АНТИТЕЛА К КОМПОНЕНТУ КОМПЛЕМЕНТА С5
ANTIBODIES TO COMPLEMENT COMPONENT C5

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА
[0001] В соответствии с п. 119(e) раздела 35 Кодекса законов США, настоящая заявка заявляет приоритет по предварительной заявке на патент США №61/768374, поданной 20 февраля 2014 года, и предварительной заявке на патент США №61/944943, поданной 26 февраля 2014 года, которые обе в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее изобретение относится к антителам и их композициям, кодирующим их полинуклеотидам, экспрессионным векторам и клеткам-хозяевам для выработки антител, а также композициям и способам диагностики и лечения заболеваний, опосредованных системой комплемента.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Система комплемента состоит из почти 50 отдельных белков, функционирующих как часть врожденной иммунной системы, обеспечивая начальную стадию иммунной защиты организма, опсонизацию инородных материалов и тканевый гомеостаз. (Ricklin D., 2010 год, Complement: a Key system for immune surveillance and homeostasis. Nature: Immunology, 785-795) Система комплемента имеется у всех многоклеточных организмов и филогенетически предшествует образованию адаптивной иммунной системы (Zarkadis I.K., 2001 год Phylogenetic aspects of the complement system. Development and Comparative Immunology, 745-762.). Активация системы комплемента происходит тремя основными путями: классическим, лектиновым и альтернативным. На фигуре 1 в схематическом виде представлено три основных пути активации комплемента. См. также Donoso и соавт., "The Role of Inflammation in the Pathogenesis of Age-related Macular Degeneration", Survey of Ophthalmology, Vol. 51, No. 2, март-апрель 2006 год.
[0004] Во время процесса активации последовательные белок-белковые взаимодействия и протеолитические расщепления приводят к образованию С3- и С5-конвертаз. Эти конвертазы отвечают за образование продуктов расщепления в процессе активации комплемента, которые представляют собой эффекторные молекулы каскада комплемента, играющие важную роль в опсонизацин, образовании анафилатоксинов и формировании мембраноатакующего комплекса (МАК). Последний имеет определяющее значение для литической активности каскада комплемента (Ricklin D., 2010 год). В нормальных условиях активация каскадов комплемента обеспечивает защиту от патогенных бактерий, вирусов, а также удаление больных и поврежденных тканей. В норме формирование МАК не оказывает воздействия на окружающую ткань благодаря наличию расположенных на поверхности клеток и растворимых регуляторных компонентов, которые включают CFH, родственные CFH белки, С4ВР, CD46, CD55, CD59 и фактор комплемента I (CFI). Однако в случае избыточной активации или нарушения функции регуляторных компонентов комплемента возникают острые и хронические заболевания. Примеры заболеваний, при которых неконтролируемая активация комплемента расценивается как этиологический фактор патологии у человека, включают гломерулонефрит, системную красную волчанку, пароксизмальную ночную гемоглобинурию, болезнь Альцгеймера, наследственный ангионевротический отек, миастению гравис и возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) (Ricklin & Lambris, 2013 год, Complement in Immune and inflammatory Disorders : Pthaological Mechanisms. Journal of Immunology, 3831-3838).
[0005] C5 представляет собой белок молекулярной массой 190 кДа, состоящий из двух полипептидных цепей (α, массой 115 кДа, и β, массой 75 кДа), связанных между собой дисульфидными связями. С5-конвертаза расщепляет С5 по остатку аргинина, расположенному на 75 аминокислот ниже N-конца α-цепи, образуя продукты расщепления комплемента С5а массой 7,4 кДа и C5b массой 180 кДа. Компонент C5b выступает в качестве компонента, инициирующего сборку мембраноатакующего комплекса (МАК) путем последовательного добавления компонентов С6, С7, С8 и С9. Субъединицы С6-С8 соединяются с C5b в соотношении 1:1, тогда как С9 включается в комплекс в виде многочисленных субъединиц, образуя неспецифическую пору в плазматических мембранах как прокариотических, так и эукариотических клеток (фигура 2). См. также Bubeck D., 2014 год, "The making of a macromolecular machine: assembly of the membrane attack complex" Biochemistry, 53(12):1908-15. Формирование МАК на клеточной поверхности имеет несколько последствий для клеток. Высокие уровни нерегулируемого притока и оттока растворенных веществ приводят к набуханию и, в конечном итоге, лизису клетки. Лизис вызывает неконтролируемое высвобождение клеточного материала, способствуя созданию провоспалительной среды и потере клеток. Формирование МАК на клеточной поверхности в сублитических концентрациях может способствовать высвобождению провоспалительных и проангиогенных цитокинов и факторов роста, усилению клеточного стресса и последующей некротической гибели клеток.
[0006] Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) является основной причиной слепоты в пожилом возрасте в развитых странах. Лишь среди населения США распространенность поздних форм ВМД, которые ассоциируются с потерей зрения, составляет почти 2 миллиона случаев. Еще 7 миллионов человек с промежуточной ВМД подвержены повышенному риску развития поздних форм ВМД. При учете данных европейской популяции количество больных увеличивается почти вдвое. ВМД характеризуется прогрессирующей потерей зрения, обусловленной околовоспалительным процессом, который вызывает прогрессирующую дегенерацию нервной ткани сетчатки и поддерживающих тканей, включающих пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) и хориокапилляры. Большинство клинически значимых случаев потери зрения возникают, когда нейродегенеративные изменения поражают центр сетчатки в пределах желтого пятна - узкоспециализированной области глаза, отвечающей за остроту зрения. Заболевание оказывает колоссальное влияние на физическое и психическое здоровье пациента из-за потери зрения и повышенной зависимости от членов семьи при выполнении повседневных действий.
[0007] Нарушение регуляции системы комплемента тесно коррелирует с развитием ВМД. Во-первых, установлено, что генетические мутацин в более чем 20 генах коррелируют с риском развития ВМД, обуславливая, согласно расчетам, 70% общего риска. (Fritsche и соавт., "Age related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together", Annu Rev Genomics Hum Genet. 2014; 15: 151-71). Среди этих 20 генов 5 представляют собой гены комплемента, мутацин в которых сами по себе обуславливают 57% общего риска развития поздних форм ВМД. Кроме того, связанное с ВМД воспаление и сопутствующее нарушение регуляции активности комплемента, о котором свидетельствует повышение уровня продуктов активации комплемента в системном кровотоке и, по данным гистопатологического анализа, в пораженных ВМД тканях, возникает в отсутствие известного генетического полиморфизма белков комплимента. Новые данные подчеркнули потенциальное патологическое воздействие комплемента, обнаружив присутствие мембраноатакующего комплекса в пораженных тканях и в случаях поздних форм ВМД (Whitmore S и соавт. 2014 год, "Complement activation and choriocapillaris loss in early AMD: Implications for pathophysiology and therapy." Progress in Retinal and Eye Research, 5 декабря 2014 года, онлайн-публикация до выхода печатной версии; Nishigauchi КМ и соавт. 2012 год "C9-R95X polymorphism in patients with neovascular age-related macular degeneration", Jan 131; 53(1) 508-12). Данные результаты свидетельствуют о целесообразности блокирования конечного компонента пути активации комплемента в качестве терапевтической мишени при лечении ВМД. В настоящее время большинство лекарственных средств, мишенью которых является формирование МАК, действуют путем блокирования образования C5b - ключевого структурного элемента, необходимого для начала формирования МАК. Однако при этом они также блокируют образование С5а, что приводит к утрате функциональной активности С5а, связанной с тканевым гомеостазом (удалением опсонизированных частиц), выживанием нейронов и стимулированием антиангиогенного ответа. У человека этот процесс избирательного блокирования формирования МАК обычно осуществляется белком клеточной поверхности CD59, который блокирует сборку МАК, и растворимыми факторами витронектином и кластерином. С целью имитации естественного механизма и сохранения благоприятных предшествующих этапов активации комплемента настоящая заявка раскрывает разработку нового лекарственного моноклонального антитела, которое связывает С5, уникальным образом не препятствуя процессингу молекулы С5 до С5а и C5b, но ингибируя формирование МАК (фигура 2), таким образом предотвращая образование ключевого патогенного компонента, ассоциируемого с ВМД. Благодаря блокированию формирования МАК с сохранением ключевых поддерживающих тканей глаза, то есть хориокапилляров и ПЭС, сохраняется функция и жизнеспособность нервной ткани сетчатки, жизненно необходимой для поддержания зрения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Изобретение включает способы и композиции для приготовления лекарственной формы, содержащей антитело к компоненту комплемента С5, или антитело к С5. В одном аспекте изобретения антитело к С5 не связывается с С5а и ингибирует комплементзависимый гемолиз. В другом аспекте изобретения антитело к С5 связывается с C5b и ингибирует формирование мембраноатакующего комплекса (МАК) у пациента. В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 блокирует связывание С5 с компонентом комплемента 6 человека. В другом варианте реализации изобретения антитело к С5 блокирует связывание С5 с компонентом комплемента 7 человека. В другом аспекте изобретения антитело к С5 характеризуется тем, что после включения С5 в мембраноатакующий комплекс оно больше не связывается или связывается в меньшей степени с С5 (или его субъединицей).
2
[0009] В другом аспекте изобретения антитело к компоненту комплемента С5 или антитело к С5 связывается с С5 с Kd более чем около 10 пМ. В другом аспекте изобретения антитело к С5 представляет собой моноклональное антитело. В другом варианте реализации изобретения антитело к С5 выбрано из группы, состоящей из моноклонального антитела, поликлонального антитела, рекомбинантного антитела, гуманизированного антитела, химерного антитела, полиспецифического антитела и фрагмента антитела. В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 представляет собой фрагмент антитела, и этот фрагмент антитела представляет собой фрагмент Fab, фрагмент Fab', фрагмент F(ab'), фрагмент Fv, диатело или одноцепочечную молекулу антитела. В другом варианте реализации изобретения антитело к С5 представляет собой IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В другом аспекте изобретения антитело к С5 представляет собой IgG1.
[0010] В другом аспекте изобретения антитело к С5 соединено с метящей группой. В другом варианте реализации изобретения антитело к С5 соединено с метящей группой, и метящая группа представляет собой оптическую метку, радиоизотоп, радионуклид, ферментную группу и биотинильную группу.
[0011] В другом аспекте изобретение включает процесс приготовления выделенного антитела, связывающегося с компонентом комплемента С5, который включает выделение указанного антитела из клетки-хозяина, секретирующей антитело.
[0012] В другом аспекте изобретение относится к антителу к компоненту комплемента С5, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 18, 23, 28, 33 и 38. В другом аспекте антитело к С5 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 19, 24, 29, 34 и 39. В другом аспекте антитело к С5 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из GTS, SGS, RTS, YTS и WAS. В другом аспекте антитело к С5 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 20, 25, 30, 35 и 40. В другом аспекте антитело к С5 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 21, 26, 31, 36 и 41. В другом аспекте антитело к С5 содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 22, 27, 32, 37 и 42. В другом аспекте изобретение относится к антителу, содержащему первую и вторую аминокислотные последовательности, причем первая аминокислотная последовательность содержит CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, 18, 23, 28, 33 и 38; CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей GTS, SGS, YTS и WAS; CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, 19, 24, 29, 34 и 39; и вторая аминокислотная последовательность содержит CDR1, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15, 20, 25, 30, 35 и 40; CDR2, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 21, 26, 31, 36 и 41; и CDR3, которая выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17, 22, 27, 32, 37 и 42. В другом варианте реализации изобретение относится к антителу, содержащему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 2.
[0013] В другом аспекте изобретение включает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую выделенное антитело, которое связывается с компонентом комплемента С5. В одном варианте реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело, которое связывается с компонентом комплемента С5, функционально связана с регуляторной последовательностью.
[0014] В другом аспекте изобретение включает антитело к компоненту комплемента С5 и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте реализации изобретения антитело к компоненту комплемента С5 также содержит дополнительное действующее вещество. В другом варианте реализации изобретения антитело к компоненту комплемента С5 и дополнительное действующее вещество также включают фармацевтически приемлемый носитель.
[0015] В другом аспекте изобретение включает способ лечения или профилактики по показанию у пациента, нуждающегося в лечении или профилактике, причем такой способ включает введение пациенту эффективного количества по меньшей мере одного антитела к компоненту комплемента С5. В одном варианте реализации изобретения показание представляет собой возрастную макулярную дегенерацию (ВМД). В другом варианте реализации изобретения заболевание или расстройство у пациента, нуждающегося в лечении или профилактике, представляет собой глазное заболевание.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ-
[0016] На фигуре 1 в схематическом виде представлен путь активации комплемента.
[0017] На фигуре 2 показана схема формирования МАК и механизм терапевтического действия моноклонального антитела, заключающийся в блокировании формирования МАК, но не С5а.
[0018] На фигуре 3 показано выраженное в процентах ингибирование МАК субклонами антител к С5.
[0019] На фигурах 4А и 4В показано выраженное в процентах ингибирование МАК субклонами антител к С5.
[0020] На фигурах 5А, 5В и 5С показано выраженное в процентах ингибирование МАК субклонами антител к С5.
[0021] На фигурах 6А, 6В и 6С показано ингибирование формирования С5а, идентифицируемое путем анализа одноточечных определений или титрования антитела.
[0022] На фигуре 7 показано дозозависимое взаимодействие моноклональных антител с С5, непосредственно нанесенным на планшеты для ИФА.
[0023] На фигуре 8 показана аффинность связывания моноклональных антител к С5 с С5.
[0024] Фигура 9 демонстрирует связывание моноклональных антител с белком С5 в растворе с использованием метода биослойной интерферометрии (BLI).
[0025] Фигура 10 иллюстрирует способность распознавать С5 в комплексе C5b-9, осажденном на дне планшетов для ИФА, после активации системы комплемента с помощью IgM.
[0026] Фигуры 11а и 11b иллюстрируют способность моноклональных антител связывать растворимый C5b-9 с использованием методики биослойной интерферометрии (BLI).
[0027] На фигурах 12А, 12В и 12С показано ингибирование МАК при использовании полноразмерных антител с гуманизированными тяжелыми и легкими цепями 10С9.
[0028] Фигуры 13А, 13В и 13С иллюстрируют активность фрагментов Fab с гуманизированными тяжелыми и легкими цепями 10С9.
[0029] На фигурах 14А и 14В показано, что антитело H5L2 (гуманизированный 10С9) эффективно блокирует отложение компонентов комплемента в сетчатке (фигура 14А) и хориоидее (фигура 14В) по сравнению с контролем в модели повреждения светом у нечеловекообразных приматов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0030] Заголовки разделов, используемые в настоящем документе, предназначены лишь для организационных целей и не должны истолковываться как ограничения описанного объекта изобретения.
rd
[0031] Для получения рекомбинантных ДНК, синтеза олигонуклеотидов, культивирования тканей и трансформацин, очистки белков и тому подобного можно использовать стандартные методики. Ферментативные реакции и способы очистки можно проводить в соответствии со спецификацией производителя или так, как это обычно делают в данной области техники или как описано в данном документе. Приведенные далее процедуры и методики, как правило, могут осуществляться с использованием общепринятых способов, хорошо известных в данной области техники и описанных в различных общих и специализированных источниках, которые цитируются и обсуждаются в тексте описания. См., например, Sambrook и соавт., 2001 год, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 изд., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., который в полном объеме включен в настоящий документ посредством ссылки. При отсутствии конкретных определений использованная в настоящем документе номенклатура, связанная с молекулярной биологией, биохимией, физической и биофизической химией, аналитической химией, органической химией, медицинской и фармацевтической химией, а также описанные в настоящем документе лабораторные процедуры и методики этих наук являются общеизвестными и общепринятыми в данной области техники. Для химического синтеза, химического анализа, приготовления фармацевтического препарата, разработки состава, доставки лекарственной формы и лечения пациентов можно применять стандартные методики.
[0032] В настоящем документе используются следующие определения:
[0033] Термин "ВМД" относится ко всем формам возрастной макулярной дегенерации, включая начало заболевания (т.е., раннее или позднее), стадию заболевания (т.е., раннюю, промежуточную или позднюю), тип заболевания (географическая атрофия или неоваскулярная макулопатия), распространенность заболевания (г.е., односторонняя, двусторонняя, центральная или периферическая ВМД) или присутствие/отсутствие накопления друзов, присутствие/отсутствие ретикулярных псевдодрузов, аномалии пигментного эпителия сетчатки, аномалии фоторецепторов, атрофическую возрастную макулярную дегенерацию, географическую атрофию (ГА) и неоваскулярную макулопатию, но не ограничиваясь перечисленным.
[0034] Подразумевается, что в контексте настоящего документа термин "белок" означает последовательность по меньшей мере двух ковалентно связанных аминокислот и используется взаимозаменяемо с терминами "полипептид", "олигопептид" и "пептид". Две или более ковалентно связанных аминокислот связаны пептидной связью.
[0035] "С5" означает компонент комплемента 5 человека. В контексте настоящего документа термины "фактор С5", "фактор комплемента 5" синонимичны термину "С5".
[0036] Термин "С5а" означает меньший фрагмент С5 длиной приблизительно 77-74 аминокислот и массой около 7 кДа, который образуется вследствие расщепления С5 С5-коивертазой при активации в каскаде комплемента. Термин "C5b" означает больший фрагмент С5, который образуется вследствие расщепления С5-конвертазой при активации в каскаде комплемента. Белок C5b состоит из альфа-цепи (массой около 104 кДа) и бета-цепи (массой около 75 кДа), связанных одной дисульфидиой связью.
[0037] В контексте настоящего документа термины "антитело" и "иммуноглобулин" используются взаимозаменяемо в самом широком смысле для обозначения белка, содержащего одну или более полипептидных цепей, которые взаимодействуют со специфическим антигеном посредством связывания множества CDR На молекуле антитела с эпитопом антигена. Антитело может представлять собой моноклональное (например, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональное, мультивалентное и/или полиспецифическое антитело (например, биспицефические антитела, если они проявляют необходимую биологическую активность). Антитела также могут представлять собой или включать в себя фрагменты антител (согласно описанию в настоящем документе).
[0038] Термин "эпитоп" используется для обозначения последовательности, структуры или группы, распознаваемой и связываемой антителом. Эпитоп может именоваться "участком антигенной детерминанты".
[0039] "Фрагменты антитела" включают лишь часть интактного антитела, причем эта часть сохраняет по меньшей мере одну, большинство или все функции, которые обычно ассоциируются с данной частью, когда она присутствует в составе интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител и полиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В одном варианте реализации изобретения фрагмент антитела содержит антигенсвязывающий участок интактного анти тела и, таким образом, сохраняет способность связывать антиген. В другом варианте реализации изобретения фрагмент антитела, например, содержащий область Fc, сохраняет по меньшей мере одну из биологических функций, которые обычно ассоциируются с областью Fc, присутствующей в составе интактного антитела, например, связывание FcR, регулирование периода полувыведения антитела, функцию антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ) и связывание комплемента. В одном варианте реализации изобретения фрагмент антитела представляет собой одновалентное антитело, период выведения которого in vivo по существу аналогичен таковому интактного антитела. Например, такой фрагмент антитела может содержать антигенсвязывающее плечо, связанное с последовательностью Fc, которая придает стабильность данному фрагменту in vivo.
[0040] Термин "моноклональное" в контексте настоящего документа относится к антителу, полученному из популяции клеток, причем популяция клеток получена путем клонирования из единой родительской клетки. Моноклональные антитела представляют собой гомогенные антитела, то есть, отдельные антитела, составляющие популяцию, которые идентичны в том, что происходят от одних и тех же генов и имеют одну и ту же аминокислотную последовательность и структуру белка, за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах, и посттрансляционных модификаций, которые в некоторых случаях могут различаться. В некоторых вариантах реализации изобретения моноклональные антитела могут быть высокоспецифическими. В некоторых вариантах реализации изобретения моноклональное антитело может быть направлено против одного участка антигенной детерминанты. Кроме того, в отличие от прочих препаратов антител, которые обычно включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело направлено против одного и того же эпитопа антигена. Отдельные моноклональные антитела могут быть получены любым конкретным способом. К примеру, моноклональные антитела, которые предполагается применять в соответствии с настоящим описанием, могут быть получены методом гибридом, впервые описанным Kohler и соавт. (1975 год) Nature 256:495, или методами рекомбинантных ДНК (см., например, патент США №4816567), или из фаговых библиотек антител с использованием методик, описанных в Clackson и соавт. (1991 год) Nature 352:624-628 и Marks и соавт. (1991 год) J. Mol. Biol. 222:581-597.
[0041] Термин "поликлональное" применяется для описания гетерогенной популяции антител, происходящих из гетерогенной популяции родительских антителообразующих клеток. В большинстве случаев поликлональные антитела обладают разной аффинностью к разным эпитопам и кодируются генами с различающимися последовательностями.
[0042] "Химерные" антитела представляют собой антитела, содержащие аминокислотные последовательности, происходящие из двух или более разных биологических видов.
[0043] "Гуманизированные" антитела представляют собой химерные антитела, происходящие от нечеловеческого исходного антитела. Во многих случаях аминокислоты в конкретных позициях в составе гуманизированного антитела заменены, чтобы соответствовать аминокислотам в соответствующих позициях в составе человеческого антитела. Во многих случаях аминокислотные позиции в вариабельной области исходного (нечеловеческого) антитела замещены аминокислотами из вариабельной области антитела человека. Таким образом создается гуманизированное антитело мыши, крысы, кролика или нечеловекообразного примата, обладающее желаемой специфичностью, аффинностью и активностью.
[0044] Термин "вариант" относится к последовательностям, имеющим по меньшей мере одно отличие от исходной последовательности. Вариант полипептида представляет собой белок, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на около 75% идентична исходной последовательности. Вариант белка может иметь аминокислотную последовательность, по меньшей мере на около 80% или по меньшей мере на около 85%, или по меньшей мере на около 90%, или по меньшей мере на около 95%, или по меньшей мере на около 98%, или по меньшей мере на около 99% идентичную исходной аминокислотной последовательности. В некоторых случаях варианты антител представляют собой антитела, имеющие одно или более отличий в аминокислотной последовательности по сравнению с исходным антителом. Гуманизированные и химерные антитела представляют собой варианты антител. Следовательно, аминокислотная последовательность варианта антитела идентична последовательности исходного антитела менее чем на 100%. Варианты нуклеотидных последовательностей менее чем на 100% идентичны исходной нуклеотидной последовательности.
[0045] Термин "выделенная" или "очищенная" относится к молекуле, которая была отделена от и/или извлечена из по меньшей мере одного компонента своей естественной среды, причем компонент представляет собой материал, который может препятствовать использованию или снижать активность молекулы. Компоненты включают пептиды, сахара, нуклеиновые кислоты, ферменты, гормоны и прочие белковые или небелковые растворенные вещества.
[0046] "Определяющие комплементарность области" (CDR) означают одну или более областей антитела, причем аминокислотные остатки одной или более CDR помогают связывать антиген. Во многих случаях отдельные аминокислоты CDR могут находиться в непосредственной близости от атомов антигена-мишени. В некоторых вариантах реализации изобретения CDR может быть расположена в молекуле иммуноглобулина, которая может состоять из трех областей CDR. В. некоторых случаях, когда в пределах более длинной аминокислотной последовательности имеется более одной последовательности CDR, области CDR могут быть разделены другими последовательностями и пронумерованы. В некоторых случаях несколько CDR обозначаются как CDR1, CDR2 и CDR3. Каждая CDR может содержать аминокислотные остатки из определяющей комплементарность области согласно определению Kabat. Kabat и соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5 изд. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 год)). Аминокислоты CDR, а также другие последовательности в пределах антитела или фрагмента антитела нумеруются по Kabat. Во многих случаях CDR могут определяться по их позиции в последовательности вариабельной области (нумерация по Kabat), например, CDR 1 легкой цепи может содержать аминокислотную последовательность, расположенную между позицией 24 и позицией 33; LC CDR2 - между позицией 50 и позицией 56; LC CDR 3 - между позицией 89 и позицией 97; и CDR тяжелой цепи (НС CDR) может располагаться между позицией 26 и позицией 33 в случае CDR1; между позицией 50 и позицией 66 в случае НС CDR2; между позицией 97 и позицией 103 в случае НС CDR 3; и/или гипервариабельные петли могут быть расположены в легкой цепи между остатками 26-32 (LC CDR1), остатками 50-52 (LC CDR2) и остатками 91-96 (LC CDR3); и в тяжелой цепи между остатками 26-32 (НС CDR1), остатками 53-55 (НС CDR2) и остатками 97-101 (НС CDR3). В некоторых случаях определяющая комплементарность область может включать аминокислоты как из области CDR, определенной по Kabat, так и из гипервариабельной петли. В некоторых вариантах реализации изобретения, а именно, когда антитело представляет собой одноцепочечный иммуноглобулин, может быть более одной CDR, более двух CDR, более грех CDR, более четырех CDR или более пяти CDR. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело может состоять из шести CDR.
[0047] "Каркасные области" (FR) представляют собой аминокислотные остатки вариабельного домена, не являющиеся остатками CDR. В большинстве вариантов реализации изобретения вариабельный домен содержит от 2 до 4 последовательно идентифицируемых FR. Например, вариабельная область, содержащая три CDR, содержит четыре FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определены по Kabat, остатки FR легкой цепи расположены в позициях около 1-23 (LCFR1), 34-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4) в легкой цепи, а остатки FR тяжелой цепи расположены в позициях около 1-25 (HCFR1), 34-49 (HCFR2), 67-96 (HCFR3) и 104-113 (HCFR4) в тяжелой цепи. Если CDR содержат аминокислотные последовательности из гипервариабельных петель, остатки FR легкой цепи расположены в позициях около 1-23 (LCFR1), 34-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4) в легкой цепи, а остатки FR тяжелой цепи расположены в позициях около 1-25 (HCFR1), 34-49 (HCFR2), 67-96 (HCFR3) и 104-113 (HCFR4) в тяжелой цепи. В некоторых случаях, когда CDR содержит аминокислоты как из области CDR, определенной по Kabat, так и из гипервариабельной петли, позиция остатков FR корректируется соответствующим образом. Например, если НС CDR1 включает аминокислоты Н26-Н35, остатки FR1 тяжелой цепи расположены в позициях 1-25, а остатки FR2 - в позициях 36-49.
