СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРОГНОЗА КАРИЕСА ЗУБОВ ПУТЕМ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА КАЛЛЕКРЕИНА-4 В МУТАЦИОННЫХ ТОЧКАХ G2664153A И G2142A В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
METHOD FOR CARIES PREDICTION ESTIMATION BY ANALYSIS OF CALLEKREIN-4 GENE POLYMORPHISM IN MUTATION POINTS G2664153A AND G2142A IN BLOOD SERUM

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и может найти свое применение при разработке новых подходов к прогнозированию развития кариеса, основанных на оценке генетических факторов, инициирующих процессы кристаллизации эмали.
Кариес зубов до настоящего времени представляет важнейший аспект современной стоматологии. В литературе по проблеме кариеса зубов существует достаточно много работ, авторы которых считают, что причиной кариеса является зубная бляшка [ S. Caries risk assessment in an educational environment / S. , S.A. Gansky, J.D. Featherstone // J. of dental education. - 2006. - Vol. 70, №12. - P. 1346-1354; Jacobsson B. Dental caries and caries associated factors in Swedish 15-year-olds in relation to immigrant background / B. Jacobsson, L.-K. Wendt, I. Johansson // Swedish Dental Journal. - 2005. - Vol. 29, №2. - P. 71-79.]. Однако есть исследования, свидетельствующие, что кариес может протекать активно и при идеальной гигиене полости рта [About I. Molecular aspects of tooth pathogenesis and repair: in vivo and in vitro models / I. About, T.A. Mitsiadis // Adv. Dent. Res. - 2001. - Vol. 15. - P. 59-62]. Хотя зубные бляшки образуются едва ли не у каждого человека, поражение зубов кариесом отнюдь не является их неизбежным следствием. Следовательно, тканевое поражение эмали определяется сочетанием внешнего деструктивного фактора (микрофлоры зубной бляшки) и локальной тканевой реакции (свойствами и строением самого субстрата воздействия микрофлоры, то есть эмали зубов). Структура зубной эмали, на наш взгляд, играет важнейшую роль в реализации кариеса, обеспечивая устойчивость или «податливость» ее при воздействии деминерализующих факторов. Другими словами, реализация кариеса в значительной мере определяется тканевой резистентностью эмали, обеспечивающей возможность противостоять воздействию на нее патогенной микрофлоры зубного налета. Тканевая резистентность эмали определяется ее физико-химическим строением, обусловливающим морфологические и текстуральные особенности, фазовый состав, взаимное расположение и распределение по размерам отдельных компонентов фаз, морфологию частиц и другие структурно-геометрические характеристики [Дроздов В.А. Текстурные характеристики эмали зуба и ее резистентность к кариесу / В.А. Дроздов, И.Л. Горбунова, В.Б. Недосеко // Стоматология. - 2002. - №4. - С. 4-9; Исследование текстуры интактной зубной эмали лиц с различным уровнем резистентности к кариесу методами адсорбции и ртутной порометрии / В.Б. Недосеко [и др.] // Омский науч. вестн. - 2000. - №10. - С. 142-145; Исследование термоустойчивости интактной зубной эмали лиц с различным уровнем резистентности к кариесу / В.Б. Недосеко [и др.] // Стоматология. - 2003. - №3. - С. 4-8; Сравнительный анализ термоустойчивости интактной зубной эмали с разной резистентностью к кариесу / Н.В. Антоничева [и др.] // Материалы VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока»: тез. докл. - Новосибирск, 2004. - Т. 2. - С. 179]. Совокупность этих факторов и определяют особенности протекания процессов деминерализации и реминерализации эмали зубов.
