СПОСОБ РЕГУЛИРОВАНИЯ СТЕПЕНИ ЗИГОТНОСТИ БЕРЕМЕННОСТИ В ПРОГРАММАХ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И ПЕРЕНОСА ЭМБРИОНОВ
METHOD OF CONTROLLING DEGREE OF ZYGOSITY OF PREGNANCY IN EXTRACORPOREAL FERTILISATION AND EMBRYO TRANSFER PROGRAMS

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, и может быть использовано при переносе эмбрионов (ПЭ) после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Способ позволяет регулировать наступление одноплодных или многоплодных (дизиготных) беременностей в программах (ЭКО и ПЭ).
В настоящее время остается нерешенной проблема нежелательного многоплодия (МП) при осуществлении программы ЭКО и ПЭ. Ятрогенное МП составляет 30-80% многоплодных беременностей, что связано, прежде всего, с применением современных методов лечения бесплодия: гормональной стимуляцией суперовуляции и ЭКО с переносом нескольких эмбрионов хорошего качества.
Феномен МП до сих пор не вполне изучен. Важно различать монозиготное и дизиготное (полизиготное) МП. В свою очередь дизиготное (или полизиготное) МП связано с одновременной овуляцией (в течение одного овариального цикла) с последующим оплодотворением двух и более яйцеклеток, созревших в разных фолликулах одного яичника (ovulatio uniovarialis), и с одновременной овуляцией с последующим оплодотворением двух и более яйцеклеток, созревших в разных фолликулах в обоих яичниках (ovulatio biovarialis) [Макаров О.В., Акушерство. Клинические лекции. Издательство. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. - 640 с.].
МП имеет медицинские, социальные, психологические, этические и финансовые аспекты. К медицинским аспектам относятся, прежде всего, риски преждевременных родов и более высокие показатели перинатальной смертности.
Таким образом, снижение МП представляет собой актуальную проблему. В настоящее время наиболее распространенным способом решения указанной проблемы в области вспомогательных репродуктивных технологий является метод селективного переноса единичного эмбриона (Elective single-embryo transfer, eSET) [Thurin et al., 2004; Magli, 2007; Allen et al., 2006; De Neubourg et al., 2002; Ubaldi et al., 2015].
Однако этот метод сопряжен с рядом дополнительных обстоятельств.
Селективный перенос единичного эмбриона, отобранного на основании традиционной морфологической оценки качества переносимого эмбриона, приводит к значительному снижению эффективности программ ЭКО+ПЭ, в особенности по относительному количеству успешных родов [Назаренко Т.А. Стимуляция функции яичников. - М.: Медпресс - информ, 2008. - 272 с., 2008; Whitney J.B., Nugent N., Zozula S., Anderson R.E., Schiewe M.C. Single embryo transfer (SET) yields equivalent clinical pregnancy rates and higher implantation rates compared to dual embryo transfer (DET) of euploid blastocysts // Fertil. Steril. 2013 100 (3): S29].
Известно несколько подходов усовершенствования метода селективного переноса единственного наиболее полноценного эмбриона.
а) Инвазивные, включающие преимплантационную генетическую диагностику полярного тельца, одного из бластомеров, либо клеток трофобласта бластоцисты для отбора наиболее здорового эмбриона [Harper JC1, Sengupta SB. Preimplantation genetic diagnosis: state of the art 2011 // Hum Genet. 2012; 131 (2): 175-86]. Однако имеется информация о том, что травмирование блестящей оболочки эмбриона при проведении необходимого в этом случае ИКСИ и ее повторное травмирование при заборе клеток может повышать число монозиготного МП [Haimov-Kochman R1, Daum Н, Lossos F, Aizenman E, Werner M, Yagel S, Laufer N, Simon A, Hurwitz A. Monozygotic multiple gestation after intracytoplasmic sperm injection and preimplantation genetic diagnosis // Fertil Steril. 2009 Dec; 92 (6): 2037. e11-7].
б) Неинвазивные, включающие системы непрерывного наблюдения за развитием эмбрионов (time-lapse embryo selection).
