Влияние композиции «Талерин» на фонд свободных аминокислот сердца при субхронической алкогольной интоксикации

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2011

ВЛИЯНИЕ КОМПОЗИЦИИ «ТАЛЕРИН» НА ФОНД СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ СЕРДЦА ПРИ СУБХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ

ИНТОКСИКАЦИИ

СМИРНОВ В.Ю., РАЗВОДОВСКИЙ Ю.Е., ДОРОШЕНКО Е.М., ШЕЙБАК В.М.

УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Резюме. Исследовано влияние внутрижелудочного введения препарата «Талерин» на пул свободных аминокислот сердца крыс при субхронической алкогольной интоксикации (СХАИ). Установлено, что СХАИ сопровождается снижением концентраций цистатионина и фосфоэтаноламина, и повышением уровня аланина, метионина, аргинина и триптофана. Показано, что препарат «Талерин» повышает в сердце соотношение АРУЦ/ ААК, предотвращает в сердце рост уровней триптофана, аргинина и аланина, а также усиливает катаболизм серосодержащих аминокислот.

Ключевые слова: аминокислоты, хроническая алкогольная интоксикация, таурин, лейцин, АРУЦ, цинк, магний, рибофлавин.

Abstract. We investigated the effect of intragastric administration of preparation «Talerin» on the pool of free amino acids of the heart of rats in subchronic alcohol intoxication (SChAI). It was found that SChAI decreases the levels of cystathionine and phosphoethanolamine, elevates the levels of alanine, methionine, arginine and tryptophan. The administration of the preparation tested was shown to raise BCAA/AAA ratio, to prevent the increase of the levels of tryptophan, alanine and arginine, and to promote catabolism of sulfurcontaining amino acids in the heart.

Чрезмерное потребление алкоголя при водит к поражению практически всех органов, в том числе сердца. Для описания поражения сердца при хронической алкогольной интоксикации используется термин «алкогольная кардиомиопатия» (АКМП) [12]. Патогенез АКМП до конца не исследован. При алкогольном поражении сердца «включаются» следующие механизмы: прямое токсическое

Адрес для корреспонденции: 230009, г. Гродно, ул.Горького, д. 80. Гродненский государственный медицинский университет - Смирнов В.Ю.

действие алкоголя и его метаболитов на сердечную мышцу, вызывающее апоптоз мышечных клеток, анойкис, воспаление и фиброз, влияние токсических примесей (кобальт, ар-сениты), дефицит нутриентов, активация аутоиммунных процессов (образование антител к миозину и аддуктам белков с ацетальдегидом), активация пероксисомального окисления в миокарде как адаптивный ответ на замещение ацетатом жирных кислот в качестве источника питания, накопление эстерофицированных жирных кислот, ингибирование окислительного фосфорилирования в митохондриях, на-

рушение синтеза сократительных белков в сар-коплазматическом ретикулуме, ингибирование взаимодействия кальций-микрофиламенты, активация перекисного окисления липидов, угнетение активности миофибриллярной АТФ-азы, нарушение структуры клеточных мембран и повреждение находящихся на них рецепторов, кардиодепрессивные эффекты эндотоксинов, цитокинов, оксида азота [5, 6, 911, 13].

Имеются основания предполагать, что аминокислотный дисбаланс, вызванный хронической алкогольной интоксикацией, является одним из патогенетических механизмов развития алкогольной кардиомиопатии. В частности, было показано, что синдром отмены этанола сопровождается выраженным аминокислотным дисбалансом, проявляющимся в снижении уровней ряда незаменимых аминокислот (треонина, изолейцина, лейцина), а также концентраций серина и аспартата.

