СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ L-КАРНИТИНА И D-КАРНИТИНА В КОРМАХ, КОМБИКОРМАХ, КОРМОВЫХ ДОБАВКАХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВАХ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
METHOD OF MEASURING WEIGHT FRACTION OF L-CARNITINE AND D-CARNITINE IN FODDERS, FORMULATED FEED, FEED ADDITIVES AND MEDICINAL AGENTS FOR ANIMALS BY HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH FLUORESCENT DETECTION

Изобретение относится к области фармацевтической химии, фармацевтической и пищевой промышленности, в частности к анализу качества кормов, комбикормов, кормовых добавок, ветеринарных лекарственных средств методом хиральной высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ХВЭЖХ).
Предложенный способ может использоваться для измерения массовой доли L-карнитина и D-карнитина (в том числе при совместном присутствии) методом ХВЭЖХ с флуоресцентным детектированием и используется для выявления продукции, содержащую D-карнитин и обладающую токсическим эффектом в кормах, комбикормах, кормовых добавках, ветеринарных лекарственных средствах. Метод предназначен для количественного контроля качества лекарственных средств, кормовых добавок в испытательных лабораториях и на производстве, а также в любых других областях, где используется ХВЭЖХ.
Известно, что L-карнитин - кофермент, участвующий в транспорте активированных жирных кислот с длинной цепью внутрь митохондрий, благодаря чему организм обеспечивается энергией. Дефицит L-карнитина ведет к нарушению бета-окисления жирных кислот, что оказывает негативное влияние на организм животных. Было описано несколько синдромов вторичного дефицита карнитина, которые могут быть результатом дефектов промежуточного метаболизма и изменений, в основном связанных с митохондриальными окислительными путями. Острая нехватка L-карнитина наблюдается при нарушениях обмена веществ, в результате чего появляется мышечная слабость, развивается быстрая утомляемость, гипотония, нервное истощение, возникают нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы и печени. Более 75% суточной потребности L-карнитина должно поступать из пищи.
Введение L-карнитина в рацион скота и птицы приводит к повышению выносливости организма, улучшению функции сердца, снижению жировых отложений, более быстрому восстановлению за счет общего улучшения обменных процессов в клетках, улучшает физиолого-биохимический статус и состояние естественной резистентности, воспроизводительные функции. Это позволяет существенно повысить переваримость питательных веществ корма, что влияет на уровень и качество получаемой продукции.
Карнитин имеет оптически активный центр и существует в виде двух пространственных изомеров - L-карнитина и D-карнитина, имеющих одинаковый химический состав, но различную пространственную конфигурацию. Биологически активным действием обладает только L-карнитин, который обнаруживают в природных источниках.
D-карнитин конкурирует с L-карнитином за одни и те же транспортные системы, нарушает его синтез в печени, препятствует проникновению в миокард, мышечную ткань, блокируют транспорт L-карнитина в тонком кишечнике и обратную реабсорбцию в почках. D-карнитин не влияет на внутримитохондриальное окисление длинноцепочечных жирных кислот и, вызывая дефицит L-карнитина, может приводить к снижению внутримитохондриальной концентрации жирных кислот, вследствие этого - к снижению энергопродукции [1].
Результаты экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о выраженных токсических эффектах D-карнитина со стороны скелетной и сердечной мускулатуры, проявляющихся миастенией и аритмиями.
Указанные симптомы исчезают после введения L-карнитина. Применять следует только L-формы, так как получаемый синтетическим путем может представлять собой как чистый энантиомер, так и смесь L- и D-энантиомеров. На основании данных, приведенных в научной литературе, D- и DL-карнитин нельзя рассматривать как полностью безопасные вещества для применения в ветеринарной и медицинской практике, или в качестве добавок к рационам питания [2].
С появлением эффективных методов получения L-карнитина и по причине отрицательного влияния D-карнитина на организм человека американский Департамент пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) запретил в 1986 г. распространение в США D-карнитина и DL-карнитина [2, 3, 4].
На практике до сих пор продолжают легально использоваться фармацевтические составы, содержащие не L-карнитин, а рацемическую смесь D- и L-карнитина. При этом фармакопеи Евросоюза и США не допускают содержание D-карнитина в лекарственных препаратах более 4% [5, 6].
Известные способы определения изомеров L- и D-карнитина достаточно сложны и трудоемки. Они проводятся с использованием тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС), где требуется использование дорогостоящего масс-спектрометрического оборудования, что зачастую недоступно для большинства лабораторий.
