СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА DIROFILARIA REPENS
PURIFIED SOMATIC ANTIGEN DIROFILARIA REPENS PRODUCTION PROCESS

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунодиагностике дирофиляриоза, и может быть использовано для серодиагностики данного заболевания у человека и животных.
Дирофиляриоз является одной из важных проблем паразитологии. Несмотря на то, что этот паразитоз отнесен к редким, в последние годы отмечается рост числа случаев данного заболевания у человека. Это обусловлено высокой пораженностью данным возбудителем собак и отсутствием надлежащих мер по их выявлению и дегельминтизации. Диагностика дирофиляриоза у человека затруднена из-за отсутствия иммунологических тестов.
Проблема иммунодиагностики этого гельминтоза является приоритетной задачей гельминтологической науки и практики, в связи с чем способ получения антигена дирофилярий имеет большую научную и практическую ценность.
Известен способ получения антигена дирофилярий, включающий помещение самки Dirofilaria immitis в 0,9% солевой раствор (в соотношении 1:3), ультразвуковую гомогенизацию в трех циклах при 70 кГц в течение 30 с при температуре 0°С, центрифугирование при 15000 g в течение 30 мин при температуре 4°С, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена (Е.Espinoza, M.Cordero, A.Muro, F.Lorente, F.Simon. Anti-Dirofilaria immitis IgE: Seroepidemiology and seasonal variation in an exposed human population / Tropical Medicine and Parasitology. - 1993. - V.44. - №3. - P.172).
Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, не обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности, так как дает перекрестные реакции с сыворотками крови больных другими паразитозами (токсокароз, аскаридоз, фасциолез, эхинококкоз). Для увеличения специфичности данного антигена Simon F. et al сыворотки предварительно обрабатывают антигенами Toxocara canis, Ascaris suum, Fasciola hepatica и Echinococcus granulosus (F.Simon, A.Muro, M.Corder, J.Marti. A seroepidemiologic survey of human dirofilariosis in Western Spain / Tropical Medicine and Parasitology. - 1991. - V.42. - №2. - 106-108 p.).
Целью изобретения является разработка способа получения очищенного соматического антигена из неполовозрелой самки Dirofilaria repens с высокими показателями специфичности для его дальнейшего использования в диагностике дирофиляриоза у людей и животных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
Цель достигается путем оптимизации условий гомогенизации паразита (использование дополнительно механической гомогенизации), что позволяет добиться полного разрушения тканей и клеток; использованием экстракции белка в 0,25 М водном растворе сахарозы, тем самым увеличивается концентрация белка в антигене; проведением дополнительной очистки антигена дирофилярий от липоидов с помощью ацетона, что повышает его специфичность.
Способ включает следующие этапы.
1. Подготовка неполовозрелой самки Dirofilaria repens к гомогенизации.
Неполовозрелую самку Dirofilaria repens, удаленную хирургическим путем, отмывают многократно физиологическим раствором и помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы (в соотношении 1:3). Пробу замораживают при температуре -18°С.
2. Получение полного соматического экстракта.
Проводят механическую гомогенизацию гельминта 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С. Для дальнейшей экстракции белков гомогенат выдерживают при температуре 4°С в течение 12 часов.
Проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С.
3. Очистка экстракта в ацетоне.
Суспензию антигена медленно по каплям добавляют во флакон с охлажденным ацетоном (1 объем суспензии на 20 объемов ацетона) при непрерывном быстром перемешивании при 0°С. Смесь во флаконах выдерживают 1 час в холодильнике при температуре +4°С. Проводят центрифугирование смеси в центрифуге при 2000 об/мин в течение 8 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость удаляют. Пробирку с осадком высушивают под вакуумом в течение 3 часов при 0°С.
К сухому остатку во флаконе добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 6,4. Флакон энергично встряхивают в течение 1-2 минут, а затем помещают в холодильник при 4°С на 12 часов для полной гидратации препарата.
Раствор центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость используют как антиген.
4. Анализ диагностических свойств полного соматического очищенного антигена.
Чувствительность и специфичность полученного антигена определяли в ИФА по общепринятой методике. Полученный антиген использовали в концентрации 40 мкг/мкл в объеме 100 мкл на лунку. Разведение сывороток 1:200.
Пример 1.
Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных. В опытах использовали сыворотки крови собак больных дирофиляриозом Dirofilaria repens, дирофиляриозом Dirofilaria immitis, свободных от данной инвазии и собак с другими паразитозами. Кровь всех собак предварительно была исследована на наличие микрофилярий классическим способом.
Результаты представленные в таблице 1, свидетельствуют, что чувствительность и специфичность очищенного соматического антигена с сыворотками крови животных составила 100%.
Пример 2.
Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей. В этом эксперименте использовались сыворотки больных дирофиляриозом людей (банк сывороток Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии) и людей вне инвазии: здоровых и больных токсокарозом и другими паразитозами (лямблиозом, описторхозом).
Результаты представлены в таблице 2. По результатам ИФА установлено, что чувствительность теста с сыворотками крови людей составила 84,62%, специфичность - 87,50%.
Пример 3.
Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибиции антител. Для этого соматический антиген в различных разведениях (концентрация белка от 21,90 до 1,10 мк/мл) добавляли в стандартизированные дозы сыворотки больного дирофиляриозом, инкубировали 30 мин при +37°С. Далее смесь антиген-антитело обрабатывали в ИФА по стандартной методике.
Результаты реакции ингибиции представлены в таблице 3 и на чертеже. Как видно из таблицы и чертежа, отмечалась ярко выраженная зависимость эффекта ингибиции от внесенной дозы антигена. Чем выше концентрация белка вносимого антигена, тем ниже оптическая плотность данной сыворотки.
Таблица 1.Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных.
Сыворотки крови собак
Количество животных
Результаты ИФА
положит.
отриц.
чувствит.
специфич.
Животные, больные дирофиляриозом Dirofilaria repens
126
126
0
100%
100%
Животные, больные дирофиляриозом Dirofilaria immitis
10
-
10
Животные вне данной инвазии
10
-
10
Животные с другими паразитозами
10
-
10
Таблица 2.Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей.
Сыворотки крови людей
Количество обследованных
Результаты ИФА
положит.
отриц.
чувствит.
специфич.
Больные дирофиляриозом с подтвержденным диагнозом
39
34
6
84,62%
87,50%
Здоровые лица
12
1
11
Больные токсокарозом
9
2
7
Больные другими паразитозами (описторхоз, лямблиоз)
11
1
10
Таблица 3.Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибирования антител.
Оптическая плотность
К<sup>-</sup>
0,057
К<sub>Диагн.</sub>
0,171
100 мкл Д<sup>+</sup>
0,412
100 мкл Д<sup>+</sup> + 100 мкл антигена (концентрация белка 21,90 мк/мл)
0,093
100 мкл Д<sup>+</sup> + 100 мкл антигена (концентрация белка 5,48 мк/мл)
0,119
100 мкл Д<sup>+ </sup>+ 100 мкл антигена (концентрация белка 2,74 мк/мл)
0,131
100 мкл Д<sup>+</sup> + 100 мкл антигена (концентрация белка 1,10 мк/мл)
0,157
100 мкл Д<sup>+</sup> + 100 мкл жидкости для разведения сывороток
0,277
К<sup>-</sup> - контроль отрицательныйК<sub>Диагн.</sub> - контроль диагностическийД<sup>+ </sup>- сыворотка крови больного дирофиляриозом в разведении 1:50