УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ ТЕСТ ДЛЯ CSFV АНТИТЕЛ
IMPROVED DIAGNOSTIC TEST FOR CSFV ANTIBODIES

Настоящее изобретение относится к области диагностики в ветеринарии, в частности, к тесту для обнаружения антител против CSFV. В частности, изобретение относится к способу обнаружения антител против CSFV дикого типа в тестируемом образце. Кроме того, изобретение относится к набору для диагностического теста и к использованию способа обнаружения антител против CSFV дикого типа. Вдобавок, изобретение относится к способу дифференциации между животными, инфицированными CSFV дикого типа, и животными, которых вакцинировали против CSFV с использованием CSFV вакцины, и к способу управления инфекцией CSFV дикого типа в популяции животных свиней.
Известны различные тесты для серодиагностики инфекции микроорганизмом, чтобы определять, что человек или животное является положительным или отрицательным или по микроорганизму или по антителам против микроорганизма. Типично такие тесты включают способы обнаружения иммунных комплексов, которые можно формировать с использованием другого антитела для обеспечения специфичности. Часто тест также имеет стадию усиления силы сигнала и одну или несколько стадий смывания несвязанных, неспецифичных или нежелательных компонентов. Обнаружение иммунных комплексов может происходить различными способами, например, оптическими посредством обнаружения изменения цвета, флуоресценции или изменения размера частицы, или альтернативно посредством обнаружения радиоактивно-меченых антигенов или антител в иммунных комплексах. Аналогичным образом, физическая форма теста может варьировать широко и может, например, использовать микротитровальный планшет, мембрану, тест-полоску, микросхему биодатчика, гелевую матрицу или раствор, содержащий частицы (микро)носителя, такие как латекс, металл или полистирол, и т.д.
Выбор конкретной схемы такого теста обычно определяется типом входного образца, желаемой чувствительности (чтобы правильно идентифицировать положительный образец) и специфичности (чтобы правильно проводить различия между истинно положительными и истинно отрицательными образцами) теста; такие свойства зависят от силы и временных параметров иммунного ответа или присутствия микроорганизма. Дополнительные требования к экономическим аспектам теста, таким как его применимость в большом масштабе и его стоимость, могут влиять на выбор конкретного формата.
Хорошо известные диагностические тесты: радиоиммунологические анализы, иммунодиффузия, иммунофлуоресценция, иммунопреципитация, агглютинация, гемолиз, нейтрализация и «твердофазный иммуноферментный анализ», или ELISA. В частности, для тестирования в большом масштабе, требованием может являться автоматизация манипуляций с жидкостями, считывания и обработки результатов или, или того и другого. Это также может требовать замены традиционного формата анализа на более современный и миниатюризованный формат, такой как AlphaLISA™ (Perkin Elmer).
Часто используемым диагностическим тестом является иммуноферментный анализ, такой как ELISA. Его легко масштабировать, и он может быть очень чувствительным. Дополнительным преимуществом является динамический диапазон его результатов, поскольку образцы можно тестировать в определенном диапазоне разведений. Результаты выражают в произвольных единицах поглощения, типично в виде оптической плотности (OD) от 0,1 до 2,5 единицы, в зависимости от свойств и настроек технологического оборудования, используемого для считывания. Обычным образом, включены подходящие положительные и отрицательные контрольные образцы, и в большинстве случаев образцы тестируют многократно. Стандартизации добиваются посредством включения (в определенном диапазоне разведений) определенного эталонного образца, который также делает возможным согласование определенной оценки с данными значениями для определения положительных или отрицательных проб, и делает возможной корреляцию с биологическим смыслом, например: количество антигена с активностью, или количество антитела с уровнем иммунной защиты.
Известно множество вариантов схемы ELISA, но типично используют иммобилизацию антигена или антитела на твердой фазе, например, в лунке микротитровального планшета. Когда иммобилизуют антитело, тест называют ELISA «с захватом» или «сэндвич» ELISA. Затем добавляют тестовый образец, позволяя связываться с лигандом (например, антигеном или антителом, подлежащим обнаружению). Затем добавляют детектор (антитело, антиген или другой связывающий компонент), который конъюгирован с меткой, например, с ферментом, который может вызывать цветную реакцию, которую можно считывать спектрофотометрически. Другие типы меток могут использовать люминесценцию, флуоресценцию или радиоактивность. Использование меченого детектора предусмотрено для того, чтобы обеспечивать увеличение силы сигнала, чтобы повышать чувствительность теста, однако, также оно может вводить фоновый сигнал, снижающий отношение сигнала к шуму.
В одном из вариантов протокола ELISA специфичность теста повышают посредством введения конкурентного связывания, в случае которого тест называют «конкурентным», «ингибирующим», «интерферирующим» или «блокирующим» ELISA. В таком анализе некоторый фактор в тестовом образце (антитело или антиген) конкурирует с меченым детекторным антителом/антигеном за связывание с молекулой (антигеном или антителом), иммобилизованной на твердой фазе. Это вызывает снижение максимального цветного сигнала, что является чувствительным путем для того, чтобы измерять присутствие или количество конкурирующего фактора. Результат можно выражать в виде процентной доли ингибирования максимального сигнала ELISA.
В силу его универсальности и чувствительности, ELISA используют в целом, например, в эпидемиологии, программах контроля инфекций или для того, чтобы верифицировать эффект компании по вакцинации. Эти использование ELISA также распространяется на сектор здравоохранения животных, например, чтобы осуществлять мониторинг мер эрадикации и контроля относительно значимых инфекционных заболеваний. Критичным в этом контексте является достаточный уровень чувствительности и специфичности диагностического теста, поскольку недостатки в этом отношении могут иметь серьезные последствия так или иначе: ложные положительные пробы могут влечь ненужный карантин или выбраковку животных, а ложные отрицательные пробы влечь за собой распространение патогена посредством транспортировки незащищенных животных-носителей через границы. Одним из примеров такого использования ELISA является контроль заболеваний, подлежащий регистрации в OIE, таких как классическая чума свиней (CSF) у животных свиней.
CSF, также известная как холера свиней или чума свиней, представляет собой часто фатальное заболевание животных свиней, которое встречается по всему миру. Оно обусловлено вирусом классической чумы свиней (CSFV), также известным как вирус холеры свиней, который является высоко инфекционным. Заболевание влечет сильные страдания животных и существенные экономические потери в секторах, зависящих от коммерческого свиноводства и его продуктов.
CSFV относится к семейству Flaviviridea и к роду Pestivirus. Общеизвестные другие Pestivirus представляют собой вирус пограничной болезни (BDV), который инфицирует овец и свиней, и вирус диареи крупного рогатого скота (BVDV), который инфицирует крупный рогатый скот, овец и свиней. Между этими родственными вирусами возникает некоторый уровень перекрестной защиты. Вирион CSF является относительно маленьким, имеет оболочку и содержит положительный смысловой одноцепочечных РНК вирусный геном приблизительно из 12,3 т. п. н. Этот геном транслируется в один большой полипротеин приблизительно из 4000 аминокислот, который подвергается авторасщеплению с помощью нескольких неструктурных вирусных белков. Результатом этого являются основные структурные вирусные оболочечные гликопротеины: Erns, E1 и E2. Обзор вируса и заболевания им см. В Moennig (2000, Vet. Microbiol., том 73, стр. 93).
Золотым стандартом для обнаружения антител против CSFV является тест нейтрализации вируса. Однако поскольку он является трудоемким и сложным, тесты типа ELISA используют для быстрого скрининга и обнаружения, и для обнаружения антигена CSFV или антител к CSFV доступны различные коммерческие тесты. Обзор таких тестов приведен в Blome et al. (2006, Rev. Sci. Tech. (Int. Off. Epiz.), том 25, стр. 1025). Тесты на антиген CSFV обнаруживают или целый вирус или специфичные вирусные (оболочечные) белки, такие как Erns или E2. Аналогичным образом, тесты на антитела к CSFV обнаруживают антитела к вирусу, E2 или Erns. Обнаружение антител в целевом животном является более чувствительным, чем обнаружение антигена или вируса, поскольку антитела присутствуют в животном в течение более длительного времени, обеспечивая более широкий временной интервал для обнаружения. Кроме того, в силу перекрестной реактивности среди Pestivirus, диагностические тесты для CSFV на основании обнаружения антигена Erns или антител к Erns не является надежным в регионах с высокой распространенностью BVD и/или BVDV. Следовательно, современная диагностика CSFV сосредоточена на обнаружении антител против белка E2 CSFV. Обзор: Schroeder et al. (2012, Rev. Sci. Tech. (Int. Off. Epiz.), том 31, стр. 997).
Белок E2 CSFV (ранее известный как гликопротеин E1 или gp51-54) кодируют аминокислоты (а. о.) от положения 690 в полипротеине CSFV. Зрелый белок E2 CSFV составляет приблизительно 370 а. о. в длину, без N-концевой сигнальной последовательности приблизительно в 22 а. о., которая перекрывает C-конец E1, но содержит C-концевую трансмембранную область приблизительно в 40 а. о. (Ganges et al., 2005, Vaccine, том 23, стр. 3741). В E2 иммунодоминантный домен расположен между аминокислотными положениями 766 и 866 полипротеина (van Rijn et al., 1993. J. of Gen. Virol., том 74, стр. 2053). Внутри этого домена идентифицирован один линейный B-клеточный эпитоп, который индуцирует антитела, нейтрализующие вирус: эпитоп TAVSPTTLR (SEQ ID № 1). Этот эпитоп расположен в полипротеине CSFV в аминокислотных положениях 829-837, соответствующих а. о. 140-148 в аминокислотной последовательности E2, и обладает высокой консервативностью среди штаммов CSFV, но не обладает перекрестной реактивностью с антителами к BVDV или BVD (Lin et al., 2000, J. of Virol., том 74, стр. 11619).
Разработано множество коммерческих тестов с антителами к E2, в которых используют специфичность этого эпитопа: PrioCHECK CSFV Ab 2.0 (предыдущее название Ceditest CSFV 2.0) (оба: Prionics AG, Schlieren-Zurich, Switzerland) и IDEXX CSFV Ab Test (IDEXX Europe B.V., Hoofddorp, Netherlands). Эти тесты представляют собой конкурентные ELISA, в которых используют иммобилизованный белок E2 CSFV. Когда какие-либо антитела к E2 присутствуют в тестовом образце, они связываются с иммобилизованным E2 CSFV и, таким образом, конкурируют с меченым индикаторным антителом, которое представляет собой моноклональное антитело, конъюгированное с ферментом, специфичное к эпитопу TAVSPTTLR из E2 CSFV дикого типа; меченые моноклональные антитела, используемые в качестве индикатора в этих наборах, называют V2 (Prionics) или A18 (IDEXX), и они обладают той же специфичностью, что и моноклональное антитело WH303, использованное Lin et al. (2000, выше).
Известны вакцины против CSF, которые используют обычным образом в странах, где CSFV является эндемиком. Поскольку инактивированные вакцины от CSFV непрактичны, в течение многих лет использовали живые аттенуированные противовирусные вакцины; наиболее эффективные из них основаны на так называемом китайском или C-штамме. Существует обширный опыт многолетнего использования, а также только живая аттенуированная вакцина разрешена в Европейском союзе, но только для экстренной вакцинации в случае вспышки CSF. Часто предусмотрены программы правительственного контроля CSF (например, EU Council Directive 2001/89/EC) с помощью систем торговых ограничений, запрещающих транспортировку свиней, которые являются сероположительными по антителам против CSFV.
