Способ определения генотипов бета-казеина крупного рогатого скота путём проведения ПЦР в реальном времени с использованием универсального красителя
METHOD FOR DETERMINING BOVINE BETA-CASEIN GENOTYPES BY REAL-TIME PCR USING A UNIVERSAL DYE

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, генетики и селекции сельскохозяйственных животных, в частности к оценке аллельного полиморфизма гена бета-казеина (CSN2) крупного рогатого скота молекулярно-генетическим методом исследования.
Изобретение позволяет упростить способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А1 и А2 бета-казеина, сократить время проведения анализа и значительно удешевить анализ за счет отказа от использования аллель-специфичных флуоресцентно-меченных зондов и заменой их на интеркалирующий универсальный краситель SYBR-GREEN.
Коровье молоко содержит шесть основных белков: четыре казеина (альфа-s1, альфа-s2, бета (β) и каппа) и два сывороточных белка. Среди видов казеина вторым по распространенности является бета-казеин, который имеет, как минимум, 13 различных генетических вариантов. Варианты А1 и А2 CSN2 являются наиболее распространенными среди молочных пород [1, 2].
Ген бета-казеина CSN2 (NSBI ID 281099) расположен в геноме крупного рогатого скота в позиции 6q31 и содержит 8 экзонов.
Аллельный вариант бета-казеина А2 является исходной формой [3] и встречается у зебу и исторически более старых пород крупного рогатого скота. Аллельный вариант бета-казеина А1 обнаружили сравнительно недавно. Он чаще встречается в современных породах крупного рогатого скота [4, 5].
По данным исследований диетологов, бета-казеин А1 не полностью расщепляется в желудочно-кишечном тракте и оказывает негативное воздействие на организм человека, в то время как вариант А2 является более безопасным [6]. Во время переваривания в организме бета-казеина А1 высвобождается короткий белок бета-казоморфин-7 (Beta-casomorphin-7 или ВСМ-7), который является опиоидным пептидом. Предполагают, что именно бета-казоморфин-7 является причиной проблем с молоком А1. На Западе продвижением молока А2 занимается компания «А2 Milk Company».
Холмогорская порода - одна из лучших и старейших пород, выведенных в нашей стране. Она не имеет конкурентов по производству молока в суровых климатических условиях северных регионов России [7]. По численности поголовья на начало 2021 г. холмогорский скот занимает третье место, после черно-пестрой и голштинской пород. Удельный вес животных указанного происхождения составляет 5,16% в общем поголовье крупного рогатого скота молочных пород в Российской Федерации. Основными зонами разведения популяции 135,1 тыс.гол племенного холмогорского скота, в т.ч. 80,0 тыс. коров, являются Архангельская и Вологодская области, Республики Коми и Татарстан. Среди 16 основных молочных пород КРС России холмогорская порода по уровню молочной продуктивности коров (7137-3,88-3,17) занимает 4 ранговую позицию после голштинской (9334-3,87-3,29), айрширской (7580-4,12-3,33), черно-пестрой (7558-3,89-3,20) пород [8].
Для практической селекции крупного рогатого скота на желательный вариант А2 бета-казеина гена CSN2 для целей молочной промышленности необходимо знание существующего соотношения аллельных вариантов А1/А2 бета-казеина в породах скота отечественной селекции и возможность исполнения быстрого и дешевого анализа на больших массивах животных на популяционном уровне.
Несмотря на наличие достоверных данных о взаимосвязи варианта А2 бета-казеина с пищевой безопасностью молочной продукции, на сегодняшний день нет относительно простого в исполнении, быстрого, и главное, дешевого и массово применимого на больших массивах животных метода генотипирования крупного рогатого скота по гену бета-казеина CSN2. Для дифференциации аллельных вариантов генов используются методы ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) [9, 10], аллель-специфичный вариант метода ПЦР (АС-ПЦР) [11] и ПЦР в реальном времени с использованием олигонуклеотидов, меченых флуоресцентными зондами [12].
Основными недостатками первых двух методов являются многостадийность анализа (амплификация полиморфного участка гена, рестрикция полученного ампликона специфической эндонуклеазой, электрофоретическое разделение образующихся фрагментов), его длительность (8-16 часов), вероятность недостоверных результатов в случае неоптимального соотношения количества ДНК, рестриктазы и времени рестрикции. ПЦР в реальном времени с использованием олигонуклеотидов, меченых флуоресцентными зондами, отличается дороговизной и высокой специфичностью применения. То есть зонды, меченные флуорофором, подходят только для одного вида исследования.
