АНТИТЕЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ГЕПАТИТОМ В И СВЯЗАННЫХ С НЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ANTIBODIES FOR TREATMENT OF HEPATITIS B INFECTION AND RELATED DISEASES

Область техники
Настоящее изобретение относится к области молекулярной вирусологии и иммунологии, в частности, к области лечения инфекции вирусом гепатита B (HBV). В частности, настоящее изобретение относится к антителу против поверхностного антигена гепатита B (HBsAg), молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей его, к способу их получения и к содержащей их фармацевтической композиции. Фармацевтическую композицию можно использовать для предупреждения и/или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV у индивидуума (например, человека) или для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума. Таким образом, изобретение, кроме того, относится к применению антитела (в частности, гуманизированного антитела) и его варианта для производства фармацевтической композиции, для предупреждения и/или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV у индивидуума (например, человека) или для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума.
Уровень техники
Инфекция вирусом гепатита B, особенно хроническая инфекция HBV, является одной из наиболее важных проблем здравоохранения в мире (Dienstag JL. Hepatitis B virus infection. N Engl J Med 2008 Oct 2; 359(14): 1486–1500). Хроническая инфекция HBV может приводить к серии заболеваний печени, таких как хронический гепатит B (CHB), цирроз печени (LC) и печеночно–клеточная карцинома (HCC) (Liaw YF, Chu CM. Hepatitis B virus infection. Lancet 2009 Feb 14;373(9663): 582–592). Согласно сообщаемым данным, приблизительно 2 миллиарда человек по всему миру инфицированы HBV и приблизительно 350 миллионов имеют хронический гепатит B, и эти инфицированные люди в конечном итоге могут умереть в результате связанных с инфекцией HBV заболеваний печени с риском 15%–25%, и каждый год от этих заболеваний может умирать более 1 миллиона человек по всему миру (Dienstag JL., там же; и Liaw YF et al., там же).
in vivo
В настоящее время терапевтические средства против хронической инфекции HBV могут быть в основном подразделены на интерфероны (IFN) и нуклеозиды или нуклеотиды (NA) (Dienstag JL., там же; Kwon H, Lok AS. Hepatitis B therapy. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2011 May; 8(5): 275–284; и Liaw YF et al., там же). Первые из них включают обычный интерферон (IFN) и пегинтерферон (пег–IFN, также известный как интерферон длительного действия), которые достигают эффекта ингибирования HBV и лечения CHB в основном посредством общего повышения иммунитета у пациента; в то время как последние в основном включают, ламивудин (LMV), адефовир дипивоксил (ADV), энтекавир (ETV), телбувидин (LdT), тенофовир (Tenofovir) и т.п., которые ингибируют репликацию HBV, в основном посредством прямого ингибирования активности полимеразы HBV. Для этих инфицированных HBV пациентов (таких как пациенты с CHB), терапия с использованием описанных выше лекарственных средств отдельно или в комбинации может эффективно ингибировать репликацию вируса  и значительно снижать уровни ДНК HBV; в частности, после проведения терапии в течение 52 недель или более длительного периода времени, уровень вирологического ответа, состоящего в том, что уровни ДНК HBV у пациентов находятся ниже уровня предела обнаружения, может достигать 40–80% (Kwon H et al., там же.). Однако терапия с использованием вышеупомянутых лекарственных средств отдельно или в комбинации, не может полностью устранить вирус HBV у инфицированного пациента, что приводит к уровню ответа, который представляет собой негативную конверсию HBsAg или сероконверсию HBsAg (признак полной элиминации вируса HBV у инфицированного пациент), обычно менее 5% (Kwon H et al., там же). Таким образом, является срочной и необходимой разработка инновационного способа и лекарственного средства для инфицированных HBV пациентов, которые могут более эффективно устранять вирус HBV, особенно HBsAg.
Разработка новых лекарственных средств для лечения хронической инфекции HBV на основе иммунологических способов является одним из важных направлений исследований в данной области. Иммунотерапию хронической инфекции HBV обычно проводят двумя способами: активной иммунотерапией (которая соответствует форме лекарственного средства, такой как вакцина и т.д.) и пассивной иммунотерапией (которая соответствует форме лекарственного средства, такой как антитело, и т.д.). Активная иммунотерапия относится к способу стимуляции индивидуума с хронической инфекцией HBV к активной индукции клеточного иммунного ответа (эффект CTL и т.д.) или/и гуморального иммунного ответа (антитело и т.д.) против HBV путем введения терапевтической вакцины (включая белковую вакцину, полипептидную вакцину, вакцину на основе нуклеиновой кислоты и т.д.), для достижения цели, состоящей в ингибировании или устранении HBV. В настоящее время отсутствуют лекарственные средства или вакцины для активной иммунотерапии, которые являются достаточно эффективными для лечения хронической инфекции HBV. Пассивная иммунотерапия (например, антителом) относится к способу введения терапевтического антитела инфицированному HBV индивидууму, и, таким образом, препятствования инфицированию HBV наивных гепатоцитов посредством опосредуемого антителом иммунного выведения, тем самым достигая терапевтических эффектов. В настоящее время поликлональные антитела против HB, полученные посредством очистки из сыворотки/плазмы индивидуума, отвечающего на профилактическую вакцину против гепатита B, или индивидуума, выжившего после инфекции HBV, а именно, иммуноглобулин против гепатита B высокого титра (HBIG), широко используют для блокирования вертикальной передачи HBV от матери к плоду, для предупреждения повторной инфекции HBV после трансплантации печени у пациента с хронической инфекцией HBV, и для предупреждения инфекции у людей, которые случайным образом столкнулись с HBV. Однако терапия, состоящая в прямом введении HBIG инфицированным HBV пациентам (например, пациентам с CHB), демонстрирует отсутствие значительного эффекта и имеет большое количество ограничений, таких как малое количество источников плазмы с высоким титров, высокая стоимость, нестабильный характер и потенциальные проблемы безопасности.
Таким образом, является срочной и необходимой разработка инновационного способа терапии и лекарственного средства против инфекции HBV, которые являются более эффективными для лечения инфекции HBV.
Сущность изобретения
В одном аспекте изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые могут специфически связываться с HBsAg, содержащим:
(a) одну или несколько (например, 1, 2 или 3) определяющих комплементарность областей (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), выбранных из группы, состоящей из:
(i) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(ii) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(iii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20, или последовательности с одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);
и/или
(b) одну или несколько (например, 1, 2 или 3) CDR вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из группы, состоящей из:
(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(v) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(vi) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как определено выше.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:
(i) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 7 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 7 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(ii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 8 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 8 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(iii) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR1 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина;
и/или
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:
(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 9 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(v) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 11 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 11 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(vi) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VL, содержащаяся в вариабельной области легкой цепи любого иммуноглобулина (например, вариабельная область легкой цепи к).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR1 VH представляет собой последовательность CDR1 VH, содержащуюся в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR1 VH состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 6 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 6 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR1 VH, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген тяжелой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGHV4–4*08 и IGHV4–61*01.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и CDR1 VH, имеющей следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 137 или SEQ ID NO: 138.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL представляет собой последовательность CDR2 VL, содержащуюся в вариабельной области легкой цепи иммуногобулина человека (например, вариабельной области легкой цепи к).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 10 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VL, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека, причем ген легкой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGKV1–39*01 и IGKV1–5*03.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9; CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11; и CDR2 VL, имеющую следующую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 139 или SEQ ID NO: 140.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8, и CDR1 VH, имеющую следующую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 6, 137 или 138; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11, и CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 10, 139 или 140.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:
(i) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 12 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 12 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(ii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 14 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 14 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(iii) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина;
и/или
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:
(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 15 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 15 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(v) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 17 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 17 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(vi) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VL, содержащаяся в вариабельной области легкой цепи любого иммуноглобулина (например, вариабельной области легкой цепи к).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VH представляет собой последовательность CDR2 VH, содержащуюся в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VH состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 13 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 13 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VH, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген тяжелой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGHV4–30–4*07 и IGHV4–4*01.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: (a) CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 и SEQ ID NO: 142.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL представляет собой последовательность CDR2 VL, содержащуюся в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека (например, вариабельной области легкой цепи к).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 16 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VL, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген легкой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGKV2–28*01 и IGKV3–15*01.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15; CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17; и CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 143 и SEQ ID NO: 144.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14, и CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 и SEQ ID NO: 142; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17, и CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 143 и SEQ ID NO: 144.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую:
(i) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 18 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 18 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(ii) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 19 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 19 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(iii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 20 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 20 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);
и/или
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:
(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 15 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 15 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(v) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 16 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(vi) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 17 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 17 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 18, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 19, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 20; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению являются гуманизированными. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению обладают степенью гуманизации по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97% или по меньшей мере 98%. В определенных предпочтительных вариантах осуществления не являющаяся CDR область антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит не более 19, не более 15, не более 14, не более 13, не более 12, не более 11, не более 10, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, ее более 4 или не более 3 аминокислотных остатков не человека (например, яванского макака).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержат каркасную область (FR).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержат:
(a) одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) каркасных областей (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), выбранных из следующих:
(i) FR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(ii) FR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 51 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(iii) FR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 52 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(iv) FR4 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 53 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);
и/или
(b) одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) каркасных областей (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из:
(v) FR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(vi) FR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 55 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(vii) FR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот); и
(viii) FR4 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержат FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH и FR4 VH, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержат FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и FR4 VL, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержат FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH, FR4 VH, FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и FR4 VL, как определено выше.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) каркасную область тяжелой цепи, которая обладает идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% по сравнению с каркасной областью тяжелой цепи, содержащейся в вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из следующих: вариабельные области тяжелой цепи, как указано в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164;
и/или
(b) каркасную область легкой цепи, которая обладает идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% по сравнению с каркасной областью легкой цепи, содержащейся в вариабельной области легкой цепи, выбранной из следующих: вариабельные области легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) четыре FR, содержащихся в вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из следующих:
вариабельные области тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164;
и/или
(b) четыре FR, содержащихся в вариабельной области легкой цепи, выбранной из следующих:
вариабельные области легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24;
(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32;
(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32;
(d) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 44, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 45, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 46; или
(e) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53;
и/или VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(a) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28;
(b) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36;
(c) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 47, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 48, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 49, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28; или
(d) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область иммуноглобулина человека (например, каркасная область, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном антитела эмбрионального типа человека), и каркасная область необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека, и/или каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV 4–4*08, и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV 1–39*01, где каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV 4–4*02, и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV 4–1*01, где каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24; и, FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28;
(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и, FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36;
(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и, FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36;
(d) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 44, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 45, FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 46; и, FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 47, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 48, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 49, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28; или
(e) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению обладает идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% по сравнению с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи выбранный из группы, состоящей из: вариабельных областей тяжелой цепи, указанных в SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению обладает идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% по сравнению с аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из: вариабельных областей легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи или ее антигенсвязывающий фрагмент представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, как определено выше, и вариабельную область легкой цепи, как определено выше.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 57, 157 и 158; и вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 58, 159 и 160; или
вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 3, 59, 163 и 164; и вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 4, 60, 165 и 166.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит:
(1) VH, как указано в SEQ ID NO: 1, и VL, как указано в SEQ ID NO: 2;
(2) VH, как указано в SEQ ID NO: 3, и VL, как указано в SEQ ID NO: 4;
(3) VH, как указано в SEQ ID NO: 5, и VL, как указано в SEQ ID NO: 4;
(4) VH, как указано в SEQ ID NO: 57, и VL, как указано в SEQ ID NO: 58;
(5) VH, как указано в SEQ ID NO: 59, и VL, как указано в SEQ ID NO: 60;
(6) VH, как указано в SEQ ID NO: 157, и VL, как указано в SEQ ID NO: 58;
(7) VH, как указано в SEQ ID NO: 158, и VL, как указано в SEQ ID NO: 58;
(8) VH, как указано в SEQ ID NO: 57, и VL, как указано в SEQ ID NO: 159;
(9) VH, как указано в SEQ ID NO: 57, и VL, как указано в SEQ ID NO: 160;
(10) VH, как указано в SEQ ID NO: 163, и VL, как указано в SEQ ID NO: 60;
(11) VH, как указано в SEQ ID NO: 164, и VL, как указано в SEQ ID NO: 60;
(12) VH, как указано в SEQ ID NO: 59, и VL, как указано в SEQ ID NO: 165; или
(13) VH, как указано в SEQ ID NO: 59, и VL, как указано в SEQ ID NO: 166.
2
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению выбраны из группы, состоящей из scFv, Fab, Fab', (Fab'), фрагментов Fv, диантител, биспецифических антител, мультиспецифических антител, химерных антител и гуманизированных антител. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент класса IgG (например, класса IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению способны специфически связываться с HBsAg, нейтрализовывать вирулентность HBV и/или уменьшать сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению является меченным. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент является меченным посредством подающейся обнаружению метки, такой как радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, хромофорное вещество или фермент (например, пероксидаза хрена).
В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент согласно изобретению, или его вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи.
В другом аспекте изобретение относится к вектору (например, клонирующему вектору или экспрессирующему вектору), содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.
В другом аспекте изобретение относится к клетке–хозяину, содержащей выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению или вектор по изобретению.
В другом аспекте предусматривается способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, включающий культивирование клетки–хозяина по изобретению в условиях, позволяющих экспрессию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры культивируемой клетки–хозяина.
В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, кроме того, содержит поддающуюся обнаружению метку. В предпочтительном варианте осуществления набор дополнительно содержит второе антитело, которое специфически распознает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. Предпочтительно, второе антитело дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку. Такие поддающиеся обнаружению метки, которые хорошо известны специалисту в данной области, включают, но не ограничиваются ими, радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество. хромофорное вещество и фермент (например, пероксидаза хрена) и т.д.
В другом аспекте изобретение относится к способу обнаружения присутствия или уровня белка HBsAg в образце, включающему использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку. В другом предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает использование второго антитела, содержащего поддающуюся обнаружению метку, для обнаружения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. Способ можно использовать для диагностических целей или для не диагностических целей (например, указанный образец представляет собой образец клеток, а на образец от пациента).
В другом аспекте изобретение относится к способу диагностики того, инфицирован ли индивидуум HBV, включающему: использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению для обнаружения присутствия белка HBsAg в образце от индивидуума. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку. В другом предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает использование второго антитела, содержащего поддающуюся обнаружению метку, для обнаружения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению.
В другом аспекте предусматривается применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению для производства набора для обнаружения присутствия или уровня HBsAg в образце для диагностики того, инфицирован ли индивидуум HBV.
in vitro
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно использовать для предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B) у индивидуума (такого как человек), для нейтрализации вирулентности HBV  или у индивидуума (такого как человек), и для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума (такого как человек).
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно содержать дополнительное фармацевтически активное средство. В предпочтительном варианте осуществления дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой средство для предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B), например, средства на основе интерферонов, такие как интерферон или пегилированный интерферон.
in vitro
В другом аспекте предусматривается применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для производства лекарственного средства для предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как B) у индивидуума (такого как человека), для нейтрализации вирулентности HBV  или у индивидуума (такого как человек), и/или для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума (такого как человек).
В другом аспекте изобретение относится к способу предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B) у индивидуума (такого как человек), для нейтрализации вирулентности HBV у индивидуума (такого как человек) и/или для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума (такого как человек), включающему введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению.
Лекарственное средство и фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать отдельно или в комбинации или можно использовать в комбинации с дополнительным фармацевтически активным средством (например, другие противовирусные средства, например средства типа интерферона, такие как интерферон или пегилированный интерферон).
Варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны ниже с отсылкой на прилагаемые чертежи и примеры, однако специалистам в данной области будет понятно, что приведенные ниже чертежи и примеры только иллюстрируют настоящее изобретение и не ограничивают объем настоящего изобретения. Различные задачи и преимущественные аспекты настоящего изобретения станут очевидными специалистам в данной области из приведенного ниже подробного описания предпочтительных вариантов осуществления и прилагаемых чертежей.
Описание чертежей
10
На фиг.1 представлены результаты анализа ELISA для определения активности связывания трех химерных моноклональных антител яванский макак–человек M1–23, M3–23 и M3–13 с антигеном HBsAg согласно примеру 2, где по оси абсцисс приведена концентрация антитела (Log нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что все из трех химерных моноклональных антител яванского макака–человека имели хорошую активность связывания антигена.
На фиг.2 представлены результаты конкурентного анализа ELISA для перекрестного блокирования связывания трех химерных моноклональных антител яванского макака–человека M1–23, M3–23 и M3–13 с антигеном HBsAg посредством антитела мыши 6D11 согласно примеру 2. Результаты показали, что связывание M1–23, M3–23 и M3–13 с HBsAg могло значительно ингибироваться посредством 6D11.
in vivo
10
10
На фиг.3A–3B представлены результаты оценки терапевтических эффектов  химерных моноклональных антител яванского макака–человека M1–23, M3–23 у трансгенных мышей с HBV согласно примеру 2. На фиг.3A представлено изменение уровня HBsAg в сыворотке мышей, где по оси абсцисс представлено количество суток после инъекции химерного антитела и по оси ординат представлено относительное снижение уровня HBsAg в сыворотке мышей (Log МЕ/мл); на фиг.3B представлено изменение уровня ДНК HBV в сыворотке мышей, где по оси абсцисс представлено количество суток после инъекции химерного антитела, и по оси ординат представлено относительное снижение уровня ДНК HBV в сыворотке мышей (Log МЕ/мл). Результаты показали, что M1–23 и M3–23 могли заметно снижать уровень HBsAg и ДНК HBV у животного.
10
На фиг.4 представлены результаты анализа посредством ELISA активности связывания гуманизированных антител M1D, M3D с антигеном HBsAg согласно примеру 4, где по оси абсцисс представлена концентрация антитела (Log нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что оба из двух гуманизированных антител имели высокую активность связывания антигена и их аффинность к HBsAg была более высокой, чем аффинность эталонного антитела 162.
На фиг.5 представлены результаты конкурентного анализа ELISA в отношении перекрестного блокирования связывания гуманизированных антител M1D, M3D с антигеном HBsAg посредством антитела мыши 6D11 согласно примеру 4. Результаты показали, что связывание гуманизированных антител M1D, M3D с антигеном HBsAg могло значительно ингибироваться посредством 6D11.
На фиг.6A–6B представлены результаты определения активности гуманизированного антитела M1D в отношении нейтрализации вируса HBV согласно примеру 4, где на фиг.6A представлена стандартная кривая, построенная с использованием HBIG в качестве стандарта, и на фиг.6B представлены результаты определения активности нейтрализации в образцах, где по оси ординат представлено количество стандартных единиц (мМЕ) HBIG, которое обладает активностью нейтрализации, равной активности нейтрализации на мг антитела. Результаты показали, что активность M1D в отношении нейтрализации HBV была сравнимой с активностью нейтрализации эталонного антитела 162.
in vivo
10
10
На фиг.7 представлены результаты оценки терапевтических эффектов  гуманизированных антител M1D и M3D и химерного антитела M3–13 у трансгенных мышей с HBV согласно примеру 5. На фиг.7A представлено изменение уровня HBsAg в сыворотке мышей, где по оси абсцисс представлено количество суток после инъекции гуманизированных антител и по оси ординат представлено относительное снижение уровня HBsAg в сыворотке мышей (Log МЕ/мл); на фиг.7B представлено изменение уровня ДНК HBV в сыворотке мышей, где по оси абсцисс представлено количество суток после инъекции химерного антитела и по оси ординат представлено относительное снижение уровня ДНК HBV в сыворотке мышей (Log МЕ/мл). Результаты показали, что все три антитела могли заметно снижать уровень HBsAg и ДНК HBV у животного, и их эффекты были лучшими, чем у эталонного антитела 162.
10
На фиг.8A–8E представлены результаты анализа посредством ELISA активности связывания антитела, которое содержало замену области CDR по сравнению с гуманизированным антителом M1D, с антигеном HBsAg согласно примеру 6, где по оси абсцисс представлена концентрация антитела (Log нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что замена областей HCDR1 и LCDR2 антитела M1D не влияла на активность связывания с антигеном HBsAg, что указывает на то, что области HCDR1 и LCDR2 антитела M1D не были ключевыми областями CDR для связывания с антигеном HBsAg.
10
На фиг.9A–9E представлены результаты анализа посредством ELISA активности связывания антитела, которое содержало замену области CDR по сравнению с гуманизированным антителом M3D, с антигеном HBsAg согласно примеру 6, где по оси абсцисс представлена концентрация антитела (Log нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что замена тяжелой цепи CDR2 (HCDR2) и легкой цепи CDR2 (LCDR2) не влияла на активность связывания с антигеном HBsAg, что указывает на то, что области HCDR2 и LCDR2 антитела M3D не были ключевыми областями CDR для связывания с антигеном HBsAg.
На фиг.10 представлены результаты анализа с использованием вестерн–блоттинга связывания антител M1D, M3D, 162 с различными полипептидными фрагментами HBsAg а.к. 113–135 с мутацией одного участка согласно примеру 8. Результаты показали, что антитело 162 утрачивало активность связывания с HBsAg, когда в участки в а.к. 120, а.к. 122 и а.к. 123 вносили мутации на аланин, и его основным эпитопом был CKTC (а.к.121–124); M1D утрачивало активность связывания с HBsAg, когда в участки в а.к.118–124 вносили мутацию на аланин, и связываемый им основной эпитоп представлял собой TGPCKTCT (а.к. 118–124), который был более длинным, чем у эталонного антитела 162, и находился после положения эпитопа у эталонного антитела 162; M3D утрачивало активность связывания с HBsAg, когда в участки в а.к. 121–125 вносили мутацию на аланин, и его центральный эпитоп представлял собой CKTCT (а.к. 121–125), который находился перед положением эпитопа антитела 162.
10
На фиг.11A–11B представлены результаты анализа посредством ELISA активности связывания гуманизированных антител M1D, M3D с HBsAg а.к. 113–135 различных подтипов согласно примеру 9, где по оси абсцисс представлена концентрация антитела (Log нг/мл) и по оси ординат представлена величина OD. Результаты показали, что M1D и M3D могли связываться с большинством подтипов HBV.
На фиг.12A–12B представлены кривые для концентраций в крови гуманизированного антитела M1D в сыворотке каждого яванского макака (группа 1) в зависимости от времени после однократной внутривенной инъекции 20 мг/кг гуманизированных антител M1D, M3D согласно примеру 11, где по оси абсцисс представлено время (ч) и по оси ординат представлена концентрация в крови (нг/мл).
На фиг.13A–13B представлены величины Tm для гуманизированных антител M1D, M3D в трех различных буферах согласно примеру 12. По оси абсцисс представлена температура (°C) и по оси ординат представлена CP (кал/°C). Результаты показали, что Tm начала для гуманизированного антитела M1D была выше 61,7°С, и все величины Tm начала для M3D превышали 61,6°С, что указывает на то, что M1D и M3D имели высокую термостабильность.
Информация о последовательности
Информация о некоторых последовательностях, вовлеченных в настоящее изобретение, представлена в таблице 1 ниже.
