Способ получения раствора факторов роста из тромбоцитов
METHOD FOR OBTAINING A SOLUTION OF GROWTH FACTORS FROM PLATELETS

Предлагаемое изобретение относится к области регенеративной медицины, касается способа получения раствора факторов роста из тромбоцитов, который может быть использован для получения препарата с высоким содержанием аутологичных факторов роста для регенерации поврежденных тканей.
На сегодняшний день одной из самых актуальных проблем регенеративной медицины остается безопасность биомедицинских клеточных продуктов. Применение такого рода препаратов должно не только способствовать активации и поддержанию регенеративных процессов, способствующих восстановлению структуры и функции тканей, но и не должно приводить к возникновению нежелательных побочных эффектов, связанных с воздействием биологически активных молекул.
Богатая тромбоцитами плазма (PRP) - фракция плазмы, содержащая повышенную концентрацию тромбоцитов, в последние годы широко исследуется и применяется в регенеративной медицине. Клиническая полезность PRP подтверждается тем, что она содержит высокие концентрации содержащихся в тромбоцитах факторов роста и нормальные концентрации фибриногена, которые синергетически способствуют регенеративному процессу [Lubkowska, Dolegowska, Banfi, 2012]. Факторы роста (ФР), высвобождаемые из активированных тромбоцитов, инициируют и модулируют заживление как в мягких, так и в твердых тканях [Kawase, 2015]. В альфа-гранулах тромбоцитов содержатся многочисленные белки: фактор роста тромбоцитов (PDGF), трансформирующий фактор роста (TGF), интерлейкины, фактор ангиогенеза тромбоцитов (PDAF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), эпидермальный фактор роста (EGF), инсулиноподобный фактор роста IGF и фибронектин. Все эти молекулы участвуют в таких процессах, как направленный транспорт, пролиферация и дифференцировка стволовых клеток, оказывая комплексное влияние на про/противовоспалительные и анаболические/катаболические процессы в тканях. Основываясь на вышесказанном, можно говорить о том, что PRP представляет собой простую, недорогую и минимально инвазивную процедуру для доставки высоких концентраций аутологичных ФР и цитокинов в поврежденные ткани в физиологических пропорциях. Этот продукт, полученный из крови, которым производят обработку поврежденных тканей, широко используется в различных областях медицины и демонстрирует свою эффективность.
2
PRP различается по содержанию факторов в зависимости от протокола подготовки, и основными факторами, влияющими на конечный состав продукта обычно являются: исходное количество тромбоцитов, характер применяемых антикоагулянтов, наличие в суспензии лейкоцитов и применяемые активаторы, приводящие к различным биологическим результатам [Marques и др., 2015]. Термин «активация» тромбоцитов относится к двум ключевым процессам, которые инициируются во время подготовки PRP: дегрануляция тромбоцитов для высвобождения ростовых факторов из α-гранул и расщепление фибриногена для инициации образования матрикса, который позволяет формировать тромбоцитарный гель и, следовательно, ограничить секрецию молекул выбранным участком [Wasterlain, Braun, Dragoo, 2012]. Стадия активации перед введением PRP включена во многие используемые протоколы, обычно путем добавления тромбина и/или хлорида кальция (CaCl), но иногда PRP предпочитают вводить в неактивированной форме, полагаясь на спонтанную активацию тромбоцитов, происходящую после воздействия на нативный коллаген, присутствующий в соединительных тканях [Matteo Di и др., 2015]. Одним из основных недостатков применения PRP является то, что для того, чтобы добиться целевого уровня биологически активных тромбоцитарных факторов важна не только концентрация тромбоцитов, но и форма препарата. Применение препаратов с неактивированными недегранулировавшими тромбоцитами может приводить к несинхронизированной и замедленной секреции стимуляторов роста и противовоспалительных цитокинов.
