Диагностика уровня нефтезагрязнения почвы на основе морфофизиологических показателей растений и активности микроорганизмов

5. Семаль В.А., Нестерова О.В. Характеристика гуминовых кислот буроземов юга Сихотэ-Алиня по данным элементного анализа и ИК-спектрометрии (на примере Уссурийского заповедника) // Вестн. КрасГАУ. - 2009. - № 10. - С. 29-35.

6. Семаль В.А. Физико-химические свойства почв южной части Сихотэ-Алиня (на примере Уссурийского заповедника) // Почвоведение. - 2010. - № 3. - С. 303-312.

УДК 574.24:581.19 В.И. Полонский, Д.Е. Полонская, Т.С. Бородулина

ДИАГНОСТИКА УРОВНЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ НА ОСНОВЕ МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ РАСТЕНИЙ И АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ

Авторами статьи в зависимости от возраста растений выделены показатели, которые значимо изменяются под влиянием различных уровней нефтезагрязнения почвы. По их данным, пороговый уровень поллютанта в почве (0,3 г/кг) можно определить по снижению интенсивности гуттации проростков пшеницы, ингибированию активности почвенной пероксидазы и уменьшению общей численности микроорганизмов.

Ключевые слова: нефть, почва, семена, проростки, интенсивность гуттации, пшеница, салат, микроорганизмы, пероксидаза, полифенолоксидаза.

V.I. Polonsky, D.E. Polonskaya, T.S. Borodulina

DIAGNOSTICS OF SOIL PETROPOLLUTION LEVEL ON THE BASIS OF PLANT MORPHOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL INDICATORS AND MICROORGANISM ACTIVITY

Depending on plant age the indicators which are significantly changed under the influence of various levels of soil petropollution are emphasized by the authors of the article. According to their data, pollutant threshold level in soil (0,3 g/kg) can be determined on guttation rate decrease in wheat germs, soil peroxidase activity inhibition and microorganism total number reduction.

Kew words: oil, soil, seeds, germs, guttation rate, wheat, lettuce, microorganisms, peroxidase, polyphenoloxidase.

Загрязнение природной среды нефтью и продуктами ее переработки - острейшая экологическая проблема, затрагивающая многие страны. Нефтезагрязнение окружающей среды сопровождается сильным негативным воздействием на растения [1, 14], также под влиянием нефти изменяется активность ряда ферментов [5, 16], что сказывается на жизнедеятельности микробоценоза [13, 15].

Известно, что мониторинг поллютантов в окружающей среде основан на их количественном содержании. К сожалению, не всегда удается установить зависимость между концентрацией загрязнителя в среде и ее пригодностью для обитания живых организмов [6]. Удобным методом определения интегральной токсичности почвы является биотестирование. Показателем степени токсичности при этом служит изменение выбранной тест-функции биоиндикаторного организма при его взаимодействии с пробой среды. Наиболее полный анализ интегральной токсичности достигается при применении набора биотестов с использованием различных тест-организмов при контроле их биологических параметров [7]. При мониторинге нефтяного загрязнения почв целесообразно использовать показатели активности оксидоредуктаз как более чувствительных к данному виду антропогенного воздействия, более информативных и менее варьирующих по сравнению с другими показателями биологической активности [8].

Проблема установления минимально допустимого нефтезагрязнения окружающей среды остается недостаточно изученной.

Цель исследований. Изучение морфофизиологических параметров модельных растений, роста микроорганизмов и активности оксидоредуктаз под влиянием низких уровней нефтезагрязнения почвы.

Методика исследований. Изучение влияния нефти на пшеницу сорта Новосибирская 29 и салат листовой сорта Парниковый проводили в три этапа (почва для исследований одинаковая).

1) При проведении лабораторного эксперимента использовали известную методику [4]. В чашки Петри с почвой вносили водную эмульсию сырой нефти из расчета конечных концентраций: 0,3, 1, 3, 6, 9, 12, 15 г/кг почвы. Через 1 сутки в них раскладывали по 25 шт. семян пшеницы и салата в 4-х повторностях. Семена про-

ращивали при температуре 23°С и через 4 суток проводили учет количества проросших семян, сырой биомассы, длины корней и надземной части проростков. У 4-суточных проростков пшеницы определяли интенсивность гуттации (ИГ) по методике [12].

2) При выполнении лабораторного эксперимента на проростках почвой заполняли вегетационные сосуды емкостью 0,5 л и вносили на ее поверхность нефть, создавая концентрации те же, что указаны выше. В каждом сосуде находилось по 10 растений, которые выращивали в течение 10 суток (от всходов) при температуре 23°С до формирования трех листьев (повторность трехкратная). С помощью периодического взвешивания вегетационных сосудов влажность почвы в них поддерживали на уровне 60 % от полной влагоем-кости ^ = 102,5 %) [2]. В конце опыта измеряли биометрические показатели и скорость выделения пасоки у проростков пшеницы и салата [12].

