Прогностическое значение экспрессии иммуногистохимических маркеров Ki-67, ММР-9 и коллагена IV у больных папиллярным уротелиальным раком мочевого пузыря

Прогностическое значение экспрессии иммуногистохимических маркеров К1-67, ММР-9 и коллагена IV у больных папиллярным уротелиальным раком мочевого пузыря

В.П. Авдошин, И.И. Бабиченко, Е.В. Котельникова

РУДН, Москва

Контакты: Владимир Павлович Авдошин susya@kmail.ru

Проведена оценка прогностического значения экспрессии маркеров Ш-67, матриксной металлопротеиназы-9 (ММР-9) и коллагена IVпри различных уротелиальных опухолях мочевого пузыря (ОМП). Исследован биопсийный и операционный материал 43 пациентов (27мужчин и 16 женщин) в возрасте от 42 до 87 лет (средний возраст 66 + 1,5 года), получавших комбинированное лечение по поводу ОМП. Установлено, что по мере увеличения стадии опухолевого процесса возрастает степень злокачественности клеток, увеличивается их пролиферативная активность, повышается экспрессия ММР-9.

Ключевые слова: уротелиальные опухоли мочевого пузыря, иммуногистохимическое исследование, прогностические маркеры

Prognostic significance of Ki-67, MMP-9 and Col IV immunohistochemical markers at bladder tumors

V.P. Avdoshin, I.I. Babichenko, E.V. Kotelnikova

Russian Peoples,Friendship Universiti, Moskow

The prognostic value of the expression Ki-67, MMP-9 and collagen IV were estimated in urotelial bladder tumors. The biopsy and surgery samples from 43 patients (27 males and 16 females ) aged 42 to 87 years (mean age 66 + 1.5 years) who received combination treatment for urotelial tumors. It has been found that Ki-67, MMP-9 and collagen IV are important prognostic markers of urotelial invasive bladder carcinoma.

Key words: urotelial bladder tumors, immunohistochemical markers, prognostic markers

Введение

Уротелиальные опухоли занимают 7-10-е место в структуре злокачественных новообразований [1-3], темпы прироста их заболеваемости постоянно увеличиваются. Ежегодно в России от рака мочевого пузыря (РМП) умирают 7,4 тыс. человек [1]. Высокая смертность от РМП свидетельствует о неэффективности терапевтического вмешательства и диктует необходимость исследования молекулярных механизмов опухолевой прогрессии. Высокая экспрессия опухолевыми клетками матриксных металлопротеиназ (ММР) может лежать в основе опухолевой прогрессии и метастазирования раковых опухолей различного генеза за счет способности протеолитических ферментов расплавлять различные компоненты внеклеточного матрикса, включая базальные мембраны эпителия [3-6].

В настоящей работе с помощью иммуногистохими-ческой (ИГХ-) методики было проведено изучение экспрессии ММР-9 в клетках уротелия при различных видах их опухолевой трансформации.

Цель исследования — оценка прогностического значения экспрессии Ю-67, ММР-9, коллагена IV в различных уротелиальных опухолях мочевого пузыря.

Материалы и методы

В работе был использован операционный материал 43 пациентов, в числе которых 16 (37%) женщин и 27 (63%) мужчин. Средний возраст больных составил 66 ± 1,5 года. Все пациенты находились на лечении в урологических отделениях ГКБ № 64 и ГКБ № 29, являющихся клиническими базами кафедры урологии и оперативной нефрологии РУДН.

Исследования проводились в иммуногистохими-ческой лаборатории кафедры патологической анатомии РУДН.

У всех пациентов по данным клинико-лабораторных и инструментальных обследований была выявлена опухоль мочевого пузыря.

