ВЕЩЕСТВА И СПОСОБЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ПРИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИИ БОЛЕЗНИ ГЕНТИНГТОНА
SUBSTANCES AND METHODS FOR USE IN THE PREVENTION AND/OR TREATMENT OF HUNTINGTON'S DISEASE

Настоящее изобретение относится к предлагаемым веществам и способам для применения при лечении и предупреждении болезни Гентингтона.
Болезнь Гентингтона представляет собой малораспространенное моногенетическое расстройство с аутосомнно-доминантным типом наследования. Она вызывается экспансией повтора тринуклеотида CAG в кодирующей области гена гентингтина (НТТ) на хромосоме 4 человека (Novak & Tabrizi, 2011). Экспансия вызывающего болезнь повтора CAG ассоциируется с генетической нестабильностью во время репликации и изменениями при сплайсинге РНК. Однако наиболее важно, что кодированный белок изменяется по структуре из-за расширенного участка полиглутамина (полиQ) в N-концевой части белка, ведущего к накоплению со временем структурно изменившегося и модифицированного белка гентингтина и фрагментов белка в головном мозгу и других органах или клетках. Такой процесс имеет сходство с другими нейродегенеративными протеинопатиями, такими как, например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона или множественная системная атрофия, где общим знаменателем является образование агрегатов белковых фибрилл в комбинации с продуктами разрушения белков. При болезни Гентингтона патофизиологическим критерием является прогрессирующая нейродегенерация главным образом в полосатом теле и коре головного мозга с накоплением агрегированного и разрушенного белка гентингтина.
Клинические симптомы болезни Гентингтона развиваются предсказуемым образом, начиная с едва заметных изменений в настроении или когнитивных проблем с последующими непостоянными проблемами походки и движений. Со временем физические способности разрушаются с видимыми проблемами координации движения в сочетании с ухудшением умственных способностей и психическими и поведенческими проблемами. Средняя продолжительность жизни составляет примерно двадцать лет после первого клинического проявления. Симптомы могут существенно изменяться, и хорошо описано, что возраст начала в обратной зависимости коррелирует с числом повторов CAG в мутантном гене гентингтина, подтверждая причинную роль мутированного гентингтина.
Не существует методов лечения или предупреждения болезни Гентингтона. Для контроля за симптомами требуется постоянное лечение пациента в поздних стадиях заболевания, и существенной является нагрузка на пациента и его социальное окружение. Симптоматические методы лечения, такие как методы лечения фармацевтическими средствами и нелекарственные методы лечения, могут ослабить некоторые симптомы.
В связи с сегодняшним пониманием этиологии болезни Гентингтона и генетической причины мутантный ген гентингтина рассматривается как основная мишень для модифицирующих болезнь таргетных стратегий, хотя и не традиционная (Yu et al., 2014). На основании клинических генетических и функциональных данных от животных моделей (Bard et al., 2014) стратегии ослабления болезни Гентингтона рассматриваются как подходы первостепенной важности, несмотря на молекулярные проблемы, ассоциированные с такой концепцией (Zheng & Diamond, 2012). Современные стратегии типично испытывают затруднения из-за отсутствия доставки терапевтического средства к намеченному участку в пораженных нейронах в головном мозгу. Это в настоящее время учитывается при разработке для подходов с нацеливанием на ДНК или мРНК (Davidson, 2012), включая антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК и генную терапию с использованием вирусной доставки миРНК, shRNA или ZFP (для нацеливания на уровне гена), или косвенных подходов на основе небольших молекул, таких как ингибирование SirT1 или mTPR. Альтернативный подход состоит в использовании интрател, снабженных вирусными векторами, имеющими мишенью внутриклеточный гентингтин в головном мозгу (Butler et al., 2012). Несмотря на их доказанную функциональность на преклинических моделях, большинство таких подходов сталкивается с основными проблемами доставки в намеченный участок. Кроме того, структуры «чужеродных» крупных молекул, таких как интратела на основе scFv (Messer & Joshi, 2013), несут опасность потенциального составления новых эпитопов для реципиента, причем посредством этого вызываются нежелательные гуморальные иммунные реакции против терапевтического средства или нежелательные реакции аутореактивных Т-клеток против клеток, экспрессирующих и представляющих «чужеродный» белок.
В WO 2012/140376 А1 раскрываются терапевтические пептиды рер4 и рер42, и оба пептида не распространяются до сайта расщепления с6 НТТ. Эти пептиды предлагаются для применения в качестве ингибиторов агрегации НТТ и не связаны с какой-либо вакцинацией или иммунологическим применением. В WO 2010/015592 А2 раскрывается получение моноклональных антител для цели количественной диагностики. Одни из таких моноклональных антител (4С9) получают для цели детекции/количественных анализов мутированного белка полиQ, но не для какого-либо терапевтического применения. Антитело получили с использованием пептида с аминокислотами с 65 до 84, полученного из белковой последовательности НТТ. Ko et al. (Brain Res. Bull., 56 (2001): 319-329) раскрывают анти-НТТ моноклональные антитела с наибольшим связыванием с доменом полиQ НТТ. Persichetti et al. (Mol. Med., 1 (1995): 374-383) раскрывают антителовыявлющие пептиды НР1 и НР12. Miller et al. (Mol. Ther., 7 (2003), 572-579) раскрывают вакцинацию ДНК, причем ДНК кодирует первые 17 АК плюс 103 глутаминовых остатка, слитые с белком CFP.
В US 2007/0026029 А1 раскрывается устройство для афереза для лечения и предупреждения болезни Альцгеймера. Weiss et al. (Anal. Biochem., 395 (2009): 8-15) раскрывают методы детекции мутантного НТТ в тканях животного и человека. Butler et al. (Prog. Neurobiol., 97 (2011): 190-204) раскрывают терапию интрателами для HD у животных моделей на основе scFv. В US 2010/0233180 А1 раскрываются антитела, которые связываются с участком полиР НТТ. Chen et al. (Chem. Biol., 18 (2011): 1113-1125) предлагают наращенный пептоид полиQ для лечения HD путем прямого связывания полиQ, но не для вакцинации.
Для того чтобы дать альтернативный лечебный подходя к болезни Гентингтона, в настоящем изобретении предлагаются активные и пассивные вакцины (например, антигены и антитела), которые способны попадать в гентенгтин с помощью более простых средств. При болезни Гентингтона имеет место возрастающая осведомленность, что состояние сопровождается генерализованными изменениями, включающими иммунную систему, периферические ткани, лимфоциты периферической крови (PBL) и метаболизм, лежащими в основе системного характера этого заболевания. Как пример, патологическое накопление гентингтина не ограничивается только ЦНС, но также может обнаруживаться в клетках периферической крови (Weiss et al., 2012). Путем уменьшения экспрессии гентингтина в первичных макрофагах/моноцитах человека нарушение врожденной иммунной системы могло бы быть частично инвертировано путем вмешательства в РНК, таргетную для гентингтина (Träger et al. 2014).
Кроме детекции гентингтина в клетках крови, растворимый гентингтин или фрагменты гентенгтина по счастливой случайности детектированы в протеоме плазмы здоровых доноров (Liu et al., 2007) или детектированы ELISA в плазме больных глаукомой, до сих пор не связываемой с болезнью Гентингтона (Tezel et al., 2012). Хотя важная роль иммунной системы при болезни Гентингтона выяснена (Ellrichmann et al., 2013), возможная причинная роль внеклеточного гентингтина в значительной мере отрицалась. Позднее гентингтин плазмы и КОЕ предложен только в качестве потенциального биомаркера для мониторинга развития болезни (Weiss et al., 2014). Нацеленный возможно болезнетворно, промотирующий заболевание внеклеточный белок гентингтин ранее не рассматривался как терапевтическая мишень, и не показано, могут ли активно индуцированные или пассивно введенные антитела обеспечить терапевтическое благоприятное действие.
Целью настоящего изобретения являются новые терапевтические стратегии для болезни Гентингтона, в особенности стратегии, которые выходят за рамки просто контроля симптомов. Другой целью являются средства предупреждения или отсрочки появления симптомов, связанных с болезнью Гентингтона.
Поэтому настоящее изобретение относится к вакцинам на основе пептидов и антителам для лечения болезни Гентингтона или отсрочки появления ее клинических симптомов. Поэтому настоящее изобретение относится к полностью новой терапевтической концепции, основанной на белке НТТ как терапевтической мишени. Настоящее изобретение относится к «стратегии уменьшения НТТ на основе антител» с двумя стратегическими вариантами, которые можно применять или по одному или можно объединить: активной иммунизации на основе пептидов НТТ и/или пассивной иммунизации на основе антител. Обе стратегии можно рассматривать как эквивалентные в отношении терапевтической мишени белка НТТ. В обеих стратегиях также применяется один и тот же (т.е. без фундаментальных различий) терапевтический принцип и тип действия, поскольку активным принципом, который борется с патогенным НТТ, в итоге всегда является антитело (или активно созданное анти-НТТ антитело или пассивно введенное антитело). Это уже показано далее в разделе примеров согласно настоящему изобретению путем экспериментов по активной иммунизации и экспериментов по фагоцитозу с моноклональными и поликлональными антителами, четко показывающими один и тот же конечный тип действия. Обе терапевтические стратегии по настоящему изобретению не раскрыты в известном уровне техники. Антитела к НТТ в настоящее время используют только в научных целях и для детекции НТТ в образцах.
Вакцинация и пассивная иммунизация согласно настоящему изобретению являются совершенно новым подходом к лечению болезни Гентингтона, и как показано, являются высокоэффективными по настоящему изобретению. Иммуносыворотки и антитела по настоящему изобретению специфически узнают части белка гентингтина, которые, как показано ранее, имеют различные роли в функции и патологии белка. В частности, активные вакцины индуцируют антитела, которые имеют целью определенные эпитопы вблизи ранее описанного сайта расщепления протеазой в аминокислотной позиции 586 белка гентингтина. Далее этот этиологически/функционально важный участок расщепления будет называться «каспазным участком 586». Graham et al., 2006, показали, что предотвращение расщепления протеазой генетическими средствами ингибирует фенотип у мышей, несущих мутантный трансген человеческого гентингтина. Также показано, что другие протеазы могут вовлекаться в расщепление в этом сайте in vivo (Wong et al., 2014). Так как расщепление каспазой является внутриклеточным процессом, стратегия вакцинации, имеющая целью этот участок, пока не рассматривалась или не демонстрировалась. Кроме того, активные вакцинации индуцируют антитела, которые имеют целью определенные эпитопы в так называемом богатом пролином участке белка-мишени.
В настоящем изобретении впервые предлагается воздействовать на гентингтин в плазме путем активной или пассивной вакцинации для борьбы с болезнью Гентингтона. До сих пор (внеклеточный) плазменный гентингтин не рассматривался как мишень для лечения этой болезни. Более того, настоящее изобретение предлагает вероятный тип механизмов действия (но без ограничения изобретения такими механизмами) на основании анализа фагоцитоза in vitro и снижения уровней НТТ in vivo у вакцинированных животных и фенотипических эффектов у животных моделей, обеспечивая убедительное Р.О.С. (подтверждение концепции), показывая, что нацеливание на плазменный НТТ также благоприятно для больных людей.
Кроме того, настоящее изобретение относится к специфическим таргетным участкам и образованным пептидам, которые обеспечивают мишеньспецифическую иммунную реакцию, и которые вводятся в состав выявляющих иммунную реакцию фармацевтических композиций по настоящему изобретению, в особенности, для выявления подходящих реакций на антитела у людей. По ходу настоящего изобретения определены коровые эпитопы наиболее релевантных пептидов для выявления таких иммунных реакций. Применение таких коровых эпитопов (соответствующих субфрагментам соответствующих пептидов для вакцинации) является центром иммуногенных композиций и вакцин по настоящему изобретению. Пептиды, используемые в настоящем изобретении для выявления специфических иммунных реакций (в особенности в качестве вакцин), следовательно, состоят из или включают такие коровые эпитопы, и могут быть введены in vivo одни или в комбинации. В разделе примеров такие пептиды по настоящему изобретению уже показаны как благоприятные на заслуживающих доверия и признанных трансгенных мышиных моделях. Кроме того, также предлагаются пептиды, образованные из каспазного участка 586 НТТ, которые используются так же, как иммуногенные композиции, и также используются для обеспечения и индукции антител (АВ), которые ингибируют расщепление протеазой, такой как, например, каспаза 6, или другие протеазы (Wong et al., 2014). Пептиды по настоящему изобретению также применяют для генерации различных моноклональных антител (mAB), которые также применимы при диагностике и терапии болезни Гентингтона, в особенности, для пассивной вакцинации (одни или в комбинации по аналогии с активной вакцинацией), в качестве инструмента и (совместно) диагностических средств, а также зонда для анализа на ингибирование каспазы 6 (пептиды, которые ингибируют расщепление каспазами в каспазном участке 586), и т.д.
Термины «гентингтин», «белок гентингтин» или «НТТ», используемые в настоящем описании, относятся к продукту экспрессии гена гентингтина. Подробности о белке доступны (и упоминаются в настоящем описании) под номером Р42858 (HD_HUMAN) в базе данных UniProtKB/Swiss-Prot (версия 148, последнее изменение 14 мая 2014). Из-за изменений в участке полиQ, начиная с аминокислотной позиции 18 НТТ, сайт расщепления каспазой упоминается в записи базы данных UniPort как находящийся между аминокислотами 584 и 585. В научной литературе и также в настоящем описании сайт расщепления каспазой упоминается как находящийся между аминокислотными остатками 586 и 587 (т.е. после «VLO» и перед «GTD», т.е. между D и G). Соответственно, «участок расщепления С6» или «участок расщепления С6 586» согласно настоящему изобретению соответствует аминокислоте 584 в записи базы данных Р42858 HD_HUMAN) UniProtKB/Swiss-Prot.
Вакцины по настоящему изобретению также имеют мишенью второй функционально определенный участок гентингтина, называемый доменом PRR (производное от Proline-Rich Region (участок, богатый пролином)). Ранее показано, что этот участок вовлекается во внутримолекулярные взаимодействия пролина, такие как, например, с PACSIN1 (Modregger et al., 2002), и оценен как потенциально таргетный участок интрател с использованием одноцепочечных фрагментов Fv, которые противодействуют изменению состояний внутриклеточной среды (Southwell et al., 2011).
В одном воплощении изобретения пептидные вакцины по изобретению индуцируют специфическую иммунную реакцию против гентингтина, например, как показано в примере 1, у реципиента, способного к опосредованию фагоцитоза (агрегированного) гентингтина или его фрагментов, обеспечивая посредством этого терапевтическое действие, например, как показано в примере 3, фигура 9, и примере 8, которое не отмечалось при лечении болезни Гентингтона в известном уровне техники какими-либо антителами или относящимся к вакцинам подходом. В другом воплощении изобретения антитела по изобретению можно использовать для пассивной иммунизации против белка гентингтина по аналогии с подходом с активной иммунизацией, на основании того факта, что генерированные моноклональные антитела происходят от тех же пептидов и узнают те же мишени, например, как показано в примерах 1, 4 и 5.
Кроме того, настоящее изобретение также раскрывает применение его воплощений для выбора лекарственного средства, а также в способе диагностики и контроля развития болезни Гентингтона.
Настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, содержащей образованный из гентингтина пептид, при этом пептид предоставляется в иммуногенной форме, т.е. такой, какая выявляет иммунную реакцию у человека, которому композицию вводят (в форме, когда антитела, направленные на пептид, продуцируются у человека). Предпочтительно пептид сочетают с носителем, предпочтительно, белковым носителем, или предоставляют в суспензии, в частности, суспензии масло-в-воде, так, чтобы предоставить пептид в иммуногенной форме. Композицию «вакцина» по настоящему изобретению поэтому также можно рассматривать как «иммуногенную композицию», т.е. композицию, которая выявляет иммунную реакцию у человека, к которому композицию применяют. Однако известно, что способность выявлять иммунную реакцию у человека может существенно меняться в пределах популяции, поэтому для цели настоящего изобретения ее относят к «иммуногенной композиции», если у по меньшей мере 10%, предпочтительно, у по меньшей мере 20%, предпочтительнее, у по меньшей мере 30%, в особенности, у по меньшей мере 50% индивидуумов в данной популяции детектируется иммунная реакция после доставки иммуногенной композиции по настоящему изобретению, например, иммунной системой индивидуума образуются антитела, специфические для доставленных пептидов.
Настоящее изобретение раскрывает иммуногенные пептиды белка НТТ, включающие p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), особенно производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37) и p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), предпочтительно для применения при вакцинации против симптомов, вызванных болезнью Гентингтона, или для отсрочки начала заболевания. Остаток «С» в этих последовательностях всегда используют (и вводят) в качестве линкера; этот цистеиновый линкер в N- или С-конце (как любой другой линкер, такой как -GC, -GGC, -KC, -KCC, -KKC, -KKG, -KGC, -KCG, -KKCG, -KKGC (и их N-концевые варианты, такие как CG-, CGG- и т.д.) или подобные комбинации цистеина с аминокислотами, такими как, например, бета-аланин или лизин в качестве спейсера, который используют, например, в пептидах р6775 или р6768, р9394, р9395, р9396 или р9297, соответственно, или как другие химические группы, которые обеспечивают функцию линкера или спейсера или улучшают растворимость пептидов без препятствия иммунологическим свойствам) может присутствовать или нет или предоставляться альтернативно по С- или N-концу пептида (т.е. другому концу пептидной цепи). Такие комбинации линкерных пептидов с улучшением растворимости обеспечиваются, например, в производных лизина р9394-р9397. В других воплощениях линкер также может быть предоставлен в иных аминокислотных позициях, чем N- или С-конец, например, по аминокислоте с функциональной группой, такой как серин, лизин, аргинин, тирозин, треонин, аспарагиновая или глутаминовая кислота, аспарагин или глутамин, гистидин, метионин и т.д. (в особенности производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94), с существенно улучшенными практическими функциональными свойствами); однако в таких воплощениях необходимо тщательно наблюдать, чтобы иммунологические свойства пептидов не испытывали серьезных препятствий от такого соединения (о возможности определения вариаций по размеру см., например, US 2010/0158933 А1).
Настоящее изобретение раскрывает пептиды, образованные от PRR и участка С6. Пептиды по настоящему изобретению имеют существенное благоприятное техническое соотношение, которое отражается несколькими общими признаками. (1) Все PRR- и С6-производные пептиды по настоящему изобретению разделяют общую определенную иммуногенность; их эпитопы определенно доступны (в отличие от, например, пептидов из того же N-конца или участка полиQ, как показано в примере 1); в частности, таргетинг их эпитопов весьма релевантен для достижения терапевтического действия при таргетинге НТТ, как видно из функциональных примеров in vivo в разделе примеров ниже. (2) Пептиды по настоящему изобретению картируются к участкам НТТ, для которых показана структурная/функциональная релевантность, такая как доступность протеаз или взаимодействие белок-белок. (3) Наиболее важно, что комбинаторный таргетинг таких двух эпитопов обеспечивает эффективное терапевтическое действие (в отличие от использования одного единственного эпитопа).
В связи с этим следует отметить, что для лечения НТТ не любой образованный от НТТ пептид можно использовать. Это также показано ниже в разделе примеров. Действительно, некоторые пептиды являются более иммуногенными, чем другие. Кроме того, комбинация некоторых пептидов показывает более сильную эффективность (например, комбинация пептидов участков PRR и С6, в отношении очищения плазмы от НТТ при двигательных действиях) наиболее вероятно из-за усиленного фагоцитоза из-за специфического узнавания одного или больше эпитопов гентингтина. Настоящее изобретение также относится к выгодным комбинациям пептидов для лечения НТТ. Как уже упоминалось, по настоящему изобретению предлагаются терапевтические вакцины, которые имеют мишенью (как терапевтический принцип) внеклеточный НТТ. Одно это уже является совершенно новой стратегией, так как НТТ давно известен как белок, образующий агрегаты внутри клеток.
Пептиды по настоящему изобретению и вакцины по настоящему изобретению, нацеленные на участки, определены (1) согласно доступности и (2) иммуногенности участков/пептидов. Кроме того, некоторые комбинации пептидов (как видно из примеров ниже) обеспечивают усиленный клиренс НТТ и фенотипические (двигательные и гистологические) изменения. Такие изменения можно объяснить антителами против гентингтина и опосредуемого Fc-рецептором фагоцитозом, как видно из примеров. Опосредуемый Fc-рецептором фагоцитоз требует поливалентности комплексов антиген-антитело, что объясняет более высокую эффективность таргетинга НТТ по двум или больше, а не одному единственному эпитопу: комплекс антиген/антитело, представляющий несколько частей Fc, более подходящих для очищения фагоцитозом, чем одна молекула НТТ, связанная одним отдельным антителом.
Это не раскрывается и не предполагается в известном уровне техники. Например, терапевтические пептиды рер4 и рер42, раскрытые в WO 2012/140376 А1, или пептиды, образованные от N-конца НТТ, описанные Miller et al. (2003), образованы из участков НТТ иных, чем пептиды по настоящему изобретению. Даже важнее, что такие пептиды, описанные, например, в WO 2012/140376 А1, никогда не предназначались или не использовались для какой-либо терапевтической цели, такой как, например, вакцины (т.е. для индукции В-клеточных иммунных реакций в живом организме). Взамен в WO 2012/140376 А1 раскрываются пептиды, которые можно использовать для ингибирования агрегации (т.е. путем прямого препятствования НТТ или его фрагментам), которое не связано с индукцией иммунных реакций, таких, какие необходимы для вакцины. Антитела в WO 2010/015592 А2 генерированы как зонды для детекции НТТ (или его агрегатов или фрагментов) в помощь анализу FRET или другим аналитическим способам in vitro. Цель для получения таких антител снова была экспериментальная/аналитическая или диагностическая, но не терапевтическая. Вообще ранее никогда не предполагалось и не демонстрировалось, что антитела против НТТ можно использовать для терапевтических целей для лечения болезни Гентингтона. Более того, никакие антитела из WO 2010/015592 А2 не пересекаются с пептидами для вакцинации по настоящему изобретению. Наконец, пептиды «НР1» и «НР2», упомянутые в работе Persichetti et al. (1995), использовались для генерации поликлональных антисывороток для того, чтобы предоставить аналитические зонды для детекции НТТ в экспериментальных условиях (например, таких, как детекция НТТ методом вестерн-блоттинга или IHC), но не для применения в вакцинной терапии. То же самое относится к моноклональным антителам, таким как, например, описанные Ko et al. (2001) (например, MW1-8), которые генерированы слитым белком полиQ-HTT-GST, но не для иммунизации пептидами.
