Способ получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека
METHOD FOR OBTAINING MONOSPECIFIC ANTIBODIES TO HUMAN LACTOFERRICIN

Изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии и биотехнологии и может быть использовано для получения антител и разработки тест-системы на пептид лактоферрицин человека.
Структурный домен лактоферрина, ответственный за бактерицидные свойства, является расщепляемый пепсином фрагмент, названный лактоферрицином (Bellamy W., Takase М., Yamauchi K. [et al.] Identification of the bactericidal domain of lactoferrin // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol. 1121, №1-2 - P. 130-136).
Пептид лактоферрицин (ЛФЦ) проявляет активность против всех протестированных бактерий (Е. coli, Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Listeria spp., Staphylococcus spp.) и эффективен даже против инфекций, вызываемых устойчивыми к антибиотикам Staphylococcus aureus и Klebsiella pneumoniae (Oda H., Wakabayashi H., Yamauchi K. [et al.]. Isolation of a bifidogenic peptide from the pepsin hydrolysate of bovine lactoferrin // Appl. Environ. Microbiol. - 2013. - Vol. 79(6): - P. 1843-1849). ЛФЦ человека, помимо антимикробной, противовирусной и противогрибковой активности обладает антиканцерогенной активностью (Перродэн Ж.П. Способ производства лактоферрина, фракция, содержащая лактоферрин, и ее применения / Патент на изобретение RU 2579661, 10.04.2016).
Образующиеся при пепсиновом гидролизе лактоферрина человека пептиды, после удаления непрореагировавших белков с помощью трихлоруксусной кислоты (ТХУ), имеют молекулярную массу в диапазоне 2-5 кДа, и не обладают иммуногенными свойствами. По информации, содержащейся в базе данных UniProt ЛФЦ человека состоят из 48 аминокислотных остатка и имеют молекулярную массу 5345 Да (Серебряков А.А., Коханова А.В. Динамика лактоферрицина и альфа-фетопротеина в крови кроликов после различных вариантов повреждения печени // Крымском журнале экспериментальной и клинической медицины. - 2022. - Т. 12, №2. - С. 41-48).
Как правило, белки с низкой молекулярной массой и пептиды оказываются неимунногенными и плохо сорбируются на пластик, что затрудняет их скрининг и мониторинг в биологических жидкостях.
Вместе с тем, несмотря на полную информацию о строении этого важного антибактериального пептида до настоящего времени не существует иммунохимического способа определения лактоферрицина.
Иммунохимический метод регистрации антимикробных пептидов, основанный на реакции антиген-антитело, имеет большое преимущество над спектрофотометрическим и другими методами регистрации результата измерения, к числу которых относятся универсальность, избирательность, специфичность, высокая чувствительность (Фримель X. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - 472 с.; Чехонин В.П., Дмитриева Т.Е., Жирков Ю.А. Иммунохимический анализ нейроспецифических антигенов. - 2000. - М.: Медицина - 416 с.).
В тоже время давно отработана технологии конъюгации низкомолекулярных лигандов с макромолекулярными носителями для получения иммуногенных комбинаций. Чтобы перевести неиммуногенные молекулы пептидов в иммуногенное состояние можно агрегировать их в частицы большего размера или присоединить к соответствующему носителю. Предпочтительнее пользоваться вторым способом (Фримель X. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - 472 с.).
Например, известен способом конъюгирования антибактериальных пептидов путем их иммобилизация на нерастворимых носителях, изготовленных из полистироловых, полипропиленовых, полиамидных, целлюлозных, агарозных, полиакриламидных, декстрановых или виниловых полимерных материалов (Блондэлле Сильви Э. (US) и соавт. Антибактериальные пептиды // Патент РФ №2468033 от 10.07.2007).
Однако как оказалось, способы приготовления коньюгатов на основе нерастворимых полимеров не позволяет получать на кроликах антитела к неиммуногенному пептиду лактоферрицину.
