ИЗМЕРИТЕЛЬНАЯ КЮВЕТА ДЛЯ ПОДСЧЕТА И/ИЛИ ХАРАКТЕРИЗАЦИИ КЛЕТОК
MEASURING CELL FOR COUNTING AND/OR CHARACTERIZATION OF CELLS

Область техники
Настоящее изобретение относится к области проточной цитометрии, в частности, к принадлежностям для проточной цитометрии, таким как измерительные кюветы и опоры для таких измерительных кювет.
Уровень техники
В настоящее время проточная цитометрия позволяет определять характеристики и свойства клеток, например, их размеры, внутриклеточное содержание, содержание ДНК и т.д. Это также позволяет изучать вариации и распределение этих характеристик в клеточной популяции, что в конечном итоге дает возможность идентификации субпопуляций в составе клеток, например, идентификации различных клеток, входящих в состав крови.
Кроме того, проточная цитометрия является быстрым методом. Как правило, она дает возможность охарактеризовать несколько тысяч клеток в минуту. Таким образом, она позволяет подсчитать и характеризовать редкие клеточные субпопуляции. Редкость этих субпопуляций, как правило, не позволяет осуществлять их наблюдение и характеризацию с помощью микроскопии, в частности, из-за невозможности получения статически приемлемого количества измерений на этих субпопуляциях.
Кроме того, благодаря усовершенствованию оптических датчиков в последние годы и, в частности, способности датчиков обнаруживать сигналы все более низкой интенсивности, стало возможным как измерение объема клетки, так и получение информации о её содержимом посредством, с одной стороны, измерения полного сопротивления, и с другой стороны, посредством оптического измерения.
По существу, проточная цитометрия заключается в поштучном пропускании клеток в потоке жидкости с большой площадью поперечного сечения относительно размеров клетки. Этот поток жидкости заканчивается насадкой с отверстием, размеры которого выбирают таким образом, чтобы предотвратить одновременное или слишком близкое прохождение двух или нескольких клеток в один момент времени. При постоянном расходе жидкости скорость клетки увеличивается по мере уменьшения диаметра струи жидкости, и на выходе из насадки скорость клеток достигает порядка нескольких тысяч в секунду в струе жидкости, диаметр которой равен диаметру насадки.
Измерение объема клеток осуществляется путем измерения полного сопротивления с обеих сторон от выходного отверстия насадки. Действительно, объем клеток коррелирует с изменением полного сопротивления, вызванного прохождением клетки в проводящей среде (в системе Култера); при этом считается, что клетка обладает электроизолирующими свойствами. Объем определяется абсолютно, независимо от формы клетки.
Кроме того, прохождение клеток через отверстие насадки обеспечивает их определенное гидродинамическое центрирование, а также ориентацию. Таким образом, можно точно позиционировать струю жидкости, выходящую из насадки и содержащую клетки, в световом луче, испускаемом источником возбуждения. Когда клетка пересекает световой луч, она рассеивает определенное количество оптических сигналов, пригодных для использования в цитометре для определения свойств клетки. Эти оптические сигналы включают в себя:
- отражение света клеткой, обусловленное различием свойств жидкости и клетки, а также различием свойств различных компонентов клетки, проявляющимся в отражении части падающего луча света;
- отражение света клеткой, обусловленное отклонением светового луча, входящего в клетку; и
- дифракцией света на клетке, в основном, под пространственным углом, изменяющимся от нескольких градусов до пространственного угла 360°.
Все эти сигналы собираются оптической системой сбора, затем разделяются в зависимости от их длины волны (ширины на уровне половины амплитуды от 20 до 50 нм или от 30 до 40 нм) системой оптических фильтров, и, наконец, поступают к различным световым датчикам. Эти различные датчики могут использоваться для:
- измерения прямого светорассеяния клетки;
- измерения бокового светорассеяния клетки;
- измерения светопоглощения клетки; и
- измерения флуоресценции клетки.
Прямое светорассеяние обусловлено рассеянием клеточной мембраны части падающего света, попадающего на ее поверхность. Эта часть рассеянного света имеет такую же длину волны, что и падающий свет. Она воспринимается в направлении вдоль оси падающего света. Она дает информацию о размере и среднем показателе преломления клетки.
Боковое светорассеяние обусловлено рассеянием внутриклеточными органеллами во всех пространственных направлениях части падающего света, который прошел сквозь клеточную мембрану. Оно может быть измерено с помощью фотоэлектронного умножителя или лавинного фотодиода. Использование свойств преломления и отражения дает информацию о тонкой гетерогенности клеточного содержимого.
Светопоглощение требует стабильного источника возбуждения. Оно пропорционально диаметру клетки и коэффициенту поглощения внутриклеточных органелл.
