СОСТАВ FGF-18 В КСИЛОГЛЮКАНОВЫХ ГЕЛЯХ
FGF-18 COMPOSITION IN XYLOGLUCAN GELS

Область изобретения
Изобретение относится к области фармацевтических составов. Более конкретно, изобретение относится к белковому составу фактора роста фибробластов 18 (FGF-18) в ксилоглюкановых гелях и к способам получения таких составов.
Предшествующий изобретению уровень техники
Фактор роста фибробластов 18 (FGF-18) является представителем семейства белков факторов роста фибробластов (FGF), родственным с FGF-8 и FGF-17. Представители семейства FGF характеризуются гепарин-связывающими доменами. Такой предполагаемый гепарин-связывающий домен был идентифицирован для FGF-18. Предполагают, что передача сигнала, опосредованная рецептором, инициируется после связывания лиганда FGF в комплексе с поверхностно-клеточными гепаринсульфатпротеогликанами.
et al.
Показано, что FGF-18 является фактором пролиферации для хондроцитов и остеобластов (Ellsworth , 2002; Shimoaka et al., 2002). FGF-18 был предложен для лечения нарушений хрящевой ткани, таких как остеоартрит (ОА) и повреждения хрящевой ткани (ПХТ), или отдельно (WO2008/023063) или в комбинации с гиалуроновой кислотой (WO2004/032849).
Из уровня техники известны фармацевтические композиции, содержащие полипептид FGF. WO2012172072 описывает лиофилизированный состав, содержащий FGF-18, где указанная композиция содержит FGF-18, буфер, сурфактант полоксамер и сахар в качестве стабилизатора. Указанный лиофилизированный состав с FGF-18 показывает многообещающие результаты в лечении ОА или ПХТ. Распространенный режим дозирования с использованием указанного лиофилизированного состава представляет собой цикл лечения по одной инъекции раз в неделю в течение трех недель. Цикл лечения можно повторять.
В случае ПХТ, основной недостаток настоящего состава заключается в том, что, после однократного введения внутрь сустава (в.с.), присутствие FGF-18 в синовиальной жидкости может вызывать неконтролируемый рост хрящевой ткани также в здоровых участках. Это может вызывать, конечно, нежелательные эффекты, такие как сниженная подвижность сустава. Избирательная доставка FGF-18 на уровень участка-мишени может способствовать росту хрящевой ткани только в поврежденной области. В частности, доставка FGF-18 на уровень поврежденной области была бы весьма полезной для лечения ПХТ в сочетании с микропереломами. Микроперелом представляет собой хирургическую технику для восстановления суставного хряща, которая работает путем создания небольших переломов в подлежащей кости. Это приводит к высвобождению плюрипотентных мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга (Ringe J. et al., 2012). Заполнение отверстия в хряще инъекционным гелем, содержащим FGF-18, будет направлять клетки внутрь геля, который, в свою очередь, будет действовать как механическая подложка для роста клеток и одновременно как резервуар для лекарственного средства. По этой причине, было бы предпочтительным, если бы FGF-18 не высвобождался из геля, а оставался заключенным в матрицу.
Типичным подходом в технологии культивирования тканей является удерживание факторов роста в 3D-матрице, т.е. в каркасе, который может быть или имплантирован, или инъецирован, в зависимости от механических свойств, для того чтобы принять форму акцепторного участка. Необходимыми характеристиками каркаса являются биосовместимость и рассасываемость. Дополнительно, каркасы должны быть способны обеспечивать клеткам идеальное окружение для роста, пролиферации, и восстановления формы поврежденной ткани. В идеале, матрица должна иметь механические свойства, схожие со свойствами, исходной ткани и должна обладать микропористостью, подходящей для клеток-хозяев (взаимосвязанные поры достаточного размера) (Tessmar and Göpferich, 2007).
et al.
Гидрогели представляют собой трехмерные сети из цепей гидрофильного полимера, способные поглощать и удерживать большие количества воды. Их основной отличительной чертой является то, что они способны набухать или усыхать, но не растворяться в водной среде. Таким образом, в их матрице возможно задерживать активную молекулу (Активный Фармацевтический Ингредиент, т.е. АФИ), которая затем медленно высвобождается или удерживается, в зависимости от наличия специфических взаимодействий между матрицей и АФИ (Lo Presti , 2011). Преимуществом использования инъекционных гидрогелей для лечения заболеваний хрящевой ткани, является возможность инъецировать каркас путем артроскопии в дефектный участок хряща, без необходимости какого-либо инвазивного хирургического вмешательства при использовании твердых каркасов.
et al
et al
Среди разнообразных гидрогелей, которые уже известны, некоторые составы основаны на полимерах, способных проходить процесс гелеобразования в ответ на конкретный физический или химический импульс. Эти полимеры присутствуют в виде вязких инъекционных жидкостей, которые после введения превращаются в макроскопические гели в ответ на стимулы окружающей среды в месте инъекции, такие как изменения температуры, pH или ионной силы. Композицию состава можно регулировать для того чтобы получить гидрогели с различными характеристиками, такими как вязкоупругие свойства, микропористость и т.п. (WO2008063418; Lo Presti ., 2011; C. Dispenza , 2011).
Гидрогели из природных полимеров, в частности полисахаридов, широко используются из-за их уникальных преимуществ, таких как отсутствие токсичности, биосовместимость, биоразрушение и распространенность. Природные полимеры, в том числе коллаген, желатин, гликозаминогликаны и их производные, часто обладают высокой афинностью к белкам. Большое число биополимеров обладают свойством самоструктурироваться при изменении температуры или содержания ионов.
in situ
Ксилоглюканы представляют собой основной класс структурных полисахаридов, обнаруженных в стенках первичных клеток высших растений. Когла ксилоглюкан частично дегалактозилирован (Deg-XG), он становится температуро-чувствительным (термочувствительным): он может образовывать физические, обратимые гели при изменениях температуры в водных растворах. Дегалактозилирование ксилоглюкана происходит при помощи β-галактозидазы (Rilton et al., 2011). Дегалактозилированные ксилоглюканы демонстрируют некоторые приемимущества над остальными системами гелеобразования , доступными в настоящее время: гелеобразование не требует присутствия двухвалентных катионов, и оно не зависит от природы заряда лекарственного средства; гель образуется в течение нескольких минут, в зависимости от концентрации полимера в растворе и температуры (Shirakawa et al., 1998).
При приготовлении фармацевтической композиции, содержащей биологически активный белок, указанная композиция может быть составлена таким образом, что активность белка поддерживается в течение соответствующего периода времени. Потеря активности/стабильности белка может быть результатом химической или физической нестабильности белка, в частности, из-за денатурации, агрегации или окисления. Полученные продукты, таким образом, могут быть фармацевтически неприемлемыми. Хотя известно, что использование эксципиента (-ов) и/или гидрогеля (-ей) повышает стабильность указанного белка, стабилизирующие воздействия этих эксципиентов сильно зависят от полимера в гелях, природы эксципиентов и самого биологически активного белка.
Остается потребность в дополнительных составах, содержащих FGF-18 в качестве активного ингредиента, при этом указанные составы одновременно сохраняют биоактивность активного ингредиента и подходят для использования в виде инъекции, предпочтительно внутрисуставной инъекции, и позволяют уменьшить число инъекций, необходимых для лечения. Такая отличительная черта позволяла бы снизить риск инфекций и повышала комфорт пациента, поскольку не требуется ни хирургического вмешательства, ни инвазивной имплантации. Указанные составы могут быть полезны для введения при лечении заболеваний хрящевой ткани у пациента, таких как остеоартрит или повреждения хрящевой ткани.
Сущность изобретения
Объектом по настоящему изобретению является создание нового состава, содержащего белок FGF-18. Более конкретно, указанный состав представляет собой гидрогель, содержащий FGF-18, где указанный гидрогель предпочтительно является термочувствительным гидрогелем, и, более предпочтительно, ксилоглюкановым гелем. Изобретение также относится к способам получения гидрогелей по настоящему изобретению из жидкого состава. Описанный в настоящем документе гидрогель, содержащий FGF-18, может быть полезным для введения при лечении заболеваний хрящевой ткани, таких как остеоартрит или повреждение хрящевой ткани. Особый интерес представляет ксилоглюкановый гидрогель, дополнительно содержащий белок FGF-18. Следует отметить, что перед инъекцией, или перед воздействием температуры гелеобразования, гидрогели по изобретению находятся в жидкой форме.
