НОВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
NOVEL APPLICATION

Настоящее изобретение относится к применению олигосахарида, в частности галактоолигосахарида, для профилактики или лечения воспаления, в частности для профилактики или лечения воспалительного заболевания кишечника. Галактоолигосахариды представляют собой неперевариваемые углеводы, которые устойчивы к действию пищеварительных ферментов желудочно-кишечного тракта млекопитающих, но расщепляются особыми бактериями толстой кишки.
Кишечная флора человека включает группы болезнетворных, безвредных и полезных микроорганизмов. Преобладание первых может приводить к заболеваниям кишечника, которые могут быть как острыми (например, гастроэнтерит), так и хроническими (например, воспалительное заболевание кишечника и некоторые виды злокачественных новообразований кишечника).
Guarner F, Malagelada JR, Best Pract. Res. Clin. GatroenteroL, (2003); 17; 793-804
Sartor RD., Gastroenterology, (2004), 126, 1620-1633
Было показано, что пребиотики, под которыми подразумеваются неперевариваемые пищевые ингредиенты, оказывающие полезное влияние на организм посредством избирательной стимуляции роста и/или активности одного или нескольких видов бактерий в толстой кишке и тем самым способствующие улучшению состояния здоровья, обладают непрямым защитным эффектом при ряде воспалительных состояний, таких как воспалительные заболевания кишечника (ВЗК). Было установлено, что адаптивная иммунная система некоторых пациентов с ВЗК гиперчувствительна по отношению к симбионтной флоре кишечника (смотри ). Как следствие, пребиотики применяют с целью коррекции полезной микрофлоры кишечника, которая помогает предотвращать рецидив заболевания (смотри ).
n
HBittenden, (1999) Probiotics: Α HBitical Review, Tannock, G. (ed) Horizon Scientific Press, Wymondham, pp 141-156
Одной из групп соединений, классифицируемых как пребиотики, являются галактоолигосахариды. Это галактозосодержащие олигосахариды вида Глю(β 1-4)[Гал(β l-6)], где n=2-5, которые получают из лактозного сиропа, используя трансгалактозилазную активность фермента β-галактозидазы ().
Bifidobacterium bidifum
Bifidobacteria
Lactobacilli
EP1644482 описывает новый штамм , который продуцирует активность фермента галактозидазы, превращающую лактозу в смесь новых галактоолигосахаридов. Такая смесь галактоолигосахаридов включает дисахариды Гал(β 1-3)-Глю; Гал(β l-3)-Гал; Гал(β l-6)-Гал; Гал(β l-6)-Гал; трисахариды Гал (β 1-6)-Гал(β l-4)-Глю или Гал(β l-3)-Гал(β l-4)-Глю; тетрасахарид Гал(β l-6)-Гал(β 1-6)-Гал(β l-4)-Глю или пентасахарид Гал(β l-6)-Гал(β l-6)-Гал(β l-6)-Гал(β l-4)-Глю и, как было показано, обладает пребиотическими свойствами и увеличивает численность полезных бактерий  и . Такая смесь галактоолигосахаридов представлена на рынке под названием Bimuno (зарегистрированная торговая марка) и продается фирмой Clasado Ltd. (Milton Keynes, UK).
Vulevic, J et al.
Am. J Clin. Nutr., (2008), 88: 1438-46
описали в , что назначение галактоолигосахаридов здоровым людям пожилого возраста приводило к положительным эффектам как на состав микрофлоры фекалий, так и на иммунный ответ.
К настоящему времени установлено, что галактоолигосахарид, имеющий СП (степень полимеризации) 3 или более, способен напрямую модулировать воспалительный ответ слизистой кишечника млекопитающих. В частности, он снижает провоспалительный хемокиновый ответ в присутствии факторов воспаления. Таким образом, подобный галактоолигосахарид может быть пригоден для лечения таких воспалительных состояний кишечника, как воспалительное заболевание кишечника, колит, некротический энтероколит, псевдомембранозный колит, язвенный колит, болезнь Крона, дивертикулит, ишемия и т.д.
