Гистохимическая активность некоторых ферментов в функционально различных мышцах после неонатального введения капсаицина

УДК 612.1

Т. Р. Ковригина

Гистохимическая активность некоторых ферментов в функционально различных мышцах после неонатального введения капсаицина

Целью исследования явилось выявление активности никотинадениндинуклеотидН - диафоразы (НАДН-диафоразы) в функционально различных мышцах голени деафферентированных белых крыс. Изучены икроножная, подошвенная и кам-баловидная мышцы у 72 белых крыс с 14 до 180-суточного возраста. Типирование мышечных волокон проводилось по выраженности гистохимической активности НАДН - диафоразы. В результате исследования было установлено, что при нарушении чувствительной иннервации изменяются активность и сроки стабилизации топографии мышечных волокон с различной активностью ферментов.

Ключевые слова: деафферентация, мышечное волокно, никотинадениндинуклеотидН - диафораза. T. R. Kovrigina

Histochemical Activity of Some Enzymes in Functionally Different Muscles after Neonatal Introduction of Capsaicin

The research objective was to define activity of nicotinadenindinucleotideN - diaphorase (NADN-diaphorase) in functionally different muscles of the crus of deafferented white rats. The gastrocnemius, plantar and salens muscles of 72 white rats from 14 to 180-days old were studied. Typing of muscular fibers was carried out due to expressiveness of the histochemical activity of NADH -diaphorase. As the result of the research it was determined that at disturbance of a sensitive innervation the activity and terms of stabilization of topography of muscular fibers with the different activity of enzymes are changed.

Keywords: deafferentation, a muscular fiber, nicotinadenindinucleotideN - diaphorase.

Введение

Изучение закономерностей постнатальной дифференцировки и формирования дефинитивного строения на различных уровнях организации живой материи остается актуальной и наиболее плодотворной целью научных исследований морфологического плана. Различные виды деаффе-рентации в мышце вызывают в принципе однотипный процесс, сходный со структурными изменениями в других деафферентированных органах [3]. Гистохимически установлено снижение активности ферментов тканевого дыхания, особенно в красных мышечных волокнах. Гликолитические процессы в этих условиях проявляют большую устойчивость [4]. В последние годы в целях нарушения афферентного звена рефлекторной дуги применяется химическая деафферентация, позволяющая изучить различные органы и избежать небезразличной при трактовке результатов тяжелой хирургической травмы и осложнений. В качестве препарата применяется капсаицин, обладающий селективным цитолитическим действием на чувствительные нейроны [5]. Влияние капсаицина на становление гистохимического

© Ковригина Т. Р., 2013

спектра мышечных волокон функционально различных мышц в постнатальном онтогенезе изучено недостаточно.

Цель исследования: выявить становление активности никотинадениндинуклеотид Н-диафоразы (НАДН-диафоразы) в функционально различных мышцах голени интактных и деаффе-рентированных белых крыс.

Материал и методы исследования

Исследование проведено на 72 белых беспородных крысах с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». Крысы были разделены на две группы: контрольную (n=36) и подопытную (n=36). Деафферентация достигалась однократным внут-рибрюшинным ведением 2-суточным крысятам капсаицина (N-vanillylonamide, Sigma) из расчета 100 мг на 1 кг массы, растворенного в наполнителе (твин-80, 96 % этиловый спирт, 0,9 % раствор NaCl) в соотношении 1:1:8), что приводит к гибели до 50 % чувствительных нейроцитов [6,8,9].

Подопытных и интактных животных выводили из эксперимента в 14-, 21-, 30-, 60-, 90- и 180-суточном возрасте. В каждом указанном возрасте

контрольной и подопытной групп крыс были исследованы по 6 самок. Объектом исследования служили медиальная головка быстрой окисли-тельно-гликолитической икроножной мышцы, гликолитическая подошвенная, медленная окислительная камбаловидная мышцы.

Свежезамороженные мышцы в криостате разлагали на срезы толщиной 8 мкм. Типирование мышечных волокон (МВ) проводилось по результатам оценки гистохимической активности НАДН-диафоразы [производитель Bio-Optica, Milano]. Мышечные волокна по выраженности активности НАДН-диафоразы подразделяли на волокна с высокой, промежуточной и низкой активностью фермента.