Таблица 1: Описание последовательностей
SEQ ID NO
Информация о последовательности
1
QVQLQESGPGLVKPSEILSVTCSVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLRSRVTLSVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGLRVTVSS
2
EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPQLLIYYANRLESGVPSRFRGSGSGTEFTLTISSLQPEDFTTYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
3
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGVSISSPYDWTWIRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKNRVTISKDTSKNQFSLILSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGVLVTVSS
4
DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQAPKLLFYWASTRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
5
QVQLQESGPRLVKSSETLPLTCAVSGASNSSNYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYGNSGSTDYNPSLKSRVSISTDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARGSVYTYSWGQGVLVTVSS
6
GGSITSNF
7
ISGSGTYT
8
ARSHDYGSNDYAFDF
9
QDISSS
10
YAN
11
QQYHSLPLT
12
GVSISSPYDW
13
IHGNGGST
14
VRDET
15
QSLLYSSNNKNY
16
WAS
17
QQHYTTPLT
18
GASNSSNY
19
IYGNSGST
20
ARGSVYTYS
21
QVQLQESGPGLVKPSEILSVTCSVS
22
WSWIRQPPGKGLEWIGY
23
DYNPSLRSRVTLSVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYC
24
WGQGLRVTVSS
25
EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAT
26
LNWYQQKPGKAPQLLIY
27
RLESGVPSRFRGSGSGTEFTLTISSLQPEDFTTYYC
28
FGGGTKVEIK
29
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVS
30
TWIRQPPGKGLEWIGR
31
SYNPSLKNRVTISKDTSKNQFSLILSSVTAADTAVYYC
32
WGQGVLVTVSS
33
DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSS
34
LAWYQQKPGQAPKLLFY
35
TRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYC
36
FGQGTKVEIK
37
QVQLQESGPRLVKSSETLPLTCAVS
38
WSWIRQPPGKGLEWIGR
39
DYNPSLKSRVSISTDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFC
40
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
41
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
42
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
43
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP
44
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS
45
DYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC
46
WGQGTTVTVSS
47
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAT
48
LNWYQQKPGKAPKLLIY
49
RLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
50
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVS
51
TWVRQPPGKGLEWIGR
52
SYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC
53
GQGTLVTVSS
54
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSS
55
LAWYQQKPGQPPKLLFY
56
TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC
57
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
58
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
59
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
60
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
61
GGACAGCCKGGAAGGTGTGC
62
GAGGCAGTTCCAGATTTCAA
63
CCGCGTACTTGTTGTTGCTCTGT
64
5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTcaggtgcagctgcaggagtcaggcccag
65
5’– caggagtcaggcccaggactggtgaagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCAC
66
5’– aagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCACtgtctctggtggctccatc
67
5’– GTTCTTGGACGTGTCTACGGATATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTGTAGT
68
5’– TCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTtctccctgaaactgagctc
69
5’– GATGGGCCCTTGGTCGACGCtgaagagacggtgacGGTGGTcccttggccccagaaatc
70
5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTCTCCATCC
71
5’– CAGCAAAAACCGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGC
72
5’– GAACCTTGATGGGACCCCACTTTGCAAACGATTTGCATAATAGATCAGGAGC
73
5’– CTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACCCC
74
5’– GCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAGG
75
5’– GCAGCCTGCAACCTGAGGATTTTGCAACTTATTACTGTCAAC
76
5’– GACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCAT
77
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCC
78
5’– ATTCCCGGGTagatgcccaGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGGCTGTCCTGGTTTCTGCTG
79
5’– ggtgtctccatcagcagtccttatgacTGGACCTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAG
80
5’– AACTGGTTCTTGGACTTGTCTACTGAAATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTG
81
5’– AGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGC
82
5’– gaaaccTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATC
83
5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCC
84
5’– CCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAG
85
5’– CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCTTTTACtgggcatctACCCGGGAAT
86
5’– GTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAATCGGTCAGGGACCCCGGATTCCCGGGTagatgcc
87
5’– GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATG
88
5’– ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC
89
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGC
90
5’– GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGAC
91
5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTC
92
5’– ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC
93
5’– GTAGTAACTACTGATGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
94
5’– GgtggctccatcagtagttactacTGGAGCTGGATCCGCCAG
95
5’– ATAGTAACTACCACTGCTGACGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
96
5’– GgtggctccgtcagcagtggtagttactATTGGAGCTGGATCCGCCAG
97
5’– GGTGCTCCCACTGGTATAGATATACCCAATCCACTCCAG
98
5’– AtctataccagtgggagcaccGACTACAACCCCTCCCTC
99
5’– TGTGTAACTACTACTACTACTAATATACCCAATCCACTCCAG
100
5’– AttagtagtagtagtagttacacaGACTACAACCCCTCCCTC
101
5’– GTAGCTGCTGCTAACACTCTGAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
102
5’– CagagtgttagcagcagctacTTAAATTGGTATCAGC
103
5’– AGTATTACTTCCGATGTTGGAGCTAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
104
5’– AgctccaacatcggaagtaatactTTAAATTGGTATCAGC
105
5’– GACCCCACTTTGCAAACGGGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGG
106
5’– CCTAAGCTCCTGATCTATGctgcatccCGTTTGCAAAGTGGGGTC
107
5’– GACCCCACTTTGCAAACGAGACGCCTTATAGATCAGGAGCTTAGG
108
5’– CCTAAGCTCCTGATCTATAaggcgtctCGTTTGCAAAGTGGGGTC
109
5’– AGTGAGAGGGTAATTGTAATCTTGTAGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
110
5’– CtacaagattacaattaccctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
111
5’– AGTGAGAGGTAAACTACTACTCTGATGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
112
5’– catcagagtagtagtttacctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
113
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG
114
5’– GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG
115
5’– AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTC
116
5’– ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTC
117
5’– GGAGTAACCACCACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
118
5’– ggtggctccatcagcagtggtggttactccACCTGGGTCCGCCAGCCC
119
5’– CCAGTTACTACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
120
5’– GgtggctccatcagcagtagtaactggACCTGGGTCCGCCAGCCC
121
5’– GGTGCTCCCACTATGATAGATTCGTCCAATCCACTCCAG
122
5’– AtctatcatagtgggagcaccAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
123
5’– TGTGCTACCACCACTACCACTAATTCGTCCAATCCACTCCAG
124
5’– attagtggtagtggtggtagcacaAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
125
5’– ATAGGTCTTTCCATCACTATGCAGGAGGCTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
126
5’– cagagcctcctgcatagtgatggaaagacctatTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
127
5’– GTAGCTGCTGCTAACACTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
128
5’– CagagtgttagcagcagctacTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
129
5’– GGGACCCCGGATTCCCGGGTAGAACCCAAGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
130
5’– CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACTtgggttctACCCGGGAATCCGGGGTCCC
131
5’– GGGACCCCGGATTCCCGGGTGGATGCACCGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
132
5’– CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACGgtgcatccACCCGGGAATCCGGGGTCCC
133
5’– CGTCCAAGGAGTACTATAATATTGCTGACAGTAATACACTGCCACATC
134
5’– CagcaatattatagtactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG
135
5’– CGTCCAAGGAGTTTGTAGAGCTTGCATACAGTAATACACTGCCACATC
136
5’– AtgcaagctctacaaactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG
137
GGSISSYY
138
GGSVSSGSYY
139
AAS
140
KAS
141
IYHSGST
142
ISGSGGST
143
LGS
144
GAS
145
IYTSGST
146
ISSSSSYT
147
QSVSSSY
148
SSNIGSNT
149
LQDYNYPLT
150
HQSSSLPLT
151
GGSISSGGYS
152
GGSISSSNW
153
QSLLHSDGKTY
154
QSVSSSY
155
QQYYSTPWT
156
MQALQTPWT
157
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
158
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
159
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
160
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYKASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
161
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISSSSSYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
162
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATSSNIGSNTLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
163
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRIYTSGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
164
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRISGSGGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
165
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYLGSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
166
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
167
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLHSDGKTYLAWYQQKPGQPPKLLFYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
168
SSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFP
169
SSTTATGPCKTCTTPAQGTSMFP
170
SSTTSAGPCKTCTTPAQGTSMFP
171
SSTTSTAPCKTCTTPAQGTSMFP
172
SSTTSTGACKTCTTPAQGTSMFP
173
SSTTSTGPSKTCTTPAQGTSMFP
174
SSTTSTGPCATCTTPAQGTSMFP
175
SSTTSTGPCKACTTPAQGTSMFP
176
SSTTSTGPCKTSTTPAQGTSMFP
177
SSTTSTGPCKTCATPAQGTSMFP
178
SSTTSTGPCKTCTAPAQGTSMFP
179
SSTTSTGPCKTCTTAAQGTSMFP
180
SSTTSTGPCKTCTTPAAGTSMFP
181
SSTTSTGPCKTCTTPAQGASMFP
182
SSTTSTGPCKTCTTPAQGTAMFP
183
ATCAACTACCGCCACGGGACCATGCAAGACCTGCAC
184
GGTCCCGTGGCGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGTAGA
185
AACTACCAGCGCGGGACCATGCAAGACCTGCACGAT
186
CATGGTCCCGCGCTGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGT
187
ACCAGCACGGCACCATGCAAGACCTGCACGATTCCT
188
CTTGCATGGTGCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCTGG
189
CAGCACGGGAGCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGC
190
GTCTTGCATGCTCCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCT
191
ACGGGACCATCCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAA
192
GCAGGTCTTGGATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGATGT
193
GGGACCATGCCGGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
194
GTGCAGGTCCGGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
195
GGGACCATGCGCGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
196
GTGCAGGTCGCGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
197
ACCATGCAAGGCCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAAC
198
ATCGTGCAGGCCTTGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTT
199
TGCAAGACCTCCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCT
200
AGGAATCGTGGAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTGGT
201
CAAGACCTGCGCGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTAT
202
GCAGGAATCGCGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTG
203
GACCTGCACGGCTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTT
204
TGAGCAGGAGCCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTG
205
CTGCACGATTGCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCC
206
CCTTGAGCAGCAATCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCC
207
GATTCCTGCTGCAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTG
208
GAGGTTCCTGCAGCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCAT
209
TGCTCAAGGAGCCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTG
210
AACATAGAGGCTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAGGTC
211
TCAAGGAACCGCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTAC
212
GGAAACATAGCGGTTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAG
213
STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
214
TSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFP
215
SSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYP
216
SSTTSTGPCRTCTTLAQGTSMFP
217
STTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFP
218
STTTSTGPCKTCTALAQGTSMFP
219
STTTSTGPCRTCTTLAQGTSMLP
220
SSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYP
Подробное описание изобретения
Определение терминов
В рамках настоящего изобретения научные и технические термины, используемые в настоящем описании, имеют значения, обычно подразумеваемые специалистами в данной области, если нет иных указаний. Более того, стадии работы с клеточными культурами, экспериментов по биохимии, химии нуклеиновых кислот, иммунологии и т.п., используемые в настоящем описании, представляют собой стандартные стадии, широко используемые в соответствующих областях. Также для лучшего понимания настоящего изобретения ниже предоставлены определения и пояснения связанных с ним терминов.
H
H
H
H
H
L
L
H
L
H
L
H
L
Как используют в рамках изобретения, термин "антитело" относится к молекуле иммуноглобулина, которая, как правило, состоит из двух пар полипептидных цепей (каждая пара имеет "легкую" (L) цепь и "тяжелую" (H) цепь). Легкие цепи антител можно классифицировать как легкие цепи к и л. Тяжелые цепи антител можно классифицировать как µ, д, г, б или е, и изотипы антител определяют как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. В легких и тяжелых цепях вариабельная область и константная область соединены областью "J" приблизительно из 12 или более аминокислот, и тяжелая цепь дополнительно содержит область "D" приблизительно из 3 или более аминокислот. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (V) и константной области тяжелой цепи (C). Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов (C1, C2 и C3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (C). Константная область легкой цепи состоит из одного домена C. Константная область антитела может опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями хозяина или фактором, включающим различные клетки (например, эффекторные клетки) иммунной системы и первый компонент (C1q) классической системы комплемента. Области V и V также можно подразделить на гипервариабельные (называемые определяющими комплементарность областями (CDR)), между которыми располагаются относительно консервативные области, называемые каркасными областями (FR). Каждая из V и V состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 от N–конца к С–концу. Вариабельные области (V и V) каждой пары тяжелая/легкая цепь образуют связывающий участок антитела, соответственно. Распределение аминокислот в различных областях или доменах соответствует определению по Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)), или Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901–917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878–883.
th
Как используют в рамках изобретения, термин "определяющая комплементарность область" или "CDR" относится к аминокислотным остаткам в вариабельных областях антитела, которые ответственны за связывание антигена, которые, главным образом, могут включать остатки 24–34 {LCDR1}, 50–56 {LCDR2}, 89–97 {LCDR3} в вариабельной области легкой цепи, и остатки 31–35 {HCDR1}, 50–65 {HCDR2}, 95–102 {HCDR3} в вариабельной области тяжелой цепи (см., например, Kabat et al, Sequences of Proteins of lmmunological lnterest, 5 edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991), или остатки 26–32 {Ll}, 50–52 {L2}, 91–96 {L3} в вариабельной области легкой цепи и остатки 26–32 {H1}, 53–55 {H2}, 96–101 {H3} в вариабельной области тяжелой цепи (см., Chothia и Lesk J. Mol. Biol. 196: 901–917 (1987)).
Как используют в рамках изобретения, термин остатки "каркасной области" или "FR" относятся к аминокислотным остаткам, отличным от остатков CDR, как определено выше, в вариабельных областях антитела.
Термин "антитело" не ограничивается конкретным способом получения антитела. Например, он включает рекомбинантные антитела, моноклональные антитела и поликлональные антитела. Антитела могут представлять собой антитела различных изотипов, например, антитела IgG (например, подтип IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.
2
Как используют в рамках изобретения, термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела относится к полипептиду, содержащему фрагмент полноразмерного антитела, который сохраняет способность специфически связываться с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или конкурирует с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном, и который также называется "антигенсвязывающей частью". См., главным образом, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed., Raven Press, NY (1989), которая включена в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме для любых целей. Антигенсвязывающий фрагмент антитела можно получать способами рекомбинантных ДНК или посредством ферментативного или химического расщепления интактного антитела. В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент включает Fab, Fab', F(ab'), Fd, Fv, dAb и фрагменты определяющих комплементарность областей (CDR), одноцепочечные антитела (например, scFv), химерные антитела, диантитела и полипептиды, содержащие по меньшей мере часть антитела, которая является достаточной для сообщения полипептиду способности к специфическому связыванию антигена.
H
H
H
L
H
L
H
2
Как используют в рамках изобретения, термин "Fd–фрагмент" относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов V и C1; термин "dAb–фрагмент" относится к фрагменту антитела, состоящему из V–домена (Ward et al, Nature 341:544 546 (1989)); термин "Fab–фрагмент" относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов V, V, C и C1; термин "F(ab')–фрагмент" относится к фрагменту антитела, содержащему два Fab–фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области.
L
H
Как используют в рамках изобретения, термин "Fv–фрагмент" относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов V и V одного плеча антитела. Fv–фрагментом обычно считается наименьший фрагмент антитела, который может образовывать полный антигенсвязывающий центр. Полагают, что шесть CDR сообщают антителу специфичность связывания антигена. Однако даже одна вариабельная область (например, Fd–фрагмент, который содержит только три CDR, специфичных к антигену) способна распознавать и связывать антиген, хотя и с меньшей аффинностью, чем полный связывающий участок.
L
H
2
L
H
2
H
L
4
В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой одноцепочечное антитело (например, scFv), где домены V и V спарены с образованием одновалентной молекулы через линкер, который позволяет им образовать единую полипептидную цепь (см., например, Bird et al., Science 242: 423–426 (1988); Huston et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879–5883 (1988); и Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, под редакцией Roseburg and Moore, Springer–Verlag, New York, pp. 269–315 (1994)). Такая молекула scFv может иметь общую структуру: NH–V–линкер–V–COOH или NH–V–линкер–V–COOH. Подходящий линкер уровня техники может состоять из повторяющейся аминокислотной последовательности GGGGS или ее варианта. Например, можно использовать линкер, имеющий аминокислотную последовательность (GGGGS), а также можно использовать его варианты (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444–6448). Другие линкеры, пригодные в рамках настоящего изобретения, описаны Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725–731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94–106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055–3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41–56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.
Как используют в рамках изобретения, термин "одноцепочечное антитело–Fc" или "scFv–Fc" относится к сконструированному антителу, образованному путем связывания scFv с Fc–фрагментом антитела. Как используют в рамках изобретения, термин "Fc–фрагмент" относится к фрагменту антитела, образованному связыванием второй и третьей константных областей первой тяжелой цепи антитела с второй и третьей константными областями второй тяжелой цепи через дисульфидные связи. Fc–фрагмент антитела обладает различными функциями, но он не вовлечен в связывание антигена.
H
L
В некоторых случаях антигенсвязывающий фрагмент антитела представляет собой диантитело, т.е. двухвалентное антитело, в котором домены V и V экспрессируются на одной полипептидной цепи, однако используемый линкер является слишком коротким, чтобы позволить образование пары между двумя доменами одной цепи, тем самым вынуждая домен образовывать пару с комплементарным доменом другой цепи и создавая два антигенсвязывающих центра (см., например, Holliger P.et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA 90: 6444–6448 (1993), и Poljak R.J.et al., Structure 2: 1121–1123 (1994)).
Антигенсвязывающий фрагмент (например, фрагменты антител, описанные выше) антитела можно получать из данного антитела (например, моноклонального антитела, описанного в настоящем описании) с использованием общепринятых способов, известных специалистам в данной области (например, способы рекомбинантных ДНК или способы ферментативного или химического расщепления), и их можно подвергать скринингу в отношении специфичности тем же способом, посредством которого проводят скрининг интактных антител.
В этом контексте, если конкретно не указано, когда упоминается термин "антитело", он включает не только интактные антитела, но также и антигенсвязывающие фрагменты антител.
Как используют в рамках изобретения, термины "mAb" и "моноклональные антитело" относятся к антителу или фрагменту антитела из совокупности высокогомологичных молекул антител, т.е. совокупности полностью идентичных молекул антител за исключением природной мутации, которая может возникнуть спонтанно. Моноклональное антитело обладает высокой специфичностью в отношении одного эпитопа антигена. Поликлональное антитело, относительно моноклонального антитела, обычно содержит по меньшей мере два или более различных антител, которые обычно распознают различные эпитопы на антигене. Моноклональные антитела обычно получают способом гибридом, впервые описанным Kohler et al. (Nature, 256:495, 1975), а также их можно получить способом рекомбинантных ДНК (см., например, U.S.P 4816567).
in vitro
in vitro
Например, моноклональные антитела можно получать следующим образом. Во–первых, не являющегося человеком примата (например, яванского макака) или других подходящих животных–хозяев иммунизируют посредством инъекции иммуногена (если необходимо, добавляют адъюванты). Способы инъекции иммуногенов или адъювантов представляют собой подкожную инъекцию в несколько точек или внутрибрюшинную инъекцию. Предварительная конъюгация иммуногенов с некоторыми известными белками (например, сывороточным альбумином или ингибитором трипсина сои) может обеспечить иммуногенность антигенов у хозяина. Адъюванты могут представлять собой адъювант Фрейнда или MPL–TDM и т.д. После иммунизации животного у животного продуцируются лимфоциты, секретирующие антитела, которые специфически связываются с иммуногеном. Кроме того, лимфоциты также можно получать посредством иммунизации . Представляющие интерес лимфоциты собирают и подвергают слиянию с миеломными клетками с использованием подходящего агента слияния (такого как ПЭГ), тем самым получая гибридомные клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles и Practice, pp.59–103, Academic Press, 1996). Гибридомные клетки, полученные, как описано выше, высевают в подходящую культуральную среду и выращивают в среде, и культуральная среда предпочтительно содержит одно или несколько веществ, способных ингибировать рост неслитых родительских миеломных клеток. Например, в случае родительских миеломных клеток с дефицитом гипоксантингуанинфосфориозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), рост клеток с дефицитом HGPRT ингибируется посредством добавления веществ, таких как гипоксантин, аминоптерин и тимидин (культуральная среда HAT) в культуральную среду. Предпочтительные миеломные клетки должны иметь высокую частоту слияния, стабильную способность секретировать антитела, должны быть чувствительными к культуральной среде HAT и т.п. Культуральные среды для выращивания гибридомных клеток используют для обнаружения продукции моноклональных антител против конкретных антигенов. Для определения специфичности связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, можно использовать следующие способы: иммунопреципитация или анализы связывания , такие как радиоиммунный анализ (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Например, для определения аффинности моноклональных антител можно использовать анализ Скэтчарда, описанный в Munson et al., Anal. Biochem. 107: 220 (1980). После определения специфичности, аффинности и реактивности антител, продуцированных гибридомами, представляющие интерес клеточные линии можно субклонировать стандартным способом лимитирующих разведений, описанным в Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59–103, Academic Press, 1996. Подходящая культуральная среда может представлять собой DMEM или RPMI–1640 и т.д. Кроме того, гибридомные клетки можно выращивать в форме асцитных опухолей в организмах животных. С использованием традиционных способов очистки иммуноглобулинов, таких как хроматография на агарозном геле с белком A, хроматография с гидроксиапатитом, гель–электрофорез, диализ и аффинная хроматография, из клеточной культуры, асцитной жидкости или сыворотки можно выделять моноклональные антитела, секретируемые клетками субклона.
E. coli
Моноклональные антитела также можно получать рекомбинантными способами генной инженерии. Праймеры нуклеиновых кислот, которые специфически связываются с генами тяжелой цепи и легкой цепи Mab, подвергают амплификации способом ПЦР с получением молекул ДНК, кодирующих тяжелую цепь и легкую цепь Mab из гибридомных клеток. Полученные молекулы ДНК встраивают в экспрессирующий вектор, клетки–хозяева (например, клетки, клетки COS, клетки CHO или другие миеломные клетки, которые не продуцируют иммуноглобулин) трансфицируют ими и культивируют в подходящих условиях с получением представляющих интерес антител посредством рекомбинантной экспрессии.
Как используют в рамках изобретения термины "антигенный эпитоп" и "эпитоп" относятся к части антигена, с которой специфически связывается иммуноглобулин или антитело. "Эпитоп" также известен как "антигенная детерминанта". Эпитоп или антигенная детерминанта в основном состоит из химических активных поверхностных групп молекулы, таких как аминокислоты, углеводы или сахарные боковые цепи, и, как правило, обладает определенной трехмерной структурой и определенными зарядовыми характеристиками. Например, эпитоп, как правило, содержит по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательно расположенных или не расположенных последовательно аминокислот в уникальной пространственной конформации, которая может быть "линейной" или "конформационной". См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996). В линейном эпитопе все участки взаимодействия между белком и взаимодействующей с ним молекулой (например, антителом) присутствуют линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе участки взаимодействия охватывают аминокислотные остатки, которые отделяют друг от друга участки взаимодействия в белке. Антитела можно подвергать скринингу в зависимости от способности к конкуренции за связывание с одним и тем же эпитопом общепринятыми способами, известными специалисту в данной области. Например, исследование конкуренции или перекрестной конкуренции можно проводить для получения антител, которые конкурируют или перекрестно конкурируют друг с другом за связывание с антигенами. Высокопрозводительные способы получения антител, связывающихся с одним и тем же эпитопом, которые основаны на их перекрестной конкуренции, описаны в международной патентной заявке WO 03/48731.
Как используют в рамках изобретения, термин "ген антитела эмбрионального типа" или "сегмент гена антитела эмбрионального типа" относится к последовательности, присутствующей в геноме организма, кодирующего иммуноглобулин, который не подвергался процессу созревания, который может приводить к генетическим перестройкам и мутациям для экспрессии конкретного иммуноглобулина. В рамках настоящего изобретения, выражение "ген тяжелой цепи эмбрионального типа" относится к гену или фрагменту гена антитела эмбрионального типа, кодирующему тяжелую цепь иммуноглобулина, который включает V–ген (вариабельный), D–ген (разнообразие), J–ген (соединение) и C–ген (константный); аналогично, выражение "ген легкой цепи эмбрионального типа" относится к гену или фрагменту гена антитела эмбрионального типа, кодирующему легкую цепь, который включает V–ген (вариабельный), J–ген (соединение) и C–ген (константный). В рамках настоящего изобретения аминокислотная последовательность, кодирующая геном антитела эмбрионального типа или фрагментом гена эмбрионального типа, также называется "последовательностью эмбрионального типа". Ген антитела эмбрионального типа или фрагмент гена антитела эмбрионального типа и их соответствующие последовательности эмбрионального типа хорошо известны специалистам в данной области и могут быть получены или запрошены из профессиональных баз данных (например, IMGT, unswag, NCBI или VBASE2).
D
–5
–6
–7
–8
–9
–10
Как используют в рамках изобретения, термин "специфически связывать" или "специфически связывающийся" относится к связыванию двух молекул неслучайным образом, например, путем реакции между антителом и антигеном, на который оно направлено. В некоторых вариантах осуществления антитело, которое специфически связывается с антигеном (или антитело, специфичное к антигену), относится к антителу, которое связывается с антигеном с аффинностью (K) менее чем приблизительно 10 M, например, менее чем приблизительно 10 M, 10 M, 10 M, 10 M или 10 M или менее.
D
D
–5
–6
–7
–8
–9
–10
Как используют в рамках изобретения, термин "K" относится к константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело–антиген, которую используют для описания аффинности связывания антитела с антигеном. Чем меньшей является константа диссоциации, тем более прочно связывается антитело, и тем выше аффинность между антителом и антигеном. Как правило, антитело (например, антитело по изобретению) связывается с антигеном (например, HBsAg) с K менее чем приблизительно 10 M, например, менее чем приблизительно 10 M, 10 M, 10 M, 10 M или 10 M или менее, при определении, например, посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в устройстве BIACORE.
Как используют в рамках изобретения, термин "иммуногенность" относится к способности стимулировать образование специфических антител или сенсибилизированных лимфоцитов в организмах. Он не только относится к свойству антигена стимулировать конкретный иммуноцит к активации, пролиферации и дифференцировке с образованием в итоге иммунологического эффекторного вещества, такого как антитело и сенсибилизированный лимфоцит, но также относится к специфическому иммунному ответу, при котором в иммунной системе организма после стимуляции антигеном может образовываться антитело или сенсибилизированный T–лимфоцит. Когда гетерологичное антитело вводят индивидууму, иммуногенность гетерологичного антитела является нежелательной у индивидуума. Такая иммуногенность может приводить к отторжению гетерологичного антитела иммунной системой/иммунной клеткой индивидуума, что, тем самым, приводит к снижению эффективности гетерологичного антитела у индивидуума или нежелательным побочным эффектам у индивидуума. Таким образом, перед введением человеку, как правило, гетерологичное антитело (например, антитело, происходящее из яванского макака) необходимо модифицировать для снижения его иммуногенности настолько, насколько это возможно.
Как используют в рамках изобретения, термин "химерное антитело" относится к такому антителу, где часть его легкой цепи и/или тяжелой цепи происходит из антитела (которое может происходить из конкретного вида или принадлежать к конкретному типу или подтипу антител), и другая часть его легкой цепи и/или тяжелой цепи происходит из другого антитела (которое может происходить из идентичного или отличающегося вида или принадлежать к идентичному или отличающемуся типу или подтипу антител), при условии, что антитело все еще сохраняет активность связывания с представляющим интерес антигеном (U.S.P 4816567, выданный Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851–6855 (1984)). Например, термин "химерное антитело" может включать такое антитело (например, химерное антитело человека–обезьяны), где вариабельная область тяжелой цепи и легкой цепи антитела происходит из первого антитела (например, антитело, происходящее из яванского макака), в то время как константная область тяжелой цепи и легкой цепи антитела происходит из второго антитела (например, антитела человека).
Как используют в рамках изобретения, термин "гуманизированное антитело" относится к генетически модифицированному не являющемуся человеческим антителу, аминокислотная последовательность которого модифицирована для повышения его гомологии с последовательностью антитела человека. Как правило, все или часть областей CDR гуманизированного антитела происходят из не являющегося человеческим антитела (донорное антитело), и все или часть областей не CDR (например, FR вариабельной области и/или константная область) происходят из не являющегося человеческим иммуноглобулина (реципиентное антитело). Гуманизированное антитело как правило, сохраняет предполагаемые свойства донорного антитела, включая, но не ограничиваясь ими, антигенную специфичность, аффинность, реактивность, способность нейтрализовывать и/или расщеплять вирус и т.п. Донорное антитело может представлять собой антитело мыши, крысы, кролика или не являющегося человеком примата (например, яванского макака), которое обладает предполагаемыми свойствами (например, антигенная специфичность, аффинность, реактивность, способность к нейтрализации вируса и/или способность к выведению вируса).
Гуманизированное антитело является особенно преимущественным, поскольку оно способно сохранять предполагаемые свойства не являющегося человеческим донорного антитела (например, происходящего из яванского макака антитела) и является эффективным в отношении снижения иммуногенности не являющегося человеческим донорного антитела (например, происходящего из яванского макака антитела) у человека. Однако вследствие проблем соответствия между CDR донорного антитела и FR реципиентного антитела, предполагаемые свойства гуманизированного антитела (например, антигенная специфичность, аффинность, реактивность, способность к нейтрализации вируса и/или способность к выведению вируса), как правило, являются худшими, чем предполагаемые свойства не являющегося человеческим донорного антитела (например, происходящего из яванского макака антитела).
Таким образом, хотя исследователи данной области провели тщательные исследования, касающиеся гуманизации антител, и достигли некоторого прогресса (см., например, Jones et al., Nature, 321:522 525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323 329 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593 596 (1992); и Clark, Immunol. Today 21: 397 402 (2000)), в данной области отсутствует детальное руководство, касающееся того, каким образом можно в достаточной степени гуманизировать определенное донорное антитело, чтобы позволить полученному гуманизированному антителу иметь настолько высокую степень гуманизации, насколько это возможно, при сохранении ожидаемых свойств донорного антитела настолько, насколько это возможно. Специалисты в данной области должны исследовать, изучать и модифицировать конкретное донорное антитело и должны осуществить большую творческую деятельность для получения гуманизированного антитела, которое не только обладает высокой степенью гуманизации (например, степенью гуманизации по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%), но также сохраняет предусматриваемые свойства донорного антитела.
В рамках настоящего изобретения, чтобы обеспечить сохранение гуманизированным антителом свойств донорного антитела (включая, например, специфичность, аффинность, реактивность, способность к нейтрализации вируса и/или способность к выведению вируса) настолько, насколько это возможно, каркасная область (FR) в гуманизированном антителе по настоящему изобретению может содержать как аминокислотные остатки реципиентного антитела, происходящего из человека, так и аминокислотные остатки соответствующего донорного антитела, происходящего не из человека.
