КОМПЛЕКС РЕКОМБИНАНТНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ В ОТНОШЕНИИ STREPTOCOCCUS AGALACTIAE И STREPTOCOCCUS PYOGENES
COMPLEX OF RECOMBINANT POLYPEPTIDES WITH PROTECTIVE PROPERTIES IN RELATION TO STREPTOCOCCUS AGALACTIAE AND STREPTOCOCCUS PYOGENES

Изобретение относится к области иммунологии, микробиологии и молекулярной генетики и может быть использовано в медицинской промышленности при производстве вакцин против Streptococcus agalactiae (стрептококков группы В (СГВ)) и Streptococcus pyogenes (стрептококков группы А (СГА)).
Streptococcus agalactiae (СГВ) является основной причиной серьезных перинатальных инфекций, чаще всего протекающих в виде пневмоний, сепсиса и менингита. Заражение ребенка происходит во время родов от матери с носительством СГВ или еще антенатально в случае бессимптомного носительства СГВ у матери. У детей старшего возраста стрептококковая инфекция проявляется в форме остеомиелита, артрита, поражения глаз, кожи и мочевого пузыря. У взрослых стрептококки группы В также могут вызывать ряд тяжелых заболеваний, таких как пиелонефрит, артрит, офтальмит, эндокардит, септицемия и др. Streptococcus pyogenes (СГА) являются широко распространенным патогеном для человека и приматов, инфицируя, главным образом, назофарингеальную слизистую и кожу. Стрептококки, инфицирующие слизистую человека, вызывают острую ангину, скарлатину, хронический тонзиллит и фарингит, которые часто сопровождаются серьезными осложнениями, такими как отит, ревматизм и гломерулонефрит. К кожным заболеваниям, вызываемым СГА, относятся импетиго, васкулиты, гнойные посттравматические и постожоговые поражения тканей, рожистое воспаление. В ряде случаев инфекции, вызванные СГА, переходят в более генерализованные формы: некротический фасцит, стрептококковый сепсис и токсический шоковый синдром. Эти заболевания характеризуются высоким процентом летальных исходов вследствие быстрого развития шока на фоне общей недостаточности работы органов человеческого организма.
Заболевания, вызываемые стрептококками групп А и В, рассматриваются как важная социально-экономическая и медицинская проблема во всех странах мира.
Общепризнанным методом лечения бактериальных инфекций, вызванных стрептококками групп А и В, является антибиотикотерапия. Широкое использование антибиотикотерапии выявило целый ряд недостатков. Установлено, что побочные эффекты применения антибиотиков связаны с изменением биохимических характеристик крови человека, развитием аллергических реакций, дисбактериоза, иммуносупрессии, угнетения кроветворения и рядом других нарушений. Существенным недостатком является также неизбежная селекция антибиотикорезистентных вариантов микроорганизмов, связанная с широким, часто бесконтрольным применением антибиотиков. Это приводит к снижению оперативности антибактериальной терапии и необходимости постоянного поиска новых эффективных вариантов антибиотиков.
При лечении СГВ и СГА инфекций препаратами выбора являются беталактамы: бензилпенициллин, ампициллин [Семина Н.А., Сидоренко C.B. и др., Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. 6 (4): 306-359 (2004)], ампициллин + сульбактам [Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 332 (2003)]; макролиды: эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, азитромицин; ванкомицин [Зуева Л.П., Поляк М.С. и др., Микробиологический мониторинг, СПб: Медицинский информационно-аналитический центр, 1-72 (2004)].
В целях профилактики СГА и СГВ инфекций используют такие антибиотики, как бензатин бензилпенициллин [Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 323-324 (2003)], эритромицин [Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 352 (2003)], ампициллин + сульбактам [Бурбелло А.Т. и др., Соврем. Лекар. Средства, СПб: Нева, 332 (2003)].
Альтернативой антибиотикотерапии стали разработки вакцинных препаратов, что продолжает оставаться перспективным направлением на протяжении последних десятилетий. В русле этой тенденции проводятся интенсивные исследования по созданию эффективных вакцин против стрептококка групп А и В.
Вакцины, специфичные в отношении стрептококка группы В, создаются на основе:
а) полисахаридов бактериальной капсулы;
б) конъюгатов капсульных полисахаридов с белками;
в) поверхностных бактериальных белков.
Недостатком полисахаридных вакцин является низкая эффективность вследствие недостаточной иммуногенности самой полисахаридной капсулы, Т-независимого характера иммунного ответа и узкой типовой специфичности антител, поскольку существует одиннадцать различных серотипов СГВ [Lindahl G. и др. Clin Microbiol Rev. 18(1): 102-127 (2005); Slotved H.C., Kong F., и др. J Clin Microbiol. 45(9): 2929-36 (2007)].
Расширение пределов специфичности полисахаридных вакцин достигается за счет включения в вакцинный препарат полисахаридов, принадлежащих всем наиболее распространенным серотипам СГВ, что существенно удорожает стоимость вакцины. Наиболее хорошо разработаны и доведены до этапа клинических испытаний конъюгированные вакцины, представляющие собой комплекс полисахаридов СГВ и бактериальных токсинов и токсоидов, используемых в качестве адъювантов. Препятствием на пути применения препаратов подобного типа у людей является наличие иммунитета к адъювантным компонентам вакцины, что ощутимо снижает иммунный ответ на специфический полисахарид [Burrage M., Robinson А. и др., Infect Immun. 70: 4948-54 (2002)].
Наиболее востребованными вакцинами, специфичными в отношении СГА, являются вакцины на основе различных производных антифагоцитарного M белка. В литературе описаны вакцинные препараты на основе консервативного эпитопа пептида Ρ 145, локализованного в области С повторов и расположенного проксимально по отношению к клеточной стенке бактерии; на основе полипептида, соответствующего полноразмерному участку С-повторов; а также рекомбинантного полипептида, составленного из N-терминальных последовательностей M белков, принадлежащих 26 различным М-серотипам СГА [Good M., Cleary Р. и др. New generation vaccines, M.M. Levine (ed.), NY, 695-710 (2004); (Fischetti V.A. ASM News 62: 405-410 (1996); Hu M.C., M.A. Walls и др. Infect. Immun. 70: 2171-2177 (2002)].
Вакцины на основе M белка СГА являются средством борьбы с инфекциями, вызываемыми стрептококком группы А, и не эффективны для профилактики СГВ инфекций.
Вакцинные препараты на основе других поверхностных белков СГА, в том числе общих для стрептококков групп А и В, находятся на начальных стадиях разработки [Hae-Sun Park H.S., Cleary P.P. Infect. Immun. 73(12): 7878-7886 (2005); Schulze Kai, Eva Medina и др. Vaccine 21(17-18): 1958-1964 (2003)].
Аналогами заявляемого изобретения являются разработки СГВ вакцин на основе рекомбинантных белков. В состав подобных разработок входят рекомбинантные полипептиды, полученные на основе хорошо изученных поверхностных белков стрептококка группы В: Вас, Sip, Rib, С5а пептидазы, LrrP [Yang H.H., Madoff L.C. Inf Immun. 75: 3455-61 (2007); Martin D., Rioux S. и др., Infect Immin. 70(9): 4897-4901 (2002); Stålhammar-Carlemalm M. и др., J Exp Med. 177(6): 159301603; Cleary P.P., Matsuka Y.V. и др., Vaccine 22(31032): 4332-41 (2004); Seepersaud R., Hanniffy S.B. Infect Immun. 73(3): 1671-83 (2005)].
Недостатком рекомбинантных моновакцин против стрептококков группы В является дифференциальная экспрессия различных поверхностных белков бактерий в зависимости от фазы роста, а также существование антигенной вариабельности белков среди бактериальных штаммов одного вида.
Другим недостатком рекомбинантных моновакцин является отсутствие экспрессии поверхностного белка, на основе которого была создана моновакцина, некоторыми стрептококковыми штаммами. Следствием этого станет неэффективность такой моновакцины в отношении определенных стрептококковых штаммов. Примером может служить Вас белок, который не продуцируется СГА штаммами.
Аналогом заявляемого изобретения является четырехкомпонентный комплекс рекомбинантных полипептидов, полученных на основе четырех консервативных белков СГВ [Maione D., Margarit I. и др. Science 309 (5731): 148-150 (2005)]. Три из этих белков входят в состав пилей СГВ, четвертый белок был идентифицирован как Sip.
