СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИГЕННОСТИ БАКТЕРИЙ CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIA
METHOD OF DEFINING TOXIGENITY OF CORYNEBACTERIUM DIPHTHERIA

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для микробиологической диагностики дифтерии
Известно, что токсигенность возбудителя дифтерии является ведущим патогенным свойством, определяющим развитие дифтерийной инфекции [3]. Поэтому основным признаком в бактериологической диагностике дифтерии является определение токсина [4, 5, 7, 8]. Однако не все бактерии, имеющие ген токсигенности, продуцируют токсин in vitro. По данным разных авторов, подобные штаммы с «молчащим» геном встречаются в 30% случаев [6]. При исследовании методом полимеразной цепной реакции у них определяется участок А фрагмента tox-гена, но продукции токсина не происходит [1, 2]. У части таких штаммов возможно восстановление токсинопродукции в результате применения обогащенных жидких питательных сред и/или лабораторных животных.
Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению относится способ, включающий пассирование (не менее 3-х раз) коринебактерий дифтерии, содержащих «молчащий ген», в жидкой питательной среде (среда 199, содержащая 20% сыворотки крупного рогатого скота), или парентеральное заражение чувствительных лабораторных животных (морских свинок) с последующим выделением из органов и тканей коринебактерий и их исследование на продукцию токсина [4].
Недостатком указанного способа является длительность процедуры (от 6 до 10 суток), значительные материальные затраты, трудоемкость.
Изобретение направлено на создание способа определения токсигенности C.diphtheriae, ускоряющего выявление токсинпродуцирующих C.diphtheriae и повышающего достоверность результатов определения токсигенных бактерий.
Изобретение реализуется следующим образом. Коринебактерии засевают на плотную питательную среду (Клауберг 2), выращивают на ней в течение 1 суток при температуре +37°С.
2
Пример 1. На выросшую культуру с открытой крышкой чашки Петри воздействуют излучением с длиной волны λ=650 нм плотностью мощности излучения на поверхности колоний бактерий 2 мВт/см в течение 4 минут.
Примеры реализации изобретения при других параметрах излучения и времени представлены в таблице 1.
Для этого может быть использован лазерный прибор для микробиологических исследований «Барва ЛПМИ - 01», выполненный Харьковским НИИ лазерной биологии и лазерной медицины, или другой прибор с указанными параметрами излучения.
После воздействия на штаммы НИЛИ изучаем токсинопродукцию контрольных и экспериментальных штаммов в Elek-тесте [5]. В результате воздействия НИЛИ на штаммы, содержащие «молчащий» ген, у 45% культур происходит активация токсинопродукции и, как следствие, подтверждение токсигенности штамма в общепринятом Elek-тесте, а также в других методах определения токсигенности (РНГА, ИФА, ICS-тесте).
Из представленных результатов исследования видно, что при заявленных параметрах достигается высокая эффективность метода определения токсигенности (в 2-3 раза превышает показатели прототипа), даже среди слаботоксигенных штаммов.
Источники информации
1. Безруков В.М., Шипулин Г.А., Федоров Н.А. и др. Полимеразная цепная реакция в диагностике бактериальных инфекций. // Журн. микробиол. Приложение. - 1997. - С.243.
2. Ковган А.А., Жданов В.М. Сравнительный анализ ДНК фагов C.diphtheriae и клонирование гена, детерминирующего синтез дифтерийного токсина. // Журн. 1994. - №3. - с.39-43.
3. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. // С.-Петербург: «Специальная литература». - 1998. - С.592.
4. Методические указания МЗ РФ «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» (МУ 4.2.698-98).
5. Приказ МЗ СССР №450 «О мерах по предупреждению заболеваемости дифтерией».
6. Ценева Г.Я., Березина Л.А., Вуопио-Варкила Я. и др. Микробиологические и диагностические аспекты изучения дифтерийной инфекции на Северо-Западе России // Материалы 2-й межд. конф., посвященной 75-летию института им. Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», СПб., 1998. С.30.
7. Holmes R.K. Biology and molecular epidemiology of diphtheria toxin and the tox gene (Review). // J. Inf. Dis. 181 Suppl. 1: S 156-67. 2000 Feb.
8. Tseneva G. Pathogenic properties of Corynebacterium diphteriae and methods of detection. // Proceedings of the First Internacional meeting of the European Laboratory Working Group of Diphtheria. London. UK. 1994. P.21.
Таблица 1
Зависимость количества токсинопродуцирующих колоний от плотности мощности излучения на поверхности колоний бактерий и времени воздействия НИЛИ
№ п/п
λ (нм)
Плотность мощности излучения на поверхности колоний бактерий (мВт/см<sup>2</sup>)
Количество колоний C.diphtheriae, продуцирующих токсин при разной экпозиции НИЛИ
4 мин
4,5 мин
5 мин
5,5 мин
6 мин
Прототип
1
650
2
11
12
13
14
14
11
2
2,5
10
12
15
13
13
11
3
3
12
15
17
15
14
12
4
3,5
14
18
17
13
10
11
5
4
13
16
15
15
14
11
6
660
2
16
17
19
18
21
10
7
2,5
20
22
26
25
17
10
8
3
25
30
36
33
29
11
9
3,5
24
26
30
25
23
11
10
4
21
22
28
25
26
12
11
670
2
19
20
23
22
17
10
12
2,5
18
21
22
20
14
11
13
3
17
19
23
18
13
11
14
3,5
20
22
21
23
16
11
15
4
16
18
23
21
15
11