Согласно настоящему изобретению обеспечивается галактоолигосахарид со СП3 или более для применения в целях профилактики или лечения воспаления, предпочтительно для профилактики или лечения воспалительных заболеваний кишечника. Предпочтительный галактоолигосахарид имеет СП от 3 до 5.
Галактоолигосахарид имеет формулу трисахарида Гал-Гал-Глю, тетрасахарида Гал-Гал-Гал-Глю или пентасахарида Гал-Гал-Гал-Гал-Глю, в которой Гал обозначает остаток галактозы и Глю обозначает остаток глюкозы. Структуры галактоолигосахаридов представляют собой Гал(β 1-6)-Гал(β 1-4)-Глю, Гал(β 1-3)-Гал(β l-4)-Глю, Гал (β 1-6)-Гал(β 1-6)-Гал(β l-4)-Глю и Гал(β 1-6)-Гал(β 1-6)-Гал (β 1-6)-Гал(β l-4)-Глю. Галактоолигосахарид предпочтительно выбран из группы, состоящей из указанных выше галактоолигосахаридов.
Энтероциты образуют однорядный поляризованный эпителиальный слой, разграничивающий организм и содержимое кишечной полости. Они принимают активное участие в защите организма. Их врожденный иммунный ответ на различные воспалительные стимулы, главным образом, отвечает за быстрое восстановление барьерной функции эпителия. При необходимости стимулированный эпителий способен выделять провоспалительные цитокины и хемокины, которые запускают процесс привлечения в поврежденные слизистые клеток врожденного иммунитета, таких как нейтрофилы. Например, в ходе иммунного ответа эпителиальные клетки и макрофаги могут секретировать провоспалительные хемокины, такие как IL-8, для привлечения в воспаленные слизистые нейтрофилов и ПЯЛ (полиморфноядерных лейкоцитов). Макрофагальный воспалительный белок-3α (MIP-3α) или CCL20 является еще одним хемокином, запускающим адаптивную иммунную систему посредством активации лимфоцитов и дендритных клеток через активацию их хемокинового рецептора CCR6. Индукция IL-8 и MIP-3α (CCL20) отражает выраженность ответа на воспалительное воздействие.
Изучено влияние галактоолигосахарида на воспалительный ответ в различных модельных культурах клеток толстой кишки взрослых людей. Неожиданно было установлено, что в эпителиальных клетках кишечника, т.е. энтероцитах человека, он в физиологических концентрациях ослабляет провоспалительный хемокиновый ответ, вызванный воспалительной стимуляцией TNF-α.
Галактоолигосахарид можно получать из коммерчески доступной смеси галактоолигосахаридов, известной как Bimuno, посредством очистки, например, методом эксклюзионной хроматографии (гель-фильтрации), проводимой при комнатной температуре с помощью, например, колонки Biogel P2. Образец можно получать посредством растворения порошка в воде 10% масс./об. и элюировать со скоростью 2 мл/мин в деионизированной воде.
Альтернативно, активную фракцию смеси Bimuno можно получать посредством ферментативного трансгалактозилирования с использованием соответствующего фермента.
Галактоолигосахарид может быть представлен в форме порошка, сиропа или в виде мягкой пастилки. Его можно давать пациенту, страдающему воспалительным заболеванием, например воспалительным заболеванием кишечника, ежедневно в эффективной дозировке активного галактоолигосахарида от 1 до 10 г, предпочтительно от 2 до 5 г, наиболее предпочтительно 2,75 г. Его можно принимать однократно или в двух раздельных дозах через несколько часов. Порошок галактоолигосахарида можно добавлять в горячее питье или насыпать в пищу. Сироп можно потреблять непосредственно или, альтернативно, добавлять в напиток или смешивать с пищей. Мягкую пастилку разжевывают во рту.
С целью профилактики воспаления индивидууму можно вводить галактоолигосахарид в эффективной ежедневной дозировке от 1 до 10 г, предпочтительно 2 до 5 г, наиболее предпочтительно 2,75 г.
Согласно другому аспекту изобретения, настоящим обеспечивается способ лечения или профилактики воспаления, такого как воспаление кишечника, включающий введение эффективного количества галактоолигосахарида.
Настоящее изобретение будет дополнено при помощи ссылок на следующие примеры и фигуры.
