Получение ферментативного гидролизата изолята соевого белка

Формирование современной индустрии здорового питания предполагает развитие производства диетических (лечебных и профилактических) продуктов, отвечающих современным требованиям безопасности и эффективности и позволяющих не только удовлетворять физиологические потребности организма в пищевых веществах и энергии, но также улучшать здоровье человека, снижать риск возникновения и проявления алиментарнозависимых заболеваний. Заданные физиологические эффекты обеспечиваются включением в составы таких продуктов функциональных пищевых ингредиентов (ФПИ), что требует научного обоснования их выбора. Это предполагает разработку биотехнологических подходов к созданию ФПИ, представленных макро- и /или микрону-триентами, ответственными за клиническую эффективность создаваемой продукции.

Самостоятельный интерес представляет технология получения пептидных модулей на основе ферментативных гидролизатов пищевых белков, что связано с использованием продуктов с модифицированным аминокислотным составом. Продукты с модифицированным пептидным и аминокислотным составом предназначены для питания больных с различными метаболическими нарушениями, включая продукты для больных с нарушениями функций пищеварения, продукты энтерального зондового питания, гипоаллергенные продукты для детей, страдающих аллергическими реакциями или входящих в группу риска по развитию таких состояний, продукты для питания спортсменов [1, 2].

Перспективным объектом для получения пептидных модулей профилактического назначения является соевый белок, так как накоплен значительный опыт эффективного использования соевых белковых продуктов в лечебном питании. Потребление белка сои обеспечивает гиполипиде-мический эффект, способствуя профилактике атеросклероза и снижая риск развития сердечно-сосудистых заболеваний [3, 4]. Многочисленные эпидемиологические и клинические исследования свидетельствуют, что изоляты соевого белка (ИСБ) обладают выраженной способностью снижать уровень липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и повышать концентрацию липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Клиническими и экспериментальными исследованиями последнего времени доказана перспективность применения ферментативных гидролизатов изолятов

УДК 557.15.07

Получение ферментативного гидролизата изолята соевого

белка

С. Н. Зорин, канд. биол. наук; И.С. Воробьева, канд. биол. наук; В. М. Воробьева, канд. техн. наук; Е. А Нетунаева; Ю.С. Сидорова, канд. биол. наук; А. А. Кочеткова, д-р техн. наук, профессор; В.К. Мазо, д-р биол. наук, профессор Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва

соевого белка (ФГИСБ) для нормализации липидного обмена и благоприятного влияния на осложнения, связанные с метаболическим синдромом [5 - 7]. К сожалению, в нашей стране не налажен выпуск ферментативных гидролизатов изолятов соевых белков для использования в качестве функциональных пищевых ингредиентов в составе диетических продуктов для профилактического и /или лечебного питания.

В этой связи были проведены исследования по оценке различных ферментных препаратов и их пригодности для одностадийного получения в лабораторных условиях гидролизатов ИСБ.

Объектом исследования служил изолят белков сои марки Pro-Vo 500U производства КНР (ИБС-Pro), используемый в пищевой промышленности при производстве мясных, рыбных и молочных продуктов. Использовались ферментные препараты:

Панкреатин из панкреатической железы свиньи («SICHUAN BIOSYN PHARMACEUTICAL Co», КНР, активность 2,25 Eur. u/mg);

Флавоэнзим «Flavourzyme» - комплекс грибных протеаз/пептидаз, продуцируемых штаммом Asp. Oryzae, (Novozymez, Дания, активность 500 LAPu/g);

Нейтральная протеаза В 2256, продуцируемая штаммом Bac. Licheniformis (РФ, а кти в ность 57775ед/г, ГОСТ 20264.2- 88);

Щелочная протеаза «Протозим В» -комплексный ферментный препарат, получаемый путем направленной ферментации селекционного штамма Bac. Subtilis (ЕНЗИМ, Украина, активность 100000 ед / г, ГОСТ 20264.2 - 88).

