Разработка системы ввода наноколичеств пробы в масс-спектрометр

ISSN 0868-5886 НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2008, том 18, № 4, c. 88-96

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ.

ПРИБОРЫ

УДК 621.384.668.8 + 543.544

© И. А. Краснов, Е. П. Подольская, М. З. Мурадымов, М. В. Апацкая, Я. И. Лютвинский, С. В. Фиронов, А. В. Витин, К. А. Беляев, Д. И. Корнев, А. А. Каюмов, А. В. Подтележников, Л. Н. Галль, Н. В. Краснов

РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ВВОДА НАНОКОЛИЧЕСТВ ПРОБЫ В МАСС-СПЕКТРОМЕТР

Настоящая работа посвящена разработке отечественной nano-LC-MS аналитической системы. Основными функциональными блоками такой системы являются: хроматографическая установка на основе HPLC микроколоночной технологии, блок ионизации nano-ESI и времяпролетный анализатор (TOF). Реализована данная система на базе отечественного масс-спектрометра МХ-5310 (ИАнП РАН). В статье представлены результаты исследования полученной экспериментальной установки, а также проведено сравнение основных параметров с параметрами отечественных ЖХ-МС установок. Полученная установка позволяет работать с наноколичествами исходного материала. В разработанной системе хроматографическая капиллярная колонка непосредственно используется в качестве наноэмиттера, что приводит к уменьшению количества приборных узлов и снижает неизбежные потери анализируемых образцов. Система ввода установки отличается простотой исполнения, очень экономична в использовании растворителей и других расходных материалов.

ВВЕДЕНИЕ

За последние 15 лет масс-спектрометрия стала мощным и удобным методом анализа макромолекул и биологических веществ [1-3].

Минимизация внутреннего диаметра распылительной иглы привела к появлению micro- и nano-ESI-источников, которые позволяют работать со скоростью потока в несколько десятков нанолит-ров в минуту. Nano-ESI — усовершенствованный метод распыления небольших количеств образцов низкой концентрации (наномоль/мл). Метод обладает повышенной толерантностью к высоко аква-тированным растворам и солевым загрязнениям [4, 5]. Спектры могут быть получены из пикограмма образца, при этом не требуется специальной очистки. Переход от обычного ESI-MS к nano-ESI-MS повысил чувствительность анализа до ат-томолей при идентификации белка при скоростях потока 1-4 нл/мин [4]. Повышение чувствительно -сти и уменьшение количества анализируемого вещества считаются важнейшими преимуществами nano-ESI-источника.

Особого внимания заслуживает то, что основной проблемой, стоящей перед исследователями, является малое количество анализируемого вещества, поскольку количество пробы, особенно полученной из биологического материала, ограничено и зачастую не превышает нескольких пикомо-лей, причем количество компонент, содержащихся в образце, может составлять тысячи и десятки тысяч. Решением этой проблемы становится сочетание нанохроматографа с масс-спектрометром,

снабженным nano-ESI источником ионизации. В настоящее время существуют решения по созданию комплексов nano-LC-ESI-MS как в нашей стране, так и за рубежом [7-10]. Эти комплексы оказываются либо слишком дороги, особенно в таких расходных материалах, как хроматографи-ческие колонки, либо обладают рядом недостатков, к которым относятся размывание пробы после элюирования ее с колонки и высокая скорость потока (100-150 мкл/мин), требуемая для успешного хроматографического анализа, но усложняющая работу источника ESI.

На сегодняшний день единственным отечественным комплексом, сочетающим жидкостной хроматограф и масс-спектрометр, снабженный источником ионов ESI, является тандем Милихром А02 (Институт хроматографии, Новосибирск)— МХ-5310 (ИАнП РАН, СПб.). Данный комплекс позволяет успешно анализировать сложные смеси при условии, что в пробе содержится примерно 200 пМ анализируемого вещества, при этом минимальная скорость потока элюента, обеспечивающая эффективное разделение соединений, составляет 150 мкл/мин. Для того чтобы получить качественное распыление такого потока требуется нагрев спутного газа в источнике ионов до 150 °С. Все перечисленное значительно усложняет процедуру анализа и не позволяет проводить анализ образцов, содержащих единицы пМ соединений.

