Взаимодействие фитолектинов с мембранами энтероцитов тощей кишки как этиологический фактор гипомикроэлементозов

6. Устройство для изучения всасываемости веществ кишечником животных: пат. 111427 Российская Федерация. МПК A61D 99/00 / Ю.К. Коваленок, Г.Г. Щербаков, А.А. Груздков, Л.В. Громова, А.В. Богомольцев; заявитель Коваленок Юрий Казимирович (BY). - № 2011131486/13; заявл. 28.07.11; опубл. 20.12.2011 // Бюллетень. - № 35. - 2 с.

7. Bunzel, M. Chemical Characterization of Klason Lignin Preparations from Plant-Based Foods / M. Bunzel, A. SchuBler, G. Tchetseubu Saha // J Agric Food Chem. - 2011. -Dec 14; 59 (23). - P. 12506-12513.

8. Effects of denaturation and amino acid modification on fluorescence spectrum and he-magglutinating activity of Hericium erinaceum Lectin / M. Gong [et al.] // Acta Biochim Bio-phys Sin (Shanghai). - 2004. - Vol. 36. - №2. 5. - Р. 343-350.

9. Goldstein, I.J. Isolation, physicochemical characterization, and carbohydrate-binding specificity of lectins / I. J. Goldstein, R. D. Porez // The Lectins: Properties, Functions, and Applications in Biology and Medicine / I.E. Liener, N. Sharon, I.J. Goldstein. - Orlando: Academic Press, 1986. - Р. 33-243.

10. Higuchi, M. Growth inhibition and small intestinal lesions in rats after feeding with isolated winged bean lectin / M. Higuchi, I. Tsuchiya, K. Iwai // Agrie. Biol. Chem. - 1984. -Vol. 48. - № 3. - Р. 695-701.

11. Lectin-mediated drug delivery: influence of mucin on cytoadhesion of plant lectins in vitro / M. Wirth [et al.] // J. Control Release. - 2002. - Vol. 79. - P. 183-191.

12. Lorenzsonn, V. In vivo responses of rat intestinal epithelium to intraluminal dietary lectins / V. Lorenzsonn, W. A. Olsen // Gastroenterology. - 1982. - Vol. 82. - Р. 838-848.

13. Maize-Glucosidase-aggregating Factor Is a Polyspecific Jacalin-related Chimeric Lec-tin, and Its Lectin Domain Is Responsible for -Glucosidase Aggregation / Farooqahmed S. Kittur [et al.] // Journal of biological chemistry. - 2007. - Vol. 282. - № 10. - Р. 72997311.

14. Oliveira, A.C. Lesions of intestinal epithelium by ingestion of bean lectins in rats / A.C. Oliveira, B.C. Vidal, V.C. Sgarbier // J. Nutr. Sci. Vitaminol. - 1989. - Vol. 35. - № 4. -Р. 315-322.

15. Soybean protein isolate and soybean lectin inhibit iron absorption in rats / Hisayasu Sanae [et al.] // J. Nutr. - 1992. - Vol. 122. - P. 1190-1196.

16. The interaction between plant lectins and the small intestinal epithelium: a primary cause of intestinal disturbance / M. J. Kik [et al.] // Vet Q. - 1989. - Apr. 11 (2). - P. 108-115.

УДК 619:616.391

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФИТОЛЕКТИНОВ С МЕМБРАНАМИ ЭНТЕРОЦИТОВ ТОЩЕЙ КИШКИ КАК ЭТИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКТОР ГИПОМИКРОЭЛЕМЕНТОЗОВ

Ю.К. КОВАЛЕНОК УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» г. Витебск, Республика Беларусь, 210026

Введение. Для успешного решения актуальных вопросов производства животноводческой продукции необходимы глубокие исследования в области биохимии и, в частности, молекулярной биологии. Прогресс и достижения в этой области науки тесно связаны с развитием новых методов исследований [1-3]. Одним из них является изучение особого класса белков - лектинов. Эти белки являются одним из эволюционно выработанных растениями защитных факторов, позволяющих растительному организму противостоять различного рода не-

благоприятным воздействиям [6, 9, 10]. Лектины - это белки, не относящиеся к классу иммунных и ферментных белков, способные к обратимому связыванию с углеводной частью гликоконъюгатов без нарушения ковалентной структуры любых из узнаваемых гликозильных лигандов. В основе образования комплекса лектин-гликолиганд лежит явление комплементарности, т. е. пространственного соответствия молекул лектина и углеводного детерминанта друг другу [5]. Благодаря своей способности к комплексообразованию с углеводами, в том числе и с углеводными детерминантными системами любых цитоплазмати-ческих мембран, лектины вызывают реакции агглютинации, преципитации, а также биологический ответ системы, на которую они воздействуют. Поэтому многие исследователи относят лектины к белкам -модификаторам биологического ответа [5, 7, 8].

