СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНЫХ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR MAKING PREPARATION USED FOR TREATMENT OF RADIATION INJURIES IN ANIMALS AND TREATMENT METHOD OF RADIATION INJURIES IN ANIMALS

Изобретение относится к радиационной биологии, в частности к получению и применению радиозащитных препаратов микробного происхождения.
Известны способы получения веществ микробного происхождения (белково-полисахаридного комплекса, декстранов, пептидогликана почвенных бактерий, экстрактов туберкулезных микобактерий, эндотоксинов кишечной палочки) и применения их для профилактики и лечения радиационных поражений организма (см. статью В.Н.Андрущенко и др. Противолучевое действие веществ микробного происхождения // Радиац. биол. радиоэкол. - 1996. - Т.38. - В.3. - С.416-425).
80-90
К недостаткам данных способов следует отнести низкую радиозащитную эффективность (30-40%) препаратов при поражении организма в летальных (ЛД) дозах облучения.
70/30
Известно также применение пробиотического препарата «Биоспорин» для лечения радиационных поражений организма путем трехкратного внутрибрюшинного введения пробиотика облученным в дозе ЛД лабораторным животным (см. статью А.В.Степанова и др. Исследования радиомодифицирующих свойств препарата «Биоспорин» // Сб. материалов научно-практ. конф. - Екатеринбург, 1977. - С.42-45).
90-100
Недостатками способа являются низкая радиозащитная эффективность препарата, необходимость многократного применения и ограничение места введения (внутрибрюшинное, что исключает возможность применения препарата на крупных животных). При облучении животных в летальных дозах (ЛД) эффективность препарата также резко снижается.
Известен способ приготовления и применения бактериального препарата на основе продуктов метаболизма Bacillus subtitlis и адсорбента токсинов - цеолита, связывающего и выводящего из организма низкомолекулярные токсины, тяжелые металлы и радионуклиды (см. статью Е.И. Ткаченко и др. Эрадикационная терапия, включающая пробиотики: консенсус эффективности и безопасности // Клиническое питание. - 2005. №1. - С.14-20).
К недостаткам данного способа следует отнести использование в его составе неочищенного цеолита, содержащего значительное количество нерастворимых солей и кварца, не участвующих в процессе адсорбции токсинов и, будучи неактивными компонентами адсорбента, выводящихся из организма в качестве балласта, создавая при этом необоснованную излишнюю нагрузку на желудочно-кишечный тракт пациента. При этом следует отметить, что препарат оказывает положительный эффект только при длительном (прием 2 раза в день в течение 2-3 недель) пероральном (внутреннее - через рот) применении и предназначен для лечения людей. Применение на животных этого препарата не предусмотрено, и в той форме производства (таблетки) использование его неэкономично и нецелесообразно.
Для использования биопрепаратов с лечебной целью наиболее экономичным, эффективным и целесообразным является парентеральное (подкожное, внутривенное, внутрибрюшинное) применение их, при котором эффект достигается за более короткие сроки и с меньшими расходами препаратов с одновременной более точной дозировкой. Однако парентеральное применение «Бактистатина» невозможно, поскольку при переводе препарата в жидкую (инъекционную) форму один из основных действующих компонентов препарата - цеолит выпадает в осадок и не попадает в организм, что ведет к резкому снижению лечебного эффекта. Кроме того, известная питательная среда (мясо-пептонный бульон - МПБ), используемая для культивирования Bacillus subtitlis ВКПМ № В-2335 (3), готовится из высокоценного пищевого продукта - говяжьего мяса высокого качества и дорогостоящего дефицитного компонента - пептона, вместе с тем не обеспечивает оптимального синтеза пробиотических веществ (лизоцима, бактериоцинов, ферментов, аминокислот), способствующих увеличению численности и метаболической активности бифидо- и лактобактерий (бифидогенных факторов), обладающих радиозащитными свойствами (см. автореф. диссертации Хафизова А.Ш. Изыскание радиозащитных средств из класса веществ микробного происхождения. - Казань, 2007, 19 с). Способ предполагает, кроме того, использование в «Бактистатине» труднодоступного и неполноценного по аминокислотному составу дорогостоящего пищевого продукта - гидролизата соевой муки, содержащей в своем составе только 2 незаменимые аминокислоты: лизин и метионин, причем в весьма незначительных количествах (0,2 и 0,096% против 8,85 и 1,4% в предлагаемом - гидролизате лактоальбумина) (см. справочник: Кормление сельскохозяйственных животных. - М.: Росагропромиздат, 1988, с.363, приложение 6).
Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности способа защиты организма от радиационного поражения и сокращение сроков его применения.
3
3
3
Поставленная задача решается тем, что в способ получения препарата, включающий получение культуральной жидкости Bacillus subtilis 3, добавление цеолита, согласно изобретению в качестве питательной среды используют гидролизат плацентарный эмбрионально-маточный тканей и органов животных (ГПЭМ), содержащий 90 мг % аминного азота, полученный из белоксодержащих отходов мясокомбинатов, - плаценты, эмбрионов и матки убойных животных, в качестве адсорбента токсических веществ - суспензиеобразующую монтмориллонитовую фракцию цеолита, а в качестве источника незаменимых аминокислот - гидролизат лактоальбумина (ГЛА), полученного из отходов молококомбинатов ферментативным путем, которые смешивают в соотношениях 1:1:0,5 соответственно, определяют количество сухого вещества в суспензии, стерилизуют, затем разливают во флаконы емкостью 100 или 200 см, герметично закрывают и хранят в холодильнике при температуре 4-6°С. Кроме того, цеолит предварительно подвергают обработке соляной кислотой с последующим удалением растворимых солей и кварца дистиллированной водой, а из оставшихся частиц цеолита отмучивают частицы монтмориллонита величиной 0,0006-0,0009 мм, полученную фракцию высушивают. При этом полученный радиозащитный препарат вводят облученным животным однократно подкожно в дозах 7-10 см(мелким) и 15-20 см (крупным) из расчета 6,5-7,5 мг сухого вещества на 1 кг живой массы в первые 10 суток после облучения.
Существенным отличием способа получения и применения пробиотического препарата для лечения радиационных поражений организма животных является то, что вместо дорогостоящей питательной среды для культивирования продуцента пробиотиков Bacillus subtilis 3 используют более дешевую и общедоступную, но более полноценную питательную среду - гидролизат плацентарный эмбрионально-маточный (ГПЭМ), обеспечивающий максимальный направленный биосинтез пробиотических факторов штамма - продуцента, т.е. эта среда позволяет повысить скорость и количество образования пробиотических факторов за счет повышения концентрации биомассы в культивируемой среде и конкурентного ингибирования лимитирующих рост и биосинтез продуктов метаболизма штамма - продуцента. Использование гидролизата лактоальбумина вместо гидролизата соевой муки в предлагаемом способе обеспечивает максимальные благоприятные условия для бесконкурентного роста микрофлоры и восстановления нормального микробного пейзажа облученного организма.
Гидролизат плацентарный эмбрионально-маточный (ГПЭМ), используемый в качестве питательной среды для культивирования Вас. subtilis, получают из белоксодержащих отходов мясо-молочной промышленности согласно разработанной сотрудниками ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (Казань) технологии (см. Новые бактериологические питательные среды для культивирования микроорганизмов: Методические рекомендации. - Казань, 1981; ст. С.Х.Хаертынова и др. «Бактериальные питательные среды из гидролизатов белоксодержащих отходов мясокомбинатов. - Ж-л «Ветеринария», 1991, №4, с.63-65). В качестве белоксодержащих отходов используют органы и ткани: плаценту, эмбрионы, матку лошадей, коров, овец и свиней, вместе взятые, количество которых в течение года только на одном (Казанском) мясокомбинате составляет не менее 100 т. Отходы измельчают по Хоттингеру при 45°С в течение 4-5 дней, затем проводят ферментативный гидролиз с помощью трипсина согласно общепринятой в микробиологии методике (см. кн. Дж. Мейнелл, Э.Мейнелл. Экспериментальная микробиология. - М.: Мир, 1967, с.59-61). Полученный по вышеописанной технологии препарат, названный «Гидролизат плацентарный эмбрионально-маточный (ГПЭМ)», по общему и аминному азоту, аминокислотному составу и содержанию липидов практически не отличается от МПБ, однако среда из ГПЭМ обеспечивает более активный рост бактерий, сохраняя генетическую стабильность микробной популяции, культивированной на среде из ГПЭМ. Существенным преимуществом использования ГПЭМ является то, что при этом ценнейший и дорогой пищевой продукт - говяжье мясо можно заменить непищевыми белоксодержащими отходами мясокомбинатов.
