СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ ФОЛАТНОГО РЕЦЕПТОРА 1 В ОБРАЗЦЕ ПАЦИЕНТА
METHODS FOR DETECTING FOLATE RECEPTOR 1 IN PATIENT SAMPLE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Область данного изобретения в целом относится к способам и наборам для обнаружения человеческого рецептора фолиевой кислоты 1 (FOLR1) в образце.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0002] Рак является одной из основных причин смерти в развитых странах мира с более чем одним миллионом человек с диагнозом онкологическое заболевание и 500 000 смертей в год в одних только Соединенных Штатах. В целом, по оценкам, более чем у 1 из 3 человек будут развиваться некоторые формы онкологических заболеваний в течение их жизни. Существует более 200 различных типов рака, на четыре из которых - рак молочной железы, легкого, колоректальный и простаты - приходится более половины всех новых случаев (Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26).
[0003] Рецептор фолиевой кислоты 1 (FOLR1), также известный как рецептор фолиевой кислоты альфа или фолат-связывающий белок представляет собой N-гликозилированный белок, экспрессируемый на плазматической мембране клеток. FOLR1 обладает высокой аффинностью к фолиевой кислоте и к нескольким восстановленным производным фолиевой кислоты. FOLR1 опосредует доставку физиологической формы фолиевой кислоты, 5-метилтетрагидрофолата, во внутреннюю часть клетки.
[0004] FOLR1 сверхэкспрессируется при подавляющем большинстве случаев злокачественных новообразований яичников, а также при многих злокачественных новообразованиях матки, эндометрия, поджелудочной железы, почек, легкого и молочной железы, в то время как экспрессия FOLR1 в здоровых тканях ограничена апикальной мембраной эпителиальных клеток в проксимальных почечных канальцах, альвеолярных пневмоцитах легкого, мочевом пузыре, яичках, хороидном сплетении и щитовидной железе (Weitman SD, et al., Cancer Res 52: 3396-3401 (1992); Antony AC, Annu Rev Nutr 16: 501-521 (1996); Kalli KR, et al. Gynecol Oncol 108: 619-626 (2008)). Данный профиль экспрессии FOLR1 делает его желательной мишенью для FOLR1-направленной противораковой терапии.
[0005] Поскольку рак яичников, как правило, протекает бессимптомно до поздней стадии, он часто диагностируется на поздней стадии и имеет плохой прогноз при лечении доступными в настоящее время процедурами, как правило, химиотерапевтическими препаратами после циторедуктивного оперативного вмешательства (von Gruenigen V et al., Cancer 112: 2221-2227 (2008); Ayhan A et al., Am J Obstet Gynecol 196: 81 e81-86 (2007); Harry VN et al., Obstet Gynecol Surv 64: 548-560 (2009)). Таким образом, существует очевидная неудовлетворенная медицинская потребность в более эффективных терапевтических средствах при злокачественных новообразованиях яичников.
[0006] Некоторые предыдущие анализы, использованные для обнаружения слущивающегося FOLR1, недостаточно специфичны для FOLR1. Например, в некоторых анализах не проводится различие между FOLR1 и другими членами семейства рецепторов фолиевой кислоты (FOLR2, 3 и 4) или регистрируемыми значениями общего FBP (фолат-связывающего белка). Кроме того, некоторые анализы требуют, чтобы человеческие образцы (например, плазма) были предварительно обработаны слабой кислотой на стадии промывки для диссоциации фолиевой кислоты от рецептора. Некоторые результаты анализа могут также иметь неточности из-за конкурентных эффектов между препаратом на основе антитела и диагностическим антителом. Кроме того, многие коммерчески доступные наборы, как правило, ненадежны как в своих реагентах, так и в их стабильности от партии к партии. Оценки этих наборов дали очень неоднозначные результаты и предназначены только для применения в научных исследованиях. Для многих необходимо, чтобы человеческий образец был предварительно разведен перед анализом, чтобы уменьшить вероятность ложноположительных результатов из-за «матричного эффекта». Более того, многие современные анализы, например, анализы на основе ИФА, не обеспечивают достаточной чувствительности, чтобы различать изменения в слущивающемся FOLR1 на физиологических уровнях, и ограничены ложноположительными результатами. Таким образом, существует очевидная потребность в высокочувствительных и точных способах для обнаружения FOLR1 в образцах пациентов.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Данное изобретение обеспечивает способы обнаружения FOLR1 в образце и может быть применено, например, для количественного определения уровня человеческого FOLR1 в образце.
[0008] В одном варианте осуществления способ обнаружения человеческого рецептора фолиевой кислоты 1 (FOLR1) в образце включает: (а) захват указанного рецептора фолиевой кислоты 1 (FOLR1) с помощью реагента для иммунозахвата, связанного с твердой подложкой; (b) элюирование FOLR1 с твердой подложки; (c) расщепление элюированного FOLR1; и (d) проведение анализа методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ/МС) на расщепленный FOLR1, причем указанный FOLR1 детектируют путем мониторинга хроматографического разделения и масс-спектрометрического отклика по меньшей мере одного сигнатурного пептида FOLR1.
[0009] В одном варианте осуществления уровень FOLR1 в образце количественно определяют при помощи анализа методом ЖХ/МС. В одном варианте осуществления уровень FOLR1 в образце количественно определяют путем сравнения уровня FOLR1 в образце с эталонным уровнем FOLR1.
[0010] В одном варианте осуществления реагент для иммунозахвата содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с FOLR1. В одном варианте осуществления связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1 конкурентно не ингибируется связыванием IMGN853 с FOLR1. В одном варианте осуществления связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1 конкурентно не ингибируется связыванием huMov19 с FOLR1. В одном варианте осуществления связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1 конкурентно не ингибируется связыванием второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1, причем второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит: определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 59; CDR-2 VL SEQ ID NO: 60; CDR-3 VL SEQ ID NO: 61; CDR-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 62; CDR-2 VH SEQ ID NO: 64; и CDR-3 VH SEQ ID NO: 65. В одном варианте осуществления связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1 конкурентно не ингибируется связыванием второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1, причем второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую последовательность SEQ ID NO: 56, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую последовательность SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 58. В одном варианте осуществления связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1 конкурентно не ингибируется связыванием второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1, причем второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) тяжелую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность тяжелой цепи, кодируемая плазмидой, депонированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС) как PTA-10772, и (ii) легкую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность легкой цепи, кодируемая плазмидой, депонированной в АТСС как PTA-10774. В одном варианте осуществления связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1 не ингибируется связыванием фолиевой кислоты с FOLR1.
[0011] В одном варианте осуществления антитело представляет собой muFR1-9. В одном варианте осуществления антитело представляет собой muFR1-13. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 1; CDR-2 VH SEQ ID NO: 2; CDR-3 VH SEQ ID NO: 3; определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 13; CDR-2 VL SEQ ID NO: 14; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 15. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 4; CDR-2 VH SEQ ID NO: 5; CDR-3 VH SEQ ID NO: 6; определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 16; CDR-2 VL SEQ ID NO: 17; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 18.
[0012] В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 29. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 29. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 30. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 30.
[0013] В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую последовательность SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую последовательность SEQ ID NO: 29. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую последовательность SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую последовательность SEQ ID NO: 30. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 37. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 38.
[0014] В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с человеческим FOLR1 с Kd от около 1,0 нМ до около 10 нМ. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с человеческим FOLR1 с Kd от около 0,5 нМ до около 5 нМ.
[0015] В одном варианте осуществления твердая подложка включает микроколонку для масс-спектрометрического иммуноанализа (MSIA). В одном варианте осуществления твердая подложка включает магнитные гранулы.
[0016] В одном варианте осуществления по меньшей мере одну стадию промывки выполняют перед элюированием FOLR1 с твердой подложки. В одном варианте осуществления по меньшей мере две или более стадий промывки выполняют перед элюированием FOLR1 с твердой подложки. В одном варианте осуществления стадия промывки включает приведение в контакт FOLR1, связанного с твердой подложкой, с промывочными буферами, раствором соли и детергентом. В одном варианте осуществления FOLR1 элюируют с твердой подложки кислым раствором.
[0017] В одном варианте осуществления FOLR1 восстанавливают и алкилируют перед расщеплением FOLR1. В одном варианте осуществления FOLR1 расщепляют трипсином/Lys-C. В одном варианте расщепления FOLR1 продуцирует пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 42. В одном варианте осуществления расщепление FOLR1 продуцирует пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 43. В одном варианте осуществления расщепление FOLR1 продуцирует пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 44. В одном варианте осуществления расщепление FOLR1 продуцирует пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 45.
[0018] В одном варианте осуществления по меньшей мере два сигнатурных пептида FOLR1 выбирают и контролируют на стадии анализа методом ЖХ/МС. В одном варианте осуществления по меньшей мере три сигнатурных пептида FOLR1 выбирают и контролируют на стадии анализа методом ЖХ/МС. В одном варианте осуществления по меньшей мере четыре сигнатурных пептида FOLR1 выбирают и контролируют на стадии анализа методом ЖХ/МС.
[0019] В одном варианте осуществления сигнатурные пептиды содержат: (a) пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 42; (b) пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 43; (c) пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 44; и (d) пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 45.
[0020] В одном варианте осуществления образец содержит биологическую жидкость. В одном варианте осуществления биологическая жидкость представляет собой плазму. В одном варианте осуществления биологическая жидкость представляет собой сыворотку. В одном варианте осуществления биологическая жидкость представляет собой асцитную жидкость.
[0021] В одном варианте осуществления образец содержит образец периферической крови.
[0022] В одном варианте осуществления образец получают от пациента с раком. В одном варианте осуществления рак выбирают из группы, состоящей из: рака яичников, мозга, молочной железы, матки, эндометрия, поджелудочной железы, почек, легкого и рака брюшины. В одном варианте осуществления рак представляет собой рак яичника. В одном варианте осуществления обнаружение FOLR1 не ингибируется IMGN853, присутствующим в образце. В одном варианте осуществления обнаружение FOLR1 не ингибируется huMov19, присутствующим в образце.
[0023] В одном варианте осуществления обнаружение FOLR1 не ингибируется антителом или антигенсвязывающим фрагментом, присутствующим в образце, причем указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит: определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 59; CDR-2 VL SEQ ID NO: 60; CDR-3 VL SEQ ID NO: 61; CDR-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 62; CDR-2 VH SEQ ID NO: 64; и CDR-3 VH SEQ ID NO: 65. В одном варианте осуществления обнаружение FOLR1 не ингибируется антителом или антигенсвязывающим фрагментом, присутствующим в образце, причем указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую последовательность SEQ ID NO: 56, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую последовательность SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 58. В одном варианте осуществления обнаружение FOLR1 не ингибируется антителом или антигенсвязывающим фрагментом, присутствующим в образце, причем указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) тяжелую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность тяжелой цепи, кодируемая плазмидой, депонированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС) как PTA-10772, и (ii) легкую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность легкой цепи, кодируемая плазмидой, депонированной в АТСС как PTA-10774.
[0024] В одном варианте осуществления обнаружение FOLR1 не ингибируется фолиевой кислотой, присутствующей в образце.
[0025] В одном варианте осуществления способ может обнаружить по меньшей мере 0,5 нг/мл FOLR1 в образце. В одном варианте осуществления способ может обнаружить по меньшей мере 0,3 нг/мл FOLR1 в образце. В одном варианте осуществления способ может обнаружить по меньшей мере 0,25 нг/мл FOLR1 в образце.
[0026] В одном варианте осуществления отношение сигнал/шум составляет по меньшей мере 5. В одном варианте осуществления отношение сигнал/шум составляет по меньшей мере 10.
[0027] В одном варианте осуществления FOLR1 представляет собой слущивающийся FOLR1.
[0028] Данное изобретение также обеспечивает новые пептиды FOLR1. В одном варианте осуществления пептид состоит из последовательности SEQ ID NO: 42. В одном варианте осуществления пептид состоит из последовательности SEQ ID NO: 43. В одном варианте осуществления пептид состоит из последовательности SEQ ID NO: 44. В одном варианте осуществления пептид состоит из последовательности SEQ ID NO: 45.
[0029] Данное изобретение также обеспечивает наборы для обнаружения FOLR1 в образце. В одном варианте осуществления набор содержит реагент для иммунозахвата, который связывается с FOLR1, реагент для расщепления и по меньшей мере один пептид, выбранный из группы, состоящей из: а) пептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 42; b) пептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 43; c) пептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 44; и d) пептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 45.
[0030] В одном варианте осуществления реагент для иммунозахвата содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с FOLR1. В одном варианте осуществления антитело представляет собой muFR1-9. В одном варианте осуществления антитело представляет собой muFR1-13.
[0031] В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 1; CDR-2 VH SEQ ID NO: 2; CDR-3 VH SEQ ID NO: 3; определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 13; CDR-2 VL SEQ ID NO: 14; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 15. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 4; CDR-2 VH SEQ ID NO: 5; CDR-3 VH SEQ ID NO: 6; определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 16; CDR-2 VL SEQ ID NO: 17; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 18.
[0032] В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 29. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 29. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 30. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 30.
[0033] В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую последовательность SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую последовательность SEQ ID NO: 29. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую последовательность SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую последовательность SEQ ID NO: 30.
[0034] В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 37. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 38.
[0035] В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с человеческим FOLR1 с Kd от около 1,0 нМ до около 10 нМ. В одном варианте осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент связывается с человеческим FOLR1 с Kd от около 0,5 нМ до около 5 нМ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0036] На Фиг. 1 показано схематическое представление анализа методом ЖХ/МС с иммунозахватом FOLR1.
[0037] На Фиг. 2 показана хроматограмма по выделенному иону из образца, содержащего низкий уровень растворимого FOLR1 в суррогатной матрице при 0,3 нг/мл.
[0038] На Фиг. 3 показана хроматограмма по выделенному иону из образца нормальной человеческой плазмы.
