Генетический и морфометрический анализ поселений мидии (Mytilidae: Mytilus ex. Gr. Edulis) из вод Приморья: исследование дифференциации популяций в гибридной зоне

Вестник ДВО РАН. 2016. № 3

УДК 574/577+57.015

НА. МАСАЛЬКОВА, Ю.Ф. КАРТАВЦЕВ, О.В. ЧИЧВАРХИНА

Генетический и морфометрический анализ поселений мидии (Mytilidae: Mytilus ex. gr. edulis) из вод Приморья:

исследование дифференциации популяций в гибридной зоне

Изучена изменчивость мидий комплекса Mytilus ex. gr. edulis из района гибридизации Mytilus trossulus и M. galloprovincialis в зал. Петра Великого (западная часть Японского моря) на основе изменчивости 4—6 ал-лозимных локусов, ДНК-маркера Me-5, 11 морфометрических признаков и 10 индексов. В выборках обнаружено преобладание особей вида M. trossulus. M. galloprovincialis в проанализированных выборках отсутствовали. Однако по локусу Me-5 были выявлены гибридные особи со средней частотой в выборках Fh = 9,6 ± 3,3 %. Подтверждена отмеченная ранее инвазия M. galloprovincialis в ареал местного вида M. trossulus. Установлено, что интенсивность инвазии год от года различается, изменяются также и доли гибридов в общей структуре комплекса Mytilus ex. gr. edulis. Обнаружена новая локальность, где встречаются гибриды, — бухта Лазурная (зал. Уссурийский).

Ключевые слова: мидии, гибридная зона, ДНК-маркеры, аллозимная изменчивость.

Genetic and morphometric analysis of mussel settlements (Mytilidae: Mytilus ex. gr. edulis) from Primorye waters: research of population differentiation in a hybrid zone. NA. MASALKOVA (A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, FEB RAS, Vladivostok), Yu.Ph. KARTAVTSEV (A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, FEB RAS, Vladivostok; Far Eastern Federal University, Vladivostok), O.V. CHICHVARKHINA (A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, FEB RAS, Vladivostok).

Based on variability of4—6 allozyme loci, DNA marker Me-5,11 morphometric traits and 10 indices, genetic variability of mussels Mytilus ex. gr. edulis from the area of hybridization between Mytilus trossulus and M. galloprovincialis, is studied in the Peter the Great Bay of the west-pacific part of the Sea of Japan. Among the samples gathered there was prevalence of local species M. trossulus. No M. galloprovincialis individuals were detected. However, data obtained at Me-5 evidenced on the presence of hybrids with average proportion Fh = 9.6 ± 3.3 %. Data obtained confirmed the continuation of the invasion ofM. galloprovincialis in the area of local species M. trossulus. Analysis of literature sources proved that intensity of invasion varied from year to year and the hybrid shares in the whole structure of the complex Mytilus ex. gr. Edulis were also changed. New locality was obtained that inhabited by hybrid individuals — the Lazurnaya Inlet (the Ussuri Bay).

Key words: mussels, hybrid zone, DNA markers, allozyme variability.

МАСАЛЬКОВА Наталья Александровна - аспирант (Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток), *КАРТАВЦЕВ Юрий Федорович - доктор биологических наук, профессор (Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток, Дальневосточный федеральный университет, Владивосток), ЧИЧВАРХИНА Ольга Владимировна - младший научный сотрудник (Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток). *E-mail: yuri.kartavtsev48@hotmail.com

Исследование поддержано грантом РФФИ 14-04-00758, а также грантом РНФ (соглашение № 14-50-00034) в части молекулярной систематики морских организмов, а также грантом РФФИ 15-29-02456-офи в части исследований генетических основ биоразнообразия.

Двустворчатые моллюски рода МуЫ1ш семейства МуйШае широко распространены по всему земному шару, являются объектами исследований в разных дисциплинах биологии и используются в промысле и марикультуре. Именно поэтому их генетическое исследование имеет первостепенное значение. Однако для видов, относящихся к комплексу ЫуШив ех. gr. edulis [13] (ЫуШш trossulus, М. galloprovincialis и М. edulis), идентификация по морфологическим признакам затруднена и реально диагностическими являются только генетико-биохимические и молекулярно-генетические признаки. Анализ генети-ко-биохимических маркеров для этих видов, будучи быстрым и дешевым, используется традиционно. Анализ молекулярных ДНК-маркеров более дорогой, но обладает большим диагностическим потенциалом.

