Исследование действия диклофенака натрия на мембраны эритроцитов

ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ДИКЛОФЕНАКА НАТРИЯ НА МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ

В.А. Николаевский, Д.Б. Холодов, С.Н. Шамарин

Кафедра фармакологии Фармацевтический факультет ВГУ ул. Студенческая, 3, Воронеж, Россия, 394036

Работа посвящена анализу событий, происходящих на клеточном уровне в ответ на введение диклофенака натрия in vitro в инкубационную среду. На основании анализа данных по кислотной и осмотической резистентности эритроцитов крови в присутствии широкого диапазона концентраций диклофенака натрия (0,7 • 10-4; 1,7 • 10-4; 2,8 • 10-4 моль/л) показано, что указанное соединение обладает непосредственным повреждающим действием на биологические мембраны; выявлен его до-зозависимый эффект повреждающего действия на мембраны эритроцитов: первый порог соответствует концентрациям 0,7 • 10-4 моль/л и 1,4 • 10-4 моль/л, второй — концентрации 2,8 • 10-4 моль/л; диклофенак натрия вызывает еще и скрытые повреждения в клеточных мембранах.

Нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) занимают одно из наиболее важных мест в клинической практике. Однако, несмотря на несомненную клиническую эффективность, применение НПВС имеет свои ограничения. По современным представлениям повреждающее действие НПВП на слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) связано с основным механизмом их действия — тормозящим влиянием на активность фермента циклооксигеназы, что приводит к уменьшению синтеза простагландинов и как следствие — к снижению выработки защитной слизи и бикарбонатов [6].

В связи с вышеизложенным актуальным является вопрос изучения молеку-лярно-клеточных основ процесса взаимодействия диклофенака натрия с биологическими структурами, особенно с компонентами плазматических мембран соматических клеток организма.

Целью настоящего исследования являлось выявить влияние ЛП «Дикло-фенак» на структурно-функциональные свойства эритроцитарных мембран.

В задачи исследования входило: изучить воздействие ЛП «Диклофенак» на структурно-функциональные свойства эритроцитарных мембран с использованием метода регистрации кислотных и гипоосмотических эритрограмм.

Для решения поставленной проблемы наиболее предпочтительным в качестве объекта исследования является использование эритроцитарных клеток, поскольку их структура к настоящему времени достаточно полно изучена и отражает состояние мембранолитических процессов в организме. Предметом исследования является гемолиз эритроцитов, модифицированных ЛП «Диклофенак».

В качестве модифицирующего агента мы использовали коммерческий препарат диклофенака натрия (DF-Na) («Лотус Лабораториз Пвт. Лтд.», Индия) в концентрациях 0,7 • 10-4; 1,4 • 10-4; 2,8 • 10-4 моль/л, что соответствует ED25, 50, юо. Данные концентрации были получены в результате определения анальгетической активности по тесту «Уксусные корчи» [3]. В опытах было использовано 50 беспородных белых мышей обоих полов, массой 20—30 г. Полученные данные обработаны по методу наименьших квадратов (пробит анализ) [5].

Суспензии эритроцитов получали по методу Л.А. Блюменфельда [2]. В опытах использовали кровь, полученную из хвостовых вен белых беспородных крыс (п = 28) в количестве 1 мл, с соблюдением требований по гуманному обращению с животными. Содержание клеток в образцах контролировали спектрофотомет-рически при длине волны 490 нм [1].

Кинетику индуцированного DF-Na гемолиза эритроцитов изучали с помощью метода регистрации кислотных и гипоосмотических эритрограмм с использованием прибора КФК-3 (ОАО Загорский оптико-механический завод г. Загорск) [1, 4, 7].

Анализ данных эксперимента показал, что в гипоосмотической среде максимальная скорость гемолиза эритроцитов, модифицированных DF-Na в концентрациях 0,7 • 10-4; 1,4 • 10-4; 2,8 • 10-4 моль/л, практически не зависит от содержания модификатора в инкубационной среде. В то же время при повышении концентрации DF-Na в инкубационной среде увеличивается доля гемолизированных эритроцитов. При увеличении концентрации DF-Na в кислотной среде наблюдается увеличение скорости гемолиза эритроцитов, модифицированных данным препаратом, это свидетельствует о снижении кислотной резистентности эритроцитов, модифицированных DF-Na.

Анализ кинетических кривых кислотного гемолиза эритроцитов, модифицированных DF-Na, проводили по показателям Кшж и Gсф.

Для характеристики кислотной резистентности эритроцитов ипользовали величину КШЕХ, которая характеризует долю эритроцитов, одновременно вступивших в стадию гемолиза. По результатам исследования построен график зависимости ЛКШЕХ от времени инкубации (рис. 1).

Увеличение Кшж свидетельствует об увеличение количества средне- и высокостойких эритроцитов, модифицированных DF-Na, которые одновременно вступают в стадию гемолиза. Это указывает на увеличение сродства клеточных мембран к структуре препарата, который вызывает конформационные изменения в бел-ково-липидных комплексах как «старых», так и более стойких эритроцитов.

