СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ ПУТЕМ ВОСПРОИЗВЕДЕНИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ
METHOD OF MODELLING ENDOTHELIAL DYSFUNCTION BY REPRODUCTION OF METABOLIC DISORDERS

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной кардиофармакологии.
Наиболее близким к заявленному решению является способ моделирования эндо-телиальной дисфункции у овариэктомизированных крыс с фруктозиндуцированной инсулинорезистентностью, описанный Zhou S.H., Ling H.Y., Tian S.W., Liu X.Q., Wang B.X и Ни В. в работе «17β-estradiol protects against injury of aortic relaxation and contraction in ovariectomized rats with insulin resistance induced by fructose», Acta Physiologica Sinica, 628, October 25, 2005, 57(5): 627-635, который заключается в использовании диеты с высоким содержанием фруктозы (60% от пищевого рациона) у крыс самок линии Sprague-Dawley в течение 8 недель при моделировании билатеральной овариэктомии. Вазомоторные эффекты системных сосудов крыс изучали путем исследования контрактильной активности колец грудного отдела аорты, индуцируемой фенилэфрином, и релаксационной активности в ответ на ацетилхолин (ЭЗВД) и нитропруссид натрия (ЭНВД).
Основным недостатком способа является отсутствие оценки функционального состояния сосудистого русла в условиях целостного организма при воспроизведении комплекса метаболических нарушений в эксперименте.
Задачей изобретения является способ моделирования эндотелиальной дисфункции путем воспроизведения метаболических нарушений, включающих формирование стрес-смодифицирующего компонента.
Поставленная задача достигается тем, что на фоне моделирования гипоэстрогенного состояния в эксперименте путем билатеральной овариэктомии лабораторному животному в течение 6 недель добавляли в корм фруктозу, удельный вес которой составлял 60% от общего пищевого рациона, а также дополнительно проводилось ежедневное однократное раздражение электрическим током (длительностью 10 мс, напряжением 30 В, силой 0,66 мА) при наложении клемм на хвост животного.
Изобретение поясняется чертежом, который отражает динамику уровня глюкозы плазмы крови крыс в пероральном тесте толерантности глюкозы на 6-й неделе эксперимента. На чертеже изображено:
- Δ - группа животных с билатеральной овариэктомией, получавших фруктозсодержащую диету с нанесением болевого раздражения;
-  - группа животных с билатеральной овариэктомией, получавших обычный рацион;
- ◊ - интактная группа.
СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЛЕДУЮЩИМ ОБРАЗОМ.
Опыты проводят на белых самках линии Wistar массой 250-300 г. В первый день эксперимента у самок под наркозом (хлоралгидрат 300 мг/кг) хирургическим путем вскрывают брюшную полость и удаляют оба яичника. В дальнейшем на протяжении 6 недель в корм животных добавляют фруктозу, удельный вес которой равен 60% от общего рациона пищи. В течение всего срока кормления ежедневно однократно вызывают болевое раздражение хвоста животных электрическим током (длительностью 10 мс, напряжением 30 В, силой 0,66 мА), пропускаемым через электроды, наложенные на смоченный физиологическим раствором хвост животного. Положительный электрод прикреплен на расстоянии 1 см от корня хвоста, отрицательный - в полутора сантиметрах книзу от него. Еженедельно, однократно, в утреннее время, натощак, в течение всего срока эксперимента измеряли уровень глюкозы в крови, взятой из вены хвоста животных, при помощи глюкометра Satellit Plus (Россия). На 6-й неделе эксперимента проводился тест толерантности к глюкозе, натощак, путем орального введения глюкозы (1 мг/кг) и регистрации уровня глюкозы на протяжении 120 минут при помощи глюкометра Satellit Plus (Россия). В течение кормления еженедельно измеряли показатели артериального давления с использованием неинвазивного датчика измерения кровяного давления у мелких животных на хвосте Doc-NIBP200A, производства Biopac System, Inc., США. На 42-й день от начала эксперимента под наркозом (этаминал-натрия 50 мг/кг) вводят катетер в правую сонную артерию для регистрации показателей артериального давления (АД), болюсное введение фармакологических агентов осуществляют в левую бедренную вену. Показатели гемодинамики: систолическое артериальное давление (САД), диастолическое артериальное давление (ДАД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС) измеряют непрерывно посредством датчика TSD104A аппаратно-программного комплекса МР100, производства Biopac System, Inc., США. Проводятся следующие функциональные сосудистые пробы - эндотелийзависимая вазодилатация (ЭЗВ) с внутривенным введением ацетилхолина (АХ) в дозе 40 мкг/кг; эндотелийнезависимая вазодилатация (ЭНЗВ) с внутривенным введением нитропруссида натрия (НП) в дозе 30 мкг/кг.