В первом аспекте, изобретение относится к жидкому составу, содержащему или включающему ксилоглюкан, буфер и FGF-18 в качестве активного ингредиента. Этот состав предлагается в виде системы гелеобразования, которая находится в жидкой форме при хранении при 5°C и становится гелем (или гидрогелем) при 37°C, т.е. после введения в организм человека. Предпочтительно, ксилоглюкан представляет собой дегалактозилированный ксилоглюкан, даже более предпочтительно Deg-ксилоглюкан со степенью дегалактозилирования на уровне или приблизительно 44 или 45%, и буфер представляет собой фосфатный буфер, такой как PBS. В предпочтительном варианте осуществления концентрация ксилоглюкан находится на уровне или приблизительно от 1 до 5% масс., предпочтительно на уровне или приблизительно от 3 до 4% масс. или даже более предпочтительно на уровне или приблизительно 4%, буфер находится в концентрации на уровне или приблизительно от 95 до 99% масс., предпочтительно на уровне или приблизительно 96% масс. Предпочтительно, FGF-18 выбран из группы, состоящей из: 1) полипептида, содержащего или состоящего из зрелой формы FGF-18 человека, которая соответствует последовательности, содержащей или включающей последовательность от остатка 28(Glu) до остатка 207(Ala) из SEQ ID NO: 1, 2) полипептида, содержащего или состоящего из укороченной формы FGF-18 человека, содержащую или состоящую из последовательности от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) SEQ ID NO:1, и 3) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO:2. Более предпочтительно, FGF-18 представляет собой сприфермин, определение которого дано ниже.
Во втором аспекте, изобретение относится к способу для получения гомогенного гидрогеля FGF-18, включающему стадии :
1) получения раствора 1, содержащего или состоящего из FGF-18, вместе с ксилоглюканом и буфером, и
2) воздействие на гель температуры 37°C или приблизительно 37°C для образования геля,
in situ
где ксилоглюкан предпочтительно представляет собой дегалактозилированный ксилоглюкан, даже более предпочтительно Deg-ксилоглюкан со степенью дегалактозилирования на уровне или приблизительно 44 или 45%, и буфер представляет собой фосфатный буфер, такой как PBS. Предпочтительно, pH конечного состава сохраняется на уровне или приблизительно от 5 до 8, более конкретно на уровне или приблизительно от 5,5 до 7,5, такой как на уровне или приблизительно 5,5, 6, 6,5, 7, 7,3 или 7,5, и даже более предпочтительно на уровне или приблизительно от 5,5 до 6. В предпочтительном варианте осуществления FGF-18 выбран из группы, состоящей из: 1) полипептида, содержащего или состоящего из зрелой формы FGF-18 человека, которая соответствует последовательности, содержащей или состоящей из последовательности от остатка 28(Glu) до остатка 207(Ala) SEQ ID NO: 1, 2) полипептида, содержащего или состоящего из укороченной формы FGF-18 человека, содержащего или состоящего из последовательности от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) SEQ ID NO:1, и 3) полипептида, содержащего или включающего SEQ ID NO:2. Более предпочтительно, FGF-18 представляет собой сприфермин, определение которого дано ниже. В предпочтительном варианте осуществления гель находится под воздействием температуры гелеобразования после инъекции в организм человека, т.е..
В третьем аспекте, изобретение относится к гидрогелю, полученному способом в соответствии со вторым аспектом.
В четвертом аспекте, изобретение относится к промышленному изделию для фармацевтического или ветеринарного применения, включающему контейнер, содержащий ксилоглюкан, белок FGF-18 и буфер, где ксилоглюкан предпочтительно представляет собой дегалактозилированный ксилоглюкан, даже более предпочтительно Deg-ксилоглюкан со степенью дегалактозилирования на уровне или приблизительно 44 или 45%, и буфер представляет собой фосфатный буфер, такой как PBS. Предпочтительно, FGF-18 выбран из группы, состоящей из: 1) полипептида, содержащего или состоящего из зрелой формы FGF-18 человека, которая соответствует последовательности, содержащей или включающей последовательность от остатка 28(Glu) до остатка 207(Ala) SEQ ID NO: 1, 2) полипептида, содержащего или состоящего из укороченной формы FGF-18 человека, содержащей или состоящей из последовательности от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) SEQ ID NO:1, и 3) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO:2. Более предпочтительно, FGF-18 представляет собой сприфермин, определение которого дано ниже.
Определения
- Применяемый в настоящем документе термин «белок FGF-18» или «FGF-18», предназначен для белка, сохраняющего, по меньшей мере, одну биологическую активность белка FGF-18 человека. FGF-18 может быть нативным в его зрелой форме, или в его укороченной форме. Виды биологической активности белка FGF-18 человека включают, в частности, повышение активности остеобластов (см. WO98/16644) или усиление формирования хряща (см. WO2008/023063).
Нативный, или дикого типа, FGF-18 человека представляет собой белок, который экспрессируется хондроцитами суставного хряща. FGF-18 человека был изначально обозначен zFGF-5 и полностью описан в WO98/16644. SEQ ID NO:1 соответствует аминокислотной последовательности нативного FGF-18 человека, с сигнальным пептидом, состоящим из аминокислотных остатков от 1(Met) до 27(Ala). Зрелая форма FGF-18 человека соответствует аминокислотной последовательности от остатка 28(Glu) до остатка 207(Ala) SEQ ID NO: 1 (180 аминокислот).
E. coli
E.coli,
FGF-18 в настоящем изобретении можно получать рекомбинантным способом, таким, как описанный в заявке WO2006/063362. В зависимости от экспрессирующих систем и условий, FGF-18 в настоящем изобретении экспрессируется рекомбинантной клеткой-хозяином, начиная с метионина (остаток Met) или с сигнальной последовательности для секреции. При экспрессии в прокариотическом хозяине, таком как , FGF-18 содержит дополнительный остаток Met на N-конце своей последовательности. Например, аминокислотная последовательность FGF-18 человека, при экспрессии в  начинается с остатка Met на N-конце (положение 1) с последующими остатками от 28(Glu) до остатка 207(Ala) SEQ ID NO: 1.
E.coli
.
- Применяемый в настоящем документе термин «укороченная форма» FGF-18, относится к белку, который содержит остатки или состоит из остатков с 28(Glu) по 196(Lys) SEQ ID NO: 1. Предпочтительно, укороченная форма белка FGF-18 представляет собой полипептид, обозначенный «trFGF-18» (170 аминокислот), который начинается с остатка Met (на N-конце) с последующими аминокислотными остатками 28(Glu)-196(Lys) человеческого FGF-18 дикого типа. Аминокислотная последовательность trFGF-18 показана в SEQ ID NO:2 (аминокислотные остатки от 2 до 170 SEQ ID NO:2 соответствуют аминокислотным остаткам от 28 до 196 SEQ ID NO:1). trFGF-18 представляет собой рекомбинантную укороченную форму FGF-18 человека, вырабатываемую (смWO2006/063362). Международным непатентованным названием (INN) для этой конкретной формы FGF-18 является сприфермин. Показано, что сприфермин демонстрирует активности, аналогичные зрелому FGF-18 человека, например, он повышает пролиферацию хондроцитов и накопление хрящевой ткани, что приводит к восстановлению и реконструкции ряда хрящевых тканей (см. WO2008/023063).
- термины «активная молекула» и «активный ингредиент» относятся к Активному Фармацевтическому Ингредиенту, т.е. АФИ. Предпочтительно АФИ, в контексте настоящего изобретения, представляет собой FGF-18.
- термины «гель» или «гидрогель» в этой заявке применяют взаимозаменяемо. Они относятся к трехмерной матрице, или каркасу, подходящему в качестве фармацевтического состава.
- Применяемый в настоящем документе термин «жидкий состав» относится к составу гидрогеля перед инъекцией, поскольку гель сам по себе образуется только после изменения температуры после введения в организм человека.
- термин «ксилоглюкан» относится к любой форме ксилоглюкана, т.е. к гемицеллюлозе, поизводимой в стенках первичных клеток высших растений. Это хорошо известное гелеобразующее вещество, в частности, при воздействии температуры приблизительно 37°C. Одна из предпочтительных форм, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения, представляет собой дегалактозилированную форму, более предпочтительно со степенью дегалактозилирования на уровне или приблизительно 44 или 45%. Дегалактозилированный ксилоглюкан описан в настоящем документе как Deg-Ксилоглюкан, D-ксилоглюкан, или Deg-XG.
- Применяемый в настоящем документе термин «буфер»", относится к растворам соединений, о которых известно, что они безопасны в составах для фармацевтического или ветеринарного использования и которые имеют свойство поддерживать или контролировать pH состава в желаемом для состава диапазоне pH. Приемлемые буферы для контроля pH в пределах от умеренно кислого pH до умеренно основного pH в качестве неограничивающих примеров включают фосфатный, ацетатный, цитратный, аргининовый, Трис и гистидиновый буферы. "Трис" относится к 2-амино-2-гидроксиметил-1,3,-пропандиолу, и к его любой фармакологически приемлемой соли. Предпочтительным буфером по настоящему изобретению является фосфатный буфер, такой как, например, PBS.
- Применяемый в настоящем документе термин "флакон" или «контейнер», относится в широком смысле к резервуару, подходящему для сохранения состава в жидкой форме. Примеры флакона, который можно использовать в настоящем изобретении, включают шприцы, ампулы, картриджи или другой подобный резервуар, подходящий для доставки состава FGF-18 пациенту путем инъекции, предпочтительно путем внутрисуставной инъекции. Флаконы, подходящие для упаковки продуктов для внутрисуставного введения хорошо известны и общепризнаны в данной области.
- Применяемый в настоящем документе термин «заболевание хрящевой ткани» охватывает нарушения, возникшие в результате повреждений из-за травмы или хондропатии. Примеры заболеваний хрящевой ткани, которые можно лечить введением состава FGF-18, описываемого в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, артрит, такой как остеоартрит или ревматоидный артрит, и повреждения хрящевой ткани.