[0048] "Вариабельный домен" относится к частям легкой цепи и тяжелой цепи традиционной молекулы антитела, которые включают аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей (CDR) и каркасных областей (FR). "VH" означает вариабельный домен тяжелой цепи. "VL" означает вариабельный домен легкой цепи.
[0049] "Fv" или "фрагмент Fv" относится к фрагменту антитела, который содержит полный антигенраспознающий и антигенсвязывающий участок, включая последовательности FR и CDR. Во многих вариантах реализации изобретения Fv состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в тесной связи, которая может быть ковалентной по своей природе, например, в одноцепочечной молекуле Fv (scFv). Три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют между собой, определяя антигенсвязывающий участок на поверхности полипептида VH-VL. В совокупности шесть CDR или их подмножество придают антителу специфичность связывания с антигеном. В то же время даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичные к антигену,) в некоторых случаях обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя, как правило, с более низкой аффинностью, чем полный участок связывания.
2
[0050] "Fab" или "фрагмент Fab" содержит вариабельный и константный (CL) домены легкой цепи и вариабельный и первый константный (СН1) домены тяжелой цепи. Фрагменты антитела F(ab') содержат пару фрагментов Fab, которые, как правило, ковалентно связаны у карбоксильных концов расположенными между ними шарнирными остатками цистеина. В данной области техники известны и другие варианты химического связывания фрагментов антител.
[0051] «Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» определяется как процентное содержание аминокислотных остатков в потенциальной последовательности, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной последовательности после выравнивания этих последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, не учитывая любые консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может осуществляться различными способами в пределах уровня знаний, доступных специалисту в данной области техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или программного обеспечения Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения степени выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Затем рассчитывается степень идентичности последовательности относительно более длинной последовательности, то есть, даже если более короткая последовательность на 100% идентична части более длинной последовательности, степень общей идентичности последовательностей будет составлять менее 100%.
[0052] «Процент (%) гомологии аминокислотных последовательностей» определяется как процентное содержание аминокислотных остатков в потенциальной последовательности, которые гомологичны аминокислотным остаткам в эталонной последовательности после выравнивания этих последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимального процента гомологии последовательностей. В этом способе принимаются во внимание консервативные замены. Консервативными заменами являются такие замены, в которых возможна замена аминокислоты сходной аминокислотой. Аминокислоты могут иметь сходство в нескольких характеристиках, например, размере, форме, гидрофобности, гидрофильности, заряде, изоэлектрической точке, полярности, ароматичности и т.д. Выравнивание с целью определения процента гомологии аминокислотных последовательностей может осуществляться различными способами в пределах обычного уровня знаний, доступных специалисту в дайной области техники. В некоторых случаях аминокислотные последовательности можно выравнивать с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или программного обеспечения Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения степени выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Затем рассчитывается степень гомологии последовательности относительно более длинной последовательности, то есть, даже если более короткая последовательность на 100% идентична части более длинной последовательности, степень общей идентичности последовательностей будет составлять менее 100%.
[0053] «Процент (%) идентичности нуклеотидных последовательностей» определяется как процент нуклеотидов в потенциальной последовательности, которые являются идентичными с нуклеотидами в эталонной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей может осуществляться различными способами в пределах уровня знаний, доступных специалисту в данной области техники, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или программного обеспечения Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для измерения степени выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Затем рассчитывается степень идентичности последовательности относительно более длинной последовательности, то есть, даже если более короткая последовательность на 100% идентична части более длинной последовательности, степень общей идентичности последовательностей будет составлять менее 100%.
[0054] "Активность" или "биологическая активность" молекулы может зависеть от типа молекулы и доступности испытаний на количественную оценку данной активности. Например, в контексте антител к С5, активность относится к способности антитела частично или полностью ингибировать биологическую активность С5, например, связывание с другими белками комплемента, расщепление протеазой, примером которой является С5-конвертаза или другая известная протеаза внешнего пути активацин, способная расщеплять С5 (Krisinger M.J. и соавт., Thrombin generates previously unidentified C5 products that support the terminal complement activation pathway. Blood, 2012 год 120(8) 1717-1725), или формирование МАК. Предпочтительная биологическая активность заявленного антитела к С5 представляет собой способность блокировать процессы, связанные с активацией молекулы С5. Предпочтительно ингибирующая активность обеспечит поддающееся измерению улучшение состояния, например, течения патологического процесса, при связанном с С5 заболевании или патологическом состоянии, таком как, например, связанное с нарушением системы комплемента глазное заболевание. В некоторых случаях ингибирующая активность описанного антитела к С5 осуществляется посредством блокирования С5-протеазы или расщепления С5. В других случаях активность представляет собой способность связывать другие белки комплемента в комплексе, предотвращая встраивание в мембрану и лизис клеток. В некоторых вариантах реализации изобретения активность описанного антитела к С5 измеряется его способностью ингибировать гемолиз, образование С5а, формирование МАК или ассоциацию друг их белков комплемента с С5. Активность можно определять с помощью испытаний in vitro или in vivo, включая анализы связывания, анализ формирования МАК, образования продуктов расщепления компонентов комплемента, индукции высвобождения цитокинов, или с использованием подходящих животных моделей, или путем проведения клинических испытаний с участием людей.
[0055] Термин "связанное с нарушением системы комплемента глазное заболевание" используется в самом широком смысле и включает все глазные заболевания, патология которых касается системы комплемента, активированной любым путем: классическим, лектиновым, альтернативным или внешним. Связанные с нарушением системы комплемента глазные заболевания включают дегенеративные заболевания желтого пятна, например, все стадии возрастной макулярной дегенерации (ВМД), включая сухую и экссудативную (неэкссудативную и экссудативную) ее формы, хориоидальную неоваскуляризацию (ХНВ), увеит, диабетическую и другие связанные с ишемией ретинопатии, включая диабетический отек желтого пятна, окклюзию центральной вены сетчатки (ОЦВС), окклюзию ветви вены сетчатки (ОВВС) и другие неоваскулярные внутриглазные заболевания, например, диабетический отек желтого пятна, патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, глазной гистоплазмоз, неоваскуляризацию роговицы и неоваскуляризацию сетчатки, но не ограничиваются перечисленным. Предпочтительная группа глазных заболеваний, связанных с нарушением системы комплемента, включает возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), включая сухую и влажную (неэкссудативную и экссудативную) ВМД, хориоидальную неоваскуляризацию (ХНВ), макулярную телеангиэктазию, увеит, диабетическую и другие связанные с ишемией неоваскулярные ретинопатии или диабетический отек желтого пятна с дегенерацией клеток, патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, глазной гистоплазмоз, сотовую дистрофию сетчатки Дойна/malattia leventinese, болезнь Штаргардта, глаукому, окклюзию центральной вены сетчатки (ОЦВС), окклюзию ветви вены сетчатки (ОВВС), неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризацию сетчатки.
[0056] Термин "фармацевтически приемлемый" означает утвержденный или пригодный для утверждения регуляторным органом федерального правительства США или правительства штата или указаний в Фармакопее США или других общепризнанных фармакопеях как подходящий для применения у животных и, в частности, у людей.
[0057] "Фармацевтически приемлемая соль" относится к соли соединения, которая обладает необходимой фармакологической активностью исходного соединения. Такие соли включают соли присоединения кислот, образуемые присоединением неорганических кислот, таких как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и тому подобные; или образуемые присоединением органических кислот, таких как уксусная кислота, пропионовая кислота, капроновая кислота, циклопентанпропионовая кислота, гликолевая кислота, пировипоградная кислота, молочная кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2-этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4-хлорбензолсульфоиовая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, 4-метилбицикло[2.2.2]-окт-2-ен-1-карбоновая кислота, глюкогептоновая кислота, 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота, трет-бутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтоевая кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота и тому подобные; и соли, образуемые, когда кислотный протон в исходном соединении замещается ионом металла, например ионом щелочного металла, ионом щелочноземельного металла или ионом алюминия; или координируется с органическим основанием, таким как этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, N-метилглюкамин и тому подобные. В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтически приемлемая соль представляет собой хлористоводородную соль. В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтически приемлемая соль представляет собой натриевую соль.
[0058] "Фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество" относится к фармацевтически приемлемому разбавителю, фармацевтически приемлемому адъюванту, фармацевтически приемлемому наполнителю, фармацевтически приемлемому носителю или любому сочетанию перечисленного выше, с помощью которого соединение, предлагаемое в настоящем описании, можно вводить пациенту, который не подавляет фармакологическую активность этого соединения и который является нетоксичным при введении в дозах, достаточных, чтобы обеспечить терапевтически эффективное количество соединения или его фармакологически активного метаболита.
[0059] "Лечение" означает введение по меньшей мере одного лекарственного препарата с целью предотвратить развитие или изменить патологию заболевания. Соответственно, термин "лечение" относится как к терапевтическому воздействию, так и к профилактическим или превентивным мерам. Пациенты, нуждающиеся в лечении, включают тех, к то уже имеет нарушение, а также тех, у кого нарушение необходимо предотвратить. В контексте настоящего описания предпочтительный препарат для введения пациенту содержит по меньшей мере одно из раскрытых в настоящем документе антител к С5. При лечении заболевания, связанного с системой комплемента, лекарственный препарат, содержащий по меньшей мере одно из раскрытых в настоящем документе антител или последовательность, кодирующую такое антитело, может прямо или косвенно изменять величину ответа компонента пути активации комплемента или делать заболевание более восприимчивым к лечению другими лекарственными препаратами, например антибиотиками, противогрибковыми средствами, противовоспалительными средствами, химиотерапевтическими средствами и так далее.
[0060] "Терапевтически эффективное количество" означает количество препарата, которое при введении субъекту с целью лечения заболевания или по меньшей мере одного из клинических симптомов заболевания является достаточным для того, чтобы произвести такое лечение заболевания или его симптома. Конкретное терапевтически эффективное количество может варьировать в зависимости, например, от препарата, заболевания и/или симптомов заболевания, тяжести заболевания и/или симптомов заболевания, возраста, массы тела и/или состояния здоровья пациента, подлежащего лечению, а также от мнения врача, назначающего лечение. Подходящее количество каждого отдельного соединения может быть установлено специалистом в данной области техники и/или может быть определено с помощью рутинных испытаний.
[0061] "Терапевтически эффективная доза" означает дозу, обеспечивающую эффективное лечение заболевания у пациента. Терапевтически эффективные дозы могут различаться от препарата к препарату и/или от пациента к пациенту и могут зависеть от таких факторов, как состояние пациента и тяжесть заболевания. Терапевтически эффективная доза определяется в соответствии с рутинными фармакологическими процедурами, известными специалистам в данной области техники.
[0062] Термин "патология" заболевания, такого как связанное с нарушением системы комплемента глазное заболевание, включает все явления, которые нарушают благосостояние пациента. Он включает не соответствующий норме или неконтролируемый рост клеток, выработку белков, не соответствующую норме или неконтролируемую гибель клеток, выработку аутоантител, выработку компонентов комплемента, активацию комплемента, формирование МАК, препятствие нормальному функционированию соседних клеток, высвобождение цитокинов или других секреторных продуктов в количествах, не соответствующих норме, подавление или обострение любой воспалительной или иммунологической реакции, инфильтрацию воспалительных клеток в межклеточное пространство, отек и так далее, но не ограничивается перечисленным.
[0063] В контексте данного документа термин "млекопитающее" относится к любому животному, относящемуся к классу млекопитающих, включая людей, высших приматов, домашних и сельскохозяйственных животных, а также зоопарковых животных, животных для участия в спортивных мероприятиях или домашних любимцев, таких как лошади, свиньи, крупный рогатый скот, собаки, кошки, хорьки и тому подобные, но не ограничиваясь перечисленными. В предпочтительном варианте реализации изобретения млекопитающее является человеком.
[0064] Введение "в комбинации с" одним или более дополнительными лекарственными препаратами включает одновременное (параллельное) введение и последовательное введение в любом порядке.
[0065] В настоящем изобретении предложены антитела, связывающим белок-компонент комплемента 5. В частности, в настоящем описании раскрыты антитела, связывающие компоненты С5 и C5b, но не С5а. Раскрытые в настоящем документе антитела не ингибируют расщепление С5, однако ингибируют формирование МАК и МАК-зависимый лизис клеток.
[0066] Антитела, описанные в настоящем документе, содержат каркасную структуру с одной или более определяющими комплементарность областями (CDR). В определенных вариантах реализации изобретения CDR включают не более двух вставок, делеций или замен аминокислот из одной или более областей CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи исходной последовательности, например, последовательности SEQ ID NOs: 13-48.
[0067] В других вариантах реализации изобретения CDR определяются консенсусной последовательностью, имея общие консервативные аминокислотные последовательности и вариабельные аминокислотные последовательности согласно описанию в настоящем документе.
[0068] В некоторых вариантах реализации изобретения каркасная структура антител к С5 согласно изобретению может быть основана на антителах, включая, но не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, биспецифические антитела, мини-антитела, доменные антитела, синтетические антитела (например миметики антител), химерные антитела, гуманизированные антитела, слитые антитела (например, конъюгаты антител), а также фрагменты каждого из них, соответственно. Различные структуры дополнительно описаны и определены в данном документе ниже. В некоторых вариантах реализации изобретения каркасные структуры содержат одну или более из SEQ ID NO: 1-12. В некоторых вариантах реализации изобретения каркасные последовательности содержат вставки, делении или замены одной или более аминокислот, по сравнению с SEQ ID NO: 1-12.
[0069] Антитела к С5 применимы в лечении последствий, симптомов и/или патологий, связанных с активацией комплемента. К ним относятся, но не ограничиваются ими, атеросклероз, ишемически-реперфузиониое повреждение при остром инфаркте миокарда, болезнь Шенлейн-Геноха, геморрагический васкулит, ревматоидный артрит, артериит, аневризма, инсульт, кардиомиопатия, геморрагический шок, размозжение, полиорганная недостаточность, гиповолемический шок и кишечная ишемия, отторжение трансплантата, кардиохирургия, ЧТКА (чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика), самопроизвольный аборт, нейроповреждение, повреждение спинного мозга, миастения гравис, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, синдром острой дыхательной недостаточности, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, синдром острого посттрансфузиоиного повреждения легких, острое повреждение легких, болезнь Гудпасчера, инфаркт миокарда, воспаление после сердечно-легочного шунтирования, сердечно-легочное шунтирование, септический шок, отторжение трансплантата, ксенотрансплантация, ожоговая травма, системная красная волчанка, мембранозный гломерулонефрит, церебральная малярия, болезнь Бергера, псориаз, пузырчатка, дерматомиозит, антифосфолипидный синдром, воспалительное заболевание кишечника, гемодиализ, лейкоферез, плазмаферез, индуцированная гепарином экстракорпоральная мембранная оксигенация преципитация ЛПНП (липопротеин низкой плотности), экстракорпоральная мембранная оксигенация лейкоферез, плазмаферез, индуцированная гепарином экстракорпоральная мембранная оксигенация преципитация ЛПНП, экстракорпоральная мембранная оксигенация и тому подобное.
[0070] Другие варианты использования раскрытых антител включают, например, диагностирование комплемент - и С5-ассоциированных заболеваний.
[0071] В аспектах настоящего изобретения предложены антитела к С5, в частности, антитела, которые содержат по меньшей мере одну CDR, в том числе CDR тяжелой цепи и/или легкой цепи, как более подробно описано ниже, или их комбинации.
[0072] В одном аспекте антитела к С5 ингибируют активность С5 и/или C5b, и ингибируют способность C5b образовывать белковые комплексы. Не ограничиваясь конкретным механизмом или теорией, можно сказать, что в некоторых вариантах реализации изобретения антитела нарушают путь комплемента, тем самым нарушая каскад комплемента, образование МАК и лизис клеток. Это нарушение может предотвратить или изменить течение таких заболеваний, как географическая атрофия и экссудативная ВДМ, увеит, диабетическая и другая неоваскулярная или связанная с ишемией ретинопатия, диабетический отек макулы, патологическая миопия, болезнь фон Хиппель-Линдау, гистоплазмоз глаз, ретинальная ангиоматозная пролиферация, окклюзия центральной вены сетчатки (ОЦВС), окклюзия ветки вены сетчатки (ОВВС), неоваскуляризация роговицы, неоваскуляризация сетчатки глаза и тому подобное, но не ограничиваясь перечисленным. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело к С5 может ингибировать C5b опосредованное инициирование формирования МАК.
[0073] Таким образом, антитела согласно изобретению могут служить для идентификацин патологических состояний, связанных с системой комплемента, или заболеваний или патологических состояний, связанных с С5. Кроме того, антитела могут быть использованы для регуляции и/или подавления эффектов, опосредованных С5 и/или другими нижерасположенными белками комплемента, как такие, которые проявляют эффективность в лечении и предотвращении различных заболеваний и патологических состояний, связанных с комплементом и/или С5.
[0074] В частности, в изобретении предложены антитела к С5 и полинуклеотиды, которые их кодируют. В различных аспектах антитела к С5 ингибируют по меньшей мере один из биологических ответов, опосредованных С5, C5b и/или другими белками комплемента, и, по существу, могут применяться для ослабления эффектов от заболеваний и расстройств, связанных с комплементом и С5. Также в изобретении предложены системы экспрессии, включая клеточные линий млекопитающих и бактериальные клетки, для продуцирования антитела к С5, и способы лечения заболеваний, связанных с активацией комплемента.
[0075] Антитела согласно настоящему изобретению включают в себя каркасную структуру и одну или более гипервариабельную область (CDR), которые связываются с С5. В различных вариантах реализации изобретения антитело содержит первую и/или вторую аминокислотную последовательность.
[0076] В одном варианте реализации изобретения первая и/или вторая аминокислотная последовательность содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-48.
[0077] В различных вариантах реализации изобретения антитела могут содержать одну или обе из первой и второй аминокислотных последовательностей. Первая и вторая аминокислотные последовательности могут быть одной линейной аминокислотной последовательностью, могут быть ковалентно связаны дисульфидными мостиками или могут быть связаны нековалентно.
Компонент комплемента 5, С5
[0078] Мембраноатакующий комплекс (МАК), как правило, формируется в результате активации одного или более из трех основных путей, например, альтернативного пути, лектинового пути или классического пути системы комплемента, или путем изменений конформацин С5, или активации посредством менее известного внешнего пути. МАК является одним из эффекторных белков иммунной системы и формирует трансмембранные каналы. Эти каналы разрушают фосфолипидный бислой клеток-мишеней, что приводит к лизису клеток и смерти. Важнейшим белком в сборке МАК является С5. С5 имеет молекулярную массу около 190 кДа (около 1600 аминокислот) и состоит из двух полипептидных цепей, альфа-цепи (α, 115 кДа) и бета-цепи (β, 75 кДа). Альфа- и бета-цепи связаны дисульфидными связями. С5-конвертаза расщепляет С5 в положении аргинина, 75 остатков ниже от N-конца альфа-цепи. Это расщепление освобождает небольшой фрагмент С5а (приблизительно 77-74 аминокислот в длину и около 11 кДа), который является мощной воспалительной молекулой. Расщепление С5 конвертазой также приводит к активации C5b, который затем может инициировать образование мембраноатакующего комплекса (МАК). Белок C5b состоит из альфа-цепи (в настоящее время 104 кДа) и бета-цепи (75 кДа).
[0079] Расщепление С5 конвертазой С5 приводит к образованию С5а и C5b. Новообразованный фрагмент C5b рекрутирует С6 с последующим последовательным добавлением С7, С8 и нескольких молекул С9, чтобы собрать МАК. Активный МАК обладает следующим составом субъединиц: C5b-С6-С7-С8-С9 {n}. Кольцевая структура, которую образует С9, представляет собой пору в мембране клетки-мишени. Если образовывается достаточное количество пор, клетка больше не может выжить из-за свободной диффузии молекул в и из клетки. При сублитических концентрациих эти поры могут способствовать активации провоспалительных клеток, в то время как при литических концентрациях, образование пор приводит к гибели клеток. Формирование МАК схематически показано на фигуре 2. Обе С5а и C5b являются провоспалительными молекулами. С5а связывается с рецептором С5а (C5aR) и стимулирует синтез и выделение лейкоцитами человека провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-альфа, ИЛ-1 бета, ИЛ-6 и ИЛ-8. Также было показано, что C5a связан с тканевым гомеистазом (удаление опсонированных частиц), выживанием нейронов и развитием антиангиогенного ответа. Большинство антител к С5 ингибируют образование С5а и C5b, которые не только препятствуют активации МАК путем блокирования образования C5b, но и пагубно блокируют активность С5а, что может способствовать поддержанию здорового состояния сетчатки. Что необходимо, антитело селективно блокирует C5b таким образом, что это ингибирует образование МАК, сохраняя при этом активность С5а.
[0080] Сокращение образования C5b может быть полезным при лечении многих заболеваний, связанных с системой комплемента, а также воспалительных заболеваний. Одним из таких заболеваний является возрастная макулярная дегенерация или ВМД. ВМД является патологическим состоянием, которое приводит к потере зрения из-за ухудшения состояния сетчатки. Система комплемента вовлечена в ВМД посредством прочной ассоциации между несколькими генами в системе комплемента и риском развития ВМД у человека. Таким образом, ингибирование системы комплемента путем предотвращения включения белка C5b в МАК может иметь решающее значение для терапевтического лечения ВМД.
Антитела к С5
[0081] В одном аспекте описания предложены антитела, которые связываются с С5, не связываются с С5а и не ингибируют образование С5а. В некоторых аспектах в изобретении предложены рекомбинантные антитела, которые связываются с С5, т.е. антитела к С5. В этом контексте рекомбинантные антитела могут быть получены с использованием рекомбинантных методов, т.е., посредством экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, как описано ниже. Способы и методы получения рекомбинантных белков хорошо известны в данной области техники.
[0082] В некоторых вариантах реализации изобретения антитела описания выделяют или очищают. Выделенное или очищенное антитело может быть избавлено по меньшей мере от некоторого материала, с которым оно обычно связано в естественном состоянии (загрязняющего материала). В одном варианте реализации изобретения загрязняющий материал составляет менее чем около 50%, в альтернативном варианте менее чем около 20% и в альтернативном варианте менее чем около 10% по массе относительно общей массы заданного образца. В некоторых вариантах реализации изобретения загрязняющим материалом может быть белок.
[0083] Во многих вариантах реализации изобретения очищенное антитело к С5 получают в или из организма, отличного от организма, из которого оно происходит. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело к С5 может быть получено в значительно более высокой концентрации, чем обычно наблюдается, посредством использования индуцибельного промотора или промотора высокой экспрессии, таким образом, что то получают повышенные концентрационные уровни антитела.
[0084] В некоторых вариантах реализации изобретения выделенное или очищенное антитело может быть очищено от компонентов, которые могут мешать диагностическим и/или терапевтическим применениям антитела. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело будет очищено до такой степени, что массовая доля антитела будет составлять более чем 90%, причем концентрация общего белка определяются, например, методом Лоури, а процентная концентрация антител определяется визуальным способом, таким как белковый гель. В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 очищено до такой степени, что массовая доля антитела будет составлять более чем 99%, например, достаточно чистое, чтобы получить по меньшей мере 15 остатков на N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием стандартной методики аминокислотного секвенирования (например, расщепление по Эдману и масс-спектрометрия) или до гомогенности, полученной методом ДСН-ПААГ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием Кумасси синего или окрашивания серебром. Выделенные антитела включают антитела in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один из компонентов природной среды антитела отсутствует. В то же время обычно выделенное антитело получают с использованием по меньшей мере одного этапа очистки.
[0085] Раскрытое антитело может специфически связываться с С5 и может использоваться для ингибирования или модуляции биологической активности С5 и C5b. В некоторых вариантах реализации изобретения раскрытые антитела создают путем иммунизацин животного, в других случаях антитела могут быть получены с помощью технологий рекомбинантных ДНК. В дополнительных вариантах реализации изобретения антитела к С5 антитела могут быть получены путем ферментативного или химического расщепления традиционных антител (традиционные антитела могут быть равнозначны человеческим антителам). В некоторых вариантах реализации изобретения антитело может содержать тетрамер. В некоторых из этих вариантов реализации изобретения каждый тетрамер, как правило, состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара обладает одной легкой цепью (как правило, имеющей молекулярную массу около 25 кДа) и одной тяжелой цепью (как правило, имеющей молекулярную массу около 50-70 кДа). Аминоконцевая область каждой цепи содержит вариабельную область от около 100 до 110 или более аминокислот, ответственную за распознавание антигена. С-концевая область каждой цепи может определять константную область, главным образом ответственную за эффекторную функцию. Человеческие легкие цепи классифицируют как каппа и лямбда легкие цепи. Тяжелые цепи классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела, соответственно, как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. IgG имеет несколько подклассов, в том числе, но не ограничиваясь ими IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.