3) При проведении вегетационного опыта использовали вегетационные сосуды емкостью 3 л, в которые вносили эмульсию нефти в воде, создавая те же концентрации, что были приведены выше, кроме двух наибольших. В каждом сосуде находилось по 10 растений пшеницы или по 5 растений салата. Повторность трехкратная. Растения выращивали в остекленной теплице в течение 40 (пшеница) или 30 суток (салат). С помощью периодического взвешивания вегетационных сосудов влажность почвы в них поддерживали на уровне 60 % от полной влагоемкости [2]. Параллельно в эксперименте поддерживали варианты с сосудами, содержащими нефтезагрязненную почву аналогичных концентраций, но без растений. После завершения опытов проводили учет высоты и сухой биомассы растений, измерение длины, площади листовых пластинок и их толщины, определение количества побегов у растений, количества зерен в колосе и длины колоса.

Учет почвенной микробиоты во всех вегетационных сосудах по завершению опытов проводили последовательным высевом почвенной суспензии в чашки Петри на поверхность агаризованной среды Чапека. Чашки с посевами инкубировали в термостате при температуре 26±0,5°С до завершения появления новых колоний. При обработке полученных данных результаты последовательных рассевов и повторностей суммировали и статистически обрабатывали на основе распределения Пуассона [10-11].

Для измерения активности пероксидазы (ПО) и полифенолоксидазы (ПФО) использовали образцы почвы массой 5 г. Активность этих ферментов определяли по реакции с пирогаллолом [3]. Повторность определения трехкратная.

Результаты исследований и их обсуждение. Как видно из табл. 1, фитотоксические свойства неф-тезагрязненных почв проявлялись в снижении всхожести семян, ингибировании начальных ростовых процессов и интенсивности гуттации (ИГ).

Таблица 1

Чувствительность морфофизиологических показателей, отражающих влияние нефтезагрязненной

среды на 4-суточные проростки

Объект Пороговая концентрац ответной реакц 1я нефти при появлении ии объекта, г/кг* Регистрируемый показатель

Положительная реакция Отрицательная реакция

Пшеница 1,0 6,0 Доля проросших семян

1,0 12,0 Масса корней

0,3 9,0 Масса побега

3,0 9,0 Длина максимального корня

0,3 9,0 Длина побега

Нет 0,3 Интенсивность гуттации

Салат Нет 6,0 Доля проросших семян

3,0 >15,0 Масса корней

3,0 12,0 Масса побега

3,0 >15,0 Длина максимального корня

3,0 9,0 Длина побега

*ПДК для нефти в почве 0,3 г/кг.

Отрицательная реакция растений на наличие поллютанта регистрировалась по большинству показателей, начиная лишь от 6-9 г/кг (20-30 ПДК) и выше. Исключение составила величина ИГ, которая оказалась самой чувствительной из исследованных морфофизиологических показателей. При меньших концентрациях нефти в почве отмечалась стимуляция большинства ростовых процессов. Семена и проростки салата были менее чувствительными к нефтезагрязнению по сравнению с пшеницей, угнетение процессов роста салата отмечалось при более высоком уровне загрязнения почвы поллютантом.

Таблица 2

Чувствительность морфофизиологических показателей, отражающих влияние нефтезагрязненной

среды на 10-суточные проростки

Объект Пороговая концентраци ответной реакц я нефти при появлении ии объекта, г/кг Регистрируемый показатель

Положительная реакция Отрицательная реакция

Пшеница Нет 6,0 Интенсивность выделения пасоки

3,0 9,0 Сухая масса надземной части

Нет 9,0 Содержание воды в листьях

3,0 9,0 Длина 1-го листа

Нет 6,0 Длина 2-го листа

Салат 0,3 9,0 Интенсивность выделения пасоки

Нет 9,0 Содержание воды в листьях

Нет 12,0 Площадь трех листьев

Нет >15,0 Сухая масса надземной части

У 10-суточных растений заметное снижение ростовых процессов начиналось при тех же уровнях загрязнения почвы поллютантом, что и для прорастающих семян - 6-9 г/кг (табл. 2). Уменьшение оводненно-сти листьев и ухудшение работы нижнего концевого двигателя, оцененное по интенсивности выделения пасоки, регистрировалось при этих же концентрациях нефти.

