ШТАММ L.bulgaricus, СПОСОБНЫЙ ИНГИБИРОВАТЬ АДГЕЗИЮ ШТАММОВ Н.pylori К ЭПИТЕЛИАЛЬНЫМ КЛЕТКАМ
L.bulgaricus STRAIN CAPABLE OF INHIBITING ADHESION OF H.pylori STRAINS TO EPITHELIAL CELLS

Настоящее изобретение относится к области пробиотиков. В частности, изобретение относится к новому штамму Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, пригодному для лечения или профилактики инфекции.
В соответствии с определением, недавно одобренным Национальной Ассоциацией производителей йогурта (National Yogurt Association (NYA)) или Международным Институтом биологических наук (International Life Science Institute (ILSI)) в США, пробиотики представляют собой живые микроорганизмы, которые при приеме внутрь в достаточном количестве оказывают пользу для здоровья помимо основного питания. Пробиотические бактерии были описаны среди разновидностей, принадлежащих к родам Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus и Lactococcus, обычно используемых в молочной промышленности. Считается, что пробиотики действуют на уровне кишечной флоры, препятствуя развитию патогенных микроорганизмов и/или действуя напрямую на иммунную систему.
Helicobacter pylori (H. pylori) представляет собой грамотрицательную спиралеобразную бактерию, которая заселяет слизистый слой желудка человека у более чем 50% мировой популяции. Тогда как у большинства индивидуумов, инфицированных H. pylori, не обнаруживаются симптомы заболевания, несмотря на то, что в их желудочном эпителии есть признаки воспаления, у 15-20% индивидуумов, инфицированных H. pylori, развиваются заболевания. Действительно, H. pylori является главным этиологическим фактором хронического активного гастрита, пептических язвенных болезней, атрофии, метаплазии, дисплазии, рака желудка и лимфомы лимфоидной ткани слизистой оболочки желудка (MALT) (см. для обзора Fox and Wang, 2007 и Polk and Peek, 2010).
Во время заражения H. pylori специфически прикрепляется к желудочным эпителиальным клеткам, выстилающим желудочный эпителий, посредством нескольких адгезивных молекул (адгезинов), продуцируемых данными бактериями, таких как белки BabA и SabA. Адгезия к эпителиальным клеткам желудка защищает бактерий от потока жидкости, перистальтических движений и отслоения слизистого слоя. Адгезия H. pylori к слизистой оболочке желудка индуцирует путь сигнальной трансдукции в пределах эпителиальных клеток желудка, что приводит к повреждению эпителиальной клетки желудка и атрофии посредством механизмов окислительного стресса, апоптоза и/или аутофагии. Соответственно, адгезия H. pylori эпителиальным клеткам является ключевой стадией в установлении инфекции слизистой оболочки желудка.
Стандартным лечением больных, инфицированных H. pylori, является прием двух антибиотиков вместе с ингибитором протонового насоса (PPI), так называемая тройная терапия. Тем не менее, степень эрадикации H. pylori после тройной терапии падает из-за устойчивости к антибиотику или недостаточного соблюдения больным режима и схемы лечения. Более того, несмотря на некоторые клинические испытания, в настоящее время на рынке нет эффективной вакцины.
Из вышеизложенного следует, что существует потребность в альтернативах или дополнениях к тройной терапии для лечения или профилактики инфекции H. pylori.
Было предложено, в качестве альтернативы, использование пробиотических молочнокислых бактерий (LAB), которые продуцируют молочную кислоту, бактериоцины и другие противомикробные субстанции. Boyanova et al. (2009) обнаружили несколько штаммов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (L. bulgaricus), которые ингибируют рост штаммов H. pylori, в том числе штаммов, устойчивых к антибиотикам, in vitro (используя метод диффузии в агаре), в штамм-зависимой манере. Однако данные изученные штаммы L. bulgaricus не четко идентифицированы и не доступны публично. Simova et al. (2009) провели скрининг нескольких молочнокислых бактерий, продуцирующих бактериоцины. Затем они определили противомикробную активность указанных штаммов посредством анализа противомикробной активности бесклеточного супернатанта (CFS) этих штаммов двумя методами in vitro: методом диффузии в агаре и методом критических разведений Barefoot и Klaenhammer. Они обнаружили, что данный CFS штамма L. bulgaricus BB18 ингибирует рост широкого спектра патогенных микроорганизмов (бактерий или дрожжей), в том числе штамма H. pylori, благодаря своей противомикробной активности.
