Клональное распространение CTX-M-5-продуцирующих нозокомиальных штаммов Salmonella Typhimurium в России, Беларуси и Казахстане

Клональное распространение CTX-M-5-продуцирующих нозокомиальных штаммов Salmonella Typhimurium в России, Беларуси и Казахстане

В.К. Козырева1, М.В. Эйдельштейн1, Д.В. Тапальский2, И.С. Азизов3, А.В. Романов1, Р.С. Козлов1

1 НИИ антимикробной химиотерапии, Смоленск, Россия

2 Гомельский государственный медицинский университет, Гомель, Беларусь

3 Карагандинский государственный медицинский университет, Караганда, Казахстан

В настоящей работе представлены данные, свидетельствующие о широком географическом распространении штаммов Salmonella enterica серовар Typhimurium, принадлежащих к одной генетической линии и проявляющих резистентность к оксииминоцефалоспоринам вследствие продукции в-лактамазы расширенного спектра действия CTX-M-5. Родственность штаммов, которые выделялись в ходе многочисленных вспышек нозокомиального сальмонеллеза на территории России, Беларуси и Казахстана, была установлена с помощью методов электрофореза в пульсирующем поле (PFGE) и мульти-локусного анализа тандемных повторов (MLVA). Циркуляция клона была впервые зафиксирована в 1994 году и, согласно представленным нами

данным, продолжается в настоящее время. Изученные штаммы характеризуются полирезистентностью, в том числе к ингибитороза-щищенным пенициллинам и не-в-лактамным антибиотикам, детерминанты резистентности к которым располагаются на больших конъюга-тивных плазмидах, в то время как ген blaCTX-M-5 находится в сцеплении с мобильным элементом ISEcpl на небольшой неконъюгативной плазми-де. Часть штаммов проявляет резистентность к налидиксовой кислоте, которая связана с мутациями в QRDR области гена gyrA.

Ключевые слова: Salmonella Typhimurium, нозокомиальные инфекции, клональное распространение, антибиотикорезистентность.

Clonal dissemination of CTX-M-5-producing nosocomial strains of Salmonella Typhimurium in Russia, Belarus, and Kazakhstan

V.K. Kozyreva, M.V. Edelstein, D.V. Tapalski, I.S. Azizov, A.V. Romanov, R.S. Kozlov

1 Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk, Russia

2 Gomel State Medical University, Gomel, Belarus

3 Karaganda State Medical University, Karaganda, Kazakhstan

In this paper, the evidence of broad geographic dissemination of Salmonella enterica serovar Typhimurium strains belonging to a single genetic lineage is presented.

Контактный адрес:

Варвара Константиновна Козырева Эл. почта: barbara.kozyreva@gmail.com

The isolates described possess resistance to oxiimino-cephalosporines due to production of CTX-M-5 extended-spectrum /3-lactamase. The genetic relatedness of the strains isolated during multiple outbreaks of nosocomial salmonellosis in various parts of Russia, Belarus and Kazakhstan was established by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multi-locus tandem repeat analysis (MLVA). Circulation of the clone was first noticed in 1994

and is currently ongoing according to the data presented. The resistance to multiple antibiotics including penicillininhibitor combinations and various non-/3-lactam drugs is mediated by large conjugative plasmids, while blaCTX-M-5 gene is associated with ISEcp1 element and carried by

small non-conjugative plasmid. Some isolates express resistance to nalidixic acid owing to mutations in QRDR of gyrA gene.

Key words: Salmonella Typhimurium, nosocomial infection, clonal dissemination, antimicrobial resistance.

Введение_

Сальмонеллы нетифоидной группы, относящиеся к различным сероварам Salmonella enterica, прежде всего Enteritidis и Typhimurium (S. Typhimurium), являются одними из главных возбудителей острого гастроэнтерита [1]. Серовар Typhimurium в течение многих лет являлся наиболее часто выделяемым, по сравнению с другими сероварами сальмонелл. Значительный вклад в увеличение частоты встречаемости S. Typhimurium внесло быстрое всемирное распространение полирезистеных штаммов фаготи-па DT104, которое было признано угрозой мировому здравоохранению [2].

В 2001 г. приблизительно 22,1% случаев саль-монеллеза, зафиксированных в США, были вызваны серотипом Typhimurium [3, 4]. Доминирование данного серотипа было еще более явно выраженным во Франции, где >32% случаев были вызваны S. Typhimurium [3]. Несмотря на то что в странах Евросоюза и других странах, в том числе и России [5], в последние годы штаммы серовара Enteritidis выделялись с большей частотой [2], клиническое значение серовара Typhimurium по-прежнему велико.

Чаще всего сальмонеллез у людей связан с употреблением в пищу зараженных продуктов, таких как мясо, птица, яйца, молоко, морепродукты и овощи. Другим источником инфицирования может являться прямой контакт с зараженным животным [4]. Помимо пищевых инфекций существует проблема сальмонеллеза как нозокомиальной инфекции. В отличие от пищевых инфекций, вызванных S. enterica, источником которых являются продукты питания, основным способом распространения нозокомиального сальмонеллеза является контактный путь, который связан с прямой передачей возбудителя от человека к человеку. Высокая частота носительства отдельных штаммов S. Typhimurium у пациентов стационаров и медицинских работников является важным фактором, способствующим клональному распространению данных штаммов в нозокомиальной среде [5].

Несмотря на то что в большинстве случаев инфекция, вызванная S. Typhimurium, протекает как гастроэнтерит средней и легкой тяжести, в неко-

торых случаях бактерии могут вызвать тяжелые инвазивные формы заболевания с сепсисом и даже летальным исходом. Большая доля таких осложнений приходится на нозокомиальные инфекции. Штаммы сальмонелл, распространяющиеся в госпитальной среде, как правило, отличаются от внеболь-ничных изолятов множественной лекарственной устойчивостью (полирезистентностью) [5, 6].

В ряде отечественных [5, 7, 8] и зарубежных публикаций [9-11] отмечается увеличение частоты нозокомиальных сальмонеллезов, вызванных S. Typhimurium, с преобладанием инвазивной формы инфекции, при которой назначение антимикробных препаратов является необходимым.

Для выбора адекватной антимикробной химиотерапии рекомендуется определять чувствительность сальмонелл при неинвазивной инфекции к следующим препаратам: ампициллину, фторхино-лонам, ко-тримоксазолу; а в случае инвазивного сальмонеллеза - к хлорамфениколу и цефалоспо-ринам III поколения [12]. Вместе с тем, глобальное распространение в последние годы получили полирезистентные штаммы S. Typhimurium, устойчивые к ампициллину, ко-тримоксазолу, хлорамфе-николу, тетрациклину, стрептомицину, сульфаниламидам и ряду других антимикробных препаратов [11, 13-15]. Данные молекулярного типирования свидетельствуют о преимущественно клональном распространении таких штаммов [16]. Наибольшую опасность в настоящее время представляет появление и распространение штаммов S. Typhimurium, устойчивых к цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму, цефтриаксону) и фторхинолонам -препаратам выбора для лечения инвазивных саль-монеллезов [16, 17].

