ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ ИММУННОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ PCV2 И СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТАКИХ КОМПОЗИЦИЙ
MULTIVALENT IMMUNOGENIC COMPOSITIONS PCV2 AND METHODS FOR PRODUCING THESE COMPOSITIONS

В настоящей заявке содержится перечень последовательностей в бумажном формате, а также в формате, доступном для прочтения с помощью компьютера, сущность и содержание которых включено в настоящее изобретение в виде ссылки.
Предпосылки создания изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Один из объектов настоящего изобретения связан с выделением белка, экспрессируемого открытой рамкой считывания (open reading frame 2 - ORF2) цирковируса свиней тип 2 (porcine circovirus тип 2 - PCV2). Точнее, белок является рекомбинантным белком, экспрессируемым трансфецированным вирусом, содержащим рекомбинантные кодирующие последовательности цирковируса свиней, тип 2, открытой рамки считывания 2. Еще точнее, трансфецированный вирус способен инфицировать клетки на питательных средах, и белок, экспрессированный открытой рамкой считывания 2, выделяют из надосадочной жидкости в большей степени, чем из самих клеток. Еще точнее, способ настоящего изобретения включает стадии амплификации гена открытой рамки считывания 2 из цирковируса свиней тип 2, клонирования этой амплифицированной части в первом векторе, иссечения части открытой рамки считывания 2 из этого первого вектора и клонирования ее в векторе переноса, совместной трансфекции вектора переноса с вирусным вектором в клетки на питательных средах, в результате чего клетки становятся инфицированными вирусным вектором и, следовательно, экспрессируют открытую рамку считывания 2, а также выделения экспрессируемого рекомбинантного белка, кодируемого открытой рамкой считывания 2, из надосадочной жидкости.
Другой объект настоящего изобретения связан с иммуногенной композицией, эффективно индуцирующей иммунный ответ в отношении вируса PCV2, и со способами получения таких иммуногенных композиций. Точнее настоящее изобретение связано с иммунологической композицией, эффективной в выработке иммунного ответа, которая защищает животное, получившее такую композицию, снижает тяжесть проявления клинических симптомов, связанных с инфекцией PCV2. Кроме того, точнее, настоящее изобретение связано с основанной на белке иммунологической композицией, которая создает эффективную защиту в отношении инфекции PCV2. Конкретнее настоящее изобретение связано с иммунологической композицией, включающей ORF2 из вируса PCV2, причем введение PCV2-ORF2 приводит к защите от инфекции PCV2. Наиболее конкретно настоящее изобретение связано с иммунологической композицией, эффективной в выработке эффективного иммунитета у свиней, получающих иммунологическую композицию, причем эта композиция включает белок, экспрессируемый открытой рамкой считывания ORF2 вируса PCV2.
Другим объектом настоящего изобретения являются комбинированные вакцины и поливалентные вакцины. Точнее настоящее изобретение предусматривает иммуногенные композиции, эффективные в индукции иммунного ответа против инфекции, вызываемой вирусом PCV2, и по меньшей мере еще одного другого болезнетворного микроорганизма свиней.
Уровень техники
Свиной цирковирус тип 2 (PCV2) имеет малый размер (17-22 им в диаметре), форму икосаэдра, без оболочки и содержит ДНК в виде однонитевого кольцевого генома. Последовательность ДНК вируса PCV2 примерно на 80% идентична последовательности свиного цирковируса тип 1 (PCV1). Однако в отличие от вируса PCV1, который обычно невирулентен, у свиней, инфицированных вирусом PCV2, проявляется синдром, обычно называемым синдром мультисистемного послеотъемного истощения поросят (post-weaning multisystemic wasting syndrome - PMWS). PMWS клинически характеризуется истощением, бледностью кожных покровов, болезненным видом, расстройством внешнего дыхания, диареей и желтухой. У некоторых зараженных свиней сочетание всех симптомов может быть очевидным, хотя у других особей может проявляться только один или два из числа перечисленных симптомов. При вскрытии микро- и макроскопические повреждения проявляются в разных тканях и органах, причем лимфоидные органы поражаются наиболее часто. Наблюдалась четкая корреляция между количеством нуклеиновой кислоты вируса PCV2 или антигена и тяжестью микроскопических лимфоидных повреждений. Смертность у инфицированных вирусом PCV2 свиней может составлять примерно 80%. Помимо PMWS, вирус PCV2 также связан с несколькими другими инфекциями, в том числе с инфекционным бульбарным параличом, репродуктивно-респираторным синдромом свиней (porcine reproductive and respiratory syndrome - PRRS), болезнью Глассера, стрептококковым менингитом, сальмонеллезом, послеотъемным колибациллезом поросят, диетическим гепатозом и гнойной бронхопневмонией.
Белок открытой рамки считывания 2 (ORF2) вируса PCV2, с молекулярной массой примерно 30 кДа по результатам фореза в SDS-PAGE геле, использовалась ранее в качестве антигенного компонента в вакцинах PCV2. Типичные способы получения ORF2 для применения в таких вакцинах обычно заключаются в амплификации ДНК PCV2, кодирующей ORF2, трансфекции вирусного вектора с ДНК ORF2, инфицировании клеток вирусным вектором, содержащим ДНК ORF2, создании условий для экспрессии вирусом белка ORF2 в клетках и экстракции белка ORF2 из клетки в результате клеточного лизиса. Эти процедуры обычно занимают примерно до четырех суток после инфицирования клеток вирусным вектором. Однако недостаток этих процедур заключается в том, что экстракции и дороги, и занимают много времени. Кроме того, выделенное из клеток количество ORF2 не столь велико, поэтому требуется большое количество клеток для инфицирования вирусными векторами и получения достаточных количеств рекомбинантного экспрессируемого белка для применения в вакцинах и т.п.
К современным подходам к иммунизации PCV2 относится применение вакцин на основе ДНК, например, вакцин, описанных в US 6703023. Однако такие вакцины были неэффективны при выработке иммунитета против инфекции PCV2 и в отношении связанных с ней клинических признаков.
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome - PRRS) вызывается вирусом, который не так давно впервые был выделен и классифицирован в качестве артеривируса (в 1991 году). Данный синдром впервые был описан в США в середине 1980-х годов и назван «загадочной болезнью свиней». Это заболевание также называют «болезнью синего уха». Название вируса «свиной артеривирус» было дано недавно. Вирус PRRS обладает выраженным сродством с макрофагами, особенно теми, которые выделены из легких. Макрофаги представляют часть защиты организма. Макрофагов, присутствующих в легких, называют альвеолярными макрофагами. Они расщепляют и удаляют вторгшиеся бактерии и вирусы, но не вирус PRRS. Вместо этого вирус размножается в макрофагах, вырабатывая все больше вирусов и уничтожая макрофаги. Попав в стадо, вирус проявляет тенденцию сохраняться в нем и действует без ограничений. До 40% макрофагов разрушается, в результате чего утрачивается существенная часть защитного механизма организма, что позволяет бактериям и вирусам размножаться и вызывать повреждения. Примером является выраженное увеличение тяжести энзоотической пневмонии у растущих/откормленных особей в случае инфицирования вирусом PRRS. Для заражения всего размножаемого поголовья может потребоваться год, особенно в случае большого стада, которое инфицируется впервые, и хотя вирус быстро распространяется среди животных в стаде, может пройти 4-5 месяцев, прежде чем по меньшей мере 90% свиноматок станут серопозитивными. Некоторые свиноматки остаются незараженными. Кроме того, не исключено, что среди свиноматок через 1-2 года после инфицирования менее 20% животных остаются серопозитивными. Однако это не означает, что они по прежнему сохраняют иммунитет, или что они передают иммунитет потомству. У взрослых животных вирус выделяется из организма гораздо быстрее (14 суток) по сравнению с растущими поросятами, которые экскретируют его на протяжении 1-2 месяцев. Клиническая картина может очень сильно варьировать между разными стадами. Обычно из каждых трех стад животных, инфицированных PRRS, первоначально только в одном нет признаков заболевания, во втором заболевание может проявляться в мягкой форме, а в третьем заболевание протекает в форме от умеренной до тяжелой. Причины этого точно не установлены. Однако улучшение состояния здоровья у животных в стаде в целом приводит к менее тяжелым проявлениям заболевания. Это может быть связано с тем, что вирус мутирует по мере размножения, формируя и высоковирулентные штаммы, и не вирулентные. PRRS инфицирует все типы стад, и с высоким, и с обычным статусом здоровья животных, содержащихся и под открытым небом, и в помещении, причем независимо от его размера.
Mycoplasma hyopneumoniae (М. hyo.) представляет собой бактерию небольшого размера (400-1200 нм), которая относится к семейству Mycoplasmataceae. Бактерия М. hyo. связана с энзоотической пневмонией - респираторным заболеванием свиней, которое обычно наблюдается у растущих особей и у уже откормленных свиней, предназначенных для забоя. М. hyo. поражает реснички эпителиальных клеток трахеи и легких, прекращая их биение (зоостаз) и в итоге приводит к формированию коллапса в зонах легких. В зависимости от проявления заболевания суточный прирост массы тела свиней может быть снижен до 17%. Энзоотическая пневмония широко распространена в популяциях свиней и обнаруживается практически в каждом стаде. Предполагается, что М. hyo. является первичным патогеном, который облегчает поступление PRRSV и других респираторных патогенов в легкие. У трех разных штаммов, 232, J и 7448, геномы были секвенированы (Minion и др., J. Bacteriol. 186, 2004, сс.7123-7133, Vasconcelos и др., J. Bacteriol. 187, 2005, сс.5568-5577).
Пролиферативный энтерит свиней - распространенное заболевание, проявляющееся в форме диареи у молодых откармливаемых свиней и свиней, откорм которых завершается, отличающееся гиперплазией и воспалением подвздошной и ободочной кишки в целом. Обычно оно протекает в умеренной форме и является самоограничивающимся, но иногда вызывает стойкую диарею, тяжелый некротический энтерит или геморрагический энтерит с высоким процентом смертности. В качестве этиологической причины ранее была определена бактерия Lawsonia intracellular is. Эту бактерию культивировали только в культуре клеток, а попытки размножить ее на бесклеточной среде были неудачными. Инокулирование чистых культур L. intracellularis в определенным образом выращенных свиней полностью подтвердило постулат Коха, поскольку были получены типичные для этого заболевания поражения, а бактерия L. intracellularis была заново выделена из мест этих поражений. Наиболее распространенная негеморрагическая форма заболевания часто поражает свиней массой 18-36 кг и характеризуется внезапной диареей. Консистенция фекалий от жидкой до пастообразной, цвет коричневатый или слегка кровянистый. Через ~2 суток у свиней могут формироваться желтые фибринонекротические цилиндры, которые формируются на подвздошной кишке. Большинство пораженных свиней выздоравливает спонтанно, но у многих особей развивается хронический некротический энтерит с прогрессирующим истощением. Геморрагическая форма отличается бледностью кожных покровов, слабостью и выделение геморрагических или черных смолистых фекалий. У беременных подсвинок могут быть выкидыши. Поражения могут возникать в организме где-нибудь в нижней половине тонкого кишечника, слепой кишке или в ободочной кишке, причем наиболее часто и обильно именно в подвздошной кишке. Стенка кишки утолщается, а брыжейка может быть отечной. Лимфатические узлы брыжейки увеличены. Слизистая тонкой кишки становится утолщенной и складчатой с коричневатой или желтой фибринонекротической мембраной, а иногда содержит петехиальные кровоизлияния. Желтые некротические цилиндры могут быть обнаружены в подвздошной кишке или по всей ободочной кишке. Диффузный полный некроз слизистой в хронических случаях приводит к ригидности кишечника, который начинает напоминать садовый шланг. Пролиферативные поражения слизистой оболочки часто присутствуют в ободочной кишке, но они выявляются только при тщательном поиске на вскрытии. При выраженной геморрагической форме в ободочной кишке присутствуют красные или черные смолянистые фекалии, а в подвздошной кишке - сгустки крови.
Вирус бычьей вирусной диареи (Bovine Viral Diarrhoea Virus - BVD) и вирус пограничной болезни - два вируса, которые относятся к той же группе пестивирусов, что и вирус свиной лихорадки (чумы свиней), но преимущественно инфицируют крупный рогатый скот и овец, соответственно. Они могут инфицировать животных в репродуктивных стадах и вызывать осложнения, связанные с репродукцией. Это заболевание не является обычной причиной бесплодия свиноматок, поэтому его следует рассматривать в последнюю очередь при постановке диагноза.
Лептоспироз - контагиозное заболевание животных, в том числе людей, вызываемое различными иммунологически различными серологическими вариантами лептоспир, большинство из которых рассматривается в качестве подгрупп Leptospira interrogans. Имеется пять серологических вариантов и групп, важных для свиней: ротопа, australis, tarassovi, canicola, icterohaemorrhagicae и grippotyphosa. Инфекции могут быть бессимптомными или могут сопровождаться разными симптомами, в том числе анорексией, пирексией, апатией, желтухой, прерыванием беременности, мертворождением и другими неопределенными репродуктивными проблемами, а также смертью. После острой инфекции лептоспиры часто локализуются в почках или репродуктивных органах и формируют разбросанные мелкие серые очаги инфекции интерстициального нефрита, причем иногда в большом количестве выводятся с мочой на протяжении месяцев или лет. Поскольку лептоспиры выживают в поверхностных водах на протяжении длительных периодов времени, заболевание часто передается с водой. В США заболевание в основном вызывается серологическими вариантами Leptospira hardjo, Leptospira ротопа и Leptospira grippotyphosa. Постановка диагноза может быть затруднена, поскольку титры антител могут долго не сохраняться, элиминируя менее чем за месяц. Кроме того, лептоспиры также могут быть обнаружены у здоровых животных. Бактерии L. australis, серовар bratislava, наиболее часто связаны с проблемами репродукции. В группах хронически инфицированных свиней наблюдаются выкидыши, мертворождение или ослабленное потомство.
Бруцеллез вызывается бактериями рода Brucella и характеризуется выкидышами, задержкой плаценты, стерильностью, орхитами у хряков и тяжелыми формами воспаления эндометрия у свиноматок. У поросят заболевание проявляется параличом задних конечностей и хромотой. У свиней заболевание вызывается почти исключительно бактериями Brucella suis, биовары 1, 2 и 3. Некоторые виды млекопитающих могут быть носителями бактерий Brucella suis и передавать их свиньям. Инфекции быстро распространяются и могут вызывать большое количество прерываний беременности у особей в поголовьях свиней, не подвергнутых вакцинации. Передача инфекции происходит в основном при контакте свиней, хотя также возможен половой способ передачи. Серологическая диагностика может быть затруднена в связи с тем, что относительно близкий микроорганизм, Yersinia enterocolitica 0:9, выделяет общий с Brucella антиген, поэтому могут быть получены ложноположительные результаты. После вскрытия обычно наблюдают воспаления эндометрия и орхит, а также возможны абсцессы, иногда с некротическими очагами в печени.
Clostridium - повсеместно встречающиеся грамположительные бактерии из семейства Clostridiaceae, которых обычно выделяют из почвы, но они также могут естественным образом присутствовать в кишечнике у большинства животных. Инфекции С.difficile у свиней отличаются тяжелым отеком брыжейки подвздошной кишки, диареей и отеком в других тканях, например, гидротораксом. Вызываемый клостридиями энтерит у свиней связан с С.perfringens и отличается хроническим течением, сопровождаемым диареей, потерей массы тела и лихорадкой. Инфицирование С perfringens, типы А, В и С, вызывает тяжелый энтерит, дизентерию, токсикоз и высокую смертность среди новорожденных телят. Типы В и С вырабатывают Р-токсин, который вызывает некрозы и падеж животных из-за тяжелого поражения кишечника. Этот токсин чувствителен к протеолитическим ферментам и заболевание связано с подавлением протеолиза в кишечнике. Молозиво свиноматок, в котором содержится ингибитор трипсина, рассматривается в качестве фактора предрасположенности у молодых поросят. Заболевание может привести к внезапной гибели поросят в возрасте моложе одной недели, обычно в течение 3 суток после рождения. У поросят постарше Clostridium enteritis вызывает утолщение тонкой кишки, что затрудняет всасывание пищи и питательных веществ. Поросята обычно гибнут в результате сочетания инфекции и нарушения поступления питательных веществ. Гибель может произойти за несколько часов, но в менее тяжелых случаях животные живут несколько суток, причем на протяжении нескольких суток возможно выздоровление. Геморрагический энтерит с изъязвлением слизистой является основным повреждением у всех видов. Макроскопические признаки показывают, что пораженная часть кишечника имеет темный сине-пурпурный цвет и на первый взгляд является следствием инфаркта, связанного с заворотом брыжейки. Мазки содержимого кишечника могут быть изучены на предмет выявления большого количества грамположительных палочковидных бактерий, а фильтраты получают для выявления токсина и последующей идентификации путем нейтрализации специфической антисывороткой.
Бактерия Clostridium novyi предположительно, однако до сих пор это не доказано, является причиной внезапной смерти крупного рогатого скота и свиней, содержащихся на кормах с высоким содержанием зерна, причем ранее у этих животных не было выявлено поражений печени. Смертельно опасные и некротизирующие токсины (преимущественно а-токсин) повреждают паренхиму печени, в результате чего становится возможным размножение бактерий и выработка смертельно опасного количества токсина. Смерть обычно наступает внезапно без явных причин. Зараженные животные обычно отстают от стада, принимают лежачее положение на груди и умирают через несколько часов. Большинство случаев заболевания наблюдают летом, причем их число быстро спадает, когда заражение печеночной двуусткой достигает максимума. Болезнь в большинстве случаев наблюдается у овец в возрасте 1-4 лет и только у животных, пораженных печеночной двуусткой. Бывает трудно отличить заболевание от острого фасциолеза, но из-за внезапной гибели животных, у которых на вскрытии выявляют типичные повреждения, следует предположить инфекционный некротический гепатит. Наиболее характерными повреждениями являются серовато-желтые некротические очаги в печени, которые часто соответствуют миграционным путям молодых двуусток. К другим обычным признакам относятся растянутая околосердечная сумка (перикард), заполненная жидкостью соломенного цвета, а также избыток жидкости в брюшной и грудной областях. Обычно наблюдается выраженный разрыв капилляров в подкожных тканях, что приводит к почернению кожи вокруг этих разрывов (в обиходе это состояние называют черной болезнью).
Бактерия Clostridium septicum обнаружена в мире повсеместно, она присутствует в почве и в содержимом кишечников животных (в том числе человека). Инфекция обычно присутствуют в зараженных ранах с омертвевшей тканью, в почве или в некоторых других ослабленных тканях. Раны, полученные в результате травмы, кастрации, антисанитарно поведенной вакцинации, плохих условий содержания и родов, могут стать инфицированными. Основные признаки, например, анорексия, интоксикация, высокая температура тела и местные поражения, развиваются за период от нескольких часов до нескольких суток после получения раны. Локальные повреждения становятся мягкими и припухлыми, а при нажатии остается углубление, которое быстро восстанавливается из-за формирования большого количества экссудата, который инфильтруется под кожу и во внутримышечную соединительную ткань пораженных областей. Накопление газа происходит редко. Молниеносная гангрена, связанная с разрывами, отличается выраженным отеком, тяжелым токсикозом и смертью в течение 24-48 ч.
Столбняк - заболевание, вызываемое специфическим нейротоксином, вырабатываемым бактерией Clostridium tetani в некротических тканях. Почти все млекопитающие, в том числе свиньи, чувствительны к этому заболеванию. Хотя столбняк широко распространен в мире, в некоторых областях, например, на севере Скалистых гор в США, эта бактерия редко встречается в почве и поэтому столбняк почти не встречается. Обычно встречаемость С.tetani в почве и частота случаев заболевания людей столбняком выше в странах с жарким климатом. Бактерия Clostridium tetani является анаэробной, формирует терминальные сферические споры, обнаруживается в почве и в пищеварительном тракте. В большинстве случаев эта бактерия проникает в ткани через раны, особенно глубокие колотые раны, в результате которых создаются для бактерии анаэробные условия.
Инфицирование бактериями Salmonella spp.может вызвать диарею у животных всех возрастов, особенно у тех, которые пребывают в стрессе, содержатся в тесноте или получают сильно обсемененные корм или воду. Сальмонеллез вызывается многими видами сальмонелл и характеризуется клинически одним или несколькими из трех основных синдромов - сепсиса, острого энтерита и хронического энтерита. Частота заболеваемости возрастает по мере интенсификации животноводства. Хотя различные типы Salmonella могут вызывать инфекции у свиней, классический сальмонеллез, установленный у свиней, вызывается видами S. choleraesuis и S. typhimurium. Клинические картины, вызываемые разными видами сальмонелл, принципиально не отличаются, но разные виды сальмонелл проявляют тенденцию к эпидемиологическим отличиям. Плазмидный профиль и характер лекарственной устойчивости иногда являются удобными маркерами для эпидемиологических исследований. Септический сальмонеллез часто ассоциирован с S. choleraesuis. Инфицированные поросята не хотят двигаться, у них наблюдают анорексию, высокую температуру тела (40,5-41,6°C), возможен поверхностный кашель. У павших поросят могут быть синюшные конечности. Вид сальмонелл S. choleraesuis - один из редко встречаемых возбудителей заболевания, которое выражается и в воспалении легких, и в диарее, причем смертность инфицированных поросят часто высокая. Энтероколит обычно ассоциирован с более распространенным возбудителем - S. typhimurium. Инфекции характеризуются желтой или водянистой диареей с возможным содержанием крови или слизи по мере прогрессирования заболевания. Смертность низкая и часто наступает из-за обезвоживания и дефицита калия в связи с диареей. Фекалии инфицированных животных могут загрязнять пищу и воду, парное мясо и обработанное, поступившее с бойни, растительные и животные продукты, используемые в качестве удобрений или кормов, пастбища и загоны, а также многие инертные материалы. Следует отметить, что бактерия S. choleraesuis иногда обнаруживается в пище. Заражение также может произойти при непосредственном контакте с инфицированным животным. Сальмонеллы могут выживать на протяжении месяцев во влажных теплых зонах, например, в свинарниках или в поилке. Источниками инфекции также могут быть грызуны и дикие птицы. Преобладание определенной инфекции зависит от вида и от страны и встречается гораздо чаще, чем проявление клинического заболевания, которое обычно проявляется из-за стрессовых ситуаций, например, внезапного прекращения кормления, транспортировки, жажды, скученности содержания, родов и введения некоторых лекарственных средств.
Escherichia coli - бактерия из семейства Enterbacteriaceae, которая является одним из основных видов бактерий, обитающих в тонком кишечнике у всех видов млекопитающих. Хотя обычно эта бактерия безвредна, штаммы Е. coli могут вырабатывать ряд экзо- и эндотоксинов, вызывающих инфицирование и болезнь. Некоторые штаммы интенсивно вырабатывают термостабильные (ТС) и термолабильные (ТЛ) экзотоксины, ответственные за индукцию поноса. Вариант токсина, напоминающего токсин шигеллы, тип II (SLT-IIe), Stx2e и веротоксин действуют на стенку мелких артерий, вызывая отек. Эндотоксины, например, липид А, участвуют в мастите и инфекциях мочевых путей. Инфекция Е. coli характеризуется рядом симптомов, зависящих от конкретного штамма, например, диареей, запавшими глазами, слабостью, заметной потерей массы тела, угнетенным ростом, депрессией, отеком кишки, маститом, циститом, пиелонефритом и смертью. Типы Е. coli могут классифицироваться и кодироваться по клеточной стенке (О антигены) и фимбриям (F антигены). Например, понос часто ассоциируется с Е. coli Abbotstown: 0147, F4, F5, причем вздутие кишечника ассоциируется с фимбриями F18. Правильная идентификация является ключевым моментом для правильного выбора вакцины. Инфекции Е. coli подвергают риску иммунную систему свиней, причем смерть часто является результатом вторичных инфекций и заболеваний.
Свиная оспа - заболевание, вызывающее кожные повреждения, папулы, пустулы и струпья.
Эперитрозооноз - риккетсионное (гематрофное) заболевание, вызываемое риккетсией Eperythrozoon suis, внеклеточной бактерией, которая прилипает к мембранам эритроцитов свиней, вызывая их деформацию и разрушение. Заболевание характеризуется анемией и желтухой (пожелтение слизистых оболочек, склеры и внутреннего уха). Это может привести к плохому уровню оплодотворяемости, другим возможным репродуктивным расстройствам и даже к гибели.
Чума свиней, также называемая классической лихорадкой свиней(classical swine fever - CSF) или африканской свиной лихорадкой (African swine fever -ASF), - заболевание, вызываемое флавивирусом, который состоит из РНК и оболочки, или, в случае ASF, вирус состоит из ДНК и оболочки и относится к поксвирусам. Клинически CSF и ASF неразличимы. Первыми симптомами являются понижение активности и сонливость, а также некоторое проявление анорексии и возможно снижение температуры тела. В течение нескольких суток у свиней наступает выраженная лихорадка (41-42°C), которая иногда сопровождается покраснением кожи. Затем у свиней развивается конъюнктивит и копростаз, приводящий к диарее с желтоватыми фекалиями. В стадах у животных может появиться простуда, и они часто жмутся друг к другу, сбиваясь в группы. У некоторых свиней перед смертью наступают конвульсии. Начинается падеж свиней, которому сопутствует покраснение кожи, и смерть часто происходит через 10-20 суток после инфицирования. У выживших свиней часто может наблюдаться тяжелая форма задержки роста и искривление спины. В сформировавшихся стадах плод, инфицированный от матери во время беременности, может быть абортирован, мумифицирован, поросенок может появиться на свет мертворожденным, возможно рождение ослабленных поросят.
Поросята, рожденные от CSF-инфицированных матерей, могут оставаться здоровыми, но являются источником заражения среды в месте своего обитания.
Пневмонический пастеррелез и стрептококкоз вызываются бактерией Pasteurella multocida и различными видами стрептококков, обычно S. suis. Инфицирование каузальным агентом обычно представляет конечную стадию послеотъемного респираторного синдрома. Клинические признаки проявляются в трех формах, причем острая форма наиболее часто ассоциируется с бактерией P. multocida, серотип В. У животных наблюдаются одышка, затрудненное дыхание, чрезвычайно высокая температура тела (42,2°C), прострация и в итоге - смерть. В некоторых случаях живот меняет цвет и становится красным. Вторая форма является подострой и характеризуется плевритом, кашлем и затрудненным дыханием. У свиней возможна потеря значительной массы тела, плохой рост или отсутствие роста, причем с серьезными последствиями для свиней. Хроническая форма характеризуется редким кашлем, головной болью и небольшой лихорадкой или отсутствием лихорадки. Этой формой обычно заболевают свиньи в возрасте 10-16 недель.
Стрептококковый менингит вызывает воспаление оболочек мозга - мембран, которые покрывают мозг. У молочных поросят он обычно вызывается бактериями Streptococcus suis, Haemophilus parasuis или иногда, например, Е. coli и стрептококками других видов. У бактерии S. suis много серологических вариантов. В большинстве стран основным возбудителем у молочных поросят являются бактерии S. suis, тип 1, но в других странах может быть по-другому. Например, в Дании основным возбудителем является тип 7. Бактерия S. suis также вызывает комбинированные повреждения, особенно типы 1 и 14. Длительное время происходит носительство S. suis в миндалинах, а передача молочным поросятам может происходить от свиноматок или от других поросят. Свиноматки также передают иммунитет, уровень которого различен, с молозивом. Стрептококковый менингит у молочных поросят является спорадически проявляющимся у отдельных поросят. Стрептококковый менингит может протекать тяжелее у молочных поросят, если особь была помещена в стадо впервые, или если он вторичен по отношению к инфекции PRRS.
Псевдобешенство, также известное, как заболевание, вызываемое вирусом свиного бешенства, вирусом Suid herpes, в котором каузальным агентом является ДНК-содержащий герпес-вирус с оболочкой. В незараженных стадах у новорожденных поросят наблюдают диапазон тяжелых поражений центральной нервной системы от припадков до нарушения координации. Паралич задних конечностей может возникнуть у поросят, которые садятся в позу, в которой обычно сидят собаки. Кроме того, высока смертность. У отъемных поросят симптомы поражения центральной нервной системы могут быть понижены, но могут сопровождаться усилением нарушения респираторных признаков. Часто респираторные инфекции связаны с вторичными инфекциями. Отъемные поросята теряют массу тела, плохо набирают массу тела и часто являются малорослыми. У растущих свиней признаки центральной нервной системы продолжают редуцироваться, а респираторные признаки усиливаются. Степень проявления респираторного заболевания зависит от наличия и тяжести вторичных инфекций. У половозрелых животных преобладают нарушения репродуктивных признаков. У свиноматок возможны выкидыши, а на поздних сроках беременности возможно рождение мертвых или ослабленных поросят. В адаптированных стадах может быть несколько клинических проявлений.
Вирус гриппа свиней вызывает у свиней грипп, и этот возбудитель относится к группе вирусов гриппа типа А. В стадах неинфицированных животных клинические признаки могут проявляться в виде внезапных эпизоотии, когда все или многие животные заболевают одновременно. У животных может быть пассивность, депрессия, скучивание/сбивание и анорексия. Животные часто дышат через рот и дыхание затруднено. Кашель может возникать при движении. К другим клиническим признакам относятся выделения из носа и отекшие глаза при ректальной температуре 40,5-41,5°C. Высокая температура у размножающихся животных может привести к выкидышам, бесплодию, получению малочисленного слабого приплода и повышенному мертворождению. В адаптированном стаде ежегодно проявляется повторная инфекция.
Спирохетозный колит вызывается бактериями Brachyspira pilosicoli. Эта инфекция обычно поражает набирающих массу тела свиней в возрасте 10-20 недель или уже откормленных свиней. Заболевание характеризуется не фатальной истощающей диареей растущих свиней, которая приводит к тому, что необходимо больше времени для откорма свиней. Диарея также приводит к снижению эффективности потребления корма и к водной диарее или несформированному стулу. Примерно у половины свиней может быть диарея по форме от перемежающейся до постоянной с жидким или слизистым стулом с окраской от зеленой до коричневатой без крови. Клинические признаки обычно проявляются на 10-14 сутки после смешивания и замены корма.
Дизентерия свиней вызывается бактерией Brachyspira hyodysentheriae. В настоящее время установлено 12 серологических типов этой бактерии. К клиническим признакам в адаптированном стаде относится диарея, быстрая утрата здорового состояния у некоторых животных, волосистый вид, обезвоживание, болезненный живот и гибель одной или двух свиней до проявления каких-либо признаков у других свиней. При вспышке заболевания в незараженных стадах могут быть поражены животные разных возрастных групп - от молочных поросят до взрослых свиноматок.
Трансмиссивный гастроэнтерит является заболеванием кишечника, вызванным коронавирусами. Эти вирусы относятся к тому же семейству, что и свиной респираторный коронавирус, вирус эпидемической диареи и вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита. Первыми клиническими признаками являются водная диарея, тошнота и анорексия. Поросята в возрасте менее 21 суток обычно умирают, отъемные поросята становятся хилыми, но набирающие массу тела растущие свиньи и уже откормленные свиньи обычно подвергаются болезни в умеренной степени и могут выжить, если их правильно снабжать водой.
Парвовирус вызывает заболевание, проявляющееся в виде репродуктивных осложнений у свиней. Каузальным агентом является мелкий ДНК-содержащий вирус, не имеющий оболочки. Вирус поражает только внутриутробный плод, причем воздействие на плод зависит от его возраста. В возрасте 10-30 суток инфекция приводит к гибели и рассасыванию плода. В возрасте 30-70 суток инфекция приводит к гибели и мумифицированию плода. После 70 суток и до родов инфекции приводят к рождению ослабленных поросят и к мумификации. Инфекция может преодолеть плацентарный барьер и попасть в каждый плод, расположенный в матке. У свиноматок клиническими признаками являются мертворождение, мумифицированные эмбрионы, гибель эмбрионов, бесплодие, а также рождение существенно меньшего числа жизнеспособных поросят. Выкидыши не являются отличительной чертой парвовирусной инфекции.
Актинобациллюсная плевропневмония, (actinobacillus pleuropneumonia - АРР) гемофилюсная плевропневмония, вызывается бактерией Actinobacillus pleuropneumonia. В настоящее описано 15 серологических вариантов, причем тяжесть клинических симптомов разная в зависимости от разных серологических вариантов и наличия других факторов. Серологические варианты 1, 5, 9, 10 и 11 оценивают в качестве более вирулентных вариантов. Кроме того, серологические варианты 1, 9 и 11, 2, 6 и 8, а также 4 и 7, могут реагировать перекрестно. Чувствительны свиньи всех возрастов. Клиническими признаками являются внезапность заболевания, выражаемая в том, что животные подолгу лежат и у них высокая ректальная температура (41, 5°C). У животных обычно развивается анорексия, они не пьют воду, конечности становятся синюшными и холодными. Синюшность может распространиться на все тело, может быть затруднено дыхание, часто перед смертью животные дышат ртом. Изо рта и ноздрей может идти кровавая пена, причем смерть обычно наступает через 24-48 ч. К острым клиническим признакам относятся: большой процент животных в стаде, пребывающих в депрессивном состоянии и находящихся в положении лежа, высокая ректальная температура 40,5-41°C, анорексия, отказ от питья, тяжелый температурный дистресс, кашель, дыхание ртом, цианоз, рвота и выкидыши. К подострым клиническим признакам относятся: перемежающийся кашель в группе свиней, общая потеря аппетита и задержка роста. Серологический вариант тип 3 связан с артритом, эндокардитом и абсцессами. В хронически инфицированных стадах суточный прирост может не измениться, но можно услышать перемежающийся кашель.