Наиболее близким по достигаемому техническому результату, или прототипом, можно считать метод ПЦР в реальном времени, описанный I. Manga et al. (I. Manga, J.  / TaqMan allelic discrimination assay for A1 and A2 alleles of the bovine CSN2 gene // Czech J. Anim. Sci., 55, 2010 (8): 307-312.). Указанный метод определения аллельных вариантов гена бета-казеина осуществляется путем применения ПЦР в реальном времени с использованием олигонуклеотидов, меченых специфическими флуоресцентными зондами.
Для амплификации продукта длиной 101 п.н., включающего SNP rs43703011 (геномная ДНК: Х14711 (http://www.ncbi.nih.gov) были сконструированы два праймера для определения аллельных вариантов гена бета-казеина.
Для проведения ПЦР в реальном времени были использованы праймеры со следующей нуклеотидной последовательностью: прямой праймер, 5'-CTTTGCCCAGACACAGTCTCTA GT-3'; обратный праймер, 5'-GCACCACCACAGGGG ТТ-3'). Для генотипирования были использованы два флуоресцентных TaqMan зонда с различными флуоресцентными красителями, что позволяет проводить ПЦР в одной пробирке для аллелей А1 и А2 одновременно. Первый зонд был нацелен на аллель А2 дикого типа (5'-YAKTGGACCCATCCCTAACAGCCTCCC-BBQ-3'), а второй на мутированный аллель А1 (5'-FAM-CTGGACCCATCCATAACAGCCTCCCA BBQ-3') гена CSN2. BBQ гаситель был связан с 3' концом обоих зондов. ПЦР в реальном времени проводили в реакционной смеси объемом 20 мкл с использованием 10 мкл универсального TaqMan ПЦР мастер-микса, содержащего ДНК AmpliTaq Gold полимеразу, 300 нМ прямого и обратного праймера, 200 нМ каждого зонда, 0,2 мкл урацил-N-гликозилазы (UNG) и 1 мкл (50-100 нг) образца ДНК.
ПЦР в режиме реального времени проводили на приборе 7500 Real Time PCR System. Временной и температурный профиль ПЦР содержал следующие этапы: 2 мин при 50°С, 10 мин при 95°С, 40 циклов при 95°С 15 сек и 60°С 1 мин.
Был изучен полиморфизм гена бета-казеина 7 экзона в нуклеотидной последовательности GenBank (m 55158), в g.8101 C>A, (кодон 67) у крупного рогатого скота.
Для достижения заявленного результата по определению аллельных вариантов гена бета-казеина CSN2 мы предлагаем использовать метод ПЦР в реальном времени с применением интеркалирующего красителя, который является универсальным для исследования многих видов генов, и обладает низкой стоимостью.
Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в том, что способ генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А1 и А2 гена бета-казеина CSN2 проводится методом ПЦР в реальном времени с использованием реакционной смеси для ПЦР, содержащей интеркалирующий краситель SYBR Green. Для достижения технического результата используются прямой праймер для аллеля А1 5/CTTCCCTGGGCCCATCCA3/; прямой праймер для аллеля А2 5/CTTCCCTGGGCCCATCCC3/; обратный праймер для A1, А2 5/AGACTGGAGCAGAGGCAGAG3/, интеркалирующий краситель SYBR green, в составе реакционной смеси для ПЦР. Определение аллельного варианта гена А1/А2 происходит на основании сравнение амплификации гена с отрицательным контролем по пороговому циклу (Ct).
При использовании данного метода сохраняется надежность детекции аллелей А1 и А2 гена бета-казеина, при этом обеспечивается значительное удешевление анализа на больших массивах животных на популяционном уровне за счет отсутствия необходимости использования дорогих и специфических флуоресцентных зондов.
