СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ У ОСОБИ ЖЕНСКОГО ПОЛА
METHOD FOR PREDICTING RISK OF GETTING CARDIOVASCULAR EVENT IN FEMALE SUBJECT

Объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска развития сердечно-сосудистой патологии у особи женского пола, который включает:
- определение уровня про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной из указанной особи женского пола; и
- корреляцию указанного уровня про-нейротензина или его фрагментов с риском развития сердечно-сосудистой патологии, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития сердечно-сосудистой патологии.
Термин "повышенный уровень" обозначает уровень выше определенного порогового уровня.
Нейротензин представляет собой нейропептид, состоящий из 13 аминокислот, который имеет происхождение из предшественника препро-нейротензина и стехиометрически высвобождается совместно со стабильным пептидом из 117 аминокислот про-нейротензин (P-NT) и зрелый гормон связывается с тремя различными рецепторами, рецептором нейротензина 1 и 2 (Ntsr1 и Ntsr2), которые представляют собой рецепторы, связанные с G-белком, и рецептором нейротензина 3 (Ntsr3), который не связан с G-белком и также известен как Сортиллин-1 (SORT1).
Нейротензин высвобождается периферически из тонкого кишечника, а также центрально из гипоталамуса. Периферическая секреция нейротензина стимулируется потреблением пищи, в особенности жиров, и известно, что он регулирует моторику желудочно-кишечного тракта и секрецию поджелудочного сока и желчи. Интересно, что нейротензин вовлечен в контролирование аппетита в качестве анорексического гормона, поскольку он сильно уменьшает потребление пищи, как после центральной (интрацеребровентрикулярной), так и после периферической (внутрибрюшинной) инъекции крысам, эффект, который, вероятно, опосредуется главным образом через рецептор нейротензин-1 (Ntsr1). У людей, страдающих ожирением, по сравнению со здоровыми людьми с нормальным весом, послеобеденные концентрации нейротензина в плазме уменьшены после потребления жидкой жирной пищи (Widen и др., 1992, Reg пептиды; Plasma concentrations of regulatory peptides in obesity following modified sham feeding (MSF) and a liquid test meal), что указывает на нарушение регуляции секреции нейротензина при ожирении. Тем не менее, не было проведено существенных исследований о том, будет ли и как нейротензин связан с регуляцией ожирения. Интересно, что P-NT существенно повышается после обходного желудочного анастомоза (Roux-en-Y), операции, которая, как показано, приводит к нормогликемии у большинства пациентов, страдающих ожирением, при диабете 2 типа, но не известно, вовлечен ли в целом нейротензин в развитие сахарного диабета. Кроме того, система нейротензина вовлечена в развитие ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда в виде вариации гена Ntsr3 (SORT1), который является одним из наиболее сильно чувствительных генов при распространенной ишемической болезни сердца, что известно для людей.
Механизм взаимосвязи между ожирением и злокачественным новообразованием в значительной степени неизвестен, тем не менее, одна из основных теорий состоит в том, что избыток жировых отложений приводит к повышенной периферической ароматизации андрогенов и, следовательно, к повышенному уровню циркулирующих эстрогенов. Дополнительно, было показано, что один из отличительных признаков ожирения, гиперинсулинемия, ингибирует продукцию в печени глобулина, связывающего половые гормоны (Sexual Hormone Binding Globulin (SHBG)), таким образом повышая биодоступные уровни как эстрогенов, так и андрогенов, предполагая пути, посредством которых ожирение может повышать риск распространенных форм злокачественных новообразований, запускаемых формами половых гормонов, таких как рак молочной железы и предстательной железы. Интересно, что экспрессия как нейротензина, так и Ntsr1 является распространенной при злокачественных раковых опухолях протоков груди и экспериментально фармакологическая блокада или РНК молчание NTSR1 уменьшает рост опухоли у мышей.
Уровни экспрессии рецептора нейротензина 1 (NTSR1) в клетках рака молочной железы используют для определения прогноза субъекта, страдающего от рака молочной железы (US 2011/0305633). Кроме того, те же самые авторы отмечают, что в настоящее время не описана четкая корреляция между циркулирующим нейротензином и состоянием опухолей поджелудочной железы, предстательной железы или медуллярных опухолей щитовидной железы, вероятно, вследствие быстрого клиренса печенью. Интересно, что было обнаружено в группе из 51 пациентов с инвазивным раком протоков молочной железы 91% всех опухолей были положительными по рецептору нейротензина 1 (NTSR1), но только 31% всех опухолей были положительными по нейротензину в указанной ткани (Souaze и др. Cancer Research 2006; 66: (12) страницы 6243-6249.
