СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЖИВЫХ И МЕРТВЫХ ОРГАНИЗМОВ МЕЗОЗООПЛАНКТОНА В МОРСКИХ ПРОБАХ
METHOD FOR IDENTIFYING LIVING AND DEAD MESOZOOPLANKTON IN SEAWATER SAMPLES

Изобретение относится к гидробиологии и может быть использовано для дифференцированного учета живых и мертвых организмов в морских пробах.
Количественное соотношение живых и мёртвых организмов в пробах мезозоопланктона - один из базовых показателей смертности сообщества, который может быть использован при изучении закономерностей функционирования морских экосистем, их биопродуктивности и круговорота веществ, а также для оценки экологического состояния акваторий.
Известны два основных методических подхода для идентификации живых и мёртвых организмов зоопланктона: визуальная оценка и окрашивание. При визуальном анализе оценивают внешнее и внутреннее состояние организма на фиксированном материале, другими словами, выявляют наличие или отсутствие признаков разложения. Этот подход начали применять ещё в 30-х годах XX в. и продолжают использовать в настоящее время [1,2], однако, он не лишен серьёзных недостатков: во-первых, - исследователю необходим большой опыт работы с зоопланктоном; во-вторых, - достоверное выявление признаков разложения возможно лишь спустя 2-3 часа после гибели организма (в некоторых случаях и позднее), что неминуемо приводит к недооценке доли мёртвых особей в пробе.
Известен способ, получивший свое развитие в 70-е годы прошлого века, основанный на окрашивании планктона различными красителями [3]. Главный недостаток этого подхода заключается в том, что степень окрашенности организмов в природных пробах может сильно варьировать. Следовательно, вывод исследователя о принадлежности организма с «сомнительной» окраской к той или иной категории носит субъективный характер. Если же численность таких организмов в пробе велика, достоверные и воспроизводимые результаты получить невозможно.
В основу изобретения «Способ идентификации живых и мёртвых организмов мезозоопланктона в морских пробах» поставлена задача получения достоверных, объективных и воспроизводимых результатов путем классификации организмов по степени окрашенности.
Поставленная задача решается тем, что в способе, осуществляя под микроскопом визуальную оценку интенсивности окраски особей, одновременно производят их микрофотосъёмку с настройками фотокамеры в ручном режиме, сохраняя эти настройки неизменными в течение фотосъемки, по крайней мере, одной пробы, после чего для полученных изображений выполняют измерение средних для каждой особи цветовых и яркостных характеристик, применяя редактор растровой графики, например программный пакет Adobe Photoshop, и классифицируют полученные значения, применяя дискриминантный анализ.
Между перечисленными существенными признаками и ожидаемым техническим эффектом присутствует следующая причинно-следственная связь. Независимо от того, какой краситель используется для маркировки живых/мёртвых организмов, основополагающим является наличие или отсутствие цвета и/или яркости. Цветовые (тоновые) и яркостные характеристики каждой из анализируемых особей, представленные в цифровом виде, позволяют применить дискриминантный анализ для объективного и достоверного разделения всей исследуемой популяции на два класса - живых и мёртвых особей.
Изобретение поясняется иллюстрациями. На фиг. 1 представлены Цифровые изображения копепод, окрашенных флуоресцеин диацетатом - FDA (А, Б) и нейтральным красным - НК (В, Γ)· А и В - живые особи, Б и Г - мёртвые особи. Пунктиром выделена область наиболее интенсивной окраски - цефалоторакс; на фиг. 2 - Измерение осредненных цветовых характеристик особи копеподы, окрашенной НК, с применением палитры цветов редактора Adobe Photoshop CS2; на фиг. 3 - Выявление кластеров живых и мёртвых организмов после их окраски FDA (А) и НК (Б). Данные получены для живой и убитой температурным шоком культуры копепод (Calanipeda aquae dulcís). На фиг. 4 - Формат данных в пакете Statistica 5.0; на фиг. 5 - Основные результаты анализа; на фиг. 6 - Кластеры точек, соответствующие классам организмов L (живые, ), D (мёртвые, ∇) и Q (сомнительные, +), на 2-параметрических диаграммах с разными независимыми переменными: А - зелёный (Green) и синий (Blue); Б - зелёный и оттенок (Hue); В - зелёный и красный (Red). На диаграмме В представлены результаты классификации особей класса Q с помощью дискриминантного анализа: - отнесены к живым; - отнесены к мёртвым. Стрелкой указан единственный «выброс» класса D; пунктирная прямая - условная граница между классами L и D; на фиг. 7 - Фрагмент таблицы апостериорных вероятностей принадлежности особей к тому или иному классу.
