СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ УСТОЙЧИВОСТИ КОРОВ К МАСТИТУ
METHOD FOR DIAGNOSTICS OF COW IMMUNITY TO MASTITIS

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма генов, в частности гена, содержащего домен активации каспазы 15 (CARD15), обуславливающего пониженное содержание соматических клеток, и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.
Для минимизирования случаев заболевания маститом предлагается проведение лечебных, профилактических мероприятий. Однако повсеместно признаются дополнительные стратегии, основанные на улучшении генетики животного через селективное разведение. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) сейчас широко исследуются и используются в качестве генетических маркеров в области устойчивости/восприимчивости к заболеванию маститом. Количество соматических клеток (SCC) в молоке часто используется в качестве косвенного показателя при выборе животных для селекции [Артемьева О.А, Переселкова Д.А., Виноградова И.В., Котковская Е.Н., Гладырь Е.А., Сивкин Н.В., Зиновьева Н.А. Скрининг стада молочных коров на наличие в молоке гемолитических микроорганизмов во взаимосвязи с содержанием соматических клеток. Сельскохозяйственная биология, 2015, том 50, №6, с. 810-816; Beecher, С., Daly, М., Childs, S., Berry, D., Magee, D., McCarthy, Т., and Giblin, L.: Polymorphisms in bovine immune genes and their associations with somatic cell count and milk production in dairy cattle, BMC Genetics, 11, 99, doi: 10.1186/1471-2156-11-99, 2010; Muhasin Asaf VN, Kumar A, Rahim A, Sebastian R, Mohan V, Dewangan Pand Panigrahi M: An overview on single nucleotide polymorphismstudies in mastitis research. VeterinaryWorld 7(6): 416-421. 2014.]. Мастит по оценке Международной молочной федерации во всех высокоразвитых странах мира остается основным источником потерь в молочном скотоводстве, а по данным Всемирной организации ветеринарного здравоохранения, мастит наносит наиболее значительный ущерб молочному скотоводству, чем все болезни коров, вместе взятые [Halasa, Т.; Huijps, К.; Osteras, О.; Hogeveen, Н.: Economic effects of bovine mastitis and mastitis management. Vet. Q. 29:18-31, 2007; Kumar, A., Rahal, A., Dwivedi, S. K., and Gupta, M. K.: Bacterial prevalence and antibiotic resistance profile from bovine mastitis in Mathura, India. J. Dairy Sci., 38: 31-34, 2010.].
Этиология воспалительных заболеваний в молочной железе разнообразна и может включать в себя инфекции, вызываемые бактериями, паразитами, вирусами и грибками. Иммунный ответ возникает против широкого спектра патогенов благодаря рецепторам, которые распознают консервативные молекулярные структуры, связанные с разными классами возбудителей. Они называются патоген-ассоциированные молекулярные образы (pathogen-associated molecular patterns - РАМР), рецепторы, которые распознают PAMPs, обозначаются как образ-распознающие молекулы или рецепторы (PRMs & PRR) [Schumann RR: Host cell-pathogen interface: molecular mechanisms and genetics. Vaccine, 22 Suppl 1: 21-24. 2004.]
«Образраспознающие рецепторы» PRMs по структурным характеристикам относятся к нескольким классам белковых молекул, а по функции делятся на две группы: эндоцитозные и сигнальные. Среди сигнальных рецепторов центральное место занимают NOD (nucleotide-binding oligomerization domain) рецепторы [Leung E, Hong J, Eraser A, Krissansen GW: Splicing of NOD2 (CARD15) RNA transcripts. Molecular immunology 44(4):284-294. 2007; Sharma, B.S.; Leyva, I.; Schenkel, F.; Karrow, N.A.: Association of Toll-Like Receptor 4 Polymorphisms with Somatic Cell Score and Lactation Persistency in Holstein Bulls. J. Dairy Sci. 89:3626-3635. 2006.].