[0086] Некоторые антитела, например, антитела, выявляемые у верблюдов и лам, могут быть димерами, состоящими из двух тяжелых цепей, и не включать легких цепей. Muldermans ct al., 2001 год,./. Biotechnol. 74:277-302; Desmyter et al., 2001 год, J. Biol. Chem. 276:26285-26290. Кристаллографические исследования антител верблюдов показали, ч то области CDR3 этих антител образуют поверхность, которая взаимодействует с антигеном, и, таким образом, имеет решающее значение для связывания антигена, как это происходит и в более типичных тетрамерных антителах. Изобретение включает в себя димерные антитела, состоящие из двух тяжелых цепей или их фрагментов, которые могут связываться с и/или ингибировать биологическую активность С5 и/или C5b.
d
a
-7
-13
-9
-12
-11
-12
-8
-9
-10
-11
-12
-13
-12
-11
-10
-9
[0087] Антитела согласно изобретению специфически связываются с человеческим С5. Антитело может специфически связываться с С5, в том случае, если антитело обладает более высокой аффинностью связывания с данным С5, по сравнению с любым другим антигеном или белком. В различных вариантах реализации изобретения аффинность связывания измеряется путем определения равновесной константы связывания, например K (или Kd) или K (или Ka). В некоторых вариантах реализации изобретения раскрытое антитело связывается с антигеном-мишенью с Kd от около 10 М до около 10 М или от около 10 М до около 10 М или от около 10 М до около 10 М. В различных вариантах реализации изобретения Kd меньше чем около 10 М, 10 М, 10 М, 10 М или 10 М, и больше чем около 10 М, 10 М, 10 М, 10 М, 10 М.
-09
-08
-10
-08
a
[0088] В некоторых случаях Kd для другого антигена превышает Kd антигена-мишени больше чем в 1X, превышает Kd антигена-мишени больше чем в 2Х, превышает Kd антигена-мишени больше чем в 3Х, превышает Kd антигена-мишени больше чем в 4Х, превышает Kd антигена-мишени больше чем в 5Х, превышает Kd антигена-мишени больше чем в 6Х, превышает Kd антигена-мишени больше чем в 7Х, превышает Kd антигена-мишени больше чем в 8Х, превышает Kd антигена-мишени больше чем в 9Х, превышает Kd антигена-мишени больше чем в 10Х (например, если Kd антитела составляет X М для антигена-мишени, то Kd антитела для другого антигена может быть в 10Х больше или X М), или превышает Kd антигена-мишени больше, чем в 100Х (например, если Kd антитела составляет X М для антигена-мишени, Kd антитела для другого антигена может быть в 10Х больше, или X М). В некоторых случаях равновесная константа связывания может быть выражена как равновесная константа ассоциации, K или Ka.
1
-1
[0089] Равновесная константа связывания может быть определена различными способами. В некоторых случаях равновесная константа связывания раскрытого антитела определяют путем измерения скорости ассоциации (k) и диссоциацин (k) в анализе связывания белка. Одним типовым способом определения равновесной константы связывания является биослойиая интерферометрия (BLI). BLI является технологией без использования метки, дающей возможность определить кинетику связывания в растворе. В одном типовом способе антитело может быть человеческим IgG, и захват антитела к С5 может происходить па захватывающих наконечниках биосенсора на основе антител к фрагменту Fc человеческого IgG (AHC) (, Менло-Парк, штат Калифорния, США) в соответствии с указаниями производителей. Другие типы анализов связывания белков включают в себя: коиммунопреципитацию; бимолекулярную комплементацию флуоресценции; аффинный электрофорез; пул-даун анализы; передачу метки; двугибридный дрожжевой скрининг; фаговый дисплей; in vivo сшивку белковых комплексов с использованием аналогов фотореактивной аминокислоты; тандемную аффинную очистку; химическую сшивку; химическую сшивку с последующей матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI) масс-спектрометрией больших молекул; SPINE (определения взаимодействия стрептококкового протеина); количественную иммунопреципитацию в сочетании с нокдауном; метод близкого лигирования; биослойную интерферометрию; двойную поляризационную интерферометрию; статическое рассеяние света; динамическое рассеяние света; поверхностный плазмонный резонанс; флуоресцентную поляризацию/анизотропию; флуоресцентную корреляционную спектроскопию; резонансный перенос энергии флуоресценции; определение активности белка с помощью ЯМР измерений мульти-ядерной релаксацин или 2D-FT ЯМР-спектроскопию в растворах в сочетании с нелинейным регрессионным анализом ЯМР релаксацин, или 2D-FT набором данных спектроскопии; белок белковый докинг; изотермическую титрационную калориметрию; и микромасштабный термофорез.
[0090] В вариантах реализации изобретения, в которых антитело к С5 используется для терапевтических применений, одна характеристика антитела к С5 является таковой, что оно может модулировать и/или ингибировать один или более видов биологической активности С5 или опосредованных С5. В этом случае антитело может специфически связываться с С5, может в значительной степени модулировать активность С5 и/или C5b, и/или может ингибировать связывание C5b с другими белками (например, С6, С7).
++
++
0
8
0
0
[0091] Во многих вариантах реализации изобретения активность С5, а также способность антитела ингибировать эту активность определяют, анализируя лизис красных кровяных телец в присутствии 10% человеческой сыворотки. Активация альтернативного пути (АП) требует более высоких концентраций сыворотки, чем в случае классического пути. Как правило, конечная концентрация 5 мМ Mg в присутствии 5 мМ ЭГТА используется в анализах, при этом ЭГТА преимущественно хелатирует Са. АП большинства видов млекопитающих спонтанно активируется посредством эритроцитов кролика, таким образом они являются удобной мишенью. Кроличьи эритроциты (Комплемент Технолоджи, корп.) готовят путем 3-разовой промывки GVB (продукт КомпТех) и пересуспендирования в 5×10 /мл. Разные количества антитела к фактору С5 разводили в GVB. Смешивают 100 мкл реакции на льду из ряда серийных разведений антитела к фактору Bb, 0,1М MgEGTA (продукт Комптех), 1/2 НЧС (нормальная человеческая сыворотка, разведенная  GVB) и и кроличьи эритроциты. Затем инкубируют реакцию при 37°С в течение 30 минут на шейкере. Добавляют 1,0 мл холодного GVBE. Смешивают и центрифугируют в течение 3 мин приблиз. при 1000×g или выше, чтобы осадить клетки. Переносят 100 мкл супернатанта в 96-луночный планшет и считывают на 412 нм (СофтМакс Про 4.7.1). Данные анализируются с помощью Graphpad Prism 4.
[0092] Не каждое антитело, которое специфически связывается с антигеном, может блокировать связывание антигена с его обычным лигандом и, таким образом ингибировать или модулировать биологические эффекты антигена. Как известно специалистам в данной области техники, такой эффект может зависеть от того, какую часть антигена связывает антитело, и как от абсолютных, так и от относительных концентраций антигена и антитела, в данном случае, антитела к С5. Как подразумевается в данном документе антитело считается способным к ингибированию или модулированию биологической активности С5 и/или C5b, если оно может быть способно, например, ингибировать гемолиз, вызванный человеческой сывороткой, по меньшей мере на около 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% или более.
[0093] Концентрация антитела, необходимая для ингибирования активности С5 и/или C5b, может значительно различаться и может зависеть от того, насколько тесно антитело связывается с С5 и/или C5b. Например, для ингибирования биологической активности может быть достаточно одной молекулы антитела или менее на молекулу С5. В некоторых вариантах реализации изобретения соотношение С5:антитело к С5 составляет от около 1000:1 до около 1:1000, включая около 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20, 1:40, 1:60, 1:100, 1:500, 1:1000 или более. Во многих случаях способность ингибировать активность С5 может зависеть от концентрации С5 и/или концентрации антитела к С5.
[0094] В некоторых вариантах реализации изобретения антитела согласно описанию содержат (а) каркасную структуру и (б) одну или более CDR, которые являются областями, определяющими специфичность связывания с антигеном и аффинность. Определяющие комплементарность области или CDR являются областями антитела, которые формируют контактные точки на поверхности антитела для связывания антигена. В каркасную структуру антитела включена одна или более CDR. Каркасная структура антител согласно изобретению может представлять собой антитело или его фрагмент, или его вариант, или может быть полностью синтетическим продуктом по своей природе. Различные каркасные структуры антител изобретения дополнительно описаны ниже.
[0095] В одном варианте реализации раскрытых антител антитело может представлять собой вариант антитела, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 75% идентичную, гомологичную или подобною на исходную аминокислотную последовательность. Например, в некоторых вариантах реализации изобретения последовательность вариабельного домена легкой или тяжелой цепи варианта антитела на 75% идентична исходной последовательности вариабельного домена тяжелой или легкой цепи, в альтернативном варианте по меньшей мере на 80%, в альтернативном варианте по меньшей мере на 85%, в альтернативном варианте по меньшей мере на 90% и в альтернативном варианте меньшей мере на 95%. В большинстве случаев вариант антитела будет иметь немного или совсем не иметь изменений в последовательности CDR, и, следовательно, в большинстве случаев будет связываться с антигеном-мишенью с аналогичной аффинностью. Идентичность или сходство но отношению к этой последовательности определяется в данном документе как процент аминокислотных остатков в последовательности варианта, которые являются идентичными (т.е. такой же остаток) или сходными (т.е. аминокислотный остаток, принадлежащий той же группе на основании общих свойств боковых цепей, смотрите ниже) с аминокислотной последовательностью родительского антитела после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей.
CDR
[0096] Антитела согласно изобретению включают в себя каркасные области и одну или более CDR. Антитело согласно изобретению может содержать от одной до шести CDR (как обычно содержат антитела естественного происхождения), например, одну CDR1 тяжелой цепи ("НС CDR1" или "CDRH1"), и/или одну CDR2 тяжелой цепи ("НС CDR2" или "CDRH2"), и/или одну CDR3 тяжелой цепи ("НС CDR3" или "CDRH3 "), и/или одну CDR1 легкой цепи ("LC CDR1" или "CDRL1"), и/или одну CDR2 легкой цепи ("LC CDR2" или "CDRL2"), и/или одну CDR3 легкой цепи ("LC CDR3" или "CDRL3"). Термин "естественного происхождения", используемый в данном описании, связан с биологическими материалами, такими как полипептиды, нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева и тому подобное, относится к материалам, которые встречаются в природе. В анти телах естественного происхождения CDR1 тяжелой цепи, как правило, содержит от около пяти (5) до около семи (7) аминокислот, CDR2 тяжелой цепи, как правило, содержит от около шестнадцати (16) до около девятнадцати (19) аминокислот, и CDR3 тяжелой цепи, как правило, содержит около трех (3) до около двадцати пяти (25) аминокислот. CDR1 легкой цепи, как правило, содержит от около десяти (10) до около семнадцати (17) аминокислот, CDR2 легкой цепи, как правило, содержит около семи (7) аминокислот, и CDR3 легкой цепи, как правило, содержит от около семи (7) до десяти (10) аминокислот.
[0097] Аминокислоты согласно настоящему описанию включают в себя природные и синтетические аминокислоты (например, гомофенилаланин, цитруллин, орнитин и норлейцин). В частности, такие синтетические аминокислоты могут быть включены, когда антитело синтезируют in vitro традиционными, хорошо известными в данной области техники способами. Кроме того, можно использовать любую комбинацию остатков/структур пептидомиметического, синтетического и естественного происхождения. Аминокислота включает такие иминокислотные остатки, как пролин и гидроксипролии. "R группа" или "боковая цепь" аминокислоты может находится либо в (L)- либо в (S)-конфигурацин. В конкретном варианте реализации аминокислоты находятся в (L)- или в (S)-конфигурацин. В некоторых вариантах реализации изобретения аминокислоты могут образовывать пептидомиметические структуры, т.е., пептидные или белковые аналоги, такие как пептоиды (см., Simon et al., 1992 год, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:9367, который включен в данный документ посредством ссылки), которые могут быть устойчивыми к протеазам или другим физиологическим условиям и/или условиям хранения.
[0098] Структура и свойства CDR в антителе естественного происхождения дополнительно описаны ниже. Вкратце, в традиционном каркасе антитела CDR включены в рамках каркасной области в вариабельную область тяжелой и легкой цепи, где они образуют области, отвечающие за связывание и распознавание антигена. Вариабельная область содержит по меньшей мере три CDR тяжелой или легкой цепи, см. выше (Kabat et al., 1991 год, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; см. также Chothia и Lesk, 1987 год, J, Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989 год, Nature 342:877-883), в пределах каркасной области (каркасные области 1-4 обозначаются как FR1, FR2, FR3 и FR4, согласно Kabat et al., 1991 год, см. выше; см. также Chothia и Lesk, 1987 год, см. выше). См. ниже. При этом CDR, предложенные в настоящем изобретении, могу использоваться не только для определения антигенсвязывающего домена традиционной структуры антитела, но также могут быть включены в большое количество других каркасных структур, как описано в данном документе.
[0099] Конкретные CDR для использования в антителах изобретения представлены в таблице 1.
[00100] В других вариантах реализации изобретения описание предоставляет антитело, которое связывается с С5, причем указанное антитело содержит по меньшей мере одну область НС CDR, имеющую не более двух (2) вставок, делеций или замен аминокислот из любой из SEQ ID NO: 16-18, 22-24, 28-30, 34-36, 40-42, и 46-48, и/или по меньшей мере одну область LC CDR, имеющую не более двух (2) вставок, делеций или замен аминокислот из любой из SEQ ID NO: 13-15, 19-21, 25-27, 31-33, 37-39 и 43-45. Варианты реализации изобретения различных вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи описания описаны в ТАБЛИЦЕ 2 и SEQ ID NO: 1-12. В некоторых вариантах реализации изобретения применяют конкретно антитела с областью НС CDR3 или LC CDR3. Кроме того, в некоторых вариантах реализации изобретения антитела могут иметь одну CDR, содержащую не более двух (2) вставок, делеций или замен последовательностей, выбранных из областей НС CDR любой из SEQ ID NO: 16-18,22-24, 28 -30, 34-36, 40-42 и 46-48, и LC CDR, содержащей не более двух (2) вставок, делеций или замен аминокислотных последовательностей из любой из SEQ ID NO: 13-15,19-21, 25-27, 31-33, 37-39 и 43-45 (например, антитело имеет две области CDR, одну НС CDR и одну LC CDR, конкретный вариант реализации изобретения представляет собой антитела как с НС CDR3, так и с LC CDR3, например, SEQ ID NO: 45 и 48).
Последовательности тяжелой цепи
Последовательности CDR варианта
[00101] В другом варианте реализации изобретения описание предоставляет антитело, которое связывается с С5, причем указанное антитело содержит по меньшей мере одну область НС CDR, имеющую не более двух (2) вставок, делеций или замен аминокислот из любой из НС CDR1, НС CDR2 или НС CDR3 области (как описано выше) из SEQ ID NO: 16-18,22-24,28-30, 34-36,40-42 и 46-48, и/или по меньшей мере одну область LC CDR, имеющую не более двух (2) вставок, делеций или замен аминокислот из любой изLС CDR1, LC CDR2 или LC CDR3 области (как описано выше) из SEQ ID NO: 13-15, 19-21, 25-27, 31-33, 37-39 и 43-45. В этом варианте реализации изобретения конкретно используются антитела с областью НС CDR3 или LC CDR3. Дополнительные варианты реализации изобретения используют антитела с одной CDR, содержащей не более двух вставок, делеций или замен последовательностей, выбранных из областей НС CDR любой из SEQ ID NO: 16-18, 22-24, 28-30, 34-36, 40-42 и 46-48, и областью LC CDR, содержащей не более двух вставок, делеций или замен аминокислотных последовательностей из любой из SEQ ID NO: 13-15, 19-21, 25-27, 31-33, 37-39 и 43-45 (например, антитело имеет две области CDR, одну НС CDR и одну LC CDR, конкретный вариант реализации изобретения представляет собой антитела как с НС CDR3, так и с областью LC CDR3, например, SEQ ID NO: 45 и 48).
[00102] Как понятно специалистам в данной области техники, для любого антитела с одной или более CDR из проиллюстрированных последовательностей можно применять любую комбинацию CDR, независимо выбранных из проиллюстрированных последовательностей. Таким образом, можно создавать антитела с одной, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью независимо выбранными CDR. При этом, как понятно специалистам в данной области техники, в конкретных вариантах реализации изобретения применяют комбинации CDR, которые не повторяются, например, в общем случае не получают антитела с двумя областями НС CDR2 и т.д.
[00103] В дополнительном аспекте изобретения предложено выделенное антитело, которое связывается с С5, при этом выделенное антитело содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи, имеющую не более двух (2) вставок, делеций или замен аминокислот из любой из SEQ ID NO: 16-18, 22-24, 28-30, 34-36, 40-42, и 46-48, и аминокислотную последовательность легкой цепи, имеющую не более двух (2) вставок, делеций или замен аминокислот из любой из SEQ ID NO: 13-15, 19-21, 25-27, 31-33, 37-39 и 43-45. Следует отметить, что любая из последовательностей тяжелой цепи может сочетаться и комбинироваться с любой из последовательностей легкой цепи.
[00104] Как правило, аминокислотная гомология, сходство или идентичность между отдельными вариантами CDR, описанными в данном документе, составляет по меньшей мере 80%, если сравнивать с последовательностями, описанными в данном документе. В различных случаях аминокислотная гомология, сходство или идентичность составляет по меньшей мере 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99%.
Идентичность гомология последовательностей
[00105] Как известно специалистам в данной области техники, целый ряд различных программ может использоваться для определения степени идентичности или сходства последовательности белка или нуклеиновой кислоты по сравнению с другой последовательностью.
[00106] В случае аминокислотных последовательностей идентичность и/или сходство последовательностей определяют, применяя стандартные методы, известные в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, алгоритм локальной идентичности последовательностей авторства Smith and Waterman, 1981 год, Adv. Appl. Math. 2:482, алгоритм выравнивания идентичности последовательности Needleman и Wunsch, 1970 год, J. Mol. Biol. 48:443, метод поиска сходства Pearson и Lipman, 1988 год, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, компьютеризированные реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Мадисон, штат Висконсин), Best Fit программа последовательности, описанная Devereux et al., 1984 год, Nucl. Acid Res. 12:387-395, используя настройки по умолчанию, или путем проверки. Процент идентичности может вычисляться посредством FASTDB на основе следующих параметров: штраф за несовпадение 1; штраф за гэп 1; штраф за размер гэпа 0,33; и штраф за соединение 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis." Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988 год), Alan R. Liss, Inc.
[00107] Примером используемого алгоритма является PILEUP. PILEUP создает множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессивного, попарного выравнивания. Также существует возможность построения дерева, показывающего групповые взаимосвязи, используемые для создания выравнивания. PILEUP использует упрощение прогрессивного метода выравнивания Feng & Doolittle, 1987 год, J. Mol. Evol. 35:351-360: метод аналогичен тому, который описан у Higgins и Sharp, 1989 год, CABIOS 5:151-153. Применяемые параметры PILEUP включают вес гэпа по умолчанию 300, вес длины гэпа по умолчанию 0,10 и взвешенные концевые гэпы.
[00108] Другим примером применяемого алгоритма является алгоритм BLAST, описанный в: Altschul соавт., 1990 год, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997 год, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; и Karin et al., 1993 год, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Особенно подходящей программой BLAST является программа WU-BLAST-2, который была получена из Altschul et al., 1996 год, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 использует несколько параметров поиска, большинство из которых имеют установленные значения по умолчанию. Регулируемые параметры устанавливаются со следующими значениями для белков: длина перекрывания =1, доля перекрывания =0,125, пороговая длина сегмента, Т=11. Параметры HSP S и HSP S2 являются динамическими величинами и устанавливаются самой программой в зависимости от состава конкретной последовательности и состава конкретной базы данных, против которой проводится поиск представляющей интерес последовательности; при этом данные величины можно корректировать для повышения чувствительности.
u
g
[00109] Дополнительным применяемым алгоритмом является gapped BLAST, который описанный в Altschul et al., 1993 год, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. BLAST с гэпами использует матрицу весовых оценок замен BLOSUM-62; пороговый параметр Т установлен на 9; метод двух совпадений для запуска продлений без гэпов, затраты на длину гэпа к стоимостью 10+k; X установлен на 16, a X установлен на 40 на этапе поиска по базе данных и на 67 на выходном этапе алгоритмов. Выравнивание с гэпами запускается при оценке, соответствующей приблизительно 22 битам.
[00110] Как правило, аминокислотная гомология, сходство или идентичность между отдельными вариантами CDR или вариабельными областями составляет по меньшей мере 80%, или в альтернативном варианте процент гомологии и сходства увеличивается по меньшей мере до 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и почти до 100%.
[00111] Аналогично, процент (%) идентичности нуклеотидных последовательностей по отношению к нуклеотидной последовательности, кодирующей антитела согласно описанию, представляет собой процентную долю нуклеотидных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны нуклеотидным остаткам в кодирующей последовательности антитела. В конкретном способе используют модуль BLASTN WU-BLAST-2 с установленными по умолчанию параметрами, с длиной перекрытия и долей перекрьтия, установленными на 1 и 0,125, соответственно.
[00112] Как правило, гомология, сходство или идентичность между нуклеотидными последовательностями, кодирующими отдельные варианты CDR и последовательностями варианта вариабельного домена составляет по меньшей мере 80% или в альтернативном варианте процент гомологии и сходства увеличивается по меньшей мере до 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и почти до 100%. Во многих случаях неидентичные нуклеотидные последовательности вследствие вырожденности генетического кода могут кодировать одну и ту же аминокислотную последовательность.
[00113] Гомологию между нуклеотидными последовательностями часто определяют по их способности гибридизироваться друг с другом. В некоторых вариантах реализации изобретения селективная гибридизация может относиться к связыванию с высокой специфичностью. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты в соответствии с изобретением избирательно гибридизируются с цепями нуклеиновой кислоты в условиях гибридизацин и промывки, которые минимизируют значительное количество выявляемого связывания с псспецифическими нуклеиновыми кислотами. Условия высокой жесткости могу т использоваться для достижения условий селективной гибридизацин, как известно в данной области техники и рассмотрено в данном документе.
[00114] Жесткость условий реакций гибридизацин легко определяется средним специалистом в данной области техники и, как правило, представляет собой эмпирический расчет, результат которого зависит от длины зонда, концентрации/состава зонда, концентрации/состава мишени, температуры промывки и концентрации соли. В общем случае для более длинных зондов необходимы более высокие температуры для надлежащего отжига, в то время как для более коротких зондов необходимы более низкие температуры. В общем случае гибридизация зависит от способности денатурированной ДНК к повторному отжигу, когда комплементарные цепи находятся в среде ниже их температуры плавления. Чем выше степень требуемой гомологии между зондом и способной к гибридизацин последовательностью, тем выше относительная температура, которая может быть использована. Из этого следует, что более высокие относительные температуры имеют тенденцию к повышению жесткости реакционных условий, в то время как низкие температуры - к понижению. Дополнительные детали и объяснение жесткости реакций гибридизацин см. в Ausubel и соавт., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995 год).
[00115] Условия высокой жесткости известны в данной области техники; см., например, Sambrook et al., 2001 год, вышеи Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel и соавт.изд., John Wiley & Sons, 1992 год, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки. Жесткие условия зависят от последовательностей и будут различаться в разных обстоятельствах. Специфическая гибридизация более длинных последовательностей происходит при более высоких температурах. Расширенное руководство по гибридизацин нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen, Techniques In Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993 год).
[00116] В некоторых вариантах реализации изобретения условия жесткости или высокой жесткости можно определить по тому, что: (1) применяют низкую ионную силу и высокую температуру для промывки, например, 0,015 М хлорида натрия /0,0015 М цитрата натрия/ 0,1% додецилсульфата натрия при 50°С; (2) во время гибридизацин применяют денатурирующий агент, такой как формамид, например, 50% (об/об) формамида с 0,1% бычьего сывороточного альбумина /0,1% фиколл/0,1% поливинилпирролидона/50 мМ натрий-фосфатного буфера при рН 6,5 с 750 мМ хлорида натрия, 75 мМ цитрата натрия при 42С; или (3) применяется 50% формамида, 5Х SSC (0,75 М NaCl, 0,075 М цитрата натрия), 50 мМ фосфата натрия (рН 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5Х раствора Денхардта, фрагментированную ДНК из молок лососевых (50 мкг/мл), 0,1% ДСН и 10% декстран сульфата при 42°С с промывками при 42°С в 0,2Х SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°С с последующей промывкой с высокой жесткостью, состоящей из 0,1 X SSC, содержащего ЭДТА, при 55°С.
[00117] Как правило, жесткие условия выбираются таким образом, чтобы быть ниже, чем температура плавления (Tm) на около 5-10°С для определенной последовательности при определенной ионной силе и рН. Tm представляет температуру (при определенных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50% зондов, комплементарных последовательности-мишени, гибридизируются с последователыюстью-мишенью в состоянии равновесия (если последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Тm наблюдается занятость 50% зондов в состоянии равновесия). Жесткими условиями являются те, при которых концентрация соли составляет менее чем около 1,0 М ионов натрия, как правило, от около 0,01 до 1,0 М ионов натрия (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, а температура составляет по меньшей мере около 30°С для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60°С для длинных зондов Например, более 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид.
[00118] В другом варианте реализации изобретения применяют менее жесткие условия; например, как известно в данной области техники, можно применять условия умеренной или низкой жесткости; см., Sambrook et al., 2001 год, см. выше; Ausubel et al., 1992 год, см. выше, и Tijssen, 1993 год, см. выше.
[00119] В некоторых случаях условия умеренной жесткости могут включать применение промывочного раствора и гибридизационных условий (например, температуры, ионной силы и % ДСН), менее жестких, чем вышеописанные. Примером условий умеренной жесткости является инкубация в течение ночи при 37°С в растворе, содержащем: 20% формамида, 5Х SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатриевого цитрата), 50 мМ фосфата натрия (рН 7,6), 5Х раствора Денхардта, 10% декстран сульфата и 20 мг/мл фрагментированной ДНК из молок лососевых, с последующей промывкой фильтров в IX SSC при около 37-50°С. Специалисту в данной области техники известно, как проводить корректировку температуры, ионной силы и т.д. в случае необходимости учитывать такие факторы, как длина зондов и тому подобное.