Авторы данного изобретения изолировали новый штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и обнаружили, in vitro и in vivo, что этот штамм ингибирует адгезию штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам. Этот штамм L. bulgaricus (называемый DN_100_0602 или CNCM I-4428), может, вследствие этого, быть использован для лечения или профилактики инфекции H. pylori, в результате таргетирования главной стадии в установлении этой инфекции, а именно ингибируя адгезию штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам.
Соответственно, предметом настоящего изобретения является штамм Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, депонированный, в соответствии с Будапештской конвенцией, в CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, Paris) 3 февраля 2011 г., под входящим номером CNCM I-4428.
Этот штамм CNCM I-4428 имеет следующие характеристики:
- Морфология: грамположительный микроорганизм, неподвижная палочковидная длинная бацилла с зернистостью,
- Метаболизм: гомоферментативная, каталаза (-),
- Ферментация сахаров (результаты получены в тесте API 50 CH в среде MRS при 37°C в течение 48 ч): глюкоза, фруктоза, манноза и лактоза.
Более того, этот штамм способен ингибировать адгезию штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам in vitro и in vivo.
Используемый здесь термин «ингибирование адгезии штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам» означает значительное ингибирование (а именно, полное или частичное ингибирование) адгезии штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам. Данное ингибирование адгезии штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам можно оценить in vitro, как показано в Примере 1 далее.
Настоящее изобретение также включает в себя мутантные штаммы, или генетически трансформированные штаммы, происходящие из исходного штамма CNCM I-4428, при условии что они способны ингибировать адгезию штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам. Эти мутантные или генетически трансформированные штаммы, где один или несколько эндогенных генов данного исходного штамма были видоизменены, например, для модифицирования некоторых его метаболических характеристик (например, способность ферментировать сахар, резистентность к кислотности, выживаемость при транспортировании в желудочно-кишечном тракте, постокислительные свойства или продукция метаболитов). Они также могут представлять собой штаммы, полученные в результате генетической трансформации данного исходного штамма CNCM I-4428 в одном или нескольких генах, представляющих интерес, например, для того, чтобы придать указанным генетически трансформированным штаммам дополнительные физиологические характеристики или для обеспечения возможности экспрессировать белки терапевтического или вакцинного значения, которыми желают снабдить указанные штаммы. Эти штаммы могут быть получены из данного штамма CNCM I-4428 посредством стандартных технологий для случайного или сайт-направленного мутагенеза и генетической трансформации Lactobacilli, например, таких, которые описаны у Gury et al. (2004), или у Perea Velez et al., 2007, или посредством технологии, известной как «геномный шифтинг» (Patnaik et al., 2002 и Wang et al., 2007).
Предметом настоящего изобретения также является способ получения штамма Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, способного ингибировать адгезию штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам, включающий в себя этап мутагенеза или генетической трансформации данного штамма CNCM I-4428.
Предметом настоящего изобретения также являются клеточные фракции, которые могут быть получены из штамма L. bulgaricus, как определено выше, предпочтительно штамма CNCM I-4428, при условии, что они способны ингибировать адгезию штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам. Они представляют собой, в частности, препараты ДНК или препараты бактериальных клеток, полученные из культур указанного штамма. Они также могут представлять собой супернатанты культур или фракции этих супернатантов. В качестве примера, бесклеточный супернатант (CFS) данного штамма CNCM I-4428 может быть получен, используя способ получения CFS из другого штамма L. bulgaricus, описанного у Simova et al., 2009.
Предметом настоящего изобретения также является способ получения клеточной фракции, которая способна ингибировать адгезию штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам, включающий в себя стадии:
а) культивирование штамма L. bulgaricus, как определено выше, предпочтительно штамма CNCM I-4428, и
b) получение клеточной фракции из культуры стадии a).
Предметом настоящего изобретения также является композиция, включающая в себя штамм L. bulgaricus в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно данный штамм CNCM I-4428, или клеточную фракцию, полученную из указанного штамма в соответствии с настоящим изобретением.
