УСТРОЙСТВО И СПОСОБ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ЖИДКИХ СРЕД
APPARATUS AND METHOD FOR DETERMINING TOXICITY OF LIQUID MEDIA

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к определению токсичности и может найти широкое применение в аналитической практике при определении токсичности разнообразных жидких сред без привлечения дорогостоящих и трудоемких методов анализа. Более конкретно, изобретение относится к водной токсикологии и установлению токсичности водных сред и образцов. В частности, в настоящей заявке предложены набор и мультисенсор, способ калибровки мультисенсора, а также способ для качественного и количественного определения токсичности жидких образцов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Токсичность представляет собой свойство химических веществ проявлять повреждающее или летальное действие на живые организмы. Вещество, оказывающее токсическое действие, называется токсикантом, а процесс воздействия токсиканта на организм - токсикацией (на экосистему - токсификацией). Токсичность водной среды представляет собой токсичность воды и донных отложений для гидробионтов, возникающую вследствие появления в ней токсических веществ природного или антропогенного происхождения (ксенобиотиков), загрязнения сточными водами, токсическими атмосферными осадками и пр. Обычно степень токсичности водной среды оценивается методами биотестирования, факультативно с последующим определением ПДК (предельно допустимых концентраций) веществ с помощью стандартных методов аналитической химии. Биотестирование, т.е. определение токсичности с привлечением биологических объектов, как правило, используют до химического анализа, т.к. этот метод позволяет провести экспресс-оценку природной среды и выявить "горячие точки", указывающие на ее наиболее загрязненные участки. На участках, где методами биотестирования выявлены какие-либо отклонения и исследуемая среда характеризуется как токсичная, аналитическим путем устанавливают причины этого явления, определяя вид и концентрации конкретных токсикантов. Таким образом, вследствие сложного состава многокомпонентной системы биологическое тестирование играет главную роль на начальном этапе. Основной принцип биотестирования заключается в испытании действия проб воды на биологический организм - тест-объект (эквивалентно называемые также биосенсорами или биообъектами) его часть или сообщество организмов с известными и поддающимися учету характеристиками. В качестве тест-объектов рекомендован широкий круг организмов, охватывающий все группы биологического сообщества. В частности, предпочтительные тест-объекты представляют собой растительные и/или животные организмы, включая дафнии, инфузории, креветки, раки, менидии, морские ежи, моллюски, устрицы, водоросли, рыбу и др. В процессе биотестрирования определяют тест-функции, т.е. жизненную функцию или критерий токсичности для характеристики отклика тест-объекта на повреждающее действие среды. Тест-функции в зависимости от тест-объекта различны и могут представлять собой:
- выживаемость - для инфузорий, ракообразных, эмбриональных стадий моллюсков, рыб, насекомых;
- плодовитость, появление аномальных отклонений в раннем эмбриональном развитии организма, степень синхронности дробления яйцеклеток - для ракообразных, рыб, моллюсков;
- гибель клеток, изменение (прирост или убыль) численности клеток в культуре, коэффициент деления клеток, средняя скорость роста, суточный прирост культуры для культур одноклеточных водорослей и инфузорий;
- скорость прорастания семян, длина первичного корня и др. - для растений.
Из уровня техники известно множество изобретений, предлагающих различные варианты реализации устройств и приборов, включающих совокупность биологических объектов, а также способов для определения токсичности жидких образцов. Среди таких изобретений можно отметить следующие: SU 1507275, SU 1413525, US 2002137093, KR 20080013846, KR 20090013764. Однако все из вышеуказанных изобретений имеют недостатки, связанные с применением живых тест-объектов. К таким недостаткам, в частности, относятся: затраты, связанные с поддержанием биообъектов в рабочем состоянии (кормление, разведение, поддержание соответствующих внешних условий среды обитания); продолжительное время анализа составляющее от нескольких часов до нескольких суток; высокая стоимость одного измерения. Кроме того, ни один из тест-объектов не может служить универсальным индикатором, в равной степени чувствительным ко всем экологическим факторам, из-за видовой избирательности действия потенциальных токсикантов. С введением каждого дополнительного объекта надежность схемы испытаний повышается, однако бесконечное расширение ассортимента обязательных объектов невозможно.
В свою очередь, определение токсичности жидких сред, в частности водосодержащих проб и/или образцов, с привлечением по существу только физико-химических методов анализа из уровня техники не известно. Причина этого кроется в самом определении токсичности как меры влияния внешних условий на физиологические параметры живого организма - биосенсора, в то время как методы аналитической химии дают ответ на вопрос о качественном и количественном содержании индивидуальных химических компонентов в тестируемых пробах и образцах. Другими словами, токсичность отражает нарушение рабочего состояния биообъекта. В то же время поиск зависимости токсичности и химического состава измеряемого образца на практике представляется трудоемкой задачей.
Таким образом, анализ уровня техники позволяет сформулировать задачу настоящего изобретения, заключающуюся в обеспечении технических решений для определения токсичности водосодержащих сред, исключающих вышеуказанные недостатки.
В частности, было бы желательным обеспечить такую систему, которая, с одной стороны, обладала бы чувствительностью, сходной с чувствительностью биообъектов, а с другой стороны, была бы лишена недостатков, связанных с необходимостью их постоянного использования.
В частности, было бы желательным обеспечить такую систему для определения токсичности, которая, с одной стороны, имела бы чувствительность, сравнимую с чувствительностью биообъектов, а с другой стороны, обладала бы простотой и воспроизводимостью измерений, характерной для сенсоров, основанных на измерении физико-химических параметров. Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение свободного от вышеуказанных недостатков устройства, позволяющего определять токсичность водных проб и образцов без постоянного использования биообъектов и при этом обеспечивающего высокую чувствительность и воспроизводимость результатов. Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа определения токсичности жидких образцов с помощью указанного устройства.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен набор для определения токсичности жидкой среды, включающий:
- совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров для получения сигналов, пропорциональных физико-химическим параметрам указанной жидкой среды; и
- данные калибровки указанной совокупности сенсоров, устанавливающие зависимость между значениями указанных сигналов и токсичностью, полученные на образцах жидкой среды с предварительно установленной токсичностью с применением по меньшей мере одного биообъекта.
Согласно одному варианту реализации указанная совокупность включает спектральный прибор.
Согласно одному варианту реализации указанная совокупность включает по меньшей мере два перекрестно-чувствительных сенсора.
Согласно одному варианту реализации указанные перекрестно-чувствительные сенсоры представляют собой два или более сенсора одного типа или разных типов, выбранных из группы, включающей вольтамперометрические сенсоры, потенциометрические сенсоры, полевые транзисторы, оптические сенсоры, потенциометрические сенсоры с лазерным сканированием, кварцевые пьезоэлектрические устройства, сенсоры на акустических волнах, сенсоры, работающие на основе метода поверхностного фотопотенциала.
Согласно одному варианту реализации жидкая среда представляет собой многокомпонентные водные или водно-органические суспензию, дисперсию, эмульсию или гомогенный раствор.
Согласно одному варианту реализации жидкая среда представляет собой воду из промышленных стоков, канализационную воду, воду открытых водоемов, грунтовую воду, талую воду, морскую воду.
Согласно одному варианту реализации жидкая среда представляет собой водную или водно-органическую вытяжку из твердого материала.
Согласно одному варианту реализации указанный биообъект выбран из растительных и/или животных организмов, включая дафнии, инфузории, креветки, раки, менидии, морские ежи, моллюски, устрицы, водоросли, рыбу.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен мультисенсор для определения токсичности жидкой среды, включающий:
- детектор для получения совокупности сигналов, пропорциональных физико-химическим параметрам указанной жидкой среды, соединенный с регистрирующим устройством для регистрации указанной совокупности сигналов детектора; и
- блок преобразования указанной совокупности сигналов детектора в характеристический сигнал с помощью методов многомерной обработки данных, позволяющий рассчитать токсичность указанной жидкой среды с использованием данных калибровки указанного детектора, устанавливающих зависимость между значениями сигналов детектора и токсичностью, полученные на образцах жидкой среды с предварительно установленной токсичностью с применением по меньшей мере одного биообъекта.
Согласно одному варианту реализации указанный детектор содержит совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров.
Согласно одному варианту реализации указанный детектор представляет собой спектральный прибор.
Согласно одному варианту реализации указанная совокупность включает по меньшей мере два перекрестно-чувствительных сенсора.
Согласно одному варианту реализации указанная совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров представляет собой два или более сенсора, выбранных из группы, включающей вольтамперометрические сенсоры, потенциометрические сенсоры, полевые транзисторы, оптические сенсоры, потенциометрические сенсоры с лазерным сканированием, кварцевые пьезоэлектрические устройства, сенсоры на акустических волнах, сенсоры, работающие на основе метода поверхностного фотопотенциала.
Согласно одному варианту реализации указанное регистрирующее устройство представляет собой устройство, выбранное из группы, включающей регистратор электрического сигнала, вольтметр, амперметр, измеритель импеданса, измеритель C-V характеристик, измеритель поверхностного фотопотенциала, кондуктометр, фотоэлектронные умножители (ФЭУ) или их комбинаций, при этом указанное регистрирующее устройство факультативно выполнено с возможностью передачи сигнала к электронно-вычислительной машине (ЭВМ).
Согласно одному варианту реализации указанная совокупность включает перекрестно-чувствительные сенсоры одного и того же типа.
Согласно одному варианту реализации указанная совокупность состоит из различных по типу перекрестно-чувствительных сенсоров.
Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложен способ определения токсичности жидкой среды с помощью вышеуказанного мультисенсора, при этом указанный способ включает следующие стадии:
а) калибровку детектора с помощью представительного набора образцов жидкой среды с предварительно установленной токсичностью с применением по меньшей мере одного биообъекта с получением калибровочной модели;
б) детектирование совокупности сигналов, пропорциональных физико-химическим параметрам указанной жидкой среды, и их регистрацию с помощью регистрирующего устройства;
в) преобразование указанной совокупности сигналов в характеристический сигнал с помощью одного или более методов многомерной обработки данных;
г) подстановку значения характеристического сигнала в калибровочную модель с определением токсичности в указанной жидкой среде.
Согласно одному варианту реализации указанная калибровочная модель является воспроизводимой линейной зависимостью.
Согласно одному варианту реализации указанная калибровочная модель является воспроизводимой нелинейной зависимостью.