Однако некоторые страны могут страдать частыми повторными инфекциями из естественного резервуара CSFV в диких свиньях и кабанах. Следовательно, происходят случайные вспышки CSF и отбраковывают множество свиней, как инфицированных, так и не инфицированных. Это является причиной множества этических вопросов, а также существенных затрат. Кроме того, свиней, которые прошли экстренную вакцинацию, больше нельзя экспортировать, поскольку они становятся сероположительными. Это вызывает переполнение хлевов и дополнительные экономические потери.
Следовательно, усилия, сосредоточенные на разработке вакцин, которые делают возможной серологическую «дифференциацию инфицированных и вакцинированных животных» или «DIVA». Основной принцип, лежащий в основе различающего теста этого типа, состоит в том, что вакцинация целевого животного с использованием вакцины, которая имеет функцию положительного или отрицательного «маркера», можно серологически дифференцировать от инфекции животного микроорганизмом дикого типа. Например, у маркерной вакцины может не доставать одного или нескольких антигенов, которые присутствуют у микроорганизма дикого типа. Тогда инфицированная мишень будет становиться сероположительной по этому антигену, а вакцинированные организмы будут оставаться сероотрицательными по этому антигену.
Один класс вакцин DIVA, разработанных для использования против CSF, основан на вирусных субъединицах, таких как E2 и/или Erns. Однако они являются менее защитными и имеют более медленное начало иммунитета, чем цельновирусные вакцины.
Также в режиме невакцинации и полного санитарного убоя при CSFV, единственным путем, который будет разрешен на рынке, является такая CSFV маркерная вакцина в комбинации с надежным сопроводительным диагностическим тестом.
С целью объединения в одной вакцине сильной и ранней защиты, а также способности к DIVA, существующую живую аттенуированную вакцину из C-штамма CSFV модифицировали с использованием способов рекомбинантной ДНК (Kortekaas et al., 2010, J. of Virol. Methods, том 163, стр. 175), посредством чего сосредотачивались на эпитопе TAVSPTTLR в домене белка E2 CSFV. Некоторые аминокислоты в эпитопе подвергали мутациям или удаляли, после чего мутантный вирус CSFV претерпевал усиленную эволюцию вируса. Получали жизнеспособные мутантные вирусы, имеющие различные мутации эпитопа TAVSPTTLR.
Из серии vFlc ΔPT мутантов C-штамма CSFV по E2 для дальнейшего изучения выбирали один, названный: vFlc ΔPTa1. Этот вирус имеет мутантную версию эпитопа TAVSPTTLR из E2 за счет замены одной и делеции двух аминокислот, после чего эпитоп, соответствующий исходному эпитопу TAVSPTTLR, стал: TAGSTLRTE (SEQ ID № 2). Этот мутантный вирус демонстрировал хорошую жизнеспособность и индуцировал мощное образование антител против E2. Кроме того, антитела кролика против мутантного E2 более не распознают E2 дикого типа из родительского C-штамма вируса. Следовательно, его считали идеальным кандидатом на эффективную живую CSFV маркерную вакцину, которая допускает DIVA.
Затем мутантный вирус vFlc ΔPTa1 тестировали на вакцинный эффект у целевого животного (Kortekaas et al., 2011, Vet. Microbiol., том 147, стр. 11), где обнаружено, что он индуцирует уровень защиты, близкий к таковому у родительского штамма, и эффективно предотвращает слущивание вируса стимула. Однако авторы не смогли обнаружить, что сыворотку от свиней, вакцинированных с использованием этого мутантного вируса, нельзя четко дифференцировать от сыворотки от свиней, вакцинированных с использованием родительского C-штамма вирус. Это обусловлено тем, что E2 мутантный вирус индуцировал у свиней антитела, которые давали ложные положительные оценки с силой от промежуточной до полной для E2 ELISA. Следовательно, это исключало введение на рынок новой DIVA маркерной вакцины из-за отсутствия надежного различающего теста на антитела к CSFV.
В попытке преодолеть ложные положительные оценки для E2 ELISA в сыворотке от свиней, вакцинированных маркерной вакциной, Kortekaas et al. (2011, выше) рассмотрели несколько улучшений для ELISA, таких как: модификация используемых пептидов с использованием предсказания третичной структуры; использование новых моноклональных антител, которые сделают возможной более хорошую дифференциацию; изменение ELISA с использованием различных блокирующих антител, поскольку доказана эффективность этого в других случаях (Holinka et al., 2009, Virology, том 384, стр. 106); и: изменение порогового значения для считывания, при этом сохраняя приемлемую чувствительность. Обнаружено, что все эти подходы неэффективны для преодоления возникновения ложных положительных результатов.
Как показано, результаты Holinka et al. (2009, выше) не дают ложных положительных результатов в схожем E2 ELISA при тестировании сывороток от свиней, вакцинированных с использованием отличающегося рекомбинантного CSF маркера. Однако их результаты нельзя рассматривать как значимые: с одной стороны, поскольку в тестах использовали объединенные образцы вместо индивидуальных сывороток и, с другой, поскольку их считанные показания находятся в нижней части диапазона обнаружения (между 0,100 и 0,350 единиц OD; см. Holinka et al., 2009, выше; фиг. 3A), где отношение сигнала к шуму слишком неблагоприятно для того, чтобы формировать основу для надежного крупномасштабного диагностического исследования.
Более хорошим примером является публикация Reimann et al. (2010, Vet. Microbiol., том 142, стр. 45), которые сконструировали рекомбинантную CSF вакцину, очень похожую на таковую у Holinka et al., посредством замены эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2 на соответствующую последовательность из BVDV E2. Наряду с результатами Kortekaas et al. (2011, выше), Reimann et al. также обнаружили антитела с перекрестной реактивностью в сыворотках свиней, вакцинированных их вирусом с мутантным E2, которые связывались с немодифицированным эпитопом E2. Также в этом случае получали ложные положительные оценки и DIVA тест не мог быть разработан. Для решения этой проблемы Reimann et al. предложили адаптировать пороговые значения за счет чувствительности или модифицировать каркасную последовательность мутантного вируса для того, чтобы снижать ложные положительные оценки.
Таким образом, обнаружено, что различные мутации в эпитопе TAVSPTTLR вызывают те же вопросы для CSFV маркерной вакцины на основании такого мутантного эпитопа: в случае CSFV вакцины на основании вируса vFlc-ΔPTa1, мутации в эпитопе TAVSPTTLR изменяли 6 из 9 аминокислот в этом локусе. Аналогичным образом, у Reimann et al. (2010, выше), тестировавших 5 различных аминокислот из 9 в соответствующем локусе белка E2, эта проблема также возникала.
Следовательно, проблема ложных положительных оценок в ELISA для антител к E2 CSFV дикого типа в сыворотках, полученных у животных, вакцинированных CSFV (маркерной) вакциной, содержащей мутантный эпитоп TAVSPTTLR белка E2 CSFV, имеет общий характер и до сегодняшнего дня не была решена. В недавнем обзоре кандидатов на CSF вакцину Eblé et al. (2013, Vet. Microbiol., том 162, стр. 437) подтвердили ту дилемму, что для CSFV до сих пор не доступна оптимальная комбинация CSFV вакцины и соответствующего DIVA теста.
Следовательно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы преодолеть недостатки известного уровня техники и сосредоточиться на потребностях в данной области посредством снижения ложных положительных результатов в диагностических анализах для антител против CSFV дикого типа при тестировании образцов от животных, которых вакцинировали CSFV вакциной, имеющей мутацию в эпитопе TAVSPTTLR из CSFV E2.
К удивлению обнаружено, что эта цель может быть достигнута и, следовательно, недостатки известного уровня техники могут быть устранены с помощью усовершенствованного диагностического теста для антител к CSFV дикого типа, который делает возможной DIVA. Усовершенствование относится к модификации стадии инкубации в диагностическом анализе для антител к E2 CSFV дикого типа, где тестируемый образец инкубируют с иммобилизованным носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, и теперь включает совместную инкубацию с носителем, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2. Обнаружено, что модификация полностью снижает ложные положительные результаты посредством только ограниченной модификации в протоколе существующего диагностического анализа на антитела к CSFV E2.
Существует несколько полезных эффектов этого модифицированного диагностического способа: основной заключается в том, что эту модификацию можно полностью интегрировать в протокол существующего теста. Следовательно, не нужна дополнительная стадия инкубации и усовершенствованный способ тестирования не требует больше времени, чем ранее. Это является значимым преимуществом, если принимать во внимание потенциально очень большое число тестовых образцов, которые могут требовать тестирования за короткое время в случае вспышки CSF в определенной области.
Кроме того, теперь не требуется вносить существенные изменения в соответствующую CSFV вакцину или в исходный диагностический анализ. Напротив, теперь возможно использование базовой схемы существующего CSFV E2 ELISA для обнаружения антител к E2 CSFV дикого типа в образцах от животных, вакцинированных CSFV вакциной. Это позволяет полагаться на созданные CSFV диагностические анализы и их доказанную надежность, а также точно установленные профили специфичности и чувствительности.
При этой модификации CSFV диагностический анализ теперь можно использовать для того, чтобы эффективно различать инфицированных и вакцинированных животных, и, таким образом, изобретение относится к усовершенствованному диагностическому тесту для CSFV дикого типа, который делает возможным DIVA скрининг и который можно использовать в качестве сопроводительного диагностического теста для CSFV (маркерной) вакцины, чтобы управлять частотой CSFV в восприимчивой популяции животных.
Важной стадией, направленной на эти полезные эффекты, является идентификация авторами изобретения причины невозможности отличать вакцинацию против CSFV от инфекции CSFV дикого типа или вакциной из C-штамма.
Обнаружено, что эта причина состоит в том, что CSFV (маркерная) вакцина, которая содержит E2 с мутантным эпитопом TAVSPTTLR, индуцирует антитела, которые специфично связываются не только с мутантным эпитопом E2 вакцины, но также с такой же высокой аффинностью с немодифицированным эпитопом TAVSPTTLR из E2 в CSFV дикого типа и в вакцине из C-штамма. Это влекло ложные положительные оценки при тестировании образцов сыворотки вакцинированных животных для инфекции CSFV дикого типа. В отличие от этого не обнаружено, что антитела, являющиеся результатом инфекции CSFV дикого типа или инокуляции вакцины из C-штамма, или моноклональные антитела против эпитопа TAVSPTTLR E2 дикого типа (например: V2 (Prionics), A18 (IDEXX) или WH303 (Lin et al., 2000, выше)) имеют какую-либо значимую аффинность к белку E2 с мутантным эпитопом TAVSPTTLR из CSFV вакцины. По этой причине совместная инкубация с носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из белка E2 CSFV дикого типа не решает проблему ложных положительных оценок в отношении вакцины с мутантным эпитопом TAVSPTTLR.
В настоящее время не известно, как или почему возникает этот феномен. Однако без ограничения какой-либо теорией или моделью, которая будет объяснять эти наблюдения, автор изобретения предполагает, что влияние оказывает трехмерная форма эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2; эту трехмерную форму изменяют при мутации его линейной аминокислотной последовательности. Это индуцирует антитела против мутантного эпитопа E2, которые очевидно все еще способны связываться специфично с эпитопом TAVSPTTLR из CSFV E2 дикого типа. Такие антитела обладают перекрестной реактивностью в диагностическом анализе на основании белка E2 CSFV дикого типа, вызывающем высоко специфичные ложные положительные оценки.
Затем, используя эту идею о причине проблемы ложных положительных тестовых оценок, автор изобретения нашел удивительный способ решения этой проблемы и смог реализовать решение в одной стадии протокола созданного E2 диагностического анализа: стадия инкубации тестового образца с иммобилизованным носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR белка E2 CSFV, и вдобавок: совместная инкубация с носителем, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR белка E2 CSFV. Это решило вопрос с ложными положительными оценками.