В случае, когда клетка помечена одной или несколькими флуорохромами, во время своего возбуждения флуорохромы испускают флуоресцентное излучение на одной или нескольких длинах волн больших, чем у источника возбуждения, во всех пространственных направлениях. Интерференционные светофильтры позволяют разделить различные длины волн флуоресценции (как правило, на спектры шириной на полувысоте от 20 до 50 нм или от 30 до 40 нм), каждая из которых передается на фотоэлектронный умножитель. Интенсивность измеренной флуоресценции зависит от количества флуорохромных молекул, привязанных к клетке. Например, в случае использования маркера DRACQ 5, представляющего собой флуорохром, пассивно проходящий сквозь цитоплазматическую мембрану клеток и связывающийся именно с ДНК, можно получить информацию о ядросодержащих клетках. Маркер DRACQ 5 имеет два пика поглощения на 622 нм и на 676 нм, и еще два других в ультрафиолетовом диапазоне на 240 нм и на 314 нм. Он испускает флуоресценцию в красном диапазоне с длиной волны от 665 нм до 800 нм. В качестве фильтра обычно используется фильтр дихроичного типа, отражающий на 90° падающего луча все спектральные компоненты ниже 650 нм и пропускает спектральные компоненты выше 650 нм. При определении источника света первый фильтр естественным образом центрируется на длине волны источника света с шириной полосы пропускания порядка 50 нм. Таким образом, с помощью такой системы для каждой частицы можно измерить три физические величины: электрического параметра, характеризующего объем частицы, величины экстинции, связанной со светопреломлением клетки, и величины флуоресценции, характеризующей содержание нуклеиновых кислот в исследуемой клетке.
Проточная цитометрия преимущественно используется для гематологических исследований, позволяющих диагностировать и проводить терапевтический мониторинг различных вирусов, инфекций и паразитов, а также для функциональных исследований здоровых клеток. Проточная цитометрия дает возможность подсчета и характеризации различных типов клеток крови.
Например, применительно к лейкоцитам проточная цитометрия позволяет установить их общее количество, дифференцировать их в соответствии с морфологией, а также разделить их на три различных типа посредством определения клеточного объема по полному сопротивлению и измерения поглощения.
К первому типу относятся моноциты, представляющие собой большие клетки (диаметром от 20 до 40 мкм). Форма их ядра может быть круглой, овальной, почковидной или совершенно неправильной; наиболее частым случаем является почковидная форма. Их хроматин имеет низкую плотность, не комковатый, однородной структуры. Время пребывания моноцитов в крови составляет 2 суток до их прохождения по мягким тканям, а время прохождения по костномозговым тканям составляет от 1 до 2 суток. После активации они превращаются в макрофаги. Они способны фагоцитировать бактерии, целые клетки, а также различные так называемые загрязняющие частицы, такие как, например, частицы пыли.
Вторым типом являются лимфоциты, которые играют главную роль в иммунной системе человека. Их можно разделить на две группы по размерам:
- малоразмерные лимфоциты (диаметром от 7 до 9 мкм) с ядром круглой или овальной, иногда почковидной формы, с нерасширенной, легко или слабо базофильной цитоплазмой, обычно расширяющейся с одной стороны ядра;
- крупноразмерные лимфоциты (диаметром от 9 до 15 мкм), имеющие ядро, расположенное по центру или слегка смещенное от центра, с более обширной цитоплазмой, чем у малоразмерных лимфоцитов, полностью окружающей ядро.
К третьему типу лимфоцитов относятся гранулоциты, также известные под названием "полинуклеарные клетки", основная функция которых заключается в защите организма от инфекций; их можно разделить на три подкатегории.
К первой относятся нейтрофилы, являющиеся наиболее многочисленными гранулоцитами (составляют около 96%). Это клетки круглой формы диаметром от 12 до 14 мкм. Для них характерна форма ядра с несколькими (от 3 до 5) выступами. Время их пребывания в крови до прохождения через мягкие ткани составляет 2 суток, а время прохождения гранулярных предшественников по костномозговой ткани составляет от 10 до 14 суток. Существует категория резервных костномозговых нейтрофилов. Они обладают высокой эффективностью при уничтожении бактерий и преобладают при воспалениях острого типа. Их основная функция заключается в защите организма от чужеродных микроорганизмов, таких как бактерии и дрожжи. Их экскреторные функции способствуют развитию местных воспалительных реакций тканей и способствуют их защите.
К следующей подкатегории относятся базофилы, которые очень малочисленны и составляют лишь около 0,5% лейкоцитов. Они имеют диаметр от 10 до 14 мкм. Их двудольное ядро замаскировано специфическими гранулами, относительно многочисленными и рассеянными по всей клетке. Их время пребывания в крови составляет от 12 до 24 часов, время прохождения по мягким тканям неизвестно. Время прохождения по костномозговой ткани идентично времени прохождения по костномозговой ткани нейтрофилов. Важной функцией базофилов является привлечение эозинофилов.
И, наконец, эозинофилы составляют приблизительно от 2% до 5% циркулирующих лейкоцитов (приблизительно 350 элементов в 1 кубическом миллиметре). Они представляют собой клетки диаметром от 12 до 14 мкм с двудольным ядром и отличаются, прежде всего, внешним видом гранул, которые являются сферическими (диаметром от 0,5 до 1,5 мкм). Они содержат азурофильные гранулы. Эозинофильные полинуклеарные клетки играют основную роль при аллергических воспалениях и антипаразитарной защите. Они распространены преимущественно в тканях, циркулирующая фракция составляет всего лишь 1% от общего числа эозинофилов. После выхода из костного мозга их время прохождения в крови до осаждения в мягких тканях (в частности, в кишечнике, легких, коже и в матке) составляет от 3 до 8 часов, где их время существования составляет около 10 суток.
Как еще один пример, проточная цитометрия позволяет определить общее количество эритроцитов и тромбоцитов, дифференцировать их в соответствии с морфологией и классифицировать посредством определения объема и поглощения клетки путем измерения полного сопротивления.
