УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ ХАРАКТЕРИСТИК КЛЕТОК МЕТОДОМ ЛАЗЕРНОЙ ДИФРАКЦИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА

Область техники
Заявляемое техническое решение относится к функциональной оценки форменных элементов крови, в которой совмещаются различные методы анализа (лазерная дифракция, флуоресцентный анализ) и может быть использовано клинико-диагностическими лабораториями медицинских учреждений для выполнения диагностики предтромбоза и тромботических состояний, диагностики анемий различной этиологии, фармацевтическими предприятиями для тестирования действия фармпрепаратов и научными лабораториями для исследования молекулярных механизмов функционирования клеток крови и принципов организации сигнальных систем.
Уровень техники
Известны устройства лазерных анализаторов клеток, основанных на принципах лазерной дифракции, достаточно хорошо известна и представлена рядом патентов (патент USA №3,563,660, 1971 г., патент USA №4,348,111, 1982 г., патент USA №4,387,993, 1983 г., патент USA №4,842,406, 1989 г., патент USA №4,957,363, 1990 г., патент USA №5,105,093, 1992 г., патент USA №5,426,501, 1995 г., патент USA №6,999,171, 2006 г.). Практически во всех лазерных анализаторах измерение происходит по следующей схеме: предварительно готовится суспензия клеток и далее водяным потоком суспензия пропускается через проточную кювету, облучаемую лазером. Этот способ хорошо себя зарекомендовал для определения размеров клеток минерального и техногенного характера, но плохо подходит для цитологических исследований. Для проведения кинетических исследований клеток, предпочтительной выглядит схема, когда клеточная суспензия непрерывно перемешивается и термостатируется, что предопределяет изменение стандартной проточной схемы реализованной в лазерных анализаторах клеток.
Для цитологических исследований одновременная регистрация светорассеяния и флуоресценции используется в проточных цитометрах. Метод проточной цитометрии является мощным информационным методом клеточного анализа, детектирующий интенсивность светорассеяния и флуоресценции, пролетающих в потоке клеток, и представлен в большом количестве патентов (патент USA №4,284,412, 1981; патент USA №4,673,288, 1987; USA №5,540,494, 1996; патент USA №5,559,037, 1996; патент USA №5,994,089, 1999; патент USA №7,485,433 2009; патент USA №9,671,326, 2017; патент USA №10,094,76, 2018;). Однако метод проточной цитометрии ограничен в оценке размеров клеток, - для крупных клеток (>10 мкм) сигнал не пропорционален размеру. Это обусловлено тем, что сигнал светорассеяния «вперед» регистрируется широкоапертурным фотодетектором, не захватывающий область углов меньше 2 градусов. Помимо этого, метод проточной цитометрии достаточно сложно применять для кинетических исследований.
В качестве прототипа устройства выбрано устройство, описанное в патенте на изобретение RU2391665C1 (Миндукшев И.В. Способ определения агрегационной активности тромбоцитов и устройство для его осуществления. Патент RU 2391665 С1 от 2008.12.29, заявка №2008153058 С1, класс МПК G01N 33/49). В качестве источника излучения в прототипе используется полупроводниковый лазер, луч света фокусируется в коллиматоре и проходит через кювету, в которую помещена суспензия клеток (тромбоцитов). Кювета снабжена перемешивающим устройством, состоящая из перемешивающего волчка (stirring bar) и магнитной мешалки, обеспечивающей перемешивание. Рассеянный клетоками (тромбоцитами), свет регистрируется множеством фотодиодов, электрический сигнал с которых усиливается и преобразовывается в АЦП, и далее поступает на компьютер.
Недостатком прототипа является отсутствие флуоресцентного детектора, и как следствие, невозможность проводить исследования клеток с использованием флуоресцентых зондов (меток), позволяющих более качественно характеризовать свойства клеток. Кроме того, дополнительным недостатком прототипа является отсутствие системы термостатирования, что существенно для биологических исследований.
Основной задачей заявляемого технического решения является возможность функционального тестирования клеток в условиях их трансформации с использованием флуоресцентых красителей (флуорохромов), что обеспечивает качественное описание нарушений функциональных свойств клеток.
