СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРДИОМИОГЛОБИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ИММУНОСЕНСОРА
METHOD OF BLOOD PLASMA PROXIMATE ANALYSIS FOR CARDIOMYOGLOBIN BY MEANS OF ELECTROCHEMICAL IMMUNOSENSOR

Изобретение относится к области аналитической химии, электрохимиии и медицинской диагностики и касается методики экспресс-определения кардиомиоглобина в плазме крови с помощью электрохимического иммуносенсора.
Изобретение может быть использовано в медицинской практике для диагностики инфаркта миокарда (ИМ). Согласно статистике сердечно-сосудистые заболевания занимают первое место среди причин смерти населения в России (www.gks.ru) и вызывают почти половину из общего числа смертей в Европе (www.ehnheart.org). Неэффективность или недоступность систем ранней диагностики также напрямую влияет на ситуацию. За последние десятилетие большое количество исследований было направлено на идентификацию кардиомаркеров, которые могут быть использованы для диагностики при сердечных болях. Кардиомаркер - это биологическое вещество, повышение уровня которого в крови наблюдается в течение сердечно-сосудистого заболевания или сразу после повреждения сердечной мышцы [1]. На сегодняшний день известно 177 соединений-маркеров сердечно-сосудистых заболеваний и исследования в данной области продолжаются [2].
Определение биомаркеров в крови пациентов для диагностики ИМ стало стандартной процедурой в медицинской практике за рубежом и применяется в ведущих клиниках РФ. Тем не менее непрерывно ведется поиск новых кардиомаркеров, а также проводятся различные статистические исследования, подтверждающие эффективность тест-систем для диагностики ИМ. В настоящее время для диагностики ИМ широкое распространение получили тропонины I и Т, креатинкиназа-МВ и кардиомиоглобин. Сывороточные тропонины и креатинкиназа-МВ указывают на смерть клеток миокарда. Сывороточный кардиомиоглобин - один из наиболее ранних биомаркеров ИМ. Кардиомиоглобин - гемопротеин с молекулярной массой 17800 и благодаря своим маленьким размерам он быстро выделяется из поврежденной ткани в кровь. Его период полураспада в плазме всего 8.9±1.5 мин. Среди пациентов с острым периодом ИМ общая картина изменения концентрации кардиомиоглобина в плазме схожа с зависимостями для креатинкиназы-МВ и тропонинов. Однако высвобождение тропонинов и креатинкиназы-МВ более медленное, что позволяет обнаружить их в крови только через 4-6 часов после появления симптомов, у некоторых пациентов повышение уровня этих маркеров не проявляется в течение 12 часов. Сывороточный кардиомиоглобин появляется в крови в пределах от 1 до 4 часов. Сывороточные концентрации кардиомиоглобина повышаются после повреждения различных тканей (особенно скелетных мышц) или принятия кокаина, либо у пациентов с почечной недостаточностью за счет снижения клиренса (коэффициента очищения). Тем не менее ранний скачек уровня кардиомиоглобина и его способность определять острый ИМ раньше других биомаркеров компенсирует эти недостатки, особенно в комбинации с тропонинами и креатинкиназой-МВ, а также проведением серии тестов [3, 4].
В различных источниках пороговые концентрации кардиомиоглобина в крови, превышение которых свидетельствует об ИМ, варьируются в достаточно широких пределах (от 70-90 мкг/л [5-8] до 200 мкг/л [9]) и, по всей видимости, зависят от индивидуальных особенностей организма. Однако среднего порогового значения 100 мкг/л придерживаются большинство исследователей [10-14].
На сегодняшний день на рынке представлены следующие тесты и системы настольного иммуноанализа белков-кардиомаркеров, выпускаемые зарубежными производителями: Stratus CS STAT (Dade Behring Inc), i-STAT (Abbott), Triage Cardiac Panel (Biosite), RAMP (Response Biomedical Corp), Cardiac Reader™ (Roche), PATHFAST (Mitsubishi Chemical Europe GmbH), MGL-CHECK-1 (Vedalab), HEXAGON TROPONIN (HUMAN GmbH).
Опубликованные работы по определению кардиомиоглобина - это «сендвичевый» иммуноанализ. Метод основан на селективном связывании белков-маркеров соответствующими антителами, закрепленными на поверхности датчика. Детекция сигнала осуществляется за счет второго покровного слоя антител с различными метками (Табл. 1).
Однако все вышеперечисленные методики являются достаточно сложными, требующими больших затрат времени. Ни одна из них не разрешена на сегодняшний день к клиническому применению. Как видно из представленных данных, только одна методика иммуноанализа адаптирована для работы с кровью. Никто из авторов не приводит данных о работе с реальными образцами больных с ИМ. Точность и другие аналитические характеристики определения в данном случае будут зависеть от множества факторов: активности самих антител, фермента-метки, концентрации субстратов и т.д.
Редокс-активность железа гема служит своего рода маркером гемопротеинов и дает возможность как для их непосредственного определения, так и для воздействия извне на активный центр фермента. Миоглобин принадлежит семейству гемопротеинов - электроактивных белков, молекулы которых содержат ион железа. Эффект прямого переноса электрона с электрода на железо гема широко используется при создании электрохимических сенсоров на пероксид водорода и нитрит-ион. Для его регистрации и модификации поверхности электрода используются ПАВы [19-21], полимерные гидрогели [21], мембраноподобные комплексы полиэлектролитов и др.
Целью настоящего изобретения является разработка методики определения кардиомиоглобина в образцах плазмы крови с помощью электрохимического иммуносенсора. Способ получения электрохимического иммуносенсора для прямого определения кардиомиоглобина описан в патенте [22]. Ранее была показана возможность селективного определения кардиомиоглобина в буферных растворах. Проведение экспресс-анализа кардиомиоглобина в образцах плазмы крови потребовало значительных доработок методики определения и изготовления иммуносенсоров. Основными задачами были: 1) повышение чувствительности определения и 2) значительное сокращение времени анализа.
В отличие от большинства зарубежных исследователей, реализующих «сэндвичевую» схему анализа, предлагаемый метод основан на собственной электроактивности кардиомиоглобина и прямой детекции специфического взаимодействия между молекулами гемопротеина и соответствующими антителами. Предложена схема прямой регистрации миоглобина за счет прямого переноса электрона с электрода на ион железа гема, катализируемого кислородом воздуха:
Свой вклад в усиление сигнала вносят:
1) золотые наночастицы;
2) стабилизатор золотых наночастиц - ДДАБ, сорбирующий кислород из фонового электролита;
3) метод регистрации сигнала - квадратно-волновая вольтамперометрия.
Необходимость использования антител обусловлена задачей селективного определения кардиоизоформы фермента, высвобождающегося в кровь при повреждении сердечной мышцы. Аналитическим сигналом служит величина регистрируемого тока переноса электрона с железа гема на поверхность графитового электрода, модифицированного наночастицами золота. Нанесенные на поверхность электрода коллоидные частицы золота работают как ансамбль из микроэлектродов и позволяют не только увеличить площадь активной поверхности сенсора, но и улучшить соотношение сигнал/шум. Переход от плоского электрода к системе микроэлектродов с радиусами, соизмеримыми с толщиной диффузионного слоя, приводит к возникновению краевого эффекта, когда величина предельного тока прямо пропорциональна радиусу микроэлектрода.
ПРИМЕР 1. Методика приготовления коллоидного раствора золота
Приготовление раствора золотохлорводородной кислоты.
4
2
Взвешивают (3.9) мг трехводной золотохлорводородной кислоты (HAuCl×3НО), переносят навеску в эппендорф и растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в эппендорфе при 4°С не более 1 месяца.
Приготовление раствора диметилдидодециламмоний бромида (ДДАБ) (0.1 М).
Взвешивают (46.3) мг диметилдидодециламмоний бромида, переносят навеску в эппендорф и растворяют в 1 мл хлороформа. Раствор хранят в эппендорфе при 4°С не более 1 месяца.
Приготовления раствора боргидрида натрия (0.4 М).
Взвешивают (15.2) мг боргидрида натрия, переносят навеску в эппендорф и растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Раствор не хранят.
Приготовление коллоидного раствора золота (5 мМ).
Круглодонную колбу закрепляют на штативе над магнитной мешалкой. В колбу с помощью пипетки переносят 1 мл 0.1 М раствора ДДАБ. При интенсивном перемешивании к раствору ДДАБ прибавляют 0.5 мл 10 мМ раствора золотохлорводородной кислоты, отобранного пипеткой. Затем при интенсивном перемешивании по каплям прибавляют 0.2 мл свежеприготовленного раствора боргидрида натрия. Через 2 часа окрашенный органический слой отделяют от воды.
ПРИМЕР 2. Изготовление электрохимических иммуносенсоров на кардиомиоглобин в плазме крови.
