Норадреналин в ишемическом прекондиционировании миокарда

УДК 616.1/2

С.Е. Науменко, М.А. Гилинский, Т.В. Латышева

НОРАДРЕНАЛИН В ИШЕМИЧЕСКОМ ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИИ МИОКАРДА

ГУ НИИ физиологии СО РАМН, Новосибирск

Несмотря на то, что норадреналин (НА) играет важную роль в защитных механизмах ишемического прекондиционирования, до настоящего времени результаты исследования его динамики после одно- двукратных кратковременных эпизодов ишемии-реперфузии во время последующей продолжительной ишемии остаются разноречивыми. Цель исследования: изучить динамику НА в интерстиции миокарда после ишемического прекондиционирования двукратными эпизодами ишемии-реперфузии. Выполнено проспективное рандомизированное исследование, включавшее в себя 32 крыс-самцов Вистар. В 1-й группе (опыт) ишемическое прекондиоционирование осуществляли двумя пятиминутными циклами, разделенными 10 мин реперфузии. После этого осуществляли 60-мин окклюзию, сопровождавшуюся 60-мин реперфузией. Во 2-й группе (контроль) 60-мин окклюзии предшествовал 30-мин период ожидания. Статистически достоверное по сравнению с исходным повышение уровня НА в интерстиции миокарда отмечено в

1-й группе на 15 минуте ишемии, тогда как во 2-й группе — на 10 минуте. Уже к 30 мин окклюзии содержание НА в интерстиции миокарда животных 2-й группы превышало таковое у животных 1-й группы (p < 0,05). Такое соотношение сохранялось до 10 мин реперфузии (p < 0,05). Во время реперфузии в 1-й группе темп снижения содержания НА в интерстиции миокарда был более выражен. Содержание НА в интерстиции миокарда на 60 мин реперфузии снижалось в 1-й группе в 31 раз (p < 0,01) по сравнению с содержанием НА на 60 мин окклюзии, тогда как во 2-й группе лишь в 14,5 раза (p < 0,01). Таким образом, двукратное ишемическое прекондиционирование (5 мин ишемии + 10 реперфузии) эффективно предотвращает накопление норадреналина в интерстиции миокарда при 60-минутной ишемии.

Ключевые слова: миокард, норадреналин.

Термин «ишемическое прекондиционирова- кроликам резерпина (для истощения запасов

ние» появился в литературе после работы НА в пресинаптических нервных терминалях).

C.E. Murry с соавт. (1986), в которой было по- Только в группе с ишемическим прекондицио-

казано, что повторные кратковременные эпизо- нированием без применения резерпина обна-

ды ишемии-реперфузии существенно умень- ружено уменьшение зоны инфаркта миокарда.

шают величину инфаркта миокарда после по- У животных, получавших резерпин, величина

следующей продолжительной ишемии [4]. зоны инфаркта при использовании преконди-

Несмотря на двадцатилетнюю историю изу- ционирования и без него не различалась.

чения ишемического прекондиционирования, На основании этого авторы сделали вывод, что

до настоящего времени не существует единой, освобождение НА играет важную роль в защи-

общепринятой его модели. Это относится те миокарда, обеспечиваемую прекондициони-

как непосредственно к прекондиционированию, рованием [11].

так и следующему за ним периоду ишемии- Было показано, что множественные эпизоды

реперфузии. ишемии-реперфузии способствуют уменьше-

Прекондиционирование выполняли как од- нию содержания НА в интерстиции миокарда

нократно, так и многократно, причем кратность при последующей продолжительной ишемии

эпизодов кратковременной ишемии также была [12]. Однако с клинических позиций больший

различной в разных исследованиях [1, 11, 14]. интерес представляет изучение влияния одно-

Участие норадреналина (НА) в преконди- двукратных кратковременных эпизодов ише-

ционировании было продемонстрировано мии-реперфузии на развитие повреждения мио-

в экспериментах с предварительным введением карда во время последующей продолжительной

ишемии [14]. Одни исследователи обнаружили, что и однократный эпизод ишемии-реперфузии приводит к снижению содержания интерстициального НА при последующей продленной ишемии [1], другие такого снижения не обнаружили [9].

