Способ получения липосомальной формы бетулина, обладающей гепатопротекторной активностью
METHOD OF PRODUCING LIPOSOMAL FORM OF BETULIN, HAVING HEPATOPROTECTIVE ACTIVITY

Изобретение относится к прикладной биотехнологии, в частности, к способу получения липосомальной субстанции на основе лупанового тритерпеноида - бетулина (фиг.1), обладающей гепатопротекторной активностью. Наносуспензию бетулина получали методом осаждения холодной водой горячего раствора, содержащего соответствующую смесь веществ, включая основной компонент - бетулин, в органическом растворителе. В роли источника фосфолипидов выступал лецитин. В качестве эмульгатора и дополнительного липофильного внутривезикулярного растворителя использовали ланолин. Данный способ позволяет получить стабильную наносуспензию бетулина с большей выраженной гепатопротекторной активностью по сравнению с чистым биологически активным веществом (бетулин, 95% чистоты).
Изобретение относится к области прикладной биотехнологии, а именно к способу получения липосомальной субстанции бетулина с выраженной гепатопротекторной активностью. Данные липосомальные формы бетулина предполагается использовать для профилактики и лечения гепатозов у сельскохозяйственных животных и птиц» а также в качестве биологически активной добавки к пище.
На сегодняшний день в современной фармакологии одной из ведущих тенденций является создание систем направленного транспорта лекарств [Провоторов В.М., Иванова Г.А. Роль и место эритроцитов в системе направленного транспорта различных фармакологических средств // Клиническая медицина. 2009. №9. С. 4-8.]. Реализация целенаправленного концентрирования лекарственного препарата преимущественно в зоне, охваченной патологическим процессом, позволяет резко снизить нежелательные реакции организма на медикаментозное воздействие, сократить терапевтическую дозу лекарства и кратность его введения [Генинг Т.П., Белозерова Л.A. Эритроцитарные носители в направленном транспорте лекарств в гепатологии. Ульяновск: УлГУ, 2006; Чазов Е.И., Смирнов В.Н., Торчилин В.П. Направленный транспорт лекарств: проблемы и перспективы // Журнал Всесоюзного химического общества им. Д.И. Менделеева. 1987. Т. 32, №5. С. 485-487].
В основе такой доставки нанопрепаратов к мишеням лежат два основных механизма. Во-первых, они обладают свойством пассивного нацеливания: в районе воспаления в капиллярах расширяются поры и нанолекарства проходят через них, то есть, попадают в зону поражения. Второй вариант - это активный транспорт, который реализуется присоединением к наночастице "молекулярного фрагмента", адресуемая к рецепторам на мембранах клеток-мишеней.
Один из таких методов - создание контейнера на основе липосомальной формы лекарственных препаратов. Для этих целей наночастица включается в липосомный лекарственный препарат на стадии их приготовления. В липосомах существенно увеличивается растворимость лекарственных препаратов, уменьшается токсичность. Действие лекарственного препарата начинается только тогда, когда он достигает клетки-мишени, никак не раньше, и по пути не деградирует, а доходит в активной форме. Все это позволяет снизить эффективную дозу лекарства и значительно уменьшить негативные эффекты.
Липосомы представляют собой искусственно получаемые сферические частицы диаметром от 20 нм до 50 мкм, образованные из одного или нескольких бимолекулярных слоев фосфолипидов и содержащие внутри воду или раствор [Kozlowska D., Foran P., MacMahon P. et all. Molecular and magnetic resonance imaging: the value of immunoliposomes // Advanced Drag Delivery Reviews / 2009. V. 61, №15. P. 1402-1411].
