Экспериментальное изучение гравидопротекторных свойст препарата липин на модели плацентарной дисфункции, вызванной оксидативным стрессом

экспериментальное изучение гравидопротекторных свойст препарата липин на модели плацентарной дисфункции, вызванной оксидативным стрессом

© О. В. Кудина

Национальный фармацевтический университет, г. Харьков, Украина

УДК 615.256.5

Ключевые слова

плацентарная дисфункция; эссенциальные фосфолипиды; гравидопротекторы; липин; тетрахлорметан.

Резюме

На модели плацентарной недостаточности, вызванной тетрахлорметаном в период органогенеза у крыс, установлено выраженное гравидопротекторное действие препарата липин по способности предупреждать задержку внутриутробного развития плодов крыс и нормализовать морфологические нарушения в печени, почках и плаценте беременных крыс. По совокупности данных показателей исследуемый препарат липин превышает действие препарата сравнения эссенциале.

введение

Ведущей проблемой современного акушерства продолжает оставаться фетоплацентарная недостаточность [5], или, как сегодня принято употреблять термин, — плацентарная дисфункция (ПД) [3]. Среди всех осложнений беременности данная патология занимает второе место [10]. Для ПД характерны: гипоксия, недоношенность, задержка внутриутробного развития плода (ЗВУРП), респираторный дистресс-синдром [9]. Поэтому своевременная профилактика и лечение ПД играют важнейшую роль в создании оптимальных условий рождения здорового ребенка.

В современные схемы лечения входит целый ряд лекарственных препаратов, способных влиять только на отдельные звенья ПД. Назначение большого количества препаратов во время беременности может привести к появлению побочных эффектов у ребенка. В сложившейся ситуации актуальным вопросом остается использование препаратов, которые одновременно могли бы действовать на многие звенья патогенеза и имели бы минимальное количество побочных эффектов. В полной мере этим требованиям отвечают гравидопротекторы — лекарственные препараты, сохраняющие беременность и обеспечивающие благоприятные условия для внутриутробного развития плода. Одними из основных целей препаратов этой группы является способность нормализовать метаболи-

ческую, гемодинамическую, гормонсинтезирую-щую функции плаценты [2]. Арсенал препаратов с такими функциями очень ограничен. Учитывая это перед учеными стоит задача разработки и исследования эффективных и безопасных гравидо-протекторов, целью данной работы явилось изучение гравидопротекторного действия препарата «Липин» (ЗАТ «Биолек», м. Харьков, Украина), содержащего липосомальную форму эссенциальных фосфолипидов.

методика

Экспериментальные исследования выполнены в соответствии с «Общими этическими принципами экспериментов на животных» (Украина, 2001) в соответствии с положениями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985).

Для постановки эксперимента использовали беременных самок белых нелинейных крыс (массой 200-220 г), выращенных в виварии Центральной научно-исследовательской лаборатории Национального фармацевтического университета (Украина, г. Харьков). Все экспериментальные животные содержались в стандартных санитарных условиях. При отборе для эксперимента самок с установленным эстральным циклом в фазе эструс подсаживали к самцам в расчете 2 самки на 1 самца. Дату первого дня беременности определяли по наличию сперматозоидов в мазках беременных самок [6, 7].

Плацентарную недостаточность на фоне окси-дативного стресса вызывали путем введения беременным самкам крыс масляного раствора те-трахлорметана (СС14) (1:1) на 12, 13, 14 и 15-й дни беременности. Эти термины соответствуют периоду органогенеза у крыс. Токсин вводили крысам в утренние часы до приема еды внутрижелудочно в дозе 4 мл/кг в соответствии с методикой Губско-го Ю. И. и Позднякова В. С. в нашей модификации [1, 4, 8, 9,].

В эксперименте использовали 4 группы животных по 10 животных в группе. Животные первой

группы были интактным контролем, вторая группа — группа контрольной патологии с 12-го по 15-й дни беременности получала масляный раствор тетрахлорметана. Третьей группе самок на фоне введения тетрахлорметана вводили внутривенно препарат «Липин» в дозе 100 мг/кг в лечебно-профилактическом режиме с 11-го по 16-й дни беременности, четвертая группа на фоне введения тетрахлорметана получала препарат сравнения ЭссенциалеН внутривенно в дозе 30 мг/кг в аналогичном режиме. Эсеенциале так же, как и липин, содержит эссенциальные фосфолипиды, но не в ли-посомальной форме, и входит в современные схемы лечения плацентарной недостаточности и ге-стоза.