В композиции по изобретению указанный штамм можно использовать в виде целой бактерии, которая может быть живой или мертвой. Альтернативно, указанный штамм можно использовать в виде бактериального лизата или в виде бактериальных фракций; бактериальные фракции, пригодные для этого применения, могут быть выбраны, например, в результате тестирования их качеств при адгезии штаммов H. pylori к эпителиальным клеткам. Предпочтительно бактериальные клетки представлены живыми, жизнеспособными клетками.
Композиции по изобретению могут быть в любой форме, подходящей для применения, в частности, для перорального применения. Это включает в себя, например, твердые вещества, полутвердые вещества, жидкости или порошки. Жидкие композиции являются обычно предпочтительными для более легкого применения, например, в виде напитков.
5
6
Композиция может содержать, по меньшей мере, 10 КОЕ, предпочтительно, по меньшей мере, 10 КОЕ, на г сухой массы, по меньшей мере, одного бактериального штамма, как указано выше.
Композиция, кроме того, может содержать другие штаммы бактерий, отличные от штаммов по настоящему изобретению, в частности пробиотический штамм(ы), такие как штамм(ы) Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus или Lactococcus.
5
13
6
7
8
9
4
12
5
6
7
9
Если бактерии представлены в форме живых бактерий, композиция может обычно содержать в себе от 10 до 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), предпочтительно, по меньшей мере, 10КОЕ, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 КОЕ, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 10 КОЕ, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 10КОЕ на г сухой массы композиции. В случае жидкой композиции, это соответствует обычно от 10 до 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), предпочтительно, по меньшей мере, 10КОЕ, более предпочтительно, по меньшей мере, 10 КОЕ, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 10 КОЕ, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 10КОЕ/мл.
Композиция может представлять собой пищевую композицию, в том числе пищевые продукты, пищевые добавки и функциональный пищевой продукт. «Пищевая добавка» определяет продукт, полученный из соединений, обычно используемых в продуктах питания, но которые представлены в форме таблеток, порошка, капсул, питья или любой другой форме, обычно не связанной с питанием, и который имеет благоприятное воздействие на здоровье человека. «Функциональный пищевой продукт» представляет собой пищевой продукт, который также оказывает благоприятные воздействия на здоровье человека. В частности, пищевые добавки и функциональный пищевой продукт могут иметь физиологический эффект - защитный или лечебный - в отношении заболевания, например, по отношению к хроническому заболеванию.
Питательная композиция по изобретению также включает в себя продукты детского питания, молочную смесь для детского питания или молочную смесь второго уровня. Предпочтительно настоящая композиция представляет собой нутрицевтик или фармацевтический препарат, питательную добавку или лечебное питание.
Композиция может представлять собой молочный продукт, предпочтительно ферментированный молочный продукт. Ферментированный продукт может быть представлен в форме жидкости или в форме сухого порошка, полученного посредством высушивания ферментированной жидкости. Примеры молочных продуктов включают входящее внутрь ферментированное молоко и/или ферментированную сыворотку, перемешиваемую или питьевую форму, сыр и йогурт.
Ферментированным продуктом может быть ферментированный овощ, такой как ферментированная соя, злаки и/или фрукты, перемешиваемые или питьевые формы.
В предпочтительном варианте осуществления ферментированный продукт представляет собой свежий продукт. Свежий продукт, который не проходит стадии интенсивной термической обработки, имеет преимущество, потому что бактериальные штаммы присутствуют в живой форме.
Предметом настоящего изобретения также является штамм L. bulgaricus, как определено выше, предпочтительно штамм CNCM I-4428, или композиция, как определено выше, для использования в качестве лекарственного средства.
Предметом настоящего изобретения также является штамм L. bulgaricus, как определено выше, предпочтительно штамм CNCM I-4428, или композиция, как определено выше, для использования в качестве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции Helicobacter pylori.
Предметом настоящего изобретения также является штамм L. bulgaricus, как определено выше, предпочтительно штамм CNCM I-4428, или композиция, как определено выше, для использования в качестве лекарственного средства, предпочтительно лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции H. pylori.