на фигуре 1 показано влияние B-ГОС на индуцированную TNF-α секрецию IL-8 в клетках T84;
фигуры 2(Α) и (B) показывают влияние B-ГОС на индуцированную TNF-α секрецию IL-8 и MIP-3 в клетках NCM-460;
фигуры 3(Α) и (B) показывают влияние B-ГОС на экспрессию IL-8 и MIP-3α мРНК в клетках NCM-460, обработанных TNF-α;
фигуры 4(Α), (B) и (C) показывают влияние B-ГОС на перемещение белка NF-κB p65 в ядра клеток NCM-460, обработанных TNF-α;
фигуры 5 и 6 показывают влияние B-ГОС на индуцированную TNF-α секрецию IL-8 в клетках NCM-460;
фигуры 7(Α) и (B) показывают влияние B-ГОС на секрецию IL-6 и MIP-2 у мышей, получавших декстран сульфата натрия (ДСН);
фигуры 8(Α) и (B) показывают влияние различных фракций галактоолигосахаридов на продукцию IL-8 и MIP-3α, соответственно; и
фигуры 9(Α) и (B) показывают влияние на индуцированную TNF-α продукцию IL-8 и MIP-3, соответственно, в случаях, когда клетки NCM460 обрабатывают Bimuno и его фракциями СП3 и СП>3.
ПРИМЕР 1
Влияние галактоолигосахаридов на секрецию цитокинов
5
Эпителиальные клетки кишечника выращивали в монослое в 24-луночных планшетах из начальной концентрации 5×10 клеток/мл. Когда клетки достигали 70% конфлюэнтности, их обрабатывали следующим образом в четырех повторах: (i) отрицательный контроль, (ii) положительный контроль TNF-α (10 нг/мл), (iii) B-ГОС (5 г/л) и (iv) TNF-α (10 нг/мл) с B-ГОС (5 г/л). Концентрацию олигосахаридов 5 г/л использовали исходя из того, что она является физиологической концентрацией олигосахаридов, обнаруженных в человеческом молоке. Через 16 часов собирали супернатанты и хранили при -20°C для дальнейшего измерения уровней секреции IL-8 и MIP-3α методом ELISA. В последующих экспериментах TNF-α заменяли на IL-1β или флагеллин.
Измерение IL-8.
Claud EC, Savidge T, Walker WA 2003 Modulation of human intestinal epithelial cell IL-8 secretion by human milk factors. Pediatr Res 53:419-425
2
4
Концентрацию IL-8 измеряли методом ELISA как было описано ранее (). В кратком изложении, каждую лунку 96-луночного высокоадгезивного планшета (Nunc Immulon, Fisher Scientific, Middletown, VA, USA) покрывали в течение ночи 100 мкл 3 мкг/мл моноклональных антител мыши к IL-8 человека, трижды промывали с помощью 200 мкл 1% BSA в PBS и инкубировали по 100 мкл образцов в течение одного часа при 37°C. Затем лунки трижды промывали и инкубировали в присутствии 100 мкл 0,1 мкг/мл биотинилированных антител мыши к IL-8 человека в течение одного часа. После еще одного промывания, каждую лунку инкубировали в присутствии 100 мкл пероксидазы хрена и снова промывали перед инкубацией со 100 мкл O-фенилендиамин дигидрохлорида и пероксида водорода. Реакцию останавливали 100 мкл 2Н HSО и измеряли оптическую плотность при 490 нм. Концентрацию IL-8 в образцах рассчитывали по калибровочной кривой стандарта IL-8.
Измерение MIP-3α.
Уровень секреции MIP-3α измеряли методом ELISA аналогично IL-8, за исключением того, что планшет покрывали в течение ночи 100 мкл 2,0 мкг/мл моноклональных антител мыши к MIP-3α человека. Детектируемые антитела, биотинилированные антитела мыши к MIP-3α человека, использовали в качестве детектируемых антител в концентрации 50 нг/мл в конечном объеме 100 мкл. Концентрацию MIP-3α в образцах рассчитывали по калибровочной кривой стандарта MIP-3α.
Анализ жизнеспособности клеток.
