Альтернативные модели клеточной трансплантологии при сахарном диабете 2 типа в различные сроки заболевания

Биомедицина • № 5, 2010, С. 22-25

Альтернативные модели клеточной трансплантологии при сахарном диабете 2 типа в различные сроки заболевания

О.И.Степанова, Н.Н.Каркищенко, Н.А.Онищенко*, О.В.Баранова

Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Московская область

* НФЦ трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И.Шумакова,

Москва

На гомозиготных мутантных мышах линии С57BL/KsYJLeprdb/+ изучены возможности коррекции углеводного обмена, метаболических и иммунологических нарушений с помощью алло- и изогенных гемопоэтической и стромальной фракций клеток костного мозга. Опыт проводился на первой и второй стадиях заболевания. В результате экспериментов было доказано, что стволовые и прогениторные ККМ выполняют не заместительную, а биорегуляторную функцию.

Ключевые слова: сахарный диабет, мыши линии С57BL/KsYJLeprdb/+, стволовые клетки.

Сахарный диабет (СД) II типа относится к числу наиболее распространенных хронических неинфекционных заболеваний в мире и число больных СД продолжает, неуклонно расти. Несмотря на определенные достижения последних лет, современная медикаментозная терапия сахарного диабета по-прежнему не способна надежно препятствовать прогрессированию клинических проявлений СД и его осложнений, поэтому поиск и разработка новых подходов к лечению СД остается актуальной проблемой.

Целью нашего исследования было изучение возможности коррекции углеводного обмена, а также метаболических и иммунологических нарушений с помощью алло- и изогенных гемопоэтической и стромальной фракций клеток костного мозга (ККМ) при использовании генетической модели СД II типа на разных стадиях развития этого заболевания.

Материалы и методы

Для коррекции клинических и морфологических признаков СД II типа

использовали модель гомозигот-

ных мутантных мышей линии С57BL/ KsYJLeprdb/+, эта модель имеет стадийность течения заболевания и соответствующие патогенетические изменения внутренних органов. В опытных группах использовали мышей в возрасте 1 мес. (первая стадия заболевания) и в возрасте 3-4 мес. (вторая стадия заболевания). Для коррекции клинических и патогенетических нарушений заболевания использовали аллогенные клетки (гемопоэтической и стромальной фракций) клеток костного мозга (ККМ) от доноров мышей линии B10.GFP и изо-генные (аутологичные) клетки (гемо-поэтической и стромальной фракций) ККМ от фенотипически здоровых гетерозиготных мышей той же линии С57BL/KsYJLeprdb/+. Введение ККМ проводили внутрибрюшинно, возраст доноров соответствовал возрасту реципиентов, сроки наблюдений составили 2 и 4 месяца.

Опыт проводился на первой и второй стадиях заболевания. Всего было проведено 8 серий экспериментов.

I. В опытных сериях на второй стадии заболевания были введены ал-логенные и изогенные ККМ:

серия 1 - 4,5-5 млн. культивированных (в течение 5 суток) гемопоэтиче-ских ККМ (ГПККМ) однократно;

серия 2 - 4,5-5 млн. некультивированных ККМ однократно;

серия 3 - семикратное введение ККМ по следующей схеме: сначала вводили 18-20 млн. ГПККМ (мононуклеарную фракцию) культивированные в течение 5 суток четырехкратно с интервалом в 7 дней; затем - 6-7,5 млн. культивированных мультипотентных мезенхимальных стромальных (фибробластоподобных) ККМ (ММСК КМ) трехкратно (с интервалом в 14 дней);

серия 4 - 24-39 млн. культивированных (в течение 5 суток) ГПККМ трехкратно с интервалом 3-4 дня;

серия 5 - 24-30 млн. культивированных (в течение 14 суток) ММСК КМ трехкратно с интервалом 14 дней;

серия 6 - 100 млн. культивированных (в течение 5 суток) ГПККМ однократно.

II. В опытных сериях на первой стадии заболевания были введены ал-логенные и изогенные ККМ:

серия 7 - семикратное введение ККМ по следующей схеме: сначала вводили 18-20 млн. аллогенные ГПККМ (моно-нуклеарную фракцию) культивированные в течение 5 суток четырехкратно с интервалом в 7 дней, а затем 6-7,5 млн. культивированные (в течение 14 суток) ММСК КМ трехкратно с интервалом в 14 дней;

серия 8 - 100 млн. культивированных (в течение 5 суток) ГПККМ однократно.

У мышей-реципиентов в динамике определяли в крови содержание глюкозы, гликозилированного гемоглобина, замеряли массу тела и массу внутрен-

них органов; определяли объем выпитой воды и съеденного корма.

Результаты и их обсуждение

После введения аллогенных ККМ в одинаковых дозах (4,5-5 млн.) у животных (через 3-4 мес. после рождения) наблюдали снижение показателей уровня глюкозы и гликозилированного гемоглобина в крови, наиболее достоверно выраженный эффект был получен в серии с использованием культивированных клеток, а менее выраженный в серии с некультивированными ККМ. Однако, как показали наблюдения, при многократном последовательном (семикратном) применении аллогенных культивированных клеток удается достичь более пролонгированного воздействия на показатели углеводного обмена.