Для получения растворимых комплексов белковых носителей с неиммуногенными пептидами чаще всего применяются гетерогенные белки: бычий сывороточный альбумин, гемоцианин лимфы улитки (KLH), тиреоглобулин или овальбумин. Например, известен способы иммобилизации путем ковалентного конъюгирования пептида с гемоцианином лимфы улитки (Ширакава Камон. Специфически очищенные антитела против пресепсина // Патент РФ №2739607 от 25.08.2015).
Однако самым надежным и наиболее часто используемым носителем для пептидов является бычий сывороточный альбумин (БСА) (Heisch R.D., Hufner М. Highly specific antibodies to triiodthyronine. - Acta biol. Med. Germ., 1972. - Vol. 28. - P. 861-864.).
Для получения конъюгатов различных гаптенов с БСА часто применяются методы диазотирования или реакции взаимодействия альдегидной группы с аминогруппой БСА (Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям. М., 1985, с. 14-25; Костянко М.В., Глушков А.Н. Способ получения конъюгата гаптен-белок / Патент на изобретение RU 2141114, 16.02.1998). Однако данные методы конъюгации не подходят для пептида типа лактоферрицина, несущего значительный положительный заряд.
В связи с отсутствием в литературе иммуноферментного метода выявления лактоферрицин в качестве прототипа использована наша статья по определению лактоферрицина в сыворотке крови и других биологических жидкостях спектрофотометрическим способом (Серебряков А.А., Коханов А.В., Луцева О.А., Таспенова Г.К., Мулдашева Н.Р. Лактоферрин и лактоферрицин в моче и фекалиях у больных с ургентной урологической и хирургической патологией // Современные проблемы науки и образования. - 2021. - №4. (Электронный журнал); URL: http://www.science-education.ru/article/view?id=27717).
Изобретение направлено на упрощение и повышение точности определения лактоферрицина человека.
Поставленная в изобретении цель достигается тем, что с помощью фермента пепсина свиньи с активностью 90 МЕ/мг производят кислотный гидролиз белков обезжиренного женского молока в течение 4-6 часов при 37°С, образующиеся при гидролизе пептиды, отделяют от непрореагировавших белков молока осаждением 10% трихлоруксусной кислотой с последующим центрифугированием при 5000 g в течение 10 мин, после нейтрализации депротеинизированного фильтрата его конъюгируют с бычьим сывороточным альбумином из расчета 2-3 мг белка фильтрата на 100 мг бычьего сывороточного альбумина в 0,1 н NaOH, после трехчасовой инкубации при комнатной температуре в реакционную смесь вносят 20 мг восстановителя боргидрида натрия и через 30 минут реакцию останавливают ледяной уксусной кислотой, доводя рН до значений 7,2-7,4, проводят циклы иммунизации кроликов троекратным еженедельным внутримышечным введением конъюгата БСА-лактоферрицин с полным адъювантом Фрейнда в течении 28-35 дней до формирования у кроликов гипериммунного ответа, в полученных кроличьих сыворотках производят элиминацию балластных примесей путем добавления к 10 мл сыворотки 200 мг лиофилизированной плазмы человека и 50 мг коммерческого бычьего сывороточного альбумина для получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека.
Примеры осуществления изобретения.
Пример 1.
Источником для получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека служит обезжиренное женское молоко. Для получения из молочного белка пептидной фракции раствор закисляют соляной кислотой до рН 2,0, вносят раствор пепсина свиньи с активностью 90 МЕ/мг (Sigma, США) и полученную смесь выдерживали в термостате в течение 4 часов при 37°С. За это время в инкубационной среде накапливался пептиды, имеющие молекулярную массу ниже 4 кДа, которые отделяют от непрореагировавших белковых компонентов, путем прибавления 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, с последующим центрифугирования при 5000 g в течение 10 мин. Депротеинизированный фильтрат, содержащие лактоферрицин нейтрализуют гидрокарбонатом натрия до рН 7,6-7,8 и после центрифугирования при 5000 g в течение 20 мин хранят до следующего этапа получения конъюгата БСА-ЛФЦ в морозильной камере при -20°С. Концентрация пептида лактоферрицина в полученных препаратах обезжиренного женского молока, рассчитанная спектрофотометрически по методу Скоупс (Скоупс Р. Методы очистки белков: Пер. с англ. - М.: Мир, 1985. - 358 с.) на волнах длиной 260 и 280 нм, составляет 2-3 мг/мл.
