Способ длительного депонирования in vitro растений малины ремонтантной
METHOD FOR LONG-TERM IN VITRO DEPOSITION OF REMONTANT RASPBERRY PLANTS

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к биотехнологии растений, и может быть использовано для длительного беспересадочного хранения микрорастений малины ремонтантной.
При клональном микроразмножении мериклоны требуют частых пересадок, подвергающих растения стрессу, потере физиологической и генетической стабильности [1, 8, 9]. Число пассажей на этапе мультипликации не должно превышать 10-15, так как с увеличением их количества увеличивается вероятность возникновения у растений-регенерантов сомаклональной изменчивости, снижения регенерационного потенциала, способности к укоренению и приживаемости при переводе в нестерильные условия [2, 3, 6, 14, 16, 17, 19].
Перспективной может быть оптимизация технологического процесса, при которой часть растений, введенных в культуру in vitro, отправляют на массовое размножение, после которого все микрорастения адаптируют к нестерильным условиям. А другую часть стерильной культуры депонируют до следующего производственного цикла.
К настоящему времени в источниках литературы изложен обширный экспериментальный материал по методикам сохранения и воспроизводства растений в условиях in vitro с подробным описанием большого количества приемов и методов. В конечном итоге все способы содержания коллекций in vitro можно разделить на две категории: пересадочные коллекции, в которых хранение растительного материала происходит в условиях нормального роста, и депонированные коллекции, в которых растения находятся в состоянии замедленного роста [24].
Частота генетических отклонений зависит от скорости клеточных делений, в связи с этим риск появления уклоняющихся форм может быть существенным на фоне постоянных пересадок микрорастений на свежую питательную среду. При постоянных пересадках растительного материала с одной питательной среды на другую может произойти множество негативных последствий: нарушение стерильности, потеря морфогенетического и регенерационного потенциала растений и их гибель. Чаще всего этот способ применяют для сезонного накопления микрорастений перед этапом массовой адаптации к условиям ex vitro в теплице [15]. Одним из лимитирующих факторов при поддержании коллекции микрорастений в состоянии активного роста является ограниченный объем питательной среды, котором с течением времени происходит истощение питательных веществ и накопление токсичных продуктов обмена веществ, что в свою очередь, негативно сказывается на состоянии растений и приводит к потере их жизнеспособности.
Депонирование растительного материала in vitro является более ресурсосберегающим способом поддержания коллекций микрорастений, по причине увеличения интервала пересадок регенерантов [10, 22].
В большинстве случаев, способность растений к генетически стабильной регенерации значительно выше в культурах с замедленным ростом, поэтому разработка новых и совершенствование существующих методов хранения растений в состоянии замедленного роста является перспективным направлением для сохранения генофонда [1]. Главный методический подход к депонированию растений in vitro - достижение состояния максимально замедленного метаболизма, поддерживающего жизнеспособность тканей экспланта.
Лучшими условиями для депонирования микрорастений черной смородины in vitro являлись низкие положительные температуры в диапазоне +2…+4°С на фоне пониженной освещенности и фотопериода 16 часов и добавление в питательную среду маннита, при этом опытные образцы сохраняли жизнеспособность на протяжении 1,5-2 лет [18].
Широко применяется способ добавления в питательные среды для замедления роста микрорастений in vitro органических веществ, обладающих осмотической активностью, таких как манит или сорбит, или гормональной, например абсцизовая кислота (АБК) [1, 11,21, 20, 23].
Публикации на тему длительного хранения микрорастений в настоящее время все еще не немногочисленны. Поиск веществ, одновременно замедляющих рост растений и поддерживающих их жизнеспособность длительный период времени, отработка способов их применения очень актуальны в настоящее время [7].