Согласно одному варианту реализации детектирование многомерного отклика осуществляют путем приведения во взаимодействие указанной совокупности сенсоров и указанной жидкой среды в течение периода времени от по меньшей мере 10 миллисекунд до 30 минут.
Согласно одному варианту реализации токсичность указанной жидкой среды определяют в единицах тест-функции биообъекта, использованного при калибровке.
Согласно одному варианту реализации метод многомерной обработки данных представляет собой один или несколько методов, выбранных из группы, включающей метод проекций на латентные структуры (PLS), метод главных компонент (РСА), регрессию по главным компонентам (PCR), мягкое независимое моделирование классовых аналогий (S)MCA), метод опорных векторов (SVM), искусственные нейронные сети (ANN), линейный и квадратичный дискриминантный анализ (LDA и QDA).
Согласно одному варианту реализации жидкая среда представляет собой воду из промышленных стоков, канализационную воду, воду открытых водоемов, грунтовую воду. талую воду, морскую воду.
Согласно одному варианту реализации указанный биообъект выбран из растительных и/или животных организмов, включая дафнии, инфузории, креветки, раки, менидии, морские ежи, моллюски, устрицы, водоросли, рыбу.
Согласно четвертому аспекту настоящего изобретения предложен способ калибровки мультисенсора по любому из пп. 9-16, включающий
приведение во взаимодействие детектора поочередно с по меньшей мере двумя образцами жидкой среды с предварительно установленной токсичностью с применением по меньшей мере одного биообъекта, с получением совокупности сигналов в каждом из по меньшей мере двух жидких образцов, пропорциональных физико-химическим параметрам указанных по меньшей мере двух образцов, и регистрацию указанных сигналов с помощью регистрирующего устройства,
преобразование указанной совокупности сигналов, полученной в каждом из указанных образцов, в характеристический сигнал с помощью методов многомерной обработки данных:
построение калибровочной модели в единицах «токсичность образца, установленная предварительно с применением биообъекта (введено) - характеристический сигнал детектора (найдено)».
В результате реализации настоящего изобретения достигаются следующие преимущества по сравнению с решениями, известными из уровня техники:
- существенно увеличивается скорость определения токсичности за счет того, что анализ одного образца с помощью указанных набора или мультисенсора в соответствии с предложенным способом сокращается до нескольких минут в отличие от нескольких часов (суток) в случае определения токсичности с помощью биологических объектов; т.е. настоящее изобретение предполагает возможность обеспечения экспресс-анализа водных сред, проб и образцов;
- существенно упрощается определение токсичности за счет того, что биообъект не участвует в анализе и отсутствует необходимость его поддержания в рабочем состоянии (разведение, кормление, поддержание температурного режима и других параметров среды для обеспечения нормальной жизнедеятельности и прочее);
- определение токсичности может быть выполнено непосредственно на месте, т.е. вне лабораторных условий;
- существенно сокращается стоимость одного определения токсичности за счет снижения расходов на поддержание тест-объектов в рабочем состоянии.
Настоящее изобретение может быть использовано в промышленности, сельском хозяйстве, здравоохранении и других отраслях экономики или социальной сферы. В частности, изобретение найдет применение:
- при проведении токсикологической оценки промышленных, сточных бытовых, сельскохозяйственных, дренажных, загрязненных природных и прочих вод с целью выявления потенциальных источников загрязнения;
- в контроле аварийных сбросов высокотоксичных сточных вод;
- при проведении оценки степени токсичности сточных вод на разных стадиях формирования при проектировании локальных очистных сооружений;
- в контроле токсичности сточных вод, подаваемых на очистные сооружения биологического типа с целью предупреждения проникновения опасных веществ для биоценозов активного ила;
- при определении уровня безопасного разбавления сточных вод для гидробионтов с целью учета результатов биотестирования при корректировке и установлении предельно допустимых сбросов (ПДС) веществ, поступающих в водоемы со сточными водами;
- при проведении экологической экспертизы новых материалов, технологий очистки, проектов очистных сооружений и пр.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 (а)- схема мультисенсора согласно одному из вариантов настоящего изобретения; (б) фотография мультисенсора согласно одному из вариантов настоящего изобретения.
Фиг.2 - распознавание образцов с различной токсичностью мультисенсором согласно одному из вариантов настоящего изобретения (график распределения интрегральных откликов по главным компонентам РС1 и РС2).
Фиг.3 - вид калибровочной зависимости, полученной с помощью мультисенсора согласно одному из вариантов настоящего изобретения, построенной с применением метода PLS1 по результатам 8 образцов с предварительно установленной токсичностью с помощью Daphnia.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Термин «сенсоры», используемый в настоящем описании, представляет собой устройство, реагирующее (откликающееся) на определенные свойства окружающей его среды и позволяющее регистрировать этот отклик в виде соответствующего электрического оптического и др. сигнала.
Термин «совокупность сенсоров», используемый в настоящем описании, в общем случае относится к множеству сенсоров, объединенных друг с другом. Совокупность может представлять собой спектральный прибор либо состоять из по меньшей мере двух сенсоров. Предпочтительно совокупность содержит от 1 до 100 сенсоров, более предпочтительно от 1 до 50, предпочтительнее от 1 до 30 и наиболее предпочтительно от 1 до 10 сенсоров.
Термин «набор», используемый в настоящем описании, относится к системе, одним из элементов которой является совокупность сенсоров, а вторым элементом - данные калибровки указанной совокупности сенсоров в виде калибровочной модели/зависимости.
Термин «токсичность», используемый в настоящем описании, характеризует влияние среды на жизненные функции (тест-функции) живого организма, находящего в такой среде. К таким жизненным или тест-функциям живого организма относятся выживаемость, плодовитость, скорость размножения, скорость роста и другие характеристики его жизнедеятельности.
«Жидкая среда» согласно настоящему описанию представляет собой любую среду, обладающую характеристиками жидкости. Предпочтительно в рамках настоящего изобретения под жидкой средой подразумевают многокомпонентные водные или водно-органические системы, воду из различных бытовых и природных источников, вытяжки из твердых материалов и т.д.
Термин «перекрестно-чувствительный», используемый в настоящем описании применительно к сенсору, означает то, что указанный сенсор обладает чувствительностью к различным компонентам/веществам/соединениям/ионам среды, с которой его приводят во взаимодействие. Перекрестная чувствительность предполагает отсутствие селективности у указанного сенсора. В рамках настоящего изобретения термины «перекрестная чувствительность», «неселективность», «перекрестная реактивность», «низкая селективность», «частичная специфичность» и «глобальная селективность» являются взаимозаменяемыми и эквивалентными.
Термин «пропорциональный физико-химическим параметрам жидкой среды», используемый применительно к сигналу сенсора, подразумевает наличие зависимости значения сигнала от определенного физико-химического параметра. Под физико-химическими параметрами следуют понимать любые физические и химические свойства среды, определяемые ее качественным и количественным компонентным составом. В частности, к физико-химическим параметрам относятся вязкость, плотность, диэлектрическая проницаемость, теплоемкость, теплопроводность, электропроводность, абсорбция, цвет, оптическая плотность, выход люминесценции, выход флуоресценции, текучесть, индуктивность, радиоактивность, концентрация компонентов среды и т.д.
Под терминами «биообъект», «биосенсор» и «тест-объект», используемыми в настоящем описании, взаимозаменяемо подразумеваются любые организмы из царства животных или растений, которые используют в данной области техники для определения токсичности жидких сред.
Термин «мультисенсор», используемый в настоящем описании, относится к устройству, включающему детектор, содержащий совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров, регистрирующее устройство и блок обработки данных, полученных при взаимодействии детектора и жидкой среды. Мультисенсор может включать набор, определенный выше. Более подробно данное устройство раскрывается в нижеследующем разделе описания «осуществление изобретения».
Термин «калибровка», используемый в настоящем описании, предполагает проведение совокупности действий, направленных на установление зависимости величины токсичности, определенной с помощью биообъекта, и данными, полученными от совокупности перекрестно-чувствительных сенсоров в определенной жидкой среде.
Взаимозаменяемые эквивалентные термины «калибровочная модель» и «калибровочная зависимость» раскрывают взаимосвязь значений совокупности сигналов, полученных с помощью перекрестно-чувствительных сенсоров и токсичностью жидкой среды, определенной с помощью биообъекта. При этом указанная функциональная зависимость может быть как линейной, так и нелинейной.
Термин «представительный», используемый в настоящем описании в отношении набора образцов, по которым проводят калибровку совокупности сенсоров, соответствует такому набору образцов, количество которых необходимо и достаточно для определения токсичности жидкой среды, подлежащей определению в образце с неустановленной токсичностью.
Термин «характеристический сигнал» представляет собой единый сигнал, полученный после обработки совокупности сигналов мультисенсора в жидкой среде с помощью по меньшей мере одного многомерного метода обработки данных, при этом характеристический сигнал индивидуализирующий указанную жидкую среду и, в частности, ее токсичность.
Термин «воспроизводимый», используемый в настоящем описании, относится к любой характеристике, отклонение численного значения которой от среднего варьирует в интервале от 0 до 20%, предпочтительно от 0 до 10% и более предпочтительно от 0 до 5%.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложен набор для определения токсичности жидкой среды, включающий:
- совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров для получения сигналов, пропорциональных физико-химическим параметрам указанной жидкой среды; и
- данные калибровки указанной совокупности сенсоров, устанавливающие зависимость между значениями указанных сигналов и токсичностью, полученные на образцах жидкой среды с предварительно установленной токсичностью с применением по меньшей мере одного биообъекта.
Настоящее изобретение основано на неожиданном обнаружении того, что совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров позволяет получать отклики, коррелирующие со значениями токсичности образцов, установленными с привлечением одного или нескольких биологических объектов (далее также используются эквивалентные понятия биообъект, тест-объект, биосенсор). Совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров, будучи по меньшей мере единожды откалиброванной по образцам с установленной токсичностью с привлечением по меньшей мере одного биообъекта, позволяет впоследствии, на основе полученных данных калибровки, определять токсичность различных сред неограниченное число раз, тем самым исключая трудовые и экономические затраты, связанные с поддержанием биообъектов в рабочем состоянии (кормление, разведение, поддержание соответствующих внешних условий среды обитания), а также существенно увеличивает скорость определения токсичности с нескольких часов или суток до нескольких минут с сокращением общей стоимости анализа.
