находились на относительно низком уровне. Ферментативная активность АСТ достигала 0,97±0,08 мкмоль/л, а АЛТ - 0,74±0,06 мкмоль/л.

Таким образом, клинические и биохимические показатели у собак контрольной группы свидетельствуют о нарушении функционального состояния печени. На это указывают и результаты биопсии печени у собак на 30 день эксперимента, которые подтвердили, что у контрольных животных в тканях печени имеются изменения характерные для воспалительного процесса (рисунок 2). В частности в печени выявлялась ячеистая структура, в некоторых случаях отмечались микроцир-куляторные нарушения. В гепатоцитах уменьшалось содержание гликогена, а содержание жировых включений, наоборот, увеличивалось. При этом архитектоника балочной структуры гепатоцитов сохранялась.

Таблица 2 - Гематологические показатели у собак на 30 день после применения нанокапсулированного

Примечание: * - при Р<0,05 по сравнению с контрольной группой

Полученные результаты апробации изготовленного нами нанокапсулированного комплексного биологически активного препарата позволяют сделать следующее заключение: препарат «БиаП-1» не токсичный, не вызывает аллергических реакций, обладает выраженным гепатокорректорным действием и его можно рекомендовать к использованию в практике ветеринарной медицины.

Список используемых источников

1 Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - М.: Медгиз, 1969. - 340 с.

2 Саркисов Д.С., Петрова Ю.Л. Микроскопическая техника. Руководство для врачей и лаборанта. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.

Информация об авторах

Сеин Олег Борисович, доктор биологических наук, профессор кафедры терапии и акушерства ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА», тел. (4712)53-15-55.

Кролевец Александр Александрович, кандидат химических наук, профессор кафедры аналитической и органической химии ФГБОУ ВПО «Юго-Западный государственный университет».

Смахтин Михаил Юрьевич, доктор биологических наук, профессор кафедры биологической химии ФГБОУ ВПО «Курский ГМУ».

Стариков Виктор Александрович, аспирант ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА», тел. (4712)53-15-55.

препарата «БиаП-1»

Показатели Физиологическая норма Группа

1 опытная 2 контрольная

СОЭ, мм/час 2,0-3,5 2,4±0,07* 3,0±0,08

Гематокрит, % 42-48 45,0±2,4 41,2±1,8

Эритроциты, *1012/л 5,2-8,4 6,8±0,34* 5,4±0,27

Лейкоциты, *109/л 8,5-10,5 8,7±0,50* 11,5±0,53

Гемоглобин, г/л 110-170 131,0±2,7* 110,5±3,1

Глюкоза, ммоль/л 3,3-4,4 3,4±0,25* 2,5±0,18

Общий белок, г/л 59-76 68,8±2,8 72,0±3,5

Альбумины, % 48-57 49,5±1,9 51,0±2,4