ПРИМЕНЕНИЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ В ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ АНАЛИЗАХ
USING GLYCOSAMINOGLYCANS FOR DECREASING NON-SPECIFIC BINDING IN IMMUNOLOGICAL ASSAYS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к иммунологическим анализам, и, в частности, к использованию гликозаминогликанов с целью уменьшения неспецифического связывания в иммунологических анализах.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Биохимические анализы связывания широко используются для определения присутствия и концентрации анализируемых веществ в биологических образцах. Такие анализы основаны на концепции партнеров связывания. Интересующее анализируемое вещество связывается со связывающимся с анализируемым веществом агентом (таким как, например, антитело к анализируемому веществу или рецептор для анализируемого вещества). Таким образом, анализируемое вещество и связывающийся с анализируемым веществом агент называют "партнерами связывания". Когда один из партнеров связывания связан с твердой фазой, анализ называют гетерогенным. Такие гетерогенные анализы включают, например, сэндвич-метод, косвенный метод и конкурентный метод. Все эти термины используются в данной области техники.
Чувствительность анализа обычно означает наименьшую массу анализируемого вещества, которая обеспечивает статистически значительное изменение в сигнале, генерируемом анализом, по сравнению с сигналом, полученным при отсутствии анализируемого вещества. Увеличение чувствительности является желательным, поскольку это позволяет обнаружить меньшие количества анализируемого вещества, а также обеспечивает более высокую общую точность измерения анализируемого вещества.
Неспецифическое связывание означает неспецифическое взаимодействие партнеров связывания в гетерогенной системе анализа с твердой фазой. Неспецифическое связывание часто снижает чувствительность гетерогенных анализов, и поэтому желательно уменьшить такое неспецифическое связывание.
Известно много способов, используемых для этой цели. Например, белки, такие как бычий сывороточный альбумин (BSA), желатин и казеин, добавляют к реагентам анализа или предварительно адсорбируют на твердой фазе, чтобы заблокировать неспецифические участки адсорбции. Кроме того, в литературе описано применение различных поверхностно-активных веществ, часто - в высоких концентрациях.
Хотя эти способы могут помочь в некотором снижении неспецифической адсорбции, многие из них связаны с влиянием на желаемое специфическое взаимодействие партнеров связывания. Эти методы могут также привести к замещению комплекса, образующегося между партнерами связывания. Кроме того, несмотря на использование высоких концентраций белка и поверхностно-активного вещества, во многих гетерогенных анализах наблюдается значительное количество неспецифического связывания. Таким образом, существует потребность в альтернативных методах снижения неспецифического связывания в гетерогенных анализах.
Это особенно верно в случае анализов для определения сердечного тропонина I, где обнаруживаемые уровни анализируемого вещества являются очень малыми, и увеличенная чувствительность необходима для получения точных и полезных результатов анализа. Определение сердечного тропонина I помогает в точном диагностировании острого инфаркта миокарда и стратификации риска пациентов с острыми коронарными синдромами без повышения в сегменте ST в плане относительного риска смертности, инфаркта миокарда или увеличенной вероятности ишемических событий, требующих проведения срочных процедур реваскуляризации.
Тропонин I (TnI) является белком, обычно содержащимся в мышечной ткани, и вместе с Тропонином Т и Тропонином С регулирует кальций-зависимое взаимодействие актина и миозина (Tobacman, Annu Rev Physiol 58:447-481, 1996). Были идентифицированы три изотипа TnI: один - связанный с быстрым подергиванием скелетной мускулатуры, другой - с медленным подергиванием скелетной мускулатуры, и третий - с сердечной мышцей (Wilkinson and Grand, Nature 271:31-35, 1978; Bodor, J Clin Immunoassay 17(l):40-44, 1994). Сердечная форма имеет 31 дополнительный аминокислотный остаток на N-конце и является единственной изоформой тропонина, присутствующей в миокарде (Vallins et al., FEBS Letts 270(1,2):57-61, 1990).
