СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА

1. Способ вставки донорной последовательности в геном клетки, включающий:
введение в клетку средства доставки с нагрузкой, содержащей:
(a) нуклеазную композицию, содержащую: одну или более сиквенс-специфических нуклеаз или одну или более нуклеиновых кислот, которые кодируют одну или более сиквенс-специфических нуклеаз, где одна или более сиквенс-специфических нуклеаз расщепляют геном клетки;
(b) донорную композицию-мишень, содержащую: первую донорную ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, которая вставлена в геном клетки, где вставка указанной нуклеотидной последовательности дает, в геноме клетки в сайте вставки, последовательность-мишень для сайт-специфической рекомбиназы;
(c) рекомбиназную композицию, содержащую: сайт-специфическую рекомбиназу или нуклеиновую кислоту, кодирующую сайт-специфическую рекомбиназу, где сайт-специфическая рекомбиназа распознает указанную последовательность-мишень; и
(d) донорную композицию-вставку, содержащую: вторую донорную ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, которая вставлена в геном клетки в результате распознавания указанной последовательности-мишени сайт-специфической рекомбиназой.
2. Способ по п.1, где вставка нуклеотидной последовательности первой донорной ДНК донорной композиции-мишени дает первую последовательность-мишень для сайт-специфической рекомбиназы в первой локализации в геноме клетки, и вторую последовательность-мишень для сайт-специфической рекомбиназы во второй локализации в геноме клетки.
3. Способ по п.1, где нуклеазная композиция расщепляет геном клетки на двух локализациях, и где донорная композиция-мишень содержит две указанных первых донорных ДНК, каждая из которых содержит нуклеотидную последовательность, которая вставлена в геном клетки, с получением первой последовательности-мишени для сайт-специфической рекомбиназы в первой локализации в геноме клетки и второй последовательности-мишени для сайт-специфической рекомбиназы во второй локализации в геноме клетки.
4. Способ по п.2 или 3, где первая и вторая локализации в геноме клетки разделены 1000000 пар оснований или менее.
5. Способ по п.2 или 3, где первая и вторая локализации в геноме клетки разделены 100000 пар оснований или менее.
6. Способ по п.2 или 3, где нуклеотидная последовательность донорной композиции-вставки, которая вставлена в геном клетки, имеет длину от 10 пар оснований (п.о.) до 100 тысяч пар нуклеотидов (т.п.н.).
7. Способ по любому из пп. 1-6, где вторая донорная ДНК содержит две последовательности-мишени для сайт-специфической рекомбиназы, где две последовательности-мишени окружают нуклеотидную последовательность, которая вставлена в геном клетки.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где последовательность-мишень для сайт-специфической рекомбиназы выбирают из: attB сайта, attP сайта, attL сайта, attR сайта, loxP сайта и FRT сайта.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где сайт-специфическую рекомбиназу выбирают из: ΦC31, ΦC31 RDF, Cre и FLP.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где по меньшей мере одну из одной или более сиквенс-специфических нуклеаз выбирают из: мегануклеазы, хоуминг-эндонуклеазы, цинк-пальцевой нуклеазы (ZFN) и эффекторной нуклеазы, подобной активаторам транскрипции (TALEN).
11. Способ по любому из пп. 1-9, где по меньшей мере одна из одной или более сиквенс-специфических нуклеаз является a CRISPR/Cas эффекторным белком 2 класса.
12. Способ по п.11, где CRISPR/Cas эффекторный белок 2 класса выбирают из Cas9 и cpf1.
13. Способ по п.11 или 12, где нуклеазная композиция содержит одну или более CRISPR/Cas направляющих нуклеиновых кислот или одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих CRISPR/Cas направляющие нуклеиновые кислоты.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где средство доставки является невирусным.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где средством доставки является наночастица.
16. Способ по п.15, где, в дополнение к нагрузке, наночастица содержит ядро, содержащее анионную полимерную композицию, катионную полимерную композицию и катионную полипептидную композицию.
17. Способ по п.16, где указанная анионная полимерная композиция содержит анионный полимер, выбранный из поли(глутаминовой кислоты) и поли(аспарагиновой кислоты).
18. Способ по п.16 или 17, где указанная катионная полимерная композиция содержит катионный полимер, выбранный из поли(аргинина), поли(лизина), поли(гистидина), поли(орнитина) и поли(цитруллина).