Поэтому важно отметить, что пептиды по настоящему изобретению подходят для получения терапевтических вакцин, в то время как пептиды известного уровня техники для генерации поликлональных или моноклональных антител созданы для получения зондов для аналитического или диагностического применения.
Соответственно, пептиды по настоящему изобретению, полученные из участка PRR и С6, специфически благоприятны. Обе группы являются высоко иммуногенными, в особенности, SEQ ID Nos. 1, 4, 16, 19 и 28; и 2, 3, 6-18 и 20-50; причем SEQ ID Nos. 1-4 особенно предпочтительны из-за их функциональных свойств в экспериментах in vivo.
Другие предпочтительные иммуногенные пептиды выбирают из группы, включающей p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23) и p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), в которых N- или С-концевой цисетиновый остаток (С) может присутствовать или нет или предоставляться альтернативно в С- или N-конце; предпочтительно для применения при вакцинации против симптомов, вызванных болезнью Гентингтона, или для отсрочки начала заболевания.
Другие подходящие иммуногенные пептиды выбирают из группы, включающей p6763 (CaMATLEKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 25), p6764 (CaKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 26), p6765 (CEEQQRQQQQQQQ, SEQ ID No. 27), p6768 (QQQQQQPPPPPPPPaKKKC, SEQ ID No. 28), p7541 (CSEIVLD, SEQ ID No. 29), p7552 (CSSEIVLD, SEQ ID No. 30), p7562 (CDSSEIVLD, SEQ ID No. 31), p7563 (CSDSSEIVLD, SEQ ID No. 32), p7567 (CEIVLD, SEQ ID No. 33), p7568 (CIVLD, SEQ ID No. 34), p7605 (CSEIVL, SEQ ID No. 35), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p6776b (SEIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 38), p7752 (CAEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 39), p7753 (CSAIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 40), p7754 (CSEAVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 41), p7755 (CSEIALDGTDNQYL, SEQ ID No. 42), p7756 (CSEIVADGTDNQYL, SEQ ID No. 43), p7757 (CSEIVLAGTDNQYL, SEQ ID No. 44), p7758 (CSEIVLDATDNQYL, SEQ ID No. 45), p7745 (CSEIVLDGADNQYL, SEQ ID No. 46), p7746 (CSEIVLDGTANQYL, SEQ ID No. 47), p7747 (CSEIVLDGTDAQYL, SEQ ID No. 48), p7748 (CSEIVLDGTDNAYL, SEQ ID No. 49), p7749 (CSEIVLDGTDNQAL, SEQ ID No. 50) и p7750 (CSEIVLDGTDNQYA, SEQ ID No. 51), в которых N- или С-концевой цисетиновый остаток (С) может присутствовать или нет или предоставляться альтернативно в С- или N-конце.
Согласно настоящему изобретению иммуногенность представляет собой способность определенного вещества, такого как антиген или эпитоп, вызывать иммунную реакцию, например, выявлять антитела для данного пептида.
Предпочтительно такие пептиды имеют длину по меньшей мере в 7 аминокислот, и предпочтительные длины могут доходить до 16, предпочтительно до 14 или 20 аминокислотных остатков (например, 7 или 8-20, 7 или 8-16 и т.д.). «С» по N- или С-концу пептидов SEQ ID Nos. 1-51 предоставляется как линкер, который может присутствовать или нет или может быть заменен другой аминокислотой или химическим линкером, допускающим иммобилизацию на носителе. Другие соединяющие аминокислоты могут быть предоставлены по такому концу пептида или непосредственно перед «С» (цистеиновый остаток) или непосредственно после «С». «С» также может быть не включен, если нет необходимости в соединении, и/или если иммуногенность гарантирована иными средствами, чем «С»-связывание с носителем. С другой стороны, также можно использовать фрагменты таких пептидов по настоящему изобретению, предпочтительно минимальной длины в 7 аминокислотных остатков, в которые одна или больше аминокислот перед цистеиновым остатком не включаются. С другой стороны, полярные или имеющие заряд аминокислоты, не влияющие на иммуногенность и специфичность иммуногенного пептида, можно использовать для повышения растворимости пептида. Таким образом, пептид по настоящему изобретению включает 7-30, предпочтительно 7-20, предпочтительнее 7-16, наиболее предпочтительно 8 аминокислотных остатков. Однако согласно изобретению весьма удачно также можно использовать более длинные пептиды в качестве антигенов, индуцирующих антитела против НТТ, например, как показано в примере 1.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к вакцинам на основе пептидов для применения при лечении и/или предупреждении болезни Гентингтона, включающим по меньшей мере один иммуногенный пептид белка НТТ и, необязательно, также один или несколько адъювантов. Согласно настоящему изобретению вакцина представляет собой биологический препарат, который улучшает иммунитет к определенному заболеванию. Согласно настоящему изобретению адъювант представляет собой фармакологическое средство, которое модифицирует действие других средств, например, усиливает иммунную реакцию на доставленный пептидный эпитоп.
Предпочтительно, согласно настоящему изобретению, когда указанный по меньшей мере один иммуногенный пептид соединяют с фармацевтически приемлемым носителем, который предпочтительно представляет собой KLH. Вообще любой препарат, который способен промотировать реакцию Th1, посредством которой преимущественно индуцируется IgG1 и IgG3 у людей, предпочтителен по настоящему изобретению. Иммуногенный пептид может быть предоставлен в вакцине в изолированной (пептидной) форме или может быть соединен или включен в комплекс (ковалентно или нековалентно) с другими молекулами, такими как вещества фармацевтических носителей или полипептиды, липидные или углеводные структуры, в особенности, пептидные линкеры или белковые носители. Кроме того, пептидные линкеры или белковые носители могут состоять из или содержать Т-клеточные хелперные эпитопы, например, как показано в примерах 2 и 3.
Предпочтительно фармацевтически приемлемым носителем является KLH (гемоцианин Keyhole Limpet), столбнячный токсин, альбуминсвязывающий белок, бычий сывороточный альбумин, дендример (MAP; Biol.Chem., 358: 581) один или в комбинации с веществами-адъювантами, описанными Singh & O'Hagan, 1999 (конкретно в таблице 1 названного документа) и O'Hagan & Valiante, 2003 (конкретно можно использовать иммунопотенцирующие соединения и системы доставки, описанные в указанной работе, или их смеси, такие как плохорастворимые композиции алюминия (например, гидроксид алюминия), фосфат алюминия МF59, фосфат кальция, цитокины (например, IL-2, IL-12, GM-CSF), сапонины (например, QS21), производные МОР, CpG oligos, IC31, LPS, MOL, сквален, D,L-альфа-токоферол (например, смешанный в системе масло-в-воде с забуференным фосфатом физиологическим раствором), полифосфазены, эмульсии (например, Фрейнда, SAF), липосомы, виросомы, искомы, кохлеаты, микрочастицы PLG, частицы полоксамеров, вирусоподобные частицы, неустойчивый при нагревании энтеротоксин (LT), холерный токсин (СТ), мутантные токсины (например, LTK63 и LTR72), микрочастицы и/или полимеризованные липосомы). В предпочтительном воплощении изобретения композиция НТТ-пептидной вакцины содержит гидроксид алюминия.
Вакцину, включающую пептид по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель, можно вводить любым подходящим способом применения, например, i.v., i.p., i.m., интраназальным, пероральным, подкожным и т.д., и любым подходящим устройством для доставки (O'Hagan & Valiante, 2003).
Типично вакцина содержит НТТ-пептид по настоящему изобретению в количестве 0,1 нг – 10 мг, предпочтительно 10 нг – 1 мг, в частности, 100 нг – 100 мкг, или с другой стороны, например, 100 фмоль – 10 мкмоль, предпочтительно, 10 пмоль – 1 мкмоль, в частности, 100 пмоль – 100 нмоль.
Вакцина также может включать типичные вспомогательные вещества, например, буферы, стабилизаторы и т.д.
Предупреждение болезни Гентингтона по настоящему изобретению определяется как предупреждение или отсрочка появления и/или начала симптомов, ассоциированных с болезнью Гентингтона, таких как двигательные и психические симптомы или иммуногенные и метаболические изменения у индивидуумов с предрасположенностью к развитию симптомов болезни Гентингтона на основании наличия у них повышенного числа повторов CAG в по меньшей мере одном аллеле НТТ.
Лечение болезни Гентингтона по настоящему изобретению определяется как уменьшение интенсивности двигательных симптомов, ассоциированных с болезнью Гентингтона, таких как хорея, и психических, или иммуногенных и метаболических изменений у индивидуумов, которые генетически идентифицированы как имеющие мутированный НТТ (т.е. индивидуумов, которые несут более 26 повторов CAG в по меньшей мере одном аллеле НТТ) и положительно диагностированы на болезнь Гентингтона на основании их симптомов и генотипа, так, как показано путем индукции изменений на животных моделях болезни Гентингтона, например, как в примерах 2 и 3.
Активная иммунизация, т.е. вакцинация, иммуногенными пептидами из НТТ по изобретению ведет к опсонизации белка-мишени НТТ и посредством этого индуцирует его специфический фагоцитоз. Опсонизация представляет собой процесс, с помощью которого антитела связываются с антигеном, таким как гентигтин, и следовательно маркируют его для иммунной реакции. Фагоциты связываются с Fc частью иммуноглобулинов и затем интернализуют маркированный антиген, например, как показано для антител против гентингтина PRR13 и С6-17 в примере 8.
Особенно предпочтительными по настоящему изобретению являются вакцины на основе пептидов, содержащие по меньшей мере один иммуногенный пептид, выявляющий иммунную реакцию против НТТ или его встречающегося в природе фрагмента, в особенности, фрагмента релевантности к болезни Гентингтона, для применения при предупреждении и/или лечении болезни Гентингтона, при этом указанный по меньшей мере один иммуногенный пептид белков НТТ выбирают из группы, включающей p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), в особенности, производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23), p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), p6763 (CaMATLEKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 25), p6764 (CaKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 26), p6765 (CEEQQRQQQQQQQ, SEQ ID No. 27), p6768 (QQQQQQPPPPPPPPaKKKC, SEQ ID No. 28), p7541 (CSEIVLD, SEQ ID No. 29), p7552 (CSSEIVLD, SEQ ID No. 30), p7562 (CDSSEIVLD, SEQ ID No. 31), p7563 (CSDSSEIVLD, SEQ ID No. 32), p7567 (CEIVLD, SEQ ID No. 33), p7568 (CIVLD, SEQ ID No. 34), p7605 (CSEIVL, SEQ ID No. 35), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p6776b (SEIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 38), p7752 (CAEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 39), p7753 (CSAIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 40), p7754 (CSEAVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 41), p7755 (CSEIALDGTDNQYL, SEQ ID No. 42), p7756 (CSEIVADGTDNQYL, SEQ ID No. 43), p7757 (CSEIVLAGTDNQYL, SEQ ID No. 44), p7758 (CSEIVLDATDNQYL, SEQ ID No. 45), p7745 (CSEIVLDGADNQYL, SEQ ID No. 46), p7746 (CSEIVLDGTANQYL, SEQ ID No. 47), p7747 (CSEIVLDGTDAQYL, SEQ ID No. 48), p7748 (CSEIVLDGTDNAYL, SEQ ID No. 49), p7749 (CSEIVLDGTDNQAL, SEQ ID No. 50) и p7750 (CSEIVLDGTDNQYA, SEQ ID No. 51), предпочтительно p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23) и p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), в особенности p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), в особенности, производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37) и p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), или пептиды, включающие по меньшей мере один из таких пептидов, предпочтительно общей длиной максимум в 50 аминокислотных остатков, предпочтительнее максимум в 30 аминокислотных остатков, еще предпочтительнее максимум в 20 аминокислотных остатков, в особенности максимум в 16 аминокислотных остатков. Специфически предпочтительные пептиды по настоящему изобретению могут иметь в длину от 6 до 10 аминокислотных остатков, например, 7, 8 или 9 аминокислотных остатков, в особенности, 9 аминокислотных остатков.
Настоящее изобретение также относится к фрагментам иммуногенных пептидов SEQ ID Nos. 1-51, которые содержат коровый эпитоп. Коровый эпитоп пептидов р6771, р6773 и р7543 идентифицирован в разделе примеров настоящего изобретения. Коровым эпитопом пептида p6771 или p6773 являются PPQAQPL (SEQ ID No. 78), PPQAQP (SEQ ID No. 79), QPLL (SEQ ID No. 80) и PQAQPLL (SEQ ID No. 81) и в особенности LLPQP (SEQ ID No. 77), соответственно. Коровым эпитопом пептида p7543 являются QYLGLQIG (SEQ ID No. 82), YLGLQIG (SEQ ID No. 83), DNQYLGLQIG (SEQ ID No. 84), DNQYLGL (SEQ ID No. 85) и YLGLQIG (SEQ ID No. 86), в особенности QYLGLQIG. Соответственно, предпочтительные иммуногенные пептиды по настоящему изобретению включают по меньшей мере один из таких коровых эпитопов и предпочтительно имеют максимальную длину в 30, предпочтительно в 20, в особенности в 16 аминокислотных остатков, при этом указанные пептиды предпочтительно используют для получения или идентификации специфических ингибиторов расщепления гентингтина С6, и при этом указанные специфические ингибиторы расщепления гентингтина С6 предпочтительно определяют как моноклональные антитела, поликлональные антисыворотки, фрагменты, полученные из моноклональных антител, такие как Fv’s, scFv's, F(ab), F(ab)2.
Согласно предпочтительному аспекту, настоящее изобретение относится к иммуногенной композиции, которую можно использовать в качестве активной вакцины, и которая включает по меньшей мере два иммуногенных пептида, раскрытых в настоящем изобретении. Предпочтительно композиция содержит по меньшей мере три таких пептида, предпочтительнее, по меньшей мере четыре таких пептида, в особенности, по меньшей мере пять таких пептидов. Предпочтительно по меньшей мере один из этих двух или больше пептидов выбирают из группы, включающей p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), в особенности производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37) и p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5). Также предпочтительно комбинировать по меньшей мере один пептид из участка «С6» с по меньшей мере одним пептидом из участка «PRR» (как раскрывается, например, в таблице 2). Специфически предпочтительной комбинацией является комбинация р7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3) с любым другим пептидом, конкретно, с SEQ ID Nos. 1, 2, 4 и 5. Особенно предпочтительной является комбинация р7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3) (или p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), особенно производных p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90)) с p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4) и p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3) с p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2).
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармакологической композиции, включающей поликлональную антисыворотку, специфически узнающую по меньшей мере один пептид белка НТТ, для применения в качестве вакцины при лечении и/или предупреждении болезни Гентингтона.
В настоящем изобретении термины «фармацевтический препарат» и «фармакологическая композиция» используются как взаимозаменяемые и относятся к композиции, которая предназначена и подходит для доставки людям. Такие препараты или композиции изготовляются соответственно GMP (надлежащая производственная практика), являются достаточно стерильными и упакованы согласно требованиям ЕМА и FDA, в особенности ЕМА.
Согласно настоящему изобретению антитела поликлональной антисыворотки можно очистить согласно методам, известным специалистам в данной области техники, такими как аффинная хроматография.
Фармакологическая композиция дополнительно может содержать фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент, с которым поликлональные антитела могут связываться или образовывать комплексы (ковалентно или нековалентно). Фармацевтическая композиция, включающая поликлональные антитела, может дополнительно содержать по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
Согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы антитела поликлональной антисыворотки приводили к опосредованным иммуноглобулинами эффекторным функциям, таким как, например, опсонизация и фагоцитоз белка НТТ, агрегированного белка или их фрагментов, как показано в примере 8. Для этого требуется иммуноглобулин, имеющий соответствующую предопсонофагоцитарную активность в своей Fc-части, кодированной определенными остатками сахаров, допускающими эффекторные функции опсонизации, фагоцитоза, комплементарного лизиса или киллинга NK-клетками в комбинации с блокирующей/изолирующей функцией для гентингтина дикого типа и мутанта гентингтина в растворимой, агрегированной или фрагментированной форме. Приводится пример, показывающий фагоцитарную активность, обеспечиваемую моноклональными телами из вакцины с р6773 или р7543 (пример 8).
В другом предпочтительном воплощении изобретения поликлональная антисыворотка, включенная в указанную фармакологическую композицию, создана против по меньшей мере одного пептида, выбранного из группы, включающей p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), в особенности производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23), p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), p6763 (CaMATLEKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 25), p6764 (CaKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 26), p6765 (CEEQQRQQQQQQQ, SEQ ID No. 27), p6768 (QQQQQQPPPPPPPPaKKKC, SEQ ID No. 28), p7541 (CSEIVLD, SEQ ID No. 29), p7552 (CSSEIVLD, SEQ ID No. 30), p7562 (CDSSEIVLD, SEQ ID No. 31), p7563 (CSDSSEIVLD, SEQ ID No. 32), p7567 (CEIVLD, SEQ ID No. 33), p7568 (CIVLD, SEQ ID No. 34), p7605 (CSEIVL, SEQ ID No. 35), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p6776b (SEIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 38), p7752 (CAEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 39), p7753 (CSAIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 40), p7754 (CSEAVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 41), p7755 (CSEIALDGTDNQYL, SEQ ID No. 42), p7756 (CSEIVADGTDNQYL, SEQ ID No. 43), p7757 (CSEIVLAGTDNQYL, SEQ ID No. 44), p7758 (CSEIVLDATDNQYL, SEQ ID No. 45), p7745 (CSEIVLDGADNQYL, SEQ ID No. 46), p7746 (CSEIVLDGTANQYL, SEQ ID No. 47), p7747 (CSEIVLDGTDAQYL, SEQ ID No. 48), p7748 (CSEIVLDGTDNAYL, SEQ ID No. 49), p7749 (CSEIVLDGTDNQAL, SEQ ID No. 50) и p7750 (CSEIVLDGTDNQYA, SEQ ID No. 51), предпочтительно p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23) и p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), в особенности p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37) и p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5).
В другом предпочтительном воплощении изобретения поликлональная антисыворотка, включенная в указанную фармакологическую композицию, которая создана против по меньшей мере одного пептида из р6773 (SEQ ID No. 1) и р6771 (SEQ ID No. 4), охватывает участок корового эпитопа, как показано в примере с тонким анализом иммуносывороток на эпитопы, например, как показано в примере 4. На основании анализа одной аминокислотной замены коровый эпитоп охватывает аминокислотные позиции, которые не могут быть заменены аланином или большинством других аминокислот без утраты связывания испытываемыми антителами, например, как поясняется в примере 4.
С другой стороны, или в комбинации, поликлональную антисыворотку, включенную в указанную фармакологическую композицию, создают против пептида р7543 (SEQ ID No. 3), охватывающего участки корового эпитопа, предоставленные в примере 4, как показывает тонкий анализ на эпитопы сывороток, полученных с пептидом р7543. На основании анализа аминокислотных замен пептидные позиции не могут быть поменяны без модификации узнавания эпитопа (по меньшей мере в участках корового эпитопа) соответствующими антителами, например, как поясняется в примере 4.
С другой стороны или в комбинации, поликлональную антисыворотку, включенную в указанную фармакологическую композицию, создают против пептида р7564 (SEQ ID No. 2), охватывающего участок корового эпитопа р7564, наследованного mAB M1D1, например, как показано в примере 5, фигура 17.
С другой стороны или в комбинации, поликлональную антисыворотку, включенную в указанную фармакологическую композицию, создают против пептида р67576 (SEQ ID No. 36), охватывающего участок корового эпитопа, например, как показано в примере 4, фигура 11.
Согласно другому аспекту, настоящее изобретение относится к моноклональным антителами против НТТ или его встречающихся в природе фрагментов, предпочтительно для применения при лечении болезни Гентингтона или для отсрочки появления симптомов этого заболевания. Моноклональные (так же, как поликлональные) антитела по настоящему изобретению предоставляются как «выделенные антитела». «Выделенным» антителом является антитело, которое отделено от компонента его природной окружающей среды. В некоторых воплощениях антитела очищают до чистоты более 95% или 99%, что определяют, например, электрофорезом (например, SDS-PAGE, изоэлектрическим фокусированием (IEF), капиллярным электрофорезом) или хроматографией (например, ионообменной хроматографией или ВЭЖХ с обращенной фазой). В случае моноклонального антитела также доступна нуклеиновая кислота, кодирующая антитело; поэтому настоящее изобретение также охватывает изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие такие антитела. «Выделенной» нуклеиновой кислотой называют молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от компонента ее природной окружающей среды. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в местоположении хромосомы, которое отличается от естественного местоположения хромосомы. Определение «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело против НТТ» относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновой кислоты, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или его фрагментов), включая такую(ие) молекулу(ы) нуклеиновой кислоты в одном векторе или отдельных векторах, и такая(ие) молекула(ы) нуклеиновой кислоты присутствует(ют) в одном или нескольких местах в клетке-хозяине.
Термин «моноклональное антитело», используемый в настоящем описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих встречающиеся в природе мутации и возникших во время получения препарата моноклональных антител, причем такие варианты как правило присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые типично включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты в антигене. Таким образом, определение «моноклональное» показывает характер антитела как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно истолковываться как требующее продуцирования антитела каким-либо определенным способом. Например, моноклональные антитела, используемые согласно настоящему изобретению, могут быть получены различными методами, включая, но не ограничиваясь перечисленным, метод гибридом, методы рекомбинантных ДНК, методы с фаговым, дрожжевым дисплеем или дисплеем млекопитающего, и методами с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть локусов иммуноглобулинов человека, причем такие методы и примеры других методов маркирования моноклональных антител описаны в настоящем описании.