Болезнь Глассера вызывается бактерией Haemophilus parasuis (Hps), которой известно по меньшей мере 15 разных типов. Это заболевание встречается в мире повсеместно, причем могут быть заражены даже животные в стадах, отличающихся хорошим здоровьем особей. Если такие стада формируют, используя методики SPF или MEW, и в них нет животных, зараженных Hps, первое заражение может быть опустошительным, вызывая заболевание типа сибирской язвы с высокой смертностью среди свиноматок. Обычно в стадах, в которых бактерия является эндемичной, у свиноматок вырабатывается сильный материнский иммунитет, который обычно сохраняется у потомства до возраста 8-12 недель. В результате воздействие инфекции на отъемных поросят обычно отсутствует или проявляется минимально. Однако данное заболевание поражает молочных поросят. Свиньи обычно становятся суб-клинически инфицированными, если они все еще защищены материнскими антителами и затем у них стимулируется выработка собственного иммунного ответа. Однако если действие материнского иммунитета заканчивается до инфицирования, у этих животных может развиться тяжелая форма заболевания. Обычно это происходит после прекращения кормления материнским молоком (отъема). Данный вирус также может действовать в качестве второго патогена по отношению к другим тяжелым заболеваниям, особенно по отношению к энзоотической пневмонии {Mycoplasma hyopneumoniae). Вспышки заболевания иногда проявляются у молочных поросят, в частности в группах подсвинок. Hps поражает гладкие поверхности суставов, слизистую кишечника, легкие, сердце и мозг, вызывая пневмонию, инфицирование перикарда, перитонит и плеврит. Способ распространения инфекции - респираторный. Заболевание, вызываемое Hps, редко поражает свиноматок до тех пор, пока яловые самки не беременеют. Хромота или неподвижность, небольшая отечность вокруг суставов и сухожилий, реже менингит, изредка наблюдаются у подсвинок. У подсвинок острая форма заболевания наблюдается у тех особей, которые быстро впадают в угнетенное состояние с повышенной температурой, утратой аппетита и задержкой роста. Характерным симптомом является сухой кашель (2-3 приступа кашля). Часто наблюдается внезапная гибель молочных поросят. Также известно, что Hps вызывает отдельные случаи артрита и хромоты с лихорадкой и утратой аппетита. Для хронической формы заболевания свиней свойственны бледность и плохой прирост. Возможна внезапная смерть. Для отъемных поросят и откармливаемых свиней с болезнью Глассера характерна быстро развивающаяся депрессия и в итоге смерть. К другим симптомам относятся повышенная температура, анорексия, нежелание вставать, нарушения функционирования нервной системы, например, судороги и конвульсии, включая менингит, а также низкая продуктивность, часто возникает истощение и развитие волосистости. У молодых откармливаемых свиней распространены следующие симптомы: лихорадка, умеренная форма менингита, артрит, хромота, пневмония, инфекция перикарда, перитонит и плеврит. Также характерен сухой кашель (только по 2-3 приступа).
Экссудативный эпидермит - заболевание, вызываемое бактерией Staphylococcus hyicus, которая в норме существует на коже без развития заболевания. Неизвестно, почему иногда эта бактерия становится патогенной и вызывает мокнущий дерматит. Бактерия образует токсины, которые всасываются и повреждают печень и почки. Среди молочных поросят заболевание обычно поражает отдельных животных, но оно может представлять серьезную угрозу в стадах молодых подсвинок и отъемных поросят. В дни, предшествующие опоросу, бактерии интенсивно размножаются во влагалище свиноматок, поэтому поросята инфицируются во время родов или вскоре после них. К симптомам заболевания у свиноматок относятся редкие, но локализованные повреждения, особенно за лбом и за глазами. Поросята с тяжелыми поражениями могут пасть. У поросят к симптомам относятся локализованные повреждения сбоку и сзади ушей. Повреждения обычно начинаются с мелких темных локальных инфицированных областей вокруг морды и на ногах. Кожа по бокам живота и между ногами становится коричневой, постепенно такую окраску приобретает все тело. Кожа становится морщинистой, морщинистость занимает большие области, а кожа становится сальной на ощупь. В тяжелых случаях кожа становится черной из-за некроза и поросята погибают. Более локализованную картину наблюдают, если свиноматка в некоторой степени передает иммунитет поросятам, которая проявляется в виде мелких ограниченных повреждений, составляющих примерно 5-10 мм в диаметре, которые не распространяются дальше по телу. У отъемных поросят и откармливаемых свиней симптомы обычно проявляются через 3 суток после отъема с локализованными коричневыми областями инфекции или зонами дерматита вокруг морды или на ногах, где кожа повреждена. Она может изъязвляться. Кожа по бокам живота и между ногами становится коричневой, постепенно такую окраску приобретает все тело. Кожа становится морщинистой, морщинистость занимает большие области, постепенно кожа становится темной и сальной, а в тяжелых случаях - черной. В таких случаях обычно животное погибает из-за токсинов, вырабатываемых стафилококками. Среди новорожденных до 15% популяции может болеть, причем обычным является обезвоживание.
Рожа свиней - заболевание, вызываемое бактерией Erysipelothrix rhusiopathiae, которое выявляется на большинстве, если не на всех свиноводческих фермах. До 50% животных может быть инфицировано, причем инфекция локализуется в миндалинах. Возбудитель инфекции всегда присутствует либо в организме животного, либо во внешней среде, поскольку бактерия экскретируется со слюной, фекалиями или мочой. Эта бактерия также обнаружена у многих других видов животных, в том числе у птиц и овец, и может выживать вне организма свиньи в течение нескольких недель, а на легких почвах даже дольше. Бактерию невозможно полностью удалить из стада. Инфицированные фекалии вероятно основной источник инфекции, особенно для растущих и уже откормленных животных. Одна бактерия может вызвать заболевание, но сопутствующая вирусная инфекция, например, PRRS или грипп, может вызвать эпидемию. Заболевание относительно редкое для свиней в возрасте до 8-12 недель из-за защиты, обеспечиваемой материнскими антителами через молозиво. Наиболее чувствительными животными являются растущие свиньи, невакцинированные подсвинки и свиноматки, у которых было до 4 опоросов. Бактерия размножается в организме свиньи и попадает в кровяное русло, вызывая сепсис. Скорость размножения бактерии и уровень иммунитета свиньи определяют клинические симптомы.
Эперитрозооноз (Ере) - заболевание, вызываемое бактерией Eperythrozoonosis suis, которая присоединяется к поверхности эритроцитов и иногда разрушает их. В результате свинья может стать анемичной, а содержимое разрушенных клеток может вызвать желтуху. Клинические проявления заболевания обычно наблюдают у молодых растущих свиней. Однако это заболевание также связано с репродуктивными осложнениями в репродуктивном стаде. Свиноматка может быть носителем Ере, но при этом сохранять хорошее здоровье, однако, бактерия может преодолеть плацентарный барьер, в результате рождаются слабые бледные поросята. Бактерии Ере присутствуют в большинстве популяций свиней, возможно, во всех, но механизм, который делает бактерию патогенной и вызывает заболевание в некоторых популяциях, но не действует в других популяциях, неизвестен. Вероятность возникновения заболевания мала.
Энцефаломиокардит (Encephalomyocarditis - EMQ - инфекционное заболевание, поражающее многие виды позвоночных, но среди сельскохозяйственных животных свиньи вероятно наиболее чувствительны. Вирус широко распространен в мире, но в разных странах и регионах отличается по патогенности и вирулентности. В большинстве стран Европы, особенно стран Евросоюза, проявляется тенденция вируса к относительно умеренной патогенности или к ее отсутствию, причем заболевание свиней диагностируют редко. В Австралии штаммы намного более вирулентны для свиней, чем штаммы в Новой Зеландии. Вирулентные штаммы во Флориде, на Кариббах и, возможно, в Центральной Америке, поражают сердце и приводят к гибели, а на Среднем Западе США они вызывают репродуктивные осложнения. Клинические признаки заболевания у свиней обычно наблюдаются, когда численность крыс достигает уровня, обеспечивающего вспышку инфекционного заболевания. Свиньи могут заражаться от крыс или от корма и воды, зараженных продуктами жизнедеятельности крыс. Вероятно у свиней это заболевание не столь контагиозно. В зараженных стадах у отъемных поросят и откармливаемых свиней обычно нет клинических признаков заболевания.
Болезнь Ауески (Aujeszky's disease - AD) - заболевание свиней, вызываемое герпес-вирусом, которое имеет важное значение. Вирус может сохраняться в латентном состоянии в нервах свиней на протяжении длительного периода времени, а затем он может реактивироваться. Попав в стадо, вирус обычно сохраняется в нем и может постоянно влиять на репродуктивный процесс на разных уровнях. Вне организма свиньи вирус может сохранять жизнеспособность до трех недель. Острые вспышки заболевания происходят, когда вирулентные штаммы вируса впервые инфицируют особей невакцинированного чувствительного стада. Вирус проходит матку и плаценту и инфицирует плод. Свинья является основным хозяином данного вируса. Однако также могут быть инфицированы собаки и крупный рогатый скот, у которых проявляются признаки поражения нервной системы и смерть.
Цитомегаловирусная инфекция свиней (Porcine Cytomegalovirus Infection -PCMV) вызывается вирусом герпеса, который обнаруживается во всех тканях организма, в том числе в носу новорожденных поросят, где он вызывает воспаление (ринит). PCMV распространен во всем мире и присутствует в большинстве популяций, а возможно во всех популяциях, но обычно инфекции не являются субклиническими или клиническими. Серологические исследования, выполненные в Великобритании, показали, что более 90% групп животных подвергались инфицированию. Ринит, вызываемый данным вирусом, встречается не у всех инфицированных животных, преимущественно он встречается у новорожденных поросят и не связан с атрофическим ренитом, вызываемым бактерией Pasteurella multocidia, вырабатывающей токсин. Таким образом, в большинстве популяций свиней инфекция является незначительной, и, помимо возникающего иногда чихания, не оказывает большого воздействия на здоровье свиней.
Синдром «голубой глаз свиней» - вирусное заболевание, вызывающее нарушения нервной системы, бесплодие и помутнение или посинение роговицы. В основном это заболевание наблюдается в Мексике, но поступали сообщения также из других стран, однако в Европе оно не отмечено. К симптомам относится отсутствие аппетита, помутнение роговицы - конъюнктивит, нарушение работы нервной системы, например, судороги и конвульсии, тенденция садиться по-собачьи, лихорадка, повышенный венозный приток, более ранний отъем относительно интервалов между спариваниями, мертворождение, мумификация плода, высокий падеж поросят, набухание семенников и утрата либидо.
Вирус японского энцефалита В (Japanese В Encephalitis Virus - JE) распространяется комарами и важен в тех странах, где распространены эти насекомые. Поражается большинство домашних животных. У людей вирус вызывает энцефалит. Свиньи являются важным источником инфекции. Симптомами заболевания являются мумификация плода и мертворождение, поражение нервной системы у поросят, например, судороги и конвульсии, отеки у поросят. Также возможно бесплодие и отек семенников у хряков.
Эпидемическая диарея свиней (Porcine Epidemic Diarrhoea - PED) вызывается коронавирусом, несколько напоминающим вирус, вызывающий TGE. Этот вирус широко распространен в Европе. Вирус повреждает ворсинки кишечника, в результате чего снижается всасывающая поверхность, теряется жидкость и происходит обезвоживание. После внедрения вируса в чувствительное репродуктивное стадо сильный иммунный ответ развивается за две-три недели. Затем иммунитет, передаваемый через молозиво, защищает поросят. Обычно вирус исчезает спонтанно из относительно малочисленных репродуктивных стад (<300 свиноматок). Острые вспышки диареи наблюдаются при первом внедрении вируса в чувствительную популяцию. В таких случаях может быть заражено до 100% свиней, у которых развивается диарея, от умеренной до сильно водянистой. Распознают две клинические формы: PED типа I болеют только растущие свиньи, a PED типа II болеют животные всех возрастов, от молочных поросят до зрелых свиноматок. Период инкубации составляет примерно 2 суток, а диарея длится 7-14 суток. У молочных поросят болезнь протекает в умеренной или тяжелой форме, и смертность составляет до 40%. В крупных репродуктивных стадах, особенно при экстенсивном животноводстве, при первом обнаружении инфекции не все самки могут стать инфицированными с первого раза, а также возможны рецидивы. Заболевание развивается только у молочных поросят, содержащихся при свиноматке, которая не имеет антител и, следовательно, заболевание носит спорадический характер.
Респираторная коронавирусная инфекция свиней (Porcine Respiratory Corona Virus Infection - PRCV) впервые появилась в Европе несколько десятков лет тому назад или даже раньше. Эта инфекция напоминает вирус TGE, который также является коронавирусом. Предполагают, что вирус распространяется по фермам ветром и поэтому чрезвычайно трудно уберечь поголовье от этого вируса. Инфекция часто возникает у молочных поросят в возрасте 2-3 недель, но не имеет большого значения. Она может воздействовать на ткань легких, если имеются другие респираторные патогены в комплексах хронических респираторных заболеваний. У свиноматок обычно симптомы отсутствуют, но кашель может быть в связи с другими респираторными агентами, с которыми ассоциирован кашель. У поросят может быть преходящий кашель. У отъемных поросят и откармливаемых свиней в стадах, которые впервые поддаются заражению, практически отсутствуют симптомы заболевания. Наиболее распространенным симптомом является преходящий кашель, длящийся всего несколько часов.
Ротавирусная инфекция - вирусная инфекция, которая широко распространена в популяциях свиней. Она имеется в большинстве, хотя и не во всех, стадах свиней с практически 100% сероконверсией у взрослого поголовья. Другое эпидемиологически важное свойство заключается в выживаемости вируса вне организма свиньи, поскольку он устойчив к изменением внешней среды и ко многим дезинфектантам. Материнские антитела сохраняются в течение 3-6 недель, после чего свиньи становятся чувствительными к инфекции, но заражение не обязательно приводит к развитию заболевания. Согласно оценке только 10-15% случаев диареи у свиней инициируется первичной ротавирусной инфекцией. В репродуктивном стаде болезнь проявляется по достижении поросятами 7-10 суточного возраста. С возрастом ее угроза резко снижается. Однако если имеются патогенные штаммы Е. coli, может развиться тяжелое заболевание с высокой смертностью.
Бешенство вызывается вирусом и оценивается как редкое заболевание свиней. Заболевание однозначно смертельно опасно для всех видов, в том числе для людей. Бешенство отсутствует в Великобритании, но присутствует во многих других странах во всем мире. Инфицирование поросят и свиноматок встречается редко. У свиноматок, отъемных поросят и откармливаемых свиней заболевания часто начинаются симптомами, к которым относятся подергивание лицевых мышц, судороги и конвульсии, быстрое пережевывание, слюнотечение, спазмы мышц и паралич задней части тела. Смерть обычно наступает в течение 3 суток.
Пузырчатка свиней (Swine Vesicular Disease -SVD) вызывается вирусом, который отличается от вируса, вызывающего ящур. Однако он вызывает заболевание у свиней, которое клинически не отличается от ящура. Это заболевание всегда следует иметь в виду, если внезапно повсеместно проявляется хромота и пузыри или волдыри на рыле, языке и верхней части копыт.
Туберкулез поражает млекопитающих, в том числе людей, свиней, а также птиц. Каузальной бактерией является Mycobacterium tuberculosis, которая классифицируется на типы, поражающие людей, крупный рогатый скот и птиц. Птичий тип относится к М. avium или чаще к комплексу avian/intracellulare, поскольку комплекс представлен не одним видом. Бактерия М. avium сама инфицирует птиц, но также установлено ее присутствие в окружающей среде наряду с М. intracellulare, которая преимущественно является сапрофитной или свободноживущей бактерией. Свиньи редко инфицируются человеческим или бычьим типом, но обычно инфицируются комплексом avian/intracellulare. Комплекс avian/intracellulare также вызывает субклиническую непрогрессирующую инфекцию у здоровых людей. Важно, что этот комплекс вызывает более серьезное заболевание у людей с подавленным иммунитетом и у людей со СПИДом. В большинстве стран при обнаружении ран на шее после забоя бракуется все туша, а если они обнаружены в брыжеечных лимфатических узлах, которые пронизывают кишечник, бракуются побочные продукты переработки. Если повреждения распространены по всему организму, что бывает редко, вся туша может быть забракована или переработана. Если мелкие повреждения на мясе при продаже пропущены инспектором ветнадзора, обычная кулинарная обработка разрушает бактерии. У всех свиней бактерия вызывает формирование мелких узелков в лимфоузлах на шее и тех, которые пронизывают тонкий кишечник. В подавляющем большинстве случаев повреждения не прогрессируют и не распространяются по организму, не вызывают заболевания свиней и не экскретируются. Клинические симптомы отсутствуют, и нет различий в функционировании инфицированных и неинфицированных свиней.
Вирус везикулярной экзантемы свиней (virus of vesicular exanthema of swine - VES) отличается от вируса, вызывающего ящур (FMD), и от вируса, вызывающего пузырчатку свиней (SVD), но он вызывает заболевание, по клиническим признакам не отличимое от FMD и SVD. В отличие от FMD, этот вирус инфицирует только свиней. К симптомам относится низкая смертность, но возможен некоторый падеж молочных поросят. К другим симптомам относятся слюнотечение, потеря аппетита, пузырьки вокруг рта, носа, языка и конечностей.
Везикулярный стоматит (Vesicular Stomatitis - VS) - заболевание, преимущественно встречаемое в Южной и Центральной Америке, изредка в США и редко в виде эпидемий, встречающихся на севере до Канады, а на юге - до Аргентины. Вирус VS вызывает заболевание свиней, которое клинически неотличимо от FMD, SVD и VES. Однако большинство инфекций у свиней протекает субклинически. У всех свиней инфекции отличаются слюнотечением, поражениями ног и хромотой, задержкой роста, повышением температуры тела до 40-41°C (106-107°F), формированием пузырьков (волдырей) до 30 мм в диаметре на носу, губах, сосках и вокруг венчиков копыт, в результате чего у свиней может быть хромота. Смертность обычно низкая и большинство свиней выздоравливает в течение 1-2 недель.
Атрофический ринит, прогрессирующее и непрогрессирующее заболевание, характеризуется воспалением носа, которое может быть вызвано многими бактериями и раздражающими веществами. Во время протекания инфекции тонкие структуры или носовые раковины поражаются и атрофируются или исчезают. Прогрессирующий атрофический ринит является специфическим заболеванием, при котором ткани носа постоянно атрофируются. Атрофия вызывается специфическим токсином, вырабатываемым бактерией Pasteurella multocidia (PMt). Имеется два типа: А и D. У молочных поросят чихание, сопение и носовые выделения являются первыми симптомами заболевания, но при острых вспышках при недостаточном количестве материнских антител риниты могут быть такими тяжелыми, что из носа идет кровь. В возрасте 3-4 недель и после отъема подтверждением диагноза является окраска слез и деформация носа, связанная с его скручиванием и укорочением. У свиней с тяжелым поражением могут быть осложнения, связанные с кормлением. В связи с этим уменьшается суточный прирост. При тяжелых вспышках свиньи могут не набрать товарной массы.
Вирусы восточного энцефаломиелита лошадей (Eastern equine encephalomyelitis viruses - EEEV) являются представителями рода Alphavirus, семейства Togaviridae. EEEV может быть передан лошадям и людям с укусом инфицированного комара. Помимо лошадей и людей EEEV может вызывать тяжелое заболевание у обычных сельскохозяйственных животных, например, свиней и крупного рогатого скота. EEEV, или вирус-специфиченские антитела, были выделены из птиц, например, индюков, фазанов, перепелов, африканских страусов, эму и др.
Микоплазматический артрит вызывается бактерией Mycoplasma hyosynoviae. Этот артрит характеризуется воспалением одного или нескольких суставов и распространен у молочных поросят, подсвинков и свиноматок. Однако он редко встречается у поросят.
Инфекции свиней также вызываются аденовирусом и вирусом гемаглютинизирующего энцефаломиелита.
Таким образом, в данной области техники необходим способ получения белка ORF2, который не требует экстракции белка ORF2 из инфицированных клеток. Также необходимы способы получения рекомбинантного белка ORF2 в количествах, достаточных для эффективного получения вакцинных композиций. Кроме того, необходимы способы получения белка ORF2, которые не требуют сложных и трудоемких методов, которые используются в современных протоколах экстракции белка ORF2. Также, применительно к композициям, в данной области техники требуется иммуногенная композиция, которая обеспечивает защитный иммунитет против инфекции PCV2 и уменьшает тяжесть или предупреждает клинические проявления, связанные с инфекцией.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение решает проблемы, свойственные предшествующему уровню техники, и предусматривает явное продвижение в данной области техники. Конкретно один из объектов настоящего изобретения предусматривает улучшенные способы получения и/или выделения рекомбинантного белка вируса PCV2 открытой рамки считывания ORF2:i) путем инфицирования чувствительных клеток в культуре рекомбинантным вирусным вектором, содержащим кодирующие последовательности ДНК PCV2 ORF2, причем белок ORF2 экспрессируется рекомбинантным вирусным вектором, и ii) последующего выделения ORF2 из надосадочной жидкости. Неожиданно было установлено, что ORF2 высвобождается в надосадочную жидкость в большом количестве, если инфицирование и последующее инкубирование инфицированных клеток позволяет усовершенствовать предшествующий стандартный способ выделения белка PCV 2 ORF2r, согласно которому экстрагируют белок PCV2 ORF2 из клеток. Также неожиданно было установлено, что белок PCV ORF2 устойчив к прототипичному разрушению за пределами клеток-продуцентов. Эти два выявленных обстоятельства позволяют выделять большие количества белка PCV2 ORF2 из надосадочной жидкости клеточных культур, инфицированных рекомбинантными вирусными векторами, содержащими ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующими белок PCV2 ORF2. Большие количества белка PCV2 ORF2 соответствуют количеству, превышающему примерно 20 мкг/мл в надосадочной жидкости, предпочтительно превышающему примерно 25 мкг/мл, еще более предпочтительно превышающему примерно 30 мкг/мл, еще более предпочтительно превышающему примерно 40 мкг/мл, еще более предпочтительно превышающему примерно 50 мкг/мл, еще более предпочтительно превышающему примерно 60 мкг/мл, еще более предпочтительно превышающему примерно 80 мкг/мл, еще более предпочтительно превышающему примерно 100 мкг/мл, еще более предпочтительно превышающему примерно 150 мкг/мл и наиболее предпочтительно превышающему примерно 190 мкг/мл. такие уровни экспрессии могут быть достигнуты, например, способами, описанными в примерах 1-3.
6
6
6
6
6
Предпочтительные культуры клеток содержат примерно 0,3-2,0×10клеток/мл, более предпочтительно примерно 0,35-1,9×10 клеток/мл, еще более предпочтительно примерно 0,4-1,8×10 клеток/мл, еще более предпочтительно примерно 0,45-1,7×10 клеток/мл и наиболее предпочтительно примерно 0,5-1,5×10 клеток/мл. Предпочтительные клетки определяет специалист. Предпочтительными клетками являются те клетки, которые чувствительны к инфицированию соответствующим рекомбинантным вирусным вектором, содержащим ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующим белок PCV2 ORF2. Предпочтительно клетки являются клетками насекомых, более предпочтительно такими клетками являются клетки насекомых под торговым названием «клетки насекомых Sf+» (фирма Protein Sciences Corporation, Мэриден, Коннектикут).
6
6
6
6
Пригодные среды для культивирования также определяет специалист в данной области, причем предпочтительными являются среды для клеток насекомых без сыворотки, например, среда Excell 420 (фирма JRH Biosciences, Inc., Ленекса, Канзас) и др. К предпочтительным вирусным векторам относятся бакуловирусы, например, BaculoGold (фирма BD Biosciences Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния), особенно если клетки-продуценты являются клетками насекомых. Хотя экспрессирующая система бакуловирусов является предпочтительной, специалистам в данной области очевидно, что в рамках настоящего изобретения могут быть использованы другие экспрессирующие системы, а именно система экспрессии белка PCV2 ORF2 в надосадочную жидкость культуры клеток. Например, другие экспрессирующие системы могут нуждаться в применении сигнальной последовательности для индукции экспрессии ORF2 в среды. Неожиданно было установлено, что если ORF2 вырабатывается бакуловирусной экспрессирующей системой, не требуется какой-либо сигнальной последовательности или дополнительной модификации для индукции экспрессии ORF2 в среду. Предполагают, что этот белок может независимо формировать вирусоподобные частицы (Journal of General Virology, 2000, 81, cc. 2281-2287) и секретироваться в надосадочную жидкость культуральной среды. Рекомбинантный вирусный вектор, содержащий последовательности ДНК PCV2 ORF2, содержит предпочтительное разнообразие инфекции (РИ) в диапазоне примерно 0,03-1,5, более предпочтительно примерно 0,05-1,3, еще более предпочтительно примерно 0,09-1,1 и наиболее предпочтительно примерно 0,1-1,0, при использовании для инфицирования чувствительных клеток. Предпочтительно величина указанного выше показателя РИ относится к 1 мл надосадочной жидкости культуры клеток. Предпочтительно способ, описанный в настоящем изобретении, включает инфицирование клеток в количестве 0,35-1,9×10 клеток/мл, более предпочтительно примерно 0,4-1,8×10 клеток/мл, еще более предпочтительно примерно 0,45-1,7×10 клеток/мл и наиболее предпочтительно примерно 0,5-1,5×10 клеток/мл рекомбинантным вирусным вектором, содержащим ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующим белок PCV2 ORF с показателем РИ (разнообразие инфекции) в диапазоне примерно 0,03-1,5, более предпочтительно примерно 0,05-1,3, еще более предпочтительно примерно 0,09-1,1 и наиболее предпочтительно примерно 0,1-1,0.
Затем инфицированные клетки инкубируют на протяжении периода до 10 суток, более предпочтительно примерно от 2 суток до примерно 10 суток, еще более предпочтительно примерно от 4 суток до примерно 9 суток и наиболее предпочтительно примерно от 5 суток до примерно 8 суток. К предпочтительным условиям инкубирования относятся температура в диапазоне примерно 22-32°C, более предпочтительно примерно 24-30°C, еще более предпочтительно примерно 25-29°C, еще более предпочтительно примерно 26-28°C и наиболее предпочтительно примерно 27°C. Предпочтительно клетки Sf+ после инокуляции проявляют специфические индуцированные бакуловирусом изменения. К наблюдениям за этими изменениями может относиться мониторинг плотности клеток и снижения выживаемости клеток после инфицирования. Установлено, что пик титра вируса наступает через 3-5 суток после инфицирования и пик высвобождения ORF2 из клеток в надосадочную жидкость наступает на 5-8 сутки и/или когда жизнеспособность клеток снижается до величины менее 10%.
Таким образом, один из объектов настоящего изобретения предусматривает улучшенный способ получения и/или выделения рекомбинантного белка PCV2 ORF2, предпочтительно в количествах, описанных выше, в результате: i) инфицирования определенного количества чувствительных клеток (см. выше) в культуре рекомбинантным вирусным вектором с величиной РИ, указанной выше, и) экспрессии белка PCV2 ORF2 рекомбинантным вирусным вектором и iii) последующего выделения PCV2 ORF2 в надосадочную жидкость из клеток, полученных через 5-8 суток после инфицирования, и/или из клеток, жизнеспособность которых снижается до величины менее 10%. Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор является рекомбинантным бакуловирусом, содержащим последовательности ДНК, кодирующие PCV2 ORF2, а клетки - клетками Sf+. Также предпочтительно периодически макро- и микроскопически контролировать контаминацию или типичные изменения морфологии клеток после инфицирования. В случае каких-либо признаков контаминации культуру клеток следует выбросить. Предпочтительно экспрессируемый рекомбинантный белок ORF2 секретируется клетками в окружающую культуральную среду, которая поддерживает жизнеспособность клеток. Затем ORF2 выделяют из надосадочной жидкости культуры клеток в большей степени, чем из самих клеток.
Процесс выделения предпочтительно начинается с разделения остатков клеток от экспрессированного в среду белка ORF2 через стадию разделения. К предпочтительным стадиям разделения относятся фильтрация, центрифугирование на скорости примерно до 20000xg, непрерывное жидкостное центрифугирование, хроматографическое разделение с применением ионообменной фильтрации или гель-фильтрации и традиционные иммуноафинные методы. Эти методы известны специалистам в данной области (см., например, кн.: «Protein purification methods - a practical approach)), 1995, под ред. Harris, Angel, изд-во IRL press, Oxford). Большинство предпочтительных способов разделения включает центрифугирование на скорости примерно до 20000xg и фильтрацию. К предпочтительным способам фильтрации относятся тупиковая микрофильтрация и фильтрация касательного тока (или перекрестного тока), включая тупиковую микрофильтрацию с фильтрацией с системой полых волокон. Из них предпочтительной является тупиковая микрофильтрация. Предпочтительный размер пор для тупиковой микрофильтрации составляет примерно 0,30-1,35 мкм, более предпочтительно примерно 0,35-1,25 мкм, еще более предпочтительно примерно 0,40-1,10 мкм, и наиболее предпочтительно примерно 0,45-1,0 мкм. Предположительно какие-либо традиционные фильтрующие мембраны могут применяться для целей настоящего изобретения, но полиэфирсульфоновые мембраны являются предпочтительными. На стадии фильтрации какие-либо низкомолекулярные нуклеиновые кислоты удаляются.
Таким образом, еще один объект настоящего изобретения предусматривает улучшенный способ получения и/или выделения рекомбинантного белка PCV2 ORF2, предпочтительно в количествах, описанных выше, в результате: i) инфицирования определенного количества чувствительных клеток (см. выше) в культуре с рекомбинантным вирусным вектором с величиной РИ, указанной выше, ii) экспрессии белка PCV2 ORF2 рекомбинантным вирусным вектором, iii) выделения PCV2 ORF2 в надосадочную жидкость из клеток, полученных через 5-8 суток после инфицирования, и/или из клеток, жизнеспособность которых снижается до величины менее 10%, и iv) отделения клеточных остатков от экспрессированного белка PCV2 ORF2 на стадии разделения. Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор является бакуловирусом, содержащим ДНК кодирующих последовательностей ORF2, а клетками являются клетки SF+. Предпочтительными стадиями разделения являются стадии, описанные выше. Наиболее предпочтительной является тупиковая микрофильтрация с применением мембраны с размером пор примерно 0,30-1,35 мкм, более предпочтительно примерно 0,35-1,25 мкм, еще более предпочтительно примерно 0,40-1,10 мкм, и наиболее предпочтительно примерно 0,45-1,0 мкм.
Для выделения PCV2 ORF2, используемого в иммуногенетической или иммунологической композиции, например, в вакцине, включение стадии инактивации является предпочтительным для инактивации вирусного вектора. Понятие «иммуногенетическая или иммунологическая композиция» относится к композиции, которая включает по меньшей мере один антиген, который вызывает иммунологический ответ в организме хозяина в виде клеточного и/или антитело - опосредованного иммунного ответа на конкретную композицию или вакцину. Обычно к понятию «иммунологический ответ» относятся, но ими понятие не ограничивается, один или несколько из следующих эффектов: выработка или активирование антител, В-клеток, хэлперных Т-клеток, и/или цитотоксических Т-клеток, и/или yd Т-клеток, направленных точно на антиген, или антигены, включенные в конкретную композицию или вакцину. Предпочтительно организм хозяина проявляет терапевтический или защитный иммунологический ответ, например, устойчивость к новой инфекции может быть повышена и/или степень клинической тяжести заболевания понижена. Такая защита может быть показана в виде уменьшения проявления или утраты симптомов, которые в норме проявляются при инфицировании организма хозяина, быстром излечении и/или понижении титра вируса в инфицированном организме хозяина. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения и/или выделения рекомбинантного белка PCV2 ORF2, предпочтительно в количестве, указанном выше, в результате: i) инфицирования определенного количества чувствительных клеток (см. выше) в культуре рекомбинантным вирусным вектором с величиной РИ, указанной выше, ii) экспрессии белка PCV2 ORF2 рекомбинантным вирусным вектором, iii) выделения PCV2 ORF2 в надосадочную жидкость из клеток, полученных через 5-8 суток после инфицирования, и/или из клеток, жизнеспособность которых снижается до величины менее 10%, и iv) отделения клеточных остатков от экспрессированного белка PCV2 ORF2 на стадии разделения, и v) инактивирования рекомбинантного вирусного вектора.
Предпочтительно такую инактивацию выполняют либо перед стадией фильтрации, либо сразу после нее, поскольку стадия фильтрации оптимальна для проведения инактивации. Какие-либо традиционные способы инактивации могут применяться для целей настоящего изобретения. Таким образом, инактивация может быть выполнена путем химической и/или физической обработки. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения объем собранной жидкости является определенным, а температура корректируется в диапазоне примерно 32-42°C, более предпочтительно примерно 34-40°C, и наиболее предпочтительно примерно 35-39°C. К предпочтительным способам инактивирования относится внесение циклизированного бинарного этиленимина (БЭИ), предпочтительно в концентрации примерно от 1 до примерно 20 мМ, более предпочтительно примерно от 2 до примерно 10 мМ, еще более предпочтительно примерно от 2 до примерно 8 мМ, еще более предпочтительно примерно от 3 до примерно 7 мМ, и наиболее предпочтительно примерно 5 мМ. Например, инактивирование включает внесение раствора 2-бромэтиленамингидробромида, предпочтительно примерно в количестве 0,4 М, который циклизуется с 0,2 М бинарным этиленимином (БЭИ) в 0,3 н. NaOH, к жидкостям для получения конечной концентрации примерно 5 мМ БЭИ. Предпочтительно жидкости затем непрерывно перемешивают в течение 72-96 ч и инактивированные полученные жидкости могут храниться замороженными при -40°C или ниже или при температуре примерно 1-7°C. После завершения инактивирования добавляют раствор натрия тиосульфата, предпочтительно 1,0 М, для нейтрализации остаточного количества БЭИ. Предпочтительно натрий тиосульфат вносят в эквивалентном количестве относительно БЭИ, добавленным ранее для инактивирования. Например, при добавлении БЭИ до конечной концентрации 5 мМ, вносят раствор 1,0 М тиосульфата натрия для получения конечной минимальной концентрации 5 мМ для нейтрализации остаточного количества БЭИ.
Таким образом, один из объектов настоящего изобретения относится к способу получения рекомбинантного белка PCV2 ORF2, предпочтительно в количестве, описанном выше, в результате: i) инфицирования определенного количества чувствительных клеток (см. выше) в культуре с рекомбинантным вирусным вектором с величиной РИ, указанной выше, п) экспрессии белка PCV2 ORF2 рекомбинантным вирусным вектором, iii) выделения PCV2 ORF2 в надосадочную жидкость из клеток, полученных через 5-8 суток после инфицирования, и/или из клеток, жизнеспособность которых снижается до величины менее 10%, и iv) отделения клеточных остатков от экспрессированного белка PCV2 ORF2 на стадии разделения, и v) инактивирования рекомбинантного вирусного вектора. Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор является бакуловирусом, содержащим последовательности ДНК, кодирующие ORF2, а клетки являются клетками SF+. Предпочтительными стадиями разделения являются стадии, описанные выше, и наиболее предпочтительна стадия фильтрации. Предпочтительными стадиями инактивации являются стадии, описанные выше. Предпочтительно инактивацию проводят при температуре примерно 35-39°C в присутствии 2-8 мМ БЭИ, и еще более предпочтительно в присутствии примерно 5 мМ БЭИ. Неожиданно было обнаружено, что повышенные концентрации БЭИ отрицательно воздействуют на белок PCV2 ORF2.