К недостаткам этого комплекса можно отнести использование в ходе иммунизации лабораторных животных адъюванта Фрейнда, который как было продемонстрировано еще в 1993 г. является токсически активным веществом [Gupta R.k, Relyveld Е.Н. и др. Vaccine 11: 293-306 (1993)].
К недостаткам этого комплекса относится отсутствие данных о синергетическом эффекте комплекса по отношению к синтезу специфических антител, а также высокая вариабельность белков пилей у штаммов СГВ.
Также недостатком комплекса является продемонстрированная протективность специфических антител только по отношению к стрептококку группе В.
5РП
В представленном изобретении заявляется комплекс рекомбинантных полипептидов К, полученных на основе пяти поверхностных белков СГВ: Вас, С5а пептидазы, ScaAB, CspA и SspB1.
Вас белок, молекулярная масса которого была определена равной 131 кДа, продуцируется большинством СГВ Ib, II серотипов, реже Ia и V серотипов Отличительной особенностью Вас белка является способность связывать Fc-часть IgA человека [Jerlstrom p.G., Talay S.R. и др. Infect. Immun. 64: 2787-2793 (1991)].
Биологическое значение неиммунного IgA-связывания до сих пор дискуссируется, но преобладает мнение, что это свойство СГВ относится к мимикрии и помогает микробу избегать защитной реакции со стороны макроорганизма. Известно, что Вас белок взаимодействует с компонентом комплемента H и, как следствие этого, препятствует активации системы комплемента по альтернативному пути [Areschoug Т. и др. J. Biol. Chem. 277: 12642-12648 (2002)]. Новые экспериментальные данные указывают на то, что Вас белок посредством связывания с рецепторами лейкоцитов человека противодействует фагоцитозу [Carlin A.F., Chang Y.C. и др. J. Exp. Med. 206 (8): 1691-1699 (2009)].
Важным доводом в пользу выбора этого белка стало свидетельство о протективных свойствах антител, полученных к Вас белку [Bevanger L., Naess A.I. Acta Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B. 93: 121-124 (1985)].
Другим белком, на основе которого был создан один из компонентов вакцинного комплекса, является С5а пептидаза. Практически все штаммы СГА и СГВ продуцируют на поверхности клетки практически идентичную по аминокислотному составу С5а пептидазу - фермент молекулярной массы 125 кДа, относящийся к сериновым протеазам и расщепляющий С5а компонент комплемента человека, обезьяны и коровы. С5а компонент комплемента обладает свойствами анафилатоксина и участвует в привлечении полиморфноядерных лейкоцитов в очаг инфекции [Wexler D.E., and P.P. Cleary. Infect. Immun. 39: 239-246 (1983); Wexler D.E., and P.P. Cleary. Infect. Immun. 50: 757-764 (1985)]. К настоящему времени установлено, что С5а пептидаза обладает способностью связывать фибронектин, а также непосредственно участвует в адгезии и инвазии эпителиальных клеток [Beckmann С и др. Infect. Immun. 70: 2869-2876 (2002)].
Протективная активность антител, полученных к С5а пептидазе обеих стрептококковых групп, была продемонстрирована на мышиной модели в ряде исследований 2004-2005 гг. [Park H.S., Cleary P.P. Infect. Immun. 73(12): 7878-7886 (2005); Cleary P.P., Matsuka Y.V. и др. Vaccine 22 (31-32): 4332-4341 (2004)].
C5a пептидазу рассматривают в качестве потенциального компонента для создания вакцины против СГА и СГВ, так как она обладает такими преимуществами, как высокая распространенность среди этих групп стрептококка и консервативность. Более того, при сравнении генов scpA и scpB, кодирующих С5а пептидазу стрептококка групп А и В, была выявлена 95-98% гомология их нуклеотидных последовательностей [Chmouryguina I., Suvorov А. и др. Infect. Immun. Jul: 2387-2390 (1996)].
Поверхностная сериновая протеаза CspA (153 кДа), на 38% гомологичная С5а пептидазе, также является фактором патогенности СГВ. Протеаза CspA способна специфически расщеплять альфа цепь фибриногена, участвуя, таким образом, в распространении микроорганизма в крови организма хозяина. Недавно было продемонстрировано, что протеаза CspA способна расщеплять хемокины подсемейства СХС (GRO-α, GRO-β, GRO-γ, NAP-2 (пептид, активирующий нейтрофилы), GCP-2 (гранулоцитарный хемотаксический белок 2). Хемокины подсемейства СХС, также как и С5а компонент комплемента, обладают свойствами анафилотоксина и стимулируют привлечение в очаг инфекции нейтрофилов. Протеаза CspA посредством расщепления хемокинов подсемейства СХС препятствует активации и миграции нейтрофилов, и тем самым участвует в подавлении иммунного ответа организма хозяина [Bryan J.D., Shelver D.W. J Bacteriol. 191(6): 1847-1854 (2009)].
На поверхности СГА была обнаружена сериновая протеаза ScpC с высокой степенью гомологии протеазе CspA. Ген scpC присутствует во всех 12 геномах СГА (M1, М3, М5, М6, M18, М28 и М49 серотипов), представленных в GenBank. Протеаза ScpC расщепляет IL-8, KC ((keratinocyte-derived chemokine), MIP-2 ((macrophage inflammatory protein-2), (GCP-2) и (GRO-α) [Hanski E. и др. EMBO Journal, (2006); Musser J.M. и др. Infect. Immun. (2008)].
2+
ScaAB белок - поверхностный белок СГВ молекулярной массы 37 кДа, который относят к липопротеинам LraI семейства. Основной функцией стрептококковых липопротеинов LraI семейства является связывание ионов Mn и транспорт их в бактериальную клетку [Novak R., Braun J.S. и др. Mol. Microbiol. 29: 1285-1296 (1998); Oetien J., Fives-Taylor P. и др. Infect. Immun. 70 (10): 5706-5714 (2002)]. Липопротеины LraI семейства также необходимы для выживания бактерий в организме хозяина [Tseng H.J., McEwav A.G. и др. Infect. Immun. 70: 1635-1639 (2002)]. Известно, что большинство стрептококковых LraI липопротеинов являются факторами адгезии и коагрегации [Lowe A.M., Lambert Р.А., and Smith A.W. Infect. Immun. 63 (2): 703-706 (1995)]. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей LraI липопротеинов стрептококка различных групп выявил 75-90% гомологию, что свидетельствует о высокой консервативности этих белков [Sutcliffe I.C., and Harrington D.J. Microbiol. 148: 2065-2077 (2002)].
Впервые ген, кодирующий белок ScaAB, был изучен Воробьевой Е.И. и Суворовым А.Н. [Воробьева Е.И. и др., Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 3:9-11 (2005)]. В последующих исследованиях Воробьевой Е.И. с соавторами было продемонстрировано, что ScaAB белок участвует в процессах адгезии СГВ к клеткам эпителия человека и коагрегации СГВ [Vorobieva E.I., Meringova L.F. и др. Folia Microbiol. 50: 172-176 (2005)]. Известно, что адгезия бактериальных клеток к клеткам организма человека играет ведущую роль в колонизации стрептококков. Этот факт учитывали при выборе адгезина ScaAB, в качестве основы для создания рекомбинантного полипептида, входящего в вакцинный комплекс.
Поверхностный адгезии SspB1 (180 кДа) также был отобран для создания пятивалентной вакцины. Доводами в пользу этого выбора стали данные о корреляции тяжелых клинических случаев СГВ инфекций с наличием генов, кодирующих белки данного семейства [Суворов А.Н., Савичева A.M. и др, Ж. Акушерства и женских болезней: 50-56 (2005)]. Необходимо отметить, что в настоящее время описана группа поверхностных СГВ белков, высоко гомологичная SspB1 и обозначенная как SspB2. SspB1 и SspB2 относят к адгезинам системы секреции V типа [Suvorov A.N., Ferretti J.J. J. Basic Microbiol.: 64-74 (2004)].
Прототипом заявляемого изобретения является двухкомпонентный комплекс Р6-ScaAB, включающий в себя рекомбинантные полипептиды Р6 и ScaAB [Грабовская К.Б., Г.Ф. Леонтьева и др. Ж. Микробиол., Эпидемиол. и Иммунобиол. 5: 44-50 (2007)]. Авторами были продемонстрированы хорошие иммуногенные свойства этого комплекса и протективная активность специфических антител. К недостаткам комплекса Р6-ScaAB относится использование адъюванта Фрейнда в ходе иммунизации лабораторных животных. К недостаткам комплекса Р6-ScaAB также относится отсутствие синергетического эффекта при совместной циркуляции анти-Р6 и анти-ScaAB антител в опытах по изучению развития генерализованной СГВ инфекции у мышей, предварительно иммунизированных комплексом P6-ScaAB.