Таким образом, возникает необходимость создания отечественного комплекса nano-LC-nano-ESI-MS, который позволял бы эффективно проводить анализ сложных биологических проб, отли-

чался простотой в использовании и был экономичен в расходных материалах.

Решение данной задачи может быть реализовано путем создания системы ввода пробы, которая обладала бы следующими преимуществами:

1) проведение анализа как в режиме хромато-графирования, так и в изократическом режиме;

2) возможность проведения анализа при содержании в образце 1-5 пМ анализируемого вещества;

3) снижение скорости потока до 100200 нл/мин;

4) отсутствие нагрева и спутного газа;

5) отсутствие узла, приводящего к размыванию пробы.

Аналитическая система ввода наноколичеств проб (АСВНП) предназначена для внедрения уникальной отечественной технологии анализа нано-количеств образцов, имеющих биологическое происхождение, в рамках исследований, посвященных молекулярно-биологическим и физиоло-го-биохимическим процессам в живых системах. АСВНП представляет собой сочетание нанохро-матографической системы, метода ионизации папо-Ё81 и времяпролетного анализатора

(АСВНП-nano-ESI-TOF), при котором хромато-графическая колонка непосредственно используется в роли наноэмиттера, а сама система полностью удовлетворяет вышеперечисленным параметрам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Насадочные колонки получали набивкой кварцевых капилляров (TSP075375, Polimicro Technologies) с ID = 75 мкм и OD = 375 мкм готовым коммерческим сорбентом Zorbax С18 (размер частиц 5-9 мкм в диаметре). Для удерживания сорбента в колонках применялось вытягивание конца капилляра под воздействием высокой температуры (рис. 1). Контроль диаметра выходящего отверстия колонки (рис. 1, б) проводился с помощью микроскопа, и этот диаметр был не более 3 мкм. Перед использованием сорбент промывали 3 раза

а

А

I

б

70 мм

10мм

Рис. 1. Схема установки для получения капилляров с оттянутым носиком.

а — общая схема установки: капилляр с вытягивающим грузом в штативе под воздействием пламени газовой горелки Т; б — капилляр

Рис. 2. Схема установки для набивки колонок гранулированным сорбентом.

а — капилляр, подготовленный для набивки гранулированным сорбентом; б— уплотнитель; в — виала, г — взвесь гранулированного сорбента (2огЪах С18) в 50 % ацетонитриле; д — корпус установки для набивки капилляров; е — манометр; ж — баллон со сжатым воздухом

б

г

д

а

Рис. 3. Общая схема системы ввода наноколичества пробы (АСВНП) в масс-спектрометр МХ-5310. а — растворители (А, В); б — насос; в — капилляр слива избытка растворителя; г — капилляр ввода образца в хроматографическую колонку; д — распыление пробы на входе масс-спектрометра

смесью вода—ацетонитрил (50:50) для удаления частиц менее 5 мкм. Набивка колонки проводилась в специально сконструированной установке (рис. 2). Установка представляет собой металлическую емкость, в которую подводился воздух под давлением 2 МПа. В это устройство помещалась виала, содержавшая взвесь сорбента в 50 % растворе ацетонитрила в воде. Капилляр погружался входным концом в виалу с взвесью сорбента, с помощью специального уплотнителя (PEAK) колонка зажималась в выходящем отверстии устройства. Под действием высокого давления жидкость с сорбентом поступала через колонку во вне установки, при этом частицы сорбента задерживались вытянутой частью капилляра, происходила набивка колонки. Далее полученная насадочная колонка промывалась 50 %-м раствором ацетонитрила в воде в течение 30 минут при скорости потока 200 мкл/мин и устанавливалась в систему ввода пробы в масс-спектрометр МХ-5310 (рис. 3).