Жалобы на боли над лоном и в области мочевого пузыря выявлены у 38 (92,4 %) пациентов , наличие примеси крови — у 43 (100 %), наличие сгустков крови в моче — у 38 (92,4 %), задержку мочеиспускания — у 7 (16,9 %), частые и болезненные позывы к мочеиспусканию — у 38 (92,4 %). При анализе анамнестических данных только 11 (24,5 %) пациентов ранее обследовались в урологических стационарах, где был верифицирован диагноз. Остальные пациенты обратились в лечебное учреждение с вышеуказанными жалобами

впервые. Анализ результатов инструментального и со-нографического исследования показал, что при ультразвуковом обследовании при поступлении в стационар наличие опухоли мочевого пузыря выявлено у 32 (73,5 %) пациентов, у 11 (26,4 %) пациентов выявление опухоли было невозможным из-за наличия сгустков в просвете пузыря или гемотампонады. При цистоскопии опухоль пузыря была выявлена у всех пациентов (100 %). Однако у 10 (24 %) пациентов цистоскопическая картина не соответствовала злокачественным опухолям.

Гистологическая оценка новообразований выполнена согласно классификации ВОЗ 2004 г. и зарубежных исследований [7, 8]. При этом были выявлены 17 (16 %) неинвазивных уротелиальных опухолей, в том числе 7 папиллом, 10 (23 %) опухолей низкого злокачественного потенциала (ОНЗП) и 26 (61 %) инвазивных уроте-лиальных карцином. В группе Т1 карцином, инфильтрирующих субэпителиальную соединительную ткань, в 18 (42 %) случаев выявлен инвазивный рак, 6 (14 %) случаев отнесены в группу Т2 карцином, инфильтрирующих мышечную оболочку мочевого пузыря, и 2 (5 %) новообразования отнесены к группе Т3 (табл. 1).

По степени злокачественности опухоли разделены на следующие группы: папилломы и ОНЗП составили нулевую группу — 17 (40 %) случаев, карциномы низкой степени злокачественности (НСЗ) G1 — 14 (33 %) опухолей и карциномы высокой степени злокачествен но-сти (ВСЗ) G2 — 12 (28 %) случаев (табл. 2).

ИГХ-исследование проводилось в соответствии со стандартным протоколом. Ткани фиксировали в 10 % забуференном формалине (рН 7,4) и заливали в парафин. Использован парафин с температурой плавления 54 °С. Нарезали серийные срезы толщиной 5 мкм и наклеивали на поли^-лизиновые стекла. Де-парафинизация выполнена в термостате при температуре 60 °С в течение 1 ч. После погружения в ксилол срезы регидрировались проводкой по спиртам в убывающей концентрации в течение 15 мин.

Восстановление антигенной активности осуществлялось методом теплового демаскирования в 0,01 М цитратном буфере в микроволновой печи при мощности 300 Вт в течение 20 мин.

Блокирование эндогенной пероксидазной активности выполнено с помощью 3 % перекиси водорода в течение 10 мин.

Таблица 1. Экспрессия Киб7, ММР-9 и коллагена IVв уротелиалъных опухолях мочевого пузыря в зависимости от стадии заболевания

Опухоль (ВОЗ, 2004 г.) Стадия Уровень экспрессии Ki-67 (M±s), % Уровень экспрессии MMP-9 (M±s), у. е. Уровень экспрессии коллагена IV (M±s), у. е. Всего

Уротелиальная папиллома Та 3,3 ± 2,5 0,4 ± 0,8 1,4 ± 0,5 7

ОНЗП Та 3,2 ± 2,3 0,7 ± 0,5 1,3 ± 0,5 10

T1 16,4 ± 13,5 1,8 ± 1,1 0,5 ± 0,6 18

Инвазивная карцинома T2 21,0 ± 7,3 2,2 ± 0,8 0,3 ± 0,5 6 2

T3 41,0 ± 8,5 3,0 ± 0,0 0

Итого... 43

Достоверность различий Папиллома, ОНЗП-карцинома T1; p < 0,01; T1-T2; p = 0,04 T2-T3; p = 0,04 ОНЗП-карцинома T1; p = 0,01 ОНЗП-карцинома T2; p < 0,01 ОНЗП-карцинома T3; p = 0,03 Папиллома, ОНЗП-карцинома T1,T2,T3; p < 0,01

