CD4-позитивные клетки тимуса при введении хорионического гонадотропина

6. Лузикова Е.М. Морфо-физиологическая реакция аминосодержащих структур тимуса на введение АКТГ1-24: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Чебоксары, 2005. 25 с.

7. Мелатонин, введенный крысе, эффективно синхронизирует ритм синтеза белка в первичных культурах гепатоцитов, выделенных из этой крысы / В.Я. Бродский, С.И. Рапопорт, Т.К. Дубовая и др. // Онтогенез. 2010. Т. 41, № 2. С. 101-106.

8. Мендель В.Э., Мендель О.И. Мелатонин: роль в организме и терапевтические возможности. Опыт применения препарата Мелаксен в российской медицинской практике // Человек и лекарство. 2010. Т. 18, № 6. С. 336-342.

9. Морфологические изменения тимуса после применения Полиоксидония / ГЮ. Стручко, Л.М. Меркулова, О.Ю. Кострова и др. // Фундаментальные исследования. 2012. № 5-1. С. 197-202.

10. Перцов С. С. Роль супрахиазматического ядра гипоталамуса в реализации эффектов мелатонина на тимус, надпочечники и селезенку у крыс // Бюл. эксп. биол. мед. 2006. Т. 141, № 4. С. 364-367.

11. Сарилова И.Л. Морфофункциональная характеристика структур тимуса при экспериментальной тестэктомии: автореф. дис.....канд. мед. наук. Саранск, 2009. 24 с.

12. Cloez-Tayarani I., Petit-Bertron A.F., Venters H.D., Cavaillon J.M. Differential effect of serotonin on cytokine production in lipopolysaccharide-stimulated human peripheral blood mononuclear cells: involvement of 5-hydroxytryptamine2A receptors // Int. Immunol. 2003. Vol. 15. Р. 233-240.

13. Hardelan R, Madrid J.A., Tan D.-X, Reiter R.J. Melatonin, the circadian multioscillator system and health: the need for detailed analyses of peripheral melatonin signaling // Journal of Pineal Research. 2012. Vol. 52, № 2. Р. 139-166.

14. New perspectives in melatonin uses / A. Carpentieri, G. Diaz de Barboza, V. Areco et al. // Pharmacological research. 2012. Vol. 65, № 4. Р. 437-444.

15. Patay B, Kurz B, Mentlein R. Effect of transmitters and cotransmitters of the sympathetic nervous system on interleukin-6 synthesis in thimic epithelial cells // Neuroimmunomodulation. 1999. Vol. 6, № 1-2. P. 45-50.

16. Srinivasan V., Maestroni G.J.M., Cardinali D.P., Esquifino A.I. Melatonin, immune function and aging // Immunity & Ageing. 2005. Vol. 29. P. 2-17.

ШАТСКИХ ОКСАНА АЛЕКСЕЕВНА - аспирант кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (dum2dum@mail.ru).

SHATSKIKH OKSANA ALEKSEEVNA - post-graduate student of Medical Biology Chair with the Microbiology and Virology Course, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.

УДК 612.438.06:612.018.2:577.175.32 ББК Е 60:737

Л.Р. ЯЛАЛЕТДИНОВА, С.А. ЯСТРЕБОВА CD4-ПОЗИТИВНЫЕ КЛЕТКИ ТИМУСА ПРИ ВВЕДЕНИИ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА*

Ключевые слова: тимус, хорионический гонадотропин, CD4-позитивные клетки.

Введение мышам хорионического гонадотропина приводит к уменьшению количества CD4-позитивных крупных клеток в корковом веществе долек тимуса; к увеличению количества CD4-позитивных клеток в мозговом веществе долек и кортикомедуллярной зоне.

L.R. YALALETDI NOVA, S.A. YASTREBOVA CD4-POSITIVE THYMUS CELLS AT THE INTRODUCTION OF THYMUS CHORIONIC GONADOTROPIN Key words: thymus, human chorionic gonadotropin, CD4-positive cells.

Introduction of chorionic gonadotropin results in fewer CD4-positive large cells in the cortex of the thymus lobes of mice and in increase of the number of CD4-positive cells in medullar lobes and corticomedullar zone.