Согласно еще одному способу настоящего изобретения способ, описанный выше, включает стадию нейтрализации после стадии v). Стадия vi) включает добавление эквивалентного количества агента, который нейтрализует инактивирующий агент в растворе. Предпочтительно, если инактивирующим агентом является БЭИ, добавлять натрий тиосульфат в эквивалентном количестве. Таким образом, согласно еще одному объекту настоящего изобретения стадия vi) включает добавление раствора натрия тиосульфата до конечной концентрации примерно от 1 до примерно 20 мМ, предпочтительно примерно от 2 до примерно 10 мМ, еще более предпочтительно примерно от 2 до примерно 8 мМ, еще более предпочтительно примерно от 3 до примерно 7 мМ, и наиболее предпочтительно примерно 5 мМ, если инактивирующим агентом является БЭИ.
2
В предпочтительных формах, и особенно в формах, в которых может быть применен рекомбинантный белок PCV2 ORF2 в иммуногенной композиции, например, в вакцине, каждая партия полученного ORF2 контролируется на полноту инактивации путем пассажа в чувствительных к бакуловирусу клетках Sf+ на якорной подложке. В предпочтительном варианте такого контроля 150 см монослоя соответствующей культуры клеток инокулируют 1,0 мл инактивированных PCV2 жидкостей и выдерживают при 25-29°C в течение 14 суток по меньшей мере с двумя пассажами. В конце этого периода клеточные монослои исследуют на цитопатогенное действие (ЦПД), типичное для бакуловируса PCV2 ORF2. Предпочтительно также применяют позитивные вирусные контроли. Такие контроли могут состоять из одной культуры клеток Sf+, инокулированной неинактивированным контрольным бакуловирусом PCV2 ORF2, и одной колбы с клетками Sf+, которая остается неинокулированной. После инкубации и пассажа отсутствие вирус-инфицированных клеток в БЭИ-обработанных вирусных жидкостях может представлять достаточный критерий инактивирования. Контрольные клетки, инокулированные контрольным вирусом, могут проявить величину цитопатогенного действия, типичную для бакуловируса PCV2 ORF2, а незараженная колба не должна показывать какого-либо присутствия цитопатогенного действия бакуловруса PCV2 ORF2. В другом варианте к концу поддерживающего периода образцы надосадочной жидкости могут быть собраны и инокулированы в 96-луночные планшеты с клетками Sf+, после чего их выдерживают при 25-29°C в течение 5-6 суток. Затем планшеты фиксируют и окрашивают анти-РСУ2 ORF2 антителом, конъюгированным с флюоресцеин-изотиоцианатом (FITC). Отсутствие цитопатогенного действия и ORF2 экспрессии, о чем свидетельствует иммунофлюоресцентная микроскопия, в БЭИ обработанных вирусных жидкостях представляет достаточный критерий инактивирования. Контрольные клетки, инокулированные контрольным вирусом, могут проявить цитопатогенное действие и иммунно-флюоресцентную активность, а неинокулированная колба не должна проявить какого-либо признака цитопатогенного действия бакуловируса PCV2 ORF2 или иммунно-флюоресцентной активности.
Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к способу определения инактивирования для определения эффективности инактивирования рекомбинантного вирусного вектора, включающему стадии: i) контактированияпо меньшей мере части культуральной жидкости, содержащей рекомбинантный вирусный вектор, с инактивирующим агентом, предпочтительно согласно описанному выше, ii) добавления нейтрализующего агента для нейтрализации инактивирующего агента, предпочтительно согласно описанному выше, и iii) определения остаточной инфективности методами, описанными выше.
Другой объект настоящего изобретения относится к способу конструирования рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующего в большом количестве белок PCV2 ORF2 при инфицировании чувствительных клеток. Неожиданно было установлено, что рекомбинантный вирусный вектор, предусмотренный выше в настоящем изобретении, PCV2 ORF2 после инфицирования чувствительных клеток. Таким образом, настоящее изобретение также относится к улучшенному способу получения и/или выделения белка PCV2 ORF2, предпочтительно включающего стадии: конструирования рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующего белок PCV2 ORF2. Предпочтительно вирусный вектор является рекомбинантным бакуловирусом. Подробности способа конструирования рекомбинантных вирусных векторов, содержащих ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующих белок PCV2 ORF2, предусмотренного в настоящем изобретении, являются следующими: в предпочтительных формах рекомбинантный вирусный вектор, содержащий ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующий белок PCV2 ORF2, используемый для инфицирования клеток, получают путем трансфекции передающего вектора, который содержит ген ORF2, клонированный в вирусном векторе. Предпочтительно только часть передающего вектора, который содержит ДНК ORF2, переносят в вирусный вектор. Понятие «трансцецированный в вирусный вектор» означает, и используется в настоящем изобретении в качестве синонима понятий «интродуцируя» или «клонируя» гетерологичную ДНК в вирусный вектор, например, в бакуловирусный вектор. Вирусный вектор предпочтительно, но не обязательно, является бакуловирусом.
Таким образом, согласно еще одному объекту настоящего изобретения рекомбинантный вирусный вектор получают рекомбинацией между передающим вектором, содержащим гетерологичную ДНК PCV2 ORF2 и вирусным вектором, предпочтительно бакуловирусом, и даже более предпочтительно линеаризованным дефицитным по репликации бакуловирусом (например, ДНК Baculo Gold). Понятие «вектор переноса» означает молекулу ДНК, которая включает по меньшей мере один источник репликации, гетерологичный ген, в данном случае PCV2 ORF2, и последовательности ДНК, которые позволяют клонировать указанный гетерологичный ген в вирусном векторе. Предпочтительно последовательности, которые позволяют клонировать гетерологичный ген в вирусном векторе, фланкируют гетерологичный ген. Еще более предпочтительно, если эти фланкирующие последовательности являются по меньшей мере частично гомологичными с последовательностями вирусного вектора. Гомология последовательностей, которая позволяет осуществляться рекомбинации обеих молекул, вирусного вектора и вектора переноса, для получения рекомбинантного вирусного вектора, содержащего гетерологичный ген. Одним из предпочтительных передающих векторов является вектор pVL1392 (фирма BD Biosciences Pharmingen), который создан для совместной трансфекции с ДНК BaculoGold в предпочтительной клеточной линии Sf+. Предпочтительно указанный передающий вектор включает ДНК PCV2 ORF2. Длина совместно трансфецируемой конструкции примерно составляет 10387 пар оснований.
В более предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения способы настоящего изобретения могут начинаться с выделения ДНК PCV2 ORF2. Обычно ДНК выделяют из известного или неизвестного штамма, поскольку ДНК ORF2 проявляет себя высоко консервативной и ее идентичность у разных изолятов составляет по меньшей мере примерно 95%. Какой-либо ген PCV2 ORF2, известный в данной области техники, может применяться в настоящем изобретении и может экспрессироваться в надосадочную жидкость. ДНК PCV ORF2 предпочтительно амплифицируют, используя методы ПЦР, более предпочтительно вместе с интродукцией 5'-фланкирующей консенсусной последовательность Козака (CCGCCAUG) (SEQ ID NO 1) и/или 3'-фланкирующем сайтом EcoRl (GAATTC) (SEQ ID NO 2). Такая интродукция 5'-конценсусной последовательности Козака предпочтительно удаляет естественным образом присутствующий стартовый кодон AUG в PCV2 ORF2. 3'-сайт EcoRl предпочтительно интродуцируют ниже стоп-кодона PCV2 ORF2. Более предпочтительно его интродуцируют по цепи ниже поли-А последовательности терминации транскрипции, которая сама располагается ниже по цепи стоп-кодона PCV2 ORF2. Установлено, что применение конценсусной последовательности Козака, в частности описанной выше, повышает уровень экспрессии последующего белка PCV2 ORF2. Амплифицированную ДНК PCV2 ORF2 вместе с дополнительными последовательностями, клонируют в векторе. Предпочтительным вектором для такой инициальной стадии клонирования является вектор pGEM-T-Easy (фирма Promega, Мэдисон, Висконсин). ДНК PCV2 ORF2, включающая некоторые pGEM векторные последовательности (SEQ ID NO:7), предпочтительно берут из вектора по сайту рестрикции Notl. Образующуюся ДНК затем клонируют в векторе переноса.
Таким образом, по одному из объектов настоящего изобретения предусмотрен способ конструирования рекомбинантного вирусного вектора, включающего ДНК PCV2 ORF2. Этот способ включает стадии: i) клонирования рекомбинантного PCV2 ORF2 в векторе переноса, и ii) трансфекции части вектора переноса, содержащего рекомбинантный PCV2 ORF2, в вирусный вектор. Предпочтительно вектором переноса является вектор, описанный выше, или вектор, сконструированный согласно описанному выше, или вектор, показанный на фиг.1. Таким образом, согласно еще одному объекту вектор переноса, используемый для конструирования рекомбинантного вирусного вектора, описанного в настоящем изобретении, содержит последовательность SEQ ID NO: 7.
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения настоящий способ дополнительно включает до стадии i) следующую стадию: амплификации ДНК PCV2 ORF2 in vitro, причем фланкирующие последовательности ДНК PCV2 ORF2 модифицированы описанным выше образом. Способы in vitro для амплификации ДНК PCV2 ORF2 и модификации фланкирующих последовательностей, клонирования in vitro амплифицированной ДНК PCV2 ORF2 в векторе переноса и соответствующие векторы переноса описаны выше, примеры показаны на фиг.1, и известны специалистам в данной области. Таким образом, согласно еще одному объекту настоящее изобретение относится к способу конструирования рекомбинантного вирусного вектора, содержащего ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующего белок PCV2 ORF2, включающему стадии: i) амплификации ДНК PCV2 ORF2 in vitro, в которой фланкирующие последовательности указанной ДНК PCV2 ORF2 модифицированы, ii) клонирования амплифицированной ДНК PCV2 ORF2 в векторе переноса, и iii) трансфекции вектора переноса или части его, содержащих рекомбинантную ДНК PCV2 ORF2, в вирусный вектор для получения рекомбинантного вирусного вектора. Предпочтительно модификацию фланкирующих последовательностей ДНК PCV2 ORF2 проводят по описанному выше методу, например, путем интродукции 5'- последовательности Козака и/или сайта EcoR 1, предпочтительно согласно описанному выше.
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения предусмотрен способ получения и/или выделения рекомбинантного белка, экспрессируемого открытой рамкой считывания 2 вируса PCV2. Способ обычно включает стадии: i) клонирования рекомбинантного PCV2 ORF2 в векторе переноса, ii) трансфекции части вектора переноса, содержащей рекомбинантный PCV2 ORF2, в вирус, iii) инфицирования клеток, находящихся в питательной среде, трансфецированным вирусом, iv) индукции у трансфецированного вируса экспрессии рекомбинантного белка из PCV2 ORF2, v) отделения клеток от надосадочной жидкости, vi) выделения экспрессированного белка PCV2 ORF2 из надосадочной жидкости.
6
6
6
6
6
Способы клонирования рекомбинантной ДНК PCV2 ORF2 в векторе переноса описаны выше. Предпочтительно вектор переноса содержит последовательность SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:7. Однако вектор переноса может содержать какую-либо ДНК PCV2 ORF2, немодифицированную или модифицированную, длина которой может быть равна ДНК PCV2 ORF2, при трансфекции в рекомбинантный вирусный вектор, которая экспрессируется в культуре клеток. Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор включает последовательность SEQ ID NO:8. Кроме того, способы инфицирования клеток, предпочтительно для инфицирования клеток насекомых определенным числом бакуловирусов, содержащих ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующих белок PCV2 ORF2, подробно описаны выше. Кроме того, стадии отделения клеток от надосадочной жидкости, а также стадии выделения экспрессированного белка PCV2 ORF2, подробно описаны выше. Некоторые из этих конкретных стадий, описанных выше, являются частью способа получения и/или выделения рекомбинантного белка, экспрессируемого открытой рамкой считывания 2 в составе PCV2, что было описано выше. Предпочтительно используют клетки SF+. Еще более предпочтительно в культурах клеток содержится примерно 0,3-2,0×10 клеток/мл, более предпочтительно примерно 0,35-1,9×10 клеток/мл, еще более предпочтительно примерно 0,4-1,8×10клеток/мл, еще более предпочтительно примерно 0,45-1,7×10 клеток/мл и наиболее предпочтительно примерно 0,5-1,5×10 клеток/мл. Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор, содержащий ДНК PCV2 ORF2, обладает предпочтительным разнообразием инфекции (РИ) примерно 0,03-1,5, более предпочтительно примерно 0,05-1,3, еще более предпочтительно примерно 0,09-1,1, еще более предпочтительно примерно 0,1-1,0 и наиболее предпочтительно примерно 0,5, если для инфицирования применяют чувствительные клетки. Предпочтительно выделение белка PCV2 ORF2 в надосадочную жидкость клеток происходит после 5-8 суток культивирования после инфицирования и/или при снижении выживаемости клеток до менее чем 10%. Предпочтительно для получения белка PCV2 ORF2 клетки культивируют при температуре 25-29°C. Предпочтительно стадия разделения является стадией центрифугирования или фильтрации.
Необязательно данный способ может включать стадию амплификации ДНК PCV2 ORF2 из штамма PCV2 перед клонированием ДНК PCV2 ORF2 в векторе переноса. В предпочтительных формах 5'-последовательность Козака, 3' EcoRl сайт и их комбинации также могут быть добавлены к амплифицированной последовательности, предпочтительно перед амплификацией или во время ее проведения. Предпочтительная 5'-последовательность Козака включает последовательность SEQ ID NO:1. Предпочтительный 3'-сайт EcoRl включает последовательность SEQ ID NO: 2. Предпочтительная ДНК PCV2 ORF2 включает нуклеотидные последовательности Genbank Accession No. AF086834 (SEQ ID NO: 3) и SEQ ID NO:4. Предпочтительный рекомбинантный белок PCV2 ORF2 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, которая является белком, кодируемым SEQ ID NO:3 (Genbank инвентарный номер AF086834), и SEQ ID NO:6, которая является последовательностью белка, кодируемой последовательностью SEQ ID NO:4. Предпочтительной средой является среда для клеток насекомых без сыворотки, более предпочтительными является среда Excell 420. При проведении дополнительной стадии амплификации предпочтительно сначала клонировать амплифицированную открытую рамку считывания 2 в первом векторе, вырезать открытую рамку считывания 2 из первого вектора и использовать вырезанную открытую рамку считывания для клонирования в векторе переноса. Предпочтительной линией клеток для совместной трансфекции является линия клеток SF+. Предпочтительным вирусом для совместной трансфекции является бакуловирус.В предпочтительных вариантах осуществления настоящего способа трансфецированная часть вектора переноса включает последовательность SEQ ID NO: 8. Таким образом, предпочтительно, чтобы в настоящем способе выделение белка PCV2 открытой рамки считывания 2 (ORF2) в надосадок культуральной жидкости культуры клеток происходило по меньшей мере через 5 суток после инфицирования клеток вирусом.
Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к способу получения и/или выделения PCV2 открытой рамки считывания 2, включающему стадии: i) амплификации ДНК PCV2 ORF2 in vitro, предпочтительно добавлением 5'-последовательности Козака и/или добавлением 3'-сайта рестрикции EcoRl, ii) клонирования амплифицированной PCV2 ORF2 в векторе переноса, iii) трансфекции части вектора переноса, содержащей рекомбинантную PCV2 ORF2 в составе вируса, iv) инфицирования клеток, содержащихся в культуральной среде, вирусом переноса, v) индукции у вектора переноса экспрессии рекомбинантного белка с PCV2 ORF2, vi) отделения клеток от надосадочной жидкости и vii) выделения экспрессированного белка PCV2 ORF2 из надосадочной жидкости.
Еще один объект настоящего изобретения относится к способу получения композиции, включающей белок PCV2 ORF2 и инактивированный вирусный вектор. Этот способ включает стадии: i) клонирования амплифицированной PCV2 ORF2 в состав вектора переноса, ii) трансфекции части вектора переноса, содержащей рекомбинантную PCV2 ORF2, в состав вируса, iii) инфицирования клеток, содержащихся в культуральной среде, вирусом переноса, iv) индукции у вектора переноса экспрессии рекомбинантного белка с PCV2 ORF2, v) отделения клеток от надосадочной жидкости, vi) выделения экспрессированного белка PCV2 ORF2 из надосадочной жидкости и vii) инактивирования рекомбинантного вирусного вектора. Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор является бакуловирусом, содержащим ORF2 ДНК кодирующие последовательности, а клетки являются клетками SF+. Предпочтительными стадиями разделения являются стадии, описанные выше, наиболее предпочтительна стадия фильтрации. Предпочтительными стадиями инактивации являются стадии, описанные выше. Предпочтительно стадию инактивации проводят при температуре примерно 35-39°C в присутствии 2-8 мМ БЭИ, еще более предпочтительно в присутствии примерно 5 мМ БЭИ. Неожиданно было установлено, что повышенные концентрации БЭИ отрицательно воздействуют на белок PCV2 ORF2, а пониженные концентрации не эффективны для инактивации вирусного вектора на протяжении 24-72 ч инактивирования. Предпочтительно инактивацию проводят на протяжении по меньшей мере 24 ч, еще более предпочтительно на протяжении 24-72 ч.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения композиции, включающей белок PCV2 ORF2 и инактивированный вирусный вектор, описанный выше, включающий стадию нейтрализации после стадии vii). Это стадия viii), которая включает добавление эквивалентного количества агента, который нейтрализует инактивирующий агент в растворе. Предпочтительно агентом инактивирования является БЭИ, предпочтительно внесение натрия тиосульфата в эквивалентном количестве. Таким образом, согласно еще одному объекту настоящего изобретения стадия viii) включает добавление раствора натрия тиосульфата до конечной концентрации примерно от 1 до примерно 20 мМ, предпочтительно примерно от 2 до примерно 10 мМ, еще более предпочтительно примерно от 2 до примерно 8 мМ, еще более предпочтительно примерно от 3 до примерно 7 мМ, наиболее предпочтительно примерно 5 мМ, если инактивирующим агентом является БЭИ.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения композиции, включающей белок PCV2 ORF2 и инактивированный вирусный вектор, описанный выше, включающий перед стадией i) следующую стадию: амплификации ДНК PCV2 ORF2 in vitro, в которой фланкирующие последовательности ДНК PCV2 ORF2 модифицированы согласно описанному выше. Способы in vitro для амплификации ДНК PCV2 ORF2 и модификации фланкирующих последовательностей, клонирования in vitro амплифицированной ДНК PCV2 ORF2 в состав вектора переноса и пригодные векторы переноса, описанные выше, например, приведенные на фиг.1 или известные специалисту в данной области. Таким образом, согласно еще одному объекту настоящего изобретения способ включает стадии: i) амплификации ДНК PCV2 ORF2 in vitro, в которой фланкирующие последовательности указанной ДНК PCV2 ORF2 модифицированы, ii) клонирования амплифицированной ДНК PCV2 ORF2 в состав вектора переноса, iii) трансфекции вектора переноса или части вектора переноса, содержащей рекомбинантную ДНК PCV2 ORF2, в состав вирусного вектора для получения рекомбинантного вирусного вектора, iv) инфицирования клеток, содержащихся в культуральной среде, вирусом переноса, v) индукции у вектора переноса экспрессии рекомбинантного белка с PCV2 ORF2, vi) отделения клеток от надосадочной жидкости, vii) выделения экспрессированного белка PCV2 ORF2 из надосадочной жидкости, viii) инактивирования рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно, в присутствии примерно от 1 до примерно 20 мМ БЭИ, наиболее предпочтительно в присутствии примерно 5 мМ БЭИ, и ix) внесения эквивалентного количества агента, нейтрализующего инактивирующий агент в растворе, предпочтительно, добавления раствора натрия тиосульфата до конечной концентрации примерно от 1 до примерно 20 мМ, предпочтительно примерно 5 мМ, если инактивирующим агентом является БЭИ.
Еще одним объектом настоящего изобретения предусмотрен способ получения композиции, предпочтительно антигенной композиции, например, вакцины, для индукции иммунного ответа против PCV2. Обычно этот способ включает стадии трансфекции конструкции в состав вируса, причем данная конструкция включает: i) рекомбинантную ДНК из ORF2 вируса PCV2, ii) инфицирование клеток, находящихся в культуральной среде, трансфецированным вирусом, iii) индукции у вируса экспрессии рекомбинантного белка с PCV2 ORF2, iv) выделения экспрессированного белка PCV2 ORF2 из надосадочной жидкости, v) приготовления композиции путем комбинирования выделенного белка с соответствующим адъювантом и/или другим фармацевтически приемлемым носителем.
В контексте настоящего изобретения к понятию «адъювант» относится алюминий гидроксид и алюминий фосфат, сапонины, например, Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кембридж, Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, Алабама), эмульсия воды в масле, эмульсия масла в воде, эмульсия воды в масле в воде. Основой эмульсии частично может быть легкое вазелиновое масло (типа Европейской фармакопеи), изопреноидное масло, например, сквален или скваленовое масло, образующееся в результате олигомеризации алкенов, в частности, изобутена или децена, сложные эфиры кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, точнее растительные масла, этилолеат, пропиленгликольди-(каприлат/капрат), глицерилтри-(каприлат/капрат) или пропиленгликольдиолеат, сложные эфиры разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности сложные эфиры изостеариновой кислоты. Масло применяют в комбинации с эмульгаторами для создания эмульсии. Эмульгаторы предпочтительно являются неионными поверхностно-активными соединениями, в частности, сложными эфирами сорбита, маннита (например, ангидроманнитололеата), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолевой кислоты или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно этоксилированы, и блоками сополимера полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности, плюроновыми продуктами, особенно L121. См. Hunter и др. в кн.: «The Theory and Practical Application of Adjuvants», 1995, под ред. Stewart-Tull D.E.S., изд-во JohnWiley and Sons, Нью-Йорк, сс.51-94, Todd и др., Vaccine 15, 1997, сс.564-570.
Например, можно использовать эмульсию SPT, описанную на с.147 в кн.: «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach)), 1995, под ред. M. Powell и M. Newman, изд-во Plenum Press, и эмульсию MF59, описанную на с.183 в той же книге.
Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и производного алкенила. Полезными адъювантными соединениями являются полимеры акриловой или метакриловой кислот, которые имеют перекрестные сшивки, особенно с полиалкенильными эфирами Сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под названием карбомер (Phameuropa, 8, 1996). Специалисты в данной области могут обратиться к патенту US 2909462, который описывает такие акриловые полимеры с поперечными сшивками с полигидроксилированным соединением, имеющим по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов заменяются ненасыщенными алифатическими радикалами, имеющими по меньшей мере два атома углерода. Предпочтительными являются радикалы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие этилен-ненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы могут сами содержать другие заместители, например, метил. Эти продукты, известные под коммерческим названием карбопол (фирма BF Goodrich, Огайо, США), являются особенно пригодными. Они перекрестно сшиты с аллильной сахарозой или с аллильным пентаэритритом. Среди них следует отметить карбопол 974Р, 934Р и 971Р. Наиболее предпочтительно применение карбопола 971Р. Среди сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного сополимеры ЕМА (фирма Monsanto), которые являются сополимерами малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде приводит к кислому раствору, который может быть нейтрализован, предпочтительно до физиологического рН, для получения адъювантного раствора, в который может быть включена иммуногенная, иммунологическая или вакцинная композиция.
К другим соответствующим адъювантам относятся, но ими не ограничиваются, адъювантная система RIBI (фирма Ribi Inc.), продукт Block copolymer (фирма CytRx, Атланта, Atlanta Джорджия), продукт SAF-M (фирма Chiron, Emeryville, Калифорния), монофосфорильный липид А, липидно-аминный адъювант авридин, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или иной), холерный токсин, продукт IMS 1314 или мурамилдипептид, а также многие другие.
Предпочтительно адъювант вносят в количестве примерно от 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Более предпочтительно адъювант вносят в количестве примерно от 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант вносят в количестве примерно от 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант вносят в количестве примерно от 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант вносят в количестве примерно 1 мг на дозу.
Таким образом, еще одним объектом настоящего изобретения является способ приготовления антигенной композиции, например, вакцины, для индукции иммунного ответа против PCV2, включающий: i) приготовление и выделение белка PCV2 ORF2 и ii) его смешивание с соответствующим адъювантом. Предпочтительно адъювантом является карбопол 971Р. Еще более предпочтительно карбопол 971Р вносят в количестве примерно от 500 мкг до примерно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве примерно от 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу и наиболее предпочтительно в количестве примерно 1 мг на дозу. Предпочтительно стадия i) этого способа включает стадии, описанные для приготовления и выделения PCV2 ORF2. Например, в предпочтительных вариантах осуществления этого способа конструкцию, включающую ДНК PCV2 ORF2, получают в составе вектора для переноса. Соответствующие векторы переноса и способы их приготовления описаны выше, необязательно способ может включать стадию амплификации ORF2 из PCV2 методом ПЦР перед клонированием ORF2 в составе вектора переноса. Предпочтительными последовательностями открытой рамки считывания, последовательностями Козака, последовательностями сайта 3' EcoRl, рекомбинантными белковыми последовательностями, последовательностями трансфецированных конструкций, питательными средами, клетками и вирусами являются те объекты, которые перечислены в описанных ранее способах. Другая необязательная стадия этого способа включает клонирование амплифицированной ДНК PCV2 ORF2 в первом векторе, иссечение ДНК ORF2 из первого вектора и применение этой иссеченной ДНК PCV2 ORF2 для клонирования в векторе переноса. Подобно другим способам, предпочтительно выждать в течение по меньшей мере 5 суток после инфицирования клеток трансфецированным бакуловирусом перед выделением рекомбинантного белка ORF2 из надосадочной жидкости. Предпочтительно стадия выделения данного способа также включает стадию отделения среды от клеток и клеточных остатков. Она может быть проведена разными методами, но проще и обычнее фильтровать клетки и остатки клеток от культуральной среды через фильтр с размером пор примерно от 0,45 мкм до примерно 1,0 мкм. При осуществлении этого способа предпочтительно включить заключительную стадию инактивирования вируса перед комбинированием выделенного рекомбинантного белка PCV2 ORF2 в составе композиции. Она может быть выполнена разными способами, но предпочтительно в практике настоящего изобретения использовать БЭИ.
Таким образом, согласно еще одному объекту указанный способ включает стадии: i) амплификации ДНК PCV2 ORF2 in vitro, в которой фланкирующие последовательности указанной ДНК PCV2 ORF2 модифицированы, ii) клонирования амплифицированной ДНК PCV2 ORF2 в состав вектора переноса, iii) трансфекции вектора переноса или части вектора переноса, содержащей рекомбинантную ДНК PCV2 ORF2, в состав вирусного вектора для получения рекомбинантного вирусного вектора, iv) инфицирования клеток, содержащихся в культуральной среде, вирусом переноса, v) индукции у вектора переноса экспрессии рекомбинантного белка с PCV2 ORF2, vi) отделения клеток от надосадочной жидкости, vii) выделения экспрессированного белка PCV2 ORF2 из надосадочной жидкости, viii) инактивирования рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно, в присутствии примерно от 1 до примерно 20 мМ БЭИ, наиболее предпочтительно в присутствии примерно 5 мМ БЭИ, и ix) внесения эквивалентного количества агента, нейтрализующего инактивирующий агент в растворе, предпочтительно, добавления раствора натрия тиосульфата до конечной концентрации примерно от 1 до примерно 20 мМ, предпочтительно примерно 5 мМ, если инактивирующим агентом является БЭИ и х) добавления соответствующего количества адъюванта, предпочтительно добавления карбопола, более предпочтительно карбопола 971Р, еще более предпочтительно в количествах, описанных выше (например, примерно от 500 мкг до примерно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве примерно от 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу, и наиболее предпочтительно в количестве примерно 1 мг на дозу).
Дополнительно композиция может включать один или несколько фармацевтически приемлемых носителей. В контексте настоящего изобретения понятие «фармацевтически приемлемый носитель» означает один или все из следующих агентов: растворителей, дисперсионной среды, покрытий, стабилизирующих агентов, разбавителей, консервантов, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических агентов, агентов задержки адсорбции и др. Наиболее предпочтительно в предусмотренных композициях содержится белок PCV2 ORF2, выделенный из надосадочной жидкости выращенных in vitro клеток, которые были инфицированы рекомбинантным вирусным вектором, содержащим ДНК PCV2 ORF2 и экспрессирующим белок PCV2 ORF2, и указанная культура клеток была обработана БЭИ в концентрации примерно от 2 до примерно 8 мМ, предпочтительно примерно 5 мМ БЭИ для инактивирования вирусного вектора, и эквивалентной концентрацией нейтрализующего агента, предпочтительно раствором натрия тиосульфата, до конечной концентрации примерно от 2 до примерно 8 мМ, предпочтительно примерно 5 мМ, карбополом, более предпочтительно карбополом 971Р, предпочтительно в количестве примерно от 500 мкг до примерно 5 мг на дозу, и еще более предпочтительно в количестве примерно от 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу и наиболее предпочтительно в количестве примерно 1 мг на дозу, а также физиологическим раствором, предпочтительно в количестве примерно от 50 до примерно 90 об.%, более предпочтительно примерно от 60 до 80 об.%, еще более предпочтительно примерно 70 об.%.
Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к способу приготовления антигенной композиции, например, вакцины, для индукции иммунного ответа против PCV2, включающего стадии: i) амплификации ДНК PCV2 ORF2 in vitro, в которой фланкирующие последовательности указанной ДНК PCV2 ORF2 модифицированы, ii) клонирования амплифицированной ДНК PCV2 ORF2 в состав вектора переноса, iii) трансфекции вектора переноса или части вектора переноса, содержащей рекомбинантную ДНК PCV2 ORF2, в состав вирусного вектора для получения рекомбинантного вирусного вектора, iv) инфицирования клеток, содержащихся в культуральной среде, вирусом переноса, v) индукции у вектора переноса экспрессии рекомбинантного белка с PCV2 ORF2, vi) отделения клеток от надосадочной жидкости, vii) выделения экспрессированного белка PCV2 ORF2 из надосадочной жидкости, viii) инактивирования рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно, в присутствии примерно от 2 до примерно 20 мМ БЭИ, наиболее предпочтительно в присутствии примерно 5 мМ БЭИ, и ix) внесения эквивалентного количества агента, нейтрализующего инактивирующий агент в растворе, предпочтительно, добавления раствора натрия тиосульфата до конечной концентрации примерно от 0,5 до примерно 20 мМ, предпочтительно примерно 5 мМ, если инактивирующим агентом является БЭИ, х) добавления соответствующего количества адъюванта, предпочтительно добавляя карбопол, более предпочтительно карбопол 971Р, еще более предпочтительно в количествах, описанных выше (например, примерно от 500 мкг до примерно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве примерно от 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу и наиболее предпочтительно в количестве примерно 1 мг на дозу), и xi) добавление физиологического раствора, предпочтительно в количестве примерно от 50 до примерно 90 об.%, более предпочтительно примерно от 60 до 80 об.%, еще более предпочтительно примерно 70 об.%. Необязательно настоящий способ также может включать добавление защитного средства. Защитное средство, используемое в настоящем изобретении, относится к антимикробному действующему агенту, например, гентамицину, мертиолату и др. В частности внесение защитного средства является наиболее предпочтительным для приготовления многодозовой композиции. Эти антимикробные действующие агенты вносят в концентрациях, эффективных для защиты композиции от какой-либо микробной контаминации или для подавления какого-либо микробного роста в данной композиции.
Кроме того, настоящий способ также может включать внесение какого-либо стабилизирующего агента, например, сахаридов, трегалозы, маннита, сахарозы и др. для повышения и/или поддержания срока годности продукта. Однако неожиданно было установлено, что формирующийся состав иммунологически эффективен на протяжении по меньшей мере 24 месяцев без добавления какого-либо дополнительного стабилизирующего агента.
Еще один объект настоящего изобретения относится к продуктам, получаемым описанными выше способами. В частности настоящее изобретение относится к композиции, включающей рекомбинантно экспрессируемый белок PCV2 ORF2. Кроме того, настоящее изобретение также относится к композиции, включающей рекомбинантно экспрессируемый белок PCV2 ORF2, выделяемый из надосадочной жидкости культуры клеток насекомого. Предпочтительно эта композиция также включает агент для инактивации вирусных векторов. Предпочтительно указанным инактивирующим агентом является БЭИ. Кроме того, настоящее изобретение также относится к композиции, которая включает рекомбинантно экспрессируемый белок PCV2 ORF2, выделяемый из надосадочной жидкости культуры клеток насекомого, а также агент для инактивации вирусных векторов, предпочтительно БЭИ, и нейтрализующий агент для нейтрализации инактивирующего агента. Предпочтительно нейтрализующим агентом является натрий тиосульфат, если применяют БЭИ в качестве инактивирующего агента.
В еще одном объекте настоящего изобретения предусмотрена иммуногенная композиция, которая индуцирует иммунный ответ и, более предпочтительно, создает иммунную защиту против клинических признаков инфекции PCV2. Эта композиция обычно включает полипептид или его фрагмент, которые экспрессируются открытой рамкой считывания 2 (ORF2) вируса PCV2, в качестве антигенного компонента композиции.
