Метаболиты фазы II синтетических каннабимиметиков в моче: нужна ли пробоподготовка?

менту смерти, приходится игнорировать. Однако ясно, что это не приводит к сильному занижению результата, т.к. у детей процессы элиминации протекают гораздо медленнее, чем у взрослых, и концентрация, близкая к максимальной, может сохраняться в течение многих часов.

Наконец, наиболее современный метод - непосредственное определение содержания воды с помощью специальных весов, определяющих содержание воды и жира. Даже недорогие бытовые приборы обнаруживают отличное совпадение с результатами расчета по модели Ватсон. Этот метод незаменим при оценке TBW у особенно тучных или истощенных людей, для которых плохо подходят антропометрические модели, ориентированные на средние параметры.

I Метаболиты фазы II синтетических каннабимиметиков в моче: нужна ли пробопоаготовка?

• О. Л. Заикина1, к.х.н. А. М. Григорьев2

1ГКУЗ Ленинградский областной наркологический диспансер, 2ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» МЗ МО (нач.— д.м.н., проф. В. А. Клевно) Аннотация: Представлены разработки быстрых методов обнаружения метаболитов синтетических каннабимиметиков фазы I и II в моче, базирующиеся на применении жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Рассмотрены способы подготовки проб, допускающие отказ от применения стадий экстракции и деконъю-гирования образцов. Предложены поисковые библиотеки, адаптированные для разных типов масс-фильтров и предназначенные для автоматизированного скрининга биообразцов в практике судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Ключевые слова: ГХ-МС, ЖХ-МС\МС, синтетические каннабиноиды, метаболиты, глюкуро-ниды, моча, скрининг, библиотеки

Phase II metabolites of synthetic cannabimimetics in urine: is the sample preparation necessary?

• O. L. Zaikina, A. M. Grigoryev Abstract: The development of fast methods of phases I and II synthetic cannabimimetics metabolites detection in urine which is based on application of liquid chromatography-mass spectrometry is presented. The sample preparation methods based on refusal of application of extraction and deconjugation stages are considered. The search libraries adapted for different types of mass filters and intended for the automated screening of samples in the forensic-chemical and toxicological analysis are offered.

Keywords: GC-MS, LC-MS/MS, synthetic cannabinoids, metabolites, glucuronides, urine, screening, libraries

ВВЕДЕНИЕ

Одним из важнейших достоинств жидкостной хроматографии (ЖХ, обращенно-фазовый вариант) следует признать возможность минимизации стадии подготовки проб или полного отказа от нее. Учитывая меньшую (по сравнению с газовой хроматографией) зависимость этого метода от молекулярного веса и термической стабильности аналитов, в круг определяемых соединений должны включаться метаболиты фазы II. Такой подход

позволяет нивелировать стадию деконъюгирования биологических образцов, что значительно снижает стоимость и трудоемкость анализа.

Группа синтетических каннабимиметиков (канна-биноидов, СК, «спайсы») - естественный объект для подобного подхода, поскольку эти соединения подвержены практически полному метаболизму, приводящему, как правило, к образованию преимущественной доли конъю-гатов в метаболических смесях. Поскольку о свойствах этих соединений известно немного, мы выполнили идентификацию ряда метаболитов СК фаз I и II методами газовой и жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Кроме того были разработаны способы пробоподготовки, адаптированные для разных концентрационных диапазонов метаболитов СК в моче и ориентированные на разные возможности аналитических лабораторий. Полученные результаты позволили создание скрининговых методов, облегчающих диагностику употребления и интоксикации СК для целей судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Для идентификации метаболитов СК использовали следующие жидкостно-хроматографические системы:

• ЖХ + МС LCMC-8040 (тройной квадруполь, Shimadzu). Применен скрининговый метод, рекомендованный производителем.

• ЖХ 1200 + МС 6460 (тройной квадруполь, Agilent Technologies).

• ЖХ UltiMate 3000 (Thermo Scientific) + МС amaZon Speed (ионная ловушка, Bruker Daltonik). Применены условия скрининговой библиотеки Toxtyper 1.1.

• ЖХ 1200 Infinity + МС 6520 (квадруполь-времяпро-летный масс-анализатор, Agilent). Применены условия скрининговой библиотеки Broecker, Herre, Pragst.

• ЖХ 1200 + диодно-матричный детектор G1315B (Agilent). Система использована для поиска конъюгатов при учете их гидролизуемости и идентичности хромофоров у метаболитов фаз I и II, а также для количественных измерений.

Подготовка проб мочи включала следующие варианты.

• Центрифугирование и добавку 10 об.% ацетонитрила (минимальная пробоподготовка; метод пригоден для анализа образцов с высоким и средним содержанием аналитов. Требует наличия линии сброса элюата и предколонки).

• Подкисление муравьиной кислотой и экстракцию ацетонитрилом при сниженной температуре (-20 °C) с последующим упариванием водно-органической фазы досуха и растворением остатка в ЖХ элюенте (метод не содержит ограничений по концентрации аналитов).

• Подкисление ортофосфорной кислотой и экстракцию этилацетатом с последующим упариванием органической фазы досуха и растворением остатка в ЖХ элю-енте (метод не содержит ограничений по концентрации аналитов; низкую степень экстрагируемости (~ 40%) наблюдали только для наиболее гидрофильного аналита -моноглюкуронида 1-(4-карбоксибутил)-1Н-индол-3-карбо-новой кислоты).

• Твердофазная экстракция на анионообменных патронах Sampli Q Silica SAX, Agilent (получаемые растворы почти свободны от соединений неионогенного и катион-ного характера; метод не содержит ограничений по концентрации аналитов, но ограничен анионообменгой емкостью сорбента и, следовательно, содержанием ионогенных соединений в образце мочи; степень экстрагируемости для наиболее гидрофильных аналитов > 50%).

