СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
COMMERCIAL PRODUCTION PROCESS OF HUMAN RECOMBINANT INSULIN

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, биотехнологии и медицине, в частности к способам промышленного получения рекомбинантного инсулина человека, преимущественно связанных с разрушением клеток-продуцента при производстве субстанций инсулина.
Инсулин - белковый гормон животных и человека, вырабатываемый поджелудочной железой. Понижает содержание сахара в крови, задерживая распад гликогена в печени и увеличивая использование глюкозы мышечными и другими клетками регулирующий. Недостаток инсулина приводит к сахарному диабету (см., например, Новая иллюстрированная энциклопедия. Кн.7. Жа - Н76 Ит. - М.: Большая Российская энциклопедия. 2004. - 256 с.: ил., стр.199). Из-за ограниченности сырьевой базы потребности в инсулине не могут быть покрыты инсулином только животного происхождения.
Кроме того, при лечении сахарного диабета существует необходимость в использовании различных препаратов инсулина. Поэтому разработка эффективных способов получения инсулина из рекомбинантных штаммов микроорганизмов является актуальной задачей.
Из уровня техники известен способ разрушения бактериальных клеток с использованием фермента лизоцима и последующей обработке клетки под высоким давлением (см. Бухарин О.В., Васильев Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. - Томск, 1974; Основы биохимии, пер. с анг., т.I, - М., 1981, с.313-317; Lisozymeed, by E.F.Osserman, R.E Canfied, S. Beychok, N.Y., 1974; Jolles P., Jolles J, "Molec. And Cell Biochem.", 1984, v.63, №2, p.165-189).
Лизоцим - фермент класса гидролаз. Это стойкий белок, не теряющий литической способности при нагревании до 100°С. Способность лизоцима лизировать микроорганизмы настолько высока, что это свойство сохраняется в разведении 1:1000000.
Хорошо известно литическое действие лизоцима в отношении грамположительных бактерий М.lysodeikticus, В.megatherium S.flava (см. Бритвина Е.И. Бета-лизины и лизоцим в секретах и тканях организма человека. / Факторы естественного иммунитета при различных физиолигических и патологических состояниях. Вып.4, - Омск, 1976. - стр.93) и грамотрицательных бактерий (Escherichia coli) (см. http://microbiolgu.ru).
Описаны функции лизоцима - разрушение клеточной стенки (см. Бухарин О.В., Васильев Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. - Томск, 1974).
Фермент атакует пептидогликаны, в частности, муреин, входящие в состав клеточных стенок бактерий. Лизоцим гидролизует (1,4)-гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином. Пептидогликан при этом связывается с активным центром фермента (в форме кармана), расположенным между двумя его структурными доменами. Молекула субстрата в активном центре принимает конформацию, близкую к конформации переходного состояния. В соответствии с механизмом Филлипса, лизоцим связывается с гексасахаридом, затем переводит 4-й остаток в цепи в конформацию твист-кресла. В этом напряженном состоянии гликозидная связь легко разрушается (см. http://wikipedia.org).
Благодаря воздействию фермента лизоцима на клетку происходит утончение клеточной стенки. Последующая обработка клетки под высоким давлением приводит к ее разрушению, и гранулы рекомбинантного белка выходят в раствор (см. http://microbiolgu.ru).
Недостатками известного способа является неуправляемость процессом разрушения клеток. Это связано с тем, что клетка под действием лизоцима может разрушаться в нескольких местах, вследствие чего остатки клеточных стенок имеют различные размеры и различную массу. Наличие в растворе неоднородных образований затрудняет последующее отделение гранул рекомбинантного белка от разрушенных клеток, остатки которых, равные по массе гранулам рекомбинантного белка, загрязняют полупродукт.
Помимо этого, лизоцим - дорогостоящий фермент, его применение значительно увеличивает стоимость готового продукта.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу, включающему разрушение клеток-продуцентов, является способ, состоящий из культивирования штамма-продуцента Escherichia coli, разрушения бактериальных клеток дезинтеграцией, отделения телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и получением целевого продукта. В качестве штамма-продуцента используют штамм бактерии Escherichia coli 09/pNS07 (штамм депонирован в Центральной коллекции микроорганизмов Российского акционерного общества «БИОПРЕПАРАТ» ЦКМК «Б» под №ЦКМ В - 66ИН). Разрушение бактериальных клеток проводят на гомогенизаторе Гаулина в 0,1М трисбуфере, рН 6,8 - 7, содержащем 1,5 М мочевину и 1 мМ ЭДТА, 7 (см. патент РФ №2232813, 8 МПК C08L 23/12, дата подачи заявки 25.04.1997, опубликовано 20.07.2004 г. «Способ промышленного получения рекомбинантного инсулина человека»).
Недостатком известного способа является многостадийная последовательность разрушения клеток-продуцента. Это связано с тем, что давление, создаваемое в гомогенизаторе Гаулин и равное 900 бар, не обеспечивает полного разрушения клетки-продуцента за один проход культуры клеток через гомогенизатор. Полное разрушение клетки достигается только при неоднократном, например двух-трехкратном, пропускании культуры клеток-продуцента через гомогенизатор. Кроме того, после многостадийного разрушения клеток используют сложный многоэтапный процесс ренатурации белка и осаждения примесных белков.