Наличие у пептида лактоферрицина положительно заряженных групп позволяет получать иммунные комплексы с бычьим сывороточным альбумином только за счет адсорбции без использования дополнительных спейсерных функциональных групп. Для получение конъюгатов БСА-лактоферрицин к 0,1 грамму БСА, растворенного в 1 мл 0,1 н раствора гидроксида натрия, добавляют 1 мл препарате лактоферрицина, содержащего 2-3 мг пептида. После трехчасового перемешивания при комнатной температуре в раствор вносят 20 мг восстановителя боргидрида натрия и через 30 минут реакцию останавливают ледяной уксусной кислотой, доводя рН до значений 7,2-7,4. После центрифугирования при 5000 g в течение 20 мин конъюгаты БСА-лактоферрицин хранят до следующего этапа иммунизации в морозильной камере при -20°С.По данным спектрофотометрии в полученном конъюгате на 1 моль БСА приходится 40-60 моль лактоферрицина.
Для получения антисывороток к пептиду лактоферрицину человека проводят иммунизацию кроликов породы шиншилла массой 3-4 кг по схеме разработанной Калашниковым [Калашников В.В. Раково-эмбриональные белки человека: Дис. … д-ра. мед. наук. - М., 1986]. В качестве антигена использовались полученные на предыдущих этапах конъюгаты БСА-лактоферрицин.
Полученным конъюгатом БСА-лактоферрицин иммунизировали кроликов по следующей схеме:
а) 10 мг конъюгата, растворенного в 5 мл физиологического раствора, тщательно суспендировали с 1 мл полного адъюванта Фрейнда и вводили кроликам подкожно в 6-8 мест;
б) через неделю 10 мг препарата, растворенного в 5 мл физиологического раствора, суспендировали с 1 мл неполного адъюванта Фрейнда и вводили кроликам подкожно в 6-8 мест;
в) после недельного перерыва повторяли процедуру иммунизации кроликов тем же препаратом повторяя условия, описанные в пункте б);
в) через неделю после последней инъекции кроликов проводили пробный забор крови из краевой вены ушной раковины.
При невысоком титре антител к конъюгату БСА-лактоферрицин через 2,5-3 месяца животные иммунизировались повторно путем однократной подкожной инъекции 2-3 мл конъюгата содержащего 8-10 нг белка.
При высоком качестве сыворотки забор крови из краевой вены уха кролика проводился строго через 7 дней после последней инъекции, при этом у кролика однократно отбиралось 50-100 мл крови. Забор крови повторяли через 2-3 дня и продолжали в таком режиме в течение 15-20 дней.
Все полученные кроличьи сыворотки, после проверки на наличие антител к лактоферрицину, дополнительно подвергали процедуре элиминацию балластных примесей путем добавления к 10 мл кроличьей сыворотки 200 мг лиофилизированной плазмы человека и 50 мг коммерческого бычьего сывороточного альбумина.
Через два часа полученные кроличьи сыворотки центрифугировали и полноту истощения проверяли иммунодиффузионным методом с сывороткой и плазмой крови доноров и сывороткой крови коров.
После чего определяли преципитирующая способность полученных кроличьи сывороток с лактоферрицину в специфических реакциях иммунодиффузионного анализа. При этом, если полученная кроличья сыворотка давала единственную линию преципитации с пептидом лактоферрицином (ЛФЦ), она считалась моноспецифической.
Пример 2.
Источником лактоферрицина для получения комплекса этого пептида с БСА служили препараты чистого белка лактоферрина человека, предоставленные для исследования профессором Николаевым А.А. (кафедра химии Астраханского ГМУ). Для получения из лактоферрина пептидной фракции 200 мг лиофилизированного белка ЛФ растворяли в 1 мл воды, полученный раствор закисляли соляной кислотой до рН 2,0, вносили раствор пепсина свиньи с активностью 90 МЕ/мг (Sigma, США) и полученную смесь выдерживали в термостате в течение 4 часов при 37°С.
Все дальнейшие этапы получения препарата лактоферрицина из очищенного лактоферрина человека, получения конъюгата БСА-лактоферрицин, иммунизации кроликов, получения гипериммунных кроличьих сывороток, процедуры элиминацию из сывороток балластных примесей до получения моноспецифических кроличьих антител к лактоферрицину человека аналогичны примеру 1.
При этом, если полученная кроличья сыворотка давала единственную линию преципитации с пептидом лактоферрицином (ЛФЦ) и не реагировала с антителами к лактоферрину (ЛФ) и какими либо другими веществами, она считалась моноспецифической и полученные антитела использовалась для конструирования тест-системы на лактоферрицин.
Проверка качества тест-системы на лактоферрицин человека с помощью моноспецифических антител к лактоферрицину человека методом иммунодиффузионного анализа. Этот вариант иммунохимического анализа позволяет изучать различные антигены в составе сложных смесей без их очистки и выделения из сыворотки крови или другой биологической жидкости. Метод обладает достаточно высокой чувствительностью и позволяет исключить ошибки связанные с применением недостаточно истощенных антисывороток.
Результаты сопоставления двух моноспецифических тест-систем на лактоферрин и лактоферрицин человека методом двойной радиальной диффузии в агаре по Ouchterloni [Фримель X. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - 472 с.] в формате штампа «семерка» представлены на фиг. 1.
При этом в центральную лунку штампа семерка в агаровом геле вносят моноспецифические антитела к лактоферрицину человека, а в центральные верхнюю и нижнюю лунки вносят образцы очищенного препарата лактоферрицина. Для сопоставления в боковые лунки штампа семерка вносят тест-антиген и тест-сыворотку на лактоферрин из набора кафедры химии Астраханского ГМУ.
1 - препарат очищенного пептида лактоферрицина;
2 - антисыворотка против пептида лактоферрицина;
3 - препарат очищенного лактоферрина, предоставленный профессором Николаевым А.А. (кафедра химии Астраханского ГМУ);
4 - антисыворотка против лактоферрина человека из набора кафедры химии Астраханского ГМУ.
Полученный результат свидетельствует об отсутствии перекрестной реакции между антителами к лактоферрин человека и антителами к лактоферрицин человека.
Пример 3.
Этапы получения препарата лактоферрицина из очищенного лактоферрина человека, получения конъюгата БСА-лактоферрицин, иммунизации кроликов, получения гипериммунных кроличьих антисывороток, процедуры их истощения и формирования моноспецифических антисывороток к лактоферрицину человека аналогичны примеру 2.
Если концентрация специфических антител к ЛФЦ в кроличьих антисыворотках не превышает 10% от общего количества сывороточных гамма-глобулинов, то такие кролисьи сыворотки нельзя использовать для активации полистирольных планшетов и для приготовления коньюгатов с ферментами. В этом случае включают этап выделения из кроличьей сыворотки фракции моноспецифического иммуноглобулина IgG к лактоферрицину с помощью комбинации общепринятых биохимических методов высаливания и хроматографии на Сефадексе G-150.
Однако наилучшие результаты для получения моноспецифических антител к лактоферрицину человека дает применения иммуносорбционных методов.
Для выделения специфических антител из поликлональных кроличьих сывороток мы использовали иммуносорбенты, приготовленные на основе сефарозы 4 В, активированной бромцианом ("Sigma", США). К этому носителю химически привязываются очищенные лактоферрицин.