Были получены данные, свидетельствующие о том, что нейротензин и рецепторы нейротензина принимают участие в росте злокачественных новообразований, в частности, при раке легких, раке поджелудочной железы и раке толстой кишки (Carraway и др.; Peptides 27 (2006) 2445-2460). Было описано, что уровни NT в сыворотке пациентов с раком поджелудочной железы были существенно увеличенными (Picheon и др., Anticancer Research 1999; 19; 1445-50). Также интересно, что в этой группе было обнаружено, что NT уровни согласуются с прогрессированием заболевания как при раке предстательной железы, так и при раке поджелудочной железы. Дополнительно, в отличие от этого, Meggiato и др.; Tumori 1996; 82; 592-5; обнаружили, что уровни NT в плазме были нормальными при раке поджелудочной железы, но были повышены в случае диагностирования панкреатита.
Применение вазоактивных пептидов для предсказания рисков злокачественных новообразований у самцов было описано belting и др., Cancer, Epidemiology, Biomarkes & Prevention. MR-про-ANP, MR-про-ADM и копептин измеряли в плазме натощак у участников исследований Malmö Diet and Cancer Study, у которых не было обнаружено злокачественного новообразования перед начальным обследованием в 1991-1994 гг.(1768 особей мужского пола и 2293 особи женского пола). Авторы отметили, что среди особей женского пола, отсутствует взаимосвязь между биомаркерами и частотой случаев злокачественных новообразований.
CRP и Про-BNP являются известными прогностическими факторами сердечно-сосудистых патологий в популяции (Melander и др, JAMA. 2009; 302(1):49-57). Сейчас имеется информация относительно каких-либо половых отличий предсказательной способности CRP и Про-BNP для конечных точек CVD.
Задачей настоящего изобретения является исследование прогностической и диагностической способности NT для предсказания риска развития сердечно-сосудистой патологии у субъекта, для решения этой задачи, мы измеряли стабильные фрагменты про-нейротензина в плазме натощак в указанном перспективном групповом исследовании Swedish (Malmö Diet and Cancer Study, см. Melander и др, JAMA. 2009; 302(1):49-57) и относительный исходный уровень этого биомаркера к сердечно-сосудистым патологиям в течение последующих 15 лет.
Неожиданно, было показано, что нейротензин является эффективным и высоко значимым биомаркером для женщин для предсказания риска развития сердечно-сосудистой патологии
Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ прогнозирования риска развития сердечно-сосудистой патологии у особи женского пола, который включает:
- определение уровня про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной из указанной особи женского пола; и
- корреляцию указанного уровня про-нейротензина или его фрагментов с риском развития сердечно-сосудистой патологии, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития сердечно-сосудистой патологии.
В специфическом варианте осуществления изобретения указанная сердечно-сосудистая патология представляет собой острую сердечно-сосудистую патологию, выбранную из группы, включающей инфаркт миокарда, удар, острую сердечную недостаточность и смерть по причине сердечно-сосудистой патологии, связанную с инфарктом миокарда, ударом или острой сердечной недостаточностью.
В специфическом варианте осуществления изобретения объектом изобретения является способ прогнозирования риска развития сердечно-сосудистой патологии у особи женского пола, который включает:
- определение уровня про-нейротензина 1-117 или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в биологической жидкости, полученной из указанной особи женского пола; и
- корреляцию указанного уровня про-нейротензина 1-117 или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, с риском развития сердечно-сосудистой патологии, где повышенный уровень является прогностическим для повышенного риска развития сердечно-сосудистой патологии.
И где указанная сердечно-сосудистая патология представляет собой острую сердечно-сосудистую патологию, выбранную из группы, включающей инфаркт миокарда, удар, острую сердечную недостаточность и смерть по причине сердечно-сосудистой патологии, связанную с инфарктом миокарда, ударом или острой сердечной недостаточностью.
Уровни про-нейротензина 1-117 или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в биологической жидкости, полученной из указанной особи женского пола, которые являются предсказательными для риска развития сердечно-сосудистой патологии в указанной особи женского пола, могут высвобождаться из тонкого кишечника. Высвобождение нейротензина из тонкого кишечника стимулируется поглощением пищи, в особенности жирами, и известно, что он регулирует моторику желудочно-кишечного тракта и секрецию поджелудочного сока и желчи. Про-нейротензин 1-117 и его фрагменты или про-нейротензин 1-117, содержащий пептиды, которые используются в качестве суррогатного маркера для высвобожденного нейротензина в виде нейротензина и про-нейротензина 1-117 и его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, высвобождаются в эквимолярных количествах из про-нейротензина. Неожиданно в настоящем изобретении было обнаружено, что периферическая секреция нейротензина/про-нейротензина 1-117 или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, является индикаторной для чувствительности особи женского пола к развитию сердечно-сосудистой патологии. Таким образом, режим питания в виде уменьшения потребления жиров может снижать указанный риск в указанной особи женского пола.
