Электронно-микроскопическое изучение дифференцировки опухолевых клеток толстой кишки линии lim 1863 при развитии множественной лекарственной устойчивости

Усиление цитотоксичности JIAK-клеток и МНК в ходе I, а в случае МНК II и III курсов АИТ может быть связано с увеличением в крови больных предшественников цитотоксических Т-лимфоцитов и ЛАК-клеток за счет введения аутологичных ЛАК-клеток и рИЛ-2. Этим можно объяснить частичную (до 50%) регрессию опухоли у больного № 2 после первых двух циклов лечения, вследствие чего стало возможным ее полное оперативное удаление [21 ].

Снижение цитотоксичности ЛАК-клеток и МНК, наблюдаемое у некоторых больных в ходе I, II, III и IV курсов АИТ, а также увеличение числа таких случаев к концу лечения может быть связано со способностью "старых" ЛАК-клеток убивать вновь введенные ЛАК-клетки [8 ] либо с активацией супрессорных клеток. Ранее нами [7] было показано, что супрессоры, присутствующие в периферической крови человека, препятствуют образованию ЛАК-клеток пожилых доноров.

Электронно-микроскопическое исследование ЛАК-клеток на стадии контакта с опухолевой КМ выявило признаки, свидетельствующие о секреторном механизме взаимодействия. В цитоплазме ЛАК-клеток были обнаружены многочисленные секреторные гранулы, аппарат Гольджи, а также отмечена характерная реориентация органелл, описанная нами ранее для цитотоксических Т-лимфоцитов [2—6 ]. Одной из особенностей изученных ЛАК-клеток являлось наличие уро-под у части некоторых клеток. Преобладание лимфоцитов с уроподами в популяции ЛАК-клеток (до 80%) было описано ранее P.A. Paciucci и соавт. [16 ], наблюдавших эти морфологические изменения в периферической крови онкологических больных после АИТ.

Полученные нами данные согласуются с результатами ультраструктурного исследования конъюгатов ЛАК-клеток с опухолевыми клетками глиомы человека SNB-92, проведенного G.R. Hooku с соавт. По мнению этих авторов, лизис опухолевых КМ связан с локальным экзоцитозом везикул эффекторных лимфоцитов в зону контакта с опухолевой клеткой и является сходным с механизмом лизиса цитотоксических Т-лимфоцитов и естественных киллерных клеток [11].

© Коллектив авторов, 1993 УДК 616-018-006.04-076.4-085.015

Н.Т. Райхлин, Ю.Л. Володина, А. Г. Перевощиков,

Б.П. Копнин

ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ТОЛСТОЙ КИШКИ ЛИНИИ LIM 1863 ПРИ РАЗВИТИИ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ

НИИ клинической онкологии, НИИ канцерогенеза

Одно из наиболее перспективных направлений в изучении резистентности опухолей человека к химиотерапии связано с открытием так называемой множественной лекарственной устойчивости — МЛУ (англ.

— Multidrug Resistance — MDR), обусловливаемой повышением функции Р-гликопротеина (Р170). Кодиру-

7. Bykovskaya S.N., Abronina I.F., Kupriyanova T.A. II Ibid. — Vol. 44. — P. 333.

8. Callacher G., Findlay J., Al-Azzawi F.A. // Immunology. — 1989. — Vol. 66 — P. 471.

9. Grimm E.A., Mazumder A., Chang H.L. et al. // J. exp. Med.

— 1982. — Vol. 155. — P. 1823.

10. Grimm E.A., Rosenberg S.A // Limphokines. Ed. E. Pick. — New York, 1984 — P. 279.

11. Hook G.R., Greenwood M.A., Barba D. et al. // J. nat. Cancer Inst. — 1988. — Vol. 80. — P. 171.

12. Iton K., Tilten B., Kumagai C. et al. // J. Immunol. — 1985. — Vol. 134. — P.802.

13. Mitchel M.S., Kempf R.A., Harel W. et al. III. clin. Oncol. —

1988. — Vol. 6 — P. 402.

14. Muul L.M., Nasoti-Burchenal K., Carter C.S. et al. // J. Immunol. Methods. — 1987. — Vol. 101. — P. 171.

15. Ortaldo J.O., Mason A., Overton К. I/ J. exp. Med. — 1986. — Vol. 264. — P. 1193.

16. Paciucci P.A., Holland J.E., Glidwell O. et al // J. clin. Oncol.

— 1989. — Vol. 7. — P. 869.

17. Ramsdell F.J., Lindemann R.A., Shau H. et al. II Cell. Immunol.

— 1988. — Vol. 116. — P. 287.

18. Rosenstein M., Yron I., Kaufman Y. et al. // Cancer Res. — 1984. — Vol. 44. — P. 1946.

19. Rosenberg S./I., Lotze M.T., Muul L.M. et al. // New Engl. J. Med. — 1987. — Vol. 316. — P. 889.

20. Rosenberg S.A., Lotze M.T., Yang J.C. et al. // Immunol. Today.

— 1990. — № 11. — P. 113.

21. Trapeznikov N.N., Yavorsky V.V., SyrkinA.B. et al. II All Union Cancer Res. Center Transaction Collection. — 1990. — № 1. — P. 31.

22. Urba W.J., Clark J.W., Steis R.G. et al II J. nat. Cancer Inst. —

1989. — Vol. 81. — P. 602.

23. Wang I., Wall A., Gordon B. et al. // Amer. J. Med. — 1987. — Vol. 83. — P. 1016.

24. Yu A., Watts H., Jaffe N. et al. // New Engl. J. Med. — 1977.

— Vol. 297. — P. 121.