Система ввода пробы состоит из резервуаров (а) растворителей (в качестве подвижной фазы использовались А — 0.25 % НСООН в воде и В — 0.25 % НСООН в ацетонитриле); градиентного насоса (б) со скоростью подачи растворителя 10 мкл/мин; капилляра для отвода избыточного

потока растворителя (в); капилляра объемом 0.4 мкл для ввода образца в систему (г), заполненного на устройстве для заполнения колонок (в виалу вместо взвеси сорбента помещали образец) и полученной микроколонки (д) (рис. 1, б). Подведение напряжения порядка 4 кВ прямо в растворитель, подаваемый на колонку, обеспечивало распыление с эмиттера колонки на сопло масс-спектрометра МХ-5310.

Модельный хромато-масс-спектрометрический анализ проводили как с использованием описанной установки (АСВНП—МХ-5310), так и с использованием комплекса Милихром А02—МХ-5310. В качестве модельного объекта исследования был выбран триптический гидролизат БСА [8]. Количества наносимого на колонки гидролизата составили 200 пМ для комплекса Милихром А02—МХ-5310 и 1.8 пМ для комплекса АСВНП—МХ-5310. При использовании комплекса АСВНП—МХ-5310 спутный газ не подавался.

Анализ проводился в течение 10 мин в паре растворителей ацетонитрил—вода с линейным увеличением концентрации ацетонитрила в элю-енте с 0 % до 70 %.

Спектры регистрировались с интервалом в 1 с в течение всего процесса хроматографирования.

Управление настройками и запись данных с масс-спектрометров проводили с помощью программы TOF control. Масс-спектры записывали с помощью программы TOF+ (программы разработаны в Лаборатории биомедицинской масс-спектрометрии ИАнП РАН [13, 16]). При этом регистрировалась величина общего ионного тока в зависимости от времени. Полученный график рассматривается как хроматограмма (зависимость интенсивности общего ионного тока от времени).

Обработку спектров проводили при помощи программного обеспечения TOF explorer v. 0.2 (ИАнП РАН). После определения центра масс масс-спектрометрических пиков к полученным данным был применен алгоритм разрешения зарядных и изотопных распределений IPEX (ИАнП РАН). Полученный список моноизотопных масс составляющих пробы был экспортирован в Excel для последующей интерпретации.

Поиск в базе SwisProt [11] осуществляли с помощью программного комплекса MASCOT [10] (Matrix Science, Великобритания), при этом использовали следующие параметры поиска: точность определения массы 50 ppm, возможные модификации — окисление метионина. Качество

проведенного масс-спектрометрического анализа оценивали по степени идентификации БСА методом PMF (Peptide Mass Fingerprit) [9], являющимся наиболее распространенным при идентификации белков. Как критерии рассматривались следующие параметры:

• количество обнаруженных пептидов, принадлежащих БСА;

• процент перекрывания аминокислотной последовательности;

• достоверность идентификации (Score);

Для выяснения качественности проведения хроматографического анализа по полученным хроматограммам были определены параметры хроматографических пиков отдельных пептидов, такие как времена удерживания пептидов (tr), ширина пиков на полувысоте (Wh). Из их значений было рассчитано число теоретических тарелок (ЧТТ) и высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ), для капиллярной колонки [12, 13]:

N = 5.45(tr / Wh)2,

где N — число теоретических тарелок (ЧТТ), определенное для конкретного соединения;

Табл. 1. Результаты по идентификации БСА после обработки данных LC-MS-анализа

АСВНП—МХ-5310

Мишкром А02—МХ-5310

Probability Based Mowse Score

Protein score is -10*Locjj[P) , where P is the probability

that the observed match is a random event.

Protein scores greater than 60 are significant (p<0.05).

ft 35 -

= 30 -

23 -

Ü 20 -

13 -

10 -

5 -

0 -

1.

