Порообразующие белки наружной мембраны некоторых грамотрицательных бактерий. Структура и свойства

Вестник ДВО РАН. 2014. № 1

УДК 577.012.5'083.3

О. Д. НОВИКОВА, В. А. ХОМЕНКО, О.П. ВОСТРИКОВА,

О.Ю. ПОРТНЯГИНА, О.В. СИДОРОВА, Д.К. ЧИСТЮЛИН, Т.Ф. СОЛОВЬЕВА

Порообразующие белки

наружной

некоторых грамотрицательных Структура и свойства

В обзоре представлены направления и результаты проводимых в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН за последние 10 лет исследований структуры, функциональных свойств и иммунобиологической активности поринов психротолерантных наземных (рода Yersinia) и морских (рода Pseudoalteromonas) грамотрицательных бактерий.

Ключевые слова: грамотрицательные бактерии, порообразующие белки, пространственная структура, иммунобиологические свойства.

Outer membrane pore-forming proteins of some Gram-negative bacteria. Structure and function.

O.D. NOVIKOVA, V.A. KHOMENKO, O.P. VOSTRIKOVA, O.Yu. PORTNYAGINA, O.V. SIDOROVA, D.K. CHISTYULIN, T.F. SOLOVYEVA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

The lines of research and the findings of the structures, functional properties, and immunobiological activity of porins from psychrotolerant terrestrial (Yersinia genus) and marine (Pseudoalteromonas genus) Gram-negative bacteria carried out at the laboratory of the molecular basics of antibacterial immunity of the Pacifi c Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS during the last 10 years have been reviewed.

Key words: Gram-negative bacteria, pore-forming proteins, spatial .structure, immunobiological properties

лекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН, является изучение структуры, функции и биологических свойств неспецифических порообразующих белков наружной мембраны (НМ) грамотрицательных бактерий.

По своим физико-химическим свойствам это слабокислые белки с необычайно большим для интегральных мембранных белков количеством полярных аминокислот. Основным структурным элементом поринов является эллипсообразный в сечении р-складчатый цилиндр (баррель), состоящий из антипараллельных р-тяжей (или стрэндов), соединенных так называемыми петлями - участками полипептидной цепи белка с неупорядоченной и/или а-спиральной структурой. В нативной мембране порины существуют в виде тримеров, в стабилизации пространственной структуры которых, помимо гидрофобных

* НОВИКОВА Ольга Данииловна - доктор химических наук, ведущий научный сотрудник, ХОМЕНКО Валентина Александровна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник, ВОСТРИКОВА Ольга Павловна -кандидат химических наук, старший научный сотрудник, ПОРТНЯГИНА Ольга Юрьевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, СИДОРОВА Ольга Вениаминовна - кандидат химических наук, научный сотрудник, ЧИСТЮЛИН Дмитрий Константинович - младший научный сотрудник, СОЛОВЬЕВА Тамара Федоровна - доктор химических наук, главный научный сотрудник (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). *Е-таП: novolga_05@mail.ru

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке программы «Дальний Восток» (проекты №№ 12-1-П5-08, 12-1-П5-09, 12-1-П6-10, 12-111-А-05-063, 12-Ш-Л-05-055, 14-3-В-05-103).

Одним из направлений научных исследований, проводимых в лаборатории мо-

взаимодействий, существенную роль играют водородные и ионные связи. Этим объясняется необычайная устойчивость поринов по отношению к протеазам, повышенной температуре и другим денатурирующим факторам [22, 39, 40].

Необычная пространственная структура поринов позволяет им осуществлять в мембране транспортную функцию. Водонаполненные каналы, образуемые поринами, создают трансмембранную систему, проницаемую для гидрофильных молекул с молекулярной массой не более 600 Да [36]. Причем это не постоянно открытые каналы, а более сложные комплексы с динамическим поведением, состояние которых напрямую зависит от условий окружающей среды [37]. Таким образом, порины выполняют в клетке основополагающую функцию, обеспечивающую жизнедеятельность бактерий.

В то же время благодаря тому, что неупорядоченные и/или а-спирализованные элементы структуры поринов, соединяющие в-тяжи, выходят на поверхность бактериальной клетки, эти белки играют заметную роль в развитии инфекционного процесса. В этом качестве они выступают как эффекторы патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживание патогена в организме. Вместе с тем порины представляют собой молекулы-мишени для системы врожденного иммунитета хозяина. Они активируют факторы немедленной защиты макроорганизма и включаются в формирование специфического иммунного ответа [28, 34]. Исследования, проводимые в нашей лаборатории, затрагивают оба вышеуказанных аспекта функциональной активности поринов.

Особенности структуры и многообразие свойств поринов делают их идеальным объектом для установления корреляций между структурой и функцией важных биоактивных макромолекул и обусловливают неослабевающий интерес к ним ученых. Свидетельством масштабных исследований в этой области может служить тот факт, что за последние пять лет появилось порядка 1000 научных статей, в заголовках которых фигурирует термин «порин». Проведение поиска в информационных базах данных с использованием в качестве ключевого слова этого термина дает сотни ссылок как на оригинальные работы, так и на обзорные статьи, посвященные этим «интригующим белкам», как назвал их Хироши Никаидо, один из корифеев в области структуры и функции бактериальных антигенов.

Структура и функция поринов иерсиний

Заболевания, вызываемые патогенными иерсиниями (псевдотуберкулез, кишечный иерсиниоз), занимают большой удельный вес в инфекционной патологии человека. Кроме того, возбудители иерсиниозов широко распространены и имеют особую эпидемиологическую значимость на территории Приморского края. Способность этих микроорганизмов выживать при пониженной температуре усиливает их патогенетический потенциал, так как именно в этих условиях происходит активация некоторых факторов вирулентности.

В связи с этим главным объектом наших исследований стал один из неспецифических порообразующих белков - OmpF порин из НМ псевдотуберкулезного микроба Yersinia pseudotuberculosis. Его структура и свойства изучены нами наиболее полно. Кроме того, за эти годы был выделен и охарактеризован целый ряд белков из патогенных и непатогенных для человека видов иерсиний, в частности Y. enterocolitica, в том числе несколько поринов из группы так называемых энтероколитикоподобных видов иерсиний (Y. intermedia, Y. kris-tensenii, Y. frederiksenii) [5, 13], а также порин из Y. ruckeri [33], являющейся патогеном рыб. Были также изучены неспецифические порообразующие белки НМ Y. pseudotuberculosis [23] и Y. entrocolitica [10] другого типа, а именно OmpC порины. Все выделенные белки отличались большим содержанием суммарной в-структуры (60-80 %) и высокой степенью конформационной пластичности на уровне третичной структуры белка.

Известно, что порины являются термозависимыми белками. В диапазоне температур 50-70 °С они претерпевают необратимый конформационный переход, сопровождающийся

диссоциацией тримеров на мономеры. OmpF порины энтероюлитикоподобных видов иерсиний оказались менее устойчивыми по отношению к температуре в сравнении с порином из псевдотуберкулезного микроба. Необычный термоустойчивый OmpF порин был выделен из Y. ruckeri, температура его необратимого термоперехода была на 20 °С выше температуры термоперехода OmpF белков изученных нами ранее иерсиний и других энтеробактерий [33].