Еще одной очевидной областью интереса к применению проточной цитометрии является диагностика благодаря возможности характеризации и/или подсчета количества клеток крови различных типов, таких как ретикулоциты, эритробласты, незрелые клетки и клетки-предшественники лейкоцитов, активированные лимфоциты или все еще поперечно-сшитые тромбоциты.
При измерении объема клетки путем измерения полного сопротивления используется устройство, представляющее собой кювету, в основании которой имеется отверстие диаметром приблизительно 50 мкм, которое обеспечивает возможность прохождения по отдельности клеткам в потоке жидкости. Перед отверстием кюветы формируется поток жидкости, включающий в себя образцовую струю, содержащую клетки, которые требуется охарактеризовать, и окружающий поток (как правило, солевого раствора), который окружает образцовую струю и обеспечивает её гидравлическое фокусирование. Выводы вольтметра соединены с электродами, один из которых расположен вверху по потоку перед отверстием, а другой - внизу по потоку за отверстием, причем для обеспечения герметичности в этих точках требуются уплотнительные кольца. Изменение напряжения, наблюдаемое в момент прохождения клетки, характеризует её объем.
Основание кюветы обычно изготавливают из диска диаметром несколько миллиметров и толщиной несколько микрон, выполненного из драгоценных камней, таких как дорогостоящий синтетический рубин. В диске выполняют сквозное отверстие, после чего этот диск обжимают вручную на торце насадки. Операция обжатия не лишена риска, поскольку в ходе её проведения могут появиться микротрещины, изменяющие удельное сопротивление между положительным и отрицательным электродами и искажающие результаты измерения полного сопротивления.
Для оптических измерений используется другое устройство, включающее в себя кювету с плоским основанием, в центре которого имеется отверстие диаметром 80 мкм, обеспечивающее возможность прохождения по отдельности клеток в потоке жидкости, и прозрачный корпус, прижатый к основанию. Между корпусом и основанием имеется герметизирующее уплотнение. Вход для создания вспомогательного окружающего потока в нижней части корпуса в непосредственной близости от основания позволяет получить окружающий поток, охватывающий образцовую струю на расстоянии 400 мкм, где образцовая струя пересекает луч света, испускаемый источником возбуждения. Для обеспечения герметичности в верхней части кюветы необходимо второе уплотнение.
Для одновременного измерения объема и выполнения оптических измерений можно объединить два вышеописанных устройства в одном устройстве, в котором основание для измерения объема будет использоваться также для оптических измерений. Однако создание такого устройства требует применения четырех уплотнений. Кроме того, применение таких уплотнений не может гарантировать абсолютного отсутствия утечек между отдельными элементами устройства.
Раскрытие изобретения
Одна из целей настоящего изобретения заключается в устранении по меньшей мере одного из недостатков известного уровня техники.
С этой целью настоящим изобретением предлагается измерительная кювета для подсчета и/или характеризации клеток, в частности, клеток крови, содержащая основание и прозрачный боковой корпус, отходящий от основания и образующий вместе с ним оптическую измерительную камеру; основание которой содержит сквозное отверстие диаметром от 30 до 100 мкм для прохождения клеток, причем основание вместе с прозрачным боковым корпусом образуют цельную кювету, пригодную для измерения полного сопротивления и для оптических измерений.
С помощью такой цельной измерительной кюветы можно обойтись без трех или четырех уплотнений, которые требовались ранее для измерительной кюветы при измерении объема клетки и при оптических измерениях. Действительно, поскольку измерительная кювета является цельной и цельной, она более не нуждается в уплотнениях между сквозным отверстием и оптической измерительной камерой, а также между положительным электродом и частью, служащей для разрядки различных жидкостей (жидкости окружающей струи, лизисной жидкости и т.д.). Кроме того, такая измерительная кювета обеспечивает возможность измерения объема путем измерения полного сопротивления и посредством оптических измерений для одной и той же клетки с интервалом в несколько микросекунд.
Ниже описываются дополнительные признаки, не имеющие ограничительного характера.
Основание измерительной кюветы может содержать верхнюю поверхность, которая является объединением боковой поверхности и поверхности меньшего радиуса усеченного тела, причем сквозное отверстие проходит сквозь основание на участке, соответствующем поверхности меньшего радиуса указанной верхней поверхности.
Основание измерительной кюветы может содержать нижнюю поверхность, которая является объединением боковой поверхности и поверхности меньшего радиуса усеченного тела, причем сквозное отверстие проходит сквозь основание на участке, соответствующем поверхности меньшего радиуса указанной нижней поверхности.
Основание на указанном участке рядом со сквозным отверстием может иметь толщину от 40 до 100 мкм.
Измерительная кювета может дополнительно содержать входное отверстие для жидкости, ведущее в измерительную камеру, причем входное отверстие расположено ниже сквозного отверстия.
Корпус может иметь сферическую внешнюю поверхность, центр которой находится на выходе и вблизи сквозного отверстия. Центр сферической наружной поверхности может находиться на расстоянии от 200 до 600 мкм от выхода сквозного отверстия.
Измерительная кювета может содержать гнездо на верхней поверхности корпуса для уплотнения.
Измерительная кювета может дополнительно содержать нижнее основание, расположенное под вышеуказанным основанием, причем указанное нижнее основание совместно с вышеуказанным основанием и корпусом образуют цельную кювету, при этом указанное нижнее основание содержит боковую поверхность, содержащую V-образные центрирующие элементы.
