Способ выявления первично-рефрактерной формы множественной миеломы в дебюте заболевания
METHOD FOR DETECTION OF PRIMARY REFRACTORY  FORM OF MULTIPLE MYELOMA AT THE DISEASE ONSET

Изобретение относится к медицине, а именно к онкогематологии, и может быть использовано для прогнозирования первично-рефрактерной формы множественной миеломы (ММ) в дебюте заболевания на основании обнаружения определенных генотипов гена интерлейкина-10 (IL10).
В настоящее время в клиническую практику внедрены протоколы лечения ММ с использованием новых лекарственных препаратов, высокодозной химотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток, что позволило значительно повысить общую выживаемость и выживаемость без прогрессирования этих пациентов [1-4]. Несмотря на достигнутые успехи в лечении ММ у подавляющего числа больных развиваются рецидивы заболевания или диагностируется устойчивость к проводимой терапии [1, 5-9]. Механизмы возникновения резистентности ММ к лекарственным препаратам до конца не изучены, обсуждаются фармакокинетические, метаболические, цитогенетические, молекулярно-генетические, эпигенетические, клеточные (мембранные, ядерные), апоптотические и др. факторы, с которыми связывают истинную первичную резистентность или снижение чувствительности опухолевых клеток к лекарственным препаратам в процессе лечения при повторных курсах терапии (вторичная резистентность) [1, 2, 4, 5, 8].
Под термином «первичная рефрактерность» принято понимать отсутствие ответа на индукционную терапию, прогрессирование заболевания на последующих режимах противоопухолевого лечения [1, 10, 11].
Исследования показали, что нарушение регуляции сигнальных путей, связанных с выживанием и пролиферацией клеток, а именно, механизмов репарации ДНК, апоптоза, регуляции клеточного цикла, структуры протеинов, участвующих в метаболизме и относящихся к мишеням лекарственных препаратов, способствовали развитию лекарственной устойчивости опухолевых клеток у больных ММ. В частности, гиперэкспрессия онкогенов - рецептора 3 фактора роста фибробластов и с-myc ассоциировалась с резистентностью к дексаметазону у пациентов с ММ, в то время как нарушение регуляции мембранного транспортерного белка Р-гликопротеина (P-gp), которое может быть вызвано применением антрациклинов и алкилирующих агентов - с устойчивостью плазмоцитов при ММ к стандартной химиотерапии. Кроме того, показано, что точечные мутации гена PSMB5, кодирующего субъединицу β5 протеасомы, ассоциированы с резистентностью клеток ММ к бортезомибу, вследствие нарушения его пространственного расположения в PI-связывающем кармане [4, 6-8, 12-14].
Как правило, miRNAs (microRNAs - микроРНК) подавляют свои мишени РНК-мессенджеры (мРНК) путем связывания с 3'-нетранслируемыми областями (untraslated regions - UTRs) и вовлекают РНК-индуцированный комплекс сайленсинга, который ингибирует трансляцию и усиливает деградацию мРНК. Считается, что более 60% генов находятся под воздействием miRNAs, свидетельствуя об их решающей роли в регуляции биологических функций клеток. Исследования разнообразия miRNAs и их индивидуальных функций при ММ выявили их участие в патогенезе ММ. Установлена связь между экспрессией miRNAs и генетическими подгруппами ММ, что обозначило miRNAs как потенциальные диагностические, прогностические биомаркеры ММ и мишени для терапии. В последние годы проводятся исследования по изучению miRNAs в качестве маркеров развития лекарственной устойчивости при различных злокачественных новообразованиях. Предполагается, что miRNAs могут стимулировать или ингибировать ответ на лекарственные препараты, в зависимости от генов-мишеней miRNAs, усиливающих или ослабляющих терапевтический эффект. Поэтому при злокачественных новообразованиях, уровень экспрессии miRNAs, является показателем, свидетельствующим о развитии резистентности к лекарственным препаратам или прогрессировании опухолевого роста. В этом контексте мишени miRNAs, а также нарушение регуляции экспрессии miRNAs являются ключевыми факторами, лежащими в основе miRNA-опосредованной лекарственной устойчивости [4, 6, 9, 12, 14].
Первичную рефрактерность к терапии при ММ связывают с изменением регуляции генов при наличии ряда цитогенетических аберраций, таких как транслокации t(4;14), t(14;16), t(14;20) и делеция локуса ТР53 на хромосоме 17. Однако первичная резистентность может наблюдаться и при отсутствии этих нарушений [1, 4, 9, 12, 14-16]. Применение высокопроизводительного массового параллельного секвенирования (NGS - next generation sequencing) при ММ расширило понимание гетерогенного ландшафта генетических изменений при данном заболевании и способствовало выявлению множественных мутаций молекул сигнальных путей, имеющих диагностическое и терапевтическое значение, а также свидетельствующих о клональной эволюции ММ. Использование профилирования экспрессии генов выявило около 20 различных вариантов ММ, фенотипически отличающихся ответом на лечение и характером течения заболевания. Так, найдены мутации генов KRAS, NRAS, FAM46C, ТР53, DIS3, BRAF, TRAF3, CYLD, RB1 и PRDM1, имеющих отношение к развитию дифференцированного ответа на терапию, которые могут быть использованы для разработки новых лекарственных препаратов и персонифицированных терапевтических опций [7, 11, 13, 14, 17].
