Lactobacillus fermentum Ess-1, DSM17851, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ КАНДИДОЗА И ИНФЕКЦИЙ МОЧЕВЫХ ПУТЕЙ
Lactobacillus fermentum Ess-1, DSM17851, AND ITS APPLICATION FOR TREATMENT AND/OR PREVENTION OF CANDIDOSIS AND URINARY TRACT INFECTIONS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Candida
Настоящее изобретение относится к области пробиотических бактерий, обладающих благоприятным воздействием на дрожжевые грибковые инфекции , то есть кандидоз, и на бактериальные инфекции. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям и продуктам для личной гигиены, содержащим такие бактерии, и к медицинскому применению таких бактерий.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
et al.
Lactobacillus
et al
Обычная флора мочеполовой области представлена сложной экосистемой, содержащей более 50 различных видов бактерий (Hill , Scand. J. Urol. Nephrol. 1984(86 (suppl.)):23-29). В нормальной флоре доминируют бактерии, принадлежащие к роду  (LB), являющиеся грамположительными палочками, приспособленными к окружающей среде влагалища фертильной женщины. Эти бактерии также способствуют поддержанию специфической микросреды и экологического баланса во влагалище. pH в среде влагалища составляет менее 4,5. Дрожжевые грибки и энтеробактерии присутствуют в ограниченном количестве или отсутствуют (Redondo-Lopez , Rev. Inf. Dis. 1987(12):856-872).
et al
Некоторые штаммы LB подавляют рост потенциально патогенных бактерий посредством различных механизмов. В результате метаболизма LB образуются органические кислоты, в частности молочная кислота и уксусная кислота, которые способствуют низкому pH во влагалищной жидкости, что является неблагоприятным для многих других видов микробов. LB также могут продуцировать растворимые вещества, которые напрямую подавляют рост потенциально патогенных бактерий и дрожжевых грибков. Также они могут продуцировать пероксид водорода, который является токсичным для бактерий и грибков. Такие характеристики подавления могут значительно отличаться у разных штаммов LB (Hooton ., JAMA 1990(265):64-69).
2
2
Так же, как и мочеполовая область, кожа заселена группой микроорганизмов, образующих ее нормальную флору. Количество и особенности микроорганизмов различаются для различных участков кожи, при этом во влажных и липидных областях кожи присутствует больше микроорганизмов на единицу площади. Это вместе со структурным барьером кожи предоставляет организму отличную защиту против вторжения микробов. Число бактерий на коже варьирует в диапазоне от нескольких сотен на см на сухих поверхностях предплечья и спины до десятков тысяч на см во влажных областях, таких как подмышки и пах. Нормальная флора играет важную роль в предотвращении заселения кожи «чужеродными» организмами, но ее необходимо контролировать в целях предотвращения кожных инфекций.
14
Candida
Candida
Желудочно-кишечный (ЖК) тракт, от рта до ануса, содержит богатую флору из более чем 500 различных видов бактерий, некоторые из которых имеют важные для здоровья функции. ЖК флора состоит из около 10 бактерий и небольшого числа дрожжевых грибков-комменсалистов. Вследствие изменения обычного состояния здоровья вид  может чрезмерно разрастаться и вызывать поверхностные инфекции. Кроме того, чрезмерное разрастание вида  среди пациентов с ослабленным иммунитетом может привести к системной инфекции, которая является очень серьезным состоянием.
Ослабление или дисбаланс естественной защитной системы может позволить потенциально патогенным микроорганизмам вызвать клиническую инфекцию, например, в связи с лекарственной терапией, недостаточной личной гигиеной или миграциями в микрофлоре или в слизистых оболочках. Миграции в микрофлоре могут быть также выявлены в связи с различными патогенными состояниями.
Candida
Candida albicans
C. glabrata
C.tropicalis
C. parapsilosis
C. krusen
Candida
Candida
Дрожжевые организмы всегда присутствуют в организме человека, но их чрезмерное разрастание обычно предотвращается местной микробной флорой. Кандидоз представляет собой инфекцию, вызываемую дрожжевыми организмами , которая влияет на широкий спектр систем органов. Чаще всего инфекция вызывается , и . Менее часто инфекция вызывается ,  и , и реже возбудителями болезни являются другие виды . Кандидоз часто инициируется гормональными изменениями, например, имеющими место во время беременности, менструации и применения противозачаточных таблеток. Другими распространенными причинами являются дисбалансы pH во влагалище, сахарный диабет и лечение антибиотиками, вызывающие нарушение хрупкого микробиологического равновесия организма. Естественная природная защита против инфекций  включает механические барьеры, неспецифичные противомикробные вещества (полипептиды, щелочные протеазы), фагоцитоз и специфический иммунный ответ (T- и B-лимфоциты), гиперчувствительность замедленного типа.
У иммунокомпетентных индивидуумов любая теплая, влажная часть тела, подверженная воздействию окружающей среды, является восприимчивой к инфекциям, вызывающим вагинит; влагалищные высыпания; кандидозный стоматит; конъюнктивит; эндофтальмит; опрелости; и инфекции на ногтях, прямой кишке и других кожных складках. У пациентов с иммунной недостаточностью могут появляться системные заболевания, такие как миокардит, абсцесс печени, легочная инфекция, инфекция ЦНС и хроническое заболевание. Кандидоз может распространяться из локальной инфекции и вызывать системную инфекцию с серьезными осложнениями, такими как миокардит, эндофтальмит и абсцесс печени. Таким образом, очень важным является нахождение эффективных средств лечения и средств профилактического лечения кандидоза с целью предотвращения развития серьезных состояний у объектов.
Candida
albicans
Кандидозный стоматит - это стандартное название инфекции полости рта, вызываемой грибками , которая поражает влажные поверхности вокруг губ, внутри щек, а также на языке и небе. Кандидозный стоматит распространен среди лиц с диабетом или раздражением от зубных протезов. Также кандидозом часто поражаются лица с такими заболеваниями, как рак или СПИД, каждое из которых подавляет иммунную систему.
Candida
Инфекция  ротовой полоти может распространиться на пищевод, вызывая эзофагит. Данная инфекция часто встречается у лиц со СПИДом и лиц, подвергающихся противораковой химиотерапии.
Candida
Инфекции  также часто встречаются на влажных участках кожи, таких как области кожи, покрытые подгузниками, руки людей, регулярно носящих резиновые перчатки, края кожи в основании ногтей пальцев рук, особенно на руках, подвергающихся воздействию влаги, паховая область и область вокруг бороздки ягодиц, и кожные складки под большими грудями.