Получение данных калибровки, т.е. построение калибровочной модели/зависимости, и обработку сигналов, полученных от совокупности сенсоров, осуществляют с применением хемометрических методов, выбранных из группы, включающей метод проекций на латентные структуры (PLS), метод главных компонент (РСА), регрессию по главным компонентам (PCR), мягкое независимое моделирование классовых аналогий (S)MCA), метод опорных векторов (SVM), искусственные нейронные сети (ANN), линейный и квадратичный дискриминантный анализ (LDA и QDA). Эти методы хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Н.Martens, Muttivariate Cafibration. Wi)ey, New York, 1989; К.Эсбенсен. Анализ многомерных данных. Изд-во Алтайского ун-та, Барнаул, 2003).
Таким образом, при анализе конкретной жидкой среды, пробы или образца вышеуказанный набор может быть использован для определения токсичности в единицах тест-функции биообъекта, используемого при калибровке. Необходимыми и достаточными условиями такого определения будут являться совокупность сенсоров, откалиброванных по образцам, токсичность которых была установлена с помощью указанного по меньшей мере одного биообъекта, а также данных калибровки или калибровочной модели, например, представленных в виде линейной зависимости в координатах «введено» - «найдено» или в виде матрицы коэффициентов, учитываемой определенным образом при расчете совокупности сигналов в исследуемом образце. Сущность калибровки с применением тест-объектов будет детальнее раскрыта ниже.
Под физико-химическими параметрами следуют понимать любые физические и химические свойства среды, определяемые ее качественным и количественным компонентным составом. В частности, к физико-химическим параметрам относятся вязкость, плотность, диэлектрическая проницаемость, теплоемкость, теплопроводность, электропроводность, абсорбция, цвет, оптическая плотность, выход люминесценции, выход флуоресценции, текучесть, индуктивность, радиоактивность, концентрация компонентов среды, а также любые другие свойства, поддающиеся измерению и зависящие от вышеуказанных параметров.
В общем, термин «сенсоры» означает первичное устройство, реагирующее (откликающееся) на определенные свойства окружающей среды и позволяющее регистрировать этот отклик в виде соответствующего электрического (оптического и др.) сигнала. Сенсоры в указанном наборе обладают воспроизводимыми аналитическими характеристиками и высокой перекрестной чувствительностью, которая понимается как чувствительность сенсора к содержанию (концентрации) по меньшей мере двух или более компонентов анализируемого раствора одновременно. Другими словами, перекрестно-чувствительный сенсор не является селективным относительно конкретного компонента в многокомпонентной системе. Хотя термин «перекрестная чувствительность» является общепринятым для описания свойств сенсоров в литературе, посвященной мультисенсорным системам, его однозначного и общепринятого определения до настоящего времени не предложено. Существует целый ряд терминов, описывающих аналогичное явление, и используемых как синонимы, например, неселективность, перекрестная реактивность, низкая селективность, частичная специфичность и даже глобальная селективность. Эти термины следует рассматривать в качестве эквивалентных при рассмотрении настоящего изобретения. Далее по тексту заявки будет использован термин «перекрестная чувствительность» как наиболее точно описывающий, по мнению авторов изобретения, данное явление.
Авторами настоящего изобретения был предложен свой эмпирический метод оценки перекрестной чувствительности, заключающийся в использовании трех параметров: среднего наклона электродной функции S, фактора воспроизводимости (стабильности) К и фактора неселективности F, описывающие чувствительность и воспроизводимость отклика сенсора, а также распределение его селективности по изучаемым компонентам раствора. Для расчета этих параметров используются экспериментальные данные, полученные при калибровочных измерениях с сенсором в индивидуальных растворах выбранного набора веществ (ионов) и для заранее определенного круга сенсорных материалов, перекрестная чувствительность которых будет изучаться. Даже самые «неселективные» сенсорные материалы не будут обладать чувствительностью ко всем ионам в растворе, а, скорее, только к определенной группе веществ. Подробное описание метода оценки перекрестной чувствительности может быть найдено в работе Ю.Г.Власов, А.В.Легин, A.M.Рудницкая. ЖАХ. 52, №8, (1997) 837-842, включенной в настоящее описание во всей полноте при помощи ссылки. Важно отметить, что поскольку в рамках предложенного подхода не делается никаких априорных предположений о механизме отклика сенсоров, он может быть применен для оценки перекрестной чувствительности любых типов сенсоров, описываемых ниже.
Под совокупностью перекрестно-чувствительных сенсоров следует понимать по меньшей мере один или более сенсор, обладающий перекрестной чувствительностью к компонентам жидкой среды, токсичность которой определяют.
В частности, согласно одному варианту реализации совокупность может включать спектральный прибор. Указанный спектральный прибор позволяет получить индивидуальный спектр жидкого образца среды. В зависимости от качественного и количественного компонентного состава среды, его физико-химических параметров, частоты (длины волны) расположения пиков (линий), а также их интенсивности в спектре будут различными. Таким образом, проявляется перекрестно-чувствительный характер указанного сенсора. Авторами настоящего изобретения удалось найти корреляцию между расположениями линий в спектре, а также их интенсивностью, пропорциональные в свою очередь физико-химическим свойствами среды и токсичностью указанной среды. Перед определением токсичности жидкой среды спектрометр калибруют по образцам с предварительно установленной токсичностью с применением по меньшей мере одного биообъекта. Калибровка заключается в установлении зависимости между показаниями, регистрируемыми в спектре образца, и его токсичностью с применением биообъекта. В результате калибровки по нескольким представительным образцам получают корреляционную воспроизводимую зависимость, позволяющую определять далее токсичность любого образца без привлечения соответствующего биообъекта.
Согласно одному варианту реализации в качестве указанного спектрального прибора может выступать спектрофлуориметр, позволяющий регистрировать спектры флуоресценции, возбуждения и поглощения. При флуориметрических исследованиях производится измерение спектральных характеристик возбуждения и/или испускания люминесценции исследуемых образцов в момент воздействия импульсов возбуждающего света. При фотометрических исследованиях проводятся измерения спектральных характеристик поглощения зондирующего излучения в анализируемых образцах. Спектральные области в каналах возбуждения и регистрации люминесценции флуориметра задаются встроенными светосильными монохроматорами. Предпочтительно, монохроматоры управляются независимо. При измерениях возможно запрограммировать любую функцию их состояний, в частности, можно проводить синхронное сканирование спектров в различных спектральных областях. Управление прибором осуществляется от внешнего компьютера либо со встроенной клавиатуры. В частности, в качестве вышеуказанного спектрального прибора в наборе для определения токсичности можно использовать спектрофлуориметр «Панорама» компании ООО «Люмэкс».
Согласно еще одному варианту реализации изобретения перекрестно-чувствительные сенсоры представляют собой два или более сенсора одного типа или разных типов, выбранных из группы, включающей вольтамперометрические сенсоры, потенциометрические сенсоры, полевые транзисторы, оптические сенсоры, потенциометрические сенсоры с лазерным сканированием, кварцевые пьезоэлектрические устройства, сенсоры на акустических волнах, сенсоры, работающие на основе метода поверхностного фотопотенциала. Однако необходимо отметить, что типы сенсоров, составляющих совокупность в наборе, не имеют существенного значения с точки зрения их внешнего воплощения. Существенным условием является перекрестная чувствительность каждого из них к нескольким химическим компонентам. При этом перечень компонентов, относительно которых сенсоры проявляют перекрестную чувствительность, не является строго определенным и не может являться таковым в силу нескольких причин.
3
4
-
2-
2-
-
-
-
2-
Не желая связываться какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения предполагают, что для успешной реализации изобретения сенсоры должны обладать перекрестной чувствительностью к самым разнообразным компонентам. Например, к таким предельно допустимым, концентрации которых указаны в различных нормативных документах, определяющих загрязнение водных объектов, а следовательно, прямо или косвенно влияющих на параметры жизнедеятельности биологических объектов, т.е. на токсичность (см., например, перечень ПДК, приведенный в ГН 2.1.5.1315-03 - ПДК химических веществ в воде водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования от 19.05.2003). Более конкретно, к таким компонентам относятся, во-первых, ионные компоненты, в том числе катионы тяжелых металлов, такие как катионы Zn, Cd, V, Sn, Pb, Cu, Fe, Co, Mn, Hg, As, актиноидов и лантаноидов, а также различные анионы - NO , SO , S, CI, F, I, NO и др. Важно учитывать, что на токсичность могут влиять даже вполне безобидные вещества, например пищевые, ПДК которых существенно превышены. Во-вторых, к указанным компонентам относятся разнообразные неионные частицы, способные оказывать влияние как непосредственно на сам сенсор, так и косвенно на ионные формы, перекрестная чувствительность к которым проявляется конкретным сенсором. Типичный пример - разнообразные нефтепродукты, которые зачастую не обладают ионным характером, а также в большинстве своем представляют собой неполярные органические соединения. В-третьих, к таким компонентам относятся разнообразные вещества, которые имеют физический характер влияния на отдельно взятый сенсор. Например, к указанной группе могут относиться вещества, адсорбирующиеся на поверхности сенсоров, такие как ПАВ, гуминовые кислоты, эфиры жирных кислот, изменяющие отклик сенсора вследствие взаимодействия с его поверхностью. К указанным веществам также относятся широко известные токсиканты окружающей среды, пестициды, биоциды и др.
Перекрестная чувствительность указанной совокупности сенсоров позволяет получить уникальный отклик массива сенсоров даже при незначительном изменении одного из компонентов сложной системы, а, следовательно, обеспечить оптимальное соответствие сигналов совокупности сенсоров и биообъекта в системе. Специалисту в данной области техники будут очевидны различные сенсоры, обладающие перекрестной чувствительностью, а соответственно, потенциально пригодные для определения токсичности жидких сред.
Предпочтительно, указанные сенсоры представляют собой сенсоры, включающие полимерную мембрану, содержащую активный компонент (ионофор), нанесенную на преобразователь (трансдьюсер). Полимерную мембрану изготавливают путем смешения подходящих полимера, пластификатора и ионофора в приемлемом растворителе, с последующим высушиванием смеси в течение достаточного количества времени и механической модификацией застывшей пленки для придания необходимых геометрических размеров. Мембрану наносят/устанавливают на преобразователь, получая, таким образом, один из вышеуказанных сенсоров. В зависимости от типа используемого преобразователя получают вольтамперометрические сенсоры, потенциометрические сенсоры, полевые транзисторы, оптические сенсоры, потенциометрические сенсоры с лазерным сканированием, кварцевые пьезоэлектрические устройства, сенсоры на акустических волнах, сенсоры, работающие на основе метода поверхностного фотопотенциала.
В качестве подходящего полимера для мембранной матрицы можно использовать, например, поливинилхлорид, полиуретаны, ацетилцеллюлозу и другие полимеры, известные специалистам в данной области техники. Пластификатор служит для придания высоких механических свойств мембраны и может быть выбран из группы, включающей диоктилфенилфосфонат (DOPP), 2-нитрофенилоктиловый эфир (NPOE), бис-(1-бутилпентил)адипат (ВВРА), три-2-этилгексиловый эфир фосфорной кислоты (РТЕН), диэтиленгликольдибутиловый эфир (DGDE), 3-(треметоксисилил)пропилметакрилат (TMSPM), триоктилтримелиат (ТОТМ), трибутил-O-ацетилцетрат и другие. В качестве ионофоров выбирают соединения, обеспечивающие перекрестную чувствительность сенсоров к различным органическим и неорганическим веществам, а также к катионам и анионам, в том числе катионам тяжелых металлов и анионам, указанным выше. Из уровня техники известно множество веществ, используемых в качестве активного вещества, обеспечивающих перекрестную чувствительность. В качестве ионофоров могут выступать разнообразные органические вещества, в частности, бромид тетрадодециламмония (TDAB), хлоридтриоктилметиламмония (ТОМА), олеиновая кислота, 1-гексадеканол, галловая кислота, эфиры фосфорной кислоты, димамиды дипиколиновой кислоты (2,6-пиридинкарбоновой), фосфиноксиды, мателлопорфирины, калликсарены и другие соединения известные специалистам в данной области техники. В некоторых источниках такие сенсоры называют сенсорами на основе липидных мембран.
2
2
2
2
3
2
3
2
3
2
3
2
2
3
2
2
3
х
у
z
b
3
2
-
-
-
-
-
2+
2+
2+
Также предпочтительно указанные сенсоры представляют собой перекрестно-чувствительные потенциометрические сенсоры на основе оксидных и/или халькогенидных стекол. Указанные оксиды представляют собой один или несколько оксидов, выбранных из группы, включающей NaO, LiO, KO, MgO, CaO, SrO, AlO, ScO, YO LaO, SiO, AsO, ZrO, MoO, WO и другие. Халькогенидные стекла по существу содержат один или несколько халькогенидов металлов общей формулы МС и/или один или несколько халькогенидов неметаллов общей формулы EC, где М представляет собой щелочной металл, щелочноземельный металл, переходный металл, лантанид или актинид; С представляет собой S, Se, Те; Е представляет собой неметалл, выбранный из группы, включающей Si, As, P, Sb, Ge, Sn, I; x принимает значения от 1 до 3; у - от 1 до 5; и z - от 1 до 3 и b - от 1 до 5. Также согласно некоторым вариантам реализации изобретения мембраны могут быть выполнены на основе моно- или поликристаллических веществ, в частности из труднорастворимых кристаллических солей, например, таких как LaF, AgA, где А представляет собой CI, Br, I, SCN, CN; и/или TS-AgS, где М представляет собой Cu, Pb, Cd.
Способы получения вышеуказанных сенсоров хорошо известны специалистам в данной области техники, например, из: (а) Bratov A. et al, Analytica Chemica Acta, Volume 678, Issue 2, 30 September 2010, Pages 149-159; (б) Jimenez-Jorquera et al, Sensors, Volume 10, Issue 1, January 2010, Pages 61-83; (в) Schöning M.J., Kloock J.P., Electroanalysis, Volume 19, Issue 19-20, October 2007, Pages 2029-2038.
Промышленный выпуск или поставку сенсоров для анализа жидких сред осуществляет целый ряд отечественных фирм (некоторые из них приведены в Табл.А). Среди зарубежных фирм можно назвать такие как Radiometer Ana)ytical (France), HANNA instruments USA), Metier Toiedo (USA), Orion (USA), Eiectrochemicai Sensor Technology (EST) Ltd (UK), Sentek (UK). В табл.А в качестве примера показаны выпускаемые фирмой «Сенсорные системы» отечественные ИСЭ, которые также продаются рядом фирм-поставщиков (см. табл. 1).
Таблица А
Фирмы производители и поставщики химических сенсоров
Название фирмы потребителя
Местонахождение
Источник в Интернете
«Сенсорные системы»
Россия, Санкт-Петербург
www.sensorsystems.ru
НПП «Эконикс-Эксперт»
Россия, Москва
www.econix.com
«Вольта»
Россия, Санкт-Петербург
www.ntfvoita.spb.ru
ООО "Аналитприбор"
Россия, Смоленск
www.anaiytpribor-smoiensk.ru
«Измерительная техникам
Россия, Москва
www.izmteh.ru
«НИКО Аналит»
Россия, Москва
www.med.nico-anaiyt.ru
«Петролазер»
Россия, Санкт-Петербург
www.petrotaser.ru
НПП «Семико»
Россия, Новосибирск
www.muititest.semico.ru
Важное преимущество настоящего изобретения заключается в том, что для определения токсичности жидкой среды с использованием вышеуказанного набора вовсе не обязательно располагать каким-либо знанием относительно химического состава сложной системы (жидкой среды), токсичность которой необходимо определить. Необходимо, чтобы отклик совокупности сенсоров коррелировал с откликом, получаемым с применением биологического объекта. Это достигается за счет перекрестной чувствительности используемой совокупности сенсоров к разнообразным химическим компонентам.
Согласно еще одному варианту реализации изобретения указанная совокупность содержит по меньшей мере два откалиброванных перекрестно-чувствительных сенсора. Согласно другому варианту реализации количество сенсоров составляет от 2 до 50, предпочтительно от 2 до 30, более предпочтительно от 2 до 20 и наиболее предпочтительно от 2 до 10 сенсоров. Изначально, количество сенсоров в наборе может быть максимальным. По мере определения корреляций с откликом по биообъекту их число может быть уменьшено до оптимального количества с исключением сенсоров, не вносящих существенного вклада в определение токсичности. Согласно другому варианту реализации возможно использовать всю совокупность доступных сенсоров, но при обработке учитывать сигналы от определенных сенсоров, вносящих основной вклад в определение токсичности.
+
+
+
+
2+
2+
2+
2+
2+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
2-
2-
2-
4
3
4
4
4
3
4
Предпочтительно, в дополнение к совокупности перекрестно-чувствительных сенсоров использовать сенсоры, высокоселективные к определенным ионам. В качестве таких сенсоров, в частности, могут быть использованы ион-селективные электроды, такие как рН-электрод, электроды, имеющие селективность по существу к одному из следующих ионов: Н, Na, K, NH , Ca, Mg, Cd, Pb, Cu, Ag, F, Cl, Br, NO , CN, SCN, BF , ClO , SO , СО , PO . Такие электроды хорошо известны специалистам в данной области техники. Кроме того, в дополнение к указанным сенсорам может быть использован хлорсеребряный электрод в качестве электрода сравнения.
Согласно одному варианту реализации изобретения указанная жидкая среда представляет собой многокомпонентные водные или водно-органические суспензию, дисперсию, эмульсию или гомогенный раствор. В частности, жидкий образец может представлять собой воду из промышленных стоков, канализационную воду, воду открытых водоемов, грунтовую воду, морскую воду.
Согласно еще одному варианту в качестве жидкого образца также выступают водные растворы, представляющие собой водные или водно-органические вытяжки из твердых материалов, в частности, почв, грунтов, торфа, осадков сточных вод, донных отложений, активного ила, отходов (промышленных, твердых бытовых отходов, смешанных, порошкообразных, шлаков, шламов и др.).
Водные вытяжки из почв, грунтов, торфа, донных отложений готовят путем встряхивания одной части воздушно-сухой пробы почвы, отобранной и подготовленной, например, согласно ГОСТ 17.4.4.02-84 («Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа») и ГОСТ 27753.1-88 («Грунты тепличные. Методы отбора проб»), и 2-10 частей дистиллированной воды в течение периода времени, достаточного для полной экстракции содержимого пробы в воду, на аппарате для встряхивания, фильтрования полученной вытяжки через обеззоленные фильтры или мембранные фильтры с диаметром пор 1-10 мкм, возможно с последующим центрифугированием и/или отстаиванием в холодильнике вплоть до нескольких суток, а при необходимости с последующим разбавлением.
Водные вытяжки из осадков сточных вод, активного ила и отходов готовят путем перемешивания с использованием механической или магнитной мешалки одной части твердой фазы, прошедшей соответствующую пробоподготовку, и десяти частей дистиллированной воды в течение 1-10 часов, отстаивания раствора с осадком в течение 10-20 часов, возможно с последующим фильтрованием надосадочной жидкости через обеззоленные фильтры, центрифугированием и последующим разбавлением.
Все вытяжки должны иметь величину рН в диапазоне 3,0-10,0. При необходимости пробы нейтрализуют, после чего аэрируют в течение нескольких минут для стабилизации величины рН. Регулирование рН не должно вызывать химической реакции с веществами, присутствующими в пробе (выпадение осадка, комплексообразование), и не должно более чем на 5% изменять концентрацию исследуемой пробы. При необходимости уточнения результатов экспериментов расширяют и определяют токсичность проб после нейтрализации и без нейтрализации.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения предложен мультисенсор для определения токсичности жидкой среды, включающий:
- детектор для получения совокупности сигналов, пропорциональных физико-химическим параметрам указанной жидкой среды, соединенный с регистрирующим устройством для регистрации указанной совокупности сигналов детектора; и
- блок преобразования указанной совокупности сигналов детектора в характеристический сигнал с помощью методов многомерной обработки данных, позволяющий рассчитать токсичность указанной жидкой среды с использованием данных калибровки указанного детектора, устанавливающих зависимость между значениями сигналов детектора и токсичностью, полученные на образцах жидкой среды с предварительно установленной токсичностью с применением по меньшей мере одного биообъекта.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный мультисенсор представляет собой установку, состоящую из по меньшей мере двух основных блоков - детектора и блока преобразования сигналов детектора, соединенных между собой по известным для специалистов правилам с образованием единого аналитического устройства для определения токсичности.