- термин «остеоартрит» применяют для обозначения наиболее распространенной формы артрита. Он может быть вызван разрушение хряща. Кусочки хряща могут откалываться и вызывать боль и опухание в суставе между костями. Со временем хрящ может стираться полностью, и кости будут тереться друг о друга. Остеоартрит может поражать любой сустав, но, как правило, затрагивает руки и опорные суставы, такие как бедренные, коленные, голеностопные и позвоночные. В предпочтительном примере, остеоартрит может быть остеоартритом колена или остеоартритом бедра. Специалист имеет полное представление о классификациях остеоартрита, которые используют в данной области, в частности о системе оценки Международного общества по изучению остеоартрита (OARSI) (см. например Custers et al., 2007). Остеоартрит является одним из предпочтительных заболеваний хрящевой ткани, которые можно лечить введением составов FGF-18 по настоящему изобретению.
- применяемый в настоящем документе термин «повреждение хрящевой ткани» представляет собой заболевание хрящевой ткани или повреждение хряща, возникшее, в частности, в результате травмы. Повреждения хрящевой ткани могут возникать в результате травматического механического разрушения, в частности, в дополнение к аварии или хирургическому вмешательству (такому, как техника микропереломов). Также в рамках этого определения рассматриваются повреждения, связанные со спортом, или истирание тканей сустава, связанные со спортом.
- термин «мкг» или «mcg» используется взаимозаменяемо и относится к разделу единиц СИ для массы.
Подробное описание изобретения
in situ
Основным объектом по настоящему изобретению является состав ксилоглюканового геля (или гидрогеля), содержащий или состоящий из ксилоглюкана, белка FGF-18 и буфера. Указанный гидрогель находится в жидкой форме перед инъекцией , или перед воздействием температуры гелеобразования, альтернативным основным объектом по изобретению является жидкий состав ксилоглюкана, содержащий или включающий ксилоглюкан, белок FGF-18 и буфер. В предпочтительном варианте осуществления ксилоглюкан представляет собой дегалактозилированный ксилоглюкан, даже более предпочтительно Deg-ксилоглюкан со степенью дегалактозилирования на уровне или приблизительно 44 или 45%, и буфер представляет собой фосфатный буфер, такой как PBS.
Указанный жидкий состав (или гидрогель) подходит для инъекции на уровне хряща. Предпочтительно, белок FGF-18 выбран из группы, состоящей из: 1) полипептида, содержащего или состоящего из зрелой формы FGF-18 человека, которая соответствует последовательности, содержащей или состоящей из последовательности от остатка 28(Glu) до остатка 207(Ala) SEQ ID NO: 1, 2) полипептида, содержащего или состоящего из укороченной формы FGF-18 человека, содержащего или состоящего из последовательности от остатка 28(Glu) до остатка 196(Lys) SEQ ID NO:1, и 3) полипептида, содержащего или состоящего из SEQ ID NO:2. Более предпочтительно, FGF-18 представляет собой сприфермин.
Преимуществом использования инъекционных гидрогелей для лечения заболеваний хрящевой ткани, является возможность инъецировать каркас (или компонент каркаса; указанный каркас находится в жидкой форме перед тем как на него воздействуют температурой гелеобразования)), уже содержащий FGF-18, в дефектный участок хряща, без необходимости какого-либо инвазивного хирургического вмешательства, как при использовании твердых каркасов. Предпочтительно, такую инъекцию гидрогеля производят путем артроскопии.
in situ
Наиболее предпочтительно, гидрогели по настоящему изобретению образуются после инъекции.
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению жидких полимерных растворов (или жидких составов), способных проходить процесс гелеобразования сразу после введения пациенту из-за изменений температуры.
Следует отметить, что жидкий состав и гидрогель, в контексте настоящего изобретения, относятся к одному и тому же составу. Однако, жидкий состав конкретно направлен на образование состава перед гелеобразованием, в то время как гидрогель относится к тому же составу, но прошедшему черезх процесс гелеобразования. Компоненты обоих составов, таким образом, одинаковы.
Концентрация FGF-18 в жидком составе (или гидрогеле) предпочтительно находится на уровне или приблизительно от 1 нг/мл до 600 мкг/мл, предпочтительно на уровне или приблизительно 0,001, 0,006, 0,01, 0,1, 1, 5, 6,5, 10, 20, 30, 40, 50, 54, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или 300, 540 мкг/мл. Более предпочтительно FGF-18 находится в концентрации на уровне или приблизительно от 0,1 до 100 мкг/мл, даже более предпочтительно на уровне или приблизительно от 0,1 до 54 мкг/мл.
Гелирующий компонент, т.е. ксилоглюкан, в жидком составе или в гидрогеле, находится в концентрации на уровне или приблизительно от 1 до 5% масс., предпочтительно на уровне или приблизительно от 2 до 4% масс., более предпочтительно на уровне или приблизительно 3 или 4% масс. Предпочтительно, указанный ксилоглюкан представляет собой дегалактозилированный ксилоглюкан, даже более предпочтительно указанный Deg-ксилоглюкан имеет степень дегалактозилирования на уровне или приблизительно 44 или 45%. Конкретное преимущество указанного Deg-ксилоглюкана в том, что переход раствор-гель происходит около 37°C, т.е. при температуре человеческого тела, в то время как переход гель-золь происходит около 70°C. Таким образом, как только гель сформировался в организме человека, он остается в состоянии геля; не существует риска, что он вернется в исходное состояние.
Буфер, такой как PBS, находится на уровне или приблизительно 95-99% масс., более предпочтительно на уровне или приблизительно 96-97% масс.
В предпочтительном варианте осуществления жидкий состав или гидрогель (поскольку жидкий состав образует гидрогель после инъекции в организм человека) содержит или включает FGF-18 на уровне или приблизительно 0,1-100 мкг/мл, ксилоглюкан на уровне 3 или 4% масс., буфер на уровне 96 или 97% масс. Предпочтительно соотношение между полимером (т.е. ксилоглюканом) и FGF-18 находится в пределах от 20:1 до 1:1, более предпочтительно, 9:1.
После смешивания друг с другом, конечные концентрации каждого компонента предпочтительно являются следующими:
- FGF-18: от 0,00001 до 0,6% масс., такая как 0,0054% масс.;
- Ксилоглюкан: от 1 до 5% масс., такая как 3 или 4% масс.;
- Буфер: от 95 до 99% масс., такая как 96 или 97% масс..
В предпочтительном варианте осуществления pH конечного состава сохраняется на уровне или приблизительно от 5 до 8, более конкретно на уровне или приблизительно от 5,5 до 7, такой как на уровне или приблизительно 5,5, 6, 6,5, 7, 7,3 или 7,5, и даже более предпочтительно на уровне или приблизительно от 5,5 до 6.
Изобретение дополнительно относится к способу получения гидрогелей FGF-18, включающему этапы:
1) получения раствора 1, содержащего или включающего FGF-18, вместе с ксилоглюканом и буфером, и
2) воздействия на гель температуры 37°C или приблизительно 37°C для образования геля,
in situ
где ксилоглюкан предпочтительно представляет собой дегалактозилированный ксилоглюкан, даже более предпочтительно Deg-ксилоглюкан со степенью дегалактозилирования на уровне или приблизительно 44 или 45%, и буфер представляет собой фосфатный буфер, такой как PBS. Предпочтительно, pH конечного состава сохраняется на уровне или приблизительно от 5 до 8, более конкретно на уровне или приблизительно от 5,5 до 7, такой как на уровне или приблизительно 5,5, 6, 6,5, 7, 7,3 или 7,5, и даже более предпочтительно на уровне или приблизительно от 5,5 до 6. В предпочтительном варианте осуществления FGF-18 выбран из группы, состоящей из: 1) полипептида, содержащего или включающего зрелую форму FGF-18 человека, которая соответствует последовательности, содержащей или включающей последовательность от остатка 28(Glu) до остатка 207(Ala) из SEQ ID NO: 1, 2) полипептида, содержащего или включающего укороченную форму FGF-18 человека, содержащую или включающую последовательность от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) из SEQ ID NO:1, и 3) полипептида, содержащего или включающего SEQ ID NO:2. Более предпочтительно, FGF-18 представляет собой сприфермин, определение которого дано ниже. В предпочтительном варианте осуществления жидкий состав находится под воздействием температуры гелеобразования после инъекции в организм человека, т.е.., таким образом, формируя гель (или гидрогель).
Предпочтительно соотношение между полимером (т.е. ксилоглюканом) и FGF-18 находится в пределах от 20:1 до 1:1, более предпочтительно, 9:1. Каждое из соединений (т.е. FGF-18, ксилоглюкан и буфер) можно использовать в любой/любом из вышеописанных концентраций, pH, и/или соотношений.