5
Raimondi F, HBivaro V, Capasso L, Maiuri L, Santoro P, Tucci M, Barone MV, Pappacoda S, Paludetto R 2006 Unconjugated bilirubin modulates the intestinal epithelial barrier function in a human-derived in vitro model. Pediatr Res 60:30-33
Цитотоксичность B-ГОС оценивали методом исключения по окраске трипановым синим. Клетки NCM-460 выращивали на покровных стеклах из начальной концентрации 2×10 клеток/мл. Клетки обрабатывали в трех повторах B-ГОС (5 г/л) или контрольной средой. Через 16 часов жизнеспособность клеток NCM-460 изучали методом исключения по окраске трипановым синим (). При данной концентрации не было выявлено существенного влияния B-ГОС на жизнеспособность клеток.
Влияние B-ГОС на индукцию транскрипции цитокинов.
5
Клетки NCM-460 растили в монослое в 6-луночных планшетах из начальной концентрации 5×10 клеток/мл. Когда клетки достигали 70% конфлюэнтности, их обрабатывали следующим образом в четырех повторах: (i) отрицательный контроль, (ii) положительный контроль TNF-α или IL-1β или флагеллин (10 нг/мл), и (iii) TNF-α или IL-1 или флагеллин (10 нг/мл) с B-ГОС (5 г/л). Через 18 часов выделяли общую клеточную РНК методом экстракции в тризоле с хлороформом. Экспрессию мРНК IL-8, MIP-3α и MCP-1 измеряли на MJ Opticon 2 при помощи набора Superscript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR и стандартизовали по экспрессии мРНК гена GAPDH.
Влияние B-ГОС на перемещение NF-κB.
Клетки NCM-460 выращивали до 70% конфлюэнтности на покровных стеклах и обрабатывали следующим образом в течение 10 или 30 минут в двух повторах: (i) отрицательный контроль, (ii) положительный контроль TNF-α (10 нг/мл), и (iii) TNF-α (10 нг/мл) с B-ГОС (5 г/л). Удаляли среду и клетки фиксировали 4% параформальдегидом. После пермеабилизации метанолом и блокировки 10% сывороткой козы в 0,25% BSA в TBS, клетки обрабатывали поликлональными антителами кролика к NF-κB p65 человека. После промывания клетки инкубировали с конъюгированными с CyTM-3 антителами козы к антителам кролика. Затем покровные стекла промывали и помещали на предметные стекла для дальнейшей визуализации под микроскопом (Nikon Eclipse TE2000-S).
Материалы
Цитокины TNF-α, ИЛ-1β, флагеллин, стрептавидин-пероксидаза хрена и коммерческие наборы ELISA для CCL20-MIP-3α человека (Quantikine) получены от R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). IL-8 человека и антитела мыши к IL-8 человека получены от Pierce Endogen (Woburn, MA, USA). Таблетки O-фенилендиамина получены от Pierce (Rockford, IL, USA). Тризол, наборы Superscript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR и другие реагенты, необходимые для проведения количественной ПЦР получены от Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Среда DMEM/F12, среда CMRL, пенициллин, стрептомицин и буфер Hepes получены от Gibco-Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Фетальная бычья сыворотка получена от Atlanta Biologicals (Lawrenceville, GA, USA). M3D получена от Incell Corp. (San Antonio, TX, USA). Поликлональные антитела кролика к NF-κB (p65) человека получены от Calbiochem (Gibbstown, NJ, USA). Конъюгированные с CyTM-3 F(ab')2 фрагменты антител козы к IgG кролика получены от Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA). Все другие реагенты для иммунофлуоресценции получены от Vector Lab (Burlingame, CA, USA). Остальные реагенты соответствовали требованиям аналитических или медико-биологических исследований и были получены от Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
B-Галактоолигосахариды B-ГОС.
Bimuno был предоставлен Clasado Ltd., Milton Keynes, UK.
Клеточные линии эпителия кишечника.
