Анализ гетерогенности полипептидных фракций на начальных этапах побегообразования у Dendrobium sp. В культуре in vitro

Букурия, Да-Хуан-Хоу, Кок-Пшар, Лючак Сумбарский, 319-757 без перекрёстного опыления завязей и полноценного урожая не образуют.

2. При проращивании пыльцы на искусственной среде лучшим оказался вариант с содержанием сахарозы 15%.

3. У сортов Мельничка Рана, Sulina, Cegledi Orias при опылении собственной пыльцой завязывание плодов не происходит в годы с неблагоприятными погодными условиями.

Перспективы дальнейших исследований

Полученные результаты могут быть направлены на привлечение в дальнейшую селекцию интродуцированных перспективных сортов и форм (Roxana, 7(2)-2-50, Н-II 5/33) проявивших признак самофертильности на протяжении всего времени изучения.

Список литературы

1. Костина К. Ф. Опыт с самоопылением плодовых деревьев в Государственном Никитском ботаническом саду // Записки Гос. Никитского ботан. сада. - 1928. - Т. 10. - Вып. 1. - 86 с.

2. Костина К. Ф. Степень самоплодности сортов и гибридов абрикоса различных эколого-географических групп // С.-х. биол. - 1966. - Т. 1. - № 3. - С. 352-355.

3. Костина К. Ф., Доманская Э. Н. Опыт по самоопылению абрикоса //Доклады ВАСХНИЛ. - 1956. - Вып. 5. - С. 12-14.

4. Костина К. Ф., Горшкова Г. А. К вопросу о самоопылении абрикоса // Сельскохозяйственная биология. - 1976. - № 4. - С. 612-613.

5. Лагутова Е. И. Стерильность пыльцы и самоплодность абрикоса различных эколого-географических групп // Бюл. Никит. ботан. сада. - 1987. - Вып. 64. - С. 102-106.

6. Лагутова Е. И. Биологические и цитоэмбриологические особенности самоплодности абрикоса: Дисс. канд. биол. наук: 03.00.05; защищена 27.03.1992; Утв. 11.06.92 - Ялта, 1991. -156с.: илл. - Библиогр.: С.112-133.

7. Морикян Э. С. Опыление и оплодотворение стандартных и малораспространенных сортов абрикоса // Известия сельскохозяйственных наук. - Ереван, 1984. - № 6. - С. 30-31.

8. Смыков В. К. Биология яблони и абрикоса и принципы формирования промышленных сортиментов. - Кишинев: Штиинца, 1978. - 163 с.

9. Audergon J. M., Guerriero R., Monteleone P., Viti R. Contribution to the study of inheritance of the character self-incompatibility in apricot // International symposium on apricot culture. Veria-Makedonia, Greece, 25-30 May, 1997. - Vol. 1. - P. 275-279.

10. Burgos L., Perez-Tornero O. Review of self-incompatibility in apricot // International symposium on apricot culture. Veria-Makedonia, Greece, 25-30 May, 1997. - Vol. 1. - P. 267-271

Рекомендовано к печати д.с-х.н., проф. Смыковым В.К.

БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

АНАЛИЗ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ФРАКЦИЙ НА НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПАХ ПОБЕГООБРАЗОВАНИЯ У DENDROBIUM SP. В КУЛЬТУРЕ IN VITRO

ОН. КОЗЛОВА

Центральный ботанический сад НАН Беларуси, г.Минск, Республика Беларусь

Введение

На современном этапе развития науки, а также промышленных технологий производства высококачественного посадочного материала ценных декоративных растений все большее распространение приобретает культура изолированных органов, клеток и тканей растений. Необходимым условием успешного использования этих методик является разработанная система индуцируемого морфогенеза [2]. Однако, несмотря на широкое использование регенерации in vitro в научных и практических целях, до сих пор не получено целостной картины механизмов этого процесса. Важным моментом изучения процессов

морфогенеза является исследование самых ранних этапов, когда некоторые клетки суспензии или экспланта приобретают способность развития в орган или эмбриоид [4]. Полученные на сегодняшний момент научные данные характеризуют, в основном, отдельные стадии регенерации in vitro. Также следует отметить, что большинство исследований проводятся с использованием ограниченного круга растений: арабидопсис, табак, морковь [2, 6]. Литературные данные, характеризующие эти процессы у орхидных, отсутствуют.

Целью нашей работы явилось проведение анализа полипептидных фракций легкорастворимых, мембраносвязанных белков и белков клеточной стенки на ранних стадиях побегообразования в культуре in vitro у Dendrobium sp. (Orchidaceae) для определения возможных маркеров данного процесса.

