Клинико-иммунологический статус, цитокиновый ответ у детей с норовирусной инфекцией

УДК 616.34-022.6-053.2-097

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ СТАТУС, цитокиновый ОТВЕТУ ДЕТЕЙ С НОРОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

Р.К. Бабик

ЧелГМА, г. Челябинск

В статье представлены результаты изучения места норовирусов в этиологии острых кишечных инфекций у детей, проходивших лечение в детской клинической больнице № 8 г. Челябинска в период с 2005 по 2009 гг. Уточнены варианты клинического течения норовирусной инфекции у детей в различные возрастные периоды. В исследовании проанализирован характер иммунного ответа и цитокинов у детей при норовирусной инфекции.

Ключевые слова: норовирусная инфекция, ПЦР-диагностика, цитокины, дети.

В настоящее время в этиологической структуре острых кишечных инфекций (ОКИ) у детей значительно преобладает доля вирусов [1-3, 7]. В последние годы активно изучаются норовирусы, первоначально названные Norwalk virus по той местности, где в 1968 году была зарегистрирована вспышка острого гастроэнтерита среди школьников начальной школы. Название норовирус (род Норовирус, семейство Caliciviridae) было утверждено Международным комитетом по таксономии вирусов в 2002 году. Геном норовирусов определяет одноцепочная РНК. Норовирусы классифицируют на 5 геногрупп (GI, GII, GUI, GIV и GV), которые подразделяются на разные кластеры или генотипы. Геногруппы I, II и IV вызывают поражения у человека. Геногруппа II содержит 19 генотипов норовируса. Норовирусы геногруппы II, генотипа 4 (GII4), являются причиной большинства вспышек гастроэнтерита у взрослых [5, 6].

На протяжении последних лет норовирусы находятся на втором месте после ротавирусов среди диагностируемых возбудителей ОКИ [3, 7]. Однако клинико-эпидемиологические аспекты ОКИ норовирусной этиологии у детей до конца не раскрыты [3, 4]. Представляется актуальным, в связи с развитием методов генной диагностики и расширением возможности этиологической верификации ОКИ, оценить клиническую значимость норовирусной инфекции у детей. Изучение уровня цитокинов, показателей иммунного ответа у детей с норовирусной инфекцией позволяет охарактеризовать реализацию механизмов действия противовирусной защиты при развитии этого инфекционного заболевания.

Целью данной работы явилось изучение распространенности и клинических особенностей течения ОКИ норовирусной этиологии у детей разных возрастных групп с оценкой их иммунного статуса, уровня цитокинов.

Пациенты и методы. Проведено обследование 276 детей, больных ОКИ норовирусной этиологии, в возрасте от 1 недели до 14 лет, госпитали-

зированных в инфекционное кишечное отделение детской клинической больницы № 8 г.Челябинска в 2005-2009 гг.

Лабораторная диагностика, наряду со стандартными методами обследования больных ОКИ, включала исследование с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) фекалий в ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (г. Москва). Для исследований методом ПЦР забор материала производили в течение первых 72 часов после госпитализации детей. Предварительную обработку материала осуществляли в вирусологической лаборатории клиники Челябинской медицинской академии. Транспортировали материал в условиях «Холодовой цепи». Тестирование образцов фекалий проводилось с использованием реагентов ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. Проводили скрининг образцов на норовирусы, с определением их генотипов, кроме того, исключали наличие в образцах ротавирусов группы А, астровирусов, аденовирусов, шигелл и энтероин-вазивных Е. СоИ (Е1ЕС), сальмонелл, термофильных кампилобактеров. В 2005 году материал исследовался с применением разработанных в ЦНИИЭ (г. Москва) тест-систем с электрофоретической детекцией продуктов амплификации АмплиСенс. Для мультиплексной гибридизаци-онно-флуоресцентной детекции наиболее распространенных возбудителей ОКИ использовали тест-системы «АмплиСенс ОКИ-скрш». Для определения норовирусов применяли методики типиро-вания на основе использования специфических праймеров и зондов. Для выявления редких типов норовирусов применяли метод прямого секвени-рования. С целью оптимизации работ по выявлению редких генотипов норовирусов в 2006 году были выбраны олигонуклеотиды, специфичные для превалирующего в настоящее время на территории Российской Федерации генетического кластера 02.4 (Бристоль).

Клиническое наблюдение за всеми детьми проводили с момента поступления в стационар до

выписки. Подробно изучали эпидемиологический анамнез, симптомы заболевания, сроки их появления и исчезновения. Учитывали также развитие у части пациентов осложнений. Всем детям были проведены общие клинические лабораторные исследования в 1-2 сутки с момента поступления в стационар и перед выпиской. В тяжелых, осложненных случаях, негладком течении ОКИ дополнительно проводили исследование биохимических, электролитных параметров и оценку кислотно-щелочного состояния организма ребенка.

