Способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале
METHOD OF SAMPLE PREPARATION FOR GAS CHROMATOGRAPHIC DETERMINATION OF ORGANOCHLORINE COMPOUNDS IN BIOMATERIAL

Изобретение относится к способам количественного определения стойких хлорорганических соединений – хлорорганических пестицидов (α-, β-, γ-, δ- гексахлорциклогексана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилтрихлорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилдихдорэтана, 2,4- и 4,4-дихлордифенилэтилена, дильдрина, эндрина) и полихлорированных бифенилов – газохроматографическими методами в биологических жидкостях и придатках кожи человека и может быть использовано в биологии, экологии, медицине.
Известен способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических пестицидов в крови, включающий экстракцию пестицидов из крови n-гексаном, очистку от соэкстративных веществ концентрированной серной кислотой, концентрирование n-гексанового экстракта (см. RU № 2414711, МПК G01N 33/50, G01N 33/48, 2011).
Недостатком этого решения является ограниченная область применения из-за невозможности исследования всего спектра биологических жидкостей человека, а также полная невозможность работы с придатками кожи – волосом или ногтевой пластиной.
Известны методические указания по избирательному газохроматографическому определению хлорорганических пестицидов в биологических средах (моче, крови, жировой ткани и грудном женском молоке), отличающиеся обработкой проб раствором оксалата калия и далее этанолом, диэтиловым эфиром и гексаном (МУ № 3151 от 27.11.84 и № 4362 от 08.06.87).
Недостатком этого решения является сравнительно неполный выход хлорорганических соединений (ХОС) в n-гексановый экстракт, а также невозможность работы с волосом или ногтевой пластиной.
Известен также способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение и последующую экстракцию хлорорганических соединений n-гексаном, и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой и получение концентрата n-гексанового экстракта хлорорганических соединений (см. патент РФ № 2543360, МПК G01N 33/483, 2015).
Недостатком этого способа является низкая эффективность и точность исследования из-за многократности этапов экстракции и очистки экстракта серной кислотой и, кроме того, сравнительно невысокий «выход» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение «выхода» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта.
Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в повышении «выхода» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта за счет повышения полноты его извлечения из материала проб и исключения многоэтапности процесса очистки концентрированной серной кислотой.
3
3
3
3
Для решения поставленной задачи предложен способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биоматериале, включающий отбор пробы, ее измельчение и последующую экстракцию хлорорганических соединений n-гексаном, и последующую очистку от соэкстрактивных веществ концентрированной серной кислотой и получение концентрата n-гексанового экстракта хлорорганических соединений, отличающийся тем, что в качестве биоматериала используют биологические жидкости или придатки кожи, из которых получают измельченные гомогенизированные образцы, увлажненные бидистиллированной водой до влажности не менее 80% и двукратно криоденатурированные, отбирают пробу образца в количестве, достаточном для получения не более 0,5 г сухого липофильного экстракта, при этом в навеску пробы образца, которую принимают за 5 частей по массе, вносят 3 см 1%-ного раствора бикарбоната натрия, и после интенсивного встряхивания добавляют экстрагент, в качестве которого используют смесь трихлорметан: метиловый спирт: гексан, причем на 5 частей навески пробы образца в г берут 6 частей трихлорметана в см, 3 части метилового спирта в см и 5 частей n-гексана в см, интенсивно встряхивают 5 минут и проводят экстракцию в течение 25 мин, липофильный экстракт хлорорганического соединения отстаивают до разделения фаз, после чего водно-спиртовой слой удаляют, а экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия, выпаривают и затем очищают концентрированной серной кислотой.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Совокупность признаков формулы изобретения обеспечивает возможность повышения «выхода» хлорорганических соединений в концентрат n-гексанового экстракта за счет повышения полноты его извлечения из материала проб и исключения многоэтапности процесса очистки концентрированной серной кислотой от соэкстрактивных веществ в ходе реакции с ней липофильного экстракта. Например, при использовании навески грудного молока, в результате экстракции которой образуется менее 0,5 г липофильного экстракта, «выход» всех заявленных ХОС может быть не полный, а соединения, которые находятся в минимальных концентрациях – «не выходить» вовсе. При этом если взять навеску, в результате экстракции которой образуется более 0,5 г липофильного экстракта, то потребуется несколько стадий промывки серной кислотой, что ведет за собой «потери» концентраций искомых соединений и увеличение времени общего анализа.
При этом признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.
Признак, указывающий, что «в качестве биоматериала используют биологические жидкости или придатки кожи», расширяет область применения исследования всего спектра биологических жидкостей человека, а также возможность работы с придатками кожи – волосом или ногтевой пластиной.
Признаки «…используют измельченные гомогенизированные образцы, увлажненные бидистиллированной водой до влажности не менее 80%...» указывают параметры пробоподготовки, необходимые для более эффективного процесса криоденатурации.