В настоящее время известен ряд способов получения липосом: метод, основанный на выпаривании в обращенной фазе [Szoka Jr. F., Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75, №9. p. 4194-4198], инжекция [Method for producing liposomes. Патент США №4687661. Kikuchi H., Yamauchi H. 18.08.1987; Eckardt I.R., Campbell E., Burns H.A. et al. Phase II trial of Dauno Home, liposome-encapsulated daunomocine in patient with metastatic adenocarcinoma of the colon // American Journal of Clinical Oncology. 1994. V. 6, №17. P. 498-501.], экструзия (Способ получения липосомальной формы противоопухолевого цитостатика (антибиотика). Пат. 6700 Украина; №93121786; заявл. 26.05.1993; опубл. 29.12.1994. Бюл. №8 / Дудниченко А.С., Швец В.И., Темиров Ю.П. b др.; Mayhew Е., Lazo R., Vail W.J. et all. Characterization of liposomes prepared using a microemulsifier 11 Biochimica et Biophysica Acta. 1984. V. 775, №2. P. 169-174; Brandl M., Bachmann D., Drechsler M. et all. Liposome preparation by a new high pressure homogenizer Gauiin Micron LAB 40 // Drug Development and Industrial Pharmacy. 1990. V. 16, №14. P. 2167-2191.], озвучивание [Краснопольский Ю.М., Дудниченко A.C., Швец В.И. Фармацевтическая биотехнология: бионанотехнология в фармации и медицине. Харьков: Издательский центр НТУ «ХПИ», 2011; Липосомы в биологических системах / Под ред. Г. Грегориадиса, А. Аллисона. М.: Медицина, 1983.], методы, основанные на спонтанной везикуляции и удаления детергентов [Liposomes: А Practical Approach. Second Edition / [Edited by V.P. Torchilin, V. Weissig]. Oxford: Oxford University Press, 2003].
Получение липосом методом выпаривания в обращенной фазе основано на образовании «перевернутых мицелл», т.е. мелких капель воды, которые стабилизируются фосфолипидным монослоем и диспергируют в избытке органического растворителя [Szoka Jr. F., Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75, №9. P. 4194-4198]. Их получают обработкой ультразвуком смеси буферной водной фазы, содержащей водорастворимые вещества для липосомального инкапсулирования, и органической фазы, в которой были растворены молекулы амфифильных фосфолипидов. Медленное удаление органического растворителя с помощью упаривания в вакууме приводит к трансформации «перевернутых мицелл» в вязкую гелеподобную структуру. В критической точке этой стадии гель разрушается, часть «мицелл» распадается, и получившийся избыток фосфолипидов формирует бислой вокруг оставшихся мицелл, что приводит к образованию липосом.
Основным недостатком этого метода в случае белковых систем является воздействие органического растворителя на инкапсулируемый в липосому белок, что приводит к его частичной денатурации. Данный метод обеспечивает выход нанолипосом с размером везикул до 120 нм, относительную их однородность, он прост, удобен и не требует дополнительного оборудования.
Известны способы получения препаратов путем диспергирования компонентов в растворителе и последующего получения липосом. Для этого фосфолипиды диспергируют в водной среде, содержащей лекарственные вещества. В результате интенсивного перемешивания образуются многослойные липосомы с включенным во внутренний объем лекарственным веществом. Размер липосом можно уменьшить путем обработки раствора ультразвуком (патент RU 2153328).
При использовании способа диспергирования с помощью растворителя фосфолипиды растворяют в органическом растворителе, которые затем вливают в водную фазу, содержащую лекарственный препарат. При перемешивании он включается в структуру липосом, а растворитель затем удаляют отгонкой. Например, в патенте (RU 2068262) описано образование дисперсии липосом, содержащих лекарственное средство (цитарабин), полученных смешением в определенных количествах спиртового раствора фосфатидилхолина, хлороформенного раствора холестерина и витамина Е, с последующим формированием пленки липидов на стенках круглодонной колбы путем упаривания органических растворителей в вакууме при температуре не выше 40°С. Затем водным раствором лекарства диспергируют липидную пленку путем встряхивания колбы в течение 15 мин.
Недостатком данных способов является получение нестабильных водных или водно-спиртовых дисперсий липосомальных препаратов, которые должны быть стабилизированы с помощью дополнительных процессов лиофилизации или распылительной сушки.