Применение культивированных изо-генных ККМ показало следующие результаты. В группах с трехкратным введении ГПККМ в количестве 24-39 млн. и в группе с трехкратным введении ММСК КМ в количестве 24-30 млн. показатели углеводного обмена были достоверно равноценно ниже по сравнению с контролем, однако эти показатели были выше, чем в группе у животных с однократном введением в дозе 100 млн. ГПККМ. При введении такой дозы клеток удалось достичь более пролонгированного эффекта снижения показателей углеводного обмена. Однако аллогенные и изогенные ККМ во всех сериях опытов (на второй стадии болезни СД у животных) не способствовали устойчивому снижению показателей углеводного обмена, они лишь стабилизировали его на уровне более низком по сравнению с контролем.

При использовании культивированных аллогенных (при семикратном по-

следовательном введении ГПККМ и ММСК КМ) и изогенных (при однократном введении в дозе 100 млн. ГПККМ) ККМ у животных на ранней стадии развития болезни СД, нам удалось достичь выраженного пролонгированного эффекта снижения показателей углеводного обмена до субнормальных величин.

Во всех опытных сериях масса тела и аппетит животных стабилизировались и удерживались на одном уровне (но их выраженность была различна), а в контрольных группах с СД II типа за аналогичный период масса тела или повышалась, или понижалась в зависимости от стадии течения болезни. Наблюдали снижение полиурии до ее полного исчезновения, особенно в сериях на ранней стадии развития болезни и в сериях (на второй стадии болезни) с использованием семикратного введения ККМ и при введении 100 млн. ККМ; отмечено также устранение мацерации кожных покровов в опытных сериях после клеточной терапии, тогда как в контрольной группе мацерация становилась обширной незаживающей раной, которая оставалось у животного вплоть до его гибели.

Полученные позитивные эффекты клеточной терапии в опытных сериях у животных на регуляцию углеводного обмена привели к пролонгированному сроку выживаемости, где сроки жизни были в 1,7-2,3 раза (на второй стадии заболевания СД II типа) и 2,5-2,7 раза (на ранней стадии болезни) больше по сравнению с контролем.

Результаты морфологических исследований

В поджелудочной железе (ПЖ) при введении культивированной взвеси ал-логенных и изогенных ККМ отмечает-

ся положительный эффект, выражающийся в увеличении количества и размеров островков Лангерганса (ОЛ), увеличении базафильных ^-клеток островков, высоко достоверные результаты получены в сериях 8, 7 и 3, 6.

С целью подтверждения наличия нейроэндокринных клеток в составе ОЛ в опытных сериях использовали иммуно-гистохимический (ИГХ) анализ с хромо-гранином А. Полученные данные показали, что положительное цитоплазматическое окрашивание было выявлено практически во всех клетках островков групп с использованием ККМ при разных дозах введения.

С целью установления наличия и степени пролиферативной активности клеток островковой части ПЖ после введения ККМ, нами было выполнено ИГХ исследование (иммуннопероксидазный метод с АТ) с использованием маркеров репликации ДНК, антитела к Кь67. Использование данных ИГХ маркеров показало наличие высокой пролиферативной активности в сериях 8, 7, 3, 6, 1, 4 и 5; несколько менее выраженную активность в подгруппе 2.

В печени после клеточной терапии у реципиентов наблюдали накопление гликогена от умеренной до выраженной степени содержания. Результат был достигнут за счет улучшения белкового и углеводного обменов в печени. В экспериментальных группах (серии 8, 7, 6, 3 и 4, 5) признаки жировой дистрофии гепато-цитов отсутствовали и наблюдалось хорошее накопление гликогена гепатоци-тами всех отделов долек.

В ткани селезенки под действием алло- и изогенных ККМ формируются крупные лимфоидные фолликулы, наблюдается интенсивная бластотрансформация лимфоидных клеток в

селезенке, что свидетельствует о восстановлении структуры селезенки, как иммуно-компитентного органа и восстановлении ее иммунорегуляторной активности, что подтвердило морфометрическое исследование и масса селезенок была значительно достоверно выше (в 2-6 раза) в сериях 8, 7, 6 и 3, и менее выражена в серии 2.

В почках во всех экспериментальных сериях после клеточной терапии наблюдали снижение степени выраженности дистрофических изменений эпителия дистальных и проксимальных канальцев, исчезновение эозинофильных масс в просвете канальцев, что было связано с нормализацией углеводного и жирового обменов.

В ходе экспериментальной работы была проведена оценка введенных алло-генных ККМ с геном зеленого белка, которая показала, что на 66 и 120 сутки по-

сле введения ККМ в организме они не погибают, а сохраняют свою жизнедеятельность, мигрируя в разные органы, в том числе в ПЖ и селезенку, стимулируя участие этих органов в ауторегенерации.

Выводы

В результате экспериментов было доказано, что стволовые и прогениторные ККМ выполняют не заместительную, а биорегуляторную функцию. В связи с этим более эффективным является применение ККМ на ранней стадии развития заболевания.

При введении ККМ на этапе выраженных клинических проявлений СД терапевтический эффект не столь резко выражен и степень его зависит от стадии деструктивных процессов в организме и сохранившегося уровня адаптационных резервов.

Alternative models of stem cells transplantation with a diabetes 2 types at various terms of disease

O.I.Stepanova, N.N.Karkischenko, N.A.Onishenko, O.V.Baranova

On homozygous mutant С57BL/KsYJLepríb/ mice possibilities of correction of a carbohydrate exchange, metabolic and immunology infringements with allogeneic and isogena stem cells of hemopoetic and stromal fractions are studied. Experience was spent at the first and second stages of disease. As a result of experiments it has been proved that stem and progenitor stem cells carry out not replaceable, but biologically regulator function.

Key words: diabetes, С57BL/KsYJLeprtlb/+ mice, stem cells.