Одним из актуальных направлений в области разработки новых антиалкогольных препаратов является их поиск среди субстанций природного происхождения [4]. Перспективными в этом смысле являются аминокислоты и их производные, поскольку они обладают минимальными побочными эффектами и высоким терапевтическим индексом. Ранее нами были предложены композиции на основе таурина, аминокислот с разветвленной углеводородной цепью (АРУЦ) и микроэлементов, имеющих широкий спектр биологической активности и обладающих как иммуномодулирующими, так и гепатопротекторными свойствами [1-3]. В настоящей работе нами исследуется действие препарата «Талерин», основными компонентами которого являются таурин, лейцин, рибофлавин и катионы цинка и магния (Таи, Leu, B2, ZnSO4, MgSO4). Включение в композицию таурина, обладающего гепатопротективными и антиоксидант-ными свойствами, обусловлено тем, что, несмотря на принципиальную возможность синтеза таурина из поступающих с пищей метионина и цистеина, его внутриклеточная концентрация в значительной степени зависит от транспорта таурина из плазмы крови [7]. Цинк является необходимым элементом для жизне-

деятельности организма, так как он выступает в качестве кофактора у более чем 300 ферментов. Он играет важную роль в репликации ДНК, транскрипции и синтезе белка, влияет на процессы деления и дифференцировки клеток [8]. Обедненная цинком диета замедляет рост организма [14]. Недостаток цинка влияет на гомеостаз цинка в мозгу и вызывает изменение поведения, задержку умственного развития [14]. Включение лейцина в композицию обусловлено его ролью в энергопродукции и биосинтезе белка, активизации им процессов детоксикации на фоне печеночной недостаточности и энцефалопатии. Очевидно, что действие данной композиции будет проявляться в первую очередь влиянием на аминокислотный пул плазмы крови и тканей, анализ изменений в котором способен оценить перспективность данной композиции в условиях действия гепатотоксичных веществ, включая алкоголь.

Целю настоящего исследования было изучение влияния препарата «Талерин» на аминокислотный пул сердца при субхроничес-кой алкогольной интоксикации.

Методы

В эксперименте использовано 19 белых беспородных крыс-самцов массой 180-200 г, содержащихся на стандартном рационе вивария. Субхроническую алкогольную интоксикацию моделировали внутрижелудочным введением раствора этанола (25% об/об) равными объемами в дозе 14 мл/кг два раза в сутки на протяжении 28 суток. Препарат « Талерин» вводили животным в виде водного раствора (1:40) внутрижелудочно в дозе 5 мл/кг через 30 мин после каждого введения этанола на протяжении последних 10 дней алкоголизации. Суммарная суточная доза препарата составляла 250 мг/кг, этанола - 7 мл/кг массы животных. Контрольные животные получали внутрижелудочно воду в эквиобъемных коли -чествах. Последнее введение препарата - за 12 ч до забоя животных.

После забоя животных путем декапита-ции выделяли сердце, тщательно освобождали его от крови путем промокания бумажным

фильтром и замораживали в жидком азоте. Затем навески ткани сердца массой 100-150 мг гомогенизировались на холоду в 0,2 M хлорной кислоте с 8-аминовалерьяновой кислотой (250 мкМ) в качестве внутреннего стандарта в соотношении 100 мг ткани на 1 мл среды, полученные гомогенаты центрифугировались при 13000 g в течение 15 мин при температуре +4°С, после чего супернатанты немедленно отбирались в чистые пробирки, которые хранились при -78°С до анализа. После размораживания экстракты повторно центрифугировали.

Содержание свободных аминокислот и их производных определяли методом обра-щенно-фазной ВЭЖХ после предколоночной дериватизации с 0,4% о-фталевым альдегидом и 3-меркаптопропионовой кислотой в 0,4М Na-боратном буфере, pH 9,4. Для дериватиза-ции вторичных аминокислот (пролина и ок-сипролина) проба далее смешивалась с раствором флуоренилметиохлороформата (FMOC-хлорид) в ацетонитриле (6 мг/мл) Детектирование осуществлялось по флуоресценции (231/445 нм, начиная со времени выхода пиков пролина и оксипролина и до конца хроматограммы — 260/313 нм). В методике использовались: концентрат стандартной смеси физиологических аминокислот фирмы «Calbiohem» (США), колонка Zorbax XDB C8, 3,5 мкм, 3х150 мм. Подвижная фаза А: 0,1 М Na-ацетатный буфер, pH 6,85, содержащий 20 мг/л ЭДТА; подвижная фаза В: водный раствор ацетонитрила (60% об.). Разделение проводили с градиентным элюированием от 5 до 100% В за 78 мин; температура колонки 37°С. Определение проводили с помощью хроматографа Agilent 1100, управление прибором и обработку данных - с помощью программы ChemStation A10.01. В работе использовались реактивы квалификации не ниже хч.