На Фиг.1 (а) представлена схема одного возможного варианта реализации мультисенсора согласно настоящему изобретению. Основным элементом системы, является детектор, содержащий совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров 2, откалиброванных по образцам с установленной токсичностью с применением биологических объектов, а также регистрирующее устройство 5. Регистрирующее устройство представляет собой датчик, позволяющий зарегистрировать сигнал, исходящий от преобразователя каждого отдельно взятого сенсора. В зависимости от типа используемых сенсоров регистрирующее устройство может представлять собой регистратор электрического сигнала, вольтметр, амперметр, измеритель импеданса, измеритель C-V характеристик, измеритель поверхностного фотопотенциала, кондуктометр, фотоэлектронные умножители (ФЭУ) или их комбинации. Блок обработки данных 6 представляет собой электронно-вычислительную машину, например персональный или портативный компьютер, с установленным пакетом программ для обработки многомерного отклика мультисенсора, а также содержащий данные калибровки сенсоров для определения токсичности неизвестного образца.
На Фиг.1(б) представлена фотография мультисенсора согласно одному предпочтительному варианту настоящего изобретения. Образец, токсичность которого подлежит определению, помещают на магнитную мешалку 3, обеспечивающую гомогенизацию содержимого емкости. Предпочтительно использование магнитной мешалки с подогревом. Детектор 2, соединенный с высокоимпедансным вольтметром 1, приводят во взаимодействие с образцом, содержащимся в емкости на определенный период времени, достаточный для достижения равновесных условий, и регистрируют сигнал, исходящий от каждого сенсора совокупности. Сигналы, зафиксированные регистрирующим устройством, передаются и сохраняются в памяти ЭВМ и в дальнейшем используются при многомерной обработке. Подстановка данных калибровочной модели при обработке данных позволяет получить значение токсичности образца в единицах тест-функции биообъекта, используемого при калибровке. Другими словами, мультисенсор позволяет определить именно такую токсичность, которую продемонстрировал бы биологический объект в случае измерения токсичности с его применением в жидком образце.
Под совокупностью перекрестно-чувствительных сенсоров следует понимать по меньшей мере один или более сенсор, обладающий перекрестной чувствительностью к компонентам жидкой среды. В частности, совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров может включать спектральный прибор, например, спектрофлуориметр как определен выше и/или по меньшей мере два перекрестно-чувствительных сенсора, выбранных из группы, включающей вольтамперометрические сенсоры, потенциометрические сенсоры, полевые транзисторы, оптические сенсоры, потенциометрические сенсоры с лазерным сканированием, кварцевые пьезоэлектрические устройства, сенсоры на акустических волнах, сенсоры, работающие на основе метода поверхностного фотопотенциала.
Блок преобразования обеспечивает преобразование совокупности сигналов детектора в характеристический сигнал с помощью методов многомерной обработки данных. В качестве сигналов детектора могут выступать значения ЭДС, силы тока, сопротивления, интенсивности и частоты линий в спектре и т.д., которые определяются типом сенсоров, входящих в детектор. Сигналы детектора являются пропорциональными различным физико-химическим параметрам жидкой среды, например, таким как вязкость, плотность, диэлектрическая проницаемость, теплоемкость, теплопроводность, электропроводность, абсорбция, цвет, оптическая плотность, выход люминесценции, выход флуоресценции, текучесть, индуктивность, радиоактивность, концентрация компонентов. Данные значения сигналов с помощью хемометрических методов, также называемых методами многомерной обработки данных, можно определенным образом распознать и определить их структуру, далее классифицировать и идентифицировать, а также использовать в количественном анализе для определения концентраций отдельных веществ и других параметров. В частности, в результате обработки данных совокупность сигналов детектора преобразуется в один сигнал, включающий в себя информацию, поступающую от каждого отдельного сенсора в конкретно взятой многокомпонентной системе. Таким образом, указанный сигнал характеризует и индивидуализирует конкретную многокомпонентную систему, т.е. учитывает ее качественный и количественный состав, а также взаимодействие между отдельно взятыми компонентами системы, остальные условия при которых проводятся измерения. В силу такой особенности указанный сигнал, получаемый при обработке, назван в настоящем описании «характеристическим». При этом хемометрические методы выбирают из группы, включающей метод проекций на латентные структуры (PLS), метод главных компонент (РСА), регрессию по главным компонентам (PCR), мягкое независимое моделирование классовых аналогий (S)MCA), метод опорных векторов (SVM), искусственные нейронные сети (ANN), линейный и квадратичный дискриминантный анализ (LDA и QDA). Эти методы многомерной обработки данных хорошо известны специалистам в данной области техники (см., например, Н.Martens, Multivariate Cahbration. Witey, New York, 1989; К.Эсбенсен. Анализ многомерных данных. Барнаул, Изд-во Алтайского ун-та,  2003).
Указанный детектор на основе перекрестно-чувствительных сенсоров является пригодным для определения токсичности, будучи откалиброванным по образцам с предварительно установленной токсичностью с помощью биологического объекта (биосенсора). В одном предпочтительном варианте реализации детектор может быть откалиброван по образцам с токсичностью, установленной разными биологическими объектами. В другом предпочтительном варианте детектор калибруют по разным образцам с установленной токсичностью. В каждом из этих случаев одна и та же совокупность сенсоров будет пригодна для определения токсичности, в первом случае в единицах тест-функции биообъекта, используемого при калибровке, а во втором - в разных жидких средах. Таким образом, для расширения пределов применения настоящего мультисенсора детектор желательно калибруют по образцам, токсичность которых определялась разными видами биологических объектов, а также образцам, разным по источнику их происхождения. Например, указанный детектор может быть прокалиброван по образцам пресной и морской воды, при определении токсичности которых были использованы различные тест-объекты. В этом случае в дальнейшем это позволит определять токсичность пресной и морской воды в единицах тест-функции биообъектов, используемых при калибровке, с помощью одного и той же совокупности перекрестно-чувствительных сенсоров или одним и тем же мультисенсором. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что детектор может быть откалиброван и более чем по двум видам образцов с применением различных тест-объектов.
12
Мультисенсор для анализа токсичности жидкостей может быть разработан на основе потенциометрических химических сенсоров, являющихся одним из наиболее предпочтительных вариантов настоящего изобретения. Измерения с потенциометрическим массивом сенсоров, в целом, аналогичны измерениям с отдельными ИСЭ: измеряется э.д.с. электрохимической ячейки, состоящей из каждого из сенсоров массива поочередно и электродом сравнения. Для измерений используют многоканальные вольтметры с высоким входным импедансом (не менее 10 Ом). Как правило, управление измерениями и запись данных осуществляется с помощью компьютера. Тем не менее, устройство такого типа может включать в себя любые химические сенсоры для анализа токсичности жидкостей независимо от того, на каком физическом принципе они основаны. Основные типы сенсоров и чувствительных материалов, применяемых в настоящем мультисенсоре, описаны ниже.
Согласно одному варианту реализации настоящий мультисенсор может включать в себя детектор на основе от 2 до 50, предпочтительно от 2 до 30, более предпочтительно от 2 до 20 и наиболее предпочтительно от 2 до 10 потенциометрических сенсоров с т.н. липидными мембранами (см. выше подробно), обладающими перекрестной чувствительностью. С целью миниатюризации мультисенсора изготавливают тонкопленочные сенсоры на основе тех же чувствительных материалов, но на основе другого принципа детектирования сигнала. Тонкопленочные сенсоры изготавливают нанесением Лангмюр-Блоджеттовских пленок на полупроводниковую подложку. В качестве трансдьюсеров используют полевые транзисторы, потенциометрические сенсоры с лазерным сканированием (LAPS) и изменяемым поверхностным фотопотенциалом (SVP).
Для изготовления сенсоров, образующих детектор согласно еще одному варианту реализации, используют широкий круг мембранных материалов, в том числе халькогенидные стекла, допированные различными металлами, пластифицированные полимеры, содержащие различные активные вещества (ионофоры), а также моно- и поликристаллические композиции.
Согласно одному варианту реализации настоящий мультисенсор может быть выполнен в виде инжекционного устройства, включающего детектор, содержащий от 2 до 50 сенсоров. К достоинствам проточно-инжекционного мультисенсора относится возможность проводить многократные и часто повторяющиеся измерения токсичности в автоматическом режиме, а также уменьшенный объем пробы. Объем пробы в случае инжекционного мультисенсора составляет, как правило, от 150 до 500 мкл, но может быть уменьшен и до 50 мкл.
Согласно еще одному варианту реализации потенциометрические сенсоры, входящие в состав настоящего мультисенсора могут быть изготовлены путем нанесения пленок металлопорфиринов на подложку из стеклоуглерода. Металлопорфирины с разными центральными атомами (Mn(III), Fe(III), Co(II), Ni(II)), а также тетрафенилпорфирин наносят методом электрополимеризации.
Согласно еще одному варианту реализации настоящий мультисенсор включает детектор, содержащий вольтамперометрические перекрестно-чувствительные сенсоры. В данном случае реализуется идея о сочетании неспецифичных электрохимических сигналов и их обработки методами распознавания образов. Полярографическая волна становится неселективным аналитическим сигналом в тех случаях, когда несколько компонентов раствора, подлежащего анализу на токсичность, окисляются при одинаковых или близких потенциалах. Для разрешения такого сигнала и получения из него аналитической информации, кроме методов обработки данных, используется не один рабочий электрод, как в классической схеме, а несколько. В частности, в качестве рабочих электродов можно использовать благородные металлы: платину, золото, иридий, родий и рений.
Примерами вольтамперометрических сенсоров являются электроды, модифицированные монофталоцианинами кобальта и меди и бисфталоцианинами европия, гадолиния, лютеция и окто- или тетрабутил замещенного бисфталоцианина празеодима. Указанные модифицированные электроды изготавливают либо нанесением пленок Лэнгмюра-Блоджета на стеклянную подложку, либо с использованием технологии намазного электрода, при которой 5-25 об.% фталоцианина смешивают с графитовой пастой. Измерения с вольтамперометрическими мультисенсорными системами проводят в классической трехэлектродной схеме, измерительный электрод - электрод сравнения и вспомогательный электрод, с той лишь разницей, что «измерительным электродом» в данном случае выступает совокупность откалиброванных перекрестно-чувствительных сенсоров, описанная выше. Для переключения электродов используют коммутатор. Метод квадратно-волновой импульсной вольтамперометрии (LAPV) выбирают для измерений с совокупностью электродов, изготовленных из благородных металлов. Измерения с совокупностью модифицированных электродов можно проводить также методом циклической вольтамперометрии.
