ВЫСВОБОЖДАЮЩИЕ СЕРОВОДОРОД ПОЛИМЕРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
HYDROGEN SULPHIDE RELEASING POLYMER COMPOUNDS

Настоящее изобретение относится к высвобождающим сероводород полимерным соединениям и к их применениям.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
2
2
2
2
Сероводород (HS) является биологической сигнальной молекулой. Как представляется, его функция сопоставима и потенциально связана с лучше изученным газообразным передатчиком сигналов оксидом азота (NO). Предполагается, что сероводород участвует в таких процессах как ангиогенез и воспаление. Показано, что HS и/или высвобождающие HS соединения обладают противовоспалительным действием, подавляют апоптоз эндотелиальных клеток сосудов и кардиомиоцитов и вызывают расширение сосудов. Поскольку сероводород является газообразным соединением, его трудно вводить. Поэтому были разработаны различные подходы на основе высвобождающих сероводород соединений. Обзор приведен в публикации Zhao et al (Zhao, Y.; Biggs, T.D.; Xiang, M. Hydrog en sul fide (HS) releasing agents: chemistry and biological applications. Chem Commun, 2014; 50:11788).
Высвобождающие сероводород соединения включают, например
2
2
- соединения, высвобождающие HS путем гидролиза, такие как неорганические сульфиды (NaS и NaHS),
- производное реагента Лавессона GYY4137, фосфордитиоаты и 1,2-дитиол-3-тионы (DTTs), такие как 5-(4-гидроксифенил)-3H-1,2-дитиол-3-тион (ADT-OH),
2
- соединения, высвобождающие HS при активации светом (геминальные дитиолы, соединения в кетопрофенатной клетке),
2
- и соединения, высвобождающие HS путем активации тиола.
Основным недостатком всех соединений, которые высвобождают сероводород путем гидролиза, является их нестабильность в водном растворе. Когда эти соединения растворяют в воде, сероводород высвобождается нерегулируемым образом.
2
В WO 2016/161445 описаны доноры HS, которые высвобождают сероводород при взаимодействии с демаскирующими агентами путем циклизации соединения-предшественника посредством образования лактона или лактама. Примеры основаны на ферментативном механизме с эстеразой в качестве биологического демаскирующего агента. Соединения-предшественники могут включать фрагмент, являющийся лекарством или сахаром.
2
2
Кроме того, при специфических условиях in vivo цистеин и N-ацетилцистеин могут быть источником HS. N-Ацетилцистеин можно превратить в цистеин и некоторые пиридоксил-5'-фосфат-зависимые ферменты могут продуцировать HS из цистеина (US 2007/0197479).
2
2
2
Особый интерес представляют соединения, высвобождающие HS по механизму активации тиола. Они высвобождают HS в присутствии компонента реакции, содержащего свободную тиольную группу. Компонент реакции может естественным образом находиться на участке введения (биологический и эндогенный), или может представлять собой внешне вводимый компонент реакции (экзогенный). Механизм активации тиола обеспечивает регулируемое или зависимое от окружения высвобождение указанного газа из этих высвобождающих сероводород соединений. Группа субструктур, которые высвобождают HS по механизму активации тиола, включает, например
- пертиолы, в которых группа -SSH защищена с образованием субструктуры (-SSR) (см. также US 9096504)
2
2
- N-(ацилтио)-бензамиды, также называемые донорами HS на основе N-меркаптогруппы (такие как N-(бензоилтио)бензамид NSHD1, соответственно донор HS 5a),
- дитиопероксиангидриды,
- арилтиоамиды, и
- полученные из чеснока серосодержащие соединения, такие как диаллилдисульфид и -трисульфид.
2
2
2
Одной возможной областью применения высвобождающих HS соединений является лечение связанных с кожей нарушений, в особенности диабетических ран. Wang et al. обнаружили улучшенное заживление раны у крыс с диабетом при использовании мази с 2% бисульфида натрия (Wang, G.; Li, W.; Chen, Q.; Jiang, Y.; Lu, X.; Zhao, X. Hydrogen sulfide accelerates wound healing in diabetic rats. Int J Clin Exp Pathol. 2015; 8:5097-104). Yang et al. показали, что донор HS на основе N-меркаптогруппы NSHD1 оказывает благоприятное воздействие в случае кератиноцитной модели диабетических ран (Yang et al. A Novel Controllable Hydrogen Sulfide-Releasing Molecule Protects Human Skin Keratinocytes Against Methylglyoxal-Induced Injury and Dysfunction. Cell Physiol Biochem 2014; 34:1304-1317). Возможное применение в области тканевой инженерии предложили Feng et al., исследовавшие волокна синтетического полимера поликапролактона (PCL) в качестве носителя для смешанного донора HS NSHD1 с использованием электроспиннинга (Feng, S.; Zhao, Y; Xian, M.; Wang Q. Biological thiols-triggered hydrogen sulfide releasing microfibres for tissue engineering applications. Acta Biomaterialia 2015; 27:205-213).
2
Другой возможной областью применения высвобождающих HS соединений является предупреждение и лечение глазных заболеваний, таких как глаукома, воспалительных патологических состояний, таких как конъюнктивит (WO 2006/119258, WO 2009/109501), и заболеваний сетчатки, таких как дегенерация желтого пятна, окклюзия сосудов сетчатки и диабетическая ретинопатия (Biermann, Lagreze et al., 2011, Inhalative preconditioning with hydrogen sulfide attenuated apoptosis after retinal ischemia/reperfusion injury, Mol Vis (17): 1275-1286).
2
2
2
2
in vitro
Другой возможной областью применения высвобождающих HS соединений является предупреждение и лечение остеоартрита. Это распространенное заболевание характеризуется стойким воспалением и разрушением сустава. Недавние исследования показали, что HS является медиатором при воспалительных заболеваниях суставов, причем он оказывает противовоспалительное, противокатаболическое и/или антиоксидантное воздействие в моделях  с использованием синовиоцитов и суставных хондроцитов человека (Li, Fox et al., 2013, The complex effects of the slow-releasing hydrogen sulfide donor GYY4137 in a model of acute joint inflammation and in human cartilage cells, J Cell Mol Med (17): 365-376; Burguera, Vela-Anero et al., 2014, Effect of hydrogen sulfide sources on inflammation and catabolic markers on interleukin 1beta-stimulated human articular chondrocytes, Osteoarthritis Cartilage (22): 1026-1035). Положительные результаты также получали, когда HS вводили с помощью сернистых водных ванн или путем приема чеснока с пищей (Williams, Skinner et al., 2010, Dietary garlic and hip osteoarthritis: evidence of a protective effect and putative mechanism of action, BMC Musculoskelet Disord (11): 280; Sieghart, Liszt et al., 2015, Hydrogen sulphide decreases IL-1beta-induced activation of fibroblast-like synoviocytes from patients with osteoarthritis, J Cell Mol Med (19): 187-197). Эти данные показывают, что экзогенное добавление HS может являться полезным режимом лечения этих заболеваний.
2
2
2
2
2
Полимер на основе метакрилата с боковой S-ароилтиооксимной (SATO) субструктурой описан в публикации Foster and Matson (Foster, J. C.; Matson J. B.; Functionalization of Methacrylate Polymers with Thioximes: A Robust Postpolmerization Modification Reaction and a Method for the Preparation of HS-Releasing Polymers, Macromolecules, 2014, 47, 5089-5095). Получены полимеры с разными молекулярными массами в диапазоне от 8500 Да до 40500 Да. В этой группе исследователей также разработали высвобождающие сероводород гели на основе пептидов с концевой функциональной группой SATO, где пептид обладал молекулярной массой, равной ~ 1 кДа и таким образом не являлся полимером (Carter, J.M.; Qian, Y.; Foster, J.C.; Matson, J.B.; Peptide-based hydrogen sulfide-releasing gels; Chem. Commun., 2015, 51, 13131). Конъюгат полиэтилена с DTT субструктурой 5-(4-гидроксифенил)-3H-1,2-дитиол-3-тиона описан в публикации Hasegawa and van der Vlies (Hasegawa, U.; van der Vlies, A.L.; Design and Synthesis of Polymeric hydrogen sulfide donors; Bioconjugate Chemistry, 2014, 25, 1290-1300). Полиэтиленгликоль, использованный в качестве полимерной основной цепи для конъюгата, обладал номинальной молекулярной массой, равной 5000 Да. Конъюгат обладал уменьшенной цитотоксичностью по сравнению с ADT-OH, но по данным клеточного анализа усиливал продуцирование провоспалительного цитокинового фактора некроза опухоли (TNF-a). В WO 2011/084204 раскрыт высвобождающий сероводород полимер, где высвобождающая сероводород субструктура представляет собой тиоамид, легко гидролизующийся в присутствии воды, и полимерной основной цепью является синтетический полимер, такой как метакрилатное производное. Молекулярная масса модифицированного тиоамидом полимера, предлагаемого в настоящем изобретении, равна 77696 Да. Было предложено использовать высвобождающий HS полимер в качестве покрытия для медицинских устройств, т. е. имплантатов, таких как стенты. В US 2010/198338 также описаны высвобождающие HS полимеры для нанесения покрытия или образования медицинских устройств. Соединения содержат по меньшей мере одну основную группу, связанную с HS, и в примерах метакрилатного сополимера с третичным амином в боковой цепи образуют комплексы с газообразным HS.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является получение полимерного соединения, которое высвобождает сероводород регулируемым образом и применимо для локального введения для лечения или предупреждения патологических состояний кожи (включая заболевание кожи или косметическое патологическое состояние), глазных заболеваний и остеоартрита.
Настоящее изобретение относится к высвобождающему сероводород полимерному соединению, где полимер содержит полисахаридную основную цепь и где соединение содержит по меньшей мере две субструктуры и где указанные субструктуры способны высвобождать сероводород путем активации тиола. Кроме того, настоящее изобретение относится к соединению для применения в качестве лекарственного средства и применению соединения в качестве косметического средства.
