СПОСОБ ОЦЕНКИ ТЯЖЕСТИ ТЕЧЕНИЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ ЛИХОРАДКИ С ПОЧЕЧНЫМ СИНДРОМОМ
METHOD OF SEVERITY ASSESSMENT FOR HEMORRHAGIC FEVER WITH RENAL SYNDROME

Изобретение относится к области медицины, а именно к разделу инфекционных болезней, и может быть использовано для объективной оценки тяжести течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).
ГЛПС - острое вирусное природно-очаговое заболевание, вызываемое вирусами рода Hantaan, серотип Puumala. Особенностью патоморфологической картины заболевания является системное поражение мелких сосудов - артериол, капилляров и венул - с развитием воспалительных и деструктивно-некротических изменений во всех слоях сосудистой стенки. Характерным является отечно-деструктивный васкулит, который выражается в разрыхлении стенки мелких сосудов, отеке адвентиции, набухании и десквамации эндотелия, в последующем обусловливающий более или менее выраженные кровоизлияния в различные органы и ткани. Максимальная интенсивность указанных изменений наблюдается в тех органах, в которых имеется разветвленная система микроциркуляции, - в почках, надпочечниках, легких и гипофизе, а также в центральной нервной системе, с развитием синдрома диссеминированного свертывания крови (Фазлыева P.M. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в Республике Башкортостан / P.M.Фазлыева, Д.Х.Хунафина, Ф.Х.Камилов // Уфа, 1995; Сомова-Исачкова Л.М.Патоморфогенез геморрагической лихорадки с почечным синдромом: от прошлого к будущему / Л.М.Сомова-Исачкова, Н.Г.Плехова // Хантавирусы и хантавирусные инфекции: Материалы, посвященные к 70-летию изучения ГЛПС на Дальнем Востоке. - Владивосток, 2003. - С.182-200; Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом: актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики. Под ред. Р.Ш.Магазова. - Уфа: Гилем, 2006 - 238 с).
Известны следующие способы оценки тяжести течения ГЛПС, учитывающие динамику различных показателей:
1) способ оценки тяжести ГЛПС по степени выраженности основных клинических синдромов, наличия и продолжительности олигоанурии, уровня азотемии (креатинина и мочевины крови) и развития осложнений (заявка RU №96100318, 1998). Недостатком данного метода является то, что далеко не всегда в клинической картине ГЛПС присутствуют все синдромы заболевания, по которым может быть дана оценка тяжести. Как правило, при определении тяжести ГЛПС основным критерием является уровень азотемии, однако встречаются тяжелые формы заболевания, осложненные токсико-инфекционным шоком, геморрагическими проявлениями при неизмененных показателях креатинина и мочевины. В то же время, определение креатинина и мочевины в сыворотке крови (Долгов В. Клинико-диагностическое значение лабораторных показателей / В.Долгов, В.Морозова, Р.Марцишевская и др. // М., 1995) позволяет оценить лишь нарушения выделительной функции почек: клубочковую фильтрацию, а для ГЛПС, как известно, характерны различные отклонения в деятельности тубулоинтерстициального аппарата почек с длительным снижением канальцевых функций, особенно концентрационной способности (Сиротин Б.З. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом / Б.З.Сиротин // Хабаровск, 1994);
2) способ оценки тяжести состояния больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом, заключающийся в том, что определяют показатель железоиндуцированной хемилюминесценции мочи (патент RU №2104533, 1998). Тяжелую степень состояния больных определяют при светосумме свечения в олигоанурическом периоде 8,54±1,5 ед., в полиурическом периоде 5,44±0,9 ед., а в периоде восстановительного диуреза 13,8±1,0 ед., среднетяжелую степень состояния больных определяют при светосумме свечения в олигоанурическом периоде 11,9±1,37 ед., полиурическом периоде 9,42±1,14 ед., периоде восстановительного диуреза 15,16±1,4 ед., легкую степень состояния больных определяют при светосумме свечения в олигоанурическом периоде 21,8±3,8 ед., в полиурическом периоде 17,7±2,94 ед., в периоде восстановительного диуреза 25,14±3,8 ед.
