Бинарная каталитическая терапия - новый подход к контролю роста злокачественных опухолей с помощью высокореактивных радикалов кислорода

1 1

98 ЛЕКАРСТВЕННАЯ ТЕРАПИЯ

к УДК 616-006-085:577.164.2:615.015 G. K. Gerasimova, T. A. Sidorova, T. I. Solntseva, T. I. Suchova, E. V. Khorocheva, A. A. Egorova BINARY CATALYTIC THERAPY - A NEW APPROACH TO CONTROL OF MALIGNANT TUMORS GROWTH BY REACTIVE OXYGEN SPECIES N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT Mechanism of action of a new method for cancer treatment - binary catalytic system Theraphtal + ascorbic acid (Tp+AC) was investigated. Increase by Tp+AC of intracellular level of reactive oxygen species (ROS) and fall of glu-tathion level in cancer cell in vitro was shown. Tp has a specific site of binding on cell membrane which was identified as a1-adrenoreceptors. Tp can compete with specific ligands of these receptors. Binding of Tp with active a1-adrenoreceptors incresed intracellular level of cGMP and cAMP. Tp is the activator of human platelet soluble guanylyl cyclase. Modulation of cAMP- and cGMP-dependent signal pathways can clarify such side effects of Tp+AC as fall of arterial pressure and inhibition of platelet adhesion. These data give the basis for suggestion, that cytotoxic and antitumor effects of Tp+AC are connected not only with cell oxidative damage of ROS, but also with progressive changes in redox regulation of gene expression in some cancer cells. Key words: catalytic cancer therapy, teraphtal, ascorbic acid, mechanism of action. Г. К. Герасимова, Т. А. Сидорова, Т. И. Солнцева, Т. И. Сухова, E. В. Хорошева, А. А. Егорова БИНАРНАЯ КАТАЛИТИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ - НОВЫЙ ПОДХОД К КОНТРОЛЮ РОСТА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОРЕАКТИВНЫХ РАДИКАЛОВ КИСЛОРОДА ГУ РОНЦ им. НН Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ Исследован механизм действия нового метода лечения злокачественных опухолей - бинарной каталитической системы терафтал + аскорбиновая кислота (ТФ+АК). Установлено, что при действии ТФ+АК на опухолевые клетки in vitro увеличивается внутриклеточный уровень свободных радикалов кислорода (СР) и снижается содержание глютатиона. На мембране опухолевых клеток имеются специфические сайты связывания ТФ, которые идентифицированы как а1-адренорецепторы. Выявлена конкуренция ТФ со специфическими лигандами этих рецепторов. Связывание ТФ с функционально активными адренорецепторами повышает внутриклеточный уровень цГМФ и цАМФ. ТФ является также прямым активатором растворимой гуанилатциклазы, выделенной из тромбоцитов человека. Активация при действии ТФ+АК на клетки цАМФ- и цГМФ- сигнальных путей объясняет такие побочные эффекты этого метода лечения, как снижение артериального давления и агрегации тромбоцитов, а также дает основания для заключения о том, что механизм цитотоксического и противоопухолевого действия каталитической терапии ТФ+АК связан не только с повреждающим действием на клетки образующихся СР, но и с вмешательством в механизмы редокс регуляции экспрессии генов, контролирующих рост некоторых видов злокачественных опухолей. Ключевые слова: каталитическая терапия рака, терафтал, аскорбиновая кислота, механизм действия. ч

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

ВВЕДЕНИЕ

Исследования возможности применения комплексов кобальта в сочетании с аскорбиновой кислотой (АК) для подавления роста злокачественных опухолей были начаты в середине 1990 гг. Основанием для такого подхода служили данные о том, что эти соединения в химических (бесклеточных) системах при физиологических значениях рН и температуры катализируют автоокисление АК и, возможно, других природных восстановителей c образованием свободных высокореактивных радикалов кислорода (СР) [2]. В результате проведенной работы большого коллектива исследователей под руководством члена-корреспон-дента РАН Г. Н. Ворожцова был создан препарат те-рафтал (4,5-октакарбоксифталоцианин кобальта (II)), который при сочетанном применении с АК в условиях in vitro — in vivo вызывал цитотоксический и противоопухолевый эффекты [4; 10]. Другая система с таким же эффектом была создана на основе оксикобаламина (витамина B12b) и АК [3]. Этот метод контроля роста опухолей получил название бинарная каталитическая терапия и в настоящее время проходит II фазу клинических испытаний [5].

