СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СУППОЗИТОРИЕВ С НАНОЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА

С. Э. Ржеусский, В. В. Кугач

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СУППОЗИТОРИЕВ С НАНОЧАСТИЦАМИ СЕРЕБРА

Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет

В статье представлены результаты изучения специфической активности суппозиториев с наночастицами серебра.

В результате сравнения устойчивости антимикробной активности 5-ти опытных серий выбран стабилизатор, позволяющий ее сохранять без изменений в течение 24 месяцев.

Методом двукратных разведений исследованы 35 штаммов 9-ти родов грам-положительных и грамотрицательных микроорганизмов, дрожжеподобных грибов. Доказано, что разработанные суппозитории обладают широким спектром антимикробного действия, совпадающим со спектром действия фармацевтической субстанции повиаргол. Показано, что вспомогательные вещества суппозиториев не обладают антимикробным эффектом.

На модели плоскостной кожной раны с микробным обсеменением определено, что по ранозаживляющей эффективности суппозитории с наночастицами серебра превосходят существующий аналог, содержащий декспантенол.

Ключевые слова: суппозитории, наночастицы серебра, повиаргол, ранозажив-ление, антимикробный эффект.

ВВЕДЕНИЕ

По сравнению с другими металлами серебро оказывает наиболее сильный бактерицидный, противовирусный и фун-гицидный эффект. Оно обладает более широким спектром противомикробного действия, чем многие современные сульфаниламидные лекарственные средства и антибиотики, такие как пенициллин, биомицин [1]. Проникая в микробные клетки, ионы серебра угнетают процессы клеточного дыхания и репликацию ДНК микроорганизмов [2]. Для наночастиц серебра выявлен репаративный и противовоспалительный эффект, связанный с влиянием на хемотаксис и некоторые цитокины [3, 4].

С целью импортозамещения Витебским государственным медицинским университетом совместно с ООО «Рубикон» проводится работа по созданию нового лекарственного средства с наночастицами серебра в виде вагинальных суппозиториев (Арвагин) [5]. Важным вопросом при разработке нового лекарственного средства является обеспечение его специфической активности на протяжении всего срока годности.

Цель настоящей работы - изучение специфической активности суппозиториев с повиарголом.

Для решения поставленной цели не-

обходимо было решить следующие задачи:

- Изучить влияние стабилизаторов на биологическую активность суппозиториев с повиарголом.

- Изучить их антимикробную активность и спектр действия.

- Изучить ранозаживляющую активность суппозиториев с повиарголом.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. В качестве объектов исследования влияния природы стабилизатора на антимикробную активность суппозиториев с повиарголом в процессе хранения использовали 5 опытных серий суппозиториев с наночастицами серебра, приготовленных в лабораторных условиях по следующей технологии: на водяной бане при температуре 50-55°С расплавляли суппозиторную основу, охлаждали до температуры 40-42°С. К охлажденной суппозиторной основе прибавляли стабилизатор, повиаргол и перемешивали в течение 15 минут с помощью ручной мешалки. Готовую суппозиторную массу разливали в формы и охлаждали при температуре 8°С в течение 30 минут.

Серию №1 готовили без добавления стабилизатора. В остальных сериях в качестве стабилизатора использовали:

Серия №2 - глюкозу.

Серия №3 - желатин.

Серия №4 - поливинилпирролидон.

Серия №5 - лантана нитрат.

Биологическую активность суппозиториев изучали на опытно-промышленной серии суппозиториев с наночастицами серебра (Арвагин), произведенной в условиях ООО «Рубикон» по следующей технологии: на водяной бане при температуре 60-65°С расплавляли компоненты суппо-зиторной массы, охлаждали до температуры 40-42°С. К охлажденной суппозитор-ной массе добавляли стабилизатор лантана нитрат, повиаргол и перемешивали смесь в течение 15 минут при помощи диспергато-ра Ultra-turrax T50 при скорости вращения мешалки 6000 оборотов в минуту. Готовую суппозиторную массу разливали в одноразовые ячейки и запаивали их при помощи аппарата Dott Bonapace 8C. Охлаждение готовых суппозиториев проводили при температуре 15°С в течение 15 минут [5].

Изучение антимикробного действия. В исследовании применяли стандартные типовые штаммы микроорганизмов из коллекции АТСС, а также штаммы, выделенные у пациентов клиник Минска и Витебска: Staphylococcus aureus (n=5), Pseudomonas aeruginosa (n=5), Escherichia coli (n=5), Proteus mirabilis (n=3), Bacillus subtilis (n=3), Klebsiella pneumoniae (n=5), Streptococcus mutans (n=1), Enterococcus faecalis (n=3), Candida albicans (n=5).

