Способ прогнозирования риска развития преэклампсии
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF PREECLAMPSIA

Изобретение относится к области медицинской диагностики и может быть использовано для прогнозирования риска развития преэклампсии.
Преэклампсия (далее ПЭ) - осложнение беременности, характеризующееся развитием эндотелиальной дисфункции, полиорганной недостаточностью, нарушением свертывающей и противосвертывающей систем, микроциркуляции, обменных процессов, иммунного ответа [Серов, В.Н. Клинические рекомендации. Акушерство и гинекология. - 4-е изд. / В.Н. Серов, Г.Т. Сухих. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 1024 с.; Eiland, E. Preeclampsia / E. Eiland, C. Nzerue, M. Faulkner // J. Pregnancy, 2012. – P. 586—578].
В основе развития ПЭ могут лежать следующие механизмы: торможение инвазии цитотрофобласта в спиральные артерии матки, дисфункция эндотелия, оксидантный стресс, гиперкоагуляция, нарушения микроциркуляции.
В Российской Федерации частота ПЭ варьирует по разным территориям от 17,8% до 22,2% [Радзинский, В.Е. Иммунохимическая оценка перинатального риска [Текст] / В.Е. Радзинский, С.Г. Морозов, Л.А. Чугунова // Вестник Российского университета дружбы народов. Сер. Медицина. – 2010. – № 5. – С. 7-12].
В настоящее время активно изучаются генетические факторы развития ПЭ. Показаны ассоциации с преэклампсией более 100 полиморфных вариантов генов, связанных с системой гемостаза, функционированием эндотелия, ангиогенезом, метаболизмом клеток, иммунной системой, цитокинами, ренин-ангиотензиновой системой, вазоактивными гормонами и оксидативным стрессом [Генетический паспорт – основа индивидуальной и предиктивной медицины [Текст] / В.С. Баранов, А.С. Глотов, Т.Э. Иващенко [и др.] ; под ред. В.С. Баранова. – Санкт-Петербург : Изд-во Н-Л, 2009. – 527 с.].
Ген, кодирующий ММР-1, локализован на длинном плече 11-й хромосомы (11q22.3). Был исследован полиморфизм, связанный со вставкой нуклеотида G в положении  -1673 (-1673 1G/2G ММР-1 (rs1799750)).
С практической точки зрения представляется необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования риска развития преэклампсии на основании исследованных полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ и других возможных факторов риска с целью выявления женщин, предрасположенных к развитию данной патологии беременности.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска преэклампсии на основе данных о полиморфизме матриксных металлопротеиназ ММР-1 (rs1799750) в сочетании с другими предикторами развития ПЭ.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2016 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования развития преэклампсии на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ.
За аналог выбран патент РФ № 2538661, опубликованный 10.01.2015 по заявке РФ № 2011125546/15, 24.11.2009 «Прогнозирование и предупреждение преэклампсии» (Деннис Р. СТЬЮАРТ (US), Керк П. КОНРАД (US), Арундхати ДЖЕЯБАЛАН (US). Способ включает определение концентрации Н2-релаксина в биологическом образце, полученном из организма беременной женщины до проявления симптома преэклампсии. Считают, что беременная женщина имеет повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация Н2-релаксина меньше предельного значения нижнего квартиля концентрации, характерной для беременной женщины. Дополнительно измеряют концентрацию С-реактивного белка (CRP) в биологическом образце и определяют, что беременная женщина имеет повышенный риск развития преэклампсии, если концентрация CRP больше чем примерно 13,5 мкг/мл, даже если концентрация Н2-релаксина больше чем примерно 500 пг/мл. Недостаток метода заключается в сложности анализа и дороговизне его проведения.