В другом аспекте настоящее изобретение также относится к моноклональному антителу «PRR13», имеющему связывающий домен, способный к связыванию с эпитопом белка НТТ, имеющим последовательность «LLPQP», содержащуюся в пептиде р6773 (SEQ ID No. 1), в особенности, с коровым эпитопом LLPQP (SEQ ID No. 77). С помощью настоящего изобретения предоставляются mAB против такого минимального корового эпитопа, который получен экспериментами по настоящему изобретению, т.е. против корового эпитопа LLPQP (SEQ ID No. 77). В предпочтительном воплощении указанное моноклональное антитело характеризуется как являющееся моноклональным антителом (например, предпочтительно PRR13), которое включает вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий пептидную последовательность GYSFTDFY (SEQ ID No. 54), вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий IDPKNGDT (SEQ ID No. 55), вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий ATYYGYTMDY (SEQ ID No. 56), вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий SSVTSSY (SEQ ID No. 57), вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий STS (SEQ ID No. 58), и вариабельный участок легкой цепи, включающий HQYRRPPRT (SEQ ID No. 59), например, как показано в примере 5.
CDR представляют собой участки, определяющие комплементарность, и представляют различные участки антител, с помощью которых антитело связывается со своим специфическим эпитопом. Тип и номер тяжелой цепи определяет класс антитела, т.е. антитела IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно. Антитела также содержат две идентичные легкие цепи, которые могут быть типа лямбда или каппа.
Согласно настоящему изобретению моноклональные антитела предпочтительно представляют собой антитела, созданные методами инженерии, где CDR антител, не являющихся человеческими, переносят в каркас человеческого антитела и посредством этого адаптируют в последовательности, так что аффинность и специфичность мышиного антитела из исходной гибридомы по меньшей мере сохраняется, и иммуногенность Т-клеток и В-клеток к людям минимизируется (гуманизированные моноклональные антитела), биспецифические или химерные моноклональные антитела, антитела с усиленными эффекторными или стабилизирующими функциями, включающие Fc-рецепторы антител, несущих груз для эффекторных функций или диагностических маркерных функций. Антитела по настоящему изобретению являются предпочтительно человеческими антителами против НТТ.
«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует последовательности антитела, продуцированного человеком или человеческой клеткой, или образованного из источника, не являющегося человеческим, который использует репертуары человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Такое определение человеческого антитела специфически исключает гуманизированное антитело, включающее антигенсвязывающие остатки, не являющиеся человеческими. «Консенсусный человеческий каркас» представляет собой каркас, который представляет наиболее обычно встречающиеся аминокислотные остатки при селекции каркасных последовательностей VL или VН иммуноглобулинов человека. Как правило, селекцию последовательностей VL или VН иммуноглобулинов человека проводят из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу по Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. В одном воплощении для VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I по Kabat E.A. et al,, цит. выше. В одном воплощении для VH подгруппа представляет собой подгруппу III по Kabat E.A. et al,, цит. выше.
«Гуманизированное» антитело относят к химерному антителу, включающему аминокислотные остатки из HVR, не являющихся человеческими, и аминокислотные остатки из человеческих FR. «Каркас» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена иным, чем остатки гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR, как правило, оказываются в следующей последовательности в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4. В некоторых воплощениях гуманизированное антитело будет включать по существу все из по меньшей мере одного и типично двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все HVR (например, CDR) соответствуют доменам нечеловеческого антитела, и все или по существу все FR соответствуют FR человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может включать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей от человеческого антитела. «Гуманизированный вариант» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое претерпело гуманизацию. В одном предпочтительном воплощении мышиный HVR прививают на каркасный участок человеческого антитела и получают «гуманизированное антитело». Аминокислотная последовательность мышиного вариабельного участка выравнивают с коллекцией зародышевых V-генов антител и сортируют согласно идентичности и гомологии последовательностей. Акцепторную последовательность выбирают на основании высокой общей гомологии последовательностей и также, необязательно, присутствия правильных канонических остатков уже в акцепторной последовательности. Зародышевый V-ген кодирует только участок до начала HVR3 для тяжелой цепи и еще середину HVR3 легкой цепи. Поэтому гены зародышевых V-генов не выравнивают со всем V-доменом. Гуманизированная конструкция включает человеческие каркасы 1-3, мышиные HVR и последовательность человеческого каркаса 4, происходящую от JK4 человека, и последовательности JH4 для легкой и тяжелой цепи, соответственно. Перед селекцией одной определенной акцепторной последовательности можно определить так называемые канонические петлеобразные структуры донорского антитела. Такие канонические петлеобразные структуры определяются типом остатка, присутствующего в так называемых канонических позициях. Такие позиции находятся (частично) вне участков HVR, и следует поддерживать функционально эквивалент в конечной конструкции для того, чтобы сохранить конформацию HVR исходного (донорского) антитела. В WO 2004/006955 А1 описывается способ гуманизации антител, который включает стадии идентификации типов канонических HVR структур HVR в нечеловеческом «созревшем» антителе; получения библиотеки пептидной последовательности для вариабельных участков человеческого антитела; определения типов канонических структур HVR вариабельных участков в библиотеке и отбора человеческих последовательностей, в которых каноническая структура HVR такая же, как тип канонической структуры HVR нечеловеческого антитела в соответствующих местах в нечеловеческих и человеческих вариабельных участках. В итоге потенциальную акцепторную последовательность отбирают на основании высокой общей гомологии и, необязательно, кроме того присутствия правильных канонических остатков уже в акцепторной последовательности. В некоторых случаях простая прививка HVR приводит только к частичному сохранению специфичности связывания нечеловеческого антитела. Обнаружено, что по меньшей мере некоторые остатки нечеловеческого каркаса требуются для восстановления специфичности и также должны быть привиты на человеческий каркас, т.е. кроме введения нечеловеческих HVR следует получить так называемые «обратные мутации» (см., например, Queen et al., PNAS 86 (1989), 10029-10033). Такие специфические аминокислотные остатки каркаса принимают участие во взаимодействиях FR-HVR и стабилизируют конформацию (петлю) HVR. В некоторых случаях также вводят прямые мутации для того, чтобы лучше приблизиться к человеческой зародышевой последовательности. Таким образом, «гуманизированный вариант антитела по изобретению» (которое имеет, например, мышиное происхождение) относится к антителу, которое имеет основой последовательности мышиного антитела, в которых VH и VL гуманизированы вышеописанными стандартными методами (включая прививку HVR и, необязательно, последующий мутагенез некоторых аминокислот в каркасном участке и HVR-H1, HVR-H2, HVR-L1 или HVR-L2, в то время как HVR-H3 и HVR-L3 остаются немодифицированными).
Вообще, методы разработки антител, подходящих для лечения больных людей, из мышиных или других сначала отобранных mAB хорошо установлены (обзор в Safdari et al., 2013). Поэтому антитела, раскрытые в настоящем описании, можно подвергнуть таким разработанным способам для получения улучшенных антител путем применения таких признанных методов, в особенности методов на основе прививки CDR (таких как, например, рассматриваемые в Kim & Hong Methods Mol. Biol., 2012; 907: 237-45, или в Whitelegg N. & Rees AR, Antibody variable Regions: Towards a Unified modeling method. В Methods in Molecular Biology, Biotechnology and Medicine, (Ed. Lo, B), 2004; 248: 51-91), зародышевой гуманизации или «сверхгуманизации» (как рассматриваемые в Pelat T. еt al., Mini Rev. Med. Chem., 2009 Dec; 9(14): 1633-8) и вывертывания (таких как описанные Mader and Kunert et al., Prot. Eng. Des. Selec., 2010, 23, 947-954).
Термин «гипервариабельный участок» или «HVR», используемый в настоящем описании, относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными в последовательности («опредяющими комплементарность участками» или «CDR») и/или образуют структурно определенные петли («гипервариабельные петли») и/или содержат контактирующие с антигеном остатки («контакты с антигеном»). Как правило, антигены включают шесть HVR: три в VH (Н1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Примеры HVR раскрываются в настоящем описании.
Согласно настоящему изобретению также предоставляются антитела против НТТ, которые включают последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH) и/или последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), имеющие по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичность аминокислотным последовательностям SEQ ID Nos: 60-65. В некоторых воплощениях последовательность VH, имеющая по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции, соответственные эталонной последовательности, но антитело против НТТ, включающее такую последовательность, сохраняет способность связываться с НТТ, особенно с заданным эпитопом. В некоторых воплощениях в SEQ ID Nos: 60-65 в целом заменены, вставлены и/или делетированы 1-10 аминокислот. В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции имеют место в участках вне HVR (т.е. в FR).
Предпочтительные варианты антител против НТТ по настоящему изобретению i.a. раскрыты на фиг. 27 (т.е. варианты hPRR13-2 по -16 и hC6-17-2 по -16). Соответственно, антитела против НТТ с заменами аминокислот в каркасе H/L являются специфически предпочтительными согласно настоящему изобретению. Более того, все комбинации таких вариантов также специфически предпочтительны. Например, для тяжелой цепи антитела к PRR имеются 1 wt + 3 мутации, для легкой цепи также имеются 1 wt + 3 мутации. Это обеспечивает возможный интервал комбинаций 4х4 варианта, как отражено в таблице на фиг. 27. Для mAB huC6-17 предпочтительны следующие комбинации: легкая цепь - 1 wt + 1 мут; тяжелая - 1 wt + 7 мутаций, что дает в целом 16 вариантов.
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» по отношению к эталонной полипептидной последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и введения брешей при необходимости, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без рассмотрения каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивания с целью определения идентичности аминокислотных последовательностей можно добиться различными путями, которые известны специалистам в данной области техники, например, с использованием общедоступной компьютерной программы, такой как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR), или применения пакета программ EMBOSS парного выравнивания последовательностей «needle». Специалисты в данной области техники могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения величины в % идентичности аминокислотных последовательностей вычисляют с использованием выравнивания последовательностей по компьютерной программе «needle» пакета программ EMBOSS (широко доступного от European Molecular Biology Laboratory; Rice et al., EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite, Trends Genet. 2000 Jun; 16(6): 276-7, PMID: 10827456).
Программа needle может быть доступна на сайте http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/, или ее можно переслать для местной установки как часть пакета EMBOSS с http://emboss.sourceforge.net/. Она действует во многих широко используемых операционных системах UNIX, таких как Linux.
Для того, чтобы выровнять две белковые последовательности, программу needle предпочтительно использовать со следующими параметрами:
командная строка: needle -auto -stdout -asequence SEQUENCE_FILE_A -bsequence SEQUENCE_FILE_B -datafile EBLOSUM62 -gapopen 10.0 -gapextend 0.5 -endopen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair -sprotein1 -sprotein2 (Align_format: pair Report_file: stdout).
Идентичность аминокислотной последовательности в % заданной аминокислотной последовательности А с или против заданной аминокислотной последовательности В (которую альтернативно можно назвать как заданную аминокислотную последовательность А, которая имеет или включает некоторый % идентичности аминокислотной последовательности с или против заданной аминокислотной последовательности В) вычисляют следующим образом:
100 раз фракция X/Y,
где Х представляет собой число аминокислотных остатков, отмеченных как идентичные пары программой выравнивания последовательностей needle при выравнивании А и В по такой программе, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в В. Следует иметь в виду, что когда длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотных последовательностей А и В не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В по отношению к А.если конкретно не указано иное, все величины в % идентичности аминокислотных последовательностей, используемых в настоящем описании, получают как описано в предыдущем абзаце с использованием компьютерной программы ALIGN-2.
В некоторых воплощениях антитело по изобретению представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в US 4816567 A и в Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984), 6851-6855. В одном примере химерное антитело включает нечеловеческий вариабельный участок (например, вариабельный участок, полученный от мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, не являющегося человеком, такого как обезьяна) и константный участок человека. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело «переключенного класса», в котором класс или подкласс претерпел изменения от класса исходного антитела. Химерные антитела включают его антигенсвязывающие фрагменты.
В некоторых воплощениях химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Типично нечеловеческое антитело гуманизируют для уменьшения иммуногенности для людей, в то же время сохраняя специфичность и аффинность являющегося исходным нечеловеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело включает один или больше вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их части), происходят от последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно также будет включать по меньшей мере часть константного участка человека. В некоторых воплощениях некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела. Гуманизированные антитела и способы их получения, рассматриваются, например, в WO 2004/006955 А1 (подход через канонические структуры).
В некоторых воплощениях антитело по настоящему изобретению представляет собой человеческое антитело. Человеческие антитела можно получить с использованием различных методов, известных в технике. Человеческие антитела можно получить путем введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицировано для продуцирования интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными участками в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные типично содержат все или часть человеческих иммуноглобулиновых локусов, которые заменяют эндогенные иммуноглобулиновые локусы, или которые присутствуют вне хромосом или рандомизированно интегрированы в хромосомы животного. В таких трансгенных мышах эндогенные иммуноглобулиновые локусы, как правило, инактивированы. Для представления о способах получения человеческих антител от трансгенных животных см. Lonberg, Nat. Biotech., 23 (2005) 1117-1125, US 6075181 и 6150584, описывающих технологию XENOMOUSE™; US 5770429 A, описывающий технологию HuMab; US 7041870 A, описывающий технологию K-M MOUSE, и US 2007/0061900 A1, описывающий технологию VelociMouse. Человеческие вариабельные участки из интактных антител, генерированных такими животными, можно дополнительно модифицировать, например, объединяя с другим константным участком человека.
Человеческие антитела также можно получить методами на основе гибридом. Описаны клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для продуцирования человеческих моноклональных антител. Также в Li et al, PNAS, 103 (2006) 3557-3562, описаны человеческие антитела, полученные гибридомной технологией с В-клетками человека. Другие способы включают способы, описанные, например, в US 7189826 (описано продуцирование моноклональных человеческих антител из гибридомных клеточных линий), или получение технологией триом. Человеческие антитела также можно получить выделением клона FV последовательностей вариабельного домена, выбранных из библиотек фаговых дисплеев, происходящих от человека. Затем такие последовательности вариабельного домена можно комбинировать с нужным константным участком человека. Методы отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
Антитела по настоящему изобретению также можно выделить скринингом комбинаторных библиотек на антитела с нужной активностью или активностями. Например, ряд методов известен в технике для получения библиотек фаговых дисплеев и скрининга таких библиотек на антитела, обладающие нужными характеристиками связывания. Такие способы также описаны, например, в Fellouse, PNAS (2004), 12467-12472.
В некоторых способах с фаговыми дисплеями репертуары генов VH и VL клонируют отдельно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и произвольно рекомбинируют в фаговых библиотеках, которые затем можно скринировать на антигенсвязывающий фаг. Фаг типично отображает фрагменты антител или как одноцепочечные фрагменты Fv (scFv) или как фрагменты Fab. Библиотеки из иммунизированных источников обеспечивают высокоаффинные антитела к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. С другой стороны, можно клонировать первичный набор (например, из человека) и получить один источник антител для широкого ряда не-аутоантигенов и также аутоантигенов без какой-либо иммунизации. Наконец, первичные библиотеки также можно получить синтетически, клонируя неперестроенные сегменты V-гена из стволовых клеток и используя праймеры ПЦР, содержащие случайную последовательность, кодирующую высоковариабельные участки CDR3, и осуществить реаранжировку in vitro. Другие публикации, описывающие фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например, US 5750373 A, US 2005/0079574 A1, US 2005/0119455 A1, US 2005/0266000 A1, US 2007/0117126 A1, US 2007/0160598 A1, US 2007/0237764 A1, US 2007/0292936 A1 и US 2009/0002360 A1. Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, в настоящем описании считаются человеческими антителами или фрагментами человеческих антител.
В некоторых воплощениях антитело по настоящему изобретению представляет собой полиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Полиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичность связывания в отношении по меньшей мере двух сайтов. В некоторых воплощениях одна из специфичностей связывания является специфичностью для НТТ и другая для любого другого антигена. Биспецифические антитела также можно использовать для локализации цитотоксических агентов для клеток, которые экспрессируют НТТ. Биспецифические антитела можно получить в виде полноразмерных антител или фрагментов антител. Методы получения полиспецифических антител включают, но не ограничиваются перечисленным, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулинов, имеющих различную специфичность (WO 93/08829 A, US 5731168 A). Полиспецифические антитела также можно получить конструированием белков с использованием эффектов электростатического взаимодействия для получения Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009/089004 А); cшиванием двух или больше антител или фрагментов (например, US 4676980 А); с использованием лейциновых «молний» для получения биспецифических антител; с использованием технологии «диател» для получения фрагментов биспецифических антител (например, Holliger et al, PNAS 90 (1993), 6444-6448) и с использованием димеров одноцепочечных Fv (sFv); и получения триспецифических антител. Сюда также включены сконструированные антитела с тремя или больше функциональными антигенсвязывающими сайтами, включая «антитела осьминоги» (например, US 2006/0025576 А1). В настоящем описании антитело или фрагмент также включает «Fab двойного действия» или «DAF», включающий антигенсвязывающий сайт, который связывается с НТТ, а также с еще одним другим антигеном (см. US 2008/0069820 А1, например). Антитело или фрагмент в данном случае также включают полиспецифические антитела, описанные в WO 2009/080251 A, WO 2009/080252 A, WO 2009/080253 A, WO 2009/080254 A, WO 2010/112193 A, WO 2010/115589 A, WO 2010/136172 A, WO 2010/145792 A и WO 2010/145793 A.
В некоторых воплощениях рассматриваются варианты аминокислотных последовательностей антител по настоящему изобретению. Например, может быть желательно улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела можно получить путем введения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или пептидным синтезом. Такие модификации включают, например, делеции из и/или вставки в и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Можно осуществить любую комбинацию делеции, вставки и замены для достижения конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желательными характеристиками, например, связыванием антигена.
В некоторых воплощениях предоставляются варианты антител, имеющие одну или больше аминокислотных замен. Сайты, интересные для замещающего мутагенеза, включают HVR и FR. В следующей далее таблице показаны консервативные замены под заголовком «Предпочтительные замены». Более существенные изменения приводятся ниже при обращении к классам аминокислотных боковых цепей. Аминокислотные замены могут быть введены в представляющее интерес антитело и продукты, скринированные на нужную активность, например, сохраненное/улучшенное связывание антигена, уменьшенную иммуногенность или улучшенные ADCC или CDC.
Исходный остаток Пример замены Предпочтительная замена
Ala (A) Val, Leu, lle, Val
Arg (R) Lys, Gln, Asn Lys
Asn (N) Gln, His, Asp, Lys, Arg Gln
Asp (D) Glu, Asn Glu
Cys (C) Ser, Ala Ser
Gln (Q) Asn, Glu Asn
Glu (E) Asp, Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile (I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, Leu
норлейцин
Leu (L) Норлейцин, Ile, Val, Met, Ala, Phe lle
Lys (K) Arg, Gln, Asn Arg
Met (M) Leu, Phe, Ile Leu
Phe (F) Trp, Leu, Val, Ile, Ala, Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val, Ser Ser
Trp (W) Tyr, Phe Tyr
Tyr (Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val (V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala, норлейцин Leu
Аминокислоты можно сгруппировать согласно общим свойствам боковых цепей:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Неконсервативные замены повлекут за собой замену члена одного из таких классов на другой класс. Один тип заменяющего варианта включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка исходного антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(ые) вариант(ы), выбранный(ые) для дальнейшего исследования, будет(будут) иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) относительно исходного антитела и/или будет(будут) иметь по существу сохранившиеся некоторые биологические свойства исходного антитела. Примером заменяющего варианта является аффиннозрелое антитело, которое можно обычно получить, например, с использованием методов созревания аффинности на основе фагового дисплея, таких как описанные в настоящем описании. Коротко, один или больше остатков HVR мутируют, и вариантные антитела отображают на фаге и скринируют на определенную биологическую активность (например, аффинность связывания). Изменения (например, замены) можно сделать в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения можно сделать в «горячих точках» HVR, т.е. остатках, кодированных кодонами, которые претерпевают мутацию с высокой частотой во время соматического процесса созревания, и/или SDR (a-CDR), причем полученный вариант VH или VL проверяют на аффинность связывания. Созревание аффинности осуществляют путем конструирования и повторного выбора из вторичных библиотек. В некоторых воплощениях созревания аффинности вводят разнообразие в вариабельные гены, выбранные для созревания любым способом из ряда способов (например, ПЦР пониженной точности, перестройка цепей или сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов). Затем создают вторичную библиотеку. Затем библиотеку скринируют для идентификации любых вариантов антитела с нужной аффинностью. Другой способ введения разнообразия включает подходы, направленные на НVR, в которых рандомизируют некоторые остатки HVR (например, 4-6 остатков в какое-то время). Остатки НVR, вовлеченные в связывание антигена, можно специфически идентифицировать, например, с использованием аланинсканирующего мутагенеза или моделирования. Часто мишенями являются CDR-H3 и CDR-L3.
В некоторых воплощениях замены, вставки или делеции могут иметь место в пределах одного или нескольких HVR до тех пор, пока такие изменения не снижают существенно способность антитела связывать антиген. Например, консервативные замены (например, консервативные замены, представленные в настоящем описании), которые не снижают существенно аффинность связывания, можно осуществить в HVR. Такие изменения могут быть вне «горячих точек» HVR или SDR. В некоторых воплощениях последовательностей вариантов VН и VL, представленных выше, каждый HVR или не изменяется или содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен. Применимый способ идентификации остатков или участков антитела, которое может таргетным для мутагенеза, называется «аланинсканирующий мутагенез». В этом способе остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженных остатков, таких как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или заряженной отрицательно аминокислотой (например, аланином или полиаланином) для того, чтобы определить затрагивается ли взаимодействие антитела с антигеном. Можно ввести дополнительные замены в местоположениях аминокислот, демонстрирующих функциональную чувствительность к начальным заменам. С другой стороны или дополнительно, можно определить кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации контактных точек между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут быть намечены или исключены как кандидаты для замены. Варианты могут быть скринированы для определения того, имеют ли они нужные свойства. Вставки в аминокислотные последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, колеблющиеся по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сотню или больше остатков, а также вставки в последовательность одного или нескольких аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие варианты молекулы антитела с вставками включают слияние по N- или С-концу антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который повышает время полужизни антитела в сыворотке.