Вагинит представляет собой воспаление слизистой оболочки влагалища, вызываемое бактериями или грибками. Вагинит сам по себе безвреден на ранней стадии, но может вызывать преждевременные роды у беременных женщин или приводить к бесплодию.
Вагинальный кандидоз вызывает зуд и раздражение влагалища с белесыми вязкими выделениями, напоминающими творог. Женщины, имеющие такие симптомы, испытывают сильный дискомфорт, и, кроме того, они подвергаются ограничениям в повседневной жизнедеятельности, например, это касается занятий спортом и сексуальной активности.
Вагинальный кандидоз обычно лечится средствами для местного применения, такими как кремы, суппозитории, желатиновые капсулы, вагинальные таблетки и мази, содержащие противогрибковые препараты. Также существуют лекарственные средства для орального введения. Одна из проблем противогрибковых препаратов состоит в повышении устойчивости грибков к препарату при многократном применении. Кроме того, такие лекарства часто неэффективны и для них требуется рецепт врача.
Для лечения кандидоза также применяются домашние средства, такие как нанесение йогурта, ацидофильные таблетки или промывание уксусом. Однако эффективность такого лечения достаточно низкая. Хотя йогурт содержит молочнокислые бактерии, они не предназначены именно для уничтожения или снижения роста грибков. Как ясно квалифицированному специалисту в данной области техники, такое лечение может быть эффективным только для смягчения симптомов незначительных инфекций. Также предлагалось, чтобы бактерии, продуцирующие молочную кислоту, могли доставляться с помощью впитывающих прокладок, таких как подгузники, гигиенические прокладки, ежедневные прокладки и тампоны, согласно описанному, например, в W097/02846, WO99117813, WO99/45099 и WO00/35502.
Имеется возрастающая заинтересованность в нахождении пробиотических микроорганизмов, способных к восстановлению здоровой микробной флоры и/или к предотвращению неконтролируемого роста нежелательных микроорганизмов. Введение таких пробиотических бактерий не имеет негативных побочных эффектов противомикробных препаратов и, предпочтительно, является более эффективным для лечения и/или профилактики грибковых инфекций. Предыдущие попытки выявления таких микроорганизмов имели, однако, различную степень успешности по причине таких проблем, как низкая степень связывания и выживаемости пробиотиков во влагалище, ограниченная эффективность в предотвращении роста грибков, низкая выживаемость при хранении препаратов и т.д. Другими важными характеристиками выбранного пробиотика являются способность к росту в присутствии кислорода и выживаемость при сублимационной сушке. Тем не менее, самым важным для выбранной пробиотической бактерии является эффективность уничтожения и/или предотвращения роста нежелательных грибков и/или бактерий. Ранее была доказана эффективность пробиотических молочнокислых бактерий при лечении и профилактике бактериального вагинита. Однако успешность профилактики и/или лечения вагинального кандидоза была очень ограниченной. Следовательно, все еще существует потребность в разработке эффективных пробиотиков для лечения кандидоза, включая вагинальный кандидоз, которые также могут быть эффективными против бактериальных инфекций, таких как инфекции мочевых путей.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цель изобретения состоит в предоставлении пробиотической бактерии для лечения и/или профилактики кандидоза и/или бактериальных инфекций, таких как инфекции мочевых путей.
Lactobacillus fermentum
Вышеуказанная цель в первом аспекте изобретения достигается путем предоставления нового штамма , обозначаемого Ess-1, который депонирован в Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851.
Lactobacillus fermentum
В другом аспекте изобретение относится к применению , штамм Ess-1, для использования в качестве лекарственного средства.
Lactobacillus fermentum
В другом аспекте изобретение относится к применению , штамм Ess-1, для приготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения кандидоза.
Lactobacillus fermentum
В другом аспекте изобретение относится к применению , штамм Ess-1, для приготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения бактериальных инфекций, таких как инфекции мочевых путей.
Lactobacillus fermentum
В других аспектах изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей , штамм Ess-1, в качестве варианта, с фармацевтически приемлемым переносчиком, наполнителем и/или разбавителем.
Lactobacillus fermentum
В еще одном аспекте изобретение относится к гигиеническому изделию, содержащему , штамм Ess-1.
Lactobacillus fermentum
Изобретение также относится к способу приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики кандидоза, включающему добавление , штамм Ess-1, к вышеупомянутой фармацевтической композиции.
Lactobacillus fermentum
Кроме того, изобретение относится к способу приготовления гигиенического изделия для лечения и/или профилактики кандидоза, включающему добавление , штамм Ess-1, в гигиеническое изделие.
Lactobacillus fermentum
Candida
Поскольку было показано, что новый штамм , штамм Ess-1, обеспечивает отличное подавление роста грибков , то, следовательно, этот новый бактериальный штамм продемонстрировал ценные свойства для применения в приготовлении медикаментов для лечения и/или профилактики кандидоза. Кроме того, изобретение решает задачу предоставления продуктов и изделий для доставки нового бактериального штамма в подходящие для такого лечения и/или профилактики области организма.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В контексте данного описания «противомикробный препарат» представляет собой лекарство, применяемое для лечения грибковых инфекций, при этом данное лекарство не является пробиотиком согласно приведенному ниже определению.
«Пробиотик/пробиотики» в контексте данного описания относится к живым микроорганизмам, которые дают пользу для здоровья при введении в адекватных количествах в организм хозяина.
Candida
«Кандидоз» в контексте данного описания относится к инфекции, вызываемой грибками , имеющей место в или на любой части тела, например, на коже, в мочеполовой области, в ротовой полости, пищеводе или кишечнике.
«Оральная добавка» в контексте данного описания относится к композиции, которая вводится орально, например, аэрозоль, таблетка, жевательная резинка и т.д.
«Биологически чистая» в контексте данного описания относится к культуре бактерии, которая содержит только один конкретный бактериальный штамм.
Термин «гигиеническое изделие» относится к продуктам, помещаемым рядом с кожей носителя с целью впитывания и удержания выделений организма, таких как моча, фекалии и менструальная жидкость, а также к продуктам, используемым для очищения и ухода за кожей и мочеполовой областью, и которые также могут применяться для доставки пробиотических бактерий в эти области. Изобретение в основном относится к одноразовым гигиеническим изделиям, что означает, что изделия не предназначены для стирки или восстановления другим способом и повторного использования в качестве гигиенического изделия после однократного использования. Примеры одноразовых гигиенических изделий включают влажные салфетки, сухие салфетки, гигиенические товары для женщин, такие как гигиенические салфетки, ежедневные прокладки, гигиенические трусы и тампоны; вкладки для женщин; подгузники и трусы-подгузники для детей и страдающих недержанием взрослых; урологические пакеты; вкладки-подгузники и т.п.