5
Согласно некоторым вариантам реализации для изготовления сенсоров используют различные проводящие полимеры, такие как полианилин, полипиррол, стеариновую кислоту и их смеси. Лэнгмюр-Блоджеттовские пленки полимеров наносят на металлическую подложку. Измерения с полученными электродами проводят методом импедансной спектроскопии. Комплексный импеданс измеряют при комнатной температуре (20±3)°С в диапазоне частот 20-10 Гц. Применение импедансной спектроскопии основывается на том факте, что область низких частот импедансного спектра описывает свойства двойного электрического слоя, образуемого в результате адсорбции различных веществ, содержащихся в анализируемом растворе, на поверхности сенсоров и, следовательно, несущего полезную аналитическую информацию.
Специалисту будет очевидно, что набор возможных сенсорных материалов и методов детектирования не исчерпывается только вариантами, описанными выше, и в рамках настоящего изобретения можно использовать другие типы сенсоров, обладающих перекрестной чувствительностью к компонентам образцов, подлежащих токсикологическому анализу, в мультисенсоре согласно настоящему изобретению. В частности, как указывалось выше, различные сенсоры потенциально пригодные для решения задач, поставленных в настоящем изобретении, являются коммерчески доступными (см. Табл.А).
Согласно одному варианту реализации набор согласно первому аспекту настоящего изобретения, содержащий совокупность перекрестно-чувствительных сенсоров и данные калибровки, является составной частью настоящего мультисенсора. При этом варианты реализации, относительно типа и характеристик сенсоров, раскрытые в контексте первого аспекта настоящего изобретения, подходят во всей полноте и для рассматриваемого выше мультисенсора.
Согласно третьему аспекту настоящего изобретения предложен способ определения токсичности жидкой среды с помощью мультисенсора согласно любому варианту реализации изобретения, при этом указанный способ включает следующие стадии:
а) калибровку детектора с помощью представительного набора образцов жидкой среды с предварительно установленной токсичностью с применением по меньшей мере одного биообъекта с получением калибровочной модели;
б) детектирование совокупности сигналов, пропорциональных физико-химическим параметрам указанной жидкой среды, и их регистрацию с помощью регистрирующего устройства;
в) преобразование указанной совокупности сигналов в характеристический сигнал с помощью одного или более методов многомерной обработки данных;
г) подстановку значения характеристического сигнала в калибровочную модель с определением токсичности в указанной жидкой среде.
Согласно одному варианту реализации изобретения калибровка включает регистрацию значений сигналов детектора в каждом образце с предварительно установленной токсичностью по биообъекту и обработку полученных данных с привлечением многомерного метода обработки данных с получением калибровочной модели. Калибровочная модель представляет собой график зависимости токсичности, определенной с помощью мультисенсора, от токсичности, определенной с помощью биообъекта. Калибровочная зависимость может быть линейной или нелинейной. При этом для реализации задач настоящего изобретения вид калибровочной модели должен быть воспроизводимым, что означает неизменность вида калибровочной модели при неизменности условий, при которых ее получают. В общем случае под нелинейной зависимостью следует понимать любую зависимость, отличную от линейной. Так, нелинейная зависимость может представлять собой полиномиальную, экспоненциальную, логарифмическую и любую другую нелинейную зависимости.
Для построения калибровочной модели/зависимости используют представительный набор образцов жидкой среды с установленной токсичностью с помощью по меньшей мере одного биообъекта. Представительный в настоящем контексте соответствует такому набору образцов, количество которых необходимо и достаточно для определения токсичности жидкой среды, подлежащей определению. Предпочтительно, набор включает от 1 до 100, более предпочтительно от 1 до 50 и наиболее предпочтительно от 1 до 10 образцов с предварительно установленной токсичностью с помощью по меньшей мере одного биообъекта. В общем, представительный набор образцов включает по меньшей мере два образца с разными значениями предварительно установленной токсичности.
Согласно одному варианту реализации биообъекты, используемые для определения токсичности представительного набора образцов, используемых для калибровки, выбирают из группы, включающей растительные и/или животные организмы, включая дафнии, инфузории, креветки, раки, менидии, морские ежи, моллюски, устрицы, водоросли, рыбу и т.д. Очевидно, что токсичность набора образцов может быть измерена с привлечением одного или разных видов биообъектов в зависимости от конкретно поставленной задачи. Токсичность жидкой среды, определяемая на основе данных калибровки с использованием такого набора, будет выражаться в единицах тест-функции биообъекта, использованного при калибровке. Таким образом, привлечение различных биообъектов для определения токсичности образцов для калибровки существенно увеличивает диапазон значений токсичности и вид токсичности, определяемый с помощью мультисенсора.
Получение значений сигналов детектора осуществляют в результате приведения во взаимодействие детектора и жидкой среды, токсичность которой подлежит определению, на период времени, достаточный для установления равновесных сигналов совокупности сенсоров, с их последующей регистрацией. Как правило, указанный период времени составляет от 10 миллисекунд до 30 минут, предпочтительно от 1 с до 15 минут, более предпочтительно от 1 с до 5 минут и наиболее предпочтительно от 10 с до 1 минуты. Данный период времени, по существу, представляет собой общее время определения токсичности согласно настоящему изобретению при условии предварительного получения калибровки. Таким образом, настоящее изобретение позволяет существенно снизить среднее время проведения анализа образца по сравнению с анализом, проводимым с помощью биосенсоров.
Необходимо понимать, что приведение во взаимодействие детектора и жидкой среды может включать как наличие непосредственного физического контакта между ними, так и его отсутствие. Так, в случае, когда детектор включает спектральный прибор, наличие контакта как такового не происходит. Указанная жидкая среда в этом случае только взаимодействует с источником света определенной частоты (длины волны), после чего фиксируется желаемый спектр, например спектр поглощения или флуоресценции. Напротив, в том случае, если детектор представляет собой, например, совокупность потенциометрических сенсоров, осуществляют его непосредственное погружение в анализируемый раствор.
При этом жидкая среда представляет собой воду, выбранную из группы, включающей воды из промышленных стоков, канализационную воду, воду открытых водоемов, грунтовую воду, талую воду, морскую воду.
После регистрации указанной совокупности сигналов в каждом отдельно взятом образце жидкой среды осуществляют их обработку с помощью многомерных методов обработки данных для получения единого характеристического сигнала. Обработку данных осуществляют в автоматическом режиме сразу после регистрации сигналов детектора с помощью соответствующего коммерчески доступного программного обеспечения. В качестве программного обеспечения, в частности, может быть использован пакет программ The Unscrambler v.9.7 (САМО, Norway).
Согласно некоторым вариантам реализации один или более метод многомерной обработки данных выбирают из группы, включающей метод проекций на латентные структуры (PLS), метод главных компонент (РСА), регрессию по главным компонентам (PCR), мягкое независимое моделирование классовых аналогий (S)MCA), метод опорных векторов (SVM), искусственные нейронные сети (ANN), линейный и квадратичный дискриминантный анализ (LDA и QDA). Данные методы, как неоднократно указывалось выше, являются хорошо известными для специалистов в области хемометрики.
При определении токсичности задачи обработки данных можно свести к трем основным: изучение структуры данных и распознавание; классификация и идентификация; количественный анализ - определение концентраций веществ или других количественных параметров. Распознавание и изучение структуры данных всегда является первым этапом при обработке данных и необходимо для первоначальной оценки воспроизводимости и детектирования выбросов, визуального изучения структуры данных, обнаружения в данных кластеров и т.д. Для этих целей используются методы неуправляемого обучения, такие как анализ по главным компонентам и некоторые типы искусственных нейронных сетей. Задачи классификации и количественного анализа решаются, как правило, с помощью методов управляемого обучения. Для классификации могут применяться такие методы как, например, SIMCA, линейный дискриминантный анализ, многомерные регрессии, нечеткая логика и искусственные нейронные сети. В тех случаях, когда априорная информация об измеряемых образцах отсутствует, классификация также может проводиться с помощью методов неуправляемого обучения. Для получения калибровочных зависимостей для определения концентраций компонентов раствора используются методы многомерных калибровок, наиболее распространенные из которых включают регрессию по главным компонентам и дробным наименьшим квадратам, а также искусственные нейронные сети. Подробное описание основных методов хемометрики, используемых для обработки результатов измерений с мультисенсорными системами, может быть найдено в обширной справочной литературе (Н.Martens, Т.Naes. Multivariate calibration. Wiley & Sons Ltd. 1989; Neural Computing. Neural Ware, Pittsburg, USA. 1997; К.Эсбенсен, Анализ многомерных данных. Барнаул, Изд-во Алт. Ун-та, Барнаул, 2003).
Согласно четвертому аспекту в настоящем изобретении предложен способ калибровки вышеуказанного мультисенсора, включающий:
приведение во взаимодействие детектора поочередно с по меньшей мере двумя образцами жидкой среды с предварительно установленной токсичностью с применением по меньшей мере одного биообъекта, с получением совокупности сигналов в каждом из по меньшей мере двух жидких образцов, пропорциональных физико-химическим параметрам указанных по меньшей мере двух образцов, и регистрацию указанных сигналов с помощью регистрирующего устройства,
преобразование указанной совокупности сигналов, полученной в каждом из указанных образцов, в характеристический сигнал с помощью методов многомерной обработки данных;
построение калибровочной модели в единицах «токсичность образца, установленная предварительно с применением биообъекта (введено) - характеристический сигнал детектора (найдено)».