ALBU BOVIN

120 160 200 Probability Based Mowse Score

Score: 197

Mass: 71244

Expect: 1.2e-15 Queries matched: 41 Serum albumin precursor - Bos taurus (Bovine) Number of mass values matched: 41 Sequence Coverage: 71%

1 MKtJVTFISLL LLFSSAYSRG VFRRDTHKSE IAHR ] CGLVL I

51 FSQYLOQCPF EEHVKLVHEL TEFBKTCVM) ESHflGCEKSL HTLFGDELCK 101 VASLRETYGD MADCCEKQEP EEHECFLSHK DDSPDLPK IPMTLCDEF 151 KTOEKKFHGK YLYEUUtKHP YFYBPELLYY BHKYHGVFQE CCQflEDKGM1 201 LLPKIETMRE KVLASSARQR LRCASIQKFG ERBLKmiSVa KLSQKFPKflE 251 FVEVTKLYTD LTKVHKECCH GJ)LLECM>DR BDLflKYICDN QDTISSKLKE 301 3 HCIAEVEKDA IPELILPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL

351 GSFLYEYSRR HPEYflVSVLL RLfiKEYEftTL EECCfiKDDPH SCYSTVFDKL 401 KHLVDEPQHL IKQHCDQFEK LGEYGFQHBL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS 451 RSLCKVCTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL HRLCVLHEKT PVSEKVTKCC 501 TESLVMRRPC FSHLIPDETY VPKfflTDEKLF TFHMICTLP DTEKQIKKQT 551 ' ' HKP KATEEQLK1 601 STQT1

Probability Based Mow£e Score

Protein score is -lO^Locj^P) , where P is the probability that the observed match is a random event.

Protein scores greater than 60 are significant

Î3 25 -

ас

о £0-

s-

1 13 -

10 -

5 -

0 -

eo lso 120 Probability Based nowse score

1.

ALBU BOVIN

Mass: 71244

Score: 114

Expec

t: 2.5e-07 Queries matched: 44 Serum albumin precursor -.Bos taurus

Number of mass values matched: 40

Sequence Coverage: 67s

1 MK RDTHKSE IAHR MFKGLVLIA

51 FSQYLQQCPF DEHVKLVHEL TEFBKTCVM) ESMGCEKSL HTLFGDELCK 101 VASLRETYGD HADCCEKQEP EPHECFLSHK DDSPDLPKLK PDPHTLCDEF 151 KADEKKFHGK YLYEISKRHP YFYBPELLYY MKYHGVFQE CCQHEDKGAC

201 LLPKIETMRE KVLASSARQR ÀtjSVA RLSQKFPKffl. 251 FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECM)DR M>LHKYICDH QDTISSKLKE 301 CCDKPLLEKS КУЕКРД IPEHLPPLTB DFBEDKDVCK MYQEBKDBFL

351 GSFLYEYSRR HPEYIVSVLL RLAKEYEML ЕЕССДКРРРН ACYSTVFDKL

401 KHLVDEPQHL IKQNCDQFEK LGEYGFQHBL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS

451 RSLGKVGTRC CTKPESEPHP CTEDYLSLIL HP T PVSEKVTKCC

501 TESLVHKRPC FSBLTPDETY VPKAFDEKLF TFHM)ICTLP DTEKQIKKQT 551 aLVFT.T.KHKP KaTEEQLKTV HEHFVaFVDK ССААРРКЕДС FÜVEGPKLW ÜOISTQTÜLI

н=ь / N

где Н — высота, эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ); Ь — длина колонки.

Полученные величины усреднялись и нормализовались:

^ =1! N

где N — ЧТТ для каждого отдельного соединения;

n — число соединении;

N = 100 N / L,

где N — приведенное ЧТТ для колонки длиной в 1 м.

Эти данные сравнивались с данными стандартных колонок HPLC с обращенной фазой. В частности, сравнение проводилось с колонками Pronto-sil 120-5C18 (2/75 мм, зернение сорбента 5мкм), поставляющимися к хроматографу Милихром А02.

Рис. 4. Хроматограммы пептидов, принадлежащих БСА.

а — комплекс АСВНП—масс-спектрометр МХ-5310.

б — тандем Милихром А02—масс-спектрометр МХ-5310.