Одностадийный ферментолиз (ИБС-Pro) проводили в лабораторных условиях при постоянном перемешивании растворов, инкубируя реакционную смесь при температуре 50 °С, для прекращения реакции инактивировали фермент нагреванием смеси до температуры 75 °С

в течение 15 мин. Растворы полученных ферментолизатов осветляли центрифугированием (центрифуга BECKMAN J-6B, США) и лиофильно высушивали (лиофильная установка ЛС 500, РФ). Соотношение ИБС-Pro/фермент составляло 20:1 (по сухой массе) для всех использованных препаратов. Значение рН реакционной среды поддерживали в нужном диапазоне, используя 5,0%-ный раствор KOH/NaOH 2 / 1.

Молекулярно-массовое распределение (ММР) пептидов в составе водорастворимой части полученных образов анализировали методом экс-клюзионной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке Супероза 12 (1,6*50 см) (Pharmacia, Швеция), предварительно откалибро-ванной по стандартным глобулярным водорастворимым белкам производства SERVA»; элюент - 0,2 М хлористый натрий, скорость элюирования 2,0 мл/мин, длина волны проточного УФ детектора UV-1 280 нм. Хрома-тограммы интегрировали весовым методом в диапазоне молекулярных масс от свободного до полного объема хроматографической колонки.

Проводили микрофильтрацию (установка тангенциальной фильтрации «МИНИТАН», Millipor, США, диаметр пор мембран 0,45 мкм) и нанофильтрацию (установка производства «ВЛАДИСАРТ», Владимир, РФ) образца, полученного путем пятичасового гидролиза ИБС-Pro панкреатином. Отбирали и анализировали фракционный состав высокомолекулярной фракции.

Содержание общего азота в образцах находили методом Къельдаля (с предварительной минерализацией) с применением автоматического анализатора Kjeltec 8100 (FOSS Analytical AB, Швеция) [8]. Осмо-ляльность гидролизата и его фракций определяли криоскопическим методом согласно ГОСТ Р 55578 - 2013 [9] на миллиосмометре - криоскопе термоэлектрическом «МТ-5-01» ( производства ОАО НПП «Буревестник»,

ПРАВИЛЬНОЕ ПИТАНИЕ - ОСНОВА ЗДОРОВЬЯ НАЦИИ

ТЕМА НОМЕРА

Молекулярно-массовое распределение пептидных фракций в составе образцов ФГИСБ Рт, отобранных в различные интервалы времени

№ фракции 4 MW, кД Флавоэнзим

3 ч 5 ч 3 ч 5 ч 3 ч 5 ч 3 ч 5 ч После нанофильтрации

1 >272 1,7 0,1 0,5 0,5 0,9 0,6 2,1 1,8 0

2 272 - 72,9 2,6 0,4 0,9 1,2 0,9 0,9 2,4 1,2 0

3 72,9 - 29,0 6,0 1,4 3,0 3,8 3,0 3,5 2,4 0,9 1,5

4 29,0 - 14,6 11,0 4,7 11,2 10,1 10,3 9,6 4,3 4,0 6,0

5 14,6 - 8,0 23,1 10,8 15,4 13,2 14,3 13,8 12,4 11,5 15,9

6 8,0 - 4,1 25,6 27,1 24,5 21,3 24,5 21,8 23,3 24,1 32,2

7 4,1 - 1,6 13,1 22,9 25,7 23,4 25,2 22,0 23,4 22,2 26,5

8 <1,6 16,9 32,7 18,8 26,5 20,9 27,9 29,8 34,3 17,8

Молекулярная масса, кД Молекулярная масса, кД

Рис. Эксклюзионные хроматограммы ФГИСБ-Рго до и после нанофильтрации: а - ФГИСБ-Рго, полученный при пятичасовом гидролизе панкреатином; б - нанофильтрат ФГИСБ-Рго

РФ). Органолептические показатели полученных гидролизатов (растворимость, вкус) оценивали по ГОСТ 31689 - 2012 [10].

В таблице приведены результаты количественного определения ММР белково-пептидных фракций в составе образцов ферментативных гидролизатов изолята соевого белка (ФГИСБ-Рго), отобранных в различные интервалы времени проведения гидролиза ИСБ-Рго Флавоэнзимом, Протозимом В, Протеазой В и Панкреатином.