y
y
1
2
3
4
5
Прототипом является патент №2578425 по заявке РФ №2014118506/15, 07.05.2014 «Способ прогнозирования риска развития преэклампсии» (Чурносов М.И. (RU), Елыкова А.В. (RU), Рудых Н.А. (RU), Добродомова И.С. (RU), Полоников А.В. (RU), Верзилина И.Н. (RU)). Сущность способа состоит в том, что осуществляют забор венозной крови, выделение геномной ДНК, проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК и исследование гена по локусу -344С/Т CYР11 В2 и прогнозируют риск развития преэклампсии по результатам уравнения Р=е/(1+е), где е - математическая константа, равная 2,72, а y находят из уравнения бинарной логистической регрессии следующего вида: y=16,462+0,820*x1+0,680*x2-2,470*х3-2,444*х4-0,132*х5, где x - генетический вариант по локусу - 344С/Т CYР11 В2, где СС или ТС - 1, ТТ - 0; х - курение: да - 0, нет - 1; х - наличие ПЭ у родственников: да - 0, нет - 1; х - наличие патологии со стороны сердечно-сосудистой системы: да - 0, нет - 1; х - САД до беременности, мм рт.ст. Использование заявленного способа позволяет эффективно спрогнозировать вероятность риска возникновения преэклампсии у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития по данным о генетическом полиморфизме ММР-1 (rs1799750) в сочетании с другими предикторами развития данного осложнения беременности.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития преэклампсии по данным о генетическом полиморфизме ММР-1 (rs1799750) в сочетании с другими предикторами развития данного осложнения беременности у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования преэклампсии, включающий:
- забор венозной крови;
-  выделение геномной ДНК из периферической венозной крови;
- проведение полимеразной цепной реакции синтеза ДНК;
- анализ полиморфизмов генов ММР-1 (rs1799750);
- прогнозирование риска развития преэклампсии у женщин в зависимости от выявленных генетических вариантов по локусу ММР-1 (rs1799750) в сочетании с другими предикторами развития данной патологии беременности по уравнениям  линейной дискриминантной функции
1
1
2
3
4
5
6
7
y=-61,329+0,434×x+2,534×x+3,433×x+2,841×x+0,874×x-0,033×x+2,062×x;
2
1
2
3
4
5
6
7
y=-55,473+0,339×x+1,528×x-1,679×x++7,717×x+0,769×x+0,066×x+1,666×x,
1
2
3
4
5
6
7
1
2
2
1
2
где x – индекс массы тела до беременности, кг/м, x- наличие преэклампсии у родственников - (1 - да; 0 - нет), x – наличие гинекологической патологии в анамнезе - (1 - да; 0 - нет), x- наличие заболеваний, передающихся половым путем (далее ЗППП) - (1 - да; 0 - нет), x- систолическое артериальное давление (далее САД) до беременности (мм рт.ст.), x - диастолическое артериальное давление (далее ДАД) до беременности (мм рт.ст.), x - генетический вариант по локусу MMP-1 (rs1799750) - (1  1G/1G или 1G/2G; 02 - G/2G). Если при расчете показателей y больше y, то есть риск развития данной патологии. При условии, что y больше  y, риска развития преэклампсии нет.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития преэклампсии у женщин по наличию генетического варианта локуса ММР-1 (rs1799750) в сочетании с предикторами развития данной патологии беременности.
Способ осуществляют следующим образом.
2
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови беременных в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде.
Измерение концентрации ДНК осуществляли на спектрофотометре NanoDrop 2000. Концентрацию и чистоту выделенной ДНК оценивали при измерении оптической плотности (ОП) полученного раствора. Далее готовили «рабочие» концентрации образцов ДНК (10-20 нг в мкл) путем разведения «стоковой» ДНК деионизированной водой. Полученные «рабочие образцы» ДНК хранили при -80°С.
Последовательность праймеров и зондов для полиморфизма гена матриксных металлопротеиназ ММР-1 (rs1799750) взяты из литературного источника [Association of MMP-1 -1607 1G/2G (rs1799750) polymorphism with primary knee osteoarthritis in the Greek population [Text] / P. Lepetsos, A. Pampanos, E. Kanavakis [et al.] // J. Orthop. Res. – 2014. – Vol. 32, № 9. – P. 1155-1160].
2
2
2
Для исследования локуса ММР-1 (rs1799750) использовали наборы 2,5х реакционной смеси для проведения ПЦР-РВ в объеме 25 мкл на 1 образец, включавших 2,5х реакционную смесь (2,5х ПЦР буфер: (KСl, ТрисHСl (рH 8,8), 6,25 мМ MgСl), SynTаq ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, глицерол, Twееn 20) в объеме 10 мкл, 25 мМ MgСl в объеме 1,5 мкл, ddHО  (деионизированная вода), по 10 пкмоль каждого праймера и по 5 пкмоль. Все наборы для проведения ПЦР, олигонуклеотидные праймеры и зонды синтезированы фирмой «Синтол».
