ПРОЦЕСС ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ С ПОДПИТКОЙ ПРИ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ КЛЕТОК ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА

1. Способ получения рекомбинантного белка, включающий
культивирование рекомбинантной бактериальной клетки для экспрессии рекомбинантного белка, включающее непрерывное добавление источника углерода в культуру, включающую рекомбинантную бактериальную клетку, и непрерывное добавление индуктора в указанную культуру после того, как культура достигла порогового параметра, и выделение указанного рекомбинантного белка из указанной культуры.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный пороговый параметр представляет собой оптическую плотность (OD), растворенный кислород (DO), концентрацию питательных веществ в культуральной среде, суммарную концентрацию источника углерода, добавленного в культуральную среду, или любую их комбинацию.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что указанный пороговый параметр представляет собой оптическую плотность (OD) указанной культуры.
600
4. Способ по п.3, включающий непрерывное добавление индуктора в культуру, когда плотность клеток в указанной культуре достигает OD, равной от приблизительно 70 до приблизительно 110.
600
5. Способ по п.4, включающий непрерывное добавление индуктора в указанную культуру, когда плотность клеток в указанной культуре достигает OD равной от приблизительно 70 до приблизительно 105.
600
6. Способ по п.5, включающий непрерывное добавление индуктора в культуру, когда плотность клеток в указанной культуре достигает OD, равной от приблизительно 75 до приблизительно 85.
600
7. Способ по п.6, включающий непрерывное добавление индуктора в культуру, когда плотность клеток в указанной культуре достигает OD, равной приблизительно 80.
8. Способ по п.1, включающий добавление индуктора в культуру при постоянной скорости, добавление индуктора в культуру посредством DO-stat подпитки или добавление индуктора в культуру посредством pH-stat подпитки.
9. Способ по п.1, включающий добавление индуктора в культуру при постоянной скорости, равной от приблизительно 3,35 г/л/ч до приблизительно 16 г/л/ч, добавление индуктора в культуру посредством DO-stat подпитки или посредством pH-stat подпитки.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру, равно от приблизительно 4 г/л до приблизительно 40 г/л.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру в процессе подачи индуктора, равно от приблизительно 5 г/л до приблизительно 20 г/л.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру в процессе подачи индуктора, равно от приблизительно 7 г/л до приблизительно 15 г/л.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру в процессе подачи индуктора, равно приблизительно 10 г/л.
14. Способ по п.1, включающий непрерывное добавление индуктора в культуру в течение от приблизительно 2 до приблизительно 8 ч после начала указанного способа.
15. Способ по п.14, включающий непрерывное добавление индуктора в культуру в течение от приблизительно 3 до приблизительно 6 ч после начала.
16. Способ по п.1, включающий выделение указанного рекомбинантного белка через промежуток времени от приблизительно 2 до приблизительно 8 ч после начала добавления индуктора в культуру.
17. Способ по п.16, включающий выделение указанного рекомбинантного белка через промежуток времени от приблизительно 3 до приблизительно 6 ч после начала добавления индуктора в культуру.
18. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный индуктор представляет собой арабинозу.
19. Способ по п.1, включающий непрерывное добавление источника углерода в культуру перед индуцированием.
20. Способ по п.1, включающий непрерывное добавление источника углерода в культуру перед и в процессе индуцирования.
21. Способ по п.1, включающий непрерывное добавление источника углерода в культуру в то время, как указанный индуктор непрерывно добавляют в указанную культуру.
600
22. Способ по п.1, включающий непрерывное добавление источника углерода в культуру до тех пор, пока плотность клеток в указанной культуре не достигнет OD, равной от приблизительно 70 до приблизительно 110.
23. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный источник углерода представляет собой источник углерода на основе сахаров.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный источник углерода на основе сахаров представляет собой глюкозу.
25. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанный индуктор представляет собой арабинозу.