Приготовление 6 М NaOH
Взвешивают (24.0) г гидроксида натрия, переносят навеску в мерную колбу на 100 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в пластиковой посуде под тягой не более 1 месяца.
Приготовление фосфатного буферного раствора
2
4
Взвешивают (1.33) г дигидрофосфата калия (KHPO) и (0,29) г хлорида натрия (NaCl). Навески солей переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения солей. На рН-метре при помощи 6 М раствора NaOH доводят рН до 6.5. Раствор хранят в пластиковой посуде с плотно закрытой крышкой при 4°С не более 1 месяца.
Приготовление раствора антител к кардиомиоглобину
Исходный раствор антител к кардиомиоглобину (фирма USBio, США, кат. № М9800-16А) разбавляют в 10 раз фосфатным буферным раствором рН 6,5±0,1. В пробирку «эппендорф» переносят аликвоту 10 мкл раствора антител и прибавляют 90 мкл буферного раствора. Раствор хранят в пробирке «эппендорф» при -20±2°С не более 1 месяца.
Приготовление электрохимических биосенсоров на кардиомиоглобин
На поверхность рабочего графитового электрода (изготовленного с использованием углеродной пасты фирмы «Gwent», Англия; изготовитель фирма «Русенс», Москва) наносят 1 мкл свежеприготовленного коллоидного раствора золота (5 мМ). Дают хлороформу испариться в течение 10 мин. Затем наносят 1 мкл раствора антител, дают капле подсохнуть 10 мин и выдерживают биосенсор в холодильнике с температурой 4±2°С в течение ночи. Биосенсоры хранят при 4±2°С не более 1 месяца.
ПРИМЕР 3. Измерения концентрации кардиомиоглобина с помощью электрохимического иммуносенсора в образцах плазмы крови.
Подготовка к измерению
На рабочую поверхность электрохимического биосенсора с помощью пипетки наносят 1 мкл исследуемого образца плазмы крови и помещают в сушильный шкаф с температурой 37±1°С на 15 мин.
Параметры измерения сигнала
В программе к прибору устанавливают следующие параметры измерения сигнала (фиг.1):
Метод: Квадратноволновая вольтамперометрия;
Время инкубации: 900 с;
Частота: 10 Гц;
Начальный потенциал: 0.1 В;
Конечный потенциал: -0.6 В;
Шаг потенциала: 0.005 В;
Амплитуда: 0.020 В;
Измерение сигнала
В ячейку вносят 1 мл фосфатного буферного раствора. Закрепляют биосенсор с нанесенной пробой в измерительной ячейке, опускают в буферный раствор и запускают процедуру измерения сигнала. Полученную вольтамперометрическую кривую запоминают в виде самостоятельного файла.
Расчет концентрации миоглобина
max
Если на полученной вольтамперограмме наблюдается пик (E=-200…-300 мВ), то с помощью программы к прибору производят определение площади полученного пика восстановления миоглобина. По построенному ранее градуировочному графику определяют концентрацию миоглобина, соответствующую полученному значению площади пика.
ПРИМЕР 4. Определение кардиомиоглобина в образцах плазмы крови больных с инфарктом миокарда и здоровых доноров.
Разработанный биосенсор и методика экспресс-определения кардиомиоглобина были протестированы на 5 образцах плазмы больных и здоровых людей. В таблице 2 приведены значения концентраций кардиомиоглобина, полученные сразу после забора крови с помощью системы RAMP (Response Biomedical Corp), для каждого из образцов согласно инструкции к прибору. Полученные образцы хранили при -70±2°С и размораживали непосредственно перед проведением измерений.
Таблица 2
Характеристики образцов плазмы
ID образца
Концетрация кардиомиоглобина, нг/мл
0001
120±12
0002
94±9
0004
118±12
К-001
57±7
К-002
18±2
На приведенных ниже фиг.1 и 2 представлены типичные квадратно-волновые вольтамперограммы восстановления железа гема кардиомиоглобина, полученные согласно разработанной методике экспресс-анализа для разных образцов: сыворотки крови без кардиомиоглобина (контрольный образец), сыворотки крови с 14 µM кардиомиоглобином, а также образца плазмы больного ИМ (ID 0001) (фиг.1), а также показана линейная зависимость между концентрацией кардиомиоглобина, определенной с помощью анализатора RAMP (Response Biomedical Corp, Канада) и сигналом иммуносенсора (площадью пика восстановления железа гема кардиомиоглобина), полученным согласно разработанной методике (фиг.2).