Остеогенный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пульпы молочных зубов до и после криоконсервации

остеогенный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из пульпы молочных зубов до и после криоконсервации

Т.Б. Бухарова 1, Г.Е. Леонов 1, Е.В. Галицына 1, А.В. Васильев 123, И.В.Вахрушев 4, Е.Б. Вихрова 1, О.В. Махнач1, Д.В. Гольдштейн 1

1 Медико-генетический научный центр, Москва, Россия

2 Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии, Москва, Россия

3 Российский университет дружбы народов, Москва, Россия

4 Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Россия

Osteogenic potential of multipotent mesenchymal stromal cells from human exfoliated deciduous teeth before and after cryopreservation

T.B. Bukharova 1, G.E. Leonov1, E.V. Galitsyna 1, A.V. Vasilyev123,1.V. Vakhrushev4, E.B. Vikhrova 1,0.V. Makhnach 1, D.V. Goldstein 1

1 Research Centre for Medical Genetics, Moscow, Russia

2 Central Research Institute of Dental and Maxillofacial Surgery, Moscow, Russia

3 Peoples' Friendship University of Russia, Moscow, Russia

4 Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia

Для эффективного применения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) из пульпы выпавших молочных зубов с целью стимулирования регенерации костной ткани необходимы данные о влиянии криоконсер-вации на способность этих клеток дифференцироваться в остеогенном направлении.

Культуры ММСК пульпы выпавших молочных зубов были подвергнуты криоконсервации. До и после замораживания индуцировали дифференцировку клеток в остеогенном направлении в присутствии витамина й3 или дексаметазона и оценивали экспрессию остеогенных маркеров: остеокальцина, щелочной фосфатазы, ВМР-2 и РипХ2 — с помощью ПЦР-анализа в режиме реального времени. Минерализацию внеклеточного матрикса оценивали путем окрашивания ализариновым красным.

Инкубация ММСК пульпы выпавших молочных зубов в остеогенной среде, содержащей витамин й3, приводила к повышению экспрессии маркеров остеогенной диффе-ренцировки: остеокальцина, щелочной фосфатазы, ВМР-2 и Рипх2 — и увеличению синтеза и минерализации внеклеточного матрикса как до, так и после криоконсервации. В присутствии витамина й3 экспрессия генов щелочной фосфатазы, ВМР-2 и РипХ2 на 14 сут. после криоконсер-вации была выше, чем до замораживания. Добавление витамина й3 приводило к более высокому уровню экспрессии генов остеокальцина, ВМР2 и РипХ2 по сравнению с использованием дексаметазона на 14 сут. дифференцировки как до, так и после криоконсервации.

Сохранение остеогенного потенциала после криокон-сервации может служить необходимой предпосылкой для банкирования ММСК пульпы молочных зубов с целью дальнейшей ауто- или аллотрансплантации.

Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки из пульпы выпавших молочных зубов, остеогенная дифференцировка, криоконсервация, банкиро-вание стволовых клеток, витамин й3, дексаметазон.

введение

Потребность клинической медицины в технологиях, обеспечивающих эффективное восстановление органов и тканей, утраченных в результате травм, резекции опухолей, аномалий развития и других патологических состояний, приводит к необходимости вести поиск новых подходов к использованию регенератор-

е-таП: bukharova-rmt@yandex.ru

The use of multipotent mesenchymal stromal cellsfrom human exfoliated deciduous teeth (SHED) to stimulate bone regeneration requires data on the influence of cryopreservation on the osteogenic differentiation capacity of these cells.

SHED were subjected to cryopreservation. Before freezing and after thawing, cell cultures were exposed osteogenic differentiation with vitamin D3 or dexametasone and assessed for expression of the osteogenic markers osteocalcin, alkaline phosphatase, BMP-2 and RunX2 using real-time qPCR. Extracellular matrix (ECM) mineralization was evaluated by Alizarin red staining.

Supplementation of osteogenic medium with vitamin D3 increased the expression of the osteogenic markers osteocalcin, alkaline phosphatase, BMP-2 and RunX2 as well as promoted an increase in the synthesis and mineralization of ECM in the cells both before and after cryopreservation. In the presence of vitamin D3 gene expression of alkaline phosphatase, BMP-2 and RunX2 after cryopreservation was higher than before freezing. Gene expression of osteocalcin, BMP2 RunX2 in osteogenic medium with vitamin D3was higher compared with dexamethasone for 14 days differentiation both before or after cryopreservation.