Статистическая обработка данных (описательная статистика, дисперсионный, корреляционный и дискриминантный анализ) реализована при помощи программы Statistica 7.0. Межгрупповые различия оценивались с применением параметрических (НЗР-тест Фишера) или ранговых (тест Ньюмана-Кеулса) методов, в зависимости от того, имеются ли откло-

нения от нормальности групповых выборок (что определялось при помощи теста Шапиро-Вилка). При анализе показателей, выборочные дисперсии которых имели выраженную него-могенность, использовался непараметрический дисперсионный анализ Краскела-Уоллеса.

Результаты и обсуждение

Субхроническая алкогольная интоксикация (СХАИ), вызываемая внутрижелудочным введением раствора этанола на протяжении 28 сут, сопровождалась снижением уровней цис-татионина и фосфоэтаноламина (Р<0,05), а также тенденцией к снижению содержания цит-руллина (Р=0,063) в сердце. Наряду с этим происходило повышение уровня аланина, метионина, аргинина и триптофана в сердце (Р<0,05), а также тенденция к повышению концентрации серина (Р=0,056) (табл.). Несмотря на то, что концентрации остальных определяемых показателей не изменялась, корреляционный анализ свидетельствует о возникновении изменений в метаболизме серосодержащих аминокислот (нарушение нормальных отрицательных корреляций таурин-цистатионин и цис-теат-серин). Тем не менее, обеднения пула незаменимых аминокислот сердца (в том числе АРУЦ) при субхронической алкогольной интоксикации не наблюдалось (табл.).

Введение препарата «Талерин» на фоне СХАИ вызвало изменения в пуле свободных аминокислот сердца (табл.). Среди наиболее значимых стоит отметить снижение уровней ароматических аминокислот, что обусловило предотвращение роста уровня триптофана при СХАИ. Другим важным эффектом явился дисбаланс уровней АРУЦ и серосодержащих аминокислот. Так, рост концентрации лейцина сопровождался снижением уровней валина и, менее выраженным, изолейцина, а снижению концентраций метионина и цистатионина сопутствовал рост уровней цистеата и таурина. Наряду с этим происходило снижение концентраций этаноламина, ГАМК, а-аминобутирата, а также рост уровня глу -тамата. Ряд эффектов СХАИ в отношении аминокислотного пула предотвращался введением препарата «: Талерин», в том числе рост уровней триптофана, аргинина и аланина.

Таблица

Содержание свободных аминокислот и их производных в сердце крыс после внутрижелудочного введения композиции «Талерин» на фоне субхронической алкогольной интоксикации, нмоль/г