Клинические исследования продемонстрировали, что сердечный тропонин I (cTnI) обнаруживается в кровотоке спустя 4-6 часов после острого инфаркта миокарда (AMI) и остается повышенным в течение нескольких дней после того (Mair et al., Clin Chem 41(9):1266-1272, 1995; Lame et al., Clin Chem 39(6):972-979, 1993). Таким образом, повышение уровня cTnI охватывает диагностические окна креатинкиназы-МВ (СК-МВ) и лактатдегидрогеназы (Bodor, J Clin Immunoassay 17(l):40-44, 1994). Дальнейшие исследования указали, что cTnI обладает более высокой клинической специфичностью к повреждению миокарда, чем СК-МВ (Adams et al., Circulation 88(1): 101-106, 1993; Apple et al., Clin Chim Acta 237:59-66, 1995).
Ввиду его сердечной специфичности и чувствительности TnI используется как надежный маркер при оценке пациентов с нестабильной стенокардией и острым коронарным синдромом без повышения сегмента ST (ACS). Предыдущие клинические исследования пациентов с ACS (Lindahl et al., J Am Coll Cardiol 38:1497-1498, 2001; Venge et al., Am J Cardiol 89:1035-1041, 2002) показали, что незначительное повышение значений cTnI предоставляет важную прогностическую информацию о близком и долгосрочном риске смерти (Galvani et al., Circulation 95:2053-2059, 1997; Antman et al., N Eng J Med 335:1342-1349, 1996; Ottani et al., Am Heart J 40:917-927, 2000; Heidenreich et al., J Am Coll Cardiol 38:478-485, 2001). В конечном счете, оценка прогноза может быть полезной для идентификации пациентов, для которых, наиболее вероятно, будут полезны те или иные терапевтические вмешательства.
Таким образом, желательно получить реагенты и способы для уменьшения неспецифического связывания в гетерогенных анализах на cTnI, a значит и повышения чувствительности анализов на cTnI.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для указанной цели изобретение предлагает реагент иммунологического анализа, включающий связывающийся с анализируемым веществом агент в разбавителе и гликозаминогликан в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы анализируемого вещества.
В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления анализируемым веществом является тропонин, связывающимся с анализируемым веществом агентом - антитропонин I моноклональное антитело, а гликозаминогликаном - хондроитинсульфат.
Также предоставляется композиция пробы, которая включает пробу для анализа на присутствие анализируемого вещества, связывающийся с анализируемым веществом агент и гликозаминогликан, отличный от гепарина, в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на анализируемое вещество.
В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления пробой является сыворотка или плазма EDTA, анализируемым веществом - тропонин, связывающимся с анализируемым веществом агентом - антитропонин I моноклональное антитело, а гликозаминогликаном - хондроитинсульфат.
Также предлагаются способы обнаружения анализируемого вещества в пробе с использованием гликозаминогликана для снижения неспецифического связывания в способе. Способ включает объединение пробы, анализируемой на присутствие анализируемого вещества, с гликозаминогликаном и связывающимся с анализируемым веществом агентом для образования комплекса между анализируемым веществом в образце и связывающимся с анализируемым веществом агентом, причем гликозаминогликан снижает неспецифическое связывание в способе и обнаружение получающегося комплекса для определения анализируемого вещества. В данном способе предпочтительным анализируемым веществом является тропонин, более предпочтительно - тропонин I, a предпочтительным гликозаминогликаном является хондроитинсульфат.
Дополнительные особенности и преимущества данного изобретения станут понятны из последующего описания, которое следует рассматривать в связи с прилагаемыми чертежами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 показаны результаты анализа TropI, когда различные сахара вводили в пробы TropI с неправильными результатами;
На Фиг. 2 показаны результаты анализа TropI, когда реагент BJ был подготовлен с хондроитинсульфатом в количестве 0, 1,2 и 4 мг/мл в присутствии или отсутствии EDTA;
На Фиг. 3 показаны результаты анализа TropI с добавлением 0,5 мг/мл CSC в реагент BJ и без такого добавления;
На Фиг. 4 показаны результаты анализа TropI, когда реактив BJ был приготовлен с различными изомерами хондроитинсульфата по сравнению с Kit Lot (без хондроитинсульфата); и
На Фиг. 5 показаны принципы анализа на сердечный тропонин I.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение предлагает реагент иммунологического анализа, который включает связывающийся с анализируемым веществом агент в разбавителе и гликозаминогликан в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на анализируемое вещество.
Как обсуждено выше, часто желательно определить присутствие и концентрацию анализируемых веществ в биологических образцах. Анализируемое вещество представляет собой вещество или химический компонент, который определяют в ходе аналитической процедуры (такой как иммунологический анализ). Иммунологические анализы основаны на концепции партнеров связывания. Представляющее интерес анализируемое вещество связывается со связывающимся с анализируемым веществом агентом (таким как, например, антитело к анализируемому веществу или рецептор для анализируемого вещества). Таким образом, анализируемое вещество и связывающийся с анализируемым веществом агент называют "партнерами связывания".
Во многих иммунологических анализах связывающимся с анализируемым веществом агентом является антитело. Такие антитела часто предоставляются в разбавителе, таком как калийфосфатный буфер. Антитело может быть из любого класса иммуноглобулинов, включая, например, IgG или IgM. Антитело может быть моноклональным антителом или поликлональным антителом. В сэндчич-иммуноанализе анализируемое вещество может быть захвачено антителом или антителами, иммобилизованными на твердой фазе. Такая иммобилизация может быть обеспечена с применением способов, известных из уровня техники, включая использование покрытой стрептавидином (SAC) твердой фазы, с которой связаны биотин-меченое антитело или антитела. Представляющее интерес анализируемое вещество, присутствующее в пробе, связывается с иммобилизованным антителом захвата или антителами, а затем меченное антитело или антитела, в свою очередь, связываются с захваченным анализируемым веществом. Метка может быть любой, известной из уровня техники, включая, например, пероксидазу хрена и щелочную фосфатазу. Детектируемый сигнал свидетельствует о количестве анализируемого вещества, присутствующего в образце. Метод обнаружения будет зависеть от типа выбранной метки, как известно из уровня техники, и может включать колориметрический, флуорометрический или хемилюминесцентный методы.
Предпочтительным в настоящее время гликозаминогликаном (GAG) является хондроитинсульфат, хотя также могут использоваться другие GAG. Другие GAG включают гиалуронат (также называемый гиалуроновой кислотой), гепарансульфат, гепарин, дерматансульфат и кератансульфат. Хондроитинсульфатом может быть хондроитинсульфат А, хондроитинсульфат В (также называемый дерматансульфат), хондроитинсульфат С или их смесь.
Гликозаминогликаны (GAG) или мукополисахариды являются длинными неразветвленными полисахаридами, содержащими повторившийся дисахаридный мотив. Дисахаридные мотивы содержат один или два модифицированных сахара, N-ацетилгалактозамин (GalNAc) или N-ацетилглюкозамин (GlcNAc) и уроновую кислоту, такую как глюкуронат или идуронат. Гиалуронаты состоят из D-глюкуроната и GlcNAc. Дерматансульфаты состоят из D-глюкуроновой кислоты (GlcA) или L-идуроната (IdoA) и GalNAc-сульфата. Гетерогенность в дерматансульфате является результатом различных степеней О-сульфатации и присутствия двух уроновых кислот. Хондроитинсульфаты состоят из D-глюкуроната и GalNAc-6 (или 4)-сульфата. Гепарин и гепарансульфаты состоят из D-глюкуронат-2-сульфата и N-сульфо-В-глюкозамин-6-сульфата (гепараны содержат меньше сульфата, чем гепарины). Кератансульфаты состоят из галактозы и галактоза-6-сульфата и GlcNAc-6-сульфата.