Более того, чтобы далее увеличить степень гуманизации так, чтобы снизить иммуногенность, вызываемую не являющимися человеческими аминокислотными остатками, настолько, насколько это возможно, часть аминокислотных остатков, происходящих из областей CDR донорного антитела, в гуманизированном антителе в рамках настоящего изобретения, может быть заменена, например, на соответствующие аминокислотные остатки областей CDR иммуноглобулина человека или другие аминокислотные остатки.
Кроме того, чтобы далее улучшить или оптимизировать характеристики гуманизированного антитела, часть аминокислотных остатков в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей гуманизированного антитела по изобретению может быть далее заменена, например, на аминокислотные остатки, которые не происходят ни из реципиентного антитела, ни из донорного антитела.
В частности, в рамках настоящей заявки авторы изобретения впервые разработали три химерных моноклональных антитела яванского макака–человека с превосходными свойствами, названных M1–23, M3–23 и M3–13, соответственно (их вариабельные области тяжелой и легкой цепей указаны в SEQ ID NO: 1–5, соответственно): три антитела могут не только специфически распознавать/связывать HBsAg и нейтрализовывать вирулентность HBV, но также снижать сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума, и могут эффективно устранять HBV и клетки, инфицированные HBV, в организме. Таким образом, антитела M1–23, M3–23 и M3–13 обладают потенциалом к применению для предупреждения и лечения инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, такого как гепатит B.
in vivo
in vivo
Исходя из этого, авторы изобретения приложили тщательные творческие усилия для глубокого исследования и модификации двух химерных антител: M1–23 и M3–23, и, таким образом, разработали гуманизированные антитела M1–23 и M3–23: гуманизированные антитела по настоящему изобретению не только обладают высокой степенью гуманизации (степень гуманизации может составлять вплоть до 98%), но также обладают по существу теми же (или даже лучшими) предусматриваемыми свойствами, что и исходное антитело (включая, но не ограничиваясь ими, активность связывания HBsAg, активность нейтрализации HBV, активность устранения ДНК HBV или HBsAg , или активность устранения HBV и клеток, инфицированных HBV,  и т.д.).
Таким образом, антитела по настоящему изобретению (в частности, гуманизированные антитела) являются в высокой степени преимущественными, поскольку они могут сохранять функции и свойства исходного антитела и, таким образом, обладают потенциалом к предупреждению и лечению инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B); более того, антитела могут обладать очень высокой степенью гуманизации (степень гуманизации вплоть до 98%), и, таким образом, их можно вводить человеку безопасно без индукции иммунологического ответа. Антитело по изобретению (в частности, гуманизированное антитело) может иметь значительную клиническую ценность.
in vivo
in vivo
В рамках настоящей заявки предусматриваемые свойства антитела по настоящему изобретению включают активность специфического связывания с HBsAg, активность нейтрализации HBV, активность устранения ДНК HBV или HBsAg , и/или активность устранения HBV и клеток, инфицированных HBV, . Гуманизированное антитело в соответствии с настоящим изобретением сохраняет одно или несколько из описанных выше предусматриваемых свойств их исходного антитела (химерного антитела яванского макака–человека), предпочтительно сохраняет все из описанных выше предусматриваемых свойств их исходного антитела (химерного антитела яванского макака–человека).
В рамках настоящей заявки гуманизированное антитело по настоящему изобретению получают путем модификации исходного антитела (химерное антитело яванского макака–человека) по настоящему изобретению. Например, некоторые аминокислотные остатки в их FR подвергают заменам (например, консервативным заменам). Такая замена может, например, (1) уменьшать чувствительность антител к протеолизу; (2) уменьшать чувствительность антител к окислению; (3) изменять (например, усиливать) антигенсвязывающую аффинность антител; (4) изменять (например, усиливать) активность антител в отношении нейтрализации HBV; (5) изменять (например, усиливать) активность антител в отношении устранения HBV; (6) дополнительно повышать степень гуманизации антител для уменьшения иммуногенности антител; или (7) изменять другие биохимические характеристики или функциональные свойства антител; но все еще сохранять предполагаемые свойства антител. Такие замены могут присутствовать в CDR и/или FR и могут представлять собой замену одной аминокислоты или замену нескольких аминокислот.
Как используют в рамках изобретения, термин "степень гуманизации" представляет собой показатель, указывающий на количество не являющихся человеческими аминокислотных остатков в гуманизированном антителе. Степень гуманизации гуманизированного антитела можно вычислять, например, по следующей формуле: степень гуманизации = (количество аминокислот FR – количество не являющихся человеческими аминокислот в FR)/количество аминокислот в FRЧ100%.
Как используют в рамках изобретения, термин "нейтрализующее антитело" относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые могут значительно снижать или полностью ингибировать вирулентность (например, способность инфицировать клетки) вируса–мишени. Как правило, нейтрализующее антитело может распознавать и связываться с вирусом–мишенью и предотвращать проникновение/инфицирование вирусом–мишенью клетки у индивидуума. Антитело по изобретению представляет собой нейтрализующее антитело.
in vivo
in vivo
Однако следует понимать, что в рамках настоящей заявки способность антитела к нейтрализации вируса не является прямо эквивалентной способности антитела устранять вирус. Как используют в рамках изобретения, "нейтрализация вируса" означает, что вирулентность вируса–мишени нейтрализуется (т.е. вирулентность вируса–мишени значительно снижается или полностью ингибируется) посредством ингибирования проникновения/инфицирования вирусом–мишенью клетки индивидуума. Как используют в рамках изобретения, "устранение вируса" означает, что вирус–мишень (независимо от того, инфицирует он клетку или нет) выводится из организма и, таким образом, организм возвращается к состоянию до инфицирования вирусом (например, результат серологического теста на вирус становится отрицательным). Таким образом, как правило, нейтрализующие антитела не обязательно обладают способностью устранять вирус. Однако в рамках настоящей заявки автор изобретения неожиданно обнаружил, что антитела по изобретению могут не только нейтрализовывать HBV, но также устранять вирус (т.е. могут устранять ДНК HBV и/или HBsAg , устранять HBV и инфицированные HBV клетки ), и таким образом, обладают высокой клинической ценностью.
Как используют в рамках изобретения, термин "выделенный" относится к состоянию, получаемому из природного состояния, искусственными способами. Если определенное "выделенное" вещество или компонент присутствует в природе, это является возможным, поскольку его природное окружение изменяется или вещество выделяют из природного окружения, или и то, и другое. Например, определенный невыделенный полинуклеотид или полипептид естественным образом существует в определенном живом организме животного и тот же полинуклеотид или полипептид, выделенный с высокой чистотой из такого неприродного состояния, называют выделенным полинуклеотидом или полипептидом. Термин "выделенный" не включает ни смешанное искусственное или синтезированное вещество, ни другие вещества с примесями, которые не влияют на активность выделенного вещества.
Как используют в рамках изобретения, термин "вектор" относится к носителю на основе нуклеиновой кислоты, который может иметь полинуклеотид, встроенный в него. Когда вектор позволяет экспрессию белка, кодируемого полинуклеотидом, встроенным в него, вектор называют экспрессирующим вектором. Вектор может иметь переносимые элементы генетического материала, экспрессируемые в клетке–хозяине при трансформации, трансдукции или трансфекции в клетку–хозяина. Векторы хорошо известны специалисту в данной области, включая, но не ограничиваясь ими плазмиды, фаги, космиды, искусственную хромосому, такую как дрожжевая искусственная хромосома (YAC), бактериальная искусственная хромосома (BAC) или происходящая из P1 искусственная хромосома (PAC); фаг, такой как фаг л или фаг M13, и вирус животного. Вирусы животных, которые можно использовать в качестве векторов, включают, но не ограничиваются ими, ретровирус (включая лентивирус), аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса (такой как вирус простого герпеса), поксвирус, бакуловирус, вирус папилломы, паповавирус (такой как SV40). Вектор может содержать множество элементов для контроля экспрессии, включая, но не ограничиваясь ими, промоторную последовательность, последовательность инициации транскрипции, энхансерную последовательность, селективный элемент и репортерный ген. Кроме того, вектор может содержать ориджин репликации.
E. coli
Bacillus subtilis
Aspergillus
Как используют в рамках изобретения, термин "клетка–хозяин" относится к клетке, в которую может быть введен вектор, включая, но не ограничиваясь ими, прокариотическую клетку, такую как или , и клетку грибов, такую как клетка дрожжей или , клетку насекомых, такую как клетка Drosophila S2 или Sf9, или клетку животных, такую как фибробласт, клетка CHO, клетка COS, клетка NSO, клетка HeLa, клетка BHK, клетка HEK 293 или клетка человека.
Как используют в рамках изобретения, термин "идентичность" относится к степени соответствия между двумя полипептидами или между двумя нуклеиновыми кислотами. Когда две последовательности для сравнения имеют одну и ту же мономерную субъединицу основания или аминокислоты в определенном участке (например, каждая из двух молекул ДНК имеет аденин в определенном участке или каждый из двух полипептидов имеет лизин в определенном участке), две молекулы в этом участки являются идентичными. Процентная идентичность двух последовательностей является функцией количества идентичных участков между двумя последовательностями на протяжении общего количества участков для сравнения Ч 100. Например, если 6 из 10 участков двух последовательностей совпадают, эти две последовательности обладают идентичностью 60%. Например, последовательности ДНК CTGACT и CAGGTT обладают идентичностью 50% (3 из 6 участков совпадают). Как правило, сравнение двух последовательностей проводят так, чтобы обеспечить максимальную идентичность. Такое выравнивание можно проводить с использованием компьютерной программы, такой как программа Align (DNAstar, Inc.), которая основана на способе Needleman, et al. (J. Mol. Biol. 48:443–453, 1970). Процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями также можно определять с использованием алгоритма E. Meyers и W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11–17 (1988)), который включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы веса остатков PAM120, штрафа за продолжение пропуска 12 и штрафа за делецию 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определять с использованием алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444–453 (1970)), который включен в программу GAP пакета программ GCG (доступную на http://www.gcg.com), с использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы PAM250, и веса пропуска 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и веса продолжения пропуска 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Как используют в рамках изобретения, термины "консервативная замена" и "консервативная аминокислотная замена" относятся к аминокислотным заменам, которые преимущественно не влияют или не изменяют предполагаемые свойства белка/полипептида, содержащего аминокислотную последовательность. Например, консервативную замену можно вносить стандартными способами, известными в данной области, такими как сайт–направленный мутагенез и ПЦР–опосредуемый мутагенез. Консервативные аминокислотные замены включают замены, где аминокислотный остаток заменен другим аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь, например, остатком, физически или функционально сходным (таким как имеющий сходный размер, форму, заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентную связь или водородную связь, и т.д.) с соответствующим аминокислотным остатком. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты, имеющие основные боковые цепи (например, лизин, аргинин и гистидин), аминокислоты, имеющие кислотные боковые цепи (например, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота), аминокислоты, имеющие незаряженные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), аминокислоты, имеющие неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), аминокислоты, имеющие в–разветвленные боковые цепи (такие как треонин, валин, изолейцин) и аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, соответствующий аминокислотный остаток предпочтительно заменяют другим аминокислотным остатком из того же семейства боковых цепей. Способы идентификации консервативных замен аминокислот хорошо известны в данной области (см., например, Brummell et al., Biochem. 32: 1180–1187 (1993); Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879–884 (1999); и Burks et al., Proc. Natl Acad. Set USA 94: 412–417 (1997), которые включены в настоящее описание в качестве ссылок).
20 общепринятый аминокислоты, вовлеченные в настоящее изобретение, обозначают стандартными способами. См., например, Immunology–A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), который включен в настоящее описание в качестве ссылки. В рамках изобретения термины "полипептид" и "белок" имеют одинаковое значение и могут быть использованы взаимозаменяемо. Более того, в рамках изобретения аминокислоты обычно обозначают с использованием однобуквенных кодов и трехбуквенных кодов. Например, аланин может быть обозначен как A или Ala. Кроме того, как используют в рамках изобретения, термины "моноклональное антитело" и "mAb" имеют одинаковые значения и могут быть использованы взаимозаменяемо; термины "поликлональное антитело" и "pAb" имеют одинаковые значения и могут быть использованы взаимозаменяемо.
Как используют в рамках изобретения, термин "фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент" относится к носителю и/или эксципиенту, фармакологически и/или физиологически совместимому с индивидуумом и активным веществом, который хорошо известен в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), и включает, но не ограничивается ими средство для коррекции pH, поверхностно–активное вещество, адъювант, средство, повышающее ионную силу, разбавитель, средство контроля осмотического давления, средство, замедляющее всасывание, и консервант. Например, средство для коррекции pH включает, но не ограничивается ими, фосфатный буфер. Поверхностно–активное вещество включает, но не ограничивается ими, катионное, анионное или неионное поверхностно–активное вещество, например Tween–80. Средство, повышающее ионную силу, включает, но не ограничивается ими, хлорид натрия. Консервант включает, но не ограничивается ими, различные антибактериальные средства и противогрибковые средства, такие как парабен, хлорбутанол, фенол и сорбиновая кислота. Средство контроля осмотического давления включает, но не ограничивается ими, сахар, NaCl и их аналоги. Замедляющее всасывание средство включает, но не ограничивается ими, моностеарат и желатин.
corynebacterium parvum
Как используют в рамках изобретения, термин "адъювант" относится к неспецифическому иммуностимулятору, который может усиливать иммунный ответ на антиген или изменять тип иммунного ответа в организме, когда его доставляют вместе с антигеном в организм или доставляют в организм заранее. Существует множество адъювантов, включая, но не ограничиваясь ими, адъюванты на основе алюминия (например, гидроксид алюминия), адъюванты Фрейнда (например, полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда), , липополисахарид, цитокины и т.п. Адъювант Фрейнда в настоящее время является наиболее часто используемым адъювантом в экспериментах на животных. Адъювант на основе гидроксида алюминия чаще используют в клинических испытаниях.
in vivo
in vivo
Как используют в рамках изобретения, термин "предупреждение/предупреждающий" относится к способу, который проводят для подавления или замедления возникновения заболевания, нарушения или симптома (такого как инфекция HBV или заболевание, ассоциированное с инфекцией HBV) у индивидуума. Как используют в рамках изобретения, термин "лечение/лечащий" относится к способу, который проводят для получения благоприятного или желаемого клинического исхода. Для целей настоящего изобретения, благоприятный или желаемый исход включает, но не ограничивается ими, облегчение симптома, сужение масштаба заболевания, стабилизацию (т.е. не ухудшение) состояния заболевания, отсрочивание или замедление прогрессирования заболевания и смягчение симптомов (либо частично, либо полностью), как поддающихся обнаружению, так и не поддающихся обнаружению. Кроме того, "лечение" также относится к продлению выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью (без лечения). В рамках настоящей заявки антитело по изобретению обладает способностью нейтрализовывать HBV, и, таким образом, может быть использовано для предупреждения/защиты не страдающего заболеванием индивидуума или его клетки от инфекции HBV. Кроме того, антитело по изобретению обладает способностью устранять HBV (т.е. способно устранять ДНК HBV и/или HBsAg , устранять HBV и клетки, инфицированные HBV), и, таким образом, его можно использовать для лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, у инфицированного индивидуума.
Как используют в рамках изобретения, термин "индивидуум" относится к млекопитающему, например, примату, такому как человек.
Как используют в рамках изобретения, термин "эффективное количество" относится к количеству, которое является достаточным для достижения или по меньшей мере частичного достижения предполагаемого эффекта. Например, количество, эффективное для предупреждения заболевания (такого как инфекция HBV или заболевания, ассоциированные с инфекцией HBV), относится к количеству, эффективному для предупреждения, подавления или отсрочивания возникновения заболевания (такого как инфекция HBV или заболевания, ассоциированные с инфекцией HBV). Эффективное количество для лечения заболевания относится к количеству, эффективному для излечения или по меньшей мере частичного блокирования заболевания и его осложнения у пациента, имеющего заболевание. Определение такого эффективного количества входит в пределы способностей специалиста в данной области. Например, количество, эффективное для терапевтического применения, зависит от тяжести заболевания, подвергаемого лечению, общего состояния иммунной системы у пациента, общих характеристик пациента, таких как возраст, масса тела и пол, способов введения лекарственных средств, дополнительных способов терапии, используемых одновременно, и т.п.
Антитела по изобретению
В рамках настоящей заявки авторы изобретения впервые разработали три химерных моноклональных антитела яванского макака–человека с превосходными свойствами, названных M1–23, M3–23 и M3–13, соответственно (их вариабельные области тяжелых и легких цепей указаны в SEQ ID NO: 1–5, соответственно): эти три антитела не только специфически распознают/связывают HBsAg и нейтрализуют вирулентность HBV, но также уменьшают сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума и, таким образом, могут эффективно устранять HBV и клетки, инфицированные HBV, в организме. Таким образом, антитела M1–23, M3–23 и M3–13 обладают потенциалом для применения для предупреждения и лечения инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, такого как гепатит B.
in vivo
in vivo
Исходя из этого, авторы изобретения провели тщательные исследования и модификации двух антител: M1–23 и M3–23, и разработали гуманизированные антитела для антител M1–23 и M3–23: гуманизированные антитела по настоящему изобретению не только обладают чрезвычайно высокой степенью гуманизации (степень гуманизации может составлять вплоть до 98%), но также обладают по существу такими же (или даже лучшими) ожидаемыми свойствами, что и их исходные антитела (включая, но не ограничиваясь ими, активность связывания HBsAg, активность нейтрализации HBV, активность устранения ДНК HBV или HBsAg , или активность устранения HBV и клеток, инфицированных HBV, , и т.д.).
Таким образом, антитела по настоящему изобретению (в частности, гуманизированные антитела) являются в высокой степени преимущественными не только потому, что они сохраняют функции и свойства их исходных антител и, таким образом обладают потенциалом для применения для предупреждения и лечения инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (например, гепатита B); но также потому, что они обладают высокой степенью гуманизации (вплоть до 98%) и, таким образом, могут быть безопасным образом введены человеку без индукции иммуногенного ответа. Антитела по изобретению (в частности, гуманизированные антитела) обладают значительной клинической ценностью.
Таким образом, в одном аспекте изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые могут специфически связываться с HBsAg, причем антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) одну или несколько (например, 1, 2 или 3) определяющих комплементарность областей (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), выбранных из группы, состоящей из:
(i) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(ii) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 19 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(iii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 20 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);
и/или
(b) одну или несколько (например, 1, 2 или 3) CDR вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из группы, состоящей из:
(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, или последовательности с одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот) по сравнению с ими,
(v) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(vi) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VH, CDR2 VH и CDR3 VH, как определено выше. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как определено выше. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL, как определено выше.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), причем VH содержит:
(i) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 7 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 7 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(ii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 8 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 8 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(iii) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR1 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина;
и/или
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:
(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 9 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 9 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(v) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 11 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 11 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(vi) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VL, содержащаяся в вариабельной области легкой цепи любого иммуноглобулина (например, вариабельная область легкой цепи к).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR1 VH представляет собой последовательность CDR1 VH, содержащуюся в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR1 VH состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 6 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 6 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR1 VH, которая содержится в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген тяжелой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGHV4–4*08 и IGHV4–61*01.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и CDR1 VH, имеющую следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 137 или SEQ ID NO: 138.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL представляет собой последовательность CDR2 VL, содержащуюся в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека (например, вариабельной области легкой цепи к).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 10 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 10 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VL, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген легкой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGKV1–39*01 и IGKV1–5*03.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9; CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11; и CDR2 VL, имеющую следующую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 139 или SEQ ID NO: 140.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR1 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина (например, SEQ ID NO: 6, 137 или 138);
и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11, и CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 10.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 6;
и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11, и CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VL (например, SEQ ID NO: 10, 139 или 140), содержащаяся в вариабельной области легкой цепи (например, вариабельной области легкой цепи к) любого иммуноглобулина.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8 и CDR1 VH, имеющую следующую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 6, 137 или 138; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11, и CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность: SEQ ID NO: 10, 139 или 140.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 6, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 10, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 137, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 10, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 138, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 10, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 6, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 139, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 6, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 7, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 8; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 9, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 140, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 11.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), причем VH содержит:
(i) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 12 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 12 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(ii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 14 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 14 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(iii) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина;
и/или
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:
(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 15 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 15 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(v) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 17 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 17 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(vi) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VL, содержащаяся в вариабельной области легкой цепи любого иммуноглобулина (например, вариабельной области легкой цепи к).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VH представляет собой последовательность CDR2 VH, содержащуюся в вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина человека.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VH состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 13 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 13 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VH, содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген тяжелой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGHV4–30–4*07 и IGHV4–4*01.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: (a) CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и CDR2 VH, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141 и SEQ ID NO: 142.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL представляет собой последовательность CDR2 VL, содержащуюся в вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина человека (например, вариабельной области легкой цепи к).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления CDR2 VL состоит из последовательности, выбранной из следующих: (a) SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 16 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот); или (b) последовательность CDR2 VL. содержащаяся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека. В определенных иллюстративных вариантах осуществления ген легкой цепи эмбрионального типа человека выбран из группы, состоящей из IGKV2–28*01 и IGKV3–15*01.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15; CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17; и CDR2 VL, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 143 и SEQ ID NO: 144.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14, и CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VH, содержащаяся в вариабельной области тяжелой цепи любого иммуноглобулина (например, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 141, или SEQ ID NO: 142);
и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17, и CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12; CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 13;
и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17, и CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: последовательность CDR2 VL, содержащаяся в вариабельной области легкой цепи (например, вариабельная область легкой цепи каппа) любого иммуноглобулина (например, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 143 или SEQ ID NO: 144).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14, и CDR2 VH, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 13, 141 или 142; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17, и CDR2 VL, имеющую последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 16, 143 или 144.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 13, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 141, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 142, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 13, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 143, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 12, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 13, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 14; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 144, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) вариабельную область тяжелой цепи (VH), причем VH содержит:
(i) CDR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 18 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 18 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(ii) CDR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 19 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 19 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(iii) CDR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 20 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 20 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот);
и/или
(b) вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит:
(iv) CDR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 15 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 15 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот),
(v) CDR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 16 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 16 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот), и
(vi) CDR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 17 или последовательность, которая отличается от SEQ ID NO: 17 одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2 или 3 заменами, делециями или вставками аминокислот).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит: CDR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 18, CDR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 19, и CDR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 20; и VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: CDR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 15, CDR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 16, и CDR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 17.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержит каркасную область.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит:
(a) одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) каркасных областей (FR) вариабельной области тяжелой цепи (VH), выбранных из следующих:
(i) FR1 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(ii) FR2 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 51 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(iii) FR3 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 52 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот); и
(iv) FR4 VH, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 53 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
и/или
(b) одну или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) каркасных областей (FR) вариабельной области легкой цепи (VL), выбранных из следующих:
(v) FR1 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 54 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(vi) FR2 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 55 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот);
(vii) FR3 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 56 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот); и
(viii) FR4 VL, которая состоит из последовательности, выбранной из следующих: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 36 или последовательность, которая отличается от этих последовательностей одной или несколькими заменами, делециями или вставками аминокислот (например, 1, 2, 3 или 4 заменами, делециями или вставками аминокислот).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH и FR4 VH, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и FR4 VL, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению содержит FR1 VH, FR2 VH, FR3 VH, FR4 VH, FR1 VL, FR2 VL, FR3 VL и FR4 VL, как определено выше.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24;
(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; или
(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(a) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28; или
(b) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28;
(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36; или
(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24; и, FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28;
(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36; или
(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению является гуманизированным. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению обладает степенью гуманизации по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%. В определенных предпочтительных вариантах осуществления области не CDR антитела или его антигенсвязывающих фрагментов по изобретению содержат не более 19, не более 15, не более 14, не более 13, не более 12, не более 11, не более 10, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 не являющегося человеческим аминокислотного остатка (например, яванского макака), или области не CDR не содержат не являющихся человеческими аминокислотных остатков (например, яванского макака). В определенных предпочтительных вариантах осуществления область FR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит не более 19, не более 15, не более 14, не более 13, не более 12, не более 11, не более 10, не более 9, не более 8, не более 7, не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 не являющегося человеческим аминокислотного остатка (например, яванского макака), или область FR не содержит не являющихся человеческими аминокислотных остатков (например, яванского макака).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит: каркасную область иммуноглобулина человека, например, каркасную область, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном антитела эмбрионального типа человека. В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека, и/или каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека.
В таких вариантах осуществления каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению может содержать один или несколько не являющихся человеческими аминокислотных остатков (например, яванского макака). В определенных предпочтительных вариантах осуществления каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи содержит один или несколько аминокислотных остатков, подвергнутых обратной мутации на соответствующие остатки яванского макака или консервативным заменам соответствующих остатков (такие мутации называют обратными мутациями).
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека IGHV 4–4*08, и каркасная область тяжелой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака. В определенных предпочтительных вариантах осуществления IGHV 4–4*08 кодирует аминокислотную последовательность, как указано в SEQ ID NO: 40.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(i) FR1 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 21 или отличается от SEQ ID NO: 21 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2 или 3 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:
(01) T в H17;
(02) L в H20; и
(03) T в H23;
(ii) FR2 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 22;
(iii) FR3 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 23 или отличается от SEQ ID NO: 23 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2 или 3 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:
(01) K в H64;
(02) I в H69; и
(03) F в H78;
(iv) FR4 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 24 или отличается от SEQ ID NO: 24 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1 или 2 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:
(01) T в H107; и
(02) T в H108;
где все положения аминокислот, упомянутые выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 44, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 45, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 46.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном тяжелой цепи эмбрионального типа человека IGHV 4–4*02, и каркасная область тяжелой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака. В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность, кодируемая IGHV 4–4*02, указана в SEQ ID NO: 42.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(i) FR1 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 29 или отличается от SEQ ID NO: 29 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1 или 2), выбранными из группы, состоящей из:
(01) V в H2; и
(02) G в H16;
(ii) FR2 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 30 или отличается от SEQ ID NO: 30 следующей аминокислотной заменой: V в H37;
(iii) FR3 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 31 или отличается от SEQ ID NO: 31 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2, 3 или 4 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:
(01) S в H65;
(02) V в H71;
(03) K в H73; и
(04) K в H81;
(iv) FR4 VH, которая представляет собой SEQ ID NO: 32 или отличается от SEQ ID NO: 32 следующей аминокислотной заменой: T в H107;
где все положения аминокислот, упомянутые выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека IGKV1–39*01, где каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака. В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность, кодируемая IGKV1–39*01, указана в SEQ ID NO: 41.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(i) FR1 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 25 или отличается от SEQ ID NO: 25 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, одной или двумя аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:
(01) D в L1; и
(02) Q в L3;
(ii) FR2 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 26 или отличается от SEQ ID NO: 26 следующей аминокислотной заменой: K в L45;
(iii) FR3 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 27 или отличается от SEQ ID NO: 27 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2, 3 или 4 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:
(01) Q в L55;
(02) S в L63;
(03) D в L70; и
(04) A в L84;
(iv) FR4 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 28;
где все положения аминокислот, упоминаемые выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 47, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 48, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 49, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой геном легкой цепи эмбрионального типа человека IGKV4–1*01, где каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или несколько обратных мутаций с остатков человека на остатки яванского макака. В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность, кодируемая IGKV4–1*01, указана в SEQ ID NO: 43.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит:
(i) FR1 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 33 или отличается от SEQ ID NO: 33 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2 или 3 аминокислотных замены), выбранными из группы, состоящей из:
(01) V в L3;
(02) T в L5; и
(03) A в L19;
(ii) FR2 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 34 или которая отличается от SEQ ID NO: 34 следующей аминокислотной заменой: V в L43;
(iii) FR3 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 35 или которая отличается от SEQ ID NO: 35 одной или несколькими аминокислотными заменами (например, 1, 2 или 3 аминокислотными заменами), выбранными из группы, состоящей из:
(01) D в L60;
(02) S в L76; и
(03) S в L77;
(iv) FR4 VL, которая представляет собой SEQ ID NO: 36;
где положения аминокислоты, упоминаемые выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.