Из диаграммы видно, что при увеличении концентрации DF-Na в инкубационной среде наблюдается смещение влево по оси ОХ как пиков КШЕХ, так и увеличение доли «средних» и «молодых» эритроцитов, вовлекаемых в процесс гемолиза. Можно предположить, что модифицирующее действие DF-Na связано с химическим связыванием с белково-липидными комплексами, что ведет к возникнове-

нию повреждений в мембране и снижению относительно контроля порога проницаемости йонов Н+. Возможно также, что лекарственный препарат проникает через мембрану внутрь эритроцитов и тем самым вызывает изменение структуры гемоглобина, нарушается осмотическое давление внутри клетки, вода поступает внутрь клетки, вызывая ее сферуляцию и последующее ее разрушение. Установлено, что при увеличении концентрации DF-Na в инкубационной среде увеличивается повреждающее действие его на эритроциты.

о -I-,-,-,-,-,

О 15 30 60 120 240

мин.

Рис. 1. Зависимость Ктах кислотного гемолиза эритроцитов, модифицированных DF-Na от времени инкубации рабочей суспензии эритроцитов,

где .......... концентрация 0,7 • 10-4 моль/л,

_._._._ концентрация 1,4 • 10-4 моль/л, _ концентрация 2,8 • 10-4 моль/л

По результатам изучения зависимости сфероцитоза эритроцитов от длительности воздействия и содержания в инкубационной среде DF-Na ^сф), отражающей количество эритроцитов, вовлекаемых в стадию сфероцитоза, построен график (рис. 2).

Из приведенного графика видно:

1) при использовании DF-Na в концентрации 0,7 • 10-4 моль/л, в качестве модификатора, вовлечение в процесс сфероцитоза субпопуляции среднестойких эритроцитов происходит после инкубирования рабочей суспензии в течение 120 мин., что соответствует пику кривой;

2) при использовании DF-Na в концентрации 1,4 • 10-4 моль/л и 2,8 • 10-4 моль/л, в качестве модификатора, вовлечение в процесс сфероцитоза субпопуляции среднестойких эритроцитов происходит после инкубирования рабочей суспензии эритроцитов уже в течение 15 мин.;

3) для DF-Na в концентрации 2,8 • 10-4 моль/л регистрируется вовлечение в процесс сфероцитоза еще и субпопуляции высокостойких эритроцитов после инкубирования рабочей суспензии в течение 240 мин.

Авсф, % 10 -|-----

9 -----

8

0 15 30 60 120 240

t, мин

Рис. 2. Зависимость Gсф кислотного гемолиза эритроцитов, модифицированных диклофенаком натрия, от времени инкубации,

где .......... концентрация 0,7 • 10-4 моль/л,

_______концентрация 1,4 • 10-4 моль/л,

_концентрация 2,8 • 10-4 моль/л

Анализ кинетических кривых гипоосмотического гемолиза эритроцитов, модифицированных DF-Na, проводили по показателям К^х, Осф.

По результатам анализа максимальной скорости гипоосмотического гемолиза (Ктах), характеризующей количество эритроцитов, одновременно вступивших в стадию гемолиза, построен график зависимости Ктх от времени инкубации (рис. 3).

Из диаграммы видно, что при использовании DF-Na в качестве модификатора в концентрациях 0,7 • 10-4 и 1,4 • 10-4 моль/л в процесс гемолиза вовлекаются субпопуляции низко- и среднестойких эритроцитов, что отражается пиками соответствующих кривых. При использовании DF-Na в качестве модификатора в концентрации 2,8 • 10-4 моль/л в процесс гемолиза вовлечены субпопуляции низко-, средне- и высокостойких эритроцитов. Смещение влево по оси ОХ пиков К^х, при увеличении концентрации DF-Na в инкубационной среде, свидетельствует о большей модификации белково-липидных комплексов. Это ведет к возникновению повреждений в эритроцитарных мембранах и увеличению доли эритроцитов, вовлеченных в процесс гемолиза, т.е. имеет место зависимость между повышением концентрации DF-Na и увеличением доли поврежденных эритроцитов.

В результате анализа относительного количества гемолизированных эритроцитов, модифицированных DF-Na, в осмотическом гемолизе (О^), построен график зависимости О^ от времени инкубации (рис. 4).

Рис. 3. Зависимость Ктах гипоосмотического гемолиза эритроцитов, модифицированных диклофенаком натрия, от времени инкубации,

где.......... концентрация 0,7 • 10-4 моль/л,

_._._._ концентрация 1,4 • 10-4 моль/л, _концентрация 2,8 • 10-4 моль/л

Рис. 4. Зависимость Gсф гипоосмотического гемолиза эритроцитов, модифицированных диклофенаком натрия, от времени инкубации,

где.......... концентрация 0,7 • 10-4 моль/л,

_._._._ концентрация 1,4 • 10-4 моль/л, _концентрация 2,8 • 10 моль/л

Анализ данного параметра свидетельствует, что при увеличении концентрации DF-Na и времени инкубации количество гемолизированных эритроцитов возрастает в зависимости от увеличения концентрации и времени инкубации, что

объясняется увеличением числа эритроцитов со скрытыми дефектами в мембране при их модификации DF-Na.

В ходе проведенных экспериментов нами установлено:

1) DF-Na обладает непосредственным повреждающим действием на биологические мембраны эритроцитов в опытах in vitro;

2) выявлен дозозависимый эффект повреждающего действия DF-Na на молекулярном и клеточном уровне: первый порог соответствует концентрациям 0,7 • 10-4 моль/л и 1,4 • 10-4 моль/л, второй — концентрации 2,8 • 10-4 моль/л;

3) DF-Na вызывает еще и скрытые повреждения в клеточных мембранах, установленные с помощью методики осмотического гемолиза, не обнаруживаемые другими методами.

Таким образом, на примере исследования ЛП «Диклофенак» показана возможность применения методов регистрации эритрограмм для изучения повреждающего действия данного препарата на клеточном уровне.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Артюхов В.Г., Резван С.Г., Гусинская В.В. и др. Структурные свойства эритроцитов и функциональная активность системы комплемента крови больных с различными формами нефропатии // Вестник ВГУ. — 2000. — № 1. — С. 130—133.

[2] Блюменфельд Л.А. Биофизика. — М.: Наука, 1972. — 954 с.

[3] Гацура В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ. — М.: Медицина,1974. — 143 с.

[4] Гительзон И.И., Терсков И.А. Состав красной крови в норме и патологии. — Томск: Издательство Томского университета, 1960. — 200 с.

[5] Кудрин А.Н. Применение математики в экспериментальной клинической медицине. — М.: Медицина, 1967. — 350 с.

[6] Насонов Е.Л. Ревматология 2005: Клинические рекомендации. — М.: Гэотар; Медицина, 2005. — 288 с.

[7] Резван С.Г., Вашанов Г.А., Лавриненко И.А. и др. Молекулярные механизмы взаимодействия гемоглобина с серотонином // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. — 2004. — Т. 90. — № 8. — С. 46—47.

THE STUDI OF DICLOFENAC-NATRIUM INFLUENCE ON THE ERYTHROCYTE'S MEMBRANES

V.A. Nicolaevsky, D.B. Holodov, S.N. Shamarin

Department of Pharmacology Pharmaceutical faculty VSU

Studencheskaya str., 8, Voronezh, Russia, 394036

The study deals with tlu analysis of processes taking place on tlu cellular level in response to introduction of diclofenac sodium in vitro incubative medium. On the basis of the data analysis of acid and osmotic resistency of blood erithrocytes in the presence of a wide range of diclofenac sodium concentration

(0,7 • 10; 1,7 • 10; 2,8 • 10-4 m/l) it is shown, that the mentioned above compound possesses a direct damaging action on biological membranes; it is revealed its dose-dependaut effect of damaging action on eritrocytes membranes; the first threshold corresponds to concentration as 0,7 • 10-4 m/l and 1,4 • 10-4 m/l, the second — concentration 2,8 • 10-4 m/l; diclofenac sodium also causes latent damages of cellular membranes, vohich cau't be found out by other methods; diclofenac sodium probably causes au accelerated ageing of erytrocites.

Key words: Non-steroid antiinflammatory drug, erythrocyte, membrane, diclofenac-natrium.

ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ГОМЕОСТАЗА У ПОЖИЛЫХ ЛИЦ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

О.Г. Ишонина, И.А. Кравченко, З.И. Микашинович

Кафедра общей и клинической биохимии № 1 ГОУ ВПО «РостГМУ» пер. Нахичеванский, 29, Ростов-на-Дону, Россия, 344022

Изучалась активность ферментов энергетического обмена и антиоксидантной защиты у пожилых больных сахарным диабетом II типа, как одного из заболеваний, снижающих продолжительность жизни. Установлено, что происходит включение компенсаторных механизмов, которые связаны с нарушением обмена глюкозы и истощением отдельных звеньев антиоксидантной защиты у пожилых больных сахарным диабетом II типа. Выявленные изменения предполагается использовать как ранние диагностические маркеры предрасположенности к данному заболеванию.

Ключевые слова: ИНСД, старение, внутриклеточный гомеостаз.

В настоящее время происходит рост численности пожилых людей в человеческой популяции в связи со снижением рождаемости и увеличением продолжительности жизни. До преклонного возраста доживают люди, сохранившие в большей мере оптимальный уровень функционирования важнейших физиологических функций. Процесс старения, как и процесс роста и развития организма, контролируется сходными эндокринными механизмами. В этой связи актуальным является своевременная диагностика и профилактика наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ и имеющих позднюю манифестацию. При этом большое значение имеет выбор диагностических критериев, которые обладают онтогенетической стабильностью и могут свидетельствовать о наличии предрасположенности к определенным наследственным заболеваниям, сокращающим продолжительность жизни.

Одним из заболеваний, снижающих жизнеспособность организма и относящихся к возрастным болезням, является сахарный диабет II типа (ИНСД). Сего-