Раскрытие сущности технического решения
Техническим результатом является разработка устройства для измерения характеристик клеток методом лазерной дифракции и флуоресцентного анализа, содержащее: лазер, ось которого проходит через измерительную кювету, находящуюся в кюветном отделении; средства перемешивания; приемник излучения; электронный блок, включающий плату усилителей и аналого-цифровой преобразователь, где кюветное отделение снабжено термостатом, при этом в перпендикулярном направлении от оси лазера расположен флуоресцентный детектор, а дополнительно введенный блок обработки выходного сигнала выполнен в виде компьютера, позволяющего на основании данных по индикатрисе рассеяния, рассчитать распределение клеток по размерам.
Указанное техническое решение обеспечивает возможность:
- определять размер клеток и регистрировать кинетику трансформации клеток с использованием метода лазерной дифракции, за счет введения блока обработки выходного сигнала выполненного в виде компьютера,
- определять интенсивность флюоресценции специализированных красителей (флуорохромов), специфически связанных с определенными клеточными компонентами (рецепторы, поверхностные антигены, внутриклеточные белки), находящимися на поверхности или внутри клеток за счет введения флуоресцентного детектора.
- регистрирования кинетики изменения физиологических параметров клетки (внутриклеточная концентрация ионов кальция, потенциал клеточной мембраны, внутриклеточный РН), за счет введения термостата, флуоресцентного детектора и блока обработки выходного сигнала выполненного в виде компьютера.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 - структурная схема устройства.
На фиг. 2 - сборочный чертеж устройства с введенной оптической плитой А) вид спереди, Б) вид сверху.
На фиг. 3 - оптическая платформа (вид сверху), (А) - с кожухом детектора, (Б) - со снятым кожухом детектора.
На фиг. 4 - запись эксперимента определения стандарта КМК 045 (А) и расчет функции распределения клеток по размерам для этого стандарта (Б).
На фиг. 5 - калибровка значений внутриклеточного pHi эритроцитов человека, прокрашенных рН-флуорофором BCECF-AM. (А) - Запись флуоресценции, регистрируемая в 4 каналах FL1 (527 нм), FL2 (578 нм), FL3 (625 нм), FL4(692 нм), клеток, обработанных калиевым ионофором Nigericin (20 мкМ), при последовательном снижении внеклеточного рН (Б) - Зависимость флуоресценции в канале FL1 (527 нм) от внутриклеточного рН клеток.
На фиг. 6 - оригинальная запись динамики внутриклеточного кальция (красная линия), изменения формы (shape change - зеленая линия) и агрегации (синяя линяя) при стимулировании тромбоцитов 500 нМ АДФ (25оС). Клетки нагружены Fluo-ЗАМ. Показаны данные для тромбоцитов двух доноров (А) и (Б).
Осуществления технического решения
Пример реализации технического решения отражен на фиг. 1-6, где на фиг. 1 основу прибора представляет технология лазерной дифракции, реализуемая в лазерных анализаторах клеток. В предлагаемом устройстве, совмещаются методы: анализ методом лазерной дифракции обеспечивается детектором малоуглового светорассеяния в прямом направлении с 28 фотодиодами в области углов 0÷12 градусов, флуоресцентный анализ - 4 каналами регистрации с различными оптическими фильтрами.
Устройство иллюстрируется структурной схемой (фиг. 1), где отображены функциональные связи его составных частей. Модуль излучателя (МИ), состоящий из драйвера излучателя и самого излучателя (лазера), генерирует видимое когерентное излучение, которое, попадая на объект исследования в кюветном отделении (КО), рассеивается. Рассеянное излучение попадает на блок фотодетектора (ФотД). Возбужденное излучение (флуоресценция) под прямым углом (по отношению к основному лазерному излучению) регистрируется флуоресцентным детектором (ФлД), что обеспечивает определение интенсивности флюоресценции специализированных красителей (флуорохромов) специфически связанных с определенными клеточными компонентами клеток.
Модуль излучателя представлен полупроводниковым лазером с резонатором Фабри-Перо, совмещенный с коллиматором оптоволокном. Лазер упакован в микромодуль, содержащий элемент Пельтье. Микромодуль вставлен в плату управления, формирующую ток для лазера и осуществляющую термостабилизацию.
Блок фотодетектора (ФотД) представлен 28 каналами: фотодиодами, расположенными в области малых углов 0÷12 градусов. Схема каждого канала содержит в себе трансимпедансный усилитель, сопротивление обратной связи которого определяет коэффициент усиления. Плата блока фотодетектора осуществляет измерение рассеянного излучения от объекта исследования в 28 углах, преобразование полученных измерений в цифровой вид, и передача данных в центральный контролер.