Изобретение характеризуется:
Фиг.1. Дискриминации аллелей методом детекции TaqMan зондов по данным величин УОФ (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad) c детектирующей системой в режиме реального времени полиморфизма ММР-1 (rs1799750), где  - гомозиготы 1G,  - гомозиготы 2G,  - гетерозиготы  1G/2G,  - отрицательный контроль.
Фиг.2. В таблице представлены показатели линейной дискриминантной функции (далее ЛДФ) для женщин с преэклампсией и без преэклампсии с учетом предикторов развития данного осложнения беременности и генетических факторов.
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития преэклампсии подтверждает анализ результатов обследования 1045 женщин: 468 женщин с диагнозом преэклампсия и 577 женщин с физиологическим течением беременности (контрольная группа). В исследуемые выборки включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженками Центрально-Черноземного региона России и не имеющие родства между собой. Возраст в группе беременных с ПЭ варьировал от 17 до 45 лет (в среднем 27,74±5,4 лет), а в контрольной группе от 15 до 49 лет (в среднем 27,80±6,5 лет) (р>0,05). Таким образом, группа контроля не отличалась от основной группы по возрасту, полу, национальности и месту рождения.
Диагностику преэклампсии осуществляли сотрудники Перинатального центра областной клинической больницы Святителя Иоасафа г. Белгорода в соответствии с Международной классификацией болезней 10-го пересмотра. Степень тяжести преэклампсии оценивалась по критериям Федеральных клинических рекомендаций «Гипертензивные расстройства во время беременности, в родах и послеродовом периоде. Преэклампсия. Эклампсия» [18. Гипертензия во время беременности. Преэклампсия. Эклампсия: клинич. протокол [Электронный ресурс] / Науч. центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России ; Ин-т Здоровья семьи ; Проект «Мать и Дитя» ; рук. авт. кол.: Г.Т.  Сухих, Н.В. Вартапетова. – Москва, 2012. – 51 с. – Режим доступа: http://www.volgmed.ru/uploads/files/2013-4/18295]. Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществляли в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского факультета Белгородского государственного национального исследовательского университета. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляли с использованием программы «STATISTICA 6.0». Прогнозирование риска развития ПЭ осуществляли с использованием дискриминантного анализа [Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA [Текст] / О.Ю. Реброва. – [3-е изд.]. – Москва : Медиа Сфера, 2006. – 305 с. : ил.; Боровиков, В.П. Statistica: искусство анализа данных на компьютере [Текст] / В.П. Боровиков. – 2-е изд. – Санкт-Петербург: Питер, 2003. – 688 с.].
На первом этапе данного исследования методом дискриминантного анализа построена  статистическая модель прогнозирования риска развития преэклампсии с учетом предикторов развития ПЭ, характеризующих медико-биологический статус женщин до беременности: возраст возникновения беременности, показатели артериального давления, наличие заболеваний, передающихся половым путем (далее  ЗППП), семейный анамнез и т.д., а также генетические характеристики по вышеуказанным локусам матриксных металлопротеиназ. Полученная итоговая модель включает семь признаков: индекс массы тела до беременности, наличие ПЭ у родственников, наличие гинекологических заболеваний в анамнезе, наличие заболеваний, передающихся половым путем, уровень САД до беременности, уровень ДАД до беременности, генетический вариант по локусу MMР-1 (rs1799750), которые при проведении дискриминантного анализа получили значение критерия Уилкса 0,389 при F (7,814)=247,25 и р<0,00001. Параметры дискриминантного анализа представлены в таблице на фиг.2.
Полученные данные позволяют сделать вывод, что изучаемые нами группы беременных с преэклампсией и без преэклампсии по набору из всех исследованных признаков показывают неслучайную межгрупповую дисперсию. Анализ показателей F-критериев и вероятности статистической ошибки 1-го рода (р) по каждому из признаков указывает на то, что по исследуемым показателям р<0,05. Это свидетельствует о возможности их включения в дискриминантный анализ.