Исследование мидий становится особенно актуальным из-за инвазии атлантического вида М. galloprovincialis в зал. Петра Великого Японского моря, населенный тихоокеанской мидией М. trossulus. Судя по предыдущим исследованиям, вселение атлантического вида скорее всего произошло не позднее 1970-х годов. Существование здесь гибридных особей обнаружилось в 1990-е годы [11, 25]. Таким образом, возникли вопросы о существовании гибридной зоны, ее стабильности, размерах, взаимодействии двух форм и ин-трогрессии генов.

Таксономический статус трех номинальных видов комплекса ЫуМив ех. gr. edulis, гибридизация которых наблюдается в зонах контакта их ареалов, обсуждается до сих пор. На данный момент ранг вида генетически обоснован для М. trossulus, тогда как два других номинальных вида определены в статусе полувидов [25].

В настоящее время виды комплекса, включая М. trossulus и М. galloprovincialis, образуют гибридные поселения в северных и других районах Тихого океана [5, 11, 21, 23, 25]. Вопросы таксономии и генетики этих видов подробно исследованы в восточных акваториях (Калифорния и зал. Пьюджет-Саунд) [14, 15, 21, 30] и не столь детально в западных районах океана [13, 25]. Хорошо изучено распространение М. trossulus, М. gal-loprovincialis и их гибридов вдоль островов Хонсю и Хоккайдо [17, 23], в то же время сведений о генетической и морфометрической дифференциации и динамике гибридизации вдоль западного побережья Японского моря, в том числе в зал. Петра Великого, недостаточно.

Таксономический статус трех номинальных видов комплекса ЫуМив ех. gr. edulis, гибридизация которых наблюдается в зонах контакта их ареалов, обсуждался ранее [5, 12, 25, 34, 35]. Как упоминалось выше, твердо ранг биологического вида признан только за М. trossulus [25]. Далее необходимо решить следующие задачи: 1) уточнить таксономический ранг представителей группы с применением популяционно-генетических и моле-кулярно-филогенетических подходов, учитывая отсутствие четких диагностических признаков традиционной систематики, 2) проанализировать генетические процессы и морфологическую дифференциацию в гибридных зонах в связи с инвазиями, видообразованием и дальнейшим поиском дискриминирующих морфологических признаков. Комплексный подход к исследованию поселений мидии Японского моря реализуется достаточно давно [25]. Однако и сегодня он является актуальным, учитывая возможность комбинирования имеющихся данных с перспективными генетико-биохимическими и ДНК-маркерами.

Материал и методика

Материал собран в 2012-2013 гг. Детализация по размеру выборок из обследованных поселений мидии дана в подписи к рис. 1. Общее количество особей, отловленных в зал. Петра Великого и близлежащих бухтах Киевка и Преображение, составило 327.

Морфометрическое исследование основывалось на следующих процедурах:

1) корректное описание индивида по набору признаков, которые должны представлять различные морфофункциональные системы организма;

Рис. 1. Карта сбора материала в зал. Петра Великого в 2012-2013 гг. Кружками с номерами отмечены выборки из поселений мидий. Численность исследованных особей в выборках составила: 1 - 56

2) представительная характеристика отдельных групп, которые нужно исследовать, т.е. сбор биологически представительного материала;

3) правильное осуществление выборочной процедуры в пространственно-временном измерении, чтобы получить количественно определяемую матрицу данных;

4) адекватный статистический анализ.

Исследование основано на общепринятых подходах [1, 2]. Особи проанализированы по 11 морфометрическим признакам (рис. 2, табл. 1) и 10 индексам. Индексы получали делением каждого из признаков на признак 1 (длину раковины). Затем индексы преобразовывали по формуле [7, 10]: 2arcsin^(p), где p - значение соответствующего индекса. Исходные признаки и преобразованные индексы стандартизировали для проведения многомерного анализа (x. - M)/s , приведя все вариационные ряды к виду с M = 0, s = 1 , где M - средняя арифметическая, s - стандартное отклонение.

Анализ изменчивости частот генотипов и аллелей проведен по 4-6 аллозимным ло-кусам и Me-5 - маркеру ядерной ДНК (ген прикрепительного белка нитей биссуса). Исследованы следующие аллозимные маркеры ферментных локусов: фосфоглюкомутазы (ФГМ, PGM-1*, КФ 5.4.2.2), глюкозофосфатизомеразы (ГФИ, GPI*, КФ 5.3.1.9), аспар-татаминотрансферазы (ААТ, AAT-1*, КФ 2.6.1.1), октопиндегидрогеназы (ОНДГ, ODH*, КФ 1.5.1.11), маннозофосфатизомеразы (МФИ, MPI*, КФ 5.3.1.8) и лейцинаминопептида-зы (ЛАП, LAP*, КФ 3.4.11.1). Эти локусы являются полудиагностическими для дискриминации M. trossulus и M. galloprovincialis [5, 8, 19]. Изученный маркер ядерной ДНК, локус Me-5, является диагностическим для дискриминации двух видов. На основании генотипи-рования особей по всем описанным локусам оценены доли встречаемости аборигенного вида, гибридов и интродуцентов (представителей инвазивной формы M. galloprovincialis) в выборках из исследованных районов.

