МОДИФИЦИРОВАННАЯ ПОВЕРХНОСТЬ, СПОСОБНАЯ ПРИОБРЕТАТЬ БАКТЕРИОСТАТИЧЕСКУЮ И БАКТЕРИЦИДНУЮ АКТИВНОСТЬ, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ
MODIFIED SURFACE WITH ABILITY TO ACQUIRE BACTERIOSTATIC AND BACTERICIDE ACTIVITY AND METHOD OF ITS PRODUCTION AND APPLICATIONS

Область техники
Настоящее изобретение относится к модифицированной поверхности, способной приобретать бактериостатическую и бактерицидную активность. В частности, настоящее изобретение относится к новой модифицированной поверхности, которая при облучении светом превращает поверхность субстрата, имеющего указанную модифицированную поверхность, в бактериостатическую и бактерицидную поверхность. Настоящее изобретение также относится к способу модификации поверхности с целью приобретения у нее бактериостатической и бактерицидной активности при ее облучении светом, а также относится к медицинскому или немедицинскому устройству, имеющему указанную поверхность. Модифицированная поверхность согласно настоящему изобретению подходит для предотвращения прикрепления микроорганизмов к данной поверхности, ингибировать формирование биопленки на данной поверхности и/или разрушать уже сформированную биопленку на данной поверхности при ее облучении светом. Этих эффектов можно достичь столько раз, сколько это необходимо и бессрочно без доставки противомикробного агента или фармацевтического агента, такого как антибиотик или лекарственное средство, соответственно.
Уровень техники
Организмы, которые прикрепляются, например, к поверхности катетера, поддерживают себя путем продуцирования «внеклеточной слизи», вещества, богатого экзополисахаридами, часто называемого волокнистым гликокаликсом или микробной биопленкой. Микроорганизмы связываются с поверхностью белков хозяина, таких как фибрин и фибронектин с образованием биопленки. Организмы, внедряющиеся в слой биопленки, становятся более устойчивыми к противомикробным агентам и терапиям. Известным способом удаления биопленок является применение полостных промывочных растворов, включающих комбинацию противомикробных агентов а также антикоагулянтов.
Другая стратегия заключается в пропитывании поверхностей указанных катетеров противомикробными агентами с целью предотвращения колонизации и образования биопленки. Желательна разработка улучшенного способа предотвращения внутрисосудистых инфекций, связанных с катетером.
Значительное количество внимания и исследований было направлено на предотвращение колонизации бактериальными и грибными организмами поверхностей ортопедических имплантатов путем использования противомикробных агентов, таких как антибиотики, связанные с поверхностью таких устройств. Целью таких попыток было получение достаточного бактериостатического или бактерицидного действия для предотвращения колонизации. Ранее применяли различные способы для покрытия поверхностей медицинских устройств антибиотиком.
В патенте США No. 4442133, Greco et al., описан способ покрытия поверхности медицинских устройств антибиотиками, включающий в себя первое покрытие выбранных поверхностей с помощью хлорида бензалкония с последующим ионным связыванием с композицией антибиотиков.
В патенте США No. 4879135, Greco et al., описана модификация поверхности хирургических имплантатов путем связывания лекарственных средств, которые после имплантации медленно высвобождались. Более конкретно, он относится к улучшенным хирургическим имплантатам, обладающим замедленной локализованной доставкой фармакологических агентов, как например, антибиотиков, обладающих продолжительной активностью, или агентов с пониженной тромбогенностью, а также он относится к способам их получения. Модификация поверхности хирургических имплантатов с помощью адгезии на них фармакологических агентов для целей минимизации инфекции и отторжения протезов хорошо известна и одно время породила широкий интерес.
Биопленка представляет собой накапливающиеся микроорганизмы, включающие бактерии, грибы и вирусы, которые заключены в полисахаридном матриксе и прикреплены к твердым биологическим и небиологическим поверхностям. Биопленки важны с медицинской точки зрения, поскольку они могут отвечать за большинство микробных инфекций в организме. Биопленки отвечают за множество инфекций ротовой полости, среднего уха, инфекций, связанных с постоянными катетерами и трахеальными и дыхательными трубками.
Биопленки обладают значительной устойчивостью к обработке стандартными местными и внутривенными противомикробными агентами. Как полагают, это связано с неспособностью антибиотиков проникать через полисахаридное покрытие биопленки.
Бактерии и другие микроорганизмы, заключенные внутри биопленок, также устойчивы к обоим механизмам защиты организма - иммунологическому и неспецифическому. Бактериальный контакт с твердой поверхностью запускает экспрессию панели бактериальных ферментов, которые обуславливают образование полисахаридов, которые стимулируют колонизацию и защиту бактерий. Полисахаридная структура биопленок такова, что иммунный ответ может быть направлен только на те антигены, которые находятся на внешней поверхности биопленки, и антитела и другие сывороточные или слюнные белки часто не способны проникать в биопленку.
Кроме того, может эффективно предотвращаться фагоцитарное поглощение бактерий, растущих внутри комплексного полисахаридного матрикса, прикрепленного к твердой поверхности.
Использование множества различных медицинских устройств может приводить к инфекции при контакте с тканью или жидкостью организма. Примеры таких устройств представляют собой катетеры для сосудистого доступа (артериальные и венозные), интродъюсеры, сосудистые трансплантаты, мочевые катетеры и ассоциированные с ними устройства, такие как дренажные мешки и коннекторы, и дренажные трубки для брюшной полости, мешки и коннекторы и многие другие.
WO 200289750 относится к фотодинамической терапии с применением пирролнитрина. В частности, он относится к улучшенным хирургическим имплантатам, обладающим замедленной локализованной доставкой фармакологических агентов, как например, агентов с продолжительной активностью антибиотиков или пониженной тромбогенностью, и к способам их получения. Более конкретно, он описывает способ световой эрадикации клеток и бесклеточных организмов, как например, во время in vitro или in vivo процедуры дезинфекции или стерилизации, или способ эрадикации опухолевых клеток или бесклеточных организмов. В одном варианте реализации способа применяют фоточувствительный материал, пирронитрин, в растворе и химический агент, такой как поверхностно-активное вещество. Согласно этой международной патентной заявке описана фотодинамическая терапия с применением фоточувствительного материала, такого как метиленовый синий, метиленовый зеленый или толуиденовый синий в комбинации с пирронитрином, и свето-испускающего устройства, такого как светящийся шпатель, светящийся пластырь, светящаяся прокладка или свето-испускающее или свето-передающее изделие.