2
2
3) способ оценки тяжести течения по уровню концентрации простагландина Е в плазме крови больных ГЛПС (патент RU №2155337, 2000). Недостатком этого метода является необходимость определения уровня простагландина Е в тест-наборе и дороговизна.
Прототипом изобретения является способ оценки тяжести течения ГЛПС по уровню конечных стабильных метаболитов оксида азота (II) (NOx) в цельной крови (патент №RU 2245552, 2005). Однако применение предложенного способа в клинической практике имеет определенные ограничения из-за значительной зависимости от других источников нитритов и нитратов, в том числе и пищевого происхождения.
Эндотелий сосудов - единичный слой тонких клеток, покрывающих изнутри стенки сосудов и обладающих крайне высокой метаболической и секреторной активностью. Он играет ключевую роль в регуляции тонуса и роста сосудов, при процессах адгезии лейкоцитов, в балансе профибринолитической и протромбогенной активности и другие функции (Haller Н. Endothelial function. General considerations / H.Haller // Drugs. 1997; 53 Suppl.l, pp.1-10). Ввиду уникальности расположения этой внутренней выстилки на границе между кровью и тканями именно ее клетки - эндотелиоциты первыми встречаются с различными патогенными факторами, находящимися в системном кровотоке, первыми вовлекаются в процесс ограничения действия повреждающих агентов (вирусов, малых молекул, свободных радикалов и др.) и поэтому именно они в первую очередь подвержены повреждению. Эндотелий сосудов вовлекается в самые ранние сроки в патогенез таких заболеваний, как ИБС, гипертоническая болезнь, сахарный диабет, а также заболеваний вирусной этиологии, в том числе и геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС) (Vane J.R. Regulatory functions of the vascular endothelium / J.R. Vane, E.E. Anggard, R.M. Botting // New England Jornal of Medicine, 1990; 323 - p.27-36; Lusher T.F. Biology of endothelium / T.F. Lusher, M. Barton // Clin. Cardiol., 1997; 10 (suppl.11), II-3-II-10), поскольку возбудитель ГЛПС относится к вирусам, проявляющим выраженный тропизм именно к клеткам этой внутренней выстилки сосудов (Смородинцев А.А. Геморрагический нефрозо-нефрит / А.А.Смородинцев, В.Т.Чудаков, А.В.Чурилов // М.: Медицина, 1953, - 126 с.; Башкирев Т.А. Современные аспекты морфогенеза геморрагической лихорадки с почечным синдромом / Т.А.Башкирев, Ю.Г. Забусов // Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в Среднем Поволжье и Приуралье: Сб. науч. трудов. - Л., 1980. - С.84-103; Фазлыева P.M. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом в Республике Башкортостан/Р.М. Фазлыева, Д.Х.Хунафина, Ф.Х.Камилов // Уфа, 1995. - 343 с). Патогенетической сущностью заболевания является поражение стенок мелких сосудов с развитием в них воспалительных и деструктивно-некробиотических процессов (Суздальцев А.А. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (современные критерии оценки тяжести течения, эффективности лечения и прогноза) / А.А. Суздальцев // Автореф. дисс… д-ра мед. наук. - СПб., 1992, - 19 с). Вследствие повторяющихся циклов внутриклеточной репродукции хантавируса нарастает степень повреждения эндотелиоцитов с последующим отслоением их от базальной мембраны. Результатом изменения архитектоники внутренней выстилки сосудов является нарушение продукции эндотелиоцитами медиаторов, обеспечивающих в норме оптимальное течение всех эндотелийзависимых процессов. Как следствие увеличивается проницаемость сосудистой стенки, усиливаются ее тромбогенность и адгезия лейкоцитов, нарушается тонус сосудов, и это является одной из причин взаимного усиления многочисленных «порочных кругов» в патогенезе геморрагической лихорадки с почечным синдромом.
От точности оценки тяжести течения болезни зависит как адекватность и длительность терапии, так и возможность прогнозирования исхода заболевания, развития осложнений.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного и простого в применении метода оценки тяжести течения ГЛПС путем определения количества десквамированных циркулирующих эндотелиальных клеток (ЦЭК) в периферической крови.
Технический результат при использовании изобретения - повышение точности и объективности способа, сокращение времени анализа.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.