Известен способ получения липосомальных форм лекарственных препаратов путем приготовления при смешивании лекарственного средства или биологически активного вещества, фосфолипидов, органического растворителя, порошкообразного наполнителя в одной емкости с последующим удалением растворителя в условиях пониженного давления (вакуума) при постоянном перемешивании (патент RU 2130771). Недостатком данного способа получения липосом является получение эмульсий с размером липосом от 1 до 15 мкм. После высушивания эмульсии под вакуумом образуется агломерированный порошок с размером частиц от 100 до 500 мкм, который при диспергировании в воде образует липосомальный препарат с размером от 50 до 300 мкм. Такие крупные частицы сохраняют биологическую активность введенных в них препаратов на уровне исходных лекарственных средств. Основной недостаток липосом как лекарственной формы - относительная небольшая стабильность при хранении.
Известно, что пентациклические тритерпеновые соединения лупанового ряда - бетулин и его производные, получаемые в виде экстракта березовой коры, обладают широким набором биологических и терапевтических активностей: антиоксидантной, иммуномодулирующей, антимутагенной и пр.
Наиболее близким по технике проведения эксперимента и достигаемому результату к заявляемому способу является изобретение по патенту RU 2386446 С1, сущность которого сводится к тому, что гидрофобные субстанции бетулина или его производных (лупеол, 3-О-кофеат бетулина) первоначально растворяются в органическом растворителе (тетрагидрофуран, ацетон) при концентрации 2,5-5 г/л с последующим смешиванием и гомогенизацией этого раствора с пищевым маслом или водным раствором поверхностно-активного вещества в количестве от 0,1 до 40 мас. % (для предотвращения коагуляции образующихся наночастиц при длительном хранении) в рабочем органе коллоидной мельницы при интенсивном перемешивании и дальнейшем удалении растворителя при его кипении. Для лучшего распределения порошкообразного бетулина (или его производных), получению однородной наносуспензии, а также для лучшей усвояемости бетулина авторы патента использовали пищевые масла: растительное (подсолнечное, кукурузное, оливковое, арахисовое, льняное, хлопковое, рапсовое, соевое, кунжутное конопляное, оливковое, тыквенное, масло виноградных косточек и другие) или рыбий жир, минеральное масло (Е905а), полидиметилсилоксановое масло (Е900) и смеси из них. Размер получаемых при этом наночастиц бетулина оценивался с помощью лазерного спектрофотометра марки ЛКС-03.
К недостаткам данного способа можно отнести использование большого количества растворителя, обязательного наличия роторного испарителя, а также затраты времени и электроэнергии на испарение растворителя.
Для приготовления липосомальной наносуспензии на основе бетулина, обладающей высокой гепатопротекторной активностью, предлагается новый способ.
Сущность изобретения состоит в том, что из продукта экстракции бересты - бетулина, по модифицированной методике получения липосом, описанной в работе [Szoka Jr. F., Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75, №9. P. 4194-4198], была изготовлена липосомальная наносуспензия, которая обладает большей выраженностью гепатопротекторной активностью по сравнению с чистым биологически активным веществом.
Для получения липосомальной наносуспензии бетулина были выбраны собственно сам бетулин (95%-ой чистоты по данным ВЭЖХ), подсолнечный лецитин (в качестве источника фосфолипидов, с содержанием эссенциальных фосфолипидов не менее 88%, производства «Ювикс-Фарм») и ланолин (в качестве эмульгатора и дополнительного липофильного внутривезикулярного растворителя).
В качестве растворителя использовали диоксан, который умеренно растворяет при нагревании все три необходимых компонента. Все представленные вещества: бетулин, лецитин и ланолин последовательно растворяли при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке в нагретом до 80-90°С диоксане, перемешивали в течении 5 минут до образования прозрачного гомогенного раствора и затем постепенно добавляли дистиллированную воду до образования устойчивой эмульсии. Раствор охлаждали до комнатной температуры и оставляли на сутки для осаждения суспензии осадка, который затем отфильтровывали, промывали от остатков растворителя водой и аккуратно сушили теплым воздухом до постоянной массы.
Модификацией метода выпаривания в обращенной фазе является то, что вместо удаления органического растворителя и остатков воды под вакуумом, к гомогенному горячему раствору взятых компонентов при интенсивном перемешивании добавлялся большой избыток холодной воды, который приводит к осаждению образующихся при растворении липосом бетулина в виде мелкой эмульсии. Поскольку все 3 исходных компонента не растворимы в воде, они полностью выпадают в виде суспензии при добавлении к раствору холодной воды. При этом полученная масса липосом почти количественно совпадает с суммарной массой взятых исходных компонентов, что свидетельствует о ~50% содержании бетулина в липосомах.
Таким образом, в состав полученных липосом вошли три компонента: бетулин, лецитин и ланолин (таблица 1).
Размерность образующихся частиц дополнительно анализировалась методом фотонной корреляционной спектроскопии (статического и динамического рассеяния света) при помощи анализатора Photocor Compact.
Для измерения размерности образующихся первоначально при осаждении частиц был проведен аналогичный опыт и получен водный раствор эмульсии с выпавшими липосомами бетулина. При этом с учетом массы взятых компонентов и объема полученного конечного раствора, концентрация частиц в воде составила 0,002% (масс.). Результаты измерений представлены на фиг. 2 и в таблице 2.
Из представленных данных видно, что экспериментальные липосомы бетулина соответствуют одному из основных требований, которые предъявляются к препаратам подобного рода - являются наноразмерными. Кроме того, после фильтрования и сушки, они являются достаточно однородными, сыпучими, не слипаются. Дополнительные ИК-спектральные исследования полученных липосом и липосом, хранившихся в закрытой таре в течении 10 месяцев, не выявили никаких деструктивных изменений, что свидетельствует и об их устойчивости при хранении.
Отличительной особенностью предлагаемой заявки является получение стабильных порошкообразных липосом бетулина. Далее были проведены биологические испытания данной наносубстанции бетулина на базе лаборатории ветеринарии РАСХН СибНИИ Птицеводства (с. Морозовка, Омская область) на гепатопротекторную активность, которые выявили ее двукратную активность в сравнении с чистым бетулином.
Техническим решением заявляемого изобретения является легкое масштабирование технологического процесса от лабораторного до промышленного.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение липосом бетулина.
В стакан на 800 мл приливают 100 мл диоксана, нагревают до 80-90°С и при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке растворяют последовательно 13,65 г бетулина (~95% чистоты), 4,55 г лецитина и 6,8 г ланолина до полного растворения всех компонентов. Перемешивают около 3-5 минут и к прозрачному желтоватому раствору также при интенсивном перемешивании приливают тонкой струей 600 мл холодной дистиллированной воды. Образующаяся эмульсия отстаивается при комнатной температуре на ночь. Выпавший осадок светло-бежевого цвета фильтруют через несколько слоев хлопчатобумажной ткани под вакуумом водоструйного насоса, промывают примерно 2000 мл холодной воды от остатков растворителя, сушат теплым воздухом при температуре 80-90°С до постоянной массы и получения однородного сыпучего порошка светло-бежевого цвета. Получают около 25 г нанолипосом, которые после сушки представляют собой рассыпчатый порошок светло-серого цвета, слегка жирный на ощупь.
Пример 2. Исследование гепатопротекторной активности.
Для исследования гепатопротекторной активности бетулина (95% чистоты) и нанолипосомальной формы бетулина были отобраны 277-дневные куры-несушки с биохимическими показателями сыворотки крови, характерными для патологии печени: увеличение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и триглицеридов более, чем в 2,5 раза от верхней границы нормы. Из отобранных кур были скомплектованы контрольная и 2 опытные группы по 10 голов в каждой. Птицы 1 опытной группы получали бетулин (~95% чистоты), 2 опытной группы - бетулин с лецитином в липосомах. Испытуемые препараты применяли индивидуально через зонд в дозе 20 мг/кг (для бетулина в липосомах - 40 мг/кг) живого веса в течение 28 дней, предварительно размешав в заваренном картофельном крахмале для получения равномерной взвеси. Для моделирования равных условий куры контрольной группы получали равный объем заваренного картофельного крахмала без препаратов. Условия содержания и кормления во всех группах были одинаковы. По окончанию лечения кур в возрасте 305 дней от них были отобраны пробы крови для биохимического исследования и проведен убой с диагностической целью для отбора проб печени для гистологического исследования. Через 7 дней после применения препаратов от птицы 312-дневного возраста повторно были отобраны пробы крови для биохимических исследований.
Схема биологических испытаний представлена в таблице 3.
При гематологическом исследовании крови кур (таблица 4) в возрасте 305 дней (окончание дачи препаратов) количество эритроцитов в опытных группах превышало контроль на 4-12%. Количество гемоглобина у птиц опытных групп также было больше контроля на 10,9-64,2% с наибольшим результатом во 2 группе (бетулин в липосомах).
Таким образом, применение бетулина у птиц с признаками поражения печени стимулирует кроветворение и оксигенацию организма. После окончания лечения в возрасте 305 дней был проведен диагностический убой кур по 3 головы с группы. При этом были определены абсолютная и относительная массы печени и отобраны кусочки органа для гистологического исследования (таблица 5).
Абсолютная и относительная масса печени в 1 и 2 опытных группах была меньше, чем в контроле на 8,8-14,8 и 1,2-18,9% соответственно, что можно объяснить регенеративными процессами.
При гистологическом исследовании печени кур контрольной группы в цитоплазме гепатоцитов были обнаружены изменения в виде помутнения и зернистости при отсутствии некробиоза ядер, что является признаком клеточной дистрофии, как морфологического проявления нарушения обмена веществ (фиг. 3). Присутствие в инфильтрате эозинофильных лейкоцитов является признаком аллергической реакции. Расширение пространств Диссе является признаком отека.
У двух кур 1 опытной группы, получавших бетулин, гистологическая структура печени соответствовала структуре здорового органа (фиг. 4). У третьей головы в цитоплазме гепатоцитов отмечалась небольшая зернистость, что может указывать на слабо выраженные дистрофические изменения органа.
Отличие гистопрепаратов печени кур 2 группы (фиг. 5) от контроля заключалось в наличии у одной особи (№97) структуры печени соответствующей здоровому органу. У двух других особей гепатоциты находились в состоянии клеточной белковой дистрофии без признаков аллергической реакции.
Таким образом, проведенные гистологические исследования показали наличие выраженных в разной степени улучшений структуры органов у кур-несушек опытных групп. Лучший результат отмечен при применении бетулина в липосомах: после лечения которым у двух голов структура органа соответствовала норме, а у третьей изменения были незначительны.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1 - структурная формула молекулы бетулина;
Фиг. 2 - показывает результаты измерений размерности частиц при помощи анализатора Photocor Compact;
Фиг. 3 - печень кур контрольной группы. 1. В цитоплазме мелкие вакуоли. 2. Печеночные балки. 3. Цитоплазма мелкозернистая 4. Желчный проток печеночной триады. 5. Эозинофильные лейкоциты. Окраска гематоксилином Ганзена и эозином. Об. 40, ок. 10;
Фиг. 4 - печень кур 1 опытной группы. 1. Цитоплазма мелкозернистая. 2. Пространства Диссе расширены. Окраска гематоксилином Ганзена и эозином. Об. 40, ок. 10;
Фиг, 5 - печень кур 2 опытной группы. А - вена печеночной триады. 1. В цитоплазме гепатоцитов мелкие вакуоли. 2. Цитоплазма гепатоцитов однородная. 3 и 5. Лейкоцитарный инфильтрат 4. Пространства Диссе расширены. Окраска гематоксилином Ганзена и эозином. Об. 40, ок. 10;
Фиг. 6 - хроматограмма образца бетулина и соответствующие площади ликов.
Чистоту бетулина-сырца определяли методом ВЭЖХ-анализа (высокоэффективной жидкостной хроматографии) с помощью жидкостного хроматографа Agilent 1200 (с диодно-матричным детектором). Параметры хроматографирования:
• Колонка: Zorbax SB-C18, 2.1×150 mm, 3.5 мкм.
• Элюент: вода: ацетонитрил (5:95), элюирование в изократическом режиме.
• Температура колонки 40°С
• Объем пробы: 5 мкл.
3
• Скорость потока: 0.4 см/мин.
• Время анализа 30 мин.
УФ-детектирование велось на двух длинах волн: 210±16, 254±16 нм.
Было определено содержание бетулина в 95,95%.