Термин «впитывающая прокладка» относится к продуктам, помещаемым рядом с кожей носителя с целью впитывания и удержания выделений организма, таких как моча, фекалии и менструальная жидкость. Примеры впитывающих прокладок включат гигиенические товары для женщин, такие как гигиенические салфетки, ежедневные прокладки, гигиенические трусы и тампоны; вкладки для женщин; подгузники и трусы-подгузники для детей и страдающих недержанием взрослых; урологические пакеты; вкладки-подгузники и т.п.
Под «гигиенической тканью» понимается любое приспособление для протирки кожи, например, мочалка, тряпка, туалетная бумага, салфетка, влажная салфетка, сухая салфетка и т.п.
Под «липидами» в контексте настоящего изобретения понимаются вещества, которые являются нерастворимыми в воде, но растворимыми в органическом растворителе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
C. albicans
C. glabrata
C. albicans
C. glabrata
На Фиг. 1 показано среднее подавление роста для трех штаммов, каждый из которых -  и . =, =. *pH dMRSs приведен к самому низкому зарегистрированному pH для всех фильтратов (pH 3,7). 0 означает отсутствие наблюдаемого роста, 5 означает очень хороший рост.
C. albicans
На Фиг. 2 показано подавление роста для  в 50 мМ аскорбиновой кислоте (Фиг. 2a) и 50 мМ пропионовой кислоте (Фиг. 2b), в фильтрате Ess-1 и в фильтрате Ess-1 с добавлением 50 мМ аскорбиновой кислоты (Фиг. 2a) и 50 мМ пропионовой кислоты (Фиг. 2b). 0 означает отсутствие наблюдаемого роста, 5 означает очень хороший рост.
Lactobacillus
Фиг. 3 показывает продуцирование янтарной кислоты, уксусной кислоты и пропионовой кислоты в пяти различных штаммах , включая Ess-1. Штаммы были выращены в питательной среде MRS, и продуцирование кислоты регистрировалось в питательной среде после стерильной фильтрации надосадочной жидкости.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Lactobacillus fermentum
Candida
Candida
Lactobacillus fermentum
Настоящее изобретение относится к новому штамму , далее в данном документе называемому Ess-1, депонированному согласно Будапештскому соглашению в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig), с присвоением инвентарного номера DSM17851 (депозитор Essum AB, Box 3160, SE 90304 Umea, Sweden, депонировано 6 января 2006). Штамм продемонстрировал уникальные свойства в лечении и/или профилактике инфекций , то есть кандидоза, благодаря своим свойствам подавления роста дрожжевых грибков . Также штамм Ess-1 продемонстрировал ценные свойства при лечении и/или профилактике бактериальных инфекций, таких как инфекции мочевых путей. Кроме того, Ess-1 остается жизнеспособным в течение длительных периодов хранения, что является важным при эксплуатации продуктов, содержащих бактерии. Кроме того, Ess-1 не является строго анаэробным и может расти в присутствии кислорода и демонстрировать хорошую выживаемость при сублимационной сушке. Штамм Ess-1  изобретения является биологически чистым.
Candida
Lactobacilli
Candida
Lactobacillus
in vivo
in vivo
Как показано в Примере 1, Ess-1 демонстрирует уникальное подавление роста различных штаммов дрожжевых грибков . В этом эксперименте были проверены свойства большого количества штаммов  по подавлению роста . 23 лучших штамма были отобраны для дальнейшего изучения. Подавление роста для Ess-1 более чем в два раза превышает показанное лучшим из 23 различных штаммов , использованных для сравнения. Также было продемонстрировано, что Ess-1 подавляет рост ряда бактериальных штаммов, о которых известно, что они вызывают инфекцию мочевых путей. Кроме того, было продемонстрировано, что Ess-1 может заселять влагалище и выживать в нем после введения во влагалище. Важно, что Ess-1 выживает во влагалище также и во время менструации. Заселение и выживание  после введения объекту является важным фактором успешного выполнения пробиотиком задач, для которых он предназначен. При этом отсутствие колонизации и заселения или их ограниченность  часто ограничивает практическую применимость пробиотических бактерий, продуцирующих молочную кислоту. Кроме того, ограниченная выживаемость при хранении и обработке продуктов, содержащих продуцирующие молочную кислоту бактерии, часто приводит к применению неэффективных продуктов.
Lactobacillus fermentum
В первом аспекте настоящее изобретение относится к новому штамму , обозначенному «штамм Ess-1», который был депонирован в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851.
Candida
Поскольку штамм Ess-l обладает свойствами подавления роста  и бактерий, вызывающих инфекции мочевых путей, то настоящее изобретение также относится к медицинскому применению этого штамма. В частности, изобретение относится к применению штамма Ess-1 для приготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения кандидоза, предпочтительно, у объекта-млекопитающего, более предпочтительно, у объекта-человека. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к применению штамма Ess-1 для приготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения кандидоза в мочеполовой области, например, вагинального кандидоза. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению штамма Ess-1 для приготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения эзофагита. Другой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению штамма Ess-1 для приготовления фармацевтической композиции для лечения кандидозного стоматита.
Поскольку было экспериментально продемонстрировано (см. «Экспериментальный раздел»), что штамм Ess-1 подавляет рост ряда различных бактерий, вызывающих инфекцию, такую как инфекцию мочевых путей, то другой аспект изобретения относится к применению штамма Ess-1 для приготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения бактериальных инфекций, таких как инфекция мочевых путей.
Lactobacillus fermentum
В одном из аспектов настоящее изобретение относится применению , штамм Ess-1, который был депонирован в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851, для приготовления фармацевтической композиции для орального введения.