В медицине для активации процессов регенерации помимо самой PRP могут использоваться факторы, выделенные из тромбоцитов в процессе активации, а также рекомбинантные факторы. Тромбоциты содержат различные биологически активные молекулы с естественным балансом анаболических и катаболических функций, что, способствует оптимизации тканевой среды и способствует процессу заживления [Qian и др., 2017; Tschon и др., 2011]. Факторы роста, полученные из PRP, могут способствовать регенерации тканей, способствуя миграции клеток, пролиферации, дифференцировке и синтезу внеклеточного матрикса [Gulotta и др., 2011; Isaac и др., 2012]. Основным способом получения факторов из тромбоцитов является приготовление лизата тромбоцитов.
Известно, что способность к адгезии для тромбоцитов является одной из ключевых функций, отвечающих за реализацию их биологических функций, в т.ч. формирование тромба начинается с прикрепления тромбоцита к стенке поврежденного сосуда с последующим вовлечением других тромбоцитов и иммунных клеток в процесс формирования тромба и последующей регенерации. При этом адгезия приводит к активации тромбоцитов с последующим выбросом содержимого их гранул [Wu, 2015]. Известным способом активация тромбоцитов через их адгезию (и последующую агрегацию) является метод пропускания крови или плазмы через колонку, содержащую стеклянные шарики [Добровольский, Титаева, 2015]. Этот принцип был использован для обеспечения активации тромбоцитов в составе PRP, что обеспечивало выделение клетками в среду факторов роста.
В настоящее время известно достаточное количество различных способов получения и сохранения факторов роста в надлежащем качестве с последующим применением в различных препаратах, способных увеличивать скорость регенерации поврежденных тканей. Однако, практически все известные и применяемые способы имеют ряд недостатков: недостаточно быстрый процесс регенерации после применения, использование веществ, которые могут оказать негативное влияние по отношению к организму.
Следовательно поиск более эффективного и безопасного способа является наиболее актуальной задачей.
Известен органоспецифический регенерант GI, содержащий этап центрифугирования концентрата тромбоцитов с последующей фильтрацией. (RU 2462255 C1, кл. A61K 35/16, A61L 27/22, A61L 27/44, опубл. 27.09.2012 г.).
Данный регенерант включает фибриновую матрицу с тромбином, криопреципитат, полученный из карантинизированной свежезамороженной донорской плазмы, оказывающий деструктивное влияние на организм человека.
Известен способ получения ростовой добавки на основе лизата тромбоцитов из тромбоцитарной массы доноров к среде для наращивания клеточной массы стволовых, прогениторных, дифференцированных и опухолевых клеток, включающий нормирование образца тромбоцитарной массы до заданной концентрации тромбоцитов посредством центрифугирования тромбоцитарной массы и ресуспендирования осадка в супернатанте заданного объема до указанной концентрации тромбоцитов. (RU 2648162 C2, кл. С12N5/071, опубл. 22.03.2018 г.).
Данный способ не позволяет добиться получения необходимого количества аутологичных факторов роста по причине деструкции ростовых факторов путем замораживания и дальнейшего оттаивания.
Известен способ приготовления лизата тромбоцитов с высоким содержанием факторов роста, включающий следующие этапы: забор венозной крови пациента, оценка содержания тромбоцитов с гранулами, центрифугирование крови и полученной плазмы, а также удаление надосадка. (RU 2739515 C1, кл. A61K 35/19, G01N 33/49, B01D 21/26, A61P 43/00, опубл. 25.12.2020 г.).
Данный способ не позволяет добиться получения необходимого количества аутологичных факторов роста по причине отсутствия этапов смешивания суспензии с последующим отделением жидкой фракции.
В задачу изобретения положена разработка способа получения раствора факторов роста из тромбоцитов в бесплазменной среде.
Техническим результатом от использования изобретения является повышение содержания факторов роста из тромбоцитов в растворе, способного увеличить скорость регенерации поврежденных тканей.
