Морфологические изменения слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки у крыс при дисбалансе оксида азота

Перспективы дальнейших исследований. Полученные данные позволяют расширить наши представления о развитии целого ряда патологических состояний и могут служить основой для будущих исследований.

1. Бурых М. П. Клиническая анатомия мозгового отдела головы / М. П. Бурых, И. Е. Григорова // - Харьков, - 2002. - 240 с.

2. Вовк Ю. Н. Хирургическая анатомия парасагиттальной зоны лобно-теменно-затылочной области / Ю. Н. Вовк, Д. Б. Беков, Д. А. Ткаченко // Научн. тр. Луг. гос. мед. универ. и врачей практ. здравоохр. -Луганск, - 1997. - С. 12-19.

3. Вовк Ю. Н. Клиническая анатомия головы / Ю. Н. Вовк // - Луганск: Элтон-2, - 2010. - 194 с.

4. Коновалов А. Н. Атлас нейрохирургической анатомии / А. Н. Коновалов // - АМН СССР - М., Медицина, - 1990. - 362 с.

5. Ким В. И. Особенности макромикроскопической конструкции твёрдой мозговой оболочки внутреннего основания черепа человека / В. И. Ким //- СПб. - 1998. - С. 152-153.

6. Ким В. И. Микрохирургическая анатомия твердой оболочки головного мозга на внутреннем основании черепа: автореф. дис. докт. мед. наук : 14.00.02 «Нормальная анатомия» / В. И. Ким. - Уфа, - 2008. - 34 с.

7. Cooper G. M. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect / G. M. Cooper, M .P. Mooney, A. K. Gosain [et al.] // Plast Reconstr Surg. - 2010. - Vol. 125(6). - Р.1685-1692.

8. Jivraj K. Diploic venous anatomy studied in-vivo by MRI / K. Jivraj, R. Bhargava, K. Aronyk [et al.] // Clin Anat. - 2009. -Vol. 22(3). - Р.296-301.

9. Martins C. Microsurgical anatomy of the dural arteries / C. Martins, A. Yasuda, A. Campero [et al.] // Neurosurgery. - 2005. -Vol. 56. - P. 211-251.

ОСОБЛИВОСТ1 ВЗАСМОВ1ДНОСИН К1СТОК

СКЛЕП1ННЯ ЧЕРЕПА З ТВЕРДОЮ ОБОЛОНОЮ ГОЛОВНОГО МОЗКУ У ДОРОСЛИХ ЛЮДЕЙ Вовк О. Ю., 1крамов В. Б., Шмаргальов А. О.

Робота присвячена вивченню морфо- i кратометричних особливостей взаемовщносин юсток склетння черепа з твердою оболоною головного мозку у дорослих людей з позицп шдивщуально! анатомiчноi мшливоси.

КЛючовi слова: склетння черепа, тверда оболона головного мозку, шдивщуальна анатомiчна мшливють, доро^ люди.

Стаття надтшла 4.09.2014 р.

THE RELATIONS OF VAULT OF SKULL BONES WITH THE DURA MATTER OF BRAIN FOR ADULT HUMANS Vovk O. Yu., Ikramov V. B., Shmargalev A. A.

The article is devoted the study of morpho- and craniometric features of relations of vault of skull bones with the dura matter of brain for adult persons from position of individual anatomic variability.

Key words: vault of skull, dura matter of brain, individual anatomic variability, adult humans.

Рецензент Попов О.Г.

УДК 591.475+546.17+616.342

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЖЕЛУДКА И ДВЕНАДЦАТИПЕРСТНОЙ КИШКИ У КРЫС ПРИ ДИСБАЛАНСЕ ОКСИДА АЗОТА

В работе исследованы изменения морфологической структуры и распределения эндотелиальной и индуцибельной ЫО-синтазы (еК^ и слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки (ДПК) крыс,

вызванные 6 и 12-ти дневным введением нитропруссида натрия и №нитро-Ь-аргинина. При длительном избытке N0 отмечалась атрофия секретирующих клеток желез желудка с компенсаторным снижением уровня eN0s и повышением его в ДПК, что сопровождается элиминацией iN0s+ клеток в исследуемых отделах. Дефицит N0 приводит к нарушению структуры желез желудка и к тканевой эозинофилии при повышенном уровне iN0s, eN0s, как в слизистых, так и в С-клетках желез. Дисбаланс в N0-эргической системе приводит к нарушению адаптационно-компенсаторных механизмов, приводящих к изменениям в N0-синтазной активности, нарушению функционального состояния гастродуоденальной зоны и потере целостности морфоструктуры слизистой оболочки желудка.

Ключевые слова: слизистая оболочка желудка, двенадцатиперстная кишка, оксид азота.

Работа является фрагментом НИР "Изучить механизмы развития фиброзных процессов при хроническом панкреатите и усовершенствовать технологии их хирургической коррекции " (№ гос. регистрации 0111и001065).