2
2
2
Авторы изобретения синтезировали полисахаридные производные с ковалентно связанными субструктурами, для которых показано, что они высвобождают HS регулируемым образом при взаимодействии с агентом, содержащим активирующую тиольную группу (см. примеры). Эти высвобождающие сероводород полимерные соединения полезны для указанных выше случаев применения, например, для лечения патологических состояний кожи, и объединяют благоприятные воздействия полисахаридного полимера (например, образуют гидрогель, способный к набуханию; обеспечивают смазывание) с благоприятными воздействиями высвободившегося HS. Предпочтительно, если высвобождающее сероводород полимерное соединение с полисахаридной основной цепью поглощает воду или жидкость из раны и самопроизвольно не растворяется или не диспергируется в ней. Гель, образованный высвобождающим сероводород полимерным соединением с полисахаридной основной цепью, предлагаемым в настоящем изобретении, также пригоден для использования в качестве кожного наполнителя, внутриглазного имплантата или заменителя стекловидного тела. Пленка, образованная высвобождающим сероводород полимерным соединением с полисахаридной основной цепью, предлагаемым в настоящем изобретении, пригодна для разделения тканей и предупреждения адгезии тканей после операции. Водный раствор, содержащий высвобождающее сероводород полимерное соединение с полисахаридной основной цепью, предлагаемый в настоящем изобретении, пригоден для использования в качестве смазывающих глазных капель. Кроме того, гель с высвобождающим сероводород полимерным соединением с полисахаридной основной цепью, предлагаемый в настоящем изобретении, пригоден для использования в качестве дополнения для синовиальной жидкости для предупреждения и лечения остеоартрита. Такое дополнение для синовиальной жидкости позволяет использовать терапевтическое воздействие HS и улучшить смазывающую способность синовиальной жидкости.
Полимерные соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, высвобождают сероводород регулируемым образом по реакции т. е. в присутствии биологического (эндогенного) или вводимого извне компонента реакции, содержащего свободную тиольную (-SH) группу. Сероводород находится в свободном виде только в присутствии компонента реакции, который обеспечивает регулируемое или зависимое от среды высвобождение указанного газа. При отсутствии компонента реакции полимерные соединения стабильны в том смысле, что они не высвобождают сероводород и могут быть приготовлены, например, в виде стабильного водного раствора. Таким образом, полимерные соединения исключают недостатки соединений, высвобождающих сероводород путем гидролиза.
Таким образом, настоящее изобретение, в частности, относится к высвобождающему сероводород полимерному соединению, которое можно использовать в качестве имплантируемого, биологически разрушающегося и биологически совместимого наполнителя, внутриглазного имплантата, заменителя стекловидного тела или дополнения для синовиальной жидкости, т. е. для подкожной, внутрикожной, внутриглазной и внутрисуставной инъекции, или в качестве повязки для местного нанесения на кожу, стимулирующей заживление раны (например, диабетические язвы или ожоговые раны) и/или улучшающего рубцевание, или в качестве глазных капель для применения в офтальмологии. Ни один из высвобождающих сероводород полимеров предшествующего уровня техники не включает полисахаридую основную цепь полимера, по меньшей мере две высвобождающие сероводород субструктуры и не предложен для применения для лечения или предупреждения патологических состояний кожи, глазных заболеваний или остеоартрита.
2
Таким образом, настоящее изобретение относится к полимерному высвобождающему HS соединению для применения для лечения и предупреждения заболевания кожи, для применения для лечения и предупреждения глазных заболеваний и для применения для лечения и предупреждения остеоартрита, а также в качестве косметического средства или к способам применения этих соединений.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Приведенные ниже определения терминов и предпочтительных вариантов осуществления в равной степени относятся к соединению, предлагаемому в настоящем изобретении, и соединению для применения или применение соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, а также способам применения соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, если это является подходящим.
Высвобождающее сероводород соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой соединение, которое способно высвобождать газообразный сероводород при подходящих условиях. Термин высвобождение можно понимать, как синонимы выделения или выделения в свободном виде, т. е. высвобождающее сероводород соединение также можно считать донором сероводорода.
Полимерное соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, дополнительно включает по меньшей мере две субструктуры, где указанные субструктуры способны высвобождать сероводород путем активации тиола. Эта функциональная особенность определяет субструктуры, которые высвобождают сероводород по механизму активации тиола. В литературе описаны разные классы таких субструктур. Подходящие субструктуры являются органическими и включают по меньшей мере один ковалентно связанный атом серы. Они характеризуются общим признаком, таким что при взаимодействии с содержащим тиольную группу (-SH) компонентом реакции активируется/инициируется высвобождение сероводорода. Соответственно, наличие субструктур, способных высвобождать сероводород путем активации тиола в полимерном соединении, можно легко проверить путем введения соединения во взаимодействие с компонентом реакции, содержащим тиольную группу, при условиях, которые позволяют обнаружить газообразный сероводород. При использовании ниже термины "субструктура" или "высвобождающая сероводород субструктура" означают субструктуру, способную высвобождать сероводород путем активации тиола, если не указано иное.
Настоящее изобретение предпочтительно относится к соединениям, которые способны высвобождать сероводород в присутствии содержащего тиольную группу компонента реакции при физиологических условиях в коже или на поверхности кожи человека, в глазах человека или на их поверхности или в суставах человека, например, при температурах от 20 до 40°C и при значениях pH от 4 до 8, предпочтительно при значениях pH от 4 до 7.
Предпочтительно, если субструктуры, способные высвобождать сероводород путем активации тиола, выбраны из группы, включающей защищенные ацильной группой пертиолы, N-(ацилтио)-бензамиды, дитиопероксиангидриды, арилтиоамиды и образованные из чеснока серусодержащие соединения.
2
2
2
Кроме того, следует отметить, что высвобождающее сероводород полимерное соединение означает полимерное соединение, которое само способно высвобождать HS и не является смесью полимерного соединения и высвобождающего HS соединения. По меньшей мере две субструктуры, способные высвобождать сероводород путем активации тиола, являются частью полимерной структуры. Для высвобождающего сероводород полимерного соединения исходное вещество используется в виде функционального звена и на кинетику высвобождения не влияют характеристики смешивания и разложения возможного материала (материалов) носителя и примешиваемого донора HS.
2
В полимерном соединении, предлагаемом в настоящем изобретении, или в полимерном соединении для применения в настоящем изобретении, основной цепью является полисахарид. Полисахариды обладают превосходной биологической совместимостью. Примеры подходящих полисахаридов можно выбрать из группы, включающей гиалуроновую кислоту (гиалуронат натрия, гиалуронан, HA), производные целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлоза, натриевую или кальциевую соль альгиновой кислоты, хондроитинсульфат, дерматансульфат, хитозан и производные хитозана, такие как триметилхитозан и другие кватернизованные производные хитозана и модифицированные карбоксигруппой производные хитозана, такие как карбоксиметилхитозан, и пектин. Эти полисахариды содержат функциональные группы, которые обеспечивают получение производных. В частности, подходящие полисахаридные полимеры содержат функциональную группу, выбранную из группы, включающей аминогруппу или карбоксигруппу. Авторы изобретения, в частности, показали, что модифицированная гиалуроновая кислота с высвобождающей HS субструктурой хорошо переносится разными линиями клеток. В соединении (для применения), предлагаемом в настоящем изобретении, где основной цепью является полисахарид, предпочтительно, если полисахарид выбран из группы, включающей хитозан и гиалуроновую кислоту (HA). Хитозан и гиалуроновая кислота хорошо охарактеризованы, как биологически совместимые материалы, способными образовывать гидрогели, что является полезным эффектом настоящего изобретения в контексте применений для кожи (Boateng, Matthews et al., 2008, Wound healing dressings and drug delivery systems: a review, J Pharm Sci (97): 2892-2923; Dai, Tanaka et al., 2011, Chitosan preparations for wounds and burns: antimicrobial and wound-healing effects, Expert Rev Anti Infect Ther (9): 857-879), внутрикожного применения (WO 97/04012, WO 2010/065784, WO 2011/124380), локального применения для глаз (WO 2015/169728), внутриглазного применения (Schramm, Spitzer et al., 2012, The cross-linked biopolymer hyaluronic acid as an artificial vitreous substitute, Invest Ophthalmol Vis Sci (53): 613-621) и в качестве дополнения для синовиальной жидкости (Brockmeier and Shaffer, 2006, Viscosupplementation therapy for osteoarthritis, Sports Med Arthrosc (14): 155-162; Oprenyeszk, Chausson et al., 2013, The intra-articular injection of a new chitosan biomaterial prevents the progression of osteoarthritis in ACLT rabbit model, Osteoarthritis and Cartilage (21): S69). Кроме того, полисахариды, в особенности хитозан и гиалуроновая кислота, способны абсорбировать экссудат раны (жидкость, вырабатываемая в ране). Кроме того, содержащие тиольную группу, хитозан и производные гиалуроновой кислоты описаны ранее (Hongyok, T., 2009, Effect of chitosan-N-acetylcysteine conjugate in a mouse model of botulinum toxin B-induced dry eye; Arch. Ophthalmol. 127:525-532; US2010/0028399 A1; Palumbo Salvatore, F., 2012; In situ forming hydrogels of new amino hyaluronic acid/benzoyl-cysteine derivatives as potential scaffolds for cartilage regeneration), например, с N-ацетилцистеином или бензоилцистеином в боковых цепях. Хотя и представляющие собой производные цистеина, эти полимеры не предназначены для высвобождения и не способны высвобождать сероводород путем активации тиола.