1
m
1
m
1
m
i
i
i-1
В общем, сущность калибровки заключается в построении калибровочной модели, т.е. зависимости, позволяющей качественно и количественно оценить совместимость показаний совокупности сенсоров и значений токсичности в образцах, которую устанавливают с привлечением биосенсоров. Так, при наличии n сенсоров и m образцов с предварительно установленной токсичностью Y…Y, где Y - токсичность установленная биобъектом в 1-м образце, a Y - в m-м, калибровка будет включать регистрацию сигнала от каждого из n сенсоров детектора в каждом из m образцов, в результате чего на выходе будет получена матрица значений [mXn]. К этой матрице добавляют столбец значений токсичности, определенных с помощью биологического объекта, с получением матрицы значений [mX(n+1)]. Далее применяют подходящий метод многомерной обработки данных применительно к указанной матрице с получением калибровочной модели (зависимости). В результате применения указанного метода происходит разложение матрицы и автоматический поиск корреляций между показаниями мультисенсора и значениями Y…Y. Как правило, калибровочную модель представляют в виде графика линейной зависимости в единицах «введено - найдено», где «введено» соответствует токсичности, определенной указанным биообъектом, а «найдено» представляет собой значение токсичности, полученное с помощью мультисенсора или, по-другому, его характеристический сигнал в конкретном образце. Таким образом, когда калибровочная модель готова, то ее результатом, в предпочтительном случае, является набор коэффициентов к и b, как в обычной линейной регрессии: у=kx+b, где у представляет собой токсичность образца, подлежащую определению, х - характеристический сигнал детектора в неизвестном образце. В общем, калибровочная модель может представлять собой нелинейную зависимость, например в виде полинома вида у=∑k·+b. Количество коэффициентов в данном случае будет гораздо большим по сравнению с линейным вариантом, но принцип определения токсичности остается тем же самым. В общем случае, под нелинейной зависимостью, следует понимать любую зависимость, отличную от линейной. Так, нелинейная зависимость может представлять собой полиномиальную, экспоненциальную, логарифмическую и любую другую нелинейную зависимости.
Указанная калибровочная модель используется далее при обработке значений совокупности сигналов детектора в образцах с неизвестной токсичностью. После получения калибровочной модели регистрируют значения от каждого из n сенсоров детектора в образце, токсичность которого необходимо установить. Применяя многомерный метод обработки данных применительно к полученным значениям с подстановкой вышеуказанных коэффициентов из модели, определяют значение токсичности образца жидкой среды. В результате неизвестный образец проходит «инструментальное биотестирование», т.е. определение токсичности без прямого привлечения биосенсора, причем в единицах тест-функции биообъекта, используемого при калибровке. Таким образом, настоящее изобретение в дополнение к компенсации времени позволяет устранить недостатки способов определения токсичности, связанные с непосредственным использованием биологических объектов.
Далее настоящее изобретение раскрывается с помощью конкретных примеров реализации для более наглядной демонстрации заявленных технических решений. Специалисту в данной области техники будет очевидно, что представленные примеры могут быть незначительно изменены без изменения сущности настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Анализ токсичности речной воды с применением мультисенсора на основе потенциометрических сенсоров, откалиброванных по образцам с установленной токсичностью с помощью Daphnia (ракообразные).
В настоящем примере продемонстрирована возможность применения мультисенсорных систем на основе потенциометрических сенсоров для оценки качества образцов речной воды в терминах общей токсичности в единицах тест-функции биообъекта, используемого при калибровке.
В настоящем примере использовали мультисенсор, включающий детектор, состоящий из 25 перекрестно-чувствительных потенциометрических сенсоров на основе пластифицированного ПВХ (15 сенсоров) и халькогенидных стекол (10 сенсоров). В качестве биосенсора для определения токсичности калибровочных образцов использовали планктонных ракообразных - дафний (Daphnia).
Для приготовления проверочных растворов солей использовали реактивы квалификаций «х.ч», «о.с.ч» и «ч.д.а», приобретенные в компаниях "Вектон" и «Реактива (Санкт-Петербург). Растворы наивысшей концентрации (как правило, 1 моль/л) готовили весовым методом, а менее концентрированные растворы - методом последовательного объемного разбавления. Все растворы были приготовлены на бидистиллированной воде. Электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод ЭВЛ 1М 3.1, заполненный насыщенным раствором хлорида калия. Для контроля значения рН исследуемых растворов использовался стеклянный электрод ЭСЛ-43-07, откалиброванный по стандартным буферным смесям. Измерения потенциалов сенсоров детектора производили при помощи 32-канального цифрового вольтметра с высоким входным сопротивлением, подключенным к персональному компьютеру для сбора и обработки данных. Все измерения проводились при комнатной температуре (20±2°С). Для проведения измерений детектор погружали в образец таким образом, чтобы сенсорные мембраны оказались полностью покрыты жидкостью. Измерения проводили в течение 3 минут, затем совокупность сенсоров отмывали дистиллированной водой 2 раза по 2 минуты.
Калибровочные образцы воды и данные результатов анализа общей токсичности с помощью биосенсора были предоставлены независимой сертифицированной лабораторией контроля качества воды (далее СЛККВ). В таблице 1.1 приведены данные об этих образцах.
Таблица 1.1
Кодировка
Дата и номер образца (СЛККВ)
Общая токсичность, установленная биосенсором
1-1
01.07.2010, №1
1
1-2
01.07.2010, №2
0
1-3
01.07.2010, №3
0
8-1
08.07.2010, №1
0.2
8-2
08.07.2010. №2
0.14
8-3
08.07.2010, №3
0.2
8-4
08.07.2010, №4
0.07
16-1
16.07.2010, №1
0.1
16-2
16.07.2010. №2
0.12
16-3
16.07.2010, №3
0.11
16-4
16.07.2010, №4
0.2
Cu
Cu, 0.1 мг/литр
1
Измерения в каждом образце повторяли 3 раза, полученные данные использовались для последующей обработки как независимые реплики.
Для калибровки данных, полученных с помощью детектора на основе потенциометрических сенсоров в растворах образцов с предварительно установленной токсичностью, использовали алгоритмы РСА (Principal Component Analysis, анализ по главным компонентам) и PLS1 (Projections on Latent Structures, Partial Least Squares - метод проекций на латентные структуры или метод дробных наименьших квадратов). Обработка проводилась с помощью пакета программ The Unscrambter v.9.7 (САМО, Norway).
Суть метода РСА заключается в том, что отклик детектора представляется в виде матрицы, в которой число строк - это число измеренных системой образцов, а число столбцов - число сенсоров в совокупности. Каждый элемент матрицы представляет собой отклик индивидуального сенсора в конкретном образце. Каждый элемент матрицы может, кроме того, быть представлен как точка в многомерном пространстве с числом координатных осей, равным числу сенсоров в массиве. Вся матрица в этом варианте может быть представлена как облако точек в многомерном пространстве. Алгоритм метода РСА позволяет отыскивать в таком облаке направление наибольшей дисперсии в данных и последовательно уменьшать размерность пространства, проецируя точки на это направление. В результате таких уменьшений размерности исходную матрицу можно представить в виде графика в двумерном пространстве, в координатах направлений с наибольшей дисперсией в матрице данных. Такое проецирование позволяет выявить наличие скрытой внутренней структуры данных и, в частности, установить наличие групп образцов схожих/различных между собой. Метод РСА широко применяется для оценки возможности мультисенсорных систем к распознаванию (разделению) различных классов внутри единой группы образцов.
Метод PLS1 основан на схожем матричном представлении совокупности сигналов детектора, однако здесь помимо собственно данных от совокупности мультисенсора применяются данные референтных методов анализа, с которыми планируется обнаружить корреляцию, т.е. эти данные для каждого образца включаются в матрицу в виде вектор-столбца Y. Алгоритм PLS1 проводит разложение исходной матрицы данных таким образом, чтобы оно было увязано с изменением данных в вектор-столбце Y с референтными данными. Подобная процедура позволяет выявить наличие численных корреляций в совокупности сигналов с различными характеристиками образцов, иными словами, позволяет откалибровать систему по какому-либо свойству (разумеется, это возможно, только если совокупность сигналов детектора действительно имеет корреляцию с определяемой величиной).
Результаты построения калибровочной модели представляются обычно в виде прямых для калибровки и проверки в координатах «введено-найдено» или что то же самое «токсичность образца, установленная предварительно с помощью биообъекта - характеристический сигнал детектора». Основными параметрами калибровочной PLS1-модели являются наклон, оффсет, квадрат коэффициента корреляции и остаточная среднеквадратичная ошибка калибровки и предсказания. Наклон и квадрат коэффициента корреляции описывают, насколько хорошо точки в калибровке и проверке ложатся на прямую. Чем ближе эти величины к единице, тем лучше модель описывает данные. Оффсет описывает смещение прямой относительно начала координат и должен быть максимально близок к нулю. Остаточная среднеквадратичная ошибка (RMSE, root mean square error) характеризует предсказательную силу модели, она имеет размерность величины Y, по которой проводилась калибровка и для хорошей модели должна быть минимальна.
Таким образом, для оценки способности мультисенсора различать образцы с разной токсичностью результаты анализа образцов были обработаны с помощью алгоритма РСА. На Фиг.2 представлен график счетов для исследованных образцов. Эти данные отражают качественную оценку токсичности. Взаимное расположение точек на графике счетов отвечает сходству/различию интегрального химического состава образцов согласно данным детектора на основе совокупности химических сенсоров. Так, образцы, находящиеся рядом, имеют схожий химический состав, образцы, расположенные на разных концах осей главных компонент - максимально различный.
Как видно из представленной фигуры, реплики в одних и тех же образцах имеют очень схожие координаты, что свидетельствует о высокой воспроизводимости совокупности сенсоров. На фигуре можно выделить три отчетливых кластера: в первый попадают все образцы с токсичностью в диапазоне 0-0,2. Второй кластер представлен тремя репликами образца 1-1 с токсичностью около 1, третий кластер содержит реплики в модельном токсиканте - растворе меди. Кластеры между собой не перекрываются. Таким образом, используемый мультисенсор позволяет уверенно различать между собой образцы с низкой токсичностью, образцы с высокой токсичностью и модельный токсикант. Следует особо отметить, что метод РСА - это метод с так называемым «неконтролируемым обучением», то есть для получения приведенного графика на Фиг.2, используются исключительно данные анализа образцов с совокупностью сенсоров. Система в таком варианте «не знает» уровни токсичности для образцов, а просто располагает их на карте согласно разнице в интегральном химическом составе, оцененном детектором.
Кроме того, для обработки данных детектора использовался метод PLS1, в качестве референтных данных для построения калибровочной модели использовались данные по общей токсичности образцов, определенные с помощью биосенсора (дафний), предоставленные СЛККВ, в качестве моделируемых данных использовались сигналы сенсоров в образцах.
На Фиг.3 приведен вид калибровочной зависимости в координатах «введено-найдено» и численные параметры проверочной и калибровочной прямых. Ввиду небольшого количества образцов использовалась полная перекрестная проверка модели. Численные параметры модели (синим цветом калибровка, красным - проверка) позволяют сделать вывод о наличии высокой корреляции между характеристическими сигналами мультисенсора и оценками токсичности, полученными стандартным методом с помощью биосенсора. И в калибровке, и в проверке квадрат коэффициента корреляции близок к единице.
Для демонстрации возможностей системы по предсказанию токсичности неизвестных образцов был проведен следующий эксперимент. Калибровочная модель PLS1 была построена по образцам от 8 и от 16 июля, образцы от 1 июля в калибровке не участвовали. Затем в полученную модель подставили значения откликов массива для образцов от 1 июля и получили предсказанные системой значения токсичностей. Результаты приведены в Таблице 1.2.
Таблица 1.2
Кодировка реплики
Токсичность, установленная с помощью мультисенсора
Ошибка предсказания, ±[единицы токсичности]
Истинное значение токсичности, установленная биосенсором (данные СЛККВ)
1-1-1
1.027
0.04
1
1-1-2
0.983
0.03
1
1-1-3
0.992
0.04
1
1-2-1
0.04
0.06
0
1-2-2
0.02
0.03
0
1-2-3
-0.04
0.06
0
1-3-1
-0.01
0.08
0
1-3-2
0.06
0.04
0
1-3-3
-0.01
0.06
0
Как видно из представленных данных, значения токсичности, предсказанные мультисенсорной системой для всех 9 реплик, совпадают в пределах ошибки со значениями, определенными стандартным методом.
В результате эксперимента установлено, что данные от массива мультисенсорной системы на основе сенсоров с высокой перекрестной чувствительностью могут быть использованы для предсказания токсичности в терминах биосенсоров.
Пример 2. Анализ токсичности морской воды с применением мупьтисенсора на основе потенциометрических сенсоров, откалиброванных по образцам с установленной токсичностью с помощью Phaeodactylum tricornutum.
Мультисенсор для определения токсичности, включающий детектор на основе 10 перекрестно-чувствительных потенциометрических сенсоров, использовали для определения токсичности образцов морской воды. Предварительно осуществлялась калибровка набора сенсоров по 8 образцам воды с известной токсичностью, определенной с помощью морских диатомовых водорослей Phaeodactylum tricornutum на базе СЛККВ. 3 образца воды использовались для предсказания токсичности. Каждый образец был измерен в трех репликах. Для проведения измерений детектор погружали в 50 мл образца таким образом, чтобы сенсорные мембраны оказались полностью покрыты жидкостью. Измерения проводили аналогично условиям, указанным в Примере 1.
В Таблице 2.1 приведены результаты определения токсичности с помощью мультисенсора в сравнении с истинными значениями, полученными с помощью Phaeodactylum tricornutum.
Таблица 2.1
Кодировка образца
Токсичность, установленная с помощью мультисенсора
Ошибка предсказания, ±[единицы токсичности]
Истинное значение токсичности по показанию биосенсора (данные СЛККВ)
1-1-1
1.027
0.04
1
1-1-2
0.983
0.03
1
1-1-3
0.992
0.04
1
1-2-1
0.04
0.06
0
1-2-2
0.02
0.03
0
1-2-3
-0.04
0.06
0
1-3-1
-0.01
0.08
0
1-3-2
0.06
0.04
0
1-3-3
-0.01
0.06
0
Значения токсичности, предсказанные мультисенсором, для всех 9 реплик совпадают в пределах ошибки со значениями, определенными стандартным методом с помощью биобъекта.
Пример 3. Анализ токсичности проб грунта с применением мультисенсора на основе оптических сенсоров, откалиброванных по образцам с установленной токсичностью с помощью инфузорий-туфелек.
В настоящем эксперименте демонстрируется вариант реализации мультисенсора, детектором в котором является спектральный прибор, применяемый для анализа токсичности проб грунта.
Для выполнения работы были выбран спектральный прибор, разработанный и производимый серийно в группе компаний ЛЮМЭКС. В частности, спектры флуоресценции, возбуждения и поглощения измерялись с использованием импульсного спектрофлуориметра «Панорама».
В общем, при флуориметрических исследованиях производится измерение спектральных характеристик возбуждения и/или испускания люминесценции исследуемых объектов в момент воздействия импульсов возбуждающего света. При фотометрических исследованиях проводятся измерения спектральных характеристик поглощения зондирующего излучения в анализируемых объектах. Спектральные области в каналах возбуждения и регистрации люминесценции флуориметра задаются встроенными светосильными монохроматорами. Монохроматоры управляются независимо. При измерениях можно запрограммировать любую функцию их состояний, в частности, можно проводить синхронное сканирование спектров. Оригинальная оптическая схема обеспечивает высокую чувствительность прибора, особенно в ультрафиолетовой области спектра, где фильтровая спектральная селекция затруднена.
Управление прибором осуществлялось от внешнего компьютера. Математическая обработка результатов измерений осуществляется средствами программного обеспечения The Unscrambler v. 9.7 (САМО, Norway), а также иными программными продуктами, для чего был предусмотрен экспорт результатов измерения в форматы ASCii и MS Excel. Прибор подсоединяли к свободному СОМ-порту компьютера по интерфейсу RS-232 или через стандартный адаптер USB-COM.

Для определения общей токсичности была использована программа «СпектраЛЮМ/Про», которая позволяет пользователю изменять калибровки и разрабатывать собственные калибровки. При разработке калибровок использовали следующие математические модели: метод частных наименьших квадратов (PLS), метод регрессии по главным компонентам (PCR).
Для нахождения связи между полученным спектром и концентрациями компонентов исследуемого образца спектрофлуориметр «Панорама» предварительно калибровали. Для проведения калибровки использовали набор образцов, представительный к тем образцам, которые будут в дальнейшем анализироваться, то есть используемый набор включал образцы, свойства которых охватывали весь диапазон возможных значений определяемых показателей и свойств анализируемых образцов.
Образцы для калибровки первоначально анализировали с помощью биосенсора, в качестве которых выступали инфузории-туфельки стандартным референтным методом биотестирования для определения в них значений показателей, а далее производили регистрацию их спектров и рассчитывали калибровочную модель, связывающую спектральные данные со свойствами образца. Для расчета модели использовали методы многомерной обработки данных - метод регрессии по главным компонентам (PCR) и метод дробных наименьших квадратов (PLS).
Образцы воды с установленной токсичностью и данные результатов анализа общей токсичности были предоставлены СЛККВ. В таблице 3.1 приведены данные об образцах.
Таблица 3.1
Образцы воды с заданной токсичностью, используемые для калибровки прибора
Кодировка
Дата и номер образца (СЛККВ)
Истинное значение токсичности по показанию биосенсора (данные СЛККВ)
1-1
01.07.2010, №1
1
1-2
01.07.2010, №2
0
8-1
08.07.2010, №1
0.2
16-1
16.07.2010, №1
0.1
17-1
16.07.2010, №2
0.4
В качестве исследуемых образцов выступали водные растворы, представляющие собой водные вытяжки грунтов, которые готовили путем встряхивания одной части воздушно-сухой пробы грунта и четырех частей дистиллированной воды в течение 2 часов на аппарате для встряхивания, фильтрования полученной вытяжки через обеззоленные фильтры «белая лента» или мембранные фильтры с диаметром пор 2-4 мкм, при необходимости центрифугирования (в течение 10 минут при 4-5 тыс.оборотов/мин) и/или отстаивания в холодильнике до 5 суток, при необходимости разбавления. Измерения производились в стандартной 1 см кварцевой кювете.
По представленным образцам с заданной токсичностью (табл.3.1) осуществлялась калибровка прибора, а измерения токсичности проводились на реальных образцах проб грунта промышленных зон из различных точек отбора с использованием описанной выше методики и последующим измерением токсичности этих проб стандартными биосенсорами.
Таблица 3.2
Результаты измерений токсичности водных вытяжек образцов грунта с помощью мультисенсора, включающего детектор на основе спектрального прибора
Номера проб
Токсичность, предсказанная мультисенсором
Общая токсичность, измеренная биосенсором
1
1,8
1,7
2
2,1
2,3
3
1,3
1,4
4
2,5
2,8
5
0
0
Из результатов, представленных в таблице 3.2, можно видеть практически полное совпадение результатов измерений общей токсичности стандартным биосенсором и оптическим интегральным методом. В качестве пробы №5 была использована бидистиллированная вода.
Пример 4. Анализ токсичности водных образцов из техногенных отходов с применением мультисенсора на основе потенциометрических сенсоров, откалиброванных по образцам с установленной токсичностью с помощью одноклеточных водорослей Chloralla и ракообразных Daphnia.
Были проанализированы 6 образцов водных вытяжек из техногенных отходов неизвестного происхождения с помощью биосенсора Chloralla (аналитический сигнал - % подавления) при кратных разведениях пробы 1, 50 и 500.
Те же образцы были проанализированы с помощью мультисенсора на основе 15 перекрестно-чувствительных потенциометрических сенсоров, каждый из образцов был проанализирован в трех повторностях.
Данные от Chloralla были использованы в качестве референтных для построения многомерной калибровочной зависимости по алгоритму PLS1, при этом в качестве независимых данных использовался отклик совокупности потенциометрических сенсоров.
В таблице 4.1 приведены параметры калибровочных моделей в координатах «введено-найдено» для предсказания % подавления Chloralla (тест-функция). Проверка калибровочных моделей осуществлялась по методу полной перекрестной проверки.
Наклон
Оффсет
RMSE
R<sup>2</sup>
1-кратное разведение
Калибровка
0,98
0,71
1,01
0,98
Проверка
0,81
9,73
4,94
0,74
50-кратное разведение
Калибровка
0,96
1,16
1.21
0,96
Проверка
0.94
1,61
1,54
0.95
Высокие значения наклонов и коэффициентов корреляции позволяют сделать вывод о возможности предсказания общей токсичности в терминах процента подавления Chloralla из данных анализа образцов мультисенсорной системой.
Аналогичный эксперимент был проделан для этих же образцов с помощью биосенсора Daphnia (тест-функция - % смертности). Параметры калибровочных зависимостей представлены в таблице ниже.
Наклон
Оффсет
RMSE
R<sup>2</sup>
Калибровка
0,91
3,13
10,01
0,91
Проверка
0,77
6,91
15,11
0,82