The maintenance of SHED osteogenic differentiation potential after long-term cryopreservation provides a basis for banking of these cellsfor further auto- or allotransplantation.

Keywords: multipotent mesenchymal stromal cellsfrom human exfoliated deciduous teeth, osteogenic differentiation, cryopreservation, cell banking, vitamin D3, dexamethasone.

ного потенциала стволовых клеток. Наиболее доступными и безопасными для применения в клинической практике являются мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), получаемые из разных тканей взрослого человека. С возрастом пролиферативная активность и способность к дифференцировке ММСК заметно снижаются, поэтому выделение

этих клеток из тканей людей в молодом возрасте и их банкирование позволит сохранить биологический потенциал ранних популяций [1, 2]. Одним из наиболее доступных источников ММСК у детей являются ткани пульпы молочных зубов, выпавших естественным путем [3]. Получение биологического материала из таких зубов относится к неинвазивным методам, поэтому не имеет этических ограничений и может применяться для создания персонального банка стволовых клеток пациента с целью применения, при необходимости, спустя десятки лет. Важным аспектом при разработке технологий забора и хранения клеток и тканей пульпы является сохранение их биологических свойств после криоконсервации.

Для длительного хранения ММСК пульпы выпавшего молочного зуба (в зарубежной номенклатуре — SHED-клеток (от англ. stem cells from humanexfoliated deciduous teeth)) используют разные подходы к криоконсервации: замораживание целого зуба, извлеченной из зуба интактной пульпы и культур SHED-клеток, полученных из тканей пульпы [4—7]. Поскольку пульпа молочных зубов постепенно деградирует по мере резорбции корня зуба, и, следовательно,не каждый образец пульпы содержит жизнеспособные клетки, наиболее эффективно порционно криоконсервировать культуры SHED-клеток.

Результаты недавно проведённого исследования показали, что криоконсервация не влияет на пролиферативный потенциала SHED-клеток [8]. Однако для эффективного применения SHED-клеток с целью стимулирования регенерации костной ткани необходимы данные о влиянии криоконсервации на их способность дифференцироваться в остеогенном направлении.

Целью настоящего исследования являлась оценка остеогенного потенциала SHED-клеток до и после криоконсервации при использовании различных индукторов костной дифферен-цировки.

Материал и методы

Получение культур SHED-клеток

Культуру SHED-клеток человека выделяли из пульпы, экстрагированной из выпавших молочных зубов детей 7—9 лет (n = 4) после получения от родителей информированного согласия на использование биоматериала в научных исследованиях.

Выпавший здоровый зуб без признаков воспаления помещали в стерильный флакон с транспортной средой: F-12 (ПанЭко, Россия), содержащей 500 мкг/л амикацина (Синтез, Россия), 10 Ед/мл гепарина натрия (Braun, Германия), и доставляли в лабораторию в термоконтейнере при 2—8°С. Зуб обрабатывали 0,05% раствором хлоргексидина биглюкона-та (Росбио, Россия). При помощи стерильных

пульпоэкстракторов (КМИЗ, Россия) из зуба извлекали пульпу и промывали раствором Хэнк-са с добавлением 0,5 г/л цефазолина (Синтез, Россия) (рис. 1А). Ткани пульпы измельчали ножницами и инкубировали в растворе коллаге-назы I типа (2 мг/мл; ПанЭко, Россия) 40 мин. при 37°С. Клеточную суспензию помещали в чашки ПетриШипс, Дания) и культивировали в ростовой среде ДМЕМ (ПанЭко, Россия), содержащей 10% ФТС ^¡Ьсо, США), 2 тМ Ь-глутамина (ПанЭко, Россия), 100 мг/л амикацина, при стандартных культуральных условиях (37°С, 5% СО2) до образования 70% монослоя. Смену ростовой среды производили каждые 3 сут.