На 20-й день беременности под легким эфирным наркозом проводили эвтаназию и вскрытие самок. Плоды самок извлекали и изучали органо-метрические показатели внутриутробного развития: массу и кранио-каудальный размер (ККР). Исследовали также морфологические изменения в тканях плаценты, почках и печени беременных крыс.

Статистическую обработку проводили с помощью программы <^а^юа-5.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Одним из осложнений патологии гестации, в том числе плацентарной дисфункции является ЗВУРП. С целью установления фетопротекторно-го действия препарата липин, как составляющего гравидопротекторного действия, нами были исследованы показатели внутриутробного развития плодов крыс на модели тетрахлорметановой плацентарной недостаточности (табл. 1).

Как видно из данных таблицы 1, на модели те-трахлорметановой плацентарной недостаточности, кранио-каудальный размер крысят из выводка самок группы контрольной патологии достоверно уменьшился на 24 % в сравнении с животными ин-тактного контроля, что является свидетельством

Таблица 1. Органометрические показатели плодов крыс на модели плацентарной недостаточности

Группа животных Органометрические параметры

ККР, см Масса, г

Интактные животные 3,19 ± 0,03 2,62 ± 0,04

Контрольная патология 2,42 ± 0,03* 1,72 ± 0,03*

Липин 3,13 ± 0,04**@ 2,6 ± 0,03**@

ЭссенциалеН 2,66 ± 0,02*/** 1,93 ± 0,02*/**

Примечание. * — отклонение, статистически значимое по отношению к показателю группы интактного контроля, р < 0,05; ** — отклонение, статистически значимое по отношению к показателю группы контрольной патологии, р < 0,05; @ — отклонение, статистически значимое по отношению к показателю группы, которая получала ЭссенциалеН, р < 0,05.

нарушения развития плодов под действием токсиканта. В группе животных, получавших липин, кранио-каудальный размер крысят увеличился на 29 %. Что касается крысят из выводка самок, получавших эссенциале, то данный показатель увеличился всего на 10 %. Следовательно, по влиянию на нормализацию кранио-каудального размера препарат липин имеет преимущество по отношению к референс-препарату.

Произошли также существенные изменения массы плодов крысят. Так, введение тетрахлорметана беременным самкам крыс в период органогенеза способствовало снижению данного показателя на 34 % в сравнении с крысятами из выводка самок интактной группы, что также является существенным показателем задержки внутриутробного развития плодов. Достоверное увеличение массы плодов крысят наблюдалось в группе животных, получавших липин — на 51 %. Как и по влиянию на кранио-каудальный размер, так и по нормализации массы плодов, липин выявил достоверное преимущество по отношению к препарату сравнения эссенциале (под влиянием референс-препарата масса плодов крыс увеличилась лишь на 12 % в сравнении с группой контрольной патологии).

Учитывая вышесказанное, можно сделать выводы, что на модели тетрахлорметановой плацентарной недостаточности липин нормализует орга-нометрические показатели перинатального развития плодов крыс, достоверно превышая влияние препарата сравнения.

Наличие выраженного гравидопротекторного действия препарата подтверждается также морфологическими исследованиями печени, почек и плаценты беременных крыс. Результаты светлоопти-ческой микроскопии показали, что ткань печени самок интактного контроля имела типичную структуру (рис. 1 а). После введения тетрахлорметана беременным самкам крыс в период органогенеза у 75 % самок на 20-е сутки беременности обнаружены патологические изменения в гистоструктуре паренхимы печени, наиболее пораженными были центролобулярные и перипортальные зоны долек. Обнаружена средняя мелькокапельная жировая дистрофия, умеренная гидропическая дистрофия, некробиотические изменения клеток. В зонах поражения была нарушена радиальная направленность печеночных пластин. Пул двуядерных ге-патоцитов снижен, что свидетельствует о слабых регенераторных процессах в тканях печени этих животных. У остальных 25 % беременных самок изменения в паренхиме печени были минимальные (рис. 1 б). Введение липина способствовало полному структурному восстановлению паренхимы печени у 50 % беременных самок (рис. 1 в). У остальных животных сохранены слабые и еле заметные следы жировой дистрофии гепатоцитов, которые охватывают отдельные клетки или мелкие