В определенных иллюстративных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит:
(a) каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV4–4*08, и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV1–39*01; или
(b) каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGHV4–4*02, и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодируемой IGKV4–1*01.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 44, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 45, FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 46; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 47, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 48, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 49, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28; или
(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53; и FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит:
(a) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 21, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 23, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 24;
(b) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 29, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 30, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 31, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32;
(c) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 37, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 38, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 39, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 32;
(d) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 44, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 22, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 45, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 46; или
(e) FR1 VH, как указано в SEQ ID NO: 50, FR2 VH, как указано в SEQ ID NO: 51, FR3 VH, как указано в SEQ ID NO: 52, и FR4 VH, как указано в SEQ ID NO: 53.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению содержит:
(a) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 25, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 26, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 27, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28;
(b) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 33, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 34, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 35, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36;
(c) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 47, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 48, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 49, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 28; или
(d) FR1 VL, как указано в SEQ ID NO: 54, FR2 VL, как указано в SEQ ID NO: 55, FR3 VL, как указано в SEQ ID NO: 56, и FR4 VL, как указано в SEQ ID NO: 36.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит FR1 VH, CDR1 VH, FR2 VH, CDR2 VH, FR3 VH, CDR3 VH и FR4 VH, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит FR1 VL, CDR1 VL, FR2 VL, CDR2 VL, FR3 VL, CDR3 VL и FR4 VL, как определено выше. В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению содержит FR1 VH, CDR1 VH, FR2 VH, CDR2 VH, FR3 VH, CDR3 VH и FR4 VH, как определено выше; и вариабельная область легкой цепи содержит FR1 VL, CDR1 VL, FR2 VL, CDR2 VL, FR3 VL, CDR3 VL и FR4 VL, как определено выше.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению обладает по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99 или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из: вариабельных областей тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 3, 5, 57, 59, 157, 158, 163 и 164.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела или антигенсвязывающего фрагмента по изобретению обладает по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из вариабельных областей легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 58, 60, 159, 160, 165 и 166.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело по изобретению содержит вариабельную область тяжелой цепи, как определено выше, и вариабельную область легкой цепи, как определено выше.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 1, 57, 157 и 158; и вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 2, 58, 159 и 160.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 3, 59, 163 и 164; и вариабельная область легкой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой вариабельную область легкой цепи, как указано в любой из SEQ ID NO: 4, 60, 165 и 166.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитела по изобретению содержат:
(1) VH, как указано в SEQ ID NO: 1, и VL, как указано в SEQ ID NO: 2;
(2) VH, как указано в SEQ ID NO: 3, и VL, как указано в SEQ ID NO: 4;
(3) VH, как указано в SEQ ID NO: 5, и VL, как указано в SEQ ID NO: 4;
(4) VH, как указано в SEQ ID NO: 57, и VL, как указано в SEQ ID NO: 58;
(5) VH, как указано в SEQ ID NO: 59, и VL, как указано в SEQ ID NO: 60;
(6) VH, как указано в SEQ ID NO: 157, и VL, как указано в SEQ ID NO: 58;
(7) VH, как указано в SEQ ID NO: 158, и VL, как указано в SEQ ID NO: 58;
(8) VH, как указано в SEQ ID NO: 57, и VL, как указано в SEQ ID NO: 159;
(9) VH, как указано в SEQ ID NO: 57, и VL, как указано в SEQ ID NO: 160;
(10) VH, как указано в SEQ ID NO: 163, и VL, как указано в SEQ ID NO: 60;
(11) VH, как указано в SEQ ID NO: 164, и VL, как указано в SEQ ID NO: 60;
(12) VH, как указано в SEQ ID NO: 59, и VL, как указано в SEQ ID NO: 165; или
(13) VH, как указано в SEQ ID NO: 59, и VL, как указано в SEQ ID NO: 166.
E. coli
Антитело по настоящему изобретению может быть получено рекомбинантными способами генной инженерии. Например, молекулы ДНК генов, кодирующих тяжелые и легкие цепи антител по изобретению, можно получать химическим синтезом или амплификацией способом ПЦР. Полученную молекулу ДНК встраивают в экспрессирующий вектор, а затем ей трансфицируют клетку–хозяина, такую как клетка , COS обезьян, клетка CHO или другие миеломные клетки, которые не продуцируют иммуноглобулин. Затем трансфицированные клетки–хозяева культивируют в определенных условиях, и они экспрессируют антитело по настоящему изобретению.
–5
–6
–7
–8
Антитело по настоящему изобретению обладает высокой специфичностью связывания и высокой аффинностью в отношении белка HBsAg. Например, антитело по изобретению может связывать HBsAg с KD менее 1Ч10M; предпочтительно величина KD составляет менее 1Ч10M; более предпочтительно величина KD составляет менее 1Ч10M; наиболее предпочтительно величина KD составляет менее 1Ч10M.
2
Антитело по изобретению может представлять собой антитело, содержащее две тяжелых цепи и две легких цепи и имеющее традиционную структуру "Y"–типа. Кроме того, антитело по настоящему изобретению также может представлять собой Fab–фрагмент, Fab', F(ab), Fv или другой тип фрагмента антитела, имеющего традиционную структуру "Y"–типа, который сохраняет аффинность в отношении белка HBsAg и который может связывать с белком HBsAg с более высокой или более низкой аффинностью, чем антитело, имеющее традиционную структуру "Y"–типа.
E.coli
2
2
Антигенсвязывающий фрагмент по изобретению может быть получен посредством гидролиза интактной молекулы антитела (см.: Morimoto et al., J. biochem. Biophys. Methods 24: 107–117 (1992) и Brennan et al., Science 229: 81 (1985)). Альтернативно эти антигенсвязывающие фрагменты можно получать непосредственно из рекомбинантных клеток–хозяев (обзор представлен в Hudson, curr. Opin. Immunol. 11: 548–557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21: 364–370 (2000)). Например, Fab'–фрагмент может быть получен непосредственно из клеток ; и Fab'–фрагменты могут быть химически связаны с образованием фрагмента F(ab') (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163–167 (1992)). Более того, фрагменты Fv, Fab или F(ab') также могут быть выделены непосредственно из культуры рекомбинантных клеток–хозяев. Другие способы получения этих антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны средним специалистам в данной области.
2
Таким образом, в определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению выбраны из группы, состоящей из фрагментов scFv, Fab, Fab', (Fab'), Fv, диантител, биспецифических антител, мультиспецифических антител, химерных антител или гуманизированных антител. Особенно предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению способны специфически связываться с HBsAg, нейтрализовывать вирулентность HBV и/или снижать сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума.
В определенных предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент класса IgG. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению может представлять собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент класса IgG1, или IgG2, или IgG3, или IgG4.
Слитые антитела
В другом аспекте можно получать слитое антитело или иммуноадгезин, например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению могут быть связаны с другим полипептидом. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления слитое антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела по изобретению. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления слитое антитело содержит VH–домен и VL–домен антитела по изобретению; где VH–домен связан с первым полипептидом, а VL–домен связан со вторым полипептидом.
Дериватизированные антитела
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно дериватизировать, например, связывать с другой молекулой (например, другим полипептидом или белком). Как правило, дериватизация (такая как мечение) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента не оказывает неблагоприятного влияния на его связывание с HBsAg. Таким образом, также подразумевается, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению включает такие дериватизированные формы. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно функционально связывать (путем химического присоединения, генетического слияния, нековалентного связывания или других способов) с одной или несколькими другими молекулярными группами, такими как другое антитело (например, с образованием биспецифического антитела), средство детекции, медицинское средство и/или белок или полипептид, способные опосредовать связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с другой молекулой (такой как авидин или полигистидиновая метка).
Один тип дериватизированного антитела (такой как биспецифическое антитело) получают путем сшивания двух или более антител (которые принадлежат или не принадлежат к одному и тому же типу). Подходящие сшивающие агенты включают, например, гетеробифункциональное сшивающее средство, содержащее две различных реакционноспособных группы, разделенных подходящим спейсером (таких как м–малеимидобензоил–N–гидроксилсукцинимидный сложный эфир); и гомобифункциональное сшивающее средство (дисукцинимидилсуберат). Такие сшивающие средства можно приобретать от Pierce Chemical Company, Rockford, II.
Другим типом дериватизированного антитела является меченое антитело. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению могут быть связаны с подходящим средством детекции. Такие средства детекции включают, например, флуоресцентные соединения, такие как флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дансилхлорид, фикоэритрин, люминофор на основе комплексов лантанидов и т.д. Кроме того, антитело также может быть меченным ферментом, таким как пероксидаза хрена, бета–галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозооксидаза и т.д. Когда антитело является меченным ферментом, для детекции меченого антитела можно добавлять реагент, который может использоваться ферментом для генерирования поддающегося обнаружению сигнала или продукта реакции. Например, когда для мечения антитела используют пероксидазу хрена, можно добавлять пероксид водорода и диаминобензидин для получения поддающегося обнаружению хромофорного продукта реакции, чтобы определять присутствие или количество меченого антитела. Кроме того, антитело также можно метить биотином. В этом случае присутствие или количество меченого антитела можно определять путем непрямого определения связывания авидина. Кроме того, антитело также можно метить меткой, которая может распознаваться второй репортерной молекулой (такой как парные последовательности лейциновой молнии, металл–связывающий домен, эпитопная метка и т.д.). В некоторых конкретных вариантах осуществления метка может быть связана с антителом через спейсерное плечо различной длины для уменьшения потенциального пространственного препятствования.
Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению также могут быть дериватизированы химической группой, такой как полиэтиленгликоль (PEG), метильная или этильная, или сахаридная группа. Эти группы можно использовать для улучшения биологических свойств антитела, таких как повышение времени полужизни в сыворотке.
Молекула нуклеиновой кислоты, вектор и клетка–хозяин
В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, или их вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты по изобретению кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, или его вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи.
В другом аспекте изобретение относится к вектору (например, клонирующий вектор или экспрессирующий вектор), содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению изобретение. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вектор по изобретению представляет собой, например, плазмиду, космиду, фаг и т.д. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вектор может экспрессировать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению у индивидуума (например, млекопитающего, такого как человек).
E. coli
В другом аспекте изобретение относится к клетке–хозяину, содержащей выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению или вектор по изобретению. Такие клетки–хозяева включают, но не ограничиваются ими, прокариотическую клетку, такую как клетка , и эукариотическую клетку, такую как дрожжевая клетка, клетка насекомых, клетка растения и клетка животных (например, клетка млекопитающих, такая как клетка мыши и клетка человека). Клетка по изобретению может представлять собой клеточную линию, такую как 293T.
В другом аспекте предусматривается способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, включающий культивирование клетки–хозяина по изобретению в условиях. позволяющих экспрессию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры культивируемой клетки–хозяина.
Способ диагностики и диагностический набор
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению может специфически связываться с HbsAg и, таким образом, может быть использовано для обнаружения присутствия или уровня белка HBsAg в образце и может быть использовано для диагностики того, инфицирован ли индивидуум HBV.
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку. В предпочтительном варианте осуществления набор дополнительно содержит второе антитело, которое специфически распознает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению. Предпочтительно, второе антитело дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку.
125
В соответствии со способами, описанными выше, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент или второе антитело по изобретению могут быть мечеными. Например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению могут быть меченными поддающейся обнаружению меткой. Такие поддающиеся обнаружению метки, которые хорошо известны специалисту в данной области, включают, но не ограничиваются ими, радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, хромофорное вещество и фермент (например, пероксидазу хрена) и т.д. Кроме того, такие поддающиеся обнаружению метки, кроме того, включают, например, радиоизотоп, такой как I; флуоресцентное вещество, такое как флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, 5–диметиламино–1–нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и люминофор на основе комплексов лантанидов; фермент, способный генерировать поддающийся обнаружению сигнал или продукт реакции, такой как пероксидаза хрена, в–галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза и глюкозооксидаза; метку, которая может распознаваться второй репортерной молекулой, такой как биотин, авидин, парную последовательность лейциновой молнии, металл–связывающий домен и эпитопную метку. В некоторых конкретных вариантах осуществления средство детекции (например, метка) может быть связано с антителом через линкер различной длины для уменьшения потенциального пространственного препятствования.
В другом аспекте изобретение относится к способу детекции присутствия или уровня белка HBsAg в образце, включающему использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку. В другом предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает использование второго антитела, содержащего поддающуюся обнаружению метку, для детекции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. Способ можно использовать для диагностических целей или для недиагностических целей (например, указанный образец представляет собой клеточный образец, а не образец от пациента).
В другом аспекте изобретение относится к способу диагностики того, инфицирован ли индивидуум HBV, включающему: использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению для детекции присутствия белка HBsAg в образце индивидуума. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению дополнительно содержит поддающуюся обнаружению метку. В другом предпочтительном варианте осуществления способ дополнительно включает использование второго антитела, содержащего поддающуюся обнаружению метку, для детекции антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению.
В другом аспект предусматривается применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению для изготовления набора для обнаружения присутствия или уровня HBsAg в образце или для диагностики того, инфицирован ли индивидуум HBV.
Способы терапии и фармацевтические композиции
in vitro
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно использовать для предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B) у индивидуума (такого как человек), для нейтрализации вирулентности HBV  или у индивидуума (такого как человек), и для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума (такого как человек).
Таким образом, в другом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция по изобретению, кроме того, может содержать дополнительное фармацевтически активное средство. В предпочтительном варианте осуществления дополнительное фармацевтически активное средство представляет собой средство для предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B), например, другие противовирусные средства, например средства типа интерферонов, такое как интерферон или пегилированный интерферон.
in vitro
В другом аспекте предусматривается применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению для производства лекарственного средства для предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B) у индивидуума (такого как человек), для нейтрализации вирулентности HBV  или у индивидуума (такого как человек) и/или для снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума (такого как человек).
В другом аспекте изобретение относится к способу предупреждения или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (такого как гепатит B), у индивидуума, нейтрализации вирулентности HBV у индивидуума (такого как человек) и/или снижения сывороточного уровня ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума (такого как человек), включающему введение индивидууму, нуждающемуся в этом, эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению, или фармацевтической композиции по изобретению.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить традиционными путями, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный, буккальный, сублингвальный, внутриглазной, местный, парентеральный, ректальный, интравагинальный, интрацистернальный, ингвинальный, внутрипузырный, местный (такой как порошок, мазь или капли) или назальный путь. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению можно вводить множеством путей, известных в данной области. Однако для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения является парентеральное введение (такое как внутривенная инъекция, подкожная инъекция, внутрибрюшинная инъекция и внутримышечная инъекция). Специалисту в данной области понятно, что путь/способ введения может изменяться в зависимости от предполагаемого назначения. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению вводят посредством внутривенной инфузии или инъекции.
Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению или фармацевтическую композицию по изобретению можно получать в виде множества дозированных форм, таких как жидкие, полутвердые и твердые формы, например, раствор (например инъекционный), дисперсия или суспензия, таблетка, порошок, гранула, эмульсия, пилюля, сироп, порошок, липосома, капсула и суппозиторий. Предпочтительная дозированная форма зависит от предполагаемого пути введения и терапевтического применения.
Например, одной предпочтительной дозированной формой является инъекция. Такая инъекция может представлять собой стерильный инъекционный раствор. Например, стерильный инъекционный раствор можно получать следующим способом: необходимую дозу антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению включают в подходящий растворитель, и необязательно также одновременно включают другие предполагаемые ингредиенты (включая, но не ограничиваясь ими, регулятор pH, поверхностно–активное вещество, адъювант, средство, повышающее ионную силу, обеспечивающее изотоничность средство, консервант, разбавитель или любую их комбинацию), а затем проводят стерилизацию фильтрованием. Кроме того, стерильный инъекционный раствор можно получать в виде стерильного порошка (например, посредством вакуумной сушки или лиофилизации) для удобства хранения и применения. Такой стерильный порошок перед применением можно диспергировать в подходящем носителе, таком как стерильная свободная от пирогенов вода.
Другой предпочтительной дозированной формой является дисперсия. Дисперсию можно получать следующим способом: антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению включают в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и необязательно другие предполагаемые ингредиенты (включая, но не ограничиваясь ими, регулятор pH, поверхностно–активное вещество, адъювант, средство, повышающее ионную силу, обеспечивающее изотоничность средство, консервант, разбавитель или любую их комбинацию). Кроме того, также в дисперсию можно включать средство, замедляющее всасывание, такое как моностеарат и желатин, для достижения ожидаемого фармакокинетического свойства.
Другая предпочтительная дозированная форма представляет собой пероральную твердую дозированную форму, включая капсулу, таблетку, порошок, гранулу и т.п. Такая твердая дозированная форма обычно содержит по меньшей мере одно из: (a) инертного эксципиента лекарственного средства (или наполнителя), такого как цитрат натрия и фосфат кальция; (b) наполнителя, такого как крахмал, лактоза, сахароза, манноза и кремниевая кислота; (c) связующего вещества, такого как карбоксиметилцеллюлоза, альгинат, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик; (d) смачивающего вещества, такого как глицерин; (e) дезинтегрирующего вещества, такого как агар, карбонат кальция, картофельный или маниоковый крахмал; (f) замедлителя твердения, такого как олефин; (g) усилителя всасывания, такого как четвертичное соединение аммония; (h) увлажнителя, такого как цетиловый спирт и глицерилмоностеарат; (i) адсорбента, такого как каолин и бентонит; (j) смазывающего вещества, такого как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердый полиэтиленгликоль, додецилсульфат натрия, или любую их комбинации. В случае дозированных форм в виде таблеток или капсул, также может быть включен буфер.
Кроме того, также в пероральную твердую дозированную форму можно добавлять модификатор скорости высвобождения (т.е. средство, способное изменять скорость высвобождения лекарственного средства), для получения дозированной формы модифицированного высвобождения или импульсного высвобождения. Такой модификатор скорости высвобождения включает, но не ограничивается ими, карбоксипропилметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу натрий, этилцеллюлозу, ацетат целлюлозы, полиэтиленоксид, ксантановую смолу, изоакриловый амино–сополимер, гидрогенизированное ароматизированное масло, карнаубский воск, парафин, целлюлозы ацетат фталат, карбоксипропилметилцеллюлозы фталат, сополимер метакриловой кислоты или любую их комбинацию. Дозированная форма модифицированного высвобождения или импульсного высвобождения может содержать один или группу модификаторов скорости высвобождения.
Другой предпочтительной дозированной формой является пероральная жидкая дозированная форма, включающая эмульсию, раствор, суспензию, сироп и т.п. В дополнение к активным ингредиентам такая пероральная жидкая дозированная форма может дополнительно включать инертные растворители, часто используемые в данной области, например, воду или другие растворители, такие как этиловый спирт, изопропанол, пропиленгликоль, 1,3–бутиленгликоль, масло (такое как хлопковое масло, арахисовое масло, кукурузное масло, оливковое масло, ароматизированное масло и кунжутное масло), глицерин, полиэтиленгликоль и сложный эфир сорбитана и жирной кислоты и любую их комбинацию. В дополнение к этим инертным растворителям такая пероральная жидкая дозированная форма может дополнительно включать увлажнитель, эмульгатор, суспендирующее вещество, подсластитель, вкусовую добавку, отдушку и т.п.
Кроме того, для удобства введения в фармацевтической композиции антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению могут находиться в единичной дозированной форме. Фармацевтическая композиция по изобретению должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения.
Лекарственное средство и фармацевтическая композиция, предусматриваемые в рамках изобретения, могут быть использованы отдельно или в комбинации или могут быть использованы в комбинации с дополнительным фармацевтически активным средством (например, другие противовирусные средства, например, средства типа интерферонов, такие как интерферон или пегилированный интерферон). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению используют в комбинации с другим противовирусным средством(ами) для предупреждения и/или лечения заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению и такое противовирусное средство(а) можно вводить одновременно, по отдельности или последовательно. Такое противовирусное средство(а) включает, но не ограничиваются ими, средства типа интерферонов, рибавирин, адамантан, гидроксимочевину, IL–2, L–12 и цитозольную пентакарбоксикислоту и т.д.
Фармацевтическая композиция по изобретению может содержать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, которое является достаточным для предупреждения, подавления или замедления развития заболевания (такого как инфекция HBV или заболевание, ассоциированное с инфекцией HBV). "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, которое является достаточным для излечения или по меньшей мере частичного подавления заболевания и его осложнений у пациента с заболеванием. Терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению может варьироваться в зависимости от следующих факторов: тяжесть заболевания, подлежащего лечению, общее состояние иммунной системы пациента, общие характеристики пациента, такие как возраст, масса тела и пол, пути введения лекарственных средств, дополнительные способы терапии, используемые одновременно, и т.д.
Режим дозирования можно корректировать для обеспечения оптимального требуемого эффекта (например, терапевтического или профилактического эффекта). Например, можно вводить однократную дозу или можно вводить множество доз в течение некоторого периода времени, или дозу можно пропорционально снижать или увеличивать в зависимости от терапевтической ситуации.
Для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению иллюстративный и неограничивающий диапазон для терапевтически или профилактически эффективного количества составляет от 0,025 до 50 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 до 50 мг/кг, более предпочтительно 0,1–25 мг/кг, 0,1–10 мг/кг. Следует отметить, что доза может варьироваться в зависимости от типа и тяжести заболевания, подлежащего лечению. Кроме того, специалист в данной области поймет, что для любого конкретного пациента конкретный режим дозирования необходимо корректировать с течением времени в зависимости от потребностей пациента и профессиональной оценки врачом; диапазон дозировок, описанный в настоящем описании, предоставлен только для иллюстрации, а не для ограничения применения или объема фармацевтической композиции по изобретению.
Полезные эффекты изобретения
По сравнению с уровнем техники техническое решение в соответствии с изобретением имеет следующие полезные эффекты:
in vivo
(1) Антитело по изобретению может не только специфически распознавать/связывать HBsAg и нейтрализовывать вирулентность HBV, но также снижать сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg у индивидуума и эффективно устранять HBV и клетки, инфицированные HBV, . Таким образом, антитело по настоящему изобретению потенциально может применяться для предупреждения и лечения инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, такого как гепатит B.
(2) Антитело (в частности, гуманизированное антитело) по изобретению не только сохраняет функцию и свойства исходного антитела обезьяны, и, таким образом, потенциально может использоваться для предупреждения и лечения инфекции HBV и заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (например, гепатита B); но также обладает очень высокой степенью гуманизации (вплоть до 98%), которая позволяет безопасное введение человеку без индукции иммуногенного ответа. Таким образом, антитело (в частности, гуманизированное антитело) по изобретению имеет значительную клиническую ценность.
Конкретные модели для осуществления изобретения
Изобретение далее описано с помощью следующих примеров, которые предназначены для иллюстрации, но не ограничения, изобретения.
Если нет иных указаний, экспериментальные способы молекулярной биологии и способы иммуноанализа, используемые в рамках настоящего изобретения, в основном описаны в J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и FM Ausubel et al., Guide to Editing Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995; эндонуклеазы рестрикции используются в соответствии с рекомендованными изготовителем условиями. Специалистам в данной области будет понятно, что примеры иллюстрируют изобретение в качестве примера и не предназначены для ограничения объема заявленного изобретения.
Пример 1: Получение химерного моноклонального антитела человека–яванского макака, специфически связывающегося с HBsAg
1.1 Иммунизация яванского макака
Рекомбинантную вакцину против HBV, ранее разработанную в лаборатории (рекомбинантная вакцина подробно описана в китайской патентной заявке 201710085194.3), использовали для иммунизации яванских макаков, возраст которых составлял старше 6 месяцев и масса тела составляла 4±1 кг, посредством внутримышечной инъекции, и инъецируемая доза составляла 20 мкг/обезьяна/один раз. Моменты времени для иммунизации составляли недели 0, 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, соответственно. После того, как сывороточный титр яванских макаков достигал плато после 4–й инъекции в ходе иммунизации (недель 10), авторы проводили взятие образцов периферической крови яванского макака 10 мл/обезьяна/один раз на 13, 17, 25 и 29 неделях, соответственно (т.е. на 3–й неделе после каждой иммунизации и к этому моменту времени образовывалось большое количество B–клеток памяти).
1.2 Выделение мононуклеарных клеток периферической крови яванского макака
TM
TM
Выделение мононуклеарных клеток периферической крови яванского макака проводили по инструкции SepMate. Пробирки SepMate использовали для отделения мононуклеарных клеток (MNC) от образцов периферической цельной крови и пуповинной крови человека посредством центрифугирования в градиенте плотности. Перед выделением образцы, буфер PBS, содержавший 2% эмбриональную телячью сыворотку (FBS) (PBS+2% FBS), среду для градиента плотности и центрифугу держали при комнатной температуре (15–25°С). Конкретные стадии были следующими:
TM
TM
1) Среду для градиента плотности осторожно добавляли в пробирку SepMeter через центральное отверстие вкладыша SepMeter с использованием пипетки. Верхняя граница среды градиента плотности должна была быть выше вкладыша. Примечание: среда для градиента плотности может образовывать небольшие пузырьки после использования пипетки, что не влияет на эффективность.
2) Образцы разбавляли равным объемом PBS+2% FBS, и перемешивали осторожно и тщательно.
TM
3) Пробирку SepMeter держали вертикально и по стенке пробирки добавляли разбавленный образец с использованием пипетки. Образец должен был перемешиваться со средой для градиента плотности выше вкладыша. Примечание: образец можно прямо наливать по стенке пробирки. Примечание: разбавленный образец не следует наливать непосредственно через центральное отверстие.
4) Центрифугирование проводили при 1200Чg в течение 10 минут при комнатной температуре без необходимости выключать торможение центрифуги. Примечание: для образцов, хранившихся более 24 часов, было рекомендовано время центрифугирования 20 минут.
TM
TM
5) Верхний слой, который содержал обогащенные MNC, переливали в новую пробирку. Пробирки SepMate не следует держать в перевернутом положении в течение более чем 2 секунд. Примечание: после центрифугирования некоторые эритроциты (RBC) могут появиться на поверхности вкладыша SepMeter, однако это не влияет на эффективность.