Способ реализуется следующим образом:
1. Отбор пробы мезозоопланктона и её окраска для идентификации живых/мёртвых организмов - осуществляются в соответствии с методами, предусмотренными для этих целей.
2. Исследование репрезентативной выборки организмов под микроскопом:
а) отнесение каждой из особей к одному из трёх классов по визуальным признакам (интенсивности окраски):
- «Живые» (L);
- «Мёртвые» (D);
- «Сомнительные» (Q).
Визуальная оценка интенсивности окраски особей производится в поле зрения микроскопа в соответствии с методикой применения красителя. Каждую особь относят к одному из двух классов - «Живые» (L) или «Мёртвые» (D). Если это затруднительно или невозможно, особь относят к классу «Сомнительные» (Q).
б) получение цифровых изображений каждой из особей с помощью микрофотографирования.
Микрофотосъёмка окрашенных организмов производится цифровой фотокамерой в цветном режиме. Автоматический режим камеры (автоматический выбор экспозиции) не рекомендуется использовать, т.к. если в поле зрения попадают только яркие (например, живые организмы, окрашенные FDA) или только тёмные объекты (например, близкие по яркости к темному фону мёртвые организмы), то автокоррекция изображений, производимая фотокамерой, будет искажать цветовые и яркостные (контраст объекта с фоном) характеристики объектов, и, как следствие этого, сопоставление таких изображений будет невозможным. Рекомендуется выбрать настройки фотокамеры в ручном режиме таким образом, чтобы избежать, во-первых, - пересветов на наиболее ярких объектах (т.е. потери информации о яркости и цвете) и, во-вторых, - сливания объектов с фоном (например, неокрашенные объекты на тёмном поле люминесцентного микроскопа), и сохранять эти настройки неизменными в течение фотосъемки, по крайней мере, одной пробы. Это гарантия того, что изображения как живых, так и мёртвых организмов одной и той же пробы получены в одинаковых условиях и, следовательно, могут быть использованы для дальнейшего анализа. Чем реже приходится изменять настройки фотокамеры, адаптируя их к каждому конкретному красителю, виду организмов или серии проб, тем выше достоверность получаемых результатов. Вместе с тем, индивидуальные особенности фотокамер, которыми пользуются разные исследователи (отличия в уровне шума, смещение в балансе белого и др.), не могут отразиться на качестве получаемых результатов. Это означает, что анализ одной и той же пробы зоопланктона, проведенный на разном оборудовании, но в соответствии с предлагаемым способом, даст близкие результаты оценки соотношения живых и мёртвых организмов в пробе.
3. Измерение средних для каждой особи цветовых и яркостных характеристик (цветовые модели HSB, RGB, CMYK, LAB) в графическом редакторе.
В качестве программного обеспечения для дальнейшей работы с изображениями применяют любой редактор растровой графики, который позволяет определять основные цветовые и яркостные характеристики любого из пикселей изображения в соответствии с тремя цветовыми моделями: HSB (Н- цветовой тон, S - насыщенность, В - яркость), RGB (R - красный, G - зелёный, В - синий) и CMYK (С - циановый, M - пурпурный, Y - жёлтый, K - черный). Для этих целей можно использовать, например, программный пакет Adobe Photoshop или ряд бесплатных графических редакторов, которые свободно распространяются в Интернете, например, Eyedropper 4.0 beta, Pixel Pick 1.5, SI ColorPicker 1.0 и др.