До недавнего времени как основная гипотеза биологических эффектов СР рассматривалось их повреждающее действие, приводящее к развитию в клетках состояния окислительного стресса, повреждению ДНК, белков, мутагенезу, дегенеративным процессам и гибели клеток [14]. С этой позиции оценивались и данные о противоопухолевых эффектах воздействий, результатом которых было повышение в клетках уровня высокореактивных СР кислорода. Так, при действии на опухолевые клетки B12b и АК обнаружено образование и накопление двунитевых фрагментов ДНК, сопоставимое по величине с индуцируемой гамма-облучением (150 Гр) деградацией ДНК [1; 6]. В то же время при действии этой же каталитической системы показано, что развитие окислительного стресса, сопровождающееся повреждением митохондрий и внутриклеточным образованием пероксида водорода (Н2О2), является, скорее, следствием, а не причиной апоптотической гибели клеток [1].

В последние годы появились данные о том, что СР могут выполнять роль вторичных мессенджеров в сигнальных путях, усиливая передачу сигнала от различных мембранных рецепторов, в том числе ответственных за такие физиологические функции, как регуляция тонуса сосудов, агрегация тромбоцитов, продукцию цитокинов и др. [14].

В лаборатории биохимической фармакологии НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН проведен комплекс исследований механизма действия каталитической системы ТФ+АК, результаты которого позволяют по-новому оценить противоопухолевые и побочные эффекты каталитической системы, выявленные на доклиническом и клиническом этапах изучения этого метода лечения злокачественных опухолей.

Основные задачи исследования:

1) установить, образуются ли внутриклеточные свободные радикалы в опухолевых клетках при действии каталитической системы ТФ+АК;

2) оценить влияние каталитической системы на уровень внутриклеточного глютатиона;

3) оценить влияние ТФ и ТФ+АК на цАМФ-и цГМФ-зависимые сигнальные пути опухолевых клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Внутриклеточный уровень свободных радикалов кислорода (гидроксил радикал, оксид радикал и перекись водорода) оценивали с помощью флюоресцентного зонда - дихлорофлюоресцеин диацетата (H2DCFDA, Sigma) [15]. Интенсивность флюоресценции зонда (Ifl) измеряли на спектрофлюориметре Hitachi F4010 при длине волны возбуждения флюоресценции Ex=485 нм и испускания флюоресценции Em=530 нм. Зонд H2DCFDAв конечной концентрации 10-5 М вносили в лунку планшета с клетками рака яичника человека линии СaOv в экспоненциальной фазе роста клеток (37 оС, 18 ч) и инкубировали 30 мин при 37 оС. Затем клетки отмывали, вносили свежую питательную среду и добавляли каталитическую систему ТФ+АК. В качестве позитивного контроля за образованием радикалов использовали Н2О2. Базальный уровень радикалов определяли в клетках без препаратов. После внесения ТФ+АК клетки инкубировали 2 ч, в контрольное время отмывали их раствором Хэнкса и определяли If зонда. Общий внутриклеточный глу-татион (окисленный и восстановленный) определяли ферментным методом [11].

Внутриклеточный уровень цАМФ определяли с помощью стандартных наборов “Biotrak cAMP”, протокол 3 (производство “Amersham”) по конкуренции между немеченым цАМФ и фиксированным количеством цАМФ-меченой пероксидазы за ограниченное количество мест связывания на цАМФ-специфичес-ких антителах.

Содержание в пробах цГМФ, синтезированного растворимой гуанилатциклазой в ходе ферментативной реакции [13], определяли с помощью фермент-связанного иммуносорбентного метода (ELISA), используя коммерческие наборы фирмы Bioimmunogen (Россия). Результаты экспериментов представлены в виде удельной активности фермента, выраженной в единицах пикомоль цГМФ/мг белка/мин.

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Каталитическая система ТФ+АК индуцирует образование свободных радикалов в опухолевых клетках in vitro

Уровень СР в клеточной системе при действии каталитической пары ТФ+АК изучали на клетках карциномы яичника человека СаО^ чувствительной к ее действию [4]. В клетках СаОv выявлен небольшой уровень флюоресценции зонда, что свидетельствует о наличии в клетках базального уровня СР. При добав-

лении к клеткам Н202 (контроль на образование радикалов) Ifi зонда постепенно увеличивался и достигал максимума через 105 мин инкубации (рис. 1). Примерно такая же кинетика изменения If! зонда наблюдалась и при инкубации клеток с каталитической парой ТФ+АК. Так, максимальное повышение флюоресценции (в 6 раз по сравнению с исходным уровнем) наблюдалось также через 105 мин при концентрации ТФ (10-6М) + АК (10-5М), минимальное (в 2 раза) при концентрациях ТФ (10-4М) + АК (10-3М). Таким образом, показано, что в опухолевых клетках каталитическая система ТФ+АК генерирует СР кислорода, уровень образования которых зависит от концентрации компонентов.