Резистентность к цефалоспоринам III поколения у сальмонелл может быть обусловлена продукцией кодируемых плазмидами ß-лактамаз расширенного спектра действия (БЛРС) молекулярного класса A или цефалоспориназ (AmpC) класса C. Экспрессия БЛРС, относящихся к группам TEM, SHV и особенно часто CTX-M, является наиболее распространенным механизмом устойчивости к современным цефалоспоринам у сальмонелл [18].

Устойчивость к хинолонам, как правило, связана с мутациями хромосомных генов ДНК-гиразы

и/или топоизомеразы IV. У сальмонелл, как и у большинства других грамотрицательных бактерий, резистентность к налидиксовой кислоте и пониженная чувствительность к фторхинолонам формируется в результате появления единичных аминокислотных замен в основном сайте связывания хинолонов - QRDR области А-субъединицы ДНК-гиразы ^угА), обычно в позициях 83 и 87. Наличие нескольких мутаций в QRDR области обеспечивает высокий уровень устойчивости к ципрофлоксаци-ну [19]. Известно, что даже резистентность низкого уровня к ципрофлоксацину, обусловленная единичными мутациями в QRDR GyгA, зачастую приводит к клинической неэффективности фторхи-нолонов или же требует продления курса терапии ципрофлоксацином [20]. Устойчивость низкого уровня к хинолонам у сальмонелл может быть связана также с иными механизмами: снижением проницаемости наружной мембраны, активным выведением антибиотика из клетки (эффлюксом) [21], продукцией плазмидокодируемых протективных Qnг-белков [22, 23] или ципрофлоксацин-модифи-цирующего фермента, кодируемого геном aac(6') \b-cr [24].

В свете вышесказанного становится очевидно, что распространение антибиотикорезистентности у сальмонелл должно находиться под тщательным эпидемиологическим контролем. Немаловажным при этом является использование современных молекулярно-генетических методов субтипирова-ния сальмонелл, позволяющих адекватно оценить степень родственности, источники появления и распространения полирезистентных штаммов [25]. Ранее использовавшийся с этой целью метод фаготипирования, согласно современным данным, далеко не всегда позволяет оценить родственность штаммов сальмонелл, вследствие возможности изменения фаготипа в результате потери или приобретения мобильного элемента - про-фага [2]. То же самое касается метода плазмид-ного типирования, который как дополнительный метод по-прежнему является ценным для описания свойств штаммов и понимания природы распространения антибиотикорезистентности, но, тем не менее, не может использоваться в качестве самостоятельного подхода для оценки родственности изолятов ввиду высокой вариабельности плазмид, их способности к горизонтальному переносу и возможности спонтанной элиминации [26].

Метод электрофореза в пульсирующем поле (PFGE), позволяющий проводить сравнение макрорестрикционных профилей ДНК микроорганизмов, на протяжении ряда лет считался «золотым стандартом» типирования изолятов рода

Salmonella [27]. Однако основными недостатками данного подхода являются высокая трудоемкость и сложность интерпретации данных для оценки филогенетических связей между штаммами.

Метод мультилокусного анализа тандемных повторов (MLVA), который основан на амплификации участков ДНК с переменным числом тандемных повторов (VNTR локусов), по данным многих работ, превосходит по своей дискриминирующей способности метод пульс-электрофореза. Поэтому метод MLVA был предложен как альтернатива для генетического типирования микроорганизмов, обладающих преимущественно клональной попу-ляционной структурой, в частности S.enterica [25, 27-29]. Другим преимуществом MLVA является высокая стандартизация анализа, которая позволяет сравнивать результаты, полученные разными лабораториями [30].

Эпидемиология, популяционная структура и механизмы антибиотикорезистентности штаммов S. Typhimurium, циркулирующих в госпиталях на территории Российской Федерации и сопредельных государств, остаются недостаточно изученными. В связи с этим целью нашего исследования явилось определение механизмов резистентности к в-лактамам и хинолонам, а также оценка генетической родственности нозокомиальных цефотак-симорезистентных штаммов S. Typhimurium, выделенных в различных регионах России, Беларуси и Казахстана.

Материал и методы

Клинические штаммы Salmonella Typhimurium.

Всего исследовано 88 цефотаксиморезистент-ных изолятов Salmonella enterica подвид enterica серовар Typhimurium, выделенных у госпитализированных пациентов в 15 населенных пунктах 10 регионов России, Беларуси и Казахстана в 1994-2009 гг. (табл. 1). Все изоляты были неповторяющимися (по одному от каждого пациента), пятнадцать из них были выделены у детей в возрасте до 3 лет. Дополнительно в исследование были включены два чувствительных эпидемиологически неродственных изолята SE054/ Sm-1878 и SE086/Mz-1910 из тех же стационаров, откуда были получены резистентные штаммы S. Typhimurium, и цефотаксиморезистентый штамм CAS5 из Аргентины, продуцирующий БЛРС CTX-M-2 [31], которые были использованы в качестве контролей при оценке клональности изолятов. Первичная видовая и серологическая идентификация проводилась в локальных микробиологических лабораториях в соответствии с принятыми стандартами. Повторно все штаммы были иденти-

Таблица 1. Источники выделения цефотаксиморезистентных изолятов S. Typhimurium

Регион Количество изолятов Годы выделения

Смоленск, Россия 26 1994-2009

С.-Петербург, Россия 6 1996-1997

Гомель, Беларусь 22 1997-2007

Москва, Россия 1 1998

Витебск, Беларусь 13 1999-2000

Иркутск, Россия 1 2003

Воронеж, Россия 5 2004

Ярославль, Россия 2 2004

Караганда, Казахстан 9 2006-2007

Томск, Россия 3 2007-2008

фицированы в НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии с помощью биохимических идентификационных систем API20E (bioMerieux, Франция) и наборов сывороток к О- и Н-антигенам Salmonella (BioRad, Франция).

Определение чувствительности к антибиотикам. Значения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибиотиков были определены с помощью метода последовательных разведений в агаре Мюллера-Хинтон [12] для следующих препаратов: ампициллин, амоксициллин/клавулановая кислота (2:1), азтреонам, цефотаксим, цефотаксим/ клавулановая кислота (4 мг/л), цефтазидим, цеф-тазидим/клавулановая кислота (4 мг/л), цефепим, цефоперазон, цефоперазон/сульбактам (1:1), пипе-рациллин, пиперациллин/тазобактам (4 мг/л), ген-тамицин, левофлоксацин, ко-тримоксазол, имипе-нем, меропенем, эртапенем, налидиксовая кислота, ципрофлоксацин. Чувствительность к тетрациклину и хлорамфениколу была определена с помощью диско-диффузионного метода [12]. Для контроля качества определения чувствительности были использованы штаммы E. coli ATCC25922 и E. coli ATCC35218. Интерпретация результатов определения чувствительности проводилась с использованием критериев Европейского комитета по оценке антибиотикочувствительности (EUCAST) 2012 г. [32]. Для оценки чувствительности к амоксицилли-ну/клавулановой кислоте и налидиксовой кислоте использовались критерии Института клинических лабораторных стандартов (CLSI) 2011 г. [12].

Продукция БЛРС оценивалась с помощью метода двойных дисков [12], а также по снижению не менее чем в 8 раз МПК цефотаксима или цефтази-дима в присутствии клавулановой кислоты (4 мг/л).