Анализ аллозимных маркеров. Для анализа аллозимных маркеров использовали мягкие ткани живых моллюсков. Ткани аддуктора и гепатопанкреаса гомогенизировали механически с добавлением стабилизирующего раствора 2-меркаптоэтанола (0,2 %), го-могенат центрифугировали и надосадочную фракцию использовали в качестве проб. Белковые фракции разделяли при помощи горизонтального электрофореза в 14 %-ном крахмальном геле. При электрофорезе применяли трис-малеатную (pH 7,4) и трис-цитратную (pH 8,0) буферные системы. Продолжительность электрофореза составляла 13-19 ч при постоянном токе 130-180 В и 20-40 мА на блок 15 см и температуре 4 oC. Специфическое

1

Рис. 2. Исследованные морфометрические признаки особей мидий

Таблица 1

Морфометрические признаки особей мидии, исследованные в данной работе

Признак Обозначение признака

1. Длина раковины LENGTH

2. Высота раковины HEIGHT

3. Длина лигамента LIG_LN

4. Длина участка перламутрового слоя, заходящего под лигамент PERL_L

5. Расстояние от вентрального конца лигамента до макушки раковины LIG_T

6. Длина зубной пластинки DENT_PL

7. Длина отпечатка переднего аддуктора ADR_FR

8. Длина отпечатка заднего ретрактора BAC_RT

9. Длина отпечатка заднего аддуктора ADR_BAC

10. Максимальная ширина мантийной линии вблизи ее слияния с отпечатком заднего аддуктора SINUS

11. Расстояние между передним краем отпечатка заднего ретрактора и дорсальным краем раковины RETR_MN

гистохимическое окрашивание ферментных фракций в геле проводилось по описанным в литературе методикам [20, 27] с небольшими модификациями.

Для оценки видовой принадлежности отдельных особей по мультилокусным генотипам применяли программу Structure, использующую описанные ранее алгоритмы [18, 29]. При расчетах использовали следующие параметры модели: admixture, correlated allele frequencies, k: 1-5, burnin: 30 000, MCMC: 50 000-500 000; предполагались различные значения стандартизированной дисперсии частот аллелей (F ) для разных субпопуляций и средние априорные Fst = 0,01 (для краткости часть параметров здесь не названа). Возможность использования указанной программы в целях описания генетической структуры популяций и оценки видовой принадлежности особей в гибридных зонах мидий по набору аллозимных локусов была показана ранее [12]. В результате анализа получено два показателя, отражающих вклад в генофонд мидии видов M. trossulus и М. galloprovincialis. В сумме оба показателя дают единицу, по этой причине в дальнейших расчетах достаточно использовать один из них. Терминологически индекс по Structure используется далее как вклад M. trossulus в составной генотип тестируемой особи. Ферментные локусы при идентификации особей посредством этого индекса для удобства обозначали как GBL (ге-нетико-биохимические локусы) [5].

Анализ индивидуальных индексов позволяет проводить классификацию особей на группы родительских видов и гибридов [12, 32, 33]. Как показано в литературе, границы значений индексов для разделения чистых видов и гибридов могут быть выбраны субъективно в пределах 0,08-0,95 [32, 33]. В данной работе особь относили к M. trossulus, если ее индекс по Structure попадал в диапазон значений 0,6-1,0, т.е. вклад M. trossulus в генотип этой особи составлял 60 % и более. За вид M. galloprovincialis признавались особи со значениями индивидуальных индексов от 0 до 0,1 (вклад M. trossulus в генотип не более 10 %). Особи с индексом по Structure > 0,1 и < 0,6 классифицировались как гибриды. На основании этих данных мы рассчитывали частоты родительских и гибридных генотипов в исследованных выборках.

Анализ ДНК-маркера. Для анализа Me-5 использовали следующие методики. Тотальную ДНК выделяли из жаберных пластинок, фиксированных в 95 %-ном этиловом спирте методом HotSHOT [11] или по стандартной методике [9] с небольшими модификациями, состоявшими в удалении фенола из протокола и добавлении рибонуклеазы. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей дистиллированную воду - 2,3 мкл, 10 х буфер (Evrogen) - 1,0 мкл; смесь dNTP (концентрация каждого три-фосфата - 2,5 мМ, Evrogen) - 1,0 мкл; 25 mM MgCl2 - 0,6 мкл; праймеры (5 пмоль/мкл) -по 1,0 мкл; Taq-полимераза (5 ед/мкл, Evrogen) - 0,1 мкл; ДНК - 1,0 мкл. Полимеразная цепная реакция проводилась при следующих условиях: предварительная денатурация при 94 °С в течение 1 мин; далее для 30 циклов: денатурация при 92 °С в течение 30 с, отжиг при 53 °С в течение 60 с, синтез при 75 °С в течение 1 мин; заключительный цикл реакции при 75 °С в течение 5 мин. В качестве специфических использовали праймеры для гена Me-5 прикрепительного белка (прикрепительный полифенольный белок, образующий клеящие нити биссуса у мидий): Me15 5'-CCAGTATACAAACCTGTGAAAA-3' и Ме16 5'-TGTTGTCTTAATAGGTTTGTAAGA-3' [23]. Идентификация особей и классификация генотипов выполнены с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле.

Классификация генотипов по ДНК-маркеру, имеющему только два аллеля, каждый из которых типичен для одного из родительских видов (условно аллель 1 и аллель 2), проводилась следующим образом: генотип 2-2 - M. trossulus, 1-2 - гибриды и 1-1 -M. galloprovincialis (в материалах нашего исследования не обнаружен). На основании полученных данных были рассчитаны доли встречаемости аборигенного вида, гибридов и интродуцентов.

Далее сравнивались данные, полученные по разным типам маркеров. При сопоставлении оценивали стандартные ошибки средних значений и отклонения в пределах доверительных интервалов. Расчеты частот генотипов, частот аллелей и других характеристик изменчивости выполнены с помощью пакета программ SPECSTAT [26]. С использованием программы Statistica 6 (www.statsoft.com) проведен дисперсионный, а также многомерный анализ морфометрической изменчивости.

Результаты исследований

В целом проанализирована изменчивость 6 аллозимных локусов и ДНК-маркера Ме-5 в изученных нами выборках. По аллозимным локусам выявлено наличие до 7 аллелей, по Ме-5 внутривидовой изменчивости не обнаружено, т.е. у каждого номинального вида имеется по 1 фиксированному аллелю, отличающемуся от аллелей других видов. Распределение частот наиболее распространенных аллелей для каждого GBL показано на рис. 3. Частоты аллелей свидетельствуют о наличии статистически существенной генетической неоднородности выборок по трем из шести локусам (рис. 3, см. значения хи-квадрат).

По итогам экспериментальной работы в табл. 2 представлена оценка доли генотипов вида M. trossulus и гибридов в исследованных выборках по комплексу аллозимных

Рис. 3. Распределение частот наиболее распространенных аллелей для каждого исследованного локуса. 1-5 -номера выборок особей из поселений мидий (см. табл. 2). Звездочками отмечены статистически существенные различия частот в выборках: * P < 0,05; *** P < 0,01

Рис. 4. Распределение доли гибридных особей в исследованных выборках мидий (см. табл. 2) по ДНК-маркеру Ме-5. На графике указано среднее значение Fh = 9,6 % для всех выборок

Рис. 5. График оценки нормального распределения признака длина лигамента в исследованных выборках мидий

локусов (GBL) и Me-5 (особи ин-вазивного вида не встречены). Распределение долей (частоты встречаемости) гибридных генотипов (Fh) в исследованных выборках и их стандартные ошибки (SE) на основе Me-5 показаны на рис. 4.

Анализ морфологических признаков показывает, что вариационные ряды в основном не отклоняются значительно от нормального распределения по критерию Колмогорова-Смирнова (KS) и главное - имеют одномодальное распределение, что показано на примере признака длины лигамента (рис. 5). Коэффициенты асимметрии и эксцесса, а также морфологические индексы тоже имеют нормальное или близкое к нормальному распределение (табл. 3).

О соотношении морфологических различий поселений мидий можно судить по итогам дискрими-нантного анализа. Распределение особей во всех исследованных нами выборках по значениям канонических переменных (КП 1, КП 2 и КП 3), оценивающих в дискрими-нантном анализе интегральную картину дифференциации, показано на рис. 6, 7. В случае 6 выборок анализ включал 11 признаков, 10 индексов и

Таблица 2

Экспериментальная оценка доли генотипов Mytilus trossulus и их гибридов в исследованных выборках по комплексу аллозимных локусов

Поселения мидий M. trossulus Гибриды

GBL Me-5 GBL Me-5

1. Зал. Восток, МБС «Восток» 0,810 ± 0,050 1 0,190 ± 0,050 0

2. Зал. Восток, бухта Ливадия 0,990 ± 0,010 1 0,010 ± 0,010 0

3. Зал. Посьета, пос. Зарубино 0,030 ± 0,030 0,758 ± 0,030 0,970 ± 0,030 0,242 ± 0,002

4. Бухта Киевка 0,410 ± 0,070 0,854 ± 0,051 0,590 ± 0,070 0,146 ± 0,051

5. Бухта Лазурная 0 0,910 ± 0,032 0 0,090 ± 0,032

Средняя ± ошибка 0,448 ± 0,020 0,914 ± 0,033 0,552 ± 0,020 0,096 ± 0,033

Примечание. При значении доли 0 или 1 стандартные ошибки не рассчитываются.

Tаблица 3

Характеристики вариационных рядов основных морфометрических признаков особей мидий

Признак Коэффициент асимметрии (As) SE Коэффициент эксцесса (Ex) SE

LENGTH 0,28 0,28 0,08 0,27

HEIGHT 0,69 0,69 0,85 0,27

LIG_LN 0,21 0,21 -0,13 0,27

PERL_L 0,35 0,35 0,08 0,27

LIG_T 1,02 1,02 2,1 0,27

DENT_PL 0,57 0,57 0,02 0,27

ADR_FR 0,93 0,93 1,74 0,27

BAC_RT 0,49 0,49 0,33 0,27

SINUS 0,75 0,75 1,42 0,27

ADR_BAC 0,62 0,62 0,2 0,27

RETR_MN 3,13 3,13 25,15 0,27

IND1 0,56 0,56 2,53 0,27

IND2 0,34 0,34 -0,26 0,27

IND3 0,19 0,19 -0,21 0,27

IND4 -0,2 -0,20 2,31 0,27

IND5 0,36 0,36 0,13 0,27

IND6 0,18 0,18 0,01 0,27

IND7 0,46 0,46 1,24 0,27

IND8 -1,19 -1,19 3,11 0,27

IND9 0,28 0,28 3,29 0,27

IND10 0,73 0,73 2,37 0,27

значения кодов генотипов по 4 локусам: PGM-1*, ODH*, MPI*, LAP*, а особи соответственно группировались по принадлежности к 6 различным выборкам.

По значениям комплекса признаков для 5 выборок, 10 индексов и 6 локусов выявлены кластеры особей, которые пересекаются (на рис. 6, 7 показаны ломаными линиями), что свидетельствует о наличии значительного сходства проанализированных особей в выборках из поселений мидий. Наиболее обособлены выборки из зал. Посьета (в районе пос. Зарубино), где ранее было обнаружено большое число особей вида интродуцента [5], и бухты Преображение (рис. 6).

В результате анализа векторов генотипов по комплексу из 6 аллозимных локусов для 5 поселений была выявлена высокая общность по происхождению комбинированных

КП 1

Рис. 6. График распределения значений координат для двух канонических переменных (КП 1 и КП 3) для изученных поселений мидий западной части Японского моря. Усл. обозначения: 1-6 - номера выборок из поселений мидий, указанных на рис. 1

Рис. 7. Распределение значений канонических переменных (КП 1, КП 2) для модифицированных значений генотипов 6 аллозимных локусов и 10 морфологических индексов исследованных мидий из 5 выборок. В таблице показана точность дискриминации выборок по комплексу представленных признаков

генотипов и слабая генетическая дифференциация проанализированных выборок из поселений мидий в зал. Петра Великого.

Обсуждение результатов

Оценки вероятностей происхождения или гибридных индексов, полученные с помощью программы Structure, как и любые другие результаты моделирования,

базируются на ряде допущений. Поэтому их интерпретация требует известной осторожности. Полученные доли генотипов представлены в табл. 2 по отдельности для двух групп -M. trossulus и гибридов M. trossulus х M. galloprovincialis. Даже на основе визуального анализа генотипической идентификации исследованных мидий можно заметить слабую воспроизводимость данных по разным группам маркеров. Средние частоты встречаемости, определенные по Me-5, показывают, что в выборках преобладают особи аборигенного вида M. trossulus (91 ± 3 %), тогда как по оценке на основе GBL доля этого вида равна 45 ± 2 %. Результаты оценки генотипов по происхождению для 6 условно диагностических GBL показывают необходимость использования большего числа маркеров. Данные по 8 локусам свидетельствуют о хорошем совпадении оценок разных групп маркеров [5].

Установлена слабая генетико-морфометрическая дифференциация исследованных поселений мидий в зал. Петра Великого. Например, усредненная по 8 локусам и взвешенная по проанализированному набору из 6 выборок стандартизированная, нормализованная дисперсия частот аллелей F' [28] в 2011 г. составляла 0,0473 ± 0,0559 [5], а в 2012-2013 гг. среднее значение F' для 6 локусов из 5 выборок было равно 0,0379 ± 0,0330 (среднее рассчитано по F' отдельных локусов; из стандартных ошибок следует практически нулевая суммарная генетическая дифференциация). Однако пусть небольшая, но статистически значимая генетическая дифференциация поселений мидий все же наблюдается. В тесте хи-квадрат значимой является гетерогенность частот аллелей трех из шести ло-кусов (рис. 3). Эта дифференциация имеет сложную природу и неодинакова для разных локусов. По-видимому, она слагается из генетического дрейфа, присутствующего в любых природных популяциях, и естественного отбора, частично нивелируемых миграцией между поселениями. При этом отдельные локусы демонстрируют высокую гетерогенность частот генотипов и аллелей. Данные об относительно низкой генетической дифференциации поселений мидий в зал. Петра Великого были известны и ранее [3, 4]. Это связано с большим потоком генов между поселениями мидий, представляющими собой субпопуляции подразделенной популяции за счет планктонирущих в течение 20-30 дней личинок и их разноса течениями на большие расстояния [3, 4]. Данные по разным типам маркеров показывают, что при гибридизации у мидий генетические компоненты могут вести себя несогласованно. Это известно и для Балтийского моря, где гибридизация в течение нескольких лет привела к интрогрессии генов североморской M. edulis в геном балтийской M. trossulus. Следует отметить, что интрогрессия выявлена преимущественно по митохондриальным генам, а по ядерным маркерам выражена в меньшей степени [16, 31]. Обнаружение же согласованной изменчивости по разным типам маркеров у гибридизую-щих мидий из Японского моря, описанной ранее [5], - одно из свидетельств относительно низкого текущего уровня инвазии M. galloprovincialis и гибридизации M. trossulus и M. galloprovincialis в этом регионе.

Если исключить выборку мидий из поселения близ пос. Преображение, представленную на рис. 6, то дифференциация по комплексным переменным, включающим значения КП по 10 индексам и 6 локусам, принципиально не меняется, хотя точность дискриминации немного снижается (рис. 7). Для 6 выборок и большего числа анализируемых морфологических признаков и индексов она составила 87 %. Как видно из рис. 7, мидии в 5 выборках слабо различаются между собой по комплексу GBL и 10 морфометрическим индексам. Добавление признаков вносит вклад в итоговую дифференциацию, по-видимому, за счет экологических факторов, определяющих рост моллюсков. Максимальная точность дискриминации выборок не превышает 87 %, а средняя равна 77,6 %. Эти данные согласуются с представленным выше популяционно-генетическим анализом и поддерживаются результатами моделирования генотипической дифференциации в предположении существующего смешения (admixture) или потока генов. Размер этой межвидовой миграции генов (интрогрессии) предстоит оценить в будущем.

Полученные результаты в целом соответствуют данным предыдущих исследований [8, 11, 25] и оценкам на основе ДНК-маркера Ме-5. Средняя частота встречаемости генотипов

M. trossulus при оценке по Ме-5 составила 91,4 ± 3,3 %. Доля этих генотипов в большинстве выборок колебалась в пределах 76-100 %. В выборке из зал. Посьета близ пос. За-рубино доля вида снижается до 75,8 %. В этой же выборке обнаружена максимальная доля гибридов (24,2 %). В выборках из бухт Киевка и Лазурная отмечено достаточно много гибридных генотипов - 14,6 и 9,0 % соответственно (табл. 2, рис. 4).

Данные анализа подтверждают ранее высказанное предположение о мозаичном характере распределения исследуемых видов мидий [5]. Скорее всего, эта мозаичность обусловлена векторами расселения M. galloprovincialis. Возможна инвазия M. galloprovincialis из Южной Кореи в пос. Зарубино через паром и суда, которые, как известно, могут обрастать мидиями. Довольно неожиданным является обнаружение гибридных особей в бухтах Киевка и Лазурная. Источник инвазии M. galloprovincialis в эти районы не вполне ясен, хотя допускается влияние иммиграции через обрастание судов, заходящих на отстой после посещения ими портов Японии и Республики Корея непосредственно в бухту Киевка или порт г. Большой Камень (на противоположной от порта стороне Уссурийского залива находится бухта Лазурная). Распространение M. galloprovincialis во многих случаях ограничено температурным фактором (см. [22]). По данным предыдущих исследований [6, 11, 24], южная часть зал. Петра Великого предположительно является северной границей распространения этого вида в западной части Японского моря. Тем не менее результаты как данной, так и предыдущей работы [5] показывают, что граница ареала M. galloprovincialis пролегает севернее (бухта Киевка) и что появился новый очаг инвазии (бухта Лазурная). Ясно, что интенсивность инвазии год от года различается, изменяются также и доли гибридов в общей структуре комплекса Му^1ш' ех. gr. edulis. Так, доля гибридов в зал. Восток изменяется следующим образом: в 1999 г. - 8,95 ± 1,68 % [11], в 2003 г. - 1,60 ± 0,90 % [24], в 2011 г. - 0 % [5], в 2012-2013 гг. (данные, полученные в настоящей работе) - 0 %.

Выводы

Из полученных результатов следует, что в выборках преобладает местный вид M. trossulus, однако инвазия M. galloprovincialis сохраняется. Преобладающая интрогрес-сия генов местного вида в генофонд вселенца в водах зал. Петра Великого [25] позволяет надеяться на минимальный генетический ущерб местным популяциям M. trossulus. Тем не менее ситуация может измениться, поэтому генетический мониторинг зоны гибридизации и оценивание в динамике уровня интрогрессии генов необходимы и в будущем.

ЛИТЕРАТУРА

1. Андреев В.Л. Классификационные построения в экологии и систематике. М.: Наука, 1980. 142 с.

2. Афифи А., Эйзен С. Статистический анализ. Подход с использованием ЭВМ. М.: Мир, 1982. 488 с.

3. Картавцев Ю.Ф. Аллозимный полиморфизм у двух видов мидий // Генетика и размножение морских животных. Владивосток: ДВНЦ АН СССР, 1981. С. 36-38.

4. Картавцев Ю.Ф., Заславская Н.И. Генетическая структура, факторы интеграции и дифференциации популяций обыкновенной мидии (Mytilus edulis) // Генетика. 1982. T. 18, № 10. C. 1653-1666.

5. Картавцев Ю.Ф., Католикова М.В., Шарина С.Н., Чичвархина О.В., Масалькова Н.А. Популяционно-ге-нетическое исследование зоны гибридизации Mytilus trossulus и инвазивного вида M. galloprovincialis (Bivalvia, Mytilidae) в заливе Петра Великого Японского моря // Биология моря. 2014. № 3. С. 220-228.

6. Кепель А.А., Озолинш А.В. Морфометрический анализ мидий рода Mytilus (Mollusca, Bivalvia, Mytilidae) морей СССР // Зоол. журн. 1992. Т. 71, № 9. С. 33-40.

7. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. школа, 1980. 293 с.

8. МакДональд Дж.Х., Коуэн Р.К., Балакирев Е.С., Манченко Г.П., Пудовкин А.И., Сергиевский С.О., Кру-товский К.В. Видовая принадлежность «съедобной мидии», обитающей в приазиатской части Тихого океана // Биология моря. 1990. № 1. С. 13-22.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: пер. с англ. М.: Мир, 1984. 480 с.

10. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск: Высш. школа, 1973. 326 с.

11. Скурихина Л.А., Картавцев Ю.Ф., Панькова М.В., Чичвархин А.Ю. Исследование двустворчатых моллюсков Mytilus trossulus и Mytilus galloprovincialis (Bivalvia, Mytilidae) с помощью ПЦР-маркеров в зоне их гибридизации в заливе Петра Великого Японского моря // Генетика. 2001. Т. 37, вып. 11. С. 1556-1559.

12. Стрелков П.П., Католикова М.В., Лайус Д.Л., Андреев В.М., Федюк М.Л. Дискриминация беломорских мидий Mytilus edulis L. и M. trossulus Gould // Вестн. СПбГУ 2008. Сер. 3. Вып. 4. C. 77-82.

13. Чичвархин А.Ю., Картавцев Ю.Ф., Кафанов А.И. Генетические связи между некоторыми видами Mytilidae (Mollusca, Bivalvia) северной части Тихого океана // Генетика. 2000. Т. 35, вып. 7. С. 1206-1220.

14. Anderson A.S., Bilodeau A.L., Gilg M.R., Hilbish T.J. Routes of introduction of the Mediterranean mussel (Mytilus galloprovincialis) to Puget Sound and Hood Canal // J. Shellfish Res. 2002. Vol. 21. P. 75-79.

15. Borsa P., Daguin C., Caetano S.R., Bonhomme F. Nuclear-DNA evidence that northeastern Atlantic Mytilus trossulus mussels carry M. edulis genes // J. Molluscan Stud. 1999. Vol. 65. P. 504-507.

