СПОСОБ БИОИНДИКАЦИИ ВОДОЕМОВ
METHOD FOR BIOINDICATION OF WATER BODIES

Изобретение относится к области физики и биологии, может быть использовано для экологического мониторинга водоемов.
Известно, что для принятия решения и осуществления мероприятий по охране природной среды, например - нарушенной под влиянием антропогенной нагрузки, необходимо своевременное выявление нарушения для выполнения природоохранных мер.
Известен «Способ биоиндикации среды» [1]. Недостатком известного способа [1] является неудовлетворительная достоверность результатов оценки степени загрязнения водоемов, вследствие этого - низкая результативность действий, направленных на восстановление нарушенного природного равновесия. Кроме того, известный способ трудоемкий, а используемые индикаторные организмы имеют ограниченный ареал распространения. Эти недостатки существенно ограничивают возможные области применения известного способа.
Известен способ биоиндикации среды [2], включающий выбор группы индикаторов, извлечение элементов среды с индикаторами, обработку полученных данных и заключение о классе чистоты среды. При этом качество среды, как и в вышеперечисленных способах, определяют по одной из "показательных групп" ("таксонов") и числу всех "прочих групп" обнаруженных организмов.
Недостатками известного способа [2] являются недостаточная для практики применения достоверность результата из-за формализованного подхода к оценке разнообразия исследуемых сообществ, сводящегося к тому, что не все гидробионты имеют индикаторную значимость, а также отсутствия оценки показательной значимости "прочих групп" организмов.
Наиболее близким по существу предлагаемого изобретения - прототипом - является способ оценки средней сапробности (сапробность - классификация организмов по их сопротивляемости загрязнению, органической нагрузке, недостатку кислорода, присутствию соединений сероводорода, а также районирование водоемов по степени органического загрязнения) водоемов с использованием индикаторных организмов [3].
Недостатком [3] является неудовлетворительная достоверность результатов оценки степени загрязнения водоемов и вследствие этого - низкая результативность действий, направленных на восстановление нарушенного природного равновесия. Кроме того, известный способ весьма трудоемкий, его осуществление требует участия персонала весьма высокой квалификации, а используемые индикаторные организмы имеют ограниченный ареал распространения. Эти недостатки существенно ограничивают возможные области применения известного способа.
Общими недостатками аналогов и прототипа являются ограниченность территорий их применения из-за недостаточной универсальности, необходимость привлечения высококлассных специалистов, трудоемкость и, как следствие - несвоевременное получение информации о состоянии водоемов и запаздывание с принятием природоохранных мероприятий на основе полученной путем мониторинга информации.
Целью предлагаемого изобретения является повышение достоверности результата биомониторинга для использования без ограничения территорией, независимо от географического местоположения исследуемого водоема.
Цели достигают тем, что мониторинг осуществляют путем биоиндикации водоемов на исследуемой территории. Мониторинг включает отбор проб обитающих в водоеме планктонных организмов, определение уровня загрязнения путем филогенетического анализа гена 18S рРНК планктонных организмов, оценку результатов анализа.
Предлагаемый способ осуществляют, например, следующими путями.
Пример первый
1. Из исследуемого водоема известным способом [4, 5] отбирают пробу планктонных организмов. Количество попавших в пробу видов планктонных организмов на достоверность результата не влияет. Полное отсутствие планктонных организмов в пробе в определенной ситуации интерпретируют как свершившуюся экологическую катастрофу. Этот случай в примере не рассматривают.
2. У организмов, попавших в пробу, известным способом, например [6], определяют нуклеотидные последовательности генов 18S рибосомальной РНК (далee по тексту 18S рРНК), например - с помощью универсальных эукариотических праймеров.
3. Используют полученные нуклеотидные последовательности гена 18S рРНК и выполняют молекулярный филогенетический анализ нескольких, например одного и более, разных видов фито- и зоопланктона, содержащихся в пробах планктонных организмов.
4. Выполняют независимый (для каждого вида из анализируемых организмов) поиск гомологичных нуклеотидных последовательностей, например - с использованием известного банка данных [7], и определяют консервативные сайты стабильных индикаторных видов.
5. Выполняют множественное выравнивание (сравнение каждого консервативного сайта (нуклеотидных последовательностей 18S рРНК) одного планктонного организма со всеми найденными выше консервативными сайтами стабильных индикаторных видов планктонных организмов, например с использованием компьютерной программы ClustalW [8].
6. По нуклеотидным последовательностям 18S рРНК конструируют, например - с использованием пакета компьютерных программ Phylip [9], молекулярные филогенетические деревья, например - известным методом максимальной экономии.
7. Анализируют филогенетические деревья, сконструированные по консервативному гену 18S рРНК и выявляют эволюционные отношения исследуемого организма с другими сапробионтами. Оценивают значение бутстреп-поддержки кластеров, включающих исследуемые планктонные организмы и устойчивые сапробионты.
При высоком (более 85%) значении бутстреп-поддержки кластеров делают вывод:
7.1. при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов ксено- и олигосапробных (или исключительно ксеносапробных) водоемов определяют, что водоем находится в благополучном экологическом состоянии и угроза негативного антропогенного воздействия отсутствует,
7.2. при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов олиго- и мезосапробных (или исключительно олигосапробных) водоемов определяют, что водоем находится в нестабильном (в переходном от благополучного к неблагополучному состоянию) экологическом состоянии, испытывает несущественную антропогенную нагрузку, обладает способностью к самовосстановлению и не нуждается в осуществлении дополнительных природоохранных мероприятий,
7.3. при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов мезо- и полисапробных (или исключительно мезосапробных) водоемов определяют, что водоем находится в неблагополучном состоянии и испытывает существенную антропогенную нагрузку, естественной способности к самовосстановлению недостаточно и водоем нуждается в осуществлении природоохранных мероприятий,
7.4. при объединении в один кластер устойчивых индикаторных организмов полисапробных водоемов делают вывод о наличии локальной экологической катастрофы и предпринимают безотлагательные восстановительные меры, например - сочетающие биологические и искусственные средства, с использованием технических средств очистки, аэрации.
Пример второй
1. Из исследуемого водоема известным способом [4, 5] отбирают пробу планктонных организмов. Количество видов планктонных организмов, попавших в пробу на достоверность результата не влияет. Полное отсутствие планктонных организмов в пробе в определенной ситуации интерпретируют как свершившуюся экологическую катастрофу. Этот случай в примере не рассматривают.
2. Определяют видовой состав полученных проб на основании морфологических признаков.
3. Выполняют поиск нуклеотидных последовательностей генов 18S рРНК попавших в пробу планктонных организмов, например - в известной базе данных [7].
4. Переходят к п.3 Примера первого и последовательно выполняют все пункты 3-7.
Пример третий
Выполнена биоиндикация водоема БУЛАК, расположенного на территории г.Казани Республики Татарстан [10]. Биоиндикация осуществлена с использованием известного способа [3]. Работа (биоиндикация) с участием 5 специалистов выполнена с затратой 450 человеко-часов. Результат биоиндикации: по уровню загрязнения водоем соответствует альфа-мезосапробной зоне, вода относится к четвертому классу качества - загрязненная. Наличие рыб не обнаружено. По результату биоиндикации отсутствует оценка способности водоема БУЛАК к самовосстановлению. Отсутствуют и рекомендации к осуществлению природоохранных мероприятий в водоеме.
Повторная биоиндикация того же водоема БУЛАК выполнена по заявленному способу, двумя специалистами, с затратой 40 человеко-часов рабочего времени. Последовательность действий:
1. Отбирают пробы планктона.
2. Из пробы выделяют образцы планктонных организмов.
3. Определяют первичные нуклеотидные последовательности гена 18S рРНК.
4. Выполняют молекулярный филогенетический анализ по гену 18SpPHK индикаторных видов планктона.
5. Выполняют независимый программный поиск гомологичных последовательностей в международной базе данных GenBank. По нуклеотидным последовательностям гена 18S рРНК попавшие в пробу организмы идентифицированы как Brachionus calyciflorus, Keratella cochlearis, Moina brachiata, Scapholeberis mucronata (уникальные номера в международной базе данных нуклеотидных последовательностей соответственно - GQ503607.1, GQ503608.1, GQ503606.1, GQ503605.1 [7]).
6. Выполняют множественное выравнивание найденных гомологичных последовательностей.
7. Конструируют и анализируют филогенетические деревья, сконструированные по консервативному гену 18S рРНК, и выявляют эволюционные отношения исследуемого организма с другими сапробионтами.
8. Оценивают значение бутстреп-поддержки. Кластеры, включающие исследуемые планктонные организмы и устойчивые сапробионты, имеют высокую (более 85%) бутстреп-поддержку.
Результат биоиндикации по заявленному способу показал, что водоем БУЛАК по уровню загрязнения относится к альфа-мезосапробной зоне, что совпадает с оценкой по известному способу. Дополнительно (к оценке по известному способу) выявлена причина загрязнения - испытываемая водоемом существенная антропогенная нагрузка; водоем находится в неблагополучном состоянии, естественной способности к самовосстановлению недостаточно и водоем нуждается в осуществлении природоохранных мероприятий. Вода относится к четвертому классу качества - загрязненная. Для уменьшения загрязнения воды рекомендуется ее (воды) аэрация. На водоеме установлены фонтаны, способствующие аэрации воды, в водоеме появились рыбы, а на берегу - рыболовы, на водоеме появились перелетные птицы. Выполнение рекомендации по итогам биоиндикации заявленным способом привело к позитивному результату.