При статистической обработке данных рассчитываются среднее значение и величина стандартного отклонения. Различия считали достоверными при p<0,05.
ПРИМЕР КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ.
Экспериментальные исследования проводили на следующих группах животных: интактные (И) - животные, у которых проводилась ложная операция (вскрытие брюшной полости с последующим ушиванием); животные с билатеральной овариэктомией (БО), получавшие обычный пищевой рацион; животные с билатеральной овариэктомией, которым давалась фруктозсодержащая диета и наносилось болевое раздражение электрическим током (БОФБ). Измерение уровня глюкозы натощак на протяжении 6 недель не выявило изменения значений во всех исследуемых группах животных относительно нормальных показателей. В то время как при проведении теста толерантности к глюкозе наблюдалось незначительное снижение уровня гликемии к 120 минуте в группе БОФБ относительно групп И и БО, этот показатель был достоверно выше и составил 6,9±0,4 ммоль/л (см. чертеж). В группе И и БО таковые значения глюкозы крови приближались к исходным на 120 минуте и составляли 4,8±0,2 и 4,6±1,2 ммоль/л соответственно (таблица 1).
Измерение уровня артериального давления неинвазивным способом выявило достоверное его повышение в группах БО и БОФБ по сравнению с интактными животными и, начиная с 4-й недели развития патологии, находилось на уровне 159,5±4,6 и 165,7±4,3 мм рт.ст. соответственно (таблица 2).
Таблица 2
Динамика уровня артериального давления, определяемого неинвазивным способом, при моделировании эндотелиальной дисфункции на фоне воспроизведения метаболических нарушений (n=10, M±m, мм рт.ст.)
Группы животных
1 нед
2 нед
3 нед
4 нед
5 нед
6 нед
Интактные (И)
136,7±3,4
136,6±3,4
136,9±3,6
136,8±3,5
136,9±3,6
137,1±3,6
Билатеральная овариэктомия (БО)
135,8±3,3
141,2±3,9
147,4±4,1*
153,9±4,4*
157,1±4,2*
159,5±4,6*
Билатеральная овариэктомия +Фруктозсодержащая диета +Болевое раздражение (БОФБ)
136,1±3,4
142,3±4,0
149,1±4,7*
155,2±4,1*
161,8±4,1*
165,7±4,3*
* - p<0,05 в сравнении с группой интактных
При проведении исследований на наркотизированных животных с инвазивным определением параметров гемодинамики получили следующие данные: болюсное внутривенное введение АХ в течение 3-5 сек приводило к резкому падению артериального давления, достигающего пика у ложнооперированных животных (для систолического артериального давления (САД) 84,3±4,4, для диастолического артериального давления (ДАД) - 38,7±2,8 и для среднего артериального давления (СрАД) 53,9±2,7 мм рт.ст.). При этом в течение первых 2-3 сек развивалась резкая брадикардия до 130-150 ударов в минуту. Восстановление АД происходило в среднем за 42,2±0,8 сек после нормализации сердечного ритма. ЭНЗВ также характеризовалась снижением САД до 83,0±3,7, ДАД до 42,1±4,4 и СрАД до 55,7±3,5 мм рт.ст. с последующим полным восстановлением в среднем в течение 45,1±1,0 сек.
У животных с билатеральной овариэктомией, получавших обычный рацион, через 6 недель отмечалось достоверное увеличение цифр АД: САД - 160,0±6,2, ДАД - 124,9±5,5, СрАД - 135,9±5,0 мм рт.ст. по сравнению с интактной группой животных. ЭЗВ и ЭНЗВ характеризовались достоверно меньшим снижением (таблица 3).
Ежедневное, в течение 6 недель, введение фруктозсодержащей диеты в рацион питания животных на фоне гипоэстрогении состояния и ежедневное однократное болевое раздражение электрическим током вызывали более значимую артериальную гипертензию (САД - 167,4±3,9, ДАД - 122,9±5,2, СрАД - 137,7±4,5 мм рт.ст.) и приводили к меньшему снижению показателей АД после введения АХ (САД до 87,4±3,2, ДАД до 53,4±3,8, СрАД до 64,8±2,8 мм рт.ст.) и НП (САД до 95,6±9,1, ДАД до 51,2±5,0 и СрАД до 66,0±5,2 мм рт.ст.) по сравнению с интактными животными и животными с билатеральной овариэктомией, получавшими обычный рацион (таблица 3). Восстановление АД при введении АХ и НП происходило в среднем за 38,3±4,3 сек и 102,4±11,9 сек после нормализации сердечного ритма соответственно (таблица 4).
Таблица 3
Динамика показателей АД и ЧСС при моделировании эндотелиальной дисфункции на фоне воспроизведения метаболических нарушений (n=10, M±m)
Группы животных
Функциональные пробы
САД, мм рт.ст.
ДАД, мм рт.ст.
ЧСС, уд. в мин
Интактные (И)
Исходные
137,7±3,7
101,9±4,3
420,0±9,0
ЭЗВ с АХ
84,3±4,5
38,7±2,8
416,0±14,0
ЭНЗВ с НП
83,0±3,7
42,1±4,4
415,0±10,0
Билатеральная овариэктомия (БО)
Исходные
160,0±6,2*
124,9±5,5*
385,0±13,0
ЭЗВ с АХ
91,8±8,0
57,3±7,1*
385,0±9,0
ЭНЗВ с НП
87,4±7,5*
57,8±6,6
397,0±8,0
Билатеральная овариэктомия +Фруктозсодержащая диета +Болевое раздражение (БОФБ)
Исходные
167,4±3,9**
122,9±5,2
364,7±15,2
ЭЗВ с АХ
87,4±3,2
53,4±3,8
328,2±23,4
ЭНЗВ с НП
95,6±9,1**
51,2±5,0
359,1±14,2
* - p<0,05 в сравнении с группой интактных** - p<0,05 в сравнении с группой животных, у которых проводилась билатеральная овариэктомия и получавших обычный пищевой рацион
Степень развития эндотелиальной дисфункции при воспроизведении метаболических нарушений в экспериментальных условиях оценивалась с использованием специального показателя - коэффициента эндотелиальной дисфункции (КЭД), являющегося отношением площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение НП к площади треугольника над трендом реакции восстановления АД в ответ на введение АХ.
Значения КЭД составили: 1,1±0,1 - в группе интактных животных, 2,1±0,2 - в группе животных с билатеральной овариэктомией, получавших обычный пищевой рацион, а в группе животных с билатеральной овариэктомией, которым давалась фруктозсодержащая диета и наносилось болевое раздражение электрическим током, - 3,3±0,3, что достоверно больше в сравнении с вышеуказанными группами (таблица 4).
Таким образом, полученные результаты позволяют констатировать развитие эндотелиальной дисфункции при воспроизведении метаболических нарушений у белых лабораторных крыс самок линии Wistar на фоне билатеральной овариэктомии, получавших фруктозсодержащую диету (60% от общего рациона пищи) при нанесении болевого раздражения электрическим током.