Признаки, указывающие, что гомогенизированные образцы «двукратно криоденатурированные» обеспечивают значительное увеличение «выхода» экстрагируемых веществ за счет процессов повторяющейся низкотемпературной денатурации белково-липидных комплексов образца.
Признаки, указывающие, что отбирают пробу образца «в количестве, достаточном для получения не более 0,5 г сухого липофильного экстракта» обеспечивают максимальный выход исследуемого вещества из образца.
3
Признак, указывающий, что «в навеску пробы образца, которую принимают за 5 частей по массе, вносят 3 см 1%-ного раствора бикарбоната натрия» обеспечивает высокую степень денатурации казеиногена, связывание ионов кальция, улучшение смачиваемости образца.
Признаки, указывающие, что «после интенсивного встряхивания добавляют экстрагент, в качестве которого используют смесь трихлорметан: метиловый спирт: гексан» необходимы для эффективного разрушения липопротеидных комплексов пробы и более полного извлечения хлорорганических соединений.
3
3
3
Признаки, указывающие, что «на 5 частей навески пробы образца в г берут 6 частей трихлорметана в см, 3 части метилового спирта в см и 5 частей n-гексана в см» необходимы для уточнения наилучшего соотношения реагентов, эффективно разрушающих липогликопротеидные комплексы пробы и в результате повышающие «выход» исследуемых хлорорганических веществ.
Признак, указывающий, что «интенсивно встряхивают 5 минут и проводят экстракцию в течение 25 мин» обеспечивает ускорение работ за счет увеличения площади границы раздела фаз трихлорметаново-гексанового и водно-спиртового слоев.
Признаки, указывающие, что «липофильный экстракт хлорорганического соединения отстаивают до разделения фаз, после чего водно-спиртовой слой удаляют» описывают технологический процесс отделения липофильного экстракта хлорорганических соединений от водно-спиртового слоя.
Признаки, указывающие, что «экстракт фильтруют через безводный сульфат натрия» описывают процесс осушения и удаления твердых фрагментов коагулировавшего белка из трихлорметан-гексанового экстракта.
Признаки, указывающие, что экстракт «выпаривают и затем очищают концентрированной серной кислотой» описывают последовательность действий, значительно ускоряющую технологический процесс.
На фиг. показано распределение липидов в биологических жидкостях и таких придатках кожи человека, как волосы и ногтевые пластины для определения объема навески в зависимости от типа материала.
Объем пробы определяют исходя из концентраций анализируемых веществ в образце, чувствительности аналитического метода и воспроизводимости результатов при повторе количественного анализа.
Предел обнаружения определялся из расчета три стандартных отклонения на восемь – десять анализируемых на ХОС образцов. Для анализа следовых концентраций ХОС обычно используют образцы от 1 до 10 г. Однако для более эффективного определения ХОС с высоким коэффициентом «октанол-вода» необходимо учитывать различное содержание липидов в биологических жидкостях и придатках кожи человека, а также степень их химического участия в фосфолипидных комплексах мембран или кератинового матрикса придатков кожи, поскольку такой подход позволяет унифицировать дальнейшие этапы, включая экстракцию.
3
3
Установлено, что наиболее эффективная очистка концентрированной серной кислотой исследуемых соединений от соэкстрактивных веществ происходит в ходе реакции липофильного экстракта, растворенного в 20 см n-гексана, и концентрированной серной кислоты объемом 10 см при перемешивании на лабораторном шейкере.
Наибольшая масса липофильного экстракта, которая может быть очищена указанным объемом серной кислоты, составляет 0,5 г. На фиг. показано распределение липидов в биологических жидкостях и таких придатках кожи человека, как волос или ногтевая пластина.
В таблице 1 приведен максимальный объем проб, который может быть оптимально очищен при однократной кислотной экстракции.
Таблица 1
Распределение липидов в органах и тканях человека
Биоматериал
% липидов
Максимальный вес пробы, г
Ногтевая пластина
10
5
Волос
4
12,5
Грудное молоко
4
12,5
Слюна
0,5
100
Моча
0,5
100
Сперма
0,3
167
Экссудат
0,5-4
12,5-100
Транссудат
0,5
100
Потожировые отделения
4
12,5
Желчь
1
50
Спино-мозговая жидкость
0,01
5000
Лимфа
0,5-2
25-100
Менструальная кровь
0,05
1000
Для обеспечения повторяемости исследований обязательны к соблюдению следующие правила сбора проб.
Для мочи рекомендуется использовать суточную пробу мочи, предварительно упаренную до объема 100 мл.
При низкой концентрации липидов в пробе образцы предварительно концентрируются упариванием и далее передаются в технологическую цепочку экстракции.
Волос: сбор проб производится с затылочной области головы; волос должен быть срезан максимально близко к корню.
