ПОЛИПЕПТИДЫ ГЕМАГГЛЮТИНИНОВ, А ТАКЖЕ СВЯЗАННЫЕ С НИМИ РЕАГЕНТЫ И СПОСОБЫ
HEMAGGLUTININ POLYPEPTIDES, AND REAGENTS AND METHODS RELATING THERETO

Перекрестные ссылки на родственные заявки
[0001] В настоящей заявке испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на патент США №61/389639, поданной 4 октября 2010 г, полное содержание которой включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Государственная поддержка
[0002] Данное изобретение было сделано при государственной поддержке по грантам под номерами GM57073 и U54 GM62116, выданным Национальным Институтом Здравоохранения. Правительство Соединенных Штатов Америки может иметь определенные права на данное изобретение.
Уровень техники
[0003] Грипп имеет долгую историю пандемий, эпидемий, возобновления активности и вспышек. Птичий грипп, включая штамм H5N1, является высоко контагиозным и потенциально смертельным патогеном, но в настоящее время он обладает лишь ограниченной способностью инфицировать людей. Однако были сделаны исторические наблюдения, что у вирусов птичьего гриппа могут накапливаться мутации, которые изменяют их специфичность в отношении хозяина и позволяют легко инфицировать человека. Фактически две из крупных пандемий гриппа в последние сто лет были вызваны вирусами птичьего гриппа, которые изменили свое генетическое строение и стали способны инфицировать человека.
[0004] Существует серьезная обеспокоенность тем, что существующие в настоящее время штаммы вирусов птичьего гриппа H5N1, H7N7, H9N2 и H2N2 могли накопить мутации, которые изменили их специфичность в отношении хозяина и позволяют легко инфицировать человека. Следовательно, есть необходимость установить, действительно ли белок-гемагглютинин (ГА) у данных штаммов превращается в форму, которая может легко инфицировать человека, а также далее требуется идентифицировать варианты ГА с такой способностью. Также необходимо получить представление о характеристиках белков ГА в общем, которые делают возможным или препятствуют инфицированию различных субъектов, в частности людей. Также есть необходимость в разработке вакцин и терапевтических стратегий для эффективного лечения или отсрочки начала заболевания, вызванного вирусом гриппа.
Краткое описание
[0005] Настоящее изобретение относится к связывающим агентам с определенными характеристиками связывания с гликанами. В частности, согласно настоящему изобретению предложены связывающие агенты, которые связываются с сиалированными гликанами, обладающими топологией, напоминающей зонтик. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с гликанами, обладающими топологией зонтика, с высоким сродством и/или специфичностью. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению демонстрируют предпочтительное связывание с гликанами, обладающими топологией зонтика, по сравнению с гликанами с топологией конуса. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению конкурируют с гемагглютинином за связывание с гликанами на рецепторах гемагглютининов. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению конкурируют с гемагглютинином за связывание с гликанами с топологией зонтика.
[0006] Также согласно настоящему изобретению предложены диагностические и терапевтические реагенты и способы, связанные с предложенными связывающими агентами, включая вакцины.
[0007] В частности, настоящее изобретение основано на установление того факта, что варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16) с измененным гликозилированием могут проявлять увеличенное (или уменьшенное) связывание с рецепторами ГА человека по сравнению с эталонным полипептидом ГА. Согласно некоторым вариантам реализации эталонным полипептидом ГА является любой из следующих полипептидов ГА:
[0008] А/Южная Каролина/1/18 (H1):
[0009] А/Брисбен/59/07 (H1):
[0010] А/Калифорния/04/09 (H1):
[0011] А/Албания/6/58 (H2):
[0012] А/Аичи/1/68 (H3):
[0013] А/Москва/10/99 (H3):
[0014] А/Перт/16/09 (H3):
[0015] А/Вьетнам/1203/04 (H5):
[0016] A/Египет/2786-NAMRU3/06 (H5):
[0017] А/Нью-Йорк/107/03 (H7):
[0018] Также настоящее изобретение в частности основано на том, что варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16) с изменениями в петлевой области ГА могут проявлять увеличенное (или уменьшенное) связывание с рецепторами ГА человека по сравнению с эталонным полипептидом ГА (например, включая полипептид ГА в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID №:43-52).
[0019] Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение основао на том, что варианты полипептида ГА H5 с измененным гликозилированием могут проявлять увеличенное (или уменьшенное) связывание с рецепторами ГА человека по сравнению с эталонным полипептидом ГА. Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом является любой из следующих полипептидов ГА:
[0020] А/Гонконг/486/97
[0021] А/Гонконг/213/03
[0022] А/Вьетнам/1203/04
[0023] А/Индонезия/5/05
[0024] A/Египет/2786-NAMRU3/06
[0025] Также настоящее изобретение в частности основано на том, что варианты полипептида ГА H5 с изменениями в петлевой области ГА могут проявлять увеличенное (или уменьшенное) связывание с рецепторами ГА человека по сравнению с эталонным полипептидом ГА (например, включая полипептид ГА в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID №:50, 51 и 53-55).
Краткое описание рисунков
[0026] Фигуры 1A-1C. Выравнивание примерных последовательностей ГА дикого типа. Последовательности были получены из базы данных вирусов гриппа NCBI (Национальный центр биотехнологической информации) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html). H1_Av (SEQ ID №:1). H1_Hu1 (SEQ ID №:2). H1_Hu2 (SEQ ID №:3). H2_Av (SEQ ID №:4). H2_Hu (SEQ ID №:5). H3_Av (SEQ ID №:6). H3_Hul (SEQ ID №:7). H3_Hu2 (SEQ ID №:8). H4_Av (SEQ ID №:9). H5_Av1 (SEQ ID №:10). H5_Av2 (SEQ ID №:11). H6_Av (SEQ ID №:12). H7_Av (SEQ ID №:13). H8_Av (SEQ ID №:14). H9_Av (SEQ ID №:15). H10_Av (SEQ ID №:16). H11_Av (SEQ ID №:17). H12_Av(SEQ ID №:18). H13_Av (SEQ ID №:19). H14_Av (SEQ ID №:20). H15_Av (SEQ ID №:21). H16_Av (SEQ ID №:22).
[0027] Фигуры 2A-2B. Выравнивание последовательностей связывающего гликан домена ГА. Серый цвет: консервативные аминокислоты, участвующие в связывании сиаловой кислоты. Красный цвет: конкретные аминокислоты, участвующие в связывании мотивов Neu5Acα2-3/6Gal. Желтый цвет: аминокислоты, которые влияют на позиционирование Q226 (137, 138) и Е190 (186, 228). Зеленый цвет: аминокислоты, участвующие в связывании с другими моносахаридами (или модификациями), присоединенными к мотиву Neu5Acα2-3/6Gal. Последовательности ASI30, APR34, ADU63, ADS97 и Viet04 были получены из соответствующих кристаллических структур. Другие последовательности были получены из SwissProt (http://us.expasy.org). Сокращения: ADA76, А/утка/Альберта/35/76 (H1N1) (SEQ ID №:23); ASI30, А/свинья/Айова/30 (H1N1) (SEQ ID №:24); APR34, А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) (SEQ ID №:25); ASC18, А/Южная Каролина/1/18 (H1N1) (SEQ ID №:26); AT91, А/Техас/36/91 (H1N1) (SEQ ID №:27); ANY 18, А/Нью-Йорк/1/18 (H1N1) (SEQ ID №:28); ADU63, А/утка/Украина/1/63 (H3N8) (SEQ ID №:29); AAI68, А/Аичи/2/68 (H3N2) (SEQ ID №:30); AM99, А/Москва/10/99 (H3N2) (SEQ ID №:31); ADS97, А/утка/Сингапур/3/97 (H5N3) (SEQ ID №:32); Viet04, А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1) (SEQ ID №:33).
[0028] Фигуры 3A-3B. Выравнивание последовательностей, иллюстрирующее характеристики консервативных подпоследовательностей ГА H1. На Фигуре 3A представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1A, за исключением того, что на Фигуре 3A указано присутствие дополнительной консервативной последовательности. На Фигуре 3B представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1C, за исключением того, что на Фигуре 3A указано присутствие дополнительной консервативной последовательности.
[0029] Фигуры 4A-4B. Выравнивание последовательностей, иллюстрирующее характеристики консервативных подпоследовательностей ГА H3. На фигуре 4A представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1А, за исключением того, что на Фигуре 4A указано присутствие дополнительной консервативной последовательности. На Фигуре 4В представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1C, за исключением того, что на Фигуре 4A указано присутствие дополнительной консервативной последовательности.
[0030] Фигура 5A-1. Выравнивание последовательностей, иллюстрирующее характеристики консервативных подпоследовательностей ГА H5. На Фигуре 5A-1 представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1A, за исключением того, что на Фигуре 5A-1 указано присутствие дополнительной консервативной последовательности.
[0031] На Фигуре 5A-2 представлено то же выравнивание, что и на Фигуре 1C, за исключением того, что на Фигуре 5A-2 указано присутствие дополнительной консервативной последовательности.
[0032] На Фигурах 5B1-5B5 представлено выравнивание дополнительных последовательностей H5HA. Консенсусная последовательность (SEQ ID №:34); AAL59142 (SEQ ID №:35); AAZ29963 (SEQ ID №:36); ABA70758 (SEQ ID №:37); ABB87042 (SEQ ID №:38); ABD14810 (SEQ ID №:39); ABD46740 (SEQ ID №:40); ABD85144 (SEQ ID №:41); и ABE97569 (SEQ ID №:42).
[0033] На Фигуре 5B-6 представлены дополнительные штаммы вирусов птичьего гриппа 4 (ГА) H5N1.
[0034] Фигуры 6A, 6B-1-6B-2 и 6C-A-6C-F. Основа для понимания специфичности рецепторов гликанов. α2-3- и/или α2-6-связанные гликаны могут принимать разную топологию. Согласно настоящему изобретению способность полипептида ГА к связыванию с определенными из данных топологий придает ему способность к опосредованию инфицирования у разных хозяев, например, человека. Как проиллюстрировано на панели А данной фигуры, в настоящем изобретении определены две особенно значимые топологии - тополгия «конуса» и топология «зонтика». Топологию конуса могут принимать α2-3- и/или α2-6-связанные гликаны, и она типична для коротких олигосахаридов или разветвленных олигосахаридов, присоединенных к коровой структуре (хотя данную топологию могут принимать и определенные длинные олигосахариды). Топологию зонтика могут принимать только α2-6-связанные гликаны (предположительно из-за повышенной конформационной некомпактности, обеспечиваемой дополнительной С5-С6 связью, которая присутствует в связи α2-6), и ее преимущественно принимают длинные олигосахариды или разветвленные гликаны с длинными цепями олигосахаридов, особенно содержащие мотив Neu5Acα2-6Galβ1-3/4GlcNAc-. Как описано в настоящей заявке, способность полипептидов ГА к связыванию с гликанами с топологией зонтика дает возможность связывания с рецепторами человека и/или способность к опосредованию инфицирования человека. На панели B данной фигуры кокретно показана топология α2-3 и α2-6, регулируемая углами внутреннего вращения гликозидов трисахаридных мотивов - Neu5Acα2-3Galβ1-3/4GlcNAc и Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAc, соответственно. Чтобы охарактеризовать топологию определяли параметр (θ) - угол между атомом C2 Neu5Ac и атомом C1 последующего Gal и сахарами GlcNAc в данных трисахаридных мотивах. Наложение контура θ и конформационные карты мотивов α2-3 и α2-6 показывают, что мотивы α2-3 и α2-6 в 100% случаев принимают топологию конуса, а мотивы α2-6 принимают и топологию, напоминающую конус, и топологию, напоминающую зонтик (панель C). В топологии, напоминающей конус, которую принимают и α2-3, и α2-6, GlcNAc и последующие сахара расположены вдоль области, охватывающей конус. Взаимодействия ГА с топологией, напоминающей конус, главным образом включают контакты аминокислот в пронумерованных положениях (на основании нумерации ГА H3) с сахарами Neu5Ac. С другой стороны, в топологии, напоминающей зонтик, которая уникальна для α2-6, GlcNAc и последующие сахара изгибаются по направлению к сайту связывания ГА (который выявляется в совместной кристаллической структуре ГА-α2-6). Для более длинных α2-6-олигосахаридов (например, по меньшей мере для тетрасахаридов) данная конформация может быть предпочтительной, поскольку она стабилизирована внутриуглеводными Вандервальсовыми силами между ацетильными группами GlcNAc и Neu5Ac. Взаимодействия ГА с топологией, напоминающей зонтик, включают контакты аминокислот в нумерованных положениях (на основании нумерации ГА H3) с сахарами GlcNAc и последующими сахарами, наряду с контактами с сахарами Neu5Ac и Gal. На панели С данной фигуры показано распределение конформаций для топологии, напоминающей конус, и топологии, напоминающей зонтик, у структур α2-3 и α2-6. В секциях (A)-(D) показаны конформационные (φ, ψ) карты связей Neu5Acα2-3Gal, Neu5Acα2-6Gal, Galβ1-3GlcNAc и Galβ1-4GlcNAc, соответственно. Указанные карты, полученные от GlycoMaps DB (http://www.glvcosciences.de/modeling/glycomapsdb/). были сгенерированы при помощи моделирования методом молекулярной динамики ab initio с применением силового поля метода ММ3. Распределение энергии закодировано цветом от темного (соответствует максимальной энергии) до светлого, соответствующего наименьшей энергии. Обведенные кружком области 1-5 соответствуют (φ, ψ) значениям, наблюдаемым для олигосахаридов α2-3 и α2-6 в совместной кристаллической структуре ГА-гликан. Транс-конформация (обведенная область 1) Neu5Acα2-3Gal преобладает в связывающем кармане ГА за исключением совместной кристаллической структуры ГА А/Аичи/2/68 H3N2 с α2-3, в которой данная конформация является гош-конформацией (обведенная область 2). С другой стороны цис-конформация Neu5Acα2-6Gal (обведенная область 3) преобладает в связывающем кармане ГА. Топология, напоминающая конус, выбрана обведенными областями 1 и 2, а топология, напоминающая зонтик, выбрана обведенной областью 3. В секциях (E)-(F) показано распределение топологии, напоминающей конус, и топологии, напоминающей зонтик, мотивами α2-3 и α2-6, соответственно. Более темные области на конформационных картах применяли в качестве внешних границ для расчета параметра θ (угол между атомом C2 Neu5Ac и атомом C1 последующего Gal и сахарами GlcNAc) для данного набора значений (φ, ψ). На основании порогового значения энергии, для описания топологии, напоминающей конус, применяли значение θ>110°, а для описания топологии, напоминающей зонтик, значение θ<100°. Наложение контура θ и конформационные карты показывали, что мотив α2-3 принимает 100% топологию, напоминающую конус, поскольку ему энергетически не выгодно принимать топологию, напоминающую зонтик. С другой стороны, мотив α2-6 принимает и топологию, напоминающую конус, и топологию, напоминающую зонтик, и данный выбор был классифицирован на основании угла ω (O-C6-C5-H5) связи Neu5Acα2-6Gal.
[0035] Фигура 7. Взаимодействия остатков ГА с топологией конуса в сравнении с топологией зонтика. Анализ совместной кристаллической структуры ГА-гликанов выявил, что положение Neu5Ac относительно сайта связывания ГА почти неизменно. Контакты с Neu5Ac включают высоко консервативные остатки, такие как F98, S/T136, W153, H183 и L/I194. Контакты с другими сахарами включают разные остатки в зависимости от того, α2-3 или α2-6 связь между углеводами, а также от того, топология типа консуса или зонтика. Например, в топологии конуса основные контакты образуются с Neu5Ac и с сахарами Gal. E190 и Q226 играют определяющую роль в таком связывании. Данная фигура также иллюстрирует другие положения (например, 137, 145, 186, 187, 193, 222), которые могут участвовать в связывании со структурами типа конусов. Тип аминокислоты в указанных положениях может влиять на способность полипептида ГА связываться с рецепторами с разной модификацией и/или характером ветвления в структурах гликанов. В топологии зонтика контакты образованы сахарами за пределами Neu5Ac и Gal. Данная фигура также иллюстрирует другие положения (например, 137, 145, 156, 159, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 196, 222, 225, 226), которые могут участвовать в связывании со структурами типа зонтика. В некоторых случаях другие остатки могут образовывать другие контакты с разными структурами гликанов. Тип аминокислоты в указанных положениях может влиять на способность полипептида ГА связываться с рецепторами с разной модификацией и/или характером ветвления в структурах гликанов. Согласно некоторым вариантам реализации вклад в связывание с топологиями зонтика вносит остаток D в положении 190 и/или остаток D в положении 225.
[0036] Фигура 8. Примеры топологии конуса. Данная фигура иллюстрирует примеры (не исчерпывающие) структур гликанов, которые принимают топологию конуса.
[0037] Фигуры 9A-1-9A-7 и 9B. Примеры топологии зонтика. (A) Конкретный пример (не исчерпывающий) структур N- и O-связанных гликанов, которые могут принимать топологию зонтика. (B) Конкретный пример (не исчерпывающий) структур O-связанных гликанов, которые могут принимать топологию зонтика.
[0038] Фигуры 10A-10B. Профиль гликанов в клетках эпителия бронхов человека и клеток эпителия толстой кишки. Для дальнейшего изучения многообразия гликанов в тканях верхних дыхательных путей из НВЕ (линия клеток, репрезентативных для верхних дыхательных путей) выделяли N-связанные гликаны и анализировали их посредством MALDI-MS (масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы). Преобладающая экспрессия α2-6 в HBE была подтверждена посредством предварительной обработки пробы сиалидазой S (α2-3-специфичной) и сиалидазой A (расщепляет и SA). Преобладающая экспрессия гликанов с длинными ветвями подтверждается посредством анализа фрагментации TOF-TOF (тандемной времяпролетной) репрезентативных максимумов масс-спектра. Чтобы получить эталон для оценки многообразия гликанов в тканях верхних дыхательных путей, был получен профиль N-связанных гликанов в эпителиальных клетках толстой кишки. Данная линия клеток была выбрана, поскольку было показано, что современные вирусы H5N1 инфицируют клетки кишечника. Контроли с предварительной обработкой сиалидазой А и S показали преобладание экспрессии α2-3-гликанов в клетках HT-29. Кроме того, топология гликанов с длинными цепями не настолько распространена, как в случае клеток НВЕ. Следовательно, адаптация ГА H5N1 к организму человека может подразумевать мутации ГА, которые создают возможность для связывания с разнообразными гликанами, экспрессируемыми в тканях верхних дыхательных путей, с высоким сродством (например, гликаны с топологией зонтика).
α2-3
α2-3
α2-6
α2-3
[0039] Фигуры 11A-11D. Конформационная карта и доступность для растворителей мотивов Neu5Acα2-3Gal и Neu5Acα2-6Gal. На панели А показана конформационная карта связи Neu5Acα2-3Gal. Обведенная кружком область 2 представляет собой транс-конформацию, наблюдаемую в совместных кристаллических структурах APR34_H1_23, ADU63_H3_23 и ADS97_H5_23. Обведенная кружком область 1 представляет собой конформацию, наблюдаемую в совместной кристаллической структуре АА168_H3_23. На панели В показана конформационная карта связи Neu5Acα2-6Gal, где цис-конформация (обведенная область 3) наблюдается во всех совместных кристаллических структурах ГА-α2-6-сиалированный гликан. На панели C показано различие между площадью доступной для растворителя поверхности (SASA) в Neu5Acα2-3 и α2-6-сиалированных олигосахаридах в совместных кристаллических структурах ГА-гликан. Красные и синие столбцы, соответственно, показывают, что Neu5Ac в α2-6 (положительное значение) или α2-3 (отрицательное значение) - сиалированных гликанах образует больше контактов с сайтом связывания гликана. На панели D показано различие между SASA NeuAc в α2-3-сиалированных гликанах, связанных с H1 свиньи и человека (H1), H3 птиц и человека (H3), и NeuAc в α2-6-сиалированных гликанах, связанных с H1 свиньи и человека (H1). Отрицательный столбик для H3 показывает, что контактов ГА H3 человека с Neu5Acα2-3Gal меньше, чем у H3 птиц. Углы внутреннего вращения - φ: C2-C1-O-C3 (для связи Neu5Acα2-3/6); ψ: C1-O-C3-H3 (для Neu5Acα2-3Gal) или C1-O-C6-C5 (для Neu5Acα2-6Gal); ω: O-C6-C5-H5 (для Neu5Acα2-6Gal) связей. Карты φ, ψ были получены от GlycoMaps DB (http://www.glycosciences.de/modeling/glycomapsdb/), которые были разработаны доктором Мартином Франком и доктором Клаус-Вильгельмом фон дер Лит (Германский центр исследования рака, Гейдельберг, Германия). Цветовая схема от высокой энергии к низкой энергии соответствует переходу от ярко-красного к ярко-зеленому цвету, соответственно.
[0040] Фигура 12A-12B. Окрашивание срезов ткани верхних дыхательных путей пектинами. Совместное окрашивание ткани трахеи Джакалином (светлее) и Конканавалином A (ConA - темнее) выявило предпочтительное связывание Джакалина (специфически связывается с O-связанными гликанами) с бокаловидными клетками на апикальной поверхности трахеи и ConA (специфически связывается с N-связанными гликанами) с клетками ресничного эпителия трахеи. Не вдаваясь в конкретные теоретические объяснения, стоит отметить, что такое связывание указывает на то, что бокаловидные клетки экспрессируют преимущественно O-связанные гликаны, тогда как клетки ресничного эпителия экспрессируют преимущественно N-связанные гликаны. Совместное окрашивание трахеи Джакалином и SNA (темный; специфически связывается с α2-6) указывает на связывание SNA как с бокаловидными, так и с ресничными клетками. С другой стороны, совместное окрашивание Джакалином (светлее) и MAL (темнее), который специфически связывается с α2-3-сиалированными гликанами, показывает слабое минимальное связывание или отсутствие связывания MAL с многорядным эпителием трахеи, но интенсивное связывание с нижележащими областями данной ткани. В совокупности данные, полученные при окрашивании пектинами, показали преобладающую экспрессию и широкое распределение α2-6-сиалированных гликанов в составе N-связанных или O-связанных гликанов, соответственно, в ресничных и бокаловидных клетках на апикальной стороне эпителия трахеи.
[0041] Фигура 13: Сравнение RBS (связывающих сайтов рецептора) ГА в разных генетических кладах. А/Гонконг/486/97, Генетическая клада 0 (HK_486_97_C0) (SEQ ID №:76); А/утка/человек/795/02, Генетическая клада 2.1.1 (DK_Hunan_795_02_c.2.1.1) (SEQ ID №:77); А/Гонконг/213/03, Генетическая клада 1 (Hk_213_03_c1) (SEQ ID №:78); А/Вьетнам/1194/04, Генетическая клада 1 (Viet_1194_04_c1) (SEQ ID №:79); А/Вьетнам/1203/04, Генетическая клада 1 (Viet_1203_04_c1) (SEQ ID №:80); А/Индонезия/5/05, Генетическая клада 2.1.3 (Ind_5_05_c2.1.3) (SEQ ID №:81); А/Аньхой1/05, Генетическая клада 2.3.4 (Anhui_1_05_c2.3.4) (SEQ ID №:82); A/Египет/2786-NAMRU3/06, Генетическая клада 2.2 (Egypt_2876-N3_06_c2.2) (SEQ ID №:83); А/гусь/Гуйян/337/06, Генетическая клада 4 (Go_Guiy_337_06_c4) (SEQ ID №:84); А/Египет/2321-NAMRU3/07, Генетическая клада 2.2.1 (Egypt_2321-N3_07_c2.2.1) (SEQ ID №:85); A/Египет/3300-NAMRU3/08, Генетическая клада 2.2.1 (Egypt_3300-N3_08_c.2.2.1) (SEQ ID №:86); А/сорока/Гонконг/5052/07, Генетическая клада 2.3.2 (Mag_HK_5052_07_c.2.3.2) (SEQ ID №:87); А/курица/Вьетнам/NCVD-016/2008, Генетическая клада 7 (Ck_Viet_NCVD-016_08_c7) (SEQ ID №:88).
[0042] Фигура 14: Адаптирована из Stevens et al., 2008, J. Mol. Biol., 381: 1382-94. Viet0304: А/Вьетнам/1203/04. Ind505: А/Индонезия/5/05. LS: Мутации RBS ГА Q226L и G228S.
[0043] Фигура 15: ГА Viet0304-LS и Viet0304-RLS (эквивалентен Ind505-LS) дозозависимо анализировали на нашей матрице гликанов, содержащей репрезентативные рецепторы птиц и человека. Оба мутанта продемонстрировали минимальное связывание с α2-6 (сигналы связывания наблюдались только при высокой концентрации ГА), что отличается от высокого сродства связывания с α2-6, которое характерно и для адаптированных к организму человека ГА.
[0044] Фигура 16: Анализ зависимости от дозы для ГА H5N1, которые не подвергаются гликозилированию на N158 в контексте мутации LS. Устранение гликозилирования на N158 в контексте мутации LS повышало сродство связывания с рецепторами до того же диапазона (Kd' ~20 пМ), который наблюдался для ГА адаптированных к организму человека H1N1 and H2N2. Устранение гликозилирования на N158 в матрице ГА H5 с одной только мутацией Q226L (т.е., без G228S мутации LS) приводило к повышенному предпочтению в отношении рецепторов человека (по сравнению с рецепторами птиц), но к существенно сниженному сродству связывания с рецепторами по сравнению с N158-дегликозилированным мутантом LS.
[0045] Фигура 17: Сравнение отличительных признаков RBS между ГА адаптированного к организму человека H2N2 (Alb6_58) и ГА H5N1 (Viet1203_04). Четыре различия между ГА H2N2 и ГА H5N1 включают: (1) состав 130 петли в ГА H2N2, который включает делецию, (2) отсутствие гликозилирования в положении 158 ГА H2N2, (3) аминокислотный состав основания участвующих в RBS положений 137, 221, 226 и 228, и (4) аминокислотный состав на верхней части участвующих в RBS положений 188, 192 и 193.
[0046] Фигура 18: Сравнение RBS мутантов ГА H5 с RBS ГА H2N2. Alb6_58_H2N2 (SEQ ID №:89): А/Албания/6/58 H2N2 HA; Viet1203_04_D (SEQ ID №:90): модифицированная версия А/Вьетнам/1203/04 HA; Viet1203_04_D_H2RBS (SEQ ID №:91): мутант Vietl203_04_D с делецией в положении 130 и 13 заменами аминокислот; Viet1203_04_D_H2RBSmin (SEQ ID №:92): мутант Viet1203_04_D с делецией в положении 130 и 7 заменами; ckEgy_07 (SEQ ID №:93): А/курица/Египет/R2/2007 ГА H5N1, который уже содержит делецию в положении 130; ckEgy_07_H2RBS (SEQ ID №:94): мутант ckEgy_07 с 8 заменами; ckViet_08 (SEQ ID №:95): А/курица/Вьетнам/NCVD-093/2008 H5N1 HA, который уже содержит смену заряда в положениях 192 и 193; ckViet_08_H2RBS (SEQ ID №:96): мутант ckViet_08 с делецией в положении 130 и 6 заменами; ckViet_08H2RBSmin (SEQ ID №:97): мутант ckViet_08 с делецией в положении 130 и 6 заменами; ckViet_08_H2RBSmin (SEQ ID №:98): мутант ckViet_08 делецией в положении 130 и 4 заменами. Остальные положения, в которых произошли замены, выделены жирным шрифтом и цветом. Указанная делеция в петле 130 показана жирным шрифтом и выделена цветом. Гликозилирование в положении 158 выделено цветом.
[0047] Фигура 19: Анализ зависимости от дозы для ГА H5N1 (Viet1203_04_D_H2RBS), модифицированного так, что молекулярный состав его RBS имитирует ГА адаптированного к организму человека H2N2. Данный мутант демонстрирует связывание с рецепторами человека с высокой специфичностью и высоким сродством, что характерно для других ГА, адаптированных к организму человека. Сродство связывания данного мутанта с рецептором человека (6'SLN-LN) оценивают количественно по Kd' ~3 пМ, что попадает в тот же диапазон, что и сродство для адаптированных к организму человека ГА H1N1 и H2N2.
[0048] Фигура 20: Характерные свойства связывания гликан-рецептор для пандемичных ГА
ГА из прототипных адаптированных к организму человека пандемичных штаммов 1918 H1N1 (57) и 1958 H2N2 (S2), а также штамма 2009 H1N1 (S3) демонстрируют специфическое высокоаффинное связывание с рецепторами человека (6'SLN-LN), и минимальное или существенно сниженное сродство связывания с рецепторами птиц (3'SLN-LN) (по сравнению со сродством к рецепторам человека). С другой стороны введение характерной мутации LS в последовательность ГА Viet1203_04 H5N1 не приводит к переключению рецепторного предпочтения на связывание с рецептором человека, отмечаемого у пандемических ГА.
[0049] Фигура 21: Филогенетическое дерево репрезентативных последовательностей из подтипов ГА
Ветви, ведущие к кладам 1 и 2 ГА, отмечены и показаны красным и синим цветом, соответственно. Близкородственные подтипы расположены на ветвях, расположенных близко друг к другу.
[0050] Фигура 22: Ключевые структурные особенности в RBS ГА H5
На данной фигуре показана схема, отражающая RBS ГА Alb6_58 (серый цвет) и Viet0304 (зеленый цвет) с боковыми цепями аминокислот, которые различаются между указанными ГА. Четыре характерные черты, которые отличают RBS H2 от H5, которые описаны в тексте, выделены цветом в пунктирных красных кружках.
[0051] Фигура 23: Выравнивание последовательностей RBS репрезентативных ГА H2 и H5
Выравниванию подвергают последовательности ГА из пандемичного штамма H2N2 (А/Албания/6/58 или Alb58) (SEQ ID №:98), репрезентативных изолятов, выделенных у человека с 1997 по 2006 год (А/Гонконг/486/97 или НК_486_97 (SEQ ID №:105), А/Гонконг/213/03 или НК_213_03 (SEQ ID №:104), А/Вьетнам/1203/04 или Viet1203_04 (SEQ ID №:103), А/Индонезия/5/05 или Ind_5_05 (SEQ ID №:102), A/Египет/2786-NAMRU3 или Egy_2786-N3_06 (SEQ ID №:101)) вместе с выбранным в качестве матрицы ГА H5 (А/курица/Египет/R2/07 или ckEgy_07) (SEQ ID №:100) для введения мутации LS (ckEgy_07mutv5.3) (SEQ ID №:99)).
[0052] Фигуры 24A-24C: Свойства связывания с рецепторами гликанов ckEgy_07 и ckEgy_07, содержащих замены аминокислот LS
Дозозависимое прямое связывание ГА с гликанами проводили на матрице вариантов гликанов, включающей репрезентативные рецепторы человека и животных. A - ГА ckEgy_07 дикого типа демонстрирует типичное специфичное и высокоаффинное связывание с рецептором птиц, характерное для других ГА H5N1 дикого типа. B - Введение мутаций LS в данный ГА количественно сдвигает данную специфичность в сторону рецептора человека (6'SLN-LN) и к существенному уменьшению связывания с рецептором птиц до минимального уровня. C - связывание мутанта LS ckEgy_07 с физиологическими рецепторами человека, экспрессируемыми преимущественно на апикальной поверхности среза ткани трахеи человека. Специфичность и сродство по отношению к рецептору человека, определенные на основании профиля дозозависимого связывания в совокупности с данными окрашивания тканей трахеи человека на мутантный ГА, таковы, что они могут быть достаточными, чтобы обеспечить воздушно-капельную передачу вируса H5N1, содержащего данный мутантный ГА в контексте других необходимых изменений (таких как PB2).
[0053] Фигура 25: Анализ влияния утраты гликозилирования в положении 158 в контексте мутаций LS на связывание ГА H5 с гликанами рецепторов. A - мутант ckEgy_07_LS демонстрирует количественное переключение, в чем напоминает другие пандемичные ГА. B - для сравнения показана кривая связывания для ГА А/Калифорния/04/2009 H1N1, адаптированная из предыдущего исследования (S3). C - мутация T160A в мутанте Viet03_04_ALS приводит к удалению сиквона гликозилирования в положении N158, что ведет к утрате гликозилирования на данном сайте. Хотя данный мутант демонстрирует существенное увеличение связывания с рецептором человека, он сохраняет большую часть связывания с рецептором птиц, что не характерно для пандемических ГА и мутанта ckEgy_07_LS (на верхней панели). D - мутации LS в последовательности аминокислот, введенные в последовательность ГА Egy_06, в которой от природы не происходит гликозилирования в положении 158, также демонстрируют такой же профиль связывания, как и мутант Viet03_04_ALS.
[0054] Фигура 26: Адаптирующие к организму человека изменения в последовательности аминокислот ГА H5N1, который в природе приобрел свойство 2
ГА вируса птиц H5N1 А/курица/Вьетнам/NCVD-093/2008 уже приобрел изменения последовательности аминокислот в петле 190, где положение 192 обычно содержит Thr, который мутировал и заменился на Lys, а положение 193 обычно содержит Lys/Arg, который мутировал и заменился на Met. Введение 6 аминокислотных замен и делеции, чтобы обеспечить соответствие свойству 1 (делеция в петле 130+A130T) и свойству 3 (S137R/S221P/Q226L/S227G/G228S), приводит к образованию мутантного ГА, который имеет количественный сдвиг к сторону предпочтения в отношении рецепторов человека, даже при наличии гликозилирования в положении 158. Однако при введении утраты гликозилирования T160A наряду с LS, без делеции петли 130 приводит к существенному снижению связывания с рецепторами человека и птиц (данные не показаны). Следовательно, для данных ГА H5N1 делеция петли 130 является более важным изменением, чем утрата гликозилирования в контексте мутации LS.
[0055] Фигуры 27A-27B: Выявление свойств у изолятов последнего H5 птиц и H5N1 человека
A - Процент изолятов H5N1 птиц и человека, у которых ГА приобрел изменения в последовательности аминокислот, чтобы соответствовать свойствам 1 и 4 RBS ГА H2, отложен на графике как функция от года, когда был выделен конкретный штамм. Имело место существенное увеличение процента изолятов, обладающих указанными ключевыми свойствами, с тех пор как они были впервые выявлены в 2007 году. Филогенетический анализ последовательностей данных изолятов показал, что они принадлежат к кладе 2.2.1. B - Процент изолятов вирусов птиц и человека, у которых ГА приобрел изменения в последовательности аминокислот, чтобы соответствовать свойству 2 RBS ГА H2. Данное свойство приобрел лишь малый процент изолятов H5N1. Было выполнено выравнивание непроцессированных неизбыточных последовательностей ГА из Ресурса вирусов гриппа NCBI, и встречаемость каждого из свойств вычисляли за нужный год и выражали в процентах. Всего для анализа применили 2277 непроцессированных неизбыточных последовательностей H5N1.
