Формирование зоны паратомии: возможные клеточные источники новообразованных структур дочерних зооидов

И. В. Загайнова, А. В. Харин, Р. П. Костюченко

ФОРМИРОВАНИЕ ЗОНЫ ПАРАТОМИИ:

ВОЗМОЖНЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ИСТОЧНИКИ НОВООБРАЗОВАННЫХ СТРУКТУР ДОЧЕРНИХ ЗООИДОВ

Введение. Бесполое размножение широко распространено среди различных представителей животного царства,-а для некоторых из них является основным или даже единственным способом репродукции. К настоящему времени эта биологическая проблема изучена недостаточно, а между тем, исследование бесполого размножения представляет огромный интерес, в.том числе и в связи с проблемами клеточной дифференцировки и возможностей клеток менять свою судьбу. В большинстве случаев в результате эмбрионального развития и бластогенеза возникают морфологически идентичные формы, однако эмбриогенез начинается с одной недифференцированной клетки - зиготы, а бесполое размножение происходит при участии нескольких (многих) клеток, которые могут происходить из уже дифференцированных тканей [1,9].

Среди первичноротых животных одной из наиболее распространенных форм бесполого размножения является поперечное деление, т. е. такой тип бесполого размножения, при котором разделение происходит поперек длинной оси животного, и дочерние особи • сохраняют все оси материнского организма [1]. Из всех форм бесполого размножения де-1 ление теснее всего связано с процессами посттравматической регенерации. При делении и регенерации задействованы общие морфогенетические механизмы и генетические программы [10]. Как правило* виды, размножающиеся путем деления, имеют также высокие регенеративные способности [9].

Большой интерес вызывает вопрос о клеточных источниках восстановления недостающих структур зооидов при бесполом размножении, так как он затрагивает проблемы состояния клеточной дифференцировки и возможностей клеток менять свою судьбу под воздействием сигналов, инициирующих бластогенез. Важно понять, насколько широк диапазон клеток, способных отвечать на эти сигналы пролиферацией и дифференцировкой. Могут ли эти сигналы, инициирующие изменение состояния клеточной дифференцировки и пролиферацию, восприниматься всеми типами клеток организма или только некоторыми тканями, или существует специальная популяция клеток, единственно компетентных к ответу на эти факторы путем участия в бластогенезах. Авторы, так или иначе исследовавшие этот вопрос у олигохет, не дают на него однозначного ответа. В то время как одни из них описывают массовую дедифференциацию различных тканей организма [6], другие упоминают участие в восстановительных процессах олигохет исходно недифференцированных клеток, которые они по аналогии со стволовой популяцией планарий называют необластами [2, 11, 15, 19]. Проводить прямые аналогии с бластогенезом планарий в данном случае нельзя, так как у планарий необласты являются единственной популяцией клеток, способных к делению [16, 17]. Терминально дифференцированные клетки планарий неспособны к выхо-  ду из фазы во. У олигохет же рядом авторов описывается способность дифференцированных клеток менять свои потенции. Е. А. Сапаев [5, 6] описывает присутствие в зоне паратомии клеток, имеющих признаки дедифференцированных. Он приписывает им происхождение из эпителиальных тканей - покровного и кишечного эпителия, а также из мышечных кле- ' ток. Возможная дедифференциация мышечных клеток и участие их в восстановительных

© И. В. Загайнова. А. В. Харин. Р. П. Костюченко, 2004

морфогенезах олигохет не отрицается также и авторами, описывающими необласты у оли-гохет [11].

В настоящей работе предпринята попытка ответить на вопрос о клеточных источниках восстановления недостающих структур зооидов. В данном исследовании в качестве объекта использовали олигохет двух видов — Nais communis и Pristina longiseta (Oligochaeta, Naididae), размножающихся исключительно бесполым путем. v

Материалы и методы. Олигохет N. communis и P..longiseta раздельно содержали в кристаллизаторах на культуре нитчатых Chlorophyta при температуре 15—25°С и фотопериоде 16 ч света на 8 ч темноты. Кормом служили живущие на водорослях микроорганизмы.

