Экстракорпоральное иммуномодулирующее действие гидролитических ферментов и витаминов

число молодых форм клеток снижено в 1,5-3,5 раза, при этом исчезают бласты. В структурах коркового вещества - в центрах размножения, в мантии лимфоидных узелков и в паракортикаль-ной зоне - число малых лимфоцитов остается меньше интактных значений (на 11-15%). Спустя 7 недель в структурных зонах лимфатического узла резко (в 1,7-22,9 раза) снижается плазматическая реакция. В мантии, паракортикальной зоне и в мозговых синусах плазмоцитов нет (рис.2). В этот период во всех структурных компонентах лимфатического узла резко усиливается деструкция клеток (в 1,4-4,2 раза). Больше деструктивных клеток появляется в краевом и мозговых синусах (в 3,9-4,2 раза).

сроки эксперимента

Рис.2. Содержание плазматических клеток (в %) в структурных зонах печеночного лимфатического узла в группе интактных крыс и через 1-7 недель после длительного употребления 5% раствора спирта. Обозначения: по оси абсцисс - сроки эксперимента; по оси ординат - содержание клеток в относительных величинах (в %); вертикальные отрезки на столбиках -95% доверительные интервалы

Высокое накопление макрофагов в мозговых синусах по сравнению с краевым (10,20% и 4,48%, соответственно) говорит об усилении утилизирующей функции в мозговых синусах.

Заключение. Изучение динамики реакции печеночных лимфатических узлов крыс через 1-7 недель после прекращения 4-недельного употребления 5% спиртового раствора позволило выделить 2 периода. Первый период отмечается с 1-й по 4-ю недели эксперимента, который характеризуется признаками компенсаторной реакции. Это подтверждается сохранением в лимфатических узлах на протяжении всех сроков опыта функционально активных лимфоидных узелков с центрами размножения и наличием в них клеток с картинами митозов. Во всех зонах органа отмечается высокое содержание молодых форм клеток и макрофагов. Изменения в структурной организации и цитоархитектонике в печеночных лимфатических узлах в отдаленный период (через 7 недель) после окончания употребления 5% раствора спирта можно рассматривать как период декомпенсации. В этот период происходит резкое снижение лимфоцитотопоэза (исчезают клетки с картинами митозов и бласты), иммунопоэза (резко уменьшается число плазматических клеток) и усиление деструкции клеток во всех структурных зонах лимфатического узла. Комплекс изменений и через 7 недель эксперимента в морфологии и клеточном составе печеночных лимфатических узлов, является отражением пролонгированного действия спиртового раствора на организм животных, приводящем к снижению иммунологической активности органа.

Литература

1. Михайленко С.И. // Успехи психиатрии, неврологии, нейрохирургии и наркологии.- 1996.- Т. 3.- С. 512-513.

2. Новиков В.С.// Авиакосмич. и эколог. медицина.- 2000.-Т. 34, №1.- С. 5-14.

3. Сытинский И.А., Флерова Н.И. //Укр. биохим. журнал-1982.- Т.54, №2.- С. 149-153.

4. Меркурьева Р.В. и др. Медико-биологические исследования в гигиене.- М.; Медицина,1986.- 272 с.

5. Бородин Ю.И. Лимфатический узел при циркуляторных нарушениях.- Новосибирск: Наука СО, 1986.- 268 с.

6. Сапин М.Р., Никитюк Д.Б. Иммунная система, стресс и иммунодефицит.- М.: Джангар, 2000.- 184 с.

7. Стефанов С.Б.//. Цитология.- 1974.- Т. 16, №6.- С. 785.

8. Бородин Ю.И. и др. // Мат-лы II съезда лимфологов России.- СПб.-. 2005.- С. 39-41.

9. Жаксылыкова А.К., Нурмухамбетова Б.Н. // Мат-лы 1 Сибирского съезда лимфологов с междун. участием.- Новосибирск.- 2006.- С. 128-130.

