СПОСОБ ОЧИСТКИ БЕЛКА ФАКТОРА РОСТА

1. Способ очистки белка фактора роста, выбранного из группы, состоящей из колониестимулирующего фактора (CSF), такого как G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор) или гранулоцитарно-макрофагальный CSF (GM-CSF), интерлейкина 3 (IL-3), фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста и фактора роста фибробластов (кислого),
в последовательности очистки, применяющей хроматографию, отличающийся тем, что
- по меньшей мере, одна хроматография осуществляется с использованием многомодальной смолы,
- белок фактора роста связывается с многомодальной смолой при pH 4-6,2 и
- белок фактора роста элюируется при pH >6,3
ab
- необязательно в комбинации со стадией хроматографии с аффинным лигандом, выделенным из дрожжей, в частности с F-фрагментом, выделенным из дрожжей, направленным против белка фактора роста.
2. Способ по п.1, где многомодальная смола включает компоненты, связанные с матрицей, и компоненты, способные взаимодействовать с белком фактора роста в смеси посредством ионных взаимодействий и взаимодействий других типов, таких как водородные связи и гидрофобное взаимодействие.
3. Способ по п.1, где смесь, включающая белок фактора роста, представляет собой раствор.
4. Способ по п.1, где белок фактора роста представляет собой рекомбинантный белок фактора роста.
5. Способ по п.1, где белок фактора роста элюируется с помощью изменения pH >6,3.
6. Способ по п.1, где элюцию осуществляют с помощью изменения pH или с помощью элюирующего агента, включающего аминокислоту, содержащую основную боковую цепь, и/или высокой ионной силы в элюирующем буфере.
7. Способ по п.6, где концентрация элюирующего агента находится от примерно 0,1 до примерно 2,0 M.
8. Способ по п.1, где белок фактора роста связывается с мнгомодальной смолой при pH от примерно 4,0 до примерно 6,0 и белок фактора роста элюируется из многомодальной смолы при pH 6,5 или выше, в частности при pH примерно 7,0.
9. Способ по п.1, где используется буферное вещество, включающее цитрат натрия, ацетат натрия, HEPES, причем буферное вещество предпочтительно выбрано из группы, состоящей из цитрата натрия, гистидина, 2-(4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил)этансульфокислоты (HEPES), 2-(N-морфолино)этансульфокислоты (MES), основания Tris и ацетата натрия, в частности, в интервале pH от примерно 4 до примерно 8.
10. Способ по п.1, где неионный детергент присутствует в любом из используемых буферов, причем неионный детергент предпочтительно выбран из группы, состоящей из полисорбатов (полисорбат 20, 40, 60, 80) и Pluronic F68.
11. Способ по любому из пп.8-10, где аминокислота, содержащая основную боковую цепь, представляет собой аргинин, лизин и/или гистидин.
12. Способ по п.1, где используются буферы, включающие примерно 0,1 - 2 M хлорида натрия, или может использоваться 0,1 - 2 M моногидрохлорид аргинина в стадии промывки при pH 4,0-6,0 перед элюцией белка фактора роста.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что для отмывки многомодальной смолы от загрязнителей и для удержания белка фактора роста перед его высвобождением применяется промывочный буфер, отличающийся тем, что он включает аминокислоту, содержащую основную боковую цепь, и/или соль, выбранную согласно рядам Гофмейстера.
14. Способ по п.1, отличающийся тем, что многомодальная хроматографическая смола содержит, по меньшей мере, один из следующих компонентов:
a. положительно заряженный лиганд в виде N-бензил-N-метилэтаноламина,
b. отрицательно заряженный лиганд в виде 2-(бензоиламино)бутановой кислоты,
с. фенилпропиловый лиганд,
d. N-гексиловый лиганд,
e. лиганд в виде 4-меркаптоэтилпиридина,
f. лиганд в виде 3-((3-метил-5-((тетрогидрофуран-2-илметил)амино)фенил)амино)бензойной кислоты или их комбинации.
15. Способ по п.1, отличающийся тем, что многомодальная хроматографическая смола выбрана из следующих коммерчески доступных смол: HEP Hypercel™; PPA Hypercel™; Capto Adhere™; Capto MMC™; МЕР Hypercel™.
16. Способ по п.1, включающий следующие стадии:
- применение катионной многомодальной смолы, такой как Capto MMC;
- стадия на основе химической инактивации для оболочечных вирусов, в частности инактивация с использованием растворителя/детергента, применяющая три-н-бутилфосфат и Triton X-100, как раскрыто в EP-A-131 740;
- применение аффинной смолы на основе лиганда, экспрессируемого в дрожжах;
- применение катионообменной смолы, такой как SP Sepharose или Resource S;
- стадия удаления патогенов фильтрацией со средним размером пор примерно 20 нм, как например у Planova 20N;
- стадия замены буфера и/или концентрирования, как, например, ультрафильтрация с использованием приблизительной границы пропускания 1-5 кДа;
- применение смолы для эксклюзионной хроматографии, такой как Superdex 75.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что стадию многомодальной хроматографии объединяют со стадией аффинной хроматографии, где аффинность обеспечивается лигандом на основе белка, экспрессируемого в дрожжах, и тем, что чистота продукта, полученного в результате использования смолы аффинной хроматографии, составляет более чем 90%.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что осуществляют дополнительную(ые) стадию(стадии) хроматографии, выбранную из эксклюзионной хроматографии, анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии, хроматографии на основе гидрофобного взаимодействия и аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом, отличающийся тем, что чистота конечного продукта составляет более чем 99%.
19. Способ по п.1, отличающийся тем, что последовательность очистки дополнительно включает стадии удаления/инактивации патогенов, включающие стадию химической инактивации, стадию удаления на основе размера, хроматографические стадии или их комбинации, которые основаны на различных физиологических свойствах, направленных на удаление патогенов.