ПРОБЛЕМЫ СТАБИЛИЗАЦИИ ЦЕННЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ BACILLUS THURINGIENSIS - ПРОДУЦЕНТОВ ЛАРВИЦИДНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ

26

УДК 632.953

ПРОБЛЕМЫ СТАБИЛИЗАЦИИ ЦЕННЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ BACILLUS THURINGIENSIS - ПРОДУЦЕНТОВ ЛАРВИЦИДНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ

О.В. Смирнов, С.Д. Гришечкина

Всероссийский НИИ сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург

Рассмотрены проблемы сохранения ценных свойств штаммов энтомоцидной бактерии Bacillus thuringiensis var. israelensis (Н14). Биопрепараты на ее основе эффективны против личинок комаров и мошек, а также рисового и шампиньонного комариков. Показано, что разные способы хранения модельных штаммов ВТ в различной степени способны обеспечить энтомоцидную активность, продуктивность и стабильность культур. Обосновывается целесообразность хранения перспективных штаммов разными способами при обязательной оценке физиологического статуса диссоциантов (включая биопробы на их целевую активность) и проведения поддерживающей селекции штамма перед его использованием в качестве продуцента биопрепаратов.

Микробиологический метод борьбы с вредными насекомыми служит альтернативой применению химических пестицидов. Основой энтомоцидных биопрепаратов является тот или иной микроорганизм, который должен совмещать стабильно высокие показатели эффективности против целевого объекта-вредителя (сопоставимой с активностью химического инсектицида, предназначенного для борьбы с тем же вредителем) и технологичности (которая позволяет гарантированно получать стандартный продукт при уровне рентабельности, также сопоставимом с химическим эталоном). Источники пополнения производственных штаммов могут быть различны: выделение из природных объектов, скрининг коллекций, селекция ранее используемых штаммов, мутагенез, генетическая инженерия и др. (Кандыбин, 1989), но безотносительно от методов получения таких штаммов неизбежно встает вопрос о сохранении их полезных свойств. Действительно, успех выделения перспективного штамма при скрининге отнюдь не гарантирован, а генетическое конструирование продуцентов - это в высшей степени дорогой наукоемкий метод, поэтому сохранение имеющихся производственных штаммов имеет большое практическое значение.

Предметом настоящей работы является изучение этой проблемы на примере Bacillus thuringiensis Н14. Препараты

энтомоцидного назначения на основе ВТ выпускаются давно, однако мировой опыт использования этой бациллы как экологически безопасного средства контроля вредных насекомых в течение ряда десятилетий был связан по преимуществу с контролем чешуекрылых-фитофагов при наземном способе применения. Сравнительно недавно была установлена разновидность ВТ, подвид israelensis, обладающий специфическим действием на личинок двукрылых насекомых, что открыло путь к новой сфере применения ВТ - против кровососущих комаров и мошек в местах их выплода, то есть в водоемах различного типа, а также против рисового и шампиньонного комариков (Кандыбин, 1989, 1990; Кандыбин и др., 1986,1988; Смирнов и др., 1990). Естественно, что при новом приложении ВТ приходится пересматривать многие аспекты технологии применения, проблемы персистентности этой бактерии в природе, предъявлять новые требования к препаративной форме, отличные от препаратов ВТ наземного применения (Смирнов, Гришечкина, 1989,1994; Смирнов и др., 1990). Однако эти усилия компенсируются появлением нового класса препаратов, не загрязняющих водные ресурсы, безвредных для нецелевых объектов, высокоэффективных в водоемах любого типа и во всех ландшафтно-географических зонах и абсолютно безопасных (подобно другим препаратам ВТ) для человека. В на-

Вестник защиты растений, 1, 2009 стоящее время во всем мире разработано немало бактериальных ларвицидов, в основе которых тот или иной штамм ВТ Н14. Одним из первых таких препаратов был бактокулицид, разработанный во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии (Кандыбин, 1989,1990; Смирнов и др., 1990).

Настоящие исследования предприняты в связи с необходимостью изучения изменчивости штаммов-продуцентов бактокулицида при различных способах

хранения.

