Биотехнологический потенциал бактерии Pseudomonas sp. Иб-1. 1 как основы полифункционального биопрепарата

nauch.-pract. konf. "Perspectivy razvitiya tekhnologii, ekologii i avtomatizatsii khimicheskikh, pishchevykh i metallurgicheskikh proizvodstv" [Proc. Rus. Sci. Pract. Conf. "Development prospects of technology, ecology and automation of chemical, food and metallurgical productions"]. Irkutsk, 2008, pp. 155-157.

21. Gunich S.V., Malysheva T.I. Sposob pere-rabotki bytovykh i proizvodstvennykh otkhodov v pechnoe toplivo i uglerodnoe veshchestvo i ustroistvo dlya ego osushchestvleniya [Method of processing of domestic and productive wastes in the stove fuel and carbon substance and device for his realization]. Patent RF no. 2013126238, 2014.

22. Rodionov A.I., Gunich S.V., Yanchukov-skaya E.V. Razrabotka tekhnologii utilizatsii nefte-khimicheskogo absorbenta [Development of technology of utilization of petrochemical absorbent]. Vestnik Irkutskogo gosudarstvennogo tekhnich-eskogo universiteta - The Bulletin of Irkutsk State Technical University, 2011, no. 10, pp. 165-170.

23. Fedotov K.V. Proektirovanie obogatitel'-nykh fabrik [Planning of washeries]. Moscow, Gor-naya kniga Publ., 2012, 536 р.

24. Shubov L.Ya., Stavrovskii M.E., Shekhirev D.V. Tekhnologiya otkhodov (Tekhnologicheskie protsessy v servise) [Waste technology (Processes in service)]. Moscow, MGUS Publ., 2006, 411 p.

25. Yanchukovskaya E.V., Gunich S.V., Dne-provskaya N.I. Primenenie reaktora SVCh-termoliza

dlya pererabotki tverdykh bytovykh otkhodov [Application of reactor of microwave thermolysis for processing of domestic solid wastes]. Materialy III Vse-ross. nauch.-pract. konf. s mezhdunarodnym uchas-tiem "Perspektivy razvitiya tekhnologii pererabotki uglevodorodnykh, rastitel'nykh i mineral'nykh resur-sov [Proc. Rus. Sci. Pract. Conf. Intern. Part. "Development prospects of technology of processing of hydrocarbon, vegetable and mineral resources"]. Irkutsk, 2013, pp. 177-179.

26. Yanchukovskaya E.V., Dneprovskaya N.I. Intensifikatsiya protsessa vysokotemperaturnogo piroliza elektromagnitnym polem [Intensification of process of high temperature pyrolysis by the electromagnetic field]. Materialy IV Vseross. nauch.-pract. konf. s mezhdunarodnym uchastiem "Perspektivy razvitiya tekhnologii pererabotki uglevodorodnykh, rastitel'nykh i mineral'nykh resursov" [Proc. Rus. Sci. Pract. Conf. Intern. Part. "Development prospects of technology of processing of hydrocarbon, vegetable and mineral resources"]. Irkutsk, 2014, pp. 170-172.

27. Yanchukovskaya E.V., Dneprovskaya N.I., Gunich S.V. Perspektivy tekhnologii SVCh-termoliza organicheskikh komponentov tverdykh bytovykh otkhodov [Technology prospects of microvave thermolysis for organic components of domestic solid wastes]. In: Uspekhi v khimii I khimicheskoi tekhnologii [Advances in chemistry and chemical technology]. Moscow, 2012, pp. 114-118.

Статья поступила в редакцию 30.10.2015 г.

