СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
METHOD OF PREPARING HISTOLOGICAL PREPARATIONS

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для приготовления гистологических препаратов, полученных в том числе при микробиопсии (трепанобиопсии, инцизионной биопсии).
Известны следующие способы фиксации и приготовления гистологических препаратов (биоптатов):
- стандартный способ приготовления гистологических препаратов, описанный в учебном пособии «Гистология», авторы Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. и другие, М., Изд-во: Медицина, 1983 г., с. 9-10;
- использование микрокассет с множеством нумерованных отделений, в каждое из которых укладывается образец. Затем кассету помещают в фиксирующий раствор (Use and rationale of a multicompartment microcassette for site-specific biopsies of the prostate in a consecutive cohort of men / M.E.Laniado, I.McMullen, M.M.Walker, A.Patel // Prostate Cancer and Prostatic Diseases. - 2003. - Vol.6. - P.50-52);
- укладка образца на сгиб бумажного контейнера между двумя слоями бумаги или другого пористого материала, с последующим помещением бумажного контейнера в фиксирующий раствор (Усовершенствование методики исследования толстоигольных биоптатов предстательной железы / А.И.Урбанский, А.Б.Маркочев, А.Ю.Плеханов и др. // Архив патологии. - 2005. - №2. - С.50).
Каждый из перечисленных способов, конечно, имеет свои плюсы, вместе с тем, ни один из них не лишен недостатков. А точность постановки диагноза и получение объективных результатов в исследовательской работе при микроскопическом исследовании во многом зависят от адекватности получения биоптата и качества его (гистологических препаратов) изготовления. Часто размеры биоптата очень малы, что вызывает сложности в процессе подготовки микропрепаратов, в частности, на этапе дегидратации тканевых объектов. Проблемы связаны с потерей микропрепарата еще до начала гистологической проводки, так, после фиксации биоптат помещают в марлевые мешочки, через широкие отверстия которых небольшие фрагменты биоптатов выпадают; во время обезвоживания и обезжиривания биоптатов они теряют свою форму, значительно уменьшаясь в размерах, сморщиваясь и распадаясь на отдельные клетки, что приводит к невозможности постановки диагноза или ложному диагнозу, то есть неинформативности столь малого по размерам биоптата.
Используемые материалы для улучшенной проводки биоптатов не обладают пластичностью и требуют в последующем, на разных этапах гистологического исследования, извлечения из них материала (биоптата) для дальнейшей обработки и осмотра, что представляет технически сложно осуществимую задачу ввиду мелких размеров биопсийных материалов и является более трудоемким процессом.
В качестве прототипа нами выбран стандартный способ приготовления гистологических препаратов, описанный в учебной литературе «Гистология», авторы Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. и другие, М., Изд-во: Медицина, 1983 г., с. 9-10.
Способ включает в себя следующие основные этапы: взятие материала и его фиксация, обезвоживание и уплотнение (заливка в парафин) материала, приготовление и окрашивание срезов.
Задачей изобретения является создание нового способа приготовления гистологических препаратов.
Техническим результатом изобретения является обеспечение сохранения исходного положения образца от момента резки до приготовления срезов, исключение возможности потери биоптата или его дезориентации, а также отсутствие повреждения лезвия микротома при изготовлении срезов.
Технический результат достигается тем, что в способе приготовления гистологических препаратов, включающем забор биоптата, фиксацию в 10% растворе формалина, обезвоживание в спиртах восходящей концентрации, пропитывание парафином, заливку в парафин, приготовление срезов и окрашивание, согласно изобретению предварительно из подготовленной плотной волокнистой оформленной соединительной ткани вырезают прямоугольную полоску необходимого размера, в которой формируют карман, соответствующий размерам биоптата, и после забора помещают биоптат в карман, стенки которого сшивают, и полученный биологический контейнер с биоптатом внутри помещают в фиксирующий раствор, подвергая последовательным этапам обработки вплоть до приготовления и окрашивания срезов.
Целесообразность данного способа обусловлена тем, что плотная волокнистая оформленная соединительная ткань, такая как склера, твердая мозговая оболочка, сухожилия, является доступным материалом, не представляет собой препятствия на этапе дегидратации, так как является тканевой органической структурой, в ней отсутствует клеточный материал. Предложенный биологический контейнер с биоптатом внутри представляет собой плотную ткань, через которую не могут утеряться мелкие фрагменты ткани. Являясь фиброзной тканью с четкой бесклеточной морфологической картиной, используемый биологический контейнер с биоптатом внутри создает естественный контраст с другими исследуемыми тканями. Кроме того, его использование не требует в последующем извлечения из нее исследуемых образцов (биоптатов).
