Способ определения гипердиплоидии с помощью морфометрического анализа при множественной миеломе
METHOD FOR DETERMINING HYPERDIPLOIDY USING MORPHOMETRIC ANALYSIS IN MULTIPLE MYELOMA

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и предназначено для определения гипердиплоидии в опухолевых плазматических клетках при множественной миеломе (ММ).
ММ или плазмоклеточная миелома (в редакции ВОЗ 2017 г.) - это В-клеточная злокачественная опухоль, морфологическим субстратом которой являются плазматические клетки (ПК), продуцирующие моноклональный иммуноглобулин (Менделеева Л.П., Вотякова О.М., Рехтина И.Г. Российские клинические рекомендации по диагностике и лечению злокачественных лимфопролиферативных заболеваний / под ред. И.В. Поддубной, В.Г. Савченко. - М., 2018. - С.213-241). Заболеваемость ММ составляет приблизительно 1% среди всех злокачественных опухолей и до 10-15% всех опухолей кроветворной и лимфоидной тканей. Заболевают преимущественно люди старшей возрастной группы (Злокачественные новообразования в России в 2017 году (заболеваемость и смертность) / под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. - М.: МНИОИ им. П.А. Герцена -филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018).
За последнее десятилетие накоплен большой объем данных, указывающих на значительные различия в клинических проявлениях, прогнозе и ответе на терапию у больных ММ с различными цитогенетическими подтипами, что привело к значительному пересмотру клинического, прогностического и терапевтического значения генетических аномалий при ММ. В результате систематизации этих данных Международная рабочая группа по миеломе (International Myeloma Working Group, IMWG) предложила классификацию MM, выделив несколько неперекрывающихся молекулярных подтипов, определенных на основе конкретных цитогенетических аномалиий (International Myeloma Working Group molecular classification of multiple myeloma: spotlight review / R. Fonseca, P.L. Bergsagel, J. Drach [et al.] // Leukemia. - 2009. - Vol.23, №12. - P. 2210-21).
При ММ выделяют первичные и вторичные цитогенетические аномалии. Большинство первичных цитогенетических аномалий у пациентов с ММ являются транслокациями либо трисомиями. Первичные транслокации обычно включают локус гена тяжелой цепи иммуноглобулина (IgH) на хромосоме 14 и один из нескольких партнерских хромосом. Пять партнерских хромосом, наиболее часто встречающихся у больных ММ, представляют собой хромосомы 4, 6, 11, 14 и 20. Первичные трисомии обычно включают нечетные хромосомы 3, 5, 7, 9, 11, 15, 19 и 21, приводящие к гипердиплоидному кариотипу. Первичные цитогенетические аномалии обнаруживаются почти у всей популяции клональных клеток в пределах клинического образца. Напротив, вторичные цитогенетические аномалии обычно субклональные.
Пересмотренная международная система стадирования (R-ISS), разработанная Международной рабочей группой по миеломе, предписывает выполнение FISH-анализа на наличие транслокаций t(4; 14) и t(14;16), а также делеции del17p для стратификации риска у больных MM (Revised international staging system for multiple myeloma: A report from International Myeloma Working Group / Palumbo A., Avet-Loiseau H., Oliva S. [et al.] // J. Clin. Oncol. -2015. - Vol.33, №26. - P. 2863-2869). Вместе с тем в связи с применением в последние годы новых терапевтических средств следует признать оправданным тестирование гипердиплоидного статуса опухолевых клеток при ММ, поскольку наличие такой аномалии обеспечивает, в частности, связанные с благоприятным исходом наилучшие результаты при лечении леналидомидом (Trisomies in multiple myeloma: impact on survival in patients with high-risk cytogenetics / Kumar S., Fonseca R., Ketterling R.P. [et al.] // Blood. - 2012. - Vol.119, №9. - P. 2100-2105; The multiple myelomas - current concepts in cytogenetic classification and therapy / S. K. Kumar, S. V. Rajkumar // Nat. Rev. Clin. Oncol. - 2018. Vol.15, №7. - P. 409-421). Кроме того, в нескольких крупных исследованиях получены данные, согласно которым выявление гипердиплоидии может улучшить плохой прогноз у больных ММ, обусловленный цитогенетическими аномалиями высокого риска, такими как del17р, t(4;14) и t(14;16) (Trisomies in multiple myeloma: impact on survival in patients with high-risk cytogenetics / Kumar S., Fonseca R., Ketterling R.P. [et al.] // Blood. - 2012. - Vol.119, №9. - P. 2100-2105; Prognostic impact of hyperdiploidy in multiple myeloma patients with high-risk cytogenetics: a pilot study in China / Mei J., Zhai Y., Li H. J. // Cancer Res Clin Oncol. - 2018. - Vol.144, №11. - P. 2263-2273).
