Способ криоконсервации биологических объектов при одновременной гомогенной нуклеации кристаллов льда и клатрата ксенона
METHOD FOR CRYOPRESERVATION OF BIOLOGICAL OBJECTS WITH SIMULTANEOUS HOMOGENEOUS NUCLEATION OF CRYSTALS OF ICE AND XENON CLATHRATE

Область техники
Изобретение предназначено для реализации процесса криоконсервации биообъектов, таких как клетки, ткани, органы.
Уровень техники
Для криоконсервации биообъектов используют методы витрификации (стеклования), сущность которых сводится к насыщению растворов специальными веществами, криопротекторами, которые увеличивают вязкость среды, - это и способствует реализации процесса витрификации. Также используют методы программного замораживания, суть которых сводится к осуществлению охлаждения с контролируемым ростом кристаллов льда, при котором реализуется минимальный повреждающий эффект для биообъекта. В последнее время в процедуре криоконсервации рассматривается возможность применения инертных газов.
Известен патент РФ №RU 2433173, который относится к криоконсервации клеточных суспензий человека. Способ криоконсервации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) включает подготовку смеси культуры в культуральной среде, смешивание культуры клеток в культуральной среде с криопротектором, ступенчатое контролируемое охлаждение и замораживание смеси культуральной среды с криопротектором до температуры хранения и последующее хранение замороженной смеси при низких температурах. При этом в качестве криопротектора для насыщения смеси используют газ ксенон, вводимый до насыщения в подготовленную смесь клеточной культуры ММСК в среде Игла в модификации Дальбекко (DMEM), находящуюся в открытых криопробирках путем продувания культуральной среды ксеноном при 0°С с дальнейшим охлаждением и образованием первичного монолита культуральной среды с криопротектором, направляемым затем на замораживание до температуры хранения. Изобретение обеспечивает сохранность клеток при криоконсервации.
В описании патента РФ №RU 2268590 раскрыт способ криоконсервации органов и тканей in situ. Способ заключается в том, что биологический объект (сердце, почка и др.) предварительно охлаждают в воде до 0°С с одновременным насыщением смесью ксенона, криптона, аргона в соотношении 2,5:47,5:50 об.%. На следующем этапе из объекта вытесняют воду указанной смесью газов, создают давление 1,5 атм и затем понижают температуру до - 43°С. Далее снижают давление газовой среды до нормального и продолжают охлаждение до - 196°С. Утверждается, что способ позволил добиться криоконсервации сердца животного в составе всего организма (in situ), и удалось добиться восстановления адекватной сердечной деятельности.
В патенте США №US 8124329 описан способ применения клатратобразующей газовой смеси для сохранения биологической ткани для последующего ее восстановления в жизнеспособном состоянии. Способ консервации биологической ткани включает стадию обработки биологической ткани в закрытой среде клатратобразующей газовой смесью, состоящей из клатратобразующего газа и кислорода, при этом клатратобразующий газ выбирают из группы, включающей гексафторид серы и ксенон, при этом концентрация клатратобразующего газа в клатратобразующей газовой смеси находится в диапазоне от 75 до 95 мольных процентов. В процессе обработки клатратобразующая газовая смесь вытесняет газы, окружающие биологическую ткань. На следующем этапе при температуре от 1 до 5°С создают давление на биологическую ткань и окружающую ее клатратобразующую газовую смесь величиной до 6,9 атм для образования клатратов внутри биологической ткани при постоянном визуальном мониторинге состояния биоматериала. Последующее охлаждение биологической ткани и окружающей ее клатратобразующей газовой смеси проводят до температуры ниже - 20°С.
Задачей изобретения является разработка способа криоконсервации, обладающего минимальным повреждающим действием на клетки, ткани и органы.
Задача решается тем, что для снижения повреждающего воздействия на биообъект при криоконсервации используют добавку в раствор для криоконсервирования биообъекта мелкодисперсных кристаллов клатрата ксенона с последующим резким охлаждением до температур от -115 до -130°С, что снижает повреждающее действие кристаллов клатрата и льда, с одной стороны, и позволяет понизить концентрацию криопротекторов и, следовательно, их токсичность, с другой стороны.
Сущность изобретения
Одним из аспектов изобретения является способ криоконсервации биообъекта путем сочетания охлаждения и давления клатратообразующим инертным газом в закрытом объеме, содержит размещение биообъекта в камере, где на первом этапе проводят добавку измельченного предварительно подготовленного клатрата ксенона и, по меньшей мере, один криопротектор. На втором этапе повышают давление ксенона в объеме камеры до 0,5-3 атм и затем охлаждают биообъект до температур от -115°С до -130°С. После хранения восстанавливают работоспособность биообъекта быстрым нагревом до температур от +5 до +20°С, с последующей декомпрессией при сбросе давления до атмосферного за время 2-20 минут, проводят отмывку биообъекта от криопротектора путем многократного замещения среды на аналогичную среду без криопротектора и продолжают медленный прогрев биообъекта со скоростью 0,5-2,0°С/мин до физиологической температуры биообъекта, после чего биообъект извлекают из камеры и помещают в свежую среду без криопротектора.
Следующий аспект способа состоит в том, что клатрат ксенона изготавливают под давлением ксенона 3-6 атм при температуре от 0°С до +4°С в герметичной емкости с раствором содержащим, по меньшей мере, один криопротектор, при этом состав раствора идентичен раствору, в котором находится биообъект во время криоконсервации.
Другой аспект способа состоит в том, что измельченный клатрат ксенона, входящий в клатратообразующий раствор составляет в объеме от 5 до 50%, при этом раствор с клатратом ксенона добавляют в камеру с биообъектом при температуре от -2 до+5°С.
Перечень фигур
На фиг. 1 представлен микроскопический снимок исходной суспензии фибробластов.
На фиг. 2 представлен микроскопический снимок клеток в окружении кристаллов клатрата при температуре +6°С.
На фиг. 3 представлен микроскопический снимок клеток после полного разложения клатрата. Видны пузырьки выделившегося ксенона.
На фиг. 4 представлен микроскопический снимок клеток, перенесших процедуру криоконсервации, после двухчасового культивирования в среде DMEM при+36°С.
Описание изобретения
В процессе разработки способов криоконсервации биообъектов, таких как клетки, ткани, органы сталкиваются с проблемами выбора режимов криоконсервации, с проблемой формирования кристаллов льда, которые разрушают объекты при заморозке и необходимостью снижения токсичности криопротекторов. Эти факторы влияют на жизнеспособность биообъектов и получение положительных результатов криоконсервации.
При насыщении объекта, подлежащего криоконсервации, клатратообразующим газом, таким как ксенон, и резком охлаждении возникает гомогенная нуклеация как кристаллов льда, так и клатрата. При этом оба типа кристаллов мешают друг другу вырастать до критических размеров с точки зрения их способности повреждать биообъект. Однако равновесная концентрация газа, до которой можно насытить биообъект путем продувки, слишком мала, чтобы обеспечить достаточное количество образующихся при охлаждении кристаллов клатрата. Также формированию гомогенной нуклеации мешает неравномерная концентрация клатратообразующего газа в разных частях объекта криоконсервации, поскольку насыщение клатратообразующим газом под давлением перед резким охлаждением не дает гарантий того, что насыщение клатратообразующим газом происходит равномерно по всему объему.
Было обнаружено, что предварительная добавка к исходному раствору,в котором находится биообъект, предварительно подготовленного измельченного клатрата ксенона позволяет сильно пересытить раствор газом относительно равновесной концентрации, выровнять концентрацию ксенона по объему в биообъекте перед основным клатратообразованием, что позволяет улучшить результат формирования гомогенной нуклеации и улучшить результаты криоконсервации. Под гомогенной нуклеацией подразумевается флуктационное возникновение стабильных зародышей кристаллической фазы в исходной жидкой фазе в отсутствие примесей.
Одновременное образование мелкодисперсных кристаллов двух типов: клатрата ксенона и льда, приводит к тому, что, образуясь одновременно в больших количествах, кристаллы препятствуют друг другу вырастать до больших размеров, при которых они могут повреждать биообъект.