[00120] В некоторых вариантах реализации изобретения раскрытые антитела и их варианты можно получать при помощи сайт-специфического мутагенеза нуклеотидов в последовательности ДНК, кодирующей антитело. Это можно осуществить, используя кассету или ПЦР-мутагенез или другие методы, хорошо известные в данной области техники, для получения ДНК, кодирующей вариант, и экспрессируя после этого рекомбинантную ДНК в клеточной культуре, как описано в данном документе. В некоторых случаях фрагменты антител, содержащие вариантные CDR, содержащие до около 100-150 остатков, можно получать путем in vitro синтеза, используя известные методы. Эти вариантные фрагменты могут обладать такой же качественной биологической активностью как и аналоги естественного происхождения, например, связывание с С5 и ингибирование комплемента, хотя также могут быть выбраны варианты, которые обладают модифицированными характеристиками, как будет более полно описано ниже.
[00121] В то время как сайт или область внесения вариацин аминокислотной последовательности является определенным, нет необходимости в предопределении мутацин per se. Например, для того, чтобы оптимизировать мутацин в данном сайте может быть осуществлен неспецифический мутагенез в целевом кодоне или области, и экспрессированная CDR антитела или варианты последовательности вариабельной области поддаются скринингу для определения оптимальной желательной активности антитела. Методы введения мутаций замещения в предопределенные участки в ДНК, имеющие известную последовательность, хорошо известны, например, это мутагенез с праймером М13 и ПЦР-мутагенез. Скрининг мутантов осуществляется с помощью анализов активности антител, например, анализ на связывание с С5,
[00122] Аминокислотные замены, как правило, проводят в одном остатке; инсерции обычно занимают от около одного (1) до около двадцати (20) аминокислотных остатков, хотя допустимы и значительно большие инсерции. Диапазон делеций составляет от около одного (1) до около двадцати (20) аминокислотных остатков, хотя в некоторых случаях делении могут быть намного крупнее.
[00123] Для получения конечного производного или варианта можно использовать замены, делеций, инсерции или любые их комбинации. В целом, эти изменения касаются нескольких аминокислот для того, чтобы свести к минимуму, изменение молекулы, в частности, иммуногенности и специфичности антитела. Однако в определенных обстоятельствах допустимы большие изменения. Консервативные замены, как правило, сделаны в соответствии со следующей схемой, описанной в таблице 3.
[00124] Изменения в функции или иммунологической идентичности могут быть получены путем выбора замен, которые являются менее консервативными, чем приведенные в таблице 3. Например, можно делать замены, которые более существенно влияют на: структуру полипептидного скелета в участке изменения, например, альфа-спиральную или бета-складчатую структуру; заряд или гидрофобность молекулы в целевом участке; или объем боковой цепи. Заменами, которые в общем случае должны приводить к наибольшим изменениям в свойствах полипептида, являются те, в которых (а) гидрофильный остаток, например, серил или треонил, заменяется на гидрофобный остаток (или гидрофобным остатком), например, лейцил, изолейцил, фенилаланил, валил или аланил; (б) цистеин или пролин заменяется на любой другой остаток (любым другим остатком); (в) остаток, имеющий электроположительную боковую цепь, например, лизил, аргинил или гистидил, заменяется на электроотрицательный остаток (или электроотрицательным остатком), например, глутамил или аспартил; или (г) остаток, имеющий объемную боковую цепь, например, фенилаланин, заменяется на остаток (остатком), не имеющий боковую цепь, например, глицин.
[00125] Как правило, варианты проявляют такую же качественную биологическую активность и будут вызывать тот же иммунный ответ, что и аналог естественного происхождения, хотя варианты также выбираются таким образом, чтобы изменить характеристики описанного антитела С5 по мере необходимости. В альтернативном варианте вариант может быть выбран, причем биологическая активность описанного антитела изменяется. Например, могут быть изменены или удалены участки гликозилирования, как обсуждается в данном документе.
[00126] Описанные в данном документе полипептидные последовательности являются гомологичными к последовательностям из SEQ ID NO: 1-48. Раскрытые в данном документе полипептиды могут содержать аминокислотные последовательности, идентичные раскрытым аминокислотным последовательностям. В других случаях заявляемые полипептиды содержат аминокислотные последовательности, которые могут содержать консервативные аминокислотные замены по сравнению с раскрытой последовательностью. Консервативные аминокислотные замены могут включать в себя аминокислоты, которые имеют общие характеристики с замещенной аминокислотой. В различных случаях консервативную замену можно проводить без существенного изменения структуры или функции полипептида.
[00127] Консервативные аминокислотные замены можно проводить на основании относительного сходства боковой цепи, размера, заряда, гидрофобности, гидрофильности, изоэлектрической точки и т.д. В различных случаях влияние замен на функцию белка можно оценить при помощи рутинных исследований. Консервативные аминокислотные замены включают аминокислоты со сходной величиной гидрофильности, например, когда аминокислоты имеют индекс гидрофобности, который может быть основан на гидрофобности и заряде аминокислоты. В различных случаях консервативные аминокислотные замены можно проводить между двумя аминокислотами одного класса, например, неполярными аминокислотами, кислотными аминокислотами, основными аминокислотами и нейтральными аминокислотами. Консервативные замены также могут быть основаны на размере или объеме. Аминокислоты также можно классифицировать на основании их способности образовывать или разрушать заданную структуру, такую как альфа-спираль, бета-складчатость или меж- или внутримолекулярное взаимодействие. В различных случаях консервативные аминокислотные замены основаны на более чем одной характеристике.
[00128] Раскрытые в настоящей заявке полипептиды могут содержать аминокислоты как природного, так и неприродного происхождения. В различных случаях боковые цепи аминокислот природного происхождения можно замещать боковыми цепями неприродного происхождения. В различных случаях аминокислоты могут быть производными.
[00129] Описанные полипептиды включают полипептиды, которые являются гомологичными последовательностям из SEQ ID NO: 1-48. Гомология может быть выражена в виде % идентичности или % сходства, или % положительных результатов. В различных случаях % идентичности представляет процентную долю аминокислот, являющихся идентичными для двух выравниваемых последовательностей, а % сходства или % положительных результатов представляет процентную долю аминокислот, являющихся неидентичными, но представляющих консервативные замены. Консервативной заменой может быть замена аминокислоты с подобным зарядом, аминокислоты с подобным размером, аминокислоты с подобной полярностью и т.д. Например, если учитывать заряд, то консервативной заменой можно считать замену лизина на аргинин.
[00130] В различных случаях выравнивание двух полипептидов можно проводить при помощи алгоритмов, например, BLASTp. В различных случаях параметры BLASTp могут быть установлены с максимальной длиной последовательности-мишени, эквивалентной, большей или меньшей чем длина наиболее длинного из двух полипептидов, ожидаемый порог может быть установлен на 10, длина сегмента на 3, а матрицей замен может быть BLOSUM62 со стоимостью гэпа 11 за внесение и 1 за продление. BLASTp может представлять гомологию выровненных полипептидов в виде «идентичности» или «количества положительных результатов». Выровненные последовательности могут включать гэпы для достижения выравнивания.
[00131] В различных случаях гомология аминокислотных последовательностей может отражать процент идентичности или положительных результатов при оптимальном выравнивании, как описано выше. В различных случаях % гомологии (% положительных результатов) или % идентичности можно рассчитать, разделив количество выровненных аминокислот в окне сравнения. Окно сравнения может составлять полную длину одного или другого полипептида, если длина двух полипептидов не одинакова. В других случаях окно сравнения может быть частью одного из полипептидов. В различных случаях окно сравнения для определения гомологии или идентичности двух полипептидных последовательностей больше чем около 40 ак (аминокислот), 45 ак, 50 ак, 55 ак, 60 ак, 65 ак, 70 ак, 75 ак, 80 ак, 85 ак, 90 ак, 95 ак, 100 ак, 150 ак или 200 ак, и/или менее чем около 200 ак, 150 ак, 100 ак, 95 ак, 90 ак, 85 ак, 80 ак, 75 ак, 70 ак, 65 ак, 60 ак, 55 ак, 50 ак, или 45 ак. В некоторых вариантах реализации изобретения, как в случае с последовательностями CDR, окно сравнения может быть менее чем 40 ак, например, между менее чем около 25 ак, 24 ак, 23 ак, 22 ак, 21 ак, 20 ак, 19 ак, 18 ак, 17 ак, 16 ак, 15 ак, 14 ак, 13 ак, 12 ак, 11 ак, 10 ак, 9 ак, 8 ак, 7 ак, 6 ак, 5 ак или 4 ак, и больше чем около 3 ак, 4 ак, 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак, 10 ак, 11 ак, 12 ак, 13 ак, 14 ак, 15 ак, 16 ак, 17 ак, 18 ак, 19 ак, 20 ак, 21 ак, 22 ак, 23 ак, или 24 ак.
[00132] В различных случаях заявленные аминокислотные последовательности могут иметь % идентичности или % гомологии (% положительных результатов) в заданном окне сравнения, который составляет больше чем около 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и/или меньший чем около 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80%, 75%, или 70%.
[00133] В различных случаях выравнивание последовательностей можно проводить, используя различные алгоритмы, включая динамическое, локальное и глобальное выравнивание. Например, алгоритм Smith и Waterman, 1981 год, Adv. Appl. Math 2: 482; алгоритм выравнивания Needleman и Wunsch, 1970 год, J. Mol. Biol. 48:443; метод поиска сходства Pearson и Lipman, 1988 год, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 В различных случаях эти алгоритмы могут быть реализованы компьютерными программами (такими как EMBOSS, GAP, BESTFIT, FASTA, TFASTA BLAST, BLOSUM и т.д.).
[00134] В альтернативных случаях можно проводить консервативные аминокислотные замены, в которых аминокислотный остаток замещен другим из того же класса, например, в которых аминокислоты делятся на неполярный, кислотный, основной и нейтральный классы следующим образом: неполярные: Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Pro, Met; кислотные: Asp, Glu; основные: Lys, Arg, His; нейтральные: Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Tyr.
[00135] В некоторых случаях можно проводить консервативные аминокислотные замены, в которых аминокислотный остаток замещен другим, имеющим сходную величину гидрофильности (например, в пределах плюс или минус 2,0), когда следующей может быть аминокислота с индексом гидрофобности около -1,6, такой как Tyr (-1,3) или Pro (-1,6) приписаны такие значения: Arg (+3,0); Lys (+3,0); Asp (+3,0); Glu (+3,0); Ser (+0,3); Asn (+0,2); Gln (+0,2); Gly (O); Pro (-0,5); Thr (-0,4); Ala (-0,5); His (-0,5); Cys (-1,0); Met (-1,3); Val (-1,5); Leu (-1,8); Ile (-1,8); Tyr (-2,3); Phe (-2,5); и Trp (-3,4).
[00136] В альтернативных случаях можно проводить консервативные аминокислотные заметил, в которых аминокислотный остаток замещен другим, имеющим сходный индекс гидрофобности (например, в пределах плюс или минус 2,0). В таких случаях каждой аминокислоте может быть приписан индекс гидрофобности на основании ее гидрофобности и зарядовых характеристик следующим образом: Ile (+4,5); Val (+4,2); Leu (+3,8); Phe (+2,8); Cys (+2,5); Met (+1,9); Ala (+1,8); Gly (-0,4); Thr (-0,7); Ser (-0,8); Trp (-0,9); Tyr (-1,3); Pro (-1,6); His (-3,2); Glu (-3,5); Gln (-3,5); Asp (-3,5); Asn (-3,5); Lys (-3,9); и Arg (-4,5).
[00137] В альтернативных случаях консервативные аминокислотные замены включают изменения с учетом гидрофильности или гидрофобности, размера или объема или заряда. В целом, аминокислоты могут характеризоваться как гидрофобные или гидрофильные, главным образом, в зависимости от свойств боковой цепи аминокислоты. Гидрофобные аминокислоты демонстрируют гидрофобность больше нуля, а гидрофильные аминокислоты демонстрируют гидрофильность меньше нуля на основании нормированной консенсусной оценки гидрофобности по Eisenberg и соавт.(J. Mol. Bio. 179:125-142, 184). Генетически кодируемые гидрофобные аминокислоты включают Gly, Ala, Phe, Val, Leu, lie, Pro, Met и Trp, и генетически кодируемые гидрофильные аминокислоты включают Thr, His, Glu, Gln, Asp, Arg, Ser и Lys. He кодируемые генетически гидрофобные аминокислоты включают t-бутилаланин, а не кодируемые генетически гидрофильные аминокислоты включают цитруллин и гомоцистеин.
2
2
2
1
6
1
6
0
6
1
6
1
6
0
6
5
20
0
20
6
26
6
26
[00138] Гидрофобные или гидрофильные аминокислоты могут быть дополнительно подразделены на основании характеристик их боковых цепей. Например, ароматическая аминокислота представляет собой гидрофобную аминокислоту с боковой цепью, содержащей по меньшей мере одно ароматическое или гетероароматическое кольцо, которое может содержать один или несколько заместителей, таких как -ОН, -SH, -CN, --F, -Cl, -Br, --I, --NO, --NO, -NH, --NHR, --NRR, --C(O)R, --C(O)OH, -C(O)OR, --C(O)NH, --C(O)NHR, --C(O)NRR и т.д., где R независимо представляет собой (C-С) алкил, замещенный (C-С) алкил, (С-С) алкенил, замещенный (C-С) алкенил, (C-С) алкинил, замещенный (С-С) алкинил, (С-С) арил, замещенный (С-С) арил (С-С) алкарил, замещенный (С-С) алкарил, 5-20 членный гетероарил, замещенный 5-20 членного гетероарил, 6-26 членный алкгетероарил или замещенный 6-26-членный алкгетероарил. Генетически кодируемые ароматические аминокислоты включают Phe, Tyr и Trp.
[00139] Неполярной или аполярной аминокислотой является гидрофобная аминокислота с боковой цепью, которая является незаряженной при физиологическом уровне рН и которая содержит связи, в которых пара электронов, общая для двух атомов, в общем случае удерживается одинаково каждым из этих двух атомов (т.е. боковая цепь не является полярной). Генетически кодируемые неполярные аминокислоты включают Gly, Leu, Val, Ile, Ala и Met. Неполярные аминокислоты можно дополнительно разделить, чтобы выделить алифатические аминокислоты, которые являются гидрофобными аминокислотами с алифатической углеводной боковой цепью. Генетически кодируемые алифатические аминокислоты включают Ala, Leu, Val и Ile.
[00140] Полярной аминокислотой является гидрофильная аминокислота с боковой цепью, которая является незаряженной при физиологическом уровне рН, но которая содержит одну связь, в которой пара электронов, общая для двух атомов, более близко удерживается одним из атомов. Генетически кодируемые полярные аминокислоты включают Ser, Thr, Asn и Gln.
a
a
[00141] Кислотной аминокислотой является гидрофильная аминокислота с величиной pK боковой цепи менее 7. Кислотные аминокислоты, как правило, имеют отрицательно заряженные боковые цепи при физиологическом уровне рН вследствие нехватки иона водорода. Генетически кодируемые кислотные аминокислоты включают Asp и Glu. Основной аминокислотой является гидрофильная аминокислота с величиной pK боковой цепи более 7. Основные аминокислоты, как правило, имеют положительно заряженные боковые цепи при физиологическом уровне рН вследствие ассоциации с ионом гидрония. Генетически кодируемые основные аминокислоты включают Arg, Lys и His.
[00142] Значение процента идентичности последовательности аминокислоты определяется числом совпадающих идентичных остатков, разделенным на общее число остатков "более длинной" последовательности в окне сравнения. «Более длинной» последовательностью является последовательность, содержащая большее количество фактических остатков в окне сравнения (гэпы, вносимые WU-Blast-2 для максимизации счета выравнивания, игнорируются).
[00143] Выравнивание может включать внесение гэпов в последовательности, предназначенные для выравнивания. Кроме того, понятно, что для последовательностей, которые содержат больше или меньше аминокислот, чем белок, кодируемый последовательностью раскрытого полипептида, в одном случае процент идентичности последовательностей определяется на основании числа идентичных аминокислот по отношению к общему числу аминокислот. При расчете процента идентичности разным проявлениям вариативности последовательностей, таким как инсерции, делеций, замены и т.д., не приписывают относительную массу.
[00144] В одном случае положительное значение (+1) приписывается только идентичным остаткам, а всем формам вариативности последовательностей, включая гэпы, приписывается значение «0», что устраняет необходимость во взвешенной шкале или параметрах, как описано ниже для расчета сходства последовательностей. Процент идентичности последовательностей можно рассчитать, например, разделив число совпадающих идентичных остатков на общее число остатков «более короткой» последовательности в выровненной области и умножив на 100. «Более длинной» последовательностью является последовательность, содержащая большее количество фактических остатков в выровненной области.
Каркасные структуры
[00145] Как отмечено в данном документе, антитела согласно настоящему изобретению могут содержать каркасную структуру, в которую можно прививать описанные выше CDR. В одном варианте реализации изобретения каркасная структура является традиционной структурой антитела, что означает, что антитело содержит последовательности вариабельных доменов двух тяжелых и двух легких цепей. В некоторых случаях описанные в данном документе комбинации антител могут содержать дополнительные компоненты (каркасную область, J- и D-области, константные области и т.д.), которые составляют тяжелую и/или легкую цепь. Некоторые варианты реализации изобретения включают применение человеческих каркасных компонентов.
[00146] Соответственно, в различных вариантах реализации антитела согласно изобретению содержат каркасы традиционных антител. В некоторых вариантах реализации изобретения раскрытые антитела могут быть человеческими и моноклональными антителами, биспецифическими антителами, диателами, минителами, доменными антителами, синтетическими антителами, химерными антителами, слитыми анти телами и фрагментами каждого из перечисленных компонентов, соответственно. Вышеописанные CDR и комбинации CDR можно прививать в любой из следующих каркасов.
[00147] Химерные антитела согласно настоящему изобретению могут содержать последовательность тяжелой и/или легкой цепи, идентичную или гомологичную соответствующим последовательностям, полученным от конкретного вида. Например, в одном варианте реализации изобретения антитело к С5 является химерным антителом, содержащим человеческий Fc-домен, в то время как оставшаяся часть антитела может быть идентичной или гомологичной соответствующим последовательностям мыши или грызуна. Химерные антитела могут представлять фрагменты таких антител до тех пор, пока эти фрагменты демонстрируют необходимую биологическую активность и содержат последовательность, полученную от другого вида, класса антител или подкласса антител (патент США №4,816,567; и Morrison и соавт. (1984 год) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).
[00148] В некоторых вариантах реализации изобретения вариабельная область раскрытого в настоящем документе антитела к С5 содержит по меньшей мере три CDR тяжелой или легкой цепи, см. выше (Kabat et al., 1991 год, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; см. также Chothia и Lesk, 1987 год, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989 год, Nature 342:877-883), встроенных в пределах каркасной области (каркасные области 1-4 обозначены как FR1, FR2, FR3 и FR4, согласно Kabat et al., 1991 год, см. выше; см. также Chothia и Lesk, 1987 год, см. выше).
[00149] В некоторых случаях антитело может состоять из последовательности вариабельного домена тяжелой цепи или последовательности вариабельного домена легкой цепи. В некоторых случаях последовательность вариабельного домена тяжелой или легкой цепи может содержать последовательность, выбранную из последовательностей из таблицы 1.
[00150] В большинстве случаев традиционные структурные единицы антитела включают в себя тетрамер. Каждый тетрамер, как правило, состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая пара обладает одной легкой цепью (как правило, имеющей молекулярную массу около 25 кДа) и одной тяжелой цепью (как правило, имеющей молекулярную массу около 50-70 кДа). Аминоконцевая область каждой цепи содержит вариабельную область от около 100 до 110 или более аминокислот, главным образом ответственную за распознавание антигена. С-концевая область каждой цепи определяет константную область, в то время как тяжелая цепь может содержать в общей сложности три константные области (CH1, СН2 и СН3), причем константные области содействуют регуляции эффекторной функции. Человеческие легкие цепи классифицируют как каппа и лямбда легкие цепи. Тяжелые цепи классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела, соответственно, как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. IgG имеет несколько подклассов, в том числе, но не ограничиваясь ими IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет несколько подклассов, в том числе, но не ограничиваясь ими, IgM1 и IgM2.
[00151] В пределах легкой и тяжелой цепи вариабельные и константные области соединяются "J" - областью из около двенадцати (12) или более аминокислот, причем тяжелая цепь также содержит "D"-область из около десяти (10) или более аминокислот. См., в целом, Paul, W., изд., 1989 год, Fundamental Immunology Ch. 7,2 изд. Raven Press, N.Y. Вариабельные области каждой пары легкой и тяжелой цепи образуют связывающий сайт антитела.
[00152] Некоторые антитела природного происхождения, например, антитела, выявляемые у верблюдов и лам, могут быть димерами, состоящими из двух тяжелых цепей и не иметь легких цепей. Muldermans et al., 2001 год, J. Biotechnol. 74:277-302: Desmyter et al., 2001 год, J. Biol. Chem. 276:26285-26290. Кристаллографические исследования верблюжьего антитела показали, что области CDR3 образуют поверхность, которая взаимодействует с антигеном, и, таким образом, имеет решающее значение для связывания антигена, как это происходит и в более типичных тетрамерных антителах.
Изобретение включает в себя димерные антитела, состоящие из двух тяжелых цепей или их фрагментов, которые могут связываться с и/или ингибировать биологическую активность С5.
[00153] Вариабельные области тяжелой и легкой цепей, как правило, обладают аналогичной общей структурой относительно консервативных каркасных областей (FR), соединенных тремя областями, определяющими комплементарность или CDR. CDR содержат гипервариабельные области антитела, которые отвечают за распознавание и связывание антигена. CDR из двух цепей каждой пары ориентированы и поддерживаются каркасными областями, что обеспечивает возможность связывать конкретный эпитоп. От N-конца к С-концу как тяжелые, так и легкие цепи содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Отнесение аминокислот к каждому домену проводят в соответствии с определениями из Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest. Chothia et al., 1987 год, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989 год, Nature 342:878-883.
[00154] CDR формируют основные контактные точки на поверхности антитела для связывания антигена. См., например, Chothia и Lesk, 1987 год, J. Mol. Biol. 196:901-917. Дополнительно, CDR3 легкой цепи и, в особенности, CDR3 тяжелой цепи могут формировать наиболее важные антигенсвязующие детерминанты в границах вариабельных областей легкой и тяжелой цепи. См., например, Chothia и Lesk, 1987 год, см. выше; Desiderio et al., 2001 год, J. Mol. Biol. 310:603-615; Xu и Davis, 2000 год, Immunity 13:37-45; Desmyter et al., 2001 год, J. Biol. Chem. 276:26285-26290; и Muyldermans, 2001 год, J. Biotechnol. 74:277-302. В некоторых антителах CDR3 тяжелой цени составляет основную площадь контакта между антигеном и антителом. Desmyter et al., 2001 год, см. выше. Схемы in vitro отбора, в которых варьируется только CDR3, можно использовать, чтобы варьировать связывающие свойства антитела. Muyldermans, 2001 год, см. выше; Desiderio et al., 2001 год, см. выше.
[00155] Антитела естественного происхождения, как правило, включают си шальную последовательность, которая направляет антитела в клеточный путь для секреции белков, и которая не присутствует в зрелом антителе. Полинуклеотид, кодирующий антитело согласно изобретению, может кодировать сигнальную последовательность природного происхождения или гетерологичную сигнальную последовательность, как описано ниже.
[00156] В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 является моноклональным антителом, которое имеет от одного (1) до шести (6) CDR, как описано в настоящем документе. Антитела согласно изобретению могут принадлежать любому типу, включая антитела IgM, IgG (включая IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgD, IgA или IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения антитело представляет собой антитело типа IgG. В одном варианте реализации изобретения антитело представляет собой антитело типа IgG2.
[00157] В некоторых вариантах реализации изобретения антитело может содержать полные тяжелые и легкие цепи, причем все CDR происходят от тех же видов, например, человека. В альтернативном варианте, например, в вариантах реализации изобретения, в которых антитело содержит менее шести CDR из вышеприведенных последовательностей, дополнительные CDR могут принадлежать как другому виду (например, мышиные CDR), так и могут являться человеческими CDR, отличными от приведенных в последовательностях. Например, человеческие области НС CDR3 и LC CDR3 из соответствующих определенных в данном документе последовательностей можно использовать с НС CDR1, НС CDR2, LC CDR1 и LC CDR2, необязательно выбранными из других видов или из других последовательностей человеческих антител, или их комбинациями. Например, CDR согласно изобретению могут замещать области CDR коммерчески релевантных химерных или гуманизированных антител.
[00158] Конкретные варианты реализации изобретения могут включать в себя каркасные структуры антител, которые содержат человеческие последовательности.
[00159] В некоторых вариантах реализации изобретения, однако, каркасные компоненты могут представлять смесь от разных видов. Следовательно, антитело может быть химерным антителом и/или гуманизированным антителом. В целом, и химерные антитела и гуманизированные антитела могут быть антителами, которые сочетают в себе области или аминокислоты из более чем одного вида. Например, химерные антитела в большинстве вариантов реализации изобретения содержат вариабельную(ые) область(и) от мыши, крысы, кролика или другого подходящего отличного от человека животного и константную(ые) область(и) от человека. В других вариантах реализации изобретения химерные антитела содержат последовательности FR человека и нечеловеческие CDR.
[00160] Гуманизированные антитела представляют собой антитела, которые первоначально получены из нечеловеческих антител, например, мышиные антитела. В различных вариантах реализации изобретения гуманизированного антитела к С5, каркасные области вариабельных доменов или каркасные аминокислоты, которые получены из нечеловеческого антитела, могут быть заменены идентичными аминокислотными последовательностями, найденными в соответствующих положениях человеческих антител. В некоторых вариантах реализации гуманизированного антитела целое антитело за исключением CDR может кодироваться полинуклеотидом человеческого происхождения или может быть идентичным такому антителу за исключением участков CDR. В других вариантах реализации изобретения гуманизированное антитело может содержать конкретные аминокислотные позиции, остатки в которых были заменены на остатки такой же или сходной позиции в соответствующем человеческом антителе. CDR, некоторые или все из которых могут кодироваться нуклеиновыми кислотами, принадлежащими нечеловеческому организму, прививаю т в бета-складчатый каркас вариабельной области человеческого антитела для создания анти тела, специфичность которого определяется привитыми CDR. Создание таких антител описано в, например, WO 92/11018, Jones, 1986 год, Nature 321:522-525. Verhoeyen et al., 1988 год, Science 239:1534-1536. Гуманизированные антитела также можно получить, используя мышей с генетически сконструированной иммунной системой. Roque et al., 2004 год, Biotechnol. Prog. 20:639-654. В некоторых вариантах реализации изобретения CDR могут быть человеческими, и, таким образом, и гуманизированные и химерные антителами, в данном контексте, могут включать в себя некоторые нечеловеческие CDR. В некоторых случаях можно получить гуманизированные антитела, которые содержат области НС CDR3 и LC CDR3 с одной или более других областей CDR отличного видового происхождения.
[00161] В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 может быть мультиспецифическим антителом, в частности, биспецифическим антителом, (например, диателом). Эти антитела, которые связываются с двумя (или более) различными антигенами, например, с С5, и с другим антигеном, или с двумя различными эпитопами С5. Диатела можно получать множеством известных в данной области техники способов (Holliger и Winter, 1993 год, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449), например, получать химическим путем или из гибридных гибридом.
[00162] В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 является мини-антителом. Мини-антитела представляют собой минимизированые антителоподобные белки, содержащие ScFv, присоединенную к домену СН3. Hu и соавт., 1996 год, Cancer Res. 56:3055-3061.
[00163] В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 является доменным антителом; см., например, патент США №6,248,516. Доменные антитела (dAb) являются функциональными связывающими доменами антител, соответствующие вариабельным областям тяжелой (VH) или легкой (VL) цепей антител человека. dAB имеют молекулярные вес около 13 кДа или меньше, чем одна десятая размера полного ан титела. dAB хорошо экспрессируются в различных хозяевах, включая бактериальные, дрожжевые и клеточные системы млекопитающих. Кроме того, dAb обладают высокой стабильностью и сохраняют активность даже после воздействия на них тяжелых условий, например, лиофилизацин или тепловой денатурацин. См., например, патенты США 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; серийный № США 2004/0110941; европейский патент 0368684; патенты США 6,696,245, WO 04/058821, WO 04/003019 и WO 03/002609, которые включены в настоящий документ посредством ссылки.
[00164] В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 является фрагментом антитела, который представляет собой фрагмент любого из антител, описанного в настоящем документе, который сохраняют связывающую специфичность с С5. В различных вариантах реализации изобретения антитела являются фрагментами F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv или одноцепочечными фрагментами Fv. В контексте данного документа антитело, как минимум, содержит полипептид, который может специфически связываться с антигеном, при этом полипептид содержит всю или часть вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи.
2
[00165] Конкретные фрагменты антител включают, но не ограничиваются этим, (i) фрагмент Fab, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1, (ii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1, (iii) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного антитела; (iv) фрагмент dAb (Ward et al., 1989 год, Nature 341:544-546), который состоит из одной вариабельной области, (v) выделенные области CDR, (vi) фрагмент F(ab'), бивалентный фрагмент, содержащий два связанных фрагмента Fab (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), в которых домен VH и домен VL связаны пептидным линкером, который обеспечивает ассоциацию двух доменов с образованием антигенсвязывающего участка (Bird et al., 1988 год, Science 242:423-426, Huston и соавт., 1988 год, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883), (viii) биспецифические одноцепочечные димеры Fv (PCT/US 92/09965) и (ix) диатела или триатела, мультивалентные или мультиспецифические фрагменты, сконструированные путем генного слияния (Tomlinson et al., 2000 год, Methods Enzymol. 326:461-479; WO 94/13804; Holliger et al., 1993 год, Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448). Фрагменты антитела могут быть модифицированы. Например, молекулы можно стабилизировать путем включения дисульфидных мостиков, связывающих домены VH и VL (Reiter et al., 1996 год, Nature Biotech. 14:1239-1245).
[00166] В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 представляет собой традиционное антитело, например, иммуноглобулин человека. В этом варианте реализации изобретения, как указано выше, конкретные структуры содержат полные тяжелые и легкие цепи, содержащие области CDR. В дополнительных вариантах реализации изобретения применяют одну или более CDR согласно изобретению с другими CDR, каркасными областями, областями J и D, константными областями и т.д., принадлежащими другим человеческим антителам. Например, CDR согласно изобретению могут замещать CDR любого числа человеческих антител, в частности, коммерчески релевантных антител.
[00167] В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 представляет собой слитый белок (например, конъюгат антитела). В этом варианте реализации изобретения антитело слито с партнером по конъюгацин. Партнер по конъюгацин может быть белковым или небелковым; последнее в общем случае получают при помощи функциональных групп на антителе (см. обсуждение ковалентных модификаций антител) и на партнере по конъюгацин. Например, линкеры являются известными в данной области техники; например, хорошо известны гомо- или гетеро-бифункциональные линкеры (см., каталог Pierce Chemical Company, технический раздел по кросс-линкерам, страницы 155-200, включенный в данный документ посредством ссылки).
[00168] В одном варианте реализации изобретения антитело к С5 представляет собой аналог антитела. В некоторых случаях аналоги антител могут называться синтетическими антителами. Например, во многих недавних работах используют альтернативные белковые каркасные структуры или искусственные каркасные структуры с привитыми CDR. Такие каркасные структуры включают, но не ограничиваются ими, мутацин, введенные для стабилизацин трехмерной структуры антитела, а также полностью синтетические каркасы, состоящие, например, из биосовместимых полимеров. См., например, Korndorfer et al., 2003 год, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129. Roque et al., 2004 год, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Кроме того, пентидомиметики антител (ПМА) могут быть использованы также как работы на основе миметиков антител с использованием компонентов фибронектина в качестве каркаса.
VH и VL варианты
[00169] Как указано выше, в некоторых вариантах реализации в изобретении предложены антитела, содержащие или состоящие из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 и 12 и/или вариабельной области легкой цепи из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 и 11, соответственно, или их фрагменты, как определено выше. Таким образом, в этих вариантах реализации изобретения антитело содержит не только по меньшей мере одну CDR или вариант, но также по меньшей мере часть описанной каркасной последовательности. Кроме того, изобретение включает в себя варианты таких вариабельных последовательностей тяжелой цепи или вариабельных последовательностей легкой цепи.
[00170] Вариабельная область варианта, как правило, имеет аминокислотную гомологию, сходство или идентичность с исходной вариабельной областью, например, описанной в данном документе, по меньшей мере на 80%. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность варианта и исходная последовательность являются гомологичными или идентичными по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и почти на 100%. Гомология, сходство или идентичность между нуклеотидными последовательностями, кодирующими отдельный вариант VH и VL и последовательностями нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, составляет по меньшей мере 70%, или в альтернативном варианте процент гомологии и сходства увеличивается по меньшей мере до 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и почти до 100%. Кроме того, вариантная вариабельная область может во многих вариантах реализации изобретения обладать биологической функцией, включая, но не ограничиваясь этим, составляющей 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% от специфичности и/или активности исходной CDR. В некоторых случаях гомологию и/или идентичность определяют только за пределами последовательностей CDR, которые могут быть идентичными. В других случаях гомологию и/или идентичность определяют на полной длине последовательности, включая последовательности CDR. В некоторых вариантах реализации изобретения также могут быть включены варианты константных областей.
[00171] В различных случаях гомология аминокислотных последовательностей может отражать процент идентичности или положительных результатов при оптимальном выравнивании, как описано выше. В различных случаях % гомологии (% положительных результатов) или % идентичности можно рассчитать, разделив количество выровненных аминокислот в окне сравнения. Окно сравнения может составлять полную длину одного или другого полипептида, если длина двух полипептидов не одинакова. В других случаях окно сравнения может быть частью одного из полипептидов. В различных случаях окно сравнения для определения гомологии или идентичности двух полипептидных последовательностей больше чем около 40 ак (аминокислот), 45 ак, 50 ак, 55 ак, 60 ак, 65 ак, 70 ак, 75 ак, 80 ак, 85 ак, 90 ак, 95 ак, 100 ак, 150 ак или 200 ак, и/или менее чем около 200 ак, 150 ак, 100 ак, 95 ак, 90 ак, 85 ак, 80 ак, 75 ак, 70 ак, 65 ак, 60 ак, 55 ак, 50 ак, или 45 ак. В некоторых вариантах реализации изобретения, как в случае с различными последовательностями CDR настоящего описания, окно сравнения может быть менее чем 40 ак, например, между менее чем около 25 ак, 24 ак, 23 ак, 22 ак, 21 ак, 20 ак, 19 ак, 18 ак, 17 ак, 16 ак, 15 ак, 14 ак, 13 ак, 12 ак, 11 ак, 10 ак, 9 ак, 8 ак, 7 ак, 6 ак, 5 ак или 4 ак, и больше чем около 3 ак, 4 ак, 5 ак, 6 ак, 7 ак, 8 ак, 9 ак, 10 ак, 11 ак, 12 ак, 13 ак, 14 ак, 15 ак, 16 ак, 17 ак, 18 ак, 19 ак, 20 ак, 21 ак, 22 ак, 23 ак, или 24 ак.
[00172] В различных случаях заявленные аминокислотные последовательности могут иметь % идентичности или % гомологии (% положительных результатов) в заданном окне сравнения, который составляет больше чем около 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% и/или меньший чем около 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80% или 75%.
Ковалентные модификации антител к С5
[00173] Ковалентные модификации антител включены в объем данного изобретения и в общем случае, но не всегда, происходят после трансляции. Например, в молекулу вносят несколько типов ковалентных модификаций антитела путем приведения конкретных аминокислотных остатков антитела в реакцию с органическим дериватизирующим агентом, который способен вступать в реакцию с выбранными боковыми цепями N- или С-концевых остатков.
[00174] Остатки цистеинила наиболее часто приводят в реакцию с α-галогенацетатами (и соответствующими аминами), такими как хлоруксусная кислота или хлорацетамид, чтобы получить карбоксиметильные или карбоксиамидометильные производные. Остатки цистеинила также дериватизируют посредством реакции с бромтрифторацетоном, α-бром-β-(5-имидозоил)пропионовой кислотой, хлорацетилфосфатом, N-алкилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом, метил-2-пиридилдисульфидом, п-хлорртутьбензоатом, 2-хлорртуть-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом.
[00175] Остатки гистидила дериватизируют посредством реакции с диэтилпирокарбонатом при рН 5,5-7,0, поскольку этот агент является относительно специфичным в отношении боковой цепи гистидила. Пара-бромфенацилбромид также является полезным; реакция может быть проведена в 0,1 М какодилате натрия при рН 6,0.
[00176] Лизиниловые и амино-концевые остатки приводят в реакцию с янтарным ангидридом или ангидридами других карбоновых кислот. Дериватизация этими агентами может приводить к изменению заряда остатков лизинила. Другие подходящие реагенты для дериватизацин альфа-аминосодержащих остатков включают имидоэфиры, такие как метилпиколинимидат; пиридоксальфосфат; пиридоксаль; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновую кислоту; О-метилизомочевина; 2,4-пентандион; и катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксилатом.
a
[00177] Остатки аргинила модифицируют путем реакции с одним или несколькими традиционными реагентами, среди которых фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогексаидион и нингидрин. Для дериватизацин остатков аргинина необходимо, чтобы реакцию проводили в щелочной среде из-за высокой pK гуанидиновой функциональной группы. Кроме того, такие реагенты могут взаимодействовать с группами лизина, а также с эпсилон-амино-группой аргинина.
125
131
[00178] Можно проводить конкретные модификации остатков тирозила, в особенности интересны случаи введения спектральных меток в остатки тирозила при помощи реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Наиболее часто применяют N-ацетилимидизол и тетранитрометан для образования видов О-ацетил тирозила и 3-нитропроизводных, соответственно. Остатки тирозила йодируют, применяя I или I, для получения меченых белков для применения в радиоиммунологическом анализе, при этом подходящим является описанный выше метод с хлорамином Т.
[00179] Карбоксильные боковые группы (аспартил или глутамил) селективно модифицируют при помощи реакции с карбодиимидами (R'-N=C=N--R'), где R и R' необязательно представляют собой разные алкильные группы, такие как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилфенил)карбодиимид. Кроме того, остатки аспартила и глутамила превращают в остатки аспарагинила и глутаминила при помощи реакции с ионами аммония.
[00180] Дериватизацию с бифункциональными агентами применяют для перекрестного сшивания антител с нерастворимой в воде матричной подложной или поверхностью для применения в различных способах. Обычно применяемые перекрестиосшивающие агенты включают, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, N-гидроксисукцинимид эфиры, например, сложные эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные сложные имидоэфиры, включая дисукцинимидилэфиры, такие как 3,3'-дитио-бис-(сукцинимидилпропионат), и бифункциональные малеимиды, такие как бис-N-малеимидо-1,8-октан. При помощи дериватизирующих агентов, таких как метил-3-[(п-азидофенил)дитио]пропиоимидат, получают фотоактивируемые промежуточные соединения, которые способны образовывать перекрестные связи в присутствии света. В альтернативном варианте для иммобилизацин белка применяют нерастворимые в воде матрицы, такие как активируемые бромистым цианогеном углеводы и реактивные субстраты, описанные в патентах США №3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; и 4,330,440 (все они включены полностью посредством ссыпки) используются для иммобилизацин белков.
[00181] Остатки глутаминила и аспарагинила часто деамидируют до соответствующих остатков глутамила и аспартила, соответственно. В альтернативном варианте эти остатки деамидируют в умеренно кислых условиях. Любая форма этих остатков входит в объем настоящего изобретения.
[00182] Другие модификации включают гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилироваиие гидроксильных групп остатков серила или треонила, метилирование α-амипогрупп лизина, аргинина и боковых цепей гистидина (Т.Е. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., Сан-Франциско, 1983 год, стр. 79-86), ацетилирование N-концевого амина и амидирование любой С-концевой карбоксильной группы.
Гликозилирование
[00183] Другой тип ковалентной модификации антител, входящий в объем данного изобретения, включает изменение профиля гликозилирования белка. Как известно в данной области техники, профили гликозилирования могут зависеть как от последовательности белка (например, присутствия или отсутствия конкретных аминокислотных остатков гликозилирования, обсуждаемых ниже), так и от клетки-хозяина или организма-хозяина, в которых вырабатывается белок. Конкретные системы экспрессии рассматриваются ниже.
[00184] Гликозилирование полипептидов, как правило, бывает N-связанным или О-связанным. N-связанное гликозилирование относится к присоединению углеводного компонента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-Х-серин и аспарагин-Х-треонин, где X является любой аминокислотой за исключением пролина, представляют последовательности распознавания для ферментативного присоединения углеводного компонента к боковой цепи аспарагина. Следовательно, присутствие любой из этих трипептидных последовательностей создает потенциальный участок гликозилирования. О-связанное гликозилирование относится к присоединению одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, наиболее часто серину или треонину, хотя также можно использовать 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин.
[00185] Добавление участков гликозилирования к раскрытому антителу удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности так, чтобы она содержала одну или более из вышеописанных трипептидных последовательностей (для N-связанных участков гликозилирования). Изменение также можно проводить путем добавления или замещения на один или более остатков серина или треонина в исходной последовательности (для О-связанных участков гликозилирования). Для простоты аминокислотная последовательность антитела изменяется за счет изменений на уровне ДНК, в частности, путем мутацин ДНК, кодирующей целевой полипептид, в предварительно выбранных основаниях, таким образом, что образуются кодоны, которые будут транслированы в желаемые аминокислоты.
[00186] Другим способом повышения числа углеводных компонентов в антителе является химическое или ферментативное сопряжение гликозидов с белком. Эти процедуры являются преимущественными, так как они не требуют выработки белка в клетке-хозяине, которая обладает способностью осуществлять N- или О-связанное гликозилирование. В зависимости от используемого способа соединения, сахар(а) может быть присоединен к (а) аргинину и гистидииу, (б) свободным карбоксильным группам, (в) свободным сульфгидрильным группам, таким как сульфгидрильные группы цистеина, (г) свободным гидроксильным группам, таким как гидроксильные группы серина, треонина или гидроксипролина, (д) ароматическим остаткам, таким как ароматические остатки фенилаланина, тирозина или триптофана или (е) амидной группе глутамина. Эти способы описаны в WO 87/05330, опубликованый 11 сентября, 1987 года, и в Aplin и Wriston, 1981 год, CRC Crit. Rev. Biochem., стр. 259-306.
[00187] Удаление углеводных остатков, присутствующих на исходном антителе, может быть осуществлено химически или ферментативно. Для химического дегликозилирования необходимо подвергнуть белок действию соединения трифторметансульфоновой кислоты или эквивалентного соединения. Эта обработка приводит к расщеплению большинства или всех Сахаров, кроме связующего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-ацетилгалактозамина), при этом полипептид остается интактным. Химическое дегликозилирование описано в Hakimuddin et al., 1987 год, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 и в Edge et al., 1981 год, Anal. Biochem. 118:131. Ферментативное расщепление углеводных остатков на полипептидах может быть достигнуто за счет использования ряда эндо- и экзогликозидаз, как описано в Thotakura соавт., 1987 год, Melh. Enzymol. 138:350. Гликозилирование потенциальных сайтов гликозилирования можно предотвратить путем использования соединения туникамицина, как описано в Duskin et al., 1982 год, J. Biol. Chem. 257:3105. Туникамицин блокирует образование белок-N-гликозидных связей.
ПЭГилированние
[00188] Другой тип ковалентной модификации антитела включает присоединение к антителу различных небелковых полимеров, включая, но не ограничиваясь ими, различные полиолы, такие как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, или полиоксиалкилены, способом, приведенным в патентах США №4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 или 4,179,337. Кроме того, как известно в данной области техники, аминокислотные замены могут быть сделаны в различных положениях в пределах антитела, чтобы способствовать добавлению полимеров, таких как ПЭГ.
[00189] Метки
[00190] В некоторых вариантах реализации изобретения ковалентная модификация антител согласно изобретению включает добавление одной или более меток.
3
14
15
35
90
99
111
125
131
[00191] Термин "метящая группа" означает любую детектируемую метку. Примеры подходящих метящих групп включают в себя, но не ограничиваются ими, следующие: радиоизотопы и радионуклиды (например, Н, С, N, S, Y, Тс, In, I,I), флуоресцентные группы (например, ФИТЦ, родамин, люминофоры на основе комплексов лантанидов), ферментные группы (например, пероксидаза хрена, (3-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные группы, биотинильные группы или предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновых молний, участки связывания вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах реализации изобретения метящая группа сопряжена с антителом посредством спейсерных ножек различной длины для снижения потенциального стерического несоответствия. В данной области техники известны различные способы мечения белков, которые можно применять для осуществления настоящего изобретения.
[00192] В общем случае метки делятся на различные классы в зависимости от метода их выявления: а) изотопные метки, которые могут быть представлены радиоактивными или тяжелыми изотопами; б) магнитные метки (например, магнитные частицы); в) редокс-активные компоненты; г) оптические красители; ферментные группы (например, пероксидаза хрена, β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза); д) биотинилированные группы; и f) предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновых молний, участки связывания вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки и т.д.). В некоторых вариантах реализации изобретения метящая группа сопряжена с антителом посредством спейсерных ножек различной длины для снижения потенциального стерического несоответствия. В данной области техники известны различные способы мечения белков, которые можно применять для осуществления настоящего изобретения.
[00193] Конкретные метки включают оптические красители, включая, но не ограничиваясь ими, хромофоры, люминофоры и флуорофоры, при этом последние в различных случаях являются специфическими. Флуорофоры могут быть как «низкомолекулярными» флуорофорами, так и белковыми флуорофорами.
[00194] Флуоресцентная метка может представлять собой любую молекулу, которую можно выявить вследствие присущих ей флуоресцентных свойств. Подходящие флуоресцентные метки включают, но не ограничиваются ими, флуоресцеин, родамин, тетраметилродамин, эозин, эритрозин, кумарин, метилкумарины, пирен, малахитовый зеленый, стильбен, желтый люцифер, каскад голубой J, техасский красный, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Су 5, Су 5.5, LC Red 705, зеленый Орегон, красители Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), каскад голубой, каскад желтый и R-фикоэритрин (ФЭ) (Молекулар Пробс, Юджин, штат Орегон), ФИТЦ, родамин и техасский красный (Пирс, Рокфорд, штат Иллинойс), Су5, Су5.5, Су7 (Амершам Лайф Сайнс, Питсбург, штат Пенсильвания). Подходящие оптические красители, включая флуорофоры, описаны в Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland, в явной форме включенной в данный документ посредством ссылки.
[00195] Подходящие белковые флуоресцентные метки также включают, но не ограничиваются ими, зеленый флуоресцентный белок, включая виды ЗФБ Renilla, Ptilosarcus или Aequorea (Chalfie et al., 1994 год, Science 263:802-805), УЗФБ (Клонотек Лабораториз, корпор., Genbank Accession Number U55762), голубой флуоресцентный белок (ГФБ, Квантум Биотекнолоджис, корпор. Бульвар Мазонева 1801 западный, 8 этаж, Монреаль, провинция Квебек, Канада НЗН 1J9; Stauber, 1998 год, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996 год, Curr. Biol. 6:178-182), усиленный желтый флуоресцентный белок (УЖФБ, Клонтек Лабораториз, корпор.), люциферазу (Ichiki et al., 1993 год, J. Immunol. 150:5408-5417), бета-галактозидазу (Nolan et al., 1988 год, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) и Renilla (WO 92/15673, WO 95/07463, WO 98/14605, WO 98/26277, WO 99/49019, патенты США №5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558). Все документы, процитированные в данном документе, в явной форме включены посредством ссылки.
Полинуклеотиды. кодирующие антитела к С5
[00196] В определенных аспектах в изобретении предложены молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие описанные в данном документе антитела. В некоторых случаях раскрытые нуклеиновые кислоты кодируют антитела, вариабельные области или CDR, описанные в данном документе. Нуклеиновые кислоты включают молекулы как ДНК, так и РНК. Нуклеиновые кислоты могут быть природными, неприродными нуклеиновыми кислотами, аналогами нуклеиновых кислот или синтетическими нуклеиновыми кислотами. Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, как правило, являются полинуклеиновыми кислотами; что означает полимеры из отдельных нуклеотидов, которые ковалентно соединены посредством фосфодиэфирных связей. В различных случаях полинуклеотидные последовательности могут быть одноцепочечными, двухцепочечными или комбинированными. Нуклеотидные последовательности могут дополнительно содержать другие, отличные от нуклеиновых кислот молекулы, такие как аминокислоты и другие мономеры.
[00197] Во многих вариантах реализации изобретения кодирующая последовательность может представлять собой выделенную молекулу нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты выявлена и отделена по меньшей мере от одного компонента, с которым она обычно связана в естественном источнике. В некоторых случаях этот компонент может быть нуклеотидной последовательностью, белком или небелковой молекулой. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело к С5, отличается от той формы, в которой она находится в природе. Следовательно, выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела к С5, отличаются от кодирующей(их) молекул(ы) нуклеиновых кислот, присутствующих в природных клетках. При этом, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело к С5, включает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела к С5, содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют антитело к С5, где, например, молекула нуклеиновой кислоты находится в хромосомной локацин, отличной от локацин в природных клетках. Следовательно, выделенные молекулы нуклеиновых кислот отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, присутствующей в организме. При этом в некоторых случаях выделенная молекула нуклеиновой кислоты может быть нуклеиновой кислотой, содержащейся в клетке, например, если выделенную молекулу нуклеиновой кислоты внесли в клетку, и она находится во внехромосомной локации или в хромосомной локации, отличной от ее нативной локацин.
[00198] В зависимости от применения нуклеиновая кислота может быть двухцепочечной, одноцепочечной или содержать части как двухцепочечной, так и одпоцепочечной последовательности. Как будет понятно специалистам в данной области техники, описание одной цепи (иногда называемой цепью "Уотсон") также определяет последовательность другой цепи (иногда называемом цепью "Крика"). Рекомбинантная нуклеиновая кислота может быть аминокислотой, изначально образуемой in vitro, в общем случае путем обработки нуклеиновой кислоты эндонуклеазами в форме, которая обычно не встречается в природе. Таким образом, выделенное антитело может кодироваться нуклеиновой кислотой в линейной форме или экспрессионным вектором, образуемым in vitro путем лигирования молекул ДНК, которые обычно не соединены, и в обоих случаях считается рекомбинантным в целях данного изобретения. Понятно, что если рекомбинантная нуклеиновая кислота со всеми необходимыми регуляторными элементами получена и внесена в клетку-хозяина или организм, она может реплицироваться нерекомбинантно, т.е. при помощи in vivo клеточного аппарата клетки-хозяина, а не in vitro манипуляций; при этом такие нуклеиновые кислоты после рекомбинантного получения, хотя впоследствии и реплицируются нерекомбинантно, все равно считаются рекомбинантными в целях данного изобретения.