Предметом настоящего изобретения также является штамм L. bulgaricus, как определено выше, предпочтительно штамм CNCM I-4428, или композиция, как определено выше, для промышленного производства лекарственного средства, предпочтительно лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции H. pylori.
Предметом настоящего изобретения также является способ лечения или профилактики инфекции H. pylori у нуждающегося в этом человека, указанный способ включает в себя введение в организм указанного человека терапевтически эффективного количества штамма L. Bulgaricus, как определено выше, предпочтительно штамма CNCM I-4428, или композиции, как определено выше.
Определение терапевтически эффективного количества хорошо известно специалисту в данной области, в особенности с учетом подробного описания, обеспеченного здесь.
Предметом настоящего изобретения также является способ промышленного производства лекарственного средства, предпочтительно лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции H. pylori, указанный способ включает в себя объединение штамма L. bulgaricus, как определено выше, предпочтительно штамма CNCM I-4428, или композиции, как определено выше, с, по меньшей мере, одним фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или инертным наполнителем.
Как используется здесь, лечение или профилактика включают, среди прочего, профилактику инфекции, стабилизируя нагрузку H. pylori и/или снижая нагрузку H. pylori. Данное лечение или профилактика также обращены к, по меньшей мере, одному из симптомов, ассоциированных с H. pylori, упомянутых ниже.
Способы диагностики инфекции H. pylori известны в данной области. В качестве примера, диагноз инфекции H. pylori может быть поставлен посредством анализа антител в крови, анализа антигена в кале или углерод мочевинного дыхательного теста. Также он может быть поставлен посредством биопсии под эндоскопическим контролем с последующим уреазным тестом, гистологическим исследованием или микробным культивированием.
Симптомами и заболеваниями, ассоциированными с инфекцией H. pylori, являются боль в желудке, изжога, кислотный рефлюкс, боль в области живота, регургитация, рвота, отрыжка, метеоризм, тошнота, гастриты, например, хронический активный гастрит, пептические язвенные болезни, атрофия, метаплазия, дисплазия, рак желудка и лимфома лимфоидной ткани слизистой оболочки желудка (MALT).
Настоящее изобретение будет понятно более четко из последующего описания, которое включает в себя примеры, иллюстрирующие противоинфекционные свойства штамма CNCM I-4428, а также приложенные фигуры.
На Фигуре 1 представлено изменение массы (в граммах) мышей, инфицированных H. pylori SS1, получающих контролируемый продукт, или инфицированных H. pylori SS1 и получающих лечение с помощью L. bulgaricus CNCM I-4428, или инфицированных H. pylori SS1 и получающих лечение с помощью L. bulgaricus CNCM I-1632 (Lb 130), измеренное непосредственно перед лечением (первый столбец), через 3 недели после лечения (второй столбец) и непосредственно перед умерщвлением (третий столбец).
На Фигуре 2 представлена оценка инфекции в баллах, полученная в результате иммуногистохимического анализа с использованием анти-H. pylori антител у мышей (i), неинфицированных H. pylori, (ii) инфицированных H. pylori SS1, получающих контролируемый продукт (неферментированное молоко), (iii) инфицированных H. pylori SS1 и получающих лечение с помощью L. bulgaricus CNCM I-1632 (Lb 130) и (iv) инфицированных H. pylori SS1 и получающих лечение с помощью L. bulgaricus CNCM I-4428. Определение баллов: 0: нет инфицированных желез, 1: редкие инфицированные железы, 2: 25% инфицированных желез, 3: от 25 до 50% инфицированных желез, 4: >50 % инфицированных желез.
На Фигуре 3 представлено количественное определение ДНК H. pylori SS1, полученное посредством ПЦР в режиме реального времени у мышей (i), неинфицированных H. pylori, (ii) инфицированных H. pylori SS1, но получающих контролируемый продукт (неферментированное молоко), (iii) инфицированных H. pylori SS1 и получающих лечение с помощью L. bulgaricus CNCM I-4428 и (iv) инфицированных H. pylori SS1 и получающих лечение с помощью L. bulgaricus CNCM I-1632 (Lb 130).
