Способ отбора особей крупного рогатого скота с высоким уровнем молочной продуктивности, Ca и Mn по полиморфизму гена LRP4
METHOD FOR SELECTION OF CATTLE INDIVIDUALS WITH HIGH LEVEL OF MILK PRODUCTION, Ca AND Mn BY LPR4 GENE POLYMORPHISM

Изобретение относится к области животноводства, в частности к селекции крупного рогатого скота. Новый подход позволит идентифицировать животных молекулярно-генетическим методом и осуществить маркер-направленную селекцию животных с благоприятным генотипом, не допуская скрещивания между носителями мутации, в целях получения здорового потомства.
Считается, что множественные мутации в гене LRP4 являются причиной возникновения синдактилии крупного рогатого скота, характеризующейся слиянием или неделением функциональных пальцев бычьей стопы [1]. Однако ген, вызывающий это заболевание или изменение в ДНК не были идентифицированы [2]. Микросателлитные маркеры в соседней области были использованы для идентификации носителей заболевания [3]. Ген LRP4 был предложен в качестве кандидата на нахождение в этой хромосомной области, и SNP в гене были связаны с этим местом локации [4].
Ранее было известно, что ген LRP4 оказывает воздействие на продуктивные характеристики крупного рогатого скота, так отбор гетерозиготных особей способствовал повышению удоя на 134 кг и выходу молочного жира на 0,95 кг больше, в сравнении с гомозиготами [5].
В связи с результатами последних исследований например, ранее сообщавшийся вариант LRP4 c.4940C>T не связан с синдактилией у крупного рогатого скота [6], информативность данного гена может быть пересмотрена.
Известно, что LRP4 относится к генам-кандидатам, связанных с развитием волосяных фолликулов, и может является основой молекулярной селекции для выращивания тонкорунных овец [7].
Кроме того, LRP4 экспрессируется адипоцитами и остеобластами влияя через эндокринные эффекты склеростина на состав тела и метаболизм глюкозы [8, 9].
Таким образом ген LRP4 можется использоваться в качестве ценного маркера при раннем отборе особей высокоценных сельскохозяйственных животных.
Оценка показателей минерального обмена животных является неотъемлемой частью контроля состояния здоровья КРС в связи с высокой интенсивностью метаболизма эссенциальных элементов в организме высокопродуктивных животных, а также значительным влиянием данных элементов на работу иммунной системы, гормонов и ферментов. Также большое внимание необходимо уделять контролю обмена токсичных элементов, в категорию которых входят тяжелые металлы, накопление которых негативно отражается на здоровье и продуктивности животных, снижая экономическую эффективность животноводства.
В кости LRP4 функционирует как специфический посредник опосредованного склеростином ингибирования передачи сигналов Wnt1/β-catenin и, следовательно, обеспечивает зависимое от склеростина ингибирование образования кости. Склеростин вызывает снижение внеклеточного pH и способствует высвобождению ионов кальция из минерализированного субстрата, что приводит к нарушению минерального обмена организма в целом.
Известен способ отбора молодняка крупного рогатого скота по скорости роста [10]. Изобретение относится к области селекции и генетики крупного рогатого скота. Способ предусматривает выделение ДНК из крови животного и с помощью использования полимеразной цепной реакции проведение отбора телят от гомозиготных А/А и гетерозиготных A/G животных по гену TNF-α -824. Способ позволяет проводить ранний отбор животных с более высокими показателями скорости роста для увеличения выхода мяса и повышения эффективности селекционно-племенной работы.
Известен способ отбора лошадей с низким уровнем обмена токсичных элементов по желательному генотипу [11].
Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ отбора лошадей с низким уровнем обмена токсичных элементов по желательному генотипу для селекционного процесса, включающий определение полиморфизма микросателлитной ДНК по локусу HMS7, отбор животных производят по желательным аллелям: OQ, LO, JM, NO, NQ, средние значения которых не превышают концентрацию 3,09 ммоль/кг суммы токсических микроэлементов (Sr, Al, Cd, Pb, Sn, Hg). Изобретение позволяет отобрать лошадей с низким уровнем обмена токсичных элементов по желательному генотипу для селекционного процесса.