Известен малозатратный способ хранения микрорастений осины с использованием питательной среды WPM, содержащей сахарозу (10-20 г/л), сорбитол (5-10 г/л), маннитол (5-10 г/л), агар-агар (9 г/л) и витамины по MS 1 мл/л. Вначале, субкультивирование микрорастений при интенсивном режиме освещения (5000 люкс, 16 ч день/8 ч ночь) при температуре +22°С проводят в течение 2 недель, затем микрорастения переносят в условия хранения на +4°С на фоне пониженного освещения (примерно 2000 люкс) и режиме короткого дня (8 ч день/16 ч ночь) (Патент RU 2522823) [13]. Таким образом, применение в составе питательной среды осмотически активных веществ и подбор оптимального фотопериода во время депонирования способствуют постепенному переходу растений в состояние покоя, что позволяет сохранять их жизнеспособность в течение года.
В целом, все из перечисленных выше способов поддержания коллекций микрорастений в асептических условиях имеют свои недостатки. При использовании культуры in vitro для сохранения ценных генотипов возникает ряд проблем, обусловленных спецификой технологии клонального микроразмножения.
Наиболее близким к изобретению по совокупности существенных признаков относится способ сохранения ювенильного статуса культуры in vitro малины (Rubus idaeus) (Патент RU 2662670) [12], включающий перенос микрорастений малины на стадиях мультипликации или укоренения на питательные среды в условия с пониженным уровнем освещенности и пониженной температурой, где смена освещенности и температуры происходит через 5 дней на стадии мультипликации и через 14 дней на стадии укоренения после начала очередного пассажа культивирования, при этом в качестве питательной среды на стадии мультипликации используют питательную среду MS с добавлением сахарозы 30 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, 6-БАП 0,8 мг/л и зеатина 0,1 мг/л, а на стадии укоренения в качестве питательной среды используют питательную среду 1/2 QL с добавлением сахарозы 20 г/л, инозитола 100 мг/л, пиридоксина 0,1 мг/л, тиамина 0,1 мг/л, никотиновой кислоты 0,5 мг/л, индолилмасляной кислоты (ИМК) 0,1 мг/л, ИУК 0,1 мг/л, при этом уровень интенсивности освещенности снижается до 1000±200 люкс, а температура - до 4-8°С.
Из анализа известных аналогичных технических решений выявлено, что технической проблемой в данной области является необходимость расширения арсенала средств для сохранения жизнеспособности in vitro растений малины ремонтантной при длительном, беспересадочном депонировании.
Технический результат изобретения - повышение коэффициента размножения растений за счет увеличения укореняемости и приживаемости на этапе адаптации.
-6
-9
Для решения указанной проблемы и достижения заявленного технического результата в способе длительного депонирования in vitro микрорастений малины ремонтантной, включающем укоренение микрорастений на питательной среде по прописи Мурасиге и Скуга (MS) с минеральными солями для этапа пролифирации, дополнительно в питательную среду добавляют препарат Суперстим-1 в концентрации от 1×10% до 1×10%, и микрорастения в течение 10-12 месяцев инкубируют в световой комнате при интенсивности освещения 2500 люкс, 16-и часовом фотопериоде и температуре 20-22°С.
-6
-9
Существенными признаками, характеризующими изобретение, являются длительное, беспересадочное депонирование микрорастений малины ремонтантной в условиях световой комнаты на питательной среде с минеральными солями по прописи Мурасиге и Скуга (MS), обогащенной следующими веществами: (мг/л) тиамин-гидрохлорид (В1), пиридоксин-гидрохлорид (В6), никотинамид (РР) - 0,5; мезоинозит - 100; глицин - 1; сахароза - 30000 мг/л, агар-агар - 6000, и содержащей препарат Суперстим-1 в концентрациях от 1×10% до 1×10%. Далее в течение 10-12 месяцев депонируют в условиях световой комнаты при нтенсивности освещения 2500 люкс, 16-и часовом фотопериоде и температуре 20-22°С.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа.
Исследования по разработке способа длительного депонирования in vitro растений малины ремонтантной в условиях световой комнаты проводили в лаборатории клонального микроразмножения садовых растений лаборатории плодоводства РГАУ МСХА имени К.А. Тимирязева в 2017-2019 годах.
