ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ОСНОВЕ ГИДРИРОВАННОГО ПИРИДО(4,3-b)ИНДОЛА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО НА ЕЕ ОСНОВЕ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR NEURODEGENERATIVE DISEASES OF HYDROGENATED PYRIDO(4,3-b)INDOLE, METHOD FOR PREPARING AND BASED DRUG

Предлагаемая группа изобретений относится к медицине, более конкретно к применению фармацевтических композиций на основе гидрированных пиридо(4,3-b) индолов для лечения нейродегенеративных заболеваний, особенно для улучшения памяти.
Известно, что широкий круг нейрологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера (БА), хорея Гентингтона, боковой амиотрофический склероз, а также ишемия мозга, связан с иксайто-токсическим действием нейромедиаторных возбуждающих аминокислот (ВАК) - глутамата и аспартата (Excitatory Amino Acids and Drug Research. Ed. by M.R. Szewczak & N.J. Huib. Alan R. Liss, New York, 1989, p.380; The NMDA Receptor. Eds. Watkins & Collingridge G., 1989, IRL Press.). В соответствии с этим механизмом гипервозбуждение нейронов при длительной активации их N-метил-0-аспартатных (NMDA) рецепторов глутаматом приводит к избыточному входу ионов кальция в клетку, что инициирует целый ряд патологических метаболитических процессов, вызывающих в конечном итоге гибель нервных клеток (Mill S, Neuron, 1990, v.2, p.l49; Saitch et al., Lab Suvest., 1991, v.64, p.596).
В частности, в случае БА массовая гибель нейронов, как предполагают, осуществляется следующим образом. Нейротоксическим фактором, вызывающим нейродегенеративные процессы в нейронах, является эндогенный олигопептид - бета-амилоид, содержащийся в нейротических бляшках, обильно расположенных на поверхности мозга больных БА (Prelli et al., J. Neurochem., 1988, v.51, p.648; Yankner et al., Science. 1990, v.250, p.279). Как показали исследования последних лет, бета-амилоид существенно усиливает иксайто-токсическое действие глутамата, осуществляемое через систему NMDA-рецепторов (Koh et al., Brain Res., 1990, v.533, p.315; Nattson et al., J. Neurosci., 1992, v.l2, p.376). В результате этого нетоксические в нормальных условиях концентрации медиатора глутамата становятся в условиях развивающегося бета-амилоидоза токсическими для нейронов и вызывают их гибель.
В этой связи поиск эффективных антагонистов NMDA-рецепторов мозга, способных препятствовать реализации нейротоксического действия ВАК, считается оригинальным и перспективным подходом к созданию нейропротекторов широкого спектра действия, в том числе препаратов, препятствующих развитию БА и полезных для лечения таких заболеваний, как БА (Maragos W.F. et al., Trends Neurosci., 1987, №10, p.65).
Известным антагонистом NMDA-рецепторов является 2-амино-5-фосфоновалерионовая кислота (АР5) (Evans et al., Brit. J. Pharma col., 1982, v.75, p.65). Основным недостатком соединения АР5 является побочный нейротоксический эффект (нарушение координации движений, седативное действие), проявляющийся в дозах, в которых оно оказывает свое анти-NMDA действие (ЕД50=190 мг/кг) (Григорьев и др. Хим.-фарм. ж., 1988, №3, С.275).
Было показано, что димебон проявляет ярко выраженные свойства антагонистов NMDA-рецепторов, позволяющие восстанавливать когнитивные функции и память у животных с моделью болезни Альцгеймера, вызванной хроническим введением холинотоксина AF64A. Крысы с моделью БА, у которых предварительно были поражены холинергические нейроны, после приема димебона в эксперименте условного рефлекса активного избегания показывали значительно лучшие результаты, чем контрольные животные, которые димебон не получали (Bachurin, S., Bukatina, E., Lermontova, N., et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2001, v.939, р.425). Кроме того, димебон оказывает положительное влияние на больных болезнью Альцгеймера. Современные представления о механизмах патогенеза болезни Альцгеймера (БА) говорят о существовании многочисленных нейротических бляшек на поверхности ряда областей мозга. Находящийся в них белок бета-амилоид (β-амилоид) оказывает нейротоксическое действие и вызывает гибель в первую очередь холинергических нейронов (поэтому холинергические препараты ингибиторы холинестераз - арисепт, физостигмин и другие широко применяются для лечения БА). С гибелью нейронов связывают ухудшение памяти и когнитивных функций и при других нейродегенеративных заболеваниях (Alzheimer Disease and Related Disorders. 1999. Willey. Eds. Iqbal et al., 1-819).