[0039] На Фиг. 4 показана хроматограмма по выделенному иону из образца, полученного от пациента до введения дозы, с повышенным растворимым FOLR1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0040] Данное изобретение обеспечивает новый способ обнаружения человеческого рецептора фолиевой кислоты 1 (FOLR1) в образце пациента. Выполняют начальную стадию иммунозахвата FOLR1 с последующим расщеплением захваченного FOLR1 в пептиды и количественным анализом пептидов при помощи жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ/МС). Антитела, которые конкурентно не ингибируют связывание активного агента против FOLR1 (например, активного агента, содержащего антитело huMov19, такого как IMGN853), с FOLR1, являются полезными на стадии иммунозахвата согласно изобретению.  Антитела, которые конкурентно не ингибируют связывание активного агента против FOLR1, особенно полезны при захвате FOLR1 (например, слущивающегося FOLR1) в образцах от пациентов, которых лечили активным агентом против FOLR1. Также раскрыты пептиды FOLR1, полученные способами согласно изобретению. Такие пептиды полезны для определения уровня FOLR1 в образце пациента при помощи ЖХ/МС. Также предложены наборы, содержащие FOLR1-связывающие агенты и пептиды FOLR1.
I. Определения
[0041] Для облегчения понимания данного изобретения ниже приведен ряд терминов и фраз.
[0042] Используемые в данном документе термины «человеческий рецептор фолиевой кислоты 1», «FOLR1» или «рецептор фолиевой кислоты альфа (FR-α)» относятся к любому природному FOLR1 человека, если не указано иное. Таким образом, все эти термины могут относиться к последовательности белка или нуклеиновой кислоты, как указано в данном документе. Термин «FOLR1» охватывает «полноразмерный» непроцессированный FOLR1, а также любую форму FOLR1, которая является результатом процессинга в клетке. Термин также охватывает встречающиеся в природе варианты FOLR1, например сплайс-варианты (кроме тех вариантов, которые охватывают FOLR2, FOLR3 или FOLR4), аллельные варианты и изоформы. Описанные в данном документе полипептиды FOLR1 могут быть выделены из различных источников, например, из разных типов тканей человека, или из другого источника, или получены рекомбинантными или синтетическими способами. Примеры последовательностей FOLR1 включают, но не ограничиваются идентификационными номерами NCBI P15328, NP_001092242.1, AAX29268.1, AAX37119.1, NP_057937.1, и NP_057936.1. Последовательность FOLR1 человека является следующей:
MAQRMTTQLLLLLVWVAVVGEAQTRIAWARTELLNVCMNAKHHKEKPGPEDKLHEQCRPWRKNACCSTNTSQEAHKDVSYLYRFNWNHCGEMAPACKRHFIQDTCLYECSPNLGPWIQQVDQSWRKERVLNVPLCKEDCEQWWEDCRTSYTCKSNWHKGWNWTSGFNKCAVGAACQPFHFYFPTPTVLCNEIWTHSYKVSNYSRGSGRCIQMWFDPAQGNPNEEVARFYAAAMSGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS (SEQ ID NO:41).
[0043] Термины «слущивающийся антиген» и «слущивающийся FOLR1» («sFOLR1» или «sFRα») используются в данном документе взаимозаменяемо. Эти термины относятся к белку FOLR1, который растворим и не связан с клетками. В некоторых вариантах осуществления он содержит внеклеточный домен (ВКД) и гликозилфосфатидилинозитольный (ГФИ) линкер. В одном варианте осуществления слущивающийся FOLR1 содержит только ВКД. FOLR1 содержит сигнальный пептид (аминокислоты 1-24) цепи белка FOLR1 (аминокислоты 25-233 или 234) и пропептид, который может быть расщеплен (аминокислоты с 235 по 257). Слущивающийся FOLR может содержать аминокислоты от 1 до 257, от 1 до 233, от 1 до 234, от 25 до 233, от 25 до 234 или любые другие их фрагменты. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность отщепляется. В других вариантах осуществления ВКД и часть ГФИ могут быть погружены в мембрану (например, растворимый липидный рафт). В одном варианте осуществления слущивающийся FOLR1 может содержать аминокислоты 1-233 или их фрагмент.
[0044] Термин «антитело» означает молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид, или комбинацией вышеперечисленного, через по меньшей мере один сайт распознавания антигена в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Как используется в данном документе термин «антитело» включает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, пока антитела проявляют желаемую биологическую активность. Антитело может быть любым из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG, и IgM, или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2), на основе идентичности их константных доменов тяжелой цепи, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю, соответственно. Различные классы иммуноглобулинов имеют различные и хорошо известные структуры субъединиц и трехмерные конфигурации. Антитела могут быть неконъюгированными или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и т. д.
[0045] Термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела. «Антигенсвязывающий фрагмент» относится к части интактного антитела, которая связывается с антигеном.  Антигенсвязывающий фрагмент может содержать определяющие антигенность вариабельные области интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, и Fv, линейные антитела, и одноцепочечные антитела.
[0046] Термин «антитело против FOLR1» или «антитело, которое связывается с FOLR1» означает антитело, которое способно связываться FOLR1 с достаточной аффинностью таким образом, что антитело становится пригодным в качестве диагностического и/или терапевтического агента для нацеливания на FOLR1 (например, антитело huMov19 (M9346A)). Степень связывания антитела против FOLR1 с неродственным белком, не являющимся FOLR1, составляет менее чем около 10 % от связывания антитела с FOLR1, как измерено, например, с помощью радиоиммунологического анализа (РИА).
[0047] Термин «IMGN853» (также известный как мирветуксимаб соравтанзин) относится к описанному в данном документе иммуноконъюгату, содержащему антитело huMov19 (M9346A), линкер сульфо-SPDB и майтанзиноид DM4. Полипептиды SEQ ID NO: 56-58 содержат вариабельный домен тяжелой цепи huMov19 (M9346A), вариабельный области легкой цепи из версии 1.00, и вариабельный домен легкой цепи из версии 1.60 huMov19, соответственно. В определенных вариантах осуществления антитело huMov19 (M9346A) представляет собой антитело против FOLR1, содержащее последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 56 и последовательность вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO:58 (версия 1.60 huMov19). DM4 относится к N2'-деацетил-N2'-(4-меркапто-4-метил-1-оксопентил)-майтанзину. «Сульфо-SPDB» относится к линкеру N-сукцинимидил 4- (2-пиридилдитио)-2-сульфобутаноат). В некоторых вариантах осуществления антитело huMov19 (M9346A) кодируются плазмидами, депонированными в Американской коллекции типовых культур (АТСС), расположенной по адресу 10801, Университетский Бульвар, Манассас, штат Вирджиния 20110, США от 7 апреля 2010 года в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры и имеющим номера хранения ATCC. PTA-10772 и PTA-10773 или 10774. Приведенная ниже информация о последовательности обеспечивает определяющие комплементарность области (CDR), вариабельные области тяжелых и легких цепей и полноразмерные тяжелые и легкие цепи huMov19:
Вариабельная область тяжелой цепи huMov19 (SEQ ID NO: 56)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSS
Вариабельная область легкой цепи huMov19 версии 1.00 (SEQ ID NO: 57)
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR
Вариабельная область легкой цепи huMov19 версии 1.60 (SEQ ID NO: 58)
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKR
CDR1 вариабельной области легкой цепи huMov19 (SEQ ID NO: 59)
KASQSVSFAGTSLMH
CDR2 вариабельной области легкой цепи huMov19 (SEQ ID NO: 60)
RASNLEA
CDR3 вариабельной области легкой цепи huMov19 (SEQ ID NO: 61)
QQSREYPYT
CDR1 вариабельной области тяжелой цепи huMov19 (SEQ ID NO: 62)
GYFMN
CDR2 вариабельной области тяжелой цепи huMov19 - определено по Кабату (SEQ ID NO: 63)
RIHPYDGDTFYNQKFQG
CDR2 вариабельной области тяжелой цепи huMov19 - определено по Abm (SEQ ID NO: 64)
RIHPYDGDTF
CDR3 вариабельной области тяжелой цепи huMov19 (SEQ ID NO: 65)
YDGSRAMDY
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи huMov19 (SEQ ID NO: 66)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYFMNWVKQSPGQSLEWIGRIHPYDGDTFYNQKFQGKATLTVDKSSNTAHMELLSLTSEDFAVYYCTRYDGSRAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Аминокислотная последовательность легкой цепи huMov19 версии 1.00 (SEQ ID NO: 67)
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLNISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Аминокислотная последовательность легкой цепи huMov19 версии 1.60 (SEQ ID NO: 68)
DIVLTQSPLSLAVSLGQPAIISCKASQSVSFAGTSLMHWYHQKPGQQPRLLIYRASNLEAGVPDRFSGSGSKTDFTLTISPVEAEDAATYYCQQSREYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[0048] Термин «иммуноконъюгат» или «конъюгат», используемый в данном документе, относится к соединению или его производному, которое связано с клеточносвязывающим агентом (то есть, анти-FOLR1 антителом или его фрагментом) и определяется общей формулой: C-L-A, где C = цитотоксин, L = линкер и A = антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, например, антитело против FOLR1 или фрагмент антитела. Иммуноконъюгаты также могут быть определены с помощью общей формулы в обратном порядке: A-L-C.
[0049] «Линкер» означает любой химической фрагмент, который способен связывать соединение, как правило, лекарственное средство (такое как майтанзиноид), с агентом, связывающимся с клеткой, (таким как анти-FOLR1 антитело или его фрагмент) стабильным ковалентным способом. Линкеры могут быть восприимчивы к или по существу устойчивы к, например, расщеплению дисульфидной связи, в условиях, при которых соединение или антитело остается активным. Подходящие линкеры хорошо известны в данной области техники и включают, например, дисульфидные группы и тиоэфирные группы.
[0050] «Моноклональное» антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к гомогенной популяции антитела или антигенсвязывающего фрагмента, вовлеченной в высокоспецифическое распознавание и связывание одной антигенной детерминанты, или эпитопа. Этим они отличаются от поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных антигенных детерминант. Термин «моноклональное» антитело или его антигенсвязывающий фрагмент охватывает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (например, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), одноцепочечные (ScFv) мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую сайт распознавания антигена. Кроме того, «моноклональное» антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к таким антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, сделанным любым количеством способов, в том числе, но не ограничиваясь ими, гибридомой, селекцией фагов, рекомбинантной экспрессией, и трансгенными животными.
[0051] Термин «гуманизированное» антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к формам нечеловеческих (например, мышиных) антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые являются специфическими иммуноглобулиновыми цепями, химерными иммуноглобулинами или их фрагментами, которые содержат минимальные нечеловеческие (например, мышиные) последовательности. Как правило, гуманизированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из определяющей комплементарность области (CDR) заменены остатками из CDR отличных от человека видов (например, мыши, крысы, кролика, хомяка), которые имеют желаемую специфичность, аффинность и характеристики («с привитой CDR») (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками антитела или фрагмента из отличных от человека видов, которое обладает желаемой специфичностью, аффинностью и характеристиками. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может быть дополнительно модифицирован путем замены дополнительных остатков или в каркасной области Fv и/или в пределах замененных нечеловеческих остатков для улучшения и оптимизации специфичности, аффинности, и/или характеристик антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В общем, гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент будет содержать по существу все из по меньшей мере одного, и, как правило, двух или трех вариабельных доменов, содержащих все или по существу все области CDR, которые соответствуют нечеловеческому иммуноглобулину, а все или по существу все области FR представляют собой области консенсусной последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может также содержать по меньшей мере часть константной области или домена (Fc) иммуноглобулина, как правило, иммуноглобулина человека. Примеры способов, используемых для генерации гуманизированных антител, описаны в патенте США. 5225539; Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994), и Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996). В некоторых вариантах осуществления «гуманизированное антитело» представляет собой антитело с измененной поверхностью.
[0052] «Вариабельная область» антитела относится к вариабельной области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, или отдельно, или в комбинации. Каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи состоит из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя определяющими комплементарность областями (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR, в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости посредством FR, и, с CDR, из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антител. Существует по меньшей мере два способа определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовой вариабельности последовательностей (т. е. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.), "Kabat"); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-lazikani et al, J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997)). Кроме того, иногда в данной области техники для определения CDR используются комбинации этих двух подходов.
[0053] Система нумерации по Кабату в общем случае используется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (например, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. (5th Ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) ("Kabat").
[0054] Нумерация положений аминокислот как в Кабат относится к системе нумерации, используемой для вариабельных доменов тяжелой цепи или вариабельных доменов легкой цепи, составляющих антитела в Кабат и др. (Sequences of Immunological Interest. (5th Ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.), "Kabat"). При использовании этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительное количество аминокислот, что соответствует укорочению FR или CDR вариабельного домена или вставке в них. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может содержать вставку одной аминокислоты (остаток 52a в соответствии с Кабат) после остатка 52 H2 и вставленные остатки (например, остатки 82a, 82b, 82c и т. д. в соответствии с Кабат) после остатка 82 FR тяжелой цепи. Нумерация остатков по Кабату может быть определена для данного антитела путем выравнивания областей гомологии в последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной по Кабату последовательностью. Чотиа, вместо этого, относится к расположению структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 по Чотиа при нумерации согласно системе нумерации по Кабату варьируется между H32 и H34 в зависимости от длины петли (это связано с тем, что в схеме нумерации по Кабату в H35A и H35B размещаются вставки; если ни 35A ни 35B не присутствуют, петля заканчивается в 32; если присутствует только 35A, петля заканчивается в 33; если присутствуют оба 35A и 35B, петля заканчивается в 34). Гипервариабельные области по AbM представляют собой компромиссный вариант между CDR по Кабату, и структурными петлями по Чотиа, и используются в программном обеспечении для моделирования антител Oxford Molecular's AbM.
[0055] Термин «химерные» антитела или их антигенсвязывающие фрагменты относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, причем аминокислотная последовательность получена из двух или более видов. Как правило, вариабельная область как легких, так и тяжелых цепей соответствует вариабельной области антител или их антигенсвязывающих фрагментов, полученных из одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика и т. п.) с желаемой специфичностью, аффинностью и характеристиками в то время как константные области гомологичны последовательностям антител или их антигенсвязывающих фрагментов, полученным из другого источника (как правило, от человека), чтобы избежать индукции иммунного ответа у этого вида.
[0056] Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к той части антигена, которая может распознаваться и специфически связывается с конкретным антителом. Когда антиген является полипептидом, «эпитопы» могут образовываться как смежными аминокислотами, так и несмежными аминокислотами, сформированными укладкой третичной структуры белка. Эпитопы, образованные из смежных аминокислот, как правило, сохраняются при денатурации белка, тогда как эпитопы, образованные третичной структурой, как правило, теряются при денатурации белка. Эпитоп обычно включает по меньшей мере 3 и более, обычно, по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.
