Микрофлюидное устройство для выборочного отбора высокоподвижных и морфологически нормальных сперматозоидов из необработанной семенной жидкости
MICROFLUIDIC DEVICE FOR SELECTIVE SAMPLING OF HIGH-MOBILITY AND MORPHOLOGICALLY NORMAL SPERMATOZOA FROM UNTREATED SEMINAL FLUID

Область, к которой относится изобретение
Это изобретение имеет отношение к способам, устройствам и системам для отбора высокоподвижных морфологически нормальных и/или генетически нормальных сперматозоидов из необработанной семенной жидкости.
Предпосылки к созданию изобретения
Бесплодие человека является распространенной во всем мире болезнью, достигшей эпидемических масштабов, распространение которой оценивают в 80 миллионов страдающих бесплодием супружеских пар в год. В развитых странах 1-3% от всех родившихся были зачаты посредством вспомогательных репродуктивных технологий, чаще всего - экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ, от англ. ICSI - "IntraCytoplasmic Sperm Injection") [1]. Источником одной трети причин бесплодия является мужчина, и многие из таких случаев лечат с использованием вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [2, 3]. Хотя они и являются достаточно эффективными для решения проблемы бесплодия человека, вспомогательные репродуктивные технологии в большинстве случаев не решают проблему, поскольку в США в 2014 году доля рождений живого ребенка составила в среднем менее чем 35% на 1 цикл лечения [4]. Кроме того, с ВРТ могут быть связаны риски для потомства, среди которых: а) повышенный риск аномалий половых хромосом, Ь) повышенный риск дефектов геномного импринтинга [5, 6], с) спорный фактор повышенного риска врожденных пороков, и d) передача бесплодия по отцовской или материнской линии [7]. Хотя ВРТ и способны помочь множеству супружеских пар, они по-прежнему ограничены в своей способности излечивать большинство случаев бесплодия человека.
При использовании ВРТ для лечения мужского фактора бесплодия семенную жидкость, как правило, обрабатывают с использованием традиционных технологий градиентного отмывания или всплытия с тем, чтобы выделить подвижные и морфологически нормальные сперматозоиды [8-10]. Затем, при выполнении процедур ИКСИ, сперматозоиды отбирают для использования квалифицированные эмбриологи, которые выбирают конкретный сперматозоид для введения в яйцеклетку на основе морфологических особенностей [7, 11]. К другим характеристикам сперматозоидов, которые могут влиять на результаты ВРТ, такие как качество эмбрионов, частота наступления беременности и частота выкидышей, относятся результаты исследования ДНК/хроматина, или хромосомной целостности, или мутационного исследования, или метиломного исследования сперматозоидов, и эти характеристики не учитывают при стандартных процедурах ИКСИ [12-13]. При этом возникает вопрос о том, способна ли технология ИКСИ преодолевать имеющие важное значение препятствия на пути естественного отбора сперматозоидов.
В настоящее время не существует надежных способов неинвазивного определения характеристик сперматозоидов, которые могут быть особенно важны для успешного зачатия и родов при выполнении ИКСИ. Преодоление этих недостатков в данной области и является целью настоящего изобретения.
Сущность изобретения
В настоящем изобретении предложены способ и устройство для самоотбора относительно высокоподвижных или морфологически нормальных сперматозоидов с высокой целостностью ДНК из неочищенной или необработанной семенной жидкости.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предложен флюидный канал с входной камерой на одном конце и выходной камерой на другом конце. Внутри этого флюидного канала размещено множество расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого столбчатых элементов. Расстояние между соседними столбчатыми элементами составляет от 1 мкм до 250 мкм. Неочищенную или необработанную семенную жидкость, содержащую сперматозоиды, вводят во входную камеру флюидного канала. Отобранные сперматозоиды собирают из выходной камеры флюидного канала. Отобранные сперматозоиды проходят самоотбор вследствие их собственных самопроизвольных перемещений внутри флюидного канала с взаимодействием с множеством расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого столбчатых элементов, причем данное устройство работает и самоотбор протекает без использования каких бы то ни было внешнего потока, сил или механизмов для подачи неочищенной или необработанной семенной жидкости через флюидный канал, и при этом в результате упомянутого самоотбора в выходную камеру выводятся относительно высокоподвижные морфологически нормальные сперматозоиды с высокой целостностью ДНК по сравнению с неотобранными сперматозоидами необработанной семенной жидкости.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложен флюидный канал с одной или более входной(-ыми) камерой(-ами) для ввода необработанной семенной жидкости в данное устройство, и внутри этого флюидного канала размещено одно или более множество(-еств) расположенных с соблюдением цикличности_на расстоянии один от другого имеющих определенную геометрическую форму элементов или препятствий. Расстояние между соседними столбчатыми элементами составляет от 1 мкм до 500 мкм.
Упомянутое множество имеющих определенную геометрическую форму элементов выполнено так, что при самопроизвольных перемещениях сперматозоидов внутри этого множества они проходят самоотбор без использования каких бы то ни было внешнего потока, сил или механизмов для подачи неочищенной или необработанной семенной жидкости через флюидный канал. Эти имеющие определенную геометрическую форму элементы могут иметь форму цилиндра, квадратной, шестиугольной или иной призмы, и они могут не иметь покрытия или могут быть покрыты какими-либо химическими веществами, которые привлекают или отталкивают сперматозоиды. Множество элементов может иметь квадратную, прямоугольную, шестиугольную или любую другую схему размещения в виде правильных геометрических фигур.
В процессе отбора отбираются относительно высокоподвижные морфологически нормальные или генетически нормальные сперматозоиды по сравнению со сперматозоидами, не прошедшими самоотбор. Для сбора из устройства отобранных сперматозоидов используют одну или более выходную(-ых) камеру(-ер).