Методика проведения реакции
Выделение ДНК производили с использованием набора ДНК-ЭКСТРАН-2 (Синтол, Россия) согласно прилагаемой инструкции. Дизайн праймеров для ПЦР осуществляли с помощью программы Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi). Праймеры произведены в компании «Синтол» и представлены в списке реактивов: прямой праймер для аллеля Al 5/CTTCCCTGG GCCCATCCA3/; прямой праймер для аллеля А2 5/CTTCCCTGGGCCCATCCC3/; обратный праймер для А1, А2 5/AGACTGGAGCAGAGGCAGAG3/. В качестве флуорофора для визуализации результатов методом реал-тайм ПЦР был использован интеркалирующий раситель SYBR green, в составе реакционной смеси для ПЦР qPCRmix-HS SYBR+LowROX (Евроген, Россия). В качестве отрицательного контроля использована очищенная методом Millipore вода. Прибор для проведения ПЦР в реальном времени - CFX96™ Real-Time PCR Detection Systems (Bio-Rad, США). ПЦР - программа проходила в следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация - 5 минут при 94°С; далее следует 5 циклов: 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 66°С, 30 секунд при 72°С; затем следует 30 циклов: 30 секунд при 94°С, 30 секунд при 64°С, 30 секунд при 72°С - детекция сигнала флуорофора; анализ кривых плавления.
Для определения аллельного варианта гена А1/А2 производили сравнение амплификации гена с отрицательным контролем по пороговому циклу (Ct). Пороговую линию (threshold) устанавливали на середине характерной S-образной кривой амплификации. Амплификация считалась успешной (наличие аллеля) при наличии S-образной кривой амплификации и при отличии Ct в образце в меньшую сторону от отрицательного контроля более чем на 1,5 цикла (ΔCt>1,5). В качестве дополнительного критерия качества амплификации использовался анализ кривых плавления.
Апробацию разработанного способа генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А1 и А2 гена CSN2 методом ПЦР в режиме реального времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR-GREEN провели в лаборатории ДНК-технологий ВНИИПлем на пробах ДНК от 88 быков-производителей ОАО «Архангельское племпредприятие».
Валидацию разработанного метода проводили с помощью аллель-специфичной ПЦР с использованием анализа данных путем электрофорезного разделения амплифицированных фрагментов ДНК в агарозном геле, их визуализации по флуоресцентному свечению в ультрафиолете после окрашивания бромистым этидием и компьютерной регистрации полученных изображений электрофореграмм. По результатам исследований установлено достоверное совпадение аллельных вариантов и генотипов бета-казеина, выявленных путем ПЦР в реальном времени с универсальным красителем SYBR Green и с помощью аллель-специфической ПЦР с электрофорезным разделением амплификатов в агарозном геле, что свидетельствует о возможности использования данного метода для анализа аллельных вариантов и генотипов бета-казеина (CSN2).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате практических исследований, направленных на апробацию разработанного способа генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А1 и А2 гена бета-казеина CSN2 методом ПЦР в режиме реального времени с использованием универсального интеркалирующего красителя SYBR-green, нами получен обеспечиваемый предложенным способом технический результат, выраженный в эффективной идентификации искомых генотипов (А1А1, А1А2, А2А2) ввиду корректной интерпретации данных (наличия) кривых увеличения интенсивности флуоресценции для оценки аллельных вариантов гена бета-казеина крупного рогатого скота.
Таким образом, нами разработан эффективный и надежный способ для экспресс-идентификации аллельных вариантов А1 и А2 гена бета-казеина CSN2 крупного рогатого скота на основе ПЦР в режиме реального времени с использованием интеркалирующего красителя SYBR green в составе реакционной смеси для ПЦР. Разработанный нами способ позволяет значительно удешевить анализы за счет отсутствия необходимости использования дорогих флуоресцентных зондов, что выгодно отличает его от прототипа, а также позволяет значительно (до 2,5 часов) сократить время проведения анализа, по сравнению с наиболее широко распространенным методом ПЦР-ПДРФ анализа (16 часов) с осуществлением анализа данных путем электрофорезного разделения амплифицированных фрагментов ДНК в агарозном геле. Данный способ является быстрым, эффективным и экономически более выгодным, поскольку требует меньших материальных и временных затрат, позволяет проводить одновременно генотипирование большого количества биологического материла (до 48 животных, в зависимости от модели амплификатора) и может быть использован для отбора коров на популяционном уровне в больших массивах животных для целей селекции.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Genetic Variants of Beta-Casein in Holstein Dairy Cattle In Slovakia Slovak / E. , J. Huba, M.  [et al] // J. Anim. Sci. - 2010. - V. 43 (2). - P. 63-66.
