Пробиотический штамм Bacillus megaterium - продуцент антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов
PROBIOTIC BACILLUS MEGATERIUM STRAIN - PRODUCER OF ANTIBACTERIAL SUBSTANCES, IMMUNOMODULATORS AND PROTEOLYTIC ENZYMES

Пробиотический штамм Bacillus megaterium - продуцент антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к средствам профилактики и лечения инфекционных болезней, вызываемых патогенными микроорганизмами, аллергических заболеваний, повышения иммунной резистентности организма, коррекции дисбиозов различной этиологии.
Известно, что пробиотики - класс микроорганизмов и веществ микробного и иного происхождения, использующихся в терапевтических целях, а также пищевые продукты и биологически активные добавки, содержащие живые микрокультуры. Хотя большинство бактерий, обладающих пробиотическими свойствами, являются представителями семейств Lactobacillus и Bifidobacterium, стали использоваться и спорообразующие бактерии, в особенности из рода Bacillus (см. Химическая и биологическая безопасность. 2007. №2-3 (32-33)).
7
15
В патенте ЕР 0363491 (B1), NIKITENKO, 02.02.1994 описан препарат для профилактики и лечения гнойно-воспалительных процессов различной локализации и пищевой аллергии, использующий штамм Bacillus subtilis 534, депонированный за №1666 D. Препарат обеспечивает усиление лечебного эффекта за счет проникновения бактерий в очаг повреждения, где они вырабатывают биологически активные вещества, тем самым подавляя развитие инфекции и способствуя очищению от некротизированных тканей. Препарат «Споробактерин» (RU 2217154 С2, Никитенко М.В., 20.06.2003), который содержит жизнеспособные клетки штамма Bacillus subtilis ВКМ 1666D в концентрации 10-10 КОЕ/мл в растворе хлорида натрия, проявляет антагонистическую активность к бактериям золотистого стафилококка, протея мирабильного, грибкам рода Candida. В патенте (RU 2035185 С1, ИМиВ АН Украины и др., 20.05.1995) описан биопрепарат для профилактики желудочно-кишечных заболеваний на основе рекомбинантного штамма В. Subtilis ВКПМ В-4759, который характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, антивирусной активностью за счет синтеза интерферона.
Известно, что штаммы Bacillus megaterium (В-4440 и В-200) использовались ранее в сельском хозяйстве для восстановления плодородия почвы, увеличения всхожести семян, укрепления иммунной системы растений, сопротивляемости болезням и вредителям (RU 2322061 С2, НПО "Экобиотех+", 20.04.2008).
Ближайшим аналогом патентуемого штамма является пробиотический штамм Bacillus megaterium LJ2014 (регистрационный № KCCM11676P), используемый в составе фармацевтической композиции для лечения или профилактики воспалительных заболеваний или аллергических заболеваний, которая проявляет иммунологическую активность и отбеливающий эффект (KR 101583600 (В1), 21.01. 2016 - прототип). Композиция (пищевая или косметическая) содержит штамм, лизат штамма, культуры штамма, концентрат культуры и высушенного материала из культуры Bacillus megaterium.
Настоящее изобретение направлено на решение технической проблемы - расширение арсенала пробиотических штаммов, направленных на профилактику и лечение дисбактериозов различной этиологии, инфекционных заболеваний человека и животных, вызываемых широким спектром патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а также аллергических заболеваний, повышения иммунной резистентности организма, что и является техническим результатом изобретения.
Патентуемый штамм Bacillus megaterium 874 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером В-12251, является продуцентом антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов. Штамм В. megaterium 874 обладает иммуномодулирующей способностью и может быть использован для снижения аллергии и, например, может быть добавлен в пищевые продукты. Штамм обладает, подобно антибиотику широкого спектра действия, выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра микробных патогенов - Staphylococcus aureus, E.coli, Pr.mirabilis и др. Штамм продуцирует следующие ферменты: протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Обладает лизоцимной активностью.
Характеристика штамма Bacillus megaterium 874
Штамм Bacillus megaterium 874 выделен из почвы. Это грубая палочка размером (4-7)×(1,5-2) мкм. Располагается одиночно, попарно или цепочками, подвижна. Образует споры, капсул не образует, грамположительна. Аэроб, на плотной среде колонии круглые, белые, с ровным или слегка волнистым краем. В бульоне - белесоватая пленка на поверхности и небольшой придонный осадок.