[00199] В некоторых вариантах реализации изобретения рекомбинантная нуклеиновая кислота может содержать один или более регуляторных элементов или регуляторных последовательностей. Регуляторные элементы и регуляторные последовательности относятся к нуклеотидным последовательностям, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Регуляторные последовательности, которые подходят для прокариот, например, включают промотор, не обязательно последовательность оператора и сайт связывания рибосомы. Известно, что в эукариотических клетках используются промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры. В данном контексте функционально связанной последовательностью является нуклеотидная последовательность, находящаяся в функциональной взаимосвязи с другой нуклеотидной последовательностью. Например, кодирующие иуклеотидные последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными нуклеотидными последовательностями. Например, ДНК для предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности может быть функционально связана с ДНК для полипептида, если он экспрсссируется в виде белка-предшественника, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, чтобы облегчить трансляцию. В большинстве вариантов реализации изобретения функционально связанная последовательность представляет собой последовательность ДНК, ковалентно связанную, например, с секреторной лидерной последовательностью. Тем не менее, как описано выше, некоторые регуляторные последовательности могут проявлять активность в виде последовательности РНК. Во многих вариантах реализации изобретения нет необходимости, чтобы энхансерные последовательности были смежными с кодирующей последовательностью, наоборот, две последовательности могут быть разделены одной или более нуклеиновыми кислотами.
[00200] В различных случаях нуклеиновые кислоты описанных нуклеотидных последовательностей могут содержать нуклеотиды, которые метаболизируются сходным образом с нуклеотидами естественного происхождения. Также включены подобные нуклеиновым кислотам структуры с синтетическими аналогами остова, включая, без ограничений, фосфодиэфирные, тиофосфатные, дитиофосфатные, метилфосфонатные, фосфорамидатные, алкил фосфодиэфирные, сульфаматные, 3'-тиоацетальные, метилен(метилимино), 3'-N-карбаматные, морфолино карбаматные и пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) (смотрите, например: "Oligonucleotides and Analogues, а Practical Approach," под редакцией F. Eckstein, IRL Press at Oxford University Press (1991 год); "Antisense Strategies," Annals of the New York Academy of Sciences, Volume 600, изд. Bascrga and Denhardt (NYAS 1992 год); Milligan (1993 год) J. Med. Chem. 36:1923-1937; and "Antisense Research and Applications" (1993 год, CRC Press)). ПНК содержат неионные скелеты, такие как N-(2-аминоэтил) глициновые единицы. Тиофосфатные связи описаны в: WO 97/03211; WO 96/39154; и Mata (1997 год) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197. Другие синтетические остовы, подпадающие под этот термин, включают метилфосфонатные связи или чередующиеся метилфосфонатные и фосфодиэфирные связи (Strauss-Soukup (1997 год) Biochemistry 36: 8692-8698) и бензилфосфонатные связи (Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153-156).
[00201] Как понятно специалистам в данной области техники, вследствие вырожденности генетического кода можно получить намного большее число нуклеиновых кислот, которые кодируют CDR (а также тяжелые и легкие цепи или другие компоненты антитела) согласно настоящему описанию. Таким образом, после определения конкретной аминокислотной последовательности специалисты в данной области техники могут получить любое количество разных нуклеиновых кислот, просто модифицируя последовательность одного или более кодонов так, чтобы не изменять аминокислотную последовательность кодируемого белка.
[00202] В различных случаях включены нуклеотидные последовательности, кодирующие нолипептидные последовательности из SEQ ID NOS:1-48. Эти кодирующие нуклеотидные последовательности могут транслироваться в полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную раскрытой полипептидной последовательности. Во многих случаях нуклеотиды, кодирующие идентичные полипептиды, могут не иметь идентичные нуклеотидные последовательности. Раскрытые кодирующие последовательности могут дополнительно содержать нетранслируемые последовательности, например, последовательности полиаденилирования. Кодирующие последовательности согласно изобретению также могут содержать интрон или промежуточную нетранслируемую последовательность, которые вырезаются из транскрибируемой мРНК перед трансляцией. В различных случаях транскрибируемая мРНК может быть копирована концевым 7-метилгуанозином. В некоторых вариантах реализации изобретения кодирующие последовательности включают кодирующие последовательности аминокислот, которые не присутствуют в конечном антителе, например, последовательности, необходимые для экспортирования антитела. [00203] Выравнивание кодирующих нуклеотидных последовательностей можно проводить с помощью BLASTn, как описано выше. В различных случаях гомология (или идентичность в BLASTn) этих выровненных нуклеотидных последовательностей может составлять больше чем около 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% и/или меньше чем около 100%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50% или 45%. В различных случаях выровненные гомологичные последовательности могут составлять меньше чем около 700 нуклеотидов, 600 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 400 нуклеотидов, 300 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 90 нуклеотидов, 80 нуклеотидов, 70 нуклеотидов, 60 нуклеотидов, 50 нуклеотидов или 40 нуклеотидов и/или больше чем около 50 нуклеотидов, 60 нуклеотидов, 70 нуклеотидов, 80 нуклеотидов, 90 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 200 нуклеотидов, 300 нуклеотидов, 400 нуклеотидов, 500 нуклеотидов или 600 нуклеотидов.
[00204] В различных случаях кодирующая последовательность управляет транскрипцией рибонуклеотидной последовательности, которая может быть транслирована в аминокислотную последовательность в соответствии со стандартным генетическим кодом. В различных случаях код может включать вариации канонического кода. В некоторых вариациях кодирующая последовательностью может содержать интроны или промежуточные последовательности, которые не кодируют аминокислоты, но могут быть транскрибированы и впоследствии удалены перед трансляцией рибонуклеиновой кислоты в полипептид.
Способы получения антител
[00205] Также в настоящем изобретении предложены системы экспрессии и конструкции в форме плазмид, экспрессионных векторов, транскрипционных или экспрессионных кассет, которые содержат по меньшей мере один из вышеуказанных полинуклеотидов. Кроме того, в изобретении предложены клетки-хозяева, содержащие такие системы экспрессии или конструкции.
[00206] Как правило, экспрессионные векторы, применяемые в любых клетках-хозяевах, содержат последовательности для поддержания плазмид и для клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности, обобщенно называемые фланкирующими последовательностями, в некоторых вариантах реализации изобретения, как правило, содержат одну или более из следующих нуклеотидных последовательностей: промотор, одну или более энхансерных последовательностей, точку начала репликации, последовательность терминации транскрипции, полную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный участки сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную последовательность для секреции полипептида, участок связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, полилинкерную область для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей предназначенный для экспрессии полипептид, и элемент селективного маркера. Каждая из этих последовательностей рассматривается ниже.
[00207] В некоторых случаях вектор может содержать последовательность, кодирующую «метку», т.е. молекулу олигонуклеотида, расположенную в 5' или 3' конце кодирующей последовательности антитела к С5; олигонуклеотидная последовательность может кодировать метку полиHis (такую как гексаHis) или другую «метку», такую как FLAG, НА (гемагглютинин вируса гриппа) или mус для которых существуют коммерчески доступные антитела. Такая метка обычно сливается с полипептидом после экспрессии полипептида может служить в качестве средства для аффинной очистки или выявления антитела к С5в клетке-хозяине. Аффинную очистку можно проводить, например, при помощи колоночной хроматографии, используя антитела к метки в качестве аффинной матрицы. В некоторых случаях метку можно впоследствии удалять из очищенного антитела к С5 разными способами, такими как использование определенных пептидаз для расщепления.
[00208] Фланкирующие последовательности могут быть гомологичными (т.е.принадлежать тому же виду и/или штамму, что и клетка-хозяин), гетерологичными (т.е. принадлежать виду, отличному от вида или штамма клетки-хозяина), гибридными (т.е. комбинация фланкирующих последовательностей из более чем одного источника), синтетическими или нативными. Следовательно, источником фланкирующей последовательности может быть любой прокариотический или эукариотический организм, любой позвоночный или беспозвоночный организм или любое растение, при условии, что фланкирующая последовательность является функциональной и может быть активирована аппаратом клетки-хозяина.
[00209] Фланкирующие последовательности, применяемые в векторах согласно данному изобретению, можно получить любым из нескольких способов, хорошо известных в данной области техники. Как правило, фланкирующие последовательности, применяемые в данном документе, были предварительно идентифицированы при помощи картирования и/или расщепления рестрикциоными эндонуклеазами и, следовательно, могут быть выделены из соответствующего тканевого источника, используя подходящие рестрикционные эндонуклеазы. В некоторых случаях может быть известна полная нуклеотидная последовательность фланкирующей последовательности. В данном случае фланкирующая последовательность может быть синтезирована при помощи описанных в данном документе способов для синтеза и клонирования нуклеиновых кислот.

[00210] Вне зависимости от того, известна вся или только часть фланкирующей последовательности, ее можно получить при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или при скрининга геномной библиотека с подходящим зондом, таким как олигонуклеотид и/или фрагмент фланкирующей последовательности от того же или другого вида. Если фланкирующая последовательность неизвестна, фрагмент ДНК, содержащий фланкирующую последовательность, можно выделить из более крупного участка ДНК, который может содержать, например, кодирующую последовательность и даже другой ген или гены. Выделение можно проводить путем расщепления рестрикциоными эндонуклеазами для получения надлежащего фрагмента ДНК с последующим выделением при помощи очистки в агарозном геле, колоночной хроматографии Qiagen (Чатсворт, штат Калифорния) или других способов, известных специалисту в данной области техники. Выбор подходящих ферментов для осуществления э той цели очевиден для среднего специалиста в данной области техники.
[00211] Точка начала репликации, как правило, является частью приобретенных на коммерческой основе прокариотических экспрессионных векторов и способствует амплификации вектора в клетке-хозяине. Если выбранный вектор не содержит точку начала репликации, ее можно химически синтезировать на основании известной последовательности и лигировать в вектор. Например, точка начала репликации из плазмиды pBR322 (Нью Ингланд Биолабс, Беверли, штат Массачусетс) подходит для большинства грамотрицательных бактерий, а различные вирусные источники (например, SV40, полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (ВВС) или папилломавирусов, таких как ВПЧ или ВПКРС) подходят для клонирования векторов в клетках млекопитающих. В целом, компонент точки начала репликации необязателен в экспрессионных векторах млекопитающих (например, точку SV40 часто используют только потому, что она также содержит ранний вирусный промотор).
[00212] Последовательность терминацин транскрипции как правило расположена в 3'-направлении относительно конца кодирующей полипептид области и служит для терминации транскрипции. Обычно последовательность терминации транскрипции в прокариотических клетках представляет собой G-C-богатый фрагмент, за которым следует последовательность поли-Т. Хотя последовательность легко клонировать из библиотеки или даже приобрести на коммерческом основании в качестве части вектора, ее также нетрудно синтезировать, используя способы для синтеза нуклеиновых кислот, такие как описанные в данном документе.
[00213] Ген селективного маркера кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина в селективной культуральной среде. Типичные гены селективных маркеров кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, тетрациклину или канамицину в случае прокариотических клеток-хозяев; (б) восполняют ауксотрофный дефицит в клетке; или (в) обеспечивают необходимые питательные вещества, недоступные из комплексной или определенной среды. Конкретными селективными маркерами являются ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину. Предпочтительно можно также использовать ген устойчивости к неомицину для селекции как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах.
[00214] Для амплификации гена, предназначенного для экспрессии, можно использовать другие селективные гены. Амплификацией называется процесс, в котором гены, необходимые для выработки белка, критического для роста или выживания клетки, повторяются в тандеме в хромосомах последовательных генераций рекомбинантных клеток. Примеры подходящих селективных маркеров для клеток млекопитающих включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) и беспромоторный ген тимидинкиназы. Трансформацин клеток млекопитающих помещаются в условия селекционного давления, в которых только трансформанты однозначно способны к выживанию благодаря селективному гену, присутствующему в векторе. Селекционное давление создается путем культивирования трансформированных клеток в условиях, в которых последовательно увеличивается концентрация селекционного агента в среде, что приводит к амплификации как селективного гена, так и ДНК, которая кодирует другой ген, такой как ген антитела, которое связывается с полипептидом С5 или эпитопом С5. В результате из амплифицированной ДНК синтезируется повышенное количество полипептида, такого как антитело к С5.
[00215] Участок связывания рибосомы обычно необходим для инициации трансляции мРНК и характеризуется наличием последовательности Шайна-Дальгарно (прокариоты) или последовательности Козака (эукариоты). Как правило, этот элемент расположен в 3' направлении относительно промотора и в 5' направлении относительно кодирующей последовательности предназначенного для экспрессии полипептида.
[00216] В некоторых случаях, например, когда в системе экспрессии эукариотической клетки-хозяина необходимо гликозилирование, можно манипулировать с разными пре- или пропоследовательностями для улучшения состояния гликозилирования или выхода. Например, можно изменять участок расщепления пептидазами конкретного сигнального пептида или добавлять пропоследовательности, которые также могут влиять на гликозилирование. Конечный белковый продукт может содержать в позиции -1 (по отношению к первой аминокислоте зрелого белка) одну или более дополнительных аминокислот, связанных с экспрессией, которые могли быть не полностью удалены. Например, конечный белковый продукт может содержать один или более аминокислотных остатков, находящихся в сайте расщепления пептидазами, присоединенных к амино-концу. В альтернативном варианте применение некоторых сайтов расщепления может приводить к слегка укороченной форме необходимого полипептида, если фермент делает надрез в такой области зрелого полипептида.
[00217] Экспрессионные и клонирующие векторы согласно изобретению, как правило, содержат промотор, который распознается организмом-хозяином и функционально связан с молекулой, кодирующей антитело к С5. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, расположенные выше (т.е. 5') стартового кодона структурного гена (в целом, в пределах от около 100 до 1000 и.о.), которые регулируют транскрипцию структурного гена. Традиционно промоторы подразделяют на два класса: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции из ДНК, находящейся под их управлением, в ответ на некоторые изменения в культуральных условиях, такие как присутствие или отсутствие питательных веществ или изменение температуры. С другой стороны конститутивные промоторы равномерно транскрибируют ген, с которым они функционально связаны, что означает слабую или отсутствующую регуляцию генной экспрессии. Хорошо известно большое число промоторов, распознаваемых различными потенциальными клетками-хозяевами. Подходящий промотор функционально связывается с ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, содержащую антитело к С5 согласно изобретению, при помощи удаления промотора из источника ДНК путем расщепления рестрикционными ферментами и вставки необходимой промоторной последовательности в вектор,
[00218] В некоторых вариантах реализации изобретения для получения раскрытых в данном документе антител к С5 можно использовать дрожжевые клетки. Также в данной области техники хорошо известны промоторы, подходящие для применения с дрожжевыми хозяевами. Дрожжевые энхансеры предпочтительно используют с дрожжевыми промоторами. Подходящие промоторы для применения с клетками-хозяевами млекопитающих хорошо известны и включают, но не ограничиваются ими, полученные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (такой как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирусы, вирус гепатита В и или вирус обезьян 40 (SV40). Другие подходящие промоторы млекопитающих включают гетерологичные промоторы млекопитающих, например, промоторы теплового шока и промотор актина.
[00219] Дополнительные промоторы, которые могут представлять интерес, включают, но не ограничиваются этим: ранний промотор SV40 (Benoist и Chambon, 1981 год, Nature 290:304-310); промотор ЦМВ (Thornsen et al., 1984 год, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); промотор, содержащийся в 3' длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto el al., 1980 год, Cell 22:787-797); промотор тимидинкиназы герпеса (Wagner et al., 1981 год, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); промотор и регуляторные последовательности из гена металлотионина (Prinster et al., 1982 год, Nature 296:39-42); и прокариотические промоторы, такие как промотор бета-лактамазы (Villa-Kamaroff et al., 1978 год, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); или промотор tac (DeBoer et al., 1983 год, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). Также представляют интерес следующие транскрипционные регуляторные области животных, которые демонстрируют тканевую специфичность и применялись в трансгенных животных: регуляторная область гена эластазы I, активная в панкреатических ацинарных клетках (Swift et al., 1984 год, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986 год, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987 год, Hepalology 7:425-515); регуляторная область гена инсулина, активная в панкреатических бета-клетках (Hanahan, 1985 год, Nature 315:115-122): регуляторная область гена иммуноглобулина, активная в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., 1984 год, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985 год, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987 год, Mol. Cell. Biol. 2:1436-1444); регуляторная область вируса опухоли молочной железы мышей, активная в клетках яичек, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al., 1986 год, Cell 45:485-495); регуляторная область гена альбумина, активная в печени (Pinkert et al,, 1987 год, Genes и Devel. 1:268-276); регуляторная область гена альфа-фетопротеина, активная в печени (Krumlauf et al., 1985 год, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987 год, Science 253:53-58); регуляторная область гена альфа-1-антитрипсина, активная в печени (Kelsey et al., 1987 год, Genes и Devel. 1:161-171); регуляторная область гена бета-глобина, активная в миелоидных клетках (Mogram et al., 1985 год, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986 год, Cell 46:89-94); регуляторная область гена основного белка миелина, активная в клетках олигодендроцитов головного мозга (Readhead et al., 1987 год, Cell 48:703-712); регуляторная область гена легкой цепи-2 миозина, активная в скелетных мышцах (Sani, 1985 год, Nature 314:283-286): и регуляторная область гена гонадотропного рилизинг-гормона, активная в гипоталамусе (Mason et al., 1986 год, Science 234:1372-1378).
[00220] Энхаисерную последовательность можно вставлять в вектор для повышения транскрипции ДНК, кодирующей легкую цепь или тяжелую цепь, содержащую антитело к С5 согласно изобретению, высшими эукариотами. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, длиной обычно около 10-300 п. о., которые воздействуют на промотор для повышения транскрипции. Энхансеры являются относительно ориентациошю и позиционно независимыми и могут находиться в позициях как 5', так и 3' к транскрипционной единице. Известно несколько энхансерных последовательностей, доступных из генов млекопитающих (например, глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). При этом, как правило, используют энхансеры из вирусов. Известные в данной области техники энхансер SV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер полиомы и энхансер аденовируса представляют собой типовые энхансерные элементы для активации эукариотических промоторов. Хотя энхансер может находиться в векторе как 5', так и 3' к кодирующей последовательности, как правило, он расположен 5' от промотора. Для стимуляции внеклеточной секреции антитела в экспрессионный вектор может быть включена последовательность, кодирующая соответствующую нативную или гетерологичную последовательность (лидерную последовательность или сигнальный пептид). Выбор сигнального пептида или лидерной последовательности зависит от типа клеток-хозяев, в которых должно вырабатываться антитело, а гетерологичная сигнальная последовательность может заменить нативную сигнальную последовательность. Примеры сигнальных пептидов, которые функциональны в клетках-хозяевах млекопитающих, включают следующие: сигнальную последовательность интерлейкина-7 (IL-7), описанную в патенте США №4965195; сигнальную последовательность рецептора интерлейкина-2, описанную в Cosman et al., 1984 год, Nature 312:768; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-4, описанный в патенте ЕР №0367 566; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-1 типа I, описанный в патенте США №4968607; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-1 типа II, описанный в патенте ЕР №0460846,
[00221] Экспрессионные векторы для экспрессии заявляемых антител согласно изобретению можно сконструировать из исходного вектора, такого как коммерчески доступный вектор. Такие векторы могут содержать или не содержать все необходимые фланкирующие последовательности. Если одна или более из описанных в данном документе фланкирующих последовательностей изначально не присутствует в векторе, их можно получить отдельно и лигировать в вектор. Способы, применяемые для получения каждой из фланкирующих последовательностей, хорошо известны специалисту в данной области техники.
[00222] После того, как вектор был сконструирован, а молекула нуклеиновой кисло ты, кодирующая легкую цепь, тяжелую цепь или легкую цепь и тяжелую цепь, составляющие кодирующую последовательность антитела к С5, были вставлены в соответствующий участок вектора, полный вектор можно вносить в подходящую клетку-хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Трансформацию экспрессионного вектора для антитела к С5 в выбранную клетку-хозяина можно осуществлять хорошо известными способами, включая трансфекцию, инфицирование, совместное осаждение фосфатом кальция, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию или другие известные методы. Выбранный способ частично будет зависеть от применяемого типа клетки-хозяина. Эти способы и другие подходящие способы хорошо известны специалисту в данной области техники и приведены, например, в Sambrook et al., 2001 год, см. выше.
[00223] При культивировании в соответствующих условиях клетка-хозяйн синтезирует антитело к С5, которое впоследствии можно собрать из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует в среду) или непосредственно из вырабатывающей его клетки-хозяина (если не секретирует). Выбор подходящей клетки-хозяина будет зависеть от различных факторов, таких как необходимые уровни экспрессии, полипептидные модификации, желательные или необходимые для активности (такие как гликозилирование или фосфорилирование) и легкость сворачивания в биологически активную молекулу. Клетка-хозяин может быть эукариотической или прокариотической.
[00224] Доступные в качестве хозяев клеточные линии млекопитающих хорошо известны в данной области техники и включают, но не ограничиваются ими, иммортализованные линии клеток, доступные от Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но не ограничиваясь ими, клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки HeLa, клетки почки новорожденного хомяка (ВНК), клетки почки обезьяны (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2) и большое количество других клеточных линий. В определенных вариантах реализации изобретения клеточные линии можно выбирать, определяя, какие клеточные линии имеют высокие уровни экспрессии и конститутивно вырабатывают антитела со свойством связывания С5. В другом варианте реализации изобретения может быть выбрана клеточная линия из линии В-клеток, которая не вырабатывает свое антитело, но обладает способностью вырабатывать и секретировать гетерологичное антитело.
Применение антител к С5 в диагностических и терапевтических целях
[00225] Антитела согласно изобретению применимы для выявления С5 и/или C5b в биологических образцах и определения клеток или тканей, которые вырабатывают белок С5. В некоторых вариантах реализации изобретения антитела к С5 согласно изобретению можно применять в диагностических методах анализа, например, анализе связывания для выявления и/или количественной оценки С5, экспрессируемого в ткани или клетке или C5b в сыворотке или ткани, или на клетке.
[00226] В некоторых вариантах реализации изобретения антитела согласно изобретению, которые специфически связываются с С5, можно применять в лечение заболеваний, связанных с системой комплемента или С5 у пациента, имеющего для этого показания. Кроме того, антитело к С5 согласно изобретению можно применять для ингибирования формирования С5 комплекса с другими белками комплемента, тем самым модулируя биологическую активность С5 в клетке или ткани. Антитела, которые связываются с С5, могут таким образом модулировать и/или блокировать взаимодействие с другими связывающими соединениями и, следовательно, могут иметь терапевтическое применение в облегчении опосредованных комплементом и С5 заболеваний.
[00227] В некоторых вариантах реализации изобретения связывание С5 антителами к С5 может приводить к нарушению индуцированного С5 каскада комплемента.
Диагностические способы
[00228] Антитела согласно изобретению можно применять в диагностических целях для выявления, диагностирования или мониторинга заболеваний и/или патологических состояний, связанных с комплементом или С5. В изобретении предложено выявление наличия С5 в образце при помощи классических иммунопатологических способов, известных специалистам в данной области техники (например, Tijssen, 1993 год, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, vol 15 (Eds R.H. Burdon и P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, 1987 год, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, стр. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985 год, J. Cell. Biol. 101:976-985; Jalkanen и соавт., 1987 год, J. Cell Biol. 105:3087-3096). Выявление C5 можно проводить in vivo or in vitro.
[00229] Предложенные в данном документе диагностические применения включают применение антител для выявления экспрессии С5. Примеры способов, применяемых для определения наличия С5, включают методы иммуноанализа, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и радиоиммуноанализ (РИА).
3
14
15
35
90
99
111
125
13I
[00230] Для диагностических применений антитело, как правило, может быть помечено выявляемой метящей группой. Подходящие метящие группы включают, но не ограничиваются ими, следующие: радиоизотопы и радионуклиды (например, Н, С, N, S, Y, Тс, In, I, I), флуоресцентные группы (например, ФИТЦ, родамин, люминофоры на основе комплексов лантанидов), ферментные группы (например, пероксидаза хрена, (3-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные группы, биотинильные группы или предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновых молний, участки связывания вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах реализации изобретения метящая группа сопряжена с антителом посредством спейсерных ножек различной длины для снижения потенциального стерического несоответствия. В данной области техники известны различные способы мечения белков, которые можно применять для осуществления настоящего изобретения.
[00231] В одном аспекте изобретения предложен способ определения клетки или клеток, которые экспрессируют С5. В конкретном варианте реализации изобретения антитело метят метящей группой и определяют связывания меченого антитела с С5. В другом конкретном варианте реализации изобретения связывание антитела с С5 можно определять in vivo. В другом конкретном варианте реализации изобретения выделяют комплекс антитело/С5 и проводят измерения при помощи известных в данной области техники методов. См., например, Harlow и Lane, 1988 год, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (изд. 1991 год и периодические дополнения); John Е. Coligan, изд., 1993 год, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons.
[00232] В другом аспекте изобретения предложен способ определения присутствия тестовой молекулы, которая конкурирует с антителами к С5 согласно изобретению за связывание с С5. Пример такого анализа включает определение количества свободного антитела в растворе, содержащем некоторое количество С5, в присутствии или отсутствии тестовой молекулы. Повышение количества свободного антитела (т.е. антитела, не связанного с С5) указывает на то, что тестовая молекула способна конкурировать с антителом к С5 за связывание с С5. В одном варианте реализации изобретения антитело мстят метящей группой. В альтернативном варианте метят тестовую молекулу и отслеживают количество свободной тестовой молекулы в присутствии или отсутствии антитела.
