ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ПЛОТНАЯ ДЛЯ КОНТРОЛЯ КОЛИЧЕСТВА ЖИВЫХ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА Y. PESTIS EV
DENSE NUTRIENT MEDIUM FOR MONITORING THE NUMBER OF LIVE MICROBIAL CELLS OF THE VACCINE STRAIN OF THE PLAGUE MICROBE Y.PESTIS EV

Изобретение относится к микробиологии, а именно к приготовлению микробиологических питательных сред для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV.
Известна питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, включающая, г/л: гидролизат говяжьего мяса, содержащий аминного азота 0,12%; натрий хлористый 4,0; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный 4,0; натрий сернисто кислый 0,04; кислоту соляную (1:1) 1,6; агар микробиологический 24,0; водопроводную воду до 1 литра. (Промышленный регламент на производство вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекций, накожного скарификационного нанесения и ингаляций ПР 01897080-09-16).
Недостатком данной среды является ее дороговизна.
Наиболее близкой предлагаемому изобретению является питательная среда для культивирования чумного микроба, содержащая, г/л: ферментативного гидролизата картофеля 310,0-410,0 мл, натрия хлористого 4,0-6,0, натрия фосфорнокислого 2-замещенного 3,0-5,0, натрия сернистокислого 0,3-0,5, агара микробиологического 10,0-14,0, дистиллированной воды до 1 литра. (Патент RU на изобретение №2380409 С1 Опубликовано: 27.01.2010 Бюл. №3).
Недостатком данной среды является недостаточное количество живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV.
Целью изобретения является разработка питательной среды плотной для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, позволяющей получать высокий процент живых микробных клеток.
Достигаемый технический результат заключается в том, что питательная среда в качестве питательной основы содержит ферментативный гидролизат говяжьего мяса, а также включает: натрий хлористый, натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, агар микробиологический, дистиллированную воду и стимулирующие добавки - натрий сернистокислый, аммоний молибденовокислый 4-водный, кукурузный экстракт 20% раствор, при следующем соотношении ингредиентов:
Ферментативный гидролизат говяжьего мяса,
содержащий 120 мг % аминного азота
85,0 мл
Натрий хлористый
5,0 г
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный
12-водный
4,0 г
Натрий сернистокислый
0,3 г
Кукурузный экстракт 20% раствор
20,0 мл
Аммоний молибденовокислый 4-водный
30,0 мг
Агар микробиологический
9,0 г
Дистиллированная вода
до 1 л
Для приготовления питательной основы в качестве исходного сырья используют свежее говяжье мясо, содержащее, в среднем, от 12,7% до 21,71% азотистых веществ. Минеральные вещества мяса состоят из солей натрия, калия, кальция, фосфора и железа; общее их количество достигает 1%. Мясо содержит также витамины, микроэлементы. Целесообразно использование именно свежего говяжьего мяса, т.к. оно содержит больше экстрактивных веществ, чем свежемороженое (Ю.А. Козлов. Питательные среды в медицинской микробиологии. Медгиз. 1950. с. - 46).
Характеристика ферментативного гидролизата говяжьего мяса - рН 7,0; общий азот 1,1%; аминный азот 0,878%; процент расщепления белка 78,0%; пептон 1,2%; сухой остаток 10,0-1,5%; минеральные вещества, мг %: натрия хлорид 0,087; кальций 4,2; магний 5,21; фосфор общий 6,5; фосфор неорганический 57,1; редуцирующие вещества 367. Приготовление ферментативного гидролизата из говяжьего мяса производили (по ПР 01897080-09-16).
При ферментативном гидролизе из белковых веществ говяжьего мяса образуются аминокислоты: лизин, метионин, триптофан, цистин, треонин, серии, фенилаланин, пролин, аланин, глицин, валин, лейцин, тирозин, гистидин.
Натрий хлористый «чда», ГОСТ 4233-77. Необходимость минимального количества солей в составе питательной среды обусловлена тем, что минеральные соединения являются катализаторами различных химических процессов, происходящих в микробной клетке.