Порообразующие свойства поринов иерсиний исследованы с помощью техники бис-лойных липидных мембран (БЛМ). Каналы, образуемые поринами патогенных видов иерсиний в искусственной мембране, были, как правило, однородны. Величины их наиболее вероятных уровней проводимости составляли 180-240 пСм. В случае поринов непатогенных видов иерсиний наблюдался значительно больший разброс этих величин (от 180 до 400 пСм), что, вероятно, вызвано большим разнообразием условий обитания этих микроорганизмов [13, 33]. Уровень проводимости каналов, образованных этими белками в БЛМ, регулируется величиной прилагаемого потенциала.

Наиболее важными в эпидемиологическом отношении свойствами патогенных для человека и животных иерсиний (Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. ruckeri) являются их устойчивость к различным факторам внешней среды и способность расти при низких температурах. Изменения в структуре поринов, влияющие на проявление их функциональной активности, в значительной степени определяются как внешними условиями существования бактерий, так и взаимодействием с компонентами наружной мембраны, в частности с липидами.

Влияние условий среды на экспрессию неспецифических поринов

Известно, что тип популяции неспецифических поринов с большим или меньшим размером пор (OmpF и OmpC, соответственно) может изменяться под влиянием условий окружающей среды, таким образом клетка регулирует проницаемость НМ. Это происходит благодаря механизму «переключения» биосинтеза поринов, кодируемых различными генами. Иерсинии обладают широкими адаптационными возможностями, что позволяет им существовать как в паразитическом, так и в сапрофитическом состоянии. На примере Y. ruckeri было изучено влияние условий культивирования микроорганизма (температуры и осмолярности среды) на регуляцию экспрессии неспецифических поринов.

Показано, что, хотя Y. ruckeri является патогеном для холоднокровных организмов, роль температурного фактора при переключении биосинтеза с одного типа поринов на другой - основная. Имеет существенное значение и осмолярность среды. Анализ фракции пориновых белков, выделенных из бактерий, выращенных в различных условиях (при температурах 8, 24, 37 °С и концентрацих NaCl 0, 150, 300 мМ), показал, что во всех случаях экспрессируются оба типа поринов. Тем не менее изменение условий культивирования бактерий значительно влияет на соотношение этих белков. При пониженной и комнатной температуре в бессолевой среде экспрессируется преимущественно OmpF по-рин. При этом максимальное уменьшение (более чем в 50 раз) экспрессии OmpC белка наблюдается на холоде при высокой концентрации соли в среде (300 мМ). При повышении температуры вне зависимости от концентрации соли наблюдается снижение экспрессии OmpF порина (в 3-7 раз). Максимальный сдвиг соотношения двух типов белков в пользу OmpC происходит при 37 °С в присутствии соли.

Интересным объектом для исследования влияния окружающей среды на структуру и свойства поринов могут служить бактерии, обитающие в особых, морских условиях. Показано, что обитание в морской среде может служить причиной некоторых изменений в геноме микроорганизмов, в том числе в генах, кодирующих мембранные белки [42]. Предполагается, что это может обусловить необычные функциональные свойства пориноподобных белков морских бактерий по сравнению с поринами наземных

микроорганизмов. Установление специфических особенностей структуры «морских» поринов и проявлений их порообразующих свойств имеет определяющее значение для выяснения роли неспецифических поринов грамотрицательных бактерий в адаптации микроорганизмов к условиям окружающей среды.

Из морских психротолерантных бактерий рода Pseudoalteromonas (P haloplanktis, P. tetraodonis, Pseudoalteromonas sp. КММ 223) выделены фракции НМ, в состав которых входят термозависимые пориноподобные белки [24]. Из морской бактерии P haloplanktis выделены порообразующие белки П-1 и П-2 с молекулярной массой 43 и 39 кДа, соответственно. Характер флуктуаций тока в БЛМ и величина проводимости пор, образованных данными белками, свидетельствуют о том, что выделенные порины не идентичны по своим функциональным свойствам. Для белка П-2 обнаружен нелинейный характер зависимости величины проводимости канала от концентрации соли в водной фазе, что свойственно по-ринам морских бактерий и отличает их от поринов наземных микроорганизмов.

Влияние компонентов бактериальной мембраны

на структуру и свойства поринов

Различия в биологических свойствах иерсиний определяются не только температурой культивирования и присутствием соли в среде. Они могут зависеть также и от плотности среды или фазы роста микроорганизма. Поскольку бактерии Y. pseudotuberculosis распространены повсеместно в объектах окружающей среды, они адаптированы к росту как на жидких средах в виде суспензии клеток (суспензионная культура), так и на твердых субстратах в виде колоний (колониальная культура). Ранее было показано, что количество свободных липидов, относительное содержание фосфолипидов (ФЛ) и нейтральных липидов в липидных экстрактах Y pseudotuberculosis варьируют в зависимости от возраста культуры и способа выращивания - на питательном бульоне (ПБ) или питательном агаре (ПА) [2]. Клетки, выращенные на ПА, содержали заметно большее количество ФЛ, чем клетки, растущие на ПБ, - 2,6 и 1,7 %, соответственно. Оказалось, что OmpF порин, выделенный из колониальной культуры бактерий, собранной на стационарной фазе роста, имел наиболее компактную и устойчивую по отношению к температуре структуру и наиболее эффективно встраивался в искусственный бислой [20]. Таким образом, была установлена корреляция между липидным составом НМ псевдотуберкулезного микроба и структурой и функциональной активностью OmpF белка.

Известно, что в нативной мембране порин образует с липополисахаридом (ЛПС) прочный, но нековалентно связанный комплекс. Многие исследователи считают, что существование такого комплекса является необходимым условием для функционирования белка в бактериальной мембране. С помощью метода тушения собственной белковой флуоресценции мы изучили характер взаимодействия порина из псевдотуберкулезного микроба с R- и S-формами эндогенного ЛПС. Исследуемые полисахариды отличались как длиной О-специфической цепи, так и степенью ацилирования. Оказалось, что количество сайтов связывания с порином и степень их аффинности зависят от конформации ЛПС, которая, в свою очередь, определяется увеличением или уменьшением гидрофобной области его макромолекулы [3].

Анализ первичной структуры OmpF поринов бактерий рода Yersinia

Первичные структуры поринов иерсиний (Y. pseudotuberculosis и Y. enterocoliti-ca) были выведены из нуклеотидной последовательности соответствующих ompF и ompC генов [15]. Сравнительный анализ аминокислотного (АК) состава поринов патогенных видов иерсиний был проведен с привлечением соответствующих данных для Y. pestis, взятых из банка Swiss-Prot (Q8ZG94). АК состав исследованных поринов НМ бактерий

рода Yersinia был характерен для порообразующих белков энтеробактерий. Отмечено значительное содержание аспарагиновой и глутаминовой аминокислот (индекс полярности белков 43-45 %), отсутствие цистеина и низкое содержание лизина (не более 5 %). Относительное содержание ароматических аминокислот в поринах оказалось достаточно высоким, около 13 %. В состав мономеров исследованных поринов входит по 3 остатка триптофана и 26-27 остатков тирозина. Суммарное количество остатков таких пар аминокислот, как Lys-Arg, Asp-Glu, Ile-Leu, для исследованных белков составляет 30, 90, 30, соответственно. Эти значения близки значениям подобных сумм, рассчитанным для OmpF поринов энтеробактерий, в частности трех видов сальмонелл [40].