Тимус является центральным органом иммуногенеза, обеспечивая диф-ференцировку лимфоцитов [3]. В настоящее время известно, что CD4-позитив-ные клетки - маркеры Т-хелперов-индукторов. Отмечено, что ко-рецептор CD4

* Работа выполнена на кафедре медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии. Госбюджетная тема 0120.085.1887 от 2008 г. «Гистохимия биогенных аминов в морфофункциональном состоянии органов и тканей в норме и эксперименте».

сохраняется на тимоцитах, распознающих пептиды в составе молекул МНС (главный комплекс гистосовместимости) II класса. Такое распределение способствует сродству гистохимических маркеров ОР4 и МНС II класса. Под влиянием прямого контакта с тимусными эпителиальными клетками макрофаги взаимодействуют с гуморальными факторами, вырабатываемыми клетками микроокружения тимуса, далее в кортикомедуллярной зоне дольки тимуса происходят окончательная антигеннезависимая дифференцировка и становление аутотолерантности Т-лимфоцитов [5].

Хорионический гонадотропин (ХГ) снижает иммунный ответ организма и способствует сохранению беременности. При трофобластической болезни на фоне повышенных концентраций ХГ иммунный противоопухолевый ответ снижается, что способствует метастазированию опухоли [1]. Выявлены морфологические изменения в тимусе при введении асцитной опухоли ячников [3].

Много внимания уделяется клеточно-опосредуемым иммунным механизмам как возможным этиологическим факторам самопроизвольного выкидыша; в частности, речь идет о клетках Т-хелперах (ТХ1, ТХ2) и секретируемых ими цитокинах. В организме эти клетки активируются по очереди. Реакция, обусловленная клетками ТХ2, способствует сохранению нормальной беременности, в то время как реакция, обусловленная клетками ТХ1, является антагонистической по отношению к беременности и может вызывать аборт [4].

Несмотря на то, что в настоящее время механизм развития самопроизвольного выкидыша окончательно не выяснен, полагают, что важную роль в них могут играть естественные Т-киллеры, активируемые лимфокинами, а также активированные децидуальные макрофаги [4].

Д.С. Гордон и соавт. [2] при беременности обнаружили иммуносупрессию и появление нейроэндокринных клеток в тимусе, проследили динамику их морфофункционального состояния в течение I, II, III триместров беременности. В работе М. Рыкауата [8] описаны иммуноцитохимические изменения в тимусе при введении хорионического гонадотропина.

Существует взаимосвязь между гормональными и иммунными факторами. Под влиянием прогестерона активируются лимфоциты и начинают вырабатывать прогестерониндуцированный блокирующий фактор (ПИБФ), который способствует сохранению беременности. Эстрогены способствуют синтезу и накоплению биогенных аминов в тимусе. Под влиянием эстрогенов усиливается выяв-ляемость нейроэндокринных клеток кортикомедуллярной зоны дольки тимуса.

Хорионический гонадотропин образуется в клетках синцитиотрофобласта и цитотрофобласта плаценты. ХГ присутствует в крови беременных с начала дробления оплодотворенной яйцеклетки вне зависимости от локализации беременности. Первоначальная функция ХГ на ранних сроках - стимуляция продукции и секреции эстрогенов и прогестерона в желтом теле, ХГ также стимулирует выработку ряда гормонов в плаценте. ХГ проходит через плаценту и может обнаруживаться в тканях плода, где он предположительно играет роль в дифференциации генитального тракта. На поздних сроках беременности этот гормон играет также роль своеобразного тормоза, снижая сократительную активность матки. Кроме того, для благополучного течения беременности необходима защита эмбриона от иммунной системы материнского организма [4]. Предполагается, что основными иммунодепрессантами являются ХГ и белки трофобласта - трофобластический (3-гликопротеин), плацентарный лактоген, плацентарный белок-14 и белок беременности РАРР-А.

Сведений о влиянии хорионического гонадотропина на иммунологические процессы недостаточно. В задачу настоящего исследования входило изучение популяции ОР4-позитивных клеток тимуса мышей при введении Хг.