6) MNC промывали PBS+2% FBS. Промывание повторяли один раз. Примечание: рекомендовано промывание клеток посредством центрифугирования при 1200Чg в течение 8 минут при комнатной температуре без необходимости в выключении торможения центрифуги.
1.3 Выделение B–клеток памяти
TM
Поскольку в продаже отсутствовал специальный реагент для сортировки B–клеток памяти яванского макака, их выделение проводили с использованием набора EasySep HUMAN PAN–B CELL ENRICHMENT KIT.
1) Клетки PBMC, выделенные способом, описанным в 1,2 выше, центрифугировали при 300 g в течение 10 минут, а затем промывали один раз 10 мл бессывороточной культуральной среды 1640.
2) Промывание повторяли один раз посредством 10 мл фильтрованного буфера MACS.
3) Клетки ресуспендировали в 1 мл буфера MACS, а затем переносили в 5–мл полистироловую пробирку с круглым дном.
TM
4) К клеткам добавляли 50 мкл/мл коктейля EasySep Human Pan–B Cell Enrichment Cocktail.
TM
5) После инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут к клеткам добавляли 75 мкл/мл магнитных частиц EasySep D Magnetic Particles.
6) Добавляли буфер MACS для достижения 2,5 мл и осторожно перемешивали вверх и вниз.
7) Пробирки помещали на магнитный сепаратор на 5 минут, а затем требуемые положительные клетки переносили в новую пробирку, в то время как нежелательные негативные клетки оставались в исходной пробирке.
1.4 Стимуляция и культивирование
in vitro
1.4.1 Облучение HEK293–CD154
Доза облучения составляла 40 Гр, и конкретные стадии процесса описаны в инструкциях RS 2000 Biological X–ray Irradiator.
1.4.2 Посев клеток
4
2
Клетки, ресуспендированные в среде RPMI 1640 в количестве 5 клеток/лунка, смешивали с IL21 в количестве 50 нг/мл и облученными HEK293–CD154 в количестве 10 клеток/лунка, а затем инкубировали и высевали в 96–луночный планшет, по 250 мкл на лунку. Клетки оставляли стоять в инкубаторе с CO при 37°С и инкубировали в течение 14 суток для стимуляции.
1.4.3 Анализ положительных лунок с культурой клеток
2
4
Использовали коммерческий реакционный планшет для HBsAg (приобретенный от Beijing Wantai), в каждую лунку добавляли 100 мкл подлежащего тестированию супернатанта и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем планшеты для ELISA 5 раз посредством PBST, а затем добавляли 100 мкл GAH–HRP, разбавленного 1:5000, и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Затем планшет для ELISA промывали 5 раз посредством PBST и добавляли раствор субстрата TMB. После развития окраски в течение 15 мин реакцию развития окраски останавливали посредством HSO и проводили считывание при OD450/620. В качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду RPMI 1640.
1.5 Получение генов вариабельной области антитела B–клеток
1.5.1 Обработка клеток
Планшет с лунками для культивирования положительных B–клеток центрифугировали при 300Чg в течение 5 минут и супернатант клеток отбирали. Добавляли 150 мкл лизирующего буфера (приобретенного от Beijing GenMagBio), пипетировали вверх и вниз несколько раз и переносили в 1,5–мл пробирку Eppendorf без РНКаз. Образец можно было хранить в холодильнике при –80°С в течение одного года.
1.5.2 Экстракция РНК
Способ экстракции РНК описан в инструкциях совместной экстракции вирусной ДНК/РНК (GenMagBio).
1) 10 мкл протеазы K, 4 мкл акрилового носителя, 300 мкл лизирующего буфера и 20 мкл магнитных гранул (магнитные гранулы смешивали однородно перед применением путем переворачивания вверх–вниз или путем пипетирования вверх и вниз) добавляли в 1,5– мл свободную от нуклеаз пробирку Eppendorf; далее добавляли 200 мкл образца, каждую центрифужную пробирку встряхивали вверх и вниз при комнатной температуре в течение 10 минут для однородного перемешивания и обеспечения достаточного связывания между магнитными гранулами и нуклеиновой кислотой.
2) Магнитные гранулы в центрифужной пробирке адсорбировали путем помещения пробирки на магнитную полку на 1 минуту, жидкость в пробирке удаляли пипеткой и центрифужную пробирку снимали.
3) Магнитные гранулы ресуспендировали добавлением 500 мкл промывочного буфера I и адсорбировали на магнитной полке, жидкость в пробирке удаляли через 1 мин и центрифужную пробирку снимали.
4) Магнитные гранулы ресуспендировали добавлением 500 мкл промывочного буфера II и адсорбировали на магнитной полке, жидкость в пробирке удаляли через 1 мин и при этом центрифужную пробирку держали на магнитной полке, так что магнитные гранулы непрерывно адсорбировались.
5) Добавляли 550 мкл промывочного буфера III так, чтобы избежать промывания магнитных гранул настолько, насколько это возможно; жидкость в пробирке удаляли через 1 минуту и центрифужную пробирку снимали.
6) Добавляли 50 мкл элюирующего буфера для ресуспендировалия магнитных гранул; водяную баню проводили при 55°С в течение 5 минут и в ходе водяной бани проводили небольшое встряхивание два раза для полного элюирования нуклеиновой кислоты.
7) Центрифужную пробирку помещали на магнитную полку на 1 минуты, чтобы позволить магнитным гранулам адсорбироваться и жидкость переносили в новую 1,5–мл свободную от нуклеаз центрифужную пробирку.
1.5.3 ОТ–ПЦР для вариабельной области антитела B–клеток
Праймеры, использованные для обратной транскрипции (см. Meng W, Li L, Xiong W, et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single rhesus macaque antibody securing cells [C]// mAbs. Taylor & Francis, 2015, 7 (4): 707–718) представлены в таблице 2.
Таблица 2: Праймеры для обратной транскрипции генов вариабельной области антитела яванского макака
Название праймера
SEQ ID NO
Последовательность праймеров
Rh гамма–PCR1
61
5’GGACAGCCKGGAAGGTGTGC
Rh каппа–PCR1
62
5’GAGGCAGTTCCAGATTTCAA
Rh лямбда–PCR1
63
5’CCGCGTACTTGTTGTTGCTCTGT
Конкретные стадии являются следующими:
(1) Сначала получали раствор I со следующим составом:
Буферы
Объем
Вода DEPC
6,8 мкл
Каждый праймер
0,6 мкл
RNAsin
0,1 мкл
Mrna
5 мкл
(2) Поддерживали на теплой бане при 75°C в течение 5 минут.
(3) Быстро помещали на ледяную баню и держали в течение 5 минут.
(4) Затем получали раствор II со следующим составом:
Буферы
Объем
5Чбуфер AMV
4 мкл
10 ммоль dNTP
1 мкл
обратная транскриптаза AMV
0,2 мкл
(5) Перемешивали до получения однородной смеси и добавляли 5,2 мкл в каждую пробирку.
(6) Перемешивали до получения однородной смеси и проводили обратную транскрипцию в течение 40 минут на водяной бане при 42°C.
(7) Упаковывали и хранили, помещали в условия –20°C, когда намеревались использовать вскоре, или помещали в условия –80°C, когда не намеревались использовать в скором времени.
1.5.4 Амплификация гена вариабельной области антитела
Гены вариабельных областей H–цепи, легкой цепи к и легкой цепи л антител B–клеток амплифицировали гнездовой ПЦР, праймеры для амплификации описаны в литературе (Meng W, Li L, Xiong W, et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single rhesus macaque Antibody secreting cells [C]//mAbs. Taylor & Francis, 2015, 7(4): 707–718), где последовательность, содержавшуюся в праймерах для второго раунда гнездовой ПЦР, гомологичную вектору, заменяли сегментом эукариотического экспрессирующего вектора (см. пример 1.5.5.1), созданного в лаборатории авторов изобретения, в качестве гомологичной последовательности. Реакционную систему для ПЦР получали в соответствии с таблицей 3, причем каждая система имела объем 25 мкл. Подвергнутую обратной транскрипции кДНК использовали в качестве матрицы на первом раунде гнездовой реакции, и условия реакции были следующими: 95°C, 5 мин; 95°C, 30 с; 55°C, 60 с; 72°C, 90 с; 72°C, 7 мин; число циклов амплификации составляло 35; продукт первого раунда амплификации использовали в качестве матрицы во втором раунде гнездовой реакции, и условия реакции представляли собой: 95°C, 5 мин; 95°C, 30 с; 58°C, 60 с; 72°C, 90 с; 72°C, 7 мин; число циклов амплификации составляло 35. Затем продукт амплификации анализировали агарозным гель–электрофорезом, и продукт амплификации выделяли с использованием набора для выделения и очистки ДНК (TianGen, DP214–03).
Таблица 3: Реакционная система для гнездовой ПЦР
Буферы
Объем на 1–м раунде ПЦР(мкл)
Объем на 2–м раундеПЦР (мкл)
Вода DEPC
12,5 мкл
15,5 мкл
10Чбуфер для ПЦР
2,5 мкл
2,5 мкл
2,5 ммоль/л dNTP
2,5 мкл
2,5 мкл
ДНК–полимераза HS Taq
0,5 мкл
0,5 мкл
F<sub>mix</sub>
1 мкл
1 мкл
R<sub>mix</sub>
1 мкл
1 мкл
Матрица
5 мкл
2 мкл
1.5.5 Экспрессия и очистка генов антител
1.5.5.1 Конструирование рекомбинантных векторов для эукариотической экспрессии
E.coli
В рамках настоящего изобретения требуется высокий уровень рекомбинации антител и, таким образом, было необходимо сконструировать набор векторов легких и тяжелых цепей, способных эффективно рекомбинировать антитела. В рамках настоящего изобретения существующий эукариотический экспрессирующий вектор pTT5 в лаборатории авторов изобретения был специально модифицирован для конструирования набора рекомбинантных векторов тяжелых и легких цепей для совместной трансфекции двойных плазмид. Сигнальный пептид для легких и тяжелых цепей представляет собой MGWSCIILFLVATATGVHS. Нижнюю часть сигнального пептида связывали с последовательностью, кодирующей константную область легкой или тяжелой цепи антитела человека, конструируя набор эукариотических экспрессирующих векторов pTT5–CH, pTT5–Cк и pTT5–Cл для облегчения рекомбинации антител. Сконструированные эукариотические экспрессирующие векторы лигировали с продуктом ПЦР генов вариабельных областей антител, выделенных согласно 1.5.4 (праймер с последовательностью, гомологичной вектору) с использованием изготовленного в лаборатории раствора для сборки Gibson с получением рекомбинантных векторов VH+pTT5–CH, VH+pTT5–Cк и VH+pTT5–Cл. Рекомбинантные векторы трансформировали в штамм DH5б , распределяли на планшете с LB и инкубировали в течение ночи в инкубаторе при 37°С. Моноклональные колонии отбирали с планшета и секвенировали, и результаты секвенирования выравнивали с использованием Igblast для подтверждения правильности генов и исключения псевдогенов.
1.5.5.2 Экспрессия генов антител в малом и большом количестве
6
2
Сконструированные рекомбинантные векторы VH+pTT5–CH и VH+pTT5–Cк и VH+pTT5–Cл вводили путем совместной трансфекции в клетки HEK293 и двойные плазмиды для экспрессии в малом количестве совместно трансфицировали в 24–луночные планшеты, по 500 мкл на лунку; и если клеточный супернатант после экспрессии в малом количестве обладал антигенной активностью, систему трансфекции увеличивали в масштабе вплоть до 100 мл (в зависимости от количества антитела) суспензии клеток CHO–S (плотность клеток: приблизительно 2Ч10 клеток/мл). Трансфицированные клетки культивировали во вращающихся флаконах при 32°С в инкубаторе с 5% CO, и супернатант собирали после экспрессии в течение 7 суток.
1.5.5.3 Очистка антител
2
4
Супернатант после экспрессии в клетках собирали и очищали с использованием хроматографических колонок с белком A в соответствии с инструкциями изготовителя. Конкретные стадии были следующими: собранный супернатант клеточной культуры центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 мин, полученный супернатант сохраняли, его pH доводили до 8,4 посредством NaHPO в форме сухого порошка, а затем фильтровали через фильтрующую мембрану с размером пор 0,22 мкм. Колонку заполняли 10 мл носителя Sepharose 4B, конъюгированного с белком A, колонку подсоединяли к системе AKTA Explorer 100. Насос A подсоединяли к 0,2 M раствору гидрофосфата натрия, и насос B подсоединяли к 0,2 M раствору лимонной кислоты. Длина волны УФ–детекции составляла 280 нм, скорость потока составляла 5 мл/мин, и корректировали соотношение инъекций образцов насосов A/B. Колонку сначала промывали 100% B (pH 2,3) для удаления белковых примесей, pH уравновешивали 10% B (pH 8,0), сигнал при этой длине волны детекции возвращался к нулю после того, как он был стабильным, а затем загружали образец. После прохождения пика потока использовали 10% B для уравновешивания до тех пор, пока сигнал при длине волны детекции не снижался до нуля и не был стабильным, элюирование проводили с использованием 70% B (pH 4,0), и собирали фракцию пика элюирования. Образец пика элюирования подвергали диализу в буфер PBS и подвергали анализу концентрации и анализу SDS–PAGE для определения чистоты IgG–антитела.
Пример 2: Анализ свойств химерного моноклонального антитела яванского макака–человека, специфически связывающегося с HBsAg
Три химерных моноклональных антитела яванского макака–человека, специфически связывающихся с HBsAg, названных M1–23, M3–23 и M3–13, получали в соответствии со способом согласно примеру 1. Аминокислотные последовательности VH и VL этих трех типов представлены в таблице ниже (SEQ ID NO: 1–5). Кроме того, последовательности CDR этих трех типов антител определяли с использованием IMGT, и аминокислотные последовательности CDR вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи этих антител представлены в таблице 5 (SEQ ID NO: 6–20).
Таблица 4: Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепи M1–23/M3–23/M3–13
Название последова–тельности
SEQ ID NO
Аминокислотная последовательность
M1–23 VH
1
QVQLQESGPGLVKPSEILSVTCSVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLRSRVTLSVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGLRVTVSS
M1–23 VK
2
EIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPQLLIYYANRLESGVPSRFRGSGSGTEFTLTISSLQPEDFTTYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
M3–23 VH
3
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGVSISSPYDWTWIRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKNRVTISKDTSKNQFSLILSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGVLVTVSS
M3–23 VK
4
DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQAPKLLFYWASTRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
M3–13 VH
5
QVQLQESGPRLVKSSETLPLTCAVSGASNSSNYWSWIRQPPGKGLEWIGRIYGNSGSTDYNPSLKSRVSISTDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARGSVYTYSWGQGVLVTVSS
M3–13 VK
4
DIQMSQSPDSLAVSLGERVTINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQAPKLLFYWASTRESGVPNRFSGSGSGTDFTLTIRGLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
Таблица 5: Последовательности CDR легкой и тяжелой цепей M1–23/M3–23/M3–13
M1–23
CDR1 VH
GGSITSNF
SEQ ID NO: 6
CDR2 VH
YISGSGTYT
SEQ ID NO: 7
CDR3 VH
ARSHDYGSNDYAFDF
SEQ ID NO: 8
CDR1 VL
QDISSS
SEQ ID NO: 9
CDR2 VL
YAN
SEQ ID NO: 10
CDR3 VL
QQYHSLPLT
SEQ ID NO: 11
M3–23
CDR1 VH
GVSISSPYDW
SEQ ID NO: 12
CDR2 VH
IHGNGGST
SEQ ID NO: 13
CDR3 VH
VRDET
SEQ ID NO: 14
CDR1 VL
QSLLYSSNNKNY
SEQ ID NO: 15
CDR2 VL
WAS
SEQ ID NO: 16
CDR3 VL
QQHYTTPLT
SEQ ID NO: 17
M3–13
CDR1 VH
GASNSSNY
SEQ ID NO: 18
CDR2 VH
IYGNSGST
SEQ ID NO: 19
CDR3 VH
ARGSVYTYS
SEQ ID NO: 20
CDR1 VL
QSLLYSSNNKNY
SEQ ID NO: 15
CDR2 VL
WAS
SEQ ID NO: 16
CDR3 VL
QQHYTTPLT
SEQ ID NO: 17
2
4
Авторы изобретения провели серию анализов свойств трех очищенных моноклональных антител. Во–первых, способность M1–23, M3–23 и M3–13 к связыванию с HBsAg определяли посредством ELISA. Проводили разведение с 3–кратным градиентом концентрации, начиная с 10 мкг/мл, с получением 12 градиентов концентрации. Затем разбавленное антитело добавляли в коммерческий реакционный планшет для HBsAg (приобретенный от Beijing Wantai), и инкубировали при 37°C в течение 1 ч с последующим промыванием PBST 5 раз и сушкой. Затем добавляли меченное ферментом GAH–HRP вторичное антитело, инкубировали в течение 30 мин, а затем промывали PBST 5 раз и сушили. Добавляли раствор субстрата TMB. После развития окраски в течение 15 минут цветную реакцию останавливали HSO и проводили считывание при OD450/630. Результаты представлены на фиг.1, на которой все из M1–23, M3–23 и M3–13 имели хорошую активность связывания антигена.
Блокирование связывания M1–23, M3–23 и M3–13 с HBsAg посредством моноклонального антитела мыши 6D11 (описанного в китайской патентной заявке № 201610879693.5), которое распознает эпитоп HBsAg типа SA (а.к. 113–135 HBsAg), исследовали способом конкурентного ELISA. См. пример 4.2 для конкретных стадий конкурентного способа ELISA. Как показано на фиг.2, результаты показали, что mAb мыши 6D11 значительно блокировало связывание M1–23, M3–23 и M3–13 с HBsAg, что указывает на то, что M1–23, M3–23, M3–13 и моноклональное антитело мыши 6D11 распознают один и тот же линейный эпитоп SA HBsAg.
Способность к устранению вируса у химерных антител яванского макака–человека у животных оценивали у трансгенных мышей с HBV. Химерное антитело яванского макака–человека вводили трансгенным мышам с HBV (6 трансгенных мышей с HBV на группу) в качестве однократной дозы в дозе 10 мг/кг посредством инъекции в хвостовую вену. Затем проводили взятие крови мышей из ретроорбитального венозного сплетения, и определяли изменения уровня HBsAg и уровня ДНК HBV в сыворотке мышей. Способы определения уровня HBsAg и уровня ДНК HBV в сыворотке мышей могут быть найдены в примерах 5.1 и 5.2. Результаты показали, что M1–23, M3–23 и M3–13 (результаты для M1–23, M3–23 представлены на фиг.3A–3B; и результаты выведения M3–13 для HBsAg представлены на фиг.7A–7B) обладают потенциалом для лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, такого как гепатит B.
Пример 3: Гуманизация антител M1–23 и M3–23
Для снижения иммуногенности, вызываемой гетерологичным антителом, введенным человеку, авторы изобретения гуманизировали два антитела, M1–23 и M3–23. Вследствие высокой идентичности аминокислотных последовательностей между иммуноглобулинами яванского макака и человека, для двух антител: M1–23 и M3–23, необходимо только заменить несколько аминокислот FR вариабельных областей на соответствующие аминокислоты в последовательности FR вариабельной области человека, чтобы эти два антитела стали пригодными для лечения человека. Однако, хотя антитело первично контактирует и распознает антиген через CDR, некоторые из остатков в FR–области антитела также могут быть вовлечены во взаимодействия антиген–антитело, тем самым влияя на пространственную конфигурацию CDR. Например, после замены области FR антитела мыши областью FR антитела человека, пространственная конфигурация CDR антитела мыши часто может изменяться, что приводит к значительному снижению аффинности гуманизированного антитела в отношении распознавания/связывания антигена и даже приводит к потере способности гуманизированного антитела связываться с антигеном (Ge Yan, Development Strategy Analysis and Application Research of Humanized Antibodies [J]. Foreign Medical Sciences, Immunology, 2004, 27(5): 271). Таким образом, в процессе гуманизации M1–23 и M3–23 положение точковой мутации в последовательности FR вариабельной области и выбор аминокислоты, на которую может быть заменена исходная, являются очень важными.
С использованием информационной системы IMGT (http://–www.imgt.org) в комбинации с результатами экспериментов, и, исходя из большого количества анализов и экспериментов, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что последовательности генов эмбрионального типа человека IGHV4–4*08 (SEQ ID NO: 40) и IGKV1–39*01 (SEQ ID NO: 41) являются особенно преимущественными в качестве матриц для гуманизации M1–23, IGHV4–4*02 (SEQ ID NO: 42) и IGKV4–1*01 (SEQ ID NO: 43) являются особенно преимущественными в качестве матриц для гуманизации M3–23, и вовлеченные последовательности генов эмбрионального типа приведены в таблице 6 ниже.
Таблица 6: аминокислотные последовательности генов эмбрионального типа человека
Ген эмбрионального типа
Название соответствующей последовательности
SEQ ID NO
Аминокислотная последовательность
IGHV4–4*08
M1–23 VH
40
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYTSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
IGKV1–39*01
M1–23 VK
41
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
IGHV4–4*02
M3–23 VH
42
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSTNYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAR
IGKV4–1*01
M3–23 VK
43
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP
В соответствии с последовательностью генов эмбрионального типа и учитывая, что изменение аминокислот в FR–области вблизи CDR может влиять на аффинность гуманизированного антитела в отношении распознавания/связывания антигена, авторы настоящего изобретения разработали следующие единичные точковые мутации при сохранении аминокислот вблизи области CDR, чтобы модифицировать FR–области двух антител. Гуманизированные M1–23 и M3–23 были названы M1D и M3D, соответственно.
Таблица 7: Единичные точковые мутации аминокислотных остатков в FR–области антитела M1–23
№<sup>※</sup>
Исходная амино–кислота
Аминокислота после гуманизации
№<sup>※</sup>
Исходная амино–кислота
Аминокислота после гуманизации
HFR1
LFR1
H17
I
T
L1
E
D
H20
V
L
L3
V
Q
H23
S
T
LFR2
HFR3
L45
Q
K
H64
R
K
LFR3
H69
L
I
L55
E
Q
H78
L
F
L63
R
S
HFR4
L70
E
D
H107
L
T
L84
T
A
H108
R
T
※: Положения аминокислот, упомянутые в таблице выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.
Таблица 8: Единичные точковые мутации аминокислотных остатков в FR–области антитела M3–23
№<sup>※</sup>
Исходная аминок–ислота
Аминокислота после гуманизации
№<sup>※</sup>
Исходная амино–кислота
Аминокислота после гуманизации
HFR1
LFR1
H2
L
V
L3
Q
V
H16
E
G
L5
S
T
HFR2
L19
V
A
H37
I
V
LFR2
HFR3
L43
A
P
H65
N
S
LFR3
H71
K
V
L60
N
D
H73
T
K
L76
R
S
H81
I
K
L77
G
S
HFR4
H107
V
T
※: Положения аминокислот, упомянутые в таблице выше, пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat.
Таблица 9: Праймеры для гуманизации FR–областей M1–23, M3–23
Название праймера
SEQ ID NO
Последовательность праймера
PTT5–1–23H–F
64
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTcaggtgcagctgcaggagtcaggcccag
1–23H–F1
65
5’–caggagtcaggcccaggactggtgaagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCAC
1–23H–F2
66
5’–aagccttcggagaCCCTGTCCCTCACCTGCACtgtctctggtggctccatc
1–23H–R1
67
5’–GTTCTTGGACGTGTCTACGGATATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTGTAGT
1–23H–F3
68
5’–TCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTtctccctgaaactgagctc
PTT5–1–23H–R
69
5’–GATGGGCCCTTGGTCGACGCtgaagagacggtgacGGTGGTcccttggccccagaaatc
PTT5–1–23K2–F
70
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTCTCCATCC
1–23K–R2
71
5’–CAGCAAAAACCGGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTATGC
1–23K2–R1
72
5’–GAACCTTGATGGGACCCCACTTTGCAAACGATTTGCATAATAGATCAGGAGC
1–23K2–R2
73
5’–CTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACCCC
1–23K–F2
74
5’–GCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAGG
1–23K–F3
75
5’–GCAGCCTGCAACCTGAGGATTTTGCAACTTATTACTGTCAAC
PTT5–1–23K–R
76
5’–GACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCAT
PTT5–3–23HV2–F
77
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCC
3–23HV2–R1
78
5’–ATTCCCGGGTagatgcccaGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGGCTGTCCTGGTTTCTGCTG
3–23HV2–F1
79
5’–ggtgtctccatcagcagtccttatgacTGGACCTGGGTCCGCCAGCCCCCAGGGAAG
3–23HV2–R2
80
5’–AACTGGTTCTTGGACTTGTCTACTGAAATGGTGACTCGACTCTTGAGGGAGGGGTTG
3–23HV2–F2
81
5’–AGACAAGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGC
PTT5–3–23HV1–R
82
5’–gaaaccTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATC
PTT5–3–23KV1–F
83
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCC
3–23KV1–F1
84
5’–CCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAAGTCCAG
3–23KV2–R1
85
5’–CAGCAGAAACCAGGACAGCCTCCTAAGCTGCTCTTTTACtgggcatctACCCGGGAAT
3–23KV1–R2
86
5’–GTGAAATCTGTCCCAGATCCACTGCCACTGAATCGGTCAGGGACCCCGGATTCCCGGGTagatgcc
3–23KV1–F2
87
5’–GGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGGCTGAAGATG
PTT5–3–23KV1–R
88
5’–ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCC
В соответствии с единичными точковыми мутациями, приведенными в таблице 7 и таблице 8, конструировали соответствующие праймеры (см. таблицу 9). Мутацию всех исходных аминокислот в соответствующих положениях осуществляли посредством ПЦР, где M1–23–H, M1–23–L, M3–23–H и M3–23–L использовали по отдельности в качестве матриц. Взяв гуманизацию вариабельной области тяжелой цепи M1–23 (M1–23–H) в качестве примера, конструировали олигонуклеотидные праймеры PTT5–1–23H–F, 1–23H–F1, 1–23H–F2, 1–23H–R1, 1–23H–F3 и PTT5–1–23H–R (их последовательности представлены в таблице выше). Конкретный протокол ПЦР был следующим: ген, кодирующий M1–23–H, использовали в качестве матрицы, пары праймеров 1–23H–F1/1–23H–R1 и 1–23H–F3/PTT5–1–23H–R использовали для амплификации для получения фрагмента 1 и фрагмента 2, соответственно; с использованием фрагмента 1 в качестве праймера, пару праймеров 1–23H–F2/1–23H–R1 использовали для амплификации для получения фрагмента 3; с использованием фрагмента 3 в качестве матрицы, пару праймеров PTT5–1–23H–F/1–23H–R1 использовали для амплификации для получения фрагмента 4; фрагмент 4 и фрагмент 2 лигировали вместе посредством ПЦР с удлинением внахлест, а затем PTT5–1–23H–F/PTT5–1–23H–R использовали в качестве вышележащих и нижележащих праймеров для амплификации для получения гуманизированого фрагмента гена M1D–H.