- 10-4МН202  10-4МТФ:10-ЗАК

- -А- 10-5 М ТФ: 10-4 АК И 10-6М ТФ: 10-5 АК

Рис. 1. Кинетика образования свободных радикалов в опухолевых клетках СаОу при действии Н202 и каталитической пары ТФ+АК:

по оси ординат - уровень радикалов (% от уровня в “нулевой” точке);

по оси абсцисс - время

2. Влияние каталитической системы ТФ+АК на внутриклеточный уровень глютатиона

Высокая внутриклеточная концентрация глютатиона (вВН) и других соединений (редокс реактивных

сульфгидрильных групп некоторых белков) создают мощную ловушку радикалов и способствуют их дезактивации, что поддерживает редокс гомеостаз в клетках и тканях. Поскольку каталитическая система ТФ+АК повышает внутриклеточный уровень СР, то можно предположить, что при ее действии может нарушаться редокс гомеостаз в опухолевых клетках. Исследования на клетках асцитной опухоли Эрлиха (А0Э) in vitro показали, что при добавлении к клеткам одного ТФ уровень GSH снижается, причем в концентрации 10-6 М в большей степени (43 % по сравнению с контролем), чем ТФ в концентрации 10-5 М (18 %). Введение в клеточную суспензию только АК приводит к резкому повышению уровня GSH: при концентрации АК 10-5М — в 2,2 раза, а при концентрации АК 10-4М в — 5,75 раз (табл. 1). Каталитическая система ТФ (10-5М) +АК (10-4М) повышает уровень GSH в 3,9 раз, а при концентрации ТФ (10-6М) + АК(10-5М) отмечено снижение его уровня на 53 %. Таким образом, высокая концентрации АК (10-4М) в каталитической системе in vitro препятствует снижению уровня GSH. АК в концентрации 10-5М в каталитической паре не препятствует действию ТФ (см. табл. 1). Клетки А0Э in vitro чувствительны к действию ТФ+АК. При воздействии каталитической пары ТФ (10-6М) + АК (10-5М) наблюдалось снижение жизнеспособности клеток на 60 % на фоне снижения уровня GSH в 2 раза по сравнению с контролем.

Таким образом, цитотоксическое действие каталитической пары ТФ+АК наблюдается на фоне значительного снижения уровня GSH в клетках. При этом большая эффективность воздействия отмечена при более низких концентрациях ТФ и АК. Повышение концентрации АК в каталитической паре значительно снижает этот эффект.

3. Влияние ТФ и ТФ+АК на цАМФ- и цГМФ-за-висимые сигнальные пути опухолевых клеток

3.1. Связывание ТФ с а1-адренэргическими рецепторами (а1-АРц) опухолевых клеток

Радиолигандным методом с использованием 3H празозина — специфического блокатора а1-АРц — установлено, что на мембране опухолевых клеток гепа-

