СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕСТИЦИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВЭЖХ
METHOD FOR DETERMINATION OF PESTICIDES IN BIOLOGICAL MATERIAL USING HPLC

Изобретение относится к области экологической химии и может быть использовано для совместного определения пестицидов разных химических классов в одной пробе.
Проблема загрязнения окружающей среды пестицидами возникла в середине 50-х годов 20 века, когда производство и применение этих веществ приняли массовый характер. Пестициды как экотоксиканты с каждым годом оказывали все более заметное влияние на живую природу и здоровье человека.
Пестициды, используемые в сельском хозяйстве, в растворенном и твердом виде вносятся в акватории рек и морей, где происходит их седиментация в донных отложениях или разбавление в водной массе. Загрязнение водоемов пестицидами и продуктами их разложения весьма опасно для их нормального биологического функционирования. При рациональном применении химикатов в сельском хозяйстве в водоемы попадает минимальное количество препаратов.
Несмотря на сравнительно низкие концентрации в воде и донных отложениях пестициды могут довольно интенсивно накапливаться в жизненно важных органах и тканях гидробионтов, особенно у рыб, как высшего трофического звена в водных экосистемах. В организм рыб пестициды поступают в основном осмотически через жабры и частично кожу, через кормовые объекты, распределяются по всем органам и тканям, концентрируясь в наибольших количествах во внутренних органах (печени, почках, стенке кишечника, селезенке). Так как пестициды обладают свойством растворяться и накапливаться в жирах, то они почти не выводятся из организма. И даже незначительное, но постоянное поступление пестицидов приводит к повышению их концентрации в жировых запасах рыб.
Задача определения не заведомо известных веществ, а набора соединений из всего списка применяемых на практике пестицидов, количество которых превышает 1000 названий, является наиболее сложной.
Существующие в мире методики определения содержания пестицидов в рыбе (QuEChERS) пока не нашли широкого применения в научно-исследовательской и прикладной области. Пестициды определяют, главным образом, с помощью метода газожидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС), когда идентификация пестицидов осуществляется по заранее созданной библиотеке масс-спектров. Темпы развития ВЭЖХ для определения остатков пестицидов в настоящее время почти в 2 раза превышают темпы развития газожидкостной хроматографии..
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - один из самых информативных аналитических методов. Он широко используется во всех развитых странах, но, по сравнению с другими физико-химическими методами анализа, требует весьма высокой квалификации персонала, а стоимость одного анализа достигает нескольких десятков и даже сотен долларов США. Таким образом, упрощение самой процедуры ВЭЖХ-анализа и снижение ее стоимости представляется важной задачей.
Указанные недостатки ВЭЖХ обусловлены тем, что для каждого пестицида (или группы пестицидов) нормативные документы регламентируют свой «уникальный» вариант ВЭЖХ-анализа. Это приводит к необходимости часто перестраивать хроматограф, что занимает много времени и требует определенного опыта. Кроме того, аналитическая лаборатория, выполняющая анализы с привлечением многих разных методик, вынуждена содержать целый склад дорогостоящих колонок, органических растворителей и стандартных образцов пестицидов.
К пестицидам, определяемым в мировой практике методом ВЭЖХ, относятся труднолетучие и термолабильные соединения. Кроме того, ВЭЖХ позволяет проводить совместное определение пестицидов и их метаболитов. В анализе пестицидов методом ВЭЖХ особенно важны способы пробоподготовки.
Известен способ определения ХОП в мясе, мясопродуктах и в рыбе, состоящий в том, что мясо и мясопродукты пропускают через мясорубку. Рыбу очищают от чешуи, внутренних органов и тоже пропускают через мясорубку. 20 г пробы перемешивают с безводным сернокислым натрием и помещают в колбу с притертой пробкой. Пестициды экстрагируют дважды смесью гексан-ацетон или петролейный эфир-ацетон в соотношении 1:1 порциями по 50 мл в течение 1,5 часов при встряхивании. Экстракт фильтруют через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 безводным сернокислым натрием, затем растворитель отгоняют, сухой остаток растворяют в 20 мл н-гексана и вносят его в колонку с силикагелем АСК. После впитывания экстракта в сорбент пестицид элюируют 110 мл смеси бензола с гексаном в соотношении 3:8 порциями по 25-30 мл. Элюат собирают в круглодонную колбу со шлифом емкостью 250-300 мл. Через 10 минут после впитывания последней порции растворителя сорбент отжимают с помощью груши. Элюат отгоняют до объема 0,1 мл и наносят на хроматографическую пластинку. В том случае, если пробы мяса или рыбы содержат большое количество жира, после испарения первого экстрагента (смеси ацетона с гексаном) и растворения сухого остатка в гексане следует провести очистку гексанового экстракта серной кислотой, а затем колоночную очистку, как описано выше, (www.bestdravo.ru Методические указания по определению хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных изделиях хроматографией в тонком слое. Утвержден зам. Главного гос. санитарного врача СССР А.И. Заиченко 28 января 1980 г. №2142-80. Текст документа по состоянию на июль 2011 года).
Недостатком данного способа является его низкая чувствительность, сложность и длительность проведения анализа.
Известен также «Способ определения тетраметилтиурамдисульфида в биологическом материале» (Патент РФ №2415425, МПК G01n 33/48, 2009), в котором проводят измельчение биологической ткани, двукратную обработку этилацетатом по 30 мин. массой в 2 раза больше ткани, фильтрацию безводным сульфатом натрия, испарение растворителя, растворение остатка в ацетонитриле, разбавленном водой в соотношении 1:4. Далее дважды экстрагируют пробу порциями хлороформа, экстракты объединяют, упаривают, остаток растворяют в подвижной фазе гексан-диоксан-пропанол-2 (15:5:1 по объему), очищают в колонке с силикагелем L 40/100µ с применением подвижной фазы, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в подвижной фазе и проводят определение методом ВЭЖХ с УФ-детектированием.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предложенному способу (прототип) является «Способ определения тиоклоприда в биологических объектах с использованием ВЭЖХ» (Патент РФ №2517075, МПК G01n 30/95, 2012). Способ состоит из отбора пробы, экстракции, фильтрации, дегидратации натрия сульфатом безводным, упаривания, введения растворенного сухого остатка в жидкостный хроматограф, обработки результатов анализа, а в качестве пробы берут навеску органов или тканей животных массой от 50 до 200 мг, экстракцию проводят ацетоном, растворенный сухой остаток вносят в жидкостный хроматограф «Хромос-ЖХ301» с детектором спектрофотометрическим UVV104M, используют колонку Диасфер-НОС-16(150×4)мм с размером пор сорбента 5 мкм, в качестве элюента используют смесь ацетонитрил-вода в соотношении 30:70.
Оба описанных способа позволяют определить лишь один пестицид в биологическом материале.
Технической задачей предлагаемого изобретения является обеспечение совместного определения нескольких пестицидов в одной пробе за счет повышения чувствительности способа.
Техническая задача решается тем, что способ определения пестицидов в биологическом матриале с использованием ВЭЖХ включает отбор пробы, экстракцию органическим растворителем, упаривание, растворение сухого остатка и введение его в хроматограф, обработку результатов анализа, в качестве пробы берут навеску печени рыбы, гомогенизируют ее с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия, экстрагируют ацетонитрилом, встряхивают и отстаивают, далее центрифугируют при 3000 об/мин и добавляют сорбенты - силикагель С18, Bondesil-PSA и безводный сульфат натрия, после чего повторяют центрифугирование, сухой остаток растворяют в ацетонитриле, затем анализируют с помощью ВЭЖХ с УФ-детектором.
Техническим результатом изобретения является обеспечение совместного определения нескольких пестицидов в одной пробе за счет повышения чувствительности способа.
О влиянии отличительных признаков на технический результат.
1. Использование в качестве пробы навески печени рыбы, как органа, в наибольшей степени накапливающего токсиканты, приводит к наиболее точному количественному результату определения. Печень играет большую роль в детоксикации вредных веществ, а высокое содержание жира ведет к накоплению в ней липофильных веществ, к которым относятся и пестициды нового поколения.
2. Гомогенизация пробы печени с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия дает эффективное осушение пробы от излишков влаги и поддержание постоянной pH.
3. Ацетонитрил является очень сильным и почти универсальным экстрагентом, обеспечивая хорошее извлечение всего набора анализируемых веществ. Жир печени, мешающий проведению хроматографического определения, очень трудно растворяется в ацетонитриле, что также приводит к увеличению числа определяемых пестицидов.
4. Проводимое дважды центрифугирование при 3000 об/мин. позволяет наилучшим образом отделить экстракт от частиц сорбентов, сульфата натрия и излишков жира при помощи простой декантации без применения фильтрования, что дает возможность повысить чувствительность способа..
5. Использование в качестве сорбентов силикагеля-С18, Bondesil-PSA и безводного сульфата натрия обеспечивает качественную очистку экстракта от липидов, жирных кислот, пигментов и других мешающих примесей.
6. Наконец, ВЭЖХ с УФ-детектором обладают высокой точностью определения.
Таким образом, совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение указанного результата, а именно совместного определения нескольких пестицидов разных классов в одной пробе за счет повышения чувствительности.
В результате проведенного анализа уровня техники не обнаружен аналог, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявляемого изобретения, а определение прототипа из имеющихся аналогов позволило выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков.
Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию патентоспособности «новизна».
При дополнительном поиске других решений, относящихся к предлагаемому способу, указанных отличительных признаков не обнаружено.
Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень».
Способ осуществляется следующим образом.
Пробу печени рыбы гомогенизируют с безводным сульфатом натрия и гидроцитратом натрия. Затем добавляют ацетонитрил и после интенсивного встряхивания отстаивают. После этого смесь центрифугируют при 3000 об/мин, ацетонитрильный слой сливают и добавляют сорбенты (силикагель С18, Bondesil-PSA и безводный сульфат натрия), встряхивают и отстаивают. После отстаивания повторяют центрифугирование, ацетонитрильный слой сливают и концентрируют досуха при температуре не выше 50°C. Сухой остаток растворяют в ацетонитриле и анализируют на ВЭЖХ с УФ-детектором.
Примеры осуществления способа.
3
Пример 1. 5 г печени рыбы (кефаль-пиленгас) гомогенизировали в пробирке объемом 50 дм с 10 г безводного сульфата натрия и 0,6 г гидроцитрата натрия. Затем добавили 8 дм  ацетонитрила и после интенсивного встряхивания в течение 1 минуты отстаивали 30 минут.
3
После этого смесь центрифугировали 5 минут при 3000 об/мин, ацетонитрильный слой сливали в пробирку объемом 15 дм и добавляли 50 мг сорбента Bondesil-PSA, 50 г сорбента С18 и 1,2 г безводного сульфата натрия, интенсивно встряхивали 1 минуту и отстаивали 30 минут. Затем смесь центрифугировали повторно 5 минут при 3000 об/мин, ацетонитрильный слой сливали в колбу объемом 100 мл и концентрировали до объема 1 мл на вакуумном концентраторе при температуре 40°C.
3
Растворитель и сухой остаток растворяли в 1 см ацетонитрила и анализировали на жидкостном хроматографе фирмы "Applied Biosystems" (США) с ультрафиолетовым детектором, снабженным дегазатором и термостатом колонки. Колонка 4,6×150 мм Reprosil-PUR ODS-3,5 мкм (Элсико, Россия); рабочая длина волны - 230 нм, термостатирование - +40°C; подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 60:40 (по объему) в изократическом режиме; скорость потока 0,6 мл/мин, объем вводимого в хроматограф экстракта пробы - 10 мкл. Идентификацию пестицидов проводили по времени удерживания.
Количественное содержание определяли исходя из площади хроматографического пика по уравнению калибровочного графика.
В результате обнаружены следующие пестициды (мг/кг): 1-имазалил 1,1014; 2-имазапир 0,8996; 3-имидаклоприд 0,596; 4-имазетапир 0,6776; 5-ципросульфамид 0,9136; 6-метрибузин 0,7294; 7-флумиоксазин 1,3232; 8-хизалофоп-П-этил 0,7704; 9-этофумезат 1,2012; 10-ипродион 1,1248; 11-димоксистробин 1,4122; 12-фамоксадон 3,925; 13-пенцикурон 3,0524.
На рис. 1 приведена хроматограмма смеси пестицидов, обнаруженных в пробе (пример 1), на рис. 2 - пример калибровочного графика одного из пестицидов (имазапир). Уравнение калибровки Y=0.377192X.,
Пример 2. Аналогично примеру 1, анализ проводили без предварительной гомогенизации пробы печени. В результате обнаружено примерно на 50% меньше пестицидов, чем в примере 1, что объясняется необходимостью гомогенизации для увеличения степени извлечения.
Пример 3. Аналогично примеру 1, исключили повторное центрифугирование.
В результате проба оказалась загрязнена и степень извлечения пестицидов уменьшилась. Так как после первого центрифугирования в пробу вводили сорбенты, образовалась взвесь, которую было необходимо удалить с помощью повторного центрифугирования.
Пример 4. Аналогично примеру 1, исключили использование сорбента силикагель С18. В результате незначительно уменьшилось количество определяемых веществ, но появились артефакты.
Таким образом, опыты показывают, что оптимальным является пример 1, описанная последовательность действий с пробой печени с использованием вышеупомянутых ацетонитрила в качестве эстрагента и набора сорбентов позволяет выявить наибольшее количество пестицидов.
Предлагаемый способ по сравнению с прототипом является более простым, экономичным и результативным, т.к. позволяет определить 10-13 пестицидов в одной пробе вместо одного.
Способ может быть использован в Роспотребнадзоре для мониторинга загрязнения пестицидами биологических объектов, организациях экологического профиля, в научно-исследовательских разработках.