ЭКСТРАКТ ВОДОРОСЛЕЙ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО АГЕНТА
ALGAE EXTRACT FOR USE AS IMMUNOMODULATORY AGENT

Область техники, к которой отосится изобретение
Настоящее изобретение относится к экстракту водорослей рода ульва, в частности, к экстракту зеленых водорослей типа Ulva, для его применения с целью модуляции иммунной реакции у человека или животного, в частности, для стимулирования иммунной реакции по отношению к инфекциям. Оно также относится к не-терапевтическому применению экстракта зеленых водорослей типа Ulva для модуляции иммунной реакции человека или животного.
Уровень техники
Модуляция иммунной реакции представляет собой важную линию лечения для множества заболеваний. На самом деле, важно, например, улучшить иммунную реакцию у пациентов, страдающих от инфекций.
Стимулирование иммунной реакции, кроме того, представляет собой механизм важный во многих отношениях. Например, известно, что материнское молоко обогащено IgA, антителами, которые делают возможной защиту новорожденного против определенного ряда инфекций. Интестинальные клетки, в частности эпителиальные клетки кишечника, экспонируются для различных патогенов, против которых продуцируются антитела. Затем эти антитела будут мигрировать по всей молочной железе, и они будут находиться в материнском молоке, обеспечивая тем самым защиту младенца. Всегда существует необходимость в идентификации новых веществ, способных стимулировать эту иммунную реакцию. В частности, эпителиальные клетки кишечника представляют собой предпочтительный активный центр, на котором могут действовать иммуностимулирующие вещества, вводимые перорально. Кроме того, существует необходимость в идентификации новых веществ, способных повысить реакцию на вакцинацию посредством стимулирования иммунной реакции, в частности, посредством их введения, дополнительного к вакцинации. Виды ульва (Ulvales, Chlorophyta) представляют собой распространенные водоросли, находящиеся в приливной зоне или в береговой полосе, затопляемой приливом. Они колонизируют твердые подложки, закрепляясь с помощью диска прикрепления, но определенные виды могут также образовывать свободно живущие дрейфующие формы. Ulvae представляют собой быстро растущие и легко приспосабливающиеся водоросли по отношению к пространству и поглощению питательных веществ. Их рост, в частности, наблюдается в столбе воде в заболоченных прибрежных водах и лагунах, где Ulva sp.распространяются как «зеленый прилив» (Fletcher, 1996). Результатом этого часто является массовое продуцирование и выбросы, производящие вредные газы во время их аккумуляции (Morand and Briand, 1996). До настоящего времени, эта биомасса имела очень низкую практическую пользу, и средства для ее использования, за исключением компоста (Maze et al. 1993, Cuomo et al. 1995), производства метана (Briand и Morand, 1997), потребления в пищу людьми (Perez, 1997) или в качестве основы для бумаги (Nicolucci and Monegato 1993), могут дать возможность для использования их специфических свойств.
Раскрытие изобретения
Авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что экстракт водорослей рода ульва, в частности, экстракт зеленых водорослей типа Ulva, имеет иммуномодулирующие свойства.
Таким образом, настоящее изобретение относится к экстракту водорослей рода ульва, в частности, к экстракту зеленых водорослей типа Ulva, содержащему сульфатированные и несульфатированные полианионные полисахариды, у которых размер является равным или меньшим чем 50 кДа, для их использования с целью модуляции иммунной реакции человека или животного.
Оно также относится к не-терапевтическому использованию экстракта водорослей рода ульва, в частности, к экстракту зеленых водорослей типа Ulva, содержащих сульфатированные и несульфатированные полианионные полисахариды, у которых размер является равным или меньшим чем 50 кДа, для модуляции иммунной реакции человека или животного.
В частности, настоящее изобретение относится к экстракту водорослей, к его применению, как определено выше, или к не-терапевтическому использованию экстракта водорослей, как определено выше, где полисахариды содержат маннозу и/или арабинозу, преимущественно, маннозу. Еще более конкретно, указанные полисахариды содержат, по меньшей мере, 0,005% маннозы и/или, по меньшей мере, 0,005% арабинозы, по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом, преимущественно, по меньшей мере, 0,005% маннозы. Еще более конкретно, указанные полисахариды содержат маннозу в количестве, находящемся в пределах от 0,005 до 0,5%, например, от 0,005 до 0,20% или от 0,15 до 0,5% и/или арабинозу в количестве, находящемся в пределах от 0,005 до 0,5% по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом, преимущественно, маннозу в количестве, находящемся в пределах от 0,005 до 0,5%, например, от 0,005 до 0,20% или от 0,15 до 0,5% по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом.
Кроме того, более конкретно, настоящее изобретение относится к экстракту водорослей для его применения, как определено выше, или к не-терапевтическому использованию экстракта водорослей, как определено выше, где указанные полисахариды дополнительно содержат:
- галактозу и/или
- глюкозу; и/или
- рамнозу; и/или
- ксилозу; и/или
- глюкуроновую кислоту.
Более конкретно, указанные полисахариды содержат:
- от 0,05 до 0,5% галактозы и/или
- от 0,005 до 0,5% глюкозы, в частности, от 0,005 до 0,05% или от 0,05 до 0,5%; и/или;
- от 2 до 15% рамнозы; и/или
- от 0,1 до 1% ксилозы; и/или
- от 1 до 7% глюкуроновой кислоты;
по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом. Настоящее изобретение также относится к экстракту водорослей рода ульва, в частности, к экстракту зеленых водорослей типа Ulva, которые могут быть получены с помощью способа приготовления, в котором:
a) водоросли промываются и очищаются от песка;
b) указанные водоросли измельчаются;
c) твердая фаза измельченного материала отделяется от его жидкой фазы;
d) указанная жидкая фаза осветляется;
e) сок, полученный на стадии d), подвергается ультрафильтрации на мембране 50 кДа или меньше; и
f) отфильтрованный сок, полученный на стадии е), концентрируется, а затем сушится;
для его использования с целью модуляции иммунной реакции человека или животного.
Оно также относится к не-терапевтическому использованию экстракта водорослей рода ульва, в частности, к экстракту зеленых водорослей типа Ulva, которые могут быть получены с помощью способа приготовления, в котором:
a) водоросли промываются и очищаются от песка;
b) указанные водоросли измельчаются;
c) твердая фаза измельченного материала отделяется от его жидкой фазы;
d) указанная жидкая фаза осветляется;
e) сок, полученный на стадии d), подвергается ультрафильтрации на мембране 50 кДа или меньше; и
f) отфильтрованный сок, полученный на стадии e), концентрируется, а затем сушится; для модуляции иммунной реакции человека или животного.
В частности, настоящее изобретение относится к экстракту водорослей, к его использованию, как рассмотрено выше, или к не-терапевтическому использованию экстракта водорослей, как показано выше, для стимулирования иммунной реакции человека или животного, в частности, в иммунной системе кишечника. В рамках настоящего изобретения, под «иммуномодулирующими» свойствами или под предоставлением возможности «модуляции иммунной реакции» понимаются значения, обычно приписываемые этим терминам и хорошо известные специалистам в данной области, в частности, это любое свойство, дающее возможность стимулирования или замедления иммунных реакций организма человека или организма животного.