Качественно оценивали топографию мышечных волокон с разной активностью фермента на поперечном сечении мышцы и процентное содержание типов мышечных волокон. Методом прямой морфометрии определяли диаметр мышечных волокон.

Результаты

В 14-суточном возрасте изучаемые скелетные мышцы интактных животных, типированные по активности НАДН-диафоразы представлены гетерогенными по гистохимическим свойствам мышечными волокнами. В составе всех изученных мышц в этом возрасте преобладали волокна с промежуточной активностью фермента (в подошвенной - 71,60±1,73 %, в икроножной -56,60±7,76 %, в камбаловидной - 82,20±0,82 %). Камбаловидная мышца отличалась низким процентом волокон с высокой активностью фермента и отсутствием волокон с низкой активностью НАДН-диафоразы. Максимальное процентное содержание волокон с низкой активностью фермента обнаружено в икроножной мышце (83,19±2,15 %).

Изменение спектра МВ, типированных по активности НАДН-диафоразы характеризовалось уменьшением доли волокон с высокой активностью фермента до 30-суточного возраста, а затем - стабилизировалось. Доля мышечных волокон с промежуточной активностью НАДН-диафоразы, максимальная в 14-суточном возрасте, уменьшалась до 60-суточного возраста в икроножной и подошвенный мышцах и в дальнейшем спектр МВ стабилизировался. В камбаловидной мышце процент волокон с промежуточной активностью НАДН-диафоразы возрастал до 60-суточного возраста, а затем стабилизировался. Процент мышечных волокон с низкой активностью фермента в икроножной и подошвенной мышцах возрастал.

Стабилизация показателя отмечена с 60-суточного возраста. В камбаловидной мышце во все исследуемые сроки не обнаруживались мышечные волокна с низкой активностью НАДН-диафоразы.

В возрасте 14 суток МВ с высокой активностью фермента располагались группами по 2-5 волокон в центральной части и в краевой зоне. В подошвенной мышце - небольшими группами (2-3 волокна), иногда изолированно и в центральной части и в краевой зоне. Во всех исследуемых мышцах в постнатальном онтогенезе отмечена смена группового расположения МВ с высокой активностью НАДН-диафоразы на преимущественно изолированное. Стабилизация топографии МВ отмечена в икроножной и подошвенной мышцах в 90-суточном возрасте, а в камбаловид-ной с 60-суточного.

В 14-суточном возрасте изученные мышцы с разной активностью НАДН-диафоразы различались и по диаметру мышечных волокон. Волокна с высокой гистохимической активностью НАДН-диафоразы имели меньший диаметр по сравнению с диаметром волокон с низкой и промежуточной активностью. В 14-суточном возрасте наименьший средний диаметр имела икроножная мышца (13,89±0,14 мкм), максимальный - камбаловидная (17,29±0,16 мкм), промежуточное положение занимала подошвенная мышца (14,75±0,18 мкм). Волокна с одинаковой гистохимической активностью из трех мышц имели наибольший диаметр в кам-баловидной мышце. Такая закономерность прослеживалась на протяжении всего наблюдения.

Наибольшие темпы прироста характеризовали период с 14 по 30 сутки после рождения (56,54 %, 68,19% в подошвенной и камбаловидной соответственно). С 60 по 90 сутки темпы прироста уменьшались в подошвенной и камбаловидной мышцах, составляя 22,09 %, 20,12 % соответственно, и после 90 суток темпы прироста составили не более 4-6 % в месяц, что позволяет говорить об относительной стабилизации диаметра мышечного волокна. В икроножной мышце максимальные темпы прироста отмечены с 14 по 60-суточный возраст (132,76 %), а позднее отмечена стабилизация прироста среднего диаметра мышечного волокна (прирост составил 5,97-5,25 % в месяц).