Гидролизат лактоальбулина (ГЛА) коммерческий, используемый в способе получения и применения пробиотического препарата для лечения радиационных поражений организма животных, в качестве активатора кишечной нормофлоры и источника незаменимых аминокислот для обеспечения питательной потребности бифидо-, лактобактерий и клеток облученного макроорганизма, в отличие от предлагаемого (гидролизата соевой муки), согласно данным производителей питательной среды (фирмы «Ferak Berlin», «Serva», Германия; ТОО «Армед», Санкт-Петербург, ООО «Спектроскопия», Казань) содержит все незаменимые аминокислоты, %: валин (5,68), лейцин (7,05), изолейцин (4,16), треонин (5,87), лизин (1,12), триптофан - 1,18, фенилоланин (0,2), метионин (1,4), аминый азот (52,3), натрий (0,098), фосфаты (0,31). В отличие от предлагаемого известный (гидролизат соевой муки) содержит только 2 незаменимые аминокислоты: лизин (0,2%) и метионин (0,096%), что в 56 и 146 раз меньше соответственно, чем в гидролизате лактоальбулина (см. Справочник: Кормление с.-х. животных. - М.: Росагропромиздат, 1988, с.363, приложение 6).
Отечественная промышленность изготавливает для медицины коммерческий ферментативный гидролизат лактоглобулина, содержащий полноценный набор аминокислот согласно требованиям фармакопийной статьи ФС 42-630-72. Технология изготовления препарата, общепринятая в микробиологии, - это ферментативный гидролиз белков молока (альбумина, казеина) с использованием пепсина, панкреатина, трипсина или папаина (см. кн. Дж. Мейнелл, Э.Мейнелл. Экспериментальная микробиология. - М.: Мир, 1967, С.59-61).
2
2
В качестве антитоксического адсорбента и антиоксиданта, обеспечивающего связывание и выведение низкомолекулярных токсинов (хиноидного и липидного радиотоксинов), супероксидных радикалов (Н, ОН, НО и т.д.), тяжелых металлов и радионуклидов, в предлагаемом способе применяют высокоактивную, очищенную от кварца и растворимых солей, легкую фракцию цеолита, которая в смеси образует не выпадающую в осадок стабильную суспензию микрочастиц цеолита - адсорбента, обеспечивающего постепенное высвобождение иммобилизованных на нем компонентов биологически активной добавки (БАД), что позволяет длительное время (до 10 сут) поддерживать уровень активности препарата, являясь дополнительным источником микроэлементов, оказывающих, в совокупности с витаминами, ферментами и другими биологически активными компонентами культуральной жидкости, антиоксидантный радиозащитный эффект.
Способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных и способ лечения осуществляются следующим образом.
3
3
На первом этапе в стерильные стеклянные колбы емкостью 1 (3,5) л наливают 666,6 см дистиллированной воды (например, при приготовлении 1 л питательной среды), в которую вносят 333,4 смосновного раствора гидролизата плацентарного эмбрионально-маточного (ГПЭМ), содержащего 90 мг % аминного азота, калия фосфорнокислого однозамещенного - 0,543 г, натрия фосфорнокислого двухзамещенного - 5,450 г и натрия хлористого - 5,450 г, рН доводят до 7,2-7,4, полученную среду подвергают стерилизации автоклавированием и используют для выращивания штамма - продуцента.