2
Подходящие высвобождающие HS полимерные соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, с хитозановой основной цепью предпочтительно обладают средней молекулярной массой в диапазоне от 20 кДа до 500 кДа, например, молекулярной массой, равной примерно 150 кДа. Подходящие полимерные соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, с состоящей из гиалуроновой кислоты основной цепью предпочтительно обладают средней молекулярной массой в диапазоне от 20 кДа до 3 МДа, предпочтительно от 90 кДа до 3 МДа например, примерно 600 кДа. Обычно полимерный характер соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, проявляется в средней молекулярной массой, предпочтительно равной более 10 кДа, более предпочтительно, более 25 кДа или более 50 кДа. Например, полимер может обладать средней молекулярной массой от 10 кДа до 3 МДа, такой как, например, от 50 кДа до 1000 кДа или от 100 кДа до 600 кДа, или от 100 кДа до 300 кДа.
Полимерное соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, дополнительно можно описать с помощью полисахаридной основной цепи из повторяющихся звеньев моносахаридов, дисахаридов или олигосахаридов и по меньшей мере двух субструктур, ковалентно присоединенных к полисахаридной основной цепи, например, с помощью мостика. Таким образом, высвобождающие сероводород субструктуры можно описать, как часть боковой цепи полимерного соединения. По меньшей мере в двух высвобождающих сероводород субструктурах по меньшей мере два из повторяющихся звеньев основной цепи полимера обладают соответствующей модификацией с введением высвобождающих сероводород субструктур. Обычно степень, в которой полисахаридная основная цепь подвергнута модификации, можно представить с помощью степени модификации. Предпочтительно, если степень модификации высвобождающими сероводород субструктурами на 1 г полимера равна более 10 мкМ субструктур на 1 г полимера, более предпочтительно, более 50 мкМ или более 100 мкМ. Например, полимер может обладать степенью модификации высвобождающими сероводород субструктурами на 1 г полимера, равной от 10 мкМ до 1000 мкМ, такой как, например, от 50 мкМ до 500 мкМ или от 100 мкМ до 300 мкМ.
В предпочтительном варианте осуществления полимерное соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой субструктуру формулы I
1
в которой R означает алкил, алкенил, алкинил, алкиларил, арилалкил или арил, предпочтительно выбранный из группы, включающей фенил и метил, и в которой квадратик указывает положение, в котором субструктура связана с полисахаридной основной цепью высвобождающего сероводород полимерного соединения (также называющееся положением присоединения).
2
Предпочтительными соединениями в этих вариантах осуществления являются связанные с полисахаридом защищенные ацильной группой пертиолы. По мнению авторов изобретения связанные с полисахаридом защищенные ацильной группой пертиолы не описаны ранее. Авторы изобретения смогли показать, что эти полимерные соединения высвобождают сероводород, что инициируется присутствием тиола, такого как аминокислота L-цистеин, цистеамин или антиоксидант глутатион. Полимерный характер и высокая вязкость полученного водного полимерного соединения не подавляет высвобождение HS.
1
1
1
3
2
В формуле I R предпочтительно означает C-C алкил, такой как метил, этил, проп-1-ил или проп-2-ил, или арил, такой как фенил. Следовательно, защитной группой пертиола является, например, ацетильная или бензоильная группа. Предпочтительно, если R означает метил, т. е. защитной группой является ацетил. Пертиольное производное гиалуроновой кислоты с ацетильной защитной группой характеризуется большей степенью высвобождения HS, чем бензоильный аналог.
Предпочтительно, если по меньшей мере две защищенные ацильной группой пертиольные субструктуры связаны с полисахаридной основной цепью с помощью мостиковой группы L. Таким образом, предпочтительное высвобождающее сероводород полимерное соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, содержит по меньшей мере два повторяющихся звена формулы II
1
1
в которой R означает алкил, алкенил, алкинил, алкиларил, арилалкил или арил, предпочтительно выбранный из группы, включающей фенил или метил, в которой повторяющееся звено является частью полисахаридной основной цепи, где полисахаридная основная цепь указана штриховой линией и в которой L означает мостиковую группу. Звенья формулы II описываются формулой I и такие же предпочтения, как в формуле I, применимы для каждого R. Мостиковая группа L образует связь между субструктурой и повторяющимся звеном, предпочтительно образования первой связи с субструктурой и второй связи с повторяющимся звеном, т. е. с атомом повторяющегося звена, образующим часть полисахаридной основной цепи. Разумеется, полимерные соединения предпочтительно могут содержать другие субструктуры формулы I, в которой предпочтительно любые дополнительные субструктуры включены в дополнительное звено формулы II.
Обычно мостиковая группа может обладать разной структурой L. Мостиковая группа L может включать разные химические группы в зависимости от природы полисахаридной основной цепи. Например, мостиковая группа может быть присоединена с помощью амидной связи, где карбоксильная часть или аминная часть амидной связи является частью полисахаридной основной цепи, т. е. повторяющимся звеном. Предпочтительно, если полисахариды, образующие полимерную основную цепь, предоставляют аминогруппы или карбоксигруппы для присоединения функционализированных мостиковых групп (см. выше предпочтительные полисахариды). Гиалуроновая кислота, например, содержит звенья глюкуроновой кислоты и звенья N-ацетилглюкозамина. Предпочтительно, если карбоксигруппа звена глюкуроновой кислоты модифицирована мостиком на основе амина. Хитозан включает глюкозаминовые звенья, где амин предпочтительно модифицирован мостиковой группой на основе карбоксила. Например, на фиг. 1 приведен защищенный ацильной группой модифицированный пертиолом хитозан и гиалуроновая кислота.
Эти примеры соответствуют предпочтительному варианту осуществления, в котором мостиковая группа выбрана из группы, включающей структуру формулы III
и формулы IV
2
3
в которой квадратик указывает положение присоединения к полисахаридной основной цепи, т. е. повторяющееся звено полисахаридной основной цепи высвобождающего сероводород полимерного соединения и тильда указывает положение присоединения к субструктуре формулы I, и в которой R и R независимо выбраны из группы, включающей водород, алкил или арил.
2
3
2
В одном варианте осуществления может быть предпочтительно, если R и R не означает водород, т. е. образуется третичный пертиол. Третичные пертиолы ранее описаны в контексте обладающих молекулярной массой доноров HS (US 9096504).
2
3
Защищенный ацильной группой содержащий пертиол полимер с хитозановой основной цепью и мостиковой группой формулы III, в которой R и R оба означают водород, относится к хитозану, модифицированному N-ацетилцистеином (NAC). NAC-хитозан ранее описан, как биологически совместимый полимер, обладающий разными благоприятными воздействиями, который особенно полезен для высвобождения лекарственного средства и для применения в офтальмологии (Hombach, Hoyer et al., 2008, Thiolated chitosans: development and in vitro evaluation of an oral tobramycin sulphate delivery system, Eur J Pharm Sci (33): 1-8; Schmitz, Grabovac et al., 2008, Synthesis and characterization of a chitosan-N-acetyl cysteine conjugate, Int J Pharm (347): 79-85); WO 2015/169728).
2
3
Защищенный ацильной группой содержащий пертиол полимер с основной цепью из гиалуроновой кислоты и мостиковой группой формулы IV, в которой R и R оба означают водород, относится к гиалуроновой кислоте, модифицированной цистеамином, которая описана ранее (Clausen, Hornof et al., 2008, Thiolated Biopolymers: New Polymers for Ocular Use, Investigative Ophthalmology & Visual Science (49): 5770-5770; Hornof, Hoffer et al., 2008, Evaluation of Thiolated Polymers With Antioxidative Properties for the Use in Artificial Tears, Investigative Ophthalmology & Visual Science (49): 113-113; Hugh-Bloch, Hornof et al., 2008, Disulfide Crosslinked Hyaluronic Acid Films for Ocular Drug Delivery, Investigative Ophthalmology & Visual Science (49): 5773-5773); WO 2008/077172 „Use of polymers").
Другими объектами настоящего изобретения является соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, для применения в качестве лекарственного средства и применение соединений в качестве косметического средства. В этих объектах также высвобождающий сероводород полимер содержит полисахаридную основную цепь и по меньшей мере две субструктуры, способные высвобождать сероводород путем активации тиола, и необязательно характеризуется другими предпочтениями, раскрытыми выше.
2
По данным настоящего изобретения благоприятные эффекты соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, распространяются на родственные полимеры без способности высвобождать HS и они должны быть полезны для лечения и предупреждения патологических состояний кожи, глазных заболеваний и остеоартрита.
Области применения соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, включают патологические состояния кожи медицинского характера, т. е. заболевания кожи, а также косметические патологические состояния кожи. Таким образом, в одном объекте настоящее изобретение относится к применению соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, в качестве косметического средства. Следует отметить, что термины косметическое средство или лекарственное средство при использовании в настоящем изобретении также могут относиться к медицинскому устройству или медицинскому продукту. Одним объектом настоящего изобретения является соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, для применения или применение соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, для лечения и предупреждения патологического состояния кожи. Патологическое состояние кожи представляет собой заболевание кожи в случае соединения для применения или косметическое патологическое состояние кожи в случае применения соединения.
2
В одном варианте осуществления заболеванием кожи может быть поражение кожи, т. е. рана, такая как царапина, порез, прокол, повреждение, отклонение от нормы, ожог или язва, в особенности открытая рана. Воздействие на заживление раны может быть опосредовано антиокислительными, модулирующими воспаление и ангиогенными характеристиками HS. В частности, лечение может быть полезным на таких фазах заживления раны, на которых воспаление играет важную роль, а также во время нагноения и ремоделирования. Рана также может представлять собой хроническую рану, такую как рана, связанная с диабетом, венозным или артериальным заболеванием, инфекцией и метаболическими нарушениями в пожилом возрасте. Заболеванием кожи также может быть рубец, т. е. изменение кожи, указывающее на нанесенную ранее рану.