Анализ темпов прироста диаметра разных по активности мышечных волокон выявил следующие закономерности независимо от активности НАДН-диафоразы: наибольший темпы прироста диаметра отмечены с 14 по 30 сутки после рождения, с 30 по 90 сутки темпы прироста замедлялись и после 90 суток - стабилизировались.

С 14 по 30 сутки наибольшие темпы прироста диаметра имели мышечные волокна подошвенной мышцы.

С 30 по 90 сутки более высокие темпы прироста имели волокна икроножной мышцы. Причем в сопоставимые сроки наибольшие темпы прироста характеризовали мышечные волокна, проявляющие наименьшую гистохимическую активность фермента, наименьшие темпы прироста диаметра характеризовали волокна, проявляющие наибольшую гистохимическую активность на НАДН-диафоразу.

Неравномерный рост мышечных волокон с различной гистохимической активностью НАДН-диафоразы сопровождался углублением по диаметру. К 90 суткам в волокнах с крайним типом реакции разница в диаметре достигала 66 % (подошвенная мышца), «однотипные» волокна в камбаловидной мышце были всегда больше по диаметру.

В целом за период наблюдения в подошвенной и икроножной мышце отмечалось увеличение доли МВ с низкой активностью НАДН-диафоразы при одновременном уменьшении доли мышечных волокон с промежуточной активностью фермента.

Наиболее глубокая трансформация спектра мышечных волокон, типированных по активности НАДН-диафоразы отмечалась в подошвенной мышце. В камбаловидной мышце волокна с низкой активностью фермента не выявлялись на протяжении всего наблюдения.

Таким образом, во всех исследуемых мышцах с возрастом отмечена смена группового расположения МВ с высокой активностью НАДН-диафоразы на преимущественно изолированное. Стабилизация топографии мышечных волокон отмечена в икроножной и подошвенной с 90-суточного возраста, а в камбаловидной с 60-суточного возраста.

В подошвенной и в белой части икроножной мышцы расстояние между мышечными волокнами с высокой активностью фермента составляло от 1 до 4 диаметров и с возрастом практически не изменялось. В камбаловидной мышце расстояние между волокнами с высокой активностью НАДН-диафоразы и в красной части икроножной мышцы также с возрастом практически не изменяется, но расстояние между волокнами с высокой активностью фермента составляло в среднем 2 диаметра.

В целом постнатальная дифференцировка скелетных мышц характеризовалась в подошвенной и икроножной мышцах увеличением доли мышечных волокон с низкой активностью НАДН-диафоразы при одновременном уменьшении доли волокон с промежуточной активностью фермента. В камбаловидной мышце спектр мышечных волокон практически не изменялся. Состав мышечных волокон, типируемых по активности НАДН-диафоразы во всех трех мышцах стабилизировался к 60-суточному возрасту. Во всех трех мышцах выявлена устойчивая тенденция к незначительному снижению доли волокон с высокой активностью НАДН-диафоразы.

Дифференцировка МВ по активности НАДН-диафоразы деафферентированных животных характеризовалась той же направленностью, что и в контрольном исследовании. Отмечено изменение топографии и процентного соотношения МВ по активности ферментов.

У деафферентированных животных в 14-суточном возрасте по сравнению с интактными обнаружено меньшее количество МВ с промежуточной активностью фермента. В камбаловидной мышце выявлены волокна с низкой активностью фермента, не характерные для нормы (таблица 1,

2, 3).

Таблица 1. Процентное содержание мышечных волокон типированных

Мышцы Возраст

14 21 30 60 90 180

+++* Норма 25,33±2,20 22,16±1,16 21,37±1,76 20,74±2,11 20,32±2,26 21,80±1,27

Деафф 16,51±0,88 18,49±1,99 26,09±2,77 24,56±1,72 20,79±2,48 18,01±1,91

++ Норма 56,80±7,76 59,20±4,30 52,60±1,53 37,78±2,02 35,44±3,10 25,43±1,71

Деафф 42,34±2,27 39,81±1,58 32,49±1,94 28,79±1,86 19,73±1,37 17,38±1,38

+ Норма 17,87±6,34 18,64±4,27 26,03±1,88 41,48±1,30 44,24±3,29 52,68±1,58

деафф 41,15±2,68 41,70±3,29 41,42±2,01 46,65±2,01 59,48±1,54 64,61±1,98

* - выраженность активности фермента: +++ - высокая, ++ - промежуточная, + - низкая.

