История разработки и использования метода смешанной культуры лимфоцитов — MLC и его HLA-генотипическая значимость при подборе геноидентичного донора для трансплантации костного мозга (45 лет применения метода в мире)

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

© А.П. ШПАКОВА, ТИ. БУЛЫЧЕВА, 2012 УДК 612.6.02.017.1:616.419-089.843

ИСТОРИЯ РАЗРАБОТКИ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДА СМЕШАННОЙ КУЛЬТУРЫ ЛИМФОЦИТОВ — MLC И ЕГО HLA-ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ значимость ПРИ ПОДБОРЕ ГЕНОИДЕНТИЧНОГО ДОНОРА ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА

А.П. Шпакова, Т.И. Булычева

ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, Москва

Резюме. В обзоре представлена история разработки метода смешанной культуры лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Culture — MLC) и описано его использование с целью определения гистосовместимости донора и реципиента по области HLA-D при трансплантации костного мозга больным. Показана зависимость пролиферативного ответа в реакции MLC от наборов аллелей и генов HLA класса II донора-сибса и реципиента, показана информативность реакции MLC и определено ее место в сочетании с HLA-генотипированием в полимеразной цепной реакции при подборе HLA-геноидентичных с реципиентом доноров-сибсов для трансплантации костного мозга.

Ключевые слова: трансплантация костного мозга, подбор HLA-геноидентичного донора-сибса, реакция смешанной культуры лимфоцитов — реакция MLC, пролиферативный ответ в реакции MLC, сочетание с HLA-генотипированием в полимеразной цепной реакции

HISTORY OF DEVELOPMENT AND USE OF MIXED LYMPHOCYTE CULTURE METHOD AND ITS HLA GENOTYPICAL SIGNIFICANCE FOR SEARCH OF HLA IDENTICAL DONOR FOR BONE MARROW TRANSPLANTATION: 45 YEARS OF THE METHOD APPLICATION IN THE WORLD

A.P. Shpakova, T.I. Bulycheva

Hematology Research Center, Moscow

Summa r y. This review presents the history of development of mixed lymphocyte culture (MLC) method and its use for evaluation of the donor-recipient HLA-D histocompatibility before bone marrow transplantation. The relationship between the proliferative response in MLC reaction and donor sibling and recipient's HLA class II alleles and genes is shown. The informative value of MLC reaction is demonstrated and its important role (in addition with HLA genotyping in polymerase chain reaction) in search of HLA genoidentical donor siblings for bone marrow transplantation is defined.

Key words: bone marrow transplantation, search of HLA genoidentical donor sibling, mixed lymphocyte culture (MLC) reaction, MLC reaction proliferative response, HLA PCR genotyping

Трансплантация аллогенного костного мозга (алло-ТКМ) и гемопоэтических стволовых клеток в настоящее время все шире используется для лечения гемобластозов, являясь единственным методом лечения, позволяющим больным после ее применения многие годы жить без химиотерапии [1].

Для того чтобы трансплантация костного мозга (ТКМ) проходила успешно, т. е. во избежание главных ее осложнений — реакции "трансплантат против хозяина" (РТПХ) или отторжения трансплантата, алло-ТКМ требует наличия HLA-совместимых доноров, наилучшим из которых является HLA-геноидентичный сибс больного.

Следует напомнить, что все потенциальные доноры— сибсы пациента подразделяются на три категории, различающихся с ним по степени геноидентичности по большому комплексу гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex — MHC), более известному под его первоначальным названием: система HLA (Human Leucocyte Antigens — человеческие лейкоцитарные антигены). Гены системы HLA располагаются на коротком плече хромосомы С6. Возможность формирования трех категорий сибсов обусловлена тем, что родительские гаметы — сперматозоиды и яйцеклетки — являются гаплоидными, т.е. содержат половинный набор хромосом. Они образуются из зачатковых диплоидных клеток, которые содержат двойной набор хромо-

Для корреспонденции:

Шпакова Анна Петровна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник, лаборатория иммунологической гематологии ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России. Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, д. 4а.

Телефон: +7 (495) 612-28-12 E-mail: annaschp@yandex.ru

сом, в том числе две гомологичные хромосомы С6, поэтому в процессе мейоза будет формироваться два типа сперма-тазоидов и два типа яйцеклеток. Половина сперматозоидов будет содержать хромосому С6 типа а, другая их половина — гомологичную хромосому С6 типа в; половина яйцеклеток будет содержать хромосому С6 типа с, другая их половина — хромосому С6 типа d. HLA-геноидентичный сибс получает от отца и матери хромосомы С6 одного типа с пациентом (а и с), т.е. имеет с ним общность по обеим родительским хромосомам С6. HLA-гаплоидентичный сибс получает от отца хромосому С6 одного типа с пациентом (а), а от матери — хромосому С6 другого типа (d), чем у пациента (с), и имеет с ним общность только по одной родительской хромосоме С6. HLA-генонеидентичный сибс получает и от отца, и от матери хромосомы С6 (в и d), отличные от хромосом С6 пациента (а и с), и не имеет с ним общности по хромосомам С6. Подходящими в качестве доноров костного мозга являются HLA-геноидентичные сибсы. Согласно закону наследования Менделя, HLA-геноидентичные (диплоидентичные) сибсы встречаются лишь в 25% случаев; в 50% случаев встречаются гаплоидентичные сибсы и в 25% — неидентичные сибсы [2].

Первый антиген HLA был открыт методом серологического типирования в реакции лейкоагглютинации французским ученым Жаном Доссэ в 1956 г. [3] и назван им "Мак". Вскоре были открыты и другие антигены HLA уже с помощью лимфоцитотоксического теста, который с тех пор стал применяться для этой цели. Серологически выявляемым антигенам HLA соответствуют гены HLA, которые локализуются на коротком плече хромосоме С6 в виде трех структурных единиц — локусов HLA-A, HLA-B, HLA-С.

9

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

Феномен смешанной культуры лимфоцитов (Mixed Lymphocyte Culture — MLC) был открыт и впервые описан в 1961 г R. Schrek и W. Donelly [4]; сущность его заключалась в том, что лимфоциты периферической крови от двух людей культивировали совместно в питательной среде в течение 5—6 сут, в результате чего развивался двунаправленный пролиферативный ответ лимфоцитов обоих участников реакции. В 1966 г. F. Bach и N. Voynow [5] разработали однонаправленный вариант реакции MLC, в котором способность лимфоцитов к синтезу ДНК и пролиферации одного из двух участников реакции стало возможным блокировать, и таким образом получать в чистом виде пролиферативный ответ лимфоцитов другого участника реакции. В 1970 г. D. Amos [6] выдвинул гипотезу о существовании самостоятельного локуса HLA, продукты которого ответственны за индукцию реакции смешанной культуры лимфоцитов, а в 1971 г. им же в соавторстве с E. Yunis (цит. по [7]) уже было доказано существование локуса HLA-D, выявляемого в реакции MLC in vitro по наличию пролиферативного ответа лимфоцитов и имеющего основное значение для успешной трансплантации костного мозга. Позднее было показано, что антигены локусов HLA-A, HLA-B, HLA-С, выявляемые серологически в лимфоцитотоксическом тесте, состоят из одной длинной цепи гликопротеидов, укрепленной в мембране клетки, и одной короткой цепи (эти антигены стали называть анигенами HLA класса I, антигены же локуса HLA-D, выявляемые по величине пролиферативного ответа лимфоцитов в реакции MLC, структурно представлены двумя длинными цепями гликопротеидов, укрепленными в мембране клетки (их стали называть анигенами HLA класса II) [8].

В 1970-х годах с целью иммунологического HLA-типи-рования в мире началось широкое использование микролимфоцитотоксического теста на 60-луночных планшетах, разработанного в 1967—1970 гг. Полем Терасаки, для подбора HLA-идентичного донора при ТКМ. Наряду с серологическим типированием локусов HLA-A и HLA-B одновременно стали определять совместимость донора и реципиента по локусу HLA-D, используя реакцию MLC [9], которая по существу представляла собой моделирование in vitro иммунологического взаимодействия лимфоцитов донора и реципиента, и ее можно было рассматривать как биологическую пробу на их совместимость по локусу HLA-D перед ТКМ. При несовместимости пары донор — реципиент по локусу HLA-D пролиферативный ответ в реакции MLC лимфоцитов донора на стимуляцию лимфоцитами реципиента отражал риск развития РТПХ; пролиферативный ответ лимфоцитов реципиента на стимуляцию лимфоцитами донора отражал риск отторжения или неприживления трансплантата.

Первые работы по поиску донора для ТКМ, выполненные с учетом его селекции по антигенам HLA-D на основании данных его MLC-совместимости с реципиентом, позволили сделать заключение о высокой степени корреляции между совместимостью по локусу HLA-D и приживляемостью трансплантата [3]. Вскоре было окончательно установлено, что решающее значение для успешной ТКМ имеет именно совместимость по локусу HLA-D.

В начальном периоде развития науки об антигенах HLA реакция MLC была использована в близнецовом методе. Донора и реципиента типировали с помощью HLA-D-гомо-зиготных типирующих клеток, полученных от однояйцовых близнецов. Это позволило в 1972—1974 гг. открыть существование в генетическом локусе HLA-D 12 специфичностей Dw (Dw1, Dw2, Dw3 т. д.) [10]. Типируемые клетки стимулировали в реакции MLC различными типирующими клетками с известным фенотипом, но гомозиготными по локусу HLA-D. Если типируемые клетки имели фенотип HLA-D, идентичный таковому типирующих клеток, пролиферативный ответ в реакции MLC не развивался. Самая большая коллекция HLA-D-гомозиготных типирующих

клеток (Homozygous Typing Cells — HTC), полученных от однояйцовых близнецов и от детей, имеющих общность по обеим гомологичным хромосомам С6, была создана в Уни -верситете в г. Лейден в Голландии и включила 22 образца типирующих гомозиготных клеток [11]. Основываясь на свойствах антигенов, входящих в локус Dw, индуцировать образование бластов из аллогенных лимфоцитов в однонаправленной смешанной культуре — MLC, V Eijsvoogel и со-авт. [12] в 1972 г. картировали гены HLA-D в HLA-регионе хромосомы С6. В 1980 г. на VIII Международном рабочем совещании по тканевому типированию в Лос-Анджелес метод MLC был унифицирован уже как микрометод на 96-луночных планшетах с радиометрической оценкой результатов по включению в ДНК пролиферирующих клеток радиоактивного 3Н-тимидина и предложен в качестве метода типирования людей по антигенам HLA-D [13]. Было показано, что наиболее успешное приживление трансплантата костного мозга происходит от донора-сибса, имеющего с реципиентом два общих родительских HLA-гаплотипа вследствие общности с ним по двум гомологичным хромосомам С6 [8]. Это достигалось с помощью типирования донора и реципиента как по HLA класса I, так и по HLA класса II. Необходимость типирования сибсов по двум классам HLA обусловлена возможностью того, что при созревании родительских гамет иногда на уровне между HLA класса I и класса II происходит кроссинговер с образованием рекомбинантной хромосомы С6.

С 1981 г. реакцию MLC стали использовать в Гематологическом научном центре (ГНЦ) в лаборатории, руководимой профессором Е. А. Зотиковым, для определения совместимости по области HLA-D между идентичными по HLA-A, HLA-B и HLA-C донорами-сибсами и реципиентом при родственной аллогенной ТКМ у больных гемобластозами.

Позже было установлено, что так называемый локус HLA-Dw на самом деле представляет собой целую область HLA-D, состоящую из нескольких входящих в нее локусов: HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP.

Вскоре оказалось, что локусы HLA-DR и HLA-DQ можно выявлять не только с помощью реакции MLC, но и серологически, используя В-лимфоциты периферической крови человека. В то же время локус HLA-DP серологически выявить не удавалось — различия по локусу HLA-DP можно было выявить только в реакции MLC. Были предприняты попытки определять идентичность донора и реципиента по области HLA-D с помощью одного только серологического типирования локуса HLA-DR и таким образом заменить культуральную реакцию MLC более простым методом серологического типирования. В процессе накопления данных оказалось, что в значительном проценте случаев наблюдается несоответствие результатов серологического типирования локуса HLA-DR с наличием или отсутствием пролиферативного ответа в реакции MLC. Таким образом, серологическое типирование локуса HLA-DR не смогло заменить реакцию MLC, но наряду с реакцией MLC было включено в подбор HLA идентичного донора для ТКМ.

Пик использования реакции MLC во всех странах мира для определения совместимости донора и реципиента по области HLA-D приходится на 1990-е годы. В этот период во всех мировых центрах определение HLA-совместимости донора и реципиента перед алло-ТКМ проводится путем серологического типирования локусов HLA-A, HLA-B, HLA-DR и постановки реакции MLC, которая была признана "финальным арбитром совместимости" [14—16]. В 1996 г M. Bishop и соавт. [17] опубликовали данные о попытках использования реакции MLC для определения совместимости донора и реципиента по региону HLA-D при трансплантации — га-плоидентичного костного мозга.

Открытие в 1990-е годы метода молекулярно-генетического ДНК-типирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) на основе сиквенс-специфических

10

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

праймеров (ПЦР-SSP, ПЦР-SSOP) позволило картировать генетическую область HLA-D и показать, что она состоит из множества полиморфных, тесно связанных между собой, генетически трансплантационно значимых HLA-сублокусов, расположенных на коротком плече хромосомы С6. Методом ДНК-типирования было установлено, что гены HLA, имеющие 2-цифровое обозначение, определенное при серологическом HLA-типировании соответствующих антигенов, у разных людей существуют в виде различных вариантов — аллелей, имеющих 4-цифровое обозначение (HLA является полиаллельной системой). В настоящее время известно [18], что локус HLA-DR состоит из неполиморфного сублокуса DRA1, включающего 3 специфичности, и из нескольких полиморфных сублокусов DRB: DRB1 (463 специфичности), DRB3, DRB4 и DRB5 (локусы с DRB2 по DRB9 включают 82 специфичности); локус DQ включает сублокусы DQA1 (34 специфичности) и DQB1 (78 специфичностей) и локус DP состоит из сублокусов DPA1 (23 специфичности) и DPB1 (125 специфичностей).

Широкое использование HLA-генотипирования в ПЦР привело к решению о замене серологического типирования антигенов HLA-DR и HLA-DQ на поверхности лимфоцитов на более точный метод HLA-генотипирования по локусам HLA-DRE1 и HLA-DQВ1, которое было принято на совещаниях в Германии в Университе в г Гейдельберг 1993 г. [19], а затем в г. Эссен в 1996 г. [20]. На совещании по ТКМ в г. Эcceн для типирования близкородственных доноров-сиб-сов было признано достаточным как минимум серологическое типирование HLA-A, HLA-B и генотипирование DRE1 по низкому разрешению; для типирования неродственных доноров было признано необходимым серологическое ти-пирование HLA-A, HLA-B и генотипирование HLA-DRE1, HLA-DQВ1 по высокому разрешению. Определение совместимости донора и реципиента в реакции MLC было рекомендовано использовать факультативно, в качестве дополнительного теста. С открытием метода ПЦР-генотипирования вновь появилась надежда, что генотипирование HLA-DRE1, HLA-DQВ1, более точное, чем серологическое типирование антигенов, сможет заменить реакцию MLC. Вместе с тем, поскольку реакция MLC отражала совместимость донора и реципиента не по двум локусам, а по всей области HLA-D, многие лаборатории в разных странах мира продолжали включать ее в алгоритм подбора HLA-идентичного донора. В 2005 г. была опубликована работа об использовании реакции MLC в алгоритме поиска HLA-идентичного донора-сибса для ТКМ [21]. Этот алгоритм включал три этапа: 1) серологическое HLA-типирование и генотипирование низкого разрешения (или высокого разрешения, если это необходимо) HLA класса I (А, В); генотипирование HLA класса II (DRB1, DQB1) высокого разрешения; 2) подтверждающее HLA-типирование донора; 3) реакция MLC.

Публикации, в которых отражен опыт наших собственных исследований по разработке постановки реакции MLC и ее использованию с целью нахождения HLA-идентичного донора-сибса для проведения ТКМ в ГНЦ, а также те работы, в которых приведены данные сопоставления результатов реакции MLC с результатами проводимого нами с 2000 г. параллельно ПЦР-генотипирования, вышли из печати в 1992 г. [22], 1993 г. [23], 2000 г. [24], 2003 г. [25], 2005 г. [26], 2006 г. [27], 2007 г. [28], 2008 г. [29], 2009 г. [30], 2010 г. [31], 2011 г. [32].

Мы разработали и в 1993 г. опубликовали оптимальный протокол постановки реакции MLC для определения совместимости пары донор—реципиент при ТКМ, который включал 2 варианта тестовых смешанных культур лимфоцитов и 19 вариантов контрольных смешанных культур, в том числе стимуляцию лимфоцитов фитогемагглютинином [23]. Позднее протокол был нами дополнен. Окончательный протокол реакции MLC включил 3 варианта тестовых культур и 20 вариантов контрольных культур [26].

Для удобства оценки совместимости пар в реакции MLC мы разработали и опубликовали [23] графическое изображение результатов реакции MLC, которое в виде столбиков наглядно отображает многочисленные цифровые данные пролиферативных ответов лимфоцитов во всех вариантах смешанных культур. С этого времени реакцию MLC для каждой пары донор-реципиент мы стали проводить в соответствии с разработанным протоколом, графически представляя ее результаты.

Проведенные в 1989 г. T. Glay и соавт. [33] работы по сравнению эффективности двух методов — определения совместимости в реакции MLC и определения геноидентичности по DRE1 — показали, что некоторые идентичные по DRE1 с реципиентом доноры были несовместимы с ним в реакции MLC, но все совместимые в реакции MLC доноры были идентичны и по DRE1. Из 19 идентичных по HLA-DRE1, HLA-DQВ1 неродственных доноров 13 были совместимы с реципиентом в реакции MLC, а 6 оказались несовместимыми. Таким образом, показано, что часть пролиферативного ответа в MLC отражает неидентичность донора и реципиента по иному локусу, чем HLA-DRE1 и HLA-DQВ1. Этим локусом оказался локус HLA-DPB1.