В другом варианте осуществления заболевание кожи может обладать острой или хронической воспалительной природой, такой как солнечный ожог, воспалительные реакции после воздействия аллергенов или контакта с химическими раздражителями, псориаз или дерматит (экзема).
Другим вариантом осуществления применения является применение в качестве косметического средства для патологического состояния кожи косметической природы, т. е. косметического патологического состояния кожи, в котором на кожа проявляются, например, признаки старения или другие нежелательные немедицинские кожные явления. Типичное косметическое применение включает применение для лечения и предупреждения морщин кожи и мелких морщин, а также лечения участков кожи, на которых проявляются другие признаки старения, такие как уменьшенная эластичность (эластоз), поврежденные капилляры и повреждение от солнечных лучей.
Другим объектом настоящего изобретения является соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, для применения для лечения и предупреждения глазного заболевания, где соединением является высвобождающий сероводород полимер. Типичное глазное заболевание можно выбрать из группы, включающей глаукому, воспалительные патологические состояния, такие как конъюнктивит, и заболеваний сетчатки, такие как дегенерация желтого пятна, окклюзия сосудов сетчатки и диабетическая ретинопатия.
Другим объектом настоящего изобретения является соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, для применения для лечения и предупреждения остеоартрита, где соединением является высвобождающий сероводород полимер. В одном варианте осуществления может быть предпочтительно, чтобы остеоартрит являлся вторичным артритом, связанным с воспалительным заболеванием, и/или хроническим артритом (артрит при болезни Лайма, ревматоидный артрит, псориатический артрит).
Применение соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, для лечения и предупреждения описанных выше заболеваний и/или патологических состояний включает тот факт, что соединение или композицию, содержащую соединение, вводят субъекту, например, человеку. Локальное введение предпочтительно и следует понимать, как введение в конкретное положение, т. е. на участок введения, например, участок кожи, ткани глаза (чаще глаз) или сустав субъекта, подвергающегося лечению, где на указанном участке патологическое состояние кожи, глазное заболевание или остеоартрит имеется или ожидается, что возникнет соответственно.
В случае применения для лечения и предупреждения патологического состояния кожи (заболевание кожи или косметическое патологическое состояние кожи) локальное введение, предпочтительно кожное введение, следует понимать, как введение на определенный участок кожи, например, на участок кожи, на котором патологическое состояние кожи имеется или ожидается, что возникнет. Локальное введение может включать лечение участка кожи на поверхности, внутрикожно или подкожно, т. е. путем инъекции под рассматриваемый участок кожи. В предпочтительном варианте осуществления соединение для применения, предлагаемое в настоящем изобретении, вводят на или в участок кожи, где на участке кожи имеется (косметическое или медицинское) патологическое состояние кожи или где на участке кожи ожидается проявление патологического состояния кожи.
2
2
В случае применения для лечения и предупреждения глазных заболеваний локальное введение в ткани глаза (чаще в глаз) является предпочтительным. Локальное введение может включать нанесение соединения для применения, предлагаемое в настоящем изобретении, на поверхность глаза, например, в форме глазных капель, или путем инъекции в глаз. Соединение для применения, предлагаемое в настоящем изобретении, можно вводить в качестве заменителя стекловидного тела или в качестве внутриглазного имплантата. Заменитель стекловидного тела вводят путем инъекции в виде геля в заднюю часть глаза после витректомии. Внутриглазной имплантат вводят путем инъекции в глаз или имплантируют во время операции глаза. В вариантах осуществления, в которых соединение для применения, предлагаемое в настоящем изобретении, вводят на поверхность глаза (в композициях, представляющих собой глазные капли, глазные гели и т. п.), HS, высвобождаемый соединением, также может действовать на другие части глаза. Высвободившийся HS может диффундировать в эти другие части и таким образом соединение может действовать на заболевания, связанные с неповерхностными частями глаза, такие как заболевания, включающие сетчатку, или глаукому.
В случае применения для лечения и предупреждения остеоартрита предпочтительно локальное введение в сустав, где указанный сустав характеризуется остеоартритом или где для указанного сустава ожидается проявление остеоартрита. Соединение для применения, предлагаемое в настоящем изобретении, можно вводить в качестве дополнения для синовиальной жидкости. Дополнение для синовиальной жидкости вводят путем инъекции в виде геля в рассматриваемый сустав, например, колено, называющейся внутрисуставной инъекцией. Соединение или композицию, вводимую в качестве дополнения для синовиальной жидкости также называют имплантатом.
Композиция введения соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, включает соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, и один или большее количество подходящих инертных наполнителей. Композиция содержит соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, которое может представлять собой лекарственное средство, косметическое или медицинское устройство или медицинский продукт. Фармацевтически приемлемый инертный наполнитель, содержащийся в композиции, предлагаемой в настоящем изобретении, можно выбрать из группы, включающей подходящий носитель и/или разбавитель, например, включая наполнители, связующие, разрыхлители, агенты, улучшающие сыпучесть, смазывающие вещества, отдушки, консерванты, стабилизаторы, смачивающие агенты и/или эмульгаторы, солюбилизаторы, соли для регулирования осмотического давления и/или буферы. Композиция также может содержать полимерные инертные наполнители, такие как хитозан и/или гиалуроновая кислота. Композиция также может содержать стабилизированные полимеры, такие как сшитая гиалуроновая кислота.
Некоторые полимерные соединения с полисахаридной основной цепью, например, гиалуроновая кислота, пектин, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза или хитозан, могут образовывать гидрогели с водой, таким образом композицию можно получать в виде гидрогеля. Гель можно наносить местно на кожу или на поверхность глаза. Композиция может представлять собой имплантат для инъекции для введения соединения внутрикожно или подкожно в виде кожного наполнителя. Композиция может представлять собой имплантат для инъекции для введения соединения в качестве заменителя стекловидного тела или внутриглазного имплантата. Композиция также может представлять собой имплантат для инъекции для введения соединения в качестве внутри суставного дополнения для синовиальной жидкости.
Композиция для введения соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, также может включать одно или большее количество других активных соединений, например, из группы витаминов, противовоспалительных средств, противоревматических средств, анальгетиков, противоинфекционных средств, протвовирусных средств, антибиотиков, антимикотиков, антисептических средств, химиотерапевических средств, цитостатических средств, местные анестетиков, противоаллергенных средств, антигистаминов, противовоспалительных средств и факторов роста.
Для использования соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, или композиции, содержащей соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, специалист в данной области техники должен рассматривать разные вводимые формы в зависимости от предполагаемого применения. Вводимые формы соединения могут представлять собой повязку на рану или накожный пластырь, например, в виде гелеобразующего агента в гидроколлоидной повязке в комбинации с другими материалами, такими как клеи, или в виде гидрогелевой повязки. Такие повязки на рану могут представлять собой гели, тонкие листы, пленки или многослойные композиционные повязки. Соединение также может находиться в виде шариков, чешуек, порошка и нитей и приготовлено в форме пленки, волокнистой подушечки, сетки, тканого или нетканого материала, высушенной вымораживанием губки, пенки или их комбинации. Другие местные препараты для введения соединения включают жидкие (растворы, например, растворы глазных капель, суспензии и эмульсии) и полужидкие препараты (гели, мази и кремы). В случае композиций, предназначенных для применения для лечения открытых ран или лечения глаз или композиций для применения путем инъекции, они должны готовиться в виде стерилизованной формы для введения. В примерах 6-19 приведены разные формы для введения.
2
2
2
2
Как указано выше, высвобождающие HS полимерные соединения, содержащие субструктуры, способные высвобождать сероводород путем активации тиола, взаимодействуют со свободными тиольными группами (-SH) для высвобождения HS. Таким образом, соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, предпочтительно наносят/вводят в комбинации с содержащим тиольную группу компонентом реакции, который обеспечивает инициированное высвобождение HS из предпочтительных соединений. Альтернативно, высвобождение HS может основываться на компонентах реакции со свободными тиольными группами, которые естественным образом находятся на участке нанесения.
В одном варианте осуществления соединение для применения, предлагаемое в настоящем изобретении, или применение этого соединения включает случай, когда соединение вводят на участке локального введения (т. е. в конкретном положении организма, например, на участке кожи, глаза или сустава) и одновременно или последовательно содержащий тиольную группу компонент реакции вводят на участок введения.
Объединенное или последовательное введение обеспечивает совместное лечение высвобождающим сероводород полимерным соединением, предлагаемым в настоящем изобретении, и содержащим тиольную группу компонентом реакции. Объединенное введение поставляет компоненты реакции при условиях, когда они могут взаимодействовать друг с другом. Для протекания взаимодействия необходимо локальную близость, т. е. прямое соприкосновение, что, например, происходит, когда их оба наносят на один участок кожи. Участком кожи может быть положение или небольшой кусочек кожи, где размер участка может зависеть от соответствующего патологического состояния кожи.
В этом контексте одновременное или последовательное означает, что соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, и содержащий тиольную группу компонент реакции вводят примерно в одно и то же время. В качестве предпочтительного режима в настоящем изобретении "одновременно" указывает на совпадение по времени. "Последовательно" может означать, что содержащий тиольную группу компонент реакции или соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, вводят первым. Однако в контексте настоящего изобретения предпочтительное "последовательно" предпочтительно указывает, что эти два соединения вводят одно сразу после другого.
Хотя предпочтительно, если соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, и содержащий тиольную группу компонент реакции вводят совместно, им не следует предоставлять возможность взаимодействовать друг с другом во время получения или хранения вводимой формы. В одном объекте настоящего изобретения соединение, предлагаемое в настоящем изобретении, и содержащий тиольную группу компонент реакции не включают в одну композицию. Для получения вводимой формы, подходящей для одновременного введения, специалист в данной области техники должен рассматривать подходящий содержащий одну дозу набор или упаковку, в которой полимер, предлагаемый в настоящем изобретении, и содержащий тиольную группу компонент реакции могут храниться и поставляться по отдельности, включая инструкцию о том, как их следует смешивать незадолго до или во время введения.