Классическим способом, позволяющим выявлять хромосомные аномалии, в том числе полисомии, является стандартное цитогенетическое исследование, которое основано на структурном и количественном анализе всех хромосом клетки (кариотип), дифференциально окрашенных в результате обработки трипсином с последующей окраской красителем Гимзы или Райта. (Seabright, М. A rapid banding technique for human chromosomes / M. Seabright // Lancet. - 1971. - Vol.2. - №7731. - P. 971-972). Данный способ имеет существенный недостаток, заключающийся в низкой информативности цитогенетического исследования опухолевых плазматических клеток ввиду их низкой митотической активности и часто незначительного содержания таких клеток в аспирате костного мозга. Так, согласно литературным данным с использованием стандартного цитогенетического исследования нарушения кариотипа выявляются у 30-50% больных ММ (Бессмельцев, С.С.Множественная миелома (Патогенез, клиника, диагностика, дифференциальный диагноз). Часть 1 / С.С. Бессемельцев // Клиническая онкогематология. - 2013. - Т. 6, №3. - С.237-259).
Недавно разработан способ, позволяющий оценить гипердиплоидию посредством определения индекса ДНК в плазматических клетках благодаря применению технологий многопараметрической проточной цитометрии. Достоинством методического подхода является быстрота выполнения анализа: результаты можно получить в течение одного рабочего дня (Rapid Assessment of Hyperdiploidy in Plasma Cell Disorders Using a Novel Multi-Parametric Flow Cytometry Method / Sidana, S., Jevremovic, D., Ketterling [et al.] // American Journal of Hematology. - 2019. - Vol.94, №4. - P. 424-430). Недостатками указанного способа являются относительная дороговизна себестоимости одного исследования и отсутствие возможности в одном исследовании проводить анализ на наличие гипердиплоидии и других цитогенетических аномалий, и прежде всего нарушений высокого риска.
В качестве прототипа изобретения выбран стандартный способ определения хромосомных аномалий методом интерфазной FISH, основанный на рутинном приготовлении препаратов для FISH-исследования и анализе флуоресцентных гибридизационных сигналов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа со специальными фильтрами, оснащенного камерой с устройством с зарядовой связью (CCD), позволяющей создавать цифровые изображения даже при слабом флуоресцентом гибридизационном сигнале, и программного обеспечения для анализа изображений (Swansbury, J. Fluorescence in situ hybridization methods and troubleshooting applied to fixed cell suspensions / J. Swansbury, T. Min, S. Aruliah // Methods Mol Biol. - 2011. - Vol 730. - P. 13-31). Сердцевину метода FISH составляет гибридизация in situ между созданным по специальным технологиям ДНК-зондом (нуклеотидная последовательность ограниченного размера) и комплементарным ему участком ДНК мишени в препаратах фиксированных метафазных и интерфазных клеток. Визуализация ДНК-зондов, гибридизованных с соответствующим участком ДНК мишени, осуществляют с помощью простого люминесцентного микроскопа, оснащенного фильтрами, адекватными для оценки соответствующих ДНК-зондов. Клинико-диагностические исследования при ММ обычно проводят с помощью стандартизованных коммерческих ДНК-зондов и в соответствии с протоколами, рекомендуемых фирмами-производителями этих зондов, применяя интерфазный вариант FISH. Основная причина невключения оценки гипердиплоидного статуса в перечень цитогенетических аномалий, подлежащих в обязательном порядке FISH-тестированию согласно системе стадирования R-ISS, заключается в необходимости использования нескольких ДНК-зондов для идентификации нечетных хромосом, что увеличивает финансовые затраты, усилия по тестированию и количество необходимых опухолевых плазматических клеток. Необходимость использования нескольких ДНК-зондов вызвана тем, что гипердиплоидия регистрируется только тогда, когда наблюдаются трисомии не менее 2 хромосом. Последнее, в свою очередь, обусловлено тем, что гипердиплоидия нередко может быть «замаскирована» присутствием моносомий, особенно с участием хромосом 13 и 14 (Trisomies in multiple myeloma: impact on survival in patients with high-risk cytogenetics / Kumar S., Fonseca R., Ketterling R.P. [et al.] // Blood. - 2012. - Vol.119, №9. - P. 2100-2105). Кроме того, применение ограниченного набора флуорохромов при изготовлении различных коммерческих ДНК-зондов в подавляющем большинстве случаев делает невозможным анализ гибридизационной картины с участием более 3 ДНК-зондов в одной интерфазной клетке.
