Сравнение синтетазной активности двух видов липаз в неводных средах

БИОХИМИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

УДК 577.15

М. Е. Зиновьева, В. С. Гамаюрова, К. Л. Шнайдер

СРАВНЕНИЕ СИНТЕТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ДВУХ ВИДОВ ЛИПАЗ

В НЕВОДНЫХ СРЕДАХ

Ключевые слова: панкреатическая липаза, липаза из Candida rugosa, синтез этиллаурата.

Показана возможность синтеза этиллаурата в среде гексана с помощью нанокатализаторов - панкреатической липазы и липазы из Candida rugosa. Выход эфира в подобранных условиях составил 89 % при использовании панкреатической липазы и 94 % при использовании липазы, выделенной из Candida rugosa.

Keywords: pancreatic lipase, lipase from Candida rugosa, the synthesis of lauric acid ethyl ester.

The possibility of the synthesis of lauric acid ethyl ester by using pancreatic lipase and Candida rugosa lipase as biocatalysts in organic solvents has been shown.

The yield of lauric acid ethyl ester at the selected conditions was to 89 % with the use of pancreatic lipase and 94 % at using lipase extracted from Candida rugosa.

В настоящее время исследователи во многих странах [1-7] стали уделять внимание ферментативному синтезу душистых веществ. Благодаря высокой каталитической активности и непревзойденной субстратной специфичности ферментов, их применение для синтеза душистых веществ может иметь высокую экономическую эффективность. Для этого наиболее часто используют свободные или иммобилизованные липолитические ферменты, проводя реакции в неводных средах.

Экспериментальная часть

В качестве катализаторов при проведении синтеза этиллаурата были использованы:

1. Панкреатическая липаза - коммерческий препарат Lipase from porcine pancreas, Type II, лиофильно высушенный с активностью 100-400 ед./мг белка.

2. Липаза, выделенная из Candida rugosa - коммерческий препарат Lipase from Candida rugosa, Type VII, лиофильно высушенный с активностью 700-1500 ед./мг белка.

Исследована возможность синтеза этиллаурата в среде гексана в системе жидкость:твердая фаза и в мицеллярной системе аэрозоля ОТ (АОТ, натриевая соль диоктилового эфира сульфоянтарной кислоты).

Количество образовавшегося эфира определяли титриметрическим методом по изменению количества кислоты в системе. Титрование проводили спиртовым раствором щёлочи (0.1 N раствором NaOH) до устойчивой розовой окраски с фенолфталеином в качестве индикатора при температуре 20°С.

Результаты и их обсуждение

В данной работе исследован ферментативный синтез этиллаурата с помощью двух видов липаз - панкреатической липазы и липазы, выделенной из Candida rugosa.

Этиловый эфир лауриновой кислоты (этиллаурат) представляет собой бесцветную или слегка желтоватую жидкость и имеет мягкий, цветочно-фруктовый запах. Он входит в состав композиций при производстве мыла, синтетических моющих средств, товаров бытовой химии [8].

На первом этапе работы была исследована возможность синтеза этиллаурата в среде гексана с помощью панкреатической липазы и липазы из Candida rugosa в системе жидкость:твердая фаза и в мицеллярной системе АОТ.

Мицеллярные системы представляют собой универсальную микрогетерогенную среду для ферментативных реакций. Спонтанное образование мицелл идет в самых различных

органических растворителях, таких, как углеводороды (например, октан или бензол), высшие спирты, хлороформ, а также в их смесях. В качестве мицеллообразующего материала пригодны широко используемые в биохимии детергенты, например, додецилсульфат натрия, алкилированные полиэтиленгликоли (бридж, твин или тритон) или же природные фосфолипиды. Известны как нормальные мицеллы, существующие в воде (при не слишком большой концентрации органических добавок), так и обращенные мицеллы в органических растворителях при умеренном содержании воды. Ограничения, накладываемые на скорость ферментативной реакции диффузией субстрата и продукта, в микроэмульсиях практически отсутствуют из-за огромной удельной поверхности раздела между водными микрокаплями и органическим растворителем. Дополнительное преимущество таких систем состоит в том, что фермент, находящийся внутри микроэмульсионной капли, защищен от денатурирующего воздействия органического растворителя слоем молекул ПАВ.

Однако, как показали проведенные исследования, панкреатическая и микробная липаза в мицеллярной системе проявляют крайне малую синтетазную активность — выход этиллаурата составил 2 % и 1 % при использовании панкреатической липазы и липазы из Candida rugosa, соответственно. Поэтому в дальнейшем было решено использовать для синтеза этиллаурата систему жидкость: твердая фаза.

При проведении синтеза в системе жидкость:твердая фаза лиофильно высушенные ферментные препараты помещали в реакционную среду в нативном виде. Было показано, что в таком виде они сохраняют свою активность без дополнительной иммобилизации. Реакцию вели 24 ч, без перемешивания при температуре 30 °С. Выход продукта составил 14 % и 50 % при использовании в качестве катализатора панкреатической липазы и липазы из Candida rugosa, соответственно, что доказало принципиальную возможность синтеза этиллаурата.

На втором этапе работы был более подробно исследован синтез этиллаурата в среде гексана с целью определения наиболее оптимальных условий протекания процесса.

Ранее проведенные исследования [9] показывают, что наиболее существенное влияние на выход продукта оказывает соотношение субстратов. Поэтому было изучено влияние изменения концентрации спирта в реакционной среде на выход эфира. Полученные данные приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Соотношение субстратов при синтезе этиллаурата

Соотношение кислота: спирт Выход продукта при использовании панкреатической липазы, % Выход продукта при использовании липазы из Candida rugosa, %

1 : 1,0 14,0 і 3,7 50,0 ± 4,6

1 : 1,5 — 59,0 ± 2,9

1 : 2,0 б4,0 і 1,3 73,0 ± 3,1

1 : 2,5 — 73,0 ± 6,0

1 : 3,0 70,0 і 2,2 64,0 ± 1,6

1 : 4,0 72,0 і 3,0 55,0 ± 2,9

1 : 5,0 75,0 і 1,б 37,0 ± 1,6

1 : б,0 78,0 і б,0 —

1 : 7,0 71,0 і 2,3 —

Как видно из представленных данных, при повышении содержания спирта в среде выход эфира плавно увеличивается. Максимальный выход продукта при использовании панкреатической липазы наблюдается при соотношении кислота : спирт 1 : 5 и 1 : 6, а при

использовании липазы из Candida rugosa при соотношении 1 : 2 и 1 : 2,5. При дальнейшем увеличении концентрации этилового спирта в среде выход этиллаурата снижается.

Представленные данные свидетельствуют о том, что микробная липаза более чувствительна к ингибирующему воздействию избытка этилового спирта, чем липаза животного происхождения. Это может быть связано с тем, что на поверхности белковых молекул панкреатической липазы содержится больше гидрофобных групп, чем на поверхности белковых молекул липазы из Candida rugosa, поэтому панкреатическая липаза менее чувствительна к воздействию гидрофильного растворителя, например такого, как этиловый спирт.

Таким образом, изменяя соотношения субстратов, удалось значительно повысить выход целевого продукта с 14 % до 75 % для панкреатической липазы и с 50 % до 73 % для микробной липазы.

Поскольку выход целевого продукта зависит не только от соотношения субстратов, но и от действующего начала - количества ферментного препарата, то для увеличения выхода продукта был проведен ряд опытов с различным содержанием фермента в смеси. Изучение влияния количества фермента на синтез эфира показало целесообразность увеличения его содержания в 2 раза, что отражено на рисунке 1.

Рис. 1 - Влияние количества фермента на синтез этиллаурата при использовании в качестве катализатора: 1 - панкреатической липазы; 2 - липазы из Candida rugosa

Полученные данные показывают, что увеличение концентрации ферментов свыше 20 мг/мл реакционной среды не привело к существенным изменениям выхода эфира. Оказалось, что для микробной липазы это даже привело к снижению выхода этиллаурата, что вероятно связано со снижением доступности ферментов для субстратов.

Поскольку скорость протекания реакции зависит от ряда факторов, оптимальное соотношение водной и неводной частей реакционной среды устанавливается экспериментально. Фермент может проявить в полной мере свои каталитические свойства только в том, случае если он обладает строго определенной конформацией. В свою очередь, конформация молекулы фермента в растворе определяется сложным комплексом водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий. Для того чтобы комбинация этих взаимодействий обеспечивала именно нативную конформацию, молекула фермента должна иметь определенную гидратно-сольватную оболочку.

Исходные ферментные препараты содержат небольшие количества воды (—10—12 %). Неясно, достаточно ли такого количества воды для проявления максимально высокой активности фермента. Поэтому было изучено влияние экзогенно добавленной воды в систему на синтез эфира. Влияние изменения количества воды в реакционной смеси на синтез этиллаурата показано в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние изменения количества экзогенной воды в системе на синтез этиллаурата

Количество добавленной экзогенной воды, % Выход продукта при использовании панкреатической липазы, % Выход продукта при использовании липазы из Candida rugosa, %

0,0 88,0 ± 2,0 80,0 ± 1,5

0,2 88,0 ± 1,4 80,0 ± 1,4

0,4 89,0 ± 2,6 81,0 ± 5,7

0,6 89,0 ± 1,6 81,0 ± 2,1

0,8 84,0 ± 4,9 78,0 ± 2,8

1,0 81,0 ± 4,3 73,0 ± 5,9

Как видно из результатов исследования, при добавлении воды в количестве от 0,2 % до

0,6 % выход этиллаурата незначительно увеличивается. Слабый эффект влияния добавления экзогенной воды на выход эфира можно объяснить тем, что того количества воды, которое содержат исходные ферментные препараты достаточно для проявления их максимальной каталитической активности. А так как вода является участником процесса, то при высоком ее содержании начинает протекать процесс гидролиза эфира.

Известно, что температура оказывает существенное влияние на каталитическую активность фермента. В органических средах ферменты могут проявлять активность при различных температурах. Например, как показывают данные [10], максимальная активность липазы из КМ2отисот т1еке1 в реакции синтеза гексенилацетата в среде гексана наблюдалась при температуре 49 °С. А при изучении термостабильности панкреатической липазы в неводных средах показано, что оптимальной температурой для проявления максимальной активности фермента является температура 60 °С [11].

Влияние температуры на синтез этиллаурата показано на рисунке 2.

Рис. 2 - Влияние температуры на синтез этиллаурата при использовании в качестве катализатора: 1 - панкреатической липазы; 2 - липазы из Candida rugosa

Как видно из рисунка, оптимальной температурой для синтеза этиллаурата в гексане оказалась температура 30 °С. Тогда как в водной среде оптимальной температурой действия исследуемых липаз, является температура 37 °С. Таким образом, температурный оптимум действия и микробной, и животной липазы в органической среде ниже, чем в водной среде.

Исследованная в работе система гетерогенна, и перемешивание может положительно сказаться на процессе за счет увеличения скорости диффузии субстратов и продуктов реакции к границе раздела фаз. Результаты исследований показали, что перемешивание не вызывало существенного повышения активности ферментов, как следовало бы ожидать. Выход эфира при использовании панкреатической липазы в системах с перемешиванием был ниже, чем в отсутствии перемешивания. По-видимому, перемешивание нарушает целостность частиц ферментного препарата, приводит к усилению ингибирующего действия органической среды на фермент. При действии микробной липазы выход продукта был незначительно выше. Данные приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние перемешивания на синтез этиллаурата

Условия проведения Выход эфира при Выход эфира при

процесса использовании использовании липазы из

панкреатической липазы, % Candida rugosa, %

С перемешиванием 10,0 ± 0,7 42,0 ± 2,5

Без перемешивания 45,0 ± 2,1 40,0 ± 1,2

Скорость ферментативной реакции, как и активность фермента, в значительной степени определяется присутствием в среде активаторов и ингибиторов: первые повышают скорость реакции, а вторые тормозят эту реакцию.

В работе были исследованы химический метод активации ферментов - добавление ионов кальция и физический метод активации путем воздействия на ферментный препарат электромагнитного излучения крайне высокой частоты.

Из литературных данных [12,13] известно, что ионы кальция являются стабилизатором панкреатической липазы в водной среде, поэтому было исследовано влияние добавления водного раствора Са+2 в различных концентрациях на процесс синтеза этиллаурата

Неожиданным фактом оказалось, что в исследуемых условиях добавление раствора хлорида кальция снижает активность панкреатической липазы и, соответственно, выход этиллаурата. В то время как выход эфира при использовании в качестве катализатора микробной липазы при добавлении хлорида кальция (в концентрации 0,48 мкМ/мл) увеличился на 14 %.

Вероятно, что при действии ионов кальция на панкреатическую липазу происходит изменение конформации фермента в сторону увеличения его гидролитической, а не синтетазной активности. Также причиной снижения активности может быть то, что изменение конформации фермента при добавлении ионов кальция делает панкреатическую липазу более чувствительной к негативному воздействию на нее органического растворителя (гексана).

Так как белковые молекулы липазы из Candida rugosa имеют иное строение и более гидрофильную поверхность, то возможно, что ионы Са+2 закрепляют активную конформацию этого фермента. Вследствие этого, выход этиллаурата повышается.

Электромагнитное излучение способно оказывать воздействие практически на все известные типы клеток (нервные, мышечные, рецепторные и другие) в системах любого уровня организации биологического объекта исследований (одиночные клетки, культура клеток, колонии микроорганизмов, культура ткани, изолированные органы, целостный организм) [14]. Наблюдаемые закономерности действия на живые организмы

монохроматических электромагнитных излучений объясняются тем, что, проникая в организм, эти излучения на определенных (резонансных) частотах трансформируются в информационные сигналы, осуществляющие управление и регулирование восстановительными и приспособительными процессами в организме.

С целью изучения влияния электромагнитного излучения крайне высокой частоты на активность ферментов проводили облучение ферментных препаратов с использованием

частотного генератора ГЧ-142. Параметры излучения: частота излучения 61,22 ГГц, мощность излучения 50 мВт/см2, время экспозиции - 10 мин, расстояние от рупора излучателя до объекта 10 см. Полученные результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4 - Влияние облучения на синтез этиллаурата

Фермент Выход эфира, %

Панкреатическая липаза облученная 50,0 ± 1,0

не облученная 89,0 ± 1,6

Липаза из Candida rugosa облученная 49,0 ± 1,4

не облученная 94,0 ± 0,1

Электромагнитное облучение данной частоты не приводит к увеличению выхода эфира, а наоборот, снижает активность панкреатической липазы на 39 % и микробной липазы на 45 %.

Возможность повторного использования ферментного препарата в процессе синтеза снижает, с экономической точки зрения, затраты на проведение процесса. Неоднократное применение ферментов в реакциях синтеза эфира возможно, однако, каталитическая активность фермента снижается. Если при повторном использовании панкреатической липазы выход продукта понизился на 17 %, то при третьем - уже на 23 %. При использовании микробной липазы во второй раз выход уменьшился на 13 %, а в третий раз - на 30 %.

После определения оптимальных условий проведения синтеза этиллаурата с помощью двух видов липаз была изучена временная зависимость выхода эфира. Полученные зависимости отражены на рисунке 3.

Время, ч

Рис. 3 - Влияние времени на синтез этиллаурата при использовании в качестве катализатора: 1 - панкреатической липазы; 2 - липазы из Candida rugosa

Как видно из представленных данных, при использовании и микробной, и животной липазы с увеличением времени реакции выход эфира плавно возрастает. При проведении реакции синтеза с использованием микробной липазы в течение 16 ч выход эфира составил 91 % и в дальнейшем менялся незначительно. При использовании панкреатической липазы по мере увеличения времени процесса выход эфира увеличивается, достигая максимума в 89 % при 24 ч. Таким образом, оптимальное время проведения процесса синтеза -24 ч для панкреатической липазы и 16 ч - для микробной липазы.

Для подтверждения получения целевого продукта был использован метод тонкослойной хроматографии.

Таким образом, изучена возможность синтеза этилового эфира лауриновой кислоты с помощью панкреатической липазы и липазы из Candida rugosa в неводных средах. Подобраны оптимальные условия синтеза этиллаурата.