Цель исследования: изучить динамику НА в интерстиции миокарда после ишемического прекондиционирования двукратными эпизодами ишемии-реперфузии

Материал и методы

Выполнено проспективное рандомизированное исследование, включавшее в себя 32 крысы — самца Вистар массой тела от 245 до 510 г (393,5±10,6 г). Животные случайным образом были разделены на две группы. В 1-й группе (опыт) ишемическое прекондиционирование осуществляли двумя пятиминутными циклами, разделенными 10 мин реперфузии. После этого осуществляли 60-мин окклюзию, сопровождавшуюся 60-минутной реперфузией. Во 2-й (контроль) — 60-мин окклюзии предшествовал 30-мин период ожидания. Заборы проб проводили на следующих этапах:

1, 2, 3 - через 30 мин после начала перфузии с интервалами 10 мин;

4 — после выполнения ишемического прекондиционирования (на второй 10-мин реперфузии) в опытной группе, либо на последних 10 минутах ожидания в контрольной группе;

5, 6, 7, 8 — через каждые 5 мин ишемии (первые 20 мин ишемии);

9, 10, 11, 12 — через каждые 10 мин ишемии (последующие 40 мин ишемии);

13, 14, 15, 16, 17, 18 — через каждые 10 мин реперфузии.

Общую анестезию осуществляли внутри-брюшинным введением уретана 2,2±0,07 мг/кг. Искусственное дыхание через трахеостомиче-скую канюлю осуществляли смесью воздух + 40% 02 при помощи аппарата Rodent Respirator Model 683 (Harvard Apparatus, США). Дыхательный объем составлял 0,8-1 мл/100 г веса животного. Частота дыхания — 75100 мин-1. В течение всего эксперимента при помощи анализатора синусового ритма контролировали электрокардиограмму (ЭКГ) крысы с оценкой состояния животного по форме и частоте сердечных сокращений. Температуру крысы поддерживали путем подогрева операционного стола. Сбор образцов диализата для определения НА в интерстициуме миокарда начинали не ранее, чем через 30 мин после вживления.

В экспериментах использовались линейные микродиализные зонды на базе полиакрилнит-риловой мембраны с внутренним диаметром 240 мкм, внешним — около 300 мкм (CGH Medical Inc., Lakewood, США). Окно диализа составляло 5-6 мм при критической массе пропускания — 29000 дальтон. С обеих сторон к мембране ультрафиолет-чувствительным клеем (UV Adhesive 518A UVEX, США) приклеивались входной и выходной полиимидные капилляры с внутренним диаметром около 150 мкм, внешним 165 мкм (Microlumen, США). Для уменьшения «мертвого объема» и обеспечения прочности и несминаемости мембраны, внутрь зонда вставлялось нейлоновое волокно диаметром 70 мкм.

Вживление микродиализных зондов. При вживлении микродиализного зонда левостороннюю торакотомию выполняли в пятом меж-реберье. Пятое ребро в большинстве экспериментов удалялось. После иссечения перикарда с помощью нейлоновой нити № 5 с иглой диаметром 13 мм формировали петлю вокруг левой нисходящей коронарной артерии на расстоянии 1-2 мм ниже ушка левого предсердия. Оба конца петли вводили в отверстия пластикового окклюдера, изготовленного из колпачков инъекционных игл. Диализный зонд вживлялся в зону ишемии, которая обнаруживалась по обесцвечиванию ткани миокарда при кратковременном затягивании нитей окклюдера. Микродиализный зонд протягивался через миокард при помощи инъекционной иглы диаметром 0,4 мм, подклеенной к началу выходного капилляра. После вживления зонда на выходной капилляр до упора в миокард одевалась силиконовая трубка, диаметром 0,6 мм, которая препятствовала подвижкам зонда в миокарде. Подача перфузата осуществлялась насосом CMA-120 со скоростью 2 мкл/мин.

Аналитическая процедура. Система высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией состояла из насоса Shim adz u LC-10ADvp, инжектора

Rheodyne 9125 с петлей 10 мкл и проводящих капилляров, выполненных из материала PEEK. Образцы хроматографировались при помощи колонки Hypersil (С18, 2x150 мм с размером сфер 5 мкм). Электрохимическое детектирование осуществлялось сдвоенным электродом с диаметром стеклоуглеродных пластин 3 мм в последовательном включении по отношению к потоку элюента. Потенциалы верхнего и ниж-

него по течению элюента электродов устанавливались соответственно +0.6 и +0.02 В относительно референтного электрода Ag/AgCl. В качестве потенциостатов и усилителей тока использовали контроллеры LC-4C (BAS, США). Хроматограммы записывались в компьютер и обрабатывались при помощи системы «Мультихром-1,5» (Амперсенд, Москва). Анализ концентрации НА в большинстве экспериментов выполнялся по показаниям второго, более устойчивого к загрязнениям, электрода.