Оксид азота (N0) представляет собой мембранно-проницаемый газообразный вторичный мессенджер, участвующий в сигнальной трансдукции. Физиологические функции N0 были показаны в разных типах клеток и тканей, в том числе в эндотелиальных клетах, нейронах, клетках иммунной системы и кровеносных сосудов. N0 функционирует в центральной и автономной нервной системе, регулирует деятельность органов дыхательной и мочеполовой системы, желудочно-кишечного тракта. Молекула N0 является одной из самых мелких известных молекул - биологических мессенджеров [26]. Благодаря химической простоте, ее эффекты могут регулироваться исключительно концентрацией и стабильностью. N0 легко проникает через мембраны клеток, не нуждаясь в участии

каналов или рецепторов, а инициированный N0 сигнальный период достаточно короткий, поскольку молекула быстро окисляется с переходом в нитриты и нитраты, поэтому биологические эффекты N0 ограничены местом возникновения [20]. N0 также относится одновременно к аутокринным и паракринным медиаторам, поскольку, будучи синтезированным в любых клетках, он способен влиять на метаболические процессы, как в этих клетках, так и в расположенных по соседству [27].

N0 действует во всех направлениях, является универсальным регулятором физиологических функций и передачи нервных импульсов, мощным вазодилататором, протектором слизистой оболочки, регулятором моторики и секреции в желудочно-кишечном тракте [25]. Основными первичными задачами в исследовании роли N0 было изучение его релаксирующего действия на гладкую мускулатуру, которое связано с активацией растворимой гуанилатциклазы и накоплением циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Повышенная концентрация ГМФ активирует цГМФ-зависимую протеинкиназу и АТФазу, участвующих в дефосфорилировании легких цепей миозина, что приводит к выходу кальция из мышечных клеток и в результате - к вазодилатации [5]. Возможными мишенями для N0 являются растворимый аденозиндифосфат-рибозилирующий фермент и факторы транскрипции, через которые N0 может непосредственно влиять на транскрипцию генов и трансляцию информационной РНК [18].

Значительное количество исследований посвящено роли N0 в желудочно-кишечном тракте [24]. На сегодняшний день изучаются особенности моторно-эвакуаторной функции органов пищеварения, молекулярные механизмы развития нарушений в гладких мышцах органов пищеварения, развитие эрозивно-язвеных поражений при дисбалансе системы Ь-аргинин/К0/К0-синтазы (N08) как одного из ключевых факторов в развитии этих нарушений. По данным авторов [4], N0 как активный вазодилататор способен обеспечить значительное увеличение кровоснабжения слизистой оболочки желудка. При этом доноры N0 не имея сущесвенного влияния на базальную желудочную секрецию, могут модулировать стимулированную кислую [9]. В свою очередь, повышение уровня N0, вызванное однократным введением его доноров, вызывает стимуляцию продукции гликопротеинов и бикарбонатов и, таким образом, повышают защитные свойства слизистой оболочки желудка.

Зависимость показателей метаболизма N0 от активности воспалительного процесса, протекания, степени повреждения слизистой оболочки указывают на его значение в патогенезе заболеваний желудочно-кишечного тракта [13].

Несмотря на то, что многими авторами показана его протекторная роль, известно, что N0 способен вызвать и клеточные повреждения, что частично объясняется его радикальной природой. Негативное действие N0 начинает проявляться, когда его суммарное количество либо резко снижается, либо возрастает, приводя к функциональному и структурному повреждению органа [18, 28]. Кроме того, усиленная инактивация или недостаточный синтез N0, вызванные нарушением системы N08, индуцируют оксидативний стресс, вызванный дисбалансом между активностью эндогенных проокислительных ферментов и антиоксидантами [23]. В последнее время проводится широкий спектр исследований и разработок новых терапевтических стратегий в лечении системных патологий на основе молекулярного и клеточного действия N0 [17].

В физиологических условиях синтез N0 из Ь-аргинина происходит с помощью ферментов N08, вторым продуктом данной реакции является Ь-цитруллин. N08 - единственные известные на данный момент ферменты, которые используют в этом процессе одновременно 5 кофакторов (флавинадениндинуклеотид, флавинмононуклеотид, гем, тетрагидробиоптерин и кальций/ кальмодулин), являясь таким образом одними из самых регулируемых в природе ферментов [5]. Все три изоформы N08 представлены в разных типах клеток желудочно-кишечного тракта (эпителиальные клетки, макрофаги, нейроны, гепатоциты, фибробласты, эпителиальные и гладкомышечные клетки) [29]. Широкое распространение N0s-зависимой передачи сигнала обусловило зависимость от него кровоснабжения, поддержания целостности слизистой оболочки, моторики, секреции, электролитного и водного баланса, а также воспаления. В целом нейрональная N0-синтаза ^N08) преимущественно синтезируется в нейронах, эндотелиальная N0-синтаза (€N08) - в сосудистом эндотелии, а индуцибельная N0-синтаза ^N08) - в макрофагах. Однако ^08 можно так же обнаружить в поперечнополосатых и гладкомышечных клетках, нейтрофилах, панкреатических островках и эпителии, €N08 - в гладкомышечных клетках и нейронах, а iN0s - в нейронах, эндотелии и других типах клеток после индукции медиаторами воспаления [26].