Детекция генов ß-лактамаз и их генетического окружения. Гены ß-лактамаз, принадлежащих

к группам OXA-1, TEM, SHV и CTX-M, определяли с помощью ПЦР с праймерами, перечисленными в табл. 2, как описано ранее [7, 33, 34]. Для выявления ассоциации генов blaCTX-M с известными мобильными элементами - ISEcp1 или ISCR1 (ранее описанным как orf513) использовали ПЦР-картирование с праймерами CTX-M-Rext, ISEcp1-F и orf513 [7].

Секвенирование полученных ПЦР-продуктов проводилось с помощью амплификационных прай-меров, наборов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США).

Определение мутаций в QRDR области гена gyrA. Амплификацию и прямое секвенирование внутреннего фрагмента гена gyrA проводили с помощью праймеров STGYRA1 и STGYRA12-GT как описано ранее [1].

Анализ плазмид, несущих bla

CTX-M

гены.

Конъюгационный перенос плазмид от исследуемых штаммов в реципиентный штамм E. coli AB1456 (RifR) [35] проводился при совместном культивировании клеток донора и реципиента в бульоне Мюллера-Хинтон с последующим рассевом на плотные среды, содержащие рифампи-цин (100 мг/л) в комбинации с ампициллином (100 мг/л) или цефотаксимом (1 мг/л).

CTX-M-кодирующие плазмиды были выделены у исследованных штаммов и их трансконъюгантов с помощью наборов Plasmid Midi Kit (QIAGEN, Германия). С помощью полученной плазмидной ДНК был трансформирован компетентный лабораторный штамм E. coli EPI300.

Рестрикционный анализ плазмид, повторно выделенных от трансформантов, проводили с помощью эндонуклеаз PstI (Promega, США) и PvuII (Amersham, США) в соответствии с методикой, описанной ранее [7].

Таблица 2. Использованные праймеры

№ Наименование праймера Последовательность (5'-3') Назначение Ссылка

1 2 TEM fwd TEM rev GCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACC GACAGTTACCAATGCTTAATCA blaTEM [7]

3 4 SHV fwd SHV rev CGCCGGGTTATTCTTATTTGTCGC TCTTTCCGATGCCGCCGCCAGTCA blaSHV [33]

5 6 OXA-1 fwd OXA-1 rev ATGAAAAACACAATACATATCAAC AAAGGACATTCACGCCTGTG blaOXA-1 [7]

7 CTX-M-Fext TTTGCGATGTGCAGTACCAGTAA

8 CTX-M-R1c CCGCTGCCGGTCTTATC blaCTX-M [34]

9 CTX-M(1-2)-RNest TGATCTCAACGCGCTGATTTA

10 CTX-M-Rext CGATATCGTTGGTGGTGCCATA Генетическое

11 ISEcp1-F TGTCTGGTATAATAAGAATATCATC окружение [7]

12 ORF513 ATCCATCACAGAGTCGTCTC blaCTX-M

13 STGYRA1 TGTCCGAGATGGCCTGAAGC QRDR GyrA [1]

14 STGYRA12-GT CGTTGATGACTTCCGTCAGGT

Типирование изолятов с помощью пульс-электрофореза макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК (PFGE). PFGE-типирование выполнено в соответствии с методом, описанным M.J. Struelens и соавт. [36]. Геномная ДНК была подвергнута рестрикции эндонуклеазой XbaI (MBI Fermentas, Литва). Разделение фрагментов ДНК проводили на приборе CHEF DRIII (Bio-Rad, США). Для интерпретации результатов анализа использовали критерии, предложенные F.C. Tenover и соавт. [37].

Типирование изолятов с помощью мультило-кусного анализа тандемных повторов (MLVA). MLVA-типирование выполнено по методике B.A. Lindstedt и соавт. [25] с детекцией по пяти VNTR локусам (STTR3, STTR5, STTR6, STTR9, STTR10). Анализ соответствующих флуоресцентно-меченных ПЦР-продуктов был проведен с помощью генетического анализатора ABI Prism 310 и программного обеспечения Peak Scanner Software v.1.0 (Applied Biosystems). Кластерный анализ MLVA-профилей выполнен с помощью программного пакета BioNumerics Software v.6.1 (Applied Maths, Бельгия) с использованием алгоритма минимального остовного дерева (minimum spanning tree, MST) и метода невзвешенных попарных арифметических средних (unweighted pair-group method using arithmetic averages - UPGMA) для категориальных значений.

Результаты исследований

Чувствительность к антибиотикам

Результаты определения чувствительности исследованных нозокомиальных изолятов 5. ТурЫтшшт представлены в табл. 3. Все изо-ляты обладали высоким уровнем устойчивости к цефоперазону, цефотаксиму, цефепиму и азтрео-наму (МПК >256, >256, >128 и >64 мг/л соответственно) и пониженной по сравнению с чувствительными в норме штаммами чувствительностью к цефтазидиму (МПК 0,5-16 мг/л). Тем не менее, 6,4% изолятов оставались чувствительными к цефтазидиму согласно критериям EUCAST. При определении МПК и методом «двойных дисков» у всех изолятов был выявлен синергизм между оксиими-ноцефалоспоринами и клавулановой кислотой, что свидетельствует о продукции БЛРС.

Устойчивость к ингибиторозащищенным пени-циллинам была вариабельной: 88,5 и 75,7% изо-лятов были нечувствительны соответственно к амоксициллину/клавулановой кислоте и пипера-циллину/тазобактаму. Все изоляты проявляли чувствительность к карбапенемам.

Ассоциированная устойчивость к одному и более не-в-лактамным антибиотикам была отмечена у всех изолятов. Резистентностью одновременно к пяти не-в-лактамным антибиотикам обладали 30,8% изолятов (профиль резистентности Те^СЫ-Gm-Sxt-Nal), к четырем - 34,6% (профили Те^СЫ-Gm-Sxt - 30,8% или Те^Ы^т-Ш - 3,8%), к трем препаратам - 7,7% (профили Те^СЫ^т - 6,4%

Таблица 3. Чувствительность изолятов к антибиотикам

Антибиотик

МПК, мг/л

Распределение штаммов по категориям чувствительности, %

диапазон МПК50 МПК90 Ч УР Р

Ампициллин >256 >256 >256 0 0 100,0

Амоксициллин/клавулановая кислота 8-32 32 32 11,5 15,4 73,1

Пиперациллин >256 >256 > 256 0 0 100,0

Пиперациллин/тазобактам 2->256 >256 > 256 24,4 1,3 74,4

Цефоперазон 4->256 >256 > 256 - - -

Цефоперазон/сульбактам 2-128 16 32 - - -

Цефотаксим 2->256 >256 > 256 0 1,3 98,7

Цефотаксим/клавулановая кислота 0,06-1 0,25 0,5 - - -

Цефтазидим 0,25-16 8 16 6,4 1,3 92,3

Цефтазидим/клавулановая кислота 0,25-1 0,5 0,5 - - -

Цефепим 4->256 128 128 0 1,3 98,7

Азтреонам 0,006->256 64 64 3,8 0 96,2

Имипенем 0,06-0,5 0,25 0,25 100,0 0 0

Дорипенем 0,06 0,06 0,06 100,0 0 0

Меропенем 0,06-0,125 0,06 0,125 100,0 0 0

Эртапенем 0,06-0,5 0,06 0,06 100,0 0 0

Гентамицин 2->256 16 16 10,3 1,3 88,5

Ко-тримоксазол 0,125->256 >256 > 256 33,3 0 66,7

Налидиксовая кислота 4->512 8 >512 56,4 0 43,6

Ципрофлоксацин 0,03-0,5 0,03 0,5 100,0 0 0

Левофлоксацин 0,03-1 0,06 0,5 100,0 0 0

Хлорамфеникол - - - 26,9 0 73,1

Тетрациклин - - - 26,9 0 73,1

Примечание. Ч - чувствительные, УР - умеренно резистентные, Р - резистентные.

