Исследование механизмов лекарственной устойчивости к нитруллину (лизомустину)

YAK 615.277.3.015

L. B. Gorbacheva, L. Yu. Dederer

INVESTIGATION OF DRUG RESISTANCE MECHANISMS TO NITRULLINE

>

N. M. Emanuel Institute of Biochemical Physics RAS, Moscow

ABSTRACT

Biochemical mechanisms of resistance to nitrulline, a new chloroethylnitrosourea, were studied. Alterations in DNA- and RNA-synthesis, SH-groups level, intracellular content of nitrulline, activities of ribonucleotide reductase (RR), thymidine kinase (TK), 06-alkylguanine-DNAalkyltransferase (06-AGT), a and p DNA polymerases, and beside damages of DNA secondary structure in sensitive (L1210/0) and resistant to nitrulline (L1210/N) leukemia cells were investigated. Nitrulline induced complete inhibition of DNA-synthesis in L1210/0 and L1210/MNU leukemia cells while in L1210/N-cells rapid repair of DNA synthesis was observed. No differences between RR and TK activities were found both in intact L1210/0 and L1210/N-cells and in these cells after in vivo treatment by nitrulline. The efficiency of repair of DNA chloroethyl adducts by 06-AGT in L1210/0 and L1210/N-cells slightly differed in contrast to L1210/aranoza cells. The decrease in DNA-polymerases a- and especially (3-activities, in L1210/0 but not L1210/N leukemia cells during 48 hours after drug administration to tumor-bearing mice was observed. This phenomenon and the increase of SH-groups level in L1210/N-cells may be responsible for resistance L1210 leukemia to this drug.

Key words: lysomustine, biochemical mechanism of the drug resistance.

Л. Б Горбачева, Л. Ю. Дедерер

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К НИТРУЛЛИНУ

Институт биохимической физики им. Н. М. Эммануэля РАН, Москва

РЕЗЮМЕ

Были изучены биохимические механизмы резистентности к нитруллину (лизомустину) — новому противоопухолевому препарату — производному хлорэтилнитрозомочевины. Исследованы изменения в синтезе ДНК и РНК, уровне БН-групп, внутриклеточном содержании нитруллина, активности ферментов рибонуклеотидредукгазы (РР), тимидинкиназы (ТК), 06-алкилгуанин-ДНК алкилтрансферазы (Об-АГТ), ДНК полимераз а и (3 и, кроме того, повреждения вторичной структуры ДНК в чувствительных (1Л210/0) и резистентных (Ы210/Н) к нитруллину лейкозных клетках. Нитруллин вызывал полное ингибирование синтеза ДНК в клетках Ь1210/0 и Ы210/МНМ, в то время как в клетках 1Л210/Н наблюдалась быстрая репарация синтеза ДНК. Не было обнаружено никаких различий а активности РР и ТК как в интактных клетках Ы210/0 и Ы210/Н, так и в этих же клетках после введения препарата мышам-опухоленосителям. В отличие от клеток, резистентных к аранозе, эффективность репарации хло-рэтильных адцуктов Об-АГТ в клетках Ы210/0 и Ы210/Н различается незначительно. Было отмечено существенное уменьшение активности ДНК полимераз а и особенно р в чувствительных, но не резистентных к нитруллину клетках в течение 48 ч после введения препарата мышам-опухоленосителям. Это наблюдение, а также увеличение уровня 8Н-групп в клетках Ы210/Н может быть ответственно за появление резистентности к этому препарату.

Ключевые слова: лизомустин, биохимический механизм лекарственной устойчивости.

Н-алкил-Ы-нитрозомочевины (АНМ) в настоящее время успешно применяются в составе схем комбинированной химиотерапии при лечении лимфогранулематоза, лимфосаркомы, диссеминированной меланомы, мелкоклеточного рака легкого, некоторых форм опухолей мозга [2, 3]. Очень высокая противоопухолевая активность АНМ, установленная в экспериментальных исследованиях, полностью не реализуется при лечении

опухолевых заболеваний. Это обусловлено, в частности, существованием врожденной или приобретенной в процессе лечения резистентности к АНМ [1].

В отличие от большинства противоопухолевых препаратов для АНМ не характерна множественная лекарственная устойчивость. Более того, оказалось, что не существует полной перекрестной устойчивости между близкими аналогами АНМ (табл. 1).