Учитывая значительную цитогенетическую нестабильность и молекулярно-генетическую гетерогенность ММ, первичная резистентность ассоциируется с доминированием химиорезистентного опухолевого клона уже в дебюте заболевания [1, 5]. Проблема лечения пациентов с первично-рефрактерной формой ММ заключается в том, что течение заболевания расценивается как быстро прогрессирующее, сопровождаемое быстрым нарастанием опухолевой массы и требующее назначение программ терапии второй и последующих линий [1, 4, 9, 11, 13]. При неблагоприятных формах течения ММ применяются различные способы: терапия «спасения», использование ингибиторов контрольных точек, гистоацетилазы, белка теплового шока, моноклональных антител, адоптивной клеточной терапии [2, 4, 10, 11, 16-18].
Необходимым условием развития ММ считается взаимодействие клональных плазматических клеток с компонентами костномозгового стромального микроокружения, которые являются источником различных факторов роста, включая цитокины. Они обеспечивают рост опухолевых клеток, способствуют их выживанию, дифференцировке и экспансии [1,4, 12]. Полиморфизм их генов может быть вовлечен в прогрессирование ММ путем нарушения баланса между про- и противовоспалительными цитокинами при наличии мутаций генов цитокинов и хемокинов [7, 8, 15, 19, 20].
Одним таких цитокинов является интерлейкин-10 (IL-10). Он продуцируется, в основном CD4+ Т-лимфоцитами-хелперами, а также некоторыми активированными В-клетками и макрофагами. IL-10 ингибирует функции Т-клеток и антигенпрезентирующих клеток путем подавления экспрессии провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли альфа, IL-1, -6, -8, -12, а также HLA II класса и В7 соответственно [4, 8, 15, 21-24]. В дополнение к своим супрессивным свойствам, IL-10 повышает выживаемость, пролиферацию, дифференцировку В-лимфоцитов и выработку ими антител [21-24]. Также показано, что IL-10 влияет на рост и дифференцировку обычных плазматических клеток. При ММ наблюдается повышение сывороточного уровня этого цитокина, который выступает в качестве фактора роста трансформированных плазматических клеток через индукцию аукринной петли онкостатина М и ассоциирован с прогрессирующим течением заболевания [6, 20,22, 25].
В свою очередь, секреция цитокинов находится под жестким генетическим контролем, опосредуемым структурными особенностями, кодируемых генов. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP - single nucleotide polymorphisms), расположенные в регуляторных участках генов, относятся к наименее изученной функциональной группе SNP. Однако, изменяя уровень экспрессии генов, они играют значимую роль в развитии различных патологических состояний человека, включая злокачественные новообразования [12, 16, 23, 24].
Ген IL10 высоко полиморфен, картирован на 1 хромосоме (участок 1q31-q32), составляет по протяженности около 5,2 килобаз, включает пять экзонов. В гене насчитывается 194 полиморфизма, однако в области промотора обнаружены три наиболее частые и наиболее значимые точечные мутации: -1082 (G/A), -819 (С/Т) и -592 (С/А). Кроме того, там же описаны два микросателлитных полиморфизма (IL10.G и IL10.R). Биаллельный полиморфизм G-1082A (rs1800896) локализован на участке узнавания транскрипционного фактора Ets, заключается в замене гуанина (G) на аденин (А), влияет на экспрессию гена и на продукцию цитокина. Показано, что аллель А и гомозиготный генотип АА коррелирует со снижением продукции IL-10 при стимуляции клеток in vitro и in vivo и низкой концентрации цитокина в плазме крови и более выраженным воспалительным ответом [19-22, 25, 26] и является значимым предиктором короткой продолжительности выживаемости без прогрессирования и общей выживаемости пациентов с ММ [19, 20].
В ряде исследований была найдена корреляция между мутационным статусом гена IL10 и повышенным риском развития неходжкинских лимфом, в частности, диффузной В-крупноклеточной лимфомы [21, 26, 27]. С другой стороны, при обследовании больных ММ, моноклональной гаммапатией неясного значения и здоровых лиц выявлено, что частота генотипов и аллелей в положении - 1082 гена IL10 не отличалась. Кроме того, не было выявлено различий в частоте распределения генотипов в зависимости от возраста начала заболевания, пола, стадии ММ при постановке диагноза, уровня М-протеина или типа секретируемой легкой цепи [22].
Мультивариантный анализ определения полиморфизма генов семейства интерлейкинов в качестве прогностического фактора выживаемости пациентов с ММ выявил, что полиморфизм ряда локусов связан со статистически значимым повышением риска развития ММ, неблагоприятным прогнозом течения заболевания и с короткой выживаемостью больных ММ [19].
Описано несколько способов прогнозирования течения ММ. Так, был предложен способ прогнозирования безрецидивной выживаемости у больных ММ после проведения трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (аутоТГСК) на основании относительного содержания CD45+CD19+ В-лимфоцитов в продукте афереза больного перед трансплантацией. При их числе более 2,5% прогнозируют более короткий, а при их количестве менее 2,5% - более продолжительный период безрецидивной выживаемости после аутоТГСК [28]. К недостаткам данного способа относится определение прогноза ответа на лечение на стадии консолидации ремиссии, а не в дебюте заболевания, а также не включает пациентов с неудачами в индукционной терапии и не учитывает генетическую гетерогенность ММ.