9
Поставленная задача достигается тем, что способ получения раствора факторов роста из тромбоцитов включает забор венозной крови пациента, оценку содержания в крови тромбоцитов при норме не менее 0,75×10 тромбоцитов/мл, двухэтапное центрифугирование пробы крови, сначала при 100-1500 g в течение 3-15 минут при температуре 12-26°С для получения фракции плазмы с тромбоцитами без примеси лейкоцитов и эритроцитов, затем при 300-1500 g в течение 3-19 минут при температуре 12-26°С для осаждения тромбоцитов, удаление надосадка с последующим ресуспендированием осажденных тромбоцитов в фосфатно-солевом буферном растворе c водородным показателем pH 7,3 или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия, активацию тромбоцитов с последующим высвобождением факторов путем смешивания полученного объема суспензии с двумя объемами стеклянных гранул диаметром 0,5-4,5 мм с последующим помещением в шприц на 10 мл и инкубировании при температуре 18-37°C в течение 5-25 часов с последующим отделением жидкой фракции от стеклянных гранул путем выдавливания из шприца и последующей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм с дополнительным промыванием стеклянных гранул фосфатно-солевым буфером, с последующим выделением фильтрацией раствора, содержащего факторы роста, при помощи центрифужного фильтра с диаметром пор 100-500 кДа путем 10-60 минутного центрифугирования при скорости ускорения равной 3200-5000 g при температуре 4-25°C с последующим отбором отфильтрованной фракции.
2
На фиг. 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая пример 1, показывающая, что пролиферативная активность фибробластов после воздействия факторов роста из тромбоцитов увеличивается, где: OD - оптическая плотность раствора; 1 - неактивированная PRP; 2 - PRP, активированная с помощью 20 мМ CaCl; 3 - раствор, содержащий факторы роста тромбоцитов, полученный после инкубации PRP со стеклянными гранулами.
2
На фиг. 2. представлены диаграмма и микрофотографии, иллюстрирующие пример 2, отображающие показатели миграции фибробластов in vitro после добавления к их культуре факторов роста из тромбоцитов, где: А - сравнение количества фибробластов, мигрировавших в место соскоба; Б - изображение соскобов после миграции фибробластов, полученные с помощью инвертированного светового микроскопа; 1 - фосфатно-солевой буфер (pH 7.3); 2 - неактивированная PRP; 3 - активированная с помощью 20 мМ CaCl PRP; 4 - раствор, содержащий факторы роста тромбоцитов, полученный после инкубации PRP со стеклянными гранулами.
2
2
На фиг. 3 представлена диаграмма, иллюстрирующая пример 3, отображающая концентрации эпидермального фактора роста тромбоцитов в растворе, полученном с применением способа получения факторов роста из тромбоцитов по сравнению с PRP и активированной CaCl PRP, определенная с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, где: 1 - неактивированная PRP; 2 - активированная с помощью 20 мМ CaCl PRP; 3 - раствор, содержащий факторы роста тромбоцитов, полученный после инкубации PRP со стеклянными гранулами.
Способ получения раствора факторов роста из тромбоцитов осуществляют следующим образом.
Осуществляют забор венозной крови у пациента в стандартную пробирку с антикоагулянтом, который прерывает процесс свертывания.
9
Пробирки с собранной венозной кровью помещают в центрифугу и центрифугируют в течение 3-15 минут при скорости ускорения равной 100-1500 g и температуре 12-26°C для получения плазмы с тромбоцитами без примеси лейкоцитов и эритроцитов. Затем оценивают содержание тромбоцитов при норме не менее 0,75×10 тромбоцитов/мл. Количество тромбоцитов оценивают с помощью подсчета клеток методом оптической микроскопии. В таблице 1 приведены данные о концентрации тромбоцитов в плазме после применения разных режимов первого центрифугирования.