Для OmpF поринов иерсиний были определены теоретические изоэлектрические точки и рассчитаны значения молекулярных масс: для OmpF Y. pseudotuberculosis эти величины составляют, соответственно, 4,45 и 37,7 кДа, а для OmpF Y. enterocolitica - 4,34 и 39,5 кДа. Расчетные значения молекулярных масс поринов иерсиний хорошо согласуются с соответствующими величинами, ранее полученными экспериментально с помощью SDS, ПААГ-электрофореза и масс-спектрометрии MALDI-TOF.

Результаты сравнительного анализа АК последовательностей поринов иерсиний, в том числе взятых из GeneBank (NCBI), показали, что наиболее близкими между собой видами являются Y. pseudotuberculosis и Y. pestis. Степень гомологии поринов этих микроорганизмов (до 95 %) близка к таковой для внутривидового подобия: 98,6 % - для серотипов Y. pseudotuberculosis и 99,2 % - для серотипов Y. pestis. Полученные данные подтверждают близкое эволюционное родство этих двух видов иерсиний и гипотезу происхождения чумной бактерии Y. pestis от Y. pseudotuberculosis, вызывающей псевдотуберкулез. Степень подобия между OmpF и OmpC поринами каждого из исследуемых видов иерсиний оказалась ниже, чем между поринами одного типа из разных видов иерсиний [10, 23].

При множественном выравнивании АК последовательностей зрелых OmpF белков иер-синий и других энтеробактерий (Escherichia coli и Serratia marcescens) обнаружены следующие закономерности. Во-первых, наблюдается наличие протяженных областей высокой и низкой гомологии, при этом консервативные участки приходятся на трансмембранные домены, а высоковариабельные участки - на «внешние» петли. Во-вторых, отмечается очевидная закономерность в распределении гидрофобных аминокислот и консервативных аминокислотных остатков, в первую очередь глициновых, тирозиновых и фенилаланино-вых. Известно, что в поринах ароматические аминокислоты образуют два так называемых ароматических пояса, один из которых находится на границе мембраны и периплазмати-ческого пространства, второй - на границе мембраны и внеклеточного пространства. Их функция заключается в удержании гомотримера в липидном слое мембраны [15].

Теоретические модели пространственной структуры поринов иерсиний

Учитывая практически полную идентичность первичной структуры поринов из Y. pseudotuberculosis и Y. pestis, пространственные модели мономерных форм поринов Y. pseudotuberculosis (YPS) и Y pestis (YP) были построены с помощью метода гомологичного моделирования (с использованием серверов PredPort, 3DSSM и SWISS-MODEL) [38]. В качестве прототипа взята 3D структура PhoE порина из E. coli. Суперпозиция Са атомов мономеров патогенных иерсиний и порина PhoE имела среднее квадратичное отклонение 0,47 А и 0,43 А (для YPS и YP, соответственно). Нами также была построена модель три-мера OmpF Y. pseudotuberculosis с использованием в качестве матрицы пространственной структуры тримера порина OmpF E. coli (3HXX) [38].

В результате обнаружено, что порины иерсиний имеют те же особенности пространственной организации молекулы и расположения петли L3, что и порины E. coli. Известно, что петля L3 проникает внутрь поры и участвует в образовании электростатического взаимодействия между этим участком АК последовательности белка и внутренней

стенкой р-барреля и, соответственно, играет важную роль в проявлении функциональной активности поринов. Однако OmpF порины иерсиний, по сравнению с порином из E. coli, содержат необычную замену в функционально значимом участке аминокислотной последовательности. Так, в высококонсервативном пептиде (Pro-Glu-Phe-Gly-Gly-Asp), расположенном в средней части петли L3, остаток Glu заменен на Val, что разрушает функционально важный кластер кислых АК в зоне констрикции (сужения) поры [38].

Методом сравнительного моделирования на основе кристаллической структуры ос-мопорина из Klebsiella pneumoniae построена теоретическая модель мономера и тримера OmpC порина из Y. pseudotuberculosis [23]. С использованием веб-сервера AGGRESCAN определена локализация участков белка с повышенной «способностью» к агрегации (hot spots). Обнаружено, что частично эти зоны располагаются в области межмономерных контактов в тримере порина, однако большая их часть находится на внешней поверхности р-барреля [23]. Эти области либо включают в себя остатки глицина, либо ограничены р-тяжами, содержащими так называемые глициновые кластеры. Высокое содержание остатков глицина (около 14 %) и частота встречаемости этой аминокислоты в составе белка (больше 13 %) характерны для порообразующих белков НМ бактерий. Оказалось, что OmpC порин из Y. pseudotuberculosis в этом отношении не исключение. Как показали наши расчеты, 78 % остатков глицина в составе этого белка являются консервативными и расположены преимущественно в р-тяжах [23].

Интересно отметить, что функционально значимый высоко консервативный для энте-робактерий пептид PEFGG в петле L3 в случае OmpC порина из Y. pseudotuberculosis не имеет замены, отмеченной ранее для OmpF поринов иерсиний. OmpC и OmpF порины из Y. pseudotuberculosis содержат по 3 остатка триптофана, два из которых имеют одинаковое расположение в полипептидной цепи белков (в 3-м р-тяже - Трп56 для обоих белков и в петле L3 - Трп106). Положение 3-го остатка триптофана существенно различается: в случае OmpC порина Трп186 находится в области периплазматической петли Т9, а в случае OmpF белка Трп256 входит в состав внешней петли L6 [23].

Влияние различных факторов на структуру изолированного порина.

Изменения под действием температуры

Для выяснения особенностей температурной денатурации порина из псевдотуберкулезного микроба были использованы методы оптической спектроскопии и сканирующей микрокалориметрии. Мы проанализировали изменения в пространственной организации молекулы порина на уровне третичной и вторичной структуры белка [20]. Оказалось, что в спектрах кругового дихроизма (КД), записанных при тепловой денатурации порина, присутствует изодихроичная точка при 211 нм. Наличие этой точки означает, что переход порина из нативного состояния в денатурированное представляет одностадийный кооперативный процесс. При начальной (25 °С) и конечной (85 °С) температурах белок в растворе существует только в двух спектрально различающихся состояниях, которые, соответственно, имеют конформации нативного белка и его денатурированной формы. В этих условиях в растворе данного белка отсутствуют значительные количества каких-либо частично разрушенных промежуточных состояний (интермедиатов). Из этого следует, что спектр КД, измеренный при промежуточной температуре, является линейной комбинацией спектров КД белка в нативном и денатурированном состояниях.