Таблица 3

Чувствительность морфофизиологических показателей, отражающих влияние нефтезагрязненной

среды на взрослые растения

Объект Пороговая концентрация нефти при появлении ответной реакции объекта, г/кг* Регистрируемый показатель

Положительная реакция Отрицательная реакция

Нет 9,0 Толщина флага

0,3 3,0 Площадь листьев главного побега

Нет 6,0 Содержание воды в листьях

Нет 3,0 Сухая масса надземной части

1,0 >9,0 Длина 1 листа

Пшеница, 40 сут. Нет 6,0 Длина 2 листа

Нет 6,0 Длина 3 листа

Нет 6,0 Длина 4 листа

Нет 6,0 Длина 5 листа

0,3 9,0 Длина 6 листа

Нет 1,0 Высота растений

Нет 6,0 Количество зерен в колосе

Нет 6,0 Длина колоса

0,3 1,0 Высота растений

Салат, 30 сут. Нет 1,0 Количество листьев

0,3 1,0 Площадь листьев

Нет Нет Содержание воды в листьях

0,3 1,0 Сухая масса надземной части

При меньших концентрациях нефти в почве отмечалась стимуляция некоторых ростовых процессов пшеницы. Нефть может выступать дополнительным источником азота для растений [9]. В этом возрасте проростки салата были также менее чувствительны к нефтезагрязнению, чем пшеница.

Взрослые растения пшеницы и салата показали себя более чувствительными к воздействию нефти, чем проростки и семена этих растений. Отрицательная реакция 40-суточных растений пшеницы, оцененная по уменьшению высоты растений, снижению площади листьев главного побега и сухой биомассы, начиналась при уровне загрязнения нефтью 1-3 г/кг (табл. 3). Дальнейшее увеличение концентрации нефти в почве приводило к уменьшению толщины листа-флага, содержания воды в надземной части биомассы, роста листовых пластинок. При этих же уровнях поллютанта отмечалось его отрицательное влияние на потенциальную хозяйственную продуктивность пшеницы (длина колоса и количества в нем зерен). Отрицательное действие нефти на взрослые растения салата проявлялось, начиная с концентрации 1 г/кг, которое регистрировалось по снижению высоты растений, площади листьев, надземной биомассы. Кроме того, негативное влияние нефти на растения салата хорошо прослеживалось по уменьшению количества листьев растения.

Стимуляция ростовых процессов у взрослых растений пшеницы и салата была отмечена только при низких концентрациях нефти (0,3-1,0 г/кг), что значительно меньше по сравнению с большинством ответных позитивных реакций прорастающих семян и проростков. В этом возрасте салат показал себя более чувствительным к действию поллютанта, чем пшеница.

Загрязнение почвы нефтью при самых низких концентрациях 0,3 г/кг сопровождалось ингибированием активности ПО почти во всех вариантах опытов (табл. 4). Уменьшение активности ПФО в большинстве вариантов не наблюдалось вовсе. Все это говорит о более высокой чувствительности почвенной ПО к нефтезаг-рязнению. Присутствие растений в нефтезагрязненной почве практически не влияло на пороговую концентрацию поллютанта, снижающую активность обоих ферментов.

Учет численности микроорганизмов, способных расти на богатой питательной среде, показал наличие стимуляции их роста при низких уровнях поллютанта, а также отсутствие ингибирования численности микроорганизмов в вариантах без растений (табл. 4).

Таблица 4

Чувствительность показателей, отражающих влияние нефтезагрязненной среды

на почвенные микроорганизмы

Объект Пороговая концентрация нефти при появлении ответной реакции объекта, г/кг* Регистрируемый показатель

Положительная реакция Отрицательная реакция

Почва, 40 сут. Из-под пшеницы 6,0 0,3 Активность ПО

3,0 Нет Активность ПФО

Без растений 6,0 0,3 Активность ПО

3,0 Нет Активность ПФО

Почва, 30 сут. Из-под салата Нет 0,3 Активность ПО

0,3 1,0 Активность ПФО

Без растений 3,0 1,0 Активность ПО

0,3 Нет Активность ПФО

Почва, 40 сут. Из-под пшеницы 1,0 Нет Общая численность микроорганизмов

Без растений 1,0 Нет Общая численность микроорганизмов

Почва, 30 сут. Из-под салата Нет 0,3 Общая численность микроорганизмов

Без растений 0,3 Нет Общая численность микроорганизмов

Таким образом, на основании полученных результатов можно констатировать, что с увеличением возраста пшеницы и салата повышалась чувствительность растений к нефтезагрязнению. Нарастающее в онтогенезе отрицательное влияние нефти на растения может быть обусловлено либо снижением уровня устойчивости организмов, либо прогрессирующим повреждающим действием поллютанта. Первое является маловероятным вследствие существования онтогенетической адаптации к стрессорам. Второе может представлять как физический механизм (усиливающийся дефицит кислорода, воды, минеральных эл е-

ментов вследствие образования гидрофобной пленки на корнях), так и фитотоксический эффект (вследствие накопления в растениях ядовитых соединений, которые образует в корнеобитаемой среде развивающаяся специфическая микрофлора).

