РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS NIDULANS И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ 11α-ГИДРОКСИЛИРОВАНИЯ ПРОГЕСТЕРОНА И ДЛЯ АЦЕТИЛИРОВАНИЯ 11α-ГИДРОКСИПРОГЕСТЕРОНА
RECOMBINANT STRAIN OF FILAMENTOUS FUNGUS ASPERGILLUS NIDULANS AND ITS USE FOR PROGESTERONE 11Α-HYDROXYLATION AND FOR ACETYLATION OF 11Α-HYDROXYPROGESTERONE

Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а также к генетике и молекулярной биологии, конкретно к клеткам живых культур, включая рекомбинантные, и касается создания и применения нового рекомбинантного штамма мицелиального гриба для гидроксилирования и ацетилирования стероидных соединений, в частности, соединений ряда прегнана (производных прогестерона), и может быть использовано в промышленной биотехнологии, а также в фармацевтической промышленности, для производства стероидных медицинских препаратов.
Уровень техники
11
9
Введение гидроксильной группы в положение С стероидной молекулы имеет большое промышленное значение, так как не только обеспечивает изменение биологической активности исходной молекулы в желаемом направлении, но и создает возможность для дальнейшей модификации молекулы, например, введения атома галогена в положение С, с целью создания фармакологически более активных производных. Осуществление 11(α/β)-гидроксилирования стероидов микроорганизмами, особенно прогестерона, является экономически важным для производства кортикостероидов, так как одной из основных проблем их синтеза является введение кислородной функции в 11 положение, трудно осуществимое химическими методами. Так, например, химический синтез кортизона из желчных кислот включает ~30 стадий и общий выход составляет несколько десятых долей процента [Л. Физер, М. Физер. Стероиды. Пер. с англ. под ред. д.х.н. Н.Н Суворова и д.х.н. И.В. Торгова. М.: Мир, 1964, с. 673]. Напротив, синтез ацетата кортизона из 11α-гидроксипрогестерона состоит из 10 стадий и общий выход достигает 14,6% [SU 106380, 1956].
Известно, что 11-гидроксилирование стероидов в одну стадию с высокой степенью селективности возможно только биотехнологически с применением ферментной системы микроорганизмов, в основном, мицелиальных грибов, одним из которых является род Aspergillus. Однако этому роду присуща видовая специфичность трансформации стероидов ряда прегнана. Так, трансформация прогестерона у ряда видов (например, А. terreus [K. Yildirim, A. Uzuner, and E.Y. Gulcuoglu. Biotransformation of some steroids by Aspergillus terreus MRC 200365. Collect. Czech. Chem. Commun. 2010, Vol. 75(6), 665-673], A. tamarii [K. Yildirim, A. Uzuner and E.Y. Gulcuoglu. Baeyer-Villiger oxidation of some steroids by Aspergillus tamarii MRC 72400. Collect. Czech. Chem. Commun. 2011, Vol. 76(6), 743-754], A. versicolor [H.Y. Yang, H.L. Su, G. Du, G.J. Shen, J.X. Sun, and H.Y. Chen. Progesterone side-chain cleavage by Aspergillus versicolor. Advanced Materials Research. Advances in Chemical Engineering III. 2013. Vols. 781-784, 1164-1167; Abed Nosrat M. Side chain degradation of progesterone by Aspergillus versicolor 79. Pakistan Journal of Biochemistry, 1972, Vol. 5(1), 5-7], A. flavus [M.E. Mostafa, and A.A. Zohri. Progesterone side-chain degradation by some species of Aspergillus flavus group. Folia Microbiol (Praha). 2000; Vol. 45(3), 243-7]) может протекать не в направлении гидроксилирования, а в направлении элиминирования боковой прегнановой цепи с образованием соединений ряда андростана. Другие штаммы рода Aspergillus способны гидроксилировать прогестерон, вводя гидроксильную группу в различные положения молекулы, в том числе в 11α-положение. При этом направление гидроксилирования может существенно зависеть не только от видовой принадлежности штамма, но и от условий проведения трансформации.
Биотрансформация прогестерона с образованием 11α-гидроксипрогестерона наиболее изучена с применением грибов Aspergillus ochraceus, селективность 11α-гидроксилирования у которых может достигать 90% и более [Т.K. Dutta, and Т.В. Samanta. Bioconversion of progesterone by the activated immobilized conidia of Aspergillus ochraceus TS. Curr. Microbiol. 1999; Vol. 39(6), 309-312; P. Somal, and C.L. Chopra. Microbial conversion of steroids. III: 11a-hydroxylation by fungal mycelium. Applied Microbiology and Biotechnology, 1985, Vol. 21(5), 267-269]. Штаммы A. ochraceus нашли применение в качестве промышленных культур.
17
20
Мицеллиальный гриб Aspergillus nidulans является одной из наиболее известных эукариотических генетических систем и широко используется в качестве модельной системы для расшифровки биологии клеточного цикла, патогенности, лекарственной устойчивости, болезней человека, первичного и вторичного метаболизма других микроорганизмов. Несмотря на это, штаммы гриба A. nidulans как стероид-трансформирующие микроорганизмы мало изучены. Однако имеются сообщения, что этот вид обладает 11α-монооксигеназной активностью и способен трансформировать прогестерон с образованием преимущественно 11α-гидрокси-производного. Так, M.J. Henry и H.D. Sisler [M.J. Henry, and H.D. Sisler. Effects of sterol biosynthesis-inhibiting (SBI) fungicides on cytochrome P-450 oxygenations in fungi. Pesticide Biochemistry and Physiology, 1984, Vol. 22(3), 262-275], изучая влияние фунгицидов, ингибирующих биосинтез эргостерина в грибах, на цитохором-Р450-зависимое гидроксилирование прогестерона, сообщили, что гриб A. nidulans (Eidam) Winter (штамм 003) гидроксилирует прогестерон при начальной концентрации 100 мкг/мл с образованием смеси, содержащей 11α-гидроксипрогестерон (50%), 6β-гидроксипрогестерон (5%), 6β,11α-дигидроксипрогестерон (14%) и неконвертированный прогестерон (31%). При этом лиазная активность (расщепление боковой цепи по связи С-С) у этого штамма не наблюдалась.
Также известно, что культура гриба A. nidulans (из коллекции Центра культур лаборатории микробиологической химии, National Research Centre, Каир, местная среда обитания), обладая стероид-11α-гидроксилирующей активностью, может трансформировать прогестерон не только в 11α-гидроксипрогестерон, но и в 21-гидроксипрогестерон (он же 11-дезоксикортикостерон) [А.Н. El-Refai, and K.М. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338; A.H. El-Refai, and K.M. Ghanem. Microbial response to steroids. Egyptian Journal of Microbiology, 1989, Vol. 23(1), 1-11]. Авторы вносили прогестерон в ростовую среду в растворе 96% этанола с финальной концентрацией растворителя 1%. Трансформацию прогестерона проводили с нагрузкой 1 г/л при температуре 30±2°С на качалке (200 об/мин, амплитуда 7 см) в течение 48 ч. При этом наблюдалось образование дигидроксилированного производного - 6β,11α-дигидроксипрогестерона. Был сделан вывод, что при значениях рН среды, близких к нейтральным, 6β-гидроксилирование является вторичным процессом и 6β,11α-дигидроксипрогестерон образуется из первично образованного 11α-гидроксипрогестерона [А.Н. El-Refai, and K.М. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338].
