СПОСОБ ПРОДУКЦИИ БЕЛКА
METHOD FOR PRODUCING PROTEIN

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу секреторной продукции белка, в том числе используемого в промышленных масштабах фермента или биологически активного белка, посредством применения ассимилирующих метанол бактерий.
Предшествующий уровень техники
Метанол представляет собой ферментативное вещество, доступное в большом количестве при низкой стоимости, которое является чрезвычайно ценным в качестве источника углерода. Разработан способ продукции L-аминокислоты при помощи ассимилирующих метанол бактерий с применением в качестве основного источника углерода метанола (патентный документ 1) и способ продукции полисахарида с применением ассимилирующих метанол бактерий (патентный документ 2).
Pichia
Кроме того, до настоящего времени был известен пример продукции lacZ в бактериальных клетках с применением промотора гена алкогольоксидазы (AOX) путем индукции с метанолом в дрожжах  (непатентный документ 1) и пример секреции апротинина (бычьего панкреатического ингибитора трипсина) в культуральном супернатанте в виде активной формы (непатентный документ 2).
Methylobacterium extorquens
Кроме того, известен пример накопления флуоресцентного белка (GFP) в клетке необлигатной ассимилирующей метанол бактерии , которая представляет собой одну из ассимилирующих метанол бактерий (патентный документ 3 и непатентный документ 3). Однако не было известно примера секреции белка вне клеток облигатной ассимилирующей метанол бактерии.
Патентный документ 1: EP 1188822
Патентный документ 2: JP 11-56384 A
Патентный документ 3: WO 2003/046226 A1
Непатентный документ 1: Nucleic Acids Res. 1987 May 11; 15(9): 3859-76.
Непатентный документ 2: J Ind Microbiol. 1991 Apr; 7(3): 197-201.
Непатентный документ 3: FEMS Microbiol Lett. 2000 Dec 15; 193(2): 195-200
Описание изобретения
Escherichia coli
Объектом настоящего изобретения является способ эффективной секреторной продукции белка, который трудно получать посредством секреторной продукции с применением бактерии  или т.п.
Авторы настоящего изобретения обратили внимание на полученную из ассимилирующих метанол бактерий промоторную и сигнальную последовательности и провели обширные исследования. В результате было обнаружено, что секреторную продукцию белка можно эффективно осуществлять путем культивирования в жидкой среде, содержащей метанол в качестве основного источника углерода, ассимилирующей метанол бактерии с конструкцией ДНК, содержащей функционирующую в ассимилирующей метанол бактерии промоторную последовательность и нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность и целевой белок, таким образом, осуществляя настоящее изобретение.
Таким образом, настоящее изобретение относится к следующим объектам.
(1) Способ продукции белка, включающий культивирование ассимилирующей метанол бактерии с конструкцией ДНК, содержащей промоторную последовательность, функционирующую в ассимилирующей метанол бактерии, и нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, включающий сигнальную последовательность и последовательность целевого белка, функционально связанного с промоторной последовательностью, в жидкой среде, содержащей метанол в качестве основного источника углерода, для обеспечения секреции бактериями целевого белка и выделение секретированного целевого белка.
(2) Способ по (1), где функционирующая в ассимилирующей метанол бактерии промоторная последовательность выделена из группы, состоящей из промотора метанолдегидрогеназы, промотора tac, промотора σE и промотора рибосомального белка.
(3) Способ по (1), где промоторная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 11, 12, 21 или 22.
(4) Способ по любому из (1)-(3), где сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность белка, выбранного из метанолдегидрогеназы, фитазы и кислой фосфатазы.
(5) Способ по любому из (1)-(3), где сигнальная последовательность имеет аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 20.
Methylophilus, Methylobacillus, Methylophaga, Achromobacter, Pseudomonas, Protaminobacter, Methanomonas, Microcyclus
Methylobacterium.
(6) Способ по любому из (1)-(5), где ассимилирующая метанол бактерия представляет собой бактерию, выбранную из группы, состоящей из бактерий, принадлежащих родам  и
(7) Способ по любому из (1)-(6), где белок выбран из группы, состоящей из фитазы, интерлейкина, трансглутаминазы, интерферона, инсулина, кислой фосфатазы и пептидсинтазы.
(8) Способ по любому из (1)-(7), где ассимилирующая метанол бактерия представляет собой облигатную ассимилирующую метанол бактерию.
Methylophilus, Methylobacillus
Methylophaga.
(9) Способ по п.(8), где облигатная ассимилирующая метанол бактерия выбрана из группы, состоящей из бактерий, принадлежащих родам  и
Описание предпочтительных вариантов осуществления
Способ продукции по настоящему изобретению включает культивирование ассимилирующей метанол бактерии с конструкцией ДНК, содержащей промоторную последовательность, функционирующую в ассимилирующей метанол бактерии, и нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, включающий сигнальную последовательность и последовательность целевого белка, функционально связанного с промоторной последовательностью, в жидкой среде, содержащей метанол в качестве основного источника углерода, для обеспечения секреции бактерией целевого белка; и выделение секретированного целевого белка. Здесь термин «секретировать» обозначает выделение или высвобождение целевого белка из бактериальных клеток и не включает накопление целевого белка в клетках.
Таким образом, ассимилирующая метанол бактерия продуцирует содержащий сигнальную последовательность и целевой белок полипептид, и затем при расщеплении сигнальной последовательности целевой белок переносят в периплазму, секретируемый, таким образом, из бактериальных клеток. Для получения продукции целевого белка выделяют секретированный белок. Далее продукцию белка обозначают как «секреторная продукция белка» при предоставлении возможности бактерии секретировать белок и выделять белок.
Широко известно, что секреторный белок транслируется в виде препептида или препропептида и превращается в зрелый белок. Таким образом, общеизвестно, что секреторный белок транслируется в виде препептида или препропептида и превращается в зрелый пептид или пропептид гидролизом пребелковой части, а пропептид дополнительно превращают в зрелый белок гидролизом пробелковой части при помощи протеазы. Такую расщепляющую сигнальный пептид протеазу обычно обозначают как сигнальная пептидаза.
В настоящем изобретении целевой белок можно секретировать в виде зрелого белка или пропептида, и в случае если целевой белок секретируется в виде пропептида, пропептид можно превращать в зрелый белок при обработке пропептида соответствующей протеазой после экстракции.
В данном описании термин «сигнальная последовательность» обозначает последовательность, имеющуюся на N-конце предшествующего типа секреторного белка и определяющуюся, когда белок секретируется, и термин «сигнальный пептид» обозначает пептид, состоящий из остатков аминокислот.
В данном описании белок, имеющий пребелковую последовательность и пробелковую часть, таким образом, продукт первичной трансляции можно обозначать как «препробелок», тогда как белок без пребелковой последовательности и имеющий пробелковую часть можно обозначать как «пробелок». Пробелковую часть пробелка можно обозначать как «пробелковая структурная часть» или просто «пробелковая структура», и в данном описании термин «пробелковая структурная часть/пробелковая структура» белка равнозначно применяют с термином «пробелковая часть» белка.
Применяемую в способе продукции по настоящему изобретению бактерию можно получать введением в ассимилирующую метанол бактерию конструкции ДНК, содержащей функционирующую в ассимилирующей метанол бактерии промоторную последовательность и нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, включающий сигнальную последовательность и последовательность целевого белка, функционально связанную с промоторной последовательностью.
Methylophilus, Methylobacillus, Methylophaga, Achromobacter, Pseudomonas
, Protaminobacter
, Methanomonas
, Microcyclus
Methylobacterium.
Methylophilus,
Methylobacillus
Methylophaga.
Methylophilus
Methylophilus methylotrophus,
Methylobacillus
Methylobacillus glycogenes
Methylobacillus flagellatus
Methylophaga
Methylophaga thalassica, Methylophaga marina
Methylophaga alcaliphila
В данном случае термин «ассимилирующая метанол бактерия» обозначает бактерию, которая может расти в среде, содержащей метанол в качестве основного источника углерода, и их примеры включают бактерии, принадлежащие родам  (JP 45-25273 A)(JP 49-125590 B)(JP 50-25790 A) (JP 52-18886 A) и  Среди них предпочтительной является облигатная ассимилирующая метанол бактерия, которая не может расти или может расти незначительно в среде, содержащей глюкозу в виде единственного источника углерода. Конкретные примеры такой бактерии, способной расти в среде, содержащей метанол в качестве источника углерода, но не способной к росту и плохо растущей в среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода, включают бактерии бактерии  и бактерии  Пример бактерии  включает  а примеры бактерии включают и , а примеры бактерии  включают и (Biology of Methylotrophus; Edited by Israel Goldberg and J.Stefan Roken and published by Butterworth-Heinemann). Кроме того, предпочтительными также являются бактерии, обладающие способностью секретировать метанолдегидрогеназу (MHD) за пределы бактериальных клеток.
