ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПОЛИСАХАРИДА, ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТА НА ЕГО ОСНОВЕ И ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ
HIGH-EFFECTIVE METHOD FOR BACTERIAL POLYSACCHARIDE PRODUCTION, PREPARATION OF CONJUGATE BASED THEREON AND IMMUNOGENIC COMPOSITION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к вакцинам против менингококка Neisseria meningtidis.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Менингококк (Neisseria meningtidis) является причиной эпидемического бактериального менингита. Капсульный полисахарид является основным фактором, определяющим вирулентность N.meningitidis. Среди 13 серогрупп менингококков, классифицированных на основе структуры капсульного полисахарида, серогруппы А, В, С, Y и W135 связаны с большинством случаев менингококковой инфекции. В Африканском менингитном поясе наиболее крупные эпидемии были вызваны менингококками серогруппы А, в то время как спорадические заболевания и вспышки в развитых странах, как правило, вызваны менингококками серогрупп В и С. Менингококки серогруппы Y стали основной причиной спорадических заболеваний и вспышек в Соединенных Штатах в конце 1990-х годов, а в 2000 году менингококки серогруппы W135 вызвали заболевания во всем мире в связи с паломничеством в Мекку и крупными вспышками в странах Африки южнее Сахары.
Серогруппа X Neisseria meningitidis (МеnХ), ранее редко являвшаяся причиной спорадических случаев заболевания менингитом, в последнее время оказалась связанной с увеличением заболеваемости менингококковой инфекцией и стала причиной крупных вспышек в "поясе менингита" в Африке. Вспышки были зафиксированы в Нигерии, Буркина-Фасо, Того и Гане и они изменились в размерах. В сезон менингита в 2010 году более 6500 случаев заболевания были зарегистрированы в Буркина-Фасо, и разумно предположить, что, по крайней мере, 1000 из этих случаев были обусловлены заболеванием МеnХ и локально сообщалось о 120 случаях на 100000 заболеваний. Ранее были подтверждены в рамках вспышки у нескольких пациентов заболевание с МеnХ, по крайней мере, в 82 случаях бактериального менингита на границе Кении и Уганды в 2007 году.
Капсульные полисахариды серогрупп В, С, Y и W135 менингококков состоят из производных сиаловой кислоты. Серогруппа В и С менингококков представляет собой (α 2-8) - и (α 2-9) - связанную полисиаловую кислоту, соответственно, в то время как чередующиеся последовательности D-глюкозы или D-галактозы и сиаловой кислоты представляют собой серогруппу Y и W135 N.meningitidis. В противоположность этому капсула серогруппы А менингококков состоит из (α 1-6)-связанного N-ацетилманнозамин 6-фосфата, в то время как серогруппа X N.meningitidis, синтезирует капсульные полимеры (α 1-4) -связанного N-ацетилглюкозамин 1-фосфата.
Увеличение заболеваемости МеnХ в африканском поясе менингита за последние 5 лет вызывает необходимость разработки и внедрения вакцины МеnХ в отдельных районах области для профилактики и контроля последующих эпидемий. Конъюгация менингококковых капсульных полисахаридов с белком-носителем привела к разработке моновалентных (А или С) полисахарид-конъюгированных вакцин с высокой эффективностью, и данные клинических исследований по иммуногенности показывают, что широкое использование четырехвалентных конъюгированных вакцин, охватывающих серогруппы А, С, Y и W-135 могут быть одинаково эффективны. Аналогичный подход может быть также плодотворным для МеnХ. Ссылка Ouli Xiea et al "Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide, and development of an assay for quantification of human antibodies", Vaccine 30, 2012.
Gunnstein Norheim обсуждает, что в настоящее время вакцина против серогруппы X не доступна, и что доступные вакцины нового поколения должны быть направлены против наиболее распространенных серогрупп: A, W-135, X. Ссылка "Preventing the emerging serogroup X meningococcal disease in the African Meningitis Belt" Oxford Vaccine Group, 2011.
В последние несколько лет отсутствие вакцины против менингококка группы X является причиной внимания к вспышкам, вызванным менингококками именно этой серогруппы. Ссылка "Meningococcal vaccines: WHO position paper", November 2011.
Для того, чтобы способствовать развитию конъюгированной вакцины на основе полисахарида МеnХ, необходимо получить структурно неповрежденные полисахариды МеnХ с более высокими выходами.