Штамм В. megaterium 874 хорошо растет на простых питательных средах в течение 18-24 часов. Оптимальная температура культивирования - 37°C.
Штамм ферментирует без выделения газа глюкозу, сахарозу, арабинозу, ксилозу, манит. Не разлагает лактозу. Не образует индол, сероводород. Штамм продуцирует протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Не образует уреазу. Основные физиолого-биохимические свойства представлены в таблице 1.
Специфическая активность В. megaterium 874
Специфическая активность штамма В. megaterium 874 изучена методом отсроченного антагонизма в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов (Таблица 2). В качестве контроля использованы тест-штаммы: Staphylococcus aureus "Никифоров", Staphylococcus aureus "Филиппов", E.coli 157, Pr.mirabilis. Определяли антагонистическую активность по зоне задержки роста тест-штаммов (в мм), при этом антагонистическую активность считали положительной при задержке роста тест-культур не менее 10 мм.
Безопасность В. megaterium 874
Изучали острую и хроническую токсичность штамма В. megaterium 874. Опыты проводили на крысах и мышах (Таблицы 3, 4). При изучении острой токсичности животным вводили культуру В. megaterium 874 внутримышечно и внутрибрюшинно в различных концентрациях.
При исследовании острой токсичности гибели животных за весь период наблюдения на протяжении 15 дней не наблюдалось.
При наблюдении за животными.
Первые сутки после введения препарата
Общее состояние удовлетворительное, поведение обычное, движения координированы, судорог не отмечалось. Реакция на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители идентична наблюдавшейся до эксперимента в обеих группах. Волосяной и кожный покров не изменялся. Потребление корма и воды обычное.
В последующие 14 дней наблюдения изменений в поведении, реакции на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, в потреблении корма и воды, в характере, режиме дефекации и мочеиспускания не было.
Результаты измерения массы тела крыс отражены в таблице 5. Статистически достоверных различий в прибавке массы за 14 суток не выявлено. Средняя прибавка массы крыс за время наблюдения в опытных группах составила: группа, получавшая 0,5 мл препарата - 21±1,8 г; группа, получавшая 1,5 мл препарата - 20±2,6 г; группа, получавшая 5,0 мл препарата - 20±1,9 г. Средняя прибавка массы за время наблюдения в контрольных группах составила: группа, получавшая 0,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 18±1,5 г; группа, получавшая 1,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 19±2,7 г; группа, получавшая 5,0 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 20±2,5 г. Статистически достоверных различий в прибавке массы тела крыс в опытных и контрольных группах не выявлено (p>0,1).
Результаты измерения массы тела мышей отражены в таблице 6. Статистически достоверных различий в прибавке массы за 14 суток не выявлено. Средняя прибавка массы мышей за время наблюдения в опытных группах составила: группа, получавшая 0,1 мл препарата - 2,3±0,9 г; группа, получавшая 0,5 мл препарата - 1,9±1,2 г; группа, получавшая 1,0 мл препарата - 2,2±0,9 г. Средняя прибавка массы за время наблюдения в контрольных группах составила: группа, получавшая 0,1 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 2,2±0,7 г; группа, получавшая 0,5 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 2,8±0,7 г; группа, получавшая 1,0 мл 0,9% раствора хлористого натрия - 2,0±1,0 г. Статистически достоверных различий в прибавке массы тела мышей в опытных и контрольных группах не выявлено (p>0,1).
В связи с тем, что летальности во всех группах не наблюдалось, клинические анализы крови, патоморфологические и гистологические исследования выполнялись в группах животных, получавших максимальное количество препарата или физиологического раствора. Для крыс это количество составило 5,0 мл внутримышечно, для мышей - 1,0 мл внутрибрюшинно.
Клинический анализ крови выполнялся на вторые, седьмые и четырнадцатые сутки опыта. Результаты анализов крови лабораторных крыс показаны в таблице 7. Нормальные показатели отражены в таблице 8.
При внешнем визуальном осмотре тел животных различий между опытной и контрольной группами также не выявлено. Кожа эластичная, подвижная; шерсть гладкая, блестящая; видимые слизистые оболочки бледные, чистые, без изъязвлений и посторонних наложений; подкожная клетчатка умеренно выражена; патологические выделения из естественных отверстий тела отсутствовали.
При макроскопическом исследовании внутренних органов различий между опытной и контрольной группами не обнаружено. Раздражающего воздействия тестируемого вещества в месте введения (брюшинная полость) не выявлено.
При изучении острой токсичности штамма В. megaterium 874 установлено, что при парентеральном введении препарата в максимальной дозе он не вызывает летального и токсического эффекта.
9
При изучении хронической токсичности животным вводили культуру перорально по 10 микробных клеток ежедневно в течение 10 дней. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Результаты изучения хронической токсичности культуры представлены в таблице 9.
Наблюдение за животными проводили в течение 7 дней.
Через 1 и 7 суток по 5 животных из каждой группы умерщвляли глубоким эфирным наркозом и проводили макроскопическое исследование внутренних органов, а также отбирали различные органы для гистологического изучения: печень, почки, легкие, селезенку, кишечник, мезентериальные лимфатические узлы, головной мозг, тимус, мягкие ткани в области глотки (последние только при оральном введении). Материал фиксировали в растворе формалина, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином.
Проводили в таком же объеме гистологические исследования органов контрольных животных.
В течение всего периода наблюдения животные были здоровы, хорошо поедали пищевые рационы, поведенческие реакции не нарушены, шерстный покров не изменен. Макроскопическое и гистологическое изучение внутренних органов животных не выявило никаких патологических изменений даже в группах животных, получавших максимальное количество бактериальных клеток.
Промышленная применимость штамма подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Использование штамма B. megaterium 874 в качестве продуцента антибактериальных веществ
Штамм отличается выраженной антагонистической активностью, подобно антибиотику широкого спектра действия, он обладает активностью в отношении широкого спектра микробных патогенов - Staphylococcus aureus, E.coli, Pr.mirabilis и др. Антагонистическая активность штамма дает возможность добавлять его в препарат для использования в плановой предоперационной подготовке и послеоперационном периоде для лечения заболеваний легких и верхних дыхательных путей (бронхиты, пневмонии, синуситы, тонзиллиты и т.п., вызванные стафилококками, клебсиеллой и грамотрицательными бактериями), для профилактики и лечения послеоперационных инфекционных осложнений, вызываемых патогенными и условно-патогенными микроорганизмами.
Пример использования штамма В. megaterium 874 для получения препарата
1-й пассаж: Стерильно вскрывают ампулу лиофилизированного штамма В. megaterium 874. Содержимое ампулы разводится в 1 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида. Затем полученную взвесь микроорганизмов засевают на жидкую питательную среду (ПБ). Инкубируют при температуре 37±1°C в течение 18-20 часов.
9
2-й пассаж: Выросшую культуру разводят 0,9% раствором натрия хлорида до получения суспензии, количество живых клеток в которой составляет не менее 10×10.
Полученную суспензию высевают в бактериологические матрацы с питательным агаром стерильным шприцом из расчета примерно 5,0±1,0 мл на матрац. Засеянные матрацы инкубируют при температуре (37±1)C в течение 120±12 ч.
Смыв биомассы с питательного агара после выращивания.
9
Смыв биомассы, выросшей на поверхности питательной среды, осуществляют 5% раствором натрия хлорида с помощью микробиологических петель. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду. Полученная биомасса представляет собой жидкий концентрат бактерий штамма В. megaterium 874, который можно использовать в качестве лекарственного препарата. Предварительно биомассу разводят 5% раствором натрия хлорида, до получения суспензии, количество живых клеток в которой составляет не менее 10. Готовый продукт разливают по 10 мл во флаконы и укупоривают.
Пример 2. Использование штамма В. megaterium 874 как продуцента иммуномодуляторов
9
При изучении штамма В. megaterium 874 как продуцента иммуномодуляторов опыты проводили на мышах, животным вводили культуру перорально по 10 микробных клеток каждый день в течение 10 дней. Под влиянием этих процедур усилились функциональные свойства фагоцитов (повысился фагоцитоз), возросла продукция провоспалительных цитокинов, необходимых для инициации гуморального и клеточного иммунитета. В результате увеличилась продукция антител, активировалось образование антигенспецифических Т-хелперов и Т-киллеров.
Учитывая результаты проведенных исследований, можно рекомендовать использовать данный штамм в качестве иммуномодулятора.
1-й пассаж: Лиофилизированную культуру штамма В. megaterium 874 разводят стерильным раствором натрия хлорида, полученную суспензию засевают в 50 мл пептона. Инкубируют 18-20 часов при температуре (37±1)C.