Взаимное расположение входной(-ых) камеры(-ер), множества(-еств) столбчатых элементов и выходной(-ых) камеры(-ер) может быть линейным, круговым или другим расположением.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ самоотбора сперматозоидов с использованием описанного выше устройства. Во входную камеру упомянутого устройства вводят образец семенной жидкости, будь-то необработанной или обработанной каким-либо другим способом. Затем устройство инкубировали в течение промежутка времени, составляющего от пяти минут до шестидесяти минут. Во время этого инкубирования сперматозоиды проходят самоотбор без использования каких бы то ни было внешнего потока, сил или механизмов, помимо упомянутого начального введения семенной жидкости в устройство для подачи необработанной семенной жидкости через флюидный канал, и в результате этого самоотбора получают относительно высокоподвижные морфологически нормальные сперматозоиды с высокой целостностью ДНК и низкой эпигенетической анормальностью по сравнению со сперматозоидами необработанной семенной жидкости.
Затем из выходной камеры устройства извлекают часть семенной жидкости. Отобранные с использованием этого устройства сперматозоиды, содержащиеся в этой части семенной жидкости, являются прежде всего такими, которые имеют предпочтительные свойства, такие как (i) высокая подвижность и линейная персистенция, (ii) морфологическая нормальность, (iii) высокая целостность ДНК, и (iv) низкая эпигенетическая анормальность. Неизвлеченную семенную жидкость отбраковывают, поскольку она является менее предпочтительной по сравнению с семенной жидкостью, извлеченной из выходной камеры устройства.
Краткое описание фигур
На Фиг. 1, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показано схематическое изображение предназначенного для отбора сперматозоидов микрофлюидного чипа с расположенными с соблюдением цикличности_на расстоянии один от другого элементами. Показанный образец конструктивного исполнения полидиметилсилоксанового (ПДМС) чипа соединен со стеклянной подложкой и имеет канал шириной 1,5 мм, длиной 8 мм и высотой 50 мкм. В середине упомянутого канала цилиндрические элементы (диаметром 10 мкм на этой фигуре) образуют группу элементов, расположение которых характеризуется цикличностью (периодичностью).
На Фиг. 2, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, проиллюстрирован способ отбора подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов, названный SPARTAN ("Simple Periodic ARray for Trapping And isolatioN", т.е. использующий для улавливания и отбора сперматозоидов группу структурных элементов, характеризующуюся простой конфигурацией и цикличностью расположения этих элементов).
На Фиг. 3 показана фотография приведенного в качестве примера варианта исполнения микрофлюидного устройства (длина масштабной линейки составляет 10 мм).
На Фиг. 4 показано полученное с помощью растрового электронного микроскопа изображение приведенного в качестве примера варианта множества расположенных с соблюдением цикличности_на расстоянии один от другого элементов в устройстве (длина масштабной линейки составляет 50 мкм).
На Фиг. 5 показано полученное с помощью автоэлектронного сканирующего микроскопа изображение приведенного в качестве примера варианта множества расположенных с соблюдением цикличности_на расстоянии один от другого столбчатых элементов со сперматозоидом внутри этого множества (длина масштабной линейки составляет 20 мкм).
На Фиг. 6, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показана блок-схема процесса, используемого для моделирования с целью разработки некоторых приведенных в качестве примера вариантов исполнения устройства.
На Фиг. 7, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны смоделированные траектории движения нормальных сперматозоидов (n=100) в приведенных в качестве примера каналах со схемами расположения множества элементов 18×26 мкм (на фигуре слева) и 26×26 мкм (на фигуре справа).
На Фиг. 8, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны смоделированные траектории движения сперматозоидов (n=100) с аномальной морфологией (с увеличенными в 3 раза головками) в канале со схемой расположения множества элементов 30×26 мкм.
На Фиг. 9, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны смоделированные траектории движения сперматозоидов (n=100) с аномальной морфологией (с изогнутыми на 18° шейками) в канале со схемой расположения множества элементов 30×26 мкм.
На Фиг. 10, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, проиллюстрирован способ измерения криволинейной и прямолинейной скоростей сперматозоидов.
На Фиг. 11, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны смоделированные траектории движения нормальных сперматозоидов (n=100) в приведенном в качестве примера канале со схемой расположения множества элементов 30×26 мкм.
На Фиг. 12, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны траектории движения сперматозоидов в приведенном в качестве примера канале со схемой расположения множества элементов 30×26 мкм.
На Фиг. 13, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны смоделированные результаты прямолинейной скорости (VSL) движения сперматозоидов до и после прохождения через совокупность приведенных в качестве примера каналов с различными схемами расположения множества элементов.
На Фиг. 14, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны экспериментальные результаты для прямолинейной скорости (VSL) движения сперматозоидов до и после прохождения через совокупность приведенных в качестве примера каналов с различными значениями расстояния между столбчатыми элементами в упомянутом множестве.
На Фиг. 15, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны смоделированные результаты прямолинейной скорости (VSL) движения сперматозоидов до и после прохождения через совокупность приведенных в качестве примера каналов с различными длинами.
На Фиг. 16, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны экспериментальные результаты для прямолинейной скорости (VSL) движения сперматозоидов до и после прохождения через совокупность приведенных в качестве примера каналов с различными длинами.
На Фиг. 17, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны смоделированные результаты прямолинейной скорости (VSL) движения сперматозоидов до и после прохождения через совокупность приведенных в качестве примера каналов с различной продолжительностью инкубации.
