СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МОНОЦИТОВ
METHOD FOR EVALUATING THE PRO-INFLAMMATORY ACTIVITY OF MONOCYTES

Изобретение относится к области медицины, а более конкретно к области клинической иммунологии, и может использоваться, например, в клинических исследованиях, направленных на определение роли моноцитов с провоспалительной активностью в развитии различных заболеваний.
++
-
+
+
++
-
+
+
Моноциты являются наиболее крупными клетками крови (диаметр около 9-15 мкм) и выполняют в организме важные функции. Они состоят по крайней мере из двух фенотипически различных субпопуляций, которые обладают различными видами активности, например, фагоцитарной активностью («классические моноциты» с фенотипом CD14/CD16), или антигенпредставляющей и провоспалительной активностью («неклассические моноциты» с фенотипом CD14/CD16). При этом у здоровых людей CD14/CD16 моноциты составляют более 95% моноцитов периферической крови, а субпопуляция моноцитов с фенотипом CD14/CD16составляет соответственно около 5%.
Известны различные способы оценки активности моноцитов, включающие операции, связанные с выделением моноцитов из периферической крови и их последующим анализом.
Методы выделения моноцитов из крови достаточно разнообразны, но основные методические приемы преимущественно связаны с выделением моноцитов в составе мононуклеарных клеток центрифугированием в градиенте плотности с последующим фракционированием чистой популяции моноцитов, основанным на способности моноцитов прилипать к стеклу или пластиковой поверхности (например, Ковальчук Л.В. и др. Иммунология. Практикум. М., «ГЕОТАР-Медиа», 2010, с. 27-28).
Методы анализа активности моноцитов также разнообразны и связаны с оценкой функционального состояния разных субпопуляций моноцитов.
Известен, например, способ оценки фагоцитарной активности моноцитов крови человека, в котором из суспензии мононуклеарных клеток, выделяемых из венозной крови человека в градиенте плотности фиколл-верографина, с использованием прилипания к стеклу получают препарат моноцитов, инкубируют с опсонизированными частицами зимозана, окрашивают по Романовскому, микроскопируют в световом микроскопе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток и по их количеству, равному 94,8±4,7%, определяют функциональное состояние моноцитов крови как нормальное (RU 2089899 С1, 1997). Способ позволяет оценить функциональное состояние моноцитов крови здоровых людей и его нарушение при патологии. Однако этот способ не позволяет определить количество моноцитов с провоспалительной активностью, которые осуществляют в организме воспалительные реакции и участвуют в механизмах развития хронического иммунного воспаления.
+
+
+
Известны способы оценки провоспалительной активности моноцитов, основанные преимущественно на измерении количества моноцитов с фенотипом CD14/CD16методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител у здоровых людей и у больных с разными соматическими заболеваниями (например, Waschbisch A. et al. Pivotal Role for CD16 Monocytes in Immune Surveillance of the Central Nervous System. «The Journal of Immunology», 2016, v. 196, №4, p. 1558-1567). Основной недостаток этих способов заключается в их высокой трудоемкости и необходимости использования сложного дорогостоящего оборудования.