Вскоре стали появляться работы, авторы которых исследовали зависимость наличия пролиферативного ответа в реакции MLC от неидентичности пары донор—реципиент по локусу DPB1. В 1990 г. O. Olernp и соавт. [34] на основании генотипирования, проведенного методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP — restriction fragment length polimorfism), указывают, что большая часть пролифративного ответа в реакции MLC отражает неидентичность донора и реципиента по локусу HLA-DRВ1, а меньшая составляющая часть пролиферативного ответа отражает их неидентичность по локусам DQ и DP У идентичных по локусу HLA-DRВ1, но неидентичных по локусам HLA-DRВ3, HLA-DQ и HLA-DP пар донор—реципиент невысокий уровень пролиферативного ответа в реакции MLC "демаскировал" неидентичность этих сибсов именно по этим локусам. Далее авторы провели исследование стимулирующей активности лимфоцитов в реакции MLC, зависящей изолированно от неидентичности пар донор—реципиент по локусу HLA-DPВ1. Оказалось, что из 82 пар неродственный донор—реципиент, идентичных по HLA-A, HLA-В, HLA-DR и HLA-DQ и неидентичных только по локусу DPВ1, пролиферативный ответ в реакции MLC развился у 80 пар (в 98% случаев), две DPВ 1-неидентичные пары оказались совместимы в реакции MLC. Таким образом, было показано, что неидентичность по HLA-DPВ1 не всегда проявляется пролиферативным ответом в реакции MLC, причина чего все еще оставалась неясной. В этой же работе было показано существование влияния кумулятивного эффекта неидентичености по двум генам локуса HLA-DP на развитие пролиферативного ответа в реакции MLC. Так, показатель пролиферативного относительного ответа (Relation Response — RR) был в 2 раза выше при неидентичности донора и реципиента по двум генам HLA-DP (RR = 60,5%), чем при неидентичности по одному гену HLA-DP (RR = 35,4%).

Одновременно A. Cesbron и соавт. [35] во Франции тоже показали существование кумулятивного эффекта несовместимости по двум генам локуса HLA-DP на развитие пролиферативного ответа в реакции MLC: неидентичность D и R по одному гену HLA-DP вызывала пролиферативный ответ в 21% случаев из всех HLA-идентичных по остальным локусам неродственных пар, тогда как неидентичность по двум генам HLA-DP вызвала ответ в 41% случаев. При этом очень важно отметить, что авторы никогда не наблюдали пролиферативный ответ в реакции MLC между HLA-DP-идентичными донором и реципиентом. Причину отсутствия пролиферативного ответа в реакции MLC у некоторых HLA-DP-неидентичных пар эти авторы объясняли тем, что донор и реципиент имели "допустимые аминокислотные вариации".

11

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

Отец

Мать

А

А

С

В

1  1  1  1

А

Реципиент

Донор

Рис. 1. Формирование ложной HLA-идентичности гаплоиден-тичного донора с реципиентом в результате гомозиготности гомологичных хромосом С6 матери по всем HLA класса I и по некоторым HLA класса II.

W. Bodmer и соавт. [36] подтвердили, что в реакции MLC раскрываются HLA-DP специфичности.

Таким образом, было показано, что в реакции MLC можно выявить генетическую HLA-неидентичность донора и реципиента по всем трансплантационно значимым локусам региона HLA-D. При этом большая составляющая часть пролиферативного ответа является выражением неидентичности донора и реципиента по локусу HLA-DR, а меньшая его часть — по локусам HLA-DQ и HLA-DРВ1.

Одновременно показано отрицательное влияние несовместимости реципиента и донора по локусам HLA-DQВ1 и HLA-DPB1 на результаты ТКМ. E. Petersdorf и соавт. [37] показали, что локус DQB1 является трансплантационно значимым и несовместимость по нему отрицательно влияет на исход ТКМ. Позже Е. Petersdorf и соавт. [38] приводят данные о том, что неидентичность неродственного донора и реципиента по локусу HLA-DPB1 увеличивала количество случаев развития РТПХ III и IV степени после ТКМ у больных с 27 до 44%. Об отрицательном влиянии несовместимости по локусу HLA-DPB1 и о кумулятивном эффекте влияния двух HLA-DPBl-несовместимостей реципиента и донора на исход ТКМ сообщили M. Fernandez-Vina и соавт. [39]: одна DPBl-несовместимость негативно влияла на результат ТКМ у больных, а две DPB1 несовместимости являлись причиной смерти больных вследствие развития РТПХ среди реципиентов, идентичных с неродственными донорами по 10/10 (2 А, 2В, 2С, 2 DPB1, 2 DQВ1) локусов HLA. G. Fischer и соавт. [40] привели данные о неблагоприятном влиянии на исход ТКМ неидентичности донора с реципиентом даже по одному аллелю локуса HLA-DPB1.

Появились работы, свидетельствующие о необходимости генотипировать по локусу DPB1 также и родственные

Малое плечо Большое плечо

> Г Центромера

f HLA ^Класса V hla ^Класса Пуу XX )

Малый

фрагмент

-V

Большой фрагмент рекомбинантной хромосомы С6

Рис. 2. Кроссинговер гомологичных хромосом С6.

пары донор-сибс — реципиент. M. Muro и соавт. [41] сообщают о необходимости типирования доноров-сибсов по локусу HLA-DPB1 и о корреляции DPB1-несовместимости с пролиферативным ответом в реакции MLC. Автор приходит к заключению о необходимости типирования доноров-сиб-сов по всем локусам HLA только по высокому разрешению во избежание ошибочного заключения о якобы имеющейся HLA-идентичности с реципиентом, которая на самом деле отсутствует. Такая ложная HLA-идентичность может быть определена при типировании частично по низкому разрешению и по ограниченному количеству локусов HLA у реципиентов, доноров и даже у их родителей. M. Fernandez-Vina и соавт. [42] также сообщают о необходимости типиро-вания доноров-сибсов для алло-ТКМ по локусу HLA-DPB1. Авторы проанализировали степень совместимости по локусу DPB1 доноров-сибсов для 137 пациентов, идентичных по локусам HLA-A, HLA-B, HLA-С, HLA-DRB1, HLA-DRB3/4/5 и HLA-DQB1, при генотипировании по промежуточному разрешению. Все пациенты и доноры-сибсы были дополнительно протипированы ими по локусу HLA-DPB1. Выявлено, что 6 (4,4%) из 137 доноров-сибсов оказались неидентичны с больными по локусу HLA-DPB1, что указывало на то, что эти доноры не являются HLA-генотипически идентичными сибсами. У этих 6 пар донор—реципиент было проведено генотипирование всех локусов по высокому разрешению, в результате чего выявлено, что у 2 пар помимо неидентичности по локусу HLA-DPB1, имелась еще неидентичность и по другим локусам HLA. Таким образом, частота определения ложной HLA-идентичности, выявленная с помощью типирования локуса DPB1, составила 4,4%. Авторы рекомендуют при поиске донора-сибса при ТКМ дополнительно к генотипированию локусов HLA-A, HLA-B, HLA-С, HLA-DRB1, HLA-DRB3/4/5 и HLA-DQB1 в качестве обязательного включить генотипирование еще и локус HLA-DPB1.

Таким образом, если при нахождении HLA-генотипически идентичного донора генотипирование по HLA классов I и II реципиента, донора и даже их родителей проводится частично по низкому разрешению, может быть ошибочно сделан вывод об HLA-идентичности сибсов, на самом деле таковыми не являющихся.

В ГНЦ подбор доноров для ТКМ с определением их совместимости с больными в реакции МЬС мы начали проводить с 1981 г. и за период до 2011 г. в реакции MLC исследовали совместимость более чем у 440 пациентов с их HLA-A, HLA-B, HLA-C-идентичными потенциальными донорами.

С 2001 г. было обследовано 213 пациентов. Всем пациентам и донорам-сибсам параллельно с реакцией MLC проводили ПЦР-HLA-генотипирование [26—32]. Подбор осуществляли с помощью ПЦР-MSSP (реактивы "ДНК-технология") локусов: DRB1 по низкому разрешению, DQB1 по высокому разрешению и определяли совместимость по региону HLA-D в целом (по HLA класса II) в реакции MLC по включению 3Н-тимидина в пролиферирующие в 6-суточной культуре лимфоциты. За отсутствие пролиферативного ответа принимали величину RR, равную или меньшую, чем 15%. При выявлении наличия HLA-геноидентичности сибсов, но при одновременном развитии пролиферативного ответа в реакции MLC всем имеющимся членам семьи (сибсам и их родителям) проводили генотипирование в ПЦР-SSP (реактивы "Protrans") по высокому разрешению — по локусу DRB1 и дополнительно по локусам DQA1 и DPB1.

HLA-гаплоидентичными с донорами и несовместимыми в реакции MLC оказались 11 из 213 пациентов (в двух семьях при этом был обнаружен кроссинговер), а 1 пациент оказался HLA-неидентичным с донором и несо-

12

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

вместимым с ним в реакции MLC. HLA-геноидентичными с донорами оказался 201 пациент, из которых 198 были совместимы (с донорами) в реакции MLC (пролиферативный ответ отсутствовал), а 3 — несовместимы с донорами в реакции MLC (пролиферативный ответ был). Следует заметить, что при нахождении HLA-геноидентичного донора, если генотипирование по HLA класса I и класса II реципиента, донора и даже у их родителей проведено по ограниченному количеству локусов или частично по низкому разрешению, может быть сделан ошибочный вывод об HLA-идентичности сибсов, на самом деле таковыми не являющихся. Так, в наших исследованиях в трех семьях (семьи Я., А. и Г) выявлению изначально определенной при ПЦР-генотипировании ложной HLA-идентичности 7 доноров-сибсов с 3 реципиентами помогло только развитие пролиферативного ответа в проведенной одновременно с генотипированием реакции MLC, что позволило во время установить истинную HLA-неидентичность доноров и реципиентов.

Как показали наши исследования, первой причиной определения ложной HLA-идентичности сибсов является гомозиготность одного из родителей или обоих родителей по некоторым генам HLA гомологичных хромосом С6, что ведет к тому, что у реципиента и донора выявляются идентичные гены типированных локусов, между тем как неидентичность генов других, нетипированных локусов так и остается невыявленной, что создает иллюзию HLA-идентичности на самом деле HLA-гаплоидентичного донора (рис. 1). Причиной определения ложной HLA-идентичности гаплоидентичного с пациентом донора в семье Я. оказалась гомозиготность генов на уровне аллелей трех локусов — HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1 — гомологичных хромосом С6 отца [28, 29]. И только наличие пролиферативного ответа в реакции MLC позволило избежать ошибки. Пролиферативный ответ был вызван неидентичностью сибсов всего по одному гену DPB1. В семье Г. при типировании по HLA класса II по низкому разрешению была изначально установлена HLA-геноидентичность четырех доноров-сибсов с реципиентом по HLA класса II. Было определено, что два донора — брат и сестра D1 и D2 — являются идентичными с реципиентом по локусам HLA-DRB1, HLA-DQB1 при типировании по низкому разрешению, однако при этом в реакции MLC наблюдался пролиферативный ответ: RR R vs D1 = 63,1%, D1 vs R = 22,3%; R vs D2 = 14,2%, D2 vs R = 28,6%, который, как оказалось, после проведения типирования по высокому разрешению и дополнительного типирования по локусу DPB1, был вызван различиями гаплоидентичных D1 и D2 от реципиента по одному аллелю DRB1 и одному гену DPB1 различающихся материнских хромосом. Наряду с этим было определено, что и два других донора — братья D3 и D4 — также идентичны с реципиентом по локусу HLA-DRB1 при типировании по низкому разрешению и по локусу DQB1 при типировании по высокому разрешению, однако в реакции MLC также наблюдался пролиферативный ответ: R vs D3 = 23,6%, D3 vs R = 17,4% ; R vs D4 = 9,5%, D4 vs R = 22,1%, который, как оказалось, был вызван отличиями HLA-неидентичных с реципиентом доноров D3 и D4 как по одному аллелю DRB1 и одному гену DPB1 различающихся с реципиентом материнских хромосом, так и по одному аллелю DQB1 различающихся с реципиентом отцовских хромосом. Причиной изначально установленной HLA-идентичности по HLA класса II на самом деле гаплоидентичных с реципиентом сибсов D1 и D2 оказалась гомозиготность указанных выше генов и аллелей HLA класса II гомологичных хромосом С6 матери сиб-сов. Причиной ложной HLA-идентичности по HLA класса II неидентичных с реципиентом сибсов D3 и D4 оказалась гомозиготность указанных выше генов и аллелей HLA класса II гомологичных хромосом С6 матери и одновременно гомозиготность гомологичных хромосом С6 отца сибсов, что особенно важно, так как свидетельствует о возможно-

Отец

Мать

I

А

С

В

DRB1

DQA1

DQB1

DPB1

Рекомбинантная хромосома С6

Рис. 3. Формирование ложной HLA-идентичности гаплоиден-тичного донора с реципиентом в результате кроссинговера и гомозиготности гомологичных хромосом С6 матери по некоторым HLA класса II.

сти существования множественной гомозиготности в одной семье обоих родителей, создающей повышенную опасность определения ложной HLA-идентичности сибсов.

Второй причиной определения ложной HLA-идентичности, является сочетание гомозиготности генов гомологичных хромосом С6 одного из родителей сибсов с кроссингове-ром, произошедшим у этого родителя [29—31]. В этой ситуации возникает особенно высокий риск определения ложной HLA-идентичности. В большинстве случаев гены HLA тесно связаны на хромосоме и наследуются от родителей единым блоком, гаплотипом, вместе с хромосомой С6 при получении ее целиком от кого-либо из родителей. В некоторых случаях при созревании родительских гамет образуются две рекомбинантные хромосомы С6 вследствие кроссинговера, который может произойти на различных уровнях между локусами HLA. Показано [43, 44], что кроссинговер чаще всего проходит на уровне между локусами HLA-B и HLA-DRB1 (рис. 2) с частотой 0,01—0,013 при около 1200 Kb (Kilobasis), несколько реже — между локусами HLA-DQB1 и HLA-DPB1 с частотой 0,008 при около 400 Kb; и еще реже рекомбинации встречаются между локусами HLA-DRB1 и HLA-DQB1 (менее 100 Kb в отдельности). M. Muro и соавт. [41], показали, что в двух семьях рекомбинации, возникшие в результате кроссинговера, послужили причиной изначально ложного заключения об HLA-идентичности неидентичных с больным доноров-сибсов для ТКМ. В наших исследованиях в семье А. наблюдалось сочетание гомозиготности у одного из родителей генов DRB1 и аллелей DQB1 гомологичных хромосом С6 с произошедшим у него кроссинговером на уровне HLA класса I и HLA класса II. В результате каждый из двух гаплоидентичных с реципиентом доноров-братьев оказался полностью идентичным с ним на уровне аллелей по HLA-A, HLA-B, HLA-C, т. е. по малому фрагменту его рекомбинантной хромосомы, включающему все HLA класса I, и в то же время идентичным с реципиентом также и по генам DRB1 и аллелям DQB1 (рис. 3). И только пролиферативный ответ в реакции MLC позволил выявить неидентичность двух доноров (D1, D2) с реципиентом по HLA класса II (рис. 4): по одному аллелю DRB1, одному аллелю DQA1 и одному гену DPB1. Следующие два потенциальных донора — третий брат и сестра больного (D3, D4) — оказались неидентичны с реципиентом. В то же время вторая и третья сестры больного (D5, D6) оказались гаплоидентичны с реципиентом и HLA-идентичны с ним еще и по большому фрагменту его ре-

13

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

срт Донор

Рис. 4. Результаты определения совместимости в реакции MLC доноров-братьев (D1, D2) с реципиентом (R) в семье А.: неидентичность по генам DPB1 и аллелям DRB1, DQB1.

R, D - пролиферативные ответы лимфоцитов реципиента и доноров;

Rx, Dx, Ux - у-облученные стимулирующие лимфоциты реципиента, донора и неродственного донора.

По оси ординат - cpm (calculation per minute - счет за минуту) или имп/мин.

Рис. 5. Результаты определения совместимости в реакции MLC доноров-сестер (D5, D6) с реципиентом (R) в семье А.: геноидентичность по всем HLA класса II.

R, D - пролиферативные ответы лимфоцитов реципиента и доноров;

Rx, Dx, Ux — у-облученные стимулирующие лимфоциты реципиента, донора и неродственного донора.

По оси ординат - cpm (calculation per minute - счет за минуту) или имп/мин.

комбинантной хромосомы, включающему все HLA класса II. Пролиферативный ответ в реакции MLC лимфоцитов обеих сестер с пациентом отсутствовал (рис. 5).

Эти факты также свидетельствуют о том, что типирова-ние сибсов по HLA класса II только по двум локусам (DRB1 и DQB1) по низкому или даже по низкому и высокому разрешению перед ТКМ крайне недостаточно и обязательно должно сопровождаться постановкой реакции MLC, определяющей их совместимость по HLA класса II в целом.

Проведение же ТКМ от HLA-неидентичного донора, ошибочно принятого за HLA-геноидентичного, по протоколу, предназначенному для HLA-геноидентичного сибса, грозит развитием тяжелой РТПХ III—IV степени в результате несовместимости трансплантата с реципиентом по комплексу МНС.

Проведенные исследования свидетельствуют о зависимости пролиферативного ответа в реакции MLC от генетической неидентичности пары донор — реципиент по HLA класса II, что указывает на информативность реакции MLC и на необходимость включения ее в комплекс методов при подборе HLA-идентичного донора.

При этом за все годы нашей работы результаты совместимости в реакции MLC больных гемобластозами, находящимися в ремиссии с их донорами-сибсами не показали ни одного ложно положительного или ложно отрицательного результата.

Имеются работы с противоречивыми данными в отношении влияния неидентичности неродственного донора и больного по локусу HLA-DPB1 на исход ТКМ. В противоположность данным E. Petersdorf и соавт. [37] и M. Fernan-dez-Vina и соавт. [39], показавших выраженное влияние HLA-DPВ1-неидентичности донора и реципиента на развитие РТПХ, P. Moreau и A. Cesbron [45] нашли, что HLA-DP-

неидентичность донора не является фактором риска для возникновения у реципиента РТПХ после ТКМ.

Ситуация разъяснилась только после того, как был использован функциональный подход к оценке совместимости донора и реципиента по локусу HLA-DРB1. В 2004 г. была опубликована работа Е. Zino и соавт. [46], в которой была представлена концепция существования так называемых HLA-DРB1-допустимых (приемлемых) несовместимостей, т.е. о существования определенного соотношения Т-клеточных эпитопов (ТСЕ3) у DPB1-неидентичных донора и реципиента, определяющего их функциональную совместимость по HLA-DPB1 при ТКМ. Авторы выделили три группы аллелей DPB1 до 4-го знака, различающиеся по степени иммуногенности и названные ими T-клеточными эпитопами 3 (ТСЕ3 — Т Cell Epitope 3), различные сочетания которых у донора и реципиента прогнозировали либо возникновение РТПХ, либо развитие отторжения, либо отсутствие и РТПХ, и отторжения.

Эту новую концепцию о функционально "допустимых несовместимостях" и функционально "недопустимых несовместимостях" между донором и реципиентом, среди неидентичных по локусу HLA-DPB1 пар донор—реципиент далее разработали F. Sizzano и соавт. [47, 48], проведя эксперименты, в которых они использовали генно-инженерный подход и реакцию MLC в качестве контролирующего теста. Авторы подразделили все возможные сочетания аллелей HLA-DPB1 до 4-го знака между донорами и реципиентами на функционально "допустимые несовместимости" и функционально "недопустимые несовместимости" на основании иммуногенности клеточных эпитопов, что было предварительно определено в экспериментах, проведенных с помощью генно-инженерной техники и протестированных по наличию или отсутствию пролиферативного ответа в реакции

14

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

DPB1* alleles ТСЕЗ group ТСЕ4 group Immunogenicity

0901 1001 1701 1 1

0301 1401 4501 2 2

0201 0202 0203 3 3

Others 4

RECIPIENT DPB1 GROUP

ТСЕЗ —

1 TCE4

1/1 1/1

1/2 1/2

1/3 1/3

1/4

2/2 2/2

2/3 2/3

2/4

3/3

3/3 3/4

4/4

2/2 2/3 3/3

Non-permissive GvH

Permissive

Permissive

Perm

1/1 1/2

1/1 1/2 1/3

1/3

1/4

Permissive

Non-permissive GvH

Permissive in TCE3 and TCE4 Non permissive in TCE3 and TCE4

Permissive in TCE3, but in TCE4

Рис. 6. Алгоритм функционально “недопустимых несовместимостей” HLA-DPB1 в соответствии с ТСЕ3 или ТСЕ4 [48].

ТСЕ3 (T-Cell Epytope 3) - ЭТК3 (эпитоп Т-клеток 3); ТСЕ4 (T-Cell Epytope 4) - ЭТК4 (эпитоп Т-клеток 4). Permissive in TCE3 and TCE4 - допустимый по TCE3 и TCE4.

Permissive in tCe3 but not in TCE4 - допустимый по TCE3, но не по TCE4. Non-permissive in TCE3 and TCE4 - недопустимый по TCE3 и TCE4. GvH - реакция "трансплантат против хозяина"; HvG - реакция "хозяин против трансплантата"; Immunogenicity - иммуногенность;

Recipient DPB1 group - принадлежность реципиента к той или иной группе (от № 1 до № 3 или, соответственно, от № 1 до № 4) в зависимости от его аллелей DPB1; Donor DPB1 group - принадлежность донора к той или иной группе (от № 1 до № 3 или, соответственно, от № 1 до № 4) в зависимости от его аллелей DPB1.

MLC. R. Crocchiolo и соавт. [49, 50] предложили вместо трех групп (ТСЕ3) четыре группы (ТСЕ4) эпитопов с различной иммуноген-ностью, выделив внутри группы 3 (ТСЕ3) две подгруппы — 3 и 4 (рис. 6).

В многоцентровом исследовании K. Flei-schhauer и соавт. [51] показано, что риск общей смертности при трансплантации неродственного костного мозга от функционально "недопустимо несовместимого" по HLA-DPB1 донора значительно выше, чем при ТКМ от функционально "допустимо несовместимого" по HLA-DPB1 донора.

R. Crocchiolo и соавт. [49] показали, что неидентичность донора и реципиента даже только по одному гену ИЬА^РВ1 при наличии функционально "недопустимой несовместимости" значительно увеличивает риск развития у реципиента острой РТПХ.

На основании результатов этих исследований авторы предлагают проводить ТКМ от неродственного донора при его идентичности с реципиентом по 10/10 или 9/10 локусам HLA высокого разрешения, но с рекомендацией из нескольких, неидентичных с реципиентом по локусу HLA-DPB1 доноров, выбирать того, у которого по локусу HLA-DPB1 имеется функционально "допустимая несовместимость" с реципиентом. Количество таких доноров, по данным R. Crocchiolo и соавт. [49], составляет 30% от всех неродственных пар донор-реципиент, идентичных по 10/10 + 9/10 локусам HLA. Развитие пролиферативного ответа в реакции MLC для идентичных по локусам HLA-DRB1, HLA-DQB1, но неидентичных по локусу HLA-DРВ1 пар донор-реципиент может отражать их функционально "недопустимую несовместимость" по локусу HLA-DРВ1; отсутствие же пролиферативного ответа в реакции MLC у доноров идентичных по локусам HLA-DRB1 и HLA-DQB1, но неидентичных по локусу HLA-DPB1 должно отражать их функционально "допустимую несовместимость" и возможность проведения ТКМ.

Таким образом, наличие или отсутствие пролиферативного ответа в MLC между донором и реципиентом при наличии между ними идентичности по всем HLA класса II, за исключением локуса HLA-DPB1, может варьировать в зависимости от того, какое сочетание эпитопов HLA-DPB1 имеется у донора и реципиента и являются ли эти несовместимости между ними " допустимыми" или " недопустимыми".

Эти новые данные объяснили противоречивость работ о наличии или отсутствии влияния неидентичности по локусу HLA-DРВ1 неродственного донора и реципиента на частоту возникновения и тяжесть РТПХ после ТКМ. Объяснение состоит в том, что некоторые доноры, будучи структурно HLA-DРВ 1-неидентичными с реципиентами, функционально совместимы с ними, так как, согласно приведенной классификации ТСЕ4, находятся в группе "HLA-DРВ1-допустимо несовместимых" доноров, и у них, естественно, РТПХ не развивается. Это обстоятельство и послужило основанием для неверного вывода некоторых авторов об отсутствии отрицательного влияния HLA-DPB1-несовместимости в целом на исход ТКМ.

При некоторых неидентичностях по локусу DPB1 донора и реципиента реакция MLC была отрицательной, а не положительной, что объясняется тем, что концепция о сочетаниях функционально "допустимых" и функционально "недопустимых" несовместимостей между донором и реци-

пиентом доказала, что наличие у реципиента и донора не-имунногенных эпитопов — аллелей, согласно классификации ТСЕ4, создает ситуацию функциональной "допустимости" при структурной неидентичности. Из-за присутствия у донора и реципиента неиммунногенных эпитопов локуса DPB1 реакция MLC между ними может оказаться и отрицательной.

С 2009 г. подбор неродственных доноров для ТКМ во многих странах мира проводится с учетом функционально "недопустимых" и функционально "допустимых" несовместимостей донора и реципиента по эпитопам ТСЕ3 и ТСЕ4 локуса DPB1, обладающих различной степенью иммуноген-ности, т.е. способностью вызывать или не вызывать пролиферативный ответ в реации MLC. При наличии функционально "недопустимых несовместимостей" по эпитопам ТСЕ4 локуса DPB1 между донором и реципиентом в реакции MLC может развиваться пролиферативный ответ, а при функционально "допустимых несовместимостях" такой ответ в реакции MLC может не развиться.

Таким образом, значимость влияния DPB1-несовмести-мости или ее отсутствия на исход ТКМ объясняется разной иммуногенностью эпитопов DPB1.

15

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

Схема

Варианты подбора HLA-геноидентичного донора-сибса для ТКМ Вариант А Вариант Б

ПЦР-генотипирование донора и реципиента

HLA-I: А, В, С

HLA-II: DRB1

DQB1 (высокое разрешение) +

Реакция MLC между донором и реципиентом

ПЦР-генотипирование донора и реципиента

HLA-I: А, В, С (высокое разрешение) HLA-II (высокое разрешение): DRA1,

DRB1, DRB3, DRB4, DRB5

DQA1

DQB1

DPA1

DPB1

В рекомендациях EFI "Стандарты гистосовместимости и иммуногенетического тестирования", опубликованных в 2011 г. [52], излагаются необходимые требования для подбора HLA-идентичного донора-сибса для ТКМ и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, но, не приводится перечень генов и аллелей HLA, типирование которых необходимо. В качестве первого этапа предлагается типирование по локусам HLA-A, HLA-B или HLA-DR доступных членов непосредственной семьи пробанда, а в качестве второго этапа — установление генотипической идентичности между донором и реципиентом на основании определения сегрегации четырех гаплотипов. При случае невозможности выполнить это требование в связи с недоступностью для типирования родителей или других сибсов предлагается использование ДНК-генотипирования высокого разрешения HLA класса I и/или HLA класса II (4-значное обозначение аллели). При этом перед ТКМ от родственного донора считается необходимым (минимальное требование) повторение типирования донора и реципиента по локусам HLA-А, HLA-В и HLA-DRB1 с использованием вновь взятых от них образцов крови для типирования в качестве подтверждающего исследования ранее проведенного HLA-типирования второго этапа.

При использовании же генотипирования высокого разрешения только HLA класса I или только HLA класса II не учитываются возможные случаи ложной HLA-идентичности сибсов, обусловленной гомозиготностью родителей по генам или аллелям HLA, или вследствие сочетания гомозиготности у родителей с кроссинговером. Следует отметить, что при подборе донора-сибса для реципиента при ТКМ не всегда проводят и подтверждающее генотипи-рование донора и реципиента по локусам ИЬА-А, HLA-В, HLA-DRB1, как это предусмотрено в качестве минимального требования в рекомендациях [52]. Между тем наряду с подтверждающим типированием локуса DRB1 определение совместимости HLA-идентичных при генотипировании донора и реципиента в реакции MLC также может служить подтверждающим исследованием на их совместимость по HLA класса II.

Генотипирование при ТКМ доноров-сибсов по ограниченному количеству локусов HLA и их аллелей, проводимое частично по низкому разрешению и иногда даже без подтверждающего типирования локусов ИЬА-А, HLA-В и HLA-DRB1, таит в себе опасность ошибочного заключения о якобы имеющейся HLA-генотипической идентичности доноров-сибсов с реципиентом, которая на самом деле отсутствует.

Мы пришли к заключению, что для идентифицирования донора-сибса в качестве HLA-геноидентичного рациональным является использование конкретного минимального перечня локусов для HLA-типирования с указанием уровня

разрешения их типирования с включением в этот комплекс реакции MLC, пролиферативный ответ которой всегда отразит несовместимость по негеноти-пированным в ПЦР локусам HLA класса II донора и реципиента.

Реакция MLC в настоящее время применяется в области фундаментальных научных исследований в генно-инженерных экспериментах по открытию новых Т -клеточных эпитопов локусов области HLA-D, играющих существенную роль в практической трансплантологии, так как только с помощью ее тестовой функции — по наличию в экспериментах пролиферативного ответа в клеточной культуре — можно достоверно определять эпитопные функциональные "несовместимости" донора и реципиента. Если различия по Т-клеточным эпитопам локуса HLA-DPB1, выражающиеся в пролиферативном ответе реакции MLC, в настоящее время в значительной степени разработаны, то вопрос об отражении в реакции MLC неидентичности донора и реципиента по эпитопам других локусов области HLA-D еще требует изучения. Малоизучены связь неидентичности донора и реципиента по генам и аллелям трансплантационно значимых локусов HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 с пролиферативным ответом в реакции MLC и влияние этой неидентичности на исход ТКМ. Разные исследователи типируют либо один, либо два, либо все три указанных выше локуса при нахождении HLA-идентичного донора для ТКМ. O. Olerup и соавт. [34] типировали при определении идентичности донора и реципиента локус DRB3, M. Muro и соавт. [41] — локус DRB4, а M. Fernandez-Vina и соавт. [42] типировали все три локуса HLA-DRB3/4/5.

В работах по ксеногенной трансплантации органов и тканей от животных к человеку реакция MLC также является единственным критерием совместимости особей. Комплексные исследования [53—55] показали, что для каждого человека можно подобрать животное, которое будет совместимо с ним в реакции MLC. В смешанных культурах лимфоцитов конкретного человека с лимфоцитами некоторых свиней пролиферативный ответ отсутствовал, в то время как с лимфоцитами других свиней он наблюдался. Это указывает на то, что имеется идентичность в строении генов HLA класса II человека и Большой Системы Гистосовместимости класса II свиньи, т.е. может существовать, по крайней мере, частичная гистосовместимость между определенным человеком и некоторыми особями свиней. Следует принимать во внимание возможность существования между ними и функционально "допустимых неидентичностей" по разным локусам, подобно тому, как это было показано для локуса HLA-DPB1 у человека. Эти данные свидетельствуют об имеющейся общности регионов HLA-D человека и SLA (Swine Leucocyte Antigens)-D свиньи. Таким образом, в плане ксеногенного варианта человек — животное реакция MLC является единственным критерием, позволяющим определить гистосовместимость животного и человека по HLA класса II.

Пролиферативный ответ в реакции MLC генетически обусловлен, в связи с чем реакция MLC является HLA-генотипически значимой и вследствие этого высокоспецифичной. Реакция MLC выявляет неидентичности, имеющиеся у донора и реципиента по локусам области HLA-D как суммарно, так и в отдельности по каждому из трансплантационно значимых локусов этой области [56—58]. Генотипическая значимость пролиферативного ответа в реакции MLC заключается в зависимости развития ответа от наборов генов и аллелей HLA класса II у реципиента и донора. Неидентичность донора с реципиентом по одному гену локуса HLA-DPB1 в наших исследованиях вызывала низкий двунаправленный пролиферативный ответ в реакции MLC. Неидентичность донора и реципиента по одному гену локуса HLA-DRB1 вызывала высокий двунаправленный пролифе-

16

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

ративный ответ в реакции MLC. При нескольких генетических различиях доноров-сибсов по HLA класса II — по одной аллели локуса HLA-DRB1 + одной аллели локуса DQA1 + одному гену DРB1 проявлялся кумулятивный эффект: в реакции MLC развивался высокий пролиферативный ответ. Когда один из двух гаплоидентичных сибсов имел гены локусов HLA класса II, отсутствующие у другого сибса, развивается однонаправленный пролиферативный ответ — асимметричная реакция MLC. При геноидентичности гаплоидентичных доноров с реципиентом по всем HLA класса II (при их общности по большому фрагменту рекомбинантной хромосомы вследствие кроссинговера) пролиферативный ответ в реакции MLC отсутствовал в обоих направлениях. При этом неидентичность этих двух доноров с реципиентом по генам HLA класса I локусов HLA-В, HLA-С не смогла вызвать пролиферативный ответ в реакции MLC. При различии HLA-неидентичного донора сибса от реципиента по двум генам локуса DRB1 и одному гену локуса DQB1 в реакции MLC отмечен максимально высокий пролиферативный ответ. Эти результаты свидетельствуют о том, что пролиферативный ответ в реакции MLC избирательно отражает генетическую неидентичность именно по HLA класса II и зависит от набора генов и аллелей донора и реципиента.

Метод ПЦР-генотипирования HLA класса II, который в настоящее время используется вместо реакции MLC, открыл возможности для точного идентифицирования генов и аллелей всех локусов области HLA-D. В последнее время для исключения возможности принять HLA-неидентичного донора за HLA-геноидентичного предлагают при подборе донора-сибса для ТКМ включить в качестве обязательного исследования ПЦР-генотипирование локуса HLA-DPB1 при условии генотипирования всех локусов HLA как доноров, так и реципиентов и их родителей только на уровне аллелей — по высокому разрешению [40, 41]. В работе M. Muro [40] приводятся сведения об обнаружении у родителей пациентов и доноров-сибсов гомозиготности генов HLA-DRB1. У матерей двух пациентов из двух семей были выявлены гомозиготные гены DRB1*04 на гомологичных хромосомах С6 при типировании по низкому разрешению, но аллели этих генов при типировании по высокому разрешению оказались различными. При этом по локусам HLA-DRB4, -DQA1 и -DQB1 у обеих матерей имелась полная гомози-готность на аллельном уровне — при типировании по высокому разрешению! Таким образом, типирование родителей по низкому разрешению для определения наследственной сегрегации родительских гаплотипов может оказаться недостаточным. Авторы приходят к выводу, что для достоверного определения сегрегации всех четырех гаплотипов в семье необходимо HLA-генотипирование как сибсов, так и родителей по всем трансплантационно значимым локусам HLA и только по высокому разрешению. На практике это не всегда доступно из-за дороговизны реактивов.

Альтернативой этому является наше предложение использовать реакцию MLC в практической работе при подборе HLA-идентичного донора для ТКМ в качестве теста in vitro на совместимость донора-сибса и реципиента по HLA класса II, т. е. по всей области HLA-D при одновременном ПЦР-генотипировании их по локусам HLA-DRB1, HLA-DQB1 частично по низкому и частично по высокому разрешению. Пролиферативный ответ в реакции MLC всегда предупредит о грозящей опасности принять HLA-неидентичного донора (чаще гаплоидентичного) за HLA-геноидентичного и выявит неидентичность между сибсами по тем генам локусов области HLA-D, которые не удалось типировать, а также по аллелям, которые не были генотипи-рованы (по высокому разрешению). Реакция MLC способна специфически отражать неидентичность донора с реципиентом как кумулятивно — по всем локусам области HLA-D в целом, так и по каждому локусу этой области в отдельности.

Для гарантированного идентифицирования донора сибса в качестве HLA-генотипически идентичного (имеющего с пациентом две одинаковые хромосомы С6) считаем целесообразным рекомендовать использовать надежный комплекс обследования пары донор—реципиент, включающий как конкретный перечень минимально необходимых локусов HLA для ПЦР-SSP-генотипирования с указанием уровня разрешения генотипирования, так и параллельное определение совместимости пары донор—реципиент в реакции MLC — проведение биологического тестирования на их совместимость in vitro.

Алгоритм подбора HLA-геноидентичных доноров-сибсов для ТКМ, предлагаемый нами (см. схему, вариант "А"), состоит из двух этапов:

I. HLA класса I:

ПЦР-генотипирование донора-сибса и реципиента по HLA-А, HLA-В и HLA-С высокого разрешения;

II. HLA класса II:

сочетание ПЦР-генотипирования донора-сибса и реципиента по локусу HLA-DRB1 низкого (или высокого) разрешения и локусу HLA-DQB1 высокого разрешения с параллельным определением совместимости донора и реципиента в реакции MLC.

В противном случае (см. схему, вариант "Б") при поиске HLA-геноидентичного донора сибса для ТКМ необходимо проведение ПЦР-генотипирования донора-сибса и реципиента только по высокому разрешению по всем трансплантационно значимым локусам HLA класса I и класса II, включая HLA-DRB3/4/5, HLA-DQA1, HLA-DPB1 и т.д., что, однако, значительно удорожает и усложняет подбор доноров-сибсов, являясь малодоступным в практической работе.

Наши исследования показали [56—58], что реакция MLC, являясь моделированием in vitro взаимодействия лимфоцитов потенциальных донора и реципиента, в то же время генетически информативна и ее использование оправдано при поиске доноров костного мозга и стволовых кроветворных клеток при ТКМ, так как ее пролиферативный ответ всегда выявит HLA-неидентичность донора и реципиента по неге-нотипированным генам и аллелям HLA класса II.

Таким образом, как бы в дальнейшем ни детализировали структуру трансплантационно значимых локусов HLA, реакция MLC есть и остается единственным простым, доступным, биологическим, чувствительным методом, позволяющим достоверно определить in vitro совместимость донора и реципиента по HLA класса II перед проведением in vivo ТКМ больным в клинике.

Работа выполнена по теме НИР "Изучить эффективность трансплантации аллогенных и аутогенных гемопоэтических клеток в комплексной терапии острых лейкозов и хронического миелолейкоза" (№ государственной регистрации: 012000602115; научный руководитель темы — акад. РАМН В.Г. Савченко; сроки выполнения: 2006—2010 г.).

ЛИТЕРАТУРА

1. Савченко В.Г., Любимова Л.С., Паровичникова Е.Н., Менделеева Л.И., Момотюк К.С., Демидова И.А. и др. Трансплантация аллогенных и аутологичных гемопоэтических стволовых клеток при острых лейкозах (итоги 20-летнего опыта). Терапевтический архив 2007; 79(7): 30—5.

2. Робертис Е. Де, Новинский В., Саэс Ф. Общая цитология. Пер. с англ. М.: Издательство иностранной литературы; 1962: 291—2.

3. Доссэ Ж. Иммуногематология. Пер. с франц. М.: Медгиз; 1959: 544—5.

4. Schrek R., Donnelly W.J. Differences between lymphocytes of leukemic and non-leukemic patients with respect to morphologic features, motility, and sensitivity to quinea pig serum. Blood 1961; 18: 561—71.

5. Bach F.N., Voynow N.K. One-way stimulation in mixed leukocyte cultures. Science 1966; 153(3735): 545—7.

17

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

6. Amos D. Functional aspects of HLA. In: Biological basis of immunodeficiency. Gulfand E., Dosch. H., eds. New York; 1970: 83—97.

7. Медуницын Н.В., Алексеев Л.П. Система Ia-антигенов. М.: Медицина; 1987: 84—9.

8. ЗотиковЕ. А. Антигенные системы человека и гомеостаз. М.: Наука; 1982: 127—9.

9. Rudolph R.H., Mickelson E., Thomas E. D. Mixed leukocyte reactivity and leukemia: study of identical siblings. J. Clin. Invest. 1970; 49(12): 2271—5.

10. Dupont B., Jersild C., Hansen G.S., Nielsen L.S., Thomsen M., Svejgaard A. Typing for MLC determinants by means of LD-homozygous and LD-heterozygous test cells. Transplant. Proc. 1973; 5(4): 1543—59.

11. Снелл Дж., Доссе Ж., Нэтенсон С. Совместимость тканей. Пер. с англ. М.: Мир; 1979: 261—5.

12. Eijsvoogel V.P., de Groot-Kooy L., Huismans L., van Rood J.J., van Leeuwen A., DuToit E.D. Mixed lymphocyte culture and HLA. Transplant. Proc. 1972; 4(2): 199—204.

13. Layrisse Z., Heinen Н. D., Simonney N. HLA-D typing with homozygous cells identified in an American indigenous isolate. II Family studies and D/DR relationship. Tissue Antigens 1982; 20(2): 86—99.

14. Termijtelen A., van Rood J.J. Complexity of stimulation in MLC and the influence of matching for HLA-A and -B. Scand. J. Immunol. 1981; 14(5): 459—66.

15. Poulter L., Adams J.A., Knight I., McCarthy D.M., Barrett A.J. Mixed lymphocyte cultures using automated blood cell counters. Bone Marrow Transplantation 1989; 4(6): 659—62.

16. McGlave P.B., Beatty P., Ash R., Hows J.M. Therapy for chronic myelogenous leukemia with unrelated donor bone marrow transplantation: results in 102 cases. Blood 1990; 75(8): 1728—32.

17. Bishop M.R., Henslee-Downey P.J., Anderson J.R., Romond E.H., Marciniak E., Yankey R., et al. Long-term survival in advanced chronic myelogenous leukemia following bone marrow transplantation from haploidentical related donors. Bone Marrow Transplantation 1996; 18(4): 747—53.

18. Алексеев Л.П., Хаитов P.М., Долбин А.Г., Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю., Алексеева П.Л., Минина М.Г. Главный комплекс тканевой совместимости человека (HLA) и клиническая трансплантология. Иммунология 2008; 4: 237—44.

19. Бубнова Л.Н., Зубарева Т.С., Лысова Л.В., Беляева Е.В., Болдырева М.Н., Трофимов Д.Ю. и др. Применение метода молекулярного типирования для определения HLA-специфичностей II класса в Республиканском центре иммунологического типирования тканей. Иммунология 1998; 2: 54—6.

20. Ottinger H.D., Albert E., Arnold R., Beelen D.W., Blasczyk R., Bunjes D., et al. German consensus on immunogenetic donor search for transplantation of allogeneic bone marrow and peripheral blood stem cells. Bone Marrow Transplant. 1997; 20(2): 101—5.

21. Cecuk-Jelicic E., Grubic Z., Zunec R., Humar I., Labar B., Kerhin-Brkljacic V. Bone marrow transplantation — searching for HLA compatible donor. EFI. The 19th European Immu-nogenetics and Histocompatibility Conference. Turkey, Istanbul, 22—26 April 2005. Genes and Immunity 2005; 6(Suppl. 1): 75.

22. Шпакова А. П., Булычева Т. И. Определение совместимости по локусу HLA-D в смешанной культуре лимфоцитов при трансплантации костного мозга. Клиническая лабораторная диагностика 1992; 1—2: 36—40.

23. Шпакова А.П., Булычева Т.И., Дронова В. М., Охрименко Т.Н., Любимова Л.С., Менделеева Л.П., Савченко В.Г. Результаты определения совместимости в реакции MLC больных гемобластозами при трансплантации костного мозга от HLA-идентичных сибсов. Гематология и трансфузиология 1993; 38(5): 17—20.

24. Шпакова А.П., Булычева Т.И., Любимова Л.С., Менделеева Л.П. Значение и особенности реакции смешанной культуры лимфоцитов в определении гистосовместимости донора и реципиента при трансплантации аллогенного костного мозга у больных гемобластозами. Терапевтический архив 2000; 72(11): 62—67.

25. Демидова И.А., Савченко В.Г., Ольшанская Ю.В., Пореши-на Л.П., Кутьина Р.М., Сурин В.Л. и др. Аллогенная трансплантация костного мозга после режимов кондиционирования пониженной интенсивности в терапии больных гемобла-стозами. Терапевтический архив 2003; 7: 15—21.

26. Шпакова А.П., Булычева Т.И., Кутьина Р.М., Любимова Л. С., Демидова И. А., Александрова И. Я. и др. Сопоставление результатов реакции смешанной культуры лимфоцитов — MLC и ПЦР-генотипирования при аллогенной трансплантации костного мозга. Гематология и трансфузиология 2005; 50(3): 29—36.

27. Shpakova A.P., Kutyina R.M., Bulycheva T.I., Boldireva МХ. A rare immunogenetical findings for a search HLA identical siblings for BMT in patients with hematological malignancies . EFI. Abstracts for the 20th (EFI) European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, Oslo, Norway, 8—11 June, 2006. Tissue Antigens 2006; 67(6): 468—9.

28. Shpakova A.P., Golovkina L.L., Kutyina R.M., Savtchenko EG. A case of HLA-B unexpressing on lymphocytes of health donor. Book of Abstracts East-West Immunogenetics Conference. Prague, Czech Republic. 1—3 March 2007: 43.

29. Shpakova A.P., Golovkina L.L., Kutyina R.M., Atroshchenko G.V., Pushkina T.D., Bulicheva T.I. The proliferation response in MLC of HLA-A, -B, -DPB1-mismatched, but HLA-DRB1, -DQA1, -DQB1 identical lymphocytes of sibling pair. EFI. 22ed European Immunogenetics and Histocompatibility Conference. Toulouse. France. 2—5 April 2008. Tissue Antigens 2008; 71(4, pt 102): 324.

30. Шпакова А.П., Кутьина Р.М., Пушкина Т.Д., Болдырева М.Н., Головкина Л.Л., Булычева Т.И. Подбор HLA идентичного донора сибса в многодетной семье с кроссинго-вером при использовании ПЦР генотипирования высокого разрешения и реакции MLC. Материалы Всероссийской конференции с международным участием: "Главный комплекс HLA — к 50-летию открытия", Санкт-Петербург, 16—17 декабря 2009 г. Вестник гематологии 2009; 5(4): 66—68.

31. Shpakova A.P., Golovkina L.L., Kutjina R.M. Detection of HLA incompatibility in a presumably HLA identical related donor by high resolution genotyping and MLC reaction. EFI. 24th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference & 17thItalian Society for Immunogenetics and Transplantation Biology Meeting. 15 — 18 May 2010. Florence. Italy. Tissue antigens 2010; 75(5, pt 165): 560.

32. Шпакова А.П., Булычева Т.И., КутьинаР.М., Головкина Л.Л., Кузьмина Л.А., Любимова Л.С., Савченко В.Г. Значение реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLC) в комплексном определении HLA-идентичности родственного донора и реципиента при трансплантации костного мозга. Матерiали науково-практичноi конференци за участю мiжнародних спещалиспв, присвяченоi 75^ччю ДУ !нститут гематологи та трансфузюлоги НАМН Украши, м. Кив, 27 — 28 жовтня 2011 р. «Актуальш питання гематологи та трансфузиологи». Кшв: Атка-Н; 2011: 162—4

33. Clay T.M., Jones H.P., Bidwell J.L., Darke C., Harvey J., Bradley B.A. A comparison of DNA — RFLP typing with serology and mixed lymphocyte reaction in the selection of matched unrelated bone marrow donors. Bone Marrow Transplant. 1989; 4(5): 493—497.

34. Olerup O., Moller E., Persson U. HLA-DP incompatibilities induce significant proliferation in primary mixed lymphocyte cultures in HLA-A, -B, -DR and -DQ compatible individuals: implications for allogeneic bone marrow transplantation. Tissue Antigens 1990; 36(5): 194—202.

18

Гематол. и трансфузиол., 2012, т. 57, № 5

35. Cesbron A., Moreau P., MilpiedN., Muller J.Y. , Harousseau J.L. , Bignon J.D. Influence of HLA-DP mismatches on primary MLR responses in unrelated HLA-A, -B, -DR, -DQ, Dw identical pairs in allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplantation 1990; 6(5): 337—40.

36. Bodmer W. HLA Polymorphism: Origin and Maintenance. In: Terasaki P., Gjertson D.W. eds. HLA 1997. Los Angeles; 1997: 135—70.

37. Petersdorf E.W., Longton G.M., Anasetti C., Mickelson E.M., Smith A.G., Martin P.J., Hansen J.A. Definition of HLA-DQ as a transplantation antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93(26): 15358—63.

38. Petersdorf E.W., Gooley T., Malkki M., Anasetti C., Martin P., Woolfrey A., et al. The biological significance of HLA-DP gene variation in haemopoietic cell transplantation. Br. J. Haematol. 2001; 112 (4): 988—94.

39. Fernandez-Vina M., Cano P., Parmar S., Andersson B., Liu P., Munsell M., et al. A dose effect of DPB1 mismatches may increase the risk for graft versus host disease in bone marrow transplants from unrelated donors of patients with high risk myeloid leukemias. Tissue Antigens 2007; 69(5): 520—521

40. Fischer G.F., Ludajic K., Balavarca Y., Bickeboeller H., Pohl-reich D., Kouba M., et al. Impact of HLA-DPB1 allelic and single amino acid mismatches on haematopoietic stem cell transplantation outcomes. Bone Marrow Transplantation 2008; 41(Suppl. 1): 78.

41. Muro M., Moya-Quiles M.R., Marin L., Torlo A., Vallejo C., Mo-raleda J.M., Alvarez-Lopez M.R. Report of recombinations between HLA loci within two families: utility of high resolution typing. Clin. Transplant. 2002; 16(5): 329—333.

42. Fernandez-VinaM., Guerrero E., Zhao W., Patel H., Sheldon S., Cano P. DPB1 typing in related-donor allogeneic bone-marrow transplantation. Tissue Antigens 2007; 69(5): 512.

43. Carrington M. Recombination within the human MHC. Immunol. Rev. 1999; 167: 245—56.

44. Sullivan K.A., Wolfe M.A., Lopez M., Jaspan J.B., Bryer-Ash M. First report of recombination between the HLA-DR and HLA-DQ loci within a family. Human Immunol. 1997; 57 (1): 37—43.

45. Moreau P., Cesbron A. HLA-DP and allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplantation 1994; 13 (6): 675—81.

46. Zino E., Frumento G., Marktel S., Sormani M.P., Ficara F., Di Terlizzi S., et al. A T-cell epitope encoded by a subset of HLA-DPB1 alleles determines nonpermissive mismatches for hematologic stem cell transplantation. Blood 2004; 103(4): 1417—24.

47. Sizzano F., Zito L., Crivello P., Zino E., Fleischhauer K., et al. Preferential in vitro CD4+ T cell expansion in response to HLA-DP alloantigens carrying a T cell epitope disparity. Tissue antigens 2010; 75(5): 554.

48. Sizzano F., Zito L., Crivello P., Crocchiolo R., Vago L., Zino E., et al. In vitro evidence for an innovative, clinically relevant T cell epitope matching strategy for HLA-DPB1 in unrelated hematopoietic stem cell transplantation. Tissue Antigens 2011; 77(5): 373—4.

49. CrocchioloR., ZinoE., VagoL., OnetoR., BrunoB., PollichieniS., et al.; Gruppo Italiano Trapianto di Midollo Osseo, Cellule Staminale Ematopoietiche (CSE) e Terapia Cellulare; Italian Bone Marrow Donor Registry. Nonpermissive HLA-DPB1

disparity is a significant independent risk factor for mortality after unrelated hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2009; 114(7): 1437—44.

50. Crocchiolo R., Oneto R., Bruno B., Pollichieni S., Sacchi N., Fanin R. , et al. HLA-DP1 T cell epitope 4-group matching is significantly predictive of survival after unrelated hematopoietic stem cell transplantation in onco-hematologic patients from Italy: an updated analysis. Tissue Antigens 2010; 75(5): 553—4.

51. Fleischhauer K., Shaw B., Malkki M., Gooley T., Zino E., Spellman S., et al. Significant correlation between donor-recipient HLA-DPB1 T cell epitope matching and survival in 4490 unrelated 10/10 matched hematopoietic stem cell transplants analyzed within the 15th International Histocompatibility Workshop on behalf of the International Histocompatibility Working Group (IHWG) in hematopoietic cell transplantation. Tissue Antigens 2010; 75(5): 469—70.

52. European Federation for Immunogenetics. Standards for histocompatibility & immunogenetics testing. Version 5.6.2. (Accepted by the Standards and Quality Assurance Committee on 3 May 2011. Accepted by the EFI Executive Committee on 31 August 2011. 2011; 8: 13—4. http://www.efiweb.eu/fileadmin/ user_upload/members/pdf/Standards_version_5_6_2.pdf

53. Леднёв Ю.А., Зарецкая Ю.М., Шпакова А.П., МарзановН.С., Павленко С., Гайков В.А. Трансплантационный иммуннитет в ксеногенной комбинации человек-свинья. Материалы III Всероссийского съезда по трансплантологии и искусственным органам. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2005; 3: 20—1.

54. Lednev Y.A., Shpakova A.P., Zaretskaya Y.M. Transplantation immunity in the xenogenic combination human versus pig. EFI. Abstracts for the 20th European Immunogenetics and Histocompatibility Conference, Oslo, Norway, 8—11 June, 2006. Tissue Antigens 2006; 67(6, pt 098): 496—7.

55. ЗарецкаяЮ.М., ЛедневЮ.А. HlA 50 лет: 1958—2008. Тверь: Триада; 2008.

56. Shpakova A.P., Golovkina L.L., Bulycheva T.I. Impotence of the proliferative response in mixed lymphocyte culture reaction at the genotype search of HLA identical sibling as donors for bone marrow transplantation. Abstracts for the joint 16th International HLA and Immunogenetics Workshop, 26th European Federation for Immunogenetics Conference and 23rd British Society of Histocompatibility and Immunogenetics Conferences, Liverpool, U.K. 31 May—3 June 2012. Tissue antigens 2012; 79(6): 447—8.

57. Шпакова А.П., Булычева Т.И., Головкина Л.Л., Кутьина Р.М., Хасигова Б.Б., Пушкина Т.Д. и др. Выявление ложной HLA идентичности в реакции MLC при генотипическом подборе доноров костного мозга. Материалы Конгресса гематологов России, 2—4 июля 2012, Москва. Гематология и трансфузиология 2012; 3 (прил.): 147.

58. Шпакова А.П., Булычева Т.И., Головкина Л.Л., Кутьина Р.М., Пушкина Т.Д., Хасигова Б.Б. и др. Реакция смешанной культуры лимфоцитов — MLC и генотипическая значимость ее пролиферативного ответа при подборе HLA идентичного донора сибса для трансплантации костного мозга (итоги 30-летней работы). Гематология и трансфузиология 2012; 3: 13—21.

Поступила 21.06.12

Уважаемые читатели!

Издательство "Медицина" не высылает авторские экземпляры статьи. Подписаться или купить номер Вы можете в издательстве: ул. Верхняя Красносельская, д.17а, стр. 1б. тел.8(499)264-57-92 с 11 до 16 часов (поторопитесь, так как дополнительных номеров 2—3, остальные распространяются только по предварительной подписке). С 2012 г. существует также электронная подписка через научную электронную библиотеку РИНЦ (eLIBRARY.RU), правда на весь номер, а с 2013 г. возможно будет

подписаться и на одну статью.

19