[0056] Фигура 28: Расширенная номенклатура гликанов, применяемых в матрице гликанов
Neu5Ac: N-ацетил-D-нейраминовая кислота; Gal: D-галактоза; GlcNAc: N-ацетил-D-глюкозамин. α/β: аномерная конфигурация пиранозных Сахаров. Все сахара связаны посредством линкера через спейсер - биотин
(-Sp-LC-LC-биотин, как описано на сайте http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecored5.shtml).
Описание элементов последовательностей ГА
Элемент 1 последовательности ГА
[0057] Элемент 1 последовательности ГА представляет собой элемент, соответствующий приблизительно остаткам в положениях 97-185 (где положения остатков обозначают, приняв за эталон ГА H3) многих белков ГА, обнаруживаемых у природных изолятов вирусов гриппа. Данный элемент последовательности обладает базовой структурой:
1
2
3
4
С(Y/F)PXCXWXWXHHP (SEQ ID №:106), в которой:
1
X обладает приблизительной длиной 30-45 аминокислот;
2
X обладает приблизительной длиной 5-20 аминокислот;
3
X обладает приблизительной длиной 25-30 аминокислот; и
4
X обладает приблизительной длиной 2 аминокислоты.
1
2
3
4
4
4
4
4
[0058] Согласно некоторым вариантам реализации X обладает длиной приблизительно 35-45, или приблизительно 35-43, или приблизительно 35, 36, 37, 38, 38, 40, 41, 42 или 43 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации, Х обладает длиной приблизительно 9-15, или приблизительно 9-14, или приблизительно 9, 10, 11, 12, 13 или 14 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации, X обладает длиной приблизительно 26-28, или приблизительно 26, 27 или 28 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации, X обладает последовательностью (G/A) (I/V). Согласно некоторым вариантам реализации X обладает последовательностью GI; согласно некоторым вариантам реализации X обладает последовательностью GV; согласно некоторым вариантам реализации X обладает последовательностью AI; согласно некоторым вариантам реализации X обладает последовательностью AV. Согласно некоторым вариантам реализации элемент 1 последовательности ГА содержит дисульфидную связь. Согласно некоторым вариантам реализации указанная дисульфидная связь соединяет остатки в положениях 97 и 139 (на основании канонической системы нумерации H3, применяемой в настоящей заявке).
1
2
3
[0059] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H1, X обладает длиной приблизительно 43 аминокислоты, и/или X обладает длиной приблизительно 13 аминокислот, и/или X обладает длиной приблизительно 26 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H1, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:
1A
2
3
4
CYPXT(A/T)(A/S)CXWXWXHHP (SEQ ID №:107), в которой:
1A
2
4
X обладает длиной приблизительно 27-42 или приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 26-41, или приблизительно 31-41, или приблизительно 31-39, или приблизительно 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот, а X-X такие же, как описаны выше.
[0060] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H1, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:
1A
2
3A
4
CYPXT(A/T)(A/S)CXW(I/L)(T/V)XWXHHP (SEQ ID №:108), в которой:
1A
X обладает длиной приблизительно 27-42, или приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот,
3A
2
4
X обладает длиной приблизительно 23-28, или приблизительно 24-26, или приблизительно 24, 25 или 26 аминокислот, а X и X такие же, как описаны выше.
[0061] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H1, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:
QLSSISSFEK (SEQ ID №:109),
1
1A
1
обычно в пределах X, (в том числе, в пределах X) и конкретно начинаясь около остатка 12 X (как проиллюстрировано, например, на Фигурах 1-3).
1
2
3
[0062] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H3, X обладает длиной приблизительно 39 аминокислот, и/или X обладает длиной приблизительно 13 аминокислот, и/или X обладает длиной приблизительно 26 аминокислот.
[0063] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H3, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:
1A
2
3
4
CYPXS(S/N)(A/S)CXWXWXHHP (SEQ ID №:110), в которой:
1A
2
4
X обладает длиной приблизительно 27-42, или приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 23-38, или приблизительно 28-38, или приблизительно 28-36, или приблизительно 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот, а X-X такие же, как описаны выше.
[0064] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H3, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:
1A
2
3A
4
CYPXS(S/N)(A/S)CXWL(Т/Н)XWXHHP (SEQ ID №:111), в которой:
1A
X обладает длиной приблизительно 27-42, или приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот,
3A
2
4
X обладает длиной приблизительно 23-28 или приблизительно 24-26, или приблизительно 24, 25 или 26 аминокислот, а X и X такие же, как описаны выше.
[0065] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H3, элемент 1 последовательности ГА включает последовательность:
(L/I)(V/I)ASSGTLEF (SEQ ID №:112),
1
1A
1
обычно в пределах X (в том числе, в пределах X) и конкретно начинающуюся около остатка 12 X (как проиллюстрировано, например, на Фигурах 1, 2 и 4).
1
2
3
[0066] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H5, X обладает длиной приблизительно 42 аминокислоты, и/или Х обладает длиной приблизительно 13 аминокислот, и/или X обладает длиной приблизительно 26 аминокислот.
[0067] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H5, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:
1A
2
3
4
CYPXSSACXWXWXHHP (SEQ ID №:113), в которой:
1A
2
4
X обладает длиной приблизительно 27-42 или приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 23-38, или приблизительно 28-38, или приблизительно 28-36, или приблизительно 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот, а X-X такие же, как описаны выше.
[0068] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H5, элемент 1 последовательности ГА обладает структурой:
1A
2
3A
4
CYPXSSACXWLIXWXHHP (SEQ ID №:114), в которой:
1A
X обладает длиной приблизительно 27-42, или приблизительно 32-42, или приблизительно 32-40, или приблизительно 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 аминокислот, и
3A
2
4
X обладает длиной приблизительно 23-28 или приблизительно 24-26, или приблизительно 24, 25 или 26 аминокислот, а X или X такие же, как описаны выше.
[0069] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H5, элемент 1 последовательности ГА увеличен (т.е., в положении, соответствующем остаткам 186-193) с добавлением последовательности:
NDAAEXX(K/R) (SEQ ID №:115)
[0070] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H5, элемент 1 последовательности ГА включает последовательность:
YEELKHLXSXXNHFEK (SEQ ID №:116),
1
1
обычно в пределах X, и конкретно начинающуюся около остатка 6 в X (как проиллюстрировано, например, на Фигурах 1, 2 и 5).
Элемент 2 последовательности ГА
[0071] Элемент 2 последовательности ГА представляет собой элемент, соответствующий приблизительно остаткам в положениях 324-340 (опять же с учетом системы нумерации на основе ГА H3) многих белков ГА, обнаруживаемых у природных изолятов вирусов гриппа. Данный элемент последовательности обладает базовой структурой:
GAIAGFIE (SEQ ID №:117)
Согласно некоторым вариантам реализации, элемент 2 последовательности ГА обладает последовательностью:
1
PXGAIAGFIE (SEQ ID №:118), в которой:
1
X обладает длиной приблизительно 4-14 аминокислот, или приблизительно 8-12 аминокислот, или приблизительно 12, 11, 10, 9 или 8 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации, данный элемент последовательности обеспечивает сайт расщепления ГАО, благодаря чему образуются ГА1 и ГА2.
[0072] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H1, элемент 2 последовательности ГА обладает структурой:
1A
PS(I/V)QSRXGAIAGFIE (SEQ ID №:119), в которой:
1A
1A
X обладает длиной приблизительно 3 аминокислоты; согласно некоторым вариантам реализации, X представляет собой G(L/I)F.
[0073] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H3, элемент 2 последовательности ГА обладает структурой:
1A
PXKXTRXGAIAGFIE (SEQ ID №:120), в которой:
1A
1A
X обладает длиной приблизительно 3 аминокислоты; согласно некоторым вариантам реализации, X представляет собой G(L/I)F.
[0074] Согласно некоторым вариантам реализации, и в частности в полипептидах H5, элемент 2 последовательности ГА обладает структурой:
1A
PQRXXXRXXRXGAIAGFIE (SEQ ID №:121), в которой:
1A
1A
X обладает длиной приблизительно 3 аминокислоты; согласно некоторым вариантам реализации, X представляет собой G(L/I)F.
Определения
[0075] Сродство: Как известно в технике, «сродством» называют меру силы, с которой конкретный лиганд (например, полипептид ГА) связывается со своим партнером (например, рецептором ГА). Сродство можно измерить разными способами.
[0076] Связывание: Следует понимать, что термин «связывание» в настоящей заявке обычно относится к нековалентной ассоциации между определенными агентами. Согласно многим вариантам реализации, описываемым в настоящей заявке, термин «связывание» относится к конкретным гликанам (например, гликанам с топологией зонтика или к гликанам с топологией конуса). Специалисты в данной области техники должны понимать, что такое связывание можно оценивать в разных контекстах. Согласно некоторым вариантам реализации связывание оценивают относительно свободных гликанов. Согласно некоторым вариантам реализации связывание оценивают относительно гликанов, присоединенных к носителю (например, ковалентной связью). Согласно некоторым таким вариантам реализации указанным носителем является полипептид. Согласно некоторым вариантам реализации связывание оценивают относительно гликанов, присоединенных к рецепторам ГА. Согласно таким вариантам реализации можно определять связывание как связывание с рецепторами или связывание с гликанами.
[0077] Связывающий агент: В общем, термин «связывающий агент» в настоящей заявке относится к любому веществу, которое связывается с гликанами (например, с гликанами с топологией зонтика), описываемыми в настоящей заявке. Связывающие агенты могут быть любого химического типа. Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами являются полипептиды (включая, например, антитела или фрагменты антител); согласно некоторым таким вариантам реализации связывающие агенты представляют собой полипептиды ГА и/или их варианты, и/или их характеристические части; согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами являются полипептиды, последовательность аминокислот в которых не включает характерной последовательности ГА (т.е., «не-ГА полипептиды»). Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами являются малые молекулы. Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами являются нуклеиновые кислоты. Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами являются аптамеры. Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами являются полимеры; согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами являются неполимерные вещества. Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами являются углеводы. Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами являются лектины. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты, описываемые в настоящей заявке, связываются с сиалированными гликанами, обладающими топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты связываются с гликанами с топологией зонтика с высоким сродством и/или специфичностью. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты демонстрируют предпочтительное связывание с гликанами с топологией зонтика по сравнению с гликанами с топологией конуса. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты конкурируют с гемагглютинином за связывание с гликанами на рецепторах гемагглютининов. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты конкурируют с гемагглютинином за связывание с гликанами с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации определенный связывающий агент, предложенный в настоящей заявке, является блокатором с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации определенный связывающий агент, предложенный в настоящей заявке, является специфическим блокатором с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты связываются с миметиками гликанов с топологией зонтика.
[0078] Биологически активный: В настоящей заявке фраза «биологически активный» относится к характеристике любого агента, который обладает активностью в биологической системе, в частности, в организме. Например, биологически активным считается агент, который при введении в организм, производит биологическое действие на данный организм. Согласно некоторым вариантам реализации, при которых биологически активен белок или полипептид, часть такого белка или полипептида, обладающая по меньшей мере одним общим видом биологической активности с указанным белком или полипептидом, как правило, считают «биологически активной» частью».
[0079] Характеристическая часть: В настоящей заявке фраза «характеристическая часть» белка или пептида относится к части, которая содержит непрерывный массив аминокислот или набор непрерывных массивов аминокислот, которые в совокупности характерны для белка или полипептида. Каждый такой непрерывный массив, как правило, должен содержать по меньшей мере две аминокислоты. Кроме того, специалисты в данной области техники должны понимать, что для характеристической части белка требуется по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или более аминокислот. Как правило, характеристической частью является часть, которая помимо идентичности последовательностей, указанной выше, обладает общими функциональными характеристиками с рассматриваемым интактным белком.
[0080] Характеристическая последовательность: Термин «характеристическая последовательность» относится к последовательности, которая обнаруживается у всех членов семейства полипептидов или нуклеиновых кислот, и, следовательно, специалисты в данной области техники могут применять ее для определения членов указанного семейства.
[0081] Топология конуса: В настоящей заявке фраза «топология конуса» относится к части 3-мерной пространственной конфигурации, принимаемой определенными гликанами и, в частности, гликанами на рецепторах ГА. Как проиллюстрировано на Фигуре 6, топологию конуса могут принимать α2-3-сиалированные гликаны или α2-6-сиалированные гликаны, и она типична для коротких цепей олигонуклеотидов, хотя данную конформацию могут принимать и некоторые длинные олигонуклеотиды. Топология конуса характеризуется углами внутреннего вращения гликозидов связи Neu5Acα2-3Gal, которые выбирают три области с конформациями с минимальной энергией, определяемые по значению φ (C1-C2-O-C3/C6) приблизительно -60, приблизительно 60 или приблизительно 180, и по значению ψ (C2-O-С3/C6-H3/C5) от -60 до 60 (Фигура 11). На Фигуре 8 представлены определенные репрезентативные (но не исчерпывающие) примеры гликанов, которые принимают топологию конуса.
[0082] Соответствующий чему-либо: В настоящей заявке термин «соответствующий чему-либо» часто применяется для обозначения положения/сущности остатка аминокислоты в полипептиде ГА. Специалисты в данной области техники должны понимать, что в целях упрощения в настоящей заявке применяется каноническая система нумерации (на основе ГА H3 дикого типа) (как проиллюстрировано, например, на Фигурах 1-5), так что, например, аминокислота «соответствующая» остатку в положении 190, не обязательно должна быть 190 по порядку аминокислотой в конкретной цепи аминокислот, а просто соответствует остатку, находящемуся в положении 190 в ГА H3 дикого типа; так, специалисты в данной области техники должны понимать, как идентифицировать соответствующие аминокислоты.
[0083] Удаленная степень разделения: В настоящей заявке аминокислоты, которые являют собой «удаленную степень разделения» - это аминокислоты ГА, которые оказывают непрямое действие на связывание с гликанами. Например, аминокислоты с одной удаленной степенью разделения могут: (1) взаимодействовать с непосредственно связывающимися аминокислотами; и/или (2) другим образом влиять на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, который ассоциирован с рецепторами ГА в клетке-хозяине; такие аминокислоты с одной удаленной степенью разделения могут непосредственно связываться с самим гликаном, а могут и не связываться. Аминокислоты с одной удаленной степенью разделения могут: (1) взаимодействовать с аминокислотами с одной степенью разделения; и/или (2) другим образом влиять на способность аминокислот с одной степенью разделения к взаимодействию с непосредственно связывающимися аминокислотами, и т.д.
[0084] Непосредственно связывающиеся аминокислоты: В настоящей заявке фраза «непосредственно связывающиеся аминокислоты» относится к аминокислотам полипептида ГА, которые непосредственно взаимодействуют с одним или более гликанами, ассоциированными с рецепторами ГА в клетке-хозяине.
[0085] Сконструированный: В настоящей заявке термин «сконструированный» описывает полипептид, последовательность аминокислот которого была выбрана человеком. Например, сконструированный полипептид ГА имеет аминокислотную последовательностью, которая отличается от последовательностей аминокислот полипептидов ГА, обнаруживаемых у природных изолятов вирусов гриппа. Согласно некоторым вариантам реализации сконструированный полипептид ГА обладает последовательностью аминокислот, которая отличается от последовательностей аминокислот полипептидов ГА, включенной в базу данных NCBI.
[0086] Полипептид H1: В настоящей заявке термин «полипептид H1» относится к полипептиду ГА, последовательность аминокислот которого включает по меньшей мере один элемент последовательности, который характерен для H1 и отличает H1 от ГА других подтипов. Представителя таких элементов последовательностей можно определить при их выравнивании, например, как проиллюстрировано на Фигурах 1-3, и они включают, например, описываемые в настоящей заявке элементы в отношении H1-специфичных вариантов реализации элементов последовательностей ГА.
[0087] Полипептид H3: В настоящей заявке термин «полипептид H3» относится к полипептиду ГА, последовательность аминокислот которого включает по меньшей мере один элемент последовательности, который характерен для H3 и отличает H3 от ГА других подтипов. Представителя таких элементов последовательностей можно определить при их выравнивании, например, как проиллюстрировано на Фигурах 1, 2 и 4, и они включают, например, описываемые в настоящей заявке элементы в отношении Н3-специфичных вариантов реализации элементов последовательностей ГА.
[0088] Полипептид H5: В настоящей заявке термин «полипептид H5» относится к полипептиду ГА, последовательность аминокислот которого включает по меньшей мере один элемент последовательности, который характерен для H5 и отличает H5 от ГА других подтипов. Представителя таких элементов последовательностей можно определить при их выравнивании, например, как проиллюстрировано на Фигурах 1, 2 и 5, и они включают, например, описываемые в настоящей заявке элементы в отношении H5-специфичных вариантов реализации элементов последовательностей ГА.
[0089] Полипептид HX: В настоящей заявке термин «полипептид HX» относится к полипептиду ГА, последовательность аминокислот которого включает по меньшей мере один элемент последовательности, который характерен для HX и отличает HX от ГА других подтипов, причем «X» обозначает номер подтипа ГА (например, когда «X» = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16, «HX» = H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16, соответственно).
[0090] Полипептид гемагглютинина (ГА): В настоящей заявке термин «полипептид гемагглютинина» или «полипептид ГА» относится к полипептиду, последовательность аминокислот которого включает по меньшей мере одну характеристическую последовательность ГА. В технике известен широкий спектр последовательностей ГА из изолятов вирусов гриппа; на самом деле Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) поддерживает базу данных (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/flu.html), в которой на момент составления настоящей заявки содержалось 9796 последовательностей ГА. Специалисты в данной области техники, обращающиеся к указанной базе данных, могут без труда идентифицировать последовательности, которые характерны для полипептидов ГА в целом, и/или для конкретных полипептидов ГА (например, полипептидов H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16); или ГА, которые опосредуют инфицирование конкретных хозяев, например, птиц, верблюдов, собак, кошек, виверр, лошади, человека, леопарда, норки, мыши, тюленя, горной ласточки, свиней, тигра, кита и др. Например, согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА включает один или более элементов характеристических последовательностей, обнаруживаемых приблизительно в области остатков 87, приблизительно в области остатков 185, в области остатков 324, в области остатков 340, в области остатков 96, и/или в области остатков 130 и 230 белка ГА, обнаруживаемого у природного изолята вируса гриппа. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА обладает последовательностью аминокислот, содержащей по меньшей мере элементы последовательности 1 и 2, согласно некоторым вариантам реализации отделенные друг от друга от приблизительно 100 до приблизительно 200, или друга от приблизительно 125 до приблизительно 175, или от приблизительно 125 до приблизительно 160, или от приблизительно 125 до приблизительно 150, или от приблизительно 125 до приблизительно 139, или приблизительно 129, или приблизительно 130, или приблизительно 131, или приблизительно 132, или приблизительно 133, или приблизительно 134, или приблизительно 135, или приблизительно 136, или приблизительно 137, или приблизительно 138, или приблизительно 139 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА обладает последовательностью аминокислот, которая включает остатки в положениях в пределах области 96-100 и/или 130-230, участвующие в связывание с гликаном. Например, многие полипептиды ГА включают один или более из следующих остатков: Tyr98, Ser/Thr136, Trp153, His183 и Leu/Ile194. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА включает по меньшей мере 2, 3, 4 или все 5 из указанных остатков.
[0091] Изолированный: В настоящей заявке термин «изолированный» относится к агенту или веществу, которое (i) было отделено по меньшей мере от некоторых компонентов, с которыми оно было ассоциировано при первоначальном получении (либо в природе, либо в экспериментальных условиях); или (ii) было получено человеком. Изолированные агенты или вещества могут быть отделены от других компонентов, с которыми они были изначально ассоциированы, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 20%, по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 70%, по меньшей мере приблизительно на 80%, по меньшей мере приблизительно на 90% или более. Согласно некоторым вариантам реализации изолированные агенты чисты более чем на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
[0092] Специфичный в отношении определенной связи блокатор (LSBA): В настоящей заявке термин «специфичный в отношении определенной связи блокатор» относится к агенту, который связывается с рецептором ГА, содержащим α2-6-сиалированный гликан. Согласно некоторым вариантам реализации LSBA селективно связывается с рецептором ГА, содержащим α2-6-сиалированный гликан, со сродством, которое составляет по меньшей мере приблизительно 40, 50 или 75% от сродства в отношении рецептора ГА, содержащего α2-3-сиалированный гликан. Согласно некоторым вариантам реализации LSBA селективно связывается с рецептором ГА, содержащим α2-6-сиалированный гликан, со сродством, которое по меньшей мере приблизительно в 2, 4, 5 или 10 выше сродства в отношении рецептора ГА, содержащего α2-3-сиалированный гликан. Согласно некоторым вариантам реализации LSBA обладает сродством в отношении α2-6-сиалированного гликана, которое составляет по меньшей мере приблизительно 50, 100, 150 или 200% от сродства в отношении α2-3-сиалированного гликана. Согласно некоторым вариантам реализации LSBA может конкурировать с гемагглютинином за связывание с рецепторами ГА. Например, LSBA может селективно ингибировать связывание частицы вируса гриппа (например, вируса гриппа человека или птиц) с рецептором ГА на основе характеристик связи (например, α2-6-сиалированный гликан или α2-3-сиалированный гликан). Согласно некоторым вариантам реализации LSBA является полипептидом. Согласно некоторым таким вариантам реализации полипептид LSBA обладает последовательностью аминокислот, которая по существу идентична или по существу гомологична последовательности, существующей в природе. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид LSBA является полипептидом ГА. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид LSBA является существующим в природе полипептидом ГА или его фрагментом. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид LSBA обладает последовательностью аминокислот, которая не родственна полипептиду ГА. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид LSBA является антителом или его фрагментом. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид LSBA является пектином (например, SNA-1). Согласно некоторым вариантам реализации LSBA не является полипептидом. Согласно некоторым вариантам реализации LSBA является малой молекулой. Согласно некоторым вариантам реализации LSBA является нуклеиновой кислотой.
[0093] Длинные олигосахариды: В целях настоящего описания олигосахарид обычно считают «длинным», если он включает по меньшей мере одну линейную цепь, которая содержит по меньшей мере четыре остатка сахаридов.
[0094] Не встречающиеся в природе аминокислоты: Фраза «не встречающиеся в природе аминокислоты» (неприродные аминокислоты) относится к веществу, обладающему химической структурой аминокислоты (т.е.
и, следовательно, способному участвовать в образовании по меньшей мере двух пептидных связей, но содержащему группу R, которая отличается от таких групп, обнаруживаемых в природе. Согласно некоторым вариантам реализации не встречающиеся в природе аминокислоты могут также содержать вторую группу R вместо водорода, и/или могут содержать один или более других заместителей амино- или карбоксильных групп.
[0095] Полипептид: В самом общем виде «полипептид» представляет собой нить по меньшей мере из двух аминокислот, присоединенных друг к другу пептидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид может включать по меньшей мере 3-5 аминокислот, каждая из которых соединена друг с другом по меньшей мере одной пептидной связью. Специалисты в данной области техники должны понимать, что иногда полипептиды могут включать «не встречающиеся в природе» аминокислоты или другие вещества, которые, тем не менее, способны интегрироваться в полипептидную цепь.
[0096] Чистый: В настоящей заявке «чистым» называют агент или вещество, если оно по существу не содержит других компонентов. Например, препарат, который содержит более чем приблизительно 90% конкретного агента или вещества, как правило, считается чистым препаратом. Согласно некоторым вариантам реализации агент или вещество чистые по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%.
[0097] Короткий олигосахарид: В целях настоящего описания олигосахарид обычно считают «коротким», если он содержит менее 4 или определенно менее 3 остатков в любой линейной цепи.
[0098] Специфичность: Как известно в технике, «специфичность» является мерой способности конкретного лиганда (например, полипептида ГА) отличать своего партнера по связыванию (например, рецептор ГА человека, и в частности рецептор ГА верхних дыхательных путей человека) от других потенциальных партнеров по связыванию (например, рецептора ГА птиц).
[0099] Существенная гомология: Фраза «существенная гомология» в настоящей заявке относится к сравнению последовательностей аминокислот и нуклеиновых кислот. Как должно быть понятно специалистам в данной области техники, две последовательности обычно считаются по существу гомологичными, если они содержат гомологичные остатки в соответствующих положениях. Гомологичные остатки могут быть идентичными остатками. В качестве альтернативы гомологичные остатки могут быть не идентичными остатками, но должны, соответственно, обладать сходными структурными и/или функциональными характеристиками. Например, как хорошо известно специалистам в данной области техники, определенные аминокислоты обычно классифицируются как «гидрофобные» или «гидрофильные» аминокислоты, и/или как аминокислоты, содержащие «полярные» или «неполярные» боковые цепи. Замену аминокислоты на другую аминокислоту того же типа часто можно считать «гомологичной» заменой.
Типичные
классификации аминокислот в обобщенном виде представлены ниже:
Аланин
Ala
A
неполярная
нейтральная
1,8
Аргинин
Arg
R
полярная
положительно заряженная
-4,5
Аспарагин
Asn
N
полярная
нейтральная
-3,5
Аспарагиновая кислота
Asp
D
полярная
отрицательно заряженная
-3,5
Цистеин
Cys
С
неполярная
нейтральная
2,5
Глутаминовая кислота
Glu
E
полярная
отрицательно заряженная
-3,5
Глутамин
Gln
Q
полярная
нейтральная
-3,5
Глицин
Gly
G
неполярная
нейтральная
-0,4
Гистидин
His
H
полярная
положительно заряженная
-3,2
Изолейцин
Ile
I
неполярная
нейтральная
4,5
Лейцин
Leu
L
неполярная
нейтральная
3,8
Лизин
Lys
K
полярная
положительно заряженная
-3,9
Метионин
Met
M
неполярная
нейтральная
1,9
ФенилалаНИН
Phe
F
неполярная
нейтральная
2,8
Пролин
Pro
P
неполярная
нейтральная
-1,6
Серин
Ser
S
полярная
нейтральная
-0,8
Треонин
Thr
T
полярная
нейтральная
-0,7
Триптофан
Trp
W
неполярная
нейтральная
-0,9
Тирозин
Tyr
Y
полярная
нейтральная
-1,3
Валин
Val
V
неполярная
нейтральная
4,2
Двойственные аминокислоты
3 буквы
1 буква
Аспарагин или аспарагиновая кислота
Asx
B
Глутамин или глутаминовая кислота
Glx
Z
Лейцин или изолейцин
Xle
J
Неуказанная или неизвестная аминокислота
Xaa
X
Как хорошо известно в данной области техники, последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот можно сравнивать при помощи разных алгоритмов, включая алгоритмы, доступные в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для последовательностей нуклеотидов и BLASTP, BLAST с брешами и PSI-BLAST для последовательностей аминокислот. Примеры таких программ описаны у Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.132), Humana Press, 1999; причем каждая из вышеперечисленных публикаций включена в настоящую заявку посредством ссылки. Помимо идентификации гомологичных последовательностей вышеупомянутые программы обычно позволяют идентифицировать степень гомологии. Согласно некоторым вариантам реализации две последовательности считаются по существу гомологичными, если по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более их соответствующих остатков гомологичны на значимом протяжении остатков. Согласно некоторым вариантам реализации таким значимым протяжением является вся последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации такое значимое протяжение составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 125, по меньшей мере 150, по меньшей мере 175, по меньшей мере 200, по меньшей мере 225, по меньшей мере 250, по меньшей мере 275, по меньшей мере 300, по меньшей мере 325, по меньшей мере 350, по меньшей мере 375, по меньшей мере 400, по меньшей мере 425, по меньшей мере 450, по меньшей мере 475, по меньшей мере 500 или более остатков.
[00100] Существенная идентичность: Фраза «существенная идентичность» в настоящей заявке относится к сравнению последовательностей аминокислот и нуклеиновых кислот. Как должно быть понятно специалистам в данной области техники, две последовательности обычно считаются «по существу идентичными», если они содержат идентичные остатки в соответствующих положениях. Как хорошо известно в данной области техники, последовательности аминокислот или нуклеиновых кислот можно сравнивать при помощи разных алгоритмов, включая алгоритмы, доступные в коммерческих компьютерных программах, таких как BLASTN для последовательностей нуклеотидов и BLASTP, BLAST с брешами и PSI-BLAST для последовательностей аминокислот. Примеры таких программ описаны у Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs". Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.132), Humana Press, 1999; причем каждая из вышеперечисленных публикаций включена в настоящую заявку посредством ссылки. Помимо идентификации идентичных последовательностей вышеупомянутые программы обычно позволяют идентифицировать степень идентичности. Согласно некоторым вариантам реализации две последовательности считаются по существу идентичными, если по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более их соответствующих остатков идентичны на значимом протяжении остатков. Согласно некоторым вариантам реализации таким значимым протяжением является вся последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации такое значимое протяжение составляет по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 55, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70, по меньшей мере 75, по меньшей мере 80, по меньшей мере 85, по меньшей мере 90, по меньшей мере 95, по меньшей мере 100, по меньшей мере 125, по меньшей мере 150, по меньшей мере 175, по меньшей мере 200, по меньшей мере 225, по меньшей мере 250, по меньшей мере 275, по меньшей мере 300, по меньшей мере 325, по меньшей мере 350, по меньшей мере 375, по меньшей мере 400, по меньшей мере 425, по меньшей мере 450, по меньшей мере 475, по меньшей мере 500 или более остатков.
[00101] Терапевтический агент: В настоящей заявке термин «терапевтический агент» относится к любому агенту, который производит желаемое биологическое или фармакологическое действие.
[00102] Лечение: В настоящей заявке термин «лечение» относится к способу, применяемому для облегчения, отсрочки начала, уменьшения тяжести или частоты, или обеспечения профилактики одного или более симптомов или аспектов заболевания, расстройства или патологического состояния. В целях настоящего изобретения лечение может проводиться до появления симптомов, во время или после их появления.
2
1
1
[00103] Топология зонтика: В настоящей заявке фраза «топология зонтика» относится к 3-мерной пространственной конфигурации, принимаемой определенными гликанами и, в частности, гликанами на рецепторах ГА. Настоящее изобретение включает выяснение того факта, что связывание с гликанами с топологией зонтика характерно для белков ГА, которые опосредуют инфицирование людей. Как проиллюстрировано на Фигуре 6, топологию зонтика обычно принимают α2-6-сиалированные гликаны, и она типична для длинных олигосахаридов (т.е., длиннее, чем тетрасахариды). Согласно некоторым вариантам реализации гликаны с топологией зонтика - это гликаны, обладающие трехмерной структурой, по существу сходной со структурой, представленной на Фигуре 6 (правая панель). Согласно некоторым вариантам реализации гликаны с топологией зонтика - это гликаны, которые контактируют с полипептидами ГА через остаток аминокислоты, показанный на Фигуре 6 (правая панель). Согласно некоторым вариантам реализации гликаны с топологией зонтика - это гликаны, которые способны контактировать и/или специфически связываться с аминокислотным связывающим карманом, показанным на Фигуре 6 (правая панель). Согласно некоторым вариантам реализации структурную топологию гликанов классифицируют на основании параметра θ, определяемого как угол между C Sia, C Gal и C GlcNAc. Значения θ<109° соответствуют топологии, напоминающей конус, которую принимают α2-3 и короткие α2-6 гликаны. Значения θ>110° соответствуют топологии, напоминающей зонтик, которую принимают α2-6 гликаны (Фигура 6). Приведен пример топологии зонтика с углом φ связи Neu5Acα2-6Gal приблизительно -60 (см., например, Фигуру 11). На Фигуре 9 представлены некоторые репрезентативные (но не исчерпывающие) примеры гликанов, которые могут принимать топологию зонтика. Длинные α2-6-мотивы, представленные на Фигуре 9, включают Neu5Acα2-6, связанный на невосстанавливающем конце длинной цепи (например, по меньшей мере трисахарида), который обнаруживается как часть биологических N-связанных гликанов, O-связанных гликанов и гликолипидов. На врезке в рамке показаны примеры компонентов длинных α2-6-гликанов с топологией зонтика, которые обнаруживаются как часть биологических гликанов, связывающихся с ГА с высоким сродством. Согласно некоторым вариантам реализации гликаны с топологией зонтика (например, в определенном сайте) содержат больше длинных (например, много субъединиц лактозаминов) α2-6-олигосахаридных ветвей, чем коротких α2-6 (например, из одного лактозамина) ветвей. Согласно некоторым вариантам реализации гликаны с топологией зонтика (например, в определенном сайте) содержат приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 5 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 20 раз, приблизительно в 50 раз или более чем приблизительно в 50 раз больше длинных α2-6-олигосахаридных ветвей, чем коротких α2-6 (например, из одного лактозамина) ветвей. Согласно некоторым вариантам реализации уникальным свойством взаимодействий ГА с гликанами с топологией зонтика и/или гликанами-ловушками является контакт ГА с гликаном, содержащим сиаловую кислоту (СК) и/или аналоги СК на невосстанавливающем конце. Согласно некоторым вариантам реализации по длине цепи указанный олигосахарид представляет собой по меньшей мере трисахарид (не включая СК или аналог СК). Согласно некоторым вариантам реализации в контактах с топологией, напоминающей зонтик, вступает сочетание пронумерованных остатков, показанных на Фигуре 6. Согласно некоторым вариантам реализации гликаны с топологией зонтика представляют собой олигосахариды следующей формы:
Neu5Acα2-6Sug1-Sug2-Sug3
где:
(a) Neu5Ac α2-6 обычно (но не преимущественно) находится на невосстанавливающем конце;
(b) Sug1:
(i) представляет собой гексозу (часто Gal или Glc) или гексозамин (GlcNAc или GalNAc) в конфигурации α или β (часто β- для N- и O-связанной продолжающейся цепи и α- в случае GalNAcα-, который O-связан с гликопротеином);
(ii) к невосстанавливающим положениям Sug1 не присоединяется ни один сахар, кроме Neu5Acα2-6 (за исключением случаев, когда Sug1 представляет собой GalNAcα-, который O-связан с гликопротеином); и/или
(iii) к невосстанавливающим положениям Sug1 (как правило, положению 6) может быть присоединен неуглеводный фрагмент, такой как сульфат, фосфат, гуанидин, амин, N-ацетил и др. (например, для улучшения контактов с ГА);
(c) Sug2 и/или Sug3 представляют собой:
(i) гексозу (часто Gal или Glc) или гексозамин (GlcNAc или GalNAc) в конфигурации α или β (часто β); и/или
(ii) к невосстанавливающим положениям Sug2, Sug3 и/или Sug4 может быть присоединен углевод или неуглеводный фрагмент, такой как сульфат, фосфат, гуанидин, амин, N-ацетил и др.