Таблица 1

Содержание глютатиона в клетках АОЭ при действии каталитической системы ТФ+АК

Условия опыта Содержание глутатиона нмоль/мг белка

контроль 36,0 ± 1,8

ТФ кг5 м 29,5 ± 1,5

АК ю^м 207,1 ± 10,3

ТФ 10'5 М + АК 10'4 м 140,4 + 7,0

ТФ 10'6 м 20,6 ± 1,2

АК 10'5 М 82,5 ± 4,0

ТФ 10'6 М + АК Ю'5 М 17,0 ± 0,9

томы крысы линии МсАИИ 7777 существуют сайты связывания блокатора [9]. Эти сайты были охарактеризованы: рассчитаны величины констант диссоциации (Кё) и максимальные числа мест связывания на клетку (Bmax) для 3Н празозина. На мембране клеток выявлены два типа а1-АРц с высоким и низким сродством к специфическому лиганду. Установлено, что ТФ конкурировал с 3Н празозином за места связывания, локализованные на поверхности клеток (рис. 2). Полученные значения Кё и Bmax сайтов связывания для 3Н ТФ совпадали с таковыми для 3Н празозина (табл. 2). Одновременное добавление к клеткам празозина и ТФ не выявило аддитивности в величине их связывания с рецепторами (Bmax). Все эти факты позволили сделать вывод об идентичности мест связывания ТФ и празозина, и эти сайты связывания идентифицированы как а1-АРц. Характеристики а1-АРц были рассчитаны по методу Скетчарда, исходя из предположения, что один рецептор связывает одну молекулу лиганда. Однако из литературы известно, что рецепторы в определенных условиях способны присоединять две молекулы лиганда. Для уточнения стехиометрии изучаемого процесса все экспериментально полученные кривые насыщения были проанализированы по одно- и двусай-товым моделям связывания с помощью компьютерной программы “Graphpad Prizm Software (version 4, San

Рис. 2. Конкуренция 3Н празозина [1,3 пМ] и ТФ за связывание с клетками гепатомы крысы МсАЯН7777: по оси ординат - связывание ^рт); по оси абсцисс - логарифм концентрации ТФ

Diego, CA, USA) с последующим сравнением обеих моделей по F тесту. Результаты анализа подтвердили односайтовый механизм взаимодействия ТФ с а1-АРц клеток гепатомы и неприменимость к данному процессу двусайтовой модели. Таким образом, стехиометрия связывания ТФ с а1-АРц на поверхности опухолевых клеток составляет 1:1.

3.2. Связывание ТФ с fi-адренэргическими рецепторами (в-АРц) опухолевых клеток

Определение равновесных кинетических параметров в-АРц клеток гепатомы крысы линии McARH 7777 проводили радиолигандным методом по конкуренции специфического в-блокатора 3Н-дигидроальпренелола (3Н-ДНА) с избытком холодного DL-пропранолола без добавления ТФ, а также после 15 мин предынкубации клеток с ТФ (10-5 М) или ТФ (10-5 М) + АК (10-4 М) [12]. На мембране клеток гепатомы выявлены и охарактеризованы /3-АРц (табл. 3). Под действием ТФ (10-5 М) максимальное число высокоаффинных в-АРц оставалось неизменным, но их сродство к 3Н-ДНА увеличивалось в среднем в 1,6 раза. При действии каталитической системы ТФ+АК сродство к в-блокатору резко возрастало (Кё для 3Н-ДНА снижалось в 4 раза по сравнению с контрольными клетками), и при этом выявлено появление низкоаффинных мест связывания блокатора. Изменение кинетических характеристик в-АРц при действии каталитической системы ТФ+АК в сторону повышения сродства к природным лигандам этих рецепторов может привести к активации контролируемых ими сигнальных путей.

3.3. Исследование сопряженности а1-АРц и в-АРц с системой гуанилатциклазы и аденилатциклазы

Необходимым условием реализации действия лигандов через эти рецепторы является сопряженность мембранных рецепторов с эффекторными белками, в частности, ферментами гуанилат- и аденилатцикла-зами, продуктами которых являются циклические нуклеотиды цГМФ и цАМФ. Установлено, что в клетках К562 10-7М клонидина (агонист а1/а2-адренорецепто-ров) и ТФ (10-7 — 10-6М ) вызывают повышение базального уровня цГМФ, что свидетельствует о полноценности функционирования в данных клетках системы фермента гуанилатциклазы (табл. 4).

Такой же эффект наблюдали на клетках CaOv. Добавление ТФ к опухолевым клеткам CaOv увеличивало внутриклеточный уровень цГМФ. Специфический

Таблица 2

Кинетические параметры специфического связывания терафтала с природными а1-адренорецепторами клеток гепатомы крысы МсАИН7777

Высокоаффинные сайты Низкоаффинные сайты

Kd ТФ = Kdpz = 2 X Ю'11 М Kd ТФ= Kd pz < 2 X 10“1ОМ

В max = 9 ООО рец/ кл Bmax < 25 ООО рец/ кл

Таблица 3

Эффекты ТФ и ТФ+AK на кинетические параметры $-АРц клеток линии McARH7777

Клетки без препаратов Клетки + ТФ

Kd=8xl0'nM Bmax=(3 5±9)х 103 рец/кл Kd =(4,9 ± 0,9)х10'п М Втах=(30 + 1)х103 рец/кл Kd=(2,3±l,2)xl0-UM Bmax=36xl03 рец/кл Kd =(24,7 ±5,2 ) х10"пМ Втах=(27,5+1,5)х103 рец/кл

Таблица 4

Изменение внутриклеточного содержания цГМФ под действием клонидина и ТФ в клетках эритролейкоза человека линии К-562

Лиганд Концентрация, М Внутриклеточный уровень цГМФ

Клонидин 10'7 10'6 -10'5 80,0 5,0

ТФ 10'7 60,0

10'6 50,0

Без лиганда 5,0

блокатор а1-АРц празозин блокировал этот эффект. Это свидетельствует о том, что изучаемые а1-АРц функционально активны, т.е. сопряжены с системой циклических нуклеотидов. Такой же эффект ТФ выявлен на клетках эритролейкоза человека линии К562, чувствительного in vitro к воздействию ТФ+АК.

