УЛУЧШЕННЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЗИКУЛ ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ

1.Способ получения спонтанно высвобождаемых бактериальных везикул внешней мембраны (OMV), включающий стадии:
а) культивирования популяции грамотрицательных бактерий, которое включает стимуляцию высвобождения OMV путем применения напряжения растворенного кислорода (DOT), которое выше, чем физиологическое DOT, составляющее 30% насыщения воздуха, измеренное при 35°C; и,
b) восстановления OMV, высвобождаемых в а), где восстановление по меньшей мере включает удаление бактерий из OMV.
2. Способ по п.1, в котором DOT, используемое для стимуляции высвобождения OMV, составляет по меньшей мере 31, 32, 35, 40, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 или 200% насыщения воздуха, измеренного при 35°C, причем предпочтительно, DOT, используемое для стимуляции высвобождения OMV, составляет менее чем 350, 325, 300, 275, 250, 225, 205 или 185% насыщения воздуха, измеренного при 35°C.
3. Способ по п.1 или 2, в котором указанное культивирование включает режим, в котором используется добавление питательной среды, причем указанный режим выбирают из периодического режима с подпиткой, полунепрерывного режима и непрерывного режима.
4. Способ по любому из пп. 1-3, включающий
а) первую фазу, в которой биомасса грамотрицательной бактерии накапливается при первом DOT; и
b) вторую фазу, в которой высвобождение OMV из биомассы, накопленной в а), стимулируется применением второго DOT, которое выше, чем первое DOT;
где предпочтительно первое DOT представляет собой физиологическое DOT, предпочтительно DOT, составляет менее чем 50, 40, 35 или 32% насыщения воздуха, измеренное при 35°C.
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором грамотрицательная бактерия имеет по меньшей мере одно из следующего:
а) генетическую модификацию, которая заставляет бактерию продуцировать LPS с пониженной токсичностью, но которые сохраняют по меньшей мере часть своей адъювантной активности; предпочтительно, указанная генетическая модификация представляет собой модификацию, которая уменьшает или блокирует экспрессию одного или более генов, выбранных из генов lpxL1 и lpxL2 или их гомологов и гена lpxK или его гомолога, и/или представляет собой модификацию, которая влияет на экспрессию одного или более генов lpxE и/или pagL;
b) генетическую модификацию, которая заставляет бактерию сверхпродуцировать OMV по сравнению с соответствующей бактерией дикого типа без генетической модификации, где генетическая модификация представляет собой модификацию, которая ослабляет пептидогликан-связывающую активность одного или более белков, включающих пептидогликан-ассоциированный сайт, предпочтительно, указанная генетическая модификация представляет собой модификацию, которая уменьшает или блокирует экспрессию одного или более генов, выбранных из группы, состоящей из генов tolQ, tolR, tolA, tolB, tolRA, rmpM и ompA; и
c) генетическую модификацию, которая уменьшает или нокаутирует экспрессию генного продукта, предпочтительно, генного продукта, выбранного из группы, состоящей из cps, генного продукта биосинтеза липида A, PorA, PorB и OpA.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором грамотрицательная бактерия относится к роду, выбранному из группы, состоящей из родов Neisseria, Bordetella, Helicobacter, Salmonella, Vibrio, Shigella, Haemophilus, Pseudomonas, Escherichia, Moraxella, Klebsiella, и Acinetobacter, предпочтительно, бактерия относится к виду, выбранному из группы, состоящей из Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica, Neisseria gonorrhoeae, Helicobacter pylori, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Vibrio cholerae, Hajelisisis spis. Spis. Moraxella catarrhalis, Klebsiella pneumoniae и Acinetobacter baumannii.
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором грамотрицательная бактерия экспрессирует антиген, чужеродный для указанной грамотрицательной бактерии.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором грамотрицательная бактерия экспрессирует множество антигенов, где предпочтительно популяция включает более чем один штамм грамотрицательных бактерий, и где каждый штамм экспрессирует разные антигены.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором OMV стерилизуют, предпочтительно стерилизацией фильтром, предпочтительно с использованием фильтра с порами менее чем примерно 0,3 микрометра.
10. Способ по любому из пп. 1-9, дополнительно включающий стадию объединения OMV с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом и, необязательно, адъювантом.
11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором OMV предназначены для применения в вакцинах.
12. OMV, которые могут быть получены способом по любому из пп. 1-11.
13. Фармацевтическая композиция, содержащая OMV по п.12 и фармацевтически приемлемый эксципиент и, необязательно, адъювант.
14. OMV по п.12 или фармацевтическая композиция по п.13 для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно для лечения менингита.