В пилотных клинических исследованиях было показано, что применение димебона в дозе 20 мг три раза в день оказывает улучшение состояния больных БА, имеющих отчетливое нарушение памяти, т.е. восстановление памяти и когнитивных функций (Патент РФ №2106864).
Применение димебона для улучшения когнитивных функций и памяти у мышей показало (Патент РФ №2334514), что димебон обладает дозозависимым свойством с максимально выраженным эффектом в дозе 0,1 мг/кг.
В настоящее время проводится интенсивный поиск и испытание эффективных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний. Однако в клинической практике такие препараты пока практически отсутствуют.
Предлагаемое изобретение решает задачу создания лекарственных средств, которые обладали бы высокой терапевтической активностью в малых дозах и не вызывали бы побочных эффектов.
В наших исследованиях неожиданно было обнаружено, что фармацевтическая композиция, состоящая из гидрированного пиридо(4,3-b)индола (Rs), представляющего собой по крайней мере одно соединение, выбранное из группы: цис(±)2,8-диметил-2,3,4,4а,5,9b-гексагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол; 2-этил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол; 2-бензил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол; 2,8-диметил-5-бензил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол; 2,8-диметил-5-[2-(6-метил-3пиридил)этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индола и/или его дигидрохлорид; 2-метил-5-[2-(6-метил-3-пиридил)этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол; 2-метил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол; 2,8-диметил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол; 2-метил-8-бром-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол, и полимерного компонента (Rp), выбранного из ряда: альбумин сыворотки крови, альгинат натрия, амилопектин, гидроксиэтилкрахмал, декстран, желатин, казеинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, каррагинан, крахмал, крахмал фосфорилированный, лактальбумин, метилцеллюлоза, овальбумин, пектин, поливинилпирролидон, полигалактуронат натрия, сополимер молочной и гликолевой кислот, циклодекстрин, (2-гидроксипропил)циклодекстрин или их смеси, причем Rs и Rp ассоциированы и входят в состав композиции в следующих соотношениях (масс.части): Rs - 10-60, Rp 40-90, позволяет существенно лучше подавлять нейродегенеративные процессы, вызванные β-амилоидом, а также в 10 раз снизить дозу, доведя ее до значения 0,01 мг/кг, и тем самым на порядок увеличить активность предлагаемой композиции.
Технический результат, таким образом, заключается в снижении дозы и увеличении активности заявляемой композиции для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Еще одним аспектом изобретения является способ получения заявляемой фармацевтической композиции, заключающийся в том, что компоненты Rs и Rp растворяют в общем растворителе, выдерживают при температуре от -40 до +50°С в течение от 0,5 до 8 ч и высушивают любыми известными методами, например упариванием, распылительной сушкой или лиофильной сушкой, что определяется свойствами (в частности, термостойкостью) конкретного гидрированного пиридо(4,3-b)индола (Rs) и полимерного компонента (Rp), а также летучестью используемого растворителя и, наконец, экономическими параметрами выбранного метода сушки.
Замораживание образца перед лиофильным высушиванием ниже -40°С не имеет технической целесообразности из-за излишних энергозатрат, так же как и нагревание свыше +50°С. Причем, в последнем случае, перегревание может явиться причиной термической деструкции компонентов фармацевтической композиции. Экспериментальным путем было установлено, что временной интервал инкубации смеси в течение 0,5-8 часов при указанных температурах является необходимым и достаточным для переведения компонентов Rs и Rp в ассоциированную форму..
Метод ИК-спектроскопии подтвердил получение фармацевтической композиции заявляемого состава, в которой Rs и Rp ассоциированы, что и приводит к появлению нового неожиданного эффекта этой композиции, указанного выше.
Следующим аспектом изобретения является фармакологическое средство для лечения нейродегенеративных заболеваний, содержащее активное начало и фармацевтически приемлемый наполнитель, в котором в качестве активного начала содержится эффективное количество заявляемой фармацевтической композиции.