Рисунок 1. Состояние печени крыс экспериментальных групп на модели тетрахлорметановой плацентарной недостаточности (а-г): а — интактная крыса; б — контроль патологии; в — лечение липином; г — лечение эссен-циале. Гематоксилин и эозин. х 250

Рисунок 2. Состояние почек крыс экспериментальных групп на модели тетрахлорметановой плацентарной недостаточности (а—з): а, д — интактная крыса; б, е — контроль патологии; в, ж — лечение липином; г, з — лечение эссенциале. Гематоксилин и эозин. х 250

группы клеток диффузно, по долькам. После введения по аналогичной схеме беременным самкам крыс препарата сравнения эссенциале в печени 50 % животных этой группы выраженность жировой дистрофии и гидропичной дистрофии, деструктивных проявлений была на уровне контрольной патологии. У остальных самок интенсивность сдвигов значительно снижена (рис. 1 г).

Почки интактных самок крыс отклонений от нормального состояния не имели (рис. 2 а, д). в отличие от них в почках большинства беременных самок, получавших тетрахлорметан, выявлены разной степени выраженности увеличение просвета капсулы клубочка почечных телец, увеличение размеров самих телец. Во многих клубочках капиллярные петли отечны, рисунок петель нечеткий,

что, вместе с дилатацией капсулы клубочков, является признаком нарушения гемодинамики в органе (рис. 2 б). в канальцевом аппарате прослеживали очаговую или диффузную (реже) гидропическую дистрофию нефроцитов проксимальных частей нефронов (рис. 2 е). У животных, которым вводили липин, размер почечных телец обычный (рис. 2 в). Отсутствуют дилатация капсулы клубочков, явления гидропичной дистрофии сведены к минимуму (рис. 2 ж). В почках беременных самок группы, получавшей эссенциале, наблюдались те же характерные изменения почечных телец и проксимальной части канальцев нефронов, что и описанные выше. Интенсивность этих изменений у 33 % животных практически отвечала контрольной патологии (рис. 2 г, з).

Непосредственным органом-мишенью при ПД является плацента. Представляло особый интерес проследить изменения в ней в условиях токсического поражения тетрахлорметаном. В плаценте интактных крыс четко определяется материнская часть с децидуальной тканью и фетальная, которая представлена трофоспонгиумом и лабиринтом синтициальной структуры. Децидуальная оболочка содержит в основном мелкие фиброциты и материнские сосуды, от подлежащего слоя она отделена слоем гигантских клеток, погруженного в фибриноид. Для трофоспонгиума характерно наличие «гликогенных» клеток, которые часто группируются в целые поля. Содержание гликогена оценивали в 3,5 балла. Основная масса плаценты приходится на разрыхленную ткань лабиринтной зоны. Для лабиринта здоровой плаценты характерно большое количество фетальных сосудов, местами ограниченных от материнских лакун

только тонкими прослойками трофобластическо-го синцития и вкрапленными крупными клетками трофобласта (рис. 3 а). И в материнской, и в плодовой частях обнаруживается гликоген, содержание которого оценивали в 3,75 бала. В пустотах фетальных сосудов много ядерных эритроцитов, которые имеют более крупные, нежели материнские клетки, размеры. Данные морфометрии разных зон плаценты крыс экспериментальных групп приведены в таблице 2.

Введение тетрахлорметана беременным самкам вызывает значительное повреждение структуры плаценты. Достоверно уменьшается в сравнении с интактным контролем относительный объем децидуальной оболочки (на 40 %) и лабиринтного отдела (на 30 %) (см. табл. 2). Обнаруживаются признаки воспаления, островки гликогенных клеток большей частью разрушены, на их месте обнаруживаются пустоты. Гигантские клетки дистрофично изменены. В плодовых сосудах обнаруживали деструкцию и элиминацию хориального эпителия, перераспределение кро-вонаполнения сосудов в разных зонах плаценты. Более массивные отложения фибриноида наблюдаются на границе трофоспонгиума и лабиринта, что свидетельствует о напряжении адаптивных процессов в органе. Хориальная структура лабиринтного отдела уплотнена, фетальные сосуды малочисленны и малокровны (рис. 3 б), встречаются плодовые сосуды, в которых в результате деструкции и элиминации хориального эпителия стенки буквально истончены, просветы их расширены и пусты (рис. 3 в).

