НОВЫЕ БЕЛКИ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ ИНГИБИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К НАСЕКОМЫМ
NEW PROTEINS SHOWING INHIBITORY ACTIVITY RELATIVELY TO INSECTS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001]
Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США №62/199,024, поданной 30 июля 2015 года, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002]
Файл с именем "MONS394WO-sequence_listing.txt", содержащий машиночитаемую форму списка последовательностей, был создан 19 июля ‎2016 года. Этот файл составляет 16,077 байт (измеренный в MS-Windows), одновременно подан в электронной форме (с использованием системы регистрации EFS-Web Патентного ведомства США) и полностью включается в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003]
Данное изобретение в целом относится к области белков, обладающих ингибиторной активностью в отношении насекомых. Раскрывается новый класс белков, проявляющих инсектицидную ингибирующую активность против сельскохозяйственных вредителей сельскохозяйственных культур и семян. В частности, описанный белок является инсектицидно активным в отношении вредителей сельскохозяйственных культур и семян, в частности видов жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых-вредителей. Предлагаются растения, части растений и семена, содержащие рекомбинантный полинуклеотидный конструкт, кодирующий один или более описанных белков токсина.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004]
Все большее значение приобретает повышение урожайности сельскохозяйственных культур, включая, среди прочего, кукурузу, сою, сахарный тростник, рис, пшеницу, овощи и хлопок. По прогнозам, в дополнение к растущей потребности в сельскохозяйственной продукции для обеспечения пищей, одеждой и обеспечения энергией растущего населения, климатическим последствиям и давления со стороны растущего населения на использование земли, отличной от сельскохозяйственной, уменьшается количество доступных пахотных земель для ведения сельского хозяйства. Данные факторы привели к неоптимистичным прогнозам продовольственной безопасности, особенно в условиях отсутствия значительных улучшений в области биотехнологии растений и агрономических приемов. В свете данных факторов, экологически устойчивые усовершенствования в области технологий, агротехники и борьбы с вредителями являются жизненно важными инструментами для расширения производства сельскохозяйственных культур на ограниченном количестве пахотных земель, доступных для ведения сельского хозяйства.
[0005]
Helicoverpa zea, Ostrinia nubilalis, Diatraea saccharalis, Diatraea grandiosella, Anticarsia gemmatalis, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Agrotis ipsilon, Trichoplusia ni, Chrysodeixis includens, Heliothis virescens, Plutella xylostella, Pectinophora gossypiella, Helicoverpa armigera, Elasmopalpus lignosellus, Striacosta albicosta
Phyllocnistis citrella
Agriotes
Anthonomus
Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis
Cosmopolites
Curculio
Dermestes
Diabrotica
Epilachna
Eremnus
Leptinotarsa decemlineata
Lissorhoptrus
Melolontha
Orycaephilus
Otiorhynchus
Phlyctinus
Popillia
Psylliodes
Rhizopertha
Scarabeidae
Sitophilus
Sitotroga
Tenebrio
Tribolium
Trogoderma
Diabrotica virgifera virgifera
Diabrotica barberi
Diabrotica virgifera zeae
Diabrotica balteata
Diabrotica undecimpunctata howardii
Diabrotica viridula
Diabrotica speciosa
Lygus hesperus
Lygus lineolaris
Pseudatomoscelis seriatus
Насекомые, особенно насекомые в пределах отряда чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых считаются основной причиной повреждения полевых культур, тем самым снижая урожайность культур в зараженных районах. Виды чешуекрылых вредителей, которые отрицательно влияют на сельское хозяйство, включают, но без ограничений: и . Виды жесткокрылых вредителей, которые отрицательно влияют на сельское хозяйство, включают, но без ограничений: spp., spp., , spp., spp., spp., spp., spp., spp., , spp., spp., spp., spp., spp., spp., spp., spp., , spp., spp., spp., spp. и spp, в частности, в которых вредителем является (западный кукурузный жук, WCR), (северный кукурузный жук, NCR), (мексиканский кукурузный жук, MCR), (бразильский кукурузный жук (BZR), (южный кукурузный жук, SCR) и группа бразильского кукурузного жука (BCR), состоящая из и ). Виды полужесткокрылых вредителей, которые отрицательно влияют на сельское хозяйство, включают, но без ограничений: , и .
[0006]
Исторически сложилось так, что интенсивное применение синтетических химических инсектицидов использовалось в качестве средства борьбы с вредителями в сельском хозяйстве. Обеспокоенность по поводу окружающей среды и здоровья человека, помимо возникающих проблем с устойчивостью, стимулировала исследования и разработку биологических пестицидов. Данное исследование привело к прогрессивному открытию и применению различных энтомопатогенных видов микроорганизмов, включая бактерии.
[0007]
Bacillus
Bacillus thuringiensis
Bt
Bt
Bt
например
Bt
Bacillus
Brevibacillus laterosporus
Lysinibacillus sphaericus
Ls
Bacillus sphaericus
Paenibacillus popilliae
Парадигма биологических методов борьбы изменилась, когда был открыт потенциал энтомопатогенных бактерий, особенно бактерий, относящихся к роду , и применен в разработке агентов для биологической борьбы с вредителями. Штаммы бактерии () использовали в качестве источника пестицидных белков, так как было обнаружено, что штаммы проявляют высокую токсичность против конкретных насекомых. Известно, что штаммы продуцируют дельта-эндотоксины, которые локализованы в параспоральных кристаллических тельцах включения в начале споруляции и во время фазы стационарного роста (, белки Cry) и также известно, что они продуцирует секретируемый инсектицидный белок. При проглатывании восприимчивым насекомым, дельта-эндотоксины, а также секретируемые токсины оказывают свое действие на поверхность эпителия средней кишки, разрушают клеточную мембрану, приводя к разрушению и гибели клеток. Гены, кодирующие инсектицидные белки, также были идентифицированы у бактериальных видов, отличных от , в том числе другие и множество других видов бактерий, таких как , ("" ранее известный как ) и .
[0008]
Кристаллические и секретируемые растворимые инсектицидные токсины являются высокоспецифичными для их хозяев и получили мировое признание как альтернативы химическим инсектицидам. Например, инсектицидные белки-токсины применяют в различных сельскохозяйственных целях для защиты хозяйственно-ценных растений от заражения насекомыми, уменьшения потребности в применении химических пестицидов и повышения урожайности. Инсектицидные белки-токсины применяют для борьбы с сельскохозяйственными вредителями культурных растений механизированными способами, такими как распыление дисперсных микробных препаратов, содержащих различные штаммы бактерий, на поверхности растений, и с использованием методов генетической трансформации для получения трансгенных растений и семян, экспрессирующих инсектицидный белок-токсин.
[0009]
Bt
Применение трансгенных растений, экспрессирующих инсектицидные белки-токсины, признано в мировом масштабе. Например, в 2012 году 26,1 миллиона гектаров были засажены трансгенными культурами, экспрессирующими токсины (James, C., Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2012. Краткое содержание отчета ISAAA (Международная служба по сбору сведений о применении биотехнологий в сельском хозяйстве) № 44). Глобальное применение трансгенных культур, защищенных от насекомых, и ограниченное количество инсектицидных белков-токсинов, применяемых для этих культур, создало давление отбора для существующих аллелей насекомых, которые придают устойчивость к применяемым в настоящее время инсектицидным белкам.
[0010]
Развитие резистентности у целевых вредителей к инсектицидным белкам-токсинам создает постоянную потребность в открытии и разработке новых форм инсектицидных токсичных белков, которые полезны для контроля над повышением резистентности насекомых к трансгенным культурам, экспрессирующим инсектицидные белки-токсины. Новые белковые токсины с повышенной эффективностью, и которые контролируют более широкий спектр восприимчивых видов насекомых, уменьшают число выживших насекомых, которые могут развить резистентные аллели. Кроме того, применение в одном растении двух или более трансгенных инсектицидных белков-токсинов, токсичных для одного и того же насекомого-вредителя и демонстрирующих различные способы воздействия, снижает вероятность резистентности у любых отдельных целевых видов насекомых.
[0011]
Bacillus thuringiensis
Таким образом, авторы данного изобретения раскрывают новое семейство белковых токсинов от вместе с подобными белками-токсинами, вариантными белками и типовыми рекомбинантными белками, которые проявляют инсектицидную активность к целевым видам чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых вредителей, в частности, к западному кукурузному жуку.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012]
in planta
В данном документе описана новая группа белков с ингибирующей активностью по отношению к насекомым (белки-токсины), упоминаемые в данном документе как TIC5290, которые, как показано, проявляют ингибирующую активность против одного или более вредителей сельскохозяйственных растений. TIC5290 белок и белки в классе белка-токсина TIC5290 могут применяться отдельно или в сочетании с другими инсектицидными белками и токсичными веществами в препаратах и , таким образом обеспечивая альтернативы инсектицидным белкам и химии инсектицидов, которые в настоящее время используются в сельскохозяйственных системах.
[0013]
В одном варианте реализации изобретения в данной заявке представлена молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащая гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его фрагмент, в котором: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; или (d) указанный полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, содержит полинуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности последовательности к нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; или (e) указанная молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты находится в функциональной связи с вектором, и указанный вектор выбирают из группы, состоящей из плазмиды, фагмиды, бакмиды, космиды и бактериальной или дрожжевой искусственной хромосомы. Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты может содержать последовательность, которая функционирует для экспрессии пестицидного белка в растении; или экспрессируется в растительной клетке для получения пестицидно эффективного количества пестицидного белка.
[0014]
Agrobacterium, Rhizobium
Bacillus
Brevibacillus
Escherichia
Pseudomonas
Klebsiella
Pantoea
Erwinia
Bacillus
Bacillus cereus
Bacillus thuringiensis
Brevibacillus
Brevibacillus laterosperus
Escherichia
Escherichia coli
Gossypium sp.),
В другом варианте реализации изобретения данной заявки присутствуют клетки-хозяева, содержащие молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты данной заявки, причем клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из бактериальной и растительной клетки. Рассматриваемые клетки-хозяева включают в себя , , , , , , и . В определенных вариантах реализации изобретения указанными видами являлись или , указанным являлся , или указанным являлся . Рассматриваемые клетки-хозяева растений включают в себя клетку двудольных и клетку однодольных. Дополнительно, рассматриваемые клетки-хозяева растений включают в себя растительную клетку люцерны, банана, ячменя, фасоли, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника (тыквовых, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, подвои, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
[0015]
Diabrotica viridula
Diabrotica speciosa.
В еще одном варианте реализации изобретения пестицидный белок проявляет активность против жесткокрылого насекомого, в том числе западного кукурузного жука, южного кукурузного жука, северного кукурузного жука, мексиканского кукурузного жука, бразильского кукурузного жука или группы бразильского кукурузного жука, состоящей из и
[0016]
В другом варианте реализации изобретения пестицидный белок проявляет активность против чешуекрылого насекомого, в том числе совки бархатных бобов, огневки тростниковой, точильщика зернового кукурузного, совки хлопковой, табачной листовертки, соевой совки, африканской совки, южной совки, совки травяной, совки свекольной, совки американской, азиатской хлопковой совки, розового коробочного червя хлопчатника, совки-ипсилон, огневки кукурузной юго-западной, капустной моли или мотылька стеблевого кукурузного.