Хондроитинсульфат (CS) является сульфатированным гликозаминогликаном (GAG). В цепи хондроитина может быть более чем 100 отдельных сахаров, каждый из которых может быть сульфатирован в различных положениях и количествах. Хондроитинсульфат А означает CS преимущественно сульфатированный поуглероду 4 сахара GalNAc (хондроитин-4-сульфат). Хондроитинсульфат В называют дерматансульфатом. Хондроитинсульфат С означает CS, преимущественно сульфатированный по углероду 6 сахара GalNAc (хондроитин-6-сульфат). Хондроитинсульфат D означает CS, преимущественно сульфатированный по углероду 2 GlcA и 6 сахара GalNAc (хондроитин-4,6-сульфат).
Гликозаминогликан обеспечивается в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на анализируемое вещество. Если GAG является хондроитинсульфатом, это количество предпочтительно составляет от приблизительно 0,25 мг/мл до приблизительно 4 мг/мл (эквивалентно от приблизительно 0,025% до приблизительно 0,4%). В одном конкретном варианте осуществления хондроитинсульфат присутствует в количестве 1 мг/мл (эквивалентно 0,1%). Следующие примеры подробно иллюстрируют выбор подходящего количества GAG для использования в соответствии с данным изобретением.
Анализируемая на присутствие анализируемого вещества проба может быть любой подходящей пробой, предпочтительно пробой крови, такой как проба сыворотки или плазмы. Плазма крови - жидкий компонент крови, в которой суспендированы клетки крови. Центрифугирование представляет собой простой способ отделения плазмы от клеток крови в пробе крови. Сыворотка представляет собой плазму крови, из которой факторы свертывающей системы крови были удалены естественным путем, позволяя крови свернуться до выделения жидкого компонента. Пробы плазмы получают из пробирок с кровью, которые содержат антикоагулянты, такие как гепарин натрия, цитрат натрия, фторид натрия и оксалат калия или калий EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). В случае пробы плазмы согласно данному изобретению плазму предпочтительно получают, используя антикоагулянт, отличный от гепарина.
В одном варианте осуществления реагент иммунологического анализа согласно данному изобретению содержит моноклональное антитело, специфическое к сердечному тропонину I в разбавителе и 0,1% хондроитинсульфата. Подходящие антитела к сердечному тропонину I известны из уровня техники, и конкретные пары или сочетания антител часто рекомендуют как партнеры для анализа. В частности, могут использоваться моноклональные антитела, обозначаемые 19С7 и 24-40 как двойные антитела захвата, меченые биотином, для присоединения к покрытой стрептавидином лунке, и антитело 16А11, в качестве антитела обнаружения, меченное пероксидазой хрена. Эти антитела коммерчески доступны (см. упомянутые ниже источники) и обсуждаются в литературе в связи с анализами на сердечный тропонин I, а процедуры биотинилирования и мечения также известны из уровня техники.
Приведенное выше описание относится к реагенту иммунологического анализа, который включает гликозаминогликан в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания. GAG может присутствовать в разбавителе, содержащем антитело. Альтернативно, GAG может быть добавлен к композиции пробы, в которую затем добавляют связывающийся с анализируемым веществом агент. Порядок составления может меняться, но GAG должен добавляться до наступления неспецифического связывания любого анализируемого вещества, присутствующего в пробе, со связывающимся с анализируемым веществом агентом.
Таким образом, также предоставляется композиция пробы, которая включает пробу для анализа на присутствие анализируемого вещества, связывающийся с анализируемым веществом агент и гликозаминогликан, отличный от гепарина, в количестве, достаточном для снижения неспецифического связывания в анализе пробы на анализируемое вещество.
В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления пробой является сыворотка или плазма EDTA, анализируемым веществом - тропонин, связывающимся с анализируемым веществом агентом - антитропонин I моноклональное антитело, а гликозаминогликаном - хондроитинсульфат.