Сайт PRR (пролином богатый участок) гентингтина располагается вблизи последовательности полиQ белка. Из литературы известно, что участок PRR функционально релевантен белку гентингтину (Modregger et al., 2002). Показано, что интратело, полученное из библиотеки рекомбинантных scFv, имеющее целью участок PRR гентингтина в клетке, благоприятно для живой модели болезни Гентингтона (Southwell et al., 2011) за счет селективно усиливающегося внутриклеточного метаболизма мутантной формы белка НТТ. Моноклональные антитела, узнающие полипролиновые участки, фланкирующие участок PRR, описаны ранее как зонды (mAB MW7 по Ko et al., 2001), однако терапевтическое применение при болезни Гентингтона не рассматривается или не могло быть показано, поскольку низкая сложность его эпитопа, состоящего из полипролинового участка, не уникальна для гентингтина в протеоме человека. Главнее то, что ранее активный или пассивный таргетинг гентингтина с помощью антител или вакцин не рассматривался, поскольку гентингтин всегда считался внутриклеточной мишенью, подходящей только для внутриклеточного таргетинга. В отличие от моноклонального антитела MW7, которое связывает эпитопы с более чем 5 последовательными пролинами (Ko et al., 2001), mAB PRR13 по настоящему изобретению имеет сложный эпитоп и специфически и селективно связывается с его коровым эпитопом, содержащимся в р6773, например, как определено в примере 5.
Согласно настоящему изобретению в фармацевтической композиции, применяемой при предупреждении и/или лечении болезни Гентингтона, особенно предпочтительно использовать моноклональные антитела. Согласно настоящему изобретению фармацевтическая композиция, включающая моноклональные антитела, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты. Кроме того, фармацевтическая композиция, включающая моноклональные антитела по настоящему изобретению, может дополнительно содержать терапевтическое средство или может быть физически связана с терапевтическим средством. Такая фармацевтическая композиция также может быть составлена с адъювантом, предпочтительно гидроксидом алюминия.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, имеющему связывающий домен, способный связываться с пептидом белка НТТ, имеющим последовательность р7543 (SEQ ID No: 3), или предпочтительно коровый эпитоп С6-17, например, как определено в примере 4. В предпочтительном воплощении указанное моноклональное антитело характеризуется как представляющее собой моноклональное антитело (например, предпочтительно С6-17), которое включает вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий GYTFTEYT (SEQ ID No. 66), вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий INPNNGGT (SEQ ID No. 67), вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий ASLDGRDY (SEQ ID No. 68), вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий QSLLNSRTRKNY (SEQ ID No. 69), вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий WAS (SEQ ID No. 7ß), и вариабельный участок легкой цепи, включающий KQSYNLLT (SEQ ID No. 71), например, как показано в примере 5.
Согласно настоящему изобретению, каспазный участок 586 относится к участку белка НТТ, окружающему определенный ранее сайт расщепления каспазой в позиции 586 белка гентингтина, который чувствителен к расщеплению протеазами, такими как каспаза 2, 8 или 10 (Wong et al., 2014). Этиологическая роль расщепления протеазами в данном участке установлена ранее Graham et al., 2006, и предупреждение или уменьшение получающегося фрагмента гентингтина выяснены как благоприятные. В настоящем изобретении показано, что отдельные пептиды, полученные из этого участка, могут эффективно индуцировать антитела с неожиданно большей доступностью к гентингтину, чем соседние пептиды из того же участка, например, как показано в примерах 1 и 7. Антитела, генерированные такими пептидами, способны маскировать еще не идентифицированные эпитопы, причем посредством этого предупреждается расщепление протеазой. Так, антитела, ингибирующие расщепление каспазой в участке от 586, согласно примеру 7 также можно определить как ингибиторы сайтспецифического расщепления протеазами.
В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к моноклональному антителу, имеющему связывающий домен, способный связываться с пептидом белка НТТ, имеющим последовательность р7564 (SEQ ID No. 2), или предпочтительно эпитоп M1D1, например, согласно примеру 5, фигура 17, предпочтительно для применения для лечения болезни Гентингтона. В предпочтительном воплощении указанное моноклональное антитело характеризуется как представляющее собой моноклональное антитело (например, предпочтительно M1D1), которое включает вариабельный участок тяжелой цепи CDR1, включающий GFTFNTYA (SEQ ID No. 72), вариабельный участок тяжелой цепи CDR2, включающий IRSKSNNYAT (SEQ ID No. 73), вариабельный участок тяжелой цепи CDR3, включающий VRHGEYGNPWFAY (SEQ ID No. 74), вариабельный участок легкой цепи CDR1, включающий QSLVHSNGNTY (SEQ ID No. 75), вариабельный участок легкой цепи CDR2, включающий KVS (SEQ ID No. 76), и вариабельный участок легкой цепи, включающий SQSTHVPYT (SEQ ID No. 77), например, как описано в примере 5.
583
586
В отличие от моноклональных и поликлональных антител известного уровня техники, образованных от пептида IVLD, часто встречающегося в протеоме человека (Warby et al., 2008), антитело M1D1 узнает коровый эпитоп, состоящий из образованной от гентингтина последовательности SSEIVLD, содержащей свободную С-концевую аспарагиновую кислоту, что является уникальным в базе данных белков человека RefSeq, посредством чего обеспечивается высокая специфичность к расщепленному каспазами белку гентингтину, например, как показано в примере 4, фигура 12, и примере 5, фигура 17. В отличие от антитела по Warby et al. антитело по настоящему изобретению более специфично. Оно также имеет иной коровый эпитоп, чем «IVLD» (см. пример 1, фигура 3). Более высокая специфичность имеет место также из-за того факта, что «IVLD» (согласно Warby et al.) в протеоме человека встречается чаще, чем несколько сотен раз, в то время как эпитоп M1D1 встречается только один раз согласно анализу BLAST-RefSeq. M1D1 по настоящему изобретению представляет собой особый клон с уникальным CDR изотипом IgM.
Согласно предпочтительному воплощению антитело по настоящему изобретению включает следующие аминокислотные последовательности VH и VL:
консенсусная аминокислотная последовательность >C6-17 VH:
MGWSCIMLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGTRYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASLDGRDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVFPLA (SEQ ID No. 60);
консенсусная аминокислотная последовательность > C6-17 VL:
MVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYSCKQSYNLLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK (SEQ ID No. 61).
Согласно предпочтительному воплощению антитело по настоящему изобретению включает следующие аминокислотные последовательности VH и VL:
консенсусная аминокислотная последовательность >PRR13 VH:
MGWSWVMLFLLSGTGGVLSEVQLQQSAPELVKPGASVKMSCKASGYSFTDFYMKWVKQSHGKGLEWIGDIDPKNGDTFYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMQLNSLTTEDSAVYYCATYYGYTMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYF (SEQ ID No. 62);
консенсусная аминокислотная последовательность >PRR13 VL:
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVTSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYRRPPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPR (SEQ ID No. 63).
Согласно предпочтительному воплощению антитело по настоящему изобретению включает следующие аминокислотные последовательности VH и VL:
консенсусная аминокислотная последовательность >M1D1 VH:
MDFGLSWVFFVVFYQGVHCEVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGEYGNPWFAYWGQGTLVTVSAESQSFPNVFPL (SEQ ID No. 64);
консенсусная аминокислотная последовательность >M1D1 VL:
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK (SEQ ID No. 65).
Согласно предпочтительному воплощению антитело по настоящему изобретению представляет собой гуманизированное антитело, в особенности, антитело, включающее следующие аминокислотные последовательности VH и VL:
> hPRR13 VL (вариабельный участок тяжелой цепи):
EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCTASSSVTSSYLHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCHQYRRPPRTFGGGTKLEIKR (SEQ ID No.95);
> hPRR13 VH (вариабельный участок тяжелой цепи):
EVQLVESGPEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDFYMKWVQQAPGRGLEWMGDIDPKNGDTFYNQKFKGRVTMTADTSTGTAYMQLSSLTSEDTAVYFCASYYGYTMDYWGQGTTVTVAS (SEQ ID No.96);
> hC6-17 VL (вариабельный участок легкой цепи):
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCKQSYNLLTFGGGTKLEIK (SEQ ID No.97);
> hC6-17 VH (вариабельный участок тяжелой цепи):
Антитела по настоящему изобретению также могут быть предоставлены в виде лекарственных конъюгатов антител (т.е. в сочетании с молекулой, которая обеспечивает активность, например, которая усиливает фагоцитарные свойства mAB), например, подходящих для обеспечения улучшенной опсонофагоцитарной активности, такой как, например, модификация гликозилирования, или другие модификации, и т.д. Соответственно термин «антитело», используемый в настоящем описании, относится к антителу, специфическому к НТТ, в особенности к специфическому эпитопу НТТ (или его встречающимся в природе фрагментам). Настоящее изобретение также относится к связывающим НТТ белкам, которые имеют способность связываться с НТТ или эпитопами НТТ, раскрытыми в настоящем описании, например, к каркасному антигенсвязывающему белку. Каркасные антигенсвязывающие белки известны в технике, например, фибронектин и белки, созданные с анкириновыми повторами (DARP), используют как альтернативы каркасам для антигенсвязывающих доменов. В одном воплощении каркасный НТТ-связывающий белок выбирают из группы, включающей CTLA-4 (Evibody); липокалин; молекулы, образованные от белка А, такие как Z-домен белка А (Affibody, SpA), А-домен (Avimer/Maxibody); белки теплового шока, такие как GroEI и GroES; трансферин (trans-body); белок с анкириновым повтором (DARPin); пептид аптамер; лектиновый домен типа C (тетранектин); человеческий гамма-кристаллин и человеческий убиквитин (affilins); домены PDZ; домены скорпионовго токсина Кунитц-типа ингибиторов протеаз человека и фибронектин (адниктин); который подвергнут конструированию белка для того, чтобы получить связывание с лигандом иным, чем природный лиганд.
Антитела по настоящему изобретению можно вводить в любой подходящей дозировке, известной из схем приема других mAB или специфически оцененной и оптимизированной для данного индивидуума. Например, mAB по настоящему изобретению можно предоставить в виде лекарственной формы (или применять как дозировку) в количестве от 1 мг до 10 г, предпочтительно, 50 мг – 2 г, в частности, 100 мг – 1 г. Обычные дозировки можно также определить на основе массы тела пациента в кг, например, предпочтительные дозировки находятся в интервале 0,1 мг – 100 мг/кг массы тела, в особенности 1-10 мг/кг массы тела (на сеанс введения).
Специфически предпочтительное биспецифическое антитело включает участки связывания с более чем одним эпитопом НТТ, в особенности как с PRR-, так и с доменом 586 каспазного участка, определенными в настоящем описании.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к моноклональным антителам для применения в качестве зонда для скрининга лекарственных средств, который основан на детекции расщепленного гентингтина по сравнению с нерасщепленным или фрагментов или пептидов, полученных из него. В принципе M1D1 способен детектировать пептид р7564 в отличие от р7605 (как видно из примера 5, фигуры 16 и 17, соответственно), посредством чего обеспечивается способ количественного определения протеазной активности по релевантному сайту аспарагиновой кислоты 586 этого участка белка гентингтина.
В особенности предпочтительно применение mAB M1D1, раскрытого в настоящем изобретении, в качестве зондов для скринига лекарственных средств, допускающего различную детекцию расщепленного НТТ по сравнению с нерасщепленным. На основании анализа расщепления каспазой 6 по настоящему изобретению и показанного, например, в примере 10, возможен скрининг на AB или другие ингибирующие молекулы, которые специфически связываются с каспазным участком 586 гентингтина (как например, на фигуре 18), и посредством этого ингибируют доступ протеаз вообще к этому сайту (т.е. доступ протеаз в окружении этой позиции (ак 586), т.е. протеаз, имеющих целью этот сайт (а не другие сайты белка НТТ)). В таком анализе M1D1 используют в качестве зонда для того, чтобы различать гентингтин и его фрагменты, которые отщеплены ферментативно по аспарагиновой кислоте (позиция 586), или которые защищены от расщепления ингибитором расщепления, таким как указанные в примерах. Например, в анализе на ингибирование расщепления каспазами согласно примерам в настоящем изобретении С6-17 (и некоторые поликлональные антитела, как показано на фигуре 19) являются прототипичными ингибиторами. Использование такой ингибирующей активности С6-17 (или его производных, в особенности, внутриклеточных производных) в таких анализах или способах скрининга является предметом настоящего изобретения. Например, при скрининге ингибиторов каспазы 6 M1D1 может являться зондом, и С6-17 может представлять собой прототипичный ингибитор.
Особенно предпочтительно применение mAB С6-17 в качестве прототипичного ингибитора для ингибирования расщепления каспазами в этом участке белка гентингтина, т.е. в качестве положительного контрольного ингибитора в целях проверки по эталонному тесту для анализов на скрининг ингибиторов, как показано в примере 7, или в качестве основы для дериватизации ингибитора расщепления в формате происхождения от антитела, специфичном для участка расщепления каспазами 586 гентингтина, например, как показано в примере 7.
В еще одном воплощении настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro болезни Гентингтона у млекопитающего, включающему стадии определения уровня свободного, агрегированного, образовавшего комплексы или фрагментированного НТТ в образце от млекопитающего с использованием антител по настоящему изобретению, в особенности антител PRR13, M1D1 и С6-17, для того, чтобы диагностировать болезнь Гентингтона, контролировать развитие болезни или иного применения НТТ в качестве биомаркера, если уровень НТТ или ферментативно расщепленного НТТ в указанном образце повышается по сравнению с эталонным образцом от здоровых индивидуумов или индивидуумов, которые генетически не поражены болезнью Гентингтона. По ходу настоящего изобретения показано, что патология болезни Гентингтона также коррелирует с (низким) количеством НТТ, присутствующего в плазме и других жидкостях организма и тканевом материале. Определение изменений в таких (низких) уровнях НТТ становится возможным с антителами по настоящему изобретению, но конечно делает возможными другие методы после раскрытия настоящего изобретения, когда изменения в уровне НТТ коррелируют с заболеванием и статусом заболевания. Поэтому с помощью инструментов по настоящему изобретению возможно не только диагностировать болезнь, но также контролировать лечение заболевания.
Соответственно, настоящее изобретение относится к способу диагностики in vitro болезни Гентингтона у млекопитающего, включающему стадии
- определения уровня гентингтина дикого типа или мутированного или его фрагментов в образце от млекопитающего с использованием антител PRR13, M1D1 или С6-17 одних или в комбинации;
- диагностирования болезни Гентингтога, если уровень wt или мутированного гентингтина в указанном образце повышен по сравнению с эталонным образцом от здоровых индивидуумов, которые генетически не поражены болезнью Гентингтона;
- и, необязательно, контроля действия терапевтических стратегий по снижению гентингтина в образцах от пациентов с предстоящим проявлением или проявлением болезни Гентингтона, причем терапевтические стратегии предпочтительно выбирают из активной или пассивной вакцинации, в особенности, в курсе терапии для снижения гентингтина.
Согласно настоящему изобретению определение уровня мутированного НТТ в образце включает преимущественно анализы на основе иммунопреципитации или захвата, такие как твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA), твердофазный иммунный анализ (EIA), иммунопреципитацию на других поверхностях и носителях, таких как смолы и гранулы, масс-спектрометрию, анализы на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), вестерн-блоттинг или иммуногистохимию и анализы на основе иммунофлуоресценции, такие как анализы на основе FRET или подходящие методы визуализации (например, PET, SPECT) и проточную цитометрию или любые другие методы, известные специалисту в данной области техники. Кроме mAB по настоящему изобретению в такие диагностические анализы также можно вводить другие антитела к НТТ (например, антитела, уже описанные на известном уровне техники).
Согласно настоящему изобретению образец предпочтительно получают из спинномозговой жидкости (CSF), крови, плазмы, сыворотки, урины, слюны, пота или слезной жидкости, или других жидкостей организма или тканевых и клеточных экстрактов, в особенности, ткани головного мозга, мышечной ткани и клеток крови, где изменяется экспрессия и структура (мутантного) гентингтина.
Согласно настоящему изобретению млекопитающее предпочтительно представляет собой человека.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу определения in vitro стадии болезни Гентингтона или действия на млекопитающее новой таргетной для гентингтина терапии, такой как подход с активной или пассивной вакцинацией, включающему стадии
- определения уровня гентингтина дикого типа или мутированного или его фрагментов в образце от млекопитающего с использованием антител PRR13, M1D1 или С6-17 одних или в комбинации (такие антитела могут быть использованы одни или в комбинации для захвата белка гентингтина или фрагментов с последующей детекцией биохимическими метолами, масс-спектрометрией или другими аналитическими способами); и
- определения стадии болезни Гентингтона.
Такое определение также возможно через уровни НТТ у данного пациента. Это можно использовать для контроля за развитием заболевания путем сравнения (изменений) уровней НТТ у данного пациента со временем (относительное определение у одного и того же индивидуума), но также для начальной диагностики стадии заболевания (абсолютное определение в корреляции для контингента пациентов с контингентом пациентов с известным статусом заболевания). «Изменение уровней НТТ» будет, по меньшей мере при более длительном периоде лечения, представлять собой уменьшение уровней НТТ, так что, например, уровни НТТ в плазме у пациентов, которых лечат согласно настоящему изобретению, будут снижаться (как, например, отображено на фигуре 9). Однако также возможно, что у некоторых пациентов или на некоторой стадии заболевания при начале лечения может иметь место возрастание уровней НТТ. Тем не менее, это также показатель успешного лечения, поскольку, например, антитела могут парадоксально стабилизировать белок в плазме, но в то же время блокируют его патофизиологическую активность. В таком случае можно наблюдать парадоксальное начальное возрастание таргетного НТТ в плазме, хотя введены АВ против НТТ. Такое явление видно, например, в парадоксальном увеличении IgE после лечения анти-IgE. Другим примером являются антитела против гормона роста, которые ведут к неожиданному возрастанию или эффекту промотирования его роста из-за стабилизации.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу контроля за развитием болезни Гентингтона или контроля за эффективностью лечения болезни Гентингтона у млекопитающего, включающему стадии
- определения уровня мутированного НТТ в образце от млекопитающего с использованием PRR13, M1D1 и С6-17 согласно настоящему изобретению и
- определения развития болезни Гентингтона или эффективности лечения болезни Гентингтона путем сравнения полученного уровня мутированного НТТ с уровнем мутированного НТТ, полученным при первом измерении уровней мутированного НТТ, предпочтительно при измерении во время диагностики заболевания согласно симптомам, причем изменение (такое «изменение» обычно представляет собой уменьшение уровней НТТ, по меньшей мере при более длительном периоде, как пояснено выше) уровня НТТ является показателем успешной терапии и предпочтительно используется для цели прогноза и регулирования терапии.
Снова такой способ возможен благодаря настоящему изобретению, поскольку в настоящем изобретении впервые показана эффективность вакцин против НТТ. Также в способах in vitro определения стадии/контроля кроме mAB по настоящему изобретению в такие анализы можно включать также другие антитела к НТТ (например, антитела, которые уже описаны на известном уровне техники).
В этих способах по настоящему изобретению некритично различие между «здоровым» и «патологическим» НТТ (т.е. НТТ «дикого типа» или «мутированным»). Это означает, что антитела, которые не могут различить эти две формы (но связываются с обеими формами), можно использовать для определения уровня НТТ, и они вообще предпочтительны в таких способах.
В другом воплощении настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного иммуногенного пептида каспазного участка 586 гентингтина или другого участка НТТ, выбранного из группы, включающей p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), а особенности производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23), p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), p6763 (CaMATLEKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 25), p6764 (CaKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 26), p6765 (CEEQQRQQQQQQQ, SEQ ID No. 27), p6768 (QQQQQQPPPPPPPPaKKKC, SEQ ID No. 28), p7541 (CSEIVLD, SEQ ID No. 29), p7552 (CSSEIVLD, SEQ ID No. 30), p7562 (CDSSEIVLD, SEQ ID No. 31), p7563 (CSDSSEIVLD, SEQ ID No. 32), p7567 (CEIVLD, SEQ ID No. 33), p7568 (CIVLD, SEQ ID No. 34), p7605 (CSEIVL, SEQ ID No. 35), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p6776b (SEIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 38), p7752 (CAEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 39), p7753 (CSAIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 40), p7754 (CSEAVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 41), p7755 (CSEIALDGTDNQYL, SEQ ID No. 42), p7756 (CSEIVADGTDNQYL, SEQ ID No. 43), p7757 (CSEIVLAGTDNQYL, SEQ ID No. 44), p7758 (CSEIVLDATDNQYL, SEQ ID No. 45), p7745 (CSEIVLDGADNQYL, SEQ ID No. 46), p7746 (CSEIVLDGTANQYL, SEQ ID No. 47), p7747 (CSEIVLDGTDAQYL, SEQ ID No. 48), p7748 (CSEIVLDGTDNAYL, SEQ ID No. 49), p7749 (CSEIVLDGTDNQAL, SEQ ID No. 50), p7750 (CSEIVLDGTDNQYA, SEQ ID No. 51), preferably p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23) и p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), в особенности p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37) и p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), для изготовления лекарственного средства для предупреждения или лечения болезни Гентингтона.