Материалы и методы исследования. Объектом исследования служил тимус 120 белых беспородных мышей массой 30 г. Животные были разделены на три группы: I - интактная группа (п = 20), II - контрольная (п = 20), которым внутримышечно вводили 0,02 мл физраствора, III - опытная с внутримышечным введением 0,02 мл раствора ХГ - ША подгруппа (п = 20) с введением ХГ в течение 1 недели (2 раза через каждые 3 дня), III Б подгруппа (п = 20) с введением ХГ в течение 2 недель (4 раза через каждые 3 дня), III В подгруппа (п = 20) с введением ХГ в течение 3 недель (6 раз через каждые 3 дня), III Г подгруппа (п = 20) с введением ХГ в течение 4 недель (8 раз через каждые 3 дня). Введение препаратов проводилось с соблюдением правил асептики и антисептики. Все процедуры по уходу за мышами осуществляли согласно нормам и правилам обращения с лабораторными животными. Тимус извлекали под наркозом после завершения экспериментального воздействия.

Срезы яичников обрабатывались по стандартному протоколу [10]: сначала подавлялась пероксидазная активность путем инкубации срезов в 3%-ном растворе Н2О2 в течение 30 мин с последующей промывкой 0,1 М фосфатным буфером. Для блока неспецифического связывания срезы инкубировались в течение 1 ч в 10%-ной козьей сыворотке, после чего к ним были добавлены первые антитела к белкам ОР4 на 18 ч при температуре 4°С. В качестве вторых антител были использованы антивидовые антииммуноглобулиновые биотилированные антитела. С целью выявления биотиновой метки срезы обрабатывались авидин-пероксидазным комплексом. Метод основан на высоком сродстве авидина к биотину. Пероксидазную активность проявляли в инкубационной среде с диамино-бензидином. В результате ферментативной реакции субстрат превращался в нерастворимый продукт коричневого цвета, совпадающий по локализации с местонахождением белка. Препараты анализировались под световым микроскопом Микмед. Произведен подсчет Ой4-позитивных клеток в 10 полях зрения. Статистическая обработка данных производилась с применением критерия Стъюдента.

Результаты исследования и их обсуждение. Тимус интакных животных имеет дольчатое строение. В дольке различаются темное корковое вещество и более светлое - мозговое. Среди эпителиальных клеток находятся лимфоциты (тимоциты). Популяция СР4-позитивных клеток представлена в дольках тимуса клетками средних размеров 7,25±0,25 мкм округлой формы, в цитоплазме которых хорошо просматриваются коричневые гранулы. В тимусе интактных и контрольных животных исследуемые клетки определяются в корковом и мозговом

веществах долек, а также в кортикомедуллярной зоне. Количественный анализ СР4-позитивных клеток (табл.) свидетельствует о преобладании их в корковом веществе долек (от 2,2 до 4,6 в среднем в поле зрения). В мозговом веществе СР4-позитивных клеток значительно меньше (от 1,2 до 2,4 клеток в одном поле зрения). В кортикомедуллярной зоне долек они единичны (0,2±0,1 клеток в одном поле зрения). Итак, у интактных и контрольных животных СР4-позитивные клетки (с Т-хелперной направленностью) выявляются во всех зонах долек тимуса (рис. 1).

Рис. 1. Тимус мыши. Интактная группа. Иммуногистохимическая реакция с антителами СР4. МИКМЕД Об. 40, ок. 15

Ранее у мышей-самок мы наблюдали формирование дольчатой структуры тимуса с пальцевидыми выростами при введении ХГ в течение 4 недель [б].

Количество Ой4-позитивных клеток после введения ХГ в корковом веществе долек тимуса увеличивается по сравнению с таковым у интактных животных. Если рассматривать динамику данного процесса, уже через 1 неделю введения ХГ количество Ой4-позитивных Т-клеток начинает увеличиваться, достигая почти максимума к четырехнедельному сроку эксперимента (5,4+0,3, р < 0,05). Количество этих же клеток в мозговом веществе долек тимуса и кортикомедуллярной зоне увеличивается и зависит от длительности введения гормона (таблица).

Количественное распределение Сй4-позитивных структур тимуса мышей в норме и при введении ХГ

Микроструктуры Г руппы животных

I группа (интакт-ные) II группа (контрольные) III группа (с введением ХГ

IIIА

Ой4-позитивные клетки в корковом веществе долек 2,2±0,01 4,6+0,02 5,2+0,03 0 5,6+0,5 5,4+0,3*

Ой4-позитивные клетки в мозговом веществе долек 1,2+0,01 2,4+0,05 4,6+0,1 2,8+0,6 2,8+0,1 9,6+0,6*

Ой4-позитивные клетки в кортикомедулярной зоне долек тимуса 0,2+0,009 0 0,6+0,004 0 1,8+0,008 3,0+0,2*

Общее количество Ой4-позитивных клеток долек тимуса 3,6±0,9 7,0+0,8 10,4+0,9 2,8+0,7 10,2+0,2 18,0+0,8*

Примечание. р < 0,05 по сравнению с I группой.