ДНК PCV2 ORF2 и белок, применяемые в настоящем изобретении для приготовления композиций, а также применяемые в способах, предусмотренных в настоящем изобретении, является высоко консервативным доменом в изолятах PCV2, причем какой-либо PCV2 ORF2 может быть эффективен в качестве источника ДНК PCV ORF2 и/или полипептида, применяемого в настоящем изобретении. Предпочтительным белком PCV2 ORF2 является белок последовательности SEQ ID NO. 11. Предусмотренный в настоящем изобретении предпочтительный полипептид PCV ORF2 имеет последовательность SEQ ID NO.5, но специалисту в данной области очевидно, что гомология последовательности может варьировать на 6-10%, сохраняя антигенные свойства, которые делают его полезным для применения в иммуногенных композициях. Антигенные свойства иммунологической композиции могут быть, например, оценены с помощью контрольного эксперимента, предусмотренного в примере 4. Кроме того, антигенное свойство модифицированного антигена сохраняется, если модифицированный антиген создает по меньшей мере 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета, по сравнению с белком PCV2 ORF 2, кодируемым полинуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4. В контексте настоящего изобретения понятие «иммуногенная композиция» означает белок PCV2 ORF2, который вызывает «иммунологический ответ» в организме хозяина в виде клеточного и/или опосредованного антителом иммунного ответа на белок PCV2 ORF2. Предпочтительно такая иммуногенная композиция способна вызывать защитный иммунитет против инфекции PCV2 и связанных с ней клинических признаков. В некоторых вариантах иммуногенные части белка PCV2 ORF2 используют в качестве антигенного компонента в составе композиции. Понятие «иммунногенная часть» в контексте настоящего изобретения относится к усеченным и/или замещенным формам или фрагментам белка PCV2 ORF2 и/или полинуклеотида, соответственно. Предпочтительно, такие усеченные и/или замещенные формы или фрагменты могут включать по меньшей мере 6 смежных аминокислот из полипептида ORF2 полной длины. Более предпочтительно усеченные и/или замещенные формы или фрагменты могут иметь по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 15, и еще более предпочтительно по меньшей мере 19 смежных аминокислот из полипептида ORF2 полной длины. В связи с этим в настоящем изобретении предусмотрены две предпочтительные последовательности, а именно SEQ ID NO. 9 и SEQ ID NO. 10. Также установлено, что такие последовательности могут быть частью более крупных фрагментов или усеченных форм. Другой предпочтительный полипептид PCV2 ORF2, предусмотренный в настоящем изобретении, кодируется нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO:4. Однако специалисту в данной области очевидно, что гомология последовательности может варьировать на 6-20%, сохраняя антигенные свойства, которые делают его полезным для применения в иммуногенных композициях. В некоторых случаях усеченная или замещенная форма или фрагмент ORF2 используют в качестве антигенного компонента в данной композиции. Предпочтительно такие усеченные или замещенные формы или фрагменты могут включать по меньшей мере 18 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности ORF2 полной длины, например, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO:4. Более предпочтительно усеченные или замещенные формы или фрагменты могут иметь по меньшей мере 30, более предпочтительно по меньшей мере 45, и еще более предпочтительно по меньшей мере 57 смежных нуклеотидов из нуклеотидной последовательности ORF2 полной длины, например, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4.
Понятие «идентичность последовательности» в данной области означает взаимосвязь между двумя или более полипептидными последовательностям, а именно контрольной и анализируемой последовательностями. Идентичность последовательности определяют, сравнивая анализируемую последовательность с контрольной последовательностью после оптимального совмещения последовательностей для получения наивысшей степени схожести последовательностей, определяемой совпадениями между нитями таких последовательностей. По таким совпадениям идентичность последовательности устанавливают по совпадению основания с основанием, например, последовательности «идентичны» по какому-то положению, если нуклеотиды или аминокислотные остатки идентичны. Общее число таких идентичных позиций затем делят на общее число нуклеотидов или остатков в контрольной последовательности для получения процента идентичности последовательности. Идентичность последовательности может быть легко определена известными способами, включая, но, не ограничиваясь ими, способы, описанные в кн.: «Computational Molecular Biology», 1988, под ред. Lesk A. N., изд-во Oxford University Press, Нью-Йорк, в кн.: «Biocomputing: Informatics and Genome Projects», 1993, под ред. Smith D.W., изд-во Academic Press, Нью-Йорк, в кн.: «Computer Analysis of Sequence Data», 1994, часть I, под ред. Griffin A.M. и Griffin H. G., изд-во Humana Press, Нью-Джерси, в кн.: von Heinge G. «Sequence Analysis in Molecular Biology», 1987, изд-во Academic Press, в кн.: «Sequence Analysis Primer», 1991, под ред. Gribskov M., Devereux J., изд-во M. Stockton Press, Нью-Йорк, Carillo H., Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, c. 1073; эти способы включены в настоящее изобретение в виде ссылок. Предпочтительные способы определения идентичности последовательности разработаны для выяснения наибольшей совместимости между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности последовательности систематизированы в общедоступных компьютерных программах, которые позволяют определить идентичность данных последовательностей. К примерам таких программ относятся, но ими не ограничиваются, программный пакет GCG (Devereux J., и др., Nucleic Acids Research, 12, 1984, с.387), программы BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul S. F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, сс.403-410). Программа общедоступна в NCBI и других источниках (кн.: «BLAST Manual», Altschul, S. и др., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, cc. 403-410, сущность которых включена в настоящее изобретение в виде ссылки). Эти программы оптимально совмещают последовательности, используя массы отсутствующих гэпов для получения наивысшего уровня идентичности данной и контрольной последовательности. Например, если полинуклеотидная последовательность по меньшей мере например, на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% обладает «идентичностью последовательности» по отношению к контрольной последовательности, значит нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида идентична контрольной последовательности, но данная полинуклеотидная последовательность может включать до 15, предпочтительно до 10, еще более предпочтительно до 5 точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов контрольной последовательности. То есть, если полинуклеотид, у которого нуклеотидная последовательность по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% идентична контрольной нуклеотидной последовательности, значит до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% нуклеотидов в контрольной последовательности может быть дебетировано или замещено на другие нуклеотиды, или ряд нуклеотидов, до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% от общего числа нуклеотидов в контрольной последовательности может быть инсертировано в контрольную последовательность. Эти мутации в контрольной последовательности могут располагаться с 5'- или 3'-концевых позиций контрольной нуклеотидной последовательности или где-либо между концевыми положениями контрольной нуклеотидной последовательности, распределяясь либо по отдельности между нуклеотидами в контрольной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в составе контрольной последовательности. Аналогично полипептид, у которого аминокислотная последовательность содержит по меньшей мере например 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% идентичности последовательности контрольной аминокислотной последовательности, это означает, что данная аминокислотная последовательность полипептида идентична контрольной последовательности, за исключением того, что данная полипептидная последовательность может включать до 15, предпочтительно до 10, еще более предпочтительно до 5 аминокислотных замен на каждые 100 аминокислот контрольной аминокислотной последовательности. То есть для получения данной полинуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно на 90%, еще более предпочтительно на 95% идентична контрольной аминокислотной последовательности, до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% аминокислотных остатков в контрольной последовательности может быть делетировано или замещено на другие аминокислоты, или ряд аминокислот, до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% от общего числа аминокислотных остатков в контрольной последовательности может быть инсертировано в контрольную последовательность. Эти изменения контрольной последовательности могут быть с амино- или карбокси-конца контрольной аминокислотной последовательности или где-либо между концевыми положениями, распределяясь либо по отдельности между аминокислотными остатками в контрольной последовательности, либо в одной или нескольких смежных группах в составе контрольной последовательности. Предпочтительно положения аминокислотных остатков, не являющихся идентичными, не являются заменами консервативных аминокислот. Однако консервативные замещения не рассматриваются в качестве совместимых при определении идентичности последовательности.
В контексте настоящего изобретения понятие «гомология последовательности» означает способ определения совместимости двух последовательностей. Для определения гомологии последовательности проводят оптимальную выверку двух или нескольких последовательностей и при необходимости гэпы интродуцируют. Однако в противоположность «идентичности последовательности» консервативные замещения аминокислот учитываются в качестве совместимых при определении гомологии последовательности. То есть для получения полипептида или полинуклеотида с 95% гомологии последовательности с контрольной последовательностью, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в контрольной последовательности должны быть идентичными или должны включать консервативную замену другой аминокислотой или нуклеотидом или рядом других аминокислот или нуклеотидов до 15%, предпочтительно до 10%, еще более предпочтительно до 5% от общего числа аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативных замен, в контрольной последовательности может быть инсертировано в контрольную последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность включает по меньшей мере удлинение из 50, еще более предпочтительно из 100, еще более предпочтительно из 250, еще более предпочтительно из 500 нуклеотидов.
В контексте настоящего изобретения понятие «консервативное замещение» означает замещение аминокислотного остатка или нуклеотида на другой аминокислотный остаток или нуклеотид с близкими характеристиками или свойствами, включая размер, гидрофобность и т.д., таким образом, что общая функциональность существенно не меняется.
Понятие «выделенный» можно заменить понятием «сделанный руками человека» исходя из природного статуса, т.е. присутствует ли в природе, и был ли изменен или выделен из естественной среды, или и то, и другое. Например, полинуклеотид или полипептид, естественным образом имеющийся у живого организма, не является «выделенным», тот же самый полинуклеотид или полипептид, выделенный от других сопутствующих материалов, которые также являются природными, является «выделенным» в том смысле, который вкладывается в это понятие в рамках настоящего изобретения.
Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к иммунногенной композиции, эффективной для понижения тяжести клинических симптомов, связанных с инфицированием вирусом PCV2, включающей белок PCV2 ORF2. Предпочтительно белок PCV2 ORF2 является одним из белков, описанных выше. Предпочтительно указанным белком PCV2 ORF2 является:
i) полипептид, включающий последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11,
ii) какой-либо полипептид, который по меньшей мере на 80% гомологичен полипептиду по пункту i),
iii) какая-либо иммунногенная часть полипептидов по пунктам i) и/или ii),
iv) иммунногенная часть пункта iii), включающая по меньшей мере 10 смежных аминокислот, включающих последовательности SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:11,
v) полипептид, который кодируется ДНК, включающей последовательность SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4,
vi) какой-либо полипептид, который кодируется полинуклеотидом, который по меньшей мере на 80% гомологичен полинуклеотиду по пункту v),
vii) какая-либо иммунногенная часть полипептидов, кодируемых полинуклеотидами по пунктам v) и/или vi),
viii) иммунногенная часть по пункту vii), в которой полинуклеотид, кодирующий указанную иммуногенную часть, включает по меньшей мере 30 смежных нуклеотидов в последовательностях SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4,
Предпочтительно какая-либо из иммунногенных частей может обладать иммунногенными свойствами белка PCV2 ORF2, который кодируется последовательностью SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4.
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения предусмотрено включение белка PCV2 ORF2 в иммунологическую композицию на антигенном уровне, эффективном для индукции желаемого иммунного ответа, а именно понижения частоты возникновения или уменьшения тяжести клинических признаков, возникших в результате инфицирования PCV2. Предпочтительно уровень включения белка PCV2 ORF2 составляет по меньшей мере 0,2 мкг антигена/мл конечной иммуногенной композиции (мкг/мл), более предпочтительно примерно от 0,2 до примерно 400 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 0,3 до примерно 200 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 0,35 до примерно 100 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 0,4 до примерно 50 мкг /мл, еще более предпочтительно примерно от 0,45 до примерно 30 мкг /мл, еще более предпочтительно примерно от 0,6 до примерно 15 мкг /мл, еще более предпочтительно примерно от 0,75 до примерно 8 мкг/мл, еще более предпочтительно примерно от 1,0 до примерно 6 мкг /мл, еще более предпочтительно примерно от 1,3 до примерно 3,0 мкг /мл, еще более предпочтительно примерно от 1,4 до примерно 2,5 мкг /мл, еще более предпочтительно примерно от 1,5 до примерно 2,0 мкг /мл, и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/мл.
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения уровень включения антитела ORF2 составляет по меньшей мере 0,2 мкг белка PCV2 ORF2, согласно описанному выше, на дозу итоговой антигенной композиции (мкг/дозу), более предпочтительно примерно от 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,6 до примерно 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 1,4 до примерно 2,5 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 1,5 до примерно 2,0 мкг/дозу, и наиболее предпочтительно примерно 1,6 мкг/дозу.
Полипептид PCV2 ORF2, применяемый в иммунногенной композиции согласно настоящему изобретению, может быть получен каким-либо методом, включая выделение и очистку PCV2 ORF2, стандартный синтез белка и рекомбинацию. Предпочтительные способы получения полипептида PCV2 ORF2, описанные в настоящем изобретении выше, также предусмотрены в патентной заявке US 11/034797, методики и содержание которой включены в настоящее изобретение в виде ссылки. Вкратце, чувствительные клетки инфицируются рекомбинантным вирусным вектором, содержащим кодирующие последовательности ДНК PCV2 ORF2, полипептид PCV2 ORF2 экспрессируется рекомбинантным вирусом, экспрессированный полипептид PCV2 ORF2 выделяют из надосадочной жидкости фильтрацией и инактивируют каким-либо обычным способом, предпочтительно используя бинарный этиленимин, который затем нейтрализуют для остановки процесса инактивации.
Таким образом, согласно одному из объектов настоящего изобретения иммунногенная композиция включает: i) какой-либо из белков PCV2 ORF2, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, ii) по меньшей мере, часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок PCV2 ORF2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса. Кроме того, согласно еще одному объекту настоящего изобретения иммунногенная композиция включает: i) какой-либо из белков PCV2 ORF2, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, ii) по меньшей мере, часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок PCV2 ORF2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и iii) часть надосадочной жидкости культуры клеток.
Согласно одному из конкретных вариантов осуществления способа выработки и выделения белка PCV2 ORF2 надосадочную жидкость культуры клеток фильтруют через мембрану с размером пор предпочтительно примерно 0,45-1 мкм. Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к иммунногенной композиции, которая включает: i) какой-либо из белков PCV2 ORF2, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, ii) по меньшей мере, часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок PCV2 ORF2, предпочтительно рекомбинантного бакуловируса, и Hi) часть культуры клеток, в которой размер примерно 90% компонентов меньше 1 мкм.
Еще один объект настоящего изобретения относится к иммунногенной композиции, которая включает: i) какой-либо из белков PCV2 ORF2, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, ii) по меньшей мере, часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок PCV2 ORF2, iii часть культуры клеток, iv) и инактивирующий агент для инактивирования рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, причем примерно 90%) компонентов по пунктам с i) по Hi) имеет размер меньше 1 мкм. Предпочтительно БЭИ содержится в концентрациях, эффективных для инактивации бакуловируса. Эффективные концентрации приводятся выше.
Согласно еще одному из объектов настоящее изобретение относится к иммунногенной композиции, которая включает: i) какой-либо из белков PCV2 ORF2, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, ii) по меньшей мере, часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок PCV2 ORF2, iii) часть культуры клеток, iv) и инактивирующий агент для инактивирования рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, и v) нейтрализующий агент для прекращения инактивации, опосредованной инактивирующим агентом, причем примерно 90% компонентов по пунктам с i) по iii) имеет размер меньше 1 мкм. Предпочтительно, если инактивирующим агентом является БЭИ, указанная композиция включает натрий тиосульфат в эквивалентном количестве по отношению к БЭИ.
Полипептид включают в композицию, которая может быть введена животному, чувствительному к инфекции PCV2. В предпочтительных вариантах осуществления композиция также может включать дополнительные компоненты, известные специалистам в данной области (см., например, кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences», 1990, 18-е изд., изд-во Mack Publ., Истон). Кроме того, композиция может включать один или более ветеринарно приемлемых наполнителя. В контексте настоящего изобретения понятие «ветеринарно приемлемый носитель» означает один или все из следующих агентов: растворителей, дисперсионной среды, покрытий, адъювантов, стабилизирующих агентов, разбавителей, консервантов, антибактериальных и противогрибковых агентов, изотонических агентов, агентов задержки адсорбции и др.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммунногенная композиция включает белок PCV2 ORF2, предусмотренный в настоящем изобретении, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, в качестве антигенного компонента, который смешивают с адъювантом, предпочтительно карбополом, и физиологическим раствором.
Специалисту в данной области очевидно, что композиция настоящего изобретения может включать известные инъекционные физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к применению раствора для парентеральной инъекции или инфузии легко доступны водные изотонические растворы, например, физиологический раствор или соответствующие растворы белков плазмы. Кроме того, иммунногенные и вакцинные композиции настоящего изобретения могут включать разбавители, изотонические агенты, стабилизаторы или адъюванты. К разбавителям может относиться вода, физиологический раствор, декстроза, этанол, глицерин и т.п. К изотоническим агентам относятся натрий хлорид, декстроза, маннит, сорбит, лактоза и др. К стабилизаторам относятся альбумин и соли щелочных металлов этилендиаминтетрауксусной кислоты, а также другие агенты. К приемлемым адъювантам относятся описанные выше адъюванты. Наиболее предпочтительным является применение карбопола, в частности применение карбопола 971Р, предпочтительно в количествах, описанных выше (например, примерно от 500 мкг до примерно 5 мг на дозу, еще более предпочтительно в количестве примерно от 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу, и наиболее предпочтительно в количестве примерно 1 мг на дозу).
Таким образом, настоящее изобретение также относится к иммунногенной композиции, которая включает: i) какой-либо из белков PCV2 ORF2, описанных выше, предпочтительно в концентрациях, описанных выше, ii) по меньшей мере, часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок PCV2 ORF2, iii) часть культуры клеток, iv) и инактивирующий агент для инактивирования рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, v) нейтрализующий агент для прекращения инактивации, опосредованной инактивирующим агентом, предпочтительно натрием тиосульфатом, в количестве, эквивалентном БЭИ, и vi) соответствующий адъювант, предпочтительно карбопол 971, в количествах, описанных выше, причем примерно 90% компонентов по пунктам с i) по iii) имеет размер меньше 1 мкм. Согласно еще одному объекту настоящего изобретения иммунногенная композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно фосфат в физиологически приемлемых концентрациях. Предпочтительно рН указанной иммунногенной композиции доводят до физиологической величины рН, составляющей 6,5-7,5.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к имунногенной композиции, включающей (в 1 мл): i) по меньшей мере, 1,6 мкг белка PCV2 ORF2, описанного выше, ii) по меньшей мере, часть бакуловируса, экспрессирующего указанный белок PCV2 ORF2, iii) часть культуры клеток, iv) примерно 2-8 мМ БЭИ, v) натрий тиосульфат, в количестве, эквивалентном БЭИ, и vi) примерно 1 мг карбопола 971, vii) фосфат в физиологически приемлемой концентрации, причем примерно 90% компонентов по пунктам с i) по iii) имеет размер меньше 1 мкм и рН указанной иммунногенной композиции доводят до величины рН, составляющей примерно 6,5-7,5.
Иммунногенные композиции также могут включать один или несколько других иммуномодулирующих агентов, например, интерлейкинов, интерферонов и других цитокинов. Иммунногенные композиции могут также включать гентамицин и мертиолат. Хотя количества и концентрации адъювантов и вспомогательных агентов, применяемых в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены опытным специалистом в данной области, настоящее изобретение предусматривает композиции, включающие примерно от 50 мкг до примерно 2000 мкг адъюванта и предпочтительно примерно 250 мкг/мл дозы композиции вакцины. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены композиции вакцин, включающие примерно от 1 мкг/мл до примерно 60 мкг/мл антибиотиков, и более предпочтительно менее чем примерно 30 мкг/мл антибиотиков.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к имунногенной композиции, включающей: i) какой-либо из белков PCV2 ORF2, описанных выше, ii) по меньшей мере, часть вирусного вектора, экспрессирующего указанный белок PCV2 ORF2, iii) часть культуры клеток, iv) инактивирующий агент для инактивации рекомбинантного вирусного вектора, предпочтительно БЭИ, v) нейтрализующий агент для остановки инактивирования, опосредованного инактивирующим агентом, предпочтительно натрий тиосульфатом, в количестве, эквивалентном БЭИ, vi) соответствующий адъювант, предпочтительно Carbopol 971, в количествах, описанных выше, vii) фармацевтически приемлемая концентрация солевого буфера, предпочтительно фосфата, и viii) антимикробный действующий агент, причем примерно 90% компонентов по пунктам с i) по iii) имеет размер меньше 1 мкм.
Неожиданно было установлено, что иммунногенная композиция, предусмотренная в настоящем изобретении, высоко стабильна на протяжении 24 месяцев. Было установлено, что иммунногенная композиция, предусмотренная в настоящем изобретении, включающая рекомбинантный экспрессируемый бакуловирусом белок PCV2 ORF2, высоко эффективна в понижении проявления клинических симптомов, ассоциированных с инфицированием вирусом PCV2. Неожиданно было установлено, что иммунногенные композиции, включающие рекомбинантный экспрессируемый бакуловирусом белок PCV2 ORF2, предусмотренный в настоящем изобретении, более эффективны по сравнению с иммунногенной композицией, включающей целый вирус PCV2 в инактивированной форме или выделенный вирусный PCV2 ORF2 антиген. В частности неожиданно было установлено, что рекомбинантный экспрессируемый бакуловирусом белок PCV2 ORF2 эффективен в очень низких концентрациях, вплоть до концентрации 0,25 мкг/дозу. Этот неожиданный высоко иммунногенный потенциал белка PCV2 ORF2 может быть дополнительно повышен добавлением карбопола.
Другой объект настоящего изобретения относится к контейнеру, включающему по меньшей мере одну дозу иммунногенной композиции белка PCV2 ORF2, предусмотренного в настоящем изобретении, причем одна доза включает по меньшей мере 2 мкг белка PCV2 ORF2, предпочтительно 2-16 мкг белка PCV2 ORF2. Указанный контейнер может включать 1-250 доз иммунногенной композиции, предпочтительно 1,10, 25, 50, 100, 150, 200 или 250 доз иммунногенной композиции белка PCV2 ORF2. Предпочтительно каждый контейнер, содержащий более одной дозы иммунногенной композиции белка PCV2 ORF2, дополнительно включает антимикробный действующий агент.К таким агентам, например антибиотикам, относятся гентамицин или мертиолат и др. Таким образом, один из объектов настоящего изобретения относится к контейнеру, который содержит 1-250 доз иммунногенной композиции белка PCV2 ORF2, причем одна доза содержит по меньшей мере 2 мкг белка PCV2 ORF2, а также гентамицин и/или мертиолат, предпочтительно примерно от 1 мкг/мл до примерно 60 мкг/мл антибиотика, более предпочтительно менее примерно 30 мкг/мл.
Другой объект относится к набору, включающему какой-либо из контейнеров, описанных выше, и инструкцию, содержащую информацию по внутримышечному введению по меньшей мере одной дозы иммунногенной композиции белка PCV2 ORF2 поросятам для снижения тяжести проявления клинических симптомов, связанных с инфицированием вирусом PCV2. Кроме того, согласно еще одному объекту настоящего изобретения указанная инструкция включает информацию о втором или последующем введении (введениях)по меньшей мере одной дозы иммунногенной композиции PCV2 ORF2, причем второе введение или какое-либо последующее введение осуществляют по меньшей мере через 14 суток после первого или какого-либо последующего введения. Предпочтительно указанная инструкция также включает информацию по применению стимулятора иммунитета. Предпочтительно стимулятор иммунитета вводят по меньшей мере дважды, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно по меньшей мере 5, и еще более предпочтительно по меньшей мере через 7 суток между первым и вторым или каким-либо последующим введением стимулятора иммунитета. Предпочтительно стимулятор иммунитета вводят по меньшей мере через 10 суток, предпочтительно 15, еще более предпочтительно 20, и еще более предпочтительно по меньшей мере через 22 суток после первого введения иммунногенной композиции белка PCV2 ORF2. Предпочтительным стимулятором иммунитета является, например, гемоцианин моллюска блюдечко (keyhole limpet hemocyanin - KLH), предпочтительно эмульгированный с конъюгированный с неполный адъювантом Фрейнда (KLH/ICFA). Однако из настоящего изобретения следует, что какой-либо другой стимулятор иммунитета, известный специалистам в данной области, также может быть применен. В контексте настоящего изобретения понятие «стимулятор иммунитета» относится к какому-либо агенту или композиции, которая может индуцировать системный иммунный ответ, предпочтительно без инициации или повышения специфического иммунного ответа, например, иммунного ответа в отношении специфического патогена. Также приводится инструкция по введению стимулятора иммунного ответа в соответствующей дозе. Кроме того, набор также может включать контейнер, содержащий по меньшей мере одну дозу стимулятора иммунитета, предпочтительно одну дозу KLH или KLH/ICFA.
Кроме того, неожиданно было установлено, что иммунногенный потенциал иммунногенных композиций, включающих белок PCV2 ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, предпочтительно в комбинации с карбополом, может быть повышен введением вакцины IngelVac PRRS MLV (см. пример 5). Клинические признаки инфицирования вирусом PCV2 и проявления заболевания существенно усиливается при наличии в организме инфекции PRRS. Однако иммунногенные композиции и стратегии вакцинации, предусмотренные в настоящем изобретении, существенно снижают этот эффект, причем в большей степени, чем предполагалось. Иначе говоря, неожиданный синергетический эффект был установлен, когда животных, предпочтительно свиней, лечат какой-либо иммунногенной композицией PCV2 ORF2, предусмотренной в настоящем изобретении, и вакциной Ingelvac PRRS MLV vaccine (фирма Boehringer Ingelheim).
Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к описанному выше набору, содержащему иммунногенную композицию PCV2 ORF2, предусмотренную в настоящем изобретении, и инструкцию, причем в инструкции также содержится информация по введению иммунногенной композиции PCV2 ORF2 вместе или примерно в одно и то же время с иммунногенной композицией, которая содержит антиген PRRS, предпочтительно адъювантный антиген PRRS. Предпочтительно антигеном PRRS является IngelVac PRRS MLV (фирма Boehringer Ingelheim).
Другой объект настоящего изобретения также относится к набору, включающему: i) контейнер, содержащий по меньшей мере одну дозу иммунногенной композиции PCV2 ORF2, предусмотренной в настоящем изобретении, и ii) контейнер, содержащий иммунногенную композицию, включающую антиген PRRS, предпочтительно адъювантный антиген PRRS. Предпочтительно антигеном PRRS является IngelVac PRRS MLV (фирма Boehringer Ingelheim). Более предпочтительно набор также содержит инструкцию, включающую информацию по введению обеих фармацевтических композиций. Предпочтительно набор содержит информацию о том, что композицию, содержащую PCV2 ORF2, вводят непрерывно перед композицией, содержащей PRRS. Другой объект настоящего изобретения относится к применению каких-либо композиций, предусмотренных в настоящем изобретении, в качестве лекарственного средства, предпочтительно в качестве ветеринарного лекарственного средства, еще более предпочтительно в качестве вакцины. Кроме того, настоящее изобретение также относится к применению каких-либо композиций, описанных в настоящем изобретении, для приготовления лекарственного средства для снижения тяжести клинических симптомов, связанных с инфекцией PCV2. Предпочтительно лекарственное средство предназначено для предупреждения инфицирования вирусом PCV2, еще более предпочтительно у поросят.
Еще один объект настоящего изобретения также относится к способу (i) предупреждения инфицирования или повторного инфицирования вирусом PCV2, или (ii) снижения проявления или элиминации клинических симптомов, вызываемых вирусом PCV2 у субъекта, предусматривающему введение каких-либо иммунногенных композиций, предусмотренных в настоящем изобретении, субъекту, нуждающемуся в таком введении. Предпочтительно субъектом является свинья. Предпочтительно иммунногенную композицию вводят внутримышечно. Предпочтительно вводят одну дозу или две дозы иммунногенной композиции, причем одна доза предпочтительно содержит по меньшей мере примерно 2 мкг белка PCV2 ORF2, еще более предпочтительно примерно от 2 до примерно 16 мкг, и по меньшей мере примерно от 0,1 до примерно 5 мг карбопола, предпочтительно примерно 1 мг карбопола. Еще один объект настоящего изобретения относится к способу лечения, описанному выше, в котором применяется второе введение иммунногенной композиции. Предпочтительно при втором введении используют ту же иммунногенную композицию, предпочтительно содержащую то же количество белка PCV2 ORF2. Предпочтительно второе введение также проводят внутримышечно. Предпочтительно второе введение проводят по меньшей мере через 14 суток после первоначального введения, еще более предпочтительно по меньшей мере через 4 недели после первоначального введения.
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения способ также включает введение стимулятора иммунитета. Предпочтительно указанный стимулятор иммунитета вводят по меньшей мере дважды. Предпочтительно по меньшей мере через 3 суток, более предпочтительно по меньшей мере через 5 суток, еще более предпочтительно по меньшей мере через 7 суток между первым и вторым введением стимулятора иммунитета. Предпочтительно стимулятор иммунитета вводят по меньшей мере через 10 суток, предпочтительно через 15 суток, еще более предпочтительно через 20 суток, еще более предпочтительно по меньшей мере через 22 суток после первого введения иммунногенной композиции PCV2 ORF2. Предпочтительным стимулятором иммунитета является, например, гемоцианин моллюска блюдечка (keyhole limpet hemocyanin - KLH), предпочтительно эмульгированный с неполным адъювантом Фрейнда (KLH/ICFA). Однако из настоящего изобретения следует, что какой-либо другой стимулятор иммунитета, известный специалистам в данной области, также может быть применен. В компетенции специалиста в данной области назначить соответствующую дозу стимулятора иммунитета.
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения способ лечения, описанный выше, также включает введение антигена PRRS. Предпочтительно антигеном PRRS является IngelVac PRRS MLV (фирма Boehringer Ingelheim). Предпочтительно указанный антиген PRRS скоротечно вводят после введения иммунногенной композиции белка PCV2 ORF2.
Еще один объект настоящего изобретения предусматривает поливалентную комбинированную вакцину, которая включает иммунологический агент, эффективно понижающий частоту инфицирования вирусом PCV2 или тяжесть проявления инфекции, и по меньшей мере один иммунногенный действующий компонент против другого микроорганизма, вызывающего заболевания у свиней.
В частности иммунологическим агентом, эффективно снижающим частоту встречаемости инфицирования вирусом PCV2 или тяжесть проявления инфекции является антиген PCV2. Предпочтительно указанный антиген PCV2 является белком PCV2 ORF2, предусмотренным в настоящем изобретении, или иммунногенной композицией, описанной выше, которая включает белок PCV2 ORF2.
Однако следует учитывать, что антиген PCV2 также относится к какой-либо композиции, которая включает по меньшей мере один антиген, который может индуцировать, стимулировать или повышать иммунный ответ в отношении инфекции PCV2 при введении в организм свиньи. Предпочтительно указанный антиген PCV2 является целым вирусом PCV2, предпочтительно в инактивированной форме, живым модифицированным или аттенуированным вирусом PCV2, химерным вирусом, который включает по меньшей мере иммунногенную аминокислотную последовательность PCV2, какой-либо другой полипептид или компонент, который включает по меньшей мере иммунногенную аминокислотную последовательность PCV2. К понятиям «иммунногенный белок», «иммунногенный полипептид» или «иммунногенная аминокислотная последовательность» в контексте настоящего изобретения относится какая-либо аминокислотная последовательность, которая вызывает иммунный ответ в организме хозяина в отношении патогена, включающая указанный иммунногенный белок, иммунногенный полипептид или иммунногенную аминокислотную последовательность. В контексте настоящего изобретения понятия «иммунногенный белок», «иммунногенный полипептид» или «иммунногенная аминокислотная последовательность» относятся к полноразмерной последовательности какого-либо белка, его аналогов или его иммунногенных фрагментов. Понятие «иммунногенный фрагмент» означает фрагмент белка, который включает один или несколько эпитопов, и таким образом вызывает иммунологический ответ против значимого патогена. Такие фрагменты могут быть идентифицированы, используя ряд методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. См., например, главу «Epitope Mapping Protocols)) в книге: «Methods in Molecular Biology», 1996, т.66, под ред. Glenn Е. Morris, изд-во Humana Press, Totowa, Нью-Джерси. Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, одновременным синтезом большого количества пептидов на твердой основе, пептидов, соответствующих частям большой молекулы, и реакцией этих пептидов с антителами, причем антитела по-прежнему остаются присоединенными к основе. Такие методики, известные в данной области, описаны, например, в US 4708871, Geysen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 3998-4002, Geysen и др., Molec. Immunol. 23, 1986, cc. 709-715. Аналогично конформационные эпитопы легко идентифицируются по установлению пространственной конформации аминокислот, например, методом кристаллографического анализа с помощью рентгеновских лучей и двухмерного ядерно-магнитного резонанса. См., например, приведенную выше ссылку на главу «Epitope Mapping Protocols)). Синтетические антигены также относятся к данному определению, например, полиэпитопам, фланкирующим эпитопам и другим производным антигенам, полученным методом рекомбинации или синтезом. См., например, Bergmann и др., Eur. J. Immunol. 23, 1993, cc. 2777-2781, Bergmann и др., J. Immunol. 157, 1996, cc. 3242-3249, Suhrbier A., Immunol, and Cell Biol. 75, 1997, cc. 402-408, Gardner и др. в кн.: «12th World AIDS Conference)), 1998, Женева, Швейцария.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения указанным антигеном PCV-2 является продукт Ingelvac CircoFLEX™, (фирма Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, Сэнт-Джозеф, Монтана, США), продукт CircoVac (фирма Merial SAS, Лион, Франция), продукт CircoVent (фирма Intervet Inc., Millsboro, Дэлавер, США) или продукт Suvaxyn PCV-2 One Dose (фирма Fort Dodge Animal Health, Канзас-сити, Канзас, США).
Понятие «иммунологический или иммунный ответ» применительно к композиции или вакцине означает развитие в организме хозяина клеточного ответа и/или иммунного ответа на основе антител в качестве реакции на определенную вакцину или композицию. Обычно к понятию «иммунный ответ» относятся, но ими перечень не ограничивается, следующие эффекты: выработка или активирование антител, В-клеток, хэлперных Т-клеток, супрессорных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток и/или yd Т-клеток, специфически нацеленных на антиген или антигены, включенные в конкретную композицию или вакцину. Предпочтительно организм хозяина может проявить терапевтический или защитный иммунологический ответ таким образом, что устойчивость к новой инфекции может быть повышена и/или клиническая тяжесть заболевания понижена. Такая защита может быть выражена либо в снижении, либо в утрате симптомов, связанных с инфекциями организма хозяина, описанными выше.