УДК 579.66

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОТЕНЦИАЛ

БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS SP. ИБ-1.1

КАК ОСНОВЫ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОГО БИОПРЕПАРАТА

© Т.Ю. Коршунова, С.П. Четвериков, Э.Г. Валиуллин, О.Н. Логинов

Уфимский институт биологии РАН,

450054, Россия, г. Уфа, пр. Октября, 69, korshunovaty@mail.ru

Исследованы свойства психротолерантного штамма Pseudomonas sp. ИБ-1.1, выделенного ранее авторами из нефтезагрязненной почвы Красноярского края. Способность бактерий к окислению органических веществ до конечных продуктов - СО2 и Н2О - рассчитывали по количеству углекислого газа, оттитрованного кислотой. Способность микроорганизмов к азотфиксации, а также потенциальную нитрогеназную активность почвенных образцов, инокулированных бактерями Pseudomonas sp. ИБ-1.1, определяли ацетиленовым методом с помощью газового хроматографа. Все эксперименты проведены при температуре 8 оС и 26 оС. Штамм проявил себя как активный

деструктор, разлагающий различные углеводороды, нефть и продукты ее переработки (73,9169,0 мг СО2/г субстрата/72 ч при 8 оС и 38,7-154,9 мг СО2/г субстрата/72 ч при 26 оС). Установлено, что способность к фиксации атмосферного азота у изучаемого микроорганизма с понижением температуры возрастает. Потенциальная нитрогеназная активность почвы, обработанной бактериями Pseudomonas sp. ИБ-1.1, была значительно выше, чем у контрольных образцов, содержащих только аборигенную микрофлору, как при 8 оС, так и при 26 оС. Штамм Pseudomonas sp. ИБ-1.1 может быть использован в качестве основы биопрепарата для очистки почвы от нефтяного загрязнения и восстановления ее плодородия в холодных климатических условиях. Ключевые слова: нефтедеструктор; азотфиксация; штамм Pseudomonas sp. ИБ-1.1; окислительная активность; нитрогеназная активность.

BIOTECHNOLOGICAL POTENTIAL

OF THE BACTERIUM PSEUDOMONAS SP. IB-1.1

AS BASES OF THE MULTIFUNCTIONAL BIOLOGICAL PRODUCT

T.Yu. Korshunova, S.P. Chetverikov, E.G. Valiullin, O.N. Loginov

Ufa Institute of biology RAS,

69, prospect Oktyabrya, Ufa, 450054, Russia, korshunovaty@mail.ru

Properties of a psychrotrophic strain Pseudomonas sp. IB-1.1 are investigated. Authors allocated this strain from the oil-contaminated soil of Krasnoyarsk Krai earlier. Ability of bacteria to oxidation of organic substances to the final products (CO2 and H2O) is calculated by amount of carbon dioxide. Ability of microorganisms to nitrogen fixation and potential nitrogenase activity of soil samples, the processed Pseudomonas sp. IB-1.1, is determined by the gas chromatography. All experiments were made at a temperature of 8 °C and 26 °C. The strain proved as the active destructor of various hydrocarbons, oil and products of its processing (73,9-169,0 mg of CO2/g of a substratum/72 h at 8 °C and 38,7-154,9 mg of CO2/g of a substratum/72 h at 26 °C). Ability to fixing of atmospheric nitrogen at a microorganism with fall of temperature increased. Potential nitrogenase activity of the soil with bacteria Pseudomonas sp. IB-1.1, was much higher, than at the control samples containing only native microflora both at 8 °C, and at 26 °C. Strain. IB-1.1 can be used as a basis of biological product for weeding from oil pollution and restoration of its fertility in cold climatic conditions.

Keywords: oil-destructor; nitrogen fixation; strain Pseudomonas sp. IB-1.1; oxidizing activity; nitrogenase activity.

ВВЕДЕНИЕ

Длительность сохранения нефтепродуктов в почве определяется их количеством и составом, а также климатическим потенциалом загрязненных территорий. Поскольку оптимальными условиями для разложения нефти являются температура 25-30 оС и влажность, близкая к наименьшей влагоемкости почвы, то в холодных и переувлажненных почвах деградация нефти продолжается в течение десятилетий [1]. Поэтому проблема загрязнения нефтью особенно актуальна для Западной Сибири, где сосредоточена значительная часть нефтедобывающих предприятий России и природно-климатические условия которой характеризуются длительным периодом низких температур и наличием многомерзлых пород. Так как при разложении поллютантов в почве в естественных условиях важнейшее значение имеет функциональная активность почвенных микроорганизмов, то одним из приоритетных решений для этого региона является проведение

биорекультивационных работ с использованием психротолерантных микроорганизмов-деструкторов, которые обеспечивают полную минерализацию нефти и нефтепродуктов до углекислого газа и воды и способны функционировать при пониженных температурах [15, 18].

В процессе загрязнения нефтью в почву попадает большое количество углерода, которое вызывает резкое изменение соотношения 0:Ы и приводит к недостатку азота для нефте-окисляющих микроорганизмов. Его чаще всего устраняют путем внесения больших объемов минеральных азотных удобрений, что является экономически невыгодным, а, зачастую, и бесполезным, так как не учитывается неодинаковое влияние различных форм удобрений и их количества на интенсивность азотфиксации [7], к тому же повышенные дозы минеральных удобрений могут приводить к солевой фитотоксичности и микробному токсикозу почв [11, 14].

В то же время в природных экосистемах баланс биогенных элементов поддерживается,

в основном, за счет биологической азотфикса-ции [9]. Целый ряд бактерий, усваивающих углеводороды, обладает способностью связывать молекулярный азот атмосферы. Так, существует много данных о способности представителей рода Pseudomonas к разложению нефтяных загрязнений; созданы биопрепа-раты-нефтедестукторы на основе этих микроорганизмов [5, 10]. Имеются также сведения, что в холодных климатических зонах в ризосфере растений азотфиксирующие бактерии рода Pseudomonas доминируют над представителями других таксономических групп диазо-трофов [13, 16, 19].

Ранее, из образцов почвы с территории нефтедобывающего предприятия Красноярского края методом накопительных культур авторами был выделен бактериальный изолят, способный использовать нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода и энергии; исследованы его культу-рально-морфологические и физиолого-биохи-мические свойства, а также способность к деструкции ряда органических соединений [3]. Указанный штамм депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов как Pseudomonas sp. ИБ-1.1 (ВКМ B-2831D).

Целью данной работы было изучение окислительной активности штамма Pseudomonas sp. ИБ-1.1 в отношении органических веществ различных классов, нефти, нефтепродуктов, его способности к азотфиксации, а также влияния инокуляции этим штаммом бактерий на потенциальную активность азотфиксации в почве, в т.ч. при пониженной температуре.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Окислительную активность штамма рассчитывали по выделению углекислого газа, так как это было описано ранее [4].

Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым методом [8]. Микроорганизмы культивировали 2 сут на среде Эшби [2] при комнатной температуре (26 оС) и в условиях пониженной положительной температуры (8 °C). Для проверки влияния источника углерода на способность к азотфиксации, маннит в среде Эшби в других вариантах опыта был последовательно заменен на декан (0,5%), ме-тилбензол (1%) и 2-метилнафталин (0,5%). Ацетилен вводили в колбы (V = 250 мл) со 100 мл бактериальной суспензии Pseudomonas sp. ИБ-1.1 до концентрации 10% (по объему) и перемешивали при 180 об/мин без доступа воздуха. Через 1,5 ч отбирали шприцем пробы газа из каждой колбы в троекратной повторно-сти. Содержание ацетилена и этилена определяли на газовом хроматографе «Кристалл

Люкс 4000» (Россия) с пламенным ионизационным детектором (длина колонки - 3 м, сорбент - Porapak Q, стандартный газ - азот). Объем вводимой газовой пробы - 1 мл.

Потенциальную активность азотфиксации в почве (чернозем выщелоченный) рассчитывали по [6] с нашими модификациями. В почвенные пробы массой 200 г вносили по 10 мл бактериальной суспензии с титром 1-109 КОЕ/мл (колониеобразующих единиц в 1 мл), увлажняли до 60% полной влагоемкости почвы, тщательно перемешивали. После трех суток инкубации из каждого образца отбирали в пени-циллиновые флаконы по 5 г почвы, добавляли по 2% (от массы абсолютно сухой почвы) источника углерода (манит (контроль), декан, ме-тилбензол и 2-метилнафталин соответственно), увлажняли до 60% полной влагоемкости почвы, перемешивали, герметично закупоривали и хранили при 8 оС и 26 оС. Через сутки во флаконы вводили по 0,5 мл ацетилена и спустя час отбирали газовую пробу (0,5 мл) для анализа на газовом хроматографе.