Данные, полученные в настоящем исследовании, также обнаружили корреляцию между риском развития сердечно-сосудистой патологии у особей мужского пола с уровнями про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот в биологической жидкости, полученной из указанного субъекта мужского пола; тем не менее, эта корреляция, не является достоверной для данных, представленных в настоящей заявке. Таким образом, мы предполагаем, что способ в соответствии с изобретением также является ценным для особей мужского пола, но наблюдаемый эффект не является сильным для особей мужского пола в настоящем исследовании.
Термин "субъект", как используется в настоящей заявке, относится к живому организму человека или организму, отличному от человека. Предпочтительно в настоящей заявке субъект относится к человеку.
Корреляция между уровнем про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в биологической жидкости, полученной из указанной особи женского пола и риском развития сердечно-сосудистой патологии является непрерывной, то есть чем более высокий уровень, тем более высокий риск. Это можно увидеть из данных, представленных, например, в таблице 17. По сравнению с первым квартилем, второй, третий и четвертый квартиль проявляют более высокие риски опасности соответственно.
Учитывая целесообразность, специалист в данной области техники может использовать порог(и).
Таким образом, термин "повышенный уровень" может обозначать уровень выше порогового уровня.
В одном варианте осуществления изобретения, уровень про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в биологической жидкости, представляет собой уровень натощак про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды. Уровень натощак обозначает отсутствие потребления пищи за 12 ч до отбора образца крови.
Биологическая жидкость может быть выбрана из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, церебро-спинальную жидкость (cfc) и слюну.
В одном варианте осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением указанная особь женского пола не имеет в анамнезе диагноза острая сердечно-сосудистая патология во время отбора образца биологической жидкости из указанной особи женского пола.
В другом варианте осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением указанной особи женского пола был поставлен диагноз сердечно-сосудистое заболевание или диабет в период отбора образца биологической жидкости из указанной особи женского пола.
В специфическом варианте осуществления указанное сердечно-сосудистое заболевание во время отбора образца биологической жидкости из указанной особи женского пола может быть выбрано из группы, включающей сердечную недостаточность, атеросклероз, и гипертонию.
Данные согласно настоящему изобретению указывают на сильную корреляцию между уровнем про-нейротензина или его фрагментов с сердечно-сосудистой патологией у женщин без преобладающего диабета, без преобладающего рака молочной железы и без преобладающего сердечно-сосудистого заболевания.
Данные согласно настоящему изобретению также указывают на сильную корреляцию между уровнями про-нейротензина или его фрагментов с сердечно-сосудистой патологией у женщин с повышенным кровяным давлением, которые представляют собой распространенную группу с высоким риском для сердечно-сосудистого заболевания.
Кроме того, данные согласно настоящему изобретению также указывают на сильную корреляцию между уровнями про-нейротензина или его фрагментов с сердечно-сосудистой патологией у женщин с нормальным кровяным давлением. Кроме того, данные согласно настоящему изобретению указывают на сильную корреляцию между уровнем про-нейротензина или его фрагментов с сердечно-сосудистой патологией у женщин с диабетом.
В другом специфическом варианте осуществления изобретения во время отбора образца биологической жидкости из указанной особи женского пола, указанной особи женского пола был поставлен диагноз диабет II типа.
В специфическом варианте осуществления изобретения предсказание первого побочного явления у субъекта или идентификация субъекта, имеющего повышенный риск развития первого побочного явления, улучшается путем дополнительного определения и использования уровня по меньшей мере одного другого маркера, выбранного из группы, включающей: CRP, LpLA2, Цистатин С и натрийуретические пептиды А- и В-типа, а также их предшественники и их фрагменты, включая ANP, проANP, NT-проANP, MR-проANP, BNP, проBNP, NT-проBNP триглицериды, HDL холестерин или его субфракции, LDL холестерин или его субфракции, GDF15, ST2.
В очень специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением дополнительно к уровню про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, определяют и используют уровень следующего маркера: проBNP или его фрагменты или предшественники, имеющие по меньшей мере 12 аминокислоты и/или CRP.
В другом специфическом варианте осуществления изобретения дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей: возраст, систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, лечение гипертонии, индекс массы тела, наличие сахарного диабета, курение в настоящее время.