В третьем аспекте, изобретение относится к промышленному изделию для фармацевтического или ветеринарного применения, включающему контейнер, содержащий жидкий состав по изобретению. Указанный жидкий состав содержит или включает ксилоглюкан, белок FGF-18 и буфер, где ксилоглюкан предпочтительно представляет собой дегалактозилированный ксилоглюкан, даже более предпочтительно Deg-ксилоглюкан со степенью дегалактозилирования на уровне или приблизительно 44 или 45%, и буфер представляет собой фосфатный буфер, такой как PBS. Предпочтительно, FGF-18 выбран из группы, состоящей из: 1) полипептида, содержащего или включающего зрелую форму FGF-18 человека, которая соответствует последовательности, содержащей или включающей последовательность от остатка 28(Glu) до остатка 207(Ala) из SEQ ID NO: 1, 2) полипептида, содержащего или включающего укороченную форму FGF-18 человека, содержащую или включающую последовательность от остатка 28 (Glu) до остатка 196 (Lys) из SEQ ID NO:1, и 3) полипептида, содержащего или включающего SEQ ID NO:2. Более предпочтительно, FGF-18 представляет собой сприфермин, определение которого дано ниже. Предпочтительно соотношение между полимером (т.е. ксилоглюканом) и FGF-18 находится в пределах от 20:1 до 1:1, более предпочтительно, 9:1. Каждое из соединений (т.е. FGF-18, ксилоглюкан и буфер) можно использовать в любой/любом из вышеописанных концентраций, pH, и/или соотношений.
Настоящее изобретение дополнительно относится к гидрогелю, полученному в соответствии с вышеописанным способом.
in situ
Также описан упаковочный материал, предоставляющий инструкции по формированию гидрогеля по настоящему изобретению, предпочтительно .
Жидкий состав, способный образовывать гидрогель по изобретению, можно хранить в течение, по меньшей мере, приблизительно от 12 месяцев до приблизительно 24 месяцев. При предпочтительных условиях хранения, перед первым использованием, составы хранят вдали от яркого света (предпочтительно, в темноте), предпочтительно при температуре охлаждения (на уровне или приблизительно 2-8°C).
Настоящее изобретение относится к жидким составам или гидрогелям, содержащим FGF-18, в частности, для однократного использования, подходящим для фармацевтического или ветеринарного использования. Жидкие составы или гидрогели (поскольку жидкие составы способны к образованию гидрогеля после воздействия температуры гелеобразования) по настоящему изобретению, содержащие FGF-18, можно использовать для введения для улучшения восстановления хрящевой ткани или для лечения заболеваний хрящевой ткани, таких как остеоартрит или повреждения хрящевой ткани.
in situ
Эти жидкие составы или гидрогели подходят для использования для инъекций и альтернативных систем доставки. В особенно предпочтительном варианте осуществления составы по изобретению предназначены для внутрисуставной (в.с.) инъекции. Их можно вводить путем прямой инъекции в поврежденное место, где гель предпочтительно образуется. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, в.с. введение производят в сустав, выбранный из сустава бедра, колена, плеча, запястья, лодыжки, позвоночника, ноги, пальца руки, пальца ноги, руки, плеча, ребер, лопатки, голеней, пяток и среди точек окостенения позвоночника. Еще в одном предпочтительном варианте осуществления в.с. введение производят в тазобедренный или коленный сустав.
Следующие примеры предназначены для дополнительной иллюстрации получения составов и гидрогелей по изобретению. Объем изобретения не может быть истолкован как состоящий исключительно из следующих примеров.
Описание чертежей:
фигура 1: (a) Вязкость при сдвиге в зависимости от скорости сдвига и (b) скорость сдвига в зависимости от напряжения при сдвиге для систем Deg-XG, приготовленных на воде.
фигура 2: Вязкость при сдвиге в зависимости от скорости сдвига для систем Deg-XG, приготовленных на D-PBS.
фигура 3: Измерения вязкости при сдвиге для (a) 3% масс.Deg-XG, нагруженного FGF-18; (b) 4% масс. Deg-XG в D-PBS, нагруженного FGF-18, после различного времени инкубации при 25°C.
фигура 4: Измерения развертки по времени при 25°C и 1 Гц, для 4,4% масс. Deg-XG и 4% масс. Deg-XG, нагруженного FGF-18 в количестве 54 мкг/мл, в D-PBS.
фигура 5: Влияние автоклавирования на вязкость при сдвиге на системах Deg-XG/вода (4 и 5% масс.).
фигура 6: (a) Влияние автоклавирования на вязкость при сдвиге на системах Deg-XG/D-PBS (3,3, 4,4, 5,5% масс.); (b) Сравнение между системами Deg-XG/Вода (4 и 5% масс.) и Deg-XG/D-PBS (4,4 и 5,5% масс., обе автоклавированы).
фигура 7: Графики развертки по механическому напряжению для систем Deg-XG/вода (a) через 5 минут и (b) через 30 минут инкубации при 37°C.
фигура 8: Графики развертки по механическому напряжению для систем Deg-XG/D-PBS с (a) 3% масс. с наличием и отсутствием FGF-18; (b) 4% масс. с наличием и отсутствием FGF-18; (c) 5% масс. с наличием и отсутствием FGF-18.
фигура 9: Графики развертки по частоте для систем Deg-XG/вода (a) инкубированных 5 минут при 37°C; (b) инкубированных 30 минут при 37°C.
фигура 10: Графики развертки по частоте для систем Deg-XG/D-PBS с (a) 3% масс. с наличием и отсутствием FGF-18; (b) 4% масс. с наличием и отсутствием FGF-18; (c) 5% масс. с наличием и отсутствием FGF-18.
фигура 11: Gʹ и Gʺ при 1 Гц в зависимости от времени для систем Deg-XG/вода.
фигура 12: Влияние лиофилизации на систему 4,4% масс.Deg-XG/D-PBS.
фигура 13: Лиофилизированный и восстановленный 4,4% масс. Deg-XG в D-PBS, в форме золя и геля.
фигура 14: Графики развертки по частоте для свежих и разрушенных образцов: (a) 4% масс.Deg-XG, нагруженного 540 мкг/мл FGF-18; (b) 4% масс. Deg-XG, нагруженного 54 мкг/мл FGF-18; (c) 5% масс.Deg-XG, нагруженного 540 мкм/мл FGF-18; (d) 5% масс.Deg-XG, нагруженного 54 мкм/мл FGF-18.
фигура 15: Анализ клеточной пролиферации при помощи реагента аламарового синего (ось X: время инкубации (сутки). Ось Y: жизнеспособность клеток). Она показывает результаты анализа при помощи аламарового синего (5000 хондроцитов/лунки) для клеточной пролиферации, проведенного с хондроцитами, которые культивировали на образцах гидрогеля с Deg-XG (3,3% масс.), не нагруженных (контроль) или нагруженных FGF-18 в трех различных концентрациях: 54 мкг/мл, 6,7 мкг/мл, 6,7 нг/мл.
фигура 16: Окрашивание акридиновым оранжевым хондроцитов, культивированных в течение 12 суток на Deg-XG (вверху слева); Deg-XG +6,7 нг/мл FGF-18 (вверху справа); Deg-XG +6,7 мкг/мл FGF-18 (внизу слева); Deg-XG +54 мкг/мл FGF-18 (внизу справа).
фигура 17: Последовательность FGF-18 человека, соответствующая SEQ ID NO:1 (a) и последовательность сприфермина, соответствующая SEQ ID NO:2 (b).
Описание последовательностей:
SEQ ID NO.1: Аминокислотная последовательность нативного FGF-18 человека.
SEQ ID NO.2: Аминокислотная последовательность рекомбинантного укороченного FGF-18 (trFGF-18 или сприфермина).
Примеры
Материалы
E.coli
Рекомбинантный укороченный FGF-18 (trFGF-18 или сприфермин) в настоящих примерах был приготовлен своими силами путем экспрессии в  в соответствии со способом, описанным в заявке WO2006/063362. В следующих примерах, сприфермин и FGF-18 используют взаимозаменяемо.
Другие основные вещества, использованные в примерах, были следующими:
et al
- Ксилоглюкан из семян тамаринда получали от Megazyme International (Ирландия). Он был дегалактозилирован по протоколу, описанному Rilton ., 2011;
- БСА, САЧ и Полоксамер F68 получали от Sigma Aldrich;
- Пенициллин Стрептомицин (Pen-Strep) и 10×PBS Дульбекко получали от Gibco;
- Хитозан 75% степень деацетилирования (СД) высокомолекулярный (ВММ), Sigma Aldrich 419419;
- Хитозан 95% СД низкомолекулярный (НММ), Faravelli 43000;
- Хитозан 95% СД ВММ, Heppe medical 24711.
Оценку качественных характеристик проводили на растворах дегалактозилированного варианта ксилоглюкана (Deg-XG) для того чтобы выполнить начальный быстрый скрининг различных составов. В частности, эти характеристики представляли собой тесты на возможность вводимости через шприц при комнатной температуре и тесты на переворачивание при 37°C. На выбранных системах также проводили дополнительные исследования и оценку характеристик, при необходимости также в присутствии FGF-18.
Для того чтобы четко различать в этом разделе состав перед процессом гелеобразования и состав после образования геля, первый обозначают как «жидкий раствор», а последний обозначают как «гель», соответственно.