Пример 1: Отбор штаммов L. bulgaricus по их действию на адгезию Helicobacter pylori к эпителиальным клеткам желудка
Способ, описанный у Oleastro et al. (2008), использовали с модификациями для оценки действия двух штаммов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (CNCM I-4428 и CNCM I-1632, занесенных в CNCM 25 октября 1995 г.) на адгезивную способность H. pylori с эпителиальными клетками.
1.1 Материалы и методы
8
600nm
Были протестированы два штамма H. pylori: штамм J99 (BabA2; ATCC номер: 700824) и штамм 09.193 (BabA1, изолированный в Японии исследователем Yoshio Yamaoka, из Oita University). Эти штаммы были протестированы со значением MOI 50 (множественность заражения). Клетки H. pylori переносили в буфер PBS после культивирования в течение 24 ч в агаре Pylori (Biomerieux, France). Концентрация бактериальных суспензий данных двух штаммов H. pylori, соответственно, была нормализована при 2,10 КОЕ/мл (соответствует OD = 1).
Две суспензии Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus были протестированы с MOI 50 (соответствует 25 мкл нормализованной суспензии L. bulgaricus на лунку).
100000 эпителиальных клеток AGS (ATCC номер: CRL-1739) были инокулированы накануне эксперимента по инфицированию в 500 мкл среды DMEM F12, дополненной фетальной телячьей сывороткой 10%.
Окрашивание суспензий H. pylori
2
1 мл суспензии H. pylori центрифугировали в течение 10 минут при 10000 g. осадок ресуспендировали в 1 мл разбавителя А (из набора PKH2 Green Fluorescent Cell Linker Kit, Sigma Aldrich, Saint-Louis) и добавляли 2,5 мкл PKH (Sigma Aldrich, Saint-Louis). Данную суспензию инкубировали в течение 2 минут и 30 секунд при комнатной температуре. Окрашивание останавливали посредством добавления 2 мл фетальной телячьей сыворотки. Затем добавляли 4 мл среды DMEM/F12 перед центрифугированием данной суспензии в течение 10 минут 10000 g. Осадок ресуспендировали в 4 мл культуральной среды и центрифугировали в течение 10 минут при 10000 g. Эту стадию отмывки повторяли дважды для удаления избытка флуорохрома.
Оценка адгезии
Эпителиальные клетки AGS были диссоциированы с помощью трипсина, следуя стандартным условиям после трех отмывок с помощью PBS для удаления неприлипших бактерий. Флуоресцентную эмиссию анализировали посредством проточной цитометрии. Флуоресценцию измеряли, используя проточный цитометр FACSCalibur (Becton Dickinson). Каждое условие исполняли в трех повторах.
Инфицирование с помощью H. pylori осуществляли в двух условиях:
- в условиях пре-инфицирования (пре-): тестируемую суспензию L. bulgaricus добавляли к данным эпителиальным клеткам AGS за 1 ч 30 мин перед инфицированием с помощью H. pylori. Проводили анализ клеток посредством проточной цитометрии через 1 ч 30 мин после инфицирования (общее время инкубации 3 ч);
- в условиях ко-инфицирования (ко-): тестируемую суспензию L. bulgaricus и штамм H. pylori добавляли к эпителиальным клеткам AGS одновременно и проводили анализ данных клеток посредством проточной цитометрии после времени инкубации 1 ч 30 мин.
Контроль
Контрольное значение интенсивности флуоресценции было получено с помощью эпителиальных клеток AGS, инкубированных со штаммами H. pylori в течение 1 ч 30 мин.
Значения процента адгезии были даны относительно адгезии H. pylori к эпителиальным клеткам AGS воздействия L. bulgaricus, которые были установлены за 100%.
Результаты были проанализированы из среднего значения, полученного из трех повторений, и они были оценены в баллах, когда они были значимо отличны в соответствии с критерием Стьюдента (P<0,05).
1.2 Результаты
Результаты представлены далее в Таблице 1.
Таблица 1Результаты получены для двух штаммов L. bulgaricus по их действию на адгезию H. pylori к эпителиальным клеткам AGS
<img file="00000001.tif" he="52" wi="155" img-content="undefined" img-format="tif" />
Определение баллов: -3: значимое повышение адгезии, 0: нет значимого эффекта на адгезию, 1: значимое ингибирование адгезии от 1 до 10%, 2: значимое ингибирование адгезии от 11 до 20%, 3: значимое ингибирование адгезии от 21 до 30%, 4: значимое ингибирование адгезии свыше 30%.