Сердечно-сосудистые патологии (CVD) определяются как сердечные события или смертельный или несмертельный удар. События идентифицируют с помощью взаимосвязи 10ти значного персонального идентификационного номера для каждого жителя Швеции с 3 регистрами: Swedish Hospital Discharge Register, Swedish Cause of Death Register, и Stroke in Malmö register. Инфаркт миокарда определяли на основе Международной классификации заболеваний, 9-ая и 10-ая измененная редакция (ICD-9 и ICD-10) коды 410 и 121, соответственно. Смертельный или несмертельный удар определяли с использованием кодов 430, 431, 434, и 436 (ICD-9) и 160,161,163, и 164 (ICD-10). Определение диабета было следующим: в анамнезе диагноз врача или прием противодиабетических лекарственных средств или уровень глюкозы в цельной крови натощак >/=6,1 ммоль/л (примечание, это составляет =7,0 ммоль/л в плазме) на момент начала исследования.
Определение нормального/повышенного кровяного давления (НВР) осуществляли следующим образом:
НВР: Систолическое ВР>/=140 мм рт.ст. Диастолическое BP>/=90 мм рт. ст. или прием противогипертонических лекарственных средств. Субъекты, которые имеют нормальное кровяное давление (BP), представляют собой все другие субъекты, то есть субъекты с Систолическим ВР<140 мм рт.ст. или Диастолическим BP<90 мм рт. ст. или которые не принимают противогипертонических лекарственных средств.
Фрагменты про-нейротензина, которые могут быть определены в биологической жидкости, могут быть выбраны, например, из группы следующих фрагментов:
SEQ ID НЕТ: 1 (про-нейротензин 1-147)
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE
ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ
EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY ENKPRRPYIL KRDSYYY
SEQ ID НЕТ: 2 (про-нейротензин 1-125 (большой нейромедин N))
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE
ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ
EDILDTGNDK NGKEEVI KR KIPYIL
SEQ ID НЕТ: 3 (нейромедин N:)
KIPYIL
SEQ ID НЕТ: 4 (нейротензин)
pyroQLYENKPRRP YIL
SEQ ID НЕТ: 5 (про-нейротензин 1-117)
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE
ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ
EDILDTGNDK NGKEEVI
SEQ ID НЕТ: 6 (про-нейротензин 1-132)
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE
ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ
EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYILKRQLY EN
Seq ID НЕТ 7: (про-нейротензин 1-125)
SDSEEEMKAL EADFLTNMHT SKISKAHVPS WKMTLLNVCS LVNNLNSPAE
ETGEVHEEEL VARRKLPTAL DGFSLEAMLT IYQLHKICHS RAFQHWELIQ
EDILDTGNDK NGKEEVIKRK IPYIL
SEQ ID НЕТ: 8 (про-нейротензин 120-140)
KIPYILKRQL YENKPRRPYI L
SEQ ID НЕТ: 9 (про-нейротензин 120-147)
KIPYILKRQL YENKPRRPYIL KRDSYYY
SEQ ID НЕТ: 10 (про-нейротензин 128-147)
QLYENKPRRP YILKRDSYYY
В более специфическом варианте осуществления способа в соответствии с настоящим изобретением определяют уровень про-нейротензина 1-117.
В специфическом варианте осуществления уровень про-нейротензина измеряют с помощью иммуноанализа. Более специфически используют иммунологический анализ, как описано в Ernst и др. Peptides 27 (2006) 1787-1793. Иммунологический анализ, который можно использовать для определения уровня про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот, может включать стадии, как изложено в примере 2. Все пороги и значения следует анализировать в корреляции с тестом и калибровкой, используемой в соответствии с примером 2. Для квалифицированного специалиста в данной области техники известно, что на абсолютное значение порога может оказывать влияние используемая калибровка. Это обозначает, что все значения и пороги, представленные в настоящей заявке, следует понимать в контексте калибровки, используемой в настоящей заявке (Пример 2). Человеческий P-NT-калибратор доступен от ICI-Diagnostics, Berlin, Germany. Альтернативно, анализ также можно калибровать с помощью синтетического или рекомбинантного P-NT 1-117 или его фрагментов (см. также Ernst и др, 2006).
Порог для определения риска развития сердечно-сосудистой патологии у особи женского пола в соответствии со способами согласно настоящему изобретению составляет больше 78 пмоль/л PNT, предпочтительно 100 пмоль/л, более предпочтительно 150 пмоль/л. В специфическом варианте осуществления указанный порог составляет около 100 пмоль/л. Эти пороги относятся к вышеуказанному способу калибровки. P-NT значение выше указанного порога обозначает, что у субъекта есть повышенный риск развития сердечно-сосудистой патологии.
В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением предсказание риска для субъекта развития сердечно-сосудистых патологий улучшается путем дополнительного определения и использования уровня по меньшей мере одного лабораторного параметра или другого маркера, выбранного из группы, включающей уровень глюкозы в крови или плазме натощак, триглицериды, HDL холестерин или его субфракции, LDL холестерин или его субфракции, Цистатин С, Инсулин, CRP, вазопрессин или его предшественники или его фрагменты и BNP или его предшественники или его фрагменты.