Исследования показали, что введение хорионического гонадотропина вызывает гипотрофию дольки тимуса, чего не отмечалось в контрольной группе. ОР4-

позитивные клетки вилочковой железы располагались в корковом, мозговом веществах и кортико-медул-лярной зоне доек тимуса. В корковом и мозговом веществах долек железы Ой4-позитивные клетки располагались диффузно (рис. 2).

Таким образом, Ой4 белки экспрессируются клетками центрального органа иммунной системы.

После введения ХГ в течение 4 недель в корковом веществе долек тимуса количество Ой4-позитивных клеток увеличивается в 2,5 раза, в кортико-медуллярной зоне - в 15 раз по сравнению с данными I группы интактных животных (таблица). В мозговом веществе количество ОР4-пози-

Рис. 2. Тимус мыши. Внутримышечное введение хорионического гонадотропина в течение 4 недель. Иммуногистохимическая реакция с антителами СР4. Об. 40, ок. 15

тивных лимфоцитов увеличивается в 8 раз (1,2+0,01 Ой4-позитивных клеток у животных I группы и 9,6+0,6 Ой4-позитивных лимфицитов у мышей после введения ХГ в течение 4 недель). Суммарное количество Ой4-позитивных клеток долек тимуса увеличивается в 5 раз (с 3,6+0,9 у интактных животных до 18,0+0,8, р < 0,05 у животных III Г подгруппы).

Эксперимент с введением Хг доказывает наличие взаимосвязи между нейроэндокринной и иммунной системами. Дендритные макрофаги, имеющие свойства антигенпредставляющих клеток, при введении ХГ активизируются. Это доказывает необходимость патогенетически обоснованного применения ХГ у пациенток при невынашивании беременности [4]. Вероятно, зрелые ти-моциты, выделяемые из вилочковой железы под действием экзогенно введенного ХГ, способствуют подавлению иммунной агрессии организма.

Нашими исследованиями обнаружено, что под влиянием ХГ происходят процессы селекции лифоцитов в центральном органе иммунитета - тимусе. В корковом веществе долек тимуса увеличивается количество Т-хелперов-ин-дукторов. В нашем эксперименте с введением ХГ количество Ой4-позитивных клеток увеличивается в 2,5 раза по сравнению с таковым у животных интактной группы.

Обращает на себя внимание то, что общее количество Ой4-позитивных клеток в дольках тимуса при введении ХГ становится больше в 5 раз (18,0+0,8, р < 0,05 при введении ХГ в течение 4 недель), в то время как у интактных животных количество субпопуляции Ой4-позитивных клеток совершенно одинаковое (3,6+0,9). Возможно, это обстоятельство связано с иммуномодулирующим воз-действим ХГ на субпопуляцию Ой4-позитивных клеток.

Через 2 недели эксперимента с введением ХГ мы не обнаружили в тимусе Ой4-позитивных клеток в корковом веществе и кортикомедуллярной зоне долек тимуса.

В тимусе под воздействием ХГ через 3-4 недели наблюдается положительная селекция Ой4-позитивных клеток, а значит, МНСИ-специфических клеток тоже. Под влиянием прямого контакта с тимусными эпителиальными клетками, дендритными макрофагами, гуморальными факторами в корковом и мозговом веществах, кортикомедуллярной зоне долек тимуса происходят окончательная антигеннезависимая дифференцировка и становление субпопуляции Т-хелперов. Данные процессы стимулируются ХГ.

Известно, что по мере перемещения в глубокие слои тимусной дольки ти-моциты подвергаются селекции [7, 9]. Назначение процесса селекции состоит в выбраковке тимоцитов, несущих аутоспецифические рецепторы. В результате наших исследований выявлено, что в I группе животных по мере продвижения вглубь дольки тимуса только небольшая часть тимоцитов подвергается селекции. Если количество Ой4-позитивных тимоцитов в корковом веществе у мышей I группы составляет 2,2+0,01 и в мозговом веществе 1,2+0,01, то при воздействии ХГ количество Ой4-позитивных тимоцитов увеличивается в корковом веществе в 2,5 раза и в мозговом веществе - в 9 раз. Возможно, при введении ХГ происходит положительная селекция Ой4-тимоцитов, которые являются МНС-И специфическими клетками. Это позволяет организму в период введения ХГ не распознавать молекулы главного комплекса гистосовместимости.