2
2
2
2
В примерах раскрыты формы для введения, которые предоставляют возможность совместного введения соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, и содержащего тиольную группу компонента реакции. Чаще различные формы можно описать следующим образом: Например, при открывании набора или упаковки с одной дозой высвобождающий HS полимер, содержащийся в композиции "A", и композицию содержащего тиольную группу компонента реакции "B" смешивают до или во время введения с получением готовой местной композиции: потребитель (например, пациент, потребитель косметического продукта, медицинский персонал) открывает упаковку с одной дозой, потребитель помещает содержимое камер упаковки на свою ладонь или в подходящую для смешивания емкость и затем смешивает композицию A, например, содержащую высвобождающее HS гиалуроновой кислоты производное, с композицией B, например, содержащей L-цистеин, и получает готовую местную композицию до нанесения местной композиции на пораженный участок. Альтернативно, потребитель может сначала нанести композицию A на пораженный участок кожи и затем сразу нанести композицию B на тот же участок кожи. В альтернативном варианте осуществления поставляют упаковку с одной дозой с двумя разными камерами, содержащими композицию A и B соответственно. Потребитель открывает упаковку с одной дозой и помещает камеры упаковки прямо на. Затем композиция A и композиция B, например, содержащая высвобождающее HS гиалуроновой кислоты производное и L-цистеин соответственно, смешиваются, когда потребитель растирает композиции по пораженному участку кожи. В другом предпочтительном варианте осуществления соединение для применения, предлагаемое в настоящем изобретении, вводят из (многодозового) двухкамерного аппарата, содержащего отдельные камеры для размещения композиции A и композиции B. В одном примере такого аппарата дозатор может подавать одновременно эти две композиции, по отдельности содержащиеся в камерах, при нажатии на дозирующую головку, которая затем выдает эти две композиции в примерно одинаковых объемах. Другим вариантом осуществления введения местной композиций, предлагаемой в настоящем изобретении, является двухкамерная пробирка, где композиция A находится в одной камере и композиция B находится в другой камере. Эти две камеры разделены тонкой мембраной, которая разрывается, когда потребитель пытается освободить пробирку, что обеспечивает смешивание двух компонентов перед нанесением. В каждом из альтернативных вариантах осуществления упаковки композицию A и композицию B смешивают непосредственно до или во время введения с образованием готовой местной композиции. В случае введения путем инъекции, т. е. внутрикожной или подкожной инъекции для предупреждения и лечения патологического состояния кожи (включая заболевание кожи и косметическое патологическое состояние), внутриглазной инъекции для предупреждения и лечения глазных заболеваний и внутрисуставной инъекции для предупреждения и лечения остеоартрита, соединение для применения, предлагаемое в настоящем изобретении, поставляется в композиции для инъекции. Например, композицию "A", содержащую соединение, помещают в содержащие одну дозу шприцы и стерилизуют нагреванием во влажной среде. Содержащий тиольную группу компонент реакции также можно вводить путем инъекции, т. е. он поставляется в виде стерильного раствора и таким образом композицию "B" можно вводить путем инъекции с той же стороны, т. е. на тот же участок кожи, участок введения в глаз или в тот же сустав. Двухкамерные шприцы позволяют провести одновременное введение путем инъекции двух композиций. Однако в особенности в случае инъекции (например, в примерах 9, 10-15), совместное введение композиции B можно исключить, поскольку содержащий тиольную группу компонент реакции для инициирования высвобождения HS может поступать из кожи, тканей глаза или синовиальной жидкости (см. ниже).
В одном варианте осуществления содержащий тиольную группу компонент реакции представляет собой органическое соединение с низкой молекулярной массой, например, равной примерно 500 Да или менее. Небольшие органические соединения могут входить в высвобождающие сероводород субструктуры даже в случае агломерата полимера, такого как гидрогель или имплантат, образованный полимерным соединением. Стерические затруднения могут препятствовать основанному на ферменте механизму активации, поскольку ферменты, как обладающие высокой молекулярной массой соединения, могут с трудом входить в высвобождающие сероводород субструктуры в полимерной среде. Однако для соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, способных высвобождать сероводород путем активации тиола, доступны небольшие активирующие реагенты (содержащие тиольную группу компоненты реакции). В предпочтительном варианте осуществления содержащий тиольную группу компонент реакции выбран из группы, включающей цистеин, цистеамин, N-ацилцистеин, гомоцистеин и глутатион. Глутатион следует понимать, как означающий восстановленный глутатион. Предпочтительно, если цистеин представляет собой L-цистеин, и N-ацилцистеин представляет собой N-ацетилцистеин.
2
2
В другом варианте осуществления содержащий тиольную группу компонент реакции также может представлять собой тиолированный полимер, например, тиолированный хитозан, тиолированную гиалуроновую кислоту или другие тиолированные полисахариды. Например, композиция включает высвобождающее HS соединение с полисахаридной основной цепью и содержащий тиольную группу компонент реакции, где содержащий тиольную группу компонент реакции представляет собой тиолированный полисахарид с одинаковыми или разными полисахаридными основными цепями в качестве высвобождающего HS соединения.
2
В другом варианте осуществления содержащий тиольную группу компонент реакции может представлять собой соединение, естественным образом находящееся в коже, в глазу, в грануляционной ткани во время заживления раны, в экссудате раны, или в синовиальной жидкости, такое как восстановленный глутатион (Shindo, Witt et al., 1994, Enzymic and non-enzymic antioxidants in epidermis and dermis of human skin, J Invest Dermatol (102): 122-124; Rose, Richer et al., 1998, Ocular oxidants and antioxidant protection, Proc Soc Exp Biol Med (217): 397-407; Rhie, Shin et al., 2001, Aging- and photoaging-dependent changes of enzymic and nonenzymic antioxidants in the epidermis and dermis of human skin in vivo, J Invest Dermatol (117): 1212-1217; Angthong, Morales et al., 2013, Can levels of antioxidants in synovial fluid predict the severity of primary knee osteoarthritis: a preliminary study, Springerplus (2): 652; Honnegowda, Kumar et al., 2015, Effects of limited access dressing in chronic wounds: A biochemical and histological study, Indian J Plast Surg (48): 22-28). Таким образом, в особенности в случае введения путем инъекции или лечения открытой раны, может не требоваться совместное введение экзогенного содержащего тиольную группу компонента реакции для инициирования высвобождения HS из полимера.
Другим объектом настоящего изобретения является способ лечения или предупреждения патологического состояния, где патологическое состояние выбрано из группы, включающей патологическое состояние кожи (включая заболевание кожи или косметическое патологическое состояние), глазное заболевание или остеоартрит, способ включает следующие стадии
i) получение соединения, предлагаемого в настоящем изобретении, и
ii) введение соединения на участок локального введения, где патологическое состояние имеется или ожидается, что возникнет на указанном участке.
Локальным участком может быть участок кожи, глазная ткань или сустав в случае, когда способ относится к лечению или предупреждению патологического состояния кожи, глазного заболевания или остеоартрита соответственно.
Введение на участок кожи предназначено для лечения или предупреждения патологического состояния кожи и локальное введение может быть местным, а также подкожной или внутрикожной инъекцией, как описано выше. В случае лечения и предупреждения глазного заболевания стадия введения может включать местное нанесение на поверхность глаза, но также внутриглазную инъекцию, как описано выше. В случае лечения и предупреждения остеоартрита локальное введение, описанное для стадии ii), означает, что соединение следует вводить в сустав, и предпочтительно соединение вводят путем внутрисуставной инъекции. В одном варианте осуществления способ лечения или предупреждения включает дополнительную стадию одновременного или последовательного введения содержащего тиольную группу компонента реакции в том же положении, что и для локального введения.
В предпочтительном варианте осуществления способ представляет собой способ предупреждения и лечения косметических патологических состояний кожи, таким образом, способ представляет собой косметический способ и относится к лечению и предупреждению не заболевания, а патологического состояния кожи косметической природы.
Настоящее изобретение подробнее описано на чертежах и в неограничивающих примерах.
На фиг. 1 представлены структуры типичных высвобождающих сероводород полимерных соединений, предлагаемых в настоящем изобретении, где на фиг. 1A и 1B представлена гиалуроновая кислота с защищенными ацильной группой пертиольными субструктурами и на фиг. 1C представлен хитозан с защищенными ацильной группой пертиольными субструктурами.
На фиг. 2 схематично представлена схема синтеза полимера, приведенного на фиг. 1C.
На фиг. 3 схематично представлена схема синтеза полимера, приведенного на фиг. 1A.
На фиг. 4 схематично представлена альтернативная схема синтеза полимера, приведенного на фиг. 1A.
На фиг. 5 схематично представлена схема синтеза полимера, приведенного на фиг. 1B.
2
2
На фиг. 6 представлены результаты анализа высвобождения HS, который проведен с использованием высвобождающего HS производного хитозана.
2
2
На фиг. 7 представлены результаты анализа высвобождения HS, который проведен с использованием высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты.
На фиг. 8 приведены результаты анализов совместимости с клетками, где исследованными линиями клеток являлись первичные кожные фибробласты человека (dFb) (фиг. 8A), бессмертные эндотелиальные клетки микрососудов человека (HMEC-1) (фиг. 8B) и кератиноциты линии клеток HaCat (фиг. 8C). "% GAG" означает используемую при исследовании концентрацию исследуемых соединений. Статическую значимость рассчитывали с использованием непарного T-критерия Стьюдента, где результаты, отмеченный звездочками, соответствуют * для p<0,05; ** для p<0,01; *** для p<0,005 и **** для p<0,001.