В специфическом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей возраст, пол, систолическое артериальное давление, диастолическое артериальное давление, лечение гипертонии (АНТ), индекс массы тела, окружность талии, отношение окружности талии к окружности бедер, курение в данный период, наследственная предрасположенность к диабету и более ранее сердечно-сосудистое заболевание (CVD).
Объектом настоящего изобретения также является способ прогнозирования риска развития сердечно-сосудистой патологии у субъекта или идентификация субъекта, имеющего повышенный риск развития сердечно-сосудистой патологии в соответствии с изобретением, где уровень про-нейротензина или его фрагментов из по меньшей мере 5 аминокислот либо отдельно или в сочетании с другими прогностически пригодными лабораторными или клиническими параметрами используют для предсказания риска для субъекта развития сердечно-сосудистой патологии с помощью способа, который может быть выбран из следующих альтернатив:
- Сравнение со средним значением уровня про-нейротензина или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в группе заранее определенных образцов в популяции "здоровых" или "предположительно здоровых" субъектов,
- Сравнение с квантилем уровня про-нейротензина или его фрагментов или про-нейротензина 1-117, содержащего пептиды, в группе заранее определенных образцов в популяции "здоровых" или "предположительно здоровых" субъектов,
- Расчет на основе анализа пропорциональных рисков Кокса (Сох Proportional Hazards analysis) или с помощью расчета индекса риска, такого как NRJ (Net Reclassification Index) или IDI (Integrated Discrimination Index).
В одном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением указанный способ осуществляют более одного раза для наблюдения за риском развития сердечно-сосудистой патологии у особи женского пола.
В другом варианте осуществления способа в соответствии с изобретением указанное наблюдение осуществляют для оценки ответа указанной особи женского пола на проведенные профилактические и/или терапевтические процедуры.
В другом варианте осуществления способа в соответствии с заявленным изобретением способ используют для классификации указанных особей женского пола в группы риска.
Также настоящим изобретением охватывается портативное устройство для осуществления способа в соответствии с изобретением.
Также настоящим изобретением охватывается анализ и/или набор для осуществления способа в соответствии с изобретением.
Объектом изобретения также является связующее к нейротензину или к рецептору нейротензина, для применения для предотвращения или лечения сердечно-сосудистой патологии у особи женского пола.
11
11
В одном варианте осуществления изобретения, связующее уменьшает биологическую активность нейротензина на 70% или меньше. В соответствии с изобретением связующее к нейротензину выбирают из группы, включающей антитела, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, как, например, химически связанные антитела (фрагмент, связывающий антиген), включая, но не ограничиваясь только ими, Fab-фрагменты, включая Fab мини-тела, одноцепочечное Fab антитело, одновалентное Fab антитело с эпитопными метками, например, Fab-V5Sx2; двухвалентное Fab (мини-антитело), димеризованное с СН3 доменом; двухвалентное Fab или мультивалентное Fab, например, образованное путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, путем димеризации dHLX доменов, например, Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные мультивалентные или/и мультиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические диатела, BITE (биспецифический захватыватель Т-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из другого класса, чем G; антитела с одним доменом, например, нанотела, имеющие происхождение из нанотела, имеющие происхождение из верблюдов или рыб. В соответствии с изобретением связующее к рецептору нейротензина выбирают из группы, включающей антитела, например, IgG, типичный полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, как, например, химически связанные антитела (фрагмент, связывающий антиген), включая, но не ограничиваясь только ими, Fab-фрагменты, включая Fab мини-тела, одноцепочечное Fab антитело, одновалентное Fab антитело с эпитопными метками, например, Fab-V5Sx2; двухвалентное Fab (мини-антитело), димеризованное с СН3 доменом; двухвалентное Fab или мультивалентное Fab, например, образованное путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, путем димеризации dHLX доменов, например, Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные мультивалентные или/и мультиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические диатела, BITE (биспецифический захватыватель Т-клеток), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из другого класса, чем G; антитела с одним доменом, например, нанотела, имеющие происхождение из нанотела, имеющие происхождение из верблюдов или рыб, или пептидный антагонист например, [D-Trp]-Нейротензин, [Tyr(Ме)]-Нейротензин (например, описанный Quiron и др.)» или непептидный антагонист, например, Левокабастин, SR-48692 (NTS1 селективный), SR-142948 (неселективный), SR-142948A, CP 96345, [3H]SR-48692, SR 48692, SR-48527 и SR-49711, или связующий каркас, например, не-Ig каркасы на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), фибронектиновые каркасы (например, описанные в ЕР 1266025; каркасы на основе липокалина ((например, описанные в WO 2011/154420); убиквитиновые каркасы (например, описанные в WO 2011/073214), трансфериновые каркасы (например, описанные в US 2004/0023334), каркасы белка А (например, описанные в ЕР 2231860), каркасы на основе анкиринового повтора (например, описанные в WO 2010/060748), микробелки, предпочтительно микробелки, образующие цистиновый клубок) каркасы (например, описанные в ЕР 2314308), каркасы на основе домена Fyn SH3 (например, описанные в WO 2011/023685) каркасы на основе домена EGFR-A (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе домена Куница (например, описанные в ЕР 1941867).