• Твердофазная экстракция на обращенно-фазовых патронах AccuBond ODS C18, Agilent. (метод не содержит ограничений по концентрации аналитов, хотя содержание соэлюирующихся соединений в получаемых растворах подобно их содержанию при экстракции этилацетатом; степень экстрагируемости > 95% даже для наиболее гидрофильных аналитов).

Следует отметить, что все перечисленные способы ориентированы на упрощение пробоподготовки. Наиболее низкие пределы обнаружения могут быть получены только посредством минимизации числа метаболических форм, для чего необходима стадия деконъюгирования. Тем не менее, корректность решения аналитических задач определяется верным соотношением необходимых затрат и получаемых результатов.

Дополнительным способом увеличения количеств аналитов, попадающих в хромато-масс-спектрометриче-скую систему, может быть повышение объема вводимой пробы от обычных 1-5 до 50 мкл при условии малого содержания органических модификаторов в образцах и градиентного элюирования. Данный подход минимизирует общее время анализа, но требует обязательного наличия линии сброса элюата и предколонки, а также приводит к снижению времени жизни основной колонки.

Основные направления ионизации аналитов определяются составом элюента, а фрагментации - типом масс-фильтра. При использовании элюентов, содержащих муравьиную кислоту и не содержащих ионов аммония, наблюдали образование значительной доли натриевых ионов-аддуктов, причем для аналитов, имеющих в структуре карбоксильные группы, связанные с алифатическими остатками, их интенсивность была сравнима с интенсивностью протонированных молекул. В случае присутствия в элюенте формиата аммония доля натриевых ионов-ад-дуктов была невелика. Регистрация положительных ионов была найдена более предпочтительной даже для элюентов, в которых определяемые аналиты находятся в анионных формах (при pH водной фазы > 2.5-3). MC/MC спектры, получаемые с применением ионной ловушки, характеризуются значительным содержанием пиков ионов с высокими m/z по сравнению со спектрами, получаемыми на квадрупольных масс-фильтрах. Спектры, получаемые на масс-фильтрах одного типа, но разных производителей (Agilent и Shimadzu, тройной квадруполь) различаются незначительно при условии подбора режимов столкнови-тельной диссоциации.

Доля метаболитов фазы II по сравнению с формами фазы I в целом, определяется гидрофильностью структур последних. Так, для соединений, получивших в результате метаболических трансформаций несколько гидрофильных групп (обычно карбоксильную и гидроксильную или две гидроксильных) интенсивность хроматографических пиков конъюгатов (измеряемых с применением диодно-матричного детектора) составляла менее 10%, а для соединений с одной приобретенной гидрофильной группой (обычно карбоксильной) - более 90% от пиков форм фазы I. Данное наблюдение имеет исключения.

Дополнительным следствием представленной работы является формирование поисковых библиотек для автоматизированного обнаружения метаболитов СК в разных условиях.

ВЫВОДЫ

Обнаружение метаболитов фазы II синтетических каннабимиметиков позволяет значительно снизить время подготовки проб, и - при необходимости - добиваться весьма низких пределов обнаружения. Прямой ввод мочи приемлем для образцов со средним и высоким содержа-

нием аналитов; при необходимости получения низких порогов обнаружения необходимо концентрирование. Для увеличения чувствительности обнаружения карбок-силированных форм рекомендуется применение элюентов, содержащих соли аммония при режиме регистрации положительных ионов.

Определение этил глюкуронида методом иммунохроматографии и ВЭЖХ/ МС/МС в биологических объектах

• Н. Н. Ерощенко

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России, кафедра аналитической токсикологии, фармацевтической химии и фармакогнозии Аннотация: Доклад посвящен рассмотрению проблемы подтверждения потребления алкоголя и определению концентрации этил глюку-ронида в биологических образцах иммунохро-матографическим методом с подтверждением методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектометрии. В докладе рассмотрена валидация аналитической методики определения этил глюкуронида методом ВЭЖХ/МС/МС в биологических образцах, а также приводится сравнение точности измерения концентрации методом иммунохро-матографии и ВЭЖХ/МС/МС. Ключевые слова: потребление алкоголя, метаболизм этанола, этил глюкуронид, этил сульфат, ВЭЖХ/МС/МС

Determination of ethyl âliicuronide in biological samples by hniminochroinatoâraphic method and HPLC/MS/MS

• N. N. Eroshchenko

Abstract: This report is devoted to the problem of confirmation of alcohol consumption and determining the concentration of ethyl glucuronide in biological samples by immunochromatographic method with confirmation by high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry. This report presents the validation of analytical methods for determining ethyl glucuronide in biological samples by HPLC/MS/MS and comparison of the accuracy of measuring the concentration by immunochromatographic method and HPLC/MS/MS. Keywords: alcohol consumption, metabolism of ethanol, ethyl glucuronide, ethyl sulfate, HPLC/ MS/MS

ВВЕДЕНИЕ

Установление факта употребления алкоголя ограничивается главным образом измерением концентрации этанола в крови, моче и его паров в выдыхаемом воздухе. Данный метод дает отрицательные результаты уже спустя сутки, лишь в отельных случаях чуть больше.

Для решения этой проблемы в течение многих лет были проведены различные лабораторные испытания и предложены биохимические маркеры (метаболиты) употребления алкоголя.

Такие метаболиты, как этил глюкуронид и этил сульфат, интересны своим длительным периодом распада (по сравнению с исходным соединением), что позволяет обнаруживать их на протяжении длительного периода времени (этил глюкуронид обнаруживается в моче вплоть