или Gm-Sxt-Nal - 1,3%), к двум - 24,4% (профили Gm-Sxt - 21,8% или Gm-Nal - 2,6%). Только 2,6% изолятов проявляли резистентность к одному не-в-лактамному антибиотику - гентамицину.

Среди исследованных изолятов не было выявлено ни одного резистентного к ципрофлоксацину и левофлоксацину. Значения МПК фторхинолонов не превышали 0,5 мг/л, однако 43,6% изолятов проявляли устойчивость к налидиксовой кислоте.

Молекулярная характеристика детерминант резистентности кв-лактамам и хинолонам

У всех исследованных изолятов методом ПЦР в реальном времени были выявлены гены БЛРС, принадлежащие к кластеру CTX-M-2. Анализ нуклео-тидной последовательности ORF blaCTX-M у 10 произвольно выбранных изолятов из разных регионов показал их идентичность гену blaCTX-M-5 (GenBank

Асс. № и95364), кодирующему ранее описанный у S. ТурЫтшшт вариант БЛРС - СТХ-М-5.

При амплификации с праймерами к внутренним последовательностям генов tnpA ISEcp1 и ЫaCTX_u_s, у всех изолятов был получен характерный ПЦР-фрагмент длиной около 470 пн. ПЦР-тест на наличие сцепления гена blaCTX_M с ISCR1 не дал положительных результатов ни у одного из исследованных изолятов, кроме СТХ-М-2-продуцирующего штамма CAS-5 из Аргентины, взятого для сравнения. Таким образом, результаты ПЦР картирования свидетельствуют о наличии характерной для ЬШ^х-м^ ассоциации с инсерци-онной последовательностью ISEcp1 [38].

ПЦР-анализ на наличие генов других распространенных в-лактамаз молекулярных классов А и D выявил присутствие Ь^^ у 8,8% и Ь^^^-подобных генов у 75,6% изолятов (рис. 1). Гены SHV в-лактамаз не были обнаружены. Наличие

01Л0Ю01Л0Ю01Л01Л0Ю0 Иэолят Гопол

-с

SE054 SE086 SE048 SE049 SE012 SE014 SE016 SE022 SE023 SE024 SE025 SE026 SE027 SE028 SE029 SE030 SE031 SE032 SE033 SE034 SE035 SE036 SE037 SE041 SE042 SE050 SE051 SE052 SE053 SE002 SE003 SE004 SE117 SE020 SE043 SE072 SE073 SE074 SE075 SE076 SE078 SE080 SE008 SE010 SE011 SE013 SE015 SE018 SE019 SE044 SE045 SE046 SE047 SE089 SE090 SE101 SE102 SE077 SE079 SE006 SE081 SE100 SE005 SE001 SE116 SE118 SE057 SE060 SE061 SE062 SE063 SE064 SE065 SE066 SE067 SE068 SE069 SE070 SE071 SE085 SE088 SE009 SE058 SE059 SE082 SE083 SE007 SE017 SE084 SE087 SE021

Смоленск

Гомель

Смоленск

Смоленск

Витебск

Витебск

Витебск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

Смоленск

С.-Петербург

С.-Петербург

С.-Петербург

Ярославль

Москва

Воронеж

Караганда

Караганда

Караганда

Караганда

Караганда

Караганда

Караганда

Витебск

Витебск

Витебск

Витебск

Витебск

Витебск

Витебск

Воронеж

Воронеж

Воронеж

Воронеж

Смоленск

Смоленск

Томск

Томск

Караганда

Караганда

Витебск

Иркутск

Томск

С.-Петербург

С.-Петербург

С.-Петербург

Ярославль

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Витебск

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Гомель

Витебск

Гомель

Гомель

БуэноеАйрес

Страна

Россия

Беларусь

Россия

Россия

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Казахстан

Казахстан

Казахстан

Казахстан

Казахстан

Казахстан

Казахстан

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Казахстан

Казахстан

Беларусь

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Россия

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Беларусь

Аргентина

ПЦР

ОХА1

ОХА1

ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1

ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1

ОХА1 ОХА1 ОХА1

ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1

ОХА1

ОХА1 ОХА1

ОХА1 ОХА1

ОХА1 ОХА1

ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1 ОХА1

ОХА1 ОХА1

QRDR дугА

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

Asn87

Asn87

Asn87

Phe83

Gly87

WT

Phe83

Phe83

Phe83

Phe83

Phe83

Phe83

Phe83

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

WT

Asn87

Asn87

Gly87

Gly87

WT

WT

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

WT

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

Asn87

WT

Tyr87

Tyr87

WT

WT

WT

WT

WT

WT

Рис. 1. Дендрограмма MLVA-профилей, построенная методом невзвешенного попарного среднего (иРОМА).

Длина ветвей пропорциональна числу отличающихся VNTR локусов

ОХА-1-подобных в-лактамаз, которые проявляют устойчивость к ингибированию клавулановой кислотой и тазобактамом [39], ожидаемо коррелировало с резистентностью к пиперациллину/ тазобактаму.

Методом ПЦР и последующего секвенирования у изолятов, резистентных к налидиксовой кислоте, были выявлены различные точечные мутации, приводящие к аминокислотным заменам в QRDR области А субъединицы ДНК-гиразы (ОугА): Asn-87, О1у-87, Туг-87 и Phe-83 (см. рис. 1). Во всех случаях точечные мутации в QRDR были единичными и приводили к значительному повышению МПК только налидиксовой кислоты, но не фторхинолонов.

Анализ ^/^-кодиру-ющих плазмид

При конъюгативном переносе плазмид выявлено 2 типа трансконъюгантов, отличающихся по фенотипу резистентности. Трансконъюганты первого типа были получены от большинства исследованных изолятов при культивировании на среде с рифампици-ном и ампициллином с высокой частотой (10-3-10-4) и обладали резистентностью к пенициллинам, комбинациям пенициллинов с ингибиторами, тетрациклину, хлор-амфениколу, а в некоторых случаях - также к гентами-цину и ко-тримоксазолу, но проявляли чувствительность к оксиимино-в-лактамам. С помощью ПЦР у транс-конъюгантов данного типа были выявлены только гены ОХА-1-подобных пеницил-линаз. Трансконъюганты второго типа были получены

Рис. 2. Рестрикционный анализ СТХ-М-кодирующих плазмид, полученных от разных изолятов. А - рестрикция эндонуклеазой P.stl, Б - рестрикция эндонукле-азой РотП. Изоляты: 1 - 8Б007/Яе-27; 2 - SE009/Vt-6570; 5 - 8Б010^-3078; 4 - SE015/Vt-13526; 5 - SE046/Vo-516; 6 - SE008/Vt-1603; 7 - SE014/Vt-14533; 8 - SE019/Vt-700; 9 - SE018/Us-16753; 10 - SE013/Us-1845; 11 - SE011/Us-13205; 12 - SE012/Or-13935; 13 - SE057/Go-16; 14 - SE058/Go-302; 15 - SE072/Ka-1124; 16 - SE084/Go-735; 17 - SE087/Re-401; 18 - SE089/Sm-527; М - маркер молекулярной массы 2/BstEII+pUC18/ffaeIIL

всего от двух цефотаксиморезистентных изолятов S. Typhimurium на среде, содержащей рифампицин и цефотаксим, с гораздо меньшей частотой (10-710-8) и проявляли БЛРС фенотип (резистентность к пенициллинам и оксиимино-в-лактамам), обусловленный наличием гена blaCTX-M, оставаясь при этом чувствительными к пиперациллину/тазобактаму и не-в-лактамным антибиотикам.