Тот факт, что модификация диагностического способа может принимать форму совместной инкубации, был сюрпризом, поскольку обычно ожидают, что такая процедура обычно нарушает надлежащее и полное связывания антител к CSFV E2 в тестовом образце с иммобилизованным носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, и, таким образом, обычно специалист не принимает ее во внимание.
Следовательно, в первом аспекте изобретение относится к способу обнаружения антител против вируса классической чумы свиней (CSFV) дикого типа в тестируемом образце, при этом указанный образец также может содержать антитела против мутантного эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2, способ включает стадию инкубации указанного тестового образца с иммобилизованным носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, который отличается тем, что способ включает совместную инкубацию на указанной стадии с носителем, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2.
«Способ обнаружения» в соответствии с изобретением представляет собой способ in vitro, применяемый к тестовому образцу для того, чтобы определять значение или свойство (часто называемое «биологическим маркером») тестового образца, после которого результат анализа можно интерпретировать, чтобы придавать определенный смысл его исходу. Эта интерпретация основана на сравнении результата, полученного для тестового образца с использованием способа, с эталонным значением или предыдущим измерением и она устанавливает, если измеряемое значение присутствует или отсутствует или увеличено или снижено.
Для изобретения измеряемое значение представляет собой качественное и количественное присутствие антител, специфичных к эпитопу TAVSPTTLR белка E2 CSFV дикого типа.
Способ в соответствии с изобретением может представлять собой диагностический тест в одной из различных хорошо известных форм, например: радиоиммунологический анализ, анализ иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, иммунопреципитации, агглютинации, гемолиза, нейтрализации, «твердофазный иммуноферментный анализ» (ELISA) или AlphaLISA™.
В нескольких изданиях описано множество диагностических тестов, которые доступны, и их конкретные признаки; например: J. Huebner: Antibody-antigen interactions and measurements of immunologic reactions (глава 9 в: Pier, Lyczak and Wetzler (ред.): Immunology, infection, and immunity, ASM Press, Washington D.C., 2004, ISBN: 1555812465, стр. 207-232); «Antibodies: A Laboratory Manual» (ред.: Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, ISBN-10: 0879693142); и «Immunoassays: A Practical Approach» (J. P. Gosling edt., Oxford University press, 2000, ISBN-10: 0199637105).
Большое число коммерческих компаний может предоставлять материалы и реактивы для диагностических тестов или полные диагностические наборы или могут обеспечивать тестирование и анализ.
Полностью в рамках обычных возможностей специалиста разрабатывать и оптимизировать протоколы, материалы и условия для способа в соответствии с изобретением.
Также в данной области хорошо известно, что «антитела» представляют собой белки иммуноглобулинов и в целом представлены в 5 классах. Для тестового образца антитела типично относятся к типу IgG или IgM и представляют собой целые антитела. Однако другие антитела, которые можно использовать в качестве реактива в способе в соответствии с изобретением, например, в качестве вторичного антитела, или в качестве меченого антитела, не обязаны представлять собой целые иммуноглобулины, например, одноцепочечное антитело или часть иммуноглобулина; и также могут быть в другой форме: (синтетическая) конструкция из таких частей, при условии, что части антител все еще содержат участок связывания антигена. Хорошо известные фрагменты иммуноглобулинов: фрагменты Fab, Fv, scFv, dAb или Fd, домены Vh или мультимеры таких фрагментов или доменов.
Антитела для применения в качестве реактива в диагностических анализах обыкновенно получают посредством (гипер)иммунизации донорного животного целевым антигеном и сбора продуцируемых антител из сыворотки животного. Хорошо известными донорами являются кролики и козы. Другим примером являются куры, которые могут продуцировать высокие уровни антител в яичном желтке, так называемых IgY. Альтернативно, антитела можно получать in vitro, например, через общеизвестную технологию моноклональных антител из культур иммортализованных B-лимфоцитов (гибридомные клетки) и для которых известны системы получения в промышленном масштабе. Также сами антитела или их фрагменты можно экспрессировать в рекомбинантной экспрессирующей системе, через экспрессию клонированных генов тяжелых и/или легких цепей Ig. Все это хорошо известно специалисту в данной области.
В изобретении и на всем протяжении этого текста антитела упоминают, исходя из мишени, против которой они направлены; например: антитела против CSFV обозначают как «антитела к CSFV» и «E2 антитела» представляют собой антитела против белка E2, также известные как анти-E2 антитела, и т.д.
Как хорошо известно в данной области, антитела, направленные «против» определенной мишени, представляют собой антитела, которые обладают специфичностью к эпитопу на этой мишени, и тем самым мишень представляет собой конкретную молекулу или сущность. Антитело (или его фрагмент) обладает специфичностью к эпитопу, если оно способно избирательно связывать этот эпитоп.
Является ли взаимодействие между антителом и мишенью специфичным и/или избирательным или нет, может легко оценить специалист. Например, специфичность результатов иммунного анализа на основе ингибирования можно определять посредством демонстрации корреляции ингибирования с концентрацией антигена или антитела, используемого в анализе. Используя, например конкурентный анализ связывания, можно определять, сколько антигена нужно для того, чтобы ингибировать связывание антитела с этим иммобилизованным антигеном на 50% (Bruderer et al., 1990, J. of Imm. Meth., том 133, стр. 263). В качестве примера для данного случая: использование белка E2 CSFV дикого типа и (моноклонального) антитела, специфичного к эпитопу TAVSPTLLR.
Большим значением в контексте диагностического иммуноанализа является то, когда антитело демонстрирует ложное положительное связывание, которое ведет к ложным положительным результатам диагностического анализа. Это может быть обусловлено относительно сильным связыванием с эпитопом, отличным от того, против которого создавали антитело, или специфичным связыванием с его исходным эпитопом, но тогда расположенным на другой мишени, нежели исходная мишень.
Специалист в области способов иммунных анализов знает, как различать истинные и ложные положительные результаты, например, посредством подтверждения результатов с использованием диагностического анализа другого типа или подтверждения результата с использованием тестового образца из другого момента времени.
С помощью способа в соответствии с изобретением можно получать значительное снижение ложных положительных оценок при тестировании антител против белка E2 из CSFV дикого типа. Как описано и проиллюстрировано в настоящем документе, достигнуто снижение ложных положительных оценок вплоть до 5-кратного (например, от больше чем 50% ELISA ингибирования до меньше чем 10% ингибирования) и снижение числа животных, которых неправильно рассматривали как CSFV положительных, вплоть до 100%.
В различных тестах с использованием способа в соответствии с изобретением все сыворотки от свиней, инфицированных CSFV дикого типа, количественно определяли как положительные, на основании результатов тестов, приблизительно от 3 недель после инфекции, тогда как ни одна сыворотка от животных, вакцинированных повторно с использованием вакцины на основании vFlc-ΔPTa1, не становилась положительной после третьей вакцинации, до последнего измеренного момента времени.
Способ в соответствии с изобретением тестирование также проводили на большом наборе приблизительно из 900 тестовых образцов из коллекции Central Veterinary Institute (Lelystad, Netherlands), который содержит антитела к CSFV, которые были высокими, низкими, отрицательными или подозрительными, а также множество сывороток, содержащих BVD- или BVDV-антитела, и даже некоторые смешанные инфекции CSFV, BVD и/или BVDV. С помощью способа в соответствии с изобретением почти все образцы можно идентифицировать правильно с превосходной специфичностью и чувствительностью, см. примеры далее.
Фактически, при тестировании коллекции из 900 образцов, наблюдали даже увеличенную чувствительность для большинства протестированных образцов, когда совместную инкубацию применяли со способом в соответствии с изобретением. Это обозначает, что процентная доля ингибирования, наблюдаемого в блокирующем ELISA для антител к E2 CSFV дикого типа, выше для нескольких из образцов при применении способа в соответствии с изобретением по сравнению с применением стандартного коммерческого блокирующего ELISA с использованием антител к CSFV E2. В результате, 5 образцов, которые ранее были подозрительными, теперь оценивали как положительные и два ранее отрицательных образца теперь оценивали как подозрительные (см. пример 2.3 и таблицу 2).
Для изобретения «дикого типа» вирус классической чумы свиней относится к CSFV, как он встречается в природе. Это не означает, что все такие CSFV дикого типа являются одинаковыми, поскольку многие вариации в генетическом составе и биологических признаках возможны или уже известны. Однако этот термин предназначен для того, чтобы исключать использование в изобретении тех CSFV, которые являются результатом вмешательства человека, например, посредством модификации или мутации, например, посредством повторного пассирования или посредством адаптации их нуклеиновой кислоты с помощью способов рекомбинантной ДНК.
Для изобретения «вирус классической чумы свиней» или «CSFV» в целом относится к вирусам из таксономического рода Pestivirus, которые имеют общеизвестные характеристики CSFV. Он также включает CSFV, которые каким-либо образом выделены в его подклассы, например, в виде подвида, штамма, изолята, генотипа, серотипа, серовара, серогруппы, варианта или подтипа и т. п. Такие CSFV имеют общие характеристические признаки членов их таксономического семейства, такие как геномные, физически, электронно-микроскопические и биохимические характеристики, а также биологические характеристики, такие как физиологическое, иммунологическое или патогенное поведение. Наряду с серологической классификацией другие определения могут быть основаны на секвенировании нуклеотидов или ПЦР анализе, как известно в данной области.
Специалисту будет ясно, что хотя вирусный вид, который является предметом настоящего изобретения, в настоящее время называют CSFV, это является таксономической классификацией, которая может быть предметом для изменения, поскольку новые идеи ведут к переклассификации в новую или другую таксономическую группу. Однако поскольку это не изменяет вовлеченный микроорганизм или его характеристические признаки, а только его научное название или классификацию, такие переклассифицированные организмы остаются в пределах объема изобретения.
«Тестовый образец» для использования в способе в соответствии с изобретением в принципе может относиться к образу любого типа, который содержит антитела, например, к образцу плазмы или сыворотки, полученному из образца цельной крови животного. Специалист хорошо осведомлен о способах и материалах, необходимых для получения и подготовки такого образца плазмы или сыворотки от животного.
Предпочтительным является образец сыворотки, поскольку это чище, и его можно получать с помощью стандартных лабораторных способов, например, включающих стадии: свертывания, центрифугирования и инактивации комплемента.
Необязательно тестовый образец можно дополнительно обрабатывать или очищать, например, чтобы увеличивать силу сигнала, или снижать фоновый сигнал. Например, можно выделять антитела. Хорошо известные способы очистки антител представляют собой, например, преципитацию таких антител с использованием каприловой кислоты или сульфата аммония или использование аффинной хроматографии.
В изобретении термин «содержать» (а также вариации, такие как «содержащий», «содержит» и «содержащийся»), как используют в настоящем документе, относится ко всем элементами и в любой возможной комбинации, возможной в изобретении, которую покрывает или охватывает текстовый раздел, абзац, пункт формулы изобретения и т.д., в котором этот термин используют, даже если такие элементы или комбинации не перечислены явно; и это не относится к исключению какого-либо из таких элементов или комбинаций. Следовательно, любой такой текстовый раздел, абзац, пункт формулы изобретения и т.д. также может относиться к одному или нескольким вариантам осуществления, в которых термин «содержать» (или его вариации) заменяют на такой термин, как «состоять из», «состоящий из» или «состоять по существу из».
«Эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2» относится к общеизвестному эпитопу в домене белка E2 CSFV с этим названием и представляет собой линейный эпитоп из 9 аминокислот в длину. Специалисту будет ясно, что название «TAVSPTTLR», данное этому эпитопу, совпадает с аминокислотной последовательностью этого эпитопа, когда ее представляют стандартным однобуквенным кодом по IUPAC, в котором треонин обозначают как T, аланин как A и т.д.
Эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2 является консервативным у CSFV дикого типа (Lin et al., 2000, выше), и его аминокислотная последовательность представлена в настоящем документе как SEQ ID № 1.
В изобретении «мутантный» эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2 отличается своей аминокислотной последовательностью от SEQ ID № 1 по меньшей мере в одном положении. Мутация может содержать одинарное или множественное изменение и может представлять собой инсерцию, делецию или замену аминокислоты или их сочетание.
Пример мутантного эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2 для использования в способе в соответствии с изобретением представляет собой соответствующий эпитоп, присутствующий в белке E2 мутантного CSFV вируса, например, vFlc ΔPTa1, где этот эпитоп представляет собой: TAGSTLRTE (SEQ ID № 2). Другим примером является рекомбинантный CSFV, как описано у Reimann et al. (2010, выше), например, вирус pA/CP7_E1E2alf_TLA, где соответствующий эпитоп представляет собой: TLANKDTLA (SEQ ID № 3).
Мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2 для использования в способе в соответствии с изобретением можно получать из различных источников, или природных или синтетических. Наиболее удобно вводить мутацию в эпитопе TAVSPTTLR из CSFV E2 через вмешательства человеком, например, посредством модификации или мутации, например, посредством адаптации кодирующей нуклеотидной последовательности через технологию рекомбинантных ДНК, после чего следует экспрессия белка (например, белка E2 CSFV или его части), который содержит мутантный эпитоп в рекомбинантной экспрессирующей системе in vitro.
В изобретении «инкубация» относится к предоставлению возможности связывания между антителом и его специфичным эпитопом. Для этого необходимы условия реакции, которые способствуют формированию таких молекулярных взаимодействий и включают использование правильных буферов, температуры и длительности. Материалы и способы инкубации в изобретении описаны в общеизвестных источниках и в инструкциях, предоставляемых поставщиками коммерческих тестов.
«Носитель» в контексте настоящего изобретения относится к макромолекулярной структуре, которая может нести и представлять эпитоп белка E2 CSFV. В принципе, может подходить любая структура, при условии, что эпитоп доступен для связывания с антителом. Носитель может иметь биологическое или минеральное происхождение, природное или синтетическое, иметь большие или малые размеры и, например, может представлять собой металлическую частицу, полимер, белок или углевод. Эпитоп можно прикреплять посредством ковалентных связей или посредством нековалентных связей, включая ионные, электростатические, гидродинамические или молекулярные взаимодействия любого типа. Эпитоп содержится в или на носителе и, таким образом, может представлять собой его часть, например, в качестве внутреннего элемента в белке или в виде слитного белка. Носитель также может содержать такие другие молекулы или группы, как когда белок, содержащий эпитоп, представляет собой липо- или гликопротеин или конъюгат и т.д. Способы прикрепления эпитопа к носителю хорошо известны в данной области и могут включать биохимические способы или способы рекомбинантной ДНК.
В изобретении белок представляет собой молекулярную цепь аминокислот. Белок может представлять собой нативный или зрелый белок, белок-предшественник или пропротеин или иммуногенный фрагмент белка. Помимо прочего: пептиды, олигопептиды и полипептиды включены в определение белка.
В изобретении носитель «иммобилизован», то есть прикреплен к твердой фазе, посредством образования ковалентных или нековалентных связей, например, посредством адсорбции или нанесения покрытия или тому подобное. Это не подразумевает, что сама твердая фаза неподвижна. Твердая фаза, в принципе, может представлять собой какой-либо твердый носитель, при условии что он делает возможным выполнение способа обнаружения в соответствии с изобретением, и может иметь различные размеры, геометрическую или иную форму, например, пластинка, частица, мембрана и т.д.
Способы и материалы для иммобилизации носителя на твердой фазе хорошо известны в данной области и могут, например, включать использование карбонатного буфера и основного значения pH. Альтернативно иммобилизацию можно осуществлять, например, через химическую реакцию, которая вызывает образование ковалентных связей, или через биотинилирование носителя и связывание с твердым носителем, покрытым авидином.
Предпочтительно твердая фаза представляет собой лунку микротитровального планшета или гранулу носителя для использования в анализе AlphaLISA.
В изобретении «совместная инкубация» указывает на то, что носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, инкубируют вместе с иммобилизованным носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, и тестовым образцом. На практике это означает, что носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, присутствует в инкубационной смеси, которую применяют на стадии инкубации иммобилизованного носителя, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, и тестового образца, в течение по меньшей мере существенной части времени, которое необходимо для этой инкубации. Сколько времени составляет «существенная часть», зависит от деталей конкретного протокола используемого диагностического анализа. Например, в инструкциях производителя IDEXX CSFV Ab Test указано, что период времени для стадии инкубации тестового образца и иммобилизованного белка E2 длится или 2 часа или в течение ночи (12-18 часов).
В изобретении «существенная часть времени» относится по меньшей мере к 25% времени для стадии инкубации иммобилизованного носителя, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, и тестового образца. Предпочтительно 50% времени, более предпочтительно 75, 90, 95, 99 или 100% времени, в этом порядке предпочтения.
Эта совместная инкубация определяет способ в соответствии с изобретением, помимо инкубации, которую следует рассматривать в качестве предварительной инкубации, при которой следует использовать отдельную и дополнительную стадию инкубации тестового образца и носителя, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR, и которую следует выполнять перед инкубацией с иммобилизованным носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2. Такая предварительная инкубация является стандартным выбором специалиста при оптимизации протоколов инкубации, поскольку это допускает хорошие возможности уменьшения каких-либо нежелательных реакций связывания. Однако удивительная находка по настоящему изобретению состоит в том, что эти инкубации можно предпочтительно интегрировать в одной стадии в виде совместной инкубации, без вредного эффекта на избирательности и специфичности теста.
Как описано, одно из значимых преимуществ состоит в том, что совместная инкубация не требует дополнительного времени для осуществления диагностического анализа. Дополнительное преимущество состоит в том, что базовый протокол стандартного коммерческого E2 ELISA можно использовать без значительных изменений в компонентах теста или его протоколе.
В одном из вариантов осуществления способа в соответствии с изобретением обнаружение опосредовано ферментным иммуноанализом, более предпочтительно ELISA (твердофазным иммуноферментным анализом).
ELISA хорошо известен, и также хорошо известны различные типы формата и протокола. Основные преимущества состоят в том, что они обеспечивают быстрые и надежные результаты и их можно легко масштабировать.
В предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением, ELISA представляет собой непрямой блокирующий ELISA. Как известно в данной области, это подразумевает, что антитела из тестового образца конкурируют с меченым детекторным антителом для связывания с иммобилизованным эпитопом. Чем больше антител присутствует в тестовом образце, тем больше их связывается с иммобилизованным эпитопом и тем меньше меченого антитела может быть удержано, что ведет к снижению (ингибированию) максимального уровня связывания метки.
Образцовый протокол способа в соответствии с изобретением, в котором обнаружение опосредовано непрямым блокирующим ELISA, может включать некоторые или все из последовательных стадий:
- нанесение покрытия носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, на твердую фазу,
- совместная инкубация тестового образца и носителя, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, с нанесенным носителем, после чего следует промывание,
- инкубация с меченым вторичным антителом, после чего следует промывание,
- окрашивание реакции, и
- считывание результатов.
Некоторые из стадий можно осуществлять отдельно или с помощью другой стороны. Например, при применении в качестве коммерческого теста, коммерческий поставщик может предоставлять предварительно покрытую твердую фазу, готовую для использования в совместной инкубации с тестовым образцом.
Необязательно протокол может дополнительно содержать одну или несколько стадий для блокирования реакций ложного положительного связывания. Типично это включает инкубацию с избытком неспецифичного белка в буфере, используемом для стадий инкубации и/или промывания, например, обезжиренного молока или сывороточного альбумина.
ELISA дополнительно можно оптимизировать посредством адаптации его реактивов и стадий процесса, например, температуры и длительности стадий инкубации; специфичности и типа антитела или антигена, используемого для иммобилизации или для обнаружения; применяемого количества и способа иммобилизации; и композиции используемых буферов для инкубации и промывания.
Основные ссылки на иммуноферментные анализы существуют в различных публикациях, среди прочих, в стандартных лабораторных руководствах, таких как: «The Immunoassay Handbook (4-е издание: Theory and applications of ligand binding, ELISA and related techniques»; ред. D. G. Wild, 2013, ISBN-10: 0080970370); и «The ELISA Guidebook» (Methods in Molecular Biology, том 149, J. R. Crowther, Humana Press, 2000, ISBN-10: 0896037282). Альтернативой являются руководства от коммерческих поставщиков, таких как: «Technical guide for ELISA», KPL Inc., Gaithersburg, MD, USA, 2013; и «Assay guidance manual» Eli Lilly &Co., глава «Immunoassay methods», K. Cox et al., May 2012.
В дополнительном предпочтительном варианте осуществления ELISA по изобретению по существу схож с коммерческим ELISA для антител к CSFV E2, например, с PrioCHECK CSFV Ab 2.0 ELISA, предыдущее название Ceditest CSFV 2.0 ELISA, оба доступны в Prionics AG (Schlieren-Zurich, Switzerland), или с IDEXX CSFV Ab Test, доступном в IDEXX Europe B.V. (Hoofddorp, Netherlands). «По существу схож» в этом отношении относится к протоколу и материалам, используемым для этих коммерческих тестов.
Также можно разрабатывать альтернативные протоколы для способа в соответствии с изобретением. Например, способ в соответствии с изобретением можно устанавливать на основании характеристики протокола теста AlphaLISA, хорошо известных в данной области. В таком тесте не нужны стадии промывания, и хотя анализ можно осуществлять вручную, автоматизированный AlphaLISA является предпочтительным.
Характеристики протокола AlphaLISA таковы, что антиген (здесь: носитель, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2) и антитело (здесь: (моноклональное) антитело, специфичное к эпитопу TAVSPTTLR из CSFV E2) связывают с гранулами носителя и их связывание поддается обнаружению с помощью испускания света.
Носитель, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, например, может быть биотинилированным и иммобилизованном на покрытой авидином акцепторной грануле, и его используют вместе с антителом, которое конъюгировано с донорными гранулами. Тогда одна стадия в таком тесте AlphaLISA будет содержать совместную инкубацию акцепторных гранул, покрытых носителем, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, с тестовым образцом и носителем, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2. В равной мере возможен другой путь (наносят покрытие с использованием носителя, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2), или промежуточная форма, в которой покрытие наносят с использованием обоих носителей. Затем следующей стадией может быть инкубация с донорными гранулами, покрытыми антителом, и, наконец, считывание результатов.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления способа в соответствии с изобретением, обнаружение опосредовано диагностическим тестом, который обладает характеристиками AlphaLISA.
Способ в соответствии с изобретением наиболее благоприятен для тестируемых образцов, полученных от животных, которые восприимчивы к инфицированию CSFV. Они представляют собой различных животных семейства свиней.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления способа в соответствии с изобретением тестовый образец извлекают у животного свиньи.
В изобретении «свинья» относится к животным семейства Suidae и, предпочтительно, к животным рода Sus, например: дикая или домашняя свинья, свиньи, кабан, вепрь, бабирусса или бородавочник. Это также включает свиноподобных животных, обозначаемых с помощью произвольного названия, относящегося к их полу или возрасту, например: свиноматка, хряк, боров, подсвинок, отъемыш или поросенок.
Дополнительное благоприятное применение способа в соответствии с изобретением состоит в тестировании образцов животных свиней, которые вакцинированы против CSFV с использованием CSFV маркерной вакцины.
Как хорошо известно и описано выше, антиген в маркерной вакцине отличается антигенными свойствами от антигена дикого типа, на котором он основан, например, отсутствием эпитопа или наличием другой версии эпитопа по сравнению с версией дикого типа. Типично антиген в маркерной вакцине адаптируют или модифицируют биохимическими способами или способами рекомбинантной ДНК, и результатом является то, что образование антител против модифицированного антигена маркерной вакцины можно отличать от образования антител к не модифицированному антигену дикого типа. Это делает возможной серологическую «дифференциацию инфицированных и вакцинированных животных» или «DIVA».
Следовательно, в одном из вариантов осуществления способа в соответствии с изобретением тестовый образец извлекают у животного свиньи, которое вакцинировано против CSFV с использованием CSFV маркерной вакцины.
Особенное благоприятное применение способа в соответствии с изобретением становится очевидным, когда CSFV (маркерная) вакцина содержит в качестве антигена CSFV белок E2 CSFV, который отличается от E2 дикого типа за счет мутации в эпитопе TAVSPTLLR из CSFV E2. Как описано выше, в образцах от животных, вакцинированных такой вакциной, ложные положительные оценки получали при использовании существующих диагностических тестов на антитела к CSFV. Однако способ в соответствии с изобретением демонстрировал только истинные положительные оценки. Это имеет основные импликации для ветеринарного здоровья и экономических аспектов свиноводства.
Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением тестовый образец получают от животного свиньи, которое вакцинировали против CSF с использованием CSFV вакцины, которая содержит белок E2 CSFV, содержащий мутантный эпитоп TAVSPTTLR.
Как описано выше, в принципе, многие формы мутантного эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2 возможно использовать при совместной инкубации в способе в соответствии с изобретением. Однако этот способ наиболее предпочтительно применяют в случае, когда мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, который используют при совместной инкубации, является таким же, как таковой в CSFV маркерной вакцине.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления способа в соответствии с изобретением, мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, который содержится в носителе для использования при совместной инкубации в способе в соответствии с изобретением, является таким же, как мутантный эпитоп TAVSPTTLR, который присутствует в белке E2 CSFV из CSFV маркерной вакцины.
Дополнительная направленность применима к мутантному эпитопу TAVSPTTLR из CSFV E2 в CSFV маркерной вакцине: эта вакцина еще должна быть способна индуцировать эффективный иммунный ответ против CSFV у целевого животного, несмотря на мутацию в эпитопе TAVSPTTLR.
В изобретении предпочтительно имеет место совпадение с одной стороны мутантного эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2 в CSFV маркерной вакцине, которую используют для того, чтобы вакцинировать животных, у которых извлекают тестовые образцы, которые подлежат тестированию в способе в соответствии с изобретением, и с другой стороны мутантного эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2, который содержится в носителе для использования при совместной инкубации в способе в соответствии с изобретением.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления способа в соответствии с изобретением мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, который содержится в носителе для использования при совместной инкубации, является таким же, как мутантный эпитоп TAVSPTTLR, содержащийся в белке E2 CSFV из CSFV вакцины, которую использовали для того, чтобы вакцинировать животных свиней, у которых получали тестовые образцы.
Специалист вполне способен определять, какие мутантные эпитопы TAVSPTTLR позволяют CSFV маркерной вакцине, которая содержит белок E2 CSFV, содержащий такой мутантный эпитоп, быть эффективным иммуногеном. Например, посредством мониторинга иммунологического ответа после вакцинации или после инфекционной иммунизации, например, посредством мониторинга клинических признаков заболевания, клинической оценки, серологических параметров у мишени или посредством повторного выделения патогена и сравнения этих результатов с ответами, которые наблюдают у вакцинированных имитатором животных.
Примечание: поскольку CSFV является высоко контагиозным и заболеванием, подлежащим регистрации, во многих странах, какое-либо лабораторное или зоотехническое использование образцов, возможно содержащих контагиозный CSFV (дикого типа или аттенуированный) следует осуществлять при подходящих мерах биологической безопасности, наряду с национальными или международными рекомендациями.
Примеры CSFV вакцин, которые содержат белок E2 CSFV с мутантным эпитопом TAVSPTTLR из CSFV E2, которые могут совпадать с носителем, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2 для использования при совместной инкубации в способе в соответствии с изобретением, известны в данной области и описаны выше. Например, у Kortekaas et al. (2010, выше); один из примеров представляет собой мутант CSFV, названный vFlc ΔPTa1, который имеет белок E2 CSFV, содержащий мутантный эпитоп TAVSPTTLR с аминокислотной последовательностью: TAGSTLRTE, как представлено в SEQ ID № 2.
Другой пример есть у Reimann et al. (2010, выше): мутант CSFV, названный pA/CP7_E1E2alf_TLA, который имеет белок E2 CSFV, содержащий мутантный эпитоп TAVSPTTLR с аминокислотной последовательностью: TLANKDTLA, как представлено в SEQ ID № 3.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления способа в соответствии с изобретением мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, который содержится в носителе для использования при совместной инкубации, имеет аминокислотную последовательность: TAGSTLRTE (SEQ ID № 2).
В альтернативном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, который содержится в носителе для использования при совместной инкубации, имеет аминокислотную последовательность: TLANKDTLA (SEQ ID № 3).
В дополнительном варианте осуществления тестовый образец по изобретению извлекают у животного свиньи, которое вакцинировали с использованием CSFV вакцины, как описано у Kortekaas et al. (2011, выше), такой как вакцина на основании мутанта CSFV, названного vFlc-ΔPTa1, как описано выше.
Следовательно, в дополнительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением, CSFV вакцина основана на вирусе vFlc-ΔPTa1.
Два различных варианта осуществления носителя, описанного для использования в способе в соответствии с изобретением, представляют собой: носитель, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, используемые для иммобилизации на твердой фазе, и носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, используемый для совместной инкубации. Эти носители могут иметь различные формы, и носители для мутантного эпитопа и эпитопа дикого типа TAVSPTTLR могут одного и того же или различающихся типов; также они могут быть отдельными или могут представлять собой одну и ту же сущность, например, один носитель, который содержит эпитопы TAVSPTTLR обоих типов.
В одном из вариантов осуществления способа в соответствии с изобретением, или иммобилизованный носитель, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, или носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, представляет собой белок, или оба носителя представляют собой белки.
Эти белки могут быть одинаковыми или различающимися.
В предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением или иммобилизованный носитель, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, или носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, представляет собой белок E2 CSFV или оба носителя представляют собой белки E2 CSFV.
Помимо наличия эпитопа дикого типа или мутантного эпитопа TAVSPTTLR, остальная часть белкового носителя E2 CSFV также может отличаться аминокислотными последовательностями; несколько примеров CSFV E2 описаны в литературе, и их последовательности доступны в публичных базах данных, таких как GenBank™.
Когда иммобилизованный носитель, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, представляет собой белок E2 CSFV, это предоставляет наилучшую возможность для обнаружения антител против CSFV в тестовом образце.
Аналогичным образом, когда носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, представляет собой белок E2 CSFV, это предоставляет наилучшую возможность для захвата любых антител с перекрестной реактивностью, которые могут присутствовать в тестовом образце животного и которые в ином случае ведут к ложным положительным результатам. Причина в том, что белок E2 CSFV обеспечивает трехмерное представление мутантного эпитопа TAVSPTTLR из CSFV E2, которое ближе всего к естественной форме этого эпитопа.
Следовательно, в предпочтительном варианте осуществления способа в соответствии с изобретением оба носителя представляют собой полноразмерные зрелые белки E2 CSFV.
Однако, как известно в данной области, C-концевая трансмембранная область, и фактически C-концевая половина E2, менее значима для связывания антител (van Rijn et al., 1994, J. of Virology, том 68, стр. 3934; Chang et al., 2010, Virus Res., том 149, стр. 183). Следовательно, специалист без труда разработает и оптимизирует способ обнаружения антител к CSFV дикого типа в соответствии с изобретением, в котором или один или оба носителя не являются полноразмерными зрелыми белками E2, но его часть, при условии, что (мутантный) эпитоп TAVSPTTLR per se все еще присутствует, все еще делает возможным хорошее обнаружение антител к CSFV дикого типа, а также хорошее снижение ложных положительных оценок, в контексте способа в соответствии с изобретением.
Использование CSFV белка или его части в качестве носителя, который содержит (мутантный) эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2 в способе в соответствии с изобретением, дополнительно можно оптимизировать посредством изменения количеств и условий для совместной инкубации. Например, автор изобретения экспрессировал белок E2 CSFV с мутантным эпитопом TAVSPTTLR в общеизвестной системе бакуловирусного экспрессирующего вектора, очищал белок и использовал рекомбинантный экспрессированный белок E2 для анализа совместной инкубации.
Чистота и количество экспрессированного белка E2 можно оценивать, например, посредством электрофореза на SDS геле, окрашивания белка и количественного определения посредством фотоденситометрии. Альтернативой является количественное определение в Elisa с использованием антитела, которое связывается с E2, через эпитоп, отличный от TAVSPTTLR, и эталонных образцов с известной концентрацией.
В зависимости от чистоты белка, количество белкового носителя E2, который содержит (мутантный) эпитоп TAVSPTTLR, выбирают для того, чтобы достигать оптимального обнаружения антител к CSFV дикого типа, при этом обеспечивая оптимальное снижение ложных положительных оценок. Как показано на примере в настоящем документе, типично меньше чем 2 мкг белка E2 необходимо на лунку 96-луночного микротитровального планшета. Количества 1 мкг или даже 0,5 мкг на лунку также эффективны.
Как описано, существующие коммерческие диагностические тесты для антител к CSFV дикого типа обеспечивают свою надежность, основываясь на большом массиве тестовых данных для определения их профилей чувствительности и специфичности. Это подтверждается международно признанными наборами стандартных положительных и отрицательных эталонных образцов. Доверие к этой комбинации анализа и эталонных образцов является основой для ее допуска на рынок и ее использования в контролируемой правительством сертификации экспорта животных, тестируемых с использованием таких анализов.
Для того чтобы способ в соответствии с изобретением достигал полной интеграции с эталонными значениями и предшествующими тестовыми оценками таких общепринятых анализов, можно выполнять дополнительную адаптацию к тестовому протоколу. В частности, условия инкубации в протоколе анализа можно адаптировать для того, чтобы вместить дополнительный компонент на стадии совместной инкубации, в которую вводят мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2.
Автор изобретения обнаружил, что без адаптации условий инкубации на указанной стадии способ в соответствии с изобретением остается функциональным и высоко эффективным в отношении снижения ложных отрицательных оценок; однако при тестировании общепринятых стандартных образцов с использованием способа в соответствии с изобретением получаемые точные OD оценки могут отклоняться от предыдущих результатов для этих стандартов, в большую или меньшую сторону. Это обусловлено тем, что добавление дополнительного соединения может требовать добавления некоторого объема жидкости в инкубационную смесь, и это может вести к разведению буфера для инкубации и компонентов, которые он может включать, таких как соли, стабилизатор, детергент или блокирующие средства, что ведет к отклонению от стандартных оценок.
Следовательно в одном из вариантов осуществления способ в соответствии с изобретением включает адаптацию условий инкубации на стадии, включающей совместную инкубацию с носителем, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, чтобы вмещать добавление указанного носителя.
Существует несколько путей, которыми можно осуществлять эту «адаптацию». Самый прямой путь представляет собой включение раствора, содержащего носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, в буфер для инкубации для использования в способе в соответствии с изобретением, посредством чего буфер для инкубации имеет повышенную концентрацию по сравнению с его конечной концентрацией при использовании в способе. Например, при объединении равных объемов раствора, содержащего носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, и буфера для инкубации, буфер для инкубации можно предоставлять в виде стокового раствора в 2× концентрации относительно его конечного использования. Также может быть необходимо корректировать какие-либо соли или буферы, которые уже присутствуют в растворе, содержащем носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2. Этот принцип легко адаптировать к другим соотношениям объемов и соответствующим концентрациям для стокового раствора буфера для инкубации.