Methylophilus methylotrophus
Methylophilus methylotrophus
Примеры включают штамм AS1 (NCIMB 10515), W3A1 (штамм NCIMB 11348) и штамм ATCC 53528. Штамм AS1  (NCIMB 10515) и W3A1 (штамм NCIMB 11348) доступны в National Collections of Industrial and Marine Bacteria, address: NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom.
Methylobacillus glycogenes
Methylobacillus glycogenes
Примеры включают штамм T-11 (NCIMB 11375), штамм ATCC 21371, штамм ATCC 29475, штамм ATR80 (описан в Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), vol.42, p.67-72) и штамм A513, описанный в Appl. Microbiol. Biotechnol., (1994), vol.42, p.67-72). Штамм NCIMB 11375  доступен в National Collections of Industrial and Marine Bacteria, address: NCIMB Lts., Torry Research Station 135, Abbey Road, Aberdeen AB9 8DG, United Kingdom.
Methylobacillus flagellatus
Methylobacillus flagellatus
Примеры  включают штамм ATCC 51484, штамм KT (описан у N.I.Govorukhina et al., Microbiology (Russia) 56 (1987), p.849-854) и штамм VKM B-1610. Штамм VKM B-1610  доступен в ALL-RUSSIAN COLLECTION OF MICROORGANISMS (Russia, 142290, Moscow Region, Pushchino, pr. Nauki, 5 IBPM).
Methylophilus methylotrophus
Methylobacillus glycogenes
Methylobacillus flagellatus
Штамм ATCC 53528 , штамм ATCC 21276 , штамм ATCC 21371, штамм ATCC 29475, штамм ATCC 51484  можно получить в American Type Culture Collection (ATCC) (адрес ATCC, Address: P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America).
Methylophaga thalassica
Methylophaga marina
Methylophaga alcaliphila
Примеры  включают штамм ATCC 33145 и штамм ATCC 33146. Пример  включает штамм ATCC 35842. Пример включает ATCCBAA-297™. Штамм ATCC 33145 и штамм ATCC 33146 можно получить в American Type Culture Collection (ATCC) (адрес ATCC, Address: P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America).
Термин «функционирующий в ассимилирующей метанол бактерии промотор», содержавшийся в конструкции ДНК, введенной в ассимилирующую метанол бактерию, относится к промотору с промоторной активностью в ассимилирующей метанол бактерии, но получение промотора не ограничивается только ассимилирующей метанол бактерией, и может быть получен из другого микроорганизма. Кроме того, «функционирующий в ассимилирующей метанол бактерии промотор» включает индуцируемый метанолом промотор и неиндуцируемый промотор. Примеры индуцируемого метанолом промотора включают промотор гена метанолдегидрогеназы, промотор гена дигидроксиацетонсинтазы и промотор гена формиатдегидрогеназы.
Escherichia coli
Конкретные примеры функционирующего в ассимилирующей метанол бактерии промотора в качестве неограничивающего примера включают индуцируемый метанолом промотор гена метанолдегидрогеназы (SEQ ID NO: 11), промотор tac, являющийся высокоэкспрессируемым промотором, полученным из  (SEQ ID NO: 12), промотор σE (SEQ ID NO: 21) и промотор рибосомального белка (SEQ ID NO: 22).
Кроме того, промоторная последовательность не ограничена промотором дикого типа и может представлять собой промотор, полученный посредством модификации последовательности дикого типа таким образом, чтобы целевой ген являлся высокоэкспрессированным. Например, последовательность можно получить посредством модификации промоторной последовательности дикого типа так, чтобы иметь замену, делецию, вставку или инсерцию нескольких нуклеотидов при условии, что промотор обладает промоторной активностью в указанных выше бактериях. Кроме того, для увеличения промоторной активности промотор можно модифицировать в -35 области или -10 области или модифицировать посредством изменения длины спейсерной области между -35 областью и -10 областью. Примеры способа модификации -35 и -10 областей включают способ, описанный в EP 1033407, и способ, описанный в Nucleic Acids Res. 1999 Dec 15; 27(24): 4768-74.
Промоторную активность определяют по частоте инициации синтеза РНК. Примеры способа оценки промоторной активности и активные промоторы, которые можно применять по настоящему изобретению, описаны у Goldstein et al. (Procariotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) или др. Кроме того, как описано в WO 00/18935, промотор можно модифицировать в более активный промотор введением нуклеотидной замены нескольких нуклеотидов в промоторной области целевого гена.
В введенной в ассимилирующую метанол бактерию конструкции ДНК нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид, включающий сигнальную последовательность и целевой белок, функционально связана с последовательностью справа от промотора.
«Функционирующая в ассимилирующей метанол бактерии сигнальная последовательность» обозначает последовательность, узнаваемую ассимилирующей метанол бактерией для того, чтобы секретировать целевой белок, в тех случаях, когда она связана с целевым белком.
Сигнальную последовательность можно получать из белка, отличающегося от целевого белка, или содержавшуюся в белке-предшественнике целевого белка. Однако предпочтительно сигнальную последовательность получают из секреторного белка применяемой ассимилирующей метанол бактерии-хозяина. Сигнальная последовательность, которую можно применять по настоящему изобретению, может содержать часть N-концевой аминокислотной последовательности целевого белка вместе с сигнальной последовательностью в белке-предшественнике, из которого получают сигнальную последовательность.
Если источник сигнальной последовательности отличается от последовательности целевого белка, препробелок можно обозначать как «гетерологичный слитый препробелок». Например, если белок представляет собой инсулин, его обозначают как «гетерологичный слитый препроинсулин» в противоположность «препроинсулин» или «проинсулин».
Methylophilus methylotrophus
Escherichia coli
Morganella morganii
Сигнальная последовательность конкретно не ограничена, если она функционирует в ассимилирующей метанол бактерии, и можно применять сигнальную последовательность, полученную из белка, секретированного из ассимилирующей метанол бактерии, или сигнальную последовательность, полученную из белка, секретированного из других бактерий, дрожжей, растений, животных и т.д. Конкретный пример сигнальной последовательности включает сигнальную последовательность метанолдегидрогеназы (MHD), полученную из  (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 18). Кроме того, примеры полученной из другой бактерии сигнальной последовательности включают сигнальную последовательность фитазы, кодируемую геном appA  (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 20) и сигнальную последовательность кислой фосфатазы  (положения от 1 до 20 SEQ ID NO: 26). Нуклеотидные последовательности, кодирующие данные аминокислотные последовательности, показаны на SEQ ID NO: 17, 19 и 25.
Нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальную последовательность, может представлять собой нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность дикого типа, или нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность дикого типа, можно замещать таким образом, чтобы кодоны последовательности представляли собой кодоны, подходящие для применения ассимилирующей метанол бактерией, секретирующей и продуцирующей белок.
Escherichia.
«Целевой белок», который можно секретировать и экстрагировать при помощи способа по настоящему изобретению, конкретно не ограничен, пока его можно секретировать с применением ассимилирующей метанол бактерии, если он связан с сигнальной последовательностью, функционирующей в ассимилирующей метанол бактерии, и включает различные белки, такие как секреторные белки и внутриклеточные белки, полученные из животных, растений и микроорганизмов. Способ по настоящему изобретению можно применять в отношении белка, который не получают при помощи секреторной продукции в грамотрицательной бактерии, такой как бактерия  «Целевой белок» предпочтительно представляет собой гетерологичный белок, полученный из источника, отличающегося от ассимилирующей метанол бактерии-хозяина.
В случае, когда секретированный белок применяют как «целевой белок», можно применять белок с последовательностью, полученной удалением из предшественника пребелковой последовательности и пробелковой последовательности, или белок с пробелковой последовательностью. Однако «целевой белок» может представлять собой белок, полученный удалением из предшественника белка, по меньшей мере, одной аминокислоты, формирующей пребелковую часть и пробелковую часть гидролизом пептидной связи, и включает белок с N-концевой областью, полностью соответствующей области природного зрелого белка, белок, имеющий, по меньшей мере, одну дополнительную аминокислоту, полученную из пребелковой части или пробелковой части на N-конце, по сравнению с природным зрелым белком, и белок с аминокислотной последовательностью, более короткой, чем последовательность природного зрелого белка.
Целевой белок, к которому можно применять способ продукции по настоящему изобретению, конкретно не ограничен, и их примеры включают зрелые белки или пробелки указанных далее белков:
Фитаза [EC: 3.1.3.2.3.1.3.26]
Человеческий интерлейкин-2 (IL2: Genbank Accession № ФФЛ26665, зрелый вид IL2: аминокислоты в положениях от 21 до 153)
Белок глутаминаза
Трансглутаминаза (Genbank Accession № AF531437)
Интерферон
Инсулин (JP 07-284394 A)
Кислая фосфатаза
Пептидсинтаза (WO 2004/011653, WO 2004/065610)
Гранулоцитарный стимулирующий фактор (GCSF)
Среди них предпочтительными являются фитаза и кислая фосфатаза, продуцированные в показанных далее примерах.