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
В одном из предпочтительных вариантов осуществления фармацевтическая композиция, содержащая , штамм Ess-1, также содержит один или более фармацевтически приемлемых переносчиков, наполнителей и/или разбавителей. Как правило, такие вещества должны быть нетоксичными для реципиентов в используемых концентрациях и дозировках. Примерами таких веществ являются буферы, загущающие агенты формирующих гель агентов, такие как глицерин, полиэтиленгликоль, антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота), полипептиды с низкой молекулярной массой (менее чем около 10 остатков), белки, углеводы, включая глюкозу, сукрозу и декстрины. Примеры переносчиков включают сахара, такие как лактоза, глюкоза и сукроза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натриевая карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетаты целлюлозы; трегалозу; порошкообразный трагант, солод; желатин; тальк; стеариновые кислоты; стеарат магния; сульфат кальция; полиолы, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбитол, маннитол и полиэтиленгликоль; агар; альгиновые кислоты; апирогенную воду; изотонический раствор; и раствор фосфатного буфера. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения в качестве переносчика для пробиотических бактерий используется безводная среда. Такая безводная среда продлевает выживаемость бактерий во время производства, транспортировки и хранения. Одним из примеров таких переносчиков являются липидные переносчики, включающие липиды, являющиеся нефтяными производными, такие как парафинум ликвидум (минеральные масла, парафиновые масла и другие масла), петролатум (вазелин и нефтяной вазелин), микрокристаллический воск, озокерит, церезин и парафины. В качестве альтернативы могут использоваться синтетические липиды, такие как диметикон, циклометикон и силиконовые эфиры, такие как цетиариловый метикон. Третья альтернатива состоит в использовании липидов животного или растительного происхождения, которые обычно представляют собой триглицериды. Липиды животного и растительного происхождения часто представляют собой смесь моно-, ди- и триглицеридов и свободных жирных кислот. Липиды могут быть рафинированными, гидрогенизированными, очищенными, модифицированными и могут использоваться по отдельности или в различных смесях. Примеры подходящих естественных липидов животного происхождения включают пчелиный воск, жир эму, молочко пчелы-каменщицы, ланолин, жир печени акулы и таловый жир. Примеры подходящих естественных липидов растительного происхождения включают масло из косточек абрикоса, арахидное масло, масло/воск авокадо, воск восковницы, масло из семян черной смородины, масло из семян бурачника, масло бразильского ореха, масло камелии китайской, канделильский воск, масло канолы, карнаубский воск, касторовое масло, какао-масло, кокосовое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло дикого шиповника, масло из семян энотеры, масло из семян винограда, масло ореха бассия, жасминовый воск, воск жожоба, лавандовый воск, масло из льняного семени, масло из семян манго, оливковое масло, апельсиновый воск, пальмовое масло, пальмоядровое масло, арахисовое масло, рисовый воск, сафлоровое масло, масло из кунжутного семени, масло масляного дерева, соевое масло, воск из семян подсолнечника, масло сладкого миндаля, масло теобромы и масло пшеничных зародышей. Использование липидных переносчиков дает дополнительное преимущество, заключающееся в увеличении передачи бактерий пользователю, например, когда фармацевтическая композиция вводится с помощью гигиенического продукта, такого как впитывающий продукт или гигиеническая ткань (см., например, WO 04/060416). Примеры предпочтительных липидов включают петролатум и силиконовый воск. Также могут присутствовать смачивающие компоненты и смазочные материалы, такие как лаурилсульфат натрия, и окрашивающие добавки, смазочные материалы, таблетирующие агенты, стабилизаторы и консерванты. Предпочтительными фармацевтически приемлемыми переносчиками являются трегалоза или фактор роста молочнокислых бактерий, например, инулин и/или олигофруктоза, полидекстроза, лактитол или резистентный крахмал в форме порошка или в другой форме. Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может в одном из предпочтительных вариантов осуществления также содержать в дополнение к клеткам  Ess-1 органическую кислоту и/или ее соль, такую как уксусная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, аскорбиновая кислота, фенилаланин, лимонная кислота, масляная кислота, валериановая кислота, капроновая кислота, янтарная кислота и/или соли вышеперечисленного; предпочтительно, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, молочную кислоту, аскорбиновую кислоту, фенилаланин, лимонную кислоту или янтарную кислоту и/или соли вышеперечисленного; наиболее предпочтительно аскорбиновую кислоту, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, янтарную кислоту и/или соли вышеперечисленного. Эффект взаимного усиления может быть достигнут путем объединения пробиотика Ess-1 с органическими кислотами и/или их солями, при этом органические кислоты должны иметь значение pKa, не превышающее 5,5. Органические кислоты или соответствующие соли должны иметь такую природу, что при нанесении на гигиеническое изделие они не должны вызывать раздражение кожи носителя гигиенического изделия, таким образом, значение pKa органической кислоты, при измерении в воде при 25°C, предпочтительно, должно быть меньше 2. Если значения pKa являются, наоборот, большими, то органические кислоты или их соли могут в основном быть в своих кислотных формах. Это означает, что добавка не будет достаточным образом диссоциировать на ионы водорода и его депротонированную анионную форму, что считается предпосылкой для вышеупомянутого эффекта с пробиотическими бактериями или их внеклеточными продуктами. Следовательно, по меньшей мере одно из значений pKa для органической кислоты, подходящей для настоящего изобретения, должно быть меньше 5,5, предпочтительно, меньше 5. Кроме того, в фармацевтическую композицию также могут быть добавлены, по отдельности или в различных комбинациях, питательные вещества для размножения бактерий, такие как аминокислоты, пептиды, производные нуклеиновых кислот, витамины, соли, жирные кислоты, глюкоза, фруктоза, рибоза, мальтоза и лактоза.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению предпочтительно вводится в форме аэрозоля, крема, порошка, суппозитория, жидкости для орального введения, капсулы, таблетки, влагалищной вставки или оральной добавки. Композиции для лечения кожи могут быть приготовлены, например, согласно US 2006/0171936.
Другими примерами продуктов, содержащих штамм Ess-1, являются порошок в перчатке, пастилки, жевательная резинка, жидкость для полоскания рта или средство для ароматизации рта в аэрозольной упаковке.
Кроме того, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также содержать вещество, которое уменьшает запахи, такое как цеолиты, кремний, циклодекстрин и активированный уголь. Также в фармацевтическую композицию согласно изобретению могут включаться вещества, которые обладают способностью к усилению прикрепления молочнокислых бактерий и/или веществ, которые снижают прикрепление патогенных микроорганизмов.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может вводиться посредством единичной дозы, но предпочтительным является введение в нескольких дозах. Фармацевтическая композиция также может быть, предпочтительно, введена вместе с введением противомикробного(ых) препарат(ов).
В одном из предпочтительных вариантов осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит высушенные бактериальные клетки, такие как высушенные сублимацией клетки, высушенные распылением клетки или высушенные воздухом клетки. Такие клетки обладают хорошими способностями к выживанию в течение хранения (см. экспериментальный раздел изучения выживаемости высушенных сублимацией клеток).
4
11
6
10
8
10
Lactobacillus fermentum
Фармацевтическая композиция согласно изобретению, предпочтительно, содержит от 10 до 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), более предпочтительно, от 10 до 10 КОЕ, даже более предпочтительно, от 10 до 10 КОЕ , штамм Ess-1, на одну дозу.