+
+
6
6
-
+
+
2
Из известных способов наиболее близким к предложенному является способ оценки провоспалительной активности моноцитов, включающий выделение моноцитов в составе мононуклеарных клеток из периферической венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина с последующим наслаиванием в чашки Петри, отделением прилипших клеток и их разведением, и проведение анализа полученной взвеси моноцитов (Васильева Е.Ф. и др. Оценка уровня субпопуляции моноцитов CD14/CD16у больных с юношескими депрессиями. «Медицинская иммунология», 2019, т. 21, №2, с. 257-268). В этом способе выделенные центрифугированием в градиенте плотности фиколл-урографина мононуклеарные клетки разводят в питательной среде 1640 с глутаматом (ПанЭко, РФ). Взвесь мононуклеарных клеток наслаивают в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм (Nunclon, Delta, Denmark) и инкубируют в CO инкубаторе до концентрации 5×10/мл при температуре 37°С в течение 1 часа, затем сливают надосадочную жидкость, а прикрепившиеся клетки (моноциты) открепляют со дна чашки Петри с помощью охлажденного раствора Версена (ПанЭко) в течение 20 минут. Полученные клетки отмывают средой 1640 с добавлением 10% FCS (Serva, USA) и разводят до концентрации 1.10/мл в среде 1640. Полученную таким образом взвесь моноцитов используют для последующего анализа. При этом проводят фенотипирование методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител CD16FITCH и CD14-PE, которые добавляют к выделенным моноцитам. Цитофлуориметрический анализ выполняют на проточном лазерном цитофлуориметре FC-500 (Beckman Coulter, USA), оценивая уровень субпопуляции моноцитов с провоспалительной активностью с фенотипом CD14/CD16. Уровень моноцитов с провоспалительной активностью оценивают в процентах относительно общего количества моноцитов, которое принимают за 100%.
+
+
Этот способ позволяет оценивать провоспалительную активность моноцитов. Однако он является сложным, имеет высокую трудоемкость и требует использования дорогостоящего и сложного в настройке оборудования, для обслуживания которого и работы на нем необходима высокая квалификация оператора. Проточный цитофлуориметр требует проведения его первоначальной настройки с участием представителя фирмы-изготовителя. Работа на нем также требует проведения до начала анализа каждого образца трудоемких настроек программного обеспечения. Для проведения анализа на проточном цитофлуориметре необходима пробоподготовка для каждого образца, занимающая определенное время (до 20 минут). Для оценки количества провоспалительных моноцитов CD14/CD16 необходимо использование по крайней мере двух видов моноклональных антител и сопутствующих реактивов. При этом моноклональные антитела обладают невысоким сроком годности, что дополнительно ограничивает возможности проведения анализа. Сам же анализ на проточном цитофлуориметре состоит из достаточно сложных манипуляций.
Техническая проблема, решаемая изобретением, заключается в создании способа оценки провоспалительной активности моноцитов, лишенного недостатков прототипа. Технический результат изобретения состоит в упрощении способа и снижении его трудоемкости при сохранении высокой достоверности результатов оценки провоспалительной активности моноцитов (на уровне способа-прототипа).
Это достигается тем, что в способе оценки провоспалительной активности моноцитов, включающем выделение моноцитов в составе мононуклеарных клеток из периферической венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина с последующим наслаиванием в чашки Петри, отделением прилипших клеток и их разведением, и проведение анализа полученной взвеси моноцитов, провоспалительную активность моноцитов оценивают по количеству моноцитов больших размеров, при этом готовят пробы путем разведения и перемешивания полученной взвеси моноцитов в изотоническом растворе, подсчитывают в них посредством счетчика клеток количество моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм и количество моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм, и рассчитывают индекс провоспалительной активности моноцитов в качестве ее критерия как процентное отношение количества моноцитов диаметром от 12,5 до 15 мкм к количеству моноцитов диаметром от 9 до 15 мкм, а в качестве его окончательного значения используют среднее значение индекса провоспалительной активности моноцитов, полученного в результате по меньшей мере двукратного подсчета количества моноцитов в каждой пробе. Для разведения подготовленной для анализа взвеси моноцитов преимущественно отбирают 100 мкл взвеси, которую добавляют к 10 мл изотонического раствора для разведения проб Isoton в кюветах объемом 20 мл из комплекта счетчика клеток. В качестве счетчика клеток преимущественно используют автоматический счетчик Культера, настроенный на выявление клеток диаметром от 9 до 15 мкм.
Указанный технический результат обеспечивается всей совокупностью существенных признаков заявленного изобретения, каждый признак которой необходим, а вместе они достаточны для решения указанной технической проблемы и для достижения указанного технического результата.