При использовании нейтральной протеазы В и щелочной протеазы В (протозим В) были получены ги-дролизаты, практически не отличающиеся между собой по ММР пептидных фракций. Однако наиболее высокие (и достаточно близкие между собой) значения содержания корот-коцепочечных пептидов и свободных аминокислот (фракция № 8, моле-

кулярная масса менее 1,6 кД) были определены в продуктах пятичасового ферментолиза ИСБ-Рго флавоэнзимом и панкреатином. При фер-ментолизе в течение 5 ч потери белкового азота были наименьшими при использовании панкреатина и наибольшими - для флавоэнзима: суммарный выход общего азота относительно исходного ИБС составил (83,1±4,2) % и (56,9±2,8) %. Аналогичные значения для нейтральной протеазы В и протозима В составили (64,3±3,2) % и (77,8±3,9) % соответственно.

Образец, полученный путем пятичасового гидролиза ИСБ-Рго панкреатином, был подвергнут микрофильтрации и нанофильтрации (рисунок).

В нанофильтрате содержание низкомолекулярной фракции № 8 снизилось почти в 2 раза по сравнению с исходным ферментолизатом и соответственно улучшились органо-

лептические показатели: произошло некоторое снижение осмоляльности (27 ммоль/кг против 32 ммоль /кг) и горечи.

Таким образом, проведенный в лабораторных условиях одноэтапный пятичасовой протеолиз ИСБ-Pro ферментным препаратом панкреатином с последующей нанофильтрацион-ной обработкой позволил получить гидролизат с высоким содержанием средних пептидов и приемлемым вкусом. Результаты работы говорят о целесообразности получения пептидного модуля с целью его дальнейшего использования в качестве функционального пищевого ингредиента специализированных пищевых продуктов для лиц с различными метаболическими нарушениями.

ЛИТЕРАТУРА

1. Зорин, С.Н. Ферментативные гидро-лизаты пищевых белков и органические комплексы эссенциальных микроэлементов на их основе/С.Н. Зорин // Ферментативные гидролизаты пищевых белков и органические комплексы эссенци-альных микроэлементов на их основе. -2009. - Т. 78. - № 6. - С. 60 - 66.

2. Prasad Patil, Surajit Mandal, Sudhir Kumar Tomar, Santosh Anand. Food protein derived bioactive peptides in management of type 2 diabetes // Eur J Nutr, Eur J Nutr. 2015 Sep; 54 (6):863 - 80.

3. Соя и продукты ее переработки в питании здорового и больного человека/под ред. В.А. Тутельяна. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 192 с.

4. Тутельян В. А. Клинико-гигие-нические аспекты применения сои/ В. А. Тутельян, А. В. Погожева, В.Г. Высоцкий. - М.: Фонд «Новое тысячелетие», 2011. - 258 с.

5. M. Claessens, W. Calame, AD Siemensma, MA van Baak, WHM Saris The effect of different protein hydrolysate/carbohydrate mixtures on postprandial glucagon and insulin responses in healthy subjects // European Journal of Clinical Nutrition (2009) 63, 48 - 56.

6. Morifuji M, Ishizaka M, Baba S, Fukuda K, Matsumoto H, Koga J, Kanegae M, Higuchi M. Comparison of Different Sources and Degrees of Hydrolysis of Dietary Protein: Effect on Plasma Amino Acids, Dipeptides, and Insulin Responses in Human Subjects // J Agric Food Chem. 2010 Aug 11;58 (15):8788 - 97. doi: 10.1021/jf101912n.

7. Manuel T. Velasquez and Sam J. Bhathena Role of Dietary Soy Protein in Obesity International Journal of Medical Sciences. 2007 4 (2):72 - 82.

8. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов/ под ред. И. М. Скурихина,

B.А. Тутельяна. - М.: Медицина, 1998. -

C. 37 - 42, 183 - 185.

9. ГОСТР 55578 - 2013. Продукты пищевые специализированные. Метод определения осмоляльности. - М.: Стан-дартинформ, 2014. - 8 с.

10. ГОСТ 31689 - 2012 Казеинат. Технические условия. Межгосударственный

стандарт казеин. - М.: Стандартинформ, 2014.

REFERENCES

1. Zorin S.N. [Enzymatic hydrolysates of food proteins and organic complexes of essential trace elements based on them]. Voprosy pitaniya, 2009, vol. 78, no. 6, pp. 60 - 66.

2. Prasad Patil, Surajit Mandal, Sudhir Kumar Tomar, Santosh Anand. Food protein derived bioactive peptides in management of type 2 diabetes. Eur J Nutr., 2015, vol. 54, no. 6, pp. 863 - 880.