Прототипом заявляемого изобретения также является трехкомпонентный комплекс Р6-ScaAB-ScpB, включающий в себя рекомбинантные полипептиды Р6, ScaAB и ScpB [Суворов А.Н., Леонтьева Л.Ф., и др. Медицинский академический журнал. 10 (2): 32-39 (2010)]. В данном исследовании было продемонстрировано, что применение комплекса Р6-ScaAB-ScpB приводит в ходе иммунизации мышей к индукции специфических антител, обладающих протективными свойствами.
5РП
5РП
5РП
Задачей данного изобретения стало получение комплекса, состоящего из пяти рекомбинантных полипептидов Р6, recScaAB, StV, РВ1 и Csp1a, получившего обозначение К (P6-recScaAB-StV-PB1-Csp1a), обладающего иммуногенными свойствами, причем с синергетическим эффектом в ходе синтеза специфических антител, и выраженными протективными свойствами с синергетическим эффектом комплекса анти-К антител. Получение перечисленных рекомбинантных полипептидов необходимо на основе Вас, ScaAB, С5а пептидазы, SspB1 и CspA СГВ Ia и II серотипов. Комплекс рекомбинантных полипептидов К используют в качестве вакцинного препарата против Streptococcus agalactiae и Streptococcus pyogenes.
Поставленная задача решалась:
а) получением монопрепаратов Р6, recScaAB, StV, РВ1 согласно патентам №2387715, №2378374, Воробьевой Е.И. и др. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология 3: 9-11 (2005), патенту №2542483; получением штамма-продуцента recScaAB и рекомбинантного полипептида recScaAB;
б) получением штамма-продуцента Csp1a и рекомбинантного полипептида Csp1a;
5РП
в) объединением монопрепаратов в определенном соотношении в комплекс P6-recScaAB-StV-PB1-Csp1a, получивший обозначение К.
5РП
Сущностью предлагаемого изобретения является создание уникального комплекса рекомбинантных полипептидов К, обладающего выраженным иммуногенным и протективным эффектами.
5РП
Авторами заявляемого изобретения были определены анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антитела при подкожном введении К млекопитающим (мышам и кроликам).
Авторами заявляемого изобретения изучены:
3РП
1) синергетический эффект индукции специфических антител мыши при применении трехкомпонентного комплекса К (Р6-recScaAB-PB1) по сравнению с монопрепаратами Р6, recScaAB, РВ1;
5РП
2РП
2РП
2) синергетический эффект индукции анти-recScaAB, анти-PB1 и анти-Csp1a антител мыши при применении К по сравнению с двухкомпонентными комплексами К (РВ1-Csp1a) или К′ (recScaAB-Csp1a);
3) протективные свойства комплекса анти-Р6, анти-recScaAB и анти-PB1 антител мыши в отношении СГВ и СГА in vivo;
4) протективные свойства комплекса анти-Р6, анти-recScaAB, анти-PB1 и анти-StV антител кролика в отношении СГВ in vivo;
5) протективные свойства комплекса анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител мыши в отношении СГВ и СГА in vivo, а также в защите новорожденных мышей от генерализованной СГВ инфекции;
5РП
В дополнительных экспериментах также была продемонстрирована безопасность применения рекомбинантных полипептидов Р6, recScaAB и РВ1, входящих в комплекс К, на мышиной модели.
5РП
Новый комплекс рекомбинантных полипептидов К имеет высокую физиологическую стабильность, не обладает какой-либо ферментативной активностью, не токсичен, вызывает синтез анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител с проявлением синергетического эффекта в отношении Streptococcus agalactiae, причем синтезируемые специфические антитела обладают протективными свойствами против Streptococcus agalactiae и Streptococcus pyogenes.
5РП
Новый комплекс К полезен в качестве поливалентного вакцинного препарата для профилактики и лечения бактериальных инфекций, вызванных Streptococcus agalactia и/или Streptococcus pyogenes.
5РП
Получение комплекса рекомбинантных полипептидов К
РП
Результатом заявленного изобретения является создание комплекса К5, состоящего из рекомбинантных полипептидов: Р6, recScaAB, StV, РВ1 и Csp1a.
Рекомбинантные полипептиды Р6, recScaAB, StV, РВ1 и Csp1a получали с использованием генно-инженерных методов. В качестве генетической матрицы для получения фрагментов ДНК (р6, recscaAB, stV, рВ1 и csp1a), кодирующих соответственно Р6, recScaAB, StV, РВ1 и Csp1a, использовали ДНК СГВ штамма 090R Ia (для рВ1 и csp1a) или 219/4849 Ib серотипа (для р6), или 78/471 II серотипа (для recscaAB). Фрагменты ДНК получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и специфических праймеров. Затем фрагменты ДНК разделяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% или 1,5% агарозном геле и выделяли из агарозы с помощью набора «The QIAquick Gel Extraction Kit» (Qiagen, США). Выделенные фрагменты ДНК клонировали с использованием экспрессионных плазмид pQE-30-32 («The QIAexpress System», Qiagen, США). Полученными в результате клонирования рекомбинантными плазмидами затем трансформировали клетки Е.coli M15 или Ε.coli JM 109 (для p6) («The QIAexpress System», Qiagen, США) с помощью «кальциевого метода». Отбор клонов-трансформантов проводили через 18 часов роста клеток при 37°С на плотной среде с 1% L-агаром (Difco, США), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл). В результате клонирования были получены рекомбинантные клоны, несущие рекомбинантные плазмиды, наличие которых определяли с помощью ПЦР с использованием исходных праймеров.
600
2
4
2
4
2
4
2
4
Для получения чистых препаратов рекомбинантных полипептидов клетки штаммов-продуцентов Е.coli культивировали на L-бульоне (Difco, США) с добавлением антибиотиков до поздней логарифмической фазы роста (OD=0,7÷0,9). Затем продукцию рекомбинантных полипептидов индуцировали добавлением изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида (IPTG), и клетки культивировали еще от 4 до 4,5 часа в зависимости от конкретного полипептида. После этого клетки осаждали центрифугированием, отмывали лизирующим буфером А (20 мМ NaHPO, 20 мМ NaHPO, 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазола, рН=7.4) и суспендировали в том же буфере. Суспензию клеток вскрывали ультразвуком. Очистку рекомбинантных полипептидов проводили с использованием Ni-сефарозы (Amersham, США). Полученные после аффинной хроматографии рекомбинантные полипептиды диализовали против 20 мМ NaHPO, 20 мМ NaHPO, рН=7,8 с добавлением 500 мМ NaCl. Чистоту и молекулярную массу рекомбинантных полипептидов определяли с помощью 12% или 14% SDS-PAGE, сравнивая пробег полипептидов с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (№161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса рекомбинантных полипептидов оказалась равной: Р6=(35±0,5) кДа, recScaAB=(37±0,5) кДа, StV=(130±0,5) кДа, РВ1=(43,0±0,5) кДа, Csp1a=(12,0±0,5) кДа.
5РП
Результатом изобретения является комплекс рекомбинантных полипептидов К, который представляет собой смесь Р6, recScaAB, StV, РВ1 и Csp1a в равных долях.
5РП
Комплекс К обладает следующими свойствами:
а) при введении в организм млекопитающим (мышам и кроликам) вызывает синтез анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител;
2РП
2РП
б) при введении в организм млекопитающим (мышам) вызывает повышенный синтез анти-Р6, анти-recScaAB и анти-PB1 антител по сравнению с введением монопрепаратов Р6, recScaAB и РВ1, а также повышенный синтез анти-recScaAB, анти-PB1 и анти-Csp1a антител по сравнению с введением двухкомпонентных комплексов К (РВ1-Csp1a) или К′ (recScaAB-Csp1a);
в) при введении в организм млекопитающих (мышей) не вызывает токсического действия;
г) синтезируемые специфические антитела по п. (а) обладают протективными свойствами в отношении Streptococcus agalactiae и Streptococcus pyogenes;
д) синтезируемые специфические антитела по п. (а) проявляют синергетический протективный эффект на организм млекопитающих (мышей) в отношении Streptococcus agalactiae.
Ниже приводятся конкретные примеры, иллюстрирующие некоторые варианты изобретения, но не ограничивающие его.