4
Определение циркулирующих в крови десквамированных эндотелиоцитов проводят методом J. Hladovec (Hladovec J. Circulating endothelial cells as a sign of vessel wall lesions / J.Hladovec / TPhysiol. Bohemoslov. - 1978. - Vol.27, №2. - P.140-144). Метод основан на выделении десквамированных клеток эндотелия сосудов вместе с тромбоцитами с последующим осаждением последних с помощью раствора аденозиндифосфата (АДФ). Кровь из локтевой вены берут натощак в количестве 5 мл. В качестве стабилизатора добавляют 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 1:9. Для получения плазмы, богатой тромбоцитами, кровь сразу после взятия центрифугируют в течение 10 мин при 200g. Затем 1 мл плазмы смешивают с 0,2 мл раствора натриевой соли аденозиндифосфата (АДФ-Na) в конечной концентрации 1 мг/мл. Полученную смесь механически перемешивают в течение 10 мин аккуратным встряхиванием пробирок, после чего вновь центрифугируют в прежнем режиме для удаления агрегатов тромбоцитов. Супернатант, свободный от тромбоцитов, переносят в другую пробирку и центрифугируют в течение 15 мин при 200g для осаждения эндотелиальных клеток. Затем надосадочную жидкость тщательно удаляют, а полученный осадок суспендируют стеклянной палочкой в 0,1 мл 0,9% раствора NaCl. Готовой суспензией заполняют камеру Горяева и подсчитывают количество эндотелиоцитов в 2 сетках камеры методом фазово-контрастной микроскопии. Учитывая соотношение между количеством клеток в сетке и объемом камеры Горяева, объем плазмы и объем полученной суспензии, при подсчете количества эндотелиальных клеток результат умножают на 10/л.
4
4
4
Повышение уровня ЦЭК до 6,4-10,0×10/л оценивают как среднетяжелую форму ГЛПС; повышение уровня ЦЭК до 10,7-14,6×10/л - как тяжелую форму заболевания без осложнений, повышение уровня ЦЭК до 14,9-21,0×10/л на фоне выраженной клинической картины расценивают как тяжелую форму ГЛПС с осложненным течением.
В доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружено сведений об известности определения содержания десквамированных ЦЭК в периферической венозной крови для оценки тяжести течения ГЛПС. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна».
Сравнение заявляемого решения не только с прототипом, но и с другими решениями в данной области медицинской науки показало, что оптимальным диагностическим методом является прямое измерение количества десквамированных эндотелиоцитов в крови больных ГЛПС, что позволяет оценить степень повреждения эндотелиальной выстилки сосудов, которая вовлекается в патогенез заболевания в самые ранние сроки. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Нами обследовано 44 больных ГЛПС в возрасте от 15 до 65 лет без сопутствующих заболеваний в анамнезе. Пациентов со среднетяжелой формой ГЛПС было 18, тяжелой - 12, осложненным течением - 14. Результаты показали значительное повышение в крови уровня ЦЭК, что отражает интенсивность десквамативных процессов во внутренней выстилке сосудов из-за повреждения их как вирусом-возбудителем заболевания, так и активными формами кислорода, продукция которых при ГЛПС повышается в значительной степени (Мирсаева Г.Х. Патогенез и лечение геморрагической лихорадки с почечным синдромом / Г.Х.Мирсаева, P.M.Фазлыева, Ф.Х.Камилов, Д.Х.Хунафина // Уфа, 2000, - 234 с). Уровень ЦЭК находился в прямой зависимости от тяжести течения заболевания (см. таблицу 1). Так, в лихорадочном периоде среднетяжелой формы ГЛПС средний уровень десквамированных эндотелиоцитов составил 6,4±0,6×10/л (p<0,02), тяжелой без осложнений - 10,7±0,5×10/л (p<0,001), тяжелой с осложнениями - 14,9±2,0×10/л (p<0,001), то есть соответственно в 1,5; 2,5 и 3,5 раз выше контрольных значений. В олигоанурическом периоде среднетяжелой формы ГЛПС средний уровень ЦЭК составил 8,2±0,8×10/л (p<0,001), тяжелой без осложнений - 12,3±1,5×10/л (p<0,002), тяжелой с осложнениями - 15,1±2,6×10/л (p<0,001), то есть