На Фиг. 18, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны экспериментальные результаты для прямолинейной скорости (VSL) движения сперматозоидов до и после прохождения через совокупность приведенных в качестве примера каналов с различной продолжительностью инкубации.
На Фиг. 19, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, проиллюстрированы основные этапы отбора высокоподвижных сперматозоидов из необработанного образца.
На Фиг. 20, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны экспериментальные результаты для криволинейной скорости движения и для степени извлечения сперматозоидов после прохождения через совокупность приведенных в качестве примера каналов с различными длинами.
На Фиг. 21, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны экспериментальные результаты для криволинейной скорости движения и для степени извлечения сперматозоидов после прохождения через совокупность приведенных в качестве примера каналов с различной продолжительностью инкубации.
На Фиг. 22, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны полученные с помощью микроскопа и автоэлектронного сканирующего микроскопа изображения сперматозоидов с морфологическими дефектами и без них в приведенном в качестве примера варианте исполнения устройства.
На Фиг. 23, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, проиллюстрирована разница в распространенности сперматозоидов с морфологическими дефектами в образце семенной жидкости до и после обработки с использованием приведенного в качестве примера варианта исполнения устройства.
На Фиг. 24, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, приведена выраженная в процентах доля сперматозоидов с нормальной морфологией после обработки семенной жидкости различными способами, в том числе с использованием приведенного в качестве примера варианта исполнения устройства.
Фиг. 25, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, иллюстрирует зрелость сперматозоидов.
На Фиг. 26, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показано различие в зрелости ядер сперматозоидов в образце семенной жидкости до и после обработки с использованием приведенного в качестве примера варианта исполнения устройства.
На Фиг. 27, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показаны изображения, иллюстрирующие фрагментацию ДНК в сперматозоидах.
На Фиг. 28, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показано различие в индексе фрагментации ДНК сперматозоидов в образце семенной жидкости до и после обработки с использованием приведенного в качестве примера варианта исполнения устройства.
На Фиг. 29, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показано отличие общего метилирования сперматозоидов в образце семенной жидкости до и после обработки с использованием приведенного в качестве примера варианта исполнения устройства.
На Фиг. 30, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, приведены параметры, выбранные для SRD-моделирования сперматозоидов.
На Фиг. 31, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, приведены уравнения, которые описывают крупнозернистую модель устройства и способа.
На Фиг. 32, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показано соотношение состояний, которые образуют крупнозернистую модель устройства и способа.
На Фиг. 33, в соответствии с приведенным в качестве примера вариантом осуществления настоящего изобретения, показано распределение значений VSL, используемых для моделирования устройства и способа.
Подробное описание изобретения
Для достижения целей настоящего изобретения считают, что перемещение сперматозоидов по женскому репродуктивному тракту, которое представляет собой явление, сохраняющееся у живородящих млекопитающих на протяжении миллионов лет эволюции и размножения, является естественным эффективным "фильтром" для фертильных сперматозоидов. Физические компоненты этого тракта моделируют in vitro с использованием микрофлюидного метода, разработанного с применением мультимасштабного компьютерного моделирования, в котором задействована физика текучих сред, и исследуют, как этот искусственный тракт "шейка матки - маточная труба" влияет на описательные характеристики сперматозоидов, а также на менее очевидные, но клинически значимые показатели фертильных сперматозоидов, в том числе целостность ДНК и состояние метилома.
Разработанный по настоящему изобретению способ с использованием SPARTAN ("Simple Periodic ARray for Trapping And isolatioN") обеспечивает успешное имитирование основных фильтрующих особенностей упомянутого естественного тракта и выделение высокоподвижных и морфологически нормальных сперматозоидов с высокой целостностью ДНК и низкой эпигенетической анормальностью с целью их использования в клинике для больных бесплодием.
Устройство, делающее возможным выполнение этого способа, содержит ряд изготовленных микротехнологическими методами элементов, оптимизирующих эффективность самоотбора и выделения морфологически жизнеспособных сперматозоидов. Схематическое изображение микрофлюидного устройства показано на Фиг. 1. В одной из частей устройства имеется(-ются) входная камера или несколько входных камер, выполненная(-ых) в виде сквозного(-ных) отверстия(-ий) в верхней поверхности устройства. За ними расположен факультативный переходной участок микроканала, который не содержит каких-либо поверхностных элементов. Этот переходной участок не является обязательным для функционирования устройства, но может требоваться при практическом изготовлении устройства. Следующей частью устройства является основной рабочий участок, состоящий из множества столбчатых элементов, характеризующегося цикличностью их расположения. Одним из возможных примеров взаимного расположения элементов этого множества является прямоугольная решетка из цилиндрических элементов. После упомянутого множества элементов, расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого, имеется второй факультативный переходной участок, за которым расположена(-ы) выходная камера или несколько выходных камер, также выполненная(-ых) в виде сквозного(-ых) отверстия(-ий) в верхней поверхности устройства.
Устройство используют, сначала наполняя его буферным раствором, который может поддерживать жизнеспособность сперматозоидов. Одним из примеров такого раствора может быть среда для промывания сперматозоидов. Кроме того, для предотвращения испарения такой среды входная(-ые) камера(-ы) и выходная(-ые) камера(-ы) могут быть покрыты неиспаряющейся средой, которая не смешивается с буферным раствором. Одним из примеров такой среды является минеральное масло. Затем в устройство загружают семенную жидкость, вводя образец необработанной семенной жидкости во входную(-ые) камеру(-ы) с использованием, например, пипетки. Затем устройство инкубируют в течение заранее определенного периода времени, составляющего от 5 мин до 120 мин в зависимости от конкретного устройства. По окончании этого этапа отобранные сперматозоиды могут быть собраны из выходной(-ых) камеры(-ер), также с использованием, например, пипетки.