Хорошо известно, что при кариесе зубов существует наследственная предрасположенность [Горбунова И.Л. Использование ДНК-технологий для раннего выявления предрасположенности к кариесу / И.Л. Горбунова // Стоматология. - 2006. - №4. - С. 18-19, Горбунова И.Л. Молекулярно-генетические аспекты реализации кариеса зубов / И.Л. Горбунова // Стоматология для всех. - 2006. - №1. - С. 6-9, Горбунова И.Л. Обоснование возможностей генетического маркирования стоматологических заболеваний / И.Л. Горбунова // Омский науч. вестн. - 2006. - №3(37). - С. 240-242, Cloning human enamelin cDNA, chromosomal localization, and analysis of expression during tooth development / С.C. Hu [et al.] // J. Dent. Res. - 2000. - Vol. 79, №4. - P. 912-919, Lau E.C. Analysis of human enamel genes: Jnsights into genetic disorders of enamel / E.C. Lau, H.C. Slavkin, M.L. Snead // Cleft. Palate J. - 1990. - Vol. 27, №2. - P. 121-130, Localization of a gene for autosomal dominant amelogenesis imperfecta (ADAI) to chromosome 4q / K. Forsman [et al.] // Hum. Mol. Genet. - 1994. - Vol. 3, №9. - P. 1621-1625]. Однако до сих пор не изучены какие-либо факторы впрямую связанные с наследственностью кариеса. Исходя из этого, генетическую обусловленность кариеса необходимо рассматривать с позиций наследуемости физико-химических, анатомических и морфологических особенностей зубных тканей, количественного и качественного соотношения в них апатитов, состава микроэлементов и т.д. [Гемонов В.В. Гистоархитектоника эмали зубов человека / В.В. Гемонов, Г.В. Большаков, Б.В. Цыренов // Стоматология. - 1998. - №1. - С. 5-7, Недосеко В.Б. Влияние массивной местной углеводной нагрузки на органы и ткани полости рта кариесрезистентных лиц / В.Б. Недосеко, И.Л. Горбунова, А.Н. Питаева // Омский науч. вестн. - 2000. - №10. - С. 137-141, Савранский Ф.З. Физико-химические и структурные особенности строения эмали зуба человека, изученные методом электронного парамагнитного резонанса / Ф.З. Савранский // Новое в терапевтической, детской и хирургической стоматологии. - М., 2004. - С. 78-79].
Органическая (белковая) матрица формирует кристаллическую структуру эмали и является инициатором кальцификации эмали [Боровский Е.В. Биология полости рта / Е.В. Боровский В.К. Леонтьев. - М.: Медицина, 1991. - 302 с.; Вавилова Т.П. Биохимия тканей и жидкостей полости рта / Т.П. Вавилова. - М., 2008. - 208 с.; Amino acid sequence of a major human amelogenin protein employing Edman degradation and cDNA sequencing / J. Catalano-Sherman [et al.] // J. Dent. Res. - 1993. - Vol. 72, №12. - P. 1566-1572; Enamel matrix proteins and ameloblast biology / D. Deutsch [et al.] // Connect Tissue Res. - 1995. - Vol. 32, №1-4. - P. 97-107; Hess W.C. Amino acid composition of enamel protein / W.C. Hess, С.I. Lee, B.A. Heldig // J. Dent. Res. - 1953. - Vol. 32. - P. 585-587; Hess W.C. The amino acid composition of proteins isolated from the healthy enamel and dentin of carions teeth / W.C. Hess, С.I. Lee // J. Dent. Res. - 1954. - Vol. 33, №1. - P. 62-64].
Функции минерализации и удержания минеральной фазы эмали осуществляется через построение нерастворимой в нейтральной среде трехмерной белковой матрицы эмали, которая связана с кристаллами гидроксиапатита и кислоторастворимым белком эмали, образующими «скелет» этой ткани [Comparative tem study of dental tissue hydroxyapatite with chemically obtained apatite / C. Stefanov [et al.] // Romanian in Biotechnological Letters. Printed in Rumania. All rights reserved. Original paper. - 2010. - Vol. 15, №3. - P. 117-125; Human amelogenesis: high resolution electron microscopy of nanometer-sized particles / F.J. Cuisinier [et al.] // Cell Tissue Res. - 1993. - Vol. 273, №1. - P. 175-182; Yanagisawa T. High-resolution