[0057] «Аффинность связывания» в целом относится к силе суммарного количества нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом) и ее связывающим партнером (например, антигеном). Если не указано иное, как используется в данном документе, «аффинность связывания» относится к истинной аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y в целом можно выразить константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерена обычными способами, известными в данной области техники, включая описанные в данном документе. Низкоаффинные антитела обычно связывают антиген медленно и склонны легко диссоциировать, тогда как высокоаффинные антитела обычно связывают антиген быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными дольше. В данной области техники известен ряд способов измерения аффинности связывания, любой из которых можно использовать в целях данного изобретения. Конкретные иллюстративные варианты осуществления описаны в данном документе.
-3
-12
-6
-11
-6
-10
-6
-9
-6
-8
-6
-7
[0058] Фраза «или более», когда используется в данном документе для обозначения аффинности связывания, относится к более сильному связыванию между молекулой и ее партнером по связыванию. Фраза «или более», когда используется в данном документе, относится к более сильному связыванию, представленному меньшим числовым значением Kd. Например, антитело, которое имеет аффинность к антигену «0,6 нМ или более», аффинность антитела к антигену составляет <0,6 нМ, т. е. 0,59 нМ, 0,58 нМ, 0,57 нМ и т. д., или любое значение меньше чем 0,6 нМ. В одном варианте осуществления аффинность антитела, определяемая по Kd, будет от около 10 до около 10 M, от около 10 до около 10 M, от около 10 до около 10 M, от около 10 до около 10 M, от около 10 до около 10 M, или от около 10 до около 10 M.
[0059] Считается, что антитело «конкурентно ингибирует» связывание эталонного антитела с данным эпитопом, если оно преимущественно связывается с этим эпитопом до такой степени, что оно в некоторой степени блокирует связывание эталонного антитела с эпитопом. Конкурентное ингибирование может быть определено любым способом, известным в данной области техники, например, конкурентным ИФА. Можно сказать, что антитело конкурентно ингибирует связывание эталонного антитела с данным эпитопом на по меньшей мере 90 %, по меньшей мере 80 %, по меньшей мере 70 %, по меньшей мере 60 %, или по меньшей мере 50 %.
[0060] Выражение «по существу сходный» или «по существу одинаковый», как используется в данном документе, означает достаточно высокую степень сходства между двумя числовыми значениями (как правило, одним, связанным с антителом по изобретению, и другим, связанным с эталонным антителом / антителом для сравнения), так что специалист в данной области техники посчитает разницу между этими двумя значениями такой, которая имеет небольшую или нулевую биологическую и/или статистическую значимость в контексте биологической характеристики, измеряемой указанными значениями (например, значениями Kd). Разница между указанными двумя значениями составляет менее чем около 50 %, менее чем около 40 %, менее чем около 30 %, менее чем около 20 %, или менее чем около 10 % в зависимости от значения для эталонного антитела / антитела для сравнения.
[0061] Полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка, или композиция, которые являются «выделенными», представляют собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку, или композицию, которая присутствуют в форме, не встречающейся в природе. Выделенные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетки или композиции включают те, которые были очищены до такой степени, что они больше не присутствуют в той форме, в которой они находятся в природе. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитело, полинуклеотид, вектор, клетка, или композиция являются по существу чистыми.
[0062] Используемый в данном документе термин «по существу чистый» относится к материалу, который чистый по меньшей мере на 50 % (то есть без загрязнений), чистый по меньшей мере на 90 %, чистый по меньшей мере на 95 %, чистый по меньшей мере на 98 % или чистый по меньшей мере на 99 %.
[0063] Термин «повышенная экспрессия» FOLR1 относится к образцу, который содержит повышенные уровни экспрессии FOLR1 по сравнению с эталонным образцом, эталонным уровнем FOLR1 или предыдущим уровнем FOLR1, обнаруженным у того же субъекта. Таким образом, например, «повышенные уровни белка FOLR1» в образце пациента могут иметь уровни белка FOLR1, которые выше, чем уровни белка FOLR1 в эталонном образце нераковых клеток. «Повышенные уровни белка FOLR1» в образце пациента также могут, например, иметь уровни белка FOLR1, которые равны уровням белка FOLR1 в образце раковых клеток.
[0064] «Эталонный образец» может использоваться для сопоставления и сравнения результатов, полученных в способах согласно изобретению из тестового образца. Эталонные образцы могут представлять собой клетки (например, клеточные линии, клеточный осадок), биологические жидкости или ткани. Уровни FOLR1 в «эталонном образце» могут представлять собой абсолютное или относительное количество, диапазон значений, минимальное и/или максимальное количество, среднее количество и/или медианное количество FOLR1. «Эталонный образец» может также представлять собой исходный уровень экспрессии FOLR1, с которым сравнивается тестовый образец. «Эталонный образец» может включать предыдущий образец или исходный образец от того же пациента, нормальный образец или образец из соответствующей популяции пациентов. Как правило, уровни FOLR1 выражаются в виде значений на стандартной кривой. Стандартная кривая представляет собой количественный способ построения данных анализа для определения концентрации FOLR1 в образце.  В одном варианте осуществления эталонный образец представляет собой стандарт антигена, содержащий очищенный FOLR1 или FOLR1-Fc. Раскрытые в данном документе способы обнаружения могут включать сравнение между уровнями экспрессии FOLR1 в тестовом образце и «эталонным значением» или «эталонным уровнем». В некоторых вариантах осуществления эталонное значение представляет собой уровень экспрессии FOLR1 в эталонном образце. Эталонное значение может быть заранее определенным значением и также может быть определено из эталонных образцов (например, эталонных биологических образцов), тестируемых параллельно с тестовыми образцами. Эталонное значение может представлять собой одно пороговое значение, например, медиану или среднее значение, или диапазон значений, например, доверительный интервал. Эталонные значения могут быть установлены для различных подгрупп индивидуумов, таких как индивидуумы, предрасположенные к раку, индивидуумы с раком на ранней или поздней стадии, индивидуумы мужского и/или женского пола или индивидуумы, проходящие лечение рака. В данном документе описаны примеры нормальных эталонных образцов или значений и положительных эталонных образцов или значений.
[0065] «Образец» или «биологический образец» согласно данному изобретению имеет биологическое происхождение в конкретных вариантах осуществления, например, от эукариотических организмов. В предпочтительных вариантах осуществления образец представляет собой человеческий образец, но образцы животных также могут быть использованы при практическом применении изобретения. Неограничивающие источники образца для применения в данном изобретении включают, например, плотные ткани, биопсийные пунктаты, асцит, жидкие экстракты, кровь, плазму, сыворотку, спинномозговую жидкость, лимфатическую жидкость, наружные участки кожи, дыхательные пути, кишечник и мочеполовые пути, слезы, слюну, молоко, опухоли, органы, культуры клеток и/или компоненты культуры клеток. Данное изобретение в особенности применимо для образцов рака, которые обычно содержат биологические жидкости, такие как асцит, где количество доступного материала мало. Метод может быть использован для изучения аспекта экспрессии FOLR1 или состояния образца, включая, но не ограничиваясь этим, сравнение различных типов клеток или тканей, сравнение различных стадий развития и обнаружение или определение наличия и/или типа заболевания или аномалии.
[0066] Используемый в данном документе термин «реагент для захвата» относится к реагенту, способному связывать и захватывать целевую молекулу в образце таким образом, что при подходящих условиях комплекс реагент для захвата - целевая молекула может быть отделен от остальной части образца. Термин «реагент для иммунозахвата» относится к иммунологическому реагенту, который способен связывать и захватывать целевую молекулу в образце таким образом, что при подходящих условиях комплекс реагент для захвата - целевая молекула может быть отделен от остальной части образца. В одном варианте осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент. В одном варианте осуществления реагент для захвата или реагент для иммунозахвата иммобилизован. В одном варианте осуществления реагент для захвата или реагент для иммунозахвата иммобилизован на твердой подложке.
[0067] Используемый в данном документе термин «детектируемое антитело» относится к антителу, которое может быть обнаружено или непосредственно через метку, усиленную при помощи средства обнаружения, или косвенно, например, через другое антитело, которое является меченным. Для прямого мечения антитело обычно конъюгируют с фрагментом, который можно обнаружить некоторыми способами. В одном варианте осуществления детектируемое антитело представляет собой биотинилированное антитело.
[0068] В контексте данного документа слово «метка» относится к детектируемому соединению или композиции, которые прямо или косвенно конъюгированы с антителом, чтобы генерировать «меченое» антитело. Метка может быть детектируемой сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение субстратного соединения или композиции, которое обнаруживается.
[0069] Под «корреляцией» или «коррелировать» подразумевается сравнение, каким-либо образом, производительности и/или результатов первого анализа с производительностью и/или результатами второго анализа. Например, можно использовать результаты первого анализа при проведении второго анализа и/или можно использовать результаты первого анализа, чтобы определить, следует ли выполнять второй анализ, и/или можно сравнить результаты первого анализа. анализ с результатами второго анализа.
[0070] Термины «рак» и «раковый» относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, при котором популяция клеток характеризуется нерегулируемым клеточным ростом. Примеры рака включают, но без ограничения этим, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких злокачественных новообразований включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак эндометрия или матки, рак слюнной железы, рак почки, рак печени, рак простаты, рак влагалища, рак щитовидной железы, карциному печени и различные типы рака головы и шеи. Рак может представлять собой злокачественную опухоль, которая экспрессирует FOLR1.
[0071] «Опухоль» и «новообразование» относятся к любой массе ткани, являющейся результатом чрезмерного роста или пролиферации клеток, или доброкачественных (неопухолевых), или злокачественных (раковых), включая предраковые поражения.
[0072] Термины «раковая клетка», «опухолевая клетка» и их грамматические эквиваленты относятся к общей популяции клеток, полученных из опухоли или предраковых поражений, в том числе как неонкогенных клеток, которые составляют большую часть популяции опухолевых клеток, так и онкогенных стволовых клеток (раковых стволовых клеток). Термин «опухолевая клетка», при использовании в данном документе, будет изменен на термин «неонкогенный», когда речь идет только о тех опухолевых клетках, которые не способны обновляться и дифференцироваться, чтобы отличить эти опухолевые клетки от раковых стволовых клеток.
[0073] Термин «субъект» относится к любому животному (например, млекопитающему), включая, но не ограничиваясь этим, людей, приматов, грызунов, и тому подобное, которое должно быть получателем конкретного лечения. Как правило, термины «субъект» и «пациент» используются в данном документе взаимозаменяемо по отношению к субъекту-человеку.
[0074] Термин «фармацевтический состав» относится к препарату, который находится в такой форме, чтобы обеспечить биологическую активность активного ингредиента, чтобы быть эффективным, и который не содержит каких-либо дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводиться состав. Такой состав может быть стерильным.
[0075] Как описано в данном документе «эффективное количество» антитела представляет собой количество, достаточное для выполнения конкретной указанной цели. «Эффективное количество» может быть определено эмпирически и стандартным способом по отношению к указанной цели.
[0076] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может быть разделен не аминокислотами. Кроме того, указанные термины включают аминокислотный полимер, который был модифицирован природным путем или путем вмешательства; например, образованием дисульфидных связей, гликозилированием, липидацией, ацетилированием, фосфорилированием или любыми другими манипуляциями или модификациями, такие как конъюгация с меченым компонентом. Также термин включает, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включающие, например, неприродные аминокислоты и т. д.), а также другие модификации известные в данной области техники. Понятно, что, поскольку полипептиды согласно данному изобретению основаны на антителах, в некоторых вариантах осуществления полипептиды могут встречаться в виде отдельных цепей или связанных цепей. В некоторых вариантах осуществления полипептид, пептид или белок не являются природными. В некоторых вариантах осуществления полипептид, пептид или белок очищают от других природных компонентов. В некоторых вариантах осуществления полипептид, пептид или белок получают рекомбинантным способом.
[0077] Термины «идентичный» или процент «идентичности» в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании (вводя гэпы, если необходимо) для максимального соответствия, не рассматривая какие-либо консервативные аминокислотные замены как часть идентичности последовательностей. Процент идентичности может быть измерен с использованием программного обеспечения или алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуального осмотра. В данной области техники известны различные алгоритмы и программное обеспечение, которые можно использовать для получения выравниваний аминокислотных или нуклеотидных последовательностей. Одним из таких неограничивающих примеров алгоритма выравнивания последовательностей является алгоритм, описанный в Karlin et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, модифицированный Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877, и включенный в программы NBLAST и XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). В определенных вариантах осуществления Gapped BLAST можно использовать как описано в Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, Южный Сан-Франциско, Калифорния) или Megalign (DNASTAR) представляют собой дополнительные общедоступные программы, которые можно использовать для выравнивания последовательностей. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы GAP в программном обеспечении GCG (например, с использованием матрицы NWSgapdna.CMP и штраф за открытие гэпа 40, 50, 60, 70 или 90 и штрафа за продолжение гэпа 1 , 2, 3, 4, 5 или 6). В определенных альтернативных вариантах осуществления программа GAP в программном пакете GCG, которая содержит алгоритм Нидлмана-Вунша (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), можно использовать для определения процента идентичности между двумя аминокислотными последовательностями (например, используя матрицу Blossum 62 или матрицу PAM250 и штраф за открытие гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6, или 4, и штраф за продолжение гэпа 1, 2, 3, 4, 5). Альтернативно, в определенных вариантах осуществления процент идентичности между нуклеотидными или аминокислотными последовательностями определяют с использованием алгоритма Майерса и Миллера (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Например, процентная идентичность может быть определена с использованием программы ALIGN (версия 2.0) и с использованием PAM120 с таблицей весов замен остатков, штрафом за продление гэпа 12 и штрафом за открытие гэпа 4. Подходящие параметры для максимального выравнивания с помощью конкретного программного обеспечения для выравнивания могут быть определены специалистом в данной области техники. В определенных вариантах осуществления используются параметры по умолчанию программного обеспечения для выравнивания. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности «X» первой аминокислотной последовательности с второй аминокислотной последовательности рассчитывается как 100 x (Y/Z), где Y представляет собой количество аминокислотных остатков, оцененных как идентичные совпадения при выравнивании первой и второй последовательностей (выровненные при помощи визуального осмотра или конкретной программы для выравнивания последовательностей), а Z представляет собой общее количество остатков во второй последовательности.  Если длина первой последовательности больше, чем вторая последовательность, процент идентичности первой последовательности ко второй последовательности будет больше, чем процент идентичности второй последовательности к первой последовательности.