Объектом настоящего изобретения является также система, предназначенная для характеризации клеток, в частности, клеток крови, содержащая вышеописанную измерительную кювету и кюветную опору.
Кюветная опора может содержать две канавки, пересекающиеся в точке пересечения и имеющие V-образный профиль поперечного сечения, и указанная точка пересечения образует гнездо для измерительной кюветы.
Краткое описание чертежей
Остальные цели изобретения, его признаки и преимущества станут более ясными после ознакомления с приведенным ниже подробным описанием одного из возможных вариантов его реализации, приведенным в качестве иллюстративного примера и не носящим ограничительного характера, со ссылками на прилагаемые чертежи, на которых:
Фиг. 1 - изометрическое изображение измерительной кюветы согласно настоящему изобретению;
Фиг. 2 - вид в разрезе по плоскости P измерительной кюветы, показанной на Фиг. 1;
Фиг. 3 - вид в увеличенном масштабе сквозного отверстия, показанного на Фиг. 2;
Фиг. 4 - вид в разрезе по плоскости P заготовки, используемой для изготовления измерительной кюветы, показанной на Фиг. 2;
Фиг. 5 - изометрическое изображение измерительной кюветы, показанной на Фиг. 1, установленной на кюветной опоре;
Фиг. 6 - изометрическое изображение измерительной системы, содержащей измерительную кювету и кюветную опору, показанные на Фиг. 5, а также различные оптические элементы, необходимые для проведения оптических измерений;
Фиг. 7 - вид измерительной системы в разрезе по плоскости P, показанной на Фиг. 6 и проходящей через оптический центр измерительной системы;
Фиг. 8 - блок-схема, демонстрирующая различные этапы способа изготовления измерительной кюветы, показанной на Фиг. 1.
Описание изобретения
В настоящем описании термины, характеризующие пространственное положение различных элементов, определяются относительно измерительной кюветы в её нормальном рабочем положении.
Измерительная кювета
Измерительная кювета 1 согласно настоящему изобретению для подсчета и/или характеризации клеток будет описана ниже со ссылками на Фиг. 1 - 4.
Измерительная кювета 1 содержит основание 11 и прозрачный боковой корпус 12, отходящий от основания 11, образующий вместе с основанием 11 оптическую измерительную камеру 13; основание содержит сквозное отверстие 111 диаметром от 30 до 100 мкм для прохождения клеток. Основание 11 с корпусом 12 образуют цельную кювету, пригодную для измерения полного сопротивления и для оптических измерений.
Средний диаметр сквозного отверстия 111, предпочтительно, составляет от 40 до 80 мкм или от 50 до 60 мкм. Предпочтительно, сквозное отверстие 111 имеет цилиндрическую форму с круглым основанием. Преимущество такой формы заключается в том, что она не мешает измерениям. Действительно, отверстия, получаемые микрообработкой с использованием промышленного лазера, имеют естественную конусность вследствие гауссовского энергетического профиля луча, испускаемого лазером. Однако коническое отверстие изменяет, иногда значительно, форму импульсов, создаваемых клеткой при прохождении сквозь коническое отверстие, изменяя, в частности, длительность импульса.
Кроме того, основание 11 может содержать верхнюю поверхность 112, которая включает в себя боковую поверхность 1121 и поверхность 1122 меньшего радиуса усеченного тела, предпочтительно, усеченного тела вращения, известного также под названием "прямой круговой конус". Соответствующий угол раствора конуса составляет, предпочтительно, от 20° до 60°. Меньший радиус может составлять от 0,5 до 1,5 мм, предпочтительно, около 1 мм. Сквозное отверстие 111 проходит сквозь основание 11 в его части, соответствующей поверхности 1122 меньшего радиуса верхней поверхности 112. Таким образом, верхняя поверхность 112 основания 11 входит в оптическую измерительную камеру 13. Вхождение верхней поверхности 112 основания 11 в оптическую измерительную камеру 13 дает возможность проведения измерений в открытом пространстве, в отличие от кювет, в которых измерения производятся в замкнутом пространстве, соответствующем поперечному сечению сквозного отверстия. Выполнение измерений в открытом пространстве имеет преимущество, заключающееся в облегчении очистки зоны измерений путем промывки. Наклон усеченного тела вращения обеспечивает адаптацию к оптической апертуре, максимально приближая выход сквозного отверстия 111 к точке фокусировки световых лучей, испускаемых источником возбуждения (см. ниже).
Как вариант или дополнительно, основание 11 может содержать нижнюю поверхность 113, включающую в себя боковую поверхность 1131 и поверхность меньшего радиуса 1132 усеченного тела, предпочтительно, усеченного тела вращения. Соответствующий угол раствора конуса составляет, предпочтительно, от 20° до 60°. Сквозное отверстие 111 в данном случае проходит сквозь основание 11 в его части, соответствующей поверхности 1131 меньшего радиуса нижней поверхности 113. Таким образом, нижняя поверхность 113 основания 11 образует сужающуюся камеру 114, которая сужается в направлении от основания большего радиуса усеченного тела к сквозному отверстию 111. Такая конфигурация позволяет окружить струю образца, содержащую клетки, которые необходимо подсчитать и/или охарактеризовать, и направить её по центру через сквозное отверстие 111 с помощью окружающего потока, инжектируемого сбоку в сторону поверхности 1132 меньшего радиуса, тем самым, обеспечивая точное гидродинамическое центрирование струи образца. Технология, используемая в такой конфигурации, известна под названием "гидравлического фокусирования".