Показания
[00233] Система комплемента вовлечена в развитие нескольких острых и хронических заболеваний, включая атеросклероз, ишемически-реперфузионное повреждение при остром инфаркте миокарда, болезнь Шенлейн-Геноха, геморрагический васкулит, ревматоидный артрит, артериит, аневризму, инсульт, кардиомиопатию, геморрагический шок, размозжение, полиорганную недостаточность, гиповолемический шок и кишечную ишемию, отторжение трансплантата, кардиохирургию, ЧТКА (чрескожная транслюминальная коронарная ангиопластика), самопроизвольный аборт, нейроповреждение, повреждение спинного мозга, миастения гравис, болезнь Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, рассеянный склероз, синдром Гийена-Барре, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, синдром острой дыхательной недостаточности, астму, хроническую обструктивную болезнь легких, синдром острого посттрансфузионного повреждения легких, острое повреждение легких, болезнь Гуднасчера, инфаркт миокарда, воспаление после сердечно-легочного шунтирования, сердечно-легочное шунтирование, септический шок, отторжение трансплантата, ксенотрансплантация, ожоговую травму, системную красную волчанку, мембранозный гломерулонефрит, церебральную малярию, болезнь Бергера, псориаз, пузырчатку, дерматомиозит, антифосфолипидный синдром, воспалительное заболевание кишечника, гемодиализ, лейкоферез, плазмаферез, индуцированную гепарином экстракорпоральную мембранную оксигенацию преципитацию ЛПНП (липопротеин низкой плотности), экстракорпоральную мембранную оксигенацию лейкоферез, плазмаферез, индуцированную гепарином экстракорпоральную мембранную оксигенацию преципитацию ЛПНП, экстракорпоральную мембранную оксигенацию и дегенерацию желтого пятна.
[00234] Дегенеративные заболевания желтого пятна, такие как все стадии возрастной макулярной дегенерации (ВМД), включая сухую и влажную (неэкссудативную и экссудативную) формы, хориоидальную неоваскуляризацию (ХНВ), увеит, диабетические и другие связанные с ишемией ретинопатии, а также другие внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как диабетическая макулярная эдема, патологическая миопия, болезнь фон Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаза, окклюзия центральной вены сетчатки (ОЦВС), неоваскуляризация роговицы и неоваскуляризация сетчатки. Одна группа комплемент-ассоциированных патологических состояний глаза включает возрастную макулярную дегенерацию (ВМД), включая неэкссудативную (влажную) и экссудативную (сухую или атрофическую) ВМД, хориоидальную неоваскуляризацию (ХНВ), диабетическую ретинопатию (ДР) и эндофтальмит.
[00235] Раскрытые в настоящем изобретении антитела к С5 можно применять в комбинации с одним или более цитокинами, лимфокинами, гемопоэтическими факторами и/или противовоспалительными агентами.
[00236] Лечение перечисленных в данном документе заболеваний и нарушений может включать применение лекарственных препаратов первой линии для контроля боли и воспаления в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с лечением одним или более антителами к С5 из предложенных в данном документе. В некоторых случаях лекарственные препараты классифицируются как нестероидные противовоспалительные препараты (NSAID). Вторичное лечение включает кортикостероиды, медленно действующие противоревматические препараты (SAARD) или препараты, модифицирующие течение заболевания (DM). Информацию по следующим соединениям можно найти в The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Sixteenth Edition, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, N.J. (1992 год) и в Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.
[00237] В конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антитела и любого одного или более NSAID для лечения перечисленных в данном документе заболеваний и нарушений. Противовоспалительное действие NSAID связано, по меньшей мере частично, с ингибированием синтеза простагландина (Goodman и Gilman в "The Pharmacological Basis of Therapeutics," MacMillan 7 издание (1985 год)). NSAID можно разделить на следующие девять групп: (1) производные салициловой кислоты; (2) производные пропионовой кислоты; (3) производные уксусной кислоты; (4) производные фенаминовой кислоты; (5) производные карбоновой кислоты; (6) производные масляной кислоты; (7) оксикамы; (8) пиразолы и (9) пиразолоны.
[00238] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антитела в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более производными салициловой кислоты, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями. Такие производные салициловой кислоты, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли включают: ацетаминосалол, алоксиприн, аспирин, бенорилат, бромосалигенин, кальция ацетилсалицилат, холин магний трисалицилат, магния салицилат, холина салицилат, дифлунизал, этерсалат, феидозал, геитизиновая кислота, гликольсалицилат, имидазолсалицилат, лизинацетилсалицилат, мезаламин, морфолинсалицилат, 1-нафтил салицилат, парсалмид, пареалмид, фенилацетилсалицилат, фенилсалицилат, салацетамид, салициламин, О-уксусную кислоту, салсалат, натрия салицилат и сульфасалазин. Структурно родственные производные салициловой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00239] В дополнительным конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антитела в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более производными пропионовой кислоты, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями. Производные пропионовой кислоты, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли включают: алминопрофен, беноксапрофен, буклоксовую кислоту, капрофен, дексиндопрофен, фенопрофен, флуноксапрофен, флупрофеи, флурбипрофен, фурклопрофен, ибупрофен, ибупрофен-алюмииий, ибунроксам, иидопрофен, кетопрофен, локсопрофен, миропрофен, напроксен, напроксен-натрий, оксапрозин, пикетопрофен, пимепрофен, пирпрофен, пранопрофен, протициповую кислоту, пиридоксипрофен, супрофен, тиапрофеновую кислоту и тиоксапрофен. Структурно родственные производные пропионовой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00240] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антитила в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более производными уксусной кислоты, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями. Производные уксусной кислоты, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли включают: ацеметацин, аклофенак, амфенак, буфексамак, ципметацин, клопирак, делметацин, диклофенак кальция, диклофенак натрия, этодолак, фелбинак, фенклофенак, фенклорак, фенклозовую кислоту, фентиазак, фурофенак, глюкаметацин, ибуфенак, индометацин, изофезолак, изоксепак, лоназолак, метиациновую кислоту, оксаметацин, окспинак, пиметацин, проглуметацин, сулиндак, талметацин, тиарамид, тиопинак, толметии, толметин натрия, зидометацин и зомепирак. Структурно родственные производные уксусной кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00241] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антителав комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более производными фенаминовой кислоты, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями. Производные фенаминовой кислоты, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли включают: энфенаминовую кислоту, этофенамат, флуфенаминовую кислоту, изонексин, меклофенаминовую кислоту, меклофенамат натрия, медофенаминовую кислоту, мефенаминовую кислоту, нифлумовую кислоту, талнифлумат, терофенамат, толфенаминовую кислоту и уфенамат. Структурно родственные производные фенаминовой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00242] В дополнительном конкретном варианте реализации настоящее изобретение от носится к применению антитела в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более производными карбоновой кислоты, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями. Производные карбоновой кислоты, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли, которые можно использовать, включают: клиданак, дифлунизал, флуфенизал, иноридин, кеторолак и тиноридин. Структурно родственные производные карбоновой кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00243] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антитела в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более производными масляной кислоты, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями. Производные масляной кислоты, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли включают: бумадизон, бутибуфен, фенбуфен и ксенбуцин. Структурно родственные производные масляной кислоты, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00244] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антителав комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более оксикамами, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями. Оксикамы, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли включают: дроксикам, эноликам, изоксикам, пироксикам, судоксикам, теноксикам и 4-гидроксил-1,2-бензотиазин-1,1-диоксид-4-(N-фенил)-карбоксамид. Структурно родственные оксикамы, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00245] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антитела в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более пиразолами, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями. Пиразолы, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли, которые можно использовать, включают: дифенамизол и эпиризол. Структурно родственные пиразолы, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00246] В дополнительном конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антител в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более пиразолонами, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями. Пиразолоны, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли, которые можно использовать, включают: апазон, азапропазон, бензпиперилон, фенразон, мофебутазон, моразон, оксифенбутазон, фенилбутазон, пипебузон, пропилфеназон, рамифеназон, суксибузон и тиазолинобутазон. Структурно родственные пиразолоны, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, -также входят в эту группу.
[00247] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антитела в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более из следующих NSAID: ε-ацетамидокапроновая кислота, S-аденозил-метионин, 3-амино-4-гидроксимасляная кислота, амиксетрин, анитразафен, антрафенин, бендазак, бендазак лизинат, бензидамин, бепрозин, бропермол, буколом, буфезолак, ципроквазон, клоксимат, дазидамин, дебоксамет, детомидин, дифенпирамид, дифенпирамид, дифизаламин, дитазол, эморфазон, фанетизол мезилат, фенфлумизол, флоктафенин, флумизол, флунксин, флупроквазон, фопиртолин, фосфозал, гуаймесал, гуайзолон, исониксирн, лефетамин HCl, лефлупомид, лофемизол, лотифазол, лизин клониксинат, месеклазон, никтиндол, нимесулид, орготеин, орпаноксин, оксацепрол, оксападол, паранилин, перисоксал, перисоксал цитрат, пифоксим, пипроксен, пиразолак, пирфенидон, проквазон, проксазол, тиелавин В, тифламизол, тимегадин, толектин, толпадол, триптамид и те, что обозначены кодом компании номер 480156S, АА861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, АР504, AU8001, ВРРС, BW540C, CHINOIN 127, CN100, ЕВ382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-бензоил-1-инданкарбоксиловая кислота), TVX2706, U60257, UR2301 и WY41770. Структурно родственные NSAID, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства с NSAID, также входят в эту группу.
[00248] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению antibody в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более кортикостероидами, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями для лечения перечисленных в данном документе заболеваний и нарушений, включая острые и хронические воспаления, такие как ревматические заболевания, болезнь «трансплантат против хозяина» и множественный склероз. Кортикостероиды, пролекарственные сложные эфиры и их фармацевтически приемлемые соли включают гидрокортизон и соединения, которые являются производными от гидрокортизона, такие как 21-ацетоксипрегненолон, алгестон, амцинонид, беклометазон, бетаметазон, бетаметазона валерат, будесонид, хлоропреднизон, клобетазол, клобетазола пропионат, клобетазон, клобетазон бугират, клокортолон, клопреднол, кортикостерон, кортизон, кортивазол, дефлазакон, дезонид, дезоксимеразон, дексаметазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифлупреднат, эноксолон, флузакорт, флуклоронид, флуметазон, флуметазона пивалат, флуцинолона ацетонид, флунизолид, флуоцинонид, флуороцинолона ацетонид, флуокортина бутил, флуокортолон, флуокортолона гексаноат, дифлукортолона валерат, флуорометолон, флуролона ацетат, флупреднидена ацетат, флупреднизолон, flurandenolide, формокортал, галцинонид, галометазон, галопредона ацетат, гидрокортамат, гидрокортизон, гидрокортизона ацетат, гидро-кортизона бутират, гидрокортизона фосфат, гидрокортизона 21-натрия сукцинат, гидрокортизона тебутат, мазипредон, медризон, мепреднизон, метилпреднизолон, мометазона фуроат, параметазон, предникарбат, преднизолон, преднизолона 21-дедриаминоацетат, предпизолона натрия фосфат, преднизолона сукцинат натрия, преднизолона натрия 21-m-сульфобензоат, преднизолона натрия 21-стеарогликолат, преднизолона тебутат, преднизолона 21-триметилацетат, преднизолон, преднивал, преднилиден, преднилиден 21-диэтиламиноацетат, тиксокортол, триамцинолон, триамцинолона ацетонид, триамцинолона бенетонид и триамцинолона гексацетонид. Структурно родственные кортикостероиды, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00249] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение от носится к применению антитела в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более медленнодействующими противоревматическими препаратами (SAARD) или модифицирующими заболевание противоревматическими препаратами (DMARD), их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями для лечения перечисленных в данном документе заболеваний и нарушений, включая острые и хронические воспаления, такие как ревматические заболевания, болезнь «трансплантат против хозяина» и множественный склероз. SAARD или DMARD, их пролекарственные сложные эфиры или фармацевтически приемлемые соли включают: аллокупреид натрия, ауранофин, ауротиоглюкозу, ауротиоглюканид, азатиоприн, бреквинар натрия, буцилламин, кальций 3-ауротио-2-пропанол-1-сульфонат, хлорамбуцил, хлороквин, клобузарит, купроксолин, циклофосфамид, циклоспорин, дапзон, 15-дезоксиспергуалин, диацереин, глюкозамин, соли золота (например, золотая соль циклоквина, золотая соль тиомалата, золотая соль тиосульфата), гидроксихлороквин, гидроксихлороквин сульфат, гидроксимочевина, кебузон, левамизол, лобензарит, меллитин, 6-меркаптопурин, метотрексат, мизорибин, микофенолат мофетил, майорал, азотистый иприт, D-пенницилламин, такие имидазолы пиридинола, как SKNF86002 и SB203580, рапамицин, тиолы, тимопоэтин и винкристин. Структурно родственные SAARD или DMARD, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу.
[00250] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антитела в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более ингибиторами COX2, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями для лечения перечисленных в данном документе заболеваний и нарушений, включая острые и хронические воспаления. Примеры ингибиторов СОХ2, их пролекарственных сложных эфиров или фармацевтически приемлемых солей включают, например, целекоксиб. Структурно родственные ингибиторы СОХ2, имеющие сходные анальгезирующие и противовоспалительные свойства, также входят в эту группу. Примеры селективных ингибиторов СОХ-2 включают, но не ограничиваются ими, эторикоксиб, вальдекоксиб, целекоксиб, ликофелон, люмиракоксиб, рофекоксиб и тому подобные.
[00251] В другом конкретном варианте реализации настоящее изобретение относится к применению антитело в комбинации (предварительное лечение, последующее лечение или одновременное лечение) с любым одним или более противомикробными препаратами, их пролекарственными сложными эфирами или фармацевтически приемлемыми солями для лечения перечисленных в данном документе заболеваний и нарушений, включая острые и хронические воспаления. Противомикробные препараты включают, например, широкий класс пенициллинов, цефалоспоринов и других бета-лактамов, аминогликозидов, азолов, квинолонов, макролидов, рифамицинов, тетрациклииов, сульфонамидов, лиикозамидов и полимиксииов. Пенициллины включают, но не ограничиваются ими, пенициллин G, пенициллин V, метициллин, нафциллин, оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин, флоксациллин, ампициллин, ампициллин/сульбактам, амоксициллин, амоксициллин/клавуланат, гетациллин, циклациллин, вакампициллин, карбенициллин, карбенициллин инданил, тикарциллин, тикарциллин/клавуланат, азлоциллин, мезлоциллин, пеперациллин и мециллинам. Цефалоспорины и другие бета-лактамы включают, но не ограничиваются ими, цефалотин, цефапирин, цефалексин, цефрадин, цефазолин, цефадроксил, цефаклор, цефамандол, цефотетан, цефокситин, церуроксим, цефоницид, цефорадин, цефиксим, цефотаксим, моксалактам, цефтизоксим, цетриаксон, цефоперазон, цефтазидим, имипенем и азтреонам. Аминогликозиды включают, но не ограничиваются ими, стрептомицин, гентамицин, тобрамицин, амикацин, нетилмицин, канамицин и неомицин. Азолы включают, но не ограничиваются им, флуконазол. Квинолоны включают, но не ограничиваются ими, налидиксовую кислоту, норфлоксацин, эноксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, спарфлоксацин и темафлоксацин. Макролиды включают, но не ограничиваются ими, эритомицин, спирамицин и азитромицин. Рифамицины включают, но не ограничиваются им, рифампин. Тетрациклины включают, но не ограничиваются ими, спициклин, хлортетрациклин, кломоциклин, демеклоциклин, дезоксициклин, гуамециклин, лимециклин, метоциклин, метациклин, миноциклин, окситетрациклин, пенимепициклин, пипациклин, ролитетрациклин, санциклин, сеноциклин и тетрациклин. Сульфонамиды включают, но не ограничиваются ими, сульфаниламид, сульфаметоксазол, сульфацетамид, сульфадиазин, сульфисоксазол и ко-тримоксазол (триметоприм/сульфаметоксазол). Линкозамиды включают, но не ограничиваются ими, клиндамицин и линкомицин. Полимиксины (полипептиды) включают, но не ограничиваются ими, полимиксин В и колистин.
Способы лечения Фармацевтические лекарственные формы, пути введения
[00252] Раскрыты композиции, содержащие терапевтически эффективное количество одного или множества антител согласно изобретению вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, солюбилизатором, эмульсификатором, консервантом и/или адьювантом. Кроме того, в изобретении предложены способы лечения пациента путем введения такой фармацевтической композиции. Пациент может быть как субъектом-человеком, так и субъектом-животным.
[00253] Фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, можно применять для снижения активности С5. Фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, можно применять для лечения последствий, симптомов и/или патологий, связанных с активностью С5. В различных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, можно применять в способах ингибирования пути комплемента. Фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, можно применять в способах лечения последствий, симптомов и/или патологий, связанных с активностью С5. Фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, можно применять в способах ингибирования выработки МАК. Фармацевтические композиции, содержащие одно или более антител, можно применять в способах ингибирования макулярной дегенерации.
[00254] Различные приемлемые материалы для препаратов являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях. В конкретных вариантах реализации изобретения предложены фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество антител к С5.
th
[00255] В определенных вариантах реализации изобретения приемлемые материалы для препаратов являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях. В определенных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может содержать материалы для препаратов для модификации, поддержания или сохранения, например, pH, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, всасывания или проникновения композиции. В таких вариантах реализации изобретения приемлемые материалы для препаратов включают в себя, но не ограничиваются ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); противомикробные; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или бикарбонат натрия-сульфит); буферы (такие как борат, бикарбонат, трис-HCl, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты); наполнители (такие как маннит или глицин); хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); наполнители; моносахариды; дисахариды; и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители, вкусовые добавки и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); полипептиды с низкой молекулярной массой; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие как маннит или сорбит); суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества или смачивающие агенты (такие как плюроники, ПЭГ, сложные эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат, тритон, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); усиливающие стабильность агенты (такие как сахароза или сорбитол); повышающие тонус агенты (такие как галогениды щелочных металлов, натрия или калия хлорид, сорбит маннитол); носители; разбавители; вспомогательные вещества и/или фармацевтические адъюванты. См., REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18 Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990 год, Mack Publishing Company.
[00256] В определенных вариантах реализации изобретения оптимальную фармацевтическую композицию определяет специалист в данной области техники в зависимости, например, от способа введения, формата доставки и необходимой дозировки. См., например, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, см. выше. В определенных вариантах реализации изобретения такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость in vivo высвобождения и скорость in vivo выведения антител согласно изобретению. В определенных вариантах реализации изобретения базовый раствор или носитель в фармацевтической композиции может быть как водным, так и неводным по природе. Например, подходящим базовым раствором или носителем может быть вода для инъекций, физиологический солевой раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, возможно, дополненные другими материалами, обычными в композициях для парентерального введения. Дополнительными типовыми несущими средами являются забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином. В конкретных вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат Трис-буфер с рН около 7,0-8,5 или ацетатный буфер с рН около 4,0-5,5, и могут дополнительно содержать сорбит или его подходящий заместитель. В определенных вариантах реализации изобретения композиции, содержащие антитело к С5, можно подготовить к хранению путем смешивания выбранной композиции, имеющей необходимую степень очистки, с необязательными агентами (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, см. выше) в форме лиофилизированной таблетки или водного раствора. Дополнительно, в определенных вариантах реализации изобретения продукт антитела к С5 можно получать в виде лиофилизата, используя соответствующие вспомогательные вещества, такие как сахароза.
[00257] Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть предназначены для парентеральной доставки. В альтернативном варианте композиции могу т быть предназначены для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например, пероральной. Приготовление таких фармацевтически приемлемых композиций находится в компетенции данной области техники.
[00258] Компоненты препарата могут присутствовать в концентрациях, которые являются приемлемыми с учетом места введения. В определенных вариантах реализации изобретения для поддержания композиции при физиологическом уровне рН или немного меньшем рН, как правило, в диапазоне рН от около 5 до около 8, используют буферы.
[00259] Если предусмотрено парентеральное введение, терапевтические композиции для применения в данном изобретении могут находиться в форме апирогенного, парентерально приемлемого водного раствора, содержащего необходимое антитело к С5 в фармацевтически приемлемой несущей среде. В особенности подходящим базовым раствором для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, в которую добавлено антитело к С5, в виде стерильного, изотонического раствора с надлежащим консервантом. В определенных вариантах реализации изобретения приготовление может включать смешивание необходимой молекулы с агентом, таким как инъецируемые микросферы, биоразлагаемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолиевая кислота), гранулы или липосомы, которые могут обеспечивать контролируемое или пролонгированное высвобождение продукта, который может быть доставлен посредством депо-инъекции. В определенных вариантах реализации изобретения также можно использовать гиалуроновую кислоту, которая способствует продлению периода циркуляции. В определенных вариантах реализации изобретения можно использовать имплантируемые устройства для доставки лекарственных препаратов для внесения необходимого антитела.
[00260] Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть приготовлены для ингаляции. В этих вариантах реализации изобретения антитела к С5 предпочтительно приготовлены в виде сухого, вдыхаемого порошка. В конкретных вариантах реализации изобретения ингаляционные растворы, содержащие антитело к С5, также могут быть приготовлены с пропеллентом для аэрозольной доставки. В определенных вариантах реализации изобретения растворы можно распылять. Ингаляционное введение и способы получения препаратов для него дополнительно описаны и Международной патентной заявке № PCT/US 94/001875, которая включена посредством ссылки и описывает ингаляционную доставку химически модифицированных белков. Также предусматривается, что препараты можно вводить перорально. Антитела к С5, которые вводят таким образом, можно готовить с или без носителей, обычно применяемых в составлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. В определенных вариантах реализации изобретения капсула может быть приготовлена так, чтобы обеспечивать высвобождение активной части препарата в точке желудочно-кишечного факта с максимальной биодоступностью и минимальной пресистемной деградацией. Для облегчения всасывания антитела к С5 могут быть включены дополнительные агенты. Также можно применять разбавители, ароматизаторы, тугоплавкие воски, растительные масла, лубриканты, суспендирующие агенты, вещества для улучшения распадаемости таблеток и связующие вещества.
[00261] Фармацевтическая композиции согласно изобретению содержит эффективное количество одного или нескольких антител к С5 в смеси с нетоксичными вспомогательными веществами, которые подходят для производства таблеток. Растворяя таблетки в стерильной воде или другом подходящем базовом растворе, можно получить раствор в форме единичной дозы. Подходящие вспомогательные вещества включают, но не ограничиваются ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связующие агенты, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или лубриканты, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
[00262] Существование дополнительных фармацевтических композиций очевидно для специалистов в данной области техники, включая лекарственные формы антител к С5 с пролонгированной или контролируемой доставкой. Способы приготовления различных других средств с пролонгированной или контролируемой доставкой, таких как липосомные носители, биоразлагаемые микрочастицы или пористые гранулы и депо-инъекции, также известны специалистам в данной области техники. См., например, Международную патентную заявку № PCT/US 93/00829, которая включена посредством ссылки и описывает контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций. Препараты с пролонгированным высвобождением могут включать полупроницаемые полимерные матрицы в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. Матрицы для пролонгированного высвобождения могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (как описано в патенте США №3773919 и опубликованной заявке на Европейский патент № ЕР 058481, которые включены посредством ссылки), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма этил-L-глутамата (Sidman et al., 1983 год, Biopolymers 2:547-556), поли(2-гидроксиэтил-инетакрилат) (Langer et al., 1981 год, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 и Langer, 1982 год, Chem. Tech. 12:98-105), этиленвинилацетат (Langer et al., 1981 год, см. выше) или поли-D(-)-3-гидроксимасляную кислоту (опубликованная заявка на Европейский патент №ЕР 133988). Композиции с пролонгированным высвобождением также могут включать липосомы, которые можно изготовить любым из нескольких известных в данной области техники способов. См., например, Eppstein et al., 1985 год, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692; опубликованные заявки на Европейский патент № ЕР 036676; ЕР 088046 и ЕР 143949, включенные посредством ссылки.
[00263] Фармацевтические композиции, применяемые для in vivo введения, как правило, предоставлены в виде стерильных препаратов. Стерилизацию можно осуществлять путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. Если композиция лиофилизирована, стерилизацию можно проводить как до, так и после лиофилизации и восстановления. Композиции для парентерального введения можно хранить в лиофилизированной форме или в растворе. Парентеральные композиции в общем случае помещают в емкость со стерильным входным отверстием, например, пакет для внутривенных растворов или флакон с пробкой, прокалываемой гиподермической иглой для инъекций.
[00264] После приготовления фармацевтической композиции ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого препарата, кристалла или в виде обезвоженного или лиофилизированного порошка. Такие препараты можно хранить как в готовой для использования форме, так и в форме (например, лиофилизированной), которую восстанавливают перед введением. Также и изобретении предложены наборы для получения единичной дозы для введения. Каждый из этих наборов согласно изобретению может содержать первый контейнер, содержащий сухой белок, и второй контейнер, содержащий водный раствор. В определенных вариантах реализации данного изобретения также предложены наборы, содержащие одно- и многокамерные предварительно наполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).