Установить точную роль изоформ N08 в желудочно-кишечном тракте сложно в связи с тем, что они локализуются в одинаковых тканях, а также из-за недостатка действительно специфичных и селективних N08 ингибиторов. Хотя N0 является одной из наиболее изученных в

биомедицинских исследованиях молекул, однако его роль в физиологии и патофизиологии желудочно-кишечного тракта окончательно не раскрыта [15].

Целью работы было исследование морфологической структуры и распределение eNOs и iNOs в слизистой оболочке желудка и двенадцатиперстной кишке (ДПК) при дисбалансе оксида азота.

Материал и методы исследования. Экспериментальное исследование проводили на 100 белых лабораторных крысах-самцах (возрастом - 6-8 месяцев, весом 200-230 г). Крысы находились на стандартном рационе вивария при свободном доступе к воде и пище, с естественной сменой освещения. Перед началом эксперимента, для уменьшения погрешностей, вызванных индивидуальной чувствительностью к влиянию экстремальных факторов, животных тестировали на устойчивость к гипобарической гипоксии. Экспериментальные группы были сформированы из среднестойких к недостатку кислорода особей: I группа (n=40) - животные, которым вводили нитропруссид натрия ("РЕАХИМ", Россия) в дозе 1,5 мг/кг в 2,0 мл 0,9% раствора NaCl; II группа (n=40): - животные, которым вводили NG-нитро-Ь-аргинина ("Sigma-Aldrich",USA) в дозе 40 мг/кг в 2,0 мл 0,9% раствора NaCl; III группа (n=20): - контрольные животные, им вводили 2 мл 0,9% раствора NaCl.

Введение веществ проводили интраперитонеально (в нижнюю часть брюшной стенки), все растворы готовили непосредственно перед введением (согласно рекомендациям производителя препаратов) и вводили каждодневно в 9-10 часов. Через 6 и 12 дней моделирования, животных подвергали 18-часовой пищевой депривации со свободным доступом к воде. Забор биоптатов из тела желудка и ДПК проводили после выведения животного из эксперимента путем введения летальной дозы анестетика. Исследования проводили, придерживаясь нормативов Конвенции по биоэтике Совета Европы (в 1997 г.), Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных исследований, общих этических принципов экспериментов на животных, принятых законом Украины (№ 1759 - VI от 15.12.2009 г.) "О защите животных от жестокого обращения".

Для проведения морфологического исследования биопсийный материал очищали от жира и лимфатических узлов, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение 24 часов с целью сохранения целостности клеток и тканей. После фиксации и обезвоживания в растворах этанола возрастающей концентрации материал заливался в парафин, согласно стандартной методике. Парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм, при окраске гематоксилином-эозином подвергались тщательному микроскопическому исследованию [7]. Световая микроскопия проводилась с помощью светового микроскопа Leica DM2500 ("Leica", Германия) с использованием объективов, х10, х20, х40, х100 и окуляра х10.

Для иммунофлюоресцентного исследования использовали срезы тканей толщиной 3 мкм на адгезивных ("Superfrost Plus") предметных стеклах. После депарафинации, демаскировки антигенов и промывки в TRIS-буфере (рН=7,4) на каждый из срезов наносили смесь первичных антител, одно из которых обязательно было против ядерного антигена Ki-67 (мышиные MIB-1 или кроличьи SP6), а второе - против мембранного или цитоплазматического антигена (табл. 1). Инкубацию первичных антител проводили в течение 14 часов во влажной камере при температуре 4°С. После трехкратного промывания в TRIS-буфере на каждый из срезов наносили смесь антимышиных и антикроличьих антител ("Invitrogen") в разведении 1:50, меченных флуоресцентной меткой AlexaFluor 568 и AlexaFluor 488 соответственно, а также DAPI ("Sigma"), который дает синее свечение и используется для контрастирования ядер в разведении. Инкубацию проводили в течение 30 минут в темном месте во влажной камере при температуре 24°С. Затем срезы промывали в буфере, подсушивали, покрывали средой Fluormount (Electron Microscopy Sciences) и покровным стеклом [3].

Таблица 1

Антитела, использованные при иммунофлюоресцентном исследовании_

Первичное антитело, разведение Вторичное антитело, разведение

Vimentin (clone) 1:100 AlexaFluor 488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen), 1:50 AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (Invitrogen), 1:50 DAPI (Sigma), 1:400

eNOS (clone) 1:100

iNOS (clone) 1:100

Флуоресцентный анализ проводили с помощью микроскопа Leica DM2500, оборудованного тремя флюоресцентными фильтрами и 10-мегапиксельной фотокамерой Leica D-Lux3. В каждом из образцов исследовали 10 полей зрения при увеличении х400. Каждое из полей зрения фотографировались 3 раза при использовании каждого флюоресцентного фильтра [2].

Результаты исследования и их обсуждение. У животных контрольной группы после 6 и 12 дней введения раствора №С1 было сохранено нормальное гистологическое строение желудка и ДПК (рис. 1А), при иммунофлюорисцентном окрашивании еК08 определялась в виде слабого диффузного свечения в области сосудов и желез (рис. 1Б). При окрашивании гематоксилином и эозином и сравнительном анализе БЛР1+ ядер и стромальных структур область еК08+ чаще всего соответствовала расположению слизистых клеток в железах. В ДПК область еК08+ клеток была сконцентрирована строго в области сосудов, где отмечалось слабое диффузное свечение. Клетки, положительно окрашенные антителами к ¡N08, определялись в незначительном количестве в желудке и ДПК, в области крупных сосудов и лимфатических фолликулов (рис. 1В). У крыс контрольной группы как eN0s, так и ¡N08 в ДПК были сконцентрированы в основном в клетках эпителия сосудистой сети. В желудке при сохраненном гистологическом строении заметное количество сЫОэ также определялось в слизистых клетках желудочных желез.

А

Г

Б

Д

В

Рис. 1. Структура слизистой оболочки и распределение N08 в желудке и ДПК у крыс контрольной группы. А) Желудок, окраска гематоксилином и эозином, иммерсионный объектив, х1000; Б) Желудок, ммунофлюорес-центное окрашивание, антитела к eN0s+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40; В) Желудок, иммунофлюорес-центное окрашивание, антитела к 1Ж>8+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40; Г) ДПК, иммунофлюорес-центное окрашивание, антитела к еШ8+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40; Д) ДПК, иммунофлюорес-центное окрашивание, антитела к 1Ш8+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40.

При визуальном анализе слизистой оболочки желудка после 6-суточного введения нитропруссида натрия не отмечалось видимых повреждений. При иммунофлюорисцентном окрашивании уже после 6 дней отмечалось снижение интенсивности свечения eN0s в слизистой оболочке желудка, по сравнению с контролем, и незначительное повышение интенсивности свечения в ДПК, в области сосудов (рис. 2).

В

Рис. 2. Распределение N08 в желудке и ДПК у крыс, получавших нитропруссид натрия в течение 6 дней: А) ДПК, иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к iN0s+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40; Б) Желудок, иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к eN0s+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40; В) Желудок, иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к iN0s+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40.

При продлении срока введения до 12 дней у единичных животных отмечали наличие одиночных эрозивных повреждений, которые по характеру диффузного расположения совпадали с теми, что определялись в условиях моделирования стрессорных повреждений [11]. В условиях 12-дневного избытка N0 при гистологическом исследовании биоптатов желудка отмечалось расширение протоков желез, истощение и атрофия секретирующих клеток всех видов, апоптотические тельца и легкая лимфо-плазмоцитарная инфильтрация (рис. 3А). Через 12 дней после начала эксперимента клетки, положительно окрашенные на ¡N08, как в желудке, так и в ДПК, встречаются значительно реже и их свечение отличается меньшей интенсивностью (рис 3). У крыс, принимающих нитропруссид натрия в течение 12 дней, в эксперименте отмечалось расширение протоков, истощение и атрофия секретирующих клеток желез желудка с выраженным снижением концентрации eN0s и практически полным отсутствием iN0s. Можно предположить,

что механизм управления распределением N08 основан, в том числе, и на принципе обратной связи, который реализуется при повышении поступления экзогенного N0.

м

Ш

-А ^^НШ^^НВЬ еШЯВНИЯ^НИ

Рис. 3. Структура слизистой оболочки и распределение N08 в желудке у крыс, получавших нитропруссид натрия в течение 12 суток. А) Окраска гематоксилином и эозином, иммерсионный объектив, х1000; Б) Иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к eN0s+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40; В) Иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к iN0s+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40.

Избыток N0 может вызывать повреждения за счет ингибирования окислительного фосфорилирования в митохондриях, разрывов ДНК, ингибирования ферментов цикла Кребса и образования чрезвычайно токсичных периоксинитритов. Также, избыток N0 вызывает избыточную вазодилатацию и угнетение вазоконстрикции, что является звеном в патогенезе связанном с развитием гипотензии [6]. Полученные нами данные в предыдущих исследованиях секреторной активности слизистой оболочки желудка в условиях избытка N0 [14] совпадают с данными [8], где автор в опытах на изолированных главных клетках желудка свиньи отмечал снижение стимулированной секреции пепсина 50-60% при введении Ь^ММЛ. К тому же, один из механизмов тормозного влияния N0 на кислую желудочную секрецию реализуется за счет стимулирующего влияния N0 на циклооксигеназы, в результате чего увеличивается синтез простагландинов. Последние, как известно, тормозят стимулированную секрецию соляной кислоты [9].