19. Способ по любому из пп. 16-18, где наночастица дополнительно содержит сбрасываемый слой, инкапсулирующий ядро.
20. Способ по п.19, где сбрасываемым слоем является анионное покрытие или катионное покрытие.
21. Способ по п.19 или 20, где сбрасываемый слой содержит один или более компонентов из числа: диоксида кремния, пептоида, полицистеина, кальция, оксида кальция, гидроксиапатита, фосфата кальция, сульфата кальция, марганца, оксида марганца, фосфата марганца, сульфата марганца, магния, оксида магния, фосфата магния, сульфата магния, железа, оксида железа, фосфата железа и сульфата железа.
22. Способ по любому из пп. 19-21, где наночастица дополнительно содержит поверхностное покрытие, окружающее сбрасываемый слой.
23. Способ по п.22, где поверхностное покрытие содержит катионный или анионный якорный домен, который взаимодействует электростатически со сбрасываемым слоем.
24. Способ по п.22 или 23, где поверхностное покрытие содержит один или более направленных лигандов.
25. Способ по п.24, где один или более направленных лигандов выбирают из: пептида, ScFv, F(ab), аптамера нуклеиновой кислоты или пептоида.
26. Способ по п.22 или 23, где поверхностное покрытие содержит один или более направленных лигандов, выбранных из группы, состоящей из: фрагмента гликопротеина вируса бешенства (RVG), ApoE-трансферрина, лактоферрина, меланоферритина, овотрансферритина, L-селектина, E-селектина, P-селектина, сиалилированных пептидов, полисиалилированных O-связанных пептидов, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, рецепторов смерти-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, фактора стволовой клетки (SCF), CD70, SH2 домен-содржащего белка 1A (SH2D1A), эксендина-4, GLP1, RGD, лиганда Трансферрина, FGF фрагмента, янтарной кислоты, бифосфоната, хемотактического жира гемопоэтических стволовых клеток, сфингозина, церамида, сфингозин-1-фосфата, церамид-1-фосфата IL2, CD80, CD86, CD8 эпсилон, пептида-HLA-A*2402 и активного направленного фрагмента любого из вышеописанных.
27. Способ по п.22 или 23, где поверхностное покрытие содержит один или более направленных лигандов, которые представлены для направленного связывания с мишенью, выбранной из: CD3, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD3-эпсилон, CD3-гамма, CD3-дельта; TCR Альфа, TCR Бета, TCR гамма и/или TCR дельта постоянных областей; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL2R, IL7R, IL10R, IL12R, IL15R, IL18R, TNFα, IFNγ, TGF-β и α5β1.
28. Способ по п.22 или 23, где поверхностное покрытие содержит один или более направленных лигандов, которые представлены для направленного связывания клетками-мишенями, выбранными из: клеток костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток (HSC), гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников (HSPCs), мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), миелоидных клеток-предшественников, лимфоидных клеток-предшественников, T-клеток, B-клеток, NKT клеток, NK клеток, дендритных клеток, моноцитов, гранулоцитов, эритроцитов, мегакариоцитов, мастоцитов, базофилов, эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, клеток-предшественников эритроидов, клеток-предшественников мегакариоцитов-эритроидов (MEP), общих миелоидных клеток-предшественников (CMP), плюрипотентных клеток-предшественников (MPP), гемопоэтических стволовых клеток (HSC), краткосрочных HSC (ST-HSC), IT-HSC, долгосрочных HSC (LT-HSC), эндотелиальных клеток, нейронов, астроцитов, клеток поджелудочной железы, клеток β-островков поджелудочной железы, клеток печени, мышечных клеток, скелетных клеток, клеток сердечной мышцы, клеток печени, жировых клеток, клеток кишечника, клеток толстой кишки и клеток желудка.
29. Способ по любому из пп. 1-14, где средством доставки является направленный лиганд, конъюгированный с нагрузкой, где направленный лиганд представлен для направленного связывания с белком клеточной поверхности.
30. Способ по любому из пп. 1-14, где средством доставки является направленный лиганд, конъюгированный с полипептидным доменом заряженного полимера, где направленный лиганд представлен для направленного связывания с белком клеточной поверхности, и где полипептидный домен заряженного полимера конденсирован с нуклеиновой кислотной нагрузкой и/или электростатически взаимодействует с белковой нагрузкой.