Вместе с тем физиологическая роль эндолектинов изучена не достаточно. Лектины семян рассматривают как запасные белки, средства транспорта углеводов, а также способа защиты растений от поедания. В последнее время получены данные о том, что инфицирующая способность вирусов, а также образование симбиоза азотфиксирующих бактерий с бобовыми культурами также осуществляется за счет лек-тин-углеводного взаимодействия [3]. Исследователями обнаружено, что многие фитолектины являются термостабильными белками, а лек-тины содержащиеся в семенах растений выступают в роли антипитательных веществ. Ранее в модельных экспериментах нами установлено статистически значимое снижение всасывания микроэлементов кишкой крупного рогатого скота при наличии в реакционной смеси выделенных лектинов кукурузы.

Цель работы - изучить взаимодействия лектинов со слизистой оболочкой кишки.

Материал и методика исследований. Исследования, положенные в основу настоящей работы выполнены в УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» при техническом сотрудничестве РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию» (Республика Беларусь).

Реализация поставленной цели осуществлялась путем гистохимического исследования фрагментов тощей кишки бычков, инкубировавшихся in vitro в модельной системе изучения всасывания веществ [4] кишкой животных в солевых растворах Си, Zn, Co и Fe.

В данные растворы вносился меченый пероксидазой хрена лектин кукурузы в концентрации 50 мг/л - 2-я и 3-я группы проб, также в состав 3-й группы проб дополнительно к названным компонентам вводился N-ацетил-Б-глюкозоамин в концентрации 10 мг/л. К данному веществу проявляет высокую специфичность лектин кукурузы [8], связывая его в своих активных центрах, тем самым ослабляя или полностью ликвидируя лектиновую активность. Лектин кукурузы получали

из молодых проростков кукурузы методом аффинной хроматографии по протоколу [8].

Материал, предназначенный для гистологических исследований, фиксировали в 10%-ном растворе формалина. Зафиксированный материал подвергали уплотнению путем заливки в парафин по общепринятой методике, а также замораживанием. Гистологические срезы готовили на санном и замораживающем микротомах. Для изучения общих структурных изменений срезы кишечника бычков окрашивали гематоксилин-эозином.

При проведении гистохимических исследований быстро извлеченные участки тощей кишки замораживали до температуры -30 oC на охлажденном блок-держателе криостата. Затем готовили криостат-ные срезы кишки толщиной 5 мкм. Замороженные срезы фиксировали смесью ацетон: метанол:формалин (в пропорции 19:19:2) в течение 90 с при комнатной температуре, а затем высушивали на воздухе. В последующем гистосрезы кишечника дважды отмывали трис -солевым буфером в течение 2 мин, а затем инкубировали в смеси с 0,5 мг/мл 3,3-диаминобензидина (3,3-diaminobenzidin, DAB, Sigma) и 4 мкл/мл Н2О2 в трис-солевом буфере в течение 5 мин. Раствор NiCl2 добавляли к инкубационной смеси для улучшения контраста клеток (конечная концентрация 1 мг/мл). Окрашенные препараты отмывали дистиллированной водой, сушили на воздухе, обезвоживали в спирте и заключали в бальзам.

Общегистологические и гистохимические исследования проводили с помощью светового микроскопа «БИОМЕД-6» (Россия). Полученные данные документированы микрофотографированием с использованием цифровой системы считывания и ввода видеоизображения «ДСМ-510», а также программного обеспечения по вводу и предобработке изображения «ScopePhoto».

Оценку гистохимической реакции на лектин производили по 4 бальной системе. Интенсивно окрашенные структуры отмечали «+++» (резко положительный результат окраски), среднеокрашенные -«++» (положительный результат окраски), слабоокрашенные - «+» (слабо положительная окраска), неокрашенные - «0» (негативный результат окраски).