10.Lennert K., Stein H. The germinal center: morphology, histochemistry and immunohistology. «Lymphoproliferative Diseases». Berlin.- 1982.- P. 3-15.

УДК 616-097:616-005.1

ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ГИДРОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И ВИТАМИНОВ

И.Л. БРОВКИНА, Л.Г. ПРОКОПЕНКО, В.Н. РЫБНИКОВ*

В регуляции биохимических процессов и физиологических функций важную роль играют протеолитические и гидролитические ферменты. Использование этих ферментов в качестве фармакологических препаратов оказывает выраженное влияние на процессы фагоцитоза, развитие клеточной и гуморальной форм иммунного ответа на различные антигены [13]. Иммунотропное действие протеолитических и гликолитических ферментов опосредуется клетками периферической крови - эритроцитами и лейкоцитами [8]. Интракорпоральное применение протеолитиче-ских и гликолитических ферментов не всегда оправдано, так как может привести к возникновению нежелательных побочных эффектов, обусловленных неконтролирующей фрагментацией белковых и углеводных соединений мембраны клеток крови и тканей. Учитывая это, большой интерес представляет изучение эффективности экстракорпорального применения ферментов, осуществляемое с помощью эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Связывание лекарственных соединений с форменными элементами крови и влияние на их активность происходит вследствие сорбции на мембране, проникновения внутрь клеток с помощью транспортных механизмов или при искусственном образовании пор в клеточной мембране [1]. Связывание с эритроцитами или их стромой повышает фармакологическую активность некоторых гормонов, нейромидиаторов и их ингибиторов, и цитокинов [2]. Экстракорпоральное воздействие протеолитиче-ских ферментов на мембрану эритроцитов или их строму приведет к появлению у них иммунотропных свойств, вследствие модификации пептидных и олигосахаридных структур поверхности мембраны клеток. Есть основания ожидать, что определенное влияние на это действие ферментов окажет изменение состояния фосфолипидной матрицы клеточной мембраны, вызываемое жиро- и водорастворимыми витаминами [9].

Цель работы - изучение опосредуемого эритроцитами и лейкоцитами иммуномодулирующего действия лизоцима и тер-рилитина, в сочетании с менадионом и кобаламином.

Материалы и методы. Опыты выполнены на крысах Вис-тар массой 190-210 г. Острую кровопотерю вызывали одномоментным кровопусканием из бедренной артерии в объеме 1% от массы тела. Эритроциты выделяли спомощью декстрана Т-500 и HBS-целлюлозы [15]. Нейтрофилы выделяли из гепаринизиро-ванной крови в растворе трилона Б с помощью фикол-верографина [10].

Клетки обрабатывали in vitro лизоцимом или террилитином [11], менадионом или кобаламином [4] и вводили аллогенным животным: эритроциты по 107 клеток/кг внутрибрюшинно трехкратно с интервалом 12 часов, нейтрофилы по 107 клеток/кг в/в однократно. Реципиентов иммунизировали эритроцитами барана (внутрибрюшинно, однократно, в дозе 108 клеток/кг). Через 5 суток после иммунизации определяли фагоцитарнометаболическую активность нейтрофилов по величинам индекса активности фагоцитов и окислительному резерву нейтрофилов [7, 14], выраженность перекисного окисления липидов по содержанию диеновых конъюгат и малонового диальдегида [12] в экстрактах печени. Об иммунном ответе судили по числу антите-лобразующих клеток [6] в селезенке и разности массы регионарного и контралатерального лимфатических узлах [10]. Клетки селезенки инкубировали в среде 199 в течение 4 часов [5]. Надо-садочную жидкость и фракцию спленоцитов, прилипающих к

* Курский ГМУ, 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3

стеклу. фракционировали на сефадексе 0-150. Фракции, содержавшие С-пептиды с молекулярной массой >150 и <10-15 кД внутрибрюшинно вводили интактным особям 500 мкг белка/кг.

Данные обрабатывали статистически с использованием критериев Стьюдента и Вилкоксона - Манна и Уитни.

Результаты. Эритроциты крыс, экстракорпорально обработанные лизоцимом или террилитином, при аллогенном переносе повышали фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофи-лов и стимулировали развитие иммунного ответа в норме и при острой кровопотере. Лейкоциты интактных крыс, обработанные террилитином, имели иммуностимулирующие свойства, а инкубированные с лизоцимом были лишены иммунологической активности. Иммуностимулирующий эффект после острой кро-вопотери вызывают лейкоциты, обработанные террилитином, наименьший - эритроциты, так же обработанные (рис. 1).

Рис. 1. Иммуномодулирующая активность эритроцитов и лейкоцитов интактных крыс (А) и крыс подвергнутых кровопусканию (Б), экстракорпорально обработанных лизоцимом или террилитином. Обозначения: 1 -эритроциты, не подвергнутые обработке; 2 - эритроциты, обработанные лизоцимом; 3 - эритроциты, обработанные террилитином; 4 - лейкоциты, не подвергнутые обработке; 5 - лейкоциты, обработанные лизоцимом; 6 -лейкоциты, обработанные террилитином; по оси ординат - количество АОК, тыс./селезенка.

Инкубация с лизоцимом или террилитином эритроцитов после кровопотери индуцировала появление у них иммуностимулирующих свойств, а лейкоциты, обработанные террилитином или лизоцимом, не иимели иммуномодулирующей активности. Эритроциты, экстрокорпорально обработанные лизоцимом, и лейкоциты, инкубированные с террилитином, могли индуцировать выделение прилипающими к стеклу клетками селезенки факторов, стимулирующих развитие иммунного ответа, активность антиоксидантных ферментов и снижающих уровень продуктов ПОЛ в печени после кровопотери (рис. 2).

АОК

І

сод

Рис. 2. Влияние фракций супернатантов прилипающих к стеклу спленоци-тов крыс, получавших инъекции эритроцитов, экстракорпорально обработанных лизоцимом, на показатели иммунологических функций, антиоксидантного потенциала и ПОЛ печени крыс после кровопотери. Обозначения: 1 - радиус окружности - кровопотеря (группа 1); 2 - . - крово-

потеря + инъекции низкомолекулярной (<10 кД) фракции спленоцитов

(группа 2); 3-----кровопотеря + инъекции высокомолекулярной (более

150 кД) фракции спленоцитов

Экстракорпоральное воздействие менадиона повышало иммуномодулирующие свойства после инкубации с лизоцимом эритроцитов крыс, подвергнутых кровопусканию, но не индуцировало иммуномодулирующей активности после инкубации с террилитином. Кобаламин после кровопотери не влиял на эритроциты, обработанные лизоцимом или террилитином (рис.3).

Рис. 3. Влияние менадиона и кобаламина на эффект появления иммуномодулирующих свойств у эритроцитов и лейкоцитов после кровопотери, вызываемый лизоцимом и террилитином. Обозначения: 1 - введение клеток, обработанных лизоцимом; 2 - введение клеток, обработанных террилитином; 3 - введение клеток, обработанных менадионом; 4 - введение клеток, обработанных кобаламином; 5 - введение клеток, обработанных лизоцимом и менадионом; 6 - введение клеток, обработанных терри-литином и менадионом; 7 - введение клеток, обработанных лизоцимом и кобаламином; 8 - введение клеток, обработанных террилитином и кобала-мином; радиус окружности - введение интактных клеток (группа 1);

.....- введение эритроцитов (гр. 2 ); ---- - введение лейкоцитов

(группа 3); о - различия между 3 и 2 группами по отношению к 1 группе (р<0,05).

Инкубация лейкоцитов, полученных до и после кровопоте-ри, с менадионом или кобаламином усиливала выраженность действия террилитина и не вызывала эффекта усиления в сочетании с лизоцимом. Кобаламин повышал чувствительность эритроцитов к действию протеаз и гликозидаз, но не влиял на эффект, вызываемый ферментами после обработки ими стромы клеток. Менадион повышал чувствительность эритроцитов и их стромы к действию протеаз и гликозидаз (табл.).

Таблица

Иммуномодулирующие свойства эритроцитов и их стромы после экстракорпоральной обработки лизоцимом, менадионом и кобалами-ном

Объект воз- дейст- вия Эффект

ИАФ ОРН АОК РМЛ

Эрит- роцит - 42,5±4,6 22,7±2,1 23,4±2,6 4,4±0,4

Строма - 40,3±4,8 20,5±2,2 21,3±2,5 4,0±0,4

Эрит- роцит Лизоцим 69,4±5,7*1-2 43,5±3,3*1-2 67,2±6,8*1-2 6,6±0,6*1-2

Строма Лизоцим 60,5±5,1*‘-2 34,3±2,8*‘-2 59,4±5,7*‘-2 6,2±0,5*‘-2

Эрит- роцит Лизоцим, менадион 56,2±5,6*1-3 32,4±2,8*1-3 55,6±5*1-3 6±0,5*1-3

Строма Лизоцим, менадион 55,7±5,4*1-3 34,9±3,0*1-3 52,8±5*1-3 5±0,5*1-3

Эрит- роцит Лизоцим, кобаламин 58,0±6,1*1-3 31,5±2,4*1-3 54±5,2*1-3 5±0,6*1-3

8. Строма Лизоцим, кобаламин 43,7±4,5*3-7 20,9±2,7*3-7 25,8±2,9*3- 4,6±0,4*3-

Примечания: звездочкой отмечены достоверные отличия средних арифметических (р<0,05); цифры рядом со звездочкой - группы по отношению к показателям которых эти различия достоверны.

Результаты проведенных экспериментов позволяют предположить, что действие кобаламина опосредуется реакциями, катализируемыми ферментами цитоплазмы эритроцитов, контролирующими экспрессию белковых и углеводных структур на поверхности мембраны эритроцитов. Эффект менадиона, по-видимому, реализуется через молекулы двойного фосфолипидно-го слоя, состояние которого определяют архитектонику белковых и углеводных компонентов на мембране клеток. Изученные ферменты и витамины оказывают взаимосвязанное влияние на иммуномодулирующие свойства эритроцитов и, в силу этого, последние одинаково реагируют на действие агентов, модифицирующих олигосахаридные, пептидные и фосфолипидные структуры мембраны, а также на ферментные системы цитоплазмы клеток. Обращает на себя внимание тот факт, что после кровопо-тери строма эритроцитов реагировала на кобаламин повышением иммуномодулирующей активности, индуцируемой лизоцимом и террилитином. Это позволяет предположить, что деструктивные изменения, вызываемые в мембране кровопотерей, в сочетании с метаболическим сдвигами, вызываемыми ферментами и витаминами, обуславливают повышение выраженности иммуномодулирующих свойств эритроцитов. В то же время, нарушения метабо-

лических процессов, происходящие при кровопотере в лейкоцитах, обусловливают их рефрактерность к индуцирующему появлению иммуномодулирующих свойств от действия террилитина.

Литература

1. Гущин И.С. и др. // Актуальные вопросы иммунофармакологии.- М., 1987.- С. 71-76.

2. Завьялов А.В. и др.// Курская биофабрика: к 100-летию биологической промышленности России.- Курск, 1996.- С. 547574.

3. Иванов В.П. и др. Белки клеточных мембран и сосудистые дистонии у человека.- Курск, 2004.- С. 278.

4. Конопля А.А. Иммунометаболические эффекты взаимодействия витаминов при токсических формах анемии: Дис.. .канд. мед. наук.- Курск, 2004.

5. Конопля А.И. Эндогенные иммуномодуляторы как фактор сохранения гомеостаза при патологии печени: Дис. докт. мед. наук.- Киев, 1989.

6. Мальберг К., Зигль Э. // Иммунологические методы: Пер. с англ.- М., 1987.- С. 262-267.

7. Медведев А.Н., Чаленко В.В. // Лаб. дело.- 1991.- № 2.-С. 19-20.

8. Земсков А.М. и др. Нелимфоидные механизмы иммунопатологии.- М., 2007.

9. Прокопенко Л.Г. и др. Окислительный, энергетический и иммунный гомеостаз.- Курск, 2003.

10. Федосеева Т.В. и др. Руководство по иммунологическим методам в гигиенических исследованиях.- М., 1993.- С. 319.

11. Сипливая Л.Е. Модифицированные эритроциты как иммуномодуляторы в норме и патологии: Дис. д.биол.н.- М., 1992.

12. Стальная Н.Д. // Современные методы в биохимии / Под. ред. В.Н. Ореховича.- М., 1977. - С. 63-64.

13. Прокопенко Л.Г. и др. Ферментная иммуномодуляция.-Курск, 1998.

14. Щербаков В.И. // Лаб. дело.- 1989.- № 2.- С. 30-33.

15. BeutlerB.et al. // J. Immunol.- 1985.- Vol. 135.- P. 3972.

УДК 616.61-002.3:615.032]-092.9

ВЛИЯНИЕ ЛИМФОТРОПНОЙ ТЕРАПИИ НА ЭКСКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ ПОЧЕК У КРЫС С АПОСТЕМАТОЗНЫМ ПИЕЛОНЕФРИТОМ

Ю.В.НАЧАРОВ, А.В.КАРПОВ, К.В.ЛОШАКОВ, Р.А. МАНКИЛИДЗЕ, Г.Г.ВОЛКОВ*

Мнения авторов относительно способов лечения больных с острым пиелонефритом противоречивы. Большинство авторов предпочитают более раннее оперативное лечение, обусловливающее органосохраняющую тактику, с устранением обструкции мочевых путей и последующей антибактериальной терапией [2]. При наличии обструкции, почки должны быть дренированы катетером-стентом, чрезкожной пункционной нефростомией с последующей антибактериальной терапией, которая назначается с учетом вида возбудителя и его чувствительности к препаратам. Вопрос об оперативном лечении у таких больных должен решаться при отрицательной клинической динамике [1]. Результаты лечения больных с гнойными формами пиелонефрита остаются неудовлетворительными: сохраняется высокая частота развития таких грозных осложнений, как уросепсис, бактериотоксический шок, токсический гепатит, острая и хроническая почечная недостаточность, которые и определяют высокий уровень летальности у данной категории больных. Вопросам антибактериальной терапии инфекций мочевыводящих путей уделяется большое внимание в отечественной и в зарубежной литературе [3, 5]. Применяемая антибактериальная терапия нередко не оказывает достаточного лечебного эффекта, так как в результате нарушений в системе гомеостаза снижается возможность доставки препарата в очаг воспаления и достижения необходимой концентрации в нём [6-8]. Антибиотикотерапия становится эффективной лишь при создании высоких, длительно сохраняющихся концентраций лекарственного вещества в очаге микробного воспаления, что не всегда достигается внутримышечным или внутривенным введением [4]. Для достижения достаточной концентрации антибакте-

* Новосибирский ГМУ

риального препарата в очаги воспаления разработан новый метод эфферентной терапии - направленный транспорт антибиотиков.

Цель — анализ влияния лимфотропной терапии на экскреторную функцию почек у крыс с апостематозным пиелонефритом.