31. Способ по п.29 или 30, где направленным лигандом является пептид, ScFv, F(ab), аптамер нуклеиновой кислоты или пептоид.
32. Способ по п.30, где полипептидный домен заряженного полимера имеет длину в диапазоне от 3 до 30 аминокислот.
33. Способ по любому из пп. 30-32, где средство доставки дополнительно содержит анионный полимер, взаимодействующий с нагрузкой, и полипептидный домен заряженного полимера.
34. Способ по п.33, где анионный полимер выбирают из поли(глутаминовой кислоты) и поли(аспарагиновой кислоты).
35. Способ по любому из пп. 29-34, где направленный лиганд имеет длину от 5-50 аминокислот.
36. Способ по любому из пп. 29-35, где направленный лиганд представлен для направленного связывания с белком клеточной поверхности, выбранным из семейства B рецептора, сопряженного с G-белком (GPCR), рецепторной тирозинкиназой (RTK), поверхностноклеточным гликопротеином и молекулой межклеточной адгезии.
37. Способ по любому из пп. 29-35, где направленный лиганд выбирают из группы, состоящей из: фрагмента гликопротеина вируса бешенства (RVG), ApoE-трансферрина, лактоферрина, меланоферритина, овотрансферритина, L-селектина, E-селектина, P-селектина, сиалилированных пептидов, полисиалилированных O-связанных пептидов, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, рецепторов смерти-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, фактора стволовой клетки (SCF), CD70, SH2 домен-содржащего белка 1A (SH2D1A), эксендина, эксендина-S11C, GLP1, RGD, лиганда Трансферрина, FGF фрагмента, α5β1 лиганда, IL2, Cde3-эпсилона, пептида-HLA-A*2402, CD80, CD86, янтарной кислоты, бифосфоната, хемотактического жира гемопоэтических стволовых клеток, сфингозина, церамида, сфингозин-1-фосфата, церамид-1-фосфата и активного направленного фрагмента любого из вышеописанных.
38. Способ по любому из пп. 29-35, где направленный лиганд представлен для направленного связывания с мишенью, выбранной из: CD3, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD19, CD20, CD22, CD3-эпсилон, CD3-гамма, CD3-дельта; TCR Альфа, TCR Бета, TCR гамма и/или TCR дельта постоянных областей; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, TNFα, IFNγ, TGF-β и α5β1.
39. Способ по любому из пп. 29-35, где направленный лиганд представлен для связывания с клеточным типом, выбранным из группы, состоящей из: клеток костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток (HSC), гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников (HSPCs), мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), миелоидных клеток-предшественников, лимфоидных клеток-предшественников, T-клеток, B-клеток, NKT клеток, NK клеток, дендритных клеток, моноцитов, гранулоцитов, эритроцитов, мегакариоцитов, мастоцитов, базофилов, эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, клеток-предшественников эритроидов, клеток-предшественников мегакариоцитов-эритроидов (MEP), общих миелоидных клеток-предшественников (CMP), плюрипотентных клеток-предшественников (MPP), гемопоэтических стволовых клеток (HSC), краткосрочных HSC (ST-HSC), IT-HSC, долгосрочных HSC (LT-HSC), эндотелиальных клеток, нейронов, астроцитов, клеток поджелудочной железы, клеток β-островков поджелудочной железы, клеток печени, мышечных клеток, скелетных клеток, клеток сердечной мышцы, клеток печени, жировых клеток, клеток кишечника, клеток толстой кишки и клеток желудка.
40. Способ по любому из пп. 1-39, где вставка нуклеотидной последовательности второй донорной ДНК в геном клетки дает оперативную связь вставленной последовательности с эндогенным промотором.
41. Способ по п.40, где эндогенный промотор выбирают из группы, состоящей из: (i) специфического T-клеточного промотора; (ii) CD3 промотора; (iii) CD28 промотора; (iv) специфического к стволовой клетке промотора; (v) специфического к соматической клетке промотора; и (vi) промотора Т-клеточного рецептора (TCR) Альфа, Бета, Гамма или Дельта; (v) специфического к B-клетке промотора; (vi) CD19 промотора; (vii) CD20 промотора; (viii) CD22 промотора; (ix) B29 промотора; и (x) V(D)J-спцифического к T-клетке или B-клетке промотора.