Таблица 1Концентрации тромбоцитов в плазме в зависимости от режима первого центрифугирования (ускорение, время, температура)
Значение ускорения для первого центрифугирования, g
Время, мин
Температура, °C
Концентрациятромбоцитов, кл/мл
100
3
12
0,80⋅10<sup>9</sup>
100
6
12
0,83⋅10<sup>9</sup>
100
15
12
0,90⋅10<sup>9</sup>
100
3
19
0,87⋅10<sup>9</sup>
100
6
19
0,83⋅10<sup>9</sup>
100
15
19
0,92⋅10<sup>9</sup>
100
3
26
0,78⋅10<sup>9</sup>
100
6
26
0,86⋅10<sup>9</sup>
100
15
26
0,95⋅10<sup>9</sup>
700
3
12
0,90⋅10<sup>9</sup>
700
6
12
0,84⋅10<sup>9</sup>
700
15
12
0,94⋅10<sup>9</sup>
700
3
19
0,76⋅10<sup>9</sup>
700
6
19
0,78⋅10<sup>9</sup>
700
15
19
0,80⋅10<sup>9</sup>
700
3
26
0,98⋅10<sup>9</sup>
700
6
26
0,93⋅10<sup>9</sup>
700
15
26
0,95⋅10<sup>9</sup>
1500
3
12
1,40⋅10<sup>9</sup>
1500
6
12
1,32⋅10<sup>9</sup>
1500
15
12
1,23⋅10<sup>9</sup>
1500
3
19
1,75⋅10<sup>9</sup>
1500
6
19
1,52⋅10<sup>9</sup>
1500
15
19
1,57⋅10<sup>9</sup>
1500
3
26
1,48⋅10<sup>9</sup>
1500
6
26
1,42⋅10<sup>9</sup>
1500
15
26
1,53⋅10<sup>9</sup>
Пробирки с собранной плазмой центрифугируют в течение 3-19 минут при скорости ускорения равной 300-1500 g и температуре 12-26°C для осаждения тромбоцитов на дне пробирки. Затем частично удаляют плазменную часть - 2/3 объема пробирки, содержащей тромбоциты, с последующим ресуспендированием тромбоцитов в оставшемся объеме плазмы. Концентрацию тромбоцитов в суспензии подсчитывают методом оптической микроскопии. В таблице 2 представлены данные о концентрации тромбоцитов в плазме после применения разных режимов второго центрифугирования.
Таблица 2Концентрации тромбоцитов в плазме в зависимости от режима второго центрифугирования (ускорение, время, температура)
Значение ускорения для первого центрифугирования, g
Время, мин
Температура, °C
Концентрация тромбоцитов, кл/мл
300
3
12
1,30⋅10<sup>9</sup>
300
11
12
1,67⋅10<sup>9</sup>
300
19
12
1,80⋅10<sup>9</sup>
300
3
19
1,36⋅10<sup>9</sup>
300
11
19
1,43⋅10<sup>9</sup>
300
19
19
1,45⋅10<sup>9</sup>
300
3
26
1,73⋅10<sup>9</sup>
300
11
26
1,84⋅10<sup>9</sup>
300
19
26
1,85⋅10<sup>9</sup>
900
3
12
1,91⋅10<sup>9</sup>
900
11
12
1,87⋅10<sup>9</sup>
900
19
12
1,94⋅10<sup>9</sup>
900
3
19
1,72⋅10<sup>9</sup>
900
11
19
1,78⋅10<sup>9</sup>
900
19
19
1,82⋅10<sup>9</sup>
900
3
26
1,93⋅10<sup>9</sup>
900
11
26
1,95⋅10<sup>9</sup>
900
19
26
1,92⋅10<sup>9</sup>
1500
3
12
2,42⋅10<sup>9</sup>
1500
11
12
2,29⋅10<sup>9</sup>
1500
19
12
2,23⋅10<sup>9</sup>
1500
3
19
2,27⋅10<sup>9</sup>
1500
11
19
2,32⋅10<sup>9</sup>
1500
19
19
2,72⋅10<sup>9</sup>
1500
3
26
2,41⋅10<sup>9</sup>
1500
11
26
2,56⋅10<sup>9</sup>
1500
19
26
2,35⋅10<sup>9</sup>
Смешивают получившийся объем суспензии тромбоцитов с двумя объемами стеклянных гранул (в качестве примера необходимо указать из каких материалов используются гранулы) диаметром 0,5-4,5 мм, предварительно промытых фосфатно-солевым раствором c водородным показателем pH 7,3 или изотоническим 0,9% раствором хлорида натрия, с последующим помещением в шприц на 10 мл и инкубацией при температуре 18-37°C на протяжении 5-25 часов. Концентрацию EGF определяют с помощью коммерческого ИФА набора для определения концентрации EGF в биологических жидкостях SEA560Hu (CCC, США). В таблице 3 представлены значения концентрации EGF в зависимости от диаметра стеклянных гранул, времени и температуры инкубации плазмы (PRP) с гранулами.