[0017]
В еще одном варианте реализации изобретения пестицидный белок проявляет активность против полужесткокрылого насекомого, в том числе слепняка западного матового, клопа травяного или хлопкового слепняка.
[0018]
Также в данной заявке рассматриваются растения, содержащие молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащую гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидным сегментом, кодирующим пестицидный белок или его фрагмент, причем: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или приблизительно 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется в условиях жесткой гибридизации с комплементарной нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3; или (d) указанное растение проявляет обнаруживаемое количество указанного пестицидного белка. В определенных вариантах реализации изобретения пестицидный белок содержит SEQ ID NO: 2. В одном варианте реализации изобретения растение является однодольным или двудольным. В другом варианте реализации изобретения растение выбирают из группы, состоящей из люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквовых, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, подвои, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы.
[0019]
В дополнительных вариантах реализации изобретения описываются семена, содержащие молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты.
[0020]
В другом варианте реализации изобретения рассматривается описанная в данной заявке композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащая молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты. Композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, может дополнительно содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один другой пестицидный агент, который отличается от указанного пестицидного белка. По меньшей мере один другой пестицидный агент выбирают из группы, состоящей из белка, обладающего ингибиторной активностью по отношению к насекомым, молекулы дцРНК, обладающей ингибиторной активностью по отношению к насекомым, и вспомогательного белка. По меньшей мере один другой пестицидный агент в композиции, обладающей ингибирующей активностью по отношению к насекомым, проявляет активность против одного или более видов вредителей из отрядов чешуекрылых, жесткокрылых или полужесткокрылых. По меньшей мере один другой пестицидный агент в композиции, обладающей ингибирующей активностью по отношению к насекомым, в одном варианте реализации изобретения является выбранным из группы, состоящей из: Cry1A, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A. 105, Cry1Ae, Cry1B, Cry1C, вариантов Cry1C, Cry1D, Cry1E, Cry1F, химер Cry1A/F, Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, Cry2A, Cry2Ab, Cry2Ae, Cry3, вариантов Cry3A, Cry3B, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry34, Cry35, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET29, ET33, ET34, ET35, ET66, ET70, TIC400, TIC407, TIC417, TIC431, TIC800, TIC807, TIC834, TIC853, TIC900, TIC901, TIC1201, TIC1415, TIC2160, TIC3131, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869, TIC1100, VIP3A, VIP3B, VIP3Ab, AXMI-AXMI-, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100, AXMI-115, AXMI-113 и AXMI-005, AXMI134, AXMI-150, AXMI-171, AXMI-184, AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, AXMI-209, AXMI-205, AXMI-218, AXMI-220, AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z и AXMI-225z, AXMI-238, AXMI-270, AXMI-279, AXMI-345, AXMI-335, AXMI-R1 и его вариантов, IP3 и его вариантов, DIG-3, DIG-5, DIG-10, DIG-657 и белка DIG-11.
[0021]
Рассматриваются товарные продукты, содержащие обнаруживаемое количество молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке. Такие товарные продукты включают в себя товарную кукурузу, упакованную обработчиком зерна, кукурузные хлопья, кукурузные лепешки, кукурузную муку, кукурузную муку крупного помола, кукурузный сироп, кукурузное масло, кукурузный силос, кукурузный крахмал, кукурузную кашу и тому подобное, а также соответствующие хлопковые товарные продукты, такие как цельные или обработанные семена хлопчатника, хлопковое масло, линт, семена и части растений, обработанные для корма или продуктов питания, волокно, бумага, биомассы и топливные продукты, такие как топливо, полученное из хлопкового масла или таблеток, полученных из отходов хлопковой очистки, и соответствующие товарные продукты из сои такие как цельные или обработанные семена сои, соевое масло, соевый белок, соевая мука крупного помола, соевая мука, соевые хлопья, соевые отруби, соевое молоко, соевый сыр, соевое вино, корм для животных, содержащий соевые бобы, бумага, содержащая сою, сливки, содержащие сою, биомассу соевых бобов и топливные продукты, произведенные с использованием растений сои и частей растений сои, а также соответствующие продукты из риса, пшеницы, сорго, голубиного гороха, арахиса, фруктов, дыни и товарной продукции овощей, включая, где это применимо, соки, концентраты, джемы, желе, мармелады и другие съедобные формы таких товарных продуктов, содержащих обнаруживаемое количество таковых полинуклеотидов и или полипептидов данной заявки.
[0022]
В данной заявке также рассматривается способ производства семян, содержащих молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке. Способ включает посадку, по меньшей мере, одного из семени, содержащего молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, описанной в данной заявке; выращивание растения из семени; и сбор семени из растений, причем собранное семя содержит молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты данной заявки.
[0023]
В другом иллюстративном варианте реализации изобретения предлагается растение, устойчивое к заражению насекомыми, в котором клетки указанного растения содержат: (a) молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующую инсектицидно эффективное количество пестицидного белка, как указано в SEQ ID NO: 2; или (b) инсектицидно эффективное количество белка, содержащего аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или примерно 100% идентичность аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2.
[0024]
,
Также в данной заявке описаны способы борьбы с вредителями видов жесткокрылых или чешуекрылых, или полужесткокрылых, и борьбы с поражением растений вредителями видов жесткокрылых или чешуекрылых, или полужесткокрылыхв частности сельскохозяйственной культуры. В одном варианте реализации изобретения способ включает (a) приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или более пестицидных белков, как указано в SEQ ID NO: 2; или (b) приведение в контакт вредителя с инсектицидно эффективным количеством одного или более пестицидных белков, содержащих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или примерно 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2.
[0025]
Дополнительно в данном документе предлагается способ обнаружения наличия молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащей полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, в котором: (a) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или (b) указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или приблизительно 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2; или (c) указанный полинуклеотидный сегмент гибридизуется с полинуклеотидом, имеющим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3. В одном варианте реализации изобретения способ включает приведение в контакт образца нуклеиновых кислот с зондом на основе нуклеиновой кислоты, который гибридизуется в условиях жесткой гибридизации с геномной ДНК из растения, содержащего полинуклеотидный сегмент, кодирующий пестицидный белок или его фрагмент, представленный в данном документе, и не гибридизуется в таких условиях гибридизации с геномной ДНК из другого изогенного растения, которое не содержит сегмент, причем зонд является гомологичным или комплементарным к SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, или последовательности, которая кодирует пестицидный белок, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2. Способ может дополнительно включать в себя (a) применение к образцу и зонду жестких условий гибридизации; и (b) обнаружение гибридизации зонда с ДНК образца.
[0026]
Также изобретением предусмотрены способы обнаружения наличия пестицидного белка или его фрагмента в образце, содержащем белок, причем указанный пестицидный белок, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; или указанный пестицидный белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 65%, или 70%, или 75%, или 80%, или 85%, или 90%, или 95%, или 98%, или 99%, или около 100% идентичности аминокислотной последовательности к SEQ ID NO: 2. В одном варианте реализации изобретения способ включает в себя: (a) приведение в контакт образца с иммунореактивным антителом; и (b) обнаружение наличия белка. В некоторых вариантах реализации изобретения этап обнаружения включает в себя твердофазный иммуноферментный анализ ELISA или вестерн-блоттинг.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0027]
in planta
На Фиг. 1 изображена ингибирующая активность типовых целевых и нецелевых белков TIC5290 хлоропласта к западному кукурузному жуку (WCR).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0028]
Bacillus thuringiensis
SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую последовательность пестицидного белка TIC5290, полученную из вида EG6657.
[0029]
SEQ ID NO: 2 представляет собой аминокислотную последовательность белка TIC5290.
[0030]
SEQ ID NO: 3 представляет собой синтетическую кодирующую последовательность, которая кодирует пестицидный белок TIC5290, используемый для экспрессии в растительных клетках.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0031]
Проблема в области борьбы с сельскохозяйственными вредителями может быть охарактеризована как потребность в новых белках-токсинах, которые эффективны против целевых вредителей, проявляют токсичность широкого спектра по отношению к целевым видам вредителей, способны экспрессироваться в растениях, не вызывая нежелательных агрономических проблем, и обеспечивают альтернативный способ воздействия по сравнению с существующими на сегодняшний день токсинами, которые используют в растениях в коммерческих целях.
[0032]
В данном документе описаны новые инсектицидные белки, примером которых является TIC5290 и родственные члены семейства, которые обеспечивают устойчивость к жесткокрылым, чешуекрылым и полужесткокрылым насекомым-вредителям, более конкретно к видам-вредителям кукурузных жуков. Также описанными являются синтетические кодирующие последовательности, предназначенные для экспрессии в растительной клетке, которые кодируют TIC5290. Далее описаны молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, содержащие промотор в оперативной связи с кодирующей последовательностью, которая кодирует белок-токсин TIC5290, или родственные члены семейства или их фрагменты.
[0033]
Ссылка в этой заявке на TIC5290, "белок TIC5290", "белковый токсин TIC5290", "белок-токсин TIC5290", "пестицидный белок TIC5290", "TIC5290-подобные токсины", или "TIC5290-подобные белки-токсины" и тому подобные, относится к любому новому пестицидному белку или обладающему ингибиторной активностью по отношению к насекомым белку, который включает в себя, состоит, является по существу гомологичным, является подобным или получен из любого пестицидного белка или обладающей ингибиторной активностью по отношению к насекомым белковой последовательности TIC5290 (SEQ ID NO: 2), а также их ингибирующим пестицидным или обладающим ингибиторной активностью по отношению к насекомым сегментам или их комбинациям, которые придают активность против жесткокрылых насекомых-вредителей, чешуекрылых насекомых-вредителей и полужесткокрылых насекомых-вредителей, включая любой белок, проявляющий пестицидную или ингибирующую активность по отношению к насекомым, если выравнивание такого белка с TIC5290 приводит к идентичности аминокислотной последовательности любого процента фракции от около 65 до около 100 процентов.
[0034]
Термин "сегмент" или "фрагмент" используется в данной заявке для описания непрерывных последовательностей аминокислот или нуклеиновых кислот, которые короче, чем полная аминокислотная или нуклеотидная последовательность, описывающая белок TIC5290 или связанный с ним член семейства инсектицидных белков. Сегмент или фрагмент, проявляющий ингибирующую активность в отношении насекомых, также раскрыт в данной заявке, если выравнивание такого сегмента или фрагмента с соответствующим участком белка TIC5290, изложенным в SEQ ID NO: 2 приводит к идентичности аминокислотной последовательности любого процента фракции от около 65 до около 100 процентов между сегментом или фрагментом и соответствующим участком белка TIC5290.