Предпочтительно другой микроорганизм, вызывающий заболевание свиней, выбран из группы, состоящей из: Actinobacillus pleuropneumonia (1), аденовируса (2), альфавируса, например, вирусов восточного энцефаломиелита лошадей (3), Bordetella bronchiseptica (4), Brachyspira spp.(5), предпочтительно В. hyodyentheriae (6), В. piosicoli (7), Brucella suis, предпочтительно биовары 1, 2 и 3 (8), вируса классической лихорадки свиней (9), Clostridium spp.(10), предпочтительно Cl. difficile (11), Cl. perfringens, типы А, В и С (12), Cl. novyi (13), Cl. septicum (14), Cl. tetani (15), коронавируса (16), предпочтительно респираторного коронавируса свиней (17), Eperythrozoonosis suis (18); Erysipelothrix rhsiopathiae (19) Escherichia coli (20), Haemophilus parasuis, предпочтительно подтипы 1, 7 и 14 (21), вируса гемагглютинирующего энцефаломиелита (22), вируса японского энцефалита (23), Lawsonia intracellularis (24), Leptospira spp.(25), предпочтительно Leptospira australis (26), Leptospira canicola (27), Leptospira grippotyphosa (28), Leptospira icterohaemorrhagicae (29), Leptospira interrogans (30), Leptospira pomona (31), Leptospira tarassovi (32), Mycobacterium spp.(33), предпочтительно M. avium (34), M. intracellulare (35), M.bovis (36), Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo) (37), Pasteurella multocida (38), цитомегаловируса свиней (39), парвовируса свиней (40), вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRS) (41), вируса псевдобешенства (42), ротавируса (43), Salmonella spp.(44), предпочтительно S. thyhimurium (45) и S. choleraesuis (46), Staph, hyicus (47), Staphylococcus spp.(48) предпочтительно Streptococcus spp.(49), предпочтительно Strep, suis (50), вируса герпеса свиней (51), вируса гриппа свиней (52), поксвируса свиней (53), поксвируса свиней (54), вируса везикулярного стоматита (55), вируса везикулярной экзантемы свиней (56), Leptospira Hardjo (57) и/или Mycoplasma hyosynoviae (58).
Какое-либо приведенное ниже упоминание патогена свиней может быть обозначено названием патогена, например, M.hyo, или номером, указанным в скобках выше. Например, ссылка на Mycoplasma hyopneumoniae может быть обозначена «М. hyo» или «(37)».
Таким образом, настоящее изобретение относится к комбинированной вакцине для лечения и/или профилактики свиней, которая содержит иммунологический агент, эффективный для снижения встречаемости заболевания или снижения тяжести проявления инфекции PCV2, предпочтительно антиген PCV2, а также эффективный компонент иммунологического действия для лечения и/или профилактики инфекций, вызванных патогенами свиней (1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10), (11), (12), (13), (14), (15), (16), (17), (18), (19), (20), (21), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35), (36), (37), (38), (39), (40), (41), (42), (43), (44), (45), (46), (47), (48), (49), (50), (51), (52), (53), (54), (55), (56), (57) и/или (58), или иммунологически активный компонент указанного патогена (патогенов) свиней. [Комбинированная вакцина 1].
В контексте настоящего изобретения понятие «иммунологически активный компонент» означает компонент, который индуцирует или стимулирует иммунный ответ у животных, которым вводят указанный компонент. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанный иммунный ответ направлен на указанный компонент или на микроорганизм, включающий указанный компонент. Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения иммунологически активный компонент является аттенуированным микроорганизмом, в том числе измененным живым вирусом (ИЖВ), убитым микроорганизмом или по меньшей мере иммунологически активной частью микроорганизма.
В контексте настоящего изобретения понятие «иммунологически активная часть микроорганизма» относится к фракции микроорганизма, содержащей белки, сахара и гликопротеины, которая содержит по меньшей мере один антиген, индуцирующий или стимулирующий иммунный ответ у животных, которым был введен указанный компонент. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанный иммунный ответ направлен на указанную иммунологически активную часть микроорганизма или микроорганизм, включающий указанную иммунологически активную часть.
Предпочтительно еще один иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] является эффективным для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (41) или иммунологически активным компонентом патогена свиней (41).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (37) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (37).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (1) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (1).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (7) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (7).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (24) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (24).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (38) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (38).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (21) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (21).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (40) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (40).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (2) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (2).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (44) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (44).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (50) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (50).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (19), предпочтительно (20) и/или (21) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (19), предпочтительно (20) и/или (21).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогеном свиней (22) или является иммунологически активным компонентом патогена свиней (22).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (41) и (37), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (41) и (37).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (1) и (41), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (1) и (41).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (1) и (37), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (1) и (37).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (1), (41) и (37), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (1), (41) и (37). В предпочтительной форме вспомогательным веществом в этой комбинации является карбопол.
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (1) и (21), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (1) и (21).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (21) и (41), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (21) и (41).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (21) и (37), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (21) и (37).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (21) и (38), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (21) и (38).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (7) и (19), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (7) и (19).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (38) и (33), предпочтительно (34), (35) и/или (36), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (38) и (33), предпочтительно (34), (35) и/или (36).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (49), предпочтительно (50) и (21), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (49), предпочтительно (50) и (21).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (49), предпочтительно (50), (20) и (21), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней(49), предпочтительно (50), (20) и (21).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (49), предпочтительно (50), (20) и (21), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней(49), предпочтительно (50), (20) и (21).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (49), предпочтительно (50), (20), (38) и (21), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (49), предпочтительно (50), (20), (38) и (21).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (49), предпочтительно (50), (20), (33) и (21), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (49), предпочтительно (50), (20), (33) и (21).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (49), предпочтительно (50), (20), (38), (33) и (21), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (49), предпочтительно (50), (20), (38), (33) и (21).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (41), (40), и (19), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (41), (40) и (19).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (38), (4) и (19), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (38), (4), и (19).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (38), (4), (21) и (19), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (38), (4), (21) и (19).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (20), предпочтительно (20), (31) и (38), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (20), (31), (38).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (5), предпочтительно (5) и (24), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (5) и (24).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (1), предпочтительно (1) и (5), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (1) и (5).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (41), предпочтительно (40), (27), (28), (29), (31), (19) и (59), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (41), (40), (27), (28), (29), (31), (19) и (57).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в [комбинированной вакцине 1] эффективен для лечения и/или профилактики инфекций, вызываемых патогенами свиней (6), предпочтительно (6), (19), (38) и (58), или является иммунологически активным компонентом патогенов свиней (1) и (5).
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в комбинированной вакцине выбран из группы, включающей продукты: Enterisol Ileitis, Enterisol Ileitis FF, Enterisol SC-54, Enterisol SC-54 FF, Enterisol ERY-ALC, Ingelvac APP ALC, Ingelvac AR4, Ingelvac HP-1, Ingelvac HPE-1, Ingelvac M. hyo, Ingelvac PRRS MLV, Ingelvac PRRS ATP, Ingelvac PRV-G1, Reprocyc PRRS PLE, Reprocyc PLE, Tetguard™, Toxivac AD+E, Toxivac Plus Parsius (все продукты фирмы Boehringer Ingelheim, Сэнт Джозеф, Монтана, США), Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY+PARVO, Porcilis Ery, Porcilis Glasser, Porcilis Parvo, Porcilis Porcoli DF, Porcilis APP, Porcilis AR-T, Porcilis AR-T DF, Porcilis Porcoli, Porcilis Porcoli Diluvac forte, Porcilis PRRS, Porcilis Porcol 5, Porcilis Aujeszky, Porcilis Begonia Diluvac, Porcilis Begonia I.D.A.L., Porcilis Begonia Unisole, Porcilis M. hyo, Porcilis Atrinord, Myco Silencer BPM, Myco Silencer BPME, Myco Silencer ME, Myco Silencer M, Myco Silencer Once, Myco Silencer MEH, Rhinogen BPE, Rhinogen CTE 5000, Rhinogen CTSE, Score, Sow Вас E II, Sow Вас СЕ II, Sow Вас TREC, ProSystem CE, ProSystem RCE, ProSystem TREC, ProSystem Pillmune, ProSystem Rotamune с Imugan II, ProSystem Rota, ProSystem Rotamune KV, ProSystem TG-Emune Rota с Imugan II, ProSystem TGE/Rota, ProSystem TG-Emune с Imugen, ProSystem TGE, MaGESTIC 7, MaGESTIC 8, MaGESTic™ с Spur, MaGESTic 7 с Spur, MaGESTic 8 с Spur, End-FLUence с Imugen II, End-FLUence 2, PRRomiSE, PRV-Begonia с Diluvac Forte, Argus SC/ST, Strep Вас, Strep Вас с Imugen II, Colisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo (все продукты от фирмы Intervet Inc., Millsboro, DE, USA), Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvosuin, Progressis, Viraflu, Akipor 6.3, Jespur gl-, Jesflu gl- (все продукты от фирмы Merial LTD, Duluth, GA), ER ВАС PLUS, ER ВАС, ER ВАС PLUS/LEPTOFERM-5' ER ВАС Leptoferm-5, Farrowsure, Farrowsure B, FARROWSURE PLUS B, FARROWSURE PLUS, FARROWSURE PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE™, FLUSURE™ RTU, FLUSURE™/ER ВАС PLUS, FLUSURE™/ER ВАС PLus, FLUSURE™/RESPISURE, FLUSURE™/RESPISURE RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE/ER ВАС PLUS, FLUSURED/RespiSure 1 ONE/ER ВАС Plus, FLUSURE™/RESPISURE ONE, FLUSURED/RESPISURE 1 ONE, FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure Plus B, LITTERGUARD LT-C, LITTERGUARD LT, PleuroGuard 4, Pneumosuis III, Stellamune One, Stellamune Uno, Stellamune Once, Stellamune Mono, Stellamune Mycoplasma, Respisure One, Respisure, Respisure 1 ONE, Respisure 1 One/ER Вас Plus, Enduracell T, Zylexis (ранее называвшийся Baypamune), Atrobac 3, BratiVac, BratiVac-B, Leptoferm-5Parvo-Vac/Leptoferm-5, PR-Vac-Killed, PR-Vac, PR-Vac Plus™DD (все продукты от фирмы Pfizer Inc., Нью-Йорк, CHIA), Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend MH, Suvaxyn Mycoplasma, Suvaxyn Aujeszky Bartha+разбавитель, Suvaxyn Aujeszky Bartha+o/w, Suvaxyn Aujeszky-Flu, Suvaxyn Aujeszky 783+o/w, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-One, Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend APP, Suvaxyn RespiFend HPS, Suvaxyn RespiFend MH/HPS, Suvaxyn RespiFend MH, Suvaxyn AR/T/E, Suvaxyn EC-4, Suvaxyn E, Suvaxyn-E, Suvaxyn E-oral, Suvaxyn PLE, Suvaxyn PLE/PrV gpl-, Suvaxyn LE+B, Suvaxyn PLE+B, Suvaxyn PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn SIV, Suvaxyn SIV/Mh-one, Suvaxyn P, Suvaxyn PrV gpl-, Suvaxyn PCV-2 One Shot (все продукты от фирмы Fort Dodge Animal Health, Overland Park, Канзас, США (Уайет), SCOURMUNE, SCOURMUNE-C, SCOURMUNE-CR, AR-PAC-PD+ER, AR-PARAPAC+ER, M+Rhusigen, M+PAC, MaxiVac Excell3, MaxiVac H1N1, MaxiVac H3N2, MaxiVac-FLU, MaxiVac-M+, MaxiVac Excell, MaxiVac Excell 3, PARAPAC, PNEU РАС, PNEU PAC-ER, PNEU PAC+ER, PRV/Marker Gold, PRV/Marker Gold, PRV/Marker Gold-MaxiVac FLU, Rhusigen™, Gletvax 6, Covexin 8, M+РАС, Gletvax plus, M-Parapac™DDSS РАС (все продукты от фирмы Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, Нью-Джерси, США), AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLASSER, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS (все продукты от фирмы Laboratorios Hipra S.A., Amer, Гирона, Испания), Clostricol, Coliporc Plus, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART+EP, RESPIPORC FLU, Respiporc M. HYO 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35 (все продукты от фирмы IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Торнау, Германия), Mypravac Suis, (фирма Albrecht GmbH, Германия), Haemo Shield P, Parapleuro Shield P, Parapleuro Shield P+BE, Rhinicell FD, Rhini Shield™ TX4, Prefarrow Shield 9, Prefarrow Strep Shield, Clostratox BCD, Clostratox C, Clostratox Ultra С 1300, Porcine Ecolizer 3+C, Porcine Pili Shield ™D+C, Porcine Pili Shield ™nDDPorcine Ecolizer 3, Ery Serum™DDEry Shield™DDEry Vac Oral, Ery Shield™+L5, PanSTAR™ Ery, Erycell™Parvo Shield E, Parvo Shield L5E, Parvo Shield L5, Parvo Shield, Para Shield, PneumoSTAR SIV, PneumoSTAR™ Myco, Lepto Shield™ 5, Myco Shield™ DSalmo Shield 2, Salmo Shield Live, Amitox Tet™DDC. Perfingens Type A Toxoid (все продукты от фирмы Novartis Animal Health, Базель, Швейцария), Nitro-Sal (фирма Akro), или какой-либо антиген, включенный в описанные выше композиции. В другом варианте, если антиген PCV2 уже содержится в какой-либо из этих вакцин, (i) антиген PCV2, согласно описанному в настоящем изобретении, добавляют к какой-либо из этих композиций/антигенов, или (ii) антиген PCV2, содержащийся в какой-либо из этих вакцин, замещают антигеном PCV2, согласно описанному в настоящем изобретении.
Согласно еще одному объекту настоящего изобретения дополнительный иммунологически активный компонент в комбинированной вакцине выбран из группы, включающей продукты: Enterisol Ileitis, Enterisol Ileitis FF, Enterisol SC-54, Enterisol SC-54 FF, Enterisol ERY-ALC, Ingelvac APP ALC, Ingelvac AR4, Ingelvac HP-1, Ingelvac HPE-1, Ingelvac M. hyo, Ingelvac PRRS MLV, Ingelvac PRRS ATP, Ingelvac PRV-G1, Reprocyc PRRS PLE, Reprocyc PLE, Tetguard™, Toxivac AD+E, Toxivac Plus Parsius (все продукты фирмы Boehringer Ingelheim, Сэнт Джозеф, Монтана, США), Circovent, Porcilis Coli, Porcilis ERY+PARVO, Porcilis Ery, Porcilis Glasser, Porcilis Parvo, Porcilis Porcoli DF, Porcilis APP, Porcilis AR-T, Porcilis AR-T DF, Porcilis Porcoli, Porcilis Porcoli Diluvac forte, Porcilis PRRS, Porcilis Porcol 5, Porcilis Aujeszky, Porcilis Begonia Diluvac, Porcilis Begonia I.D.A.L., Porcilis Begonia Unisole, Porcilis M. hyo, Porcilis Atrinord, Myco Silencer BPM, Myco Silencer BPME, Myco Silencer ME, Myco Silencer M, Myco Silencer Once, Myco Silencer MEH, Rhinogen BPE, Rhinogen CTE 5000, Rhinogen CTSE, Score, Sow Вас E II, Sow Вас СЕ II, Sow Вас TREC, ProSystem CE, ProSystem RCE, ProSystem TREC, ProSystem Pillmune, ProSystem Rotamune с Imugan II, ProSystem Rota, ProSystem Rotamune KV, ProSystem TG-Emune Rota с Imugan II, ProSystem TGE/Rota, ProSystem TG-Emune с Imugen, ProSystem TGE, MaGESTIC 7, MaGESTIC 8, MaGESTic™ с Spur, MaGESTic 7 с Spur, MaGESTic 8 с Spur, End-FLUence с Imugen II, End-FLUence 2, PRRomiSE, PRV-Begonia с Diluvac Forte, Argus SC/ST, Strep Вас, Strep Вас с Imugen II, Colisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo (все продукты от фирмы Intervet Inc., Millsboro, DE, USA), Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac, Parvosuin, Progressis, Viraflu, Akipor 6.3, Jespur gl-, Jesflu gl- (все продукты от фирмы Merial LTD, Duluth, GA), ER ВАС PLUS, ER ВАС, ER ВАС PLUS/LEPTOFERM-5' ER ВАС Leptoferm-5, Farrowsure, Farrowsure B, FARROWSURE PLUS B, FARROWSURE PLUS, FARROWSURE PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSURE™, FLUSURE™ RTU, FLUSURE™/ER ВАС PLUS, FLUSURE™/ER ВАС PLus, FLUSURE™/RESPISURE, FLUSURE™/RESPISURE RTU, FLUSURE™/RESPISURE-ONE /ER ВАС PLUS, FLUSURED/RespiSure 1 ONE/ER ВАС Plus, FLUSURE™/RESPISURE ONE, FLUSURED/RESPISURE 1 ONE, FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure Plus B, LITTERGUARD LT-C, LITTERGUARD LT, PleuroGuard 4, Pneumosuis III, Stellamune One, Stellamune Uno, Stellamune Once, Stellamune Mono, Stellamune Mycoplasma, Respisure One, Respisure, Respisure 1 ONE, Respisure 1 One/ER Вас Plus, Enduracell T, Zylexis (ранее называвшийся Baypamune), Atrobac 3, BratiVac, BratiVac-B, Leptoferm-5Parvo-Vac/Leptoferm-5, PR-Vac-Killed, PR-Vac, PR-Vac Plus™DD (все продукты от фирмы Pfizer Inc., Нью-Йорк, США), Suvaxyn МН One, Suvaxyn RespiFend MH, Suvaxyn Mycoplasma, Suvaxyn Aujeszky Bartha+разбавитель, Suvaxyn Aujeszky Bartha+o/w, Suvaxyn Aujeszky-Flu, Suvaxyn Aujeszky 783+o/w, Suvaxyn Ery, Suvaxyn Flu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-One, Suvaxyn Parvo ST, Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend APP, Suvaxyn RespiFend HPS, Suvaxyn RespiFend MH/HPS, Suvaxyn RespiFend MH, Suvaxyn AR/T/E, Suvaxyn EC-4, Suvaxyn E, Suvaxyn-E, Suvaxyn E-oral, Suvaxyn PLE, Suvaxyn PLE/PrV gpl-, Suvaxyn LE+B, Suvaxyn PLE+B, Suvaxyn PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn SIV, Suvaxyn SIV/Mh-one, Suvaxyn P, Suvaxyn PrV gpl-, Suvaxyn PCV-2 One Shot (все продукты от фирмы Fort Dodge Animal Health, Overland Park, Канзас, США (Уайет), SCOURMUNE, SCOURMUNE-C, SCOURMUNE-CR, AR-PAC-PD+ER, AR-PARAPAC+ER, M+Rhusigen, M+PAC, MaxiVac Excell3, MaxiVac H1N1, MaxiVac H3N2, MaxiVac-FLU, MaxiVac-M+, MaxiVac Excell, MaxiVac Excell 3, PARAPAC, PNEU РАС, PNEU PAC-ER, PNEU PAC+ER, PRV/Marker Gold, PRV/Marker Gold, PRV/Marker Gold-MaxiVac FLU, Rhusigen™, Gletvax 6, Covexin 8, M+РАС, Gletvax plus, M-Parapac™D DSS РАС (все продукты от фирмы Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, Нью-Джерси, США), AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLASSER, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS (все продукты от фирмы Laboratorios Hipra S.A., Amer, Гирона, Испания), Clostricol, Coliporc Plus, Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART+EP, RESPIPORC FLU, Respiporc M. HYO 1 SHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35 (все продукты от фирмы IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Торнау, Германия), Mypravac Suis, (фирма Albrecht GmbH, Германия), Haemo Shield P, Parapleuro Shield P, Parapleuro Shield P+BE, Rhinicell FD, Rhini Shield™ TX4, Prefarrow Shield 9, Prefarrow Strep Shield, Clostratox BCD, Clostratox C, Clostratox Ultra С 1300, Porcine Ecolizer 3+C, Porcine Pili Shield ™D+C, Porcine Pili Shield ™DDDPorcine Ecolizer 3, Ery Serum™DDEry Shield™DDEry Vac Oral, Ery Shield™+L5, PanSTAR™ Ery, Erycell™Parvo Shield E, Parvo Shield L5E, Parvo Shield L5, Parvo Shield, Para Shield, PneumoSTAR SIV, PneumoSTAR™ Myco, Lepto Shield™ 5, Myco Shield™ DSalmo Shield 2, Salmo Shield Live, Amitox Tet™DDC. Perfingens Type A Toxoid (все продукты от фирмы Novartis Animal Health, Базель, Швейцария), Nitro-Sal (фирма Akro), или какой-либо антиген, включенный в описанные выше композиции. В другом варианте, если антиген PCV2 уже содержится в какой-либо из этих вакцин, (i) антиген PCV2, согласно описанному в настоящем изобретении, добавляют к какой-либо из этих композиций/антигенов, или (ii) антиген PCV2, содержащийся в какой-либо из этих вакцин, замещают антигеном PCV2, согласно описанному в настоящем изобретении.
Составы
Важной задачей, решаемой в настоящем изобретении, является приготовление комбинированной вакцины (вакцин). Специалисту в данной области известны дополнительные компоненты, которые могут быть включены в указанную композицию (см., например, кн.: «Remington's Pharmaceutical Sciences)), 1990, 18-е изд., изд-во Mack Publ., Истон). Специалист может применять известные инъекционные физиологически приемлемые стерильные растворы. Для приготовления готового к применению раствора для парентеральной инъекции или инфузии могут быть легко применены водные изотонические растворы, например, физиологический раствор или соответствующие растворы белков плазмы. Фармацевтические композиции могут быть приготовлены в виде лиофилизированных или сухих препаратов, которые могут быть восстановлены с помощью известного инъекционного раствора непосредственно перед применением в стерильных цсловиях, например, в виде набора частей.
Кроме того, иммунногенные и вакцинные композиции настоящего изобретения могут включать один или несколько ветеринарно приемлемых носителей. В контексте настоящего изобретения к понятию «ветеринарно приемлемый носитель» относятся какие-либо растворители, дисперсионные среды, покрытия, адъюванты, стабилизирующие агенты, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические агенты, агенты задержки всасывания и др.
К разбавителям может относиться вода, солевой раствор, декстроза, этанол, глицерин и др. Изотонические агенты могут включать натрий хлорид, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу наряду с другими соединениями. Стабилизаторами среди прочих могут быть альбумин и соли щелочных металлов этилендиаминтетрауксусной кислоты.
Предпочтительными являются адъюванты, описанные выше. Иммунногенные композиции могут дополнительно включать один или несколько других иммуномодулирующих агентов, например, интерлейкинов, интерферонов или других цитокинов. Иммунногенные композиции могут также включать гентамицин и мертиолат. Хотя количества и концентрации адъювантов, применимых в контексте настоящего изобретения, могут быть легко определены специалистами в данной области, в настоящем изобретении рассмотрены композиции, включающие примерно от 50 мкг до примерно 2000 мкг адъюванта, предпочтительно примерно 250 мкг/мл дозы композиции вакцины. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения рассмотрены композиции вакцины, включающие примерно от 1 мкг/мл до примерно 60 мкг/мл антибиотиков, и более предпочтительно менее примерно 30 мкг/мл антибиотиков.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения комбинированная вакцина сначала высушивается. Если композиция сначала лиофилизируется или высушивается другими методами, затем, перед вакцинацией, указанная композиция переводится в водный раствор (например, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер - ФСБ) или неводные растворы (например, масляную эмульсию (на основе минерального масла или растительного/метаболизируемого масла в виде одинарной или двойной эмульсии), на основе алюминия, на основе адъюванта карбомера).
Дозировка и введение
Согласно настоящему изобретению эффективное количество комбинированной вакцины, введенной свиньям, предусматривает эффективный иммунитет в отношении микробиологических инфекций, вызванных PCV2 и по меньшей мере одного дополнительного патогена из числа перечисленных выше. Предпочтительные комбинации антигенов для лечения и профилактики микробиологических заболеваний у свиней перечислены выше.
Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения комбинированная вакцина вводится свиньям в количестве одной или двух доз с интервалом примерно 2-4 недели. Например, первое введение проводят животным в возрасте примерно от 2-3 недель до примерно 8 недель. Второе введение проводят в интервале примерно от 1 недели до примерно 4 недель после первой вакцинации. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения ревакцинацию проводят с интервалом от 3 до 12 месяцев после введения второй дозы. Введение последующих доз вакцины предпочтительно проводят через 6 месяцев или через год. В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения животных, вакцинированных вакцинируют в возрасте до 2-3 недель, следует ревакцинировать.
2
9
3
8
4
8
3
9
4
8
5
6
50
50
50
Количество комбинированной вакцины, проявляющей эффективность, зависит от ингредиентов вакцины и схемы введения. Обычно при применении инактивированного вируса или модифицированного живого вируса в комбинированной вакцине, количество вакцины, содержащей примерно от 10 до примерно 10 TCIDна дозу, предпочтительно примерно от 10 до примерно 10TCID на дозу, более предпочтительно, примерно от 10 до примерно 10 TCID на дозу. Обычно инактивированный антиген в норме используют в больших количествах по сравнению с живыми модифицированными вирусами. Обычно при использовании бактериального антигена в составе комбинированной вакцины, вакцина содержит примерно от 10 до примерно 10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на дозу, предпочтительно, примерно от 10до примерно 10 (КОЕ) на дозу, более предпочтительно примерно от 10 до примерно 10 (КОЕ) на дозу. Часть вакцин обычно вводят с антигеном, уровень которого составляет по меньшей мере 0,2 мкг антигена на дозу, предпочтительно примерно от 0,2 до примерно 400 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,3 до примерно 200 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,35 до примерно 100 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,4 до примерно 50 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,45 до примерно 30 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,6 до примерно 15 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 0,75 до примерно 8 мкг/дозу, еще более предпочтительно примерно от 1,0 до примерно 6 мкг/дозу, и еще более предпочтительно примерно от 1,3 до примерно 3,0 мкг/дозу. Например, уровень включения антигена, а именно антигена PCV ORF2, предпочтительно белка PCV2 ORF2, согласно настоящему изобретению, составляет примерно от 2 мкг до примерно 150 мкг, предпочтительно примерно от 2 мкг до примерно 60 мкг, еще более предпочтительно примерно от 2 мкг до примерно 50 мкг, еще более предпочтительно примерно от 2 мкг до примерно 40 мкг, еще более предпочтительно примерно от 2 мкг до примерно 30 мкг, еще более предпочтительно примерно от 2 мкг до примерно 25 мкг, еще более предпочтительно примерно от 2 мкг до примерно 20 мкг, еще более предпочтительно примерно от 4 мкг до примерно 20 мкг, и еще более предпочтительно примерно от 4 мкг до примерно 16 мкг.В случае комбинированной вакцины, которые включают (37), предпочтительно использовать по меньшей мере от 1 до 10 log, более предпочтительно, 5-10 log, и наиболее предпочтительно 6-8 log. В случае комбинированных вакцин, которые включают (41), предпочтительно использовать по меньшей мере от 1 до 10 log, более предпочтительно, 3-10 log, и наиболее предпочтительно 5-6 log.
Композиция согласно настоящему изобретению может быть введена внутрикожно, внутритрахеально или внутривлагалищно. Композиция предпочтительно может быть введена внутримышечно или интраназально. Более целесообразно применять фармацевтические композиции согласно описанному выше через внутривенную инъекцию или прямой инъекцией в ткань-мишень. Для системного применения предпочтительными являются внутривенное, внутрисосудистое, внутримышечное, интраназальное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, пероральное или интратекальное введение. Более локальное применение может быть эффективным при введении подкожно, внутрикожно, чрезкожно, внутрь сердца, внутридольковом, интрамедуллярном, внутрилегочном или непосредственно в подвергаемую лечению ткань или около нее (соединительную, костную, мышечную, нервную, эпителиальную ткань). В зависимости от желаемой длительности и эффективности лечения композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены один раз или несколько раз, могут быть периодическими, например, на суточной основе на протяжении нескольких суток, на основе недель или месяцев, причем дозы могут быть различными.
Способы лечения
Еще одним важным вариантом осуществления настоящего изобретения является способ профилактики или лечения заболеваний, вызываемых вирусом PCV2 и одним или несколькими патогенными микроорганизмами свиней, в котором антиген PCV2, предпочтительно белок PCV2 ORF2, согласно настоящему изобретению, и другие иммунологически активные компоненты, эффективные для лечения и/или профилактики инфекции, вызванной указанным дополнительным патогенным микроорганизмом свиней, вводят животному, нуждающемуся в этом, в соответствующих дозах. Согласно еще одному объекту настоящего изобретения указанный белок PCV2 ORF2 является частью антигенной композиции, согласно описанному выше. Таким образом, еще один объект настоящего изобретения относится к комбинированной вакцине, которая включает какую-либо из антигенных композиций, предусмотренных в настоящем изобретении, и которая включает белок PCV2 ORF2, а также другой иммунологически активный компонент, эффективный для лечения и/или профилактики инфекции, вызванной указанным другим патогенным микроорганизмом свиней.
Краткое описание фигур
Фиг.1 показывает схематическую структурную схему предпочтительной конструкции PCV2 ORF2 рекомбинантного бакуловируса.
Фиг.2а и 26 показывают схематические структурные схемы получения композиции по настоящему изобретению.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения
Приводимые ниже примеры представляют предпочтительные материалы и способы в соответствии с настоящим изобретением. Однако следует учитывать, что эти примеры приведены только для пояснения настоящего изобретения в качестве иллюстрации и никоим образом не ограничивают области охвата настоящего изобретения.
Пример 1
6
6
6
Настоящий пример сравнивает относительные уровни получения ORF2, используя способы настоящего изобретения, с уровнями, полученными способами, известными в предшествующем уровне техники. Каждую из четырех центрифужных колб объемом 1000 мл засевают клетками примерно в количестве 1,0×10 Sf+ клеток/мл в 300 мл среды для насекомых, не содержащей сыворотки, Excell 420 (фирма JRH Biosciences, Inc., Линекса, Канзас). Маточную культуру клеток идентифицируют в качестве исходной маточной суспензии SF+клеток (Spodoptera frugiperda), пассаж 19, Lot#Nl 12-095W. Клетки, использованные для получения исходной маточной суспензии SF+клеток, приобретают в фирме Protein Sciences Corporation, Inc., Мериден, Коннектикут. Линию клеток SF+для этого примера ограничивают пассажами 19-59. Другие пассажи могут быть использованы для целей настоящего изобретения, но для масштабирования процесса и получения большого количества продукта, предположительно по меньшей мере 19 пассажей могут потребоваться, а пассажи после 59 могут повлиять на экспрессию, хотя это не было изучено. Точнее, изначальные культуры клеток SF+, хранящихся в жидком азоте, выращивают в среде Excell 420 в виде суспензии в стерильных качалочных колбах при постоянном перемешивании. Культуры выращивают в 100-250 мл в центрифужных колбах с 25-150 мл среды Excell 420 без сыворотки. Если клетки размножают до плотности 1,0-8,0×10 клеток/мл, их разделяют и помещают в новые сосуды с плотностью высева 0,5-1,5×10 клеток/мл. Последующее размножение клеток проводят в центрифужных колбах объемом до 36 л или в биореакторе из нержавеющей стали объемом до 300 л в течение 2-7 суток при 25-29°C.
После засева колбы инкубируют при 27°C в течение 4 ч. Затем в каждую колбу засевают рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген PCV2 ORF2 (SEQ ID NO:4). Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген PCV2 ORF2, получают следующим образом: ген PCV2 ORF2 из североамериканского штамма PCV2 амплифицируют с помощью ПЦР для включения в свой состав 5'-последовательности Козака (SEQ ID NO:1) и 3' EcoRl сайт (SEQ ID NO:2), клонированные в векторе pGEM-T-Easy (фирма Promega, Мэдисон, Висконсин). Затем его последовательно иссекают и субклонируют в векторе переноса pVL1392 (фирма BD Biosciences Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния). Субклонированная часть в настоящем изобретении представлена последовательностью SEQ ID NO:7. Плазмиду pVL1392, содержащую ген PCV2 ORF2, обозначают N47-064Y и затем трансфецируют совместно с ДНК бакуловируса BaculoGold (фирма BD Biosciences Pharmingen) в клетки насекомых Sf+(фирма Protein Sciences, Мериден, Коннектикут) для получения рекомбинантного бакуловируса, содержащего ген PCV2 ORF2. Новую конструкцию, предусмотренную в настоящем изобретении, обозначают SEQ ID NO:8. Рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген PCV2 ORF2, выделяют в изолированном виде из бляшек и исходный вакцинный вирус (ИВВ) размножают в клетках линии SF+, разделяют на аликвоты и хранят при -70°C. Исходный вакцинный вирус позитивно идентифицируют в качестве бакуловируса PCV2 ORF2 методом PCR-RFLP, используя специфические бакуловирусные праймеры. Клетки насекомых, инфицированные бакуловирусом PCV2 ORF2 для выработки ИВВ или нарабатываемого вакцинного вируса (НВВ), экспрессируют антиген PCV2 ORF2, что подтверждается поликлональной сывороткой или моноклональными антителами в косвенном исследовании флюоресцирующих антител. Кроме того, идентичность бакуловируса PCV2 ORF2 подтверждают N-концевым аминокислотным секвенированием. ИВВ бакуловирус PCV2 ORF2 также анализируют на чистоту в соответствии с 9 C.F.R. 113.27 (с), 113.28 и 113.55. Каждый рекомбинантный бакуловирус, высеянный в центрифужную колбу, обладает варьирующими показателями разнообразия инфекции (РИ). Колбу №1 засевают 7,52 мл посевного 0,88 РИ, колбу №2 засевают 3,01 мл посевного 0,36 РИ, колбу №3 засевают 1,5 мл посевного 0,18 РИ, колбу №4 засевают 0,75 мл посевного 0,09 РИ. Схема последовательности операций, иллюстрирующая основные этапы с применением конструкции PCV2 ORF2 рекомбинантного вируса, приведена на фиг.1.
После засева бакуловирусом колбы инкубируют при 27±2°C в течение 7 суток и также перемешивают при 100 об/мин на протяжении указанного времени. Колбы оснащают вентилируемыми колбами для доступа воздуха. Образцы из каждой колбы отбирают каждые 24 ч на протяжении 7 суток. После экстракции каждый образец центрифугируют, разделяют осадок и надосадочную жидкость, которую затем фильтруют через мембрану с размером пор 0,45-1,0 мкм.
В получаемых образцах затем определяют количество ORF2 с помощью иммунно-ферментного метода ELISA. Иммуноферментный анализ ELISA проводят с применением очищенного иммобилизованного свиного антитела анти-РСУ2 Pab IgG Prot. G (разведение 1:250 в ФСБ), разведенным до 1:6000 в 0,05М карбонатном буфере (рН 9,6). Затем по 100 мкл антитела переносят в лунки микропланшетки, запечатывают и инкубируют в течение ночи при 37°C. Планшетку затем промывают три раза промывным раствором, включающим 0,5 мл Tween 20 (фирма Sigma, Сэнт-Луис, Монтана), 100 мл 10Х D-ФСБ (фирма Gibco Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) и 899,5 мл дистиллированной воды. Затем в каждую лунку вносят по 250 мкл блокирующего раствора (5 г обезжиренного сухого молока Карнейшн (фирма Nestle, Глэндейл, Калифорния) в 10 мл D-ФСБ QS до 100 мл дистиллированной водой) вносят в каждую лунку. На следующей стадии промывают исследуемую планшетку и затем добавляют предварительно разведенный антиген. Предварительно разведенный антиген получают путем добавления 200 мкл раствора для разведения (0,5 мл Tween 20 в 999,5 мл D-ФСБ) в каждую лунку в планшете для разведений. Образец затем разводят в пропорции 1:240 и 1:480, и по 100 мкл каждого из этих разведенных образцов затем добавляют в одну из верхних лунок в планшете для разведений (т.е. в одну верхнюю лунку вносят 100 мкл разведения 1:240, а в другую - 100 мкл разведения 1:480). Затем проводят серийные разведения в остальных лунках путем переноса 100 мкл по порядку из каждой лунки в следующую лунку на планшете. Содержимое каждой лунки перемешивают перед осуществлением следующего переноса. Исследуемые планшеты трижды промывают промывочным буфером. Затем планшет запечатывают и инкубируют в течение 1 ч при 37°C до проведения трехкратной промывки промывочным буфером. В качестве антитела для обнаружения применяют моноклональное антитело к PCV ORF2. Его разводят до пропорции 1:300 в растворе для разведения, и по 100 мкл разведенного антитела для обнаружения вносят в каждую лунку. Планшету затем запечатывают и инкубируют 1 ч при 37°C до проведения трехкратной промывки промывочным буфером. Затем готовят конъюгирующий разбавитель путем внесения нормальной сыворотки кролика (фирма Jackson Immunoresearch, West Grove, Пенсильвания) в раствор для разбавления до концентрации 1%. Конъюгирующее антитело козье анти-мышиное (H+1)-HRP (фирма Jackson Immunoresearch) разводят в конъюгирующем разбавителе до пропорции 1:10000. По 100 мкл разведенного конъюгирующего антитела затем вносят в каждую лунку. Планшетку затем запечатывают и инкубируют в течение 45 мин при 37°C, после чего трижды промывают промывочным буфером. По 100 мкл субстрата (пероксидазного субстрата ТМВ, фирма Kirkgaard and Perry Laboratories (фирма KPL), Gaithersberg, Мэриленд), смешанного с равным объемом пероксидазного субстрата В (фирма KPL), добавляют в каждую лунку. Планшетку инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем по 100 мкл раствора 1 н. HCL добавляют во все лунки для завершения реакции. Затем планшетку проводят через ридер ELISA. Результаты этого исследования представлены в табл.1 ниже.
Таблица 1
Сутки
Колба
ORF2 в осадке (мкг)
ORF2 в надосадочной жидкости (мкг)
3
1
47,53
12
3
2
57,46
22
3
3
53,44
14
3
4
58,64
12
4
1
43,01
44
4
2
65,61
62
4
3
70,56
32
4
4
64,97
24
5
1
31,74
100
5
2
34,93
142
5
3
47,84
90
5
4
55,14
86
6
1
14,7
158
6
2
18,13
182
6
3
34,78
140
6
4
36,88
146
7
1
6,54
176
7
2
12,09
190
7
3
15,84
158
7
4
15,19
152
Эти результаты показывают, что при продлении времени инкубирования экспрессия ORF2 в надосадке при центрифугировании клеток и сред больше, чем экспрессия в осадке от центрифугированных клеток и сред. Соответственно, продолжение осуществления экспрессии ORF2 в течение по меньшей мере 5 суток, и выделение этого белка из надосадочной жидкости лучше, чем продолжение экспрессии в течение менее 5 суток и выделение ORF2 из клеток, поскольку обеспечивается значительное повышение уровня формирования ORF2 и существенное улучшение предшествующих способов.
Пример 2
6
В настоящем примере приводят данные об эффективности настоящего изобретения, заявленного в формуле изобретения. Центрифужные колбы объемом 1000 мл засевают клетками Sf+ примерно в количестве 1,0×10клеток/мл в 300 мл среды Excell 420. Колбу затем инкубируют при 27°С и перемешивают при 100 об/мин. Затем колбу засевают 10 мл PCV2 ORF2/Bac р+6 (рекомбинантный бакуловирус, содержащий ген PCV2 ORF2, который выдержал 6 дополнительных пассажей в клетках насекомых Sf9), засеянных вирусом с показателем 0,1 РИ после 24 ч инкубирования.
Колбы затем инкубируют при 27°C в течение полных 6 суток. После инкубирования колбы центрифугируют и три образца получаемого надосадка собирают и инактивируют. Надосадочную жидкость инактивируют, доводя ее температуру до 37±2°C. К первому образцу в надосадочную жидкость добавляют 0,4 М раствор 2-бромэтиленамид гидробромида, который был циклизирован в 0,2 М бинарный этиленимин (БЭИ) в 0,3 н. NaOH, для получения конечной концентрации БЭИ равной 5 мМ. Во второй образец к надосадочной жидкости добавляют 10 мМ БЭИ. В третьем образце к надосадочной жидкости не добавляют БЭИ. Образцы затем постоянно перемешивают в течение 48 ч. Добавляют 1,0 М раствор натрия тиосульфата для получения конечной минимальной концентрации 5 мМ для нейтрализации какого-либо остаточного БЭИ. Количество ORF2 в каждом образце затем подсчитывают, используя ту же методику ELISA, которая описана в примере 1. Результаты представлены в табл.2 ниже.
Таблица 2
Образец
ORF2 в надосадке (мкг)
1
78,71
2
68,75
3
83,33
Это пример показывает, что нейтрализация с помощью БЭИ не разрушает или не удаляет значительных количеств рекомбинантного белкового продукта PCV2 ORF2. Это подтверждается тем обстоятельством, что нет большой потери ORF2 в надосадке из-за БЭИ или повышенных температур. Специалисты в данной области могут установить, что выделенный ORF2 является стабильным белковым продуктом.
Пример 3
5
Настоящий пример показывает, что в настоящем изобретении возможно перейти от мелкомасштабного получения рекомбинантного PCV2 ORF2 к крупномасштабному получению рекомбинантного PCV2 ORF2. Клетки SF+в количестве 5,0×10 клеток/мл в 7000 мл среды ExCell 420 высевают в биореактор Applikon объемом 20000 мл. Среду с клетками затем инкубируют при 27°C и перемешивают при 100 об/мин в течение последующих 68 ч. Через 68 ч 41,3 мл PCV2 ORF2 бакуловируса MSV+3 вносят в 7000 мл среды ExCell 420. Полученную смесь затем вносят в биореактор. В последующие 7 суток смесь инкубируют при 27°C и перемешивают при 100 об/мин Образцы из биореактора экстрагируют каждые 24 ч, начиная с 4-х суток после инфицирования и каждый образец центрифугируют. Надосадок образцов сохраняют и затем подсчитывают количество ORF2, используя SDS-PAGE денситометрию. Результаты представлены в табл.3 ниже.
Таблица 3
Сутки после
ORF2 в надосадке (мкг/мл)
инъекции
4
29,33
5
41,33
6
31,33
7
60,67
Пример 4
В настоящем примере исследуют эффективность семи созданных вакцин PCV2, а также определяют параметры эффективности после заражения вирулентным штаммом вируса PCV2. Сто восемь (108) поросят, рожденных через кесарево сечение и не получивших молозиво (cesarean derived colostrum deprived - CDCD), в возрасте 9-14 суток рандомизируют по девяти группам одинаковой численности. В табл.4 приведена общая схема эксперимента для данного примера.
Таблица 4
Общая схема эксперимента
Группы
№№
Лечение
Сутки
KLH/ICFA
Контрольное
Аутопсия
свиней
лечения
на 21 и 27
заражение
на 49
сутки
вирулентным
сутки
вирусом
PCV2 на 24
сутки
1
12
PCV2 вакцина №1 - (vORF2 16 мкг)
0
+
+
+
2
12
PCV2 вакцина №2 - (vORF2 8 мкг)
0
+
+
+
3
12
PCV2 вакцина №3 - (vORF2 4 мкг)
0
+
+
+
4
12
PCV2 вакцина №4 - (rORF2 16 мкг)
0
+
+
+
5
12
PCV2 вакцина №5 - (rORF2 8 мкг)
0
+
+
+
6
12
PCV2 вакцина №6 - (rORF2 4 мкг)
0
+
+
+
7
12
PCV2 вакцина №7 - (убитые клетки с вирусом)
0
+
+
+
8
12
Без вакцины - контрольное заражение
N/A
+
+
+
9
12
Без вакцины - группа строго отрицательные контроли
N/A
+
+
vORF2=выделенный вирусный ORF2, rORF2=рекомбинантный бакуловирус, экспрессирующий ORF2, убитые клетки с вирусом=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Животные в семи группах (группы 1-7) получают дозы полипептида PCV2 ORF2, животные в одной из групп представляют группу контрольного заражения и не получают PCV2 ORF2, а животные в еще одной группе представляют группу строгого отрицательного контроля и также не получают PCV2 ORF2. В О сутки животных в группах 1-7 обрабатывают назначенными вакцинами. Поросята в группе 7 получают повторную вакцинацию на 14 сутки. Наблюдают за поросятами для выявления неблагоприятных состояний и побочных реакций от инъекций после вакцинации и на 19 сутки поросят переводят на вторую стадию исследования. На второй стадии исследования животных в группах №№1-8 содержат по группам в одном здании, а группу 9 содержат в отдельном здании. Все свиньи получают гемоцианин моллюска блюдечка (ГМБ)/неполный адъювант Фрейнда (НАФ) на 21 и 27 сутки и на 24 сутки, животных в группах 1-8 заражают вирулентным вирусом PCV2.
До и после заражения отбирают образцы крови для серологического исследования PCV2. После заражения определяют массу тела животных для определения среднесуточного привеса, описывают клинические симптомы, а также отбирают образцы смывов из носа для определения истечения через нос PCV2. На 49 сутки всех выживших свиней забивают и вскрывают, подсчитывают повреждения легких и отдельные ткани консервируют в формалине для последующего иммуногистохимического исследования.
Материалы и методы
Исследование с частично слепой вакцинацией-заражением проводят на свиньях, рожденных через кесарево сечение и не получивших молозиво, в возрасте 9-14 суток на 0 сутки. Свиноматок включают в исследование, если титр PCV2 по данным иммуноферментного анализа составляет <1:1000. Кроме того, по серологическому статусу свиноматок получают от PRRS-отрицательного поголовья. Двадцать восемь свиноматок (28) исследуют на серологический статус PCV2. У четырнадцати свиноматок (14) титр PCV2 составляет <1000, и их переводят в место первого исследования. Сто десять поросят (110), рожденных с применением кесарева сечения, включают в настоящее исследование на -4 сутки. На -3 сутки 108 CDCD свиней на первой стадии исследования взвешивают, маркируют ушной биркой, фиксируют массу тела и рандомизируют по группам с 1 по 9, согласно указанному выше в табл.4. Если каких-либо животных, соответствующих критериям для включения в исследование, включают в настоящее исследование, а позднее по каким-либо причинам из этого исследования исключают, исследователь и консультант принимают решение, использовать ли полученные по этим животным данные для заключительного анализа. Дату исключения из исследования ранее включенных в нее поросят и причину исключения документируют.Сначала не было исключенных свиноматок. В общей сложности 108 свиней из имеющихся ПО свиней рандомизированно распределяют в 9 групп на -3 сутки. Двух самых маленьких свиней (№№17 и 19) не включают в группу, и они являются запасными. При проведении курса исследования несколько животных выбывает: свинья №82 (группа 9) на -1 сутки, свинья №56 (группа 6) на 3 сутки, свинья №53 (группа 9) на 4 сутки, свинья №28 (группа 8) на 8 сутки, свинья №69 (группа 8) на 7 сутки и свинья №93 (группа 4) на 9 сутки были найдены мертвыми до проведения заражения. Этих шестерых свиней не включают в итоговые результаты исследования. Свинью №17 (одно из запасных животных) включают в группу 9. Оставшуюся свинью №19 исключают из исследования.
Составы, введенные животным каждой группы, являются следующими: Животным в группе 1 вводят 1 мл вирусного ORF2 (vORF2) с 16 мкг ORF2/4w. Для этого смешивают 10,24 мл вирусного ORF2 (256 мкг/25 мкг/мл=10,24 мл vORF2) с 3,2 мл 0,5% карбопола и 2,56 мл фосфатно-солевого буфера при рН 7,4. В результате получают 16 мл состава для группы 1. Животным в группе 2 вводят 1 мл vORF2 с 8 мкг vORF2/мл. Для этого смешивают 5,12 мл vORF2 (128 мкг/25 мкг/мл=5,12 мл vORF2) с 3,2 мл 0,5% карбопола и 7,68 мл фосфатно-солевого буфера при рН 7,4. В результате получают 16 мл состава для группы 2. Животным в группе 3 назначают 1 мл vORF2 с 4 мкг vORF2/мл. Для этого смешивают 2,56 мл vORF2 (64 мкг/25 мкг/мл=2,56 мл vORF2) с 3,2 мл 0,5% карбопола и 10,24 мл фосфатно-солевого буфера при величине рН 7,4. В результате получают 16 мл состава для группы 3. Животным в группе 4 вводят 1 мл рекомбинантного ORF2 (rORF2) с 16 мкг КЖР2/мл. Для этого смешивают 2,23 мл rORF2 (512 мкг/230 мкг/мл=2,23 мл rORF2) с 6,4 мл 0,5% карбопола и 23,37 мл фосфатно-солевого буфера при величине рН 7,4. В результате получают 32 мл состава для группы 4. Животным в группе 5 вводят 1 мл rORF2 с 8 мкг rORF2/Mn. Для этого смешивают 1,11 мл rORF2 (256 мкг/230 мкг/мл=1,11 мл rORF2) с 6,4 мл 0,5%) карбопола и 24,49 мл фосфатно-солевого буфера при величине рН 7,4. В результате получают 32 мл состава для группы 5. Животным в группе 6 вводят 1 мл rORF2 с 8 мкг rORF2Avni. Для этого смешивают 0,56 мл rORF2 (128 мкг/230 мкг/мл=0,56 мл rORF2) с 6,4 мл 0,5% карбопола и 25,04 мл фосфатно-солевого буфера при величине рН 7,4. В результате получают 32 мл состава для группы 6. Животным в группе 7 вводят 2 мл PCV2 вакцины полностью убитых клеток (PCV2 KV) с MAX PCV2 KV. Для этого смешивают 56 мл PCV2 KV с 14 мл 0,5%) карбопола. В результате получают 70 мл состава для группы 7. В заключении животным в группе 8 вводят KLH в количестве 0,5 мкг/мл или 1,0 мкг/мл на 2 мл дозы. Для этого смешивают 40,71 мл KLH (7,0 мкг белка/мл при 0,5 мкг/мл=570 мл (7,0 мкг/мл)(х)=(0,5)(570 мл)), 244,29 мл фосфатно-солевого буфера при величине рН 7,4, и 285 мл адъюванта Фрейнда. В табл.5 представляют по времени ключевые активности, описанные в данном примере.
Таблица 5
Изучение активности
Сутки исследования
Изучение активности
-4, 0 до 49
Анализ общего состояния здоровья и проявления клинических симптомов.
-3
Взвешивание. Рандомизирование по группам. Отбор образцов крови у всех свиней.
0
Оценка здоровья. Вводят IVP №№1-7 в группы 1-7 соответственно.
0-7
Осмотр свиней для выявления побочных реакций инъекции.
14
Повторная иммунизация свиней в группе 7 вакциной PCV2 №7. Образцы крови берут у всех свиней.
14-21
Осмотр свиней группы №7 для выявления побочных реакций инъекции.
16-19
Обработка всех свиней антибиотиками (данные отсутствуют).
19
Свиней переводят с первого места исследования на второе место исследования.
21
Группы 1-9, обработанные KLH/ICFA.
24
Отбирают образцы крови и смывы из носа у всех свиней. Взвешивание всех свиней. Животных в группах №№1-8 заражают PCV2.
25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43,45,47
Взятие мазков из носа у всех свиней.
27
Группы 1-9, обработанные KLH/ICFA.
31
Образцы крови берут у всех свиней.
49
Отбирают образцы крови и смывы из носа у всех свиней. Взвешивают всех свиней. Вскрывают всех свиней. Отмечают макроскопические поражения, уделяя особое внимание желтухе и язвам желудка. Оценивают повреждения легких. Сохраняют свежие и фиксированные в формалине образцы тканей. Заканчивают прижизненную фазу исследования.
После завершения прижизненной стадии исследования, фиксированные в формалине образцы тканей патолог исследует методом иммунногистохимии для выявления антигена PCV2, образцы крови оценивают серологически на наличие PCV2, смывы из носа оценивают на выделение PCV2, а с 24 по 49 сутки определяют среднесуточный привес.
В первом месте проведения исследования животных содержат в отдельных клетках в пяти комнатах с момента рождения до примерного возраста 11 суток (примерно нулевые сутки исследования). Все комнаты идентичны по планировке и заполнены расположенными друг над другом отдельными стальными клетками с подогревом, причем подачу фильтрованного воздуха осуществляют в каждый отдельный блок. Каждая комната имеет отдельный обогрев и вентиляцию, что предотвращает перекрестное заражение воздуха между комнатами. Животных содержат в двух разных зданиях в месте проведения второго исследования. Группу №9 (группа строгого отрицательного контроля) содержат отдельно в переделанном здании для откорма животных. Каждую группу содержат в отдельном загоне (11-12 свиней в загоне) и в каждом загоне предусмотрено примерно 3,0 квадратных фута на свинью. Каждый загон находится на приподнятой доске с пластиковым настилом. Яма под загоном служит резервуаром для экскрементов и отходов. Каждое здание обладает отдельными системами подогрева и вентиляции, что уменьшает вероятность перекрестного заражения воздуха между зданиями.
В первом месте исследования поросят кормят специально составленной молочной смесью, начиная с рождения до примерного возраста 3 недели. Всех поросят кормят твердым специально замешанным кормом с 19 суток (примерно с возраста 4 ½ недели). Во втором месте исследования всех поросят кормят по потребности обычным коммерческим кормом немедицинского назначения, соответствующим их возрасту и массе. В обоих местах исследования воду также предоставляют по потребности.
Всем исследуемым свиньям дают витамин Е в 2 сутки, вводят инъекцией железо в 1 сутки и продукт NAXCEL (1,0 мл внутримышечно в разные бедра) на 16, 17, 18 и 19 сутки. Кроме того, свинье №52 (группа 9) вводят инъекцией железо на 3 сутки, свинье №45 (группа 6) вводят инъекцией железо на 11 сутки, свинье №69 (группа 8) вводят продукт NAXCEL на 6 сутки, свинье №74 (группа 3) вводят дексаметазон и пенициллин на 14 сутки, свинье №51 (группа 1) вводят дексаметазон и пенициллин на 13 сутки и продукт NAXCEL на 14 сутки по различным медицинским показаниям.
В обоих местах проведения исследования свиней содержат под ветеринарным контролем. Оценку здоровья животных проводят на 0 сутки и оставляют запись в карточке регистрации медицинского состояния. Отмечают, что все животные обладают хорошим здоровьем и состоянием упитанности перед вакцинацией, что было определено на нулевые сутки наблюдения. Также отмечают, что все животные обладали хорошим здоровьем и состоянием упитанности перед заражением. Туши и ткани ликвидируют вытапливанием сала. Итоговое расположение исследуемых животных записывают в карту размещения животных.
В 0 сутки свиньи, распределенные по группам 1-6, получают по 1,0 мл вакцин PCV2 1-6, соответственно, внутримышечно в левую область шеи, используя люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу. Свиньям, помещенным в группу 7, вводят внутримышечно по 2,0 мл вакцины PCV2 №7 в левую область шеи, используя люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу. На 14 сутки свиньям, помещенным в группу 7, вводят внутримышечно по 2,0 мл вакцины PCV2 №7 в правую область шеи, используя люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу. На 21 сутки всем исследуемым свиньям вводят внутримышечно по 2,0 мл KLH/ICFA в правое бедро, используя стерильный люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу. На 27 сутки всем исследуемым свиньям вводят по 2,0 мл KLH/ICFA в левое бедро, используя стерильный люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу.
На 24 сутки свиньям, помещенным в группы 1-8, вводят внутримышечно по 1,0 мл материала для заражения PCV2 ISUVDL в левую область шеи, используя люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу. Дополнительно по 1,0 мл того же материала вводят интраназально каждой свинье (по 0,5 мл в каждую ноздрю), используя стерильный люэровский шприц объемом 3,0 мл и носовую канюлю.
Исследуемых свиней осматривают на - 4 сутки и ежедневно на 0-19 сутки для общей оценке здоровью и побочных эффектов. Наблюдения вносят в карту клинических наблюдений. Всех свиней осматривают с 0 по 7 сутки, а животных в группе 7 дополнительно осматривают на 14-21 сутки для контроля реакций в местах инъекций. Среднесуточный привес определяют взвешиванием каждой свиньи на градуированных весах на - 3, 24 и 49 сутки, или в те сутки, когда после заражения свинью обнаружили мертвой. Массу тела заносят в карту контроля массы тела. На - 3 сутки массу тела свиней фиксируют перед рандомизированием. Массу тела на 24 и 49 сутки используют для определения среднесуточного прироста у каждой свиньи в эти временные точки. Для свиней, умерших после заражения ранее 49 суток среднесуточный прирост определяют с 24 суток по сутки смерти.
Для определения серологии PCV2 цельную венозную кровь отбирают у каждой свиньи из орбитального венозного синуса на -3 и 14 сутки. У каждого поросенка берут кровь из орбитального венозного синуса, для чего вставляют стерильную капиллярную трубку в медиальный угол глазной щели и отбирают примерно 3,0 мл цельной крови в пробирку для отделения сыворотки объемом 4,0 мл. На 24, 31 и 49 сутки цельную венозную кровь от каждой свиньи отбирают из передней полой вены, используя стерильную 18g × 1 ½" иглу Vacutainer (иглу-бабочку с гибким катетером и люер-адаптером фирмы Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, Нью-Джерси), держатель иглы Vacutainer и пробирку для отделения сыворотки объемом 13 мл. Образцы крови в каждой временной точке отбора отмечают в карте сбора образцов. Кровь в каждой пробирке для отделения сыворотки сворачивается, после чего пробирку центрифугируют и сыворотку собирают. Отобранную сыворотку переносят в стерильную пробирку с колпачком и хранят при -70±10°C до последующего исследования. Сотрудники фирмы BIVI-R&D анализируют образцы на наличие антител PCV2. У свиней ежедневно с 20 по 49 сутки наблюдают клинические симптомы, а наблюдения заносят в карту клинического наблюдения.
Для определения истечения PCV2 из носа на 24, 25 и затем по четным дням исследования, а также на 49 сутки, каждой свинье вставляют стерильный дарконовый тампон либо в правую, либо в левую ноздрю (один тампон на свинью) в максимально возможных асептических условиях, проворачивают в течение нескольких секунд и затем удаляют. Каждый тампон затем переносят в отдельную стерильную пробирку со съемным колпачком, содержащую 1,0 мл среды ЕМЕМ с 2% IFBS, 500 Ед./мл пенициллина, 500 мкг/мл стрептомицина и 2,5 мкг/мл фунгизона. Тампон извлекают из пробирки, пробирку с колпачком запечатывают и соответственно маркируют номером животного, номером исследования, датой отбора материала, датой исследования и надписью «смыв из носа». Запечатанные пробирки с колпачком хранят при -40±10°C до транспортировки на льду в течение ночи на фирму BIVI-St. Joseph. Данные о смывах из носа заносят в форму сбора образцов смывов из носа. На фирме BIVI-R&D проводят количественное изучение выделяемого вируса PCV2 из образцов смывов из носа. Результаты выражают в десятичных логарифмах (logio). Величину 1,3 log или меньше оценивают в качестве отрицательной, а величину больше 1,3 log оценивают в качестве положительной.
Павших свиней (№№28, 52, 56, 69, 82 и 93) в первом месте проведения исследования вскрывают в той степени, которая необходима, чтобы поставить диагноз. Макроскопические поражения учитывают, а образцы тканей от этих свиней не берут. Во втором месте проведения исследования свиней, павших на 49-е сутки (№№45, 23, 58, 35), свиней, обнаруженных павшими на 49-е сутки (№№2, 43), и забитых свиней на 49-е сутки, вскрывают. Отмечают какие-либо крупные повреждения, подсчитывают процент поврежденных долей легких и записывают полученные данные в форму результатов вскрытия.
От каждой из 103 вскрытых свиней, забитых во втором месте проведения исследования, берут образцы тканей миндалин, сердца, печени, кишечных лимфатических узлов, почек и паховых лимфатических узлов, помещают в отдельный контейнер с 10% формалином в буфере, а другие такие же образцы тканей от тех же органов помещают в контейнеры Whirl-рак (фирма M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Великобритания), и каждый контейнер Whirl-pak помещают на лед. На каждый контейнер наносят соответствующую метку. Собранные образцы записывают в форму результатов вскрытия. В заключении фиксированные в формалине образцы тканей и форму запроса на диагностику отправляют на иммунногистохимическое исследование. Иммунногистохимическое исследование проводят в соответствии со стандартными лабораторными методиками ISU получения образцов, приготовления образцов и срезов и окрашивания. Свежие ткани, обложенные пакетами со льдом, направляют в Study Monitor для хранения (-70°±10°C) и возможного последующего применения. Фиксированные формалином ткани исследует патологоанатом для выявления PCV2 с помощью иммунногистохимического анализа, и их оценивают по следующей системе: 0=окрашивания нет, 1=слабое положительное окрашивание в нескольких местах, 2=умеренное положительное окрашивание во многих местах, и 3=обильное положительное окрашивание, диффундирующее сквозь ткань. Из-за того, что патологоанатом не может уверенно отличить паховые лимфоузлы от брыжеечных лимфоузлов, результаты по этим тканям просто обозначают «лимфатическими узлами» и заключительная оценка означает наивысший показатель для каждой из двух тканей у одного животного.
Результаты
Результаты этого примера приведены ниже. Отмечают, что одна свинья из группы 9 пала на 0 сутки, и еще пять свиней пало после вакцинации (1 свинья из группы 4, 1 свинья из группы 6, одна свинья из группы 8 и 1 свинья из группы 9). Вскрытие после падежа показывает, что все шесть животных пали из-за инфекций, которые не связаны с вакцинацией или PMWS. Кроме того, ни в одной из групп не обнаружено побочных действий или реакций в месте инъекции.
Результаты среднесуточного привеса по группам (ССПГ) показаны ниже в табл.6. В группе №9 (строгого отрицательного контроля) величина среднесуточного прироста наивысшая (1,06±0,17 фунтов/сутки), затем следует величина среднесуточного прироста в группе 5 (0,94±0,22 фунтов/сутки), в которой животным вводят одну дозу, составляющую 8 мкг rORF2. В группе №3, в которой животным вводят одну дозу, составляющую 4 мкг vORF2, установлен наименьший суточный прирост (0,49±0,21 фунты/сутки), затем следует группа №7 (0,50±0,15 фунты/сутки), в которой животным вводят 2 дозы убитой вакцины.
Таблица 6
Результаты среднесуточного привеса по группам (ССПГ)
Группа
Лечение
N
ССПГ - фунты/сутки (сутки 24-49) или по свиньям, павшим до 29 суток
1
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
12
0,87±0,29 фунты/сутки
2
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
0,70±0,32 фунты/сутки
3
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
12
0,49±0,21 фунты/сутки
4
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
11
0,84±0,30 фунты/сутки
5
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
0,94±0,22 фунты/сутки
6
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
11
0,72±0,25 фунты/сутки
7
KV (2 дозы)
12
0,50±0,15 фунты/сутки
8
Контрольные заражения
10
0,76±0,19 фунты/сутки
9
Строго отрицательные контроли
11
1,06±0,17 фунты/сутки
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Серологические результаты по PCV2 представлены ниже в табл.7. Установили, что животные во всех девяти группах были серо-отрицательными по PCV2 на - 3 сутки. На 14-е сутки в группах, в которых животные получали вакцины vORF2, у животных установили наивысшие титры, а именно от 187,5 до 529,2. Свиньи, получающие убитую вирусную вакцину, имеют несколько меньшие, но также очень высокие уровни титров, за ними по уровням титров следуют животные из групп, получающие вакцины rORF2. На этом сроке животные в группах 8 и 9 остаются серо-отрицательными. На 24 и 31 сутки свиньи, получающие вакцины vORF2, по-прежнему остаются серо-отрицательными, затем по результатам близко приближаются к животным из группы, в которой животные получали две дозы вакцины из убитых вирусов. Свиньи, получающие вакцины rORF2, вырабатывают более слабый иммунный ответ, а животные в группах №№8 и 9 остаются сорологически отрицательными. На 49-е сутки свиньи, получающие вакцину vORF2, 2 дозы убитой вирусной вакцины и самую низкую дозу rORF2, показывают самые сильные иммунные ответы. У свиней, получивших 16 мкг и 8 мкг вакцин rORF2, несколько выше титры по результатам иммуноферментного анализа по сравнению с титрами у животных при контрольном заражении. В группе №9 на 49 сутки животные проявляют сильный иммунный ответ.
Таблица 7
Сводка титров PCV2 по группам по результатам
Группа
Лечение
3 сутки
14 сутки
24 сутки
31 сутки**
49 сутки***
1
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
50,0
529,2
4400,0
7866,7
11054,5
2
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
50,0
500,0
3466,7
6800,0
10181,8
3
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
50,0
187,5
1133,3
5733,3
9333,3
4
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
50,0
95,5
1550,0
3090,9
8000,0
5
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
50,0
75,0
887,5
2266,7
7416,7
6
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
50,0
50,0
550,0
3118,2
10570,0
7
KV (2 дозы)
50,0
204,2
3087,5
4620,8
8680,0
8
Контрольные заражения
50,0
55,0
50,0
50,0
5433,3
9
Строго отрицательные контроли
50,0
59,1
59,1
54,5
6136,4
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=0RF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом,
вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
*Для количественных оценок при титре IFA≤100 допускают, что титр равен «12800».
**Сутки заражения.
***Сутки вскрытия.
Результаты пост-клинических исследований после заражения представлены ниже в табл.8. В представленную сводку результатов входит нарушенное поведение, нарушенное дыхание, кашель и диарея. Табл. 9 включает сводку результатов по общей частоте проявления клинических симптомов в разных группах, а табл.10 включает сводку результатов по смертности после заражения в разных группах. Самым распространенным клиническим симптомом, отмеченным в настоящем исследовании, является нарушение поведения, которое оценивают от умеренного до тяжелого летаргического. У свиней, получающих 2 пониженные дозы vORF2, получающих 16 мкг rORF2 и получающих 2 дозы вакцины KV, отмечают частоту встречаемости ≥27,3%. У свиней, получающих по 8 мкг rORF2, и в группе строгого отрицательного контроля не отмечают нарушения поведения. Ни у одной из свиней в настоящем исследовании не отмечают какого-либо нарушения дыхания. Отмечают, что кашель во всех группах отмечали редко (0-25%), то же касается диареи (0-20%). Ни один из отмеченных клинических симптомов не является патогномоничным для PMWS.
Средние показатели частоты встречаемости клинических симптомов различны в разных группах. В группах, получающих какие-либо вакцины vORF2, 16 мкг rORF2, 2 дозы вакцины KV и в группе контрольного заражения, наблюдают наивысшую частоту встречаемости всех клинических симптомов (≥36,4%). В группе строгого отрицательного контроля, группе введения 8 мкг rORF2 и группе введения 4 мкг rORF2, частота встречаемости всех клинических симптомов составляет 0%, 8,3% и 9,1% соответственно.
Средние показатели смертности по группам также варьируют. Группа, в которой животные получают 2 дозы вакцины KV, демонстрирует самую высокую смертность (16,7%), а в группах, в которых животные получают 4 мкг vORF2, 16 мкг rORF2 или 8 мкг rORF2, а также в группе строгого отрицательного контроля, смертность составляет 0%.
Таблица 8
Сводка результатов по проявлению симптомов, а именно нарушения поведения, нарушения дыхания, кашлю и диарее, в разных группах
Группа
Лечение
N
Нарушение поведения<sup>1</sup>
Нарушение поведения
Кашель<sup>3</sup>
Диарея<sup>4</sup>
1
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
12
2/12 (16,7%)
0/12 (0%)
3/12 (25%)
2/12 (16/7%)
2
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
4/12 (33,3%)
0/12 (0%)
1/12 (8,3%)
1/12 (8,3%)
3
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
12
8/12 (66,7%)
0/12 (0%)
2/12 (16,7%)
1/12 (8,3%)
4
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
11
3/11 (27,3%)
0/11 (0%)
0/11 (0%)
2/11 (18,2%)
5
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
0/12 (0%)
0/12 (0%)
1/12 (8,3%)
0/12 (0%)
6
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
11
1/11 (9,1%)
0/11 (0%)
0/11 (0%)
0/12 (0%)
7
KV (2 дозы)
12
7/12 (58,3%)
0/12 (0%)
0/12 (0%)
1/12 (8,3%)
8
Контрольные заражения
10
1/10 (10%)
0/10 (0%)
2/10 (20%)
2/10 (20%)
9
Строго отрицательные контроли
11
0/11 (0%)
0/11 (0%)
0/11 (0%)
0/11 (0%)
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в
соответствующей культуре клеток.
1
Общее число свиней в каждой группе, у которых проявляется какое-либо нарушение поведения по меньшей мере в течение одних суток.
2
Общее число свиней в каждой группе, у которых проявляется какое-либо нарушение дыхания по меньшей мере в течение одних суток.
3
Общее число свиней в каждой группе, у которых проявляется кашель по меньшей мере в течение одних суток.
4
Общее число свиней в каждой группе, у которых проявляется диарея по меньшей мере в течение одних суток.
Таблица 9
Сводка результатов по общему проявлению клинических симптомов
Группа
Лечение
N
Частота встречаемости свиней с клиническими симптомами<sup>1</sup>
Частота встречаемости
(%)
1
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
12
5
41,7%
2
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
5
41,7%
3
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
12
8
66,7%
4
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
11
4
36,4%
5
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
1
8,3%
6
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
11
1
9,1%
7
KV (2 дозы)
12
7
58,3%
8
Контрольные заражения
10
4
40%
9
Строгоотрицательные контроли
11
0
0%
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, вирус убитых целых клеток - вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
1
Общее число свиней в каждой группе, у которых проявляется какой-либо клинический симптом по меньшей мере в течение одних суток.
Таблица 10
Сводка результатов по смертности в разных группах после заражения
Группа
Лечение
N
Павшие свиньи после заражения
Смертность (%)
1
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
12
1
8,3%
2
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
1
8,3%
3
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
12
0
0%
4
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
11
0
0%
5
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
0
0%
6
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
11
1
9,1%
7
KV (2 дозы)
12
2
16,7%
8
Контрольные заражения
10
1
10%
9
Строго отрицательные контроли
11
0
0%
vORF2 - выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Результаты по выделению из носа PCV2 представлены ниже в табл.11. После заражения на 24 сутки одна свинья в группе №7 начинает выделять вирус PCV2 на 27 сутки. Ни в одной из других групп до 33 суток выделения не наблюдают.Объем истечении из носа отмечают с 35 по 45 сутки. Группы, в которых животные получают какую-либо из трех вакцин vORF2, и группы, в которых животные получают по 4 или 8 мкг rORF2, имеется самая низкая частота встречаемости выделения из носа вируса PCV2 (<9,1%). В группе контрольного заражения (группа №8) у животных наблюдают наивысшую частоту выделения из носа вируса PCV2 (80%), затем следует группа строгого отрицательного контроля (группа №9), в которой частота встречаемости составляет 63,6%.
Таблица 11
Сводка по результатам выделения вируса PCV2 из носа в разных группах
Группа
Лечение
N
Количество свиней, у которых по меньшей мере в течение одних суток выделяется вирус
Частота встречаемости
1
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
12
1
8,3%
2
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
1
8,3%
3
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
12
1
8,3%
4
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
11
2
18,2%
5
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
1
8,3%
6
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
11
1
9,1%
7
KV (2 дозы)
12
5
41,7%
8
Контрольные заражения
10
8
80%
9
Строго отрицательные контроли
11
7
63,6%
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, вирус убитых целых клеток - вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Сводка по группам частоты встречаемости желтухи, язв желудка, средних оценок легочных повреждений и частоты встречаемости легочных повреждений показаны ниже в табл.12. Шесть свиней пало в первом месте проведения исследования во время фазы пост-вакцинации настоящего исследования (группа №4, N=1; группа №6, N=1; группа №8, N=2; группа №9, N=2). У четырех из шести свиней имеются фибринозные повреждения в одной или нескольких полостях тела, у одной свиньи (группа №6) повреждения согласуются с инфицированием клостридиями, и еще у одной свиньи (группа №9) нет макроскопических повреждений. Ни у одной свиньи, павшей в период после вакцинации в настоящем исследовании, нет повреждений, связанных с PMWS.
Свиньи, павшие после заражения, и свиньи, подвергнутые эвтаназии на 49-е сутки, были вскрыты. Установлено на вскрытии, что желтуха и язвы желудка во всех группах отсутствуют. Средний процент повреждения легких в группе №9 самый низкий (0%), затем следует группа №1 (0,40±0,50%) и группа №5 (0,68±1,15%). В группах №№2, 3, 7 и 8 самый высокий средний процент повреждения легких (≥7,27%). В каждой из этих четырех групп имеется одна свинья, у которой процент повреждения легких составляет ≥71,5%, причем этот показатель является отклонением и превышает результаты, полученные для этих четырех групп. За исключением группы №9, в которой отмечают 0% повреждений легких, в оставшихся восьми группах величина легочных повреждений составляет<36%. Почти все отмеченные повреждения легких описывают в виде красных/пурпурных сливающихся повреждений.
Таблица 12
Сводка по группам частоты встречаемости желтухи, язв желудка, средних оценок легочных повреждений и частоты встречаемости легочных повреждений
Группа
Лечение
Желтуха
Язвы желудка
Средний процент повреждения легких
Частота встречаемости отмеченных повреждений легких
1
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
0/12 (0%)
0/12 (0%)
0,40±0,50%
10/12 (83%)
2
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
0/12 (0%)
0/12 (0%)
7,41±20,2%
10/12 (83%)
3
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
0/12 (0%)
0/12 (0%)
9,20±20,9%
10/12 (83%)
4
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
0/11 (0%)
0/11 (0%)
1,5±4,74%
4/11 (36%)
5
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
0/12 (0%)
0/12 (0%)
0,68±1,15%
9/12 (75%)
6
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
0/11 (0%)
0/11 (0%)
2,95±5,12%
7/11 (64%)
7
KV (2 дозы)
0/12 (0%)
0/12 (0%)
7,27±22,9%
9/12 (75%)
8
Контрольные заражения
0/10 (0%)
0/10 (0%)
9,88±29,2%
8/10 (80%)
9
Строго отрицательные контроли
0/11 (0%)
0/11 (0%)
0/11 (0%)
0/11 (0%)
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Сводка результатов по встречаемости в группах иммунногистохимически-позитивных тканей показана в табл.13. Группа 1 (vORF2 - 16 мкг) и группа 5 (rORF2 - 8 мкг) имеют самые низкие показатели иммунногистохимически-позитивных результатов (16,7%). Группа №8 (контрольные заражения) и группа №9 (строго отрицательные контроли) имеют самые высокие показатели иммунногистохимически-позитивных результатов, 90% и 90,9% соответственно.
Таблица 13
Сводка частоты встречаемости иммунногистохимически-позитивных тканей
Группа
Лечение
N
Количество свиней, у которых по меньшей мере одна ткань позитивна по вирусу PCV2
Частота встречаемости
1
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
12
2
16,7%
2
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
3
25,0%
3
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
12
8
66,7%
4
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
11
4
36,3%
5
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
12
2
16,7%
6
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
11
4
36,4%
7
KV (2 дозы)
12
5
41,7%
8
Контрольные заражения
10
9
90,0%
9
Строго отрицательные контроли
11
10
90,9%
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
После заражения группа №5, в которой животные получали одну дозу, составляющую 8 мкг антигена rORF2, превосходит другие шесть групп вакцинации. В группе №5 у животных самый высокий показатель суточного привеса (0,94±0,22 фунта/сутки), самая низкая частота встречаемости нарушения поведения (0%), второй самый низкий показатель частоты встречаемости кашля (8,3%), самая низкая частота встречаемости клинических симптомов в целом (8,3%), самый низкий показатель смертности (0%), самая низкая частота выделения из носа вируса PCV2 (8,3%), второй самый низкий показатель средней величины повреждения легких (0,68±1,15%) и самая низкая частота встречаемости вирус-позитивных тканей (16,7%). Группы, в которых животные получают различные уровни антигена rORF2, в целом превосходят группы, в которых животные получают различные уровни vORF2, а группа, в которой животные получают 2 дозы вакцины из убитых целых клеток, зараженных PCV2, проявляет наихудшие результаты. Табл. 14 и 15 приводят сводки данных по группам после заражения.
Таблица 14
Сводка данных по группам после заражения. Часть 1.
Группа
N
Лечение
Среднесуточный прирост массы тела (фунты в сутки)
Нарушенное поведение
Кашель
Средняя частота проявления клинических симптомов
1
12
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
0,87±0,29
2/12 (16,7%)
3/12 (25%)
41,7%
2
12
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
0,70±0,32
4/12 (33,3%)
1/12 (8,3%)
41,7%
3
12
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
0,49±0,21
8/12 (66,7%)
2/12 (16,7%)
66,7%
4
11
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
0,84±0,30
3/11 (27,3%)
0/11 (0%)
36,4%
5
12
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
0,94±0,22
0/12 (0%)
1/12 (8,3%)
8,3%
6
11
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
0,72±0,25
1/11 (9,1%)
0/11 (0%)
9,1%
7
12
KV (2 дозы)
0,50±0,15
7/12 (58,3%)
0/12 (0%)
58,3%
8
10
Контрольные заражения
0,76±0,19
1/10 (10%)
2/10 (20%)
40%
9
11
Строго отрицательные контроли
1,06±0,17
0/11 (0%)
0/11 (0%)
0%
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Таблица 15
Сводка данных по группам после заражения. Часть 2.
Группа
N
Лечение
Смертность
Выделение вируса из носа
Средний % повреждений легких
Частота встречаемости по меньшей мере одной ткани иммунногистохимически-позитивной на вирус PCV2
1
12
vORF2 - 16 мкг (1 доза)
8,3%
8,3%
0,40±0,50%
16,7%
2
12
vORF2 - 8 мкг (1 доза)
8,3%
8,3%
7,41±20,2%
25,0%
3
12
vORF2 - 4 мкг (1 доза)
0%
8,3%
9,20±20,9%
66,7%
4
11
rORF2 - 16 мкг (1 доза)
0%
18,2%
1,50±4,74%
36,3%
5
12
rORF2 - 8 мкг (1 доза)
0%
8,3%
0,68±1,15%
16,7%
6
11
rORF2 - 4 мкг (1 доза)
9,1%
9,1%
2,95±5,12%
36,4%
7
12
KV (2 дозы)
16,7%
41,7%
7,27±22,9%
41,7%
8
10
Контрольные заражения
10%
80%
9,88±29,2%
90,0%
9
11
Строго отрицательные контроли
0%
63,6%
0/11 (0%)
90,9%
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Результаты настоящего исследования показывают, что дальнейшие усилия по созданию вакцины должны быть сфокусированы на вакцине rORF2. В целом, установлено, что выделение из носа PCV2 происходит после заражения, а вакцинации вакциной PCV2 приводит к понижению выделений. Иммунногистихимический анализ отдельных лимфоидных тканей также является хорошим параметром для оценки эффективности вакцины, хотя больших различий по среднесуточному привесу, клиническим симптомам и макро-повреждениям между группами не выявлено. Настоящее исследование было осложнено тем обстоятельством, что чужеродный вирус PCV2 интродуцируется в некоторой точке в ходе настоящего исследования, что доказывается выделением из носа PCV2, PCV2 серо конверсией и иммунногистохимически-позитивными тканями в группе №9 (группа строгого отрицательного контроля).
Обсуждение
Семь вакцин PCV2 оценивают в настоящем исследовании, в которое включены три разных уровня доз антигена vORF2, введенных однократно на нулевые сутки, три разные уровня доз антигена rORF2, введенных однократно на нулевые сутки, и один дозовый уровень вакцины из убитых целых клеток с PCV2, введенных на 0 и 14 сутки. В целом, животные в группе №5, которые получают 1 дозу вакцины, содержащей 8 мкг антигена rORF2, показывают наилучшие результаты. В группе №5 наивысший среднесуточный привес, самая низкая частота встречаемости нарушений поведения, самая низкая частота встречаемости нарушений дыхания, вторая самая низкая частота возникновения кашля, самая низкая частота проявления общих клинических симптомов, самая низкая смертность, самая низкая степень выделения из носа PCV2, вторая самая низкая частота средних легочных повреждений и самая низкая частота встречаемости иммунногистохимически-позитивных тканей.
Интересно отметить, что животные в группе №4, получившие большую дозу антигена rORF2 по сравнению с антигеном группы №5, имеют результаты такие же или лучше, чем в группе №5. В группе №4 несколько ниже среднесуточный привес, выше частота встречаемости нарушенного поведения, повышенная частота встречаемости общих клинических симптомов, выше показатель выделения из носа PCV2, выше средний процент повреждения легких, выше доля иммунногистохимически-позитивных тканей по сравнению с группой №5. Статистический анализ этих данных, который мог бы подтвердить, что различия между этими двумя группами статистически не достоверны, не проводят, но отмечают тенденцию, выраженную в том, что результаты в группе №4 такие же, что и в группе №5.
После вакцинации 6 свиней пало в первом месте проведения исследования. Четыре из шести свиней относятся к группе №8 или №9. Ни у одной из шести свиней нет повреждений, связанных с PMWS, не было побочных эффектов, и все семь вакцин показали свою безопасность при введении свиньям в возрасте примерно 11 суток. В настоящем исследовании после вакцинации свиньи, получившие либо вакцину vORF2 трех дозовых уровней, либо вакцину из убитых целых клеток, показывают самые высокие уровни IFAT, хотя в группе №5 наблюдают наименьшие уровни IFAT непосредственно перед заражением из всех групп вакцинации.
Хотя формально это не было доказано, преимущественный путь трансмиссии PCV2 молодым свиньям вскоре после отъема предположительно осуществляется через рот и нос, и эффективность вакцины, которая понижает выделения из носа PCV2 может помочь контролировать распространение инфекции. Группы, в которых животные получают антиген vORF2 на одном из трех уровней, и группа, в которой животные получают 8 мкг rORF2, показывают наименьший показатель выделения из носа вируса PCV2 (8,3%). В соответствии с предполагавшимися ожиданиями в группе контрольного заражения наблюдают самый высокий показатель выделения из носа вируса (80%).
Макро повреждения в легких у свиней с инфекцией PMWS, которая является вторичной по отношению к инфекции PCV2, обычно представляют генерализованную лимфаденопатию в комбинации с одним или несколькими из следующих признаков: (1) интерстициальной пневмонией с междолевым отеком, (2) бледностью кожи или желтухой, (3) мозаичной атрофией печени, (4) язвами желудка и(5) нефритом. При вскрытии желтуха, гепатит, нефрит и язвы желудка в некоторых группах не обнаруживают, а лимфаденопатию специально не исследуют. Оценка средних процентов повреждения легких между группами варьирует. Животные в группе введения 16 мкг антигена vORF2 имеют самый низкий процент повреждения легких (0,40±0,50%), затем следует группа, в которой животным вводят по 8 мкг rORF2 (0,68±1,15%). Согласно прогнозу в группе контрольного заражения наблюдают самый высокий средний процент повреждения легких (9,88±29,2%). Во всех четырех группах средние проценты повреждения легких повышены из-за того, что данные по одной из свиней в каждой из этих групп весьма высоки. Большинство повреждений легких описывают в виде красных/пурпурных консолидированных повреждений. Обычно повреждения легких, ассоциированные с PMWS, описаны в виде не распадающихся цвета загара с междолевыми отеками повреждений. Отмеченные в настоящем исследовании повреждения легких либо не связаны с инфекцией PCV2, либо может присутствовать второй агент индукции легочной инфекции. В данном контексте процент легочных повреждений, возможно, не отражает истинную оценку повреждения легких, связанного с инфекцией вирусом PCV2.
В других исследованиях ранее было установлено, что имеется прямая корреляция между наличием антигена PCV2, определенного иммунногистихимическим методом и методом гистопатологии. В настоящем исследовании гистопатологические исследования отдельных тканей не проводят. В группах №1 (16 мкг vORF2) и №5 (8 мкг rORF2) наблюдают наименьшую частоту встречаемости свиней, позитивных по антигену PCV2 (8,3%), хотя в группе №9 (группа строгого отрицательного контроля - 90,9%) и группе №8 (группа контрольного заражения - 90,0%) отмечают наивысшие частоты встречаемости свиней, положительных по антигену PCV2. Из-за объективной природы данного анализа вероятно результаты иммунногистохимического анализа являются одним из наилучших показателей эффективности вакцины. В связи с этим согласно одному из объектов настоящего изобретения была определена минимальная защитная доза (Minimum Portective Dosage - MPD) 1 мл/1 дозу рекомбинантного продукта с экстрагированным антигеном PCV2 ORF2 (rORF2) на модели свиней CDCD на фоне заражения вирусом PCV2. Из трех групп, которые получили варьирующие уровни антигена rORF2 antigen, группа №5 (8 мкг антигена rORF2), безусловно, обладает наивысшим уровнем защиты. В группе №5 также выявляют наилучшие результаты или эта группа связана с наиболее предпочтительными результатами по всем исследуемым параметрам. При сравнении группы №5 с другими шестью группами вакцинации после заражения, группа №5 обладает наивысшим показателем среднесуточного привеса (0,94±0,22 фунтов/сутки), наименьшей частотой встречаемости нарушенного поведения (0%), второй наименьшей частотой встречаемости кашля (8,3%), наименьшей частотой встречаемости клинических симптомов в целом (8,3%), наименьшей смертностью (0%), наименьшей частотой выделения из носа PCV2 (8,3%), второй наименьшей степенью повреждения легких (0,68±1,15%) и наименьшей частотой встречаемости иммунногистохимически-позитивных тканей (16,7%).
Согласно другой задаче, решаемой в настоящем изобретении, определяют MPD 1 мл/1 дозу традиционного продукта, представляющего частично очищенный антиген PCV2 ORF2 (vORF2) на модели свиней CDCD при заражении вирусом PCV2. Из трех групп, в которых животным вводят различные уровни антигена vORF2, группа №1 (16 мкг vORF2) проявляет наивысший уровень защиты. Группа №1 превосходит группы №2 и №3 по среднесуточному привесу, среднему проценту поражения легких и по данным иммунногистихимии. Группы №1 и №2 (8 мкг антигена vORF2) имеют равные показатели общего проявления клинических симптомов, группа №3 (4 мкг антигена vORF2) обладает наименьшей смертностью, и все три группы имеют равные показатель выделения вируса из носа. Таким образом, вакцины vORF отличаются от вакцин rORF.
Согласно еще одной задаче, решаемой в настоящем изобретении, определяют эффективность максимальной дозы 2 мл/2 дозы обычным образом убитой вакцины PCV2 на модели свиней CDCD при заражении вирусом PCV2. Из семи вакцин, оцениваемых в настоящем исследовании, вакцина убитых целых клеток с PCV2 показывает наихудший результат.У поросят, получивших 2 дозы вакцины из убитых целых клеток с PCV2, наблюдают наименьший среднесуточный привес, вторую наивысшую частоту встречаемости нарушения поведения (58,3%), вторую наивысшую среднюю частоту встречаемости клинических симптомов (58,3%), наивысшую смертность (16,7%), вторую наивысшую частоту встречаемости выделения из носа вируса (41,7%), наивысший средний процент повреждения легких (9,88±29,2%), высокую частоту встречаемости выявленных повреждений легких (75%) и умеренную встречаемость иммунногистохимически-позитивных тканей (41,7%). Однако сохраняется эффективность индукции иммунного ответа.
Согласно другой задаче, решаемой в настоящем изобретении, подтверждают, что выделение из носа вируса PCV2 является эффективным параметром, что было установлено впервые ранее. Результаты настоящего исследования показывают, что выделение из носа вируса PCV2 происходит после заражения через нос, и что вакцины PCV2 понижают выделение из носа PCV2 после заражения. Кроме того, результаты настоящего исследования и сведения из литературных источников показывают, что иммунногистохимический анализ будет и в дальнейшем применяться для оценки вакцины PCV2.
Из проведенного настоящего исследования были сделаны дополнительные выводы, в частности, что лимфаденопатия является одним из симптомов при PMWS. Другой отличительный признак PMWS - истощение лимфатической системы и полиядерных/гигантских гистиоцитов. Кроме того, не было установлено ни одного побочного эффекта или реакций в месте вакцинации для какой-либо из семи вакцин, а также установили, что все семь вакцин PCV2 проявляют свою безопасность при введении маленьким поросятам.
Пример 5
В настоящем примере исследуют эффективность восьми испытуемых вакцин PCV2 и подтверждают параметры заражения PCV2, полученные в предшествующих исследованиях с последующим заражением вирулентным штаммом PCV2. У ста пятьдесят (150) поросят, рожденных с помощью кесарева сечения и лишенных молозива (cesarean derived colostrum deprived - CDCD), в возрасте 6-16 суток была фиксирована масса тела, и эти поросята были рандомизированно поделены на 10 групп равного размера. Табл. 16 показывает общую схему исследования настоящего примера.
Таблица 16
Общая схема исследования
Группа
Количество свиней
Лечение
Сутки лечения
KLH/ICFA на 22 и 28 сутки
Заражение вирулентным вирусом PCV2 на 25 сутки
PRRSV MLV на 46 сутки
Вскрытие на 50-е сутки
1
15
PVC2 вакцина 1 16 мкг rORF2 - IMS 1314
0 и 14
+
+
+
+
2
15
PVC2 вакцина 2 16 мкг vORF2 - карбопола
0 и 14
+
+
+
+
3
15
PCV2 вакцина 3 16 мкг rORF2 - карбопола
0 и 14
+
+
+
+
4
15
PCV2 вакцина 2 16 мкг vORF2 - карбопола
0
+
+
+
+
5
15
PVC2 вакцина 3 4 мкг rORF2  - карбопола
0 и 14
+
+
+
+
6
15
PVC2 вакцина 3 1 мкг rORF2  - карбопола
0 и 14
+
+
+
+
7
15
PVC2 вакцина 3 0,25 мкг rORF2 - карбопола
0 и 14
+
+
+
+
8
15
PVC2 вакцина 4 >8,0 log KV - карбопола
0 и 14
+
+
+
+
9
15
Контрольные заражения
Без лечения
+
+
+
+
10
15
Без лечения - строго отрицательный контроль
Без лечения
+
+
+
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Составы вакцин по группам следующие. Вакцина PCV2 №1, введенная в дозе 1×2 мл животным в группе №1, содержит высокую дозу (16 мкг/2 мл дозу) инактивированного рекомбинантного антигена ORF2 с адъювантом IMS 1314 (16 мкг rORF2 - IMS 1314). Вакцина PCV2 №2, введенная в дозе 1×2 мл животным в группе №2, содержит высокую дозу (16 мкг/2 мл дозу) частично очищенного VIDO R-1 выработанного антигена PCV2 ORF2 с адъювантом карбополом (16 мкг vORF2 - карбопол). Вакцина PCV2 №3, введенная в дозе 1×2 мл животным в группе №3, содержит высокую дозу (16 мкг/2 мл дозу) инактивированного рекомбинантного антигена ORF2 с адъювантом карбополом (16 мкг rORF2 - карбопол). Вакцина PCV2 №4, введенная в дозе 1×1 мл животным в группе №4, содержит высокую дозу (16 мкг/1 мл дозу) частично очищенного VIDO R-1 выработанного антигена PCV2 ORF2 с адъювантом карбополом (16 мкг vORF2 - карбопол). Вакцина PCV2 №5, введенная в дозе 1×2 мл животным в группе №5, содержит 4 мкг/2 мл дозы инактивированного рекомбинантного антигена ORF2 с адъювантом карбополом (4 мкг rORF2 - карбопол). Вакцина PCV2 №6, введенная в дозе 1×2 мл животным в группе №6, содержит 1 мкг/2 мл дозы инактивированного рекомбинантного антигена ORF2 с адъювантом карбополом (1 мкг rORF2 - карбопол). Вакцина PCV2 №7, введенная в дозе 1×2 мл животным в группе №7, содержит низкую дозу (0,25 мкг/2 мл дозы) инактивированного рекомбинантного антигена ORF2 с адъювантом карбополом (0,25 мкг rORF2 - карбопол). Вакцина PCV2 №8, введенная в дозе 1×2 мл животным в группе №8, содержит высокую дозу (предварительно инактивированный титр (>8,0 log/2 мл дозы) антигена инактивированного традиционным способом убитого VIDO R-1 выработанного вируса PCV2 Struve с адъювантом карбополом (>8,0 log KV - карбопол). На 0 сутки животных в группах 1-8 обрабатывают соответствующими вакцинами. Животные в группах 1-3 и 5-8 получают ревакцинацию соответствующими вакцинами еще раз на 14 сутки. Эффективность одной дозы 16 мкг vORF2 - карбопола тестируют на животных в группе №4, которым не проводили повторной вакцинации на 14-е сутки. У поросят контролируют побочные эффекты и реакции в местах инъекции после обеих вакцинаций. На 21-е сутки поросят переводят во второе место проведения исследования, в котором животных в группах 1-9 содержат всех в одном здании, а группу №10 содержат в отдельном здании. Все животные получают гемоцианин моллюска блюдечка в неполном адъюванте Фрейнда (KLH/ICFA) на 22 и 28 сутки. На 25 сутки животных в группах 1-9 заражают примерно 41og вирулентного вируса PCV2. К 46-м суткам в зараженных группах погибло всего несколько животных. При попытке стимулировать иммунитет свиней и повысить вирулентность инфицирующего материала PCV2 все группы обрабатывают продуктом INGELVAC PRRSV MLV (репродуктивно-респираторная вакцина свиней, модифицированный живой вирус) на 46-е сутки.
Образцы крови, собранные до и после заражения, предназначены для серологического анализа на PCV2. После заражения определяют массу тела для вычисления среднесуточного прироста и оценивают клинические признаки. На 50-е сутки забивают и вскрывают всех свиней, фиксируют все микроповреждения, патологические признаки в легких, а некоторые ткани сохраняют в формалине для проведения иммунногистохимического исследования для выявления антигена PCV2, что возможно осуществить в более поздние сроки.
Материалы и методы
Настоящее исследование, выполненное на свиньях CDCD в возрасте 6-16 суток на нулевые сутки, является частично слепым исследованием с вакцинацией и заражением. Для включения в настоящее исследование титры PCV2, полученные иммуноферментным анализом, должны быть<1:1000. Кроме того, иммунный статус свиноматок соответствует известному PRRS-отрицательному стаду. Шестнадцать (16) свиноматок тестируют на серологический статус PCV2, причем все шестнадцать (16) имеют титр PCV2<1000 и их помещают в первое место проведения исследования. Сто пятьдесят (150) поросят, рожденных в результате кесарева сечения, поступают для данного исследования на -3 сутки. На -3 сутки 150 свиней CDCD в первом месте исследования взвешивают, маркируют ушными бирками, фиксируют массу тела и рандомизированно делят на 1-10 группы (см. выше табл.16). Образцы крови отбирают у всех свиней. Если каких-либо животных, соответствующих критериям для включения в исследование, включают в настоящее исследование, а позднее по каким-либо причинам из этого исследования исключают, исследователь и консультант принимают решение, использовать ли полученные по этим животным данные для заключительного анализа. Дату исключения из исследования ранее включенных в нее поросят и причину исключения документируют. Ни одну из свиноматок, соответствующую выбранным для данного исследования критериям и помещенную в первое место проведения исследования, не исключают из исследования. Ни одного из поросят не исключают из этого исследования, и ни одно подопытных животных не исключают из настоящего исследования до его завершения. Табл. 17 описывает временные рамки для проявления ключевых активностей в настоящем примере.
Таблица 17
Исследования активностей
Сутки исследования
Даты
Исследуемая активность
-3
4-04-2003
Масса тела свиней, состояние здоровья, рандомизирование по группам, отбор образцов крови.
-3,
4-04-2003
Анализ общего состояния здоровья и
0-21
С 4-07-2003 по 5-27-2003
побочных эффектов после вакцинации.
0
4-07-2003
Введение соответствующих IVP в группах 1-8.
С 4-07-2003 по
Осмотр свиней для анализа реакций в месте
0-7
4-14-2003
инъекции.
14
4-21-2003
Группы активной иммунизации 1-3, 5-8 с соответствующими IVP. Отбор образцов крови у всех свиней.
14-21
С 4-21-2003 по
Осмотр свиней для анализа реакции на
4-28-2003
инъекции.
19-21
С 4-26-2003 по 4-28-2003
Обработка всех свиней антибиотиками.
21
4-28-2003
Свиней перевозят из Struve Labs, Inc. в Veterinary Resources, Inc.(VRI)
22-50
С 4-28-2003 по
Осмотр свиней для анализа клинических
5-27-2003
признаков после заражения.
22
4-29-2003
Группы 1-10, обработанные KLH/ICFA
25
5-02-2003
Отбор образцов крови у всех свиней. Взвешивание всех свиней. Заражение свиней в группах 1-9 вирусом PCV2.
28
5-05-2003
Группы 1-10, обработанные KLH/ICFA.
32
5-09-2003
Отбор образцов крови у всех свиней.
46
5-23-2003
Введение продукта INGELVAC PRRS MLV во всех группах.
50
5-27-2003
Отбор образцов крови. Взвешивание и аутопсия всех свиней. Анализ и запись всех макро повреждений. Оценка повреждений в легких. Сохранение свежих и фиксированных в формалине образцов тканей. Завершение стадии прежизненного исследования.
После завершения стадии прижизненного исследования, фиксированные формалином ткани исследует патологоанатом с помощью иммунногистохимического анализа для выявления антигена PCV2, образцы крови оценивают серологически на PCV2, а среднесуточный привес определяют с 25 по 50 сутки.
В первом месте проведения исследования животных содержат в отдельных клетках в семи комнатах с момента рождения до примерного возраста 11 суток (примерно нулевые сутки исследования). Все комнаты идентичны по планировке и заполнены расположенными друг над другом отдельными стальными клетками с подогревом, причем подачу фильтрованного воздуха осуществляют в каждый отдельный блок. Каждая комната имеет отдельный обогрев и вентиляцию, что предотвращает перекрестное заражение воздуха между комнатами. Животных содержат в двух разных зданиях в месте проведения второго исследования. Группу №10 (группа строгого отрицательного контроля) содержат отдельно в переделанном здании для откорма животных, а группы 1-9 содержат в перестроенном помещении для опороса. Каждую группу содержат в отдельном загоне (14-15 свиней в загоне) и в каждом загоне предусмотрено примерно 2,3 квадратных фута на свинью. Группы 2, 4 и 8 содержат в трех прилежащих загонах со стороны узкого прохода, а группы 1, 3, 5, 6, 7 и 9 содержат в шести прилежащих загонах со стороны узкого прохода. Отделение групп проводят на том основании, что по данным мониторинга вакцины, введенные животным в группах №№2, 4 и 8, не были полностью инактивирован. Каждый загон располагается на приподнятой доске с пластиковым покатым полом. Яма под загоном служит резервуаром для экскрементов и отходов. Каждое здание обладает отдельными системами подогрева и вентиляции, что уменьшает вероятность перекрестного заражения воздуха между зданиями.
В первом месте исследования поросят кормят специальной молочной смесью от рождения до примерного возраста 3 недели. Всех поросят переводят на твердый специально замешанный корм на 21 сутки (примерно в возрасте 4 ½ недель). Во втором месте проведения исследования всех поросят кормят обычной коммерческой смесью немедицинского назначения, соответствующей их возрасту и массе без ограничений. Воду также не ограничивают.
Всем исследуемым свиньям вводят внутримышечно 1,0 мл продукта NAXCEL, попеременно в разные бедра на 19, 20 и 21 сутки. Кроме того, свинье №11 (группа №1) вводят внутримышечно 0,5 мл продукта NAXCEL на 10 сутки, свинье №13 (группа №10) вводят 1 мл пенициллина и 1 мл продукта PREDEF 2Х на 10 сутки, свинье №4 (группа №9) вводят внутримышечно 1,0 мл продукта NAXCEL на 11 сутки и свиньям №1 (группа №1), №4 и №11 каждой вводят 1,0 мл продукта NAXCEL на 14 сутки по разным медицинским показаниям.
В обоих местах проведения исследования свиней содержат под ветеринарным контролем. Оценку здоровья животных проводят на 3 сутки и оставляют запись в карточке регистрации медицинского состояния. Отмечают, что все животные обладают хорошим здоровьем и состоянием упитанности перед вакцинацией, что было определено на нулевые сутки наблюдения. Также отмечают, что все животные обладали хорошим здоровьем и состоянием упитанности перед заражением. Туши и ткани ликвидируют вытапливанием сала. Итоговое расположение исследуемых животных записывают в карту размещения животных.
В 0 и 14 сутки свиньи, распределенные по группам 1-3 и 5-8, соответственно, получают по 2,0 мл вакцин PCV2 1-4, соответственно, внутримышечно правую в левую область шеи, соответственно, используя стерильный люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу. Свиньям, помещенным в группу 4, вводят внутримышечно по 1,0 мл вакцины PCV2 №2 в правую область шеи, используя люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу только на 0 сутки.
На 22 сутки всем исследуемым свиньям, которым ввели внутримышечно по 2,0 мл KLH/ICFA в левую область шеи, используя стерильный люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу. На 28 сутки всем исследуемым свиньям вводят внутримышечно по 2,0 мл KLH/ICFA в правое бедро, используя стерильный люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу.
5
На 25 сутки свиньям в группах 1-9 вводят внутримышечно по 1,0 мл инфекционного материала PCV2 ISUVDL (3,98 logio TCIDo/мл) в правую область шеи, используя стерильный люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу. Кроме того, дополнительно 1,0 мл того же материала вводят интраназально каждой свинье (по 0,5 мл в каждую ноздрю), используя стерильный люэровский шприц объемом 3,0 мл и носовую канюлю.
На 46 сутки всем свиньям вводят внутримышечно по 2,0 мл INGELVAC PRRS MLV в правую область шеи, используя стерильный люэровский шприц объемом 3,0 мл и стерильную 20g × ½" иглу. PRRSV MLV вводят для повышения вирулентности инфицирующего материала PCV2.
Исследуемых свиней наблюдают ежедневно, оценивая состояние здоровья и побочные эффекты, на -3 и 0-21 сутки. У каждого животного оценивают нормальное и нарушенное поведение, дыхание или кашель. Наблюдения записывают в карту клинического контроля. Всех исследуемых свиней наблюдают на 0-7 сутки, а животных в группе №7 также наблюдают на 14-21 сутки для контроля места инъекции. Среднесуточный привес определяют взвешиванием каждой свиньи на калибровочных весах на -3, 25 и 50 сутки или в те сутки, когда животное после заражения было обнаружено павшим. Масса тела вносится в карту регистрации массы тела. Массу тела на -3 сутки фиксируют перед рандомизированием. Данные по массе на 25 и 50 сутки используют для определения среднесуточного привеса у каждой свиньи по данным временным точкам. У свиней, павших после заражения ранее 50-х суток, среднесуточный привес определяют с 25 суток по дату падежа.