Пептиды, соответствующие хроматографическим пикам, представлены в табл. 2

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Для выяснения основных параметров полученных капиллярных колонок, входящих в состав системы ввода наноколичества пробы, был проведен тестовый хромато-масс-спектрометрический анализ смеси триптических пептидов альбумина при помощи комплексов АСВНП—МХ-5310 и Милихром А02—МХ-5310. В первую очередь проводилось сравнение полученных масс-спектро-метрических данных по критериям, перечисленным выше. Результаты представлены в табл. 1. Как показано в таблице, качество анализа, проведенного с помощью комплекса АСВНП—МХ-5310 превышает качество анализа на комплексе Мили-хром А02—МХ-5310 по всем критериям, и особенно в надежности идентификации. Затем из числа пептидов, отнесенных к БСА, были выбраны те,

которые надежно воспроизвелись в обоих экспериментах. Из хроматограммы общего ионного тока были выделены пики, соответствующие выходу каждого выбранного пептида (рис. 4, табл. 2), и затем для каждого пика рассчитывались основные характеристики используемых колонок (табл. 3).

По результатам, представленным в табл. 3, видно, что при применении капиллярной колонки полуширина пиков уменьшается в среднем в 2 раза, соответственно во столько же повышается эффективность колонки для каждого пептида. Высота, эквивалентная теоретической тарелке, для капиллярной колонки составила 2.7 мкм, для Ргоп1ю8Й 120-5С18 — 13 мкм. Приведенные эффективности составили 2.8-105 и 0.7-105 ЧТТ/м для капиллярной колонки и Ргоп1о8Й 120-5С18 соответственно (табл. 4).

Табл. 2. Общие идентифицированные пептиды сывороточного альбумина быка и времена их удерживания

№ Время удерживания

пи- г г > с Молекулярная Аминокислотная последовательность

ка Милихром А02 АСВНП масса, Да

1 338 281 688.3656

2 307 312 1462.5817 ТСУАБЕ8НАОСЕК

3 332 305 1531.7738 ЬКЕССБКРЬЬЕК

4 348 310 1442.6347 УГСБКОБТ^К

5 359 321 1248.6139 РКБЬОЕЕНРК

6 387 352 1001.5757 ЬУУ8Т0ТАЬА

7 398 365 1304.7088 НЬУБЕР0КЬ1К

8 407 389 926.4861 УЬУЕ1АЯ

9 405 382 1638.9305 КУР0У8ТРТЬУЕУ8Я

10 414 393 1438.8045 КНРЕУАУ8УЬЬЯ

11 434 411 1141.7070 КОТАЬУЕЬЬК

12 435 422 1418.6864 8ЬНТЬРаБЕЬСК

13 442 431 1162.6234 ЬУЧЕЬТЕРАК

14 480 464 1478.7881 ЬаЕУОРОКАиУЯ

15 492 489 1723.8273 МРСТЕБУЬ8Ь1ЬКЯ

16 530 520 2491.2570 аЬУЬ1АР80УЬ00СРРБЕНУК

Табл. 3. Числа теоретических тарелок для набивной капиллярной колонки и колонки РгойобП 120-5С18, определенные по отдельным пикам

№ пи- АСВНП—МХ-5310

ка tr, с Wh, с ЧТТ ЧТТср. tr, с Wh, с ЧТТ ЧТТср.