Чтобы подтвердить работоспособность предложенной концепции, с использованием обычной фотолитографии было изготовлено приведенное в качестве примера микрофлюидное устройство для отбора сперматозоидов, содержащее цилиндрические элементы. Вкратце, слой фоторезиста SU-8 толщиной 50 мкм был нанесен и проявлен на 4-дюймовой кремниевой пластине, с образованием микроканала. Затем был изготовлен микрофлюидный чип для отбора сперматозоидов с использованием материала Sylgard 184 (Dow Corning, Midland, MI, США), содержащего основу и отвердитель в объемном соотношении 1:10, который нанесли на кремниевую пластину, дегазировали, и отверждали при температуре 70°С в течение 2 ч. После отверждения были выполнены входная и выходная камеры с использованием Acu Punch (наконечники 1,0 мм и 2,0 мм). Перед использованием полученный канал плотно закрывали стеклянной пластиной с использованием кислородной плазмы и запекали при температуре 60°С в течение 30 мин. На Фиг. 2 показано схематическое изображение этого конкретного устройства, и на Фиг. 3 показана фотография реального устройства. На Фиг. 4 показано полученное с помощью автоэлектронного сканирующего микроскопа изображение изготовленных микротехнологическими методами элементов, расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого, и на Фиг. 5 показан сперматозоид внутри множества этих элементов.
Назначением устройства по настоящему изобретению является эффективный отбор подвижных и здоровых сперматозоидов с использованием гидродинамических эффектов, воздействующих на сперматозоиды в микрофлюидном канале как следствие размещения в нем с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого конструктивных элементов. Поскольку в этом процессе участвует много переменных, таких как размеры и форма конфигурации элементов, расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого, расстояние между конструктивными элементами, длина канала, время собирания и т.д., то для оптимизации конструкции канала была разработана мультимасштабная вычислительная модель.
Проектирование устройства с использованием мультимасштабного компьютерного моделирования
Принцип моделирования
Так как неясно и неочевидно, как геометрические характеристики устройства самоотбора могут быть выбраны с учетом нелинейного характера взаимодействия текучей среды с плавающими в ней объектами и наличия сложных геометрических форм, авторами настоящего изобретения была создана мультимасштабная модель для моделирования движения сперматозоидов в устройстве. Эта модель состоит из двух частей: мелкозернистой модели на основе частиц и крупнозернистой модели, в которой используется вероятностное движение по решетке, образованной множеством расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого элементов. Вкратце, в мелкозернистой модели мезомасштабного растворителя, основанной на представлении его в виде частиц, которая уже более десятилетия успешно используется в многочисленных системах мягкого вещества, используется стохастическая вращательная динамика (SRD, "stochastic rotation dynamics"). В модели SRD текучую среду моделируют крупнозернистым способом, при этом сперматозоиды представлены как структуры "шарик-пружина", а упомянутые столбчатые элементы - как непроницаемые барьеры, и все эти элементы взаимодействуют между собой посредством гидродинамических взаимодействий при наличии тепловых флуктуаций. С помощью этой модели генерируют микроскопические траектории, которые затем используют для подготовки вероятностной, основанной на правилах, модели решетки для описания движения сперматозоидов при данных геометрических характеристиках столбчатых элементов в реальном масштабе времени и расстояний. Точнее, крупнозернистая модель представляет собой модель решетки с дискретным временем и периодическим повторением. На каждом временном шаге сперматозоид имеет зависящую от направления вероятность поворота вправо или влево, и затем вероятность сделать шаг по решетке. Используя правила вероятности, полученные из модели SRD, эта модель может моделировать поведение сперматозоида для большого количества сперматозоидов и большого количества шагов. На Фиг. 6 показано общее представление этого подхода к моделированию. Более подробную информацию см. в разделе "Подробное описание подхода к моделированию".
Результаты моделирования по скорости движения и коэффициенту собирания сперматозоидов
Для исследования воздействия группы расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии одно от другого препятствий на поведение сперматозоидов было построено несколько моделей препятствий с различными геометрическими характеристиками с использованием мультимасштабной модели, предложенной в настоящем изобретении. Поскольку известно, что сперматозоиды гидродинамически взаимодействуют с поверхностями, вблизи от которых они находятся, то один из вероятных результатов такого взаимодействия заключается в том, что различные варианты размещения препятствий могут ускорять, замедлять или изменять направление движения взаимодействующих с ними сперматозоидов. Выполненное изобретателями моделирование показало, что при достаточно малом расстоянии между столбчатыми элементами сперматозоиды будут застревать вследствие негибкости смоделированных сперматозоидов. Однако для менее плотного размещения препятствий было обнаружено, что при этих геометрических характеристиках сперматозоиды будут сохранять достаточно устойчивые траектории (см. Фиг. 7).
Кроме того, если решетка имеет небольшое соотношение геометрических размеров в одном измерении и большое соотношение геометрических размеров в другом измерении (порядка длины сперматозоида), то сперматозоид поплывет преимущественно вдоль той оси, вдоль которой расстояния между столбчатыми элементами больше. Это явление на первый взгляд является парадоксальным, поскольку естественно ожидать, что сперматозоид выберет путь наименьшего сопротивления, т.е. широкие каналы. Однако если столбчатые элементы расположены достаточно близко один к другому, то они действуют наподобие пористой стенки, и сперматозоид притягивается к ним. Как и у всех объектов, плавающих посредством толкающих движений, геометрия плавания сперматозоидов заставляет их поворачивать по направлению к поверхности, к которой они подплывают. При взаимодействии с плоской поверхностью это заставляет сперматозоид двигаться вдоль нее. Однако если поверхность имеет промежутки достаточного размера и подходящей геометрической формы, то сперматозоид повернет в такой промежуток и проплывет сквозь него. Конечным результатом является изменение направления движения сперматозоида.