Фитаза (также обозначаемая как фосфоангидрид-фосфорилаза) представляет собой фермент, гидролизующий фитин (также обозначаемый как инозитол гексакисфосфат или фитиновая кислота), и используется в продуктах питания, сельском хозяйстве и медицинских областях и т.д. В качестве фитазы можно применять нижеследующие. Информацию об аминокислотной последовательности каждой фитазы и кодирующей каждую фитазу нуклеотидной последовательности можно получать со ссылкой на Genbank Accession № каждой фитазы.
Escherichia coli
Полученная из  фитаза: Genbank Accession № AAC74065 (SEQ ID NO: 16), зрелый белок: аминокислоты в положениях от 23 до 432.
Полученная из плесени фитаза: Genbank Accession № AAU93518, AAU93517 и AAG40885 и BAB40715.
Bacillus
Полученная из  фитаза: Genbank Accession № AAC38573, AAG17903 и AAL59320.
Полученная из дрожжей фитаза: Genbank Accession № CAB70441.
Yersinia
Полученная из фитаза: Genbank Accession № YP_070934.
Klebsiella
Полученная из фитаза: Genbank Accession № AAM23271.
Xanthomonas
Полученная из фитаза: Genbank Accession № AAM38967.
Pseudomonas
Полученная из фитаза: Genbank Accession № AAN77879.
Полученная из грибов фитаза: Genbank Accession № CAC48195, CAC48164 и CAC48234.
Полученная из кукурузы фитаза: Genbank Accession № AAB52233.
Полученная из сои фитаза: Genbank Accession № AAK49438.
Полученная из батата фитаза: Genbank Accession № AAF60315.
Полученная из крыс фитаза: Genbank Accession № AAA42305.
Morganella morganii
Кислая фосфатаза представляет собой фермент, катализирующий реакцию гидролиза фосфата в кислых условиях (EC 3.1.3.2), и можно применять указанную далее кислую фосфатазу, полученную из , описанную в WO 96/37603 кислую фосфатазу и их мутантные формы.
Morganella morganii
Полученная из  кислая фосфатаза: Genbank Accession № AB035805 (SEQ ID NO: 25).
Зрелая форма - аминокислоты в положениях от 21 до 259.
Кодирующий каждый из данных белков ген можно модифицировать в зависимости от применяемого хозяина и/или получить желаемую активность, и такая модификация включает модификацию со вставкой, делецией или заменой, по меньшей мере, одной аминокислоты в кодируемой аминокислотной последовательности. Специалистам в данной области хорошо известна такая общая молекулярно-биологическая технология, включающая способы модификации, способы генного клонирования и способы детекции продуцируемых белков. Например, способы, описанные у Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, DNA cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N.Glover ed. 1985), F.M.Ausubel et al., (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994), PCR Technology: Principles and Application for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Pres., etc. В случае гетерологичных белков ген можно модифицировать, чтобы осуществить замену кодонов кодонами, часто применяемыми в микроорганизме для секреторной продукции.
Кодирующий белок ген можно получать при помощи ПЦР или т.п. с применением праймеров, сконструированных на основе известной последовательности. Кроме того, здесь можно применять кодирующий целевой белок ген, полученный выделением из хромосом микроорганизмов, животных, растений и др. посредством гибридизации или т.п. на основе гомологии, и ген, нуклеотидная последовательность которого определена. В качестве альтернативы можно применять полученный химическим синтезом ген, основываясь на известной нуклеотидной последовательности. Информация о последовательности доступна в базе данных, такой как Genbank.
Кроме того, целевой белок может представлять собой белок с заменой, делецией, вставкой или добавлением одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких положениях при условии, что он обладает активностью целевого белка. В настоящем изобретении в зависимости от положения остатков аминокислот в третичной структуре или типов белка термин «один или несколько» конкретно обозначает от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 20 и более предпочтительно от 1 до 10.
Указанная выше замена в белке представляет собой консервативную замену для сохранения активности белка. Замена является заменой с использованием удаления, по меньшей мере, одного остатка в аминокислотной последовательности и вставки в нее другого остатка. Примеры такой замены аминокислоты, выполняемой для замещения исходной аминокислоты ферментного белка и рассматриваемой в качестве консервативной замены, включают замену Ser или Thr на Ala; замену Gln, His или Lys на Arg; замену Glu, Gln, Lys, His или Asp на Asn; замену Asn, Glu или Gln на Asp; замену Ser или Ala на Cys; замену Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg на Gln; замену Gly, Asn, Gln, Lys или Asp на Glu; замену Pro на Gly; замену Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr на His; замену Leu, Met, Val или Phe на Ile; замену Ile, Met, Val или Phe на Leu; замену Asn, Glu, Gln, His или Arg на Lys; замену Ile, Leu, Val или Phe на Met; замену Trp, Tyr, Met, Ile или Leu на Phe; замену Thr или Ala на Ser; замену Ser или Ala на Thr; замену Phe или Tyr на Trp; замену His, Phe или Trp на Tyr и замену Met Ile или Leu на Val.
in vitro
Escherichia
ДНК, кодирующую белок, в значительной степени идентичный указанному выше белку, можно получать посредством модификации кодирующей такой белок нуклеотидной последовательности, например, при помощи сайт-специфичной мутации так, что аминокислотный остаток в определенном участке замещен, делетирован, вставлен, добавлен или переставлен. Кроме того, указанную выше модифицированную ДНК можно получать посредством традиционно известного мутационного воздействия. Примеры мутационного воздействия включают способ обработки  немутировавшей ДНК гидроксиламином или т.п., способ обработки содержащего немутировавшую ДНК микроорганизма, например, бактерии  воздействием ультрафиолетового излучения или применением обычно используемого для мутационного воздействия мутагена, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) или азотистая кислота, способ, искусственно вызывающий случайную ошибку при замещении отношения составляющих дезоксинуклеотидов в реакционном растворе ПЦР из равных отношений (обычных) на неравные отношения, что является способствующей ошибкам ПЦР.
ДНК, кодирующую в значительной степени идентичный белок, можно получать экспрессией ДНК с такой мутацией в подходящей клетке и определять активность продукта, экспрессированного из ДНК.
Кроме того, ДНК, гибридизующуюся с нуклеотидной последовательностью, комплементарной последовательности гена дикого типа, или с зондом, составляющим его часть, при строгих условиях, и кодирующую белок, обладающий активностью целевого белка, можно получать из ДНК, кодирующей мутировавший белок, или содержащих ДНК клеток. В данном случае термин «строгие условия» относится к условиям, когда образуется так называемый специфический гибрид и не образуется неспецифический гибрид. Трудно четко обозначить условия при помощи числовых значений, но их примеры относительно гибридизации включают условия, когда ДНК с высокой степенью гомологии, например, ДНК с гомологией не менее 70%, предпочтительно степенью гомологии не менее 80%, более предпочтительно степенью гомологии не менее 90%, особенно предпочтительно степенью гомологии не менее 95% гибридизуются друг с другом, а ДНК со степенью гомологии менее 70% не гибридизуются друг с другом; и условия отмывки при обычной саузерн-блот гибридизации, т.е. условия отмывки при температуре 60°C и с солевыми концентрациями 1×SSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1×SSC, 0,1% SDS.
Указанный выше целевой белок может быть непосредственно связан с сигнальной последовательностью или связан с сигнальной последовательностью опосредованно через линкерную последовательность. В случае содержания линкерной последовательности линкерная последовательность может представлять собой любую последовательность при условии, что она не ингибирует продуктивность полипептида или активность целевого белка, и можно применять, например, последовательность для очистки целевого белка, такую как полигистидин.
Нуклеотидную последовательность, кодирующую содержащий сигнальную последовательность полипептид, и целевой белок можно соответствующим образом получать при связывании кодирующей сигнальную последовательность нуклеотидной последовательности с кодирующей целевой белок нуклеотидной последовательностью при помощи фермента рестрикции или т.п.
Кроме того, в случае применения сигнальной последовательности и целевого белка, полученных из одного белка-предшественника, последовательность, кодирующую белок-предшественник, включающий сигнальную последовательность и целевой белок, можно амплифицировать при помощи ПЦР или т.п. Можно применять различные модифицированные способы ПЦР, и среди них для амплификации предпочтительно применяют перекрестную ПЦР.
Вводимую в ассимилирующую метанол бактерию конструкцию ДНК можно получать путем функционального связывания с промотором нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, включающий сигнальную последовательность и целевой белок. Фраза «функциональное связывание с промотором нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, включающий сигнальную последовательность и целевой белок» обозначает, что кодирующая полипептид мРНК транскрибируется при помощи промотора таким образом, что полипептид продуцируется бактерией, когда конструкцию вводят в бактерию.