В связи с вышеизложенным, технической задачей предлагаемого изобретения является разработка простого и экономичного способа определения гипердиплоидии с помощью оценки диаметра клеточных ядер в препарате, приготовленном для FISH-исследования из аспирата костного мозга у больных ММ, что позволяет проводить тестирование на наличие гипердиплоидии и цитогенетических аномалий высокого риска в одном исследовании.
Сущность предлагаемого изобретения заключается в выявлении не менее 11% клеточных ядер с диаметром ≥11,2 мкм в препарате, приготовленном для FISH-исследования из аспирата костного мозга у больных ММ, что позволяет примерно с 94%-ной специфичностью (95% CI: 92,0-95,7%) и максимальной чувствительностью (39,6%, 95%Сl: 34,2-45,3%), обеспечивающей данную специфичность, определять наличие гипердиплоидии с помощью морфометрической оценки ядер, тем самым значительно снижая финансовые затраты, усилия по тестированию и количество необходимых опухолевых плазматических клеток.
Технический результат изобретения заключается в получении критерия оценки наличия гипердиплоидии при морфометрическом анализе клеточных ядер в препарате, приготовленном для FISH-исследования из аспирата костного мозга у больных ММ.
Технический результат достигается разработанным способом, включающим в себя 1) приготовление препарата для FISH-исследования из аспирата костного мозга у больных ММ и 2) выявление не менее 11% ядер с диаметром ≥11,2 мкм при морфометрической оценке 100 и более ядер. Наличие указанного содержания ядер в приготовленном препарате позволяет примерно с 94%-ной специфичностью превысить пороговый уровень отсечки в 10%) для положительного результата, установленный рекомендациями Европейского сообщества по множественной миеломе для ДНК-зондов, предназначенных для определения хромосомных аномалий по типу численного прироста (Detection of chromosomal aberrations in multiple myeloma: Abstracts and Application Manual // Cytogenetic Workshop.- Brno, 2006. - 30 p.).
Для повышения экономичности проведения анализа на наличие цитогенетических аномалий высокого риска и гипердиплоидии в одном исследовании авторы предполагаемого изобретения рекомендуют следовать следующему алгоритму, а именно: вначале следует выполнять тестирование на наличие высокорисковых цитогенетических аномалий, а затем на тех же FISH-препаратах осуществлять морфометрическую оценку плоидности ядер.
Способ осуществляли следующим образом.
Переносили 1 мл костного мозга в центрифужную пробирку, доводили объем средой RPMI-1640 до 10 мл. Центрифугировали при 1000 об./мин. в течение 10 минут. Удаляли большую часть супернатанта, оставив его примерно 1,0 мл в пробирке. Суспендировали осадок и добавляли 9 мл нагретого до 37°С гипотонического (0,075 М) раствора КСl, клетки инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Далее добавляли 0,5 мл свежеприготовленного фиксатора (смесь метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1), перемешивали пипетированием и центрифугировали суспензию при 1000 об./мин. в течение 10 минут. Удаляли большую часть супернатанта, оставив его примерно 0,5 мл в пробирке. Тщательно суспендировали осадок, добавляли по каплям при перемешивании 9-10 мл фиксатора и выдерживали суспензию в течение 20 мин при комнатной температуре. Затем центрифугировали при 1000 об./мин. в течение 10 минут, осадок суспендировали в 5 мл фиксатора и выдерживали в течение 10 минут при комнатной температуре. После проводили центрифугирование при 1000 об./мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Ресуспендирование клеток в фиксаторе с последующим их центрифугированием повторяли еще 2 раза, затем суспендировали осадок в 0,1-0,4 мл свежего фиксатора.
Раскапывали суспензию фиксированных клеток на чистое предметное стекло, добавляли 3-4 капли свежего фиксатора и давали сохнуть на воздухе. После с помощью фазово-контрастной микроскопии оценивали качество приготовленного препарата. Фиксированные клетки (ядра) должны быть распределены равномерно, без наложений друг на друга (при большой плотности клеточного материала на стекле гибридизация может быть неэффективной и/или может наблюдаться интенсивный фон вследствие неспецифического связывания ДНК-зонда). Перед проведением процедур, связанных непосредственно с FISH, выдерживали стекла в течение часа в термостате при 37°С.