Подвижная фаза состояла из 0,05 М одноосновного фосфата натрия, 0,05 М лимонной кислоты (Fisher Scientific, США), 80 мг EDTA (Aldrich, США) и 500 мг октилсульфоната натрия (Sigma, США) на 1 литр. pH подвижной фазы доводился до 5,6 при помощи 6M NaOH. Метанол, дополнительно дистиллированный, добавлялся до концентрации 12% (v/v). Подвижная фаза фильтровалась через нейлоновые фильтры 0,2 мкм и дегазировалась вакуумом. Скорость подачи элюента составляла 0,070,08 мл/мин. Сквозная чувствительность системы была на уровне 0,5 пикограмма НА в 10 мкл образце (отношение сигнал/шум 3:1).

Основные данные выражены отношением к содержанию НА в первой пробе, полученной после имплантации микродиализного зонда (относительные единицы). В качестве исходных значений рассматривается отношение пробы 3 к пробе 1. При сопоставлении данных, представленных как M±m, использовался непараметрический анализ: Friedman ANOVA для повторных измерений или Wilcoxon Matched Pairs Test с уровнем достоверности 0,05.

Эксперименты проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755).

Результаты и обсуждение

Исходное содержание НА в интерстициальном пространстве миокарда не различалось у животных опытной (1-я группа) и контрольной (2-я группа) групп, составляя 23,0±5,4 и 19,9±3,9 отн. ед. соответственно.

Ишемическое прекондиционирование двумя пятиминутными циклами с десятиминутными периодами реперфузии не приводило к существенному изменению содержания НА в интер-стиции миокарда по сравнению с исходным. На этом этапе исследования не было отмечено различий и между группами (Рис. 1). Содержа-

3000 нн 2500

л

а

К

В 2000

нн

3 1500

5

к

§ 1000

и н О

500 0

123456789 10

Опыт  Контроль

Рис. 1. Динамика норадреналина в интерстиции миокарда во время ишемии.

По оси абсцисс: этапы исследования 1 — исходный уровень; 2 — после ишемического прекондиционирова-ния; 3-6 — 5, 10, 15, 20 мин ишемии; 7-10 — 30, 40, 50, 60 мин ишемии. По оси ординат: содержание норадреналина (относительные единицы).

ние НА в интерстиции миокарда составляло в 1-й группе 30,2±4,9 отн. ед, во 2-й группе — 18,0±4,2 отн. ед, p > 0,05.

Это соответствует ранее полученным данным других исследователей, которые не обнаруживали увеличения уровня НА в интерстиции миокарда при коротких циклах преконди-ционирования [12]. Лишь при увеличении продолжительности прекондиционирования до 10 мин отмечено некоторое нарастание содержания НА [9].

Во время основного ишемического эпизода отмечено постепенное нарастание содержания НА в интерстиции миокарда. Такая динамика отмечена как в 1-й, так и во 2-й группе, однако во 2-й группе темп нарастания содержания НА был существенно выше. Статистически достоверное по сравнению с исходным повышение уровня НА в интерстиции миокарда отмечено в 1-й группе на 15 минуте ишемии, тогда как во

2-й группе — на 10 минуте. Уже к 30 мин окклюзии содержание НА в интерстиции миокарда животных 2-й группы статистически достоверно превышало таковое у животных 1-й группы ф < 0,05).

Статистически достоверное различие между группами сохранялось до окончания окклюзии вплоть до 10 мин реперфузии (598,5± ±129,4 отн. ед. в 1-й группе, 1273,3±

±405,0 отн. ед. во 2-й группе, p < 0,05).

Во время реперфузии (Рис. 2) содержание НА в интерстиции миокарда быстро снижалось в обеих обследованных группах. Тем не менее,

1600 - 1400

л

а

1 1200

1000

и

5 800 I 600

о

* 400 О

200 0

1 2 3 4 5 6

Опыт  Контроль

Рис. 2. Динамика норадреналина в интерстиции миокарда во время реперфузии.

По оси абсцисс: этапы исследования 1, 2, 3, 4, 5, 6 —10, 20, 30, 40, 50, 60 мин реперфузии.

По оси ординат: содержание норадреналина (относительные единицы).

Примечание: по сравнению с 1й группой *р < 0,05; по сравнению с исходным +р < 0,05.

в 1-й группе темп снижения был более выражен. Содержание НА в интерстиции миокарда в конце (на 60 мин) реперфузии снижалось в 1-й группе в 31 раз (р < 0,01) по сравнению с содержанием НА на 60 мин окклюзии, тогда как во 2-й группе лишь в 14,5 раза (р < 0,01).

О том, что норадреналин играет существенную роль в ишемическом повреждении миокарда, известно уже давно. Было показано, что концентрация интерстициального НА при ишемии многократно возрастает [1]. В эксперименте на изолированных папиллярных мышцах отмечено, что освобождение эндогенных катехоламинов при ишемии ухудшает их сократительную способность, усиливает оглушение и препятствует эффектам клинических доз Р-адреноблокаторов, что снижает их защитное противоишемическое действие [2].

При изучении токсических эффектов экзогенного НА на изолированных сердцах кроликов обнаружено, что НА влияет на величину инфаркта миокарда дозозависимо. При низких концентрациях (10-7 моль/л) размер инфаркта не увеличивался. При более высоких (10-6, 10-5 моль/л) отмечалось увеличение зоны инфаркта [10].

Действительно, было показано, что НА способствует образованию свободных гидроксильных радикалов в интерстиции миокарда, причем между концентрациями НА и свободных радикалов имеется сильная положительная корреляционная зависимость [7]. Существует мнение, что генерация свободных радикалов зависит не столько от самого НА, сколько от

его метаболита, образующегося в результате действия моноаминооксидазы А-3, 4-

дигидрофенилгликольальдегида. Именно под его воздействием при оксидативном стрессе образуются свободные радикалы [6].

С другой стороны, оказалось, что введение экзогенного НА воспроизводит защитный эффект ишемического прекондиционирования, который сохраняется и после прекращения ге-модинамических эффектов НА [8].

Известно, что в физиологических условиях НА элиминируется из синаптической щели преимущественно посредством механизма обратного захвата с помощью белка-переносчика. Обратный захват НА играет существенную роль и в симпатической нейротрансмиссии во время ишемии миокарда, когда в начале ишемии отмечается увеличение элиминации НА вследствие активации обратного захвата. Увеличивается как функциональная активность этого механизма, так и плотность белков-переносчиков обратного захвата [13]. Тем не менее, после 10 мин ишемии содержание НА в интерстиции миокарда начинает нарастать.

Высказано предположение, что повышение содержания НА в интерстиции миокарда при ишемии связано с реверсией его обратного захвата и зависит от двух условий: 1) увеличения концентрации этого медиатора в цитоплазме симпатического нейрона и 2) интранейрональ-ного накопления №+. Сочетание этих условий необходимо для транспорта НА через плазматическую мембрану с включением в процесс НА транспортера обратного захвата с реверсией нормального направления транспорта [5].

Учитывая данные, свидетельствующие о защитном действии экзогенного НА, его способности имитировать эффект ишемического прекондиционирования, можно предположить, что повышение уровня НА как в аксоплазме (во время ишемического прекондиционирования), так и в интерстиции миокарда (при его экзогенном введении) может приводить к увеличению плотности белков переносчиков обратного захвата, обеспечивая более эффективное и длительное функционирование этого механизма в нормальном направлении при продолжительной ишемии. Вероятно, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что нормальная деятельность механизма обратного захвата сохраняется более продолжительное время, чем считалось ранее - по крайней мере, до 60 мин ишемии. Кроме того, о сохранности нормального механизма обратного захвата свидетельст-

вует и более эффективное снижение содержания интерстициального НА во время реперфузии.

Таким образом, двукратное ишемическое прекондиционирование (5 мин ишемии + 10 реперфузии) эффективно предотвращает накопление норадреналина в интерстиции миокарда при 60-минутной ишемии.

