Экспериментальное исследование анальгетической активности экстракта аконита Кузнецова

УДК 615.322:582.675.1:615.212.7

экспериментальное исследование анальгетической активности экстракта аконита Кузнецова

С.Г. Крылова1, П.С. Зориков2, Е.П. Зуева1 3, Т.Г. Разина1, Е.Н. Амосова1, О.Ю. Рыбалкина1,3

1 НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга СО РАМН

Ключевые слова: Aconitum Kuznezoffi Rekhenk, экстракт, «горячая пластина», уксусные корчи.

experimental study of the analgesic activity of aconitum kuznezoffi reichenb

S.G. Krylova1, P.S. Zorikov2, E.P. Zueva1, 3, T.G. Razina1, E.N. Amosova1, O.Yu. Rybalkina1, 2

1E.D. Goldberg Research Institute of Pharmacology, Siberian Branch of RAMS

Background. One of the urgent problems of modern pharmacology is the development of high-efficiency low-dose analgesics. Promising direction is the development of drugs based on the diterpene alkaloids produced by Ranunculaceous family plants. Methods. For the experimental study of the analgesic activity of a standardized alkaloid-containing aconite extract (Aconitum Kuznezoffi Reichenb. - Ranunculaceae Juss.) the researchers used screening models of thermic (Hot plate) and chemical (Abdominal constriction test) impact of pain.

Results. In the test "hot plate" there was revealed a pronounced analgesic effect of the Aconitum Kuznezoffi Reichenb. in intragastric course use. On the model of chemical pain stimulation in the peritoneum the phyto-drug showed analgesic activity comparable with the effect of indometacin.

conclusions. Aconite extract showed a mixed type of receptor response on the models with different profile of pain stimulation that allows to include it into a group of promising highly active analgesics with a complex mechanism of action.

Keywords: Aconitum Kuznezoffi Reichenb., extract, hot plate, acetic cramps.

Pacific Medical Journal, 2014, No. 2, p. 38-40.

Одной из актуальных задач современной фармакологии является разработка высокоэффективных низ-кодозовых анальгетиков для купирования болевого синдрома различного генеза [2, 5]. В последние годы особый интерес в этом аспекте вызывают данные о фармакологической активности алкалоидсодержащих растений. Перспективным направлением является исследование и разработка лекарственных средств на основе дитерпеновых алкалоидов, продуцируемых растениями семейства лютиковые (Ranunculaceae) [3, 4]. Входящие в эту группу алкалоиды, благодаря способности взаимодействовать с рецепторной системой восприятия боли и своей полипотентной активности, стали базисными веществами в современной таргет-ной фармакологии и используются в хирургической

Крылова Светлана Геннадьевна - д-р биол. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории онкофармакологии НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга СО РАМН; e-mail: krylova5935@gmail.com

и неврологической клиниках («Мелликтин», «Кон-дельфин»). В кардиофитофармакологии проводятся исследования антиангинальных, антиаритмических, кардиотонических свойств биологически активных веществ аконитов [4]. Среди дальневосточных борцов наименее изученным в химическом отношении является аконит Кузнецова (Aconitum Kuznezoffi Reichenb. -Ranunculaceae Juss.). В русской народной, китайской и тибетской медицине трава, корнеклубни, плоды и листья этого вида аконита применяют при бронхиальной астме, скарлатине, анемии, инфекционных и желудочно-кишечных заболеваниях как противовоспалительное, болеутоляющее, спазмолитическое, мочегонное средство [3, 4]. Согласно данным литературы, все части аконита Кузнецова содержат алкалоиды, главный из которых - аконитин. В корнеклубнях выявлено до 0,3 %, в листьях - 0,1 % алкалоидов аконитина и псевдоаконитина. При нагревании с водой образуется менее ядовитый алкалоид О-бензоилаконин, а при кипячении - малоядовитый аконин. Надземная часть и корнеклубни также содержат 3-дезоксиаконитин, неолин, зонгорин, бейвутин, наргарин, хигенамин, пендулин, мезаконитин, гипаконитин, 3-О-ацетила-конитин, буллатин А и буллатин С. В надземной части растения обнаружены лепенин и денудатин, в корнях найдены флавоноиды [4].