electron microscopy of enamel-crystal demineralization and remineralization in carious lesions / T. Yanagisawa, Y. Miake // J. of Electron Microscopy. - 2003. - Vol. 52, №6. - P. 605-613]. С белками связана способность твердых тканей к росту, регенерации и другим свойствам [Stack М. Organic constituents of enamel / M. Stack // J. Amer. Dent. Ass. - 1954. - Vol. 48. - P. 297]. Сегодня не оставляет сомнения значение белков как матриц в процессах биологической кальцификации. Минерализации всегда предшествует формирование белковой матрицы, биологическая минерализация неосуществима без белковых матриц и совершается только на них [Glimcher М. Morphological and biochemical consideration in structural studies of the organic matrix enamel / M. Glimcher, P. Levine, L. Bonar // J. Ultrastr. Res. - 1965. - Vol. 13. - P. 281-295]. На сформированной матрице возникают ядра кристаллизации, в которых происходит первоначальное обызвествление с образованием в дальнейшем кристаллов гидроксиапатита [Battistone G. Studies of the composition of teeth. IV. The amino acid composition of human enamel protein / G. Battistone, G. Burnett // J. Dent. Res. - 1956. - Vol. 35, №2. - P. 260-263]. Таким образом, белковые матрицы инициируют минерализацию и делают процесс минерализации упорядоченным и регулируемым [Биохимия человека / Р. Мари [и др.]. - М.: Мир, 1993. - 561 с.; Не L. Preparation and characterization of dicalcium phosphate dehydrate coating of enamel / L. He, Z. Feng // Materials letters. - 2007. - Vol. 61. - P. 3923-3926]. Подавление синтеза белка влечет нарушение минерализации [Петрович Ю.А. Изучение белка эмали зуба человека в онтогенезе с помощью ИК спектроскопии в области колебаний ортофосфатных групп / Ю.А. Петрович, Н.А. Турин, Л.Д. Кисловская // Заболевания челюстно-лицевой системы и их профилактика: тез. I съезда науч. о-ва стоматологов Эстонии. - Таллин, 1988. - С. 45-47; Петрович Ю.А. Функционально-молекулярная модель строения эмали / Ю.А. Петрович, В.К. Леонтьев, К.С. Десятниченко // Стоматология. - 1979. - №1. - С. 70-74; Цитрин Д.Н. Новые данные о строении и физико-химических свойствах эмали зубов человека и животных / Д.Н. Цитрин // Стоматология. - 1950. - №1. - С. 14].
Первичная минерализация эмали представляет собой двухступенчатый процесс, включающий инициацию и последующий рост кристаллов [Epitaxial overgrowth of apatite crystals on the thin-ribbon precursor at early stages of porcine enamel mineralization / Y. Miake [et al.] // Calcif. Tissue Int. - 1993. - Vol. 53, №4. - P. 249-256; Cui Fu-Zhai. New observations of the hierarchical structure of human enamel, from nanoscale to microscale / Cui Fu-Zhai, Ge Jun. // J. of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - 2007. - Vol. 1, №3. - P. 185-191].
Для роста кристаллов необходимы белки с небольшой молекулярной массой, а в составе секретируемых гранул белков содержатся высокомолекулярные гликофосфопротеины, поэтому в норме они подвергаются расщеплению протеолитическими ферментами - энамелизинами (ММР-20), калликреин-связанной пептидазой и матриксными сериновыми протеазами [Enamel proteins and proteases in Mmp20 and Klk4 null and double-null mice / Y. Yamakoshi [et al.] // Eur J Oral Sci. - 2011. - Vol. 1, №119. - P. 206-216; Fluoride down-regulates the expression of matrix metalloproteinase-20 in human fetal tooth ameloblast-lineage cells in vitro / Y. Zhang [et al.] // Eur J Oral Sci. - 2006. - Vol. 1, №114. - P. 105-110; Genetic variation in MMP20 contributes to higher caries experience / P.N. Tannure [et al.] // J. Dent. - 2012. - Vol. 40, №5. - P. 381-386; How do enamelysin and kallikrein 4 process the 32-kDa enamelin? / Y. Yamakoshi [et al.] // Eur J Oral Sci. - 2006. - Vol. 1, №114. - P. 45-51].