Иммунологическое обследование детей проводилось в ЦНИИ Челябинской медицинской академии. Изучали иммунный статус пациентов в остром периоде норовирусной инфекции, до начала лечения, по содержанию в крови кластеров диф-ференцировки (CD) моноклональных субпопуляций лимфоцитов, концентрации IgA, IgM, IgG и ЦИК, цитокинов ИФН-сс, ИФН-у, ИЛ-ip, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-4, ИЛ-10 и РАИЛ.

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакетов прикладных программ «SPSS 13.0», «Biostatistica 4.03» и приложения Excel из пакета MS Office ХР. Сравнение параметрических величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента, непараметрических величин - точным методом Фишера, методом хи-квадрат. Результаты сравнений считали статистически значимыми при р < 0,05 [4].

Результаты исследования и их обсуждение. У детей, госпитализированных в детскую клиническую больницу № 8 г. Челябинска, кишечные инфекции норовирусной этиологии по частоте регистрации занимают второе место после ротави-русных диарейных заболеваний, составляя 36,89 % в общей структуре заболеваемости ОКИ. В 96,40 % (п = 266) случаев норовирусной инфекции у больных был определен второй генотип данного вируса и лишь у 3,60 % (п = 10) пациентов выявлен его первый генотип. Норовирусная инфекция встречалась как в виде моно-, так и микст-заболевания (в 57,25 % и 42,75 % случаев соответственно).

В структуре сочетанных инфекций норови-русно-вирусные ОКИ составили 74,58 % (п = 88), из них, норо-ротавирусные ОКИ - 69,32 % (п = 61), норо-астровирусные ОКИ - 7,95 % (п = 7), норо-аденовирусные - 22,73 % (п = 20). Микст норови-русно-бактериальные ОКИ составили 25,42 % (п = 30), из них, смешанных с сальмонеллезом, было 9,30 % (n = 11), шигеллезом - 0,84 % (n = 1), кампилобактериозом - 13,55 % (п = 16), шигеллезом и кампилобактериозом - 1,69 % (п = 2).

Клинические особенности норовирусной инфекции изучались при втором генотипе - моноформе. Наиболее часто данная инфекция определялась у детей в возрасте 1-3 лет (в 54,40 % случаев).

Проведен статистический анализ частоты выявления и продолжительности основных клинических симптомов ОКИ норовирусной этиологии у детей в разных возрастных группах.

У детей, заболевших норовирусной инфекцией на первом году жизни, в клинике превалировал диарейный синдром. С увеличением возраста детей нарастали частота и продолжительность рвоты, в то время как выраженность и продолжительность диа-рейного синдрома уменьшались. Рвота у детей первых трех месяцев жизни регистрировалась в 23,1 % случаев наблюдений и была менее выражена, чем у пациентов других возрастных групп. Длительность заболевания этих детей была несколько большей, в связи с более продолжительной по времени лихорадкой и диарейным синдромом.

Обращает на себя внимание, что у значительного количества детей в каждой возрастной группе (от 16 до 39 %) в первые сутки заболевания не было подъема температуры тела. Температурная реакция у 1-3-месячных детей была в 100 % случаев, но с первого дня болезни ее подъем отмечался лишь в 61,53 % случаев наблюдений. Для этой группы детей была характерна фебрильная температура тела. Преобладающим в клинике норовирусной инфекции у детей 13-24 и 25—36 месяцев жизни было острое начало болезни с появления рвоты (в 100% случаев наблюдений), чаще упорного характера, со средней продолжительностью более двух суток.

Катаральные симптомы, характеризующиеся умеренно выраженной заложенностью носа и гиперемией ротоглотки, с увеличением возраста детей встречались реже.

В клинической картине ОКИ норовирусной этиологии у детей первых 6 месяцев жизни превалировал энтеритный вариант. Наибольшая продолжительность диарейного синдрома отмечалась у детей первого полугодия, что было обусловлено в большей степени измененной жидко-кашицеобразной консистенцией стула, чем увеличенной его кратностью. Эксикоз у детей первого года жизни развивался значительно реже по сравнению с пациентами возрастных групп 13-24 месяцев и 25-36 месяцев жизни, в которых преимущественно встречалась гастроэнтеритическая форма норовирусной инфекции. Синдром кишечного токсикоза диагностировался в этих же возрастных группах (в 9,1 % и 8,7 % случаев соответственно). У детей старше 3 лет при норовирусной инфекции чаще встречалась гастритическая форма, длительность заболевания определялась менее продолжительными лихорадкой (1,45 ± 0,12 дн.), рвотой (1,08 ± 0,1 дн.), диареей (1,39 ± 0,15 дн.), чем у детей раннего возраста.