Известно, что микроорганизмы способны ацетилировать стероидные вторичные спирты. Так, известна способность некоторых видов дрожжей и дрожжеподобных организмов (Saccharomyces fragilis, S. lactis, Candida pseudotropicalis и Torulopsis sphaerica) ацетилировать тестостерон [A. , M. Tadra, and J. . Microbial transformations of steroids XXIV. Separation of androstane 17-hydroxy-epimers. Folia Microbiol. 1964, Vol. 9(6), 380-382]. При этом отмечалось, что ацетилирование происходит только с 17β-гидроксипроизводным, тогда как соответствующий 17α-эпимер остается нетронутым. В этих условиях не происходит ацетилирования молекулы стероида с гидроксигруппой в положениях 11α, 11β, 20β и 21. Однако информация о способности мицелиальных грибов, к которым относится род Aspergillus, ацетилировать стероидные спирты, в литературных источниках отсутствует.
Из уровня техники известно, что ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона осуществляют химически, используя в качестве ацетилирующего агента уксусный ангидрид. Так, известным химическим методом [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74 (23), 5933-5936] получают 11α-ацетоксипрогестерон, ацетилируя 11α-гидроксипрогестерон (20 мг) действием уксусного ангидрида (0,6 мл) в среде пиридина (0,6 мл). Смесь выдерживают в течение 16 ч при комнатной температуре. По окончании реакции реакционную массу разбавляют 25 мл воды, выдерживают в течение 1 ч, охлаждают для начала кристаллизации. Кристаллы отделяют фильтрацией, промывают водой и сушат. Получают 16,1 мг 11α-ацетоксипрогестерона с т.пл. 176-177°С.
Таким образом, из уровня техники следует, что образование 11α-ацетоксипрогестерона при трансформации прогестерона культурами мицеллиальных грибов вообще, в частности, рода Aspergillus, конкретно Aspergillus nidulans, ранее не наблюдалось. О применении грибов A. nidulans, обладающих стероид-11α-гидроксилирующей активностью и способных конвертировать прогестерон в 11α-гидроксипрогестерон, для получения 11α-ацетоксипрогестерона сообщается впервые. При этом этерификация 11α-гидроксипрогестерона грибом A. nidulans с образованием 11α-ацетоксипрогестерона является вторым этапом процесса трансформации прогестерона и может быть осуществлена как с выделением, так и без выделения 11α-гидроксипрогестерона из культуральной жидкости, образованного на первом этапе биотрансформации.
11α-Гидроксипрогестерон (11α-гидроксипрегн-4-ен-3,20-дион, CAS №80-75-1) является физиологически активным производным прогестерона (прегн-4-ен-3,20-диона, CAS №57-83-0) - нативного стероидного гормона, синтезируемого желтым телом яичника, корковым веществом (корой) надпочечников, семенными пузырьками и плацентой. Препараты на основе прогестерона применяются в качестве лекарственных средств в медицине и ветеринарии. 11α-Гидроксипрогестерон, как и его 11β-эпимер, обладает ингибирующей активностью в отношении фермента 11β-гидроксистероид-дегидрогеназы, который окисляет 11-гидрокси-группу в 11-кето-группу, таким образом играя регулятивную роль в поддержании электролитного баланса [G.W. Souness, S.A. Latif, J.L. Laurenzo, D.J. Morris. 11 alpha- and 11 beta-hydroxyprogesterone, potent inhibitors of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase (isoforms 1 and 2), confer marked mineralocorticoid activity on corticosterone in the ADX rat. Endocrinology. 1995, Vol. 136(4), 1809-1812].
11α-Ацетоксипрогестерон (11α-гидроксипрогестерона ацетат, CAS №2268-98-6) обладает физиологической активностью, является активным фармацевтическим ингредиентом и относится к средствам, снижающим риск преждевременных родов [http://www.imcopharma.cz/ru/api/11-alfa-gidroksiprogesteron-acetat]. 11α-Ацетоксипрогестерон также служит исходным субстратом в синтезе других стероидных соединений.
11α-Ацетоксипрогестерон и 11α-гидроксипрогестерон, являясь производными прогестерона, обладающими гестагенной активностью, могут быть использованы в комбинации с природными или синтетическими эстрогенами в качестве активного ингредиента как в препаратах для пероральной контрацепции, так и в препаратах для гормональной заместительной терапии женщин в постклимактерический период.
Кроме того, 11α-гидроксипрогестерон и его ацетат могут быть использованы не только в качестве прогестагенных средств, как указано выше, но и в качестве антиандрогенных агентов для снижения сальных выделений у пациентов, страдающих себореей, аллопецией и другими заболеваниями кожи, связанными с гиперандрогенизацией [RU 2432952, 2011]. Также известны косметические композиции для ухода за волосами и кожей головы, содержащие 11α-гидроксипрогестерон или 11α-ацетоксипрогестерон [DE 2757024, 1979]. При этом отмечено, что у этих соединений при местном применении гормональные побочные эффекты отсутствуют.
11α-Гидроксипрогестерон и 11α-ацетоксипрогестерон могут быть использованы как исходные продукты в синтезе других лекарственных средств для медицинского применения. Например, 11α-гидроксипрогестерон может быть использован в синтезе 11-кетопрогестерона (кетогестина, CAS №516-15-4), который далее превращают в кортизон или 11β-гидроксипрогестерон - предшественник нативного гидрокортизона - методами, известными из уровня техники. Химический метод перехода от 11α-гидроксипрогестерона к 11-кетопрогестерону с выходом более 90% и далее в 11β-гидроксипрогестерон описан в патенте [US 2015376225, 2015, примеры 1 и 7 соответственно]. Кроме того, 11α-гидроксипрогестерон может быть использован в качестве исходного соединения в синтезе перспективных аналогов нейростероидного анестетика альфаксолона [P.Y. Savechenkov, D.C. Chiara, R. Desai, A.T. Stern, X. Zhou, A.M. Ziemba, A.L. Szabo, Y. Zhang, J.B. Cohen, S.A. Forman, K.W. Miller, K.S. Bruzik. Synthesis and pharmacological evaluation of neurosteroid photoaffinity ligands. European Journal of Medicinal Chemistry. 2017. Vol. 136, P. 334-347].
Раскрытие изобретения
11
11
Технической задачей, решаемой с помощью настоящего изобретения, является расширение номенклатуры микроорганизмов, способных проводить 11α-гидроксилирование прогестерона, а именно, создание нового рекомбнантного штамма аскомицета A. nidulans, содержащего новую автономно реплицируемую плазмиду, способного к 11α-гидроксилированию прогестерона, а также расширение ассортимента методов ацетилирования вторичной гидроксильной группы при атоме С молекулы прогестерона, благодаря наличию способности штамма по настоящему изобретению ацетилировать вторичную гидроксильную группу при атоме С молекулы прогестерона, как альтернативы химическому методу ацетилирования.