За формирование зубной эмали отвечает множество генов, которые кодируют матричные белки и протеиназы, необходимые для управления процессами минерализации и кристаллизации созревающей эмали. В настоящее время практически полностью идентифицированы полиморфизмы генов, кодирующих основную триаду белков амелогенеза: амелогенина, энамелина, амелобластина [Mutationin kallikrein 4 causes autosomal recessive hypomaturation amelogenesis imperfect / P.S. Hart [et al.] // J. Med. Genet. - 2004. - Vol. 41. - P. 545-549]. Калликреин-4 является основным ферментом стадии созревания и отвечает за замещение белковой матрицы на минералы и формирование правильной организации кристаллов [Functions of KLK4 and ММР-20 in dental enamel formation / Y. Lu [et al.] // Biol Chem. - 2008. - Vol. 389, №6. - P. 695-700; Human enamel phenotype associated with amelogenesis imperfecta and a kallikrein-4 (g.2142G>A) proteinase mutation / J.T. Wright [et al.] // Eur J Oral Sci. - 2006. - Vol. 1, №114. - P. 13-17; Hypomaturation Enamel Defects in KLK4 Knockout / LacZ Knockin Mice / Simmer J.P. [et al.] // J. of Biological Chemistry. - 2009. - Vol. 284. - P. 19110-19121; Mutationin kallikrein 4 causes autosomal recessive hypomaturation amelogenesis imperfect / P.S. Hart [et al.] // J. Med. Genet. - 2004. - Vol. 41. - Р. 545-549]. Пептидаза KLK-4 является, своего рода, эвакуатором остаточных фрагментов матричных белков при замене их на минералы, регулирует обработку органической матрицы эмали, что, в конечном итоге, определяет структуру и состав эмали [Mmp-20 and Klk4 cleavage site preferences for amelogenin sequences / T. Nagano [et al.] // J Dent Res. - 2009. Vol. 88, №9. - P. 823-828]. Мутации гена каллекреина-4 приводят к усечению молекулы белка пептидазы, что влияет на протеолитическую активность и непосредственно на структуру гидроксиаппатита. Изменяется ширина или толщина кристаллов, но их длина остается неизменной [Simmer KLK4 and ММР-20 in dental enamel formation / Y. Lu [et al.] // Biol. Chem. - 2008. - Vol. 389, №6. - P. 695-700]. Внешние слои эмали обладают нормальной твердостью, но внутренние области мягки и содержат намного больше белка, чем в норме [Биоминерализация в организме человека и животных / В.Т. Волков [и др.] - Томск: Тандем-Арт, 2004. - 498 с.; Галюкова А.В. Исследование структуры поверхности эмали зубов методом травления кислотой в сканирующем и трансмиссионном электронных микроскопах / А.В. Галюкова, С.М. Ремизов // Стоматология. - 1980. - №5. - С. 18-20; Турин Н.А. Изучение состояния эмали при поверхностной декальцинации с помощью растрового электронного микроскопа / Н.А. Турин // Результаты экспериментальных и клинических исследований: сб. науч. тр. - М., 1976. - С. 240-241; Деньга О.В. Спектро-колориметрическая оценка процессов минерализации в твердых тканях зубов / О.В. Деньга // Вестн. стоматологии. - 1999. - №1. - С. 2-4, 81-82; Особенности структуры и состава твердых тканей зубов и зубных камней при генерализованном пародонтите / А.В. Цимбалистов [и др.] // Пародонтология. - 2006. - №1(38). - С. 3-7]. Темп минерализации эмали при дефекте KLK-4 в целом ниже на 25% [Human enamel phenotype associated with amelogenesis imperfecta and a kallikrein-4 (g.2142G>A) proteinase mutation / J.T. Wright [et al.] // Eur J Oral Sci. - 2006. - Vol. 1, №114. - P. 13-17]. Таким образом, эмаль, созревающая под влиянием мутированной пептидазы KLK-4, по толщине абсолютно не отличается от нормальной эмали. Влияние мутаций гена калликреина-4 проявляется в нарушении минерализации кристаллов гидроксиаппатита и увеличении остаточного количества белка в эмали [Турин Н.А. Ультраструктура развивающейся эмали зуба человека / Н.А. Турин, Ю.А. Петрович, Н.П. Лебкова // Стоматология. - 1986. - №5. - С. 7-9]. В калликреин-4-мутированой эмали повышено содержание белка по сравнению с нормальной эмалью, поэтому измененная таким образом эмаль в большей степени подвержена процессам минерализации по сравнению с эмалью, не пострадавшей от мутаций гена калликреина-4 [Билобров В.М. ИК спектроскопические проявления особенностей строения эмали зубов / В.М. Билобров, И.В. Чижевский, О.И. Сысун // Новое в терапевтической, детской и хирургической стоматологии: VIII Всесоюз. съезд стоматологов. - М., 1987. - С. 14-15; In vitro albumin binding on apatite crystals from developing enamel / J. Menanteau [et al.] // Bone Miner. - 1987. - Vol. 3, №2. - P. 137-141].
Полиморфизм гена каллекреина-4 (KLK-4) в мутационных точках G2664153A и G2142A определяет наличие высокой или низкой массовой доли белка, и таких аминокислот, как аспарагиновая, глутаминовая, гистидин, глицин, лейцин, лизин и цистин, сопоставимых с повышением каллекреин-транслируемой пептидазы промотора гена KLK4, регулирующего амелогенез. KLK-4 является основным ферментом стадии созревания зубной эмали и отвечает за замещение белковой матрицы на минералы и формирование правильной организации кристаллов, специфической текстуры, плотности и пористости.
Об информативности гомозигот А/А гена KLK-4 в мутационных точках G2664153A и G2142A свидетельствуют ранее проведенные в медицине исследования. Так, есть данные о том, что повышение гомозигот А/А, сопоставимое с повышением каллекреин-транслируемой пептидазы промотора гена KLK4, статистически значимо сопровождающейся активацией прогестероновых рецепторов (T47D) при ранней диагностике и прогнозе рака молочной железы и андрогенных рецепторов (LNCaP, 22Rv1 и MDA-PCa-2b) при ранней диагностике и прогнозе рака предстательной железы [Lai J. Direct Progesterone Receptor and Indirect Androgen Receptor Interactions with the Kallikrein-Related Peptidase 4 Gene Promoter in Breast and Prostate Cancer / J. Lai [et al.] // A New Journal From AACR Cancer Discovery An AACR Special Conference Targeting PI3K/m TOR Signaling in Cancer. - San Francisco, CA. - February 24-27. - 2011.].
Задача изобретения - разработка способа прогноза кариеса зубов путем анализа полиморфизма гена калликреина-4 в мутационных точках G2664153A и G2142A в сыворотке крови для определения точечных мутаций гена каллекреина-4 с помощью метода ПЦР.
Результат решения поставленной задачи - повышение качества ранней диагностики и прогноза кариеса зубов на основании выявления аллеля А гена калликреина-4 при анализе полиморфизма гена калликреина-4 в мутационных точках G2664153A и G2142A. Генетическое обоснование определенной кристаллохимической организации зубной эмали позволит прогнозировать кариозный процесс при отсутствии клинических признаков заболевания.
Поставленная задача решается за счет того, что в комплексе клинико-лабораторных параметров определяется распределение полиморфизма гена калликреина-4 (KLK-4) в мутационных точках G2664153A и G2142A, при этом присутствие аллеля А в мутационных точках G2664153A и G2142A может быть использовано в качестве предиктора высокого риска развития кариеса у конкретного пациента.
Анализ отличительных признаков показал, что предлагаемый способ существенно отличается от известных тем, что предполагает прогнозирование развития кариеса на основании установления корреляционных взаимосвязей между наличием аллеля А гена KLK4 в мутационных точках G2664153A и G2142A, с подавлением синтеза белка и дисбалансом аминокислотного состава в зубной эмали (аспарагиновая, глутаминовая, гистидин, глицин, лейцин, лизин и цистин), что влечет за собой нарушение процесса минерализации и как следствие реализацию кариеса зубов. Выяснив особенности распределения аллеля А гена KLK4 в мутационных точках G2664153A и G2142A, продемонстрирована его потенциальная генетическая информативность в качестве донозологического маркера риска развития кариеса зубов.
Сущность изобретения.
Исследованы однонуклеотидные полиморфизмы гена KLK4 в мутационных точках: G2664153A и G2142G.
Образцы ДНК выделены из венозной крови обследуемых. Для определения точечных мутаций использовался метод "SNP-Экспресс", представляющий собой универсальный метод, основанный на единой программе амплификации, а также в формате реакционный смеси со стандартным праймером. ПЦР-набор "SNP-Экспресс" включает в себя две реакционные смеси для идентификации "нормальной" и "патологической" аллели соответственно. Каждая реакционная смесь содержит по паре аллель - специфичных праймеров, имеющих общие типовые черты: все праймеры имеют одинаковую длину в 40 нуклеотидов и один mismatch в 8-м положении от 3- конца в результате амплификации формируются ампликоны одной длины (79 нуклиатидов). Таким образом, каждый образец выделенной ДНК подвергается амплификации дважды - с двумя аллель - специфичными реакционными смесями, что, соответственно, позволяет после проведения электрофореза давать три типа заключения: "нормальная" гомозигота, гетерозигота, "патологическая" гомозигота.
В исследовании использовались праймеры, входящие в стандартный набор «Литех». Праймеры подобраны с помощью программы Primer-express 3.0. Специфичность праймеров проверена в программе NCBI для Macintosh.
Выборки больных кариесом и контрольная популяционная (лица, не имеющие кариеса) были сформированы из представителей европеоидной расы, проживающей на территории г. Омска. Исследовательская когорта состояла из 131 человека в возрасте от 25 до 60 лет, из которых 68 (51,9%) мужчин и 63 (48,1%) женщин, средний возраст - 33±1,2 лет.
Критериями исключения являлись:
• география проживания, не входящая в территорию г. Омска и Омской области;
• наличие тяжелой соматической патологии, могущей повлиять на формирование и строение зубов (наследственные и специфические заболевания, сахарный диабет, эпидемический паротит, болезнь Шегрена в анамнезе и др.);
• наличие хронических соматических заболеваний (патология ЖКТ; сахарный диабет, онкологические заболевания, заболевания печени и почек, патология крови; патология сердца и сосудов, дыхательной и нервной систем в фазе декомпенсации);
• прием лекарственных препаратов, влияющих на состояние органов и тканей полости рта;
• токсическая, в том числе алкогольная, и (или) наркотическая зависимость, установленные на основании анамнестических данных, либо выявленные на любом этапе обследования;
• беременность или лактация;
• наличие поражений твердых тканей зубов некариозного происхождения;
• лица, не понимающие цели исследования и не подписавшие добровольного информированного согласия на участие в исследовании, а также отказавшиеся от участия в исследовании на любом из его этапов.
Определение белка в зубной эмали проводили по методу Барнштейна [Практикум по биохимии / под ред. Н.П. Мешковой, С.Е. Северова. - М.: Изд-во Моск. ун-та, 1979. - С. 90-91].
Частоты полиморфизмов гена KLK4 у обследованного контингента представлены в таблицах 1 и 2.
При анализе генотипов аллельного полиморфизма гена KLK4 среди больных кариесом, в мутационной точке 1 (G2664153A) было зафиксировано статистически значимое (р<0,01) повышение частот генотипов А/А по отношению к генотипам G/G и G/A, а также значимое (р<0,05) преобладание патологического аллеля А у кариесподвеженных, в то время как у лиц с интактным зубным рядом была значимо (р<0,01) выше частота генотипа G/G (нормальная гомозигота) и преобладание нормального аллеля G (р<0,05).
В мутационной точке 2 (G2142A) аллельного полиморфизма гена KLK4 у кариесподверженных также отмечается статистически значимое (р<0,001) увеличение не только патологических гомозигот А/А по сравнению с кариесрезистентными, но и значительное преобладание патологического аллеля А. У кариесрезистентных, напротив, отмечается статистически значимое увеличение полиморфизма G/G (нормальная гомозигота) по сравнению с полиморфизмами G/A и А/А. Результаты статистического анализа представлены в таблицах 1, 2, 3.
95%
При оценке частоты выявления аллелей G и А (мутация 1 G2664153A), величина относительного риска развития кариеса (OR, OP) составила 1,374 (CI: 1,062-1,776), величина отношения шансов (ОШ) составила 1,778 (1,122-2,816).
95%
При оценке частоты выявления аллелей G и А (мутация 2 G2142A), величина относительного риска (OR, OP) составила 2,517 (CI: 1,902-3,333), величина отношения шансов развития кариеса (ОШ) составила 6,014 (3,65-9,91).
При анализе таблиц сопряженности оценивались значения информационной статистики Кульбака (2I-статистика) (для оценки связи изучаемых факторов и результативных признаков), которая рассматривается как мощный вариант непараметрического дисперсионного анализа, применяемый, в т.ч. и на относительно малых выборках.
Вычисление информационной статистики Кульбака для таблицы с двумя входами осуществлялось по следующей формуле:
или
2I=(сумма 1)-(сумма 2), где
2I - показатель информационной статистики;
i
j
n и n - объемы выборок в двух альтернативных группах.
Полученное фактическое значение 2I сравнивали с табличным значением хи - квадрат при соответствующем числе степеней свободы.
Результаты исследования свидетельствуют об информативности полиморфизма гена KLK4 в мутационных точках G2664153A и G2142A для прогноза развития кариеса.
