Искусственные хромосомы для генотерапии и тканезамещения

обзоры

Искусственные хромосомы для генотерапии и тканезамещения

М. Лисковых1, Н. Куприна 2, В. Ларионов 2, А. Томилин 1

1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

2 Национальный раковый институт, Бетезда, США

Artificial chromosomes for gene therapy and tissue replacement

M. Likovykh 1, N. Kouprina 2, V. Larionov1, A. Tomilin 1 11nstitute of Cytology of RAS, Saint-Petersburg 2 National Cancer Institute, Bethesda, USA

Искусственные хромосомы (ИХ) уже на протяжении более чем 20 лет рассматриваются как перспективная альтернатива другим векторным системам, таким как вирусная и трансгенная. ИХ обладают практически неограниченной емкостью и способны стабильно поддерживаться в виде отдельных хромосом, тем самым, не несут в себе риск инсерционного мутаганеза. Тем не менее, до последнего времени ИХ не получили широкого распространения ввиду неопределенности состава и неуправляемости. Ситуация в корне изменилась недавно, когда был предложен способ создания ИХ de novo, на основе известных ДНК последовательностей. В статье обсуждаются наиболее продвинутые на сегодняшний день типы ИХ, обсуждаются перспективы использования этих векторов в тканезамещении и генотерапии заболеваний человека.

Ключевые слова: искусственные хромосомы, векторная система, ДНК последовательности, генная терапия.

For more than 20 years artificial chromosomes (ACs) are considered as a promising alternative to other vector systems, such as viral and transgene. Acs have almost unlimited capacity and can be stably maintained as separate chromosomes, thus, do not carry the risk of insertional mutagenesis. However, until recently, Acs have not widely spread due to the uncertainty of their composition and lack of. The situation has changed recently, when the method of de novo construction of ACs, based on defined DNA sequences, was suggested. The review is focused on the most advanced types of ACs and their perspectives in tissue replacement and gene therapy of human diseases.

Key words: artificial chromosomes, vector systems, DNA sequences, gene therapy.

Генетические манипуляции с клетками человека, нацеленные на проведение генетической коррекции или же репрограммирование с целью получения новых клеточных типов, требуют экспрессии гена, максимально приближенной к нормальным физиологическим значениям. На сегодняшний день это является одной из самых сложных задач современной медицины. Считается, что такого рода экспрессия может быть достигнута только путем введения полноразмерного гена, со всеми присутствующими регуляторными элементами и при условии, что только одна его копия будет введена в дефектные клетки. Большинство используемых в настоящее время систем доставки генов не отвечают этим требованиям. Например, наиболее развитые системы на основе адено-, ленти-, ретровирусных векторов, в которых используется кДНК гена или «миниген» [1—9] оказываются не способны воспроизвести тонкую физиологическую регуляцию эндогенных локусов. При помощи вирусных векторов, несущих в своем составе ампликоны вируса простого герпеса (ВПГ-1) и вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) можно доставить и обеспечить экспрессию полноразмерного гена до 150 т.п.н. [1, 10]. Тем не менее, при использовании этих векторов, не удается контролировать число их копий, попадающих в клетки-реципиенты. Кроме

e-mail: antom@mail.cytspb.rssi.ru

того, использование вирусных векторов сопряжено с рядом нежелательных эффектов, как то иммунологические реакции, риск возникновения инсерционного мутагенеза при использовании интегрирующих векторных систем, а также вероятность их эпигенетической инактивации [11—15].

Искусственные хромосомы (ИХ) являются альтернативной системой для доставки и экспрессии генов, обладающей достаточным потенциалом, для того, чтобы решить проблемы, возникающие при использовании вирусных систем доставки генов [16—22]. Все ИХ, по определению, содержат функциональную центромеру, что, в свою очередь, предоставляет им ряд преимуществ по сравнению с эписомными вирусными векторами, используемыми в настоящее время для изучения функции генов и применяемыми в генотерапии. Во-первых, наличие функциональных центромер обеспечивает стабильное, долгосрочное поддержание ИХ как единичной эписомы на клетку, без интеграции в генетический материал клетки-хозяина, минимизируя, таким образом, возможность эпигенетического глушения терапевтически значимого гена и инсерционного мутагенеза. Во-вторых, не существует верхнего предела для размера клонируемой ДНК в ИХ. Таким образом, можно клонировать целый геномный локус, со

всеми регуляторными элементами, необходимыми для тонкой регуляции работы терапевтического гена, и позволяющими максимально точно эмитировать его экспрессию в сравнении с нормальным хромосомным локусом. В-третьих, ИХ может быть перенесена из одной клетки в другую. Наконец, из-за отсутствия вирусных последовательностей ДНК в ИХ, сведен к минимуму риск иммунного отторжения и клеточной трансформации.

Более того, не только одиночные гены, но и группы генов, кодирующие, например, несколько участников сигнального каскада, могут быть клонированы в одну ИХ. Несмотря на эти очевидные преимущества ИХ, по сравнению с вирусными векторами, до недавнего времени ИХ использовались исключительно для изучения структуры и функций кинетохора человека [23—25]. Использование ИХ для изучения функции генов было ограничено рядом технологических проблем, таких как трудность клонирования целевых геномных последовательностей в ИХ и отсутствие точно известного состава ИХ. Хотя, возможность использования ИХ для доставки и изучения экспрессии генов была продемонстрирована в целом ряде исследований [16— 22]. Ситуация изменилась несколько лет назад, после того как была разработана методика создания ИХ предопределенной структуры, содержащей уникальный сайт для введения гена.

В настоящем обзоре мы обобщили достижения технологии искусственных хромосом, приведшие к конструированию двух наиболее продвинутых ИХ-векторов: 21ИХ, на основе усеченной 21-й хромосомы человека [26] и альфоид-1еШ-ИХ, полностью синтетической ИХ, синтезированной на основе повторов альфа-сателлитной ДНК [27, 28].

Два вида ИХ

Несколько исследовательских групп разрабатывали технологию ИХ и возможности этой технологии были подробно описаны в различных обзорах [16—22]. ИХ могут быть сконструированы с применением «top-down» (т.е. путем манипуляций, как правило редукции обычных хромосом) или «bottom-up» (т.е. путем de novo формирования центромеры) подходов. Оба эти подхода, позволяют генерировать ИХ, содержащие функциональную центромеру, сохраняющие ядерную локализацию (как и нормальные хромосомы) и участвующие в процессах митоза и мейоза.

«Top-down» подход, как правило, заключается в теломер-ассоциированной фрагментации хромосом, посредством гомологической рекомбинации в клетках линии DT40. При введении вектора определенного состава, несущего клонированную теломерную последовательность (TTAGGG)n в экспериментальные клетки линии DT40, содержащие хромосому 21, происходит укорочение нативной хромосомы на участке интеграции вектора и происходит формирование новой теломеры. В результате подобных манипуляций, большая часть последовательности ДНК как q- так и p- плеча хромосомы может быть удалена. При помощи этого подхода можно сконструировать линейные минихромосомы или ИХ размером от 0,5 до 10 миллионов пар оснований (м.п.о.), несущие функциональные центромеры и сохраняющие стабильность в процессе митоза в клетках человека и мыши. При помощи подобного подхода были

успешно сконструированы ИХ из нативных хромосом X, Y, 14 и 21 [29-37]. Наиболее удачной ИХ, синтезированной при помощи «top-down» подхода, можно считать недавно сконструированную 21-ИХ, у которой были успешно удалены почти все перицентро-мерные районы, при проведении нескольких раундов теломер-направленных разрывов [26].

«Bottom-up» подход, изначально разработанный на клетках фибросаркомы человека НТ1080, заключается в проведении трансфекции клеток естественной последовательностью ДНК из центромерной области хромосомы или синтетической альфа-сателлитной (альфоидной) последовательностью, размером 30-200 т.п.о., предварительно клонированной в кольцевой бактериальный вектор (BAC) или в линейный дрожжевой вектор (YAC), содержащий теломеры [38-47]. В обоих случаях, при формировании ИХ (кольцевой в случае использования BAC вектора и линейной в случае использования YAC вектора) происходит мультимеризация вводимых в клетку ДНК-фрагментов в клетках человека. В течение последних 14 лет различные группы ученых сообщали об успешном de novo синтезе ИХ из различных субстратов [38-47]. Размер полученных в этих исследованиях ИХ варьировал от 1 до 10 м.п.о., также была продемонстрирована их ми-тотическая стабильность в клетках человека и грызунов. Несмотря на то, что протокол формирования ИХ был значительно усовершенствован, в т.ч. за счет использования ампликона ВПГ-1 для доставки альфоид-ДНК конструкций [48], основным ограничивающим фактором оставалась возможность сборки их исключительно в клетках фибросаркомы НТ1080.