Lactobacillus
Lactococcus
Pediococcus
Bacillus genus
Bifidobacterium genus
Pseudomonas limbergii
Lactobacillus
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus casei
Lactobacillus cereale
Lactobacillus delbrukeii
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus gaserii
Lactobacillus jensenii
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus rhamnosus
Lactobacillus salivarius
Lactobacillus thermophilus
Lactobacillus papacasai sp. paracasai
Lactobacillus crispatus
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus lactis
Lactococcus lactis
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus curvatus или Lactobacillus plantarum
Coccus
S. nalivarius
S. oralis
S. mitis
Lactobacillus plantarum
Фармацевтическая композиция или продукт согласно изобретению может в дополнение к Ess-1 содержать другие бактерии, обладающие пробиотическими свойствами, с целью достижения более обширного клинического эффекта. Предпочтительные бактерии такого типа для цели настоящего изобретения включают продуцирующие молочную кислоту бактерии, например, из родов , , , непатогенных членов рода , всех членов рода  и . Предпочтительные члены рода  включают , , ,,,,,,,,,,,,, и т.п. Более предпочтительным является выбор используемой бактерии из видов ,,. Другие предпочтительные примеры включают непатогенные виды , такие как ,и. Один из даже более предпочтительных примеров такой продуцирующей молочную кислоту бактерии включает , штамм LB931 (EP 1060240, инвентарный номер DSM 11918 в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen), но не ограничивается вышеуказанным.
Фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть внедрена в ряд различных продуктов. Например, порошок, содержащий Ess-1, может поставляться в различных типах защитных перчаток. Такие перчатки часто создают влажную окружающую среду для рук, что может способствовать росту грибков, приводящему к грибковым инфекциям кожи и ногтей рук.
Lactobacillus fermentum
В другом аспекте настоящее изобретение относится к гигиеническому изделию, содержащему  штамм Ess-1, который был депонирован в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851. Такое гигиеническое изделие может представлять собой впитывающую прокладку, такую как гигиенические товары для женщин, такие как гигиенические салфетки, ежедневные прокладки, гигиенические трусы и тампоны; вкладки для женщин; подгузники и трусы-подгузники для детей и страдающих недержанием взрослых; урологические пакеты; или вкладку-подгузник. Также гигиеническое изделие может представлять собой гигиеническую ткань, такую как мочалка, тряпка, туалетная бумага, салфетка, влажная салфетка или сухая салфетка. Гигиеническая ткань, подходящая для настоящего изобретения, была описана ранее в WO 04/060416. Продуцирующие молочную кислоту бактерии были «инкапсулированы» в липид в не содержащей воды среде с целью защиты бактерий от влаги во время хранения и способствования их передачи пользователю гигиенической ткани. Такая гигиеническая ткань также может факультативно содержать одну или более очищающих добавок, таких как смягчающие вещества, эмульгаторы, увлажнители, pH-регулирующие агенты, хелатообразующие вещества, модификаторы вязкости, противомикробные вещества, консерванты и отдушки согласно описанному в WO 04/060416. Дополнительные сведения о подходящих веществах, обычно добавляемых в продукты для очищения кожи, приведены в Woodruff's Ingredients and Formulary Handbook, John Woodruff, First ed., 1997, Miller Freeman fJK Ltd. Впитывающий продукт или гигиеническая ткань согласно изобретению также может содержать кислоты, соли, подавители запахов, вещества, влияющие на адгезию пробиотиков и нежелательных микроорганизмов, согласно обсуждаемому выше. Такой впитывающий продукт может включать проницаемый внешний слой, который предназначен для нахождения в тесном контакте с кожей носителя, предпочтительно непроницаемый для жидкости нижний слой, который предназначен для нахождения на удалении от носителя в процессе использования, и впитывающую структуру, размещенную между внешним слоем и нижним слоем. В некоторых случаях между внешним слоем и впитывающей структурой может помещаться дополнительный слой в форме, например, ваты или подобного материала. Нижний слой предпочтительно является воздухопроницаемым. Пробиотические бактерии могут быть размещены в различных частях впитывающей прокладки, например, во внешнем слое, во впитывающей структуре, между двумя слоями впитывающей прокладки, в продукте-вставке во впитывающем продукте, или некоторым другим способом. Впитывающий продукт согласно настоящему изобретению также может, предпочтительно, содержать сверхпоглощающий полимер (SAP).
Lactobacillus fermentum
Гигиеническое изделие согласно изобретению может в дополнение к клеткам  Ess-1 дополнительно содержать органическую кислоту и/или ее соль, такую как уксусная кислота, пропионовая кислота, молочная кислота, аскорбиновая кислота, фенилаланин, лимонная кислота, масляная кислота, валериановая кислота, капроновая кислота, янтарная кислота и/или соли вышеперечисленного; предпочтительно, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, молочную кислоту, аскорбиновую кислоту, фенилаланин, лимонную кислоту или янтарную кислоту и/или соли вышеперечисленного; наиболее предпочтительно, аскорбиновую кислоту, уксусную кислоту, пропионовую кислоту, янтарную кислоту и/или соли вышеперечисленного, при этом значение pKa для такой кислоты не превышает 5,5. Эффект взаимного усиления может быть достигнут путем объединения пробиотических клеток Ess-1 с органическими кислотами и/или их солями.
4
11
6
10
8
10
Lactobacillus fermentum
Гигиеническое изделие согласно изобретению предпочтительно содержит от 10 до 10 колониеобразующих единиц (КОЕ), более предпочтительно, от 10 до 10 КОЕ, даже более предпочтительно, от 10 до 10 КОЕ , штамм Ess-1, на одно гигиеническое изделие.
Пробиотические бактерии настоящего изобретения могут напрямую наноситься на гигиеническое изделие согласно изобретению или поставляться в фармацевтической композиции, наносимой на продукт, согласно изложенному в данном документе. В одном из предпочтительных вариантов осуществления бактерии представляют собой обезвоженные бактерии согласно описанному выше, и они наносятся на гигиеническое изделие, отдельно или в фармацевтической композиции согласно вышеописанному. В другом предпочтительном варианте осуществления бактерии могут сначала наноситься на гигиеническое изделие, например, в виде содержащей бактерии суспензии, после чего гигиенический продукт высушивается, в результате чего продукт снабжается бактериями, высушенными в нем, факультативно, в комбинации с дополнительными фармацевтическими агентами согласно описанному выше. В другом предпочтительном варианте осуществления высушенный бактериальный порошок поставляется в липиде, добавленном в гигиеническое изделие. С целью сокращения воздействия влаги на бактерии во время производства, транспортировки и хранения изделий, содержащих пробиотик Ess-1, в одном из предпочтительных вариантов осуществления гигиеническое изделие упаковано в непроницаемую для воды упаковку.