В качестве прототипа был выбран способ определения карнитина, заключающийся в исследовании образцов с помощью ВЭЖХ. Существующий в Российской Федерации ГОСТ Р 53185-2008, п. 4.4 [7] устанавливает метод количественного определения L-карнитина в напитках безалкогольных и слабоалкогольных тонизирующих, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением рефрактометрического детектирования. Этот способ не позволяет разделять L-карнитин и D-карнитин при их совместном присутствии.
Другой прототип (BY 17743 С1, 2013.12.30, дата приоритета 30.12.2013 «Способ определения N-ацетил-L-карнитина»), при котором пробу исследуемого образца анализируют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе, оснащенном колонкой с сорбентом С18 и спектрофотометрическим детектором не позволяет разделять энантиомеры, ввиду слабого поглощения исследуемых аналитов в этой области спектра.
Таким образом, очевидным является поиск унифицированного способа, позволяющего детектировать изомеры карнитина, который позволит выявлять кормовые добавки и лекарственные средства для животных, содержащие D-карнитин и обладающие токсическим эффектом, создавать более эффективные кормовые добавки и лекарственные препараты, обладающие наименьшей токсичностью.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Технический результат: Заявляемый способ обеспечивает избирательность, линейность, прецизионность (повторяемость и воспроизводимость) и правильность, что достигается благодаря тому, что обработку образца проводят 9-флуоренилметоксикарболнил хлоридом (FMOC хлорид) в концентрации 5 мг/см. Пробы в форме таблеток или гранул растирают в ступке, корма и кормовые добавки измельчают на лабораторной мельнице. Пастообразные, порошкообразные и жидкие пробы тщательно перемешивают. Пробы с высоким содержанием жира обезжиривают. Экстракт пробы центрифугируют при 17608 g в течение 5 мин. В мерную колбу вместимостью 5 см переносят 30 мм верхнего слоя экстракта, добавляют 30 мм карбонатного буфера (0,05 моль/дм), 80 мм раствора 9-флуоренилметоксикарболнил хлорида (FMOC хлорида) в концентрации 5 мг/см), перемешивают. Колбу выдерживают на водяной бане при 45°С в течение одного часа, охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки ацетатным буфером с молярной концентрацией 0,05 моль/дм. В мерную колбу вместимостью 10 см переносят 1 см полученного раствора, объем доводят до метки ацетатным буфером (0,05 моль/дм). Условия хроматографирования:
Последовательно соединенные колонки:
- 1-я - SPHERIOSORB SCX 250 × 4,60 мм, 5 мкн;
- 2-я - Astec Chirobiotic TAG 250 × 4,60 мм, 5 мкн;
3
3
Температура колонок 25°С; разделение проводят в режиме градиентного элюирования (фаза А - фосфатный буфер с триэтиламином (6,8 см триэтиламина на 1 дм деионизованной воды, рН буфера доводят ортофосфорной кислотой до значения рН 2,6), фаза Б - ацетонитрил; при соотношении фазы А к фазе Б - 80:20). Регистрация сигнала проводится при длине волны возбуждающего света 260 нм, эмиссии - 310 нм.
х
Массовую долю L-карнитина и D-карнитина С в анализируемом образце рассчитывают по формуле, %:
где:
гр
3
С - массовая концентрация L-карнитина и D-карнитина в экстракте анализируемой пробы, мкг/см;
x
m - масса анализируемой пробы, г;
3
V - объем, до которого разбавлена проба, см;
10 - коэффициент, учитывающий разведение анализируемой пробы;
1
K - коэффициент, учитывающий разведение анализируемой пробы, если массовые концентрации аналитов в экстракте анализируемой пробы выходят за диапазон градуировочной характеристики;
К=1, при представлении результата анализа в массовых долях L- и D-карнитина; или
К=1,23, при представлении результата анализа в массовых долях L- и D-карнитина гидрохлорида;
0,0001 - коэффициент пересчета окончательного результата измерений в проценты.
С использованием предлагаемого способа был определен диапазон измерений от 0,1% до 50% в кормах, комбикормах, кормовых добавках, лекарственных средствах. Расширенная неопределенность результатов измерений находится в пределах от 12 до 35% для L-карнитина и от 10 до 13,5% для D-карнитина.