Пример 1. Выделение и очистка рекомбинантного полипептида Р6.
Выделение и очистку рекомбинантного полипептида Р6 проводили согласно патенту №2387715 от 07.06.2008 г. Аминокислотная последовательность, состоящая из 294 аминокислотных остатков, приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.
Пример 2. Получение и очистка рекомбинантного полипептида recScaAB. На основе геномной ДНК, выделенной из СГВ 78/471 II серотипа, методом ПЦР был получен ДНК-фрагмент recscaAB (864 п.н.), с использованием специфических праймеров: прямого Sca5 (5′-gctaacaagcaggatcaagc) и обратного Sca2 (5′-aagtcagtttttagattaggatttc). Фрагмент recscaAB был проклонирован с использованием плазмиды pGEM-T Easy (Promega, США). Далее ДНК-фрагмент recscaAB был переклонирован из плазмиды pGEM-Teasy в три экспрессионных вектора pQE-30, pQE-31, pQE-32 («The QIAexpress System», Qiagen, США) с использованием рестриктаз SphI и PstI.
Рекомбинантные плазмидные ДНК pQE30-scaAB, pQE31-scaAB, pQE32-scaAB, несущие фрагмет recscaAB, трансформировали в гетерологичную систему Е. coli M15. Генетическим маркером плазмид pQE-30, pQE-31, pQE-32 был ген amp, кодирующий бета-лактамазу, что обеспечивало устойчивость к ампициллину клеток, несущих данную плазмиду. Трансформацию осуществляли как описано в примере 3. Отбор клонов-трансформантов проводили через 18 часов роста клеток при 37°C на плотной среде с 1% L-агаром (Difco, США), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл).
В результате анализа рекомбинантных клонов после трансформации был отобран клон Е. coli M15, содержащий плазмиду pQE31-scaAB с фрагментом recscaAB, обозначенный как Е. coli M15-recScaAB. Данный клон Е. coli M15-recScaAB, в отличие от клонов, содержащих плазмиды pQE30-scaAB и pQE32-scaAB с фрагментом recscaAB, показал наличие экспрессируемого рекомбинантного белка recScaAB в лизатах культур. Лизаты анализировали методом белкового 12% SDS-электрофореза в полиакриламидном геле. В качестве контроля использовали лизат культуры Е. coli штамма M15, который использовали для трансформации экспрессионных векторов pQE. Клон клеток Е. coli M15-recScaAB был использован для дальнейшей работы как штамм-продуцент.
Для получения чистого препарата recScaAB клетки Е. coli M15-recScaAB культивировали на L-бульоне (Difco, США) с добавлением антибиотиков (ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл)). Продукцию и очистку (с использованием Ni-сефарозы, Amersham, США) recScaAB проводили как описано в примере 3. Молекулярную массу recScaAB определяли с помощью 12% SDS-PAGE, сравнивая пробег полипептида recScaAB с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (№161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса рекомбинантного полипептида recScaAB оказалась равной (37,0±0,5) кДа.
Рекомбинантный полипептид recScaAB содержит аминокислотную последовательность поверхностного белка ScaAB СГВ штамма 78/471 II серотипа с 2 по 289 аминокислотный остаток, ковалентно связанную с 25 аминокислотными остатками, кодируемыми pGEM-T Easy и pQE-31.
Аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида recScaAB приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 2.
Пример 3. Выделение и очистка рекомбинантного полипептида РВ1.
Выделение и очистку рекомбинантного полипептида РВ1 проводили согласно патенту №2378374 от 10.01.2010 г. Аминокислотная последовательность приведена в Перечне последовательностей под номером SEQIDNO: 3.
Пример 4. Выделение и очистка рекомбинантного полипептида StV.
Выделение и очистку рекомбинантного полипептида StV проводили согласно патенту №2542483 от 17.05.2012. Аминокислотная последовательность, состоящая из 1227 аминокислотных остатков, приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 4.
Пример 5. Получение и очистка рекомбинантного полипептида Csp1a.
На основе геномной ДНК, выделенной из СГВ 090R Ia серотипа, методом ПЦР был получен ДНК-фрагмент csp11a (266 п.н.), с использованием специфических праймеров: прямого Csp1 (5′-aaggatccctaacaaaattgacgctgat), несущего на 5′-конце сайт рестрикции для BamHI и обратного Csp2 (5′-agcttctgcaggtaaagaagtatctgttt), несущего на 5′-конце сайт рестрикции для PstI.
Клонирование ДНК-фрагмента csp11a осуществляли с использованием экспрессионной плазмиды pQE-30 («The QIAexpress System», Qiagen, США). При подготовке к клонированию была проведена двойная рестрикция выделенного из агарозы csp11a (266 п.н.) и плазмиды pQE-30 (3462 п.н.) ферментами BamHI и PstI с образованием липких концов. В ходе клонирования была получена рекомбинантная плазмидная ДНК (обозначенная как pQE-csp1a), несущая рекомбинантную ДНК (обозначенную как csp1a и состоящую из 257 п.н. фрагмента гена cspA и 36 п.н. фрагмента плазмиды pQE-30). Рекомбинантную плазмидную ДНК pQE-csp1a трансформировали в гетерологичную систему Е. coli M15. Генетическим маркером плазмидной ДНК pQE-30 был ген amp, кодирующий бета-лактамазу, что обеспечивало устойчивость к ампициллину клеток, несущих данную плазмиду. Трансформацию осуществляли как описано в примере 3. Отбор клонов-трансформантов проводили через 18 часов роста клеток при 37°C на плотной среде с 1% L-агаром (Difco, США), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл). В результате проведенного клонирования были получены рекомбинантные клоны, несущие плазмиду pQE-csp1a с рекомбинантной ДНК csp1a. Один из рекомбинантных клонов получил название Е. coli M15-Csp1a и был использован для дальнейшей работы.
Клон E.coli M15-Csp1a проверяли на способность продуцировать полипептид Csp1a. Для получения чистого препарата Csp1a клетки Е. coli М15-Csp1a культивировали на L-бульоне (Difco, США) с добавлением антибиотиков (ампициллин (100 мкг/мл) и канамицин (25 мкг/мл)). Продукцию и очистку (с использованием Ni-сефарозы, Amersham, США) Csp1a проводили как описано в примере 3. Молекулярную массу Csp1a определяли с помощью 14% SDS-PAGE, сравнивая пробег полипептида Csp1a с пробегом белков известной молекулярной массы (Precision Plus Protein standards (№161-0373), Bio-Rad, США). Молекулярная масса рекомбинантного полипептида Csp1a оказалась равной (12,0±0,5) кДа.
Таким образом, рекомбинантный полипептид Csp1a содержит аминокислотную последовательность поверхностного белка CspA СГВ штамма 090R Ia серотипа с 1249 по 1330 аминокислотный остаток, ковалентно связанную с четырнадцатью аминокислотными остатками, кодируемыми pQE-30 (The QIAexpress System, Qiagen, США).
Аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида Csp1a, состоящая из 96 аминокислотных остатков, приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 5.
Пример 6. Сравнительное изучение динамики изменения титра анти-Csp1a антител в ходе подкожной иммунизации мышей полипептидом Csp1a.
Иммунный ответ приобретенного иммунитета к рекомбинантному полипептиду Csp1a изучали на беспородных белых мышах (самцах, массой 16÷18 г), полученных из питомника «Рапполово», РАМН. Иммунизацию проводили двукратно и подкожно с адъювантом гидроокиси алюминия (Imject Alum, Thermo Scientific, США).
Первой группе мышей из 30 особей вводили 0,2 мл Csp1a пополам с адъювантом. Конечная концентрация Csp1a составляла 100 мкг/мл при первой инъекции и 50 мкг/мл при второй инъекции, которые делали на 1-й и 22-й дни, соответственно. Специфические антитела к Csp1a определяли с 20 по 216 день от начала иммунизации, используя пул сывороток от 3-х животных. Специфические антитела определяли с помощью двухслойного метода иммуноферментного анализа (ИФА).
В лунки полистиролового планшета с высокой сорбционной емкостью (Costar, США) вносили по 100 мкл Csp1a в концентрации 2 мкг/мл. Сорбцию проводили в 100 мМ бикарбонатном буфере (рН=9,45) в течение 16÷20 часов при 4°C. После этого содержимое из планшета удаляли и добавляли в лунки по 150 мкл 0,15 М NaCl, рН=7,4 (PBS), содержащего 0,05% Твин-20 (PBST). Инкубацию проводили при 37°C в течение 30 мин. Содержимое планшета удаляли и трижды промывали PBST. Затем в лунки планшета вносили иммунную или нормальную (в качестве отрицательного контроля) сыворотку (с начальным разведением 1:100) с последующим шагом разведения равным двум. Все разведения осуществляли в PBST, и каждую пробу дублировали. Инкубацию проводили в течение 1 часа при 37°C.