42. Способ по любому из пп. 1-39, где нуклеотидная последовательность донорной композиции-вставки, которая вставлена, включает кодирующую белок последовательность, которая оперативно связана с промотором.
43. Способ по п.42, где промотор выбирают из группы, состоящей из: (i) специфического T-клеточного промотора; (ii) CD3 промотора; (iii) CD28 промотора; (iv) специфического к стволовой клетке промотора; (v) специфического к соматической клетке промотора; и (vi) промотора Т-клеточного рецептора (TCR) Альфа, Бета, Гамма или Дельта; (v) специфического к B-клетке промотора; (vi) CD19 промотора; (vii) CD20 промотора; (viii) CD22 промотора; (ix) B29 промотора; и (x) V(D)J-спцифического к T-клетке или B-клетке промотора.
44. Способ по любому из пп. 1-43, где нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК, которая вставлена в геном клетки, кодирует: (i) белок Т-клеточного рецептора (TCR); (ii) IgA, IgD, IgE, IgG или IgM белок; или (iii) κ или λ цепи IgA, IgD, IgE, IgG или IgM белка.
45. Способ по любому из пп. 1-43, где нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК, которая вставлена в геном клетки, кодирует CDR1, CDR2 или CDR3 область белка Т-клеточного рецептора (TCR).
46. Способ по любому из пп. 1-43, где нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК, которая вставлена в геном клетки, кодирует химерный антигенный рецептор (CAR).
47. Способ по п.46, где вставка нуклеотидной последовательности, которая кодирует CAR, дает оперативную связь нуклеотидной последовательности, которая кодирует CAR, с эндогенным специфическим к T-клетке промотором.
48. Способ по любому из пп. 1-43, где нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК, которая вставлена в геном клетки, кодирует мультивалентный поверхностный рецептор.
49. Способ по п.48, где клеткой является T-клетка.
50. Способ по п.48 или п.49, где мультивалентным поверхностным рецептором является биспецифический или триспецифический химерный антигенный рецептор (CAR) или Т-клеточный рецептор (TCR).
51. Способ по любому из пп. 1-43, где нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК, которая вставлена в геном клетки, кодирует клеточноспецифический направленный лиганд, который связан с мембраной и присутствует внеклеточно.
52. Способ по любому из пп. 1-43, где нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК, которая вставлена в геном клетки, кодирует белок-репортер.
53. Способ по п.52, где белком-репортером является флуоресцентный белок.
54. Способ по п.52 или 53, где нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок-репортер, оперативно связана с клеточноспецифическим или ткань-специфическим промотором.
55. Способ по п.52 или 53, где нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок-репортер, оперативно связана с конститутивным промотором.
56. Способ по любому из пп. 1-55, где нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК, которая вставлена в геном клетки, включает кодирующую белок нуклеотидную последовательность, которая не имеет интроны.
57. Способ по п.56, где нуклеотидная последовательность, которая не имеет интроны, кодирует весь или часть TCR белка или иммуноглобулина.
58. Способ по любому из пп. 1-57, где способ включает введение первого и второго указанных средств доставки в клетку, где:
(1) нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК первого средства доставки, которая вставлена в геном клетки, кодирует субъединицу Альфа или Дельта Т-клеточного рецептора (TCR), и нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК второго средства доставки, которая вставлена в геном клетки, кодирует субъединицу Бета или Гамма TCR; или
(2) нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК первого средства доставки, которая вставлена в геном клетки, кодирует субъединицу Альфа или Гамма Т-клеточного рецептора (TCR), и нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК второго средства доставки, которая вставлена в геном клетки, кодирует субъединицу Бета или Дельта TCR; или
(3) нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК первого средства доставки, которая вставлена в геном клетки, кодирует κ цепь IgA, IgD, IgE, IgG или IgM белка, и нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК второго средства доставки, которая вставлена в геном клетки, кодирует λ цепь IgA, IgD, IgE, IgG или IgM белка.
59. Способ по любому из пп. 1-57, где способ включает введение первого и второго указанных средств доставки в клетку,
где нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК первого средства доставки, которая вставлена в геном клетки, кодирует постоянную область субъединицы Альфа или Дельта Т-клеточного рецептора (TCR), и
где нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК второго средства доставки, которая вставлена в геном клетки, кодирует постоянную область субъединицы Бета или Гамма TCR.