[0078] В качестве неограничивающего примера, может ли какой-либо конкретный полинуклеотид иметь определенную процентную идентичность последовательности (например, по меньшей мере 80 % идентичность, по меньшей мере, 85 % идентичность, по меньшей мере 90 % идентичность, и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичность) с эталонной последовательностью, может быть определено в некоторых вариантах осуществления с помощью программы Bestfit (пакет для анализа последовательностей Wisconsin, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). В Bestfit используется алгоритм локальной гомологии Смита и Уотермана, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981),чтобы найти лучший сегмент гомологии между двумя последовательностями. При использовании Bestfit или любой другой программы выравнивания последовательностей для определения того, является ли конкретная последовательность, например, на 95 % идентичной эталонной последовательности в соответствии с данным изобретением, параметры устанавливаются таким образом, что процент идентичности рассчитывается по всей длине эталонной нуклеотидной последовательности и что в гомологии допускаются гэпы до 5 % от общего числа нуклеотидов в эталонной последовательности.
[0079] В некоторых вариантах осуществления две нуклеиновые кислоты или полипептида согласно изобретению являются по существу идентичными, что означает, что они имеют по меньшей мере 70 %, по меньшей мере 75 %, по меньшей мере 80 %, по меньшей мере 85 %, по меньшей мере 90 %, и в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % идентичность нуклеотидных или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия, измеренного с использованием алгоритма сравнения последовательностей или путем визуального осмотра. В некоторых вариантах осуществления идентичность существует в области последовательностей, длина которой составляет по меньшей мере около 10, около 20, около 40-60 остатков или любое целое значение между ними, или в более длинной области, чем 60-80 остатков, по меньшей мере около 90 100 остатков, или последовательности по существу идентичны по всей длине сравниваемых последовательностей, таких как, например, кодирующая область нуклеотидной последовательности.
[0080] «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой консервативную аминокислотную замену, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих аналогичные боковые цепи, были определены в данной области техники, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислые боковые цепи (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Например, замещение фенилаланина на тирозин представляет собой консервативную замену. В определенных вариантах осуществления консервативные замены в последовательности полипептидов и антител согласно изобретению не отменяют связывание полипептида или антитела, содержащего аминокислотную последовательность, с антигеном(ами), то есть FOLR1, с которым связывается полипептид или антитело. Способы идентификации консервативных замен последовательностей нуклеотидов и аминокислот, которые не устраняют связывание антигена, хорошо известны в данной области техники (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1 187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); и Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).
[0081] Как используется в данном описании и формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное.
[0082] Следует понимать, что в тех случаях, когда варианты осуществления описаны в данном документе с формулировкой «содержащий», в другом случае также обеспечены аналогичные варианты осуществления, описанные в терминах «состоящий из» и/или «состоящий в основном из».
[0083] Термин «и/или», используемый в фразе, такой как «A и/или B» в данном документе, предназначен для включения «A и B», «A или B», «A», и «B». Аналогично, термин «и/или», используемый во фразе, такой как «A, B и/или C», предназначен для охвата каждого из следующих вариантов осуществления: A, B, и C; A, B, или C; A или C; A или B; B или C; A и C; A и B; B и C; A (отдельно); B (отдельно); и C (отдельно).
II. FOLR1-связывающие агенты
[0084] Агенты, которые специфически связывают человеческий FOLR1, полезны при осуществлении способов согласно изобретению. Такие агенты упоминаются в данном документе как «FOLR1-связывающие агенты». FOLR1-связывающие агенты, полезные для осуществления способов по данному изобретению, описаны, например, в WO 2014/036495 и WO 2015/031815, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[0085] FOLR1-связывающие агенты включают агенты, которые содержат последовательности CDR тяжелой и легкой цепей muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, muFR1-64 и FOLR1-2.1 (также называемые «IMGN 353.2-1», «353.2-1», «2.1», или «muFRIHC2-1»). Последовательности CDR muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, FOLR1-2.1 описаны в таблицах 1 и 2 ниже.
Таблица 1. Аминокислотные последовательности CDR вариабельной области тяжелой цепи
Антитело
VH-CDR1
VH-CDR2
VH-CDR3
muFR1-9
SFGMH (SEQ ID NO:1)
YISSGSSTFYYADTVKG (SEQ ID NO:2)
ELTGTFAY (SEQ ID NO:3)
muFR1-13
RYSVH (SEQ ID NO:4)
MIWSGGNTDYNSVFKS (SEQ ID NO:5)
FDGKVSWFAY (SEQ ID NO:6)
muFR1-53
DYDIS (SEQ ID NO:7)
EIYPGSGRTYYNERFKG (SEQ ID NO:8)
SYYYGTNSPFAY (SEQ ID NO:9)
muFR1-62
TYTMH (SEQ ID NO:10)
YINPTSGYNNYNQKFKE (SEQ ID NO:11)
GGAYGRRPVDY (SEQ ID NO:12)
muFRIHC2-1(«2.1»)
NSYIH (SEQ ID NO:46)
WIYPESLNTQYNEKFKA (SEQ ID NO:47)
RGIYYYSPYALDH (SEQ ID NO:48)
Таблица 2: Аминокислотные последовательности CDR вариабельной области легкой цепи
Антитело
VL-CDR1
VL-CDR2
VL-CDR3
muFR1-9
RASQSINNNLH (SEQ ID NO:13)
YASQSIS (SEQ ID NO:14)
QQSNSWPQVT (SEQ ID NO:15)
muFR1-13
KASQSVSNDVL (SEQ ID NO:16)
YAYNRYS (SEQ ID NO:17)
QQDHSSPFT (SEQ ID NO:18)
muFR1-53
RASQDISNYLH (SEQ ID NO:19)
YTSRLQS (SEQ ID NO:20)
QQGNSLPPT (SEQ ID NO:21)
muFR1-62
KASQNVGTNVA (SEQ ID NO:22)
SASSRYS (SEQ ID NO:23)
HQYNSYPYT (SEQ ID NO:24)
muFRIHC2-1(«2.1»)
KSSKSLLNSDGFTYLD (SEQ ID NO:49)
LVSNHFS (SEQ ID NO:50)
FQSNYLPLT (SEQ ID NO:51)
[0086] FOLR1-связывающие молекулы могут представлять собой антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с FOLR1, которые содержат CDR muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, muFR1-64 или FOLR1-2.1 (также называемые «IMGN 353.2-1», «353.2-1», «2.1», или «muFRIHC2-1») с максимум четырьмя (т.е. 0, 1, 2, 3 или 4) консервативными аминокислотными заменами на CDR.
[0087] Полипептиды могут содержать одну из отдельных вариабельных легких цепей и вариабельных областей тяжелых цепей, описанных в данном документе. Антитело и полипептиды могут также содержать как вариабельную область легкой цепи, так и вариабельную область тяжелой цепи. Последовательности вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи мышиных антител muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, и FOLR1-2.1 (также называемые «IMGN 353.2-1», «353.2-1», «2.1», или «muFRIHC2-1») представлены в таблицах 3 и 4 ниже.
Таблица 3. Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи
Антитело
Аминокислотная последовательность VH (SEQ ID NO)
muFR1-9HCvar
QVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCAKELTGTFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:25)
muFR1-13HCvar
QVQLKESGPDLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWIRQPPGKGLEWLGMIWSGGNTDYNSVFKSRLNITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCATFDGKVSWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:26)
muFR1-53HC
QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYKFTDYDISWVLQRTGQGLEWIGEIYPGSGRTYYNERFKGKATLTADKSSNTVYMQLSSLTSEDSAVYFCASSYYYGTNSPFAYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO:27)
muFR1-62HC
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTMHWVKQRPGQGLEWIAYINPTSGYNNYNQKFKEKATLTADKSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYYCASGGAYGRRPVDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:28)
muFRIHC2-1(«2.1»)
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTNSYIHWVKKRPGQGLEWIGWIYPESLNTQYNEKFKAKATLTADKSSSTSYMQLSSLTSEDSAVYFCARRGIYYYSPYALDHWGQGASVTVSS (SEQ ID NO:52)
Таблица 4: Аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи
Антитело
Аминокислотная последовательность VL (SEQ ID NO)
muFR1-9Lcvar
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSINNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPQVTFGAGTKLELKR (SEQ ID NO:29)
muFR1-13LCvar
SIVMTQTPKFLLVSTGDRFTITCKASQSVSNDVLWYQQKPGQSPKLLIYYAYNRYSGVPDRFTGSGYGTDFTFTITTVQSEDLAVYFCQQDHSSPFTFGSGTKLEIKR (SEQ ID NO:30)
muFR1-53LC
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLHWYQRKPDGTVKLLVYYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNSLPPTFGSGTKLEIKR (SEQ ID NO:31)
muFR1-62LC
DIVMTQSQKFMSISVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKTLIYSASSRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCHQYNSYPYTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:32)
muFRIHC2-1(«2.1»)
SDVVLTQTPLSLPVNIGDQASISCKSSKSLLNSDGFTYLDWYLQKPGQSPQLLIYLVSNHFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQSNYLPLTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO:53)
[0088] Также предложены полипептиды, которые содержат: (а) полипептид, имеющий по меньшей мере около 90 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 25-28; и/или (b) полипептид, имеющий по меньшей мере около 90 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 29-32. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит полипептид, имеющий по меньшей мере около 95 %, по меньшей мере около 96 %, по меньшей мере около 97 %, по меньшей мере около 98 % или по меньшей мере около 99 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 25-32. Таким образом, в определенных вариантах осуществления полипептид содержит (а) полипептид, имеющий по меньшей мере около 95 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 25-28; и/или (b) полипептид, имеющий по меньшей мере около 95 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 29-32. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит (а) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25-28; и/или (b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29-32. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой антитело и/или полипептид, который специфически связывает FOLR1. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное антитело, которое специфически связывает FOLR1. В некоторых вариантах осуществления полипептид, имеющий определенный процент идентичности последовательности с SEQ ID NO: 25-32, отличается от SEQ ID NO:25-32 только консервативными аминокислотными заменами.
[0089] Полипептиды могут содержать одну из отдельных легких цепей и тяжелых цепей, описанных в данном документе. Антитела и полипептиды могут также содержать и легкую цепь и тяжелую цепь. Последовательности легких цепей и тяжелых цепей мышиных антител muFR1-9, muFR1-13, muFR1-53, muFR1-62, и FOLR1-2.1 (также называемые «IMGN 353.2-1», «353.2-1», «2.1», или «muFRIHC2-1») представлены в таблицах 5 и 6 ниже. В некоторых вариантах осуществления антитело против FOLR1 представляет собой антитело, продуцируемое гибридомой, депонированной в ATCC 16 апреля 2013 г. и имеющей номер депонирования в ATCC PTA-120197 («FOLR1-2.1», также называемое «IMGN 353.2-1», «353.2-1», «2.1», или «muFRIHC2-1»).
Таблица 5. Полноразмерные аминокислотные последовательности тяжелой цепи
Антитело
Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой цепи (SEQ ID NO)
muFR1-9HC
QVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTFYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCAKELTGTFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:33)
muFR1-13HC
QVQLKESGPDLVAPSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWIRQPPGKGLEWLGMIWSGGNTDYNSVFKSRLNITKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCATFDGKVSWFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK (SEQ ID NO:34)
muFR1-53HC
QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCKASGYKFTDYDISWVLQRTGQGLEWIGEIYPGSGRTYYNERFKGKATLTADKSSNTVYMQLSSLTSEDSAVYFCASSYYYGTNSPFAYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:35)
muFR1-62HC
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTMHWVKQRPGQGLEWIAYINPTSGYNNYNQKFKEKATLTADKSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYYCASGGAYGRRPVDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:36)
muFRIHC2-1(«2.1»)
QVQLQQSGPELVKPGASVRISCKASGYTFTNSYIHWVKKRPGQGLEWIGWIYPESLNTQYNEKFKAKATLTADKSSSTSYMQLSSLTSEDSAVYFCARRGIYYYSPYALDHWGQGASVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDLYTLSSSVTVPSSMRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:54)
Таблица 6. Полноразмерные аминокислотные последовательности легкой цепи
Антитело
Полноразмерная аминокислотная последовательность легкой цепи (SEQ ID NO)
muFR1-9LC
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSINNNLHWYQQKSHESPRLLIKYASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQSNSWPQVTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:37)
muFR1-13LC
SIVMTQTPKFLLVSTGDRFTITCKASQSVSNDVLWYQQKPGQSPKLLIYYAYNRYSGVPDRFTGSGYGTDFTFTITTVQSEDLAVYFCQQDHSSPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:38)
muFR1-53LC
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLHWYQRKPDGTVKLLVYYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNSLPPTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:39)
muFR1-62LC
DIVMTQSQKFMSISVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKTLIYSASSRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCHQYNSYPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:40)
muFRIHC2-1(«2.1»)
SDVVLTQTPLSLPVNIGDQASISCKSSKSLLNSDGFTYLDWYLQKPGQSPQLLIYLVSNHFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQSNYLPLTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:55)
[0090] Также предложены полипептиды, которые содержат: (а) полипептид, имеющий по меньшей мере около 90 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 33-36; и/или (b) полипептид, имеющий по меньшей мере около 90 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37-40. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит полипептид, имеющий по меньшей мере около 95 %, по меньшей мере около 96 %, по меньшей мере около 97%, по меньшей мере около 98 % или по меньшей мере около 99 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 33-40. Таким образом, в определенных вариантах осуществления полипептид содержит (а) полипептид, имеющий по меньшей мере около 95 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 33-36; и/или (b) полипептид, имеющий по меньшей мере около 95 % идентичность последовательности с SEQ ID NO: 37-40. В некоторых вариантах осуществления полипептид содержит (а) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33-36; и/или (b) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37-40. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой антитело и/или полипептид, который специфически связывает FOLR1. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой мышиное, химерное или гуманизированное антитело, которое специфически связывает FOLR1. В некоторых вариантах осуществления полипептид, имеющий определенный процент идентичности последовательности с SEQ ID NO: 33-40, отличается от SEQ ID NO:33-40 только консервативными аминокислотными заменами.