Флуоресцентный детектор (ФлД) измеряет флуоресценцию меток в биологической пробе, возникающую под воздействием лазерного излучения. Оптический сигнал снимается в кюветном отделении оптоволоконным кабелем под углом 90° к оси излучения. Оптический сигнал в кабеле расщепляется на 4 канала и поступает в 4-канальный фотодетектор. Каждый канал фотодетектора содержит предустановленный светофильтр с определенной длиной волны. Выходные аналоговые сигналы поступают на АЦП каналов 28-31 основного фотодетектора. Все четыре каналы ФлД идентичны между собой. В качестве приемника излучения (VD1) используется кремниевый фотоумножитель, состоящий из массива микроячеек лавинных фотодиодов с шунтирующими резисторами. Выходной сигнал является суммой выходных сигналов с каждого фотодиода.
Блок кюветного отделения предназначен для помещения, перемешивания, термостатирования и облучения исследуемой суспензии клеток, и содержит вспомогательные элементы: мешалку M1, датчик температуры Т1 (ДТ), термоэлектрический модуль ТЭМ1 (ТЭМ). Мешалка M1 обеспечивает перемешивание жидкой фазы и удержание измеряемых клеток во взвешенном состоянии. Скорость мешалки изменятся в широких пределах, в зависимости от размера клеток и режима работы прибора. ТЭМ должен обеспечивать нагрев/охлаждение в пределах 5°С ÷ 50°С в КО и стабилизацию заданной температуры с точностью 0.1°С. Информация о температуре снимается с ДТ.
Контроль и управление МИ и элементами блока КО осуществляет контроллер управления (КУ). КУ формирует управляющие сигналы, получая и обрабатывая информацию от центрального контроллера и датчиков ФотД и ФлД, используя заложенные алгоритмы. КУ так же формирует электропитание МИ, передает контрольную информацию об элементах, которыми управляет, а также информирует центральный контроллер о нештатных ситуациях.
Центральный контроллер (ЦК) осуществляет общий контроль и управление работой прибора. Основной задачей ЦК является формирование управляющих сигналов для работы блоков ФоД и ФлД, получения с него данных, их первичная обработка, формирование пакетов для передачи обработанных данных и контрольной информации на встроенный компьютер для дальнейшей обработки. ЦК также формирует пакеты для КУ, задавая параметры и режимы работы по заложенным алгоритмам, а также принимает и обрабатывает контрольную информацию. Взаимодействие ЦК и КУ осуществляется посредством шины SPI.
Центральный контроллер (ЦК) является основным управляющим компонентом системы. Он осуществляет управление всеми компонентами прибора непосредственно или через плату исполнительных устройств, производит необходимые вычисления, обеспечивает интерфейс взаимодействия с пользователем. ЦК также обеспечивает взаимодействие с компьютером. Непосредственно к ЦК подключен встроенный дисплей и сенсорная панель, с помощью которых пользователь взаимодействует с прибором. Для встроенного дисплея ЦК формирует управляющие сигналы, а также осуществляет управление подсветкой. Для взаимодействия ЦК с платой исполнительных устройств используется шина SPI. По ней от ЦК передаются команды на включение/выключение исполнительных устройств и параметры, определяющие режимы их работы. В обратном направлении принимаются данные, позволяющие определить состояние некоторых исполнительных устройств. Для защиты шины от помех внутри устройства и повышения надежности ее работы передача осуществляется по дифференциальным каналам. Взаимодействие прибора с компьютером ЦК осуществляет по шине USB 2.0. Шины имеют гальваническую развязку для обеспечения ЭМС, защиты прибора от внешних электрических воздействий.
Плата исполнительных устройств (ПИУ) принимает пакеты данных по SPI и транслирует их по обычному каналу SPI другим устройствам, содержащим SPI-интерфейс, или с помощью драйверов формирует управляющие сигналы на исполнительные устройства. ПИУ содержит 2 драйвера излучателей, которые формируют питание излучателей, управляют их состоянием и обеспечивают стабильность их работы. ПИУ управляет элементами блока кюветного отделения (КО) в состав которого входят:
- мешалка M1 - осуществляет перемешивание суспензии клеток с заданной скоростью;
- термоэлектрический модуль ТЭМ1 с вентилятором В1 - поддерживают заданную температуру рабочей среды и являются исполнительными органами программного регулятора температуры;
- 2 датчика температуры Т1, Т2 - измеряют температуру рабочей среды и являются элементами обратной связи для программного регулятора температуры.
Сборочный чертеж предлагаемого устройства представлен на фиг. 2 - вид спереди и вид сверху. Центральным связующим звеном анализатора является оптическая платформа (фиг. 2, 3), на которой располагаются узел юстировки лазера, кюветное отделение, на расстоянии 550 мм от кюветы расположен фотодетектор. К юстировочному узлу световодом подводится когерентное излучение лазера. Слева от оси лазерного излучения к кюветному отделению крепится элемент Пельтье, посредством которого осуществляется термостатирование кюветы. Справа световод флюоресцентного детектора - под 90 градусов по отношению к оси лазера. Под кюветным отделением располагается шаговый двигатель с магнитным приводом для перемешивания кюветы. Оптическая платформа не жестко соединяется с корпусом прибора, а крепится на демпферных резинках в четырех точках, что позволяет защитить ее от вибраций и напряжений, поступающих от корпуса. Модуль излучателя (лазер) располагается на площадке, отдельной от оптической платформы, и излучение от лазера передается в кюветное отделение через оптоволокно (световод). Лазер упакован в микромодуль, содержащий элемент Пельтье. Микромодуль вставлен в плату управления, формирующую ток для лазера и осуществляющую термостабилизацию. Световод, через который излучение передается в кювету, крепится в юстировочном узле, где оптоволокно совмещается с коллиматором. Расположение оптического детектора на значительном расстоянии от кюветы (550 мм) обусловлено необходимостью регистрации сигнала шагом в 0.1 градус в области углов 0÷2 градуса. Фотодетектор представлен 28 оптическими сенсорами. Флуоресцентный сигнал снимается в кюветном отделении оптоволоконным кабелем под углом 90° к оси излучения. Оптический сигнал в кабеле расщепляется на 4 канала и поступает в 4-канальный фотодетектор.
Для определения функции распределения клеток, по размерам разработан оригинальный алгоритм решения обратной задачи, реализованный как программный продукт для компьютера. Поэтапно поиск решения выглядит следующим образом:
- определяется значимая часть индикатрисы;
- на основании значимой части индикатрисы вычисляется «угловой параметр», связанный с размером клеток аналитической калибровочной функцией;
- данная калибровочная функция устанавливается на основании предъявления стандартов;
- по найденному «угловому параметру» вычисляется средний диаметр клеток и функция распределения клеток по размерам;
- по найденной функции распределения клеток по размерам вычисляется индикатриса с использованием уравнений теории Ми;
- вычисленная индикатриса сравнивается с экспериментально найденной индикатрисой;
- на основании этого сравнения варьируются функции распределения клеток по размерам таким образом, чтобы вычисляемая индикатриса наиболее близко соответствовала экспериментально найденной.
Заявляемое устройство было апробировано на клетках корунда (стандарт ВНИИМ им. Д.И. Менделеева) и на клетках крови (тромбоциты, эритроциты) с использованием внутриклеточных флуоресцентных красителей для детекции внутриклеточного кальция - Fluo3-AM и внутриклеточного рН - BCECF-AM. Для испытаний был использован прибор (устройство) с голубым лазером λ=495 нм и четырьмя флуоресцентными каналами с фильтрами: 527 нм (FL1), 578 нм (FL2), 625 нм (FL3), и 692 нм (FL4).
Реализация технического решения поясняется на следующих примерах:
Пример 1. Определение распределения клеток, по размерам.
На фиг. 4 показана запись эксперимента и расчет функции распределения клеток по размерам для стандарта КМК045 (ВНИИМ им. Д.И. Менделеева) с D50=45.6 мкм, с использованием приведенного выше алгоритмом. На записи три окна, в левом окне представлена интенсивность светорассеяния в каналах, находящихся в области углов 1.5÷12 градусов, посередине - 0.1÷1 градус, и в правом окне. Оценка размеров, сделанная на устройстве, с хорошей точностью (>5% относительной ошибки) воспроизводит стандарт КМК 045. Данный пример демонстрирует возможности использования блока обработки выходного сигнала выполненного в виде компьютера.
Пример 2. Исследования внутриклеточного рН (pHi) эритроцитов человека.