В приготовленную вышеописанным способом питательную среду засевают 7-суточную споровую агаровую культуру Bacillus subtilis 3 и термостатируют в течение 24 часов при температуре 37°С, затем после определения концентрации микробов среду культивирования подвергают центрифугированию при 5000 об/мин в течение 15 мин, полученный супернатант декантируют, в ней определяют сухое вещество, которое составляет в пределах 29-31 мг на 1 мл. Полученную культуральную жидкость в дальнейшем используют в качестве основного компонента в предлагаемом препарате.
Микробные клетки штамма-продукта пробнотических веществ - Bacillus subtilis 3 являются строгими аэробами, поэтому на жидких питательных средах растут в виде клеток. Микроскопически представляются в виде одиночных клеток стрептобацилл. Клетки подвижны, движения цепочек ундулирующего типа. На питательных средах легко спорулируют. Споры эллипсоидные или цилиндрические (0,6-0,9×1,0-1,5 мкм).
1
3
Вас.subtilis умеренно гидролизует желатин, крахмал, редуцирует нитраты, молоко не свертывает, в анаэробных условиях сбраживает углеводы. В процессе роста на жидких питательных средах Вас. subtilis вырабатывает антибактериальные субстанции (бактериоцины, лизоцим, каталаза). Наиболее высокой биологической активностью обладают продуцируемые микроорганизмом антибиотики бацитрацин - 10,-20, -30, субтилин, амилосубтилин, протосубтилин. Наиболее высокой антибактериальной активностью обладают А, В, С, D, Е, F-F из - бацитрацины. Бацитрацин А, содержащий 10 аминокислот (L-изолейцин, L-лейцин, D-фенилаланин, L-цистеин, L- и D-аспарагиновые кислоты, D-глутаминовую кислоту, L-гистидин, L-лизин и D-орнитин), губительно действует на аэробные и анаэробные грамположительные микроорганизмы (см. кн. Н.П.Блинов. Общие закономерности строения и развития микробов - продуцентов биологически активных веществ. - П.: Медицина, 1977, с.184-184).
Ферменты, вырабатываемые Вас. subtilis, представлены каталазой, амилазой, целлюлазой, липазой, лизоцимом, протеазой (см. статью Е.И.Ткаченко и др. Эрадикационная терапия, включающая пробиотики: консенсус эффективности и безопасности // Клиническое питание, 2005, №1, с.14-20; Методические рекомендации «Коррекция нарушений кишечного микробиоценоза пробиотиками на основе природного адсорбента». СПб., 2005, 11 с.; Рекламный проспект «Бактистатин»).
На втором этапе проводят активирование природного сорбента - цеолита путем выделения из него наиболее активной и высокосорбционной фракции. Для этого цеолит подвергают специальной обработке. Для разрушения карбонатов глину обрабатывают 1 н. соляной кислотой, а затем 0,1 н. Образовавшиеся растворимые соли и кварц удаляют путем отмывания дистиллированной водой. Для этого глину с помощью воды переносят в вегетационные стаканы (20×12 см). На каждый стакан наносят метки: первая - на высоте 3 см от дна, вторая - на 7 см выше, третья - на 7 см выше второй. Дистиллированную воду доливают до третьей метки, взмучивают в ней цеолит и оставляют на 12 ч для отстаивания. Когда твердая часть глины оседает, а над ней остается прозрачная жидкость, то последнюю удаляют сифоном и вновь наливают дистиллированной воды до верхней метки. Когда суспензия остается во взвешенном состоянии, приступают к отмучиванию частиц величиной 0,0006-0,0009 мм. Для этого в стакан наливают дистиллированную воду до верхней метки, содержимое перемешивают, через 24 ч погружают сифон на глубину 7 см и с его помощью суспензию переливают в стакан приемник. Отмучивание продолжают до просветления суспензии. В стаканы-приемники к каждой новой порции суспензии добавляют 3-4 капли концентрированной соляной кислоты для коагуляции и осаждения суспензии. Фракцию отмывают дистиллированной водой, а затем высушивают в водяной бане и используют в качестве сорбционного компонента в иммунопробиотическом препарате.
3
3
3
3
3
На следующем этапе приготавливают радиозащитную композицию на основе культуральной жидкости Bacillus subtilis, монтмориллонитовой фракции цеолита и гидролизата лактоальбумина. Для составления пробиотической композиции берут определенное количество (например, 100 см) культуральной жидкости Bacillus subtilis 3, содержащей 29-31 мг сухого вещества в 1 см препарата, в нее вносят порошок растворимой (суспензиеобразующей) фракции цеолита в количестве 29-31 мг на 1 см среды и порошок гидролизата лактоальбумина в количестве 14,5-15,5 мг на 1 см культуральной жидкости, смесь тщательно перемешивают, определяют в ней содержание биологически активных веществ (сухого вещества), которое колеблется в пределах 73,5-77,5 мг на 1 см среды, затем композицию подвергают стерилизации общепринятыми в микробиологии методами.
Для определения ареактогенности и безвредности полученного препарата последний в различных дозах (1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 и 10,0 мг/кг живой массы) перорально, внутримышечно, внутривенно и внутрибрюшинно, одно-, двух- и трехкратно с интервалом 30, 45, 60, 120 мин вводят белым мышам, используя по 6 животных на каждый вариант опыта, учитывая наличие или отсутствие адекватной или неадекватной реакции на препарат. Установлено, что использование препарата при всех вариантах опыта побочных реакций не вызывало: животные были активны, охотно принимали корм и воду, адекватно реагировали на естественные раздражители, что свидетельствует об ареактогенности препарата и переносимости ими использованного диапазона доз, путей и кратности введения.
Полученный по вышеописанному способу пробиотический комплекс на основе активной фракции цеолита, продуктов микробного метаболизма и гидролизата лактоальбумина используют в качестве радиозащитного (лечебного) средства на облученных в летальных дозах лабораторных и сельскохозяйственных животных.
Радиозащитное действие предлагаемого трехкомпонентного пробиотического препарата осуществляется путем иммуномодулирующего действия синтезируемых Bacillus subtilis биологически активных веществ (различных ферментов и коферментов, аминокислот, полипептидов, пробиотических компонентов), способствующих улучшению микроэкологических условий в кишечнике, оказывает бактериостатическое и бактерицидное действие по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, антиаллергическое действие, обеспечивает питательные потребности нормальной микрофлоры кишечника и клеток макроорганизма благодаря входящему в его состав гидролизату лактоальбумина, являющемуся источником аминокислот, оказывает антитоксическое действие за счет высокоактивной фракции цеолита, связывающего и выводящего низкомолекулярные токсины (метан, сероводород, аммиак), радиотоксины (супероксидные радикалы, эпоксиды, о-фенолы, о-хиноны, малоновый диальдегид, продукты липопероксидации липидов, белков и т.д.), тяжелые металлы и радионуклиды, нормализации процессов липопероксидации, пополнения резервов антиоксидантной системы и усиления антиоксидантной активности крови.
Способ получения препарата для лечения радиационных поражений организма животных и способ лечения радиационных поражений организма животных иллюстрируется следующими примерами.
9
9
Пример 1. Изучение возможности замены питательной среды для выращивания Bacillus subtilis в пробиотическом препарате. Для получения культуральной среды штамм-продуцент высевали на предлагаемую среду, приготовленную вышеописанным способом на основе гидролизата плацентарного эмбрионально-маточного (ГПЭМ), и на обычную (мясо-пептонный бульон - МПБ), посевы с тест-микробом термостатировали в течение 24 ч при температуре 37°С, по истечении указанной экспозиции в культуральных средах определяли концентрацию микробных клеток. Установлено, что концентрация микробов в культуральной среде с ГПЭМ составляла в пределах 2,3·10±0,35 м.к./мл, в то время как при использовании известной питательной среды (МПБ) концентрация их не превышала 1,1·10±0,41м.к./мл клеток. Поскольку количество синтезируемых пробиотических факторов (ферментов, витаминов, антибиотиков и т.д.) прямо пропорционально концентрации микробных клеток в культуральной среде (см. кн. С. Дж. Перт. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. - М.: Мир, 1978, с.299), справедливо было допустить, что пробиотический препарат, изготовленный на основе культуральной жидкости, полученной путем выращивания штамма-продуцента на предлагаемой питательной среде (ГПЭМ), должен был обладать более высокой радиозащитной эффективностью.
Для проверки справедливости такого допущения готовили два варианта пробиотичного препарата на основе культуральной жидкости, полученной путем выращивания штамма-продуцента (Вас. subtilis) на известной (МПБ) и предлагаемой (ГПЭМ) питательных средах с сохранением состава остальных компонентов. Полученные варианты пробиотиков использовали на радиозащитную активность на облученных в летальной дозе (7,7 Гр) 30 белых мышах, разделенных на 3 группы по 10 животных в каждой. Животные 1-й группы через 24 ч после облучения перорально получали пробиотик, приготовленный по известному способу, 2-й группы - по предлагаемому и 3-й - препараты не получали (контроль облучения). Установлено, что выживаемость в 1-й группе составляла 20%, 2-й - 30% и 3-й - 0%. Следовательно, замена питательной среды МПБ в известном на предлагаемую (ГПЭМ) позволяет повышать радиозащитную эффективность препарата.
Пример 2. Изучение возможности замены соевой муки в известном на гидролизат лактоальбумина в предлагаемом пробиотике. Для этой цели готовили 3 варианта пробиотика: 1-й - с использованием известной технологии на основе культуральной жидкости Вас. subtilis, выделенной на среде МПБ, с добавлением соевой мукой и цеолита, 2-й - с использованием той же среды, с заменой соевой муки на гидролизат лактоальбумина и добавлением цеолита, 3-й - с использованием среды ГПЭМ, гидролизата лактоальбумина и цеолита. Полученные варианты пробиотиков использовали на радиозащитную готовность на облученных в летальной дозе (7,7 Гр) белых мышах, разделенных на 4 группы по 15 животных в каждой. Животные 1-й группы перорально получали пробиотик, приготовленный по известной технологии, 2-й группы - пробиотик, приготовленный по второму варианту с заменой соевой муки на гидролизат лактоальбумина, 3-й - пробиотик, приготовленный по третьему варианту с заменой МПБ на среду ГПЭМ; 4-я группа облученных животных не получала никакие препараты и служила контролем облучения. Установлено, что выживаемость в 1-й группе составила 26,6%, 2-й - 33,3%, в 3-й - 46,6% и в четвертой - 0%. Следовательно, замены известной среды МПБ на ГПЭМ и соевой муки на гидролизат лактоальбумина приводила к существенному увеличению радиозащитной активности пробиотика, которая составила 46,6% против 26,6% в известном.
Пример 3. Изучение возможности парентерального применения известного и предлагаемого пробиотика для радиозащиты организма.
Для этой цели проводили опыты на 75 облученных в дозе 7,7 Гр белых мышах, разделенных на 5 групп по 15 животных в каждой. Через 24 ч после облучения животные 1-й группы в течение 3 дней перорально получали известный препарат в дозе по 1,0 мл на каждый прием; 2-й группы - в аналогичных условиях и дозах предлагаемый пробиотик, 3-й - известный пробиотик вводили подкожно по 0,33 мл трехкратно, 4-й - в аналогичных условиях и дозах - предлагаемый пробиотик также подкожно. Облученным животным 5-й группы препараты не вводили (контроль облучения).
Установлено, что выживаемость в 1-й группе составила 40%, 2-й - 30%, 3-й - 45%, 4-й - 40% и 5-й - 0%. При этом перед подкожным введением раствора препаратов было отмечено, что цеолит, содержащийся в пробиотике, несмотря на тщательное перемешивание перед инъекцией выпадает в осадок, а на месте инъекции у животных образовывался нерассасывающийся горошек, состоящий из цеолита. Это свидетельствует о нецелесообразности и невозможности парентерального применения препарата, а при пероральном применении его радиозащитный эффект был неудовлетворительным (до 30% защиты).
Пример 4. Испытание радиозащитной эффективности пробиотического препарата на основе суспензиеобразующей фракции цеолита. Для этой цели предварительно цеолит подвергали специальной обработке соляной кислотой с последующим удалением дистиллированной водой растворимых солей кварца.
Из оставшихся после химической обработки цеолит подвергали селективному фракционированию с последующим отмучиванием микрочастиц величиной 0,0006-0,0009 мм. Выделенную легкую фракцию цеолита высушивали и использовали в качестве адсорбирующего компонента в предлагаемом пробиотике. Перед использованием полученной легкой фракции цеолита проверяли его суспензиеобразующую способность путем суспендирования на жидких средах (воде, сыворотке, лимфе, экстрактах). Установлено, что используемая фракция цеолита, в отличие от нативного, после суспендирования в жидкой фазе длительное время не выпадала в осадок, т.е. обладала суспензиеобразующей способностью.
С использованием полученной фракции цеолита был приготовлен предлагаемый вариант пробиотика на основе культуральной жидкости Вас.subtilis на среде ГПЭМ и гидролизата лактоальбумина с последующей оценкой радиозащитной активности препарата.
Для оценки радиозащитной активности препарата опыты ставили на облученных в дозе 7,7 Гр белых мышах, разделенных на 3 группы (1-я, 2-я - опытные, 3-я - контроль облучения). Животным 1-й группы через 24 часа после облучения трехкратно (ежедневно в течение 3 дней) перорально (через зонд) вводили по 1 мл раствора препарата, 2-й группе - подкожно, одно-, двух- и трехкратно по 0,33 раствора препарата, 3-я группа препарат не получала и служила контролем облучения.
Установлено, что трехкратное пероральное введение препарата и однократное подкожное введение раствора испытуемого препарата оказывали идентичное радиозащитное действие, обеспечивая 60%-ную защиту животных от радиационной гибели. Увеличение кратности подкожного (2-3-кратно) введения раствора препарата не приводило к увеличению радиозащитного эффекта, уменьшение кратности перорального введения приводило к снижению радиозащитного эффекта. Таким образом, замена нативного цеолита на суспензиеобразующую фракцию его приводила к значительному усилению радиозащитного эффекта (на 20% по сравнению с известным). При этом отмечено, что подкожное введение препарата имело преимущество перед пероральным, поскольку при этом расход препарата сокращался в 3 раза и высокий радиозащитный эффект достигался при однократном введении препарата, что гораздо более технологично, удобно, легко и точно дозируемо по сравнению с пероральным применением пробиотика.
Пример 5. Определение оптимального соотношения компонентов в предлагаемом препарате. Перед постановкой опытов получали варианты препарата, содержащие различные соотношения компонентов: 1:1:1; 0,5:0,5:0,5; 1:0,5:0,5; 1:1:0,5; 1:0,5:1 сухого вещества культуральной жидкости Bacillus subtilis на основе среды ГПЭМ, легкой (растворимой, суспензиеобразующей) фракции цеолита и гидролизата лактоальбумина соответственно. Полученные варианты препарата испытывали на 60 облученных в
100
ЛД белых мышах, разделенных на 6 групп по 10 животных соответственно. Животные 1-й группы через 24 ч после облучения получали подкожно однократно препарат с соотношением вышеуказанных компонентов 1:1:1; 2-й - 0,5:0,5:0,5; 3-й - 1:0,5:0,5; 4-й - 1:1:0,5; 5-й - 1:0,5:1. Шестая группа животных препараты не получала и служила контролем облучения. Установлено, что выживаемость животных в 1-й, 2-й, 3-й и 5-й группах составляла 50-60%, в 4-й - 80% при 100%-ной гибели животных в 6-й группе.
Пример 6. Определение оптимальной лечебной дозы радиозащитного действия препарата при парентеральном (подкожном) введении.
Для определения оптимальной лечебной дозы готовили различные концентрации препарата по содержанию биологически активных веществ (БАВ), т.е. по содержанию сухого вещества в нем. Для этого препарат подвергали лиофилизации и полученный сухой осадок растворяли в стерильной кипяченой воде в концентрациях 100,0; 50,0; 25,0; 12,5; 6,25; 3,12; 1,3; 1,25; 1,12; 0,6 мг/мл. Перечисленные концентрации препарата подкожно однократно вводили облученным в летальной дозе (7,7 Гр) 120 белым мышам (по 12 животных на каждую концентрацию препарата) в количестве по 0,1 мл на животное.
Установлено, что при подкожном введении препарата в концентрациях 100,0-50,0 мг/мл выживаемость животных составляла 80%. При введении животным менее концентрированных растворов наблюдалось постепенное снижение радиозащитной активности препарата с 60 до 15% соответственно. Следовательно, оптимальной лечебной дозой препарата является содержание активно действующих веществ в концентрациях от 5,0 до 10,0 мг/кг живой массы, что в среднем составляет 7,5 мг/кг животного.
Пример 7. Определение длительности радиозащитного действия препарата.
100
Для определения длительности (продолжительности) радиозащитного действия препарата опыты проводили на 100 облученных в дозе ЛД (7,7 Гр) белых мышах, разделенных на 10 групп по 10 животных в каждой. Животным соответствующих групп через 1 (1-я), 2 (2-я), 3 (3-я), 4 (4-я), 5 (5-я), 6 (6-я), 7 (7-я), 8 (8-я), 9 (9-я) и 10 сут (10-я) однократно подкожно вводили препарат в оптимальной лечебной дозе (по 0,1 мл, 7,0 мг/кг живой массы) и в течение 30 сут вели наблюдение, регистрируя павших и выживших животных. Установлено, что в первых 8 группах за весь период наблюдения гибели мышей не наблюдалось, только лишь в 9-й и 10-й группах пали по 1 животному. Следовательно, после однократного подкожного введения препарата облученным животным радиозащитный эффект сохраняется в течение 8-10 сут, составляя 90-100% защиты животных от радиационной гибели.
Сравнительная характеристика способов получения и применения радиозащитных препаратов представлена в таблице. Как видно из ее данных, предлагаемый способ позволяет значительно повысить радиозащитный эффект известного за счет замены основных компонентов пробиотика на более экономичные, доступные и биологически активные компоненты и сократить сроки лечения более чем в 40 раз.
ТаблицаСравнительная характеристика способов приготовления и применения радиозащитных пробиотических препаратов
Отличительные особенности получения и применения пробиотиков
Известный
Предлагаемый
Среда для выращива-ния Вас. subtilis
Выход биомассы(м.к./мл)
Адсорбент токсикантов
Активатор пробиотичес-ких факторов
Среда для выращивания Вас. subtilis
Выход биомассы(м.к./мл)
Адсорбент токсикантов
Активатор пробиотических факторов
Мясо-пептонный бульон
1,1×10<sup>9</sup>
Неактивный цеолит
Гидролизат соевой муки
Гидролизат плацентарно-эмбрионально-маточный
2,1×10<sup>9</sup>
Фракция цеолита размером 0,0006-0,0009
Гидролизат лактоальбумина
Радиозащитный эффект (% защиты)
30-40
75-80
Таким образом, полученный радиозащитный препарат позволяет увеличить эффективность защиты от радиационных поражений в 2 раза и сократить сроки лечения радиационных поражений более чем в 40 раз.