Таким образом, в клетках с функционально активными а1-АРц ТФ стимулирует синтез вторичного мессенджера цГМФ. Следствием этого эффекта может быть изменение функциональной активности систем, регулируемых цГМФ: блокада проходящего по цГМФ зависимому пути митогенного сигнала, а также гипотензивный эффект из-за конкуренции ТФ за общие а1-АРц с катехоламинами, гиперпродукция которых характерна для опухоли надпочечников феохромоцитомы.

Сопряжение в-АРц с системой аденилатциклазы и действие ТФ на внутриклеточный уровень цАМФ оценены на клетках аденокарциномы человека линии CaOv. Показано, что в присутствии L-изопротеренола, неселективного полного агониста в-АРц в диапазоне концентраций (10-8-10-5М) наблюдается увеличение базального уровня цАМФ в клетках, и максимальная концентрация циклического нуклеотида (250фмо-лей/104 клеток) достигается при концентрации агониста 10-7М (см. рис. 3). При этом наблюдается «колоколообразная» кривая продукции цАМФ, что характерно

300

250 -

200 -

150 -

100 -

50

Г

-8

/Ї-J і.

ТФ

Базальный

-7

-6

-5

Рис. 3. Влияние Ь-изопротеренола (Ь-Ьо) и ТФ на базальный уровень цАМФ в клетках рака яичника человека линии СаОу;

по оси ординат - внутриклеточный уровень цАМФ(фмоль/104 клеток);

по оси абсцисс - логарифм концентрации препарата

для взаимодеиствия с рецепторами лигандов — типичных полных агонистов. Добавление ТФ к клеткам также сопровождалось увеличением базального уровня цАМФ. Кривая образования цАМФ носила колоколообразный характер с максимальным уровнем циклического нуклеотида при концентрации лиганда 10-7М. Однако в отличие от Ь-изопротеренола, полного агониста в-АРц, в присутствии ТФ уровень цАМФ оказался ниже (170 фмоль/104 клеток). Несмотря на то, что увеличение уровня цАМФ в присутствии ТФ начинается при более высокой концентрации препарата (>10-8 М) по сравнению с концентрацией стандартного агониста, максимум концентрации цАМФ в клетках в присутствии каждого из лигандов наблюдается при одной и той же их концентрации в среде (10-7 М). Эти результаты свидетельствуют в пользу более низкой эффективности ТФ по сравнению с изопротеренолом в системе регуляции внутриклеточного содержания цАМФ через в-АРц.

Таким образом, установлено, что в клетках карциномы яичника человека линии СаОу система в-АРц сопряжена с аденилатциклазой. Связывание ТФ с данным типом рецепторов приводит к повышению внутриклеточного уровня цАМФ, что, вероятно, обусловлено усилением функциональной активности фермента.

Итак, в исследованных опухолевых клетках (СаОу К562) мембранные адренергические рецепторы функционально сопряжены с эффекторными белками аде-нилат- и гуанилатциклазами и участвуют в регуляции внутриклеточного уровня вторичных мессенджеров — цАМФ и цГМФ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ТФ является неспецифическим положительным агонистом как в-, так и а1-АРц, взаимодействие с которыми сопровождается увеличением внутриклеточного уровня циклических нуклеотидов. При сочетанном применении ТФ и АК эти эффекты ТФ существенно усиливаются.

3.4. Влияние ТФ на растворимую гуанилатциклазу (рГц) тромбоцитов человека

рГЦ, локализованная в цитозоле многих клеток, синтезирует из 1 моля ГМФ 1 моль цГМФ. Контролируемые этим вторичным мессенджером сигнальные

пути вносят вклад в регуляцию различных физиологических процессов, включая поддержание тонуса гладких мышц сосудов, некоторых механизмов свертывания крови (агрегация тромбоцитов).