(d) Связь между любыми двумя углеводами в олигосахариде за исключением связи Neu5Acα2-6 может быть 1-2, 1-3, 1-4 и/или 1-6 (как правило, 1-3 или 1-4); и/или
(e) Структура, в которой Neu5Acα2-6 связана GalNAcα, которая O-связана с указанным гликопротеином, а дополнительные сахара связаны с невосстанавливающим концом GalNAcα, например
(i) Neu5Acα2-6(Neu5Acα2-3Galβ1-3)GalNAcα-
(ii) Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAcα-
[00104] Блокатор топологии зонтика (UTBA): В настоящей заявке термин «блокатор топологии зонтика» относится к агенту, который связывается с рецептором ГА, содержащим гликан с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации UTBA связывается с рецептором ГА, содержащим гликан с топологией зонтика, обнаруживаемым в верхних дыхательных путях человека. UTBA может связываться или с гликаном с топологией зонтика и/или с гликаном с топологией конуса. Согласно некоторым вариантам реализации UTBA селективно связывается с гликаном с топологией зонтика, проявляя 50, 100, 150 или 200% от своего сродства, проявляемого в отношении гликана с топологией конуса. Согласно некоторым вариантам реализации UTBA селективно связывается с гликаном с топологией зонтика, проявляя 50-150% от своего сродства, проявляемого в отношении гликана с топологией конуса. Согласно некоторым вариантам реализации UTBA связывается с гликаном с топологией зонтика, проявляя приблизительно такое же сродство, как и в отношении гликана с топологией конуса. Например, согласно некоторым вариантам реализации UTBA связывается с гликаном с топологией зонтика (например, 6'SLN-LN), проявляя приблизительно 50-200%, 50-150% от своего сродства, проявляемого в отношении гликана с топологией конуса (например, 3'SLN-LN), или приблизительно такое же сродство. Согласно некоторым вариантам реализации UTBA селективно ингибирует связывание частицы вируса гриппа (например, вируса гриппа человека или птиц) с рецептором ГА на основании топологии гликанов указанного рецептора (например, зонтик или конус). Согласно некоторым вариантам реализации UTBA является полипептидом. Согласно некоторым таким вариантам реализации полипептид UTBA обладает последовательностью аминокислот, которая по существу идентична или по существу гомологична последовательности существующего в природе полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид UTBA является полипептидом ГА. Согласно некоторым таким вариантам реализации полипептид UTBA является существующим в природе полипептидом ГА или его фрагментом. Согласно некоторым таким вариантам реализации полипептид UTBA обладает последовательностью аминокислот, которая не родственна последовательности полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид UTBA представляет собой антитело или его фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид UTBA представляет собой лектин (например, SNA-1). Согласно некоторым вариантам реализации UTBA не является полипептидом. Согласно некоторым вариантам реализации UTBA представляет собой малую молекулу. Согласно некоторым вариантам реализации UTBA представляет собой нуклеиновую кислоту.
[00105] Миметик гликана с топологией зонтика: Под «миметиком гликана с топологией зонтика» понимают агент, отличный от гликана с топологией зонтика, который связывается со связывающими агентами, описываемыми выше. Согласно некоторым вариантам реализации миметики гликана с топологией зонтика представляют собой агенты, которые связываются с полипептидами ГА. Согласно некоторым таким вариантам реализации миметики гликана с топологией зонтика представляют собой агенты, которые взаимодействуют с остатками полипептидов ГА, выбранными из группы, состоящей из остатков 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227, 228 и их сочетаний. Согласно некоторым таким вариантам реализации миметики гликана с топологией зонтика представляют собой агенты, которые взаимодействуют с остатками полипептидов ГА, выбранными из группы, состоящей из остатков 130, 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и их сочетаний. Согласно некоторым таким вариантам реализации миметики гликана с топологией зонтика представляют собой агенты, которые взаимодействуют с остатками полипептидов ГА, выбранными из группы, состоящей из остатков 160, 192, 193 и их сочетаний. Следует отметить, что положения аминокислот, указанные выше, даны на основании нумерации в ГА H3. Согласно некоторым вариантам реализации миметик гликана в рецепторе ГА представляет собой агент, который конкурирует с гликаном с топологией зонтика за взаимодействие с полипептидом ГА.
[00106] Блокатор специфичный для топологии зонтика (UTSBA): В настоящей заявке термин «блокатор специфический для топологии зонтика» относится к агенту, который связывается с рецептором ГА, содержащим гликан с топологией зонтика, обнаруживаемом в верхних дыхательных путях человека. UTSBA селективно связывается с гликаном ГА с топологией зонтика. Например, UTSBA связывается с гликаном с топологией зонтика (например, 6'SLN-LN) со сродством, которое приблизительно по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 5 или по меньшей мере в 10 раз превышает сродство, с которым он связывается с гликаном с топологией конуса (например, 3'SLN-LN). Как правило, сродство UTSBA в отношении гликана с топологией зонтика выше 1 нМ. Как правило, сродство UTSBA в отношении гликана с топологией конуса по меньшей мере на 2-3 порядка ниже, чем сродство связывания гликанов с топологией зонтика с адаптированными к организму человека ГА, такими как SC18, Mos99, Tx91 и др. и сродство связывания с пектинами растений, такими как SNA-I. Сродство UTSBA, измеряемое посредством дозозависимого прямого анализа связывания (Фигуры 19 и 20), как правило, должно быть выше 1 нМ. Как правило, максимальное сродство UTSBA в отношении гликана с топологией конуса на 1-3 порядка ниже, чем сродство связывания гликанов топологией конуса с ГА птиц, такими как Viet0405, Av18 и др. Согласно некоторым вариантам реализации UTSBA селективно ингибирует связывание частицы вируса гриппа (например, вируса гриппа человека или птиц) с рецептором ГА (например, H1, H2 или H3, или адаптированных к организму человека H5, H7 или H9) на основании топологии гликанов указанного рецептора (например, зонтик или конус). Согласно некоторым вариантам реализации UTSBA является полипептидом. Согласно некоторым таким вариантам реализации полипептид UTSBA обладает последовательностью аминокислот, которая по существу идентична или по существу гомологична последовательности существующего в природе полипептида. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид UTSBA является полипептидом ГА. Согласно некоторым таким вариантам реализации полипептид UTSBA является существующим в природе полипептидом ГА или его фрагментом. Согласно некоторым таким вариантам реализации полипептид UTSBA обладает последовательностью аминокислот, которая не родственна последовательности полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид UTSBA представляет собой антитело или его фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид UTSBA представляет собой лектин (например, SNA-1). Согласно некоторым вариантам реализации UTSBA не является полипептидом. Согласно некоторым вариантам реализации UTSBA представляет собой малую молекулу. Согласно некоторым вариантам реализации UTSBA представляет собой нуклеиновую кислоту.
[00107] Вакцинация: В настоящей заявке термин «вакцинация» относится к введению композиции, предназначенной для генерирования иммунного ответа, например, на вызывающий заболевание агент. В целях настоящего изобретения вакцинацию можно проводить до воздействия вызывающего заболевание агента, во время или после его воздействия, и согласно некоторым вариантам реализации до, во время и/или вскоре после воздействия указанного агента. Согласно некоторым вариантам реализации вакцинация включает многократное введение, должным образом разнесенное во времени, композиции для вакцинации.
[00108] Вариант: В настоящей заявке термин «вариант» является относительным термином, который описывает взаимосвязь между конкретным рассматриваемым полипептидом (например, полипептидом ГА) и «родительским» полипептидом, с которым сравнивается его последовательность. Рассматриваемый пептид считается «вариантом» родительского полипептида, если рассматриваемый полипептид обладает последовательностью аминокислот, идентичной последовательности родительского полипептида, но с небольшим количеством изменений в конкретных положениях последовательности. Как правило, в указанном варианте по сравнению с родительским полипептидом заменено менее 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% остатков. Согласно некоторым вариантам реализации в варианте по сравнению с родительским полипептидом заменены 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 остаток. Часто в варианте заменено очень малое число (например, меньше 5, 4, 3, 2 или 1) функциональных остатков (т.е., остатков, которые обусловливают конкретную биологическую активность). Кроме того, вариант, как правило, содержит не более 5, 4, 3, 2 или 1 добавления или делеции, и часто не содержит не добавлений, ни делеции по сравнению с родительским полипептидом. Кроме того, любые добавления или делеции обычно охватывают не более чем приблизительно 25, приблизительно 20, приблизительно 19, приблизительно 18, приблизительно 17, приблизительно 16, приблизительно 15, приблизительно 14, приблизительно 13, приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6, и обычно менее чем приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2 остатка. Согласно некоторым вариантам реализации указанный родительский полипептид представляет собой полипептид, обнаруживаемый в природе. Например, родительский ГА полипептид может быть полипептидом, обнаруживаемым у природного (например, дикого типа) изолята вируса гриппа (например, ГА дикого типа).
[00109] Вектор: В настоящей заявке термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к транспортировке другой нуклеиновой кислоты, к которой она присоединена. Согласно некоторым вариантам реализации векторы способны к экстрахромосомной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, к которым они присоединены в клетке-хозяине, такой как клетка эукариот или прокариот. Векторы, способные управлять экспрессией функционально связанных генов, в настоящей заявке называются «векторами экспрессии».
[00110] Дикий тип: Как принято понимать в технике, фраза «дикий тип» обычно относится к нормальной форме белка или нуклеиновой кислоты, которая обнаруживается в природе. Например, полипептиды ГА дикого типа обнаруживаются у природных изолятов вируса гриппа. В базе данных последовательностей вирусов гриппа NCBI можно найти разные последовательности ГА дикого типа, sequence database, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html.
Подробное описание конкретных вариантов реализации
[00111] Согласно настоящему изобретению предложены связывающие агенты (например, полипептиды ГА, варианты полипептидов ГА, LSBA, UTBA, UTSBA и др.), которые связываются с гликанами с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены связывающие агенты, которые связываются с гликанами с топологией зонтика, обнаруживаемыми в составе рецепторов ГА конкретного целевого вида. Например, согласно некоторым вариантам реализации предложены связывающие агенты, которые связываются с гликанами с топологией зонтика, обнаруживаемыми в составе рецепторов ГА человека, например, рецепторов ГА, обнаруживаемых в клетках эпителия человека, и в частности, связывающие агенты, которые связываются с гликанами с топологией зонтика, обнаруживаемыми в составе рецепторов ГА в верхних дыхательных путях человека.
[00112] Согласно настоящему изобретению предложены связывающие агенты, которые связываются с рецепторами ГА, обнаруживаемыми на клетках верхних дыхательных путей человека, и в частности, предложены связывающие агенты, которые связываются с такими рецепторами (и/или с их гликанами, в частности, с их гликанами с топологией зонтика) с заданным сродством и/или специфичностью.
[00113] Согласно некоторым вариантам реализации, связывающие агенты согласно настоящему изобретению представляют собой последовательность полипептида ГА или содержат такую последовательность. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению содержат последовательность полипептида ГА, которая отличается от последовательности существующего в природе полипептида ГА по одному или более остаткам, выбранным из группы, состоящей из остатков в положениях 130, 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и их комбинаций. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению содержат последовательность полипептида ГА, которая отличается от последовательности родительского существующего в природе полипептида ГА по одному или более остаткам, выбранным из группы, состоящей из остатков в положениях 160, 192, 193 и их комбинаций.
[00114] Настоящее изобретение основано на том, что повышенная способность к связыванию с гликанами с топологией зонтика (например, длинными α2-6-сиалированными гликанами), и в частности способность к высокоаффинному связыванию может придавать варианту полипептида ГА способность к инфицированию человека (при том, что родительский полипептид ГА не может инфицировать человека). Не вдаваясь в какую-либо теорию, авторы настоящего изобретения предполагают, что связывание с гликанами с топологией зонтика может меть первостепенную важность, и в частности, что утраты связывания с гликанами других типов не требуется.
[00115] Также согласно настоящему изобретению предложены разные реагенты и способы, ассоциированные со связывающими агентами согласно настоящему изобретению (например, полипептиды ГА, варианты полипептидов ГА, UTBA, UTSBA и др.), включая, например, системы их идентификации, стратегии их получения, антитела, которые с ними связываются, и разные способы диагностики и лечения, связанные с ними. Дальнейшее описание конкретных вариантов реализации указанных и других аспектов настоящего изобретения представлено ниже. Гемагглютинин (ГА)
[00116] Вирусы гриппа являются РНК-вирусами, которые характеризуются оболочкой из липидной мембраны, содержащей два гликопротеина, гемагглютинин (ГА) и нейраминидазу (НА), встроенные в мембрану частицы вируса. Известно 16 подтипов ГА и 9 подтипов HA, разные штаммы вирусов гриппа называют на основании подтипов ГА и HA штамма. На основании сравнения идентичности последовательностей и кристаллической структуры подтипы ГА были подразделены на две основных группы и четыре более мелких клады. Разные подтипы ГА не обязательно демонстрируют высокую идентичность последовательности аминокислот, но общие 3-мерные структуры разных подтипов ГА схожи между собой, и есть лишь несколько незначительных различий, которые можно применять для классификации. Например, конкретная ориентация мембранных дистальных субдоменов относительно центральной α-спирали является одной из структурных характеристик, которые обычно применяют для определения подтипа ГА (Russell et al., 2004, Virology, 325: 287; включена в настоящую заявку посредством ссылки).
[00117] ГА в мембране существует в форме гомотримера одного из 16 подтипов, называемых H1-H16. К настоящему времени к инфицированию человека адаптировались только три указанных подтипа (H1, H2 и H3). Одной из описанных характеристик ГА, которые адаптировались к инфицированию человека (например, ГА из пандемичных подтипов вирусов гриппа H1N1 (1918) и H3N2 (1967-68)), является их способность преимущественно связываться с α2-6-сиалированными гликанами по сравнению с их предшественниками из вируса гриппа птиц, которые преимущественно связываются с α2-3-сиалированными гликанами (Skehel & Wiley, 2000, Annu Rev Biochem, 69: 531; Rogers, & Paulson, 1983, Virology, 127: 361; Rogers et al., 1983, Nature, 304: 76; Sauter et al., 1992, Biochemistry, 31: 9609; Connor et al., 1994, Virology, 205: 17; Tumpey et al., 2005, Science, 310: 77; каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки). Однако настоящее изобретение основано на том, что способность к инфицированию людей меньше коррелирует со связыванием гликанов с определенным типом связи, но в большей степени коррелирует со связыванием гликанов с определенной топологией. Таким образом, в настоящем изобретении продемонстрировано, что ГА, которые опосредуют инфицирование людей, связываются с гликанами с топологией зонтика, часто проявляя предпочтение в отношении гликанов с топологией зонтика по сравнению с гликанами с топологией конуса (даже несмотря на то, что гликаны с топологией конуса могут быть α2-6-сиалированными гликанами).
[00118] Существует несколько кристаллических структур ГА из подтипов H1 (вирус человека и свиньи), H3 (вирус птиц) и H5 (вирус птиц), связанных с сиалированными олигосахаридами (со связями и α2-3, и α2-6), и предложены представления на молекулярном уровне о специфических аминокислотах, которые участвуют в особых взаимодействиях указанных ГА с указанными гликанами (Eisen et al., 1997, Virology, 232: 19; На et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA, 98: 11181; Ha et al., 2003, Virology, 309: 209; Gamblin et al., 2004, Science, 303: 1838; Stevens et al., 2004, Science, 303: 1866; Russell et al., 2006, Glycoconj J 23: 85; Stevens et al., 2006, Science, 312: 404; каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки).
[00119] Например, кристаллические структуры H5 (А/утка/Сингапур/3/97), одиночного или связанного с α2-3 или α2-6-сиалированным олигосахаридом, позволяет идентифицировать определенные аминокислоты, которые взаимодействуют непосредственно со связанными гликанами, а также аминокислоты, которые обладают одной или более удаленными степенями разделения (Stevens et al., 2001, Proc Nati Acad Sci USA 98: 11181; включена в настоящую заявку посредством ссылки). В некоторых случаях конформация указанных остатков отличается в связанном и несвязанном состоянии. Например, Glu190, Lys193 и Gln226 вместе участвуют во взаимодействиях непосредственного связывания и обладают разными конформациями в связанном и несвязанном состоянии. Конформация Asn186, который расположен проксимально относительно Glu190, также значительно отличается в связанном и несвязанном состоянии.
Связывающие агенты
[00120] Как отмечалось выше, настоящее изобретение основано на установлении того факта, кто связывание с гликанами с топологией зонтика коррелирует со способностью опосредовать инфицирование конкретных хозяев, включая, например, человека. Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены связывающие агенты (например, полипептиды ГА, варианты полипептидов ГА, LSBA, UTBA, UTSBA и др.), которые связываются с гликанами с топологией зонтика (и/или с миметиками гликанов с топологией зонтика). Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с гликанами с топологией зонтика (и/или с миметиками гликанов с топологией зонтика) с высоким сродством. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с целым рядом разных гликанов с топологией зонтика, часто с высоким сродством и/или высокой специфичностью.
[00121] Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с гликанами с топологией зонтика (например, длинными α2-6-сиалированными гликанами, например, Neu5Acα2-6Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAc-) с высоким сродством. Например, согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с гликанами с топологией зонтика со сродством, сопоставимым со сродством, наблюдаемым у ГА дикого типа, который опосредует инфицирование человека (например, H1N1 HA или H3N2 HA). Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с гликанами с топологией зонтика со сродством, которое составляет по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% от сродства, наблюдаемого при сопоставимых условиях для ГА дикого типа, который опосредует инфицирование человека. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с гликанами с топологией зонтика со сродством, которое выше, чем сродство, наблюдаемое при сопоставимых условиях для ГА дикого типа, который опосредует инфицирование человека.
[00122] Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению оценивают в диапазоне концентраций. Такая стратегия позволяет получить значительно больше информации, в частности, при анализе мультиспецифического связывания, чем анализ с одной концентрацией. Согласно некоторым вариантам реализации, например, сродство связывания для связывающих агентов согласно настоящему изобретению оценивают при концентрациях, варьирующих по меньшей мере в 2, по меньшей мере в 3, по меньшей мере в 4, по меньшей мере в 5, по меньшей мере в 6, по меньшей мере в 7, по меньшей мере в 8, по меньшей мере в 9, по меньшей мере в 10 или более раз.
[00123] Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению проявляют высокое сродство, если они демонстрируют насыщенный сигнал при анализе связывания на мультиспецифичной матрице гликанов, который описан в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению проявляют высокое сродство, если они демонстрируют сигнал выше чем приблизительно 400000 или более {например, выше чем приблизительно 500000, приблизительно 600000, приблизительно 700000, приблизительно 800000, и т.д.) в таких исследованиях. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты, описываемые в настоящей заявке, демонстрируют насыщающее связывание с гликанами с топологией зонтика в диапазоне концентраций, варьирующих по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз или более, и согласно некоторым вариантам реализации в диапазоне концентраций, варьирующих по меньшей мере в 10 раз или более.
[00124] Кроме того, согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с гликанами с топологией зонтика (и/или с миметиками гликанов с топологией зонтика) сильнее, чем они связываются с гликанами с топологией конуса. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению демонстрируют относительное сродство к гликанам с топологией зонтика по сравнению со сродством к гликанам с топологией конуса, приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6, приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2.
[00125] Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с α2-6-сиалированными гликанами; согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются преимущественно с α2-6-сиалированными гликанами. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с целым рядом разных α2-6-сиалированных гликанов. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению не способны связываться с α2-3-сиалированными гликанами, а согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению способны связываться с α2-3-сиалированными гликанами.
[00126] Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с рецепторами, обнаруживаемыми в клетках эпителия верхних дыхательных путей. Согласно некоторым вариантам реализации, связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с рецепторами ГА бронхов или трахеи. Согласно некоторым вариантам реализации, связывающие агенты согласно настоящему изобретению на способны связываться с рецепторами в глубоких отделах легких, и согласно некоторым вариантам реализации, связывающие агенты согласно настоящему изобретению способны связываться с рецепторами в глубоких отделах легких.
[00127] Согласно некоторым вариантам реализации, связывающие агенты согласно настоящему изобретению связывают по меньшей мере приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30% приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или более гликанов, обнаруживаемых в составе рецепторов ГА в тканях верхних дыхательных путей человека (например, в клетках эпителия).
[00128] Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с одним или более гликанами, представленными на Фигуре 9. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с несколькими гликанами, представленными на Фигуре 9. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с гликанами, проиллюстрированными на Фигуре 9, с высоким сродством и/или специфичностью. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению предпочтительно связываются с гликанами, проиллюстрированными на Фигуре 9, по сравнению с их связыванием с гликанами, проиллюстрированными на Фигуре 8. Согласно некоторым вариантам реализации связывающие агенты согласно настоящему изобретению связываются с олигосахаридами следующей формы:
Neu5Acα2-6Sug1-Sug2-Sug3
где:
1. Neu5Ac α2-6 всегда или почти всегда находится на невосстанавливающем конце;
2. Sug1:
a. представляет собой гексозу (часто Gal или Glc) или гексозамин (GlcNAc или GalNAc) в конфигурации α или β (часто β - для N- и O-связанной продолжающейся цепи и α- в случае GalNAcα-, который O-связан с гликопротеином);
b. к невосстанавливающим положениям Sug1 не присоединяется ни один сахар, кроме Neu5Acα2-6 (за исключением случаев, когда Sug1 представляет собой GalNAcα-, который O-связан с гликопротеином); и/или
c. к невосстанавливающим положениям Sug1 (как правило, положению 6) может быть присоединен неуглеводный фрагмент, такой как сульфат, фосфат, гуанидин, амин, N-ацетил и др. (например, для улучшения контактов с ГА);
3. Sug2 и/или Sug3 представляют собой:
a. гексозу (часто Gal или Glc) или гексозамин (GlcNAc или GalNAc) в конфигурации α или β (часто β); и/или
b. к невосстанавливающим положениям Sug2, Sug3 и/или Sug4 может быть присоединен углевод или неуглеводный фрагмент, такой как сульфат, фосфат, гуанидин, амин, N-ацетил и др.
4. Связь между любыми двумя углеводами в олигосахариде за исключением связи Neu5Acα2-6 может быть 1-2, 1-3, 1-4 и/или 1-6 (как правило, 1-3 или 1-4); и/или
5. Структура, в которой Neu5Acα2-6 связана GalNAcα, которая O-связана с указанным гликопротеином, а дополнительные сахара связаны с невосстанавливающим концом GalNAcα, например
i. Neu5Acα2-6(Neu5Acα2-3Galβ1-3)GalNAcα-
ii. Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAcα-
[00129] Согласно настоящему изобретению предложены связывающие агенты с заданной специфичностью связывания, а также предложены связывающие агенты с заданными характеристиками связывания в отношении гликанов с топологией зонтика.
[00130] Некоторые конкретные связывающие агенты, предложенные согласно настоящему изобретению, описаны ниже более подробно.
Полипептиды ГА
[00131] Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами согласно настоящему изобретению являются полипептиды ГА. Например, согласно настоящему изобретению предложены изолированные полипептиды ГА с заданной специфичностью связывания, а также предложены сконструированные полипептиды ГА с заданными характеристиками связывания в отношении гликанов с топологией зонтика.
[00132] Согласно некоторым вариантам реализации предложенные полипептиды ГА с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H1. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H2. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H3. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H4. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H5. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H6. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H7. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H8. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H9. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H10. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H11. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H12. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H13. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H14. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H15. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению с заданными характеристиками связывания представляют собой полипептиды H16.
[00133] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению не включают белок H1 из любого из штаммов:
А/Северная Каролина/1/1918; А/Пуэрто-Рико/8/1934; А/Тайвань/1/1986; А/Техас/36/1991; А/Пекин/262/1995; А/Йоханнесбург92/1996; А/Новая Каледония/20/1999; А/Соломоновы острова/3/2006.
[00134] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению не представляют собой белок H2 из любого из штаммов, вызвавших эпидемию азиатского гриппа в 1957-58 годах. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению не включают белок H2 из любого из штаммов: А/Япония/305+/1957; А/Сингапур/1/1957; А/Тайвань/1/1964; А/Тайвань/1/1967.
[00135] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению не включают белок H3 из любого из штаммов:
А/Аичи/2/1968; А/Филлипины/2/1982; А/Миссисипи/1/1985; А/Ленинград/360/1986; А/Сычуань/2/1987; А/Шанхай/11/1987; А/Пекин/353/1989; А/Шаньдунь/9/1993; А/Йоханнесбург/33/1994; А/Наньчан/813/1995; А/Сидней/5/1997; А/Москва/10/1999; А/Панама/2007/1999; А/Вайоминг/3/2003; А/Оклахома/323/2003; А/Калифорния/7/2004; А/Висконсин/65/2005.
Варианты полипептидов ГА
[00136] Согласно некоторым вариантам реализации, предложенный полипептид ГА представляет собой вариант родительского полипептида ГА, в том смысле, что его последовательность аминокислот идентична последовательности аминокислот родительского ГА, но с малым числом определенных изменений в последовательности. Согласно некоторым вариантам реализации родительским ГА является полипептид ГА, обнаруживаемый у природного изолята вируса гриппа (например, полипептид ГА дикого типа).
[00137] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают другими характеристиками связывания с гликанами по сравнению с соответствующими родительскими полипептидами ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают более высоким сродством и/или специфичностью в отношении гликанов с топологией зонтика (например, по сравнению с гликанами с топологией конуса), по сравнению с родственными родительскими полипептидами ГА. Согласно некоторым вариантам реализации такие варианты полипептидов ГА представляют собой сконструированные варианты.
[00138] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают более высоким сродством и/или специфичностью в отношении гликанов с топологией зонтика по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают сниженным сродством и/или специфичностью в отношении гликанов с топологией зонтика по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают повышенным сродством и/или специфичностью в отношении гликанов с топологией зонтика по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА.
[00139] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают более высоким сродством и/или специфичностью в отношении α2-6 гликанов по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают более высоким сродством и/или специфичностью в отношении α2-6 и α2-3 гликанов по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают более высоким сродством и/или специфичностью в отношении α2-6 гликанов и пониженным сродством и/или специфичностью в отношении α2-3 гликанов по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА.
[00140] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают более высоким сродством и/или специфичностью в отношении гликанов с топологией зонтика и α2-3 гликанов по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают более высоким сродством и/или специфичностью в отношении гликанов с топологией зонтика и пониженным сродством и/или специфичностью в отношении α2-3 гликанов по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА.
[00141] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают более высоким сродством и/или специфичностью в отношении α2-6 гликанов и гликанов с топологией конуса по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению обладают более высоким сродством и/или специфичностью в отношении α2-6 гликанов и пониженным сродством и/или специфичностью в отношении гликанов с топологией конуса по сравнению с родственными им родительскими полипептидами ГА.
[00142] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению содержат одно или более изменений в последовательности, которые согласуются с последовательностями ГА, обнаруживаемыми в ГА другого подтипа. Если привести один из конкретных примеров,
согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 согласно настоящему изобретению содержит одно или более изменений в последовательности, что делает такой вариант полипептида ГА H5 боле схожим с полипептидом ГА H2. В соответствии с другим конкретным примером, согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 согласно настоящему изобретению содержит одно или более изменений в последовательности, которые приводят к большей схожести такого варианта полипептида ГА H5 с полипептидом ГА H1.
[00143] Настоящее изобретение в частности основано на том, что варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16) с измененным гликозилированием могут проявлять сродство в отношении рецепторов ГА человека, которое в 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10000 или более раз превышает сродство у эталонного полипептида ГА. Также настоящее изобретение в частности основано на том, что варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16) с измененями в петлевой области ГА могут проявлять сродство в отношении рецепторов ГА человека, которое в 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10000 или более раз превышает сродство у эталонного полипептида ГА (например, полипептида ГА в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID №:43-55).
[00144] Также настоящее изобретение в частности основано на том, что варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16) с измененным гликозилированием могут проявлять специфичность в отношении рецепторов ГА человека, которая в 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10000 или более раз превышает сродство у эталонного полипептида ГА. Также настоящее изобретение в частности основано на том, что варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16) с изменениями в петлевой области ГА могут проявлять специфичность в отношении рецепторов ГА человека, которая в 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10000 или более раз превышает сродство у эталонного полипептида ГА (например, полипептидом ГА в соответствии с любой из последовательностей SEQ ID №:43-55).
[00145] Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Северная Каролина/1/18 (H1N1) (SEQ ID №:43). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Брисбен/59/07 (SEQ ID №:44). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Калифорния/04/09 (SEQ ID №:45). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Албания/6/58 (H2N2) (SEQ ID №:46). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Аичи/1/68 (SEQ ID №:47). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Москва/10/99 (SEQ ID №:48). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Перт/16/09 (SEQ ID №:49). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Вьетнам/1203/04 (SEQ ID №:50). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Египет/2786-NAMRU3/06 (SEQ ID №:51). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Нью-Йорк/107/03 (SEQ ID №:52). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Гонконг/486/97 (SEQ ID №:53). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Гонконг/213/03 (SEQ ID №:54). Согласно некоторым вариантам реализации указанным эталонным полипептидом ГА является ГА из штамма А/Индонезия/5/05 (SEQ ID №:55).
[00146] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептида ГА с измененными характеристиками связывания содержат одно или более изменений в последовательности, которые затрагивают остатки в пределах сайта связывания с гликанами или влияющие на него. Согласно некоторым вариантам реализации такие замены касаются аминокислот, которые непосредственно взаимодействуют со связанным гликаном; согласно некоторым вариантам реализации такие замены касаются аминокислот, которые обладают одной удаленной степенью разделения с теми аминокислотами, которые взаимодействуют со связанным гликаном, в том смысле, что аминокислоты с одной удаленной степенью разделения либо (1) взаимодействуют с непосредственно связывающимися аминокислотами; либо (2) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, но не взаимодействуют непосредственно с самими гликанами; или (3) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, а также взаимодействуют непосредственно с самими гликанами. Варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению содержат одну или более замен в непосредственно связывающихся аминокислотах, аминокислотах с одной или более первыми удаленными степенями разделения, аминокислотах с одной или более вторыми удаленными степенями разделения и/или их сочетаниях. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению могут содержать замены в одной или более аминокислотах даже с более высокми степенями разделения.
[00147] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА с измененными характеристиками связывания гликанов содержат изменения в последовательности, которые затрагивают остатки, образующие контакты с углеводами за исключением Neu5Ac и Gal (см., например, Фигуру 7).
[00148] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА содержат по меньшей мере одну замену аминокислот по сравнению с родительским ГА дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере две, три, четыре, пять или более замен аминокислот по сравнению с родственным родительским ГА дикого типа; согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению содержат две, три или четыре замены аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации все такие замены аминокислот локализованы в пределах сайта связывания с гликанами.
[00149] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению содержат по меньшей одну или более замен аминокислот, описанных в любой из следующих публикаций: Публикации патента США №2009/0269342 и 2010/0004195, и Публикация патента США с серийным номером 12/829931 от 2 июля 2010 г., под названием "COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING И/ИЛИ TREATING INFLUENZA INFECTION" (каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки).
[00150] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА содержат замены аминокислот в положениях, соответствующих одному или более из остатков 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА, в частности варианты полипептида H5, содержат одну или более замен аминокислот по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, H5) в остатках, выбранных из группы, состоящей из остатков 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА, в частности варианты полипептида H5, содержат одну или более замен аминокислот по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, H5) в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или 37 остатках, выбранных из группы, состоящей из остатков 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 и 228.
[00151] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептида H5) содержат замены аминокислот, которые уменьшают или упраздняют гликозилирование в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептида H5) содержат замены в последовательности, которые влияют и/или изменяют идентичность и/или структуру гликана, связываемого с сайтом, соответсвующим аминокислоте в положении 158. Согласно некоторым вариантам реализации такой заменой в последовательности является мутация в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 158, например, Asn158Xaa, где Xaa - любая аминокислота кроме Asn. Согласно некоторым вариантам реализации такой заменой в последовательности является мутация в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 160, например, Thr160Xaa, где Xaa - любая аминокислота кроме Asn. Согласно некоторым вариантам реализации такая замена в последовательности включает мутацию Thr160Ala. Согласно некоторым вариантам реализации замена в последовательности, которая уменьшает, устраняет, влияет на гликозилирование или изменяет его в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 158, может приводить к более близкому подобию полипептида ГА не-H2 (например, полипептид ГА H5) с полипептидом ГА H2. Согласно некоторым вариантам реализации мутация в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 160 (например, Thr160Xaa, такая как Thr160Ala), может приводить к более близкому подобию (например, структурному и функциональному) полипептида ГА не-H2 (например, полипептид ГА H5) с полипептидом ГАН2.
[00152] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более из остатков 226, 228 и 160. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих остаткам 226, 228 и 160. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих остаткам 226 и 160. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих остаткам 228 и 160. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих остаткам 226 и 228.
[00153] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более из остатков 226, 228, и 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих остаткам 226, 228, и 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих остаткам 226 и 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих остаткам 228 и 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих остаткам 226 и 228.
[00154] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены, которые включают делецию в одной или более петлевой области полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности, которые включают делецию в сайте, соответствующем петлевой области 128-137 полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности, которые включают делецию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих остаткам 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 и/или 137 полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности, которые включают делецию в сайте, соответствующем петлевой области 128-134 полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности, которые включают делецию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих остаткам 128, 129, 130, 131, 132, 133, и/или 134 полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности, которые включают делецию аминокислоты, соответствующей остатку 130. Согласно некоторым вариантам реализации такие замены в петлевой области могут приводить к более близкому подобию (например, и структурному, и функциональному) варианта полипептида не-H2-полипептида ГА (например, полипептида ГА H5) с полипептидом ГА H2. Согласно некоторым вариантам реализации делеция аминокислоты, соответствующей остатку 130, может приводить к более близкому подобию (например, и структурному, и функциональному) варианта полипептида не-Н2-полипептида ГА (например, полипептида ГА H5) с полипептидом ГА H2.
[00155] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более из остатков 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130, и (2) одному или более из остатков 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130, и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228.
[00156] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более из остатков 131, 132, 135, 188, 192, 221 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 остаткам 131, 132, 135, 188, 192, 221 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 132, 135, 188, 192 и 221. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остаткам 131, 132, 135, 188, 192 и 221.