Таблица 2. Экспрессия Ш-67, ММР-9 и коллагена IVв уротелиалъных опухолях мочевого пузыря в зависимости от степени злокачественности опухоли

Опухоль (ВОЗ, 2004 г.) Степень злокачест- венности Уровень экспрессии Ki-7 (M±s), % Уровень экспрессии MMP-9 (M±s), у. е. Уровень экспрессии коллагена IV (M±s), у. е. Всего

Уротелиальная папиллома Та (0) 17

ОНЗП 3,2 ± 2,3 0,6 ± 0,6 1,4 ± 0,5

Инвазивная карцинома НСЗ ВСЗ 12.9 ± 4,2 26.9 ± 16,7 1,4 ± 0,8 2,8 ± 0,6 0,8 ± 0,6 0 14 12

Итого. 43

Достоверность различий Та - НСЗ; p < 0,01 НСЗ - ВСЗ; p < 0,01 Та - НСЗ; p = 0,02 НСЗ - ВСЗ; p < 0,01 Та - НСЗ; p = 0,03 НСЗ - ВСЗ4; p < 0,01

В работе использованы следующие антитела к антигенам человека:

— моноклональные мышиные антитела к белку Ki-67 (MM1, Diagnostic Biosystems, 1:200);

— очищенные антитела кроличьей антисыворотки к ММР-9 (Thermoscientific, 1:400).

— моноклональные мышиные антитела к коллагену IV (PHM-12, Thermoscientific, 1:100).

Для проведения ИГХ-реакции на срезы наносили 50 мкл разведенной первичной сыворотки. Срезы инкубировались при 37 °С в течение 30 мин. Выявление иммунных комплексов проводили при помощи без-биотиновой системы детекции на основе пероксидазы хрена (BioGenex, США). Срезы докрашивали гематоксилином Майера.

В качестве индикатора пролиферативной активности использован индекс пролиферации (ИП) Ki-67 (ИП Ki-67), который определялся долей интенсивно окрашенных ядер при учете 300 клеток, выраженной в процентах.

Оценку интенсивности ИГХ-реакции с MMP-9 проводили по следующим параметрам: 0 — отсутствие коричневых гранул в цитоплазме клеток, 1 — наличие отдельных мелких гранул в цитоплазме, 2 — распределение в отдельных клетках крупных гранул, 3 — наличие крупных гранул в цитоплазме большинства клеток.

Распределение коллагена IV в базальной мембране уротелия оценивали полуколичественным методом по следующим показателям: 0 — отсутствие коллагена вдоль базальной мембраны, 1 — наличие тонкой полоски коллагена, 2 — толстая полоска коллагена вдоль базальной мембраны, сравнимая по толщине и интенсивности окрашивания со стенкой сосудов подслизи-стой оболочки мочевого пузыря.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы STATISTICA 6.0. В табл. 1, 2 приведены средние значения М ± s, где s — среднее квадратическое отклонение. Учитывая ненормальное распределение полученных статистических показателей, сравнение двух независимых групп осуществляли непараметрическим методом при помощи U-критерия Манна—Уитни. Достоверным считали различия средних показателей при уровне статистической значимостиp < 0,05. Корреляционные взаимоотношения между стадией опухоли, степенью злокачественности, ИП клеток (Ki-67), выраженностью экспрессии MMP-9 и коллагена IV оценивали с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

Результаты

При гистологическом исследовании неизмененной слизистой оболочки мочевого пузыря выявлено: слизистая оболочка складчатая, переходный эпителий состоит из базального, промежуточного и поверхностного слоя зонтичных клеток. Толщина эпителиально-

го пласта составляет 5—6 клеточных слоев. Признаков воспаления и атипии не выявлено.