Влияние ТФ и каталитической системы ТФ+АК на активность рГЦ в образцах, выделенных из тромбоцитов 5 здоровых доноров, изучали в сравнении с эффектами нитропруссида натрия (8№), известного активатора изучаемого фермента. Установлено, что во всех 5 образцах рГЦ была функционально активна: уровень продукции цГМФ составлял от 50 до 138 пикомоль/мг белка/мин. При действии непосредственно на фермент как ТФ, так и наблюдается усиление продукции цГМФ, превышающее базальную активность фермента в 2 - 4 раза (табл. 5). Кривая активации фермента при действии ТФ (10-9 - 10-4 М) имеет выраженный «колоколообразный» характер. Максимум активности фермента в присутствии ТФ наблюдается при концентрации препарата 10-6М (рис. 4).

-9 -8 -7 -6 -5 -4

Рис. 4. Влияние ТФ на активность рГц, выделенной из тромбоцитов человека (доноры 1 и 2):

по оси ординат - активность фермента (пикомоль цГМФ/мг белка/мин);

по оси абсцисс - логарифм концентрации ТФ

Таблица 5

Базальная и индуцированная препаратами активность рГц тромбоцитов человека

Образцы Активность рГЦ, пикомоль цГМФ/мг белка/мин

рГЦ от базальная Индуцированная препаратом

БЫР, ЮмкМ Степень активации * ТФ, 1мкМ Степень активации*

1. 138 372 2,7 552 4,0

2. 123 380 3,0 320 2,6

3. 113 360 3,2 340 3,0

4. 52 317 6,0 98 1,9

5. 60 374 6,2 96 1,6

*Степень активации = Индуцированная активность/базальная активность

1 1

104 ЛЕКАРСТВЕННАЯ ТЕРАПИЯ

к В литературе стали появляться сведения о том, что ОБСУЖДЕНИЕ изменения окислительно-восстановительного (редокс) Цитотоксический эффект каталитической системы гомеостаза в клетках могут влиять на экспрессию не-ТФ (катализатор) + АК связывают со СР, образующи- которых генов [13]. Известны данные о том, что гидро-мися в ходе катализируемой ТФ реакции окисления ксильный радикал является физиологическим регуля-АК [2]. В бесклеточных системах показано, что основ- тором рГЦ и, следовательно, может влиять на образо-ным маршрутом исследуемого каталитического про- вание факторов транскрипции - конечных продуктов цесса в присутствии ТФ является окисление АК моле- сигнальных путей. Исследуя влияние ТФ и каталити-кулярным кислородом до дигидроаскорбиновой с об- ческой системы ТФ+АК на цАМФ- и цГМФ- зависи-разованием Н2О2 [7]. Промежуточные продукты мые сигнальные пути, мы установили, что ТФ более радикального характера (супероксид-радикал О2-. или менее селективно связывается с а1-АРц и в-АРц, и аскорбат радикал) не выходят за пределы координа- вызывая изменения их характеристик в сторону повы-ционной сферы иона кобальта и не идентифицируют- шения чувствительности рецептора к специфическо-ся в реакционной среде. Образовавшийся Н2О2 му лиганду. Этот эффект усиливается при введении взаимодействует с ТФ, что сопровождается образова- АК. Выявлена также конкуренция ТФ с природным нием высокореактивных радикалов ОН*. Положение лигандом за связывание с а1-АРц. При воздействии на максимума на кинетических кривых образования опухолевые клетки ТФ и ТФ+АК наблюдается усиле-Н2О2 в бесклеточной системе совпадает с полным ис- ние продукции циклических нуклеотидов. Более того, черпанием в реакционном объеме АК, после чего уро- рГЦ тромбоцитов, синтезирующая цГМФ, активиру-вень Н2О2 в системе снижается. В то же время кривая, ется при непосредственном действии на фермент характеризующая изменение концентрации ОН*, пока- ТФ. Полученные нами данные показывают, что гене-зывает рост, продолжающийся и при снижении уровня рируемые в присутствии ТФ и каталитической систе-Н2О2. Рассматривая полученные