[0091] В некоторых вариантах осуществления полипептид конкурентно не ингибируется связыванием huMov19 с FOLR1. В некоторых вариантах осуществления полипептид конкурентно не ингибируется связыванием IMGN853 с FOLR1. В некоторых вариантах осуществления полипептид конкурентно не ингибируется связыванием huMov19 с FOLR1. В определенных вариантах осуществления полипептид конкурентно не ингибируется связыванием антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1, причем указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит: определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 59; CDR-2 VL SEQ ID NO: 60; CDR-3 VL SEQ ID NO: 61; CDR-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 62; CDR-2 VH SEQ ID NO: 64; и CDR-3 VH SEQ ID NO: 65. В определенных вариантах осуществления полипептид конкурентно не ингибируется связыванием антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1, причем указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую последовательность SEQ ID NO: 56, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую последовательность SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления полипептид конкурентно не ингибируется связыванием антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1, причем указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) тяжелую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность тяжелой цепи, кодируемая плазмидой, депонированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС) как PTA-10772, и (ii) легкую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность легкой цепи, кодируемая плазмидой, депонированной в АТСС как PTA-10774. В некоторых вариантах осуществления полипептид не ингибируется связыванием фолиевой кислоты с FOLR1.
on
off
[0092] Аффинность или авидность антитела к антигену можно определить экспериментально, используя любой подходящий метод хорошо известный в данной области техники, например, цитометрию (включая проточную цитометрию), иммуноферментный анализ (ИФА) или радиоиммуноанализ (РИА) или кинетику (например, анализ методом поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии (BIACORE™)). Анализы прямого связывания, а также форматы анализа конкурентного связывания могут быть легко использованы. (См., например, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); и способы, описанные в данном документе. Измеренная аффинность конкретного взаимодействия антитело-антиген может варьироваться, если измерять в различных условиях (например, концентрация соли, pH, температура). Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, KD или Kd, K, K, проводят с помощью стандартизованных растворов антител и антигена и стандартизированного буфера, как известно в данной области техники, и такого как буфер, описанный в данном документе.
5
[0093] В одном аспекте анализы связывания могут быть выполнены с использованием цитометрии (например, проточной цитометрии) на клетках, экспрессирующих антиген FOLR1 на поверхности. Например, FOLR1-положительные клетки, такие как SKOV3, инкубировали с различными концентрациями антител против FOLR1, используя 1 × 10 клеток на образец в 100 мкл буфера FACS (среда RPMI-1640 с добавлением 2 % нормальной козьей сыворотки). Затем клетки осаждали, промывали и инкубировали в течение 1 часа с 100 мкл FITC-конъюгированного козьего антитела к мышиному или человеческому IgG (такого, которое можно получить, например, в лаборатории Джексона, 6 мкг/мл в буфере FACS). Клетки снова осаждали, промывали буфером FACS и ресуспендировали в 200 мкл PBS, содержащего 1 % формальдегид. Образцы брали, например, с использованием проточного цитометра FACSCalibur с модулем для подачи проб из планшетов HTS и анализировали с использованием CellQuest Pro (все от BD Biosciences, Сан-Диего, США). Для каждого образца среднюю интенсивность флуоресценции для FL1 (СИФ) экспортировали и наносили на график в полулогарифмическом масштабе против концентрации антител для получения кривой связывания. Для кривых связывания подбирается сигмоидальная кривая доза-эффект, а значения EC50 рассчитываются с использованием таких программ, как GraphPad Prism v4 с параметрами по умолчанию (программное обеспечение GraphPad, Сан-Диего, Калифорния). Значения EC50 можно использовать в качестве показателя кажущейся константы диссоциации «Kd» или «KD» для каждого антитела.
[0094] Моноклональные антитела могут быть получены с использованием методов гибридом, таких как описанные Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495. С использованием метода гибридомы иммунизируют мышь, хомяка или другое подходящее животное-хозяин, как описано выше, чтобы вызвать продукцию лимфоцитами антител, которые будут специфически связываться с иммунизирующим антигеном. Лимфоциты также могут быть иммунизированы in vitro. После иммунизации лимфоциты выделяют и сливают с подходящей клеточной линией миеломы с использованием, например, полиэтиленгликоля, с образованием клеток гибридомы, которые затем могут быть отобраны из неслитых лимфоцитов и клеток миеломы. Гибридомы, которые продуцируют моноклональные антитела, специфически направленные против выбранного антигена, как определено иммунопреципитацией, иммуноблоттингом или анализом связывания in vitro (например, радиоиммуноанализом (РИА); твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА)), могут быть затем размножены в культуре in vitro с использованием стандартных методов (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) или in vivo при асцитных опухолях у животного. Моноклональные антитела могут быть затем очищены от культуральной среды или асцитной жидкости, как описано для поликлональных антител.
[0095] Альтернативно, моноклональные антитела также могут быть получены с использованием методов рекомбинантной ДНК, как описано в патенте США 4816567. Полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело, выделяют из зрелых В-клеток или клеток гибридомы, например, с помощью ОТ-ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, которые специфически амплифицируют гены, кодирующие тяжелые и легкие цепи антитела, и с использованием обычных процедур определяют их последовательность. Выделенные полинуклеотиды, кодирующие тяжелые и легкие цепи, затем клонируют в подходящие векторы экспрессии, которые при трансфекции в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, обезьяньи клетки COS, клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки миеломы, в ином случае не продуцирующие белок иммуноглобулина, и указанные клетки-хозяева генерируют моноклональные антитела. Кроме того, как описано, рекомбинантные моноклональные антитела или их фрагменты от желаемых видов могут быть выделены из библиотек фагового дисплея, экспрессирующих CDR желаемых видов (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).
[0096] Полинуклеотид(ы), кодирующий моноклональное антитело, может быть дополнительно модифицирован рядом различных способов с использованием технологии рекомбинантной ДНК для получения альтернативных антител. В некоторых вариантах осуществления константные домены легкой и тяжелой цепей, например, мышиного моноклонального антитела, могут быть заменены 1) для тех областей, например, человеческого антитела, чтобы генерировать химерное антитело, или 2) для неиммуноглобулинового полипептида, чтобы генерировать слитое антитело. В некоторых вариантах осуществления константные области укорачивают или удаляют для получения желаемого фрагмента антитела моноклонального антитела. Сайт-направленный или высокоплотный мутагенез вариабельной области может быть использован для оптимизации специфичности, аффинности и т. д. моноклонального антитела.
[0097] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело против человеческого FOLR1 представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления такие антитела используются терапевтически для снижения антигенности и образования HAMA (человеческое антитело против Ig мыши) при введении субъекту-человеку.
[0098] Способы конструирования, гуманизации или изменения поверхности нечеловеческих или человеческих антител также могут быть использованы и хорошо известны в данной области техники. Гуманизированное, с измененной поверхностью или сконструированное аналогичным образом антитело может иметь один или более аминокислотных остатков из источника, который не является человеком, например, но не ограничиваясь этим, мыши, крысы, кролика, отличного от человека примата, или другого млекопитающего. Эти нечеловеческие аминокислотные остатки заменены остатками, которые часто называют «импортированными» остатками, которые обычно берутся из «импортированного» вариабельного, константного или другого домена известной человеческой последовательности.
[0099] Такие импортированные последовательности могут быть использованы для снижения иммуногенности или уменьшения, усиления или модификации связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, периода полужизни или любой другой подходящей характеристики, как известно в данной области техники. В целом, остатки CDR непосредственно и в существенной степени вовлечены в воздействие на связывание с FOLR1. Соответственно, часть или все нечеловеческие или человеческие последовательности CDR сохраняются, тогда как нечеловеческие последовательности вариабельной и константной областей могут быть заменены человеческими или другими аминокислотами.
[0100] Антитела также могут необязательно быть гуманизированными, с измененной поверхностью, сконструированными или человеческими антителами, сконструированными с сохранением высокой аффинности к антигену FOLR1 и другими благоприятными биологическими свойствами. Для достижения этой цели гуманизированные (или человеческие) или сконструированные антитела против FOLR1 и антитела с измененной поверхностью могут быть необязательно получены путем анализа исходных последовательностей и различных концептуальных гуманизированных и сконструированных продуктов с использованием трехмерных моделей исходных, сконструированных, и гуманизированных последовательностей. Трехмерные модели иммуноглобулина являются общедоступными и известны специалистам в данной области техники. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные трехмерные конформационные структуры выбранных кандидатных последовательностей иммуноглобулина. Изучение таких представлений позволяет проводить анализ вероятной роли остатков в функционировании кандидатной последовательности иммуноглобулина, то есть анализ остатков, которые влияют на способность кандидатного иммуноглобулина связываться со своим антигеном, таким как FOLR1. Следовательно, можно выбирать и объединять каркасные остатки (FR) из консенсусных и импортированных последовательностей таким образом, чтобы получить необходимую характеристику антитела, такую как повышенная аффинность к целевому(ым) антигену(ам).
[0101] Гуманизация, изменение поверхности или конструирование антител, раскрытых в данном документе, могут быть выполнены с использованием любого известного способа, такого как, но не ограничиваясь теми, которые описаны в Winter (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994), Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996), патентах США №№ 5639641, 5723323; 5976862; 5824514; 5817483; 5814476; 5763192; 5723323; 5766886; 5714352; 6204023; 6180370; 5693762; 5530101; 5585089; 5225539; 4816567; PCT/: US98/16280; US96/18978; US91/09630; US91/05939; US94/01234; GB89/01334; GB91/01134; GB92/01755; WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; EP 229246; 7557189; 7538195; и 7342110, каждый из которых полностью включен в данный документ посредством ссылки, включая ссылки, приведенные в них.
[0102] Агенты, которые специфически связываются с FOLR1, раскрытым в данном документе, также включают фрагменты антител. Известны различные способы получения фрагментов антител. Традиционно эти фрагменты получают путем протеолитического расщепления интактных антител (например, Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). В определенных вариантах осуществления фрагменты антител получают рекомбинантным способом. Фрагменты антител Fab, Fv и scFv могут экспрессироваться в и секретироваться из клеток E. coli или других клеток-хозяев, что позволяет получать большие количества этих фрагментов. Такие фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител, обсуждаемых выше. Фрагмент антитела также может быть линейным антителом, как описано, например, в патенте США 5641870, и может быть моноспецифическим или биспецифическим. Другие способы получения фрагментов антител очевидны для специалиста-практика.
[0103] Для целей данного изобретения следует понимать, что модифицированные антитела могут содержать вариабельную область любого типа, которая обеспечивает ассоциацию антитела с полипептидами человеческого FOLR1. В этом отношении вариабельная область может содержать или происходить от любого типа млекопитающего, которое можно индуцировать для формирования гуморального ответа и генерации иммуноглобулинов против желаемого опухолеассоциированного антигена. Как таковая, вариабельная область модифицированных антител может происходить от, например, человека, мыши, отличного от человека примата, (например, яванских макак, макак и т. д.) или волка. В некоторых вариантах осуществления вариабельные и константные области модифицированных иммуноглобулинов являются человеческими. В других вариантах осуществления вариабельные области совмещенных антител (обычно полученных из нечеловеческого источника) могут быть сконструированы или специально оптимизированы для улучшения свойств связывания или снижения иммуногенности молекулы. В этом отношении вариабельные области, используемые в данном изобретении, могут быть гуманизированы или иным образом изменены посредством включения импортированных аминокислотных последовательностей.
[0104] В некоторых вариантах осуществления вариабельные домены как в тяжелой, так и в легкой цепях изменяются по меньшей мере частичной заменой одного или более CDR и, если необходимо, частичной заменой каркасной области и изменением последовательности. Хотя CDR могут быть получены из антитела того же класса или даже подкласса, что и антитело, из которого получены каркасные области, предполагается, что CDR будут получены из антитела другого класса и в некоторых вариантах осуществления из антитела другого вида. Возможно, нет необходимости заменять все CDR полными CDR из донорной вариабельной области для переноса антигенсвязывающей способности одного вариабельного домена в другой. Скорее, может потребоваться перенести только те остатки, которые необходимы для поддержания активности антигенсвязывающего сайта. С учетом объяснений, изложенных в патентах США №№ 5585089, 5693761 и 5693762, получение функционального антитела с пониженной иммуногенностью или путем стандартного экспериментирования, или путем проб и ошибок будет в рамках компетенции специалистов в данной области техники.
[0105] Несмотря на изменения в вариабельной области, специалисты в данной области поймут, что раскрытые в данном документе модифицированные антитела будут включать антитела (например, полноразмерные антитела или их иммунореактивные фрагменты), в которых по меньшей мере часть одного или более доменов константной области была удалена или иным образом изменена, чтобы обеспечить желательные биохимические характеристики, такие как увеличенная локализация опухоли или уменьшенный период полужизни в сыворотке по сравнению с антителом приблизительно такой же иммуногенности, содержащим нативную или неизмененную константную область. В некоторых вариантах осуществления константная область модифицированных антител будет содержать человеческую константную область. Модификации константной области, совместимой с данным изобретением, включают добавления, делеции или замены одной или более аминокислот в одном или более доменах. То есть описанные в данном документе модифицированные антитела могут содержать изменения или модификации одного или более из трех константных доменов тяжелой цепи (СН1, СН2 или СН3) и/или константного домена легкой цепи (CL). В некоторых вариантах предусмотрены модифицированные константные области, в которых один или более доменов частично или полностью удалены. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитела будут содержать конструкты или варианты с удаленным доменом, причем весь домен CH2 был удален (конструкты ΔCH2). В некоторых вариантах осуществления удаленный домен константной области будет заменен коротким аминокислотным спейсером (например, 10 остатками), который обеспечивает некоторую молекулярную гибкость, обычно присущую отсутствующей константной области.
[0106] Следует отметить, что в определенных вариантах осуществления модифицированные антитела могут быть сконструированы для слияния домена СН3 непосредственно с шарнирной областью соответствующих модифицированных антител. В других конструктах может быть желательно обеспечить пептидный спейсер между шарнирной областью и модифицированными доменами СН2 и/или СН3. Например, могут быть экспрессированы совмещенные конструкты, в которых домен CH2 был удален, а оставшийся домен CH3 (модифицированный или немодифицированный) соединен с шарнирной областью с помощью спейсера из 5-20 аминокислот. Такой спейсер может быть добавлен, например, для обеспечения того, чтобы регуляторные элементы константной области оставались свободными и доступными или чтобы шарнирная область оставалась гибкой. Однако следует отметить, что аминокислотные спейсеры могут в некоторых случаях оказаться иммуногенными и вызывать нежелательный иммунный ответ против конструкта. Соответственно, в определенных вариантах осуществления любой спейсер, добавленный в конструкт, будет относительно неиммуногенным или даже вообще исключен, чтобы поддерживать желаемые биохимические свойства модифицированных антител.