Объекты и методы исследования

В качестве объекта исследования использовалась асептическая культура Dendrobium sp. (коллекция ЦБС ПАН Беларуси). Для культивирования эксплантов использовали среду MS [5]. Основной режим культивирования: температура 25 ± 2°, освещенность 3 ООО лк, фотопериод 16 часов. Для изучения индукции побегообразования в качестве эксплантов использовали молодые туберидии Dendrobium sp с двумя сформировавшимися листьями и корешками. Наблюдение за культурой велось до появления видных невооруженным глазом новых побегов. В каждую колбу высаживалось по 10 побегов Dendrobium sp. Эксперименты проводись в трехкратной повторности.

Материал для последующего выделения белков отбирали по схеме: контроль (эксплант без высадки на среду) - 1 день культивирования - 2 день - 3 день - 5 день - 6 день - 7 день - 9 день - 13 день - 15 день для Dendrobium sp. Отобранные образцы взвешивали, фиксировали в жидком азоте и хранили при -800С.

При выделении белков различных фракций использовали методику, предложенную в диссертационной работе Василевко для определения растительных глюконаз [1]. Электрофоретическое разделение белков проводили при комнатной температуре в полиакриламидном геле (ПААГ) при постоянном токе 30 мА в щелочной системе с ДСН. Для электрофореза использовали 5%-ный концентрирующий и 15%-ный разделяющий ПААГ. После разделения белковых фракций гели фиксировали 10% ТХУ, а затем окрашивали 0,1% Coomassie Blue R-250. Гели фотографировали, интенсивность окрашивания зон и величины молекулярных масс полипептидов оценивали с помощью компьютерной программы Phoretix 1D (Nonlinear Dynamics LTD). В качестве маркера молекулярных масс полипептидов использовали LMW стандарт производства Amersham Pharmacia Biotech.

Результаты и обсуждение

Анализ качественного состава различных фракций белков проводился с целью идентификации возможных маркеров процессов, обуславливающих образование новых побегов при развитии в культуре in vitro Dendrobium sp. Спустя сутки после пассажа на среду видимых качественных и количественных изменений в составе полипептидов легкорастворимой фракции из туберидиев Dendrobium sp. по сравнению с контролем не происходило. На второй день культивирования наблюдалось увеличение количества полипептидов с молекулярной массой 16,1-16,8 кДа и снижение количества полипептидов с молекулярной массой от 12,1 до 14,2 кДа по сравнению с контролем и первым днем культивирования (рис.1). На следующие сутки количество 16,1-16,8 кДа белков снижалось и возрастало количество 12,1-14,2 кДа группы полипептидов. На пятый день культивирования проявлялся полипептид с массой 91,8 кДа (рис. 1), а полипептиды 114,7; 101,6 и 85,9 кДа исчезали и появлялись снова 85,9 кДа на шестые и 114,7-101,6 кДа на седьмые сутки после высадки туберидиев на среду. Количество полипептидов 16,1-16,6 кДа и 12,1-14,2 кДа между пятым и седьмым днем менялось в противоположном направлении относительно друг друга: если интенсивность окрашивания 16,1-16,8 кДа зон уменьшалась (пятые и седьмые сутки), то 12,1-14,2 кДа увеличивалась и наоборот (шестые сутки). Количество 12,1 -14,2 кДа полипептидов снова возрастало на тринадцатые-пятнадцатые сутки. Согласно данным денситограммы, количество полипептида 13,3кДа на седьмой день было максимальным. На девятые сутки наблюдалось резкое увеличение количества полипептида с молекулярной массой 30,7 кДа. Полипептидов с

молекулярной массой выше 80 кДа не наблюдалось. На тринадцатые сутки снова появлялись 101,6 и 85,9 кДа полипептиды. На пятнадцатый день появлялся новый полипептид 96,1 кДа.

Рис. 1. Электрофорез и денситограммы фракции легкорастворимых полипептидов

из туберидиев Dendrobium sp.

При изучении фракции мембраносвязанных белков из туберидиев Dendrobium sp. четких качественных и количественных различий по составу полипептидов в процессе индукции адвентивного побегообразования не выявлено. Количество белка остается практически неизменным с момента высадки на среду и до момента образования новых побегов. Наблюдается небольшое увеличение количества белка с молекулярной массой 11,9 кДа с пятого по девятый день культивирования.

Различия среди полипептидов клеточных стенок Dendrobium sp. определены для низкомолекулярных белков. Количество 21,2 кДа полипептида снижается на пятый-седьмой день и снова возрастает на девятый. Так же после пяти дней культивирования полностью исчезает 16,2 кДа полипептид и снова появляется на девятый день. Для всего периода культивирования характерна стабильная экспрессия полипептида с молекулярной массой 13,8 кДа. 11,2 кДа полипептид обнаружен на первый-третий, а так же девятый-тринадцатый дни культивирования эксплантов.

Как известно, процесс адвентивного морфогенеза состоит из трех стадий: приобретение компетенции, индукция и реализация [2]. В связи с этим можно предположить, что резкое увеличение количества 16,1-16,8 кДа полипептидов на второй день культивирования является показателем завершения приобретения компетенции и началом процесса индукции морфогенеза у Dendrobium sp. Так же об этом может свидетельствовать начало синтеза полипептидов с молекулярной массой 114,7-85,9 кДа. Предположительно, эти полипептиды могут являться субъединицами некоторых ферментов, в частности пероксидазы, которые рассматриваются рядом авторов как возможные маркеры различных стадий регенерации в культуре in vitro [3]. Новое увеличение количества 16,1-16,8 кДа полипептидов на шестой день культивирования и появление 114,7-85,9 кДа полипептидов на шестой-седьмой день может быть связано с началом процесса реализации. Так же на пятый день отмечено появление полипептида с молекулярной массой 91,6 кДа. В это же время показано снижение синтеза 21,2 кДа полипептида и прекращение синтеза 11,2 и 16,2 кДа полипептидов в клеточных стенках Dendrobium sp. Изменение количества 12,1 - 14,2 кДа легкорастворимых полипептидов, обратно коррелирующее с количеством полипептидов 16,1-16,8 кДа, так же может рассматриваться, как маркер процессов индукции и реализации при адвентивном побегообразовании у Dendrobium sp. Дальнейшие качественные и количественные изменения в составе полипептидов скорее всего связаны с началом синтеза соединений необходимых для роста новых побегов.

Выводы

В результате анализа электрофореграмм различных фракций белков выявлено двенадцать полипептидов фракции легкорастворимых белков и три полипептида из фракции белков клеточных стенок, которые могут быть использованы в качестве потенциальных маркеров процесса побегообразования у Dendrobium sp.

Однако, полученные данные не дают целостного представления о начальных стадиях процесса побегообразования у Dendrobium sp в культуре in vitro. Поэтому в последующих экспериментах предполагается проанализировать количественные изменения в составе нуклеиновых кислот, изменения изоферментного состава ряда энзимов (в частности, пероксидазы), а так же провести цитологические исследования для более точного определения стадий развития новых побегов Dendrobium sp в культуре in vitro.

Список литературы

1. Василевко В.Т. Модель переноса гена бактериальной полиглюкангидголазы ф-1,4-глюканазы) в растения табака как способ защиты растений фитопатогенов: Автореф. дис. ... кандидата биол. наук / Центральный ботанический сад НАНБ. - Мн., 2002. - 23 с.

2. Моисеева Н. А. Молекулярные и клеточные механизмы морфогенеза в культуре клеток растений // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. - М.: Наука, 1991. -С. 166-185.

3. Шан Х., Ли С.В., Ли Д., Шао С., Лиу Б. Дифференциальная экспрессия специфических белков при органогенезе томата in vitro // Физиология растений. - 2004. - Вып.51. - № 3. - C. 422-328.

4. De Klerk G.-J., Arnhold-Schmitt B., Lieberei R., Neuman K.-H. Regeneration of roots, shoots and embryos: physiological, biochemical, molrcular aspects // Biologia Plantarum. - 1995. - Vol. 39. -№ 1. - P. 53-66.

5. Murashige T., Skug F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiol. Plant. - 1962. - V.15. - P.473-497.

6. Jimenez V.M., Bangerth F. Endogenous hormone levels in explants and in embryogenic and non-embryogenic cultures of carrot // Physiol. Plant. - 2001. - Vol.111. - P. 389-395.

Рекомендовано к печати д.б.н., проф. Митрофановой О.В.

ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ ПРИ КЛОНАЛЬНОМ МИКРОРАЗМНОЖЕНИИ ЧЕРЕШНИ

Н.В. КУЗНЕЦОВА Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Черешня (Prunus avium L.) относится к числу экономически важных плодовых культур в Украине. Одной из главных проблем ее выращивания является внезапная гибель плодоносящих деревьев. На сегодня существует две серьезные причины этого. Первая - несовместимость подвоя с привоем [9]. Вторая, не менее важная причина, - это высокая степень поражения промышленных насаждений черешни вирусными, бактериальными и грибными болезнями. Решить первый вопрос можно было бы выращиванием черешни на собственных корнях. Однако, основываясь на литературных данных и исследованиях, выполненных в НБС-ННЦ (г. Ялта) на сортах Валерий Чкалов, Крупноплодная, Бигарро-Бурлат, Мелитопольская Черная, Сказка и других, можно считать, что черешня имеет низкую способность к ризогенезу как в условиях ex situ, так и in vitro [7-9, 11]. Рассматривая второй вопрос, следует отметить, что в южных регионах Украины, в том числе Крыму, на черешне выявлены наиболее вредоносные болезни, причиняющие значительный экономический ущерб плодоводству: скручивание листьев черешни (CLRV), мозаика резухи (ArMV), черная кольцевая пятнистость томатов (ТВRV) [4, 5]. Поэтому одним из эффективных способов получения здоровых корнесобственных сортов являются методы биотехнологии, которые позволяют значительно сократить сроки получения полноценных растений и повысить эффективность размножения в условиях in vitro по сравнению с традиционными методами. Несмотря на то, что первые