На фиг. 9 схематично представлена структура многослойной повязки на рану.
2
2
2
На фиг. 10 показано получение производного N-(бензоилтио)бензамида и производного высвобождающей HS гиалуроновой кислоты с ковалентно присоединенными N-(бензоилтио)бензамидными субструктурами. На фиг. 10A представлена схема реакции синтеза производного донора HS 5a, модифицированного аминогруппой. На фиг. 10B представлено высвобождающее HS производное гиалуроновой кислоты с ковалентно присоединенными N-(бензоилтио)бензамидными субструктурами.
На схемах полимерные соединения представлены в виде звеньев полимера и скобки указывают, что звено повторяется, т. е. повторяется в полимере n раз. Следует понимать, что схемы являются символическими и применительно к немодифицированным и модифицированным повторяющимся звеньям не характеризуют реальную степень модификации.
Примеры
2
Пример 1: Получение высвобождающего HS производного хитозана
2
Хитозан-N-ацетилцистеингидрохлорид (хитозан-NAC), исходное вещество для получения высвобождающего HS полимера, представленного на фиг. 1C, синтезировали по методике, описанной ранее (WO 2015/169728 "Aqueous ophthalmic solution and method for treating dry eye syndrome"). Other routes for synthesis were published as well (Schmitz, Grabovac et al., 2008, Synthesis and characterization of a chitosan-N-acetyl cysteine conjugate, Int J Pharm (347): 79-85). Схема реакции приведена на фиг. 2.
2 г Хитозан-NAC (MW 150 кДа, степень модификации 185 мкмоль тиольных фрагментов/г полимера) растворяли в 200 мл воды (WFI, вода для инъекции). Примерно 90 мг (примерно 400 мкмоль) 2,2'-дитиодипиридина растворяли в 5 мл этанола и смешивали с раствором полимера. Раствор перемешивали в течение 1 ч при температуре окружающей среды. Затем 76 мг (1 ммоля) тиоуксусной кислоты растворяли в 0,5 мл 1 M NaOH и добавляли к раствору реакционной смеси. Раствор перемешивали в течение еще 35 мин. Затем раствор нейтрализовывали с помощью NaOH и полимер осаждали путем добавления 2-пропанола. Полимер собирали фильтрованием с отсасыванием. Для очистки полимер суспендировали в WFI и сильно подкисляли (pH~1) с помощью 5 M HCl. Полимер повторно осаждали путем добавления 2-пропанола и собирали фильтрованием с отсасыванием. Полимер несколько раз промывали 2-пропанолом и в заключение сушили при пониженном давлении.
2
1,6 г Полимера получали в виде белого растворимого в воде порошка с оцененной молекулярной массой, равной 150 кДа (в пересчете на исходное вещество) и степенью модификации высвобождающими HS пертиол структурами, составляющей 178 мкМ на 1 г полимера. Это соответствует равной 96% степени превращения тиольных фрагментов полимера, использующихся в качестве исходного вещества.
2
Пример 2: Получение высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты
Защищенное S-меркаптоникотиновой кислотой тиолированное производное гиалуроновой кислоты использовали в качестве промежуточного продукта для введения защищенных ацильной группой пертиольных групп в полимер. Схематичная схема реакции этой стадии синтеза приведена на фиг. 3. Защита тиольных групп тиолированных полимеров меркаптоникотиновой кислотой (стадия b) и их производных описана в EP 2482852 "Mucoadhesive polymers having vitamin B partial structures".
Стадия a): Синтез 2-(2-аминоэтилдисульфанил)пиридин-3-карбоновой кислоты
2
2
2
2-Меркаптоникотиновую кислоту диспергировали в HO и полностью растворяли после добавления 5 M NaOH до pH 9-10. После регулирования pH примерно до 8,0 с помощью HCl по каплям добавляли 30% раствор HO, поддерживая постоянный pH в диапазоне 7,5-8,5. После подкисления до pH=1,0-1,5 с помощью 5 M HCl, димерное соединение 2-(3-карбоксипиридин-1-ий-2-ил)дисульфанилпиридин-1-ий-3-карбоновая кислота осаждалась в виде белого твердого вещества. Продукт фильтровали и промывали с помощью 1 M HCl и 2-пропанола. В заключение его сушили при пониженном давлении при 50°C.
Димер (2-[3-карбоксипиридин-1-ий-2-ил]дисульфанилпиридин-1-ий-3-карбоновую кислоту) суспендировали в 96% этаноле и растворяли после добавления триэтиламина. Раствор цистеамин-HCl (1,1 экв.) в 96% этаноле нейтрализовывали эквимолярным количеством триэтиламина. Раствор цистеамина добавляли к раствору димера и смеси давали реагировать в течение 45 ч. Осадок отфильтровывали, промывали этанолом и сушили при пониженном давлении при 50°C (т.пл. [нескорректированная] =184-186°C).
Стадия b): Синтез защищенной S-меркаптоникотиновой кислотой тиолированной гиалуроновой кислоты
3,2 г Свободной гиалуроновой кислоты (средняя молекулярная масса (MMW) примерно 0,6 МДа) суспендировали в 300 мл DMSO.
Добавляли 900 мкл триэтиламина.
Суспензию перемешивали при температуре окружающей среды до полного растворения соли гиалуроновой кислоты с триэтиламином.
Значение pH раствора устанавливали равным от 2,55 до 2,75 путем добавления HCl в подходящем органическом растворителе.
Добавляли 470 мг N,N'-карбонилдиимидазола в 10 мл DMSO и раствор перемешивали в течение 30 мин при температуре окружающей среды.
Добавляли 600 мг 2-(2-аминоэтилдисульфанил)пиридин-3-карбоновой кислоты (см. стадию a) и раствор перемешивали в течение 20 ч.
Раствор реакционной смеси подкисляли с помощью 5 M HCl.
Защищенную S-меркаптоникотиновой кислотой тиолированную гиалуроновую кислоту осаждали путем добавления 2-пропанола и собирали центрифугированием.
2
Полимер растворяли в 300 мл HO и повторно осаждали 2-пропанолом.
Полимер собирали центрифугированием и сушили при пониженном давлении.
Получали 2,6 г белого растворимого в воде порошка со степенью модификации примерно 250 мкмоль содержащих меркаптоникотиновую кислоту боковых цепей/г полимера.
2
Стадия c) Синтез высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты с использованием в качестве исходного вещества продукта стадии b)
2
Полимер, полученный на стадии 10 при синтезе защищенной S-меркаптоникотиновой кислотой тиолированной гиалуроновой кислоты, как описано выше, растворяли в 300 мл HO и значение pH устанавливали равным 7,3.
228 мг (3 ммоля) Тиоуксусной кислоты смешивали с 1,50 мл 1 M NaOH и добавляли к раствору полимера.
Раствор перемешивали в течение 15 мин.
Раствор сильно подкисляли путем добавления HCl.
Конечный полимер осаждали путем добавления 500 мл 2-пропанола и собирали центрифугированием.
Твердый полимер суспендировали в 2-пропаноле, фильтровали с отсасыванием, трижды промывали с помощью 50 мл 2-пропанола и дважды с помощью 50 мл этанола, пока фильтрат не становился бесцветным.
Полимер сушили при пониженном давлении при 35-40°C.
1
Получали 2,4 г белого растворимого в воде порошка с оцененной степенью модификации примерно 250 мкмоль S-ацетильных фрагментов и с оцененной молекулярной массой, равной 0,6 МДа (в пересчете на исходное вещество). Отсутствие аномальных сигналов ароматических групп в спектре H-ЯМР указывало на полное превращение защищенной S-меркаптоникотиновой кислотой тиолированной гиалуроновой кислоты в искомый продукт.
2
Аналогичный синтез также применим для получения другого высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты с тиобензойной кислотой на стадии c) 2), как схематично показано на фиг. 5.
2
Пример 3: Получение высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты - альтернативный путь синтеза
2
Альтернативно, высвобождающие HS гиалуроновой кислоты производные синтезировали по схеме реакции, приведенной на фиг. 4, с использованием тиолированной гиалуроновой кислоты в качестве исходного вещества.
1 г Конъюгата гиалуроновая кислота-цистеамин (степень модификации ~150 мкмоль тиольных фрагментов на 1 г полимера, MW 270 кДа) растворяли в 100 мл WFI. Примерно 45 мг (примерно 195 мкмоль) 2,2'-дитиодипиридина растворяли в 1,5 мл этанола и смешивали с раствором полимера. Раствор перемешивали в течение 2 ч при температуре окружающей среды.
Примерно 38 мг (примерно 490 мкмоль) тиоуксусной кислоты растворяли в 245 мкл 1 M NaOH и полученный раствор добавляли к раствору полимера. После перемешивания в течение 2 ч при температуре окружающей среды раствор полимера нейтрализовывали путем добавления NaOH. После добавления 2-пропанола полимер осаждался. Продукт собирали фильтрованием с отсасыванием и очищали путем многократного промывания этанолом. В заключение полимер сушили при пониженном давлении.
2
2
2
850 мг Полимера получали в виде белого волокнистого продукта с оцененной молекулярной массой, равной 270 кДа (в пересчете на исходное вещество) и степенью модификации высвобождающими HS пертиол структурами, составляющей 147 мкМ на 1 г полимера. Это соответствует равной 98% степени превращения тиольных фрагментов полимера, использующегося в качестве исходного вещества. Полимер был нерастворим в воде, но растворялся после суспендирования в WFI в присутствии 10-кратного избытка L-цистеина с получением прозрачного вязкого раствора с высвобождением HS. Выделяющийся HS регистрировали с помощью коричневеющей бумаги, пропитанной ацетатом Pb.