Таблица 2. Процентное содержание мышечных волокон типированных по активности НАДН-диафоразы в подошвенной мышце

Мышцы Возраст

14 21 30 60 90 180

+++ Норма 26,53±2,36 24,77±1,94 24,62±1,08 24,69±1,84 24,41±1,69 21,57±2,22

Деафф 29,16±1,99 30,30±1,86 28,31±1,94 26,89±1,33 20,37±2,33 16,47±1,06

++ Норма 71,60±1,73 57,08±2,26 35,96±1,80 32,72±1,26 32,14±1,57 22,00±1,49

Деафф 47,73±2,25 44,52±1,92 33,38±1,22 31,23±1,99 30,47±1.68 24,68±1,59

+ Норма 1,87±2,05 18,15±2,69 39,42±1,70 42,59±2,11 43,45±2,35 56,43±2,76

деафф 23,11±2,45 25,18±1,99 38,31±1,31 41,88±2,55 49,16±2,32 58,85±2,14

* - выраженность активности фермента: +++ - высокая, ++ - промежуточная, + - низкая.

Таблица 3. Процентное содержание мышечных волокон типированных по активности НАДН-диафоразы в камбаловидной мышце

Мышцы Возраст

14 21 30 60 90 180

+++ Норма 17,80±0,82 17,15±1,26 14,85±1,15 12,75±0,68 12,66±1,32 11,67±2,73

Деафф 23,70±2,25 21,63±1,41 15,82±0,73 14,66±1,09 13,99±1,89 13,06±2,35

++ Норма 82,20±0,82 82,85±1,26 85,15±3,89 87,25±2,39 87,34±1,78 88,33±3,79

Деафф 69,16±3,19 75,69±2,47 84,18±0,73 85,34±1,09 86,01±1,89 86,94±2,35

+ Норма - - - - - -

деафф 7,14±2,16 2,68±1,23 - - - -

* - выраженность активности фермента: +++ - высокая, ++ - промежуточная, + - низкая.

Рис. 2. Микрофото. Гистохимический метод выявления активности никотинамиддинуклеотидН-диафоразы в мышечных волокнах. Групповое расположение МВ с высокой активностью НАДН-диафоразы. а. Икроножная мышца. Возраст 180 суток. Интактное животное. б. Икроножная мышца после химической деафферентации. Возраст 60 суток

Диаметр МВ, типированных по активности НАДН-диафоразы в этом возрасте в икроножной и подошвенной мышцах был достоверно выше (р<0,05), чем у интактных крыс. В камбаловидной мышце обнаружено увеличение диаметра волокон с высокой активностью фермента 17,14±0,19 мкм (контроль 15,83±0,21 мкм). МВ с промежуточной активностью практически не различались с ин-тактными животными.

Диаметр МВ с высокой и промежуточной активностью НАДН-диафоразы во всех исследуемых мышцах превышал значения интактных животных с 14- до 21-суточного возраста и с 60-суточного возраста до конца исследования

(рис. 2). Диаметр МВ с низкой активностью фермента в подошвенной мышце был выше контрольных значений с 60-суточного возраста, а в икроножной - во все сроки исследования.

У деафферентированных животных изменяются динамика прироста диаметра мышечных волокон с различной активностью фермента. Во всех мышцах изменяется динамика прироста диаметра волокон, типированных по активности НАДН-диафоразы. Отмечено превышение темпов прироста диаметра в икроножной мышце с 60- до 90-суточного возраста, в подошвенной - с 30- до 60-суточного возраста, в камбаловидной мышце более высокие темпы прироста волокон с высокой

активностью фермента отмечены с 14- до 90-суточного возраста, а с промежуточной активностью - с 30- до 90-суточного возраста.

Обсуждение результатов

В результате проведенного исследования было установлено, что при нарушении чувствительной иннервации, как и у интактных животных сохраняется стадийность и сопряженность развития некоторых показателей.