Поступила 30.01.92 / Submitted 30.01.92

N.T. Raikhlin, J.L. Volodina, A.G. Perevoschikov,

B.P. Kopnin

ELECTRON MICROSCOPIC STUDY OF DIFFERENTIATION OF HUMAN COLONIC CARCINOMA LIM 1863 DURING DEVELOPMENT OF MULTIDRUG RESISTANCE

Research Institute of Clinical Oncology, Research Institute of Carcinogenesis

A most promising field of research of human tumor resistance to chemotherapy is associated with discovery of multidrug resistance (MDR) caused by enchanced functioning of P-glycoprotein (PI70). The membrane protein PI70 coded by the mdrl gene acts like an energy-dependent pump that throws off from cells a wide

емый геном mdrl мембранный белок Р170 работает как энергозависимый насос, откачивающий из клеток широкий спектр неродственных липофильных соединений, в том числе и рад противоопухолевых препаратов. Таким образом, клетки, в которых гиперпродуци-руется Р170, приобретают перекрестную устойчивость сразу к нескольким группам цитостатических агентов: антрациклинам (адриамицин, даунорубицин и др.), винка-алкалоидам (винкристин, винбластин), эпифил-лотоксинам (подофиллотоксин, тенипозид и др.), антибиотикам (актиномицин D и др.) и т.д. Подробные сведения о механизмах возникновения МЛУ и функционировании Р170 приведены в работах [9, 15, 19— 22, 30]. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы при изучении механизмов МЛУ, до сих пор малоизученным является вопрос о связи между приобретением МЛУ и уменьшением выраженности признаков трансформированного фенотипа и/или изменением степени дифференцировки клеток. Еще в середине 70-х годов группой Biedler было обнаружено, что трансформированные клетки китайского хомяка при развитии устойчивости к актиномицину D теряли способность формировать опухоли после прививки сингенным животным [13 ]. "Нормализация" фенотипа опухолевых клеток по этому и ряду тестов in vitro отмечена при развитии МЛУ и в других клеточных линиях [1, 3, 4, 27 и др. ]. Реверсию трансформированного фенотипа можно было объяснить образованием в процессе развития МЛУ более зрелых и более дифференцированных клеток. Действительно, есть данные [2, 4, 8, 10, 12, 29 и др.], косвенно указывающие на связь МЛУ с дифференцировкой опухолевых клеток. Однако характер этой связи и молекулярные механизмы, лежащие в основе данного фенотипа, остаются неясными. Более того, в ряде клеточных линий с МЛУ не обнаружено каких-либо изменений диффе-ренцировочного статуса по сравнению с исходными клеточными популяциями [10—12]. Для детального исследования взаимоотношений между МЛУ и дифференцировкой опухолевых клеток толстой кишки мы решили получить на основе уникальной клеточной линии рака толстой кишки человека LIM 1863, растущей in vitro в виде суспензии морфологически упорядоченных органоидов, клетки с типичной МЛУ и провести сравнительное электронно-микроскопическое изучение исходных и резистентных сублиний.

Материал и методы. Клетки. Линия LIM 1863 получена при культивировании in vitro ткани низкодифференцированного рака илеоцекального угла толстой кишки, удаленного у женщины 74 лет [34]. Несколько десятков или сотен клеток этой линии образуют шаровидные скопления (органоиды), которые иногда, группируясь, строят более крупные агрегаты. Клетки данной линии сохранили способность к дифференцировке в направлении бокаловидных клеток (бокаловидных энтероцитов) и клеток со щеточной каемкой (цилиндрических энтероцитов) |34]. Клетки LIM 1863, любезно предоставленные д-ром Whitehead (Институт Людвига, Мельбурнское отделение, Австралия), культивировали в среде RPMI-1640 с 5% телячьей эмбриональной сыворотки и 100 ЕД/мл мономицина.

Иммунофлюоресцентный анализ экспрессии Р170 проводили с помощью двух мышиных моноклональных антител, специфически реагирующих с Р-гликопротеином, — С219 (фирма "Centocor Inc.", США ) и UIC2 (любезно предоставлены д-ром Roiiinson, Иллиной-ский университет, Чикаго, США). Органоиды осаждали центрифугированием, заключали в желатиновые блоки и замораживали в жидком азоте. Срезы толщиной 10 мкм, приготовленные из этих

range of alien lipophilic compounds including antitumor agents. Therefore cells with hyperexpression of PI70 acquire cross resistance to several groups of cytostatics, such as anthracyclines (adriamycin, dauno-rubicin, etc.), vinca-alkaloids (vincristine, vinblastine), epiphyllotoxins (podophyllotoxin, teniposide, etc.), antibiotics (actinomycin D, etc.) and others. MDR establishment and PI70 functioning are described in a greater detail in [9, 15, 19 — 22, 30]. In spite of considerable progress in study of MDR mechanisms the problem of relation of MDR acquisition and decrease in expressiton of traits of transtormed phenotype and/or change in cell differentiation degree is unsolved yet. In the mid seventies Biedler’s group discovered that after implantation to syngeneic animals of transformed cells of Chinese hamsters lost their ability to generate tumors when acquiring resistance to actinomycin D [13]. The tumor cell phenotype "normalization" is also detected by this and a number of in vitro tests during MDR development in other cell lines [1, 3, 4, 27 and others ]. The transformed phenotype reversion may be due to generation of more mature and more differentiated cells during MDR development. Indeed, there are data [2, 4, 8, 10, 12, 29 and others] that give an indirect evidence of MDR relation with tumor cell differentiation. However, the nature of this relation and the molecular mechanisms in the basis of this phenotype remain unknown. More over, several cell lines with MDR do not show any changes in their differentiation statuses as compared with parental cell populations [10 — 12]. To study the relation between MDR and colonic tumor cell differentation we used cells with typical MDR cultured from a unique human colonic cancer cell line LIM 1863 growing in vitro as suspension of organoids with regular morphology. Then we compared the parental and resistant sublines by electron microscopy.

Materials and Methods. Cells. The LIM 1863 line was obtained by in vitro culture of poorly differentiated cancer tissue of ileocecal colonic flexure taken from a 74-year old woman [34]. Several tens or hundreds of line cells looked as spheroid clusters (organoids) that sometimes joined into greater aggregates. Cells of this line preserved ability to differentiation towards goblet cells and brush-border enterocytes (cylindrical enterocytes) [34]. The LIM 1863 cells kindly supplied by Dr Whitehead (Ludwig Institute, Melbourn Tumor Biology Branch, Australia) were cultured in RPMI-1640 with 5% calf fetal serum and 100 U/ml monomycin.