6
6
2
Предложенный способ реализован следующим образом. Выделяют моноциты в составе мононуклеарных клеток (моноциты + лимфоциты) из периферической венозной крови больных и здоровых в градиенте плотности фиколл-урографина (ПанЭко). Полученные клетки разводят в питательной среде RPMI 1640 с L-глутамином (ПанЭко) до концентрации 5×10/мл. Взвесь мононуклеарных клеток наслаивают в пластиковые чашки Петри диаметром 60 мм (Nunclon, Delta), инкубируют в CO инкубаторе при температуре 37°С в течение 1 часа и отделяют прикрепившиеся ко дну чашки Петри моноциты путем добавления к ним охлажденного раствора Версена (ПанЭко) на 20 минут с последующим двойным отмыванием в центрифужных пробирках питательной средой 199 (ПанЭко) с добавлением 10% сыворотки FCS (Serva). Выделенные моноциты разводят питательной средой RPMI 1640 с L-глютамином до концентрации 1×10/мл. Разводят подготовленную для анализа взвесь моноцитов, для чего отбирают 100 мкл взвеси, которую добавляют к 10 мл изотонического раствора для разведения проб Isoton (Beckman Coulter) в кюветах (акуветтах) объемом 20 мл из комплекта счетчика клеток. Взвесь тщательно перемешивают. Для подсчета моноцитов кюветы помещают в автоматический счетчик Культера MS4e (Beckman Coulter), настроенный на выявление клеток диаметром от 9 до 15 мкм. Подсчитывают общее количество моноцитов с диаметром от 9 до 15 мкм и количество больших моноцитов с диаметром от 12,5 до 15 мкм. Подсчет в каждой пробе проводят по меньше мере два раза (преимущественно два-три раза). Рассчитывают индекс провоспалительной активности моноцитов как процентное отношение количества моноцитов диаметром от 12,5 до 15 мкм к количеству моноцитов диаметром от 9 до 15 мкм, а в качестве его окончательного значения используют среднее значение индекса провоспалительной активности моноцитов, полученного в результате по меньшей мере двукратного подсчета количества моноцитов в каждой пробе.
3
+
+
+
+
1
2
3
Возможность оценки провоспалительной активности моноцитов с помощью критерия, основанного на подсчете в пробе относительного количества моноцитов с большим диаметром, обусловлена следующим. Известно, что моноциты распределяются по объему на три субпопуляции - малые, средние и большие и что эти субпопуляции обладают разными функциональными характеристиками (например, Arenson Е.В. Jr et al. Volumetric and Functional Heterogeneity of Human Monocytes. «The Journal of Clinical Investigation)), 1980, v.65, №3, p.613-618). Крупные моноциты (около 480 мкм) в значительно большей степени, чем другие субпопуляции (малые и средние моноциты) в сумме, способны к направленной миграции в очаг воспаления (хемотаксису). Моноциты, обладающие способностью к хемотаксису, осуществляют воспалительные реакции и участвуют в механизмах развития хронического воспаления при различных системных заболеваниях, т.е. по существу могут быть отнесены к провоспалительным моноцитам с фенотипом CD14/CD16. Авторами изобретения проведены экспериментальные исследования по подсчету моноцитов с фенотипом CD14на автоматическом счетчике Культера. При этом выделяли общее количество моноцитов из пула мононуклеарных клеток в сильном магнитном поле с помощью специфичных к моноцитам моноклональных антител CD14, меченных магнитными частицами (метод магнитной сепарации). Полученные результаты свидетельствуют о том, что при подсчете клеток на автоматическом счетчике Культера моноциты с фенотипом CD14распределяются по диаметру от 9 до 15 мкм, а в диапазоне от 12,5 до 15 мкм существует заметный пик больших моноцитов. Например, для донора N. получено: количество всех моноцитов диаметром 9-15 мкм составило 532, суммарное количество малых и средних моноцитов диаметром 9-12,5 мкм (субпопуляции М и М) составило 496, количество больших моноцитов диаметром 12,5-15 мкм (субпопуляция М) составило 36. Поэтому индекс провоспалительной активности оценен как (36÷532)×100%=6,8%. Таким образом, выбор указанных значений диаметра моноцитов обусловлен объективными и подтвержденными экспериментально обстоятельствами. Кроме того, установка соответствующих фиксированных значений диаметров при подсчете количества моноцитов обеспечивает однозначность трактовки результатов оценки их провоспалительной активности при обследовании пациентов с различным состоянием здоровья.