2
2
В настоящих исследованиях использовали модельные эпителиальные культуры из кишечника двух взрослых людей: клетки T84 и NCM-460 представляют собой трансформированные и нетрансформированные эпителиальные клетки толстой кишки, соответственно. Клетки культивировали в культуральных флаконах Falcon при 37°C в атмосфере 95% O и 5% CO, насыщенной водяным паром. Среда для культивирования T84 состояла из DMEM/F12, дополненной FBS (5%), буфером Hepes, глутамином, заменимыми аминокислотами, пенициллином и стрептомицином (12). Среда для культивирования NCM-460 состояла из среды M3D, дополненной FBS (10%), пенициллином и стрептомицином, как описано ранее (13).
Статистическая обработка.
t-
t-
Индукцию цитокинов стандартизовали по положительному контролю с планками погрешностей, отражающими среднеквадратические отклонения (СО). Сравнения между группами осуществляли посредством двустороннего теста Стьюдента. Результаты генетической экспрессии, полученные методом количественной ПЦР, отражены в виде средних значений с указанием СО. Сравнения между группами осуществляли посредством двустороннего теста Стьюдента после логарифмического преобразования. Значение p<0,05 считали статистически достоверным и обозначали с помощью звездочки (*), значение p<0,01 обозначали двумя звездочками (**) и значение p<0,001 обозначали тремя звездочками (***).
Результаты
Влияние галактоолигосахаридов B-ГОС на секрецию цитокинов в клетках T84 (фигура 1).
Индуцированную TNF-α секрецию IL-8 в клетках T84 нормализовали к 100% для возможности сравнения между 4 независимыми экспериментами. Необработанные клетки T84 обладали базальным уровнем секреции IL-8 равным 20,5%. После стимуляции TNF-α секреция IL-8 достоверно возрастала в 4,9 раза (p<0,001).
С целью определения влияния B-ГОС, клетки T84 стимулировали галактоолигосахаридами B-ГОС (5 г/л) в присутствии или без TNF-α. Клетки T84, обработанные B-ГОС, секретировали 16,4% IL-8. Это незначительно отличалось от базального уровня необработанных клеток T84. В случае стимуляции TNF-α, B-ГОС достоверно снижал секрецию IL-8 до 38,5% (p<0,001).
Влияние галактоолигосахаридов B-ГОС на секрецию цитокинов в клетках NCM-460 (фигура 2, фигура 5, фигура 6)
Индуцированную TNF-α секрецию IL-8 и MIP-3α в клетках NCM-460 нормализовали к 100% для возможности сравнения между 4 независимыми экспериментами. Необработанные клетки NCM-460 обладали базальными уровнями секреции IL-8 и MIP-3α, равными 1,7% и 4,0%, соответственно. После стимуляции TNF-α секреция IL-8 и MIP-3α достоверно возрастала в 58,8 раз (p<0,001) (фигура 2A) и в 25,0 раз (p<0,001) (фигура 2B), соответственно.
С целью определения влияния B-ГОС, клетки NCM-460 стимулировали галактоолигосахаридами B-ГОС (5 г/л) в присутствии или без TNF-α. Обработанные B-ГОС клетки NCM-460 секретировали IL-8 и MIP-3α с уровнями 1,1% и 3,9%, соответственно; это незначительно отличалось от базальных уровней необработанных клеток NCM-460. В случае стимуляции TNF-α, B-ГОС достоверно снижали секрецию IL-8 и MIP-3α до 43,5% (p<0,001) (фигура 2A) и 52,1% (p<0,05) (фигура 2B), соответственно. Аналогичным образом, если клетки NCM-460 предварительно промывали с B-ГОС перед стимуляцией TNF-α, то секреция IL-8 достоверно снижалась до 32% (p<0,001) даже в отсутствие B-ГОС (фигура 6). Это позволяет предположить, что компоненты смеси B-ГОС взаимодействуют с эпителиальными рецепторами, такими как Toll-подобные рецепторы (TLR), с предотвращением воспалительной стимуляции клеток.
Подобным образом, после стимуляции флагеллином B-ГОС достоверно снижали секрецию IL-8 до 21,5% (p<0,05) (фигура 5). После стимуляции IL-1β не было обнаружено никакого эффекта.