Immunofluorescence of PI 70 expression was studied with two murine monoclonal antibodies reacting specifically with P-glycoprotein, C219 ("Centocor Inc.", USA) and UIC2 (kindly supplied by Dr Roninson, Illinois University, Chicago, USA). The organoids were precipitated by centrifugation, embedded in gelatin blocks and frozen in liquid nitrogen. Sections 100 fim thick made of these blocks using a Leitz 1720 cryostat were fixed with acetone (C219) or 10% formaline (UIC2), washed in phosphate buffer to be incubated with C219 or UIC2. The antibodies were visualized with TRITC-labeled rabbit antibody to murine immunoglobulins ("Sigma”, USA). All the sections were incubated for 30 min at room temperature and studied using an Opton III (FRG) fluorescence photomicroscope.

Histology and Electron Microscopy. The organoids suspended in the mediun were centrifuged, the precipitate was fixed in 2% glutaraldehyde in phosphate buffer and post-fixed in 1 % osmium tetroxide in phosphate buffer, dehydrated, and embedded in Epon 812. Semithin and ultrathin sections were made using an LKB III (Sweeden) ultramicrotome to be examined and photographed by a JEM-1200EX-II (Japan) electron microscope. The semithin sections

блоков на криостате "Leitz 1720", фиксировали ацетоном (в случае С219) или 10% формалином (для UIC2), отмывали в фосфатном буфере и инкубировали с С219 или UIC2. Эти антитела визуализировали с помощью меченных TRJTC кроличьих антител к мышиным иммуноглобулинам ("Sigma", США). Инкубацию со всеми антителами проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. Срезы анализировали на флюоресцентном фотомикроскопе "Opton III" (ФРГ).

Гистологическое и электронно-микроскопическое исследование. Взвешенные в среде органоиды центрифугировали, осадок фиксировали глутаральдегидом, затем четырехокисью осмия и обычныя способом заливали в эпон-812. Полутонкие и ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме LKB III (Швеция), просматривали и фотографировали в электронном микроскопе JEM-I200EX-II (Япония). Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим. Часть материала заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Полутонкие и парафиновые срезы просматривали и фотографировали на микроскопе "Polyvar" (Австрия). Анализ электронно-микроскопических особенностей клеточных линий проводили на основании ультраструктурной классификации опухолевых клеток [5—7]. В соответствии с этой классификацией в опухолях различают: а) 2 группы клеток (первая группа — дифференцированные опухолевые клетки с определенными ультраструктурными органо-, ткане- и/или цитоспецифическими признаками, вторая — недифференцированные клетки без этих признаков); б) различные типы дифференцированных клеток в зависимости от их цитоспецифиче-ских особенностей. Для количественной оценки в 2 сетках с каждого из 5 блоков исходной линии LIM 1863 и резистентных сублиний LIM 1863/2-0,025 и 1863/3-0,015 подсчитывали в электронном микроскопе 100 клеток (в сумме 500 клеток в каждой серии, всего 1500 клеток) и определяли в процентах соотношение: дифференцированных и недифференцированных элементов (т.е. клеток первой и второй групп), клеток с различным направлением дифференци-ровки (т.е. типы дифференцированных клеток — цилиндрические энтероциты и бокаловидные клетки). Количество железистых просветов подсчитывали в световом микроскопе в 2 полутонких срезах одинаковой площади с тех же 5 блоков исходной линии и опытных сублиний (всего в 30 полутонких срезах).

Результаты исследования. Получение сублиний LIM 1863 с МЛУ. В результате независимых селекций в среде с возрастающими концентрациями актиномицина D были получены 2 сублинии: 1863/2-0,025 и 1863/3-0,015 (рис. 1). На каждом этапе селекции использовали дозы препарата, вызывающие гибель около 90% органоидов. Окончательные селективные дозы актиномицина D составили для этих сублиний соответственно 0,025 и 0,015 мкг/мл. При этих концентрациях цитостатика в исходной популяции L1M 1863 наблюдается 100% гибель клеток в течение 1,5—2 нед. Устойчивость к актиномицину D во всех исследованных к настоящему времени случаях связана

ИСХОДНАЯ КУЛЬТУРА

0,004 мгк/мл, 8 нед

I

0,007 мкг/мл, 5 нед \

0,01 мкг/мл, 8 нед

0,015 мкг/мл, 4 нед \

0,025 мкг/мл, 8 нед 1863/2 - 0,025

0,0035 мкг/мл, 5 нед

I

0,007 мкг/мл, 8 нед

I

0,01 мкг/мл, 8 нед 1

0,015 мкг/мл, 5 нед 1863/3 - 0,015

Рис. 1. Селекции клеток, устойчивых к актиномицину D.

were stained with toluidin blue. A part of the sections were embedded in paraffin and stained with hematoxylin and eosin. The semithin and paraffin sections were studied and photographed using a "Polyvar" (Austria) microscope. The study of electron microscopic peculiarities of the cell lines was performed with respect to ultrastructural tumor cell classification (5 — 7]. The classification suggests that tumor cells should be startified into a) 2 cell groups (the first group consists of differentiated tumor cells with certain ultrastructural organ-, tissue-and/or cytospecific features, the second group combines undifferentiated cells without these features); b) various types of differentiated cells respective of their cytospecific features. To make quantitative assessment 100 cells were counted by electron microscopy in 2 grids from each of 5 blocks of the parental line LIM 1863 and the resistant sublines LIM 1863/2-0.025 and 1863/3-0.015 (to make 500 cells in each series and a total of 1500 cells). Then percentage of differentiated and undifferentiated elements (i.e. cells of the first and second groups), cells with different trends of differentiation (i.e. differentiated cell types of cylindrical enterocytes and goblet cells) was calculated. The number of glandular spaces was counted by light microscopy in 2 semithin sections of equal area from the same 5 blocks of the parental line and experimental sublines (to make a total of 30 semithin sections).