[0035]
В контексте данной заявки термины "активная" или "активность", "пестицидная активность" или "пестицидная" или "инсектицидная активность", "ингибитор в отношении насекомых" или "инсектицидная" относятся к эффективности токсического вещества, такого как белок-токсин, в ингибировании (ингибировании роста, питания, плодовитости или жизнеспособности), подавлении (подавлении роста, кормления, плодовитости или жизнеспособности), борьбе (борьбе с поражением насекомыми-вредителями, контроле интенсивности питания насекомых-вредителей на определенной культуре, содержащей эффективное количество белка TIC5290), или уничтожении (вызывающем заболеваемость, смертность или снижение плодовитости) вредителя. Эти термины призваны включать в себя результат обеспечения пестицидно эффективного количества токсичного белка для вредителя, при котором предоставление вредителю токсичного белка приводит к заболеваемости, смертности, снижению плодовитости или задержке роста. Данные термины также включают отпугивание вредителя от растения, ткани растения, части растения, семян, растительных клеток или от конкретного географического местоположения, причем растение может расти, в результате обеспечения пестицидно эффективного количества токсичного белка в или на растении. В общем, пестицидная активность относится к способности токсичного белка быть эффективным в ингибировании роста, развития, жизнеспособности, кормового поведения, брачного поведения, плодовитости или любого измеримого снижения, вызванного неблагоприятными эффектами, в связи с предоставлением в рацион насекомого данного белка, фрагмента белка, сегмента белка или полинуклеотида, конкретному целевому вредителю, включая, но не ограничиваясь ими, насекомых отряда чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых. Токсичный белок может быть произведен растением или может быть применен к растению или к окружающей среде в том месте, где находится растение. Термины "биоактивность", "эффективный", "действенный" или их вариации также являются терминами, взаимозаменяемо используемыми в данной заявке, для описания воздействия белков данного изобретения на целевых насекомых-вредителей.
[0036]
Пестицидно эффективное количество токсического вещества, обеспеченное в рационе целевого вредителя, проявляет пестицидную активность при контакте токсического вещества с вредителем. Токсичное вещество может представлять собой пестицидный белок или одно, или более химических веществ, известных в данной области техники. Пестицидные или инсектицидные химические вещества и пестицидные или инсектицидные белковые агенты могут быть использованы по отдельности или в сочетании друг с другом. Химические вещества включают в себя, но без ограничений, молекулы дцРНК, нацеленные на специфические гены для подавления в целевом вредителе, органохлориды, органофосфаты, карбаматы, пиретроиды, неоникотиноиды и рианоиды. Пестицидные или инсектицидные белковые агенты включают в себя белковые токсины, изложенные в данной заявке, а также другие белковые токсичные вещества, включая те, которые нацелены на виды-вредители чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых, а также белковые токсины, которые используются для борьбы с другими вредителями растений, такие как белки Cry, доступные в данной области техники для применения при борьбе с видами чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых.
[0037]
Предполагается, что ссылка на вредителя, особенно вредителя сельскохозяйственного растения, означает вредителей культурных растений, особенно тех вредителей, которые контролируются белком TIC5290. Однако, ссылка на насекомого-вредителя может также включать в себя равнокрылых насекомых-вредителей, а также нематод и грибов при тех условиях, когда токсичные вещества, нацеленные на этих вредителей, совместно локализуются или присутствуют вместе с белком TIC5290 или белком, который имеет от около 65 до около 100 процентов идентичности с TIC5290.
[0038]
Инсектицидные белки, класса белковых токсинов TIC5290 связаны общей функцией и проявляют инсектицидную активность по отношению к насекомым-вредителям из видов жесткокрылых и чешуекрылых насекомых, включая взрослых особей, куколок, личинок и новорожденных, а также представителей полужесткокрылых, включая взрослых особей и нимф.
[0039]
например
Spodoptera frugiperda
Spodoptera exigua
Mamestra configurata
Spodoptera eridania
Agrotis ipsilon
Trichoplusia ni
Pseudoplusia includens
Anticarsia gemmatalis
Hypena scabra
Heliothis virescens
Agrotis subterranea
Pseudaletia unipuncta
Agrotis orthogonia
например,
Ostrinia nubilalis
Amyelois transitella
Crambus caliginosellus
Herpetogramma licarsisalis
Homoeosoma electellum
Elasmopalpus lignosellus
например
Cydia pomonella
Endopiza viteana
Grapholita molesta
Suleima helianthana
например
Plutella xylostella
Pectinophora gossypiella
Lymantria dispar
например
Alabama argillacea
Archips argyrospila
Archips rosana
Chilo suppressalis,
Cnaphalocrocis medinalis
Crambus caliginosellus
Crambus teterrellus
Diatraea grandiosella
Diatraea saccharalis
Earias insulana
Earias vittella
Helicoverpa armigera
Helicoverpa zea,
Heliothis virescens
Herpetogramma licarsisalis
Lobesia botrana
Phyllocnistis citrella
Pieris brassicae
Pieris rapae,
Plutella xylostella
Spodoptera exigua
Spodoptera litura
Tuta absoluta
Насекомые отряда чешуекрылых, включают в себя, но без ограничений, совок луговых, совок, пядениц, и совок из семейства Noctuidae, , кукурузную листовую совку (), совку помидорную (), совку латуковую (), южную совку (), совку-ипсилон (), совку капустную (), соевую совку (), совку бархатных бобов (), совку клеверную (), табачную листовертку (), совку хлопковую (), совку луговую (), совку прямоугольную (); точильщиков, чехлоносок, бабочек, огневок шишковых, гусениц бабочки капустницы и пироморфид из семейства Pyralidae, мотылька стеблевого кукурузного (), бабочку-огневку (), кукурузную огневку (), лугового мотылька (), огневку подсолнечниковую (), точильщика зернового кукурузного (); листоверток, дымчастых листоверток, плодожорок и плодовых листоверток из семейства Tortricidae, , плодожорку яблонную (), листовертку виноградную (), листовертку восточную (), листовертку подсолнечника (); и многих других экономически важных чешуекрылых, , капустную моль (), розового коробочного червя () и шелкопряда непарного (). Насекомые отряда чешуекрылых, включают в себя, , совку хлопковую американскую (), листовертку плодовых деревьев (), листовертку розанова () и других представителей листоверток, (огневку стеблевую азиатскую или желтую рисовую огневку), листовертку рисовую (), блошку длинноусую (), гусеницу мятлика (), огневку кукурузную юго-западную (), тростниковую огневку (), совку хлопковую египетскую (), совку пятнистую (), совку американскую (), американскую кукурузную совку (также известную как совка хлопковая), табачную листовертку (), мотылька лугового (), листовертку виноградную (), цитрусовую минирующую моль (), белянку капустную (), белянку репную (также известную как репница), капустную моль (), совку свекольную (), табачную совку (, также известную как табачный озимый червь) и томатную минирующую моль ().
[0040]
Agriotes
Anthonomus
Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis
Cosmopolites
Curculio
Dermestes
Diabrotica
Epilachna
Eremnus
Leptinotarsa decemlineata
Lissorhoptrus
Melolontha
Orycaephilus
Otiorhynchus
Phlyctinus
Popillia
Psylliodes
Rhizopertha
Scarabeidae
Sitophilus
Sitotroga
Tenebrio
Tribolium
Trogoderma
Diabrotica virgifera
Diabrotica barberi
Diabrotica virgifera zeae
Diabrotica balteata
Diabrotica undecimpunctata howardii
Diabrotica viridula
Diabrotica speciosa
Насекомые отряда жесткокрылых включают в себя, но без ограничений, spp., spp., , spp., spp., spp., spp., spp., spp., , spp., spp., spp., spp., spp., spp., spp., spp., , spp., spp., spp., spp. и spp, в частности, в которых вредителем является западный кукурузный жук (, WCR), северный кукурузный жук (, NCR), мексиканский кукурузный жук (, MCR), бразильский кукурузный жук (, BZR), южный кукурузный жук (, SCR) и группа бразильского кукурузного жука (BCR, состоящая из и ).
[0041]
Lygus hesperus
Lygus lineolaris
Pseudatomoscelis seriatus
Насекомые отряда полужесткокрылых включают в себя, но без ограничений, слепняка западного матового (), клопа травяного () и хлопкового слепняка ().
[0042]
то есть
В контексте данной заявки термин "изолированная молекула ДНК" или эквивалентный термин или фраза означает, что молекула ДНК представляет собой молекулу ДНК, которая присутствует отдельно или в комбинации с другими композициями, но не в ее естественной среде. Например, элементы нуклеиновой кислоты, такие как кодирующая последовательность, интронная последовательность, нетранслируемая лидерная последовательность, промоторная последовательность, терминирующая последовательность транскрипции и тому подобные, которые, естественно, находятся в ДНК генома организма, не считаются "выделенными" до тех пор, пока элемент находится в геноме организма и в том месте генома, в котором он встречается в природе. Тем не менее, каждый из этих элементов и их части были бы "выделены" в рамках данного описания при условии, если элемент не находится внутри генома организма и не в том месте в геноме, в котором он встречается в природе. Точно так же нуклеотидная последовательность, кодирующая инсектицидный белок или любой встречающийся в природе инсектицидный вариант этого белка, будет представлять собой выделенную нуклеотидную последовательность, если нуклеотидная последовательность не находится в ДНК бактерии, в которой естественным образом находится последовательность, кодирующая белок. Синтетическая нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность природного инсектицидного белка, будет считаться выделенной для целей данного описания. Для целей данного описания любая трансгенная нуклеотидная последовательность, , нуклеотидная последовательность ДНК, встроенная в геном клеток растения или бактерии или присутствующая во внехромосомном векторе, будет считаться выделенной нуклеотидной последовательностью независимо от того, присутствует ли она в плазмиде или подобной структуре, используемой для трансформации клеток, в геноме растения или бактерии, или присутствует в обнаруживаемых количествах в тканях, потомстве, биологических образцах или товарах, полученных из растения или бактерии.
[0043]
Bacillus thuringiensis
Diabrotica virgifera virgifera
Spodoptera frugiperda
Helicoverpa zea
Ostrinia nubilalis
Plutella xylostella
Lygus hesperus
Как описано далее в данном документе, открытая рамка считывания (ОРС), кодирующая TIC5290 (SEQ ID NO: 1), была обнаружена в ДНК, полученной из штамма EG6657 . Кодирующую последовательность клонировали и экспрессировали в микробных клетках-хозяевах для получения белка (SEQ ID NO: 2), используемого в биологических анализах. Ближайшим гомологом токсина TIC5290 является белок Vip4Aa с идентичностью последовательности 56,9%, что указывает на то, что TIC5290 представляет собой новое подсемейство Vip4. Биологический анализ с использованием белков TIC5290, полученных из микробных клеток-хозяев, продемонстрировал активность против вредителя жесткокрылых западного кукурузного жука (, WCR); видов чешуекрылых - кукурузной листовой совки (, FAW), американской кукурузной совки (, CEW), мотылька стеблевого кукурузного () и капустной моли (); а также вредителя полужесткокрылых слепняка западного матового ().