Способы
Получение растворов FGF-18
2
4
2
4
FGF-18 в концентрации 5,41 мг/мл хранят при -80°C в отдельных флаконах на 3 мл и, после оттаивания при комнатной температуре, добавляют или непосредственно к раствору полимера (в соотношении 9:1 между раствором полимера и FGF-18) для достижения целевой конечной концентрации 540 мкг/мл, или разводят «раствором для объема белка» для достижения целевой конечной концентрации 54 мкг/мл перед добавлением к раствору полимера. «Раствор для объема белка» представляет собой раствор PBS с pH 7,3, приготовленный из NaHPO (7 мМ), KHPO (1 мМ) и KCl (2,7 мМ). Ионная сила этого буфера приблизительно равна 25 мМ.
Получение растворителей для полимера и среды для высвобождения (модифицированные искусственные синовиальные жидкости):
Тип I
2
2
2
4
2
4
(также называемый D-PBS): 10×PBS Дульбекко, разведенный в десять раз водой Millipore, 0,1% масс. Pen-Strep; pH 5,5. Ионная сила 1×D-PBS составляет приблизительно 166 мМ, и его композиция является следующей: CaCl (0,9 мМ), MgCl (0,49 мМ), KCl (2,66 мМ), KHPO (1,47 мМ), NaCl (137,9 мМ), NaHPO (8,06 мМ).
Тип II
: аналогично Типу I с 0,1% масс. БСА.
Тип III
: аналогично «раствору для объема белка» с 0,25 г/л Полоксамера, 1% масс. Pen-Strep и 1% масс. САЧ; pH 7,3.
Протокол загрузки FGF-18
Для растворов Deg-XG, приготовленных в растворителе Типа I (D-PBS) или в PBS с pH 7,3 (приготовленном в виде «раствора для объема белка»), концентрация полимера была увеличена на 10% для того чтобы получить такую же конечную концентрацию полимера, как и при нагрузке систем растворами FGF-18 в массовом отношении 9:1.
Раствором белка медленно наполняли шприц, перемешивая иглой образец, чтобы обеспечить равномерное распределение. Загруженный гель всегда хранили при 5°C, в течение ночи, без перемешивания перед использованием.
Растворы полимера: получение и хранение
Растворы Deg-XG получали, как в воде Millipore, так и в растворителе Типа I, pH 5,5. Раствор 4,4% масс. Deg-XG также готовили в «растворе для объема белка», при pH 7,3.
Способ растворения выглядит следующим образом:
• Добавление твердого полимера в холодную воду или холодный PBS в желаемой концентрации;
• Гомогенизация в течение 5 часов при 5°C и 13500 об./мин.;
• Автоклавирование при 120°C в течение 20 минут;
• Хранение при 5°C.
Во время работы с предварительными составами хитозан смешивали с другими эксципиентами для того чтобы получить водные растворы с приемлемой осмоляльностью для в.с. инъекций (целевое значение: 350 мОсм/кг). Жидкие растворы затем исследовали на время и температуру гелеобразования.
Тесты на вводимость через шприц, вязкость при сдвиге и поведение при переворачивании
Вводимость через шприц
:
Вводимость через шприц тестировали при комнатной температуре при инъекции 1 мл через шприц с иглой G25. Оценивали время инъекции и остаточное количество в шприце.
Вязкость при сдвиге
: Измерения вязкости при сдвиге проводили при 25°C при помощи реометра Ar 1000 (TA Instruments).
Тесты на поведение при переворачивании
текучесть
отсутствие текучести
: 2-3 мл раствора инкубировали при 37°C в прозрачных цилиндрических пробирках и наблюдали через различные периоды времени. Пробирки переворачивали для того чтобы оценить, был ли материал подобен жидкости («») или гелю («»).
Реометрия динамического механического напряжения
Динамико-механические свойства гелей Deg-XG оценивали при помощи экспериментов с малоамплитудным сдвигом (с регулируемым напряжением сдвига). Тесты проводили с использованием реометра с регулируемым напряжением сдвига Ar 1000 (TA Instruments) с измерительной геометрией акриловой пластинки (диаметр 4 см) и пропуском 500 мкм.
-3
• Тесты развертки по механическому напряжению проводили при частоте 1 Гц, в то время как тесты развертки по частоте проводили при механическом напряжении 4,10. Тесты развертки по механическому напряжению и частоте проводили через 5 и 30 минут инкубации при 37°C.
-3
• Кинетические параметры гелеобразования при 37°C исследовали при помощи повторных тестов развертки по частоте при механическом напряжении 4,10.
-3
• Кинетические параметры гелеобразования при 25°C исследовали при помощи тестов развертки по времени с фиксированной частотой 1 Гц и механическим напряжением 4,10.
Микроскопия СЭМ
Получали изображения морфологии поверхности при помощи системы для полевой эмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FESEM) JEOL при ускоряющем напряжении 10 кВ. Образцы для FESEM перед сканированием покрывали слоем золота при помощи аппарата для нанесения золотого покрытия JFC-1300 (JEOL) в течение 50 секунд при 30 мА. Лиофилизированные образцы закреплены на алюминиевых стержнях для СЭМ при помощи графитного адгезивного слоя.
Исследования набухания-разрушения
Ws(t)
t
Ws(0)
Для предварительных исследований с гелями Deg-XG, приготовленными на воде, образцы гелей (4-6 для каждой системы) помещали в предварительно взвешенные цилиндрические стеклянные пробирки с пористым дном (спеченное стекло с пористостью G0/G1), погружали в большой избыток среды для высвобождения типа I и помещали в термостат, установленный на 37°C. Для гелей Deg-XG, нагруженных FGF-18, образцы гелей помещали на предварительно взвешенные вкладыши в мультилуночные планшеты с пористой мембраной (0,4 мкм) на дне, погружали в среду для высвобождения типа II и помещали в термостат, установленный на 37°C. Проводили круговое встряхивание при 100 об./мин. Среду для высвобождения меняли каждые 2-3 суток. Образцы геля взвешивали перед инкубацией и через различные периоды времени при инкубации при 37°C. представляет собой массу набухшего образца во временной точке и представляет собой массу образца во временной точке=0.
Исследования разрушения-высвобождения
Для исследования высвобождения, проводимого на 4% масс., образцы геля Deg-XG, приготовленного в PBS при pH 7,3 (в виде «раствора для объема белка») и нагруженного FGF-18, помещали на предварительно взвешенные вкладыши в мультилуночные планшеты с пористой мембраной (0,4 мкм) на дне, погружали в среду для высвобождения типа III и помещали на орбитальный шейкер, выставленный на 37°C. Тестируемые системы (4 образца для каждой) были следующими:
• 4% масс.Deg-XG;
• 4% масс.Deg-XG, нагруженный 540 мкг/мл FGF-18;
• 4% масс.Deg-XG, нагруженный 54 мкг/мл FGF-18.
Среду для высвобождения меняли через 24 часа, 48 часов, а затем каждые 3-4 суток. Принимающие фазы, собранные через 24 часа, 48 часов и 7 суток, анализировали при помощи Biacore и ОФ-ВЭЖХ.
Исследование высвобождения in vitro
in vitro
Образцы, использованные для тестов набухания, также анализировали в тестах высвобождения . В частности, собранные фазы анализировали посредством ВЭЖХ. Выбранные образцы анализировали также посредством Biacore (данные не показаны).
Пример 1: Температуро-чувствительные системы гелеобразования на основе DEG-XG
Растворы Deg-XG получали в воде с концентрацией 1, 2, 3, 4, 5% масс. Deg-XG получали в D-PBS с 3,3% масс. и 4,4% масс. и и их также нагружали FGF-18 с концентрацией 54 мкг/мл. Все системы тестировали на вводимость через шприц после хранения при 5°C в течение ночи (время=0) и через 1, 2 и 3 часа дополнительной инкубации при 37°C.
Вводимость через шприц (Таблицы 1 и 2).
Время инъекции заданного объема (1 мл) раствора полимера увеличивается вместе с концентрацией полимера. Остаточное количество в шприце находилось в пределах между 5-8% вплоть до концентрации 4% масс., в то время как оно значительно повышалось, приблизительно до 15%, для 5% масс. Присутствие FGF-18 не оказывало значительного влияния на поведение обоих охарактеризованных систем (3 и 4% масс.). После хранения при 25°C, остаточное количество в шприце повышалось только после 4 часов для системы с 3% масс., в то время как для системы с 4% масс. остаточное количество в шприце повышалось более заметно со временем инкубации при 25°C, и время инъекции почти удваивалось через 2 часа. Эти результаты позволяют предположить, что гелеобразование происходит при 25°C для обоих систем и с различной кинетикой (быстрее для более высокой концентрации полимера).
Поведение при переворачивании (Таблица 1)
. В то время как 4% масс. и 5% масс. Deg-XG становились гелями даже быстрее, чем через 5 минут инкубации при 37°C, менее концентрированные растворы становились гелями не ранее, чем через 30 минут инкубации. Для 1% масс. не наблюдали видимого гелеобразования.
Измерения вязкости при сдвиге (Реологические свойства при 25°C).