Нуклеотидная последовательность предпочтительно связана с промотором в области, расположенной непосредственно выше от кодона инициации трансляции в кодирующей полипептид последовательности, таким образом, что она включает 5'-нетранслируемую область, содержащую область инициации транскрипции. 5'-нетранслируемая область может представлять собой 5'-нетранслируемую область последовательности, из которой получают промотор, как, например, 5'-нетранслируемая область гена MDH в случае промотора гена MDH. Кроме того, 5'-нетранслируемая область может представлять собой 5'-нетранслируемую область гена, из которого получают последовательность, кодирующую сигнальную последовательность, как, например, 5'-нетранслируемая область гена фитазы в случае применения сигнальной последовательности фитазы.
Известно, что эффективность трансляции мРНК значительно страдает при замене нескольких нуклеотидов в спейсере между участком связывания рибосомы (RBS) и инициаторным кодоном, конкретно в последовательности, расположенной непосредственно выше от инициаторного кодона в случае применения 5'-нетранслируемой области, и поэтому можно применять включающую подобную модификацию 5'-нетранслируемую область.
Escherichia,
Операции для получения подобной конструкции ДНК можно выполнять с применением грамотрицательной бактерии, которую легко генетически модифицировать, такой как бактерия  или с применением секретирующего белок микроорганизма.
Для того чтобы модифицировать ассимилирующую метанол бактерию таким образом, чтобы получить указанную выше конструкцию ДНК, можно вводить, например, несущий конструкцию ДНК вектор. Например, ассимилирующую метанол бактерию-хозяина можно трансформировать получением рекомбинантной ДНК при связывании фрагмента кодирующего белок гена с функционирующим в ассимилирующей метанол бактерии вектором, предпочтительно с многокопийным вектором; и введением рекомбинантной ДНК.
Целевой промотор, сигнальную последовательность, белковую последовательность можно получать, например, посредством ПЦР (полимеразной цепной реакции; White T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) с применением в качестве матрицы хромосомной ДНК животного, растения или микроорганизма, имеющего целевую последовательность. Хромосомную ДНК можно получать из бактерии, применяемой в качестве донора ДНК, например, при помощи способа Saito и Miura (H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Experiment Manual for Biotechnology, edited by The Society for Biotechnology, Japan, p.97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992) или др. Праймеры для ПЦР можно получать на основе последовательностей генов, приведенных в известной базе данных, такой как Genbank, или основываясь на информации относительно области, сохраняющейся между генами, имеющими известные последовательности в другой бактерии или т.п.
Methylophilus
Methylobacillus.
Примеры способного к автономной репликации вектора, например, в ассимилирующей метанол бактерии включают плазмиды, способные к автономной репликации, например, в бактерии  или Их конкретные примеры включают вектор с широким кругом хозяев RSF1010 и его производное, такое как pAYC32 (Chistosterdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167), pMFY42 (gene, 44, 53 (1990)), pRP301 или pTB70 (Nature, 287, 396, (1980)).
E.coli
При этом применяемый в примерах данного описания pAYCTER3 является предпочтительным вектором. pAYCTER3 представляет собой плазмиду, полученную делецией области, предшествующей области гена устойчивости к стрептомицину из pAYC32 (strA и strB), и вставкой туда области множественного клонирования из pUC19 и терминатора гена rrnB из . Таким образом, pAYCTER3 представляет собой высокоэкспрессируемый вектор, не проявляющий устойчивости к стрептомицину, но становится устойчивым к стрептомицину, если в область множественного клонирования в прямом направлении к strA вставить ДНК, содержащую промоторную последовательность.
Чтобы получить рекомбинантную ДНК связыванием конструкции ДНК с вектором, несущим маркер, функционирующий в ассимилирующей метанол бактерии, вектор гидролизуют ферментом рестрикции, пригодным для конца целевого гена. Лигирование обычно выполняют при помощи лигазы, такой как T4 ДНК-лигаза.
Введение полученной, как описано выше, рекомбинантной ДНК в ассимилирующую метанол бактерию можно выполнять описанным способом трансформации. Его примеры включают способ, состоящий из получения компетентной клетки из клетки на стадии пролиферации и введения в нее ДНК (Dubunau and Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol., 56, 209 (1971); Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)), и способ, состоящий из преобразования клетки-хозяина в протопласт или сферопласт, легко воспринимающий рекомбинантную ДНК, и введения рекомбинантной ДНК в бактерию-реципиента ДНК (Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979)).
Кроме того, ассимилирующую метанол бактерию с конструкцией ДНК по настоящему изобретению можно сконструировать введением одной копии или множества копий конструкции ДНК в хромосомную ДНК ассимилирующей метанол бактерии. В хромосомную ДНК ассимилирующей метанол бактерии можно вводить одну копию или множество копий конструкции ДНК по настоящему изобретению посредством гомологичной рекомбинации с применением в качестве мишени последовательности, присутствующей в хромосомной ДНК в многократных копиях, или при помощи случайной вставки в хромосомную ДНК с применением фага или др. В качестве последовательности, присутствующей в хромосомной ДНК в многократных копиях, можно применять транспозон, повторяющуюся последовательность, инвертированный повтор, присутствующий в конце мобильного элемента или т.п. Кроме того, амплификацию с вектором и многократное копирование на хромосоме можно комбинировать с указанной выше модификацией, регулирующей экспрессию последовательности.
Белок можно продуцировать культивированием полученной, как описано выше, ассимилирующей метанол бактерии в жидкой среде, содержащей в качестве источника углерода метанол для предоставления бактерии возможности секретировать целевой белок, а затем выделения секретированного целевого белка.
В данном описании «секреция» белка или пептида означает транспортировку молекулы белка или пептида из бактериальных клеток, которая включает не только случай, когда белок или пептид в результате находится в среде в полностью свободном состоянии, но также случай, когда только его часть находится снаружи бактериальных клеток, а также случай, когда белок или пептид находится в поверхностном слое бактериальных клеток.
В настоящем изобретении целевой белок предпочтительно секретируется в таком объеме, чтобы его собрать из среды или бактериальных клеток.
Ассимилирующую метанол бактерию культивируют в среде, содержащей в качестве источника углерода метанол. Примеры среды, содержащей в качестве источника углерода метанол, включают среду, дополненную от 0,001 до 30% метанола. Среда может содержать отличающийся от метанола источник углерода, такой как сахара, включающие глюкозу, сахарозу, лактозу, галактозу, фруктозу и гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин и сорбит; и органические кислоты, такие как фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота.
В качестве отличающегося от метанола компонента среды можно добавлять компонент среды, такой как источник азота или неорганический ион, применяемый в обычной культуре. Для того чтобы достичь более быстрого роста, если необходимо, можно добавлять органическое меченое питательное вещество, такое как витамин и аминокислота. В качестве источника азота можно применять газообразный аммиак, водный раствор аммиака, соли аммония и т.д. В качестве неорганического иона можно соответственно применять, если необходимо, ион кальция, ион магния, фосфат-ион, ион калия, ион железа и т.д. Например, культивирование можно проводить при pH от 5,0 до 9,0 и от 15°C до 45°C при аэробных условиях, и период культивирования может составлять приблизительно от 1 до 7 суток. Если ассимилирующую метанол бактерию культивируют при таких условиях, целевой белок продуцируется в бактериальных клетках в большом количестве, а затем эффективно секретируется.
В случае применения индуцируемого метанолом промотора, такого как промотор гена MDH, для увеличения продукции полипептида культивирование можно проводить при индуцибельных условиях. Индукцию можно выполнять в соответствии с условиями, как правило, применяемыми для индукции промотора гена MDH. Обычно когда ассимилирующую метанол бактерию культивируют в метаноле, промотор MDH может функционировать без необходимости в специфической индукции.
После культивирования секретированный в среду белок при помощи способа по настоящему изобретению можно выделять и очищать из среды в соответствии с хорошо известным специалисту в данной области способом. Например, белок можно выделять и очищать при помощи удаления бактериальных клеток центрифугированием или т.п. и выполнения известного соответствующего способа, такого как высаливание, преципитация этанолом, ультрафильтрация, хроматография гель-фильтрацией, ионообменная колоночная хроматография, аффинная хроматография, жидкостная хроматография высокого и среднего давления, хроматография с обращенной фазой или гидрофобная хроматография; или сочетание данных способов. Очистку можно выполнять с применением последовательности, если полипептид содержит последовательность для очистки.