Results. LIM 1863 Sublines with MDR. Two sublines 1863/2-0.025 and 1863/3-0.015 were cultured as a result of independent selection in medium with escalated actinomycin D concentration (fig. 1). Drug doses inducing death of about 90% of organoids were used at each selection stage. The final actinomycin D selective doses for these sublines were 0.025 and 0.015 jug/ml, respectively. The drug at these concentrations caused death of 100% of the parental population within 1.5 — 2 weeks. Resistance to actinomycin D in all cases studied by now is due to amplification and hyperexpression of the mdrl gene [14, 25, 26, 28, 33]. Increased production of protein PI70 coded by this gene was also observed in the isolated sublines in our experiments. The resistant cultures in contrast to the parental lines showed specific fluorescence with both monoclonal antibodies (C219 and UIC2) to PI70 (fig. 2, a). Thus, our sublines 1863/2-0.025 and 1863/3-0.015 exhibited typical MDR.

Histology. The parental LIM 1863 cells made in organoids 2 — 3 clear spaces looking like small glandular spaces of round or irregular shape that could be seen in semithin sections (fig. 2, b). The cells that directly formed the glandular spaces were usually of cy-

PARENTAL CULTURE

0,004 /¿g/ml, 8 weeks

I

0,007 ¿¿g/ml, 5 weeks \

0,01 8 weeks

I

0,015 /<g/ml, 4 weeks

I

0,025/¿g/ml, 8 weeks 1863/2 - 0,025

0,0035 yug/ml, 5 weeks 1

0,007 ,ug/ml, 8 weeks 1

0,01 |ig/ml, 8 weeks

I

0,015 /¿g/ml, 5 weeks 1863/3 - 0,015

Fig. 1. Selection of actinomycin D-resistant cells.

Рис. 2. Экспрессия P170 и изменения морфологии в сублиниях LIM 1863, обладающих МЛ У.

а — иммунофлюоресценция в органоидах 1863/2-0,025 после инкубации с антителами LIM 1863. Наибольшее свечение, т.е. экспрессия Р170, наблюдается в клетках, окружающих просветы, х 400; b — полутонкий срез органоидов LIM 1863. Окраска толуидиновым синим, х 250. Видны мелкие единичные железистые полости округлой или неправильной формы, вокруг которых размещаются клетки в виде сплошных полей; с — полутонкий срез органоидов 1863/2-0,025. Окраска толуидиновым синим, х 250. Органоиды более крупные, количество железистых просветов и их размеры увеличены.

Fig. 2. Expression of Р170 and morphologic changes in sublines LIM 1863 with MDR.

a, immunoflurescence In organoids 1863/2-0.025 after incubation with antibody UIC2. The most intense fluorescence i.e. expression of P170, is observed in cells surrounding spaces. x400; b, semithin section of organoids LIM 1863. Toluidln blue staining. x250. There are scarce small glandular spaces of round and irregular shape surrounded by compact cell fields; c, semithin section of organoids 1863/2-0.025. Toluidln blue staining. x250. The organoids are larger, the glandular spaces are greater in size and number.

с амплификацией и гиперэкспрессией гена mdrl [14,

25, 26, 28, 33]. Повышенная продукция кодируемого этим геном белка Р170 наблюдается и в выделенных нами сублиниях: в резистентных культурах в отличие от родительской линии при использовании обоих типов моноклональных антител к Р170 (С219 и UIC2) выявлялось специфическое свечение (рис. 2, а). Таким образом, полученные нами сублинии 1863/2-0,025 и 1863/3-0,015 обладают типичной МЛУ.

Гистология. Исходные клетки LIM 1863 формируют в органоиде видимые на полутонком срезе 2—3 просвета в виде железистых структур небольшого размера, округлой или неправильной формы (рис. 2, А). Клетки, непосредственно формирующие железистый просвет, обычно цилиндрической формы, изредка в этих местах встречаются бокаловидные клетки. Основная масса клеток, лежащих по периферии просветов или образующих сплошные поля, неправильной формы, иногда с короткими тонкими отростками. Отдель-

lindrical shape, though goblet cells could also be encountered. Most cells surrounding the spaces or forming compact areas had irregular shape, sometimes with short thin processes. Some cells or cells groups were in the state of necrosis. Both resistant sublines presented larger organoids. The number of glandular spaces in semithin sections reached 6 — 10, the spaces were also larger and had irregular outline (fig. 1, c). The cells surrounding the glandular spaces were cylindrical more ofter than in the parental line, there were goblet cells too. Most cells had polymorphous histology. There were necrotic areas in some sections. Desquamated dying cell elements were observed in some of the glandular spaces.

Electron Microscopy. Both the parental LIM 1863 line and resistant 1863/2-0.025 and 1863/3-0.015 sublines contained cells of the first and second groups. The first group cells were mainly cylindrical and goblet-like.

ные клетки или группы клеток в состоянии некроза. В обеих резистентных сублиниях органоиды более крупные. Количество железистых просветов в полутонком срезе достигает 6—10, размеры просветов также увеличиваются, часто они неправильных очертаний (рис. 2, с). Клетки, окружающие железистый просвет, цилиндрической формы, чаще, чем в родительской линии, встречаются бокаловидные клетки. Основная масса клеток имеет гистологически полиморфный вид. Местами встречаются участки некроза. В некоторых просветах видны слущенные погибающие клеточные элементы.

Электронная микроскопия. В исходной линии LIM 1863 и резистентных сублиниях 1863/2-0,025 и 1863/3-0,015 встречались клетки как первой, так и второй группы. Из клеток первой группы присутствовали клетки типа цилиндрических и бокаловидных.

Исходная линия LIM 1863. Большинство клеток (88%) недифференцированные, т. е. принадлежат ко второй группе (рис. 3, а). Они неправильной формы, иногда вытянутые, плазматическая мембрана образует множественные тонкие извитые, иногда длинные отростки. Между этими клетками специализированные контакты практически не встречаются. Цитоплазма клеток второй группы обычно электронно-плотная, содержит в основном рибосомы. Митохондрии, лизосо-мы, структуры шероховатого эндоплазматического ре-тикулума развиты плохо. Недифференцированные клетки располагаются сплошными полями по периферии железистых просветов. Железистые просветы обычно небольших размеров, их немного. Они, как правило, образованы клетками первой группы, общее количество которых составляет 12 %, но со слабовыра-женными ультраструктурными признаками специфической дифференцировки. Обычно это клетки типа цилиндрических энтероцитов (92% из числа клеток первой группы), на апикальной поверхности которых видны отдельные ворсинки различной длины (рис. 3, Ъ, с). Эти клетки образуют специализированные контакты. Их цитоплазма содержит рибосомы, митохондрии, лизосомы, шероховатый эндоплазмати-ческий ретикулум. Более высокую степень дифференцировки имеют лишь единичные клетки, образующие железистый просвет. Иногда встречаются клетки типа бокаловидных (8% из числа клеток первой группы).