Показатели иммунофенотипирования лимфоцитов у детей в острый период норовирусной инфекции представлены в табл. 1.

В сравнении с контрольной группой изменение иммунного ответа у детей в остром периоде норовирусной инфекции выражалось в уменьшении содержания в периферической крови некоторых субпопуляций лимфоцитов. Так, было снижено содержание в периферической крови С08-лимфоцитов. Было определено выраженное снижение СОЗ антигенов, которые экспрессируют

Проблемы здравоохранения

только Т-клетки. Определенный интерес представляло выявление снижения содержания субпопуляций СО 16 у больных в остром периоде норовирус-ной инфекции. Известно, что эти рецепторы (СБЗ и СБ16) экспрессируются преимущественно на мембранах ЫК-клеток (естественные киллеры). С низкой активированностью К’К., вероятно, связано достоверное снижение СО 11Ь, также экспрессируемые этими клетками. ЬГК-клетки являются эффекторным механизмом противовирусной защиты. В частности, ]\1К-клетки, наряду с активированными Т-лимфоцитами, служат источниками образования интерферона гамма (ИФН-у). Статистически значимо снизились значения СБ95-рецепто-ров, индуцирующих РаБ-зависимый апоптоз клетки. Достоверно не изменилось среднее значение содержания СБ25-молекулы, которая является

рецептором для интерлейкина-2 (ИЛ-2) и экспрессируется на ранних стадиях активации Т-клеток иммунной системы. Не изменилось значение показателя НЬА-ОЯ, что экспрессируется на активированных Т-, В-клетках, моноцитах и является маркером состоявшейся активации иммунной системы. Достоверно не изменилось у обследованных детей с норовирусной инфекцией и содержание маркера фенотипически незрелых клеток - СБ34.

В своих исследованиях, оценивая величины иммуноглобулинов в периферической крови детей в первые дни острой кишечной инфекции норовирусной этиологии, не выявили достоверных изменений показателей гуморального иммунитета (табл. 2).

Определенное значение придавалось изучению параметров цитокинов в ответ на норовирусы (табл. 3).

Таблица 1

Показатели иммунофенотипирования лимфоцитов у детей с норовирусной инфекцией

Показатели Здоровые дети, п = 39 Норовирусная инфекция, п = 28 Достоверность различий, Р

СБЗ 38,87 ± 2,54 25,66 ± 1,23** Р< 0,001

СБ4 25,12 ± 1,41 22,82 ± 1,73 Р > 0,05

СБ8 22,97 ± 1,90 17,25 ± 1,10* Р < 0,05

СБ4СБ8 1,25 ±0,07 1,41 ±0,10 Р > 0,05

СБПЬ 19,79 ± 1,77 14,78 ± 1,62* Р < 0,05

СБ16 17,33 ± 1,25 13,07 ± 1,13* Р < 0,05

СБ25 14,28 ± 1,15 15,13 ± 1,48 Р > 0,05

СБ34 13,69 ± 1,56 11,83 ± 1,79 Р > 0,05

СБ56 14,10 ±0,89 12,40 ± 1,22 Р > 0,05

С095 21,53 ± 1,92 10,40 ±0,84*** Р< 0,001

НЬА-БК 16,30 ± 1,00 16,31 ± 1,87 Р > 0,05

Примечание. Различия значимы при *** р < 0,001 и * р < 0,05 по сравнению с показателями здоровых детей.

Таблица 2

Показатели гуморального звена иммунитета у детей при норовирусной инфекции

Показатели Здоровые дети, п = 39 Норовирусная инфекция, п = 28 Достоверность различий, Р

С020, % 21,66 ± 1,6 19,77 ± 1,49 Р > 0,05

1^А, г/л 0,25 ± 0,04 0,39 ±0,15 Р > 0,05

1§М, г/л 0,98 ± 0,06 0,96 ±0,16 Р > 0,05

1§С, г/л 7,77 ± 0,97 7,09 ±2,46 Р > 0,05

ЦИК, у. е. 89,74 ± 9,49 64,78 ± 9,67 Р > 0,05

Таблица 3

Содержания цитокинов в периферической крови детей с норовирусной инфекцией, пг/мл

Цитокины Здоровые дети, п = 15 Среднетяжелая форма ОКИ, острое течение, п = 15 Тяжелая форма ОКИ, затяжное течение, п = 12

ИЛ-1 а 155,32 ±31,88 883,55 ±28,34*** 32,41 ±8,66***

ИЛ-1 р 12,81 ±4,13 73,04 ± 15,51*** 14,32 ±3,17

ИЛ-8 54,0 ± 6,02 279,48 ± 39,29*** 155,53 ±64,35

ИЛ-4 6,61 ± 1,03 5,35 ±0,86 5,09 ±0,17

ФНО-а 2,37 ± 0,89 1,85 ±0,06 2,11 ±0,22

ИФН-а 8,01 ±0,84 13,23 ± 1,61* 9,08 ± 1,68

ИФН-у 38,28 ±2,08 688,18 ± 140,96*** 92,06 ±24,95*

РАИЛ 152,97 ±42,16 681,88 ±236,26* 181,33 ±88,79

Примечание. Различия значимы при *** р < 0,001, * р < 0,05 по сравнению с показателями здоровых детей.