1. Для приготовления 1 л питательной среды сначала делают навески (мг): сахарозы - 30000, агар-агара - 6000 и мезоинозита-100.
2. В мерный цилиндр или мерную колбу объемом 1 л наливают примерно 150 мл дистиллированной воды и добавляют маточные растворы минеральных макросолей и микросолей по прописи Мурасиге и Скуга (MS), далее добавляют следующие вещества: (мг/л) тиамин-гидрохлорид (В1), пиридоксин-гидрохлорид (В6), никотинамид (РР) - 0,5, глицин - 1.
3. Параллельно на лабораторной плитке в огнеупорном мерном стакане разогревают дистиллированную воду объемом около 800 мл, доводя ее практически до кипения. Затем около 400 мл горячей воды отливают в другой мерный стакан, растворяют в ней сахарозу и добавляют ее в мерный цилиндр с растворами солей и витаминов.
4. Далее в огнеупорный мерный стакан высыпают агар-агар и заливают его небольшим количеством холодной дистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют заранее приготовленную горячую дистиллированную воду и растворяют агар-агар на лабораторной плитке, доводя до кипения. При этом важно следить, что в момент кипения агар-агар не переливался через стенки мерного стакана.
5. Далее расплавленный агар-агар добавляют в мерный цилиндр или мерную колбу, с предварительно добавленными растворами макросолей, микросолей, глицина, витаминов, гормонов и сахарозы. И горячей дистиллированной водой доводят объем до 1000 мл.
6. Измеряют рН раствора и с помощью 0,1н КОН доводят его до уровня рН 5,7-5,8.
-2
-2
-3
7. Технология приготовления экспериментальных растворов препарата Суперстим 1 состоит из последовательного разведения исходного маточного раствора. Для приготовления исходного раствора с концентрацией 1×10% препарат Суперстим в количестве 100 мг растворяют в 1000 мл готовой питательной среды. Далее 100 мл раствора с концентрацией 1×10% доводят питательной средой до 1000 мл и получают раствор 1×10%. Аналогичным образом последовательно проводят разведение до более низких концентраций.
8. Готовую питательную среду разливают по культуральным сосудам объемом 200 мл порциями по 30 мл. И подвергают стерилизации в автоклаве при температуре 120°С и давлении 0,1 мПа и в течение 20 мин.
9. В ламинарном боксе в каждый сосуд помещают по 5 микрочеренков.
10. Далее культуры инкубируют в световой комнате при интенсивности освещения 2500 люкс, 16-и часовом фотопериоде и температуре 20-22°С в течение 12 месяцев.
Примеры конкретного выполнения способа.
-9
-15
-18
При изучении динамики изменения морфометрических показателей микропобегов малины ремонтантной сорта Бриллиантовая начиная с шестого месяца депонирования в контроле с ИМК (0,3 мг/л) жизнеспособность микрорастений резко ухудшилась и составила 53,3%, а на 12 месяц хранения снизилась до 10%. В опытных вариантах с применением препарата Суперстим-1 в концентрациях 1×10%, 1×10%, 1×10% на шестой месяц субкультивирования жизнеспособность эксплантов составила 90,0-93,3%, а к 12 месяцу субкультивирования - 80,0-86,5% (таблица 1).
-6
-9
-15
-18
Что касается сорта Геракл, то начиная с шестого месяца депонирования в контроле с ИМК жизнеспособность микрорастений резко ухудшилась и составила 36,2%, а на двенадцатый месяц хранения всего 15,6%. В опытных вариантах с применением препарата Суперстим-1 в концентрации 1×10%, 1×10%, 1×10%, 1×10% на шестой месяц субкультивирования жизнеспособность эксплантов составила 76,7-85,2%, а к 10 месяцу субкультивирования составила 66,7-80%, но к 12 месяцу упала до уровня контроля - 6,7-20,2% (таблица 1).