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный «чда», ГОСТ 4172-76. Важность включения в состав среды натрия фосфорнокислого 2-замещенного 12-водного обусловлена наличием у него буферных свойств в физиологически важном диапазоне рН при наименьшем токсическом влиянии на биологические объекты (М.С. Поляк; В.И. Сухаревич; М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛБИ-СПб. - 2008. - С. 37-38).
Натрий сернистокислый ГОСТ - 195-77 «чда». Натрий сернистокислый является восстановителем окислительного потенциала питательной среды и стимулятором роста микроорганизмов - источником серы, необходимой для клеток микроорганизмов в количестве 1%. Для подавляющего числа микробов, в том числе патогенных, благоприятной для роста и размножения является нейтральная реакция среды (рН 7,0±0,5), корректировка осуществляется с использованием сернистых солей или кислот, в данном случае - натрием сернистокислым. Кроме того, при добавлении натрия сернистокислого среда становится прозрачнее.
1
2
3
4
5
6
Кукурузный экстракт содержит до 45% азотистых веществ в сухом остатке; в среднем, 9,4% белка и до 25% углеводов. Кроме того, экстракт богат микроэлементами, в его составе, мг/кг: цинка 22; марганца 5; меди 5; кобальта 0,02; йода 0,30; макроэлементами, в %: фосфора 0,25; натрия 0,04; кальция 0,59; калия 0,36; магния 0,12; серы 0,11; хлора 0,04; аминокислотами, в %: аргинина 90,0; гистидина 72,0; лейцина 72,0; изолейцина 89,0; фенилаланина 59,0; треонина 95,0; валина 12,7; лизина 0,96; метионина 0,56; триптофана 0,22; метионина с цистином 0,27 и витаминами, мг/кг: каротина (витамина А) 8,0; B4,0; В 1,0; В (пантотеновой кислоты) 6,5; В (холина) 400; В 17; В 2,9 (М.Ф. Нестерин, И.М. Скурихин. Химический состав пищевых продуктов. Москва. «Пищевая промышленность». 1979. 247 с).
Аммоний молибденовокислый 4-водный «чда», ГОСТ 3765-78. Соль аммония обеспечивает раскрытие пептидных связей белковых молекул и они становятся более доступными для различных микроорганизмов.
Агар микробиологический - ГОСТ 17206-96. Порошок светло - кремового цвета сероватого оттенка, запах без постороннего. Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85% не ниже 80°С, температура застудневания - 30-37°С, прочность студня - не менее 350±40 г.
Дистиллированная вода-ГОСТ 6709-72, рН - 6,5. Вода составляет 80-90% от клеточной массы микроорганизмов и играет важнейшую роль в их физиологических функциях, а также входит в состав структурных элементов клетки, служит средой для биохимических реакций, источником кислорода в процессах метаболизма, непосредственно участвует в метаболических реакциях, например в реакциях гидролиза.
Приготовление ферментативного гидролизата из говяжьего мяса в реакторе.
2
3
Мясо очищают от жира, сухожилий и пленок, режут на кусочки размером 2,5×2,5 см. Наливают в котел достаточного объема водопроводную воду, погружают обработанное мясо из расчета на 1 кг мяса 1,5 литра воды. Варят мясо 15-20 мин, затем вынимают, охлаждают и пропускают через мясорубку. Бульон, остывший до 50°С, подщелачивают NaCO из расчета 3,0 г соды на 1 л взятой в реактор воды. Добавляют поджелудочную железу, дважды пропущенную через мясорубку, из расчета 80,0-100,0 г железы на 1 л воды в зависимости от ее активности. Активность должна быть не менее 5 тыс единиц по Фульд-Гроссу. Проверяют показатель рН, который должен быть 8,5±0,2. Добавляют хлороформ 2% к общему объему жидкости. Первые сутки гидролизат перемешивают механической мешалкой через каждые 15 мин по 5 мин. В дальнейшем переходят на режим, когда автоматическая мешалка включается через каждые 2 ч на 5 мин. Ежедневно определяют аминный азот в гидролизате. По достижению аминного азота 0,6%-0,9%, что бывает на 7-10 сутки, мешалку и подогрев отключают. Гидролизату дают отстояться 2 суток, затем отфильтровывают от осадка на пресс-фильтре, разливают в 10 литровые бутыли, добавляют хлороформ 2%, закрывают резиновыми пробками, этикетируют и хранят в холодовой комнате при температуре 6±2°С.
