СПОСОБ ОЦЕНКИ ОСМОТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
METHOD FOR EVALUATING OSMOTIC FRAGILITY

Предлагаемая разработка относится к области медицинской биологии, а именно к лабораторным методам исследования в гематологии и физиологии.
Определение осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) является одним из наиболее доступных в лабораторной диагностике способом оценки физико-химических свойств мембран эритроцитов. Изменение ОРЭ наблюдается при ряде таких заболеваний, как гемолитическая анемия, сердечная недостаточность (снижение ОРЭ), талассемия, механическая желтуха, артериосклероз (повышение ОРЭ) (Адо А.Д., Ишимова Л.М. 1980). В физиологии определение ОРЭ используется для оценки адренореактивности эритроцитов (Соминский В.Н., Окунь К.В., 1981).
Наиболее близким к предлагаемой разработке рассматривается микроскопический способ Яновского (Предтеченский В.Е., Кост Е.А., 1964). Сущность его состоит в том, что капиллярную кровь разводят в 200 раз при использовании четырех растворов NaCl - 0,50%; 0,46%, 0,40% и 3%, а затем в счетной камере определяют число негемолизированных эритроцитов в каждой пробе. Его выражают в процентах к исходному числу (т.е. в 3% растворе NaCl). Чем меньше сохраняется эритроцитов в 0,50%; 0,46% и 0,40% растворах NaCl, тем ниже ОРЭ.
Недостатками способа является длительность выполнения, отсутствие стандартного времени экспозиции эритроцитов, необоснованность выбора указанных гипоосмотических сред, т.е. концентраций раствора NaCl, сложность в дифференцировке негемолизированных эритроцитов от их стром-теней, трудоемкость метода, связанная с подсчетом эритроцитов, отсутствие четких критериев для оценки нормальной и измененной ОРЭ. Метод в целом не нашел широкого применения в клинической и экспериментальной практике.
Существует комбинированный способ Вакеза (Предтеченский В.Е., Кост Е.А., 1964). Капиллярную кровь разводят гипотоническими растворами NaCl (0,42%, 0,46%, 0,52%, 0,62%, 0,70% и 0,82%) и через 6 часов в каждой пробе ведут подсчет эритроцитов в счетной камере. Мерой ОРЭ является та концентрация раствора NaCl, при которой эритроциты уже не разрушаются. Недостатками способа являются большая длительность наблюдения, большое (6) число сред, необходимых для определения ОРЭ, сложность в дифференцировке негемолизированных эритроцитов от их стром-теней, трудоемкость метода, связанная с подсчетом эритроцитов, отсутствие четких критериев для оценки нормальной и измененной ОРЭ. Способ из-за сложности и низкой точности не нашел применения в клинической и экспериментальной практике.
Предложен способ определения осмотической резистентности эритроцитов крови (4) по изменению диаметра эритроцитов, помещенных в 0,25% раствор NaCl, которое определяют при микроскопии при 400-кратном увеличении. Мерой ОРЭ являлось время, за которое диаметр эритроцитов возрастает в 2 раза. К недостаткам способа можно отнести большую трудоемкость, отсутствие доказательств в целесообразности применения именно 0,25% раствора NaCl и отсутствие нормативных показателей ОРЭ.
Известны различные способы определения осмотической стойкости эритроцитов, основанные на оценке содержания в растворе гемоглобина, вышедшего из эритроцитов при их гемолизе. Эти способы можно рассмотреть в качестве аналогов. Среди них - способ, основанный на визуальной оценке гемолиза по интенсивности окраски гипотонического раствора NaCl; способ, основанный на замере интенсивности гемолиза по степени поглощения света определенной длины; способ, основанный на прямом определении содержания гемоглобина в гипотонической среде.