6
В проведенных исследованиях использовалась венозная кровь здоровых доноров, собранная в вакутейнеры с ЭГТА в качестве антикоагулянта. Образцы суспензии эритроцитов получали после двукратной промывки (центрифуга СМ-50, Elmi, Латвия; 350g) изотоническим ХЕПЕС-буфером (рН 7.4, 300 мОсм). Отмытые эритроциты (1×10 кл/мл) инкубировали 30 мин в термошейкере TS-100 Biosan при 37°С, и встряхивании, с конечной - красителя BCECF-AM 5 μМ. После нагрузки BCECF-AM клетки 3 раза отмывали в изотонической солевой среде. Калибровка внутриклеточного рН была выполнена нигерициновым методом. Эритроциты, нагруженные BCECF-AM, инкубировали с калиевым ионофором Nigericin (20 mkM) в течение 5 мин, затем помещали клетки в калиевый буфер (полное замещение NaCl на KCl) с начальным значением рН=7.6. Последующее фиксированное изменение рН достигалось последовательным внесением 1N соляной кислоты. При достижении критических значений рН=3.6 наблюдали лизис эритроцитов, приводящий к выходу краски из эритроцитов и значительному повышению флуоресценции (фиг. 5, А). Зависимость флуоресценции BCECF от pHi в разных диапазонах рН имеет различный характер и можно выделить два участка: в диапазоне 6.8÷7.6 и 4.0÷6.4 (фиг. 5, Б). Для цитологических исследований важен, первый диапазон 6.8÷7.8.
Пример 3. Определение внутриклеточной концентрации ионов кальция [Ca2+]i в тромбоцитах человека
7
Кровь бралась от здоровых доноров и собиралась в пробирку с цитратным буфером (12 mM citric acid, 15 mM sodium citrate, 25 mM D-glucose, 2 μM EGTA). Плазму, обогащенную тромбоцитами (PRP), получали при центрифугировании 330 g в течение 7 мин, которую затем центрифугировали при 430g (2,5 мин). При исследованиях тромбоцитарная плазма (PRP) ресуспендировалась в HEPES буфере (рН 7.4, 300 мОсм). Нагрузка тромбоцитов Fluo-3АМ - зондом для измерения внутриклеточного кальция [Ca2+]i. В 500 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) вносили 5 мкл Fluo-3АМ (2mM), и инкубировали в спокойном состоянии в течение 1 часа при 25°С. Далее при эксперименте прокрашенная плазма (PRP) ресуспендировалась в HEPES буфере, конечная концентрация тромбоцитов 1×10 кл/мл. Наши предыдущие исследования показали, что процесс изменение формы клеток (shape change) регистрируется методом лазерной дифракции, как повышение интенсивности светорассеяния в области углов: 8÷12 градусов. Агрегация регистрируется как повышение сигнала в малоугловой области: 0.5÷4 градуса (Патенте RU 2391665 C1). На фиг. 6 представлены оригинальные записи динамики внутриклеточного кальция (красная линия), изменения формы - shape change (зеленая линия) и агрегации тромбоцитов (синяя линяя) для тромбоцитов двух доноров. Внутриклеточный кальций регистрировали как флуоресценцию Fluo-3 в фильтре F1 (527 нм), shape change - как увеличение интенсивности светорассеяния в угле 12 градусов, агрегацию - как увеличение интенсивности светорассеяния в угле 1 градус. В ответ на стимуляцию АДФ в тромбоцитах наблюдалось резкое повышение внутриклеточного кальция с последующим значительным снижением. У тромбоцитов разных доноров наблюдался различный характер динамики изменения сигнала, так у тромбоцитов донора Б, наблюдался двухфазный характер ответа, - после первичного снижения сигнала, наблюдается вторая волна повышения кальция. В проведенных исследованиях хорошо видно, что три регистрируемых процесса (повышение Са2+, активация, агрегация) происходят последовательно друг за другом.
Представленные примеры применения устройства показывают возможность использования его для определения распределения клеток по размерам с использованием блока обработки выходного сигнала выполненного в виде компьютера (Пример 1), и в условиях термостатирования определение интенсивности флюоресценции специализированных красителей (Пример 2 и Пример 3) с использованием термостата и флуоресцентного детектора.
Заявляемое техническое решение обеспечивает возможность определять размер клеток и регистрировать кинетику трансформации клеток с использованием метода лазерной дифракции; а также одновременно определять интенсивность флюоресценции специализированных красителей (флуорохромов), специфически связанных с определенными клеточными компонентами (рецепторы, поверхностные антигены, внутриклеточные белки) и регистрировать кинетику изменения физиологических параметров клетки (внутриклеточная концентрация ионов кальция, потенциал клеточной мембраны, внутриклеточный рН).