60. Способ по любому из пп. 1-57, где способ включает введение первого и второго указанных средств доставки в клетку, где:
(1) нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК первого средства доставки вставлена в нуклеотидную последовательность, которая действует как промотор подъединицы Альфа или Дельта Т-клеточного рецептора (TCR), и нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК второго средства доставки вставлена в нуклеотидную последовательность, которая действует как промотор субъединицы Бета или Гамма TCR; или
(2) нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК первого средства доставки вставлена в нуклеотидную последовательность, которая действует как промотор подъединицы Альфа или Гамма Т-клеточного рецептора (TCR), и нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК второго средства доставки вставлена в нуклеотидную последовательность, которая действует как промотор субъединицы Бета или Дельта TCR; или
(3) нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК первого средства доставки вставлена в нуклеотидную последовательность, которая действует как промотор для κ цепи IgA, IgD, IgE, IgG или IgM белка, и нуклеотидная последовательность второй донорной ДНК второго средства доставки вставлена в нуклеотидную последовательность, которая действует как промотор λ цепи IgA, IgD, IgE, IgG или IgM белка.
61. Способ по любому из пп. 1-60, где клеткой является клетка млекопитающего.
62. Способ по любому из пп. 1-61, где клеткой является клетка человека.
63. Композиция, содержащая:
(a) нуклеазную композицию, содержащую: одну или более сиквенс-специфических нуклеаз или одну или более нуклеиновых кислот, которые кодируют одну или более сиквенс-специфических нуклеаз;
(b) донорную композицию-мишень, содержащую: первую донорную ДНК, которая содержит последовательность-мишень для сайт-специфической рекомбиназы;
(c) рекомбиназную композицию, содержащую: сайт-специфическую рекомбиназу или нуклеиновую кислоту, кодирующую сайт-специфическую рекомбиназу, где сайт-специфическая рекомбиназа распознает указанную последовательность-мишень; и
(d) донорную композицию-вставку, содержащую: вторую донорную ДНК, которая содержит нуклеотидную последовательность, представляющую интерес, для вставки в геном клетки-мишени;
где (a), (b), (c) и (d) являются нагрузками как часть одного и того же средства доставки.
64. Композиция по п.63, где средством доставки является наночастица.
65. Композиция по п.64, где наночастица содержит ядро, содержащее (a), (b), анионную полимерную композицию, катионную полимерную композицию и катионную полипептидную композицию.
66. Композиция по п.64 или 65, где наночастица содержит направленный лиганд, который направляет наночастицу на белок клеточной поверхности.
67. Композиция по п.66, где белком клеточной поверхности является CD47.
68. Композиция по п.67, где направленным лигандом является миметик SIRPα белка.
69. Композиция по п.68, где наночастица дополнительно содержит лиганд, запускающий эндоцитоз.
70. Композиция по любому из пп. 63-69, где нагрузки образуют один или более деоксирибонуклеопротеиновых комплексов или один или более рибо-деоксирибонуклеопротеиновых комплексов.
71. Композиция по любому из пп. 63-70, где средством доставки является направленный лиганд, конъюгированный с полипептидным доменом заряженного полимера, где направленный лиганд представлен для направленного связывания с белком клеточной поверхности, и где полипептидный домен заряженного полимера взаимодействует электростатически с одной или более нагрузками.
72. Композиция по п.71, где средство доставки дополнительно содержит анионный полимер, взаимодействующий с одной или более нагрузками и полипептидным доменом заряженного полимера.
73. Композиция по любому из пп. 63-70, где средством доставки является направленный лиганд, конъюгированный с одной или более нагрузками, где направленный лиганд представлен для направленного связывания с белком клеточной поверхности.
74. Композиция по любому из пп. 63-70, где средство доставки включает направленный лиганд, нанесенный на частицу эмульсии вода-масло-вода, на мицеллярную частицу эмульсии масло-вода, на многослойную частицу эмульсии вода-масло-вода, на многослойную частицу или на нанобот ДНК-оригами.
75. Способ по любому из пп. 66-71, где направленным лигандом является пептид, ScFv, F(ab), аптамер нуклеиновой кислоты или пептоид.
76. Композиция по любому из пп. 63-70, где средство доставки является невирусным.