3
3
Заявленный способ изобретения основывается на разделении энантиомеров L- и D-карнитинов с предварительной дериватизацией. В качестве дериватизирующего агента применяют 9-флуоренилметоксикарболнил хлорид (FMOC хлорид), при взаимодействии с которым, энантиомеры L- и D-карнитинов образуют дериваты, обладающие большей гидрофобностью и флуоресценцией, что позволяет в дальнейшем анализировать их с помощью ХВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. К тому же предколоночная дериватизация позволяет повысить специфичность разделения. Мы провели разделение методом ион-парной хроматографии, используя подвижную фазу с фосфатным буфером с триэтиламином (6,8 см на 1 дм деионизованной воды. Доводят рН раствора с помощью ортофосфорной кислоты, рН 2,6), что способствовало увеличению удерживания дериватов L- и D-карнитина на колонке с сорбентом на основе силикагеля с привитой бензол-сульфокислотой, использующейся в качестве сильного катионообменника и обеспечивающей хорошее разрешение (например, Waters SPHERIOSORB SCX250 × 4,60 мм с размером частиц 5 мкм, или аналогичная). Последовательное присоединение хиральной колонки, содержащей в качестве хирального селектора агликон тейкопланин (например, SUPELCO Astec Chirobiotic TAG 250 × 4.60 мм с размером частиц 5 мкм, или аналогичная), позволило нам добиться необходимого разделения энантиомеров L- и D-карнитина.
3
3
Условия хроматографирования: температура колонок 25°С; разделение проводят в режиме градиентного элюирования (фаза А - фосфатный буфер с триэтиламином (6,8 см на 1 дм деионизованной воды; рН - 2,6), фаза Б - ацетонитрил), в соответствии с таблицей 1.
3
3
В этих условиях время выхода аналитов составляет (ориентировочно): L-карнитин - 59,5 минут; D-карнитин - 61,0 минута; скорость потока элюента - 0,6 см/мин; объем вводимой пробы - 20,0 мм. Регистрация сигнала проводится при длине волны возбуждающего света - 260 нм, эмиссии - 310 нм.
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Пробы в форме таблеток или гранул растирают в ступке, корма и кормовые добавки измельчают на лабораторной мельнице. Пастообразные, порошкообразные и жидкие пробы тщательно перемешивают. Пробы с высоким содержанием жира обезжиривают. В мерных колбах вместимостью 100 см, 50 см, 25 см или 5 см взвешивали от 0,5000 до 1,000 г измеряемой пробы (в зависимости от предполагаемого содержания L- и D-карнитина), добавляли деионизованную воду до метки, помещали на 10 мин в ультразвуковую баню для экстракции в режиме без нагрева (при комнатной температуре). Экстракт переносили в микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см и центрифугировали при 17608 g в течение 5 мин. В мерную колбу вместимостью 5 см пипеткой переносили 30 мм верхнего слоя экстракта, добавляли 30 мм карбонатного буфера (0,05 моль/дм), 80 мм раствора 9-флуоренилметоксикарболнил хлорида (FMOC хлорида) в концентрации 5 мг/см, перемешивали. Колбу выдерживали на водяной бане при 45°С в течение одного часа, охлаждали до комнатной температуры, доводили до метки ацетатным буфером (0,05 моль/дм). В мерную колбу вместимостью 10 см переносили 1 см полученного раствора, объем доводили до метки ацетатным буфером (0,05 моль/дм). Раствор фильтровали через шприцевой фильтр 0,45 мкм в виалу и использовали для хроматографического измерения. Испытание проводят с помощью ХВЭЖХ с флуоресцентным детектированием. На рисунке 1 приведена хроматограмма образца, содержащего смесь L- и D- карнитина в соотношении 100:1, на последовательно соединенных колонках Waters SPHERIOSORB SCX 250 × 4,60 мм, 5 мкн и SUPELCO Astec Chirobiotic TAG 250 × 4,60 мм, 5 мкн с использованием флуоресцентного детектора. Режим градиентного элюирования при соотношении фосфатного буфера с триэтиламином, рН 2,6 и ацетонитрила (80:20). Скорость потока элюента 0,6 см/мин.
Обработка результатов измерений. Времена удерживания L-карнитина и D-карнитина, полученные при анализе градуировочных хроматограмм, используют для идентификации пиков на хроматограмме анализируемой пробы. Определяют площади пиков, идентифицированных аналитов и, используя градуировочные характеристики, находят массовую концентрацию этих аналитов в экстракте анализируемой пробы.
х
Массовую долю L-карнитина и D-карнитина С в анализируемом образце рассчитывают по формуле, %:
где:
гр
3
С - массовая концентрация L-карнитина и D-карнитина в экстракте анализируемой пробы, мкг/см;
x
m - масса анализируемой пробы, г;
3
V - объем, до которого разбавлена проба, см;
10 - коэффициент, учитывающий разведение анализируемой пробы;
1
K - коэффициент, учитывающий разведение анализируемой пробы, если массовые концентрации аналитов в экстракте анализируемой пробы выходят за диапазон градуировочной характеристики;
К=1, при представлении результата анализа в массовых долях L- и D-карнитина; или
К=1,23, при представлении результата анализа в массовых долях L- и D-карнитина гидрохлорида;
0,0001 - коэффициент пересчета окончательного результата измерений в проценты.