Данные результаты демонстрируют, что бактериальная суспензия штамма CNCM I-4428 ингибирует адгезию двух штаммов H. pylori (J99 и 09.193) к эпителиальным клеткам AGS при двух разных условиях (пре- и ко-инкубировании), но бактериальная суспензия штамма CNCM I-1632 не обладает этой характеристикой.
Пример 2: действие штамма CNCM I-4428 на нагрузку H. pylori в экспериментальной модели на мышах
2.1 Материалы и методы
Helicobacter pylori
Использовали штамм H. pylori SS1, имеющий очень хорошую способность к колониеобразованию на слизистой оболочке желудка мыши (Lee et al., 1997). Абсолютное иммунологическое родство штамма проверяли посредством секвенирования генов glm и hspA и vacA.
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus
8
9
Молочные продукты, ферментированные 2 различными штаммами L. bulgaricus (CNCM I-4428 или CNCM I-1632), готовили следующим образом: первая культура в MRSn была приготовлена из замороженного штамма и инкубирована при 37°C в течение 17 ч. Вторая культура была приготовлена в обезжиренном молоке, обогащенным дрожжевым экстрактом (2 г/л), посредством инокуляции 1% из первой культуры и инкубировании при 37°C в течение 17 ч. Третья культура была приготовлена в молоке, обогащенном дрожжевым экстрактом (2 г/л), посредством инокуляции 1% из второй культуры и инкубировании при 37°C до достижения значения pH 4,7. Данный продукт был окончательно приготовлен посредством инокуляции молока, обогащенного дрожжевым экстрактом (2 г/л), 1% данной третьей культуры до достижения значения pH 4,7. Продукты хранили при -80°C. Определение количества бактерий осуществляли в MRSn после 48 ч инкубирования. Количество бактерий составляло 6×10 и 1,3×10КОЕ/мл соответственно для штаммов CNCM I-4428 и CNCM I-1632.
МЫШИ
55 самок мышей BALB/cBy/J в возрасте 5 недель (Charles River, France), протестированные как SPF («свободные от специфической патогенной флоры»), разделили на группы: 3 группы по 15 мышей были инфицированы и 1 группу из 10 мышей использовали в качестве неинфицированного контроля. Мышей кормили кормом, бедным витаминами, для усиления развития патологического нарушения, индуцированного посредством H. pylori.
Инфицирование (8 недель)
Мыши в возрасте 6 недель, получавшие в течение 1 дня водную диету, и затем на следующее утро с принуждением накормлены 250 мкл обогащенной суспензии штамма H.pylori SS1 (1-2 чашки Петри H. pylori для 5 мышей). Затем мышей помещали в клетку и давали нормальный рацион. Затем данные мыши снова получали водную диету вечером. Этот протокол повторяли в течение 3 дней.
Лечение (6 недель)
Через восемь недель после инфицирования мыши в течение 6 недель получали лечение молочными продуктами, содержащими в себе штамм L. bulgaricus. Давали 120 г молочного продукта на клетку в день в бутылочках для кормления вместо воды. Данные бутылочки для кормления меняли каждый день. Для оценки количества продукта, съеденного каждым животным, данные бутылочки для кормления взвешивали. Более того, мышей взвешивали непосредственно перед лечением, через 3 недели после лечения и непосредственно перед умерщвлением (результаты представлены на Фигуре 1).
Мыши контрольных групп получали молоко, обогащенное дрожжевым экстрактом (2 г/л) (то есть без какого-либо штамма L. bulgaricus).
Умерщвление подопытных животных
Мышей умерщвляли посредством смещения шейных позвонков. Осуществляли лапаротомию. Выделяли желудки, и слизистую оболочку желудка отмывали в физиологической сыворотке.
Желудок разрезали посередине от пищевода до двенадцатиперстной кишки. Для правой половины желудка кардиальное отверстие было исключено, и затем эту половину желудка помещали в физиологическую сыворотку для использования в молекулярном исследовании. Левую половину желудка использовали для гистологического исследования.
