СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ДНК, ПРИГОДНОЙ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ, ИЗ СУХИХ ПЯТЕН КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ
METHOD OF DNA EXTRACTION, SUITABLE FOR CONDUCTING QUANTITATIVE REAL-TIME PCR, FROM DRY BLOOD SPOTS OF NEWBORNS

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для получения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) из сухих пятен цельной крови новорожденных, нанесенных на фильтровальную карточку для неонатального скрининга, и ее дальнейшего исследования методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).
Существующие на сегодня наборы для экстракции ДНК из сухого пятна крови (например, «Экстра-ДНК-Био» №400-20 (Алькор Био, Россия), «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия)) [1, 2] позволяют добиться выделения качественной ДНК, пригодной для ее дальнейшего исследования молекулярно-генетическими методами: аллель-специфичной ПЦР, методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и прямого секвенирования по Сэнгеру. Однако в инструкции к перечисленным наборам не указано рекомендуемое количество биологического материала (сухих пятен крови), которое необходимо взять в работу для получения ДНК требуемого качества. Между тем, проблема использования сухих пятен крови новорожденных для выделения ДНК состоит именно в наличии ограниченного количества исходного биологического материала, особенно при ретроспективном исследовании для верификации диагноза у детей с летальными исходами, когда биологический материал не может быть взят повторно.
Кроме того, метод количественной ПЦР в реальном времени предусматривает особые требования к исследуемым образцам. В частности, требуется брать одинаковый объем цельной крови для выделения ДНК у всех образцов, поскольку происходит сравнение количества продукта ПЦР, образующегося при амплификации исследуемого локуса, с количеством продукта ПЦР контрольного локуса и определяются их количественные соотношения в геноме. Такое условие не представляет сложности при работе с образцами жидкой цельной крови. Однако при выделении ДНК из пятен сухой крови на фильтровальной карточке практически невозможно определить точный объем взятого количества крови, если не указан размер пятна, взятого в исследование.
Технология неонатального скрининга предусматривает процедуру выбивания дисков стандартного размера 3,2 мм из пятен крови с помощью автоматического оборудования типа DBS Puncher Instrument (PerkinElmer, Finland) или ручным дыроколом типа Single Hole Punch, 1/8" Hole Size (USA). Известны способы экстракции ДНК из 1 стандартного диска, выбитого из сухого пятна крови новорожденных, для проведения количественной ПЦР с целью оценки количества наивных Т-лимфоцитов, основанной на определении количества копий эксцизионных колец Т-клеточного рецептора (TREC): "MyTREC RealTime qPCR Assay Reagent Kit" (GenenPlus, USA), [3] "The EnLite™ Neonatal TREC Kit" (PerkinElmer, Finland) [4]. Однако в указанных наборах выделение ДНК не является самостоятельной методикой, а служит одним из этапов непрерывного автоматизированного процесса анализа образца. Кроме того, возможность применения данных тест-систем на российском рынке ограничена следующими документами: Приказом Минпромторга России №655 от 31 марта 2015 года «Об утверждении плана мероприятий по импортозамещению в отрасли медицинской промышленности Российской Федерации» [5] и Постановлением Правительства РФ №102 от 5 февраля 2015 г. «Об установлении ограничения допуска отдельных видов медицинских изделий, происходящих из иностранных государств, для целей осуществления закупок для обеспечения государственных и муниципальных нужд» [6].
Таким образом, для получения корректных результатов исследований методом количественной ПЦР в реальном времени требуется стандартизация образцов сухих пятен, взятых для выделения ДНК, по объему цельной крови, нанесенной на фильтровальную бумагу. При этом должны соблюдаться следующие условия:
- биологический материал из фильтровальной карточки должен быть взят в минимальном количестве (количество материала на карточке ограничено пятью стандартными пятнами крови для неонатального скрининга - по одному пятну на одно скринируемое заболевание);
- взятого количества должно быть достаточно для выделения качественной ДНК (качественный ДНК-продукт - условие успешного прохождения реакции амплификации);
- цифровое значение этого количества должно быть удобным для последующих расчетов (например, при исследовании ДНК на первичные иммунодефицитные состояния, требуется рассчитать количество копий маркеров Т-клеточного (TREC) и В-клеточного неогенеза (KREC) в образце крови на количество лейкоцитов в данном объеме крови с учетом внутреннего контроля).