2
Известен способ прогнозирования характера течения ММ на основании балльной оценки сывороточных концентраций β-микроглобулина и креатинина, женского пола пациента, IgA иммунохимического варианта ММ. На основании полученных сумм баллов авторами выделены три группы риска: низкого, промежуточного и высокого с соответствующей дифференциальной продолжительностью общей выживаемости [29]. К недостаткам данного способа можно отнести отсутствие учета эффекта и характера проводимой в дальнейшем терапии, генетической гетерогенности ММ и невозможность выделить группу пациентов, не ответивших на индукционную терапию.
Прототипом использования молекулярно-генетических маркеров в качестве предикторов течения ММ является работа, в которой авторами рассматривался уровень экспрессии порядка 70 генов в CD138+ плазматических клетках у 351 пациента с впервые выявленной ММ. С короткой выживаемостью больных была ассоциирована высокая экспрессия 51 гена и низкая экспрессия остальных 19 генов. Отмечено, что в группе пациентов с ММ низкого риска профили экспрессии генов были схожи с аналогичными при моноклональной гаммапатии неясного значения и у здоровых лиц. В то же время, при ММ высокого риска выявлена экспрессия генов, характерная для клеточных линий миеломы человека [30]. Однако данный способ требует предварительной селекции CD138+ плазматических клеток, создания ДНК-микрочипов, весьма технически сложен, использует крайне дорогостоящее оборудование и реактивы. Кроме того, он не дает представления о возможности его использования для прогнозирования ответа на терапию при впервые выявленной ММ.
Известен способ прогнозирования эффективности терапии ММ на основании HLA-гистотипирования больных ММ после проведения высокодозной химиотерапии и трансплантации аутологичных гемопоэтических стволовых клеток [28, 31]. При наличии аллелей HLA-Cw*06, HLA-DQA1*0101 в генотипе пациента прогнозируют благоприятное течение заболевания, при обнаружении гомозиготных вариантов генов HLA-B*, HLA-Cw*, HLA-DQA1* и/или аллеля HLA-DRB1*07 прогнозируют низкий ответ на проводимую терапию [28]. Недостатками данного способа являются относительная дороговизна исследования, низкая чувствительность, специфичность и рекомендованное использование результатов изобретения в посттрансплантационном периоде, т.е. после весьма успешной индукционной терапии.
Существует способ прогнозирования течения множественной миеломы на основании генотипирования полиморфизма гена IL6 в сайте 174 G/C методом полимеразной цепной реакции с последующей рестрикцией. На основании обнаружения у пациента в начале заболевания генотипа СС прогнозируют медленно-прогрессирующее течение ММ [32]. Недостатками данного метода является необходимость заказа или самостоятельного синтеза специфических последовательностей олигонуклеотидных праймеров, большой объем исходного материла для выделения ДНК (8 мл периферической венозной крови), применение рестрикции полученного ПЦР-продукта, длительность выполнения анализа (более суток), невозможность установления группы больных, резистентных к индукционной терапии, небольшая численность группы обследованных больных ММ (47 человек).
Известен способ прогнозирования выживаемости больных ММ на основании результатов генотипирования полимофизма С3435Т промоторной области гена множественной лекарственной устойчивости MDR1. При выявлении генотипа СТ указанного гена прогнозируют благоприятное течение заболевания, связанное с отсутствием токсического поражения внутренних органов [33]. Этот способ также как и предыдущий, имеет ряд недостатков: необходимость заказа или самостоятельного синтеза специфических последовательностей олигонуклеотидных праймеров, большой объем исходного материла для выделения ДНК (8 мл периферической венозной крови), применение рестрикции полученного ПЦР-продукта, длительность выполнения анализа (более суток), невозможность установления группы больных, резистентных к индукционной терапии, небольшую численность группы обследованных больных ММ (66 человек). Не совсем корректным считается вывод авторов, что «благоприятное течение ММ было связано с отсутствием токсического поражения внутренних органов», что не соответствует общепринятым в гематологии критериям благоприятного течения заболевания (стадия заболевания, цитогенетические аберрации, глубина ответа на терапию и пр.).
Ни один из вышеупомянутых способов не касается прогнозирования первично-рефрактерной формы ММ в дебюте заболевания на основании анализа молекулярно-генетических маркеров.
Анализ литературы показал, что ассоциация полиморфизма гена IL10 с развитием первично-рефрактерной формы ММ в дебюте заболевания ранее не исследовалась. Таким образом, предлагаемый способ прогнозирования на основании анализа SNP гена IL10 не имеет прототипа, обладает критерием «новизна» и, по совокупности отличительных действий от аналогов, присутствует критерий «существенные отличия».
Цель изобретения - разработка способа прогнозирования неблагоприятного течения множественной миеломы в дебюте заболевания на основании ассоциативной связи с регуляторными молекулярными маркерами с целью перепрофилирования лекарственной тактики для повышения эффективности лечения.