Сравнение результатов биоиндикации по известному и заявленному способам показывает полное совпадение оценок качества воды как «загрязненная». Оценки уровня загрязнения по известному и заявленному способам совпадают и характеризуются как «альфа-мезосапробная» зона. При биоиндикации известным способом отсутствуют оценка способности водоема БУЛАК к самовосстановлению и рекомендации к осуществлению природоохранных мероприятий в водоеме. При биоиндикации заявленным способом выполнена оценка способности водоема БУЛАК к самовосстановлению. Биоиндикация по известному способу выполнена с затратой 450 человеко-часов рабочего времени, по заявленному способу на биоиндикацию затрачено 40 человеко-часов.
Результат инструментальной биоиндикации по заявленному способу обладает более высокой достоверностью, т.к. свободен от субъективности визуальной оценки состояния водоема известным способом [3] - путем оценки индекса сапробности планктонных организмов, то есть классификации организмов по их сопротивляемости неблагоприятным условиям среды обитания.
Необходимые для осуществления заявленного способа гены присущи всем планктонным организмам вне зависимости от географического местоположения подвергаемой биомониторингу местности. Применимость заявленного способа не ограничивается приведенными в примере планктонными организмами - использованный при анализе ген 18S рРНК существует и у других планктонных организмов. Поэтому для биоиндикации применимы и иные, чем приведенные в примере, планктонные организмы. Этот фактор снимает территориальные ограничения применимости заявленного способа биоиндикации водоемов.
Новизна предлагаемого способа биоиндикации водоемов заключается в использовании молекулярного филогенетического анализа при оценке степени загрязнения. Способ позволяет определить состояние водной среды путем использования организмов-индикаторов независимо от географического расположения (местонахождения) исследуемого водоема. Достоверность результата осуществления способа не зависит от видового состава организмов-индикаторов в пробе. Поэтому предлагаемый способ биомониторинга на молекулярной основе - универсален, обладает чувствительностью на уровне высших достижений молекулярной генетики, а результаты применения способа - более достоверные по сравнению с результатами применения аналогов.
Предлагаемый способ позволяет отслеживать влияние на окружающую среду как антропогенных факторов, так и естественных природных изменений, например - влияние происходящих изменений на планктонные организмы, регистрируя кумулятивный эффект их (антропогенных факторов и природных изменений) действия в реальных полевых условиях. Способ позволяет своевременно и качественно принимать решения по улучшению состояния природных сообществ, например - экологических систем, в том числе - водоемов, оценивать результаты принятых природоохранных мероприятий.
Приведенные примеры применения предлагаемого изобретения показывают его полезность для экологического мониторинга, например - в природоохранной, сельскохозяйственной, рекреационной деятельности. Применение предлагаемого способа способствует выявлению губительных антропогенных воздействий на ранних стадиях, позволяет своевременно и качественно принимать решения по улучшению состояния водоемов, с наименьшим ущербом для окружающей среды.
Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружено средство, которому присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения, включая характеристику назначения.
Способ биоиндикации имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.
Заявленное техническое решение можно реализовать в промышленных масштабах для природоохранной, сельскохозяйственной, рекреационной деятельности (организации отдыха), деятельности организаций здравоохранения, причем - посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования. Это соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям.
Источники информации
1. Патент RU 2213350, 7МПК G01N 33/24; G01N 33/18. Приоритет от 24.12.2001. Заявители - С.Г.Николаев и др. Описание патента.
2. Макрушин А.В. Биологический анализ качества вод. - Л.: Из-во АН СССР, 1974. - С.46-47
3. Sladechek V. System of water quality from the biological point of view. Arch. Hydrobiol. Ergeb. Limnol,, 1973. - С.179-191.
4. Ред. Винберг Г.Г., Лаврентьева Г.М. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Зоопланктон и его продукция. - Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1982. - 33 с.
5. Ред. Винберг Г.Г., Лаврентьева Г.М. Методические рекомендации по сбору и обработке материалов при гидробиологических исследованиях на пресноводных водоемах. Фитопланктон и его продукция. - Л.: ГосНИОРХ, ЗИН АН СССР, 1984. - 32 с.
6. Watts D., MacBeath J.R. Automated fluorescent DNA sequencing on the ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Methods Mol Biol. 2001. - С.167, 153-170.
7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov (Международная база данных нуклеотидных последовательностей GenBank/EMBL/DDBJ)
8. http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html
9. http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html
10. Экология города Казани (коллективная монография). - Казань: Изд-во «ФЭН» Академии наук РТ, 2005. - 576 с.