СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РЕВМАТОИДНОГО АРТИРИТА ПО НАЛИЧИЮ АНТИТЕЛ К МОДИФИЦИРОВАННОМУ ЦИНТРУЛЛИНИРОВАННОМУ ВИМЕНТИНУ (Anti-MCV) В РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR RHEUMATOID ARTHRITIS IF MUTATED CITRULLINATED VIMENTIN ANTIBODIES (Anti-MCV) ARE FOUND IN ORAL FLUID

Изобретение относится к области медицины, к способу неинвазивной лабораторной диагностики ревматоидного артрита на основе исследования ротовой жидкости.
Ревматоидный артрит (РА) - одно из наиболее распространенных хронических системных воспалительных заболеваний соединительной ткани с прогрессирующим поражением преимущественно периферических (синовиальных) суставов по типу симметричного эрозивно-деструктивного полиартрита (Балабанова P.M., 1997; Сигидин Я.А. и соавт., 2001, 2004). Течение заболевания имеет неуклонно прогрессирующий характер, уже в первые 2-3 года болезни 20-30% пациентов теряют трудоспособность (Sokka Т., 2003), через 10-15 лет от начала болезни нетрудоспособными становятся около 90% пациентов, а треть - полными инвалидами (Насонов Е.Л., 2004; Фоломеева О.М., 2001). РА приводит не только к ранней инвалидизации, но и к снижению продолжительности жизни пациентов. Известно, что ранняя диагностика заболевания позволяет проводить лечение на начальных этапах воспалительного процесса.
Известен «СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА ПО МИКРОЭЛЕМЕНТНОМУ СОСТАВУ И КОНЦЕНТРАЦИИ ЛАКТОБАКТЕРИЙ В НЕСТИМУЛИРОВАННОЙ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ» (Патент №2460076, опубл. 27.08.2012). Общим является исследуемая биологическая среда - ротовая жидкость, которая используется для диагностики заболевания. Способ не позволяет диагностировать ревматоидный артрит.
Известен способ дифференциальной диагностики ревматоидного артрита, раскрытый в патенте РФ №2313096, опубл. 20.12.2007 г. В известном способе в сыворотке крови пациентов с подозрением на наличие РА для подтверждения диагноза, установленного на основании клинического и лабораторного обследований, определяют содержание двух острофазовых белков - лактоферрина (ЛФ) в мкг/мл, и антитромбина III (АТБ) в мг/дл, находят диагностический критерий К, вычисляя его по формуле:
К=ЛФ×АТБ, где:
ЛФ - концентрация лактоферрина, мкг/мл;
АТБ - концентрация антитромбина III, мг/дл.
При значениях К более 4,5 диагностируют наличие ревматоидного артрита, а при значениях К менее 4,5 диагностируют другие заболевания суставов.
В настоящее время лабораторная диагностика РА осуществляется при помощи количественного определения антител класса IgG к модифицированному цитруллинированному виментину (Anti-MCV) методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) в сыворотке и плазме крови с высокой чувствительностью и специфичностью для РА (Besada Е., Nikolaisen С, 2011; Van Steendam К., 2010; Mansour Н.Е., Metwaly К.М., 2010; Liu X., Jia R., Zhao J., 2009). Виментин - широко распространенный в организме цитрулинированный белок, который синтезируется и модифицируется макрофагами под регуляцией провоспалительных и воспалительных цитокинов и встречается в синовиальной ткани пациентов с РА. Известный способ выбран нами в качестве ближайшего аналога. Данный способ позволяет выявить РА, но методика инвазивна, т.к. производится забор крови, что является недостатком методики. Кроме того, на сегодняшний день в ревматологии определение показателя Anti-MCV в сыворотке крови является высокоспецифичным методом диагностики ревматоидного артрита.
Доступной биологической средой является ротовая жидкость. Ротовая жидкость - это среда, содержащая секрет слюнных желез, десневую жидкость, микрофлору и продукты их жизнедеятельности, десквамированный эпителий, полиморфно-ядерные лейкоциты, пищевой детрит (Боровский Е.В., 2001; Вавилова Т.П., 2011; Patil Р.В., Patil B.R., 2011). Это структурированная система, ответственная за поддержание гомеостаза полости рта, а колебания показателей параметров ротовой жидкости могут манифестировать его изменения (Lee Y., Wong D.T., 2009; Helmerhorst E.J., 2007).