Фармакологическое средство согласно изобретению приготавливается с помощью общепринятых в данной области техники приемов и включает фармакологически эффективное количество активного агента, представляющего фармацевтическую композицию (называемую далее "активное начало"), составляющее обычно от 1 до 50 вес.% или от 1 мг до 50 мг в дозируемой форме, которая представляет собой таблетку, пилюлю, капсулу, драже или суппозиторий, в сочетании с одной или более фармацевтически приемлемыми вспомогательными добавками, такими как разбавители, связующие, разрыхляющие агенты, адсорбенты, ароматизирующие вещества, вкусовые агенты. В соответствии с известными методами фармакологическое средство может быть представлено различными жидкими или твердыми лекарственными формами.
Примеры твердых лекарственных форм, принимаемых энтерально, включают, например, порошки, таблетки, капсулы, драже, суппозитории. Примеры жидких лекарственных форм, принимаемых парентерально, включают растворы, эмульсии или суспензии.
Фармакологическое средство, как правило, получают с помощью стандартных процедур, предусматривающих смешение активного начала с жидким или тонко измельченным твердым наполнителем.
В таблице 1 приведены результаты in vitro экспериментов по определению зависимости средней выживаемости нейронов (% от контроля) от использования гидрированных пиридо(4,3-b)индолов, полимерных компонентов, состава композиции, способа ее получения.
В таблице 2 приведены результаты in vitro экспериментов по определению зависимости средней выживаемости нейронов (% от контроля) от состава композиции и способа ее получения на примере композиции, состоящей из 2,8-диметил-5-бензил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индола и амилопектина (образец №20).
В таблице 3 приведены результаты in vitro экспериментов по влиянию фармацевтических композиций на основе дигидрохлорида 2,8-диметил-5-[2-(6-метил-3пиридил)этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо(4,3-b)индола на способность животных обследовать объект в известной и новой локализации (процент времени обследования объекта).
Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.
Пример 1. Получение фармацевтической композиции.
47 массовых частей дигидрохлорида 2,8-диметил-5-[2-(6-метил-3пиридил)этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо(4,3-b)индола и 53 массовых части поливинилпирролидона растворяют в 450 массовых частях воды. Выдерживают при +25°С в течение 5 часов, затем высушивают с помощью распылительной сушки (образец №21 в таблице 1). Проведение процесса указанным способом позволяет получить фармацевтическую композицию, в которой Rs и Rp ассоциированы, что подтверждается методом ИК-спектроскопии.
Аналогично были получены следующие композиции, составы и условия получения которых приведены в таблице 1, где
Rs
I - цис(±)2,8-диметил-2,3,4,4а,5,9b-гексагидро-1H-пиридо(4,3-b)индол
II - 2-этил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол
III - 2-бензил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол
IV - 2,8-диметил-5-бензил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол
V - 2,8-диметил-5-[2-(6-метил-3пиридил)этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо(4,3-b)индол
VI - дигидрохлорид 2,8-диметил-5-[2-(6-метил-3пиридил)этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо(4,3-b)индола
VII - 2-метил-5-[2-(6-метил-3-пиридил)этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол
VIII - 2-метил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол
IX - 2,8-диметил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол
X - 2-метил-8-бром-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индол
Rp
A - альбумин сыворотки крови
B - альгинат натрия
C - амилопектин
D - гидроксиэтилкрахмал
E - декстран
F - желатин
G - казеинат натрия
H - карбоксиметилцеллюлоза
J - каррагинан
K - крахмал
L - крахмал фосфорилированный
M - лактальбумин
N - метилцеллюлоза
O - овальбумин
P - пектин
Q - поливинилпирролидон
R - полигалактуронат натрия
S - сополимер молочной и гликолевой кислот
T - циклодекстрин
U - (2-гидроксипропил)циклодекстрин
W - смесь
**Способ высушивания:
ЛФ - лиофилизация (сублимационная сушка)
РС - распылительная сушка
УП - упаривание.
Пример 2. In vitro определение способности ингибировать токсическое действие β-амилоида на нейроны.
Основную роль в развитии патологического процесса при болезни Альцгеймера отводят избыточному накоплению на поверхности ряда областей мозга пептида β-амилоида с образованием бляшек. Соответственно вещества, способные предотвращать избыточное накопление β-амилоида, могут рассматриваться как эффективные средства для лечения болезни Альцгеймера.