[0107] Помимо делеции целых доменов константной области, следует понимать, что антитела, раскрытые в данном документе, могут быть получены частичной делецией или заменой нескольких или даже одной аминокислоты. Например, мутации одной аминокислоты в выбранных областях домена CH2 может быть достаточно, чтобы существенно уменьшить связывание Fc и тем самым увеличить локализацию опухоли. Аналогичным образом, может быть желательно просто удалить ту часть одного или более доменов константной области, которые управляют эффекторной функцией (например, связывание C1Q комплемента), подлежащей модуляции. Такие частичные делеции константных областей могут улучшить выбранные характеристики антитела (период полужизни в сыворотке), оставляя при этом другие желательные функции, связанные с целевым доменом константной области, интактными. Кроме того, как упоминалось выше, константные области раскрытых антител могут быть модифицированы путем мутации или замены одной или более аминокислот, что усиливает профиль получаемого конструкта. В этом отношении может быть возможно нарушить активность, обеспечиваемую консервативным сайтом связывания (например, связывание Fc), при этом, по существу, сохраняя конфигурацию и иммуногенный профиль модифицированного антитела. Некоторые варианты осуществления могут включать добавление одной или более аминокислот к константной области для улучшения желаемых характеристик, таких как снижение или увеличение эффекторной функции, или обеспечение большего присоединения цитотоксина или углевода. В таких вариантах осуществления может быть желательным вставлять или реплицировать конкретные последовательности, полученные из выбранных доменов константной области.
[0108] Раскрытые в данном документе антитела также включают варианты и эквиваленты, которые по существу гомологичны химерным, гуманизированным и человеческим антителам или фрагментам антител, приведенным в данном документе. Они могут содержать, например, мутации по типу консервативных замен, то есть замены одной или более аминокислот сходными аминокислотами. Например, консервативная замена относится к замене аминокислоты другой в том же общем классе, такой как, например, одна кислая аминокислота другой кислой аминокислотой, одна основная аминокислота другой основной аминокислотой или одна нейтральная аминокислота другой нейтральной аминокислотой. То, что подразумевается под консервативной аминокислотной заменой, хорошо известно в данной области техники.
[0109] Полипептиды FOLR1-связывающих агентов, описанных в данном документе, могут представлять собой рекомбинантные полипептиды, природные полипептиды или синтетические полипептиды, содержащие антитело, или его фрагмент, против человеческого FOLR1. В данной области техники будет понятно, что некоторые аминокислотные последовательности согласно изобретению можно варьировать без значительного влияния на структуру или функцию белка. Таким образом, FOLR1-связывающие агенты, раскрытые в данном документе, также включают вариации полипептидов, которые проявляют существенную активность или которые содержат области антитела или его фрагмента против человеческого белка-рецептора фолиевой кислоты. Такие мутанты содержат делеции, вставки, инверсии, повторы и типичные замены.
[0110] Полипептиды и аналоги могут быть дополнительно модифицированы, чтобы содержать дополнительные химические группы, которые обычно не являются частью белка. Эти дериватизированные группы могут повысить растворимость, биологическое время полужизни или поглощение белка. Эти фрагменты могут также уменьшить или устранить любые нежелательные побочные эффекты белков и тому подобные. Обзор для этих фрагментов можно найти в REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
III. Способы обнаружения
[0111] Способы согласно данному изобретению обеспечивают многостадийный подход для обнаружения человеческого FOLR1 в образце. В частности, выполняют начальную стадию иммунозахвата для обогащения FOLR1 в образце с последующим расщеплением FOLR1 до пептидов и анализом с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ/МС). Анализ пептидов с помощью ЖХ/МС дополнительно позволяет количественно определять уровень FOLR1, присутствующего в образце, включая, например, уровень FOLR1 в образце от пациента со злокачественной опухолью, экспрессирующей FOLR1. В некоторых вариантах осуществления способ обнаружения человеческого рецептора фолиевой кислоты 1 (FOLR1) в образце включает: (а) захват указанного рецептора фолиевой кислоты 1 (FOLR1) с помощью реагента для иммунозахвата, связанного с твердой подложкой; (b) элюирование FOLR1 с твердой подложки; (c) расщепление элюированного FOLR1; и (d) проведение анализа методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ/МС) на расщепленный FOLR1, причем указанный FOLR1 детектируют путем мониторинга хроматографического разделения и масс-спектрометрического отклика по меньшей мере одного сигнатурного пептида FOLR1. По сравнению с другими известными способами обнаружения FOLR1 способы согласно данному изобретению имеют преимущество в повышенной чувствительности и селективности.
[0112] В некоторых вариантах осуществления образец, содержащий FOLR1, содержит биологическую жидкость. В дополнительных вариантах осуществления биологическая жидкость может представлять собой плазму, сыворотку или асцитную жидкость. В конкретном варианте осуществления образец представляет собой плазму. В некоторых вариантах осуществления образец содержит образец периферической крови. В некоторых вариантах осуществления образец получают от пациента с раком. В других вариантах осуществления рак выбирают из группы, состоящей из: рака яичников, рака легкого, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака печени, рака молочной железы, рака мозга, рака почки, рака простаты, рака желудочно-кишечного тракта, меланомы, рака шейки матки, рака мочевого пузыря, глиобластомы, рак эндометрия, рака брюшины и рака головы и шеи. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак яичников. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак эндометрия. В определенных вариантах осуществления рак представляет собой рак легкого. В определенных вариантах осуществления рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого. В некоторых вариантах немелкоклеточный рак легкого представляет собой аденокарциному легкого.
a. Иммунозахват
[0113] Начальную стадию иммунозахвата выполняют на образце с использованием реагента для иммунозахвата, связанного с твердой подложкой. Реагент для иммунозахвата может представлять собой любой иммунологический реагент, который связывается с FOLR1, включая, например, антитело, которое связывается с FOLR1, или его антигенсвязывающий фрагмент. Когда антитело или антигенсвязывающий фрагмент используют в качестве реагента для иммунозахвата, связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1 не может быть конкурентно ингибировано путем связывания активного агента на основе антител, такого как IMGN853, с FOLR1 в образце. Кроме того, когда антитело или антигенсвязывающий фрагмент используют в качестве реагента для иммунозахвата, связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с FOLR1 может не ингибироваться фолиевой кислотой, присутствующей в образце.
[0114] В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело muFR1-9. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело muFR1-13. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой muFR1-53. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело muFR1-62.
[0115] В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 1; CDR-2 VH SEQ ID NO: 2; CDR-3 VH SEQ ID NO: 3; определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 13; CDR-2 VL SEQ ID NO: 14; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат CDR-1 VH SEQ ID NO: 4; CDR-2 VH SEQ ID NO: 5; CDR-3 VH SEQ ID NO: 6; CDR-1 VL SEQ ID NO: 16; CDR-2 VL SEQ ID NO: 17; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат CDR-1 VH SEQ ID NO: 7; CDR-2 VH SEQ ID NO: 8; CDR-3 VH SEQ ID NO: 9; CDR-1 VL SEQ ID NO: 19; CDR-2 VL SEQ ID NO: 20; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат CDR-1 VH SEQ ID NO: 10; CDR-2 VH SEQ ID NO: 11; CDR-3 VH SEQ ID NO: 12; CDR-1 VL SEQ ID NO: 22; CDR-2 VL SEQ ID NO: 23; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 24.
[0116] В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VH SEQ ID NO: 25 и VL SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VH SEQ ID NO: 26 и VL SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VH SEQ ID NO: 27 и VL SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VH SEQ ID NO: 28 и VL SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VH, имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 25, и VL, имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 26, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 27, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 27, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 28, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 90 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 28, и вариабельную область легкой цепи (VL), имеющую по меньшей мере 95 % идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 32.
[0117] В одном варианте осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 37. В другом варианте осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 38. В другом варианте осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 35, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 39. В другом варианте осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат тяжелую цепь SEQ ID NO: 36 и легкую цепь SEQ ID NO: 40.
[0118] В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с человеческим FOLR1 с Kd от около 1,0 нМ до около 10 нМ. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с человеческим FOLR1 с Kd от около 0,5 нМ до около 5 нМ.
[0119] В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата является биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата связан с твердой подложкой посредством взаимодействия биотин-стрептавидин. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка представляет собой микроколонку для масс-спектрометрического иммуноанализа (MSIA). В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата включает магнитные гранулы.
[0120] Для выполнения начальной стадии иммунозахвата, образец, содержащий FOLR1, инкубируют с реагентом для иммунозахвата, связанным с твердой подложкой. Стадия промывки может быть выполнена после стадии иммунозахвата, чтобы дополнительно очистить захваченный FOLR1. В некоторых вариантах осуществления одну или более стадий промывки выполняют после инкубации образца с реагентом для иммунозахвата и до элюирования захваченного FOLR1. В некоторых вариантах осуществления две или более стадий промывки выполняют перед элюированием захваченного FOLR1. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять или по меньшей мере десять стадий промывки выполняют в отношении захваченного FOLR1. В некоторых вариантах осуществления стадия промывки включает приведение в контакт захваченного FOLR1 с промывочными буферами. В некоторых вариантах осуществления промывочные буферы являются коммерчески доступными промывочными буферами. В некоторых вариантах осуществления стадия промывки включает приведение в контакт захваченного FOLR1 с раствором соли и детергентом. В некоторых вариантах осуществления раствор соли представляет собой 400 мМ NaCl, а детергент представляет собой 0,1 % Твин-20.
[0121] После иммунозахвата FOLR1 высвобождают из твердой подложки путем выполнения стадии элюирования. В некоторых вариантах осуществления стадию элюирования выполняют путем приведения в контакт захваченного FOLR1 с кислым раствором. В некоторых вариантах осуществления кислый раствор представляет собой коммерчески доступный раствор. В некоторых вариантах осуществления элюат доводят до нейтрального рН путем добавления буфера для нейтрализации. В некоторых вариантах осуществления буфер для нейтрализации представляет собой 500 мМ бикарбонат аммония при рН 8. В некоторых вариантах осуществления буфер для нейтрализации представляет собой коммерчески доступный буфер.
b. Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия
[0122] После иммунозахвата и элюирования полученный белок FOLR1 расщепляют на пептиды и анализируют с помощью жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЖХ/МС). В некоторых вариантах осуществления раствор, содержащий FOLR1, алкилируют и восстанавливают перед анализом с помощью ЖХ/МС. В некоторых вариантах осуществления FOLR1 алкилируют метанолом. В некоторых вариантах осуществления FOLR1 восстанавливают путем приведения в контакт FOLR1 с раствором, содержащим трис(2-карбоксиэтил)фосфин (TCEP). В некоторых вариантах осуществления раствор, содержащий 100 мМ TCEP, используют для снижения FOLR1. В некоторых вариантах осуществления реагент, блокирующий цистеин, добавляют к раствору, содержащему FOLR1, после алкилирования и восстановления. В некоторых вариантах осуществления реагент, блокирующий цистеин, представляет собой йодацетамид (IAM). В некоторых вариантах осуществления раствор, содержащий 100 мМ IAM, добавляют к раствору, содержащему FOLR1.
[0123] После алкилирования и восстановления FOLR1 расщепляют на пептиды. В некоторых вариантах осуществления FOLR1 расщепляют трипсином. В некоторых вариантах осуществления FOLR1 расщепляют с помощью Lys-C. В некоторых вариантах осуществления FOLR1 расщепляют смесью трипсина и Lys-C. В некоторых вариантах осуществления FOLR1 расщепляют путем приведения в контакт FOLR1 с 50 мМ раствором бикарбоната аммония, содержащим 30 нг/мкл трипсина/Lys-C.
[0124] При расщеплении FOLR1 трипсином/Lys-C образуются пептиды, которые полезны при проведении количественного анализа образца методом ЖХ/МС. В некоторых вариантах осуществления выделенные сигнатурные пептиды согласно изобретению представлены в продукте расщепления FOLR1. Сигнатурные пептиды, полученные путем расщепления FOLR1, представлены в таблице 7 ниже.
Таблица 7. Аминокислотные последовательности сигнатурных пептидов FOLR1
Последовательность 1 сигнатурного пептида sFRα
TELLNVCMNAK (SEQ ID NO:42)
Последовательность 2 сигнатурного пептида sFRα
IAWAR (SEQ ID NO: 43)
Последовательность 3 сигнатурного пептида sFRα
VLNVPLCK (SEQ ID NO: 44)
Последовательность 4 сигнатурного пептида sFRα
CIQMWFDPAQGNPNEEVAR (SEQ ID NO: 45)
[0125] После расщепления FOLR1 на пептиды пептидсодержащий раствор подготавливают для анализа методом ЖХ/МС. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество добавляют к пептидсодержащему раствору до анализа методом ЖХ/МС. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой коммерческий реагент, изготовленный для масс-спектрометрического анализа. В некоторых вариантах осуществления реакцию с поверхностно-активным веществом гасят добавлением 10 % муравьиной кислоты.
[0126] После расщепления и подготовки образцов для анализа методом ЖХ/МС образцы вводят в прибор для ЖХ/МС и анализируют. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два сигнатурных пептида FOLR1 выбирают и контролируют на стадии анализа методом ЖХ/МС. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере три сигнатурных пептида FOLR1 выбирают и контролируют на стадии анализа методом ЖХ/МС. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере четыре сигнатурных пептида FOLR1 выбирают и контролируют на стадии анализа методом ЖХ/МС. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере четыре сигнатурных пептида, выбранных и контролируемых на стадии ЖХ/МС, включают: пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, и пептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления количественные измерения уровней FOLR1 обеспечиваются при помощи анализа методом ЖХ/МС. В дополнительных вариантах осуществления уровень FOLR1 в образце количественно определяют путем сравнения уровня FOLR1 в образце с эталонным уровнем FOLR1. Способы анализа методом ЖХ/МС хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в Yang et al. Scientific Reports. 2015 November 17; 5:16733; doi10.1038/srep16733.
