СПОСОБ ЭФФЕКТИВНОЙ ОЧИСТКИ НЕЙТРАЛЬНЫХ ОЛИГОСАХАРИДОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОЛОКА (ОЧМ), ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ

1. Способ очистки нейтральных олигосахаридов человеческого молока (ОЧМ), осуществляемый в периодическом режиме или в непрерывном режиме, от ферментативного бульона, полученного при микробиологической ферментации, причем ферментативный бульон включает нейтральный ОЧМ, биомассу, компоненты среды и загрязняющие вещества, и чистота нейтрального ОЧМ в ферментативном бульоне составляет < 80%,
отличающийся тем, что ферментативный бульон подвергают следующим этапам очистки:
i) отделение биомассы от ферментативного бульона,
ii) обработку в катионном ионообменном устройстве для удаления положительно заряженного материала,
iii) обработку в анионном ионообменном устройстве для удаления отрицательно заряженного материала,
iv) этап нанофильтрации и/или этап электродиализа,
при этом получают очищенный раствор, включающий нейтральный ОЧМ с чистотой ≥ 80%.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нейтральный ОЧМ очищают от ферментативного бульона, полученного при микробиологической ферментации с использованием рекомбинантного микроорганизма, предпочтительно бактерий или дрожжей, более предпочтительно рекомбинантного микроорганизма, выращенного в среде с определенным химическим составом, причем биомассу, отделенную в этапе i), возможно направляют рециклом на микробиологическую ферментацию.
3. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что чистота нейтрального ОЧМ в ферментативном бульоне составляет ≤ 70%, ≤ 60%, ≤ 50%, ≤ 40%, ≤ 30%, ≤ 20%, ≤ 10% или ≤ 5%, и/или очищенный раствор содержит нейтральный ОЧМ, имеющий чистоту ≥ 85%, предпочтительно ≥ 90%.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выход нейтрального ОЧМ составляет > 75%, и/или очищенный раствор не содержит ДНК, белков и/или рекомбинантного генетического материала.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нейтральный ОЧМ выбран из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-неофукопентаозы, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы V, лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукогексаозы II, 6'-галактозиллактозы, 3'-галактозиллактозы, лакто-N-гексаозы и лакто-N-неогексаозы.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что отделение биомассы от ферментативного бульона выполняют
a) ультрафильтрацией, предпочтительно отделением биомассы и материалов с молекулярной массой > 500 кДа, более предпочтительно > 150 кДа; и/или
b) фильтрованием через перекрестноточный фильтр, предпочтительно имеющий границу пропускания ≤ 100 кДа, более предпочтительно границу пропускания ≤ 10 кДа, еще более предпочтительно границу пропускания ≤ 5 кДа;
причем этап а) предпочтительно выполняют перед этапом b).
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при осуществлении способа по меньшей мере один из этапов очистки ii)-iv) повторяют по меньшей мере один раз.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ферментативный бульон по меньшей мере один раз подвергают обработке активированным углем после проведения по меньшей мере одного из этапов очистки i)-iv) для адсорбции на активированном угле окрашивающего материала и более крупных олигосахаридов.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что
a) после проведения по меньшей мере одного из этапов очистки i)-iv); или
b) после проведения по меньшей мере одной обработки активированным углем для адсорбции на активированном угле окрашивающего материала и более крупных олигосахаридов; или
c) перед проведением этапа концентрирования, который выполняют после проведения по меньшей мере одного из этапов очистки i)-iv);
раствор, включающий нейтральный олигосахарид человеческого молока, подвергают диафильтрации и/или концентрированию, предпочтительно с помощью нанофильтрационной мембраны, более предпочтительно с помощью нанофильтрационной мембраны, имеющей ограничение по размерам ≤ 20 , причем наиболее предпочтительно раствор подвергают диафильтрации до тех пор, пока его проводимость не составит ≤ 15 мСм/см, предпочтительно ≤ 10 мСм/см, более предпочтительно ≤ 5 мСм/см.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед этапом i) выполняют этап обработки ферментативного бульона глюкозидазой, предпочтительно обработки β-глюкозидазой, где указанную обработку предпочтительно выполняют следующим образом:
a) добавлением штамма микроорганизма, способного экспрессировать один или более фермент (ферментов) гликозидаза, подходящих для разложения нежелательных промежуточных соединений, субстратов и/или побочных продуктов синтеза олигосахарида; и/или
b) применением ферментационного штамма, который экспрессирует один или более фермент (ферментов) гликозидаза, предпочтительно добавлением в ферментативный бульон индуцирующего агента и/или изменением температуры ферментативного бульона; и/или
c) добавлением одной или более гликозидазы (гликозидаз), предпочтительно по меньшей мере β-глюкозидазы, в ферментативный бульон в виде неочищенного фермента или в виде очищенного фермента.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после проведения по меньшей мере одного из этапов очистки i)-iv), предпочтительно после проведения этапа очистки iv), ферментативный бульон концентрируют вакуумным испарением или с помощью обратного осмоса или нанофильтрации
a) до концентрации ≥ 100 г/л, предпочтительно ≥ 200 г/л, более предпочтительно ≥ 300 г/л; и/или
b) при температуре < 80°С, предпочтительно < 50°С, более предпочтительно от 20°С до 50°С, еще более предпочтительно от 30°С до 45°С вакуумным испарением или с помощью обратного осмоса; и/или
c) при температуре < 80°С, предпочтительно < 50°С, более предпочтительно от 20°С до 50°С.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный раствор подвергают фильтрованию в стерильных условиях, и/или из раствора удаляют эндотоксины, предпочтительно фильтрованием очищенного раствора через фильтр с ограничением по массе, составляющим 3 кДа.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный раствор концентрируют до концентрации >1,5 М и охлаждают до температуры < 25°, более предпочтительно < 8°С, с получением кристаллического материала нейтрального ОЧМ.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что очищенный раствор подвергают распылительной сушке, в частности, распылительной сушке при концентрации нейтрального ОЧМ от 20 до 60 (масс./об.), предпочтительно от 30 до 50 (масс./об.), более предпочтительно от 35 до 45 (масс./об.), при температуре сопла от 110 до 150°С, предпочтительно от 120 до 140°С, более предпочтительно от 125 до 135°С, и/или при температуре выпускного отверстия от 60 до 80°С, предпочтительно от 65 до 70°С.
15. Нейтральный олигосахарид человеческого молока (ОЧМ), который может быть получен способом по любому из пп. 1-14, причем нейтральный ОЧМ предпочтительно подвергнут распылительной сушке или кристаллизации.
16. ОЧМ по п. 15, отличающийся тем, что нейтральный ОЧМ выбран из группы, состоящей из 2'-фукозиллактозы, 3-фукозиллактозы, 2',3-дифукозиллактозы, лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-неофукопентаозы, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-неофукопентаозы V, лакто-N-дифукогексаозы I, лакто-N-дифукогексаозы II, 6'-галактозиллактозы, 3'-галактозиллактозы, лакто-N-гексаозы и лакто-N-неогексаозы.
17. ОЧМ по п. 15, отличающийся тем, что ОЧМ
a) имеет проводимость раствора концентрацией 300 г/л, составляющую менее 1 мСм/см;
b) не содержит рекомбинантного материала ДНК, возможно не содержит какой-либо ДНК; и/или
c) не содержит белков, полученных из рекомбинантных микроорганизмов, возможно не содержит каких-либо белков.
18. ОЧМ по любому из пп. 15-17 для применения в медицине, предпочтительно для применения в профилактике или лечении желудочно-кишечного расстройства.
19. Применение ОЧМ по любому из пп. 15-18 в качестве добавки к пище, предпочтительно в качестве добавки к пище человека и/или к корму для домашних животных, более предпочтительно в качестве добавки к детскому питанию.