Имея возможность изменять направление движения сперматозоидов, можно задать путь предпочтительного перемещения активных плавающих объектов (здоровых сперматозоидов), тогда как перемещение инородных частиц и вялых сперматозоидов будет ограничено их диффузией. Это позволяет создать устройства для выделения и отбора здоровых сперматозоидов, отличающиеся значительно меньшими размерами и значительно большим быстродействием.
Результаты моделирования по морфологическому отбору
Дополнительно были исследовано дифференцирующее влияние геометрических характеристик столбчатых элементов на сперматозоиды с морфологическими дефектами. Приведенные в качестве примера смоделированные траектории движения сперматозоидов с изогнутыми шейками и увеличенными в 3 раза головками показаны, соответственно, на Фиг. 9 и Фиг. 8. Для обоих показанных случаев изобретателями обнаружено, что расположенные согласно определенной геометрической конфигурации с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого препятствия содействуют изменению направления движения таких сперматозоидов и тем самым локализуют их более эффективно, чем простой канал.
Результаты экспериментальных исследований
Используя расчетные данные моделирования как руководство, был изготовлен предназначенный для подтверждения работоспособности концепции образец микрофлюидного канала, содержащий множество расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого цилиндрических элементов с большим соотношением геометрических размеров. В частности, размеры изготовленного чипа составляют 8 мм в длину и 1,5 мм в ширину, а диаметры входной и выходной камер составляют, соответственно, 1 мм и 2 мм. В середине канала на определенном расстоянии один от другого расположены цилиндрические элементы диаметром 10 мкм.
Было выполнено исследование результатов отбора сперматозоидов с использованием деидентифицированного отбракованного образца семенной жидкости из лаборатории ЭКО Стэнфордской медицинской школы (Stanford School of Medicine). Сначала предназначенный для отбора сперматозоидов микрофлюидный чип был предварительно заполнен средой для промывания сперматозоидов, и на выходную камеру для этой среды был нанесен тонкий слой минерального масла с тем, чтобы предотвратить испарение среды при исследовании результатов отбора сперматозоидов. Деидентифицированный отбракованный образец семенной жидкости объемом 0,5-2 мкл (4000-6000 сперматозоидов/мкл) был введен во входную камеру, и затем входную камеру покрыли слоем минерального масла. Затем предназначенный для отбора сперматозоидов чип был помещен в инкубатор для выдерживания в нем при 37°С в течение 15 мин. И, наконец, с использованием световой микроскопии (Carl Zeiss, Axio Vision 4.8.2.SP3) были получены и изучены изображения предназначенного для отбора сперматозоидов чипа с тем, чтобы определить выраженную в процентах долю подвижных сперматозоидов, траекторию движения сперматозоидов и выраженную в процентах долю извлеченных сперматозоидов на выходе чипа.
Измерялись кинематические характеристики траектории движения сперматозоидов, такие как подвижность сперматозоидов, криволинейная скорость (VCL, "curvilinear velocity") и прямолинейная скорость (VSL, "straight-line velocity"). VCL относится к расстоянию, которое преодолевает головка сперматозоида в течение времени наблюдения. VSL относится к прямолинейному расстоянию между начальной и конечной точками траектории движения сперматозоида (см. Фиг. 10). Процентную долю подвижных сперматозоидов определяли как долю подвижных сперматозоидов относительно общего количества сперматозоидов.
Полученные результаты моделирования и экспериментальных исследований прекрасно согласуются между собой, что доказывает эффективность проектных параметров, полученных с использованием компьютерного моделирования. На Фиг. 11 и Фиг. 12 показаны траектории движения сперматозоидов для множества расположенных с соблюдением цикличности элементов, расстояния между которыми составляют 30×26 мкм, полученные соответственно с использованием компьютерного моделирования и in vitro. На Фиг. 13 и Фиг. 14 приведено сравнение значений прямолинейной скорости (VSL) на входе и выходе чипа после 30 мин инкубации устройства полученных соответственно, с использованием мультимасштабного моделирования и измеренных экспериментально, для различных расстояний между элементами, размещенными с соблюдением цикличности. На Фиг. 15 приведены значения прямолинейной скорости (VSL), полученные мультимасштабным моделированием траекторий движения сперматозоидов, на входе и выходе чипа (после 30 мин инкубации) для каналов различной длины с множеством элементов, размещенных с соблюдением цикличности на расстоянии 30×26 мкм. На Фиг. 16 приведены результаты экспериментальных измерений VSL (полученные на выходе чипа после 30 мин инкубации) для каналов различной длины с множеством элементов, размещенных с соблюдением цикличности на расстоянии 30×26 мкм. Полученные на выходе чипа результаты отбора сперматозоидов для различной продолжительности инкубации в сравнении с пустым каналом проиллюстрированы посредством исследования VSL на Фиг. 17 для моделирования, и на Фиг. 18 для экспериментального измерения.
На Фиг. 19 схематически показан отбор сперматозоидов: сначала семенную жидкость загружают в устройство, выдерживают в нем для инкубирования, и затем сперматозоиды, собранные на выходе устройства, извлекают из него и изучают, также изучая полученные с помощью микроскопа изображения траекторий движения сперматозоидов на входе устройства, на участке со столбчатыми элементами и на выходе устройства. На Фиг. 20 приведены результаты экспериментальных измерений VCL и степени извлечения сперматозоидов для чипа SPARTAN при различной длине канала. На Фиг. 21 приведены результаты экспериментальных измерений VCL и степени извлечения сперматозоидов для чипа SPARTAN при различной продолжительности инкубации.
