Сравнительное изучение зависимости липолитической активности бактерий рода Serratia от состава питательной среды

УДК 577.153.2+576.809.53

Н. В. Паканещикова, Н. Н. Силищев, Н. Ф. Галимзянова, О. Н. Логинов

Сравнительное изучение зависимости липолитической активности бактерий рода Serratia от состава питательной среды

Институт биологии УНЦ РАН 450054, Уфа, пр. Октября, 69; тел. (3472) 35-57-83 ГУП «Опытный завод Академии наук Республики Башкортостан» 450079, г. Уфа, ул. Ульяновых, 65; тел. (3472) 42-92-52

Исследовано влияние состава питательных сред на биосинтез липаз новыми штаммами бактерий рода Serratia. Установлено, что липолитичес-кая активность значительно варьирует у микроорганизмов, относящихся к одному и тому же виду. Показано, что активность образуемых микроорганизмами липаз в большой степени зависят от концентрации отдельных компонентов питательной среды. Наилучшие результаты были получены при выращивании культур на средах, содержащих соевую муку и дрожжевой экстракт, причем оптимальные концентрации этих компонентов различны для каждого штамма.

Ключевые слова: липазы, питательная среда, соевая мука, дрожжевой экстракт.

Микробные липазы находят широкое применение в различных отраслях промышленности. Липолитические ферменты применяют в качестве обезжиривающих агентов, для получения свободных жирных кислот из природных триглицеридов. В сельском хозяйстве они используются как добавки к кормам с целью повышения их усвояемости. Кроме того, большой интерес представляют препараты микробных липаз в связи с проблемой очистки сточных вод и загрязнения окружающей среды '.

Обладая коротким циклом развития, микроорганизмы продуцируют необходимые ферменты на доступных питательных средах в промышленных условиях. Биосинтез таких ферментов можно регулировать путем подбора условий культивирования, и, прежде всего, состава питательной среды. Основными промышленными продуцентами липаз в настоящее время являются грибы 1-3. Однако задача поиска новых липолитически активных штаммов бактерий остается, по-прежнему, актуальной.

Из образцов активного ила биологических очистных сооружений Пермского мясокомбината нами был выделен ряд бактерий, обладающих липолитической активностью. Наиболее активные из них были идентифици-

рованы как Serratia marcescens (штаммы ИБ 2-1, ИБ 2-2) и Serratia species (штаммы ИБ 1, ИБ 3-1, ИБ 3-3). Идентификация проводилась стандартными методами 4 5 и путем сиквенс-анализа фрагментов гена 16S РНК. Все штаммы депонированы в коллекцию микроорганизмов Института биологии Уфимского научного центра РАН.

Целью работы являлось сравнительное изучение влияния состава питательной среды на биосинтез липаз различными штаммами бактерий рода Serratia.

Условия эксперимента

Для исследования липолитической активности использовали штаммы бактерий Serratia marcescens ИБ 2-1, Serratia marcescens ИБ 2-2, Serratia species ИБ 1, Serratia species ИБ 3-1, Serratia species ИБ 3-3.

Липолитическую активность определяли в культуральной жидкости по модифицированному методу Ота и Ямада 6. Культуры выращивали в колбах объемом 250 мл с 100 мл среды различного состава (табл.) на качалке со скоростью вращения 160 об./мин при 28—29 оС. В качестве субстрата использовали 40% эмульсию оливкового масла в 2% растворе поливинилового спирта. Реакционная смесь включала следующие компоненты: 1 мл культуральной жидкости, 4.5 мл 0.05 М фосфатного буфера pH 8.0, 5 мл эмульсии оливкового масла. Гидролиз проводили в течение 1 ч при 37 оС, после чего добавляли 10 мл этанола и продукты гидролиза от-титровывали 0.025 M раствором NaOH в присутствии 1% раствора тимолфталеина. Контрольные образцы титровали сразу же без выдерживания в термостате, добавив этанол. Активность липазы выражали в микромолях олеиновой кислоты, освобождающейся за 1 ч при гидролизе субстрата 1 мл культуральной жидкости. Значение липолитической активно-

Дата поступления 13.07.06

Башкирский химический журнал. 2006. Том 13. №> 4

сти вычисляли как среднее арифметическое из трех параллельных определений, коэффициент вариации которых не превышал 5%.