В настоящее время широко используются наночастицы для биомедицинской обработки, особенно в области нанотехнологии. Эти наночастицы должны достигать области патологии и проходить сквозь экстремально малые отверстия внутри организма. Например, необходимо транспортировать золотые наночастицы к злокачественным опухолям через отверстия приблизительно 100 нм, образованные в области точек разветвления между существовавшими ранее кровеносными сосудами и новыми кровеносными сосудами, сформированными злокачественными опухолями. Золотые наночастицы в форме стержней будут преодолевать трудности, достигая области патологии благодаря их форме.
В европейском патенте No. ЕР 2241394 описана композиция золотых наночастиц, которые могут проходить сквозь малые отверстия in vivo легче, чем золотые наночастицы в форме стержней и которые могут применяться в качестве самонагревающегося акцептора энергии.
Международная патентная заявка No. WO 2009/024636 относится к фототермической обработке. Более конкретно, в ней описан инкапсулированный гибридный материал. Такая инкапсуляция в диоксиде кремния особенно предпочтительна при измерениях для контроля текстурных параметров покрытия, и в то же время предлагает много возможностей для функционализации. Это особенно удобно для включения золотых наночастиц в мезопористый диоксид кремния, что дает возможность управления высокой пористостью и получения контролируемого размера пор и большой площади поверхности. Гибридный материал дает возможность прикрепления лекарственного средства и/или биомаркера на поверхности диоксида кремния, который формирует наносферы. Гибридный материал содержит по меньшей мере два компонента: золотые наночастицы размером от 10 до 60 нм внутри матрицы неорганического соединения, предпочтительно кремния. Свет, поглощаемый наночастицами, быстро превращается в тепло. Включение двух или более золотых наночастиц внутрь капсулы включает в себя взаимодействие между ними против электромагнитных стимулов, которые дают возможность их применения в качестве диагностических средств, контроля высвобождения лекарственного средства или фототермических обработок.
В патентной заявке US 20130018299 описаны наноконструкты, содержащие нанооболочки, и способы применения наноконструктов для лечения или облегчения патологического состояния. Более конкретно, описан способ формирования деградируемых нанооболочек на полимерном субстрате ядра. Нанооболочки включают металл, углерод или проводящий полимер. Наноконструкты могут вводить в ткань-мишень объекта, который может быть человеком или животным. К наноконструктам может быть применен источник энергии. Наноконструкты поглощают энергию и затем превращают энергию в тепло, обеспечивая таким образом терапию посредством доставки объекту лекарственного средства, содержащегося в указанных наноконструктах. Свет активирует доставку лекарственного средства.
2
1
1
2
2
В международной патентной заявке WO 2010/107720 описана система превращения энергии с ее повышением и/или с ее понижением, и система получения фотостимулированной реакции в среде. Описанная наночастица выполнена с возможностью генерации второй длины волны излучения λ, имеющей более высокую энергию, чем первая длина волны λ, при экспонировании с первой длиной волны излучения λ. Система разработана для получения фотостимулированной реакции в среде. Кроме того, такая система включает рецептор, расположенный в среде поблизости от наночастицы, которая при активации с помощью второй длины волны X, генерирует фотостимулированную реакцию. Таким образом, снова эмиссия света (λ) обуславливает активацию определенной реакции. То есть, эти частицы выполнены с возможностью превращения падающего света в отличающийся испускаемый свет.
Таким образом, по-прежнему существует потребность в обеспечении новых путей предотвращения инфекции, ингибирования биопленки и/или разрушения биопленки, которые были бы приемлемы для любого типа субстрата, чьи свойства поддерживались бы в течение долгого срока и, особенно, без доставки противомикробного агента или фармацевтического агента, такого как антибиотик или лекарственное средство, соответственно.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение было осуществлено с учетом уровня техники, описанного выше.
Задачей настоящего изобретения является обеспечение модифицированной поверхности, способной приобретать бактериостаическую, бактерицидную и противомикробную активность легким надежным и безвредным для человека и животного способом, а также обеспечение способа модификации поверхности с ее приобретением бактериостатической и бактерицидной активности на длительный срок каждый раз, когда ее облучают светом. Изобретение также относится к медицинскому или немедицинскому устройству, имеющему такую модифицированную поверхность, которая при облучении светом предотвращает прикрепление к своей поверхности микроорганизмов, ингибирует образование биопленки на этой поверхности и/или разрушает уже сформированную биопленку на такой поверхности.
Для решения проблемы, изложенной в уровне техники, в настоящем изобретении предложена модифицированная поверхность, которая способна превращать поверхность субстрата, который содержит указанную модифицированную поверхность, в бактериостатическую и бактерицидную поверхность при ее облучении светом, предотвращая таким образом прикрепление микроорганизмов к данной поверхности, ингибируя образование биопленки на такой поверхности и/или разрушая уже образованную биопленку на такой поверхности. Более конкретно, заявлена модифицированная поверхность, способная приобретать бактериостатическую и бактерицидную активность, которая включает:
- субстрат, выполненный с возможностью прикрепления тепловых наночастиц, поддерживающих локальный поверхностный плазмонный резонанс; и,
- тепловые наночастицы, поддерживающие локальный плазмонный резонанс, связанный с указанным субстратом с образованием теплового покрытия,
причем тепловые наночастицы способны увеличивать их температуру с помощью облучения светом длины волны в диапазоне, который соответствует длине волны локального поверхностного плазмонного резонанса указанных наночастиц, посредством чего указанное тепловое покрытие повышает свою температуру, давая возможность повышения температуры указанного теплового покрытия, чтобы избежать прикрепления микроорганизма к данной поверхности, ингибировать формирование биопленки на данной поверхности и/или разрушить уже сформированную биопленку на данной поверхности.