Секретированный в поверхностный слой бактериальных клеток белок при помощи способа по настоящему изобретению можно выделять и очищать посредством растворения белка способом, известным специалисту в данной области, например, увеличением содержания соли, с применением сурфактанта и т.д.; и выполнения тех же процедур, как в случае, когда белок секретируется в среду. Кроме того, в некоторых случаях секретированный в поверхностный слой бактериальных клеток белок можно применять как, например, иммобилизованный фермент без растворения белка.
Примеры
Настоящее изобретение будет описано более подробно при помощи следующих далее примеров, но не ограничивается ими в каком-либо смысле.
Escherichia coli
Methylophilus methylotrophus
Пример 1: Секреторная экспрессия получаемой из штамма К-12  бета-лактамазы в  ATCC 53528
(1) Конструирование экспрессионной плазмиды, функционирующей в ассимилирующей метанол бактерии pAYCTER3
Escherichia coli
M. methylotrophus
E.Coli
.
Показанные в SEQ ID NO: 3 и 4 синтетические ДНК, сконструированные с содержанием последовательности области множественного клонирования pUC19, отжигали известным способом для получения полилинкера. Полилинкер сконструирован с образованием тех же концевых положений как положения, полученные при расщеплении ферментами рестрикции EcoRI и BglII. Кроме того, синтезировали показанные в SEQ ID NO: 5 и 6 праймеры, и кодирующую терминаторную последовательность rrnB область амплифицировали посредством ПЦР с хромосомной ДНК К-12 , полученную обычным способом (способ Saito и Miura [Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963)]). Распознаваемую ферментом рестрикции BglII последовательность вводили в праймер из SEQ ID NO: 3, а распознаваемую ферментом рестрикции BclI последовательность вводили в праймер из SEQ ID NO: 4. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенную TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу. После расщепления фрагментов ПЦР ферментами рестрикции BglII и BclI фрагменты ПЦР и указанный выше полилинкер сшивали вместе для получения фрагмента ПЦР приблизительно 400 п.о. Для реакции лигирования применяли набор "DNA Ligation Kit Ver." (произведенный TAKARA BIO INC.), и условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу. Затем получали фрагменты приблизительно 9,2 т.п.н., вырезанные из известной плазмиды pAYC32 (J. Gen. Microbiol., 137, 169-178 (1991)) ферментами рестрикции EcoRI и BamHI, и указанный выше фрагмент ДНК вставляли в конструкцию экспрессионной плазмиды pAYCTER3, функционирующую в  ATCC 53528. В структуре pAYCTER3 отсутствует 5'-область выше последовательности гена strA, включенная в pAYC32, но вместо этого он имеет область множественного клонирования pUC19 и терминатор rrnB и включает полученный из  ген бета-лактамазы
Methylophilus methylotrophus
(2) Секреторная экспрессия бета-лактамазы в  ATCC 53528
Methylophilus methylotrophus
2
4
2
4
2
·
ATCC 53528 трансформировали сконструированной как описано выше (1) pAYCTER3 и выделяли штамм, растущий в содержащей 25 мг/л ампициллина и 1% метанола среде с агаром SEIIA (5 г сульфата аммония, 1,9 г KHPO, 1,56 г NaHPO2HO, 200 мг сульфата магния, 72 мг хлорида кальция, 5 мкг сульфата меди, 25 мкг сульфата марганца, 23 мкг сульфата цинка, 9,7 мг треххлористого железа и 15 г агара растворяли в воде до 1 л, и pH раствора доводили до 7,0).
M.methylotrophus
M.methylotrophus
Затем выделенный  ATCC 53528 с pAYCTER3 культивировали в жидкой среде SEIIA, содержащей 25 мг/л ампициллина и 2% метанола, при 37°C в течение 48 часов. После завершения культивирования культуральный супернатант бактериальных клеток  ATCC 53528 с pAYCTER3 подвергали SDS-PAGE, чтобы таким образом определить в культуральном супернатанте белок с тем же молекулярным весом, что и у бета-лактамазы.
Определение N-концевой последовательности белка с применением белкового секвенатора PPSQ-21A (произведенного Shimadzu Corporation) показало, что последовательность представляла собой зрелую последовательность бета-лактамазы, и это подтверждало, что бета-лактамаза секретировалась в культуральный супернатант.
Escherichia coli
Methylophilus methylotrophus
Пример 2: Секреторная экспрессия получаемой из штамма К-12  фитазы в  ATCC 53528
Methylophilus methylotrophus
(1) Выделение гена метанолдегидрогеназы, полученного из  ATCC 53528
M.Methylotrophus
M.Methylotrophus
Последовательность гена метанолдегидрогеназы, полученного из штамма W3A1 , уже определили ранее [Genbank Accession № U41040]. На основании последовательности синтезировали показанные в SEQ ID NO: 1 и 2 праймеры, и посредством способа ПЦР амплифицировали кодирующую последовательность метанолдегидрогеназы область из хромосомной ДНК ATCC 53528, полученной по способу Saito и Miura. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу.
M. Methylotrophus
Escherichia coli
Затем амплифицированный фрагмент ДНК приблизительно 1 т.п.н. подвергали взаимодействию с применением Random Primer DNA Labeling Kit Ver.2 (произведенный TAKARA BIO INC.) и [α-32P]dCTP в соответствии с прикрепленным к набору протоколом, чтобы таким образом получить ДНК-зонд. Саузерн-блот гибридизация с применением полученного зонда и хромосомной ДНК ATCC 53528 по обычному способу, описанному в Molecular Cloning 2nd edition [J.Sambrook, E.F.Fritsch and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p9.31 (1989)] показала, что фрагмент приблизительно 5,5 т.п.н., вырезанный при помощи фермента рестрикции PvuII, включал ген метанолдегидрогеназы. Затем для получения библиотеки полученные при расщеплении хромосомной ДНК PvuII фрагменты приблизительно 5,5 т.п.н. собирали после электрофореза в агарозном геле с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) и вставляли в область SmaI в pUC18 (произведенной TAKARA BIO INC.), и полученную плазмиду вводили в компетентные клетки  JM109 (произведенные TAKARA BIO INC.).
M. Methylotrophus
M.Methylotrophus
Скрининг библиотеки проводили посредством гибридизации колоний, описанной в Molecular Cloning 2nd edition [J.Sambrook, E.F.Fritsch and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p1.90 (1989)] с применением полученного, как описано выше, ДНК-зонда метанолдегидрогеназы, чтобы таким образом выделить штамм с плазмидой, в котором клонирован фрагмент гена метанолдегидрогеназы. После этого плазмиду выделяли из штамма и обозначали ее pUMDH. Определение нуклеотидной последовательности клонированного в pUMDH фрагмента показало, что гомология нуклеотидной последовательности гена метанолдегидрогеназы ATCC 53528 составляет 95% или более с геном метанолдегидрогеназы штамма W3A1 (SEQ ID NO: 13). Определение нуклеотидной последовательности показало, что фрагмент PvuII приблизительно 5,5 т.п.н. включал полную длину гена метанолдегидрогеназы и область приблизительно 2,5 т.п.н. выше 5'-области гена. Нуклеотидную последовательность определяли с применением набора для секвенирования "A dye terminator cycle sequencing kit" (произведенного PE Applied Biosystems) и секвенатора ДНК 373A (произведенного PE Applied Biosystems).
Escherichia coli,
(2) Выделение гена фитазы, полученного из штамма К-12 и конструирование секреторной экспрессионной плазмиды
Escherichia coli
Escherichia coli
Последовательность гена фитазы, полученного из штамма К-12 , уже определили ранее (Genbank Accession № AE000200 SEQ ID NO: 15). На основании последовательности синтезировали показанные в SEQ ID NO: 7 и 8 праймеры, и посредством способа ПЦР амплифицировали область, кодирующую последовательность (зрелую) фитазы, из хромосомной ДНК штамма К-12 , полученную по способу Saito и Miura. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу.
M.Methylotrophus
После этого промоторную область и область сигнальной последовательности метанолдегидрогеназы амплифицировали с применением праймеров, показанных в SEQ ID NO: 9 и 10 из хромосомной ДНК ATCC 53528, полученной по способу Saito и Miura. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу. Для того чтобы сконструировать слитый ген с фитазой, показанный в SEQ ID NO: 10 праймер содержит последовательность, кодирующую N-концевую аминокислотную последовательность фитазы.