Таблица 1

Противоопухолевые препараты АНМ

Соединения Общепринятое обозначение Страна

Монофункциональные метальные производные

1-метил-1 -нитрозомояевина МНМ Россия

З-Ь-арабинопиранозил-1 метил-нитрозомочевина Араноза Россия

5-(диметилтриазено)имидазол-4-карбоксамид DTIC США

Бифункциональные хлорэтильные производные

1,3-б«с(2-хлорзтил)-1-нитрозомочевина BCNU США

1-(2-[хлорэтил)-3-циклогексил-1-нитрозомочевина CCNU США

1-(4-амино-2-метил-5-пиримидинил)метил-3- (2-хлорэтил)3-нитрозомочевина ACNU Япония

9-(2-хлорэтил)-7-нитрозо-Ь-гомоцитрулин (75 %) Лизомустин (нитруллин) Россия

9-{2-хлорэтил)-9-нитрозо-Ь-гомоцитрулин

Оказалось, что штамм лейкоза L1210, резистентный к МНМ (L1210/MHM), сохраняет полную чувствительность к нитруллину (100% излечение животных). На штаммах L1210/BCNU и Ы210/араноза было отмечено увеличение продолжительности жизни на 50 и 29 % соответственно, т. е. выявлено значительное снижение чувствительности опухолей к нитруллину [4].

Известно, что в водных растворах при pH 7,0-7,5 АНМ неустойчивы и быстро подвергаются гидролитическому распаду с образованием алкилкарбониевых ионов, алкилирующих основания и фосфатные группы ДНК и РНК, а также изоцианатов, карбамоилирующих белки и липиды [6, 8]. Установлено, что определяющую роль в цитотоксичности монофункциональных метильных АНМ играет образование аддукта Об-ме-тилгуанина (06-МГ). Бифункциональные хлорэтиль-ные АНМ быстро реагируют с различными сайтами ДНК с образованием хлорэтильных аддуктов, которые затем реализуются в сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок [5,12]. Цитотоксичность хлорэтильных АНМ связывают с образованием Об-Хлорэтилгуанина, который после внутримолекулярной перестройки превращается в 06,№-этаногуанин. В результате реакции последнего с цитозином противоположной цепи ДНК образуется сшивка №-цитонизил-№-гуанилэтан [10]. Появление этой и других сшивок вызывает клеточную гибель, блокируя репликацию и индуцируя апоптоз. Противоопухолевая активность метильных АНМ определяется не только интенсивностью алкилирования хуанина ДНК в положении О6, но и длительностью существования этой модификации, которая, в свою очередь, зависит от активности ферментов репарации и, прежде всего, от Об-метилгуанин-ДНК-трансферазы (О6-МГТ). Уникальность механизма действия этого фермента (белка-переносчика) заключается в том, что в клетках эукариот он переносит метальные группировки с 06-МГ в составе ДНК на свой собственный цистеиновый остаток в положении 145.

Определение активности этого фермента в опухолевых клетках может быть использовано для предсказания их чувствительности к АНМ: в клетках чувстви-

тельных штаммов экспериментальных опухолей животных и культур опухолей человека активность О6-МГТ низкая, а в резистентных — высокая. Следует отметить, что примерно у 100 % опухолей животных активность этого фермента, так же как, в клетках костного мозга, чрезвычайно низкая, в то время как опухоли человека в 75-80 % случаев характеризуются высоким содержанием Об-МГТ [11]. Возможно, это является одной из причин различной чувствительности опухолей животных и человека к АНМ.

Мы сравнивали образование 06-МГ-аддуктов ДНК и активность Об-МГТ в клетках лейкоза L1210/0 и Ы210/араноза после введения аранозы и МНМ мы-шам-опухоленосителям. Активность 06-МГТ в лизатах клеток Ы210/араноза была приблизительно в 9 раз выше, чем в лизатах клеток L1210/0 (760 и 83 фмоль/мг белка соответственно). Активность Об-МГТ в клетках Ы210/араноза резко падала через 2 ч после введения однократной дозы МНМ или аранозы, а затем полностью восстанавливалась через 48 и 72 ч после введения МНМ и аранозы соответственно (рис. 1, а). Введение МНМ и аранозы мышам с лейкозом L1210/0 приводило к двукратному уменьшению активности 06-МГТ, которое сохранялось в течение 72 ч (рис. 1, б) [9]. Таким образом, можно предположить, что повышенный уровень фермента в резистентных клетках, обеспечивающий активную репарацию повреждений ДНК, вносит существенный вклад в развитие лекарственной устойчивости к метальным АНМ.

Активность алкилтрансферазы в клетках L1210/H (штамм, резистентный к нитруллину) была в 1,5-2 раза выше, чем в клетках чувствительного штамма. Маловероятно, что эти несущественные различия ответственны за возникновение резистентности к нитруллину

В опытах на мышах с лейкозом L1210/0 и L1210/H было показано, что в условиях in vivo и in vitro не выявлено различий во внутриклеточной концентрации нитруллина в обоих типах клеток (рис. 2). Таким образом, не удалось выявить преимущественного накопления препарата в клетках чувствительного штамма по сравнению с резистентным.

При введении мышам с лейкозом L1210/0 однократной терапевтической дозы нитруллина отмечается существенное ингибирование синтеза ДНК и РНК. Изучение различий в характере ингибирования синтеза макромолекул в клетках, чувствительных и резистентных к нитруллину, обнаружило менее глубокое ингибирование и существенно более быстрое восстановление синтеза ДНК и РНК в резистентных клетках (рис. 3). В клетках лейкоза L1210/MHM нитруллин индуцирует практически полное торможение синтеза ДНК (рис. 4) и частичное — в клетках L1210/BCNU (рис. 5).

Выявлена положительная корреляция между ингибированием включения радиоактивного предшественника в ДНК и резким снижением активности ДНК-поли-мераз а и ß в чувствительном к нитруллину штамме; в резистентном штамме активность ДНК полимеразы а практически не меняется, в то время как активность ДНК полимеразы ß — основного фермента репарации

Время, ч

а

б

Рис. 1. Влияние аранозы (1) и МНМ (2) на активность 06-МГТ в клетках лейкоза: а — 1Л210/араноза; б— L1210/0

повреждений ДНК — существенно повышается (рис. 6). Следует отметить, что в клетках L1210/H на всем протяжении развития опухолевого процесса отмечается существенное увеличение активности ДНК-полимераз аир по сравнению с лейкозом L1210/0 (рис. 7), что согласуется с заметным увеличением уровня SH-групп в клетках резистентного штамма.

Не обнаружено различий в активности ферментов тимидинкиназы и рибонуклеотидредуктазы как в ин-тактных клетках L1210/Ои L1210/H, так и после воздействия терапевтических доз нитруллина (160 мг/кг) in vivo.

Время, мин

Рис. 2. Внутриклеточная концентрация нитруллина в клетках лейкоза Ы210/0 (1) и Ы210/Н (2) после введения мышам-опухоленосителям

Методом центрифугирования в градиенте плотности нейтральной сахарозы в условиях высокой ионной силы в присутствии этидиум бромида изучали различия в появлении и репарации повреждений вторичной структуры ДНК, индуцированных нитруллином, в клетках лейкозов 1Л210/0и Ы210/Н. Обращает на себя внимание различие в профилях седиментации в контроле (необработанные клетки) между чувствительным и резистентным штаммами. Это свидетельствует о различиях в степени суперспирализации ДНК нуклеоидов клеток с разной чувствительностью к нит-руллину. Эти конформационные различия, по-видимому, могут обусловливать и различия в экспрессии генов, действие которых способно определять чувствительность клеток к препарату. Не обнаружено существенных различий в образовании сшивок в ДНК в штаммах Ы210/0 и Ы210/Н после однократного введения нитруллина в терапевтической дозе (рис. 8).

Вероятнее всего, нарушения во вторичной структуре ДНК не определяют возникновения резистентности к нитруллину, поскольку он практически не вызывает образования сшивок ДНК-ДНК. Ранее было показано, что ВСКи в терапевтических дозах индуцирует образование сшивок ДНК-ДНК [7]. Нами продемон-стировано, что алкилирующая активность нитруллина в 15 раз меньше, чем ВСЖГ (табл. 2).

Таким образом, установлено практически полное ингибирование нитруллином синтеза ДНК в клетках лейкоза Ы210/0 и Ы210/МНМ и менее выраженное в Ь1210/ВСКи, что согласуется с химиотерапевтическими данными об отсутствии полной перекрестной резистентности между различными АНМ.

Возникновение лекарственной устойчивости к нитруллину связано не с нарушением его транспорта в опухолевые клетки, а обусловлено различной скоро-

днк

Время, н

а

РНК

Время, ч

б

Рис. 3. Включение 2-14С-тимидина в ДНК

стью репарации повреждений ДНК в клетках чувствительного и резистентного штаммов. Активация репарации в клетках лейкоза Ы210/Н обусловлена увеличением активности ДНК-полимераз а и особенно р, что согласуется с повышенной концентрацией внутриклеточного глутатиона в этих клетках.

Лекарственная устойчивость к нитруллину не связана с увеличением активности 06-АГТ в клетках Ы210/Н, в то время как в клетках Ы210/араноза активность этого фермента в 9 раз выше, чем в клетках

Время, ч

Рис. 4. Влияние нитруллина (1) и МНМ (2) на включение 2-14С-тимидина в ДНК клеток лейкоза Ы210/МНМ

Время, ч

Рис. 5. Влияние нитруллина (1) и ВСЫи (2) на включение 2-14С-тимидина в ДНК клеток лейкоза 1Л210/ВСЖГ

Время, ч

Рис. 6. Влияние нитруллина на активность ДНК-полимеразы а и Р в клетках лейкоза Ы210/0 и Ы210/Н: 1 — ДНК-полимераза а в клетках Ь1210/0; 2 — ДНК-полимераза а в клетках Ы210/Н; 3— ДНК-поли-мераза Р в клетках Ь1210/0; 4 — ДНК-полимераза Р в клетках Ы210/Н

а

Время, сутки

А Б

^ fr 1 1 ^ 3»ПГЪ№ 1 ♦ 1 I H / t “l L.

1 s. J i 1 , mV4-s I *1 xvwv

t i 1'. t H »WAV*--* \ 1 \ • Vfc-r*-

tu i\ 1 ✓ ‘^v.

ЛДк/л» ^ ’i часа J ^ •1 i w. W • * 1 J V-. В я

Vw.v- i& 1 yi I» '£ чзл>* ' l  ' 4 } V r ;> ii) V

Э4[х :кигс

Рис. 8. Седиментация ДНК нуклеоида клеток лейкоза Ы210/0 (А) и Ы210/Н (Б) в градиенте нейтральной сахарозы после введения нитруллина в дозе 160 мг/кг

Рис. 7. Изменение активности ДНК-полимераз а

Таблица 2

Некоторые свойства АНМ

Препарат Ti/2, МИН Алкилирующая Карбамоилирующая

активность активность

MHM 3,5 100' 42

BCNU 43 152 22

Нитруллин 68,0 10 40

*Алкилирующая активность MHM принимается за 100 %.

чувствительного к аранозе штамма, и, вероятно, ответственна за возникновение резистентности к монофункциональным АНМ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Горбачева Л. Б. Молекулярные механизмы резистентности к N-алкил-М-нитрозомочевинам // Биол. мембраны. — 2003. — Т. 20, № 3. — С. 256-264.

2. Дементьева Н. П., Корман Д. Б. Нитрозометил-мочевина — 30 лет изучения и применения для лечения онкологических больных // Вопр. онкологии. — 2001. — Т. 47, № 6. — С. 3-11.

3. Купчая Д. 3., Манзюк Н. В. Характеристика отдельных противоопухолевых препаратов. — В кн.: Химиотерапия опухолевых заболеваний. — Ред. Перевод-чикова Н. И. — М., 2000. — С. 45-84.

4. ПеретстинаН. М, ГерасимоваГ. К, Белоусова А К, Барышников А. Ю. Доклиническое изучение противоопухолевой активности и механизмов действия лизо-мустина. В кн.: Экспериментальная онкология на рубеже веков / Под ред. М. И. Давыдов, А. Ю. Барышников,—М., 2003. С. 147-160.

5. Brent Т. P. Suppression of cross-link formation in chloroethylurea treated DNA by an activity in extracts of human leukemic lymphoblasts // Cancer Res. — 1984. — Vol. 44, —P. 1887-1892.

6. Gorbacheva L. B., Kukushkina G. V., Sokolova

I. S., Serebryanyi A. M. Studies of N-methyl-N-nitrosourea-14CO pharmacokinetics, in mice with hepatoma 22a. In: Cancer Chemotheraphy. Vol. II / Eds. K. Heilman, T. A. Connors. — Plenum Press, 1976. P. 209-213.

7. Gorbacheva L. B., Kukushkina G. V, Durdeva A. D., Ponomarenko N. A. In vivo DNA damage and resistance to 1-methyl-1-nitrourea and l,3-bis(2-chloroethyl)-l-nitrosourea in L1210 leukemia cells // Neoplasma. — 1988. —Vol. 35. —P. 3-14.

8. Montgomery J. A., James R., McCaleb G. S. et al. Decomposition of N-(2-chloroethyl)-N-nitrosoureas in aqueous media // J. Med. Chem. — 1975. — Vol. 18. — P. 568-571.

9. Perevodchikova N. A., Gorbacheva L. B., Preobrazhenskaya M. N. Aranoza // Drugs of the Future. — 2003. — Vol. 28. — P. 941-949.

10. Tong W. P., KirkM. X., Ludlum D. B. Formation of the cross-link l-[N3-deoxycytidyl]-2-(N1-deoxyguanosyl) ethane in DNA treated with N,N-bis(2-chloroethyl)-N-nitrosoureas // Cancer. Res. — 1982. — Vol. 42. — P. 3102-3105.

11. Tsujmura T., Zhang Yang-Pei, Fujio C. et al. // Jpn. J. Cancer. Res. — 1988. — Vol. 78. — P. 1207-1215.

12. Zlotogorski C., Erickson L. C. Pretreatment of human colon tumor cells with DNA methylatizing agents inhibits the ability to repair chloroethyl monoadducts // Carcinogenesis (Lond.). — 1984. — Vol. 5. — P. 83-87.