3. Tutel'yan V.A., ed. Soya i produkty ee pererabotki v pitanii zdorovogo i bol'nogo cheloveka [Soybean and products of its processing in the diet of a healthy and sick person]. Moscow, GEOTAR-Media Publ., 2006. 192 p.

4. Tutel'yan V. A., Pogozheva A. V., Vysotskii V. G. Kliniko-gigie-nicheskie aspekty primeneniya soi [Clinical and hygiene aspects of soybean application]. Moscow, Fond «Novoe tysyacheletie» Publ., 2011. 258 p.

5. Claessens M., Calame W., Siemensma A.D., Van Baak M.A. WHM Saris The effect of different protein hydrolysate/carbohydrate mixtures on postprandial glucagon and insulin responses in healthy subjects. European Journal of Clinical Nutrition, 2009, 63, pp. 48 - 56.

6. Morifuji M., Ishizaka M., Baba S., Fukuda K., Matsumoto H., Koga J., Kanegae M., Higuchi M. Comparison of Different Sources and Degrees of Hydrolysis of Dietary Protein: Effect on Plasma Amino Acids, Dipeptides, and Insulin Responses in Human Subjects. J Agric Food Chem.,

2010, vol. 58, no. 15, pp. 8788 - 8797. doi: 10.1021/jf101912n.

7. Manuel T. Velasquez and Sam J. Bhathena Role of Dietary Soy Protein in Obesity. International Journal of Medical Sciences, 2007, vol. 4, no. 2, pp.72 - 82.

8. Skurikhin I. M., Tutel'yan V.A. Rukovodstvo po metodam analiza kachestva i bezopasnosti pishchevykh produktov [Guide to methods for analyzing food quality and safety]. Moscow, Meditsina Publ., 1998.

9. GOST R 55578 - 2013. Food products specialized. Method for determining osmolality. Moscow, Standardinform, 2014. 8 p.

10. GOST 31689 - 2012 Caseinate. Technical conditions. Interstate standard is casein. Moscow, Standartinform, 2014.

Получение ферментативного гидролизата изолята соевого белка

Ключевые слова

здоровое питание; изолят белков; пептидный модуль; соя; специализированные продукты; ферментные препараты

Реферат

Перспективным объектом для получения пептидных модулей профилактического назначения является соевый белок. Потребление белка сои обеспечивает гиполипидемический эффект, нормализует липидный обмен и оказывает благоприятное влияние при осложнениях, связанных с метаболическим синдромом. В качестве объекта исследования был выбран изолят белков сои марки Рго^о 50011 (ИБС-Рго), широко используемый в пищевой промышленности. Для гидролиза использовали четыре ферментных препарата: Панкреатин, Флавоэнзим, Нейтральную протеазу и Щелочную протеазу «Протозим В». Проводили одностадийный ферментолиз в лабораторных условиях при постоянном перемешивании растворов, инкубируя реакционную смесь при температуре 50 °С, для прекращения реакции инактивировали фермент нагреванием смеси до температуры 75 °С в течение 15 мин. Соотношение ИБС-Рго/фермент составляло 20:1 (по сухой массе) для всех использованных препаратов. Образец, полученный путем пятичасового гидролиза ИСБ-Рго панкреатином был подвергнут микрофильтрации и нанофильтрации. В полученных препаратах методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления оценивали молекулярно-массовое распределение пептидных фракций. Криоскопическим методом определяли осмо-ляльность гидролизатов. Оценивали органолептические показатели полученных гидролизатов и их фракций. Содержание общего азота в образцах находили методом Къельдаля. Наиболее высокие значения содержания короткоцепочечных пептидов и свободных аминокислот были в продуктах пятичасового ферментолиза ИСБ-Рго флавоэнзимом и панкреатином. Потери белкового азота были наименьшими при использовании панкреатина и наибольшими -для флавоэнзима: суммарный выход общего азота относительно исходного ИБС составил (83,1+4,2) % и (56,9+2,8) % соответственно. Аналогичные значения для нейтральной протеазы В и про-тозима В составили (64,3+3,2) % и (77,8+3,9) % соответственно. В нанофильтрате содержание низкомолекулярной фракции (менее 1,6 кДа) снизилось почти в 2 раза по сравнению с исходным ферментолизатом и соответственно улучшились органолептиче-ские показатели: произошло некоторое снижение осмоляльности (27 ммоль/кг против 32 ммоль/кг) и горечи. Результаты работы говорят о целесообразности получения пептидного модуля с целью его дальнейшего использования в качестве функционального пищевого ингредиента специализированных пищевых продуктов для лиц с различными метаболическими нарушениями.