Недавно опубликованное исследование группы под руководством H. Masumoto [49] является прорывом в области синтеза ИХ и снимает описанное выше ограничение. H. Masumoto с коллегами обнаружили, что в клетках НТ1080 уровень триметили-рования гистона по лизину-9 (H3K9me3) в альфоидной ДНК существенно ниже, чем в других клеточных линиях человеческого происхождения. Несмотря на то что крайне критичный для формирования кине-тохора гистон CENP-A может связываться с транс-фицированной альфоидной-ДНК в клетках разных типов, эта связь оставалась стабильной только в клетках НТ1080. В других типах человеческих клеток, гетерохроматин, обогащенный H3K9me3 и HP1, быстро замещал гистон CENP-A во введённой в клетки альфоидной-ДНК, препятствуя таким образом формирование кинетохора. Технологический прорыв Масумото заключался в специфической привязке гистоновой ацетил-трансферазы (HAT) непосредственно к вводимой альфоидной-ДНК. Таким образом, наличие HAT предотвращает избыточное метилирование и замещение CENP-A, что, в свою очередь, позволяет формировать и поддерживать ИХ в стабильном состоянии в клетках различных линий и различного происхождения, в норме непер-миссивных для альфоидных ДНК.

ИХ, полученные по технологии «top-down»

Для применения векторов на основе ИХ в исследованиях, связанных с изучением функции генов, а также для исследований в области генной и клеточной терапии у человека, они должны обладать двумя основными характеристиками: 1) иметь один

уникальный сайт для введения (клонирования) интересующего гена и 2) иметь точно определенный состав и структуру.

До недавнего времени были успешно разработаны лишь несколько ИХ по технологии «top-down» и «bottom-up», имеющие уникальный сайт для загрузки интересующего гена [36, 50—53]. Как отмечалось ранее, наиболее успешными разработками в генерировании ИХ, при использовании «top-down» подхода можно считать работы, проведенные под руководством М. Ошимуры [36, 51, 52]. Эти ИХ, 21DqHAC и 21DpqHAC, были созданы при помощи технологии теломер-направленных разрывов на основе 21-й хромосомы человека в клетках линии DT40 и имеют размер около 10 м.п.о. Далее, был введен уникальный адаптер (представляющий собой одиночный loxP сайт — специфическую последовательность-мишень для направленной рекомбинации, осуществляемой ферментом Сге-рекомбиназой) для загрузки генов вместе с беспромотерным геном Neo (ген устойчивости к неомицину) в эухроматиновый участок оставшегося q-плеча хромосомы. В результате, экспрессия гена Neo в этих ИХ может быть реактивирована при Сге-опосредованной вставке по loxP сайту, что может быть достигнуто при введении любой кольцевой ДНК, содержащей loxP-сайт и промотор. Эти ИХ обладают высокой митотической стабильностью при введении в различные типы клеток [36, 51, 52]. В качестве доказательства эффективности этих векторов сообщалось об успешной вставке гена человеческого эритропоэтина (EPO) в 21DpqHAC путем загрузки через уникальный loxP сайт [54].

Однако применение описанных выше ИХ в изучении функции генов и генотерапии оставалось проблематичным, т.к. точная их структура не была определена. Поэтому была создана новая производная на основе хромосомы 21 человека, у которой было удалено не только p-, но и q- плечо [21]. Эта новая ИХ, размером 5 м.п.о. не несёт в своем составе никаких кодирующих районов ДНК. Окончательная структура ИХ была определена путем секвенирования неизвестных областей со стороны обоих плечей хромосомы, которые предварительно были клонированы в YAC-вектор при помощи технологии TAR (от англ. transformation-associated сЬптд^клонирования. Недавно была сконструирована ИХ, на основе описанной 21-й хромосомы, содержащая в своем составе геномный фрагмент размером 2,4 м.п.о., охватывающий целиком ген дистрофина (DYS) [55]. Эта ИХ была успешно использована для коррекции генетического дефекта, связанного с нарушением работы гена дистрофина на клетках, полученных из мышей линии mdx и, что особо важно, на клетках, полученных от людей с подобным генетическим дефектом [55]. Таким образом, рекомбинантные ИХ потенциально могут быть использованы в терапии нарушений, связанных с функционированием гена DYS.

ИХ, полученные по технологии «bottom-up»

Усилия последних лет привели к появлению ИХ нового поколения, так называемых альфоид-м°-ИХ, синтезированных de novo в нескольких клеточных линиях. Центромерный участок альфоид-м°-ИХ представляет собой чередующиеся последовательности либо альфа-сателлитной ДНК, либо альфа-са-теллитной ДНК и тетрациклинового оператора (tetO) [27, 28, 56].

Одним из основных преимуществ этой ИХ является то, что её центромера может быть инактивирова-на при экспрессии фьюжн-белков с tet-репрессором (tetR). Результатом такой инактивации является потеря ИХ в ходе последующих клеточных делений. Эта особенность альфоид-№Ш-ИХ даёт уникальную возможность для сравнения клеток с и без функциональной копии «спасительного» гена, т.е. фенотип, приобретаемый клеткой, при стабильной экспрессии гена в процессе «лечения» при помощи ИХ, может быть отменен путем инактивации её кинетохора в пролиферирующей клеточной популяции. Таким образом можно обеспечивать контроль за фенотипи-ческими изменениями, вызванными экспрессией генов, включённых в ИХ.

Чтобы адаптировать альфоид-№Ш-ИХ для работ, связанных с исследованием доставки генов и изучением их экспрессии, в её структуру был введен одиночный сайт для загрузки генов (уникальный loxP-сайт, подобный, описанному выше) путем гомологической рекомбинации в клетках линии DT40 [53]. На следующем этапе альфоид-№Ш-ИХ была передана в клетки яичника китайского хомячка, линия CHO (от англ. Chinese hamster ovary). В клетках этой линии интересующий ген может быть очень легко вставлен в альфоид-1йЯ-ИХ по loxP сайту в ходе Cre-опосредованной рекомбинации, и в дальнейшем, альфоид-1йЯ-ИХ, несущая интересующий ген, может быть передана во многие типы других клеток.

Недавно была продемонстрирована возможность использования альфоид-№Ш-ИХ, несущих в своем составе человеческие гены средней величины VHL (25 т.п.о.) и NBS1 (60 т.п.о.) для генетической коррекции клеток, полученных от пациентов, с генетическими нарушениями в работе соответствующих генов [57]. Функциональная экспрессия генов VHL и NBS1 в клетках-реципиентах была подтверждена рядом специфических тестов, основанных на знании функций соответствующих белковых продуктов указанных генов. Важно также отметить, что авторами было продемонстрировано специфическое и целевое удаление альфоид-м°-ИХ посредством инактивации её кинетохора. Напомним, что процесс эпигенетической инактивации генов является одной из основных проблем, ограничивающих использование «целебных» трансгенов для коррекции генетических нарушений в клетках млекопитающих. Тем не менее, не было обнаружено никаких значительных изменений в уровне экспрессии генов VHL и NBS1 на протяжении более чем 6-и месяцев после введения альфоид-м°-ИХ в клетки пациентов.

В недавней работе альфоид-м°-ИХ была проанализирована методами TAR-клонирования и Саузерн-гибридизации. Анализ показал, что альфоид-№Ш-ИХ содержит специфический центромерный участок, размером примерно 1 м.п.о., обеспечивающий стабильность поддержания ИХ при клеточных делениях. Также имеются данные о наличии похожих участков в структуре других de novo синтезированных ИХ [43, 58—60]. В терапевтических целях очень важно знать, меняется ли структура ИХ в течение длительного (в течение нескольких месяцев) культивирования, а также при нескольких передачах из одного типа клеток в другой. С этой целью центромерная область альфоид-м°-ИХ была проанализирована в клетках линии НТ1080, где была изначально

синтезирована ИХ, и в клетках той же линии, но после нескольких раундов MMCT (от англ. microcellmediated chromosome transfer) (смотри ссылку в конце текста). При помощи иммуно-FISH анализа было получено подтверждение того, что сборка CENP-A хроматина на альфоид-м0-ИХ идет аналогично, как в исходной, так и в конечной клеточной линиях. Анализ на основе хроматиновой иммунопре-ципитации (ChIP) показал, что характер распределения модификаций гистона Н3 для CENP-A хроматина совпадает у двух описанных выше популяций клеток по всем меткам: H3K4me3 (маркер промотор-проксимального транскрипционно активного хроматина), H3K4me2 (маркер открытого хроматина) и H3K9me3 (маркер гетерохроматина) на альфоид-м0-ДНК. Результаты этих анализов наглядно иллюстрируют тот факт, что альфоид-м0-ИХ стабильно сохраняет эпигенетический статус в центромерной области, установленный изначально, даже после нескольких раундов MMCT. Кроме того, было показано, что альфоид-№Ш-ИХ сохраняет кольцевую структуру после нескольких раундов MMCT. Наконец, чтобы оценить возможный риск структурных перестроек, целостность альфоид-1йЯ-ИХ была проверена после последовательного переноса через клетки разных видов позвоночных: из НТ1080 клеток человека в DT40 клетки курицы, из DT40 в СНО клетки хомячка, и из СНО снова в человеческие НТ1080 клетки. На основе Саузерн-блот гибридизации был сделан вывод, что большинство клонов, полученных после ММСТ, содержали альфоид-^-ИХ без каких бы то ни было перестроек. Таким образом, будучи однажды синтезированной или внесенной в клетку, альфоид-1йЯ-ИХ остается структурно стабильной в течение нескольких месяцев в процессе деления клеток, а также никогда не интегрирует в хромосомы клетки-хозяина.