С 14 по 30 сутки постнатальной жизни: выявлена дифференцировка МВ по активности НАДН-диафоразы.

Необычным является более медленное, чем у интактных животных формирование МВ с преимущественно аэробным типом окисления; больший диаметр одноименных МВ во все сроки исследования. Камбаловидная мышца, в отличие от икроножной и подошвенной более однородна по составу МВ, типированных по активности НАДН-диафоразы (7), с 21-суточного возраста больший диаметр, чем в контроле. Число МВ после рождения в постнатальном периоде не изменяется. Увеличивается их диаметр и изменяется группировка уже существующих волокон, что согласуется с данными полученными Тт80п В. Б. (12).

Больший диаметр МВ, вероятно можно объяснить гибелью чувствительных нейроцитов в ганг-

Библиографический список

лиях крестцовых спинномозговых нервов, вызывающих в ткани-мишени развитие изменений, комплекс которых называют нейродистрофиче-ским процессом (2, 3, 4), проявлением которого в мышцах является отек, а МВ набухают, поперечная исчерченность сохраняется (4). Возможно, следствием изменений в ткани-мишени является ускоренное развитие нейромышечных синапсов, размеры которых связаны с диаметром МВ (10).

Замедляется смена группового расположения МВ с высокой активностью НАДН-диафоразы во всех исследуемых мышцах. Следствием деаффе-рентации является ускорение прироста диаметра МВ с различной активностью фермента с 30 до 90-суточного возраста (в контрольных исследованиях с 30 по 60 сутки).

Таким образом, следствием деафферентации в изученных мышцах является изменение активности ферментов тканевого дыхания, сроков стабилизации топографии МВ с различной активностью, что указывает на изменение метаболического профиля, что возможно связано с тем, что химическая деафферентация, осуществляемая введением кап-саицина приводит к гибели преимущественно афферентных нейронов спинномозговых узлов (11) и повреждению эфферентной части рефлекторной дуги вследствие «дефицита афферентации».

1. Валлиулин, В. В., Девятаев, А. М., Зизевский, С. А. Гипотериоз ослабляет развитие денервационных изменений в быстрой и медленной скелетных мышцах морской свинки [Текст] / В. В. Валлилулин, А. М. Девятаев, С. А. Зизевский // Морфология, 2009, Т.136, №4. - С. 27

2. Волкова, О. В. Нейродистофические процессы (морфологические аспекты) [Текст] / О. В. Волкова -М.: Медицина, 1978. - С. 256

3. .Данилов, Р. К. Гистогенетические основы нервно-мышечных взаимоотношений [Текст] / Р. К. Данилов - С.-Пб., 1996. - 132 с.

4. Данилова, Л. Я., Симеонова, Н. К. Влияние де-афферентации на некоторые показатели энергетического обмена и реакции термогенеза в скелетных мышцах [Текст] / Л. Я. Данилова, Н. К. Симелнова // Патол., физиол. и экспер. терапия. - 1978, №6.- С. 56-59

5. Махорт, Н. А. Капсаицин - физиологически активное вещество [Текст] / Н. А. Махорт // Эксперим. и клинич. фармакология - 1993. - №1. - С. 67-69

6. Порсева, В. В. Возрастные преобразования ядер спинного мозга и спинномозговых ганглиев в норме и в условиях химической деафферентации: Автореф. дисс.... канд. мед. наук. Ярославль, 2006

7. Рехачева, И. П. Возрастные особенности активности некоторых ферментов в развивающихся мы-

шечных волокнах [Текст] / И. П. Рехачева // Арх. анат, 1980, Т.78, вып. 5. - С. 50-57

8. Румянцева, Т. А. Влияние химической денерва-ции на нейроциты экстра- и интрамуральных ганглиев в постнатальном онтогенезе белой крысе: Автореф... докт. мед. наук. - С.-Пб., 2002. - 42 с.