[0044]
Предполагается, что дополнительные последовательности белка-токсина, связанные с TIC5290, могут быть созданы с использованием естественной аминокислотной последовательности TIC5290 для создания новых белков с новыми свойствами. Белок-токсин TIC5290 может быть выровнен с другими белками, подобными к TIC5290, с целью объединения различий на уровне аминокислотной последовательности для новых вариантов аминокислотных последовательностей и внесения соответствующих изменений в последовательность рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которая кодирует варианты.
[0045]
in planta
Дополнительно следует иметь в виду, что улучшенные варианты TIC5290 могут быть сконструированы с использованием различных способов генной инженерии, известных в данной области техники. Такие технологии, используемые в генной инженерии, включают в себя, но без ограничений, ZFN (нуклеазу с цинковыми пальцами), мегануклеазы, TALEN (эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции) и системы CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками)/Cas (CRISPR-ассоциированные). Такие способы генной инженерии могут быть использованы для изменения кодирующей последовательности белка-токсина, трансформированной в растительную клетку, в другую последовательность, кодирующую токсин. В частности, с помощью этих способов один или более кодонов в кодирующей последовательности токсина изменяются с целью разработки новой белковой аминокислотной последовательности. В альтернативном варианте, фрагмент в пределах кодирующей последовательности заменяется или удаляется, или дополнительные фрагменты ДНК вставляются в кодирующую последовательность для создания новой кодирующей последовательности токсина. Новая кодирующая последовательность может кодировать белок-токсин с новыми свойствами, такими как повышенная активность или увеличенный спектр против насекомых-вредителей, а также обеспечивать активность против видов насекомых-вредителей, которые развили устойчивость против исходного белка-токсина. Растительная клетка, содержащая редактированную последовательность гена токсина, может быть использована, с помощью способов известных в данной области техники, для получения целых растений, экспрессирующих новый белок-токсин.
[0046]
Также предполагается, что фрагменты белка TIC5290 или его варианты, могут быть укороченными формами с ингибирующей активностью в отношении насекомых, в которых одна или более аминокислот удаляются с N-конца, С-конца, середины белка, или их комбинаций. Эти фрагменты могут быть естественного происхождения или синтетическими вариантами TIC5290 или вариантами производного белка, но должны сохранять ингибирующую активность TIC5290 в отношении насекомых.
[0047]
и соавт
Белки, которые напоминают белок TIC5290, могут быть идентифицированы путем сравнения друг с другом с использованием различных компьютерных алгоритмов, известных в данной области техники. Например, идентичности аминокислотных последовательностей белков, связанных с TIC5290, может быть проанализирована с использованием выравнивания Clustal W с использованием данных параметров по умолчанию: Матрица сравнения: blosum, штраф на внесение делеции в выравнивание: 10,0, штраф на продолжение делеции: 0,05, гидрофильные делеции: Вкл., гидрофильные остатки: GPSNDQERK, штраф на остаткоспецифичные делеции: Вкл. (Thompson, (1994) Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Процент идентичности аминокислот далее рассчитывается в виде выражения 100% умноженных на (идентичности аминокислот/длина искомого белка). Другие алгоритмы выравнивания также доступны в данной области техники и обеспечивают результаты, аналогичные тем, которые получены с использованием выравнивания Clustal W.
[0048]
Предполагается, что белок, проявляющий ингибирующую активность в отношении видов чешуекрылых, жесткокрылых или полужесткокрылых насекомых, является связанным с TIC5290, если выравнивание такого искомого белка с TIC5290 демонстрирует, по меньшей мере, от 65% до 100% идентичности аминокислот по длине искомого белка что составляет около 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% идентичности аминокислотной последовательности (или любой процент в данном диапазоне) между искомым и исследуемым белком.
[0049]
Белок TIC5290 также может быть связан первичной структурой (консервативные аминокислотные мотивы), длиной (около 937 аминокислот) и другими характеристиками. Биоинформационный анализ показывает, что TIC5290 является порообразующим белком, имеет домен PA14 Pfam (PF07691), который, вероятно, вовлечен в связывание с клеточным рецептором(-ами) в желудке целевого насекомого, домен находится в позиции аминокислот с 16 по 140 аминокислоту, а затем следует домен Binary_toxB Pfam (PF03495) в позиции аминокислот с 186 по 593, что может способствовать образованию бета-складчатой трансмембранной поры. Оба этих Pfam, вероятно, способствуют инсектицидной активности белка. Характеристики белкового токсина TIC5290 представлены в таблице 1.
Таблица 1. Отдельные характеристики белка TIC5290.
<b></b><b><u>Белок</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Молекулярная масса (в дальтонах)</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Аминокислотная длина</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Изоэлектрическая точка</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Заряд при PH 7,0</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Количество сильноосновных (-) аминокислот</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Количество сильнокислых аминокислот</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Количество гидрофобных аминокислот</u></b><b></b>
<b></b><b><u>Количество полярных аминокислот</u></b><b></b>
TIC5290
104962,93
937
6,7076
1,0
116
110
440
497
[0050]
Как описано далее в примерах данной заявки, последовательности молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие TIC5290, были сконструированы для применения в растениях. Иллюстративная, оптимизированная для растений, последовательность молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующая белок TIC5290, которая была сконструирована для применения в растениях, изложена в SEQ ID NO: 3.
[0051]
Agrobacterium
и соавт.
o
1
Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие эти синтетические последовательности нуклеиновой кислоты, могут быть сконструированы и введены в клетки растений кукурузы, сои, хлопчатника или клетки других растений в соответствии со способами и методиками трансформации, известными в данной области техники. Например, опосредованная трансформация описана в публикациях патентной заявки США 2009/0138985A1 (соя), 2008/0280361A1 (соя), 2009/0142837A1 (кукуруза), 2008/0282432 (хлопчатник), 2008/0256667 (хлопчатник), 2003/0110531 (пшеница), 2001/0042257 A1 (сахарная свекла), патентах США №5,750,871 (канола), 7,026,528 (пшеница) и 6,365,807 (рис), и в Arencibia (1998) Transgenic Res. 7:213-222 (сахарный тростник) полное содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки. Трансформированные клетки могут быть воспроизведены в трансформированные растения, которые экспрессируют TIC5290 и демонстрируют пестицидную активность посредством биологических анализов, проводимых в присутствии личинок вредителей чешуекрылых или полужесткокрылых, использующих листовые диски, полученные из трансформированных растений. Для испытания пестицидной активности к вредителям жесткокрылых, трансформированные растения генерации R и F использовались в анализе влияния вредителя на корень, как описано в примере ниже.
[0052]
то есть
например
например
В качестве альтернативы традиционным способам трансформации, последовательность ДНК, такая как трансген, экспрессионная кассета(-ты) и тому подобные, может быть вставлена или интегрирована в конкретный сайт или локус в геноме растения или растительной клетки через сайт-направленную интеграцию. Таким образом, конструкт(-ты) рекомбинантной ДНК и молекула(-ы) данного описания могут включать в себя последовательность донорной матрицы, содержащую, по меньшей мере, один трансген, экспрессионную кассету или другую последовательность ДНК для вставки в геном растения или растительной клетки. Такая донорная матрица для сайт-направленной интеграции может дополнительно включать в себя одно или два гомологичных "плеча", фланкирующие последовательность вставки (, последовательность, трансген, кассету и тому подобное, которые должны быть вставлены в растительный геном). Конструкт(-ты) рекомбинантной ДНК данного описания может дополнительно содержать экспрессионную кассету(-ты), кодирующую сайт-специфическую нуклеазу и/или любой связанный белок(-ки) для осуществления сайт-направленной интеграции. Такая кассета(-ты), экспрессирующая нуклеазу, может присутствовать в той же молекуле или векторе, что и донорная матрица (в цис) или на отдельной молекуле или векторе (в транс). В данной области техники известно несколько способов сайт-направленной интеграции с участием различных белков (или комплексов белков и/или направляющей РНК), которые режут геномную ДНК для получения двухцепочечного разрыва (ДЦР, DSB-double strand break) или ника на желаемом геномном сайте или локусе. Как понятно из уровня техники, в процессе репарации ДЦР или ника, произведенных ферментом нуклеазы, ДНК донорной матрицы может интегрироваться в геном в месте ДЦР или ника. Наличие гомологичного "плеча"(-чей) в донорной матрице может способствовать внедрению и нацеливанию последовательности вставки в геном растения во время процесса репарации посредством гомологичной рекомбинации, хотя вставка может происходить посредством негомологичного соединения концов (NHEJ-non-homologous end joining). Примерами использующихся сайт-специфичных нуклеаз являются нуклеазы с цинковыми пальцами, сконструированные или нативные мегануклеазы, TALE-эндонуклеазы и управляемые при помощи РНК-гидов эндонуклеазы (, Cas9 или Cpf1). Для способов использования управляемых при помощи РНК-гидов сайт-специфических эндонуклеаз (, Cas9 или Cpf1), конструкт(-ты) рекомбинантной ДНК также будет содержать последовательность, кодирующую одну или более направляющих РНК для направления нуклеазы на желаемый участок в геноме растения.
[0053]
Bt
Bt
Bacillus
то есть
Рассматриваются композиции молекул рекомбинантной нуклеиновой кислоты, которые кодируют TIC5290. Например, белок TIC5290 может быть экспрессирован конструктами рекомбинантной ДНК, в которых молекула полинуклеотида с ОРС (открытой рамкой считывания), кодирующая белок, функционально связана с элементами генетической экспрессии, такими как промотор и любой другой регуляторный элемент, необходимый для экспрессии в системе для которой предназначен данный конструкт. Неограничивающие примеры включают функциональный промотор растения, функционально связанный с кодирующими последовательностями белка TIC5290, для экспрессии белка в растениях, или -функциональный промотор, функционально связанный с кодирующей последовательностью белка TIC5290, для экспрессии белка в бактерии или других видах рода . Другие элементы могут быть функционально связаны с кодирующими последовательностями белка TIC5290, включая, но не ограничиваясь ими, энхансеры, интроны, нетранслируемые лидеры, кодированные белковые иммобилизационные метки (гистидиновые метки), транслокационные пептиды (, пластидные транзитные пептиды, сигнальные пептиды) полипептидные последовательности для посттрансляционных модифицирующих ферментов, сайты связывания рибосом и сайты-мишени РНКи. Типичные рекомбинантные полинуклеотидные молекулы, представленные в данном документе, включают в себя, но без ограничений, гетерологичный промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, таким как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3, который кодирует полипептид или белок, имеющий аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2. Гетерологичный промотор также может быть функционально связан с синтетическими кодирующими последовательностями ДНК, кодирующими TIC5290, нацеленный на пластид, и ненацеленный TIC5290. Кодоны молекулы рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующие белок, описанный в данном документе, могут быть заменены синонимичными кодонами (известны в данной области техники как молчащие замены).
[0054]
Конструкт рекомбинантной ДНК, содержащий последовательность, кодирующую белок TIC5290, может дополнительно содержать область ДНК, которая кодирует одно или более веществ, обладающих ингибирующей активностью в отношении насекомых, которые могут быть сконструированы для одновременной экспрессии или коэкспрессии с последовательностью ДНК, кодирующей белок TIC5290, белок отличный от белка TIC5290, молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью в отношении насекомых, или вспомогательный белок. Вспомогательные белки включают в себя, но без исключений, кофакторы, ферменты, партнеры по связыванию или другие агенты, которые способствуют повышению эффективности агента, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, например, способствуя его экспрессии, влияя на его стабильность в растениях, оптимизируя свободную энергию для олигомеризации, увеличивая его токсичность и увеличивая спектр его активности. Вспомогательный белок может облегчать захват одного или более веществ, обладающих ингибирующих активностью в отношении насекомых, например, или усиливать токсическое действие токсического вещества.
[0055]
Конструкт рекомбинантной ДНК можно собирать так, чтобы все белки или молекулы дцРНК были экспрессированы из одного промотора, или каждый белок или молекула дцРНК экспрессировались под контролем отдельного промотора, или в определенной их комбинации. Белки согласно данному изобретению могут быть экспрессированы из мультигенной система экспрессии, в которой белок TIC5290 экспрессируется из общего нуклеотидного сегмента, который также содержит другие открытые рамки считывания и промоторы, в зависимости от выбранного типа системы экспрессии. Например, мультигенная система экспрессии растений может использовать единственный промотор для управления экспрессией многократносвязанных/тандемных открытых рамок считывания из одного оперона. В другом примере мультигенная система экспрессии растений может использовать многократно несвязанные экспрессионные кассеты, каждая из которых экспрессирует другой белок или другой агент, такой как одна или более молекул дцРНК.
[0056]
например
Рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты или конструкции рекомбинантной ДНК, содержащие последовательность, кодирующую белок TIC5290, могут быть доставлены в клетки-хозяева векторами, , плазмидой, бакуловирусом, синтетической хромосомой, вирионом, космидой, фагмидой, фагом или вирусным вектором. Такие векторы могут быть использованы для достижения стабильной или транзиентной экспрессии последовательности, кодирующей белок TIC5290, в клетке-хозяине, или более поздней экспрессии кодируемого полипептида. Экзогенный рекомбинантный полинуклеотид или конструкт рекомбинантной ДНК, который содержит последовательность, кодирующую белок TIC5290, и который вводится в клетку-хозяина, упоминаемая в данном документе как "трансген".
[0057]
Agrobacterium
Bacillus
Escherichia
Salmonella
Pseudomonas
Rhizobium
В данном документе представлены трансгенные бактерии, трансгенные клетки растений, трансгенные растения и части трансгенных растений, которые содержат рекомбинантный полинуклеотид, экспрессирующий любую одну или более из кодирующих последовательностей белка TIC5290. Термин "бактериальная клетка" или "бактерия" может включать в себя, но без ограничений, клетку , , , , , или . Термин "клетка растения" или "растение" может включать в себя, но без ограничений, клетку двудольного растения или клетку однодольного растения. Рассматриваемые растения и клетки растений включают в себя, но без ограничений, клетку или растение люцерны, банана, ячменя, бобов, брокколи, капусты, Brassica, моркови, маниоки, клещевины, цветной капусты, сельдерея, нута, китайской капусты, цитрусовых, кокосовой пальмы, кофе, кукурузы, клевера, хлопчатника, тыквовых, огурца, Дугласовой пихты, баклажана, эвкалипта, льна, чеснока, винограда, хмеля, лука-порея, салата-латука, сосны ладанной, проса, дыни, грецкого ореха, овса, оливы, лука, декоративного растения, пальмы, пастбищной травы, гороха, арахиса, перца, голубиного гороха, сосны, картофеля, тополя, тыквы, сосны лучистой, редиса, рапса, риса, подвои, ржи, американского шафрана, кустарника, сорго, южной сосны, сои, шпината, кабачка, клубники, сахарной свеклы, сахарного тростника, подсолнечника, сладкой кукурузы, амбрового дерева, сладкого картофеля, проса прутьевидного, чая, табака, томата, тритикале, дерновой травы, арбуза и пшеницы. В некоторых вариантах реализации изобретения представлены трансгенные растения и части трансгенных растений, которые регенерировали из трансгенной растительной клетки. В некоторых вариантах реализации изобретения трансгенные растения могут быть получены из трансгенного семени путем разрезания, срывания, измельчения или иного отделения части от растения. В определенных вариантах реализации изобретения часть растения может быть семенем, коробочкой, листом, цветком, стеблем, корнем или любой его частью или нерегенерируемой частью трансгенной части растения. Как используется в данном контексте, "нерегенерируемая" часть трансгенной части растения представляет собой часть, которая не может быть индуцирована для образования целого растения или которая не может быть индуцирована для образования целого растения, способного к половому и/или бесполому размножению. В некоторых вариантах реализации изобретения нерегенерируемая часть отбираемой части растения представляет собой часть трансгенного семени, коробочки, листа, цветка, стебля или корня.
[0058]
Приведены способы получения трансгенных растений, которые содержат ингибирующее в отношении жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых количества белков TIC5290. Такие растения могут быть получены путем введения рекомбинантного полинуклеотида, который кодирует белок TIC5290, предусмотренный в данной заявке, в растительную клетку и отбора растения, полученного из указанной растительной клетки, которое экспрессирует ингибирующее в отношении видов жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых количество белка TIC5290. Растения могут быть получены из растительных клеток путем регенерации, из семян, пыльцы или меристемы, полученных способами трансформации. Способы трансформации растений известны в данной области техники.
[0059]
Обработанные растительные продукты, причем процессированный продукт содержит обнаруживаемое количество белка TIC5290, сегменты и фрагменты, обладающие ингибиторной активностью в отношении насекомых, или его фрагмент или любую его отличительную часть, также описаны в данном документе. В некоторых вариантах реализации изобретения обработанный продукт выбирают из группы, состоящей из частей растения, биомассы растений, масла, муки, сахара, корма для животных, муки, хлопьев, отрубей, пуха, кожуры, обработанных семян и семян. В определенных вариантах реализации изобретения обработанный продукт является нерегенерируемым. Растительный продукт может включать в себя товар или другие коммерческие продукты, полученные из трансгенного растения или части трансгенных растений, причем товар или другие продукты можно отследить путем обнаружения нуклеотидных сегментов или экспрессированных РНК или белков, которые кодируют или содержат отличающиеся части белка TIC5290.
[0060]
Растения, экспрессирующие белок TIC5290, можно скрещивать путем селекции с трансгенными объектами, экспрессирующими другие белки-токсины и/или экспрессирующими другие трансгенные признаки, такие как гены устойчивости к гербицидам, гены, повышающие урожайность или устойчивость к стрессу, и тому подобное, или признаки могут быть объединены в одном векторе, так что все признаки будут связаны между собой.
[0061]
Как описано далее в примерах, синтетические или искусственные последовательности, кодирующие TIC5290, которые были предназначены для использования в растениях, изложены в SEQ ID NO: 3.
[0062]
in vivo
in vitro
Arabidopsis thaliana
см.,
и соавт., Mol. Gen. Genet.
Petunia hybrida
см.,
и соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
см.,
Для экспрессии в растительных клетках белок TIC5290 может экспрессироваться так, чтобы он находился в цитозоле или был нацелен на различные органеллы растительной клетки. Например, нацеливание белка на хлоропласт может приводить к увеличению уровней экспрессированного белка в трансгенном растении, предотвращая появление признаков иных фенотипов. Нацеливание может также приводить к повышению резистентности к вредителям у трансгенного объекта. Целевой пептид или транзитный пептид представляет собой короткую пептидную цепь (длиной 3-70 аминокислот), которая направляет транспортировку белка в определенную область клетки, включая ядро, митохондрии, эндоплазматический ретикулум (ЭР), хлоропласт, апопласт, пероксисому и плазматическую мембрану. Некоторые сигнальные пептиды отщепляются от белка под действием сигнальной пептидазы после транспортирования белков. Для нацеливания на хлоропласт, белки содержат транзитные пептиды, которые содержат около 40-50 аминокислот. Для описания применения транзитных пептидов хлоропласта, см. патенты США № 5,188,642 и 5,728,925. Многие локализованные на хлоропласте белки экспрессируются из ядерных генов как предшественники и нацелены на хлоропласт транзитным пептидом хлоропласта (ТПХ). Примеры таких выделенных хлоропластных белков включают, но без ограничений, такие, которые связаны с малой субъединицей (МСУ) рибулозо-1,5,-бисфосфаткарбоксилазы, ферредоксином, ферредоксин-оксидоредуктазой, белком I и белком II светособирающего комлекса, тиоредоксином F, 5-енолпируват-шикимат-З-фосфатсинтазой (ЕПШФС) и транзитными пептидами, описанными в патенте США №7,193,133. В условиях и было продемонстрировано, что нехлоропластные белки могут быть нацелены на хлоропласт с использованием белковых гибридов с гетерологичным ТПХ и что наличия ТПХ достаточно для нацеливания белка на хлоропласт. Включение подходящего хлоропластного транзитного пептида, такого как ЕПШФС ТПХ (ТПХ2) (Klee 210:437-442, 1987) или ЕПШФС ТПХ (ТПХ4) (della-Cioppa 83:6873-6877, 1986) было показано, что они нацеливают гетерологичные последовательности белка ЕПШФС на хлоропласты в трансгенных растениях (патентах США №5,627,061; 5,633,435; и 5,312,910; и EP 0218571; EP 189707; EP 508909; и EP 924299). Для нацеливания белка TIC5290 на хлоропласт, последовательность, кодирующая транзитный пептид хлоропласта, расположена 5' в функциональной связи и в рамке к синтетической кодирующей последовательности, кодирующей белок TIC5290, который был сконструирован для оптимальной экспрессии в растительных клетках.
[0063]
Экспрессионные кассеты и векторы, содержащие данные синтетические или искусственные нуклеотидные последовательности, могут быть сконструированы и введены в клетки растений кукурузы, хлопка и сои в соответствии со способами и методиками трансформации, которые известны в данной области техники. Трансформированные клетки регенерировали в трансформированные растения, которые, как было обнаружено, экспрессировали TIC5290. Для проверки пестицидной активности, биологическое тестирование проводили в присутствии чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых вредителей.
[0064]
Последовательности, кодирующие белок TIC5290, и последовательности, имеющие значительную процентную идентичность с TIC5290, могут быть идентифицированы с использованием способов, известных специалистам в данной области техники, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР), термическая амплификация и гибридизация. Например, белок TIC5290 может быть использован для получения антител, которые специфически связываются с подобными белками, и могут быть использованы для скрининга и поиска других белков, которые тесно связаны.