Цель исследования - анализ анальгетической активности суммарного алкалоидсодержащего экстракта аконита Кузнецова с использованием стандартных тестов на термическое и химическое болевое воздействие.

Материал и методы. Эксперименты выполнены на 41 аутбредном самце мышей CD1 (возраст - 7-8 недель), 28 аутбредных самцах крысах CD (возраст - 7-8 недель), конвенциональных, первой категории, полученных из питомника НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга СО РАМН (сертификат здоровья лабораторных животных Научного центра биомедицинских технологий № 24-03). Дизайн экспериментов одобрен комитетом по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных и службой обеспечения качества института НИИ фармакологии СО РАМН. Экспериментальное исследование проводили в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986), приказом МЗ РФ № 708 Н от 28 августа 2010 г., ГОСТ

Оригинальные исследования

39

Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики» и «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [5, 6].

Исходный экстракт получен исчерпывающей экстракцией измельченных корней Aconitum Kuznezoffi Reichenb. (Ranunculaceae Juss.) 40 % этанолом. Стандартизацию экстракта проводили по содержанию алкалоидов на цифровом спектрофотометре UV2051PC (Shimadzu, Япония) в диапазоне 230-380 нм. Спектры обрабатывали с помощью разработанной авторами компьютерной программы, зарегистрированной в Государственном реестре программ для ЭВМ (регистрационное свидетельство № 2009614442). Содержание сухих экстрактивных веществ в экстракте составило 8,6 %. На хроматограмме выявлено пять основных аконитинов.

Дозы суммы алкалоидов аконита Кузнецова (1/5 ЛД50=2,6 мл/кг, 1/10 ЛД50=1,3 мл/кг для мышей) для внутрижелудочного введения были рассчитаны как терапевтические в предварительных исследованиях для других видов фармакологической активности изучаемого вещества [4]. Дозы для крыс - 1,3 и 0,65 мл/кг - были определены с применением коэффициента пересчета для животных [5]. В качестве препарата сравнения при проведении теста «уксусные корчи» использовали индометацин (Sigma, Германия) в дозе 10 мг/кг в виде суспензии на 1 % растворе крахмальной слизи в объеме 0,2 мл/мышь. Все вещества вводили однократно ежесуточно в течение трех суток, последнее введение осуществляли за час до тестирования болевой чувствительности. Животные контрольной группы получали эквиобъемные количества растворителя (вода) в аналогичном режиме.

Базисным методом для измерения порога болевой чувствительности и потенциального анальгезирую-щего эффекта фармакологических препаратов в ответ на термическое раздражение является тест «горячая пластина» (Hot plate) [5, 8]. Через час после последнего введения препаратов выполняли исследование с помощью прибора Hotplate Analgesia Meter (Columbus Instruments, США). Крыс помещали на пластину, нагретую до 54,0±0,5 °С, после чего фиксировали латентное время болевой реакции. К конечным точкам эксперимента относились: облизывание подушечек передних и задних лап, подпрыгивание. Анальгетическую активность агентов в тестах на термическую боль представляли в виде среднего латентного времени в группе и процента угнетения болевой реакции (УБР), который рассчитывали по формуле: где Т - время болевой реакции.

ральной и соматически глубокой боли. Специфическую болевую реакцию - «корчи» (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины) - вызывали внутрибрюшинным введением 0,75 % раствора уксусной кислоты мышам в дозе 0,1 мл/10 г массы тела [5]. Анальгезирующий эффект оценивали по способности лекарственного средства (в течение 20 мин. после инъекции) уменьшать количество «корчей» по сравнению с контрольной группой животных (критерий эффективности - снижение болевой реакции не менее чем на 50 %) и латентному времени наступления болевой реакции. Эвтаназию животных по окончании экспериментов осуществляли ингаляцией СО2 (крысы) и краниоцервикальной дислокацией (мыши).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Вил-коксона-Манна-Уитни [1].