Определение злокачественного потенциала и инвазивных свойств уротелиальных опухолей мочевого пузыря возможно на основе клинических макроскопических признаков, гистологического строения, а также иммуноморфологических особенностей новообразований.

Для оценки пролиферативной активности был использован ИП Ю-67, который определялся отношением количества клеток с интенсивной ядерной реакцией на Ю-67 к общему числу клеток.

В уротелиальных новообразованиях выявлен широкий спектр пролиферативной активности. При исследовании группы папиллом средний ИП Ю-67 составил 3,3 ± 2,5 %. ОНЗП также характеризовались умеренной пролиферацией (3,2 ± 2,3 %), пролиферирующие клетки встречались преимущественно в базальном и промежуточном слоях. В инвазивных карциномах стадии Т1 уровень пролиферации соответствовал 16,4 ± 13,5 %, при стадии Т2 — 21,0 ± 7,3%, а стадии Т3 — 41,0 ± 8,5 % соответственно, что свидетельствует о повышении пролиферативной активности опухолевых клеток по мере увеличения стадии заболевания. Достоверные различия выявлены между папилломами и ОНЗП-карциномой Т1; опухолями стадии Т1-Т2 и Т2-Т3 (см. табл. 1).

При изучении степени злокачественности опухолевых образований были выявлены следующие закономерности: в папилломах и ОНЗП ИП соответствовал 3,2 ± 2,3 %; в карциномах НСЗ ИП Ю-67 составил 12,9 ± 4,2 %, в инвазивном РМП высокой степени злокачественности отмечены значения ИП (26,9 ± 16,7 %), что также соответствует высокому уровню статистической значимости между Та — НСЗ и НСЗ - ВСЗ (см. табл. 2).

Таким образом, пролиферативная активность уротелиальных опухолей, определяемая с помощью моноклональных антител Ю-67, служит чувствительным тестом для выявления популяции пролиферирующих клеток в папилломах и ОНЗП. ИП Ю-67, также позволяет дифференцировать уротелиальные карциномы различной степени злокачественности и отражает скорость роста новообразования.

Экспрессия ММР-9 исследовалась в различных опухолевых образованиях от папилломы до карциномы высокой степени злокачественности. Как правило, фермент выявлялся в цитоплазме опухолевых клеток в виде мелких или крупных гранул, при этом отмечалась различная интенсивность окрашивания продуктами диаминобензидиновой реакции.

Согласно результатам полуколичественного анализа распределения ММР-9 в различных опухолевых образованиях мочевого пузыря, наименьший уровень экспрессии ММР-9 отмечен в папилломах моче-

вого пузыря (0,4 ± 0,8 у. е.) и ОНЗП (0,7 ± 0,5 у. е.), достоверных различий между этими показателями нами не выявлено.

В инвазивных карциномах (Т1, Т2, Т3) мочевого пузыря уровень экспрессии ММР-9 увеличивался более чем в 2,5 раза и достоверно отличался от аналогичного показателя в папилломах и ОНЗП. Однако достоверных различий между стадиями развития карцином нами не выявлено.

В связи с этим была исследована экспрессия ММР-9 в зависимости от степени злокачественного потенциала опухолевых клеток. Полученные данные показали, что существуют достоверные различия по показателю ММР-9 между доброкачественными (Та) и злокачественными (Т1, Т2) опухолями мочевого пузыря. Кроме этого, по экспрессии ММР-9 достоверно различаются уротелиальные карциномы низкой и высокой степени злокачественности.

Таким образом, показатели экспрессии ММР-9 позволяют достоверно различать доброкачественные и злокачественные опухоли мочевого пузыря, а также проводить дифференциальную диагностику уротели-альных карцином низкой и высокой степени злокачественности.