Предпочтительно такие пептиды имеют по меньшей мере 7 аминокислот, и предпочтительная длина может составлять до 16, предпочтительно до 14 или 20 аминокислотных остатков (например, от 7 или 8 до 20, от 7 или 8 до 16 и т.д.). Таким образом, пептид по настоящему изобретению включает 7-30, предпочтительно 7-20, предпочтительнее 7-16, наиболее предпочтительно 8 аминокислотных остатков. Однако согласно изобретению в качестве антигенов, индуцирующих анти-НТТ антитела, также весьма хорошо можно использовать более длинные пептиды.
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение относится к вакцинам на основе пептидов для применения при предупреждении и/или лечении болезни Гентингтона, включающим по меньшей мере один иммуногенный пептид каспазного участка 586 гентингтина, определенного выше.
Иммуногенные пептиды могут предоставляться в вакцине в выделенной (пептидной) форме или могут быть соединены или включены в комплекс (ковалентно или нековалентно) с другими молекулами, такими как фармацевтически приемлемые вещества носители или полипептиды, липидные или углеводные структуры, в особенности пептидные линкеры или белковые носители. Кроме того, пептидные линкеры или белковые носители могут состоять из или содержать Т-клеточные хелперные эпитопы.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к иммуногенным пептидам каспазного участка 586 гентингтина, определенного выше, при этом указанные пептиды используют для генерации или идентификации специфических ингибиторов расщепления каспазного участка 586, например, так, как показано в примере 7. Согласно настоящему изобретению, такие специфические ингибиторы расщепления каспазного участка 586 определяются как антитела и антисыворотки и структуры, образованные от них, такие как scFv's, Fab, Fd, Fab', F(ab')2, scFAB, интратела или Fv, или любого другого формата, в особенности, любого из предпочтительных форматов, раскрытых в настоящем описании.
В специфически предпочтительном воплощении настоящего изобретения антитела или антигенсвязывающие молекулы, таргетные для каспазного участка 586 гентингтина (НТТ), генерируются путем иммунизации вышеуказанными заданными вакцинами на основе пептидов, включающими по меньшей мере один иммуногенный пептид каспазного участка 586 гентингтина, как указано выше, или в комбинации, например, в виде, показанном в примерах 2 и 3.
Согласно настоящему изобретению такие антитела или антигенсвязывающие молекулы преимущественно используют в фармакологической композиции, применяемой при предупреждении и/или лечении болезни Гентингтона.
Изобретение дополнительно раскрывается с помощью следующих далее примеров и фигур, но без ограничения ими.
Фиг. 1 показывает иммуноанализ на титры методом ELISA пептидов-кандидатов, полученных из участка PRR и каспазного участка 586 гентингтина человека (идентифицированные как PRR и С6, соответственно), в сравнении с менее иммуногенным N-концевым и полиQ участком гентингтина.
Фиг. 2 показывает мышиные иммуносыворотки от вакцин на основе пептидов-кандидатов, полученных из участка PRR и каспазного участка 586 гентингтина человека, скринированные ELISA белка с захватом против N-концевого фрагмента рекомбинантного гентингтина из 610 аминокислот, захваченного из экстрактов временно трансфицированных клеток НЕК, показывая связывание и специфичность.
Фиг. 3 показывает, что отдельные иммуносыворотки, созданные против пептида для иммунизации р6776, дают ELISA сравнимые антипептидные титры против пептида для иммунизации (показано в logE50).
Фиг. 4 показывает, что, как отличие, те же иммуносыворотки, что на фиг. 3, показывают отличия в сигналах против рекомбинантного гентингтина, измеренных ELISA белка с захватом (OD; анти-recHTT610), посредством чего демонстрируется отдельный вариант иммунной реакции, несмотря на использование одного и того же иммуногена. Для возможного терапевтического применения интенсивность сигнала анти-recHTT610 и специфичность более релевантны, чем антипептидный титр.
Фиг. 5 показывает отсутствие изменений сигнала гентингтина (ЕМ48) у обработанных пептидной вакциной (р6771, р6773) мышей R6/1 при сравнении с мышами R6/1, обработанными носителем KLH или PBS, или мышами дикого типа, обработанными носителем KLH (числа показывают скорректированную оптическую плотность [COD] с использованием гентингтин-специфических mAB ЕМ48; величины ошибок = стандартное отклонение; n=10).
Фиг. 6 показывает, что в отличие от результатов на фиг. 5, число отмеченных синаптофизином синапсов (с использованием mAB SY38), содержащих мутированный НТТ человека (отмеченный ЕМ48), существенно уменьшается (р=0,001) у обработанных пептидной вакциной (р6771, р6773) мышей R6/1 при сравнении с мышами R6/1, обработанными носителем KLH, что предполагает благоприятное действие пептидов вакцины.
Фиг. 7 показывает, что с использованием нейронспецифического маркера NeuN у мышей R6/1 отображается существенное нейрозащитное действие в базальных ганглиях в обработанных пептидными вакцинами группах (р6771, р6773) при сравнении с контрольными группами, обработанными KLH или PBS.
Фиг. 8 показывает, что окрашивание GFAP базальных ганглиев показывает несущественное уменьшение астроглиальной активации у животных R6/1, обработанных пептидными вакцинами (р6771, р6773), при сравнении с контролями KLH и PBS, соответственно.
Фиг. 9 показывает определение гентингтина в плазме анализом FRET у животных wt и трансгенных животных YAC128 соответственно через 12 месяцев после обработки отдельной вакциной, комбинаторной вакциной или контролем носителем (KLH).
Фиг. 10 показывает результаты теста вращающегося стержня с обработанными и контрольными мышами YAC128, измеряющего латентность падения (показана в виде средней величины в секундах; n=25 животных на группу), выполненного через 4, 6, 9, 10 и 12 месяцев (показано в виде «среднее М4» - «среднее М12»), для трансгенных мышей YAC128, обработанных различными отдельными и комбинаторными вакцинами, как указано.
Фиг. 11 показывает коровый эпитоп 5 индуцированных вакциной с р6776 иммуносыороток, определенный сканированием аланиновой замены ELISA пептидов с использованием указанных пептидов, содержащих одни аминокислотные аланиновые замены.
Фиг. 12 показывает, что mAB M1D1 специфически узнает фрагмент рекомбинантного гентингтина со свободной аспарагиновой кислотой 586 в C-конце лучше, чем recHTT610.
Фиг. 13 показывает, что супернатанты с гибридом, полученных от мышей, иммунизированных пептидом р6773, обеспечивают устойчивое узнавание пептида для иммунизации 7 из 9 предварительно скринированных клонов-кандидатов при испытании ELISA пептидов.
Фиг. 14 показывает, что только 2 из 9 кандидатов в mAB, показанных на фиг. 13, а именно, PRR13 и PRR18, соответственно, специфически узнают рекомбинантный гентингтин при испытании recHTT610 ELISA с захватом.
Фиг. 15 показывает анализ на специфичность 4 предварительно отобранных mAB против гентингтина, полученных от мышей, иммунизированных пептидом р7543.
Фиг. 16 показывает скрининг предварительно отобранных mAB путем определения специфичности против «расщепленного» пептида р7564 ELISA пептидов.
Фиг. 17 показывает, что mAB M1D1 узнает пептиды гентингтина из каспазного участка 586 длиной по меньшей мере 7 АК, содержащие свободную С-концевую аспарагиновую кислоту.
Фиг. 18 показывает анализ in vitro на ингибирование расщепления каспазой 6 с целью скрининга ингибиторов протеаз со специфичностью к последовательностям гентингтина, включающим каспазный участок 586.
Фиг. 19 показывает анализ in vitro на ингибирование расщепления каспазой 6 18 поликлональных сывороток и mAB С6-17 как эталона с целью скрининга наиболее эффективных ингибиторов сайта каспазы.
Фиг. 20 показывает анализ in vitro на фагоцитоз, показывая фагоцитарную активность антител, полученных из PRR и участка расщепления каспазой 586 PRR13 и С6-17 соответственно, узнающих гентингтин человека.
Фиг. 21-26 показывают действие модифицированных вариантов пептидов по настоящему изобретению.
Фиг. 27-29 показывают примеры иммунизации антителами.
Примеры
Пример 1. Идентификация пептидов кандидатов для вакцин, таргетных для N-конца гентингтина
Вакцины и иммунизация животных
Пептиды для вакцин соединяют с носителем KLH с использованием GMBS в качестве аминсульфгидрильного кросс-линкера (Thermo/Pierce, кат.№ 22309) согласно стандартным рекомендованным процедурам для сочетания пептидов с цистеином. Конъюгированный пептид вводят в композицию с адъювантом алюмогидроксидным гелем (конечная концентрация 1 мкг/мл; альгидрогель; Brenntag, кат.№ 21645-51-2) с использованием 30 мкг соединенного пептида в объеме 200 мкл на инъекцию. Иммунизацию типично выполняют самкам мышей BALB (типично 5 мышей на группу в возрасте 10 недель) с использованием вышеописанных композиций. Контрольные группы иммунизируют неконъюгированным KLH и/или PBS и одним адъювантом. Животных вакцинируют 3-6 раз с регулярными интервалами в 2 недели, и плазму или сыворотку собирают за день до каждого введения и при конечном кровопускании.
ELISA пептидов
Вызванные вакцинами иммунные реакции у мышей определяют ELISA с использованием гепарина в качестве антикоагулянта. Планшеты ELISA (Nunc Maxisorb) сенсибилизируют активированным малеимидом BSA в качестве носителя, с которым цистеинсодержащие пептиды соединяются через устойчивые простые тиоэфирные связи. Для титрований добавляют разведения плазмы, и пептидспецифические антитела определяют количественно с помощью биотинилированного антимышиного IgG (Southern Biotech, кат.№ 1034-08) как детекцию антител, объединенных со стрептавидин-POD (Roche, кат.№ 1089153), и последующей цветной реакцией с использованием ABTS. Величины ЕС50 определяют с использованием кривой, подобранной методом 4-параметрической логистической регрессии с использованием GraphPad Prism (программа GraphPad).
Получение клеточных экстрактов, содержащих N-концевой фрагмент гентингтина recНТТ610
о
Синтезируют ДНК, перекрывающую кодирующий участок N-концевых 610 аминокислот человеческого белка гентингтина, наращенного двумя С-концевыми метками V5, и клонируют через сайты рестрикции XbaI и BamHI в эукариотный экспрессирующий вектор pCDH-EF1-MCS IRES Puro (SBI; кат.№ CD532A1), получая плазмиду precHTT610. Процедуры клонирования выполняют согласно стандартным процедурам молекулярной биологии, по существу, как указано изготовителями, включая расщепления рестриктазами и реакции лигирования (набор лигаз NEB Quick; кат.№ M2200L), бактериальную трансформацию после отбора клонов и анализ. Получение фрагментов ДНК из агарозных гелей выполняют с использованием стандартных наборов для очистки ДНК (Quiagen; кат.№ 27106). Freestyle клетки НЕК293 (Invitrogen; кат.№ R790-07) выращивают в среде, как указано изготовителем, и временно трансфицируют precHTT610 (или пустым вектором как контроль) с использованием MAXreagent (Invitrogen; кат.№ 16447-100) и Optimem (Gibco; кат.№ 31985). Через 24-48 час после трансфекции получают лизаты клеток НЕК путем лизиса клеток буфером для экстракции NP-40 (150 мM NaCl, 1% NP-40, 50 мM трис, pH 8), делят на аликвоты и хранят при -80С. Концентрации белка определяют с использованием Qubit (Invitrogen; кат.№ Q32866) согласно инструкциям изготовителя.
Детекция гентингтина ELISA белка с захватом
Связывание антигенов с N-концевым фрагментом НТТ610 определяют стандартной процедурой ELISA белка с захватом с использованием планшетов для ELISA Maxisorb™ (Thermo; кат.№ 439454), сенсибилизированных 50 мкл 1:5000 кроличьих mAB против V5 (Sigma, кат.№ V8137), с блокировкой буфером для блокировки (PBS, 1% BSA, 0,1% твина 20), с захватом рекомбинантного гентингтина из экстрактов клеток НЕК (белка в целом 100 нг/мкл) с последующей инкубацией с несколькими разведениями мышиных сывороток против НТТ (1:100; 1:300 и 1:900) или с mAB2166 как эталонными антителами (разведение 1:2000; Millipore, кат.№ MAB2166) в течение 1 часа при RT. Процедуры ELISA инкубации, промывки и детекции выполняют согласно стандартным процедурам.
Аффинная очистка антител от плазмы
Конъюгируют активированные иодацетилом магнитные гранулы (BcMag™; Bioclone, кат.№ FG-102) с цистеинсодержащими пептидами согласно протоколу изготовителя. После инкубации смеси плазма/mAB в течение 2 час при RT гранулы промывают крепким солевым буфером (PBS, 0,2% тритона Х-100, добавленного до конечной концентрации NaCl 350 мМ), и связанные антитела извлекают кислотным элюированием (4 стадии элюирования с 100 мМ глицином; рН 2,8). После нейтрализации HEPES в конечной концентрации 75 нМ, рН 8, антитела концентрируют до объема 100 мкл с использованием пробирок Spin-X UF500 (Corning, кат.№ CLS431478), и измеряют концентрацию белка так, как описано для белковых экстрактов.
Результаты
Иммунные сыворотки от вакцинированных пептидами гентингтина мышей показывают, что пептиды, полученные из богатого полипролином участка (PRR) и каспазного участка 586 (С6) белка гентингтина, как правило, дают более высокие титры в анализах пептидов ELISA (фигура 1), чем сравниваемые пептидные вакцины, полученные из полиглутаминового (полиQ) или N-концевого участка (содержащего первые 17 аминокислот) белка, соответственно. При анализе ELISA белков (фигура 2) иммуносыворотки, полученные с PRR и каспазным участком 586, показывают различия в интенсивности сигналов против белка гентингтина (фигура 4) и специфичность к белку (фигура 2), в зависимости от пептидных последовательностей пептидов для иммунизации, позволяя определить специфичных и иммуногенных кандидатов в пептиды для вакцин. Пептид р7564 индуцирует иммуносыворотки, специфично узнающие последовательности гентингтина, содержащие аспарагиновую кислоту в С-конце (фигура 3), причем посредством этого предоставляется способ направления к специфическому для болезни неоэпитопу гентингтина, генерированному расщеплением гентингтина каспазой в позиции 586. Фигура 1. Иммуноанализ на титры методом ELISA показывает, что пептиды-кандидаты, полученные из участка PRR и каспазного участка 586 гентингтина человека (идентифицированные как PRR и С6, соответственно), дают более средние титры выше 1:10000 у мышей, иммунизированных пептидными вакцинами, в отличие от животных, иммунизированных пептидами, полученными из полиглутаминого участка или N-конца (указанных как полиQ и Nter, соответственно), где средние титры ниже 1:10000. Титры выражают как средняя ЕС50 от 5 отдельных сывороток; величины ошибок показывают стандартные отклонения.
Фигура 2. Мышиные иммуносыворотки от вакцин на основе пептидов-кандидатов, полученных из участка PRR и каспазного участка 586 гентингтина человека, скринируют ELISA с захватом белка против рекомбинантного N-концевого фрагмента гентингтина из 610 аминокислот, захваченного из экстрактов временно трансфицированных клеток НЕК, показывая связывание и специфичность. Сигналы против гентингтина («recНТТ610») и сигналы фона («CTRL») различаются между различными пептидами, несмотря на однородное распределение антипептидных сигналов, видного из пептидов ELISA (показано на фигуре 1). Столбики, каждый, представляют сигналы от 5 объединенных иммуносывороток, испытанных или против рекомбинантного гентингтина (OD [экстракт recНТТ610]; светло-серые столбики) или контрольных экстрактов (OD [экстракт трансфицированного mock CTRL]; темно-серые столбики), соответственно, в сыворотках, разведенных 1:100.
Фигура 3. Отдельные иммуносыворотки, созданные против пептида для иммунизации р6776, дают ELISA сравнимые антипептидные титры против пептида для иммунизации (показано в виде logE50).
Фигура 4. В отличие от антипептидных титров (показных на фигуре 3), те же иммуносыворотки показывают отличия в сигналах против рекомбинантного гентингтина, измеренных ELISA белка с захватом (OD; анти-recHTT610), посредством чего демонстрируется отдельный вариант иммунной реакции в отношении таргетного белка, но не пептида. Это подчеркивает, что для отбора пептида для терапевтической вакцины сигналы против рекомбинантного HTT более релевантны, чем антипептидные титры.
Пример 2. Пептидная иммунизация трансгенных мышей R6/1, сверхэкспрессирующих первый экзон мутантного гентингтина человека, дает благоприятные изменения, отраженные нейропатологическими маркерами в базальных ганглиях
Мышей R6/1, экспрессирующих экзон 1 мутантного гентингтина человека под относительно строгим промотором (см. Bard et al., 2014, и цитированные работы), подвергают инъекциям вакцин в неделю 8, 10, 14 и 24, составленных как в примере 1. Для контроля за титрами собирают плазму в 8, 16, 28 и 32 недели.
Иммуногистохимия
Анализ методом иммуногистохимии выполняют по существу так, как описано в Mandler et al., 2014 [PMID: 24525765], с использованием антител EM48, SY38, GFAP и NeuN для детекции белка-маркера в базальных ганглиях (Millipore, кат.№ MAB5374, MAB5258, AB5804 и MAB377, соответственно.
Результаты
Иммуногистохимический анализ базальных ганглиев трансгенных мышей R6/1в возрасте 6 месяцев, иммунизированных пептидными вакцинами, сверхэкспрессирующих первый экзон мутантного гентингтина человека. Действие пептидной вакцинации сравнивают путем гистопатологического сравнения иммунизированных пептидом р6771 и р6773 с контрольными группами (KLH, PBS). Четкое нейрозащитное действие и эффект уменьшения гентингтина наблюдают в синапсах после вакцинации вакцинами, полученными на основе PRR.
Фигура 5. Отсутствуют изменения сигнала гентингтина (ЕМ48) у обработанных пептидной вакциной (р6771, р6773) мышей R6/1 при сравнении с мышами R6/1, обработанными носителем KLH или PBS, или мышами дикого типа, обработанными носителем KLH (числа показывают скорректированную оптическую плотность [COD] с использованием гентингтин-специфических mAB ЕМ48; величины ошибок = стандартное отклонение; n=10).
Фигура 6. Как отличие, число отмеченных синаптофизином синапсов (с использованием mAB SY38), содержащих мутированный НТТ человека (отмеченный ЕМ48), существенно уменьшается (р=0,001) у мышей R6/1, обработанных пептидной вакциной (р6771, р6773), при сравнении с мышами R6/1, обработанными носителем KLH (критерий Стъюдента; n=10 животных на группу обработки). Числа показывают отношение (в %) SY38-положительных синапсов, солокализующихся с сигналами ЕМ48 (величины ошибок = стандартное отклонение; COD = скорректированная оптическая плотность).
Фигура 7. С использованием нейронспецифического маркера NeuN у мышей R6/1 отображается существенное нейрозащитное действие в базальных ганглиях в обработанных пептидными вакцинами группах (р6771, р6773) при сравнении с контрольными группами, обработанными KLH или PBS (р=0,002, и р=0,01, соотв. критерию Стъюдента; n=10). Wt. KLH = контроль дикого типа; числа показывают скорректированную оптическую плотность (COD); величины ошибок = стандартное отклонение.
Фигура 8. Окрашивание GFAP базальных ганглиев показывает несущественное уменьшение астроглиальной активации у животных R6/1, обработанных пептидными вакцинами (р6771, р6773), при сравнении с контролями KLH и PBS, соответственно (COD = скорректированная оптическая плотность; wt. KLH = контроль дикого типа; величины ошибок = стандартное отклонение).
Пример 3. Обработка комбинаторными вакцинами ведет к уменьшенным уровням гентингтина в плазме у трансгенных мышей YAC128 в сочетании с двигательным улучшением при измерении в тесте вращающегося стержня у животных в возрасте 4-12 месяцев.
Иммунизации мышей YAC128
Собирают пять групп мышей YAC128, экспрессирующих полноразмерный мутантный гентингтин человека (см. Bard et al., 2014, и цитированные работы), и контрольных wt одного помета, состоящих из 150 в целом YAC128 и 25 в целом WT. Мышей WT обрабатывают контролем KLH. Мышей YAC128 делят на 6 групп обработки, включая 5 обработок экспериментальными пептидами и контрольную группу с KLH. Мыши получают обработку путем s.c. инъекции в возрасте 1, 2, 3, 6 и 9 месяцев, как в примере 1. Для комбинированных вакцин выдерживают общее количество пептида 30 мкг на дозу путем соединения двух пептидов 15 мкг + 15 мкг каждого на дозу объемом 200 мкл.
Определение уровней гентингтина в плазме у мышей YAC128, обработанных вакцинами
Уровни гентингтина в плазме определяют анализом для детекции на основе FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции), получая соотношение между двумя детектируемыми антителами, как описано ранее Weiss et al., 2009 [PMID: 19664996].
Тест вращающегося стержня
Двухмесячных мышей YAC128 обучают в течение 3 дней подряд на вращающемся стержне (Ugo Basille) с фиксированной скоростью 18 оборотов в минуту (об/мин). Мыши получают 3х 120 с тренировочных испытаний в день с интервалом в 1 час между испытаниями (ITI). Мышей, которые падают со стержня, сразу же заменяют для продолжения испытания. Регистрируют латентность до первого падения и число падений для каждого тренировочного испытания. Оценивают среднее из 3 испытаний для каждой мыши. Для длительного тестирования с вращающимся стержнем с 2-месячным интервалом мышей в возрасте от 2 до 12 месяцев используют ускоренную программу при 5 об/мин – 40 об/мин в течение 300 с. Мыши получают 3 испытания с 1-час IТI, и регистрируют латентность до первого падения. Вычисляют среднее из 3 тренировочных испытаний.