Анализируя результаты гистологических и функциональных исследований можно сделать выводы как о развитии адаптационно-компенсаторных изменений слизистой оболочки желудка в условиях 6-ти суточного моделирования избытка N0, так и о развитии нарушений механизмов регуляции в условиях более длительного воздействия экзогенного введения N0.

При визуальном осмотре в слизистой желудка и ДПК после 6-ти дневного введения N0-нитро-Ь-аргинина не отмечалось эрозивно-язвенных повреждений, при иммунофлюорисцентном анализе определялось диффузное интенсивное свечение как ¿N08, так и еТЧОэ во всех клетках.

В

Рис. 4. Распределение N08 в желудке и ДПК крыс, получавших КО-нитро-Ь-аргинин в течение 6 дней: А) ДПК, иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к ¡N08+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40; Б) Желудок, иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к еЫ08 + метка Л1ехаБ1иог 488,х; В) Желудок, иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к ¡N08+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40.

В условиях увеличении длительности дефицита N0 до 12 дней в ходе макроскопического анализа морфологического состояния слизистой оболочки желудка подопытных животных было выявлено наличие острых язв овальной и полигональной формы (в количестве 2-4), которые были расположены преимущественно в теле желудка [1]. При световой микроскопии биоптатов тела желудка отмечалось заметное разрушение клеток и нарушение структуры желез, тканевая эозинофилия (рис. 5 А). Через 12 дней свечение маркера ¡N08 было уже менее выражено и диффузно распределено по всей области желез. В то же время, eN0s+ клетки с более выраженным свечением, по сравнению с контролем, но менее выраженным, по сравнению с 6-ти сутками эксперимента, по локализации оставались в пределах слизистых клеток, с добавлением интенсивного свечения в апикальной части - месте вероятного расположения О-клеток (Рис. 5Б). В ДПК наблюдалась картина, аналогичная контролю, с незначительным усилением свечения eN0s.

NG-нитро-L-аргинин является конкурентным ингибитором в ферментативном процессе синтеза N0 из Ь-аргинина. Следовательно, вызывает эффекты обратные действию донаторов N0:

вазоконстрикцию, увеличение сократительной активности гладкой мускулатуры, спазмы сфинктерных аппаратов, гппертензпю протоковых систем пищеварительных желез [16].

Рис. 5. Структура слизистой оболочки и распределение N0 в желудке крыс, получавших КС-нитро-Ь-аргинин. А) Окраска гематоксилином и эозином, иммерсионный объектив, х1000; Б) Иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к eN0s+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40; В) Иммунофлюорисцентное окрашивание, антитела к iN0s+ метка Л1ехаБ1иог 488, х40.

Известно, что гистамин- и сЛМР-индуцированная секреция желез желудка снижается в присутствии Ь-аргинина, субстрата для синтеза эндогенного N0, а также при воздействии донаторов N0 -нитропруссида натрия или S-нитрозо-N-ацетилипеницилламина. В то же время, прием NG-нитро-Ь-аргинина или NG-нитро-L-аргинин-метил-эстера вызывает ответ в виде стимуляции секреции [19]. В нашем исследовании мы отмечали выраженное повышение концентрации eN0s у крыс, которые получали NG-нитро-L-аргинин, наряду с нетипичной (отсутствующей в группе контроля) локализацией eN0s+ клеток в апикальной части желез, где располагаются С-клетки, секретирующие гастрин. Это позволяет сделать вывод, что отмечаемое другими исследователями воздействие NG-нитро-Ь-аргинина на желудочную секрецию реализуется через дисбаланс системы распределения N0s, в частности в гастрин-продуцирующих клетках.

Индуцибельная изоформа N0s считается ключевой составляющей защитного механизма N0. Она синтезируется клетками в ответ на цитокины и является важным фактором в реакции организма на воздействие паразитов, бактериальной инфекции, рост опухоли, развитие аутоиммунных заболеваний и т.д. Увеличение иммунореактивности iN0s в клетках, пораженных патологическим процессом, свидетельствует о специфичности этого маркера при воспалительных и деструктивных поражениях гастродуоденальной зоны [13].

Кроме того, последние исследования указывают на цитопротекторную роль iN0s при развитии оксидативного стресса. Таким образом, наблюдаемое нами повышение концентрации iN0s в желудке у крыс, получающих NG-нитро-L-аргинин, является комплексным ответом на воздействие сразу нескольких факторов. Во-первых, прямое цитотоксическое действие NG-нитро-L-аргинина в комбинации со стимуляцией секреции вызывает разрушение клеток желудочных желез, что ведет к привлечению в данную область клеток воспаления и гиперпродукции цитокинов. Помимо этого, частичное нарушение слизисто-бикарбонатного барьера приводит к развитию реакции раздражения и активному привлечению эозинофилов, большое количество которых мы наблюдаем в слизистом и подслизистом слое желудка у крыс этой группы. В этих условиях происходит активное производство токсичного супероксида с вовлечением восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата [17]. И, наконец, оксидативный стресс, который развивается при конкурентном ингибировании всех форм N0s NG-нитро-L-аргинином, также действует, как активатор компенсаторной экспрессии iN0s, и как следствие оксида азота.

Учитывая то, что N0, принимая непосредственное участие в регуляции периодической моторной деятельности желудка, связана как с прямым действием на гладко-мышечные клетки, так и с присутствием N0s в нейронах иннервирующих желудочно-кишечный тракт [21]. Важно подчеркнуть, что через N0, как вторичного посредника, обеспечиваются вазодилаторные эффекты блуждающего нерва и эффекты многих других вазоактивных веществ [22]. Характер нарушений в гистологической структуре слизистой оболочки желудка и в функционировании гладкомышечных клеток желудка и ДПК у подопытных животных в условиях дефицита N0 имеет определенное сходство с поражениями, вызванными моделированием дуоденогастрального рефлюкса путем перорального введения желчи [10]. То есть, в данном случае установленное нарушение секреторной функции желудка, потеря согласованности между моторной активностью желудка и ДПК и, в общем, нарушение деятельности пилорического сфинктера, становится причиной заброса дуоденального содержимого в желудок. А эрозивно-язвенные повреждение, разрушение клеток и нарушение структуры желез слизистой оболочки желудка являются следствием как прямого воздействия дефицита N0 так и косвенного - через нарушение согласованной периодической деятельности гастродуоденальной зоны.

1. В норме у крыс в желудке отмечается диффузное свечение eN0s в области слизистых клеток желез, распределение в двенадцатиперстной кишке соответствует расположению сосудистой сети. Клетки, положительно окрашенные антителами к ¡N08, определяются в незначительном количестве в желудке и в двенадцатиперстной кишке, в области крупных сосудов и лимфатических фолликулов.

2. После 6-ти дневного введения нитропруссида натрия визуальное состояние слизистой оболочки органов гасродуаденальной области не отличается от контроля, хотя иммунофлюорисцентный анализ оказал снижение интенсивности свечения eN0s в слизистой оболочке желудка, по сравнению с контролем, и незначительное повышение интенсивности свечения в двенадцатиперстной кишке, в области сосудов. Воздействие донатора готовых молекул оксида азота в течение 12-ти дней в эксперименте вызывает истощение и атрофию секретирующих клеток желез желудка с выраженным компенсаторным снижением концентрации eN0s в желудке по принципу обратной связи и незначительным повышением в двенадцатиперстной кишке, что сопровождается элиминацией ¡N08+ клеток в обоих исследуемых отделах желудочно-кишечного тракта.

3. После 6-и дневного введения NG-нитро-L-аргинина не отмечается возникновение видимых повреждений слизистой оболочки, а при иммунофлюорисцентном анализе определяется диффузное интенсивное свечение как ¡N08, так и eN0s во всех клетках. Воздействие NG-нитро-L-аргинина в течение 12-ти дней практически не оказывает влияния на распределение N08 в в двенадцатиперстной кишке, однако приводит к нарушению структуры желез желудка и тканевой эозинофилии с повышением концентрации ¡N08, сигнализирующем о развитии паталогического процесса. При этом eN0s определяется не только в слизистых, но и в О-клетках желез, где оказывает влияние на механизмы желудочной секреции.

4. Длительный дисбаланс в N0-эргической системе приводит к нарушению адаптационно-компенсаторных механизмов, приводящих к изменениям в N0-синтазной активности, нарушению функционального состояния гастродуоденальной зоны и, как следствие, потере целостности морфологической структуры слизистой оболочки желудка. В условиях длительного дефицита оксида азота наблюдались дезадаптационные явления, приводящие к более выраженным патологическим процессам. В свою очередь детальная локализация механизмов развития N0-зависимых патологий требует дальнейшего углубленного изучения.

Перспективы дальнейших исследований. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности дальнейших исследований направленных на выявления особенностей изменений морфологической структуры распределения полного спектра МОз в стенке желудка и двенадцатиперстной кишке при дисбалансе оксида азота вызванных селективными ингибиторами синтеза оксида азота.

1. Галшський О. О. Моторна дiяльнiсть шлунка та дванадцятипало! кишки за умов блокування МС-ерпчио! системи / О.О. Галшський, О.С. Трушенко, В.О. Галшський [та ш.] // Вюник Дншропетровського ушверситету. Бюлопя. Еколопя. - 2010. - Вип. 18, Т. 2. - С 3-9.

2. Гуртовий В. А. Фенотип пролiферуючих клпин пухлини й мщооточення при рiзних клшжо-морфолопних варiантах класично! лiмфоми Ходжкша / В. А. Гуртовий, I. С. Шпонька, I. В. Бшенький [та ш.] // Патолопя.- 2010. - Т. 7, № 3. - С. 56-61.

3. Гуртовий В. А. Стабшьнють пухлинно! тканини при лiмфомi Ходжкша / В. А. Гуртовий, I. С. Шпонька, I. В. Бшенький [та ш.] // Патолопя. - 2011. - Т. 8, № 2. - С. 76-80.

4. Ковалев И. В. Роль оксида азота в регуляции электрической и сократительной активности гладких мышц / И.В. Ковалев, М.Б. Баскаков, Л.В. Капилевич [и др.] // Бюл. Сиб. Мед. - 2004. - Т.1, №1. - С. 7-26.

5. Крилова О. О. Роль N0 в розвитку хрошчного панкреатиту / О.О. Крилова // Буковинський медичний вюник. - 2011. -Т. 15, №2 (58). - С. 218-221.

6. Малышев И. Ю. Стресс, адаптация и оксид азота / И.Ю. Малышев, Е.Б. Манухина // Биохимия. - 1998. - Т. 63, №7. -С. 992-1006.

7. Михайлова В. С. Современные методы окраски / В.С. Михайлова // - ВюУйгиш, - 2009 -9 с.

8. Поленов С. А. Окись азота в регуляции функций желудочно-кишечного тракта / С.А. Поленов // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. - 1998. - №1. - С.53-59.

9. Полотнюк С. Вплив штропрусиду натрш на базальну та стимульовану шлункову секрещю кислоти у щурiв / С. Полотнюк, Т. Берегова, Л. Штанова // Вюник Львiвського ушверситету. Бюлопя, еколопя. - 2003. - Т. 1, № 2. - С. 217-221.

10. Руденко Л. I. Моторна дiяльнiсть гастродуоденально! зони при дуоденогастральному рефлюкс у щурiв / А. I. Руденко // Гастроентерология: мiжвiдомчий збiрник. - 2007. -Т. 38. - С. 119-127.

11. Разуваева О. В. Дiяльнiсть секреторних залоз шлунку та штроерпчш мехашзми И регуляцп за умов моделювання адреналшово! виразки/ О.В. Разуваева, О.Б. Мурзш, А! Руденко// Вюник Дншропетровського ушверситету. Бюлопя Еколопя. - Вип.17, Т.1. - С. 193-198.

12. Северина И.С. Оксид азоту. Роль розчинно! гуаншатциклази в мехашзмах його фiзiологiчних ефекив / И.С. Северина // - Вопр. мед. ммп. - 2002. - №1. - С. 4-30.

13. Степанов Ю. М. Вивчення вмсту eNOS та iNOS у слизовш оболонщ гастродуоденально!' зони у хворих на НПЗП гастропатп до та тсля лiкування / Ю.М. Степанов, Ю.С. Бреславець //Сучасна гастроeнтeрологiя.- 2010.- T. 56, № 6.- C.32-38.

14. Севериновська О. В. Оcoбливocтi перюди-но!' aктивнocтi шлунка за умов дисбалансу NO-epгiчнoi' системи. / О. В. Севериновська, О.О. Гaлiнcький, А. I. Руденко [та iн.] // Вюник Днiпpoпeтpoвcькoгo унiвepcитeту. Бioлoгiя, медицина. -2014. - Т.5, №1. - С.71-78.

15. Ткач С. М. Биологические эффекты оксидов азота в желудочно кишечном тракте / С.М. Ткач, К.С. Пучков, Ю.Г. Кузенко //Сучасна гастроентеролопя. - 2013. - T. 72, № 4. - С. 118-128.

16. Шевченко Б. Ф. Морфо-функцюнальний стан тдшлунково!' залози при експериментальному хрошчному панкреатит! / Б.Ф. Шевченко, О.М. Бабш, О.О. Галшський [та ш.] // Гастроентерология: мiжвiдoмчий збipник. - 2012. - Т. 46. -С. 288-294.

17. Alderton W. K. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition / W.K. Alderton, C.E. Cooper, R.G. Knowles // Biochem J. - 2001. - Vol. 357. - P. 593-615.

18. Bansinath M. Chronic administration of a nitric oxide synthase inhibitor, N omega-nitro-L-arginine, and drug-induced increase in cerebellar cyclic GMP in vivo / M. Bansinath, B. Arbabha, H. Turndorf [et al.] // Neurochemical research - 1993. -Vol. 18, No. 10. - P. 1063-1066.

19. Berg A. Nitric oxide-an endogenous inhibitor of gastric acid secretion in isolated human gastric glands //A. Berg, S. Redeen, A.-C. Ericson, S.E. Sjostrand / BMC Gastroenterology. - 2004. - Vol. 4. - 16 p.

20. Bryan N. S. Discovery of the nitric oxide signaling pathway and targets for drug development / N.S. Bryan, K. Bian, F. Murad //. Frontiers in Bioscience. - 2009. - Vol. 14. - P. 1-18.

21. Cavicchi M. Potentiation of cytokine induced iNOS expression in the human intestinal epithelial cell line, DLD-1, by cyclic AMP / M. Cavicchi, B.J. Whittle // Gut. - 1999. - Vol. 45, No. 3. - P. 367-374.

22. Elliott S. N. Nitric oxide: a regulator of mucosal defense and injury / S.N. Elliott, J.L. Wallace // J. Gastroenterol. - 1998. -Vol. 33, No6. - P. 792-803.

23. Forstermann U. Nitric oxide and oxidative stress in vascular disease / U. Forstermann //Pflugers Arch. - 2010. - Vol. 459, No. 6. - P. 923-939.

24. Kochar, N. I. (2011). Nitric oxide and the gastrointestinal tract / N.I. Kochar, A.V. Chandewal, R.L. Bakal [et al.] // International Journal of Pharmacology. - 2011. - Vol.7, No. 1. - P. 31-39.

25. Lukas K. A. Guanylylcyclases and signaling by cyclic GMP / K.A. Lukas, G.M. Pitari, S. Kazerounian [et al.] // Pharmacol. Rev. - 2000. - Vol. 52. - P. 375-413.

26. Litwack G. Nitric oxide. Vitamins and Hormones / G. Litwack // Academic Press. - 2014. -Vol. 96. - P. 1-18.

27. Moncada S. Nitric oxide: physiology,pathophysiology, and pharmacology / S. Moncada, R.M. Palmer, E.A. Higgs // Pharmacol. Rev. - 1991. - Vol. 43. - P. 109-141.

28. Stamler J.S. Nitrosylation. the prototypic redox-based signaling mechanism. / J.S. Stamler, S. Lamas, F.C. Fang // Cell. -2001. - Vol. 106. - P. 675-683.

29. Shah V. Nitric oxide in gastrointestinal health and disease / V. Shah, G. Lyford, G. Gores [et al.] // Gastroenterology. - 2004. - Vol. 126.-P. 903-913.

МОРФОЛОПЧШ ЗМ1НИ СЛИЗОВО1 ОБОЛОНКИ ШЛУНКА I ДВАНАДЦЯТИПАЛО1 КИШКИ У ЩУР1В ПРИ ДИСБАЛАНС ОКСИДУ АЗОТУ Галшський О. О., Ошмянська Н. Ю., Макарчук В. А., Севереновська О. В., Руденко А. I.

В робой дослщжено змши морфолопчно! структуры i розподшу ендотелiальноI та шдуцибельно! N0-синтази i iN0s) слизово! оболонки шлунка i дванадцятипало! кишки (ДПК) щурiв, викликан 6-и i 12-ти денним введенням штропрусиду натрто i Н-н^ро-С-аргшшу. При тривалому надлишку N0 вщзначалася атрофiя секретуючих кл™н залоз шлунку iз компенсаторним зниженням рiвня еМ^ i тдвищенням в ДПК, що супроводжуеться елiмiнацieю iN0s+ кйтин в дослщжуваних вщдшах. Дефщит N0 призводить до порушення структури залоз шлунку i тканинно! еозинофшп з тдвищенням рiвня iN0s, eN0s визначаеться не тшьки в слизових, але i в G-клiтинах залоз. Дисбаланс в N0-ергiчнiй системi призводить до порушення адаптацшно-компенсаторних механiзмiв, що е причиною змш в N0-синтазнiй активности порушення функцюнального стану гастродуоденально! зони, i призводить до втрати цшсност морфоструктури слизово! оболонки шлунка.

Ключовi слова: слизова оболонка шлунка, дванадцятипала кишка, оксид азоту.

Стаття надшшла 10.10.2014 р.

MORPHOLOGICAL CHANGES OF THE MUCOSA OF THE STOMACH AND DUODENUM IN RATS WHEN THE IMBALANCE OF NITRIC OXIDE Galinsky A. A., Oshmyanska N. Y., Makarchu V. A., Severenovskaya E. V., Rudenko A. I.

We have investigated the changes in the morphological structure and distribution of endothelial and inducible NO-synthase (eNOs and iNOs) in the mucous membrane of stomach and duodenal ulcers in rats, caused 6 and 12-day injection of sodium nitroprusside and N-nitro-L-arginine. Under long-term excess NO has been observed atrophy of the gastric glands secreting cells with the compensatory decrease in the level of eNOS and improvement it in the duodenum, which is accompanied by elimination of iNOs+ cells in the studied parts of the gastrointestinal tract. The long- NO deficiency leads to structural damage of the gastric glands and tissue eosinophilia with an increased levels of iNOS, eNOS has been located not only in mucosal, but also in the G-cells of the glands. The imbalance in the NO-ergic system leads to disruption of the adaptive-compensatory mechanisms and progressive changes in the NO-synthase activity, disruption of the functional state of the gastroduodenal zone and to the loss of integrity of the morphological structure.

Key words: gastric mucosa, duodenum, nitric oxide

Рецензент Костенко В. О.