С целью расширения сведений о спектре изменчивости ВТ israelensis при хранении в настоящей работе был использован широкий круг способов хранения на примере двух модельных штаммов. Для оценки изменчивости брался комплексный критерий, охватывающий все стороны практически ценных свойств продуцентов: ларвицидная активность, продуктивность и стабильность штамма.

Методика

В работе были использованы два штамма ВacШus thuringiensis Н14 под рабочими номерами 0011 и 0012.

Культуры были заложены на хранение различными способами:

1) на скошенном агаре при 4-5°С с пересевом каждые 6 месяцев на агаровые среды:

а) мясопептонный агар,

б) солевая среда Никкерсона (Nickerson, Bulla, 1974),

в) "регламентная" среда (состав среды является "ноу хау" ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии);

2) в лиофильно-высушенном состоянии в ампулах при 4-5°С. В качестве суспензионной среды использовалась молочная сыворотка,

3) в жидком азоте (криохранение),

4) в кристаллах хлористого натрия,

5) под вазелиновым маслом,

6) в трупах личинок комаров.

Штаммы ежегодно проверялись на продуктивность и ларвицидную активность согласно графику анализа их свойств. Перед анализом культуры рассевали на МПА в чашки Петри и отбирали типичные колонии, которыми засевали колбы с жидкой "регламентной средой". Культуры выращивали на качалке при 220 об/мин в течение 72 часов при 28°С.

Продуктивность определяли общепринятым методом серийных разведений.

Ларвицидную активность оценивали по значению ЛК50 на личинках комаров Aedes aegypti L4.

Анализировали также изменчивость штаммов по критерию формирования атипичных морфолого-колониальных фенотипов на рассевах культур при просмотре не менее 1000 колоний с оценкой продуктивности и активности атипичных вариантов.

Результаты

Экспериментальные результаты по испытанию модельных штаммов, хранившихся на агаровых средах в течение трех лет, представлены в таблице 1. Из данных этой таблицы видно, что оба штамма постепенно утрачивали свои ценные свойства: показатели их продуктивности и ларвицидной активности со временем снижались. Типология фенотипов культур ВТ Н14 по морфологии колоний приведена в таблице 2.

Отмечено, что наибольшая стабильность наблюдалась на солевой среде Никкерсона, на которой у обоих штаммов имело место меньшее разнообразие фенотипов морфолого-культуральной изменчивости. *Обозначение морфотипов коло-

исследовании

ний ВТ Н14 в таблице 2. Морфотипы колоний 6 и 7 не встречались. (табл. 3).

Таблица 1. Продуктивность и ларвицидная активность ВТ Щ4 при хранении _на агаровых средах_

Продуктивность в КЖ

ЛК50, % К^К х10-3 для L4

Среды Штамм (млрд спор/мл) ^^вз^^ч ^

Срок хранения

1 2 3 1 2 3

МПА 0011 0012 3.0 3.1 3.0 3.0 1.7 2.2 0.13 0.16 0.14 0.17 0.16 0.18

Регламентная 0011 0012 2.6 3.1 2.6 3.1 1.5 2.0 0.21 0.19 0.22 0.20 0.23 0.21

Ник-керсона 1 2 1—1 1—1 о о 00 2.8 3.1 2.8 2.9 1.8 1.9 0.20 0.15 0.22 0.16 0.25 0.18

_Таблица 2. Типы морфолого-культуральной изменчивости_

Типы Характеристика морфотипов

1 Колонии серовато-белые, плоские, неправильной формы, округлые или овально-вытянутые, поверхность мелкошероховатая, матовая, край гладкий или волнистый. Об_разует споры и кристаллы._

2 Колонии матовые, серовато-белые, неправильной формы, ветвистые, край лопастной, зубчатый. Образует споры, кристаллов нет.

3 Колонии серовато-белые, плотные, неправильной формы, поверхность мелкошерохова-_тая, матовая, край складчатый. Образует споры, кристаллов нет._

4 Колонии сложной секторной морфологии. Одна часть (а) соответствует типу 1, другая _менее плотная (б), полупрозрачная, серовато-бежевая. Образует споры и кристаллы._

5 Колонии плоские, неправильной формы, округлые или овальные, поверхность матовая. Пигментированные (оранжевые), край гладкий или волнистый. Образует споры, кри-

_сталлов нет._

6 Колонии округлые, матовые, край гладкий или волнистый. В середине пигментирован_ные (желтые) маслянистые вкрапления. Образует споры, кристаллов нет._

7 Колонии округлые, матовые, серо-бежевые, полупрозрачные, край гладкий или волни-_стый. Образуют споры и кристаллы._

8 Колонии бледные, прозрачные, округлые или овальные, неправильной формы с плотны_ми матовыми бугорками. Образует споры, кристаллов нет._

Сравнительный анализ сохранности полезных свойств двух модельных штаммов на агаровых средах подтвердил преимущество МПА как классической среды для хранения культур ВТ.

В таблице 4 показаны данные по хранению модельных штаммов различными способами в течение трех лет, из которой видно, что наилучшие показатели дают способы хранения ВТ Н14 в кристаллах хлористого натрия, в лиофильно-высушен-

ном состоянии и криохранение. При этом сопоставление результатов показывает, что при лиофилизации культур и при хранении в кристаллах хлористого натрия их изменчивость была несколько ниже, чем при криохранении.

Исходные данные: продуктивность штамм 0011 - 3.49 млрд спор/мл, штамм 0012 - 3.80 млрд спор/мл, ЛК50 штамм 0011 - 0.10% КЖ х10-3, штамм 0012 - 0.11% КЖ х10-3.

Таблица 3. Диссоциация культуры ВТ Н^ при хранении на агаровых средах

Среды

Штамм

Год хранения

Частота встречаемости морфотипов колоний (%)*

1

2

3

4

МПА

0011

99.9 98.1

98.5

0.1

0.1

0.2

1.8 1.2

0012

99.1

88.2 96.6

0.1 11.8 1.6

0.8

1.8

Никкерсона

0011

99.9 100 97.9

0.1

0.1

0.1

1.9

0012

98.9 99.8 99.3

0.1

1.0

0.2 0.7

Регламентная

0011

99.9 98.1 99.7

0.1

0.1

1.7

0.2

0.2

96.4 98.2 96.1

3.6 1.6

3.8

0.2 0.1

8

5

Таблица 4. Влияние различных способов хранения ВТ Н14 на продуктивность _и ларвицидную активность_

Продуктивность в КЖ ЛК50, % КЖ х10-3 для L4 Aedes

„ _ ттт (млрд/мл) aegypti через 24 часа

Способы хранения Штамм -i--р"-—г—--

Срок хранения

1 2 3 1 2 3

В кристаллах 0011 3.1 2.9 2.8 0.14 0.14 0.15

хлористого натрия 0012 3.2 3.0 2.9 0.13 0.13 0.14

В лиофильно- 0011 3.1 2.4 2.4 0.11 0.12 0.12

высушенном состоянии 0012 2.9 2.6 2.6 0.11 0.12 0.13

Криохранение 1 2 1—1 1—1 о о 00 3.0 3.1 2.7 2.8 2.4 2.5 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14 0.14

В трупах личинок 0011 1.9 2.0 1.9 0.13 0.14 0.29

комаров 0012 1.7 1.6 1.7 0.12 0.13 0.29

Под вазелиновым 0011 1.9 1.9 1.8 0.15 0.18 0.19

маслом 0012 1.8 1.8 1.7 0.17 0.18 0.18

Хуже всего штаммы хранились в трупах личинок комаров и под вазелиновым маслом. При этих способах хранения отмечена наибольшая диссоциация обоих штаммов с появлением максимального количества морфолого-колониальных фенотипов.

При анализе культур после рассевов при хранении различными способами выявлены различные типы морфолого-куль-туральной изменчивости. Применительно к изучаемым штаммам характеристика мор-фотипов ВТ Н44 приведена в таблице 5.

Эта типология, естественно, не является абсолютной и может включать переходные формы, а также малозначимые, редко встречаемые варианты. Однако, с точки зрения селекционных критериев при стабилизирующем отборе продуцентов эти данные интересны. Очевидно, что отбирать в качестве продуцента бактокулицида целесообразно высокоактивный по ларвицид-ному эффекту тип 1, обладающий к тому же стабильной продуктивностью.

Многолетние наблюдения за изменчивостью модельных штаммов ВТ Н44 при различных способах хранения можно обобщить, связывая вышеописанные (табл. .2) морфоло-го-колониальные фенотипы, морфотипы культур со способами и сроками их хранения.

Эти данные обобщены для агаровых сред в таблице 3, а для ряда других способов хранения в таблице 6.

Полученный экспериментальный материал свидетельствует о том, что при хранении ВТ Н44 происходит диссоциация культуры на различные популяции, характери-

зующиеся значительными различиями по своим биологическим свойствам.

Таблица 5. Продуктивность и ларвицидная активность различных морфотипов ВТ Н14 на "регламентной" среде

Морфо-типы Продук- ЛК50, % К^К

Штамм тивность в КЖ х10-3 для L4 Aedes aegypti

колоний* (млрд/мл) через 24 часа

1 0011 3.5 0.12

0012 3.6 0.11

2 0011 2.0 0

0012 2.0 0

3 0011 1.5 0

0012 1.5 0

4а 0011 3.0 0.15

0012 3.1 0.12

4б 0011 1.0 0.14

0012 1.5 0.13

5 0011 2.7 0

0012 2.8 0

6 0011 1.9 0

0012 1.8 0

7 0011 2.1 0.14

0012 2.1 0.14

8 0011 2.5 0

0012 2.6 0

*Обозначения морфотипов колоний ВТ Н14

в таблице 2.

На первый взгляд имеет место парадоксальное явление: хранение, то есть биоконсервация, призванное стабилизировать свойства штамма, оказывается само по себе фактором, провоцирующим появление разнообразия свойств, не все из которых к тому же оказываются практически ценными.

Таблица 6. Диссоциация культуры ВТ Н14 _в зависимости от способа хранения_

Способы ттт Срок Частота встречаемости (%) морфотипов колоний*

хранения хранения 1 2 3 4 5 6 7 8

В кристаллах 1 99.8 0.1 0.1

хлористого на- 0011 2 99.6 0.4

трия 3 89.2 10.8

1 96.5 3.5

0012 2 97.1 2.9

3 98.2 1.8

В лиофильно- 1 100

высушенном со- 0011 2 95.9 4.1

стоянии 3 76.3 0.1 23.6

1 95.9 4.1

0012 2 94.6 5.4

3 89.9 0.2 9.8 0.1

В трупах личи- 1 87.6 2.7 7.9 1.8

нок комаров 0011 2 80.1 3.0 10.1 6.8

3 89.6 1.0 0.8 6.3 2.3

1 98.7 0.8 0.5

0012 2 81.1 2.3 1.1 15.5 2.0

3 71.0 3.3 15.0 9.4 1.3

Криохранение 1 65.2 33.3 0.2 0.3

0011 2 71.2 28.6 0.2

3 78.7 0.1 0.1 21.0 0.1

1 93.8 6.2 0.1

0012 2 89.2 0.1 10.5 0.1 0.1 0.1

3 83.5 15.9 0.4 0.2

Под вазелино- 1 85.5 0.4 12.6 0.6 0.9

вым маслом 0011 2 89.1 0.2 8.9 0.8 1.0

3 89.0 0.1 0.2 10.0 0.7

1 95.3 0.1 4.3 0.1 0.1 0.1

0012 2 75.5 0.3 22.5 0.7 1.0

3 94.7 5.3

*Обозначение морфотипов колоний ВТ Н14 в таблице 2.

Однако, это явление вполне объяснимо изначальной генетически обусловленной гетерогенностью свойств культуры, закладываемой на хранение. Часть вариантов может адаптироваться к данным условиям биоконсервации и пережить их в течение всего срока, на который культура заложена на хранение, другие варианты элиминируются на том или ином его этапе, подвергаясь тем самым опосредованному процессу естественного отбора. При выводе штамма из состояния анабиоза и анализе его свойств на твердых и жидких питательных средах каждый такой этап сопровождается дальнейшим отбором вариантов культуры, при которых не обязательно выживают наиболее ценные в практическом отно-

шении диссоцианты. Любые пересевы или регидратация культур ВТ сказываются на проявлении ее изменчивости (Ягудин и др., 1983). Эти проблемы неоднократно затрагивались при сопоставлении различных способов хранения ВТ в аспекте изменчивости ее свойств и различий в жизнеспособности диссоциантов (Хачатурян и др., 1980; Ануфриев, 1981; Ануфриев и др., 1981; Смирнов, Гришеч-кина, 1988,1989; Smirnov, Grishechkma, 1988). Эти работы увязаны с практическим использованием ВТ в качестве основы биопрепаратов. Для биоконсервации культур ВТ использовались различные способы - от таких методически простых как сохранение биоматериала в трупах погибших насекомых (с теми или иными

Вестник защиты растений, 1, 2009 модификациями этого простейшего способа) до методически более трудоемких, с привлечением технических присобле-ний (криохранение, лиофилизация, кон-тактно-сорбционное обезвоживание) (Хачатурян и др., 1980; Талалаев, Гутман, 1981; Ягудин и др., 1989). По мере расширения практического применения ВТ и создания на ее основе разнообразных препаратов в работу вовлекались все новые ее штаммы, относящиеся к различным подвидам: dendrolimus (Талалаев, Гутман, 1981; Барайщук, 1981; Барайщук и др., 1981; Кашкова, 1981; Кулагин и др., 1985), galleria (Троицкая, 1979), caucasicus (Хачатурян и др., 1980; Чил-Акопян, Африкян, 1987), что соответствовало этапам разработки биопрепаратов дендробациллин, энтобактерин, БИП и др. Создание препарата битоксибациллин вызвало к жизни исследования изменчивости подвида thuringiensis (Барбашова, Владимирова, 1976; Кандыбин, 1989), а разработка бактокулицида и его аналогов на основе подвида israelensis стимулировала изучение изменчивости при хранении у этой группы бацилл (Смирнов, Гришечкина, 1988,1989; Smirnov, Grishechkina, 1988,1989).

Результаты этих исследований показывают, что хранение штаммов ВТ, как правило, сопровождается ухудшением практически ценных свойств штаммов. Снижение их энтомоцидной активности связывалось с деструктивными процессами в спорах (Талалаев, Гутман, 1981). При сопоставлении 11 способов хранения ВТ subsp. galleria отмечено, что ни один из них не обеспечивает полной стабилизации исходных свойств культуры (Троицкая, 1979). Длительное хранение приводило к потере культурами инсектицидных свойств и к изменению морфоло-го-культуральных и биохимических признаков. Отмечено снижение жизнеспособности при хранении штаммов ВТ. Так, лиофилизированные споры ВТ subsp. dendrolimus уступали по этому критерию биоматериалу, высушенному на воздухе (Ягудин и др., 1983). При хранении может происходить нарушение споро- и

кристаллообразования и другие физиологические изменения культуры (Ануфриев, 1982). Все это связано с диссоциацией культуры, вскрывающей генетическую неоднородность ее составляющих. Процесс диссоциации может идти спонтанно, усиливаясь в более старых культурах, и интесифицироваться при пересевах (Кашкова, 1981). Диссоцианты ВТ обнаруживают значительные различия по своим физиологическим свойствам (табл. 6) и, следовательно, и по тем качествам, которые делают тот или иной вариант пригодным для производства биопрепарата. Физиологические отличия диссоциантов проявляются и в морфологическом фенотипе культур, причем увязка морфолого-культуральных и ценных свойств варианта ВТ имеет практическое значение (Барайщук, 1981).

При изучении изменчивости ВТ subsp. israelensis (Барбашова и др., 1985) установлен четыре морфологических фенотипа колоний и продемонстрирована предпочтительность хранения этой культуры в кристаллах хлористого натрия. В настоящей работе был использован более широкий набор способов хранения ВТ Н14 , что позволило описать большее количество морфолого-колониальных фенотипов. К тому же, энтомоцидные свойства ВТ определяются не только уровнем биосинтеза эндотоксина, но и наличием спор (Талалаев, Гутман, 1981; Кандыбин, 1989), а в ряде штаммов, например у subsp. thuringiensis (основы битоксиба-циллина), также и их способностью к синтезу экзотоксина. Причем генетические детерминанты синтеза указанных токсинов локализованы не только в "хромосоме" бациллы, но и на одной или нескольких из ее многочисленных плаз-мид. Все эти свойства будут вовлекаться в интенсивные процессы отбора, переживаемые культурой при хранении, и в последующем использовании в производстве.

Таким образом, некий штамм, показавший после длительного хранения высокую продуктивность, может утратить способность к синтезу, например, кри-

сталлов эндотоксина в силу утраты соответствующей плазмиды, несущей ген, детерминирующий биосинтез эндотоксина. Для управления объективно протекающими процессами диссоциации, в том числе и в аспекте генетической детерминации токсинообразования, и во избежание ее негативных следствий для практики вырабатываются селекционные критерии, увязывающие физиологические свойства культуры с теми или иными ее характеристиками.

Вопрос о соотношении морфолого-колониального фенотипа того или иного варианта культуры с ее физиологическими параметрами, а тем самым и с критически ценными свойствами ВТ, широко дискутируется (Ануфриев, 1981; Ануфриев и др., 1981; Барайщук, 1981; Барайщук и др., 1981; Кулагин и др., 1982; Smirnov, Grishechkma, 1988).

Форма, консистенция, цвет (или пигментация) колонии, характер ее роста, а также те или иные биохимические характеристики находят свои корреляты со свойствами штамма как продуцента. Такие связи представляются совершенно естественными, поскольку физиологические и биохимические различия вариантов могут оказаться решающими факторами в освоении бактериями питательных сред, а следовательно и отражаться на таких практически значимых свойствах, как способность культуры к росту (то есть технологичность) или на выработке определенных метаболитов (в т.ч. и

Вестник защиты растений, 1, 2009 с энтомоцидным или ларвицидным действием). Сведения о корреляции этого рода - неоценимый показатель для отбора продуцентов биопрепаратов ВТ.

Однако, следует принимать во внимание, что Вacillus thuringiensis представляет собой политипический вид, многочисленные подвиды, сероварианты и па-тотипы которого имеют существенные различия, в т.ч. и в аспекте генетической детерминации токсинообразования (Спс-ктопе ег а1., 1998; Lecadet ег а1., 1999). Так, номенклатура ВТ в качестве политипического вида может строиться не только на основе Н-антигена, но и с учетом сгу-генов. Идентификационные критерии основываются на различной реакции штаммов на значительное (свыше 60) количество биохимических тестов. Очевидно, что какие-то штаммы или подвиды ВТ будут иметь корреляты практически ценных свойств с одними биохимическими характеристиками культуры, другие - с какими-то иными показателями физиолого-биохимических свойств ВТ.

Эти же различия играют свою роль и в адаптации бактерий к разным условиям хранения. Систематизация этих, пока еще разрозненных данных послужит не только для узких биотехнологических целей подготовки производственного штамма к наработке биопрепарата, но и для широкого целенаправленного скрининга культур с заданными свойствами ларви-цидного или энтомоцидного действия.

Изменчивость культур бактерий, в том числе и ВТ Н14, - это их объективное качество, связанное с адаптацией к различным, иногда быстро сменяющим друг друга условиям. Ее гетерогенность особенно отчетливо проявляется при переходах с твердых сред на жидкие или из состояния анабиоза к интенсивному размножению (именно на этом основан метод анализа изменчивости культур при рассевах в чашки Петри). Следовательно, появление атипичных форм, в том числе и при хранении штаммов, имеет вполне

закономерный характер.