Коллаген IV является основным компонентом базальной мембраны эпителиальных клеток, он также встречается в стенке артериальных сосудов и собственном веществе соединительной ткани. Инвазивные свойства опухолевых клеток связаны с разрушением этого важного компонента соединительной ткани. В настоящем исследовании изучалось распределение коллагена IV в базальной мембране и строме различных опухолевых образованиях от папилломы до карциномы высокой степени злокачественности. Коллаген IV выявлялся вдоль базальной мембраны эпителиальных клеток в виде тонкой коричневой полоски различной интенсивности.

Результаты полуколичественного анализа распределения коллагена IV в базальной мембране различных опухолевых образований мочевого пузыря представлены в табл. 1. Как видно из приведенных данных, самый высокий уровень экспрессии коллагена IV отмечен в папилломах мочевого пузыря (1,4 ± 0,5 у. е.) и ОНЗП (1,3 ± 0,5у. е.), достоверных различий между этими показателями нами не выявлено. В базальной мембране инвазивных карцином (Т1, Т2, Т3) мочевого пузыря уровень экспрессии коллагена IV уменьшался более чем в 2 раза и достоверно отличался от аналогичного показателя в папилломах и ОНЗП. Однако достоверных различий между стадиями развития карцином нами не выявлено.

Было исследовано распределение коллагена IV в базальной мембране опухолей в зависимости от их степени злокачественного потенциала, полученные данные представлены в табл. 2. Как видно из табл. 2, существуют достоверные различия по распределению коллагена

IV в базальной мембране при доброкачественных (Та) и злокачественных (Т1, Т2) опухолях мочевого пузыря. По интенсивности окрашивания коллагена IV в базальной мембране опухолей достоверно различаются уро-телиальные карциномы низкой и высокой степени злокачественности.

Таким образом, показатели распределения коллагена IV характеризуют доброкачественные и злокачественные опухоли мочевого пузыря, а также позволяют проводить дифференциальную диагностику уротелиальных карцином низкой и высокой степени злокачественности.

Обсуждение

Изучение молекулярных особенностей онкогенеза открывает новые возможности диагностики и лечения уротелиальных опухолей мочевого пузыря, помогает в определении инвазивных свойств и биологического потенциала опухолей.

В ряде случаев определение инвазии РМП в собственную пластинку слизистой оболочки представляет некоторые трудности (A. Lopez-Beltran, L. Cheng, 2003). При изготовлении гистологических срезов сосочковые структуры неизбежно попадают в срез в скошенном положении и в субэпителиальной соединительной ткани появляются изолированные гнезда неинвазивных опухолевых клеток. При хроническом цистите, часто сопровождающем уротелиальные новообразования, в воспалительном инфильтрате затруднено обнаружение отдельных инвазирующих клеток. Термическое повреждение также препятствует корректной оценке клеточной морфологии. В подобных ситуациях диагноз инвазии может быть принят либо отвергнут с помощью ИГХ- реакции на ММР-9.

В табл. 3 представлены корреляционные отношения между морфологическими характеристиками опухолей мочевого пузыря и исследованными их ИГХ-показателями.

Как видно из представленных данных, между стадией опухолевого роста и степенью злокачественности опухолевых клеток существует выраженная положительная корреляция (0,872), что свидетельствует о значительном клеточном атипизме в опухолях высоких стадий. Это положение подтверждается и высокой корреляционной зависимостью между стадией опухоли и индексом пролиферативной активности опухолевых клеток по показателю Ki-67 (0,850). Как следует из данных табл. 3, эта зависимость несколько выше между степенью злокачественности опухолевых клеток и их пролиферативной активностью (0,866), чем между стадией процесса и пролиферацией клеток. Стадия опухолевого процесса также умеренно положительно коррелированна с экспрессией в клетках ММР-9 (0,655) и отрицательно с распределением в базальной мембране коллагена IV (— 0,654). При этом следует отметить более высокий уровень положительной корреляции экспрессии ММР-9 в клетках со

Таблица 3. Корреляционные отношения между ИГХ- и морфологическими характеристиками опухолей мочевого пузыря

