ШТАММ БАКТЕРИЙ DESULFOVIBRIO SP. VK-9 ДЛЯ ОЧИСТКИ КИСЛЫХ СТОЧНЫХ ВОД ОТ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
STRAIN OF BACTERIA DESULFOVIBRIO SPECIES VK-9 FOR PURIFICATION OF ACIDIC WASTEWATER FROM HEAVY METAL IONS

Штамм бактерий Desulfovibrio sp. VK-9 выделен из слоистых матов с деревянной конструкции, затопленной водой на выходе из штольни, Акатуйское месторождение полиметаллических руд (Забайкальский край). Штамм характеризуется высокой устойчивостью к повышенным концентрациям ионов меди (до 125 мг/л), ионов никеля (до 250 мг/л), ионов кобальта (до 350 мг/л) и ионов кадмия (до 60 мг/л). Штамм способен к росту при широких значениях рН от 2,7 до 7,5.
Изобретение относится к промышленной микробиологии и касается получения нового штамма бактерий, которые могут быть использованы в биотехнологии очистки кислых промышленных сточных вод машиностроительных, приборостроительных, электротехнических, горно-обогатительных предприятий, гальванических производств, а также для очистки кислых шахтных вод от повышенных концентраций ионов меди и других тяжелых металлов.
3
3
3
Известен способ биосорбционной очистки воды от ионов тяжелых металлов с помощью дрожжей Saccharomyces cerevisiae (RU 2509734). Биомасса пивоваренных дрожжей способна утилизировать очистные воды, содержащие цинк (20 мг/дм), никель (100 мг/дм), медь  (40 мг/дм). Недостатком предложенного способа является неспособность его осуществления в кислых сточных водах, так как используемая дрожжевая культура способна расти при pH раствора 5,5-8,0.
Известно об использовании сульфатредуцирующих бактерий для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Образуемый сульфатредуцирующими бактериями сероводород в процессе биохимической очистки связывает ионы тяжелых металлов в нерастворимые сульфиды.
Известен штамм бактерий Desulfovibrio sp. СВБ-2 (RU 2269571), используемый для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов. Предлагаемый штамм выделен из промышленного стока гальванических производств, содержащих ионы тяжелых металлов. Однако указанная в патенте суммарная концентрация тяжелых металлов в используемых очистных водах составляет 197,9 мг/л, а меди - 8,9 мг/л. В сточных водах металлургических предприятий концентрация ионов меди может достигать 300 мг/л.  Штамм СВБ-2 растет при рН 6,5-8,5, оптимум 7,2.
Недостатком штамма СВБ-2 является недостаточно высокая устойчивость к ионам тяжелых металлов, в частности ионам меди, что существенно ограничивает его использование в биотехнологиях. Ткже невозможно его применение в кислых сточных водах, имеющих рН < 5,0.
2+
2+
3+
2+
3+
Известен штамм Desulfovibrio halophilus RETECH-SRB-I (CN 101434916), депонированный в китайском центре коллекции типовых культур (CCTCC) (университет Ухани) с номером депозита M207060, используемый для очистки кислых шахтных сточных вод от тяжелых металлов.  Штамм способен очищать кислые шахтные воды со значением рН от 1,5 до 6,0 от ионов металлов в различных концентрациях: Cu - 0,07-0,6 г/л; Zn - 0,5-1,0 г/л; As- 1,2-2,8 г/л; Fe- 1,0-2,0 г/л; Fe- 0,3-3 г/л. К недостаткам предложенного штамма можно отнести его неспособность к росту на таких высокотоксичных металлах,как кадмий и никель, что ограничивает применение штамма в сточных водах гальванических производств и сточных водах других производств, содержащих один из самых токсичных металлов - кадмий.  Кроме того, штамм имеет менее широкий спектр значений рН,при которых возможно его применение в биотехнологиях очистки сточных вод.
Наиболее близким по сущности и достигаемому результату к заявленному изобретению является штамм бактерии Desulfovibrio sp. для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов (RU 2542402). Штамм бактерий Desulfovibrio sp. A 4/1 выделен из илового отложения отстойника воды из системы охлаждения плавильных печей Челябинского металлургического комбината. Штамм характеризуется высокой устойчивостью к повышенным концентрациям ионов меди (до 600 мг/л) и других двухвалентных катионов металлов. Недостатком штамма Desulfovibrio sp. является его неспособность к росту при кислых значениях рН, оптимальный рН среды для штамма  A 4/1 равен 7,2.
Задача изобретения - получение устойчивого к металлам, высокоактивного штамма сульфатредуцирующих бактерий, используемого для очистки кислых сточных вод от ионов тяжелых металлов.
Технический результат - применение штамма бактерий Desulfovibrio sp. VK-9 для очистки кислых сточных вод, включая шахтные,  от ионов тяжелых металлов.
Штамм Desulfovibrio sp. VK-9 депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов (ВКМ) Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН (ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ В-3000D.
Предлагаемый штамм Desulfovibrio sp. VK-9 не известен в науке и технике, поэтому свойства, которые он проявляет, являются новыми, а следовательно, заявленное решение обладает изобретательским уровнем.
Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма VK-9 показал, что предлагаемый штамм является новым штаммом и принадлежит к роду Desulfovibrio.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки патентуемого штамма определяют при его культивировании на стандартной пресноводной среде Видделя (Widdel, Bak, 1992). Температура культивирования штамма составляет +28 ºС. Выращивание проводят в течение3-4 суток без ионов металлов, 7-8 суток с добавлением ионов металлов в концентрации 100 мг/л и более.
Родовое и видовое название штамма - штамм бактерий Desulfovibrio sp. VK-9.
Происхождение - выделен из слоистых матов с деревянной конструкции, затопленной водой на выходе из штольни, Акатуйское месторождение полиметаллических руд (Забайкальский край).
Морфологическая характеристика - форма клеток - вибрион, размером 0,5-1,0×3,0×5,0 мкм.
Спорообразование - нет.
Реакция по Граму - отрицательная.
Подвижность клеток - подвижные.
Физиологическая характеристика - отношение к кислороду - анаэробные.
2+
В качестве субстрата для роста используют лактат. Лактат метаболизируют по пути неполного окисления с образованием ацетата. Штамм устойчив к ионам меди (до 125 мг/л), кобальта (до 350 мг/л), никеля (до 250 мг/л), кадмия (до 60 мг/л). При культивировании штамма с ионами Fe образуют черный осадок сульфидов железа. Штамм способен к росту при значениях рН от 3 до 7,5. Оптимальный рН среды 5,0-5,5.
Полезное свойство, в связи с которым культура депонируется - осаждение ионов тяжелых металлов в концентрациях, превышающих 100 мг/л, сероводородом.
Условия культивирования - пресноводная среда Видделя.
Условия хранения - сохраняется путем пересевов на среде культивирования или лиофилизированным.
Пример 1. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. VK-9 ВКМ В-3000D к осаждению ионов меди.
Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. VK-9 ВКМ В-3000D культивировали на синтетической среде, содержащей ионы меди в концентрации 125 мг/л.
2
4
2
Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат  (1,6 мл), раствор HSO (при внесении рН доводится до 4,5), HS (2 мл). Перед внесением сероводорода добавляли маточный раствор меди в количестве 2 мл на 1 литр синтетической среды.
Во флаконы на 120 мл вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали  термостат при температуре 28 ºС.
Медь осаждается в виде сульфида на дне флакона.
Таблица 1 - Состав синтетической среды
Реактив
Концентрация, мг/л
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
4000
MgCl<sub>2</sub> 6H<sub>2</sub>O
400
NaCl (25%)
0,0125<sup>*</sup>
FeSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O
2,1
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
0,03
MnCl<sub>2</sub>*4H<sub>2</sub>O
0,1
CoCl<sub>2</sub>*6H<sub>2</sub>O
0,19
NiCl<sub>2</sub>*6H<sub>2</sub>O
0,024
CuCl<sub>2</sub>*2H<sub>2</sub>O
0,002
ZnSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O
0,144
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>*2H<sub>2</sub>O
0,036
CuSO<sub>4</sub>*7H<sub>2</sub>O
750
H<sub>2</sub>O
1 л
* - мл/л
Таблица 2 - Состав питательных веществ, добавляемых к синтетической среде
Раствор (вносимое количество на 1 литр синтетической среды)
Реактив
Концентрация
1. Витамины (2 мл/л)
4-аминобензойная кислота
4 мг/л
Биотин (витамин Н)
1 мг/л
Никотиновая кислота (витамин В<sub>5</sub>)
10 мг/л
Кальция пантотенат (витамин В<sub>3</sub>)
5 мг/л
Пиридоксин дигидрохлорид (витамин В<sub>6</sub>)
15 мг/л
Цианкобаламин (витамин В<sub>12</sub>)
5 мг/л
Тиамин (витамин В<sub>1</sub>)
10 мг/л
Рибофлавин (витамин В<sub>2</sub>)
0,5 мг/л
Фолиевая кислота
0,2 мг/л
2. Раствор солей(10 мл/л)
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
20  г/л
NH<sub>4</sub>Cl
25  г/л
NaCl
100  г/л
KCl
50  г/л
CaCl<sub>2</sub>
11,3  г/л
H<sub>2</sub>O
1 л
3. Раствор кофакторов(1 мл/л)
Na OH
4 г/л
Na<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub> x 5H<sub>2</sub>O
6 мг/л
Na<sub>2</sub>W O<sub>4 </sub>x2H<sub>2</sub>O
8 мг/л
4. Раствор Na<sub>2</sub>S(2 мл/л)
Na<sub>2</sub>S x 9 H<sub>2</sub>O
4,8 г
Пример 2. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. VK-9 ВКМ В-3000D к осаждению ионов никеля.
Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. VK-9 ВКМ В-3000D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный никель в концентрации 250 мгNi/л.
2
4
Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат (1,6 мл), раствор HSO (при внесении рН доводится до 4,5), раствор сульфида натрия  (2 мл). Стоковый раствор никеля добавляли в количестве 25 мл на 1 литр синтетической среды (таким образом, достигалась концентрация никеля в среде 250 мг/л).
Во флаконы на 120 мл вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали  термостат при температуре 28 ºС.
Никель осаждается в виде сульфида на дне флакона.
Пример 3. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. VK-9 ВКМ В-3000D к осаждению ионов кобальта.
Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. VK-9 ВКМ В-3000D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный кобальт в концентрации 350 мгСо(II)/л.
2
4
Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат (1,6 мл), раствор HSO (при внесении рН доводится до 4,5), раствор сульфида натрия  (2 мл). Стоковый раствор кобальта добавляли в количестве 35 мл на 1 литр синтетической среды (таким образом, достигалась концентрация кобальта в среде 350 мг/л).
Во флаконы вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали  термостат при температуре 28 ºС.
Кобальт осаждается в виде сульфида на дне флакона.
Пример 4. Исследование способности штамма бактерий Desulfovibrio sp. VK-9 ВКМ В-3000D  к осаждению ионов кадмия.
Чистую культуру СРБ Desulfovibrio sp. VK-9 ВКМ В-3000D культивировали на синтетической среде, содержащей двухвалентный кадмия в концентрации 60 мгCd(II)/л.
2
4
Посев проводили в стерильном ламинарном шкафу, который перед этим дезинфицировали ультрафиолетом 30 минут. Перед посевом синтетическую среду (таблица 1) доводили до кипения и затем быстро охлаждали под струей холодной воды для удаления растворенного кислорода. В охлажденную до комнатной температуры среду вносили питательные вещества (таблица 2) (в расчете на 1 л) в следующей последовательности: витамины (2 мл), раствор солей (10 мл), раствор кофакторов (1 мл), органический субстрат - лактат (1,6 мл), раствор HSO (при внесении рН доводится до 4,5), раствор сульфида натрия  (2 мл). Стоковый раствор кадмия добавляли в количестве 6,0 мл на 1 литр синтетической среды (таким образом, достигалась концентрация кадмия в среде 75 мг/л).
Во флаконы объемом 120 мл вносили около 50 мл синтетической среды с внесенными в нее добавками и 10 мл инокулята (культуры бактерий), после чего доливали средой до верха. Резиновые пробки притирали к краям флаконов с помощью стерильной иглы, что уменьшало вероятность проникновения кислорода воздуха. В конце посева флаконы закрывали алюминиевыми колпачками, запечатывали флакон закаточной машинкой и помещали  термостат при температуре 28 ºС.
Кадмий осаждается в виде сульфида на дне флакона.