А

Рис. 1. Получение культуры SHED-клеток человека: А — экстракция тканей пульпы молочного зуба; Б — культура SHED-клеток человека 3 пассажа, фазовый контраст. Ув. Б х200

Иммунофенотипический анализ SHED-клеток

SHED-клетки на 3—4 пассажах в состоянии 70—80% конфлуентного монослоя снимали с культурального пластика раствором Версе-на с добавлением 0,25% трипсина (ПанЭко, Россия), фиксировали 4% параформальдеги-дом (Merck, Германия), промывали фосфат-но-солевым буфером и инкубировали с моно-клональными антителами к поверхностным маркерам, конъюгированными с флуорохро-мами FITC, TRITC, APC:CD29 (bd 559883),

оригинальные исследования

45

CD34 (bd 555824), CD44 (bd 555478),CD45 (bd 555483), CD49b (bd 555498), CD73 (bd 550257), CD90 (bd555595) и HLA-DR (bd 559866)(BD Biosciences, США). Исследование выполняли на проточном цитофлуориметре-сортере BD FACSAria (BectonDickinson, США).

Криоконсервация SHED-клеток

SHED-клетки культивировали до достижения 70—80% конфлуентного монослоя и снимали с поверхности чашек Петри с помощью раствора Версена с добавлением 0,25% трипсина. Полученную клеточную суспензию центрифугировали при 1100 об/мин. 10 мин. Клеточный осадок ресуспензировали в ФТС с 10% крио-протектора ДМСО (ПанЭко, Россия), разливали в криопробирки и замораживали до -80°С в режиме 1 °С/мин.Затем образцы переносили в сосуды Дьюара с жидким азотом и хранили при -196°С.

Остеогенная дифференцировка SHED-клеток

SHED-клетки на 3—4 пассажах в состоянии 70—80% конфлуентного монослоя инкубировали 14 сут. в остеогенной среде: DMEM (Пан Эко, Россия) с 10% ЭТС, 0,1 мг/мл амикаци-на, 50 мг/л L-аскорбиновой кислоты (Sigma, Германия), 10 мМ/л ß-глицерофосфата натрия (Sigma, Германия) и 100 нМ дексаме-тазона (KRKA, Словения) или 10 нМ 1а,25-дигидроксикальциферола (витамин D3) (Roshe, Швейцария). Среду заменяли каждые 3 сут.

Для выявления очагов минерализации SHED-клетки фиксировали 70% этанолом (Ферейн, Россия) и обрабатывали 40 мМ водным раствором ализаринового красного S (pH = 4,1, ПанЭко, Россия).

ПЦР-анализ в режиме реального времени

Для оценки экспрессии генов применяли ПЦР-анализ в режиме реального времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green (Евроген, Россия). Общую РНК выделяли из клеток с помощью набора RNeasy Minikit (Qiagen, Германия) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Синтез кДНК на матрице РНК проводили согласно протоколу фирмы-производителя Fermentas (Европейский союз) с использованием обратной транскриптазы М-М^Уи олиго^Т-праймеров. В ПЦР-реакции использовали специфические праймеры к генам маркеров остеогенной дифференцировки: остеокальцина, щелочной фосфатазы, RunX2 и BMP-2. Уровень мРНК анализируемых генов выравнивали по отношению к данным амплификации референс-ного гена GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, глицеральдегид-3-фосфат де-гидрогеназа).

Статистический анализ

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием специализированного программного обеспечения IBMSPSSv.23 (США). Графики и диаграммы были построены в программе Microsoft Excel 2016 (США). Для выявления межгрупповых различий применяли тест Холма-Шидака.

Результаты

Для исследования остеогенного потенциала использовали SHED-клетки 3—4 пассажей (рис. 1Б).

Для подтверждения иммунофенотипа полученных культур применяли проточную цитофлу-ориметрию. По результатам оценки среднестатистических данных нескольких культур было установлено, что в них до и после криоконсер-вации не наблюдается экспрессии гемопоэтиче-ских маркеров CD34, CD45 и HLA-DR, а маркеры CD29, CD44, CD49b, CD73, CD90 экспрессиру-ются на высоком уровне, что соответствует профилю поверхностных антигенов ММСК [9].

С помощью ПЦР-анализа в режиме реального времени была исследована экспрессия осте-огенных маркеров — остеокальцина, щелочной фосфатазы, BMP-2 и транскрипционного фактора RunX2 в SHED-клетках до (свежие) и после криоконсервации и хранения в течение 6—12 мес. (замороженные) (рис. 2).