Для оценки термостабильности порина точка конформационного перехода на уровне вторичной структуры белка была определена из графика зависимости эллиптичности при 222 нм от температуры. Точка температурного перехода для порина из псевдотуберкулезного микроба составила 75 °С. Как известно [4], изменение эллиптичности при данной длине волны используется как мера упорядоченности вторичной структуры белка при

изучении его денатурации. Конформационные изменения, происходящие во вторичной структуре порина выше этой температуры, были необратимы.

С помощью метода сканирующей микрокалориметрии мы определили точку плавления порина. Как следует из полученной термограммы, температурный диапазон плавления порина - 72-80 оС, а максимум термоперехода приходится на 76 °С.

Анализ зависимости квантового выхода флуоресценции порина от температуры показал, что изменения на уровне третичной структуры белка происходят в диапазоне температур несколько меньшем (60-70 °С), нежели полученный из данных микрокалориметрии и КД. На основании этого можно предположить, что тотальному плавлению молекулы белка (фиксируемому методом микрокалориметрии) и изменениям на уровне вторичной структуры порина предшествуют изменения в отдельных доменах его молекулы, которые приводят к изменению взаиморасположения ароматических флуорофоров и, соответственно, интенсивности флуоресценции.

Для того чтобы соотнести результирующие изменения в пространственной организации молекулы порина под действием температуры с определенными изменениями локальной третичной структуры белка, мы проанализировали кривые термозависимости различных параметров спектра суммарной флуоресценции этого образца порина, а именно квантового выхода и нормированных вкладов отдельных классов триптофанилов в эмиссию белка. Обнаружено, что при изменении температуры практически не изменяются доли вкладов остатков тирозина и триптофанилов класса S, исчезает излучение триптофанилов класса I, увеличивается доля доступных воде триптофанилов класса III. Ход кривых, полученных для порина, свидетельствует о том, что заметные нарушения на уровне третичной структуры порина начинаются при 60 оС.

Наблюдаемый нами характер денатурации порина под действием температуры является отличительной чертой мультидоменных белков, как водорастворимых, так и мембранных [16]. Для последних, как известно, при очень прочной вторичной структуре белка характерна высокая степень изменчивости (пластичности) на более высоких уровнях организации молекулы.

Влияние рН среды

Изменения в структуре и функциональной активности изолированного порина в интервале значений рН 8,0-2,0 были изучены с помощью SDS, ПААГ-электрофореза, сканирующей микрокалориметрии, оптической спектроскопии и БЛМ [18, 19]. Обнаружено, что в этом диапазоне значений рН изменения в пространственной структуре белка происходят в два этапа. На первом этапе рН-титрования (8,0-4,5) порин претерпевает ряд конформационных переходов без нарушения тримерной структуры молекулы. На втором этапе при низких значениях рН (4,5-2,0) структурная реорганизация белка приводит к диссоциации тримера порина на мономеры. Полного разворачивания полипептидной цепи порина не происходит даже при низких значениях рН: конформационный интерме-диат белка при рН 2,0 сохраняет до 50 % регулярной вторичной структуры [19].

Анализ флуктуаций тока в БЛМ показал, что проводимость пор, образуемых белком в мембране, наиболее существенно изменяется в узком диапазоне значений рН среды, в слабокислой среде она уменьшается на порядок. Наиболее резкое изменение проводимости модельной мембраны отмечено при рН 5,8, при рН 5,0 наблюдается переход канала в «закрытое» состояние [18].

Полученные нами данные о характере изменения конформации OmpF порина под действием рН согласуются с общепринятым в литературе мнением о том, что функционально активные белки имеют два типа конформационных перестроек. Денатурационный переход связан, как правило, с глубокими конформационными изменениями в белке, сопровождающимися утратой его функциональной активности. Функциональный переход

наблюдается между двумя активными формами белка, степень денатурации которого при этом незначительна. Такой переход, возможно, является регуляторным механизмом в живой клетке.

Влияние обработки фенолом

Для изучения влияния факторов стресса на нативный порин мы провели исследование структуры и свойств порина, выделенного из бактерий псевдотуберкулеза, необработанных и обработанных фенолом [41]. Обнаружено, что при обработке бактерий фенолом состав суммарной липидной фракции изменялся, наиболее заметным было увеличение количества лизоформы фосфатидилэтаноламина. Методом сканирующей микрокалориметрии показано, что увеличение в 2,5 раза содержания лизофосфатидил-этаноламина в обработанных фенолом микробных клетках приводило к увеличению термоустойчивости OmpF порина в результате изменения его конформации. С помощью собственной белковой флуоресценции обнаружено, что изменения в пространственной структуре порина связаны с экспозицией значительной доли остатков триптофана в воду, предположительно, в результате «сжатия» тримера белка и, соответственно, уменьшения размера канала [41].

Таким образом, обнаружена взаимосвязь между изменениями в структуре и порооб-разующей активности порина из псевдотуберкулезного микроба под воздействием стрессовых факторов (закисление среды и обработка фенолом), что может служить прямым экспериментальным доказательством конформационной и функциональной пластичности этих белков НМ бактерий. При этом оба изученных фактора приводят к уменьшению по-рообразующей активности OmpF белка, а именно к уменьшению размера его пор и/или закрытию канала. В связи с этим можно предположить, что подобное изменение предшествует запуску традиционного механизма адаптации бактерий к изменению внешних условий, связанных с регуляцией биосинтеза неспецифических поринов наружной мембраны бактерий.

Получение и свойства рекомбинантного порина

Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде и в большом количестве аналог практически любого иммуноактивного белка. Важным преимуществом рекомбинантных белков является то, что при их получении исключается контакт человека с патогенными бактериями. Применение рекомби-нантных белков или синтетических пептидов в качестве компонентов диагностических тест-систем позволяет повысить их чувствительность, а также избежать неспецифической гипердиагностики.

Кодирующая последовательность OmpF порина из псевдотуберкулезного микроба была клонирована и экспрессирована в клетках E. coli. Подобраны условия выделения и рефолдинга рекомбинантных мономеров (РБ-1) и тримеров (РБ-2) зрелого белка. С помощью методов оптической спектроскопии (спектроскопия КД) охарактеризована их пространственная структура. Показано, что РБ-1 и РБ-2 по содержанию элементов вторичной структуры были подобны изолированным белкам, но имели значительно менее компактную третичную структуру. Порообразующая активность РБ-2 была сравнима с таковой нативного тримера порина [32].

Установлено, что рекомбинантные порины иммуногенны для животных, трехкратная иммунизация мышей этими белками ведет к получению высокоавидной иммунной сыворотки, причем как в присутствии адъювантов, так и без них [27]. Выявлено значительное повышение бактерицидной активности перитонеальных макрофагов мышей, иммунизированных РБ по сравнению с макрофагами интактных мышей [27]. Показано, что структуры

антигенных детерминант РБ-1 и РБ-2 лишь частично соответствуют структуре детерминант мономера и тримера нативного OmpF порина. Общими, скорее всего, являются так называемые линейные антигенные детерминанты, формирующиеся на уровне первичной и/или вторичной структуры белка. В то же время отсутствие и/или неполное формирование «составных», или «прерывистых», антигенных детерминант, характерных для более высоких уровней организации белковой молекулы, является следствием различий в третичной структуре нативных и рекомбинантных тримеров порина [27].

Получение и свойства мутантных рекомбинантных поринов

Высокая степень подобия структуры и свойств нативного OmpF порина из псевдотуберкулезного микроба и его рекомбинантных аналогов обусловила возможность использования их для изучения антигенной структуры порина. С целью определения роли отдельных функционально важных участков первичной структуры белка, а именно наружных петель, в формировании поверхностных эпитопов были получены рекомбинантные мутантные белки dell, del4, del6, del8 с делециями петель L1, L4, L6 и L8, соответственно [31].

Для получения мутантных белков с делециями петель Ll, L4, L6 и L8 был проведен сайт-направленный мутагенез рекомбинантной плазмиды рЕТ41а(+)-т55, несущей ompF ген. Для удаления наружных петель L1, L4, L6 и L8 были разработаны мутагенные оли-гонуклеотидные праймеры, в которых отсутствовали соответствующие участки. Тримеры мутантных поринов получали с помощью последовательной ионообменной хроматографии на Сефарозе DEAE CL 6B и Сефарозе СМ CL 4B.

Пространственная структура мутантных белков была охарактеризована с помощью методов оптической спектроскопии. Для спектров КД мутантных поринов в ароматической области спектра отмечена более низкая амплитуда и меньшая степень разрешения полос по сравнению со спектром РБ-2, что указывает на более рыхлую третичную структуру тримеров мутантных белков. Спектры КД образцов мутантных поринов в области поглощения пептидных связей были характерными для Р-структурированных белков а+Р типа. Установлено, что отсутствие отдельных наружных петель по-разному влияет на соотношение элементов вторичной структуры исследованных мутантных поринов (а-спира-лей и участков с неупорядоченной структурой). Подобные изменения были обнаружены ранее для изолированных поринов, находящихся в денатурирующих условиях [31]. Изучение функциональной активности мутантных поринов показало, что отсутствие петель L1, L4, L6 и L8 не оказывало влияния на наиболее вероятный уровень проводимости канала OmpF [31].

Мутантные порины оказались иммуногенными для животных: в результате трехкратной иммунизации мышей нами получены иммунные сыворотки с титром 3.5 (-lg). Анализ результатов взаимодействия мутантных белков с гомо- и гетерологичными антителами показал, что отсутствие отдельных петель оказывает различное влияние на формирование В- и Т-клеточных антигенных эпитопов порина. Установлено, что петля L8 включает наименьшее количество Т-эпитопов, поскольку иммуногенность del8 сравнима с иммуно-генностью РБ-2. Напротив, отсутствие петли L1 существенно снизило способность белка вызывать образование антител, что свидетельствует о наличии значительного количества Т-хелперных эпитопов на участке, соответствующем этой петле. Мутанты del4 и del6 оказались более иммуногенными для мышей по сравнению с РБ-2. По-видимому, значительные изменения в структуре порина, связанные с отсутствием петель L4 и L6, делают более доступными для антигенпрезентирующих клеток Т-эпитопы белка, локализованные на внутренних участках молекулы порина.

Это предположение основано на теоретических расчетах локализации антигенных детерминант, выполненных нами для OmpF и OmpC поринов из Y. pseudotuberculosis

с помощью программ ProPred, SYFPEITHI, RANKPEP. Согласно полученным результатам, значительная часть Т-хелперных эпитопов белка действительно приходится на участки, соответствующие Р-стрэндам [31].

Известно, что в связывании с антителами участвуют специфические В-эпитопы антигена. В случае мембранных белков такими эпитопами являются наиболее доступные для взаимодействия поверхностные структуры, в том числе наружные петли поринов. Действительно, результаты иммуноферментного анализа (ИФА) взаимодействия му-тантных поринов с антисывороткой к РБ-2 позволили предположить, что на участки, соответствующие петлям L1, L4, L6 и L8, приходится до 70 % B-клеточных эпитопов OmpF порина. Это предположение было подтверждено с помощью реакции связывания мутантных белков со специфическими антителами кроликов, иммунизированных на-тивным тримером OmpF порина, и специфическими антителами в сыворотках крови больных псевдотуберкулезом.

В результате было установлено, что мутантные порины взаимодействуют с иммунными сыворотками с меньшей эффективностью, чем нативные белки, что указывает на отсутствие части В-эпитопов в антигенной структуре мутантных белков [31]. Поскольку заметное снижение иммунохимической активности мутантных поринов было отмечено при их взаимодействии с антисыворотками к нативным тримерам порина, то, скорее всего, отсутствие указанных наружных петель в наибольшей степени приводит к изменениям в области конформационных детерминант порина, формирующихся на уровне третичной и четвертичной структуры белка.

Иммунохимические свойства синтетических антигенных пептидов

Порины наряду с ЛПС относятся к иммунодоминантным и высокоиммуно-генным антигенам НМ. В качестве компонентов вакцинных препаратов они имеют значительные преимущества по сравнению с ЛПС, поскольку нетоксичны и, как правило, являются родо- и видоспецифическими антигенами. На современном этапе развития вакцинопрофилактики одним из критериев при выборе антигена для вакцинации служит возможность получения протективного иммунного ответа, обеспечивающего одновременную защиту макроорганизма против нескольких видов возбудителей инфекционных заболеваний, принадлежащих к одному роду. Один из подходов, который широко применяется при создании антибактериальных вакцин, связан с поиском в первичной структуре белка антигенных эпитопов и синтезом соответствующих этим участкам пептидов, способных без конъюгации с инертным белковым носителем стимулировать образование после иммунизации антител определенной специфичности.

Ранее нами было установлено [17], что иммунизация порином НМ Y. pseudotuberculosis обеспечивает защиту экспериментальных животных при заражении их летальными дозами различных сероваров псевдотуберкулезного микроба. Учитывая высокую степень подобия первичных структур поринов иерсиний, можно предполагать, что протективные препараты, созданные на их основе, будут защищать от инфекций, вызываемых всеми видами патогенных иерсиний.

В соответствии с представлениями современной иммунологии, необходимым условием образования антител к искусственным пептидным антигенам является наличие в их первичной структуре не только В-, но и Т-клеточных эпитопов, которые участвуют в образовании тройного комплекса между антигеном, молекулой главного комплекса гистосовместимости II типа (МНС II) и Т-клеточным рецептором. Образовавшийся комплекс стимулирует Т-хелперные клетки и одновременно активирует В-клетки. Поиск консервативных участков, включающих Т- и В-клеточные эпитопы и, соответственно, пригодных для создания мультивалентных протективных препаратов для защиты от иерсиниозных инфекций, проводился по АК последовательностям белков-поринов

с помощью компьютерных программ. Для расчетов Т-эпитопов использовали программы ProPred, SYFPEITHI, RANKPEP, особое внимание уделяли консервативным пептидам, обладающим широким спектром специфичности по отношению к различным аллельным вариантам лимфоцитарных антигенов человека [29]. Сайты связывания с В-клетками для неспецифических поринов Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и Y. pestis были рассчитаны с помощью программы ADEPT [1].