Ген, кодирующий CARD15 у крупного рогатого скота расположен на ВТА18. Домен активации каспазы 15 (CARD15), также известный как домен олигомеризации нуклеотидов 2 (NOD2), является цитозольным белком, способным инициировать воспаление после распознавания РАМР [Ogura Y, Inohara N, Benito A, Chen FF, Yamaoka S, Nunez G: Nod2, Nod1/Apaf-1family member that is restricted to monocytes and activates NF-kappaB. The Journal of biological chemistry 276(7):4812-4818. 2001; Pant, S.D., Schenkel, F.S., Leyva-Baca, I., Sharma, B.S. and Karrow, N.A.: Identification of single nucleotide polymorphisms in bovine CARD15 and their associations with health and production traits in Canadian Holsteins. BMCGenomics 8:421-427. 2007.]. Основную часть системы распознавания пептидогликанов у млекопитающих составляют CARD15 вместе с NOD1 и TLR2. CARD15 участвует во внутриклеточном распознавании мурамил-дипептидов, минимальных биоактивных структур пептидогликанов, которые являются общими для клеточной стенки как грамположительных, так и граммотрицательных бактерий. Поэтому CARD15 выступает в качестве общего сенсора при бактериальной инфекции [Girardin SE, Philpott DJ: Mini-review: the role of peptidoglycan recognition in innate immunity. European journal of immunology 2004, 34(7): 1777-1782].
Анализ научно-технической, патентной и иной информации показал, что большинство исследований сосредоточены на полиморфизмах CARD15, так было выявлено, что SNP с.3020А>Т (rs43710288) связан с EBVs для SCC, глубины вымени, удоя и выхода белка [Pant, S.D., Schenkel, F.S., Leyva-Baca, I., Sharma, B.S., and Karrow, N.A.: Identification of single nucleotide polymorphisms in bovine CARD15 and their associations with health and production traits in Canadian Holsteins, BMC Genomics, 8, 421, doi: 10.1186/1471-2164-8-421, 2007; Tanabe, Т., Chamaillard, M., Ogura, Y., Zhu, L., Qiu, S., and Masumoto, J.: Regulatory regions and critical residues of NOD2 involved in muramyl dipeptide recognition, Embo. J., 23, 1587-1597, 2004.], a также связь с устойчивостью к паратуберкулезу [Pinedo, P.J., Buergelt, С.D., Donovan, G.A., Melendez, P., Morel, L., Wud, R., Langaee, Т.Y., and Rae D.O.: Association between CARD15/NOD2 gene polymorphisms and paratuberculosis infection in cattle, Vet. Microbiol., 134, 346-352, 2009].
В качестве прототипа заявленного способа, наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату, можно считать проведение ПЦР [Pant, S.D., Schenkel, F.S., Leyva-Baca, I., Sharma, B.S., and Karrow, N.A.: Identification of single nucleotide polymorphisms in bovine CARD15 and their associations with health and production traits in Canadian Holsteins, BMC Genomics, 8, 421, doi:10.1186/1471-2164-8-421, 2007].
Основной недостаток прототипа заключается в том, что при ПЦР длины фрагментов обоих генотипов существенно не различаются (аллель А-197 п.о., аллель Т-166 п.о.), что вызывает трудности при визуализации генотипов в агарозном геле, следовательно, для идентификации нужно использовать гели с содержанием агарозы более 2%, и также увеличивается продолжительность электрофореза, процесс становится более затратным и трудоемким.
При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке способа обнаружения аллеля А гена CARD15, ассоциированного с пониженным содержанием соматических клеток в молоке, с целью создания стада устойчивого к маститу и разработки программ их использования в разведении.
Задача нашего изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования, специфичного способа идентификации полиморфизма в гене CARD15, ассоциированного с пониженным содержанием соматических клеток в молоке, для использования в селекции крупного рогатого скота.
Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ определения полиморфизма CARD15, ассоциированного с пониженным содержанием соматических клеток, для использования в селекции крупного рогатого скота, включающий специфичный однопробирочный метод полимеразной цепной реакции, позволяющий проводить идентификацию результатов с помощью метода электрофореза в агарозном геле без использования дорогостоящего оборудования, что обеспечит относительно невысокую стоимость разрабатываемого способа.
Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании двух обратных и двух прямых праймеров, специфичных для каждого из аллелей. При этом аллелю А, ассоциированному с пониженным содержанием соматических клеток в молоке, соответствует фрагмент большей длины (562 п.о.), а аллелю Т меньшей длины (282 п.о.) - длины фрагментов существенно отличаются друг от друга, что позволяет точно и легко дифференцировать аллели гена CARD15 методом электрофореза в 2% агарозном геле.
Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов, возможно выявление желательного аллеля А гена CARD15, что позволит применить данный метод в селекции животных.
Сущность изобретения - определение полиморфизма гена CARD15 ассоциированного с пониженным содержанием соматических клеток в молоке крупного рогатого скота, методом ПЦР.