Сравнивая активность исследованных липаз, для получения этиллаурата в среде гексана можно рекомендовать липазу, выделенную из Candida rugosa.

Литература

1. Bezbradica, D. Studies on the specifity of Candida rugosa lipase catalyzed esterification reactions in organic media / D. Bezbradica, I. Karalazic, N. Ognjanovic // J. Serb. Chem. Soc. - 2006. - №71. - Р. 3141.

2. Carta, G. Enzymatic synthesis of esters using an immobilized lipase / G. Carta, J. L. Gainer, A. H. Benton // Biotechnol. Bioeng. - 2004. - №37. - P. 1004-1009.

3. Chen, J.P. Production of ethyl butyrate using gel-entrapped Candida cylindracea lipase / J. P. Chen // Journal of Fermentation and Bioengineering. - 1996. - №82. - Р. 404-407.

4. Knezevic-Jugovic, Z. Lipase catalyzed synthesis of flavor esters in non-aqueous media: Optimization of the yield of pentyl 2-methylpropanoate by statistical analysis / Z. Knezevic-Jugovic, D. Bezbradica, Z. Jakovlevic // J. Serb. Chem. Soc. - 2008. - №73. - Р. 1139-1151.

5. Yee, L.N. Pseudomonas sp. lipase-catalyzed synthesis of geranyl esters by transesterification / L. N. Yee, C. C. Akoh, R. S. Phillips // Journal of the American Oil chemists’ society. - 1995. - №72. - Р. 1407-1408.

6. De los Rios, A.P. Synthesis of flavour esters using free Candida antarctica lipase B in ionic liquids / A. P. De los Rios, F. J. Hernandez-Fernandez, F. Tomas-Alonso, D. Gamez, G. Villora // Flavour and Fragrance Journal. - 2008. - №23. - Р. 319-322.

7. Chen, H.C. Optimization of immobilized Candida rugosa lipase LIP2-catalyzed resolution to produce L-menthyl acetate / H. C. Chen, Y. T. Liang, J. Chen, C. J. Shieh // Biocatalysis and Biotransformation. -2009. - №27. - Р. 296-302.

8. Братус, И.Н. Химия душистых веществ / И. Н. Братус. - М.: Агропромиздат, 1992. - 240 с.

9. Елизарова, Е.В. Ферментативная этерификация органических кислот алифатическими спиртами / Е. В. Елизарова, М. Е. Зиновьева, В. С. Гамаюрова // Вестник КГТУ. - 2006. - №6. - С. 69-73.

10. Chiang, W.D. Studies on the optimized lipase-catalyzed biosynthesis of cis-3-hexen-1-yl acetate in n-hexane / W. D. Chiang, S. W. Chang, C. J. Shieh // Process Biochemistry. - 2003. - №38. - Р. 1193-1199.

11. Kiran, K.R. Thermostability of porcine pancreas lipase in non-aqueous media / K. R. Kiran, S. Divakar // Process Biochemistry. - 2001. - №36. - Р. 885-892.

12. Saboury, A.A. Thermodynamic studies on the interaction of calcium ions with alpha-amylase/

A. A. Saboury, F. Karbassi // Thermoclinica Acta. - 2000. - №362. - P. 121-129.

13. Francisco, J. The role of calcium ions and bile salts on the pancreatic lipase-catalyzed hydrolysis of triglyceride emulsions stabilized with lecithin / J. Francisco, A. J. Stella, V. J. Stella // Pharmaceutical research. - 1989. - № 6. - Р. 449-457.

14. Брюхова, А. К. Влияние ЭМИ миллиметрового диапазона, лазерного излучения и их комбинированного действия на свойства микроорганизмов / А. К. Брюхова, М. Б. Голант,

B. С. Исаева, Н.С. Ландау // В сб. под ред. акад. Девяткова Н. Д. - М.: ИРЭ АН СССР, 1987.

© М. Е. Зиновьева - канд. техн. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, zino-mari@yandex.ru; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. пищевой биотехнологии КГТУ, gamaur@kstu.ru; К. Л. Шнайдер - канд. хим. наук, асс. той же кафедры, 0202-84@mail.ru