При определении минимальной инги-бирующей и минимальной бактерицидной концентрации (МИК и МБК) готовили рабочие растворы, растворяя суппозиторий в 15 мл воды Р, которые последовательно разводили двукратно в жидкой среде Мюл-лер-Хинтон в ряду из 10 пробирок. В каждую пробирку вносили 0,2 мл взвеси суточной бульонной культуры исследуемого микроорганизма с величиной посевной дозы 109 КОЕ/мл. Пробирки инкубировали при температуре 37°С в течение 18-24 часов. Результаты оценивали визуально, определяя наличие или отсутствие роста в среде, содержащей различные концентрации испытуемого соединения. Последняя пробирка ряда с задержкой роста (прозрачный бульон) соответствует МИК в отношении данного штамма. Бактерицидную концентрацию определяли путем высева на агар содержимого из 3-5 последних пробирок ряда с отсутствием видимых признаков роста микроорганизмов. После оптималь-

ного для каждого микробного вида срока инкубации посевов отмечали наименьшую концентрацию вещества в пробирке, высев из которой не дал роста. Эту концентрацию принимали за МБК. Каждое определение проводили по 3 раза в разные дни. За результат принимали наименьшую концентрацию из 3-х результатов [6].

Изучение ранозаживляющей активности. Исследование выполнено на 48 белых рандомбредных крысах обоего пола, которых содержали согласно правил GLP в стандартных условиях вивария при температуре +24-25°С. Придерживались требований Директивы Совета ЕС по вопросам защиты животных, используемых для экспериментальных и других научных целей [6, 7].

Для оценки ранозаживляющего эффекта использовали модель плоскостной кожной раны с микробным обсеменением [8]. Экспериментальных животных разбили на 3 группы (по 8 самцов и самок в каждой). Раны животных 1-ой группы обрабатывали суппозиториями Арвагин (ООО «Рубикон», Республика Беларусь), раны животных 2-ой группы - суппозиториями Депантол (НИЖФАРМ ОАО, Российская Федерация, номер регистрации 9033/09/11/14), а раны животных 3-ей группы - составом плацебо.

Для воспроизведения модели раны у крыс под эфирным наркозом выстригали шерсть и подшерсток в области середины спины и вырезали кожный лоскут, удаляя также подкожную клетчатку. В рану вносили суточную культуру патогенных микроорганизмов с микробной нагрузкой 109. Все хирургические манипуляции осуществляли в условиях операционной одной хирургической бригадой. Дефект кожи оставляли открытым на протяжении всего периода наблюдения.

Через 3 суток после образования гнойной раны начинали лечение опытным и контрольным лекарственным средством, а также плацебо, нанося на раневую поверхность расплавленную суппозиторную массу. Перед нанесением суппозитории в заводской первичной упаковке помещали в воду с температурой 42-45°С на 5-10 минут до расплавления. После этого упаковку вскрывали и ее содержимое выдавливали на рану.

Период наблюдения составил 13 суток после выполнения оперативного вме-

шательства (10 суток после начала лечения). Каждый день состояние раневой поверхности оценивали визуально. Один раз в 2 дня с помощью прозрачной пленки снимали выкройку раны, сканировали ее и высчитывали площадь раны в программе ImageJ, версии 1.4.3.67. С такой же периодичностью проводили посев содержимого раневой поверхности для количественного определения микроорганизмов по Радоману [9].

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. Статистическое исследование включало расчеты среднего значения и стандартного отклонения. Разницу измерений значений площади раны оценивали с помощью коэффициента вариации. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования изучали влияние стабилизаторов различной природы на антимикробную активность опытных серий с повиарголом в процессе хранения. Установлено, что минимальная ин-гибирующая и минимальная бактерицидная концентрации суппозиториев серии №1, 3 и 4 увеличиваются уже к 9 месяцу хранения, что свидетельствует о необходимости добавления стабилизатора (серия №1) и о неэффективности использования в этом качестве желатина и поливинил-пирролидона (серии №3, 4). Добавление глюкозы увеличивает стабильность суппозиториев, но к 12 месяцу наблюдения у

серии №2 также наблюдали уменьшение антимикробной активности. Показано, что добавление лантана нитрата позволяет сохранить активность суппозиториев с по-виарголом на одном уровне в течение 24 месяцев (таблица 1).

При исследовании спектра антимикробной активности опытно-промышленных серий с повиарголом показано, что они обладают активностью против широкого спектра микроорганизмов. МИК раствора, образующаяся при растворении суппозитория, при которой останавливается рост всех исследуемых микроорганизмов, составляет 0,01б%. МБК составляет 0,064%. Показано, что МИК и МБК раствора, полученного при растворении суппозитория, полностью совпадают с этими показателями водного раствора субстанции. Определено, что раствор, содержащий только вспомогательные вещества, не обладает антимикробным эффектом в исследуемом диапазоне концентраций (таблица 2).

В опытах на животных показано, что на 3-ий день после операции у всех крыс наблюдали I фазу раневого процесса. Рана была покрыта тонким струпом, образованным раневым отделяемым. Корочка легко повреждалась при нажатии, просачивался экссудат. Фиксировали ярко выраженные признаки воспаления: отечные края раны, гной, наличие некротических масс. Микробная обсемененность ран была на уровне 109 и выше.

На вторые сутки после начала лечения (5 сутки после операции) у животных 1-ой и 2-ой групп наблюдали очищение раны от гноя и исчезновение экссудата. Микробная обсемененность раны уменьшилась

Таблица 1 - Влияние природы стабилизатора на антимикробную активность опытных серий суппозиториев с наночастицами серебра по отношению __к Escherichia coli, % (n=3)_

Серия, № Концентрация Срок хранения, месяцы

0 3 6 9 12 18 24

1 МИК 0,008 0,008 0,008 0,016 0,016 0,016 0,016

МБК 0,03 0,03 0,03 0,06 0,06 0,06 0,06

2 МИК 0,008 0,008 0,008 0,008 0,016 0,016 0,016

МБК 0,03 0,03 0,03 0,03 0,06 0,06 0,06

3 МИК 0,008 0,008 0,008 0,016 0,016 0,016 0,016

МБК 0,03 0,03 0,03 0,06 0,06 0,06 0,06

4 МИК 0,008 0,008 0,008 0,016 0,016 0,016 0,016

МБК 0,03 0,03 0,03 0,06 0,06 0,06 0,06

5 МИК 0,008 0,008 0,008 0,008 0,008 0,008 0,008

МБК 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03

Таблица 2 - Сравнительные показатели МИК и МБК растворов фармацевтической субстанции повиаргол, суппозиториев с фармацевтической

субстанцией и плацебо, %

Вид и количество штаммов микроорганизмов Арвагин Повиаргол Плацебо

МИК МБК МИК МБК МИК МБК

Candida albicans n=5 0,13 0,25 0,13 0,25 >0,5% >0,5%

Staphylococcus aureus n=5 0,016 0,13 0,016 0,13 >0,5% >0,5%

Pseudomonas aeruginosa n=5 0,03 0,13 0,03 0,13 >0,5% >0,5%

Escherichia coli n=5 0,008 0,03 0,008 0,03 >0,5% >0,5%

Proteus mirabilis n=3 0,016 0,06 0,016 0,06 >0,5% >0,5%

Bacillus subtilis n=3 0,016 0,13 0,016 0,13 >0,5% >0,5%

Klebsiella pneumoniae n=5 0,016 0,06 0,016 0,06 >0,5% >0,5%

Streptococus mutans n=1 0,008 0,13 0,008 0,13 >0,5% >0,5%

Enterococcus faecalis n=3 0,06 0,13 0,06 0,13 >0,5% >0,5%

при лечении Арвагином до 104-105, а при лечении Депантолом - до 104-106. На 4-е сутки после начала лечения и далее рана оставалась сухой и не отечной. Микробная обсемененность была на уровне 104

В 3-ей группе животных на 2-е сутки после начала лечения у 6 самок и 6 самцов наблюдали выделение экссудата, а у 4 самок и 3 самцов - гной. Края ран были отечными, микробная обсемененность -105-107. К 4-ым суткам лечения количество животных с хорошо заметными признака-

ми воспаления сократилось до 7 (3 самки и 4 самца). У двух животных (1 самка и 1 самец) выделение экссудата прекратилось только к 8-ым суткам. К этому же времени уровень микробной обсемененности раневой поверхности животных всех групп стал одинаковым и составил 104 (р>0,05).

Результаты изучения динамики уменьшения площади раневой поверхности представлены на рисунке. За 100% принимали площадь раны на 3-ий день после операции в момент начала лечения.