Также предлагается способ обнаружения анализируемого вещества в пробе, включающий: объединение анализируемой на присутствие анализируемого вещества пробы с гликозаминогликаном и связывающимся с анализируемым веществом агентом для образования комплекса между анализируемым веществом, присутствующим в пробе, и связывающимся с анализируемым веществом агентом, причем гликозаминогликан снижает неспецифическое связывание в способе; и обнаружение получающегося комплекса для определения анализируемого вещества. В одном варианте осуществления пробу объединяют с гликозаминогликаном и полученную пробу затем объединяют со связывающимся с анализируемым веществом агентом. В другом варианте осуществления пробу объединяют со связывающимся с анализируемым веществом агентом, и полученную пробу затем объединяют с гликозаминогликаном. В еще одном варианте осуществления связывающийся с анализируемым веществом агент получен как реагент иммунологического анализа, включающий связывающийся с анализируемым веществом агент в разбавителе и гликозаминогликан, и реагент иммунологического анализа объединяют с образцом. В каждом из этих способов предпочтительное анализируемое вещество - тропонин, более предпочтительно - тропонин I, а предпочтительным гликозаминогликаном является хондроитинсульфат.
В композиции пробы и способах согласно данному изобретению различные подходящие связывающиеся с анализируемым веществом агенты, разбавитель, гликозаминогликаны, пробы и анализируемые вещества являются такими, как описано выше в связи с реагентами для иммунологических анализов.
Реагенты, композиции и способы данного изобретения особенно полезны в иммунологическом анализе на сердечный тропонин I. Подробности данного варианта осуществления приведены в следующих примерах.
Пример I. Влияние добавления гепарина к реагентам захвата (BJ) и обнаружения (CJ) сердечного тропонина I (cTnI или TropI) в анализе
Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы определить, обеспечивает ли добавление гепарина к реагентам TropI BJ и/или CJ уменьшение ложных положительных результатов TropI. Были получены многочисленные отчеты о воспроизводимых ложных результатах повышенного Тропонина I в пробах сыворотки. Также было получено несколько отчетов о ложно повышенном уровне TropI в плазме EDTA. В некоторых случаях соответствующие пробы плазмы с гепарином, взятые у тех же пациентов, не давали ложных результатов повышенного уровня TropI.
Эксперимент включал введение гепарина в реагенты BJ и CJ и анализ с применением этих реагентов проб TropI, которые ранее давали ложные положительные результаты TropI.
Результаты показывают, что при введении гепарина в TropI CJ и немедленном проведении анализа наблюдается сильное ослабление полученного сигнала. При всего лишь 10 единицах на мл CJ полученный сигнал Cal 2 (калибрация 2) оказался менее 50% от номинального. Уровни гепарина в плазме, напротив, составляют обычно 25-50 единиц/мл. Для обеспечения эквивалентной концентрации гепарина, обеспечиваемой реагентом CJ, потребовалось бы присутствие гепарина на уровне 50-100 единиц/мл. На основании этих откликов не представляется возможным добавление гепарина к CJ при уровнях, которые были бы эквивалентными гепаринизированной плазме.
Группу проб сыворотки, которые ранее давали ложноположительные результаты на TropI, проверили с использованием раствора CJ, содержащего 10 единиц гепарина на мл. Эти дававшие ложные результаты пробы продемонстрировали значительное снижение в определяемой концентрации cTnI (сердечного тропонина I). Результаты были в диапазоне 8-35% для проб, которые без обработки показывали концентрации cTnI 0,7-7,0 нг/мл. Однако ни один из этих образцов не удалось полностью скорректировать до уровня ниже Верхнего справочного предела (URL) для сыворотки.
Результаты этого эксперимента приводят к выводу о том, что добавление гепарина к композиции CJ приводит к значительному снижению общей способности реагентов генерировать сигнал. При концентрациях гепарина 10 единиц на мл сигнал составлял всего лишь 50% от номинального. Однако дававшие ложные результаты пробы пациентов были частично скорректированы путем добавления указанного количества гепарина к CJ. Тем не менее, более полное исправление указанного влияния потребовало бы более высоких уровней гепарина, которые, вероятно, снизили бы сигнал анализа до уровней, несовместимых с принципами анализа.
Пример II. Влияние сахаров как факторов корректировки пробы в реагенте BJ
Цель данного эксперимента состояла в том, чтобы оценить способность сахаров, таких как сахаров, присутствующих в гликозаминогликанах и обычно связанных с боковыми цепочками углевода пероксидазы хрена (HRP), снижать влияние в ложноположительных пробах TropI при добавлении к реагентам BJ.
Как описано в Примере I, добавление гепарина к ложноположительным пробам уменьшило ложные положительные результаты. Гепарин входит в гетерогенную группу анионных мукополисахаридов с неразветвленной цепочкой, называемых гликозаминогликанами (GAG), которые обладают антикоагулянтными свойствами. Хотя могут присутствовать и другие сахара, основными сахарами в гепарине являются: α-L-идуроновой кислоты 2-сульфат; 2-деокси-2-сульфамино-α-D-глюкозы 6-сульфат; β-D-глюкуроновая кислота; 2-ацетамидо-2-деокси-α-D-глюкоза; и α-L-идуроновая кислота.
В качестве первоначального изучения возможных факторов корректировки пробы в ложноположительные пробы на TropI вводили указанные ниже сахара (для достижения конечной концентрации 2 мг/мл тестируемого вещества), чтобы оценить эффективность блокирования ложных положительных реакций: N-ацетил-глюкозамин (Sigma A8625); N-ацетил-галактозамин (Sigma A2795); глюкозамин (Sigma G4875); N-ацетилнейраминовая кислота (NANA, сиаловая кислота)(Sigma A0812); хондроитинсульфат С (Sigma C4384); хитин (гомополимер N-ацетил-глюкозамина) (Sigma C9752); муцин (полимер NANA)(Sigma M3895); и манноза (Sigma M8296). В этом первоначальном исследовании было обнаружено, что хондроитинсульфат С (CSC) значительно уменьшает ложные положительные результаты (см. Фиг. 1). Полученные результаты TropI были в целом подавлены до уровня ниже URL в ложноположительных пробах, кроме одной. Мы считаем, что эта последняя проба положительна на гетерофильные антитела.
На основании этих первоначальных отборочных исследований были проведены дополнительные эксперименты, в которых хондроитинсульфат С (CSC) добавляли непосредственно к реагенту BJ в серии увеличивающихся уровней (0,25, 0,5, 1, 2, 3 и 4 мг/мл), с и без EDTA (5,58 мг/мл) в реагенте BJ (см. Фиг. 2 и 3). Эффективность композиций была основана на блокировании ложноположительных проб TropI в сочетании с оценкой изменения в откликах справочного калибратора. Самая низкая концентрация CSC, которая эффективно подавляла ложноположительные пробы TropI, составляла 0,25 мг/мл; при немного более высоких уровнях CSC (0,5 мг/мл) наблюдалось некоторое возрастающее улучшение блокирования. Эффект, связанный с присутствием или отсутствием EDTA с дополнительными добавками реагентов, не был значительным.
Добавление CSC в количестве 0,25-0,5 мг/мл к композиции BJ оказывало небольшое, но заметное влияние на отрицательные или положительные контрольные пробы сыворотки. Кроме того, отклики справочного калибратора демонстрировали небольшое изменение при низких уровнях CSC. При уровнях CSC свыше 1 мг/мл обычно наблюдали 10-30% уменьшение откликов.
Результаты данного эксперимента приводят к выводу о том, что хондроитинсульфат С является эффективным блокирующим агентом, снижающим неспецифические фоновые реакции (неспецифическое связывание), которые демонстрируют некоторые образцы сыворотки и плазмы EDTA. В то время как самый низкий протестированный уровень (0,25 мг/мл) продемонстрировал значительные снижения наблюдаемых ложноположительных реакций, несколько более высокие уровни (0,5 мг/мл) могут обеспечить дополнительные защитные меры для образцов, которые могут содержать более высокие уровни влияющих веществ. Уровень EDTA в присутствии CSC не оказывал значительного влияния на ложноположительные пробы.
