Способ аэропонного выращивания каучуконосного растения кок-сагыз Taraxacum kok-saghyz R
METHOD FOR AEROPONIC CULTIVATION OF RUBBER PLANT KOK-SAGHYZ TARAXACUM KOK-SAGHYZ R

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к бессубстратным технологиям выращивания растений и может быть использовано для культивирования каучуконосного растения кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin) по аэропонной технологии в условиях фитотрона.
В настоящее время основным природным источником натурального каучука является бразильская гевея, плантации которой находятся, главным образом, в странах юго-восточной Азии. Однако появление реальных угроз биологического и экологического характера, монопольное положение стран, где произрастает гевея, повышение спроса и рост цен на натуральный каучук делают актуальным поиск альтернативных источников этого стратегического продукта. Одной из наиболее перспективных в этом отношении культур является произрастающее в природных условиях в Средней Азии, Казахстане, Китае, каучуконосное растение кок-сагыз (Taraxacum kok-saghyz Rodin), называемое иногда в зарубежных источниках «русский одуванчик». Кроме каучука, растение накапливает большое количество инулина, применяемого в медицине, лечебном питании и биотехнологических производствах, содержит обладающие антиоксидантной активностью флавоноиды и другие биологически активные вещества [Cherian, S., Ryu, S. В., & Cornish, K. (2019). "Natural rubber biosynthesis in plants, the rubber transferase complex, and metabolic engineering progress and prospects" Plant Biotechnology Journal, 17 (11), p. 2041-2061].
Известно, что извлекаемый из кок-сагыза натуральный каучук по своим качествам не уступает, а по некоторым характеристикам превосходит каучук из гевеи [С.Н. Кутузова и др. «Кок-сагыз - Taraxacum koL·aghyz (Asteraceae, Compositae) - источник ценного растительного сырья для резиновой, пищевой и фармацевтической промышленности», Междисциплинарный научный и прикладной журнал «Биосфера», 2015, т. 7, №4, с. 392-402], однако его содержание в корнях кок-сагыза, составляющее, по усредненным из разных источников данным, около 14 масс. % в расчете на сухое вещество, существенно ниже, чем в бразильской гевее. Промышленное выращивание кок-сагыза плантационным способом осложнено низкой продуктивностью растений даже в условиях защищенного грунта, высокой уязвимостью к бактериальным и грибным патогенам, необходимостью создания специальных технологий сбора и обработки семян и урожая каучуксодержащих корней, разработки способов селективного уничтожения сорных растений, опасностью переопыления, преодоления проблем неравномерной всхожести семян, высокой чувствительности растений к колебанию погодных условий и др.
Альтернативный подход к культивированию кок-сагыза, исключающий большинство этих проблем, состоит в использовании бессубстратных технологий, которые могут быть реализованы в современных фитотронах, позволяющих создать искусственные оптимальные и стабильные условия для роста и развития растений. Бессубстратное культивирование в условиях фитотрона позволяет сделать цикл производства натурального каучука из корней кок-сагыза внесезонным и практически непрерывным. Большинство известных в настоящее время публикаций по бессубстратному выращиванию кок-сагыза относятся к применению гидропонных технологий. В заявке [CN 111201997 А, опубл. 29.05.2020] описана гидропонная установка, система управления и процесс выращивания кок-сагыза. В качестве посадочного материала используют выращенные в почве саженцы. Корни отмывают от почвы, обрезают, оставляя длину четыре сантиметра, обеззараживают в растворе марганцевокислого калия, обрабатывают стимулятором корнеобразования и закрепляют в посадочных отверстиях так, что около одного сантиметра корня остается над поверхностью раствора. По мере роста растений корректируют температуру и длительность естественного освещения, а также состав и концентрацию питательного раствора, который заменяют каждые 2-3 недели для предотвращения развития инфекции. Культивирование растений прекращают и проводят сбор урожая корней, когда их длина достигает 20 см. Недостатком технологии является невысокая эффективность, связанная с тем, что при переносе растений, выращенных в почве, в гидропонную установку велика вероятность попадания в нее и ускоренного развития фитопатогенов, приводящих к развитию сосудистых бактериозов и гибели растений. Меры, принимаемые авторами для предотвращения инфицирования, нельзя считать достаточными. Невысокая эффективность также обусловлена прекращением культивирования растений после срезки корней при достижении ими длины 20 см.
Известен способ гидропонного выращивания растений семейства Asteraceae, к которому относится кок-сагыз [ЕР 3479684 В1, опубл. 23.09.2020]. Отличительная особенность способа состоит в том, что количество питательного раствора регулируют таким образом, что от 10 до 50% общей длины стержневого корня растения погружают в питательный раствор, а остальную его часть оставляют в воздушной среде. В этих условиях, по утверждению авторов, ингибируется образование ненужных разветвленных корней, активизируется дыхание корня, что предотвращает загнивание и стимулирует рост стержневого корня, наиболее богатого каучуком. Данные, приведенные авторами, подтверждают, что растения, выращенные предложенным способом, имеют более высокую массу стержневого корня и более высокое содержание в нем каучука, чем растения, выращенные в почве или при полном погружении корня в питательный раствор, однако использование стерилизованных или продезинфицированных питательных растворов не устраняет опасности заражения среды выращивания фитопатогенами, приводящими к заболеваниям и гибели растений.