[0127] В некоторых вариантах осуществления обнаружение FOLR1 в образце не ингибируется присутствием IMGN853 в образце. В некоторых вариантах осуществления обнаружение FOLR1 в образце не ингибируется присутствием huMov19 в образце. В некоторых вариантах осуществления обнаружение FOLR1 в образце не ингибируется присутствием антитела или антигенсвязывающего фрагмента, присутствующего в образце, причем указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит: определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 59; CDR-2 VL SEQ ID NO: 60; CDR-3 VL SEQ ID NO: 61; CDR-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 62; CDR-2 VH SEQ ID NO: 64; и CDR-3 VH SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления обнаружение FOLR1 в образце не ингибируется присутствием антитела или антигенсвязывающего фрагмента, присутствующего в образце, причем указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, имеющую SEQ ID NO: 56, и VL, имеющую последовательность SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления обнаружение FOLR1 не ингибируется присутствием антитела или антигенсвязывающего фрагмента, присутствующим в образце, причем указанное антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) тяжелую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность тяжелой цепи, кодируемая плазмидой, депонированной в Американской коллекции типовых культур (АТСС) как PTA-10772, и (ii) легкую цепь, содержащую такую же аминокислотную последовательность, как и аминокислотная последовательность легкой цепи, кодируемая плазмидой, депонированной в АТСС как PTA-10774. В некоторых вариантах осуществления обнаружение FOLR1 в образце не ингибируется присутствием фолиевой кислоты в образце.
[0128] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 0,5 нг/мл FORL1 можно обнаружить в образце при помощи способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 0,3 нг/мл FOLR1 можно обнаружить в образце при помощи способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 0,25 нг/мл FOLR1 можно обнаружить в образце при помощи способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 0,2 нг/мл FOLR1 можно обнаружить в образце при помощи способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 0,15 нг/мл FOLR1 можно обнаружить в образце при помощи способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления отношение сигнал/шум по меньшей мере 5 наблюдается при выполнении способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления отношение сигнал/шум по меньшей мере 6 наблюдается при выполнении способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления отношение сигнал/шум по меньшей мере 7 наблюдается при выполнении способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления отношение сигнал/шум по меньшей мере 8 наблюдается при выполнении способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления отношение сигнал/шум по меньшей мере 9 наблюдается при выполнении способов согласно изобретению. В некоторых вариантах осуществления отношение сигнал/шум по меньшей мере 10 наблюдается при выполнении способов согласно изобретению.
IV. Наборы
[0129] Для удобства способ анализа согласно данному изобретению может быть представлен в форме набора. Такой набор представляет собой упакованную комбинацию, содержащую основные элементы: (а) первый реагент, который может быть реагентом для иммунозахвата, который связывается с FOLR1; и (b) реагент для расщепления, который может расщеплять захваченный FOLR1 на пептиды. Набор может дополнительно содержать по меньшей мере один пептид, полученный из FOLR1. Эти основные элементы определены выше и в примерах ниже.
[0130] В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с FOLR1. В дополнительном варианте осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) SEQ ID NO: 1; CDR-2 VH SEQ ID NO: 2; CDR-3 VH SEQ ID NO: 3; определяющую комплементарность область (CDR)-1 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 13; CDR-2 VL SEQ ID NO: 14; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 15. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат CDR-1 VH SEQ ID NO: 4; CDR-2 VH SEQ ID NO: 5; CDR-3 VH SEQ ID NO: 6; CDR-1 VL SEQ ID NO: 16; CDR-2 VL SEQ ID NO: 17; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 18. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат CDR-1 VH SEQ ID NO: 7; CDR-2 VH SEQ ID NO: 8; CDR-3 VH SEQ ID NO: 9; CDR-1 VL SEQ ID NO: 19; CDR-2 VL SEQ ID NO: 20; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 21. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат CDR-1 VH SEQ ID NO: 10; CDR-2 VH SEQ ID NO: 11; CDR-3 VH SEQ ID NO: 12; CDR-1 VL SEQ ID NO: 22; CDR-2 VL SEQ ID NO: 23; и CDR-3 VL SEQ ID NO: 24.
[0131] В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VH SEQ ID NO: 25 и VL SEQ ID NO: 29. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VH SEQ ID NO: 26 и VL SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VH SEQ ID NO: 27 и VL SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат VH SEQ ID NO: 28 и VL SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата включает антитело, содержащее VH с по меньшей мере 90 % идентичностью с любой из SEQ ID NO: 25-28. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата включает антитело, содержащее VH с по меньшей мере 95 % идентичностью с любой из SEQ ID NO: 25-28. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата включает антитело, содержащее VL с по меньшей мере 90 % идентичностью с любой из SEQ ID NO: 29-32. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата включает антитело, содержащее VL с по меньшей мере 95 % идентичностью с любой из SEQ ID NO: 29-32.
[0132] В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 37. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 34, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 38. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат тяжелую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 35, и легкую цепь, имеющую последовательность SEQ ID NO: 39. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат тяжелую цепь SEQ ID NO: 36 и легкую цепь SEQ ID NO: 40.
[0133] В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой muFR1-9. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой muFR1-13. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с человеческим FOLR1 с Kd от около 1,0 нМ до около 10 нМ. В других вариантах осуществления реагент для иммунозахвата представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с человеческим FOLR1 с Kd от около 0,5 нМ до около 5 нМ. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата является биотинилированным.
[0134] В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит твердую подложку для реагентов для захвата, которая может быть предоставлена в виде отдельного элемента или на которой реагенты для захвата уже иммобилизованы. Следовательно, антитела для захвата в наборе могут быть иммобилизованы на твердой подложке или они могут быть иммобилизованы на такой подложке, которая включена в набор или поставляется отдельно от набора. В некоторых вариантах осуществления твердая подложка включает микроколонку для масс-спектрометрического иммуноанализа (MSIA). В других вариантах осуществления твердая подложка включает магнитные гранулы. В некоторых вариантах твердая подложка покрыта стрептавидином. В некоторых вариантах осуществления реагент для иммунозахвата присоединен к твердой подложке посредством взаимодействия биотин-стрептавидин.
[0135] В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит по меньшей мере один пептид FOLR1, который можно использовать в качестве стандарта в анализах методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. В некоторых вариантах осуществления набор содержит пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления набор содержит пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления набор содержит пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления набор содержит пептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 45. В одном варианте осуществления набор содержит четыре сигнатурных пептида, которые можно использовать в качестве стандарта в анализах методом жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. В одном варианте осуществления четыре сигнатурных пептида состоят из 1) пептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 42; 2) пептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 43; 3) пептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 44; и 4) пептида, содержащего последовательность SEQ ID NO: 45.
[0136] Набор также обычно содержит инструкции по проведению анализа, и/или белок FOLR1, или пептиды FOLR1, которые служат в качестве стандарта, а также другие добавки, такие как стабилизаторы, промывочные и инкубационные буферы и тому подобное. Набор также может содержать инструкции для количественного измерения уровней FOLR1 в образце.
[0137] Компоненты набора будут обеспечены в заранее определенных соотношениях, причем относительные количества различных реагентов соответственно варьируются, чтобы обеспечить концентрации в растворе реагентов, которые по существу максимально повышают чувствительность анализа. В частности, реагенты могут быть обеспечены в виде сухих порошков, обычно лиофилизированных, включая наполнители, которые при растворении обеспечат раствор реагента, имеющий подходящую концентрацию, для объединения с исследуемым образцом.
[0138] Варианты осуществления данного раскрытия могут быть дополнительно определены со ссылкой на следующие неограничивающие примеры, в которых подробно описаны способы согласно данному раскрытию. Для специалистов в данной области техники будет очевидным, что множество модификаций материалов и способов может быть осуществлено без выхода за рамки объема данного раскрытия.
ПРИМЕРЫ
[0139] Понятно, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и что различные модификации или изменения в их свете будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и сферу применения этой заявки.
Пример 1
Анализ методом ЖХ/МС с иммунозахватом sFRα
[0140] Анализ на основе ИФА был разработан и описан в WO 2014/036495. Этот анализ проводили с использованием планшетов для ИФА, покрытых FOLR1-Fc (слитый пептид huFOLR1 и шарнира, CH2, CH3 мышиного IgG2A), muFR1-9 в качестве антитела для захвата, и биотинилированного muFR1-13. Анализ был оптимизирован с помощью систематического подхода с критериями воспроизводимых сигналов с высоким отношением сигнал/шум, минимальными матричными эффектами в образцах плазмы человека, высокой повторяемостью и точностью, а также самым низким пределом обнаружения. Выбранные оптимальные условия ИФА привели к обнаружению sFRα на уровне 25 нг/мл с незначительным/низким уровнем шума. Несмотря на оптимизированные условия, этот анализ на основе ИФА не обеспечил достаточную чувствительность, чтобы различать уровни sFRα у здоровых субъектов по сравнению с диапазоном распределения уровней sFRα у пациентов с раком яичников, чтобы сделать возможным корреляционный анализ уровней sFRα и стадии заболевания.
[0141] Более современный анализ на основе ИФА с использованием двух различных человеческих FRα-специфических мышиных моноклональных антител, описанный в Kurosaki et al., Int. J. Рак. 2016 April 15;138(8):1994-2002, был разработан для изучения уровней sFRα в сыворотке пациентов с клиническим подозрением на наличие злокачественных опухолей яичников, и для оценки sFRα в качестве диагностического маркера рака яичников. Этот анализ на основе ИФА имел динамический диапазон 250-8000 пг/мл и отношение сигнал/шум 3,4 для самого низкого калибратора (250 пг/мл). В то время как этот анализ на основе ИФА обеспечил более чувствительный динамический диапазон обнаружения sFRα, показания ИФА обычно измеряются спектрофотометрически при 450 нм и корректируются на поглощение при 620 нм и, следовательно, не столь селективны и, вероятно, дают более ложноположительный результат.
[0142] Были разработаны анализы согласно данному изобретению, которые удовлетворяли критериям чувствительности и селективности. Точное измерение сигнатурных пептидов на стадии ЖХ/МС обеспечивает второй уровень селективности, который не обеспечивается типичными методами ИФА. Кроме того, чувствительность и селективность обнаружения sFRα, обеспечиваемая анализом методом ЖХ/МС с иммунозахватом, также делает этот анализ полезным для исследования sFRα в качестве предиктивного и/или прогностического биомаркера для пациентов с раком яичников.
[0143] Анализ, как показано на Фиг. 1, включает стадии инкубации раствора биотинилированного антитела для захвата (например, антитела согласно изобретению, такого как антитело muFR1-9 или muFR1-13) со средой для иммунозахвата, покрытой стрептавидином, (микроколонки для MSIA или магнитные гранулы), инкубации образцов со средой для иммунозахвата, промывки среды для иммунозахвата промывочными буферами, солевым раствором и детергентом в нескольких промывках, удаления супернатанта, высвобождение sFRα из среды для иммунозахвата кислым раствором, и нейтрализации раствора sFRα с последующим восстановлением и алкилированием. Образцы затем расщепляют трипсином/Lys-C и вводят для анализа в ЖХ/МС. Четыре различных сигнатурных пептида sFRα были выбраны и проверены на стадии анализа методом ЖХ/МС. Конкретно, пептид SEQ ID NO: 42 использовали для определения концентрации белка, а пептиды SEQ ID NO: 43-45 были использованы для подтверждения.
[0144] Стадии оптимизации для повышения эффективности анализа во время подготовки образца включают изменение условий для повышения эффективности иммунозахвата, процедуры промывки для устранения потенциальных помех от матрицы плазмы и изменение условий для повышения эффективности ферментативного расщепления. Стадии оптимизации во время ЖХ/МС включают идентификацию последовательности сигнатурного пептида, которая обеспечивает хорошее хроматографическое разделение и масс-спектрометрический отклик. Варианты автоматизации иммунозахвата были оценены с помощью технологии микроколонок для MSIA и обработки магнитными гранулами. Оба варианта были совместимы при использовании 96-луночных планшетов для значительного улучшения пропускной способности образцов, и аналогичную чувствительность наблюдали для обеих платформ автоматизации. Оценку также проводили в анализе с использованием или плазмы, истощенной антигеном, или суррогатной матрицы.
[0145] Рабочие параметры анализа следующие: обработка образца, включая иммунозахват и ферментативное расщепление в течение 8,5 часов, анализ методом ЖХ/МС 10 минут на образец, калибровочные стандарты, приготовленные в 5 % BSA, PBS (суррогатная матрица, от 0,65 нг/мл до 40,63 нг/мл), объем образца при 0,3 мл, S/N> 10 для четырех сигнатурных пептидов на уровне НПКО (низший предел концентрации обнаружения), критерии приемлемости STD (эталон) ± 20 % от номинального значения, за исключением НПКО (± 25 %), критерии приемлемости QC (КК-контроль качества) ± 20% от номинального значения.
Пример 2
Анализ данных образцов плазмы человека с использованием анализа методом ЖХ/МС с иммунозахватом sFRα
[0146] Эксперименты были разработаны с использованием вышеуказанных параметров для измерения уровней sFRα в образце, содержащем низкий уровень sFRα в суррогатной матрице при 0,3 нг/мл. Как показано на Фиг. 2, результаты этих экспериментов демонстрируют, что очень низкие уровни sFRα могут быть измерены с помощью анализа методом ЖХ/МС с иммунозахватом. Эксперименты были также разработаны для измерения уровней sFRα в образце нормальной человеческой плазмы. Как показано на Фиг. 3 эндогенные уровни sFRα, присутствующего в концентрации около 0,5 нг/мл, могут быть измерены с помощью анализа методом ЖХ/МС с иммунозахватом. На Фиг. 4 показана хроматограмма по выделенному иону из образца, полученного от пациента до введения дозы, с повышенным sFRα. Результаты этого эксперимента демонстрируют, что образцы плазмы пациента с повышенными уровнями sFRα можно четко отличить от образцов нормальной плазмы человека с эндогенными уровнями.
[0147] Эксперименты были разработаны для проверки переносимости анализа в присутствии FRα-нацеленного иммуноконъюгата, IMGN853, в образцах плазмы. Образцы sFRα для контроля качества готовили в плазме на низком, среднем и высоком уровнях, добавляли IMGN853 при прогнозируемой концентрации Cmax и сравнивали с образцами sFRα для контроля качества, приготовленными в плазме без IMGN853. Никаких помех не наблюдали ни в одном из наборов образцов для КК, и оба набора образцов имеют подобные ответы.