-7
Далее содержимое планшета удаляли и дважды промывали планшет PBST. После этого в лунки добавляли по 100 мкл А-ПХ конъюгата (белок А стафилококка, ковалентно связанный с пероксидазой хрена (Sigma, США) в концентрации 10 моль/л. После часовой инкубации при 37°C содержимое планшета удаляли и трижды отмывали планшет PBST и один раз PBS, чтобы избежать ингибирующего действия Твин-20 на ферментативную активность пероксидазы. Далее для визуализации реакции в лунки планшета вносили по 100 мкл субстратной смеси (0,5 мкг/мл о-фенилендиамин (Sigma, США) в 100 мМ фосфатно-цитратном буфере (рН=5,0), 10 мкл 30% перекиси водорода), которую готовили непосредственно перед применением.
Планшет инкубировали в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре, и реакцию останавливали внесением в лунки по 30 мкл 50% концентрированной серной кислоты. Реакцию регистрировали при длине волны 492 нм с помощью прибора Titertek Multiskan (США).
Через три недели от начала иммунизации в крови мышей регистрировали появление специфических антител к Csp1a.
На фиг. 1. показана динамика изменения титра анти-Csp1a антител в ходе иммунизации мышей Csp1a.
3
3
3
Максимум иммунного ответа наблюдали на 40 день от начала иммунизации с титром антител равным 1:12,8×10. Также отмечали наличие специфических антител через 88 дней с титром 1:3,2×10 и на 216 день с титром 1:1,6×10. Результаты, представленные на фиг. 1, демонстрируют, что введение Csp1a приводило к выраженной индукции анти-Csp1a с пролонгированной циркуляцией в организме мышей.
Пример 7. Сравнительное изучение динамики изменения титра анти-Csp1a антител в ходе подкожной иммунизации кроликов полипептидом Csp1a. Иммунный ответ приобретенного иммунитета к рекомбинантному полипептиду Csp1a изучали на беспородных кроликах (самках, массой 2,5 кг), полученных из питомника «Рапполово», РАМН. Иммунизацию проводили трехкратно и подкожно с адъювантом гидроокиси алюминия (Imject Alum, Thermo Scientific, США). Csp1a вводили в объеме 0,5 мл пополам с адъювантом. Конечная концентрация полипептида была равной 140 мкг/мл при первой инъекции и 70 мкг/мл при второй и третьей инъекциях, которые делали на 1-й, 22-й и 47-й дни, соответственно. Специфические антитела кролика к Csp1a определяли с 1-го по 63-й день от начала иммунизации, используя пул сывороток от 3-х опытных животных. Специфические антитела определяли с помощью ИФА, как описано в примере 6.
На фиг. 2. представлена динамика изменения титра анти-Csp1a антител в ходе иммунизации кроликов Csp1a.
4
Через три недели от начала иммунизации в крови кроликов регистрировали специфические антитела к Csp1a. Анти-Csp1a антитела достигали максимальных значений (1:8,0×10) на 63 день от начала эксперимента. Таким образом, результаты опыта показали интенсивную выработку специфических антител организмом кролика на введение Csp1a.
Пример 8. Изучение протективных свойств анти-Csp1a антител при внутрибрюшинном заражении мышей СГВ 5/70 (Ia).
50
7
Протективные свойства анти-Csp1a антител изучали на мышах в экспериментах in vivo на модели генерализованной инфекции. Беспородных белых мышей (самцов, 18÷20 г) из питомника «Рапполово» в количестве 24 особей сначала иммунизировали по схеме, приведенной в примере 6. Контрольной группе не вводили никаких препаратов. Затем обеим группам мышей внутрибрюшинно вводили суспензию СГВ 5/70 серотипа Ia в летальной дозе LD=7,1×10 КОЕ/мл на сроках с максимальной выработкой антител к введенным полипептидам (35-й день от начала иммунизации). Контроль развития инфекции осуществляли с помощью высева стрептококков из
гомогенатов селезенок мышей на 1% L-агар (Difco, США) с добавлением 5% крови лошади) на разных сроках после заражения СГВ (фиг. 8).
На фиг. 3. показано содержание СГВ в селезенках мышей после внутрибрюшинного заражения мышей СГВ 5/70 (Ia)):
1 - мыши, иммунизированные Csp1a;
2 - мыши без введения препаратов.
8
В течение первых трех часов наблюдали элиминацию стрептококков из селезенок как иммунных, так и контрольных мышей. Через пять часов после заражения мышей в селезенках контрольной группы происходило интенсивное накопление СГВ, достигая значения 10 КОЕ/мл. В противоположность этому продолжалась элиминация стрептококков из селезенок мышей, иммунизированных Csp1a. Полученные данные убедительно показывают протективность специфических антител, индуцированных введением Csp1a.
3РП
Пример 9. Сравнительное изучение динамики изменения титра анти-Р6, анти-RecScaAB и анти-PB1 антител в ходе подкожной иммунизации мышей отдельными полипептидами и комплексом К (P6-recScaAB-PB1).
3РП
3РП
-7
Иммунный ответ приобретенного иммунитета к рекомбинантным полипептидам Р6, recScaAB и РВ1 изучали на беспородных белых мышах (самцах, массой 16÷18 г), полученных из питомника «Рапполово», РАМН. Иммунизацию проводили двукратно и подкожно с адъювантом гидроокиси алюминия (Imject Alum, Thermo Scientific, США). В эксперименте использовали 5 групп из 24 мышей, которым вводили 0,2 мл К (либо отдельные полипептиды) с адъювантом в соотношении объемов 1:1. Конечная концентрация каждого полипептида, входящего в К, составляла 100 мкг/мл при первой инъекции и 50 мкг/мл при второй инъекции, которые делали на 1-й и 22-й дни, соответственно. Конечная концентрация каждого полипептида при индивидуальном введении, составляла 100 мкг/мл при первой инъекции и 50 мкг/мл при второй инъекции, которые делали на 1-й и 22-й дни, соответственно. Специфические антитела к Р6, recScaAB и РВ1 определяли с 21-го по 52-ой дни от начала иммунизации, используя пул сывороток от 3-х животных. Специфические антитела определяли с помощью двухслойного метода иммуноферментного анализа (ИФА). В лунки полистиролового планшета с высокой сорбционной емкостью (Costar, США) вносили по 100 мкл антигена (в данном случае какой-либо из рекомбинантных полипептидов Р6, recScaAB и РВ1) в концентрации 2 мкг/мл. Сорбцию проводили в 100 мМ бикарбонатном буфере (рН=9,45) в течение 16÷20 часов при 4°C. После этого содержимое из планшета удаляли и добавляли в лунки по 150 мкл 150 мМ NaCl, рН=7,4 (PBS), содержащего 0,05% Твин-20 (PBST). Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 мин. Содержимое планшета удаляли и трижды промывали PBST. Затем в лунки планшета вносили иммунную или нормальную (в качестве отрицательного контроля) сыворотку (с начальным разведением 1:100) с последующим шагом разведения равным двум. Все разведения осуществляли в PBST, и каждую пробу дублировали. Инкубацию проводили в течение 1 часа при 37°C. Далее содержимое планшета удаляли, и дважды промывали планшет PBST. После этого в лунки добавляли по 100 мкл А-ПХ конъюгата (белок А стафилококка, ковалентно связанный с пероксидазой хрена (Sigma, США) в концентрации 10 моль/л. После часовой инкубации при 37°С содержимое планшета удаляли и трижды отмывали планшет PBST и один раз PBS, чтобы избежать ингибирующего действия Твин-20 на ферментативную активность пероксидазы. Далее для визуализации реакции в лунки планшета вносили по 100 мкл субстратной смеси (0,5 мкг/мл о-фенилендиамин (Sigma, США) в 100 мМ фосфатно-цитратном буфере (рН=5,0), 10 мкл 30% перекиси водорода), которую готовили непосредственно перед применением. Планшет инкубировали в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре, и реакцию останавливали внесением в лунки по 30 мкл 50% концентрированной серной кислоты. Реакцию регистрировали при длине волны 492 нм с помощью прибора Titertek Multiskan (США).
3РП
ЗРП
Через три недели от начала иммунизации в крови лабораторных животных регистрировали появление специфических антител ко всем трем полипептидам, входящим в комплекс. Результаты, представленные на фиг. 4, 5 и 6, демонстрируют наличие выраженного иммунного ответа приобретенного иммунитета на введение как отдельных полипептидов, так и комплекса К. При этом следует отметить усиление выработки анти-Р6, анти-recScaAB и анти-РВ1 антител при использовании К на всех сроках тестирования по сравнению с монопрепаратами.
3РП
На фиг. 4. представлена динамика изменения титра анти-Р6 антител в ходе иммунизации мышей К и Р6:
3РП
1 - комплекс К;
2 - Р6.
3РП
На фиг. 5. показана динамика изменения титра анти-recScaAB антител в ходе иммунизации мышей К и recScaAB:
3РП
1 - комплекс К;
2 - recScaAB.
3РП
Фиг. 6. иллюстрирует динамику изменения титра анти-PB1 антител в ходе иммунизации мышей К и РВ1:
3РП
1 - комплекс К;
2 - РВ1.
5РП
Пример 10. Сравнительное изучение динамики изменения анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител в ходе внутримышечной иммунизации мышей комплексом К.
5РП
5РП
Иммунный ответ приобретенного иммунитета к рекомбинантным полипептидам Р6, recScaAB, StV, РВ1 и Csp1a, входящим в комплекс К (Р6-RecScaAB-StV-PB1-Csp1a) в равных долях изучали на беспородных мышах (самках, весом 18-20 г), полученных из питомника «Рапполово», РАМН. Иммунизацию проводили внутримышечно и двукратно с промежутком в 20 дней с адъювантом гидроокиси алюминия (Imject Alum, Thermo Scientific, США). В эксперименте использовали 3 группы из 30 мышей. Первой группе вводили 0,1 мл К в дозе 1 мг/кг, с гидроксидом алюминия (Aluminium hydroxide gel adjuvant, ALHydrogel “85”, Brenntag Biosector) в количестве 1,25 мг/доза. Второй группе мышей (контрольной) вводили PBS с гидроксидом алюминия. Третьей группе мышей (контрольной) не водили никаких препаратов. Специфические антитела определяли с 20 по 42 день от начала иммунизации, используя пул сывороток от 4-х животных.
Специфические IgG определяли с помощью ИФА, как описано в примере 9, за исключением выбора конъюгата и субстрата. В качестве конъюгата использовали анти-IgG мыши, связанный с пероксидазой хрена, (Sigma, США).
Для визуализации реакции использовали 0,1 мг/мл ТМВ (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine dihydrochloride Monohydrate, Fluka, Германия) в 100 мМ фосфатно-цитратном буфере (рН=5,0) с добавлением 2 мк 33% перекиси водорода. Планшет инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре, и реакцию останавливали внесением в лунки по 30 мкл 50% концентрированной серной кислоты. Реакцию регистрировали при длине волны 450 нм с помощью прибора Titertek Multiskan (США).
Специфические к компонентам вакцины IgG регистрировали уже на 20 день от начала эксперимента и с максимальными значениями на 35 день.
5РП
На фиг. 7. показана динамика изменения титра анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител в ходе внутримышечной иммунизации мышей К):
1 - анти-Р6 IgG;
2 - анти-recScaAB IgG;
3 - анти-StV IgG;
4 - анти-PB1 IgG;
5 - анти-Csp1a IgG.
6
6
5РП
5РП
Наиболее выраженный иммунный ответ отмечали в отношении recScaAB (1:1,2×10) и StV (1:1,4×10). Титр специфических антител во второй (контрольной) группе мышей на протяжении всего эксперимента оставался в пределах 1:800-1:6400. Титр специфических антител в третьей (контрольной) группе мышей на протяжении всего эксперимента оставался в пределах 1:800-1:3200. Таким образом, установлено, что введение мышам внутримышечно К приводит к стимуляции продукции специфических антител ко всем полипептидам, входящим в комплекс К.
5РП
2РП
Пример 11. Сравнительное изучение динамики изменения анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител в ходе подкожной иммунизации кроликов комплексами К и К.
5РП
2РП
5РП
2РП
Иммунный ответ приобретенного иммунитета к рекомбинантным полипептидам Р6, recScaAB, StV, РВ1 и Csp1a, входящим в комплексы К и К, изучали на беспородных кроликах (самках, массой 2,5 кг), полученных из питомника «Рапполово», РАМН. Иммунизацию проводили трехкратно и подкожно с адъювантом гидроокиси алюминия (Imject Alum, Thermo Scientific, США). В эксперименте использовали 3 группы из 3-х кроликов. Первой группе вводили 0,5 мл К, второй группе вводили 0,5 мл К (двухкомпонентный комплекс РВ1-Csp1a) и третьей группе (контрольной) вводили 0,5 мл PBS.
5РП
2РП
Препараты вводили с адъювантом в соотношении объемов 1:1. Конечная концентрация каждого полипептида, входящего в К или К, составляла 140 мкг/мл при первой инъекции и 70 мкг/мл при второй и третьей инъекции, которые делали на 1-й, 22-й и 47-й дни, соответственно. Специфические антитела кролика к Р6, recScaAB, StV, РВ1 и Csp1a определяли с 22-го по 61-й день от начала иммунизации, используя пул сывороток от 3-х опытных животных (фиг. 8, 9, 10). Специфические антитела определяли с помощью ИФА, как описано в примере 9.
5РП
На фиг. 8. показана динамика изменения титра анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител в ходе иммунизации кроликов К:
1 - анти-Р6 антитела;
2 - анти-recScaAB антитела;
3 - анти-StV антитела;
4 - анти-РВ1 антитела;
5 - анти-Csp1a антитела.
2РП
На фиг. 9. представлена динамика изменения титра анти-PB1 и анти-Csp1a антител в ходе иммунизации кроликов К:
1 - анти-РВ1 антитела;
2 - анти-Csp1a антитела.
На фиг. 10. показана динамика изменения титра анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител в ходе введения кроликам PBS):
1 - анти-Р6 антитела;
2 - анти-recScaAB антитела;
3 - анти-StV антитела;
4 - анти-РВ1 антитела;
5 - анти-Csp1a антитела.
5РП
2РП
5РП
5РП
2РП
5РП
2РП
Через три недели от начала иммунизации в крови лабораторных животных регистрировали появление специфических антител ко всем полипептидам, входящим в комплексы К либо К. Специфических антитела достигали максимальных значений на 58-й день, причем наиболее выраженный иммунный ответ наблюдали в отношении recScaAB (1:768000) и Р6 (1:512000) в ходе иммунизации К. Титр специфических антител в контрольной группе кроликов на протяжении всего эксперимента оставался в пределах 1:800-1:3200 (фиг. 10). Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что введение кроликам К либо К приводила к выраженному иммунному ответу приобретенного иммунитета по отношению к полипептидам, входящим в К либо К.
Пример 12. Изучение протективных свойств анти-Р6, анти-recScaAB и анти-PB1 антител при внутрибрюшинном заражении мышей СГВ.
3РП
50
7
Протективную эффективность анти-Р6, анти-recScaAB и анти-PB1 антител изучали в экспериментах in vivo на модели генерализованной инфекции. Лабораторным мышам (самцам, 18 г) из питомника «Рапполово» сначала вводили подкожно К (комплекс полипептидов Р6-recScaAB-PB1 в равных долях) или PBS по схеме иммунизации, упомянутой ранее в примере 9, или без введения препаратов (интактные мыши). Затем обеим группам мышей из 16 особей внутрибрюшинно вводили суспензию СГВ Н36 (Ibc) в летальной дозе (LD=9,5×10 КОЕ/мл) на сроках с максимальной выработкой антител к введенным полипептидам (35-й день от начала иммунизации). Контроль развития инфекции осуществляли с помощью высева стрептококков из гомогенатов селезенок мышей на 1% L-агар (Difco, США) с добавлением 5% крови лошади) на разных сроках после заражения СГВ (табл. 1).
3РП
Как видно из данных таблицы 1, в группе интактных мышей с 1-го по 3-й час после заражения мышей шло накопление СГВ в селезенках с последующей гибелью мышей. В опытной группе в течение того же периода времени проходила элиминация СГВ из селезенок мышей. Таким образом, результаты опыта показали, что комплекс К индуцировал синтез специфических антител, обладающих протективной активностью по отношению к стрептококку группы В.