Прототипом для нашего способа экстракции ДНК послужил отечественный комплект реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия).
Технической задачей изобретения является уменьшение количества исходного биологического материала, взятого для исследования, удобство и простота использования данного значения для дальнейших расчетов, а также доступность метода для ПЦР-лабораторий российских ЛПУ (лечебно-профилактических учреждений)
Технический результат достигается за счет минимизации количества материала, требуемого для получения качественной ДНК (3 выбитых стандартных диска), удобства в расчетах при проведении исследования методом количественной ПЦР в реальном времени (достигается единый объем цельной крови, взятой в реакцию).
Для достижения указанного результата предлагается способ экстракции ДНК, пригодной для проведения количественной ПЦР в реальном времени, из сухих пятен крови, нанесенных на фильтровальные карточки для неонатального скрининга, характеризующийся тем, что из сухого пятна крови выбивают 3 стандартных диска диаметром 3,2 мм каждый, вносят их в центрифужную пробирку «Эппендорф» объемом 1,5 мл, заливают 150,0 мкл лизирующего буфера, тщательно встряхивают на шейкере и, после краткосрочного центрифугирования в течение 15 с, инкубируют в термостате при 65°С на протяжении 45 мин, встряхивая каждые 15 мин, затем пробирки помещают в центрифугу «Mini Spin» и центрифугируют в течение 5 мин при 12500 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в чистую пробирку, добавляют 15 мкл Сорбента из набора «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ООО «НекстБио», Россия) и проводят экстракцию ДНК, используя указанный набор.
Предлагаемый способ выделения ДНК из сухих пятен крови для проведения количественной ПЦР может быть также реализован на базе существующих вариантов методики выделения геномной ДНК из любого биологического материала следующей последовательностью действий.
В реакцию выделения ДНК берут 3 диска, выбитых из сухого пятна крови на фильтровальной карточке ручным дыроколом. Указанные диски (3 шт. от каждого образца) помещают в пробирки типа «Эппендорф» объемом 1,5 мл, заливают 150 мкл лизирующего буфера, тщательно встряхивают на шейкере и после краткосрочного центрифугирования в течение 15 с инкубируют в термостате при 65°С на протяжении 45 мин, встряхивая на шейкере каждые 15 мин. Для исключения контаминации соседних образцов область ножа пробойника после каждого образца обрабатывают 70% раствором этанола и обжигают в пламени горелки. По окончании инкубации пробирки помещают в центрифугу «Mini Spin» (Eppendorf, USA) и центрифугируют в течение 5 мин при 12500 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в чистую пробирку и добавляют 15 мкл сорбента, входящего в состав набора. Дальнейшая процедура экстракции не отличается от инструкции фирмы-производителя. С целью концентрирования образца ввиду малого количества материала ДНК элюируют в 50 мкл ТЕ-буфера. Хранение образцов ДНК производится при -30°С без удаления сорбента.
260
280
Экспериментальным путем подтверждено, что данный объем крови (3 диска) отвечает вышеуказанным требованиям: концентрация полученных растворов ДНК составляет 10-30 нг/мкл; отношение поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм (коэффициент А/А) находится в пределах 1,7-1,9, что свидетельствует о высокой чистоте препаратов. Измерение концентрации ДНК и степени ее чистоты определялись спектрофотометрическим методом с использованием NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, USA).
Пример 1. Определение нормативных значений TREC и KREC в группе условно здоровых новорожденных
Образцы ДНК, полученной описанным выше методом, мы использовали для диагностики состояния иммунной системы новорожденных на основе оценки количества наивных Т- и В-клеток, суррогатными маркерами которых являются кольцевые молекулы ДНК TREC и KREC. Работа выполнена с помощью мультиплексной тест-системы "TREC&KREC", разработанной в Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской Академии Наук (ИХБФМ СО РАН, Новосибирск) и Новосибирского государственного исследовательского университета (Новосибирск) совместно с ГБУЗ «Детская городская клиническая больница №9 (ДГКБ №9) им. Г.Н. Сперанского (Москва) [8].