Неожиданно, указанная модифицированная поверхность становится бактериостатической и бактерицидной поверхностью при облучении ее светом длиной волны в диапазоне, который соответствует длине волны локального плазмонного резонанса указанных наночастиц, на долгий срок каждый раз, когда ее облучают светом.
Термин «поверхностный плазмонный резонанс» (SPR) относится к суммарным резонансным колебаниям электронов материала, возбуждающихся падающим светом (облучение светом). Условия резонанса устанавливаются, когда частота (диапазон длины волны) света соответствует или объединяется с природной частотой (диапазон длины волн) квазисвободных электронов, колеблющихся против восстанавливающей силы положительных ядер. SPR в наночастицах с размером порядка нанометров (диаметр <100 нм) также называют локализованным или локальным поверхностным плазмонным резонансом (LSPR).
Термин «облучение светом» или «облученные светом» означает в данном документе диапазон оптических длин волн, используемый для повышения температуры тепловых наночастиц. Длины волн данного света должны перекрываться с длиной волны плазмонного резонанса наночастиц. Для хирургических имплантатов диапазон длины волны облучения предпочтительно составляет 750-1200 нм.
Термин «тепловая наночастица» означает в данном документе плазмонную наночастицу, сконструированную для генерации электрического поля внутри наночастицы при облучении светом. Тепловая наночастица представляет собой плазмонную наночастицу, сконструированную с возможностью поглощения в наночастице падающего света при ее облучении светом, который, по большей части, рассеивается в ионы, и которая устанавливает связь между светом, улавливаемым наночастицами, и соответствующей энергией, которая хранится в электронном облаке, генерируя нагревание наночастицы.
ABS
Таким образом, тепловая наночастица, которая представляет собой плазмонную наночастицу, выполнена с возможностью генерации электрического поля внутри наночастицы при ее облучении светом. Таким образом, генерированное электрическое поле (Е) внутри наночастицы отвечает за теплообразование наночастицы, и энергия теплообразования (Q) внутри наночастицы прямо пропорциональна сечению поглощения (σ).
Материал указанных наночастиц может быть любым при условии, что он поддерживает (локальный) поверхностный плазмонный резонанс. Примеры этих материалов представляют собой металл, полупроводник, оксид, оксид металла или их комбинацию, предпочтительно представляет собой золото, серебро или медь.
Указанные тепловые наночастицы могут иметь размер в диапазоне от 1 нм до 1 мкм, более предпочтительно, от 1 нм до 100 нм.
Указанные тепловые наночастицы имеют форму, выбранную из цилиндрической, треугольной, пирамидальной, кубической, сферической, формы звезды, формы стержня или их комбинации. Любая другая форма также предусмотрена объемом настоящего изобретения при условии, что она дает возможность генерации электрического поля (Е) внутри наночастицы при ее облучении светом.
Предпочтительно, поведение света в тепловой наночастице, которая связана или закреплена на субстрате согласно настоящему изобретению, представляет собой линейное взаимодействие, то есть испускаемый свет (после взаимодействия) равен энергии падающего света. В линейном взаимодействии (LI), диэлектрическая поляризация (Р) линейно отвечает на электрическое поле (Е) света.
Кроме того, колебание электронов указанных тепловых наночастиц, стимулированное облучением света, вызывает повышение температуры наночастицы, в результате чего тепловое покрытие, которое содержит тепловые наночастицы, дополнительно нагревается с помощью тепловой диффузии.
Повышение температуры указанного покрытия, которое содержит указанные тепловые наночастицы, индуцирует разрушение внеклеточных полимерных веществ, которые используются микроорганизмами для прикрепления к поверхности, предотвращая таким образом их прикрепление к поверхности. Кроме того, это повышение температуры модифицированной поверхности также разрушает микроорганизмы, уже прикрепленные к поверхности, с получением таким образом ингибирования создания биопленки.
Предпочтительно, с использованием модифицированной поверхности согласно первому аспекту настоящего изобретения предлагается новый путь предотвращения инфекции, ингибирования биопленки и разрушения биопленки, приемлемый для любого субстрата, который сконфигурирован для прикрепления указанных наночастиц, поддерживающих локальный поверхностный плазмонный резонанс, столько раз, сколько это необходимо и бессрочно без доставки противомикробного агента или фармацевтического агента.
Тепловые плазмонные наночастицы могут прикрепляться к субстрату различными способами. Например, тепловые наночастицы могут прикрепляться посредством ковалентной связи с использованием функциональной молекулы или посредством электростатического взаимодействия или посредством реакции комплексообразования. Комбинация этих различных способов для прикрепления наночастиц к субстрату также рассматривается в объеме настоящего изобретения. Функциональная молекула является бифункциональной молекулой, содержащей по меньшей мере две реакционноспособные концевые группы.
Таким образом, согласно первому аспекту настоящего изобретения предлагается модифицированная поверхность (тепловое покрытие), которая функционирует в качестве плазмонной мета-поверхности, которая поддерживает поверхностный плазмон, с которым ассоциирует свет.
Неожиданно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что повышение температуры теплового покрытия достаточно высоко, чтобы вызвать разрушение биопленки, уже сформированной на поверхности. При данных обстоятельствах, описанных выше, облучение светом с длиной волны выбранного спектра обеспечивает повышение температуры электронов плазмонных наночастиц, посредством чего повышается температура теплового покрытия достаточно, чтобы превратить модифицированную поверхность в бактериостатическую и бактерицидную поверхность, которая предотвращает прикрепление микроорганизмов к этой поверхности, ингибирует формирование биопленки на этой поверхности и/или разрушает уже сформированную биопленку на данной поверхности.
Когда бактериостатическая и бактерицидная активность относится к хирургическим имплантатам для применения у человека, то является предпочтительным облучение светом в инфракрасном диапазоне спектра с целью уменьшения повреждения окружающих здоровых тканей. Исключительно для справки в таблице ниже приведено соответствие длины волны энергии фотонов.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что модифицированная поверхность субстрата согласно первому аспекту обеспечивает поверхность, способную приобретать бактериостатическую и бактерицидную активность при облучении светом длиной волны в определенном диапазоне, другим способом, отличным от стандартно используемых противомикробных агентов, антибиотиков, которые прикрепляются к поверхности субстратов, или другим способом, отличным от стандартно используемых фармакологических агентов, которые обладают свойством отсроченной и локализованной доставки указанных агентов, которые доставляют фоточувствительный материал, который активируется с помощью фототермической терапии.