-
r
-
-
-
-
Поставленная задача решалась путем использования штамма A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG), полученного трансформацией автономно реплицируемой плазмиды pDHG25-SgrDI с геном устойчивости к ампициллину AP, геном argB и уникальным сайтом рестрикции SgrDI в штамм A. nidulans 031 (argB; pyrG) - ауксотроф штамма дикого типа A. nidulans ВКПМ F-1069 ранее для биотрасформации стероидных соединений, в том числе прогестерона, не применялся. Штамм A. nidulans 031 (argB; pyrG) (synonym FP-308.1; AN031; CBS 129193) - ауксотроф штамма Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 (synonym FGSC A4; ATCC 3863, 12996, 26451; CBS 112.46; NRRL 194), несущий мутации argB2 (требующий аргинин) и pyrG89 (требующий уридин и урацил).
-
Штамм A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) - новый рекомбинантный штамм, получен впервые, его стероид-11α-гидроксилирующая активность обнаружена впервые. Этот штамм впервые применен для биотрасформации прогестерона. Установлена способность этого штамма конвертировать прогестерон в 11α-гидроксипрогестерон и 11α-ацетоксипрогестерон.
-
Для получения штамма A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) была создана новая плазмида pDHG25-SgrDI. Плазмида pDHG25-SgrDI сконструирована на основе известной автономно реплицируемой плазмиды pDHG25 для организма Aspergillus nidulans [D. Gems, I.L. Johnstone, A.J. Clutterbuck. An autonomously replicating plasmid transforms Aspergillus nidulans at high frequency. Gene, 1991, Vol. 98, 61-67] путем введения в нее уникального сайта SgrDI с помощью известных молекулярно-генетических методов [J. Sambrook, Т. Maniatis, and E.F. Fritsch. Molecular cloning a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989].
Для вставки уникального сайта SgrDI проводилась рестрикция известной автономной плазмиды pDHG25 по сайту BamHI с помощью рестриктазы BamHI. Затем проводили дефосфорилирование концов фрагмента с помощью щелочной фосфатазы. Олигонуклеотидный линкер Bam_SgrDI (SEQ ID №1) фосфорилировали T4 полинуклиотидкиназой и с помощью Т4 ДНК-лигазы лигировали дефосфорилированный фрагмент с линкером.
r
Полученная плазмида pDHG25-SgrDI содержит: репликон плазмиды рМВ1; ген устойчивости к ампициллину AP, что обеспечивает репликацию в E. coli; ген argB A. nidulans; участок АМА1, обеспечивающий автономное реплицирование в A. nidulans, представляющий собой обратный повтор, который является участком центромеры хромосомы A. nidulans. На фиг. 1 изображена карта кольцевой автономно реплицируемой плазмиды pDHG25-SgrDI.
-
-
-
Проведена трансформация мутантного штамма A. nidulans 031 (argB; pyrG) полученной плазмидой pDHG25-SgrDI, несущей ген argB, с отбором на селективной среде. Из полученных трансформантов, способных расти на среде без аргинина, для дальнейшей работы был выбран штамм, обозначенный как A. nidulans 031/ pDHG25-SgrDI (pyrG). [Aleksenko, A.Y., Makarova, N.A., Nikolaev, I.V., and Clutterbuck, A.J., Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet., 1995, vol. 28, pp. 474-478].
Техническим результатом является создание нового рекомбинантного штамма мицелиального гриба и применение его для биокаталитического получения стероидных спиртов и их этерификации без использования химических методов. Получение 11α-ацетоксипрогестерона биотрансформацией прогестерона в одну стадию имеет преимущества перед известным из уровня техники двухстадийным процессом, включающим следующие этапы: 1) микробиологическое 11α-гидроксилирование прогестерона и 2) химическое ацетилирование вторичной 11α-гидроксильной группы. Биотехнологическое 11α-гидроксилирование прогестерона и ацетилирование образованного 11α-гидроксипрогестерона с выделением или без выделения его из реакционной массы является экономически эффективным процессом, преимущества которого перед химическим методом ацетилирования состоят в следующем:
- процесс проводится без использования агрессивных химических реагентов, таких как уксусный ангидрид или хлорангидрид уксусной кислоты, без использования сильных минеральных кислот в качестве катализаторов ацетилирования, таких как 60% хлорная кислота;
- биокаталитическая этерификация 11α-гидроксипрогестерона является альтернативой химическому методу ацетилирования, является экологически более чистым и безопасным методом;
4
- биокаталитическое ацетилирование протекает регионаправленно без образования побочного продукта енолацетилирования Δ-3-кетогруппы молекулы 11α-гидроксипрогестерона - 3,11α-диацетоксипрегна-3,5-диен-20-она, содержание которого при использовании химического метода ацетилирования может сотавлять 20-30%, что существенно осложняет очистку целевого 11α-ацетоксипрогестерона и приводит к потерям его выхода.
Для достижения указанного выше технического результата предлагается использовать новый штамм Aspergillus nidulans по заявляемому изобретению в качестве биокатализатора для биотехнологических процессов 11α-гидроксилирования и 11α-ацетоксилирования прогестерона, а также биокаталитической этерификации 11α-гидроксипрогестерона.
11
1,4
11α-Ацетоксипрогестерон при необходимости может быть гидролизован любым удобным способом с образованием 11α-гидроксипрогестерона, известным из уровня техники. Так, например, известен химический метод получения 11α-гидроксипрогестерона сольволизом 11α-ацетоксипрогестерона действием (бистрибутилолово)оксида [M.G. Perez, and M.S. Maier. Mild deprotection of steroid esters by bis(tributyltin)oxide. Tetrahedron Letters, 1995. Vol. 36(19), 3311-3314] или традиционным способом химического сольволиза в условиях основного катализа: в среде метанола в присутствии КОН [Т. Kubota, and F. Hayashi. Studies on A-norsteroids - VI. Directing effects of С substituents on the addition of osmium tetroxide to steroidal Δ-3-ketones. Tetrahedron, 1967. Vol. 23, 995-1006].
Культурально-морфологические особенности заявляемого штамма.
-
Штамм A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) на агаризованной среде образует круглые колонии диаметром 30-35 мм через 7 суток роста. Поверхность ровная, выпуклая, пушистая. Текстура средней плотности. Край колоний плотный, неровный. Цвет колоний в зоне спороношения зеленовато-белый. Обратная сторона палево-коричневая. Эксудат отсутствует. Характеризуются интенсивным спороношением. Цвет спор ярко-зеленый.
Основным свойством штамма по заявляемому изобретению является наличие стероид-11α-гидроксилирующей активности и способности конвертировать прогестерон в 11α-ацетоксипрогестерон, а также ацетилирующей активности и способности этерифицировать 11α-гидроксипрогестерон.