При системном аутоиммунном воспалительном процессе Anti-MCV проникают в ротовую жидкость. Следовательно, появляется возможность использования неинвазивной скрининговой методики. В доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен малоинвазивный способ диагностики ревматоидного артрита путем исследования нестимулированной ротовой жидкости.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в том, что предлагается малоинвазивный и достоверный способ диагностики ревматоидного артрита по содержанию специфического маркера - Anti-MCV в ротовой жидкости (в смешанной слюне).
Указанный технический результат достигается тем, что заявляется способ диагностики ревматоидного артрита путем количественного определения антител класса IgG к модифицированному цитруллинированному виментину a-MCV методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что определяют содержание Anti-MCV в ротовой жидкости, для обработки полученных показателей Anti-MCV в ротовой жидкости используют математическое выражение:
F=0,17×Anti-MCV-0,2537,
при положительном значении F диагностируют наличие ревматоидного артрита, при отрицательном значении функции F ревматоидный артрит сомнителен.
Общим признаком в аналоге является лабораторная диагностика методом твердофазного иммуноферментного анализа. Отличительным признаком является то, что в предлагаемом нами способе диагностики исследуется ротовая жидкость - легкодоступная биологическая среда, получаемая неинвазивным способом. Используемый метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа является широко внедренным способом диагностики во многих лабораторных базах и не требует дополнительного обучения персонала.
Заявляемый способ диагностики РА осуществляется следующим образом. Сбор смешанной слюны (нестимулированной) в состоянии покоя проводится с утра натощак в сухие стерильные пробирки. Общее время сбора составляет 10 минут. Образцы транспортируются в лабораторию. Далее проводится определение Anti-MCV в смешанной слюне. Количественное определение антител к цитрулинированному виментину проводится методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа с помощью тест-системы ORGENETIC Anti-MCV (ELISA). Анализ проводится на микропланшете, в лунках которого сорбирован модифицированный цитрулинированный виментин (MCV). При наличии антител к данному антигену в образцах ротовой жидкости они связываются с иммобилизированным антигеном. Проводится промывка для удаления не связавшихся компонентов ротовой жидкости. Далее в ячейки добавляется конъюгат антител к IgG, который иммунологически связывается с аутоантителами из образцов ротовой жидкости, связавшихся с иммобилизированными антигенами, в результате чего образовываются комплексы конъюгат/антитело/антиген. Проводится промывка для удаления избытков конъюгата. Раствор гидролизуется с образованием голубого окрашивания. Добавляется стоп-раствор (10% раствор фосфорной кислоты), при этом цвет раствора меняется на желтый. Интенсивность окрашивания определяется фотометрически при 450 нм, она прямо пропорциональна концентрации IgG в образце.
В основную группу исследования были включены 36 пациентов с РА с достоверным диагнозом ревматоидного артрита, в возрасте от 24 до 55 лет (включительно), отсутствием указаний в анамнезе и клинических проявлений тяжелой хронической соматической патологии (включая другие ревматические заболевания). Контрольную группу составили 35 условно-здоровых пациентов, не страдающих ревматоидным артритом или другими ревматическими заболеваниями. Группа сравнения была сопоставима с основной группой по полу и возрасту.
У обеих подгрупп также проведено исследование Anti-MCV в сыворотке крови для подтверждения диагностики. У всех больных РА при исследовании периферической крови получены показатели, подтверждающие диагноз РА.
Для обработки полученных показателей Anti-MCV в ротовой жидкости было использовано математическое выражение, представленное ниже:
F=0,17×Anti-MCV-0,2537.
У пациентов контрольной группы получалось отрицательное значение функции F, в то время как у пациентов с РА значение функции F было положительным.
В результате статистической обработки полученных данных установлено, что при значении Anti-MCV в ротовой жидкости более 1,5 Ед./мл диагностируется РА. При значениях меньше 1,5 Ед./мл РА сомнителен.
Заявляемый способ легко воспроизводится в условиях клинической лаборатории, заявленный технический результат достигается, т.к. способ является малоинвазивным и достоверным.