NOREPINEPHRINE IN MYOCARDIAL ISCHEMIC PRECONDITIONING

S.E. Naumenko, M.A. Gylynsky, T.V. Latysheva

AIM: To determine the effects of two staged ischemic preconditioning on myocardial noradrenaline in prolonged ischemia and reperfusion. METHODS: Thirty-two male Wistar rats anesthetised with urethane were randomly divided into 2 groups: group 1 (ischemic preconditioning group, n = 16), and group 2 (control, n = 16). Myocardial interstitial noradrenaline levels were measured using a microdialysis technique. Ischemic preconditioning was elicited by a two episodes of 5 min ischemia and 10 min reperfusion. The intermittent occlusions were followed by prolonged occlusion (60 min) and reperfusion (60 min). RESULTS: An increase in interstitial noradrenaline was observed by 10 min of prolonged ischemia in group 2, and by 15 min in group 1. After 30 min of myocardial ischemia there was a significant difference between groups (p < 0,05) in interstitial noradrenaline levels. In control group it was 50% higher. On reperfusion noradrenaline levels decreased markedly in 1 group. CONCLUSION: We conclude that ischemic preconditioning by a two episodes of 5 min ischemia and 10 min reperfusion prevents excessive noradrenaline interstitial accumulation perhaps through protection of physiological uptake I carrier.

Литература

1. Ischemic preconditioning attenuates cardiac sympathetic nerve injury via ATP-sensitive potassium channels during myocardial ischemia / T. Miura, S. Kawamura, H. Tatsuno, et al. // Circulation. - 2001. - Vol. 104. - № 9. -P. 1053-1058.

2. Ishiguro Y. Effect of endogenous catecholamine on myocardial stunning in a simulated ischemia model / Y. Ishiguro, J.P. Morgan // Fundam. Clin. Pharmacol. - 2001.

- Vol. 15. - № 2. - P. 111-116.

3. Lawson C.S. Anti-arrhythmic protection by ischaemic preconditioning in isolated rat hearts is not due to depletion of endogenous catecholamines / C.S. Lawson, D.J. Hearse // Cardiovasc. Res. - 1996. - Vol. 31. - № 4. - P. 655-662.

4. Murry C.E. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium / C.E. Murry, R.B. Jennings, K.A. Reimer // Circulation. - 1986. - Vol. 74.

- № 5. - P. 1124-1136.

5. Neuronal sodium homoeostatis and axoplasmic amine concentration determine calcium-independent noradrenaline release in normoxic and ischemic rat heart /

A. Schomig, T. Kurz, G. Richardt, E. Schomig // Circ. Research. - 1988. - Vol. 63. - P. 214-226.

6. Norepinephrine transmitter metabolite generates free radicals and activates mitochondrial permeability transition: a mechanism for DOPEGAL-induced apoptosis / W.J. Burke,

B.S. Kristal, B.P. Yu, et al. // Brain Res.- 1998. - Vol. 787. -№ 2. - P. 328-332.

7. Obata T. Prazosin attenuates hydroxyl radical generation in the rat myocardium / T. Obata, Y. Yamanaka // Eur. J. Pharmacol. - 1999. - Vol. 379. - № 2-3. - P. 161-166.

8. Preconditioning against myocardial dysfunction after ischemia and reperfusion by an alpha 1-adrenergic mechanism. / A. Banerjee, C. Locke-Winter, K.B. Rogers, et al. // Circ. Res. - 1993. - Vol. 73. - № 4. - P. 656-670.

9. Rochette L. Effect of repeated regional myocardial ischemia in the rat heart on reperfusion arrhythmias and release of norepinephrine / L. Rochette, D. Moreau, L.H. Opie // J. Cardiovasc. Pharmacol. - 2001. - Vol. 38. - № 1. - P. 78-89.

10. Studies on the cardiotoxicity of noradrenaline in isolated rabbit hearts / A.F. Rump, J. Schierholz, W. Klaus // Arzneimittelforschung. - 2002. - Vol. 52. - № 7. - P. 543551.

11. Toombs C.F. Ischemic preconditioning fails to limit infarct size in reserpinized rabbit myocardium. Implication of norepinephrine release in the preconditioning effect /

C.F. Toombs, A.L. Wiltse, R.J. Shebuski // Circulation. -1993. - Vol. 88. - P. 2351-2358.

12. Transient ischemia reduces norepinephrine release during sustained ischemia. Neural preconditioning in isolated rat heart / M. Seyfarth, G. Richardt, A. Mizsnyak, et al. // Circ. Res. - 1996. - Vol. 78. - № 4. - P. 573-580.

13. Ungerer M. Upregulation of cardiac uptake 1 carrier in ischemic and nonischemic rat heart / M. Ungerer, A. Chlistalla, G. Richardt // Circ. Res. - 1996. - Vol. 78. -№ 6. - P. 1037-1043.

14. Yellon D.M. Preconditioning the human myocardium / D.M. Yellon, A.M. Alkhulaifi, W.B. Pugsley // Lancet. -1993. - Vol. 31. - № 342. - P. 276-277.