Плазмиды, кодирующие CTX-M БЛРС, были также выделены от 26 изолятов из разных стационаров и перенесены в реципиентный штамм E. coli EPI300 с помощью трансформации. Полученные цефотаксиморезистентные трансформанты обладали единственной низкомолекулярной плазмидой (размером около 7-8 тпн). Рестрикционный анализ плазмид, выделенных от трансформантов, показал, что все они могут быть отнесены к одному из двух сходных между собой типов (рис. 2). Наиболее распространенный рестрикционный профиль A был характерен для 21 изолята, 11 из которых были выделены в стационарах Беларуси, 9 - в России и 1 - в Казахстане. Плазмиды с профилем B, выявленные у 4 изолятов из Беларуси и одного -из России, отличались наличием дополнительного

сайта рестрикции для эндо-нуклеазы Рзй и большим (приблизительно на 750 пн) размером.

У одного изоля-та из Иркутска (SE081/ Гг-1732) и трех из Томска ^100/Тт-27714, SE101/Tm-27715, SE102/ Тт-27716) не удалось выделить и перенести СТХ-М-плазмиды путем трансформации или конъюгации. Тем не менее, присутствие у этих изолятов гена Ь/асТх-М-5, сцепленного с \SEcp1, было подтверждено с помощью ПЦР.

Типирование изолятов

Типирование с помощью метода PFGE было проведено для 14 изолятов, выделенных в России и Беларуси до 2003 г. Эпидемиологически неродственный штамм £ ТурЫтигшт из Аргентины, продуцирующий СТХ-М-2, был использован для сравнения.

Метод позволил отнести исследованные изо-ляты к одному из восьми макрорестрикционных паттернов (рис. 3). При этом 7 из 8 паттернов проявляли выраженное сходство. Семь изолятов из Витебска, Москвы и Санкт-Петербурга имели одинаковый паттерн (А1). Остальные 7 изолятов из России и Беларуси имели макрорестрикцион-ные паттерны (А2-А7), отличающиеся от первого паттерна максимум по трем полосам, что согласно критериям, предложенным F.C. Tenover и соавт. [26], свидетельствует о вероятной родственности соответствующих изолятов. Аргентинский штамм CAS5 обладал уникальным паттерном (В1), который отличался от паттернов А1-А7 четырьмя полосами. Таким образом, результаты PFGE анализа свидетельствуют о наличии генетического родства между всеми СТХ-М-5-продуцирующими изоля-тами ^ ТурЫтигшт, выделенными во время нозо-комиальных вспышек в различных стационарах на территории России и Беларуси.

Все СТХ-М-продуцирующие изоляты, включая более «поздние» по времени выделения культуры из России, Беларуси и Казахстана, были также типированы с помощью мультилокусного анализа

Паттерны PFGE: М

тпн

А2 А5 А1 1 2 3

А6 A4 A3 A4 А1 А1 6 7 8 9 10 11

А7 А1 12 13

Рис. 3. Генетическое родство СТХ-М-продуцирующих штаммов S. ТурЫтипит на основании сравнения паттернов PFGE. Белорусские штаммы: 1 - SE006/Vt-1358; 2 - SE007/Re-27; 3 - SE008/Vt-1603; 4 - SE009/Vt-6570; 5 - SE010/Vt-3078; 6 - SE011/Us-13205; 7 - SE012/Or-13935; 8 - SE013/Us-1845; 9 - SE014/Vt-14533; 10 - SE015/Vt-13526; 11 - SE019/Vt-700; 12 - SE018/Us-16753. Российские штаммы: 13 - SE004/Sp-891; 14 - SE020/Mo-20. Аргентинский штамм - 15 - SE02l/Ar-CAS5. М - маркер молекулярной массы бактериофаг 2.

тандемных повторов (MLVA). Для сравнения в исследование были также включены чувствительные к цефалоспоринам штаммы S. Typhimurium SE054/Sm-1878 и SE086/Mz-1910, выделенные в тех же стационарах, где и резистентные изоляты. MLVA типирование позволило отнести все изоляты к 17 типам. Несмотря на большое количество выявленных MLVA-типов, все CTX-M-продуцирующие изоляты были отнесены к одной клональной группе в результате кластеризации MLVA профилей с использованием алгоритма минимального остовно-го дерева (MST) (рис. 4). Соответствующие MLVA-профили отличались друг от друга на 1-2 VNTR-локуса. Чувствительные к цефалоспоринам штаммы SE054/Sm-1878 и SE086/Mz-1910 предсказуемо отличались между собой и от наиболее близких изолятов из описанной клональной группы по 3 и более VNTR-локусам.

Изоляты, принадлежащие к 7 MLVA-типам, были получены как минимум из двух разных регионов, что наглядно отражает легкость распространения клонов, принадлежащих указанной клональной группе (см. рис. 4). Интересно отметить, что 3 наиболее ранних изолята из данной группы, выделенные в Санкт-Петербурге в 1994 г. (SE002/ Sp-832, SE003/ Sp-838, SE004/ Sp-891), были отнесены к MLVA-типу A, который является «центральным»

для всей клональной группы, что позволяет предположить их близость к исходному штамму, потомки которого распространились на территории трех стран.

Обсуждение результатов

Клональное распространение полирезистентных штаммов 5. ТурЫтипит в разных странах и регионах мира широко описано в литературе [11, 16, 40], однако популяционная структура и эпидемиология нозокомиального сальмонеллеза, вызванного штаммами с множественной резистентностью, в России и соседних странах мало изучена.

Проблема нозокомиального сальмо-неллеза в России обозначилась в 70-е годы XX века, пик заболеваемости в России пришелся на 1992 г. При этом, более чем в 80% случаев нозокомиальная форма сальмонеллеза была вызвана штаммами серотипа ТурЫтипит [5, 41]. В 1999 г. в России было зарегистрировано 32 вспышки нозокомиального сальмонеллеза, в которые в общей сложности было вовлечено 472 человека [5]. До недавнего времени было всего несколько сообщений о распространении резистентных к цефалоспоринам 5. ТурЫтипит в России и Беларуси. Крупные вспышки нозокомиального сальмонеллеза, вызванного полирезистентными штаммами, были зарегистрированы в 1994-2003 гг. в Москве, Санкт-Петербурге, Смоленской, Минской, Гомельской, Гродненской и Витебской областях [7]. Выделение цефотаксиморезистентных штаммов, продуцирующих БЛРС СТХ-М-5, было описано в Гомельской области и позднее - в 2007 г. [8]. Помимо этого, СТХ-М-5-продуцирующие штаммы 5. ТурЫтипит выделялись в Греции, Венгрии, Латвии и США [38, 42, 43].