В общем, модифицированная поверхность, предложенная согласно первому аспекту настоящего изобретения, является легкой, надежной и безопасной для хирургических имплантатов или медицинских устройств. Модифицированная поверхность согласно первому аспекту также применяется для немидицинского устройства, например, для кухонных поверхностей, трубопроводов, игрушек или других субстратов, подвергающихся стерилизации или чистке для разрушения уже сформированной биопленки на данной поверхности или для предотвращения прикрепления микроорганизмов к поверхности.
Таким образом, повышение температуры (ΔΤ положительно) теплового покрытия, вызванное облучением светом длиной волны в определенном диапазоне, дает возможность превращения модифицированной поверхности в бактерицидную и бактериостатическую поверхность. Предпочтительно, бактериостатическая и бактерицидная активность может поддерживаться в течение долгого срока. Кроме того, бактериостатическая и бактерицидная активность субстрата, сформированного таким образом, может воспроизводиться с помощью нового облучения светом с длиной волны в определенном диапазоне спектра, пока есть потребность в данной активности.
Предпочтительно, повышение температуры модифицированной поверхности может контролироваться типом материала, размером, формой тепловых наночастиц, плотностью тепловых наночастиц, прикрепленных на субстрате, и интенсивностью применяемого света, которая управляется источником светового облучения.
Кроме того, повышение температуры модифицированной поверхности может быть настолько локальным, насколько это необходимо, путем ограничения облучаемой площади.
Это не ограничивается типом материала субстрата. Единственное условие заключается в том, чтобы материал субстрата был способен закреплять поверхностную плазмонную наночастицу на субстрате непосредственно или с помощью ранее приготовленного субстрата или наночастицы. Предпочтительно, субстрат состоит из волокна, ткани, сплава, стали, пластика, стекла, керамического материала, полимера, смолы, или их комбинации.
Субстрат также может представлять собой текстиль, наряду с тканными, вязанными плетенными и неткаными изделиями.
Полимеры, применяемые для медицинского устройства, представляют собой такие, как например полипропилен, полиэтилен, полиэтилен низкой плотности, полиэтилен высокой плотности, высокомолекулярный полиэтилен, ультравысокомолекулярный полиэтилен, полиэтилентерефталат, полипропилентерефталат, полибутилентерефталат, политетрафторэтилен и т.п.. Кроме того, могут использоваться подходящие абсорбируемые полимеры.
Как установлено выше, структурные параметры наночастицы (форма, размер, материал) определяют спектральные признаки плазмонного резонанса (центральная длина волны, диапазон резонанса и т.д.). В этом смысле, оптическая длина волны должна быть адаптирована к LSPR наночастицы и наоборот. Хотя следует заметить, что причина для смещения плазмонного резонанса и, соответственно возбуждение, определенной области спектра может происходить для избежания фотоповреждения обрабатываемой поверхности, особенно в организме.
Допускается использование любого источника света, который способен генерировать оптическую длину волны внутри целевого диапазона спектра (LSPR) тепловой наночастицы для облучения модифицированной поверхности. Без намерения ограничить возможные источники и исключительно в качестве примера в данном документе описаны флуоресцентная и галогеновая лампа, лазер, интенсивный импульсный свет, светоиспускающий диод, свет лампы накаливания или хемилюминесцентный свет или их комбинация.
Для медицинских применений свет облучения предпочтителен внутри инфракрасного диапазона спектра, так как человеческая ткань прозрачна для инфракрасного света на глубину до нескольких сантиметров. Таким образом, можно повысить температуру модифицированной поверхности с помощью облучения света, например, извне тела.
Второй аспект настоящего изобретения относится к способу модификации поверхности, способной приобретать бактериостатическую, бактерицидную и противомикробную активность согласно первому аспекту, причем способ включает:
- получение субстрата для прикрепления тепловых наночастиц, поддерживающих локальный поверхностный плазмонный резонанс;
- выбор тепловых наночастиц, поддерживающих локальный поверхностный плазмонный резонанс; и
- связывание выбранных тепловых наночастиц с указанным субстратом, с формированием посредством этого теплового покрытия,
причем тепловые наночастицы способны повышать их температуру с помощью облучения светом в диапазоне длины волны, который соответствует длине волны локального поверхностного плазмонного резонанса указанных наночастиц, посредством чего указанное тепловое покрытие повышает свою температуру, давая возможность повышения температуры указанного теплового покрытия для того, чтобы избежать прикрепления микроорганизма к данной поверхности, ингибировать формирование биопленки на данной поверхности и/или разрушить уже сформированную биопленку на данной поверхности.
Получение субстрата может включать одну или несколько из следующих обработок, когда требуется активировать или функционализировать субстрат:
- активацию поверхности субстрата с помощью способа модификации поверхности;
- функционализацию поверхности субстрата с использованием функциональной молекулы, которая содержит по меньшей мере две реакционноспособные концевые группы; и
- функционализацию поверхности тепловых наночастиц с использованием функциональной молекулы, которая содержит по меньшей мере две реакционноспособные концевые группы.
Из данного описания понятен тот факт, что существуют субстраты, которым не требуется активация или функционализация.
В данном документе описаны способы модификации поверхности для ее активации, причем способ полимеризации в холодной плазме является предпочтительным. В данном документе описаны способы функционализации поверхности, причем предпочтительным является диаминовое производное в качестве функциональной молекулы.
Способы связывания тепловых наночастиц с указанным субстратом также описаны в данном документе.
Материал и структурные параметры тепловых наночастиц, а также диапазон длины волны облучения также описаны в данном документе.
Третий аспект настоящего изобретения относится к медицинскому устройству или к немедицинскому устройству, содержащему модифицированную поверхность согласно первому аспекту настоящего изобретения, так что медицинское устройство или немедицинское устройство содержит тепловое покрытие, способное приобретать бактериостатическую и бактерицидную активность при облучении светом, предотвращая таким образом прикрепление микроорганизма к данной поверхности, ингибируя формирование биопленки на данной поверхности и/или разрушая уже сформированную биопленку на данной поверхности.