Норовирусная инфекция у детей, протекавшая, преимущественно, в среднетяжелой форме, была сопряжена значительным достоверным повышением в крови цитокинов: ИЛ-1 а, ИЛ-1Р, ИЛ-8, ИФН-а , ИФН-у и РАИЛ. При этом уровни содержания в сыворотке крови ИЛ-1а, ИЛ-1 р, ИЛ-8 повысились в 5-6 раз, значение ИФН-у увеличилось в 16 раз. Величины ИЛ-4 и ФНО-а у пациентов на момент обследования не отличались от значений аналогичных показателей группы здоровых детей.

У пациентов с тяжелой формой норовирусной инфекции и негладким, затяжным течением концентрации ИЛ-1Р, ИЛ-8, ИЛ-4, ФНО-а, ИФН-а и РАИЛ не имели достоверных отличий от величин этих показателей групп здоровых детей. Кроме того, проявлялся дефицит ИЛ-1а, среднее значение которого снизилось в 4,5 раза. Повышение ИФН-у в периферической крови детей с тяжелым, негладким течением норовирусной инфекции не проявилось столь существенно как у пациентов со среднетяжелой формой. Повышение показателя ИЛ-8 было недостоверным.

Выводы

1. ОКИ норовирусной этиологии по частоте регистрации занимает второе место после ротави-русной инфекции. Наиболее часто норовирусной инфекцией болеют дети 13-36 месяцев жизни.

2. У детей, заболевших на первом году жизни, в клинике превалировал диарейный синдром. С увеличением возраста нарастали частота и длительность рвот, в то время как выраженность и продолжительность диарейного синдрома уменьшались.

3. Затяжное течение ОКИ норовирусной этиологии с более длительным диарейным синдромом чаще выявлялось у детей первого года жизни, в то время как тяжелые формы заболевания с упорными рвотами, осложненные синдромами токсикоза и эксикоза, регистрировались чаще у детей 13-36 мес.

4. С изменением ответа системы цитокинов могут быть связаны особенности клинического

течения норовирусной инфекции у детей разных возрастных групп. Норовирусная инфекция у детей, протекавшая в среднетяжелой форме, была сопряжена значительным достоверным повышением в крови цитокинов: ИЛ-1а, ИЛ-ip, ИЛ-8, ИФН-а, ИФН-у и РАИЛ. У детей с тяжелым течением реакция иммунной системы проявилась недостаточной продукцией ИФН-у и ИФН-а на фоне дефицита ИЛ-1а, ИЛ-1 р.

Литература

1. Ильина, И.О. Клиническая оценка метода ПЦР в диагностике острых кишечных инфекций / И.О. Ильина, Л.Н. Мазанкова, А.Т. Подколзин // Детские инфекции. — 2006. — Т. 5, № 1. - С. 61—64.

2. Мухина, А.А. Калщивирусная инфекция / А.А. Мухина, Г.А. Шипулин, А.Т. Подколзин // Инфекционные болезни. - 2004. — Т. 2, N° 2. - С. 64-73.

3. Подколзин, А.Т. Изучение этиологии острых кишечных инфекций у детей, госпитализированных в инфекционные отделения стационаров Москвы / А.Т. Подколзин, А.А. Мухина, Г.А. Шипулин // Инфекционные болезни. — 2004. — Т. 2, №4. — С. 85-91.

4. Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ / О.Ю. Реброва. — М., 2006. -312 с.

5. Genotyping of GII. 4 and Glib norovirus RT-PCR amplicons by RFLP analysis / S. Ramirez, G.M. Giammanco, S. De Grazia et al. // J. Virol. Methods. - 2008. - Vol. 147 (2). - P. 250-256.

6. Norovirus and foodborne disease, United States, 1991—2000 / M.A. Widdowson, A. Sulka, S.N. Bulens et al. // Emerging Infect. Dis. — 2005. —Vol. 11 (1). -P. 95-102.

7. Proportion of sporadic of gastroenteritis cases caused by rotavirus, norovirus, adenovirus and bacteria in Japan frome January 2000 to Desember 2003 / A. Sumi, N. Kobayashi, N. Ohtomo et al. // J. Microbiol. immunol. — 2005. - Vol. 49, № 8. — P. 745—746.

Поступила в редакцию 2 мая 2010 г.