Примером указанного подхода к решению проблемы единственного наиболее полноценного эмбриона, предназначенного для переноса, является способ определения изменений в клеточной популяции (US 8265357). Данное изобретение представляет собой метод и систему установления изменения в клеточной популяции, а также оценки качественных изменений эмбрионов и отбора эмбрионов для ЭКО путем сравнения последовательных изображений эмбрионов. Известный способ включает:
- измерение продолжительности периода клеточного деления - длительность клеточного деления от начала деления цитоплазмы до превращения исходной клетки в две дочерние;
- измерение продолжительности периода между делениями - длительность периода покоя между клеточными делениями;
- измерение длительности клеточного цикла - продолжительности периода от начала одного деления до начала следующего;
- измерение внутриклеточной подвижности (исключая слабую подвижность мембраны);
- измерение подвижности внутриклеточных органелл;
- отслеживание перемещения клеток внутри эмбриона и др.
Таким образом, настоящее изобретение является методом и системой для отслеживания изменений в клеточных популяциях, в том числе внутри развивающегося эмбриона. В соответствии с данным способом эмбрионам высшего качества присущи следующие характеристики:
- короткий период клеточного деления (менее 1 часа);
- наличие лишь слабых клеточных движений в интерфазный период, т.е. клеточный центр стационарен (сдвиг менее 3 µm), клеточные мембраны в основном неподвижны (сдвиг менее 3 µm);
- раннее начало первого клеточного деления (менее 25 часов после оплодотворения;
- короткий период клеточных перемещений в промежутке между дроблениями (менее 3 часов);
- равномерное распределение клеточного движения в пределах эмбриона на протяжении всего периода наблюдений, т.е. отсутствие неактивных площадей, зон, или объемов внутри эмбриона, где клеточные движения не наблюдаются в течение более 24 часов. Наличие таких неподвижных участков может свидетельствовать о присутствии мертвых или умирающих бластомеров и фрагментов, которые могут препятствовать дальнейшему развитию.
Известный способ требует сложного инструментального и программного обеспечения.
в) Анализ молекулярно-генетического профиля фолликулярной жидкости каждого ооцита и спермы в день трансвагинальной пункции (ТВП) яичников.
К таковому относится способ прогнозирования наступления беременности в программе ЭКО при селективном ПЭ путем оценки молекулярно-генетического профиля гамет с помощью ПЦР-РВ (RU 2550965). Целью известного изобретения является снижение частоты МП беременностей, а также возможность прогнозировать наступление беременности в программе ЭКО. Поставленную задачу авторы указанного способа решают путем выбора эмбриона, имеющего высокий потенциал к имплантации, при селективном переносе эмбрионов. В процессе осуществления известного изобретения проводилась программа ЭКО и ПЭ со стимуляцией суперовуляции по стандартным протоколам. Оплодотворение проводилось методами стандартного ЭКО или с помощью ИКСИ (при наличии субфертильных отклонений спермограммы в день ТВП от нормы по критериям ВОЗ, 2010 г.) в равной доле (р=0,833). Индивидуальное культивирование эмбрионов осуществлялось в индивидуальных лунках четырехлуночного планшета в соответствии с номером образца фолликулярной жидкости. Выбор эмбриона осуществлялся на основании морфологической оценки. Селективный перенос одного или двух эмбрионов проводили на стадии бластоцисты. При этом производилась оценка транскриптомного профиля мужских и женских гамет. Выполнялась общепринятая морфологическая оценка полученных эмбрионов. ПЭ производился на основании комплексной морфологической и молекулярно-генетической оценки гамет. Кроме того, авторами разработана математическая модель, которая может быть использована в качестве дополнительного критерия объективной оценки качества гамет и позволяет классифицировать супружеские пары по исходам ЭКО и ПЭ в зависимости от совокупных данных по молекулярно-генетическому профилю фолликулярной жидкости и спермы в день ТВП яичников.
Несмотря на успешность селективного отбора единичного эмбриона в преодолении проблемы МП общим препятствием в использовании рассмотренных выше методов дополнительной преимплантационной оценки гамет и эмбрионов являются их крайняя трудоемкость и дороговизна в отношении объема необходимых исследований, высокой стоимости расходных материалов, требуемой аппаратуры и программного обеспечения. Это делает их не всегда доступными, учитывая широкое распространение ЭКО+ПЭ к настоящему моменту во множестве перинатальных центров и лабораторий ЭКО с разным уровнем оснащения и обеспечения квалифицированными кадрами.
Еще одним существенным препятствием на пути применения селективного переноса единственного эмбриона являются социально-психологические установки большого количества пациенток, проходящих лечение бесплодия методами ЭКО+ПЭ и в подавляющем большинстве настроенных против переноса единичного эмбриона. Лишь менее 9% пациентов согласны на перенос одного эмбриона, при этом 40% пациентов отказываются от переноса одного эмбриона не из опасения перед отрицательным исходом программы, а потому что хотели бы иметь двойню. Этот фактор является немаловажным, если принимать во внимание психофизиологические, а также материальные затраты пациентов в процессе лечения.
Описанные выше подходы не учитывают особенность проведения программы ЭКО, при котором априори стимулируются оба яичника и аспирацию ооцитов во время ТВП проводят из обоих яичников. Именно этот аспект является центральным в заявляемом способе.
Наиболее близким к заявляемому способу по числу совпадающих существенных признаков выбран способ проведения ЭКО (RU 2190978). Как следует из описания известного способа и приведенных клинических примеров, авторы решают задачу оптимизации отбора преовуляторных ооцитов для дальнейшего культивирования и качественной оценки переносимых эмбрионов в полость матки с учетом морфофункциональной асимметрии женской репродуктивной системы.
Поставленную задачу авторы способа-прототипа решают следующим образом.
- В момент проведения пункции фолликулов производят раздельную аспирацию преовуляторных ооцитов и фолликулярной жидкости из правого и левого яичников, определяют количество ооцитов и активность протеолитических ферментов (кислых пептид-гидролаз) в фолликулярной жидкости.
- Доминантным считают яичник, активность пептид-гидролаз, в фолликулярной жидкости которого на 20 мг/мл за 1 час и более превышает соответствующий показатель другого яичника.
- Отбор наиболее качественных ооцитов для дальнейшего культивирования и выбор переносимых эмбрионов осуществляют с учетом доминантности яичника, перенос эмбрионов в полость матки производят на сторону эндометрия, ипсилатеральную доминантному яичнику.
- Аспирацию ооцитов и фолликулярной жидкости производят через 36 часов после введения овуляторной дозы ХГ раздельно из правого и левого яичников.
- С целью получения ооцитов из фолликулов яичников и фолликулярной жидкости производят ТВП.
- Качество ооцитов, полученных при пункции, оценивают по уровню активности пептид-гидролаз. Хорошее качество ооцитов выставляют при уровне активности пептид-гидролаз свыше 75 мг/мл/час, среднее качество - при уровне 40-74 мг/мл/час, плохое качество - при уровне ниже 40 мг/мл/час.
- Перенос эмбрионов в полость матки осуществляют, как правило, через 48-50 часов после ТВП. Эмбрионы на стадии 2-8-ми бластомеров.
Однако использование способа-прототипа не решает проблему предотвращения возникновения нежелательного МП при осуществлении программ ЭКО и ПЭ.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи регулирования наступления одноплодной или многоплодной (дизиготной) беременности, а также предотвращения возникновения нежелательного МП при осуществлении программ ЭКО и ПЭ.
Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических (лечебных) результатов:
- оптимизация выбора эмбрионов, имеющих высокий потенциал для переноса в полость матки;
- обеспечение исхода программы ЭКО и ПЭ в виде одноплодной либо многоплодной беременности с вероятностью около 93% за счет того, что все эмбриологические этапы программы осуществляют путем формирования двух когорт эмбрионов, происходящих из различных яичников (овариальных когорт) и их независимого культивирования;
- возможность осознанного выбора: развития дизиготной либо монозиготной беременности с учетом пожелания самой пациентки и ее физиологических возможностей вынашивания МП беременности за счет переноса выявленных эмбрионов высокого качества (ЭВК) из одной или из 2-х различных сформированных когорт эмбрионов;
- невысокая стоимость и доступность для использования множеством перинатальных центров и лабораторий ЭКО с разным уровнем оснащения.
Указанные технические (лечебные) результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что также, как в известном способе, производят раздельную ТВП фолликулов и аспирацию преовуляторных ооцитов из правого и левого яичников.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что осуществляют формирование 2-х когорт ооцитов, зигот и эмбрионов, происходящих из различных яичников, путем раздельного проведения каждого этапа ЭКО. Для получения преимущественного результата в виде моноплодной беременности осуществляют перенос в полость матки 1-го, 2-х, редко 3-х ЭВК от одной когорты. Для получения преимущественного результата в виде дизиготной беременности осуществляют перенос в полость матки 2-х, редко 3-х ЭВК из обеих когорт.
Раскрытие изобретения
Особенностью проведения программы ЭКО в соответствии с заявляемой методикой является то, что активируют оба яичника и забор ооцитов во время ТВП проводят из обоих яичников, при этом, однако, не смешивая когорты, аспирированные из разных яичников.
Заявляемое изобретение основано на использовании раздельного культивирования ооцитов и оплодотворенных зигот, принадлежащих различным овариальным когортам ооцитов, что позволяет неинвазивно и комплексно подходить к выбору эмбриона, имеющего максимальный шанс к имплантации в программе ЭКО и ПЭ из состава каждой когорты. Заявляемый способ, по сути, представляет собой частичное воспроизведение природного механизма вычленения внутри яичника доминантного фолликула из когорты фолликулов, преодолевших блок мейоза, на экстракорпоральный отбор лидирующего ЭВК из когорты развивающихся эмбрионов.
Авторами изобретения установлено, что к третьему дню развития в условиях in vitro эмбрионы, объединенные в овариальные когорты по признаку своего происхождения из конкретного яичника, распределяются по скорости и качеству дробления. Каждая скоростная категория обычно представлена некоторым количеством членов. Среди эмбрионов, составляющих когорту, наблюдается вычленение «лидеров». Если эти «лидеры» содержат 6-7-8 бластомеров (отражение оптимальности скорости дробления, т.е. прохождение третьего деления дробления) одинакового объема, с хорошим тургором, светлой гомогенной цитоплазмой (качество бластомеров «а») и менее 25% фрагментации, их относят к эмбрионам высшей категории (ЭВК) и подсчитывают их количество. Качественную оценку эмбрионов когорты, подсчет ЭВК и отбор лидеров-претендентов на перенос производят в обеих овариальных когортах независимо.
Авторами изобретения установлено также, что многоплодие непосредственно связано с принадлежностью переносимых эмбрионов к различным когортам, берущим начало от ооцитов из разных яичников. По наблюдениям результатов имеющейся практики перенос 2-х ЭВК, взятых из разных овариальных когорт, приводил к развитию МП в 80% случаев, а перенос 2-х ЭВК из одной когорты - в 10% случаев.
Авторами заявляемого способа было проведено ретроспективное исследование 64 пациенток, у которых была получена клиническая беременность после переноса по крайней мере 2-х ЭВК при условии раздельного культивирования групп ооцитов, зигот и эмбрионов, принадлежащих к разным овариальным когортам. Пациентки были разделены на 2 группы: к одной группе были отнесены пациентки с переносом ЭВК из одной из овариальных когорт (uniovarialis), пациенткам другой группы были перенесены ЭВК, происходящие из разных овариальных когорт (biovarialis).
Результаты сравнения основных показателей для этих групп пациентов представлены в таблице, в которой приведено соотношение МП в двух группах пациенток.
Как видно из таблицы 92,3% (24 из 26) многоплодных беременностей, закончившихся родами, развилось в результате ТВП ооцитов из разных яичников, их раздельного культивирования и переноса ЭВК от двух разных овариальных когорт. Это можно считать фактологическим доказательством того, что дизиготные беременности связаны с ПЭ из разных овариальных когорт.