Недостатками данных методов является то, что они не позволяют определить и произвести подбор родительских пар с благоприятным генотипом по молочной продуктивности, в целях получения здорового потомства, по второму варианту предложены желательные аллели на другом виде животных.
В связи с этим, заявленный нами способ соответствует условию патентоспособности изобретения «новизна». Анализ доступной литературы не выявил признаки сходные с заявляемым решением, что позволяет сделать вывод о соответствии условию «изобретательский уровень». Изобретение является применимым, так как оно может использоваться в животноводстве при отборе особей крупного рогатого скота по гену LRP4.
Техническим результатом изобретения является способ отбора особей крупного рогатого скота с высоким уровнем Ca и Mn и молочной продуктивностью по полиморфизму гена LRP4.
Способ был реализован следующим образом
Исследования выполнялись на клинически здоровых коровах черно-пестрой породы разводимых в хозяйствах АО ПЗ «Первомайский» Ленинградской области.
Забор крови, объемом не менее 6 мл, осуществлялся из хвостовой вены. Для оценки элементного статуса крови были использованы вакуумные пробирки с активатором свертывания крови и гелем для отделения эритроцитарной массы, для генетических исследований - с антикоагулянтом К2-ЭДТА, на 30-50 сутки после отела.
Отделение сыворотки производилось путем центрифугирования образцов в течении 10 минут при скорости 1000 g.
Элементный состав крови по 25 показателям (Al, As, B, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, I, K, Li, Mg, Mn, Na, Ni, P, Pb, Se, Si, Sn, Hg, Sr, V, Zn) определялся методами атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии.
Выделение ДНК производилось из цельной крови исследуемых животных с использованием набора реагентов для выделения геномной ДНК «ДНК Экстран-1» («Синтол», Россия).
Осуществлялся анализ множественных однонуклеотидных полиморфизмов c.4863_4864delinsAT, c.5385+1G>A, c.3595G>A в 15 хромосоме гена LRP4 (OMIA 000963) методом ПЦР в режиме реального времени с помощью амплификатора Real-time CFX96 Connect (BioRad, США).
Illumina
SNP
Illumina
На первом этапе исследования методом высокопроизводительного секвенирования было проведено генотипирование ДНК 192 особей КРС, реализуемого при помощи секвенатора MiSeq (, США). Была получена информация о 263 локусах однонуклеотидных полиморфизмов () в геноме животных, рекомендованных Международным обществом генетики животных (ISAG) при помощи панели TruSeq Bovine Parentage Sequencing Panel (, США). В результате оценки полиморфизма гена LRP4 было установлено что частота встречаемости гомозиготного генотипа GG - 102 головы, GA - 81, GG - 9.
На втором этапе исследования у всех выявленных групп животных определен элементный статус по 25 химическим элементам в сыворотке крови (табл. 1). Установлено что коровы с генотипами GA и GG характеризовались большей концентрацией Ca на 12,9 % (р=0,008) и Mn на 23,6 % (р=0,056) по сравнению с генотипом GG.
Среди макроэлементов достоверно также различался уровень натрия, который оказался выше у животных опытной группы на 10,4 (р=0,019). Уровень фосфора оказался на 22,5 % (р=0,019) выше у носителей мутации, а значения ванадия, способствующего правильному распределению солей кальция в организме - на 34,5% (р=0,002). Также фиксировались более высокие концентрации элементов, участвующих в формировании костей, так, к примеру, Mg у гетерозиготных животных оказались 10,0 % (р=0,09) выше, чем у животных с референсным геномом. При этом обнаруживались повышенные значения токсичных и условно-токсичных элементов, таких как алюминий, мышьяк и литий.