Введение беременным самкам липина и эс-сенциале на фоне сформированной недостаточ-

Рисунок 3. Участок лабиринта плаценты крыс экспериментальных групп на модели тетрахлорметановой плацентарной недостаточности (а—е): а — интактная крыса; б, в — контроль патологии; г — лечение липином; д, е — лечение эссенциале. Гематоксилин и эозин. х 400

Таблица 2. Органометрические показатели плодов крыс на модели плацентарной недостаточности

Показатели Группы животных

Интактный контроль Контрольная патология ЭссенциалеН Липин

Ширина децидуальной оболочки, мм 0,27 ± 0,029 0,16 ± 0,23* 0,16 ± 0,027* 0,19 ± 0,037*

Ширина промежуточного слоя, мм 0,48 ± 0,047 0,41 ± 0,024 0,52 ± 0,064 0,50 ± 0,042

Ширина либиринтного слоя, мм 2,44 ± 0,11 1,89 ± 0,059* 2,13 ± 0,11** 2,31 ± 0,08**

Содержание гликогена в промежуточной зоне, баллы 3,50 2,0* 2,50 3,28**

Содержание гликогена в лабиринте, баллы 3,75 1,50* 2,66 3,57**

Примечание. * — отклонение, статистически значимое по отношению к интактному контролю (р < 0,05); ** — отклонение, статистически значимое по отношению к контрольной патологии (р < 0,05).

ности плаценты корректируют ее патологическое состояние. Степень коррекции отличается в разных экспериментальных группах. После введения референс-препарата эссенциале морфологические изменения в плаценте, как и ранее встречались, но не были постоянными и часто выраженными. Относительный объем децидуальной оболочки снижен до уровня контрольной патологии, объем трофоспонгиума увеличивается до интактных показателей. Что касается ширины лабиринта, то она является большей, нежели у крыс с контрольной патологией, хотя еще отличается от интактного контроля (табл. 2). Морфология слоев вариабельна. В 60 % плацент морфология приближается к норме. Плодовые капилляры многочисленны. Уровень их кровенаполнения не отличаются от ин-тактной группы (рис. 3 е, д). У 40 % плацент в группе животных, получавших эссенциале, еще наблюдаются дегенеративно-воспалительные явления: умеренная лейкоцитарная инфильтрация, которая не проникает глубже децидуа, уплотнена структура лабиринта. Воспалительные явления не обнаружены. Отложения гликогена приближаются к показателям интактных животных.

Введение липина беременным самкам повышает ширину децидуального слоя, который играет трофическую и защитную роль в системе плацента-плод, хотя она все ж таки достоверно отличается от интактных показателей. Морфология трофо-спонгиума соответствует норме. Препарат в этой дозе способствует восстановлению размеров лабиринтного отдела, его относительный объем достоверно повышается в сравнении с нелеченным контролем и не отличается от интактного. Морфология слоев у 80 % плацент близка к физиологической норме. Фетальная васкуляризация в сравнении с контрольной патологией увеличивается, просветы плодовых капилляров достаточно широки (рис. 3 г). Не обнаружено изменений в локализации и характере отложения гликогена в сравнении с интактным контролем. У 20 % плацент еще встречаются остаточные явления в виде переполненных кровью фетальных сосудов, но стенки их имеют нормальную толщину.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Основываясь на полученных в ходе исследования данных о наличии у препарата липин гравидо-протекторного действия, следует сделать следующие обобщения. Модель тетрахлорметановой плацентарной недостаточности сопровождается ЗВУРП, что проявляется снижением таких показателей как кранио-каудальный размер и масса плодов. Введение липина беременным самкам нормализует данные показатели, проявляя выраженное фетопротекторное действие, как одно из важнейших составляющих гравидопротекторного действия. Полученные результаты морфологического исследования также подтверждают данные заключения. Введение беременным самкам в период органогенеза тетрахлорметана вызывает у них характерные для этого токсина микроскопические изменения. В печени — это жировая и ги-дропичная дистрофия гепатоцитов, деструкция архитектоники центролобулярных и перипорталь-ных зон печеночных долек. Спонтанные репара-тивные процессы в печени протекают вяло. В почках самок крыс обнаружены гидропичная дистрофия нефроцитов проксимальной части канальцев нефронов, нарушения гемодинамики почек. В плаценте введение тетрахлорметана привело к значительным деструктивно-дистрофическим и воспалительным нарушениям хориального эпителия лабиринтного отдела, что можно расценить как проявление плацентарной недостаточности. Введение липина нормализовало микроскопическую картину печени, почек и плаценты. Выраженность жировой дистрофии в печени снизилась в 5 раз, интенсивность деструкции паренхимы уменьшалась в 12,5 раз. Регенераторные процессы активизировались, вследствие чего показатели гистограммы в значительной степени приближались к таковым у самок с физиологически протекающей беременностью. В почках животных под влиянием липина выражено уменьшалась ги-дропичная дистрофия нефроцитов проксимальной части канальцев нефронов, стабилизирова-