[0065]
Кроме того, нуклеотидные последовательности, кодирующие белок-токсин TIC5290, могут быть использованы в качестве зондов и праймеров для скрининга и идентификации других членов класса с использованием способов термоциклической или изотермической амплификации и гибридизации. Например, олигонуклеотиды, полученные из последовательности, как указано в SEQ ID NO: 3, могут быть использованы для определения присутствия или отсутствия трансгена TIC5290 в образце дезоксирибонуклеиновой кислоты, полученной из товарного продукта. Учитывая чувствительность определенных способов обнаружения нуклеиновых кислот, которые используют олигонуклеотиды, предполагается, что олигонуклеотиды, полученные из последовательности, как указано в SEQ ID NO: 3, могут быть использованы для обнаружения трансгена TIC5290 в товарных продуктах, полученных из объединенных источников, где только часть товарного продукта получена из трансгенного растения, содержащего SEQ ID NO: 3. Кроме того, признано, что такие олигонуклеотиды могут быть использованы для введения изменения последовательности нуклеотидов в SEQ ID NO: 3. Такие "мутагенезные" олигонуклеотиды полезны для идентификации вариантов аминокислотной последовательности TIC5290, проявляющих диапазон ингибирующей активности в отношении насекомых или различную экспрессию в клетках-хозяевах трансгенного растения.
[0066]
например
o
Гомологи нуклеотидной последовательности, , инсектицидные белки, кодируемые нуклеотидными последовательностями, которые гибридизуются с каждой или любой из последовательностей, раскрытых в данной заявке в условиях гибридизации, также являются вариантом реализации данного изобретения. Изобретение также относится к способу обнаружения первой нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется со второй нуклеотидной последовательностью, причем первая нуклеотидная последовательность (или ее обратная комплементарная последовательность) кодирует пестицидный белок или его пестицидный фрагмент и гибридизуется в условиях жесткой гибридизации со второй нуклеотидной последовательностью. В таком случае вторая нуклеотидная последовательность может представлять собой нуклеотидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 3 в условиях жесткой гибридизации. Кодирующие нуклеотидные последовательности гибридизуются друг с другом в соответствующих условиях гибридизации, а белки, кодируемые этими нуклеотидными последовательностями, перекрестно реагируют с антисывороткой к любому из других белков. Жесткие условия гибридизации, как определено в данном документе, включают в себя, по меньшей мере, гибридизацию при 42 °С с последующими двумя промывками в течение пяти минут каждая при комнатной температуре с 2X SSC, 0,1% ДСН, с последующими двумя промывками в течение 30 минут каждая при 65 °C в 0,5X SSC, 0,1% ДСН. Промывки при еще более высоких температурах представляют собой еще более жесткие условия, например, условия гибридизации 68°C с последующим промыванием при 68C, в 2x SSC, содержащем 0,1% ДСН.
[0067]
Bacillus
Bacillus
Специалисту в данной области техники будет понятно, что из-за вырожденности генетического кода многие другие последовательности способны кодировать белки, подобные TIC5290, и эти последовательности в той степени, в которой они функционируют для экспрессии пестицидных белков либо в штаммах или в растительных клетках являются вариантами реализации данного изобретения, подразумевая, конечно, что многие такие вырожденные кодирующие последовательности не будут гибридизоваться в этих условиях с нативными последовательностями , кодирующими TIC5290. Данная заявка рассматривает применение этих и других способов идентификации, известных специалистам в данной области техники, для идентификации последовательностей, кодирующих белок TIC5290 и последовательностей, имеющих значительную процентную идентичность с последовательностями, кодирующими белок TIC5290.
[0068]
Также в данной заявке раскрыты способы борьбы с насекомыми, в частности, заражениями культурных растений чешуекрылыми или жесткокрылыми, или полужесткокрылыми насекомыми с использованием белка TIC5290. Такие способы могут включать в себя выращивание растения, содержащего ингибирующее в отношении чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых насекомых количество белка-токсина TIC5290. В некоторых вариантах реализации изобретения такие способы могут дополнительно включать любое одно или более из: (I) нанесения любой композиции, содержащей или кодирующей белок-токсин TIC5290, на растение или семя, которое дает начало растению; и (II) трансформацию растения или клетки растения, которые дают начало растению, полинуклеотидом, кодирующим белок-токсин TIC5290. В общем, предполагается, что белок-токсин TIC5290 может быть обеспечен в композиции, имеющейся в микроорганизме, или имеющейся в трансгенном растении, чтобы обеспечить ингибирующую активность против чешуекрылых, жесткокрылых или полужесткокрылых насекомых.
[0069]
Bacillus
Bacillus
В некоторых вариантах реализации изобретения молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты белка-токсина TIC5290 является инсектицидно активным ингредиентом композиции, обладающей ингибирующей активностью в отношении насекомых, полученной культивированием рекомбинантной клетки или любой другой рекомбинантной бактериальной клетки, трансформированной с целью экспрессии белка-токсина TIC5290 в условиях, подходящих для экспрессии белка-токсина TIC5290. Такая композиция может быть получена путем высушивания, лиофилизации, гомогенизации, экстракции, фильтрации, центрифугирования, седиментации или концентрирования культуры таких рекомбинантных клеток, экспрессирующих/продуцирующих указанный рекомбинантный полипептид. Такой процесс может привести к образованию экстракта бактериальных клеток, суспензии клеток, клеточного гомогената, клеточного лизата, клеточного супернатанта, клеточного фильтрата или осаждению клеток или другого энтомопатогена. Получив таким образом сконструированный рекомбинантный полипептид, создают композицию, которая содержит рекомбинантный полипептид, может содержать бактериальные клетки, бактериальные споры, а также параспоральные тельца и может поставляться для различных применений, включая продукты-спреи, обладающие ингибирующей активностью в отношении сельскохозяйственные насекомых или препараты кормовой биомассы, обладающие ингибирующей активностью в отношении насекомых в кормовых биологических тестах.
[0070]
и соавт
В одном варианте реализации изобретения для снижения вероятности развития резистентности, композиция, обладающая ингибирующей активностью в отношении насекомых, содержащая TIC5290, может дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую активность против тех же видов чешуекрылых, жесткокрылых и полужесткокрылых насекомых, но который отличается от белка-токсина TIC5290. Возможные дополнительные полипептиды для такой композиции содержат белок, обладающий ингибирующей активностью против насекомых, и молекулу дцРНК, обладающую ингибирующей активностью против насекомых. Одним из примеров использования таких рибонуклеотидных последовательностей для борьбы с насекомыми-вредителями описаны в Baum . (публикация патента США 2006/0021087 A1). Такой дополнительный полипептид для борьбы с чешуекрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry1A (публикация патента США №5,880,275), Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1A. 105, Cry1Ae, Cry1B (публикация патента США №10/525,318), Cry1C (публикация патента США №6,033,874), Cry1D, Cry1Da и их вариантов, Cry1E, Cry1F, и химер Cry1A/F (публикация патента США №7,070,982; 6,962,705; и 6,713,063), Cry1G, Cry1H, Cry1I, Cry1J, Cry1K, Cry1L, химеры типа Cry1, такие как, но без ограничений, TIC836, TIC860, TIC867, TIC869 и TIC1100 (публикация международной заявки WO2016/061391 (A2)), TIC2160 (публикация международной заявки WO2016/061392(A2)), Cry2A, Cry2Ab (публикация патента США №7,064,249), Cry2Ae, Cry4B, Cry6, Cry7, Cry8, Cry9, Cry15, Cry43A, Cry43B, Cry51Aa1, ET66, TIC400, TIC800, TIC834, TIC1415, Vip3A, VIP3Ab, VIP3B, AXMI-001, AXMI-002, AXMI-030, AXMI-035 и AXMI-045 (публикация патента США 2013-0117884 A1), AXMI-52, AXMI-58, AXMI-88, AXMI-97, AXMI-102, AXMI-112, AXMI-117, AXMI-100 (публикация патента США 2013-0310543 A1 ), AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005 (публикация патента США 2013-0104259 A1), AXMI-134 (публикация патента США 2013-0167264 A1), AXMI-150 (публикация патента США 2010-0160231 A1), AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 A1), AXMI-196, AXMI-204, AXMI-207, axmi209 (публикация патента США 2011-0030096 A1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 2014-0245491 A1), AXMI-221z, AXMI-222z, AXMI-223z, AXMI-224z, AXMI-225z (публикация патента США 2014-0196175 A1), AXMI-238 (публикация патента США 2014-0033363 A1), AXMI-270 (публикация патента США 2014-0223598 A1), AXMI-345 (публикация патента США 2014-0373195 A1), AXMI-335 (международная публикация заявки WO2013/134523(A2)), DIG-3 (публикация патента США 2013-0219570 A1), DIG-5 (публикация патента США 2010-0317569 A1), DIG-11 (публикация патента США 2010-0319093 A1), AfIP-1A и его производные (публикация патента США 2014-0033361 A1), AfIP-1B и его производные (публикация патента США 2014-0033361 A1), PIP-1APIP-1B (публикация патента США 2014-0007292 A1), PSEEN3174 (публикация патента США 2014-0007292 A1), AECFG-592740 (публикация патента США 2014-0007292 A1), Pput_1063 (публикация патента США 2014-0007292 A1), DIG-657 (международная публикация заявки WO2015/195594(A2)), Pput_1064 (публикация патента США 2014-0007292 A1), GS-135 и его производные (публикация патента США 2012-0233726 A1), GS153 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 A1), GS154 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 A1), GS155 и его производные (публикация патента США 2012-0192310 A1), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2012-0167259 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2012-0047606 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2011-0154536 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2011-0112013 A1, SEQ ID NO: 2 и 4, и их производные, как описано в публикация патента США 2010-0192256 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2010-0077507 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2010-0077508 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США 2009-0313721 A1, SEQ ID NO: 2 или 4, и их производные, как описано в публикация патента США 2010-0269221 A1, SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США №7,772,465 (B2), CF161_0085 и его производные, как описано в WO2014/008054 A2, токсичные к чешуекрылым белки и их производные, как описано в публикации патентов США US 2008-0172762 A1, US2011-0055968 A1 и US 2012-0117690 A1; SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в US 7510878(B2), SEQ ID NO: 2 и ее производные, как описано в публикация патента США № 7812129(B1); и тому подобное.
[0071]
Такой дополнительный полипептид для борьбы с жесткокрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белка, обладающего ингибирующей активностью в отношении насекомых, такого как, без ограничений, Cry3Bb (публикация патента США №№ 6,501,009), варианты Cry1C, варианты Cry3A, Cry3, Cry3B, Cry34/35, 5307, AXMI134 (публикация патента США 2013-0167264 A1), AXMI-184 (публикация патента США 2010-0004176 A1), AXMI-205 (публикация патента США 2014-0298538 A1), axmi207 (публикация патента США 2013-0303440 A1), AXMI-218, AXMI-220 (публикация патента США 20140245491A1), AXMI-221z, AXMI-223z (публикация патента США 2014-0196175 A1), AXMI-279 (публикация патента США 2014-0223599 A1), AXMI-R1 и его варианты (публикация патента США 2010-0197592 A1, TIC407, TIC417, TIC431, TIC807, TIC853, TIC901, TIC1201, TIC3131, DIG-10 (публикация патента США 2010-0319092 A1), eHIPs (публикация патента на патент США №2010/0017914), IP3 и его варианты (публикация патента США 2012-0210462 A1) и ϖ-Hexatoxin-Hv1a (публикация заявки на патент США US2014-0366227 A1).