Таблица 3Концентрация EGF в плазме (PRP) в зависимости от диаметра стеклянных гранул и времени инкубации
Диаметр стеклянных гранул, мм
Время, ч
Температура, °C
Концентрация EGF, pg/ml
0,5
5
37
115±15
0,5
15
28
216±22
0,5
25
18
230±30
2,5
5
37
217±37
2,5
15
28
225±15
2,5
25
18
240±59
4,5
5
37
261±71
4,5
15
28
280±35
4,5
25
18
293±53
Жидкую фракцию от стеклянных гранул отделяют путем выдавливания из шприца и затем пропускают через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм с последующим промыванием стеклянных гранул фосфатно-солевым раствором с водородным показателем pH 7,3.
Выделение фракции, содержащей факторы роста, осуществляют при помощи центрифужного фильтра с порогом отсечения по молекулряной массе 10-500 кДа центрифугированием в течение 10-60 минут при скорости ускорения равной 3200-5000 g при температуре 4-25°C с последующим отбором прошедшей через фильтр фракции. В таблице 4 представлены значения концентраций EGF в растворе после пропускания полученной жидкой фракции через фильтр в зависимости от скорости центрифугирования, порога отсечения по молекулряной массе, продолжительности центрифугирования и температуры.
Таблица 4Концентрация EGF в растворе в зависимости от порога отсечения по молекулярной массе используемого фильтра и времени центрифугирования
Значение ускорения при центрифугировании, g
Порог отсечения (лимит) по мол. массе, кДа
Время, мин
Температура, °C
Концентрация EGF , pg/ml
5000
10
10
4
40±10
4000
10
35
15
35±9
3200
10
60
25
57±35
5000
300
10
4
150±15
4000
300
35
15
171±45
3200
300
60
25
183±35
5000
500
10
4
160±32
4000
500
35
15
210±10
3200
500
60
25
315±23
Повышение содержания факторов роста из тромбоцитов обеспечивается за счет контактной активации тромбоцитов с последующей секрецией содержимого гранул в раствор при взаимодействии со стеклянным гранулятом. Способ получения факторов роста включает в себя этап смешивания объема необходимой суспензии тромбоцитов с двумя объемами стеклянных гранул, предварительно промытых фосфатно-солевым буфером или изотоническим раствором хлорида натрия, впоследствии не оказывающего деструктивного влияния на человеческий организм, с последующей инкубацией при температуре 18-37°C на протяжении 5-25 часов с дальнейшим отделением от стеклянных шариков и фильтрацией полученного раствора.
Ниже представлены примеры конкретного осуществления изобретения, доказывающие достижение указанного технического результата.
Пример 1.
Активация пролиферации фибробластов факторами роста, полученных из тромбоцитов.