В процессе работы была произведена оценка чувствительности и специфичности используемого метода. Получены следующие результаты.
Чувствительность метода = 24*100/(24+2)=92,3%.
Специфичность метода = 100*18/24=75%.
Точность диагностического теста = 100*(24+18)/50=84%.
Прогностическая ценность положительного результата (ППР) теста (positive predictive value) = 100*24/(24+6)=80%.
Прогностическая ценность отрицательного результата (ПОР) теста (negative predictive value) = 100*18/(2+18)=90% [Альбом А., Норелл С. Введение в современную эпидемиологию / Пер. с англ. - Таллин: Ин-т эксперим. и клинич. медицины (Эстония), Датское противораковое общество. 1996. 122 с.].
Способ осуществляют следующим образом.
Подготовку пациенток осуществляют в соответствии со стандартным протоколом гормональной стимуляции суперовуляции (для увеличения количества яйцеклеток). Начиная с ТВП, этапы программы ЭКО+ПЭ проводят таким образом, чтобы обе когорты ооцитов, зигот и эмбрионов, происходящие из двух разных яичников, находились на каждом этапе обработки и культивирования в раздельных средах. Отмывку, оплодотворение и дальнейшее культивирование проводят в 2-х раздельных емкостях (чашках Петри, а в дальнейшем - в лунках нуклона), таким образом, чтобы когорты ооцитов из разных яичников не смешивались.
Таким образом обеспечивают обособленное (раздельное) культивирование обеих когорт. На третий день культивирования проводят индивидуальную оценку эмбрионов, составляющих различные когорты (достигнутой стадии развития и его качества: скорости дробления, т.е. прохождение третьего деления дробления), одинакового объема, с хорошим тургором, светлой гомогенной цитоплазмой (качество бластомеров «а»), фрагментацией, не превышающей 25%. Их относят к эмбрионам высшей категории (ЭВК) (трех-пронуклеарные зиготы, обнаруживаемые на следующий день после проведения оплодотворения, из овариальной когорты удаляют).
В случае успешного культивирования, приводящего к развитию двух и более ЭВК к третьему дню культивирования, осуществляют ПЭ (возвращение в условия in vivo одного или двух, редко трех эмбрионов). В ряде случаев ПЭ производят на 5-й день.
Если ЭВК формируются в обеих овариальных когортах, то при ПЭ из обеих когорт возникает вероятность МП и возможность осознанного выбора: получения дизиготной либо монозиготной беременности. Участники процесса принимают решение с учетом пожелания самой пациентки, ее предыдущего опыта и ее физиологических возможностей по вынашиванию многоплодной беременности.
Перенос эмбрионов производят с учетом их принадлежности к конкретной когорте.
Проводят перенос двух (редко трех, по договоренности с пациенткой) морфологически наиболее перспективных ЭВК. К таковым относятся эмбрионы, имеющие к началу 3-го дня развития 6-7-8 бластомеров (т.е. имеющие оптимальную скорость дробления). Они уже перешли (6 и 7) либо закончили (8) III деление дробления. Бластомеры равновеликие, шарообразные (хороший тургор), со светлой гомогенной цитоплазмой, компактно собранные в раннюю морулу (в отличие от т.н. планарных - вытянутых), фрагментация которых не превышает 25%. На этом этапе важно учитывать принадлежность выделенных для переноса эмбрионов к одной когорте либо двум разным когортам.
Проведенное авторам заявляемого изобретения ретроспективное исследование показало, что в 92,3% случаев (24 случая из 26) дизиготная беременность развивается при условии переноса ЭВК из обеих когорт. Если дизиготное МП оказывается нежелательным, для переноса берут ЭВК только от одной когорты. Оставшиеся ЭВК из данной когорты, а также ЭВК из другой когорты подвергают криоконсервации, соблюдая тот же принцип несмешивания эмбрионов из разных когорт (информацию фиксируют в сопровождающей документации). Таким образом, если текущая попытка ЭКО+ПЭ окажется неудачной и будет принято решение о разморозке эмбрионов для проведения т.н. криопереноса, возможность регулирования зиготности беременности будет полностью сохранена.