Согласно заявленной тест-системе, абсолютное количество молекул TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в анализируемом образце ДНК определяется с помощью калибровочных кривых. Поскольку концентрации TREC, KREC и нормировочного локуса IL17RA в калибровочных кривых выражены в копиях молекул на миллилитр, то и количество данных маркеров для каждого исследуемого образца, определяемое в течение реакции, выражается в тех же единицах - копиях на миллилитр. Учитывая количество взятого в реакцию объема раствора ДНК, можно получить размерность маркеров в копиях на реакцию. Однако для клинициста-иммунолога гораздо важнее знать не абсолютное количество TREC и KREC на один миллилитр цельной крови пациента или на одну абстрактную реакцию, а долю наивных Т- и В-клеток (суррогатными маркерами которых и являются TREC и KREC соответственно) среди всех клеток лейкоцитарного ряда. Таким образом, зная количество ядросодержащих клеток в единице объема цельной крови, взятой в реакцию выделения ДНК, можно легко пересчитать количество TREC (KREC) на количество лейкоцитов.
5
При исследовании ДНК, выделенной из цельной крови, количество копий TREC(KREC) в образце рассчитывают на 10 лейкоцитов с учетом внутреннего контроля, осуществляемого нормировочным локусом IL17RA, по формуле [9]:
Количество TREC(KREC)=(количество копий TREC(KREC) в 1 мл / количество копий IL17RA в 1 мл)⋅200000.
6
5
Данная формула учитывает количество ядросодержащих клеток в образце крови, взятой для выделения ДНК (100 мкл): 1 мл крови содержит примерно 10 лейкоцитов, следовательно, в 0,1 мл их 10, к тому же, количество клеток в 2 раза меньше копий IL17RA (в связи с диплоидным набором хромосом у человека).
4
При исследовании ДНК, выделенной из сухих пятен крови, разработанным нами способом количество копий TREC(KREC) в образце рассчитывают на 10 лейкоцитов с учетом внутреннего контроля IL17RA:
Количество TREC(KREC) = (количество копий TREC(KREC) в 1 мл / количество копий IL17RA в 1 мл)⋅20000.
4
Данная формула также учитывает количество ядросодержащих клеток в образце крови: количество клеток в 2 раза меньше копий IL17RA, а объем материала для выделения ДНК (3×3,2 мкл=9,6~10 мкл (0,01 мл) цельной крови [10]). С учетом объема реакции и в пересчете на лейкоциты числитель равен 2⋅10 (20 000).
5
7
4
В ходе исследования было выполнено количественное определение копий TREC, KREC и гена рецептора интерлейкина 17 - IL17RA - (в качестве внутреннего контроля взятия материала) в лимфоцитах 52 условно-здоровых новорожденных (26 девочек и 26 мальчиков). По результатам исследования количество фрагмента контрольного гена IL17RA составило 9,0⋅10-7,0⋅10 копий на мл цельной крови, что соответствует валидному уровню данного нормировочного локуса, заявленного в инструкции производителя (более 5,0⋅10 копий на мл цельной крови) [9]. Количественные значения уровней TREC и KREC, рассчитанные по вышеуказанной формуле, представлены в таблице 1.
Данные количественные значения TREC и KREC, впервые полученные в Российской Федерации в образцах ДНК, выделенной из сухих пятен крови новорожденных, использовались нами в дальнейшем как нормативные значения.
Пример 2. Клинический случай. Ретроспективное количественное определение уровней TREC и KREC у ребенка с Х-сцепленной агаммаглобулинемией
Мальчик П., ребенок от II беременности (I - девочка, здорова), роды в срок. Масса при рождении - 3390 г, рост 53 см. Привит БЦЖ, гепатит В. Грудное вскармливание до 3-х месяцев.
Анамнез заболевания: в 3,5 мес - респираторная вирусная инфекция, экссудативный отит, в 4 мес - серозный менингит, в 5 мес - острая вирусная инфекция - ларинготрахеит, серозный менингит.