2. Beta-casein (CSN2) polymorphism in Ongole (Indian zebu) and Frieswal (HFx Sahiwal crossbred) cattle / I. Ganguly, G.K. Gaur, U. Singh [et al.] // Indian Journal of Biotechnology. - 2004. - V. 12. - p. 195-198.
3. Milk protein polymorphism: Detection and diffusion of the genetic variants in Bos genus / P. Formaggioni, A. Summer, M. Malacarne [et al.] // Annali della Facolta di Medicina Veterinaria, Parma. - 1999. - vol. XIX. - p. 127-165.
4. Ng-Kwai-Hang, K. F. Association between genetic polymorphism of milk proteins and production traits during three lactations / K. F. Ng-Kwai-Hang, H. G. Monardes, J. F. Hayes // Journal of Dairy Science. - 1990. - V. 73. - p. 3414-3420.
5. Milk protein loci polymorphism in taurine (Bos Taurus) and zebu (Bos Indicus) populations bred in hot climate / G. Ceriotti, D. Marietta, A. Caroli [et al.] // Journal of Animal Breeding and Genetics. - 2004. - Vol. 121. - №6. - p. 404-415.
6. Kaminski, S. Polymorphism of bovine beta-casein and its potential effect on human health / S. Kaminski, A. Cieoelinska, E. Kostyra E. // Appl Genet. - 2007. - V. 48(3). - p.189-198.
7. Полиморфизм генов CSN3, LGB, PRL, GH, LEP у холмогорских коров / В.Л. Ялуга, В.П. Прожерин, Я.А. Хабибрахманова, Л.А. Калашникова, И.Е. Багаль // Молочное и мясное скотоводство. - 2018. - №4. - С.5-8.
8. Племенная работа с холмогорской породой скота / И.М. Дунин, Р.К. Мещеров, Н.С. Никулкин и др. // Том. Выпуск 35. - Лесные Поляны, 2021. - 86 с.
9. S. Kaminski 1 et al. A note on frequency of Al and A2 variants of bovine beta-casein locus in Polish Holstein bulls/ * S. , A.  and A.  // Journal of Animal and Feed Sciences, 15, 2006, 195-198.
10. Miluchova M., A. Trakovika, and M. Gabor /. Analysis of polymorphism of beta-casein of Slovak Pinzgau cattle by PCR-RFLP for allels Al and A2. // Zootehnie  Biotehnologii., 2009, 42(2): 288-292.
11. Ganguly I, Gaur GK, Singh U, Kumar S, Kumar S, Mann S Beta-casein (CSN2) polymorphism in Ongole (Indian zebu) and Frieswal (HF× Sahiwal crossbred) cattle.// Indian Journal of Biotechnology, 2013, 12, 195-198.
12. Manga, J.  / TaqMan allelic discrimination assay for Al and A2 alleles of the bovine CSN2 gene//Czech J. Anim. Sci., 55,2010 (8): 307-312.
Краткое описание чертежей.
Пояснение к фиг. 1
На фиг. 1 представлен пример аллельного варианта A1A1 генотипа бета-казеина CSN2. Обозначения: к - это кривая амплификации, соответствующая отрицательному контролю, а А1 - кривая амплификации, соответствующая аллелю A1, а А2 - кривая амплификации, соответствующая аллелю А2. Цикл, на уровне которого происходит пересечение пороговой линии с кривой амплификации обозначен как Ct.
Пояснение к фиг. 2
На фиг. 2 представлен пример аллельного варианта A1A2 генотипа бета-казеина CSN2. Обозначения: к - это кривая амплификации, соответствующая отрицательному контролю, а А1 - кривая амплификации, соответствующая аллелю A1, а А2 - кривая амплификации, соответствующая аллелю А2. Цикл, на уровне которого происходит пересечение пороговой линии с кривой амплификации обозначен как Ct. Пояснение к фиг. 2
На фиг. 3 представлен пример аллельного варианта А2А2 генотипа бета-казеина CSN2. Обозначения: к - это кривая амплификации, соответствующая отрицательному контролю, а А1 - кривая амплификации, соответствующая аллелю A1, а А2 - кривая амплификации, соответствующая аллелю А2. Цикл, на уровне которого происходит пересечение пороговой линии с кривой амплификации обозначен как Ct.