[0072]
Bacillus thuringiensis
Такой дополнительный полипептид для борьбы с полужесткокрылыми вредителями может быть выбран из группы, состоящей из белков, активных в отношении полужестокрылых, таких как, без ограничения, TIC1415 (публикация патента США 2013-0097735 A1), TIC807 (публикация патента США №8609936), TIC834 (публикация патента США 2013-0269060 A1), AXMI-036 (публикация патента США 2010-0137216 A1) и AXMI-171 (публикация патента США 2013-0055469 A1). Дополнительные полипептиды для борьбы с жесткокрылыми, чешуекрылыми и полужесткокрылыми насекомыми-вредителями можно найти на сайте номенклатуры токсина поддерживаемом Neil Crickmore (во всемирной паутине по адресу btnomenclature.info).
[0073]
В других вариантах реализации изобретения такая композиция/препарат может дополнительно содержать, по меньшей мере, один дополнительный полипептид, который проявляет ингибирующую активность в отношении насекомых-вредителей, которые не ингибируются белком данного изобретения, в прочих случаях обладающим ингибирующей активностью против насекомых, с тем чтобы расширить спектр ингибирующей активности в отношении насекомых.
[0074]
Способность насекомых развивать устойчивость к определенным инсектицидам была описана в данной области техники. Одна стратегия управления устойчивостью насекомых заключается в использовании трансгенных культур, которые экспрессируют два различных вещества, обладающих ингибирующей активностью против насекомых, которые действуют через различные механизмы действия. Таким образом, любые насекомые с устойчивостью к одному из веществ, обладающих ингибирующей активностью против насекомых, могут контролироваться с помощью другого вещества, обладающего ингибирующей активностью против насекомых. Другая стратегия борьбы с устойчивостью насекомых состоит в применении растений, которые не защищены от целевых видов жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых насекомых, с целью обеспечения укрытия для таких незащищенных растений. Один конкретный пример описан в патенте США №6,551,962, полное содержание которого включено посредством ссылки.
[0075]
Другие варианты реализации изобретения, такие как локально применяемые пестицидные химикаты, которые разработаны для борьбы с вредителями, которые также регулируются белками, описанными в данном документе, для применения с белками в препаратах для обработки семян, опыления, точечного полива или протирания, и которые могут быть нанесены непосредственно на почву (поливка почвы), нанесены на выращиваемые растения, экспрессирующие белки, описанные в данном документе, или приготовлены для нанесения на семена, содержащие один или более трансгенов, кодирующих один или более описанных белков. Такие препараты для применения при обработке семян можно наносить с помощью различных наклеек и липких веществ, известных в данной области техники. Такие препараты могут содержать пестициды, которые являются синергичными в способе действия с описанными белками, так что пестициды препарата действуют посредством другого способа действия для борьбы с теми же или похожими вредителями, которые могут регулироваться описанными белками, или что такие пестициды действуют для борьбы с вредителями в более широком диапазоне хозяев или видов вредителей растений, которые неэффективно регулируются пестицидными белками TIC5290.
[0076]
Bacillus
например
Вышеупомянутая композиция/препарат может дополнительно содержать сельскохозяйственно приемлемый носитель, такой как приманка, порошок, дуст, таблетки, гранулы, спреи, эмульсия, коллоидная суспензия, водный раствор, препараты спор/кристаллов , протравливание семян, рекомбинантная растительная клетка/растительная ткань/семена/растение, трансформированные для экспрессии одного или более белков, или бактерия, трансформированная для экспрессии одного или более белков. В зависимости от уровня ингибирования в отношении насекомых или инсектицидного ингибирования, присущего рекомбинантному полипептиду, и уровня препарата, который должен применяться в анализе растений или рациона, состав/препарат может содержать различные массовые количества рекомбинантного полипептида, , от 0,0001% до 0,001%, до 0,01%, до 1%, до 99% от массы рекомбинантного полипептида.
ПРИМЕРЫ
[0077]
Ввиду вышеизложенного специалистам в данной области техники должно быть понятно, что могут быть сделаны изменения в конкретных описанных аспектах, и все же будет получен подобный или аналогичный результат, не отходя от сущности и объема изобретения. Таким образом, конкретные структурные и функциональные детали, описанные в данном документе, не должны интерпретироваться как ограничивающие. Следует понимать, что полное раскрытие каждой из указанных выше публикаций включено в описании данной заявки.
ПРИМЕР 1
Обнаружение TIC5290
[0078]
В этом примере описано обнаружение пестицидного белка TIC5290.
[0079]
Bacillus thuringiensis
Bt
Bt
Bt
Bt
Последовательность, кодирующая новый пестицидный белок () была идентифицирована, клонирована, подтверждена и протестирована в биологическом анализе насекомых. Пестицидный белок TIC5290, представленный в данном документе как SEQ ID NO: 1 (кодирующая последовательность ) и 2 (белок), был выделен из штамма EG6657. TIC5290 представляет собой белок длиной 937 аминокислот, идентифицированный на основе гомологии с известными инсектицидными белковыми токсинами и с помощью анализа Pfam, с целью распределения по известным семействам инсектицидных белков. Биоинформатический анализ указывает на то, что TIC5290 является порообразующим белком. Домен PA14 Pfam (PF07691) в пределах аминокислот с 16 по 140, вероятно, вовлечен в функции связывания. За этим доменом следует домен Binary_toxB Pfam (PF03495) в пределах аминокислот с 186 по 593, что может способствовать образованию бета-складчатой трансмембранной поры. Ближайшим гомологом -токсина TIC5209 является белок Vip4Aa с идентичностью последовательности 56,9%, что указывает на то, что TIC5290 представляет собой новое подсемейство Vip4.
[0080]
ПЦР-праймеры были разработаны для амплификации полноразмерной копии кодирующей области для TIC5290 из общей геномной ДНК, выделенной из штамма EG6657. ПЦР-ампликон также включал в себя инициирующий и терминирующий кодоны кодирующей последовательности.
[0081]
Bt
Bt
Escherichia coli
E. coli
Ампликон TIC5290 клонировали с использованием способов, известных в данной области техники, в экспрессирующий вектор плазмиды в функциональной связи с экспрессируемым промотором , который является активным во время споруляции бациллы. Кроме того, ампликон клонировали в вектор, используемый для экспрессии белка, в системе экспрессии (). Было обнаружено, что рекомбинантные штаммы экспрессируют рекомбинантный белок.
ПРИМЕР 2
TIC5290 демонстрирует активность, по отношению к жесткокрылым, чешуекрылым и полужесткокрылым в биологическом анализе насекомых.
[0082]
Данный пример иллюстрирует ингибирующую активность, проявляемую белками TIC5290, по отношению к различным видам жесткокрылых, чешуекрылых и полужесткокрылых.
[0083]
Bt
E. coli
Bt
E. coli
Leptinotarsa decemlineata
Diabrotica virgifera virgifera
Helicoverpa zea
Ostrinia nubilalis
Spodoptera frugiperda
Chrysodeixis includens
Diatraea grandiosella
Heliothis virescens
Plutella xylostella
Lygus lineolaris
Lygus hesperus
Aedes aegypti
Helicoverpa zea
Новый пестицидный белок TIC5290 экспрессировали в и и анализировали на токсичность по отношению к различным видам жесткокрылых, чешуекрылых, полужесткокрылых и двукрылых. Препараты каждого токсина из и были проанализированы против видов жесткокрылых (колорадский жук, КЖ) и (западный кукурузный жук, WCR). Препараты токсина также анализировались против видов чешуекрылых американской кукурузной совки (CEW, ), мотылька стеблевого кукурузного (ECB, ), кукурузной листовой совки (FAW, ), соевой совки (SBL, ), огневки кукурузной юго-западной (SWC, ), табачной листовертки (TBW, ) и капустной моли (DBM, (). Препараты токсина также анализировались против видов полужесткокрылых клопа травяного (TPB, ) и слепняка западного матового (WTP, ); а также видов двукрылых, комара желтолихорадочного (YFM, ). Американская кукурузная совка (CEW, ) также упоминается как коробочный червь (SPW) и совка хлопковая (CBW).
[0084]
E. coli
Анализ белков, экспрессирующихся в каждом из векторов, требует различных препаратов, добавленных к рациону насекомых. Для векторов, использующих активный во время споруляции промотор, смесь кристаллов/спор собирали после трех дней роста в культуре и использовали в рационе насекомых (обычно применяли в искусственных рационах насекомых и кормили отдельно различных насекомых). Препараты белка, полученные путем экспрессии в были очищены и также представлены в рационе насекомых.
[0085]
TIC5290 продемонстрировал активность против WCR, CEW, ECB, FAW, DBM и WTP, как показано в таблице 2 ниже, в которой "+" обозначает активность.
Таблица 2. Биологический анализ активности TIC5290 против жесткокрылых, чешуекрылых, полужесткокрылых и двукрылых насекомых-вредителей.
<b>Насекомое</b>
<b>Биологический анализ диеты</b>
WCR
+
CPB
-
CEW
+
ECB
+
FAW
+
SBL
-
SWC
-
TBW
-
DBM
+
TPB
-
WTP
+
YFM
-
ПРИМЕР 3
Разработка синтетических кодирующих последовательностей, которые кодируют TIC5290 для экспрессии в клетках растений
[0086]
Bt
Синтетические или искусственные кодирующие последовательности были сконструированы для применения в экспрессии TIC5290 в растениях, клонированы в бинарный вектор для трансформации растения и использовались для трансформации растительных клеток. Синтетические последовательности нуклеиновой кислоты синтезировали в соответствии со способами, в целом описанными в патенте США 5,500,365, избегая некоторых неподходящих проблемных последовательностей, таких как последовательности полиаденилирования растений, обогащенные ATTTA и A/T, при сохранении аминокислотной последовательности нативного бека . Синтетическая кодирующая последовательность для пестицидного белка TIC5290 представлена в виде SEQ ID NO: 3 и кодирует белок, представленный в виде SEQ ID NO: 2.
ПРИМЕР 4
Экспрессионные кассеты для экспрессии TIC5290 в клетках растений
[0087]
Разнообразные экспрессионные кассеты растений были сконструированы с последовательностями, как изложено в SEQ ID NO: 3. Такие экспрессионные кассеты являются полезными для транзиентной экспрессии в протопластах растений или трансформации растительных клеток. Типичные экспрессионные кассеты были разработаны с учетом возможного размещения белка внутри клетки растения. Для белка, ориентированного на пластид, синтетическую последовательность, кодирующую пестицидный белок TIC5290, функционально связывали в рамке с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид, для доставки в хлоропласт. Полученные векторы трансформации растений содержат первую трансгенную кассету для экспрессии пестицидного белка, которая содержит конститутивный промотор, функционально связанный 5' с лидерной последовательностью, функционально связанным 5' с интроном (или при необходимости без интрона), функционально связанный 5' с синтетической кодирующей последовательностью, которая кодирует нацеленный или не нацеленный на пластид белок TIC5290, который, в свою очередь, функционально связан 5' с 3'-нетранслируемой областью и; вторую трансгенную кассету для отбора трансформированных растительных клеток с использованием глифосата или антибиотиков. Все элементы, описанные выше, были расположены рядом, часто с дополнительной последовательностью, предусмотренной для создания экспрессионной кассеты, такой как сайты эндонуклеазы рестрикции или сайты безлигазного клонирования.