Краткое описание чертежей
Для лучшего понимания того, что было описано, прилагаются некоторые чертежи, в которых схематично и исключительно в качестве примера показан частный случай варианта реализации изобретения.
Фигура 1 представляет собой блок-схему, изображающую стадии способа модификации поверхности субстрата (А) согласно частному варианту реализации настоящего изобретения. В данном варианте реализации субстрат (А) готовили, активируя поверхность с помощью полимеризации в холодной плазме (1), затем с помощью функционализации (2) поверхности с использованием диаминовых групп и, наконец, с помощью прикрепления или связывания (3) тепловых наночастиц с образованием теплового покрытия. Субстрат, имеющий модифицированную поверхность, имплантировали (4), например, в организм, и затем облучали светом с помощью лазера/IPL (5).
Фигура 2 представляет собой схематическое изображение сетки, содержащей модифицированную поверхность согласно Примеру 1. На данной фигуре реакция EDC/NHS представляет собой реакцию карбоксил-амин: Карбодиимиды (EDC), и N-гидроксисукцинамид (NHS), группа сшивки карбоксил-амина и группа сшивки с реакционноспособной аминогруппой, соответственно.
На Фигуре 3 показана SEM (Сканирующая Электронная Микроскопия) модифицированной сетки после модификации с помощью способа EDC-NHS (Пример 1). Важно особо отметить прикрепление агрегатов наностержней.
На Фигуре 4 показана флуоресцентная микроскопия сетки, модифицированной с помощью тепловых золотых наностержней, посредством комплексообразования с аминогруппами согласно Примеру 2. Прикрепление наночастиц к сетке отслеживали с помощью флуоресцентной микроскопии. Интенсивность сигнала пропорциональна количеству тепловых золотых наностержней, прикрепленных к поверхности.
2
На Фигуре 5 показана SEM (Сканирующая Электронная Микроскопия) микроскопия поверхности сетки, модифицированной с помощью тепловых золотых наностержней с помощью способа комплексообразования (Пример 2), где полученное распределение регулярной поверхности сравнивали с методом EDC-NHS (Пример 1). Наблюдали более чем 200 наностержней на 1 мкм сетки.
На Фигуре 6 показано количество наностержней, прикрепленных к сетке, путем сравнения двух картинок а) с b), правой картинки b) с помощью флуоресцентного метода.
Фигуры 7-10 предназначены для демонстрации ингибирования, разрушения и предотвращения прикрепления микроорганизмов к модифицированной поверхности согласно настоящему изобретению.
На Фигуре 7 синим цветом показано формирование биопленки (тень, окружающая нитки сетки) на модифицированной сетке после инкубации бактерий и без какого либо светового облучения.
На Фигуре 8 показано ингибирование биопленки и ее разрушение на модифицированной сетке после облучения светом длиной волны в диапазоне 750-1200 нм, где длина волны плазмона тепловой плазмонной наночастицы, которая связана с субстратом, составляет 840 нм.
На Фигуре 9 синим цветом (пометки) показаны микроорганизмы, прикрепленные к нити модифицированной поверхности сетки.
На Фигуре 10 показано предотвращение прикрепления микроорганизмов к модифицированной поверхности сетки после облучения светом с длиной волны в диапазоне 750-1200 нм, которая объединяется с длиной волны 840 нм, которая является длиной волны плазмона тепловой плазмонной наночастицы, связанной с поверхностью.
Подробное описание изобретения
С целью выполнения субстрата с возможностью прикрепления к тепловой поверхностной плазмонной наночастице, с которой может объединяться свет, субстрат может быть активирован заранее с использованием любого метода модификации поверхности, известного в данной области техники. Исключительно в качестве примера в данном документе описаны физико-химические методы, такие как обработка активными газами и парами или облучение (плазма); отложение полимеров из активных газов и паров (химическое паровое отложение); обработки активным газом или ускоренными ионами (газофазное окисление озоном, ионно-лучевая обработка); сшивки поверхностных молекул; или механические способы, такие как флотация; или химические способы, такие как физическая абсорбция, химическая конъюгация с поверхностными группами, химическая модификация поверхности; или привитая полимеризация с использованием инициации радиацией или химической инициации; или покрытие поверхности с использованием активного компонента или матрицы покрытия, которая содержит активный компонент.
Существуют субстраты, которым не требуется активации, так как они уже активированы с помощью, например, их естественного состояния. С целью идентификации того, активирован субстрат или нет, специалист будет использовать известные методы измерения, такие как измерение угла контакта, где измеряется угол между поверхностью и каплей воды. Учитывая эти данные, можно рассчитать поверхностную энергию. Другой способ - это дать поверхности прореагировать с известным хромофором и измерить прикрепленное количество по сравнению с калибровочной кривой.
2
2
Субстрат тепловой поверхностной плазмонной наночастицы также может содержать функционализированные группы, или их функционализируют с помощью способа активации с использованием реакционноспособных групп: -СООН (карбоновые кислоты), -СНО (альдегид), -NH (амин), -CONH (амид), -CN (нитрил), -ОН (спирт), -SH (тиол), и т.д.. Вообще: фтор, хлор, бром, иод, карбальдегид, кето, карбоксил, циано, нитро, амидо, гидроксил, амино, сульфат, сульфит, фосфат, фосфит, гидроксил, окси, меркапто или тио; или комплексообразующие группы; группы, способные образовывать водородные связи; молекулы, содержащие ионные группы для ионного поглощения. Альтернативные примеры представляют собой широко распространенные сшивающие агенты типа имидоэфирного сшивающего агента диметилсуберимидат, N-гидроксисукцинимидного эфира, формальдегида, глутаральдегида, и т.д. или им подобные.