Практическим следствием из этого факта может быть следующее. Полученные данные по предпочтительности хранения ВТ Н14 способами криохранения, лиофилизации или в кристаллах хлористого натрия следует не противопоставлять друг другу, а использовать в дополнении один к другому, одновременно с осуществлением анализов культуры на рассевах, биотестирования и оценок ее продуктивности перед сезоном наработки бактериального ларвицидного препарата.

Вестник защиты растений, 1, 2009 Очевидно, что ни один метод хранения не в состоянии стабилизировать все стороны полезных свойств продуцентов.

Дополнительно об этом свидетельствуют представленные данные о штаммо-вых различиях ВТ Н14 при хранении, полученные в ходе исследования двух модельных штаммов. При хранении ВТ subsp. galleriae были отмечены штаммо-вые различия в сохранении культурами исходных биохимических свойств (Троицкая, 1979). Очевидно, что такое различие между штаммами в сохранении того или

иного рода ферментативной активности или свойств при биоконсервации показывает, что одни штаммы лучше сохраняются одними способами, а другие - иными.

Несомненно, что привлечение новых методов хранения культур, увеличение сроков их хранения, а также вовлечение в работу нового круга штаммов расширят знания по изменчивости ВТ как исключительно интересной в практическом отношении группы бацилл - основы экологически безопасных энтомоцидных биопрепаратов.

Ануфриев Л.Ф. Сохранение свойств спорообра-зующих бактерий // Использование микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесном хозяйстве. Иркутск, 1981, с. 41-44.

Ануфриев Л.Ф., Ильинский О.П., Шаяхметова Т.А. Состав и свойства колоний бацилл группы thuringiensis var.dendrolimus // Там же, с. 35-41.

Барайщук Г.В., НовоченкоЕ.П., Завезенова Т.В. Физиолого-биохимические особенности диссоциативных вариантов бацилл группы thuringiensis // Там же, с. 16-26.

Барайщук Г.В. К характеристике диссоциативного процесса в штаммах бацилл группы thuringiensis // Там же, с. 26-34.

Барбашова Н.М., Владимирова Г.А. Влияние условий культивирования Bacillus thuringiensis на образование и накопление б-экзотоксина // Вопросы экологии и физиологии микроорганизмов, используемых в сельском хозяйстве. Л., 1976, с. 122-130.

Барбашова Н.М., Кандыбин Н.В., Ермолова В.П. Влияние условий хранения на состав популяции и биологическую активность Bacillus thuringiensis Н14 266/2 // Бюлл. ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, Л., 1985, 40, с. 38-42.

Кандыбин Н.В. Экологически эффективные средства контроля численности комаров и мошек Bac. thuringiensis и Bac. sphaericus // Микробиологические аспекты охраны среды обитания в условиях интенсивного земледелия. Л., 1990, с. 144-147.

Кандыбин Н.В., Смирнов О.В., Барбашова Н.М., Ермолова В.П. Бактокулицид - новое отечественное высокоэффективное средство борьбы с кровососущими комарами // Состояние и развитие сельскохозяйственной биотехнологии. Материалы Всес. конф., Москва, июнь 1986. Л., 1986, с. 222-223.

Кандыбин Н.В., Ермолова В.П., Стусь А.А. Восприимчивость рисового комарика (Cricotopus silvestris Fabr.) к микробным препаратам // Бюлл. ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, Л., 1988, 50, с. 27-31.

Кашкова Г.Г. Оценка диссоциации в культуре Bacillus thuringiensis var. dendrolimus Tal. в зависимости от питательного субстрата // Использование микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесном хозяйстве. Иркутск, 1981, с. 13-16.

Литература

Кулагин В.С., Лебедева Н.П., Барайщук Г.В. Изменчивость ВаеШш thuringiensis уаг. dendrolimus и получение высококачественного дендробациллина // Энтомопатогенные бактерии и грибы в защите растений. Иркутск, Иркутский ГУ, 1985, с. 12-32.

Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Изменчивость штаммов ВаеШш thuringiensis Н14 в связи с проблемой их хранения / / Первый болгаро-советский симпозиум с международным участием по микробным пестицидам. Пловдив, 1988, с. 107.

Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Персистент-ность ВаеШш thuringiensis Н14 при использовании бактокулицида // Бюлл. ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, 1989, 52, с. 20-23.

Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Динамика ВаеШш thuringiensis Н14 в водоеме при интродукции в качестве ларвицида // Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. Тез. докл. конф., Москва, 1993, с. 97.

Смирнов О.В., Ермолова В.П., Стусь А.А. Бакто-кулицид - биологическое средство контроля кровососущих комаров // Микробиологические аспекты охраны среды обитания в условиях интенсивного земледелия. Л., 1990, с. 147-156.

Талалаев Е.В., Гутман О.И. О жизнеспособности спор ВаеШш thuringiensis уаг dendrolimus Та1а^у при продолжительном их хранении // Использование микроорганизмов для борьбы с вредными насекомыми в сельском и лесном хозяйстве. Иркутск, 1981, с. 3-8.

Троицкая Е.Н. Сравнение методов хранения культур штаммов ВаеШш thuringiensis уаг gaПeriae // Прикладная биохимия и микробиология, 1979, 15, 3, с. 402-408.

Хачатурян А.А., Бобикян Р.А., Мартиросова Т.А., Аветян Ж.Н., Африкян Э.К. Влияние лиофи-лизации на важнейшие свойства штаммов ВаеШш thuringiensis уаг еaеiеus / / Биологический журнал Армении, 1980, 33, 4, с. 391-397.

Чилингарян В.А., Чил-Акопян Л.А. Стабильность инсектицидной активности БИП при хранении // Биологический журнал Армении, 1980, 33, 4, с. 451.

Чил-Акопян Л.А., Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их роль в защите растений. Новосибирск, 1987, с. 4-22.

Ягудин В.Д., Фрейман В.Б., Никифорова Л.С. Жизнеспособность и прорастаемость спор энтомо-патогенных бактерий в зависимости от способов

высушивания и условий регидратации // Сельско-хоз. биология, 1983, 9, с. 56-59.

Qicmone N., Zeigler D.R., Feitelson J., Schnepf E., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Dean D.H. Revision of the nomenclature for the Вacillus thuringiensis pesticidal crystal protein // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998, 62, p. 807-813.

Lecadet M.M, Frachon E., Cosmao Dumandoir V., Ripouteau H., Hamon S., Lauret P., Thiery J. Updating the Hantigen classification of Вacillus thuringiensis // J. Appl. Microbiol., 1999, 86, p. 660-672.

Nickerson K.W., Bulla L.A. Physiology of sporeforming bacterial associated with insect minimal nutrional reguirements for

growth, spoliation and parasporal crystal formation of Вacillus thuringiensis // Appl. Microbial, 1974, 28, p. 124.

Smirnov O.V., Grishechkina S.D. The storage of strains Вacillus thuringiensis H14 as the factors of their variability // Overproduction of microbial products. 2 Intern. Symp., Ceske Budejovice, 1988, p.189.

Smirnov O.V., Grishechkina S.D. Analysis of morphological-colonial variability of BT // Biopesticides theory and practice, Abstr. of Intern. Conf., Czechoslovacia, 1989, p. 6.

PROBLEMS OF STABILIZATION OF VALUABLE PROPERTIES OF BACILLUS THURINGIENSIS STRAINS -PRODUCERS OF LARVICIDE BIOLOGICAL PREPARATIONS O.V.Smirnov, S.D.Grishechkina Problems of valuable properties retention in strains of entomocide bacterium Bacillus thuringiensis var. israelensis (N14) are considered. Biological preparations on its basis are effective against mosquito and blackfly larvae, and also against rice midge and champignon midge larvae. It is shown, that different ways of model VT strains storage can provide in a various degree the entomocide activity, efficiency and stability of cultures. The expediency of storing prospective strains in different ways is justified at an obligatory estimation of the physiological status of dissociants (including biotests for their target activity), as well as of supporting selection of a strain before its use as a producer of biological preparations.