Можно сделать вывод, что альфоид-м0-ИХ соответствует всем необходимым параметрам для изучения функций генов. Кроме того, благодаря возможности регуляции кинетохора, это новое поколение полностью ситетических искусственных хромосом, возможно, является более подходящим инструментом для изучения функций генов, нежели ИХ на основа 21-й хромосомы.

Доставка ИХ в клетки-реципиенты

Доставка ИХ, несущих клонированные в них гены, в клетки первичной культуры человека является фундаментальной задачей для исследования функции генов, а также для применения в генотерапии. Тем не менее эффективность доставки ИХ в интересующий клеточный тип является известной проблемой из-за их относительно большого размера.

В настоящее время наиболее широко-используемым методом для передачи ИХ от клеток-доноров к клеткам-реципиентам является метод переноса хромосом через микроклетки или MMCT (от англ. microcell-mediated chromosome transfer), разработанный более 30 лет назад [61, 62]. Следует отметить, что процедура MMCT является длительной и трудоемкой, и что только ограниченное число клеточных линий клеток-доноров, в т.ч. CH0 клетки хомячка и мышиные A9, пригодны для передачи [36, 54]. Поэтому после синтеза ИХ её необходимо перенести в один из вышеуказанных клеточных типов для дальнейшей работы. Этот технически сложный шаг

был выполнен практически для всех опубликованных ИХ-векторов. Частота переноса ИХ из клеток грызунов в клетки-реципиенты варьируется от 10-5 до 10-4. Например, передача ИХ на основе 21-й хромосомы из клеток CHO в первичную культуру фибробластов человека [54] и эмбриональные стволовые (ЭС) клетки человека составила соответственно 1,26х10-4 и 4,0х10-4. Считается, что при проведении ММСТ риск повреждения или перестроек хромосомы минимален, однако, стандартная процедура приемлема далеко не для всех типов клеток-реципиентов, особенно для тех, у которых слияние с микроклетками идет с очень низкой эффективностью. Чтобы решить эту проблему были разработаны два варианта модификации основного протокола ММСТ. Так, в одной работе авторы использовали для слияния липидные оболочки инактивированных вирусных частиц, от японского гемаглютининового вируса (HVJ). Они оказывали эффект, подобный ПЭГ. Подобный подход увеличил эффективность слияния примерно в 3—8 раз [63]. Тем не менее, при применении модифицированного подобным образом протокола, наблюдался ярко выраженный токсический эффект для многих типов клеток-реципиентов. Недавно была описана другая модификация этого метода. Авторы использовали для слияния клетки-реципиенты, на поверхности которых экспрессировались белки H и F вируса кори [64]. Белки Н (от англ. hemaggluti-nin — гемагглютинин) и F (от англ. fusion — слияние) необходимы как для процесса прикрепления вируса к клеточной мембране, так и собственно для слияния. После проведения описанных модификаций частота передачи ИХ в клетки-реципиенты человека, экспрессирую-щие поверхностный рецептор CD46, посредством ММСТ возросла в 30-50 раз.

Для клеток, которые не формируют микроклетки в ответ на обработку нокадозолом, были опробованы альтернативные процедуры, в т.ч. очистка метафазных хромосом. Одна из таких процедур заключается в выделении целевых хромосом из клетки-донора методом проточной сортировки [65]. При помощи этой процедуры можно очистить хромосомы до однородного состояния. Однако, такая очистка сопровождается значительной фрагментацией метафазных хромосом, причем эти фрагменты могут быть отсортированы вместе с ИХ. Возможно, это одна из причин, почему на сегодняшний день нет публикаций, в которых бы сообщалось об успешном использовании проточной сортировки для получения чистых ИХ.

Недавно была опубликована работа Икено с коллегами, в которой авторы предлагают более мягкий метод выделения ИХ на стадии метафазы, подходящий для их дальнейшей передачи в клетки-реципиенты [66]. Они выделили ИХ из метафазных клеток путем центрифугирования на 25% сахарозной подушке. Дальнейшая передача ИХ в клетки человека была проведена при помощи обычных реагентов для трансфекции, что позволило передать ИХ напрямую из клеток доноров, минуя стадию образования микроклеток, которая необходима для ММСТ процедуры. Эффективность передачи ИХ в клетки по описанному методу сравнима с таковой при передаче через ММСТ. К сожалению, пока нет никакой информации о целостности ИХ, при использовании этого метода.

Таким образом, разработка безопасных и эффективных методов передачи ИХ остается актуальной задачей, решить которую предстоит в ближайшем будущем.

Выделение полноразмерных генов

для введения в ИХ

Как было отмечено ранее, одним из преимуществ технологии искусственных хромосом является возможность работы с полноразмерными генами. В последнее время значительно увеличилось число публикаций, описывающих сложные механизмы регуляции экспрессии генов, включающие альтернативный сплайсинг, использование альтернативных вариантов промотора-энхансера гена, экспрессию интронных генов, а также экспрессию ингибирующих РНК. На сегодняшний день полноразмерный ген со всеми регуляторными элементами можно получить в BAC и YAC векторах, путем создания специфичных библиотек. Однако, как правило, BAC/YAC векторы либо содержат фланкируюшие районы других генов или же наоборот, имеет место частичная делеция с 5' или 3' конца желаемого гена. Техника клонирования, основанная на рекомбинации, ассоциированной с трансформацией (от англ. transformation-associated recombination или TAR), проводимая в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, позволяет клонировать желаемые локусы из человеческого генома [67—69]. Рекомбинация между TAR-вектором, содержащим специфические последовательности ДНК, гомологичные фланкирующим участкам интересующего гена, присутствующим на введенной в клетки дрожжей ДНК человека, позволяет специфично включить интересующую нас геномную последовательность в кольцевой YAC-вектор, который может быть амплифицирован и отобран путем селекции в клетках дрожжей. Выход ген-содержащих колоний при TAR-клонировании и последующей селекции колеблется от 1 до 5 процентов. Вся процедура от создания специфичного TAR-вектора, приготовления геномной ДНК для трансфекции и клонирования интересующего гена занимает 2—3 нед. Несмотря на то, что процедура является технически не простой, TAR-клонирование является мощным инструментом для селективного выделения геномных комплексов, размером более 200 т.п.о.

Для переноса TAR-клонированного гена из YAC в ИХ, YAC вектор должен быть трансформирован в BAC-вектор, содержащий loxP-сайт. Преобразование YAC в BAC является оправданным, поскольку совершить амплификацию и дальнейшую ген-содержащую очистку гораздо легче в бактериальных клетках E. coli, чем в дрожжах. Для этих целей используется челночный вектор, способный трансформировать клетки дрожжей, бактерий и млекопитающих [57]. Этот вектор содержит в своем составе 3'HPRT-loxP кассету, что позволяет загрузить его в ИХ, находящуюся в клетках CH°, точно по loxP-сайту и провести дальнейшую селекцию при правильном встраивании конструкции в ИХ. Соответственно, при котрансфек-ции вектора-челнока, несущего интересующий ген, и плазмиды, кодирующей ген Cre-рекомбиназы, в клетки CH°, дефектные по гену HPRT, содержащие ИХ, появляется возможность отбора HPRT+ клеток на культуральной среде, содержащей HAT. Успешное введение генов в ИХ подтверждается методом ПЦР-

анализа с использованием специфичных праймеров, детектирующих восстановление гена HPRT.

На настоящий момент, два ИХ-вектора, производный от 21-й хромосом и альфоид^еШ-ИХ, содержащие уникальные loxP-сайты для введения генов и геномных локусов, послужили платформой для воспроизводимой экспрессии TAR-клонированных полноразмерных генов, таких как VHL, NBS1 и HPRT [57, 70]. Копии всех этих генов были клонированы из геномной ДНК методом TAR-клонирования, описанным выше, введены в вектор, содержащий уникальный loxP-сайт и перенесены в ИХ при использовании Cre/lox-системы. Позже было показано, что эти ИХ комплементируют генетический дефект в клетках, полученных от пациентов с соответствующими генетическими дефектами. Таким образом, комбинация двух подходов, как TAR-клонирование и ИХ представляет собой мощный инструмент для изучения функций генов и, возможно, для будущей генотерапии.

ИХ для создания трансгенных животных

С каждым годом возрастает число лабораторий, использующих мышь как основную животную модель болезней человека. Таким образом, создание линий трансгенных мышей, несущих соответствующие мутантные гены человека, ответственные за специфические заболевания будет являться первым шагом на пути к последующему применению ИХ для генотерапии. Одной из предпосылок для подобных исследований явился тот факт, что ИХ стабильно поддерживаются не только в клетках человека, но и в клетках грызунов, а также клетках курицы.