2
Таким образом, субстрат или тепловая поверхностная плазмонная наночастица может быть предварительно функционаизирована с использованием функциональной молекулы, предпочтительно, бифункциональной молекулы или функциональной молекулы, имеющей по меньшей мере две реакционноспособные концевые группы. Функциональная молекула представляет собой сшивающий агент, который должен содержать по меньшей мере две реакционноспособные концевые группы, позволяя по меньшей мере первой реакционноспособной концевой группе иметь возможность заранее прикрепляться к субстрату или не активироваться, и позволяя второй реакционноспособной концевой группе иметь возможность прикрепляться к поверхностной плазмонной наночастице. Исключительно в качестве примера в данном документе описаны следующие реакционноспособные концевые группы для прикрепления поверхностной плазмонной наночастицы к субстрату: -СООН (карбоновые кислоты), -СНО (альдегид), -CONH (амид), -CN (нитрил), -ОН (спирт), -SH (тиол) и т.д. Вообще: фтор, хлор, бром, иод, карбальдегид, кето, карбоксил, циано, нитро, амидо, гидроксил, амино, сульфат, сульфит, фосфат, фисфит, гидроксил, окси, меркапто или тио; или комплексообразующие группы; группы, способные образовывать водородные связи; молекулы, содержащие ионные группы для ионного поглощения. Альтернативные примеры представляют собой широко распространенные сшивающие агенты типа имидоэфирного сшивающего агента диметилсуберимидата, N-гидроксисукцинимидного эфира, формальдегида, глутаральдегида, и т.д. Другие коммерчески доступные бифункциональные сшивающие агенты могут представлять собой БОК-амино, этантиол, меркапто-1-бутанол и т.д.
2
2
3
+
Таким образом, поверхностные плазмонные наночастицы также могут быть модифицированы с целью связывания с субстратом, как описано в данном документе. Данная модификация может быть осуществлена с использованием гетеро- или гомофункциональных молекул, способных связываться с одной стороны с поверхностью наночастицы и с другой стороны с субстратом, как например, модификация поверхности золота с использованием тиол-содержащих реагентов, которые имеют с другой стороны целевую функциональную группу, способную связываться с субстратом либо ковалентно, либо с помощью ионного взаимодействия. Эти гетеро- или гомофункциональные молекулы включают все HS-R-функциональные группы, где -R относится к любой алкильной или полиэтиленгликолевой цепи, и функциональные группы относятся к любой химической группе, способной активироваться и связываться с поверхностью субстрата. В особенности, HS-R-COOH, HS-R-HN, HS-R-SH, HS-R-SO3, и HS-R-N(CH) подходят для целей настоящего изобретения. Поверхность тепловых наночастиц также может быть модифицирована с помощью поливинилпирролидона и большого количества полимеров.
С другой стороны, существуют субстраты, которым не требуется ни активация, ни применение функциональной молекулы. Эти субстраты могут представлять собой полимер или со-полимер, который содержит на своей поверхности активные группы, такие как свободные аминогруппы. Эти активные группы могут непосредственно прикрепляться к тепловой поверхностной плазмонной наночастице без необходимости предварительного приготовления субстрата. Предпочтительно, метод прикрепления является необратимым.
Прикрепление тепловой поверхностной плазмонной наночастицы к субстрату может проводиться с помощью ковалентной связи посредством функциональной молекулы, которая имеет по меньшей мере две реакционноспособные концевые группы, или с помощью электростатического взаимодействия или с помощью реакции комплексообразования, или с помощью их комбинации. Таким образом, субстрат может быть приготовлен так, чтобы он был способен прикрепляться к тепловой поверхностной плазмонной наночастице, и, кроме того, тепловая поверхностная плазмонная наночастица может быть приготовлена таким же способом, так, чтобы она была способна прикреплять субстрат.
В одном варианте реализации поверхность субстрата активируют с помощью полимеризации в холодной плазме, например, активируют с помощью отложения молекул типа PFM (пентафторфенилметакрилат).
В одном варианте реализации, субстрат или тепловую поверхностную плазмонную наночастицу функционализируют с помощью функциональной молекулы, причем предпочтительно функциональная молекула представляет собой диаминовое производное.
Медицинское устройство может представлять собой хирургический имплантат, зонд, сетку, нить, прямые щипцы, медицинские иглы, внутрисосудистые катетеры, эндотрахеальные трубки и имплантаты, протезы и любой медицинский продукт, применяемый в области медицины. В одном варианте реализации, медицинское устройство представляет собой грыжевую сетку, сетку при пролапсе, уретральную ленту, раневую повязку, протезы сосудов, стенты, стент-графты или подобные. Кроме имплантатов хирургические инструменты охвачены настоящим изобретением с помощью термина медицинское устройство. В одном варианте реализации поверхность представляет собой медицинское устройство.
2
Как описано выше, тепловые плазмонные наночастицы, связанные в субстрате, могут иметь размер частицы в диапазоне от 1 нм до 1 мкм, более предпочтительно, от 1 нм до 100 нм. Таким образом, согласно настоящему изобретению, макроповерхность субстрата, например, сетку, оборудуют с помощью тепловых наночастиц, имеющих размер порядка нанометра или микрометра. Таким образом, плотность оборудованных тепловых наночастиц в субстрате может быть модифицирована до определенного значения с целью контроля повышения температуры модифицированной поверхности до определенного значения для того, чтобы уничтожать или избегать прикрепления конкретного типа биопленки. Плотность тепловых наночастиц, оборудованных в субстрате, может составлять от 10 до 1000 (тепловых наночастиц/мкм).
Для понимания механизма уменьшения, уничтожения или предотвращения формирования биопленки на модифицированной поверхности согласно настоящему изобретению следует понимать, что биопленка, которая прикрепляется к субстрату, состоит из множества бактерий, совместно прикрепленных посредством физических выступающих частей и внеклеточных полимерных веществ. Ростом биопленки управляет ряд физических, химических и биологических процессов. Оптимальная температура для микроорганизма ассоциирована с увеличением поглощения питательных веществ, приводя в результате к быстрому формированию биопленки. Обмен питательных веществ непосредственно ассоциирован и зависит от присутствия ферментов. Поэтому, будет справедливым утверждение о том, что формирование биопленки зависит от присутствия и скорости реакции ферментов. Температура коррелирует со скоростью реакции ферментов и поэтому оказывает влияние на развитие клеток. Оптимальные температуры приводят к здоровому росту бактериальных популяций.