В области крупномасштабного производства менингококкового полисахарида были раскрыты несколько синтетических подходов (Frantz, I. D. Jr. Growth Requirements of the Meningococcus. J. Bact., 43: 757-761, 1942; Catlin, B.W. Nutritional profiles of Neisseria lactamica, gonorrhoeae and meningitidis, in chemically defined media. J. Inf. Dis., 128(2): 178-194, 1973; Watson-Scherp Medium: Watson R G, et al. The specific hapten of group С (group IIa) meningococcus, II. Chemical nature. J Immunol 1958; 81:337-44; Marcelo Fossa da Paz; Júulia Baruque-Ramos; Haroldo Hiss; Márcio Alberto Vicentin; Maria Betania Batista Leal; Isaias Raw. Polysaccharide production in batch process of Neisseria meningitidis serogroup С comparing Frantz, modified Frantz and Catlin 6 cultivation media, Braz. J. Microbiol, vol. 34., no. 1. Sao Paulo January/April 2003).
В US 5494808 сообщается о крупномасштабном процессе ферментации с высокой плотностью клеток (5 г/л сухого веса клеток, и оптической плотностью в диапазоне от приблизительно 10-13 при 600 нм) для культивирования N.meningitidis, (серогруппы В 11). Указанный патент раскрывает следующую среду (так называемая "МС.6") для культивирования менингококка для выделения ОМРС ("белковый комплекс внешней мембраны")
4
US 7399615 раскрывает композицию для ферментации, где композиция не содержит NHCl, а также улучшенный способ ферментации Neisseria (серогрупп А, С, и W135) в композиции для ферментации, в которой хлорид аммония (источник азота) заменен на соевый пептон (HSP-A; Nutricepts, Inc;. Миннеаполис, штат Миннесота). Указанная периодическая ферментация с добавлением субстрата (2L), отличающаяся тем, что ферментационная среда, также как и раствор субстрата содержит HSP-A, приводит к полисахариду Men А с выходом около 1300-1400 мг/л при средней максимальной оптической плотности (OD) между 14-20.
2
4
2
4
2
4
2
2
2
3
2
4
3
4
US 7491517 раскрывает Neisseria meningtidis питательную культуральную среду (NMFM) для получения капсульных полисахаридов из менингококка (серогрупп А, С, Y и W135), содержащую: DI (деионизированную) воду, NaCl, KSO, KCl, тринатриевую соль лимонной кислоты *2НO (дигидрат), MgSO*7HO, MnSO*HO, MnCl*6HO, витамин В12, НАД (никотинамид-аденин-динуклеотид) тиамин HCI, соевый пептон, D-глюкозу, L-глутаминовую кислоту, L-аргинин, L-серин, L-цистеин, глицин, морфолинпропансульфокислоту [MOPS], СаСО для поддержания рН в пределах от 6,5 до 7,0 и Fe(SO) для серогруппы А и NHCl для серогруппы W-135. Указанная ферментация приводит к полисахариду с выходом около 30-40 мг/л при средней максимальной оптической плотности (OD) 10.
David Bundle и др. обсуждает получение и выделение МеnХ полисахарида из N.meningitidis, штамма 247 X (лабораторный центр по контролю над заболеваниями Laboratory Center for Disease Control), в котором указанный штамм выращивают на химически определенной среде (NCDM) в течение 18 часов. Указанная ферментация приводит к МеnХ полисахариду с выходом около 20 мг/л. Ссылка "Studies on the Group-specific Polysaccharide of Neisseria meningitidis Serogroup X and an improved Procedure для its isolation" JBC, 1974.
Ouli Xiea и др раскрывают получение МеnХ PS из штаммов BF7/07 и BF12/03. Вкратце, штаммы МеnХ выращивают в чашках с агаром на сердечно-мозговом бульоне с дОDолнением Levinthals, и после предкультурального этапа в 0,2 л среды Франца, штамм культивируют в четырех отдельных встряхиваемых колбах с перегородками объемом 2,8 л, каждая содержит 1,0 или 1,5 л модифицированной жидкой среды Франца. Жидкие культуры инактивируют спустя 16 ч роста, путем добавления формальдегида до конечной концентрации 1% (об/об). Выход МеnХ PS на литр культуральной среды оказался немного выше, для изолята BF7/07 (4,5 мг/л) чем для изолята BF12/03 (3,8 мг/л). Ссылка "Characterization of size, structure and purity of serogroup X Neisseria meningitidis polysaccharide, and development of an assay for quantification of human antibodies", Vaccine 30, 2012.