Пример 13. Изучение протективных свойств анти-Р6, анти-recScaAB и анти-PB1 антител при внутрибрюшинном заражении мышей СГА.
3РП
50
7
Лабораторным мышам (самцам, 18 г) из питомника «Рапполово» сначала вводили подкожно К или PBS (в качестве контроля) по схеме иммунизации, упомянутой ранее в примере 9. Затем обеим группам мышей по 16 особей внутрибрюшинно вводили суспензию СГА SF 370 (M1) в летальной дозе (LD=8,5×10 КОЕ/мл) на сроках с максимальной выработкой антител к введенным полипептидам (35-й день от начала иммунизации). Контроль развития инфекции осуществляли с помощью высева стрептококков из гомогенатов селезенок мышей на 1% L-агар (Difco, США) с добавлением 5% крови лошади на разных сроках после заражения СГА (табл. 2). В табл. 2 представленные усредненные данные по 3-м особям. Среднестатистическую погрешность рассчитывали, используя программу «Microsoft Excel».
3РП
В течение первых трех часов после заражения животных в контрольной группе шла незначительная элиминация СГВ из селезенок мышей. После трех часов в контрольной группе регистрировали накопление стрептококков в селезенках мышей. В опытной группе мышей с первых часов эксперимента наблюдали выраженную элиминацию стрептококков из селезенки мышей. Таким образом, результаты опыта показали, что комплекс К индуцировал синтез специфических антител, обладающих протективной активностью по отношению к стрептококку группы А.
Пример 14. Изучение протективных свойств комплекса анти-Р6, анти-recScaAB, анти-PB1 и анти-StV антител кролика при интраназальном заражении мышей СГВ.
4АРП
Протективную активность комплекса анти-Р6, анти-recScaAB, анти-PB1 и анти-StV антител кролика (К) изучали в экспериментах in vivo, используя модель развития генерализованной инфекции при интраназальном заражении мышей. Иммунные сыворотки кролика были получены в результате подкожной иммунизации монопрепаратами (Р6, recScaAB, РВ1 и StV) по схеме иммунизации, описанной в примере 7. В эксперименте использовали сыворотки кролика с титром специфических антител:
анти-Р6 - 1:800000;
анти-recScaAB - 1:960000;
анти-StV - 1:400000;
анти-PB1 - 1:400000.
4АРП
50
7
Стрептококки инкубировали с комплексом анти-Р6, анти-recScaAB, анти-PB1 и анти-StV сывороток кролика в равном соотношении (1:1:1:1) и с каждой иммунной антисывороткой кролика отдельно в течение 2 часов при 4°С. Иммунные антисыворотки перед инкубацией разводили в пять раз раствором PBS. В эксперименте использовали 5 групп мышей по 8 особей в каждой группе. Мышам вводили интраназально под эфирным наркозом по 20 мкл каждой иммунной антисыворотки и комплекс К. Через 2 часа животных под эфирным наркозом интраназально заражали СГВ 090R (Ia) по 20 мкл в в летальной дозе (LD=3,5×10 КОЕ/мл). Контроль развития инфекции осуществляли с помощью высева стрептококков из гомогенатов легких мышей на 1% L-агар (Difco, США) с добавлением 5% крови лошади.
4АРП
На фиг. 11. графически отражено содержание СГВ в легких мышей при пассивной защите анти-Р6, анти-recScaAB, анти-PB1 и анти-StV антителами кролика при использовании моно антисывороток и К через три часа после интраназального заражения мышей СГВ 090R (Ia)).
4АРП
4АРП
5
5
5
Через три часа после заражения мышей регистрировали практически полное очищение легких мышей при использовании комплекса К. На этом же сроке наблюдали снижение количества СГВ в легких мышей при использовании моно антисывороток. Анти-Р6 и анти-РВ1 сыворотки приводили к более активной элиминации СГВ из легких мышей (1,8×10) по сравнению с анти-recScaAB (3,2×10) и анти-StV (2,8×10) сыворотками. Тем не менее, на данном сроке ни одна из используемых антисывороток не приводила к полной элиминации СГВ из легких мышей по сравнению с использованием этих антисывороток в комплексе К. Данный результат свидетельствует о синергетическом эффекте анти-Р6, анти-recScaAB, анти-PB1 и анти-StV антител кролика в защите мышей от развития генерализованной СГВ инфекции.
Пример 15. Изучение протективных свойств комплекса анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител мыши при интраназальном заражении мышей СГВ.
5РП
Протективные свойства комплекса анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител мыши изучали в экспериментах in vivo, используя модель развития генерализованной инфекции при интраназальном заражении мышей. На первом этапе лабораторным мышам (самцам, массой 16÷18 г) из питомника «Рапполово» по 12-15 мышей в двух группах вводили подкожно К или PBS (в качестве контроля) по схеме иммунизации, приведенной ранее в примере 9.
8
На 35 день от начала иммунизации мышам в опытных группах вводили интраназально под эфирным наркозом по 20 мкл суспензии СГВ Н36 (Ib) в концентрации 1,2×10 КОЕ/мл. Контроль развития стрептококковой инфекции осуществляли в течение 48 часов с помощью высева стрептококков из гомогенатов легких мышей (по 3-4 мыши на каждом сроке) на 1% L-агар (Difco, США) с добавлением 5% крови лошади.
5РП
На фиг. 12. показано содержание СГВ в легких мышей, иммунизированных К, после интраназального заражения СГВ Н36 (Ib)):
5РП
1 - иммунизированные К мыши;
2 - контрольные мыши.
5РП
5РП
3
4
8
8
2
4
Результаты опыта показали практически полное очищение легких от СГВ через 30 часов и позже (48 часов) у мышей, иммунизированных К. В противоположность этому, в контрольной группе мышей через 30 часов от начала заражения происходило накопление СГВ в легких до значений 10-10 КОЕ/мл и даже 10 КОЕ/мл. Накопление СГВ в легких мышей до 10 КОЕ/мл сопровождалось гибелью животных. К 48 часам после начала заражения в контрольной группе мышей регистрировали наличие СГВ в легких 10-10 КОЕ/мл. Полученные данные свидетельствуют об опсонизирующей эффективности специфических антител, вырабатываемых организмом мышей в ответ на введение комплекса К, при развитии генерализованной СГВ инфекции.
Пример 16. Изучение протективных свойств комплекса анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител мыши при интраназальном заражении мышей СГА.
8
Протективные свойства комплекса анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител мыши изучали в экспериментах in vivo по схеме, описанной в примере 15. Отличие данного эксперимента состояло в заражении мышей интраназально СГА SF370 (M1) в концентрации 1,2×10 КОЕ/мл. Контроль развития стрептококковой инфекции осуществляли в течение 48 часов как описано в примере 15.
5РП
На фиг. 13. представлено содержание СГА в легких мышей, иммунизированных К, после интраназального заражения мышей СГА SF370 (M1)):
5РП
1 - иммунизированные К мыши;
2 - контрольные мыши.
5РП
5РП
5
9
8
Через 30 часов после заражения регистрировали полное очищение легких от СГА у мышей, иммунизированных К. В противоположность этому, в контрольной группе мышей через 30 часов от начала заражения происходило накопление СГА в легких до значений 10-10 КОЕ/мл. Накопление СГВ в легких мышеи до 10 КОЕ/мл сопровождалось гибелью животных. Полученные данные свидетельствуют об опсонизирующей эффективности специфических антител, вырабатываемых организмом мышей в ответ на введение комплекса К, при развитии генерализованной СГА инфекции.
Пример 17. Изучение протективных свойств комплекса анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител мыши в защите новорожденных мышей от генерализованной СГВ инфекции.
5РП
2РП
2РП
Эксперимент проводили на беспородных белых мышах (самки, массой 18÷20 г), полученных из питомника «Рапполово», РАМН. На первом этапе проводили иммунизацию трехкратно и подкожно с адъювантом гидроокиси алюминия по схеме, описанной в примере 9. В отличие от схемы иммунизации в примере 9 дополнительно делали третью инъекцию на 43-й день с концентрацией 50 мкг/мл каждого полипептида, входящего в комплекс. В опыте использовали пять групп мышей по 6 особей в каждой группе. Первым трем группам мышей вводили три разных полипептидных комплекса: К (Р6-recScaAB-StV-PB1-Csp1a), К (PB1-Csp1a) и К′ (recScaAB-Csp1a). Четвертой группе мышей (контрольной) вводили PBS, и пятой группе мышей (контрольной) не вводили никаких препаратов - интактные самки.