В свою очередь, температуры, далекие от оптимального значения, эффективно уменьшают бактериальный рост. Это связано с уменьшением скорости реакции бактериальных ферментов. Помимо ферментов на физические свойства соединений внутри и вокруг клеток влияет температура окружающей среды. Kisk'o and О. Szab'o-Szab'o [Biofilm removal of Pseudomonas strains using hot water sanitation. Acta Univ. Sapientiae, Alimentaria, 4 (2011) 69-79] наблюдали уменьшение количества клеток в биопленках при высоких температурах. В планктонных клетках P. aeruginosa было показано 6-1og-уменьшение после обработки горячей водой (85°С). Когда Pseudomonas aeruginosa прикреплялись к поверхности нержавеющей стали (клетки прикреплялись к поверхности обратимо), уменьшение было более умеренным: 4,9. Клетки биопленки показали наибольшую устойчивость (3,2-log-уменьшение) против обработки водой 85°С. Scher et al. [Appl. Environ. Microbiol. March 2005 vol. 71 no. 3, page 1163-1168] обнаружили аналогичные результаты для биопленок сальмонеллы; тепловые обработки (при 70°С) приводили к менее чем 5-log-уменыпению через 40 мин. Обработка при 80°С уничтожала клетки (8-log-уменыпение) в течение 5 мин или менее. Кроме того, клетки типа дрожжевых (бластоконидии) С. albicans, растущие экспоненциально на глюкоза-содержащей среде, подвергались драматической потере жизнеспособности клеток при воздействии на них жесткого теплового стресса (52,5°С в течение 5 мин) [Juan Carles Arguelles Thermotolerance and trehalose accumulation induced by heat shock in yeast cells of Candida albicans.. FEMS Microbiology Letters Volume 146, Issue 1, page 65-71, January 1997].
Таким образом, специалисту в данной области известно, как определить температуру, которая требуется для уменьшения, уничтожения или предотвращения формирования биопленки для каждого типа микроорганизмов.
Описанные выше тепловые плазмонные наночастицы, связанные в субстрате, могут иметь форму частиц, выбранную из цилиндрической, треугольной, пирамидальной, кубической, сферической, формы звезды, формы стержня или их комбинации или любой другой формы, которая может быть способна прикрепляться в субстрате, выполненном для этой цели.
Как описано выше, материал тепловых плазмонных наночастиц может представлять собой золото, серебро, медь или любой другой металл, демонстрирующий эффект плазмонного резонанса на своей поверхности; материал также может быть полупроводником, оксидом, оксидом металла или любым другим материалом, демонстрирующим эффект плазмонного резонанса на своей поверхности. Предпочтительно, тепловые плазмонные наночастицы представляют собой золотые наночастицы благодаря тому факту, что золотые наночастицы не токсичны сами по себе. Определение того, какой из материалов демонстрирует эффект плазмонного резонанса на своей поверхности, относится к области знаний специалиста в данной области.
Таким образом, согласно настоящему изобретению параметры размера, формы или материала тепловых наночастиц могут быть модифицированы для модуляции повышения температуры субстрата до определенного значения. Кроме того, другие параметры, такие как источник света, облучающего модифицированную поверхность, также может использоваться для дополнительного контроля повышения температуры субстрата до определенного значения.
Далее подробно описан лучший способ осуществления настоящего изобретения.
В лучшем способе поверхность является поверхностью хирургического имплантата. Хирургический имплантат представляет собой сетку, имеющую модифицированную поверхность, где сетку имплантируют в тело человека. Сетка сделана из полипропилена (РР).
В данном варианте реализации активацию полипропилена проводят с помощь полимеризации в холодной плазме с получением реакционноспособных химических групп. На второй стадии сетку погружают в раствор диамина с получением реакционноспособной группы на поверхности. На третьей стадии, тепловые золотые наночастицы ковалентно присоединяются к поверхности сетки путем прикрепления к реакционноспособным аминогруппам.
Эти тепловые золотые наночастицы поглощают свет при 840 нм, который принадлежит к инфракрасной области спектра. При облучении при данной длине волны с использованием лазера или IPL (интесивный импульсный свет), тепловые золотые наночастицы начинают сами нагреваться. Повторный импульс света превращает сетку в бактериостатическую/бактерицидную поверхность. Золотые наночастицы не токсичны сами по себе, и облучение светом в инфракрасном диапазоне спектра не является инвазивным, как результат возможны повторные облучения светом в любое время после имплантации.
Примеры
Наночастицы получали с помощью хорошо известного 2-стадийного способа выращивания затравок (seed mediated process). Размеры наностержня и, соответственно, длина волны поглощения SPR могут быть адаптированы путем вариации соотношений нитрата серебра/аскорбиновой кислоты/затравки.
Приготовление затравки
4
4
Затравки коллоидного золота сначала получали путем смешивания водного раствора гексадецилцетилтриметиламмоний бромида (СТАВ, 0,2 М, 5 мл) и гидрата тетрахлораурат(III) водорода (0,5 мМ, 5 мл), которые поддерживали при 27°С. Затем добавляли свежеприготовленный раствор боргидрида натрия (NaBH, 0,01 M, 0,6 мл), заранее охлажденный до 4°С, при интенсивном перемешивании в течение 2 минут. В этот момент затравке давали возможность осаждения в течение 2 ч при 30°С, чтобы дать возможность прореагировать оставшемся NaBH. Таким образом, получали суспензию золотых наночастиц размером 1-2 нм, которые использовали в качестве затравки для приготовления наночастиц. Этот раствор будет дополнительно обозначен как Затравочная Суспензия.