На Фиг. 22 показаны полученные с помощью микроскопа изображения окрашенных по методу Diff-Quick сперматозоидов и полученные с помощью автоэлектронного сканирующего микроскопа изображения сперматозоидов с различными морфологическими дефектами, а именно: (i) нормальный сперматозоид, (ii) сперматозоид с изогнутой шейкой, (iii) сперматозоид с увеличенной головкой (длина масштабной линейки составляет 10 мкм). На Фиг. 23 показана необработанная семенная жидкость (стрелками показаны анормальные сперматозоиды), и сперматозоиды, отобранные с использованием чипа SPARTAN (длина масштабной линейки составляет 50 мкм). На Фиг. 24 приведены результаты морфологического SK-исследования сперматозоидов, обработанных с применением технологии всплытия, чипа с пустым каналом и чипа SPARTAN. Вместе взятые, эти результаты показывают в какой степени упомянутое устройство может отфильтровывать сперматозоиды с морфологическими дефектами.
На Фиг. 25 показано полученное с помощью микроскопа изображение окрашенных с использованием кислого анилинового синего сперматозоидов, на котором изображены различные стадии зрелости ядер сперматозоидов. На Фиг. 26 приведены результаты исследования выраженной в процентах доли сперматозоидов со зрелыми ядрами среди сперматозоидов, отобранных с использованием чипа SPARTAN, в сравнении с выраженной в процентах долей сперматозоидов со зрелыми ядрами среди сперматозоидов из образцов необработанной семенной жидкости (исследовано n=5 образцов семенной жидкости). На Фиг. 27 показаны флуоресцентно окрашенные изображения, полученные в процессе исследования фрагментации ДНК сперматозоидов с использованием метода TUNEL. На Фиг. 28 приведены результаты анализа индекса фрагментации ДНК (DFI) сперматозоидов, отобранных с использованием чипа SPARTAN, в сравнении с DFI сперматозоидов из образцов необработанной семенной жидкости (исследовано n=5 образцов семенной жидкости). На Фиг. 29 приведены результаты исследования общего метилирования сперматозоидов из образцов необработанной семенной жидкости и сперматозоидов, отобранных по способу с использованием чипа SPARTAN.
Дополнительные замечания
Сперматозоиды движутся быстрее среди расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого элементов, что подобно действию самоиндуцированного поля потока. Одно из новшеств предложенной системы заключается в том, что элементы, которые размещены внутри канала с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого, изменяют движение сперматозоидов. Например, взаимодействие с упомянутыми элементами и траектория движения сперматозоидов с деформированной морфологией отличаются от таковых у сперматозоидов с нормальной морфологией. Причиной этого являются гидродинамические взаимодействия между сперматозоидами и расположенными с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого элементами. Обнаружено, что сперматозоиды движутся быстрее - по сравнению со сперматозоидами на входе или выходе - внутри множества столбчатых элементов вследствие различных воздействий, в том числе гидродинамических взаимодействий, и это явление может рассматриваться как действие самоиндуцированного поля потока, генерируемого сперматозоидами. Не было очевидно, что сперматозоиды будут взаимодействовать с расположенными с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого препятствиями в канале таким образом, чтобы предпочтительно выбирать наиболее узкие пути. Имеются данные о связях между генетическим и эпигенетическим качеством сперматозоидов и их морфологией и подвижностью, что влияет на их функциональность. Таким образом, результирующее влияние этих имеющих определенную геометрическую форму элементов заключается в отборе функциональных сперматозоидов, что является уникальным и неочевидным результатом.
Кроме того, для некоторых вариантов характеризующегося цикличностью расположения препятствий обнаружено, что сперматозоиды движутся в участках канала с циклично расположенными в них препятствиями быстрее, чем вне таких участков. В зависимости от геометрических характеристик расположения препятствий в канале, а также с учетом способа движения сперматозоидов с помощью хвоста и морфологии сперматозоидов, это явление можно использовать для более эффективного отбора сперматозоидов. Компьютерное моделирование используется для разработки оптимальных вариантов конструкции, а также как руководство для начальных экспериментов и разработки прототипов устройства. Обнаруженное явление является уникальным и неожиданным. Из общин соображений можно было бы ожидать, что расположенные с соблюдением цикличности препятствия будут замедлять сперматозоиды при их движении между ними, однако было обнаружено, что сперматозоиды могут ускорять или изменять направление движения в зависимости от конкретных особенностей геометрических конфигураций расположения препятствий. Это приводит к неожиданному явлению самоотбора сперматозоидов.
Во флюидном канале, используемом в этом изобретении, отсутствует движение или поток текучей среды, и текучую среду внутри канала не приводят в активное движение. Весь отбор происходит без использования какого-либо внешнего потока или направленных сил из канала. Источником движения сперматозоидов является их собственная подвижность, которая имеет уникальный характер и варьируется от сперматозоида к сперматозоиду, особенно в случае морфологически дефектных или клинически проблемных экземпляров. Это уникальное самопроизвольное перемещение сперматозоидов приводит к их самоотбору, чего при наличии расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого элементов ранее никогда не отмечалось. Это явление является особенно поразительным с учетом того, что можно изменять результаты отбора, регулируя цикличность следования препятствий и форму препятствий, размещаемых на пути движения сперматозоидов. Эти свойства можно изменять по различным группам горизонтальных и/или вертикальных рядов препятствий с тем, чтобы добиться необходимой производительности процесса отбора.