Escherichia coli
Methylophilus methylotrophus
Methylophilus methylotrophus
Затем для получения матрицы смешивали по 1 мкл растворов ПЦР области, кодирующей последовательность фитазы (зрелого типа) из штамма К-12 , амплифицированной как описано выше, и промоторной области и области сигнальной последовательности из  ATCC 53528, амплифицированных как описано выше, и проводили перекрестную ПЦР с применением праймеров из SEQ ID NO: 9 и 8 для амплификации слитого гена фитазы, связанного с промоторной и сигнальной последовательностью гена метанолдегидрогеназы из  ATCC 53528. При электрофорезе в агарозном геле детектировали амплифицированные фрагменты приблизительно 2,4 т.п.н. Для получения pHSGMappA из агарозного геля собирали фрагменты с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) и вставляли в область SmaI в pHSG398 (произведенную TAKARA BIO INC.). Определение нуклеотидной последовательности вставленного фрагмента подтверждало конструкцию ожидаемого слитого гена. Затем из агарозного геля выделяли фрагмент BamHI-KpnI из pHSGMappA с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) и концы фрагмента дефосфорилировали с применением набора "DNA blunted kit" (произведенного TAKARA BIO INC.). После этого для получения pAYCMappA фрагмент EcoRI из сконструированной в примере 1 (1) pAYCTER3 выделяли из агарозного геля с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) и дефосфорилировали концы фрагмента с применением набора "DNA blunted kit" (произведенного TAKARA BIO INC.) с последующей вставкой фрагмента BamHI-KpnI с тупыми концами. Определение нуклеотидной последовательности вставленного фрагмента подтверждало конструкцию ожидаемого гетерогенного слитого гена.
Methylophilus methylotrophus
(3) Экспрессия гена фитазы в  ATCC 53528
Methylophilus methylotrophus
Methylophilus methylotrophus
Escherichia coli
M. methylotrophus
M. methylotrophus
M.methylotrophus
M.methylotrophus
2
4
2
4
2
·
ATCC 53528 трансформировали pAYCMappA (полученной связыванием промоторной последовательности и сигнальной последовательности метанолдегидрогеназы из  ATCC 53528 с геном фитазы, полученным из штамма К-12 ), сконструированной как указано выше (2) и pAYCTER3 (контроль) соответственно, и выделяли штаммы, растущие в содержащей 25 мг/л ампициллина и 1% метанола среде с агаром SEIIA (5 г сульфата аммония, 1,9 г KHPO, 1,56 г NaHPO2HO, 200 мг сульфата магния, 72 мг хлорида кальция, 5 мкг сульфата меди, 25 мкг сульфата марганца, 23 мкг сульфата цинка, 9,7 мг треххлористого железа и 15 г агара растворяли в воде до 1 л, и pH раствора доводили до 7,0). После этого выделенные штаммы  ATCC 53528 с pAYCMappA или pAYCTER3 культивировали в жидкой среде SEIIA, содержащей 25 мг/л ампициллина и 2% метанола, при 37°C в течение 48 часов. После завершения культивирования культуральные супернатанты штаммов с pAYCMappA и pAYCTER3 бактериальных клеток  ATCC 53528 подвергали SDS-PAGE, и в результате белок с целевым молекулярным весом определяли только в культуральном супернатанте штамма с pAYCMappA. Затем культуральные супернатанты штаммов применяли в качестве исходных ферментных растворов для определения фитазной активности. Ферментативную активность определяли по опубликованному описанию (J AOAC Int. 1994 May-Jun; 77(3): 760-4.). В результате в случае  ATCC 53528 с pAYCTER3 ферментативная активность в культуральном супернатанте не определялась, тогда как в случае  ATCC 53528 с pAYCMappA ферментативная активность в культуральном супернатанте определялась (60 FTU/мл, 37°C, pH 5,5), что доказало, что штамм секретировал фитазу в культуральный супернатант.
Morganella morganii
Methylophilus methylotrophus
Пример 3: Секреторная экспрессия полученной из штамма  кислой фосфатазы в  ATCC 53528
Morganella morganii
(1) Выделение полученного из штамма  гена кислой фосфатазы и конструирование плазмиды для секреторной экспрессии
Morganella morganii
Morganella morganii
M.Methylotrophus,
Последовательность полученного из штамма  гена кислой фосфатазы уже определили ранее (Genbank Accession №035805: SEQ ID NO: 25). На основании последовательности синтезировали показанные в SEQ ID NO: 27 и 28 праймеры, и посредством способа ПЦР амплифицировали область, кодирующую последовательность (зрелого типа) кислой фосфатазы, из хромосомной ДНК штамма , полученную по способу Saito и Miura. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу. Для того чтобы сконструировать слитый ген с метанолдегидрогеназой из  показанный в SEQ ID NO: 27 праймер содержит последовательность, кодирующую C-концевую область аминокислотной последовательности в сигнальной последовательности метанолдегидрогеназы.
M.methylotrophus
Затем промоторную область и область сигнальной последовательности метанолдегидрогеназы амплифицировали при помощи способа ПЦР с применением показанных в SEQ ID NO: 9 и 29 праймеров из хромосомной ДНК  ATCC 53528, полученной по способу Saito и Miura. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу.
Morganella morganii
Methylophilus methylotrophus
Methylophilus methylotrophus
После этого для получения матрицы смешивали по 1 мкл реакционной смеси ПЦР области, кодирующей последовательность кислой фосфатазы (зрелого типа) из штамма , амплифицированной, как описано выше, и промоторной области и области сигнальной последовательности из  ATCC 53528, амплифицированных, как описано выше, и проводили перекрестную ПЦР с применением праймеров из SEQ ID NO: 9 и 28 для амплификации слитого гена кислой фосфатазы, связанного с промоторной и сигнальной последовательностью гена метанолдегидрогеназы из  ATCC 53528. При электрофорезе в агарозном геле детектировали амплифицированный фрагмент приблизительно 1,8 т.п.н. Для получения pHSGMphoC из агарозного геля фрагмент собирали с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) и вставляли в область SmaI в pHSG398 (произведенную TAKARA BIO INC.). Определение нуклеотидной последовательности вставленного фрагмента подтверждало конструкцию ожидаемого слитого гена. Нуклеотидную последовательность определяли с применением набора для секвенирования "A dye terminator cycle sequencing kit" (произведенного PE Applied Biosystems) и секвенатора ДНК 373A (произведенного PE Applied Biosystems). После этого из агарозного геля выделяли фрагмент BamHI-KpnI из pHSGMphoC с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.), и концы фрагмента дефосфорилировали с применением набора "DNA blunted kit" (произведенного TAKARA BIO INC.). Затем для получения pAYCMphoC фрагмент SmaI из сконструированной в примере 1 (1) pAYCTER3 выделяли из агарозного геля с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) с последующей вставкой фрагмента BamHI-KpnI с тупыми концами. Определение нуклеотидной последовательности вставленного фрагмента подтверждало конструкцию ожидаемого гетерогенного слитого гена.
Methylophilus methylotrophus
(2) Экспрессия гена кислой фосфатазы в  ATCC 53528
Methylophilus methylotrophus
Methylophilus methylotrophus
Morganella morganii
M.methylotrophus
M.methylotrophus
M.methylotrophus
M.methylotrophus
ATCC 53528 трансформировали pAYCMphoC (полученной связыванием промоторной последовательности и сигнальной последовательности метанолдегидрогеназы, выделенных из  ATCC 53528 с геном кислой фосфатазы, полученным из штамма ), сконструированной как указано выше (1) и pAYCTER3 (контроль), и выделяли штаммы, растущие в среде с агаром SEIIA, содержащей 25 мг/л ампициллина и 1% метанола. После этого выделенные штаммы  ATCC 53528 с pAYCMphoC или pAYCTER3 культивировали в жидкой среде SEIIA, содержащей 25 мг/л ампициллина и 2% метанола, при 37°C в течение 48 часов. После завершения культивирования культуральные супернатанты штаммов с pAYCMphoC и pAYCTER3 бактериальных клеток  ATCC 53528 подвергали SDS-PAGE, и в результате белок с целевым молекулярным весом приблизительно 25 кДа определяли только в культуральном супернатанте штамма с pAYCMphoC. Затем для определения фосфатазной активности культуральные супернатанты штаммов применяли в качестве исходных ферментных растворов с применением субстрата pNPP. В результате в случае  ATCC 53528 с pAYCTER3 ферментативная активность в культуральном супернатанте не определялась, тогда как в случае  ATCC 53528 с pAYCMphoC ферментативная активность в культуральном супернатанте определялась, что доказало, что штамм секретировал кислую фосфатазу в культуральный супернатант.
Escherichia coli
Methylophilus methylotrophus
Пример 4: Секреторная экспрессия полученной из сигнальной последовательности с заменой штамма K-12  фитазы в  ATCC 53528
Escherichia coli
(1) Конструирование секреторной экспрессионной плазмиды для фитазы, полученной из сигнальной последовательности с заменой штамма K-12
M.methylotrophus
Посредством способа ПЦР промоторную область метанолдегидрогеназы амплифицировали с применением праймеров, показанных в SEQ ID NO: 30 и 31, из хромосомной ДНК  ATCC 53528, полученной по способу Saito и Miura. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу. Показанный в SEQ ID NO: 30 праймер содержит распознаваемую ферментом рестрикции Hind III последовательность.