Для каждой анализируемой особи получают один набор значений характеристик HSB, поэтому важное значение имеют локализация и способ отбора пробы цвета в пределах границ изображения организма. Отбор должен производиться в зонах с наибольшей интенсивностью окраски (например, у копепод, окрашенных FDA или нейтральным красным, это цефалоторакс; выделен на фиг. 1, А и В). У неокрашенных организмов используется та же зона (фиг. 1, Б и Г). Если изображение интересующей исследователя области неоднородно по цвету и яркости, имеет пятна и/или зернистость (как, например, это часто бывает у копепод, фиг. 1, В), рекомендуется сначала выделять всю окрашенную область (инструмент «лассо», Lasso Tool, в Adobe Photoshop) и осреднять её яркостные и цветовые характеристики, а потом уже производить их измерение.
4. Сведение полученных данных в таблицу в формате, пригодном для дискриминантного анализа.
По завершении измерений цветовых характеристик всех особей пробы (см. фиг. 2), полученные цифровые данные сводятся в таблицу, в которой каждая строка соответствует одной особи, количество строк равно количеству особей. Каждая особь, отнесенная к одному из классов, I, D или Q (категориальная переменная CLASS), характеризуется цветовыми переменными, максимальное число которых может составлять 13 (RGB, HSB, CMYK, LAB). Оптимальный путь - ограничиться 6-ю переменными моделей RGB и HSB. Для работы с каждым конкретным красителем, как правило, требуется небольшой набор переменных. Например, при окраске зоопланктона красителем FDA, имеющим флуоресценцию зеленого цвета, достаточно измерить насыщенность и яркость (соответственно, S и В из HSB). Уменьшить размерность данных (т.е. количество анализируемых переменных) можно после того, как будет ясно, какие именно переменные позволяют наиболее эффективно выявлять классы живых и мёртвых организмов. На 2-параметрических диаграммах последние будут выглядеть как хорошо отличимые кластеры точек (фиг. 3, А). Если кластеры L и D не могут быть выявлены ни на одной из диаграмм и, как следствие этого, затруднён выбор переменных, значение которых велико для классификации организмов, уменьшение размерности данных производится с помощью дискриминантного анализа (см. ниже).
5. Применение дискриминантного анализа для:
а) уменьшения размерности данных (пошаговый анализ с включением переменных);
б) построения классификации объектов, используя классы L и D в качестве обучающей выборки;
в) отнесения каждого из организмов класса Q к классам L или D в соответствии с дискриминантной моделью.
Классификация организмов со слабо выраженной окраской. В природных пробах обычно присутствует большое число организмов, интенсивность окраски которых невелика (класс Q), и которые трудно отнести к живым или мёртвым с помощью визуального анализа. На диаграммах они образуют облако точек, которое накладывается на кластеры L и D (см. ниже пример), что затрудняет выбор цветовых переменных, которые бы обеспечили объективную и достоверную классификацию. Для решения обеих проблем мы предлагаем использовать дискриминантный анализ - эффективный метод построения классификации с помощью обучающей выборки. Последняя должна включать организмы, которые были без затруднений отнесены исследователем к классам L или D в ходе микроскопирования пробы. В сводной таблице данных информация о принадлежности организма к тому или иному классу содержится в категориальной переменной CLASS. В дискриминантом анализе её используют в качестве группирующей зависимой переменной (grouping dependent variable), а цветовые характеристики (Hue, Saturation, Brightness, Red, Green и др.), измеренные в метрической шкале, считают независимыми переменными (independent variables). Уменьшение размерности данных может производиться в пошаговом анализе дискриминантных функций. На каждом шаге просматриваются все независимые переменные, и находится та из них, которая вносит наибольший вклад в различие между классами. Модель дискриминантного анализа, которая строится на основе обучающей выборки, позволяет установить с определённой достоверностью принадлежность организмов со спорной окраской (класс Q) к классам L или D. Иллюстрация применения дискриминантного анализа к решению подобного рода задачи приводится в Примере.