Lactobacillus fermentum
В другом аспекте изобретение относится к применению , штамм Ess-1, депонированного в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851, для производства гигиенического изделия, такого как влажная салфетка, сухая салфетка, гигиенические товары для женщин, такие как гигиенические салфетки, ежедневные прокладки, гигиенические трусы и тампоны; вкладки для женщин; подгузники и трусы-подгузники для детей и страдающих недержанием взрослых; урологические пакеты; или вкладки-подгузники. Гигиеническое изделие предпочтительно представляет собой гигиенический продукт для женщин, такой как гигиенические салфетки, ежедневные прокладки, гигиенические трусы и тампоны; вкладки для женщин; подгузники и трусы-подгузники для детей и страдающих недержанием взрослых; урологические пакеты; или вкладки-подгузники. Гигиеническое изделие также, предпочтительно, может представлять собой гигиеническую ткань, такую как мочалка, тряпка, туалетная бумага, салфетка, влажная салфетка или сухая салфетка.
Lactobacillus fermentum
Изобретение также относится к применению , штамм Ess-1, депонированному в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851, для производства фармацевтической композиции, такой как суспензия, аэрозоль, крем, порошок, суппозиторий, капсула, таблетка, оральная добавка или влагалищная вставка и т.п. согласно вышеописанному.
L. fermentum
Фармацевтические композиции и продукты, содержащие , штамм Ess-1, содержат терапевтически эффективное количество бактериального штамма.
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum,
Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики кандидоза, включающему введение терапевтически эффективного количества , штамм Ess-1, депонированного в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851, нуждающемуся в таком введении объекту. Изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики бактериальных инфекций, таких как инфекция мочевых путей, включающему введение терапевтически эффективного количества  штамм Ess-1, депонированного в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851, нуждающемуся в таком введении объекту. В этих способах штамм Ess-1 вводится объекту посредством любой из фармацевтических композиций или любых продуктов, которые были описаны выше. При введении посредством гигиенического изделия, такового как впитывающий продукт, является важным, чтобы впитывающий продукт помещался в тесном контакте с кожей вышеупомянутого объекта.
Одной из важных задач настоящего изобретения является оральное введение Ess-1. Таким образом, один из аспектов изобретения относится к фармацевтической композиции для орального введения. Такое оральное введение в первом аспекте приводит к подавлению роста грибков и/или бактерий в желудочно-кишечном тракте и к улучшению баланса микробной флоры. Однако грибы и бактерии, присутствующие в желудочно-кишечном тракте, также могут передаваться в мочеполовую область через анус. Подавление роста грибков и/или бактерий в желудочно-кишечном тракте может, таким образом, иметь благоприятное влияние как на сам желудочно-кишечный тракт, так и на мочеполовую область по причине снижения распространения патогенных грибков и/или бактерий в этой области. Также может быть достигнут системный эффект, такой как инициирование веществ иммунного ответа. Оральное введение может, например, реализовываться посредством включения Ess-1 в капсулы, таблетки, пастилки, таблетки для рассасывания, гранулы, жидкие суспензии, сухие оральные суспензии, жидкие оральные суспензии, жевательные резинки, жидкость для полоскания рта, пастилки, средства для ароматизации полости рта в аэрозольной упаковке, флаконы и т.д. Оральное введение также может осуществляться посредством пищевых продуктов, таких как йогурт, молоко, свежий сыр, мороженое, продукты, произведенные из ферментированного молока, продукты, произведенные из ферментированных зерновых культур, сухое молоко и т.д., и продукты для детей, такие как жидкая каша.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к продуктам для локального и/или орального введения штамма Ess-1 животному для улучшения здоровья животного, например, в фармацевтической композиции в соответствии с описанным выше или в кормовых продуктах или кормовых добавках для животных. Также Ess-1 может применяться для улучшения качества кормовых продуктов для животных, например, силоса, путем подавления роста грибков и бактерий в нем.
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Настоящее изобретение также относится к способу приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики кандидоза, включающему добавление , штамм Ess-1, депонированного в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851, в вышеупомянутую фармацевтическую композицию. Настоящее изобретение также относится к способу приготовления фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики бактериальных инфекций, таких как инфекции мочевых путей, включающему добавление , штамм Ess-1, депонированного в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851, в вышеупомянутую фармацевтическую композицию.
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Также настоящее изобретение относится к способу приготовления гигиенического изделия, такого как впитывающий продукт или гигиеническая ткань, для лечения и/или профилактики кандидоза, включающему добавление , штамм Ess-1, депонированного в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851, к вышеупомянутому гигиеническому изделию. Также настоящее изобретение относится к способу приготовления гигиенического изделия, такого как впитывающий продукт или гигиеническая ткань, для лечения и/или профилактики бактериальных инфекций, таких как инфекции мочевых путей, включающему добавление , штамм Ess-1, депонированного в Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, и которому был присвоен инвентарный номер DSM17851, к вышеупомянутому гигиеническому изделию.
Изобретение будет описано более подробно в приведенном ниже экспериментальном разделе. Примеры, однако, являются только иллюстрацией и не предназначаются для ограничения объема настоящего изобретения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ РАЗДЕЛ
Пример 1: Выделение и типирование Ess-1
Цель
Lactobacillus
Candida
albicans
Candida
glabrata
Lactobacillus
Первоначальная цель данного исследования заключалась в выделении и типировании штамма , подавляющего рост  и  в большей степени по сравнению с другими штаммами .
Метод
Штаммы дрожжей
Candida
albicans
Candida
glabrata
В качестве тестовых штаммов были использованы клинические штаммы  и . Они были выделены из влагалищ женщин, больных вагинальным кандидозом, и здоровых женщин.
Отбор I
Lactobacillus
C. albicans
C. albicans
Lactobacillus plantarum
Около 140 штаммов , взятых с человеческой кожи, горла, зубов, из детских экскрементов, а также овощей и семян, культивировались в питательной среде MRS и отпечатывались на чашки с агаровой средой MRS. Чашки с агаровой средой инкубировались в анаэробных условиях при 37°C. Дополнительно агар SAB (Sabouraud) (LAB M, Bury, UK) наливался на агар MRS, после чего ожидалось его застывание. Культура  высевалась на агар, и чашки аэробно инкубировались при 37°C. Проводилась визуальная оценка подавления. Штаммы, подавляющие  также или сильнее, чем эталонный штамм  LB931, выбирались для дальнейшего отбора (отбор II).