Автор выражает благодарность докторам медицинских наук М.Д. Луцику и А.Д. Луцику (г. Львов, Украина), доктору биологических наук В.М. Лахтину (г. Москва, Россия) и кандидату ветеринарных наук И.Н. Громову (г. Витебск, Беларусь), оказавшим значимую консультативную помощь при выполнении исследований, положенных в основу настоящей работы.

Результаты исследований и их обсуждение. При проведении общегистологического анализа тощей кишки крупного рогатого скота существенных структурных различий между группами проб не отмечалось. На гистопрепаратах кишечника четко визуализировались слизистая, мышечная и серозная оболочки. Среди структур слизистой

оболочки определялись эпителиальный, собственный, мышечный и подслизистый слои. Кишечные ворсинки образованы путем выпячивания всех слоев слизистой оболочки. При впячивании эпителия в собственный слой слизистой оболочки формировались многочисленные крипты. Среди эпителиоцитов, покрывающих ворсинки, определялись множественные призматические каемчатые и расположенные поодиночке бокаловидные клетки. Клетки эпителия крипт представлены каемчатыми эпителиоцитами, бокаловидными клетками и бескаемчатыми энтероцитами (камбиальными клетками). Собственный слой слизистой оболочки образован рыхлой соединительной тканью, содержал кишечные железы, кровеносные, лимфатические сосуды и узелки. Мышечную пластинку формировали 2-3 слоя гладких миоцитов. В подслизистом слое содержались железы, нервные сплетения, более крупные сосуды и лимфоидные узелки.

Гистохимическое исследование проб кишечника телят, полученных после инкубации в различных растворах, позволило выявить лектинсо-держащие структуры неодинаковой степени интенсивности окраски. Так, в пробах кишок 1-й группы, полученных после инкубации в контрольном растворе солей, результаты гистохимической окраски на выявление лектина варьировали от негативной до слабо положительной (рис. 1, 2). В случае слабо положительной реакции основными местами локализации лектиновых включений были кишечные крипты. В одних пробах лектиновые конъюгаты просматривались как диспергированные включения желто-коричневого или буро-коричневого цвета с очень низкой интенсивностью окраски, равномерно залегающие в плазмолемме эпителиальных клеток крипт (рис. 1, 2). В других случаях они принимали вид четко очерченных гранул буроватого цвета и обнаруживались в небольших группах (рис. 3) эпителиоцитов отдельных крипт, занимая преимущественно апикальный полюс клетки (рис. 2). Диффузные включения лектина с низкой интенсивностью гистохимической окраски закономерно выявлялись и в покровном эпителии ворсинок.

В пробах кишок 2-й группы, инкубированных в растворе солей микроэлементов и лектина кукурузы, результаты гистохимической окраски варьировали от положительной до резко положительной.

При изучении эпителиальной выстилки кишечных ворсинок лекти-новые включения просматривались как гранулярные, коричневого или буро-коричневого цвета, до 2-3 мкм в диаметре (рис. 3, 4). Они фиксировались в области щеточной каемки, в плазмолемме между энтероци-тами. Кроме того, отмечено незначительное усиление гистохимической окраски в местах залегания лимфоидных узелков, что связано, по нашему мнению, с частичным попаданием экзогенных лектинов в лимфатическое русло кишечника.

При этом интенсивность гистохимической окраски бокаловидных клеток была закономерно выше, нежели в каемчатом эпителии (рис. 3). Во всех случаях отмечалась высокая интенсивность окраски эпителия общекишечных желез, эндотелия лимфатических и кровеносных капилляров. При световой микроскопии таких препаратов лектиновые

конъюгаты имели вид как распыленной зернистости, так и достаточно крупных гранул.

Результаты наших исследований также показали, что добавление в инкубирующий раствор М-ацетил-Б-глюкозоамина частично блокирует адгезию лектиновых молекул на клеточных мембранах.

1 - диспергированные включения лектина; 2 - крипты; 3 - собственная пластинка

Рис. 1. Морфологическая и гистохимическая структура слизистой оболочки тощей

кишки теленка. Группа проб № 1. Ув. х 130

1 - эпителий крипт;

2 - соединительная

ткань

Рис. 2. Низкое содержание лектина в железистом эпителии тощей кишки теленка. Группа проб N° 1. Ув. х 260

1 - призматический покровный эпителий; 2 - собственная пластинка

Рис. 3. Высокое содержание лектина в плазмолемме бокаловидных клеток слизистой оболочки кишечника теленка. Группа проб № 2. Ув. х 520

1 - просвет кишечника; 2 - собственный слой; 3 - венулы; 4 - покровный эпителий

Рис. 4. Структура ворсинки тощей кишки теленка после инкубации в присутствии лектинов кукурузы. Группа проб № 2. Ув. х 130

При этом гистологические срезы тощей кишки из группы проб № 3 отличались слабой или умеренной способностью гистохимической окраски. Как и в других группах проб, диффузные и гранулярные лек-

тиновые включения обнаруживались на апикальных полюсах каемчатого эпителия (рис. 5, 6).