Проведенное нами исследование показало, что у всех нозокомиальных изолятов 5. ТурЫтипит, выделенных в России, Беларуси и Казахстане, резистентность к оксииминоцефалоспоринам обусловлена продукцией БЛРС СТХ-М-5. У всех изо-

лятов ген

bla,

CTX-M-5

одинаковым образом связан с инсерционным элементом \SEcp1 и находится в большинстве случаев на небольших плазмидах с идентичными или близкими рестрикционными профилями. Данные плазмиды не несут дополнительные детерминанты резистентности и являются неконъюгативными. Тем не менее перенос СТХ-М-5-кодирующих плазмид от двух изолятов при конъюгации с низкой частотой свидетельствует о

Воронеж, Караганда

Рис. 4. Кластеризация MLVA-профилей на основании алгоритма минимального остовного дерева (MST). Примечание. Каждому MLVA-типу соответствует круг, обозначенный буквой латинского алфавита; названия городов, где были выделены изоляты, указаны рядом с соответствующими типами. Размер круга отражает количество изолятов, принадлежащих данному MLVA-типу. Длина и тип соединительных отрезков отражают генетическое расстояние (число отличающихся VNTR локусов) между двумя ближайшими типами: короткая непрерывная линия соединяет два MLVA-типа, отличающихся друг от друга единственным VNTR локусом, длинная пунктирная линия соединяет двухлокусные варианты. MLVA-типы, отличающиеся не более чем на 2 локуса, объединены в клональные группы (выделены серым фоновым цветом). Различия на 3 локуса и более на диаграмме не отражены. Круги черного цвета соответствуют изолятам, не продуцирующим БЛРС.

возможности их ко-мобилизации другими плазми-дами. У четырех изолятов отсутствие соответствующих плазмид может быть связано с транслокацией гена Ь/аСТХ-М, опосредованной ^Еср1, которая была описана в ряде публикаций [44-47].

Аналогичный характер ассоциации гена Ь/аСТХ-М-5 с ^Еср1 с разницей в 3 точечные мутации, локализованные в некодирующей области перед геном в-лактамазы (ОепВапк #AF286192) был описан у эпидемического штамма 5. ТурЫтшшт из Латвии [38]. Так же как и у исследованных нами изолятов, у латвийского штамма ген Ь/аСТХ-М-5 был выявлен в составе небольшой (~10 тпн) плазмиды, что указывает на возможную общность их происхождения.

Следует отметить, что близкий по структуре ген Ь/аСТХ-М-2 у штамма 5. ТурЫтшшт из Аргентины имеет иное генетическое окружение, связан с ISCR1 элементом и находится в составе так называемого «модифицированного интегрона 1 класса» на большой конъюгативной плазмиде [31].

Дополнительная устойчивость к ингибитороза-щищенным пенициллинам, выявленная у большинства исследованных нами изолятов 5. ТурЫтшшт, была связана с ко-продукцией ОХА-пенициллиназ, для которых характерна нечувствительность к ингибированию клавуланатом, тазобактамом и

сульбактамом. Гены ОХА-1-подобных в-лактамаз были выявлены в составе дополнительных конъю-гативных плазмид, которые несли также детерминанты устойчивости к не-в-лактамным антибиотикам: тетрациклину, хлорамфениколу, гентамицину и ко-тримоксазолу в различных сочетаниях.

Учитывая полирезистеность СТХ-М-5-про-дуцирующих штаммов 5. ТурЫтшшт особое значение имеет факт выявления у них устойчивости к хинолонам. Несмотря на то что все исследованные изоляты проявляли чувствительность к ципроф-локсацину, согласно критериям EUCAST, 43,6% из них были резистентны к налидиксовой кислоте вследствие наличия характерных аминокислотных замен в позициях 83 или 87 А-субъединицы ДНК-гиразы (ОугА). Согласно рекомендациям CLSI устойчивость к налидиксовой кислоте, опосредованная мутациями в QRDR ОугА, должна рассматриваться как предиктор возможной клинической неэффективности терапии фторхинолонами при инвазивном сальмонеллезе [12]. Известно также, что наличие единичных мутаций в QRDR ОугА увеличивает риск селекции дополнительных (кооперативных) мутаций и формирования резистентности высокого уровня к фторхинолонам [3].

Оба использованных нами метода субтипирова-ния штаммов 5. ТурЫтшшт - пульс-электрофорез

XbaI макрорестрикционных фрагментов геномной ДНК (PFGE) и мультилокусный анализ тандемных повторов (MLVA) - показали, что все CTX-M-5-продуцирующие нозокомиальные изоляты сальмонелл, выделенные на территории России, Беларуси и Казахстана в период с 1994 по 2009 гг., представляют одну клональную группу и существенно отличаются по совокупности молекулярно-генети-ческих характеристик от чувствительных штаммов S. Typhimurium, выделенных в тех же стационарах.

Наибольшей дифференцирующей способностью в отношении клинических штаммов S. Typhimurium обладал метод MLVA. Анализ данных MLVA-типирования с помощью алгоритма минимального остовного дерева (minimum spanning tree) позволяет выявить достоверные связи между исследуемыми изолятами и является более информативным по сравнению с анализом результатов PFGE-типирования. Полученные нами результаты подтверждают вывод ряда исследователей о том, что в сочетании с должным математическим анализом метод MLVA является удобным и точным средством изучения эпидемиологии сальмонеллезов [25, 30].

Клональность пятнадцати CTX-M-5-продуциру-ющих клинических изолятов S. Typhimurium, выделенных в Смоленске, была установлена также на основании результатов независимого исследования с использованием метода PFGE, проведенного в рамках Международной программы по мониторингу антибиотикорезистентности SENTRY [48]. В другом исследовании с использованием методов PFGE и MLVA была доказана родственность 31 CTX-M-5-продуцирующих изолятов S. Typhimurium, выделенных в Гомельской области [8]. Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные подтверждают наши наблюдения о клональном характере распространения госпитальных штаммов S. Typhimurium, экспрессирующих CTX-M-5.

Несмотря на установленный с помощью моле-кулярно-генетических методов факт клонально-сти полирезистентных штаммов S. Typhimurium, недостаточность имеющихся эпидемиологических данных не позволяет однозначно установить пути их распространения между стационарами в разных городах на территории России, Беларуси и Казахстана. Опираясь на документированные наблюдения, можно предположить, что основным путем распространения инфекции внутри стационара является передача цефотаксиморезистентных штаммов контактным путем от человека к человеку, в частности между пациентами, или посредством бессимптомного носительства у медицинского персонала и далее между стационарами - в результате перевода пациентов [5].

Так, например, в ходе данного исследования нами был выявлен случай распространения СТХ-М-5-продуцирующего штамма 5. ТурЫтипит из районной больницы, где на протяжении 2 лет отмечалась его циркуляция среди пациентов, в один из стационаров города Смоленска, куда были переведены инфицированные мать и ее ребенок с тяжелой формой гастроэнтерита.