E.Coli
E.Coli
M.methylotrophus
Для того чтобы использовать полученную из штамма K-12  сигнальную последовательность фитазы, включающий сигнальную последовательность ген фитазы амплифицировали при помощи способа ПЦР с применением праймеров, показанных в SEQ ID NO: 32 и 33, из хромосомной ДНК штамма K-12 , полученной по способу Saito и Miura. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу. Для того чтобы сконструировать слитый ген с метанолдегидрогеназой из  показанный в SEQ ID NO: 32 праймер содержит последовательность, кодирующую C-концевую область аминокислотной последовательности в промоторной последовательности метанолдегидрогеназы, а показанный в SEQ ID NO: 33 праймер содержит распознаваемую ферментом рестрикции KpnI последовательность.
Escherichia coli
Methylophilus methylotrophus
E.coli
Methylophilus methylotrophus
Затем для получения матрицы смешивали по 1 мкл реакционных смесей ПЦР области, кодирующей последовательность фитазы из штамма К-12 , амплифицированной как описано выше, и промоторной области из  ATCC 53528, амплифицированной как описано выше, и проводили перекрестную ПЦР с применением праймеров из SEQ ID NO: 30 и 33 для амплификации слитого гена из сигнальной последовательности и зрелого гена фитазы , связанного с промотором гена метанолдегидрогеназы из  ATCC 53528. При электрофорезе в агарозном геле детектировали амплифицированный фрагмент приблизительно 2,4 т.п.н. Для получения pAYCAappA из агарозного геля собирали фрагмент HindIII-KpnI с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) и вставляли в область HindIII-KpnI в pAYCTER3 из примера 1 (1). Определение нуклеотидной последовательности вставленного фрагмента подтверждало конструкцию ожидаемого слитого гена. Нуклеотидную последовательность определяли с применением набора для секвенирования "A dye terminator cycle sequencing kit" (произведенного PE Applied Biosystems) и секвенатора ДНК 373A (произведенного PE Applied Biosystems).
Morganella morganii
M.Morganii
M.Methylotrophus
.
С другой стороны, для того чтобы использовать сигнальную последовательность кислой фосфатазы из штамма , ген кислой фосфатазы, включающий сигнальную последовательность, амплифицировали посредством способа ПЦР с применением праймеров, показанных в SEQ ID NO: 34 и 28, из хромосомной ДНК штамма , полученной по способу Saito и Miura. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу. Для того чтобы сконструировать слитый ген с метанолдегидрогеназой , показанный в SEQ ID NO: 34 праймер содержит последовательность, кодирующую C-концевую область аминокислотной последовательности в промоторной последовательности метанолдегидрогеназы
M.Morganii
M.methylotrophus
M.methylotrophus
M.Morganii
E.coli
.
Для получения матрицы смешивали по 1 мкл реакционных смесей ПЦР амплифицированного, как описано ранее, гена кислой фосфатазы и указанной выше промоторной области метанолдегидрогеназы, и проводили перекрестную ПЦР с применением праймеров из SEQ ID NO: 30 и 28 для амплификации слитого гена из сигнальной последовательности и зрелого гена кислой фосфатазы , связанного с промотором гена метанолдегидрогеназы из  ATCC 53528. Кроме того, промотор гена метанолдегидрогеназы из  ATCC 53528 и сигнальную последовательность кислой фосфатазы из  амплифицировали с применением в качестве матрицы слитого гена и применением показанных в SEQ ID NO: 30 и 35 праймеров. Для того чтобы сконструировать слитый ген с фитазой из , показанный в SEQ ID NO: 35 праймер содержит последовательность, кодирующую N-концевую область аминокислотной последовательности в зрелой последовательности фитазы
M.Morganii
E.coli
M.methylotrophus
Для получения матрицы смешивали по 1 мкл реакционных смесей ПЦР слитого гена промоторной области метанолдегидрогеназы и сигнальной последовательности кислой фосфатазы, амплифицированных как описано ранее, и гена фитазы, амплифицированного в примере 2 (2), и проводили перекрестную ПЦР с применением праймеров из SEQ ID NO: 30 и 33 для амплификации слитого гена из сигнальной последовательности кислой фосфатазы из  и зрелого гена фитазы из , связанного с промотором гена метанолдегидрогеназы из  ATCC 53528. При электрофорезе в агарозном геле детектировали амплифицированный фрагмент приблизительно 2,4 т.п.н. Для получения pAYCCappA амплифицированный фрагмент обрабатывали ферментами рестрикции HindIII и KpnI и собирали из агарозного геля фрагмент HindIII-KpnI с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) и вставляли в область HindIII-KpnI в pAYCTER3, полученную в примере 1 (1). Нуклеотидную последовательность определяли с применением набора для секвенирования "A dye terminator cycle sequencing kit" (произведенного PE Applied Biosystems) и секвенатора ДНК 373A (произведенного PE Applied Biosystems).
Methylophilus methylotrophus
E.coli
E.Coli
M.Morganii
(2) Экспрессия в  ATCC 53528 зрелой фитазы , связанной с сигнальной последовательностью фитазы  и сигнальной последовательностью кислой фосфатазы
M.methylotrophus
M.methylotrophus
E.Coli
M.methylotrophus
M.morganii
E.Coli
M.methylotrophus
M.methylotrophus
M. methylotrophus
M.methylotrophus
ATCC 53528 трансформировали сконструированной выше (1) pAYCAappA (полученной связыванием промоторной последовательности метанолдегидрогеназы, выделенной из  ATCC 53528 и сигнальной последовательности фитазы, полученной из со зрелой последовательностью гена) и pAYCCappA (полученной связыванием промоторной последовательности метанолдегидрогеназы, выделенной из  ATCC 53528, и сигнальной последовательности кислой фосфатазы, полученной из со зрелой последовательностью гена фитазы, полученной из ) и pAYCTER3 (контроль), и выделяли штаммы, растущие в среде с агаром SEIIA, содержащей 25 мг/л ампициллина и 1% метанола. Затем выделенные штаммы  ATCC 53528 с pAYCAappA, pAYCCappA или pAYCTER3 культивировали в жидкой среде SEIIA, содержащей 25 мг/л ампициллина и 2% метанола, при 37°C в течение 48 часов. После завершения культивирования культуральные супернатанты штаммов с pAYCAappA, pAYCCappA или pAYCTER3 бактериальных клеток  ATCC 53528 подвергали SDS-PAGE, и в результате белок с целевым молекулярным весом определяли только в культуральных супернатантах штамма с pAYCAappA и штамма с pAYCCappA. Затем культуральные супернатанты штаммов применяли в качестве исходных ферментных растворов для определения фитазной активности. В результате в случае  ATCC 53528 с pAYCTER3 ферментативная активность в культуральном супернатанте не определялась, тогда как в случаях  ATCC 53528 с pAYCAappA и pAYCCappA ферментативная активность в культуральных супернатантах определялась, что доказало, что штаммы секретировали фитазу в культуральные супернатанты. Ферментативную активность определяли тем же способом, как описано выше в примере 2.
Escherichia coli
Methylophilus methylotrophus
Пример 5: Секреторная экспрессия промотор-замещенной фитазы, полученной из штамма K-12  в  ATCC 53528
Escherichia coli
(1) Конструирование секреторной экспрессионной плазмиды для промотор-замещенной фитазы, полученной из штамма K-12
Для того чтобы использовать промотор tac, область промотора tac амплифицировали посредством способа ПЦР с применением в качестве матрицы pKK223-3 (произведенной Pharmacia) и применением показанных в SEQ ID NO: 36 и 37 праймеров. Последовательность промотора tac показана в SEQ ID NO: 12. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу. Показанный в SEQ ID NO: 36 праймер содержит распознаваемую ферментом рестрикции EcoRI последовательность.
M.Methylotrophus
E. coli
Слитый ген из полученной из  сигнальной последовательности метанолдегидрогеназы и полученной из  фитазы (зрелой) амплифицировали посредством способа ПЦР с применением в качестве матрицы pAYCMappA, полученной в примере 2 (2) и применением праймеров, показанных в SEQ ID NO: 38 и 39. ПЦР проводили с применением ДНК-полимеразы Pyrobest (произведенной TAKARA BIO INC.), а условия реакции соответствовали рекомендованному производителем протоколу. Для того чтобы сконструировать слитый ген с промотором tac, показанный в SEQ ID NO: 38 праймер содержит конкретную последовательность промотора tac, тогда как показанный в SEQ ID NO: 39 праймер содержит распознаваемую ферментом рестрикции EcoRI конкретную последовательность.
M.methylotrophus
E.coli
M.Methylotrophus
E.coli
.