Y. Kuroiwa с коллегами были первыми, кто продемонстрировал введение ИХ в эмбриональные стволовые (ЭС) клетки мыши и создание на основе этих клеток взрослой мыши [34]. Так, авторами была разработана система клонирования хромосом, в которой участок хромосомы 22, содержащий ген IgH, размером 10 м.п.о. был перенесен в ИХ, полученную из хромосомы 14, путем гомологичной рекомбинации в куриных клетках линии DT40. Эта ИХ стабильно поддерживалась в ЭС клетках и, в последующем, в клетках взрослой мыши. Более того, авторами была продемонстрирована функциональная экспрессия гена IgH с ИХ, подтверждаемая по наличию у мыши человеческих антител. В дальнейшем той же группой учёных подобная технология была применена на коровах с целью получения иммуноглобулинов человека и антиген-специфичных поликлональных человеческих антител из крупного рогатого скота [71, 72].

Несколько других групп исследователей также достигли успеха в создании трансгенных мышей на основе альфоидных ИХ. Так, были созданы трансгенные мыши, несущие ИХ со вставками генов человека: бета-глобина [72], GCH1 [73, 74], альбумина [75], CSN2 [76]. В этих работах было показано, что ИХ стабильно передаются от поколения к поколению (как минимум в течение 3-х поколений) через клетки зародышевого пути, что свидетельствует о мейотической стабильности ИХ в условиях in vivo. Особенно впечатляет пример с созданием мышей, несущих ИХ, экспрессирующую ген человеческого дистрофина (DYS) [55, 77] (более подробно обсуждается ниже).

Резюмируя, можно сказать, что система на основе ИХ может быть успешно использована для

доставки и экспрессии полноразмерных генов в организме экспериментального животного (мыши), что открывает перспективы для разработки конкретных моделей человеческих заболеваний, а так же для использования в промышленном производстве лечебной продукции. Кроме того, трансгенез на основе ИХ может быть использован для идентификации генов, ответственных за проявление рецессивного фенотипа, путем введения генов, ответственных за проявление доминантного фенотипа. Этот подход также применим для проведения работ по изучению экспрессии гена при осуществлении тонких изменений в регуляторных и структурных его областях, в хромосомном контексте.

Перспективы использования ИХ

Две недавно сконструированные ИХ, производная от 21-й хромосом и альфоид-1еШ-ИХ, открывают новые возможности для дальнейшего развития технологии искусственных хромосом, так как эти векторы отвечают очень важным критериям безопасности относительно генома клетки-реципиента, контроля экспрессии гена и обладают полностью известной структурой. Также для этих векторов были продемонстрированы: эффективное и точное введение интересующего гена; последующая передача и стабильная экспрессия трансгенов в полученных от клинических пациентов клетках, а также в клетках мыши [55, 57].

Введение нескольких генов

или целых хромосомных локусов в ИХ

Для ситуации, когда необходимо ввести в ИХ несколько разных генов была создана ИХ, содержащая 5 уникальных сайтов интеграции (UC31 attP, R4 attP, TP901-1 attP, Bxb1 attP, and FRT) [78]. Эта, созданная на основе 21-й хромосомы, ИХ обладает рядом дополнительных качеств, в частности, возможностью высокоточной локализации каждого из клонируемых генов в определенное место на хромосоме, причем сайты клонирования разнесены в пространстве друг относительно друга, чтобы клонируемые гены не оказывали влияния друг на друга. Так же, как и описанные ранее ИХ, рассматриваемая искусственная хромосома может быть передана из одной клеточной линии в другую с возможностью передачи вставленных в неё генов. ИХ, содержащая несколько сайтов интеграции, также может быть использована для сборки гена, размером более 300 т.п.о. из нескольких геномных фрагментов. Следует отметить, что прямое введение фрагментов линеаризованных плазмид в ИХ путем обычной трансфекции представляет собой крайне неэффективный процесс.

ИХ для производства человеческих антител

и белков

Антиген-специфические человеческие антитела, получаемые при гипериммунизации, обладают значительным потенциалом для лечения различных заболеваний человека. Y. Kuroiwa с коллегами [71] продемонстрировали возможность использования ИХ-векторов для производства антиген-специфических поликлональных человеческих антител в организме гипериммунизированной коровы. Для этого геномные участки, кодирующие легкие и тяжелые

цепи иммуноглобулинов, были вставлены в ИХ, полученную на основе человеческой хромосомы 14. Далее, синтезированная таким образом ИХ была перенесена в эмбриональные клетки и, в дальнейшем, был получен теленок, несущий в своем геноме описанную выше ИХ. Последующие исследования показали нормальное формирование и продукцию поликлональных человеческих антител широкого спектра и, что немаловажно, в большом количестве. Аналогичный подход может быть потенциально использован для получения специфических белков, которые трудно или невозможно наработать в бактериальных или дрожжевых системах.

ИХ как система оценки биологически активных

веществ

Другое, принципиально новое для ИХ, применение продемонстрировали недавно Такахаши с коллегами [79]. Новшество заключается в разработке технологии для оценки биологически активных веществ, широко используемых в продуктах питания и пищевых добавках. В частности, авторы сконструировали ИХ для оценки остеогенной активности продуктов питания. Конструкция, содержащая ген остеокальцина, вместе с геном зеленого флуоресцирующего белка под контролем промотора гена остеокальцина, была введена в ИХ, сконструированную на основе 21-й хромосомы человека. Биологическую активность экстрактов различных рыбьих жиров оценивали по интенсивности флуоресценции в ответ на содержащийся в рыбьем жире витамин D3. Используя эту систему оценки биоактивности на основе ИХ, авторы сумели продемонстрировать остеогенную активность отдельных образцов рыбьего жира. Аналогичный подход может использоваться для оценки активности других биоактивных соединений.

Использование ИХ для скрининга

лекарственных средств, влияющих

на стабильность хромосом

Многие раковые клетки проявляют повышенный уровень неправильной сегрегации хромосом, известной также, как хромосомная нестабильность, или CIN (от англ. chromosome instability). Предполагается, что изменение числа хромосом и крупномасштабные изменения профиля экспрессии генов в результате CIN являются основными предпосылками к прогрессированию рака, устойчивости раковых клеток к лекарственным препаратам и рецидиву заболевания. Несмотря на то, что CIN может выступать основным элементом эволюции генома раковых клеток и прогрессии опухолевого роста, исследования последних лет указывают на существование определенного порогового уровня, за пределами которого CIN становится препятствием для последующего опухолевого роста [80, 81]. Таким образом, новые препараты, позволяющие дополнительно увеличить уровень CIN в раковых клетках, могут быть полезным дополнением к имеющимся подходам в терапии рака.

Так как ИХ поддерживается в клетке человека как дополнительная не необходимая 47-й хромосома и к тому же ИХ на несколько порядков менее стабильна, чем естественные хромосомы, то она может быть полезна в качестве чувствительного инструмента для скрининга препаратов, влияющих на CIN. Особенно наглядным для этих целей представляется

использование ИХ, меченных флуоресцирующими белками. Следует отметить, что данное направление сейчас активно развивается и, возможно, в ближайшем будущем будет разработана полноценная система скрининга противоопухолевых препаратов.

ИХ для оптимизации лекарственной терапии

ИХ также может быть использована в качестве инструмента для определения дозировок противоопухолевых препаратов для различных аллелей определенных онкогенов (например, для оптимизации лечения пациентов с NSCLC (рак легкого), которым назначена терапия ингибиторами тирозин-киназ, специфичных к EGFR и HER2). Известно, что некоторые мутации в генах EGFR и HER2 могут привести к раку легкого [82]. Для проведения подбора эффективной дозы ингибиторов, была создана следующая тест-система. Был создан набор изогенных клеточных линий, каждая из которых содержала ИХ либо с разным числом копий генов EGFR и HER2 либо с различными аллельными вариантами этих генов. Далее, при помощи этой тест-системы проверялись эффективные дозы таких препаратов, как иресса и эрлотинин, используемых в противораковой терапии (неопубликованные данные). Подобные тест-системы могут быть использованы в дальнейшем для подбора эффективных доз других препаратов, используемых в терапии рака.

ИХ для идентификации новых генов,

контролирующих сегрегацию хромосом

Спектр мутаций, вызывающих CIN, известен лишь частично, и априорно невозможно предсказать все пути, которые могут привести к CIN. В недавней работе Хитера с соавторами был проведен скрининг генов, которые могут приводить к увеличению хромосомной нестабильности, в дрожжах S. cerevisiae. В результате этой работы было выявлено 257 новых генов, повышенная экспрессия которых может привести к CIN [83]. На основе последовательностей ортологов, авторы создали список генов-кандидатов, вовлеченных в процесс CIN у человека, которые также были упомянуты в базе данных соматических мутаций. Интересно, что экспрессия более 50% обнаруженных генов повышена при раке молочной железы. Для оценки роли этих генов в CIN и последующего развития рака, может быть предложена тест-система на основе ИХ, несущей ген зеленого флуоресцирующего белка. Митотическая нестабильность такой ИХ в ответ на повышенную экспрессию генов-кандидатов может быть обнаружена по потере флуоресцентного сигнала. Использование этого подхода в дальнейшем может позволить идентифицировать еще неизвестные гены, контролирующие сегрегацию хромосом в клетках человека. Также эта система позволит лучше понять проявления CIN и его роль в развитии рака.