Материал и методы. Работа выполнена на 200 белых кры-сах-самцах породы «Вистар» массой 200-230 гр. Для создания модели заболевания разработана оригинальная модель, отличающаяся от описанных раннее в литературе тем, что для обтурации мочеточника использована полоска перчаточной резины, выведенная на переднюю брюшную стенку. Это обеспечивает мягкое сдавливающее воздействие на мочеточник, снижая его травмати-зацию. При этом исключается повторная операция для разрешения уростаза. Под эфирным накозом у животных выполняли косой подвздошный разрез справа. Аккуратно, крючком Фарабе-фа, кишечник сдвигается влево, освобождая правую почку. Из жировой клетчатки, тупым способом выделяется мочеточник и берется на лигатуру из тонкой перчаточной полоски. Иглой тонкого диаметра производится инъекция 5% каловой взвеси 0,30,4 мл в полостную систему и под капсулу почки. Место пункции, во избежании истечения взвеси и развития перитонита обрабатывается медицинским клеем БФ. Операционная рана послойно ушивалась наглухо, при этом концы перчаточной резины выводится на переднюю брюшную стенку. На 3 сутки после операции перчаточная резина удаляется, восстанавливается отток мочи, что подтверждается урограммой. Операционный шов обрабатывался антисептиками с наложением глухой повязки.

Смесь препаратов для межостистой лимфотропной инъекции (МЛИ) готовили ex tempore. В состав лекарственной смеси, применяемой при межостистой лимфотропной антибактериальной терапии у животных с апостематозным пиелонефритом нами были включены препараты: антибактериальный препарат (цефа-лоспорин III генерации - цефабол в возрастной разовой дозировке - 500-1000 мг); местный анестетик (лидокаин 100 мг); лидаза 32 МЕ; глюкоза 40% в качестве растворителя и наполнителя.

Все животные были разделены на 3 группы, по 50 в каждой. Всем крысам воспроизводили модель апостематозного пиелонефрита. В группе «1» на 3 сутки от момента воспроизведения апостематозного пиелонефрита под эфирным наркозом производили релапаротомию, во время которой удаляли резиновую лигатуру и производили декапсуляцию почки. Перед ушиванием операционной раны в паранефральной клетчатке оставляли дренаж перчаточной резиной. Внутрибрюшинно вводили 50 мг канамицина в 3 мл физиологического раствора. Введение антибиотика повторяли каждые сутки в течение 7 дней от момента воспроизведения АП. Дренаж удаляется на 5-6 сутки. Выбор антибиотика был с учетом чувствительности микрофлоры. В группе «2» в качестве лечения проводились межостистые лимфо-тропные инъекции (5 инъекций через один день).

Для реализации поставленных задач мы решили использовать дигитальный ангиографический комплекс “INTEGRIS 3000” фирмы PHILIPS, что позволило произвести исследования с прямым увеличением под постоянным рентгеноскопическим контролем. При необходимости выполнялись одиночные рентгеновские снимки либо серия снимков. Средняя доза контрастного вещества для экскреторной урографии рассчитывается из соотношения -100 мг на 1 кг веса. В качестве контраста использован Гипак 76%. Наркотизированное, тиопенталом, животное закрепляется на рамке. Инъекция контрастного вещества производится в вены хвоста, или вены бедра, иглой диаметром 0,7мм. Рамка с животным помещается на рентгенологический столик. Урограммы производились на 1-й, 3-й, 5-й, 7-й, 10-й, 15-й, 20-й минутах и 11,5 часа после введения контрастного вещества. Более поздние снимки, при отсутствии заполнения верхних мочевых путей, производились через 2-3,5 часа. Экскреторная урография, являясь физиологическим методом исследования, отображает функциональное и морфологическое состояние почек и мочевых путей во всех фазах патологического процесса. В результате данного исследования определяются все стадии прохождения контраста: паренхиматозная, полостная, фаза выведения контраста. Для точного определения степени поражения паренхимы почек и функционального состояния чашечно-лоханочных систем в целом производилось измерение площади чашечно-лоханочных систем и вычисление ренально-кортикального индекса. Полученные результаты подвергались статистической обработке с вычислением средней арифметической (М) и стандартной ошибки средней арифметической (m). Достоверность различий сравниваемых параметров рассчитывалась с использованием