1. Визуальный, или макроскопический, способ оценки ОРЭ Лимбека и Рибьера (Предтеченский В.Е., Кост Е.А., 1964), состоящий в том, что капиллярная кровь (по 20 мкл) добавляется в пробирки с 10 мл гипотонического раствора NaCl (от 0,56% до 0,28%). Смесь инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре (15-25°С), после чего подвергают 3-минутному центрифугированию при 2000 оборотах в минуту, после чего отмечают максимальный и минимальный уровни резистентности, т.е. те концентрации NaCl, при которых имеет место частичный и полный гемолиз эритроцитов. Разновидностью этого метода является визуальная оценка минимальной и максимальной устойчивости эритроцитов при их инкубации в течение нескольких часов в 0,9%, 0,8%, 0,7%, 0,6%, 0,5%, 0,4% и 0,3% растворах NaCl без применения центрифугирования (Предтеченский В.Е., Кост Е.А., 1964). В целом, указанный способ имеет ряд недостатков: потребность в большом количества капиллярной крови, низкая точность оценки минимального и максимального гемолиза, неопределенность уменьшения степени тоничности растворов, отсутствие общепринятых нормативов ОРЭ.
2. Колориметрический способ оценки ОРЭ основан на прямом определении концентрации гемоглобина, выходящего из эритроцитов при их гемолизе (Скварченко Г.О., 1914; Багтон Дж.X, 1949). (Предтеченский В.Е., Кост Е.А., 1964). Первоначально в этом способе применялся гемометр Сали, в котором содержание гемоглобина оценивали по степени разведения солянокислого гематина дистиллированной водой до цвета стандартных ампул гемометра. Суть способа заключается в том, что в пробирки с растворами NaCl (0,9%, 0,8%, … 0,1%) добавляют эритроциты, после чего определяют методом Сали концентрацию гемоглобина в каждой пробирке, на основании чего строят кривую гемолиза эритроцитов при соответствующих концентрациях NaCl.
Недостатком способа является низкая точность определения гемоглобина методом Сали, трудоемкость и отсутствие нормативов.
x
1
x
1
3. Способ Л.И.Идельсона, предложенный для определения ОРЭ путем количественного определения степени гемолиза эритроцитов в забуференных гипотонических растворах NaCl по интенсивности поглощения света длиной волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в фотоэлектроколориметре (Меньшиков В.В. 1987). В две стерильные пробирки с предварительно внесенными 2 каплями гепарина добавляют по 1,5 мл венозной крови; одну пробу используют для исследования, вторую оставляют на сутки в термостате при 37°С. В 14 центрифужных пробирок разливают по 5 мл раствора NaCl в концентрации от 1,0% до 0,10% и в каждую из них добавляют по 0,02 мл гепаринизированной венозной крови; пробирки инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем в течение 5 мин центрифугируют при 2000 об/мин, после чего проводят фотоколориметрирование надосадочной жидкости (в кювете с толщиной слоя 10 мм) против холостой пробы, т.е. надосадочной жидкости в пробирке, содержащей 1% раствор хлорида натрия. На оснований значений экстинкций рассчитывают интенсивность гемолиза в каждой пробирке по формуле (E/E)×100%, где E - экстинкция надосадочной жидкости в исследуемой пробе, E - экстинкции надосадочной жидкости в пробирке с 0,1% раствором хлорида натрия (она принимается за 100%). На следующий день повторяют исследование с кровью, инкубированной 24 ч при 37°С. У здоровых лиц минимальная резистентность эритроцитов равна 0,45%-0,50% раствора NaCl, максимальная - 0,35%-0,45% раствора NaCl. Недостатки данного способа: необходимость использования венозной крови в большом объеме (3 мл); трудоемкость приготовления 28 растворов с различными концентрациями NaCl, что требует значительных затрат времени и сопряжено с возможными неточностями в навесках; большое количество лабораторной посуды; большое число измерений на фотоэлектроколориметре, что увеличивает время выполнения теста, а также возможность изменения интенсивности поглощения света в зависимости от формы гемоглобина в растворе (оксигемоглобин, восстановленный гемоглобин). До настоящего времени в литературе не используются такие нормативы, как процент гемолиза, основанный на расчете экстинкций. В литературе также дискутируется вопрос о правильности выбора длины волы света при оценке интенсивности поглощения света.
4. Способ исследования осмотической резистентности эритроцитов (6) предполагает, что эритроциты смешивают с раствором NaCl (0,9%, 0,7%, 0,5%, 0,3%, 0,1%) непосредственно в кювете (с толщиной слоя 10 мм) спектрофотометра и сразу же при 20°С начинают регистрацию оптической плотности при длине волны 650 нм до установления стабильных значений. За 100% гемолиз принимают максимальные показания оптической плотности взвеси эритроцитов с 0,1% раствором NaCl, а за нулевой гемолиз - с 0,9% раствором NaCl. Недостатками метода является: наличие специального оборудования (спектрофотометр «Unicam Sp 8000»), а также трудоемкость метода и отсутствие показателей, характеризующих осмотическую резистентность нормальных эритроцитов.
5. Способ определения осмотической резистентности эритроцитов (7) основан на регистрации оптической плотности растворов NaCl (0,1% до 0,9%), содержащих эритроциты (5 мл раствора + 0,02 мл гепаринизированной крови) при прохождении света длиной волны 670-750 нм в кювете толщиной 10 мм в фотоэлектроколориметре против холостой пробы (раствор NaCl соответствующей концентрации, без эритроцитов). Измерение проводят в пределах нескольких минут от добавления эритроцитов, причем в отличие от метода Л.И.Идельсона, не прибегая к центрифугированию и 30-минутному термостатированию при комнатной температуре. Процент гемолиза в каждой пробирке вычисляют по формуле 100 × (Дмакс-Дх/Дмакс-Дмин), где Дмакс и Дмин - максимальная и минимальная оптические плотности, а Дх - оптическая плотность исследуемой пробы. Переход на волну 670-750 нм повысил точность метода; в данном способе также снизилась трудоемкость, но сохранилась неопределенность в оценке нормативных показателей ОРЭ и сложность их интерпретации.
6. Способ определения осмотической резистентности эритроцитов (8), который является модификацией метода Л.И.Идельсона. В три пробирки (по 2,5 мл дистиллированной воды, 0,9% и 0,45% раствора NaCl) вносят по 0,01 мл капиллярной крови; смеси подвергают 10-минутному центрифугированию при 2000 об/мин, а затем оценивают на спектрофотометре при длине волны 414 нм поглощение света надосадочной жидкости в кювете с толщиной слоя 10 мм против кюветы с дистиллированной водой. Степень гемолиза оценивают по формуле (Еоп/Ек)×100%, где Еоп и Ек - оптическая плотность надосадочной жидкости соответственно в пробирке с 0,45% NaCl и с дистиллированной водой (последнюю принимают за 100%). В норме ОРЭ взрослого человека для 0,9% раствора NaCl составляет 1,61±0,23%, а для 0,45% раствора NaCl - 25,16±1,83%. При гемолитических состояниях эти показатели составляют соответственно 10,13±1,57% и 93,58±3,08%. Хотя способ отличается от метода Л.И.Идельсона меньшей трудоемкостью, меньшими затратами на лабораторную посуду, на приготовление растворов. Но он имеет и недостатки, среди которых возможность изменения интенсивности поглощения света в зависимости от формы гемоглобина в растворе (оксигемоглобин, восстановленный гемоглобин), а также недостаточная обоснованность выбора гипотонического раствора (0,45% NaCl).
Таким образом, существует много модификаций методов ОРЭ, основанных на оценке содержания в гипотонической среде гемоглобина, в том числе по оптической плотности надосадочной жидкости (способ Л.И.Идельсона), в многочисленных модификациях которого предлагаются разные длины волн света (от 414 нм до 750 нм), различные растворы NaCl и разные принципы расчета показателя, характеризующего ОРЭ.
Целью предлагаемого способа является унификация оценки осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ), повышение объективности, доступности и возможности широкого использования в клинической практике с целью диагностики патологии эритроцитов, а также снижение трудоемкости, возможности оценки содержания в эритроцитах рецепторов к адреналину, ацетилхолину, гистамину и другим гормонам и биологически активных веществ по характеру изменения ОРЭ при их воздействии на эритроциты.
50
Предлагаемый способ включает количественное определение числа негемолизированных эритроцитов в процентах от их исходного содержания, помещенных в дистиллированную воду на строго фиксированное время (30, 45, 60, 90 и 120 с), с последующим расчетом времени, при котором в этой среде еще сохраняется 50% эритроцитов (Т).
2
50
Поставленная цель достигается тем, что эритроциты помещаются в дистиллированную воду, содержащую 2,5 мМ CaCl на 1 л, на строго фиксированное время (на 30, 45, 60, 90 и 120 с), по окончании которого гемолиз эритроцитов останавливается путем создания гипертонической среды за счет добавления в дистиллированную воду 6% раствора NaCl в соотношении 1:1 с последующим подсчетом числа негемолизированных эритроцитов (классическим методом в камере Бюргера с сеткой Горяева), выраженного в процентах к исходному уровню эритроцитов, и определения длительности времени экспозиции в воде, при которой число эритроцитов уменьшается на 50% от исходного уровня (Т).
2
2
50.
50
-9
-8
-6
Реализация способа заключается в том, что у исследуемого общепринятым способом производится забор 0,02 мл капиллярной крови (например, с помощью микропипетки гемометра Сали). Этот объем крови добавляется в пробирку, содержащую 0,2 мл 0,9% раствора NaCl, гепарин (1 МЕ/мл) и CaCl (2,5 мМ); в целом, кровь разводится в 10 раз. Затем 0,02 мл этого разведения помещается в пробирку, содержащую 0,4 мл 3% раствора NaCl; это дает конечное разведение крови в 200 раз и позволяет определить исходное содержание эритроцитов в 1 л крови (абсолютный контроль, принимаемый за 100%). Кроме того, в 5 пробирок, содержащих по 0,2 мл дистиллированной воды с CaCl (2,5 мМ), вносится по 0,02 мл 10-кратного разведения крови на строго фиксированное время (соответственно на 30, 45, 60, 90 и 120 с) для проведения осмотического гемолиза. Строго через 30, 45, 60, 90 и 120 с в каждую пробирку с целью прекращения гемолиза добавляется по 0,2 мл 6% раствора NaCl (в конечном итоге кровь, подвергаемая гемолизу, также разводится в 200 раз). Затем проводится подсчет числа эритроцитов классическим методом с использованием микроскопа типа Биолам ЛОМО (Р-11) в счетной камере Алферова-Бюркера с сеткой Горяева в 80 малых квадратах. Число негемолизированных эритроцитов в каждой из 5 пробирок выражают в процентах к абсолютному контролю. На основании этих значений строится кривая (см. чертеж), отражающая скорость гемолиза, по которой рассчитывается длительность времени экспозиции в воде, при которой число эритроцитов уменьшается на 50% от исходного уровня (т.е. показатель Т). Предлагаемый способ оценки ОРЭ может быть упрощен за счет применения лишь одной длительности экспозиции (например, 30 с) без расчета показателя Т. Способ может быть использован для оценки адренореактивности эритроцитов (или реактивности к другим гормонам и биологически активных веществ) по характеру изменения ОРЭ в дистиллированной воде при добавлении в нее адреналина в соответствующих концентрациях, например 10, 10, 10 г/мл.
12
-6
50
50
В качестве примера приводим данные, полученные при исследовании в зимний период года здоровой девушки, находящейся в фолликулиновой фазе цикла. Абсолютный контроль составил 5,0×10/л. При 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секундной экспозициях в дистиллированной воде негемолизированными осталось соответственно 79%, 73%, 29%, 1% и 0% от исходного числа; Т - 50 с. В присутствии адреналина в концентрации 10 г/мл эти показатели составили соответственно 86%, 82%, 58%, 1% и 1%, а Т - 61 с. Эти данные позволили заключить, что адреналин в указанной концентрации повышает ОРЭ.
12
50
Предлагаемый нами способ оценки ОРЭ апробирован при исследовании капиллярной крови 87 девушек-студенток второго курса медицинского вуза. Оно проводилось на протяжении учебного года и с учетом фазы менструального цикла, что позволило оценить влияние на ОРЭ фазы цикла (табл.1) и сезона года (табл.2). В этих же исследованиях оценивалось влияние адреналина на ОРЭ (табл.3). В целом, установлено, что исходно в в 80 малых квадратах содержалось 410,2±7,4 эритроцитов, что соответствует 4,10±0,74×10 эритроцитов в 1 л крови. После 30-, 45-, 60-, 90- и 120-секундных экспозиций в дистиллированной воде неразрушенными осталось соответственно 76±1,6%, 60±1,7%, 43±1,5%, 20±1,5% и 8,5±1,0% от исходного уровня; значение T составило 54,3±1,5 с.
-10
-8
-6
Представленные значения предлагается использовать в качестве нормальных значений, характеризующих ОРЭ. Показано, что ОРЭ эритроцитов не зависит от фазы менструального цикла (табл.1). В то же время ОРЭ в весенний период оказалось выше, чем в зимний (табл.2). Установлено, что адреналин в концентрациях 10 г/мл не влияет на ОРЭ, в концентрации 10 и 10 г/мл (табл.3) повышает ее.
Таблица 3Число эритроцитов, неподвергнувшихся гемолизу в дистиллированной воде в присутствии адреналина в концентрации 10<sup>-6</sup> г/мл (М±m)
Гипотоническая среда
Исходное число эритроцитов (×10<sup>12</sup>) в 1 л
Число негемолизированных эритроцитов, в % к исходному уровню
Т<sub>50</sub>, с
30 с
45 с
60 с
90 с
120 с
Дистиллированная вода, ДВ (n=11)
3,86±11
75±7
46±7
39±8
13±3
1±0,3
43,2±4,1
ДВ + адреналин, 10<sup>-6</sup> г/мл (n=11)
3,83±12
68±9
59±10<sup>*</sup>
44±11
26±8
9±4
53,9±7,9
Примечание: <sup>*</sup> различие с ДВ достоверно (p<0,05) по критерию Стьюдента
2+
Преимуществами предлагаемого нами способа является использование микроколичеств крови, возможность многократного исследования (забор капиллярной крови), относительная быстрота получения результатов, относительная несложность выполнения способа, высокая точность оценки ОРЭ, простота и надежность интерпретации результатов исследования, позволяющая оценить динамику разрушения эритроцитов и дающая возможность использования данного способа для оценки хемореактивности эритроцитов (адрено-, холино-, серотонино- и гистаминореактивности; для этих целей в дистиллированную воду добавлены ионы Са в концентрации 2,5 мМ/л как необходимые посредники в действии этих веществ). Наибольшая сложность способа заключается в подсчете числа эритроцитов. Наличие современных микроскопов или гемоцитометров может существенно облегчить оценку ОРЭ по предлагаемому способу. Способ может быть использован в любых клинических условиях и в экспериментальных исследованиях, связанных с оценкой ОРЭ.
Источники информации
1. Патологическая физиология. Под ред. А.Д.Адо и Л.М.Ишимовой М.: Медицина, 1980.
2. Соминский В.Н., Окунь К.В. Повышение осмотической резистентности эритроцитов крови под влиянием пропранолола. // Лабораторное дело. - 1981. - №9. - С.525-527.
3. Руководство по клиническим и лабораторным исследованиям, основанное В.Е.Предтеченским под редакцией Е.А.Кост. - «Медицина» 1964 - прототип.
4. Коломийцев А.К. Авторское свидетельство РФ №2049998 C1, G01N 33/48, опубликовано 10.12.1995. Бюл. №34
5. Лабораторные методы исследования в клинике. Под ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987, с.119
6. Липина О.В., Шраго М.И., Морозова Т.Ф. Авторское свидетельство СССР №1097949, G01N 33/48, опубликовано 15.06.1984. Бюл. №22.
7. Рябов С.И., Шостка Г.Д., Спиридонов В.Н., Бочков Д.Н. Авторское свидетельство СССР №1647403 A1, G01N 33/49, опубликовано 07.05.1991. Бюл. №17.
8. Горшкова М.А., Миллер Д.А., Егорова Е.Н., Федотова Т.А. Авторское свидетельство РФ №2328741, G01N 33/49, опубликовано 10.07.2008. Бюл. №19.