ИХ для изучения структуры и формирования

человеческого кинетохора

ИХ имитирует эндогенные хромосомы наличием кинетохора и митотической сегрегацией, что, таким образом, делает их мощным инструментом для проведения функциональных исследований кинетохора человека. Апьфоид-1еШ-ИХ особенно подходит для изучения кинетохора, поскольку содержит прибли-

зительно 6000 копий последовательности тетра-циклинового оператора (tetO). Эти сайты являются мишенью для связывания известного белка tetR (тетрациклинового репрессора), что, в свою очередь, позволяет использовать широкий спектр белков, слитых с tetR, которые могут быть направлены в область формирования кинетохора. Таким образом представляется возможным изучить их влияние на этот процесс. Так, исследования различных модификации хроматина в районе сборки кинетохора, проведенные при помощи ИХ, уже позволили пролить свет на роль центромерного хроматина и его влияние на структуру и функции кинетохора в клетках человека [27, 49, 84—86]. При помощи слияния различных белков с tetR возможно более детально изучить и понять требуемые модификации отдельных гисто-нов, необходимые для формирования и поддержания структуры кинетохора. В недавно опубликованном обзоре обобщены результаты анализов кинетохора человека, проведенные с использованием альфоид-М°-ИХ [87].

Получение индуцированных плюрипотентных

стволовых (иПС) клеток при помощи ИХ

Культивируемые плюрипотентные стволовые клетки, к которым в первую очередь относятся выделяемые из ранних зародышей эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и получаемые из соматических клеток путем повышенной экспрессии 4 транскрипционных факторов (Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, сокращенно OKSM) индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) [88—90], интенсивно изучаются в последнее время благодаря двум уникальным свойствам этих клеток — способности неограниченно долго делиться ex vivo без изменения своих свойств, а также способности дифференцироваться во все известные типы клеток организма. Оба свойства делают ЭСК и иПСК клетки наиболее универсальным источником для тканезамещения, причем последние имеют то преимущество, что могут быть получены из соматических клеток самого пациента, т.е. являются полностью иммунологически совместимыми.

На пути к использованию иПСК в терапии стоит ряд трудностей. В частности, это низкая эффективность их получения и формирование различных геномных аномалий, вызванных использованием интегрирующих вирусов для этого процесса. Подобные интеграции значительно увеличивают риск трансформации этих клеток в раковые. Эти проблемы могут были преодолены при помощи различных подходов, вносящих минимальные или даже избегающих модификаций хозяйского генома в ходе репрограммирования. Например, иПСК могут быть получены при помощи лентивирусных векторов с последующим их выщеплением из генома полученных иПСК [91] или же с помощью неинтегри-рующих плазмидных, транспозонных векторов, или даже с помощью репрограммирующих РНК или белков [92].

В качестве векторов для доставки репрограмми-рующих факторов с целью получения иПСК могут выступать и ИХ. Так, недавно была показана возможность использования 21-ИХ для репрограм-мирования эмбриональных фибробластов мыши в иПСК [93]. Авторами была сконструирована 21-ИХ, содержащая последовательность четырёх основных

транскрипционных факторов, необходимых для эффективного репрограммирования: 0^4, Sox2, К^4 и с-Мус [89]. Анализ глобального профиля экспрессии показал, что полученные иПСК при использовании ИХ были относительно однородны и репрограм-мировались они с эффективностью, сопоставимой при использовании протоколов, основанных на использовании ретровирусных векторов. Затем авторы выделили популяцию свободных от ИХ клеток, отобрав те, которые случайным образом потеряли ИХ. Анализ экспрессии маркеров плюрипотентного состояния, тест на формирование тератом и химерных животных подтвердили, что полученные иПСК, свободные от ИХ, действительно обладают свойствами плюрипотентных клеток.

Недостатком подхода, использующего для репрограммирования 21-ИХ, является необходимость отбора клонов иПСК спонтанно потерявших ИХ, что является крайне редким событием. С другой стороны, преимуществом альфоид-1йЯ-ИХ по сравнению с 21-ИХ является то, что она может быть легко элиминирована из клеток после репрограммирования по-

средством инактивации центромеры. Эффективное удаление альфоид-1йЯ-ИХ из культивируемых клеток может быть достигнуто с помощью временной транс-фекции плазмидой, кодирующей модуль инактивации центромеры (tetR-tTS), как это было показано на раковых клетках [27, 57]. Применительно к гено-терапии, однако, этот шаг может быть потенциально опасен инсерционным мутагенезом, т.к. во время трансфекции всегда есть риск интеграции плазмиды в геном клетки. Чтобы решить эту проблему, представляется возможным клонировать tetR-tTS или аналогичный модуль инактивации центромеры непосредственно в ИХ, что поможет избежать шага трансфекции и обеспечить высокую эффективность элиминации экзогенных 0^М посредством удаления ИХ. В нашей лаборатории в настоящее время создаются альфоид1йЯ-ИХ (иИХ), включающие в себя как классические факторы репрограммирования 0^М, так и недавно открытые репрограммирующие микро-РНК, 1x^302/367 [94] и ^-^АВ репрессор, необходимый для дальнейшего удаления иИХ из иПСК (рис. 1).

Рис. 1. Манипуляции с альфоидТеЮ-ИХ. в плюрипотентных клетках:

1 - получение иПСК при помощи индуцибельной ИХ (иИХ), экспрессирующей репрограммирующие белковые факторы (0сЬ4, Sox2, К№4) или микро-РНК ^Й302/367);

2 - связывание ЬТ-КЙАВ с ТеЬО, запускаемое удалением доксициклина ÍDox) из среды культивирования, ингибирует образование кинетохоров и приводит к утере иИХ вместе с экзогенными факторами репрограммирования;

3 - введение генотерапевтической ИХ (гтИХ);

4 - генетическая сенсибилизация иПСК посредством сИХ, несущей суицидальную кассету 2A2Btk-TKiresPuro

ИХ для изучения функции генов и генотерапии

моногенных заболеваний

В некоторых исследованиях было продемонстрировано использование ИХ, полученных как при помощи «top-down» подхода, так и синтезированных de novo, для доставки и экспрессии генов в генетически дефектные клеточные линии. Первые сообщения, посвященные клонированию в ИХ полноразмерного гена и последующему анализу его экспрессии, принадлежат группам H. Cooke и Z. Larin [42, 95], которые показали функциональную экспрессию гена HPRT в составе ИХ в дефектных по этому гену клетках человека (НТЮ8Ш. В обоих работах использовалась кольцевая, HPRT-содержащая ИХ, которая была стабильна в течение нескольких месяцев и функциональна в плане коррекции метаболической недостаточности клеток НТЮ8^. Позже, T. 0kazaki с коллегами сконструировали ИХ, несущую ген GCH1 [73] и продемонстрировали, что экспрессия гена, как и ожидалось, запускается интерфероном гамма. Таким образом, было получено подтверждение, что регуляция экспрессии генов в составе ИХ сопоставима с таковой в составе нормальной хромосомы. Полный список генов, клонированных в ИХ-векторах, был опубликован в недавнем обзоре [21]. В данном списке можно выделить следующие гены, представленные полными геномными копиями со всеми необходимыми регуляторными элементами: бета-глобин человека [46], CFTR [96, 97], Factor IX [58], STAT3 [98], TP53 [52], DYS [77], VHL, и NBS1 [57]. Следует отметить, что в большинстве случаев, число копий генов, вводимых в ИХ, жестко не контролировалось, в частности, из-за наличия множественных сайтов интеграции, или же потому, что введение гена в ИХ осуществлялось на этапе de novo формирования, т. е. BAC-вектор, содержащий интересующий ген, ко-трансфицировали вместе с вектором, содержащим альфоидные ДНК-повторы (напомним, что трансформирующие молекулы ДНК амплифицируются в процессе de novo синтеза ИХ раз).

На сегодняшний день, изучение функции генов, в том числе и недавно открытых, весьма ограничено и основывается в основном на экспериментах с использованием вирусной трансфекции или ин-тегративной трансфекции BAC или YAC векторами. Следует отметить, что довольно часто, при использовании подобных систем, ген экспрессируется не на физиологическом уровне, из-за того, что невозможно контролировать количество его копий, случайным образом интегрировавших в геном клетки-реципиента. Оба типа вышеупомянутых ИХ-вектора делают возможным преодоление этой проблемы [2^, 57]. Кроме того, альфоид-№Ш-ИХ, благодаря уникальной центромере в своем составе, позволяет контролировать фенотипические изменения, связанные с экспрессией трансгена, входящего в её состав [57]. Создание ИХ, само по себе, в сочетании с полной характеристикой этих векторов, является первым шагом на пути к использованию их в терапии моногенных заболеваний. Нами создаются или уже созданы ряд генно-терапевтических альфоид-1йЯ-ИХ (гтИХ), несущих либо целые ген-содержащие хромосомные локусы (VHL, NBS1, BRCA2), либо белок-кодирующие последовательности генов (DYSF, FVIII, IL2Rgamma) под контролем гетерологичных ткане-неспецифических промоторов (EF1a, CMV, CAG и др.) для отработки на мышиных моделях методов

генотерапии моногенных заболеваний человека, таких как анемия Фанкони, дисферлинопатия, гемофилия типа А, Х-сцепленный синдром острой иммунной недостаточности ^СЮ-Х1) и др. (см. рис. 1).

Стволовые клетки и ИХ: интегрированный подход

Несмотря на очевидные достоинства, ИХ обладают одним существенным недостатком, обусловленным размерами и природой этих векторов. Во-первых, в отличие, скажем, от вирусных векторов, ИХ невозможно амплифицировать в сравнимых с вирусами или просто плазмидами количествах. Во-вторых, ИХ невозможно доставлять непосредственно в органы или ткани. Единственный существующий на сегодняшний способ доставки ИХ реализован только на культивируемых клетках весьма неэффективным и требующим совершенствования методом ММСТ. Таким образом, единственный реализуемый метод доставки ИХ в органы или ткани должен неизбежно опираться на замещение этих органов и тканей клетками-носителями ИХ. В качестве таких носителей могут выступать стволовые клетки взрослых, выбор которых обусловлен конкретными задачами. Так, например, для нужд генотерапии кроветворных клеток подходят гемопоэтические стволовые клетки, в которые будут вводиться ИХ, несущие интересующий терапевтический ген. Необходимыми условиями, позволяющими реализовывать вышеупомянутую схему доставки ИХ в органы и ткани являются: 1) обладание клетками-носителями свойством клоногенности, т.е. способностью давать начало клеточным клонам из единичных клеток (сама процедура ММСТ подразумевает клональный отбор); 2) высокий пролиферативный потенциал, позволяющий получать достаточную для трансплантаций клеточную массу клонов после введения ИХ; 3) генетическая и эпигенетическая стабильность этих клеток в ходе их наработки. За редкими исключениями, взрослые стволовые клетки не удовлетворяют указанным критериям. Удовлетворяют этим требованиям иммортализованные клетки, однако, пригодность таковых для тканезаместительной терапии вызывает большие сомнения. Условная же иммортализация первичных клеток может быть реализована, как было показано на примере первичных гепатоцитов мышей [99], однако, не ясно, насколько такой подход безопасен и эффективен в случае с клетками человека. Всем трем указанным требованиям в полной мере удовлетворяют лишь плюрипотентные стволовые клетки, такие как ЭСК и иПСК, способные практически к неограниченному самообновлению в культуре и сохраняющие при этом свои генетические, эпигенетические и дифференцировочные свойства. Таким образом, уникальные свойства ЭСК и иПСК делают их наиболее универсальными клетками-посредниками для доставки ИХ в органы и ткани посредством тканезамещения, причем последние имеют то преимущество, что могут быть получены из соматических клеток самого пациента, являясь, тем самым, иммунологически совместимыми.

Безотносительно к ИХ, пока еще нерешенной проблемой, стоящей на пути к использованию ЭСК и иПСК клеток в клинической практике, стоит туморо-генность — неотъемлемое свойство этих клеток. Так, на мышах было показано, что введение клеток реципиентам способно приводить к возникновению тератом — быстрорастущих, предположительно добро-

качественных опухолей, содержащих разнообразные клеточные типы всех трех зародышевых листков. С другой стороны, существующие способы направленной дифференцировки ЭСК и иПСК in vitro позволяют получить весьма гетерогенные популяции, в которых практически всегда присутствуют резиду-альные недифференцированные клетки, способные при трансплантациях давать начало тератомам.

Разработка одного или более способов, обеспечивающих безопасное применение иПСК и ЭСК, находится в фокусе исследований многих лабораторий в России и за рубежом. Предложенные на сегодняшний день методы являются малоэффективными и не обеспечивают надлежащего уровня безопасности, что тем самым лишает заложенный в плюрипотент-ных клетках огромный практический потенциал и заметно отдаляет перспективу использования этих уникальных клеток в клинической практике. Недавно нами был предложен новый подход для решения проблемы туморогенности иПСК и ЭСК, который

основан на генетической сенсибилизации (патент РФ №2009143025; [91] и наши неопубликованные данные). Использование такого подхода минимизирует риск развития тератом, происходящих из донорских плюрипотентных стволовых клеток в месте введения или в каком-либо дистальном сайте у реципиента. Достигается такая сенсибилизация ЭСК и иПСК через стабильное внедрение в геном клетки-хозяина разработанной нами сенсибилизирующей кассеты (2A2Btk-TKiresPuro), представляющей собой ген-самоубийцу (тимидин киназу или ТК) под контролем регуляторного участка гена 0^4 (2А2В), обеспечивающего экспрессию этой кассеты только в недифференцированных ЭСК и иПСК, но не в происходящих от них дифференцированных клетках. Такая селективность экспрессии кассеты позволяет элиминировать при помощи ганцикловира либо в культуре, либо даже непосредственно в организме реципиента несущие ее тератогенные резидуальные ЭСК и иПСК клетки, не воздействуя при этом на диффе-

Рис. 2. Схема, иллюстрирующая предлагаемый подход к тканезамащению, основанный на совмещении технологий индуцированных плюрипотентных клеток (иПСК), искусственных хромосом (ИХ) и генетической сенсибилизации в так называемом «терапевтический цикле»:

1 - получение иПСК;

2 - удаление иИХ из полученных иПСК;

3 - загрузка гтИХ в иПСК;

4 - загрузка сИХ в иПСКк

ренцированные клетки. Присутствие в кассете гена устойчивости к пуромицину (Puro), находящегося в составе бицистронной ДНК под контролем того же регуляторного участка 2A2B, позволяет вести также и позитивный отбор иПСК и ЭСК клеток. Известным недостатком обоих подходов является нестабильность экспрессии 2A2Btk-TKiresPuro кассеты при отсутствии селективного давления после введения несущих ее клеток реципиенту, что приводит к ослаблению контроля за тератомами. Более того, существует высокий риск нарушение генов опухолевых супрессоров при случайном встраивании трансгена в геном, что, как хорошо известно, часто приводит к злокачествнному перерождению клеток. Таким образом, с одной стороны, для эффективной сенсибилизации требуется стабильная интеграция в геном, а с другой — такая интеграция крайне нежелательна из-за высокого риска инсерционного мутагенеза. Неин-тегрирующие векторные системы, такие как адено-ассоциированные вирусы, не позволяют решать эту проблему, так как теряются после нескольких клеточных делений. Идеальным решением обоих проблем является генетическая сенсибилизация на основе ИХ векторов, что составляет часть прикладных исследований нашей лаборатории. Нами уже созданы сенсибилизирующие ИХ на основе альфоидм0-ИХ (см. рис. 1). В настоящее время осуществляется перенос этих ИХ в ЭСК и иПСК для дальнейших экспериментов, связанных с тканезамещением на основе этих клеток.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Lufino M.M., Edser P.A., Wade-Martins R. Advances in high-capacity extrachromosomal vector technology: episomal maintenance, vector delivery, and transgene expression. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 2008; 16(9): 1525— 38.

2. Epstein A.L. Progress and prospects: biological properties and technological advances of herpes simplex virus type 1-based amplicon vectors. Gene therapy 2009; 16(6): 709-15.

3. Mingozzi F., High K.A. Therapeutic in vivo gene transfer for genetic disease using AAV: progress and challenges. Nature reviews. Genetics 2011; 12(5): 341-55.

4. Maier P., von Kalle C., Laufs S. Retroviral vectors for gene therapy. Future microbiology 2010; 5(10): p. 1507-23.

5. Matrai J., Chuah M.K., VandenDriessche T. Recent advances in lentiviral vector development and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 2010; 18(3): 477-90.

6. Buchholz C.J., Muhlebach M.D., Cichutek K. Lentiviral vectors with measles virus glycoproteins - dream team for gene transfer? Trends in biotechnology 2009; 27(5): 259-65.

7. Banasik M.B., McCray P.B. Integrase-defective lentiviral vectors: progress and applications. Gene therapy 2010; 17(2): 150-7.

8. Wanisch K., Yanez-Munoz R.J. Integration-deficient lentiviral vectors: a slow coming of age. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 2009; 17(8): 1316-32.

9. Cartier N., Hacein-Bey-Abina S., Bartholomae C.C. et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science 2009; 326(5954): 818-23.

10. Hibbitt O.C., Wade-Martins R. Delivery of large genomic DNA inserts >100 kb using HSV-1 amplicons. Current gene therapy 2006; 6(3): 325-36.

11. Li C.M., Park J.H., Simonaro C.M. et al. Insertional mutagenesis of the mouse acid ceramidase gene leads to early embryonic lethality in homozygotes and progressive lipid storage disease in heterozygotes. Genomics 2002; 79(2): 218-24.

12. Li Z., Dullmann J., Schiedlmeier B. et al. Murine leukemia induced by retroviral gene marking. Science 2002; 296(5567): 497.

13. Raper S.E., Chirmule N., Lee F.S. et al. Fatal systemic inflammatory response syndrome in a ornithine transcarbamylase deficient patient following adenoviral gene transfer. Molecular genetics and metabolism 2003; 80(1-2): 148-58.

14. Odom G.L., Gregorevic P., Chamberlain J.S. Viral-mediated gene therapy for the muscular dystrophies: successes, limitations and recent advances. Biochimica et biophysica acta 2007; 1772(2): 243-62.

Заключение

Как было описано в настоящем обзоре, ИХ нового поколения, в первую очередь ИХ, создаваемые на основе bottom-up подхода, могут найти важные приложения в различных областях биомедицины и сыграть важную роль как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. В части, касающейся приложения ИХ в области плюрипотентных стволовых клеток и тканезамещения на основе этих клеток, перспективы внедрения ИХ кажутся особенно заманчивыми. Помимо достаточно очевидных перспектив использования альфоидм0-ИХ для получения иПСК, эти векторы могут найти важное приложение для генотерапии моногенных заболеваний человека и обеспечения безопасности использования иПСК и ЭСК посредством генетической сенсибилизации. Объединение технологий ИХ, тканезамещения на основе иПСК (ЭСК) в так называемом «терапевтическом цикле» (рис. 2) видится нам одной из самых перспективных целей современной биомедицины.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Госконтракта 16.512.11.2085, Программы президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», фонда некоммерческих программ «Династия»

15. Cavazzana-Calvo M., Payen E., Negre 0. et al. Transfusion independence and HMGA2 activation after gene therapy of human beta-thalassaemia. Nature 2010; 467(7313): 318-22.

16. Saffery R., Choo K.H. Strategies for engineering human chromosomes with therapeutic potential. J. Gene Med. 2002; 4(1): 5-13.

17. Basu J., Willard H.F. Human artificial chromosomes: potential applications and clinical considerations. Pediatric clinics of North America 2006; 53(5): 843-53.

18. Monaco Z.L., Moralli D. Progress in artificial chromosome technology. Biochemical Society transactions 2006; 34(Pt 2): 324-7.

19. Ren X., Tahimic C.G., Katoh M. et al. Human artificial chromosome vectors meet stem cells: new prospects for gene delivery. Stem cell reviews 2006; 2(1): 43-50.

20. Oshimura M., Katoh M. Transfer of human artificial chromosome vectors into stem cells. Reproductive biomedicine online 2008. 16(1): 57-69.

21. Kazuki Y., Oshimura M. Human artificial chromosomes for gene delivery and the development of animal models. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 2011; 19(9): 1591-601.

22. Ikeno M., Suzuki N. Construction and use of a bottom-up HAC vector for transgene expression. Methods in molecular biology 2011; 738: 101-10.

23. Rudd M.K., Mays R.W., Schwartz S. et al. Human artificial chromosomes with alpha satellite-based de novo centromeres show increased frequency of nondisjunction and anaphase lag. Molecular and cellular biology 2003; 23(21): 7689-97.

24. Grimes B.R., Babcock J., Rudd M.K. et al., Assembly and characterization of heterochromatin and euchromatin on human artificial chromosomes. Genome biology 2004; 5(11): R89.

25. Higgins A.W., Gustashaw K.M., Willard H.F. Engineered human dicentric chromosomes show centromere plasticity. Chromosome research 2005; 13(8): p. 745-62.

26. Kazuki Y., Hoshiya H., Takiguchi M. et al. Refined human artificial chromosome vectors for gene therapy and animal transgenesis. Gene therapy 2011. 18(4): 384-93.

27. Nakano M., Cardinale S., Noskov V.N. et al. Inactivation of a human kinetochore by specific targeting of chromatin modifiers. Developmental cell 2008; 14(4): 507-22.

28. Kouprina, N., Samoshkin A, Erliandri I. et al. Organization of Synthetic Alphoid DNA Array in Human Artificial Chromosome (HAC) with a Conditional Centromere. ASC Synthetin Biology, 2012. 1: p. 590-601.

29. Farr C.J., Stevanovic M., Thomson E.J. et al. Telomere-associated chromosome fragmentation: applications in genome manipulation and analysis. Nature genetics 1992; 2(4): 275-82.

30. Brown K.E., Barnett M.A., Burgtorf C. et al. Dissecting the centromere of the human Y chromosome with cloned telomeric DNA. Human molecular genetics 1994; 3(8): 1227-37.

31. Heller R., Brown K.E., Burgtorf C. et al. Mini-chromosomes derived from the human Y chromosome by telomere directed chromosome breakage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1996; 93(14): 7125-30.

32. Mills W., Critcher R., Lee C. et al. Generation of an approximately 2.4 Mb human X centromere-based minichromosome by targeted telomere-associated chromosome fragmentation in DT40. Human molecular genetics 1999; 8(5): 751-61.

33. Yang J.W., Pendon C., Yang J. et al. Human mini-chromosomes with minimal centromeres. Human molecular genetics 2000; 9(12): 1891-902.

34. Kuroiwa Y., Tomizuka K., Shinohara T. et al. Manipulation of human minichromosomes to carry greater than megabase-sized chromosome inserts. Nature biotechnology 2000; 18(10): 1086-90.

35. Shen M.H., Mee P.J., Nichols J. et al. A structurally defined mini-chromosome vector for the mouse germ line. Current biology 2000; 10(1): 31-4.

36. Katoh M., Ayabe F., Norikane S. et al. Construction of a novel human artificial chromosome vector for gene delivery. Biochemical and biophysical research communications 2004; 321(2): 280-90.

37. Kakeda M., Nagata K., Osawa K. et al. A new chromosome 14-based human artificial chromosome (HAC) vector system for efficient transgene expression in human primary cells. Biochemical and biophysical research communications 2011; 415(3): 439-44.

38. Harrington J.J., Van Bokkelen G., Mays R.W. et al. Formation of de novo centromeres and construction of first-generation human artificial microchromosomes. Nature genetics 1997; 15(4): 345-55.

39. Ikeno M., Grimes B., Okazaki T. et al. Construction of YAC-based mammalian artificial chromosomes. Nature biotechnology 1998; 16(5): 431-9.

40. Guiducci C., Ascenzioni F., Auriche C. et al. Use of a human minichromosome as a cloning and expression vector for mammalian cells. Human molecular genetics 1999; 8(8): 1417-24.

41. Ebersole T.A., Ross A., Clark E. et al. Mammalian artificial chromosome formation from circular alphoid input DNA does not require telomere repeats. Human molecular genetics 2000; 9(11): 1623-31.

42. Grimes B.R., Schindelhauer D., McGill N.I. et al. Stable gene expression from a mammalian artificial chromosome. EMBO reports 2001; 2(10): 910-4.

43. Mejia J.E., Alazami A., Willmott A. et al. Efficiency of de novo centromere formation in human artificial chromosomes. Genomics 2002; 79(3): 297-304.

44. Kouprina N., Ebersole T., Koriabine M. et al. Cloning of human centromeres by transformation-associated recombination in yeast and generation of functional human artificial chromosomes. Nucleic acids research 2003; 31(3): 922-34.

45. Basu J., Stromberg G., Compitello G. et al. Rapid creation of BAC-based human artificial chromosome vectors by transposition with synthetic alpha-satellite arrays. Nucleic acids research 2005; 33(2): 587-96.

46. Basu J., Compitello G., Stromberg G. et al. Efficient assembly of de novo human artificial chromosomes from large genomic loci. BMC biotechnology 2005; 5: 21.

47. Kotzamanis G., Cheung W., Abdulrazzak H. et al. Construction of human artificial chromosome vectors by recombineering. Gene 2005. 351: 29-38.

48. Moralli D., Simpson K.M., Wade-Martins R. et al. A novel human artificial chromosome gene expression system using herpes simplex virus type 1 vectors. EMBO reports 2006; 7(9): 911-8.

49. Ohzeki J., Bergmann J.H., Kouprina N. et al. Breaking the HAC Barrier: histone H3K9 acetyl/methyl balance regulates CENP-A assembly. The EMBO journal 2012; 31(10): 2391-402.

50. Dafhnis-Calas F., Xu Z., Haines S. et al. Iterative in vivo assembly of large and complex transgenes by combining the activities of phiC31 integrase and Cre recombinase. Nucleic acids research 2005; 33(22): e189.

51. Ren X., Katoh M., Hoshiya H. et al. A novel human artificial chromosome vector provides effective cell lineage-specific transgene expression in human mesenchymal stem cells. Stem cells 2005; 23(10): 1608-16.

52. Kazuki Y., Hoshiya H., Kai Y. et al. Correction of a genetic defect in multipotent germline stem cells using a human artificial chromosome. Gene therapy 2008; 15(8): 617-24.

53. lida Y., Kim J.H., Kazuki Y. et al. Human artificial chromosome with a conditional centromere for gene delivery and gene expression. DNA research 2010; 17(5): 293-301.

54. Kakeda M., Hiratsuka M., Nagata K. et al. Human artificial chromosome (HAC) vector provides long-term therapeutic transgene expression in normal human primary fibroblasts. Gene therapy 2005; 12(10): 852-6.

55. Kazuki Y., Hiratsuka M., Takiguchi M. et al. Complete genetic correction of ips cells from Duchenne muscular dystrophy. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 2010; 18(2): 386-93.

56. Ebersole T., Okamoto Y., Noskov V.N. et al. Rapid generation of long synthetic tandem repeats and its application for analysis in human artificial chromosome formation. Nucleic acids research 2005; 33(15): e130.

57. Kim J.H., Kononenko A., Erliandri I., et al. Human artificial chromosome (HAC) vector with a conditional centromere for correction of genetic deficiencies in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2011; 108(50): 20048-53.

58. Breman A.M., Steiner C.M., Slee R.B. et al. Input DNA ratio determines copy number of the 33 kb Factor IX gene on de novo human artificial chromosomes. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 2008; 16(2): 315-23.

59. Alazami A.M., Mejia J.E., Monaco Z.L. Human artificial chromosomes containing chromosome 17 alphoid DNA maintain an active centromere in murine cells but are not stable. Genomics 2004; 83(5): 844-51.

60. Moralli D., Chan D.Y., Jefferson A. et al. HAC stability in murine cells is influenced by nuclear localization and chromatin organization. BMC cell biology 2009; 10: 18.

61. Fournier R.E., Ruddle F.H. Microcell-mediated transfer of murine chromosomes into mouse, Chinese hamster, and human somatic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1977; 74(1): 319-23.

62. Koi M., Shimizu M., Morita H. et al. Construction of mouse A9 clones containing a single human chromosome tagged with neomycin-resistance gene via microcell fusion. Japanese journal of cancer research: Gann 1989; 80(5): 413-8.

63. Yamaguchi S.R., Katoh X., Miyata M. et al. A new method of microcell-mediated transfer of human artificial chromosome using a hemagglutinating virus of Japan envelope. Chromosome science 2006; 9(2): 9.

64. Katoh M., Kazuki Y., Kazuki K. et al. Exploitation of the interaction of measles virus fusogenic envelope proteins with the surface receptor CD46 on human cells for microcell-mediated chromosome transfer. BMC biotechnology 2010; 10: 37.

65. de Jong G., Telenius A., Vanderbyl S. et al. Efficient in-vitro transfer of a 60-Mb mammalian artificial chromosome into murine and hamster cells using cationic lipids and dendrimers. Chromosome research 2001; 9(6): 475-85.

66. Suzuki N., Itou T., Hasegawa Y. et al. Cell to cell transfer of the chromatin-packaged human beta-globin gene cluster. Nucleic acids research 2010; 38(5): e33.

67. Larionov V., Kouprina N., Graves J. et al. Specific cloning of human DNA as yeast artificial chromosomes by transformation-associated recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1996; 93(1): 491-6.

68. Kouprina N., Larionov V. TAR cloning: insights into gene function, long-range haplotypes and genome structure and evolution. Nature reviews Genetics 2006; 7(10): 805-12.

69. Kouprina N., Larionov V. Selective isolation of genomic loci from complex genomes by transformation-associated recombination cloning in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature protocols 2008; 3(3): 371-7.

70. Ayabe F., Katoh M., Inoue T. et al. A novel expression system for genomic DNA loci using a human artificial chromosome vector with transformation-associated recombination cloning. Journal of human genetics 2005; 50(11): 592-9.

71. Kuroiwa Y., Kasinathan P., Choi Y.J. et al. Cloned transchromosomic calves producing human immunoglobulin. Nature biotechnology 2002; 20(9): 889-94.

72. Kuroiwa Y., Kasinathan P., Sathiyaseelan T. et al. Antigen-specific human polyclonal antibodies from hyperimmunized cattle. Nature biotechnology 2009; 27(2): 173-81.

73. Ikeno M., Inagaki H., Nagata K. et al. Generation of human artificial chromosomes expressing naturally controlled guanosine triphosphate cyclohydrolase I gene. Genes to cells: devoted to molecular & cellular mechanisms 2002; 7(10): 1021-32.

74. Suzuki N., Nishii K., Okazaki T. et al. Human artificial chromosomes constructed using the bottom-up strategy are stably maintained in mitosis and efficiently transmissible to progeny mice. The Journal of biological chemistry 2006; 281(36): 26615-23.

75. Ito M., Ikeno M., Nagata H. et al. Treatment of nonalbumin rats by transplantation of immortalized hepatocytes using artificial human chromosome. Transplantation proceedings 2009; 41(1): 422-4.

76. Voet T., Schoenmakers E., Carpentier S. et al. Controlled transgene dosage and PAC-mediated transgenesis in mice using a chromosomal vector. Genomics 2003; 82(6): 596-605.

77. Hoshiya H., Kazuki Y., Abe S. et al. A highly stable and nonintegrated human artificial chromosome (HAC) containing the 2.4 Mb entire human dystrophin gene. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy 2009; 17(2): 309-17.

78. Yamaguchi S., Kazuki Y., Nakayama Y. et al. A method for producing transgenic cells using a multi-integrase system on a human artificial chromosome vector. PloS one 2011; 6(2): e17267.

79. Takahashi Y., Tsuji S., Kazuki Y. et al. Development of evaluation system for bioactive substances using human artificial chromosome-

mediated osteocalcin gene expression. Journal of biochemistry 2010; 148(1): 29-34.

80. Janssen A., Kops G.J., Medema R.H. Elevating the frequency of chromosome mis-segregation as a strategy to kill tumor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2009; 106(45): 19108-13.

81. Colombo R., Moll J. Destabilizing aneuploidy by targeting cell cycle and mitotic checkpoint proteins in cancer cells. Current drug targets 2010; 11(10): 1325-35.

82. Pao W., Girard N. New driver mutations in non-small-cell lung cancer. The lancet oncology 2011; 12(2): 175-80.

83. Stirling P.C., Bloom M.S., Solanki-Patil T. et al. The complete spectrum of yeast chromosome instability genes identifies candidate CIN cancer genes and functional roles for ASTRA complex components. PLoS genetics 2011; 7(4): e1002057.

84. Cardinale S., Bergmann J.H., Kelly D. et al. Hierarchical inactivation of a synthetic human kinetochore by a chromatin modifier. Molecular biology of the cell 2009; 20(19): 4194-204.

85. Bergmann J.H., Rodriguez M.G., Martins N.M. et al. Epigenetic engineering shows H3K4me2 is required for HJURP targeting and CENP-A assembly on a synthetic human kinetochore. EMBO 2011; 30(2): 328-40.

86. Bergmann J.H., Jakubsche J.N., Martins N.M. et al. Epigenetic engineering: histone H3K9 acetylation is compatible with kinetochore structure and function. Cell Science 2012; 125(Pt 2): 411-21.

87. Bergmann J.H., Martins N.M., Larionov V. et al. HACking the centromere chromatin code: insights from human artificial chromosomes. Chromosome research 2012; 20(5): 505-19.

88. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131(5): 861-72.

89. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126(4): 663-76.

90. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318(5858): 1917-20.

91. Liskovykh M., Chuykin I., Ranjan A. et al. Derivation, characterization, and stable transfection of induced pluripotent stem cells from Fischer344 rats. PLoS One 2011; 6(11): e27345.

92. Okita K., Yamanaka S. Induced pluripotent stem cells: opportunities and challenges. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B. Biological sciences 2011; 366(1575): 2198-207.

93. Hiratsuka M., Uno N., Ueda K. et al. Integration-free iPS cells engineered using human artificial chromosome vectors. PLoS One 2011; 6(10): e25961.

94. Anokye-Danso F., Trivedi C.M., Juhr D. et al. Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell 2011; 8(4): 376-88.

95. Mejia J.E., Willmott A., Levy E. et al. Functional complementation of a genetic deficiency with human artificial chromosomes. American journal of human genetics 2001; 69(2): 315-26.

96. Auriche C., Carpani D., Conese M. et al. Functional human CFTR produced by a stable minichromosome. EMBO 2002; 3(9): 862-8.

97. Rocchi L., Braz C., Cattani S. et al. Escherichia coli-cloned CFTR loci relevant for human artificial chromosome therapy. Human gene therapy 2010; 21(9): 1077-92.

98. Yamada H., Li Y.C., Nishikawa M. et al. Introduction of a CD40L genomic fragment via a human artificial chromosome vector permits cell-type-specific gene expression and induces immunoglobulin secretion. Journal of human genetics 2008; 53(5): 447-53.

99. Nguyen T.H., Mai G., Villiger P. et al. Treatment of acetaminophen-induced acute liver failure in the mouse with conditionally immortalized human hepatocytes. Journal of hepatology 2005; 43(6): 1031-7.

Поступила 02.12.2012