Отбор II
Lactobacillus
Candida
C. albicans
C. glabrata
Candida
sp
Суспензии молочнокислых бактерий, выращенных в питательной среде dMRSs (питательная среда MRS без добавления ацетата натрия), центрифугировались и подвергались стерильной фильтрации. Фильтрат в дальнейшем называется бесклеточный фильтрат , LCF. Заданный объем помещался в лунки планшета для микротитрования, после чего подвергался сушке на воздухе, а затем ресуспендировался в стерильной дистиллированной воде до в три раза большей концентрации и помещался в 96-луночный планшет для микротитрования.  добавлялись во все сосуды (использовались три изолята  и  соответственно). Подавление оценивалось путем визуального наблюдения мутности и градуировалась двумя сотрудниками с использованием шаблона на шкале от пяти до нуля. Лунки, содержащие сильно разросшиеся . в чистой dMRSs-питательной среде, градуировались как пять, тогда как лунки с визуально отсутствующим ростом градуировались как нуль.
API-типирование и генотипирование
Идентификация до уровня видов была выполнена с использованием системы API 50 CHL (bioMerieux, France) согласно инструкциям производителя. Данные ферментационных тестов анализировались с использованием программного обеспечения API Lab Plus. Генотипирование проводилось DSMZ (Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH) путем частичного анализа последовательности 16S рРНК.
Результаты
C. albicans
Lactobacillus
Lactobacillus
Lactobacillus
C. albicans
C. glabrata
Для всех штаммов оценивалась подавляющая способность против  в отборе I. 23 штамма  с результатами, сравнимыми с результатами для LB931 или превосходящими их, были выбраны для отбора II. Из этих 23 штаммов  три штамма были эталонными, а большинство было выделено из орального тракта. Фиг. 1 иллюстрирует подавление роста для каждого штамма , при этом каждый столбец представляет средний рост трех штаммов  и трех штаммов  соответственно.
Candida
Lactobacillus
C. albicans
C. glabrata
Lactobacillus fermentum
«Другой 1» продемонстрировал способность к всеобъемлющему подавлению роста . Ни один из тестируемых штаммов  не показал сходной с «Другим 1» активности как на , так и на . «Другой 1» был обозначен Ess-1, и его углеводная схема брожения и генотипирование показали, что он принадлежит к виду .
Характеризация Ess-1
et al
16S рДНК из штамма Ess-1 (DSM 17851) анализировалась DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) путем прямого секвенирования около 450 нуклеотидов ПЦР-амплифицированной 16S рДНК. Извлечение геномной ДНК, ПЦР-опосредованная амплификация 16S рДНК и очистка продукта ПЦР проводились согласно описанному ранее (Rainey, F.A. . Int. J. Sys. Bacteriol. 1996(46):1088-1092). Очищенные продукты ПЦР секвенировались с использованием CEQ™DTCS-набора для быстрого старта (Beckamn Coulter) согласно инструкциям производителя.
Продукты реакции секвенирования были подвергнуты электрофорезу с использованием системы генетического анализа CEQ™8000.
et al
Firmicutes
et
al
et al
Полученные данные по последовательностям помещались в редактор выравниваний ae2 (Maidak, B. L . Nucl. Acids Res. 1999(27):171-173), выравнивались вручную и сравнивались с проверочными последовательностями генов 16S рРНК организма, принадлежащего к  (Maidak, B. L. .). Для сравнения последовательности 16S рРНК были получены из базы данных EMBL или RDP (Maidak, B. L. .).
В качестве результатов данного анализа в Таблице 1 приведены те организмы, последовательности генов 16S рРНК для которых имели наибольшую величину подобия с последовательностью 16S рДНК Ess-1.
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus fermentum
Lactobacillus
Частичная последовательность гена 16S рДНК штамма Ess-1 имела наибольший уровень подобия с . Следовательно, штамм Ess-1 может представлять собой штамм , но также может представлять собой новый вид рода .
Пример 2: Тепловая обработка
Цель
Candida
Цель данного эксперимента состояла в изучении термоустойчивости для подавляющих рост  веществ, продуцируемых штаммом Ess-1.
Метод
C. albicans
C. glabrata
Candida
4
-1
LCF подвергался тепловой обработке в течение 20 минут при 90°C.  и  добавлялись до итоговой концентрации, приблизительно составлявшей 5×l0 КОЕ мл. Чашки инкубировались в течение 20 часов при 37°C, и рост  в сосудах визуально оценивался и градуировался от пяти до нуля.
Результаты
Подвергнутый тепловой обработке фильтрат штамма Ess-1 обладал такой же способностью к подавлению роста дрожжей, что и не подвергавшийся обработке фильтрат, использованный для сравнения. Следовательно, тепловая обработка фильтрата не разрушила активное вещество данной бактерии.
C. albicans
Пример 3: Подавление  посредством LCF с добавлением солей и кислот
Цель
Candida
Цель данного исследования состоит в определении того, влияют ли соли и кислоты на рост , и может ли подавление роста быть улучшено при их добавлении в LCF штамма Ess-1.
Метод-соли
C. albicans
Candida
sp
4
-1
Для аликвот LCF был настроен pH до значения pKa для каждой соли, после чего они подвергались сушке воздухом до полного осушения, затем они ресуспендировались в 0,3% ацетате натрия и пропионате натрия.  добавлялся до итоговой концентрации около 5×10 КОЕ мл. Фракции инкубировались в течение 20 часов при 37°C. Подавление оценивалось путем визуального наблюдения мутности и градуировалась двумя сотрудниками с использованием шаблона на шкале от пяти до нуля. Лунки, содержащие сильно разросшиеся . в чистой dMRSs-питательной среде, градуировались как пять, тогда как лунки с визуально отсутствующим ростом градуировались как нуль.
Методы-кислоты
C. albicans
C. glabrata
Candida
4
-1
Янтарная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота и аскорбиновая кислота добавлялись до итоговой концентрации 50 мМ в пробирки, содержащие LCF. pH фильтрата настраивался до pKa-значения для соответствующей кислоты.  и  добавлялись до итоговой концентрации около 5×10 КОЕ мл. Чашки инкубировались в течение 20 часов при 37°C, и рост  в лунках визуально оценивался и градуировался от пяти до нуля.
Результаты
C. albicans
C. albicans
Было показано, что различные кислоты и соли кислот имеют влияние на рост . Первоначальные результаты показали, что концентрация 50 мМ в фильтратах была наименьшей концентрацией, требуемой для наблюдения влияния некоторых кислот, а 0,1-0,3% - для наблюдения влияний солевых добавок. Пропионат натрия и пропионовая кислота имели наиболее обширное влияние на . Как проиллюстрировано на Фиг. 2a и b, улучшение эффекта подавления роста достигалось в случае, когда аскорбиновая кислота (50мМ, pKa и pH: 4,2) или пропионовая кислота (50мМ, pKa и pH: 4,87) добавлялись к Ess-1 LCF. Это показывает, что эффект взаимного усиления может быть достигнут путем объединения Ess-1 LCF с органическими кислотами и/или их солями. Следовательно, было предсказано, что комбинация клеток Ess-1 с органическими кислотами и/или их солями вызовет подобный эффект взаимного усиления.