Таким образом, выявлена целесообразность добавления в состав питательной среды препарата Суперстим-1 для депонирования микрорастений малины ремонтантной в условиях световой комнаты.
При длительном субкультивировании микрорастений на этапе мультипликации в культуральном сосуде увеличивается количество этилена, который, воздействуя на специфические рецепторы клеток растений-регенерантов, вызывает некротизацию тканей и даже гибель микрорастений. Вероятно, сохранение жизнеспособности микрорастений связано с тем, что при добавлении в состав питательной среды препарата Суперстим-1 меняется ее гормональный состав, который блокирует синтез этилена либо, проникая внутрь микрорастений, снижает восприимчивость к этилену специфических рецепторов клеток за счет чего сохраняется жизнеспособность растений-регенерантов.
При рекультивации после депонирования по коэффициенту размножения микрорастения в 3-5 раз превосходили показатели прототипа, на этапе ризогенеза на 20-30 дней раньше укоренялись, и в лучших вариантах на 100% приживались на этапе адаптации к нестерильным условиям в 2-2,5 раза превосходя контроль по показателям развития. Установлено, что разработанный способ позволяет в 6 раз повысить уровень рентабельности производства адатированных микроразмноженных растений, соответствующих требованиям ГОСТ 54051-2010.
-9
-6
Для большей наглядности составлены таблицы эффективных концентраций препарата Суперстим 1 на всех этапах эксперимента, в которых видна сортоспецифическая реакция исследуемых сортов: у сорта Бриллиантовая лучшие результаты получены при применении препарата Суперстим-1 в концентрации 1×10%,  а у сорта Геракл - 1×10% (таблица 2).
-6
-9
Вероятно, исследуемые сорта имеют различное соотношение ауксинов и ингибиторов роста растений, что объясняет их неодинаковую способность к активизации потенциала растительного организма к размножению. Известно, что у легкоразмножаемых растений инициаторов регенерации значительно больше, чем ингибиторов, у среднеукореняемых это соотношение находится в равновесии, у трудноукореняемых сортов преобладают ингибиторы [5, 4]. Сорт малины ремонтантной Геракл является трудноукореняемым, в связи с чем, для активации регенерационного потенциала ему требуется более высокая доза исследуемого препарата Суперстим-1 - 1×10%. Для сорта малины ремонтантной Бриллиантовая эффективной является более низкая концентрация 1×10%, так как он является среднеукореняемым.
-9
-6
Таким образом, подтвердилась гипотеза перспективности применения препарата Суперстим-1 для введения в состав питательной среды для длительного депонирования микрорастений малины ремонтантной в условиях световой комнаты. Предложенный метод не требует специального оборудования, условий, дополнительных пересадок на свежую питательную среду. При депонировании в световой комнате микрорастения сохраняют жизнеспособность без признаков некрозов и хлорозов в течение 10-12 месяцев, при рекультивации по коэффициенту размножения в 3-5 раз превосходят показатели контроля, на этапе ризогенеза на 20-30 дней сокращают длительность периода субкультивирования, и в лучших вариантах на 100% приживаются на этапе адаптации к нестерильным условиям в 2-2,5 раза превосходя контроль показателям развития. При анализе эффективных концентраций выявлено, что на всех этапах технологии клонального микроразмножения малины ремонтантной имеет преимущество препарат Суперстим-1, у сорта Бриллиантовая в концентрации 1×10%, а у сорта Геракл 1×10%.
Разработанный способ длительного депонирования в перспективе может иметь практическое значение для оптимизации производства оздоровленного посадочного материала растений рода Rubus L. Согласно методическим указаниям производства и сертификации посадочного материала плодовых, ягодных культур и винограда в России, тестирование растений-кандидатов в базисные клоны на наличие вирусной инфекции проводят через 6 месяцев после адаптации к нестерильным условиям. Поэтому процесс получения сертифицированного посадочного материала занимает от 12 до 18 месяцев, при этом значительное количество растений подлежит выбраковке. Перспективной может быть оптимизация технологического процесса при которой растения-кандидаты вводят в культуру с четкой маркировкой вегетативного потомства каждой введенной в культуру меристемы. Далее подготовленную партию размножают in vitro, адаптируют к нестерильным условиям и подвергают тестированию для выделения безвирусных экземпляров. А другую часть - депонируют по разработанному методу в условиях световой комнаты до получения результатов тестирований. Затем линии чистой культуры, чей безвирусный статус подтвержден, отправляют на рекультивацию и массовое размножение, а те линии, в которых обнаружена вирусная инфекция, уничтожают. Применение такой методики позволит сократить объемы пересадки микрорастений с неподтвержденным фитосанитарным статусом, сократить число пассажей у депонируемой культуры и снизить вероятность сомаклональной изменчивости.
Технико-экономические преимущества или иная эффективность изобретения по сравнению с прототипом.
-9
Оценка экономической эффективности применения препарата Суперстим-1 в концентрации 1×10% для длительного депонирования микрорастений малины ремонтантной сорта Бриллиантовая в условиях световой комнаты для массового производства в течение одного года, учитывали такие факторы, как затраты на электроэнергию, стоимость расходных материалов, повышение коэффициента размножения, увеличение укореняемости и приживаемости на этапе адаптации. В результате установлено, что предложенный способ позволяет в 6 раз увеличить уровень рентабельности производства адаптированных микроразмноженных растений, соответствующих требованиям ГОСТ Р 54051-2010.
В условиях световой комнаты, при последующей рекультивации микрорастения по коэффициенту размножения в 3-5 раз превосходят показатели контроля, на этапе ризогенеза на 20-30 дней сокращают длительность периода субкультивирования, и в лучших вариантах на 100% приживаются на этапе адаптации к нестерильным условиям в 2-2,5 раза превосходя контроль показателям развития.
Список, использованной литературы
1. Вечернина, Н.А. Сохранение биологического разнообразия редких, исчезающих видов, уникальных форми сортов растений методами биотехнологии: дис. … д-ра биол. наук. Барнаул. - 2006. - С. 325.
2. Высоцкий, В.А. Морфогенез и клональное микроразмножение растений / Высоцкий, В.А. // Культура клеток растений и биотехнология. - М. 1986. - С. 91-102.
3. Деменко, В.И. Микроклональное размножение садовых растений: Учебное пособие для студентов по специальности 310300 - "Плодоовощеводство и виноградарство" / Деменко, В.И. // М-во сел. хоз-ва Рос. Федерации, Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К.А. Тимирязева. -Москва: ФГОУ ВПО РГАУ - МСХА, 2007. - С. 55.
4. Иванова, З.Я. Биологические основы и приемы вегетативного размножения древесных растений стеблевыми черенками / Иванова, З.Я. // Киев: Наукова думка, 1982 - С. 288.
5. Кефели, В.И. Рост растений и природные регуляторы. / Кефели, В.И. // Физиология растений. - 1978 - Т. 25, В.5. - С. 975-981.
6. Клоконос, Н.П. Регенерационная способность верхушек смородины и малины под влиянием ростовых веществ и условий культивирования / Клоконос, Н.П. // Ускоренное размножение посадочного материала плодово-ягодных культур с использованием биотехнологических методов. (Алма-Ата). - 1991. - С. 97-102.
7. Концевая, И.И. Модификация питательных сред при депонировании березы в культуре in vitro / Концевая, И.И. // Достижения науки и образования. - 2018. - №7(29). - Т. 1. - С. 9-12.
8. Крицкая, Т.А. Использование методакультуры in vitro для сохранения некоторых редких и исчезающих кальцефильных видов растений Саратовской области / Крицкая, Т.А., Кашин, А.С.// Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. - 2013. - Т. 13, - Вып.4. - С. 65-73.
9. Крицкая, Т.А. Особенности длительного депонирования культуры in vitro Некоторых редких и исчезающих видов растений Саратовской области / Крицкая, Т.А., Кашин А.С. // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. - 2016. - Т. 16, - вып.1. - С. 74 - 80.
10. Машкина, О.С. Методы культуры ткани в лесной генетике и селекции / Машкина, О.С., Табацкая, Т.М., Бурдаева, Л.М. // Лесхоз, информация. - 2002. - №6. - С. 40.
11. Митрофанова, И.В. Соматический эмбриогенез и органогенез как основа биотехнологии получения и сохранения многолетних садовых культур. / Митрофанова, И.В. // Киев: Аграрна наука. - 2011. - С. 344.
12. Пат. RU 2662670. Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие "Микроклон" (ООО НПП "Микроклон"). Филиппов М.В., Азарова А.Б., Шестибратов К.А. Способ сохранения юнивенильного статуса культуры in vitro малины (Rubus idaeus) / номер заявки 2016109425, дата регистрации 16.03.2016, дата публикации 26.07.2018.
13. Пат. РФ 2522823, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU), Видягина Е.О., Шестибратов К.А. Способ длительного хранения in vitro растений осины. №заявки 2012147452/10, дата регистрации 08.11.2012, дата публикации 20.07.2014.
14. Райков, И.А. Совершенствование клонального микроразмножения межвидовых форм смородины черной и малины ремонтантного типа. / Райков, И.А. // дисс.канд. с.-х. наук: 06.01.05. Брянск. - 2011. - С. 132.
15. Рыжкова, Н.С. Стабильность растений земляники садовой (fragaria ananassa duch.) после длительного хранения in vitro / Рыжкова, Н.С. // диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук / Москва. - 2005. - С. 9-15.
16. Сковородников, Д.Н. Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины: / Сковородников, Д.Н. // автореф. дисс. канд. с.-х.: 06.01.05, 03.00.12. Брянск. - 2004. - С. 20.
17. Упадышев, М.Т. Размножение ежевики и малины черной методом культуры тканей / Упадышев, М.Т., Высоцкий, В.А. // Садоводство и виноградарство. - 1991. - №6. - С. 24-27.
18. Шубакова, Н.В. К вопросу о длительном хранении коллекционных образцов черной смородины in vitro / Шубакова, Н.В. // II Научно-технический бюллетень ВИР. - 1995. - Вып.234. - С. 61-62.
19. Янковская, М.Б. Сохранение и размножение ценных форм ягодных и декоративных растений методами биотехнологии / Янковская, М.Б., Шорников, Д.Г., Муратова, С.А., Соловых, Н.В. // Вестник ИрГСХА: Мат. Всероссийской научно-практической конф. с международным участием «Проблемы озеленения городов Сибири и сопредельных территорий», 18-20 августа 2011 г. - Иркутск, 2011. - Часть IV, Вып.44. - С. 160-166.
20. Alleweldt, G. Der Einfluss von Wachstuminhibitoren auf die Langzeitlagerung von in vitro Kulture der Rebe / Alleweldt, G., Harst-Langenbucher, M. // Vitis. - 1987. - T. 26. - №2. - S. 57-64.
21. Bekheet, S.A. In vitro long-term storage of date palm / Bekheet, S.A., Taha, H.S., Saker, M.M. // Biol.Plant. - 2002. - 45.- Nol. - P. 121-124.
22. Blaich, R. Recherches sur les cultures de meristemes et d'organes de vinge in vitro en vue de la selection et de la conservation de genotypes / Blaich, R. // Bull O.I.V. - 1985. -T.58. -№650/651. - P. 391-395.
23. Lizarraga, R. In vitro conservation of potato germplasm at the International potato center / Lizarraga, R., Huaman, Z., Dodds, J.H // Am. Potato J. - 1989. -T.66.-N4.-P. 253-269.
24. Romano, A. Conservasao in vitro de germeplasma de sobreiro (Quercus suber L.) / Romano, A. // J. Rev. Biol. - 1994. - №1 - 4. - P. 29-42.