В соответствии с приведенным выше способом, получали гуманизированный фрагмент гена M1D–L из M1–23–L, гуманизированный фрагмент гена M3D–H из M3–23–H, и гуманизированный фрагмент гена M3D–L из M3–23–L.
Escherichia coli
Полученные гуманизиованные фрагменты генов M1D–H и M3D–H лигировали с эукариотическим экспрессирующим вектором pTT5–CH, соответственно, с использованием изготовленной в лаборатории жидкости для сборки Cibson, и M1D–L и M3D–L соответственно лигировали с эукариотическим экспрессирующим вектором pTT5–Cк с получением рекомбинантного вектора. Рекомбинантный вектор трансформировали в  штамма DH5б, распределяли в планшеты с LB, и культивировали в течение ночи в инкубаторе с 37°C. Моноклональные колонии отбирали из планшетов, а затем секвенировали. Плазмиды с правильной последовательностью отбирали, и проводили экспрессию и очистку антител в соответствии со способом согласно примеру 1.
Аминокислотные последовательности гуманизированных антител M1D и M3D представлены в таблице 11. Кроме того, степени гуманизации M1D и M3D вычисляли по следующей формуле. Как показано в таблице 10 ниже, после гуманизации двух антител степени гуманизации возрастали от приблизительно 90% до приблизительно 98%.
Таблица 10: Анализ последовательности гуманизированных антител
До гуманизации
После гуманизации
Название антитела
Степень гуманизации
Название антитела
Степень гуманизации
M1–23
90%
M1D
98,33%
M3–23
91,67%
M3D
97,78%
Степень гуманизации = (количество аминокислот в области FR – количество аминокислот обезьяны, сохраненных в области FR) / количество аминокислот в области FR Ч 100%
Таблица 11: Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей антител M1D, M3D
Название соответствующей последовательности
SEQ ID NO
Аминокислотная последовательность
M1D VH
57
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSITSNFWSWIRQPPGKGLEWIGYISGSGTYTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSHDYGSNDYAFDFWGQGTTVTVSS
M1D VK
58
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRATQDISSSLNWYQQKPGKAPKLLIYYANRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSLPLTFGGGTKVEIK
M3D VH
59
QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGVSISSPYDWTWVRQPPGKGLEWIGRIHGNGGSTSYNPSLKSRVTISVDKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVRDETWGQGTLVTVSS
M3D VK
60
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLFYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYTTPLTFGQGTKVEIK
Пример 4: Оценка активности связывания
in vitro
гуманизированного антитела M1D, M3D
4.1 Определение антител в отношении связывания антигена
2
4
Активность связывания гуманизированного антитела M1D, M3D с антигеном HBsAg исследовали способом ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Проводили разведение с 3–кратным градиентом концентрации, начиная с 10 мкг/мл, с получением 12 градиентов концентрации. В качестве эталонного антитела использовали гуманизированное антитело 162 (подробно описанное в китайской патентной заявке CN201610879693.5). Затем разбавленное антитело добавляли в коммерческий реакционный планшет для HBsAg (приобретенный от Beijing Wantai), и инкубировали при 37°C в течение 1 ч с последующим промыванием PBST 5 раз и сушкой. Затем добавляли меченное ферментом GAH–HRP вторичное антитело, инкубировали в течение 30 мин, а затем промывали PBST 5 раз и сушили. Добавляли раствор субстрата TMB. После развития окраски в течение 15 минут цветную реакцию останавливали HSO и проводили считывание при OD450/630. Результаты представлены на фиг.4, на которой все из гуманизированных антител M1D и M3D обладали превосходной активность связывания антитела и их аффинность в отношении антигена HBsAg была лучшей, чем аффинность эталонного антитела 162. Описанные выше результаты показали, что эти два гуманизированных антитела не только имели высокую степень гуманизации (более 97%), но также по существу сохраняли активность их исходного антитела в отношении связывания антигена и даже продемонстрировали лучшую активность связывания антигена, чем их исходное антитело.
4.2 Предварительная идентификация эпитопа антител
Авторы изобретения также провели предварительную идентификацию эпитопа антител для определения того, распознавали ли выбранные химерные антитела человека–обезьяны и гуманизированные антитела эпитоп SA на HBsAg. 6D11, распознающее эпитоп типа SA, использовали в высокой концентрации для перекрестного блокирования связывания антитела, подлежащего тестированию, с HBsAg, и, если существовал значительный эффект блокирования (конкуренции), антитело, подлежащее тестированию, распознавало тот же эпитоп как 6D11. Конкретные стадии были следующими:
(1) После определения концентрации антитела антитело добавляли в коммерческий планшет для ELISA для HBsAg в концентрации 10 мкг/лунка, а затем объем доводили до 50 мкл посредством 20% NBS, и проводили инкубацию при 37°C в течение 30 мин.
(2) К планшету для ELISA добавляли 6D11–HRP, разбавленный 1:20000 посредством ED–11, в количестве 50 мкл/лунка, и инкубировали при 37°С в течение 30 мин.
(3) Планшет промывали 5 раз посредством PBST и сушили.
2
4
(4) Добавляли раствор субстрата TMB и после развития окраски в течение 15 минут цветную реакцию останавливали посредством HSO.
(5) Проводили считывание при OD450/630.
Результаты представлены на фиг.5, где в качестве положительного контроля в этом эксперименте использовали 162. M1D, M3D могли конкурировать за связывание HBsAg с антителом мыши 6D11, и эффект конкуренции был сравнимым с эффектом положительного контроля 162 и исходных антител M1–23, M3–23. Описанные выше результаты показали, что гуманизированные антитела M1D, M3D также распознавали эпитоп SA.
4.3 Определение нейтрализующей активности антител
Авторы изобретения использовали полученную в лаборатории модель HepaG2–NTCP для оценки способности антител нейтрализовывать инфекцию HBV (с инфекционным титром HBV 100 MOI). Определенное количество HBV и градиентно разведенного антитела совместно инкубировали с клетками HepaG2, и HBV был способен проникать в дифференцированные клетки HepaG2 и реплицироваться в клетках. При добавлении различных антител и изменениях количества добавленного антитела проникновение и репликации HBV ослабевали или ингибировались в различной степени, так что различные уровни антигена HBV (HBeAg) могли появляться в клеточных супернатантах. Таким образом, путем измерения уровня антигена HBV (HBeAg) можно было определить способность различных гуманизированных антител нейтрализовывать HBV.
Гуманизированные антитела разбавляли двукратными градиентами и в качестве положительного контроля использовали антитело 162. Из 10 мкг/мл всего получали 18 градиентов разведения. Затем систему вирусной инфекции отдельно смешивали с антителами и предварительно инкубировали в течение 1 ч. Затем ее добавляли в планшеты с клетками HepaG2, культивировали при 37°С в течение 24 часов, и среду заменяли свежей средой каждые двое суток. На 7–е сутки после инфекции отбирали клеточный культуральный супернатант и определяли уровень HBeAg. Способ измерения включал следующие стадии:
2
4
2
4
(1) Подготовка реакционного планшета: Моноклональное антитело против HBeAg разбавляли до 2 мкг/мл 20 мМ буфером PB (буфер NaHPO/NaHPO, pH 7,4). Разбавленное моноклональное антитело против HBeAg (100 мкл/лукна) добавляли в 96–луночный хемилюминесцентный планшет и инкубировали при 37°C в течение 2 ч, а затем при 4°C в течение ночи. Использованные исходные материалы приобретали Beijing Wantai Biological Pharmaceutical Co., Ltd. 96–луночный хемилюминесцентный планшет промывали один раз PBST и сушили. В 96–луночный хемилюминесцентный планшет добавляли блокирующий раствор, по 200 мкл на лунку, и блокировали при 37°C в течение 2 ч. Затем блокирующий раствор удаляли, планшет помещали в сухое помещение и сушили, и хранили при 2–8°C до применения.
(2) Инкубация: 100 мкл/лунка образца, подлежащего тестированию, добавляли к реакционный планшет, полученный, как описано выше, и инкубировали при 37°C в течение 60 мин.
(3) Промывание: 96–луночный хемилюминесцентный планшет промывали 5 раз PBST и сушили.
(4) Инкубация: меченное пероксидазой хрена антитело против HBeAg (100 мкл/лунка) добавляли и инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Исходные материалы приобретали от Beijing Wantai Biological Pharmaceutical Co., Ltd.
(5) Промывание: 96–луночный хемилюминесцентный планшет промывали 5 раз PBST и сушили.
(6) Развитие окраски: добавляли хемилюминесцентный реагент люминол (100 мкл/лунка).
(7) Считывание планшета: величины определяли с использованием хемилюминесцентного устройства для считывания микропланшетов.
Результаты экспериментов представлены на фиг.6A–6B, что указывает на то, что активность M1D в отношении нейтрализации HBV была сравнимой с активностью эталонного антитела 162.
Пример 5: Определение терапевтических эффектов гуманизированных антител M1D, M3D
Описанные выше 5 антител вводили по отдельности трансгенным мышам с HBV в однократной дозе 10 мг/кг, и каждая группа содержала 6 трансгенных мышей с HBV. Затем проводили взятие крови из ретроорбитального венозного сплетения мышей и определяли изменения уровней HBsAg и ДНК HBV в сыворотке мышей.
5.1 Количественное определение HBsAg
2
4
2
4
(1) Подготовка реакционного планшета: моноклональное антитело мыши HBs–45E9 разбавляли до 2 мкг/мл 20 мМ буфером PB (буфер NaHPO/NaHPO, pH 7,4) и в хемилюминесцентный планшет добавляли буфер для нанесения покрытия, по 100 мкл на лунку. Планшет покрывали при 6–8°С в течение 16–24 ч, а затем при 37°С в течение 2 ч, после чего промывали один раз промывочным раствором PBST и сушили. После промывания в каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора и проводили блокирование при 37°C в течение 2 ч. Затем блокирующий раствор удаляли, планшет помещали в сухое помещение и сушили, и хранили при 2–8°C до применения.
(2) Разбавление образца: собранную сыворотку мыши разбавляли на два градиента 1:30 и 1:150 раствором PBS, содержавшим 20% NBS (сыворотка новорожденного теленка) для последующего количественного определения.
(3) Денатурирующая обработка образца: 15 мкл описанного выше разбавленного образца сыворотки тщательно смешивали с 7,5 мкл денатурирующего буфера (15% SDS, растворенный в 20 мМ PB, 7,4), и подвергали реакции при 37°C в течение 1 ч. Затем добавляли 90 мкл нейтрализующего буфера (4% CHAPS, растворенный в 20 мМ PB, 7,4) и хорошо перемешивали.
(4) Реакция образца: 100 мкл описанного выше денатурированного образца сыворотки добавляли в реакционный планшет и подвергали реакции при 37°C в течение 1 ч. Затем реакционный планшет промывали 5 раз PBST и сушили.
(5) Реакция ферментной метки: реакционный раствор HBs–A6A7–HRP (100 мкл/лунка) добавляли в хемилюминесцентный планшет и подвергали реакции при 37°C в течение 1 ч. Затем планшет промывали 5 раз PBST и сушили.
(6) Люминесцентная реакция и измерение: в хемилюминесцентный планшет добавляли люминесцентную жидкость (100 мкл/лунка) и проводили измерение интенсивности света.
(7) Вычисление концентрации HBsAg в образцах сыворотки мыши: параллельные эксперименты проводили для стандартного образца и строили стандартную кривую на основе результатов измерения в стандартном образце. Затем величину интенсивности света образца сыворотки мыши помещали на стандартную кривую для вычисления концентрации HBsAg в образце сыворотки, подвергаемом тестированию.
5.2 Количественное определение ДНК HBV
Количественное определение ДНК HBV проводили в соответствии с инструкциями набора для количественного определения флуоресценции ДНК HBV в реальном времени (набор был приобретен в Shanghai Kehua Bioengineering Co., Ltd.).
В этом примере определяли способность гуманизированных антител M1D, M3D, химерного антитела яванского макака–человека M3–13 и эталонного антитела 162 к выведению вируса у животных. Результаты представлены на фиг.7A–7B. Результаты показали, что гуманизированные антитела M1D, M3D и химерное антитело яванского макака–человека M3–13 имели хорошую способность к выведению вируса и их способность устранять HBsAg и ДНК HBV у животных была лучше, чем у эталонного антитела 162.
Описанные выше результаты продемонстрировали, что гуманизированные антитела по настоящему изобретению не только имели очень высокую степень гуманизации (вплоть до 98%), тем самым снижая вероятность иммунологического отторжения, но также демонстрировали способность к устранению вируса, эквивалентную способности к устранению вируса у химерного антитела обезьяны–человека и превосходящую ее у эталонного антитела 162. Такие технические эффекты были значительными и неожиданными.
Пример 6: Определение некритических областей CDR гуманизированных антител M1D, M3D
В домене вариабельной области антитела участки, прямо связывающиеся с антигеном, в основном находятся в областях CDR, однако во многих исследованиях было показано, что не все из шести CDR антитела являются ключевыми областями для связывания антиген–антитело, и неключевые области CDR можно определять способом замены CDR. В рамках изобретения последовательности для замены исходных CDR выбирали в соответствии с принципом оптимального сопоставления. Аминокислотные последовательности VH и VL гуманизированных антител M1D и M3D вводили в поисковую строку информационной системы IMGT, а затем с помощью системы проводили поиск соответствующих аминокислотных последовательностей легких и тяжелых цепей антител в генах эмбрионального типа. В соответствии с принципом, что область FR иммеет наиболее высокую гомологию и последовательности области CDR имели наибольшее отличие, было выбрано две заменяющих последовательности для каждой из областей CDR гуманизированного антитела за исключением CDR3 тяжелой цепи. Заменяющие последовательности представлены в таблице ниже:
Таблица 12: Заменяющие последовательности CDR для гуманизированных антител M1D, M3D
№
Исходная CDR
Заменяющая CDR–A
Ген эмбрио–нального типа заменяющей CDR–A
Заменяющая CDR–B
Ген эмбрио–нального типа заменяющей CDR–B
M1D–H–CDR1
GGSITSNF
GGSISSYY
IGHV4–4*08
GGSVSSGSYY
IGHV4–61*01
M1D–H–CDR2
ISGSGTYT
IYTSGST
IGHV4–4*08
ISSSSSYT
IGHV3–11*03
M1D–L–CDR1
QDISSS
QSVSSSY
IGKV3D–7*01
SSNIGSNT
IGLV1–44*01
M1D–L–CDR2
YAN
AAS
IGKV1–39*01
KAS
IGKV1–5*03
M1D–L–CDR3
QQYHSLPLT
LQDYNYPLT
IGKV1–6*01
HQSSSLPLT
IGKV6–21*02
M3D–H–CDR1
GVSISSPYDW
GGSISSGGYS
IGHV4–30–4*07
GGSISSSNW
IGHV4–4*01
M3D–H–CDR2
IHGNGGST
IYHSGST
IGHV4–4*02
ISGSGGST
IGHV3–23*02
M3D–L–CDR1
QSLLYSSNNKNY
QSLLHSDGKTY
IGKV2–29*02
QSVSSSY
IGKV3D–7*01
M3D–L–CDR2
WAS
LGS
IGKV2–28*01
GAS
IGKV3–15*01
M3D–L–CDR3
QQHYTTPLT
QQYYSTPWT
IGKV4–1*01
MQALQTPWT
IGKV2–28*01
Согласно заменяющим последовательностям CDR, описанным в таблице выше, конструировали соответствующие праймеры и соответствующие области CDR в антителах M1D и M3D заменяли способом ПЦР. Сконструированные праймеры представлены в таблице ниже. Если взять первую замену (M1D–H–CDR1–A) CDR1 M1D вариабельной области тяжелой цепи (M1D–HCDR1) в качестве примера, конструировали олигонуклеотидные праймеры M1D–H–CDR1–A R и M1D–H–CDR1 F (последовательности которых представлены в таблице), и антитело после этой замены CDR было названо M1D HCDR1–1. Наименование для антител с другими заменами давали аналогичным образом. Конкретный протокол ПЦР был следующим: в качестве матрицы использовали кодирующий ген M1D–H, для амплификации использовали пары праймеров pTT5–M1D–HF/M1D–H–CDR1–A R и M1D–H–CDR1–A F/pTT5–M1D–HR для получения вышележащих и нижележащих фрагментов, соответственно; фрагменты лигировали вместе посредством ПЦР с удлинением внахлест, а затем амплифицировали с pTT5–M1D–HF/pTT5–M1D–HR в качестве вышележащего и нижележащего праймеров, получая фрагмент гена, в котором HCDR1 M1D была заменена.
Таблица 13: последовательности праймеров для замены CDR
Название праймера
SEQIDNO
Последовательность праймера
pTT5–M1D–H–F
89
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCAGGC
pTT5–M1D–H–R
90
5’–GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGAC
pTT5–M1D–L–F
91
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTC
pTT5–M1D–L–R
92
5’–ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC
M1D–H–CDR1–1R
93
5’–GTAGTAACTACTGATGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
M1D–H–CDR1–1F
94
5’–GgtggctccatcagtagttactacTGGAGCTGGATCCGCCAG
M1D–H–CDR1–2R
95
5’–ATAGTAACTACCACTGCTGACGGAGCCACCAGAGACAGTGCAGGTGAG
M1D–H–CDR1–2F
96
5’–GgtggctccgtcagcagtggtagttactATTGGAGCTGGATCCGCCAG
M1D–H–CDR2–1R
97
5’–GGTGCTCCCACTGGTATAGATATACCCAATCCACTCCAG
M1D–H–CDR2–1F
98
5’–AtctataccagtgggagcaccGACTACAACCCCTCCCTC
M1D–H–CDR2–2R
99
5’–TGTGTAACTACTACTACTACTAATATACCCAATCCACTCCAG
M1D–L–CDR2–2F
100
5’–AttagtagtagtagtagttacacaGACTACAACCCCTCCCTC
M1D–L–CDR1–1R
101
5’–GTAGCTGCTGCTAACACTCTGAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
M1D–L–CDR1–1F
102
5’–CagagtgttagcagcagctacTTAAATTGGTATCAGC
M1D–L–CDR1–2R
103
5’–AGTATTACTTCCGATGTTGGAGCTAGTTGCCCGGCAAGTGATGG
M1D–L–CDR1–2F
104
5’–AgctccaacatcggaagtaatactTTAAATTGGTATCAGC
M1D–L–CDR2–1R
105
5’–GACCCCACTTTGCAAACGGGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGG
M1D–L–CDR2–1F
106
5’–CCTAAGCTCCTGATCTATGctgcatccCGTTTGCAAAGTGGGGTC
M1D–L–CDR2–2R
107
5’–GACCCCACTTTGCAAACGAGACGCCTTATAGATCAGGAGCTTAGG
M1D–L–CDR2–2F
108
5’–CCTAAGCTCCTGATCTATAaggcgtctCGTTTGCAAAGTGGGGTC
M1D–L–CDR3–1R
109
5’–AGTGAGAGGGTAATTGTAATCTTGTAGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
M1D–L–CDR3–1F
110
5’–CtacaagattacaattaccctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
M1D–L–CDR3–2R
111
5’–AGTGAGAGGTAAACTACTACTCTGATGACAGTAATAAGTTGCAAAATC
M1D–L–CDR3–2F
112
5’–catcagagtagtagtttacctCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAG
pTT5–M3D–H–F
113
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCG
pTT5–M3D–H–R
114
5’–GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCAG
pTT5–M3D–L–F
115
5’–AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATCGTGATGACCCAGTCTC
pTT5–M3D–L–R
116
5’–ATGGTGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCACCTTGGTC
M3D–H–CDR1–1R
117
5’–GGAGTAACCACCACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
M3D–H–CDR1–1F
118
5’–ggtggctccatcagcagtggtggttactccACCTGGGTCCGCCAGCCC
M3D–H–CDR1–2R
119
5’–CCAGTTACTACTGCTGATGGAGCCACCAGAGACAGCGCAGGTGAGGGACAG
M3D–H–CDR1–2F
120
5’–GgtggctccatcagcagtagtaactggACCTGGGTCCGCCAGCCC
M3D–H–CDR2–1R
121
5’–GGTGCTCCCACTATGATAGATTCGTCCAATCCACTCCAG
M3D–H–CDR2–1F
122
5’–AtctatcatagtgggagcaccAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
M3D–H–CDR2–2R
123
5’–TGTGCTACCACCACTACCACTAATTCGTCCAATCCACTCCAG
M3D–L–CDR2–2F
124
5’–attagtggtagtggtggtagcacaAGCTACAACCCCTCCCTCAAG
M3D–L–CDR1–1R
125
5’–ATAGGTCTTTCCATCACTATGCAGGAGGCTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
M3D–L–CDR1–1F
126
5’–cagagcctcctgcatagtgatggaaagacctatTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
M3D–L–CDR1–2R
127
5’–GTAGCTGCTGCTAACACTCTGGCTGGACTTGCAGTTGATGGTGGC
M3D–L–CDR1–2F
128
5’–CagagtgttagcagcagctacTTAGCCTGGTACCAGCAGAAAC
M3D–L–CDR2–1R
129
5’–GGGACCCCGGATTCCCGGGTAGAACCCAAGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
M3D–L–CDR2–1F
130
5’–CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACTtgggttctACCCGGGAATCCGGGGTCCC
M3D–L–CDR2–2R
131
5’–GGGACCCCGGATTCCCGGGTGGATGCACCGTAAAAGAGCAGCTTAGGAGG
M3D–L–CDR2–2F
132
5’–CCTCCTAAGCTGCTCTTTTACGgtgcatccACCCGGGAATCCGGGGTCCC
M3D–L–CDR3–1R
133
5’–CGTCCAAGGAGTACTATAATATTGCTGACAGTAATACACTGCCACATC
M3D–L–CDR3–1F
134
5’–CagcaatattatagtactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG
M3D–L–CDR3–2R
135
5’–CGTCCAAGGAGTTTGTAGAGCTTGCATACAGTAATACACTGCCACATC
M3D–L–CDR3–2F
136
5’–AtgcaagctctacaaactccttggacgTTCGGCCAAGGGACCAAG
В соответствии с описанным выше способом, полученные фрагменты генов тяжелой цепи с заменой CDR по отдельности лигировали в эукариотический экспрессирующий вектор pTT5–CH, а затем совместно трансфицировали с экспрессирующим вектором соответствующей легкой цепи без замены CDR в клетки HEK293 в небольшом количестве, и определяли антигенную активность клеточного супернатанта при экспрессии в небольшом количестве. Аналогично, полученные фрагменты генов легкой цепи с заменой CDR по отдельности лигировали с эукариотическим экспрессирующим вектором pTT5–Cк, а затем совместно трансфицировали с экспрессирующим вектором соответствующей тяжелой цепи без замены CDR и определяли активность супернатанта после трансфекции в отношении связывания антигена.
После замены определенной области CDR, если соответствующий супернатант после трансфекции клеток демонстрировал отсутствие активности связывания антигена или значительное снижение активности связывания антигена, можно было сделать заключение, что замененная область CDR была ключевой областью CDR для связывания антитело–антиген; если соответствующий супернатант после трансфекции клеток демонстрировал по существу не измененную активность связывания антигена после замены, то замененная область CDR не была ключевой областью для связывания антитело–антиген.
Результаты замен M1D представлены на фиг.8A–8E. После замены CDR1 тяжелой цепи (M1D–H–CDR1) и CDR2 легкой цепи (M1D–L–CDR2) M1D, активность связывания антигена HBsAg по существу не изменялась; после замены CDR2 тяжелой цепи и CDR1 легкой цепи активность связывания антигена значительно снижалась; и после замены CDR3 легкой цепи активность связывания антигена полностью утрачивалась. Описанные выше результаты показали, что HCDR1 и LCDR2 антитела M1D не были ключевыми областями CDR для связывания антигена HBsAg, и их замена не влияла на активность связывания антитела с антигеном.
Результаты замен для M3D представлены на фиг.9A–9E. После замены CDR2 тяжелой цепи (HCDR2) и CDR2 легкой цепи (LCDR2) M3D, активность связывания антигена по существу не изменялась; после замены CDR1 легкой цепи одна замена (M3D–LCDR1–1) продемонстрировала значительное снижение активности связывания антигена, в то время как другая замена (M3D–LCDR1–2) продемонстрировала по существу отсутствие активности связывания антигена; после замены CDR1 тяжелой цепи (HCDR1) и CDR3 легкой цепи (LCDR3) активность связывания антигена по существу отсутствовала. Описанные выше результаты показали, что HCDR2 и LCDR2 антитела M3D не были ключевыми областями CDR для связывания антигена и их замена не влияла на активность связывания антитела с антигеном.
Пример 7: Определение ключевых аминокислот для связывания с антигеном в гуманизированных антителах M1D, M3D
Для определения ключевых аминокислотных участков для взаимодействий антитело–антиген авторы изобретения провели сканирование аланином четырех областей CDR M1D: HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR3, и четырех областей CDR M3D: HCDR1, HCDR3, LCDR1, LCDR3. В основном, ключевые аминокислоты являются в некоторой степени консервативными, если взять аминокислотные остатки, которые сохраняют конформацию антитела и аминокислотные остатки, которые погружены внутрь, в качестве примера, мутация этих аминокислот на аланин может привести к тому, что антитело станет неактивным. Мутантное антитело тестировали в отношении активности связывания с HBsAg способом Elisa и вычисляли rEC50 антитела после мутации (WT/мутация, относительная величина EC50 исходного антитела составляла 1, и 0 означает, что активность связывания полностью утрачивалась), где антитела с rEC50<0,2 (т.е. активность снижалась в 5 раз) после мутации указаны синим цветом, включая аминокислотные остатки, такие как D, E, R, H, L, W и Y. Результаты представлены в таблице 14. Кислотные аминокислоты D, E и основные аминокислоты R и H могли образовывать солевой мостик, когда антитело связывало антиген, тем самым играя важную роль в реакции связывания антитело–антиген, так что мутация этих аминокислот на аланин может нарушать образование ионной связи и значительно снижать активность связывания антитела. Алифатическая аминокислота L представляла собой гидрофобную аминокислоту, и W и Y представляли собой ароматические аминокислоты, которые играли важную роль в поддержании конформации антитела. Среди них, мутация H56Y, H97D, H100cD, H100dL, 94L, L96L M1D на аланин приводила к значительному снижению активности, так что они представляли собой участки, которые не следует изменять; и мутация H33Y, H34D, H35W, H94R, H95D, H101E, L27dY, L32Y, L91H M3D на аланин приводила к значительному снижению активности, так что они представляли собой участки, которые не следует изменять.