В предшествующем уровне техники обсуждаются исследования по улучшению структуры и выхода полисахаридов из серогрупп Men А, С, Y и W135. Однако ни один из источников уровня техники не обращается к давно испытываемой потребности в получении Men X полисахарида с более высоким выходом, который является необходимым условием для развития простого MenX полисахарида и вакцин с белок-конъюгированным MenX полисахаридом.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что стратегии периодической подпитки (фидинга) из предшествующего уровня техники основанные на статическом уровне рН, при скачках и постоянной скоростью, которые подходят для ферментации Men А С Y W135, тем не менее, характеризуются следующими недостатками в случае MenX: i) удовлетворительный рост, но меньший выход полисахарида ii) ограниченный рост и меньший выход полисахарида и iii) удовлетворительный рост, но ранняя фаза замедления роста, т.е. стадия отмирания. Более того методы из предшествующего уровня техники используют соевый пептон вместе с дрожжевым экстрактом в качестве питательных компонентов среды, что приводит к снижению выхода полисахарида, связанного с повышенной загрузкой белковыми загрязнениями.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение улучшенных культуральных, ферментативных и очищающих условий получения полисахаридов менингококка X с высоким выходом и минимальными примесями. С указанными усовершенствованиями, изготовление вакцин с белок-конъюгированным MenX полисахаридом может быть экономичным, и впоследствии вакцина может быть сделана доступной для детей в развивающихся странах по доступным ценам.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение возникает из неожиданного открытия, что можно получить MenX полисахарид с высоким выходом и высокой степенью чистоты путем использования а) ферментационной среды, содержащей казаминокислоту наряду с другими компонентами, б) новой непрерывной экспоненциальной стратегии подпитки и состава питательной среды, что может привести к задержке фазы замедления роста, с) оптимальных условий ферментера и d) улучшенного процесса очистки, свободного от хроматографических методов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 - Профиль роста "N. meningitidis X 8210» в среде, содержащей казаминокислоту по сравнению со средой, содержащий соевый пептон.
13
Фиг. 2 - С ЯМР-спектр MenX
31
Фиг. 3 - Р-ЯМР-спектр MenX
1
Фиг. 4 - ЯМР-спектр MenX
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому воплощению, настоящее изобретение предпочтительно использует ферментационную среду, содержащую казаминокислоту в качестве источника азота вместо соевого пептона или дрожжевого экстракта, таким образом, обеспечивая следующие преимущества i) значительное увеличение выхода полисахарида из-за задержки фазы отмирания в результате использования новой непрерывной экспоненциальной стратегии подпитки и) 50% снижение концентрации белковых и нуклеиновокислотных загрязняющих веществ непосредственно на стадии сбора клеток в биореакторе 100 кДа, обеспечивая, таким образом, условия, которые позволяют в результате последующего процесса очистки легко удалить оставшиеся примеси iii) масштабирование ферментационной среды, содержащей казаминокислоту, которое может быть простым и экономичным.
Второе воплощение настоящего изобретения заключается в том, что указанная, менингококковая ферментационная среда для получения капсульных полисахаридов из менингококка X может содержать декстрозу между 9 и 10 г/л, хлорид натрия от 5,5 до 6 г/л, сульфат калия от 0,8 до 1 г/л, двухосновный фосфат калия от 3,5 до 4 г/л, хлорид аммония от 0,14 до 0,19 г/л, глутаминовую кислоту от 4,5 до 5,5 г/л, L-аргинин между 0,2 и 0,4 г/л, L-серин между 0,4 и 0,6 г/л, L -цистеин между 0,24 и 0,26 г/л, хлорид магния от 0,18 до 0,20, хлорид кальция 0,02 г/л сульфат железа 0.002 г/л и казаминокислоту между 5 и 20 г/л.