25-35
25-35
25-35
Процесс нейродегенерации, вызываемый синтетическим нейротоксическим фрагментом β-амилоида (Аβ), оценивали на культуре клеток-зерен мозжечка крыс. Аβ в концентрации 25 мкМ вызывает гибель 45% (выживаемость 55%) нейронов. Результаты применения Аβ совместно с гидрированными пиридо(4,3-b)индолами (Rs) и фармацевтическими композициями на их основе (для установления их антинейродегенеративной активности) приведены в таблице 1. Используются эквимолярные концентрации Rs (25 мкМ). Как видно из таблицы, гидрированные пиридо(4,3-b)индолы способны увеличивать выживаемость нейронов на 20-31%. Однако те же самые Rs в составе фармацевтических композиций еще больше увеличивают выживаемость нейронов, доводя ее в некоторых случаях до 100%. Применение просто полимеров (Таблица 1, образец №34 и 35) не приводит к увеличению выживаемости нейронов, т.е. они не обладают антинейродегенеративной активностью.
В таблице 2 приведены результаты in vitro экспериментов по определению зависимости средней выживаемости нейронов (% от контроля) от состава композиции и способа ее получения на примере композиции, состоящей из 2,8-диметил-5-бензил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индола и амилопектина. Как видно из приведенной таблицы, снижение количества Rs в композиции ниже заявляемых пределов приводит к исчезновению антинейродегенеративной активности (средняя выживаемость нейронов сохраняется на уровне, достигаемом при использовании только 2,8-диметил-5-бензил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b)индола). К такому же результату приводит и увеличение количества Rs выше заявляемых приделов и соответственно снижение количества Rp. Таким образом, выход состава за заявляемые пределы, как и получение композиции простым смешением компонентов, не приводит к увеличению выживаемости нейронов.
Пример 3. Влияние фармацевтических композиций на основе дигидрохлорида 2,8-диметил-5-[2-(6-метил-3пиридил)этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо(4,3-b)индола (димебон) на способность животных обследовать объект в известной и новой локализации.
Одним из проявлений нейродегенеративных процессов является ухудшение памяти, как в случае, к примеру, с болезнью Альцгеймера. Таким образом, если вещество (или фармацевтическая композиция на его основе) обладает свойством улучшать память, значит, оно в той или иной степени активно в терапии дегенеративных процессов в нервной системе.
Поведенческий эксперимент с целью выявления способности димебона (дигидрохлорид 2,8-диметил-5-[2-(6-метил-3пиридил)этил]-2,3,4,5-тетрагидро-1H-пиридо(4,3-b)индола), а также фармацевтических композиций на его основе к улучшению памяти.
Для исследования действия фармацевтических композиций на память животных, у которых предварительно не производилось разрушение нейронов, был использован тест узнавания новой локализации известного объекта ("Object location memory test" (D. Gaffan, Amnesia for complex naturalistic scenes and for objects following fornix transaction in the Rhesus monkey. Eur. J. Neurosci. 4 (1992), pp.381-388, B. Kolb, K. Buhrmann, R. McDonald and R. Sutherland, Dissociation of the medial prefrontal, posterior parietal, and posterior temporal cortex for spatial navigation and recognition memory in the rat. Cereb. Cortex 6 (1994), pp.664-680, T.Steckler, W.H.I.M. Drinkenburgh, A. Sahgal and J.P. Aggleton, Recognition memory in rats. I. Concepts and classification. Prog. Neurobiol. 54 (1998), pp.289-311).
Эксперименты проводились на мышах, самцах линии C57BL/6. Перед проведением опытов животные были помещены в двухнедельный карантин. Мыши содержались в стандартных условиях вивария в свободном доступе к пище и воде, при 12-часовом (8:00-20:00) световом цикле. На момент выполнения эксперимента масса тела мышей составляла 22-24 г. Экспериментальные группы, одной из которых была группа контрольных животных, состояли из 10 особей.
Экспериментальная установка представляет собой камеру наблюдения, изготовленную из непрозрачного органического стекла белого цвета с размером 48×38×30 см. В качестве объектов обследования использовали стеклянные флаконы коричневого цвета диаметром 2,7 см и высотой 5,5 см. За 2 мин до помещения животного в камеру объекты протирали 85% спиртом. Животных всегда помещали в центр камеры. Исследуемые образцы растворяли в дистиллированной воде, из расчета 0,1 мл раствора на 10 г массы тела животного и вводили в дозе 0,01 мг/кг, внутрижелудочно.