Если основание 11 имеет верхнюю поверхность 112 и нижнюю поверхность 113, описанные выше, эти поверхности центрированы относительно друг друга, так что вход сквозного отверстия 111 на нижней поверхности 113 и выход сквозного отверстия 111 на верхней поверхности 112 расположены на общей продольной оси.
Предпочтительно, основание 11 рядом со сквозным отверстием 111 имеет толщину от 40 до 100 мкм, в частности, на участке, соответствующем поверхностям 1122, 1132 меньшего радиуса в верхней поверхности 112 и нижней поверхности 113. Предпочтительно, эта толщина составляет от 50 до 80 мкм, более предпочтительно, от 55 до 70 мкм, или равна 60 мкм.
Корпус 12 может иметь внутреннюю поверхность 121, форма которой соответствует форме боковой поверхности прямого цилиндра с квадратным основанием. Длину стороны квадрата, образующего основание боковой поверхности, предпочтительно, выбирают равной от 3 до 7 мм, или от 4 до 6 мм, или от 4,5 до 5,5 мм, предпочтительно, около 5 мм. Могут использоваться и другие формы основания, например, круглая, треугольная и т.д. Предпочтительно, форма основания представляет собой правильную геометрическую фигуру, т.е. имеет по меньшей мере один элемент симметрии, предпочтительно, центр симметрии или ось симметрии.
Дополнительно или альтернативно, корпус 12 имеет сферическую внешнюю поверхность 122, причем центр соответствующей сферы расположен на выходе и вблизи сквозного отверстия 111.
Сочетание сферической внешней поверхности 122 и внутренней поверхности 121, имеющей форму правильного цилиндра с квадратным основанием, образует три или четыре собирающие линзы 123, каждая из которых соответствует стороне внутренней поверхности 121, и фокусная точка которых расположена в центре сферы, соответствующей сферической внешней поверхности 122. Таким образом, конструкция измерительной кюветы 1 содержит указанные линзы, что помогает снизить общую стоимость системы измерения, освобождая пользователя от необходимости иметь в своем распоряжении собирающие линзы, установленные между измерительной кюветой и датчиками, а также от необходимости выполнять соответствующие настройки. Кроме того, такая конструкция значительно уменьшает сферическую аберрацию измерительной системы, гарантируя максимальную мощность в точке измерения. Кроме того, в отличие от коммерческих устройств, числовая апертура порядка 0,5 может быть получена без использования линзы.
Помимо этого, расположение фокусной точки линз 123 на выходе и вблизи сквозного отверстия 111 позволяет производить оптические измерения клетки, когда она только что вышла из сквозного отверстия, и центрирование струи образца является оптимальным. В самом деле, чем дальше отходит клетка от сквозного отверстия, тем более неопределенным оказывается её положение, и тем выше риск её смещения от центра струи образца.
Таким образом, центр сферической наружной поверхности 122, предпочтительно, расположен на расстоянии от 200 до 600 мкм, или от 300 до 500 мкм, или от 350 до 450 мкм, более предпочтительно, на расстоянии порядка 400 мкм от выхода сквозного отверстия 111 в направлении прохождения струи образца, в частности, параллельно продольной оси верхней поверхности 112 и нижней поверхности 113 основания 11, когда эти поверхности соответствуют объединению соответствующих боковой поверхности и поверхностей меньшего радиуса усеченного тела вращения.
Кроме того, в верхней поверхности 124 корпуса 12 может быть выполнено гнездо 15 для уплотнения, предпочтительно, уплотнительного кольца.
Измерительная кювета 11 может дополнительно содержать входное отверстие 16 для жидкости, канал от которого ведет в измерительную камеру 13. Это входное отверстие расположено ниже сквозного отверстия 111. Подача жидкости через это входное отверстие обеспечивает создание второго потока, окружающего струю образца на выходе из сквозного отверстия 111. Кроме того, вышеупомянутое входное отверстие для жидкости позволяет предотвратить образование зоны рециркуляции за счет рассеивания по площади, предупреждая выход клетки из струи образца по потоку и на расстоянии от выхода из сквозного отверстия 111, где окружение струи образца является менее эффективным, и её рециркуляцию, мешающую проведению оптических измерений на последующих клетках. Помимо этого, взаимное расположение входного отверстия 16 для жидкости и верхней поверхности 112 основания 11, т.е. боковой поверхности 1121 и поверхности 1122 меньшего радиуса усеченного тела обеспечивает преимущество, заключающееся в том, что второй поток направляется к выходу из сквозного отверстия 111.
Измерительная кювета 1 может дополнительно содержать нижнее основание 14, расположенное под основанием 11. Это нижнее основание 14, основание 11 и корпус 12 образуют цельную кювету. Нижнее основание 14 содержит отверстие 143, ведущее в сужающуюся камеру 114. На внешней стороне 1431 этого отверстия может быть предусмотрен буртик 142 для установки уплотнительного кольца.
Диаметр отверстия 143 на его внешней стороне 1431 отверстия может быть больше диаметра окружности, образующей основание усеченного тела с нижней поверхностью 113 основания 11, например, он может составлять от 400 до 700 мкм, от 450 до 650 мкм, от 500 до 600 мкм, предпочтительно, около 550 мкм. Затем диаметр отверстия 143 постепенно уменьшается до тех пор, пока не станет равным диаметру окружности, образующей основание усеченного тела с нижней поверхностью 113 основания 11.