Приготовление тотальных препаратов. Для измерений линейных размеров червей предварительно анестезировали, добавляя по каплям 30%-ный этиловый спирт в небольшой объем воды, в котором находились черви. Измерения проводились с помощью окуляр-микрометра.

Для приготовления тотальных препаратов, окрашенных по Фёльгену, Мервей фиксировали 4%-ным формалином в течение суток при +4°С. Для предотвращения резкого сокращения мышц объекты предварительно анестезировали 30%-ным этанолом. Реакцию Фёльгена производили по Пирсу [3] с изменениями для тотальных препаратов: для удаления неспецифического связывания время промывки раствором K2S205 увеличено до 50 мин. Реактив Шиффа приготовлен по методу Де Томази.

Изготовление серийных полутонких и ультратонких срезов. Для приготовления серийных полутонких срезов червей после анестезии (как указано выше) фиксировали 2,5%-ным глутаровым альдегидом на 0,1 М PBS в течение суток при +4°С. Затем отмывали в PBS, окрашивали по Фёльгену по методике для тотальных препаратов или спиртовым раствором борного кармина [4], дегидратировали в спиртах восходящей концентрации и заливали в Epon (Fluka, Швейцария) по стандартной методике. Полутонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме LKB-Nova и окрашивали метиленовым синим. Срезы заключали в среду Histokitt (Roth Chemie).

Для приготовления ультратонких срезов червей после анестезии фиксировали 2,5%-ным глутаровым альдегидом 0,05 М PBS в течение двух с половиной часов, отмывали в PBS и затем фиксировали тетроксидом осмия на 0,05 М PBS также в течение двух с половиной часов. Далее олигохет отмывали в PBS, дегидратировали в спиртах восходящей концентрации и заливали в Epon (Fluka, Швейцария) по стандартной методике. Ультратонкие срезы изготавливали на ультрамикротоме LKB-Nova и контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу [7].

Статистические методы. Для анализа динамики трансформации сегмента использовался метод сравнения средних значений двух эмпирических совокупностей (критерий Стьюдента) [8]. При этом все объекты предварительно подвергали анестезии, как указано выше.

Результаты исследований и их обсуждение. В лабораторных условиях олигохёты N. communis и Р. longiseta размножаются исключительно бесполым путем в форме паратомии — такого способа поперечного деления, при котором формирование недостающих структур новых зооидов происходит до их разделения.

Тело животных состоит из простомиума, перистомиума, специализированных головных сегментов, сегментов тела и пигидия. Количество головных сегментов специфично для каждого вида: у Р. longiseta — шесть, а у N. communis — четыре. Головные сегменты отличаются от всех остальных отсутствием хлораго! енных клеток и метанефридиев. У N. communis в них, кроме того, отсутствуют дорзальные щетинки. При бесполом размножении обоих исследованных нами видов в передней части одного из сегментов тела закладывается зона паратомии. По мере роста она разделяется кольцевой бороздой на две части — цефалогенную и соматогенную. Цефалогенная часть дает начало простомиуму, перисто-миуму и головным сегментам заднего зооида, а из соматогенной части образуются пигидий и несколько сегментов тела переднего зооида. Разделение зооидов происходит только после окончательного формирования этих структур. В отличие от N. communis и P. longiseta, у которых в цефалогенной части всегда развиваются только головные сегменты, имеющие отличную от других сегментов морфологию, у Chaetogaster lymnaei, исследованного Е. А. Сапаевым, происходит закладка позади головных сегментов еще некоторого количества сегментов тела. Их мезодерма формируется за счет клеток, образующихся на заднем конце полоски «ларвальной» мезодермы (мезодермы головных сегментов), которые автор называет вторичными телобластами [5,6].

В развитии зоны паратомии у обоих видов мы выделяем три основные стадии — раннюю, среднюю и позднюю перетяжку. На тотальных препаратах ранняя .перетяжка (первый

день с момента ее образования) представляет собой небольшую область с более высокой плотностью клеток, проходящую в передней части сегмента в форму кольца. В это время можно различить кольцевую борозду, разделяющую ее на две части - соматогенную и це-фалогенную. На стадии средней перетяжки (2-3 дня) начинается дифферёнцировка головного ганглия и появляются первые признаки сегментации. У N. communis сегментация соматогенной части значительно опережает метамеризацию цефалогенной части. На стадии поздней перетяжки (4-5 дней) происходит сегментация цефалогенной части, продолжается увеличение количества сегментов в соматогенной части и происходит дифференцировка всех основных структур формирующихся заново частей зооидов.