Поставленная цель достигается с помощью анализа двух регуляторных SNP гена IL-10 при впервые выявленной ММ.
Способ применяли следующим образом. Верификацию диагноза ММ осуществляли на основании обновленных диагностических критериев плазмоклеточных опухолей Международной рабочей группы по множественной миеломе (IMWG - International Myeloma Working Group, 2014) [34].
2
В первые сутки стационарного наблюдения, после подтверждения диагноза у больных проводили взятие 2000 мкл венозной крови в вакуумную пробирку объемом 2 мл, содержащую 3,6 мг КЭДТА.
Дальнейшее исследование осуществляли согласно методике в три этапа с использованием комплекта реагентов «SNP-экспресс» для выявления полиморфизма гена IL10 в точках -819 и -1082 методом полимеразной цепной реакции с аллель-специфичными праймерами (производства НПФ «Литех», г. Москва), на амплификаторе «Терцик» (ООО «ДНК технология», г. Москва) и электрофоретической детекцией продуктов реакции в агарозном геле.
На первом этапе (выделение ДНК из биопроб) в чистую пробирку типа Eppendorf с замком вносили 1 мл цельной крови. В случае ее расслоения в процессе хранения кровь перемешивали до однородного состояния. Пробирку закрывали пробкой и центрифугировали со скоростью 3000 об/мин на микроцентрифуге-вортексе при температуре 22±1°С в течение 5 мин. После центрифугирования крови пипеткой-дозатором переменного объема аккуратно удаляли плазму, оставляя ее тонкий слой, не захватывая лейкоциты. Пробирку закрывали и выдерживали при температуре минус 20°С в морозильной камере в течение 1 часа до полного замораживания форменных элементов. Затем размораживали содержимое пробирки при температуре 22±1°С и добавляли 500 мкл реактива «ДНК-экспресс-кровь». Объем добавляемого реактива должен быть равным суммарному объему оставшихся в пробирке форменных элементов и плазмы. После этого содержимое пробирки в течение 10 с тщательно перемешивали на вортексе. Пробирку устанавливали в предварительно прогретый до температуры 98°С твердотельный термостат и выдерживали в течение 15 мин. Затем пробирку помещали в высокоскоростную микроцентрифугу замком в сторону оси и центрифугировали при 1200 об/мин при температуре 22±1°С в течение 10 мин. Полученный супернатант использовали для исследования ДНК непосредственно после его приготовления или замораживали в морозильной камере при минус 20°С на срок не более 6 месяцев. Замороженные образцы перед использованием полностью размораживали при температуре 22±1°С.
На втором этапе (проведение полимеразной цепной реакции) использовали комплект реагентов для амплификации «SNP-экспресс». Вначале подготавливали и маркировали пробирки вместимостью 0,5 мл для проведения амплификации из расчета 2 штуки на одну пробу («норма»-N и «патология»-Р) плюс по 1 пробирке для отрицательного контроля в каждой параллели. За 20 минут до приготовления рабочей амплификационной смеси комплект реагентов для ПЦР извлекали из морозильной камеры и полностью размораживали при температуре 22±1°С. Пробирки с реакционной смесью тщательно перемешивали на вортексе, раствор разбавителя - путем переворачивания пробирки. Из компонентов комплекта готовили рабочие смеси для амплификации («Норма» и «Патология») из расчета на 1 пробу: 17,5 мкл разбавителя; 2,5 мкл реакционной смеси «Норма» или «Патология»; 0,2 мкл Taq-полимеразы. Рабочие смеси тщательно перемешивали пипетированием. В пробирки, подготовленные для амплификации, вносили по 20 мкл соответствующей рабочей смеси, затем добавляли по 1 капле минерального масла. В пробирки с рабочими амплификационными смесями «Норма» и «Патология» под слой масла вносили по 5 мкл образца. В качестве отрицательного контрольного образца использовали разбавитель в объеме 5 мкл. Пробирки закрывали и центрифугировали на микроцентрифуге-вортексе при 3000 об/мин и температуре 22±1°С в течение 3 с. Затем перемещали пробирки в прогретый до 94°С (температура, установившаяся в режиме «Пауза») программируемый твердотельный термостат (амплификатор) и проводили амплификацию по следующей программе (таблица 1).
На третьем этапе (детекция) для разделения продуктов амплификации использовали набор реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле. Для этого в камеру для горизонтального электрофореза заливали ТАЕ буфер, приготовленный путем разведения 50хТАЕ в 50 раз дистиллированной водой (рН=8,3). К 3 г агарозы с низким электроэндоосмосом добавляли 2 мл 50хТАЕ буфера и 100 мл дистиллированной воды. Смесь расплавляли в микроволновой печи и при перемешивании добавляли 10 мкл 1% раствора бромистого этидия. Расплавленную агарозу охлаждали до температуры 60°С и заливали в планшет, после чего с использованием гребенки формировали карманы для нанесения образцов. После застывания агарозы осторожно вынимали гребенку и переносили планшет с гелем в камеру для электрофореза, заполненную ТАЕ буфером. В «карманы» геля вносили по 15 мкл ампликона в последовательности, соответствующей нумерации проб. Подключали электрофоретическую камеру к источнику питания и задавали напряжение электрического поля 15 В/см геля. Проводили электрофоретическое разделение продуктов амплификации в направлении от катода (-) к аноду (+). Контроль за электрофоретическим разделением осуществляли визуально по движению полосы красителя в течение 15 мин. По окончанию электрофореза вынимали гель из формы и переносили его на стекло ультрафиолетового трансиллюминатора (λ=312 нм).