Остаточное содержание декана и ме-тилбензола определяли с помощью газовой хроматографии после экстракции гексаном, 2-метилнафталина - гравиметрическим методом после экстракции трихлорметаном.

Степень биодеградации углеводородов в ходе эксперимента рассчитывали как отношение разности между начальным и конечным содержанием углеводорода в пробе к начальному содержанию углеводорода и выражали в процентах.

Титр бактериальных суспензий подсчитывали после двух суток культивирования на ага-ризованной среде Раймонда [20], на поверхность которой наносили 100 мкл стерильного дизельного топлива.

Статистический анализ проводили при доверительной вероятности Р = 0,95.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для изучения способности микроорганизмов Pseudomonas sp. ИБ-1.1 к разложению органических веществ различных классов, нефти и ее фракций до конечных продуктов - углекислого газа и воды - была определена окислительная активность штамма при 8 оС и 26 оС (табл. 1).

Величина окислительной активности штамма Pseudomonas sp. ИБ-1.1 оказалась значительной (исключение - фенол) вне зависимости от используемого субстрата и температуры культивирования, хотя при 26 оС этот показатель был ниже, чем при 8 оС. Обнаружена высокая способность к разложению парафиновых углеводородов (130,2-147,8 мг СО2/г

субстрата/72 ч при пониженной температуре и 88,0-126,7 мг СО2/г субстрата/72 ч при комнатной температуре) и алкилированных ароматических соединений, несмотря на их токсичность для микроорганизмов (одинаковые значения 137,3 мг СО2/г субстрата/72 ч при 8 оС и 95,0 и 84,5 мг СО2/г субстрата/72 ч при 26 оС для метилбензола и 1,2-диметилбензола соответственно). Но наиболее полно идет биохимическое окисление нефти (169,0 мг СО2/г субстрата/72 ч при 8 оС и 154,9 мг СО2/г субстрата/72 ч при 26 оС) и дизельного топлива (161,9 мг СО2/г субстрата/72 ч при 8 оС и 116,2 мг СО2/г субстрата/72 ч при 26 оС), содержащих в своем составе сложные смеси углеводородов различных классов.

Так как почти все процессы аэробного метаболизма углеводородов включают в себя окисление субстрата при помощи ферментов -оксидоредуктаз смешанных функций (оксиге-наз), осуществляющих введение одного атома кислорода из его молекулярной формы в концевую метильную группу углеводорода, то можно предположить, что штамм Pseudomonas sp. ИБ-1.1 способен к разложению углеводородов до конечных продуктов (СО2 и Н2О) благодаря высокой активности оксигеназного ферментного комплекса. Это свойство является очень важным с практической точки зрения, так как благодаря ему бактерии Pseudomonas sp. ИБ-1.1 могут применяться в биотехнологии, например, в качестве основы биопрепарата для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов.

Далее была изучена численность и нитро-геназная активность микроорганизмов Pseudomonas sp. ИБ-1.1 при различных температурах (8 оС и 26 оС) и источниках углерода, таких как маннит (контроль), декан, метилбензол и 2-метилнафталин, а также степень биодеградации этих углеводородов в ходе эксперимента (табл. 2).