Другими авторами были описаны случаи распространения нозокомиального клона 5. еп£епса между стационарами разных городов на юге США [49] и разных стран (из Филиппин в США) [50], связанные с переводом пациентов из одного стационара в другой.

Р.Т. Tassios и соавт. на основании результатов PFGE-типирования, анализа плазмид и детерминант резистентности сделали вывод о родственности штаммов 5. ТурЫтипит, выделенных в Венгрии, Греции и России (в Санкт-Петербурге) [42]. При этом штамм из Санкт-Петербурга (SE005/Sp-893), описанный в работе Р.Т. Tassios и соавт. как родственный греческим и венгерским штаммам, по данным выполненного нами молекулярного типи-рования, принадлежит к той же клональной группе, что и остальные изоляты из России. Кроме того, известны факты «экспортирования» пациентами СТХ-М-продуцирующих штаммов 5. ТурЫтипит из южной части России в другие страны: в частности - российским иммигрантом в Грецию в 1998 г. [51] и ребенком, усыновленным в США в 2000 г. [43]. Несмотря на отсутствие данных типирования этих штаммов, примечательным является тот факт, что выделенный в США изолят характеризовался наличием плазмиды размером до 9 тпн, несущей ген Ь/аСТХ-М-5, и следовательно, сходной с плазми-дами, обнаруженными у нозокомиального штамма из Латвии [38] и штаммов, циркулирующих на территории России, Казахстана и Беларуси.

Все вышесказанное позволяет сделать вывод о широком географическом распространении штаммов 5. ТурЫтипит, принадлежащих к единой клональной группе. Наиболее важной особенностью штаммов данной группы является продукция БЛРС СТХ-М-5. Большинство изолятов данной группы проявляют ассоциированную устойчивость к антибиотикам разных классов за счет комбинации дополнительных плазмидных и хромосомных детерминант резистентности. Имеющиеся эпидемиологические данные указывают на возможность быстрого распространения клона в госпитальной среде путем передачи возбудителя между пациентами и, возможно, медицинским персоналом.

Литература

1. Nakaya H., Yasuhara A., Yoshimura K., Oshihoi Y., Izumiya H.,Watanabe H. Life-threatening infantile diarrhea from fluoroquinolone-resistant Salmonella enterica typhimurium with mutations in both gyrA and parC. Emerg Infect Dis 2003; 9(2):255-7.

2. Lan R., Reeves P.R.,Octavia S. Population structure, origins and evolution of major Salmonella enterica clones. Infect Genet Evol 2009; 9(5): 996-1005.

3. Velge P., Cloeckaert A., Barrow P. Emergence of Salmonella epidemics: the problems related to Salmonella enterica serotype Enteritidis and multiple antibiotic resistance in other major serotypes. Vet Res 2005; 36(3):267-88.

4. Foley S.L., Lynne A.M. Food animal-associated Salmonella challenges: pathogenicity and antimicrobial resistance. J Anim Sci 2008; 86(14 Suppl):E173-87.

5. Акимкин В.Г., Покровский В.И. Нозокомиальный сальмонеллез взрослых. Издательство РАМН 2002:35-72.

6. Акимкин В.Г. Нозокомиальный сальмонеллез как самостоятельная нозологическая форма инфекционной патологии человека. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии 1998; (4):106-110.

7. Edelstein M., Pimkin M., Dmitrachenko T., et al. Multiple outbreaks of nosocomial salmonellosis in Russia and Belarus caused by a single clone of Salmonella enterica serovar Typhimurium producing an extended-spectrum beta-lactamase. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48(8):2808-15.

8. Tapalski D., Hendriksen R.S., Hasman H., Ahrens P., Aarestrup F.M. Molecular characterisation of multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Typhimurium isolates from Gomel region, Belarus. Clin Microbiol Infect 2007; 13(10):1030-3.

9. Orman B.E., Pineiro S.A., Arduino S., et al. Evolution of multiresistance in nontyphoid salmonella serovars from 1984 to 1998 in Argentina. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46(12): 3963-70.

10. Yan J.J., Ko W.C., Chiu C.H., Tsai S.H., Wu H.M., Wu J.J. Emergence of ceftriaxone-resistant Salmonella isolates and rapid spread of plasmid-encoded CMY-2-like cephalosporinase, Taiwan. Emerg Infect Dis 2003; 9(3):323-8.

11. Yu F., Chen Q., Yu X., et al. High prevalence of extended-spectrum beta lactamases among Salmonella enterica Typhimurium isolates from pediatric patients with diarrhea in China. PLoS One 2011; 6(3):e16801.

12. Clinical and Laboratory Standards Institute, Performance standards for antimicrobial susceptibility testing (21st informational supplement). Wayne, PA, USA; 2011

13. Dionisi A.M., Graziani C., Lucarelli C., et al. Molecular characterization of multidrug-resistant strains of Salmonella enterica serotype Typhimurium and Monophasic variant (S. 4,[5],12:i:-) isolated from human infections in Italy. Foodborne Pathog Dis 2009; 6(6):711-7.

14. Targant H., Ponsin C., Brunet C., et al. Characterization of resistance genes in multidrug-resistant Salmonella enterica serotype Typhimurium isolated from diseased cattle in France (2002 to 2007). Foodborne Pathog Dis 2010; 7(4):419-25.

15. dos Reis E.M., Rodrigues Ddos P., de Freitas-Almei-da A.C., Hofer E. Prevalence of R-type ACSSuT in strains of Salmonella serovar Typhimurium DT193 isolated from human infections in Brazil. Rev Panam Salud Publica 2011; 29(6):387-92.

16. Butaye P., Michael G.B., Schwarz S., Barrett T.J., Brisabois A.,White D.G. The clonal spread of multidrug-resistant non-typhi Salmonella serotypes. Microbes Infect 2006; 8(7):1891-7.

17. Arlet G., Barrett T.J., Butaye P., Cloeskaert A., Mulvey M.R.> White D.G. Salmonella resistant to extended-spectrum cephalosporins: prevalence and epidemiology. Microbes Infect 2006; 8(7):1945-54.

18. Rodriguez I., Barownick W., Helmuth R., et al. Extended-spectrum {beta}-lactamases and AmpC {beta}-lactamases in ceftiofur-resistant Salmonella enterica isolates from food and livestock obtained in Germany during 2003-07. J Antimicrob Chemother 2009; 64(2):301-9.

19. Heisig P. High-level fluoroquinolone resistance in a Salmonella typhimurium isolate due to alterations in both gyrA and gyrB genes. J Antimicrob Chemother 1993; 32(3):367-77.

20. Aarestrup F.M., Wiuff C., Molbak K., Threlfall E.J. Is it time to change fluoroquinolone breakpoints for Salmonella spp.? Antimicrob Agents Chemother 2003; 47(2):827-9.

21. Cloeckaert A., Chaslus-Dancla E. Mechanisms of quinolone resistance in Salmonella. Vet Res 2001; 32(3-4):291-300.

22. Martinez-Martinez L., Eliecer Cano M., Manuel Rodriguez-Martinez J., Calvo J., Pascual A. Plasmid-mediated quinolone resistance. Expert Rev Anti Infect Ther 2008; 6(5):685-711.