Гистологическое исследование
Левую половину желудка фиксировали в течение 1 ночи в 3,7% формалине, и отмывали с помощью 70% этилового спирта, а затем заливали в парафин и делали срезы толщиной 3 мкм.
Иммуногистохимический анализ проводили с антителами к анти-H. pylori антигенами: первичное антитело: анти-H. pylori (Dako, Ref. B0471); вторичное антитело и DAB: Dako EnVision + System-HRP (DAB) (Dako, Ref. K4011).
Молекулярное исследование (qRT-PCR)
Правые половины желудков гомогенизировали (разрушали) в 0,2 мл физиологической сыворотки с Potter-Elvehjem (пробирку взвешивали с и без желудочной ткани для определения веса данной ткани).
Общую ДНК выделяли из измельченного желудка с использованием набора Arrow Stool DNA kit (NorDiag, Norvege), соблюдая рекомендации фирмы-поставщика. Общая ДНК каждого измельченного желудка была ресуспендирована в 180 мкл буфера TRIS (10 мМ).
2
Присутствие ДНК H. pylori было количественно определено в ДНК-экстрактах посредством ПЦР в режиме реального времени. Амплификацию проводили с праймерами, нацеленными на 23S рРНК, представленной в двух копиях в H. pylori, следуя методу, описанному у Oleastro et al. (2003). Для 20 мкл смеси (MgCl 25 мМ, праймеры Hpy-A et Hpy-S 20 мкМ, описанные у Menard et al., 2002, сенсорный зонд, меченный с 5'-конца с помощью LC-Red 640 и 3'-фосфорилированный, и якорный зонд, меченный с 3'-конца флуоресцеином (оба зонда описаны у Oleastro et al. 2003) 20 мкМ, буфер, содержащий в себе фермент (10X, набор FastStart DNA Master Hybridization Probes, Roche Diagnostics), 5 мкл ДНК в концентрации 200 нг/мкл добавляли для амплификации в Light Cycler ROCHE, используя следующую программу:
Денатурация:
95°C
10 мин
Амплификация:
50 циклов
20°C/сек
95°C
0 сек
60°C
20 с
72°C
12 сек
Синтез:
95°C
0 сек
38°C
50 сек
20°C/сек
2.2 Результаты
Результаты инфицирования, полученные посредством иммуногистохимического исследования для штаммов L. bulgaricus CNCM I-4428 и CNCM I-1632 (Lb 130), представлены на Фигуре 2. Эти результаты демонстрируют, что применение молочного продукта, ферментированного штаммом CNCM I-4428, у мышей, инфицированных H. pylori, значительно уменьшает интенсивность инфицирования, но лечение с помощью молочного продукта, ферментированного штаммом CNCM I-1632, не снижает нагрузки H pylori.
Результаты, полученные с помощью ПЦР в режиме реального времени для штаммов L. bulgaricus CNCM I-4428 и CNCM I-1632 (Lb 130), представлены на Фигуре 3. Эти результаты демонстрируют, что у мышей лечение с помощью молочного продукта, ферментированного штаммом CNCM I-4428, значительно снижает нагрузку H. pylori, но лечение с использованием молочного продукта, ферментированного штаммом CNCM I-1632, не снижает нагрузку H pylori.
Источники информации
- Boyanova L et al., Lett Appl Microbiol. 2009;48:579-84.
- Fox JG and Wang TC., J Clin Invest. 2007;117:60-9.
- Gury J et al., Arch Microbiol. 2004;182:337-45.
- Lee A et al., Gastroenterology. 1997;112:1386-97.
- Menard A et al., Antimicrob Agents Chemother. 2002;46:1156-7.
- Oleastro M et al., J Clin Microbiol. 2003;41:397-402.
- Oleastro M, et al., J Infect Dis. 2008;198:1379-87.
- Patnaik R et al., Nat Biotechnol. 2002;20:707-12.
- Perea Velez M et al., Appl Environ Microbiol. 2007;73:3595-604.
- Polk DB and Peek RM Jr., Nat Rev Cancer. 2010;10:403-14.
- Simova ED et al., J Appl Microbiol. 2009;106:692-701.
- Wang Y et al., J Biotechnol. 2007;129:510-5.