Перед связыванием 10 г сефарозы на 20 мин замачивают в 500 мл 1 мМ раствора HCI, затем промывают 2 л того же раствора на стеклянном фильтре. К активированному таким образом гелю прибавляют раствор лактоферрицина в 0,1 М карбонатном буфере с рН 8,3, содержащем 0,5 М NaCl (из расчета 5-10 мг пептида лактоферрицина на 1 мл геля). Полученная смесь инкубируется в течение 2 ч при комнатной температуре, с перемешиванием на роторной мешалке (магнитная мешалка может разрушить структуру геля). Затем иммуносорбент промывается 4 л того же буфера, оставшиеся несвязанными активные группы носителя блокируются обработкой 1М раствором глицина (2 ч). Избыток глицина отмывается попеременным промыванием 0,1 М карбонатным буфером с рН 8,3 и 0,1 М Na-фосфатным буфером с рН 4 (оба буфера содержат 0,5 М NaCl). Последняя промывка - карбонатным буфером.
Приготовленный таким образом иммуносорбент помещается в небольшую колонку (обычно бывает достаточно слоя сорбента объемом 3-5 мл), через которую пропускается 10-20 мл моноспецифической антисыворотки. Извлечение антител проводится в режиме медленной рециркуляции при скорости потока 10 мл/ч. Как показывают результаты иммунодиффузионного анализа, для полного извлечения антител указанный объем сыворотки должен быть пропущен не менее 3-5 раз через колонку с иммуносорбентом. После этого колонка промывается тем же карбонатным буфером до достижения оптической плотности элюата <0,02 (оптическую плотность регистрируют с помощью проточного фотометра, например Uvicord-S фирмы "LKB", Швеция). Адсорбированные антитела элюируются 0,2 М глициновым буфером с рН 2,2 с немедленной нейтрализацией элюата насыщенным раствором ТРИС. После диализа против дистиллированной воды антитела концентрируются ультрафильтрацией через мембрану ХМ-100А (Amicon) и лиофилизуются. Сухой препарат антител хранится при 4°С.
Пример 4.
Этапы получения препарата лактоферрицина из очищенного лактоферрина человека, получения конъюгата БСА-лактоферрицин, иммунизации кроликов, получения гипериммунных кроличьих антисывороток, процедуры их истощения и формирования моноспецифических антисывороток к лактоферрицину человека аналогичны примеру 2.
Для характеристики препарата антител к лактоферрицину человека их оценивают по двум параметрам:
• как антигены с помощью антисыворотки к иммуноглобулинам кролика;
• как антитела с помощью стандартной тест-системы на лактоферрицин.
Такой подход позволяет, с одной стороны, определить концентрацию иммуноглобулинов, а с другой - установить, какую долю в общем количестве иммуноглобулинов составляют специфические преципитирующие антитела. При этом расчеты проводятся с использованием следующих констант:
• минимальной концентрации иммуноглобулинов, выявляемой с помощью антисыворотки к иммуноглобулинам кролика ("антитела как антигены") методом двойной иммунодиффузии по Ouchterlony, составляющей 10 мкг/мл;
• минимальной концентрации антител, выявляемой с помощью стандартной тест-системы к изучаемому антигену ("антитела как антитела"), составляющей 80 мкг/мл.
Умножив на 10 то максимальное разведение антител, которое еще дает реакцию преципитации с антисывороткой к иммуноглобулинам кролика, можно получить общую концентрацию иммуноглобулинов в анализируемом растворе. Эту величину следует сравнить с расчетной концентрацией Преципитирующих специфических антител, которая получается при умножении на 80 максимального разведения антител, реагирующих как антитела в стандартной тест-системе для лактоферрицина. Близкие значения этих величин свидетельствуют о высоком качестве полученного препарата антител.
Внедрение данного способа определения лактоферрицина превосходит спектрофотометрический способ определения этого пептида по чуствительности, позволяет повысить точность и упростить процедуру определения концентрации неиммуногенного антибактериального пептида лактоферрицина.
Предлагаемый способ получения моноспецифических кроличьих антител к лактоферрицину человека может быть использован в качестве инструмента для количественного определения концентрации пептид лактоферрицина в биологических жидкостях любым иммунохимическим методом анализа (ИДА, ИФА, ИХА и т.д.).