Сублинии 1863/2-0,025 и 1863/3-0,015. Клетки первой группы, т. е. дифференцированные, обладающие ультраструктурными органо-, ткане- и/или цитоспе-цифическими признаками, встречаются по сравнению с исходной линией LIM 1863 в значительно большем количестве (28%) и степень их дифференцировки выше (рис. 4). Следует отметить, что в сублинии 1863/2-0,025, резистентной к 0,025 мкг/мл актиномицина D, эти изменения носят более выраженный характер, чем в клетках 1863/3-0,015, обладающих меньшим уровнем лекарственной устойчивости (резистентны к

0,015 мкг/мл актиномицина D). Более дифференцированные клетки сосредоточены в основном вокруг железистых просветов. Просветы крупные, встречаются часто. Выстилающие их клетки преимущественно типа цилиндрических энтероцитов (89% из числа клеток первой группы). Плазматическая мембрана содержит многочисленные ворсинки, они хорошо сформированы,

Parental Line LIM 1863. Most cells (88%) were undifferentiated, i.e. belonged to the second group (fig. 3, a). They had irregular shape, sometimes oblong, the plasmatic membranes had numerous thin, winding, sometimes long processes. There were practically no specialized contacts between these cells. The cytoplasm of cells from the second group was usually electron-dense, mainly contained ribosomes. The mitochondria, lysosmes, rough endoplasmatic reticulum structures were poorly-developed. The differentiated cells joined into compact fields around the glandular spaces. The glandular spaces were usually small in size and number. They were mainly formed by cells belonging to the first group (12%) though with poorly marked ultrastructural traits of specific differentiation. The cells were usually cylindrical enterocytes (92% of the first group cells) with scarce villi of different lenght on the apical surfaces (fig. 3, b, c). The cells had specific contacts. Their cytoplasms contained ribosomes, mitochondria, lysosomes, rough endoplasmatic reticulum. There were just a few cells with high differentiation that formed glandular spaces. There were also a few goblet cells (8 % of cells of the first group).

Sublines 1863/2-0.025 and 1863/3-0.015. Cells of the first group, i.e. differentiated cells with ultrastructural organ-, tissue- and/or cytospecific features were encountered much more often (28%) than cells of the parental line LIM 1863 and showed higher differentiation (fig. 4, a — c). It should be noted that these changes were more pronounced in the subline 1863/2-

0.025 resistant to 0.025 ^g/ml of actinomycin D as compared to the cells 1863/3-0/015 with lower drug resistance (resistant to 0.015 /¿g/ml of actinomycin D). The cells with higher differentiation were mainly focused around the glandular spaces. The spaces were large in size and number. They were mainly lined with cylindrical enterocytes (89% of the first group cells). The plasmatic membranes contained numerous wellshaped microvilli located of the apical surfaces. The microvilli often formed brush borlers (see fig. 4, b).There were frequent terminal rootlets in the cytoplasm that branched off from microvillus bases and penetrated into the cells (see fig. 3, c). Goblet cells were less frequent than cylindrical enterocytes (11% of the first group cells). Besides ribosomes, mitochondria, elements of rough endoplasmatic reticulum, the cells contained vacuoles and vesicules surrounded by double membranes. Most of them were observed near plasmatic membranes. There were specialized contacts between the cells. Undifferentiated cells (72% of cells of the first and second groups) looked like compact fields surrounding differentiated cells, they were polymorphous and had numerous thin cytoplasmatic processes. Ribosomes predominated in their cytoplasm. Mitochondria and other organelles were less frequent. There were many vesicules surrounded by double membranes and vacuoles of different size. As a whole the undifferentiated cells had electron- dense matrices.

Discussion. As a result of multistage selection in meduim with escalated concentration of actinomycin D 2 sublines with typical MDR associated with hyperproduction of P-glycoprotein PI70 were cultured from a

Рис. 3. Электронограммы клеток LIM 1863.

а — недифференцированные клетки без специфических ультраструктурных признаков. Видны тонкие цитоплазматические отростки, единичные десмосомы. Ядра крупные. В цитоплазме обилие рибосом, х 5000; b — клетки типа цилиндрических энтероцитов со слабо-выраженными признаками дифференцировки (небольшое количество ворсинок на апикальной поверхности) образуют железистый просвет. Между клетками видны различного типа специализированные контакты, х 10 ООО; с — слабо дифференцированные клетки типа цилиндрических энтероцитов с отдельными группами ворсинок на апикальной поверхности, х 15 ООО.

Fig. 3. Electronogram of cells LIM 1863.

a, undifferentiated cells without specific ultrastructural features. There are thin cytoplasmatic processes, single desmosomes. The nuclei are large. There are numerous ribosomes in the cytoplasm. x5000; b, cylindrical enetrocytes with poor differentiation features (there are a few microvilli on the apical surfaces) form a glandular space. There are various specialized contacts between the cells. x10 000; c, poorly differentiated cells of the cylindrical enterocyte type with scarce groups of microvilli on the apical surfaces. x15 000.