В работе [K. Cornish, Τ Madden "Hydroponic cultivation has high yield potential for TKS" Rubber & Plastics News, October 7, 2019] также описаны эксперименты по выращиванию растения кок-сагыз в гидропонной установке. В качестве посадочного материала использованы 6-месячные растения кок-сагыза, выращенные в почве в природных условиях. Для освещения используют естественный солнечный свет, а при его недостатке - искусственное освещение, имитирующее естественное. Подтверждено, что содержание каучука в корнях растений, выращенных гидропонным способом, практически не отличается от его содержания в корнях растений, полученных в полевых условиях. Перспективы промышленного использования гидропонных технологий при выращивании кок-сагыза авторы связывают с тем, что каучуксодержащие корни растения способны к отрастанию после срезки, что позволяет увеличить объем получаемой корневой биомассы и повысить общий выход каучука. Однако, как отмечалось выше, при переносе растений, выращенных в почве, в гидропонную установку велик риск инфицирования среды выращивания фитопатогенами, которые способны интенсивно развиваться в условиях фитотрона и приводить к болезням и гибели растений. Это тем более опасно, когда технология включает периодическую срезку корней, оказывающую на растения стрессовое воздействие, делая их еще более уязвимыми по отношению к бактериальным и грибным инфекциям.
Анализ уровня техники показывает, что в настоящее время недооценены возможности применения аэропонных технологий для получения биополимеров растительного происхождения. Аэропоника - способ бессубстратного культивирования растений с использованием распыляемых в культивационной камере питательных растворов. Благодаря использованию микропроцессорной техники, микрораспылителей, систем тонкой фильтрации, систем обеззараживания питательных растворов, энергосберегающих, программируемых, сбалансированных по спектру источников искусственного света, современный аэропонный фитотрон позволяет создавать и автоматически регулировать весь комплекс условий, необходимых для выращивания такой агротехнически сложной культуры, как кок-сагыз, а также для проведения исследований по созданию генно-модифицированных растений с улучшенными потребительскими характеристиками. Интактные или генетически модифицированные растения можно выращивать в аэропонном фитотроне в строго контролируемых, оптимальных для данного вида условиях, что позволяет достичь высокой продуктивности благодаря наиболее полной реализации генетического потенциала растений. Отсутствие почвы и ее заменителей обеспечивает прямой доступ к корням, облегчая сбор урожая и отбор проб для динамического контроля состояния растений и накопления целевых продуктов. Одним из преимуществ аэропонного способа выращивания растений, особенно в случае кок-сагыза, накапливающего целевые продукты в корнях, является возможность активной аэрации корневой системы, что способствует интенсивному корнеобразованию и защите от анаэробных патогенов.
-2
-1
Статья [Б.Р. Кулуев и др. «Гидропонное и аэропонное выращивание одуванчика Taraxacum kok-saghyz Rodin», Биомика, 2017, т. 9, №2, с. 96-100] посвящена сравнению гидропонного и аэропонного способов выращивания кок-сагыза. В работе описаны эксперименты по выращиванию кок-сагыза в лабораторной аэропонной установке (прототип). Прошедшие предпосевную обработку семена проращивают в климатической камере, проростки доращивают в гидропонной установке на среде Хогланда-Арнона, после чего их переносят в аэропонную установку и выращивают растения в течение 40 дней на среде Хогланда-Арнона под люминесцентными лампами при температуре 25°С, фотопериоде 16/8 часов, плотности светового потока 100 мкМ мсек. Относительно короткий период наблюдений не позволил авторам выявить отличия в развитии корневой системы растений, выращенных в аэропонных и гидропонных условиях, однако установлено, что побеги кок-сагыза развиваются лучше при аэропонном выращивании. Показав принципиальную возможность выращивания кок-сагыза аэропонным способом, авторы признают, что оптимальные условия выращивания этой культуры в аэропонных условиях ими не достигнуты. Влияние условий аэропонного выращивания на содержание в корнях кок-сагыза каучука и инулина в работе не исследовано. Также остался без внимания вопрос снижения рисков загрязнения среды патогенной микрофлорой, которая может стать причиной поражения корней сосудистыми бактериозами. Возможность периодической срезки корней при выращивании растений кок-сагыза в аэропонных условиях авторами не рассматривается.
Таким образом, очевидно, что потенциал современных аэропонных технологий для эффективного выращивания кок-сагыза, как источника промышленного получения натурального каучука, еще далеко не реализован.