Добавление CSC к реагенту BJ оказывало минимальное вредное влияние на общую зависимость между дозой и откликом при использовании справочных калибраторов Tropl. По данным всех восьми калибраторов изменения, вызванные концентрациями CSC до 1 мг/мл, были в целом меньше 10%. Поэтому добавление CSC к композиции BJ в концентрациях 0,25-0,50 мг/мл, как можно ожидать, будет иметь малое влияние на справочную калибровку или вообще не будет оказывать такого влияния.
Пример III. Ложноположительные образцы с 0,05% CSC в BJ
Цель данного эксперимента состояла в том, чтобы проверить ложноположительные пробы, используя 0,5 мг/мл (0,05%) CSC в BJ. Ложноположительные образцы давали положительные результаты без добавления CSC и отрицательные при добавлении 0,05% CSC к биотиновому разбавителю. Добавление 0,05% CSC не оказывало влияния на предсказание положительного или отрицательного результата пробы. Эти результаты показаны на Фиг. 3.
Пример IV. Сравнительные показатели хондроитина А, В и С
Цель этого эксперимента состояла в том, чтобы определить, может ли какой-либо изомер хондроитинсульфата обеспечить защиту от получения ложных результатов пробы. Хондроитинсульфат С, который использовался в вышеупомянутых экспериментах, представлял собой смесь хондроитинсульфата С и некоторого количества хондроитинсульфата А. Наименьшее количество хондроитинсульфата С в смеси составляло 85%. Поскольку может присутствовать до 15% изомера А, на эффективность были протестированы изомеры А, В и С.
Полученные результаты показали, что все изомеры хондроитинсульфата успешно снижали наблюдаемые концентрации в ложноположительных пробах, и не наблюдалось значительного различия между изомерами в отношении подавления ложноположительных реакций (см. Фиг. 4). Это приводит к выводу о том, что процентная чистота хондроитинсульфата в связи с концентрациями изомеров А и В не влияет на подавление ложноположительных откликов.
Пример V. Проба на сердечный тропонин I
Использовали метод иммунометрического иммунологического анализа (см. Фиг. 5), включающий одновременную реакцию сердечного тропонина I, присутствующего в пробе, с биотинилированными антителами (мышиное моноклональное анти-cTnI: клон 19С7, узнающий аминокислоты 41-49 Тропонина I, и второй клон, специфичный к участку Тропонина I, включающему аминокислоты 24-40) и конъюгатом антитела, меченным пероксидазой хрена (HRP) (мышиное моноклональное анти-cTnI: клон 16А11, узнающий аминокислоты 87-91 Тропонина I). Биотинилированные тропониновые Mab специфично реагируют с тропонином I в пробе с образованием комплекса, связывающимся со стрептавидином лунки SAC. Несвязанные материалы удаляют путем промывания, и комплекс тропонина обнаруживают, используя HRP меченый Mab (который специфично связывается с эпитопом тропонина I, отличающимся от эпитопа, с которым связываются биотинилированные Mab). Связанный конъюгат HRP измеряется люминесцентной реакцией. Реагент, содержащий люминогенные субстраты (производную люминола и соль перкислоты) и агент переноса электронов, добавляют в лунки. HRP в связанных конъюгатах катализирует окисление производной люминола, производя свет. Агент переноса электронов (замещенный ацетанилид) увеличивает уровень произведенного света и продлевает его излучение. Световые сигналы считываются иммунодиагностической системой VITROS™ (Ortho-Clinical Diagnostics, Inc., Раритан, Нью-Джерси). Количество связанного HRP конъюгата прямопропорционально концентрации присутствующего cTnI.
Протокол анализа был таким: 1) в лунку SAC добавляли 80 мкл пробы, 35 мкл биотинового реагента (BJ) и 35 мкл реагента конъюгата (CJ); 2) Инкубирование в течение 10 минут 40 секунд; 3) Промывка ячейки SAC; 4) Добавление 200 мкл реагента сигнала и измерение излучаемого света.