Результаты оценки продуктивных качеств коров выявленных генотипов за последний месяц показал, на имеющиеся существенные различия (табл. 2). Так в опытной группе животных наблюдалась более высокие показателям удоя -среднесуточный удой был больше контроля на 43,2 %, p≤0,05, а процентное содержание жирности и белка в молоке было практически одинаковым, или не имело достоверной разницы.
Таким образом, на основании проведенных исследований предложен способ отбора особей крупного рогатого скота с высоким уровнем Ca и Mn и молочной продуктивностью по полиморфизму гена LRP4.
Источники информации
1. Casas E, Kehrli ME Jr. A Review of Selected Genes with Known Effects on Performance and Health of Cattle. Front Vet Sci. 2016 Dec 15;3:113. doi: 10.3389/fvets.2016.00113.
2. Charlier C, Farnir F, Berzi P, Vanmanshoven P, Brouwers B, Vromans H, et al. Identity-by-descent mapping of recessive traits in livestock: application to map the bovine syndactyly locus to chromosome 15. Genome Res (1996) 6:580-9. doi:10.1101/gr.6.7.580.
3. Drogemuller C, Distl O. Genetic analysis of syndactyly in German Holstein cattle. Vet J (2006) 171:120-5. doi:10.1016/j.tvjl.2004.09.009.
4. Drögemüller C, Leeb T, Harlizius B, Tammen I, Distl O, Höltershinken M, et al. Congenital syndactyly in cattle: four novel mutations in the low density lipoprotein receptor-related protein 4 gene (LRP4). BMC Genet (2007) 8:5. doi:10.1186/1471-2156-8-5.
5. Leipold, H. W., J. H. Mills, and K. Huston. "Epitheliogenesis imperfecta in Holstein-Friesian calves." The Canadian Veterinary Journal 14.5 (1973): 114.
6. Eager KLM, Cauchi M, Willet CE, Häfliger IM, Drögemüller C, O'Rourke BA, Tammen I. The previously reported LRP4 c.4940C>T variant is not associated with syndactyly in cattle. Anim Genet. 2021 Jun;52(3):380-381. doi: 10.1111/age.13061.
7. He J, Zhao B, Huang X, Fu X, Liu G, Tian Y, Wu C, Mao J, Liu J, Gun S, Tian K. Gene network analysis reveals candidate genes related with the hair follicle development in sheep. BMC Genomics. 2022 Jun 8;23(1):428. doi: 10.1186/s12864-022-08552-2.
8. Kim SP, Da H, Li Z, Kushwaha P, Beil C, Mei L, Xiong WC, Wolfgang MJ, Clemens TL, Riddle RC. Lrp4 expression by adipocytes and osteoblasts differentially impacts sclerostin's endocrine effects on body composition and glucose metabolism. J Biol Chem. 2019 Apr 26;294(17):6899-6911. doi: 10.1074/jbc.RA118.006769.
9. Katchkovsky S, Chatterjee B, Abramovitch-Dahan CV, Papo N, Levaot N. Competitive blocking of LRP4-sclerostin binding interface strongly promotes bone anabolic functions. Cell Mol Life Sci. 2022 Jan 31;79(2):113. doi: 10.1007/s00018-022-04127-2.
10. Патент на изобретение RU № 2600889 Способ отбора молодняка крупного рогатого скота по скорости роста / О.С. Короткевич, М.П. Люханов, К.Н. Нарожных, Т.В. Коновалова, В.Л. Петухов, О.И. Себежко, О.А. Зайко, Е.В. Камалдинов, В.А. Солошенко : заявка 2015130930 от 24.07.2015, опубл. 27.10.2016. Бюл. № 30.
11. Патент на изобретение RU № 2699520 Способ отбора лошадей с низким уровнем обмена токсичных элементов по желательному генотипу / В.В. Калашников, А.М. Калашников, М.М. Атрощенко, С.А. Мирошников, А.Н. Фролов, О.А. Завьялов, А.В. Харламов, Б.Г. Рогачев, Л.В. Калников, Т.В. Калашникова, Н.В. Блохина :заявка 2018143676 от 10.12.2018, опубл.: 05.09.2019 Бюл. № 25.