Фактор Показатель TNM G Ki-67 MMP-9 Col IV

Коэффициент

TNM корреляции 1,GGG G,872 G,85G G,655 - G,654

р G,G1 G,G1 G,G1 G,G1

N 43 43 43 43 43

Коэффициент

G корреляции G,872 1,GGG G,866 G,761 - G,796

р G,G1 G,G1 G,G1 G,G1

N 43 43 43 43 43

Коэффициент

Ki-67 корреляции р G,85G G,G1 G,866 G,G1 1,GGG G,671 G,G1 - G,671 G,G1

N 43 43 43 43 43

Коэффициент

MMP-9 корреляции р G,655 G,G1 G,761 G,G1 G,671 G,G1 1,GGG - G,6G2 G,G1

N 43 43 43 43 43

Коэффициет

Col IV корреляции - G,654 - G,796 - G,671 - G,6G2 1,GGG

р G,G1 G,G1 G,G1 G,G1

N 43 43 43 43 43

Примечание. Со1 IV — коллаген IV.

степенью злокачественности опухоли (0,761) и высокую отрицательную корреляцию между этим показателем и распределением коллагена IV вдоль базальной мембраны опухоли (— 0,796).

Скорее всего, эти данные можно объяснить наличием умеренной положительной корреляционной связи между ИП клеток по показателю Ю-67 и экспрессией в клетках ММР-9 (0,671). В свою очередь, экспрессия в клетках ММР-9 имеет умеренную отрицательную корреляционную связь с распределением вдоль базальной мембраны коллагена IV (— 0,602).

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что по мере увеличения стадии опухолевого процесса возрастает степень злокачественности клеток и увеличивается их пролиферативная

активность. В активно пролиферирующих клетках возрастает экспрессия ММР-9, которая разрушает коллаген IV базальной мембраны уротелия и активизирует инвазию опухолевых клеток в подлежащие ткани.

Следовательно, проведение данных исследований позволяет не только более точно определить стадию опухолевого роста, но и предположить ее распространенность в окружающие ткани.

Все вышеизложенное позволяет считать вероятным высокую степень рецидива опухоли при высокой экспрессии ММР-9. В связи с этим возникает необходимость тщательного динамического наблюдения за данной категорией пациентов с обязательными общеклиническим и эндоскопическим обследованием, целью которого будет выявление возможного рецидива заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аксель Е.М. Заболеваемость злокачественными новообразованиями мочевых и мужских половых органов в России в 2003 г. Онкоурология 2005;1:6-9.

2. Суринов А.Е. Здравоохранение в России, 2005. Сб. статей. М., 2006; с.10.

3. Epstein J.I., Amin M.B., Reuter V.R. et al. The World Health Organization/International Society of Urological Pathology consensus classification of urothelial (transitional cell) neoplasms of the urinary bladder. Bladder

Consensus Conference Committee .

Am J Surg Pathol 1998;22(12):1435-48.

4. Amin M.B., Murphy W.M., Reuter V.E. et al. A symposium on controversies in the pathology of transitional cell carcinomas of the urinary bladder. Anat Pathol 1996;1:1-39.

5. Cameron K.M., Lupton C.H. Inverted papilloma of the lower urinary tract. Br J Urol 1976; 48:567-577.

6. Lopez-Beltran A., Pacelli A., Rothenberg H.J. et al. Carcinosarcoma and sarcomatoid

carcinoma of the bladder: clinicopathological study of 41 cases. J Urol 1998;159:1497-503.

7. Kunze E., Schauer A., Schmitt M. Histology and histogenesis of two different types of inverted urothelial papillomas. Cancer 1983;51:348-58.

8. Lopez-Beltran A., Croghan G.A.,

Croghan I. et al. Prognostic factors in bladder cancer. A pathologic, immunohistochemical, and DNA flow-cytometric study. Am J Clin Pathol 1994;102:109-14.