Предлагаемый способ сохранения биообъекта для последующего восстановления в жизнеспособном состоянии, включает следующие стадии: размещение биообъекта в исходном растворе в камере, способной выдерживать давление до 20 атм, при температуре от -2 до +5°С, добавка к исходному раствору, в котором размещен биообъект измельченного клатрата ксенона, приготовленного на основе раствора, идентичного исходному раствору, подача ксенона в камеру под давлением 0,5-3 атм, последующее резкое охлаждение до температур от-115 до -130°С, например путем погружения камеры с биообъектом в охлажденный до температур от -130 до -140°С этанол, и выдерживание там от 10 до 30 минут, хранение при температуре от -115 до -130°С, восстановление работоспособности объекта нагревом до температур от+5 до+20°С, например путем погружения камеры с биообъектом в этанол при температуре от+15°С до +30°С, сброс давления путем открытия крана в камере на время от 2 до 20 минут, отмывка биообъекта от криопротектора путем многократного замещения среды на аналогичную среду без криопротектора, в которой находится биообъект, на аналогичную среду без криопротектора, медленный нагрев со скоростью 0,5 - 2,0°С/мин до физиологических температур биообъекта, входящего в группу клетки, ткани, органы теплокровных животных.
Способ криоконсервации биообъектов, с учетом усовершенствованной гомогенной нуклеации кристаллов льда и кристаллов клатрата работает следующим образом.
Биообъект (клетки, ткани, органы) помещают в камеру, позволяющую регулировать температуру и давление газов внутри себя. Для достижения образования мелкодисперсных кристаллов, которые слабо вредят и мало влияют на жизнеспособность биообъекта, на первом этапе криоконсервации проводят добавку в раствор с биообъектом при температуре от -2 до +5°С измельченного клатрата ксенона при объемной доле 5-50% от объема биообъекта вместе с исходным раствором, образованного независимо. Исходный раствор может содержать различные культуральные и питательные среды, возможно, с добавками различных криопротекторов. Клатрат предварительно изготавливают под давлением ксенона при 3-6 атм и температуре от 0°С до +4°С в герметичной емкости с раствором, состав которого идентичен исходному раствору для криопротекции, в котором содержится биообъект. Таким образом, добавка клатрата в раствор с биообъектом не вносит в его состав никаких концентрационных изменений, за исключением добавки ксенона.
Для проведения криоконсервации, помимо образования клатратов, при повышенном давлении газа допускается добавка классических криопротекторов, например, диметилсульфоксида (ДМСО), этиленгликоля, пропиленгликоля, глицерина, формамида в концентрациях от 0 до 5 об%. После добавки клатрата в камеру с биообъектом она герметично закрывается.
На втором этапе проводят подачу в камеру давления ксенона в диапазоне 0,5-3 атм. При этом камера должна иметь свободный для газа объем, превышающий объем биообъекта с раствором от 20 до 500 раз. Это необходимо для того, чтобы в процессе охлаждения при клатратообразовании не возникало сильного дефицита газа и, следовательно, дефицита кристаллов клатрата.
Далее проводят резкое охлаждение камеры с биообъектом до температур от -115°С до -130°С, например путем помещения камеры с биообъектом в охлажденный до температуры от -130 до -140°С этанол.
При таком резком охлаждении достигается гомогенная нуклеация как кристаллов льда, так и клатрата. Два типа кристаллов мешают друг другу вырастать до больших размеров, при этом заполняя весь объем, вместе с биообъектом.
Биообъект хранят в камере в таком состоянии необходимое время при тех же температурах. При таких температурах биообъект находится в состоянии твердой фазы и все биохимические процессы практически полностью останавливаются.
При необходимости извлечь биообъект, производят быстрый нагрев до температур от +5 до +20°С, например путем помещения камеры в этанол при температуре от +15°С до +25°С. Затем проводят равномерную декомпрессию в течение от 2 до 20 минут путем открытия крана в камере, затем проводят отмывку биообъекта от криопротектора. После этого реализуют медленный нагрев со скоростью от 0,5 до 2,0°С/мин до физиологических температур биообъекта, после чего биообъект извлекают из камеры.
Примеры.
Пример 1. Подготовка мелкодисперсного клатрата ксенона.
Мелкодисперсный клатрат ксенона подготавливают следующим образом. Раствор, в котором планируется криоконсервация биообъекта, помещают в герметичную камеру при температуре от 0 до +4°С. Подают давление ксенона 3-10 атм. Объем свободного пространства в камере для газа должен быть не менее 200 объемов раствора. Хранят раствор при температуре 0 до +4°С не менее 3 часов. За такое время весь раствор превращается в клатрат. Затем клатрат извлекают из камеры в охлажденную посуду, например, ступку, температура которой от -10 до 0°С, и измельчают холодным предметом, например, пестиком до максимально достижимого мелкодисперсного состава. При этом необходимо, чтобы во время измельчения кристаллы не начали заметно разлагаться на воду и газ (этот процесс можно обнаружить по выделяющимся пузырькам газа). Эту суспензию затем добавляют в раствор с биообъектом в объеме от 5 до 50% биообъекта с исходным раствором.
Пример 2. Криоконсервация фибробластов.
Камеру со свободным объемом 100 мл охлаждают до +2°С. Затем в нее помещают суспензию клеток (фибробласты линии NCTC L929) в количестве 700000-900000 штук в объеме среды DMEM 180-220 мкл (фиг. 1) и добавляют криопротектор ДМСО в концентрации 4-5 об%. Затем в камеру добавляют измельченный клатрат ксенона в объеме 55-65 мкл и камеру закрывают. После этого в камере заменяют воздух на ксенон посредством подачи через входной кран и выпуска через выходной кран 300 мл ксенона. Затем выходной кран камеры закрывают и создают избыточное давление ксенона в камере 0,5 атм. После этого камера с клетками подвергается быстрому охлаждению до температуры -116°С в течение 16 минут, при этом средняя скорость охлаждения в первые 30 секунд составляет 82°С/мин. Замораживание осуществляют полным погружением камеры с клетками в термос объемом 3 л, в котором находился предварительно охлажденный до температуры -130°С этиловый спирт. Через 19 минут после начала охлаждения камеру с клетками оставляют на хранение 1 сутки при температуре -130°С. После этого камеру с клетками погружают в другой термос со спиртом при температуре +20°С для размораживания. Размораживание клеток в камере осуществляют в течение 7 минут до температуры +6°С, после чего с помощью микроскопа фиксируют данные эксперимента. В камере наблюдаются клетки, окруженные кристаллами (фиг. 2). После этого плавно открывается выходной кран и за время 7 мин производится сброс давления (декомпрессия) до атмосферного давления. В этих условиях, в камере с клетками, наблюдается разложение клатрата, что сопровождается выделением пузырьков газа (фиг. 3). После сброса давления до атмосферного барокамера открывается и производится замена среды культивирования на аналогичную свежую среду без криопротектора путем четырехкратного откачивания микропипеткой среды из камеры и заполнения свежей средой по 400 мл каждый раз. После этого производится нагрев камеры с клетками до температуры +36°С за время 15 минут и далее проводят культивирование клеток в течение 2 часов. В результате относительно исходного количества клеток наблюдается 50-55% распластанных и 30-35% визуально неповрежденных клеток в виде суспензии (фиг. 4). Фибробласты в среде DMEM при использовании описанного способа сохраняют жизнеспособное состояние на уровне от 50% до 90%.
Промышленная применимость
Способ криоконсервации с применением добавки мелкодисперсного клатрата ксенона возможно применять для разных типов биообъектов, включая ткани и органы млекопитающих. Снижение концентрации криопротекторов позволяет повысить уровень жизнеспособности при хранении и восстановлении биообъекта.
Источники информации
1. О.Г. Макеев и др. СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК, патент РФ №RU 2433173 (10.11. 2011).
2. П.В. Щербаков и др. СПОСОБ КРИОКОНСЕРВАЦИИ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ IN SITU, патент РФ №RU 2268590 (27.01. 2006).
3. S.V. Sheleg et al. Hypothermic preservation of biological tissues and cells, патент США №US 8124329 (28 02 2018).