Вместе с тем при введении ХГ увеличивается количество Ой4-пози-тивных макрофагов в кортикомедуллярной зоне долек тимуса в 5 раз. Возможно, происходят процессы отрицательной селекции тимоцитов с помощью дендритных макрофагов. Можно предположить, что в данном виде се-

лекции индуцирован апоптоз аутоспецифичных клонов лимфоцитов. Данный процесс позволяет выбраковывать в тимусе лимфоциты, несущие аутоспецифические рецепторы.

Выводы. 1. С помощью иммуногистохимической реакции в тимусе обнаружены Сй4-позитивные клетки в корковом и мозговом веществах, кортикомедуллярной зоне долек тимуса. Наибольшее количество СР4-позитивных клеток выявлено в корковом веществе долек тимуса.

2. Введение хорионического гонадотропина способствует положительной селекции СР4-позитивных клеток в корковом и мозговом веществах, кортикомедуллярной зоне долек тимуса.

3. Хорионический гонадотропин оказывает иммуномодулирующее влияние на Сй4-позитивную популяцию лимфоцитов тимуса с Т-хелперной диф-ференцировкой.

Литература

1. Кузнецов В.В., Мещерякова Л.А., Козаченко В.П. Трофобластическая болезнь [Электронный ресурс]. URL: http:/www.nk81.ru/node/36.

2. Олангин О.И, Гордон Д.С. Иммуноцитохимический анализ паренхимы тимуса крыс в разные сроки беременности // Int. J. on Immunoreabilitation. 1997. № 7. P. 167.

3. Сергеева В.Е., Гордон Д.С. Люминесцентно-гистохимическая характеристика ранней реакции моноаминсодержащих структур тимуса на антигенные воздействия / В.Е. Сергеева, Д.С. Гордон. Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 1992. 352 с.

4. Сухих Г.Т., Ванько Л.В. Иммунология беременности. М.: Изд-во РАМН, 2003.

5. Хаитов P.M., Игнатьева ГА., Сидорович И.Г. Иммунология. М.: Медицина, 2000. 430 с.

6. Ястребова С.А., Сергеева В.Е., Аюпова Л.Р. Морфометрический анализ структур тимуса и яичников под воздействием гонадотропина // Морфология в теории и практике: сб. материалов и тезисов (к 90-летию со дня рождения Д.С. Гордон). Чебоксары: Изд-во Чуваш. ун-та, 2012. С. 296-297.

7. Bosselut R. CD4/CD8-lineage differentiation in the thymus: from nuclear effectors to membrane signals // Nature Reviews Immunology. 2004. Vol. 4, July. P. 529-540.

8. Human chorionic gonadotropin in the thymus. An immunocytochemical study on discordant expression of subunits / M. Fukayama, Y. Hayash, Y. Shiozawa et al. // Am. J. Pathol. 1990. Vol. 136(1), Jan. P. 123-129.

9. Marodon G, Rocha B. Generation of mature T cell populations in the thymus: CD4 or CD8 down-regulation occurs at different stages of thymocyte differentiation // Eur. J. Immunol. 1994. Vol. 24(1), Jan. P. 196-204.

10. Sternberger L.A., Petrali J.P. The unlabeled antibody enzyme method. Attempted use of peroxidase-conjugated antigen as the third layer in the technique // J. Histochem. Cytochem. 1977. Vol. 25(9), Sep. P. 1036-1042.

ЯЛАЛЕТДИНОВА ЛЕЙСАНА РАМИЛОВНА - врач акушер-гинеколог, Городская больница № 5, Россия, Чебоксары (barbaris09@bk.ru).

YALALETDINOVA ЬБНУЭАМА RAMILOVNA - obstetrician-gynecologist, City Hospital № 5, Russia, Cheboksary.

ЯСТРЕБОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА - кандидат биологических наук, доцент кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии, Чувашский государственный университет, Россия, Чебоксары (rejsen@chuvashi.ru).

YASTREBOVA SVETLANA ALEXANDROVNA - candidate of biology sciences, associative professor of Medical Biology Chair with the Microbiology and Virology rate, Chuvash State University, Russia, Cheboksary.