23. Martinez-Martinez L., Pascual A., Jacoby G.A. Quinolone resistance from a transferable plasmid. Lancet 1998; 351(9105):797-9.

24. Robicsek A., Strahilevitz J., Jacoby G.A., et al. Fluoro-quinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase. Nat Med 2006; 12(1):83-8.

25. Lindstedt B.A., Vardund T., Aas L.,Kapperud G. Multiple-locus variable-number tandem-repeats analysis of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium using PCR multiplexing and multicolor capillary electrophoresis. J Microbiol Methods 2004; 59(2):163-72.

26. Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V. How to select and interpret molecular strain typing methods for epidemiological studies of bacterial infections: a review for healthcare epidemiologists. Molecular Typing Working Group of the Society for Healthcare Epidemiology of America. Infect Control Hosp Epidemiol 1997; 18(6):426-39.

27. Swaminathan B., Barrett T.J., Hunter S.B., Tauxe R.V. PulseNet: the molecular subtyping network for foodborne bacterial disease surveillance, United States. Emerg Infect Dis 2001; 7(3):382-9.

28. Hopkins K.L., Peters T.M., de Pinna E., Wain J. Standardisation of multilocus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA) for subtyping of Salmonella enterica serovar Enteritidis. Euro Surveill 2011; 16(32).

29. Tamamura Y., Uchida I., Tanaka K., et al. Molecular

epidemiology of Salmonella enterica serovar typhimurium isolates from cattle in hokkaido, Japan: evidence of clonal replacement and characterization of the disseminated clone. Appl Environ Microbiol 2011; 77(5): 1739-50.

30. Torpdahl M., Sorensen G., Ethelberg S., Sando G., Gammelgard K., Porsbo L.J. A regional outbreak of S. Typhimurium in Denmark and identification of the source using MLVA typing. Euro Surveill 2006; 11(5):134-6.

31. Bauernfeind A., Casellas J.M., Goldberg M., et al. A new plasmidic cefotaximase from patients infected with Salmonella typhimurium. Infection 1992; 20(3):158-63.

32. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters (v 2.0.2012-01-01). www.eucast.org.

33. Nuesch-Inderbinen M.T., Kayser F.H., Hachler H. Survey and molecular genetics of SHV beta-lactamases in Enterobacteriaceae in Switzerland: two novel enzymes, SHV-11 and SHV-12. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41(5):943-9.

34. Степанова М.Н. Мутационная изменчивость CTX-M в-лактамаз и формирование устойчивости к цеф-тазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli [диссертация на соискание уч. степ. к.б.н.]. Смоленск: СГМА 1-119.

35. Kholodii G., Yurieva O., Mindlin S., Gorlenko Z., Rubochkin V., Nikiforov V. Tn5044, a novel Tn3 family transposon coding for temperature-sensitive mercury resistance. Res Microbiol 2000; 151(4):291-302.

36. Struelens M.J., Rost F., Deplano A., et al. Pseudomonas aeruginosa and Enterobacteriaceae bacteremia after biliary endoscopy: an outbreak investigation using DNA macrorestriction analysis. Am J Med 1993; 95(5):489-98.

37. Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol 1995; 33(9):2233-9.

38. Bradford P.A., Yang Y., Sahm D., Grope I., Gardovska D., Storch G. CTX-M-5, a novel cefotaxime-hydrolyzing beta-lactamase from an outbreak of Salmonella typhimurium in Latvia. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42(8):1980-4.

39. Livermore D.M. beta-Lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995; 8(4):557-84.

40. Wasyl D., Sandvang D., Skov M.N., Baggesen D.L. Epidemiological characteristics of Salmonella Typhimurium isolated from animals and feed in Poland. Epidemiol Infect 2006; 134(1):179-85.

41. Акимкин В.Г. Современные клинико-эпидеми-ческие аспекты нозокомиального сальмонеллеза. Медицинский алфавит. Эпидемиология и санитария 2010; (3):4-9.

42. Tassios P.T., Gazouli M., Tzelepi E., et al. Spread of a Salmonella typhimurium clone resistant to expanded-spectrum cephalosporins in three European countries. J Clin Microbiol 1999; 37(11):3774-7.

43. Zirnstein G.W., Swaminathan B., Angulo F., Tenover F., Rasheed J. Plasmid-Mediated CTX-M-5 /3-lactamase Conferring Resistance to Ceftriaxone and Cefotaxime in a Salmonella serotype Typhimurium var. Copenhagen Isolate from an Infant Adopted from Russia. 2nd International Conference on Emerging Infectious Diseases; 2000 July; Atlanta, GA, US.

44. Fabre L., Delaune A., Espie E., et al. Chromosomal integration of the extended-spectrum beta-lactamase gene blaCTX-M-15 in Salmonella enterica serotype Concord isolates from internationally adopted children. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53(5):1808-16.

45. Sun Y., Zeng Z., Chen S., Ma J., He L., Liu Y., et al. High prevalence of bla(CTX-M) extended-spectrum beta-lactamase genes in Escherichia coli isolates from pets and emergence of CTX-M-64 in China. Clin Microbiol Infect 2010; 16(9):1475-81.

46. Mendonca N., Leitao J., Manageiro V., Ferreira E., Canica M. Spread of extended-spectrum beta-lactamase CTX-M-producing Escherichia coli clinical isolates in community and nosocomial environments in Portugal. Antimicrob Agents Chemother 2007; 51(6):1946-55.

47. Hopkins K.L., Batchelor M.J., Liebana E., Deheer-Graham A.P., Threlfall E.J. Characterisation of CTX-M and AmpC genes in human isolates of Escherichia coli identified between 1995 and 2003 in England and Wales. Int J Antimicrob Agents 2006; 28(3):180-92.

48. Streit J.M., Jones R.N., Toleman M.A., Stratchouns-ki L.S., Fritsche T.R. Prevalence and antimicrobial susceptibility patterns among gastroenteritis-causing pathogens recovered in Europe and Latin America and Salmonella isolates recovered from bloodstream infections in North America and Latin America: report from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (2003). Int J Antimicrob Agents 2006; 27(5):367-75.

49. Kay R.S., Vandevelde A.G., Fiorella P.D., et al. Outbreak of healthcare-associated infection and colonization with multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Senftenberg in Florida. Infect Control Hosp Epidemiol 2007; 28(7):805-11.

50. Olsen S.J., DeBess E.E., McGivern T.E., Marano N., Eby T., Mauvais S., et al. A nosocomial outbreak of fluoroquinolone-resistant salmonella infection. N Engl J Med 2001; 344(21):1572-9.

51. Tzouvelekis L.S., Gazouli M., Markogiannakis A., Paraskaki E., Legakis N.J., Tzelepi E. Emergence of resistance to third-generation cephalosporins amongst Salmonella typhimurium isolates in Greece: report of the first three cases. J Antimicrob Chemother 1998; 42(2):273-5.

Авторы выражают благодарность Т.И. Дмитраченко, В.М. Семенову, Н.С. Козловой, Д.П. Гладину, Ф.Н. Шубину, Н.К. Фурсовой, Г.И. Нехаевой за предоставленные для исследования штаммы.