Порядок проведения эксперимента
Ознакомление с поведенческой камерой
В первый день мышей приносили в исследовательскую комнату и акклиматизировали в течение 20-30 мин. После этого каждое животное помещали на 10 мин в пустую, предварительно обработанную спиртом, поведенческую камеру для ознакомления. Затем животное сажали в клетку и уносили в виварий.
Тренировка
На следующий день этих же мышей приносили в исследовательскую комнату, 20-30 мин акклиматизировали и затем вводили внутрижелудочно раствор исследуемого вещества. Через 1 час после введения вещества животное помещали в поведенческую камеру, на дно которой ставили по диагонали на расстоянии 14,5 см от углов два одинаковых объекта (стеклянные флаконы) для узнавания. Длительность тренировки каждого животного 15 мин. Через 15 минут сажали в клетку и возвращали в виварий.
Тестирование
Тестирование проводили через 48 часов после тренировки. Для этого после акклиматизации животное помещали на 1 мин в камеру для повторного ознакомления. Через минуту его убирали и на дно камеры ставили один объект в известной для животного локализации, а другой - в новой. С помощью двух электронных секундомеров регистрировали, с точностью до 0,1 секунды, время обследования отдельно каждого объекта в течение 10 мин. За поведением животных наблюдали через зеркало. В качестве положительной реакции обследования объекта считали целенаправленное приближение носа животного к объекту на расстояние 2 см или непосредственное касание объекта носом.
Статистическая обработка результатов
В связи с тем, что в данном тесте наблюдаются значительные колебания времени обследования объектов между животными, мы вычисляли процент времени обследования для каждой мыши по формуле tНл/(tИл+tНл)×100, где tНл - время обследования новой локализации и tИл - время обследования старой локализациии. За 100% принимали общее время, затраченное на обследование двух объектов. Дальнейшую обработку результатов проводили по методу Стьюдента с использованием t-теста.
Результаты
Мнемотропный эффект оценивался по увеличению процента времени обследования объекта в новом положении относительно времени обследования старой локализации объекта. Такая реакция демонстрирует процесс запоминания старой обстановки (C.Messier, Object recognition in mice: improvement of memory by glucose. Neurobiol. Learn. Mem. 67 (1997), pp.172-175). Полученные данные указывают на улучшение пространственной памяти у мышей (Таблица 3) как в случае использования димебона, так и композиций на его основе, полученных согласно изобретению.
Из таблицы видно, что животные из контрольной группы, которым не вводились ни димебон, ни исследуемые фармацевтические композиции, затрачивали на обследование объекта в известной локализации 49±2,5% времени и в новой локализации 52±3%. Столь небольшая разница в значениях указывает на то, что животные воспринимают оба объекта как новые, т.е. не происходило запоминания животным известной локализации одного объекта. Применение димебона и фармацевтических композиций на его основе привело к тому, что животные затрачивали на обследование объекта в известной локализации на 35-40% меньше, чем в новой. Однако для достижения одинакового эффекта доза димебона должна была быть в 10 раз больше, чем у композиций на его основе, полученных согласно изобретению.
50
При исследовании острой токсичности фармацевтических композиций на его основе гидрированных пиридо(4,3-b)индолов (Rs) и полимерных компонентов (Rp), согласно изобретению установлено, что ЛД для мышей при внутрижелудочном введении составляет более 1000 мг/кг, т.е. находится на уровне разрешенного к применению в качестве лекарственного средства димебона.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволит применять для лечения нейродегенеративных заболеваний новые фармакологические средства, обладающие повышенной терапевтической активностью при существенно более низких дозах.
Таблица 2
Способ получения
Состав композиции
Средняя выживаемость нейронов, % от контроля
2,8-диметил-5-бензил -2,3,4,5-тетрагидро-1Н-пиридо(4,3-b) индол
амилопектин
Согласно изобретению
5
95
77
Согласно изобретению
10
90
90
Согласно изобретению
52
48
93
Согласно изобретению
60
40
92
Согласно изобретению
65
35
78
Смешение компонентов
52
48
78
Таблица 3
Обозначение образца
Доза мг/кг
Процент времени обследования объекта
Известная локализация
Новая локализация
Контроль
-
49±2,5
52±3
Димебон
0,1
39±4,8
60,5±4,8
21
0,01
38±3
63±2
26
0,01
39±2,5
59±2
31
0,01
40±4
61±4