-
Схема создания нового штамма A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) по настоящему изобретению, исходя из известного штамма A. nidulans ВКПМ F-1069, приведена на фиг. 2.
-
На фиг. 3 представлена схема трансформации прогестерона заявляемым штаммом Aspergillus nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG).
-
-
Трансформация прогестерона протекает с первичным образованием 11α-гидроксипрогестерона. Процессы ацетилирования гидроксильной группы образованного 11α-гидроксипрогестерона и его 6β-гидроксилирования с образованием 6β,11α-дигидроксипрогестерона являются вторичными, конкурентными процессами трансформации, причем процесс биокаталитической этерификации имеет преимущества. Этот вывод подтвержден экспериментально. При продолжительности трансформации 14 ч штаммом A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) в культуральной среде определено наличие только 11α-ацетоксипрогестерона и нетрансформированного исходного субстрата. Кроме того, используя 11α-гидроксипрогестерон вместо прогестерона в качестве исходного субстрата в аналогичных условиях трансформации штаммом А. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG), было отмечено, что в течение 23 ч имеет место образование исключительно 11α-ацетоксипрогестерона.
-
-
-
Таким образом, сущность заявленного изобретения заключается в создании нового рекомбинантного штамма мицелиального гриба A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) трансформацией новой автономно реплицируемой плазмиды pDHG25-SgrDI в штамм А. nidulans 031 (argB; pyrG) - ауксотроф штамма дикого типа Aspergillus nidulans ВКПМ F-1069 - и его применении для 11α-гидроксилирования прогестерона и ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона с выделением или без выделения последнего из культуральной жидкости.
-
Преимущества применения штамма A. nidulans 03l/pDHG25-SgrDI (pyrG) по настоящему изобретению состоят в способности конвертировать прогестерон в 11α-гидроксипрогестерон и ацетилировать гидроксильную группу в молекуле 11α-гидроксипрогестерона с образованием 11α-ацетоксипрогестерона как с выделением 11α-гидроксипрогестерона из культуральной среды, так и без выделения, in situ.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 изображена карта кольцевой автономно реплицируемой плазмиды pDHG25-SgrDI.
На фиг. 2 представлена схема создания штамма Aspergillus nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) по настоящему изобретению, исходя из известного штамма A. nidulans ВКПМ F-1069.
На фиг. 3 представлена схема трансформации прогестерона штаммом A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG).
На фиг. 4, 7 и 15 представлены хроматограммы хромато-масс-спектрометрического анализа 11α-гидроксипрогестерона, 11α-ацетоксипрогестерона и 6β,11α-дигидроксипрогестерона соответственно.
1
На фиг. 5 и 6 представлены Н ЯМР-спектры 11α-гидроксипрогестерона.
1
13
На фиг. 8-14 представлены Н ЯМР-, С ЯМР-, DEPT-ЯМР-, HSQC-ЯМР- и НМВС-ЯМР- спектры 11α-ацетоксипрогестерона.
1
13
На фиг. 16-23 представлены Н-ЯМР-, С-ЯМР-, DEPT-ЯМР-, HSQC-ЯМР- и НМВС-ЯМР - спектры 6β,11α-дигидроксипрогестерона.
Осуществление изобретения
-
-
Ауксотроф штамма A. nidulans ВКПМ F-1069 - A. nidulans 031 (argB, pyrG) (synonym FP-308.1 [U. Christensen, B.S. Gruben, S. Madrid, H. Mulder, I. Nikolaev, and R.P. de Vries, Unique Regulatory Mechanism for d-Galactose Utilization in Aspergillus nidulans, Appl Environ Microbiol. 2011 Vol. 77(19), 7084-7087]; AN031 [J.V. Forment, D. , and A.P. MacCabe; Consecutive gene deletions in Aspergillus nidulans: application of the Cre/loxP system. Curr Genet. 2006. Vol. 50, 217-224]); депонирован в коллекции "The CBS-KNAW culture collection" (Нидерланды) под номером CBS 129193 [http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/Biolomics.aspx?Table=CBS%20strain%20database].
21
30
2
21
30
3
23
32
4
Прогестерон (I) (CAS №57-83-0, CHO), 11α-гидроксипрогестерон (II) (CAS №80-75-1, CHO) и 11α-ацетоксипрогестерон (CHO, M.w. 372.5 являются коммерчески доступными и могут быть приобретены, например, у компании Steraloids Inc. (USA) или у других производителей.
Неорганические соли были приобретены у компании Fluka (Germany). Дрожжевой экстракт и агар - Difco Becton Dickinson and company (Sparks, USA).
Другие реагенты, растворители, и инертные газы являются коммерчески доступными, были приобретены у российских производителей.
Для приготовления сред для культивирования и трансформации, водных растворов кислот, солей и щелочей использовали дистиллированную воду. Для промывки экстрактов в органических растворителях использовали питьевую водопроводную воду, если не оговорено особо.
Все процедуры, если не оговорено особо, осуществляли при комнатной температуре или температуре окружающей среды, то есть в диапазоне от 20 до 25°С. Для процессов, требующих более низкие температуры, чем комнатная, охлаждение обеспечивали холодной водопроводной водой (в диапазоне от 10 до 20°С), или смесью колотого льда и холодной воды (в диапазоне от 5 до 10°С), или смесью колотого льда и хлорида кальция (при температуре ниже 5°С).

Культивирование микроорганизмов осуществляли на качалке New Brunswick™ Innova 44/44R в термостатированном помещении при температуре 37°С (240-250 об/мин., амплитуда 5 см).
2
Упаривание растворителей в вакууме осуществляли с использованием ротационного вакуумного испарителя Rotavapor ( Labortechnik AG), при остаточном давлении 0,35±0,05 кгс/см (35±5 кПа) и температуре воды в бане в диапазоне от 35-50°С в зависимости от природы упариваемого растворителя.
2
Высушивание кристаллов продуктов до постоянного веса осуществляли при температуре 35-45°С при атмосферном давлении или с использованием вакуум-сушильного шкафа при остаточном давлении 0,35±0,05 кгс/см (35±5 кПа).
Для определения рН промывных вод использовали универсальную индикаторную бумагу с диапазоном значений от 0 до 12 (Лахема, Чехия).
Колоночную хроматографию осуществляли на колонке (16×650 мм), используя силикагель марки Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) (Merck, Germany).
Контроль за ходом элюирования осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя пластины Silica gel 60 F254 (Merck, Germany) и хроматографические системы растворителей: дихлорметан-ацетон 9:1 (v/v) или дихлорметан-ацетон 4:1 (v/v). Пластинки просматривали в УФ-свете при длине волны 254 нм, затем опрыскивали 1% раствором ванилина в 10% водном растворе HClO4, проявляли при температуре 100-120°С.
Структуру и чистоту всех выделенных соединений подтверждали, по меньшей мере, одним из следующих методов: ТСХ (пластины для ТСХ Silica gel 60 F254 (Merck, Germany)), масс-спектрометрия, элементный анализ, ядерный магнитный резонанс (ЯМР), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).