2-й пассаж: Выросшую культуру, с содержанием живых бактерий не менее 109 вносят в минеральную среду М9 с казаминовыми кислотами, выращивают в биореакторе при температуре (37±1)C 18-20 часов.
После завершения процесса культивирования клетки отделяют центрифугированием. После осаждения клеток надосадочную жидкость ультрафильтруют с использованием установки для ультрафильтрации. Полученный раствор имеет молекулярный вес в диапазоне 10-100 тыс. дальтон. Он свободен также от нуклеиновых кислот, жиров и органических кислот. Изолированный таким образом и очищенный раствор обладает иммуномодуляторными свойствами. Полученный раствор осаждают спиртом (этанол : вода - 3:1 по объему). Осажденный спиртом продукт лиофилизируют.
Пример 3. Использование штамма В. megaterium 874 в качестве продуцента протеолитических ферментов.
Штамм продуцирует протеазу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу. Это свойство штамма можно использовать, добавляя бесклеточную культуральную жидкость штамма В. megaterium 874.
Протеолитические ферменты, лизоцим, липазы, амилазы и другие способствуют очищению ран и воспалительных очагов от некротизированных тканей, эта способность штамма может быть использована для профилактики и лечения заболеваний полости рта (глоссит, гингивит, пародонтит, стоматит). Поскольку штамм способен вырабатывать протеолитические ферменты, его можно использовать для лечения ферментной недостаточности поджелудочной железы.
9
Культивирование штамма проводят при посевной дозе (3-5)×10 кл/мл, насыщении среды кислородом в пределах 70-90%. Культуральную жидкость отделяют от биомассы микрофильтрацией с последующей стерилизующей фильтрацией целевого ферментного препарата. Полученная биомасса является основой для получения препарата-пробиотика. Протеолитическая активность культуральной жидкости 36±6 ПЕ/г.
1-й пассаж: Штамм В. megaterium 874 высевают на 2 матраса с агаризованной синтетической питательной средой, содержащей пептон, мальтозу, минеральные соли, микроэлементы и на 18-20 ч помещают в термостат при температуре 37C.
2-й пассаж: Смытую с агара микробную взвесь засевают для подращивания на жидкой среде того же состава в объеме 5 л и растят 3-4 часа.
9
3-й пассаж: Полученную культуру в дозе (1,0±0,5)×10 КОЕ используют в качестве посевного материала для проведения основного процесса в биореакторе. Выращивание проводят при температуре 37C, насыщении среды кислородом 70-80%, перемешивании со скоростью вращения мешалки 400 об/мин, в течение 16-20 ч до перехода культуры в споровую форму и прекращения нарастания протеолитической активности культуральной жидкости.
9
В полученной при этом способе культуральной жидкости уровень протеолитической активности колеблется в пределах 10±3 ПЕ/г, а количество микробных клеток составляет (20±5)×10 КОЕ.
Протеолитическую активность культуральной жидкости определяют методом Ансона при нейтральных значениях pH.
После завершения процесса культивирования клетки отделяют центрифугированием. После осаждения клеток надосадочную жидкость ультрафильтруют с использованием установки для ультрафильтрации.
После микрофильтрации протеолитическая активность культуральной жидкости падает до 2,0-4,0 ПЕ/г из-за неспецифической сорбции фермента на мембранах.
Для снижения неспецифической сорбции фермента мембраны установки перед ультрафильтрацией обрабатывают 0,5%-ным раствором альбумина, а затем отмывают нейтральным фосфатным буфером. Фермент концентрируют до объема достижения активности (36+6) ПЕ/г. После чего проводят стерилизующую фильтрацию. Разливают полученный продукт во флаконы по 10 мл и герметично укупоривают.
Таким образом, исследования показали, что штамм В. megaterium 874 является продуцентом антибактериальных веществ, иммуномодуляторов и протеолитических ферментов. Штамм В. megaterium 874 обладает иммуномодулирующей способностью, и может быть использован для снижения аллергии. Штамм отличается выраженной антагонистической активностью в отношении широкого спектра микробных патогенов - Staphylococcus aureus, E.coli, Pr.mirabilis и др.. Продуцирует ферменты: протеазу, желатиназу, амилазу, липазу, каталазу, лецитиназу; обладает лизоцимной активностью и характеризуется высокой степенью безопасности.