Предпочтительное воплощение настоящего изобретения заключается в том, что указанная менингококковая ферментационная среда для получения капсульных полисахаридов из Neisseria meningtidis X может содержать декстрозу 10 г/л, хлорид натрия между 5,8 и 6 г/л, сульфат калия между 0,9 и 1 г/л, двухосновный фосфат калия между 3,8 до 4 г/л, хлорид аммония между 0,14 и 0,17 г/л, глутаминовую кислоту между 4,8 до 5 г/л, L-аргинин между 0,2 и 0,3 г/л, L-серин между 0,4 и 0,5 г/л, L-цистеин между 0,24 и 0,25 г/л, хлорид мания между 0,18 до 0,19, хлорид кальция 0,02 г/л, сульфат железа 0.002 г/л и казаминокислоту между 5 и 10 г/л.
Важным аспектом настоящего изобретения является то, что авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили преимущество непрерывной экспоненциальной стратегии подпитки, которая может поддерживать клетки в стационарной фазе в течение более длительного времени, таким образом, повышая выход полисахарида N. meningitidis X, так, что добавление начальной подпитки может быть начато, когда оптическая плотность OD при 590 нм находится между 3 и 4 со скоростью 10 мл/ч/1,5 л, которую постепенно увеличивают до 30 мл/ч/1.5 л до тех пор, пока оптическая плотность культуры OD не повысится, а затем поддерживается на уровне 60 мл/ч/1,5 л до тех пор, пока оптическая плотность культуры OD не достигнет 50% от высшего значения оптической плотности, после чего культура может быть собрана.
В дальнейшем изобретатели обнаружили, что во время ферментации, чтобы избежать падения рН в результате накопления образующихся клеточных метаболитов, могут непрерывно подаваться NaOH в концентрации между 0,25N и 0,5N и ортофосфорная кислота в концентрации от 5 до 10% с помощью находящихся в каскаде дозирующих насосов, поддерживая рН в заданной точке, где соотношение карбоната натрия (20%) к NaOH (0,5N) поддерживается на уровне 1: 3.
-ым
-ым
-ым
-ым
-ым
-ым
Одним из важных аспектов настоящего изобретения является то, что указанный штамм N.meningitidis X 8210, как было установлено, имеет Лаг-фазу (логарифмическую фазу) между 5 и 9 часом, стационарную фазу между 9 и 12 часом и фазу замедления роста между 12 и 19 часом.
Ферментация по настоящему изобретению может быть осуществлена в статичном режиме или в периодическом режиме с подпиткой, предпочтительно в непрерывном режиме с подпиткой.
В еще одном аспекте настоящего изобретения, указанный питательный раствор может содержать декстрозу от 72 до 76 г/л, глутамат натрия от 38 до 42 г/л, L-аргинин от 2,8 до 3,2 г/л, L-серин от 2,8 до 3,2 г/л, L-цистеин от 1,9 до 2,1 г/л, хлорид магния от 1,9 до 2,1, хлористый кальций от 0,13 до 0,15 г/л и сульфат железа 0,02 г/л.
В третьем воплощении, настоящее изобретение обеспечивает МеnХ капсульный полисахарид, имеющий выход от 600 мг/л до 800 мг/л при 100 кДа на стадии сбора клеток, выросших в культуре ферментера, где оптическая плотность, измеренная при 590 нм может быть от 8 до 15, предпочтительно от 8 до 11.
Третье воплощение настоящего изобретения заключается в том, что ферментация менингококка X может быть выполнена при заданных значениях i) рН от 7 до приблизительно 7,2, и) температура между 36 и 37°С и при каскадных значениях для i) растворенный кислород от 15 до 25%, и) перемешивание от 350-500 оборотов в минуту, iii) потока газа от 1 до 1,5, iv) воздух от 0 до 100% и v) кислород от 0 до 100%.