Оценка результатов
При ультрафиолетовом облучении агарозного геля фрагменты ДНК проявлялись в виде светящихся оранжево-красных полос (таблица 2).
Пример интерпретации результата представлен на рисунке 1: символом «К-» обозначен отрицательный контрольный образец; цифрой «1» - нормальная гомозигота, цифрой «2» - гетерозигота, цифрой «3» - патологическая (мутантная) гомозигота; при наличии контаминации или затекания амплификата из соседнего кармана геля в тесте на патологическую (мутантную) аллель наблюдается картина, обозначенная цифрой «4».
2
Распределение генотипов по каждому исследуемому полиморфизму гена IL10 проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий χ Пирсона с поправкой Иэйтса на непрерывность. Дополнительно оценивали показатель отношения шансов - odds ratio (OR) с вычислением границ 95%-го доверительного интервала (95%CI). Значение OR=1 свидетельствовало об отсутствии ассоциации риска выявления первично-рефрактерной формы ММ в дебюте заболевания с наблюдаемым генотипом. При значении OR<1 говорили об отрицательной ассоциации (фактор пониженного риска выявления первично-рефрактерной формы MM), a OR>1 рассматривали как положительную ассоциацию с признаком (фактор повышенного риска). Сравнение численных данных проводили с использованием методов параметрической и непараметрической статистики, рассчитывая коэффициенты Стьюдента (t) или Манна-Уитни (U). Для расчета результатов использовали пакеты программ MS Office Excel 2003, Stadia, а также сайт онлайн калькуляторов для расчета статистических критериев (https://medstatistic.ru/calculators.html). Статистически значимыми считали различия при р<0,05.
Разработанный способ прогнозирования первичной резистентности множественной миеломы в дебюте заболевания, был оценен у 192 пациентов (мужчин - 83 (43,2%), женщин - 109 (56,8%), медиана (Me) возраста 56 лет). В зависимости от достижения или отсутствия ответа на индукционную терапию больные были разделены на две группы, сопоставимые по тендерным характеристикам. В первую группу вошли 26 (13,5%) пациентов с неблагоприятным течением ММ: прогрессирование заболевания на фоне последовательных режимов терапии второй и последующих линий, включающие интенсивные схемы (EDAP, DCEP, VD-PACE, DHAP), лучевую терапию на экстрамедуллярные очаги поражения, при развитии полирезистентности - паллиативное лечение.
Вторая группа представлена 166 (86,5%) больными с положительным ответом на индукционную терапию. Характеристика больных ММ представлена в табл. 3.
При анализе данных, представленных в таблице 3 установлено, что группы пациентов были конгруэнтны по тендерному признаку, соотношению числа заболевших в разных возрастных группах, продолжительности наблюдения (от начала заболевания до даты последнего визита или смерчи), стадии ММ при постановке диагноза, типу секреции легких цепей, наличию или отсутствию цитогенетических аберраций, выявленных методами стандартного цитогенетического исследования и FISH (Fluorescence in situ hybridization - флюоресцентная гибридизация in situ). Пациентов с первично-рефрактерной формой ММ отличали более молодой возраст при постановке диагноза (48,5 vs. 57 лет, р=0,002) и преобладание иммунохимического варианта заболевания с секрецией моноклонального IgG (88,5% vs. 56,2%, р=0,004).
Таким образом, используемые в практике общепринятые диагностические и прогностические критерии стратификации риска неблагоприятного течения ММ, в том числе, системы стадирования (Durie-Salmon Staging System (DSS), International Staging system (ISS), Revised International Staging System (R-ISS)) и цитогенетические маркеры [3, 34, 35], не позволяют на этапе диагностики индивидуализировать терапию пациентов с высоким риском раннего развития первичной рефрактерности.
Генотипирование гена IL10 у всех пациентов с ММ выявило взаимосвязь его полиморфизма в точке - 1082 (но не в -819) с высоким риском обнаружения формы ММ, резистентной ко многим вариантам индукционной терапии (таблица 4).
Проведенные расчеты установили статистически достоверную связь полиморфизма гена IL10 (G-1082A) с первично-рефрактерной ММ в дебюте заболевания. Обнаружено, что при оценке мутационного статуса гена IL10 в точке - 1082 выявление мутантного аллеля А (р=0,002) и содержащих его гетеро- и гомозиготных генотипов GA и АА (р - 0,008) встречается достоверно чаще у лиц с первично-рефрактерной формой ММ.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о корреляции полиморфизма гена IL10 (G-1082А) с неблагоприятным течением ММ: развитием резистентности к индукционной терапии, независимо от существующих моделей прогноза плазмоклеточных новообразований [3, 34, 35]. Выявлен молекулярно-генетический маркер, повышающий риск прогнозирования неблагоприятного течения заболевания и требующий индивидуального терапевтического подхода в дебюте ММ - носительство мутантного аллеля А гена IL10 (G-1082A) в гетеро- и гомозиготном состоянии. Определение данного показателя позволяет прогнозировать неблагоприятный ответ на индукционную терапию, дает возможность персонифицировать тактику лечения на ранних этапах ММ путем перепрофилирования назначения лекарственных средств для повышения эффективности терапии.
Пример 1. Больная А., 1948 года рождения. Диагноз ММ был установлен в ноябре 2011 г. в возрасте 63 лет на основании критериев IMWG (2014), в стадии DSS IIB, подтвержден присутствием в миелограмме 16% плазмоцитов, наличием признаков остеодеструктивного синдрома (множественные литические очаги С2-6, Th2-7 тел позвонков, компрессионный перелом тел С2, С3 позвонков), миеломной нефропатии, экстрамедуллярного очага поражения (в области рукоятки и тела грудины), с сывороточной секрецией моноклонального IgG (22,1 г/л), наличием белка Бенс-Джонса в моче (2,3 г/л), повышением уровней креатинина (802 мкмоль/л), мочевины (8,4 ммоль/л), мочевой кислоты (425 мкмоль/л), лактатдегидрогеназы (832 Ед/л), бета-2-микроглобулина (7,46 мг/л) в сыворотке периферической крови. При генотипировании у больной на 2-ые сутки госпитализации было взято 2 мл венозной крови и проведено исследование полиморфизма гена IL10 (G-1082А). Выявлено носительство гена IL10 в гетерозиготном состоянии GA с присутствием мутантного аллеля А. Проведено три курса терапии (PAD) с использованием ингибитора протеосом (бортезомиб). Установлена первичная резистентность заболевания. Далее - курс лучевой терапии на экстрамедуллярные очаги поражения, четыре курса химиотерапии (LAD), включающий иммуномодулирующий препарат (леналидомид), без эффекта. У пациентки констатирована двойная резистентность. Несмотря на последующие курсы «сдерживающей» терапии по схеме М2 с доксорубицином (всего семь курсов) на фоне постоянного прогрессирования заболевания (стадия DSS IIIB) наступила смерть в январе 2015 г. в возрасте 66 лет.
9
Пример 2. Больной М., 1950 года рождения. Диагноз ММ установлен в феврале 2015 г. в возрасте 64 лет на основании критериев IMWG (2014) в стадии DSS IIIA, подтвержден присутствием в миелограмме 14% плазмоцитов, наличием признаков остеодеструктивного синдрома (мелкие округлые деструктивные просветления в костях плечевого сустава), экстрамедуллярных очагов в ткани правого легкого, с гиперпротеинемией (93 г/л), сывороточной секрецией моноклонального IgG (40 г/л), с повышением уровня мочевины (8,4 ммоль/л), снижением гемоглобина до 104 г/л, числа тромбоцитов до 140×10/л. При молекулярно-генетическом тестировании у больного в 1-ые сутки госпитализации было взято 2 мл венозной крови и проведено исследование полиморфизма гена IL10 (G-1082A). Выявлено носительство гена IL10 в виде мутантной гомозиготы АА. Проведено два курса терапии VCD без эффекта, четыре курса DCEP с бортезомибом, наблюдалось прогрессирование заболевания. В дальнейшем - четыре курса LAD, установлена двойная резистентность к ингибиторам протеасом и иммуномодулирующим препаратам. Далее - курс М2 и курс VMP, на фоне которого отмечалась непроходимость кишечника и появление экстрамедуллярного поражения тканей плеча и средостения. В августе 2015 г., через 6 месяцев от начала заболевания переведен на паллиативную терапию.
9
+
2
2
+
9
2
+
Пример 3. Больной Г., 1957 года рождения. Диагноз ММ был установлен в августе 2016 г. в возрасте 59 лет на основании критериев IMWG (2014) в стадии DSS ПА, подтвержден присутствием в миелограмме 23,2% плазмоцитов, гиперпротеинемией (109 г/л), экстрамедуллярного очага поражения (в области 6 ребра слева размерами 52×38×47 мм), с сывороточной секрецией моноклонального IgG (32,4 г/л) и легких цепей лямбда, наличием М-градиента в гамма-фракции глобулинов (25,2 г/л), снижением числа тромбоцитов (160×10/л), повышением уровня мочевой кислоты (453 мкмоль/л) в сыворотке периферической крови. При генотипировании у больного на 2-ые сутки госпитализации было взято 2 мл венозной крови и проведено исследование полиморфизма гена IL10 (G-1082A). Выявлено носительство гена IL10 в виде нормальной гомозиготы GG. Проведено 5 курсов первой линии терапии VCD, достигнут частичный ответ. Далее - четыре курса VRD, получен очень хороший частичный ответ. После курса высокодозного циклофосфана, двух аферезов периферических гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) заготовлено достаточное для тандемной трансплантации аутологичных ГСК (аутоТГСК) количество CD34-клеток: 9,1/кг массы тела пациента. Через 14 месяцев после установления диагноза и начала терапии проведена первая аутоТГСК (октябрь 2017 г.), в результате которой после режима кондиционирования (бендамустин 100 мг/м+мелфалан 140 мг/м) пациенту перелито 4,3 CD34-клеток/кг массы тела. Восстановление числа лейкоцитов свыше 1000 клеток/мкл наблюдалось на +13 сутки, количества тромбоцитов свыше 30×10/л - на +15 сутки. Вторая аутоТГСК проведена через 5 месяцев после первой (март 2018 г. ). После режима кондиционирования (мелфалан 140 мг/м) пациенту перелито 4,72 CD34-клеток/кг массы тела. Сохранялся очень хороший частичный ответ.