Примеры
Пример 1
Разработка антител
Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Пептиды для иммунизации синтезировали (JPT Technologies, Berlin, Germany) с дополнительным N-концевым цистеиновым остатком для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептиды ковалентно связывали с BSA путем использования Sulfo-SMCC (Perbio-science, Bonn, Germany). Процедуру сочетания осуществляли в соответствии с руководством Perbio.
Меченное антитело (LA) пептид (P-NT 1-19):
H-CSDSEEEMKALEADFLTNMH-NH2
Твердофазное антитело (SPA) пептид (P-NT 44-62):
H-CNLNSPAEETGEVHEEELVA-NH2
Антитела создавали в соответствии со следующим методом:
BALB/c мыши иммунизировали с помощью 100 мкг Пептид-BSA-Конъюгат в день 0 и 14 (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг в день 21 и 28 (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За три дня до этого осуществляли эксперимент слияния, животное получало 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл солевого раствора, вводимого в виде одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Спленоциты от иммунизированных мышей и клетки миеломной клеточной линии SP2/0 сливали с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывки, клетки высевали в планшет для культивирования клеток на 96 лунок. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в HAT среде [RPMI 1640 культуральная среда, дополненная 20% фетальной бычьей сывороткой и НАТ-Добавкой]. Через две недели HAT среду заменяли на НТ Среду для трех пассажей с последующим возвращением к нормальной среде для культивирования клеток.
Супернатантны культуры клеток изначально подвергали скринингу относительно антиген-специфических IgG антител через три недели после слияния. Положительные тестируемые микрокультуры переносили в планшеты на 24 лунки для размножения. После повторного испытания отобранные культуры клонировали и повторно клонировали, используя технику предельных разведений, и определяли изотипы.
(Lane, R.D. "A short-duration polyethylene glycol fusiontechnique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas", J. Immunol. Meth. 81: 223-228; (1985), Ziegler, В. и др. "Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies", Horm. Metab. Res. 28: 11-15, (1996)).
Продукция моноклонального антитела
Антитела получали с помощью стандартных методов продукции антител (Marx и др., Monoclonal antibody Production, ATLA 25, 121, 1997,) и очищали с помощью хроматографии белка А. Чистота антител составляла >95% на основе анализа SDS гель электрофореза.
Пример 2
Иммунологический анализ для количественного определения про-нейротензина человека
Используемая технология представляла собой люминесцентный иммунологический анализ на пробирке с многослойным покрытием, на основе метки сложным эфиром акридиния.
Меченное соединение (радиоактивный индикатор): 100 мкг (100 мкл) LA (1 мг/мл в PBS, рН 7,4, смешивали с 10 мкл NHS-сложного эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Germany) (ЕР 0353971) и инкубировали в течение 20 мин. при комнатной температуре. Меченное LA очищали путем гель-фильтрации ВЭЖХ на Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., USA) Очищенное LA разводили в (300 ммоль/л фосфат калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-EDTA, 5 г/л Бычий сывороточный альбумин, рН 7,0). Конечная концентрация составляла около 800 тыс.относительных световых единиц (RLU) меченного соединения (прибл. 20 нг меченного антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию сложного эфира акридиния измеряли с помощью AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG, ().
Твердая фаза: Полистироловые пробирки (Greiner Bio-One International AG, Austria) покрывали (18 ч при комнатной температуре) с помощью SPA ((1,5 мкг SPA/0,3 мл 100 ммоль/л NaCl, 50 ммоль/л tris/HCl, рН 7,8). После блокирования с помощью 5% бычьего сывороточного альбумина, пробирки промывали с помощью PBS, рН 7,4 и высушивали в вакууме.
Калибровка:
Исследование калибровали, используя разведения сыворотки человека, содержащей P-NT. Пыл сыворотки человека с высокой P-NT-иммунореактивностью (In Vent Diagostika, Hennigsdorf, Germany) разводили сывороткой лошади (Biochrom AG, Deutschland) (стандарты для анализа).