В результате проведенных расчетов были выбраны 4 пептида, каждый из которых состоял из 20 аминокислот и имел различную степень гомологии с соответствующими фрагментами молекул OmpC и OmpF поринов патогенных иерсиний. Предсказанные пептиды были синтезированы в формате мультивалентных антигенных пептидов (МАП-1-4). Для подтверждения того, что в состав МАП включены участки, соответствующие В-эпитопам, была изучена способность этих пептидов к взаимодействию со специфическими антителами в сыворотках крови кроликов, иммунизированных триме-рами поринов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, и с антителами в сыворотках крови людей, переболевших псевдотуберкулезом или кишечным иерсиниозом. Полученные результаты показали, что наиболее полно В-эпитопы представлены в МАП-1 (петля L2, 3-, 4-й р-стрэнды) [29]. Участки, соответствующие петле L2, по-видимому, включают в себя «универсальный» для поринов обоих видов иерсиний фрагмент последовательности, на который в теплокровном организме вырабатываются антитела как при иммунизации, так и при естественном течении инфекции.

Интересно также отметить существование определенной взаимосвязи между конфор-мацией порина, к которому были получены антитела, и эффективностью взаимодействия этих антител с синтетическими пептидами. Обнаружено, что МАП-1 по-разному реагирует с антителами, полученными к комплексу пептидогликан-белок (ПГ-б) Y. pseudotuberculosis, в состав которого входит порин в нативной тримерной форме, к изолированному три-меру (ИТ) и к термоденатурированному мономеру порина (ТМ). Как показали результаты ИФА, эффективность взаимодействия падает в ряду ПГ-б ^ ИТ ^ ТМ [29]. Поскольку в состав МАП-1 включены антигенные детерминанты петли L2, играющей важную роль в стабилизации пространственной структуры тримера порина в НМ, полученные результаты подтверждают литературные данные о том, что четвертичная структура порина и стабильность его Р-барреля важны для полноценной презентации антигенных эпитопов на поверхности молекулы [35].

Наличие в последовательности синтезированных МАП участков, соответствующих Т-клеточным эпитопам, определяли по способности пептидов индуцировать образование антител у экспериментальных животных. Обнаружено, что все синтетические пептиды стимулируют развитие гуморального иммунного ответа. Однако наиболее иммуногенны-ми оказались пептиды МАП-2 (петля L6, 11-й p-стрэнд) и МАП-4 (петля L5, 10-й р-стрэнд), в состав которых входят участки полипептидной цепи, расположенные на внешней стороне Р-барреля, возможно более доступные для взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками макроорганизма.

В настоящее время не существует средств и способов специфической защиты от иер-синиозов. В связи с этим полученные результаты можно рассматривать как важный этап разработки поливалентных вакцинных препаратов для защиты от инфекций, вызываемых возбудителями чумы, кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза.

Порины иерсиний как диагностические антигены

Диагностика острых кишечных инфекций, обусловленных иерсиниями, характеризуется низкой эффективностью существующих средств и способов их верификации. Такое положение определяет устойчивое внимание ученых к совершенствованию существующих и разработке новых методов лабораторной диагностики псевдотуберкулеза

и кишечного иерсиниоза. Ранее мы разработали и успешно апробировали две ИФА тест-системы на основе поринов из Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica для определения уровня антител в сыворотках больных [11, 14, 21, 25]. Использование этих тест-систем не только обеспечивает высокий уровень дифференциации иерсиниозов от других кишечных инфекций со сходными клиническими признаками, но и позволяет выявлять заболевание на ранних стадиях независимо от сероварианта возбудителя [12, 26, 30].

Для расширения сферы применения ИФА тест-систем на основе поринов иерсиний мы провели их апробацию в целях установления этиологии ряда иммунопатологических состояний. Установление этиологии вторичных иммунодефицитов является сложной проблемой ввиду отсутствия надежных и специфичных методов диагностики. По мнению некоторых отечественных и зарубежных исследователей, иерсиниозы, подобно другим бактериальным инфекциям, служат причиной формирования различных вторичных иммунодефицитных состояний с переходом в системный аутоиммунный процесс, который сопровождается поражением функции практически всех органов и систем человека (сердечно-сосудистой, нервной и мочевыделительной систем, опорно-двигательного аппарата, желудочно-кишечного тракта, почек, щитовидной железы и др.). Считается, что развитие приобретенного иммунодефицита вызвано антигенной мимикрией возбудителя, т.е. сходством структуры бактериальных антигенов с антигенами тканей и органов человека. В случае иерсиниозной инфекции иммунодефицит обусловлен не только антигенной мимикрией, но и способностью иерсиний к длительной персистенции в организме, в результате чего нарушается функция либо отдельных компонентов иммунной системы, либо всей системы в целом.

Разработанные нами тест-системы были использованы для обследования больных с различными формами заболеваний опорно-двигательного аппарата (ревматоидный артрит), периферической нервной системы (вертеброгенная люмбалгия, дискогенный радикулит) и щитовидной железы (аутоиммунный тиреоидит и узловой зоб). В результате анализа сывороток крови больных специфические антитела к поринам иерсиний были обнаружены в 49, 32 и 73 % случаев, соответственно. Полученные данные могут свидетельствовать о формировании системных заболеваний в результате перенесенного иерсиниоза [6-9]. Использование рекомбинантного порина вместо нативного белка в тест-системе для диагностики острых и вторично-очаговых форм псевдотуберкулеза не снижает эффективности обнаружения антител в сыворотке крови больных людей [27].

Анализ специфического гуморального иммунного ответа больных с различными нозологическими формами заболеваний иерсиниозной этиологии показал высокий уровень специфических иммуноглобулинов (Ig) класса G и в 3-5 раз более низкий уровень IgM к поринам Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis [8]. Этот результат может свидетельствовать о постоянной антигенной стимуляции иммунной системы, вызванной длительной персистенцией возбудителя, что, как было указано выше, характерно для иерсиний.

Иммунологический анализ крови обследованных пациентов показал, что иммуноде-фициты иерсиниозной этиологии сопровождаются нарушениями регуляции звеньев моле-кулярно-клеточного гомеостаза, развитие их происходит по типу аутоиммунного заболевания, характеризующегося длительной иммуноактивацией или иммуносупрессией [7, 9]. У больных обнаружено также снижение фагоцитарной активности, свидетельствующее о хронизации воспалительного процесса. У пациентов с различными нозологическими формами заболеваний иерсиниозной этиологии выявлены также изменения в цитокино-вом статусе. Показано, что при развитии постиерсиниозных патологических процессов (вторично-очаговых форм иерсиниозов) происходят изменения уровней как провоспали-тельных, так и противовоспалительных цитокинов [7, 9, 43].

Заключение

В результате систематических исследований поринов рода Yersinia, проводимых в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета, получен целый ряд принципиально важных результатов, имеющих как фундаментальное, так и прикладное значение.