Зарегистрированные значения толерантности по исследуемым показателям (Т=0,21-0,98) значительно выше критического уровня Т<0,10. Таким образом, можно утверждать об отсутствии высоких взаимных корреляций этих признаков. Точность определения пациентов, относящихся к группе женщин с преэклампсией составляет 96,36%, а без преэклампсии -96,89%.
Усредненный процент дискриминаций в группах женщин с ПЭ и с физиологическим течением беременности составляет 96,59%.
Уравнения линейной дискриминантной функции с учетом выявленных предикторов развития данной патологии беременности имеют следующий вид:
1
1
2
3
4
5
6
7
y=-61,329+0,434×x+2,534×x+3,433×x+2,841×x+0,874×x-0,033×x+2,062×x;
2
1
2
3
4
5
6
7
y=-55,473+0,339×x+1,528×x-1,679×x+7,717×x+0,769×x+0,066×x+1,666×x,
1
2
3
4
5
6
7
1
2
2
1
2
где x – индекс массы тела до беременности, кг/м), x - наличие преэклампсии у родственников - (1 - да; 0 - нет), x– наличие гинекологической патологии в анамнезе - (1 - да; 0 - нет), x - наличие заболеваний передающихся половым путем - (1 - да; 0 - нет), x - САД до беременности (мм рт.ст.), x - ДАД до беременности (мм рт.ст.), x - генетический вариант по локусу MMP-1 (rs1799750) - (1 - 1G/1G или 1G/2G); 0 - 2G/2G). Если при расчете показателей y>y, то есть риск развития данной патологии. В случае, если  y>y-риска развития преэклампсии нет.
С целью проверки работоспособности заявленного изобретения были дополнительно обследованы две пациентки.
Пример 1.
2
У беременной П. определены следующие показатели: индекс массы тела до беременности – 41,913 кг/м, наличие преэклампсии у родственников - да, наличие гинекологических заболеваний в анамнезе - да, наличие заболеваний, передающихся половым путем - да, значение САД до беременности – 120 мм рт.ст., значение ДАД до беременности – 80 мм рт.ст., полиморфный вариант по локусу MMР-1 (rs1799750) - 1G/1G.
1
2
По уравнениям ЛДФ вычисляем значения y и y:
1
y=-61,329+0,434×41,913+2,534×1+3,433×1+2,841×1+0,874×120-0,033×80+2,062×1=69,971;
2
y=-5,473+0,339×41,913+1,528×11,679×1+7,717×1+0,769×120+0,066×80+1,666×1=65,528.
1
2.
Выявлено, что y>y Это позволяет отнести данную беременную к группе женщин с высоким риском развития ПЭ.  Прогноз был подтвержден при проведении последующего клинико–лабораторного обследования беременной - у беременной П. была диагностирована преэклампсия.
Пример 2.
2
Для  беременной Л. были определены следующие показатели: индекс массы тела до беременности – 31,399 кг/м, наличие преэклампсии у родственников - нет, наличие гинекологических заболеваний в анамнезе - нет, наличие заболеваний, передающихся половым путем, - да, значение САД до беременности – 120 мм рт.ст., значение ДАД до беременности – 80 мм рт.ст., полиморфный вариант по локусу MMР-1 (rs1799750) - 2G/2G.
1
2
По уравнениям ЛДФ вычисляем значения y и y:
1
y=-61,329+0,434×31,399+2,534×0+3,433×0+2,841×1+0,874*120-0,033*80+2,062*0=57,38;
2
y=-5,473+0,339×31,399+1,528×01,679*0+7,717×1+0,769×120+0,066×80+1,666×0=62,335.
1
2
Выявлено, что y<y. Это позволяет отнести данную беременную к группе женщин с минимальным риском развития ПЭ.  Дальнейшее обследование подтвердило прогноз.
Таким образом, можно заключить, что предложенный способ прогнозирования на основе сочетания локуса MMР-1 (rs1799750) с предикторами развития ПЭ работоспособен. Используемая линейная дискриминантная функция с учетом вышеуказанных предикторов позволяет эффективно прогнозировать риск развития преэклампсии при планировании беременности и на ранних сроках беременности у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона России, что будет способствовать более эффективному осуществлению лечебно-профилактических мероприятий по предупреждению данной патологии беременности.