1 281 7 8782.397 338 10 6226.298

2 312 7 10827.04 307 14 2620.699

3 305 7 10346.66 332 12 4171.672

4 310 8 8183.516 348 32 644.5477

5 321 7 11460.68 359 15 3121.784

6 352 8 10551.2 387 14 4164.495

7 365 8 11344.94 398 14 4404.601

8 389 7 16830.6 13812.3 407 24 1567.339 5363.51

9 382 8 12426.34 405 12 6207.891

10 393 8 13152.3 414 12 6486.863

11 411 8 14384.68 434 12 7128.751

12 422 8 15164.97 435 9 12731.81

13 431 8 15818.71 442 11 8799.453

14 464 8 18333.8 480 14 6406.531

15 489 8 20362.65 492 16 5153.316

16 520 8 23026.25 530 16 5980.098

Как известно, коэффициент разбавления в жидкостной хроматографии пропорционален длине колонки и квадрату ее диаметра. Для капиллярной колонки в связи с уменьшением ее диаметра концентрация компонента возрастает, что соответственно приводит к увеличению чувствительности обнаружения: концентрация определяемого компонента в максимуме пика примерно в 100 раз больше, чем для обычных колонок НРЬС [19, 20]. При этом в новой системе практически автоматически происходит удаление мертвой зоны, всегда существующей в хроматографической системе, а также имеет место уменьшение времени анализа и как следствие — значительное уменьшение ширины пиков и увеличения разрешающей способности системы. Все перечисленные достоинства новой системы ввода пробы имеют особое значение при анализе сложных смесей биополимеров. К тому же наряду с набитой колонкой может быть также использован незаполненный капилляр, что позволяет проводить анализ в изократическом режиме без сложных манипуляций по отключению

хроматографа. И наконец, при использовании для анализа новой системы ввода пробы исчезает потребность в напуске спутного газа даже при распылении водных растворов образцов.

Таким образом, резюмируем.

1. Разработана новая система ввода наноколи-чества пробы с набивной капиллярной колонкой (АСВНП), существенно расширяющая возможности уникального российского времяпролетного масс-спектрометра МХ-5310 при анализе биологических проб.

2. Система ввода отличается простотой исполнения, очень экономична в использовании растворителей и других расходных материалов, не нуждается в дополнительной системе поддува спутно-го газа для стабилизации распыления.

3. В разработанной системе непосредственно хроматографическая капиллярная колонка используется в качестве наноэмиттера, что приводит к уменьшению количества приборных узлов и снижает неизбежные потери анализируемых образцов.

Табл. 4. Сравнительные характеристики систем Милихром А02—МХ-5310

Характеристики Милихром А02—МХ-5310

Объем пробы 50 мкл 0.4 мкл

Количество вещества, содержащегося в пробе 200 пМ 1.8 пМ

Скорость потока подвижной фазы 150 мкл/мин ~ 100-200 нл/мин

Нагрев спутного газа Требуется Спутный газ не используется

ЧТТср. колонки 5363.51 13812.3

Высота, эквивалентная теоретической тарелке 13 мкм 2.7 мкм

Приведенная эффективность колонки 0.7-105 ЧТТ/м 2.8-105 ЧТТ/м

Коммерческие преимущества Возможность приобрести коммерческий готовый продукт 1) возможность изготовлять колонки в ходе работы; 2) невысокие траты на расходные материалы

4. Хроматографические параметры капиллярной колонки превышают параметры отечественных колонок, используемых в современной высокоэффективной жидкостной хроматографии.

5. Использование АСВНП при масс-спектро-метрическом анализе позволяет значительно повысить качество получаемых результатов.

6. Использование АСВНП позволяет решить задачу анализа сверхмалых проб (пикоколичеств веществ), характерных для реальных задач работы с материалом, выделяемым из биологического сырья.

7. Система АСВНП легко тиражируется и может быть использована в масс-спектрометрах других типов аналогичного назначения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александров М.Л., Галль Л.Н., Веренчи-ков А.Н., Краснов Н.В., Шкуров В.А. Исследо-

вание механизма образования катионов в масс-спектрометрии ЭРИАД // Научное приборостроение. 1991. № 2. C. 2-36.

2. Веренчиков А.Н., Краснов Н.В., Мурады-мов М.З., Хасин Ю.И. Современное состояние приборов времяпролетной масс-спектро-метрии // Научное приборостроение. 2001. Т. 11, № 3. С. 45-54.

3. Aebersold R., Mann M. Mass Spectrometry-Based Proteomics // Nature. 2003. V. 422, N 6928. P.198-207.

4. Verentchikov A.N., Ens W., Standing K.G. Reflecting Time-of-Flight Mass Spectrometer with Electrospray Ion Source and Orthogonal Extraction // Anal. Chem. 1994. V. 66, N 1. P. 126-133.

5. Przybylski M., Glocker M. Electrospray // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996. V. 35, N 8. P. 806826.

6. Ramanathan R., Zhong R., Blumenkrantz N., Chowdhury S.K., Alton K.B. Response Normalized Liquid Chromatography Nanospray Ioniza-

tion Mass Spectrometry // J. Am. Soc. Mass Spec-trom. 2007. V. 18, N 10. P. 1891-1899.