[00157] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 133, 137, 155, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 остаткам 133, 137, 155, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 133, 137, 155, 193, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 остаткам 133, 137, 155, 193, 226, 227 и 228.
[00158] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 130, 192 и 193. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2 или 3 остаткам 130, 192, 193. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или обоим остаткам 192 и 193.
[00159] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 остаткам в положениях 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228.
[00160] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остакам в положении 137, 188, 192, 193, 226 и 228.
[00161] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132, 133 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 остатков 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132, 133 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 и 133. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остаткам в положениях 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 и 133.
[00162] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 227, 131, 132, 133 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4 или 5 остаткам 227, 131, 132, 133 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 227, 131, 132 и 133. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3 или 4 остаткам в положении 227, 131, 132 и 133.
[00163] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 и 228.
[00164] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 и 228.
[00165] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 и 228.
[00166] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 и 228.
[00167] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих any 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 остаткам в положениях 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 и 228.
[00168] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221, 227 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остаткам в положениях 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221, 227 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 остаткам в положениях 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 и 227.
[00169] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 132, 133, 221, 227 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остатков в положениях 131, 132, 133, 221, 227 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 132, 133, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА (например, варианты полипептидов ГА H5) содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА (например, ГА H5) в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4 или 5 остаткам в положениях 131, 132, 133, 221 и 227.
[00170] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА и, в частности, вариант полипептида H5, содержит одну или более замен аминокислот относительно родительского ГА дикого типа в остатках, выбранных из аминокислот, расположенных в области рецептора, которая непосредственно связывается с гликаном, включая без ограничений остатки 98, 136, 153, 155, 183 и 194. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА согласно настоящему изобретению и, в частности, вариант полипептида H5, содержит одну или более замен аминокислот относительно родительского ГА дикого типа в остатках, выбранных из аминокислот, расположенных вблизи области рецептора, которая непосредственно связывается с гликаном, включая без ограничений (a) остатки 98 и 195, (b) остатки 98, 138, 186, 187, 195 и 228) или (c) остатки 138, 186, 187 и 228.
[00171] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА согласно настоящему изобретению в частности, вариант H5, содержит одну или более из следующих замен аминокислот: Ser132Thr, Ala133Thr, Ser133Thr, Ser137Ala, Ser137Arg, Ile155Thr, Lys156Glu, Asn158Xaa (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn), Thr160Ala, Asn186Pro, Asp187Ser, Asp187Thr, Ala188Glu, Ala188Asp, Ala189Gln, Ala189Lys, Ala189Thr, Glu190Asp, Glu190Thr, Thr192Arg/Lys, Lys193Arg, Lys193Asn, Lys193His, Lys193Ser, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ser221Pro, Gly225Asp, Gln226Ile, Gln226Leu, Gln226Val, Ser227Ala, Gly228Ser.
[00172] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) согласно настоящему изобретению содержит замену аминокислоты в положении, соответствующем остатку 192, которая приводяит к смене заряда в данном положении. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) согласно настоящему изобретению содержит замену аминокислоты в положении, соответствующем остатку 193, которая приводяит к смене заряда в данном положении. Например, согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) согласно настоящему изобретению содержит Thr или гидрофобный остаток (например, Val или Ile) в положении, соответствующем остатку 192, а вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит гидрофильный остаток в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит гидрофильный остаток в положении, соответствующем остатку 192. В соответствии с другим примером, согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) согласно настоящему изобретению содержит Thr или гидрофобный остаток (например, Val или Ile) в положении, соответствующем остатку 192, а вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит основный остаток (например, Lys или Arg) в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит основный остаток (например, Lys или Arg) в положении, соответствующем остатку 192. В соответствии с еще одним примером, согласно некоторым вариантам реализации, полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) согласно настоящему изобретению содержит основный остаток (например, Lys или Arg) в положении, соответствующем остатку 193, а вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит нейтральный или кислый остаток в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит нейтральный или кислый остаток в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193.
[00173] Согласно некоторым вариантам реализации, адаптация полипептидов ГА (например, полипептидов ГА H5) к организму человека ассоциирована со свойством (свойствами) остатка в положении 188. В ГА H5 остатком 188 часто является Ala, который образует контакт с Thr или гидрофобным остатком в положении 192. Напротив, в ГА H2, остатком 188 часто является Glu или Asp, который образует контакт с Arg или Lys в положении 192. Следовательно, согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Glu в положении 188. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Asp в положении 188. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит замену Ala188Glu. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит замену Ala188Asp.
[00174] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188 и Thr в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188 и гидрофобный остаток в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188 and an Arg в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, и Arg в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, и Lys в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, и Lys в положении, соответствующем остатку 192.
[00175] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188, Thr в положении, соответствующем остатку 192, и Lys в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188, гидрофобный остаток в положении, соответствующем остатку 192, и Lys в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188, Thr в положении, соответствующем остатку 192, и Arg в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188, гидрофобный остаток в положении, соответствующем остатку 192, и Arg в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, Arg в положении, соответствующем остатку 192, и Thr в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, Arg в положении, соответствующем остатку 192, и Thr в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, Lys в положении, соответствующем остатку 192, и Thr в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, Lys в положении, соответствующем остатку 192, и Thr в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, Arg в положении, соответствующем остатку 192, и Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, Arg в положении, соответствующем остатку 192, и Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, Lys в положении, соответствующем остатку 192, и Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, Lys в положении, соответствующем остатку 192, и Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193.
[00176] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ala в положении, соответствующем остатку 131. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Thr в положении, соответствующем остатку 131.
[00177] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ser в положении, соответствующем остатку 132. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Thr в положении, соответствующем остатку 132.
[00178] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ser в положении, соответствующем остатку 133. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Thr в положении, соответствующем остатку 133.
[00179] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) включает Ala, Thr и/или Ser в любом из положений, соответствующих остаткам 131, 132 и/или 133. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) включает Ala, Thr и/или Ser в любом из положений, соответствующих остаткам 131, 132 и/или 133. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) включает Thr во всех положениях, соответствующих остаткам 131, 132 и 133.
[00180] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Val в положении, соответствующем остатку 135. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит любую аминокислоту, отличную от Val, в положении, соответствующем остатку 135.
[00181] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ser в положении, соответствующем остатку 137. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Arg в положении, соответствующем остатку 137.
[00182] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ile в положении, соответствующем остатку 155. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Thr в положении, соответствующем остатку 155. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) включает Thr в положении, соответствующем остатку 155. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) включает Thr в положении, соответствующем остатку 155.
[00183] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ser в положении, соответствующем остатку 221. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Pro в положении, соответствующем остатку 221.
[00184] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) включает Ser в положении, соответствующем остатку 221. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) включает Pro в положении, соответствующем остатку 221. Не вдаваясь в теорию, Рго221 может влиять на конформацию петли 220, которая связана с RBS полипептида ГА Н2.
[00185] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Gln в положении, соответствующем остатку 226. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Leu в положении, соответствующем остатку 226.
[00186] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Ser в положении, соответствующем остатку 227. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Gly в положении, соответствующем остатку 227.
[00187] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) содержит Gly в положении, соответствующем остатку 228. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) содержит Ser в положении, соответствующем остатку 228.
[00188] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА (например, полипептид ГА H5) включает остатки Gln, Ser и Gly в положениях, соответствующих остаткам 226, 227 и 228, соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА (например, вариант полипептида H5) включает Leu, Gly и Ser в положениях, соответствующих остаткам 226, 227 и 228, соответственно.
[00189] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА согласно настоящему изобретению, и в частности вариант H5, содержит одну или более из следующих аминокислот в указанных положениях (нумерация указанных положений соответствует
нумерации в ГА H3):
- Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp, Gln226Leu
- Glu190Asp, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
- Ala189Gln, Lys193Ser, Thr160Ala
- Ala189Gln, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
- Asp187Ser/Thr, Ala189Gln, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
- Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
- Asp187Ser/Thr, Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
- Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
- Lys193His, Gln226Leu/Ile/Val, Gly228Ser
- Lys193Arg, Gln226Leu/Ile/Val, Gly228Ser
- Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
- Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
- Ser137Ala, Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
- Glu190Thr, Lys193Ser, Gly225Asp
- Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp
- Asn186Pro, Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp
- Asn186Pro, Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp, Ser227Ala
- Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala
- Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala
- Gly228Ser, Thr160Ala
- Gln226Leu, Thr160Ala
- Gln226Leu, Gly228Ser
- Thr160Ala
- Gln226Leu, Gly228Ser, Asn158Xaa (wherein Xaa = any amino acid besides Asn)
- Gly228Ser, Asn158Xaa
- Gln226Leu, Asn158Xaa
- Gln226Leu, Gly228Ser
- Asn158Xaa
- Δ130 (где «Δ130» обозначает делецию аминокислоты, соответствующей положению 130) плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 135, 188, 192 и 221
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 133, 137, 155, 193, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 и 227
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 221 и 227
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 137, 188, 192, 193, 226 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 и 133
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 227, 131, 132 и 133
- Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala, Δ130
- Gln226Leu, Gly228Ser, Δ130
- Gln226Leu, Thr160Ala, Δ130
- Gly228Ser, Thr160Ala, Δ130
- Gln226Leu, Δ130
- Gly228Ser, Δ130
- Thr160Ala, Δ130
- Δ130
- Δ130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Ser227Gly, Gly228Ser
- Δ130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Gly228Ser
- Δ130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Asn159Asp (или Thr160Ala, или обе), Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Ser227Gly, Gly228Ser
- Δ130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Asn159Asp (или Thr160Ala, или обе), Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Gly228Ser
- Δ130, Ser137Arg, Ala188Glu, Thr192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val, Gln226Leu, Gly228Ser
- Δ130, Ser137Arg, Ala188Glu, Thr192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val, Gln226Leu, Gly228Ser, Xaa131Ser/Thr, Xaa132Ser/Thr, Xaa133Ser/Thr, Ser221Pro, Ser227Gly (где Xaa = любая аминокислота)
- Δ130, Xaa131Ser/Thr, Xaa132Ser/Thr, Xaa1133Ser/Thr, Ser221Pro, Ser227Gly (где Xaa = любая аминокислота)
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофобная аминокислота, а Xaa' = любая гидрофильная аминокислота)
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток)
- Δ130, Xaa193Xaa' (где Xaa = основный остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток)
- Δ130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофобная аминокислота, а Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Xaa193Xaa' (где Xaa = основный остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток)
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток)
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
- Δ130, Ala188Glu
- Δ130, Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Ala188Glu
- Δ130, Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, and Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Glu
- Δ130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, and Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Ala188Asp
- Δ130, Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, and Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Asp
- Δ130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, and Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, and Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, and Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
[00190] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены полипептиды ГА (например, варианты полипептидов ГА, сконструированные полипептиды ГА и/или сконструированные полипептиды ГА), последовательность аминокислот в которых включает элемент, указанный ниже:
- X190, X193, X225 и X226
- X190, X193, X226 и X228
- X189, X193, X160
- X189, X193, X226, X228
- X187, X189, X193, X226, X228
- X189, X193, X226, X228
- X187, X189, X193, X226, X228
- X156, X189, X193, X226, X228
- X193, X226, X228
- X193, X226, X228
- X189, X193, X225
- X156, X189, X193, X225
- X137, X156, X189, X193, X225
- X190, X193, X225
- X187, X189, X190, X193, X225
- X186, X187, X189, X190, X193, X225
- X186, X187, X189, X190, X193, X225, X227
- X226, X228, X160
- X226, X228, X160
- X228, X160
- X226, X160
- X226, X228
- Х160
- X226, X228, Xaa158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn)
- Х228, Xaa158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn)
- X226, Xaa158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn)
- X226, X228
- X158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn)
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X132, X133, X135, X137, X155, X188, X192, X193, X221, X226, X227 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X132, X135, X188, X192 и X221
- X130 плюс любое возможное сочетание X133, X137, X155, X193, X226, X227 и X228
- Х130 плюс любое возможное сочетание X131, X132, X133, X135, X137, X155, Xaa158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn), X160, X188, X192, X193, X221, X226, X227 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X227 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X227 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X133, X137, X155, Х159, X160, X188, X192, X193, X226 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X137, X188, X192, X193, X226, X228, X131, X132, X133, X221 и X227
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X132, X133, X221 и X227
- X130 плюс любое возможное сочетание X137, X188, X192, X193, X226 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X137, X188, X192, X193, X226, X227, X228, X131, X132 и X133
- X130 плюс любое возможное сочетание X227, X131, X132 и X133
- X226, X228, X160, X130
- X226, X228, X130
- X226, X160, X130
- X228, X160, X130
- X226, X130
- X228, X130
- X160, X130
- X130
- X130, X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X227, X228
- X130, X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X228
- X130, X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X227, X228
- X130, X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X228
- X130, X137, X188, X192, X193, X226, X228
- X130, X137, X188, X192, X193, X226, X228, X131, X132, X133, X221, X227
- X130, X131, X132, X133, X221, X227
- X130, X192
- X130, X193
- X130, X192, X193
- X130, X188
- X130, X192, X188
- X130, X193, X188
- X130, X192, X193, X188
где X = любая аминокислота (если выше не указано другое) и/или X = выпавшая аминокислота. Нумерация указанных положений соответствует нумерации в ГА H3.
[00191] Согласно некоторым вариантам реализации X130 является делецией в положении 130. Согласно некоторым вариантам реализации, X160 представляет собой Ala. Согласно некоторым вариантам реализации, X158 - любая аминокислота кроме Asn.
[00192] Согласно некоторым таким вариантам реализации указанный вариант полипептида ГА H5 содержит по меньшей мере еще одну замену по сравнению с ГА H5 дикого типа, такую, что повышается сродство и/или специфичность указанного варианта в отношении гликанов с топологией зонтика.
[00193] Согласно некоторым таким вариантам реализации указанный полипептид ГА содержит по меньшей мере еще одну замену по сравнению с ГА H5 дикого типа, такую, что повышается сродство и/или специфичность указанного варианта в отношении гликанов с топологией зонтика.
[00194] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают L226, S228 и А 160. Согласно некоторым вариантам реализации, полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают L226 и А160. Согласно некоторым вариантам реализации, полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают S228 и А160. Согласно некоторым вариантам реализации, полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают А160.
[00195] Согласно некоторым вариантам реализации, полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают L226, S228 и X158 (где X = любая аминокислота кроме Asn). Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают L226 и X158. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают S228 и Х158. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Х158.
[00196] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228.
[00197] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, S228, A160 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, A160 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, S228, A160 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, S228 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221 и 227.
[00198] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, A160 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221 и 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, S228 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226 и 227.
[00199] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, S228, X158 (где X = любая аминокислота кроме Asn) и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, X158 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, S228, X158 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, S228 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188,192, 193, 221 и 227.
[00200] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, X158 (где X = любая аминокислота кроме Asn) и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228.
[00201] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 (например, варианты полипептидов ГА H5) согласно настоящему изобретению содержат открытый сайт связывания по сравнению с родительским ГА, и в частности, с родительскими ГА дикого типа.
[00202] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА (например, полипептиды ГА H5) согласно настоящему изобретению связываются со следующими α2-6-сиалированными гликанами: , , , , , , , , сочетанием. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются с гликанами, обладающими структурой: , ,  и их сочетаниями; и/или ; и/или ; и/или , , , и их сочетаниями. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА (например, полипептиды ГА H5) согласно настоящему изобретению связываются с ,  или ; согласно некоторым вариантам реализации to ; согласно некоторым вариантам реализации с ; и согласно некоторым вариантам реализации с ,  и/или .
[00203] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА (например, полипептиды ГА H5) согласно настоящему изобретению связываются с гликанами с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются по меньшей мере с некоторыми из гликанов (например, α2-6-сиалированными гликанами), изображенными на Фиугре 9. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА (например, полипептиды ГА H5) согласно настоящему изобретению связываются с несколькими гликанами, изображенными на Фиугре 9.
[00204] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА (например, полипептиды ГА H5) согласно настоящему изобретению связываются по меньшей мере приблизительно с 10%, приблизительно с 15%, приблизительно с 20%, приблизительно с 25%, приблизительно с 30% приблизительно с 35%, приблизительно с 40%, приблизительно с 45%, приблизительно с 50%, приблизительно с 55%, приблизительно с 60%, приблизительно с 65%, приблизительно с 70%, приблизительно с 75%, приблизительно с 80%, приблизительно с 85%, приблизительно с 90% приблизительно с 95% или более из гликанов, обнаруживаемых в рецепторах ГА в тканях верхних дыхательных путей человека (например, в клектах эпителия).
[00205] Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложено конкретное установление того факта, что одного только высокоаффинного связывания с гликанами с топологией зонтика может быть недостаточно для эффективной передачи/инфицирующей способности в организме человека. Согласно настоящему изобретению предложено представление о том, что также может быть важно сниженное связывание с гликанами с топологией конуса. Согласно некоторым вариантам реализации высокоаффинное связывание с гликанами с топологией зонтика и сниженное связывание с гликанами с топологией конуса могут способствовать передаче инфекции/ инфицирующей способности в организме человека. Согласно некоторым вариантам реализации для эффективной передачи/инфицирующей способности в организме человека достаточно высокоаффинного связывания с гликанами с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации для эффективной передачи/инфицирующей способности в организме человека достаточно высокоаффинного связывания с гликанами с топологией зонтика, даже если сродство связывания с гликанами с топологией конуса не снижено (например, неизменно, повышено и т.д.).
[00206] Согласно некоторым вариантам реализации повышенное сродство и/или специфичность связывания варианта полипептида ГА (например, варианта полипептида ГА H5) с гликанами с топологией зонтика и пониженное сродство и/или специфичность связывания с гликанами с топологией конуса может способствовать увеличению или усилению передачи/инфицирующей способности в организме человека по сравнению с эталонным полипептидом (например, родительский полипептид ГА, родственный указанному варианту полипептида ГА). Согласно некоторым вариантам реализации повышенного сродства и/или специфичности связывания варианта полипептида ГА (например, варианта полипептида ГА H5) с гликанами с топологией зонтика достаточно для увеличения или усиления передачи/инфицирующей способности в организме человека по сравнению с эталонным полипептидом (например, родительский полипептид ГА, родственный указанному варианту полипептида ГА). Согласно некоторым вариантам реализации повышенного сродства и/или специфичности связывания варианта полипептида ГА (например, варианта полипептида ГА H5) с гликанами с топологией зонтика достаточно для увеличения или усиления передачи/инфицирующей способности в организме человека по сравнению с эталонным полипептидом (например, родительский полипептид ГА, родственный указанному варианту полипептида ГА), даже если сродство и/или специфичность связывания с гликанами с топологией конуса не понижено (например, неизменно, повышено и т.д.). Согласно некоторым вариантам реализации повышенного сродства и/или специфичности связывания варианта полипептида ГА (например, варианта полипептида ГА H5) с гликанами с топологией зонтика достаточно для увеличения или усиления передачи/инфицирующей способности в организме человека по сравнению с эталонным полипептидом (например, родительский полипептид ГА, родственный указанному варианту полипептида ГА), даже если сродство и/или специфичность связывания с гликанами с топологией конуса такое же или выше, чем сродство и/или специфичность связывания с гликанами с топологией зонтика.
Части или фрагменты полипептидов ГА
[00207] Также согласно настоящему изобретению предложены характеристические части (которые могут быть или не быть связывающими агентами) полипептидов ГА согласно настоящему изобретению и нуклеиновых кислот, которые их кодируют. Как правило, характеристической частью является часть, которая содержит непрерывный массив аминокислот или набор непрерывных массивов аминокислот, которые в совокупности характерны для полипептида ГА. Каждый такой непрерывный массив, как правило, должен содержать по меньшей мере две аминокислоты. Кроме того, специалисты в данной области техники должны понимать, что для характеристической части полипептида ГА H5 требуется по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или более аминокислот. Как правило, характеристической частью является часть, которая помимо идентичности последовательностей, указанной выше, обладает по меньшей мере одной общей функциональной характеристикой с рассматриваемым интактным полипептидом ГА. Согласно некоторым вариантам реализации, характеристические части полипептида ГА согласно настоящему изобретению обладают характеристиками связывания гликанов, общими с рассматриваемыми непроцессированными полипептидами ГА.
He-ГА полипептиды
[00208] Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами, предложенными согласно настоящему изобретению являются полипептиды, последовательность аминокислот в которых не включает характерной последовательности ГА. Такие полипептиды в настоящей заявке называют не-ГА полипептидами. Согласно некоторым вариантам реализации не-ГА полипептид содержит последовательность аминокислот, выбранную предварительно (например, посредством рациональной разработки, включая, например, введение изменений стратегических аминокислот [например, добавления, делеции и/или замены] по сравнению с эталонной последовательностью). Согласно некоторым вариантам реализации не-ГА полипептид содержит последовательность аминокислот, которую определяют случайным образом и, например, идентифицируют на основании желаемых характеристик связывания, которые определены в настоящей заявке.
Антитела
[00209] Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами, предложенными согласно настоящему изобретению, являются антитела (например, которые связываются с гликанами с топологией зонтика и/или с миметиками гликанов с топологией зонтика). Антитела, пригодные для настоящего изобретения, включают антитела или фрагменты антител, которые иммуноспецифически связываются с эпитопом гликанов с топологией зонтика. Предполагается, что в настоящей заявке термин «антитела» должен охватывать иммуноглобулины и их фрагменты, которые специфически реагируют с заданным белком или пептидом, или их фрагментом. Пригодные антитела включают без ограничений антитела человека, приматизированные антитела, химерные антитела, антитела с двойной специфичностью, гуманизированные антитела, конъюгированные антитела (т.е., антитела конъюгированные или гибридизованные с другими белками, радиоактивными метками, цитотоксинами), малые модуляторные иммунопрепараты («SMIPs™»), одноцепочечные антитела, антитела эллиптоцитов и фрагменты антител. Также в настоящей заявке термин «антитела» включает интакткные моноклональные антитела, поликлональные антитела, антитела с одним доменом (например, антитела акулы с одним доменом (например, IgNAR или его фрагмент), антитела с множественной специфичностью (например, антитела с двойной специфичностью), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, и фрагменты антител, если они проявляют желаемую биологическую активность. Полипептиды антител для применения в настоящем изобретении могут быть любого типа (например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM).
[00210] В настоящей заявке термин «фрагмент антитела» включает часть интактного антитела, например, такого как антиген-связывающая или вариабельная область антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; триотела, тетратела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; и антитела с множественной специфичностью, образованные из фрагментов антител. Термин «фрагмент антитела» также включает любой синтетический или генетически сконструированный белок, который действует подобно антителу, связываясь со специфическим антигеном и образуя комплекс. Например, фрагменты антител включают изолированные фрагменты, фрагменты «Fv», состоящие из варибельных областей тяжелых и легких цепей, молекулы рекомбинантных одноцепочечных полипептидов, в которых вариабельные области легких и тяжелых цепей соединены пептидным линекром («белки ScFv») и минимальные распознаваемые единицы, состоящие из остатков аминокислот, которые имитируют гипервариабельную область.
[00211] Антитела можно генерировать при помощи способов, известных в данной области техники. Например, протоколы получения антител описаны Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual; данная публикация включена в настоящую заявку посредством ссылки. Как правило, антитела можно генерировать в организме таких хозяев, как мышь, крыса, морская свинка, хомяк, верблюд, лама, акула, или другого подходящего хозяина. В качестве альтернативы, антитела можно получать в организме цыпленка, вырабатывающего молекулы IgY (Schade et al., 1996, ALTEX 13(5): 80-85; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Согласно некоторым вариантам реализации антитела, пригодные для настоящего изобретения, представляют собой антитела человекообразных обезьян. Например, описание общих технологий получения применимых в терапии антител, можно найти у Goldenberg et al., заявка на Международный патент под номером WO 91/11465, 1991; и у Losman et al., 1990, Int. J. Cancer 46:310; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки. Согласно некоторым вариантам реализации моноклональные антитела можно получить при помощи способа с гибридомами (Milstein and Cuello, 1983, Nature 305(5934): 537-40; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Согласно некоторым вариантам реализации моноклональные антитела можно также получить при помощи рекомбинантных технологий (Патент США под номером 4,166,452, 1979; включен в настоящую заявку посредством ссылки).
[00212] Согласно некоторым вариантам реализации антитела, пригодные для настоящего изобретения, могут включать гуманизированные антитела или антитела человека. Гуманизированные формы нечеловеческих антител включают химерные Ig, цепи или фрагменты Ig (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')2 или другие антиген-связывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого Ig. Обычно гуманизированное антитело содержит один или более остатков аминокислот, вводимых из нечеловеческого источника. Указанные нечеловеческие остатки аминокислот часто называют «импортными» остатками, которые, как правило, берут из «импортного» вариабельного домена. Гуманизации достигают путем замены гипервариабельных областей (CDR) грызунов или последовательностей CDR на соответствующие последовательности антитела человека (Riechmann et al., 1988, Nature 332(6162): 323-7; Verhoeyen et al., 1988, Science. 239(4847): 1534-6; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки). Такие гуманизированные антитела являются химерными антителами (Патент США под номером 4816 567, 1989; включен в настоящую заявку посредством ссылки), в которых по существу менее интактная область антитела человека была заменена соответствующей последовательностью из вида, отличного от человека. Согласно некоторым вариантам реализации гуманизированные антитела представляют собой, как правило, антитела человека, в которых некоторые остатки CDR и возможно некоторые остатки FR заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов. Гуманизированные антитела включают Ig человека (антитело-реципиент), в которых остатки из CDR реципиента заменены остатками из CDR вида, отличного от человека (антитело-донор), такого как мышь, крыса или кролик, обладающими желаемыми специфичностью, сродством и активностью. В некоторых случаях, соответствующие остатки из нечеловеческого антитела замещают остатками каркаса Fv из Ig человека. Гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются ни в антителе-реципиенте, ни в импортируемых последовательностях CDR или каркаса. Обычно гуманизированные антитела содержат все из по меньшей мере одного, и как правило - двух вариабельных доменов, в которых большинство, если не все из областей CDR соответствуют областям нечеловеческого Ig, а большинство, если не все из областей FR являются областями консенсусной последовательности Ig человека. В оптимальном случае гуманизированное антитело содержит по меньшей мере часть константной области Ig (Fc), как правило из Ig человека (Riechmann et al., 1988, Nature 332(6162): 323-7; Verhoeyen et al., 1988, Science. 239(4847): 1534-6; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки).
[00213] Также антитела человека можно получать при помощи разных технологий, включая библиотеки фагового дисплея (Hoogenboom et al., 1991, Mol Immunol. 28(9): 1027-37; Marks et al., 1991, J Mol Biol. 222(3): 581-97; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки) и получение моноклональных антител человека (Reisfeld and Sell, 1985, Cancer Surv. 4(1): 271-90; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Аналогично, для синтеза антител человека можно применять введение генов Ig человека в клетки трансгенных животных, у которых гены эндогенного Ig были частично или полностью инактивированы. При провокации отмечается выработка антител человека, которая во всех отношениях напоминает выработку у человека, включая перегруппировку генов, сборку и репертуар антител (Fishwild et al., 1996, Nat Biotechnol. 14(7): 845-51; Lonberg et al., 1994, Nature 368(6474): 856-9; Lonberg and Huszar, 1995, Int. Rev. Immunol. 13(1): 65-93; Marks et al., 1992, Biotechnology (NY). 10(7): 779-83; все публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки).
Лектины
[00214] Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами согласно настоящему изобретению являются лектины. Лектины представляют собой белки, связывающиеся с углеводами, которые могут связываться с растворимым углеводом или углеводной группой, который является частью гликоконъюгата (например, гликопептида или гликолипида). Как правило, лектины агглютинируют определенные клетки животных и/или осаждают гликоконъюгаты, распознавая конкретную углеводную группу. Например, SNA-1 представляет собой лектин, который обладает высоким сродством к α2-6-сиаловым кислотам. В соответствии с еще одним примером, лектины из гриба Polyporus squamosus (PSL1a и PSL1b) обладают высоким сродством связывания сиалированных гликоконъюгатов, содержащих трисахаридные последовательности Neu5Acα2,6Galβ1,4Glc/GlcNAc связанных с аспарагином гликопротеинов. Неограничивающие примеры пектинов, которые могут выступать в качестве связывающих агентов, включают SNA-1, SNA-1’, PSL1a, PSL1b и полипептиды, полученные из них.
Последовательности аминокислот примеров пектинов приведены ниже:
[00215] Лектин 1 Sambucus Nigra (№ доступа в Genbank U27122):
[00216] Пектин 1' Sambucus Nigra (№ доступа в Genbank U66191):
[00217] Пектин 1a Polyporous squamosus (UniProt Q75WT9)
[00218] Пектин 1b Polyporous squamosus (UniProt Q75WT8)
Аптамеры
[00219] Согласно некоторым вариантам реализации связывающими агентами, предложенными в настоящем изобретении, являются аптамеры. Аптамеры представляют собой макромолекулы, состоящие из нуклеиновых кислот (например, РНК, ДНК), которые прочно связываются со специфической молекулярной мишенью (например, гликаном с топологией зонтика). Конкретный аптамер можно описать линейной последовательностью нуклеотидов, и длина его составляет, как правило, от 15 до 60 нуклеотидов. Не вдаваясь в теорию, предполагается, что цепь из нуклеотидов в аптамере образует внутримолекулярные взаимодействия, которые способствуют сворачиванию молекулы в сложную трехмерную структуру, и такая трехмерная структура позволяет аптамеру прочно связываться с поверхностью молекулы-мишени. Если учесть огромное разнообразие молекулярных форм, которые существуют в мире всех возможных последовательностей нуклеотидов, можно получить аптамеры для широкого спектра молекулярных мишеней, включая белки и малые молекулы. Помимо высокой специфичности аптамеры обладают высоким сродством к своим мишеням (например, сродство в отношении белков от пикомолярного до нижнего наомолярного диапазона). Аптамеры химически стабильны и могут подвергаться кипячению и замораживанию без потери активности. Поскольку аптамеры являются синтетическими молекулами, они поддаются разнообразным модификациям, которые позволяют оптимизировать их функцию для конкретных областей применения. Например, аптамер можно модифицировать, существенно снизив его чувствительность к расщеплению ферментами в крови для применения в приложениях in vivo. Кроме того, аптамеры можно модифицировать, изменив их биораспределение или время жизни в плазме крови.
15
[00220] Выбор аптамеров, которые могут связываться с гликанами с топологией зонтика (и/или миметиками гликанов с топологией зонтика) можно сделать при помощи способов, известных в данной области техники. Например, аптамеры можно выбирать при помощи способа SELEX (Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением) (Tuerk and Gold, 1990, Science 249: 505-510; включена в настоящую заявку посредством ссылки). При применении способа SELEX получают большую библиотеку молекул нуклеиновых кислот (например, 10 разных молекул) и/или проводят скрининг с применением молекулы-мишени (например, гликана с топологией зонтика или эпитопа гликана с топологией зонтика). Молекулу-мишень инкубируют с библиотекой последовательностей нуклеотидов в течение некоторого периода времени. Затем можно применять несколько способов, известных в данной области техники, чтобы физически отделить комплексы молекула-мишень-аптамер от несвязавшихся молекул в смеси, которые можно выбросить. Аптамеры с самым высоким сродством к указанной молекуле-мишени затем можно очистить от молекулы-мишени и амплифицировать ферментативным способом, получив новую библиотеку молекул, которые по существу обогащены апатмерами, способными прочно связываться с молекулой-мишенью. Затем обогащенную библиотеку можно применять для инициации нового цикла отбора, разделения и амплификации. После 5-15 циклов такого итерационного отбора, разделения и амплификации библиотека сокращается до малого числа аптамеров, которые прочно связываются с молекулой мишенью. Отдельные молекулы в смеси можно затем выделить, определить их последовательности нуклеотидов, оценить и сравнить их свойства в отношении сродства и специфичности связывания. Выделенные аптамеры можно в дальнейшем очистить, исключив любые нуклеотиды, которые на вносят вклад в связывание с мишенью и/или структуру аптамера, и получить таким образом аптамеры, сокращенные до центрального связывающего домена. Для обзора по технологии аптамеров см. Jayasena, 1999, din. Chem. 45: 1628-50; основной замысел которой включен в настоящую заявку посредством ссылки).
Получение полипептидов
[00221] Полипептиды согласно настоящему изобретению (например, полипептиды ГА и/или не-ГА полипептиды), и/или их характеристические части, или кодирующие их нуклеиновые кислоты можно получать при помощи любых доступных способов.
[00222] Полипептиды согласно настоящему изобретению (или их характеристические части) можно получить, например, применяя систему на основе клеток-хозяев, разработанную для экспрессии кодирующей полипептид нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению.
[00223] Для получения полипептидов (или характеристических частей) можно применять любую систему, такую как яйца, бакуловирус, клетки растений, дрожжей, клетки Мадин-Дарби почек собак (MDCK) или клетки Vero (почек африканской зеленой мартышки). В качестве альтернативы или дополнительно полипептиды (или характеристические части) можно экспрессировать в клетках при помощи рекомбинантных технологий, таких как с применением вектора экспрессии (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL Press, 1989; включен в настоящую заявку посредством ссылки).
[00224] В качестве альтернативы или дополнительно полипептиды согласно настоящему изобретению (или их характеристические части) можно получить путем синтеза.
[00225] В качестве альтернативы или дополнительно полипептиды согласно настоящему изобретению (или их характеристические части), и в частности полипептиды ГА, можно получить в контексте интактного вируса, по остальным параметрам - дикого типа, ослабленного или убитого, и т.д. Полипептиды согласно настоящему изобретению (например, полипептиды ГА), или их характеристические части можно также получить в контексте вирусоподобных частиц.
[00226] Согласно некоторым вариантам реализации, полипептиды ГА (или их характеристические части) можно выделить или очистить из вируса гриппа. Например, вирус можно вырастить в яйцах, таких как куриные яйца с зародышем, и в таком случае собираемым материалом, как правило, служит аллантоисная жидкость. В качестве альтернативы или дополнительно вирус гриппа можно получить при помощи любого способа с применением культур тканей для роста вируса. Подходящие клеточные субстраты для роста вируса включают, например, клетки почек собак, такие как MDCK или клетки из клона MDCK, MDCK-подобные клетки, клетки почек обезьян, такие как клетки AGMK, включая клетки Vero, культивируемые клетки эпителия, такие как стабильные клеточные линии, клетки 293Т, клетки ВК-21, клетки CV-1 или клетки млекопитающих любого другого типа, подходящие для получения вируса гриппа с целью производства вакцин, которые можно легко получить из коммерческих источников (например, АТСС, Rockville, MD). Также подходящие клеточные субстраты включают клетки человека, такие как клетки MRC-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничиваются линиями клеток; например, также они включают первичные клетки, такие как фибробласты зародышей цыплят.
[00227] Также специалисты в данной области техники должны понимать, что полипептиды, и в частности варианты полипептидов ГА, описываемые в настоящей заявке, можно сгенерировать, идентифицировать, выделить и/или получить путем культивирования клеток или организмов, которые вырабатывают указанный полипептид (отдельно или как часть комплекса, в том числе как часть вирусной частицы или вируса), при условиях, которые делают возможными скрининг и/или отбор полипептидов, способных связываться с гликанами с топологией зонтика. В качестве примера, согласно некоторым вариантам реализации может быть полезно получить и/или исследовать сбор полипептидов (например, вариантов полипептидов ГА) при условиях, которые позволяют выявлять и благоприятны для тех вариантов, которые связываются с гликанами с топологией зонтика (например, с конкретной специфичностью и/или сродством). Согласно некоторым вариантам реализации такой сбор полипептидов (например, вариантов полипептидов ГА) возникает вследствие эволюции в природе. Согласно некоторым вариантам реализации такой сбор полипептидов (например, вариантов полипептидов ГА) получают в результате разработки. Согласно некоторым вариантам реализации такой сбор полипептидов (например, вариантов полипептидов ГА) получают сочетанием разработки и эволюции в природе.
Рецепторы ГА
[00228] ГА взаимодействуют с поверхностью клеток путем связывания с гликопротеиновыми рецепторами. Связывание ГА с рецепторами ГА преимущественно опосредуется N-связанными гликанами на рецепторах ГА. Более точно, ГА на поверхности частиц вируса гриппа распознает сиалированные гликаны, которые ассоциированы с рецепторами ГА на поверхности клетки-хозяина. После распознавания и связывания клетка-хозяин засасывает частицу вируса, и вирус может реплицироваться и производить большое количество частиц для распространения в соседние клетки. Были идентифицированы некоторые кристаллические структуры взаимодействий примерных ГА-гликан, и они приведены в Таблице 1:
Таблица 1
Кристаллические структуры комплексов ГА-гликан
Сокращение (Идентификационный номер в базе данных белковых структур)
Штамм вируса
Гликан (с присвоенными координатами)
ADkALB76_H1_26 (2WRH)
А/утка/Альберта/76 (H1N1)
Neu5Ac
ASI30_H1_23 (1RVO)
А/свинья/Айова/30 (H1N1)
Neu5Ac
ASI30_H1_26(1RVT)
А/свинья/Айова/30 (H1N1)
Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc
ASC18_H1_26(2WRG)
А/Северная Каролина/1/18 (H1N1)
Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ3Gal
APR34_H123 (1RVX)
А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)
Neu5Acα3Galβ4GlcNAc
APR34_H1_26 (1RVZ)
А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)
Neu5Acα6Galβ4GlcNAc
ACkNY91_H2_23 (2WR2)
А/курица/НЙ/29878/91 (H2N2)
Neu5Acα3Galβ3GlcNAc
AckNY91_H2_26 (2WR1)
А/курица/НИ/29878/91 (H2N2)
Neu5Acα6Galβ4GlcNAc
AdkON77_H2_23 (2WR3)
А/утка/Онтарио/77 (H2N2)
Neu5Acα3Galβ4GlcNAc
AdkON77_H2_26 (2WR4)
А/утка/Онтарио/77 (H2N2)
Neu5Acα6Galβ4GlcNAc
AckPD84_H2_26 (2WRF)
А/курица/Потсдам/475/84 (H2N2)
Neu5Acα6Gal
ASING57_H2_23 (2WRB)
А/Сингапур/1/57 (H2N2)
Neu5Ac
ASING57_H2_26 (2WR7)
А/Сингапур/1/57 (H2N2)
Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ3Gal
AJAP57_H2_26 (2WRE)
А/Япония/305/57 (H2N2)
Neu5Acα6Gal
ADU63_H3_23 (1MQM)
А/Утка/Украина/1/63 (H3N8)
Neu5Acα3Gal
ADU63_H3_26 (1MQN)
А/Утка/Украина/1/63 (H3N8)
Neu5Acα6Gal
AAI68_H3_23 (1HGG)
А/Аичи/2/68 (H3N2)
Neu5Acα3Galβ4Glc
ADS97_H5_23 (1JSN)
А/Утка/Сингапур/3/97 (H5N3)
Neu5Aca3Galβ3GlcNAc
ADS97_H5_26 (1JSO)
А/Утка/Сингапур/3/97 (H5N3)
Neu5Ac
Viet1203_04_H5 (2FKO)
А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1)
Viet1194_04_H5 (2IBX)
А/ Вьетнам/1194/2004 (H5N1)
ASI30_H1_23 (1RVO)
А/свинья/Айова/30 (H1N1)
Neu5Ac
ASI30_H1_26 (1RVT)
А/свинья/Айова/30 (H1N1)
Neu5Acα6Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc
APR34_H1_23 (1RVX)
А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)
Neu5Acα3Galβ4GlcNAc
APR34_H1_26 (1RVZ)
А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1)
Neu5Acα6Galβ4GlcNAc
ADU63_H3_23 (1MQM)
А/Утка/Украина/1/63 (H3N8)
Neu5Acα3Gal
ADU63_H3_26 (1MQN)
А/Утка/Украина/1/63 (H3N8)
Neu5Acα6Gal
Сокращение (Идентификационный номер в базе данных белковых структур)
Штамм вируса
Гликан (с присвоенными координатами)
AAI68_H3_23 (1HGG)
А/Аичи/2/68 (H3N2)
Neu5Aca3Galp4Glc
ADS97_H5_23 (1JSN)
А/Утка/Сингапур/3/97 (H5N3)
Neu5Aca3Galp3GlcNAc
ADS97_H5_26(1JSO)
А/Утка/Сингапур/3/97 (H5N3)
Neu5Ac
Viet04_H5 (2FKO)
А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1)
Комплексы ГА - α2-6-сиалированный гликан были сгенерированы путем наложения трека СА субъединица ГА1 ADU63_H3 и ADS97_H5, а также трека Viet04_H5 на ASI30_H1_26 и APR34_H1_26 (H1). Хотя есть публикация, в которой описаны структурные комплексы А/Аичи/2/68 (H3N2) человека с α2-6-сиалированными гликанами (Eisen et al., 1997, Virology, 232: 19; включена в настоящую заявку посредством ссылки), их координат пока нет в Базе данных белковых структур. Для получения структурного выравнивания разных субъединиц ГА1 для дальнейшего наложения применяли программу SARF2 (http://123d.ncifcrf.gov/sarf2.html).
[00229] Рецепторы ГА модифицируются либо α2-3, либо α2-6-сиалированными гликанами вблизи сайта связывания ГА в рецепторе, и тип связи для связанного с рецептором гликана может влиять на конформацию сайта связывания ГА в рецепторе, таким образом, оказывая влияние на специфичность указанного рецептора к разным ГА.
[00230] Например, гликан-связывающий карман для ГА вируса гриппа птиц узкий. Согласно настоящему изобретению в указанном кармане связывается транс-конформация α2-3-сиалированных гликанов, и/или гликанов с топологией конуса, соединенных либо α2-3, либо α2-6 связью.
[00231] Рецепторы ГА в тканях птиц, а также тканях глубоких отделов легких и желудочно-кишечного тракта (ЖК) характеризуются связями α2-3-сиалированных гликанов, и, кроме того, (согласно настоящему изобретению) характеризуются гликанами, включающими α2-3-сиалированные и/или α2-6-сиалированные гликаны, которые преимущественно принимают топологию конуса. Рецепторы ГА, содержащие такие гликаны с топологией конуса, в настоящей заявке можно называть ГАТК.
[00232] Напротив, рецепторы ГА в бронхах и трахее верхних дыхательных путей человека модифицированы α2-6-сиалированными гликанами. В отличие от мотива α2-3, мотив α2-6 обладает дополнительной степенью конформационной свободы благодаря C6-C5 связи (Russell et al., 2006, Glycoconj J 23: 85; включена в настоящую заявку посредством ссылки). ГА, которые связываются с такими α2-6-сиалированными гликанами, обладают более просторным связывающим карманом для приспособления к разнообразным структурам, возникающим вследствие указанной конформационной свободы. Кроме того, согласно настоящему изобретению, ГА может быть необходимо связываться с гликанами (например, α2-6-сиалированными гликанами) в топологии зонтика, и в частности может быть необходимо связываться с такими гликанами с топологией зонтика с высоким сродством и/или специфичностью, чтобы эффективно опосредовать инфицирование тканей верхних дыхательных путей человека. Рецепторы ГА, содержащие гликаны с топологией зонтика, могут быть названы в настоящей заявке ГАТЗ.
[00233] Как следствие указанных пространственно ограниченных профилей гликозилирования, человека обычно не инфицируют вирусы, содержащие много ГА вирусов птиц дикого типа (например, H5 вирусов птиц). Более точно, поскольку те отделы дыхательных путей человека, которые с наибольшей вероятностью сталкиваются с вирусом (т.е., трахея и бронхи), не содержат рецепторов с гликанами с топологией конуса (например, α2-3-сиалированных гликанов и/или коротких гликанов), а ГА вируса птиц дикого типа обычно связываются преимущественно или исключительно с рецепторами, ассоциированными с гликанами с топологией конуса (например, α2-3-сиалированными гликанами и/или короткими гликанами), люди редко инфицируются вирусами птиц. Люди инфицируются только в случае достаточно близкого контакта с вирусом, который может достичь рецепторов глубоких отделов легких и/или желудочно-кишечного тракта, состоящих из гликанов с топологией зонтика (например, длинные α2-6-сиалированные гликаны). Матрицы гликанов
[00234] Чтобы быстро расширить имеющиеся знания об известных специфических взаимодействиях между гликаном и гликан-связывающим белком (GBP), Консорциум по функциональной гликомике (CFG; www.functionalglycomics.org) - инициатива международного исследовательского сотрудничества - разработал матрицы гликанов, содержащие несколько структур гликанов, которые позволяют проводить высокопроизводительный скрининг GBP на специфичность к новым лигандам-гликанам. Указанные матрицы гликанов содержат как одновалентные, так и многовалентные мотивы гликанов (т.е., присоединенные к полиакриламидному остову), и каждая матрица содержит 264 гликана в низкой (10 мМ) и высокой (100 мкМ) концентрациях, и шесть точек на каждую концентрацию (см. http://www.functionalglycomics.org/static/consortium/resources/resourcecoreh5.shtml).
[00235] Указанные матрицы преимущественно содержат синтетические гликаны, которые захватывают все физиологическое многообразие N- и O-связанных гликанов. В указанной матрице помимо синтетических гликанов представлены смеси N-связанных гликанов, полученные из разных гликопротеинов млекопитающих.
[00236] В настоящей заявке термин «матрица» гликанов относится к набору из одного или более гликанов, по выбору иммобилизованных на твердой подложке. Согласно некоторым вариантам реализации под «матрицей» понимают набор гликанов, представленных в виде организованной компановки или паттерна в двух или более локализациях, которые физически разделены в пространстве. Как правило, матрица гликанов может содержать по меньшей мере 4, по меньшей мере 8, по меньшей мере 16, по меньшей мере 24, по меньшей мере 48, по меньшей мере 96 или несколько сотен или тысяч раздельных локализаций. Обычно матрицы гликанов согласно настоящему изобретению могут иметь любой из множества разных форматов. В технике известны разные форматы матриц, применимые для биомолекул. Например, хорошо известно огромное число матриц белков и/или нуклеиновых кислот. Специалисты в данной области техники могут непосредственно рассматривать стандартные форматы матриц, подходящие для гликанов согласно настоящему изобретению.
[00237] Согласно некоторым вариантам реализации матрицы гликанов согласно настоящему изобретению представлены в форматах «микроматриц». Как правило, микроматрица может содержать локализации проб, разнесенные на расстояние приблизительно от 50 мкм до приблизительно 200 мкл или менее, и иммобилизованные пробы в нано-микромолярном диапазоне или нано-пиограмовом диапазоне. Форматы матриц, известные в технике, включают, например, форматы, в которых каждая отдельная локализация пробы имеет шкалу десятков мкм.
[00238] Согласно некоторым вариантам реализации матрицы гликанов согласно настоящему изобретению содержат множество гликанов, иммобилизованных пространственно на подложке. Согласно настоящему изобретению предложены молекулы гликанов, упорядоченных на подложке. В настоящем изобретении термин «подложка» относится к любому материалу, который пригоден для применения в составе матрицы молекул гликанов. Специалисты в данной области техники должны понимать, что можно применять любой из широкого спектра материалов. В качестве примеров, материалы подложки, которые можно применять в рамках настоящего изобретения, включают гидрофобные мембраны, например, нитроцеллюлозу, мембрану из поливинилиденфторида или нейлона. Такие мембраны хорошо известны в технике, и их можно приобрести, например, у компании «Bio-Rad», Хемела-Хемпстед, Соединенное Королевство.
[00239] Согласно некоторым вариантам реализации подложка, на которой расположены гликаны, может содержать оксид металла. Подходящие оксиды металлов включают без ограничений оксид титана, оксид тантала и оксид алюминия. Примеры таких материалов можно приобрести в компании «Sigma-Aldrich Company Ltd», Фанси роуд. Пул, Дорсет, BH124QH, Соединенное Королевство.
[00240] Согласно некоторым вариантам реализации такая подложка представляет собой гель из оксида металла или содержит его. Считается, что гель из оксида металла обеспечивает большую площадь поверхности в заданной макроскопической области, и способствует иммобилизации молекул, содержащих углеводы.
[00241] Дополнительные или альтернативные материалы подложки, которые можно применять согласно настоящему изобретению, включают гели, например, силикагели или гели из оксида алюминия. Примеры таких материалов можно приобрести в компании «Merck KGaA», Дармштадт, Германия.
[00242] Согласно некоторым вариантам реализации матрицы гликанов иммобилизованы на подложке, которая может противостоять изменению размера или формы в ходе нормального применения. Например, подложкой может быть предметное стекло, покрытое компонентами, подходящими для применения в матрицах гликанов. Также некоторые композитные материалы могут придать подложке желаемую твердость
[00243] Как продемонстрировано в настоящей заявке, матрицы согласно настоящему изобретению можно применять при идентификации и/или определении свойств полипептидов разных ГА и их характеристик связывания. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА согласно настоящему изобретению тестируют на таких матрицах, чтобы оценить их способность к связыванию с гликанами с топологией зонтика (например, например, α2-6-сиалированными гликанами, и в частности с длинными α2-6-сиалированными гликанами, выстроенными в топологию зонтика).
[00244] Действительно, согласно настоящему изобретению предложены матрицы α2-6-сиалированных гликанов, и по выбору α2-3-сиалированных гликанов, которые можно применять для определения способности к связыванию у полипептидов ГА и/или при диагностике, например, для детекции полипептидов ГА, связывающихся с рецепторами человека. Согласно некоторым вариантам реализации матрицы согласно настоящему изобретению содержат гликаны (например, α2-6-сиалированные гликаны, и в частности длинные α2-6-сиалированные гликанами) в топологии зонтика. Как должно быть ясно специалистам в данной области техники, такие матрицы можно применять для определения свойств или детекции полипептидов любых ГА, включая, например, ГА, обнаруживаемые у природных изолятов вируса гриппа, помимо ГА, разработанных и полученных исследователями.
[00245] Согласно некоторым вариантам реализации такие матрицы включают гликаны, которые репрезентативны в отношении приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30% приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90% приблизительно 95% или более гликанов (например, гликанов с топологией зонтика, которые часто представляют собой α2-6 сиалированные гликаны, в частности длинные α2-6 сиалированные гликаны), обнаруживаемых в рецепторах ГА человека, и в частности в рецепторах ГА верхних дыхательных путей человека. Согласно некоторым вариантам реализации матрицы согласно настоящему изобретению включают некоторые или все структуры гликанов, изображенные на Фигуре 10. Согласно некоторым вариантам реализации матрицы включают по меньшей мере приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30% приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или более из изображенных на данной фигуре гликанов.
[00246] Согласно настоящему изобретению предложен способ идентификации или описания свойств белков ГА при помощи матриц гликанов. Согласно некоторым вариантам реализации такие способы включают, например, этапы (1) получения пробы, содержащей полипептид ГА, (2) контактирование указанной пробы с матрицей, содержащей гликаны, и (3) детекции связывания полипептида ГА с одним или более гликанами на указанной матрице.
[00247] Подходящие источники проб, содержащих полипептиды ГА, которые должны контактировать с матрицами гликанов согласно настоящему изобретению, включают без ограничений патологические пробы, такие как кровь, сыворотка/плазма, мононуклеарные клетки периферической крови/лимфоциты периферической крови (PBMC/PBL), мокрота, моча, кал, материал мазка из зева, спинномозговая жидкость, материал мазка из шейки матки, пробы гноя, матрицы пищевых продуктов, и ткани, взятые из разных частей организма, таких как головной мозг, селезенка и печень. В качестве альтернативы или дополнительно другие подходящие источник проб, содержащих полипептиды ГА, включают без ограничений пробы из окружающей среды, например, пробы почвы. Воды или флоры. Другие пробы включают лабораторные пробы, например, сконструированные полипептиды ГА, разработанные и/или полученные исследователями. Также можно применять другие пробы, которые не перечислены.
[00248] В технике известен широкий спектр систем детекции, применимых при анализе связывания полипептидов ГА с матрицами гликанов согласно настоящему изобретению. Например, к полипептидам ГА можно присоединять обнаруживаемую метку (прямо или косвенно) перед контактированием с указанной матрицей или после контактирования; затем связывание можно определять путем детекции локализованной метки. Согласно некоторым вариантам реализации для оценки конктерных положений на матрице можно применять сканирующие устройства.
[00249] В качестве альтернативы или дополнительно связывание с раположенными на матрице гликанами можно измерить, например, при помощи калориметрической системы детекции, систем детекции флуоресценции или радиоактивного излучения. Обычно детекция флуоресценции, как правило, подразумевает прямое зондирование матрицы с применением флуоресцентной молекулы и отследивание флуоресцентных сигналов. В качестве альтернативы или дополнительно матрицы можно зондировать при помощи молекул, которые мечены (например, биотином) для косвенной флуоресцентной детекции (в данном случае, посредством оценки связывания по стрептавидину с радиоактивной меткой). В качестве альтернативы или дополнительно можно применять способы флуоресцентного тушения, при которых расположенные на матрице гликаны зондируют при помощи тест-молекулы (которая может в качестве метки содержать разные флуорофоры, но может и не содержать). При таких вариантах реализации связывание с указанной матрицей действует как подавитель флуоресценции, возбуждаемой от расположенных на матрице гликанов, следовательно, связывание определяют по утрате флуоресцентного излучения. В качестве альтернативы или дополнительно расположенные на матрице гликаны можно зондировать при помощи проб живых тканей, которые культивировали в присутствии радиоактивного вещества с получением зонда с радиоактивной меткой. Согалсно таким вариантам реализации детекцию связывания можно проводить путем измерения флуоресцентного излучения.
[00250] Такие способы можно применять для выявления самого факта связывания и/или для оценки степени связывания полипептидов ГА с гликанами, расположенными на матрице согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации такие способы также можно применять для идентификации и/или описания свойств агентов, которые препятсвуют взаимодействиям гликан-полипептид ГА или другим образом изменяют указанные взаимодействия.
[00251] Способы, описываемые ниже, можно применять на практике, например, для выяснения, может ли молекула с предполагаемой способностью к взаимодействию на самом деле образовывать такое взаимодействие, или для выяснения, не обладает ли молекула непредвиденной способностью к взаимодействию с определенным углеводом.
[00252] Также согласно настоящему изобретению предложены способы применения матриц согласно настоящему изобретению, например, для детекции конкретнорго агента в тестируемой пробе. Например, такие способы могут включать этапы (1) контактирования матрицы гликанов с тестируемой пробой (например, с пробой, которая предположительно содержит полипептид ГА); и (2) детекции связывания определенного агента в тестируемой пробе с матрицей.
[00253] Дополнительно связывание с матрицами согласно настоящему изобретению можно применять, например, для определения кинетики взаимодействия между связывающим агентом и гликаном. Например, способы согласно настоящему изобретению для определения кинетики взаимодействия могут включать этапы (1) контактирования матрицы гликанов с молекулой, которую требуется тестировать; и (2) измерение кинетики взаимодействия между связывающим агентом и гликаном (гликанами), расположенным на матрице.
[00254] Кинетику взаимодействия связывающего агента с каким-либо из гликанов в матрице согласно настоящему изобретению можно измерять по изменениям в режиме реального времени, например, колориметрических или флуоресцентных сигналов, как подробно описапно выше. Такие способы можно применять на практике, например, при выяснении, может ли конкретный связывающий агент взаимодействовать со специфическим углеводом с более высокой степенью связывания, чем другой связывающий агент, взаимодействующий с тем же углеводом.
[00255] Конечно, следует понимать, что связывание гликанов полипептидами ГА согласно настоящему изобретению можно оценивать в пробах гликанов или источниках, которые представлены по сути не в форме матрицы. Например, полипептиды ГА согласно настоящему изобретению можно подвергать связыванию с пробами ткани и/или линиями клеток, чтобы оценить характеристики их связывания с гликанами. Соответствующие линии клеток включают, например, любые из множества линий клеток млекопитающих, в частности, линии, экспрессирующие рецепторы ГА, содержащие гликаны с топологией зонтика (например, по меньшей мере некоторые из которых могут быть α2-6-сиалированными гликанами, и в частности длинными α2-6-сиалированными гликанами). Согласно некоторым вариантам реализации применяемые линии клеток экспрессируют отдельные гликаны с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации применяемые линии клеток экспрессируют разнообразные гликаны. Согласно некоторым вариантам реализации линии клеток получают из клинических изолятов; при некоторых вариантах их хранят или манипулируют ими, чтобы получить желаемое распределение или преобладание гликанов. Согласно некоторым вариантам реализации пробы ткани и/или линии клеток экспрессируют гликаны, характерные для клеток эпителия верхних дыхательных путей млекопитающих.
Нуклеиновые кислоты
[00256] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, которые кодируют полипептиды ГА, характеристическую или биологически активную часть полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, которые комплементарны нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды ГА, характеристическую или биологически активную часть полипептида ГА.
[00257] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с нуклеиновым кислотам, кодирующим полипептиды ГА, характеристическую или биологически активную часть полипептида ГА. Такие нуклеиновые кислоты можно применять, например, в качестве праймеров или зондов. В качестве примера, такие нуклеиновые кислоты можно применять в качестве праймеров при полимеразной цепной реакции (ПЦР), в качестве щзондов при гибридизации (включая гибридизацию in situ) и/или в качестве праймеров для ПЦР с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ).
[00258] Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК, и могут быть одноцепочечными или двухцепочечными. Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут включать один или более неприродных нуклеотидов; согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению включают только природные нуклеотиды.
Антитела к полипептидам
[00259] Согласно настоящему изобретению предложены антитела к полипептидам-связывающим агентам согласно настоящему изобретению (например, полипептидам ГА). Антитела могут быть моноклональными или поликлональными, и могут быть получены при помощи любой из множества технологий, известных специалистам в данной области техники (например, см. Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Например, антитела можно получить при помощи технологии культивирования клеток, включая генерирование моноклональных антител, или путем трансфекции генов антител в подходящие клетки-хозяева бактерий или млекопитающих, чтобы сделать возможной выработку рекомбинантных антител.
Тестирование связывающих агентов в моделях на животных
[00260] Согласно настоящему изобретению предложены способы способы тестирования связывающих агентов согласно настоящему изобретению (например, полипептидов ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.) в организме животных-хозяев. В настоящей заявке термин «животное-хозяин» включает любое модельное животное для исследований гриппа. Например, животные-хозяева, подходящие для настоящего изобретения, могут быть любыми млекопитающими-хозяевами, включая приматов, хорьков, кошек, собак, коров, лошадей, грызунов, таких как мышь, хомяк, кролик и крыса. Согласно некоторым вариантам реализации животным-хозяином, применяемым для настоящего изобретения, является хорек. Согласно некоторым вариантам реализации указанное животное-хозяин ранее не подвергался действию вируса или инфицированию до введения связывающего агента согласно настоящему изобретению (по выбору в составе композиции согласно настоящему изобретению). Согласно некоторым вариантам реализации указанному животному-хозяину прививиают, инфицируют или другим образом внедряют вирус до введения связывающего агента согласно настоящему изобретению, или одновременно с его введением. Животному-хозяину, применяемому при реализации настоящего изобретения, можно прививать, инфицировать или другим образом внедряют вирус при помощи способа, известного в технике. Согласно некоторым вариантам реализации можно прививать, инфицировать или другим образом внедряют вирус интраназальным путем.
[00261] Согласно некоторым вариантам реализации подходящее животное-хозяин может обладать сходным распределением гликанов с топологией зонтика и топологией конуса и/или α2-6-гликанов и α2-3-гликанов, с тем, которое обнаруживается в дыхательных путях человека. Например, предполагается, что хорек как животное-хозяин может быть более репрезентативным, чем мышь, при применении его в качестве модели заболеваний, вызываемых вирусами гриппа у людей (Tumpey et al., 2007, Science 315; 655-59; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Не вдаваясь в теорию, настоящее изобретение включает в себя идею о том, что хорек обладает распределением гликанов в дыхательных путях, более близким к распределению в дыхательных путях человека, по сравнению с мышью. В разных исследованиях можно применять интактных и/или подвергшихся прививке вируса животных. Например, таких модельных животных можно применять для исследований передачи вируса, которые известны в технике. Предполагается, что применение хорьков в исследованиях передачи вируса позволяет получить надежные предсказания в отношении передачи выируса у человека. Например, воздушно-капельная передача вируса гриппа от животного, подвергшегося прививке вируса (например, хорька) к интактным животным, известна в технике (Tumpey et al., 2007, Science 315; 655-59; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Исследования передачи вируса можно применять для тестирования полипептидов-связывающих агентов согласно настоящему изобретению (например, полипептидов ГА). Например, связывающие агенты согласно настоящему изобретению можно вводить подходящим животным-хозяевам перед исследованием передачи вируса, во время или после них, чтобы определить эффективность указывающего связывающего агента в отношении блокирования связывания вируса и/или инфицирования животного-хозяина. На основании информации, полученной в исследованиях в исследованиях передачи вируса можно предсказывать эйффективность связывающего агента в отношении блокирования связывания вируса и/или инфицирования человека-хозяина.
Фармацевтические композиции
[00262] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции, включающие связывающие агенты согласно настоящему изобретению (например, полипептидов ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.) и/или другие сущности. Например, согласно некоторым вариантам реализации в фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают связывающие агенты-полипептиды (например, полипептиды ГА), нуклеиновые кислоты, кодирующие такие полипептиды, характеристические или биологические активные фрагменты таких полипептидов или нуклеиновых кислот, антитела, которые связываются с такими полипептидами или фрагментами или конкурируют с ними, малые молекулы, которые связываются или конкурируют с такими полипептидами или с гликанами, которые связываются с ними, и др.
[00263] Настоящее изобретение включает лечение инфекции, вызванной вирусом гриппа, путем введения таких фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению вводят субъекту, болеет гриппом или предрасположенному к нему. Согласно некоторым вариантам реализации считается, что субъект болеет гриппом, если у указанного субъекта проявляются один или более симптомов, обычно ассоциированных с гриппом. Согласно некоторым вариантам реализации известно или пердполагается, что субъект подвергся воздействию вируса гриппа. Согласно некоторым вариантам реализации считается, что субъект предрасположен к гриппу, если известно или пердполагается, что указанный субъект известно или пердполагается, что субъект подвергся воздействию вируса гриппа подвергся воздействию вируса гриппа. Согласно некоторым вариантам реализации известно или пердполагается, что указанный субъект известно или пердполагается, что субъект подвергся воздействию вируса гриппа, если субъект входил в контакт с другими лицами, о которых известно, что они подверглись воздействию вируса гриппа, и/или если субъект находится или находился в месте, где предположительно распространен грипп.
[00264] Согласно некоторым вариантам реализации субъектов, болеющих гриппом или предрасположенных к гриппу, тестируют на антитела к связывающим агентам согласно настоящему изобретению до введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, во время или после ее введения. Согласно некоторым вариантам реализации, субъектам, у которых есть такие антитела, не вводят фармацевтические композиции, содержащие связывающие агенты согласно настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам реализации соответствующую дозу фармацевтической композиции и/или связывающего агента выбирают на основании выявления (или невыявления) таких антител.
[00265] Согласно некоторым вариантам реализации выбор конкретного субъекта для лечения, конкретного связывающего агента или композиции для введения и/или конкрентной дозы или режима введения документально фиксируют, например, в письменной, печатной или электронной форме для хранения.
[00266] Композиции согласно настоящему изобретению можно вводить до развития одного или более симптомов гриппа или после их развития.
[00267] Настоящее изобретение включает лечение гриппа путем введения соединений, описываемых в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации лечение гриппа согласно настоящему изобретению достигается путем введения вакцины. На сегодняшний день. Хотя были достигнуты большие успехи в области разработки вакины от гриппа, есть место для дальнейших усовершенствований. Согласно настоящему изобретению предложены вакцины, содержащие связывающие агенты согласно настоящему изобретению (например, полипептидов ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.), и в частности, содержащие связывающие агенты, которые связываются с гликанами с топологией зонтика (например, α2-6-связанные гликаны с топологией зонтика, например, длинные α2-6-сиалированные гликаны).
[00268] В качестве еще одного примера, попытки сгенерировать вакцины, специфичные для штамма H5N1 у людей в общем не увенчались успехом, по крайней мере отчасти из-за низкой иммуногенности ГА H5. В одном исследовании было покапзано, что вакцина, направленная на штамм H5N1, приводила к титру антител 1:40, что не является достаточно высоким титром, чтобы гарантировать защиту от инфекций. Кроме того, дозировка, требуемая для генерирования даже невысокого титра антител 1:40 (две дозы по 90 мкг очищенного убитого вируса или антигена) в 12 раз превышала дозировки, обычно применяемые в случае вакцины от обычного сезонного гриппа (Treanor et al; 2006, N Eng J Med, 354: 1343; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Аналогично, другие исследования показали, что современные вакцины против H5 не обладают высокой иммуногенностью (Bresson et al., 2006, Lancet, 367: 1657; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Согласно некоторым вариантам реализации вакцины согласно настоящему изобретению составляют с применением одной или более стратегий (см., например, Enserink, 2005, Science, 309: 996; включена в настоящую заявку посредством ссылки), которые направлены на то, чтобы было возможно применение более низкой дозы белка ГА H5, и/или чтобы достичь более высокой иммуногенности. Например, согласно некоторым вариантам реализации, повышают мультивалентность (например, за счет применения дендримеров); согласно некоторым вариантам реализации применяют один или более адьювантов и т.д.
[00269] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены вакцины и введение указанных вакцин человеку. Согласно некоторым вариантам реализации вакцины представляют собой одно или более из следующих: (1) инактивированный вирус, (2) живой ослабленный вирус гриппа, например, вирус с дефективной репликацией, (3) связывающий агент согласно настоящему изобретению (например, полипептиды ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.), (4) нуклеиновую кислоту, кодирующую связывающий агент-полипептид (например, полипептид ГА) или их характкеристическую или биологически активную часть, (5) ДНК-вектор, который кодирует связывающий агент-полипептид согласно настоящему изобретению (например, полипептид ГА) или его характкеристическую или биологически активную часть и/или (6) систему экспрессии, например, клетки, экспрессирующие один или более белков вируса гриппа для применения их в качестве антигена.

[00270] Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены инактивированные вакцины против гриппа. Согласно некоторым вариантам инактивированные вакцины против гриппа содержат один из трех типов препаратов антигенов: цельный инактивированный вирус, субвирионы, в которых очищенные вирусные частицы разрушены детергентами или другими реагентами для растворения липидной оболочки (так называемая «расщепленная» вакцина), или очищенный полипептид ГА («субъединичная» вакцина). Согласно некоторым вариантам реализации вирус можно инактивировать путем обработки формальдегидом, бета-пропиолактоном, эфиром, эфиром с детергентом (таким как TWEEN-80), цетилтриметиламмония бромидом (ЦТАБ) и Тритоном N101, дезоксихолатом натрия и три-(n-бутил)фосфатом. Инактивацию можно производить после очищения аллантоисной жидкости (от вируса, наработанного в яйцах) или до этого; вирионы выделяют и очищают путем центрифугирования (Nicholson et al., eds., 1998, Textbook of Influenza, Blackwell Science, Maiden, MA; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Чтобы оценить активность вакцины, можно провести оценку методом одномерной радиальной иммунодиффузии (SRD) (Schild et al., 1975, Bull. World Health Organ., 52: 43-50 & 223-31; Mostow et al., 1975, J. din. Microbiol., 2: 531; both of which are включена в настоящую заявку посредством ссылки).
[00271] Также согласно настоящему изобретению предложены живые ослабленные вакцины против гриппа, и способы ослабления хорошо известны в технике. Согласно некоторым вариантам реализации ослабления достигают путем применения способов «обратной генетики», таких как сайт-направленный мутагенез.
[00272] Согласно некоторым вариантам реализации вирус гриппа для применения в составе вакцин выращивают в яйцах, например, в куриных яйцах с зародышем, и в таком случае собираемым материалом является аллантоисная жидкость. В качестве альтернативы или дополнительно вирус гриппа можно получить при помощи любого способа, в котором для выращивания вируса применяются культуры тканей. Подходящие клеточные субстраты для выращивания вирусов включают, например, клетки почек собак, такие как MDCK или клетки из клона MDCK, MDCK-подобные клетки, клетки почек обезьян, такие как клетки AGMK, включая клетки Vero, культивируемые клетки эпителия, такие как стабильные клеточные линии, клетки 293Т, клетки ВК-21, клетки CV-1 или клетки млекопитающих любого другого типа, подходящие для получения вируса гриппа с целью производства вакцин (включая клетки эпителия верхних дыхательных путей) для целей получения вакцин, легко доступные из коммерческих источников (например, ATCC, Rockville, MD). Также подходящие клеточные субстраты включают клетки человека, такие как клетки MRC-5. Подходящие клеточные субстраты не ограничиваются линиями клеток; например, также они включают первичные клетки, такие как фибробласты зародышей цыплят.
[00273] Согласно некоторым вариантам реализации вакцины согласно настоящему изобретению также содержат один или более адъювантов. Например, в качестве адъюванта в вакцинах для применения у человека можно применять соли алюминия (Baylor et al; 2002, Vaccine, 20: S18; включена в настоящую заявку посредством ссылки) и монофосфорил-липид A (MPL; Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p.407; включена в настоящую заявку посредством ссылки). В качестве альтернативы или дополнительно в настоящее время в качестве адъювантов в вакцинах для применения у человека проходят испытания новые соединения, такие как MF59 (Chiron Corp., http://www.chiron.com/investors/pressreleases/2005/051028.html), CPG 7909 (Cooper et al., 2004, Vaccine, 22: 3136; включена в настоящую заявку посредством ссылки) и сапонина, такие как QS21 (Ghochikyan et al., 2006, Vaccine, 24: 2275; включена в настоящую заявку посредством ссылки).
[00274] Кроме того, некоторые адъюванты, известные в технике как усилители иммуногенности вакцин против гриппа, такие как поли[ди(карбоксилатофенокси)фосфазен] (РССР; Payne et al; 1998, Vaccine, 16: 92; включена в настоящую заявку посредством ссылки), интерферон-γ (Сао et al., 1992, Vaccine, 10:238; включена в настоящую заявку посредством ссылки), блок-сополимер P1205 (CRL1005; Katz et al., 2000, Vaccine,. 18: 2177; включена в настоящую заявку посредством ссылки), интерлейкин-2 (IL-2; Mbwuike et al; 1990, Vaccine, 8: 347; включена в настоящую заявку посредством ссылки) и полиметилметакрилат (РММА; Kreuter et al; 1981, J. Pharm. Sci., 70: 367; включена в настоящую заявку посредством ссылки).
[00275] Согласно некоторым вариантам реализации композиции согласно настоящему изобретению, например, композиции связывающих агентов, не включают адъювант (например, предложенные композиции по существу не содержат адъюванта). Согласно некоторым вариантам реализации композиции согласно настоящему изобретению не включают адъюванта на основе квасцов (например, предложенные композиции по существу не содержат квасцов).
[00276] Помимо вакцин согласно настоящему изобретению предложены другие терапевтические композиции, которые можно применять при лечении вирусных инфекций. Согласно некоторым вариантам реализации лечебного эффекта достигают путем введения агента, который препятствует экспрессии или активности полипептида ГА.
[00277] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела или другие агенты, родственные предлагаемым полипептидам. Например, согласно настоящему изобретению предложены композиции, содержащие антитела, которые распознают частицы вирусов, содержащие конкретный полипептид ГА (например, полипептид ГА, которые связывается с гликанами с топологией зонтика), нуклеиновые кислоты (такие как последовательности нуклеиновых кислот, комплементарные последовательностям ГА, которые можно применять для РНК-интерференции), гликаны, которые конкурируют за связывание с рецепторами ГА, малые молекулы или гликомиметики, которые конкурируют за взаимодействие гликан-полипептид ГА, или любые их сочетания. Согласно некоторым вариантам реализации применяют наборы разных агентов, обладающих разными структурами. Согласно некоторым вариантам реализации терапевтические композиции содержат один или более поливалентных агентов. Согласно некоторым вариантам реализации лечение включает неотложное введение агентов вскоре после воздействия или предполагаемого воздействия вируса.
[00278] Согласно некоторым вариантам реализации любые вакцины, описываемые в настоящей заявке, обеспечивают широкую перекрестную защиту от разных вирусов гриппа. Например, согласно некоторым вариантам реализации вакцины, описываемые в настоящей заявке, обеспечивают широкую перекрестную защиту от адаптированных как к организму птиц, так и к организму человека H5 вирусов. Согласно некоторым вариантам реализации любые вакцины, описываемые в настоящей заявке, обеспечивают широкую перекрестную защиту от вирусов H5 любого штамма или варианта. Согласно некоторым вариантам реализации любые вакцины, описываемые в настоящей заявке, обеспечивают широкую перекрестную защиту от вирусов гриппа H2 любого штамма или варианта. Согласно некоторым вариантам реализации любые вакцины, описываемые в настоящей заявке, обеспечивают широкую перекрестную защиту от вирусов гриппа H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 или H16 любого штамма или варианта.
[00279] Обычно фармацевтическая композиция должна включать терапевтический агент наряду с одним или более неактивными агентами, такими как стерильная, биосовместимая основа, включая без ограничений стерильную воду, физиологический раствор, физиологический раствор с буфером или раствор декстрозы. В качестве альтернативы или дополнительно указанная композиция может содержать любое из множества разных вспомогательных веществ, таких как стабилизаторы, буферы, наполнители (например, сахара, аминокислоты, и др.) или консерванты.
[00280] Согласно некоторым вариантам реализации терапевтический агент, присутствующий в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, может состоять из одного или более связывающих агентов, описываемых в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит связывающий агент (например, полипептиды ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.), который связывается с гликанами с топологией зонтика (и/или миметиками гликанов с топологией зонтика). Согласно некоторым таким вариантам реализации композиция согласно настоящему изобретению по существу не содержит агентов-примесей (например, других полипептидов ГА и др.), которые не связываются с гликанами с топологией зонтика. Согласно некоторым таким вариантам реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению содержит не более 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% или 1% агента, который связывается с гликанами в составе рецепторов ГА, отличными от гликанов с топологией зонтика.
[00281] Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция может включать терапевтический агент, который инкапсулирован, захвачен или связан внутри липидной везикулы, биодоступной и/или биосовместимой, или биоразлагаемой матрицы, или другой микрочастицы.
[00282] Согласно некоторым вариантам реализации предложенная фармацевтическая композиция может включать связывающий агент (например, полипептиды ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.), который не агрегирует. Например, согласно некоторым вариантам реализации, в состоянии агрегатов находится менее 1%, 2%, 5%, 10%, 20% или 30% связывающего агента по сухому весу.
[00283] Согласно некоторым вариантам реализации предложенная фармацевтическая композиция может включать связывающий агент (например, полипептиды ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.), который не денатурирует. Например, согласно некоторым вариантам реализации денатурирует менее 1%, 2%, 5%, 10%, 20% или 30% введенного UTSBA по сухому весу.
[00284] Согласно некоторым вариантам реализации предложенная фармацевтическая композиция может включать связывающий агент (например, полипептиды ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.), который не инактивируется. Например, согласно некоторым вариантам реализации инактивируется менее 1%, 2%, 5%, 10%, 20% или 30% введенного UTSBA по сухому весу.
[00285] Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению составлена таким образом, чтобы уменьшать иммуногенность предложенного связывающего агента. Например, согласно некоторым вариантам реализации предложенный связывающий агент ассоциирован (например, связан) с таким агентом, как полиэтиленгликоль и/или карбоксиметилцеллюлоза, которые маскируют его иммуногенность. Согласно некоторым вариантам реализации предложенный связывающий агент подвергается дополнительному гликозилированию, которое снижает его иммуногенность.

[00286] Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить либо одни, либо в сочетании с одним или более терапевтическими агентами, включая без ограничений вакцины и/или антитела. Фраза «в сочетании с» не должна подразумевать, что указанные агенты обязательно следует вводить одновременно или составлять лекарственную форму для совместной доставки, хотя указанные способы доставки входят в объем настоящего изобретения. Обычно каждый агент можно вводить в дозе и по графику, определенным для данного агента. Кроме того, настоящее изобретение включает доставку фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению в сочетании с агентами, которые могут повышать их биодоступность, снижать или модифицировать их метаболизм, угнетать их выведение или модифицировать их распределение в организме. Хотя фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения любого субъекта (например, любого животного), нуждающегося в нем, наиболее предпочтительно применять их при лечении людей. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению и/или связывающие агенты вводят в сочетании с одним или более противовирусными агентами (например, озельтамивир [ТАМИФЛЮ] и занамивир [РЕЛЕНЗАА], и др.) и/или сиалидазой.
[00287] Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить разными путями, включая оральный, внутривенный, внутримышечный, внутриартериальный, подкожный, внутривентрикулярный, чрескожный, внутрикожный, ректальный, внутривлагалищный, внутрибрюшинный, местный (в форме порошков, мазей, кремов или капель), на слизистые оболочки, назальный, букальный, энтеральный, сублингвальный; путем интратрахеального вливания, бронхиального вливания и/или ингаляции; и/или в форме орального спрея, назального спрея и/или аэрозоля. Обычно большинство подходящих путей введения должно зависеть от разных факторов, включая природу агента (например, его стабильности в среде желудочно-кишечного тракта), состояния пациента (например, может ли указанный пациент переносить перорального введение) и т.д.
[00288] В настоящее время для непосредственной доставки терапевтического агента к легким и дыхательной системе чаще всего применяют оральные и назальные спреи. Однако настоящее изобретение включает доставку фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению любым подходящим путем, при котором учитываются вероятные достижения науки о доставке лекарственных препаратов.
[00289] Согласно некоторым вариантам реализации препараты для ингаляционной или аэрозольной доставки содержат множество частиц. Согласно некоторым вариантам реализации такие препараты содержат частицы со средним размером приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12 или приблизительно 13 микрон. Согласно некоторым вариантам реализации препараты для ингаляционной или аэрозольной доставки представлены в форме сухого порошка. Согласно некоторым вариантам реализации препараты для ингаляционной или аэрозольной доставки представлены в форме мокрого порошка, например, путем включения смачивающего компонента. Согласно некоторым вариантам реализации указанный смачивающий агент выбирают из группы, состоящей из воды, физиологического раствора или другой жидкости с физиологическим рН.
[00290] Согласно некоторым вариантам реализации композиции согласно настоящему изобретению вводят в форме капель в полость носа или рта. Согласно некоторым вариантам реализации одна доза может содержать несколько капель (например, 1-100, 1-50, 1-20, 1-10, 1-5, и т.д.).
[00291] Согласно некоторым вариантам реализации композиции согласно настоящему изобретению вводят при помощи устройства, которое позволяет доставлять отмеренные дозы композиции (например, связывающего агента).
[00292] Подходящие устройства для применения при внутриожной доставке фармацевтических композиций, описываемых в настоящей заявке, включают устройства с короткой иглой, такие как описаны в Патентах США №4886499 патенте США №5190521 патенте США №5328483, патенте США №552728, патенте США №4270537, патенте США №5015235, патенте США №5141496, патенте США №5417662 (каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки). Композиции для внутрикожного введения также можно вводить при помощи устройств, которые ограничивают эффективную глубину проникновения иглы в кожу, такие, как описаны в публикации WO 99/34850, включенной в настоящую заявку посредством ссылки, и их функциональных эквивалентов. Также подходят устройства для безыгольного впрыскивания, которые доставляют жидкие вакцины в собственно кожу через впрыскиваитель струи жидкости или через иглу, которая проходит сквозь роговой слой и образует струю, которая достигает собственно кожи. Устройства для безыгольного впрыскивания описаны, например, в патенте США №5480381, патенте США №5599302, патенте США №5334144, патенте США №5993412, патенте США №5649912, патенте США №5569189, патенте США №5704911, патенте США №5383851, патенте США №5893397, патенте США №5466220, патенте США №5339163, патенте США №5312335, патенте США №5503627, патенте США №5064413, патенте США №5520639, патенте США №4596556, патенте США №4790824, патенте США №4941880, патенте США №4940460, публикации WO 97/37705 и WO 97/13537 (каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки). Также подходят баллистические системы доставки порошков/частиц, в которых применяется сжатый газ для ускорения вакцины в форме порошка, которая должна пройти через наружные слои кожи к собственно коже. Кроме того, при классическом способе внутрикожного введения Манту можно применять традиционные шприцы.
[00293] Обзор общих вопросов по составлению лекарственных форм и производства фармацевтических агентов можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 191 ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995; включена в настоящую заявку посредством ссылки.
[00294] Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в любой дозе, соответствующей достижению желаемого исхода. Согласно некоторым вариантам реализации желаемым исходом является уменьшение интенсивности, тяжести и/или частоты, и/или отсрочка начала одного или более симптомов гриппа.
[00295] Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению представлены в лекарственных формах для введения дозы связывающего агента, эффективной для конкуренции с ГА вируса гриппа за связывание с гликанами с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации такое связывание с ГА вируса гриппа снижается после введения одной или более доз композиции согласно настоящему изобретению по сравнению с его уровнем в отсутствии такого снижения. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению представлены в лекарственных формах для введения дозы связывающего агента, эффективной для насыщения по меньшей мере 10%, по меньшей мере 15%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 35%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 45%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более сайтов связывания ГА (например, сайты связывания ГА, содержащие гликаны с топологией зонтика), присутствующих в организме субъекта (например, в дыхательных путях субъекта), получающего указанную композицию.
[00296] Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению представлены в лекарственных формах для доставки однократной дозы в диапазоне от 0,0001 до 1000 мг/кг.
[00297] Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению вводят многократно. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению вводят в количестве нескольких доз вдень. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению вводят согласно непрерывному режиму введения, так, чтобы у субъекта не было периодов без введения терапевтического агента между периодами введения терапевтического агента. Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению вводят согласно периодическому режиму введения, так, чтобы у субъекта был по меньшей мере один период без введения терапевтического агента между двумя периодами введения терапевтического агента.
Диагностические средства/наборы
[00298] Согласно настоящему изобретению предложены наборы для детекции связывающих агентов (например, полипептидов ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.), и в частности для детекции связывающих агентов с конкретными характеристиками связывания с гликанами (например, связывание с гликанами с топологией зонтика, с α2-6-сиалированными гликанами, с длинными α2-6-сиалированными гликанами и т.д.) в патологических образцах, включая без ограничений кровь, сыворотку/плазму, мононуклеарные клетки периферической крови/лимфоциты периферической крови (PBMC/PBL), мокроту, мочу, кал, материал мазка из зева, материал мазка с поражений на коже, спинномозговую жидкость, материал мазка из шейки матки, пробы гноя, матрицы пищевых продуктов, и ткани, взятые из разных частей организма, таких как головной мозг, селезенка и печень. Также согласно настоящему изобретению предложены наборы для детекции рассматриваемых связывающих агентов (например, полипептидов ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.) в пробах из окружающей среды, включая без ограничений, пробы почвы, воды или флоры. Также можно применять другие пробы, которые не перечислены.
[00299] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены наборы для детекции полипептидов ГА, описываемых в настоящей заявке, независимо от того, являются ли такие полипептиды связывающими агентами.
[00300] Согласно некоторым вариантам реализации наборы согласно настоящему изобретению могут включать один или более агентов, которые позволяют проводить специфическую детекцию связывающих агентов (например, полипептидов ГА, LSBA, USBA, UTSBA, и т.д.) с конкретными характеристиками связывания с гликанами. Такие агенты для детекции могут включать, например, антитела, которые специфически распознают определенные связывающие агенты (например, связывающие агенты, которые связываются с гликанами с топологией зонтика и/или с α2-6-сиалированными гликанами и/или с длинными α2-6-сиалированными гликанами), которые можно применять для специфической детекции таких связывающих агентов посредством ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), иммунофлуоресценции и/или иммуноблоттинга.
[00301] Антитела, которые связываются с полипептидами ГА, также можно применять в пробах нейтрализации вируса, в которых пробу обрабатывают антителом, специфичным по отношению к рассматриваемым полипептидам ГА, и тестируют на способность инфицировать клетки в культуре по сравнению с необработанной пробой. Если вирус в данной пробе содержит такие полипептиды ГА, указанное антитело будет нейтрализовывать вирус и предотвращать инфицирование клеток в культуре. В качестве альтернативы или дополнительно такие антитела также можно применять в пробах на ГА-ингибирование, в которых белок ГА изолируют из заданной пробы, обрабатывают антителом, специфичным по отношению к конкретному полипептиду ГА или набору полипептидов ГА, и тестируют на их способность агглютинировать эритроциты по сравнению с необработанной пробой. Если вирус в указанной пробе содержит такой полипептид ГА, указанное антитело будет нейтрализовывать активность полипептида ГА и препятствовать агглютинации эритроцитов (Harlow & Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL Press; www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/index.html; www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html). Согласно некоторым вариантам реализации такие агенты могут включать нуклеиновые кислоты, которые специфически связываются с нуклеотидами, кодирующими конкретные полипептиды ГА, и которые можно применять для специфической детекции таких полипептидов при помощи ОТ-ПЦР или гибридизации in situ (www.who.int/csr/resources/publications/influenza/WHO_CDS_CSR_NCS_2002_5/en/index.html; www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/labtests/en/index.html). Согласно некоторым вариантам реализации нуклеиновые кислоты, которые были выделены из пробы, перед детекцией амплифицируют. Согласно некоторым вариантам реализации к диагностическим реагентам можно присоединять обнаруживаемую метку.
[00302] Также согласно настоящему изобретению предложены наборы, содержащие реагенты согласно настоящему изобретению для генерирования вирусов гриппа и вакцин. Содержание таких наборов включает без ограничения плазмиды для экспрессии, содержащие нуклеотиды ГА (или характеристические, или биологические активные части), кодирующие рассматриваемые полипептиды ГА (или характеристические, или биологические активные части). В качестве альтернативы или дополнительно, наборы могут содержать плазмиды для экспрессии, которые экспрессируют рассматриваемые полипептиды ГА или характеристические, или биологические активные части). Плазмиды для экспрессии, не содержащие генов вируса, также можно включать, чтобы пользователь мог встраивать нуклеотиды ГА из любого рассматриваемого вируса гриппа. Также в набор можно включать линии клеток млекопитающих, включая без ограничений линии клеток Vero и MDCK. Согласно некоторым вариантам реализации к диагностическим реагентам можно присоединять обнаруживаемую метку.
[00303] Согласно некоторым вариантам реализации наборы для применения с настоящим изобретением могут включать пробы для сравнения, инструкции по обработке проб, проведению тестов, инструкции по интерпретации результатов, буферы и/или другие реагенты, необходимые для проведения указанной пробы. Согласно некоторым вариантам реализации указанный набор может содержать панель антител.
[00304] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения матрицы гликанов, обсуждаемые выше, можно применять в качестве диагностических средств и/или наборов.
[00305] Согласно некоторым вариантам реализации матрицы гликанов и/или наборы согласно настоящему изобретению применяют для проведения исследований зависимости «доза-ответ» для оценки связывания полипептидов ГА с гликанами с топологией зонтика в множественных дозах (например, как описано в настоящей заявке). Такие исследования дают особенно ценные представления о характеристиках связывания тестируемых полипептидов ГА, и особенно полезны для оценки специфического связывания. Исследования зависимости «доза-ответ» для связывания данного типа находит много полезных областей применения. В качестве примера, они могут помогать в отслеживании эволюции характеристик связывания в родственном ряду вариантов полипептидов ГА, независимо от того, сгенерирован ли указанный ряд в ходе природной эволюции, направленного конструирования или их сочетания.
[00306] Согласно некоторым вариантам реализации матрицы гликанов и/или наборы согласно настоящему изобретению применяют для индукции, идентификации и/или отбора связывающих агентов (например, полипептидов ГА и/или вариантов полипептидов ГА), обладающих желаемыми характеристиками связывания. Например, согласно некоторым вариантам реализации матрицы гликанов и/или наборы согласно настоящему изобретению применяют для создания давления эволюционного отбора на популяцию связывающих агентов-полипептидов (например, полипептидов ГА).
[00307] Согласно настоящему изобретению предложены наборы для введения фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Например, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий по меньшей мере одну дозу связывающего агента. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий начальную однократную дозу и последующую однократную дозу связывающего агента. Согласно некоторым вариантам реализации указанная начальная однократная доза больше, чем последующая однократная доза, или обе дозы равные.
[00308] Согласно некоторым вариантам реализации наборы согласно настоящему изобретению (в частности дозы для введения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению) содержат по меньшей мере один компонент устройства доставки, например, ингалятор. Согласно некоторым таким вариантам реализации настоящего изобретения предложен набор, содержащий по меньшей мере один компонент устройства доставки, например, ингалятор, и одну дозу связывающего агента.
[00309] Согласно некоторым вариантам реализации предложенные наборы содержат инструкцию по применению.
Иллюстративные примеры
Пример 1: Идентификация молекулярных детерминант широкого спектра связывающих полипептидов ГА, специфичных для организма человека
Введение
[00310] Вирус гриппа птиц H5N1 («птичий грипп») является высоко инфекционным и смертельно опасным патогеном. С 1996 года произошло несколько вспышек, охвативших три континента, которые погубили миллионы домашних птиц. С момента своего появления указанный вирус также продемонстрировал потенциал инфицирования людей с процентом смертности, превышающим 60%. У людей практически нет иммунитета к вирусу H5N1, но указанный вирус еще не адаптировался к организму человека, чтобы эффективно инфицировать людей и передаваться между ними. Указанный вирус может приобрести мутации, которые позволят ему занять прочное положение в популяции людей.
[00311] Гемагглютинин (ГА) - поверхностный гликопротеин вируса гриппа А, отвечает за инициацию входа вируса в клетку-хозяина. ГА связываются с рецепторами, состоящими из сиалированных гликанов (сложные гликаны, заканчивающиеся сиаловой кислотой, которая присоединена α2→3- или α2→6-связью). ГА H5N1 преимущественно связывается с рецепторами, состоящими из гликанов, заканчивающихся сиаловой кислотой, которая присоединена α2→3-связью. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что рецепторами, состоящими из гликанов, в организме человека-хозяина, для вирусов гриппа А, адаптированных к организму человека, являются α2→6-гликаны, которые принимают характерную топологию, напоминающую зонтик (называемые в дальнейшем рецепторами человека) в рецептор-связывающем сайте ГА для рецептора, состоящего из гликана (RBS) (Chandrasekharan et al., 2008, Nat Biotech, 26: 107; публикация включена в настоящую заявку посредством ссылки). Также авторы настоящего изобретения показали, что высокоаффинное связывание с указанными рецепторами человека, состоящими из гликанов, характерно для ГА, адаптированных к организму человека, и коррелирует с эффективной передачей воздушно-капельным путем адаптированных к организму человека вирусов H1N1 и H3N2 (Chandrasekharan et al, 2008, Nat Biotech, 26: 107; Srinivasan et al., 2008, PNAS, 105: 2800; обе из которых включены в настоящую заявку посредством ссылки). В настоящем исследовании авторы настоящего изобретения предложили вирус H5N1, в котором ГА содержит замены в последовательности RBS, которые делают возможным связывание с рецепторами человека с высоким сродством.
Схема эксперимента
[00312] ГА вируса гриппа представляет собой гомотримерный белок, в котором один мономер содержит 552 аминокислоты. Каждый мономер состоит из двух компонентов ГА1 и ГА2, связанных дисульфидными связями. ГА1 содержит связывающий сайт для рецептора, состоящего из гликана (RBS), тогда как ГА2 участвует в слиянии мембран вируса и клетки. В образовании кармана RBS участвуют положения 95, 131, 133, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 183, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 222, 224, 225, 226, 227, 228 (применяется нумерация H3).
[00313] Авторы настоящего изобретения провели подробный анализ молекулярных контактов между H5N1 и репрезентативным рецептором человека, и сравнили указанные контакты с контактами между ГА адаптированных к организму человека пандемичных вирусов H1N1, H2N2 и H3N2 и рецепторами человека. При помощи данного подхода авторы настоящего изобретения определили стратегии генерирования мутантных форм ГА H5N1. В ГА нескольких генетических клад H5N1 были введены мутации Q226L и G228S (или LS). Указанные мутации основаны на заменах характеристических аминокислот в положениях 226 и 228 ГА H2N2 и H3N2, которые привели к адаптации их к организму человека, соответственно.
[00314] Указанные мутации были введены в контексте RBS ГА разных генетических клад H5N1 (Фигура 13). В предыдущих исследованиях (например, Stevens et al., 2008, J. Mol. Biol., 381: 1382-94; и Stevens et al., 2006, Science, 312: 404; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки) на платформах с матрицами гликанов были проанализированы как рекомбинантный ГА, так и цельные вирусы, содержащие мутации LS в разных штаммах H5N1, и было показано, что некоторые из указанных штаммов приобрели способность к связыванию с α2→6-сиалированными гликанами (Фигура 14). Однако цель указанных исследований состояла в скрининге на связывание при высоких концентрациях белка или высоких титрах вируса, чтобы определить, сколько α2→3- или α2→6-гликанов демонстрируют сигналы связывания.
[00315] Напротив, авторы настоящего изобретения проводили дозозависимый анализ рекомбинантных ГА, содержащих мутацию LS в RBS, из нескольких штаммов H5N1 (Фигура 15). Настоящие данные демонстрируют, что ни один из указанных мутантов не проявлял характерного высокого сродства связывания с рецепторами человека, которыми обладают адаптированные к организму человека ГА. Настоящие результаты также коррелируют с неэффективной передачей вирусов H5N1, содержащих только мутацию LS в RBS. Однако ни один из указанных мутантов не проявлял характерного высокого сродства связывания с рецепторами человека. Следовательно, требовались дополнительные стратегии для определения мутантных форм ГА H5N1.
Мутации, которые упраздняют гликозилирование
[00316] Таким образом, авторы настоящего изобретения ввели 5 замен аминокислот в положениях 128, 133, 145, 159, 193 (ниже остатки выделены жирным шрифтом и подчеркиванием) в ГА Viet_1203_04_c1 (А/Вьетнам/1203/04, который является штаммом клады 1), чтобы сделать его RBS сходным с RBS более недавних генетических клад (которые включают штаммы, такие как А/Индонезия/5/05).
[00317] Авторы настоящего изобретения выяснили, что гликозилирование аминокислоты в положении N158 может интерферировать с топологией, напоминающей зонтик, в рецепторе человека в RBS ГА H5N1. Таким образом, первая стратегия авторов настоящего изобретения основывалась на генерировании мутантных форм ГА H5N1, которые содержат замены Q228L и/или G228S и дополнительную мутацию T160A, которая упраздняет гликозилирование в положении N158.
[00318] Указанный сайт гликозилирования не консервативен в ряду всех генетических клад. Если отсутствие гликозилирования в положении N158 улучшает связывание ГА H5N1 с мутацией LS с рецептором человека, тогда мутации LS сами по себе могли бы быть достаточным условием для достижения адаптации к организму человека у вирусов, принадлежащих к генетическим кладам, которые от природы не обладают данным сайтом гликозилирования (с2.2, с2.2.1, и т.д.; см. Фигуру 13). В качестве эталонной последовательности для указанных клад была выбрана последовательность Egypt_2876-N3_06_c2.2 (А/Египет/2786-N3/06, принадлежащий к кладе 2.2). Авторы настоящего изобретения также определили мутантные формы, которые содержат только мутацию Q226L (в контексте дегликозилирования в положении 158), чтобы оценить степень повышения сродства связывания с рецептором человека при условии, что в ГА H2 мутации Q226L достаточно для существенного повышения сродства.
[00319] Дозозависимый анализ названных выше мутантов (Фигура 16) показал, что устранение гликозилирования в остатке Asn-158 путем мутирования Thr-160→Ala в контексте мутации LS существенно улучшает связывание с рецепторами человека. Это отмечалось как для мутации T160A/Q226L/G228S в Vietl203_04_D, так и для мутации LS в ГА Egypt_2876-N3_06_c2.2. Авторы настоящего изобретения также продемонстрировали, что только мутации Q226L (без G228S) не достаточно для обеспечения высокого сродства связывания с рецептором человека в контексте устранения гликозилирования в положении N158. Однако настоящее изобретение включает установление того факта, что одной только мутации в положении Q226 (например, Q226L) могло бы быть достаточно для обеспечения высокого сродства связывания с рецептором человека в контексте устранения гликозилирования в положении N158 в контексте некоторых конкретных штаммов вирусов. Также настоящее изобретение включает установление того факта, что одной только мутации в положении G228 (например, G228S) могло бы быть достаточно для обеспечения высокого сродства связывания с рецептором человека в контексте устранения гликозилирования в положении N158 в контексте некоторых конкретных штаммов вирусов. Также настоящее изобретение включает установление того факта, что в контексте устранения гликозилирования в положении N158 в контексте некоторых конкретных штаммов вирусов для обеспечения высокого сродства связывания с рецептором человека могут потребоваться обе мутации в положениях Q226 и G228 (например, Q226L и G228S).
[00320] Кроме того, авторы настоящего изобретения выяснили, что связывание перечисленных выше мутантов с рецепторами птиц (в частности, с 3'SLN-LN-LN и 3'SLN-LN) также довольно сильное, что не типично для ГА, адаптированных к организму человека. Например, даже в случае ГА прототипного пандемичного H2N2 (А/Албания/6/58), который продемонстрировал связывание как с рецепторами человека, так и с рецепторами птиц, сродство связывания с рецепторами человека было на несколько порядков выше, чем сродство с связывания с рецепторами птиц.
Делеция аминокислоты в петлевой области
[00321] Авторы настоящего изобретения разработали мутантные формы ГА H5N1, такие, у которых молекулярные контакты между их RBS и рецепторами человека близко имитируют контакты между ГА адаптированного к организму человека H2N2 и рецепторами человека. На основании своей предшествующей работы в области представления о молекулярном составе RBS ГА H2N2 и того, как управляется специфичность рецепторов, состоящих из гликанов, авторы настоящего изобретения впервые провели подробное молекулярное сравнение RBS ГА H5N1 с RBS ГА прототипного адаптированного к организму человека H2N2 из пандемического штамма 1957-1958 годов (А/Албания/6//58 или Alb6_58) (Фигура 17). Чтобы минимизировать различия в молекулярном составе RBS между ГА H5 и ГА Alb6_58, авторы настоящего изобретения сгенерировали мутанта на основе шаблона Viet1203_04_D ("Viet1203_04_D_H2RBS"; SEQ ID №:61), который содержит 13 замен аминокислот в положениях 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228, и делецию в положении 130. В настоящем исследовании, в первый раз, основное внимание было уделено разработке и тестированию мутаций в RBS ГА H5N1, которые представляют собой сочетание делеции и замен на основании всестороннего сравнения ГА H2 и H5. Делецию произвели в положении 130. Хотя в ГА H2N2 отсутствует гликозилирование в положении 158, сайт гликозилирования N158 (Viet1203_04_D) в мутантном ГА был сохранен. Таким образом, настоящее изобретение включает установление того факта, что мутации, которые упраздняют гликозилирование в сайте 158, наряду с упоминаемыми выше мутациями могут даже еще больше усиливать связывание с рецепторами человека. Также авторы настоящего изобретения разработали другую версию указанного мутанта (“Viet1203_04_D_H2RBSmin"; SEQ ID №:63) с меньшими мутациями, основанными на заменах консервативных остатков.
[00322] Также авторы настоящего изобретения провели поиск последовательностей Га из других штаммов H5N1, которые могут от природы быть ближе к ГА H2N2 Alb6_58 в том, что касается молекулярного состава RBS. Авторы настоящего изобретения иде6нтифицировали два набора примерных шаблонов: (1) со свойствами изменения заряда в положениях 192 и 193 (А/цыпленок/Вьетнам/NCVD-093/2008 или ckViet_08), и (2) с делецией в петле 130 (А/цыпленок/Египет/R2/2007 or ckEgy_07). Были разработаны дополнительные формы мутантов с меньшим числом мутаций в упоминаемых выше положениях указанных новых шаблонов ГА H5N1, чтобы RBS ГА H5N1 мог имитировать RBS ГА H2N2, адаптированного к организму человека.
[00323] Сродство связывания мутантов с рецепторами человека тестировали при помощи дозозависимой матрицы гликанов. Мутант Viet1203_04_D_H2RBS продемонстрировал высокоспецифичное высокоаффинное связывание с рецепторами человека, которое характерно для ГА H1N1 и H2N2, адаптированных к организму человека (Фигура 19). Настоящее изобретение включает установление того факта, что можно разрабатывать дополнительные мутации, чтобы понять взаимосвязь между (1) составом и делецией в петле 130, (2) изменением заряда в заряженных остатках в положениях 192 и 193, и (3) гликозилированием в положении 158, а также того, как указанная взаимосвязь управляет сродством связывания мутантных ГА H5N1 с рецепторами человека.
Примеры применяемых шаблонов последовательностей H5N1 и примеры мутантных полипептидов. разработанных в соответствии с изложенными выше принципами, приведенными в Примере 2
[00324] На Фигуре 18 и ниже приведено выравнивание примеров шаблонов H5N1 и примеры полипептидов ГА H5, разработанных в соответствии с изложенными выше принципами, приведенными в Примере 2:
[00325] Viet1203_04_D: выделенные жирным шрифтом и подчеркиванием остатки обозначают сайты замен
[00326] В следующих последовательностях курсивом и цветом отмечена область, в которой произведены мутации, а жирным шрифтом и подчеркиванием указаны остатки, которые были мутированы.
[00327] Viet1203_04_D_H2RBS:
[00328] Viet1203_04_D_H2RBS_N158deglyc
[00329] Viet1203_04_D_H2RBSmin): Deletion+7 mutations
[00330] Viet1203_04_D (T160A/Q226L/G228S) mutant:
[00331] Egypt_2876-N3_06_c2.2: Lack of glycosylation at 158 is indicated by larger font
[00332] Egypt_2876-N3_06_c2.2 ГА с мутацией LS: Отсутствие гликозилирования в положении 158 показано более крупным шрифтом.
[00333] Egypt_2876-N3_06_c2.2 ГА с одиночной мутацией Q226L: Отсутствие гликозилирования в положении 158 показано более крупным шрифтом.
[00334] Viet1203_04_D с Т160А/двойная мутация Q226L:
[00335] ckViet_08: WT ГА, который уже обладает сочетанием смены заряда в Lys192 и Met193, что наблюдается в H2N2 (показано более крупным шрифтом)
[00336] ckViet_08_H2RBS: Делеция + 6 мутаций
[00337] ckViet_08_H2RBS: Делеция + 5 мутаций
[00338] ckViet_08_H2RBSmin: Делеция + 4 мутации
[00339] ckEgy_07: Уже обладает делецией в петле 130
[00340] ckEgy_07_Z5: мутация LS в ckEgy_07
[00341] ckEgy_07_H2RBS: 8 мутаций
Обсуждение
[00342] В нескольких экспериментальных исследованиях совершались попытки идентифицировать детерминанты специфичности ГА H5 к рецепторам человека. Однако в указанных исследованиях основное внимание было сосредоточено на прямой замене аминокислот в сайтах RBS без учета влияния соседних положений. Также ни в одном из предшествующих исследований даже не рассматривались вставки или делеции, как возможные детерминанты специфичности к хозяину. Основанные на структуре исследования также не были успешными в идентификации ключевых детерминант ГА H5, главным образом из-за того, что структурные эффекты делеции нельзя точно оценить при помощи анализа in silico. Напротив, авторы настоящего изобретения впервые установили важность и применили подход выравнивания последовательностей для конструирования белков с новыми свойствами. Настоящее изобретение включает установление того факта, что аналогичный подход можно применять для идентификации детерминант специфичности к хозяину у других подтипов ГА, для которых в последние годы был показан потенциал инфицирования людей (H7, H9, и др.).
Материалы и методы
Анализ зависимости «доза-ответ» прямого связывания полипептидов ГА дикого типа с гликанами разной топологией
[00343] Анализ прямого связывания обычно основан на матрице гликанов, в которых заданные структуры гликанов (например, одновалентные или поливалентные) расположены на подложке (например, предметных стеклах или в лунках планшета), часто с применением полимерного остова. При так называемом «последовательном» анализе тримерному полипептиду ГА дают связаться с указанной матрицей, а затем проводят детекцию, например, при помощи первичных и вторичных антител с меткой (например, с FITC /флуоресцеин изотионат/ или пероксидазой хрена). При «поливалентном» анализе тримерный ГА сначала образует комплекс с первичными или вторичными антителами (обычно в отношении 4:2:1 - ГА : первичное антитело : вторичное антитело) так, чтобы было 12 сайтов связывания гликанов на один предварительный комплекс ГА, а затем ему дают контактировать с указанной матрицей. Обычно анализ связывания проводят в некотором диапазоне концентраций ГА так, чтобы получить информацию о сродстве для разных гликанов в матрице.
[00344] Например, исследования прямого связывания проводили с матрицами, содержащими разные гликаны, такие как 3'SLN, 6'SLN, 3'SLN-LN, 6'SLN-LN и 3'SLN-LN-LN, где LN представляет собой Galβ1-4GlcNAc, 3’ представляет собой Neu5Acα2-3, а 6’ представляет собой Neu5Acα2-6). Более точно, биотинилированные гликаны (50 мкл раствора 120 пмоль/мл) инкубировали в течение ночи (в фосфатно-солевом буфере /ФСБ/ при 4°C) в планшете на 384 лунки с большой связывающей емкостью, покрытым стрептавидином, который предварительно трижды промывали ФСБ. Указанный планшет трижды промывали ФСБ для удаления избытка гликанов, и применяли без какой-либо дополнительной обработки.
[00345] Соответствующие количества белка ГА с His-меткой, первичное антитело (мышиное анти 6 × His-метка) и вторичное антитело (конъюгированный с пероксидазой хрена козий антимышиный IgG) инкубировали в соотношении 4:2:1 - ГА : первичное антитело : вторичное антитело в течение 5 минут на льду. Затем указанную смесь (т.е., предварительный комплекс ГА) доводили до конечного объема 250 мкл 1% БСА (бычий сывороточный альбумин) в ФСБ. 50 мкл предварительного комплекса ГА затем добавляли в планшет на 384 лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Впоследствии лунки промывали трижды ФСБ, содержащим 0,05% TWEEN-20, затем трижды ФСБ. Активность пероксидазы хрена оценивали при помощи набора Amplex Red Peroxidase Kit («Invitrogen», Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Исследовали последовательные разведения предварительных комплексов ГА. Включали соответствующие отрицательные контроли (несиалированные гликаны) и контроли фонового уровня (отсутствие гликанов или отсутствие ГА), и все циклы анализа проводили в трех экземплярах.
Пример 2: Примеры вариантов полипептидов ГА H5, связывающихся с рецепторами человека
[00346] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА представляют собой полипептиды H5. Согласно некоторым таким вариантам реализации полипептиды H5 согласно настоящему изобретению демонстрируют связывание (например, высокоаффинное и/или высокоспецифичное связывание) с гликанами с топологией зонтика. Согласно некоторым таким вариантам реализации полипептиды H5 согласно настоящему изобретению демонстрируют либо сопоставимое (со связыванием с гликанами с топологией зонтика) высокоаффинное связывание с гликанами топологией конуса, либо сниженное связывание (например, более низкое сродство и/или специфичность по сравнению со сродством и специфичностью к гликанам с топологией зонтика) с гликанами топологией конуса.
[00347] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются с рецепторами, обнаруживаемыми в верхних дыхательных путях человека. Кроме того, полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются с множеством разных α2-6-сиалированных гликанов. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 связываются с гликанами с топологией зонтика.
[00348] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются с рецепторами ГА в бронхах и/или трахее. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 не способны связываться с рецепторами с рецепторами в глубоких отделах легких, и согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 способны связываться с рецепторами в глубоких отделах легких. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 не способны связываться с α2-3-сиалированными гликанами, и согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 способны связываться с способны связываться с α2-3-сиалированными гликанами.
[00349] Согласно некоторым вариантам реализации полипептидами ГА H5 согласно настоящему изобретению являются варианты родительских ГА H5 (например, ГА H5, обнаруживаемый у природного изолята вируса гриппа). Например, согласно некоторым вариантам реализации полипептидами ГА H5 согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с ГА H5 дикого типа в сайте связывания гликана или влияющую на него. Согласно некоторым вариантам реализации такие замены касаются аминокислот, которые напрямую взаимодействуют со связываемым гликаном; согласно некоторым вариантам реализации такие замены касаются аминокислот, которые непосредственно взаимодействуют со связанным гликаном; согласно некоторым вариантам реализации такие замены касаются аминокислот, которые обладают одной удаленной степенью разделения с теми аминокислотами, которые взаимодействуют со связанным гликаном, в том смысле, что аминокислоты с одной удаленной степенью разделения либо (1) взаимодействуют с непосредственно связывающимися аминокислотами; либо (2) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, но не взаимодействуют непосредственно с самими гликанами; или (3) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, а также взаимодействуют непосредственно с самими гликанами. Полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению содержат одну или более замен в непосредственно связывающихся аминокислотах, аминокислотах с одной или более первыми удаленными степенями разделения, аминокислотах с одной или более вторыми удаленными степенями разделения и/или их сочетаниях. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению могут содержать замены в одной или более аминокислотах даже с более высокми степенями разделения.
[00350] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере две, три, четыре, пять или более замен аминокислот по сравнению с ГА H5 дикого типа; согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 согласно настоящему изобретению содержат две, три или четыре замены аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации все такие замены аминокислот локализованы в пределах сайта связывания с гликанами.
[00351] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА согласно настоящему изобретению содержат по меньшей одну или более замен аминокислот, описанных в любой из следующих публикаций: Публикации патента США №2009/0269342 и 2010/0004195, и Публикация патента США с серийным номером 12/829931 от 2 июля 2010 г., под названием "COMPOSITIONS AND METHODS FOR DIAGNOSING И/ИЛИ TREATING INFLUENZA INFECTION" (каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки).
[00352] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат замены аминокислот в положениях, соответствующих одному или более из остатков 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159. 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5, в частности варианты полипептида H5, содержат одну или более замен аминокислот по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в остатках, выбранных из группы, состоящей из остатков в положениях 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат одну или более замен аминокислот по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 или 37 остатках, выбранных из группы, состоящей из остатков в положениях 95, 98, 128, 130, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 183, 186, 187, 188, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 221, 222, 224, 225, 226, 227 и 228.
[00353] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат в последовательности замены аминокислот, которые уменьшают или упраздняют гликозилирование в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат замены в последовательности, которые влияют и/или изменяют идентичность и/или структуру гликана, связываемого с сайтом, соответсвующим аминокислоте в положении 158. Согласно некоторым вариантам реализации такой заменой в последовательности является мутация в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 158, например, Asn158Xaa, где Xaa - любая аминокислота кроме Asn. Согласно некоторым вариантам реализации такой заменой в последовательности является мутация в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 160, например, Thr160Xaa, где Xaa - любая аминокислота кроме Asn. Согласно некоторым вариантам реализации такая замена в последовательности включает мутацию Thr160Ala. Согласно некоторым вариантам реализации замена в последовательности, которая уменьшает, устраняет, влияет на гликозилирование или изменяет его в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 158, может приводить к более близкому подобию (например, как структурному, так и функциональному) полипептида ГА H5 с полипептидом ГА H2. Согласно некоторым вариантам реализации мутация в сайте, соответсвующем аминокислоте в положении 160 (например, Thr160Xaa, такая как Thr160Ala), может приводить к более близкому подобию (например, структурному и функциональному) полипептида ГА H5 с полипептидом ГА H2.
[00354] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа (например, ГА H5) в положениях, соответствующих одному или более из остатков 226, 228 и 160. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в положениях, соответствующих остаткам 226, 228 и 160. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в положениях, соответствующих остаткам 226 и 160. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в положениях, соответствующих остаткам 228 и 160. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в положениях, соответствующих остаткам 226 и 228.
[00355] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в положениях, соответствующих одному или более из остатков 226, 228 и 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в положениях, соответствующих остаткам 226, 228 и 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих остаткам 226 и 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в положениях, соответствующих остаткам 228 и 158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 содержат замены в последовательности по сравнению с родительским ГА H5 дикого типа в положениях, соответствующих остаткам 226 и 228.
[00356] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен, которые включают делецию в одной или более петлевой области полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности, которые включают делецию в сайте, соответствующем петлевой области 128-137 полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности, которые включают делецию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих остаткам 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136 и/или 137 полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности, которые включают делецию в сайте, соответствующем петлевой области 128-134 полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности, которые включают делецию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих остаткам 128, 129, 130, 131, 132, 133, и/или 134 полипептида ГА. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности, которые включают делецию аминокислоты, соответствующей остатку 130. Согласно некоторым вариантам реализации такие замены в петлевой области могут приводить к более близкому подобию (например, и структурному, и функциональному) полипептида ГА H5 с полипептидом ГА H2. Согласно некоторым вариантам реализации делеция аминокислоты, соответствующей остатку 130, может приводить к более близкому подобию (например, как структурному, так и функциональному) полипептида ГА H5 с полипептидом ГА H2.
[00357] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих одному или более из остатков 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 остаткам из остатков в положениях 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих (1) 130, и (2) одному или более из остатков 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих (1) 130, и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 остаткам из остатков в положениях 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228.
[00358] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих одному или более из остатков 131, 132, 135, 188, 192, 221 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 остаткам из остатков в положениях 131, 132, 135, 188, 192, 221 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 132, 135, 188, 192 и 221. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остаткам из остатков в положениях 131, 132, 135, 188, 192 и 221.
[00359] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих одному или более остаткам 133, 137, 155, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 остаткам из остатков в положениях 133, 137, 155, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 133, 137, 155, 193, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА дикого типа в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 остаткам из остатков в положениях 133, 137, 155, 193, 226, 227 и 228.
[00360] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 130, 192 и 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2 или 3 остаткам из остатков в положениях 130, 192, 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или обоим остаткам в положениях 192 и 193.
[00361] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 остаткам из остатков в положениях 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 остаткам из остатков в положениях 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228.
[00362] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 остаткам из остатков в положениях 137, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остакам из остатков в положениях 137, 188, 192, 193, 226 и 228.
[00363] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132, 133 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 остатков из остатков в положениях 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132, 133 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 и 133. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остаткам из остатков в положениях 137, 188, 192, 193, 226. 227, 228, 131, 132 и 133.
[00364] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 227, 131, 132, 133 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4 или 5 остаткам из остатков в положениях 227, 131, 132, 133 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 227, 131, 132 и 133. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3 или 4 остаткам из остатков в положениях 227, 131, 132 и 133.
[00365] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 остаткам из остатков в положениях 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остаткам из остатков в положениях 131, 133, 137, 155, 188,192, 193, 226, 227 и 228.
[00366] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остаткам из остатков в положениях 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остаткам из остатков в положениях 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 и 228.
[00367] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 остаткам из остатков в положениях 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остаткам из остатков в положениях 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226,227 и 228.
[00368] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остаткам из остатков в положениях 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 228 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 остаткам из остатков в положениях 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 и 228.
[00369] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221, 227 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остаткам из остатков в положениях 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221, 227 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 остаткам из остатков в положениях 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 и 227.
[00370] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих одному или более остаткам 131, 132, 133, 221, 227 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих 1, 2, 3, 4, 5 или 6 остатков из остатков в положениях 131, 132, 133, 221, 227 и 130. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) одному или более остаткам 131, 132, 133, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен в последовательности по сравнению с родительским ГА в положениях, соответствующих (1) 130 и (2) 1, 2, 3, 4 или 5 остаткам из остатков в положениях 131, 132, 133, 221 и 227.
[00371] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен аминокислот относительно родительского ГА дикого типа в остатках, выбранных из аминокислот, расположенных в области рецептора, которая непосредственно связывается с гликаном, включая без ограничений остатки в положениях 98, 136, 153, 155, 183 и 194. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 содержит одну или более замен аминокислот относительно родительского ГА дикого типа в остатках, выбранных из аминокислот, расположенных вблизи области рецептора, которая непосредственно связывается с гликаном, включая без ограничений (а) остатки в положениях 98 и 195, (b) остатки в положениях 98, 138, 186, 187, 195 и 228) или (с) остатки в положениях 138, 186, 187 и 228.
[00372] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА, в частности, вариант полипептида H5, содержит одну или более замен аминокислот относительно родительского ГА дикого типа в остатках, выбранных из аминокислот, которые обладают одной удаленной степенью разделения с теми аминокислотами, которые взаимодействуют со связанным гликаном, в том смысле, что аминокислоты с одной удаленной степенью разделения либо (1) взаимодействуют с непосредственно связывающимися аминокислотами; либо (2) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, но не взаимодействуют непосредственно с самими гликанами; или (3) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, а также взаимодействуют непосредственно с самими гликанами, включая без ограничений остатки в положениях 98, 138, 186, 187 и 228.
[00373] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА, в частности, вариант полипептида H5 содержит одну или более замен аминокислот относительно родительского ГА дикого типа в остатках, выбранных из аминокислот, которые обладают одной удаленной степенью разделения с теми аминокислотами, которые взаимодействуют со связанным гликаном, в том смысле, что аминокислоты с одной удаленной степенью разделения либо (1) взаимодействуют с непосредственно связывающимися аминокислотами; либо (2) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, но не взаимодействуют непосредственно с самими гликанами; или (3) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, а также взаимодействуют непосредственно с самими гликанами, включая без ограничений остатки в положениях 138, 186, 187 и 228.
[00374] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА, в частности, вариант полипептида H5 содержит одну или более замен аминокислот относительно родительского ГА дикого типа в остатках, выбранных из аминокислот, которые обладают одной удаленной степенью разделения с теми аминокислотами, которые взаимодействуют со связанным гликаном, в том смысле, что аминокислоты с одной удаленной степенью разделения либо (1) взаимодействуют с непосредственно связывающимися аминокислотами; либо (2) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, но не взаимодействуют непосредственно с самими гликанами; или (3) другим образом влияют на способность непосредственно связывающихся аминокислот к взаимодействию с гликаном, а также взаимодействуют непосредственно с самими гликанами, включая без ограничений остатки в положениях 98 и 195.
[00375] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА, в частности, вариант полипептида H5 содержит замену аминокислоты относительно родительского ГА дикого типа в остатке 159.
[00376] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА, в частности, вариант полипептида H5 содержит одну или более замен аминокислот относительно родительского ГА дикого типа в остатках, выбранных из остатков в положениях 190, 193, 225 и 226. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА, в частности, вариант полипептида H5 содержит одну или более замен аминокислот относительно родительского ГА дикого типа в остатках, выбранных из остатков в положениях 190, 193, 226 и 228.
[00377] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 согласно настоящему изобретению содержит одну или более из следующих замен аминокислот: Ser132Thr, Ala133Thr, Ser133Thr, Ser137Ala, Ser137Arg, Ile155Thr, Lys156Glu, Asn158Xaa (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn), Thr160Ala, Asn186Pro, Asp187Ser, Asp187Thr, Ala188Glu, Ala188Asp, Ala189Gln, Ala189Lys, Ala189Thr, Glu190Asp, Glu190Thr, Thr192Arg/Lys, Lys193Arg, Lys193Asn, Lys193His, Lys193Ser, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ser221Pro, Gly225Asp, Gln226Ile, Gln226Leu, Gln226Val, Ser227Ala, Gly228Ser.
[00378] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 согласно настоящему изобретению содержит замену аминокислоты в положении, соответствующем остатку 192, которая приводяит к смене заряда в данном положении. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 согласно настоящему изобретению содержит замену аминокислоты в положении, соответствующем остатку 193, которая приводяит к смене заряда в данном положении. Например, согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 согласно настоящему изобретению содержит Thr или гидрофобный остаток (например, Val или Ile) в положении, соответствующем остатку 192, а вариант полипептида ГА H5 (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит гидрофильный остаток в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит гидрофильный остаток в положении, соответствующем остатку 192. В соответствии с другим примером, согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 согласно настоящему изобретению содержит Thr или гидрофобный остаток (например, Val или Ile) в положении, соответствующем остатку 192, а вариант полипептида ГА H5 (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит основный остаток (например, Lys или Arg) в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит основный остаток (например, Lys или Arg) в положении, соответствующем остатку 192. В соответствии с еще одним примером, согласно некоторым вариантам реализации, полипептид ГА H5 согласно настоящему изобретению содержит основный остаток (например, Lys или Arg) в положении, соответствующем остатку 193, а вариант полипептида ГА H5 (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит нейтральный или кислый остаток в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит нейтральный или кислый остаток в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 (например, вариант, адаптированный к организму человека) содержит Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193.
[00379] Согласно некоторым вариантам реализации, адаптация полипептидов ГА H5 к организму человека ассоциирована со свойством (свойствами) остатка в положении 188. В ГА H5 остатком 188 часто является Ala, который образует контакт с Thr или гидрофобным остатком в положении 192. Напротив, в ГА H2, остатком 188 часто является Glu или Asp, который образует контакт с Arg или Lys в положении 192. Следовательно, согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Glu в положении 188. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Asp в положении 188. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 содержит замену Ala188Glu. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 содержит замену Ala188Asp.
[00380] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188 и Thr в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188 и гидрофобный остаток в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188 and an Arg в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, и Arg в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, и Lys в положении, соответствующем остатку 192. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, и Lys в положении, соответствующем остатку 192.
[00381] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188, Thr в положении, соответствующем остатку 192, и Lys в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188, гидрофобный остаток в положении, соответствующем остатку 192, и Lys в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188, Thr в положении, соответствующем остатку 192, и Arg в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ala в положении, соответствующем остатку 188, гидрофобный остаток в положении, соответствующем остатку 192, и Arg в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, Arg в положении, соответствующем остатку 192, и Thr в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, Arg в положении, соответствующем остатку 192, и Thr в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, Lys в положении, соответствующем остатку 192, и Thr в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, Lys в положении, соответствующем остатку 192, и Thr в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, Arg в положении, соответствующем остатку 192, и Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, Arg в положении, соответствующем остатку 192, и Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Glu в положении, соответствующем остатку 188, Lys в положении, соответствующем остатку 192, и Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Asp в положении, соответствующем остатку 188, Lys в положении, соответствующем остатку 192, и Thr, Ala, Met или Val в положении, соответствующем остатку 193.
[00382] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ala в положении, соответствующем остатку 131. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Thr в положении, соответствующем остатку 131.
[00383] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ser в положении, соответствующем остатку 132. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 содержит Thr в положении, соответствующем остатку 132.
[00384] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ser в положении, соответствующем остатку 133. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 содержит Thr в положении, соответствующем остатку 133.
[00385] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 включает Ala, Thr и/или Ser в любом из положений, соответствующих остаткам 131, 132 и/или 133. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 включает Ala, Thr и/или Ser в любом из положений, соответствующих остаткам 131, 132 и/или 133. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 включает Thr во всех положениях, соответствующих остаткам 131, 132 и 133.
[00386] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Val в положении, соответствующем остатку 135. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит любую аминокислоту, отличную от Val, в положении, соответствующем остатку 135.
[00387] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ser в положении, соответствующем остатку 137. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Arg в положении, соответствующем остатку 137.
[00388] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Не в положении, соответствующем остатку 155. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Thr в положении, соответствующем остатку 155. Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 включает Thr в положении, соответствующем остатку 155. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 включает Thr в положении, соответствующем остатку 155.
[00389] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ser в положении, соответствующем остатку 221. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Pro в положении, соответствующем остатку 221.
[00390] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 включает Ser в положении, соответствующем остатку 221. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 включает Pro в положении, соответствующем остатку 221. Не вдаваясь в теорию, Pro221 может влиять на конформацию петли 220, которая связана с RBS полипептида ГА Н2.
[00391] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Gin в положении, соответствующем остатку 226. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 содержит Leu в положении, соответствующем остатку 226.
[00392] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Ser в положении, соответствующем остатку 227. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 содержит Gly в положении, соответствующем остатку 227.
[00393] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 содержит Gly в положении, соответствующем остатку 228. Согласно некоторым вариантам реализации, вариант полипептида ГА H5 содержит Ser в положении, соответствующем остатку 228.
[00394] Согласно некоторым вариантам реализации полипептид ГА H5 включает остатки Gln, Ser и Gly в положениях, соответствующих остаткам 226, 227 и 228, соответственно. Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА H5 включает Leu, Gly и Ser в положениях, соответствующих остаткам 226, 227 и 228, соответственно.
[00395] Согласно некоторым вариантам реализации вариант полипептида ГА согласно настоящему изобретению, и в частности вариант H5, содержит одну или более из следующих аминокислот в указанных положениях:
- Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp, Gln226Leu
- Glu190Asp, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
- Ala189Gln, Lys193Ser, Thr160Ala
- Ala189Gln, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
- Asp187Ser/Thr, Ala189Gln, Lys193Ser, Gln226Leu, Gly228Ser
- Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
- Asp187Ser/Thr, Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
- Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gln226Leu, Gly228Ser
- Lys193His, Gln226Leu/Ile/Val, Gly228Ser
- Lys193Arg, Gln226Leu/Ile/Val, Gly228Ser
- Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
- Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
- Ser137Ala, Lys156Glu, Ala189Lys, Lys193Asn, Gly225Asp
- Glu190Thr, Lys193Ser, Gly225Asp
- Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp
- Asn186Pro, Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp
- Asn186Pro, Asp187Thr, Ala189Thr, Glu190Asp, Lys193Ser, Gly225Asp, Ser227Ala
- Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala
- Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala
- Gly228Ser, Thr160Ala
- Gln226Leu, Thr160Ala
- Gln226Leu, Gly228Ser
- Thr160Ala
- Gln226Leu, Gly228Ser, Asn158Xaa (wherein Xaa = any amino acid besides Asn)
- Gly228Ser, Asn158Xaa
- Gln226Leu, Asn158Xaa
- Gln226Leu, Gly228Ser
- Asn158Xaa
- Δ130 (где «Δ130» обозначает делецию аминокислоты, соответствующей положению 130) плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 135, 188, 192 и 221
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 133, 137, 155, 193, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 133, 137, 155, 188, 192, 193, 226 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226, 227 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 133, 137, 155, 159, 160, 188, 192, 193, 226 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 228, 131, 132, 133, 221 и 227
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 221 и 227
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 137, 188, 192, 193, 226 и 228
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 137, 188, 192, 193, 226, 227, 228, 131, 132 и 133
- Δ130 плюс любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 227, 131, 132 и 133
- Gln226Leu, Gly228Ser, Thr160Ala, Δ130
- Gln226Leu, Gly228Ser, Δ130
- Gln226Leu, Thr160Ala, Δ130
- Gly228Ser, Thr160Ala, Δ130
- Gln226Leu, Δ130
- Gly228Ser, Δ130
- Thr160Ala, Δ130
- Δ130
- Δ130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Ser227Gly, Gly228Ser
- Δ130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Gly228Ser
- Δ130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Asn159Asp (или Thr160Ala, или обе), Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Ser227Gly, Gly228Ser
- Δ130, Ala131Thr, Leu133Thr, Ser137Arg, Ile155Thr, Asn159Asp (или Thr160Ala, или обе), Ala188Glu, Thr/Ile192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Ala, Gln226Leu, Gly228Ser
- Δ130, Ser137Arg, Ala188Glu, Thr192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val, Gln226Leu, Gly228Ser
- Δ130, Ser137Arg, Ala188Glu, Thr192Arg/Lys, Arg/Lys193Thr/Met/Ala/Val, Gln226Leu, Gly228Ser, Xaa131Ser/Thr, Xaa132Ser/Thr, Xaa133Ser/Thr, Ser221Pro, Ser227Gly (где Xaa = любая аминокислота)
- Δ130, Xaa131Ser/Thr, Xaa132Ser/Thr, Xaa133Ser/Thr, Ser221Pro, Ser227Gly (где Xaa = любая аминокислота)
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофобная аминокислота, а Xaa' = любая гидрофильная аминокислота)
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток)
- Δ130, Xaa193Xaa' (где Xaa = основный остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток)
- Δ130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофобная аминокислота, а Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Xaa193Xaa' (где Xaa = основный остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток)
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток)
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Lys/Arg 193Thr/Ala/Met/Val
- Δ130, Ala188Glu
- Δ130, Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Ala188Glu
- Δ130, Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, and Xaa' = ейтральный или кислый остаток), Ala188Glu
- Δ130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, and Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Ala188Asp
- Δ130, Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, and Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Asp
- Δ130, Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, and Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, and Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, and Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Glu
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Xaa193Xaa' (где Xaa = основной остаток, например, Lys или Arg, а Xaa' = нейтральный или кислый остаток), Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Xaa' (где Xaa = любая гидрофильная аминокислота, и Xaa' = любая гидрофильная аминокислота), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
- Δ130, Xaa192Lys/Arg (где Xaa = любой гидрофобный остаток), Lys/Arg193Thr/Ala/Met/Val, Ala188Asp
[00396] Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены полипептиды ГА H5 (например, варианты полипептидов ГА H5, сконструированные полипептиды ГА H5 и/или сконструированные варианты полипептидов ГА H5), последовательность аминокислот в которых включает элемент, указанный ниже (нумерация указанных положений соответствует нумерации в ГА Н3):
- X190, X193, X225 и X226
- X190, X193, X226 и X228
- X189, X193, X160
- X189, X193, X226, X228
- X187, X189, X193, X226, X228
- X189, X193, X226, X228
- X187, X189, X193, X226, X228
- X156, X189, X193, X226, X228
- X193, X226, X228
- X193, X226, X228
- X189, X193, X225
- X156, X189, X193, X225
- X137, X156, X189, X193, X225
- X190, X193, X225
- X187, X189, X190, X193, X225
- X186, X187, X189, X190, X193, X225
- X186, X187, X189, X190, X193, X225, X227
- X226, X228, X160
- X226, X228, X160
- X228, X160
- X226, X160
- X226, X228
- X160
- X226, X228, Xaa158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn)
- X228, Xaa158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn)
- X226, Xaa158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn)
- X226, X228
- X158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn)
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X132, X133, X135, X137, X155, X188, X192, X193, X221, X226, X227 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X132, X135, X188, X192 и X221
- X130 плюс любое возможное сочетание X133, X137, X155, X193, X226, X227 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X132, X133, X135, X137, X155, Xaa158 (где Xaa = любая аминокислота кроме Asn), X160, X188, X192, X193, X221, X226, X227 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X227 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X227 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X137, X188, X192, X193, X226, X228, X131, X132, X133, X221 и X227
- X130 плюс любое возможное сочетание X131, X132, X133, X221 и X227
- X130 плюс любое возможное сочетание X137, X188, X192, X193, X226 и X228
- X130 плюс любое возможное сочетание X137, X188, X192, X193, X226, X227, X228, X131, X132 и X133
- X130 плюс любое возможное сочетание X227, X131, X132 и X133
- X226, X228, X160, X130
- X226, X228, X130
- X226, X160, X130
- X228, X160, X130
- X226, X130
- X228, X130
- X160, X130
- X130
- X130, X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X227, X228
- X130, X131, X133, X137, X155, X188, X192, X193, X226, X228
- X130, X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X227, X228
- X130, X131, X133, X137, X155, X159, X160, X188, X192, X193, X226, X228
- Х130, Х137, Х188, Х192, Х193, Х226, Х228
- Х130, Х137, Х188, Х192, Х193. Х226, Х228, Х131, Х132, Х133, Х221, Х227
- Х130, Х131, Х132, Х133, Х221, Х227
- Х130, Х192
- Х130, Х193
- Х130, Х192, Х193
- Х130, Х188
- Х130, Х192, Х188
- Х130, Х193, Х188
- Х130, Х192, Х193, Х188
где X = любая аминокислота (если выше не указано другое) и/или Х = выпавшая аминокислота. Нумерация указанных положений соответствует нумерации в ГА H3.
[00397] Согласно некоторым вариантам реализации Х130 является делецией в положении 130. Согласно некоторым вариантам реализации, X160 представляет собой Ala. Согласно некоторым вариантам реализации, X158 - любая аминокислота кроме Asn.
[00398] Согласно некоторым таким вариантам реализации указанный вариант полипептида ГА H5 содержит по меньшей мере одну дополнительную замену по сравнению с ГА H5 дикого типа, такую, что повышается сродство и/или специфичность указанного варианта в отношении гликанов с топологией зонтика.
[00399] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают L226, S228 и А160. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают L226 и A160. Согласно некоторым вариантам реализации, варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают S228 и A160. Согласно некоторым вариантам реализации, варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают А160.
[00400] Согласно некоторым вариантам реализации, варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают L226, S228 и X158 (где Х = любая аминокислота кроме Asn). Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают L226 и Х158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают S228 и Х158. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Х158.
[00401] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228.
[00402] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, S228, A160 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, А160 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, S228, А160 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, S228 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193,221 и 227.
[00403] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, А160 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221 и 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, S228 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193, 221, 226 и 227.
[00404] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, S228, X158 (где Х = любая аминокислота кроме Asn) и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, X158 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221, 227 и 228. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, S228, Х158 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221 и 227. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, L226, S228 и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 158, 160, 188, 192, 193,221 и 227.
[00405] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению (включая варианты полипептидов ГА H5) обладают последовательностями, которые включают Δ130, Х158 (где Х = любая аминокислота кроме Asn) и любое возможное сочетание мутаций в положениях, соответствующих остаткам 131, 132, 133, 135, 137, 155, 160, 188, 192, 193, 221, 226, 227 и 228.
[00406] Согласно некоторым вариантам реализации варианты полипептидов ГА H5 согласно настоящему изобретению содержат открытый сайт связывания по сравнению с родительским ГА H5, и в частности, с родительскими ГА H5 дикого типа.
[00407] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются со следующими α2-6-сиалированными гликанами: , , , , , , , , и их сочетанием. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются с гликанами, обладающими структурой: , ,  и их сочетаниями; и/или ; и/или  ; и/или , , , и их сочетаниями. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются с , , и/или ; согласно некоторым вариантам реализации с ; согласно некоторым вариантам реализации с ; и согласно некоторым вариантам реализации с , ,  и/или .
[00408] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются с гликанами с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются по меньшей мере с некоторыми из гликанов (например, α2-6-сиалированными гликанами), изображенными на Фиугре 9. Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются с несколькими гликанами, изображенными на Фиугре 9.
[00409] Согласно некоторым вариантам реализации полипептиды ГА H5 согласно настоящему изобретению связываются по меньшей мере приблизительно с 10%, приблизительно с 15%, приблизительно с 20%, приблизительно с 25%, приблизительно с 30% приблизительно с 35%, приблизительно с 40%, приблизительно с 45%, приблизительно с 50%, приблизительно с 55%, приблизительно с 60%, приблизительно с 65%, приблизительно с 70%, приблизительно с 75%, приблизительно с 80%, приблизительно с 85%, приблизительно с 90% приблизительно с 95% или более гликанов, обнаруживаемых в рецепторах ГА в тканях верхних дыхательных путей человека (например, в клектах эпителия).
[00410] Согласно некоторым вариантам реализации полипептидами ГА H5 (включая №:50, 51, 53-55 и 60-75.
[00411] Один из аспектов настоящего изобретения основан на конкретном установлении того факта, что одного только высокоаффинного связывания с гликанами с топологией зонтика может быть недостаточно для эффективной передачи/инфицирующей способности в организме человека. Настоящее изобретение связано с представлением о том, что также может быть важно сниженное связывание с гликанами с топологией конуса. Согласно некоторым вариантам реализации и высокоаффинное связывание с гликанами с топологией зонтика, и сниженное связывание с гликанами с топологией конуса могут быть вовлечены в приобретении способности эффективной передачи инфекции/ инфицирующей способности организмае человека. Согласно некоторым вариантам реализации для эффективной передачи/инфицирующей способности в отношении организма человека достаточно высокоаффинного связывания с гликанами с топологией зонтика. Согласно некоторым вариантам реализации для эффективной передачи/инфицирующей способности в отношении организма человека достаточно высокоаффинного связывания с гликанами с топологией зонтика, даже если сродство связывания с гликанами с топологией конуса не снижено (например, неизменно, повышено и т.д.).
[00412] Согласно некоторым вариантам реализации повышенное сродство и/или специфичность связывания варианта полипептида ГА H5 с гликанами с топологией зонтика и пониженное сродство и/или специфичность связывания с гликанами с топологией конуса может способствовать увеличению или усилению передачи в/инфицирующей способности в отношении организма человека по сравнению с эталонным полипептидом (например, родительский полипептид ГА, родственный указанному варианту полипептида ГА H5). Согласно некоторым вариантам реализации повышенного сродства и/или специфичности связывания варианта полипептида ГА H5 с гликанами с топологией зонтика достаточно для увеличения или усиления передачи/инфицирующей способности в отношении организме человека по сравнению с эталонным полипептидом (например, родительский полипептид ГА, родственный указанному варианту полипептида ГА H5). Согласно некоторым вариантам реализации повышенного сродства и/или специфичности связывания варианта полипептида ГА H5 с гликанами с топологией зонтика достаточно для увеличения или усиления передачив/инфицирующей способности в отношении организма человека по сравнению с эталонным полипептидом (например, родительский полипептид ГА, родственный указанному варианту полипептида ГА H5), даже если сродство и/или специфичность связывания с гликанами с топологией конуса не понижено (например, неизменно, повышено и т.д.). Согласно некоторым вариантам реализации повышенного сродства и/или специфичности связывания варианта полипептида ГА H5 с гликанами с топологией зонтика достаточно для увеличения или усиления передачив/инфицирующей способности в отношении организма человека по сравнению с эталонным полипептидом (например, родительский полипептид ГА, родственный указанному варианту полипептида ГА H5), даже если сродство и/или специфичность связывания с гликанами с топологией конуса такое же или выше, чем сродство и/или специфичность связывания с гликанами с топологией зонтика.
Пример 3: Разнообразие гликанов в тканях верхних дыхательных путей человека
[00413] Исследования связывания с пектинами показали разнообразное распределение α2-3 и α2-6 в тканях верхних дыхательных путей. Исследования с окрашиванием указывают на преимущественное распределение α2-6-сиалированных гликанов как части и N-связанных (ресничные клетки) и O-связанных гликанов (в бокаловидных клетках) на апикальной стороне эпителия трахеи (Фигура 12). С другой стороны, внутренние области ткани трахеи преимущественно содержат α2-3-сиалированные гликаны, распределенные в N-связанных гликанах.