Таблица 1
Элемент
Содержание макро- и микроэлементов в сыворотке крови коров, медиана Me и 25-75-го центилей (Q<sub>25</sub>-Q<sub>75</sub>)
контрольная группа
опытная группа
р
Макроэлементы, мг/кг
Ca
86,28 (79,60-90,75)
97,42 (95,33-98,45)
0,008
K
247,0 (235,75-261,50)
264,0 (251,0-278,0)
0,221
Mg
27,19 (24,26-29,21)
29,93 (29,17-31,98)
0,096
Na
3232,0 (3112,0-3491,7)
3571,0 (3534,0-3923,0)
0,019
P
201,5 (188,7-222,0)
247,0 (231,0-262,0)
0,019
Жизненно и условно-жизненно необходимые микроэлементы, мг/кг
Co
0,00030 (0,00024-0,00041)
0,00042 (0,00026-0,00053)
0,633
Cr
≤0,0017
≤0,0017
-
Cu
0,723 (0,608-0,850)
0,808 (0,797-0,860)
0,208
Fe
2,885 (2,405-3,457)
3,04 (2,71-4,37)
0,359
I
0,0396 (0,0265-0,0578)
0,044 (0,028-0,046)
0,972
Mn
0,0027 (0,0022-0,0033)
0,0034 (0,0030-0,0037)
0,056
Se
0,0691 (0,0565-0,0738)
0,0754 (0,0707-0,1010)
0,110
Zn
0,798 (0,736-0,919)
0,911 (0,777-0,968)
0,518
B
0,1315 (0,1175-0,1560)
0,134 (0,124 - 0,180)
0,324
Ni
0,0033 (0,0029-0,0043)
0,0036 (0,0034-0,0042)
0,357
V
0,0027 (0,0024-0,0030)
0,0037 (0,0034-0,0037)
0,002
Li
0,0658 (0,0625-0,0699)
0,0761 (0,0724-0,0867)
0,013
Si
0,183 (0,164-0,200)
0,211 (0,210-0,212)
0,324
As
0,0088 (0,0083-0,0094)
0,0097 (0,0095-0,0106)
0,029
Токсичные микроэлементы, мг/кг
Al
0,0237 (0,0211-0,0247)
0,0265 (0,0263-0,0267)
0,014
Cd
≤0,00012
≤0,00012
-
Hg
≤0,0009
≤0,0009
-
Pb
0,00038 (0,00030-0,00048)
0,00043 (0,00030-0,00044)
0,918
Sn
0,0011 (0,0011-0,0012)
0,0012 (0,0011-0,0012)
0,337
Sr
0,124 (0,112- 0,141)
0,148 (0,141-0,173)
0,095
Таблица 2
Молочная продуктивность
Показатели количества и качества молока коров, медиана Me и 25-75-го центилей (Q<sub>25</sub>-Q<sub>75</sub>)
контрольная группа
опытная группа
р
Удой за последний месяц, кг
997,0 ± 10,12(755,5-1282,0)
1428,0 ± 11,23*(1084,0-1792,0)
0,1
Среднесуточный удой, кг
33,2 ± 5,21(25,1-42,7)
47,6 ± 3,12(36,1-59,7)
0,1
Жир, %
3,88 ± 1,55(3,70-4,03)
3,73 ± 1,06(3,61-3,89)
0,3
Белок, %
3,3 ± 0,91(3,18-3,37)
3,0 ± 1,02(3,0-3,2)
0,08
Жир, кг
3,82 ± 1,22(2,93-5,16)
5,74 ± 1,87(4,21-6,46)
0,09
Белок, кг
3,26 ± 1,56(2,48-4,38)
4,84 ± 0,98(3,26-5,73)
0,1