Температуру плавления выделенных соединений определяли на приборе для определения точки плавления М-565 ( Labortechnik AG).
1
13
Н- и C- ЯМР спектры были определены на спектрометре Bruker Avance-400 (Bruker BioSpin GmbH) с рабочей частотой 400 МГц и 100.6 МГц соответственно, используя дейтерированный хлороформ (99,8% D, Sigma-Aldrich), или дейтерированный диметилсульфоксид (99,9% D, Sigma-Aldrich) в качестве растворителя относительно тетраметилсилана (TMS NMR grade ≥99,9%, Sigma-Aldrich) в качестве внутреннего стандарта, в миллионных долях (м.д.).
Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) регистрировали на приборе Bruker Daltonics micrOTOF-Q II, используя электрораспылительную ионизацию (ESI). Измерения были получены в режиме положительных ионов со следующими параметрами: граничное напряжение капилляра 4500 В; диапазон масс от m/z 50 до 3000; внешняя калибровка (Electricpray Calibrant Solution, Fluka); давление распылителя 0,4 бар; скорость потока 3 мкл/мин; азот применяли в виде сухого газа (6 л/мин); температура интерфейса была установлена при 180°С. Образец вводили в камеру масс-спектрометра из системы HPLC Agilent 1260, снабженной колонкой Agilent Poroshell 120 ЕС-С18 (3.0×50 mm; 2,7 μm) и защитой, используя автосамплер. Образец вводили в растворе 50% ацетонитрила (квалификация LC-MS) в воде (ультрачистая вода MilliQ, Merck Millipore KGaA, Germany), и колонку элюировали смесью ацетонитрила (А) и воды (В) в градиенте концентраций со скоростью потока 400 мкл/мин в следующих параметрах градиента: 0-15% А в течение 6 мин, 15% - 85% А в течение 1,5 мин, 85% - 0% А в течение 0,1 мин, 0% А в течение 2,4 мин. Время удерживания было следующим: 11α-гидроксипрогестерон - 5,2 мин; прогестерон - 6,7 мин; 11α-ацетоксипрогестерон - 6,0 мин; 6β,11α дигидроксипрогестерон - 4,2 мин.
-
1
13
Образование 11α-ацетоксипрогестерона в результате трансформации прогестерона или 11α-гидроксипрогестерона культурой гриба A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) подтверждено данными спектров Н ЯМР, С ЯМР, 2D ЯМР, хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения. На фиг. №№5, 6, 7-14 и 16-23 приведены спектры и на фиг. №№4, 7 и 15 - хроматограммы полученных соединений.
-
Для подтверждения образования 11α-ацетоксипрогестерона в процессе трансформации прогестерона или 11α-гидроксипрогестерона культурой A. nidulans 031/ pDHG25-SgrDI (pyrG) 11α-ацетоксипрогестерон был получен химическим синтезом из 11α-гидроксипрогестерона с применением метода ацетилирования.
При осуществлении изобретения помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, использовали хорошо известные специалистам методики, описанные в руководствах по молекулярной биологии и генетической инженерии [J. Sambrook, Т. Maniatis, and E.F. Fritsch. Molecular cloning a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989; F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, and K. Struhl. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, N.Y., 1997].
Выходы 11α-гидроксипрогестерона и 11α-ацетоксипрогестерона, полученные биотрансформацией прогестерона и 11α-гидроксипрогестерона штаммом по настоящему изобретению и приведенные в примерах заявляемого изобретения, безусловно, ниже тех, которые необходимы для эффективного промышленного процесса. Однако примеры даны лишь для иллюстрации биокаталитической способности заявляемых штаммов конвертировать прогестерон не только в 11α-гидроксипрогестерон, но и в ацетат 11α-гидроксипрогестерона. Следует отметить, что указанная ацетилирующая способность выявлена нами впервые. Выходы могут быть значительно улучшены за счет оптимизации условий проведения биотрансформации с целью минимизации образования 6β,11α-дигидроксипрогестерона и сдвига направления вторичной модификации 11α-гидроксипрогестерона в сторону ацетилирования. Известно, что состав продуктов зависит от состава среды, рН среды, возраста культуры, от индукции исходным субстратом или продуктом [А.Н. El-Refai, and K.M. Ghanem Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987. Vol. 22(2), 327-338]. Поэтому для снижения активности вторичного энзима 6β-гидроксилазы и уменьшения количества, образованного 6β,11α-дигидроксипрогестерона необходимо оптимизировать параметры проведения процесса трансформации, например, значение рН среды, возраст культуры, способ внесения субстрата, состав среды для трансформации, температурный режим и другие, известные из уровня техники. Для примера в таблице 1 приведено влияние состава среды на конверсию прогестерона заявляемым штаммом, на его 11α-монооксигенаазную активность (суммарно) и на относительную селективность образования 11α-гидроксипрогестерона и 11α-ацетоксипрогестерона, при прочих одинаковых условиях.
Для трансформации мы использовали 2 варианта сред следующего состава:
4
2
2
4
1 - среда СМ, использованная A.  et al. [А. , М. Tadra, J. . Microbial transformations of steroids XXIV. Separation of androstane 17-hydroxy-epimers. Folia Microbiologica. 1964. Vol. 9(6), 380-382] для ацетилирования тестостерона дрожжами и описанная в статье А.Н. El-Refai и K.M. Ghanem [А.Н. El-Refai, and K.M. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987. Vol. 22(2), 327-338] (среда II, рН 6,5), как наиболее благоприятная для конверсии прогестерона в 11α-гидрокси-производное культурой A. nidulans. Состав среды, г/л: глюкоза - 40; MgSO×7HO - 1; KHPO - 0,74; пептон - 1; дрожжевой экстракт - 1; L-аспарагин - 0,7; уридин - 1,1; урацил - 1,2.
4
2
2
4
3
4
2
2
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
-6
-3
-3
-3
-3
2 - минимальная синтетическая среда ММ. Состав среды, г/л: глюкоза - 20; MgSO×7HO - 0,52; KHPO - 1,52; NaNO - 0,85; CuSO×5HO - 0,13; CaCl - 0,11; KCl - 0,52, НВО - 5×10; MnSO×5HO - 1×10; ZnSO×7HO - 0,8×10; NaMoO×4HO - 0,8×10; FeSO×5HO - 0,8×10; уридин - 1,1; урацил - 1,2; 0.5 М фосфатно-цитратный буфер (рН 6.6) - 200 мл/л.
4
Известно, что минеральные соли, добавленные в среду для культивирования, в частности, CuSO, могут быть ингибиторами стероид-С21-монооксигеназы (ЕС №1.14.99.10 [Springer Handbook of Enzymes, Vol. 27, Class 1. Oxidoreductases XII. EC 1.14.15-1.97. Second edition. Springer. 2006, p. 302]). Однако результаты экспериментов показали, что на среде СМ образование 21-гидроксипрогестерона как продукта трансформации не наблюдается. Следует отметить, что 21-гидроксипрогестерон наряду с 11α-гидроксипрогестероном является одним из продуктов трансформации прогестерона в этой среде штаммом A. nidulans известным способом [А.Н. El-Refai, and K.M. Ghanem. Some physiological relations of progesterone conversion by Aspergillus nidulans. Egyptian Journal of Microbiology, 1987, Vol. 22(2), 327-338].