Динамика трансформации частей сегмента. Для ответа на вопрос о клеточных источниках закладки и развития зоны деления мы, прежде всего, предприняли анализ динамики трансформации частей сегмента. Статистический анализ по критерию Стьюдента показал, что при развитии зоны деления у N. communis и P. longiseta не происходит статистически значимого уменьшения длины прилегающих к перетяжке областей, в то время как длина самой зоны деления по мере развития статистически значимо увеличивается, т. е. увеличение размеров перетяжки происходит не за счет трансформации прилегающих к ней областей сегмента, а за счет пролиферации клеток и/или их миграции из соседних областей. Сохранение немодифицированной структуры частей сегментов, прилегающих к зоне паратомии, подтверждается анализом серийных полутонких срезов, т. е. восстановительные процессы при бесполом размножении у N. communis и P. longiseta предполагают развитие ' большей части структур зооидов за счет клеточной пролиферации, а не трансформации клеток уже существующих частей (за исключением их начальных стадий, когда происходит закладка зоны паратомии и первичное накопление ее клеточного материала). Большинство авторов, изучающих восстановление недостающих частей зооидов при бесполом размножении олигохет, описывают его как процесс, предполагающий значительную клеточную пролиферацию при минимальных трансформациях уже существующих частей зооидов [12, 14], хотя в некоторых случаях архитомия сопровождается незначительными клеточными перестройками в сегментах, не вовлеченных в образование зоны деления [14]. .

Развитие зоны паратомии. В районе зоны деления уже на ранних стадиях появляются недифференцированные, клетки, имеющие высокое ядерно-цитоплазматическое отно-' шение и лишенные аппарата Гольджи и ЭПР. При дальнейшем развитии зоны деления они дают начало всем дифференцирующимся заново структурам дочерних зооидов. На световом и электронном уровнях отмечено измененное состояние покровного эпителия зоны деления по сравнению с другими участками тела и сходство его клеток с недифференцированными клетками зоны деления: клетки покровного эпителия зоны деления имеют высокое ядерно-цитоплазматическое отношение, у них отсутствует аппарат Гольджи и ЭПР. Таким образом, клетки модифицированного покровного эпителия зоны паратомии и клетки бластемы имеют практически идентичную морфологию. Такое измененное состояние эпителия наблюдается на всех стадиях развития зоны паратомии. ‘ ”

На стадии средней перетяжки в соматогенной части обнаруживаются признаки мета-мерного строения. МетаМеры состоят из малодифференцированных клеток, каждому из них соответствует один зачаток вентрального щетинконосного мешка, находящийся в разных метамерах соматогенной части на различных стадиях развития. Ближе к границе зооидов он представлен одной округлой клеткой с менее базофильной цитоплазмой, в метамерах передней части перетяжки он состоит из двух-трех клеток. В цефалогенной части зоны паратомии метамерная структура появляется позднее. Надглоточный ганглий образуется только за счет недифференцированных клеток, в образовании подглоточного ганглия, видимо, принимают участие- нервные элементы материнского организма. Нервная цепочка на данной стадии непрерывна - она проходит через всю зону паратомии. Кишечник также непрерывен, его эпителий сохраняет немодифицированное строение на всем протяжении зоны

паратомии. В формировании цефалогенной части у С. lymnaei, согласно описанию Сапаева, можно видеть ряд отличий от наших данных по N. communis и P. longiseta. Во-первых, в развитии подглоточного ганглия у исследованных нами видов наблюдается участие нервных элементов материнской особи, в то время как у С. lymnaei он образуется заново из эпителия на вентральной стороне. Во-вторых, у N. communis и P. longiseta сохраняется функциональная активность кишечного эпителия и дифференцированное строение, а у С. lymnaei клетки кишечного эпителия претерпевают сильную дедифференцировку.