Пример 4: Высвобождение сероводорода
2
2
2
Исследуемые полимерные соединения, предлагаемые в настоящем изобретении (представленные на фиг. 1A и 1C), изучали для определения их способности высвобождать сероводород в присутствии содержащего тиол компонента с помощью амперометрического детектирующего устройства (микросенсор HS с проницаемой для HS мембраной; AMT Analysenmesstechnik GmbH). Высвобождение HS инициировали путем добавления L-цистеина.
2
2
2
На фиг. 6 представлены результаты анализа высвобождения HS, где 50 мл 0,1% (мас./мас.) раствора высвобождающего HS производного хитозана, которое синтезировали, как описано в примере 1, получали с использованием 50 мМ ацетатного буфера (pH 5,5). К полученному раствору, который обладал pH 5,3, добавляли 1,5 мл 100 мМ раствора L-цистеина. За результирующим высвобождением HS следили при комнатной температуре.
2
2
2
На фиг. 7 представлены результаты анализа высвобождения HS, где 0,1% (мас./мас.) высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты примера 2 (фиг. 1A) инкубировали в DMEM (модифицированная Иглом среда Дульбекко) в присутствии 3 мМ L-цистеина (при комнатной температуре и pH 7,6-7,8). После непродолжительного периода задержки при используемых при исследовании условиях высвобождение HS продолжалось в течение более 15 ч.
2
Пример 5: Совместимость с клетками высвобождающего HS полимера
2
2
Для изучения совместимости с клетками, в особенности влияния пролиферации, высвобождающее HS гиалуроновой кислоты производное, представленное на фиг. 1A (см. выше) исследовали при сопоставлении с немодифицированной HA (натриевая соль гиалуроновой кислоты, "NA HA") и защищенной S-меркаптоникотиновой кислотой тиолированной гиалуроновой кислотой ("Thiomer CAPPY"). Для дополнительного контроля в эксперименты включали хорошо известный имеющийся в продаже HS N-(бензоилтио)бензамид (донором 5a является NSHD1, небольшая молекула, способная активировать тиол).
2
В качестве моделей использовали три типа клеток кожи: первичные кожные фибробласты человека (dFb), бессмертные эндотелиальные клетки микрососудов человека (HMEC-1) и кератиноциты линии клеток HaCat. Клетки выращивали в соответствующей подходящей для них среде. Синтетическую среду Fibrolife с добавками и гентамицин использовали для dFb, EBM+добавки использовали для HMEC-1 и DMEM с 10% FCS и 1% CellShield использовали для клеток HaCat. Кроме того, при всех условиях исследования добавляли 3 мМ цистеина. По данным предварительных экспериментов добавление 3 мМ цистеина во все среды не влияло на рост клеток. Клетки высевали и выращивали по меньшей мере в течение ночи и затем среду заменяли и в соответствии с утвержденным протоколом добавляли компоненты HA. Использовали две концентрации (0,05% и 0,1%) образцов HA. Обработку проводили в течение 48 ч и 96 ч. В эксперименте, проводимом в течение 48 ч, через 24 ч после начальной обработки проводили дополнительную замену среды. В эксперименте, проводимом в течение 96 ч, через 24 ч и 72 ч после начальной обработки проводили две дополнительные замены среды. Пролиферацию клеток исследовали с использованием основанного на WST-1 колориметрического детектирующего реагента в соответствии с протоколом изготовителя со свежей средой без добавления какого-либо производного HA. Все эксперименты повторяли 3-6 раз каждый с 5 параллельными образцами для каждого условия. После каждой замены среды успешное получение HS проверяли с помощью бумаги, пропитанной ацетатом Pb.
2
Исследование показало, что высвобождающее HS производное гиалуроновой кислоты нетоксично для исследуемых типов клеток при использованных концентрациях и условиях выращивания. Экспериментальные результаты представляются достоверными, поскольку можно было наблюдать известные эффекты индуцированной пролиферации фибробластов и эндотелиальных клеток немодифицированными
2
HA (концентрация 0,1%). Эндотелиальные клетки могли быть наиболее чувствительными к HS, как это обнаружено для "H2S CAPPY" и контрольного донора 5a.
Пример 6: Заживление раны - препарат губка
2
Готовят водный раствор гидрогеля, содержащий 1,5% (мас./мас.) высвобождающего HS производного хитозан, со степенью модификации примерно 185 мкмоль S-ацетильных фрагментов, предлагаемых в настоящем изобретении. Раствор наливали в 12-луночные культуральные планшеты в количестве, равном 0,9 г/лунка, и сушат вымораживанием. Полученный лиофилизат представляет собой губку круглой формы диаметром примерно 2 см. Губки герметизируют в отдельные пакеты. Затем пакеты и вторичный упаковочный материал стерилизуют гамма-излучением.
2
Для лечения ран стерильные губки наносят на кожную рану. Несколько капель стерильного забуференного раствора N-ацетилцистеина в концентрации, равной 5 мг/мл, можно наносить на губку для инициирования немедленного высвобождения HS. Затем участок раны закрывают вторичной повязкой на рану, обладающей низкой газопроницаемостью, такой как пленка, состоящая из полиэтилена, полипропилена или политетрафторэтилена, или тканью или полотном с ворсом, обладающим низкой газопроницаемостью, например, полипропиленовым полотном с ворсом с почти газонепроницаемым слоем, таким как полиуретан.
Пример 7: Лечение кожи - местный гидрогель
2
Готовят водный раствор гидрогеля, содержащий 1% (мас./мас.) высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты со степенью модификации примерно 250 мкмоль S-ацетильных фрагментов, предлагаемые в настоящем изобретении, в фосфатном буфере с физиологически приемлемым значением pH. Затем раствор помещают в одноразовые контейнеры (например, содержащие одну дозу полипропиленовые контейнеры или стеклянные шприцы объемом примерно 3 мл) и стерилизуют нагреванием во влажной среде. Вторую композицию, содержащую N-ацетилцистеин в физиологическом буферном растворе в концентрации, равной 10 мг/мл, также помещают в одноразовый контейнер. Полученный гидрогель с низкой вязкостью наносят на неповрежденную кожу или воспаленные участки кожи сразу же после нанесения на тот же участок кожи примерно такого же количества композиции, содержащей N-ацетилцистеин.
Лечение гидрогелем может быть предпочтительным в случае косметических патологических состояний кожи или заболевания кожи, такое как лечение рубцов и закрытой раны или воспалительных заболеваний кожи.
Пример 8: Заживление раны - препарат гидрогель
2
Водный раствор гидрогеля, содержащий 2% (мас./мас.) высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты со степенью модификации примерно 250 мкмоль S-ацетильных фрагментов, предлагаемых в настоящем изобретении, готовят в фосфатном буфере с физиологически приемлемым pH. Затем гель помещают в одноразовые контейнеры (такие как шприцы) и стерилизуют нагреванием во влажной среде.
2
Полученный гидрогель наносят на кожную рану. Небольшой объем стерильного забуференного раствора N-ацетилцистеина в концентрации, равной 100 мг/мл, можно разбрызгать на гель для инициирования немедленного высвобождения HS. Затем участок раны закрывают вторичной повязкой на рану, обладающей низкой газопроницаемостью, такой как пленка, состоящая из полиэтилена, полипропилена или политетрафторэтилена, или тканью или полотном с ворсом, обладающим низкой газопроницаемостью, например, полипропиленовым полотном с ворсом с почти газонепроницаемым слоем, таким как полиуретан.
Пример 9: Препарат для инъекции - наполнитель для кожи
2
2
Гиалуроновую кислоту стабилизируют путем сшивки диглицидиловым эфиром 1,4-бутандиола (BDDE). После очистки путем диализа сшитую гиалуроновую кислоту смешивают с забуференным раствором (фосфатный буфер, pH 7,4), содержащим высвобождающее HS производное гиалуроновой кислоты, предлагаемое в настоящем изобретении, так что конечная концентрация высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты в препарате равна 5 мг/мл. Затем препарат помещают в шприцы и стерилизуют нагреванием во влажной среде.
Содержащий тиольную группу компонент реакции может представлять собой эндогенный компонент реакции, который содержится в коже, такой как восстановленный глутатион.
Пример 10: Препарат для заживления раны - многослойная повязка на рану
2
2
Высвобождающий HS полисахаридный полимер, предлагаемый в настоящем изобретении, можно готовить в виде многослойной повязки на рану (или кожного пластыря), как показано на фиг. 9. Резервуар с сухим порошком высвобождающего HS полимера 1 используют в качестве впитывающего слоя повязки. Этот слой необязательно может дополнительно содержать донор тиольной группы, такой как L-цистеин, гомоцистеин, N-ацетилцистеин или восстановленный глутатион. Альтернативно, содержащий тиольную группу компонент реакции не наносят, а предоставляют эндогенно, например, в экссудате раны. Впитывающий слой закрывают наружной защитной мембраной, обладающей низкой газопроницаемостью. Наружный защитный слой 2 дополнительно содержит слой клея, который используют для прикрепления повязки на рану к коже. Наружный слой 2 постирается за края других слоев (т. е. впитывающего слоя 1 и соприкасающегося с раной слоя 4) с образованием клеевой кромки 4. Резервуар с полимером дополнительно закрывают внутренней нелипкой и пористой мембраной, например, нетканым нейлоновым материалом. Этот соприкасающийся с раной слой 4 является проницаемым для жидкости (экссудата раны), гипоаллергенным и нераздражающим.
Соприкасающийся с раной слой 4 и открытая часть клеевого слоя 2 обеспечивают защиту до применения с помощью разделительной защитной мембраны. Защитную мембрану изготавливают из разделительной бумаги, покрытой силиконом.
Многослойную повязку на рану упаковывают в герметично закрытый пакет и стерилизуют гамма-излучением.