Частоты аллеля А гена KLK4 и генотипов А/А в популяции кариесподверженных близки к описанным в литературе [Human enamel phenotype associated with amelogenesis imperfecta and a kallikrein-4 (g.2142G>A) proteinase mutation / J.T. Wright [et al.] // Eur J Oral Sci. - 2006. - Vol. 1, №114. - P. 13-17]. Присутствие аллеля А, по-видимому, следует рассматривать как необходимый фактор для развития кариеса.
Проведенное исследование убедительно свидетельствует о том, что в изученных группах пациентов отмечается статистически значимое более частое носительство патологического аллеля А у кариесподверженных, определяющее различия в структуре и текстуре эмали зубов с кариесрезистентными.
При изучении ассоциаций генотипов и аллелей гена KLK4 в исследуемых мутационных точках с количеством белка и аминокислот удалось установить следующее. Повышение частот генотипов А/А по отношению к генотипам G/G и G/A в мутационной точке 1 у кариесподверженных статистически значимо сопровождается повышением массовой доли белка (р≤0,001) и большинства аминокислот: гистидин (р≤0,001), глицин (р≤0,001), треонин (р≤0,01), аланин (р≤0,001), фенилаланин (p≤0,01), лейцин (р≤0,001), лизин (р≤0,001) и цистин (р≤0,001). Кроме того, в мутационной точке 2 у кариесподверженных повышение гомозигот А/А сопровождается статистически значимым увеличением массовой доли белка (р≤0,001) и таких аминокислот, как аспарагиновая (р≤0,001), глутаминовая (р≤0,001), гистидин (р≤0,001), глицин (р≤0,001), лейцин (р≤0,01), лизин (р≤0,05) и цистин (р≤0,01) по сравнению с гетерозиготами и гомозиготами G/G. Наличие гомозиготного варианта А/А гена KLK4 определялось в 4,8 раз чаще у кариесподверженных с преобладанием патологического аллеля А в мутационной точке 1 и мутационной точке 2.
Помимо этого, у больных с повышением частот генотипов А/А в мутационной точке 1 отмечается тенденция к увеличению валина, изолейцина и метеонина.
Промышленная применимость способа подтверждается нижеследующими клиническими примерами.
Пример №1.
Клиническими исследованиями были установлены существенные различия в активности, распространенности и темпе прироста кариеса у русских и казахов, населяющих Омскую область. В этой связи изучение полиморфизма гена KLK-4 явилось попыткой обоснования этой разницы с молекулярно-генетических позиций.
Было проведено молекулярно-генетическое обследование исследовательской когорты, состоящей из 150 человек в возрасте от 25 до 49 лет, из которых русских - 76 человек (39 женщин и 37 мужчин) и казахов - 74 человека (37 женщин и 37 мужчин). Представленная выборка была генотипирована по гену калликреина-4 (KLK4). Ген KLK4 исследовали в трех мутационных точках: T2664152G (мутация 1), G2664153A (мутация 2), G2142A (мутация 3).
При анализе генотипов аллельного полиморфизма гена KLK4 среди казахов, в мутационной точке 2 (G2664153A) было зафиксировано статистически значимое (р<0,01) повышение частот генотипов А/А по отношению к генотипам G/G и G/A, а также значимое (р<0,05) преобладание патологического аллеля А у казахов, в то время как у русских была значимо (р<0,01) выше частота генотипа G/G (нормальная гомозигота) и преобладание нормального аллеля G (р<0,05).
В мутационной точке 3 (G2142A) аллельного полиморфизма гена KLK4 у казахов также отмечается статистически значимое (р<0,001) увеличение не только патологических гомозигот А/А по сравнению с русскими, но и значительное преобладание патологического аллеля А. У русских, напротив, отмечается статистически значимое увеличение полиморфизма G/G (нормальная гомозигота) по сравнению с полиморфизмами G/A и А/А.
Определив количество остеопротегерина (инициатора ингибирования активации и дифференциации остеокластов) у русских и казахов, проживающих на территории Омской области, генотипированных по KLK4, удалось установить статистически значимое (р≤0,001) снижение концентрации остеопротегерина в крови казахов, имеющих носительство полиморфного варианта А/А гена KLK4 в мутационной точке 2 и в мутационной точке 3.