Приготовление 20% раствора кукурузного экстракта Мерно 2 л кукурузного экстракта сгущенного вливают в 10 л кастрюлю, затем добавляют до 10 л питьевой воды, устанавливают рН до 7,0±0,1. Коррекцию рН проводят соляной кислотой в разведении 1:1 или натрием гидроокиси 20% раствором. Кипятят в течение 10-15 минут, фильтрую через ткань Бельтинг, охлаждают, затем в фильтрат добавляют хлороформ 2,0±0,1%. Хранят в условиях холодовой камеры при температуре 5±2°C.
Приготовление питательной среды плотной для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV
Для приготовления питательной среды плотной отмеряют - 85,0 мл ферментативного гидролизата говяжьего мяса, разбавляют его дистиллированной водой до содержания аминного азота 120 мг % и выливают в эмалированную кастрюлю, затем ссыпают взвешенные на механических весах натрий хлористый - 5,0 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12 водный - 4,0 г, агар микробиологический - 9,0 г, вливают дистиллированной воды воды до 1 л тщательно перемешивают до образования однородной массы. Подогревают до кипения, затем кипятят до полного расплавления агара в течение 2 мин. Фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Сбор фильтрата ведут в эмалированную кастрюлю, затем всыпают натрий сернистокислый - 0,3 г, вливают 20% раствор кукурузного экстракта - 20,0 мл, добавляют аммоний молибденовокислый - 4 водный - 30 мг. Готовая среда имеет светло-желтый цвет. После добавления соли аммония рН питательной среды повышается до 10,5-11,5, поэтому среду нейтрализуют раствором соляной кислоты (1:1) до значения рН 7,2±0,1, обеспечивающего успешный рост вакцинного штамма чумного микроба EV. Готовую питательную среду разливают в градуированные флаконы (матрацы) по 50,0 мл, затем стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. После стерилизации охлаждают до 56°С, затем скашивают.
9
В качестве примера испытывают культуру вакцинного штамма чумного микроба EV, выращенную на пластинках 2% агара Хоттингера, рН 7,2±0,1 при температуре (27±1)°С.Готовят взвесь I суточной культуры тест-штамма, соответствующую 10 ед по оптическому стандарту мутности (ОСО 42-28-85 П), эквивалентную 1,0×10 м.к./мл в стерильном 0,9% растворе натрия хлорида, затем разведением взвеси 1:1 получают содержание в 1 мл 500 млн м.к. Из данного разведения взвеси культуры высевают по 1,0 мл в 3 флакона (матраца), затем покачиванием распределяют взвесь по скошенной поверхности агара, оставляют на специально смонтированных подставках в скошенном состоянии, далее помещают в термостат. Выращивают в течение (48±2) ч при (27±1)°С.
Результат учитывают через (48±2) ч. Производят смыв выращенной культуры 5 мл 0,9% раствора натрия хлористого из каждого флакона (матраца) путем отбора биомассы в градуированную пробирку объемом 25 мл стерильной бактериологической пипеткой объемом 5 мл и устанавливают концентрацию микробов в 1 мл суспензии по ОСО мутности. Для этого из каждой пробирки с собранной биомассой отбирают взвесь культуры в количестве 0,1 мл и разводят 0,9% раствором натрия хлорида в количестве 0,9 мл. Затем последовательно добавляют физиологический раствор до получения 1 млрд м.к./мл.
Методика подсчета количества живых микробных клеток
Пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида и пипетки, используемые при определении содержания живых микробных клеток в биомассе, должны быть охлаждены до температуры (4±2)°С.
7
8
-7
-8
Из приготовленной микробной взвеси концентрацией 1 млрд м.к./мл пипетками делают последовательные десятикратные разведения по (0,5±0,01) мл взвеси в 0,9% растворе натрия хлористого (ряд из 8 пробирок с 4,5±0,05 мл 0,9% раствора натрия хлорида в пробирке), заканчивая 10 и 10 разведениями. Разведенную биомассу из двух последних пробирок (10 и 10) засевают пипеткой по (0,1±0,01) мл на 2 чашки Петри с питательным агаром (рН 7,2±0,1) и выдерживают при температуре (27±1)°С 2-3 суток. (Промышленный регламент ПР на производство Вакцины чумной живой, лиофилизата для приготовления суспензии для инъекционного накожного скарификационного нанесения и ингаляций ПР 01897080-09-16).