Пример 11: Препарат для инъекции для лечения рубцов от акне
2
Водный раствор гидрогеля, содержащий 2% (мас./мас.) высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты, предлагаемого в настоящем изобретении, со степенью модификации примерно 250 мкмоль S-ацетильных фрагментов готовят в фосфатном буфере с физиологически приемлемым pH. Готовят вторую композицию, содержащую N-ацетилцистеин в физиологически приемлемом буферном растворе в концентрации, равной 0,5% (мас./мас.). Затем гель и раствор N-ацетилцистеина помещают в отдельные двухкамерные шприцы и стерилизуют нагреванием во влажной среде.
Пример 12: Препарат для инъекции внутрисуставного дополнения для синовиальной жидкости
2
Водный раствор гидрогеля, содержащий 1,0% (мас./мас.) высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты, предлагаемого в настоящем изобретении, готовят в фосфатном буфере с физиологически приемлемыми осмоляльностью и значением pH. Гель помещают в шприцы и стерилизуют нагреванием во влажной среде.
Содержащий тиольную группу компонент реакции может представлять собой эндогенный компонент реакции, который содержится в коже, такой как восстановленный глутатион.
Пример 13: Наполнитель для кожи для инъекции
2
2
Производное гиалуроновая кислота-цистеамин стабилизируют путем сшивки дисульфидными связями (образование цистаминовых мостиков). Затем сшитую гиалуроновую кислоту смешивают с забуференным раствором (фосфатный буфер, pH 7,4), содержащим высвобождающее HS производное гиалуроновой кислоты, предлагаемое в настоящем изобретении, так что конечная концентрация высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты в препарате равна 5 мг/мл. Затем препарат помещают в шприцы и стерилизуют нагреванием во влажной среде.
Содержащий тиольную группу компонент реакции может представлять собой эндогенный компонент реакции, который содержится в коже, такой как восстановленный глутатион.
Пример 14: Наполнитель для кожи для инъекции
2
Водный раствор гидрогеля, содержащий 2,5% (мас./мас.) высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты, предлагаемого в настоящем изобретении, готовят в фосфатном буфере с физиологически приемлемыми осмоляльностью и значением pH. Гель помещают в шприцы и стерилизуют нагреванием во влажной среде.
Содержащий тиольную группу компонент реакции может представлять собой эндогенный компонент реакции, который содержится в коже, такой как восстановленный глутатион.
Пример 15: Препарат для инъекции внутрисуставного дополнения для синовиальной жидкости
2
Водный раствор гидрогеля, содержащий 0,5% (мас./мас.) производного гиалуроновая кислота-цистеамин, и другой водный гидрогель, содержащий 0,5% (мас./мас.) высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты, предлагаемого в настоящем изобретении, готовят в фосфатном буфере с физиологически приемлемыми осмоляльностью и значением pH. Гели по отдельности помещают в двухкамерные шприцы и стерилизуют нагреванием во влажной среде.
Пример 16: Препарат глазных капель
2
Водный офтальмологический раствор, содержащий 0,1% (мас./мас.) высвобождающего HS производного хитозана, предлагаемого в настоящем изобретении, готовят в боратном буфере с физиологически приемлемыми осмоляльностью и значением pH. Раствор стерилизуют фильтрованием и помещают в одноразовые офтальмологические дозированные формы.
Содержащий тиольную группу компонент реакции может представлять собой эндогенный компонент реакции, который содержится в коже, такой как восстановленный глутатион.
Пример 17: Внутриглазной имплантат
2
Водный раствор гидрогеля, содержащий 4,0% (мас./мас.) высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты, предлагаемого в настоящем изобретении, готовят в фосфатном буфере с физиологически приемлемыми осмоляльностью и значением pH. Гель помещают в шприцы и стерилизуют нагреванием во влажной среде.
Содержащий тиольную группу компонент реакции может представлять собой эндогенный компонент реакции, который содержится в коже, такой как восстановленный глутатион.
Пример 18: Заменитель стекловидного тела
2
2
Производное гиалуроновая кислота-цистеамин стабилизируют путем сшивки дисульфидными связями (образование цистаминовых мостиков). Затем сшитую гиалуроновую кислоту смешивают с забуференным раствором (фосфатный буфер, pH 7,4), содержащим высвобождающее HS производное гиалуроновой кислоты, предлагаемое в настоящем изобретении, так что конечная концентрация высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты в препарате равна 3 мг/мл. Затем препарат помещают в шприцы и стерилизуют нагреванием во влажной среде.
Содержащий тиольную группу компонент реакции может представлять собой эндогенный компонент реакции, который содержится в коже, такой как восстановленный глутатион.
Пример 19: Твердый внутриглазной имплантат
2
Готовят таблетки массой примерно 2 мг, содержащие 1 мг высвобождающего HS гиалуронового производного со степенью модификации примерно 250 мкмоль S-ацетильных фрагментов, предлагаемое в настоящем изобретении, и 0,2 мг N-ацетилцистеин. Таблетки герметизируют в отдельные пакеты. Затем пакеты и вторичный упаковочный материал стерилизуют гамма-излучением.
N
Пример 20: Получение 4-амино--(бензоилтио)бензамида
N
2
2
4-Амино--(бензоилтио)бензамид является модифицированным с помощью NH производным донора HS 5a, содержащим бензоилтиобензамидную субструктуру. Схематическая схема реакции для этого синтеза приведена на фиг. 10A.
2
O
Стадия 1: Синтез S-бензоилтиогидроксиламина: При перемешивании к раствору 5,6 г KOH (100 ммоля) в 150 мл HO и 5,65 г (50 ммоля) гидроксиламин--сульфоновой кислоты добавляли 7,25 г тиобензойной кислоты (52,5 ммоля). После перемешивания при температуре окружающей среды в течение 1 ч осадок собирали фильтрованием с отсасыванием и сушили при пониженном давлении.
2
2
2
2
2
R
Стадия 2: Синтез N-(бензоилтио)-4-нитробензамида: 7,12 г (46 ммоля) Неочищенного S-бензоилтиогидроксиламина растворяли в 250 мл CHCl и добавляли 3,6 г (46 ммоля) пиридина. 8,53 г (46 ммоля) п-NO-Бензоилхлорида суспендировали в 300 мл CHCl и по каплям добавляли через капельную воронку. За протеканием реакции следили с помощью TLC (гексан/диэтиловый эфир=1:1,5), через 2 ч раствор фильтровали через слой целита и летучие вещества удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали с помощью колоночной хроматографии на силикагеле с использованием смеси гексан/диэтиловый эфир=1:1,5 и получали 3,52 г белого твердого вещества (23% за 2 стадии).
N
N
J
J
J
2
2
2
4
f продукт
2
4
2
1
Стадия 3: Синтез 4-амино--(бензоилтио)бензамида: 1,7 г (5,6 ммоля) -(Бензоилтио)-4-нитробензамида растворяли в смеси 270 мл THF и 180 мл HO и охлаждали до 0°C. Добавляли 2,42 г (14,07 ммоля) NaSO, после чего раствор становился желтым. За степенью превращения следили с помощью TLC (диэтиловый эфир, R~0,6). Через 30 мин THF количественно удаляли при пониженном давлении и водный раствор экстрагировали этилацетатом. Органический слой сушили над NaSO и летучие вещества выпаривали при пониженном давлении и получали 640 мг желтого порошка (45%). H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 9,52 (s, 1H, NH), 7,91 (d, =7,3 Гц, 2H), 7,77-7,68 (m, 3H), 7,61 (d, =7,7 Гц, 2H), 6,59 (d, =8,6 Гц, 2H), 5,85 (s, 2H, NH)
Соответствующие гидроксилированные, фосфорилированные или сульфированные производные можно получить аналогично описанной методике с использованием различных методик введения защитной группы.
N
N
2
2
Первый обонятельное исследование, проведенное с использованием 4-амино--(бензоилтио)бензамида, растворенного в ацетон/фосфатном буфере, указало на высвобождение HS после добавления избыточного количества L-цистеина. Этот результат был позднее подтвержден путем регистрации высвобождения HS после добавления избыточного количества L-цистеина или цистеамина к 4-амино--(бензоилтио)бензамиду с помощью коричневеющей бумаги, пропитанной ацетатом Pb.
2
Пример 21: Синтез высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты
N
N,N,N',N'
Сочетание 4-амино--(бензоилтио)бензамида с гиалуроновой кислотой проводят путем растворения гиалуроновой кислоты в DMSO и триэтиламине и добавления реагента, который катализирует сочетание с образованием амида, такого как карбонилдиимидазол (CDI), карбодиимидов, таких как дициклогексилкарбодиимид (DCC), диизопропилкарбодиимид (DIC), реагентов типа фосфония или аминия/урония-умония, таких как бромтрипирролидинофосфонийгексафторфосфат (PyBrOP) или 2-(1H-бензотриазол-1-ил)--
2
тетраметиламмонийтетрафторборат/гексафторфосфат (TBTU, HBTU). После осаждения высвобождающее HS производное гиалуроновой кислоты выделяют фильтрованием, промывают и сушат в вакууме.
N
N
N'
2
Сочетание гидроксилированных, сульфированных или фосфорилированных производных 4-амино--(бензоилтио)бензамида с гиалуроновой кислотой проводили в водной среде путем растворения гиалуроната натрия в фосфатном буфере и добавления реагента, который катализирует сочетание с образованием амида, такого как растворимый в воде карбодиимид (например, -этил--(3-диметиламинопропил)карбодиимид.HCl, EDC.HCl) или производное триазина (например, 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиний хлорид, DMT-MM). После осаждения высвобождающее HS гиалуроновой кислоты производное выделяют фильтрованием, промывают и сушат в вакууме.
2
Схематичная структура полученного высвобождающего HS производного гиалуроновой кислоты приведена на фиг. 10B.