Результаты для гелей Deg-XG, приготовленных на воде и автоклавированных, представлены на фиг. 1 (a-b). Вязкость при сдвиге повышалась вместе с концентрацией полимера, и не-ньютоновское поведение становилось более выраженным.
Проверили вязкость при сдвиге в зависимости от скорости сдвига для систем Deg-XG/D-PBS (автоклавированных) (фиг. 2). Аналогично, вязкость при сдвиге повышалась вместе с концентрацией полимера, и не-ньютоновское поведение становилось более выраженным. Измерения повторили для 3 и 4% масс. в присутствии FGF-18 после различного времени инкубации при 25°C: 1, 2 и 4 часа (фиг.3). Ожидаемо, вязкость при сдвиге в диапазоне низкой скорости сдвига все более увеличивается со временем инкубации при 25°C, и наклон кривой также увеличивается. Эти результаты подтверждают гипотезу о прогрессивной модификации материалов в направлении гелеобразования уже при 25°C.
Это поведение дополнительно подтверждали при помощи исследования кинетических параметров, которое проводили посредством теста развертки по времени при фиксированной частоте 1 Гц на 4,4% масс. Deg-XG/D-PBS и загруженных FGF-18 с концентрацией 54 мкг/мл (4% масс.) (фиг.4).
Влияние автоклавирования
. У гелей с 4 и 5% масс.Deg-XG, приготовленных на воде, измеряли вязкость при сдвиге до и после автоклавирования. Автоклавирование не оказывает существенного влияния на вязкость растворов с 5% масс. (в исследованном диапазоне скорости сдвига), хотя уменьшает вязкость при сдвиге при низких скоростях сдвига для 4% масс. (фиг.5). Можно предположить, что тепловая обработка при 120°C была благоприятной для растворения полимера в воде.
Для растворов Deg-XG, приготовленных на D-PBS, концентрация полимера была повышена на 10% для того чтобы получить такую же конечную концентрацию полимера, как и при нагрузке систем растворами FGF-18 (массовое соотношение растворов полимер/FGF-18 =9:1). Автоклавированные растворы показали небольшое пожелтение по сравнению с неавтоклавированными. Также для этих систем влияние автоклавирования было более выраженным для низкой концентрации (фиг.6a). Автоклавирование в присутствии D-PBS вызвало снижение вязкости при сдвиге по сравнению с аналогичными системами, приготовленными на воде (см. Фиг.6b). Фактически, из фигуры очевидно, что кривые, относящиеся к системам, концентрированным на 10% больше, но автоклавированным в присутствии буфера, накладываются на кривые для менее концентрированного полимера, автоклавированного в виде водного раствора.
Пример 2: Динамическое механическое поведение температуро-чувствительных систем гелеобразования на основе DEG-XG.
Динамическое механическое поведение гелей, инкубированных при 37°C в течение различных периодов времени, исследовали при помощи тестов развертки по механическому напряжению и частоте.
Кривые для Gʹ разверток по механическому напряжению при частоте 1 Гц для систем гелей на основе воды, через 5 и 30 минут инкубации при 37°C, показаны на Фиг.7. Gʹ значительно увеличивается с увеличением концентрации, хотя чем более упругоподобным становится материал, тем ниже механическое напряжение, которое он может выдержать до потери целостности (состояние, определяемое по резкому снижению Gʹ). Тесты развертки по механическому напряжению через 30 минут пребывания при 37°C показали общее дополнительное увеличение динамического модуля упругости и свидетельство различия между системами 4 и 5% масс. Deg-XG/вода. Аналогичные тесты проводили на гелях D-PBS, нагруженных FGF-18 в концентрации 540 и 54 мкг/мл, и на системах «плацебо» (гели D-PBS без FGF-18)(фиг. 8a-c).
Комбинированный эффект разведения и добавления FGF-18 ведет в направлении снижения Gʹ. В десять раз более концентрированный FGF-18 вызывает лишь дальнейшее небольшое снижение Gʹ, таким образом, наблюдаемое уменьшение Gʹ, по-видимому, связано, в основном, с разведением.
Тесты развертки по частоте проводили на всех системах при 37°C. На фиг.9 показаны графики Gʹ, Gʺ для систем Deg-XG/вода через 5 минут или 30 минут инкубации при 37°C. Все системы, за исключением 1% масс., имели Gʹ>Gʺ, и Gʹ практически не изменялся с частотой. Gʺ становился неизменным при изменении частоты только для более высоких концентраций. Обе кривые, Gʹ и Gʺ, повышаются с концентрацией полимера.
Тесты развертки по частоте также проводили на гелях D-PBS, нагруженных FGF-18 с концентрацией 540 и 54 мкг/мл, и на системах «плацебо» (гели D-PBS без FGF-18) (фиг.10 a-c).
Эти результаты подтверждают уже наблюдаемое уменьшение Gʹ, когда системы разбавляют для нагрузки FGF-18, и невозможно оценить никакие очевидные воздействия увеличения концентрации FGF-18.
Пример 3: Исследование кинетических параметров гелеобразования
Исследование кинетических параметров гелеобразования проводили путем повторных тестов развертки по частоте через заданные интервалы времени на системах Deg-XG/вода при 37°C. Значения динамического модуля упругости и модуля потерь при 1 Гц отмечены на графике как функция времени (фиг. 11).
Хотя система с 1% масс. Deg-XG показывает устойчивый рост Gʹ и Gʺ со временем, которые сначала увеличиваются, а затем уменьшаются, все остальные системы показывают практически неизменные величины обоих компонентов сложного модуля в исследованном интервале времени. Эти результаты также хорошо согласуются с предварительным исследованием качественных реологических характеристик с тестами на переворачиваемость.
В свете наблюдаемого сходства между системами с D-PBS и водой мы можем предположить, что два типа гелей имеют одинаковые качественные характеристики.
Пример 4: Эффекты замораживания-оттаивания и лиофилизации
Для того чтобы получить некоторую информацию о возможных условиях хранения гелей Deg-XG, исследовали воздействие одного цикла замораживания-оттаивания на динамический механический спектр на системе с 4,4% масс., приготовленной на D-PBS. С той же целью оценивали влияние лиофилизации и восстановления. В последнем случае материал был лиофилизирован, как из состояния золя (при температуре хранения 5°C), так и из состояния геля (после инкубации при 37°C) (Фиг.12 и 13).
И Gʹ, и Gʺ повышались после замораживания-оттаивания, в то время как воздействие лиофилизации и восстановления в D-PBS при 5°C в течение ночи без перемешивания было направлено на снижение Gʹ и Gʺ, независимо от исходного состояния материала. Оба этих результата доказывают, что процессы, которые благоприятствуют растворению Deg-XG, приводят к более сильным гелям, в то время как процессы, которые благоприятствуют агрегации Deg-XG, уменьшают силу геля. Растворение Deg-XG в водной среде является критическим параметром для качества сети, формируемой при 37°C.
Пример 5: Сканирующая электронная микроскопия лиофилизированных гелей.
Гели Deg-XG, приготовленные на воде, быстро замороженные погружением в жидкий азот (внутри пробирки) и лиофилизированные, анализировали при помощи сканирующей электронной микроскопии (данные не показаны). Все системы показали неравномерную пористость, с большими полостями в десятки микрон и более мелкими порами в несколько микрон. При повышении концентрации полимера преобладающим эффектом являлось снижение размеров более крупных полостей. Но несмотря на присущую гетерогенность, морфология образцов была практически однородной.
Пример 6: Исследования набухания-разрушения
Ws(t)
t
Ws(0)
Ws(t)/Ws(0)
Предварительное исследование поведения при набухании-разрушении на гелях Deg-XG/вода с 4% масс. и 5% масс. проводили в пределах временной шкалы в 60 суток. Образцы геля взвешивали до и после инкубации при 37°C. представляет собой массу набухшего образца во временной точке ,и представляет собой массу образца во временной точке t=0 (Таблица 3). Через 60 суток тест остановили из-за роста плесени. Для обеих систем, соотношение [%] медленно снижалось со временем. Разрушенные гели анализировали при помощи микроскопии СЭМ после быстрой заморозки в жидком азоте и лиофилизации (данные не показаны). После эрозии структура геля не разрушилась, и пористость стала более гомогенной. Кроме того, поры стали более открытыми и соединенными между собой для системы с 4% масс., чем для системы с 5% масс.
Ws(t)/Ws(0)
Эксперименты по набуханию-разрушению повторили для гелей Deg-XG/D-PBS с 4 и 5% масс., нагруженных FGF-18 с концентрациями 540 мкг/мл и 54 мкг/мл (Таблица 4). Для каждой системы соотношение [%] медленно снижалось со временем, и сравнительно более и более быстрыми темпами по сравнению с системами, произведенными на воде. Это может быть или прямым влиянием солей PBS или, более вероятно, непрямым эффектом PBS, затрагивающим молекулярную структуру полимера при автоклавировании. Через 22 дня пребывания в среде для высвобождения, разрушенные гели анализировали при помощи тестов развертки по частоте для того чтобы оценить их механические свойства (фиг. 14 a-d).
Через 22 дня после погружения в среду для высвобождения остаточные гели, в основном, демонстрировали более высокие значения динамического модуля упругости Gʹ и модуля потерь Gʺ, таким образом, подтверждая перегруппировку сети в сторону более сильной структуры, которая сопутствует разрушению менее перекрестно-сшитых частей материала. Только 5% масс. Deg-XG, нагруженный 54 мкг/мл FGF-18, показал противоположную тенденцию.
Пример 7: Исследование разрушения геля/высвобождения белка
Исследование проводили на 4% масс. Deg-XG, приготовленного в PBS при pH 7,3. Принимающие фазы, собранные через 24 часа, 48 часов и 7 суток, анализировали при помощи Biacore и ОФ-ВЭЖХ (данные не показаны). Анализ при помощи ОФ-ВЭЖХ не выявил отчетливых хроматографических пиков, относящихся к «взрывному» высвобождению FGF-18. Те же самые принимающие фазы также анализировали при помощи Biacore. Аналогично, не было выявлено, FGF-18. Это позволяет предположить, что белок удерживается в матрице геля в течение периода наблюдения.
Пример 8: Анализ клеточной пролиферации
8.1. Анализ клеточной пролиферации при помощи аламарового синего
Анализ клеточной пролиферации при помощи аламарового синего (5000 хондроцитов/лунки) проводили с хондроцитами, культивированными на гидрогеле Deg-XG (с 3,3% масс.), без нагрузки (контроль) или с нагрузкой FGF-18 при трех различных концентрацииях: 54 мкг/мл, 6,7 мкг/мл, 6,7 нг/мл. Все системы, включая контрольную систему (гель Deg-XG без FGF-18), показали значительную клеточную пролиферацию с течением времени (см. Фиг.15). Присутствие фактора роста не отразилось на скорости пролиферации в течение первых восьми суток, в то время как оно слегка повысило скорость при более продолжительном времени инкубации. Никакого влияния концентрации FGF-18 не наблюдали в исследованном диапазоне концентраций для фактора роста.
8.2. Окрашивание акридиновым оранжевым для оценки апоптоза
Проводили анализ при помощи конфокальной микроскопии на клетках, культивированных в течение 12 суток на гидрогелях Deg-XG, не нагруженных и нагруженных FGF-18, после окраски акридиновым оранжевым. Акридиновый оранжевый представляет собой краску, проникающую в клетки и связывающуюся с нуклеиновыми кислотами, которая излучает зеленую флуоресценцию, когда она связана с двухцепочечной ДНК, и красную флуоресценцию, когда она связана с одноцепочечной ДНК или РНК. Это окрашивание разделяет живые (зеленые ядра) и апоптотические (красные ядра) клетки. Как показано на Фиг.16, зеленый цвет, округлая форма ядер указывают на то, что клетки не претерпевают повреждения ДНК в присутствии и в отсутствие FGF-18.
8.3. Исследование при помощи оптической микроскопии как функция от времени инкубации и количества нагрузки FGF-18
При помощи оптического микроскопа следили за пролиферацией хондроцитов на гелях Deg-XG, не нагруженных и нагруженных FGF-18, в течение периода времени в 7 суток. Количество нагрузки для фактора роста находилось в интервале от 6,7 нг/мл до 54 мкг/мл. Наблюдали, что во всех системах хондроциты изначально формируют кластеры. Когда гели были нагружены FGF-18 в более низких концентрациях (6,7 нг/мл и 6,7 мкг/мл), через 48 часов инкубации хондроциты уходили из кластеров, заселяя другие части каркаса (данные не показаны).
8.4. Исследования прорастания клеток при помощи конфокальной микроскопии.
Проводили анализ при помощи конфокальной микроскопии различных сечений, взятых из слоя толщиной 210 мкм из образца гидрогеля общей толщиной 2 мм для системы Deg-Xg + 6,7 мкг FGF после 4 суток инкубации. Клетки окрашивали бромистым этидием (красный). Результаты показывают присутствие хондроцитов по всей толщине материала. Поскольку посев клеток производили на поверхность гидрогеля, присутствие клеток в различных положениях по всей толщине позволяет предположить, что пролиферирующие клетки могут достигать внутренних слоев гелей (данные не показаны).
Пример 9: Получение хитозановых гелей
9.1. Общие положения
2
4
Для скрининга хитозановых составов, препараты жидких растворов полимера были сделаны из трех различных хитозанов: 95% степени деацетилирования (СД) с высокой молекулярной массой (ВММ), 95% СД с низкой ММ (НММ) и 75% СД с высокой ММ (ВММ). Жидкие растворы полимера получали, постепенно добавляя хитозан к 0,1N раствору уксусной кислоты при интенсивном перемешивании или при 5°C или при 25°C. Количество полимера рассчитывали таким образом, чтобы получить конечную концентрацию полимера в жидком растворе полимера, равную 1% масс., 1,5% масс. или 2% масс. После полного растворения хитозана добавляли раствор KHPO с концентрацией 10 мМ, 100 мМ или 500 мМ в воде milliQ при перемешивании для получения конечной концентрации в жидком растворе полимера 1 мМ, 10 мМ или 50 мМ. Наконец, добавляли раствор β-Глицерофосфата (β-GP) в концентрации 20% масс. в воде milliQ для того чтобы скорректировать pH конечного жидкого раствора до величины 6,0, 6,5 или 7,0. Конечная концентрация β-GP в жидком растворе полимера находилась в диапазоне от 0,5% масс. до 7% масс., для принятых составов. Не всегда было возможно достигнуть желаемого значения pH,поскольку было необходимо очень большое количество β-GP, что приводило к превышению заданного значения осмоляльности 350 мОсм/Кг или получению геля уже при комнатной температуре. Жидкие растворы полимера, при необходимости, инкубировали затем при 37°C до образования геля. Измеряли осмоляльность всех проверенных составов, удаляя составы с осмоляльностью выше, чем 350 мОсм/Кг, т.е. составы с конечными концентрациями β-GP выше, чем 2,5% масс.
9.2. Предварительный скрининг составов с плацебо (см. Таблицу 5):
Описано, что хитозан способен подвергаться переходам золь-гель при изменениях температуры, но на процесс сильно влияет молекулярная масса (ММ) полимера, его степень деацетилирования (СД), концентрация полимера в растворе, температура, время и скорость смешивания при растворении полимера, конечный pH раствора и присутствие других эксципиентов.
Таким образом, требовался исчерпывающий скрининг различных возможных комбинаций. Следует заметить, что хитозан может быть растворен только в воде при кислом pH. Повышение pH приводит к его агрегации и осаждению. Способом преодоления этой проблемы является использование β-GP для повышения pH с одновременным сохранением хитозана в растворе.
Исследование вначале было сосредоточено на высокомолекулярном хитозане с 75% СД. Получали несколько жидких растворов полимера в 0,1N соляной кислоте, отличающихся по конечной концентрации хитозана, от 1% масс. до 2,5% масс., конечной концентрации β-GP, от 1,6% масс. до 50% масс. (1,6, 5, 5,6, 8, 30, 50%), различным эксципиентам, а именно, желатин, глюкозамин, гиалуроновая кислота, гидроксиэтилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, трегалоза, и различным конечным значениям pH, от 6,0 до 7,0. Описано, что эти эксципиенты играют роль в индукции образования геля (Cheng et al., 2010; Schuetz et al., 2008; Yan et al, 2010).
Только один из исследованных составов был способен к образованию геля при 37°C после 5 минут инкубации, но количество β-GP было выше, чем 8% масс., которое описано в литературе как предел, выше которого наблюдается цитотоксичность (Ahmadi et al., 2008). Таким образом, все последующие составы получали с учетом этого ограничения. Скрининг продолжили с хитозаном с большей величиной СД. Первые испытания проводили на основе низкомолекулярного хитозана с 95% СД. Растворы полимера получали всегда в 0,1N соляной кислоте, растворяя полимер при интенсивном перемешивании при 5°C или при 25°C.
После полного растворения полимера, добавляли остальные эксципиенты, добавляя β-GP только в конце. β-GP отвечал за увеличение значения pH, а затем, способствовал процессу гелеобразования. Первые испытания были сосредоточены на составах, на основе только хитозана и β-GP в различных сочетаниях относительных концентраций. Наблюдали, что при использовании высоких концентраций хитозана (2% или 3% масс.) и высоких концентраций β-GP (8% масс.), образование геля происходит уже при комнатной температуре, и в некоторых случаях также при 5°C.
При снижении концентрации любого из компонентов, состав остается жидким, даже после долгой инкубации при 37°C. Только в одном случае было отмечено образование геля, но через 2 часа инкубации при 37°C, слишком долгое время для целей этого исследования. Таким образом, для улучшения состава было необходимым добавление эксципиента. Выбрали гидроксиэтилцеллюлозу (ГЭЦ) как наиболее подходящий эксципиент и проводили дальнейший скрининг. Во время этой оценки, концентрация хитозана находилась в диапазоне от 1,5% масс. до 2% масс. и начальная концентрация ГЭЦ составляла 0,5% масс., но в этих условиях, раствор полимера становился гелем даже при комнатной температуре во время добавления β-GP, если его концентрация была выше 1,8% масс. Жидкий раствор, способный становиться гелем при 37°C после 13 минут инкубации, получили со следующей композицией: 1,5% масс. хитозана, 0,5% масс. ГЭЦ и 1,7% масс. β-GP.