Результаты исследования. Анальгетическая активность индометацина реализовывалась за счет значительного увеличения латентного времени развития болевой реакции (в 1,9 раза) и снижения проявлений специфической болевой реакции - числа «корчей» (в 2,5 раза) по сравнению с контрольной группой. В результате введения экстракта аконита в дозе 1,3 мл/кг выявлен статистически значимый анальгетический эффект, который проявлялся как в снижении количества корчей (в 1,9 раза), так и в повышении латентного времени развития болевой реакции. Следует отметить, что выраженность специфической болевой реакции у мышей при использовании фитопрепарата в дозе 1,3 мл/кг оказалась сопоставимой с активностью индометацина. При увеличении дозы экстракта до 2,6 мл/кг отмечалось уменьшение числа корчей в 2,2 раза. В пользу выраженного обезболивающего действия исследуемого вещества в дозе 2,6 мл/кг свидетельствовало повышение латентного времени развития реакции на 20,6 %. Угнетение болевой активности в группах «экстракт» оказалось аналогичным при действии индометацина (табл. 1).

При проведении теста «горячая пластина», используемого для выявления активных соединений, подавляющих соматически поверхностную и острую

Таблица 1

Влияние экстракта аконита Кузнецова на болевую чувствительность мышей на модели химического болевого раздражения брюшины

УБР :

(Тк,

ь - Топыт)

х100 %,

Тест «уксусные корчи» (Abdominal constriction test) направлен на исследование острой висце-

Группа Доза n Кол-во «корчей» за 20 мин, абс. Латентное время развития, с УБР, %

Контроль - 10 23,30±2,21 217,00±9,78 -

Индометацин 10 мг/кг 12 9,42±1,96' 418,75±58,32' 59,6

Экстракт 1,3 мл/кг 10 12,20±3,33' 394,30±96,58' 47,6

Экстракт 2,6 мл/кг 9 10,78±2,49' 261,89±17,171' 2 53,7

1 Разница с группой •

2 Разница с группой •

¡контроль» статистически значима. :индометацин» статистически значима.

Т

Таблица 2

Анальгетическая активность экстракта аконита Кузнецова в тесте «горячая пластина» на крысах

Группа Доза, мл/кг n Латентное время развития, с УБР, %

Контроль - 9 8,73±1,23 -

Экстракт 0,65 9 27,39±4,991 213,7

Экстракт 1,30 10 12,92±1,571, 2 48,0

1 Разница с группой «контроль» статистически значима.

2 Разница с группой «экстракт, 0,65» статистически значима.

боль, продемонстрировано выраженное анальгети-ческое действие экстракта аконита Кузнецова. Латентное время облизывания передних и задних лап при введении экстракта в дозе 0,65 мл/кг превышало аналогичный показатель нелеченых животных в 3,1 раза. В случае увеличения дозы до 1,3 мл/кг отмечалось нарастание времени развития реакции в 1,5 раза по сравнению с показателем контрольной группы, но фиксировалось снижение эффекта (в 2,1 раза) относительно такового у крыс, получавших экстракт в дозе 0,65 мл/кг (табл. 2).

Обсуждение полученных данных. Модели химического и термического болевого раздражения различаются системой ноцицепции, путем проведения нервного импульса и его восприятия, что может быть использовано в качестве критерия для определения обезболивающего профиля и эффективности потенциального анальгетика [5, 8]. Известно, что методы, основанные на термических стимулах (горячая пластина), чувствительны для препаратов, являющихся по характеру взаимодействия с опиоидными рецепторами чистыми агонистами, но не пригодны для нестероидных противоспалительных средств [7, 8]. При этом анальгетический эффект опиоидных агентов на конкретный вид болевого раздражения опосредуется возбуждением определенных типов опиоидных рецепторов. Для подавления термических болевых реакций необходимо вовлечение ц- и а-рецепторов, а блокада реакции на химическое раздражение брюшины, хотя и может опосредоваться всеми подтипами опиоидных рецепторов, обусловлена преимущественно агонис-тами к-рецепторов [7-10]. Высокая анальгетическая активность исследуемого вещества в двух тестах позволяет предположить активацию нескольких типов рецепторов. Направленность действия алкалоидсо-держащего экстракта на снижение болевой реакции в тесте на висцеральную боль может указывать на его преимущественное взаимодействие с к-рецепторами, поскольку доказано, что на этих моделях наиболее эффективными анальгетиками являются к-агонисты. Выраженный обезболивающий эффект экстракта при проведении термического ноцицептивного теста «горячая пластина», скорее всего, обусловлен вовлечением ц- и а-рецепторов.

На модели химического болевого раздражения брюшины у мышей выявлен выраженный анальгетической

эффект экстракта аконита Кузнецова (2,6 и 1,3 мл/кг), сопоставимый с действием индометацина. Суммарный экстракт алкалоидов (0,65 и 1,3 мл/кг) в термическом ноцицептивном тесте «горячая пластина» показал высокую анальгетическую активность. Исходя из совокупности полученных данных, можно заключить, что экстракт аконита Кузнецова проявляет смешанный тип рецепторного реагирования на моделях с различным профилем болевого раздражения, что позволяет отнести его к группе перспективных высокоактивных анальгетиков с комплексным механизмом действия. Литература.

1. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна,

2002. Т.1. 540 с.; Т.2. 608 с.

3. Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Суслов Н.И. [и др.]. Противовоспалительная активность дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2013. Т. 156, № 11. С. 611-616.

4. Поветьева Т.Н., Нестерова Ю.Г., Гайдамович Н.Н., Пушкарский С.В. Акониты в традиционной и научной медицине // Байкальские чтения-4. СПб.: Медкнига; Элби-СПб., 2010. С. 205-209.

5. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть I. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.

6. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Strasburg: Council of Europe, 1986. 51 p.

7. Gendron L., Pintar J.E., Chavkin C. Essential role of mu opioid receptor in the regulation of delta opioid receptor-mediated antihyperalgesia // J. Neuroscie. 2007. Vol. 150. P. 807-817.

8. Lavich T.R., Cordeiro R.S., Silva P.M., Martins M.A. A novel hotplate test sensitive to hyperalgesic stimuli and nonopioid analgesics // Braz. J. Med. Biol. Res. 2005. Vol. 38, No. 3. P. 445-451.

9. Morinville A., Cahill C. M., Kieffer B. et al. Muopioid receptor knockout prevents changes in deltaopioid receptor trafficking induced by chronic inflammatory pain // Pain. 2004. Vol.109, No. 3. P. 266-273.

10. Morinville A., Cahill C. M., Esdaile M. J. [et al.]. Regulation of 5-opioid receptor trafficking via ц-opioid receptor stimulation: evidence from ц-opioid receptor knockout mice // J. Neurosci.

2003. Vol. 23, No.12. P. 4888-4898.

Поступила в редакцию 03.04.2014.

Экспериментальное исследование анальгетической активности экстракта аконита Кузнецова

С.Г. Крылова1, П.С. Зориков2, Е.П. Зуева1, 3, Т.Г. Разина1, Е.Н. Амосова1, О.Ю. Рыбалкина1, 3

1 НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга СО РАМН

Резюме. Представлены результаты исследования анальгети-ческой активности суммарного экстракта аконита Кузнецова на моделях термического и химического воздействия. В тесте «горячая пластина» (Hot plate) выявлен выраженный обезболивающий эффект суммы алкалоидов при внутрижелудочном курсовом использовании. На модели химического раздражения брюшины (Abdominal constriction test) фитопрепарат показал анальгетическую активность, сопоставимую с действием индометацина. Экстракт аконита проявил смешанный тип рецепторного реагирования на моделях с различным профилем болевого раздражения.

Ключевые слова: Aconitum Kuznezoffi Reichenb., экстракт, «горячая пластина», уксусные корчи.