Как видно из компьютерного моделирования, выполненного изобретателями, примерный диапазон значений расстояний между размещаемыми с соблюдением цикличности препятствиями, в котором явления, которые делают возможным отбор, являются четко выраженными, составляет от одного микрометра до пятисот микрометров.
Размеры устройства самоотбора
В рассматриваемых в качестве примера устройствах размеры устройства самоотбора и множества расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого элементов могут быть следующими:
- расстояние по ширине или длине между столбчатыми элементами в множестве: 1-250 мкм, 5-200 мкм или 5-30 мкм;
- высота столбчатых элементов в множестве: приблизительно 50 мкм в диапазоне от 20 мкм до 80 мкм;
- длина входной части: в диапазоне от приблизительно 2 мм до 4 мм;
- длина канала: в диапазоне от приблизительно 4 мм до 20 мм;
- длина выходной части: в диапазоне от приблизительно 2 мм до 4 мм.
Подробное описание подхода к моделированию
Был использован подход, сочетающий в себе преимущества детализации поведения, обеспечиваемой мелкозернистым моделированием, и вычислительной эффективности крупнозернистых моделей. Начнем с описания поведения наблюдаемых с использованием микроскопа сперматозоидов при конкретных геометрических характеристиках препятствий. Как только будет получено достаточно данных относительно перемещения сперматозоидов при этих конкретных геометрических характеристиках, эту информацию можно использовать для быстрой экстраполяции большего количества траекторий, что позволит исследовать поведение множества сперматозоидов в течение длительных периодов времени.
Мелкозернистая модель сперматозоида: модель сперматозоида представлена как система "шарик-пружина", с использованием потенциала Гука для предотвращения растяжения и изгибания. Непрямолинейные связи осуществляются вращением второго из сегментов с образованием связи под требуемым углом с минимальной энергией для этой связи [14].
Модель растворителя: сперматозоид присоединяют к мезомасштабному растворителю, модель которого создана с использованием метода, известного как "стохастическая вращательная динамика" (SRD). В этом методе текучую среду моделируют как совокупность точечных частиц, движущихся дискретными временными шагами, причем каждый временной шаг состоит из двух процессов. На первом (потоковом) этапе частицы движутся баллистически, тогда как на втором этапе (столкновения) частицы обмениваются импульсом силы со своими ближайшими соседями в едином коллективном столкновении [15-18].
Чтобы присоединить модель сперматозоида к этой модели растворителя, предполагают, что шарики сперматозоидов участвуют в упомянутых коллективных столкновениях, что позволяет им обмениваться импульсом силы с текучей средой. Это присоединение также используют для введения в эту модель множества расположенных с соблюдением цикличности на расстоянии один от другого столбчатых элементов. Столбчатые элементы множества состоят из частиц, которые лишены возможности перемещаться. Кроме того, шарики сперматозоидов и частицы препятствия взаимодействуют друг с другом согласно оборванному потенциалу Леннарда-Джонса, что делает возможным неупругое отталкивающее взаимодействие, которое не позволяет сперматозоидам преодолеть препятствие и дополняет гидродинамические взаимодействия, осуществляемые текучей средой, модель которой создана с использованием SRD [14]. Поскольку модель растворителя, созданная с использованием SRD, обладает рядом свойств, включая вязкость, которые зависят от температуры, то необходимо обеспечить постоянство общей температуры системы во времени. Для этого в упомянутый этап столкновения включают регулирование температуры [19]. Все параметры модели приведены на Фиг. 30.
Крупнозернистая модель решетки: для моделирования большого количества сперматозоидов, движущихся в течение длительного периода времени, была разработана крупнозернистая модель для перемещения сперматозоидов сквозь решетку. Эта модель предполагает, что существует конечное число направлений, в которых может быть повернут сперматозоид при перемещении сквозь решетку, и что его перемещение будет зависеть от направления перемещения. На каждом этапе существует вероятность того, что сперматозоид повернет влево или вправо, переходя из своего текущего состояния в следующее. Эта вероятность представлена марковской моделью состояния направленности сперматозоида. Как функция этого состояния, также существует вероятность того, что сперматозоид будет двигаться в одном из основных направлений.
Вероятность перемещения обозначена как P(i,d), и вероятность вращения - как Q(e,d), где i представляет собой направления (влево, вверх, вправо, вниз), d представляет собой направление, в котором сперматозоид повернут в настоящий момент времени, и е представляет собой направление, в котором он будет повернут на следующем этапе. Процесс изменения состояния состоит из двух частей, как описано математически на Фиг. 31 и показано графически на Фиг. 32. Этапы перемещения и вращения чередуются, обеспечивая поступательное продвижение положения сперматозоида и изменение направления, в котором он повернут, во времени.
Переход между моделями: Результатом расчетов с использованием модели SRD являются траектории движения сперматозоида (который определяли по центру массы головки сперматозоида), а также угол поворота его головки (определяемый как вектор, соединяющий центр массы головки и точку присоединения шейки), как функция времени. Эти данные выражены в единицах измерения параметров SRD. Однако для модели решетки требуются единицы измерения, имеющие отношение к столбчатым элементам и циклическим колебаниям хвоста сперматозоида. Чтобы выполнить необходимые преобразования, данные о положении сначала преобразуют в целочисленные координаты на решетке, определенной столбчатыми элементами. Время дискретизируют, разбивая его на интервалы, составляющие в среднем один интервал на цикл перемещения сперматозоида. Чтобы ограничить количество вычислений, необходимых для определения вероятностей перемещения, используют симметричность системы при расчете каждой траектории как ее самой, так и как если бы она была повернута на 180°. Другими словами, траектория, по которой сперматозоид начинает двигаться, будучи повернутым влево, и затем движется вверх, эквивалентна траектории, по которой сперматозоид начинает двигаться, будучи повернутым вправо, и затем движется вниз.