ПРИМЕР 5
TIC5290 обеспечивает эффективную устойчивость к западному кукурузному жуку (
Diabrotica virgifera virgifera
) в случае экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы
[0088]
Данный пример иллюстрирует ингибиторную активность, проявляемую TIC5290 в отношении жесткокрылых, таких как злаковый корневой червь, в случае экспрессии в растениях и предлагается в виде корма для соответствующих насекомых-вредителей.
[0089]
Diabrotica virgifera virgifera
Бинарные векторы трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, сконструированные для экспрессии как нацеленных, так и не нацеленных на пластид пестицидных белков TIC5290, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники. Полученные векторы использовались для стабильной трансформации кукурузных растений. Отбирались и выращивались объекты с одиночными вставками Т-ДНК. Пестицидную активность анализировали по отношению к жесткокрылому западному кукурузному жуку (), питающемуся корнями стабильно трансформированных кукурузных растений.
[0090]
0
1
1
Стабильно трансформированные растения R использовали для анализа устойчивости жесткокрылых, а также для получения потомства F. Из каждой трансформации бинарным вектором отбирали множество объектов с одной копией. Часть этих объектов, возникающих из каждой трансформации бинарным вектором, использовалась в анализе жесткокрылых, в то время как другая часть объектов использовалась для получения потомства F с целью дальнейшего тестирования.
[0091]
0
0
0,
Diabrotica virgifera virgifera
Растения для анализа R пересаживали в двадцатисантиметровые горшки. Растения были инокулированы яйцами западного кукурузного жука (, WCR). Яйца инкубировали в течение примерно десяти дней до инокуляции с целью их вылупления через четыре дня после инокуляции, для обеспечения достаточного количества выживших и способных атаковать корни кукурузы личинок. Трансформированные растения инокулировали примерно с V2 до V3 стадии. Растения выращивали после заражения в течение примерно двадцати восьми дней. Растения удаляли из горшков, тщательно промывая корни, чтобы удалить всю почву. Ущерб корням оценивали с использованием шкалы оценки повреждений 1-5, как показано в таблице 3 ниже по тексту. Для гарантии правильного выполнения анализа сравнение также делали с негативным контролем. Низкие оценки повреждения корней указывают на устойчивость, передаваемую белком TIC5290 к вредителю жесткокрылых. При анализе WCR использовали множество объектов Rдля каждой трансформации бинарным вектором. Многие из объектов R экспрессирующих как нацеленный, так и не нацеленный на пластид TIC5290, продемонстрировали устойчивость к WCR, определяемую шкалой оценок повреждения корней, по сравнению с трансгенными контролями.
Таблица 3. Шкала оценок повреждения корней R
.
0
<b>Оценка повреждения корня</b>
<b>Описание</b>
1
Видимые повреждения отсутствуют
2
Некоторые повреждения; нет отсечений
3
Отсечение, по меньшей мере, одного корня
4
Отсечение всего узла
5
Отсечение более одного узла
[0092]
0
1
0
1
1
1
Часть стабильно трансформированных объектов R, возникающих из каждой трансформации бинарным вектором, использовалась для получения потомства F. Стабильно трансформированные растений R самоопылялись, давая потомство F. Семена F высаживали. Гетерозиготные растения идентифицировали с помощью молекулярных методов, известных в данной области техники, и использовали для анализа против WCR, а также для измерения экспрессии белка-токсина TIC5290 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа ELISA. Часть гетерозиготного потомства F от каждого объекта использовалась для анализа на насекомых, в то время как другая часть использовалась для измерения экспрессии TIC5290.
[0093]
Diabrotica virgifera virgifera
1
Яйца от западного кукурузного жука (, WCR) инкубировали в течение примерно десяти дней для вылупления в течение четырех дней после инокуляции. Растения инокулировали примерно с V2 до V3 стадии. В случае с WCR, в каждый горшок инокулировали около двух тысяч яиц. Растения выращивали после заражения в течение примерно двадцати восьми дней. Растения удаляли из горшков, тщательно промывая корни, чтобы удалить всю почву. Ущерб корням оценивали с использованием шкалы оценки повреждений 0-3, как показано в таблице 4 ниже по тексту. Для гарантии правильного выполнения анализа сравнение делали с негативным контролем. Низкие оценки повреждения корней указывали на устойчивость, передаваемую белком TIC5290 к вредителю жесткокрылых. Многие из объектов Fдемонстрировали эффективную устойчивость к WCR по сравнению с контролями. На фигуре 1 изображена средняя оценка повреждения корней нескольких объектов для TIC5290, когда он экспрессируется в растениях кукурузы F1, независимо от того, нацелен белок на хлоропласт или нет.
Таблица 4. Шкала оценок повреждения корней F
1.
<b>Оценка повреждения корня</b>
<b>Описание</b>
0
Видимые повреждения отсутствуют
0,01-0,09
Рубцы и следы
0,1-0,9
Отсечение корня, но меньше, чем полный узел
1,0-1,9
По меньшей мере полный узел (или эквивалент) поврежден в пределах 4 см от растения
2,0-2,9
Два или более узла уничтожены
3
Три или более узла уничтожены
Пример 5
Анализ активности TIC5290 по отношению к чешуекрылым вредителям, при экспрессии в стабильно трансформированных растениях кукурузы, сои или хлопка.
[0094]
Бинарные векторы трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, сконструированные для экспрессии как нацеленного, так и не нацеленного на пластид пестицидного белка TIC5290, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники.
[0095]
Agrobacterium
Helicoverpa zea
Ostrinia nubilalis
Spodoptera frugiperda
Chrysodeixis includens
Diatraea grandiosella
Heliothis virescens
Plutella xylostella
Кукурузу, сою или хлопок трансформировали с помощью бинарных векторов трансформации, описанных выше, с применением способа трансформации, опосредованной . Трансформированные клетки индуцировали для образования растений при помощи способов, известных в данной области техники. Биотестирование с использованием листовых дисков растения выполняли по аналогии с теми, которые описаны в публикации патента США №8,344,207. Ткань, полученную из нетрансформированных растений кукурузы, сои или хлопка, использовали в качестве негативного контроля. Множественные объекты трансформации от каждого бинарного вектора оценивались против вредителей чешуекрылых таких как, но без ограничений, американская кукурузная совка (CEW, ), мотылек стеблевой кукурузный (ECB, ), кукурузная листовая совка (FAW, ), соевая совка (SBL, ), огневка кукурузная юго-западная (SWCB, ), табачная листовертка (TBW, ) и капустная моль (DBM, ). Установлено, что те насекомые, которые демонстрируют задержку роста и/или смертность в биологическом анализе насекомых, подвержены воздействию токсина TIC5290.
Пример 6
Анализ активности против полужесткокрылых вредителей с применением стабильно трансформированных хлопчатников, экспрессирующих TIC5290.
[0096]
Бинарные векторы трансформации растений, содержащие трансгенные кассеты, сконструированные для экспрессии как нацеленных, так и не нацеленных на пластид пестицидных белков TIC5290, клонировали с использованием способов, известных в данной области техники. Полученные векторы использовались для стабильной трансформации хлопчатников. Пестицидную активность анализировали против полужесткокрылых вредителей, питающихся стабильно трансформированными растениями хлопчатника.
[0097]
0
1
Бинарные векторы, описанные ранее в примере 3, в которых экспрессируется как нацеленный, так и не нацеленный на пластид TIC5290, применяли для стабильной трансформации растений хлопчатника. Отбирались и выращивались объекты с одиночными вставками Т-ДНК. Стабильно трансформированные растения R самоопылялись, давая потомство R.
[0098]
1
Lygus lineolaris
Lygus hesparus
-го
-го
-го
Трансгенные семена R, содержащие экспрессионные кассеты для TIC5290, высевали в 25-сантиметровые горшки, как и семена, соответствующие не трансгенному контролю. Растения выращивались в камере с контролируемой средой с фотопериодом шестнадцать часов света при тридцати двух градусах Цельсия и восемь часов темноты при двадцати трех градусах Цельсия, и интенсивностью света от восьмисот до девятьсот микроэйнштейнов. По истечению от сорока до сорока пяти дней после посадки, отдельные растения помещали в изолятор, сделанный из пропускающий воздух пластиковых листов "опыления" (Vilutis and Company Inc, Франкфорт, штат Иллинойс). Листы крепились к основному стержню непосредственно над поверхностью почвы, с использованием застежки Velcro. Две пары взрослых особей (в возрасте 6-ти дней), половозрелых самцов и самок или из лабораторной культуры собирали в четырнадцатимиллиметровую пластиковую трубку с круглым дном (Becton Dickson Labware, Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси) и использовали для каждого растения. Взрослые особи высвобождали в каждый отдельный изолятор через небольшую щель на стороне изолятора и затем изолятор надежно закрывали, гарантируя, что насекомые не сбегут. Насекомых, имеющих возможность спариваться, и растения содержали в изоляторе в течение двадцати одного дня. Через двадцать один день растения подрезали под изоляторами и перемещали в лабораторию, где насекомых собирали с каждого растения и подсчитывали. Перед открытием изолятора, растения интенсивно встряхивали, чтобы все насекомые отцепились от мест кормления и упали до основания изолятора. Затем основание изолятора открывали и весь растительный помещали на черный лист. Насекомые собирались с помощью аспиратора. Затем растение тщательно проверяли с целью удаления любых оставшихся насекомых. Для каждого растения фиксировали количество насекомых и их стадию развития. Подсчет насекомых делили на несколько групп, основанных на зрелость организма Лигуса; нимфы до 3 возраста, 4 возраста, 5 возраста и взрослые особи. Трансгенные растения хлопчатника, демонстрирующие сокращение числа личинок и взрослых особей по сравнению с нетрансформированными контрольными растениями хлопчатника, демонстрируют устойчивость к полужесткокрылым вредителям, посредством экспрессии белка-токсина TIC5290.
[0099]
Все композиции, раскрытые и заявленные в данном документе, могут быть сделаны и выполнены без излишнего экспериментирования в свете данного описания. Хотя композиции данного изобретения были описаны с точки зрения вышеизложенных иллюстративных вариантов реализации изобретения, специалистам в данной области техники будет понятно, что варианты, изменения, модификации и перестройки могут быть применены к композиции, описанной в данном документе, без отступления от концепции, сущности и объема данного изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что некоторые вещества, являющиеся как химически, так и физиологически родственными, могут быть заменены на вещества, которые описаны в данном изобретении, при этом будут достигнуты такие же или сходные результаты. Все таковые аналогичные замены и модификации, очевидные специалистам в данной области техники, считаются не выходящими за пределы сущности, объема и концепции данного изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
[00100]
Все публикации и опубликованные патентные документы, цитируемые в данной спецификации, включены в данный документ посредством ссылки в том же объеме, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка были конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки.