Противоопухолевое средство на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины и способ его получения
ANTI-TUMOUR AGENT BASED ON RECOMBINANT VACCINIA VIRUS STRAIN AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Группа изобретений относится к области медицины и касается противоопухолевого средства, содержащего рекомбинантный штамм вируса осповакцины W-GMCSF-Lact и способа его получения Средство может быть использовано для лечения злокачественных новообразований (солидных опухолей) млекопитающих.
В связи с большой и всевозрастающей проблемой борьбы с онкологическими заболеваниями, колоссальным многообразием типов опухолей, нестабильностью, либо отсутствием иммунного ответа на опухолевые клетки и появлением иммунодефицитных состояний при онкологических заболеваниях особенно актуальными становятся работы по разработке и получению новых противоопухолевых средств с многофункциональным механизмом действия. Очень важно, чтобы эти препараты обладали высокоизбирательными онкотоксическими свойствами, что способствовало бы распознаванию и уничтожению только опухолевых и метастатических клеток, а также высвобождению опухоль-ассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе хозяина. На роль таких агентов практически идеально подходят непатогенные или аттенуированные природные и рекомбинантные вирусы - онколитические вирусы, имеющие механизмы распознавания раковых клеток, обладающие избирательным цитолитическим потенциалом и, возможно, экспрессирующие гены иммунологически активных и других белков, специфически усиливающих их противоопухолевую активность. Помимо непосредственного лизиса раковых клеток онколитические вирусы способны вызывать иммунный ответ организма посредством стимулирования адаптивного и врожденного иммунитета (1-3).
Известны средства на основе бактериальных онколитических штаммов Clostridium ghonii, обладающие способностью подавлять рост солидных злокачественных опухолей (4). В качестве онколитических штаммов используют штаммы Clostridium ghonii MW-DCG_HNCv18, Clostridium ghonii MW-DCG_CCv17 и Clostridium ghonii MW-DCG_LCv26, депонированные в Национальном Институте Измерений (National Measurement Institute, 1/153 Bertie Street, Port Melbourne, Victoria, Australia 3207) под соответствующими регистрационными номерами V12/001485, V12/001487 и V12/001486.
L
Известно средство на основе онколитического штамма ЖЭВ-15 вируса Коксаки В6, селективно инфицирующего и лизирующего опухолевые клетки человека и имеющего фрагмент геномной последовательности, являющийся его маркерными признаком (5). Данный штамм депонирован в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под регистрационным номером V-576.
Известна композиция для лечения онкологических заболеваний, содержащая рекомбинантный штамм вируса Сендай, принадлежащий к роду Respirovirus, семейство Paramyxoviridae, полученный на основе вирусного материала, депонированного в американской коллекции клеточных культур АТСС под номером РТА-13024 и фармацевтически приемлемый носитель (6). Фармацевтически приемлемыми носителями являются: свежая аллантоисная жидкость эмбрионов кур, лиофилизированная аллантоисная жидкость, физиологический раствор или водные буферы, такие как PBS и т.п. Кроме того, композиция настоящего изобретения может содержать другие добавки, такие как адъюванты, стабилизаторы, антиоксиданты и т.п.
Недостатками известной композиции являются многокомпонентность, трудоемкость ее приготовления, а также использование нестандартизованных компонентов.
В настоящее время описан широкий круг вирусов, используемых для виротерапии злокачественных новообразований. На данный момент в США, Канаде, Китае и странах Европы (Германия, Венгрия) в клинических испытаниях протестирован ряд штаммов вируса осповакцины (ВОВ) на наличие у них противоопухолевого потенциала (7). По количеству клинических исследований среди рекомбинантых вирусов осповакцины лидируют препараты GL-ONC1 и Pexa-Vec/TG6006.
Известно противоопухолевое средство GL-ONC1 на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины, включающее аттенуированный вариант Л-ИВП, содержащий три инсерционные кассеты, кодирующие слитый белок люциферазы (Renilla) и зеленого флуоресцентного белка (Aequorea), β-галактозидазу и β-глюкуронидазу, и фармацевтически пригодный носитель (8). Трансгены встроены по локусам F14.5L, J2R (кодируют тимидинкиназу вируса) и A56R (кодирует гемагглютинин вируса), что и определяет аттенуацию рекомбинантного вируса. Противоопухолевое средство GL-ONC1 специфически инфицирует опухолевые клетки и уничтожает их путем онколизиса, что далее запускает противоопухолевый иммунный ответ.
Наиболее близким к заявляемому средству - прототипом, является противоопухолевое средство Pexa-Vec, содержащее рекомбинантный штамм JX-594 вируса осповакцины и фармацевтически приемлимый наполнитель (9). Штамм JX-594 вируса осповакцины получен на основе американского вакцинного штамма Wyeth путем встройки в район делеции гена вирусной тимидинкиназы (фактор вирулентности) двух трансгенов: гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и β-галактозидазы E. coli. Средство Pexa-Vec находится на 3 стадии клинических исследований в отношении гепатоцеллюлярной карциномы человека.
9
Способ получения противоопухолевого средства Pexa-Vec состоит из трех основных этапов, включающих получение вируссодержащего материала для противоопухолевого средства, его очистку и разбавление очищенного вируссодержащего концентрата фармацевтически приемлемым растворителем до концентрации вируса 1×10 БОЕ. Более конкретно, известный способ включает следующие стадии:
1. Получение вируссодержащего материала для лекарственного средства, включающее наработку вируса в клетках HeLa (культура клеток-продуцентов), лизирование клеток-продуцентов гипотоническим лизис-буфером (получение грубого лизата, содержащего вирус и клеточный дебрис).
2. Очистка вируссодержащего материала для лекарственного средства, включающая обработку лизата клеток-продуцентов ферментами: нуклеазой (бензоназой) для удаления ДНК клеток-продуцентов (HeLa) и протеазой (TrypLE™ Select) для удаления белков клеток-продуцентов (HeLa), тангенциальную фильтрацию вируссодержащего материала.
9
3. Разбавление очищенного вируссодержащего концентрата подходящим растворителем до концентрации вируса 1×10 БОЕ JX-594 (одна доза).
Известный способ позволяет получать целевой продукт с содержанием ДНК клеток-продуцентов - 3 мкг/дозу, содержанием белков клеток-продуцентов - 4 мг белка/дозу (10).
Недостатками противоопухолевого средства Pexa-Vec (прототип) являются:
- недостаточная онколитическая активность Pexa-Vec, связанная с использованием менее вирулентного векторного штамма вируса осповакцины (Wyeth против Л-ИВП) и за счет отсутствия встройки гена онкотоксического белка лактаптина;
- низкий уровень экспрессии ГМ-КСФ Pexa-Vec (40 пкг/мл);
- недостаточный уровень аттенуации Pexa-Vec, связанный с сохранением дополнительного гена вирулентности - вирусного ростового фактора;
- неудовлетворительная онкоселективность Pexa-Vec за счет удаления лишь одного гена - гена тимидинкиназы;
- присутствуе в геноме Pexa-Vec протяженной встройки (3000 п.н.) несмыслового репортерного гена β-галактозидазы E. coli.
Недостатками известного способа получения противоопухолевого средства Pexa-Vec являются:
- использование культуры клеток-продуцентов, не обеспечивающей получение максимальной удельной концентрации вируса (количество вирусных частиц на одну клетку культуры-продуцента);
- недостаточная (не максимальная) степень очистки лекарственного средства, что может объясняться отсутствием стадии удаления клеточного дебриса (осветление при низкоскоростном центрифугировании) после обработки лизата клеток-продуцентов ферментами (бензоназа + трипсин), а также недостаточностью использования только тангенциальной фильтрации для удаления примесей.
Задачей группы изобретений является создание высокоэффективного противоопухолевого средства, обладающего более высокой онколитической активностью и повышенными уровнями аттенуации, онкоселективности и экспрессии ГМ-КСФ.
Технический результат: повышение противоопухолевой эффективности средства и расширение диапазона его функциональной активности.
Поставленная задача достигается предлагаемым противоопухолевым средством, которое содержит рекомбинантный вирус осповакцины (штамм VV-GMCSF-Lact ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» - V-688), полученный в культуре клеток почки африканской зеленой мартышки 4647 и продуцирующий секретйруемый гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) человека и несекретируемый онкотоксический белок лактаптин, и фармацевтически приемлемый растворитель, при следующем содержании компонентов (на 1 мл):
Штамм VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины
(1-2)×10<sup>7</sup> БОЕ
фармацевтически приемлемый растворитель
до 1 мл
Предлагаемое средство представляет собой замороженный раствор - плотную затвердевшую белого цвета массу. После размораживания - бесцветная жидкость, прозрачная или слабо опалесцирующая, без посторонних включений, рН 6,2-6,8. Заявляемое средство является стерильным, нетоксичным, не содержит микоплаз и посторонних вирусных агентов. Средство не содержит консервантов и антибиотиков. Содержание эндотоксинов в лекарственном средстве не превышает 0,5 ЕЭ/мл, содержание бычьего сывороточного альбумина - не более 50 нг/мл, содержание клеточной ДНК - не более 10 нг/мл и содержание белка - не более 100 мкг/мл.
Специфическая активность предлагаемого средства измеряется как доза заражения, вызывающая 50%-ный литический эффект клеток рака молочной железы человека MDA-MB-231, и составляет не более 0,1 БОЕ/клетку.
В качестве фармацевтически приемлемого растворителя может быть использован физиологический раствор или физиологически приемлемый буферный раствор.
Характеристика активного компонента. Двойной рекомбинантный штамм VV-GMCSF-Lact сконструирован на основе умеренно патогенного российского штамма Л-ИВП вируса осповакцины, содержит делеции фрагментов генов вирусной тимидинкиназы и ростового фактора, в районы которых встроены ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека, структура которого соответствует кДНК матричной РНК ГМ-КСФ человека (GenBank Асе. M11220.1), в центральной части гена вирусной тимидинкиназы между позициями 81277 и 81308 п.н. (GenBank Асе. KP233807.1); ген ГМ-КСФ человека экспрессируется под контролем природного промотора Р7.5k вируса осповакцины и продуцирует секретируемую форму биологически активного ГМ-КСФ человека в клетках млекопитающих; ген лактаптина, кодирующий фрагмент каппа-казеина человека 23-134 а.о., в левом концевом районе вирусного генома между позициями 7770 и 8071 п.н. (GenBank Асе. KP233807.1); ген лактаптина экспрессируется под контролем синтетического промотора вируса осповакцины P7.5synth и продуцирует онкотоксический рекомбинантный белок лактаптин, который специфически индуцирует апоптотическую гибель раковых клеток человека in vitro и in vivo (11). Встройка в качестве трансгена гена лактаптина в район делеции гена вирусного ростового фактора способствует дополнительной аттенуации (ослаблению) вируса в отношении нормальных клеток и усилению его литической (цитотоксической) активности в отношении раковых клеток. Штамм VV-GMCSF-Lact депонирован в Государственной коллекции возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номером V-688(12).
Как правило, онколитические вирусы способны активировать в инфицированных клетках не один путь клеточной гибели, однако известно, что основным путем гибели, индуцируемым аденовирусами, является аутофагия, тогда как для вируса осповакцины превалирует программируемый некроз (13). Мишенью рекомбинантного вируса осповакцины VV-GMCSF-Lact являются EGFR-положительные клетки. Повышенная экспрессия гена EGFR (рецептор эпидермального фактора роста) характерна для многих раковых клеток человека. Комбинация делеций VGF и tk генов (двойные рекомбинанты) обеспечивает вирусу дополнительную таргетность в отношении раковых клеток и резко снижает его вирулентность в отношении здоровых клеток. Основным механизмом гибели EGFR-положительных клеток рака молочной железы под действием предлагаемого противоопухолевого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины является RIPK-1-независимый EGFR-зависимый некроз. Кроме того, опухолевые клетки, инфицированные вирусом VV-GMCSF-Lact, активно захватываются перитонеальными макрофагами.
7
7
Предлагаемое противоопухолевое средство предназначено для парентерального (внутриопухолевого) введения в солидную злокачественную опухоль в эффективной дозе (1-2)×10 БОЕ/мл ×10 БОЕ/мл один раз в неделю курсом из 4-х инъекций. Солидная злокачественная опухоль может быть глиобластомой, лимфосаркомой, карциномой молочной железы.
Поставленная задача достигается также предлагаемым способом получения заявляемого средства, включающим следующие основные этапы:
Этап 1. Получение вируссодержащего материала для противоопухолевого средства, включающее накопление культуры клеток-продуцентов 4647, заражение культуры клеток-продуцентов 4647 вирусом осповакцины, культивирование зараженной культуры-продуцента, сбор вируссодержащего материала для лекарственного средства.
Этап 2. Очистка вируссодержащего материала для средства, включающая следующие стадии: осаждение вируссодержащего материала ультрацентрифугированием, гомогенизацию вируссодержащего материала ультразвуком, обработку гомогената ферментами (бензоназой и трипсином), осветление вируссодержащего материала при низкоскоростном центрифугировании (удаление клеточного дебриса), доочистку осветленного концентрированного вируссодержащего материала двукратным ультрацентрифугированием в слое 36%-ной сахарозы (удаление балластных высокомолекулярных клеточных компонентов).
7
7
Этап 3. Получение противоопухолевого средства путем разбавления очищенного вируссодержащего концентрата 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации вируса не менее 1,0×10 БОЕ/мл и не более 2,0×10 БОЕ/мл.
Предлагаемый способ заключается в следующем.
7
Этап 1. Получение вируссодержащего материала проводят стандартным способом. Сначала проводят накопление культуры-продуцента путем серийных пассажей культуры клеток линии 4647 (клетки почки африканской зеленой мартышки, аттестованные для производства вакцин в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), восстановленной из посевного банка. После накопления необходимого количества клеток, полученную культуру-продуцент используют для получения вируссодержащего материала для противоопухолевого средства. Наработку вируса проводят в роллерных бутылях с монослоем клеток-продуцентов 4647. Из роллерных бутылей с монослоем клеток-продуцентов удаляют ростовую среду и в каждую бутыль добавляют по 10 мл суспензии вируса (штамм VV-GMCSF-Lact ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» - V-688) с титром не менее 10 БОЕ/мл для заражения клеток и инкубируют в роллерной установке при температуре (37±1)°С в течение 1 часа для адсорбции вируса на клетках. Затем в каждую роллерную бутыль вносят дополнительно поддерживающую среду (среда ДМЕМ, канамицин 0,06 мг/мл). Зараженные емкости инкубируют в роллерной установке при температуре 36,5-37,5°С в течение 2-х суток до образования 100%-ного ЦПД (цитопатическое действие).
Этап 2 Очистка вируссодержащего материала для противоопухолевого средства, получение вирусного концентрата
Полученный на этапе 1 вируссодержащий материал переносят в стерильные центрифужные стаканы и концентрируют ультрацентрифугированием при 4-8°С и 15300 об/мин в течение 1 часа. Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 1 мМ Трис-HCl, рН 9.0.
Полученную суспензию вируссодержащего материала обрабатывают ультразвуком (гомогенизируют) на ультразвуковом дезинтеграторе. Обработку ультразвуком проводят три раза по 20 секунд, с охлаждением после каждой обработки в течение 10 секунд во льду.
2
К полученному гомогенату вируссодержащего материала добавляют фермент бензоназу до конечной концентрации 40-42 единицы активности/мл и MgCl и инкубируют 30-40 минут при комнатной температуре. К гомогенату с бензоназой добавляют раствор трипсина до конечной концентрации 0,10-0,12 мг/мл и инкубируют еще 30-40 минут при температуре 37°С. Обработка ферментами позволяет разрушить нуклеиновые кислоты и белки клеток-продуцентов.
Обработанный ферментами гомогенат вируссодержащего материала осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10-15 минут при температуре 4-8°С (удаление клеточного дебриса).
Осветленный концентрированный вируссодержащий материал подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме двукратного ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы. Ультрацентрифугирование проводят при 12000 об/мин в течение 60-80 минут при температуре 4-8°С
После первого ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы осадки вируссодержащего материала восстанавливают в 0,001 М Трис-HCl, рН 9,0 (в  объема, наносимого на слой 36%-ной сахарозы при первом ультрацентрифугировании), обрабатывают ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе (как указано выше) и проводят повторное ультрацентрифугирование в слое 36%-ной сахарозы.
8
9
После второго ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы осадки вируссодержащего материала ресуспендируют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида (физиологический раствор) и обрабатывают ультразвуком как указано выше. В результате получают очищенный концентрат противоопухолевого средства на основе рекомбинантного вируса осповакцины с титром вируса 5,8×10 - 1,6×10 БОЕ/мл.
Этап 3 Получение противоопухолевого средства.
7
7
Очищенный вируссодержащий материал разбавляют 0,9%-ным раствором натрия хлорида до расчетной концентрации вируса не менее 1,0×10 БОЕ/мл и не более 2,0×10 БОЕ/мл, расфасовывают и хранят при температуре минус 40-42°С.
Определяющими отличиями заявляемого средства от прототипа являются:
- средство содержит литически активный (вирулентный) штамм VV-GMCSF-Lact с двойной делецией генов тимидинкиназы и ростового фактора, что обеспечивает высокую аттенуацию вируса и безопасность его использования для иммунодефицитных раковых больных. Для усиления противоопухолевой активности штамм содержит в качестве трансгенов ген ГМ-КСФ и ген цитотоксического белка лактаптина, обеспечивающие специфическую гибель раковых клеток.
7
- штамм W-GMCSF-Lact вируса осповакцины используют в средстве с экспериментально подобранным, оптимальным титром вируса, составляющим (1-2)×10 БОЕ/мл, что позволяет осуществлять избирательное инфицирование и активный лизис широкого спектра опухолевых клеток человека малым количеством вирусных частиц.
Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:
7
6
- в качестве культуры-продуцента для наработки вируса используют клетки почки африканской зеленой мартышки линии 4647, что позволяет получить максимальный выход вирусных частиц (1-2)×10 БОЕ/мл) по сравнению с клетками почки африканской зеленой мартышки линии Vero (6,4×10 БОЕ/мл), поскольку клетки 4647 крупнее клеток Vero, имеют больший объем цитоплазмы, что позволяет увеличить концентрацию вирусных частиц в одной клетке.
- обработанный ферментами гомогенат вируссодержащего материала осветляют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10-15 минут, что позволяет эффективно удалить клеточный дебрис и обеспечить максимальную степень очистки противоопухолевого средства;
- осветленный концентрированный вируссодержащий материал подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов путем двукратного ультрацентрифугирования при 12000 об/мин в слое 36%-ной сахарозы в течение 60-80 минут, что позволяет получать средство с минимальным количеством балластных высокомолекулярных клеточных компонентов, которые могут являться причиной побочных токсических эффектов.
Предлагаемое средство обладает повышенной противоопухолевой эффективностью за счет более высокой онколитической активности, а также высоких уровней аттенуации, онкоселективности и экспрессии ГМ-КСФ. Заявляемое средство имеет более широкий диапазон функциональной активности (по сравнению с прототипом), поскольку проявляет онколитическую активность в отношении таких солидных злокачественных опухолей, как глиобластома, лимфосаркома и карцинома молочной железы.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами графических изображений:
Фиг. 1. Противоопухолевая активность VV-GMCSF-Lact в отношении глиобластомы человека U87-MG in vivo. Динамика роста опухоли U87-MG на мышах SCID при лечении заявляемым средством.
Фиг. 2. Противоопухолевая активность VV-GMCSF-Lact в отношении лекарственно-устойчивой лимфосаркомы мыши RLS in vivo. Динамика изменения размера лапы мышей CBA с внутримышечно трансплантированными опухолевыми клетками RLS при лечении заявляемым средством.
фиг. 3. Противоопухолевая активность VV-GMCSF-Lact в отношений развившейся опухоли аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231. Динамика роста опухоли на мышах SCID при лечении заявляемым средством.
Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его осуществления.
Пример 1. Получение заявляемого противоопухолевого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины.
9
Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pVGF-FR2-PE/L-Pat, трансфекцию клеток CV-1 рекомбинантной плазмидой pVGF-FR2-PE/L-Pat и получение рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины проводят согласно известной методике (12). Очищенный рекомбинантный штамм вируса осповакцины VV-GMCSF-Lact с титром 10 БОЕ/мл хранится в расфасованном виде при -80°С (производственный штамм).
Этап 1. Получение вируссодержащего материала для противоопухолевого средства
Накопление культуры-продуцента проводят путем серийных пассажей культуры клеток линии 4647, аттестованной для производства вакцин в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», восстановленной из посевного банка. Используют для субкультивирования культуру клеток, сформировавшую плотный монослой, без признаков дегенерации и загрязнения микробной флорой. Техника проведения пассажа заключается в следующем: из культуральных матрасов вместимостью 50 мл удаляют ростовую среду, вносят в каждый матрас по 10 мл подогретого в термостате до температуры (32±0,5)°С фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Монослой клеток обмывают легким покачиванием, затем удаляют PBS пипеткой. Процедуру отмывки монослоя PBS повторяют дважды, затем в матрасы добавляют по 1 мл подогретого в термостате до температуры (32±0,5)°С диспергирующего раствора (100 мл раствора PBS/EDTA + 50 мг трипсина (Trypsin, for cell culture, Gerbu)), инкубируют матрасы при (37±0,5)°С до отслоения клеток, затем добавляют 9 мл ростовой среды. Флакон с клетками встряхивают 2-3 раза, не допуская образования обильной пены, осторожно пипетируют содержимое для получения однородной суспензии.
Далее полученную клеточную суспензию разводят ростовой средой (культуральная среда ДМЕМ, 10% сыворотки эмбриональной телячьей, 0,06 мг/мл канамицина) до концентрации 0,10 млн. жизнеспособных клеток в 1 мл ростовой среды. В культуральный матрас вместимостью 650 мл заливают 40 мл разведенной клеточной суспензии, матрас помещают в термостат при температуре (37±0,5)°С и выдерживают в течение 4-5 суток до формирования монослоя.
После образования монослоя процедуру снятия клеток с матраса вместимостью 650 мл повторяют также, как описано выше для матрасов вместимостью 50 мл, но с той лишь разницей, что в матрас вместимостью 650 мл с клеточным монослоем вносится по 50 мл промывочного раствора PBS, 3 мл раствора трипсина, 27 мл ростовой среды для подсчета клеток и 190 мл ростовой среды.
2
После накопления необходимого количества клеток, полученную культуру-продуцент используют для получения вируссодержащего материала для лекарственного средства. Наработку вируса проводят в 8 роллерных бутылях с монослоем клеток-продуцентов линии 4647 (роллерная установка INCUDRIVE D-I (Schuett, Германия) или подобная). Площадь поверхности каждой роллерной бутыли составляет 850 см.
7
Из роллерных бутылей с монослоем клеток-продуцентов удаляют ростовую среду и в каждую бутыль добавляют по 10 мл суспензии вируса (штамм VV-GMCSF-Lact ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» - V-688) с титром не менее 10 БОЕ/мл для заражения клеток (множественность инфекции 1 БОЕ/клетку). Емкости с зараженными клетками помещают в роллерную установку при температуре (37±0,5)°С на 1 час для адсорбции вируса на клетках. Затем в каждую роллерную бутыль вносят дополнительно по 90 мл поддерживающей среды (среда ДМЕМ, канамицин 0,06 мг/мл).
Зараженные емкости инкубируют в роллерной установке при температуре (37±0,5)°С 2 суток до образования 100%-ного ЦПД (цитопатическое действие). По истечении 2х суток роллерные бутыли с инфицированной вирусом культурой клеток-продуцентов механически встряхивают для сбрасывания неотслоившихся клеток в культуральную среду. Полученный вируссодержащий материал подвергают дальнейшей процедуре по приготовлению препарата.
Этап 2. Очистка вируссодержащего материала для противоопухолевого средства.
Все стадии очистки проводят при температуре 6°С. Полученный на этапе 1 вируссодержащий материал переносят в стерильные центрифужные стаканы вместимостью 250 мл (по 200 мл в стакан) и концентрируют ультрацентрифугированием при 15300 об/мин в течение 1 часа (Центрифуга Avanti J-E, ротор JA-14). Супернатант удаляют, а осадки восстанавливают в буферном растворе 0,001 М Трис-HCl из расчета 10% осадка к 90% буферного раствора (15 мл буфера на осадок с одной роллерной бутыли).
Полученную суспензию вируссодержащего материала обрабатывают ультразвуком (гомогенизируют) на ультразвуковом дезинтеграторе (УЗД2-0,1/22, Россия). Частота колебаний наконечника - 22 кГц, амплитуда - 14÷16 мкм, мощность дезинтеграции - 300 Вт. Обработку ультразвуком проводят три раза по 20 секунд, с охлаждением после каждой обработки в течение 10 секунд во льду.
2
К полученному гомогенату вируссодержащего материала добавляют фермент бензоназу (Benzonase, ≥250 units/mkl; Sigma-Aldrich #E1014-25KU) до конечной концентрации 40 единиц активности/мл и 60 мкл раствора 1 М MgCl из расчета на 30 мл гомогената и инкубируют 30 минут, периодически встряхивая. К гомогенату с бензоназой добавляют раствор трипсина (360 мг/мл) до конечной концентрации 0,12 мг/мл и инкубируют еще 30 минут при температуре 37°С.
Обработанный ферментами гомогенат вируссодержащего материала переносят в стерильные центрифужные стаканы и осветляют центрифугированием (центрифуга Avanti J-E, ротор JS-13.1) при 3000 об/мин в течение 10 минут (удаление клеточного дебриса).
Осветленный концентрированный вируссодержащий материал подвергают доочистке от балластных высокомолекулярных клеточных компонентов в режиме двукратного ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы. Для этого в центрифужные пробирки вместимостью 50 мл для ротора JS-13.1 центрифуги Avanti J-E (Beckman Coulter, США) вносят по 5 мл 36%-ного раствора сахарозы. Затем осветленный концентрированный вируссодержащий материал в объеме 30 мл аккуратно наслаивают по стенке центрифужных пробирок с помощью стеклянной пипетки на слой 36%-ной сахарозы. Режим центрифугирования - 80 мин при 12000 об/мин.
Осадки после первого ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы восстанавливают в 15 мл 0,001 М Трис-HCl, рН 9,0, обрабатывают ультразвуком три раза по 20 секунд, с охлаждением после каждой обработки в течение 10 секунд во льду. Частота колебаний наконечника - 22 кГц, амплитуда - 14÷16 мкм, мощность дезинтеграции - 300 Вт. Полученные суспензии объединяют попарно и в объеме 30 мл аккуратно наслаивают по стенке центрифужных пробирок с помощью стеклянной пипетки на 5 мл слой 36%-ной сахарозы. Ультрацентрифугирование проводят на центрифуге Avanti J-E (Beckman Coulter, США), используя ротор JS-13.1, режим центрифугирования - 80 мин при 12000 об/мин.
После второго ультрацентрифугирования в слое 36%-ной сахарозы осадки ресуспендируют в 8 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида (физиологический раствор) и обрабатывают ультразвуком три раза по 20 секунд, с охлаждением после каждой обработки в течение 10 секунд во льду. Частота колебаний наконечника - 22 кГц, амплитуда - 14÷16 мкм, мощность дезинтеграции - 300 Вт.
Очищенный концентрированный вируссодержащий материал для препарата хранят в низкотемпературном морозильнике при температуре минус (40±2)°С.
Этап 3 Получение противоопухолевого средства.
7
Очищенный концентрированный вируссодержащий материл, полученный на этапе 2, разбавляют 0,9%-ным раствором натрия хлорида до концентрации вируса 1,0×10 БОЕ/мл. После тщательного перемешивания контролируют величину рН, которая должна быть 6,5±0,3 (при необходимости рН корректируют разбавленной 1:1 соляной кислотой). В результате получают противоопухолевое средство, содержащее, в 1 мл:
7
штамм W-GMCSF-Lact вируса осповакцины - 1×10 БОЕ
физиологический раствор - до 1 мл.
Противоопухолевое лекарственное средство контролируют по следующим показателям: прозрачность, цветность, рН, механические включения, стерильность, аномальная токсичность, микоплазмы, посторонние агенты, бактериальные эндотоксины, бычий сывороточный альбумин, клеточная ДНК, белок, специфическая активность.
Пример 2.
2
7
Предлагаемое противоопухолевое средство получают аналогично примеру 1, за исключением того, что к полученному гомогенату вируссодержащего материала добавляют фермент бензоназу (42 единицы активности/мл) и MgCl и инкубируют 40 минут, далее к гомогенату с бензоназой добавляют раствор трипсина до конечной концентрации 0,10-мг/мл и инкубируют смесь еще 40 минут при температуре 37°С, из обработанного ферментами гомогената вируссодержащего материала удаляют клеточный дебрис центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут, ультрацентрифугирование в слое 36%-ной сахарозы проводят в течение 60 минут, а очищенный вируссодержащий материл разбавляют фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) до концентрации вируса 2,0×10 БОЕ/мл и получают противоопухолевое лекарственное средство, содержащее, в 1 мм:
7
штамм W-GMCSF-Lact вируса осповакцины - 2×10 БОЕ
фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) - до 1 мл.
Пример 3. Оценка противоопухолевой эффективности заявляемого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины в отношении глиобластомы человека U87-MG in vivo
Исследования проводили с использованием мышей линии SCID, возраст 10-12 недель, разведения SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск, Россия).
2
6
Клетки глиобластомы человека U-87-MG культивировали в среде αМЕМ (GIBCO, США) с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина сульфата, 0,25 мкг/мл амфотерицина в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО. Клетки U87-MG трансплантировали мышам SCID подкожно в область спины в количестве 2×10 клеток на мышь в 0,1 мл физиологического раствора.
3
7
Мыши линии SCID с трансплантированными опухолевыми клетками глиобластомы человека U87-MG по достижению опухолевыми узлами среднего размера 100 мм были рандомно разделены на экспериментальную и контрольную группы по 10 животных в каждой. Мышам экспериментальной группы внутриопухолево вводили лекарственное средство в дозе 1×10 БОЕ/ мышь, 4 инъекции, 1 раз в неделю, а контрольным животным вводили физиологический раствор по аналогичной схеме. Эффективность противоопухолевого действия лекарственного средства оценивали по индексу торможения роста опухоли (ТРО) после курса 4-х внутриопухолевых инъекций.
На Фиг. 1 представлены кривые роста опухолей U87-MG на мышах линии SCID в экспериментальной и контрольной группах. Стрелками отмечены дни, в которые проводили инъекции. (*) - р<0.05. Из данных Фиг. 1 видно, что лекарственное средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины обладает высокой противоопухолевой эффективностью в отношении EGFR-положительной глиобластомы человека U87-MG. Индекс ТРО составил 87%.
Пример 4. Оценка противоопухолевой эффективности заявляемого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины в отношении лекарственно-устойчивой лимфосаркомы мыши RLS in vivo
Исследования проводили с использованием мышей линии СВА, 10-12 недель, разведения вивария ИХБФМ СО РАН (г.Новосибирск, Россия).
2
Клетки лимфосаркомы мыши линии RLS культивировали в среде IMDM (SIGMA, Великобритания) с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина сульфата, 0,25 мкг/мл амфотерицина в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Клетки культивировали при 37°С в атмосфере 5% СО.
Клетки RLS трансплантировали мышам линии СВА внутримышечно в заднюю лапу в количестве 1500 клеток на мышь в 0,1 мл физиологического раствора. Лимфосаркома мыши RLS является моделью лекарственно-устойчивой опухоли и характеризуется устойчивостью к циклофосфану (14). Индукция опухолевого роста RLS происходит при внутрибрюшинной или внутримышечной (в бедро) трансплантации опухоли. Внутримышечное введение опухолевых клеток приводит к развитию опухоли между мышечными волокнами, что позволяет моделировать внутриопухолевое введение препарата при введении лекарственного средства в бедро экспериментальным животным.
7
Мыши с трансплантированными внутримышечно в ногу клетками резистентной к циклофосфамиду лимфосаркомы RLS были рандомно разделены на экспериментальную и контрольную группы по 10 животных в каждой. Через 7 дней после трансплантации опухолевых клеток мышам экспериментальной группы внутриопухолево (в мышцу бедра) вводили предлагаемое средство в дозе 1×10 БОЕ/мышь, курсом 3 инъекции, 1 раз в неделю, а контрольным животным аналогично вводили физиологический раствор. Курс введения лекарственного средства был ограничен 3-мя инъекциями, поскольку при продлении эксперимента еще на одну неделю размер опухолей животных контрольной группы не позволял животным подходить к кормушке. Продолжение эксперимента в данном случае противоречит нормам гуманного отношения к животным.
Эффективность противоопухолевого действия лекарственного средства оценивали по индексу торможения роста опухоли (ТРО). Для вычисления индекса ТРО измеряли объем лапы с опухолью у животных экспериментальной и контрольной групп.
На Фиг. 2 представлены кривые изменения объема лапы с опухолью у животных экспериментальной и контрольной групп. Стрелками отмечены дни, в которые проводили инъекции. (*) - р<0.05. Из данных Фиг. 2 видно, что лекарственное средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины обладает высокой противоопухолевой эффективностью в отношении лекарственно-устойчивой опухоли RLS (лимфосаркомы) мыши. Индекс ТРО составил 84%.
Пример 5. Оценка противоопухолевой эффективности заявляемого средства на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины в отношении развившейся опухоли аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231 in vivo
Исследования проводили с использованием мышей линии SCID, возраст 10-12 недель, разведения SPF-вивария Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск, Россия).
Клетки аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231 культивировали в среде L-15 Лейбовица (SIGMA, Великобритания) с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина сульфата, 0,25 мкг/мл амфотерицина в присутствии 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (GIBCO, США). Клетки MDA-MB-231 трансплантировали мышам SCID подкожно в область спины в 0,1 мл физиологического раствора с добавлением матригеля (Matrigel™, BD Bioscience, США) в объемном соотношении суспензия клеток : матригель 1:1.
3
6
6
Поскольку задачей исследования было изучение действия лекарственного средства на развившуюся опухоль (≥500 мм), мышей линии SCID предварительно делили на экспериментальную и контрольную группы; животным экспериментальной группы подкожно трансплантировали в 3 раза больше опухолевых клеток (4,5×10 клеток), чем животным контрольной группы (1,5×10). Такая постановка эксперимента необходима, поскольку при трансплантации одинакового количества опухолевых клеток и при отсутствии лечения животные контрольной группы не доживают до окончания эксперимента.
7
3
При исследовании противоопухолевой эффективности заявляемого средства в отношении развившейся опухоли целесообразно увеличить суммарную дозу препарата. Курс терапии состоял из 6-ти ежедневных инъекций вируса в дозе 1×10 БОЕ/мышь. Лечение начинали по достижении объема опухоли в экспериментальной группе >500 мм.
Эффективность противоопухолевой терапии лекарственным средством оценивали по индексу торможения роста опухоли (ТРО) после окончания курса лечения.
На Фиг. 3 (А) представлены кривые роста опухолей у животных экспериментальной и контрольной групп. Скобкой со стрелками обозначен период введения препарата. Из данных Фиг. 3 (А) видно, что предлагаемое противоопухолевое средство обеспечивает эффективное и достоверное уменьшение размера развившейся опухоли MDA-MB-231 по сравнению с исходными размерами опухоли (на 42%).
Поскольку разница в исходных размерах опухолей в контрольной и экспериментальной группах не позволяет напрямую корректно рассчитать индекс ТРО, полученные данные трансформировали в значения изменения роста опухоли по отношению к исходному размеру опухоли в (%).
На Фиг. 3 (Б) представлены кривые роста опухолей у животных экспериментальной и контрольной групп. Скобкой со стрелками обозначен период введения препарата. Данные представлены в процентах по отношению к размеру опухолей на момент начала лечения. Из данных Фиг. 3 (Б) видно, что противоопухолевое средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины обладает высокой противоопухолевой эффективностью в отношении развившейся опухоли аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231.
Для развившейся опухоли индекс ТРО рассчитывали по формуле:
контроль
опыт
контроль
ТРО=((%V - %V)/%V) × 100%, где
контроль
%V - процент изменения размера опухоли в финальной точке эксперимента относительно начальной точки эксперимента (животные контрольной группы);
опыт
%V - процент изменения размера опухоли в финальной точке эксперимента относительно начальной точки эксперимента (животные экспериментальной группы);
Согласно полученным данным индекс ТРО для развившейся опухоли составил 77,6%.
Данные экспериментов, описанные в примерах 3-5, свидетельствуют о том» что заявляемое противоопухолевое средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact вируса осповакцины обладает высокой противоопухолевой эффективностью в отношении солидных опухолей человека и животных.
Предлагаемое средство на основе рекомбинантного штамма VV-GMCSF-Lact может быть использовано в качестве нового вирусного препарата с противоопухолевой и антиметастатической активностью и низкой токсичностью для терапии солидных опухолей человека и животных.
Источники информации
1. Lichty BD, Breitbach CJ, Stojdl DF, Bell JC. Going viral with cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 2014 Aug; 14(8):559-67. doi: 10.1038/nrc3770.
2. Tsun A, Miao XN, Wang CM, Yu DC. Oncolytic Immunotherapy for Treatment of Cancer Adv Exp. Med. Biol. 2016; 909:241-83. doi: 10.1007/978-94-017-7555-7_5.
3. Raja J, Ludwig JM, Gettinger SN, Schalper KA, Kim HS. Oncolytic virus immunotherapy: future prospects for oncology. J. Immunother. Cancer. 2018 Dec. 4;6(1):140. doi: 10.1186/s40425-018-0458-z.
4. Патент RU 2667432 C1, опубл. 20.06.2016.
5. Патент RU 2496873 C1, опубл. 27.10.2013.
6. Патент RU 2519763 C9, опубл. 20.06.2014.
7. Jonathan G. Pol, Sarah , Samuel T. Workenhe, et. al. Trial Watch: Oncolytic viro-immunotherapy of hematologic and solid tumors, Oncoimmunology, 2018, Vol. 7, No. 12, el 503032. doi.org/10.1080/2162402X.2018.1503032.
8. Lauer UM, Schell M, Beil J, et. al, Phase I Study of Oncolytic Vaccinia Virus GL-ONC1 in Patients with Peritoneal Carcinomatosis. Clin. Cancer Res. 2018 Sep. 15; 24(18):4388-4398. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-0244.
9. Патент US 2017298324 A1, опубл. 19.10.2017.
10. Патент US 20140162342 A1, опубл. 12.06.2014.
11. Koval OA, Tkachenko AV, Fomin AS, Semenov DV, Nushtaeva AA, Kuligina EV, Zavjalov EL, Richter VA. Lactaptin induces p53-independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts. PLoS One. 2014. Apr. 7;9(4):e93921. doi: 10.1371/journal.pone.0093921.
12. Патент RU 2604187 C1, опубл. 10.12.2016.
13. Whilding L., Archibald K., Kulbe H. et al. Vaccinia virus induces programmed necrosis in ovarian cancer cells // Mol. Ther. - 2013. - V. 11. - N 45. - P. 2074-2086. doi: 10.1038/mt.2013.195.
14. Mironova NL, Petrushanko IY, Patutina OA et al. Ribonuclease binase inhibits primary tumor growth and metastases via apoptosis induction in tumor cells., Cell Cycle. 2013. Jul. 1;12(13):2120-31. doi: 10.4161/cc.25164.