Удалось установить взаимосвязь между функциональной активностью этих белков, взаимодействием с другими компонентами бактериальной мембраны и особенностями их пространственной организации. Вторичная структура изолированных поринов отличается повышенной устойчивостью к денатурирующим факторам / агентам. Для более высоких уровней пространственной структуры поринов (четвертичной и третичной) характерна конформационная пластичность (гибкость), обусловливающая образование различных промежуточных состояний (интермедиатов), структуру которых определяют условия их получения. Установлено, что при изменении значения рН среды порообра-зующий белок НМ псевдотуберкулезного микроба претерпевает два конформационных перехода: функциональный и денатурационный, что, вероятно, служит дополнительным механизмом адаптации иерсиний к изменению условий внешней среды. Каналы, образуемые поринами патогенных и непатогенных иерсиний в искусственном бислое, различаются по размеру и характеру распределения уровней проводимости. Удалось определить роль поринов как иммунодоминантных антигенов в развитии иерсиниозной инфекции. Порообразующие белки иерсиний являются родоспецифическими белками и обладают высокой степенью гомологии первичной структуры. Порины патогенных видов иерсиний могут быть использованы в качестве диагностических и протективных антигенов. Разработанные авторами ИФА тест-системы на основе поринов из НМ Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica позволяют проводить дифференциальную диагностику иерсиниозов от других кишечных инфекций, а также устанавливать иерсиниозную этиологию различных иммунопатологий.

Авторы выражают глубокую признательность Лихацкой Галине Николаевне, Вакориной Татьяне Ивановне, Ким Наталье Юрьевне и Исаевой Марине Петровне, сотрудникам ТИБОХ ДВО РАН, за многолетнее плодотворное сотрудничество.

ЛИТЕРАТУРА

1. Антонец Д.В., Бакулина А.Ю., Портнягина О.Ю., Сидорова О.В., Новикова О.Д., Максютов А.З. Предсказание антигенно-активных районов OmpF-подобного порина Yersinia pseudotuberculosis // ДАН. 2007. Т. 414, № 4. С. 1-3.

2. Бахолдина С.И., Красикова И.Н., Шубин Ф.Н., Бузолева Л.С., Соловьева Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липидный состав Yersinia pseudotuberculosis // Биохимия. 2001. Т. 66. С. 511-519.

3. Вакорина Т.И., Новикова О.Д., Красикова И.Н., Набережных Г.А., Соловьева Т.Ф., Оводов Ю.С. Взаимодействие порина из Yersinia pseudotuberculosis с различными структурными вариантами эндогенных липополисахаридов // Биохимия. 2003. Т. 68. С. 1193-1202.

4. Веньяминов С.Ю., Косых В.Г., Холодков О.А., Бурьянов Я.И. УФ- и КД-спектры рестрикционной эндонуклеазы EcoRII и ДНК-метилазы EcoRII // Биоорган. химия. 1990. Т. 6. С. 47-51.

5. Вострикова О.П., Лихацкая Г.Н., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Антигенное родство и функциональные свойства поринов рода Yersinia // Биол. мембраны. 2000. Т. 17, № 4. C. 399-409.

6. Вострикова О.П., Новикова О.Д., Горбач Т. А., Рябова Н.Н., Портнягина О.Ю., Хоменко В.А., Павлова Г.Г. Верификация и клинико-иммунологическая характеристика поражения периферической нервной системы иер-синиозной этиологии // Тихоокеан. мед. журн. 2012. № 1. С. 68-72.

7. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Дубиков А.И., Корнеева И.А., Рябова Н.Н., Павлова Г. Г. Иммунологическая характеристика вторичных иммунодефицитов, ассоциированных с иер-синиозной инфекцией // Рос. аллергол. журн. 2013. № 2, ч. 2. С. 61-63.

8. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Белоголовых Л.А., Черных Н.П., Козырева М.В., Соловьева Е.Ф., Дубиков А.И. Клинико-иммунологическая характеристика больных ревматоидным артритом, ассоциированным с иерсиниозной инфекцией // Рос. аллергол. журн. 2012. № 5, вып. 1. С. 55-57.

9. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Хоменко В.А., Малашенкова В.Г., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Новый подход в диагностике иерсиниозов // Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 3. С. 132-133.

10. Вострикова О.П., Исаева М.П., Лихацкая Г.Н., Новикова О.Д., Ким Н.Ю., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. OmpC-подобный порин наружной мембраны Yersinia enterocolitica: молекулярная структура и функциональная активность // Биохимия. 2013. Т. 78, № 5. С. 550-560.

11. Вострикова О.П., Новикова О.Д., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В., Соловьева Т.Ф. Способ дифференциальной диагностики иерсиниоза и диагностический набор для его осуществления: пат. 2345365 РФ. № 2007120080/15; опубл. 27.01.2009, Бюл. № 3. 12 с.

12. Вострикова О.П., Портнягина О.Ю., Малашенкова В.Г., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Гордеец А.В., Соловьева Т.Ф. Способ дифференциальной диагностики псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза и диагностический набор для его осуществления: пат. 2339952 РФ. № 2007120082/15; опубл. 27.11.2008, Бюл. № 33. 15 с.

13. Вострикова О.П., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н., Гузев К.В., Вакорина Т.И., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Структура и функция порообразующих белков бактерий рода Yersinia. 1. Выделение и сравнительная характеристика физико-химических свойств и функциональной активности поринов иерсиний // Биоорган. химия. 2006. Т. 32, № 4. С. 371-383.

14. Гордеец А.В., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Малашенкова В.Г., Бениова С.Н., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Способ диагностики псевдотуберкулеза: пат. 2153172 РФ. № 98122085/14; опубл. 20.07.2000, Бюл. № 20. 8 с.

15. Гузев К.В., Исаева М.П., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Рассказов В.А. Молекулярная характеристика OmpF-подобных поринов патогенных Yersinia // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 1338-1345.

16. Дамашун Г., Дамашун Х., Гаст К., Цирвер Д. Денатурированные состояния дрожжевой фосфогли-цераткиназы // Биохимия. 1998. Т. 63. С. 308-326.

17. Дармов И.В., Маракулин И.В., Погорельский И.П., Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Соловьева Т.Ф. Профилактика экспериментальной псевдотуберкулезной инфекции с помощью иммунизации порином из Yersinia pseudotuberculosis // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1999. Т. 127, № 2. C. 221-223.

18. Ким Н.Ю., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Лихацкая Г.Н., Вострикова О.П., Емельяненко В.И., Кузнецова С.М., Соловьева Т.Ф. Влияние рН на структуру и функциональную активность порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis. 1. Функционально значимые конформационные переходы иерсинина // Биол. мембраны. 2007. Т. 24, № 2. С. 150-158.

19. Новикова О.Д., Ким Н.Ю., Лукьянов П.А., Емельяненко В.И., Кузнецова С.М., Лихацкая Г.Н., Соловьева Т.Ф. Влияние рН на структуру и функциональную активность порина из наружной мембраны Yersinia pseudo-tuberculosis. 2. Характеристика рН-индуцированных конформационных интермедиаторов иерсинина // Биол. мембраны. 2007. Т. 24, № 2. С. 159-168.

20. Новикова О. Д., Вакорина Т.И., Хоменко В. А., Лихацкая Г.Н., Ким Н.Ю., Емельяненко В.И., Кузнецова С.М., Соловьева Т.Ф. Влияние условий культивирования на пространственную структуру и функциональную активность OmpF-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Биохимия. 2008. Т. 73. С. 173-184.