Результаты и обсуждение

Состав питательной среды оказывает большое влияние на уровень биосинтеза липаз микроорганизмами. Высокая липолитическая активность наблюдается на средах, богатых сложными органическими веществами (кукурузная мука, соевая мука, пептон, мочевина) 3' 10. Так, ранее нами было установлено, что активность и свойства липазы, продуцируемой одним из исследуемых нами штаммов, в большой степени зависит от таких компонентов питательной среды как соевая мука и дрожжевой экстракт. Для подбора среды, оптимальной для биосинтеза липазы изучаемыми штаммами бактерий рода Serratia, были проверены две среды сложного органического состава (среды 1, 2), различающиеся по содержанию минеральных компонентов и источников углерода.

Липолитическая активность изучаемых культур значительно различалась при выращивании их на одной конкретной среде, что, очевидно, связано с индивидуальными особенностями микроорганизмов. Значения липоли-тической активности сильно варьировали не только среди различных видов Serratia, но и в пределах одного вида (рис. 1). Культуры различались не только по величине липоли-тической активности, но и по скорости синтеза фермента. Так для штаммов S. marcescens ИБ 2-2, Serratia sp. ИБ 3-1 максимум накопления липаз на среде 1 происходил уже через

120

=н 100

о

в о н ч 80

и 1

е л ч 60

о м

2 к 3 т 40

м о л

< о и 20

к

0 5 10 15 24 39 48 63 72 84

Время культивирования, ч

Рис. 1. Зависимость липолитической активности исследуемых культур на среде 1, содержащей 5% соевой муки, от продолжительности культивирования: 1 — S. marcescens ИБ 2-1, 2 — S. marcescens ИБ 2-2, 3 — Serratia. sp. ИБ 1, 4 — Serratia sp. ИБ 3-1, 5 — Serratia sp. ИБ 3-3

10—15 ч культивирования, в то время как для Serratia. sp. ИБ 3-3 лишь на вторые сутки культивирования. Наибольшее значение ли-политической активности на этой среде наблюдалось у штамма S. marcescens ИБ 2-2

и составило 102.5 мкМ олеиновой кислоты

—1 —1 мл • ч .

Известно, что представители рода Serratia проявляют высокую липолитическую активность при выращивании на средах с соевой мукой 8' 11. В нашем эксперименте все иссле-дуемые штаммы проявили липазную активность только на среде с соевой мукой (среда 1). На среде 2, не содержащей соевую муку, синтез ферментов исследуемыми микроорганизмами не наблюдался совсем.

Дальнейшая работа заключалась в оптимизации состава питательной среды для культивирования исследуемых штаммов с целью повышения их липазной активности. Были протестированы питательные среды, содержащие 0.5% и 2.5% соевой муки. В качестве дополнительного источника питательных веществ в ряде сред использовали дрожжевой экстракт в концентрации 2% и 4% (среды 4, 5, 7, 8). Дрожжевой экстракт имеет высокую физиологическую питательную ценность, содержит многие витамины группы В и часто применяется в качестве компонента питательных сред, например, при культивировании Pseudomonas 12. Представляло определенный интерес исследование возможности повышения липолитической активности изучаемых микроорганизмов рода Serratia введением дрожжевого экстракта в питательную среду, содержащую соевую муку и минеральные соли.

Наши исследования показали, что различные концентрации соевой муки и дрожжевого экстракта в питательной среде по-разному влияли на величину липолитической активности всех изучаемых бактерий. Так, штамм S. marcescens ИБ2-1 на среде 3, содержащей минеральные соли и 0.5% соевую муку, липазу не синтезировал. При увеличении концентрации соевой муки в составе питательной среды до 2.5% (среда 6), липолитическая активность штамма S. marcescens ИБ 2-1 достигла 21 мкМ олеиновой кислоты • мл-1 • ч-1 (рис. 2). Добавление 2% дрожжевого экстракта на фоне 0.5% соевой муки (среда 4) также способствовало синтезу небольшого количества липазы у микроорганизмов этого вида, которое с увеличением концентрации дрожжевого экстракта до 4% (среда 5) увеличилось в 16 раз и достигло максимального значения 162 мкМ олеиновой кислоты • мл-1 • ч-1.