Таблица 14: Определение ключевых аминокислотных участков M1D и M3D
M1D
Номер по Kabat
Мутация
rEC50
Номер по Kabat
Мутация
rEC50
CDRH2
CDRL1
H51
I
0,34
L27
Q
0,39
H52
S
0,61
L28
D
0,54
H52A
G
0,16
L29
I
0,46
H53
S
0,38
L30
S
0,36
H54
G
0,29
L31
S
0,52
H55
T
0,25
L32
S
0,36
H56
Y
0,09
CDRL3
H57
T
0,56
L89
Q
0,65
CDRH3
L90
Q
1,39
H93
A
1,00
L91
Y
0,43
H94
R
0,58
L92
H
0,33
H95
S
0,21
L93
S
0,84
H96
H
1,18
L94
L
0,00
H97
D
0,04
L95
P
1,05
H99
Y
0,26
L96
L
0,09
H100
G
0,89
L97
T
0,76
H100A
S
1,18
H100B
N
0,51
H100C
D
0,00
H100D
Y
0,00
H100E
A
1,00
H99
F
0,25
H101
D
0,36
H102
F
1,16
M3D
Номер по Kabat
Мутация
rEC50
Номер по Kabat
Мутация
rEC50
CDRH1
LCDR1
H26
G
2,43
L27
Q
0,57
H27
V
0,63
L27A
S
0,25
H28
S
0,91
L27B
L
0,56
H29
I
0,69
L27C
L
0,49
H30
S
1,24
L27D
Y
0,03
H31
S
1,31
L27E
S
0,67
H32
P
0,71
L27F
S
0,54
H33
Y
0,02
L28
N
0,35
H34
D
0,03
L29
N
0,65
H35
W
0,01
L30
K
0,61
CDRH3
L31
N
0,78
H93
V
1,06
L32
Y
0,00
H94
R
0,14
LCDR3
H95
D
0,00
L89
Q
0,79
H101
E
0,10
L90
Q
0,94
H102
T
0,92
L91
H
0,00
L92
Y
0,50
L93
T
0,96
L94
T
0,82
L95
P
0,49
L96
L
0,41
L97
T
0,66
Пример 8: Идентификация центральных эпитопов, распознаваемых M1D и M3D
M1D и M3D распознавали линейные эпитопы SA. Для дальнейшего определения основных эпитопов, распознаваемых двумя антителами, авторы изобретения осуществили единичную точковую мутацию в а.к. 113–135 (SEQ ID NO: 168) HBsAg и синтезировали 14 полипептидов, как показано в таблице ниже. Полипептиды разбавляли CB, 100 нг/мл, для покрытия планшета, и антитела разбавляли до 1000 нг/мл 20% раствором NBS, а затем проводили 3–кратное разведение для получения 12 градиентов. Активность связывания антител с полипептидами, имеющими различные единичные точковые мутации, определяли способом Elisa, и кривые связывания строили с использованием программного обеспечения PRISM. Если активность связывания утрачивалась после мутации, участок мутации представлял собой ключевую аминокислоту для линейного эпитопа SA.
Таблица 15: последовательности пептидов с точковыми мутациями на основе SEQ 13–B
Название полипептида
SEQ ID NO
Последовательность
SEQ13–B (а.к.113–135)
168
SSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFP
S13–S117A
169
SSTTATGPCKTCTTPAQGTSMFP
S13–T118A
170
SSTTSAGPCKTCTTPAQGTSMFP
S13–G119A
171
SSTTSTAPCKTCTTPAQGTSMFP
S13–P120A
172
SSTTSTGACKTCTTPAQGTSMFP
S13–C121S
173
SSTTSTGPSKTCTTPAQGTSMFP
S13–K122A
174
SSTTSTGPCATCTTPAQGTSMFP
S13–T123A
175
SSTTSTGPCKACTTPAQGTSMFP
S13–C124S
176
SSTTSTGPCKTSTTPAQGTSMFP
S13–T125A
177
SSTTSTGPCKTCATPAQGTSMFP
S13–T126A
178
SSTTSTGPCKTCTAPAQGTSMFP
S13–P127A
179
SSTTSTGPCKTCTTAAQGTSMFP
S13–Q129A
180
SSTTSTGPCKTCTTPAAGTSMFP
S13–T131A
181
SSTTSTGPCKTCTTPAQGASMFP
S13–S132A
182
SSTTSTGPCKTCTTPAQGTAMFP
Величины EC50 для связывания M1D, M3D и эталонного антитела 162 с описанными выше полипептидами с единичной точковой мутацией обобщенно представлены в таблице 16 ниже (>500 указывает на полную утрату активности связывания). Исходя из этих результатов, основной связываемый эпитоп 162 представлял собой CKTC (а.к. 121–124), в то время как основной связываемый эпитоп M1D представлял собой TGPCKTCT (а.к. 118–124), который был более длинным, чем у эталонного антитела 162, и находился за а.к.113–135; основной связываемый эпитоп M3D представлял собой CKTCT (а.к. 121–125), который находился перед эпитопом 162.
Таблица 16: Величины EC50 для связывания M1D, M3D с полипептидами с единичной точковой мутацией на основе HBsAg (а.к. 113–135)
EC50 (нг/мл)
Название полипептида
162
M1D
M3D
SEQ13–B
39,8
58,1
33,34
S13–S117A
31,1
32,5
33,93
S13–T118A
31,4
>500
37,42
S13–G119A
38,5
>500
41,7
S13–P120A
53,6
>500
67,88
S13–C121S
>500
>500
>500
S13–K122A
111
>500
>500
S13–T123A
>500
>500
>500
S13–C124S
>500
>500
>500
S13–T125A
48,8
353
>500
S13–T126A
41,9
40,8
33,89
S13–P127A
40,4
33,2
69,39
S13–Q129A
39,8
58,1
33,34
S13–T131A
60,1
51,7
62,08
S13–S132A
39,8
58,1
33,34
Для дальнейшего подтверждения ключевых участков антител для связывания с антигеном авторы настоящего изобретения проводили подтверждение описанных выше экспериментов на антигеных белках HBsAg. Конструировали соответствующие праймеры (таблица 17), и получали 14 фрагментов гена HBsAg с точковыми мутациями путем амплификации посредством ПЦР. Фрагменты, полученные посредством амплификации, лигировали по отдельности с использованием Gibson, в пустой вектор PTT5, который подвергали двойному ферментному расщеплению посредством EcoRI и BamHI, и конструирование вектора проводили, когда результаты секвенирования были правильными. Сконструированные плазмиды использовали для трансфекции клеток HEK293T в малом количестве и после трансфекции в течение двух суток клетки собирали и подтверждали посредством вестерн–блоттинга. Конкретные стадии были следующими:
(1) Клетки собирали и промывали два раза 5 мл PBS и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 минут после подсчета клеток;
6
(2) Добавляли 30 мкл DDM на 1Ч10 клеток для лизиса клеток (количество клеточного белка можно было количественно определять способом BCA), проводили лизис в течение 2 ч при 4°C, в ходе которого несколько раз проводили встряхивание с использованием устройства для встряхивания;
(3) Проводили центрифугирование при 13300 об/мин в течение 10 минут, супернатант отбирали в качестве образца и 30 мкл его подвергали восстанавливающему гель–электрофорезу SDS–PAGE;
(4) Электрофоретический перенос осуществляли с использованием устройства для переноса при постоянном токе 300 мА в течение 90 мин, и блокирование проводили с использованием коммерческого блокирующего раствора 37°C в течение 1 ч;
(5) Антитела M1D, M3D и 162 в количестве 1 мг/мл разбавляли по отдельности в 1000 раз посредством ED–11 и инкубировали в течение 1 ч при 37°C;
(6) Проводили промывание PBST каждые 5 минут всего 3 раза;
(7) Добавляли меченое ферментом вторичное антитело GAH–HRP (1:5000) и инкубировали при 37°C в течение 30 мин;
(8) Проводили промывание PBST каждые 5 минут всего 3 раза;
(9) Проявка и фотографирование;
(10) В качестве внутреннего стандарта использовали в–актин, площадь, соответствующую в–актину на мембране PVDF на стадии (4), исключали, и конъюгированное с HRP антитело мыши против в–актина (1:5000) прямо инкубировали при 37°C в течение 30 мин, и другие стадии были такими же, как описано выше. Из результата, представленного на фиг.10, можно было видеть, что основные эпитопы трех антител подтвержденные с использованием антигенного белка HBsAg, были полностью идентичными основным эпитопам линейных полипептидов.
Таблица 17: праймеры для единичной точковой мутации C–HBsAg
Название праймера
SEQ ID NO
Последовательность праймера
C–S117A–F
183
ATCAACTACCGCCACGGGACCATGCAAGACCTGCAC
C–S117A–R
184
GGTCCCGTGGCGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGTAGA
C–T118A–F
185
AACTACCAGCGCGGGACCATGCAAGACCTGCACGAT
C–T118A–R
186
CATGGTCCCGCGCTGGTAGTTGATGTTCCTGGAAGT
C–G119A–F
187
ACCAGCACGGCACCATGCAAGACCTGCACGATTCCT
C–G119A–R
188
CTTGCATGGTGCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCTGG
C–P120A–F
189
CAGCACGGGAGCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGC
C–P120A–R
190
GTCTTGCATGCTCCCGTGCTGGTAGTTGATGTTCCT
C–C121S–F
191
ACGGGACCATCCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAA
C–C121S–R
192
GCAGGTCTTGGATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGATGT
C–K122R–F
193
GGGACCATGCCGGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
C–K122S–R
194
GTGCAGGTCCGGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
C–K122A–F
195
GGGACCATGCGCGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGG
C–K122A–R
196
GTGCAGGTCGCGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTTGAT
C–T123A–F
197
ACCATGCAAGGCCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAAC
C–T123A–R
198
ATCGTGCAGGCCTTGCATGGTCCCGTGCTGGTAGTT
C–C124S–F
199
TGCAAGACCTCCACGATTCCTGCTCAAGGAACCTCT
C–C124S–R
200
AGGAATCGTGGAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTGGT
C–T125A–F
201
CAAGACCTGCGCGATTCCTGCTCAAGGAACCTCTAT
C–T125A–R
202
GCAGGAATCGCGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTGCTG
C–I126A–F
203
GACCTGCACGGCTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTT
C– I126A–R
204
TGAGCAGGAGCCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCCGTG
C–P127A–F
205
CTGCACGATTGCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCC
C–P127A–R
206
CCTTGAGCAGCAATCGTGCAGGTCTTGCATGGTCCC
C–Q129A–F
207
GATTCCTGCTGCAGGAACCTCTATGTTTCCCTCTTG
C–Q129A–R
208
GAGGTTCCTGCAGCAGGAATCGTGCAGGTCTTGCAT
C–T131A–F
209
TGCTCAAGGAGCCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTG
C–T131A–R
210
AACATAGAGGCTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAGGTC
C–S132A–F
211
TCAAGGAACCGCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTAC
C– S132A–R
212
GGAAACATAGCGGTTCCTTGAGCAGGAATCGTGCAG
Пример 9: Идентификация активности широкого спектра у M1D и M3D
Для дальнейшего подтверждения активности широкого спектра у M1D и M3D, каждый из фрагментов HBsAg (а.к.113–135) (см. таблицу 18 для их последовательностей), соответствующий различным подтипам с A по G (где F–тип включал F1 и F2) использовали для покрытия реакционных планшетов, где полипептиды разбавляли CB в концентрации 100 нг/мл для покрытия планшета. Антитела разбавляли до 1000 нг/мл 20% раствором NBS, а затем проводили 3–кратное разведение с получением 12 градиентов. Активность связывания M1D, M3D с различными подтипами HBsAg (а.к.113–135) определяли способом Elisa. Кривые связывания строили с использованием программного обеспечения PRISM. В результате, как показано на фиг.11A–11B, как M1D, так M3D могли связываться с большинством подтипов HBV.
Таблица 18: Аминокислотные последовательности различных подтипов HBsAg – а.к.113–135
Название полипептида
SEQ ID NO
Последовательность полипептида
SEQ13–A
213
STTTSTGPCKTCTTPAQGNSMFP
SEQ13–B
168
SSTTSTGPCKTCTTPAQGTSMFP
SEQ13–C
214
TSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFP
SEQ13–D
215
SSTTSTGPCRTCTTPAQGTSMYP
SEQ13–E
216
SSTTSTGPCRTCTTLAQGTSMFP
SEQ13–F/H
217
STTTSTGPCKTCTTLAQGTSMFP
SEQ13F1
218
STTTSTGPCKTCTALAQGTSMFP
SEQ13F2
219
STTTSTGPCRTCTTLAQGTSMLP
SEQ13–G
220
SSTTSTGPCKTCTTPAQGNSMYP
Пример 10: Определение аффинности M1D и M3D
Процесс нанесения покрытия проводили на устройстве Biacore 3000 с использованием 5 мкг/мл HBsAg, растворенного в ацетате натрия (pH 4,5), и HBsAg покрывали чип CM5 со степенью покрытия 2400 RU. Анализируемый образец разбавляли от 100 нМ с 2–кратным градиентом с получением 7 концентраций образцов. Методику определения аффинности проводили на устройстве Biacore 3000, в котором скорость потока составляла 50 мкл/мин, время связывания составляло 90 c, время диссоциации составляло 600 с, температура камеры с образцом составляла 10°C, регенерирующий раствор представлял собой 50 мМ NaOH, скорость регенерирующего потока составляла 50 мкл/мин, и время регенерации составляло 60 с. В таблице 19 представлена аффинность молекулы M1D и молекулы M3D в отношении антигена HBsAg, 1,06 нМ и 1,12 нМ, соответственно.
Таблица 19: Аффинность M1D, M3D в отношении антигена
Анализируемое соединение
<i>Ka(/Мс)</i>
<i>Kd(/с)</i>
<i>KD(M)</i>
M1D
1,02E06
1,08E03
1,06E–09
M3D
5,27E05
5,89E04
1,12E–09
Пример 11: Оценка фармакокинетики и первоначальной токсичности антител M1D и M3D у яванских макаков после однократной внутривенной инъекции
Шесть самцов яванских макаков, которых не подвергали никаким экспериментам, вовлекающим макромолекулярные соединения (>2000 Дальтон), разделяли на две группы, 3 животных/группа. Среди них растворы антител M1D и M3D в дозе 20 мг/кг вводили яванским макакам групп 1 и 2 посредством внутривенной болюсной инъекции, соответственно. Оценивали фармакокинетические характеристики и первоначальная токсичность у яванских макаков после однократной внутривенной инъекции антител M1D и M3D. Конкретная схема эксперимента представлена в таблице 20.
Таблица 20: Схема эксперимента для оценки фармакокинетических характеристик и исходной токсичности молекул M1D и M3D
Группа
Экспериментальное средство
Количество животных
Путь введения
Вводимая доза
Код животного
1
M1D
3
в/в болюс
20 мг/кг
C1001,C1002,C1003
2
M3D
3
в/в болюс
20 мг/кг
C2001,C2002,C2003
Перед введением (0 часов) здоровье и внешний вид экспериментальных животных исследовали два раза в сутки (9:30 и 16:00). Физикальное обследование экспериментальных животных проводили перед экспериментом для подтверждения состояния здоровья животных. В день введения состояние экспериментальных животных исследовали до и после каждого момента взятия крови, включая общее состояние здоровья, поведение, активность, экскременты, показатели дыхания и другие аномальные симптомы экспериментальных животных. Результаты показали, что все животные не продемонстрировали аномальной реакции в ходе и после введения. Кроме того, также после введения отслеживали массу тела и температуру тела экспериментальных животных. Результаты представлены в таблицах 21–24.
Таблица 21: Масса тела экспериментальных животных после введения M1D
Время
Масса тела (кг)
C1001
C1002
C1003
Сутки 0
4,12
3,92
3,66
Сутки 7
4,02
3,88
3,70
Сутки 14
4,10
3,75
3,80
Сутки 21
4,15
3,81
3,72
Сутки 28
4,01
3,99
3,87
Таблица 22: Температура тела экспериментальных животных после введения M1D
Время
Температура тела (°C)
C1001
C1002
C1003
До введения
37,8
38,0
37,9
1 час
38,4
37,9
38,4
6 часов
38,6
38,4
38,2
10 часов
38,1
37,8
37,6
24 часов
38,1
38,2
38,4
Таблица 23: Масса тела экспериментальных животных после введения M3D
Время
Масса тела (кг)
C2001
C2002
C2003
Сутки 0
3,6
3,27
3,6
Сутки 7
3,58
3,19
3,58
Сутки 14
3,73
3,33
3,7
Сутки 21
3,68
3,33
3,7
Сутки 28
3,95
3,39
3,81
Таблица 24: Температура тела экспериментальных животных после введения M3D
Время
Температура тела (°C)
C2001
C2002
C2003
До введения
38,6
38,7
38,2
1 час
38,5
38,4
37,7
6 часов
39
39
38,2
10 часов
36,3
36,5
36,7
24 часов
38,2
38,1
37,4
Описанные выше результаты эксперимента показали, что антитела M1D и M3D не вызывают никакого неблагоприятного побочного эффекта у экспериментальных животных после введения, тем самым предварительно подтвердив хорошую безопасность этих двух антител.
Кроме того, приблизительно 1,0 мл цельной крови собирали из головной мены экспериментальных животных до введения (0 часов), через 0,25 ч (15 минут), 0,5 ч (30 минут), 1 ч, 2 ч, 4 ч, 10 ч, 24 ч (1 сутки), 48 ч (2 суток), 72 ч (3 суток), 96 ч (4 суток), 144 ч (6 суток), 192 ч (8 суток), 240 ч (10 суток), 336 ч (14 суток), 408 ч (17 суток), 504 ч (21 сутки) и 672 ч (28 суток) после введения. Собранную сыворотку и кровь подвергали следующему анализу.
Концентрации антител M1D и M3D в сыворотке яванских макаков определяли хемилюминесцентным иммуноанализом (CLIA). Нижняя граница количественного определения (LLOQ) гуманизированных антител M1D и M3D в сыворотке составляла 0,063 нг/мл, и верхняя граница количественного определения (ULOQ) составляла 4,0 нг/мл. Результаты теста представлены на фиг.12A–12B.
На фиг.12A представлена кривая для концентрации гуманизированного антитела M1D в сыворотке крови каждого яванского макака (группа 1) в зависимости от времени после однократной внутривенной инъекции 20 мг/кг гуманизированного антитела M1D.
На фиг.12B представлена кривая для концентрации в крови гуманизированного антитела M3D в сыворотке каждого яванского макака (группа 2) в зависимости от времени после однократной внутривенной инъекции 20 мг/кг гуманизированного антитела M3D.
Экспериментальные данные для гуманизированных антител M1D, M3D обрабатывали с использованием фармакокинетического программного обеспечения WinNonlinTM Version 6.2.1 (Pharsight, Mountain View, CA) с входной моделью в/в болюса.
last
1/2
dss
0–last
0–inf
0–last
0–inf
Логарифмический линейный трапецевидный способ использовали для вычисления следующих параметров: начальная сывороточная концентрация лекарственного средства (C0), последний момент времени поддающегося обнаружению определения (T), время полувыведения (T), кажущийся объем распределения (V), общий клиренс (CL), среднее время нахождения (MRT) от нулевого момента времени до последнего момента времени, когда концентрацию можно было определить, среднее время нахождения (MRT) от нулевого момента времени до бесконечности, площадь под кривой концентрация в сыворотке–время (AUC) от нулевого момента времени до последнего момента времени, когда концентрацию можно было определить, и площадь под кривой концентрация в сыворотке–время (AUC) от нулевого момента времени до бесконечности.
1/2
0–inf
Результаты показали, что CL самца яванского макака для гуманизированного антитела M1D составлял 0,00962±0,00335 мл/мин/кг после однократной внутривенной инъекции 20 мг/кг гуманизированного антитела M1D. Среднее время полувыведения (t) гуманизированного антитела M1D составляло 81,3±78,7 часов. Величины Vdss и AUC для гуманизированного антитела M1D в сыворотке яванского макака составляли 0,05±0,0209 л/кг и 38053±14915 мкг·ч/мл, соответственно.
1/2
0–inf
После однократной внутривенной инъекции 20 мг/кг гуманизированного антитела M3D, CL самца яванского макака для гуманизированного антитела M3D составил 0,0049±0,0025 мл/мин/кг. Среднее время полувыведения (t) гуманизированного антитела M3D составило 134±94,6 часов. Величины Vdss и AUC гуманизированного антитела M3D в сыворотке яванского макака составляли 0,0497±0,0143 л/кг и 79419±33500 мкг·ч/мл, соответственно.
Приведенные выше экспериментальные результаты также обобщенно представлены в таблицах 25 и 26.
Таблица 25: Основные фармакокинетические параметры гуманизированного антитела M1D в сыворотке самцов яванских макаков группы 1
параметр PK
C1001
C1002
C1003
Среднее значение, в/в
SD
CV (%)
Rsq_adj
0,800
0,830
0,581
––
±
––
––
№ точек, использованных для T<sub>1/2</sub>
17,0
17,0
14,0
ND
±
––
––
C0 (нг/мл)
593886
520570
359594
491350
±
119848
24,4
T<sub>1/2</sub> (ч)
172
32,8
39,0
81,3
±
78,7
96,8
Vdss (л/кг)
0,0583
0,0406
0,0472
0,0487
±
0,00894
18,3
Cl (мл/мин/кг)
0,00670
0,0128
0,00969
0,00971
±
0,00303
31,2
T<sub>last</sub> (ч)
672
672
672
672
±
––
––
AUC<sub>0–last</sub> (нг.ч/мл)
49777730
26142490
33521840
36480687
±
12092238
33,1
AUC<sub>0–inf</sub> (нг.ч/мл)
49781190
26142960
34385180
36769777
±
11998175
32,6
MRT<sub>0–last</sub> (ч)
145
53,1
64,0
87,4
±
50,3
57,5
MRT<sub>0–inf</sub> (ч)
145
53,1
81,2
93,2
±
47,2
50,6
AUCExtra (%)
0,00695
0,00181
2,51
0,840
±
1,45
172
AUMCExtra (%)
0,0369
0,0245
23,2
7,74
±
13,3
173
Таблица 26: Основные фармакокинетические параметры гуманизированного антитела M3D в сыворотке самцов яванских макаков группы 2
PK параметр
C2001
C2002
C2003
Среднее значение, п/о
SD
CV (%)
Rsq_adj
0,949
0,889
0,881
––
±
––
––
№ точек, использованных для T<sub>1/2</sub>
16,0
16,0
11,0
ND
±
––
––
C0 (нг/мл)
740468
562963
674855
659429
±
89752
13,6
T<sub>1/2</sub> (ч)
119
47,2
235
134
±
94,6
70,7
Vdss (л/кг)
0,0428
0,0401
0,0660
0,0497
±
0,0143
28,7
Cl (мл/мин/кг)
0,00381
0,00782
0,00308
0,00490
±
0,00255
52,0
T<sub>last</sub> (ч)
672
672
672
672
±
––
––
AUC<sub>0–last</sub> (нг.ч/мл)
86427070
42620190
89311120
72786127
±
26164236
35,9
AUC<sub>0–inf</sub> (нг.ч/мл)
87449170
42633960
108174500
79419210
±
33500012
42,2
MRT<sub>0–last</sub> (ч)
179
85,3
219
161
±
68,8
42,7
MRT<sub>0–inf </sub>(ч)
187
85,5
357
210
±
137
65,4
AUCExtra (%)
1,17
0,0323
17,4
6,21
±
9,74
157
AUMCExtra (%)
5,27
0,280
49,3
18,3
±
27,0
148
Кроме того, проводили стандартный химический анализ сыворотки яванских макаков. Различные индикаторы в сыворотке яванских макаков (включая уровни билирубина, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, общего белка, альбумин, щелочная фосфатаза, г–глутамилтрансфераза, глюкоза, мочевина, креатинин, ионы кальция, фосфор, общий холестерин, триглицериды, ионы натрия, ионы калия, хлоридный ион и глобулин) продемонстрировали отсутствие явной аномалии. Эти результаты эксперимента показали, что однократная внутривенная инъекция гуманизированного антитела M1D или M3D является безопасной в определенных условиях дозирования. Таким образом, гуманизированное антитело M1D или M3D по изобретению можно вводить индивидууму (например, человеку) для предупреждения и/или лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV (например, гепатита B).
Пример 12: Оценка медицинских свойств M1D и M3D
1. Определение изоэлектрических точек гуманизированных антител M1D и M3D
Изоэлектрические точки гуманизированных антител M1D и M3D определяли посредством капиллярного электрофореза с изоэлектрическим фокусированием (cIEF). Результаты эксперимента представлены в таблице 27. Результаты показали, что гуманизированное антитело M1D имело величину pI 8,8 и M3D имело pI 9,0.
Таблица 27: Изоэлектрические точки M1D, M3D
Изоэлектрическая точка (pI)
Площадь пика
Антитело
Главный пик
Основный пик (%)
Главный пик (%)
Кислотный пик (%)
M1D
8,8
3,8
64,7
31,5
M3D
9,0
12,1
58,7
29,2
2. Определение стабильности гуманизированных антител M1D и M3D
Величину Tm обычно используют для описания стабильности молекулы антитела. Чем более высокой является величина Tm, тем лучшей является термическая стабильность молекулы антитела. Гуманизированные антитела M1D и M3D по отдельности растворяли в трех буферах, разбавляли до 1 мг/мл, и тестировали посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Первоначальную температуру сканирования устанавливали на 10°C, конечную температуру сканирования устанавливали на 110°C, конечная скорость сканирования составляла 200°C/ч, скорость охлаждения была установлена на Exp, конечная температура, поддерживаемая устройством, была установлена на 25°C, частота получения данных была установлена на 10 с, температура капилляров перед инъекций была установлена на 30°C. Результаты экспериментов представлены на фиг.13A–13B и в таблицах 28–29. Результаты показали, что Tm начала для гуманизированного антитела M1D составляла выше 61,7°C, и все величины Tm начала для M3D превышали 61,6°C, что указывали на то, что M1D и M3D имели хорошую термическую стабильность.
Таблица 28: Величины Tm для M1D
Буфер
Tm начала (°С)
Tm1 (°С)
Tm2 (°С)
Ацетат, pH 5,0
61,7
68,9
95,6
Гистидин, pH 6,0
63,8
71,0
96,1
PBS 7,2
65,6
72,9
92,4
Таблица 29: Величины Tm для M3D
Буфер
Tm начала (°С)
Tm1 (°С)
Tm2 (°С)
Ацетат 5,0
61,6
68,8
82,2
Гистидин 6,0
62,8
71,1
82,3
PBS 7,2
65,7
78,5
/
Кроме того, гуманизированные антитела M1D и M3D растворяли в гистидиновом буфере при pH 6,0 в концентрации 60 мг/мл, затем растворяли в фосфатном буфере при pH 7,2 в концентрации 2 мг/мл, а затем хранили при 40°C, соответственно. Мониторинг физических и химических свойств (включая внешний вид, pH, концентрацию белка, и т.д.) образцов проводили на 0 неделе (T0), 1 неделе (T1W) и 2 неделе (T2W). Результаты представлены в таблицах 30 и 31.