Рост численности микроорганизмов в ходе эксперимента составил один порядок, как при комнатной, так и при пониженной температуре. При выращивании на среде с маннитом, нитро-геназная активность штамма при 26 оС (0,08 мкг Ы2/мл/ч) была в два раза ниже по сравнению с таковой при 8 оС (0,17 мкг Ы2/мл/ч). Аналогичная картина наблюдалась для данного показателя и при потреблении в качестве субстрата ме-тилбензола - 0,12 Ы2/мл/ч при 26 оС и 0,26 Ы2/мл/ч при 8 оС. В варианте с использованием декана способность к улавливанию азота при 26 оС была в три раза выше, чем при 8 оС. Наиболее низкая способность к азотфиксации при комнатной температуре обнаружена при применении декана как источника углерода и

энергии (0,03 мкг Ы2/мл/ч), а самая высокая -2-метилнафталина (0,25 мкг Ы2/мл/ч). Также на среде с 2-метилнафталином бактерии Pseudomonas sp. ИБ-1.1 проявляют самую значительную азотфиксирующую активность и при пониженной температуре (0,35 мкг Ы2/мл/ч). Таким образом, нитрогеназная активность изучаемого штамма с понижением температуры возрастает. Возможно, это свидетельствует о наличии у Pseudomonas sp. ИБ-1.1 фермента ванадий-содержащей нитрогеназы, способствующей эффективной фиксации азота в условиях низкой положительной температуры [12, 17].

Происходящая в ходе азотфиксации деградация углеводородного субстрата также увеличивалась с понижением температуры (табл. 2). Наиболее значительные показатели биодеструкции были достигнуты для метилбензола -67,30% при 8 оС и 62% при 26 оС.

Изучение потенциальной нитрогеназной активности почвы показало, что у проб, обработанных бактериями Pseudomonas sp. ИБ-1.1, она была значительно выше, чем у контрольных образцов, содержащих только аборигенную микрофлору, как при 8 оС, так и при 26 оС (табл. 3).

При пониженной положительной температуре при применении в качестве субстратов углеводородов различной химической природы азотфиксирующая способность инокулированной почвы по сравнению с неинокулированной увеличивалась в 1,73 (метилбензол), 1,83 (декан) и 2,16 раза (2-метилнафталин). При использовании маннита в тех же условиях этот показатель возрастал незначительно (в 1,19 раза).

Таблица 1

Окислительная активность микроорганизмов штамма Pseudomonas sp. ИБ-1.1

Источник углерода Окислительная активность, мг СО2/г субстрата/72 ч

8 оС 26 оС

Гептан 133,8 88,0

Декан 130,2 102,1

Ундекан 147,8 126,7

Додекан 137,3 123,2

Гексадекан 140,8 112,6

Циклогексан 109,1 91,5

Фенол 73,9 38,7

Бензол 105,6 95,0

Метилбензол 137,3 95,0

1,2-диметилбензол 137,3 84,5

Нафталин 119,7 95,0

Изопропанол 116,2 91,5

Деканол 119,7 105,6

Нефть 169,0 154,9

Дизельное топливо 161,9 116,2

Смазочное масло 133,8 112,6

Таблица 2

Численность микроорганизмов штамма Pseudomonas sp. ИБ-1.1, его нитрогеназная активность и степень биодеградации углеводородов, используемых в качестве источника углерода

Источник углерода Титр, КОЕ/мл Нитрогеназная активность, мкг ^/мл/ч Биодеградация углеводородов, %

8 оС 26 оС 8 оС 26 оС 8 оС 26 оС

Маннит 7,2 х 106 6,0 х 106 0,17 0,08 - -

Декан 2,4 х 106 1,6 х 106 0,09 0,03 н/д 56,30

Метилбензол 1,4 х 106 4,3 х 106 0,26 0,12 67,30 62,00

2-метилнафталин 9,7 х 106 7,7 х 106 0,35 0,25 43,00 22,00

Примечание: начальный титр бактериальной суспензии при 8 оС - 1,4х10 КОЕ/мл, при 26 оС - 7,7х10 КОЕ/мл;

«н/д» - нет данных.