9.3. Оптимизация состава (см. Таблицу 5)
В попытке улучшить этот состав, были проведены следующие испытания, сохраняющие концентрацию β-GP почти постоянной на уровне значений 1,65-1,7% масс., концентрация хитозана варьировала от 1,5% масс. до 1,8% масс. и количество ГЭЦ постепенно снижали до 0,1% масс.
При помощи этой стратегии выбрали несколько кандидатных составов. Однако исследование в этом направлении не продолжали, поскольку было выявлено, что эксципиент ГЭЦ может содержать загрязнитель, описанный как цитотоксическое вещество, и, с другой стороны, ответственный за изменение процесса гелеобразования в присутствии хитозана (Hoemann et al., 2007). Остальные эксципиенты, которые были протестированы в предыдущих экспериментах, такие как желатин или глюкозамин, не дали положительных результатов.
Затем начали работу по заключительному скринингу, с использованием трех типов хитозанового полимера, которые отличались по молекулярной массе и СД: высокомолекулярный хитозан с 75% СД, высокомолекулярный хитозан с 95% СД и низкомолекулярный хитозан с 95% СД. Также планировали работу на низкомолекулярном хитозане с 85% СД, но этот материал не был доступен до конца исследования. В этой работе каждый хитозан тестировали в трех установленных концентрациях, 1, 1,5 и 2% масс., и получали растворы полимера таким образом, чтобы конечные значения pH составляли 6,0, 6,5 и 7,0. Для того чтобы уменьшить количество β-GP, который использовали для повышения значения pH раствора, полимер растворили в 0,1N уксусной кислоте, вместо 0,1N HCl, использованной в предыдущих экспериментах. Также наблюдали за осмоляльностью конечного раствора и сохраняли ее ниже значения ~350 мОсм/кг. Таким образом, удаляли составы, которые требовали слишком большого количества β-GP для достижения желаемого pH, что приводило также к слишком высокому значению осмоляльности. В этих скрининговых тестах также исследовали вклад ионной силы, поскольку было описано, что присутствие солей может вносить положительный вклад в процесс гелеобразования (Filion et al., 2007).
2
4
Поскольку следует избегать натриевых солей из-за возможных взаимодействий с белком, выбрали KHPO и добавили к раствору полимера в конечной концентрации 1 мМ, 10 мМ или 50 мМ. Хитозан с 75% СД не дал положительных результатов и был полностью исключен. Также ВММ хитозан с 95% СД не дал положительных результатов: концентрации хитозана выше, чем 1% масс. требуют слишком большого количества β-GP для достижения установленных значений pH, что приводит к превышению установленного значения осмоляльности, и составы с 1% масс. не способны к формированию геля при 37°C. Два кандидатных состава выбирали из НММ хитозана с 95% СД, поскольку они проходят через переход золь-гель при 37°C, но получение этих растворов полимера было совершенно не воспроизводимо. Фактически, наблюдали, что время, необходимое для получения геля и физические макроскопические характеристики жидких растворов полимера значительно меняются в зависимости от времени, потраченного на растворение полимера, от скорости смешивания во время растворения полимера и во время смешивания эксципиентов и, наконец, от температуры и объема приготовленного раствора.
Такая высокая вариабельность результатов привела к решению прекратить исследования этого полимера.
Таблица 1Данные тестов на вводимость через шприц и поведение при переворачивании для систем Deg-XG/вода
Концентрация(% масс.)
Вводимость через шприц
Поведение при переворачивании
Время инъекции (сек/мл)
Остаточное количествов шприце (%)
5 мин
30 мин
60 мин
24 час
1
3,5
6,8
Текучесть
Текучесть
Текучесть
Текучесть
2
5,5
5,1
Текучесть
Нет текучести
Нет текучести
Нет текучести
3
9,4
5,5
Текучесть
Нет текучести
Нет текучести
Нет текучести
4
14,7
7,9
Нет текучести
Нет текучести
Нет текучести
Нет текучести
5
15,2
15,6
Нет текучести
Нет текучести
Нет текучести
Нет текучести
Таблица 2Данные вводимости через шприц для 3% масс. и 4% масс. Deg-XG, нагруженных FGF-18 в концентрации 54 мкг/мл
Система
Время инкубации при 25°C (час)
Время инъекции (сек/мл)
Остаточное количество в шприце (%)
3% масс.Deg-XG + FGF-18(54 мкг/мл)
0
11,6
5,5
1
10,7
7,2
2
13,0
7,3
4
11,1
8,1
4% масс.Deg-XG + FGF-18(54 мкг/мл)
0
13,2
6,4
1
10,9
6,6
2
19,5
9,7
4
18,7
12,3
Таблица 3Данные набухания-разрушения для систем Deg-XG, приготовленных на воде
Система
Ws(t)/Ws0 (%)
1 сутки
19 суток
27 суток
34 суток
45 суток
59 суток
4% масс. Deg-XG/H<sub>2</sub>O
106,6
90,1
80,7
78,8
75,8
71
5% масс. Deg-XG/H<sub>2</sub>O
96,4
86
78,5
75,8
69,8
66,2
Таблица 4Данные набухания-разрушения для систем Deg-XG, нагруженных FGF-18 в концентрации 54 мкг/мл (автоклавированных)
Система
Ws(t)/Ws0 (%)
5 сутки
9 суток
14 суток
16 суток
19 суток
22 суток
4% масс. Deg-XG + FGF-18540 мкг/мл
85,2
80,5
79,2
75,7
75
71,6
5% масс. Deg-XG + FGF-18 540 мкг/мл
84,8
81,3
80,5
78,1
75,1
74,8
4% масс. Deg-XG + FGF-1854 мкг/мл
79,7
78,3
76,3
73,3
72,5
70,3
5% масс. Deg-XG + FGF-1854 мкг/мл
84,3
78,5
78,5
77
76,6
74,7
Таблица 5Время гелеобразования при 37°C для выбранных составов на основе хитозана
Состав
ММ и СД хитозана
Хитозан(% масс.)
β-GP(% масс.)
ГЭЦ(% масс.)
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>(мМ)
pH
Осмоляльность(мОсм/кг)
Время гелеобразования
I
ВММ 75%
1,8
50
/
/
/
/
5 минут
II
ВММ 75%
2
6,9
/
/
7,2
/
2 часа
III
ВММ 75%
2
1,2
0,5
/
6,1
/
25 минут
IV
ВММ 75%
1,5
1,7
0,5
/
6,1
/
13 минут
V
ВММ 75%
1,5
1,6
0,25
/
6,2
/
19 минут
VI
ВММ 75%
1,6
1,6
0,25
/
6,3
/
30 минут
VII
ВММ 75%
1,8
1,5
0,5
/
6,3
/
12 минут
VIII
ВММ 75%
1,8
1,7
0,1
/
6,4
/
50 минут
IX
ВММ 95%
1,0
2,5
/
0
6,8
384
24 часа
X
НММ 75%
2,0
2,1
/
10
7,0
346
3 часа
XI
НММ 75%
2,0
2,5
/
10
6,9
379
2 часа
Ссылки
et al.
1. Ellsworth , 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320.
2. Shimoaka et al., 2002, JBC 277(9):7493-7500
3. WO2008023063
4. WO2004032849
5. WO2012172072
6. Ringe, J. et al. (2012) Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering, Nature Reviews Rheumatology, 8(8):493-498.
7. J.K. Tessmar, A.M. Göpferich, 2007, «Matrices and scaffolds for protein delivery in tissue engineering», Adv. Drug Delivery Rev. 59:274-291.
8. C. Lo Presti et al., 2011, Pulsatile protein release and protection using radiation-crosslinked polypeptide hydrogel delivery devices Reactive & Functional Polymers, 71: 155-167.
9. WO2008063418
10. C. Dispenza et al, 2011, “E-beam irradiation and UV photocrosslinking of microemulsion-laden poly(N-vinyl-2-pyrrolidone) hydrogels for “in situ” encapsulation of volatile hydrophobic compounds”, Polym. Chem., 2:192.
11. Rilton et al. 2011, “Degalatosylation of xyloglucan: effect on aggregation and conformation, as determined by time dependant static light scattering HPSEC-MALLS and viscosimetry”. Carbohydrate Polymers 83.
12. Shirakawa et al., 1998, “Tailoring of xyloglucan properties using an enzyme” Food Hydrocolloids 12.
13. WO98/16644
14. WO2006/063362
et al
15. Custers ., 2007, Osteoarthritis and Cartilage, 15:1241-1248.
16. Cheng et al., 2010, Tissue Engineering 16A:695-703
17. Schuetz et al., 2008, Eur. J. Pharm.Biopharm. 68:19-25
18. Yan et al., 2010, J.Biomat. Appl. 24:625-637
19. Ahmadi et al., 2008, J. Biomed. Mater. Res. 86A:824-832.
20. Hoemann et al., 2007, J. Biomed. Mater Res. 83A:521-529
21. Filion et al. 2007, Biomacromol. 8:3224-3234.