Четвертое воплощение настоящего изобретения заключается в том, что собранные диафильтрацией клетки, выросшие в культуре при 100 кДа, могут быть дополнительно подвергнуты стадиям очистки состоящим из:
(a) удаления белковых примесей и эндотоксинов с использованием дезоксихолата в концентрации 1%, в сочетании с этилендиаминтетрауксусной кислотой в концентрации 2 мМ и этанола в концентрации 40%;
(b) добавления от 4 до 6% ацетата натрия для удаления нуклеиновых кислот;
(c) добавления цетилтриметиламмоний бромида в концентрации от 3 до 4% для связывания полисахарида и примесей;
(d) осаждения полисахарида из комплекса бромид цетилтриметиламмония-полисахарида путем использования хлорида натрия в концентрации 0,05М в присутствии 96% абсолютного этанола;
(e) удаления примесей белков и нуклеиновых кислот путем промывки гранул этанолом с концентрацией 45% в присутствии хлорида натрия в концентрации 0,4 М;
(f) селективного осаждения полисахарида с использованием 96% абсолютного этанола;
(g) растворения полисахарида в воде для инъекций (WFI) и проведение фильтрации с тангенциальным потоком,
при этом в указанном процессе очистки не используется какая либо хроматография и указанный очищенный полисахарид имеет выход от 300 до 500 мг/л, средний молекулярный вес от 400 до 550 кДа, содержит менее 0,5% белков/пептидов, менее 0,5% нуклеиновых кислот, менее чем 5 EU/мкг эндотоксинов, и со стадией очистки извлекается от 60% до 65%.
Другой аспект четвертого воплощения заключается в том, что указанный способ очистки N.meningitidis X полисахарида является надежным и экономически эффективным, поскольку он обеспечивает извлечение примерно от 60 до 70% полисахарида и не требует каких-либо дополнительных хроматографических стадий очистки.
Пятый аспект настоящего изобретения заключается в том, что указанный способ может быть применим к N.meningitidis серотипов X, А, В, CD, Y, Z, 29Е и W-135, предпочтительно, N.meningitidis серотипа X штаммов, выбранных из М9601, М9592, М9591, 247Х, М9554, М8210 и М2526, 5967 штамма (ST 750), наиболее предпочтительно "М8210".
Шестое воплощение настоящего изобретения заключается в том, что указанный N.meningitidis X полисахарид по настоящему изобретению может быть использован для приготовления композиции полисахарид-белкового конъюгата способами, Описанными в WO 2013114268, где i) полисахарид X может быть доведен до размера механически, чтобы получить фрагменты, имеющие размер от 150 до 200 кДа, ii) измеренный сахарид может быть конъюгирован с белком-носителем через линкер с помощью цианилирования путем химического конъюгирования iii) соотношение сахарида к белку в окончательном конъюгате может быть в пределах от 0,2 до 0,6.
В одном аспекте шестого воплощения указанный полисахарид N.meningitidis X по настоящему изобретению также может быть использован для получения поливалентной менингококковой конъюгированной полисахаридной композиции, содержащей капсульный сахарид из серогрупп X и, по крайней мере, один дополнительный капсульный полисахарид из А, С, W135 и Y с помощью способов, раскрытых ранее в WO 2013114268.
Седьмое воплощение настоящего изобретения заключается в том, что указанный белок-носитель может быть выбран из группы, но, не ограничиваясь такими как CRM 197, токсоид дифтерии, токсоид столбняка, коклюшный токсоид, E. coli LT, Е: coli ST, и экзотоксин А из синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa), белковый комплекс внешней мембраны (ОМРС), порины, трансферрин-связывающие белки, пневмолизин, поверхностный пневмококковый белок A (PspA), белок адгезии пневмококков (PSAA), поверхностные пневмококковые белки BVH-3 и BVH-11, защитный антиген (РА) возбудителя сибирской язвы(Васillus anthracis) и детоксифицированного фактора отека (EF) и летального фактора (LF) из возбудителя сибирской язвы, овальбумина, гемоцианин лимфы улитки (KLH), сывороточного альбумина человека, бычьего сывороточного альбумина (BSA) и очищенного белкового производного туберкулина (PPD). Предпочтительно, белки-носители могут быть выбраны из столбнячного анатоксина, дифтерийного анатоксина и CRM 197.
Моновалентные или поливалентные иммуногенные композиции, содержащие N.meningitidis X полисахарид могут быть в буферной жидкой форме или в лиофилизованной форме. Предпочтительно, указанные белок-конъюгированные полисахариды могут быть лиофилизованы, как описано ранее, в заявке US2013/0209503, где композиция может быть стабильна по крайней мере 6 месяцев при 40°С и содержание свободного полисахарида может быть меньше, чем 11% вес/вес.
Композиция лиофилизованной вакцины по настоящему изобретению может быть преобразована с помощью средства доставки в виде носителя, имеющего рН от примерно 6 до 7,5, особенно с физиологическим раствором или PBS.