Процедура оценки активности моноцитов с использованием автоматического счетчика Культера является достаточно простой и не требует высокого уровня квалификации оператора. При этом не требуется применения дорогостоящих компонентов и сложных операций при подготовке к подсчету количества моноцитов в автоматическом счетчике Культера. Исследованиями авторов изобретения установлено, что оценка провоспалительной активности моноцитов предложенным способом обеспечивает достоверность результатов на уровне способа-прототипа.
+
+
Примеры. У 18-и больных юношеской депрессией мужского пола в возрасте от 17 до 23 лет проведен сравнительный анализ способа оценки провоспалительной активности моноцитов по измерению количества моноцитов с фенотипом CD14/CD16 (способ-прототип) и предложенного способа. Всех больных обследовали один раз до назначения им психотропной терапии. При этом определение процента провоспалительных моноцитов выполнено в разных вариантах - у больных в общей группе и в подгруппах больных с низким и высоким уровнем активных моноцитов, а также в группе здоровых лиц, возраст которых соответствовал возрасту больных. Статистические исследования проведены с использованием пакета программ Statistica, версия 10 (StatSoft Inc., USA). Для оценки достоверности различий между получаемыми показателями использован критерий малых выборок Стьюдента. Корреляционный анализ проведен с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Оценку статистической значимости связи между получаемыми показателями определяли по тесту Хи-квадрат и двустороннему критерию Фишера.
Пример 1. Определялся уровень провоспалительной активности моноцитов в общей группе с количеством больных 18. При использовании способа-прототипа индекс провоспалительной активности составил 7,8±0,95%, при использовании предложенного способа - 7,7±1,1%. Статистическая обработка результатов подтвердила практическую идентичность полученных значений, поскольку значимые различия между средними значениями определяемых показателей обнаружены не были (р=0,6). Подтверждением идентичности полученных результатов послужило также выявление статистически значимой позитивной корреляции между соответствующими показателями (Spearman r=0,75, p<0,05).
Пример 2. Определялся уровень провоспалительной активности моноцитов в подгруппе 8-и больных с высоким уровнем активных моноцитов и подгруппе из 10-и больных с низким уровнем активных моноцитов. Индекс провоспалительной активности при определении способ-прототипом и предложенным способом составил для первой подгруппы 11,8±1,3 и 11,5±1,0 соответственно, а для второй подгруппы - 4,4±0,5 и 4,9±0,6 соответственно. Статистическая обработка подтвердила практическую одинаковость показателей для двух сравниваемых способов в обоих вариантах оценки. Значимые различия между средними значениями показателей не выявлены (р=0,6). Соотношения между показателями подтверждены по критерию Хи-квадрат тесту с определением достоверности по двухстороннему точному критерию Фишера (Fisher Exact r=0,77, р=0,05).
Пример 3. Сравнивались результаты анализа провоспалительной активности моноцитов способом-прототипом и предложенным способом в общей группе здоровых (12 человек). Индекс провоспалительной активности в первом случае составил 4,7±0,6, а во втором - 4,1±0,7. Статистическая обработка результатов показала их практическую одинаковость (р=0,6).
Способ оценки провоспалительной активности моноцитов в соответствии с изобретением по сравнению с известными аналогичными более прост и менее трудоемок и одновременно обеспечивает высокую достоверность результатов оценки.