9. Шилкин, В. В., Румянцева, Т. А., Ковригина, Т. Р., Филимонов, В. И. Влияние введения капсаицина на ней-роциты спинномозговых ганглиев белой крысы [Текст] / В. В. Шилкин, Т. А. Румянцева, Т. Р. Ковригина, В. И. Филимонов // Рос. морфол. ведомости, 1999, №1 - 2. - С. 167-168

10. Шилкин, В. В., Филимонов, В. И. Зависят ли размеры нейромышечного синапса от диаметра мышечного волокна [Текст] / В. В. Шилкин, В. И. Филимонов // Российские морфологические ведомости, 1996. - №2 (5). - С.135-139

11. Bevan, S., Szolcsanyi, J. Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms and applications // Trends in Pharmacological sciences. - 1990. - V. 11, № 8. - Р. 330-333

12. Timson, B. F., Dudenhoeffer, G. A. Skeletal muscle fiber number rat from youth to adulthood // J. Anat. - 1990., V. 173. - P. 33-36

Bibliograficheskij spisok

1. Valliulin, V. V., Devjataev, A. M., Zizevskij, S. A. Gipoterioz oslabljaet razvitie denervacionnyh izmenenij v bystroj i medlennoj skeletnyh myshcah morskoj svinki [Tekst] / V. V. Vallilulin, A. M. Devjataev, S. A. Zizevskij // Morfologija, 2009, T.136, №4. - S. 27

2. Volkova, O. V. Nejrodistoficheskie processy (morfologicheskie aspekty) [Tekst] / O. V. Volkova - M.: Medicina, 1978. - S. 256

3. .Danilov, R. K. Gistogeneticheskie osnovy nervno-myshechnyh vzaimootnoshenij [Tekst] / R. K. Danilov -S.-Pb., 1996. - 132 s.

4. Danilova, L. Ja., Simeonova, N. K. Vlijanie de-afferentacii na nekotorye pokazateli jenergetiche-skogo obmena i reakcii termogeneza v skeletnyh myshcah [Tekst] / L. Ja. Danilova, N. K. Simelnova // Patol., fiziol. i jeksper. terapija. - 1978, №6. - S. 56-59

5. Mahort, N. A. Kapsaicin - fiziologicheski ak-tivnoe veshhestvo [Tekst] / N. A. Mahort // Jeksperim. I klinich. farmakologija - 1993. - № 1. - S. 67-69

6. Porseva, V. V. Vozrastnye preobrazovanija jader spinnogo mozga i spinnomozgovyh gangliev v norme i v uslovijah himicheskoj deafferentacii: Avtoref. diss.... kand. med. nauk. Jaroslavl', 2006

7. Rehacheva, I. P. Vozrastnye osobennosti aktivnosti nekotoryh fermentov v razvivajushhihsja myshechnyh voloknah [Tekst] / I. P. Rehacheva // Arh. anat, 1980, T.78, vyp. 5. - S. 50-57

8. Rumjanceva, T. A. Vlijanie himicheskoj denervacii na nejrocity jekstra- i intramural'nyh gangliev v postnatal'nom ontogeneze beloj kryse: Avtoref... dokt. med. nauk. - S.-Pb., 2002. - 42 s.

9. Shilkin, V. V., Rumjanceva, T. A., Kovrigina, T. R., Filimonov, V. I. Vlijanie vvedenija kapsaicina na nejrocity spinnomozgovyh gangliev beloj krysy [Tekst] / V. V. Shilkin, T. A. Rumjanceva, T. R. Kovrigina, V. I. Filimonov // Ros. morfol. vedomosti, 1999, № 1 - 2. - S. 167-168

10. Shilkin, V. V., Filimonov, V. I. Zavisjat li razmery nejromyshechnogo sinapsa ot diametra myshechnogo volokna [Tekst] / V. V. Shilkin, V. I. Filimonov // Rossijskie morfologicheskie vedomosti, 1996. - №2 (5). - S.135-139

11. Bevan, S., Szolcsanyi, J. Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms and applications // Trends in Pharmacological sciences. - 1990. - V. 11, № 8. - R. 330-333

12. Timson, B. F., Dudenhoeffer, G. A. Skeletal muscle fiber number rat from youth to adulthood // J. Anat. - 1990., V. 173. - P. 33-36