Пример.
Определение доли живых копепод в морском зоопланктоне после окраски нейтральным красным (НК).
Пробы морского зоопланктона отбирали в прибрежных водах г. Севастополя (Чёрное море) и окрашивали НК в соответствии со стандартными методами. Живые организмы окрашенные НК, приобретали красный цвет, в то время как мёртвые оставались бледно жёлтыми. Фотосъёмку организмов производили с помощью микроскопа Nikon Eclipse TS100-F, оборудованного камерой Ikegami ICD-848P, в световом (светлое и темное поле для НК) и люминесцентном режимах (набор светофильтров для возбуждения в синей области спектра для FDA). Осреднение и измерение цветовых переменных производили в графическом редакторе Adobe Photoshop CS2. Анализ результатов был затруднен присутствием в пробе слабо окрашенных организмов (19 из 108 исследованных особей копепод), поэтому требовалось применение дискриминантного анализа (StatSoft 8ΤΑΉ8ΤΙΟΑ 5.0). Для построения дискриминантной модели использовали 5 независимых переменных (HSB, RGB), а классы «Живые» (L) и «Мёртвые» (D) - в качестве обучающей выборки. Переменная Brightness была исключена из анализа, как малозначимая для классификации (формат данных показан на фиг. 4). Полученная дискриминантная модель является статистически значимой (р<0,001). Информация о вкладе каждой независимой переменной в различение классов представлена на фиг. 5. Только две переменные Green и Red оказались статистически значимыми (p<0,01) и вносили решающий вклад в различение классов. Это отражают 2-параметрические диаграммы, в которых одна из переменных - зелёный цвет Green. Если вторая переменная - синий цвет Blue (фиг. 6, А), значение которого в дискриминантной модели невелико (p=0,84), то хорошо заметно перекрывание кластеров L и D. Цветовой оттенок Hue вносил больший вклад в классификацию (p=0,26) и совместно с Green давал лучшую обособленность кластеров (фиг. 6, Б). Применение обеих статистически значимых переменных Green и Red на диаграмме фиг. 6, В, позволило максимизировать дистанцию между кластерами L и D.
Модель классифицировала все организмы со спорной окраской, отнеся их с некоторой долей вероятности к одному из классов - L (13 особей) или D (6 особей). Графическое представление этой классификации - на фиг. 6, В. Фрагмент таблицы апостериорных вероятностей принадлежности организмов к классам показан на фиг. 7. Лишь одна особь из обучающей выборки была отмаркирована в таблице, как классифицированная неверно (на фиг. 6, В она обозначена стрелкой). Дискриминантная модель отнесла её к классу L, хотя по визуальным признакам она была определена в класс D. В данном случае копепода была хорошо окрашена (что отражено в её цветовых характеристиках), но отнесена исследователем к мёртвым, поскольку имела визуальные признаки разложения. Дискриминантный анализ выявил это противоречие.
Заявляемый способ обладает рядом преимуществ:
- способ позволяет избежать субъективности в классификации организмов по характеру их окрашенности, тем самым увеличивая точность и достоверность результатов;
- способ универсален, поскольку он может быть применён для решения иных исследовательских задач, в которых требуется объективная классификация организмов по степени окрашенности.
Источники информации:
1. Кастальская-Карзинкина М.А. Методика определения живых и отмерших компонентов планктона на фиксированном материале // Труды лимнологической станции в Косине. - 1935. - № 19. - С. 91 - 103.
2. Губарева Е.С., Светличный Л.С., Ишинибилир М., Бельмонте Г. Распределение живого и мёртвого мезозоопланктона в прибосфорских районах Чёрного и Мраморного морей: солёностная толерантность Acartia clausi и A. tonsa II Морской экологический журнал. - 2008. - Т. 7, № 4. - С. 27 - 39.
3. Dressel D.M., Heinle D.R., Grote М.С. Vital starting to sort dead and live copepods // Chesapeake Sci. - 1972. - V. 13. - P. 156 - 159.