Список литературы:
1. Множественная миелома: рук. для врачей / С.С. Бессмельцев, К.М. Абдулкадыров. - М.: МК, 2016. - 504 с.
2. Multiple myeloma: available therapies and causes of drug resistance / V. Pinto, R. Bergantim, H.R. Caires, H. Seca, J.E. Guimaraes, M.H. Vasconcelos // Cancers. - 2020. - Vol. 12. - P. 407.
3. Множественная миелома: клинические рекомендации / Л.П. Менделеева, О.М. Вотякова, И.Г. Рехтина, Е.А. Османов, И.В. Поддубная, Л.Ю. Гривцова, Н.А. Фалалеева, В.В. Байков, A.M. Ковригина, А.А. Невольских, С.А. Иванов, Ж.В. Хайлова, Т.Г. Геворкян // Одобрено Научно-практическим Советом Минздрава РФ. - 2020. - 86 с.
4. Mechanisms of drug resistance in relapse and refractory multiple myeloma / W.-C. Yang, S.-F. Lin // BioMed Research International. - 2015. - Article ID 341430.
5. Novel mechanism of drug resistance to proteasome inhibitors in multiple myeloma / J. Zhou, WJ. Chng // World J. Clin. Oncol. - 2019. - Vol. 10. - no. 9. - P. 303-306.
6. Roles of noncoding RNAs in drug resistance in multiple myeloma / J. Li, J. Zou, X. Wan, C. Sun, Z. Chu, Y. Hu // J. Cell. Physiol. - 2020. - P. 1-15.
7. Comprehensive characterization of the mutational landscape in multiple myeloma cell lines reveals potential drivers and pathways associated with tumor progression and drug resistance / V. Vikova, M. Jourdan, N. Robert, G. Requirand, S. Boireau, A. Bruyer, L. Vincent, G. Cartron, B. Klein, O. Elemento, A. Kassambara, J. Moreaux // Theranostics. - 2019. - Vol. 9. - no. 2. - P. 540-553.
8. Drug targets and resistance mechanisms in multiple myeloma / J. Nass, T. Efferth // Cancer Drug Resist. - 2018. - Vol. 1. - P. 87-117.
9. Molecular basis of clonal evolution in multiple myeloma / Y. Furukawa, J. Kikuchi // Int. J. Hematol. - 2020. - Vol. 111. - P. 496-511.
10. Лечение больных с рецидивирующими/рефрактерными формами множественной миеломы / О.М. Вотякова // Вестник гематологии. - 2014. - Т. X. - №3. - С. 25-39.
11. Overcoming multiple myeloma drug resistance in the era of cancer 'omics' / M.H.Z. Guang, A. McCann, G. Bianchi, L. Zhang, P. Dowling, D. Bazou, P. O'Gormand, K.C. Anderson // Leuk. Lymphoma. - 2018. - Vol. 59. - no. 3. - P. 542-561.
12. Drag resistance in multiple myeloma: latest findings and new concepts on molecular mechanisms / J. Abdi, G. Chen, H. Chang // Oncotarget. - 2014. - Vol. 4. - P. 2186-2207.
13. Drag resistance in multiple myeloma / P. Robak, I. Drozdz, J. Szemraj, T. Robak // Cancer Treat. Rev. - 2018. - Vol. 70. - P. 199-208.
14. Mafb protein confers primary resistance of myeloma to proteasome inhibitors / Y.-W. Qiang, S. Ye, F.E. Davies, B. Barlogie, J. Epstein, G.J. Morgan // Blood. - 2014. - Vol. 124. - no. 21. - P. 2091.
15. An update on molecular biology and drag resistance mechanisms of multiple myeloma / P. Mutlu, Y. Kiraz, U.  Baran // Crit. Rev. Oncol. Hematol. - 2015. - Vol. 96. - no. 3. - P. 413-424.
16. Molecular mechanisms in multiple myeloma drug resistance / N. Nikesitch, S.C.W. Ling // J. Clin. Pathol. - 2016. - Vol. 69. - P. 97-101.
17. Molecular mechanisms of novel therapeutic approaches for multiple myeloma / T. Hideshima, K.C. Anderson // Nat. Rev. Cancer. - 2002. - Vol.2. - P. 927-937.
18. Множественная миелома / С.В. Семочкин // Клиническая онкогематология. - 2020. - Т. 13. - №1. - С. 1-24.
19. Association between interleukin gene polymorphisms and multiple myeloma susceptibility / M.N. Shahazad, I. Ijaz, S.S.Z.H. Naqvi, С Yan, F. Lin, S. Li, С Huang // Molecular and clinical oncology. - 2020. - Vol. 12. - P. 212-224.