Пример 4: Анализ кислот
Цель
Lactobacillus
Цель данного исследования состоит в изучении, продуцирует ли штамм Ess-1 кислоты, которые не продуцируются на более низком уровне другими штаммами  и которые могут быть объяснением сильной способности этого штамма к подавлению дрожжей.
Метод
Lactobacillus
Ess-1 и другие штаммы  культивировались в 45 мл питательной среды dMRSs (питательная среда MRS без добавления ацетата натрия) в течение 18 ч, центрифугировались при 10°C, 3000 об/мин в течение 15 минут. Надосадочная жидкость подвергалась стерильной фильтрации (0,22 мкм, Millex, Billerica, MA, USA) и замораживанию при -55°C до отсылки в Steins Laboratorium A7S (Loddekoping, Sweden) для анализа посредством жидкостной хроматографии.
Результаты
Как видно на Фиг. 3, штамм Ess-1 продуцирует больше янтарной кислоты и больше уксусной кислоты, чем другие протестированные бактериальные штаммы, что может быть одной из причин отличной способности данного штамма к подавлению роста дрожжевых грибков.
Пример 5: Выживание Ess-1 в процессе сублимационной сушки и во время хранения
Цель
Цель данного эксперимента состояла в определении того, выживает ли Ess-1 в процессе сублимационной сушки и остается ли он жизнеспособным при последующем хранении.
Метод
Ess-1 был выращен в MRS, концентрирован в 10 раз в 20% суспензии трегалозы. Суспензия замораживалась при -55°C в пластиковом контейнере. После 24 ч контейнер помещался в аппарат для сублимационной сушки (Hetosicc, Heto Birkerød, Denmark) и обрабатывался в течение 48 ч. Конечный продукт размельчался и помещался в герметичный контейнер для хранения. В целях повышения стресса контейнер помещался в температурных условиях 37°C. Образцы брались на 0, 2, 5 и 11 неделю. Жизнеспособные бактерии подсчитывались путем суспендирования порошка в растворе хлорида натрия и наблюдения на чашках с агаром.
Результаты
Штамм Ess-1 хорошо переносил сублимационную сушку и оставался стабильным в течение 11 недель только с одним снижением логарифма выживаемости в течение данного периода времени. После 17 недель хранения выживаемость уменьшалась на 4,5 по логарифмической шкале. Это указывает на очень хорошую выживаемость бактерий, поскольку обычное хранение производится при комнатной температуре или в холодильнике, а при этих температурах снижение выживаемости происходит даже медленнее.
Пример 6: Выживание штамма Ess-1 после введения во влагалище капсул, содержащих бактерии, подвергавшиеся сублимационной сушке
Цель
Изучение выживания и расселения Ess-1 после введения во влагалище.
Метод
9
Ess-1 был выращен MRS, концентрирован в 10 раз в 20% суспензии трегалозы, и подвергнут сублимационной сушке согласно описанному выше. После измельчения материала порошок заполнялся в желатиновые капсулы (размер 2, Apoteket AB, Gothenburg, Sweden) до концентрации около 1×10 КОЕ на капсулу. Четыре объекта-добровольца участвовали в исследовании путем применения одной капсулы в неделю в течение одного менструального цикла, начиная с введения за несколько дней до менструации. Объекты сами собирали образцы из влагалища один раз в неделю до введения капсулы путем вращения стерильной ватной палочки 5 раз на глубине 3 см во влагалище. Образцы культивировались на чашках с агаровой средой, и определялось число устойчивых к ванкомицину молочнокислых бактерий, морфологически сходных с Ess-1, и, следовательно, считавшихся Ess-1.
Результаты
Ни у одной из женщин не наблюдалось сильного роста устойчивых к ванкомицину молочнокислых бактерий в начале исследования. Все женщины были заселены Ess-1, согласно второму образцу, взятому в течение нескольких дней после менструации. Ess-1 затем обнаруживался в течение всего исследования у некоторых женщин и в некоторых образцах у других. Таким образом, влагалищные капсулы могут быть использованы для заселения влагалища бактериями в течение менструального цикла. Данные представлены в Таблице 2.
Lactobacillus
10
-1
Таблица 2. Количество Ess-1, обнаруженного в образцах из влагалищ женщин, участвовавших в исследовании. В исследовании принимали участие четыре женщины, и ни у одной из них в начале исследования не были обнаружены устойчивые к ванкомицину штаммы  (До). Данные представлены как LogКОЕ мл. Образцы, обозначенные "-", отсутствовали.
Пример 7: Подавление бактерий, вызывающих инфекции, такие как инфекции мочевых путей
Цель
Цель исследования заключалась в изучении, продуцирует ли Ess-1 вещества, которые подавляют рост бактерий, вызывающих инфекции, такие как инфекции мочевых путей.
Метод
E. coli
Klebsiella sp.
E. faecalis
Streptococcus
S. aureus
S. saprophyticus
P. mirabilis
Применялся модифицированный метод агаровой накладки. Ess-1 выращивался в питательной среде MRS в течение 20 ч. 1 мл бактериальной культуры смешивался с 2 мл 7,5М раствором ацетата натрия и 22 мл агара MRS при 50°C и наливался в чашку Петри, после чего ожидалось застывание. Чашка анаэробно инкубировалась при 37°C в течение 20 ч. Дополнительный слой из 24 мл агара M17 смешивался с 0,75 мл 6,5M раствора дигидрофосфата калия и заливался поверх слоя MRS, после чего ожидалось его застывание. Стальной игольчатый репликатор Стира погружался в лунки планшета Бертрама, содержащие выдержанные в течение дня культуры патогенов, и отпечатывался на верху слоя агара. Чашки оставлялись для просушки в течение 30 минут и инкубировались при 37°C в течение 24 ч до начала считывания. В качестве контроля использовалась стерильная питательная среда MRS. pH регистрировался на верху слоя агара после инкубации, а рост классифицировался как «рост» и «отсутствие роста». Патогенные штаммы (всего 23 штамма) были выделены из организмов женщин с инфекциями мочевых путей; они включали  (4),  (4),  (3), энтеробактерии (4),  группы B (3),  (2),  (1) и  (2).
Результаты
Ess-1 подавлял рост всех патогенов, хорошо растущих на контрольной чашке. pH на верху слоя агара составляя 6,0 и, следовательно, никоим образом не влиял на рост.