1 - собственный слой слизистой оболочки; 2 - общекишечные железы

Рис. 5. Неравномерная гистохимическая реакция на выявление лектина в эпителии общекишечных желез. Группа проб № 3. Ув. х 130

1 - просвет крипт; 2 - капилляры и венулы собственной пластинки

Рис. 6. Положительный результат окраски

железистого эпителия на выявление лектинсодержащих структур. Группа проб N° 3. Ув. х 260

Характерной особенностью являлась неравномерная гистохимическая окраска. Так, в близко расположенных структурах интенсивность окраски варьировала от негативной до положительной (рис. 5).

Заключение. Таким образом, исследования демонстрируют выраженное взаимодействие кишечного эпителия с лектинами кукурузы, отмечено, что локализация этого взаимодействия и его интенсивность различны. Интенсивность гистохимической окраски бокаловидных клеток была закономерно выше, нежели в каемчатом эпителии. Во всех случаях отмечалась высокая интенсивность окраски эпителия общекишечных желез эндотелия лимфатических и кровеносных капилляров. Более того, наличие в системе специфичного лектину углевода существенно нивелирует негативный эффект. Изложенное может рассматриваться как один из возможных этиопатогенетических аспектов гипомикроэлементозов у животных. Вместе с тем, для убедительных доказательств данной теории эксперименты должны быть продолжены в условиях in vivo.

ЛИТЕРАТУРА

1. Кучинский, М.П. Биоэлементы - фактор здоровья и продуктивности животных: монография / М.П. Кучинский. - Минск: Бизнесофсет, 2007. - 372 с.

2. Луцик, А.Д. Лектины: биологические свойства и применение в иммунологии / А.Д. Луцик // Биохимия человека и животных. - 1985. - Вып. 9. - С. 63-76.

3. Пономаренко, Ю. А. Питательные и антипитательные вещества в кормах: монография / Ю.А. Пономаренко; М-во сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь. - Минск: Экоперспектива, 2007. - 948 с.

4. Устройство для изучения всасываемости веществ кишечником животных: пат. 111427 Российская Федерация. МПК A61D 99/00 / Ю.К. Коваленок, Г.Г. Щербаков, А.А. Груздков, Л.В. Громова, А.В. Богомольцев; заявитель Коваленок Юрий Казимирович (BY). - № 2011131486/13; заявл. 28.07.11; опубл. 20.12.2011 // Бюллетень. - № 35. - 2 с.

5. Effects of denaturation and amino acid modification on fluorescence spectrum and he-magglutinating activity of Hericium erinaceum Lectin / M. Gong [et al.] // Acta Biochim Bio-phys Sin (Shanghai). - 2004. - Vol. 36. - №2. 5. - Р. 343-350.

6. Jackson, A.O. Plant-Microbe Interactions: Life and Death at the Interface / A.O. Jackson, C.B. Tailor // Plant Cell. - 1996. - Vol. 8. - №2 10. - P. 1651-1668.

7. Lectin-mediated drug delivery: influence of mucin on cytoadhesion of plant lectins in vitro / M. Wirth [et al.] // J. Control Release. - 2002. - Vol. 79. - P. 183-191.

8. Maize -Glucosidase-aggregating Factor Is a Polyspecific Jacalin-related Chimeric Lectin, and Its Lectin Domain Is Responsible for -Glucosidase Aggregation / Farooqahmed S. Kittur [et al.] // Journal of biological chemistry. - 2007. - Vol. 282. - №2 10. - Р. 7299-7311.

9. Malek, K. Defense on multiple fronts: how do plants cope with diverse enemies? / K. Malek, R. A. Dietrich // Trends Plant Science. - 1999. - Vol. 4. - №2 6. - P. 215-219.

10. Stotz, H.U. Plant-insect interactions / H. U. Stotz, J. Kroymann, T. Mitchell-Olds // Current Opinion in Plant Biology. - 1999. - Vol. 2. - № 4. - P. 268-272.