20. Cytokine gene polymorphisms support diagnostic monitoring of romanian multiple myeloma patients / С Banu, A. Moise, C.V. Arion, D. Coriu, A. Tanase, I. Constantinescu // Journal of Medicine and Life. - 2011. - Vol. 4. - no. 3. - P. 264-268.
21. Interleukin-10 (-1082G/A) gene promotor polymorphism in Egyptian non-Hodgkin lymphoma patients: relation to other prognostic factors / M.I.S. Ahmed, D.I. Hashad, A.E. Hassen // Egyptian Journal of Haematology. - 2014. - Vol. 39. -P. 156-163.
22. Interleukin-10 gene promoter polymorphism in multiple myeloma / C. Zheng, D. Huang, L. Liu, R. Wu, S.B. Glas, A. Osterborg, M. Bjorkholm, G. Holm, Q. Yi, A. Sundblad // Int. J. Cancer (Pred. Oncol.). - 2001. - Vol. 95. - P. 184-188.
23. Association of interleukin-10 - 1082 A/G (rs1800896) polymorphism with susceptibility to gastric cancer: meta-analysis of 6,101 cases and 8,557 controls / A. Namazi, M. Forat-Yazdi, M. Jafari, S. Farahnak, R. Nasiri, E. Foroughi, S.M. Abolbaghaei, H. Neamatzaden // Arq. Gastroenterol. - 2018. - Vol. 55. - no. 1. - P. 33-40.
24. The regulation of IL-10 production by immune cells / M. Saraiva, A. O'Garra // Nature Reviews Immunology. - 2010. - Vol. 10. - P. 170-181.
25. Interleukin-10 / F.M. Marincola. - London, UK: CRC Press, 2006. - 206 p.
26. The interleukin-10-1082 promoter polymorphism and cancer risk: a metaanalysis / J. Wangy, Q. Dingy, Y. Shiy, Q. Cao, C. Qin, J. Zhu, J. Chen, C. Yin // Mutagenesis.-2012.-2012. - Vol. 27. - no. 3. - P. 305-312.
27. The impact of IL-6 and IL-10 gene polymorphisms in diffuse large B-cell lymphoma risk and overall survival in an Arab population: a case-control study / S.M. A1-Khatib, N. Abdo, L.N. AL-Eitan, A.-H. A1-Mistarehi, D.J. Zahran, T.Z. Kewan // Cancers. - 2020. - Vol. 12. - P. 382.
28. Способ прогнозирования безрецидивной выживаемости у больных множественной миеломой после проведения аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток: пат. 2580648 Рос. Федерация. №2015109988/15; заявл. 20.03.2015; опубл. 10.04.2016, бюл. №10.
29. Способ прогнозирования общей выживаемости больных множественной миеломы: пат. 2456924 Рос. Федерация. №2010151371/14; заявл. 14.12.2010; опубл. 27.07.2012, бюл. №21.
30. Avalidated gene expression model of high-risk multiple myeloma is defined by deregulated expression of genes mapping to chromosome 1 / J.D. Shaughnessy Jr., F. Zhan, B.E. Burington, Y. Huang, S. Colla, I. Hanamura, J.P. Stewart, В. Kordsmeier, С.Randolph, D.R. Williams, Y. Xiao, H. Xu, J. Epstein, E. Anaissie, S.G. Krishna, M. Cottier-Fox, K. Hollmig, A. Mohiuddin, M. Pineda-Roman, G. Tricot, F. van Rhee, J. Sawyer, Y. Alsayed, R. Walker, M. Zangari, J. Crowley, B. Barlogie // Blood. - 2007. - Vol. 109. - no. 6. - P. 2276-2284.
31. Method for predicting the efficiency of the therapy of multiple myeloma: патент 21112 Украина. №u200612013; заявл. 15.11.2006; опубл. 15.02.2007, бюл. №2.
32. Способ прогнозирования течения множественной миеломы: пат. 2225612 Рос. Федерация. №2002111814/15; заявл. 30.04.2002; опубл. 10.03.2004.
33. Способ прогнозирования течения множественной миеломы: пат. 2282852 Рос. Федерация. №2005106447/15; заявл. 09.03.2005; опубл. 27.08.2006, бюл. №24.
34. Working Group updated criteria for the diagnosis of multiple myeloma / S.V. Rajkumar, M.A. Dimopoulos, A. Palumbo, J. Blade, G. Merlini, M.-V. Mateos, S. Kumar, J. Hillengass, E. Kastritis, P. Richardson, O. Landgren, B. Paiva, A. Dispenzieri, B. Weiss, X. LeLeu, S. Zweegman, S. Lonial, L. Rosinol, E. Zamagni, S. Jagannath, O. Sezer, S.Y. Kristinsson, J. Caers, S.Z. Usmani, J.J. Lahuerta, H.E. Johnsen, M. Beksac, M. Cavo, H. Goldschmidt, E. Terpos, R.A Kyle, K.C. Anderson, B.G.M. Durie, J.F. San Miguel // Lancet Oncol. - 2014. - Vol. 15. - no. 12. - P. e538-48.
35. A clinical staging system for multiple myeloma: Correlation of measure Myeloma cell mass with presenting clinical features, response to treatment, and survival / B.G.M. Durie, S.E. Salmon // Cancer. - 1975. - Vol. 36. - no. 9. - P. 842-854.