15
Лунки SAC готовили путем покрытия полистироловых лунок стрептавидином. Вкратце, полистироловые лунки вначале облучали 3,5 Мрад для оптимизации адсорбции белков. Биотинилированный бычий сывороточный альбумин (B-BSA), полученный путем химического соединения биотина с BSA, используя коммерчески доступный активизированный сложный эфир (биотин-ХХ-NHS, Calbiochem, Ноттингем, Великобритания), наносили на полистироловые лунки. Покрытие наносили путем инкубирования лунок с раствором B-BSA в течение 10 минут. B-BSA физически адсорбировался и не связывался ковалентно с поверхностью полистирола. Лунки промывали перед нанесением покрытия из стрептавидина. Стрептавидин наносили на лунки путем инкубирования стрептавидинового раствора с покрытой биотином поверхностью в течение 50 минут. Взаимодействие между стрептавидином и биотином является нековалентным, но очень прочным (10 л/моль). Лунки промывали еще раз, а затем сушили и хранили.
Стрептавидин имеет четыре участка связывания с биотином, поэтому после иммобилизации стрептавидина на поверхности имеются свободные участки связывания с биотином. Эти участки связывания могут реагировать с биотинилированными компонентами анализа.
Реагент конъюгата (CJ) включает следующие компоненты:
Компонент Количество г/л
Компонент
Количество г/л
Вода
849,3
К<sub>2</sub>НРО<sub>4</sub>
13
КН<sub>2</sub>РО<sub>4</sub>
17
Kathon
20
BSA 30%
100
HRP-меченый mab 16A11 клон
4 мг/л
рН
6,6
Реагент анализа или захвата (BJ) включает следующие компоненты:
Компонент
Количество г/л
Вода
К<sub>2</sub>НРО<sub>4</sub>
13
КН<sub>2</sub>РО<sub>4</sub>
17
Kathon
20
Бычий сывороточный альбумин 30%
100
EDTA (эквимолекулярный двунатриевый и тринатриевый)
15 мМ
Хондроитинсульфат С
1
Биотинилированный mab 24-40aa специфический клон
5,5 мг/л
Биотинилированный mab 19C7 клон
3 мг/л
рН
6,6
Моноклопальные антитела доступны коммерчески. HyTest, Ltd (Itainen Pitkakatu 4C, Pharma City, Торку, Финляндия 20520) является поставщиком клона 19С7 мышиного моноклонального антитела, специфического к области тропонина I, включающей аминокислоты 41-49. Это Mab биотинилировано, как описано ниже. HyTest также поставляет клон 16А11 мышиного моноклонального антитела, специфического к области тропонина I, включающей аминокислоты 87-91. Это Mab метят HRP, как описано ниже. Strategic BioSolutions (111 Pencader Dr., Newark, Делавэр, США 19702) поставляет клон мышиного моноклонального антитела, специфического к области тропонина I, включающей аминокислоты 24-40. Это Маb биотинилировано, как описано ниже.
Процедура биотинилирования включает следующее. Клон 19С7 и направленный клон Strategic BioSolutions 24-40 конъюгируют с биотином по отдельности посредством хорошо известной область-специфической химии.
Процедура мечения HRP включает следующее. Клон 16А11 от HyTest конъюгируют с HRP с использованием следующей методики: 1) Mab активируют малеимидными группами путем проведения реакции с сульфо-SMCC [сульфосукцинимидил 4-(М-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат]; 2) HRP активируют тиольными группами путем проведения реакции с NHS-SATA [N-гидроксисукцинимида s-ацетилтиоуксусной кислоты]; З) Оба активированных реагента очищают, а затем проводят их реакцию с образованием 16А11-HRP, который затем очищают.
Хотя здесь описаны конкретные варианты осуществления изобретения, следует понимать, что изобретение не ограничено ими, и специалист в данной области техники может внести различные изменения, в частности, в свете приведенного описания. В приведенное описание можно внести разумные изменения и модификации, не выходя за рамки изобретения.