располагаются на апикальной поверхности. Нередко ворсинки образуют щеточную каемку (рис. 4, Ь), часто в цитоплазме видны терминальные корешки, отходящие от оснований ворсинок и проникающие вглубь клетки (рис. 4, с). Клетки типа бокаловидных обнаруживаются реже, чем цилиндрические энтероциты (11% из числа клеток первой группы). В клетках, кроме рибосом, митохондрий, элементов шероховатого эндоплазматического ретикулума, встречаются вакуоли и везикулы, окруженные двойной мембраной. Большинство из них расположено вблизи плазматической мембраны. Между клетками развиты специализированные контакты. Недифференцированные клетки (их количество составляет 72% от числа всех клеток первой и второй групп) располагаются в виде сплошных полей по периферии вокруг дифференцированных, имеют полиморфный вид, множественные тонкие цитоплазматические отростки. В их цитоплазме присутствуют главным образом рибосомы. Митохондрии и другие органеллы встречаются редко. Часто видны везикулы, окруженные двойной мембраной и вакуоли различного размера. В целом недифференцированные клетки имеют электронно-плотный матрикс.

Обсуждение. Путем многоступенчатого отбора в среде с повышающимися концентрациями актиноми-цина D из опухолевых клеток рака толстой кишки человека линии LIM 1863, растущих in vitro в виде морфологически упорядоченных шаровидных органоидов и сохранивших определенные потенции к специфической дифференцировке, получено 2 сублинии с типичной МЛУ, обусловленной гиперпродукцией Р-глико-протеина Р170. При сравнительном электронно-мик-роскопическом исследовании популяций исходных клеток и выделенных резистентных культур обнаружено, что развитие МЛУ сопровождается увеличением степени дифференцировки опухолевых клеток: в устойчивых сублиниях повышается как доля дифференцированных клеток (с 12 до 28%), так и степень их ультраструктурной зрелости. Увеличиваются также количество (в 3 раза) и размеры железистых полостей, образуемых этими клетками. В нормальной слизистой оболочке толстой кишки, кроме базальных недифференцированных, присутствуют 2 основных типа дифференцированных клеток — цилиндрические (каемчатые) энтероциты и бокаловидные клетки (энтероциты). Для цилиндрических энтероцитов ультраструк-турным ткане- и цитоспецифическим признаком является развитие на апикальной поверхности множества ворсинок, часто образующих щеточную каемку. Органоспецифическим ультраструктурным признаком этих клеток, свидетельствующим об их высокой степени специфической дифференцировки, являются терминальные корешки. Для бокаловидных клеток специфическим ультраструктурным признаком является присутствие в цитоплазме крупных секреторных слизистых гранул. Именно эти 2 типа клеток с ультраструк-турными признаками высокой степени дифференцировки встречаются в резистентных сублиниях значительно чаще, чем в исходной линии LIM 1863, составляя соответственно 28 и 12% от всей популяции. Наиболее простым объяснением связи между развитием МЛУ и дифференцировкой клеток является то, что экспрессия Р170 входит в нормальный дифференциро-

human colonic cancer cell line LIM 1863 growing in vitro as spheroid organoids of regular morphology and certain ability of specific differentiation. Electron microscopic comparison of populations of the parental and isolated resistant cells discovered that development of MDR was accompanied with increase in tumor cell differentiation, i.e. the resistant sublines showed both increased fracture of differentiated cells (from 12 to 28%) and higher ultrastructeral maturity. There was also increase in the number (threefold) and size of glandular spaces formed by these cells. Besides basal undifferentiated cells, normal colonic mucosa contains 2 main types of differentiated cells, namely cylindrical brush-border enterocytes and goblet cells. The presence on apical surfaces of numerous microvilli that often form a brush border is an ultrastructural tissue-and cytospecific feature of cylindrical enterocytes, while terminal rootlets are their organ-specific ultra-structural trait that is evidence of high degree of their specific differentiation. The presence in cytoplasm of large secretory mucous granules is a specific ultrastructural characteristic of goblet cells. These 2 cell types with ultrastructural features of high differentiation were encountered much more often in the resistant sublines than in the parental line LIM 1863 to make 28 and 12% of the whole population, respectively. The simplest explanation of the relation of MDR establishment and cell differentiation is that expression of PI70 is a normal differentiation function of some cells, and the population is enriched with prior higher differentiated variants during selection for MDR, i.e. for hyperproduction of PI70. This supposition is supported by production of PI70 in normal tissues of many organs, such as kidneys, liver, adrenals, large and small intestines, pancreatic ducts, capillary endothelium in sites of the blood-brain barrier and testes, placenta, etc. The level of PI70 seems to be the highest in cells with excretory function [17, 18, 23, 24]. Therefore we think it interesting to find out whether differentiation of colonic tumor cells induced in vitro by phorbolic ester or calmidosaline 132] is accompanied with increased expression of PI70. There is still another interpretation of the phenomenon: selection for MDR results in survival of cells that are more sensitive to factors inducing differentiation rather than in survival of preexisting variants with higher differentiation. This situation is particularly described in development of resitance to vincristine in murine erythroleukemia induced by Friend’s virus, i.e. transcription of globin genes and discontinuation of proliferation induced by hexamethylene bisacetamide in resistant cells occur without a latent period while in parental lines these effects are observed at a 8 — 12 h interval and increase at a lower rate [29, 31 ]. However, it should be noted that in this system the increased sensitivity to differentiation induction is not accompanied with hyperexpression of the gene mdrl and protein PI70 [31 ]. Finally, it is possible that the hyperproduction of PI70 and/or proteins, coded by mdrl neighbour genes (so called MDR-domain genes) usually co-amplified with it during MDR establishment [14, 33], itself determines differentiation of some cell types including cells of intestinal epithelium.

Рис. 4. Электронограммы клеток 1863/2-0,025.

а — высокодифференцированные клетки типа цилиндрических энтероцитов образуют железистый просвет. На апикальной поверхности видно большое количество ворсинок с терминальными корешками, уходящими в цитоплазму, х 5000; b — высокодифференцированная клетка типа цилиндрического энтероцита с хорошо развитыми ворсинками и терминальными корешками, х 20 000; с — высокодифференцированные клетки типа цилиндрических энтероцитов со щеточной каемкой на апикальной поверхности, х 20 000.

Fig. 4. Electromograms of cells 1863/2-0.025.

a, highly differentiated cells of the cylindrical enterocyte type form a glandular space. There are more microvilli with terminal rootlets penetrating into cytoplasms on the apical surfaces. x5000; b, a highly differentiated cell of the cylindrical enterocyte type with well-developed microvilli and rootlets, x 20 000; c, highly differentiated cells of the cylindrical enterocyte type with a brush border on the apical surfaces, x 20 000.