Проблема, решаемая изобретением, состоит в повышении эффективности выращивания каучуконосного растения кок-сагыз Taraxacum kok-saghyz Rodin за счет улучшения морфометрических и физиологических показателей растений на разных стадиях роста вследствие создания благоприятных условий аэропонного выращивания, обеспечивающих получение здоровых, свободных от фитопатогенов растений, способных к быстрому восстановлению процесса биосинтеза целевых продуктов и накоплению дополнительных объемов корневой биомассы после многократной частичной срезки корней.
Очевидно, что для решения проблемы необходим комплекс мер, предотвращающих загрязнение внутренней среды фитотрона фитопатогенами, и минимизирующих опасность инфицирования растений в процессе срезки корней. Также важно создать условия для развития растений, учитывающие их физиологические особенности и стимулирующие быстрое восстановление способности растений к биосинтезу каучука и других ценных продуктов после неоднократной срезки корневой биомассы.
2
2
Проблема решена предлагаемым способом выращивания растения кок-сагыз Taraxacum kok-saghyz Rodin, включающим бессубстратное получение посадочного материала и последующее аэропонное выращивание растений в заданных условиях при искусственном освещении с фотопериодом 16/8, отличающимся тем, что используют посадочный материал, не содержащий патогенной микрофлоры и внутренней бактериальной инфекции в латентном состоянии, а также обеззараженные питательные растворы и газовоздушные смеси, получение посадочного материала и выращивание растений осуществляют с использованием культуральной жидкости дрожжей Nadsoniella nigra, освещение растений осуществляют светодиодными светильниками в режиме, при котором в утреннем промежутке фотопериода с 8 до 14 часов и вечернем промежутке фотопериода с 20 до 24 часов интенсивность излучения с длиной волны 630-680 нм (красный свет) на 30-45% превышает интенсивность излучения с длиной волны 440-480 нм (синий свет) при общей интенсивности света на уровне посадочной платформы от 170 до 400 микромоль фотонов/м⋅с, а в дневном промежутке фотопериода с 14 до 20 часов интенсивность излучения с длиной волны 440 - 480 нм на 30-45% превышает интенсивность излучения с длиной волны 630-680 нм при общей интенсивности света от 400 до 1200 микромоль фотонов/м⋅с., при этом интенсивность ультрафиолетового излучения с длиной волны 340-400 нм в дневном промежутке фотопериода на 2,0-2,5% превышает интенсивность этого излучения в утреннем и вечернем промежутках фотопериода, дополнительно способ включает периодическую частичную срезку корней, после которой оставшиеся корни последовательно обрабатывают антисептиком и раствором, содержащим культуральную жидкость дрожжей Nadsoniella nigra, после чего проводят периодическое опрыскивание корней питательным раствором, которое чередуют с аэрацией корней и дополняют листовыми подкормками раствором, включающим культуральную жидкость дрожжей Nadsoniella nigra.
Под общей интенсивностью света понимают совокупность интенсивности излучения всех светодиодных источников, участвующих одновременно в облучении растений в конкретном временном промежутке фотопериода.
Следует отметить, что приведенное по аналогии с естественными условиями, условное разделение суточного цикла на утренний, дневной и вечерний промежутки, важно для программирования существенных для получения результата параметров освещения культивируемых растений - количественного преобладания в спектре облучения длин волн того или иного диапазона и общей интенсивности света - в зависимости от «времени суток». При этом указанные временные значения для утреннего (с 8 до 14 часов), дневного (с 14 до 20 часов) и вечернего (с 20 до 24 часов) промежутков фотопериода являются ориентировочными, и могут в процессе выращивания растений корректироваться в разумных пределах без изменения результата.
Растения кок-сагыза, выращенные данным способом, не поражаются бактериальными заболеваниями, по морфометрическим показателям и по скорости наращивания корневой биомассы превосходят растения, выращиваемые в плантационных условиях, а после периодических частичных срезок корней быстро восстанавливают корневую систему и способность к биосинтезу целевых продуктов. Это позволяет сделать сбор корней кок-сагыза внесезонным и за год получить урожай корней в десятки раз превышающий урожай, получаемый за естественный шестимесячный вегетационный период при выращивании этой культуры плантационным способом. При этом содержание каучука и инулина в корневой биомассе растений, выращенных заявляемым способом, не ниже, чем содержание этих продуктов в растениях, выращиваемых плантационным способом.
Сущность изобретения поясняется следующими иллюстрациями:
Фиг. 1. Растения кок-сагыза в возрасте 30-35 суток в конце первого этапа -начальной фазы роста: А - растения перед посадкой в фитотрон, выращенные из каллусных тканей и размноженные микроклонально in vitro; В - растения перед посадкой в фитотрон, выращенные in vitro из семян, полученных от коллекционных образцов Федерального исследовательского центра Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова (ВИР); С - растения, выращенные из семян непосредственно в фитотроне.
Фиг. 2. Растения кок-сагыза через 30 суток после начала второго этапа - фазы активного роста. А - растение получено из посадочного материала, выращенного из каллусных тканей и размноженного микроклонально in vitro; В - растение получено из посадочного материала, выращенного из семян in vitro; С - растение, выращенное из семян, пророщенных непосредственно в фитотроне.
Фиг. 3. Вегетирующие растения кок-сагыза. А - при освещении светом, обогащенным синей частью спектра (440-480 нм); В - при освещении светом, обогащенным красной частью спектра (630-680 нм), и соответствующие им кривые Мак-Кри, характеризующие эффективность фотосинтеза в зависимости от длины волны светового излучения в условиях преобладания синей или красной части спектра.
Фиг. 4. Цветущие растения кок-сагыза в фитотроне. Возраст растений 90 суток.
Фиг. 5. Внешний вид растений кок-сагыза. А - растение в природных условиях, возраст 120 суток; В - растения в условиях фитотрона, возраст 60 суток (освещение с преобладанием красной части спектра).
Фиг. 6. Динамика накопления массы сырого корня растений кок-сагыза при выращивании в грунте и в аэропонном фитотроне заявляемым способом.
Фиг. 7. Растения кок-сагыза перед первой частичной срезкой корней. Возраст растений 125 суток.
Фиг. 8. Растения кок-сагыза через 35 суток после первой частичной срезки корней.
Фиг. 9. Полученное методом гель-проникающей хроматографии, молекулярно-весовое распределение натурального каучука, выделенного из кок-сагыза, выращенного заявляемым способом, в сравнении с натуральным каучуком из гевеи бразильской. Кривая 1 - каучук из кок-сагыза, кривая 2 - каучук из гевеи.
2
Для осуществления способа используют аэропонный фитотрон, аналогичный описанному в [RU 196013 U, опубл. 12.02.2020]. Внутреннее пространство фитотрона разделено посадочной платформой на изолированные друг от друга вегетационную (верхнюю) и корневую (нижнюю) камеры, независимое функционирование которых обеспечено управляемыми в автоматическом режиме системой освещения и системами подготовки и рециркуляции воздуха и питательного раствора. Система освещения фитотрона включает независимо управляемые светодиодные светильники с суммарным спектральным диапазоном от 315 до 850 нм. Фитотрон оборудован управляемыми автоматически ультразвуковыми увлажнителями воздуха и устройством фотокаталитического окисления и очистки воздуха - рециркулятором, предназначенным для обеззараживания газовой среды фитотрона. Для очистки циркулирующих в объеме газовоздушных смесей фитотрон содержит газовые фильтры и УФ-излучатель. Внутренние поверхности фитотрона покрыты бактерицидным составом, например, янтарным лаком слоем толщиной около 40 мкм. Посадочная платформа, установленная с возможностью изменения расстояния до источников света, представляет собой теплоизолированную свето-, влаго- и газонепроницаемую сэндвич-панель из химически стойкой пластмассы с отверстиями под диаметр держателей посадочных лунок. Отсутствие конкуренции за питание и свет позволяют загущать посадки - плотность размещения посадочных лунок составляет 96 лунок/м. Посадочные лунки, изготовленные из гигроскопичного материала, фиксируют в держателях из химически стойкой пластмассы, которые позволяют при необходимости извлекать вегетирующие растения для проведения биометрических и других исследований. Для обеззараживания питательных растворов фитотрон оснащен источниками УФ-излучения и гидроакустическим излучателем. В контроллере блока управления фитотрона записаны программы работы всех систем для каждого этапа роста и развития растений. Программное обеспечение фитотрона позволяет в автоматическом режиме накапливать, хранить и обрабатывать экспериментальные данные, а также вести дистанционный онлайн-мониторинг работы устройства.
В качестве посадочного материала используют выращенные без применения почвы и ее заменителей интактные растения кок-сагыза, полученные из семян или из каллусных тканей и размноженные микроклонально in vitro. Также могут быть использованы генетически модифицированные растения.
Предпосевная обработка семян включает прогрев семян в суховоздушном состоянии до 46 - 50°С в течение 5-7 суток с ежедневным плавным повышением температуры [Singh, S., Singh, Η., & Bharat, Ν. K. (2020). Hot Water Seed Treatment: A Review. Capsicum. DOI: 10.5772/intechopen.91314], последующую обработку стерилизующим раствором, например 0,15% раствором надуксусной кислоты в течение 2-10 мин и промывку стерильной дистиллированной водой для освобождения от поверхностной патогенной микрофлоры. Затем семена в суховоздушном состоянии обрабатывают ультразвуком с частотой 22-48 кГц и замачивают на 10-120 минут в стерильном растворе фитостимулятора, в качестве которого используют водный раствор культуральной жидкости дрожжей Nadsoniella nigra с объемной концентрацией 0,1-1,0 мл/л. Семена тестируют на отсутствие бактериальной и грибной микрофлоры и на отсутствие внутренней бактериальной инфекции в латентном состоянии, после чего подвергают стратификации в стерильных условиях в темноте при температуре 3-4°С и влажности 80±5% в течение нескольких суток.
Семена кок-сагыза проращивают непосредственно в фитотроне или вне фитотрона in vitro. В первом случае семена высевают в посадочные лунки фитотрона, в которых в автоматически регулируемых условиях влажности и температуры происходит их проращивание и развитие проростков. Материал, из которого изготовлены лунки, пропитывают раствором смеси фунгицида и бактериостатиков. В качестве фунгицида используют коммерческие препараты, содержащие беназол, тебуконазол, азоксистробин, дифеноконазол, метирам и др., или их комбинации. В качестве бактериостатических средств могут быть использованы коллоидные растворы наночастиц серебра (2-30 нм), или коллоидные растворы йода (0,1 мл/л), или препарат Превикур или другие средства в концентрациях, рекомендованных производителями.
При подготовке посадочного материала in vitro семена проращивают в стерильных условиях на питательной среде, например, на среде Кворина-Лепуавра, пересаживая проростки каждые две недели на свежую среду. Через 30-35 суток крупные экземпляры с развитой корневой системой высаживают в аэропонный фитотрон, мелкие растения оставляют для доращивания. Подготовку посадочного материала из каллусной культуры осуществляют согласно [Uteulin K., Mukhambetzhanov S., Rakhimbaev I. "Recovering Taraxacum kok-saghyz Rodin, via seed and callus culture" International Journal of Bioengineering and Life Sciences (2014) T. 8, №. 4, C. 385-387]. После подтверждения микробиологическим анализом отсутствия в тканях растений скрытых фитопатогенов в латентном состоянии отмытые от агара проростки обрабатывают в течение 30-120 сек ультразвуком с частотой 22-48 кГц при мощности УЗ излучения 300 Вт в растворе, содержащем кроме фунгицидов антибактериальных веществ, культуральную жидкость дрожжей Nadsoniella nigra в объемной концентрации 0,1-0,5 мл/л, оборачивают растения гигроскопичным материалом, пропитанным раствором смеси фунгицида и бактериостатического средства, и закрепляют в держателях посадочных лунок аэропонного фитотрона.
Для предотвращения возможного развития патогенной микрофлоры внутренние поверхности фитотрона покрывают антибактериальным составом, например, янтарным лаком, предотвращающим образование бактериальных биопленок; рециркулирующие газовоздушные смеси обеззараживают УФ облучением и пропусканием через рециркулятор - устройство фотокаталитического окисления и очистки воздуха; питательные растворы также обеззараживают УФ облучением и дополнительно подвергают гидроакустической обработке, при необходимости в питательные растворы добавляют фунгициды и/или антибиотики, регулярно тестируют на отсутствие фитопатогенов; обрабатывают антисептиками вегетирующие растения, особенно после частичной срезки корней.
В качестве антистрессового стимулятора используют содержащий меланиноподобные вещества раствор культуральной жидкости дрожжей Nadsoniella nigra, полученный согласно [RU 2675932 С1, опубл. 25.12.2018]. Нами показано, что применение этого препарата в оптимальной концентрации, которую подбирают эмпирически в зависимости от стадии выращивания - от предпосевной обработки семян до антистрессовой обработки растений после частичной срезки корней - способствует получению здоровых жизнеспособных растений кок-сагыза, способных к быстрому восстановлению корнеобразования и биосинтеза целевых продуктов после частичной срезки корней.
Процесс аэропонного выращивания растений кок-сагыза можно условно разделить на три этапа. Первый этап - начальная фаза роста, продолжается 30-35 суток. Если посадочный материал получают in vitro, начальная фаза роста проходит вне фитотрона на питательных средах как описано выше. Если растения выращивают прямым посевом семян в лунки фитотрона, первый этап отсчитывают от начала появления массовых всходов. С началом первого этапа блок управления включает в верхней вегетационной камере освещение, а в нижней камере - систему орошения корневой системы мелкодисперсным аэрозолем питательного раствора, в качестве которого используют одну из известных питательных сред (например, среду Кнопа, среду Чеснокова - Базыриной и др.), поддерживая рН в пределах 6,5±1,0 электропроводность Ec 1,2-1,4 мСм/см. В промежутках между орошениями проводят аэрацию корней обеззараженным воздухом. В нижней корневой камере поддерживают температуру 18±2°С, влажность 80±20%, в верхней вегетационной камере поддерживают температуру 22±2°С, влажность 65±5%. В первые семь суток устанавливают фотопериод длительностью 10 часов, затем ежедневно автоматически увеличивая его на 1 час, доводят до 16 часов.
На Фиг. 1 показаны фотографии растений кок-сагыза в возрасте 30-35 суток: А - растения перед посадкой в фитотрон, выращенные из каллусных тканей и размноженные микроклонально in vitro; В - растения перед посадкой в фитотрон, выращенные in vitro из семян, полученных от коллекционных образцов растений кок-сагыза Федерального исследовательского центра Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова (ВИР); С - растения, выращенные из семян непосредственно в фитотроне.
Второй этап - фаза активного роста продолжается 90-100 дней. Этап характеризуется активным ростом зеленой массы и активизацией биосинтеза каучука и инулина в стержневых корнях и корневых волосках. На Фиг. 2 показаны фотографии растений кок-сагыза, выращенных из посадочного материала, полученного описанными выше способами, через 30 суток после начала фазы активного роста. А - посадочный материал был выращен из каллусных тканей и размножен микроклонально in vitro; В -посадочный материал был выращен из семян in vitro; С - растения, выращенные из семян, пророщенных непосредственно в фитотроне. Длина корней к этому времени составляет 25-30 см, сырая масса корней 25-40 г.Для активации роста растений корневое питание дополняют периодическими листовыми подкормками при отключенном освещении. В состав питательного раствора включают культуральную жидкость дрожжей Nadsoniella nigra в концентрации 0,1-0,5 мл/л. Листовые подкормки не только ускоряют ростовые процессы, но и способствуют оттоку из листьев в корневую зону ассимилятов - предшественников, участвующих в биосинтезе каучука и инулина. Для профилактики бактериальных инфекций в питательный раствор могут быть добавлены фунгициды и антибиотики. Опрыскивание питательным раствором чередуют с интенсивной циркуляцией обеззараженного воздуха для поддержания заданных параметров влажности и газообмена. Содержание углекислого газа в верхней камере поддерживают автоматически на уровне 800±120 ppm. Ночью, когда фотосинтез не происходит, обе камеры активно вентилируют обеззараженным воздухом для удаления избытка углекислого газа. В этот период идет отток ассимилятов из надземной части растений в корневую систему.
2
2
Для ускорения ростовых процессов и управления метаболизмом растений важную роль на этапе активного роста играет оптимизация параметров освещения - длительности фотопериода, спектрального состава и интенсивности светового потока. Оптимизация параметров освещения, основанная на учете особенностей физиологии растений кок-сагыза, позволяет интенсифицировать фотосинтетические процессы и биосинтез ассимилятов, ускорять их отток в корневую зону, где в активно растущих корнях происходит биосинтез каучука и инулина из поступающих предшественников. В основе выбора оптимальных режимов освещения вегетирующих растений лежит проведенное авторами исследование влияния света различного спектрального состава на физиолого-биохимические процессы в растениях кок-сагыза, выращиваемых в условиях аэропонного фитотрона [Мартиросян, Л.Ю и др. «Влияние спектрального состава света на морфофизиологические параметры и активность фотосинтетического аппарата растений кок сагыза» Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования 2018, №13, С. 297-300]. Показано, что облучение растений кок-сагыза светом с преобладанием синей части спектра приводит к повышению скорости фотосинтеза, активности фотосинтетической системы 2 (ФС2) и почти вдвое ускоряет накопление каучука в корнях растений кок-сагыза. Синий свет также способствует ускорению биосинтеза инулина. Облучение растений светом с преобладанием красной части спектра стимулирует накопление биомассы и снижает активность фотосинтетического аппарата. Также установлено, что для активации ростовых процессов растений кок-сагыза в условиях аэропонного выращивания общая интенсивность света в дневные часы (примерно с 14 до 20 часов) должна превышать интенсивность света в утренние (примерно с 8 до 14) и вечерние (примерно с 20 до 24) часы, при этом на рост растений положительно влияет некоторое увеличение интенсивности УФ излучения в области 340-400 нм в дневные часы. С учетом найденных закономерностей на этапе активного роста устанавливают следующий режим освещения: продолжительность фотопериода составляет 16 часов, при этом в утренние часы с 8 до 14 часов и вечерние - с 20 до 24 часов задаваемая программой общая интенсивность света на уровне посадочной платформы составляет от 170 до 400 микромоль фотонов/м⋅с, а интенсивность излучения с длиной волны 630-680 нм (красный свет) на 30-45% превышает интенсивность излучения с длиной волны 440-480 нм (синий свет). В дневном промежутке с 14 до 20 часов общая интенсивность света составляет от 400 до 1200 микромоль фотонов/м⋅с, а интенсивность излучения с длиной волны 440-480 нм на 30-45% превышает интенсивность излучения с длиной волны 630-680 нм, при этом интенсивность УФ излучения с длиной волны 340-400 нм в дневном промежутке на 2,0-2,5% превышает интенсивность излучения этого диапазона в утренние и вечерние часы. Параметры освещения регулируют автоматически изменением интенсивности излучения светодиодов с соответствующим диапазоном длин волн.
На Фиг. 3 показаны фотографии вегетирующих растений кок-сагыза при освещении светом, обогащенным синей (440-480 нм) или красной (630-680 нм) частью спектра, и соответствующие им кривые Мак-Кри, характеризующие эффективность фотосинтеза в зависимости от длины волны светового излучения в условиях преобладания в излучении синей или красной части спектра (Фиг. 3А и 3Б, соответственно).
Как известно, в естественных популяциях и при выращивании плантационным способом растения кок-сагыза зацветают и дают семена только на второй год. Регулируя спектральный состав и продолжительность фотопериода, в аэропоном фитотроне возможно за несколько месяцев осуществить полный цикл вегетации кок-сагыза, вплоть до получения здоровых, свободных от фитопатогенов семян для дальнейшего использования в качестве посевного материала. Цветению кок-сагыза в условиях аэропонного фитотрона способствует увеличение продолжительности фотопериода и обогащение спектра в вечерние часы синим светом и излучением дальнего красного участка спектра (около 730 нм) в сравнении с остальными временными промежутками фотопериода. В качестве иллюстрации на Фиг. 4 показана фотография обильно цветущих, выращиваемых в фитотроне растений кок-сагыза, в возрасте 90 суток. Поскольку кок-сагыз является самонесовместимым растением растением [Кутузова С.Н., Брач Н.Б., Конькова Н.Г., Гаврилова В.А. (2015). «Кок-сагыз-Taraxacum kok-saghyz (Asteraceae, Compositae) - источник ценного растительного сырья для резиновой, пищевой и фармацевтической промышленности» Биосфера, 7(4) с. 392-402], для образования семян требуется перекрестное искусственное опыление.
Таким образом, оптимизация световых режимов является важным фактором воздействия на процессы биосинтеза и роста растений кок-сагыз в условиях аэропонного фитотрона.
К концу второго этапа растения, находящиеся в активной фазе роста, имеют большую листовую поверхность, не подвержены заболеваниям и значительно опережают в развитии растения, выращиваемые в природных условиях (см. фотографии на Фиг. 5). Об эффективности роста растений на этом этапе свидетельствуют данные, приведенные на Фиг. 6, показывающие, что растения, выращиваемые заявляемым способом, значительно быстрее накапливают корневую биомассу в сравнении с аналогичными образцами растений, выращиваемых в открытом грунте.
Третий этап выращивания растений кок-сагыза в аэропонном фитотроне связан с началом периодической частичной срезки корней. К этому времени длина корней может превышать 500 мм, масса растения может достигать 500 и более грамм, а масса сырого корня достигает 250-400 г.при влажности около 90%. Фотографии растений в начале третьего этапа показаны на Фиг. 7. Характеристики выращенных в фитотроне растений, перед первой срезкой корней в сопоставлении с аналогичными данными для растений, выращенных в грунте, приведены в Табл. 1.
Эти данные показывают, что растения, выращенные описанным способом, значительно превосходят по морфометрическим показателям растения, выращенные плантационным способом, и демонстрируют более высокое содержание каучука в сравнении с образцами, выращенными в открытом грунте.
Срезка корней - ответственная процедура, от тщательного выполнения которой зависит дальнейшая жизнеспособность растений и их способность к повторному наращиванию корневой биомассы, и, как следствие - к повышению суммарной производительности растений по целевым продуктам. Корни срезают на расстоянии около 100 мм от корневой шейки. В зависимости от размера растения, масса сырого корня, полученная от одного растения после первой срезки, может превышать 250 г. На этапе срезки корней важно не допустить инфицирования растений и создать условия для быстрого снятия вызванного срезкой корней стресса растений и восстановления процессов биосинтеза целевых продуктов. С этой целью сразу после срезки оставшиеся корни орошают раствором антисептика, например, перекисью водорода 0,01-1,0%, или надуксусной кислотой 0,05-0,15%, или перманганатом калия 0,01-0,2%, или раствором антибиотика, затем в течение суток - раствором, содержащим смесь стимулятора корнеобразования (например, индолилуксусная кислота и др.), и антистрессового фитостимулятора - культуральной жидкости дрожжей Nadsoniella nigra в объемной концентрации 0,05-0,2 мл/литр. После этого в раствор для орошения корней добавляют минеральное питание (рН питательного раствора 5,6-5,8, электропроводность Ec 1,8-2,1) при регулярном контроле отсутствия фитопатогенов в питательном растворе. Орошение корней чередуют с аэрацией обеззараженным воздухом. Для снятия стресса и интенсификации листового питания при отключенном освещении побеги также обрабатывают обеззараженными растворами, содержащими элементы минерального питания и культуральную жидкость дрожжей Nadsoniella nigra в объемной концентрации 0,5-2,0 мл/л. Процесс реабилитации растений и восстановление корнеобразования занимает 5-7 суток. После этого растения переводят на режим вегетации с параметрами, соответствующими предшествующему (до срезки корней) этапу роста.
Тщательное выполнение всех процедур обеспечивает быстрое снятие стресса, восстановление корневой биомассы и способности растений к биосинтезу каучука и инулина. Через 30-35 суток растения готовы к повторной частичной срезке корней, которую, как и все последующие, выполняют аналогично первой. На Фиг. 8 показаны растения через 35 суток после первой срезки корней, готовые к повторной срезке. В Табл. 2 приведены характеристики образцов растений кок-сагыза, подвергнутых 3-кратной частичной срезке корней с интервалом 35 суток.
Таблица 2. Характеристики образцов растений кок-сагыза, подвергнутых 3-кратной срезке корней с интервалом 35 суток.
Следует отметить, что за столь короткий срок растения не успевают восстановить прежний объем корневой биомассы и уровень биосинтеза целевых продуктов, однако это компенсируется возможностью проводить до 7-8 срезок корней в течение года.
На Фиг.9 приведены результаты определения методом гельпроникающей хроматографии молекулярно-весового распределения каучука, выделенного из кок-сагыза, выращенного в аэропонном фитотроне, и каучука, полученного традиционным способом из гевеи бразильской, По результатам видно, что каучук, полученный из корней кок-сагыза, практически идентичен каучуку, полученному из традиционного источника - гевеи бразильской Hevea brasiliensis.
2
Предлагаемый способ обеспечивает более высокую эффективность процесса выращивания кок-сагыза и получения урожая каучуксодержащих корней в сравнении с плантационными технологиями. Ориентировочные расчеты показывают, что применение предлагаемого способа позволит в течение года получить от одного растения от 0,8 до 1,2 кг сырых корней кок-сагыза. Учитывая, что плотность посадки в фитотроне составляет 96 растений/м, с одного квадратного метра посадочной площади можно получить от 70 до 90 кг сырых корней в год. Для сравнения: в работе [Kairat, U., Gabit, В., & Asian, Ζ. (2020). "Dandelion kok-saghyz (Taraxacum kok-saghyz L. Rodin) as a one-year culture developed under conditions of southeast Kazakhstan" Научный журнал «Вестник HAH РК», (3), 36-42] описан сорт кок-сагыза «Сарыжаз», который в условиях незащищенного грунта при выращивании в качестве однолетней культуры дает урожай 1,6-1,8 кг сырых корней с квадратного метра при плотности посадки 10 растений/м. По ориентировочным оценкам, предлагаемый способ позволит получить за год с одного квадратного метра посадочной площади фитотрона от 1 до 1,5 кг каучука и от 2,5 до 3 кг инулина, что в пересчете на гектар при промышленном масштабировании составляет около 10-15 тонн каучука и 25-30 тонн инулина в/год. Для сравнения: в работе [K. Cornish, Τ Madden "Hydroponic cultivation has high yield potential for TKS" Rubber & Plastics News, October 7, 2019] сообщается, что при выращивании кок-сагыза в полевых условиях количество получаемого каучука составляет 0,1 т/га/год.
Приложение. Экспериментальные методики, использованные в работе.
Тестирование посадочного материала на отсутствие внешней патогенной микрофлоры и скрытой инфекции.
Стерильно отобранные пробы посадочного материала (семена или растения) тестируют на наличие ДНК возбудителей сосудистого бактериоза род Pseudomonas ПЦР-тестом с использованием набора для выделения ДНК («ЗАО СИНТОЛ», Россия).
Семена, прошедшие предпосевную обработку, тестируют на стерильность: несколько семян стерильными инструментами в ламинарном боксе разрезают пополам, помещают в чашки Петри на агаризованную питательную среду МС и инкубируют в термостате при 28°С в течение 5-7 суток, после чего проверяют визуально наличие роста микроорганизмов.
Определение содержания каучука и инулина в корневой биомассе.
Содержание каучука и инулина в корнях кок-сагыза определяют в трех повторностях по метоикам, описанным в работе [Ramirez-Cadavid, D. Α., Valles-Ramirez, S., Cornish, K., & Michel Jr, F. C. (2018). Simultaneous quantification of rubber, inulin, and resins in Taraxacum kok-saghyz (TK) roots by sequential solvent extraction. Industrial Crops and Products, 122, 647-656].
Для определения каучука свежесобранные корни промывают водой, высушивают, измельчают на шаровой мельнице до размера частиц 25-150 микрон, после чего 2-3 г порошка корня экстрагируют хлороформом (40-45 мл) в аппарате Сокслета, полученный раствор концентрируют упариванием при 75°С до остаточного объема 1-3 мл. Каучук осаждают двойным объемом этанола при 4°С в течение 15-16 часов, центрифугируют при 14500 об/мин в течение 10 мин. Сопутствующие вещества отделяют, последовательно промывая осадок дистиллированной водой и ацетонитрилом (Sigma) с последующей 3-х кратной промывкой осадка этиловым спиртом. Осадок каучука просушивают в токе аргона, взвешивают.
Для определения инулина свежесобранные корни промывают водой, высушивают при температуре 65°С, измельчают, просеивают на сите 1x1 мм, после чего экстрагируют водой при нагревании на водяной бане при температуре 85-90°С в течение 60 мин.
Суспензию центрифугируют при 14500 об/мин в течение 5 мин. или фильтруют через мембрану из стекловолокна, размер пор 1 мкм.