Для определения цитотоксичности B-ГОС клетки NCM-460 инкубировали в течение 16 часов в присутствии или без B-ГОС. B-ГОС не влияли на жизнеспособность клеток, что определялось с помощью метода исключения по окраске трипановым синим, как описано в методах.
Влияние галактоолигосахаридов B-ГОС на экспрессию цитокинов (фигура 3)
Из обработанных TNF-α клеток NCM-460 выделяли общую РНК и методом количественной ПЦР исследовали экспрессию мРНК IL-8, MIP-3α и MCP-1. После стимуляции TNF-α экспрессия мРНК IL-8 и MIP-3α достоверно увеличивалась в 12,2 раза (p<0,001) (фигура 3A) и в 99,4 раз (p<0,001) (фигура 3B), соответственно. Ни в одном из случаев обработки клеток не было выявлено изменений в экспрессии мРНК MCP-1 (p=0,19) (результат не показан). С целью определения влияния B-ГОС, клетки NCM-460 стимулировали галактоолигосахаридами B-ГОС (5 г/л) в присутствии или без TNF-α. Галактоолигосахариды B-ГОС достоверно снижали индуцированную TNF-α экспрессию мРНК IL-8 и MIP-3α в 5,7 раз (p<0,05) (фигура 3A) и в 58,9 раз (p < 0,05) (фигура 3B), соответственно. Экспрессия мРНК MCP-1 снижалась за счет B-ГОС, но не достигала достоверного различия (p=0,06) (результат не показан).
Влияние галактоолигосахаридов B-ГОС на перемещение NF-κB (фигура 4)
Клетки толстой кишки взрослого человека NCM-460 обрабатывали TNF-α (10 нг/мл) и изучали внутриядерное перемещение белка NF-κB p65. В обработанных плацебо контрольных клетках (фигура 4A) окрашивание NF-κB p65 происходило преимущественно в цитоплазме, а ядро было свободно от белка p65. Через 30 минут после стимуляции TNF-α NF-κB p65 отчетливо выявлялся в ядре (фигура 4B).
Тем не менее, 30-минутное перемещение NF-κB, индуцированное TNF-α, частично подавлялось в присутствии B-ГОС (фигура 4C).
ПРИМЕР 2
in vivo
Изучение влияния B-ГОС  на мышиной модели колита, вызванного декстраном сульфата натрия
Материалы и методы
Для индукции колита использовали две группы (по n=24 в каждой) взрослых мышей C57BL/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbour, ME, USA), выращенных в нормальных условиях (ВН) и лишенных микрофлоры (ЛМ). Всех животных содержали в условиях 12-часового цикла чередования света и темноты и обеспечивали неограниченной пищей и водой.
В возрасте 6 недель заселенные бактериями мыши содержались в обычных условиях на неизмененной воде (группа ВН), в то время как мыши из группы ЛМ в течение 2 недель получали с питьевой водой смесь антибиотиков. Смесь антибиотиков состояла из канамицина (8 мг/мл), гентамицина (0,7 мг/мл), колистина (34000 Е/мл), метронидазола (4,3 мг/мл) и ванкомицина (0,9 мг/мл). Концентрации антибиотиков в воде рассчитывали исходя из среднего объема воды, потребляемой возрастной группой.
В возрасте 8 недель у всех мышей из обеих групп (ВН и ЛМ) вызывали воспаление толстой кишки посредством введения с питьевой водой в течение 5 суток 3,5% ДСН (декстрана сульфата натрия) (MP Biomedicals, Aurora, OH, USA). В возрасте 10 недель половина мышей каждой группы начинала получать Bimuno (5 г/л) в течение 7 суток. К концу 10 недели животных умерщвляли и извлекали органы для анализа.
Измерения цитокинов
Мышиные цитокины IL-6 и MIP-2 изучали в гомогенатах ткани толстой кишки методом ELISA (Quantikine, R&D Systems, MN, USA), согласно инструкциям производителя. В кратком изложении, в каждой группе собирали проксимальные отделы толстой кишки и гомогенизировали их в гомогенизирующем буфере PBS, содержащем 1% Triton X-100, дополненном смесью ингибиторов протеаз. Гомогенизированные растворы осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин, супернатанты разделяли на аликвоты и хранили при -70°C.
Результаты
Оценивали способность Bimuno уменьшать повреждение и воспаление при вызванном ДСН колите в обеих группах мышей (ВН и ЛМ) в сравнении с контрольными мышами (без введения Bimuno).
У обычных мышей, получавших ДСН, секреция IL-6 и MIP-2 достоверно возрастала в 2,2 (p<0,0001) и 8,3 раза (p<0,0001), соответственно. Bimuno достоверно снижал секрецию IL-6 и MIP-2 в 6,6 (p<0,0001) и 5,5 раз (p<0,0001).
У ЛМ мышей, получавших ДСН, секреция IL-6 и MIP-2 достоверно возрастала в 6,2 (p<0,0001) и 27,2 раз (p=0,0005), соответственно. Bimuno достоверно снижал секрецию IL-6 в 3,6 раза (p<0,0001). Секреция MIP-2 снижалась в 1,3 раза, но это значение не было признано достоверным (p=0,126).
Подводя итог, у обычных мышей, получавших ДСН, развивался колит, сопоставимый с интактной группой животных. Обычные мыши, получавшие ДСН и дополненные Bimuno, обладали достоверно сниженными количествами маркеров воспаления (IL-6 и MIP-2) и облегченными симптомами колита. Похожий эффект наблюдали у лишенных микрофлоры мышей, получавших ДСН. Это указывает на то, что наблюдаемое благодаря Bimuno уменьшение воспаления опосредовано не только микрофлорой. При колите, вызванном ДСН, Bimuno обладает прямым иммуномодулирующим действием на эпителий кишечника.
ПРИМЕР 3
Влияние фракций смеси галактоолигосахаридов Bimuno на продукцию цитокинов MIP-3α и IL-8 в присутствии воспалительного цитокина TNF-α
Материалы и методы
Получение фракций ГОС из смеси Bimuno
2
С целью выделения и получения различных фракций галактоолигосахаридов (СП2, очищенная от лактозы, СП3 и СП>3) применяли эксклюзионную хроматографию на колонке Biogel P2 (100 × 5 см) (Pharmacia, UK), проводимую при комнатной температуре. Все образцы элюировали со скоростью 2 мл/мин в деионизированной воде и проверяли с помощью детектора 132RI (Gilson). Из фракции СП2 удаляли лактозу посредством β-галактозидазы BIOLACTA FNS, предоставленной TENNOJI-KU (Osaka, Japan). Гидролиз проводили при 40°C и pH=6,4 с использованием 100 мМ раствора фосфата натрия в качестве буфера и 1 мМ MgCl в качестве кофактора. Содержание углеводов в каждой фракции анализировали посредством гель-проникающей и ионообменной хроматографии на ВЭЖХ-колонках RCM-MONOСАХАРИДS Rezex в сочетании с детектором LaChrom RI Detector L-7490 (MERCK). Олигосахариды элюировали в деионизированной воде со скоростью 0,5 мл/мин при 84,4°C.
Культура клеток
2
Клеточную линию NCM460, полученную из эпителия слизистой толстой кишки здорового человека, приобретали в INCELL CORPORATION LLC и поддерживали в среде M3Base (INCELL CORPORATION LLC), дополненной 10% [об./об.] фетальной бычьей сыворотки при 37°C в увлажненной среде 95% воздуха и 5% CO.
Измерение продукции цитокинов культурами NCM460
5
2
2
Клетки NCM460 помещали в 24-луночные планшеты в концентрации 5×10 клеток/мл и инкубировали при 37°C в 95% воздуха и 5% CO. Спустя 24 часа инкубации, соответствующей 70% конфлюэнтности, клетки обрабатывали в трех повторах TNF-α (10 нг/мл) (рекомбинантным человеческим TNF-α/TNFSFIA - R&D SYSTEMS), фракциями галактоолигосахаридов (0,138 г/мл СП2; 0,049 г/мл СП3; 0,041 г/мл СП>3) и смесью TNF-α с каждой из фракций. Контроль состоял из клеток, выращенных в среде. Затем клетки инкубировали при 37°C в 95% воздуха, 5% CO в течение 16 часов. После инкубации собирали супернатант и замораживали в аликвотах по 200 мкл, и, перед тестированием, центрифугировали при 400g в течение 5 минут. Концентрацию цитокинов (MIP-3α и IL-8) измеряли методом ELISA с использованием набора QUANTIKINE, предоставленного R&D Systems (MN, USA).
Результаты и обсуждение
3 различные фракции, полученные посредством эксклюзионной хроматографии, имели следующие количества галактоолигосахаридов:
a) Фракция СП2 содержала 90% галактодисахаридов и оставшиеся 10% были представлены моносахаридами (1%), лактозой (6%>), трисахаридами (2%) и пентаолигосахаридами (1%>);
b) Фракция СП3 содержала 97% галактотрисахаридов и 3% олигосахаридов СП4;
c) Фракция СП>3 содержала 96% галактоолигосахаридов со СП4 и СП5, и 4% галактоолигосахаридов со СП3.
Влияние фракций на продукцию IL-8 и MIP-3α показано на фигурах 8(Α) и (B), соответственно.
В обоих экспериментах фракции СП3 и СП>3 снижали уровень секреции цитокинов:
a) СП3 снижала продукцию IL-8 на 34% и продукцию MIP-3α на 25% в сравнении с одиночным TNF-α;
b) В случае фракции СП>3, снижение составляло 35% и 51% для IL-8 и MIP-3α, соответственно.
Результаты в случае фракции СП2 оказались неоднозначными. Снижение секреции IL-8 составило 49%, однако эта фракция не оказывала какого-либо эффекта на продукцию MIP-3α.
ПРИМЕР 4
Влияние фракций смеси галактоолигосахаридов Bimuno на продукцию цитокинов MIP-3α и IL-8 в присутствии воспалительного цитокина TNF-α по сравнению с Bimuno
Материалы и методы
Фракции ГОС получали из Bimuno, как описано в примере 3.
Культуры клеток
Культуры клеточной линии NCM460 получали от источника, указанного в примере 3, и поддерживали при тех же условиях.
Измерение продукции цитокинов в культурах NCM460
5
2
2
Клетки NCM460 помещали в 24-луночные планшеты в концентрации 5×10 клеток/мл и инкубировали при 37°C в 95% воздуха и 5% CO. Спустя 24 часа инкубации, соответствующей 70% конфлюэнтности, клетки обрабатывали в трех повторах TNF-α (10 нг/мл) (рекомбинантным человеческим TNF-α/TNFSFIA - R&D SYSTEMS), и смесью TNF-α и Bimuno (0,1 г/мл), TNF-α и фракции Bimuno СП=3 (0,1 г/мл) или TNF-α и фракции Bimuno СП>3 (0,1 г/мл). Контроль состоял из клеток, выращенных в среде. Затем клетки инкубировали при 37°C в 95% воздуха, 5% CO в течение 16 часов. После инкубации собирали супернатант и замораживали в аликвотах по 200 мкл, и, перед тестированием, центрифугировали при 400g в течение 5 минут. Концентрацию цитокинов (MIP-3α и IL-8) измеряли методом ELISA с использованием набора QUANTIKINE, предоставленного R&D Systems.
Результаты
2 различные фракции, полученные посредством эксклюзионной хроматографии, имели следующие количества галактоолигосахаридов:
α) Фракция содержала СП3
b) Фракция содержала СП>3
Эффекты фракций галактоолигосахаридов и Bimuno на продукцию IL-8 и MIP-3α показаны на фигурах 9(Α) и (B), соответственно. Из фигур 9(Α) и (B) можно увидеть, что фракция СП3 снижала продукцию IL-8 более чем на 35% по сравнению с Bimuno. Снижение продукции MIP-3α оказывалось на 37% больше в случае применения фракции СП3 по сравнению с Bimuno.
В случае фракции СП>3 снижение продукции IL-8 по сравнению с Bimuno составляло более 40%, а снижение продукции MIP-3α оказывалось на 55% больше.
Заключение
Если фракции СП3 и СП>3 присутствуют в количествах, эквивалентных общему количеству смеси галактоолигосахаридов (Bimuno), то их противовоспалительный эффект оказывается достоверно выше.