В модели решетки напрямую не применяются упомянутые траектории, однако в модели необходимы вероятности перехода, чтобы рассчитать перемещение и поворот сперматозоида на каждом шаге. Чтобы распределить по группам различные направления, в которых может быть повернут сперматозоид, строят гистограмму распределения углов поворота головки сперматозоида, и ее минимумы используют для выделения групп. Каждая группа образует дискретное направление, в котором может быть повернут сперматозоид в модели решетки. Затем эту рассчитанную с использованием крупнозернистой модели траекторию используют для вычисления вероятностей перемещения и вращательного перехода. На каждом этапе, если сперматозоид изменяет группу угла поворота головки или свое положение в решетке, то это регистрируют. Результаты каждой группы усредняют по каждому шагу, выполняемому каждым сперматозоидом, получая результирующий массив вероятностей перемещения и поворотного перехода. Затем эти данные используют для решетки.
Сначала скорость плавания сперматозоидов калибруют в зависимости от экспериментальных результатов. Эту калибровку выполняют с использованием исходных результатов модели SRD, вычисляя VSL и VCL смоделированных сперматозоидов в единицах модели SRD. Значение расстояния между столбчатыми элементами определяет преобразование между результатами модели SRD и физическими единицами измерения длины, и параметр модели SRD для колебаний хвоста сперматозоида определяет преобразование между результатами в единицах модели SRD и циклическими колебаниями хвоста сперматозоида. Для каждого сперматозоида, участвующего в испытаниях модели решетки, результирующую скорость определяют с учетом распределения скоростей, измеренного экспериментально, которое показано на Фиг. 33. Эту скорость умножают на время инкубации для этого испытания, получая общее расчетное расстояние, пройденное сперматозоидом. Затем эту общую длину траектории, выраженную в микрометрах, умножают на коэффициент преобразования в циклические колебания хвоста сперматозоида, получая общее количество циклических колебаний хвоста - каждое из которых соответствует этапу моделирования решетки - для данного сперматозоида. На этом этапе моделирование можно продолжить, выполняя такое количество шагов, как описано ранее. На каждом шаге регистрируют положение сперматозоида, и конечные положения сперматозоидов используют, чтобы определить, какие сперматозоиды достигли выхода и подлежат собиранию, а какие нет. Для собранных сперматозоидов регистрируют скорость их перемещения, и все зарегистрированные значения усредняют, получая общие результаты.
ССЫЛКИ
[1] Ombelet, W., et al., Infertility and the provision of infertility medical services in developing countries. Human Reproduction Update, 2008. 14(6): p. 605-621.
[2] Turchi, P., Prevalence, Definition, and Classification of Infertility, in Clinical Management
of Male Infertility. 2015, Springer, p. 5-11. [3] Tasoglu, S., et al., Exhaustion of Racing Sperm in Nature-Mimicking Microfluidic
Channels During Sorting. Small, 2013. 9(20): p. 3374-3384. [4] Manipalviratn, S., A. DeCherney, and J. Segars, Imprinting disorders and assisted reproductive technology. Fertility and sterility, 2009. 91(2): p. 305-315.
[5] Maher, E.R., M. Afnan, and C.L. Barratt, Epigenetic risks related to assisted reproductive technologies: epigenetics, imprinting, ART and icebergs? Human Reproduction, 2003. 18(12): p. 2508-2511.
[6] Belva, F., et al., Semen quality of young adult ICSI offspring: the first results. Human Reproduction, 2016.
[7] Henkel, R.R. and W.-B. Schill, Sperm preparation for ART. Reprod Biol Endocrinol, 2003. 1(1): p. 108.
[8] Mortimer, D. and S. Mortimer, Methods of sperm preparation for assisted reproduction. Annals of the Academy of Medicine, Singapore, 1992. 21(4): p. 517-524.
[9] Asghar, W., et al., Selection of functional human sperm with higher DNA integrity and fewer reactive oxygen species. Advanced healthcare materials, 2014. 3(10): p. 1671-1679.
[10] Berkovitz, A., et al., How to improve IVF-ICSI outcome by sperm selection. Reproductive biomedicine online, 2006. 12(5): p. 634-638.
[11] Sivanarayana, Т., et al., Sperm DNA fragmentation assay by sperm chromatin dispersion (SCD): correlation between DNA fragmentation and outcome of intracytoplasmic sperm injection. Reproductive Medicine and Biology, 2014. 13(2): p. 87-94.
[12] Daris, В., et al., Sperm morphological abnormalities as indicators of DNA fragmentation andfertilization in ICSI. Archives of gynecology and obstetrics, 2010. 281(2): p. 363-367.
[13] Mohammad, H.N.-E., et al., Effect of sperm DNA damage and sperm protamine deficiency on fertilization and embryo development post-ICSI. Reproductive biomedicine online, 2005. 11(2): p. 198-205.
[14] Y. Yang, J. Elgeti, and G. Gompper. Phys. Rev. E 78, 061903 (2008).
[15] Malevanets andR. Kapral. J. Chem. Phys. 110, 8605-8613 (1999).
[16] E. Tuzel, M. Strauss, T. Ihle, and D. M. Kroll. Phys. Rev. E 68, 036701 (2003).
[17] E. Tuzel, T. Ihle, and D. M. Kroll. Phys. Rev. E 74, 056702 (2006).
[18] E. Tuzel, Ph.D. Thesis, University of Minnesota (2006).
[19] H. Hijar and G. Sutmann. Physical Review E 83 046708 (2011).