+++
Композиции могут дополнительно содержать соли алюминия, добавленные в количестве 25-125 мкг Аlна 0,5 мл.
Также указанная композиция может содержать консервант, выбранный из тиомерсала и 2-феноксиэтанола.
Композиция лиофилизованной вакцины по настоящему изобретению может быть дана в виде 1,5 или 10 дозированного состава.
Указанный полисахарид или его конъюгат предпочтительно вводят парентерально, например, путем внутривенной инъекции или инфузии, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриартериальным или внутриочаговым путем.
Примеры:
I) Методика ферментации:
Семенной флакон, содержащий 3 мл "N.meningitidis, X М8210" (CBER) культуры, имеющей оптическую плотность (OD) 1/мл замораживают при -70°С. Затем флакон размораживают и высевают в 30 мл посевной питательной среды, которую инкубируют при 37°С и перемешивают при 150-180 оборотах в минуту. Объем удваивают до 60 мл, когда оптическая плотность OD станет выше 0,7, доводят до 120 мл, и 210 мл соответственно.
Культуру, имеющую оптическую плотность OD 1.0±0.2 с объемом 70±10 мл высевают в реактор, где объем среды в реакторе составляет 1500 мл. После инокуляции реактора 0 ч оптическую плотность поддерживают на уровне от 0,04 до 0,05.
Полный процесс ферментации проводят в стеклянном биореакторе NBS bio flow Celligen 115 (2.2L), в котором цикл ферментации проводят в режиме непрерывной подпитки и общая длительность цикла ферментации составляет 19 часов.
II) Композиция ферментационной среды:
-ым
-ым
-ым
-ым
-ым
-ым
Фаза логарифмического роста была определена между 5 и 9 часом, стационарная фаза между 9 и 12 часом и фаза отмирания между 12 и 19часами.
Новая стратегия подпитки:
Стратегия подпитки была разработана таким образом, что начальное добавление подпитки может быть начато, когда OD при 590 нм составляет от 3 до 4, со скоростью 10 мл/ч/1.5 л, которую постепенно увеличивают до 30 мл/ч/1.5 л до увеличения OD культуры, а затем поддерживается на уровне 60 мл/ч/1.5 л до тех пор, пока OD культуры не достигнет 50% наивысшего значения OD, после чего культура может быть собрана.
Питательный раствор:
Результаты:
Стратегия непрерывной экспоненциальной подпитки привела к поддержанию клеток в стационарной фазе в течение более длительного периода, увеличивая, таким образом, выход N.meningitidis X полисахарида. Было обнаружено, что использование казаминовой кислоты в качестве источника азота, обеспечивает высокий выход и высокий молекулярный вес МеnХ полисахарида с минимальными примесями при 100 кДа, по сравнению с соевым пептоном в качестве источника азота.
В случае, когда только декстроза и глутамат натрия используется в качестве питательного раствора (FS-2), морфология клеток повреждается, в конечном счете, приводя к неблагоприятным характеристикам полисахарида. В то время как, использование FS-1 (содержащего аминокислоты, соли, в дополнение к декстрозе и глутамату натрия) обнаруживает, что морфология клеток улучшается, тем самым увеличивая выход полисахарида и обеспечивая полисахарид с благоприятными характеристиками.
Исследование профиля роста N.meningitidis X 8210 показывает, что в процессе ферментации было отмечено снижение рН в результате накопления высвобождаемых клеточных метаболитов, что отрицательно сказывается на скорости получения капсульных полисахаридов. Чтобы избежать такого снижения рН, непрерывно обеспечивают NaOH в концентрации между 0,25N и 0,5N и ортофосфорную кислоту в концентрации от 5 до 10%, с помощью каскада дозирующих насосов, поддерживая рН в заданной точке, где соотношение карбоната натрия (20%) в NaOH (0,5N) поддерживается на уровне 1:3.
IV) Условия ферментации
Результаты:
Для питательной среды NMXM-CA, содержащей казаминокислоты, на этапе 100 кДа, выход полисахарида составляет между 500 и 650 мг/л с минимальной загрузкой на которой был проведен сбор клеток тогда, когда значение OD достигает 50% наивысшего значения OD культуры. В то время как для среды NMXM-SP, содержащей соевый пептон, на этапе 100 кДа, выход полисахарида был сравнительно низким, то есть между 450 и 500 мг/л с большей загрузкой примесей.
V) Сбор клеток и Инактивация
Ферментацию прекращают, как только наблюдается падение оптической плотности, после чего проводят инактивацию с использованием 1% формальдегида в течение 2 ч при 37°С.Далее температуру снижают со скоростью 10°С и инкубируют в течение 30 минут. Сбор клеток выгружают и центрифугируют при 14,500 g в течение 45 минут.
Затем супернатант подвергают фильтрации с размером пор 0.2 мкм с последующей диафильтрацией 100 кДа (10-15 раз) и дополнительно концентрируют с помощью воды для инъекций. Затем проводят стерилизующую фильтрацию с размером пор 0,2 мкм.
VI) Очистка Men X полисахарида
Протокол 1:
Добавляют 0,5% дезоксихолат, 6% ацетат натрия, 2 мМ ЭДТА и 40% этанол к клеткам, 100 кДа, собранным после диафильтрации. Затем смесь выдерживают при температуре 2-8°С в течение 3-4 часов при перемешивании. В дальнейшем смесь подвергают центрифугированию при 10000 оборотах в минуту в течение 20 мин и супернатант подвергают диафильтрации против 25 мМ Трис с кассетной мембраной 100 кДа. Затем 10% вес/объем СТАВ осаждение проводят в течение ночи при 2-8°С при перемешивании, и осадок собирают.Указанный осадок растворяют в 96%-ном этаноле с 0.05М NaCl при 2-8°С в течение 2 часов при перемешивании. Затем проводят осаждение полисахарида в течение 30 минут и осадок собирают. Указанный осадок растворяют в 45%-ном этаноле с 0,4М NaCl в течение 1 часа. Супернатант собирают и фильтруют через угольный фильтр CUNO R32SP. Затем полисахарид осаждают в 96% этаноле в течение 1-2 часов и осадок собирают. Осадок растворяют в воде для инъекций, а затем в ТГФ. Окончательно очищенный полисахарид N.meningitidis X хранят при -20°С.
Протокол 2:
Добавляют 1,5% дезоксихолат, 6% ацетат натрия, 2 мМ ЭДТА и 40% этанол к клеткам, 100 кДа, собранным после диафильтрации. Затем смесь выдерживают при температуре 2-8°С в течение 3-4 часов при перемешивании. В дальнейшем смесь подвергают центрифугированию при 10000 оборотах в минуту в течение 20 мин и супернатант подвергают диафильтрации против 25 мМ Трис с 100 кДа кассетной мембраной. Затем 6% вес/объем СТАВ осаждение проводят в течение ночи при 2-8°С при перемешивании, и осадок собирают.Указанный осадок растворяют в 96%-ном этаноле с 0,05М NaCI, при температуре 2-8°С в течение 2 часов при перемешивании. Затем проводят осаждение полисахарида в течение 30 минут и осадок собирают. Указанный осадок растворяют в 45%-ном этаноле с 0,4М NaCl в течение 1 часа. Супернатант собирают и фильтруют через угольный фильтр CUNO R32SP. Затем полисахарид осаждают в 96% этаноле в течение 1-2 часов и осадок собирают. Затем осадок растворяют в воде для инъекций, а затем в ТГФ. Окончательно очищенный полисахарид N.meningitidis X хранят при -20°С.
Протокол 3:
Добавляют 1% дезоксихолат, 6% ацетат натрия, 2 мМ ЭДТА и 40% этанол к клеткам, 100 кДа, собранным после диафильтрации. Затем смесь выдерживают при температуре 2-8°С в течение 3-4 часов при перемешивании. В дальнейшем смесь подвергают центрифугированию при 10000 оборотах в минуту в течение 20 мин и супернатант подвергают диафильтрации против 25 мМ Трис с 100 кДа кассетной мембраной. Затем 3% вес/объем СТАВ осаждение проводят в течение ночи при 2-8°С при перемешивании, и осадок собирают. Указанный осадок растворяют в 96%-ном этаноле с 0,05М NaCl, при температуре 2-8°С в течение 2 часов при перемешивании. Затем проводят осаждение полисахарида в течение 30 минут и осадок собирают.Указанный осадок растворяют в 45%-ном этаноле с 0,4М NaCl в течение 1 часа. Супернатант собирают и фильтруют через угольный фильтр CUNO R32SP. Затем полисахарид осаждают в 96% этаноле в течение 1-2 часов и осадок собирают. Затем осадок растворяют в воде для инъекций, а затем в ТГФ. Окончательно очищенный полисахарид N.meningitidis X хранят при -20°С.