вочный репертуар некоторых клеток, и при селекции на МЛУ, т.е. на гиперпродукцию Р170, в популяции происходит обогащение предсуществующими более дифференцированными вариантами. Такое предположение базируется на обнаружении продукции Р170 в нормальных тканях многих органов: почках, печени, надпочечниках, толстой и тонкой кишках, протоках поджелудочной железы, эндотелии капилляров в сайтах гематоэнцефалического барьера и яичка, плаценте и т. д., причем создается впечатление об особенно высоком его содержании в клетках, специализированных на экскреторной функции [17, 18, 23, 24]. В связи с этим нам представляется важным определить, будет ли сопровождаться дифференцировка опухолевых клеток толстой кишки, индуцированная in vitro форболо-выми эфирами или калмидозалином [32], повышением экспрессии Р170. Существует и другая возможность

— при селекции на МЛУ отбираются не предсуществу-ющие более дифференцированные варианты, а клетки, которые оказываются более чувствительными к факторам, индуцирующим дифференцировку. Такая ситуация описана, в частности, при возникновении резистентности к винкристину в мышиных эритролейкозах, вызванных вирусом Френд: в устойчивых клетках индуцируемые гексаметилен-бисацетамидом транскрипция глобиновых генов и прекращение пролиферации наступают без латентного периода, тогда как в родительских клетках данные эффекты начинают проявляться только через 8—12 ч и нарастают не так стремительно [29, 31]. Следует отметить, однако, что в этой системе повышенная чувствительность к индукции дифференцировки не сопровождается гиперэкспрессией гена mdrl и белка Р170 [31 ]. Наконец, нельзя исключить, что гиперпродукция Р170 и/или белков, кодируемых генами, которые находятся по соседству с mdrl (гены так называемого MDR-домена) и обычно ко-амплифицируются вместе с ним при развитии МЛУ [14, 33], сама детерминирует дифференцировку некоторых типов клеток, в том числе и клеток кишечного эпителия. Дальнейшие эксперименты, направленные как на проверку последнего предположения путем искусственного введения в культивируемые клетки опухолей толстой кишки гена mdrl или других представителей MDR-домена, так и на поиск ядерных белковых факторов, связывающихся с регуляторными элементами mdrl и генов, экспрессия которых изменяется при дифференцировке клеток данного гистогенеза, должны привести к лучшему пониманию молекулярных механизмов процессов созревания клеток кишечного эпителия и их связи с развитием МЛУ.

Выводы

1. На основе культивируемых in vitro опухолевых клеток толстой кишки человека линии LIM 1863 с помощью многоступенчатого отбора в среде с актиноми-цином D получены 2 сублинии — 1863/2-0,025 и 1863/3-0,015, обладающие типичной множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), обусловленной гиперпродукцией Р-гликопротеина (Р170).

2. Развитие МЛУ в линии LIM 1863 сопровождается усилением степени дифференцировки клеток.

Further experiments are needed both to confirm the last supppositon by artificial introduction of mdrl or other MDR-domain genes in colonic tumor culture and to discover nuclear protein factors binding to regulatory elements of mdrl and other genes whose expression changes during differentiation of cells of a given histogenesis. These experiments will lead to better understanding of molecular mechanisms of maturation of intestinal epithelial cells and their relation with MDR development.

Conclusions

1. 2 sublines 1863/2-0.025 and 1863/3-0.015 with typical multidrug resistance (MDR) established due to hyperproduction of P-glycoprotein (PI70) have been obtained from a human colonic tumor cell line LIM 1863 in vitro as a result of multistage selection with ac-tinomycin D.

2. The MDR development in the line LIM 1863 is accompanied with enhancement of cell differentiation.

3. The differentiation enhancement manifests itself as increase in the fraction of differentiated cells in the population (28 vs 12%), higher maturity of the cells and a thereefold rise in the number of glandular spaces formed by these cells.

The study is supported by the Russian Foundation for Fundamental Investigations. Project 93-04-22050.

ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES

1. Абдряиштов P.И., Бершадский А.Д., Какпакова .С. II Экс-пер. онкол. — 1989. — Т. 11. — С. 26—30.

2. Джураева Ф.Х., Ставровская А.А., Стромская Т.П. II Вести. ВОНЦ АМН СССР. — 1991. — Т. 4. — С. 7—12.

3. Какпакова Е.С. II Бюл. экспер. биол. — 1983. — Т. 116, № 7. — С. 89—91.

4. Какпакова Е.С., Массино Ю.С., Малахова Е.М. II Генетика.

— 1981. — Т. 17, № 3. — С. 460—467.

5. Райхлин Н.Т. II Арх. пат. — 1979. — № 11. — С. 3—13.

6. Райхлин Н.Т. II Ультраструктура опухолей человека / Под ред. Н.Т. Райхлина, Г. Давида, К. Лапиша. — М., 1981. — С. 13—20.

7. Райхлин Н.Т., Смирнова Е.А. II Арх. пат. — 1984. — № 8.

— С. 3—12.

8. Ставровская А.А., Стромская Т.П., Чернова О.Б., Джураева Ф.Х. II Молекул, генетика — 1990. — № 5. — С. 3—7.

9. Beck W.T. II Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells / Ed. l.B. Roninson. — New York; London, 1991. — P. 215—227.

10. Beck W.T., Danks M.K II Ibid. — P. 3—55.

11. Beck W.T., Cirtain M.C., Ashmun R.A., Mirro J. II Cancer Res.

— 1986. — Vol. 46. — P. 4571—4575.

12. Benard J., Da Silva J., Teyssier J.-R., Riou G. 11 Int. J. Cancer.

— 1989. — Vol. 43. — P. 471—477.

13. Biedler J.R., Riehm H., Peterson R.H., Spengler B.A. II J. nat. Cancer Inst. — 1975. — Vol. 55. — P. 671—680.

14. Borst P., Van der Bliek A. II Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells / Ed. I.B. Roninson. — New York; London, 1991. — P. 107—115.

15. Bradley G., Juranka P.F., Ling V. II Biochim. biophys. Acta. — 1988. — Vol. 948. — P. 87—128.

16. Chaudhary P.M., Roninson I.B. II Cell. — 1991. — Vol. 66. — P. 85—94.

17. Cordon-Cardo С. II Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells / Ed. I.B. Roninson. — New York; London, 1991. — P. 303—317.

18. Cordon-Cardo C., O’Brien J.P., Casals D. et al. // Proc. nat. Acad. Sci. USA. — 1989. — Vol. 86. — P. 695—698.

19. Croop J.M., Gros P., Housman D.E. II J. Clin. Invest. — 1988.

— Vol. 81. — P. 1303—1309.

20. DietelM. II Path. Res. Pract. — 1991. — Vol. 187. — P. 892— 905.

21. Endicott J.A., Ling V. // Ann. Rev. Biochem. — 1989. — Vol. 58. — P. 137—171.

22. Gottesman M.M., Pastan I. II Trends Pharmacol. Sci. — 1988.

— Vol. 9. — P. 54—58.

3. Усиление дифференцировки выражается в увеличении в популяции доли дифференцированных клеток (с 12 до 28%), степени их зрелости и в 3 раза количества железистых полостей, образуемых этими клетками.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований. Код проекта: 93-04-22050.

Поступила 07.04.92 / Submitted 07.04.92

© М.А. Бульбулян, С.А. Ильичева, 1993 УДК 616-006-02-036.2:613.63/.65

М. А. Бульбулян, С.А. Ильичева

ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОЙ КАНЦЕРОГЕННОЙ ОПАСНОСТИ В ПОЛИГРАФИЧЕСКОЙ

ПРОМЫШЛЕННОСТИ

НИИ канцерогенеза

В нашей стране производится 25% всей мировой печатной продукции. По оценкам специалистов, объем выпускаемой литературы к концу столетия должен возрасти вдвое. Между тем полиграфисты подвергаются воздействию многих потенциально токсических субстанций, некоторые из них являются известными или подозреваемыми канцерогенами человека или животных [32 ]. В связи с этим представляет интерес характеристика ряда химических веществ, применяемых на различных этапах технологического процесса, с точки зрения их канцерогенной опасности.

Серийный выпуск книг, брошюр, журналов и газет является многостадийным процессом, охватывающим формное, печатное и переплетно-брошюровочное производства. Формные процессы включают в себя изготовление печатных форм, в зависимости от типа которых различают 3 основных вида печати: высокую (или типографскую), плоскую (или офсетную) и глубокую печать.

В настоящее время наиболее распространена высокая печать с использованием преимущественно металлической (гартовой) печатной формы. Получение текстовой формы в высокой печати состоит из набора текста наборщиками (ручной набор) или буквоотливными и строкоотливными машинами (монотипами и линотипами). Изготовление букв и строк в высокой печати производится из специального сплава — гарта, состоящего из 73—75% свинца, 20—25% сурьмы и 2—4% олова. Гарт применяется также для изготовления ме-

23. Gottesman M.M., Willingham M.C., Thiebaut F., Pastan 1. II Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells / Ed. I.B. Roninson. — New York; London, 1991. — P. 279—289.

24. Gottesman M.M., Goldstein L.J., Fojo A. et al. // Ibid. — P. 291—301.

25. Gudkov A.V., Kazarov A.R., Chernova O.B., Kopnin B.P. II Somat. Cell Mol. Genet. — 1987. — Vol. 13. — P. 609—619.

26. Gudkov A.V., Chernova O.B., Kopnin B.P. II Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells / Ed.

I.B. Roninson. — New York; London, 1991. — P. 147—168.

27. Hill A.B., Beck W.T., Trent J.M. II Cancer Res. — 1988. — Vol. 48. — P. 393—398.

28. Melera P.W., Biedler J.L. II Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells / Ed. I.B. Roninson. — New York; London, 1991. — P. 117—145.

29. Melloni E., Pontremoli S., Damiani G. et al. // Proc. nat. Acad. Sci. USA. — 1988. — Vol. 85. — P. 3835—3839.

30. Molecular and Cellular Biology of Multidrug Resistance in Tumor Cells / Ed. I.B. Roninson. — New York; London, 1991.

31. Richon V.M., Weich N., Leng I. et al // Proc. nat. Acad. Sci. USA. — 1991. — Vol. 88. — P. 1666—1670.

32. Rochette-Egly C., Kedinger M., Haffen K. // Cancer Res. — 1988. — Vol. 48. — P. 6173—6182.

33. Van der Bliek A.M., Borst P. II Advanc. Cancer Res. — 1989.

— Vol. 52. — P. 165—203.

34. Whitehead R.H., Jones J.K., Cabriel A., Lukies R.E. II Cancer Res. — 1987. — Vol. 47. — P. 2683—2689.

M.A. Bulbulyan, S.A. Ilyicheva

ESTIMATING POTENTIAL CANCER RISK IN PRINTING INDUSTRY

Research Institute of Carcinogenesis

All republics of the former USSR produce 25% of the world printed issues. By expert estimates the printing industry output will double by the end of the century. Printing industry workers are exposed to many potentially toxic substances including chemicals of established or suspected carcinogenic action to man and animals [32 ]. Therefore characterization of some chemicals used at various stages of printing technological processes in respect of their carcinogenic effest is of great interest.

Serial production of books, booklets and newspapers is a multistage process including forming, printing and binding. Forming includes manufacture of printing forms. Depending upon the type of the printing forms three kinds of printing are distinguished, as follows: letterpress, lithography and gravure printing.

The most common letterpress printing mainly uses metal (hard lead) press forms. Letterpress printing forms are composed by a typesetter (hand typesetting) or with type-casting or slug-casting machines (monotypes and linotypes). Letterpress types are made of a special alloy (hard lead) consisting of lead (73 — 75%), antimony (20 — 25%) and tin (2 — 4%). Hard lead is also employed to make stereotype blocks intended for a large number of impressions. Study of quantitative parameters of air pollution in industrial premises shows that lead concentration in sections where lead-containing alloys are processed exceeds the permissible level [1 ]. However, the hypothesis of lead