Показатель Контроль n = 6 СХАИ n = 7 СХАИ + Талерин n = 6

Цистеат 8,27 ± 0,65 9,27 ± 0,58 12,8 ± 0,79*f

Аспартат 1852 ± 168 1733 ± 143 2143 ±224

Глутамат 6925 ±411 7840 ± 374 9502±514*f

Аспарагин 209,0 ± 16,5 234,4 ± 10,6 212,9 ± 12,0

Серин 573,2 ± 50,3 736,3 ± 51,9* 684,8 ± 67,3

а-аминоадипинат 10,5 ± 0,59 11,7 ± 1,26 10,2 ± 0,44

Глутамин 5003 ± 177 4846 ± 306 4930 ± 227

Гистидин 249,7 ± 19,1 244,8 ± 23,8 195,4 ± 12,7

Глицин 708,2 ± 41,0 677,4 ± 33,4 661,7 ± 34,6

Фосфоэтаноламин 629,0 ± 25,1 559,7 ± 6,29* 514,1 ± 23,2*

Треонин 295,3 ± 27,3 261,9 ± 23,2 269,5 ± 34,0

1-метилгистидин 3,20 ± 0,20 3,08 ± 0,30 2,77 ± 0,15

Цитруллин 227,2 ± 17,4 190,7 ± 10,9 188,9 ± 10,3

Аргинин 222,6 ± 8,99 263,5 ± 13,3* 212,6 ± 11,8f

в-аланин 23,2 ± 1,7 22,9 ± 1,8 18,7 ± 1,6

Аланин 1133± 78 1534± 102* 1383± 80

Таурин 23728± 961 24527 ± 752 26867± 1446*

в -аминобутират 14,0 ± 1,07 14,5 ± 1,28 16,6 ± 1,25

ГАМК 8,52 ± 1,75 6,40 ± 0,82 3,53 ± 1,05*

Тирозин 73,2 ± 3,9 75,9 ± 3,6 62,1 ± 6,5

а-аминобутират 58,2 ± 5,55 46,6 ± 7,5 25,5 ± 3,2*f

Этаноламин 49,6 ± 2,60 49,9 ± 3,68 35,4 ± 2,65*f

Валин 131,0 ± 9,95 148,6 ± 3,30 89,4 ± 4,51*f

Метионин 32,9 ± 1,29 38,8 ± 2,28* 25,7 ± 1,86*f

Цистатионин 40,1 ± 3,64 29,0 ± 2,48* 21,9 ± 1,47*f

Триптофан 16,6 ± 0,99 23,3 ± 1,4* 18,9 ± 1,6f

Фенилаланин 69,2 ± 4,30 76,3 ± 2,1 48,0 ± 2,6*f

Изолейцин 57,7 ± 3,4 72,4 ± 6,28 46,6 ± 5,5f

Лейцин 108 ± 19 130 ± 12 192 ± 17,5* f

Оксипролин 52,9 ± 4,70 45,7 ± 3,1 44,3 ± 3,7

Орнитин 76,0 ± 8,8 79,8 ± 11,4 95,0 ± 6,2

Лизин 347 ± 57 308 ± 19 306 ± 46

Пролин 184 ± 25,2 270 ± 82,3 124 ± 10,7

АРУЦ/ААК 1,85 ± 0,127 1,97 ± 0,099 2,59 ± 0,177*f

Сумма протеиноген. АК 18191± 764 19504± 720 21107±936*

замен./незам. АК 13,2 ± 1,03 13,9 ± 0,54 16,6 ± 0,35* f

РЬе/Туг 0,953 ± 0,056 1,01 ± 0,035 0,795 ± 0,047*f

Примечание: p<0,05 при сравнении с группами: * — контроль; f — ХАИ.

Введение исследуемого препарата изменило и ряд интегральных показателей пула свободных аминокислот (табл.). Повысилось общее содержание протеиногенных аминокислот,

причем рост соотношения заменимых и незаменимых аминокислот свидетельствует об преимущественном вкладе заменимых аминокислот в обогащении аминокислотного фонда сер-

дца. Достоверно как по отношению к контролю, так и по отношению к СХАИ повысилось соотношение АРУЦ и ААК. Анализ изменений уровней этих соединений позволяет предположить активацию транспорта ароматических аминокислот из тканей миокарда. Кроме того, снижение соотношения фенилаланин/тирозин говорит об преимущественно фенилаланиль-ном вкладе в процесс выведения, так как превращение его в тирозин происходит при избытке фениланина (вследствие токсичности больших концентраций последнего).

Особого внимания заслуживает влияние введения препарата на формирование фонда серосодержащих аминокислот (ССА). Снижение уровней метионина и цистатионина при одновременном повышении уровня цистеата и таурина свидетельствует об усилении катаболизма ССА. Это подтверждается также появлением положительных коррелляций между уровнями цистеата, метионина и серина.

По данным линейного дискриминантного анализа, наиболее значимыми (т.е. имеющие наибольшую вариабельность) соединениями являлись фенилаланин, глутамат, аланин и оксипролин (значения Б вкл./искл. > 5). Значение критерия Лямбда Уилкса и соответствующее ему значение критерия Фишера (0,00002 и 43,83 соответственно) доказывают высокую степень дискриминации групп.