2
2
2
2
Клетки мышиных фибробластов линии L929 разморозили после криоконсервации и культивировали в питательной среде DMEM с добавлением 10 % FBS, 4 мМ L-глютамина, произведя 1-2 пассажа. Клетки снимали с культурального матраса с помощью раствора трипсина/ЭДТА (0,25%). Доводили концентрацию клеток до 50 000 кл/мл и переносили суспензию в 96-луночный планшет по 100 мкл на лунку. Инкубировали планшет с клетками в течение ночи при 37°C, 5% CO. На следующий день к клеткам вносили неактивированную PRP, PRP, активированную с помощью 20 мМ CaCl - для этого к суспензии тромбоцитов добавляли CaClв конечной концентрации 20 мМ и инкубировали 30 мин, или раствор, содержащий факторы роста тромбоцитов, полученный после инкубации PRP со стеклянными гранулами. Растворы нормировали по содержанию в них EGF - конечная концентрация EGF в растворе должна составлять 50 нг/мл (концентрация оценивается предварительно с помощью иммуноферментного анализа и коммерческого набора для определения концентрации EGF в плазме). После разведения растворы фильтровали дополнительно через фильтр 0,22 мкм. Затем вносили по 20 мкл растворов в лунки, содержащие клетки. Инкубировали 24 часа при 37°C, 5% CO. Оценку пролиферативной активности фибробластов производили с помощью раствора 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромида (MTT). Считывание оптической плотности раствора производили при 570 нм с помощью спектрофотометра. Добавление раствора, содержащего факторы роста тромбоцитов, полученного после инкубации PRP со стеклянными гранулами, приводило к активации пролиферативной активности фибробластов (фиг. 1).
Пример 2.
Активация миграции фибробластов in vitro факторами роста, полученными из тромбоцитов.
2.
2
2
Клетки мышиных фибробластов линии L929 разморозили и культивировали в питательной среде DMEM с добавлением 10 % FBS, 4 мМ L-глютамина, произведя 1-2 пассажа. Доводили концентрацию клеток до 500 000 кл/мл и переносили суспензию в 6-луночные планшеты (2 мл на лунку), а затем инкубировали при 37°С, 5% COПри достижении 95% плотности культуры в каждой лунке делали соскоб в виде прямой линии с помощью наконечника для пипетки на 200 мкл. Лунку промывали три раза стерильным фосфатно-солевым раствором с водородным показателем pH 7,3 и заполняли растворами: фосфатно-солевым буфером (pH 7.3), неактивированной PRP; PRP, активированной с помощью 20 мМ CaCl;раствором, содержащим факторы роста тромбоцитов, полученных после инкубации PRP со стеклянными гранулами. Планшеты с культурами клеток помещали в инкубатор на 24 ч (37°С, 5% CO) и затем исследовали с помощью инвертированного оптического микроскопа. В каждой лунке подсчитывали количество мигрировавших клеток. Добавление к культуре фибробластов факторов роста, полученных из тромбоцитов, приводило к активации миграции фибробластов in vitro (фиг. 2).
Пример 3.
2
Получение раствора, содержащего факторы роста тромбоцитов: раствор, содержащий факторы роста тромбоцитов, полученных после инкубации PRP со стеклянными гранулами, содержит концентрацию EGF большую, чем PRP, активрованная CaClили неактивированная PRP.
2
2
Концентрацию эпидермального фактора роста определяли методом иммунофрементного анализа с помощью коммерческого набора для определения концентрации человеческого EGF (Cloud-Clone corp., США) в следующих растворах: неактивированной PRP, PRP активированной с помощью 20 мМ CaCl, а также в растворе, содержащем фаткоры роста тромбоцитов, полученном после инкубации PRP со стеклянными гранулами. Полученные результаты измерения концентрации EGF показали, что предложенный способ позволяет получить раствор с концентрацией EGF выше, чем для PRP, активированной с помощью CaCl(фиг. 3).