СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИОМАССЫ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ЛИПИДОВ
METHOD OF CULTIVATION OF BIOMASS WITH INCREASED CONTENT OF LIPIDS

Изобретение относится к области биотехнологических процессов и производств, в частности к способам культивирования биомассы.
Известен способ культивирования микроводорослей на основе штамма "Chlorella vulgaris ИФР №с-111" (Патент на изобретение РФ №;2176667, МПК C12N 1/12, С12М 3/00, С12М 3/04, 2001 г.). Способ предусматривает розлив питательной среды в емкости, инокуляцию суспензии штаммом, освещение культуральной жидкости в процессе роста микроводорослей и поддержание необходимой температуры суспензии. Изобретение обеспечивает интенсификацию процесса выращивания микроводорослей с использованием упомянутого выше штамма и получение стабильной плотности клеток (50-60 млн кл/мл).
Недостатком данного способа является то, что он обеспечивает низкое содержание липидов в биомассе. Данный недостаток объясняется отсутствием дополнительных стадий в процессе культивирования, которые приводили бы к росту содержания липидов.
Известен способ культивирования микроводорослей (Патент на изобретение РФ №2175013, МПК C12N 1/12, A01G 33/00, 2001 г.) и установка для его осуществления. Культивирование микроводорослей осуществляется путем фотосинтеза при воздействии на них радиолюминесцентного излучения и тепла, возбуждаемого проникающими ядерными излучениями, при этом спектр радиолюминесцентного излучения может быть выбран резонансно совпадающим со спектром действия фотосинтеза. Искусственным источником энергии служит источник проникающих ядерных излучений, источником люминесцентного оптического излучения - радиолюминофор, тепло генерируется в среде источника ядерных излучений. В качестве источника ядерных излучений используется ядерный реактор, в том числе реактор - размножитель с уран-ториевым циклом, в том числе в виде решетки из ядерных радиолюминесцентных ламп, которые со всех сторон окружены светоприемными кюветами с суспензией культивируемых микроводорослей.
Недостатком данного способа также является то, что он обеспечивает низкое содержание липидов в биомассе. Данный недостаток объясняется отсутствием дополнительных стадий в процессе культивирования, которые приводили бы к росту содержания липидов в готовом биодизельном топливе. Кроме того, недостатком данного способа является также применение дорогостоящего компонента, являющегося прекурсором, - радиолюминофора.
Наиболее близким к предлагаемому решению является способ культивирования микроводорослей биотопливного назначения (Патент на изобретение №:2497944, МПК C12N 1/12 (2006.01), C12Q 1/00 (2006.01)). Данный способ включает две стадии альголизации. На первой стадии осуществляют альголизацию первичным инокулятом культуры, преимущественно Chlorella vulgaris BIN, полученным в фотобиореакторе, синхронно или со сдвигом по времени многофункциональных закрытых бассейнов со светопроницаемыми ограждениями. Вторую стадию культивирования микроводорослей начинают путем отбора из бассейнов вторичного инокулята при температуре воды в открытых водоемах 12-18°C и продолжают его подачу в открытые водоемы до достижения в них требуемой объемной плотности микроводорослей. Частично отбирают вторичный инокулят из бассейна в качестве готового продукта в весенний и осенний периоды при температуре воды в них в диапазоне 8-12°C, при этом в многофункциональные бассейны добавляют равное количество воды с растворенными в ней биогенами.
Несмотря на увеличение производительности по объему получаемой биомассы данный способ не позволяет получать концентрацию липидов более 10%.
Задачей изобретения является получение биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris с повышенным содержанием липидов.
Решение технической задачи достигается за счет создания стрессовых условий при культивировании.
Между отличительными признаками и достигаемым техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь.
Технический результат достигается тем, что создание стрессовых условий обеспечивается изменением состава подаваемой питательной среды путем исключения из нее нитрата калия.
Культивирование биомассы Chlorella vulgaris заключается в создании благоприятных условий: температуры 29-30°C, уровня pH 5,5-8,5, содержания углекислого газа 1-2%, уровня освещенности 25000-30000 лк, соотношения темновой и световой фаз: 2 часа (темнота): 22 часа (свет) и подаче посевного материала в количестве 20% от количества питательной среды. При этом последовательно осуществляются стадии культивирования биомассы клеток микроводорослей Chlorella vulgaris в течение 8 суток и создания стрессовых условий для стимулирования накопления внутриклеточных липидов в течение 3 суток. При этом в составе подаваемой питательной среды отсутствует нитрат калия (табл. 1).
Внесение нитрата калия в питательную среду в количестве 3,2 г на 1 л суспензии осуществляется в 1-й день одновременно с внесением маточной культуры микроводорослей Chlorella vulgaris в биореактор и на 4-й день культивирования из-за дефицита азота, возникающего в процессе роста и жизнедеятельности биомассы микроводорослей.
Осуществление культивирования прироста биомассы в течение 8 суток позволяет обеспечить достижение максимально возможной концентрации микроводорослей в суспензии, а создание стрессовых условий в течение последующих 3-х суток позволяет обеспечить накопление максимального количества неполярных липидов.
Стрессовые условия обеспечиваются за счет создания дефицита азота в питательной среде в результате его исчерпания микроводорослями в процессе роста при продолжающейся фиксации углекислого газа в процессе фотосинтеза и наступления липогенной фазы, характеризующейся накоплением нейтральных липидов в количествах, в 4-6 раз превышающих их содержание в клетках в отсутствие стрессовых условий (41% - против 7,3% у ближайшего аналога).
Использование питательной среды приведенного в табл. 1 состава позволяет обеспечить создание стрессовый условий за счет отсутствия в ней нитрата калия. Использование в качестве посевного материала микроводорослей вида Chlorella vulgaris позволяет обеспечить высокий выход нейтральных липидов при разрушении клеточных оболочек микроводоросли.
Подтверждением эффективности предлагаемого метода являются результаты культивирования различных штаммов биомассы микроводорослей Chlorella vulgaris, приведенные в табл. 2. и на рисунках 1-3.
Определение качественного состава получаемых липидов (содержание полярных и нейтральных липидов) осуществлялось методом тонкослойной хроматографии. Определение количественного состава липидных компонентов осуществлялось денситометрически. Полярные липиды представляли собой смесь фосфолипидов и гликолипидов; неполярные липиды - смесь 1,2 - диглицеридов, 1,3 - диглицеридов, ко -фермента Q, триглицеридов, витамина К, сквалена, эфиров воска.
Полученные данные позволяют заключить, что предлагаемый способ культивирования позволяет получить биомассу микроводорослей Chlorella vulgaris с повышенным содержанием липидов.