лись гемодинамические процессы. Липин достоверно превышал препарат сравнения по всем исследуемым показателям, которые характеризуют морфофункциональное состояние печени, почек и плаценты беременных крыс.

Проведенные морфометрические исследования и изучение влияния на показатели внутриутробного развития плодов свидетельствует о наличии у препарата липин выраженного гравидо-протекторного действия, превышающего действие референс-препарата.

лИТЕРАТУРА

1. Губский Ю. И. АТФ-азная активность митохондрий печени крыс при остром отравлении тетрахлорме-таном // Укр. биохим. журн. — 1982. — Т. 54, № 1. — С. 46-50.

2. Зайченко А. В., Рыженко И. М., Кудина О. В. и др. Современные аспекты фармакологической коррекции плацентарной дисфункции // Провизор. — 2008. — № 9. — С. 47-51.

3. Коколина В. Ф., Картелишев А. В., Васильева О.А. Фетоплацентарная недостаточность (патогенез, диагностика, профилактика): руководство для врачей. — М.: ИД Медпрактика-М, 2006. — 224 с.

4. КудЫа О. В. Фармаколопчне вивчення гравщопротек-торних властивостей бурштиновоУ кислоти: мапстер. робота. — Харьков, 2005. — 63 с.

5. Малевич Ю. К. Фетоплацентарная недостаточность. — Минск: Беларусь, 2007. — 158 с.

6. Докл^чы дослщження лкарських засобiв: метод. рек./за ред. О. В. Стефанова. — Киев: Авщена, 2001. — 528 с.

7. Методичн рекомендацп по експериментальному вив-ченню ембрютоксичноУ дм лкарських засобiв. — Киев,

2000. — 42 с.

8. Радзинский В. Е., Смалько П. Я. Биохимия плацентарной недостаточности: моногр. — М.: Изд-во РУДН,

2001. — 273 с.

9. Сидорова И. С., Билявская О. С., Микитина Н. А. и др. Оценка степени тяжести гестоза (по данням литературы) // Акушерство и гинекология. — 2008. — № 3. — С. 40-43.

10. Сидорова И. С. Поздний гестоз. — М., 1996. — 236 с.

EXPERiMENTAL iNVESTiGATiON OF THE LiPiN GRAViDOPROTECTiVE ACTiON iN THE MODEL OF PLACENTAL DiSFUNCTiON CAUSED BY OXi-DATiVE STRESS

Kudina O. V.

♦ Summary: In the model of placental insufficiency caused by tetrachlormethane during organogenesis in rats, a pronounced effect of the gravidoprotective drug lipin was found assessed in their ability to prevent intrauterine growth retardation of rats and to normalize the morphological changes in the liver, kidney and placenta of pregnant rats. The drug lipin exceeds the reference drug essentiale on the sum of these indicators.

♦ Keywords: placental dysfunction; essential phospholipids; gravidoprotectors; lipin; tetrachlormethane.

♦ Информация об авторах

Кудина Олеся Викторовна — канд. фарм. наук. Национальный Kudina Olesya Viktorovna — PhD. Department of Pharmacology.

фармацевтический университет. 61002 г. Харьков, Украина, ул. National University of Pharmacy. Ukraine, Kharkiv, 61002, Melniko-

Мельникова, 12. E-mail: farmacol@ukrfa.kharkov.ua va street,12. E-mail: farmacol@ukrfa.kharkov.ua