Уровень иммуноглобулинов в периферической крови в возрасте 4-х месяцев: IgА - 0.05 г/л, IgМ - 0,2 г/л, IgG - 0,75 г/л.
На основании клинических и лабораторных данных мальчику П. в возрасте 6-ти месяцев был поставлен диагноз - «Первичный иммунодефицит, агаммаглобулинемия с дефицитом В-клеток».
4
4
Из архива лаборатории неонатального скрининга была извлечена фильтровальная карточка с сухими пятнами крови П., взятой на 4-е сутки жизни ребенка. Ретроспективное исследование количества копий кольцевых участков ДНК Т-клеточного и В-клеточного рецепторов лимфоцитов (TREC и KREC) в образце ДНК, полученном разработанным нами способом, показало полное отсутствие KREC в генетическом материале (0,0 копий/10L) при нормальном количестве копий TREC (280,2 копий/10L). Это явилось косвенным подтверждением наличия генетической причины дефекта В-клеточного компонента иммунной системы ребенка.
В дальнейшем, при секвенировании кодирующей части гена ВТК во втором экзоне гена была обнаружена делеция 13 нуклеотидов c.64-76del13 (delCCTCTAAACTTCA, p.P22fsX28), приводящая к сдвигу рамки считывания и преждевременной остановке синтеза тирозинкиназы.
В представленном клиническом случае своевременное тестирование ДНК, выделенной описываемым способом из сухого пятна крови новорожденного П., на KREC могло предупредить развитие тяжелых инфекций у мальчика в первые месяцы жизни и значительно сократить время до постановки правильного диагноза.
Источники информации
1. Инструкция по применению комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «Экстра-ДНК-Био» №400-20 (РУ № ФСР 2012/13631 от 29.06.2012).
2. Инструкция по применению комплекта реагентов для экстракции ДНК из клинического материала «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (РУ № ФСР 2012/14019 от 30.10.2012).
3. Sreelatha Reddy. My TREC RealTime qPCR Assay Reagent Kit for Quantification of Human T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) // J Clin Epigenet. - 2015. - Vol. 1. - No. 1-4.
4. The EnLite™ Neonatal TREC Kit. URL: http://newbornscreening.perkinelmer.com/products/enlite_neonatal_tree_instrument/enlite_neonatal_trec_kit (дата доступа 02.12.2016).
5. Приказ Минпромторга России №655 от 31 марта 2015 года «Об утверждении плана мероприятий по импортозамещению в отрасли медицинской промышленности Российской Федерации» URL: http://minpromtorg.gov.ru/docs/#!prikaz_655_ot_31_marta_2015_goda (дата доступа 02.12.2016).
6. Постановление Правительства РФ №102 от 5 февраля 2015 г. «Об установлении ограничения допуска отдельных видов медицинских изделий, происходящих из иностранных государств, для целей осуществления закупок для обеспечения государственных и муниципальных нужд». URL: http://pravo.gov.ru/proxy/ips/?docbody=&nd=102367173 (дата доступа 02.12.2016).
7. Jacalyn L. Gerstel-Thompson, Jonathan F. Wilkey, Jennifer C. Baptiste, Jennifer S. Navas, Sung-Yun Pai, Kenneth A. Pass, Roger B. Eaton, Anne Marie Comeau. High-Throughput Multiplexed T-Cell-Receptor Excision Circle Quantitative PCR Assay with Internal Controls for Detection of Severe Combined Immunodeficiency in Population-Based Newborn Screening // Clinical Chemistry. - 2010. - 56:9. - P. 1466-1474.
8. Способ диагностики состояния иммунной системы пациента и набор праймеров, зондов и стандартных образцов для количественной оценки ДНК молекул TREC, KREC и количества геном-эквивалентов ДНК (патент Российской Федерации №2587540 от 20.06.2016).
9. Инструкция по применению набора реагентов для количественного определения молекул ДНК TREC и KREC в цельной крови и сухих пятнах крови методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
10. Wood S., Neudert L., Meunier L., Struwe P. Assesment of factors influencing method precision in a human dried blood spot assay for the determination of a novel analyte // Poster Presentation at the dried blood spot sampling in the pharmaceutical industry meeting. Philadelphia, May 3-4, 2011.