Таблица 3

Потенциальная нитрогеназная активность почвенных образцов с аборигенной микрофлорой и инокулированных бактериями Pseudomonas sp. ИБ 1.1

Источник углерода Потенци альная нитрогеназная активность, мг ^/кг/ч почвы, мг ^/кг/ч

8 'С 26 оС

До инокуляции После инокуляциии До инокуляции После инокуляции

Маннит 1165 1384 990 1425

Декан 1016 1858 959 1340

Метилбензол 1074 1858 1173 1936

2-метилнафталин 950 2049 1646 2235

При комнатной температуре наивысшее значение потенциальной нитрогеназной активности наблюдалось у почвы, загрязненной 2-метилнафталином - в контроле оно составило 1646 мг Ы2/кг/ч, а после обработки суспензией бактерий Pseudomonas sp. ИБ-1.1 увеличилось в 1,36 раза (2235 мг Ы2/кг/ч). Но наиболее полно при 26 оС происходит возрастание потенциальной способности к фиксации азота у почвы с метилбензолом после внесения в нее штамма Pseudomonas sp. ИБ-1.1 (в 1,65 раза). Потенциальная нитрогеназная активность при 26 оС у почвы с маннитом и деканом была схожей как при наличии только аборигенной микрофлоры (990 и 959 Ы2/кг/ч соответственно), так и в случае инокулирования бактериями (1425 и 1340 Ы2/кг/ч соответственно).

1. Алексеев А.Ю. Не навреди // Промышленность и экология Севера. 2011. № 5-6 (1314). С. 40-47.

2. Дзержинская И.С. Питательные среды для выделения и культивирования микроорганизмов. Астрахань: Изд-во АГТУ, 2008. 348 с.

3. Коршунова Т.Ю., Сабиров А.А., Четвериков С.П., Логинов О.Н. Микроорганизмы, разлагающие нефтяные углеводороды при понижен-

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Штамм бактерий Pseudomonas sp. ИБ-1.1 имеет значительный биотехнологический потенциал. Он окисляет углеводороды, нефть и продукты ее переработки до конечных веществ - углекислого газа и воды, а также повышает потенциальную нитрогеназную активность почвы, способствуя увеличению в ней содержания азота. Штамм Pseudomonas sp. ИБ-1.1 можно использовать в качестве основы полифункционального микробного препарата, очищающего почву от нефтяного загрязнения и в то же время повышающего ее плодородие за счет фиксации атмосферного азота, в т.ч. и при пониженной температуре. Применение такого биопрепарата будет способствовать снижению расхода азотных удобрений и удлинению био-рекультивационного периода, что особенно важно в районах с холодным климатом и коротким вегетационным сезоном.

КИЙ СПИСОК

ной температуре // Известия Уфимского научного центра РАН. 2012. № 3. С. 76-82.

4. Коршунова Т.Ю., Четвериков С.П., Муха-матдьярова С.Р., Логинов О.Н. Окислительная и нитрогеназная активность бактерии Ohrobactrum sp. ИБ ДТ-5.3/2 // Известия Самарского научного центра РАН. 2013. Т. 15, № 3 (5). С. 1637-1640.

5. Рогозина Е.А., Орлова Н.А., Свечина Р.М., Переходова Л.С., Тимергазина И.Ф. Штамм

Pseudomonas citronellolis, используемый для разложения нефти и дизельного топлива // Патент РФ № 2489484. 2013. Бюл. № 22.

6. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Перевер-зева Г.И.. Практикум по микробиологии: учебное пособие для вузов. М.: Дрофа, 2004. 256 с.

7. Терещенко Н.Н., Лушников С.В., Пышь-ева Е.В. Биологическая азотфиксация как фактор ускорения микробной деструкции нефтяных углеводородов в почве и способы ее стимулирования // Биотехнология. 2004. № 5. C. 69-79.

8. Умаров М.М. Ассоциативная азотфиксация. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1986. 136 с.

9. Умаров М.М., Кураков А.В., Степанов А.Л. Микробиологическая трансформация азота в почве. М.: ГЕОС, 2007. 138 с.

10. Филонов А.Е., Кошелева И.А., Самой-ленко А.А., Шкидченко А.Н., Нечаева И.А., Пун-тус И.Ф., Гафаров А.Б., Якшина Т.В., Боронин А.М., Петриков К.В. Биопрепарат для очистки почвы от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения // Патент России № 2378060. 2010. Бюл. № 1.

11. Шаронова Н.Л., Пахомова В.М., Бунту-кова Е.К. Экология почвенной микробиоты и диагностика почв. Казань: КазГАУ, 2009. 224 с.

