Биологически активная добавка, обладающая актопротекторной активностью
BIOLOGICALLY ACTIVE ADDITIVE WITH ACTOPROTECTIVE ACTIVITY

Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности, а именно биологически активным добавкам к пище, содержащим растительные источники аминокислот для повышения физической активности.
Предшествующий уровень техники
Актопротекторы - соединения природного или синтетического происхождения, восстанавливающие физическую и умственную работоспособность без увеличения потребления кислорода клетками организма. Концепция актопротекции подразумевает применение веществ не истощающего типа действия, активность которых в первую очередь направлена на оптимизацию энергообеспечения работы клетки. В тоже время актопротекторы характеризуются незначительным латентным периодом развития фармакологического эффекта, что выгодно отличает данные средства от адаптогенов. [Oliynyk S, Oh S. The pharmacology of actoprotectors: practical application for improvement of mental and physical performance. BiomolTher (Seoul). 2012 Sep; 20(5):446-56. doi: 10.4062/biomolther.2012.20.5.446.]
Prunella
Prunella vulgaris
Prunella laciniata
Prunella grandiflora
Prunella vulgaris
Prunella
Род L. в мировой флоре насчитывает около 15 видов, из которых три встречаются во флоре России:  L., представитель Европы, Кавказа, Западной и Северной Сибири, а также Средней Азии; ч. разрезная  L. и  L. встречаются во флоре Восточной Европы и Кавказа.  L. за пределами Российской Федерации произрастает в Казахстане, в горах Средней Азии, в Закавказье, государствах Балтии, в Молдавии, Белоруссии, Украине, почти во всех странах Европы, Турции, Иране, Пакистане, Индии, Японии, северных и западных провинциях Китая, Северной Америке, Северной Африке и Австралии [Takhtadjan A. Flowering Plants. Seconded. Springer Science & Business Media; 2009. p. 573; Шамилов, А.А. Растения рода : химический состав, виды фармакологического действия / А.А, Шамилов // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2017. - № 4. - С. 152-160.].
Prunella
Химический состав видов рода L. представлен углеводами и их производными, моно- и сесквитерпеноидами, дитерпеноидами, тритерпеноидами, стероидами, фенилпропаноидами, фенолкарбоновыми кислотами, кумаринами, флавоноидами в том числе антоцианами, витаминами, высшими жирными кислотами, иридоидами, дубильными веществами.[Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность; Семейство Caprifoliaceae - Lobeliaceae. - СПб.; М.: Товарищество научных изданий КМК, 2011. - Т. 4. - 630 с.]
Prunella vulgaris
Prunella
Более 100 лет  L. используется в традиционной медицине Китая. Это связано с ее широким фармакологическим спектром действия. Исходя из этого растение признано официальным на территории Китая. Виды рода L. внародной и традиционной медицине используют как гемостатическое, ранозаживляющее, противовоспалительное, антимикробное, жаропонижающее, отхаркивающее, тонизирующее и антикомплементарное средство. Эти виды имеют следующие показания: при раке щитовидной железы, средостении, лимфогранулематозе, лимфоме, бронхите, респираторных заболеваниях и инфекциях, кровохаркании, эмпитиго, псориазе, скрофулезе, себорее, экссудативном диатезе, ларингите, нефрите, геморрое, диарее, туберкулезе (горла, кожи, легких), дифтерии, дизентерии, гипертензии, артрите, ревматическом полиартрите, лимфадените, гипертиреозе, тиреотоксикозе, гастралгии, эпилепсии, цинге, лейкорее, мастите, митрите, кольпите, ушибах, вывихах [Дикорастущие полезные растения России / Под. ред. А.Л. Буданцева, Е.Е. Лесиовской. - СПб.: Издательство СПХФА, 2001. - 663 с.]
В качестве прототипа нашего изобретения можно выделить густой экстракт из мякоти плода тыквы посевной сорта «Атлант», применяемый в качестве актопротекторного средства [Патент RU 2691079 от 10.06.2019 г.]. Преимуществом патентуемой разработки перед прототипом является низкая эффективная дозировка (двукратно в сравнении с прототипом), а также высокое содержание незаменимых аминокислот.
Технической задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента биологически активных добавок с актопротекторной активностью.
Технический результат
Prunella vulgaris L., Prunella grandiflora L., Prunella laciniata L.