Для индукции овуляции на 30 день от начала опыта всем самкам внутрибрюшинно вводили 0,1 мл фоллигона (Intervet, Голландия) 10 ед. на самку. На третий день всем самкам внутрибрюшинно вводили 0,1 мл холурона (Intervet, Голландия) 10 ед. на самку и подсаживали к интактным самцам. Беременность проходила в течение 17-21 дня. Через 17-21 день получали потомство в количестве от 5 до 11 новорожденных мышей от одной самки.
100
7
Новорожденным мышатам (1,6-1,9 г) на второй день жизни внутрибрюшинно вводили летальную дозу (LD=2,2×10) СГВ 5/70 (Ia) и наблюдали в течение 7 дней. Гибель новорожденных мышей от стрептококковой инфекции подтверждали высевом СГВ из гомогенатов селезенок на 1% L-агар (Difco, США) с 5% кровью лошади.
Средний процент выживших новорожденных мышей рассчитывали по формуле: (выжившие/общее количество)×100%.
Результаты приведены на фиг. 14. где представлена выживаемость новорожденных мышей в опытных группах после внутрибрюшинного заражения СГВ 5/70 (Ia):
5РП
1 - новорожденные мыши, полученные от самок, иммунизированных К;
2РП;
2 - новорожденные мыши, полученные от самок, иммунизированных К′
2РП
3 - новорожденные мыши, полученные от самок, иммунизированных К.
5РП
2РП
2РП
2РП
2РП
Наиболее эффективной оказалась иммунизация самок мышей К по сравнению с иммунизацией К′ и К, что обеспечило 50% выживаемость новорожденных мышей. Иммунизация самок мышей К′ и К обеспечила 22% и 13%) выживаемость новорожденных мышей, соответственно. В контрольной группе наблюдали 100% гибель новорожденных мышей в течение первых суток после заражения СГВ, полученных от интактных самок. Также регистрировали 100% гибель новорожденных мышей на вторые сутки после заражения, полученных от самок, иммунизированных PBS.
Результаты приведены на фиг. 15, где показана выживаемость новорожденных мышей в контрольных группах после внутрибрюшинного введения СГВ 5/70 (Ia)):
1 - новорожденные мыши, полученные от самок, иммунизированных PBS с адъювантом;
2 - новорожденные мыши, полученные от интактных самок.
5РП
Надо отметить, что в группе самок, иммунизированных комплексом К, на вторые сутки после заражения потомства отмечали 72% выживших новорожденных мышей.
5РП
2РП
2РП
Пример 18. Сравнительное изучение динамики изменения титра анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1a антител взрослых и новорожденных мышей, в ходе подкожной иммунизации взрослых самок К, К или К′.
Для подтверждения роли специфических IgG в защите новорожденных мышей от генерализованной СГВ инфекции изучали сыворотку выживших новорожденных мышей на наличие специфических IgG. Из каждой группы иммунизированных самок тестировали сыворотку от 3-4 новорожденных мышей (7 дней жизни) в ИФА как описано в примере 9, за исключением выбора конъюгата и субстрата. В качестве конъюгата использовали анти-IgG мыши, связанный с пероксидазой хрена, (Sigma-Aldrich, США). Для визуализации реакции использовали 0,1 мг/мл ТМВ (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine dihydrochloride Monohydrate, Fluka, Германия) в 100 мМ фосфатно-цитратном буфере (рН=5,0) с добавлением 2 мк 33% перекиси водорода. Планшет инкубировали в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре, и реакцию останавливали внесением в лунки по 30 мкл 50% концентрированной серной кислоты. Реакцию регистрировали при длине волны 450 нм с помощью прибора Titertek Multiskan (США).
Результаты опыта представлены на фиг. 16-21.
5РП
Фиг. 16. Динамика изменения титра анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1 IgG в ходе подкожной иммунизации взрослых мышей К:
1 - анти-Р6 IgG;
2 - анти-recScaAB IgG;
3 - анти-StV IgG;
4 - анти-Csp1a IgG;
5 - анти-PB1 IgG.
5РП
Фиг. 17. Титр анти-Р6, анти-recScaAB, анти-StV, анти-PB1 и анти-Csp1 IgG новорожденных мышей в результате подкожной иммунизации взрослых мышей (самок) К:
1 - анти-Р6 IgG;
2 - анти-recScaAB IgG;
3 - анти-StV IgG;
4 - анти-Csp1a IgG;
5 - анти-PB1 IgG.
2РП
Фиг. 18. Динамика изменения титра анти-recScaAB и анти-Csp1a IgG в ходе подкожной иммунизации взрослых мышей К′:
1 - анти-recScaAB IgG;
2 - анти-Csp1a IgG.
2РП
Фиг. 19. Титр анти-recScaAB и анти-Csp1a IgG новорожденных мышей в результате подкожной иммунизации взрослых мышей (самок) К′:
1 - анти-recScaAB IgG;
2 - анти-Csp1a IgG.
РП
Фиг. 20. Динамика изменения титра анти-PB1 и анти-Csp1a в ходе подкожной иммунизации взрослых мышей К2:
1-анти-PB1 IgG;
2 - анти-Csp1a IgG.
РП
Фиг. 21. Титр анти-PB1 и анти-Csp1a IgG новорожденных мышей в результате подкожной иммунизации взрослых мышей (самок) К2:
1 - анти-PB1 IgG;
2 - анти-Csp1a IgG.
5
5
5
5РП
2РП
2РП
В ходе иммунизации взрослых мышей наиболее высокий титр специфических IgG регистрировали против recScaAB (1:9,2×10) и StV (1:3,6×10). У выживших новорожденных мышей отмечали специфические антитела против всех полипептидов, входящих в К, К или К′. Самый высокий титр специфических антител у новорожденных мышей отмечали против recScaAB (1:1,4×10). Полученные данные еще раз подтверждают способность материнских антител класса G проходить через плацентарный барьер и эффективно защищать новорожденных от СГВ инфекции.
5РП
2РП
<mrow><msubsup><mi>К</mi><mrow><mn>2</mn><mi>Р</mi><mi>П</mi></mrow><mo>'</mo></msubsup></mrow>
Кроме того, надо отметить выраженный синергетический эффект в продукции специфических антител при иммунизации взрослых мышей К по сравнению с К или
(табл. 3).
5РП
2РП
5РП
<mrow><msubsup><mi>К</mi><mrow><mn>2</mn><mi>Р</mi><mi>П</mi></mrow><mo>'</mo></msubsup></mrow>
<mrow><msubsup><mi>К</mi><mrow><mn>2</mn><mi>Р</mi><mi>П</mi></mrow><mo>'</mo></msubsup></mrow>
Табл. 3 демонстрирует более высокое значение анти-recScaAB, анти-PB1 и анти-Csp1a антител в ходе иммунизации взрослых мышей при применении К по сравнению с применением К или
. Так, например, титр анти-recScaAB антител при применении К был более, чем в три раза выше по сравнению с применением
.
5РП
Пример 19. Изучение безопасности рекомбинантных полипептидов Р6, recScaAB, РВ1, входящих в комплекс К.
5РП
Исследование безопасности рекомбинантных полипептидов Р6, recScaAB, РВ1, входящих в комплекс К) проводили на четырех группах белых беспородных мышей из питомника «Рапполово». Каждая группа состояла из шести самцов и шести самок весом 15-16 г. Трем группам мышей вводили внутрибрюшинно терапевтическую дозу (30 мкг на мышь) и дозу, в 10 раз превышающую терапевтическую (300 мкг на мышь) Р6, recScaAB и РВ1 в объеме 0,2 мл раствора PBS. Контрольной группе мышей вводили 0,2 мл PBS. Утром ежедневно до кормления в течение 14 дней определяли массу тела, а также ряд показателей, характеризующих жизненную активность мышей (табл. 4, 5).
После введения Р6, recScaAB и РВ1 наблюдали постоянное и равномерное нарастание веса животных и не отмечали каких-либо отклонений по сравнению с контрольной группой мышей. Выборочное вскрытие опытных мышей на 15-й день также не выявило каких-либо патологий основных внутренних органов по сравнению с контрольной группой. Также не было отмечено каких либо отличий по нарастанию веса и другим показателям между самцами и самками.
5РП
Таким образом, эксперименты подтвердили полную безопасность для организма животных рекомбинантных полипептидов Р6, recScaAB и РВ1, входящих в комплекс К.