Ногтевая пластина: выступающая над подушечкой I, II или III пальца левой руки часть ногтевой пластины, длиной не менее 3 мм, срезают повторяя анатомические очертания подушечки пальца.
Для слюны рекомендуется сбор пробы в спокойном состоянии не ранее, чем через 3 часа после приема пищи или питья.
Для желчи рекомендуется исследование порции в связи с наиболее высокой стабильной концентрацией липидного комплекса – 7,69 г/литр.
Для сбора проб применяют одноразовый инструмент во избежание контаминации анализируемыми веществами.
Пример реализации способа
Отбирают образцы биологических жидкостей или придатков кожи. Все отобранные образцы помещают в стеклянные контейнеры достаточного объема и замораживают до температуры -20°С или ниже. Пустая пробирка необходима для контроля чистоты тары.
Пробы образцов измельчают механически на ультрагомогенизаторе, при необходимости увлажняют бидистиллированной водой до 80%. Далее производят двукратную криоденатурацию со скоростью более 5 K/минуту.
3
3
3
3
3
3
3
Взвешивают такое количество гомогенизированного образца, чтобы получить до 0,5 г сухого липофильного экстракта (табл. 1). Например, для грудного молока жирностью 4% берется навеска 12,5 г, что будет соответствовать 0,5 г сухого липофильного экстракта (табл. 1). В цилиндрическую делительную воронку вместимостью 50 см вносят 3 см 1% бикарбоната натрия и интенсивно встряхивают 1 минуту, вносят смесь трихлорметан-метиловый спирт в расчетном количестве по пропорции массово-объемного соотношения «навеска образца(12,5 г): трихлорметан (15 см): метиловый спирт (7,5 см): n-гексан (12,5 см): как 5:6:3:5, и интенсивно встряхивают, после чего добавляют необходимый для экстракции объем п-гексана (при использовании высоколипидных образцов с жирностью выше 5%, например, ногтевой пластины, объемы растворителей должны быть 9 смсмеси «трихлорметан-метиловый спирт» и 5 см п-гексана, соответственно, для предотвращения потерь), закрывают колбу парафиновой пленкой типа Parafilm и интенсивно встряхивают 5 минут и оставляют экстрагироваться на 25 минут. После разделения фаз водно-спиртовой слой удаляют.
На аналитических весах (4 класс точности) взвешивают круглодонную колбу К-1-100-29/32, предварительно просушенную в сушильном шкафу в течение 30-40 минут до стабилизации веса, охлажденную до комнатной температуры в эксикаторе с индикаторным силикагелем. Данные вносят в лабораторный журнал.
Оставшийся в воронке слой фильтруют через безводный сульфат натрия, смоченный в n-гексане, в круглодонную колбу К-1-100-29/32 и ставят на роторный испаритель (водяная баня – 35°С + вакуум) до полного выпаривания n-гексана. Далее круглодонную колбу помещают в сушильный шкаф при температуре 102°С до стабилизации веса.
После стабилизации веса липофильного экстракта круглодонную колбу взвешивают повторно. Данные вносят в лабораторный журнал и рассчитывают массу навески и процентное содержание общих жиров, полученных во время экстракции, для последующего пересчета концентраций ХОС как нг/г липидов (общепринятые измерения концентрации органических загрязняющих веществ в живых организмах).
3
3
2
4конц
Для очистки полученного липофильного экстракта от соэкстративных веществ в вытяжном шкафу в круглодонную колбу с липофильным экстрактом вносят 20-25 см n-гексана, тщательно перемешивают и вносят 10 см HSO.
Содержимое повторно перемешивают и оставляют на 24 часа. Отделяют часть кислоты автоматическим кислотостойким дозатором с одноразовым полипропиленовым наконечником и n-гексановый слой переносят в делительную воронку ВД-3-250-29/32 с PTFE краном.
3
3
Промывают раствор экстрагированных исследуемых веществ в n-гексане порцией 20 см 1% бикарбоната натрия, и далее порциями бидистиллированной воды объемом 20-30 см до нейтральной реакции универсального бумажного индикатора.
Раствор исследуемых веществ в n-гексане фильтруют через безводный сульфат натрия в коническую колбу KО-30-14/23; КО-30-29/32 и ставят на роторный испаритель (водяная баня – 35°С) до полного выпаривания n-гексана.
Определение концентраций хлорорганических пестицидов и полихлорированных бифенилов в образцах проводят на газовом хроматографе с масс-селективным детектором и на газовом хроматографе с детектором электронного захвата.
Таким образом, предложенный способ подготовки пробы для газохроматографического определения хлорорганических соединений в биологических жидкостях и придатках кожи человека позволяет сократить расходы на серную кислоту, n-гексан и бидистиллированную воду, и уменьшить трудозатраты на производство одной пробы на 48-72 часа.