Результаты
Фигура 9. Определение гентингтина в плазме анализом FRET у животных wt и трансгенных животных YAC128 соответственно через 12 месяцев после обработки отдельной вакциной, комбинаторной вакциной или контролем носителем (KLH). Используют пептидные вакцины с PRR и каспазным участком 586 (р6771 и р7564-р7543 соответственно. Существенного уменьшения гентингтина в плазме можно достичь путем комбинированной обработки с использованием комбинаций пептидов р7543+р7564 или р7543+р6771, при сравнении с уровнями гентингтина в плазме при обработке контролем носителем ((KLH) (p<0,001 и p<0,91, соответственно; критерий Стъюдента; n=25 животных на группу). Числа показывают относительные единицы (FRET); величины ошибок = стандартные отклонения.
Фигура 10. Тест вращающегося стержня с обработанными и контрольными мышами YAC128 с измерением латентности падения (показана в виде средней величины в секундах; n=25 животных на группу), выполненный через 4, 6, 8, 10 и 12 месяцев (показано в виде «среднее М4» - «среднее М12»), для трансгенных мышей YAC128, обработанных различными отдельными и комбинаторными вакцинами, как указано. Примечательно, что группы комбинаторных вакцин «р7543+7564» и «р7543+р6771» показывают общую более хорошую эффективность в этом испытании при сравнении с группами, обработанными отдельными вакцинами р7543, р6771 и р7564, соответственно. Двигательное улучшение существенно в М4-М10 в группе комбинированной вакцины р7543+7564 при сравнении с контрольными группами носителя (p<0,03, 0,02, 0,01, соотв., критерий Стъюдента; n=25). Такой результат аналогичен уменьшению гентингтина, описанному на фигуре 9.
Пример 4. Картирование эпитопов моноклональных и поликлональных антител, полученных путем иммунизации пептидами р6773, р7564 и р7543.
Определение коровых эпитопов
Картирование пептидных эпитопов выполняют с использованием сканирования аланиновых замен путем определения величин титров (OD[EC50]) ELISA, как поясняется а примере 1, или с другой стороны, применяя микроанализы пептидов, описанные Stadler et al., 2008, или сканирование аминокислотных замен с помощью микроанализов пептидов. Коротко, пептиды, содержащие каждую позицию одиночных замен аланина, располагают на панелях, и потерю сигнала из-за замен в отдельных позициях определяют с помощью вторичных антител с флуоресцентными метками в комбинации с системой визуализации Odyssey Imaging System от LI-COR Biosciences. Это позволяет оценить вклад каждой отдельной аминокислоты пептида в эпитоп. С использованием такого способа картируют исходный пептид для иммунизации плюс располагают на микропанелях отдельные замененные варианты для каждой отдельной позиции пептида и гибридизируют с помощью соответствующих моноклональных антител или испытываемых иммунных сывороток. Когда полученный сигнал от аланинзамененного пептида уменьшается до менее 70% от сигнала от исходного пептида для иммунизации, соответствующую аланинзамещенную аминокислотную позицию определяют как часть корового эпитопа. Ниже приводятся последовательности полученного корового эпитопа из отдельных сывороток или mAB.
Результаты
Поликлональные аффинно очищенные антитела и моноклональные антитела получают от отдельных мышей, иммунизированных пептидами, происходящими от PRR-участка (включая р6771 и р6773), и пептидами, происходящими от каспазного участка 586 (включая р7543 и р6776). Эпитопы картируют с использованием сканирования. Коротко, эпитопы отдельных сывороток и моноклональные антитела определяют, испытывая антитела против пептидов с отдельными аминокислотными заменами для каждой позиции, используя или микропанели пептидов или обычный ELISA пептидов (как, например, на фигуре 11).
Выравнивания пептидов и эпитопов для происходящих от PRR-участка пептидов р6771 и р6773, определенных сканированием отдельных аминокислотных замен:
LPQPPPQAQPLLPC...пептид для иммунизации p6771,
LPQPPPQAQPLLPQPQPC.пептид для иммунизации p6773,
LLPQP...эпитоп, картированный для mAB PRR13,
PPQAQPL..... эпитоп, картированный для поликлональной p6773 сыворотки 1,
PPQAQP.....эпитоп, картированный для поликлональной p6773 сыворотки 2,
QPLL....эпитоп, картированный для поликлональной p6773 сыворотки 3,
PQAQPLL....эпитоп, картированный для поликлональной p6773 сыворотки 4
(SEQ ID Nos. 1, 4 и 77-81).
Выравнивание пептидов и эпитопов поликлональных иммуносывороток, индуцированных вакциной с р7543, и mAB С6-17, определенных сканированием отдельных аминокислотных замен:
GTDNQYLGLQIGC пептид для иммунизации p7543,
QYLGLQIG эпитоп, картированный для моноклонального AB C6-17,
YLGLQIG эпитоп, картированный для поликлональной p7543 сыворотки 1,
DNQYLGLQIG эпитоп, картированный для поликлональной p7543 сыворотки 2,
DNQYLGL эпитоп, картированный для поликлональной p7543 сыворотки 3,
YLGLQIG эпитоп, картированный для поликлональной p7543 сыворотки 4
(SEQ ID Nos. 3 и 82-86).
Выравнивания пептидов и эпитопов для пептидов, происходящих от каспазного участка 586, включающих аспарагиновую кислоту 586:
Фигура 11. Коровый эпитоп 5 индуцированных вакциной с р6776 иммуносыороток, определенный сканированием аланиновой замены ELISA пептидов с использованием указанных пептидов, содержащих одни аминокислотные аланиновые замены. Гибридизируют 5 сывороток (представленных темными-светлыми столбиками) с аланинзамененными пептидами, как указано (пептидные последовательности см. в таблице 1). В результате 2 из 5 животных показывают снижение сигнала от аланинзамененных пептидов p7754, p7756, p7757 и p7758, соответственно, причем посредством этого делинеаризуется коровый эпитоп с аминокислотной последовательностью IVLD для поликлональных антисывороток. Числа показывают соотношение титр OD (logEC50) [Ala-замененный пептид: пептид wt].
Картирование эпитопов антисывороток, индуцированных р7564, и mAB M1D1 приводится в примере 5, фигура 17.
Фигура 12. mAB M1D1 специфически узнает фрагмент рекомбинантного гентингтина со свободной аспарагиновой кислотой 586 в C-конце лучше, чем нерасщепленный recHTT610. ELISA белков (выполненный как в примере 1) использует рекомбинантный гентингтин длиной в 610 и 586 аминокислот (НТТ610 и НТТ586 соответственно). Величины указывают соотношение сигнала mAB M1D1 (OD; ELISA белков с захватом, как поясняется в примере 1) к сигналу контрольного антитела mAB 2166. Величины нормализованы к эталонному mAB 2166, узнающему внутренний эпитоп, присутствующий в обоих фрагментах как белок, нагружающий контроль.
Пример 5. Получение и характеризация моноклональных антител PRR13, C6-17 и M1D1
Моноклональные антитела
Для получения и выделения моноклональных антител используют набор для клонирования гибридом ClonaCell-HY Hybridoma Cloning Kit (STEMCELL technologies, кат.№ 28411) согласно инструкциям изготовителя. Коротко, выполняют слияние гибридом с миеломной клеточной линией SP2-0 под селекцией НАТ, и сначала скринируют супернатанты ELISA пептидов с использованием пептида для иммунизации, соответственно, и нерелевантного контрольного пептида для определения фона. В случае M1D1 используют ELISA против пептида р6776, содержащего свободную С-концевую аспарагиновую кислоту, для того, чтобы определить специфичность к расщепленному пептиду со свободной аспарагиновой кислотой, как указано в примере 5. Кандидатов в mAB очищают аффинно так, как описано, и испытывают против recНТТ610 ELISA белков, как указано в примере 1. Число скринированных слитых клонов типично составляет 500 для каждого слияния соответственно. Для секвенирования участка VH и VL экстрагируют мРНК из клонов слияний, обратно транскрибируют с использованием праймеров Oligo(dT) и амплифицируют ПЦР с использованием праймеров вариабельных доменов для амплификации участков как VH, так и VL. Продукты VH и VL клонируют с использованием стандартных процедур клонирования ПЦР (Invitrogen, кат.№ K4560-01), трансформируют в клетки ТОР10 и скринируют ПЦР на положительные трансформанты. Отобранные клоны пикируют и анализируют секвенированием ДНК на генетическом анализаторе АВI3130x1.
Аффинная очистка антител
Выделяют mAB и поликлональные антитела из гибридомного супернатанта (SN) и плазмы, соответственно, с использованием активированных иодацетилом магнитных гранул BcMag™ (Bioclone, FG-102), с которыми соединены цистеинсодержащие пептиды, согласно протоколу изготовителя. После инкубации плазмы/SN в течение 2 час при RT гранулы промывают крепким солевым буфером (PBS, 0,2% тритона Х-100, добавленного до конечной концентрации NaCl 350 мМ), и связанные антитела элюируют 4 раза кислым буфером для элюирования (Thermo, кат.№ 21004). После нейтрализации HEPES (конечная концентрация 75 нМ), рН 8, элюированные антитела концентрируют, и заменяют буфер на PBS до объема 100 мкл с использованием пробирок Spin-X UF500 (Corning, кат.№ CLS431478). Концентрации антител определяют с помощью системы Qubit (Invitrogen, кат.№ Q32866) согласно протоколу изготовителя.
Результаты
Антитела PRR13 получают методом гибридом с использованием пептида р6773 в качестве иммуногена. Пептид р6773 является одним из кандидатов для вакцин, который показывает благоприятное нейрозащитное действие при активной иммунизации трансгенных мышей R6/1, как показано в примере 2, и перекрывается р6771. PRR13 выбирают из 9 предварительно отобранных кандидатов mAB, узнающих пептид, происходящий от PRR, как показано на фигуре 11. Из кандидатов mAB, перечисленных на фигуре 13, PRR13 отбирают на основании его благоприятного соотношения сигнал/шум при гибридизации с рекомбинантным НТТ610, как показано на фигуре 12.
Фигура 13. Супернатанты с гибридом, полученных от мышей, иммунизированных пептидом р6773, обеспечивают устойчивое узнавание пептида для иммунизации 7 из 9 предварительно скринированных клонов-кандидатов при испытании ELISA пептидов.
Фигура 14. В отличие от специфических антипептидных сигналов (фигура 11), только 2 из 9 кандидатов в mAB, а именно, PRR13 и PRR18, специфически узнают рекомбинантный гентингтин при испытании recHTT610 ELISA с захватом (как поясняется в примере 1). Эти два кандидата обеспечивают отношение выступающего сигнала к шуму (т.е. >=4; вычисленный recHTT610-специфический сигнал: экстракты НЕК ctrl), и выбирают PRR13 для характеризации эпитопа (см. пример 4) и секвенирования вариабельных цепей (см. ниже). PRR13 определяют как мышиный IgG2a подтипа IgG.
Консенсусная аминокислотная последовательность VH >PRR13 (SEQ ID No. 62):
MGWSWVMLFLLSGTGGVLSEVQLQQSAPELVKPGASVKMSCKASGYSFTDFYMKWVKQSHGKGLEWIGDIDPKNGDTFYNQKFKGRATLTVDKSSSTAYMQLNSLTTEDSAVYYCATYYGYTMDYWGQGTSVTVSSAKTTAPSVYPLAPVCGDTTGSSVTLGCLVKGYF.
Консенсусная аминокислотная последовательность VL >PRR13 (SEQ ID No. 63):
MDFQVQIFSFLLISASVIMSRGQIVLTQSPAIMSASLGERVTMTCTASSSVTSSYLHWYQQKPGSSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCHQYRRPPRTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPR.
Антитела С6-17 получают методом гибридом с использованием пептида р7543 в качестве иммуногена. Пептид р7543 показывает благоприятное терапевтическое действие на трансгенных животных YAC128, как показано в примере 3. Хотя сигналы против recНТТ610 сравнимы у 4 предварительно выбранных mAB при таком скрининге, как показано на фигуре 13, отношения сигнала к шуму существенно различаются у таких кандидатов, как показано на фигуре 14, показывающей ELISA recНТТ610 с захватом (выполненного как в примере 1). На основании его специфичности и подтипа IgG (определенного как мышиный IgG2a), С6-17 отбирают для характеризации эпитопов (см. пример 4) и секвенирования вариабельной цепи.
Фигура 15. Анализ на специфичность 4 предварительно отобранных mAB против гентингтина, полученных от мышей, иммунизированных пептидом р7543. Величины для 4 кандидатов mAB представляют отношения сигнала к шуму рекомбинантного гентингтин-специфического OD-сигнала против контрольного экстракта (определяют ELISA белка с захватом, как поясняется в примере 1). mAB С6-17 обеспечивает наилучшее отношение сигнала к шуму.
Консенсусная аминокислотная последовательность VH >C6-17 (SEQ ID No. 60):
MGWSCIMLFLLSGTAGVLSEVQLQQSGPELVKPGASVKISCKTSGYTFTEYTMHWVKQSHGKSLEWIGGINPNNGGTRYNQKFKGKATLTVDRSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCASLDGRDYWGQGTTLTVSSAKTTAPSVFPLA.
Консенсусная аминокислотная последовательность VL > C6-17 (SEQ ID No. 61):
MVLMLLLLWVSGTCGDIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYSCKQSYNLLTFGAGTKLELKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK.
Антитела M1D1 получают методом гибридом с использованием пептида р7564 в качестве иммуногена. Пептид р7564 является одним из кандидатов для вакцины, который показывает благоприятное терапевтическое действие на трансгенных животных YAC128, как показано в примере 3. Моноклональные антитела M1D1 отбирают дифференциальным скринингом связывания с пептидами, содержащими свободную аспарагиновую кислоту в С-конце, против пептида, содержащего остаток такой аспарагиновой кислоты, заключенный в последовательность, такую как, например, р6776, как показано в примере 1, фигура 3. На основании его специфичности в отношении «расщепленной» последовательности моноклональное антитело M1D1 отбирают для дальнейшей характеризации эпитопов и секвенирования вариабельной цепи. Его типируют как мышиный IgM, и оно связывается с неоэпитопом фрагмента человеческого гентингтина, который генерируется при расщеплении белка или соответствующей пептидной последовательности каспазой 6 или любой другой протеазой, расщепляющей в аминокислотной позиции D586.
Фигура 16. Скрининг предварительно отобранных mAB путем определения специфичности против «расщепленного» пептида р7564 ELISA пептидов (как поясняется в примере 1). В отличие от, например, М1-С2, mAB M1D1 показывает самое благоприятное отношение OD-сигналов р7564 к р6776. Следовательно, M1D1 специфично к неоэпитопу, генерированному протеолитическим расщеплением в позиции 586. С-концевая аспарагиновая кислота р7564 соответствует С-концевой точке расщепления, генерируемой каспазой 6 и возможно другими каспазами. Посредством этого обеспечивается средство для детекции специфического расщепления в этом сайте по аналогии с поликлональными антителами, генерированными с помощью терапевтически благоприятного пептида р7564, как показано в примере 3.
Фигура 17. mAB M1D1 узнает пептиды гентингтина из участка расщепления каспазой 6 длиной по меньшей мере 7 АК, содержащие свободную С-концевую аспарагиновую кислоту. Напротив, более короткие пептиды или пептиды без свободной С-концевой аспарагиновой кислоты не распознаются или очень слабо распознаются M1D1, посредством чего демонстрируется специфичность этого моноклонального антитела к расщепленной последовательности со свободной СООН-концевой аспарагиновой кислотой, такой как позиция свободной аминокислоты 586 расщепленного белка гентингтина человека (столбики представляют OD из ELISA пептидов при концентрации mAB 1 нг/мкл; обозначения пептидов слева направо следующие: p7564, p7562, p7552, p7541, p7567, p7568, p7605, p6777).
Консенсусная аминокислотная последовательность VH >M1D1 (SEQ ID No. 64):
MDFGLSWVFFVVFYQGVHCEVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGEYGNPWFAYWGQGTLVTVSAESQSFPNVFPL.
Консенсусная аминокислотная последовательность VL >M1D1 (SEQ ID No. 65):
MKLPVRLLVLMFWIPASSSDVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPK.
Пример 6. Ингибиторы расщепления в каспазном сайте
Анализ in vitro на ингибирование расщепления каспазами
о
Анализы на ингибирование каспазы 6 выполняют с использованием планшетов для ELISA Maxisorb (Thermo; 439454), в соответствии с чем 50 мкл 20 нМ пептида в сочетании с BSA (как показано на фигуре 18) наносят в течение 1 часа пр RT с последующей одночасовой обработкой 150 мкл буфера для блокады (PBS, 1% BSA, 0,1% твина 20), инкубацией в течение 1 часа при RT с очищенными аффинно поликлональными сыворотками (3 нг/мкл) или очищенными аффинно mAB (10 нг/мкл), что соответственно показано. После нескольких промывок буфером для промывки (PBS, 0,1%BSA, 0,1% твина 20) в каждую лунку добавляют 5 Е фермента каспазы 6 (Enzo; BML SE170-5000), разведенного в 1х буфере для каспазы 6 (BioVision; 1068-80), и инкубируют в течение 30 мин при 37С. Количественное определение вновь выставленного эпитопа, образовавшегося путем расщепления пептида каспазой 6, что отображает степень доступности для каспазы, выполняют методом ELISA, как описано в примере 1, с использованием индуцированных пептидом р7564 антител для детекции эпитопа, содержащего свободную С-концевую аспарагиновую кислоту.
Результаты
Поликлональные антисыворотки, таргетные для каспазного участка 586 человеческого гентингтина, генерируются пептидными вакцинами, включающими пептиды, представленные на фигуре 19. Хотя даже все кандидаты в пептиды, полученные из каспазного участка 586, индуцируют сравнимые антипептидные титры (как показано в примере 1), относительное ингибирование каспазы 6 изменяется в зависимости от пептидной последовательности и эпитопа, посредством чего демонстрируются различия в свойствах доступности эпитопа и связывания между антителами, индуцированными пептидами из этого участка. В частности, пептиды, перекрывающие сайт расщепления каспазой 586, в частности, р6776 и р6777 (как показано на фигуре 18), и пептиды, картирующие С-конец сайта расщепления каспазой 586, такие как, например, р8555, р8862-и-р7543 и р8869 (как показано на фигуре 19), соответственно, дают эффективные ингибиторы каспазы 6, такие как определенные анализом на ингибирование расщепления каспазой. При сравнении ингибирующего действия антител, индуцировнных пептидами р8868, р8869, р8870 и р8871, с пептидами р7543, р8864, р8865 и р8866, соответственно, можно показать, что на ингибирующую активность полученных антител по существу не влияют N- или С-концевые позиции цистеина, в силу чего предполагается жесткость в отношении позиции иммобилизации линкера. На основании таких функциональностей in vitro в сочетании с эффектами in vivo, показанными в примере 3, и фагоцитарной активностью in vitro, показанной в примере 11, такие пептиды делинеаризуют функционально релевантный домен, таргетный для стратегий на основе антител, представленных в данной заявке на патент, включающей активную или пассивную иммунизацию, аферезис плазмы и конкурентное связывание ингибиторов расщепления с этим участком.
Фигура 18. Анализ in vitro на ингибирование расщепления каспазой 6 с целью скрининга ингибиторов протеаз со специфичностью к последовательностям гентингтина, перекрывающим каспазный участок 586. Иммобилизованный на планшете пептид-мишень, перекрывающий каспазный участок 586, инкубируют или с аффинно очищенными поликлональными антителами р6776, р6777 и р7565 как отрицательным контролем (каждый в концентрации 3 нг/мкл) или с моноклональными антителами С6-17, полученными при пептидной иммунизации р7543. Используют mAB С6-17 как прототипичный эталонный ингибитор в концентрации 10 нг/мкл. Пептид-мишень, защищенный антителами, инкубируют с ферментом каспазой 6 с последующей детекцией эффективности протеолитического расщепления пептида-мишени. Расщепленный пептид детектируют с использованием mAB M1D1 в качестве зонда, способного отличить последовательность нерасщепленного гентингтина от расщепленного, как описано в примере 5, фигура 18. Числа слева показывают % расщепления, показывающий, что без защиты расщепление происходит на 100%, в то время как mAB С6-17 и поликлональные антитела р6776 и р6777 уменьшают расщепление, как показано, защищая пептид-мишень от доступа каспазы.
Фигура 19. Анализ in vitro на ингибирование расщепления каспазой 6 18 поликлональных сывороток и mAB С6-17 как эталона с целью скрининга наиболее эффективных ингибиторов сайта каспазы. Анализ выполняют точно так, как показано в описании фигуры 18, в то время как соответственную активность расщепления каспазой определяют в связи с сигналом связывания мишени каждого отдельного испытываемого антитела. Поэтому величины показывают отношение соответственного ингибирования каспазного сайта (% расщепления, как на фигуре 10) к связыванию пептида-мишени, определенному ELISA пептидов (OD; как в описании к фигуре 1). Такой скрининг идентифицирует несколько пептидов, которые способны генерировать поликлональные антитела, способные ингибировать расщепление в каспазном сайте 586 независимо от позиции концевого цистеина, как показано пептидами p8868, p8869, p8870 и p8871, которые отличаются от пептидов p7543, p8864, p8865 и p8866, соответственно, только в отношении позиции их цистеина, но в равной степени активны как иммуногены. Несмотря на относительно однородное связывание антител с пептидным субстратом (как показано в примере 1, фигура 1), ингибирование расщепления различно среди индуцированных антител в зависимости от пептида-иммуногена.