Процент выросших колоний вычисляют для пробы из каждого матраца, принимая за 100% число засеянных микробных клеток, исходя из вычисленной концентрации для биомассы, полученной с данного матраца, определенной методом сравнения с ОСО мутности 10 ME. За количество живых микробных клеток в процентах для серии контролируемой среды принимают среднюю арифметическую величину определений для трех образцов данного посева. Колебания результатов определения отдельных образцов не должны превышать 20% от средней арифметической величины.
-7
-8
-7
-8
Пример 1. Тест-штамм выращивали на пластинках питательной среды плотной в чашках Петри, содержащей: ферментативный гидролизат говяжьего мяса - 60,0 мл; натрий хлористый - 4,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 - водный - 3,0 г; натрий сернистокислый - 0,2 г; кукурузный экстракт раствор 20% - 10 мл; аммоний молибденовокислый 4-водный - 20,0 мг, агар микробиологический - 7 г; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний на пластинках питательной среды при посеве из разведения 10 составило 239; 211, диаметром 1,5-2 мм; при посеве из разведения 10 соответственно, 37; 31 в R-форме с выраженной кружевной зоной, сохраняющейся в течение 5 суток, что составляет 37,3% живых микробных клеток. Тогда как на контрольном питательном агаре при посеве из разведения 10 выросло 156; 129 колоний диаметром 1,3 мм, а при посеве изразведения 10 выросло, соответственно, 16; 15 в R-форме, диаметром 1,3 мм, что составляет 29,3% живых микробных клеток.
-7
-8
-7
-8
Пример 2. Тест-штамм выращивали на пластинках питательной среды в чашках Петри, содержащей: ферментативный гидролизат говяжьего мяса -85,0 мл; натрий хлористый - 5,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12 - водный - 4,0 г; натрий сернистокислый - 0,3 г; кукурузный экстракт 20% раствор - 20 мл; аммоний молибденовокислый 4-водный - 30,0 мг, агар микробиологический - 9 г; дистиллированную воду до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний на пластинках питательной среды при посеве из разведения 10 составило 382; 331, диаметром 1,5-2 мм; при посеве из разведения 10 соответственно, 93; 77 колоний в R-форме, что составляет 47,4% живых микробных клеток. Тогда как на контрольном питательном агаре при посеве из разведения 10 выросло 156; 129 колоний диаметром 1,3 мм, а при посеве 10 м.к. выросло, соответственно, 16; 15 в R-форме, диаметром 1,3 мм, что составляет 29,3% живых микробных клеток.
-7
-8
-7
-8
Пример 3. Тест-штамм выращивали на пластинках питательной среды в чашках Петри, содержащей: ферментативный гидролизат говяжьего мяса -105,0 мл; натрий хлористый - 6,0 г; натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный - 5,0 г; натрий сернистокислый - 0,4 г; кукурузный экстракт 20% раствор - 30 мл; аммоний молибденовокислый 4-водный - 40,0 мг, агар микробиологический - 11,0 г; дистиллированную юлу до 1 л. При таком соотношении ингредиентов количество выросших колоний на пластинках питательной среды при посеве из разведения 10 составило 211; 207 диаметром 1,5-2 мм; при посеве изразведения 10 соответственно, 24; 25 колоний в R-форме, что составляет 37,3% живых микробных клеток. Тогда как на контрольном питательном агаре при посеве из разведения 10 выросло 156; 129 колоний диаметром 1,3 мм, а при посеве из разведения 10 выросло, соответственно, 16; 15 в R-форме, диаметром 1,3 мм, что составляет 29,3% живых микробных клеток.
Таким образом, заявленная питательная среда плотная для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV (пример 2), приготовленная на основе ферментативного гидролизата говяжьего мяса; с добавлением натрия сернистокислого, 20% раствора кукурузного экстракта и аммония молибденовокислого 4-водного может применяться для контроля количества живых микробных клеток вакцинного штамма чумного микроба Y. pestis EV, при этом обеспечивая высокий процент микробных клеток.