26. Способ по п.25, включающий непрерывное добавление глюкозы в культуральную среду в то время, как арабинозу непрерывно добавляют в культуральную среду.
600
27. Способ по п.25, включающий непрерывное добавление глюкозы до тех пор, пока плотность клеток в указанной культуре не достигнет OD, равной приблизительно 80.
28. Способ получения рекомбинантного белка, включающий
a) введение в бактериальную клетку-хозяина вектора экспрессии, кодирующего рекомбинантный белок под контролем индуцируемого промотора, чтобы получить рекомбинантную бактериальную клетку;
b) введение указанной рекомбинантной бактериальной клетки в культуральную среду, чтобы получить культуру клеток;
c) добавление источника углерода в указанную культуру клеток в виде непрерывной подачи;
600
d) слежение за достижением ростом клеток в культуре пороговой оптической плотности (OD);
600
e) добавление индуктора указанного индуцируемого промотора в указанную культуру клеток в виде непрерывной подачи, как только пороговая оптическая плотность (OD) будет достигнута; и
f) выделение указанного рекомбинантного белка из указанной культуры клеток.
600
29. Способ по п.28, включающий непрерывное добавление индуктора в культуру, когда плотность клеток в указанной культуре достигает OD, равной от приблизительно 70 до приблизительно 110.
600
30. Способ по п.29, включающий непрерывное добавление индуктора в культуру, когда плотность клеток в указанной культуре достигает OD, равной от приблизительно 70 до приблизительно 105.
600
31. Способ по п.30, включающий непрерывное добавление индуктора в культуру, когда плотность клеток в указанной культуре достигает OD, равной от приблизительно 75 до приблизительно 85.
600
32. Способ по п.31, включающий непрерывное добавление индуктора в культуру, когда плотность клеток в указанной культуре достигает OD, равной приблизительно 80.
33. Способ по п.28, отличающийся тем, что индуктор добавляют в культуру при постоянной скорости, указанный индуктор добавляют в культуру посредством DO-stat подпитки или указанный индуктор добавляют в культуру посредством pH-stat подпитки.
34. Способ по п.33, отличающийся тем, что индуктор добавляют в культуру при постоянной скорости, равной от приблизительно 3,35 г/л/ч до приблизительно 16 г/л/ч, указанный индуктор добавляют в культуру посредством DO-stat подпитки или указанный индуктор добавляют в культуру посредством pH-stat подпитки.
35. Способ по п.28, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру, равно от приблизительно 4 г/л до приблизительно 40 г/л.
36. Способ по п.35, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру, равно от приблизительно 5 г/л до приблизительно 20 г/л.
37. Способ по п.36, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру, равно от приблизительно 7 г/л до приблизительно 15 г/л.
38. Способ по п.37, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру, равно приблизительно 10 г/л.
39. Способ по п.28, включающий выделение указанного рекомбинантного белка из указанной культуры через промежуток времени от приблизительно 2 ч до приблизительно 8 ч после начала подачи индуктора.
40. Способ по п.39, включающий выделение указанного рекомбинантного белка из указанной культуры через промежуток времени от приблизительно 3 ч до приблизительно 6 ч после начала подачи индуктора.
41. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный источник углерода добавляют в указанную культуру клеток во время подачи с постоянной скоростью как источника углерода, так и индуктора, в процессе DO-stat подпитки как источником углерода, так и индуктором, или в процессе pH-stat подпитки как источником углерода, так и индуктором.
42. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный индуктор представляет собой арабинозу.
43. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный источник углерода представляет собой источник углерода на основе сахаров.
44. Способ по п.43, отличающийся тем, что указанный источник углерода на основе сахаров представляет собой глюкозу.
45. Способ по п.28, отличающийся тем, что указанный источник углерода представляет собой глюкозу и указанный индуктор представляет собой арабинозу.
46. Способ по п.45, включающий непрерывное добавление глюкозы в культуру клеток, в то время, как арабинозу непрерывно добавляют в указанную культуру клеток.
600
47. Способ по п.45, включающий непрерывное добавление глюкозы в культуру клеток, до тех пор, пока плотность клеток в указанной культуре не достигнет OD, равной приблизительно 80.
48. Способ получения рекомбинантного белка, включающий:
культивирование рекомбинантной бактериальной клетки для экспрессии рекомбинантного белка с помощью непрерывного добавления индуктора в культуру, включающую указанную бактериальную клетку, после того, как культура достигла порогового параметра, отличающееся тем, что указанная бактериальная клетка включает последовательность нуклеиновых кислот, соответствующую гену из N. meningitidis серологической группы В.
49. Способ по п.48, отличающийся тем, что указанный пороговый параметр представляет собой оптическую плотность (OD), растворенный кислород (DO), pH, концентрацию питательных веществ в культуральной среде, суммарную концентрацию источника углерода, добавленного в культуральную среду, или любую их комбинацию.
50. Способ по п.49, отличающийся тем, что указанный пороговый параметр представляет собой оптическую плотность (OD) указанной культуры.
600
51. Способ по п.50, отличающийся тем, что непрерывная подача индуктора начинается, когда плотность клеток в культуре достигает OD, равной от приблизительно 70 до приблизительно 110.
600
52. Способ по п.51, отличающийся тем, что то непрерывная подача индуктора начинается, когда плотность клеток в культуре достигает OD, равной от приблизительно 70 до приблизительно 105.
600
53. Способ по п.52, отличающийся тем, что то непрерывная подача индуктора начинается, когда плотность клеток в культуре достигает OD, равной от приблизительно 75 до приблизительно 85.
600
54. Способ по п.53, отличающийся тем, что то непрерывная подача индуктора начинается, когда плотность клеток в культуре достигает OD, равной приблизительно 80.
55. Способ по п.48, отличающийся тем, что индуктор добавляют в указанную культуру при постоянной скорости, равной от приблизительно 3.35 г/л/ч до приблизительно 16 г/л/ч, указанный индуктор добавляют посредством DO-stat подпитки или указанный индуктор добавляют посредством pH-stat подпитки.
56. Способ по п.48, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру в процессе индукции, составляет от приблизительно 4 г/л до приблизительно 40 г/л.
57. Способ по п.56, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру в процессе индукции, составляет от приблизительно 5 г/л до приблизительно 20 г/л.
58. Способ по п.57, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру в процессе индукции, составляет от приблизительно 7 г/л до приблизительно 15 г/л.
59. Способ по п.58, отличающийся тем, что суммарное количество индуктора, добавленного в культуру в процессе индукции, равно приблизительно 10 г/л.
60. Способ по п.48, отличающийся тем, что подача индуктора продолжается в течение от приблизительно 2 ч до приблизительно 8 ч после начала указанного способа.
61. Способ по п.60, отличающийся тем, что подача индуктора продолжается в течение от приблизительно 3 ч до приблизительно 6 ч после начала указанного способа.
62. Способ по п.48, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный белок собирают через период времени от приблизительно 2 ч до приблизительно 8 ч после начала подачи индуктора.
63. Способ по п.62, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный белковый продукт выделяют через период времени от приблизительно 3 ч до приблизительно 6 ч после начала подачи индуктора.
64. Способ по п.48, отличающийся тем, что подача источника углерода в культуральную среду продолжается в процессе подачи индуктора в культуру.
65. Способ по п.48, отличающийся тем, что указанный индуктор представляет собой арабинозу.
66. Способ по п.48, отличающийся тем, что указанный источник углерода представляет собой источник углерода на основе сахаров.
67. Способ по п.66, отличающийся тем, что указанный источник углерода на основе сахаров представляет собой глюкозу.
68. Способ по п.67, отличающийся тем, что указанный индуктор представляет собой арабинозу.
69. Способ по п.68, отличающийся тем, что глюкозу подавали в культуру при постоянной скорости подачи во время подачи с постоянной скоростью арабинозы в культуру, посредством DO-stat подпитки как глюкозой, так и индуктором или посредством pH-stat подпитки как глюкозой, так и индуктором.
600
600
70. Способ по п.68, отличающийся тем, что глюкозу подавали в культуру при постоянной скорости подачи во время подачи с постоянной скоростью арабинозы в культуру, посредством DO-stat подпитки как глюкозой, так и индуктором до тех пор, пока плотность клеток в культуре не достигла OD, равной приблизительно 80, или посредством pH-stat подпитки как глюкозой, так и индуктором до тех пор, пока плотность клеток в культуре не достигла OD, равной приблизительно 80.
71. Способ по п.68, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный менингококковый белок 2086 включает липопротеин (rLP2086).
72. Способ по п.68, отличающийся тем, что указанный белок включает нелипидированный белок.
73. Способ по п.68, отличающийся тем, что указанный белок включает менингококковый белок 2086 подсемейства А.
74. Способ по п.68, отличающийся тем, что указанный белок включает менингококковый белок 2086 подсемейства В.
75. Способ получения рекомбинантного менингококкового белка 2086 (Р2086), включающий
(a) введение в бактериальную клетку-хозяина вектора экспрессии, кодирующего рекомбинантный белок 2086 под контролем индуцируемого промотора для получения рекомбинантной бактериальной клетки;
(b) введение указанной рекомбинантной бактериальной клетки в культуральную среду для получения культуры;
(c) добавление источника углерода в указанную культуру;
(d) слежение за достижением ростом клеток в указанной культуре пороговой оптической плотности (OD);
(e) непрерывное добавление индуктора указанного индуцируемого промотора в культуру, как только плотность клеток в указанной культуре достигла оптической плотности, равной приблизительно от 70 до 110; и
(f) выделение указанного рекомбинантного менингококкового белка 2086 из указанной культуры через промежуток времени от приблизительно 3 ч до приблизительно 6 ч после начала непрерывного добавления индуктора.
76. Композиция, включающая
бактериальную культуру, включающую рекомбинантный менингококковый белок 2086 при плотности, равной по меньшей мере приблизительно 1,5 г/л в общем объеме указанной бактериальной культуры.
77. Композиция по п.76, отличающаяся тем, что указанный рекомбинантный менингококковый белок 2086 представляет собой липидированный белок.
78. Композиция по п.76, отличающаяся тем, что указанный рекомбинантный менингококковый белок 2086 представляет собой нелипидированный белок.
79. Композиция по п.76, отличающаяся тем, что указанный рекомбинантный менингококковый белок 2086 представляет собой белок 2086 подсемейства А.
80. Композиция по п.76, отличающаяся тем, что указанный рекомбинантный белок представляет собой белок 2086 подсемейства В.
81. Композиция по п.80, отличающаяся тем, что указанная культура включает второй рекомбинантный менингококковый белок 2086.
82. Композиция по п.81, отличающаяся тем, что указанный второй рекомбинантный менингококковый белок 2086 представляет собой белок 2086 подсемейства А.
83. Композиция по п.76, отличающаяся тем, что плотность указанного рекомбинантного менингококкового белка 2086 равна по меньшей мере приблизительно 1,7 г/л в общем объеме указанной бактериальной культуры.
84. Композиция по п.76, отличающаяся тем, что плотность указанного рекомбинантного менингококкового белка 2086 равна по меньшей мере приблизительно 2,0 г/л в общем объеме указанной бактериальной культуры.
85. Композиция по п.76, отличающаяся тем, что указанного рекомбинантного менингококкового белка 2086 равна по меньшей мере приблизительно 3,0 г/л в общем объеме указанной бактериальной культуры.
86. Композиция, включающая бактериальную культуру, включающую рекомбинантный менингококковый белок 2086, полученный согласно способам по любому из пп.1-75.