Растения пшеницы в фазе прорастающих семян и проростков были более чувствительными к изучаемому стрессору, чем растения салата; у взрослых организмов наблюдался противоположный эффект. Поскольку отрицательная ответная реакция прорастающих семян и проростков по сравнению с взрослыми растениями проявлялась при более высоких концентрациях нефти в почве, то, по-видимому, нецелесообразно проводить оценку уровня загрязнения среды этим поллютантом, используя в качестве тест -объекта семена и проростки.

Наиболее чувствительными морфофизиологическими показателями уровня нефтезагрязнения почвы являлись следующие: 1) по негативной реакции - интенсивность гуттации проростков пшеницы, активность почвенной пероксидазы, общая численность почвенных микроорганизмов; 2) по позитивной реакции - масса и длина проростков пшеницы, интенсивность выделения пасоки проростками салата, площадь листьев главного побега растений пшеницы, площадь листьев, сухая надземная масса и высота растений салата, активность почвенной полифенолоксидазы. Из перечисленных параметров предпочтение, видимо, следует отдать интенсивности гуттации проростков пшеницы. Этот показатель является оперативным, наименее трудоемким, не повреждающим растения и не требующим специального лабораторного оборудования и дорогостоящих химических реактивов.

Литература

1. Ермаков Е.И., Панова Г.Г. Стратегия биореставрации химически загрязненных почв в зонах экологического риска // Освоение Севера и проблемы природовосстановления: тез. докл. междунар. конф. -Сыктыкар, 2001. - 84 с.

2. ЖурбицкийЗ.И. Теория и практика вегетационного метода. - М.: Наука, 1968. - 260 с.

3. ЗвягинцевД.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - М.: Изд-во МГУ, 1991. - 302 с.

4. Практикум по физиологии растений / В.Б. Иванов, И.В. Плотникова, Е.А. Живухина [и др.]. - М., 2001. - 144 с.

5. Исмаилов Н.М. Микробиология и ферментативная активность нефтезагрязненных почв // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. - М.: Наука, 1998. - С. 42-46.

6. Киреева Н.А., Тарасенко Е.М., Бакаева М.Д. Детоксикация нефтезагрязненных почв под посевами люцерны (Medicago sativa L.) // Агрохимия. - 2004. - № 10. - С. б8-72.

7. Киреева Н.А., Бакаева М.Д., Тарасенко Е.М. Комплексное биотестирование для оценки загрязнения почв нефтью // Экология и промышленность России. - 2004. - № 2. - С. 26-29.

8. Влияние загрязнения нефтью и нефтепродуктами на биологическое состояние чернозема обыкновенного / С.И. Колесников, К.Ш. Казеев, М.Л. Татосян [и др.] // Почвоведение. - 2006. - № 5. - С. 616-620.

9. Назарюк В.М. Почвенно-экологические основы оптимизации питания растений. - Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2007. - 364 с.

10. Национальный стандарт Российской Федерации. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных: общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям (ГОСТ Р ИСО 7218-2008): утв. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 декабря 2008 г. № 480-ст. Дата введ. - 1 янв. 2010 г. - М., 2008.

11. Поллард Д. Справочник по вычислительным методам статистики. - М.: Финансы и статистика, 1982. -344 с.

12. Полонский В.И., Сурин Н.А. Оценка зерновых злаков на устойчивость к неблагоприятным экологическим факторам. - Новосибирск: Изд-во СО РАСХН, 2003. - 128 с.

13. Рахимова Э.Р., Гарусов А.В., Зарипова С.К. Биологическая активность нефтезагрязненной почвы при засолении // Почвоведение. - 2005. - № 4. - С. 481-485.

14. Солнцева Н.Р. Добыча нефти и геохимия природных ландшафтов. - М.: Изд-во МГУ, 1998. - 376 с.

15. Degradation of petroleum hydrocarbons in two sub-antarctic soils: Influence of an oleophilic fertilizer / F. Cou-lon, E. Pelletier, R.S. Louis [et al.] // Environ. Toxicol. Chem. - 2004. - Vol. 23. - № 8. - P. 1893-1901.

16. Kiss S., Pasca D., Dragan-Bularda M. Enzymology of Disturbed Soils. - Amsterdam: Elsevier, 1998. - P. 3-62.