В частности, экстракт водорослей для его использования в соответствии с настоящим изобретением или не-терапевтического использования экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением дает возможность индуцирования экспрессии молекул адгезии и хемокинов, а именно, IL8 и/или IL-1α и/или IL1-β и/или IL6 и/или TNF-α и/или CCL20.
Таким образом, экстракт водорослей, как определено в рамках настоящего изобретения, является пригодным для использования при лечении и/или предотвращении инфекционных патологий, в частности, инфекционных патологий свиней, выбранных из: парвовирусной инфекции, Erysipelas Rhusiopathia, инфекционного ринита, гриппа, цирковирусной инфекции свиней, микоплазмы и колибактериоза; инфекционных патологий птиц, выбранных из: болезни Марека, болезни Ньюкасла, инфекционного бронхита, болезни Гумборо, оспы кур, микоплазмы, инфекционной анемии птиц, инфекционного ларинготрахеита, EDS (аденовирусной инфекции птиц) и птичьего гриппа; инфекционных патологий крупного рогатого скота, выбранных из: BVD (вирусных диарей крупного рогатого скота), энзоотической бронхопневмонии, IBR (инфекционного бычьего ринотрахеита), заболевания вирусного герпеса, клостридиального заболевания, колибактериоза, блутанга, короновирусного заболевания, ротавирусного заболевания и ринотрахеита; и инфекционных патологий разводимых и выращиваемых рыб и других водных животных и растений, выбранных из: гематопоэтического некроза, вибриоза, фурункулеза, инфекционного некроза поджелудочной железы и инфекционной анемии.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к экстракту водорослей, как описано в рамках настоящего изобретения, к его использованию при лечении и/или предотвращении инфекционной патологии, такой как рассмотрено выше.
В частности, экстракт водорослей, как определено в рамках настоящего изобретения, является пригодным для использования в рамках вакцинопрофилактики, в качестве дополнения к вакцинации.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к экстракту водорослей, к его использованию, как показано выше, где экстракт водорослей используется в фармацевтической композиции для перорального введения.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, экстракт водорослей для его использования, как показано выше, применяется в фармацевтической композиции парентеральным способом.
Настоящее изобретение также относится к не-терапевтическому использованию экстракта водорослей, как показано выше, где экстракт водорослей используется в качестве пищевой добавки для перорального введения.
Экстракт водорослей, как описано в рамках настоящего изобретения, в явном виде описан в заявке на патент FR 1261909.
Как показано выше, экстракт водорослей, как описано в рамках настоящего изобретения, относится к экстракту водорослей рода ульва, в частности, к экстракту зеленых водорослей типа Ulva, содержащему сульфатированные и несульфатированные полианионные полисахариды, у которых размер является равным или меньшим чем 50 кДа. Более конкретно, экстракт водорослей содержит сульфатированные и несульфатированные полианионные полисахариды, у которых размер меньше чем 40, 30, 20 или 15 кДа. Еще более конкретно, сульфатированные и несульфатированные полианионные полисахариды экстракта водорослей имеют размер равный или меньший чем 15 кДа.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, экстракт водорослей, как описано в рамках настоящего изобретения, содержит сульфатированные и несульфатированные полианионные полисахариды, у которых размер равен или меньше чем 50 кДа, за исключением сульфатированных и несульфатированных полианионных полисахаридов, у которых размер больше чем 50 кДа.
В соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, экстракт водорослей, как описано в рамках настоящего изобретения, содержит сульфатированные и несульфатированные полианионные полисахариды, у которых размер является равным или меньшим чем 15 кДа, за исключением сульфатированных и несульфатированных полианионных полисахаридов, у которых размер больше чем 15 кДа.
Дальтон (Да) представляет собой единицу массы, определенную как равная одной двенадцатой от массы атома углерода 12, массы, которая будет затем находиться посредством оценки для смеси нескольких изотопов (в основном углерода 12 и углерода 13, соответственно, имеющих 6 и 7 нейтронов, в дополнение к 6 протонам любого атома углерода). Дальтон с очень хорошей точностью представляет собой массу атома водорода, точное значение составляет 1,00794 аем (атомная единица массы). Килодальтон (кДа) равен 1000 Да.
В рамках настоящего изобретения, массы, рассмотренные в кДа, определяются с помощью любого способа, обычно используемого специалистом в данной области; в частности, массы сульфатированных и несульфатированных полианионных полисахаридов экстрактов водорослей могут различаться с помощью ультрафильтрации на мембранах, делающих возможной только фильтрацию молекул определенных размеров.
В частности, и как сказано ранее, полисахариды экстракта водорослей, описанные в рамках настоящего изобретения, содержат маннозу и/или арабинозу, предпочтительно, маннозу. Более конкретно, указанные полисахариды содержат, по меньшей мере, 0,005% маннозы и/или, по меньшей мере, 0,005% арабинозы, по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом, а именно, по меньшей мере, 0,01% маннозы и/или, по меньшей мере, 0,01% арабинозы. Еще более конкретно, указанные полисахариды содержат маннозу в количестве, находящемся в пределах от 0,01 до 0,50%, например, от 0,01 до 0,20% или от 0,20 до 0,5%, и/или арабинозу в количестве, находящемся в пределах от 0,01 до 0,5% по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом, а именно, маннозу в количестве, находящемся в пределах от 0,03 до 0,45%, например, от 0,03 до 0,15% или от 0,15 до 0,45%, и/или арабинозу в количестве, находящемся в пределах от 0,01 до 0,2%.
Преимущественно, указанные полисахариды содержат маннозу в количестве, находящемся в пределах от 0,01 до 0,50%, например, от 0,01 до 0,20% или от 0,20 до 0,5%, а именно, маннозу в количестве, находящемся в пределах от 0,03 до 0,45%, например, от 0,03 до 0,15% или от 0,15 до 0,45%.
Конкретно, и как отмечено ранее, указанные полисахариды дополнительно содержат:
- галактозу и/или
- глюкозу; и/или
- рамнозу; и/или
- ксилозу; и/или
- глюкуроновую кислоту.
Еще более конкретно, указанные полисахариды содержат:
- от 0,05 до 0,5% галактозы, а именно, от 0,1 до 0,4%; и/или
- от 0,005 до 0,5% глюкозы, в частности, от 0,005 до 0,05%, а именно, от 0,01 до 0,03% или от 0,05 до 0,5%; в %; и/или
- от 2 до 15% рамнозы, а именно, от 5 до 10%; и/или
- от 0,1 до 1% ксилозы, а именно, от 0,3 до 0,7%; и/или
- от 1 до 7% глюкуроновой кислоты, а именно, от 1 до 5%;
по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом.
Таким образом, можно отметить, например, экстракт водорослей для его использования в соответствии с настоящим изобретением, содержащий:
- маннозу и/или
- арабинозу; и/или
- галактозу; и/или
- глюкозу; и/или
- рамнозу; и/или
- ксилозу; и/или
- глюкуроновую кислоту.