16. Brannock P.M., Wethey D.S., Hilbish T.J. Extensive hybridization with minimal introgression in Mytilus galloprovincialis andM. trossulus in Hokkaido, Japan // Mar. Ecol. Prog. Ser. 2009. Vol. 383. P. 161-171.

17. Falush D., Stephens M., Pritchard J.K. Inference of population structure: Extensions to linked loci and correlated allele frequencies // Genetics. 2003. Vol. 164. P. 1567-1587.

18. Gosling E.M. Genetics of Mytilus // The mussel Mytilus: ecology, physiology, genetics and culture. Amsterdam: Elsevier Sci. Publ. B.V., 1992. Chapt 7. P. 309-382.

19. Harris H., Hopkinson D.A. Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics. Amsterdam: North-Holland Publ. Co., 1976. 680 p.

20. Heath D.A., Rawson P.D., Hilbish T.J. PCR-based nuclear markers identify alien blue mussel (Mytilus spp.) genotypes on the west coast of Canada // Can. J. Fish. Aquat. Sci. 1995. Vol. 52. P. 2621-2627.

21. Hilbish T.J., Brannock P.M., Jones K., Smith A.B., Bullock B.N., Wethey D.S. Historical changes in the distributions of invasive and endemic marine invertebrates are contrary to global warming predictions: the effects of decadal climate oscillations // J. Biogeogr. 2010. Vol. 37. P. 423-431.

22. Inoue K., Odo S., Nakao S., Takeyama S., Yamaha E., Yamazaki F., Harayama S. A possible hybrid zone in the Mytilus edulis complex in Japan revealed by PCR markers // Mar. Biol. 1997. Vol. 128, N 1. P. 91-95.

23. Ivanova M.B., Lutaenko K.B. On the distribution of Mytilus galloprovincialis Lamark, 1819 (Bivalvia, Mytilidae) in Russian Far Eastern seas // Bull. Inst. Malacology. 1998. Vol. 3 (5). P. 67-71.

24. Kartavtsev Yu.Ph., Chichvarkhin A.Y., Gubanova N.V., Kijima A., Hanzawa N., Park I.-S. Allozyme and morphometric research on two common mussel species of Mytilus genus (Mollusca, Mytilidae) in Korea, Japan and Russian waters // Korean J. Genetics. 2005. Vol. 27 (4). P. 289-306.

25. Kartavtsev Yu.Ph., Soloviev A.A. SPECSTAT: Computer software for the statistical data analysis in the field of allozyme genetics // Genetica. 1993. Vol. 88. P. 79-82.

26. Manchenko G.P. Handbook of Detection of Enzymes on Electrophoretic Gels. Boca Raton: CRC Press, 2002. 592 p.

27. Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals // Genetics. 1978. Vol. 89. P. 583-590.

28. Pritchard J.K., Stephens M., Donnelly P. Inference of Population Structure Using Multilocus Genotype Data // Genetics. 2000. Vol. 155. P. 945-959.

29. Rawson P.D., Argawal V., Hilbish T.J. Hybridization between the blue mussels Mytilus galloprovincialis and M. trossulus along the pacific coast of North America: Evidence for limited introgression // Mar. Biol. 1999. Vol. 134 (1). P. 201-211.

30. Riginos C., Cunningham C.W. Local adaptation and species segregation in two mussels (Mytilus edulis and Mytilus trossulus) hybrid zones // Mol. Ecol. 2005. Vol. 14 (2). P. 381-400.

31. Roberts D.G., Gray C.A., West R.J., Ayre D.J. Evolutionary impacts of hybridization and interspecific gene flow on an obligately estuarine fish // J. Evolutionary biol. 2009. Vol. 22 (1). P. 27-35.

32. Roberts D.G., Gray C.A., West R.J., Ayre D.J. Marine genetic swamping: hybrids replace an obligately estuarine fish // Molecular ecol. 2010. Vol. 19 (3). P. 508-520.

33. Smietanka B., Burzynski A., Hummel H., Wenne R. Glacial history of the European marine mussels Mytilus, inferred from distribution of mitochondrial DNA lineages // Heredity (Edinb). 2014. Vol. 113, N 3. P. 250-258.

34. Smietanka B., Zbawicka M., Sanko T., Wenne R., Burzynski A. Molecular population genetics of male and female mitochondrial genomes in subarctic Mytilus trossulus // Mar. Biol. 2013. Vol. 160, N 7. P. 1709-1721.

35. Sokal R., Sneath P. Principles of Numerical Taxonomy // J. Basic Microbiol. 1966. Vol. 6, N 2. P. 139-140.