результаты с точки мы СР усиливают прохождение сигналов по цАМФ-зрения химических основ каталитической терапии ра- и цГМФ- зависимым сигнальным путям, регулирую-ка, авторы делают вывод о том, что основными цито- щим такие функции, как поддержание тонуса гладкой токсическими агентами в системе ТФ + АК являются мускулатуры сосудов и, следовательно, артериальное Н2О2 и ОН*. Их концентрация сопоставима с концент- давление в организме, процесс агрегации тромбоци-рацией в системе АК, а способность разрушать биоло- тов. Действительно, при доклинических и клиничес-гические структуры хорошо известна. ких исследованиях переносимости и противоопухоле-Проведенные исследования показали, что катали- вой эффективности каталитической терапии ТФ+АК тическая система ТФ+АК генерирует СР кислорода не выявлены такие побочные эффекты, как снижение ар-только в химических системах, но и в опухолевых териального давления при ведении ТФ, умеренные из-клетках, растущих в культуре. Исследованные нами менения в системе гемостаза: у 60-70% больных отме-клетки опухолей (рак яичника человека СаОу, асцит- чено снижение концентрации фибриногена и агрега-ный рак Эрлиха мышей) имеют определенный базо- ционных свойств тромбоцитов [5; 8]. Нами показано, вый уровень СР кислорода, который увеличивается что эти эффекты ТФ на клетках-мишенях, выполняю-при воздействии на клетки ТФ+АК. Кинетика этого щих специфические функции, реализуются через АРц процесса, оцениваемого по усилению флюоресценции и сопряженную с ними систему циклических нуклео-зонда, совпадает с кинетикой образования СР при воз- тидов. АК усиливает эти эффекты ТФ, очевидно, действии на клетки Н2О2. Известно, что в присутствии вследствие усиления продукции СР. восстановленных переходных металлов (например, Роль СР в биологии опухолевых клеток в настоя-железа, меди) Н2О2 может конвертироваться в высоко щее время интенсивно изучается. реактивный гидроксильный радикал (ОН*). Нами по- Известно, что препараты, повышающие в них казано, что, несмотря на многоступенчатую антиокси- уровень циклических нуклеотидов, обладают проти-дантную систему, этот процесс происходит и в опухо- воопухолевым эффектом. Противоопухолевый эф-левых клетках в присутствии содержащего Со фтало- фект каталитической системы ТФ+АК в виде миницианина и АК при концентрациях компонентов, мальных регрессий и стабилизации процесса выяв-вызывающих цитотоксический эффект. лен у больных с исчерпанными возможностями Высокая внутриклеточная концентрация в8Н терапии при раке надпочечников, почек, злокачест-и других соединений (редокс реактивных сульфгид- венном карциноиде, метастазах в печени [5; 8]. Выяв-рильных групп некоторых белков), активность фер- ленное нами повышение уровня цАМФ и цГМФ при ментов каталазы и супероксиддисмутазы создают действии ТФ+АК также может быть одним из меха-мощную систему антиоксидантной защиты, что позво- низмов контроля роста опухолей, митотический си-ляет поддерживать редокс гомеостаз в клетках и тка- гнал которых реализуется через эти сигнальные пунях. Нами показано, что цитотоксическое действие ка- ти. Полученные нами данные дают основание для за-талитической пары ТФ+АК наблюдается на фоне сни- ключения о том, что механизм цитотоксического жения уровня в8Н в клетках. Этот эффект также и противоопухолевого действия каталитической тера-подтверждает свободнорадикальный механизм цито- пии ТФ+АК связан не только с повреждающим дей-токсического действия каталитической системы. ствием на клетки образующихся СР, но и с вмеша- ч

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1

ЛЕКАРСТВЕННАЯ ТЕРАПИЯ 105

>- тельством в механизмы редокс регуляции экспрессии окислении аскорбиновой кислоты комплексов фтало-генов, контролирующих рост некоторых видов злока- цианинов с переходными металлами // Вестник РОНЦ чественных опухолей. им. Н. Н. Блохина РАМН. - 2000. - № 4. - С. 3-8. 5. Манзюк Л. В., Бредер В. В., Гершанович М. Л. ВЫВОДЫ и др. Результаты I-II фазы клинических испытаний ка- 1. Бинарная каталитическая система Тераф- талитической системы «терафтал+аскорбиновая кис-тал+аскорбиновая кислота при действии на опухоле- лота» // РБЖ. - 2005. - Т. 4, № 1. - С. 105-107. вые клетки повышает внутриклеточный уровень сво- 6. Медведев А. И., Акатов В. С., Евтодиенко бодных радикалов кислорода и снижает содержание Ю. В. и др. Деградация и репарация ДНК в клетках глютатиона, что свидетельствует о ее влиянии на окис- эпидермоидной карциномы гортани человека НЕр-2 лительно - восстановительный гомеостаз в клетках. при совместном действии витамина В12Ь и аскорбино- 2. Терафтал имеет на мембране опухолевых вой кислоты // Цитология. - 2001. - Т. 43, № 3. - С. клеток специфические сайты связывания, идентифи- 274-277. цированные как а1- и в-адренорецепторы. Клетки, со- 7. Петрова Е. Г., Борисенкова С. А., Калия О. Л. держащие на мембране функционально активные Окисление аскорбиновой кислоты в присутствии фта-адренорецепторы, т.е. сопряженные с эффекторными лоцианиновых комплексов металлов и химические ас-белками (гуанилатциклазой и аденилатциклазой) пекты каталитической терапии рака. Сообщение 2. цАМФ- и цГМФ-зависимых сигнальных путей, явля- Катализ октакарбоксифталоцианином кобальта. Про-ются мишенями для каталитической системы ТФ+АК. дукты реакции // Известия Академии наук. Серия хи- 3. Модуляция активности цАМФ- и цГМФ-зави- мическая. - 2004. - № 10. - С. 2224-2227. симых сигнальных путей свободными радикалами 8. Патютко Ю.И., Гальперин Э.И., Сагайдак И. В. кислорода при действии на клетки-мишени каталити- и др. Результаты 1 фазы клинических испытаний по ческой системы ТФ+АК вносит существенный вклад применению каталитической системы терафтал + ас-в механизм цитотоксического и противоопухолевого корбиновая кислота при селективно-окклюзионном действия каталитической терапии ТФ+АК, а также та- введении в сосуды печени для лечения больных со зло-ких ее побочных эффектов, как снижение артериаль- качественными опухолями печени // РБЖ. - 2006. - Т. ного давления, снижение концентрации фибриногена, 5, № 1. - С. 18-19. а также агрегационных свойств тромбоцитов. 9. Солнцева Т. И., ВласенковаН. К., Герасимова Г. К. Высокоаффинные а1-адренорецепторы - молекуляр-Работа выполнена при поддержке НТП «Разра- ная мишень специфического связывания терафтала // ботка и практическое освоение в здравоохранении но- РБЖ. - 2003. - № 1. - С. 42. вых методов и средств профилактики, диагностики 10. Сыркин А. Б., Жукова О. С,. Кикоть Б. С. и др. и лечения онкологических, инфекционных и других Терафтал - новый препарат для бинарной каталитиче-опасных заболеваний». ской терапии злокачественных опухолей // Рос. хим. журнал. - 1998. - Т. XLII, № 5. - C. 140-146. ЛИТЕРАТУРА 11. Baker et al. Micro-glutathione assay // Anal. 1. Акатов В. С., Соловьева М. Е., Лещенко В. В., Biochem. -1990. - Vol. 190. - P. 360. Теплова В. В. Окислительный стресс в клетках карци- 12. Belousova A. K., Solntseva T. I., Shulepova номы гортани человека НЕр-2 в результате действия T. S. The role of a plasma membrane in the mechanisms сочетания витаминов B12b и С // БЭБМ. - 2003. - Т. of antitumor drug action. Receptor and transport sys-136. - №9. - С. 318-321. tems // Sov. Med. Rev. - Oncology. - 1992. - Vol. 4. - 2. Борисенкова С. А., Гиренко Е. Г., Калия О. Л. P. 1-52. Механизм окисления аскорбиновой кислоты и пробле- 13. Garbers D. L., MuradF. Guanylate cyclase assay мы каталитической (темновой) терапии рака // Росс. methods // Adv. Cyclic Nucleotide Res. - 1979. - Vol. 10. Хим. журн. - 1998. - Т. 42, № 5. - С.111-115. - P. 57-67. 3. Вольпин М. Е., Крайнова Н. Ю., Левитин И. Я. 14. W.Droge. Free radicalsin the physiological control и др. Соединения ряда В12 в сочетании с аскорбиновой of cell function // Physiol. Rev. - 2002. - Vol. 82. - P. 47-95. кислотой как потенциальные противоопухолевые 15. LeBel CP, Ischiropoulos H, Bondy SC. Evaluation агенты // Рос.хим. журн. - 1998. - Т.42., №5. - of the probe 2’,7’-dichlorofluorescin as an indicator of С.116-127. reactive oxygen species formation and oxidative stress // 4. Герасимова Г. К., Жукова О. С., Иванова Т. П., Chem. Res. Toxicol. - 1992. - Vol. 5 - Р. 227-231. Власенкова Н. К. Исследование цитотоксического потенциала каталитической системы, основанной на Поступила 08.08.2006. ч

№3/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1