Более конкретно, можно отметить, например, экстракт водорослей для его использования в соответствии с настоящим изобретением, содержащий:
- от 0,01 до 0,50% маннозы, например, от 0,01 до 0,20%, а именно, от 0,03 до 0,15% или от 0,20 до 0,5%; и/или
- от 0,01 до 0,5% арабинозы, а именно, от 0,01 до 0,2%; и/или
- от 0,05 до 0,5% галактозы, а именно, от 0,1 до 0,4%; и/или
- от 0,005 до 0,5% глюкозы, в частности, от 0,005 до 0,05%, а именно, от 0,01 до 0,03%, или от 0,05 до 0,5% и/или
- от 2 до 15% рамнозы, а именно, от 5 до 10%; и/или
- от 0,1 до 1% ксилозы, а именно, от 0,3 до 0,7%; и/или
- от 1 до 7% глюкуроновой кислоты, а именно, от 1 до 5%;
по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом.
Еще более конкретно, можно, например, отметить экстракт водорослей для его использования в соответствии с настоящим изобретением, содержащий:
- 0,09% маннозы и/или
- 0,1% арабинозы; и/или
- 0,3% галактозы; и/или
- 0,02% глюкозы; и/или
- 8,1% рамнозы; и/или
- 0,5% ксилозы; и/или
- 2,6% глюкуроновой кислоты;
по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом.
Также можно, например, указать экстракт водорослей для его использования в соответствии с настоящим изобретением, содержащий:
- 0,3% маннозы и/или
- 0,2% галактозы; и/или
- 0,4% глюкозы; и/или
- 7,9% рамнозы; и/или
- 0,5% ксилозы; и/или
- 4,9% глюкуроновой кислоты;
по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к не-терапевтическому использованию экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением, где экстракт водорослей содержит:
- маннозу и/или
- арабинозу; и/или
- галактозу; и/или
- глюкозу; и/или
- рамнозу; и/или
- ксилозу; и/или
- глюкуроновую кислоту, а более конкретно:
- от 0,01 до 0,50% маннозы, например, от 0,01 до 0,20%, а именно, от 0,03 до 0,15% или от 0,20 до 0,5% и/или
- от 0,01 до 0,5% арабинозы, а именно, от 0,01 до 0,2%; и/или
- от 0,05 до 0,5% галактозы, а именно, от 0,1 до 0,4%; и/или
- от 0,005 до 0,5% глюкозы, в частности, от 0,005 до 0,05%, а именно, от 0,01 до 0,03%, или от 0,05 до 0,5%; и/или
- от 2 до 15% рамнозы, а именно, от 5 до 10%; и/или
- от 0,1 to 1% ксилозы, а именно, от 0,3 до 0,7%; и/или
- от 1 до 7% глюкуроновой кислоты, а именно, от 1 до 5%;
по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом, и еще более конкретно, содержащий:
- 0,09% маннозы и/или
- 0,1% арабинозы; и/или
- 0,3% галактозы; и/или
- 0,02% глюкозы; и/или
- 8,1% рамнозы; и/или
- 0,5% ксилозы; и/или
- 2,6% глюкуроновой кислоты;
по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом, или содержащий:
- 0,3% маннозы; и/или
- 0,2% галактозы; и/или
- 0,4% глюкозы; и/или
- 7,9% рамнозы; и/или
- 0,5% ксилозы; и/или
- 4,9% глюкуроновой кислоты;
по массе, по отношению к массе сухого материала экстракта водорослей в целом. Как показано выше, экстракт водорослей, как описано в рамках настоящего изобретения, представляет собой экстракт водорослей рода ульва, в частности, экстракт зеленых водорослей типа Ulva, который может быть получен с помощью способа приготовления, в котором:
a) водоросли промываются и очищаются от песка;
b) указанные водоросли измельчаются;
c) твердая фаза измельченного материала отделяется от его жидкой фазы;
d) указанная жидкая фаза осветляется;
e) сок, полученный на стадии d), подвергается ультрафильтрации на мембране 50 кДа или меньше; и отфильтрованный сок, полученный на стадии e), концентрируется, а затем сушится. В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, экстракт водорослей содержит:
от 10 до 50% углерода; от 1 до 10% водорода; от 1 до 5% азота; от 20 до 50% кислорода и от 1 до 15% серы; в процентах массовых от сухого материала экстракта водорослей в целом.
Еще более конкретно, экстракт водорослей содержит: от 15 до 30% углерода; от 3 до 6% водорода; от 1 до 3% азота; от 25 до 40% кислорода и от 2,5 до 10% серы; в процентах массовых от сухого материала экстракта водорослей в целом. В соответствии с друг вариантом осуществления настоящего изобретения, экстракт водорослей содержит: от 10 до 50% углерода; от 1 до 10% водорода; от 0,5 до 5% азота; от 20 до 60% кислорода и от 1 до 15% серы; в процентах массовых от сухого материала экстракта водорослей в целом. Другие химические элементы, присутствующие в сухом материале экстракта, в явном виде представлены минералами (Ca, K, Na, Mr, Al, Cl, I, P, Fe, и тому подобное).
Более конкретно, экстракт водорослей, как описано в рамках настоящего изобретения отличается спектром 'Н ЯМР, показанным на Фиг. 1.
1
1
13
15
2
Этот спектр Н ЯМР регистрируется при 298 K на спектрометре Bruker Advance 500, снабженном 5-мм инверсным криогенным датчиком TCI (датчик тройного резонанса) H/C/N. Перед анализом, образцы растворяют в 99,97% атомов DO. Химические сдвиги выражаются в м.д. по отношению к внешнему стандарту (триметилсилилпропионовой кислоте). Не осуществляют подавления сигнала HOD.
В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения, экстракт водорослей, содержащий, в частности, сульфатированные и несульфатированные полианионные полисахариды, у которых размер является равным или меньшим чем 50 кДа, может быть получен с помощью способа приготовления, в котором:
a) водоросли промываются и очищаются от песка;
b) указанные водоросли измельчаются;
c) твердая фаза измельченного материала отделяется от его жидкой фазы;
d) указанная жидкая фаза осветляется;
e) сок, полученный на стадии d), подвергается ультрафильтрации на мембране 50 кДа или меньше и
f) отфильтрованный сок, полученный на стадии е), концентрируется, а затем сушится.
В частности, для применения способа, как показано в рамках настоящего изобретения, на стадии а) последнего, водоросли промывают пресной водой.
Они могут очищаться от песка с помощью любых средств, доступных специалисту в данной области.
Затем указанные водоросли измельчают, а именно, посредством измельчительного устройства, такого, например, как очистительная машина или резак.
Впоследствии, твердая фаза измельченного материала, пульпа, отделяется от ее жидкой фазы, сока, посредством прессования измельченного материала, например, посредством ленточного пресса или фильтр-пресса, или посредством центрифугирования.
Под «соком», подразумевается сок цитоплазмы, который содержит париетальную структуру двойной структуры клеток водорослей.
Затем полученную жидкую фазу осветляют, например, с помощью пластинчатого осветлителя с или посредством центрифугирования, декантирования или фильтрования (например, с помощью мешка или пластин).
Затем полученный сок подвергают ультрафильтрации.
В соответствии с одним из вариантов осуществления применения способа, как показано в рамках настоящего изобретения, ультрафильтрацию осуществляют на мембране 50 кДа или меньше, а именно, на мембране 40, 30, 20 или 15 кДа. Более конкретно, мембрана может представлять собой мембрану 15 кДа или меньше.
Эта мембрана может, например, представлять собой керамическую мембрану или органическую мембрану. Более конкретно, мембрана представляет собой керамическую мембрану.
Полученный отфильтрованный сок может затем концентрироваться, например, с помощью обратного осмоса, выпаривания или преципитации, а затем сушиться, например, с помощью сушки вымораживанием или атомизации.
Необязательно, полученный экстракт может затем опять измельчаться с получением гомогенного порошка в терминах размеров зерен.
В соответствии с одним из этих аспектов, способ частично проводят/осуществляют при комнатной температуре. Под комнатной температурой подразумевается температура, находящаяся в пределах между 5 и 25°С.
В соответствии с другим аспектом из этих аспектов, способ частично имеет место при температуре, находящейся в пределах между 4 и 10°С, это делается для устранения развития микробов.
В соответствии с одним из вариантов осуществления для применения способа, как показано в рамках настоящего изобретения, экстракт водорослей, полученный на стадии f) рассмотренного выше способа, очищается, например, посредством ультрафильтрации, в частности, на кассете для ультрафильтрации, а именно, для удаления минеральной части.
В соответствии с другим из этих аспектов, экстракт водорослей для его использования в соответствии с настоящим изобретением получают с помощью способа, как описано ранее.
Этот способ отличается от большинства способов, описанных в литературе, благодаря отсутствию стадии, включающей преципитацию экстракта водорослей. Он отличается от предыдущих способов экстракции также отсутствием использования растворителей, в частности, органических растворителей, что представляет собой главное преимущество с экологической точки зрения.
Под «зелеными водорослями типа Ulva» подразумеваются зеленые водоросли, сгруппированные в роде Ulva, из семейства Ulvaceae, рода ульва. Можно рассмотреть в явном виде следующие виды и подвиды: Ulva acanthophora, Ulva anandii, Ulva angusta, Ulva arasakii, Ulva armoricana, Ulva atroviridis, Ulva attenuata, Ulva beytensis, Ulva bifrons, Ulva brevistipitata, Ulva bulbosa, Ulva burmanica, Ulva byssoides, Ulva californica, Ulva chaetomorphoides, Ulva clathrata, Ulva coccinea, Ulva compressa, Ulva conglobata, Ulva cornucopiae, Ulva cornuta, Ulva covelongensis, Ulva crassa, Ulva erassimembrana, Ulva curvata, Ulva dactylifera, Ulva denticulata, Ulva elegans, Ulva elminthoides, Ulva enteromorpha, Ulva erecta, Ulva expansa, Ulva fasciata, Ulva fenestrata, Ulva flexuosa, Ulva gelatinosa, Ulva geminoidea, Ulva gigantea, Ulva grandis, Ulva hendayensis, Ulva hookeriana, Ulva hopkirkii, Ulva indica, Ulva intestinalis, Ulva intestinaloides, Ulva intricata, Ulva intybacea, Ulva javanica, Ulva kylinii, Ulva lactuca, Ulva lactucaefolia, Ulva laetevirens, Ulva laingii, Ulva linearis, Ulva lingulata, Ulva linkiana, Ulva linza, Ulva lippii, Ulva litoralis, Ulva littorea, Ulva lobata, Ulva lubrica, Ulva marginata, Ulva micrococca, Ulva myriotrema, Ulva neapolitana, Ulva nematoidea, Ulva ohnoi, Ulva olivacea, Ulva olivaceum, Ulva pacifica, Ulva papenfussii, Ulva paradoxa, Ulva parva, Ulva parvula, Ulva patengensis, Ulva percursa, Ulva pertusa, Ulva phyllosa, Ulva popenguinensis, Ulva porrifolia, Ulva procera, Ulva profunda, Ulva prolifera, Ulva pseudocurvata, Ulva pseudolinza, Ulva pulchra, Ulva purpurascens, Ulva quilonensis, Ulva radiata, Ulva ralfsii, Ulva ranunculata, Ulva reticulata, Ulva rhacodes, Ulva rigida, Ulva rotundata, Ulva rubens, Ulva saifullahii, Ulva scagelii, Ulva scandinavica, Ulva sericea, Ulva serrata, Ulva simplex, Ulva sorensenii, Ulva spinulosa, Ulva stenophylla, Ulva stipitata, Ulva sublittoralis, Ulva subulata, Ulva taeniata, Ulva tenera, Ulva tetragona, Ulva torta, Ulva tuberosa, Ulva umbilicata, Ulva uncialis, Ulva uncinata, Ulva usneoides, Ulva utricularis, Ulva utriculosa, Ulva uvoides, Ulva ventricosa.
Таким образом, экстракт водорослей для его применения в соответствии с настоящим изобретением может использоваться в ветеринарных применениях и содержаться в лекарственной или фармацевтической композиции, для модуляции иммунной реакции человека или животного, в частности, для стимулирования иммунной реакции человека или животного, а более конкретно, для предотвращения и/или лечения инфекционной патологии, такой как рассмотрено выше, еще более конкретно, в рамках вакцинальной профилактики, в качестве дополнения к вакцинации.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к экстракту водорослей для его использования, как рассмотрено ранее, где экстракт водорослей содержится в фармацевтической композиции или в лекарственном средстве.
He-терапевтическое использование экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением может предназначаться, относительно его целевых применений, для человека или животного, например, посредством пищевых добавок с задачей относительно здоровья без каких-либо вторичных воздействий для модуляции иммунной реакции человека или животного, в частности, для стимулирования иммунной реакции человека или животного.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к не-терапевтическому использованию экстракта водорослей, как рассмотрено ранее, где экстракт водорослей содержится в пищевой композиции.
В частности, пищевая композиция является пригодной для использования в качестве дополнения к вакцинации.
Фармацевтически приемлемые наполнители, используемые для приготовления лекарственной или фармацевтической композиции, содержащей экстракт водорослей для его использования в соответствии с настоящим изобретением, выбираются, в соответствии с фармацевтической формой и желаемым способом введения, из обычных наполнителей, которые известны специалистам в данной области.
В настоящем изобретении - для перорального, сублингвального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, наружного, местного, внутритрахеального, интраназального, трансдермального или ректального введения, в смеси с обычными фармацевтическими наполнителями, животным и человеку для модуляции иммунной реакции, в частности, для предотвращения и/или лечения от инфекционных патологий, как рассмотрено выше.
Пригодные для введения формы включают пероральные формы, такие как таблетки, мягкие и твердые желатиновые капсулы, порошки, гранулы и пероральные растворы или суспензии, сублингвальные, буккальные, внутритрахеальные, внутриглазные, интраназальные формы введения, введение посредством ингаляции, местные, парентеральные формы введения, такие как трансдермальные, подкожные, внутримышечные или внутривенные формы введения, ректальные формы введения и импланты. Для местного применения можно использовать экстракты водорослей с целью их применения в соответствии с настоящим изобретением в кремах, гелях, помадах или примочках.
Когда приготавливают твердую композицию в форме таблеток, главный активный ингредиент может смешиваться с фармацевтическим носителем, таким как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, аравийская камедь или что-либо подобное.
Таблетки могут также снабжаться покрытием из сахарозы, производного целлюлозы или других пригодных для использования материалов, или, кроме того, они могут обрабатываться таким образом, что они имеют пролонгированную или замедленную активность и высвобождают непрерывно заданное количество активного ингредиента.
Препарат в виде желатиновых капсул может, например, быть получен посредством смешивания активного ингредиента с разбавителем и посредством выливания полученной смеси в мягкие или твердые желатиновые капсулы.
В одном из конкретных вариантов осуществления, экстракт водорослей, лекарственное средство или фармацевтическая композиция для ее использования в соответствии с настоящим изобретением предназначается для перорального введения. В другом варианте осуществления, экстракт водорослей, лекарственное средство или фармацевтическая композиция для ее использования в соответствии с настоящим изобретением предназначается для парентерального введения.
Лекарственные средства или фармацевтические композиции, содержащие экстракт водорослей для его использования в соответствии с настоящим изобретением, могут также находиться в жидкой форме, например, как растворы, эмульсии, суспензии или сиропы, а именно, в форме, адаптированной, например, для перорального или интраназального введения. Пригодные для использования жидкие субстраты могут, например, представлять собой воду, органические растворители, такие как глицерин или гликоли, а также их смеси, в различных пропорциях, в воде.
Препарат в виде сиропа или эликсира или для введения в виде капель может также содержать активный ингредиент вместе с акалорическим подсластителем, например, метилпарабен и пропилпарабен в качестве антисептиков, а также агент, обеспечивающий вкус, и соответствующий подкрашивающий агент.
Порошки или гранулы, диспергируемые в воде, могут, например, содержать активный ингредиент, смешанный с диспергирующими или смачивающими агентами, или суспендирующими агентами, подобными поливинилпирролидону, а также с подсластителями или агентами для корректировки вкуса.
Как правило, в рамках настоящего изобретения, ежедневная доза экстракта водорослей будет представлять собой самую низкую эффективную дозу экстракта водорослей, способную оказывать иммуностимулирующее воздействие.
Под "эффективной дозой", подразумевается любое количество композиции, которое делает возможным наблюдение видимого воздействия, в настоящем документе - иммуностимулирующего воздействия.
В соответствии с одним из своих аспектов, экстракт водорослей для его использования в соответствии с настоящим изобретением используется в композиции, как рассмотрено выше, для введения людям при дозе, находящейся в пределах между 0,1 и 100 мг/кг, еще более конкретно, в пределах между 0,5 и 60 мг/кг, например, в пределах между 1 и 20 мг/кг или между 5 и 30 мг/кг, или при дозе для животных, находящейся в пределах между 1 и 200 мг/кг, более конкретно, в пределах между 1 и 100 мг/кг, еще более конкретно, в пределах между 2 и 45 мг/кг или между 10 и 60 мг/кг.
В соответствии с другим аспектом, в рамках не-терапевтического использования экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением, последний может использоваться в пищевой композиции.
Под «пищевой композицией» подразумевается, например, любой тип лечебного питания, пищевых продуктов, таких как йогурт или напиток, а именно, молочный напиток, любой тип сырого материала, добавки или технологического вспомогательного материала, в форме премиксов, либо лекарственных, либо нет, предназначенных для введения в продукты питания, любой тип основных или вспомогательных продуктов питания, предназначенных для людей или животных.
В соответствии с одним из этих аспектов, в рамках не-терапевтического использования экстракта водорослей в пищевой композиции, последний используется для введения людям при дозе, находящейся в пределах между 0,1 и 100 мг/кг, еще более конкретно, в пределах между 0,5 и 60 мг/кг, например, в пределах между 1 и 20 мг/кг, или в пределах между 5 и 30 мг/кг, или при дозе для животных, находящейся в пределах между 1 и 200 мг/кг, более конкретно, в пределах между 1 и 100 мг/кг, еще более конкретно, в пределах между 2 и 45 мг/кг или между 10 и 60 мг/кг.
Настоящее изобретение, в соответствии с другим его аспектом, также относится к способу модуляции иммунной реакции человека или животного, в частности, для стимулирования иммунной реакции у человека или животного, который включает введение человеку или животному эффективной дозы экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением.
Более конкретно, способ в соответствии с настоящим изобретением стимулирует иммунную реакцию у человека или животного, в частности, в иммунной системе кишечника.
Еще более конкретно, способ в соответствии с настоящим изобретением индуцирует экспрессию молекул адгезии и хемокинов, а именно, IL8 и/или IL-1α и/или IL1-β и/или IL6 и/или TNF-α и/или CCL20.
Экстракт водорослей, вводимый в рамках способа в соответствии с настоящим изобретением, может содержаться в лекарственном средстве, фармацевтической композиции или пищевой композиции, как рассмотрено выше.
Он может вводиться в соответствии с рассмотренными выше способами введения.
В соответствии с одним из вариантов осуществления, для применения способа в соответствии с настоящим изобретением, экстракт водорослей в соответствии с настоящим изобретением вводится в фармацевтической композиции.
В частности, указанный способ является пригодным для использования при предотвращении и/или лечении инфекционной патологии, такой как рассмотрено выше.
В соответствии с другим вариантом осуществления, для применения способа в соответствии с настоящим изобретением, экстракт водорослей в соответствии с настоящим изобретением вводится в пищевую композицию.
В частности, настоящее изобретение также относится к способу, как рассмотрено выше, который включает введение человеку или животному эффективной дозы экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением в течение периода от 3 до 30 дней, в частности, от 10 до 20 дней или от 3 до 10 дней, при дозе для людей, находящейся в пределах между 0,1 и 100 мг/кг, более конкретно, в пределах между 0,5 и 60 мг/кг, еще более конкретно, в пределах между 1 и 20 мг/кг или между 5 и 30 мг/кг, или при дозе для животных, находящейся в пределах между 1 и 200 мг/кг, более конкретно, в пределах между 1 и 100 мг/кг, еще более конкретно, в пределах между 2 и 45 мг/кг или между 10 и 60 мг/кг.
В соответствии с одним из вариантов осуществления, для применения способа в соответствии с настоящим изобретением, в конце рассмотренного выше периода времени, введение экстракта водорослей может быть возобновлено в течение эквивалентного периода.
В соответствии с одним из его аспектов, настоящее изобретение также относится к способу, как рассмотрено выше, который включает:
a) приготовление экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением с помощью следующего способа:
- промывки и очистки водорослей от песка;
- измельчения указанных водорослей;
- отделения твердой фазы измельченного материала от его жидкой фазы;
- осветления указанной жидкой фазы;
- ультрафильтрации сока, полученного на предыдущей стадии, на мембране 50 кДа или меньше, например, 15 кДа или меньше; и
- концентрирования, а затем сушки отфильтрованного сока, полученного на предыдущей стадии; необязательно, с последующей стадией ультрафильтрации, например, на кассете для ультрафильтрации; и
b) введение человеку или животному эффективной дозы экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением, конкретно, в течение периода от 3 до 30 дней, более конкретно, от 10 до 20 дней или от 3 до 10 дней, при дозе для людей, находящейся в пределах между 0,1 и 100 мг/кг, еще более конкретно, в пределах между 0,5 и 60 мг/кг, например, между 1 и 20 мг/кг или между 5 и 30 мг/кг, или при дозе для животных, находящейся в пределах между 1 и 200 мг/кг, более конкретно, в пределах между 1 и 100 мг/кг, еще более конкретно, между 2 и 45 мг/кг или между 10 и 60 мг/кг.
Настоящее изобретение будут иллюстрироваться более подробно с помощью фигур и примеров, ниже, которые не ограничивают его рамки.
Краткое описание фигур
1
Фиг. 1: спектр Н ЯМР экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 2: Хроматограмма, полученная для экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением, разделенного на двух колонках Shodex 802 и 803.
Фиг. 3: Хроматограмма, полученная после анализа триметилсилилированных производных образца экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением с помощью газовой хроматографии. Здесь Ara: арабиноза; Gal: галактоза; Glc: глюкоза; Xyl: ксилоза; Man: манноза; Rha: рамноза, GlcA: глюкуроновая кислота.
Фиг. 4: Оценка максимальной нетоксичной дозы экстракта водорослей ЕА1 в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 5: Оценка максимальной нетоксичной дозы экстракта водорослей ЕА2 в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 6: Оценка максимальной нетоксичной дозы экстракта водорослей EA3 в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 7: Воздействие экстрактов водорослей ЕА1, ЕА2 и ЕА3 в соответствии с настоящим изобретением на экспрессию IL8 (измерение с помощью qPCR).
Фиг. 8: Воздействие экстракта водорослей ЕА1, ЕА2 и ЕА3 в соответствии с настоящим изобретением на экспрессию TNF-α (измерено с помощью qPCR).
Фиг.9: Воздействие экстракта водорослей ЕА1, ЕА2 и ЕА3 в соответствии с настоящим изобретением на экспрессию CCL20 (измерено с помощью qPCR).
Фиг. 10: Воздействие экстракта водорослей ЕА1 в соответствии с настоящим изобретением на экспрессию IL6 (измерение с помощью qPCR).
Фиг. 11: Воздействие экстракта водорослей ЕА1 в соответствии с настоящим изобретением на экспрессию IL1α (измерено с помощью qPCR).
Фиг. 12: Воздействие экстракта водорослей ЕА1 в соответствии с настоящим изобретением на экспрессию IL1β (измерено с помощью qPCR).
Фиг. 13: Воздействие экстракта водорослей ЕА1 в соответствии с настоящим изобретением на экспрессию PPARγ (измерено с помощью qPCR).
Фиг. 14: Воздействие экстракта водорослей ЕА1 в соответствии с настоящим изобретением на экспрессию IL12p35 (измерено с помощью qPCR).
Фиг. 15: Воздействие экстрактов водорослей ЕА1 и ЕА3 в соответствии с настоящим изобретением, измеренное с помощью ELIS А на экспрессию TNF-α.
Фиг. 16: Воздействие экстрактов водорослей ЕА1 и ЕА3 в соответствии с настоящим изобретением, измеренное с помощью ELISA на экспрессию IL-8.
Примеры
Пример 1: Приготовление экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением
Одну тонну свежих сырых зеленых водорослей типа Ulva промывают свежей водой, и очищают от песка посредством устройства для промывки водорослей.
Если не утверждается иного, стадии способа осуществляются при комнатной температуре.
Водоросли (1 тонна осушенных водорослей с 8% сухого материала) затем измельчается в виде мелкодисперсных частиц посредством промышленной очистительной машины (марка Inotec тип "I175CDI-75D"). Под «мелкодисперсными частицами» подразумеваются частиц, у которых размер находится в пределах между 50 и 1000 нм, с двумя популяциями, первой, для которой размеры находятся в пределах в пределах между 50 и 200 нм, и второй, у которой размеры находятся в пределах в пределах между 600 и 1000 нм.
Затем измельченный материал прессуется с помощью промышленного ленточного пресса марки Flottweg типа "В FRU 800 HK" при скорости потока примерно 1 тонна/час.
Эта стадия делает возможным отделение твердой фазы (пульпы) от жидкой фазы (сока). Выход полученного сока составляет 75%.
Затем 750 кг полученного сырого сока осветляется посредством пластинчатого осветлителя марки Flottweg типа "АС 2000".
При этом получается 710 кг прозрачного сока с 3,10% сухого материала (выход по массе от 95 до 98%) и крем (2-5% масс).
Впоследствии, прозрачный сок подвергается ультрафильтрации на керамической мембране (Tami Industries) 15 кДа.
При этом получаются пермеат и ретентат. Пермеат собирают до тех пор, пока не будет получено 640 кг отфильтрованного сока (выход 91% объем) 2,2% сухого материала.
Затем отфильтрованный сок (пермеат) сушат посредством сушки вымораживанием, после концентрирования с помощью выпаривания.
Концентрирование осуществляют на испарителе с одинарным действием (EVA 1000, Pignat) со следующими параметрами: принудительное рециркулирование, скорость потока подачи 10 л/час, давление водяного пара 1 бар, давление вакуума 0,3 бар и температура испарения 90°С.
Первая концентрация достигается при скорости потока выпариваемой воды 8 л/час, и градус плотности Брикса повышается от 5,5 (соответствует концентрации сухого материала 4,5%) до 14,7. Затем этот раствор концентрируется второй раз при скорости потока выпариваемой воды 5-6 л/час и Вх повышается до 34. Концентрация сухого материала раствора, как определено, составляет 38,4%.
Затем осуществляется сушка вымораживанием посредством устройства Bioblock scientific (модель CHRIST alpha 1-4 LSC) при температуре вымораживания -80°С, которая также представляет собой минимальную температуру во время этой стадии.
Затем полученный порошок измельчается с помощью планетарного измельчительного устройства MiniMill марки Philips. Продукт вводится в измельчительные чашки (10 г продукта в каждую измельчительную чашку с 4 шарами из диоксида циркония). Все вместе приводится во вращение в течение 15 минут при скорости 10.
При этом получают 14 кг порошка экстракта водорослей.
Пример 2: Определение размера сульфатированных и несульфатированных полианионных полисахаридов экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением согласно GPC (гель-проникающей хроматографии)
3
5
Экстракт водорослей в соответствии с настоящим изобретением, и приготовленный в соответствии с Примером 1, подвергается ультрафильтрации на мембране 1000 Да и растворяется в воде при концентрации 0,5 г/л. Затем его инжектируют в две колонки Shodex 802 и 803, расположенные последовательно (рабочая область колонки 802: 4⋅10Да, а колонки 803: 1,7⋅10 Да). Используемый элюент представляет собой нитрат натрия 0,1 М с азидом натрия 0,2% при скорости потока 0,5 мл/мин. Детектирование осуществляют посредством рефрактометра Wyatt и детектора рассеяния света под 18 углами Wyatt. dn/dc считается равной 0,150 мл/г.
Хроматограмма, детектируемая с помощью рефрактометра, показана на Фиг. 2.
Получают средний размер полисахаридов экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением равный 4,4 кДа.
Пример 3: Определение композиции экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением
Экстракт водорослей в соответствии с настоящим изобретением и приготовленный в соответствии с Примером 1 очищают посредством фронтальной ультрафильтрации на ячейках Amicon, работающих с перемешиванием. Используют мембрану из регенерированной целлюлозы с порогом отсечения 1000 Да. 572,1 мг образца экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением растворяют в 150 мл сверхчистой воды milli-Q. Используют пять литров воды для удаления всех молекул с массой меньше чем 1000 Да. Ретентат сушат вымораживанием. Взвешивают 117 мг образца. Следовательно, выход ультрафильтрации составляет 20,5% (масс/масс). Осуществляют следующие анализы на образцах после ультрафильтрации.
Отношение моносахаридов составляющих полисахариды экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением, определяют в соответствии с методом Kamerling (Kamerling et al., 1975) модифицированным Montreuil (Montreuil et al., 1986). Идентификация и дозировка моносахаридов требуют гидролиза посредством метанолиза полимера для того, чтобы получить только мономеры. Затем гликозидные остатки триметилсилилируются, чтобы сделать их летучими. Таким образом, они идентифицируются и анализируются с помощью газовой хроматографии в форме О-триметилсилилированных метилгликозидов.
Используют следующие реагенты:
- Метанольный раствор/HCl 3 н (Supelco);
- Карбонат серебра;
- Мио-инозитол;
- Пиридин;
- Реагент Sylon ВFT (BSTFA + TMCS 99:1) (Supelco); и
- Дихлорметан.
Рабочая процедура является следующей: 400 мкг экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением, приготовленного, как рассмотрено выше, и 50 мкг мио-инозитола помещают в сухую баню в присутствии 500 мкл 3 н смеси хлористоводородная кислота/метанол (Supelco) в течение 4 часов при 100°С. После охлаждения до комнатной температуры, метанолизат нейтрализуют с помощью карбоната серебра. Образцы центрифугируют в течение 15 минут при 3000 об/мин, и супернатант выпаривают в струе азота. Затем соединения растворяют в 80 мкл пиридина и инкубируют в течение 25 минут при 80°С вместе с 80 мкл Sylon (BSTFA: TMCS, 99:1, Supelco). После осторожного выпаривания избытка реагентов в струе азота, триметилсилилированные метилгликозиды отбирают в 500 мкл дихлорметана, а затем инжектируют в газовый хроматограф (инжектирование in-column, детектор FID: ионизация в пламени). Газ носитель представляет собой азот. Колонка типа HP-5MS (30 м, внутренний диаметр 0,25 мм) является неполярной. Программа повышения температуры является следующей: поддерживают 120°С в течение 1 минуты, а затем градиент 1,5°С/мин до 180°С, затем градиент 2°С/мин до 200°С.
Каждый моносахарид идентифицируют посредством сравнения его времени удерживания по отношению к внутреннему стандарту, со временами удерживания чистых моносахаридов, обрабатываемых при таких же условиях. Коэффициент отклика вычисляется для каждого моносахарида по отношению к внутреннему стандарту для определения пропорции каждого моносахарида в полисахаридах экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением. Полученные результаты показаны в Таблице 1, ниже, и на Фиг. 3.
Пример 4: Оценка активности экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением относительно его иммуномодуляционной активности
Воздействия экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением исследуются на дифференцированных эпителиальных клетках свиньи IPEC-1.
Интестинальные эпителиальные клетки свиньи (Intestinal Porcine Epithelial Cell-1, IPEC-1) представляют собой спонтанно трансформированные еюнальные клетки поросенка.
5
2
Сначала определяют оптимальное количество клеток IPEC-1, которые должны осаждаться в лунках планшета Р6 для достижения конфлюентности через 3 дня. Доза 0,2⋅10 клетки/см удерживается как представляющая собой эту оптимальную дозу.
Затем исследуется максимальная нетоксичная доза экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением для определения максимальной дозы, которая не ингибирует пролиферации клеток для клеток IPEC-1.
Приготавливают два экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением в соответствии с примером 1 (обозначенные как ЕА1 и ЕА2, соответственно).
Третий экстракт водорослей ЕА3 также приготавливают в соответствии с примером
1, но он приготавливается в качестве субъекта последующей стадии очистки.
Для очистки, экстракт ЕА3 подвергается ультрафильтрации на минимальной кассете PALL с порогом отсечки 1 кДа. Затем этот экстракт сушат вымораживанием.
Все три экстракта растворяют в 28 мл полной среды DMEM/F12. Затем приготавливают 50 мл 1% раствора, то есть 0,5 г экстракта отбирают в 50 мл. Затем осуществляют стерилизацию посредством фильтрования на 0,2 мкм мембране.
Затем осуществляют разбавления в 50-мл пробирках Falcon для исследования различных концентраций экстракта водорослей, как показано в таблице 2, ниже.
Затем приготавливают клетки, следуя следующей процедуре:
6
6
1. приготовление 28 мл суспензии клеток при 0,07⋅10 клеток/мл для каждой дозы, которая должна исследоваться, то есть 1,96⋅10 клеток/доза,
2. трипсинизация,
3. промывка клеток PBS без какого-либо Ca-Mg,
4. осаждение ATV Trypsin (2 мл/Т175 или 0,4 мл/лунку Р6) для диссоциации и отсоединения клеток,
5. инкубирование в течение 5 минут при 37°С,
6. отбирают в среду для культивирования,
7. счет с помощью трипана голубого,
8. приготовление 6 15-мл пробирок Falcon с 2,23 мл,
9. центрифугирование и
10. извлечение осадка клеток из каждой пробирки в 28 мл каждого раствора экстракта для исследования и перенос в 50-мл пробирку Falcon.
Культивирование осуществляют посредством осаждения 3 мл/лунка каждой суспензии на планшеты, а затем инкубирования при 37°С в течение 24, 48 и 72 час. Таблица 3 приводит содержимое различных лунок.
Затем культуры наблюдают и необязательно делают фотографии.
Содержимое ячеек собирают и считают в соответствии со следующей процедурой:
1. берут планшет 6 лунками,
2. удаляют супернатант,
3. промывают 1 мл PBS без Ca-Mg,
4. осаждают 0,4 мл/лунка ATV Trypsin,
5. инкубируют в течение 5 мин при 37°С до отсоединения клеток,
6. добавляют 0,6 мл среды для культивирования,
7. хорошо перемешивают и
8. используют трипан голубой при 0,4%, (50 мкл клеток + 50 мкл 0,4% трипана голубого), а затем считают клетки на гемоцитометре от Malassez на 100 прямоугольниках в целом.
Результаты фигур 4-6 показывают, что максимальная нетоксичная доза составляет 0,1% для ЕА1 и ЕА2 и 0,5% для ЕА3.
Стимулирование дифференцированных клеток IPEC-1 с помощью экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением ЕА1, ЕА2 и ЕА3 исследуется в течение 4 час при 37°С (примерно 10 дней после достижения конфлюентности) при D15.
Три дозы (MD (максимальная доза), MD/10, MD/100) исследуют в сравнении с бактериальным LPS (положительный контроль) и со средой дифференциации (отрицательный контроль). Растворы экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением ЕА1, ЕА2 и ЕА3, полученные с помощью способа, указанного в примере 1 приготавливают с помощью 0,1% полной DMEM/F12. Для этого, 0,02 г отбирают в 20 мл и осуществляют стерилизацию посредством фильтрования на мембране 0,2 мкм. Затем осуществляют последовательные разбавления, как показано в таблице 4, ниже.
Количество экстрактов водорослей на клетку показано в таблице 5, ниже.
5
Затем приготавливают раствор в LPS (SIGMA 0111:В4) (доза: 50 нг/10 клеток).
Осаждают 200 нг LPS/лунка при объеме 2 мл. Таблица 6, ниже, показывает различные приготовленные концентрации.
2
На планшетах осаждают 2 мл среды, которую необходимо исследовать, на каждом фильтре, и 3 мл под ним. Все вместе инкубируют затем в течение 4 час при 37°С при 5% CO.
Затем обработанные клетки IPEC-1 собирают для анализа в соответствии со следующей процедурой:
1. лунки промывают два-три раза 1 мл воды с физиологическим буферным раствором,
2. клетки извлекают в 350 мкл буфера RA1 (набор Macherey-Nagel) и
3. осуществляют перенос в пробирки Eppendorf, пронумерованные от 1 до 15.
Затем экстрагируют РНК в соответствии с инструкциями поставщика набора Macherey-Nagel NucleoSpin RNA II, Ref 740955.250, Batch 1211/004. Затем полученные РНК транскрибируют в ДНК посредством обратной транскрипции в соответствии со следующей процедурой:
1. для каждого образца, вычисляют объем, который необходимо отбирать для обработки 1 мкг,
2. осаждают этот объем в каждой лунке полоски, выложенной на охлаждаемый блок,
3. добавляют необходимый объем воды QSP, 9 мкл,
4. добавляют 1,3 мкл Anchored Oligo dT_ праймера 100 мкМ Sample 3154325 Eurogentec,
5. инкубируют в течение 10 минут при 65°С на GeneAmp PCR System 9700 (USER Khalid),
6. в течение инкубирования приготавливают смесь в конической пробирке 1,5 мл (для одного образца) на льду:
i. 4 мкл буфера 5Х
ii. 2 мкл dNTP 20 мМ (Eurogentec)
iii. 1,9 мкл воды milliQ
iv. в последний момент добавляют 0,8 мкл ферментов MuMLV, 25 ед./мкл (МЕ-0125-400) (Eurogentec)
7. на каждый образец добавляют 8,7 мкл смеси до конечного объема 20 мкл,
8. выкладывают полоску на охлаждаемый блок,
9. инкубируют в течение 90 минут при 37°С для полимеризации и 5 минут при 93°С для дезактивации фермента в конце реакции на GeneAmp PCR System 9700, и
10. замораживают при -20°С в боксе DNA(1)MO.
Затем образцы анализируют с помощью qPCR (односторонние тесты ANOVA, различия исследуют с помощью непараметрических критериев Дюннета).
Исследуют воздействие экстракта ЕА1 на экспрессию IL8, TNF-α, CCL20, IL6, IL1-α, IL1-β, PPARγ и IL12p35.
Исследуют воздействие экстрактов ЕА2 и ЕА3 на экспрессию IL8, TNF-α и CCL20. Результаты показаны на Фигурах 7-14.
Они показывают рост экспрессии mRNA различных исследуемых цитокинов.
Иммуностимулирующая активность экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением также оценивается посредством исследования стимулирования факторов иммунитета с помощью ELISA на дифференцированных клетках IPEC-1.
Два используемых коммерческих набора представляют собой набор Kit Duo CXCL8/IL8 свиньи (ref: DY535) и набор Kit Duo TNF-α свиньи (ref: DY690B), поставляемые R&D Systems. Оба набора следуют одинаковой процедуре с использованием иммобилизованного антитела, антитела и системы детектирования и стандартных белков, специфичных к каждому интерлейкину.
Культивирование и инкубирование клеток вместе с экстрактами ЕА1 и ЕА3 для продуцирования цитокинов
5
-7
Клетки IPEC-1 (0,25×10 клеток/см) культивируют на вставках для культивирования в течение 3 дней до тех пор, пока не будет получена конфлюентность клеток. Затем, фетальная сыворотка теленка заменяется дексаметазоном при 10М для дифференцирования клеток в течение периода в пределах между 10 и 14 днями. Три лунки с культурами инкубируют в течение 24 час при 37°С в присутствии экстрактов ЕА1 и ЕА3. Контроли состоят из культур клеток без экстрактов водорослей. Супернатанты культур выше и ниже вставок собирают и хранят при -80°С в пробирке Eppendorf до их анализа.
Дозировка IL8 и TNF-α с помощью ELISA
Иммобилизованные антитела (анти IL-8 или анти TNF-α от мышей), разбавленные до 1/180 в PBS, иммобилизуют в количестве 100 мкл/лунка в течение ночи при комнатной температуре. Осуществляют три операции отмывки для удаления несвязанных антител с помощью 400 мкл/лунка PBS, содержащего 0,05% Tween (промывочного буфера). Затем осуществляют стадию насыщения для блокирования сайтов неспецифичного связывания и тем самым устранения связывания белков, которые должны исследоваться, с пластиком. Для этого добавляют 300 мкл/лунка буфера PBS, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Планшеты инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем промывают три раза 400 мкл/лунка промывочного буфера. Стандартные белки (рекомбинантный IL8 и TNF-α) разбавляют наполовину в буфере PBS, содержащем 1% BSA, для получения концентраций порядка 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125 пг/мл. Объем 100 мкл чистого супернатанта и образца стандартного белка осаждают на одну лунку, а затем инкубируют в течение 2 часов при комнатной температуре. После стадии трех промывок с помощью 400 мкл/лунка буфера, планшеты инкубируют в присутствии 100 мкл/лунка идентифицирующих антител, связанных с биотином, разбавленных до 1/180 с помощью буфера для разбавления, содержащего 2% декомплементизированной сыворотки козы. После инкубирования в течение 2 часов при комнатной температуре, планшеты промывают три раза промывочным буфером, а затем инкубируют вместе со 100 мкл конъюгата Streptavidin-HRP в течение 20 минут при комнатной температуре, не на свету. После трех промывок промывочным буфером, лунки инкубируют вместе со 100 мкл субстрата (объем/объем реагента А и В) в течение 20 минут при комнатной температуре в темноте. Реакция HRP-субстрата прекращается с помощью 50 мкл/лунка стоп-реагента, и осуществляют считывание данных относительно OD (оптической плотности) на 450 нм с помощью считывающего устройства для ELISA Labsystems Multiskan RC. Результаты показаны на фигурах 15 и 16.
Они показывают рост экспрессии белков для различных исследуемых цитокинов.
Выводы
Введение экстракта водорослей в соответствии с настоящим изобретением, следовательно, демонстрирует иммуностимулирующее действие продукта.