Технический результат достигается за счет того, что биологически активная добавка к пище содержит компоненты растительного происхождения с высоким содержанием аминокислот траву , которая используется в виде густого экстракта полученного в следующих массовых долях:
Трава черноголовки 100,0 г
Воды 1500,0 мл
Полученную композицию перемешивают в течение 30 минут при комнатной температуре и в последующем нагревают до 36°С при активном перемешивании в течении 120 минут, фильтруют и концентрируют на ротационном испарителе при 34-36°С.
Получение и исследование предлагаемой биологически активной добавки поясняется примерами:
Пример 1. Получение фармацевтических субстанций и определение содержания аминокислот
Субстанцию получают из воздушно-сухой травы черноголовки обыкновенной, черноголовки крупноцветковой или черноголовки разрезной предварительно измельчая и просеивая траву через сита с размером частиц 1 мм, далее 100 г измельченной травы соответствующего вида черноголовки помещают в колбу вместимостью 3000 мл и добавляют 1500 мл воды очищенной, колбу помещают на перемешивающее устройство (ЛАБ-ПУ-02), перемешивают 30 минут, затем нагревают до 36°С при активном перемешивании в течение 120 минут. Полученное водное извлечение фильтруют и с помощью ротационного испарителя (QYRE-2A) при температуре 35-36°С (насос 2НВР-5ДМ УХЛ4.2; разряжение 0,8-0,9 атм) концентрируют. Полученные субстанции представляют собой густые концентраты от светло-коричневого до темно-коричневого цвета.
Методика количественного определения общего белка и его компонентного состава состоит из следующих этапов:
1. Взвешивания около 200 мг (точная навеска) черноголовки травы.
2. Экстракции с одновременным гидролизом 20 мл кислотой хлористоводородной 6 н при температуре 110°С в течение 24 часов.
3. Очистки от хлористоводородной кислоты водой очищенной (5 мл) после полного выпаривания кислого раствора на выпарительной чашке (повторяют дважды).
4. Приготовления анализируемого раствора (сухой остаток + 50 мл загрузочного электролита рН=2.2).
5. Фильтрации анализируемого раствора (с использованием ионообменной колонки с последующей фильтрацией через фильтр).
Перед введением в ионообменную колонку анализируемый раствор отфильтровывают через фильтр.
Загрузочный электролит готовят согласно методике: в мерную колбу вместимостью 100 мл добавляют 1,4 г кислоты лимонной, 1,5 г натрия хлорида, 0,01 г натрия азида и 0,5 мл тиодигликоля, далее доводят до метки водой очищенной.
Анализ смеси проводят методом ионообменной хроматографии в аминокислотном анализаторе ААА-400. Детекцию проводят после дериватизации аминокислот нингидрином. Условия анализа смеси: ступенчатый градиент, скорость потока электролита 0,3 мл/мин, скорость потока нингидринового реактива 0,2 мл/мин, детектирование при УФ 440 и 570 нм, температура термостата реактора 121°С [ГОСТ 32195-2013 (ISO 13903:2005). Корма, Комбикорма. Метод определения содержания аминокислот [Текст]. - Введ. 2015-07-01. - М.: Стандартинформ, 2020].
Prunella L
Данные, представленные в виде таблицы 1, свидетельствуют о том, что в траве видов рода . содержится 16 аминокислот, 9 из них являются незаменимыми: лизин, валин, метионин, треонин, изолейцин, фенилаланин, аргинин, гистидин и лейцин. В общей сумме аминокислот преобладают следующие аминокислоты: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, лейцин, аланин, пролинисерин.
Пример 2. Экспериментальная оценка эффективности (актопротекторной активности) применения полученных субстанций
Влияние фармацевтических субстанций на уровень физической работоспособности животных при однократном введении оценивали в тесте «принудительное плавание с 20% отягощением». В качестве биологической модели использовали мышей самцов линии Balb/c массой 22-25 грамм (30 особей, n=10 каждая экспериментальная группа).