Затем для получения матрицы смешивали по 1 мкл реакционных смесей ПЦР области, кодирующей последовательность промотора tac, амплифицированной как описано выше, и области, кодирующей слитый ген сигнальной последовательности метанолдегидрогеназы, полученной из  и фитазы (зрелой), полученной из , амплифицированной как описано выше, и проводили перекрестную ПЦР с применением праймеров из SEQ ID NO: 36 и 39 для амплификации гена, полученного при слиянии сигнальной последовательности полученной из  метанолдегидрогеназы, связанного с промотором tac и полученным из  зрелым геном фитазы При электрофорезе в агарозном геле детектировали амплифицированный фрагмент приблизительно 1,6 т.п.н. Для получения pAYCPtacMappA амплифицированный фрагмент обрабатывали EcoRI и собирали из агарозного геля фрагмент EcoRI с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) и вставляли в область EcoRI в pAYCTER3, полученную в примере 1 (1). Нуклеотидную последовательность определяли с применением набора для секвенирования "A dye terminator cycle sequencing kit" (произведенного PE Applied Biosystems) и секвенатора ДНК 373A (произведенного PE Applied Biosystems).
Methylophilus methylotrophus
E.coli
(2) Экспрессия в  ATCC 53528 полученной из  фитазы, связанной с промотором tac
M.methylotrophus
Methylophilus methylotrophus
E.coli
M. methylotrophus
M.methylotrophus
M.methylotrophus
M.methylotrophus
ATCC 53528 трансформировали сконструированной выше (1) pAYCPtacMappA (полученной связыванием промоторной последовательности tac и сигнальной последовательности метанолдегидрогеназы, полученной из  ATCC 53528 со зрелой последовательностью гена фитазы, полученного из ) и pAYCTER3 (контроль), и выделяли штаммы, растущие в среде с агаром SEIIA, содержащей 25 мг/л ампициллина и 1% метанола. Затем выделенные штаммы  ATCC 53528 с pAYCPtacMappA или pAYCTER3 культивировали в жидкой среде SEIIA, содержащей 25 мг/л ампициллина и 2% метанола, при 37°C в течение 48 часов. После завершения культивирования культуральные супернатанты штаммов с pAYCPtacMappA или pAYCTER3 бактериальных клеток  ATCC 53528 подвергали SDS-PAGE, и в результате белок с целевым молекулярным весом определяли только в культуральном супернатанте штамма с pAYCPtacMappA. Затем культуральные супернатанты штаммов применяли в качестве исходных ферментных растворов для определения фитазной активности. В результате в случае  ATCC 53528 с pAYCTER3 ферментативная активность в культуральном супернатанте не определялась, тогда как в случае  ATCC 53528 с pAYCPtacMappA ферментативная активность в культуральном супернатанте определялась, что доказало, что штамм секретировал фитазу в культуральный супернатант. Ферментативную активность определяли тем же способом, как описано выше в примере 2.
Escherichia coli
Methylobacillus glycogenes
Пример 6: Секреторная экспрессия полученной из штамма K-12  бета-лактамазы в  ATCC 29475
Methylobacillus glycogenes
(1) Конструирование функционирующей в  ATCC 29475, pAYCTER-tet экспрессионной плазмиды
M. glycogenes
Штамм  ATCC 29475 обладает устойчивостью к ампициллину и стрептомицину и чувствителен к тетрациклину, поэтому в полученную в примере 1 (1) секреторную экспрессионную плазмиду pAYCTER3 вставляли ген устойчивости к тетрациклину. Таким образом, амплифицировали ген устойчивости к тетрациклину посредством ПЦР с применением в качестве матрицы pKR310 (описанной в Plasmid. 1985 Mar; 13(2): 149-53) и применением праймеров из SEQ ID NO: 23 и 24. При электрофорезе в агарозном геле детектировали амплифицированный фрагмент приблизительно 1,5 т.п.н. Для получения pAYCTER-tet амплифицированный фрагмент обрабатывали ферментом рестрикции BamHI и собирали из агарозного геля с применением EASYTRAP Ver.2 (произведенного TAKARA BIO INC.) и вставляли в область BamHI в pAYCTER3, полученной в примере 1 (1). Определение нуклеотидной последовательности вставленного фрагмента подтверждало конструкцию ожидаемого слитого гена. Показанные в SEQ ID NO: 23 и 24 праймеры включают распознаваемые ферментом рестрикции BamHI последовательности, и нуклеотидную последовательность определяли с применением набора для секвенирования "A dye terminator cycle sequencing kit" (произведенного PE Applied Biosystems) и секвенатора ДНК 373A (произведенного PE Applied Biosystems).
Methylobacillus glycogenes
(2) Секреторная экспрессия бета-лактамазы в  ATCC 29475
Methylobacillus glycogenes
2
4
2
4
2
·
ATCC 29475 трансформировали сконструированной, как описано выше (1), pAYCTER-tet и выделяли штамм, растущий в содержащей 5 мг/л тетрациклина и 1% метанола среде с агаром SEIIA (5 г сульфата аммония, 1,9 г KHPO, 1,56 г NaHPO2HO, 200 мг сульфата магния, 72 мг хлорида кальция, 5 мкг сульфата меди, 25 мкг сульфата марганца, 23 мкг сульфата цинка, 9,7 мг треххлористого железа и 15 г агара растворяли в воде до 1 л, и pH раствора доводили до 7,0).
M. glycogenes
M.glycogenes
Затем выделенный  ATCC 29475 с pAYCTER-tet культивировали в жидкой среде SEIIA, содержащей 5 мг/л тетрациклина и 2% метанола, при 30°C в течение 48 часов. После завершения культивирования культуральный супернатант бактериальных клеток  ATCC 29475 с pAYCTER-tet подвергали SDS-PAGE, чтобы таким образом определить в культуральном супернатанте белок с тем же молекулярным весом, что и у бета-лактамазы.
Определение N-концевой последовательности белка с применением белкового секвенатора PPSQ-21A (произведенного Shimadzu Corporation) показало, что последовательность представляла собой зрелую последовательность бета-лактамазы, и это подтверждало, что бета-лактамаза секретировалась в культуральный супернатант.
Escherichia coli
Methylobacillus glycogenes
Пример 7: Секреторная экспрессия полученной из штамма K-12  фитазы в  ATCC 29475
Escherichia coli
Methylobacillus glycogenes
(1) Конструирование секреторной экспрессионной плазмиды для полученной из штамма K-12  фитазы в  ATCC 29475
E. coli
M. glycogenes
Для того чтобы получить секреторную экспрессию полученной из штамма K-12  фитазы в штамме  ATCC 29475, обработанный BamHI фрагмент гена устойчивости к тетрациклину, продуцированный в примере 6 (1), вставляли в область BamHI в секреторной экспрессионной плазмиде фитазы pAYCPtacMappA, продуцированной в примере 5 (1), чтобы, таким образом, получить pAYCPtacMappA-tet. Определение нуклеотидной последовательности вставленного фрагмента подтверждало конструкцию ожидаемого слитого гена. Нуклеотидную последовательность определяли с применением набора для секвенирования "A dye terminator cycle sequencing kit" (произведенного PE Applied Biosystems) и секвенатора ДНК 373A (произведенного PE Applied Biosystems).
E.coli
Methylobacillus glycogenes
Экспрессия полученной из  фитазы в штамме  ATCC 29475
Methylobacillus glycogenes
M.glycogenes
M.glycogenes
M.glycogenes
M.glycogenes
ATCC 29475 трансформировали сконструированной выше (1) pAYCPtacMappA-tet или полученной в примере 6 (2) pAYCTER-tet (контроль), и выделяли штаммы, растущие в среде с агаром SEIIA, содержащей 5 мг/л тетрациклина и 1% метанола. Затем выделенные штаммы  ATCC 29475 с pAYCPtacMappA-tet или pAYCTER-tet культивировали в жидкой среде SEIIA, содержащей 5 мг/л тетрациклина и 2% метанола, при 37°C в течение 48 часов. После завершения культивирования культуральные супернатанты штаммов с pAYCPtacMappA-tet или pAYCTER-tet бактериальных клеток  ATCC 29475 подвергали SDS-PAGE, и в результате белок с целевым молекулярным весом определяли только в культуральном супернатанте штамма с pAYCPtacMappA-tet. После этого культуральные супернатанты штаммов применяли в качестве исходных ферментных растворов для определения фитазной активности. В результате в случае  ATCC 29475 с pAYCTER-tet ферментативная активность в культуральном супернатанте не определялась, тогда как в случае  ATCC 29475 с pAYCPtacMappA-tet ферментативная активность в культуральном супернатанте определялась, что доказало, что штамм секретировал фитазу в культуральный супернатант. Ферментативную активность определяли тем же способом, как описано выше в примере 2.
Промышленное применение
По настоящему изобретению возможно эффективно и недорого осуществлять секреторную продукцию белка. Конкретно возможно осуществлять секреторную продукцию используемого в промышленных масштабах белка, например, фитазы или т.п.