Стандарты калибровали с помощью P-NT-калибратора человека (ICI-Diagnostics, Berlin, Germany). Альтернативно, анализ может быть откалиброван с помощью синтетического или рекомбинантного P-NT 1-117 или его фрагментов (см. также Ernst и др, 2006).
P-NT Иммунологический анализ:
50 мкл образца (или калибратора) пипетировали в SPA покрытые пробирки, после добавления меченного LA (200 мкл), пробирки инкубировали в течение 16-22 ч при 18-25°С. Несвязанный радиоактивный индикатор удаляли путем промывок 5 раз (каждый 1 мл) с помощью промывочного раствора (20 мМ PBS, рН 7,4, 0,1% Triton Х-100).
Связанное в пробирке LA измеряли с помощью LB 953
На фигуре 1 представлена типичная P-NT кривая доза/сигнал.
Пример 3: Популяционное исследование
Методы
Мы измеряли P-NT в плазме натощак от 4362 участников популяции на основе Malmö Diet and Cancer Study начального исследования в 1991-1994 гг.(возраст особей мужского пола 58±6 лет и 59% особей женского пола). Мы использовали многофакторные подогнанные (все традиционные факторы сердечно-сосудистых рисков, факторы риска диабета и в анализах злокачественного новообразования также унаследованная склонность к злокачественному новообразованию) модели пропорциональных рисков Кокса относительно исходной линии P-NT (относительный риск на каждое среднеквадратичное отклонение повышал логарифмическое преобразование P-NT) к времени первого события каждой из изученных контрольных точек в течение среднего времени последующего наблюдения более чем 12 лет. Выборку конечных точек осуществляли из Swedish National Hospital Discharge Registry, Swedish Myocardial Infarction Registry, Stroke in Malmö Registry и Swedish Cancer Registry. Выборку конечных точек с помощью этих реестров ратифицировали и считали достоверными.
Результаты
Перекрестная взаимосвязь между факторами кардиометаболического риска и P-NT
Исходные характеристики исследуемой популяции представлены в таблице 1. У женщин был незначительно, но достоверно более высокий P-NT [средний (интерквартильный диапазон)], чем у мужчин [109 (79-150) относительно 99 (71-144) пмоль/л] (Р<0,001). Перекрестная взаимосвязь между P-NT и измеренными ожирением, факторами сердечно-сосудистого риска и факторами риска диабета были в целом слабыми с наиболее сильной корреляцией с концентрацией инсулина натощак в представителей обеих полов (Дополнительная таблица 1). На модели линейной регрессии с обратным йсключением и удерживанием Р-значения 0,10, достоверными независимыми детерминантами P-NT были курение и концентрации натощак инсулина, глюкозы, и HDL (все положительные) у женщин и курение и концентрации натощак инсулина и HDL (прямо пропорционально) и возраст и LDL (обратно пропорционально) у мужчин (Таблица 2).
P-NT и прогнозирование сердечно-сосудистого заболевания, смертности от сердечно-сосудистых заболеваний и смертности по всем причинам
Среди субъектов без сердечно-сосудистого заболевания перед начальным обследованием, 519 страдали от первого события сердечно-сосудистого заболевания в течение 14,4±4,4 лет последующего наблюдения. После полной подгонки к исходным уровням факторов сердечно-сосудистого риска (возраст, пол, лечение гипертонии, систолическое артериальное давление, индекс массы тела, сахарный диабет, HDL, LDL и курение) каждое SD повышение P-NT связано с 17% повышенным риском случаев сердечно-сосудистого заболевания (Таблица 3). Существует сильное взаимодействие между P-NT и женским полом (Р<0,001) и анализы, стратифицированные по половому признаку, указывали на то, что каждое SD повышение относительно исходных значений P-NT убедительно связано с 33% повышенным риском случаев сердечно-сосудистого заболевания у женщин, в то время как не было достоверной взаимосвязи для мужчин (Таблица 3). Квартильные анализы указывали на то, что верхний относительно нижнего квартиля связаны с 37% повышенным риском случаев сердечно-сосудистого заболевания в общей популяции и 65% повышенным риском у женщин (Таблица 3). Дополнительная подгонка для концентрации инсулина натощак, то есть наиболее сильная корреляция, захватывающая разные группы, P-NT, не оказывает влияние на результаты (не показано).
После этого мы оценивали взаимосвязь между общей смертностью и смертностью от сердечно-сосудистых заболеваний в целой популяции, а также у мужчин и женщин отдельно на моделях, полностью подогнанных для всех факторов сердечно-сосудистого риска. Каждое SD повышение P-NT связано с существенным 8% повышением риска смертности по всем причинам в общей популяции и 13% риска смертности по всем причинам среди женщины, в то время как отсутствует такой повышенный риск, связанный с P-NT, у мужчин (Таблица 3).По-видимому, чрезмерный риск смерти главным образом обусловлен смертью по причине сердечно-сосудистых патологии с 29% на SD повышением в риске смерти по причине сердечно-сосудистой патологии в общей популяции и 50% чрезмерному риску у особей женского пола. Особи женского пола, относящиеся к верхнему по сравнению с нижним квартилем P-NT, имеют более чем 2-х кратный повышенный риск смерти по причине сердечно-сосудистой патологии (Таблица 3).