Вычисления проводят с точностью до второго десятичного знака и выражают в процентах. Окончательный результат измерений округляют до первого десятичного знака и выражают в процентах. С использованием предлагаемого способа был определен диапазон измерений от 0,1% до 50% в кормах, комбикормах, кормовых добавках, лекарственных средствах. Расширенная неопределенность результатов измерений находится в пределах от 12 до 35% для L-карнитина и от 10 до 13,5% для D-карнитина.
Метрологические характеристики. Настоящая методика обеспечивает выполнение измерений массовой доли L- и D-карнитина с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата к=2, указанной в таблице 2.
За результат измерений массовой доли L-карнитина и D-карнитина  принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, которое вычисляют по формуле:
1
2
где х и х - значения массовой доли L-карнитина и D-карнитина, рассчитанные по формуле (1) для параллельных определений, расхождение между которыми не должно превышать значения предела повторяемости r (%), указанного в таблице 3.
3
4
Если условие (3) не выполняется, эксперимент повторяют, получая при этом х и х.
1
2
3
4
Результаты измерений х, х, х, х признают приемлемыми, при условии, если:
max
min
где x и x - максимальное и минимальное значения, соответственно, из четырех параллельных определений (%);
0,95
CR (4) - значение критического диапазона для четырех параллельных определений при доверительной вероятности Р=0,95 (%), указанное таблице 3.
При выполнении условия (4) за окончательный результат измерений массовой доли L-карнитина и D-карнитина в пробе  принимают среднее арифметическое значение результатов четырех параллельных определений, которое вычисляют по формуле:
При невыполнении условия (4) за окончательный результат измерений массовой доли L-карнитина и D-карнитина в пробе  принимают значение медианы результатов четырех параллельных определений, которое рассчитывают следующим образом:
- упорядочивают результаты параллельных определений по возрастанию значений массовой доли L-карнитина и D-карнитина:
(1)
(2)
(3)
(4)
где x, x, x, x - четыре результата параллельных определений, выстроенные в порядке возрастания значений массовой доли L-карнитина и D-карнитина;
- отбрасывают наименьший и наибольший результаты единичных измерений, два оставшихся результата измерений усредняют:
Кроме того, выясняют и устраняют причины появления неприемлемых результатов параллельных определений.
Значения показателя точности методики используют при:
- оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;
- оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в лаборатории.
Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:
где  - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, %;
U - значение относительной расширенной неопределенности, % (в соответствии с таблицей 2).
Контроль стабильности результатов измерений. Контроль стабильности результатов измерений в пределах лаборатории осуществляют по ГОСТ ИСО 5725-6 с использованием контрольных карт Шухарта. Результаты представленной метрологической оценки способа определения количественного содержания D- и L- карнитинов методом ХВЭЖХ доказывают применимость данного способа согласно нормам, изложенным в ГОСТ 8.563-2009, ГОСТ Р 5725-2002.
Заявленный способ позволяет разделять изомеры D- и L- карнитинов в образцах кормов, комбикормов, кормовых добавок и лекарственных средств для ветеринарии. Диапазон измерений массовой доли для L-и D-карнитина составил от 0,1 до 50%. Расширенная неопределенность результатов измерений находится в пределах от 12 до 35% для L-карнитина и от 10 до 13,5% для D-карнитина. Заявляемый метод обеспечивает избирательность, линейность, прецизионность (повторяемость и воспроизводимость) и правильность.
Способ может быть использован в целях обеспечения качества и безопасности кормов, комбикормов, кормовых добавок и лекарственных средств для ветеринарии, а также и в других отраслях промышленности, помимо фармацевтической и пищевой промышленности, например, в химическом производстве для контроля качества продукции.
Список используемой литературы
1. Спасов А.А., Иежица И.Н. Стереофармакологические особенности карнитина. Русский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, №12, 2005.
2. Preedy V.R. Reviews in Food and Nutrition Toxicity, CRC Press, 2005, v. 3, p. 288.
3. Virmani A, Pinto L, BiniendaZ, Ali S. Food, nutrigenomics, and neurodegeneration-neuroprotection by what you eat! Mol Neurobiol., 2013, v. 48, p:353-62.
4. FDA Briefing Document Pharmacy Compounding Advisory Committee (PCAC) Meeting, 2016.
5. EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDAP). Scientific Opinion on the safety and efficacy of L-carnitine as a feed additive for all animal species based on a dossier submitted by EUROPE-ASIA Import Export GmbH. EFSA Journal 2012; 10(5):2677.
6. L-Carnitine. Technical Evaluation Report. Compiled by ICF International for the USDA National Organic Program.
7. ГОСТ P 53185-2008, п. 4.4 Напитки безалкогольные и слабоалкогольные тонизирующие. Методы испытания.