соответственно в 2,0; 2,9; 3,6 раз выше контрольных значений. Анализ результатов исследования в полиурическом периоде заболевания показал, что уровень ЦЭК оставался статистически значимо выше контрольных значений (p<0,001): при среднетяжелой форме - 9,7±1,5×10/л (в 2,3 раза выше, чем у здоровых), при тяжелой форме без осложнений - 14,6±1,8×10/л (в 3,5 раза выше, чем у здоровых), при осложненном течении - 21,0±1,7×10/л (в 5 раз выше, чем у здоровых). В периоде восстановленного диуреза отмечалось повышение уровня ЦЭК при среднетяжелой форме - 10,0±0,8×10/л (р<0,001), что в 2,4 раза выше показателя в контрольной группе; статистически незначимое снижение при тяжелой форме без осложнений - 10,8±1,4×10/л (p<0,001), что в 2,6 раза выше значений в группе контроля; осложненном течении - 5,2±1,6 (p>0,05). Высокий уровень десквамированных эндотелиоцитов в крови больных ГЛПС в период восстановленного диуреза при среднетяжелой форме и тяжелой форме без осложнений свидетельствует о незавершенности патологического процесса в организме даже в периоде клинического выздоровления. Видимую нормализацию уровня определяемых клеток в крови больных с осложненным течением в данный период заболевания необходимо объяснить тем, что значительная часть поврежденных эндотелиоцитов была слущена уже в предыдущий период заболевания, приведя тем самым к абсолютному уменьшению количества этих клеток в интиме сосудов, и статистически незначимое различие с контролем в данной ситуации не может быть свидетельством клинического выздоровления. Таким образом, по уровню ЦЭК можно судить о степени тяжести течения ГЛПС.
Таблица 1
Количество десквамированных эндотелиоцитов в крови больных ГЛПС различной степени тяжести на фоне базисной лекарственной терапии (×10<sup>4</sup>/л)
периоды заболевания
формы заболевания
среднетяжелая
тяжелая без осложнений
тяжелая с осложнениями
лихорадочный
6,4±0,6
10,7±0,5
14,9±2,0
р<0,02
р<0,001
р<0,001
р<sub>1</sub>>0,05
р<sub>2</sub>>0,05
олиго-анурический
8,2±1,0
12,3±1,5
15,1±2,6
р<0,001
р<0,002
р<0,001
р<sub>1</sub>>0,05
р<sub>2</sub>>0,05
полиурический
9,7±1,5
14,6±1,8
21,0±1,7
р<0,001
р<0,001
р<0,001
р<sub>1</sub>>0,05
р<sub>2</sub><0,05
восстановленного диуреза
10,0±1,8
10,8±1,4
5,2±1,6
р<0,001
р<0,001
р>0,05
р<sub>1</sub>>0,05
р<sub>2</sub><0,005
контроль
4,2±0,5
Примечание: р - достоверность различий с группой контроля; p<sub>1</sub> - достоверность различий со среднетяжелой формой ГЛПС; р<sub>2</sub> - достоверность различий с тяжелой формой ГЛПС без осложнений.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.
12
9
3
4
4
4
4
Пример 1. Больной К., 15 лет, история болезни №11458/2010, поступил на 2-й день болезни с диагнозом: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. При поступлении состояние тяжелое, обусловленное выраженностью интоксикационного синдрома и лихорадкой. Жалобы при поступлении на боли в поясничной области, уменьшение количества мочи, боль в эпигастрии. В отделении у больного однократно была рвота. Олигурический период длился 5 дней со снижением суточного диуреза до 100 мл, подъемом креатинина до 200,0 мкмоль/л, мочевины - до 20,0 ммоль/л. Общий анализ крови: гемоглобин 159 г/л, эритроциты 5,26×10/л, лейкоциты 10,8×10/л, тромбоциты 112,0×10/л, СОЭ 10 мм/ч. Анализ мочи: гипостенурия (уд. вес до 1003), протеинурия (до 1,315 г/л), микрогематурия (до 5-6-8 в поле зрения), лейкоцитурия (до 2-3-4 в поле зрения), цилиндрурия (зернистые - до 3-3-4; гиалиновые - до 4-3-4 в поле зрения). Перед выпиской показатели общеклинических анализов нормализовались. Уровень ЦЭК в крови определялся в динамике заболевания: 4×10/л (лихорадочный период), 7×10/л (олигурический период), 9×10/л (полиурический период), 14×10/л (период восстановленного диуреза). Клинический диагноз: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, среднетяжелая форма. МФА 1:256, 1:1024 (нарастание титров антител в 4 раза).
12/
9
9
4
4
4
4
Пример 2. Больной К., 23 года, история болезни №12095/1735, поступил на 2-й день болезни с диагнозом: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом. При поступлении состояние тяжелое, выраженные явления интоксикации, лихорадка, ломота в суставах, боль в поясничной области. Олигурический период длился 5 дней со снижением суточного диуреза до 100 мл. При поступлении в общем анализе крови: гемоглобин 139 г/л, эритроциты 4,47×10л, лейкоциты 20,2×10/л, тромбоциты 100×10/л, СОЭ 15 мм/ч. В общем анализе мочи: гипостенурия (уд. вес 1000), протеинурия (до 2,457 г/л), клетки Дунаевского до 3-2-2 в поле зрения, эритроциты до 5-7-8 в поле зрения, лейкоциты до 5-6-6 в поле зрения, цилиндры: зернистые до 5-4-4 в поле зрения, гиалиновые до 1-10 в поле зрения, восковидные до 0-1-0 в поле зрения. В биохимическом анализе повышение креатинина определялось до 637,0 мкмоль/л, мочевины до 57,0 ммоль/л с последующим снижением к выписке: креатинина - до 102 мкмоль/л, мочевины - до 8,1 ммоль/л. Уровень ЦЭК в лихорадочном периоде составил 10×10/л, олигурическом - 12×10/л, полиурическом - 19×10/л, восстановленного диуреза - 10×10/л. Клинический диагноз: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, тяжелая форма. МФА 1:64; 1:1024. Таким образом, при тяжелой форме наблюдалось значительное повышение уровня десквамированных эндотелиальных клеток в крови.
12
9
9
4
4
4
Пример 3. Больной Ф., 54 года, история болезни №2007/20020, поступил на 5-й день болезни. При поступлении состояние крайне тяжелое, объективно: единичные петехии на передней грудной клетке, инъекция сосудов склер, энантема зева. Из анамнеза известно, что больной лихорадил все дни болезни, жаловался на боль в глазных яблоках, заложенность носа, боль в животе, пояснице, была рвота до 4-х раз. Больного по тяжести состояния госпитализировали в отделение гемодиализа. Олигурический период длился 7 дней со снижением суточного диуреза до 50 мл. В общем анализе крови: гемоглобин 133 г/л, эритроциты 4,14×10/л, лейкоциты 22,7×10/л, тромбоциты 273,0×10/л, СОЭ 50 мм/ч. В общем анализе мочи в день поступления определялись: белок - 19,8 г/л, эритроциты в большом количестве в поле зрения, лейкоциты 20-22-25 в поле зрения, единичные зернистые цилиндры до 0-0-1 в поле зрения. В биохимическом анализе подъем креатинина определялся до 790,0 мкмоль/л, мочевины до 38,0 ммоль/л. Уровень ЦЭК в олигурическом периоде повысился до 15×10/л, полиурическом - 25×10/л, восстановленного диуреза - снизился до 6×10/л. Учитывая клинику и результаты дополнительных методов исследования, выставлен клинический диагноз: Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, тяжелая форма. Осложнения: Инфекционно-токсический шок I-II степени, ОПН, ДВС, гематома правой почки, острый эрозивный гастрит. РНИФ 1:1024; 1:1024. Таким образом, на фоне выраженной клинической картины уровень ЦЭК в олигурическом периоде определялся в 1,9 раз выше значений здоровых лиц, с постепенным повышением к полиурическому периоду - в 6 раз, восстановленного диуреза - в 1,4 раза.
Преимущество предлагаемого способа состоит в том, что определение уровня ЦЭК в крови просто в реализации, позволяет объективно и своевременно оценить тяжесть течения геморрагической лихорадки с почечным синдромом и степень поражения эндотелия сосудов. Способ легко воспроизводим и при его использовании достигается указанный технический результат. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».