Пример 7. Анализ in vitro на фагоцитоз, показывающий in vitro фагоцитарную активность для mAB PRR13 и С6-17, соответственно, подтверждающий механизм действия in vitro индуцированных вакцинами антител, специфически направленных против иммуногенных пептидов, происходящих от человеческого НТТ, как в испытаниях в примерах 2 (фигура 6) и 3 (фигура 9), соответственно
Анализ на фагоцитоз in vitro
6
о
Выделение и дифференцировку in vitro макрофагов выполняют по существу так, как описано в Zhang et al., 2008 [PMID: 19016445]. Коротко, клетки костного мозга, полученного из большеберцовых и бедренных костей 8-12-неделльных мышей BALB/с, делят на 2-3 10-см чашки для культивирования при плотности 20-30х10 клеток на чашку, дифференцируют 4 суток в RPMI/10% FCS + P/S в присутствии 20 нг/мл M-CSF (RD-Systems, кат.№ 416-ML-010), и перераспределяют в день 5 в 24-луночные планшеты для тканевых культур при плотности 150.000 клеток/лунка до дня 9. За 24 часа до фагоцитоза клетки подвергают голоданию в 500 мкл сред RPMI + 10% FCS + P/S в отсутствие М-CSF. Фагоцитоз выполняют с использованием парамагнитных микросфер с покрытием из стрептавидина (Bang Laboratories, кат.№ CP01F), нанесенным согласно инструкциям изготовителя, с биотинилированными по С-концу пептидами р9304 (р9304 (С6): b-GGGDYKDDDDKGAVTPSDSSEIVLDGTDNQYLGLQIGQPQDG (SEQ ID No. 52); p9305 (PRR): b-GGGDYKDDDDKGPPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPG (SEQ ID No. 53)), соответственно, и инкубируют с 10 нг/мкл антител в буфере для разведения в течение 1 часа при RT с последующей промывкой PBS с добавлением NaCl до конечной концентрации соли 350 нМ, промывкой PBS и конечным ресуспендированием в среде RPMI. Затем покрытые антителами флуоресцентные пептидные гранулы добавляют к дифференцированным макрофагам в течение 1 часа при 37С (в объеме 200 мкл, содержащем 0,5 мкг гранулы/лунку), и дают возможность поглощения фагоцитозом in vitro. После промывки и снятия клеток в охлажденном льдом PBS клетки промывают в буфере для FACS (1xPBS+1% BSA) и анализируют на сигнал флуоресценции стандартной процедурой FACS. Параллельно проверяют эффективность дифференцировки клеток с использованием маркерных антител против F4/80 (Biolegend, кат.№ B123109) и против CD11b (Biolegend, кат.№ B101219) на основании протокола, предложенного изготовителем.
Результаты
Фигура 20. Анализ in vitro на фагоцитоз, показывающий фагоцитарную активность антител, полученных из участка PRR и участка расщепления каспазой 586, PRR13 и С6-17 соответственно, узнающих гентингтин человека. Пептиды р9304 (полученные из участка расщепления каспазой 586; правая панель) и р9305 (полученные из участка PRR; левая панель) иммобилизуют на флуоресцентных стрептавидиновых гранулах, инкубируют с 5 нг/мкл антител и переносят на дифференцированные MCSF in vitro первичные мышиные макрофаги, полученные из костного мозга (в течение 7 дней), как указано в способах. После 1-часовой инкубации с гранулами клетки оценивают на специфическое поглощение гранул анализом FACS. Повышенный фагоцитоз гранул показывают mAB PRR13 (левая панель) и С6-17 (правая панель) при сравнении с изотипным контрольным антителом (т.е. мышиным IgG2a).
Таблица 1. Предпочтительные применения пептидов (название пептида/пептидный участок/пептидная последовательность (С для сочетания с белком-носителем; может быть получена по N- или С-концу пептида), за исключением p7564, p7541, p7552, p7562, p7563, p7567 или p7568, где для эпитопа требуется свободная С-концевая аспарагиновая кислота); причем в списке пептидов указываются обозначения наименований, картирование к участку белка (участок: Nter = Т-конец, полиQ = полиглутаминовый участок, PRR = участок, богатый полипролином, Ex1 = картирование к экзону 1, С6 = участок расщепления каспазой 586) и аминокислотная последовательность (однобуквенный код; Nter > Cter; а = бета-аланин, b = биотин).
Пример 8. Модифицированные варианты пептидов по настоящему изобретению
Следующие далее примеры предоставляют доказательства, что структурные или химические модификации пептидов могут улучшить растворимость, сопряжение или аналитические свойства, необходимые для получения вакцин и контроля качества без негативного влияния на иммуногенность, свойства эпитопов или качество иммунной реакции, для применения вакцин.
Как пример, к прототипичному пептиду-кандидату р7543 добавляют С- или N-концевые лизины, которые улучшают растворимость. Как описано в данном случае, добавление одного или нескольких концевых лизинов, например, в пептиды p9394 (KTDNQYLGLQIGKC), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC) или p9397 (KDNQYLGLQIKKGC), дает улучшенную растворимость. Растворимость пептидов классифицируют проверкой на «нерастворимый», «промежуточно растворимый» (т.е. видимый осадок после 5-мин центрифугирования при 14000 об/мин при RT) и «прозрачный» (т.е. после центрифугирования нет видимого осадка). В то время как пептид р7543 имеет промежуточную растворимость в воде, пептиды p9394, p9395, p9396 и p9397 дают прозрачные растворы и показывают хорошую растворимость в воде. Подобных улучшений растворимости можно достичь с использованием других пептидных модификаций, обычно используемых для улучшения растворимости в воде, таких как, например, добавление других заряженных аминокислот (например, аргининов) или добавление модификаций ПЭГ (PEG) к пептиду, без воздействия на эпитоп и иммуногенность пептида.
Данный пример показывает характеризацию модифицированных лизином вариантов пептидов по настоящему изобретению. Экспериментально определенные лизиновые варианты с улучшенной растворимостью включают, например, p9394 (KTDNQYLGLQIGKC), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC) или p9397 (KDNQYLGLQIKKGC), содержащие один или больше добавленных по N- или С-концу лизинов для того, чтобы улучшить растворимость.
Фигура 21
а) Иммуносыворотки от 5 животных (М1-М5), которые иммунизированы модифицированным по С-концу пептидом р9395 (как пример), показывают даже более сильное связывание с исходным пептидом с оригинальной последовательностью wt пептида (р7543) по сравнению с их связыванием с пептидом для иммунизации (р9395). Результаты отображены на фиг. 21. Ось Y показывает величины ЕС50 для ELISA пептидов, выполненного в примере 1.
Фигура 22
b) Иммуносыворотки, генерированные различными вакцинами на основе пептидов, модифицированных по концам (таких как р9397, р9395, р9396), узнают белок рекомбинантный НТТ с той же интенсивностью сигналов, как иммуносыворотка р7543 или контрольный mAB 2166 (1:2000), как показано. Результаты отображены на фиг. 22. Ось Y показывает сигналы антител (OD) против белка recНТТ160 по ELISA, как в примере 1.
Фигура 23
с) Анализ на эпитопы иммуносывороток от мышей, иммунизированных р7543 и р9395, с использованием прогулки вдоль 12-мерного одностадийного пептида с помощью ELISA пептидов (пептидные последовательности показаны на оси Х; ELISA пептидов описан выше) подтверждает соответствие эпитопов между пептидом р7543 и его лизинсодержащим вариантом р9395 соответственно. Результаты отображены на фиг. 23. Ось Y показывает величины ЕС50, полученные из стандартного ELISA пептидов
Фигура 24
d) Сравнение скоростей диссоциации (Off-rates) против биотин/стрептавидин-иммобилизованного белка рекомбинантного НТТ (recНТТ160 как в ELISA белков) сывороток, полученных иммунизацией р7543 и его вариантом р9395 (ось Х показывает скорости диссоциации, определенные поверхностным плазмонным резонансом без меток [SPR] согласно стандартным процедурам [см. ниже]; каждый раз 5 животных, обозначенных от -1 до -5, соответственно, как указано). Результаты отображены на фиг. 24. Как вывод, иммуносыворотки, образованные пептидом р9395, показывают более медленную скорость диссоциации (среднее 1, 66Е-4), чем иммуносыворотки, образованные р7543 (среднее 5,97Е-04). Ось Y показывает вычисленные величины скорости диссоциации.
о
Способ (для фигуры 24). SPR выполняют с использованием устройства BiaCore 2000. Меченные биотином по С-концу пептиды иммобилизуют согласно рекомендованным процедурам; для того, чтобы избежать неспецифического связывания на поверхности чипа, инъецируют для блокировки 2х 100 мкл 1 мкМ свободного D-биотина. Инъекции аналита выполняют с использованием потока 30 мкл/мин при температуре при анализе 25С с использованием HBS-буфера, рН 7,4, как рабочего буфера. Инъецируют 80 мкл каждого образца hu AB-SN неразбавленного и стерилизованного фильтрацией (0,22 мкм); мышиные контрольные mAB инъецируют в концентрации 2 мкг/мл, время диссоциации 500 с. Поверхность чипа регенерируют с использованием инъекций 15 мкл 10 мМ глицина, рН 2,1, с последующей нейтрализацией. Сенсограммы обработаны по эталону вычитанием сигналов от потока клеток эталона из сигналов потока клеток с иммобилизованным пептидом. Кривую пустого SN используют для вычитания фона. Для определения скорости диссоциации используют модель диссоциации Ленгмюра 1:1 программы BiaEvaluation.
Фигура 25
е) Сравнение in vitro функциональности иммуносыворотки от модифицированного пептида (р9395) с иммуносывороткой р7543 с использованием анализа in vitro на ингибирование каспазы 6, как поясняется в примере 7. Контроль изотип IgG определяет фоновую ингибирующую активность; в качестве положительного контроля используют mAB С6-17. Результаты отображены на фиг. 25. Как вывод, имунносыворотки р9395 ингибируют более эффективно (среднее ингибирование иммуносыворотками от 5 животных 14,2%, отображено по оси Y), чем сыворотки р7543 (среднее ингибирование от 5 животных 31,8%). Такие активности ингибирования in vitro согласуются с вышеуказанной скоростью диссоциации, определенной SPR, и данными по связыванию белка рекомбинантного НТТ, определенными ELISA.
Фигура 26
f) Сравнение in vitro функциональности иммуносывороток от модифицированного пептида (р9395) с иммуносыворотками р7543 с использованием анализа in vitro на фагоцитоз, как описано ниже. Результаты отображены на фиг. 26. Смесь 5 сывороток от животных, иммунизированных р9395, показывает фагоцитарную активность (выраженную как MFI; отражена на оси Y) при сравнении со смесью сывороток, полученных от 5 неспецифически иммунизированных животных, причем подтверждается фагоцитарная активность иммуносывороток, генерированных пептидами, модифицированными по концам.
Пример 9. Гуманизация антител
а) Гуманизация антител исходных антител PRR13 и hC6-17 соответственно предпочтительно следующая: прототипичные каркасы вариабельных участков тяжелой и легкой цепи используют для генерации рядов hPRR13-1 по -16 и hC6-17-1 по -16, соответственно. Ряды включают прототипичные варианты, содержащие модификации в одной или нескольких аминокислотных позициях в тяжелой (обозначены каркасная Н) и/или легкой цепи (обозначены каркасная L), как показано на фиг. 27. Числа отражают аминокислотные позиции в каркасных участках, указанных для гуманизированных антител ниже.
Способы. Синтезируют последовательности человеческих vLC и vHC и клонируют в экспрессирующий вектор pFUSE2ss CLg-hk (EcoRI/NheI) и pFUSEss CHIg-hG1 (EcoRI/BsiWI). Процедуры клонирования выполняют согласно стандартным процедурам молекулярной биологии, по существу так, как указывают изготовители, включая расщепление рестриктазами и реакции лигирования (набор лигаз NEB Quick; кат.№ M2200L), бактериальную трансформацию и последующие отбор и анализ клонов. Получение фрагментов ДНК из агарозных гелей выполняют с использованием стандартных наборов для очистки ДНК (Quiagen; кат.№ 27106). Freestyle клетки НЕК293 (Invitrogen; кат.№ R790-07) выращивают в среде так, как указывает изготовитель, и временно котрансфицируют различными комбинациями векторов тяжелой и легкой цепи hu AB, как показано в таблице. Клеточные культуры SN собирают через 24-48 час после трансфекции и концентрируют 1:30 с последующим обменом буфера (PBS) с использованием пробирок Spin-X UF500 (Corning, CLS431478). Концентрированные человеческие антитела-SN испытывают пептидом in vitro и на связывание белков с использованием ELISA (как в примере 1). Дальнейшую характеризацию выполняют так, как указано в этом примере 9.
Фигура 28
b) Как пример, узнавание белка recНТТ160 производными гуманизированного mAB PRR13 hPRR13-10, hPRR13-12 и hPRR13-14, содержащими показанные каркасные мутации, можно продемонстрировать ELISA белков (выполняемым как в примере 1; см. фиг 28. Ось Х отражает активность связывания Htt160 [OD]).
Фигура 29
с) Как пример, гуманизированное антитело из ряда hC6-17, модифицированное так, как предложено в а), сохраняет in vitro фагоцитарную активность. Анализ in vitro на фагоцитарную активность выполняют так, как описано выше, и показывают (см. фиг. 29), что в отличие от неинкубированных гранул (без АВ) или гранул нерелевантного изотипичного контроля (IgG), гранулы, инкубированные с mAB hC6-17-6, эффективно подвергаются фагоцитозу in vitro, посредством чего дается пример сохранения специфической функциональности против НТТ на основании узнавания НТТ антителами.
p6773 PRR LPQPPPQAQPLLPQPQPC ++ активн.вакц. генерация mAB
p7564 C6 CPSDSSEIVLD ++ активн.вакц. генерация mAB
p7543 C6 GTDNQYLGLQIGC ++ активн.вакц. генерация mAB ингибирование C6
p6771 PRR LPQPPPQAQPLLPC ++ активн.вакц. генерация mAB
p8346 Ex1 CGPAVAEEPLHRP ++ активн.вакц. генерация mAB
p8855 C6 SDSSEIVLDGTDC ++ активн.вакц. ингибирование C6
p8858 C6 EIVLDGTDNQYLC ++ активн.вакц. ингибирование C6
p8859 C6 IVLDGTDNQYLGC ++ активн.вакц. ингибирование C6
p8860 C6 VLDGTDNQYLGLC ++ активн.вакц. ингибирование C6
p8861 C6 LDGTDNQYLGLQC ++ активн.вакц. ингибирование C6
p8862 C6 DGTDNQYLGLQIGC ++ активн.вакц. ингибирование C6
p8869 C6 CTDNQYLGLQIGQ ++ активн.вакц. ингибирование C6
p8868 C6 CGTDNQYLGLQIG + активн.вакц. ингибирование C6
p8870 C6 CDNQYLGLQIGQP + активн.вакц. ингибирование C6
p8871 C6 CNQYLGLQIGQPQ + активн.вакц. ингибирование C6
p6772 PRR CPQLPQPPPQAQPLLP + активн.вакц. ингибирование C6
p8864 C6 TDNQYLGLQIGQC ++ активн.вакц.
p8865 C6 DNQYLGLQIGQPC ++ активн.вакц.
p6775 PRR PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC ++ активн.вакц.
p8854 C6 PSDSSEIVLDGTC + активн.вакц.
p8856 C6 DSSEIVLDGTDNC + активн.вакц.
p8857 C6 SEIVLDGTDNQYC + активн.вакц.
p8866 C6 NQYLGLQIGQPQC + активн.вакц.
p8867 C6 QYLGLQIGQPQDC + активн.вакц.
p6763 Nter CaMATLEKLMKAFESLKSFQ
p6764 Nter CaKLMKAFESLKSFQ
p6765 polyQ CEEQQRQQQQQQQ
p6768 polyQ QQQQQQPPPPPPPPaKKKC
p7541 C6 CSEIVLD
p7552 C6 CSSEIVLD
p7562 C6 CDSSEIVLD
p7563 C6 CSDSSEIVLD
p7565 C6 CSEIVLDGT
p7567 C6 CEIVLD
p7568 C6 CIVLD
p7605 C6 CSEIVL
p6776 C6 CSEIVLDGTDNQYL ++ активн.вакц. ингибирование C6
p6777 C6 CSDSSEIVLDGTDN ++ активн.вакц. ингибирование C6
p6776b C6 SEIVLDGTDNQYLC
p7752 C6 CAEIVLDGTDNQYL
p7753 C6 CSAIVLDGTDNQYL
p7754 C6 CSEAVLDGTDNQYL
p7755 C6 CSEIALDGTDNQYL
p7756 C6 CSEIVADGTDNQYL
p7757 C6 CSEIVLAGTDNQYL
p7758 C6 CSEIVLDATDNQYL
p7745 C6 CSEIVLDGADNQYL
p7746 C6 CSEIVLDGTANQYL
p7747 C6 CSEIVLDGTDAQYL
p7748 C6 CSEIVLDGTDNAYL
p7749 C6 CSEIVLDGTDNQAL
p7750 C6 CSEIVLDGTDNQYA
Особенно предпочтительны для активной вакцинации («++актив.вакц.»)
Предпочтительны для активной вакцинации («+актив.вакц.»)
Препочтительны для генерации АВ («генерация АВ»)
Препочтительны для ингибирования расщепления С6 («ингибирование С6»)
Литература
Bard et al., 2014, Journal of Biomolecular Screening, Volume 19(2), 191-204
Butler et al., 2012, Progress in Neurobiology, Volume 97(2): 190-204
Davidson, 2012, Molecular. Therapy, Volume 20(10): 1838
Ellrichmann et al., 2013, Clin. Dev. Immunol., 2013;2013:541259
Graham et al., 2010, J. Neurosci., Volume 30(45):15019-29
Ko et al., 2001, Brain Research. Bulletin, Volume 56(3/4): 319-329
Liu, 2007, Journal of the American Society for Mass Spectrometry. Volume 18(7):1249-64
Mandler et al.; Acta Neuropathologica 127 (2014): 861-879
Messer & Joshi, 2013, Neurotherapeutics, Volume 10: 447-458
Modregger et al., 2002, Human Molecular Genetics, Volume 11(21):2547-58
Novak & Tabrizi, 2011, International Review of Neurobiology, Volume 98: 297-323
O'Hagan & Valiante, 2003, Nature Reviews Drug Discovery, Volume 2(9): 727-35
Singh & O'Hagan, 1999, Nature Biotechnology, Volume 17(11): 1075-81
Southwell et al., 2011, PloS ONE, Volume 6(1): e16676
Stadler et al.; Angewandte Chemie International Edition England 2008; Vol 47(37):7132-5Tezel et al., 2012, Investigative Ophthalmology & Visual Science Volume 53(13): 8222-31
Träger et al., 2014, Brain, Volume 137(3):819-33
Warby et al., 2008, Human Molecular Genetics, Volume 17(15): 2390-2404
Weiss et al., Analytical Biochemistry 2009; Vol 395(1):8-15
Weiss et al., 2012, The Journal of Clinical Investigation, Volume 122(10): 3731-3736
Weiss et al. 2014, 9th Annual Huntington's Disease Therapeutics Conference (CHDI); Palm Springs USA, Abstract.
Wong et al. 2014; 9th Annual Huntington's Disease Therapeutics Conference (CHDI); Palm Springs USA, Abstract.
Yu et al., 2014, Trends in Pharmacological Sciences, Volume 35(2): 53-62
Zhang et al.; Current Protocols in Immunology 2008; Chapter: Unit–14.1
Zheng & Diamond, 2012, Progress in Molecular Biology and Translational Science, Volume 107: 189-214
Соответственно, следующие далее воплощения можно определить как предпочтительные воплощения настоящего изобретения.
1. Иммуногенный пептид белка НТТ, предпочтительно выбранный из группы, включающей p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), в особенности производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23), p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), p6763 (CaMATLEKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 25), p6764 (CaKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 26), p6765 (CEEQQRQQQQQQQ, SEQ ID No. 27), p6768 (QQQQQQPPPPPPPPaKKKC, SEQ ID No. 28), p7541 (CSEIVLD, SEQ ID No. 29), p7552 (CSSEIVLD, SEQ ID No. 30), p7562 (CDSSEIVLD, SEQ ID No. 31), p7563 (CSDSSEIVLD, SEQ ID No. 32), p7567 (CEIVLD, SEQ ID No. 33), p7568 (CIVLD, SEQ ID No. 34), p7605 (CSEIVL, SEQ ID No. 35), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p6776b (SEIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 38), p7752 (CAEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 39), p7753 (CSAIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 40), p7754 (CSEAVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 41), p7755 (CSEIALDGTDNQYL, SEQ ID No. 42), p7756 (CSEIVADGTDNQYL, SEQ ID No. 43), p7757 (CSEIVLAGTDNQYL, SEQ ID No. 44), p7758 (CSEIVLDATDNQYL, SEQ ID No. 45), p7745 (CSEIVLDGADNQYL, SEQ ID No. 46), p7746 (CSEIVLDGTANQYL, SEQ ID No. 47), p7747 (CSEIVLDGTDAQYL, SEQ ID No. 48), p7748 (CSEIVLDGTDNAYL, SEQ ID No. 49), p7749 (CSEIVLDGTDNQAL, SEQ ID No. 50) и p7750 (CSEIVLDGTDNQYA, SEQ ID No. 51), более предпочтительны p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23) и p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), в особенности p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37) и p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5); причем N- или С-концевой цистеиновый остаток (С) может присутствовать или нет или представляется альтернативно в С- или N-конце; или пептиды, включающие по меньшей мере один из таких пептидов с SEQ ID Nos. 1-51, предпочтительно общей длиной максимум в 50 аминокислотных остатков, более предпочтительны длиной максимум в 30 аминокислотных остатков, еще более предпочтительны длиной максимум в 20 аминокислотных остатков, в особенности длиной максимум в 16 аминокислотных остатков.
2. Вакцина на основе пептида для применения при лечении и/или предупреждении болезни Гентингтона, включающая по меньшей мере один иммуногенный пептид белка гентингтина (НТТ), предпочтительно, по меньшей мере один пептид, выбранный из пептидов воплощения 1, и, необязательно, также один или несколько адъювантов.
3. Вакцина на основе пептида для применения согласно воплощению 2, отличающаяся тем, что по меньшей мере один иммуногенный пептид соединен с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно KLH.
4. Вакцина на основе пептида для применения согласно воплощению 2 или 3, отличающаяся тем, что вакцину получают для внутривенного, подкожного, интрадермального или внутримышечного введения.
5. Вакцина на основе пептида для применения согласно любому из воплощений 2-4, отличающаяся тем, что вакцину получают с адъювантом, предпочтительно гидроксидом алюминия.