Рост тепловых наночастиц:
Готовили «ростовой раствор», который состоял из СТАВ (0,2 М, 20 мл), к которому добавляли различные количества исходного раствора нитрата серебра (4 мМ) в зависимости от целевого соотношения наночастиц и давали смеси возможность перемешиваться при слабом помешивании. Добавляли гидрат тетрахлораурат(III) водорода (1 мМ, 20 мл) и получали желтый/коричневый раствор. После добавления аскорбиновой кислоты (79 мМ, 0,29 мл) к желтому/коричневатому раствору смесь должна стать бесцветной. Затем к ростовому раствору добавляли 72 мкл зрелой Затравочной Суспензии, быстро перемешивали и оставляли в покое на 8 часов при 30°С для предотвращения СТАВ кристаллизации. Изменение исходного цвета смеси можно заметить приблизительно через 10 мин. В результате этой процедуры получали суспензию наночастиц, представляющих максимум LSPR при примерно 820 нм (±20 нм) и максимальное поглощение 1,6 ОЕ.
Приготовление -СООН Смеси наночастиц.
20 мл суспензии наночастиц, полученной в Примере 1, центрифугировали дважды при 14000 об./мин., 30 минут. Каждый раз надосадочную жидкость удаляли и заменяли с помощью 4 мМ СТАВ в водном растворе.
Смесь раствора карбоксилирующих реагентов готовили следующим образом: 97 мг SH-PEG-COOH (Mw:3000) и 3 мг меркаптоундецилкарбоновой кислоты (MUA) растворяли в 10 мл воды и рН доводили до 7.
К суспензии наночастиц (20 мл) добавляли 2 мл смеси карбоксилирующих реагентов (10 мг/мл) и помещали в ультразвуковую ванну при 45°С. Полученную смесь подвергали воздействию ультразвука в течение 30 минут и затем помещали на ночь при 30°С.
Полученную карбоксилированную нанокомплексную суспензию затем центрифугировали (14000 об/мин, 30 минут), супернатант удаляли и, наконец, ресуспендировали с использованием чистой воды с получением поглощения около 3,5 ОЕ с максимумом SPR.
ПРИМЕР 1
Модификация сетки с помощью тепловых золотых наночастиц
Вышеописанные тепловые золотые наночастицы прикрепляли к сетке для хирургического имплантата. Тепловые золотые наночастицы конъюгировали с сеткой с помощью реакций 1-этил-3-[3-диметиламинопропил] карбодиимид гидрохлорида (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимида (NHS). Вкратце, 5 мг NHS и 10 мг ECD растворяли в 1 мл буфера 50 мМ фосфата рН 7. Сразу после добавляли к буферному раствору 2 мл раствора GNR. После этой стадии сетки погружали в такой раствор на 4 часа. Сразу после сетку промывали чистой водой для удаления несвязанных тепловых золотых наночастиц. Фигуры 2 и 3.
ПРИМЕР 2
Модификация сетки с помощью тепловых золотых наночастиц
В данном примере, тепловые золотые наночастицы, полученные, как описано выше, и суспендированные в СТАВ, связывали с амино-модифицированной сеткой без дополнительной модификации. Использовали способность металлического золота к комплексообразованию с аминогруппами для формирования большего количества комплексных связей, которые приводят к стабильному прикреплению золотых наночастиц к сетке. На практике, тепловые золотые наночастицы, суспендированные в СТАВ, после стадии роста (100 мМ СТАВ) центрифугировали, и надосадочную жидкость заменяли чистой водой для доведения концентрации СТАВ до 3 мМ, и концентрации наночастиц до поглощения 8 ОЕ при 820 нм. Сетку, модифицированную аминогруппами, добавляли к этой суспензии и инкубировали в течение ночи при 50°С для осуществления прикрепления тепловых золотых наночастиц к сетке. Сетку затем интенсивно промывали чистой водой. Фигуры 4 и 5.
Альтернативно, время инкубации может быть уменьшено с помощью увеличения температуры или путем добавления различных количеств этанола к инкубационным суспензиям до 30%. В любом случае степень модификации может контролироваться путем контроля времени инкубации.
Бактериальный рост и эффект облучения светом
8
Исходные бактерии S. aureus 8,8×10 кое/мл (консервировали 4 дня при 4°С перед анализом).
Жидкая культуральная среда: Бульон с сердечно-мозговой вытяжкой (ΒΗΙ бульон).
Твердая культуральная среда: триптический соевый агар (TSA).
Чашки Петри 6 см и 10 см.
6
2
2
6
Все работы осуществляли в стерильных условиях, S. aureus разводили с использованием BHI бульона до 2,96×10 кое/мл. Чашки Петри 6 см (8) готовили, заливая примерно 3 мм толщины твердой средой TSA. В 2 чашки помещали необработанные сетки (4 см), а в другие две чашки помещали сетки, модифицированные наностержнями (4 см). Все четыре теста инокулировали с использованием 350 мкл S. aureus (1,03×10 КОЕ), и затем другой срез твердой TSA помещали поверх инокулированной сетки с получением агарового сендвича. 350 мкл инокулята по-видимому корректно распределялись по всей агаровой поверхности. Сендвичи помещали на 37°С и инкубировали в течение 6 часов.
2
Два образца (сетки, оборудованные или необорудованные тепловыми наночастицами) обрабатывали с помощью IPL (Интенсивное импульсное излучение) за 1, 2, 3, 4, 5, 6 часов. Два импульса IPL на каждой стороне сендвича (11 джоуль/см, 40 мсек, свет отфильтрованный при 755 нм). Те, чьи значения ниже критического болевого порога, затем наносили на человеческую кожу.
Четыре образца сетки затем извлекали, слабо отмывали в 20 мл стерильного PBS и помещали в 10 мл PBS, содержащего 2 мм стерильных стеклянных гранул. Для осуществления экстракции биопленок образцы обрабатывали 2 минуты в УЗ-бане 45 кГ и затем 2 минуты на вортексе. Полученную суспензию затем помещали для культивирования в 10 см чашках Петри с агаром (100 мкл инокулята) при различных разведениях в PBS 1:10, 1:100, все в двух экземплярах.
Образцы хранили при 37°С, и подсчет КОЕ осуществляли через 18 часов.
Результаты:
Экспериментальные данные демонстрируют ингибирование роста биопленок S. aureus (3-log-уменьшение роста) при оборудовании сетки тепловыми золотыми наностержнями и IPL с помощью теплового эффекта SPR-резонанса наностержней. Фигуры 7, 8, 9 и 10 демонстрируют эффекты, когда модифицированную поверхность согласно изобретению облучают светом.