Протокол 1, имеющий низкий DOC, указывает на неэффективность удаления загрязняющих веществ (белок/нуклеиновые кислоты), также как и высокие концентрации СТАВ в конечном комплексе СТАВ-полисахарид, который не был легко отделим.
Протокол 2, имеющий более высокий DOC, указывает на более вязкие растворы полисахарида, что таким образом, делает его трудным для обработки ТГФ. К тому же, промежуточная концентрация СТАВ в комплексе СТАВ-полисахарид указывает на то, что он не является легко отделяемым.
Протокол 3, имеющий промежуточный DOC и меньшую концентрацию СТАВ был установлен, как более эффективный, чем Протоколы 1/2 и, следовательно, был завершен очисткой N.meningitidis X полисахарида.
Очищенный N. meningitidis, X полисахарид полученный в соответствии с Протоколом 3, был протестирован на наличие загрязнений, таких как белок, нуклеиновые кислоты, эндотоксин и на определение молекулярного размера. Несмотря на то, что ВОЗ спецификации/рекомендации для МеnХ полисахарида не были доступны, очищенный N. meningitidis X полисахарид был найден удовлетворяющим спецификациям ВОЗ, уже установленным для аналогичного фосфодиэфира, содержащего полисахарид, т.е. N.meningitidis А.
1
13
31
Кроме того, сравнение отнесения Н, С, Р спектров ЯМР для SIIL's МеnХ полисахарида с недавно опубликованными Х-отнесенными ЯМР данными (Vaccine 30,2012, 5812-5823 & Vaccine 30, 2012, 6409-6415) подтвердило структурную идентичность SllL's МеnХ полисахарида.
Результаты:
Оба, и NMXM-CA NMXM-SP, основанные серии Men X полисахарида были обнаружены как соответствующие спецификациям ВОЗ, установленным для N. meningitidis А полисахарида.
Для NMXM-CA среды, содержащей казаминокислоту, на заключительном этапе очистки, выделение на стадии очистки составляет между 60 и 65%, выход полисахарида составляет между 350 и 500 мг/л с минимальной нагрузкой примесей, в случае когда сбор клеток проводили когда OD культуры достигает 50% наивысшего значения OD культуры. В то время как для NMXM-SP среды, содержащей соевый пептон, на заключительном этапе очистки, выделение на стадии очистки для полисахарида, также выход полисахарида были сравнительно низкими, наряду с большей нагрузкой примесей.
Описанный выше высокий выход МеnХ полисахарида был достигнут без использования каких-либо дополнительных хроматографических методов, тем самым демонстрируя, что описанный выше протокол очистки является надежным и экономически эффективным.
VII) Получение лиофилизованных, иммуногенных конъюгатов MenX полисахарид-белок:
Моновалентные или поливалентные иммуногенные композиции, содержащие полисахарид N.meningitidis Х-столбнячный анатоксин могут находится в буферизированной жидкой форме или в лиофилизованной форме.
Предпочтительно, указанный конъюгат полисахарид-белок может быть лиофилизирован, как описано ранее в заявке США 2013/0209503, где композиция может быть стабильной, по крайней мере, 6 месяцев при 40°С и содержание свободного полисахарида может быть меньше, чем 11% вес/вес.
Полисахарид MenX по настоящему изобретению может быть использован для приготовления иммуногенных поливалентных менингококковых конъюгированных с белком полисахаридных композиции, содержащих капсульный сахарид из серогрупп X и, по крайней мере, один капсульный сахарид из А, С, W135 и Y, как описано выше в WO 2013114268.
Ввиду многих возможных воплощений, к которым могут быть применены принципы раскрытого изобретения, следует признать, что проиллюстрированные воплощения являются только предпочтительными примерами изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Скорее, объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения. Также заявляется в качестве настоящего изобретения все, что подпадает под область и дух этих пунктов формулы изобретения.