21. Новикова О.Д., Портнягина О.Ю., Фролова Г.М., Соловьева Т.Ф., Павлова Т.Н., Тимченко Н.Ф., Прокопенкова А.П., Оводов Ю.С. Использование порина из внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis для серодиагностики псевдотуберкулеза // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1995. № 8. C. 199-202.

22. Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Неспецифические порины наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Структура и свойства // Биол. мембраны. 2009. Т. 26, № 1. С. 6-20.

23. Новикова О.Д., Хоменко В.А., Емельяненко В.И., Лихацкая Г.Н., Зелепуга Е.А., Ким Н.Ю., Исаева М.П., Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. OmpC-подобный порин из Yersinia pseudotuberculosis: молекулярная характеристика, физико-химические и функциональные свойства // Биол. мембраны. 2011. Т. 28, № 1. С. 1-16.

24. Новикова О.Д., Хоменко В.А., Фролова Г.М., Лихацкая Г.Н., Романенко Л.А., Портнягина О.Ю., Кузнецова С.М., Соловьева Т.Ф. Порины морских бактерий рода Pseudoalteromonas (Gammaproteobacteria: Pseudo-alteromonadaсeae) // Биология моря. 2013. Т. 39, № 1. С. 44-49.

25. Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Бениова С.Н., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В. Апробация иммуноферментной тест-системы на основе белка порина из Yersinia pseudotuberculosis для диагностики псевдотуберкулеза (экстраинтестинального иерсиниоза) у детей // Иммунология. 2000. № 2. C. 59-61.

26. Портнягина О.Ю., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф., Бениова С.Н., Малашенкова В.Г., Гордеец А.В. Диагностика псевдотуберкулеза с помощью иммуноферментной тест-системы на основе белка порина из Yersinia pseudotuberculosis // Тихоокеан. мед. журн. 2001. № 2. C. 23-25.

27. Портнягина О.Ю., Сидорова О.В., Хоменко В.А., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Соловьева Т.Ф. Иммуногенные свойства рекомбинантного Omp-F-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotu-berculosis // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2009. № 7. С. 85-88.

28. Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Соловьева Т.Ф. Иммунологические свойства неспецифических поринов наружной мембраны грамотрицательных бактерий // Биол. мембраны. 2005. Т. 22, № 5. С. 357-365.

29. Портнягина О.Ю., Сидорова О.В., Новикова О.Д., Вострикова О.П., Хоменко В.А., Соловьева Т.Ф. Иммунохимическая характеристика синтетических пептидов, включающих Т- и В-клеточные эпитопы неспецифических поринов патогенных иерсиний // Биоорган. химия. 2010. Т. 36, № 6. С. 779-788.

30. Портнягина О.Ю., Вострикова О.П. Новикова О.Д., Исаева М.П., Стенкова А.М., Гузев К.В., Мала-шенкова В.Г., Хоменко В.А., Сидорова О.В., Горбач Е.А., Соловьева Т.Ф. Разработка и апробация высокоэффективных тест-систем для диагностики иерсиниозов // Тихоокеан. мед. журн. 2010. № 3. С. 85-90.

31. Сидорова О.В., Исаева М.П., Хоменко В. А., Портнягина О.Ю., Лихацкая Г.Н., Ким Н.Ю., Новикова О.Д., Чистюлин Д.К., Соловьева Т.Ф. Мутантные OmpF порины Yersinia pseudotuberculosis с делециями наружных петель: создание генетических конструкций, экспрессия, выделение, рефолдинг // Биоорган. химия. 2012. Т. 38, № 2. С. 156-165.

32. Хоменко В.А., Портнягина О.Ю., Новикова О.Д., Исаева М.П., Ким Н.Ю., Лихацкая Г.Н., Востри-кова О.П., Соловьева Т.Ф. Выделение и характеристика рекомбинантного OmpF-подобного порина из наружной мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Биоорган. химия. 2008. Т. 34. № 2. С. 1-8.

33. Чистюлин Д.К., Новикова О. Д., Портнягина О.Ю., Хоменко В. А., Вакорина Т.И., Ким Н.Ю., Исаева М.П., Лихацкая Г.Н., Соловьева Т.Ф. Выделение и характеристика OmpF-подобного порина наружной мембраны Yersinia ruckeri // Биол. мембраны. 2012. Т. 29, № 3. С. 156-164.

34. Achouak W., Heulin T., Pages J.P. Multiple facets of bacterial porins // FEMS Microbiol. Lett. 2001. Vol. 199, N 1. P. 1-7.

35. Arockiasamy A., Murthy G.S., Rukmini M.R., Sundara Baalaji N., Katpally U.C., Krishnaswamy S. Conformational epitope mapping of OmpC, a major cell surface antigen from Salmonella typhi // J. Struct. Biol. 2004. Vol. 148, N 1. P. 22-33.

36. Benz R., Janko K., Läuger P. Ionic selectivity of pores formed by the matrix protein (porin) of Escherichia coli // Biochim. Biophys. Acta. 1979. Vol. 551, N 2. P. 238-247.

37. Cowan S.W., Schirmer T., Rummel G., Steiert M., Ghosh R., Pauptit R.A., Jansonius J.N., Rosenbusch J.P. Crystal structure explain functional properties of two Escherichia coli porins // Nature. 1992. Vol. 358, N 6389. P. 727-733.

38. Likhatskaya G.N., Solov'eva T.F., Novikova O.D., Issaeva M.P., Guzev K.V., Kryzhko I.B., Trifonov E.V., Nurminski E.A. Homology models of the Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis general porins and compera-tive analysis of their functional and antigenic regions // J. Biomol. Struct. Dyn. 2005. Vol. 23, N 2. P. 163-174.

39. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability // Microbiol. Rev. 1985. Vol. 49, N 1. P. 1-32.

Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. Vol. 676, N 4. P. 593-656.

40. Sanina N.M., Davydova L.A., Bakholdina S.I., Novikova O.D., Portnyagina O.Yu., Solov'eva T.F., Shnyrov V.L., Bogdanov M.V. Effect of phenol-induced changes in lipid composition on conformation of OmpF-like porin of Yersinia pseudotuberculosis // FEBS Letters. 2013. Vol. 587. P. 2260-2265.

41. Vezzi A., Campanaro S., D'Angelo M., Simonato F., Vitulo N., Lauro F.M., Cestaro A., Malacrida G., Simionati B., Cannata N., Romualdi C., Bartlett D.H., Valle G. Life at depth: Photobacterium profundum genome sequence and expression analysis // Science. 2005. Vol. 307. P. 1459-1461.

42. Vostrikova O.P., Portnyagina O.Yu., Khomenko V. A., Korneeva I.A., Trifonova I.G., Pavlova G.G., Novikova O.D. Clinical and immunological characteristic of the diffusion nodasle of nontoxic goiter of Yersinia etiology // European Science and Technology: Materials ofthe 4th Intern. res. and pract. conf., Munich, Germany, Apr. 10th-11th, 2013. Munich: Vela-Verlag Waldkraiburg, 2013. Vol. 2. P. 536-544.