[00414] Анализ MALDI-MS по определению профиля гликанов показал значительное разнообразие (Фигура 10), а также преимущественную экспрессию α2-6-сиалированных гликанов в верхних дыхательных путях человека. Фрагментация пиков, соответствующих репрезентативным массам, с применением MALDI TOF-TOF подтверждает топологию гликанов, в которой более длинные ветви олигосахаридов с множественными повторами лактозаминов распространены в значительной степени по сравнению с короткими ветвями олигосахаридов (Фигура 10). Чтобы иметь эталон для оценки разнообразия в распределении и топологии гликанов в верхних дыхательных путях, проводили анализ MALDI-MS для N-связанных гликанов из эпителия ободочной кишки человека (НТ29). Последние вирусы H5N1 первично инфицировали кишечник, и, следовательно, указанные клетки были выбраны в качестве репрезентативных клеток кишечника. Профиль гликанов в клетках НТ29 существенно отличается от профиля в НВЕ, в которых отмечается преимущественное распространение α2-3, а топология гликанов с длинными ветвями олигосахаридов не наблюдается (Фигура 10).
[00415] Данные, показанные на Фигуре 12, были сгенерированы при помощи следующего способа. Срезы ткани трахеи, фиксированные формалином и заключенные в парафин, приобретали у компании «US Biological». После депарафинизации и регидратации указанных срезов ткани эндогенный биотин в них блокировали при помощи набора для блокировки стрептавидина/биотина («Vector Labs»). Затем срезы инкубировали с Джакалином, меченным FITC (специфичен в отношении O-связанных гликанов), биотинилированным Конкавалином A (Con А, специфичен в отношении α-связанных остатков маннозы, которые являются частью остова структуры олигосахарида, которая составляет N-связанные гликаны), биотинилированным пектином маакии амурсмкой (MAL, специфичен в отношении SAα2,3-gal) и биотинилированным агглютинином самбука черного (SNA, специфичен в отношении SAα2,6-gal) («Vector labs»; 10 мкг/мл в ФСБ с 0,5% Tween-20) в течение 3 часов. После отмывки ТФСБ (фосфатно-солевой трис-буфер с 1% Tween-20) срезы инкубировали со стрептавидином Alexa fluor 546 (2 мкг/мл в ФСБ с 0,5% Tween-20) в течение 1 часа. Препараты промывали ТФСБ и рассматривали под конфокальным микроскопом (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия Zeiss LSM510). Все инкубации проводили при комнатной температуре (КТ).
6
[00416] Данные, показанные на Фигуре 10, были сгенерированы при помощи следующего способа. Клетки (~70×10) отбирали, когда они демонстрировали >90% слияния в 100 нМ цитратно-солевом буфере, и мембраны клеток выделяли после обработки ингибитором протеазы («Calbiochem») и гомогенизации. Фракцию клеточных мембран обрабатывали ПНГазой F («New England Biolabs»), и указанную реакционную смесь инкубировали в течение ночи при 37°C. Затем указанную реакционную смесь кипятили в течение 10 мин, чтобы инактивировать указанный фермент, а дегликозилированные пептиды и белки удаляли при помощи картриджа Sep-Pak С 18 SPE («Waters). Также гликаны обессоливали и очищали в нейтральных (фракция 25% ацетонитрила) и кислых (50% ацетонитрил, содержащий 0,05% трифторуксусной кислоты) фракциях с применением твердофазной колонки с графитированным углеродом («Supeico»). Кислые фракции анализировали посредством масс-спектрометрии MALDI-TOF в положительном и отрицательном режимах в соответствии с мягкими условиями ионизации (ускоряющее напряжение 22 кВ, сеточное напряжение 93%, однопроводная линия передачи 0,3% и время задержки экстракции 150 не). Пики калибровали в форме некатионированного вида. Преимущественная экспрессия α2-6-сиалированных гликанов была подтверждена путем предварительной обработки проб Сиалидазой А и S. Выделенные гликаны впоследствии инкубировали с 0,1 U сиалидазы Arthrobacter ureafaciens (сиалидаза А, неспецифичная) или сиалидазой Streptococcus pneumoniae (Сиалидаза S, специфичная в отношении α2-3-сиалированных гликанов) в конечном объеме 100 мл 50 нМ фосфата натрия, pH 6,0 при 37°C в течение 24 ч. Нейтральные и кислые фракции анализировали посредством MALDI-TOF в положительном и отрицательном режимах, соответственно.
Пример 4: Связывание вариантов полипептида ГА H5 с тканями легких человека
[00417] Предложено связывание со срезами ткани легких и трахеи человека, фиксированными в формалине и заключенными в парафин (например, приобретенными у компании «US Biomax, Inc.» и у компании «US Biological», соответственно). Срезы ткани депарафинизировали, регидратировали и инкубировали с 1% БСА в ФСБ в течение 30 минут, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. ГА H5 давали образовать предварительный комплекс с первичным антителом (мышиное анти 6х с His-меткой) и вторичным антителом (Alexa fluor 488 - козье антимышиное антитело) в соотношении 4:2:1, соответственно, в течение 20 минут на льду. Образованные комплексы разводили в 1% БСА-ФСБ с получением конечной концентрации 40, 20 или 10 мкг/мл. Затем указанные срезы ткани инкубировали с указанными комплексами ГА-антитело в течение 3 часов при КТ. Проводили контрастное окрашивание срезов пропидиумом иодидом («Invitrogen», 1:100 в ТФСБ), интенсивно промывали и затем рассматривали под конфокальным микроскопом (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия Zeiss LSM510).
[00418] Также образовавшие предварительный комплекс ГА H5 применяли вместе с другими пектинами, такими как Джакалин (маркер не-ресничных слизеобразующих клеток, таких как бокаловидные клетки) для совместного окрашивания срезов ткани для получения дополнительной информации о том, окрашивает ли ГА ресничные и/или не-ресничные клетки в эпителии.
Пример 5: Тестирование ГА H5 в организме животного-хозяина
[00419] Как описано в настоящей заявке, настоящее изобретение основано на том, что применение животных-хозяев (например, хорьков) для исследования передачи вируса может служить надежным показателем передачи вируса у людей. Аналогично, настоящее изобретение основано на том, что применение животных-хозяев (например, хорьков), которым вводят связывающие агенты согласно настоящему изобретению (например, полипептиды ГА) в целях исследования передачи вируса может служить надежным показателем эффективности таких связывающих агентов согласно настоящему изобретению при профилактике или лечении вирусной инфекции у человека-хозяина.
Анализ передачи вируса
[00420] Анализ передачи вируса применяют при наличии или при отсутствии связывающих агентов согласно настоящему изобретению для определения передачи вируса в подходящих моделях на животных. Например, животных-хозяев, например, хорьков, содержат в смежных клетках, которые исключают возможность прямого или косвенного контакта между животными. Однако указанные условия содержания допускают распространение гриппа по воздуху. Первой группе животных прививают при помощи способов, известных в технике (например, интраназально, внутримышечно или любым другим путем введения, описываемым в настоящей заявке) эффективное количество вируса («животные с прививкой вируса»). Затем через один, два, три или более дней в клетки, соседние с клетками животных с прививкой вируса, помещают интактных животных.
[00421] Животных, применяемых в данном исследовании, можно умертвить в любое время через один, два, три или более дней после прививки вируса или передачи инфекции для анализа. Подходящие способы анализа, применяемые в исследованиях передачи вируса, могут включать без ограничений определение титров инфекционных вирусов (например, в смывах из носовой полости), наблюдение за физическими симптомами у животных (например, летаргия, анорексия, ринорея, чихание, высокая лихорадка и/или летальный исход), иммуногистохимический анализ тканей дыхательных путей среди прочих.
[00422] Анализ передачи вируса, описанный выше, может также включать лечение животного-хозяина связывающим агентом согласно настоящему изобретению, описанным выше в настоящей заявке, во время прививки вируса или передачи вируса или после них. Тогда способы анализа, описываемые в настоящей заявке, применяют для определения эффективности указанного связывающего агента (агентов) при блокировании передачи вируса и/или инфицирования животного-хозяина указанным вирусом.
Серологические исследования
[00423] Связывающие агенты и/или композиции вакцин, содержащие связывающие агенты, вводят хорькам внутримышечно в день 0, и в дальнейшем вводят повторную дозу в день 21. У каждого животного отбирают кровь в дни 0, 14, 21 и 35. Отобранную сыворотку исследуют in vitro, определяя ее способность к ингибированию агглютинации вируса и нейтрализации вирусной инфекции.
Анализ ингибирования гемагглютинации (ИГА)
[00424] Титрование для оценки ИГА проводили в планшете на 96 лунок с v-образным дном («Coming»). Сыворотку разводили в 2 раза и добавляли к 4 агглютинирующим дозам вируса гриппа A в общем объеме 200 мкл. Затем добавляли 25 мкл 2% (объем/объем) раствора эритроцитов. Сыворотку, вирус и эритроциты аккуратно перемешивали, и результаты анализа считывали после инкубации в течение 30 минут. Титры регистрировали как величину, обратную максимальному разведению антител, которое ингибирует 4 агглютинирующих дозы вируса.
Анализ нейтрализации in vitro
[00425] Последовательные разведения сыворотки смешивают с вирусами и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем инкубируют с клетками MDCK в течение 1 ч при 37°C. Затем клетки промывают дважды средой, не содержащей сыворотки, а затем добавляют свежую среду с трипсином или без трипсина. Рост вируса оценивают по цитопатическому эффекту. Данные выражают как величину, обратную максимальному разведению сыворотки, которое вызывает нейтрализацию.
Анализ вирусной провокации
[00426] Вакцинированным хорькам интраназально вводят штаммы гомологичного и гетерологичного дикого типа, а также мутантного H5N1. У хорьков берут смывы из носовой полости в дни 1, 3 и 5 после провокации. Вирус титруют в клетках MDCK, чтобы определить вирусовыделение в дыхательных путях.
Пример 6: Двух замен аминокислот в гемагглютинине последних изолятов H5N1 достаточно, чтобы сместить их предпочтение в сторону рецепторов человека
Введение
[00427] Высокопатогенный штамм H5N1 вызывает беспокойство во всем мире, поскольку он вызвал несколько локальных вспышек болезни у людей с 2003 года (Heumann et al., 2010, Cell Res, 20:51; Guan et. al., 2009, Rev Sci Tech, 28:39; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки). Существующие штаммы H5N1 не способны к воздушно-капельной передаче, и скорее они передаются преимущественно при прямом контакте с инфицированными животными. Однако высокий процент заболеваемости и смертности, ассоциированный с инфекцией (~60%), а также известная способность подтипов вирусов гриппа (включая H5N1) к приобретению фенотипических признаков либо посредством мутаций, либо посредством рекомбинации генов, указывают на то, что штамм H5N1 может приобретать способность передаваться воздушно-капельным путем (Yen et. al., 2009, Curr Top Microbiol Immunol, 333:3; включена в настоящую заявку посредством ссылки). В совокупности со способностью таких вирусов вызывать тяжелую инфекцию, тот факт, что популяция людей не имеет предсуществующего иммунитета к H5N1, указывает на возможность эпидемии или пандемии в будущем, если такой штамм возникнет (Subbarao et. al., 2007, PLoS pathogens, 3:e40; включена в настоящую заявку посредством ссылки).
[00428] Применение систем на основе «обратной генетики» показало, что из 11 продуктов генов приобретение определенных замен аминокислот в гемагглютинине (ГА) и полимеразе (РВ2) является жизненно-важным для воздушно-капельной передачи у людей (Hoeven et. al., 2009, Pro Natl Acad Sci USA, 106:3366; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Таким образом, для идентификации потенциала фенотипических изменений особенно важно обращаться к функциональному эффекту генетических изменений в указанных белках. В случае РВ2 ключевым для приобретения способности к воздушно-капельной передаче является критическая замена лизина на глутамат в положении 627 (Hoeven et. al., 2009, Pro Nati Acad Sci USA, 106: 3366; включена в настоящую заявку посредством ссылки). Однако исходя из биологической роли ГА, а именно связывания с рецепторами, состоящими из гликанов, приводящего к слиянию вириона и инфицированию, предполагается, что специфические мутации, которые приводят к адаптации к организму человека, должны быть подтип- и штамм-специфичные (Stevens et. al., 2006, Nat Rev Microbiol, 4:857; Russell et. al., 2006, Glycoconj J, 23: 85; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки).
[00429] В предшествующих исследованиях было выяснено, что рецептором к ГА являются гликаны, оканчивающиеся конкретными структурами гликанов (например, «топология зонтика» или «топология конуса» α2→3 или α2→6-связанной сиаловой кислоты). ГА адаптированного к организму птиц вируса H5N1 преимущественно связываются с рецепторами, состоящими из гликанов, заканчивающимися гликанами с топологией конуса, многие из которых содержат α2→3-связанную сиаловую кислоту (рецепторы птиц) (Stevens etl al., 2006, J Mol Biol, 355: 1143; Gambaryan et. al., 2006, Virology, 344: 432; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки). ГА адаптированных к организму человека штаммов H1N1, H2N2 и H3N2 продемонстрировали переход в предпочтениях связывания с топологии конуса (например, многие α2→3) на топологию зонтика (например, многие α2→6-сиалированные гликаны) (рецепторы человека), и характеризуются высокоаффинным связыванием с рецепторами человека, которое, как было показано, коррелирует со способностью к воздушно-капельной передаче указанных адаптированных к организму человека вирусов (Pappas et. al., 2010, PLoS One, 5: e11158; Tumpey et. al., 2007, Science, 315: 655; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки). На основании данной концепции в последних исследованиях были идентифицированы наборы мутаций, которые могут приводить к адаптации ныне циркулирующих штаммов H2N2, H7N7 и H9N2 к организму человека (Viswanathan et. al., 2010, PLoS One, 5: e13768; Belser et. al., 2008, Proc Nati Acad Sci USA, 105: 7558; Sorrell et. al., 2009, Proc Nati Acad Sci USA, 106: 7565; каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки). Указанные исследования демонстрируют, что мутации, требуемые для перехода, могут различаться в зависимости от исследуемого подтипа, и даже конкретного штамма. Предшествующие исследования (Maines et. al., 2011, Virology, 413: 139; Stevens et. al., 2008, JMol Biol, 381: 1382; Stevens et. al., 2006, Science, 312: 404; каждая из которых включена в настоящую заявку посредством ссылки), в которых штаммы H5N1 были мутированы там, чтобы включать либо изменения, характерные для Н3/Н3 (Q226L и G228S или LS), и/или для H1 (E190D, G225D или DD), показывают, что ни одна из указанных мутаций не приводит к количественному «переключению» на специфичность и сродство к рецепторам человека, которые характерны для ГА адаптированного к организму человека «пандемичного» штамма (Фигура 20). Попытки ввести характерные остатки LS в последовательность А/Вьетнам/1203/04 (Viet03_04) не привели к указанному переключению. Авторы настоящего изобретения установили ключевые структурные свойства, которые необходимы для того, чтобы адекватно адаптироваться к характерным остаткам LS. Также авторы настоящего изобретения определили, какие структурные особенности требуются, чтобы облегчить переход специфичности в отношении рецепторов, который позволяет связываться с рецепторами человека с высоким сродством.
Схема эксперимента
[00430] ГА вируса гриппа представляет собой гомотримерный белок, мономер в котором содержит 522 аминокислоты. Каждый мономер состоит из двух компонентов ГА1 и ГА2, связанных дисульфидными связями. ГА1 содержит связывающий сайт для рецептора, состоящего из гликана (RBS), тогда как ГА2 участвует в слиянии мембран вируса и клетки. В образовании кармана RBS участвуют положения ГА 95, 131, 133, 136, 137, 138, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 183, 186, 187, 189, 190, 192, 193, 194, 195, 196, 219, 222, 224, 225, 226, 227, 228 (применяется нумерация H3).
[00431] Чтобы определить структурные свойства и надлежащие последовательности ГА H5, которые могут адаптироваться к характерным остаткам LS, авторы настоящего изобретения провели подробное структурное сравнение RBS ГА Н2 и H5, поскольку ГА H5 филогенетически ближе всего к ГА Р2 (Фигура 21). В целях данного исследования был выбран прототипный пандемичный ГА (А/Албания/6/58 или A1b6_58) с репрезентативным ГА H5N1 из более раннего изолята, полученного у людей (А/Вьетнам/1203/04 или Viet03_04). Проведя сравнительный анализ, авторы в настоящем исследовании идентифицировали четыре характерных свойства, которые отличают RBS НА H5 от RBS ГА Н2 (Фигура 22). Во-первых, состав 130 петли в ГА Н2 отличается от таковой в ГА H5, который включает делецию в положении 130 (нумерация как в Н3) в ГА H5. Во-вторых, есть различия в аминокислотном составе на «вершине» RBS «спирали-190» (а именно в положениях 188, 192 и 193), которая взаимодействует с остатками Сахаров за пределами терминального мотива Neu5Acα2-6Gal- в рецепторе человека. В-третьих, есть различия в аминокислотном составе на «основании» RBS (а именно в положениях 137, 221, 226 и 228, которые включают изменения LS), которое взаимодействует с мотивом Neu5Acα2-6Gal- в рецепторе человека. В-четвертых, отсутствует сайт гликозилирования в положении 158 ГА H5 в ГА Н2. Гликозилирование в указанном сайте может потенциально интерферировать с остатками Сахаров за за пределами терминального мотива Neu5Acα2-6Gal- в рецепторе человека, связанного с RBS (Stevens et. al., 2008, J Mol Biol, 381: 1382; Wang et. al., 2010, Journal of Virology, 84: 6570; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки). Оригинальные результаты охватывают указанное подробное сравнение RBS ГА Н2 и H5, которое указывает на различия в конкретных аминокислотах, которые выходят за пределы более характерных изменений LS, наблюдаемых ранее. Авторы настоящего изобретения попытались идентифицировать соответствующие последовательности ГА H5, которые могли бы облегчить подбор структурных свойств RBS ГА Н2 в контексте мутаций LS.
[00432] Анализ всех последовательностей H5N1 на сегодняшний день (из изолятов как от птиц, так и от человека) позволили авторам настоящего изобретения сделать три дополнительных наблюдения: 1) ГА H5 из многих последних изолятов, полученных как от птиц, так и от людей (после 2007 г.) уже приобрели делецию в петле-130, что удовлетворяет первому свойству, 2) изменения в ключевых аминокислотах уже наблюдались в «спирали-190», что удовлетворяет свойству 2, и 3) утрата гликозилирования в положении 158 (свойство 4) также наблюдается во многих последовательностях ГА H5. В контексте ключевых структурных свойств RBS ГА авторы настоящего изобретения определили, что делеция в петле 130 наряду с утратой гликозилирования (свойства 1 и 4) одновременно в одном и том же ГА были критическими в эволюции ГА H5. Однако настоящее изобретение основано на том, что утрата гликозилирования сопутствует делеции в остатке петли-130, но не наоборот. Настоящее изобретение охватывает то наблюдение, что ГА H5 специфических современных штаммов значительно разошлись с более старыми изолятами вирусов людей (таких как Viet03_04), но также приобрели ключевые структурные свойства, необходимые для соответствия RBS пандемического ГА Н2.
[00433] Таким образом, авторы настоящего изобретения оценили, могут ли штаммы, которые обладают свойствами 1 и 4, иметь корректную последовательность ГА H5 для адекватного приспособления к характерным остаткам LS. Для эксперимента был выбран штамм А/курица/Египет/К2/2007 (или ckEgy_07) в качестве репрезентативного ГА H5, который от природы приобрел свойства 1 и 4 (Фигура 23). Введение только мутации LS (ckEgy_07_LS) в данную последовательность ГА H5 продемонстрировало переход и высокоаффинное связывание с рецепторами человека (и относительно низкое сродство связывания с рецепторами птиц), что напоминает характеристики связывания адаптированных к организму человека «пандемичных» ГА (Фигура 24А, В и Фигура 25). Дополнительные результаты указывают на связывание указанного мутанта ГА H5 с рецепторами человека на апикальной поверхности эпителия трахеи (Фигура 24С), что напоминает окрашивание данной ткани пандемичными ГА (Viswanathan et. al., 2010, PLoS One, 5: e13768; Maines et. al., 2009, Science, 325:484; обе публикации включены в настоящую заявку посредством ссылки).
[00434] Более ранние попытки других авторов ввести одни только изменения LS в более старые изоляты вирусов человека, такие как Viet03_04, не приводили к переходу, и в них недооценивалась необходимость в понимании структурных свойств RBS ГА H5, который может адаптироваться к мутации LS. Приняв во внимание, что (ckEgy_07_LS) также от природы приобрел свойство 4, авторы настоящего изобретения оценили, может ли одно данное свойство, т.е. утрата гликозилирования (достигаемая мутацией Т160А) вместе с LS изменить у Viet03_04 предпочтение связывания с рецепторами, состоящими из гликанов, Viet03_04 (Фигура 25). По сравнению с ГА Viet03_04 дикого типа дозозависимый анализ прямого связывания данного мутантного штамма с гликанами продемонстрировал связывание с рецепторами человека, но также у него сохранилось высокоаффинное связывание с рецептором птиц, которое не характерно для пандемичных адаптированных к организму человека ГА(Фигура 25). Введение одного только изменения LS в другой штамм (A/Египет/2786-NAMRU3/06 или Egy_06), который от природы приобрел свойство 4, подтверждает данное наблюдение. Кроме того, в соответствии с данной структурной концепцией, мутации в репрезентативном ГА H5 (А/курица/Вьетнам/NCVD-093/08 или ckViet_08), который приобрел от природы свойство 2 (Фигура 22С), придает сродство связывания с рецепторами человека, но также сохраняется высокоаффинное связывание с рецептором птиц (Фигура 26).
[00435]
Обсуждение
[00436] Авторы настоящего изобретения впервые определили конкретные структурные свойства, которые требуются для адекватной адаптации к характерным остаткам LS. Кроме того, результаты авторов дают представление о том, что конкретным циркулирующим в настоящее время ГА H5 требуется только два изменения аминокислот, характерные LS, чтобы предпочтение связывания ГА H5 сместилось на рецепторы человека, что должно привести к их адаптации к организму человека. На основании информации из настоящего изобретения его авторы выбрали соответствующие последовательности ГА H5 (даже хоть и из малой репрезентативной совокупности всех ГА H5), которые ответственны за переключение специфичности к рецепторам за счет включения только изменений LS. Одни характерным свойством указанных современных ГА H5 является то, что они от природы участвуют в приобретении свойств 1,2 и 4 (Фигура 27). Хотя из 2277 недублирующихся последовательностей ГА H5N1 в базе данных NCBI свойства 1 и 4 приобрели всего 6%, однако это составляет приблизительно 45% от штаммов H5N1, выделенных в 2009 и 2010 годах. Дополнительный филогенетический анализ ГА H5N1 позволяет выявить, что приобретенные от природы свойства 1 и 4 принадлежат к кладе 2.2.1. До сих пор наличие свойства 1, по-видимому, было исключительной чертой клады 2.2.1, однако существование свойства 4 не ограничивается кладой 2.2.1. Немаловажно, что штаммы клады 2.2.1 уже разошлись значительно с более старыми изолятами вирусов человека (такими как Viet03_04), и они ближе к адаптации к организму человека, чем указанные предшествующие штаммы. Все обсуждаемые изоляты вирусов человека H5N1, относящиеся к кладе 2.2.1, получены из Египта и Израиля. Следовательно, важно отслеживать эволюцию штаммов клады 2.2.1.
Примеры штаммов H5N1 с положительно заряженным остатком в положении 129 (свойство 2)
[00437] ABJ96761/204-204 птичий, Китай 2005 из клады 2.3.4; ABJ96763/204-204 птичий, Китай 2005 из клады 2.3.4; ABJ96764/204-204 птичий, Китай 2006 из клады 2.3.4; ACN39415/204-204 птичий, Китай 2007 из клады 2.3.4; АС007037/204-204 птичий, Вьетнам 2008 из клады 7; ADG28677/204-204 птичий, Египет 2009 из клады 2.2.1; ADI58758/204-204 птичий, Израиль 2010 из клады 2.2.1; ADM85 869/204-204 птичий, Египет 2010 из клады 2.2.1; и ADG28684/204-204 птичий, Египет 2010 из клады 2.2.1.
Примеры штаммов H5N1 с делецией в положении 130 (и утратой гликозилирования в положении 158) в том же ГА, все из которых принадлежат к кладе 2.2.1 (свойство 1). Включают без ограничений:
[00438] ABP96845 Человек Египет 2007
[00439] >ABP96854 Человек Египет 2007
[00440] >ABM92273 Египет 2007
[00441] >ACT15310 Человек Египет 2009
[00442] >ACT15312 Человек Египет 2009
[00443] >ACT15314 Человек Египет 2009
[00444] >ACT15316 Человек Египет 2009
[00445] >ACT15318 Человек Египет 2009
[00446] >ACT15320 Человек Египет 2009
[00447] >ACT15322 Человек Египет 2009
[00448] >ACT15324 Человек Египет 2009
[00449] >ACT15326 Человек Египет 2009
[00450] >ACT15328 Человек Египет 2009
[00451] >ACT15330 Человек Египет 2009
[00452] >ACT15334 Человек Египет 2009
[00453] >ACT15336 Человек Египет 2009
[00454] >ACT15338 Человек Египет 2009
[00455] >ACT15340 Человек Египет 2009
[00456] >ACT15342 Человек Египет 2009
[00457] >ACT15343 Человек Египет 2009
[00458] >ACT15345 Человек Египет 2009
[00459] >ACT15349 Человек Египет 2009
[00460] >ACT15353 Человек Египет 2009
[00461] >ACT15357 Человек Египет 2009
[00462] >ABY79033 Птицы Египет 2007
[00463] >ABW37432 Птицы Египет 2007
[00464] >ABW37433 Птицы Египет 2007
[00465] >ABW37434 Птицы Египет 2007
[00466] >ABW37435 Птицы Египет 2007
[00467] >ABW37436 Птицы Египет 2007
[00468] >ACR56233 Птицы Египет 2008
[00469] >ACR56248/1552 Птицы Египет 2008
[00470] >ACR56246 Птицы Египет 2008
[00471] >AEA92628 Птицы Египет 2008
[00472] >ACR56247 Птицы Египет 2008
[00473] >ACX31965 Птицы Египет 2009
[00474] >ADD21353/1565 Птицы Египет 2009
[00475] >ADD21367/1565 Птицы Египет 2009
[00476] >ADD21378/1565 Птицы Египет 2009
[00477] >ACX31969 Птицы Египет 2009
[00478] >ACX31970 Птицы Египет 2009
[00479] >ACX31978 Птицы Египет 2009
[00480] >ACX31989 Птицы Египет 2009
[00481] >ACX31993 Птицы Египет 2009
[00482] >ADD21354/1565 Птицы Египет 2009
[00483] >ADD21355/1565 Птицы Египет 2009
[00484] >ADD21361/1565 Птицы Египет 2009
[00485] >ADD21376/1559 Птицы Египет 2009
[00486] >ADD21379/1565 Птицы Египет 2009
[00487] >ADD21380/1565 Птицы Египет 2009
[00488] >ADD21371/1565 Птицы Египет 2009
[00489] >ADD21377/1553 Птицы Египет 2009
[00490] >ADY16730 Птицы Египет 2009
[00491] >ADY16731 Птицы Египет 2009
[00492] >ACX31975 Птицы Египет 2009
[00493] >ACX31997/1553 Птицы Египет 2009
[00494] >ADD21359/1565 Птицы Египет 2009
[00495] >ADD21382/1565 Птицы Египет 2009
[00496] >ADB77952/1561 Птицы Египет 2009
[00497] >ADB85109 Птицы Египет 2009
[00498] >ADM85844 Птицы Египет 2009
[00499] >ADM85845 Птицы Египет 2009
[00500] >ADM85847 Птицы Египет 2010
[00501] >ADM85852 Птицы Египет 2010
[00502] >ADM85854 Птицы Египет 2010
[00503] >ADM85855 Птицы Египет 2010
[00504] >ADM85856/1557 Птицы Египет 2010
[00505] >ADM85861 Птицы Египет 2010
[00506] >ADM85862 Птицы Египет 2010
[00507] >ADM85863 Птицы Египет 2010
[00508] >ADM85868 Птицы Египет 2010
[00509] >ADM85870 Птицы Египет 2010
[00510] >ADM85871 Птицы Египет 2010
[00511] >ADM85873/1558 Птицы Египет 2010
[00512] >ADM85874 Птицы Египет 2010
[00513] >ADM85875 Птицы Египет 2010
[00514] >ADM85876 Птицы Египет 2010
[00515] >ADM85878 Птицы Египет 2010
[00516] >ADM85884 Птицы Египет 2010
[00517] >ADM85881 Птицы Египет 2010
[00518] >ADM85883 Птицы Египет 2010
[00519] >ADQ53454 Птицы Израиль 2010
[00520] >AEN68621 Птицы Израиль 2011
Материалы и методы Клинирование. синтез бакуловируса. экспрессия и очистка ГА
[00521] Кодоны последовательностей ГА H5 дикого типа и мутантного ГА оптимизировали для экспрессии в клетках насекомых, и указанные последовательности синтезировали на DNA2.0 («Menio Park», Калифорния). Затем синтезированные гены субклонировали в плазмиду pAcGP67A, и создавали бакуловирус при помощи системы Baculogold («BD Biosciences», Сан-Хосе, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Затем указанные рекомбинантные бакуловирусы применяли для инфицирования клеток Sf9 в суспензионной культуре, культивируемых в среде, не содержащей сыворотки BD Baculogold Max-XP («BD Biosciences», Сан-Хосе, Калифорния). Инфицирование отслеживали, и кондиционированную среду отбирали через 3-4 дня после инфицирования. Растворимый ГА из отобранной среды очищали при помощи аффинной хроматографией с применением никеля (колонки HisTrap HP, «GE Healthcare», Пискатауэй, Нью-Джерси). Элюирующие фракции, содержащие ГА, объединяли, концентрировали и заменяли в них буфер на IX ФСБ, pH 8,0 («Gibco») при помощи спин-колонок 100К MWCO («Millipore», Биллерика Миннесота). Очищенный указанный белок определяли количественно при помощи способа количественного биуретового анализа («Pierce»).
Связывание рекомбинантного ГА со срезами ткани трахеи человека
[00522] Срезы ткани трахеи человека, заключенные в парафин («US Biological»), депарафинизировали, регидратировали и инкубировали с 1% БСА в ФСБ в течение 30 минут, чтобы предотвратить неспецифическое связывание. ГА давали образовать предварительный комплекс с первичным антителом (мышиное анти 6× с His-меткой, «Abeam») и вторичным антителом (Alexa fluor 488 - козье антимышиное антитело, «Invitrogen») в соотношении 4:2:1, соответственно, в течение 20 минут на льду. Связывание с тканью осуществлялось при разных концентрациях ГА, которых достигали посредством разведения предварительного комплекса ГА в 1% БСА-ФСБ.
Затем указанные срезы ткани инкубировали с указанными комплексами ГА-антитело в течение 3 часов при КТ. Проводили контрастное окрашивание срезов пропидиумом иодидом («Invitrogen», 1:100 в ТФСБ). Из указанных срезов ткани делали препараты, а затем визуализировали под конфокальным микроскопом (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия Zeiss LSM510).
Дозозависимое прямое связывание ГА дикого типа и мутантного ГА
[00523] Чтобы исследовать поливалентные взаимодействия ГА-гликан, применяли планшет-матрицу со стрептавидином, содержащую репрезентативные биотинилированные α2→3 и α2→6-сиалированные гликаны, как было описано выше. 3'SLN, 3'SLN-LN, 3'SLN-LN-LN представляют собой репрезентативные рецепторы птиц. 6'SLN и 6'SLN-LN представляют собой репрезентативные рецепторы человека. LN соответствует лактозамину (Galβ1-4GlcNAc), a 3'SLN и 6'SLN, соответственно, соответствуют Neu5Aca2-3 и Neu5Aca2-6, связанным с LN (Фигура 28). Указанные биотинилированные гликаны были получены от Консорциума по функциональной гликомике через программу запроса ресурсов. Лунки планшетов на 384 лунки с большой связывающей емкостью, покрытые стрептавидином («Pierce») на полную емкость загружали при инкубировании лунки с 50 мкл 2,4 мкМ биотинилированных гликанов в течение ночи при 4°C. Избыток гликанов удаляли посредством интенсивного промывания ФСБ. Тримерная единица ГА содержит три мономера ГА (и, следовательно, три RBS, по одному на каждый мономер). Пространственное устройство указанных биотинилированных гликанов в лунках планшета-матрицы со стрептавидином благоприятствует связыванию только одного из трех мономеров ГА в указанной тримерной единице ГА. Следовательно, чтобы специфически усилить поливалентность во взаимодействиях ГА-гликан, указанным рекомбинантным белкам ГА давали образовать предварительные комплексы с первичными и вторичными антителами в мольном отношении 4:2:1 (ГА: первичное антитело : вторичное антитело). Идентичное устройство 4 тримерных единиц ГА в предварительном комплексе для всех указанных ГА позволяет проводить сравнение их сродства связывания с гликанами. Матричный раствор, содержащий соответствующие количества белка ГА с меткой-гистидином, первичного антитела (мышиное анти 6х с His-меткой, «Abeam») и вторичного антитела (Alexa fluor 488 - козье антимышиное антитело, «Invitrogen») в соотношении 4:2:1, инкубировали на льду в течение 20 мин. Соответствующие количества матричного раствора предварительного комплекса ГА разводили до 250 мкл 1% БСА в ФСБ. 50 мкл такого ГА, образовавшего предварительный комплекс, добавляли в каждую из покрытых гликанами лунок и инкубировали в течение 3 часов, после чего следовали этапы промывания в ФСБ и ТФСБ (IX ФСБ+0,05% Tween-20). Сигнал связывания определяли на основании активности пероксидазы хрена при помощи набора «Amplex Red Peroxidase Assay» («Invitrogen», Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя.
Эквиваленты
[00524] Специалисты в данной области техники должны понимать, или должны быть способны удостовериться при помощи только стандартных экспериментов в существовании многих эквивалентов вариантов реализации настоящего изобретения, описываемых в настоящей заявке. Область настоящего изобретения не должна ограничиваться приведенным выше описанием, а охарактеризована представленными ниже пунктами формулы изобретения.