Кроме того, нижнее основание 14 имеет боковую поверхность, содержащую V-образные центрирующие элементы 141. Эти V-образные центрирующие элементы 141 входят в зацепление со специальными канавками кюветной опоры (описаны ниже). Предпочтительно, боковая поверхность нижнего основания содержит два V-образных центрирующих элемента 141, средние плоскости которых пересекаются друг с другом, предпочтительно, под прямым углом. Предпочтительно, боковая поверхность нижнего основания содержит две пары V-образных центрирующих элементов 141. Средние плоскости двух V-образных центрирующих элементов одной и той же пары параллельны друг другу, а средние плоскости двух V-образных центрирующих элементов разных пар пересекаются друг с другом, предпочтительно, под прямым углом. Предпочтительно, средние плоскости пар V-образных центрирующих элементов 141 параллельны двум противоположным сторонам внутренней поверхности прямого цилиндра с квадратным основанием 121.
Эти V-образные центрирующие элементы 141 представляют собой выступающие элементы, вершины V-образной формы которых направлены вниз, т.е. в направлении от корпуса к нижнему основанию. Предпочтительно, вершина V-образной формы направлена вниз. Направление вниз вершины V-образной формы позволяет предотвратить неправильное позиционирование измерительной кюветы 1 вследствие возможного наличия заусенцев на вершине V-образной формы, образующихся в процессе изготовления измерительной кюветы 1.
Предпочтительно, вышеописанная цельная кювета имеет показатель преломления от 1,4 до 1,6. Пластик для изготовления вышеописанной кюветы, предпочтительно, выбирают таким образом, чтобы его пропускание на рабочей длине волны составляло больше 90%, предпочтительно, с низким двойным лучепреломлением и низкой температурной деформацией.
Кроме того, для изготовления цельной кюветы, предпочтительно, выбирают материал с низким сопротивлением водопоглощению (например, менее 0,01%). Помимо этого, материал для изготовления цельной кюветы, предпочтительно, должен иметь низкую диэлектрическую проницаемость (например, не больше 3 Ф/м) при частотах ниже 3 МГц или 1 МГц, для обеспечения удовлетворительной электроизоляции электродов с обеих сторон от сквозного отверстия.
Предпочтительно, в качестве материала для изготовления цельной кюветы используется пластик. Такую цельную кювету получают путем формовки, что позволяет резко снизить стоимость измерительной кюветы по сравнению с измерительными кюветами предшествующего уровня техники. Материал для изготовления цельной кюветы может содержать в основном полициклоолефиновую смолу, в частности, более 95 мас.% этой смолы или более 99,5 мас.% этой смолы. Примером такой смолы является Zeonex E48R (2015) производства компании Zeon. Такая смола является очень жидкой в расплавленном виде, пригодна для инжектирования при очень высоком давлении с очень низким погружением трубки, и подходит для точного контроля размеров цельной кюветы и шероховатости поверхности оптического качества такой кюветы.
Измерительная система
Ниже со ссылками на Фиг. 5 - 7 будет описана измерительная система согласно настоящему изобретению для подсчета и/или характеризации клеток.
Измерительная система 10 содержит описанную выше измерительную емкость 1.
Кроме того, измерительная система 10 содержит кюветную опору 2, предназначенную для установки на неё и фиксации измерительной кюветы 1 в процессе измерений. Если измерительная кювета 1 имеет V-образные центрирующие элементы 141, кюветная опора 2, предпочтительно, содержит две канавки 21, 22, пересекающиеся друг с другом, предпочтительно, под прямым углом, имеющие V-образный профиль поперечного сечения, соответствующий форме V-образных центрирующих элементов 141 измерительной кюветы 1. В месте пересечения вышеуказанных канавок образуется гнездо для измерительной кюветы 1. Угол пересечения двух канавок 21, 22 соответствует углу пересечения средних плоскостей V-образных центрирующих элементов 141.
Помимо этого, кюветная опора 2 в месте пересечения канавок содержит отверстие 23 для приема окружающего потока и струи образца. При установке измерительной кюветы 1 на кюветную опору 2 отверстие 23 может гидравлически соединяться с сужающейся камерой 114. Кроме того, измерительная система 10 может содержать уплотнительное кольцо 3, устанавливаемое между измерительной кюветой 1 и кюветной опорой 2.
Измерительная система 10 может дополнительно включать в себя блок измерения полного сопротивления, содержащий положительный электрод и отрицательный электрод.
Кроме того, измерительная система 10 может включать в себя оптический измерительный узел, содержащий источник возбуждения 4 для испускания света в сторону измерительной кюветы 1. Оптическая ось A определяется по источнику 4 как среднее направление излучаемых им световых лучей 41. Расположение источника возбуждения 4 выбирается таким образом, чтобы оптическая ось A проходила через центр O сферической наружной поверхности 122 корпуса 12, когда измерительная кювета 1 установлена на своем месте.
Источником возбуждения 4, предпочтительно, является некогерентный источник. Таким образом, облегчается формирование световых лучей 41, и по затратам становится по меньшей мере сравнимым с системами предшествующего уровня техники, требующими применения лазеров. Действительно, ширина струи образца составляет несколько микрон. Клетка, диаметр которой меньше ширины струи образца, может располагаться в любом месте по ширине данной струи. Применение низкокогерентного источника возбуждения 4 позволяет сформировать однородно освещенную зону в точке измерения, расположенной в центре O сферической наружной поверхности 122 корпуса 12, включающей в себя ширину образцовой струи. Таким образом, поступающий на датчик оптический сигнал будет одинаковым независимо от расположения клетки в образцовой струе.