Заключение

Таким образом, композиция «Талерин» при введении на фоне субхронической алкогольной интоксикации предотвращает в сердце рост уровней триптофана, аргинина и аланина, влияет на уровни АРУЦ, повышая соотношение их уровней к содержанию ароматических аминокислот, а также усиливает катаболизм серосодержащих аминокислот. Полученные данные, проясняющие некоторые механизмы действия препарата, позволяют определить направление для оптимизации состава композиции с целью усиления ее кардиоп-ротекторного действия и минимизации побочных эффектов.

Литература

1. Влияние композиции аминокислот с разветвленной углеводородной цепью, триптофана и таурина на обмен аминокислот в экспериментальных моделях алкоголизма / В.Ю. Смирнов [и др.] // Укр. биохим. журн. - 2003. - Т. 75, № 4. - C. 101-107.

2. Композиция для коррекции нарушений метаболической функции печени: пат. Респ. Беларусь, от 2008.05.16 № 2005.0673; заявл. 05.07.2005 / В .М. Шей-бак, М.В. Горецкая, В.Ю. Смирнов, Р.Е. Лис.

3. Композиция, обладающая иммуномодулирующей активностью: пат. Респ. Беларусь, от 2008.08.15 №20061309; заявл. 21.12.2006. / В.М. Шейбак, М.В. Горецкая, А.И. Жмакин.

4. Средство для снижения уровня гомоцистеина при гипергомоцистеинемии: пат. Респ. Беларусь, от 2009.08.25 №12608; заявл. 07.07.2007. / А. А. Наумов, Е.М. Дорошенко, В.М. Шейбак, Ю.Е. Разводовский, А. А. Чиркин.

5. Circulating antibodies to cardiac protein-acetaldehyde adducts in alcoholic heart muscle disease / A. A. Harcombe [et al.] // Clin. Sci. (Lond). - 1995. - Vol. 88, N 3. - P. 263-268.

6. Effect of chronic alcohol consumption on total plasma homocysteine level in rats / F. Stickel [et al.] // Alcohol Clin. Exp. Res. - 2000. - Vol. 24, N 3. - P. 259-264.

7. Expression of taurine transporter is regulated through the TonE (tonicity-responsive element)/TonEBP (TonE-binding protein) pathway and contributes to cytoprotection in HepG2 cells / T Ito [et al.] // Biochem. J. - 2004. - Vol. 382. - P. 177-182.

8. Frederickson, C.J. Neurobiology of zinc and zinc containing neurons / C.J. Frederickson // Int. Rev. Neurobiol. - 1989. - Vol. 31. - P. 145-238.

9. Frisch, S.M. Disruption of epithelial cell-matrix interactions induces apoptosis / S.M. Frisch, H. Francis // J. Cell Biol. - 1994. - Vol. 124, N 4. - P. 619-626.

10. Heart diseases affecting the liver and liver diseases affecting the heart / J.E. Naschitz [et al.] // Am. Heart. J.

- 2000. - Vol. 140, N 1. - P. 111-120.

11. Ji, C. Role of TNF-alpha in ethanol-induced hyperhomocysteinemia and murine alcoholic liver injury / C. Ji, Q. Deng, N. Kaplowitz // Hepatology. -2004. - Vol. 40, N 2. - P. 442-451.

12. Mechanisms of ethanol-induced cardiac damage / VR. Preedy [et al.] // Br. Heart J. - 1993. - Vol. 69, N 3. - P. 197-200.

13. Plasma levels of antioxidant vitamins and oxidative stress in patients with acute myocardial infarction / R.B. Singh [et al.] // Acta Cardiol. - 1994. - Vol. 49, N 5.

- P. 441-452.

14. Takeda, A. Movement of zinc and its functional significance in the brain / A. Takeda // Brain Res. Bull.

- 2000. - Vol. 34. - P. 137-148.

Поступила 03.12.2010 г.

Принята в печать 18.02.2011 г.