Так, у русских, генотипированных по KLK4 в полиморфной точке 2, концентрация остеопротегерина в сыворотке крови при наличии полиморфного варианта А/А составила 11,659 пмоль/л, а у казахов при полиморфизме А/А этот показатель составил 2,911 пмоль/л. В полиморфной точке 3 у русских, генотипированных по KLK4, концентрация остеопротегерина в сыворотке крови составила 8,256 пмоль/л, а у казахов - 3,011 пмоль/л. При генотипировании русских и казахов по KLK4 в полиморфных точках 2 и 3 при наличии полиморфизма G/G содержание остеопротегерина в сыворотке крови не имеет статистически значимых различий (8,674 пмоль/л у русских и 7,375 пмоль/л у казахов).
Пример №2.
Выяснены особенности распределения генотипов гена калликреина-4 (KLK-4) по аллельным полиморфизмам в мутантных точках: G2664153A и G2142A у беременных женщин в возрастных группах до 30 лет и после 30 лет, срок беременности которых составлял 13-36 недель (II и III триместры), в возрасте 25-35 лет европеоидной расы.
При анализе генотипов аллельного полиморфизма гена KLK4 среди некоторых беременных, находящихся в возрасте до 30 лет, а также беременных старше 30 лет, в мутационной точке G2664153A было зафиксировано статистически значимое (р<0,01) повышение частот генотипов А/А по отношению к генотипам G/G и G/A, а также значимое (р<0,05) преобладание патологического аллеля А, в то время как у других беременных обеих возрастных групп была значимо (р<0,01) выше частота генотипа G/G (нормальная гомозигота) и преобладание нормального аллеля G (р<0,05).
В мутационной G2142A аллельного полиморфизма гена KLK4 у части обследуемых также отмечается статистически значимое (р<0,001) увеличение не только патологических гомозигот А/А, но и значительное преобладание патологического аллеля А. У других, напротив, отмечается статистически значимое увеличение полиморфизма G/G (нормальная гомозигота) по сравнению с полиморфизмами G/A и А/А. Полученные закономерности присущи женщинам обеих обследованных возрастных групп.
Клиническими исследованиями были установлены существенные различия в интенсивности, распространенности и темпе прироста кариеса у беременных, являющихся носителями патологического аллеля А гена KLK4 и беременными с преобладанием нормального аллеля G гена KLK4.
Так, было выявлено, что в обеих группах пациенток, как на момент первичного осмотра, так и после проведения курса кариеспрофилактики с использованием трехкомпонентного кальций-фосфат-фтор-содержащего геля, показатели, характеризующие состояние гигиены полости рта и кариесогенность зубного налета не имели статистически значимых различий.
При этом было установлено, что величина индекса КПУп в группе беременных, являющихся носителями патологического аллеля А гена KLK4, имела тенденцию на увеличение показателя по сравнению с первичным осмотром, несмотря на проведение кариеспрофилактических мероприятий, - ΔКПУп - 10,14±0,53 (р≤0,05). Этого, очевидно, не произошло в группе пациенток с преобладанием нормального аллеля G гена KLK4.
При сравнении основных показателей ротовой жидкости беременных с преобладанием патологического аллеля А и беременных с преобладанием нормального аллеля G гена KLK4 было установлено, что значение активной концентрации кальция было наибольшим в группе беременных с преобладанием нормального аллеля G гена KLK4 (0,00049 моль/л) и имело статистически значимые различия с аналогичным показателем в группе беременных с преобладанием патологического аллеля А гена KLK4 (0,00019 моль/л), (р≤0,001).
При изучении активных концентраций натрия и калия в ротовой жидкости обследуемых групп было установлено статистически значимое (р≤0,001) увеличение активной концентрации калия в группе беременных с преобладанием патологического аллеля А гена KLK4 по сравнению с аналогичным показателем в группе женщин с преобладанием нормального аллеля G гена KLK4. Деминерализующая активность осадка ротовой жидкости была значимо (р≤0,001) выше у беременных с преобладанием нормального аллеля G гена KLK4, по сравнению с деминерализующей активностью осадка беременных с преобладанием патологического аллеля А гена KLK4.
Результаты исследования позволяют утверждать, что при выявлении полиморфизмов А/А и G/A гена KLK-4 у беременных, несмотря на проведенные аппликации на зубы трехкомпонентного кальций-фосфат-фтор-содержащего геля, увеличивается темп прироста кариеса, а также изменяются такие показатели ротовой жидкости, как активные концентрации кальция и калия и деминерализующая активность осадка ротовой жидкости.