Для серологического выявления PCV2 отбирают цельную венозную кровь у каждого поросенка из венозного синуса на -3 и 14 сутки. У каждого поросенка берут кровь из орбитального венозного синуса, для чего вставляют стерильную капиллярную трубку в медиальный угол глазной щели и отбирают примерно 3,0 мл цельной крови в пробирку для отделения сыворотки объемом 4,0 мл. На 25, 32 и 50 сутки цельную венозную кровь от каждой свиньи отбирают из передней полой вены, используя стерильную 18g × 1 ½" иглу Vacutainer (иглу-бабочку с гибким катетером и люер-адаптером фирмы Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, Нью-Джерси), держатель иглы Vacutainer и пробирку для отделения сыворотки объемом 13 мл. Образцы крови в каждой временной точке отбора отмечают в карте сбора образцов. Кровь в каждой пробирке для отделения сыворотки сворачивается, после чего пробирку центрифугируют и сыворотку собирают. Отобранную сыворотку переносят в стерильную пробирку с колпачком и хранят при -70±10°C до последующего исследования. Сотрудники фирмы BIVI-R&D анализируют образцы на наличие антител PCV2.
Свиней наблюдают ежедневно с 22 по 50 сутки, оценивая клинические симптомы нормальное и нарушенное поведение, дыхание или кашель. Клинические наблюдения заносят в карту клинического контроля.
Свинью №46 (группа №1) и №98 (группа №9) пали в первом месте проведения исследования в обоих случаях причиной смерти считают кровотечение, и вскрытие не проводят. Во втором месте проведения исследования, свиней, павших после заражения и до 50-х суток, и свиней, забитых на 50-е сутки, вскрывают. Какие-либо макроскопические повреждения отмечают, а также фиксируют процент долей легких с повреждениями; полученные сведения вносят в карту заключения по вскрытию.
От каждой вскрытой свиньи, павшей во втором месте проведения исследования, берут образцы миндалин, легких, сердца и лимфоузла брыжейки и помещают в контейнер с 10% формалином в буфере, а другие образцы от тех же органов помещают в контейнер Whirl-pak (фирма M-Tech Diagnostics Ltd., Thelwall, Великобритания) и каждый контейнер Whirl-pak помещают на лед. Каждый контейнер тщательно маркируют. Полученные от собранных образцов сведения вносят в карту заключения по вскрытию.
В заключении фиксированные в формалине образцы тканей и форму запроса на диагностику отправляют на иммунногистохимическое исследование. Иммунногистохимическое исследование проводят в соответствии со стандартными лабораторными методиками получения образцов, приготовления образцов и срезов и окрашивания. Свежие ткани в контейнерах Whirl-paks, обложенные пакетами со льдом, направляют в Study Monitor для хранения (-70°±10°C) и возможного последующего применения.
Фиксированные формалином ткани исследует патологоанатом для выявления PCV2 с помощью иммунногистохимического анализа и их оценивают по следующей системе: 0=окрашивания нет, 1=слабое положительное окрашивание в нескольких местах, 2=умеренное положительное окрашивание во многих местах, и 3=обильное положительное окрашивание, диффундирующее сквозь ткань. Для аналитических целей оценку «0» рассматривают в качестве «отрицательной», а оценку выше нуля рассматривают в качестве «положительной».
Результаты
Результаты настоящего примера приводят ниже. Установлено, что свиньи №46 и №98 пали на 14 и 25 сутки, соответственно. Причиной смерти является кровотечение. Свинья №11 (группа 1) на 15 сутки задыхалась, и ее дыхание было учащенным. С другой стороны, у всех других свиней отмечают нормальное поведение, дыхание и отсутствие кашля на протяжении периода наблюдения, а также не было системных побочных эффектов в какой-либо группе. На 0 сутки после вакцинации не отмечают реакций в местах инъекций. После вакцинации на 14 сутки у семи (7) из четырнадцати (14) свиней группы №1 (50,0%) отмечают опухание с оценкой «2» на 15-е сутки. У четырех (4) из четырнадцати (14) свиней группы №1 (28,6%) опухание с оценкой «2» сохраняется на 16-е сутки. Ни в одной из других групп после каждой вакцинации у животных не отмечают реакций в местах инъекций.
Результаты по среднесуточным привесам указаны ниже в табл.18. Свиньи №46 и №98, павшие от кровотечения, исключены из общего анализа по группам. Группа №4, в которой животным вводят одну дозу, состоящую из 16 мкг vORF2 - карбопола, отличается самими высокими показателями среднесуточного привеса (1,16±0,26 фунтов/сутки), затем следуют группы №№1, 2, 3, 5, 6 и 10, в которых среднесуточные привесы варьируют от 1,07±0,23 фунтов/сутки до 1,11±0,26 фунтов/сутки. В группе №9 наблюдают наименьший среднесуточный привес (0,88±0,29 фунтов/сутки), затем следуют группы №8 и №7, у которых среднесуточный привес составляет 0,93±0,33 фунтов/сутки и 0,99±0,44 фунтов/сутки соответственно.
Таблица 18
Сводка среднесуточного привеса
Группа
Лечение
N
Среднесуточный привес (фунты/сутки) (Сутки 25-50) и для свиней, павших до 50-х суток
1
rORF2 - 16 мкг-IMS 1314 (2 дозы)
14
1,08±0,30 фунты/сутки
2
vORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
15
1,11±0,16 фунты/сутки
3
rORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
15
1,07±0,21 фунты/сутки
4
vORF2 - 16 мкг - карбопол (1 доза)
15
1,16±0,26 фунты/сутки
5
rORF2 - 4 мкг - карбопол (1 доза)
15
1,07±0,26 фунты/сутки
6
rORF2 - 1 мкг - карбопол (2 дозы)
15
1,11±0,26 фунты/сутки
7
rORF2 - 0,25 мкг - карбопол (2 дозы)
15
0,99±0,44 фунты/сутки
8
KV>8,0 log - карбопол (2 дозы)
15
0,93±0,33 фунты/сутки
9
Контрольные заражения
14
0,88±0,29 фунты/сутки
10
Строго отрицательные контроли
15
1,07±0,23 фунты/сутки
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Серологические результаты по PVC2 представляют ниже в табл.19. Все десять (10) групп сероотрицательны по PCV2 на -3 сутки. На 14 сутки титры PCV2 остаются низкими во всех десяти (10) группах (диапазон от 50-113). На 25 е сутки в группе №8, в которой животные получали вакцину в виде целых убитых клеток с вирусом, наблюдают наивысший титр PCV2 (4617), затем следует группа №2, в которой животным вводили по 16 мкг vORF2 - карбопола, группа №4, в которой животным вводили одну дозу, содержащую 16 мкг vORF2 - карбопола, и группа №3, в которой животным вводят 16 мкг rORF2 - карбопола, причем титры в этих группах составляют 2507, 1920 и 1503, соответственно. На 32-е сутки (через неделю после заражения) титры в группах №№1-6 и в группе №8 колеблются от 2360 до 7619, а в группах №7 (0,25 мкг rORF2 - карбопол), №9 (контрольное заражение) и №10 (строго отрицательный контроль) титры равны 382, 129 и 78, соответственно. На 50-е сутки (сутки забоя) все десять (10) групп показывают высокие титры PCV2 (>1257).
На 25, 32 и 50 сутки в группе №3, в которой свиньям вводили по две дозы, составляющие 16 мкг rORF2 - карбопол, титр антител выше, чем в группе №1, в которой свиньям вводили по две дозы, составляющие 16 мкг rORF2 - IMS 1314. На 25, 32 и 50 сутки в группе №2, в которой свиньям вводили по две дозы, составляющие 16 мкг vORF2, титры выше, чем в группе №4, в которой вводили только одну дозу той же вакцины. В группах 3, 5, 6, 7, в которых животным вводили пониженные уровни rORF2 - карбопол, 16, 4, 1 и 0,25 мкг, выявляют, соответственно, снижающиеся титры антител на 25 и 32 сутки.
Таблица 19
Сводка титров PCV2 по данным иммуноферментного анализа
Группа
Лечение
Сутки -3
Сутки 14**
Сутки 25***
Сутки 32
Сутки 50****
1
rORF2 - 16 мкг - IMS 1314 (2 дозы)
50
64
646
3326
4314
2
vORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
50
ПО
2507
5627
4005
3
rORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
50
80
1503
5120
6720
4
vORF2 - 16 мкг - карбопол (1 доза)
50
113
1920
3720
1257
5
rORF2 - 4 мкг - карбопол (1 доза)
50
61
1867
3933
4533
6
rORF2 - 1 мкг - карбопол (2 дозы)
50
70
490
2360
5740
7
rORF2 - 0,25 мкг - карбопол (2 дозы)
50
73
63
382
5819
8
KV>8,0 log - карбопол (2 дозы)
50
97
4617
7619
10817
9
Контрольные заражения
50
53
50
129
4288
10
Строго отрицательные контроли
50
50
50
78
11205
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом,
KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
*Для вычисления титр иммуноферментного анализа <100 обозначают величиной «50», а титр >6400 обозначают величиной «12800».
** Сутки заражения
***Сутки вскрытия
Результаты клинических наблюдений после заражения представлены ниже. В табл.20 включают наблюдения по нарушению поведения, нарушению дыхания, кашлю и диарее. Табл. 21 включает результаты из сводки по общей частоте встречаемости клинических симптомов, а табл.22 включает результаты из сводки по смертности после заражения.
Частота встречаемости нарушения поведения, нарушения дыхания и кашля после заражения ниже у свиней, получающих по 16 мкг rORF2 - IMS 1314 (группа №1), 16 мкг rORF2 - карбопола (группа 3), 1 мкг rORF2 - карбопола (группа №6), 0,25 мкг rORF2 - карбопола (группа №7) и свиней в группе контрольного заражения (группа №9). Частота встречаемости нарушения поведения, нарушения дыхания и кашля после заражения равна нулю у свиней, получающих 16 мкг vORF2 - карбопола (группа №2), одну дозу, составляющую 16 мкг vORF2 - карбопола (группа №4), 4 мкг rORF2 - карбопола (группа №5), >8 log KV - карбопола (группа №8) и у свиней в группе строгого отрицательного контроля (группа №10).
Средняя частота встречаемости клинических симптомов варьирует в разных группах. В группах введения 16 мкг vORF2 - карбопола (группа №2), одной дозы 16 мкг vORF2 - карбопола (группа №4), и в группе строгого отрицательного контроля (группа №10) частота встречаемости клинических симптомов составляет 0%, у свиней, получавших 16 мкг rORF2 - карбопола (группа №3), и 1 мкг rORF2 - карбопола (группа №6) частота встречаемости клинических симптомов составляет 6,7%, у свиней, получавших 16 мкг rORF2 - IMS 1314 (группа №1) частота встречаемости клинических симптомов составляет 7,1%, у свиней, получавших 4 мкг rORF2 - карбопола (группа №5), 0,25 мкг rORF2 - карбопола (группа №7) и >8 log вакцины KV частота встречаемости клинических симптомов составляет 13,3%, а в группе контрольного заражения (группа №9) частота встречаемости клинических симптомов составляет 14,3%.
Смертность между группами также варьирует.В группе №8, в которой животным вводили по 2 дозы вакцины KV, наблюдают наивысшую смертность (20,0%), затем следует группа №9 (группа контрольного заражения) и группа №7 (в которой животным вводили по 0,25 мкг rORF2 - карбопола), в которых смертность составляет 14,3% и 13,3% соответственно. В группе №4, в которой животные получали одну дозу, содержащую 16 мкг vORF2 - карбопол, смертность составляет 6,7%. Во всех группах №№1, 2, 3, 5, 6 и 10 смертность составляет 0%.
Таблица 20
Сводка наблюдений по группам по нарушению поведения, нарушению дыхания и кашлю, наблюдаемых после заражения
Группа
Лечение
N
Нарушение
Нарушение
Кашель
поведения<sup>1</sup>
поведения<sup>2</sup>
1
rORF2 - 16 мкг - IMS 1314 (2 дозы)
14
0/14 (0%)
0/14 (0%)
1/14 (7,1%)
2
vORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
15
0/15 (0%)
0/15 (0%)
0/15 (0%)
3
rORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
15
0/15 (0%)
0/15 (0%)
1/15 (6,7%)
4
vORF2 - 16 мкг - карбопол (1 доза)
15
0/15 (0%)
0/15 (0%)
0/15 (0%)
5
rORF2 - 4 мкг - карбопол (1 доза)
15
1/15 (6,7%)
1/15 (6,7%)
0/15 (0%)
6
rORF2 - 1 мкг - карбопол (2 дозы)
15
0/15 (0%)
0/15 (0%)
1/15 (6,7%)
7
rORF2 - 0,25 мкг - карбопол (2 дозы)
15
0/15 (0%)
1/15 (6,7%)
1/15 (06,7%)
8
KV >8,0 log - карбопол (2 дозы)
15
1/15 (6,7%)
1/15 (6,7%)
0/15 (0%)
9
Контрольные заражения
14
1/14 (7,1%)
1/14 (7,1%)
2/14 (14/3%)
10
Строго отрицательные контроли
15
0/15 (0%)
0/15 (0%)
0/15 (0%)
1
Общее число свиней в каждой группе, у которых проявляется какое-либо нарушение поведения по меньшей мере в течение одних суток.
2
Общее число свиней в каждой группе, у которых проявляется какое-либо нарушение дыхания по меньшей мере в течение одних суток.
3
Общее число свиней в каждой группе, у которых проявляется кашель по меньшей мере в течение одних суток.
Таблица 21
Сводка по группам общей частоты проявления клинических симптомов после заражения
Группа
Лечение
N
Количество свиней с проявлением клинических симптомов<sup>1</sup>
Частота встречаемости
1
rORF2 - 16 мкг - IMS 1314 (2 дозы)
14
1
7,1%
2
vORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
15
0
0,0%
3
rORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
15
1
6,7%
4
vORF2 - 16 мкг - карбопол (1 доза)
15
0
0,0%
5
rORF2 - 4 мкг - карбопол (1 доза)
15
2
13,3%
6
rORF2 - 1 мкг - карбопол (2 дозы)
15
1
6,7%
7
rORF2 - 0,25 мкг - карбопол (2 дозы)
15
2
13,3%
8
KV>8,0 log - карбопол (2 дозы)
15
2
13,3%
9
Контрольные заражения
14
2
14,3%
10
Строго отрицательные контроли
15
0
0,0%
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
1
Общее число свиней в каждой группе, у которых проявляется какой-либо клинический симптом по меньшей мере в течение одних суток.
Таблица 22
Сводка по группам величины смертности после заражения
Группа
Лечение
N
Павшие после заражения свиньи
Смертность (%)
1
rORF2 - 16 мкг - IMS 1314 (2 дозы)
14
0
0,0%
2
vORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
15
0
0,0%
3
rORF2 - 16 мкг - карбопол (2 дозы)
15
0
0,0%
4
vORF2 - 16 мкг - карбопол (1 доза)
15
1
6,7%
5
rORF2 - 4 мкг - карбопол (1 доза)
15
0
0,0%
6
rORF2 - 1 мкг - карбопол (2 дозы)
15
0
0,0%
7
rORF2 - 0,25 мкг -карбопол (2 дозы)
15
2
13,3%
8
KV>8,0 log - карбопол (2 дозы)
15
3
20,0%
9
Контрольные заражения
14
2
14,3%
10
Строго отрицательные контроли
15
0
0,0%
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Сводку по средним процентам поражения легких и экспериментальной диагностике по группам приводят ниже в табл.23. Группа №9 (группа контрольного заражения) обладает наивысшим процентом поражений легких, составляющим в среднем 10,81±23,27%, затем следует группа №7 (в которой животные получают 0,25 мкг rORF2 карбопола), в которой средний процент поражения легких составляет 6,57±24,74%, затем следует группа №5 (в которой животные получают 4 мкг rORF2 - карбопола), в которой средний процент поражения легких составляет 2,88±8,88%, затем следует группа №8 (в которой животные получают вакцину KV) в которой средний процент поражения легких составляет 2,01±4,98%. В оставшихся шести (6) группах фиксируют проценты повреждения легких, которые варьируют от 0,11±0,38% до 0,90±0,15%.
Экспериментально установленный диагноз «пневмония» варьирует в разных группах. Группа №3, в которой животным вводят по две дозы, состоящие из 16 мкг rORF2 - карбопола, обладает самой низкой экспериментально диагностированной частотой пневмонии, равной 13,3%. У 50% свиней в группе №9, группе контрольного заражения, экспериментально диагностируют пневмонию, затем следуют группы №10 (группа строгого отрицательного контроля) и №2, в которых животные получают по две дозы, состоящие из 16 мкг vORF2 - карбопола, и у которых в 46,7% и 40% соответственно экспериментально диагностируют пневмонию.
В группах 1, 2, 3, 5, 9 и 10 экспериментально не подтверждают инфицирование вирусом PCV2 (0%), а группа №8, в которой животные получают две дозы вакцины KV, обладает самым высоким экспериментально установленным показателем инфицирования вирусом PCV2, который составляет 20%. Группа №7, в которой животные получают две дозы по 0,25 мкг rORF2 - карбопола, и группа №4, в которой животные получают по одной дозе, состоящей из 16 мкг rORF2 - карбопола, экспериментально диагностируют инфекцию PCV2 у 13,3%) и 6,7% животных в каждой группе соответственно.
Язвы желудка диагностируют только у одной свиньи в группе №7 (6,7%), а у свиней в других группах язвы желудка отсутствуют.
Таблица 23
Сводка по средним процентам поражения легких и периментальной диагностике по группам.
Группа
Лечение
N
№№ свиней, которые выделяют вирус по меньшей мере одни сутки
Частота возникновения
1
rORF2 - 16 мкг - 1 доза IMS 1314
15
0
0%
2
vORF2- 16 мкг - 2 дозы карбопола
15
1
6,7%
3
rORF2 - 16 мкг - 2 дозы карбопола
15
3
20,0%
4
vORF2 - 16 мкг - 1 доза карбопола
15
2
13,3%
5
rORF2 - 4 мкг - 1 доза карбопола
15
3
20,0%
6
rORF2 - 1 мкг - 2 дозы карбопола
15
6
40,0%
7
rORF2 - 0,25 мкг - 2 дозы карбопола
15
7
46,7%
8
KV>8,0 log - 2 дозы карбопола
15
12
80%
9
Контрольные заражения
14
14
100,0%
10
Прямые отрицательные контроли
15
14
93,3%
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Сводка результатов
Сводка результатов по группам иммунногистохимически-позитивных тканей показана ниже в табл.24. Группа №1 (16 мкг rORF2 - IMS 1314) имеет самый низкий уровень ШС-позитивных результатов с 0% свиней, позитивных по PCV2, затем следуют группы №2 (16 мкг vORF2 - карбопол) и группа №4 (одна доза включает 16 мкг vORF2 - карбопол), в которых уровни IHC составляют 6,7% и 13,3% соответственно. Группа №9, группа контрольного заражения, имеет самый высокий уровень иммунногистохимически-позитивных животных (100% свиней), позитивных по PCV2, затем следует группа №10, группа строгого отрицательного контроля, и группа №8 (вакцина KV) с 93,3% и 80% свиней, позитивных по PCV2 соответственно.
Таблица 24
Сводка результатов по группам иммунногистохимически-итивных тканей
Группа
Лечение
N
Количество свиней, выделяющих вирус, по меньшей мере 1 сутки
Частота возникновения
1
rORF2 - 16 мкг - 2 дозы IMS 1314
15
0
0%
2
vORF2 - 16 мкг - 2 дозы карбопола
15
1
6,7%
3
rORF2 - 16 мкг - 2 дозы карбопола
15
3
20,0%
4
vORF2 - 16 мкг - 1 доза карбопола
15
2
13,3%
5
rORF2 - 4 мкг - 1 доза карбопола
15
3
20,0%
6
rORF2 - 1 мкг - 2 дозы карбопола
15
6
40,0%
7
rORF2 - 0,25 мкг - 2 дозы карбопола
15
7
46,7%
8
KV>8,0 log - 2 дозы карбопола
15
12
80%
9
Контрольные заражения
14
14
100,0%
10
Прямые отрицательные контроли
15
14
93,3%
vORF2=выделенный вирусный ORF2,
rORF2=ORF2, экспрессируемый рекомбинантным бакуловирусом, KV или вирус убитых целых клеток=вирус PCV2, выращенный в соответствующей культуре клеток.
Обсуждение
В настоящем примере оценивают семь вакцин PCV2, которые включают высокую дозу (16 мкг) антигена rORF2 с адъювантом IMS 1314, вводимую дважды, высокую дозу (16 мкг) антигена vORF2 с адъювантом карбополом, вводимую однократно в одной группе свиней и дважды во второй группе свиней, высокую дозу (16 мкг) антигена rORF2 с адъювантом карбополом, вводимую дважды, дозу 4 мкг антигена rORF2 с адъювантом карбополом, вводимую дважды, дозу 1 мкг антигена rORF2 с адъювантом карбополом, вводимую дважды, низкую дозу (0,25 мкг) антигена rORF2 с адъювантом карбополом, вводимую дважды, и высокую дозу (>8 log) вакцины убитых целых клеток с PCV2 с адъювантом карбополом. В итоге, в группе №1, в которой животным вводили две дозы по 16 мкг rORF2 - IMS 1314, показатель несколько лучше, чем в группах №№2-7, в которых животным вводили вакцины, содержащие различные уровни антигена vORF2 или rORF2 с адъювантом карбополом, и намного лучше, чем в группе №8, в которой животным вводили две дозы вакцины из убитых целых клеток с PCV2. В группе №1 наблюдают третий самый высокий среднесуточный привес (1,80±0,30 фунтов/сутки), самую низкую частоту встречаемости нарушения поведения (0%), самую низкую частоту встречаемости нарушения дыхания (0%), низкую частоту встречаемости кашля (7,1%), низкую частоту встречаемости клинических симптомов в целом (7,1%>), такую же, что и в трех других группах самую низкую смертность (0%), вторую самую низкую степень повреждения легких (0,15±0,34%), вторую самую низкую степень возникновения пневмонии (21,4%) и самую низкую частоту встречаемости иммунногистохимически-положительных тканей (0%). Однако группа №1 является единственной группой, в которой были отмечены реакции в месте инъекции, в том числе 50% через сутки после второй вакцинации. Другие вакцины, введенные свиньям в группах №№2-7, показали лучшие результаты по сравнению с убитой вакциной, примерно такие же, что и вакцина, введенная в группу №1.
В группе №8, в которой животные получают две дозы убитой вакцины PCV2 с адъювантом карбополом, показали самые плохие результаты из всех групп вакцинации. В группе №8 наблюдают самый низкий среднесуточный привес (0,93±0,33 фунтов/сутки), вторую самую высокую степень нарушения поведения (6,7%), самую высокую степень нарушения дыхания (6,7%), наряду с тремя другими группами самую высокую общую частоту встречаемости клинических симптомов (13,3%), самую высокую смертность из всех групп (20%) и самую высокую степень иммуннохимически-позитивных тканей (80%) из всех групп вакцинации. Это может быть связано с тем обстоятельством, что вакцина из убитых целых клеток с PCV2 может быть не полностью инактивированна перед введением животным в группе №8, что может объяснить плохие результаты в этой группе. К сожалению, окончательные данные недостаточны для подтверждения. Таким образом, по результатам настоящего примера обычной убитой вакцины PCV2 недостаточно для снижения проявления РСУ2-ассоциированного заболевания.
Ранее отмечалось, что нет побочных эффектов, связанных с исследуемыми вакцинами, за исключением вакцины с адъювантом IMS 1314. Реакции в местах инъекций отмечены у 50,0% свиней через 1 сутки после второй вакцинации вакциной, переработанной с адъювантом IMS 1314, и у 28,6% свиней через 2 суток после второй вакцинации. Побочной реакций не отмечено у каких-либо свиней, получавших вакцины с адъювантом карбополом. Некоторые дополнительные исследования свиней, вакцинируемых вакцинами с применением адъюванта IMS 1314, следует продолжить для более подробного мониторинга свиней для определения реакций в местах инъекций.
Все свиньи являются серо-негативными в отношении PCV2 на -3 сутки и только в группе №2 титр составлял примерно 100 на 14 сутки. На 25 сутки (сутки заражения) у животных в группе №8 наблюдают самый высокий титр антител PCV2 (4619), за этой группой следует группа №2 (2507). За исключением групп №№7, 9 и 10, все группы показали четкий ответ в виде выработки антител на 32-е сутки. К 50-м суткам все группы, включая группы №№7, 9 и 10, показали четкий ответ в виде выработки антител.
Один из признаков поздней стадии инфекции PCV2 и последующего развития PMWS представляет задержку роста отъемных поросят, и в некоторых тяжелых случаях отмечают потерю массы тела. Определение среднесуточного привеса в разных группах является количественным методом оценки задержки роста или потери массы тела. В данном примере не наблюдают большой разницы в среднесуточном привесе у животных в разных группах. Группа №4 показывает самый низкий среднесуточный привес 0,88±0,29 фунтов/сутки, а в группе №4 самый высокий среднесуточный привес составляет 1,16±0,26 фунтов/сутки. В контексте настоящего изобретения нет существенного различия между группами, поэтому в дальнейшем нельзя определять эффективность вакцин по среднесуточному привесу.
Помимо потери массы тела, клиническими симптомами, связанными с PMWS, являются одышка, летаргия, бледность кожи или иногда желтуха. В настоящем примере нарушенное поведение, нарушенное дыхание и кашель во всех группах встречаются редко. Настоящее исследование доказывает, что модель заражения и штамм, применяемый для заражения, не приводят к получению большого количества клинических симптомов, поэтому они не являются четким параметром для оценки эффективности вакцины.
Кроме того, уровни смертности в настоящем примере не являются высокими, и отсутствие высокого уровня смертности в группе контрольного заражения ограничивает применение данного параметра для оценки эффективности вакцины. До 46-х суток в группах №4 и №7 пало по одной свинье из пятнадцати, в группе №9 пало две из четырнадцати свиней, и в группе №8 пало три из пятнадцати свиней. Исходя из того, что в группе №9 (группе контрольного заражения) не было проявления PCV2 клинических симптомов и только двое животных пало в этой группе к 46-м суткам, вакцину вируса респираторно-репродуктивного синдрома свиней (PRRSV) MLV вводили всем свиньям на 46 сутки. В предшествующих исследованиях применяли продукт INGELVAC PRRS MLV в качестве иммунностимулятора для обострения РСУ2-ассоциированного заболевания PMWS и уровни смертности в этих исследованиях были выше. Вскоре после введения вакцины PRRS на 46 сутки - в группе №4 пало одно животное на 46-е сутки и в группе №7 пало одно животное на 47 сутки - что, вероятно, не связано с введением вакцины PRRS. К 50-м суткам в группе №8, в которой животные получали по две дозы убитой вакцины, имеется наивысший уровень смертности (20%), затем следуют группы №9 (контрольное заражение) и группа №7 (0,25 мкг rORF2 - карбопол), с уровнями смертности 14,3% и 13,3%), соответственно. В целом, введение вакцины PRRS животным с применением модели заражения на поздней стадии после заражения в настоящем примере существенно не повышает уровней смертности.
Макроскопические поражения у свиней с инфекцией PMWS, вторичной по отношению к инфекции PCV2, обычно состоят из генерализованной лимфоаденопатии в сочетании с одним или несколькими из следующих признаков: (1) интерстициальной пневмонией с междольковым отеком, (2) бледностью кожных покровов или желтухой, (3) пятнистой атрофической печенью, (4) язвой желудка и (5) нефритом. На вскрытии (50-е сутки) желтуха, гепатит и нефрит в некоторых группах не установлены. У одной свиньи из группы 7 выявлена язва желудка, но лимфоаденопатия специально не исследовалась. Исходя из наличия повреждений, связанных с инфекцией PCV2, три группы содержат по меньшей мере одну свинью, у которой экспериментально диагностируют PCV2 (PMWS). У животных в группе №8, получавших по две дозы убитой вакцины, 20% экспериментально диагностируют в качестве инфицированных вирусом PCV2, а в группах №7 и №4 13,3% и 6,7%, соответственно, экспериментально диагностируют в качестве инфицированных вирусом PCV2. На вскрытии средний процент повреждений легких между группами варьирует. В группах 1, 2, 3, 4, 6 и 10 наблюдают низкий процент легочных повреждений, уровень которых колеблется от 0,11±0,38% до 0,90±0,15%). Согласно прогнозу в группе №9 (группе контрольного заражения) наблюдают наивысший процент повреждений легких (10,81±23,27%). В четырех группах средние проценты повреждений легких повышены из-за 1-3 свиней в каждой из групп, у которых имеются множественные повреждения легких. Повреждения легких красного/пурпурного цвета и уплотнены. Обычно повреждения легких, связанные с PMWS, описывают в виде желто-коричневого без распада с междольковым отеком. Повреждения легких, установленные в этом исследовании, либо не связаны с инфекцией PCV2, либо может быть обнаружена вторая легочная инфекция. В контексте настоящего изобретения подсчеты процентов повреждений легких возможно не отражают истинного измерения легочной инфекции, вызванной PCV2. Подобным образом, предполагаемый диагноз «пневмония», возможно, использовался излишне. Некоторые свиньи с повреждениями легких, причем некоторые всего лишь с повреждением 0,10%, были причислены к свиньям с предполагаемым диагнозом «пневмония». В этом примере нет существенного различия между группами макро-повреждений и процентом повреждения легких, в отношении которых вакцина эффективна.
Результаты IHC показывают наибольшее расхождение между группами. В группе №1 (16 мкг rORF2 - IMS 1314) самые низкие позитивные IHC результаты по антигену PCV2 (0%), а в группах №9 и №10 наивысшие позитивные IHC результаты с частотой встречаемости 100% и 93,3% соответственно. В группах 3, 5, 6 и 7, в которых животные получали 16, 4, 1 и 0,25 мкг антигена rORF2, соответственно, вместе с адъювантом карбополом, IHC позитивные уровни составляют 20%, 20%, 40% и 46,7% соответственно. В группе №2, в которой животные получают по две дозы, равные 16 мкг vORF2 с адъювантом карбополом, IHC позитивный уровень составляет 6,7%, а в группе №4, в которой животные получают только по одной дозе той же вакцины, IHC позитивный уровень составляет 13,3%. Из-за естественной природы данного теста и того обстоятельства, что результаты IHC коррелируют с ожидаемыми результатами, определение IHC является, вероятно, одним из лучших параметров, на основании которого можно судить об эффективности вакцины.
Таким образом, согласно одному из объектов настоящего изобретения определяют минимальную защитную дозу антигена PCV2 rORF2 с адъювантом карбополом, несмотря на заражение PCV2. Во всех группах (3, 5, 6 и 7) животные получают по две дозы антигена rORF2 с адъювантом карбополом, но уровень антигена rORF2 в этих группах разный. Группы 3, 5, 6 и 7 получают 16, 4, 1 или 0,25 мкг антигена rORF2, соответственно. В общих чертах, снижение уровня антигена rORF2 снижает титры антитела PCV2 и повышает уровень смертности, средний процент повреждений легких и встречаемость IHC позитивных тканей. Из четырех групп, в которых животные получают различные уровни rORF2 - карбопола, группы №3 и №5, в которых животные получают по две дозе антигена rORF2, составляющие 16 или 4 мкг антигена, соответственно, каждая имеет степень иммунногистохимической позитивной доли только 20%, и каждая имеет сходные титры антител. Таким образом, на основании IHC-положительных результатов минимальная защитная дозировка антигена rORF2, вводимого дважды, составляет примерно 4 мкг.
Одна из задач настоящего изобретения заключается в оценке антигенности рекомбинантного (rORF2) и VIDO R-l (vORF2) PCV2 антигенов. Животные в группе 2 получают две дозы по 16 мкг vORF2, а в группе 3 получают две дозы по 16 мкг rORF2. Обе вакцины содержат адъювант карбопол. Установлено, что обе вакцины безопасны и смертность составляет 0%. У животных в группе 2 титр антитела PCV2 составляет 2507 на 25 сутки, а в группе 3 титр антитела PCV2 составляет 1503. Средний процент повреждений в легких у животных в группе №3 ниже по сравнению с группой №2 (0,11±0,38% против 0,90±0,15%), но у животных в группе №2 IHC-положительная частота ниже, чем у группе №3 (6,7% против 20%). Таким образом, обе вакцины обладают сходной антигенностью, но с vORF2 ассоциированы несколько лучшие результаты иммунногистохимического анализа.
В еще одном объекте настоящего изобретения определяли возможность применения двух разных адъювантов (карбопола и IMS 1314). Животные в двух группах (1 и 3) получали по две дозы вакцины, содержащей 16 мкг антигена rORF2, но в группе 1 вводимый антиген был вместе с адъювантом IMS 1314, а в группе 3 - вместе с адъювантом карбополом. В обеих группах у животных были практически одинаковые показатели среднесуточного привеса, практически одинаковые показатели частоты проявления клинических признаков после заражения, одинаковая смертность и практически равный процент повреждений легких, но в группе №1 отсутствовали позитивные ткани по результатам иммунногистохимического анализа, а в группе 3 эта величина составляла 20%. Однако в группе 3, в которой животным вводили вакцину с добавлением адъюванта карбопола, были повышенные титры IFAT PCV2 на 25, 32 и 50 сутки по сравнению с животными в группе 1, которым вводили вакцину с адъювантом IMS 1314. В целом, хотя вакцина PCV2 вместе с адъювантом IMS 1314 действительно дает лучшие IHC результаты, она не обеспечивает очевидно лучшей защиты от инфекции PCV2 и вызывает реакцию в месте инъекции. Хотя вакцина PCV2 с добавлением адъюванта карбопола по действию практически близка к вакцине с добавлением адъюванта IMS 1314, она не связана с какими-либо побочными эффектами.
В еще одном объекте настоящего изобретения определяли эффективность PCV2 ORF2 в виде 1 мл, 1 дозы продукта. Животные в группах 2 и 4 получали по 16 мкг вакцины vORF2 с добавлением адъюванта карбопола на 0 сутки, причем животные в группе 2 получали вторую дозу на 14 сутки. Животные в группе 4 обладали несколько повышенным среднесуточным привесом и меньшим процентом повреждений легких по сравнению с животными в группе 2, но в группе 2 титры IFAT PCV2 выше на 25, 32 и 50 сутки, и несколько сниженную частоту встречаемости иммунногистохимически-позитивных тканей. Все другие результаты по этим двум группам были схожи. Одна доза вакцины vORF2 с добавлением адъюванта карбопола по действию сопоставима с двумя дозами этой вакцины без адъюванта.