Возможность реализации заявляемого изобретения показана, но не ограничена, в примерах конкретного выполнения.
Пример 1. Конструирование плазмиды pDHG25-SgrDI
Для вставки уникального сайта SgrDI проводилась рестрикция известной автономной плазмиды pDHG25 по сайту BamHI с помощью рестриктазы BamHI (фирмы Thermo Fisher Scientific, согласно инструкции производителя [https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ER0051]). Затем проводили дефосфорилирование концов фрагмента с помощью щелочной фосфатазы (Shrimp Alkaline Phosphatase фирмы Thermo Fisher Scientific, согласно инструкции производителя [https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/783901000UN]). Олигонуклеотидный линкер Bam_SgrDI (SEQ ID №1) фосфорилировали Т4 полинуклиотидкиназой (фирмы СибЭнзим, согласно инструкции производителя [http://russia.sibenzyme.com/service/protocols/protocol17]) и с помощью Т4 ДНК-лигазы (СибЭнзим, [http://russia.sibenzyme.com/service/protocols/protocol13]) лигировали дефосфорилированный фрагмент с линкером.
Использовали следующие условия лигирования: смесь, состоящую из 5 мкл дефосфорилированного фрагмента (500 нг), 10 мкл линкера, 1 мкл 10-кратного буфера BamHI (СибЭнзим), 2 мкл 50-кратного PEG400, 1 мкл 10 mM АТР, 2 мкл Т4 ДНК лигазы (1 ед./мкл, Сибэнзим) инкубировали в течение 15 ч при 14°С, затем прогревали 10 мин при 65°С, охлаждали во льду.
-
5 мкл полученной лигазной смеси использовали для трансформации ультракомпетентных клеток штамма E. coli XL10Gold (Stratagene). Отбор ампициллин-устойчивых клонов осуществляли на среде LB с ампициллином. Дополнительную селекцию проводили с помощью рестрикционного анализа препаратов плазмидной ДНК. Для этого проводили рестрикцию по сайтам PstI, BglII и выбирали плазмидную конструкцию, образующую после рестрикции фрагменты размером 5272, 3954, 1578 пар нуклеотидов. Отобранные плазмидные конструкции секвенировали с помощью олигонуклеотида PrArgB_seq (SEQ ID №2). Выбранную конструкцию (SEQ ID №3) обозначили как pDHG25-SgrDI и использовали в дальнейшей работе для получения штамма A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG).
-
Пример 2. Получение рекомбинантного штамма Aspergillus nidulans 031/ pDHG25-SgrDI (pyrG)
-
-
-
-
Для получения рекомбинантного штамма A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG), штамм A. nidulans 031 (argB; pyrG) был трансформирован плазмидой pDHG25-SgrDI (полученной по примеру 1), несущей ген argB, с отбором по маркеру argB2. [Aleksenko, A.Y., Makarova, N.A., Nikolaev, I.V., and Clutterbuck, A.J., Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet., 1995, vol. 28, pp. 474-478]. Была получена серия трансформантов, из которой были отобраны штаммы, способные расти на среде без аргинина. Суммарную клеточную ДНК трансформантов выделяли стандартным методом, наличие плазмиды в выросших штаммах подтверждали секвенированием с использованием праймера PrArgB_seq (SEQ ID №2). Выбрали клон, несущий плазмиду pDHG25-SgrDI. Отобранный штамм был назван A nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG).
-
Пример 3. Общий метод биотрансформации прогестерона штаммом Aspergillus nidulans 031/ pDHG25-SgrDI (pyrG) на средах CM и MM в течение 66 ч.
Для получения споровой суспензии штамм выращивали на агаризованной среде МПА (мальт-экстракт - 3 г/л, пептон - 1 г/л, агар - 20 г/л, уридин - 1,1 г/л, урацил - 1,2 г/л) при температуре 37°С в течение 7-10 дней. Споровую суспензию высевали в качалочные колбы вместимостью 750 мл, содержащие по 100 мл среды для культивирования, выращивали на качалке (240-250 об/мин, амплитуда 5 см) при температуре 37°С в течение 4 дней. Затем в ростовую среду вносили прогестерон в виде раствора в диметилсульфоксиде до финальной концентрации 1 г/л, при этом концентрация растворителя не превышала 6% (об.). Трансформацию проводили в течение 66 ч в тех же условиях, параллельно культивируя штаммы без прогестерона в качестве контроля. Каждый эксперимент выполняли в трех повторностях.
2
4
Для извлечения продуктов трансформации прогестерона по окончании инкубации мицелий отфильтровывали, промывали дихлорметаном на фильтре. Культуральную жидкость экстрагировали трижды порциями дихлорметана равного объема. Стероиды, адсорбированные на мицелии, извлекали ре-мацерацией (трижды), используя метанол и выдерживая без перемешивания в течение 4 ч. Метанол упаривали, остаток, содержащий воду, экстрагировали дихлорметаном трижды. Объединенные экстракты культуральной жидкости и мицелия промывали водой, сушили NaSO, осветляли активированным углем и упаривали до прекращения погона. Остаток растворяли в 5 мл смеси этилацетата и дихлорметана (1:2) и хроматографировали на колонке, используя 30-кратное количество силикагеля к весу остатка после упаривания. В качестве элюэнта использовали смесь дихлорметана и ацетона (от 0 до 25% ацетона), для контроля элюции использовали ТСХ. Хроматографическую чистоту соединений подтверждали с помощью ТСХ и ЯМР-спектроскопии.
-
Результаты биотрансформации прогестерона штаммом A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) по настоящему изобретению приведены в таблице 1.
-
Пример 4. Трансформация прогестерона штаммом Aspergillus nidulans 031/ pDHG25-SgrDI (pyrG) в течение 14 ч.
-
Споровую суспензию штамма A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) высевали в 4 качалочные колбы вместимостью 750 мл, содержащие по 100 мл среды ММ для культивирования, выращивали на качалке (240-250 об/мин, амплитуда 5 см) при температуре 37°С в течение 4 дней. Затем в ростовую среду вносили прогестерон в растворе диметилсульфоксида до финальной концентрации 1 г/л, при этом концентрация растворителя составляла 4% (об.). Трансформацию проводили в течение 14 ч в тех же условиях.
2
4
Для извлечения продуктов трансформации прогестерона по окончании инкубации мицелий отфильтровывали, промывали дихлорметаном на фильтре. Культуральную жидкость экстрагировали трижды порциями дихлорметана равного объема. Стероиды, адсорбированные на мицелии, извлекали ре-мацерацией (трижды), используя метанол и выдерживая без перемешивания в течение 4 ч. Метанол упаривали, остаток, содержащий воду, экстрагировали дихлорметаном трижды. Объединенные экстракты культуральной жидкости и мицелия промывали водой, сушили NaSO, осветляли активированным углем и упаривали до прекращения погона. Остаток растворяли в 5 мл смеси этилацетата и дихлорметана (1:2) и хроматографировали на колонке, используя 30-кратное количество силикагеля к весу остатка после упаривания. В качестве элюэнта использовали смесь дихлорметана и ацетона (от 0 до 25% ацетона), для контроля элюции использовали ТСХ. Одинаковые по составу стероидов фракции элюата объединяли и упаривали досуха. Кристаллизующийся остаток растирали с эфиром, осадок отфильтровывали, сушили до постоянного веса в вакуум-сушильном шкафу. Хроматографическую чистоту соединений подтверждали с помощью ТСХ и ЯМР-спектроскопии.
Из 400 мг прогестерона, загруженного на трансформацию, получили 392 мг прогестерона (98%) и 5,82 мг 11α-ацетоксипрогестерона с выходом 1,23% на загруженный субстрат (61,4% на конвертированный субстрат). По данным ТСХ анализа другие продукты трансформации отсутствуют.
-
Пример 5. Биокаталитическое ацетилирование 11α-гидроксипрогестерона штаммом Aspergillus nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG)
-
Споровую суспензию штамма A. nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG) высевали в 4 качалочные колбы вместимостью 750 мл, содержащие по 100 мл среды ММ для культивирования, выращивали на качалке (240-250 об/мин, амплитуда 5 см) при температуре 37°С в течение 4 дней. Затем в ростовую среду вносили 11α-гидроксипрогестерон в растворе диметилсульфоксида до финальной концентрации 0,5 г/л, при этом концентрация растворителя составляла 2% (об.). Трансформацию проводили в течение 23 ч в тех же условиях.
2
4
Для извлечения продуктов трансформации 11α-гидроксипрогестерона по окончании инкубации мицелий отфильтровывали, промывали дихлорметаном на фильтре. Культуральную жидкость экстрагировали трижды порциями дихлорметана равного объема. Стероиды, адсорбированные на мицелии, извлекали ре-мацерацией (трижды), используя метанол и выдерживая без перемешивания в течение 4 ч. Метанол упаривали, остаток, содержащий воду, экстрагировали дихлорметаном трижды. Объединенные экстракты культуральной жидкости и мицелия промывали водой, сушили NaSO, осветляли активированным углем и упаривали до прекращения погона. Остаток растворяли в 5 мл смеси этилацетата и дихлорметана (1:2) и хроматографировали на колонке, используя 30-кратное количество силикагеля к весу остатка после упаривания. В качестве элюэнта использовали смесь дихлорметана и ацетона (от 0 до 20% ацетона), для контроля элюции использовали ТСХ. Одинаковые по составу стероидов фракции элюата объединяли и упаривали досуха. Кристаллизующийся остаток растирали с эфиром, осадок отфильтровывали, сушили до постоянного веса в вакуум-сушильном шкафу. Хроматографическую чистоту соединений подтверждали с помощью ТСХ и ЯМР-спектроскопии.
Из 200 мг 11α-гидроксипрогестерона, загруженного на трансформацию, получили 168 мг 11α-гидроксипрогестерона (84%) и 29,48 мг 11α-ацетоксипрогестерона с выходом 13,08% на загруженный субстрат (81,73% на конвертированный субстрат). По данным ТСХ анализа другие продукты трансформации отсутствуют.
ЯМР-спектры полученного 11α-ацетоксипрогестерона идентичны спектрам стандартного образца и спектрам образца, полученного химическим методом ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона.
Пример 6. Получение 11α-ацетоксипрогестерона химическим методом
К раствору 34 мг 11α-гидроксипрогестерона в 0,2 мл уксусного ангидрида добавили 1 каплю 60% хлорной кислоты. Реакционную массу выдерживали при комнатной температуре в течение 1 ч. По окончании реакции реакционную массу добавляли по каплям в 5 мл воды, содержащей 1 мл 25% раствора аммиака (рН ~7.5). Перемешивали 30 мин., затем реакционную массу экстрагировали дихлорметаном трижды, экстракт промыли водой до нейтральной реакции, упарили досуха. Получили 39 мг остатка, из которого препаративной хроматографией извлекли 27 мг 11α-ацетоксипрогестерона с выходом 70,45%. Т.пл. 173-174°С (лит. Т.пл. 176-177°С [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74 (23), 5933-5936]
Характеристика продуктов биотрансформации
-
11α-Гидроксипрогестерон, полученный биотрансформацией прогестерона штаммом Aspergillus nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG).
Т.пл. 164-166°C (лит. Т.пл. 164-165°С [K. Yildirim, and A. Kuru. Biotransformation of some steroids by Aspergillus candidus. Journal of Chemical Research, 2015. Vol. 39(9), 546-549]). M.w. 330.46.
21
30
3
+
+
Масс-спектр высокого разрешения CHO (m/z): рассчитано для [М+Н] 331.2268, найдено 331.2264; рассчитано для [M+Na] 353.2087, найдено 353.2088.
1
3
3
3
2
3
3
3
2
3
3
3
3
3
3
3
11, 9
11, 12α
11, 12β
1β, 1α
1β, 2
17, 16α
17, 16β
2
2
3
1a, 1b
1α, 2
12α, 12β
3
9, 8
7α, 7β
7, 6
7α, 8
2
3
Н-ЯМР (400 МГц, CDCl): 5.73 (с, 1Н СН-4), 4.04 (ддд (псевдо-дт), 1H, J=10.3 Гц, J 4.8 Гц, J 4.6 Гц, СН-11), 2.66 (дт, 1H, J 13.7 Гц, J 4.4 Гц, СН-1β), 2,55 (дд (псевдо-т), 1H, J 8.7 Гц, J 9.1 Гц, СН-17), 2.48-2.26 (м, 5Н, СН-2 & СН-6 & СН-12β), 2.22-2.10 (м, 1H, СН-16β), 2.13 (с, 3Н, СН-21), 2.02 (тд, 1Н, J 13.7 Гц, J 4.5 Гц, СН-1α), 1.87-1.81 (м, 1H, СН-7β), 1.78-1.64 (м, 3Н, СН-8 & СН-15α & СН-16α), 1.58-1.47 (2Н (т, 1Н, J 11.3 Гц, СН-12α), 1.31 (с, 3Н, СН-19), 1.29-1.20 (м, 2Н, СН-12α & СН-14), 1.14 (т, 1Н, J 10.3 Гц, СН-9), 1.14-1.04 (2×ддд, 2Н, J 13.1 Гц, J 13.0 Гц, J 3.8 Гц, СН-7α), 0.69 (с, 3Н, СН-18).
-
11α-Ацетоксипрогестерон, полученный биотрансформацией прогестерона штаммом Aspergillus nidulans 031/ pDHG25-SgrDI (pyrG).
Т.пл. 172-174°С (лит. Т.пл. 176-177°С [D.H. Peterson, Н.С. Murray, S.H. Eppstein, L.M. Reineke, A. Weintraub, P.D. Meister, and H.M. Leigh. Microbiological Transformations of Steroids. I. Introduction of Oxygen at Carbon-11 of Progesterone. J. Am. Chem. Soc., 1952, Vol. 74 (23), 5933-5936]. M.w. 372.5;
23
32
4
+
+
Масс-спектр высокого разрешения CHO (m/z): рассчитано для [М+Н] 373.2373, найдено 373.2361; рассчитано для [M+Na] 395.2193, найдено 395.2183.
1
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
6
11, 9
11, 10
17, 16α
17, 16β
3
3
2
12α, 12β
9, 8
14, 8
14, 15β
14, 15α
3
7α, 7β
7, 6α
7, 6β
7α, 8
2
3
Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d): 5.67 (с, 1H СН-4), 5.14 (дт, 1Н, J=10.6 Гц, J 5.0 Гц, СН-11), 2,62 (дд (псевдо-т), 1Н, J 8.9 Гц, J 9.1 Гц, СН-17), 2.47-2.35 (м, 2Н, СН-2β & СН-6β), 2.29-2.12 (м, 3Н, СН-6α & СН-12β & СН-2α), 2.10-1.96 (м, 1Н, СН-16β), 2.05 (с, 3Н, СН-21), 2.01 (с, 3Н, СН-23), 1.91-1.78 (м, 3Н, СН-1 & СН-7α), 1.72-1.60 (м, 3Н, СН-16α & СН-15α & СН-8), 1.50 (т, 1H, J 11.6 Гц, СН-12α), 1.44 (т, 1H, J 10.6 Гц, СН-9), 1.39-1.29 (ддд, 1Н, J 10.7 Гц, J 6.4 Гц, J 5.6 Гц, СН-14) 1.29 (уш.с, 4Н, СН-19 & СН-15β), 1.17-1.00 (2×ддд, 2Н, J 12.6 Гц, J ~ J 12.2 Гц, J 3.1 Гц, СН-7), 0.64 (с, 3Н, CH-18).
13
6
2
2
2
2
2
3
3
2
2
3
3
3
С-ЯМР (300 МГц, DMSO-d): 208.61 (с, СО-20), 199.40 (с, СО-3), 170.14 (с, С-5), 170.10 (с, СО-22) 124.48 (с, СН-4), 70.58 (с, СНОН-11), 62.30 (с, СН-17), 55.34 (с, СН-9), 54.39 (с, СН-14), 45.02 (с, СН-12), 43.54 (с, С-13), 39.75 (с, С-10), 36.79 (с, СН-1), 34.72 (с, СН-8) 34.19 (с, СН-2), 33.03 (с, СН-6), 31.67 (с, СН-7), 31.37 (с, СН-21) 30.92 (с, СН-21), 24.16 (с, СН-15), 22.96 (с, СН-16), 22.02 (с, СН-21), 18.20 (с, СН-19), 14.24 (с, СН-18).
-
Спектры идентичны спектрам стандартного образца, а также спектрам образца, полученного методом биокаталитического ацетилирования штаммом A. nidulans 031/ pDHG25-SgrDI (pyrG), и образца, полученного химическим методом ацетилирования 11α-гидроксипрогестерона
-
6β,11α-Дигидроксипрогестерон, полученный биотрансформацией прогестерона штаммом Aspergillus nidulans 031/pDHG25-SgrDI (pyrG).
Т.пл. 242-244°C (лит. т.пл. 244-246°C [Z. Habibi, M. Yousefi, Sh. Ghanian, M. Mohammadi, S. Ghasemi. Biotransformation of progesterone by Absidia griseolla var. igachii and Rhizomucor pusillus. Steroids, 2012, Vol. 77, p. 1446-1449]. M.w. 346.46;
23
32
4
+
+
Масс-спектр высокого разрешения CHO (m/z): рассчитано для [М+Н] 373.2373, найдено 373.2361; рассчитано для [M+Na] 395.2193, найдено 395.2183.
1
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
6
11, 9
11, 10
17, 16α
17, 16β
3
3
2
12α, 12β
9, 8
14, 8
14, 15β
14, 15α
3
7α, 7β
7, 6α
7, 6β
7α, 8
2
3
Н-ЯМР (300 МГц, DMSO-d): 5.67 (с, 1Н СН-4), 5.14 (дт, 1H, J=10.6 Гц, J 5.0 Гц, СН-11), 2,62 (дд (псевдо-т), 1Н, J 8.9 Гц, J 9.1 Гц, СН-17), 2.47-2.35 (м, 2Н, СН-2β & СН-6β), 2.29-2.12 (м, 3Н, СН-6α & СН-12β & СН-2α), 2.10-1.96 (м, 1H, СН-16β), 2.05 (с, 3Н, СН-21), 2.01 (с, 3Н, СН-23), 1.91-1.78 (м, 3Н, СН-1 & СН-7α), 1.72-1.60 (м, 3Н, СН-16α & СН-15α & СН-8), 1.50 (т, 1Н, J 11.6 Гц, СН-12α), 1.44 (т, 1Н, J 10.6 Гц, СН-9), 1.39-1.29 (ддд, 1Н, J 10.7 Гц, J 6.4 Гц, J 5.6 Гц, СН-14) 1.29 (уш.с, 4Н, СН-19 & СН-15β), 1.17-1.00 (2×ддд, 2Н, J 12.6 Гц, J ~ J 12.2 Гц, J 3.1 Гц, СН-7), 0.64 (с, 3Н, СН-18).
13
6
2
2
2
2
2
3
3
2
2
3
3
3
С-ЯМР (300 МГц, DMSO-d): 208.61 (с, СО-20), 199.40 (с, СО-3), 170.14 (с, С-5), 170.10 (с, СО-22) 124.48 (с, СН-4), 70.58 (с, СНОН-11), 62.30 (с, СН-17), 55.34 (с, СН-9), 54.39 (с, СН-14), 45.02 (с, СН-12), 43.54 (с, С-13), 39.75 (с, С-10), 36.79 (с, СН-1), 34.72 (с, СН-8) 34.19 (с, СН-2), 33.03 (с, СН-6), 31.67 (с, СН-7), 31.37 (с, СН-21) 30.92 (с, СН-21), 24.16 (с, СН-15), 22.96 (с, СН-16), 22.02 (с, СН-21), 18.20 (с, СН-19), 14.24 (с, СН-18).
1
13
Таким образом, общая селективность 11α-гидроксилирования достигает 96% и более, а содержание 11α-ацетоксипрогестерона в смеси продуктов превышает 31%. Указанная способность заявляемого рекомбинантного штамма подтверждена не только с помощью физико-химических методов анализа структуры органических соединений (масс-спектрометрия высокого разрешения, ЯМР-спектроскопия Н, С и 2D ЯМР), но и встречным химическим синтезом.