По результатам ПЦР-анализа было выявлено увеличение экспрессии всех исследуемых генов в течение 14 сут. дифференцировки в присутствии индуктора витамина D3 в культурах SHED-клеток как до, так и после криоконсерва-ции. При этом экспрессия генов щелочной фосфатазы, BMP-2 и RunX2 на 14 сут. в культурах после криоконсервации была достоверно выше по сравнению с клетками до замораживания.

Добавление в остеогенную среду витамина D3 приводило к более высокому уровню экспрессии генов остеокальцина и BMP2 по сравнению с использованием дексаметазона на 7 и 14 сут. дифференцировки как до, так и после криокон-сервации. Статистически значимых различий в экспрессии гена щелочной фосфатазы при действии разных индукторов не было выявлено.

Для гена транскрипционного фактора RunX2 был показан более высокий уровень экспрессии в присутствии витамина D3 по сравнению с дексаметазоном на 14 сут. дифференцировки до и после замораживания. На 7 сутки после замораживания, напротив, экспрессия RunX2 была выше при использовании дексаметазона.

При окрашивании ализариновым красным очаги минерализации выявлялись после 14 сут. дифференцировки SHED-клеток в среде, содержащей витамин D3 как до, так и после криоконсервации (рис. 3А, Б), а использование дексаметазона не приводило к отложению кальцификатов на данном сроке(рис. 3В, Г).

Рис. 2. ПЦР-анализ транскрипции генов щелочной фосфатазы, остеокальцина, ВМР-2 и РипХ2 при индукции остеогенной дифференцировки культур БНЕй-клеток до и после криоконсервации в присутствии разных индукторов

Рис. 3. БНЕй-клетки, культивированные в остеогенной среде в течение 14 сут.: А, В — клетки до криоконсервации; Б, Г — клетки после криоконсервации.

A, Б — индукция дифференцировки витамином й3,

B, Г — дексаметазоном. Красным окрашены очаги минерализации. Окраска: ализариновый красный.

Ув. х100

Обсуждение

ММСК, полученные из пульпы выпавших молочных зубов, являются перспективным материалом для применения в регенеративной медицине при разработке тканеинженерных

конструкций костной и мягких тканей [10, 11]. Во-первых, метод их получения является не-инвазивным. Во-вторых, ЭНЕй-клетки характеризуются высоким пролиферативным потенциалом и способностью дифференцироваться

в клетки различных видов, включая остеобласты/од онтобласты, адипоциты, нейральные клетки и др. [3].

В работах по изучению свойств SHED-клеток при криоконсервации целого зуба было установлено, что их выживаемость, пролифе-ративный и дифференцировочный потенциалы зависят от длительности периода консервации. При этом удовлетворительные результаты могут быть получены только при хранении в течение всего несколько месяцев [4—6]. Замораживание непосредственно пульпы позволяет сохранить свойства содержащихся в ней клеток в течение более 2 лет, и выделенные по истечении этого срока SHED-клетки сохраняют все свойства ММСК и регенеративную способность in vivo [7].

Замораживание культур SHED-клеток, полученных из пульпы выпавшего зуба, позволяет охарактеризовать клеточный материал, исключить контаминацию и порционно банкировать клетки для дальнейшего использования. При таком подходе к хранению клетки полностью сохраняют свою пролиферативную активность [8]. Результаты нашей работы подтверждают, что криоконсервация также не снижает остеоген-ный потенциал культур SHED-клето^инкубация в остеогенной среде клеток до и после замораживания приводила к повышению уровня экспрессии маркеров остеогенной дифференци-ровки — щелочной фосфатазы, остеокальцина, BMP-2 и RunX2- и минерализации внеклеточного матрикса. При этом после криоконсерва-ции экспрессия генов щелочной фосфатазы, BMP-2 и RunX2 на 14 сут. в культурах была даже выше, чем до замораживания.

Выбор оптимального индуктора диффе-ренцировки — ключевой момент в реализации остеогенного потенциала клеточной культуры,

ЛИТЕРАТУРА:

1. Zhu M., Kohan E., Bradley J. et al. The effect of age on osteogenic, adipogenic and proliferative potential of female adipose-derived stem cells. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2009; 3(4):290-301.

2. Yalvac M.E., Ramazanoglu M., Tekguc M. et al. Human tooth germ stem cells preserve neuro-protective effects after long-term cryo-preservation. Current Neurovascular Research 2010; 7(1): 49-58.

3. Miura M., Gronthos S., Zhao M. et al. SHED: Stem cells from human exfoliated deciduous teeth. PNAS USA 2003;100(10): 5807-12.

4. Ji E.H., Song J.S., Kim S.O. et al. Viability of pulp stromal cells in cryopreserved deciduous teeth. Cell Tissue Bank 2014;15t1): 67-74.

5. Lee S.Y., Chiang P.C., Tsai Y.H. et al. Effects of cryopreservation of intact teeth on the isolated dental pulp stem cells. Endod. 2010; 36(8): 1336-40.

6. Lee H.S., Jeon M., Kim S.O. et al. Characteristics of stem cells from human exfoliated deciduous teeth (SHED) from intact cryopreserved deciduous teeth. Cryobiology 2015; 71(3): 374-83.

7. Ma L., Makino Y., YamazaH. et al. Cryopreserved dental pulp tissues of exfoliated deciduous teeth is a feasible stem cell resource for regenerative medicine. PLoS One 2012; 7(12): e51777.

8. Ginani F., Soares D.M., Rabelo L.M. et al. Effect of a cryopreservation protocol on the proliferation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Acta Odontol.Scand. 2016; 31: 1-7.

9. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315-7.

определяющий терапевтическую эффективность ее клинического применения. Ранее было показано, что дексаметазон — синтетический глюкокортикоид, часто используемый в работах для индукции остеогенной диффе-ренцировки, оказывает индуцирующее влияние на остеопрогениторные клетки костного мозга [12]. Однако действие этого препарата на ММСК из других источников — жировой ткани, пульпы коренных зубов,значительно менее эффективно по сравнению с использованием витамина D3 [13—15]. Популяции клеток из пульпы молочных и коренных зубов различаются по своим характеристикам, поэтому для каждого источника требуется отдельное исследование [16]. Нами было показано, что в культурах SHED-клеток экспрессия генов остеокальцина и BMP-2 на 7 и 14 сут.достовер-но превышала экспрессию этих генов в среде с дексаметазоном. Такой же результат был получен и для гена RunX2 на максимальном срокедифференцировки (14 сут.). Кроме того, только в среде, содержащей витамин D3, наблюдалось формирование минеральных отложений. Эти данные подтверждают, что витамин D3 является более эффективным индуктором остеогенной дифференцировки SHED-клеток по сравнению с дексаметазоном.

По результатам исследования можно сделать следующие выводы. Витамин D3 является более эффективным индуктором остеогенной дифференцировки SHED-клеток, чем дексаметазон. Культуры SHED-клеток сохраняют свой остеогенный потенциал после длительной криоконсервации, что может служить предпосылкой для банкирования клеток, полученных из пульпы выпавших молочных зубов детей, с целью дальнейшего использования для аутогенных или аллогенных трансплантаций.

10. Вахрушев И.В., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В. и др. Мезенхимальные клетки пульпы молочного зуба: цитофенотип и первичная оценка возможности применения в тканевой инженерии костной ткани. Клеточные технологии в биологии и медицине 2012; (1): 29-33.

11. Rosa V., Dubey N., Islam I. et al. Pluripotency of stem cells from human exfoliated deciduous teeth for tissue engineering. Stem Cells Int. 2016; 2016: 5957806.

12. Haynesworth S.E., Goshima J., Goldberg V.M. et al. Characterization of cells with osteogenic potential from human marrow.Bone 1992; 13(1): 81-8.

13. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell 2002; 13(12): 4279-95.

14. Логовская Л.В., Бухарова Т.Б., Волков А.В. и др. Индукция остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека. Клеточные технологии в биологии и медицине 2013; 1: 28-34.

15. Khanna-Jain R., Mannerstrom B., Vuorinen A. et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells on p-tricalcium phosphate/poly (l-lactic acid/caprolactone) three-dimensional scaffolds. J. Tissue Eng. 2012; 3(1):2041731412467998.

16. Huang G.T., Gronthos S., Shi S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. J.Dent. Res. 2009; 88(9):792-806.

Поступила: 26.09.2016