В качестве источника возбуждения 4 может использоваться светоизлучающий диод или лампа накаливания. Источник возбуждения имеет спектр излучения, центрированный на длине волны от 620 до 680 нм, от 635 до 665 нм, предпочтительно, около 650 нм.
Оптический измерительный узел может также включать входную формирующую оптику 5, расположенную на оптической оси A. Элементы входной формирующей оптики 5 должны быть расположены между источником возбуждения 4 и измерительной кюветой 1. Формирующая оптика 5 дает возможность преобразовать световые лучи 41, излучаемые радиально относительно источника возбуждения 4 и поступающие на первый элемент формирующей оптики 5, в световые лучи, параллельные оптической оси A. Для этого она содержит первую оптическую группу 51, действующую как собирающая линза. Для улучшения фокусирования световых лучей в центре O сферической наружной поверхности 122 корпуса 12 может быть предусмотрена вторая оптическая группа 52, также действующая как собирающая линза, с целью перемещения первой конвергенции световых лучей ближе к центру O сферической наружной поверхности 122 корпуса 12. Объединение второй оптической группы 52 с собирающими линзами 123 кюветы 1 позволяет обеспечить как минимальную сферическую аберрацию в центре O сферической наружной поверхности 122 корпуса 12, максимальную мощность в данной точке O, так и максимальную числовую апертуру. Интеграция линзы 123 в измерительную кювету 1 помогает сократить затраты; без данной линзы 123 было бы необходимо интегрировать её в формирующую оптику. Первая оптическая группа 51, а если применимо, и вторая оптическая группа 52, предпочтительно, заключены в корпусе 53 общей цилиндрической формы с круглым основанием для облегчения позиционирования по высоте и угловому расположению в канавке 21 кюветной опоры 2.
Входная формирующая оптика 5 подходит также для формирования изображения сетки вблизи выхода сквозного отверстия 111, когда измерительная кювета 1 установлена на своем месте. Если это применимо, изображение сетки формируется на плоскости, в которой расположен центр O сферической наружной поверхности 122 корпуса 12. С этой целью оптический измерительный узел дополнительно содержит прямоугольную сетку между источником возбуждения 41 и входной формирующей оптикой 5. Предпочтительно, коэффициент формы (отношение длины к ширине) меньше или равен 3. Входная формирующая оптика подходит, например, для формирования прямоугольной сетки длиной приблизительно 100 мкм и шириной около 30 мкм.
Предпочтительно, входная формирующая оптика 5 выполнена таким образом, чтобы сходящиеся световые лучи 41 образовывали большой пространственный угол величиной, например, от 30° до 50°. Благодаря такой большой апертуре, возможной, в частности, благодаря форме усеченного тела верхней поверхности 112 основания измерительной кюветы 1, можно собирать максимальное количество света на выходе.
Оптический измерительный узел может включать в себя блок измерения светопоглощения, содержащий датчик для измерения светопоглощения клетки и первую оптику 6 для восприятия выходного сигнала, таким образом, чтобы световые лучи, проходящие через измерительную кювету 1 и приходящие на первую приемную оптику 6, сходились к датчику. Предпочтительно, датчик и первая приемная оптика 6 расположены на оптической оси A с противоположной стороны от источника возбуждения 41 относительно измерительной кюветы 1, причем элементы первой приемной оптики 6 должны быть расположены между измерительной кюветой 1 и датчиком. В некоторых случаях датчик и первая приемная оптика 6 могут быть расположены вне оптической оси A, и в этом случае дефлектор располагается на оптической оси A на пути прохождения световых лучей 41 между измерительной кюветой 1 и первой приемной оптикой 6. В качестве датчика, предпочтительно, используется фотодиод.
Хотя это не обязательно, предпочтительно, чтобы первая приемная оптика 6 имела такую же апертуру, что и входная формирующая оптика 5, с целью сведения к минимуму затрат на обеспечение симметричности системы.
Оптический измерительный узел может включать в себя блок измерения рассеяния, содержащий датчик для измерения бокового рассеяния и вторую оптику 7 для восприятия выходного сигнала, таким образом, чтобы световые лучи 41, рассеиваемые измерительной кюветой и приходящие на вторую приемную оптику 7, сходились к датчику. Предпочтительно, датчик и вторая приемная оптика 7 расположены на оси, перпендикулярной оптической оси A, параллельной кюветной опоре и проходящей через центр O сферической наружной поверхности 122 корпуса 12, когда измерительная кювета 1 установлена на своем месте. В некоторых случаях датчик и вторая приемная оптика 7 могут располагаться вне оси, перпендикулярной оптической оси A, и в этом случае дефлектор располагается на оси, перпендикулярной оптической оси A, на пути прохождения световых лучей 41 между измерительной кюветой 1 и второй приемной оптикой 7. В качестве датчика, предпочтительно, используется лавинный фотодиод.