Альтернативно, можно предоставлять готовый для использования предварительно смешанный раствор из буфера для инкубации, уже содержащего носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, в котором буфер для инкубации находится в концентрации для конечного использования.
Предыдущие примеры основаны на предоставлении носителя, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, в растворе. Однако, поскольку это может быть не оптимально для стабильности белка, альтернатива состоит в том, чтобы предоставлять белок, содержащий мутантный эпитоп E2 CSFV, в отдельном контейнере в лиофилизированной форме, вместе с контейнером буфера для инкубации в концентрации для конечного использования. Тогда при восстановлении белка с использованием буфера для инкубации незадолго перед использованием, это не влияет на стабильность белка, и восстановление (заметно) не изменяет концентрацию буфера для инкубации.
Специалист сможет разрабатывать и оптимизировать другие комбинации, чтобы получать схожие растворы.
Как описано, благоприятный путь применения способа в соответствии с изобретением опосредован использованием набора для диагностического теста, который содержит различные компоненты, необходимые для применения способа.
Следовательно, дополнительный аспект изобретения относится к набору для диагностического теста для осуществления способа в соответствии с изобретением.
В изобретении «набор для диагностического теста» относится к набору частей для осуществления способа в соответствии с изобретением. Набор содержит один или несколько компонентов для применения способа, в частности: носитель, который содержит эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, который иммобилизован на твердой фазе, и носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2. Они должны поступать в удобной форме и контейнере, необязательно с буфером для разведения образца и инкубации, блокирования или промывания и необязательно с инструкциями о том, как осуществлять способ и как считывать и интерпретировать результаты.
В одном из вариантов осуществления набор может содержать контейнер, который имеет множество лунок, такой как микротитровальный планшет. Лунки контейнера можно обрабатывать так, чтобы они содержали один или несколько компонентов для использования в способе в соответствии с изобретением.
В предпочтительном варианте осуществления набора для диагностического теста в соответствии с изобретением белок E2 CSFV с эпитопом TAVSPTTLR иммобилизуют в лунках микротитровального планшета.
Инструкции, необязательно содержащиеся в наборе для диагностического теста в соответствии с изобретением, например, можно писать на коробке, содержащей составляющие части набора; могут присутствовать на листке в этой коробке; или их можно просматривать или загружать на веб-сайте дистрибьютора набора в интернете и т.д.
В изобретении набор для диагностического теста также может представлять собой предложение указанных частей (в отношении коммерческой продажи), например, на веб-сайте в интернете, для комбинированного использования в анализе, включающем способ в соответствии с изобретением.
В одном из вариантов осуществления тестовый набор в соответствии с изобретением может быть основан на одном из известных коммерческих тестовых наборов для антител к E2 CSFV дикого типа, т.е. может представлять собой по существу то же самое, что и, например, PrioCHECK CSFV Ab 2.0 (Prionics) или IDEXX CSFV Ab Test (IDEXX), с модификацией для того, чтобы вместить совместную инкубацию с дополнительным компонентом. Модификация может относиться к измененным инструкциям пользователя, чтобы предоставлять инструкции для совместной инкубации. Также набор может дополнительно предусматривать контейнер, содержащий лиофилизированный препарат, который содержит носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, для ресуспендирования, например, в буфере для инкубации. Альтернативно, тестовый набор может содержать контейнер со стоковым раствором буфера для инкубации в концентрации, которая выше, чем его концентрация для конечного использования, и контейнер, содержащий раствор, содержащий носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, для использования со стоковым раствором буфера для инкубации при совместной инкубации. Специалист может предположить несколько других вариантов осуществления для того, чтобы включать компоненты набора для диагностического теста в соответствии с изобретением. Следовательно, такие варианты осуществления входят в объем настоящего изобретения.
Следовательно в одном из вариантов осуществления тестовый набор в соответствии с изобретением содержит контейнер, который содержит носитель, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2.
В дополнительном аспекте изобретение относится к использованию носителя, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, для совместной инкубации в способе в соответствии с изобретением или в наборе для диагностического теста в соответствии с изобретением.
Такое использование обеспечивает обнаружение антител к CSFV дикого типа в тестовых образцах животных, в частности для образцов от животных, которых вакцинировали против CSF с использованием CSFV вакцины, которая содержит белок E2 CSFV, содержащий мутантный эпитоп TAVSPTTLR. Это использование обеспечивает снижение любых ложных положительных оценок, как описано.
В одном из вариантов осуществления использование в соответствии с изобретением относится к использованию носителя, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2. Предпочтительно носитель представляет собой белок и предпочтительно белок представляет собой белок E2 CSFV и предпочтительно белок E2 CSFV представляет собой полноразмерный зрелый белок.
Дополнительное благоприятное применение способа обнаружения в соответствии с изобретением состоит в его применении в DIVA подходе для CSFV вакцинации и обнаружения. Это делает возможной дифференциацию между животными, которые вакцинированы против CSFV и которые инфицированы CSFV. Только за счет использования способа в соответствии с изобретением и последующей элиминации ложных положительных оценок серологическая дифференциация таким образом возможна, когда вакцинацию осуществляли с использованием вакцины против CSF, которая содержит белок E2 CSFV, содержащий мутантный эпитоп TAVSPTTLR.
Следовательно, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу дифференциации между животными, инфицированными CSFV дикого типа, и животными, которых вакцинировали против CSFV с использованием CSFV вакцины, где вакцина содержит белок E2 CSFV, содержащий мутантный эпитоп TAVSPTTLR, и способ включает использование способа обнаружения в соответствии с изобретением или включает использование набора для диагностического теста в соответствии с изобретением.
Способ дифференциации в соответствии с изобретением представляет собой способ диагностирования in vitro с использованием тестовых образцов животных, как описано выше. Специалисту будет ясно, что способ дифференциации в соответствии с изобретением по существу включает результаты в диагностических оценках для исследованных тестовых образцов. В частности, обнаружение антител к белку E2 CSFV, по их присутствию или отсутствию, или по их уровню в абсолютных значениях или относительных значениях в сравнении со значениями контрольного образца.
На входе в способ используют тестовый образец от субъекта; субъект предпочтительно представляет собой животное свинью; тестовый образец предпочтительно представляет собой образец крови, более предпочтительно образец сыворотки или плазмы.
Для того чтобы выполнять финальную дифференциацию между инфицированными и вакцинированными животными, тестовые оценки нужно интерпретировать как положительные или отрицательные; на практике это обозначает нахождение выше или ниже определенного порога. Это удобно можно выполнять посредством включения в тест множества стандартных эталонных образцов, подлежащих тестированию наряду с тестовыми образцами. Это описано в примерах. Положительный и отрицательный эталонный образец можно получать у животных или можно получать из определенных организаций и справочных лабораторий, например, Community Reference Laboratory для CSF, в University of veterinary medicine, Hannover, Germany.
После оценки тестовых образцов в качестве положительных, отрицательных или подозрительных, это можно экстраполировать на диагностирование донорного животного, у которого получали тестовый образец, в качестве положительного, отрицательного или подозрительного в отношении инфекции CSFV дикого типа.
В случае, если животное диагностируют как положительное (или подозрительное), то, наряду с правительственными нормативными документами, животное можно лечить посредством вакцинации и/или переводить на карантин или выбраковывать ответственным образом.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления способа дифференциации в соответствии с изобретением способ также включает одну или несколько стадий, выбранных из следующего:
- стадия получения тестового образца,
- стадия интерпретации полученных результатов теста посредством сравнения с результатами положительных и отрицательных эталонных образцов,
- стадия сравнения полученных результатов теста образца с предварительно определяемым пороговым значением,
- стадия оценки образца как положительного, отрицательного или подозрительного в отношении наличия антител против CSFV дикого типа,
- стадия диагностирования донора образца в качестве положительного, отрицательного или подозрительного в отношении инфекции CSFV дикого типа, или
- стадия (рекомендации) лечения донора образца на основании положительного или подозрительного результата от диагностированной инфекции CSFV дикого типа посредством вакцинации, карантина и/или выбраковки.
В одном или нескольких предпочтительных вариантах осуществления, образец представляет собой образец сыворотки, или: результаты теста представляют собой оценки для процентных долей ингибирования ELISA.
В предпочтительном варианте осуществления тестовый образец получают у животного свиньи, которое вакцинировали против CSF с использованием CSFV вакцины, которая содержит белок E2 CSFV, содержащий мутантный эпитоп TAVSPTTLR.
В альтернативном аспекте изобретение относится к способу in vitro для диагностирования инфекции CSFV, способ включает использование способа обнаружения в соответствии с изобретением или включает использование набора для диагностического теста в соответствии с изобретением, и где присутствие антител против CSFV дикого типа определяют по отношению к оценке положительных и отрицательных эталонных образцов.
В дополнительном аспекте по изобретению, способ обнаружения в соответствии с изобретением или набор для диагностического теста в соответствии с изобретением используют для эрадикации заболевания CSFV или в национальной программе контроля, в качестве сопроводительного диагностического средства, наряду с вакцинацией CSFV вакциной.
С использованием этой комбинации можно применять подход DIVA для CSFV, который делает возможной дифференциацию между инфицированными и вакцинированными животными.
Следовательно, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу управления инфекцией с использованием CSFV дикого типа в популяции животных свиней посредством комбинированного использования CSFV вакцины, которая содержит белок E2 CSFV, содержащий мутантный эпитоп TAVSPTTLR, и набора для диагностического теста в соответствии с изобретением.
Поскольку изобретение обеспечивает значительное снижение ложных положительных оценок, образцы (сыворотки) от вакцинированных животных теперь можно надежно идентифицировать в качестве отрицательных в отношении антител против CSFV дикого типа. Только истинно положительные животные нужно выделять и подвергать подходящим контрольным и карантинным мерам в контексте программ контроля, санитарного убоя или эрадикации.
Следовательно, это комбинированное использование CSFV вакцины и диагностического способа позволяет заменять нежелательную и очень дорогостоящую политику санитарного убоя на структурированную программу эрадикации на основании CSFV вакцины, снижая страдания животных и экономические издержки.
«Популяцию животных свиней» можно рассматривать в качестве группы на локальном (ферма), региональном или даже национальном уровне. Детали и протокол для «комбинированного использования» зависят от протокола вакцинации, предписанного для конкретной CSFV (маркерной) вакцины, которую следует использовать. Также эффективность комбинированного использования зависит от требований и причины скрининга, или даже от конкретных правительственных нормативных документов, которым необходимо соответствовать.
Некоторые примеры: в случае стандартной вакцинации, свиней будут вакцинировать против CSFV один или два раза в раннем возрасте и проводить вторичную вакцинацию, например, с годовыми интервалами. Этих животных можно тестировать всякий раз, когда возникает подозрение на инфекцию CSFV дикого типа. Альтернативно: свиней, предназначенных для экспорта, которых вакцинировали, можно тестировать незадолго до их планируемой даты экспорта. Также: в случае подозрения на CSFV инфекцию или в ситуации вспышки CSFV вакцинацию и тестирование можно осуществлять за короткий интервал времени, за недели, возможно, даже дни. Все эти и другие варианты осуществления, которые может предположить специалист, входят в объем изобретения.