12. Bellenger J.P., Wichard T., Kraepiel A.M.L. Vanadium Requirements and Uptake Kinetics in the Dinitrogen-Fixing Bacterium Azotobacter vinelandii // Applied Environmental Microbiology. 2008. V. 74, № 5. P. 1478-1484.

13. Bolter M. Ecophysiology of psychrophilic and psychrotolerant microorganisms // Cellular and Molecular Biology. 2004. V. 50, № 5. Р. 563-73.

14. Chaineau C.H., Yepremian C., Vidalie J.F., Ducreux J., Ballerini D. Bioremediation of a crude oil-polluted soil: Biodegradation, leaching and toxicity assessments // Water, Air and Soil Pollution. 2003. V. 144, № 1. P. 419-440.

15. Feller G., Margesin R. Polar microorganisms and biotechnology. In: Miller R., Whyte L.G. Polar Microbiology: Life in a Deepfreeze. Washington: ASM Press, 2012. P. 166-180.

16. 16. Hoover R.B., Pikuta E.V. Psychrophilic and psychrotolerant microbial extremophiles in polar environments. In: Bej A.K., Aislabie J., Atlas R.M. Polar Microbiology: The Ecology, Biodiversity and Bioremediation Potential of Microorganisms in Extremely Cold Environments // Boca Raton: CRC Press, Taylor and Francis Group, 2010. P. 115-157.

17. Igarashi R.Y., Seefeldt L.C. Nitrogen Fixation: The Mechanism of the Mo-Dependent Nitro-genase // Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 2003. V. 38, № 4. P. 51-84.

18. Margesin R., Moertelmaier C., Mair J. Low-temperature biodegradation of petroleum hydrocarbons (n-alkanes, phenol, anthracene, pyrene) by four actinobacterial strains // International Bio-deterioration and Biodegradation. 2013. V. 84. P. 185-191.

19. Paniker G., Aislabie J., Saul D. and Bej A. K. Cold tolerance of Pseudomonas sp. 30-3 from oil-contaminated soil, Antarctica // Polar Biology. 2002. V. 25. P. 5-11.

20. Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons // Development Industrial Microbiology. 1961. V. 2, № 1. P. 23-32.

REFERENCES

1. Alekseev A.Yu. Ne navredi. Promyshlen-nost' i ekologiya Severa - Industry and Ecology of the North, 2011, no. 5-6 (13-14), pp. 40-47.

2. Dzerzhinskaya I.S. Pitatel'nye sredy dlya vy-delenyja i kul'tivirovaniya mikroorganizmov [Nutrient mediums for allocation and cultivation of microorganisms]. Astrakhan': Publishing house of AGTU, 2008, 348 p.

3. Korshunova T.Yu., Sabirov A.A., Chetverikov S.P., Loginov O.N. Mikroorganizmy, razlagayushhie neftyanye uglevodorody pri ponizhennoi temperature [Microorganisms decomposing oil hydrocarbons at low temperature]. Izvesti-ya Ufimskogo nauchnogo tsentra RAN - Proceedings of the RAS Ufa Scientific Centre, 2012, no. 3. pp. 76-82.

4. Korshunova T.Yu., Chetverikov S.P., Muha-matd'yarova S.R., Loginov O.N. Okislitel'naya i ni-trogenaznaya aktivnost' bakterii Ohrobactrum sp. IB DT-5.3/2 [Oxidizing and nitrogenase activity of the bacterium Ochrobactrum sp. IB DT-5.3/2]. Izvestiya Samarskogo nauchnogo tsentra RAN - Proceedings

of the Samara Scientific Center of the Russian Academy of Sciences, 2013, vol. 15, no. 3 (5), pp. 1637-1640.

5. Rogozina E.A., [et al.]. Shtamm Pseudomonas citronellolis, ispol'zuemyi dlya razlozheniya nefti i dizel'nogo topliva [Strain Pseudomonas citronellolis, used for decomposition of oil and diesel fuel]. Patent RF, no. 2489484, 2013.

6. Tepper E.Z., Shil'nikova V.K., Pereverzeva G.I.. Praktikum po mikrobiologii [Workshop on microbiology]. Moscow, Drofa Publ., 2004, 256 p.

7. Tereshchenko N.N., Lushnikov S.V., Pysh'eva E.V. Biologicheskaya azotfiksatsiya kak faktor uskoreniya mikrobnoi destruktsii neftyanykh uglevodorodov v pochve i sposoby ee stimuliro-vaniya [Biological nitrogen fixation as a factor of acceleration of microbial destruction of oil hydrocarbons in soil and ways to stimulate the process]. Bi-otekhnologiya - Russian journal of biotechnology, 2004, no. 5, pp. 69-79.

8. Umarov M.M. Assotsiativnaya azotfiksatsiya [Associative nitrogen fixation]. Moscow, Publishing

house of Moscow university, 1986, 136 p.

9. Umarov M.M., Kurakov A.V., Stepanov A.L. Mikrobiologicheskaya transformatsiya azota v poch-ve [Microbiological transformation of nitrogen in the soil]. Moscow, GEOS Publ., 2007, 138 p.

10. Filonov A.E., [et al.]. Biopreparat dlya ochistki pochvy ot zagryaznenii neft'yu i neftepro-duktami, sposob ego polucheniya i primeneniya [Biological preparation for cleaning of soils from contaminations with oil and oil products, method of its production and application]. Patent RF, no. 2378060, 2010.

11. Sharonova N.L., Pakhomova V.M., Buntu-kova E.K. Ekologiya pochvennoi mikrobioty i diag-nostika pochv [Ecology of a soil microbiota and diagnostics of soils]. Kazan, KazGAU Publ., 2009, 224 p.

12. Bellenger J.P., Wichard T., Kraepiel A.M.L. Vanadium Requirements and Uptake Kinetics in the Dinitrogen-Fixing Bacterium Azotobacter vinelandii. Applied Environmental Microbiology, 2008, vol. 74, no. 5, pp. 1478-1484.

13. Bolter M. Ecophysiology of psychrophilic and psychrotolerant microorganisms. Cellular and Molecular Biology, 2004, vol. 50, no. 5, pp. 563-73.

14. Chaineau C.H., Yepremian C., Vidalie J.F., Ducreux J., Ballerini D. Bioremediation of a crude oil-polluted soil: Biodegradation, leaching and toxicity assessments. Water, Air and Soil Pollution, 2003, vol. 144, no. 1, pp. 419-440.

15. Feller G., Margesin R. Polar microorganisms and biotechnology. In: Miller R., Whyte L.G. Polar Microbiology: Life in a Deepfreeze. Washington: ASM Press, 2012, pp. 166-180.

16. Hoover R.B., Pikuta E.V. Psychrophilic and psychrotolerant microbial extremophiles in polar environments. In: Bej A.K., Aislabie J., Atlas R.M. Polar Microbiology: The Ecology, Biodiversity and Bioremediation Potential of Microorganisms in Extremely Cold Environments. Boca Raton, CRC Press, Taylor and Francis Group, 2010, pp. 115157.

17. Igarashi R.Y., Seefeldt L.C. Nitrogen Fixation: The Mechanism of the Mo-Dependent Nitro-genase. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2003, vol. 38, no. 4, pp. 51-84.

18. Margesin R., Moertelmaier C., Mair J. Low-temperature biodegradation of petroleum hydrocarbons (n-alkanes, phenol, anthracene, pyrene) by four actinobacterial strains. International Biodete-rioration and Biodegradation, 2013, vol. 84, pp. 185191.

19. Paniker G., Aislabie J., Saul D. and Bej A.K. Cold tolerance of Pseudomonas sp. 30-3 from oil-contaminated soil, Antarctica. Polar Biology, 2002, vol. 25, pp. 5-11.

20. Raymond R.L. Microbial oxidation of n-paraffinic hydrocarbons. Development Industrial Microbiology, 1961, vol. 2, no. 1, pp. 23-32.

Статья поступила в редакцию 25.12.2015 г.