На стадии поздней перетяжки в соматогенной части наблюдается дальнейшее развитие всех метамерных структур, в том числе диссепиментов и метанефрид^ев. Они развиваются из недифференцированных клеток. Как и в случае щетинконосных мешков, их развитие происходит в новообразованных сегментах, дальше всего отстоящих от сочленения зоо-идов, т. е. в соматогенной части можно наблюдать градиент зрелости новообразованных сегментов, когда самые молодые сегменты находятся ближе к заднему концу переднего зооида. Такое их расположение позволяет предполагать, что их пролиферация происходит в результате действия образующейся в заднем конце переднего зооида зоны роста. В цефалогенной части скопление недифференцированных клеток одновременно отделяет от себя метамеры, соответствующие головным сегментам (четыре у N. communis и шесть у P. longiseta). Развитие характерных для головных сегментов метамерных структур (щетинконосных мешков и диссепиментов) в метамерах цефалогенной части происходит без видимого градиента зрелости, т. е. практически одновременно. На стадии поздней перетяжки нервная цепочка материнского организма теряет непрерывность, возможно, за счет того, что интеркалярный рост перетяжки не сопровождается ее ростом. Часть ее принимает участие в образовании подглоточного ганглия заднего зооида. Кишечник теряет непрерывность. Глотка заднего зооида образуется из недифференцированных клеток.

Сравнение клеточного состава зоны паратомии и сегмента тела. Предположения о клеточных источниках развития зоны паратомии. Данные, полученные нами при исследовании N. communis и P. longiseta, показывают, что зона паратомии на ранних и средних стадиях развития значительно отличается от других участков тела по клеточному составу. В ней отсутствуют (или представлены в гораздо меньшей степени) такие типы дифференцированных клеток, характерных для других областей тела червя, как мышечные клетки, хлорагогенньГе клетки, клетки метанефридиев и целотелия. Из дифференцированных клеточных типов в перетяжке N. communis отмечены только нервные клетки и клетки кишечного эпителия. В перетяжке P. longiseta, кроме того, частично сохраняется мускулатура. В то же время на полутонких срезах и мацератах отмечено присутствие большого количества недифференцированных клеток. Электронно-микроскопические данные подтверждают признаки недифференцированного состояния этих клеток и указывают на две возможные стадии их дифференцировки, характеризующиеся разным состоянием хроматина, что позволяет провести аналогию со стадиями дифференцировки необластов планарий {13]. Наши данные показывают накопление в зоне паратомии большого количества малодифференцированных клеток и отсутствие там большинства дифференцированных клеточных типов, что согласуется с описаниями других авторов [6]. Из описания, данного Сапаевым, можно предполагать происхождение большей части клеточного материала зоны паратомии в результате дедифференциации клеток исходно дифференцированных тканей.

Следует отметить, что ряд авторов, описывающих восстановительные процессы у олигохет, говорят об участии в них некой популяции исходно недифференцированных клеток, которые они по аналогии со стволовой популяцией планарий также называют необлас-тами [2, 11, 15, 18, 19]. Однако среди описаний необластов у олигохет не встречается работ, которые определяли бы их именно как популяцию и давали бы серьезные доказательства участия их в образовании каких-либо частей зоны паратомии.

Как было сказано выше, клетки покровного эпителия зоны деления, так же как и не-

дифференцированные клетки, имеют высокое ядерно-цитоплазматическое отношение, у них отсутствуют аппарат Гольджи и ЭПР. Таким образом, клетки модифицированного покровного эпителия зоны паратомии и клетки бластемы имеют практически идентичную морфологию.

Специфическая окраска ДНК на тотальных препаратах выявляет митотические фигуры в клетках покровного эпителия зоны деления и в недифференцированных клетках. Положение митотических фигур свидетельствует о том, что ориентация митозов покровного эпителия направлена внутрь тела червя, а форма некоторых клеток покровного эпителия позволяет предположить их выселение. -

Свидетельства участия каких-либо других клеток в формировании бластемы нам обнаружить не удалось. ,

Таким образом, данные, полученные нами для видов N. communis и P. longiseta, не дают оснований предполагать присутствия у этих вйдов значительной стволовой популяции первично недифференцированных клеток, но хорошо согласуются с предположением о роли дедифференцированного покровного эпителия в образовании большей части клеточного материала зоны паратомии.

Статья рекомендована проф. А. К. Дондуа.

Summary

. Zagainova I. V., KharinA. V., Kostyuchenko R. P.. Formation of a paratomy zone: possible cell sources of newly formed structures of daughter zooids. '

Asexual reproduction in oiigochaete N. communis and P. longiseta is accompanied by forming of a paratomy zone, which gives rise to structures of new zooids. Our data show accumulation of a large number of undifferentiated cells in the paratomy zone and absence of most differentiated cell types there, and also the similarity between cover epithelium cells and undifferentiated cells. Mitoses were found only in cover epithelium cells of fission zone and in undifferentiated cells. These data allow us to suppose that dedifferentiated cover epithelium may have contributed to the formation of most part of cellular material in the paratomy zone. "

Литература

1. Иванова-Казас О. М. Бесполое размножение животных. Л., 1977. 2. Касинов В. Б. Необласты и развитие заднего регенерата у низших олигохет: Автореф. канд. дис. JL, 1963. 20 с. 3. Пирс Э. Гистохимия. М., 1962. 4. Ро-мейс Б. Микроскопическая техника. М., 1953. 5. Сапаев Е. А. Очерки морфологии и биологии двух подвидов Chaetogaster lymnaei, Baer, 1827: Канд. дис. Казань, 1976. 149 с. 6. Сапаев Е. А. Ультраструктурные аспекты морфогенетических процессов в задней части зоны паратомии олигохеты Chaetogaster lymnaei II Цитология. 1978. Т. 20, № 2. С. 149-153. 7. Уикпи Б. Электронная микроскопия для начинающих. М., 1975. 8. Урбах В. Ю. Биометрические методы. М., i964. 9. Bely A. Decoupling of fission and regenerative capabilities in an asexual oiigochaete //

Hydrobiologia. 1999. Vol. 406. P. 243-251.10. Bely A., Wray G. Evolution of regeneration and fission in annelids: insights

from engrailed and orthodenticle-class gene expression // Development. 2001. Vol. 128. P. 2781-2791. 11. BilelloA., PostwaldH. A cytological and Quantitative Study of Neoblasts in the Naid Ophidonais serpentina (Oligochaeta) // Wilhelm Roux’ Archiv. 1974. Vol. 174. P. 234-249. 12. Christensen B. Asexual reproduction in the Enchytraeidae (Oligochaeta) // Nature. 1959. Vol. 184, N4643. P. 1159-1166. 13. Gschwentner R„ Ladurner P., Nimeth K„ RiegerR. Stem cells in basal bilaterian (S-phase and mitotic cells in Covolutriloba longifissura (Acoela, Platyhelminthes)) // Cell Tissue Res. 2001. Vol. 304. P. 401—408. 14. Myohara М., Yochida-Noro С., Kobari F., Tochinai S. Fragmenting

oiigochaete Enchytraeusjaponensis: A new material for regeneration study // Develop. Growth Differ. 1999. Vol. 41, N 5. P. 549-555. 15. O’Brien J. P. Studies on effects of x-rays on regeneration in the fragmenting oiigochaete Nais paraguayensis // Growth. 1942. Vol. 6. P. 203-229. 16. Sanchez Alvarado A., New mark P. A. The use of planarians to dissect the molecular basis of metazoan regeneration // Wound Rep. Reg. 1998. Vol. 6. P. 413-420. 17.

Sanchez Alvarado A., Newmark P. A. Regeneration in Planaria // Encyclopedia of Life Sciences. 2001. P. 1-7. 18. Yochida-Noro C„ Myohara M, Kobari F., Tochinai S. Nervous sysem dynamics during fragmentation and regeneration in Enchytraeus japonensis (Oligochaeta, Annelida) // Dev. Genes Evol. 2000. Vol. 210. P. 311-319. 19. Zhinkin L. Ueber die Bedeutung der Mesodermanlagen bei der Regeneration von Rhynchelnis limosella (Untersuchungen ueber die Wirkung der Roentgenstrahlen auf regeneration und Transplantation)//Zool. Anz. 1934. Bd 105. S. 305-312.

Статья поступила в редакцию 17 июня 2004 г.