0

а

S

<

250 -г 200 150 100 -50 0 0

72 96 120

Время культивирования, ч  Среда 4 ♦ Среда 5 -Среда 6  Среда 7 ♦ Среда 8

Рис. 2. Зависимость липолитической активности штамма S. marcescens ИБ 2-1 от продолжительности культивирования на разных питательных средах

Однако на фоне 2.5% соевой муки лишь внесение 4% дрожжевого экстракта (среда 8) позволило увеличить синтез фермента в 5 раз, по сравнению со средой без экстракта. Следует отметить, что концентрация дрожжевого экстракта влияла не только на величину активности фермента штамма S. marcescens ИБ2-1, но и на скорость синтеза липазы. Так, на средах 4 и 8, содержащих 2 и 4 % дрожжевого экстракта соответственно, скорость синтеза фермента снижается на 24 ч.

Несколько другое поведение наблюдалось при культивировании штамма S. marcescens ИБ 2-2 на исследуемых средах. Выращивание этого штамма на средах с минеральными солями и соевой мукой (среды 3, 6) показало, что повышение концентрации соевой муки с 0.5 до 2.5 % в составе питательной среды сопровождается увеличением липолитической активности на 62% (рис. 3). Несмотря на это, максимальная липолитическая активность штамма S. marcescens ИБ 2-2 (222.5 мкМ олеиновой кислоты • мл-1 • ч-1) наблюдалась на среде 5, содержащей 0.5% соевой муки и 4% дрожжевого экстракта. Вероятно, это объясняется наличием в среде последнего компонента. Особенно заметно влияние дрожжевого экстракта на динамику синтеза фермента. Так, при увеличении концентрации дрожжевого экстракта с 2 до 4 % на фоне 0.5% соевой муки, скорость синтеза липазы штаммом S. marcescens ИБ 2-2 замедлилась и максимальная активность фермента выявилась через 48 ч. На фоне 2.5% соевой муки введение в состав питательной среды дрожжевого экстракта, также как и повышение его концентрации, сопровождалось замедлением синтеза липазы.

Аналогично предыдущим культурам, штамм Serratia sp. ИБ 1 проявил максималь-

24 48 72 96 120 Время культивирования, ч

.....Среда 3  Среда 4 ♦ Среда 5

-Среда 6  Среда 7 ♦ Среда 8

Рис. 3. Зависимость липолитической активности штамма 5. татсвзсвт ИБ 2-2 от продолжительности культивирования на разных питательных средах

ную липолитическую активность (226.5 мкМ олеиновой кислоты • мл-1 • ч-1) на среде с 0.5% соевой муки и 4% дрожжевого экстракта (рис. 4). Увеличение концентрации соевой муки положительно сказывалось на липолитической активности этого штамма, независимо от содержания дрожжевого экстракта в среде. Следует отметить, что максимум ферментативной активности этих бактерий приходился, как правило, на 24 ч. Однако на среде 8, содержащей высокие концентрации изучаемых компонентов, скорость синтеза липазы снижалась.

250 200 150 100 50 0

а

S

<

Среда 3 Среда 6

24 48 72 96 120

Время культивирования, ч

Среда 4 ♦ Среда 5

Среда 7 ♦ Среда 8

Рис. 4. Зависимость липолитической активности штамма Serratia. sp. ИБ 1 от продолжительности культивирования на разных питательных средах

Липолитическая активность штамма Serratia sp. ИБ 3-1 на среде, содержащей 0.5% соевой муки (среда 3), не превышала 10 мкМ олеиновой кислоты • мл-1 • ч-1 (рис. 5). Повышение концентрации соевой муки до 2.5% (среда 6), позволило увеличить синтез фермента в 5.6 раз. Внесение в состав питательных сред дрожжевого экстракта, также как и повышение его концентрации, позволило достичь наивысших значений липолитической

0

активности этого штамма. Максимальное значение ферментативной активности культуры было достигнуто на среде 8 с 2.5% соевой муки и 4% дрожжевого экстракта и составило 192.5 мкМ олеиновой кислоты • мл-1 • ч-1, однако скорость синтеза фермента на этой среде уменьшалась.

Время культивирования, ч

Среда 3  Среда 4 ♦ Среда 5

Среда 6  Среда 7 ♦ Среда 8

Рис. 5. Зависимость липолитической активности штамма Serratia. sp. ИБ 3-1 от продолжительности культивирования на разных питательных средах

Напротив, липолитическая активность штамма Serratia sp. ИБ 3-3 с увеличением концентрации соевой муки с 0.5 до 2.5% (среды 3, 6) уменьшалась, а максимум липолитической активности смещался с 24 на 48 ч (рис. 6). Добавление дрожжевого экстракта также не способствовало увеличению активности и скорости синтеза фермента. Максимальный синтез липазы бактериями Serratia sp. ИБ 3-3 наблюдался на среде 3, содержащей 0.5% соевой муки и минеральные соли, и составил 130 мкМ олеиновой кислоты • мл-1 • ч-1.

Время культивирования, ч

----- Среда 3  Среда 4 ♦ Среда 5 -Среда 6  Среда 7 ♦ Среда 8

Рис. 6. Зависимость липолитической активности штамма Serratia. sp. ИБ 3-3 от продолжительности культивирования на разных питательных средах

Наши исследования показали, что добавление дрожжевого экстракта в состав питательной среды и повышение его концентрации в ряде случаев не просто повышает синтез фер-

мента изучаемыми бактериями рода Serratia, а на порядок увеличивает липолитическую активность исследуемых культур. Однако при культивировании штаммов на среде 9, содержащей дрожжевой экстракт без соевой муки, активность ферментов была незначительной либо отсутствовала вообще. Это свидетельствует о том, что на синтез липазы исследуемыми штаммами большое влияние оказывают оба компонента питательной среды.

Таким образом, изучение влияния состава питательной среды на биосинтез липаз новыми штаммами бактерий рода Serratia показало, что значения липолитической активности сильно варьируют не только среди различных видов Serratia, но и в пределах одного вида, и зависят от содержания в питательной среде сложных органических компонентов. Наивысшая липоли-тическая активность четырех из пяти штаммов (Serratia marcescens ИБ 2-1, Serratia marcescens ИБ 2-2, Serratia sp. ИБ 1, Serratia sp. ИБ 3-1) наблюдалась на средах, содержащих соевую муку и 4% дрожжевого экстракта.

Литература

1. Давранов К. // Прикл. биохимия и микробиология.- 1994.- Т.30, №4-5.- С. 527.

2. Петрова Л. Я., Казанина Г. А., Селезнева А. А. // Прикл. биохимия и микробиология.- 1977. — Т. 13, №4.- С. 521.

3. Арендс И. М., Дорохов В. В., Турочкина Т. М. // Прикл. биохимия и микробиология.- 1975. — Т. 11, №5.- С. 691.

4. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практ. пособие / Под ред. Н. С. Егорова.- М.: Изд.-во Моск. ун-та, 1983.- 215 с.

5. Методы общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхардта и др.- М.: Мир, 1984.264 с.

6. Ota Y. a. Yamada K. // Agric. and Biol. Chem.-1966.- V. 30, №4.- P. 351.

7. Патент РФ №2148645 / Дужак А. Б., Панфилова З. И., Салганик Р. И./ Заявл. 12.03.1997, опубл. 10.05.2000.

8. Башкатова Н. А, Северина Л. О. // Микробиология.- 1979.- Т. 48, №5.- С. 826.

9. Свириденко Ю. Я., Лобырева Л. Б., Марченко-ва А. И., Рубан Е. Л., Усманский М. С. // Прикл. биохимия и микробиология.- 1978.— Т. 14, №5.- С. 677.

10. Borgstrom B. a. Brockman H. L. Lipases. Amsterdam: Elsevier Science Publishers B,-1984.- 527 c.

11. Дужак А. Б., Панфилова З. И., Васюни-на Е. А. // Прикл. биохимия и микробиология.— 2000.- Т. 36, №4.- С. 402.

12. Патент РФ №2203945 / Логинов О. Н., Свешникова Е. В., Силищев Н. Н., Мелентьев А. И., Галимзянова Н. Ф., Бойко Т. Ф. / Заявл. 17.08.2001, опубл. 10.05.2003.