[00265] Применяемое терапевтически эффективное количество содержащей антитело к С5 фармацевтической композиции зависит, например, от обстоятельств и целей лечения. Специалисту в данной области техники понятно, что подходящие для лечения дозировочные уровни будут варьироваться в зависимости, частично, от доставляемой молекулы, показаний, по которым применяется антитело к С5, пути введения, а также размеров (массы тела, площади поверхности тела или размеров органов) и/или состояния (возраста и общего состояния здоровья) пациента. В определенных вариантах реализации изобретения лечащий врач может титровать дозировку и модифицировать путь введения для достижения оптимального терапевтического эффекта. Типичная дозировка может соответствовать диапазону от около 0,1 мкг/кг до около 30 мг/кг или более в зависимости от вышеуказанных факторов. В конкретных вариантах реализации изобретения дозировка может соответствовать диапазону от 0,1 мкг/кг до около 30 мг/кг, в некоторых случаях, от 1 мкг/кг до около 30 мг/кг или от 10 мкг/кг до около 5 мг/кг.
[00266] Частота дозирования будет зависит от фармакокинетических параметров конкретного используемого в препарате антитела к С5. Как правило, лечащий врач вводит композицию до достижения такой дозировки, при которой достигается необходимый эффект. Следовательно, композицию можно вводить в виде одной дозы или в виде двух или более доз (которые могут содержать или могут не содержать одинаковое количество необходимой молекулы) в динамике или в виде длительной инфузии посредством имплантированного устройства или катетера. Дополнительная корректировка подходящей дозировки обычно проводится специалистами в данной области техники и соответствует диапазону осуществляемых ими задач. Подходящие дозировки можно уточнять путем применения соответствующих данных доза-ответ. В определенных вариантах реализации изобретения анти тела согласно изобретению можно вводить пациентам в течение продолжи тельного периода времени. Постоянное введение антитела согласно изобретению минимизирует нежелательные иммунные или аллергические ответы, обычно связанные с антителами, которые являются не полностью человеческими, например, антителом, полученным против человеческого антигена в организме отличного от человека животного, например, не полностью человеческим антителом или нечеловеческим антителом, полученным в организме отличного от человека вида.
[00267] Путь введения фармацевтической композиции соответствует известным способам, например, пероральный, посредством внутривенной инъекции, внутрибрюшинный, внутрицеребральный (интрапаренхиматозный), интрацеребровентрикулярный, внутримышечный, внутриглазной, интравитреальный, субретинальный, внутриартериальный, интрапортальный или внутриочаговый пути; при помощи систем для пролонгированного высвобождения или имплантируемого устройства. В определенных вариантах реализации изобретения композиции можно вводить путем болюсной инъекции или продолжительно путем инфузии или при помощи имплантируемого устройства.
[00268] Также композицию можно вводить местно посредством имплантации мембраны, губки или другого подходящего материала, в котором абсорбирована или инкапсулирована необходимая молекула. В определенных вариантах реализации изобретения, в которых применяют имплантируемое устройство, указанное устройство может быть имплантировано в любую подходящую ткань или орган, а доставка необходимой молекулы может происходить посредством диффузии, болюса с длительным высвобождением или постоянного введения. В случае глазных имплантатов, имплантат можно имплантировать при помощи внутриглазной инъекции, интравитреальной инъекции, субретинальной инъекции, супрахориоидальной инъекции, ретробульбарной инъекции или инъекции в субтеноновое пространство.
[00269] Также может возникать необходимость в применении фармацевтических композиций, содержащих антитело к С5 согласно изобретению, ex vivo. В таких случаях клетки, ткани или органы, которые были удалены из организма пациента, обрабатывают фармацевтическими композициями, содержащими антитело к С5, после чего клетки, ткани и/или органы имплантируют обратно в организм пациента.
[00270] В частности, антитела к С5 можно доставлять путем имплантации определенных клеток, которые были модифицированы методами генетической инженерии при помощи способов, таких как те, что описаны в данном документе, для экспрессии и секреции антитела к С5. В определенных вариантах реализации изобретения такие клетки могут быть клетками животного или человека и могут быть аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. В определенных вариантах реализации изобретения клетки могут быть иммортализованными. В других вариантах реализации изобретения с целью снижения вероятности иммунологического ответа клетки могут быть инкапсулированы, чтобы избежать инфильтрации окружающих тканей. В дополнительных вариантах реализации изобретения материалы для инкапсуляции, как правило, являются биосовместимыми, полупроницаемыми полимерными капсулами или мембранами, которые допускают высвобождение белковых продуктов, но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими вредоносными факторами из окружающих тканей.
[00271] Все перечисленные в тексте данного описания ссылки явным образом и в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
[00272] Нижеприведенные примеры, включая проведенные эксперименты и полученные результаты, приведены исключительно в иллюстративных целях и не ограничивают данное изобретение.
Пример 1 - Иммунизация и создание гибридомны
O
d
c
[00273] Для генерации гибридом и моноклональных антител, иммунизацию и скрининг проводили в основном, как описано в Antibodies, A laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory. Конкретная процедура для генерации моноклональных антител к С5, как описано в данной заявке, кратко описана следующим образом. B10.D2-HcH2H2-T18/702SnJ мыши с дефицитом компонента комплемента С5 (Jackson Labs, Bar Harbor Maine) были иммунизированы путем инъекции в подушечки стопы с использованием 75 мкг человеческого С5 (Квидел cat № A403) в полном адъюванте Фрейнда с последующими последовательными вторичными бустерными инъекциями путем интраперитонеального (I.P.) введения 75 мкг белка С5 в неполном адъюванте Фрейнда на 28-й день. Анализы ИФА сывороточных титров для определения реактивности белка С5 проводили на 9-10 день после вторичной бустерной инъекции. Для получения исходного набора слияний мыши, проявляющие позитивные титры, были иммунизированы с помощью бустерных инъекций (75 мкг С5 в pBS, I.P.) на 82, 83 и 84 день с последующим слиянием спленоцитов с клетками мышиной миеломы линии SP2/0 с использованием стандартных методов на 85 день. Вторую когорту мышей дополнительно иммунизировали на 68 и 175 день с последующими бустерными инъекциями на 195, 196 и 197 день и слиянием на 198 день. Все слияния были проанализированы на реактивность к С5 С помощью ИФА на 18 день после слияния, и положительные гибридомы субклонировали с использованием стандартных методов, позволяющих получение моноклональных антител.
Пример 2 - гибридомная культура
[00274] Гибридомы поддерживали в DMEM, содержащей 15% Fetal Clone II, OPI, HAT, заменимые аминокислоты и рекомбинантный мышиный IL-6. Супернатанты гибридомы подвергали скринингу с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) для обнаружения человеческих антител к С5. С5-позитивные культуры размножали в DMEM, содержащей 15% Fetal Clone II, OPI и заменимые аминокислоты, и субклонировали два раза путем лимитирующего разведения. Субклонированные гибридомы были изотипированы с помощью SBA Clonotyping System/HRP (Саузерн Биотек) в соответствии с протоколом производителя.
Пример 3 - Клонирование и определения последовательности моноклональных вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи
[00275] Вариабельные домены легкой цепи (VL) и цепи (VH) были клонированы после de novo ОТ-ПЦР амплификации. Вкратце, тотальную РНК выделяли из отобранных субклонированых гибридомных клеточных линий с использованием общего набора для выделения РНК (Квайджен). Синтез кДНК осуществляли с использованием набора First Strand cDNA Synthesis Kit (Инвитроджен). Прямые праймеры, специфичные к N-концевой аминокислотной последовательности области VL и VH, и обратные праймеры к LC и НС были разработаны, чтобы отжечь область в константном легком домене (CL) и константном тяжелом домене 1 (CH1). Праймеры, используемые для клонирования de novo, приведены ниже. Амплифицированные фрагменты VL или VH были выделены и субклонированы в вектор pCRII-TOP (Инвитроджен, Лайф Технолоджис), и секвенированы с использованием стандартных методов.
[00276] ПЦР проводили следующим образом:
кДНК 5 мкл
10× ПЦР буфер5 мкл
дНТФ 1 мкл
смесь праймеров 2,5 мкл
Полимераза 1 мкл
дН2O 35,5 мкл
Общий объем, 50 мкл
Пример 4 - Анализ ингибиторной активности антитела к С5 (СН50 тест на гемолиз)
8
7
7
2
[00277] Красные кровяные тельца овец (RBC) (инновационное исследование IС 100-0210) примировали путем инкубирования антителами к RBC стромы (Сигма Алдрич, Кат. № S8014) в течение 1 часа при 37°С с последующим промыванием и ресуспендированием в GVB ++ буфере при концентрации 5×10/мл и хранили при 4°С до использования. Для анализа гемолитической активности RBC разводили до конечной концентрации 4,1×10/мл в присутствии сыворотки человека в GVB ++ буфере с последующей инкубацией в речение 1 ч при 37°С. Уровень гемолитической активности определяли путем осаждения нелизированных RBC и продуктов распада клеток при 10,000×g в течение 10 мин при температуре 4°С и измерения уровней высвободившегося гемоглобина в супернатанте путем мониторинга оптической плотности при 541 нм. В исследованиях, изучающих функциональную активность антител, сыворотку и антитела инкубировали в течение 20 минут при 4°С перед добавлением красных кровяных клеток. Для тестирования активности гибридомных клеточных культур в супернатантах супернатанты инкубируют с 3% NHS в буфере GVB в соотношении 1: 1 в течение 60 минут при 4°С перед добавлением примированных RBC. Контроль включает только сыворотку (положительный контроль), дHО (100% лизис) и сыворотку +10 мМ ЭДТА (отрицательный контроль). Для анализа альтернативного пути использовали GVB +10 мМ ЭГТА (Бостон Биопродактс IBB-310) и C1Q-дефицитную сыворотку человека (Квидел, A509). В некоторых анализах непримированные красные кровяные клетки кролика (1×10) заменяют красными кровяными клетками овец и анализ проводят в присутствии GVB буфера, содержащего 0,5 мМ ЭГТА (Бостон Биопродактс IBB-310).
[00278] На фигуре 3 показано графическое представление результатов теста на гемолиз для выбранного числа проанализированных клонов. Черная линия между клонами 5 В201 и 5D7-5 представляет результаты коммерчески приобретенного моноклонального антитела мыши А239 (Квидел А239). Клоны, находящиеся слева от этой линии, представляют антитела, которые показали более высокое/лучшее ингибирование активации комплемента (что приводит к лизису клеток). Особый интерес представлял субклон 10С9 (и потомство с номенклатурой 10С9-Х, где X показывает различное количество субклонов от родителя).
Пример 5 - Анализ ингибиторной активности антитела к С5 (ИФА анализ IgM)
[00279] 96-луночные планшеты ИФА (Костар №3590) покрывали 2 мкг человеческого IgM, разбавленного в покрывающем буфере при рН 9,5 (БД-биосайнсес 51-2713КС) в течение ночи при температуре 4°С. Планшеты промывали промывочным буфером (БД-биосайнсес 51-9003739). Сыворотку разводили до 2% в GVB (БД-биосайнсес 51-2713KC) и объединяли с различными концентрациями супернатанта гибридомы или очищенными IgG, и инкубируют в течение 20 мин при температуре 4°С. После периода инкубации 100 мкл смеси сыворотка/антитело добавляют к промытым планшетам, покрытых IgM, и инкубуют в течение 1 часа при 37°С. После периода инкубации планшеты промывали три раза промывочным буфером, а затем инкубировали с моноклональным мышиным антителом к C5b-9 (Квидель А239) при разведении 1:10,000 раствором для разведения (БД-биосайнсес 51-2641КС) в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации планшеты промывали три раза, а затем зондировали козьим антителом к НРR мыши, конъюгированным с пероксидазой хрена, разведенным в соотношении 1:3000 в растворе для разведения. Планшеты инкубировали в течение 30 мин и промывали три раза в буфере для промывки и обнаруживали сигнал путем добавления подложки (БД-биосайнсес 51-2606KZ и БД-биосайнсес 51-2607KZ) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 10 минут перед добавлением стоп-раствора (БД-биосайнсес 51-2608KZ). Уровень активации комплемента затем определяли путем определения поглощения при длине волны 450 нм.
[00280] Фигуры 5А, 5В и 5С демонстрируют результаты IgM ИФА с использованием цельной сыворотки, в которой все пути комплемента являются активными; с использованием дефицитной по С2 сыворотки, где активным является только альтернативный путь; и с использованием дефицитной по фактору В сыворотки, где классический и лектиновый пути являются активными. А239 антитело к С5 (Квидел А239) (обозначенное на фигурах 5А-5С антитело к С5) служило в качестве отрицательного контроля. Антитело к фактору D (обозначенное на фигурах 5А-5С антитело к фактору D) служило в качестве компаратора положительного контроля в альтернативном пути (фигура 5В). В целом, 10С9-19 антитело проявляло себя одинаково хороню при всех трех условиях в сыворотке крови.
Пример 6 - ИФА антитела к С5
[00281] 96-луночные планшеты ИФА (Костар №3590) покрывали с применением 1 мкг/мл человеческого С5, разбавленного в покрывающем буфере при рН 9,5 (БД-биосайнсес 51-2713KC) в течение ночи при температуре 4°С. На следующий день планшеты отмывали с помощью промывочного буфера (БД-биосайнсес 51-9003739), а затем блокировали в течение 30 минут с использованием раствора для разведения (БД-биосайнсес 51-2641KC). Очищенные моноклональные антитела или гибридомные супсрнатанты затем разводили в растворе для разведения и добавляли в лунки, предварительно покрытое С5, и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут. Планшеты промывали 3 раза, а уровень связанных моноклональных антител детектировали с использованием вторичных козьих антител к HPR мыши, контролированных с пероксидазой хрена и подложки. Уровень связанного антитела определяли путем измерения оптической плотности при длине волны 450 нм. На фигуре 7 показано графическое представление связывания С5 с использованием выбранных моноклональных антител/гибридомных супернатантов.
Пример 7 - Анализ обнаружения нерастворимого C5b-9
[00282] 96-луночные планшеты ИФА (Костар №3590) покрывали с применением 2 мкг/мл человеческого IgM, разбавленного в покрывающем буфере при рН 9,5 (БД-биосайнсес 51-2713KC) в течение ночи при температуре 4°С. Планшеты промывали промывочным буфером (БД-биосайнсес 51-9003739). Нормальную человеческую сыворотку разводили в 2% GVB (БД-биосайнсес 51-2713КС) и 100 мкл смеси сыворотка/GVB добавляли к промытым планшетам, покрытых IgM, и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После периода инкубации планшеты промывали три раза промывочным буфером, а затем инкубировали с моноклональным антителом к С5, разведенным в растворе для разведения в концентрациях, как показано на фигуре. После инкубации планшеты промывали три раза, а затем зондировали в течение 30 минут с вторичным козьим антителом к HРR мыши, конъюгированным с пероксидазой хрена, разведенным в соотношении 1:3000 в растворе для разведения с последующей промывкой три раза в буфере для промывки. Связанное антитело детектировали путем добавления субстрата (БД-биосайнсес 51-2606KZ и БД-биосайнсес 51-2607KZ) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 10 минут перед добавлением стоп-раствора (БД-биосайнсес 51-2608KZ). Уровень активации комплемента затем определяли путем определения поглощения при длине волны 450 нм.
[00283] На фигуре 10 показано графическое представление результатов. Из проанализированных моноклональных антител 10С9-19r (r используется для обозначения того, что использованное антитело представляет собой рекомбинантный вариант 10С9-19 клона) не связывается с нерастворимым С5b9. Это согласуется с предположением, что это антитело не распознает или не связывается с С5 после его включения в МАК.
Пример 7 - Обнаружение растворимого C5b-9
[00284] Амин реакционноспособные биосенсоры (AR2G) (ФортеБио, 18-5092) были использованы для иммобилизацин антител в ОКТЕТ RED 96 (ФортеБио). AR2G сначала были регидрированы в ддН20 в течение 10 минут в загрузочном планшете. После инициации выполнения протокола OCTET биосенсоры затем переносили во вторичный гидрационный раствор ддН20 в течение 60 секунд, чтобы убедиться в отсутствии аберрантных показателей. После регидратации биосенсоры активировались в свежеприготовленных растворах 20 мМ 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлорид (EDC), 10 мМ сульфо-N-гидроксисульфосукцинимид (S-NHS) в течение 300 секунд. Антитела, связанные с-AR2G, разводили до 20 мкг/мл в 10 мМ ацетат натрия, рН 5,0. После активации AR2G их помещали в раствор антител в течение 600 секунд. Затем их погасили в 1 М этаноламине, рН 8,5 в течение 300 секунд. После гашения они были помещены в кинетический буфер в течение 120 секунд для определения исходных показателей. Растворимый C5b-9 (КомпТек, А127) разводили до 30 мкг/мл в кинетическом буфере (KB). После измерения исходных показателей антитела помещали в раствор с C5b-9 в течение 300 секунд для измерения ассоциации. Наконец, биосенсоры были возвращены в кинетический буфер, где измеряли исходные показатели и уровень дизассоциации в течение 600 секунд. Уровень отклонения от исходного показателя за 300 секунд ассоциации использовали как показатель аффинности связывания. Объемы всех используемых растворов составляли 200 мкл на лунку в 96-луночном планшете с плоским черным дном (Грейнер Био-Ван, 655209). Протокол OCTET проводился при 1000 оборотах в минуту и 30°С.
[00285] Результаты показаны на фигурах 11А и 11B. А239 (Квидель) антитело (обозначенное А239 на фигурах 11А и фигурах 11В) служит в качестве положительного контроля, так как связывается с C5b-9 (часть МАК). Как и следовало ожидать из результатов, отсутствие/очень малое связывание наблюдалось с антителом 10С9-19r. Это согласуется с предположением, что 10С9 (и его потомство/ субклоны) не связываются с растворимым C5b-9.
Пример 9 - Анализ образования С5а
[00286] 96-луночные планшеты ИФА (Костар №3590) покрывали 2 мкг/мл человеческим IgM, разбавленным в покрывающем буфере при рН 9,5, (БД-биосайнсес 51-27 ИКС) в течение ночи при температуре 4°С. Планшеты промывали промывочным буфером (БД-биосайнсес 51-9003739). Сыворотку разводили до 10% в GVB (БД-биосайнсес 51-27 ИКС) в присутствии или в отсутствии очищенных IgG (антитела к С5) и инкубировали в течение 20 мин при температуре 4°С. После периода инкубации 100 мкл смеси сыворотка/антитело добавляют к промытым планшетам, покрытых IgM, и инкубируют в течение 1 часа при 37°С. Супернатант собирают после инкубации. Уровни С5а в супернатанте затем определяли с использованием Micro Vue С5а EIA Kit (Квидел, cat № A021).
[00287] На фигурах 6А, 6В, and 6С показаны результаты анализа. На фигуре 6А показаны уровни С5а в супернатанте для отобранных антител к С5, которые были проанализированы. Черная горизонтальная линия показывает фоновые уровни. Как видно из графика, некоторые антитела лучше блокировали образование С5а, чем другие. На фигуре 6В показано сравнение 10С9-19 антитела в образовании С5а. Как видно на графике, Ms IgG служил в качестве положительного контроля и "без CVF" (нет фактора яда кобры) контроль служил, как не протеазный отрицательный контроль. При концентрации 5 мкг/мл еще одно антитело к С5 8С7-26 ингибируют образование С5а, но не ингибирует образование С5а при концентрации 0,05 мкг/мл. Однако, 10С9-19 не ингибирует образование С5а как при концентрации 5 мкг/мл, так и при концентрации 0,05 мкг/мл.
Пример 10 - статистический анализ
(00288) Ниже описывается, как рассчитывали процент ингибирования и проводили другие статистические расчеты в экспериментах, включенных в данный раздел.
(00289) Тест па гемолиз % ингибирования =1-((T-N)/(P-N))*100
[00290] T является тестом ОП (уровень гемоглобина, выделяющегося во время анализа)
[00291] N = отрицательный контроль ОП (высвобождение гемоглобина во время анализа в условиях, в которых активность системы комплемента была заблокирована добавлением ЭДТА до 10 мМ)
[00292] Р = положительный контроль ОП (высвобождение гемоглобина, когда эритроциты инкубировали в присутствии сыворотки и в отсутствие ингибитора, это соответствует 100% активности).
[00293] Z-фактор: Z-фактор = 1-((3*(Dp-Dn))/(abs(Mp-Mn))), где Dp представляет собой стандартное отклонение положительного контроля, Dn представляет собой стандартное отклонение отрицательного контроля, Мр представляет собой среднее положительного контроля, и Mn является средним отрицательного контроля.
(ECx-X
*m)
[00294] Подбор кривой (Графпад Призм) IC90:Y = Ymin+(Ymax-Ymin)/(1+10))
где ЕСх является log IC90-(1/m)*log(90/(100-90)).
Пример 11 - Иммунизация и С5-дефицитных мышей
[00295] Иммунизация С5-дефицитных мышей позволяет получить супернатанты гибридомных клеточных культур, которые способны ингибировать опосредованный комплементом лизис эритроцитов по результатам теста на гемолиз СН50. Ответ от выбранных гибридом был более значительным, по сравнению с наблюдаемым ответом от использования обычных коммерчески доступных антител, которые указанные черной линией на фигуре 3.
[00296] Размножение и клонирование первичных гибридом с последовательной очисткой IgG позволяет анализировать функции и эффективность блокирования опосредованного комплементом лизиса клеток посредством титрования концентраций IgG. Достигнуто более глубокое понимание относительной эффективности заданных моноклональных антител ингибировать опосредованный комплементом лизис клеток, как показано на фигурах 4А и 4В.
[00297] Функциональную активность моноклональных антител к С5 можно охарактеризовать на основе эффективности ингибирования выбранного пути комплемента. Ингибиторные антитела были выбраны на основе конкретного пути, который они ингибируют, как показано на фигурах 5А, 5В и 5С.
[00298] Блокирование лизиса клеток может происходить либо путем предотвращения сборки мембраноатакующего комплекса или путем блокирования превращения C5 в C5b с помощью С5 конвертазы. Дальнейшая характеристика позволяет исследовать механизм ингибирования, т.е., нарушает ли ингибирующий реагент протеолитическое расщепление С5, которое приводит к образованию C5b и сборке C5b-9 комплекса, или только блокирует сборку комплекса C5b-9 не нарушая образования С5а. В последнем случае идентификация ингибиторов, блокирующих активность конвертазы, была проведена путем изучения образования С5а, который является обязательным побочный продуктом в образовании C5b. Это было сделано путем изучения одноточечных определений или титрования антитела, как показаны на фигурах 6А, 6В и 6В.
[00299] Специфичность моноклональных антител для С5 была идентифицирована путем изучения их дозозависимого взаимодействия с С5, непосредственно непосредственно нанесенным на планшеты для ИФА, как показано на фигуре 7.
[00300] Дальнейшая характеристика может происходить путем изучения аффинности моноклональных антител с помощью биослойной интерферометрии (BLI), которая позволяет идентифицировать значения KD и относительную специфичность моноклональных антител, как показано на фигуре 8. Дополнительная характеристика была получена при изучении связывания моноклональных антител с белком С5 в растворе, как показано на фигуре 9.
Пример 12 - Отбор антител к С5
[00301] Одним из предпочтительных вариантов реализации изобретения является выбор антител, которые не распознают С5, который встроен в мембраноатакующий комплекс. Моноклональные антитела были исследованы в соответствии с их способностью распознавать С5 в комплексе с C5b-9 при его осаждении на дно планшетов ИФА после активации комплемента с IgM, как показано на рисунке 10.
[00302] Дальнейшая перекрестная реактивность с С5 в C5b-9 была идентифицирована путем изучения способности моноклональных антител связываться с растворимым C5b-9 с использованием биослойной интерферометрии (BLI) и определения уровня отклонения, как показано на рисунке 11.
Пример 13 - Выработка гуманизированных антител
[00303] Свинцовые антитела были выбраны и гуманизированы Метод гуманизации оптимизация контента нити (Lazar и соавт., US 7657380 B2, опубликованный 2 февраля 2010; US 7930107 B2, опубликованный 19 апреля 2011 года; US 20060008883 A1, поданный 3 декабря 2004 года; US 20080167449 A1, поданный 31 October, 2007; US 20110236969 A1, поданный 21 марта 2011; US 20100190247 A1, поданный 12 марта 2012, все включены полностью посредством ссылки) был применен к мышиному антителу 10С9. Отдельные гуманизированные последовательности приведены в SEQ ID NO: 1-12 и в таблице 2.
[00304] IgG были получены с помощью стандартных методик. Процент ингибирования показан на фигурах 12А, 12В и 12С для полноразмерных антител с помощью анализа ИФА, который был описан выше в примере 6. Кроме того, фрагменты Fab были получены с использованием стандартных методик, и определена их активностью, подобная таковой исходной молекулы, с помощью анализа ИФА, который был описан в примере 6. На фигурах 13А, 13В и 13С показано графическое представление результатов.
Пример 14 - Использование антитела к С5 для профилактики C5b-9 отложений в тканях сетчатки и хориоидеи
[00305] Кроме того, терапевтический потенциал соединения в блокировании образования C5b-9 в тканях сетчатки и хориоидеи путем интравитреальной доставки может быть оценен с помощью стандартных моделей, приводящих к активации комплемента в целевых тканях, как это предусмотрено в AL-78898A Ингибирование депонирования комплемента на модели повреждения светом у приматов, ARVO Ab A387 2012. Гуманизированные H5L2 (SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:2 соответственно) антитело гуманизировали из мышиного моноклонального антитела субклона 10С9. H5L2 был про тестирован на модели повреждения светом у нечеловекообразных приматов. Интравитреальное дозирование антителом H5L2 обеспечивало эффективное блокирование депонирования комплемента в сетчатке по сравнению с отрицательным контролем (PBS, без повреждения светом, обозначен "PBS без BL"). Положительный контроль PBS с повреждением светом (обозначен "PBS"). На фигурах 14А (сетчатка) и 14В (choroid) показано графическое представление результатов. Эти данные указывают на то, что местная доставка антитела H5L2 является эффективной в in vivo модели, релевантной лечению макулярной дегенерации и других глазных показаний.