[0148] Результаты этих экспериментов демонстрируют, что анализ методом ЖХ/МС с иммунозахватом согласно изобретению имеет повышенную чувствительность (0,3 нг/мл, отношение сигнал/шум по меньшей мере 10, т.е. в 2 раза более чувствительный, чем анализы на основе ИФА в данной области техники) и повышенную селективность для измерения sFRα в образцах плазмы человека в присутствии и в отсутствие FRα-нацеленного иммуноконъюгата.
[0149] Все публикации, патенты, патентные заявки, интернет-сайты и номера доступа / последовательности из баз данных (включая как полинуклеотидные, так и полипептидные последовательности), цитируемые в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент, патентная заявка, интернет-сайт или номер доступа / последовательность из базы данных были конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Immunogen, Inc.
<120> СПОСОБЫ ОБНАРУЖЕНИЯ РЕЦЕПТОРА ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ 1 В ОБРАЗЦЕ ПАЦИЕНТА
<130>  2921.095PC01
<150>  62/554 532
<151>  05.09.2017
<160>  68
<170>  PatentIn версия 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR1 muFR1-9
<400>  1
Ser Phe Gly Met His
1               5
<210>  2
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR2 muFR1-9
<400>  2
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Phe Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  3
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR3 muFR1-13
<400>  3
Glu Leu Thr Gly Thr Phe Ala Tyr
1               5
<210>  4
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR1 muFR1-13
<400>  4
Arg Tyr Ser Val His
1               5
<210>  5
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR2 muFR1-13
<400>  5
Met Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Val Phe Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>  6
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR3 muFR1-13
<400>  6
Phe Asp Gly Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>  7
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR1 muFR1-53
<400>  7
Asp Tyr Asp Ile Ser
1               5
<210>  8
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR2 muFR1-53
<400>  8
Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  9
<211>  12
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR3 muFR1-53
<400>  9
Ser Tyr Tyr Tyr Gly Thr Asn Ser Pro Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>  10
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR1 muFR1-62
<400>  10
Thr Tyr Thr Met His
1               5
<210>  11
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR2 muFR1-62
<400>  11
Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Asn Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Glu
<210>  12
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR3 muFR1-62
<400>  12
Gly Gly Ala Tyr Gly Arg Arg Pro Val Asp Tyr
1               5                   10
<210>  13
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR1 muFR1-9
<400>  13
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn Leu His
1               5                   10
<210>  14
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR2 muFR1-9
<400>  14
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1               5
<210>  15
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR3 muFR1-9
<400>  15
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Gln Val Thr
1               5                   10
<210>  16
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR1 muFR1-13
<400>  16
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Leu
1               5                   10
<210>  17
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR2 muFR1-13
<400>  17
Tyr Ala Tyr Asn Arg Tyr Ser
1               5
<210>  18
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR3 muFR1-13
<400>  18
Gln Gln Asp His Ser Ser Pro Phe Thr
1               5
<210>  19
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR1 muFR1-53
<400>  19
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu His
1               5                   10
<210>  20
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR2 muFR1-53
<400>  20
Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser
1               5
<210>  21
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR3 muFR1-53
<400>  21
Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Pro Thr
1               5
<210>  22
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR1 muFR1-62
<400>  22
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1               5                   10
<210>  23
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR2 muFR1-62
<400>  23
Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser
1               5
<210>  24
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR3 muFR1-62
<400>  24
His Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  25
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи muFR1-9HCvar
<400>  25
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Phe Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Glu Leu Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210>  26
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи muFR1-13HCvar
<400>  26
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Val Phe Lys
50                  55                  60
Ser Arg Leu Asn Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Thr Phe Asp Gly Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210>  27
<211>  121
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи muFR1-53HC
<400>  27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asp Ile Ser Trp Val Leu Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Ser Tyr Tyr Tyr Gly Thr Asn Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  28
<211>  120
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи muFR1-62HC
<400>  28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Asn Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Glu Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Gly Gly Ala Tyr Gly Arg Arg Pro Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  29
<211>  109
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи muFR1-9Lcvar
<400>  29
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn
20                  25                  30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Gln
85                  90                  95
Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100                 105
<210>  30
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи muFR1-13LCvar
<400>  30
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Thr Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Phe Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Tyr Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp His Ser Ser Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  31
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи muFR1-53LC
<400>  31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu His Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  32
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи muFR1-62LC
<400>  32
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Ile Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  33
<211>  441
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой цепи muFR1-9HC
<400>  33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Thr Phe Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Glu Leu Thr Gly Thr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115                 120                 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130                 135                 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser
165                 170                 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Met Arg
180                 185                 190
Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210                 215                 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225                 230                 235                 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245                 250                 255
Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260                 265                 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu
275                 280                 285
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290                 295                 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305                 310                 315                 320
Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325                 330                 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340                 345                 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro
355                 360                 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370                 375                 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val
385                 390                 395                 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405                 410                 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420                 425                 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440
<210>  34
<211>  454
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная тяжелая цепь muFR1-13HC
<400>  34
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Ala Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr
20                  25                  30
Ser Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Met Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ser Val Phe Lys
50                  55                  60
Ser Arg Leu Asn Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65                  70                  75                  80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Thr Phe Asp Gly Lys Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln
165                 170                 175
Ser Gly Leu Tyr Thr Met Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180                 185                 190
Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195                 200                 205
Thr Thr Val Asp Lys Lys Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile
210                 215                 220
Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn
225                 230                 235                 240
Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp
245                 250                 255
Val Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp
260                 265                 270
Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn
275                 280                 285
Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn
290                 295                 300
Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
305                 310                 315                 320
Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro
325                 330                 335
Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala
340                 345                 350
Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys
355                 360                 365
Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile
370                 375                 380
Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp
385                 390                 395                 400
Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys
405                 410                 415
Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys
420                 425                 430
Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile
435                 440                 445
Ser Arg Ser Pro Gly Lys
450
<210>  35
<211>  445
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная тяжелая цепь muFR1-53HC
<400>  35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Asp Ile Ser Trp Val Leu Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Asn Glu Arg Phe
50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Ser Ser Tyr Tyr Tyr Gly Thr Asn Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser
115                 120                 125
Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val
130                 135                 140
Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145                 150                 155                 160
Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165                 170                 175
Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro
180                 185                 190
Ser Ser Met Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro
195                 200                 205
Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly
210                 215                 220
Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile
225                 230                 235                 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys
245                 250                 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln
260                 265                 270
Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
275                 280                 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu
290                 295                 300
Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg
305                 310                 315                 320
Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325                 330                 335
Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro
340                 345                 350
Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr
355                 360                 365
Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln
370                 375                 380
Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly
385                 390                 395                 400
Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu
405                 410                 415
Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn
420                 425                 430
His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  36
<211>  444
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная тяжелая цепь muFR1-62HC
<400>  36
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Asn Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Glu Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ser Gly Gly Ala Tyr Gly Arg Arg Pro Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
115                 120                 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165                 170                 175
Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Met Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
195                 200                 205
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
210                 215                 220
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
225                 230                 235                 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
245                 250                 255
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
260                 265                 270
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
275                 280                 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
290                 295                 300
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
305                 310                 315                 320
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
325                 330                 335
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
340                 345                 350
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
355                 360                 365
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro
370                 375                 380
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser
385                 390                 395                 400
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
405                 410                 415
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
420                 425                 430
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440
<210>  37
<211>  215
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная легкая цепь muFR1-9LC
<400>  37
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn
20                  25                  30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Gln
85                  90                  95
Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala
100                 105                 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115                 120                 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130                 135                 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145                 150                 155                 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180                 185                 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210                 215
<210>  38
<211>  214
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная легкая цепь muFR1-13LC
<400>  38
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Thr Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Phe Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp
20                  25                  30
Val Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Tyr Asn Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Thr Thr Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp His Ser Ser Pro Phe
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210>  39
<211>  214
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная легкая цепь muFR1-53LC
<400>  39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu His Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Val
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Ser Leu Pro Pro
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210>  40
<211>  214
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная легкая цепь muFR1-62LC
<400>  40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Ile Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys His Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210>  41
<211>  257
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  FOLR1 человека
<400>  41
Met Ala Gln Arg Met Thr Thr Gln Leu Leu Leu Leu Leu Val Trp Val
1               5                   10                  15
Ala Val Val Gly Glu Ala Gln Thr Arg Ile Ala Trp Ala Arg Thr Glu
20                  25                  30
Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys His His Lys Glu Lys Pro Gly
35                  40                  45
Pro Glu Asp Lys Leu His Glu Gln Cys Arg Pro Trp Arg Lys Asn Ala
50                  55                  60
Cys Cys Ser Thr Asn Thr Ser Gln Glu Ala His Lys Asp Val Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Arg Phe Asn Trp Asn His Cys Gly Glu Met Ala Pro Ala Cys
85                  90                  95
Lys Arg His Phe Ile Gln Asp Thr Cys Leu Tyr Glu Cys Ser Pro Asn
100                 105                 110
Leu Gly Pro Trp Ile Gln Gln Val Asp Gln Ser Trp Arg Lys Glu Arg
115                 120                 125
Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys Glu Asp Cys Glu Gln Trp Trp Glu
130                 135                 140
Asp Cys Arg Thr Ser Tyr Thr Cys Lys Ser Asn Trp His Lys Gly Trp
145                 150                 155                 160
Asn Trp Thr Ser Gly Phe Asn Lys Cys Ala Val Gly Ala Ala Cys Gln
165                 170                 175
Pro Phe His Phe Tyr Phe Pro Thr Pro Thr Val Leu Cys Asn Glu Ile
180                 185                 190
Trp Thr His Ser Tyr Lys Val Ser Asn Tyr Ser Arg Gly Ser Gly Arg
195                 200                 205
Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu
210                 215                 220
Val Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Ala Met Ser Gly Ala Gly Pro Trp Ala
225                 230                 235                 240
Ala Trp Pro Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Met Leu Leu Trp Leu Leu
245                 250                 255
Ser
<210>  42
<211>  11
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность 1 сигнатурного пептида FOLR1
<400>  42
Thr Glu Leu Leu Asn Val Cys Met Asn Ala Lys
1               5                   10
<210>  43
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность 2 сигнатурного пептида FOLR1
<400>  43
Ile Ala Trp Ala Arg
1               5
<210>  44
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность 3 сигнатурного пептида FOLR1
<400>  44
Val Leu Asn Val Pro Leu Cys Lys
1               5
<210>  45
<211>  19
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Последовательность 4 сигнатурного пептида FOLR1
<400>  45
Cys Ile Gln Met Trp Phe Asp Pro Ala Gln Gly Asn Pro Asn Glu Glu
1               5                   10                  15
Val Ala Arg
<210>  46
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR1 muFRIHC2-1
<400>  46
Asn Ser Tyr Ile His
1               5
<210>  47
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR2 muFRIHC2-1
<400>  47
Trp Ile Tyr Pro Glu Ser Leu Asn Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ala
<210>  48
<211>  13
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH-CDR3 muFRIHC2-1
<400>  48
Arg Gly Ile Tyr Tyr Tyr Ser Pro Tyr Ala Leu Asp His
1               5                   10
<210>  49
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR1 muFRIHC2-1
<400>  49
Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp
1               5                   10                  15
<210>  50
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR2 muFRIHC2-1
<400>  50
Leu Val Ser Asn His Phe Ser
1               5
<210>  51
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL-CDR3 muFRIHC2-1
<400>  51
Phe Gln Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>  52
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи muFRIHC2 -1
<400>  52
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Ser Leu Asn Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Gly Ile Tyr Tyr Tyr Ser Pro Tyr Ala Leu Asp His Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  53
<211>  114
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи muFRIHC2 -1
<400>  53
Ser Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile
1               5                   10                  15
Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn
20                  25                  30
Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn His Phe Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln
85                  90                  95
Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg
<210>  54
<211>  446
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная тяжелая цепь muFRIHC2 -1
<400>  54
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Ser
20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Lys Lys Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Ser Leu Asn Thr Gln Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ser Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Gly Ile Tyr Tyr Tyr Ser Pro Tyr Ala Leu Asp His Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
115                 120                 125
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met
130                 135                 140
Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145                 150                 155                 160
Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165                 170                 175
Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val
180                 185                 190
Pro Ser Ser Met Arg Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His
195                 200                 205
Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys
210                 215                 220
Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro
245                 250                 255
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
275                 280                 285
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu
290                 295                 300
Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys
305                 310                 315                 320
Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro
340                 345                 350
Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile
355                 360                 365
Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn
385                 390                 395                 400
Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp
405                 410                 415
Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His
420                 425                 430
Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  55
<211>  220
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Полноразмерная легкая цепь muFRIHC2 -1
<400>  55
Ser Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Asn Ile
1               5                   10                  15
Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu Asn
20                  25                  30
Ser Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn His Phe Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln
85                  90                  95
Ser Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser
115                 120                 125
Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu
145                 150                 155                 160
Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr
180                 185                 190
Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr
195                 200                 205
Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210                 215                 220
<210>  56
<211>  118
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи huMov19
<400>  56
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  57
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи huMov19, версия 1
<400>  57
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85                  90                  95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
<210>  58
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи huMov19, версия 1.60
<400>  58
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85                  90                  95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
<210>  59
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область huMov19 легкой цепи CDR1
<400>  59
Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala Gly Thr Ser Leu Met His
1               5                   10                  15
<210>  60
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область huMov19 легкой цепи CDR2
<400>  60
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala
1               5
<210>  61
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область huMov19 легкой цепи CDR3
<400>  61
Gln Gln Ser Arg Glu Tyr Pro Tyr Thr
1               5
<210>  62
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область huMov19 тяжелой цепи CDR1
<400>  62
Gly Tyr Phe Met Asn
1               5
<210>  63
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область huMov19 тяжелой цепи CDR2 - определено по Кабату
<400>  63
Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  64
<211>  10
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область huMov19 тяжелой цепи CDR2 - определено по Abm
<400>  64
Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe
1               5                   10
<210>  65
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область huMov19 тяжелой цепи CDR3
<400>  65
Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>  66
<211>  448
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность тяжелой цепи huMov19
<400>  66
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Phe Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala His
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Tyr Asp Gly Ser Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210>  67
<211>  218
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь huMov19, версия 1.00
<400>  67
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile Ser
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85                  90                  95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  68
<211>  218
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Легкая цепь huMov19, версия 1.60
<400>  68
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ile Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Phe Ala
20                  25                  30
Gly Thr Ser Leu Met His Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro
35                  40                  45
Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ala Gly Val Pro Asp
50                  55                  60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Lys Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65                  70                  75                  80
Pro Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg
85                  90                  95
Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105                 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115                 120                 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145                 150                 155                 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165                 170                 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180                 185                 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195                 200                 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<---