Примеры выполнения
Примеры переноса эмбрионов от двух различных овариальных когорт
Пример 1
Больная С., 42 года. Обратилась в ГУБЗ-МО «МОПЦ» для проведения программ ЭКО. Проведены клиническое и лабораторное обследования. При подготовке к программе ЭКО у пациентки были удалены полипы. В силу присутствия выраженного мужского фактора при проведении ЭКО была использована донорская сперма. При ТВП из первого и второго яичников аспирировано 6 и 4 ооцитов соответственно. На 5 день развития перенесено 3 эмбриона: 2 ранние бластулы АА из первой когорты и бл2АА из второй. Наступившая беременность закончилась родами двойни.
Пример 2
Больная Д., 33 года. Обратилась в ГУБЗ-МО «МОПЦ» для проведения программ ЭКО. Проведены клиническое и лабораторное обследования. При ТВП из обоих яичников аспирировано 4 и 7 ооцитов соответственно. На 3 день развития перенесено 2 эмбриона: 8А из первой когорты и 8А - из второй. К 5 дню развития во второй когорте сформировались две бластоцисты хорошего качества, которые были криоконсервированы. Наступившая беременность закончилась родами двойни.
Пример 3
Больная И., 30 года. Обратилась в ГУБЗ-МО «МОПЦ» для проведения программ ЭКО. Проведены клиническое и лабораторное обследования. При ТВП из яичников аспирировано 6 и 4 ооцитов, перенесено на 5 день 3 эмбриона: 2 ранние бластулы АА из первой кагорты и бл2АА из второй. Наступившая беременность закончилась родами двойни.
Пример 4
Больная К., 24 года. Обратилась в ГУБЗ-МО «МОПЦ» для проведения программ ЭКО. Проведены клиническое и лабораторное обследования. Из яичников аспирировано 6 и 6 ооцитов, перенесено на 3 день 2 эмбриона: 8А и 7А соотвественно. Наступившая беременность закончилась родами двойни.
Примеры переноса эмбрионов от одной овариальной когорты
Пример 5
Больная М., 32 года. Обратилась в ГУБЗ-МО «МОПЦ» для проведения программ ЭКО. Проведены клиническое и лабораторное обследования. Из яичников аспирировано 7 и 6 ооцитов, перенесено на 3 день 3 эмбриона из первой когорты (8а, 8а, 6а), из другой овариальной когорты переноса эмбрионов не производилось. На 5 день в ней сформировалась бластоциста хорошего качества, которая была криоконсервирована. Наступившая беременность закончилась родами одного ребенка.
Пример 6
Больная Г., 33 года. Обратилась в ГУБЗ-МО «МОПЦ» для проведения программ ЭКО. Проведены клиническое и лабораторное обследования. Из обоих яичников аспирировано 9 и 5 ооцитов. Из первой когорты на 3 день развития перенесено 3 эмбриона (8в, 8в, 8в), из другой овариальной когорты переноса не производилось и к 5 дню развития в ней образовались 2 хорошие бластоцисты, которые были криоконсервированы. Наступившая беременность закончилась родами одного ребенка.
Пример 7
Больная Я., 30 года. Обратилась в ГУБЗ-МО «МОПЦ» для проведения программ ЭКО. Проведены клиническое и лабораторное обследования. Из яичников аспирировано 8 и 3 ооцитов. С ооцитами из первой овариальной когорте проводилась процедура ИКСИ. На 3 день развития из нее было перенесено 2 эмбриона (8а, 8а). Во второй овариальной когорте проводили традиционное ЭКО, но оплодотворения не произошло. Наступившая беременность закончилась родами одного ребенка.
Таким образом, заявляемый способ регулирования степени зиготности беременности в программах ЭКО и ПЭ обладает высокой специфичностью и чувствительностью и позволяет предотвратить развитие нежелательного МП в процессе проведения программы ЭКО.