6. Вакцина на основе пептида согласно любому из воплощений 2-5, отличающаяся тем, что по меньшей мере один пептид содержится в вакцине в количестве от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно 10 нг – 1 мг, в частности, 100 нг – 100 мкг.
7. Вакцина на основе пептида для применения согласно воплощению 2 или 6, причем указанный по меньшей мере один иммуногенный пептид белков НТТ выбирают из группы согласно воплощению 1, предпочтительно при этом комбинацией является p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3) (или p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), в особенности производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90)), с по меньшей мере одним пептидом, выбранным из SEQ ID NOs 1, 2, 4 и 5, в особенности при этом комбинация включает или состоит из p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3) и p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4) или p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3) и p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), при этом N- или C-концевой цистеиновый остаток (C) может присутствовать или нет или представляться альтернативно в C- или N-конце.
8. Вакцина на основе пептида согласно любому из воплощений 2-7, отличающаяся тем, что включает по меньшей мере один пептид из участка «С6» НТТ и по меньшей мере один пептид из участка «PRR» НТТ, предпочтительно при этом по меньшей мере один пептид выбирают, каждый, из группы согласно таблице 2.
9. Фармацевтический препарат, включающий иммуногенный пептид согласно воплощению 1 или иммуногенный пептид, включающий или состоящий из корового эпитопа, выбранного из группы, включающей LLPQP (SEQ ID No. 77), PPQAQPL (SEQ ID No. 78), PPQAQP (SEQ ID No. 79), QPLL (SEQ ID No. 80) и PQAQPLL (SEQ ID No. 81), в особенности LLPQP, и QYLGLQIG (SEQ ID No. 82), YLGLQIG (SEQ ID No. 83), DNQYLGLQIG (SEQ ID No. 84), DNQYLGL (SEQ ID No. 85) и YLGLQIG (SEQ ID No. 86), в особенности QYLGLQIG; предпочтительно максимальной длиной в 30, предпочтительно, в 20, предпочтительнее в 16 аминокислотных остатков, в особенности, длиной в 6-10 аминокислотных остатков.
10. Фармацевтический препарат согласно воплощению 9, отличающийся тем, что является препаратом для вызывания иммунной реакции у индивидуума, в особенности индивидуума с болезнью Гентингтона.
11. Фармацевтический препарат согласно воплощению 9 или 10, отличающийся тем, что включает вакцину на основе пептида согласно любому из воплощений 2-8.
12. Фармацевтический препарат согласно любому из воплощений 9-11, отличающийся тем, что является препаратом для применения для выявления антител против НТТ у индивидуума, в особенности, индивидуума, имеющего болезнь Гентингтона.
13. Фармацевтический препарат согласно любому из воплощений 9-12, отличающийся тем, что его комбинируют с фармацевтическим препаратом антител против НТТ и предпочтительно вводят индивидууму отдельными процедурами введения.
14. Фармакологическая композиция, включающая поликлональное антитело, специфически узнающее по меньшей мере один иммуногенный пептид белка НТТ, для применения в качестве вакцины при лечении и/или предупреждении болезни Гентингтона.
16. Моноклональное антитело, имеющее связывающий домен, способный связываться с пептидом белка НТТ, имеющим последовательность р6773 (SEQ ID No. 1), в особенности, с коровым эпитопом LLPQP (SEQ ID No. 77).
17. Моноклональное антитело согласно воплощению 16, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело включает вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, включающий GYSFTDFY (SEQ ID No. 54), вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, включающий IDPKNGDT (SEQ ID No. 55), вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, включающий ATYYGYTMDY (SEQ ID No. 56), вариабельный участок CDR1 легкой цепи, включающий SSVTSSY (SEQ ID No. 57), вариабельный участок CDR2 легкой цепи, включающий STS (SEQ ID No. 58), вариабельный участок легкой цепи, включающий HQYRRPPRT (SEQ ID No. 59), причем указанное антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело PRR13.
18. Моноклональное антитело согласно воплощению 16 или 17, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело представляет собой человеческое, гуманизированное, биспецифическое или химерное моноклональное антитело.
19. Моноклональное антитело согласно любому из воплощений 16-18 для применения в фармацевтической композиции, применяемой при предупреждении и/или лечении болезни Гентингтона.
20. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 19, отличающееся тем, что указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
21. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 19 или 20, отличающееся тем, что указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
22. Моноклональное антитело для применения согласно любому из воплощений 19-21, отличающееся тем, что указанную композицию получают для внутривенного, подкожного, интрадермального или внутримышечного введения.
23. Моноклональное антитело для применения согласно любому из воплощений 19-22, отличающееся тем, что моноклональное антитело соединено с молекулой, которая усиливает фагоцитарные свойства.
24. Моноклональное антитело для применения согласно любому из воплощений 19-23, отличающееся тем, что моноклональное антитело содержится в указанной композиции в количестве от 1 мг до 10 г, предпочтительно 50 мг – 2 г, в частности, 100 мг – 1 г.
25. Моноклональное антитело, имеющее связывающий домен, способный связываться с пептидом белка НТТ, имеющим последовательность р7543 (SEQ ID No. 3).
26. Моноклональное антитело согласно воплощению 25, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело включает вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, включающий GYTFTEYT (SEQ ID No. 66), вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, включающий INPNNGGT (SEQ ID No. 67), вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, включающий ASLDGRDY (SEQ ID No. 68), вариабельный участок CDR1 легкой цепи, включающий QSLLNSRTRKNY SEQ ID No. 69), вариабельный участок CDR2 легкой цепи, включающий WAS (SEQ ID No. 70), и вариабельный участок легкой цепи, включающий KQSYNLLT (SEQ ID No. 71), причем указанное антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело С6-17.
27. Моноклональное антитело согласно воплощению 25 или 26, при этом моноклональное антитело представляет собой человеческое, гуманизированное, биспецифическое или химерное моноклональное антитело, предпочтительно биспецифическое антитело со специфичностью к участку PRR НТТ, в особенности, содержащее антитело согласно воплощениям 16-24.
28. Моноклональное антитело согласно любому из воплощений 25-27 для применения в фармацевтической композиции, применяемой при предупреждении и/или лечении болезни Гентингтона.
29. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 28, отличающееся тем, что указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
30. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 28-29, отличающееся тем, что указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
31. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 28-30, отличающееся тем, что указанную композицию получают для внутривенного, подкожного, интрадермального или внутримышечного введения.
32. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 28-31, отличающееся тем, что моноклональное антитело соединено с молекулой, которая усиливает фагоцитарные свойства.
33. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 28-32, отличающееся тем, что моноклональное антитело содержится в указанной композиции в количестве от 1 мг до 10 г, предпочтительно 50 мг – 2 г, в частности, 100 мг – 1 г.
34. Моноклональное антитело, имеющее связывающий домен, способный связываться с пептидом белка НТТ, имеющим последовательность р7564 (SEQ ID No. 2), предпочтительно для применения для лечения болезни Гентингтона.
35. Моноклональное антитело согласно воплощению 34, отличающееся тем, что указанное моноклональное антитело включает вариабельный участок CDR1 тяжелой цепи, включающий GFTFNTYA (SEQ ID No. 72), вариабельный участок CDR2 тяжелой цепи, включающий IRSKSNNYAT (SEQ ID No. 73), вариабельный участок CDR3 тяжелой цепи, включающий VRHGEYGNPWFAY (SEQ ID No. 74), вариабельный участок CDR1 легкой цепи, включающий QSLVHSNGNTY (SEQ ID No. 75), вариабельный участок CDR2 легкой цепи, включающий KVS (SEQ ID No. 76), и вариабельный участок легкой цепи, включающий SQSTHVPYT (SEQ ID No. 77), причем указанное антитело предпочтительно представляет собой моноклональное антитело M1D1.
36. Моноклональное антитело согласно воплощению 34 или 35, при этом моноклональное антитело представляет собой человеческое, гуманизированное, биспецифическое или химерное моноклональное антитело.
37. Моноклональное антитело согласно любому из воплощений 34-36 для применения в фармацевтической композиции, применяемой при предупреждении и/или лечении болезни Гентингтона.
38. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 37, отличающееся тем, что указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
39. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 37 или 38, отличающееся тем, что указанная композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
40. Моноклональное антитело для применения согласно любому из воплощений 37-39, отличающееся тем, что указанную композицию получают для внутривенного, подкожного, интрадермального или внутримышечного введения.
41. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 37-40, отличающееся тем, что моноклональное антитело соединено с молекулой, которая усиливает фагоцитарные свойства.
42. Моноклональное антитело для применения согласно любому из воплощений 37-41, отличающееся тем, что моноклональное антитело содержится в указанной композиции в количестве от 1 мг до 10 г.
43. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 42, при этом моноклональное антитело содержится в указанной композиции в количестве от 50 мг до 2 г, в частности, 100 мг – 1 г.
44. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 42, при этом моноклональное антитело содержится в указанной композиции в количестве от 100 мг до 1 г.
45. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 42, при этом моноклональное антитело представляет собой поликлональное антитело.
46. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 42, при этом моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело.
47. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 42, при этом моноклональное антитело представляет собой человеческое моноклональное антитело.
48. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 42, при этом моноклональное антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело.
49. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 42, при этом моноклональное антитело представляет собой биспецифическое моноклональное антитело.
50. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 42, при этом моноклональное антитело представляет собой биспецифическое моноклональное антитело с двумя специфичностями против НТТ.
51. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 50, при этом моноклональное антитело представляет собой биспецифическое моноклональное антитело с участком связывания с PRR или С6.
52. Моноклональное антитело для применения согласно воплощению 50, при этом моноклональное антитело представляет собой биспецифическое моноклональное антитело с участком связывания с PRR и С6.
53. Моноклональное антитело M1D1 для применения в качестве зонда при скрининге лекарственных средств.
54. Моноклональное антитело M1D1 для применения согласно воплощению 53, при этом скринируют молекулы, которые ингибируют доступ протеаз к участку расщепления каспазой аминокислотной позиции 586 НТТ.
55. Способ диагностики in vitro болезни Гентингтона у млекопитающего, включающий стадии
- определения уровня гентингтина дикого типа или мутированного или его фрагментов в образце от млекопитающего с использованием антител PRR13, M1D1 или С6-17 одних или в комбинации;
- диагностирования болезни Гентингтона, если уровень wt или мутированного гентингтина в указанном образце изменен по сравнению с эталонным образцом от здоровых индивидуумов, которые генетически не поражены болезнью Гентингтона;
- и, необязательно, контроля действия терапевтических стратегий по снижению гентингтина в образцах от пациентов с предстоящим проявлением или проявлением болезни Гентингтона, причем терапевтические стратегии предпочтительно выбирают из активной или пассивной вакцинации, в особенности, в курсе терапии для снижения гентингтина.
56. Способ согласно воплощению 55, при этом определение уровня гентингтина дикого типа или мутированного или его фрагментов в образце включает анализы на основе иммунопреципитации или захвата, предпочтительно твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA), твердофазный иммунный анализ (EIA), анализы на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), вестерн-блоттинг или иммуногистохимию и иммунофлуоресцентный анализ, или методы визуализации, предпочтительно PET или SPECT, и проточную цитометрию.
57. Способ согласно воплощению 55 или 56, при этом указанный образец представляет собой спинномозговую жидкость (CSF), кровь, плазму, сыворотку, урину, слюну, пот или слезную жидкость или тканевый и клеточный экстракт.
58. Способ согласно воплощению 55-57, при этом указанное млекопитающее является человеком.
59. Способ определения in vitro стадии болезни Гентингтона у млекопитающего, включающий стадии
- определения уровня гентингтина дикого типа или мутированного или его фрагментов в образце от млекопитающего с использованием антител PRR13, M1D1 или С6-17 одних или в комбинации и
- определения стадии болезни Гентингтона;
- определения влияния на уровни НТТ терапии для снижения гентингтина.
60. Способ согласно воплощению 59, при этом определение уровня гентингтина дикого типа или мутированного или его фрагментов в образце включает анализы на основе иммунопреципитации или захвата, предпочтительно твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA), твердофазный иммунный анализ (EIA), анализы на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), вестерн-блоттинг или иммуногистохимию и иммунофлуоресцентный анализ, или методы визуализации, предпочтительно PET или SPECT, и проточную цитометрию.
61. Способ согласно воплощению 59-60, при этом указанный образец представляет собой спинномозговую жидкость (CSF), кровь, плазму, сыворотку, урину, слюну, пот или слезную жидкость или тканевый и клеточный экстракт.
62. Способ согласно воплощению 59-61, при этом указанное млекопитающее является человеком.
63. Способ контроля за развитием болезни Гентингтона или контроля за эффективностью лечения болезни Гентингтона у млекопитающего, включающий стадии
- определения уровня мутированного НТТ в образце от млекопитающего с использованием антител PRR13, M1D1 или С6-17 одних или в комбинации и
- определения развития болезни Гентингтона или эффективности лечения болезни Гентингтона путем сравнения полученного уровня мутированного гентингтина или его фрагментов с уровнями, полученными при первом измерении уровней мутированного гентингтина или его фрагментов, предпочтительно при измерении во время диагностики связанных с заболеванием симптомов, при этом уменьшение уровня НТТ является показателем успешной терапии.
64. Способ согласно воплощению 63, при этом определение уровня мутированного НТТ в образце включает анализы на основе иммунопреципитации или захвата, предпочтительно твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA), твердофазный иммунный анализ (EIA), анализы на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET), вестерн-блоттинг или иммуногистохимию и иммунофлуоресцентный анализ, или методы визуализации, предпочтительно PET или SPECT, и проточную цитометрию.
65. Способ согласно воплощению 63-64, при этом указанный образец представляет собой спинномозговую жидкость (CSF), кровь, плазму, сыворотку, урину, слюну, пот или слезную жидкость или тканевый и клеточный экстракт.
66. Способ согласно воплощению 63-65, при этом указанное млекопитающее является человеком.
67. Применение по меньшей мере одного иммуногенного пептида, выбранного из группы, включающей p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p7543a (DNQYLGLQIC; SEQ ID No. 88), в особенности производные p9394 (KTDNQYLGLQIGKC; SEQ ID No. 91), p9395 (GTDNQYLGLQIGKKC; SEQ ID No. 92), p9396 (KTDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 93), p9397 (KDNQYLGLQIKKGC; SEQ ID No. 94); p7543b (TDNQYLGLQIC; SEQ ID No. 89), p7543c (TDNQYLGLQIGC; SEQ ID No. 90), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23), p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), p6763 (CaMATLEKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 25), p6764 (CaKLMKAFESLKSFQ, SEQ ID No. 26), p6765 (CEEQQRQQQQQQQ, SEQ ID No. 27), p6768 (QQQQQQPPPPPPPPaKKKC, SEQ ID No. 28), p7541 (CSEIVLD, SEQ ID No. 29), p7552 (CSSEIVLD, SEQ ID No. 30), p7562 (CDSSEIVLD, SEQ ID No. 31), p7563 (CSDSSEIVLD, SEQ ID No. 32), p7567 (CEIVLD, SEQ ID No. 33), p7568 (CIVLD, SEQ ID No. 34), p7605 (CSEIVL, SEQ ID No. 35), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p6776b (SEIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 38), p7752 (CAEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 39), p7753 (CSAIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 40), p7754 (CSEAVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 41), p7755 (CSEIALDGTDNQYL, SEQ ID No. 42), p7756 (CSEIVADGTDNQYL, SEQ ID No. 43), p7757 (CSEIVLAGTDNQYL, SEQ ID No. 44), p7758 (CSEIVLDATDNQYL, SEQ ID No. 45), p7745 (CSEIVLDGADNQYL, SEQ ID No. 46), p7746 (CSEIVLDGTANQYL, SEQ ID No. 47), p7747 (CSEIVLDGTDAQYL, SEQ ID No. 48), p7748 (CSEIVLDGTDNAYL, SEQ ID No. 49), p7749 (CSEIVLDGTDNQAL, SEQ ID No. 50) и p7750 (CSEIVLDGTDNQYA, SEQ ID No. 51), предпочтительно p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37), p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), p8855 (SDSSEIVLDGTDC, SEQ ID No. 6), p8858 (EIVLDGTDNQYLC, SEQ ID No. 7), p8859 (IVLDGTDNQYLGC, SEQ ID No. 8), p8860 (VLDGTDNQYLGLC, SEQ ID No. 9), p8861 (LDGTDNQYLGLQC, SEQ ID No. 10), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 11), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ, SEQ ID No. 12), p8868 (CGTDNQYLGLQIG, SEQ ID No. 13), p8870 (CDNQYLGLQIGQP, SEQ ID No. 14), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ, SEQ ID No. 15), p6772 (CPQLPQPPPQAQPLLP, SEQ ID No. 16), p8864 (TDNQYLGLQIGQC, SEQ ID No. 17), p8865 (DNQYLGLQIGQPC, SEQ ID No. 18), p6775 (PPPQLPQPPPQAQPLLPQPQPaC, SEQ ID No. 19), p8854 (PSDSSEIVLDGTC, SEQ ID No. 20), p8856 (DSSEIVLDGTDNC, SEQ ID No. 21), p8857 (SEIVLDGTDNQYC, SEQ ID No. 22), p8866 (NQYLGLQIGQPQC, SEQ ID No. 23) и p8867 (QYLGLQIGQPQDC, SEQ ID No. 24), в особенности p6773 (LPQPPPQAQPLLPQPQPC, SEQ ID No. 1), p7564 (CPSDSSEIVLD, SEQ ID No. 2), p7543 (GTDNQYLGLQIGC, SEQ ID No. 3), p6771 (LPQPPPQAQPLLPC, SEQ ID No. 4), p6776 (CSEIVLDGTDNQYL, SEQ ID No. 36), p6777 (CSDSSEIVLDGTDN, SEQ ID No. 37) и p8346 (CGPAVAEEPLHRP, SEQ ID No. 5), причем N- или С-концевой цистеиновый остаток (С) может присутствовать или нет или представляться альтернативно в С- или N-конце, для изготовления лекарственного средства для предупреждения или лечения болезни Гентингтона.
68. Вакцина на основе пептида для применения при предупреждении и/или лечении болезни Гентингтона, включающая по меньшей мере один иммуногенный пептид белка НТТ согласно воплощению 67.
69. Вакцина на основе пептида для применения согласно воплощению 68, отличающаяся тем, что по меньшей мере один иммуногенный пептид соединен с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно KLH.
70. Вакцина на основе пептида для применения согласно воплощению 68-69, отличающаяся тем, что вакцину получают для внутривенного, подкожного, интрадермального или внутримышечного введения.
71. Вакцина на основе пептида для применения согласно воплощению 68-70, отличающаяся тем, что вакцину получают с адъювантом, предпочтительно гидроксидом алюминия.
72. Вакцина на основе пептида для применения согласно любому из воплощений 68-70, отличающаяся тем, что по меньшей мере один пептид содержится в вакцине в количестве от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно 10 нг – 1 мг, в частности, 100 нг – 100 мкг.
73. Иммуногенные пептиды согласно воплощению 67, причем указанные пептиды применяют для генерации или идентификации специфических ингибиторов расщепления гентингтина С6.
74. Иммуногенные пептиды согласно воплощению 73, причем указанные специфические ингибиторы расщепления гентингтина С6 определяют как моноклональные антитела, поликлональные антисыворотки, фрагменты, происходящие от моноклональных антител, такие как Fv’s, scFv's, F(ab), F(ab)2.
75. Антитело или антигенсвязывающая молекула, таргетные для каспазного С6 участка 586 НТТ, генерированные иммунизацией вакцинами на основе пептидов согласно воплощению 68, в особенности пептидов, выбранных из группы, включающей p7564 (CPSDSSEIVLD), p7543 (GTDNQYLGLQIGC), p8855 (SDSSEIVLDGTDC), p8858 (EIVLDGTDNQYLC), p8859 (IVLDGTDNQYLGC), p8860 (VLDGTDNQYLGLC), p8861 (LDGTDNQYLGLQC), p8862 (DGTDNQYLGLQIGC), p8869 (CTDNQYLGLQIGQ), p8868 (CGTDNQYLGLQIG), p8870 (CDNQYLGLQIGQP), p8871 (CNQYLGLQIGQPQ), p8864 (TDNQYLGLQIGQC), p8865 (DNQYLGLQIGQPC), p8854 (PSDSSEIVLDGTC), p8856 (DSSEIVLDGTDNC), p8857 (SEIVLDGTDNQYC), p8866 (NQYLGLQIGQPQC) и p8867 (QYLGLQIGQPQDC), причем N- или С-концевой цистеиновый остаток (С) может присутствовать или нет или представляться альтернативно в С- или N-конце.
76. Антитело согласно воплощению 75, при этом указанное антитело представляет собой поликлональное антитело.
77. Антитело согласно воплощению 75, при этом указанное антитело представляет собой моноклональное антитело.
78. Антитело или антигенсвязывающая молекула согласно воплощению 75 или 77, отличающиеся тем, что антитело соединено с молекулой, которая усиливает фагоцитарные свойства.
79. Антитело или антигенсвязывающая молекула согласно любому из воплощений 75 или 77 для применения в фармакологической композиции, применяемой при предупреждении и/или лечении болезни Гентингтона.
80. Антитело или антигенсвязывающая молекула для применения согласно воплощению 79, отличающиеся тем, что композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
81. Антитело или антигенсвязывающая молекула для применения согласно воплощению 79 или 80, отличающиеся тем, что композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
82. Антитело или антигенсвязывающая молекула для применения согласно любому из воплощений 79-81, отличающиеся тем, что вакцину получают для внутривенного, подкожного, интрадермального или внутримышечного введения.
83. Антитело или антигенсвязывающая молекула для применения согласно любому из воплощений 79-82, отличающиеся тем, что поликлональные антитела содержатся в вакцине в количестве от 0,1 мг до 100 мг, предпочтительно 0,5 мг – 20 мг, в частности, 1 мг – 10 мг.