На практике, когда образец оценивают как положительный или отрицательный в отношении антител к CSFV дикого типа, подтверждение можно получать посредством повторного тестирования образца от той же мишени, но в другой момент времени, или посредством тестирования других животных из того же стада или области. Альтернативно, результат можно подтвердить с использованием другого способа и образца другого типа, например, посредством обнаружения вируса в крови, ткани, назальных смывов или фекалий посредством анализа нейтрализации вируса или посредством обнаружения вирусной нуклеиновой кислоты (например, посредством ПЦР).
Далее изобретение дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих примеров.
Примеры
Пример 1: тестирование образцов свиней
1.1. Тестовые образцы
Тестовые образцы, использованные в примере 1, получали из Central Veterinary Institute (Lelystad, Netherlands) и они описаны в Kortekaas et al., 2011 (выше). Вкратце: сероотрицательных свиней в возрасте 8 недель вакцинировали живыми CSFV вакцинами: или основанными на C-штамме или на вирусе vFlc-ΔPTa1. Образцы крови брали на всем протяжении определенного числа недель. Для тестирования получали сыворотку. Через 28 суток после вакцинации животных подвергали инфекционной иммунизации с использованием CSFV дикого типа.
1.2. Тестирование ELISA известного уровня техники
Как описано в Kortekaas et al., 2011 (выше), полученные сыворотки свиней тестировали с использованием коммерческого ELISA: PrioCHECK CSFV Ab 2.0 (Prionics). Это осуществляли по инструкциям производителя, вкратце: использовали предварительно покрытые микротитровальные планшеты и распределяли буфер для образца из набора. Контрольные образцы добавляли в конкретные лунки и тестовые образцы (сыворотку свиньи) в другие лунки. Затем планшеты инкубировали, промывали и распределяли коньюгат. Планшеты снова инкубировали и промывали и наконец добавляли окрашивающий реактив, инкубировали и затем останавливали. Затем планшеты считывали посредством измерения OD. Процентные доли ингибирования ELISA вычисляли на основании положительного стандарта. Результаты изображены на фиг. 1A, в качестве сравнительных результатов, по существу воспроизводящих фиг. 4A из Kortekaas et al., 2011 (выше). Для этого ELISA, порог для положительного/отрицательного разделения равен 40% ингибированию.
Как видно из этих результатов: образцы сыворотки свиней, вакцинированных C-штаммом (пунктирные линии), а также образцы свиней, вакцинированных маркерной вакциной из вируса vFlc-ΔPTa1 (сплошные линии), отвечают положительно с течением времени; т.е. индуцируют ингибирование 40% или больше. Следовательно, нельзя провести четкие различия между животными, которых вакцинировали вакциной из C-штамма или CSFV маркерной вакциной (т.е. вирусом vFlc-ΔPTa1).
1.3. Повторное тестирование образцов известного уровня техники
Затем эти образцы сыворотки из Kortekaas et al. 2011 (выше) повторно тестировали с использованием различных коммерческих ELISA для антител к CSFV E2: IDEXX CSFV Ab Test (IDEXX), по инструкциям производителя, и с использованием протокола, который является по существу тем же, что для Prionics ELISA, описанного выше.
Результаты представлены на фиг. 1B, и серая горизонтальная полоса обозначает порог для положительного/отрицательного разделения в этом анализе, где: отрицательные результаты при 30% ингибирования или меньше; положительные результаты при 40% ингибирования или больше; оценки между 30% и 40% ингибирования соответствуют подозрительным образцам. Результаты, где уровень ингибирования представляет собой отрицательное значение, представляют образцы со значениями OD выше, чем таковые для отрицательного контроля. Это можно рассматривать как значения ингибирования 0%.
Как видно на графике, подобно результатам Prionics ELISA, почти все образцы реагируют положительно с течением времени; только один организм, вакцинированный маркерной вакциной (свинья № 3161), оставался полностью отрицательным. Два образца от свиней № 3163 и 3164 давали скачковые значения на 42 или 49 сутки после вакцинации, это может быть связано с реакцией на иммунизацию; образцы нельзя тестировать повторно из-за недостатка материала.
1.4. Белки E2
Белок E2 получали для использования в совместном инкубации в способе в соответствии с изобретением из гена E2 C-штамма вируса CSFV и из вируса vFlc-ΔPTa1. Изначально осуществляли оптимизацию кодонов нуклеотидной последовательности их генов E2 для экспрессии в бакуловирусной экспрессирующей системе в клетке насекомого, при этом используя только молчащие мутации. Затем ДНК, соответствующую оптимизированной последовательности, химическим синтезировали и клонировали в плазмиду pFastBac (Life Technologies), после промотора полиэдрина. Экспрессирующую кассету переносили посредством сайт-специфической транспозиции в ДНК рекомбинантной бакмиды и амлифицировали в компетентных бактериях DH10Bac Escherichia coli. Затем ДНК бакмиды выделяли и использовали для того, чтобы трансфицировать клетки насекомого Sf9. Рекомбинантный бакуловирус, полученный из трансфекционного супернатанта, использовали для того, чтобы инфицировать свежие клетки насекомого Sf9. Бакуловирус выделяли и использовали для того, чтобы инфицировать клетки насекомого Sf21, которые культивировали в 2 л биореакторах. Оба белка E2 экспрессировали в этих культурах в биореакторах, прежде всего, в супернатанте. Их собирали и выделяли белок E2 с помощью аффинной колоночной хроматографии на сефарозной колонке, с которой связывали моноклональное антитело со специфичностью к эпитопу TAVSPTTLR. Очищенный белок E2 собирали из колонки и определяли его количество посредством ингибирующего ELISA.
Используя электрофорез в SDS геле, определяли характеристики экспрессированного и очищенного белка E2: наблюдали одну полосу приблизительно 80 кДа при чистоте приблизительно 80%. Затем количественно определяли E2 в ELISA, наряду с образцами стандартов массы. Рекомбинантный экспрессированный белок E2 CSFV с мутантным эпитопом TAVSPTTLR можно получать обычным образом в виде очищенного стокового раствора приблизительно 800 мкг/мл.
1.5. Обнаружение с помощью способа в соответствии с изобретением
Способ обнаружения антител против CSFV дикого типа в тестируемом образце в соответствии с изобретением применяли к образцам из Kortekaas et al., 2011 (выше), описанным выше.
Протокол в целом основан на таковом для IDEXX ELISA, вдобавок с совместной инкубацией. Вкратце: набор IDEXX CSF Ab Test использовали в соответствии с инструкциями производителя, за одним исключением: стандартный разбавитель для образцов заменяли на 2× концентрированную версию. Затем 25 мкл (то есть, половину объема, предписанного в протоколе тестового набора) этого 2× разбавителя для образцов совместно инкубировали в покрытых E2 лунках с 50 мкл образца сыворотки и 25 мкл раствора бакуловирусного экспрессированного белка E2 CSFV с мутантным эпитопом TAVSPTTLR так, что присутствовало приблизительно по 1 мкг E2/лунка.
Белок E2 CSFV с мутантным эпитопом TAVSPTTLR, который использовали в этих совместных инкубациях, представлял собой E2, который содержится в вакцине из вируса vFlc-ΔPTa1.
На фиг. 1C представлены полученные результаты, которые непосредственно иллюстрируют различие с результатами того же анализа без совместной инкубации (фиг. 1B); или со схожим анализом, без совместной инкубации (фиг. 1A). Все образцы от свиней, вакцинированных C-штаммом, реагируют положительно, тогда как все образцы от свиней, вакцинированных маркерной вакциной, реагируют отрицательно. Не обнаруживали эффект вторичной вакцинации и даже скачковые значения, которые наблюдали для свиней № 3163 и 3164, были ниже порога. Таким образом, наконец, возможен эффективный DIVA тест для живой аттенуированной CSFV вакцины!
Когда этот эксперимент повторяли с использованием белка E2 из CSFV дикого типа для совместной инкубации (не представлено здесь), все результаты отличались: все образцы получали отрицательные оценки, даже образцы от свиней, вакцинированных C-штаммом. Следовательно, это не является эффективной альтернативой.
Введение совместной инкубации также выполняли в базовом протоколе PrioCHECK CSFV Ab 2.0 ELISA (Prionics). По существу, наблюдали те же результаты: очень эффективное снижение ложных положительных результатов, оставляющее положительные оценки для только истинных положительных образцов (здесь: выше 40% ELISA ингибирования).
1.6. Краткое изложение результатов повторного тестирования образцов известного уровня техники
Результаты экспериментов, как описано выше, собраны в таблице 1. Они показывают, что классификация, которую вакцинированные животные из эксперимента Kortekaas 2011 (выше) получат при тестировании на присутствие/подозрение на присутствие антител к CSFV, различается, в зависимости от того, какой способ обнаружения антител к E2 будут применять. Очевидно, что только с использованием совместной инкубации с носителем, который содержит мутантный эпитоп TAVSPTTLR из CSFV E2, животных, вакцинированных CSFV вакциной, которая содержит белок E2 CSFV, содержащий мутантный эпитоп TAVSPTTLR, можно четко отличать от животных, которые инфицированы CSFV дикого типа или вакцинированы C-штаммом.
Таблица 1Число животных из эксперимента Kortekaas 2011, которых оценивали как подозрительных или положительных в отношении антител к CSFV с использованием различных способов обнаружения антител к CSFV E2.
Способ обнаружения антител к CSFV E2
Вакцина дикого типа
Маркерная вакцина
Prionics ELISA
4/4
5/5
IDEXX ELISA
4/4
4/5
IDEXX ELISA+совместная инкубация с E2 дикого типа
0/4
0/5
IDEXX ELISA + совместная инкубация с мутантным E2
4/4
0/5
Пример 2: Установление специфичности и чувствительности теста.
Для того чтобы определять, что специфичность и чувствительность способов в соответствии с изобретением по меньшей мере сравнимы с таковыми для стандартных коммерческих ELISA для антител к E2 CSFV, большое число образцов (приблизительно 900) тестировали с использованием одного из способов в соответствии с изобретением. Доктором W. L. Loeffen предоставлен доступ к образцам из коллекции Virology Division, Central Veterinary Institute, Lelystad, Netherlands, которая содержала группу из более чем 400 CSFV отрицательных сывороток полевых свиней из Netherlands, группу из более чем 400 образцов от экспериментально инфицированных CSFV свиней, у которых образцы брали в течение нескольких недель, и группу из приблизительно 80 образцов сыворотки свиней смешанного происхождения; эта последняя группа содержала положительные и отрицательные сыворотки от свиней, вакцинированных против CSFV или инфицированных CSFV, а также свиней, инфицированных BVDV или штаммами BDV, а также некоторыми смешанными инфекциями.
Для применения способов в соответствии с изобретением все образцы тестировали с использованием протокола и материалов набора IDEXX CSF Ab Test, используя предварительно покрытые планшеты, положительные и отрицательные контрольные образцы, конъюгат моноклонального антитела A18, субстрат для цветной реакции, останавливающий раствор и раствор для промывания. Единственное отличие состояло в том, что разбавитель для образцов заменяли на 2× концентрированную версию этого разбавителя, который использовали в половине объема, указанного в тестовом протоколе; другую половину объема обеспечивали посредством добавления раствора, содержащего белок E2 CSFV с мутантным эпитопом TAVSPTTLR, а именно белок E2, содержащийся в вирусе vFlc-ΔPTa1. Контрольные образцы тестировали двукратно, тестовые образцы однократно.
Результаты ингибирующего ELISA интерпретировали так же, как для коммерческого ELISA: отрицательные при 30% ингибирования или меньше; положительные при 40% ингибирования или больше; оценки между 30% и 40% ингибирования соответствуют подозрительным образцам.
2.1. CSFV-отрицательные полевые образцы:
Группу отрицательных полевых сывороток в целом оценивали между -20% и 0% ELISA ингибирования. Результаты представлены на фиг. 2. Средняя оценка для 413 образцов составляла: -11±5,2%. Это соответствует ожиданиям: все образцы оценивали значительно ниже порогового значения для подозрительных/положительных образцов (30% ELISA ингибирование), и использование способа обнаружения и способа дифференциации, оба в соответствии с изобретением, не давало каких-либо ложных положительных оценок для истинных отрицательных образцов.
2.2. CSFV-положительные экспериментальные образцы:
Анализ группы из более чем 400 CSFV-положительных образцов, которые брали с течением времени, доказал превосходную чувствительность способов в соответствии с изобретением. Результаты представлены на фиг. 3 и показывают, что, в частности, в начальные моменты времени после инфекции, способы в соответствии с изобретением предоставляют результаты, которые позволяют классифицировать больше образцов как положительные и классифицировать меньше образцов как подозрительные или отрицательные, чем коммерческий ELISA для антител к CSFV E2. Это наиболее заметно на 14 сутки после инфекции и в некоторой степени сохраняется на 21 сутки после инфекции.
Следовательно, это доказывает, что чувствительность способов в соответствии с изобретением, при правильном обнаружении истинных положительных образцов, по меньшей мере также хороша, как у коммерческого ELISA для антител к CSFV E2, или, иначе говоря: введение совместной инкубации в одну стадию существующего ELISA для антител к CSFV E2 вовсе не вредит чувствительности теста.
2.3. Смешанные образцы
Одну группу из приблизительно 80 образцов различных типов тестировали с использованием способов в соответствии с изобретением для того, чтобы сравнивать результаты с таковыми у стандартного коммерческого ELISA. Различные образцы брали из панелей, известных как «Erns workshop», «CSFV EU reference panel» и внутренняя «Pestivirus reference panel» из CVI Lelystad.
Образцы и их коды перечислены в таблице 2, наряду с результатами обнаружения антител против E2 CSFV, используя или способы в соответствии с изобретением (указано в колонке «Изобретение») или коммерческий ELISA для антител к CSFV E2 (указано в колонке «Коммерческий»). Колонка с номерами образцов приведена только в справочных целях: образцы 1-54 представляют собой сыворотки из полевых образцов животных, инфицированных различными штаммами CSFV или вакцинированных против CSFV; образцы брали в различные сутки после инфекции (с. п. и.) или сутки после вакцинации (с. п. в.); образцы 55-60 представляют собой истинные отрицательные образцы; образцы № 61-67 представляют собой сыворотки от инфекций BVDV; образец 68 от BDV инфекции; и образцы 69-76 от смешанных инфекций.
Результаты представлены в виде процентной оценки ELISA ингибирования и классифицированы в соответствии со схемой оценки коммерческого ELISA.
Как видно из результатов в таблице 2, для подавляющего большинства тестированных образцов результаты, полученные с использованием способов в соответствии с изобретением, давали оценки для процентной доли ELISA ингибирования с большей различающей способностью, чем коммерческий ELISA. Только в двух случаях результаты, полученные способом в соответствии с изобретением, отклонялись отрицательным образом по сравнению с коммерческим ELISA: образцы 23 и 75. Не известно, имели ли место ошибки при выполнении теста. Следовательно, способы в соответствии с изобретением по меньшей мере так же чувствительны, как коммерческий ELISA для антител к CSFV E2.
Это может иметь значимые последствия, поскольку для некоторых образцов коммерческий ELISA и способы в соответствии с изобретением давали различные классификации. Примерами являются образцы №№: 8, 25, 28, 38 и 45, которые классифицировали как «подозрительные» при использовании коммерческого ELISA, но в соответствии со способами по изобретению их нужно классифицировать как «положительные» в отношении антител к CSFV E2. Аналогичным образом, классификацию образца № 37 нужно изменить с отрицательной на подозрительную.
Только для двух образцов №№ 23 и 75 результат способа в соответствии с изобретением был отрицательным, хотя оценка при использовании коммерческого ELISA для антител к E2 была положительной. Причиной может являться экспериментальная ошибка в любом из анализов.
Таблица 2Результаты обнаружения антител к E2 CSFV в наборе смешанных образцов, выраженные в процентной доле ELISA ингибирования.
#
Источник/тип образца сыворотки
Изобретение
Коммерческий
1
pr 83-01/Denissen 49 с. п. и./C5FV
105
94
2
pr 86-01/Al fort 120 с. п. и./CSFV
105
94
3
pr 96-16/cedipest 28 с. п. и./CSFV
69
48
4
pr 96-16/cedipest 28 с. п. и./CSFV
81
51
5
pr 96-16/cedipest 28 с. п. и./CSFV
61
53
6
pr 96-04/v. Zoelen 46 с. п. и./CSFV
96
77
7
pr 95-05/E2-vacc. 35 с. п. и./CSFV
95
84
8
pr 95-05/E2-vacc. 35 с. п. и./CSFV
48
31
9
pr 95-05/E2-vacc. 35 с. п. и./CSFV
76
56
10
pr 96-05/Bergen 28 с. п. и./CSFV
89
72
11
pr 96-05/Bergen 28 с. п. и./CSFV
77
56
12
pr 96-05/Bergen 35 с. п. и./CSFV
76
61
13
pr 96-04 v. Zoelen 27 с. п. и./CSFV
76
52
14
pr 96-04 v. Zoelen 27 с. п. и./CSFV
89
68
15
pr 96-04 v. Zoelen 27 с. п. и./CSFV
76
48
16
pr 96-06/Henken 28 с. п. и./CSFV
77
50
17
pr 96-06/Henken 28 с. п. и./CSFV
78
53
18
pr 96-06/Henken 28 с. п. и./CSFV
82
56
19
pr 96-06/Henken 28 с. п. и./CSFV
86
62
20
pr 98-04/Cedipest 49 с. п. в./CSFV
74
59
21
pr 98-04/Cedipest 49 с. п. в./CSFV
88
71
22
pr 98-04/Cedipest 49 с. п. в./CSFV
96
83
23
pr 98-04/Cedipest 49 с. п. в./CSFV
7
48
24
pr 98-04/Cedipest 49 с. п. в./CSFV
82
64
25
pr98-08/isolat 97-01 (Melis) 14 с. п. и./CSFV
52
38
26
pr98-08/isolat 97-01 (Melis) 18 с. п. и./CSFV
74
63
27
pr98-08/isolat 97-01 (Melis) 15 с. п. и./CSFV
23
10
28
pr98-08/isolat 97-01 (Melis) 18 с. п. и./CSFV
51
37
29
pr98-08/isolat 97-01 (Melis) 14 с. п. и./CSFV
6
16
30
pr98-08/isolat 97-01 (Melis) 18 с. п. и./CSFV
12
4
31
pr98-08/isolat 97-01 (Melis) 18 с. п. и./CSFV
72
47
32
pr98-08/isolat 97-01 (Melis) 18 с. п. и./CSFV
79
55
33
CSF D33
79
67
34
CSF D14
36
24
35
CSF D21
41
27
36
CSF D26
87
61
37
CSF D15
39
25
38
CSF D21
58
38
39
CSF D29
95
76
40
CSF D18
75
56
41
CSF D20
77
61
42
CSF0123, 14 с. п. и.
45
41
43
CSF0277, 17 с. п. и.
86
69
44
CSF0650, 20 с. п. и.
76
52
45
CSF0902, 21 с. п. и.
49
34
46
CSF0123, 20 с. п. и.
73
53
47
CSF0277, 25 с. п. и.
79
62
48
CSF0902, 26 с. п. и.
85
62
49
CSF0573, 26 с. п. и.
74
56
50
CSF0104, 29 с. п. и.
89
69
51
CSF0695, 33 с. п. и.
81
71
52
CSF0573, 33 с. п. и.
85
69
53
CSF0123, 43 с. п. и.
95
84
54
CSF0104, 77 с. п. и.
94
87
55
pr 90-07/te Breteler/BVDV
8
-7
56
pr 83-04/Borgers/BVDV
6
24
57
pr 83-04/Borgers/BVDV
2
-13
58
pr 83-04/den Otter/BVDV
12
0
59
pr 83-04/Kossink/BVDV
1
-5
60
pr 83-04/Poels/BVDV
20
29
61
BVD D69
0
18
62
BVD D34
15
-6
63
BVD D69
1
2
64
BVD 10421/96, 34 с. п. и.
-11
0
65
BVD NADL/Osloss, 179 с. п. и.
3
2
66
BVD Arnsberg, 69 с. п. и.
-8
-2
67
BVD II Giessen, 64 с. п. и.
-5
-7
68
BD "F
-9
1
69
pr 94-13/strain "F"/BDV
9
-1
70
pr 94-13/strain "F"/BDV
58
45
71
pr 94-13/strain "F"/BDV
85
75
72
pr 97-17/veld CSFV-BVDV
3
15
73
pr 97-17/veld CSFV-BVDV
12
29
74
pr 97-17/veld CSFV-BVDV/CSFV 28 с. п. и.
83
73
75
pr 97-17/veld CSFV-BVDV/CSFV 28 с. п. и.
14
41
76
BD+CSF D20
80
56
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1
Результаты анализа с использованием блокирующего ELISA для антител к E2 CSFV в образцах, описанных у Kortekaas et al., 2011 (выше): сравнивали исследования с использованием стандартных коммерческих анализов и исследования с использованием способа в соответствии с изобретением.
Штриховые линии представляют результаты для образцов свиней, вакцинированных вакциной из C-штамма CSFV, «CS» образцы; сплошные линии изображают результаты для образцов свиней, вакцинированных маркерной вакциной на основании вируса vFlc-ΔPTa1, «VS» образцы.
Горизонтальные серы полосы обозначают пороговые оценки в различных анализах для интерпретации образцов в качестве положительных, подозрительных или отрицательных в отношении антител к E2 CSFV дикого типа.
Фиг. 1A: сравнительные результаты: репродукция фиг. 4A из Kortekaas et al., 2011 (выше). В качестве E2 ELISA использовали PrioCHECK CSFV Ab 2.0 (Prionics).
Фиг. 1B: результаты тестирования образцов из Kortekaas et al., 2011 (выше) с использованием другого коммерческого E2 ELISA, IDEXX CSFV Ab Test (IDEXX).
Фиг. 1C: результаты повторного тестирования образцов из Kortekaas et al., 2011 (выше) с использованием способа обнаружения в соответствии с изобретением: совместную инкубацию вводили в одну стадию IDEXX CSFV Ab Test.
Фиг. 2
Результаты анализа антител к CSFV в более чем 400 отрицательных полевых образцах. Тест осуществляли в соответствии с протоколом для IDEXX CSFV Ab Test (IDEXX), с модификацией в виде совместной инкубации в способе в соответствии с изобретением. Результаты представлены в виде усредненных значений процентной доли ELISA ингибирования, которые обнаруживали на микротитровальный планшет, объединяя результаты для всех образцов, и одного для всех планшетов вместе. Наибольшее и наименьшее значения обозначены черными ромбами, соединенными черной полосой, и усредненные значения с помощью серого ромба.
Фиг. 3
Результаты анализа более чем 400 образцов от свиней, которых экспериментально инфицировали CSFV, которые брали на 2, 3 или 4 неделе после инокуляции. Не для всех животных было доступно три образца. Способ обнаружения представлял собой или способ в соответствии с изобретением, обозначенный как «Изобр.»; или коммерческий ELISA (IDEXX CSFV Ab Test), обозначенный как «Комм.». Классификация: отрицательные, подозрительные и положительные на основании процентной доли ELISA ингибирования, измеряемой и присваиваемой в соответствии со схемой оценки коммерческого ELISA, соответственно, меньше чем 30%, 30-40% или больше чем 40% ELISA ингибирования.