Многовариантные модели пропорциональных рисков Кокса для исходных P-NT относительно частоты сердечно-сосудистого заболевания, общей смертности и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний
Прямое сравнительное исследование между P-NT, N-BNP и CRP
Для сравнения статистической прочности и эффекта, ожидаемого в исследуемых конечных точках между P-NT и установленными биомаркерами в плазме, мы вводили P-NT одновременно с N-BNP и CRP в полностью подогнанных моделях (CRP и N-BNP измеряли, как описано Melander и др., JAMA. 2009; 302(1):49-57). Как представлено ниже, P-NT действует одинаково, также как и N-BNP и CRP для большинства конечных точек в общей популяции и у особей женского пола P-NT действует значительно лучше, чем N-BNP и CRP (CRP отдельно не является достоверным у особей женского пола). Кроме того, комбинирование (см. Melander и др., JAMA. 2009; 302(1):49-57) N-BNP и P-NT улучшает предсказательную эффективность для CVD у особей женского пола от 33% HR на 1SD (P-NT отдельно до 34,8% на 1SD (р<0,001) (комбинирование Р-NT и N-BNP.
Анализ подгрупп
Используя те же переменные в уравнении, мы использовали различные подгруппы для прогнозирования CVD, смертности, CVD смертности. Субъекты с сильными CVD-событиями исключали.
Прогнозирование CVD событий относится только к особям женского пола. Предсказательная эффективность P-NT была сходной у полностью здоровых подгруппах женщин и в подгруппах женщин в высоким риском, такие как женщины с диабетом или НВР женщины.
Прогнозирование CVD смертности с помощью P-NT было сильным у женщин и недостоверным у мужчин. Предсказательная эффективность P-NT представлена у здоровых женщин и у женщин с высоким риском (диабет или НВР).
Переклассификация женщин в группы риска
Методы:
Нами была рассчитана модель с-статистики и переклассификациии для 10-летних категорий предсказанного риска для различных событий (<5%, >=5-10%, >=10-20% и >=20%, соответственно) с Net Reclassification Improvement (NRI) для моделей с и без P-NT,30-32 Все анализы осуществляли с программным обеспечением Stata версии 11 (StataCorp, College Station, Texas). Двустороннее Р-значение <,05 принимали за статистически достоверное
Для смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, наблюдали пограничное достоверное повышение общей NRI 11%. P-NT корректно переклассифицировали 19% женщин, кто действительно умерли по причине сердечно-сосудистой патологии в категорию более высокого риска, но переклассифицировали только 5% женщин, которые не умерли по причине сердечно-сосудистой патологии в категорию с меньшим риском (Таблица 5). Среди женщин с промежуточным (10-20%) 10-ти летним риском, то есть группа, в которой полагают, что поддержка биомаркера является чрезвычайно важной для клинического решения относительно начала проведения первичного профилактического лечения (и переклассификации таким образом как "клиническая NRI"), 38 добавлений P-NT к традиционным факторам сердечно-сосудистого риска приводило к клинически достоверной NRI для 40% для смертности от сердечно-сосудистых заболеваний, с переклассификацией 21% женщин, которые умерли по причине сердечно-сосудистой патологии в категорию более высокого риска и 30% женщин, которые не умерли по причине сердечно-сосудистой патологии в категорию с меньшим риском.
Литература:
Pencina MJ, D'Agostino RB. Overall С as a measure of discrimination in survival analysis: model specific population value and confidence interval estimation. Stat Med. Jul 15 2004; 23(13):2109-2123.
Pencina MJ, D'Agostino RB, Sr., D'Agostino RB, Jr., Vasan RS. Evaluating the added predictive ability of a new marker: from area under the ROC curve to reclassification and beyond. Stat Med. Jan 30 2008; 27(2):157-172; обсуждение 207-112.
Ridker PM, Buring JE, Rifai N, Cook NR. Development and validation of improved algorithms for the assessment of global cardiovascular risk in women: the Reynolds Risk Score. Jama. Feb 14 2007; 297(6):611-619.
Описание чертежей
На фигуре 1 представлена типичная P-NT кривая доза/сигнал.
Фигура 2: График Каплан-Мейера для иллюстрации суммарных CVD-случаев у женщин, пороговое >< среднее = 109 пмоль/л P-NT.