Рисунок - Динамика уменьшения площади раневой поверхности у крыс

Показано, что уже к 6-ым суткам лечения площадь раневой поверхности у животных 1-ой группы была статистически достоверно меньше, чем у животных 3-ей группы (р=0,039), а к 8-ым суткам - меньше, чем у животных 2-ой группы (р=0,0138). Установлено, что к 10-ым суткам у 2 самок и 3 самцов 1-ой группы раневая поверхность

полностью закрылась, а у остальных ее площадь не превышала 10,5% от первоначальной. У животных 2-ой группы площадь раневой поверхности к 10-ым суткам сократилась до 4,2-22,3% от первоначальной, а у животных 3-ей группы - до 3,8-35,6%. Полного закрытия раны во 2-ой и 3-ей группах не наблюдалось.

Вестник фармации №4 (70) 2015 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что добавление в состав суппозиториев с наночастицами серебра в качестве стабилизатора лантана нитрата позволяет сохранить их антимикробную активность в течение 24 месяцев.

Установлено, что разработанные суппозитории обладают широким спектром антимикробного действия по отношению к Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Candida albicans. Как и для фармацевтической субстанции, значения минимальной ингибирующей и минимальной бактерицидной концентраций составляют 0,016% и 0,064% соответственно. Показано, что вспомогательные вещества суппозиториев не обладают антимикробным эффектом.

Определено, что по ранозаживляющей эффективности суппозитории с наночасти-цами серебра превосходят существующий аналог, содержащий декспантенол.

SUMMARY

S. E. Rzheussky, V. V. Kuhach SPECIFIC ACTIVITY OF SUPPOSITORIES WITH SILVER NANOPARTICLES

The article presents the results of a study of the specific activity of suppositories with silver nanoparticles.

By comparing stability of antimicrobial activity of 5 experimental series a stabilizer was chosen, which allows to maintain it unchanged for 24 months.

Using the two-fold dilutions method 35 strains of 9 genera of Gram-positive and Gramnegative microorganisms, and yeasts were studied. It was proved that developed suppositories possess a broad spectrum of antimicrobial activity, which coincides with the spectrum of action of the pharmaceutical substance poviargoal. It was shown that the excipients used in suppositories do not possess antimicrobial effect.

On the model of the planar skin wound contaminated by microorganisms it was determined that wound healing effectiveness of suppositories with silver nanoparticles was higher than in existing analogue containing dexpanthenol.

Keywords: suppositories, silver nanoparticles, poviargol, wound healing, antimicrobial effect.

Научные публикации ЛИТЕРАТУРА

1. Букина, Ю. А. Получение антибактериальных текстильных материалов на основе наночастиц серебра посредством модификации поверхности текстиля неравновесной низкотемпературной плазмой / Ю. А. Букина, Е. А. Сергеева // Вестник Казанского технологического университета. - 2012. - № 7. - С. 125-128.

2. Kim, J. H. Antimicrobial effects of silver nanoparticles / J. H. Kim // Nanomedi-cine. - 2007. - V. 3. Issue 1. - P. 95-101.

3. Gunasekaran, T. Silver nanoparticles as real topical bullets for wound healing / T. Gunasekaran, T. Nigusse, M.D. Dhanaraju // J. Am. Coll. Clin. Wound Spec. - 2011. - Vol. 4, №3. - P. 82-96.

4. Lee, P. Y. Silver nanoperticles mediate differential responses in keratinocytes and fibroblasts during skin wound healing / P. Y. Lee, M. Ho, V.C.H. Lui // Chem. Med. Chem. - 2010. - №5. - P. 468-475.

5. Ржеусский, С. Э. Разработка вагинальных суппозиториев с наночастицами серебра / С. Э. Ржеусский, В. В. Кугач // Вестник фармации. - 2015. №2 (68). - С. 40-45.

6. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / под общей редакцией В. П. Фисенко. - М.: Информационно-издательское агентство "Ремедиум", 2000. - 399 с.

7. ТКП 125-2008 (02040). Надлежащая лабораторная практика - Минск: М-во здравоохранения Респ. Беларусь, 2008. - 34 с.

8. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

9. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований: Учебное пособие / под ред. А. С. Лабинской, Л. П. Блинковской, А. С. Ещи-ной. - М.: Медицина, 2004. - 576 с.

Адрес для корреспонденции:

210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра организации и экономики фармации с курсом ФПК и ПК, тел. раб.: 8 (0212) 60-14-08, Ржеусский С. Э.

Поступила 05.10.2015 г.