«Принудительное плавание» проводили в установке, представляющей собой акриловый цилиндр высотой 30 см и диаметром 10 см, с десатурированной водой температурой 150°С. К хвосту животного прикрепляли груз, равный 20% массы его тела, после чего животное помещалось в цилиндр. Предварительно все животные были рандомизированы по времени плавания. Исследуемые субстанции в дозе100 мг/кг и препарат сравнения - прототип густой экстракт тыквы в дозе 200 мг/кг [RU 2691079] вводили однократно за 1 час до воспроизведения физических нагрузок. Плавание осуществлялось до полного истощения и отказа борьбы за жизнь (нахождение животного на дне бассейна на протяжении 7 сек.). Фиксировали время плавания мышей в секундах [Voronkov A.V., Gerashchenko A.D., Pozdnyakov D.I., Khusainov D.V. Effects of various aversive environments on oxygen consumption of muscle and blood in mice under conditions of the “forced swimming” test. Pharmacy&Pharmacology. 2019; 7(3):148-157. (InRuss.) https://doi.org/10.19163/2307-9266-2019-7-3-148-157]Статистическую обработку полученных результатов производили с использованием прикладного программного пакета STATISTICA 6.0 (StatSoft, США). Данные выражали в виде M (среднее значение) ±SEM. Сравнение групп средних осуществляли методом однофакторного дисперсионного анализа с пост-обработкой критерием Ньюмена-Кейсла.
Оценка фармакологчиеской активности показала, что у мышей НК группы уровень физической работоспособности к концу эксперимента уменьшился на 51,9% (p<0,05). Применение референтного препарата и изучаемых фармацевтических субстанций из травы черноголовки обыкновенной, черноголовки крупноцветковой и черноголовки разрезной способствовало повышению уровня физической активности мышей в 3,40 (p<0,05); 3,09 (p<0,05); 3,11(p<0,05) и 3,15 раза (p<0,05) соответственно по отношению аналогичному показателю НК группы животных. Стоит отметить, что по сравнению с исходными показателями времени плавания в группах мышей, которым вводили референтный препарат и изучаемые фармацевтические субстанции из травы черноголовки обыкновенной, черноголовки крупноцветковой и черноголовки разрезной к 10-му дню эксперимента данный показатель увеличился на 77,5(p<0,05); 60,3%(p<0,05); 43,1% (p<0,05) и 64,1%(p<0,05) соответственно (табл.2).
<b>Таблица 1</b>
№
Название аминокислоты
Черноголовка разрезная, %
Черноголовка крупноцветковая,%
Черноголовка обыкновенная, %
1
Аспарагиновая кислота (Аsp)
0,84
0,56
0.74
2
Глутаминоваякислота (Glu)
0,75
0,65
0.80
3
Лейцин (Leu)*
0,43
0,41
0.50
4
Глицин (Gly)
0,35
0,29
0.33
5
Аланин (Ala)
0,35
0,31
0.36
6
Пролин (Pro)
0,34
0,37
0.39
7
Серин (Ser)
0,32
0,25
0.32
8
Аргинин (Arg)
0,32
0,28
0.28
9
Валин (Val)*
0,29
0,28
0.28
10
Треонин (Тhr)*
0,28
0,22
0.29
11
Лизин (Lys)*
0,28
0,25
0.31
12
Фенилаланин*(Phe)
0,27
0,23
0.23
13
Тирозин (Tyr)
0,25
0,15
0.17
14
Изолейцин (Iie)*
0,23
0,21
0.19
15
Гистидин (His)*
0,21
0,19
0.24
16
Метионин (Met)*
0,05
0,04
0.05
Сумма аминокислот
5,57
4,70
5.56
Сырой протеин
6,82
4,96
6.9
Примечание: *незаменимые аминокислоты
<b>Таблица 2</b>
<b>Группа</b>
<b>1 день</b>
<b>10 день</b>
НК
129,8±9,1
65,2±5,6
Прототип (экстракт тыквы из RU 2691079)
119,6±2,7
212,3±10,7#*
<i>Prunella vulgaris</i><i>L</i>.
120,5±6,9
193,1±16,9#*
<i>Prunella grandiflora</i><i>L</i>.
135,9±7,2
194,5±18,3#*
<i>Prunella laciniata</i><i>L</i>.
120,1±9,5
197,1±19,6#*
Примечание: # - статистически значимо относительно НК группы животных; * - статистически значимо относительно исходного показателя.
Таким образом, проведенные фармакологические испытания позволяют заключить, что предлагаемая биологически активная добавка к пище обладает актопротекторной активностью, позволяющая повысить физическую активность организма.