Техническим результатом, на который направлено заявляемое изобретение, является сокращение технологического процесса промышленного получения инсулина, а также создание эффективного способа разрушения клеток-продуцента за счет получения однородных равномерных гранул рекомбинантного белка наноразмера.
Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе промышленного получения рекомбинантного инсулина человека, включающем разрушение бактериальных клеток, согласно изобретению, разрушение бактериальных клеток и последующую фильтрацию проводят на наногомогенизаторе, в качестве которого используют наногомогенизатор «Microfluidizer», при давлении, равном 2070 бар, и скорости потока культуральной жидкости 330-450 мл/мин.
Разрушение бактериальных клеток на наногомогенизаторе позволяет получать узкий гранулометрический состав рекомбинантного белка. Кроме того, разрушение происходит непосредственно в культуральной жидкости.
Последующая после разрушения клеток фильтрация обеспечивает стерилизацию продукта, за счет которой увеличивается стабильность препаратов и их срок годности, что способствует более эффективному осуществлению способа.
Благодаря использованию наногомогенизатора «Microfluidizer», после разрушения клеток-продуцента получают однородные равномерные гранулы рекомбинантного белка, имеющие уменьшенные размеры, а именно 60-80 нм или 50-90 нм, которые затем эффективно отделяют от более мелких остатков клеточных стенок на последующей стадии.
Кроме того, применение наногомогенизатора «Microfluidizer», обеспечивает сокращение технологического процесса, т.к. исключается стадия отделения клеток-продуцента от культуральной жидкости, что в свою очередь позволяет увеличить полезный выход рекомбинантого белка на заключительной стадии.
Обработка клеток-продуцента при давлении, равном 2070 бар, и скорости потока, равном 330-450 мл/мин, разрушает клетку до одинакового наноразмера за один проход через наногомогенизатор и обеспечивает постоянные условия обработки всего объема продукта. Сокращение числа проходов экономит время, необходимое для производства инсулина.
Технических решений, совпадающих с совокупностью существенных признаков заявляемого изобретения, не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности, как «новизна».
Заявляемые существенные признаки, предопределяющие получение указанного технического результата, явным образом не следуют из уровня техники, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого изобретения такому условию патентоспособности как «изобретательский уровень».
Условие патентоспособности «промышленная применимость» подтверждено на примере конкретного осуществления способа промышленного получения рекомбинантного инсулина человека, включающего разрушение клеток-продуцентов на наногомогенизаторе.
Заявляемый способ поясняется чертежом, где дана
схема осуществления разрушения бактериальных клеток на наногомогенизаторе.
Обрабатываемый продукт подается под давлением со скоростью до нескольких сот метров в секунду, например 330-450 мл/мин. Для достижения желаемых результатов давление регулируется в насосе-увеличителе в заданном диапазоне, например, 1720-2070 бар. Когда насос-увеличитель проходит такт сжатия, он прокачивает продукт при постоянном давлении через интерактивную камеру, в которой продукт ускоряется до высоких скоростей. Частицы продукта на высокой скорости соударяются между собой и/или с износостойкими поверхностями камеры наногомогенизатора, создаются высокие срезающие усилия и ударная сила, благодаря которым достигаются желаемые результаты. По выходе из интерактивной камеры продукт проходит по внешнему змеевику, где задается желаемая температура продукта.
Примеры конкретного выполнения.
Исследования, подтверждающие осуществление заявляемого способа, были проведены при различных режимах, в частности, различных значениях давления и скорости потока подачи культуральной жидкости.
В качестве рекомбинантного штамма использовали культуру штамма E.Coli в объеме, равном 2 л.
Разрушение бактериальных клеток проводят при постоянном давлении, равном 2070 бар, и скорости потока подачи культуральной жидкости 330-450 мл/мин. Поддержание давления постоянным обеспечивает постоянные условия обработки всего объема продукта.
Температуру продукта измеряют на выходном трубопроводе между наногомогенизатором и теплообменником и поддерживают в пределах 20-22°С.
Пробы клеток-продуцентов анализировали с помощью электронного микроскопа.
Полученные данные приведены в таблице.
№ пробы
Давление, бар
Скорость потока, мл/мин
Количество равномерных гранул, %
Количество неравномерные гранул, %
Размер гранул, нм
1
1720,00
330,00
70,00
30,00
50-90
2
2070,00
330,00
91,00
9,00
60-90
3
2070,00
450,00
98,00
2,00
60-80
Как видно из таблицы, проведенные исследования подтверждают преимущества заявляемого способа. Разрушение клеток-продуцента на наногомогенизаторе, в частности на наногомогенизаторе «Microfluidizer», является наиболее эффективным: выход гранул рекомбинантного белка составляет 98%; клетки разрушаются за один проход. В результате осуществления предлагаемого способа разрушения клеток-продуцента получают равномерные гранулы одинакового наноразмера.