Таблица 30: Результаты испытания стабильности M1D
Буфер
Время
Внешний вид
pH
Концентрация (мг/мл)
SEC–ВЭЖХ
cIEF
%Главного пика
%HMW
%LMW
%Главного пика
%Кислотных пиков
%Основных пиков
Гистидиновый буфер, pH 6,0
T0
Желтоватый, прозрачный, без видимых частиц
6,1
60,7
96,0
3,4
0,6
57,8
38,2
4,0
1W
6,2
60,0
94,5
4,0
1,5
55,1
39,2
5,6
2W
6,1
60,5
94,2
4,0
1,9
51,8
43,1
5,1
Фосфатный буфер, pH 7,2
T0
7,1
2,0
98,2
1,2
0,6
59,1
36,7
4,2
1W
7,1
2,1
95,2
3,2
1,6
43,1
52,9
4,1
2W
7,2
2,1
94,2
3,4
2,3
34,2
61,0
4,8
Таблица 31: Результаты испытания стабильности M3D
Буфер
Внешний вид
pH
Концентрация (мг/мл)
SEC–ВЭЖХ
CIEF
%HMW
%главного пика
%LMW
%кислотных пиков
%главного пика
%основных пиков
Гистидиновый буфер, pH 6,0
T0
Желтоватый, прозрачный, без видимых частиц
6,0
59,0
0,1
99,9
/
30,7
58,0
11,4
40–1W
6,0
59,2
0,2
99,6
0,2
36,2
52,7
11,2
40–2W
5,9
58,7
0,3
99,3
0,4
44,5
45,3
10,2
Фосфатный буфер, pH 7,2
T0
7,2
1,9
0,2
99,6
0,2
29,2
58,7
12,1
40–1W
7,2
1,9
0,1
99,6
0,3
52,1
39,0
8,9
40–2W
7,2
1,9
0,2
99,3
0,5
66,8
28,1
5,1
Мониторинг внешнего вида
Флаконы с образцом мыли и использовали детектор прозрачности (черный фон и белый фон) для наблюдения цвета и прозрачности образцов. Результаты, приведенные в таблицах 30–31 выше, продемонстрировали отсутствие значимых изменений двух буферов и образцов гуманизированных антител M1D и M3D в условиях хранения при 40°C.
Мониторинг pH и концентрации белка
Определяли поглощение образца при A280 и вычисляли концентрацию белка в образце с использованием закона Бэра–Ламберта. Кроме того, определяли pH образца с использованием pH–метра, измерение повторяли два раза и в качестве конечного результата брали среднюю величину. Результаты эксперимента представлены в таблицах 30–31 выше. Результаты показали, что гуманизированные антитела M1D и M3D не изменялись существенно с точки зрения pH и концентрации белка после хранения в течение 2 недель при 40°C в различных буферах.
Испытание с использованием SEC–ВЭЖХ
Образцы гуманизированных антител M1D и M3D, подвергнутые различным условиям хранения, анализировали посредством SEC–ВЭЖХ с использованием колонки с гелем Agilent 1260 infinity, TSK G3000SWXL (5 мкм, 7,8 ммЧ300 мм), в которой подвижная фаза представляла собой 50 мМ PB+300 мМ NaCl, pH 7,0 ± 0,2; скорость потока составляла 1,0 мл/мин; длина волны детекции составляла 280 нм; концентрация образца составляла 10 мг/мл, объем инъекции составлял 10 мкл. Результаты эксперимента представлены в таблицах 30–31 выше. Результаты показали, что все главные пики образцов, содержащих гуманизированные антитела M1D и M3D, в различных условиях хранения (различные буферы, различное время хранения) составляли более 95%. Это указывает на то, что гуманизированные антитела M1D и M3D были стабильными.
Испытание cIEF
Образцы анализировали капиллярным электрофорезом. Результаты показали, что главный пик cIEF снижался на 6,0% после хранения молекулы M1D в гистидиновом буфере при 40°C в течение 2 недель, в то время как главным пик снижался на 24,9% после хранения в течение 2 недель в буфере PBS. Для M3D главный пик cIEF снижался на 13,7% после хранения в течение 2 недель при 40°C в гистидиновом буфере, в то время как главный пик снижался на 30,6% после хранения в течение 2 недель в буфере PBS.
3. Анализ растворимости гуманизированных вариантов антител M1D и M3D
Гуманизированные антитела M1D и M3D растворяли по отдельности в концентрации 60 мг/мл в 25 мМ растворах гистидина (pH 6,0), содержавших 5% сахарозу и 0,02% PS80, и концентрировали посредством ультрафильтрации с использованием центрифугирования (температура центрифугирования составляла 5°C и скорость составляла 4850 об/мин) до тех пор, пока уровень жидкости в растворах образцов более не падал значительно при увеличении времени центрифугирования. Образцы осторожно собирали с использование пипетки и определяли свойства образцов в эти моменты времени. Результаты показали, что образцы раствора были желтыми.
Затем 1000 мкл образца раствора пипетировали, переносили в 1,5–мл пробирку EP и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 минут. Результаты центрифугирования показали, что отсутствовало расслоение и преципитация в образце и жидкость была прозрачной. Верхний и нижний слои образца после центрифугирования осторожно пипетировали пипеткой, и определяли концентрацию белка с помощью УФ 280. Результаты показали, что растворимость M1D составляла 171 мг/мл; растворимость M3D составляла 170 мг/мл. Кроме того, определяли вязкость гуманизированных вариантов антител M1D и M3D, по отдельности растворенных в 25 мМ растворах гистидина (pH 6,0), содержавших 5% сахарозу и 0,02% PS80. В этих буферных системах вязкость гуманизированного антитела M1D в концентрации 171 мг/мл составляла 13,2 сПз (1 сПз=1 мПа.с), в то время как M3D имело вязкость 19,8 сПз в концентрации 170 мг/мл, и вязкость 11,5 сПз в концентрации 100 мг/мл.
Хотя конкретные варианты осуществления изобретения подробно описаны, специалистам в данной области будет понятно, что возможно множество модификаций и вариантов деталей с учетом общих идей изобретения, и эти варианты входят в объем настоящего изобретения. Полнота изобретения приведена в прилагаемых пунктах формулы изобретения и любых их эквивалентах.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:
<110>  XIAMEN UNIVERSITY
YANG SHENG TANG COMPANY, LTD.
<120>  АНТИТЕЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИИ ГЕПАТИТОМ B И СВЯЗАННЫХ С НЕЙ
ЗАБОЛЕВАНИЙ
<130>  IEC170022PRU
<150>  CN 201710223992.8
<151>  2017-04-07
<160>  220
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  122
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи M1-23
<400>  1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Ile Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
20                  25                  30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Arg Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Leu Arg Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  2
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариабельная область легкой цепи M1-23
<400>  2
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  3
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи M3-23
<400>  3
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
20                  25                  30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Arg Ile His Gly Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Ile Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser
<210>  4
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариабельная область легкой цепи M3-23/M3-13
<400>  4
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Ala Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Arg Gly Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210>  5
<211>  116
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи M3-13
<400>  5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Pro Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Asn Ser Ser Asn
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Arg Ile Tyr Gly Asn Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Thr Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Ser Val Tyr Thr Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Val Leu Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>  6
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR1 M1-23
<400>  6
Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn Phe
1               5
<210>  7
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR2 M1-23
<400>  7
Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr
1               5
<210>  8
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR3 M1-23
<400>  8
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe
1               5                   10                  15
<210>  9
<211>  6
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR1 M1-23
<400>  9
Gln Asp Ile Ser Ser Ser
1               5
<210>  10
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR2 M1-23
<400>  10
Tyr Ala Asn
1
<210>  11
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR3 M1-23
<400>  11
Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>  12
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR1 M3-23
<400>  12
Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro Tyr Asp Trp
1               5                   10
<210>  13
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR2 M3-23
<400>  13
Ile His Gly Asn Gly Gly Ser Thr
1               5
<210>  14
<211>  5
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR3 M3-23
<400>  14
Val Arg Asp Glu Thr
1               5
<210>  15
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR1 M3-23/M3-13
<400>  15
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1               5                   10
<210>  16
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR2 M3-23/M3-13
<400>  16
Trp Ala Ser
1
<210>  17
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LCDR3 M3-23/M3-13
<400>  17
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>  18
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR1 M3-13
<400>  18
Gly Ala Ser Asn Ser Ser Asn Tyr
1               5
<210>  19
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR2 M3-13
<400>  19
Ile Tyr Gly Asn Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  20
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HCDR3 M3-13
<400>  20
Ala Arg Gly Ser Val Tyr Thr Tyr Ser
1               5
<210>  21
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1 M1-23
<400>  21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Ile Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser
20                  25
<210>  22
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR2 M1-23/M1D
<400>  22
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  23
<211>  38
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR3 M1-23
<400>  23
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210>  24
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR4 M1-23
<400>  24
Trp Gly Gln Gly Leu Arg Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  25
<211>  26
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR1 M1-23
<400>  25
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr
20                  25
<210>  26
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR2 M1-23
<400>  26
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  27
<211>  36
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR3 M1-23
<400>  27
Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Thr
20                  25                  30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210>  28
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR4 M1-23/M1D
<400>  28
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  29
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1 M3-23
<400>  29
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser
20                  25
<210>  30
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR2 M3-23
<400>  30
Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg
1               5                   10                  15
<210>  31
<211>  38
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR3 M3-23
<400>  31
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Ile Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210>  32
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR4 M3-23/M3-13
<400>  32
Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  33
<211>  26
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR1 M3-23
<400>  33
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
20                  25
<210>  34
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR2 M3-23
<400>  34
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  35
<211>  36
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR3 M3-23
<400>  35
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Gly Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
20                  25                  30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210>  36
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR4 M3-23/M3D
<400>  36
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1               5                   10
<210>  37
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1 M3-13
<400>  37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Pro Leu Thr Cys Ala Val Ser
20                  25
<210>  38
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR2 M3-13
<400>  38
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1               5                   10                  15
Arg
<210>  39
<211>  38
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR3 M3-13
<400>  39
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Thr Asp Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210>  40
<211>  97
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  IGHV4-4*08
<400>  40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg
<210>  41
<211>  95
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  IGKV1-39*01
<400>  41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85                  90                  95
<210>  42
<211>  98
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  IGHV4-4*02
<400>  42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg
<210>  43
<211>  101
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  IGKV4-1*01
<400>  43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro
100
<210>  44
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1 M1D
<400>  44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20                  25
<210>  45
<211>  38
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR3 M1D
<400>  45
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210>  46
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR4 M1D
<400>  46
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  47
<211>  26
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR1 M1D
<400>  47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr
20                  25
<210>  48
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR2 M1D
<400>  48
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  49
<211>  36
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR3 M1D
<400>  49
Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20                  25                  30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210>  50
<211>  25
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR1 M3D
<400>  50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser
20                  25
<210>  51
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR2 M3D
<400>  51
Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg
1               5                   10                  15
<210>  52
<211>  38
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR3 M3D
<400>  52
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys
1               5                   10                  15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20                  25                  30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210>  53
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HFR4 M3D
<400>  53
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210>  54
<211>  26
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR1 M3D
<400>  54
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
20                  25
<210>  55
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR2 M3D
<400>  55
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Phe
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  56
<211>  36
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  LFR3 M3D
<400>  56
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
20                  25                  30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210>  57
<211>  122
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи M1D
<400>  57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
20                  25                  30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  58
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи M1D
<400>  58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  59
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи M3D
<400>  59
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
20                  25                  30
Tyr Asp Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Arg Ile His Gly Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser
<210>  60
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи M3D
<400>  60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210>  61
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  61
ggacagcckg gaaggtgtgc                                                   20
<210>  62
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  62
gaggcagttc cagatttcaa                                                   20
<210>  63
<211>  23
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  63
ccgcgtactt gttgttgctc tgt                                               23
<210>  64
<211>  56
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  64
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcag gcccag           56
<210>  65
<211>  56
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  65
caggagtcag gcccaggact ggtgaagcct tcggagaccc tgtccctcac ctgcac           56
<210>  66
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  66
aagccttcgg agaccctgtc cctcacctgc actgtctctg gtggctccat c                51
<210>  67
<211>  56
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  67
gttcttggac gtgtctacgg atatggtgac tcgactcttg agggaggggt tgtagt           56
<210>  68
<211>  44
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  68
tccgtagaca cgtccaagaa ccagttctcc ctgaaactga gctc                        44
<210>  69
<211>  59
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  69
gatgggccct tggtcgacgc tgaagagacg gtgacggtgg tcccttggcc ccagaaatc        59
<210>  70
<211>  55
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  70
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catacagatg acgcagtctc catcc            55
<210>  71
<211>  44
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  71
cagcaaaaac cggggaaagc ccctaagctc ctgatctatt atgc                        44
<210>  72
<211>  52
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  72
gaaccttgat gggaccccac tttgcaaacg atttgcataa tagatcagga gc               52
<210>  73
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  73
ctgtcccaga tccactgcca ctgaaccttg atgggacccc                             40
<210>  74
<211>  54
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  74
gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaacct gagg             54
<210>  75
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  75
gcagcctgca acctgaggat tttgcaactt attactgtca ac                          42
<210>  76
<211>  38
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  76
gaccaaggtg gaaatcaaac gtacggtggc tgcaccat                               38
<210>  77
<211>  69
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  77
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcgg gcccaggact       60
ggtgaagcc                                                               69
<210>  78
<211>  58
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  78
attcccgggt agatgcccag taaaagagca gcttaggagg ctgtcctggt ttctgctg         58
<210>  79
<211>  57
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  79
ggtgtctcca tcagcagtcc ttatgactgg acctgggtcc gccagccccc agggaag          57
<210>  80
<211>  57
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  80
aactggttct tggacttgtc tactgaaatg gtgactcgac tcttgaggga ggggttg          57
<210>  81
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  81
agacaagtcc aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct gtgaccgccg c                51
<210>  82
<211>  59
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  82
gaaacctggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatc        59
<210>  83
<211>  58
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  83
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catcgtgatg acccagtctc cagactcc         58
<210>  84
<211>  64
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  84
cccagtctcc agactccctg gctgtgtctc tgggagagag ggccaccatc aactgcaagt       60
ccag                                                                    64
<210>  85
<211>  58
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  85
cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcttttact gggcatctac ccgggaat         58
<210>  86
<211>  66
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  86
gtgaaatctg tcccagatcc actgccactg aatcggtcag ggaccccgga ttcccgggta       60
gatgcc                                                                  66
<210>  87
<211>  58
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  87
ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gcctgcaggc tgaagatg         58
<210>  88
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  88
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtcc                              39
<210>  89
<211>  52
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  89
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcag gc               52
<210>  90
<211>  35
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  90
gatgggccct tggtcgacgc tgaagagacg gtgac                                  35
<210>  91
<211>  48
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  91
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catacagatg acgcagtc                    48
<210>  92
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  92
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtccc                             40
<210>  93
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  93
gtagtaacta ctgatggagc caccagagac agtgcaggtg ag                          42
<210>  94
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  94
ggtggctcca tcagtagtta ctactggagc tggatccgcc ag                          42
<210>  95
<211>  48
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  95
atagtaacta ccactgctga cggagccacc agagacagtg caggtgag                    48
<210>  96
<211>  48
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  96
ggtggctccg tcagcagtgg tagttactat tggagctgga tccgccag                    48
<210>  97
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  97
ggtgctccca ctggtataga tatacccaat ccactccag                              39
<210>  98
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  98
atctatacca gtgggagcac cgactacaac ccctccctc                              39
<210>  99
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  99
tgtgtaacta ctactactac taatataccc aatccactcc ag                          42
<210>  100
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  100
attagtagta gtagtagtta cacagactac aacccctccc tc                          42
<210>  101
<211>  41
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  101
gtagctgctg ctaacactct gagttgcccg gcaagtgatg g                           41
<210>  102
<211>  37
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  102
cagagtgtta gcagcagcta cttaaattgg tatcagc                                37
<210>  103
<211>  44
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  103
agtattactt ccgatgttgg agctagttgc ccggcaagtg atgg                        44
<210>  104
<211>  40
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  104
agctccaaca tcggaagtaa tactttaaat tggtatcagc                             40
<210>  105
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  105
gaccccactt tgcaaacggg atgcagcata gatcaggagc ttagg                       45
<210>  106
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  106
cctaagctcc tgatctatgc tgcatcccgt ttgcaaagtg gggtc                       45
<210>  107
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  107
gaccccactt tgcaaacgag acgccttata gatcaggagc ttagg                       45
<210>  108
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  108
cctaagctcc tgatctataa ggcgtctcgt ttgcaaagtg gggtc                       45
<210>  109
<211>  48
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  109
agtgagaggg taattgtaat cttgtagaca gtaataagtt gcaaaatc                    48
<210>  110
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  110
ctacaagatt acaattaccc tctcactttc ggcggaggga ccaag                       45
<210>  111
<211>  48
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  111
agtgagaggt aaactactac tctgatgaca gtaataagtt gcaaaatc                    48
<210>  112
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  112
catcagagta gtagtttacc tctcactttc ggcggaggga ccaag                       45
<210>  113
<211>  49
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  113
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcg                   49
<210>  114
<211>  38
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  114
gatgggccct tggtcgacgc tgaggagacg gtgaccag                               38
<210>  115
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  115
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catcgtgatg acccagtctc                  50
<210>  116
<211>  38
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  116
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtc                               38
<210>  117
<211>  54
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  117
ggagtaacca ccactgctga tggagccacc agagacagcg caggtgaggg acag             54
<210>  118
<211>  48
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  118
ggtggctcca tcagcagtgg tggttactcc acctgggtcc gccagccc                    48
<210>  119
<211>  51
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  119
ccagttacta ctgctgatgg agccaccaga gacagcgcag gtgagggaca g                51
<210>  120
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  120
ggtggctcca tcagcagtag taactggacc tgggtccgcc agccc                       45
<210>  121
<211>  39
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  121
ggtgctccca ctatgataga ttcgtccaat ccactccag                              39
<210>  122
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  122
atctatcata gtgggagcac cagctacaac ccctccctca ag                          42
<210>  123
<211>  42
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  123
tgtgctacca ccactaccac taattcgtcc aatccactcc ag                          42
<210>  124
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  124
attagtggta gtggtggtag cacaagctac aacccctccc tcaag                       45
<210>  125
<211>  57
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  125
ataggtcttt ccatcactat gcaggaggct ctggctggac ttgcagttga tggtggc          57
<210>  126
<211>  55
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  126
cagagcctcc tgcatagtga tggaaagacc tatttagcct ggtaccagca gaaac            55
<210>  127
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  127
gtagctgctg ctaacactct ggctggactt gcagttgatg gtggc                       45
<210>  128
<211>  43
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  128
cagagtgtta gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aac                         43
<210>  129
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  129
gggaccccgg attcccgggt agaacccaag taaaagagca gcttaggagg                  50
<210>  130
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  130
cctcctaagc tgctctttta cttgggttct acccgggaat ccggggtccc                  50
<210>  131
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  131
gggaccccgg attcccgggt ggatgcaccg taaaagagca gcttaggagg                  50
<210>  132
<211>  50
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  132
cctcctaagc tgctctttta cggtgcatcc acccgggaat ccggggtccc                  50
<210>  133
<211>  48
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  133
cgtccaagga gtactataat attgctgaca gtaatacact gccacatc                    48
<210>  134
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  134
cagcaatatt atagtactcc ttggacgttc ggccaaggga ccaag                       45
<210>  135
<211>  48
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  135
cgtccaagga gtttgtagag cttgcataca gtaatacact gccacatc                    48
<210>  136
<211>  45
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  136
atgcaagctc tacaaactcc ttggacgttc ggccaaggga ccaag                       45
<210>  137
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   CDR-A (IGHV4-4*08) для HCDR-1 M1D
<400>  137
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1               5
<210>  138
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   CDR-B (IGHV4-61*01) для HCDR-1 M1D
<400>  138
Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr
1               5                   10
<210>  139
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-A (IGKV1-39*01) для LCDR-2 M1D
<400>  139
Ala Ala Ser
1
<210>  140
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-B (IGKV1-5*03) для LCDR-2 M1D
<400>  140
Lys Ala Ser
1
<210>  141
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   CDR-A (IGHV4-4*02) для HCDR-2 M3D
<400>  141
Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  142
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>   CDR-B (IGHV3-23*02) для HCDR-2 M3D
<400>  142
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1               5
<210>  143
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-A (IGKV2-28*01) для LCDR-2 M3D
<400>  143
Leu Gly Ser
1
<210>  144
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-B (IGKV3-15*01) для LCDR-2 M3D
<400>  144
Gly Ala Ser
1
<210>  145
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-A (IGHV4-4*08) для HCDR-2 M1D
<400>  145
Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr
1               5
<210>  146
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-B (IGHV3-11*03) для HCDR-2 M1D
<400>  146
Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr
1               5
<210>  147
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-A (IGKV3D-7*01) для LCDR-1 M1D
<400>  147
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210>  148
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-B (IGLV1-44*01) для LCDR-1 M1D
<400>  148
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr
1               5
<210>  149
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-A (IGKV1-6*01) для LCDR-3 M1D
<400>  149
Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210>  150
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-A (IGKV6-21*02) для LCDR-3 M1D
<400>  150
His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr
1               5
<210>  151
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-A (IGHV4-30-4*07) для HCDR-1 M3D
<400>  151
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Ser
1               5                   10
<210>  152
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-B (IGHV4-4*01) для HCDR-1 M3D
<400>  152
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp
1               5
<210>  153
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-A (IGKV2-29*02) для LCDR-1 M3D
<400>  153
Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1               5                   10
<210>  154
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-B (IGKV3D-7*01) для LCDR-1 M3D
<400>  154
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1               5
<210>  155
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-A (IGKV4-1*01) для LCDR-3 M3D
<400>  155
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1               5
<210>  156
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  CDR-B (IGKV2-28*01) для LCDR-3 M3D
<400>  156
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr
1               5
<210>  157
<211>  122
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи M1D (HCDR1-A)
<400>  157
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  158
<211>  124
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи M1D (HCDR1-B)
<400>  158
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65                  70                  75                  80
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp
100                 105                 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  159
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи M1D (LCDR2-A)
<400>  159
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  160
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи M1D  (LCDR2-B)
<400>  160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  161
<211>  122
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи M1D (HCDR2-B)
<400>  161
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
20                  25                  30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  162
<211>  109
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи M1D  (LCDR1-B)
<400>  162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser
20                  25                  30
Asn Thr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu
85                  90                  95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  163
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи M3D (HCDR2-A)
<400>  163
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
20                  25                  30
Tyr Asp Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65                  70                  75                  80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100                 105                 110
<210>  164
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область тяжелой цепи M3D (HCDR2-B)
<400>  164
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
20                  25                  30
Tyr Asp Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35                  40                  45
Ile Gly Arg Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser
50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100                 105                 110
Ser
<210>  165
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи M3D  (LCDR2-A)
<400>  165
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210>  166
<211>  113
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи M3D  (LCDR2-B)
<400>  166
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85                  90                  95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210>  167
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  вариабельная область легкой цепи M3D  (LCDR1-A)
<400>  167
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His
85                  90                  95
Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  168
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  HBsAg-а.к. 113-135 (SEQ13-B)
<400>  168
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  169
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-S117A
<400>  169
Ser Ser Thr Thr Ala Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  170
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-T118A
<400>  170
Ser Ser Thr Thr Ser Ala Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  171
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-G119A
<400>  171
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Ala Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  172
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-P120A
<400>  172
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Ala Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  173
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-C121S
<400>  173
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Ser Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  174
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-K122A
<400>  174
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Ala Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  175
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-T123A
<400>  175
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  176
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-C124S
<400>  176
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Ser Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  177
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-T125A
<400>  177
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Ala Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  178
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-T126A
<400>  178
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ala Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  179
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-P127A
<400>  179
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Ala Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  180
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-Q129A
<400>  180
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Ala Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  181
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-T131A
<400>  181
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Ala Ser Met Phe Pro
20
<210>  182
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  S13-S132A
<400>  182
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ala Met Phe Pro
20
<210>  183
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  183
atcaactacc gccacgggac catgcaagac ctgcac                                 36
<210>  184
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  184
ggtcccgtgg cggtagttga tgttcctgga agtaga                                 36
<210>  185
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  185
aactaccagc gcgggaccat gcaagacctg cacgat                                 36
<210>  186
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  186
catggtcccg cgctggtagt tgatgttcct ggaagt                                 36
<210>  187
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  187
accagcacgg caccatgcaa gacctgcacg attcct                                 36
<210>  188
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  188
cttgcatggt gccgtgctgg tagttgatgt tcctgg                                 36
<210>  189
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  189
cagcacggga gcatgcaaga cctgcacgat tcctgc                                 36
<210>  190
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  190
gtcttgcatg ctcccgtgct ggtagttgat gttcct                                 36
<210>  191
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  191
acgggaccat ccaagacctg cacgattcct gctcaa                                 36
<210>  192
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  192
gcaggtcttg gatggtcccg tgctggtagt tgatgt                                 36
<210>  193
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  193
gggaccatgc cggacctgca cgattcctgc tcaagg                                 36
<210>  194
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  194
gtgcaggtcc ggcatggtcc cgtgctggta gttgat                                 36
<210>  195
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  195
gggaccatgc gcgacctgca cgattcctgc tcaagg                                 36
<210>  196
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  196
gtgcaggtcg cgcatggtcc cgtgctggta gttgat                                 36
<210>  197
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  197
accatgcaag gcctgcacga ttcctgctca aggaac                                 36
<210>  198
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  198
atcgtgcagg ccttgcatgg tcccgtgctg gtagtt                                 36
<210>  199
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  199
tgcaagacct ccacgattcc tgctcaagga acctct                                 36
<210>  200
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  200
aggaatcgtg gaggtcttgc atggtcccgt gctggt                                 36
<210>  201
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  201
caagacctgc gcgattcctg ctcaaggaac ctctat                                 36
<210>  202
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  202
gcaggaatcg cgcaggtctt gcatggtccc gtgctg                                 36
<210>  203
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  203
gacctgcacg gctcctgctc aaggaacctc tatgtt                                 36
<210>  204
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  204
tgagcaggag ccgtgcaggt cttgcatggt cccgtg                                 36
<210>  205
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  205
ctgcacgatt gctgctcaag gaacctctat gtttcc                                 36
<210>  206
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  206
ccttgagcag caatcgtgca ggtcttgcat ggtccc                                 36
<210>  207
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  207
gattcctgct gcaggaacct ctatgtttcc ctcttg                                 36
<210>  208
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  208
gaggttcctg cagcaggaat cgtgcaggtc ttgcat                                 36
<210>  209
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  209
tgctcaagga gcctctatgt ttccctcttg ttgctg                                 36
<210>  210
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  210
aacatagagg ctccttgagc aggaatcgtg caggtc                                 36
<210>  211
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  211
tcaaggaacc gctatgtttc cctcttgttg ctgtac                                 36
<210>  212
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  праймер
<400>  212
ggaaacatag cggttccttg agcaggaatc gtgcag                                 36
<210>  213
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  SEQ13-A
<400>  213
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro
20
<210>  214
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  SEQ13-C
<400>  214
Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  215
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  SEQ13-D
<400>  215
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro
20
<210>  216
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  SEQ13-E
<400>  216
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  217
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  SEQ13-F/H
<400>  217
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  218
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  SEQ13F1
<400>  218
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ala Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210>  219
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  SEQ13F2
<400>  219
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Leu Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Thr Ser Met Leu Pro
20
<210>  220
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  SEQ13-G
<400>  220
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1               5                   10                  15
Gln Gly Asn Ser Met Tyr Pro
20
<---