7. Lottspeich F. Proteome Analysis: a Pathway to the Functional Analysis of Proteins // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1999. V. 38. P. 2476-2492.

8. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M. Mass Spectrometric Sequencing of Proteins Silver-Stained Polyacrylamide Gels // Anal. Chem. 1996. V. 68, N 5. P. 850-858.

9. Pappin D.J., Hojrup P., Bleasby A.J. Rapid Identification of Proteins by Peptide-Mass Fingerprinting // Curr. Biol. 1993. V. 3, N 6. P. 327-332.

10. Perkins D.N., Pappin D.J., Creasy D.M., Cottrell J.S. Probability-Based Protein Identification by Searching Sequence Databases Using Mass Spectrometry Data // Electrophoresis. 1999. V.20, N 18. P.3551-3567.

11. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT Protein Sequence Database and Its Supplement TrEMBL in 2000 // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28, N 1. P. 45-48.

12. АлександровМ.Л., Галль Л.Н., Краснов Н.В. и др. Прямая стыковка микроколоночного жидкостного хроматографа с масс-спектрометром // Биоорган. химия. 1984. Т. 10, № 5. С. 710-712.

13. Макаров В.В., Самокиш А.В., ЛютвинскийЯ.И. Метод извлечения значимой информации из масс-спектров пептидов // Научное приборостроение. 2004. Т. 14, № 2. С. 96-104.

14. Назимов И.В., Корчажникова М.Н., Русанов В. А. и др. Аналитическая биотехнология генноинженерных лекарственных препаратов пептидной природы (инсулины человека, гормон роста человека) // Тезисы докладов II-го Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. С.-Петербург, 2005. С. 95.

15. Назимов И.В., Веренчиков А.Н., Оксенен-ко П.А., Новиков А.В., Краснов Н.В. Использование тандема микроколоночный жидкостный хроматограф—масс-спектрометр в режиме online для контроля состава лекарственных средств // 2-я Всероссийская конференция "Аналитические приборы". С.-Петербург, 2005.

16. Петров Д.М. Способы унифицированного управления системами регистрации время-пролетного масс-спектрометра // Научное приборостроение. 2004. Т. 14, № 2. С. 92-103.

17. Беленький Б.Г., Ганкина Э.С., Мальцев В.Г. Капиллярная жидкостная хроматография. Л.: Наука, 1987. 207 с.

18. Рудаков О.Б. и др. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. Воронеж: Водолей, 2004. 528 с.

19. Введение в микромасштабную высокоэффективную жидкостную хроматографию / Под ред. Исии Д. Мир, 1991. 240 с.

20. Chichester E.D. High Performance Liquid Chromatography: Principles and Methods in Biotechnology. UK: John Wiley & Sons, 1996. 522 р.

Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург

Университет Южной Дании, Центр экспериментальной биоинформатики, Лаборатория белковых взаимодействий, Одэнс

Материал поступил в редакцию 16.09.2008.

NANOQUANTITY MASS-SPECTROMETRY LEAD-IN SYSTEM

DEVELOPMENT

I. A. Krasnov1, E. P. Podolskaya1, M. Z. Muradimov1, M. V. Apatskaya1, Y^ I. Lutvinsky1, S. V. Fironov1, A. V. Vitin1, K. A. Belyaev1, D. I. Kornev1, A. A. Kayumov1, A. V. Podtelezhnikov2, L. N. Gall1, N. V. Krasnov1

1Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg

2Protein Interaction Laboratory, Center for Experimental Bioinformatics, University of Southern Denmark, Odense

This paper deals with the development of domestic nano-LC-MS analytical system. The main functional blocks of the system are chromatography installation based on HPLC micro column techniques, nano-ESI ionization block and TOF analyzer. This system was realized on the bases of MX-5310 mass-spectrometer (IAI RAS). The article describes the main parameters of the developed system and compares them with those of domestic LC-MS systems. The developed system allows working with nano amounts of testing samples. Capillary column use as nano emitter increases quality of analysis and makes the system more economic in solvent consumption.