Авторы

Зорин Сергей Николаевич, канд. биол. наук, Воровьева Ирина Сергеевна, канд. биол. наук, Воробьева Валентина Матвеевна, канд. техн. наук, Нетунаева Екатерина Анатольевна, Сидорова Юлия Сергеевна, канд. биол. наук, Кочеткова Алла Алексеевна, д-р техн. наук, профессор, Мазо Владимир Кимович, д-р биол. наук, профессор Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, 109240, Москва, Устьинский проезд, д. 2/14, 7ог1п@1оп.гы; уогоЫоуа@1оп.гы; уогоЫоуа_ут@1оп.гы; ка1ете1@дтаН.сот; sidorovaulia28@mail.ru; кос11е1:коуа@юп.ги; т^о@юп.ги

The processing of enzymatic hydrolysate of soy protein isolate

Key words

Healthy eating; Protein isolate; Peptide module; Soybeans; Specialized products; Enzyme preparations

Abstracts

A promising target for the production of peptide modules for preventive use is soy protein. Soy protein consumption provides a hypolipidemic effect, normalizes lipid metabolism, and has a beneficial effect on complications associated with the metabolic syndrome. The protein isolate Pro-Vo 500U was taken as the object of research. It is widely used in the food industry. 4 enzyme preparations were used for hydrolysis: Pancreatin, Flavoenzyme, Neutral Protease and Alkaline protease «Protozim B». One-step fermentolysis was performed under laboratory conditions with constant mixing, the reaction mixture was incubated at 50°C The enzyme was inactivated by heating the mixture to a temperature of 75°C for 15 minutes. The ratio of protein isolate/enzyme was 20:1 (dry weight) for all used preparations. A sample obtained by 5 hours hydrolysis of soy protein isolate with pancreatin was subjected to microfiltration and nanofiltration. In obtained preparations the molecular weight distribution of peptide fractions was evaluated with exclusion HPLC. The osmolality of the hydrolyzates was determined with the cryoscopic method. Organoleptic characteristics of derived hydrolyzates and its fractions were evaluated. Total nitrogen content in samples was evaluated with the Kjeldahl method. The highest values of the content of short-chain peptides and free amino acids were determined in products of 5-hour fermentolysis by flavoenzyme and pancreatin. The loss of protein nitrogen was the lowest for pancreatin and the largest for flavoenzyme: the yield of total nitrogen relative to the initial protein was 83.1 ± 4.2% and 56.9 ± 2.8%, respectively. Similar values for neutral protease B and protozim B were (64.3 ± 3.2) % and (77.8 ± 3.9) %, respectively. In the hydrolysate subjected to nanofiltration, the content of the low-molecular weight fraction (less than 1.6 kDa) decreased almost 2-fold compared to the initial hydrolysate and, accordingly, the organoleptic parameters improved: there was a slight decrease in osmolality (27 mmol/kg vs. 32 mmol/kg) and in bitterness. The results of the work should serve as a justification for scaling the process of obtaining the peptide module, with a view to its further use as a functional food ingredient of specialized food products for people with various metabolic disorders.

Authors

Zorin Sergey^ Nikolaevich, Candidate of Biological Sciences, Vorobeva Irina Sergeevna, Candidate of Biological Sciences, Vorobeva Valentina Matveevna, Candidate of Technical Sciences, Netunaeva Ekaterina Anatolievna,

Sidorova Yulia Sergeevna, Candidate of Biological Sciences, Kochetkova Alla Alekseevna, Doctor of Technical Sciences, Professor, Mazo Vladimir Kimovich, Doctor of Biological Sciences, Professor Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, 109240, Russia, Moscow, Ustinskiy proezd, 2/14, zorin@ion.ru; vorobiova@ion.ru; vorobiova_vm@ion.ru; katemet@gmail.com; sidorovaulia28@mail.ru; kochetkova@ion.ru; mazo@ion.ru