Способ осуществляется следующим образом: предварительно из имплантата, активно используемого в офтальмологии для склеропластики, представленного плотной волокнистой оформленной соединительной тканью, такой как склера, твердая мозговая оболочка, сухожилия (Гистология. Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. М.: Изд-во: Медицина, 1983 г., стр.181-183), вырезают прямоугольную полоску с помощью лезвия или конъюнктивальных ножниц, необходимого размера, в которой расслаивателем или лезвием формируют карман, соответствующий размерам биоптата, и после биопсии (нами выполнялась биопсия придаточного аппарата глаза и ретробульбарного пространства) гистологический материал, биоптат, продольно укладывают в карман имплантата, стенки которого сшивают одним узловым или П-образным швом, и полученный биологический контейнер с биоптатом внутри помещают в фиксирующий раствор (10% раствор формалина) на 24 часа. После фиксации контейнер с биоптатом промывают проточной водой в течение нескольких часов, и в таком виде контейнер с биоптатом проходит следующие этапы гистологической обработки:
обезвоживание - «проводят» по батарее растворов этилового спирта с возрастающей концентрацией: 70%, 80%, 96% и 100%;
заливка в парафин (уплотнение): контейнер с биоптатом помещают в ксилол-парафин, затем в жидкий парафин на 1 час при 56°C, после остывания и затвердевания парафина вырезают блоки с заключенным контейнером с биоптатом и закрепляют на деревянном кубике;
приготовление срезов осуществляется микротомом, предварительно закрепляя кубики на объектодержателе. Затем с помощью подающего устройства объектодержатель вместе с кубиком перемещается за каждый шаг на фиксированное расстояние 3-5 мкм. Микротомный нож срезает с парафинового блока слой - срез - заданной толщины. После чего срезы помещают на поверхность теплой воды для их расправления, а затем на предметное стекло;
окрашивание: перед окраской срезов удаляют уплотняющую среду, освобождают от парафина (депарафинизация) с помощью спиртов (100%, 96%, 80%,70% и 60%) и затем с помощью окраски гематоксилином и эозином достигают контрастности изучаемого гистологического препарата.
Таким образом, полученный биологический контейнер с биоптатом внутри проходит все этапы стандартной гистологической обработки, вплоть до изготовления срезов и окрашивания, не извлекая биоптата, полностью сохраняя исходное положение гистологического препарата, исключая возможность его потери, не вызывая сложностей при постановке диагноза. Для иллюстрации заявленного способа приводим следующие клинические примеры.
Пример 1. Больной М., 42 лет, обратился с жалобами на выпячивание и отклонение кнутри левого глаза. Проведена компьютерная томография: в левой орбите обнаружено новообразование. Острота зрения левого глаза 0,7 не корригируется. Правый глаз здоров.
В условиях операционной, после традиционной обработки операционного поля и местной анестезии выполнили пункцию ретробульбарного пространства левой орбиты с помощью полуавтоматического трепана диаметром 1,2 мм (18G) и выемкой для взятия биоптата до 20 мм, в результате забора материала получили биоптат размером 7×1 мм. Полученный биоптат подвергли предложенному способу приготовления гистологических препаратов: предварительно из имплантата - склеры - с помощью лезвия вырезали прямоугольную полоску размером 10×7 мм, в которой расслаивателем сформировали карман размером (8×1,5 мм), и после биопсии биоптат с помощью лезвия и пинцета аккуратно, не растягивая его, с выемки открытой иглы снимали и продольно укладывали в карман имплантата, стенки которого сшили П-образным швом, и полученный биологический контейнер с биоптатом внутри поместили в фиксирующий раствор 10% раствора формалина на 24 часа и в таком виде контейнер с биоптатом подвергли стандартным этапам гистологической обработки, не извлекая биоптата вплоть до окрашивания срезов, сохраняя исходное положение гистологического препарата. При гистологическом исследовании установлен диагноз острого васкулита орбиты. Больной получал соответствующее данному диагнозу лечение с положительным эффектом.
Через 2 года после лечения: острота зрения левого глаза 0,9 не корригируется. Рецидивов заболевания за указанный срок наблюдения не было.
Пример 2
Больной Б., 3 лет, поступил в клинику с диагнозом: Новообразование левой орбиты. Проведена компьютерная томография: в левой орбите обнаружено новообразование. По месту жительства была выполнена биопсия, неинформативная из-за малого размера полученного биоптата.
Нами в условиях операционной, под наркозом, учитывая возраст пациента, и после традиционной обработки операционного поля выполнена пункция ретробульбарного пространства левой орбиты с помощью полуавтоматического трепана диаметром 1,2 мм (18G) и выемкой для взятия биоптата до 20 мм, в результате забора материала получили биоптат размером 8×1 мм. Полученный биоптат подвергли предложенному способу приготовления гистологических препаратов: предварительно из имплантата, представленного твердой мозговой оболочкой, с помощью лезвия вырезали прямоугольную полоску размером 12×7 мм, в которой расслаивателем сформировали карман размером 9×2 мм, и после биопсии (нами выполнялась трепанобиопсия ретробульбарного пространства) биоптат с помощью лезвия и пинцета аккуратно, не растягивая его, с выемки открытой иглы снимали и продольно укладывали в карман имплантата, стенки которого сшили П-образным швом, и полученный биологический контейнер с биоптатом внутри поместили в фиксирующий раствор 10% раствора формалина на 24 часа и в таком виде контейнер с биоптатом подвергли стандартным этапам гистологической обработки, не извлекая биоптата вплоть до окрашивания срезов, сохраняя исходное положение гистологического препарата. В результате при гистологическом исследовании установлен диагноз эмбриональная рабдомиосаркома, для подтверждения диагноза полученный материал подвергался дополнительному исследованию - иммуногистохимическое исследование, диагноз подтвердился.
В результате пациенту было проведено соответствующее комбинированное лечение (полихимиотерапия с последующим облучением орбиты) с положительным эффектом.
Параллельно, выполняя дополнительную трепанобиопсию, мы подвергли полученный биоптат стандартному способу приготовления гистологических препаратов, взятому за прототип. В результате на этапе обезвоживания биоптат потерял исходную форму, значительно уменьшился в размерах, создавая трудности на остальных этапах приготовления, так как препарат стал менее заметным и возникала возможность его потери. В итоге биоптат оказался малоинформативным и не позволил сформулировать точный диагноз.
Таким образом, использование заявленного нами способа позволило сохранять биоптат в исходном положении, не повреждая его структуры и формы, не нарушая его целостности, что значительно повысило информативность полученных срезов гистологических препаратов и повысило точность установления диагноза.