Оптический измерительный узел может включать в себя блок измерения флуоресценции, содержащий датчик для измерения флуоресценции клетки и третью оптику для восприятия выходного сигнала (не показана), таким образом, чтобы световые лучи, рассеиваемые измерительной кюветой и поступающие на третью приемную оптику, сходились к датчику. Предпочтительно, датчик и третья приемная оптика расположены на оси, перпендикулярной оптической оси, параллельной кюветной опоре и проходящей через центр сферической наружной поверхности корпуса, когда измерительная кювета установлена на своем месте. В некоторых случаях датчик и третья приемная оптика могут располагаться вне оси, перпендикулярной оптической оси, и в этом случае дефлектор располагается на оси, перпендикулярной оптической оси, на пути прохождения световых лучей между опорой кюветы и третьей приемной оптикой. В качестве датчика, предпочтительно, используется лавинный фотодиод.
В случае если оптический измерительный узел содержит блок измерения бокового рассеяния и блок измерения флуоресценции, один из них может быть расположен на оси, перпендикулярной оптической оси, а другой может быть расположен вне этой оси. В таком случае в качестве соответствующего дефлектора используется дихроичное зеркало.
Альтернативно, оба вышеупомянутых блока могут располагаться вне оси, перпендикулярной оптической оси. В таком случае, дефлектором, наиболее близким к кюветной опоре, будет дихроичное зеркало. В качестве дефлектора, расположенного дальше от кюветной опоры, может использоваться либо полупрозрачное зеркало, либо реальное зеркало.
Также альтернативно, дихроичное зеркало может быть добавлено к блоку измерения бокового рассеяния для обеспечения возможности измерения одной или нескольких флуоресценций при использовании одних и тех же компонентов измерительной системы 10. Дихроичное зеркало располагается между кюветной опорой и второй приемной оптикой. Кроме того, могут быть предусмотрены дихроичные оптические фильтры для разделения оптических сигналов флуоресценции различных длин волн, обычно в спектрах с шириной на полувысоте от 20 до 50 нм или от 30 до 40 нм. В таком случае они могут быть расположены между дихроичным зеркалом и датчиком флуоресценции.
Используемые в настоящем описании термины "формирующая оптика" и "приемная оптика" служат для обозначения линзы или комплекта линз, служащих для изменения направления световых лучей. Предпочтительно, формирующая и приемная оптика идентичны друг другу. Иными словами, они составляют первую оптическую группу и вторую оптическую группу, причем вторая оптическая группа расположена ближе к измерительной кювете 1, чем первая оптическая группа.
Предпочтительно, каждая из приемных оптик 6, 7 имеет корпус цилиндрической формы с круглым основанием, как и формирующая оптика 5, для их позиционирования по высоте и угловому расположению на кюветной опоре 2. V-образные центрирующие элементы могут входить в зацепление с соответствующими канавками 21, 22 кюветной опоры 2, которые могут быть идентичны канавкам, служащим для позиционирования измерительной кюветы 1.
Измерительная кювета 1 и/или кюветная опора 2, предпочтительно, выполнены таким образом, чтобы поверхность правой внутренней цилиндрической поверхности корпуса с квадратным основанием была перпендикулярна оптической оси. В таком случае формирующая оптика располагается либо на оптической оси, либо на оси, перпендикулярной оптической оси и проходящей через центр сферической наружной поверхности корпуса, когда измерительная кювета установлена на своем месте.
Способ изготовления измерительной кюветы. Описание способа изготовления измерительной кюветы будет произведено со ссылками на Фиг. 2, 4 и 8.
Способ включает в себя формовку заготовки, форма которой, в целом, соответствует форме измерительной кюветы, за исключением основания (см. Фиг. 4). Следует отметить, что сквозное отверстие в заготовке еще не сформировано, и толщина зоны основания рядом с первым сквозным отверстием еще не достигла требуемой малой величины. Приблизительная толщина вышеупомянутой зоны составляет от 400 до 600 мкм, от 450 до 550 мкм или от 475 до 525 мкм, предпочтительно, около 500 мкм.
Способ включает в себя также абляцию зоны основания вблизи с будущим сквозным отверстием на достаточную глубину, с целью получения толщины приблизительно от 40 до 100 мкм, от 50 до 80 мкм, от 55 до 70 мкм или около 60 мкм; абляция осуществляется сверхкороткими импульсами. Предпочтительно, абляция зоны основания вблизи будущего сквозного отверстия выполняется с применением лазера, луч которого, предпочтительно, направлен на нижнюю поверхность основания. Предпочтительно, проведение такой операции приводит к образованию абляционного круга диаметром от 0,6 до 1,4 мм. Контроль толщины в данной области (т.е. толщины в зоне будущего сквозного отверстия) является важным с точки зрения обеспечения правильных размеров для обеспечения качественного измерения удельного сопротивления. Действительно, толщина сквозного отверстия непосредственно связана с шириной импульсов, создаваемых клеткой, при её прохождении через сквозное отверстие. Если толщина сквозного отверстия является чрезмерно большой или неконтролируемой, возникает риск одновременного прохождения множества клеток через данное сквозное отверстие, и, следовательно, получения неправильных результатов измерений линейных размеров.
Способ изготовления измерительной кюветы включает в себя последующее формирование сквозного отверстия путем лазерной микрообработки, например, в соответствии со способом, описанным в WO 2017/029210, что позволяет получить сквозное отверстие идеально цилиндрической формы для измерения полного сопротивления.
При необходимости, указанный способ может включать в себя установку заготовки на устройстве для позиционирования между операциями формовки и абляции (удаления материала), что позволяет зафиксировать заготовку во время удаления материала и формирования сквозного отверстия. В частности, устройство для позиционирования может представлять собой установочную опору, содержащую на своей верхней поверхности углубление, форма которого соответствует форме кюветы.