Разрабатываемый способ базируется на определении SNP (rs43710288) в кодирующей последовательности гена CARD15 на ВТА 18, в данном участке аллель А приводит к образованию лейцина, а аллель Т глутамина в аминокислотной последовательности.
Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по CARD15 (n=60) были использованы образцы крови коров голштинизированной черно-пестрой породы. ДНК выделяли методом экстракции перхлоратом [Зиновьева Н.А. и др. Введение в молекулярную генную диагностику сельскохозяйственных животных // Дубровицы: ВИЖ, 2002, 112 с.], с использованием магнитных частиц (ООО «Изоген», Россия) и колонок Nexttec (Nexttec Biotechnologie GmbH, Германия) в соответствии с рекомендациями производителей. Каждым из вышеназванных методов выделяли ДНК по 20 образцов крови. Создание серии референтных генотипов проводили посредством использования способа-прототипа. С этой целью проводили амплификацию фрагментов длиной 197 п.о., характерного для аллеля А и 166 п.о., характерного для аллеля В.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения аллелей по гену CARD15 на основе метода ПЦР (А) и результаты генотипирования образцов (Б).
На фиг. 1А представлен дизайн теоретически смоделированной тест-системы
В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=60), в том числе 25 образцов с генотипом АА, (желательный аллель), 15 образцов с генотипом AT, и 20 образцов с генотипом ТТ.
Определение полиморфизма CARD15 предложенным способом выполняли следующим образом:
1. были подобраны два обратных праймера (CARD15_Rev_A_NEW;
CARD15_Rev_T_NEW) и два прямых (CARD15_For_A_NEW;
CARD15_For_T_NEW) аллелеспецифических праймера, специфичных для аллеля А и аллеля Т:
Продукт амплификации праймеров CARD15_Rev_A_NEW и CARD15_For_A_NEW характерен для желательного аллеля А и имеет длину 562 п.о., продукт амплификации праймеров CARD15_Rev_T_NEW и CARD15_For_T_NEW характерен для аллеля Т и имеет длину 282 п.о. Место генотипирования помечено звездочкой. Фиг. 1А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.
4
2
4
2
2
2. выполняли 42 циклов ПЦР в 19 мкл реакционной смеси следующего состава: 1хПЦР буфер (16.6 мМ (NH)SO, 67.7 мМ Трис-HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1,5 мМ MgCl, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 7 мин, 40 циклов последовательно - 94°С - 0,5 мин, 64°С - 0,5 мин, 72°С - 0,75 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин;
4. определение аллелей А и Т гена CARD15 осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 2% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1х ТАЕ буфере 20 мин при 100 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ), при этом генотипу АА (желательный аллель) соответствует фрагмент длиной 562 п.о., генотипу AT - два фрагмента длиной 562 и 282 п.о. и генотипу ТТ - фрагмент длиной 282 п.о. {Фиг. 1Б). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия;
5. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.
Представленный способ диагностики направлен на определение полиморфизма гена CARD15, ассоциированного с пониженным содержанием соматических клеток в молоке, и тем самым, ассоциированного с устойчивостью к маститам, так как оценка количества соматическая клеток в молоке рекомендуется в качестве индикаторного признака для достижения генетического повышения резистентности животных к маститу. Селекция по оценке количества соматических клеток отвечает цели максимизации генетического совершенствования для экономической эффективности.
В процессе нашего исследования была выявлена связь различных полиморфных вариантов гена CARD15 с содержанием соматических клеток в молоке и молочной продуктивностью. Полученные данные показали, что у животных с генотипами АА по гену CARD15 в позиции 43710288 показатель количества соматических клеток ниже по сравнению с другими генотипами, а уровень молочной продуктивности в целом выше, что свидетельствует о лучшем физиологическом состоянии животного. Таким образом, аллель А выявляется как желательный и рекомендуется для использования в качестве маркера, при разведении резистентного к маститу стада.
Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма CARD15 было апробировано на выборке племенного поголовья голштинизированного черно-пестрого скота, на 365 коровах. Исследование выявило наличие 38,1% животных с генотипом АА (желательный), 49,3% коров с генотипом AT, и 12,6% с генотипом ТТ соответственно, частота встречаемости аллеля А составила 62,8%, а аллеля Т 37,2%. Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся устойчивыми к заболеванию маститом.
Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма в гене CARD15 крупного рогатого скота, ассоциированного с пониженным содержанием соматических клеток в молоке, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота.