Способ получения микроклубней картофеля
POTATO MICROTUBERS PRODUCTION METHOD

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к получению микроклубней от  культивируемых in vitro растений картофеля.
Микроклубни картофеля, получаемые в  изолированной культуре, являются удобным объектом, используемым для разных целей: 1) длительное сохранение безвирусных растений, культивируемых in vitro, которое не требует значительных затрат труда и материальных ресурсов, 2) обмен сортами, видами и трансгенными линиями картофеля между различными научно-исследовательскими учреждениями внутри страны и за рубежом, 3) в качестве посадочного материала для получения рассады и выращивания картофеля в полевых условиях. Получение микроклубней в настоящее время не представляет особых трудностей  (D. J. Donnelly, W. K. Coleman and S. E. Coleman. Potato microtuber production and performance: A review. American Journal of Potato Research, 2003, Volume 80, Number 2, Pages 103-115). Однако трудовые и материальные затраты на получение микроклубней ограничивают их практическое применение. Эффективность производства микроклубней слишком низка, чтобы заменить натуральный семенной картофель.
Целью данного изобретения является предложить способ, позволяющий уменьшить затраты на производство микроклубней.
Известен способ получения микроклубней картофеля in vitro, (патент KZ 24419 кл. А01Н 3/00, А01Н 4/00 опубл. 15.08.2011), состоящий в высадке одноузловых черенков пробирочных растений картофеля на предназначенную для получения микроклубней  питательную среду и их дальнейшее культивирование. Этот способ не обеспечивает уменьшение затрат на производство микроклубней, так как не устраняет необходимость работы по приготовлению и использованию новой питательной среды и работы по высадке на нее микрочеренков.
4
3
Известен «Способ получения микроклубней картофеля in vitro» (, Патент РФ № RU 2671102, МПК А01Н 4/00, опубл. 29.10.2018), включающий черенкование пробирочных растений и высадку на агаризованную питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды Мурасиге и Скуга, Fe-хелат, агар-агар, сахарозу, отличающийся тем, что по достижении растением высоты 5-6 см в культуральный сосуд в асептических условиях ламинарного бокса доливается охлажденная до 30°C агаризованная питательная среда, содержащая макро- и микроэлементы и витамины на основе прописи питательной среды Мурасиге и Скуга, Fe-хелат, агар-агар, сахарозу с уменьшенной до 220 мг/л концентрацией NHNO и увеличенной до 80 г/л концентрацией сахарозы без каких-либо фитогормонов с последующим переносом растений в условия полной темноты при температуре 21-25°С на 45-60 дней. Недостатком способа является сложность создания условий получения микроклубней in vitro, для чего необходимо черенкование пробирочных растений, высадка одноузловых черенков на агаризованную питательную среду, долив среды после нескольких дней культивирования. Все это не приводит к уменьшению затрат на получения микроклубней и не создает возможности использования остатков пробирочных растений после удаления из пробирок одноузловых черенков.
Известен «Способ массового получения микроклубней картофеля» (патент РФ 2075289, МПК А01Н, конвенционный приоритет11.03.1989 KR 89/3009). Микроклубни получают в чашках Петри диаметром 10 см и глубиной 1,5 см, герметизированных пленкой «Парафильм» (Sigma-Aldrich). Способ не уменьшает затраты на производство микроклубней.
Имеется автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Смолеговец Дмитрия Васильевича «Особенности выращивания in vitro микроклубней и их использование в оригинальном семеноводстве картофеля», Москва. 2003 г. Выращивание осуществлялось путем высадки микрочеренков пробирочного картофеля в пробирки со специальной средой и дальнейшего их культивирования. Недостатком использованного метода является необходимость специального выращивания на специальной среде, что увеличивает затраты труда и материальных ресурсов.
За прототип принят патент «Способ микроклонального размножения картофеля» (патент РФ № 2329639 МПК A01/H4, опубликован 27.10.2007), в котором исходные пробирочные растения, имеющие 12-15 листьев, извлекают из пробирок и черенкуют на чашке Петри. Микрочеренкование исходных растений проводят на апикальную, среднюю и базальную части. Микрочеренки апикальной и средней частей  используют для высадки в пробирки со свежей средой и повторного выращивания пробирочных растений,  а микрочеренки базальной части культивируют на питательной среде для получения микроклубней картофеля.
Общими признаками с прототипом является использование базальной части пробирочных растений для получения микроклубней.
Недостатком способа является то, что для микрочеренкования исходных растений их приходится извлекать из пробирок, что делает невозможным дальнейшее использование исходных пробирок с  остатками питательной среды и базальной части исходных растений для получения микроклубней. Вместо того, чтобы оставить базальную часто растений в исходных пробирках и продолжить их культивирование в условиях, благоприятных для образования микроклубней, авторы разрезают ее на черенки и высаживают их на новую питательную среду. Масса получаемых при этом микроклубней составляет от 80 до 100 мг. Способ не дает возможности уменьшить трудовые и материальные затраты на получение микроклубней.
Целью предлагаемого способа является упрощение процедуры получения микроклубней и уменьшение материальных и трудовых затрат для этого. Обычно культивируемый in vitro в пробирках картофель используют для дальнейшего размножения путем нарезания микрочеренков от вытащенных из пробирок растений и их высадки в новые пробирки со свежей питательной средой.  Такую процедуру повторяют через каждые 25-30 дней. При этом остающаяся часть растения и оставшаяся в пробирке питательная среда не пригодны для дальнейшего использования, и ее  обычно выбрасывают. Между тем эти остатки можно было бы использовать, так как в среде еще остается некоторый запас питательных веществ и воды.
Для того, чтобы остаток от нарезания микрочеренков можно было бы использовать, предложено применить хирургические ножницы длиной 23 см с изогнутыми на концах режущими лезвиями (ТМ-Н-8, Каталог Медтехники). Эти ножницы вводятся в пробирки размером 20х200мм  с выращенными в них растениями и используются для нарезания микрочеренков. В результате нижняя часть пробирки с содержащимися в ней остатками питательной среды и нижней частью растения с корневой системой остаются не нарушенными, и эту пробирку можно использовать для получения микроклубней. Для этого достаточно просто перенести их в условия, способствующие образованию микроклубней.
В предполагаемом изобретении пробирки с этими эти остатками помещают в термостат «Биндер» производства Германии с температурой 15º C и продолжительностью освещения 10 часов в сутки и культивируют два месяца. При этом не требуется нарезать микрочеренки, высаживать их на питательную среду с высокой концентрацией сахарозы. Не требуется также размножать пробирочные растения, которые будут источником микрочеренков для получения микроклубней. Все это способно значительно уменьшить трудовые и материальные затраты на получение микроклубней.
Суть предлагаемого способа состоит в том, что после удаления микрочеренков из пробирок с выращенными растениями с помощью хирургический ножниц для следующего цикла размножения пробирки с остатками растений и среды продолжают культивировать в условиях, способствующих образованию микроклубней (уменьшение продолжительности светового периода и понижение температуры). При этом не требуется готовить новую питательную среду для индукции клубнеобразования, разливать ее в новые пробирки и высаживать в них  новые микрочеренки.
Техническим результатом является создание способа получения микроклубней картофеля со значительным уменьшением затрат труда и материальных ресурсов.
Технический результат достигается тем, что способ получения микроклубней картофеля, включающий нарезание микрочеренков из базальной части вытащенных из пробирок растений картофеля, размножаемого in vitro, и выращивание их на питательной среде с содержанием сахарозы 80 г/л в темноте при температуре 8-10º C с последующим получением микроклубней картофеля in vitro,согласно изобретению, нарезание микрочеренков из апикальной и средней части растений производится непосредственно в пробирке с использованием хирургических ножниц с изогнутыми лезвиями длиной 23 см, а для получения микроклубней используют исходные пробирки с оставшейся в них базальной частью исходных растений и питательной средой после удаления микрочеренков из апикальной и средней части растений.
Сопоставительный анализ показывает, что заявляемый способ отличается от прототипа, т.е. соответствует требованиям, предъявляемым к изобретению по критерию «новизна».
Проведенный дополнительный сопоставительный анализ патентной и научно-технической информации не выявил источники, содержащие сведения об известности совокупности отличительных признаков заявляемого способа, что свидетельствует о его соответствии критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ поясняется фотографиями и таблицей:
Фиг. 1. Получение микроклубней в соответствии с предлагаемым способом. Пробирки (диаметр 2 см, длина 20 см) с растениями картофеля, от которых 2 месяца назад были срезаны микрочеренки для клонального микроразмножения, а сами пробирки перенесены в камеру с 15° C и продолжительностью освещения 10 часов в сутки для культивирования. Видно, что в пробирках с растениями, которые уже были использованы для получения микрочеренков, образуются микроклубни со средней массой 238 ± 95 мг. Чем крупнее микроклубни, тем они более пригодны для получения вегетирующих в теплице или в поле растений.
Фиг. 2.  Получение микроклубней в соответствии со способом  аналога. Банки для детского питания (200 мл) с 30 мл питательной среды для образования микроклубней, в которые было высажено по 5-6 микрочеренков, которые 3 месяца назад были перенесены в камеру с 15° C и продолжительностью освещения 10 часов в сутки. Видно, что через 2 месяца культивирования образовались микроклубни со средним весом 137 ± 73.
Таблица. Характеристики микроклубней, полученных путем приготовления питательной среды, внесения ее в банки для детского питания  (200 мл) по 30 мл, их стерилизации в автоклаве, высадке в них микрочеренков и их культивирования при 15° C и продолжительностью освещения 10 часов в сутки в течение 2-х месяцев. (Это аналогично способу получения микроклубней по патенту РФ №2329639, МПК А01Н 4/00).
Таблица
Сорт
Числочеренковв банке
Числомикро-клубней
Вес микро-клубнеймин – макс.
Средний вес, мг± станд. откл.V%**
Тулунский ранний
6
9
25 – 290
137 ± 94*  69
Тулунский ранний
5
9
37 – 179
119 ± 58   49
Жуковский ранний
6
7
55 – 262
135 ± 67   50
Жуковский ранний
6
9
33 – 223
163 ± 74   45
Всего
23
34
25 – 290
138 ± 73   53
* стандартное отклонение,  ** коэффициент варьирования
Пример 1. В пробирки диаметром 20 мм и длиной 200 мм было внесено по 10 мл питательной среды для размножения пробирочных, содержащей минеральные макросоли Мурашиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962) ¾ полной прописи, микроэлементы и Fe-хелат полную норму, другие компоненты (мг/л): сахароза 20000, тиамин-HCl 1.0, пиридоксин-HCl 0.5, никотиновая кислота 0.5, натрий фосфат однозамещенный 50, мезо-инозит 50, ИУК 0.1,  агар 6000, рН 5,8. В них были высажены микрочеренки безвирусного картофеля разных сортов. Культивирование проводилось в камере «Биндер» (Германия) при 23º C с освещением люминесцентными лампами 16 ч в сутки. Через 28 дней растения достигли высоты 13-15 см. Апекс и 2-3 нижележащих микрочеренка длиной 2-3 см использовались для пересадки в пробирки с такой же средой для продолжения размножения. Пробирки с оставшейся частью стебля и корневой системой в агаровой среде были перенесены в другую камеру с температурой 15º C и продолжительностью освещения 10 ч в сутки. После двух месяцев культивирования был проведен сбор микроклубней и их взвешивание (Фиг. 1). 80% пробирок оказались с микроклубнями. Среднее число микроклубней на 1 пробирку было равно 1,3. Средний вес одного микроклубня составил 238 ± 95* мг (*стандартное отклонение), коэффициент варьирования  V% = 40%. Минимальный вес одного микроклубня составил 86 мг, а максимальный вес был равен 479 мг. Для их получения не потребовалось 1) готовить специальную среду с высоким содержанием сахарозы, 2) разливать ее в пробирки или банки, 3) стерилизовать их в автоклаве, 4) нарезать микрочеренки из пробирок, специально выращенных для этих целей, 5) осуществить высадку этих микрочеренков в сосуды с приготовленной средой. Все это обусловило уменьшение затрат труда и материальных ресурсов.
Пример 2. Для сравнения был проведен опыт по получению микроклубней  по способу, сходному с описанном в патенте аналога. Согласно нему, от выросших в пробирках растений отрезали микрочеренки из апикальной и средней части пробирочных растений картофеля и использовали их для клонального микроразмножения. От оставшейся базальной части нарезали микрочеренки сортов Жуковский ранний и Тулунский ранний и использовали их для получения микроклубней. Они были высажены в банки для детского питания  (200 мл) с 30 мл питательной среды, содержащей  ½ макросолей среды МС (Murashige, Skoog, 1962), микроэлементы и Fe-хелат полная норма, сахароза 60000, витамины, кинетин 0.1, диэтилдитиокарбамат натрия 5, агар 6000 мг/л, рН 5,8. Банки были  поставлены в Биндер с температурой 15º и освещением 10 ч в сутки. Сбор микроклубней проведен через 2 месяца. Внешний вид полученных микроклубней представлен на фиг. 2 и в таблице. Данные, представленные в таблице, показывают, что средний вес полученных микроклубней оказался значительно меньше, чем в предлагаемом способе, несмотря на то, что была использована свежая среда с 6% сахарозы. Было получено некоторое количество очень мелких клубней (25-50 мг), которые не пригодны для получения рассады.