Для надежного обеспечения высококачественных FISH-сигналов применяли следующую предварительную обработку свежеприготовленных препаратов фиксированных клеток. Инкубировали препарат в течение 15 минут при 37°С в 2xSSC / 0,5% Igepal (рН=7,0±0,01). Проводили дегидратацию препарата в батарее восходящих 70%, 85% и 96% растворов этилового спирта по 1 минуте в каждом; высушивали препарат на воздухе при комнатной температуре. Далее наносили готовый ДНК-зонд, закрывали покровным стеклом (диаметр 10 мм), края герметизировали резиновым клеем. Препарат помещали в гибридайзер. Согласно протоколу производителя ДНК-зондов, денатурацию проводили при 75°С в течение 5-10 минут, гибридизацию осуществляли при 37°С не менее 12 часов.
После завершения гибридизации с целью удаления избытка ДНК-зонда препарат обрабатывали следующим образом. Готовили раствор Wash Buffer I (0,4 × SSC/0,3% Igepal) и нагревали его до температуры 72°С (±1°С) в водяной бане. Удаляли клей с предметных стекол, выдерживали препараты в растворе Wash Buffer II (2 × SSC/0,1% Igepal) при комнатной температуре в течение 2 минут, затем убирали покровные стекла. Препараты помещали на 2 минуты в раствор Wash Buffer I при температуре 72°С (±1°С), далее -выдерживали в растворе Wash Buffer II при комнатной температуре в течение 1 минуты. Проводили дегидратацию препарата в батарее восходящих 70%, 85% и 96% растворов этилового спирта по 1 минуте в каждом. Высушивали препарат при комнатной температуре в темноте. Для визуализации клеточных ядер на препарат наносили раствор DAPI в концентрации 1 мкг/мл, затем исследуемую зону накрывали покровным стеклом.
Для тестирования клеток костного мозга на наличие высокорисковых цитогенетических аномалий (del(17p), t(4;14), t(14;16)) у больных ММ нами использованы ДНК-зонды фирмы Kreatech, а именно: ТР53 (17p13)/SE17 FISH probe, FGFR3/IGH t(4;14) Fusion FISH probe, MAF/IGH t(14; 16) Fusion FISH probe. Для разработки критерия предлагаемого способа морфометрического определения гипердиплоидии применены также ДНК-зонды той же фирмы, а именно: 5q-(5q31;5q33)/TERT (5р15) Triple-Color FISH probe, SE 9 (classical) Red Probe и SE 15 (D15Z) Green Probe для идентификации полисомий соответственно по хромосомам 5, 9 и 15. FISH-анализ препаратов на наличие указанных цитогенетических аномалий проводили с помощью флуоресцентного микроскопа стандартным способом.
Морфометрическую оценку плоидности осуществляли с применением программного обеспечения для анализа изображений на FISH-препаратах, использованных для тестирования вышеотмеченных хромосомных аномалий. Вначале получали фотографии ядер клеток костного мозга в препарате. Затем с помощью программы анализа изображений определяли диаметры ядер всех клеток, находящихся в поле зрения. Изображения препарата с измеренными диаметрами ядер использовали для подсчета процента ядер, имеющих диаметр ≥11,2 мкм. Наличие не менее 11% ядер с диаметром ≥11,2 мкм в препарате, приготовленном для FISH-исследования из аспирата костного мозга у больного ММ, считали положительным результатом, свидетельствующим о гипердиплоидии.
Критерий предлагаемого способа определения гипердиплоидии разработан на основании ROC-анализа морфометрических данных 1000 ядер клеток костного мозга у 10 больных ММ, у которых в образцах костного мозга были выявлены трисомии по 2 хромосомам FISH-методом. Результаты использования разработанного критерия представлены в примерах, подтверждающих возможность применения способа морфометрического определения гипердиплоидии у больных ММ в аспирате костного мозга после выполнения FISH-анализа на наличие высокорисковых цитогенетических аномалий.
Пример 1. Пациентка М. поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИ-ГиПК ФМБА России 20.04.2017. У больной установлен диагноз «множественная миелома». Согласно данным миелограммы, содержание плазматических клеток составило 28,0% в аспирате костного мозга. Из данного аспирата приготовлен препарат для FISH-исследования аспирата костного мозга в соответствии со стандартной методикой. Исследование на наличие цитогенетических аномалий высокого риска (del(17p), t(4; 14) и t(14;16)) не выявило отмеченных нарушений. Не обнаружено также хромосомных аномалий при проведении тестирования на наличие полисомий по хромосомам 5, 9 и 15. После выполнения FISH-тестирования осуществлен морфометрический анализ ядер в FISH-препарате, а именно: проведено измерение диаметров 100 ядер клеток костного мозга. Проведенная оценка выявила 1% (1/100) ядер с диаметром ≥11,2 мкм, что ниже порогового уровня отсечки, равного 11% для положительного результата. Таким образом, морфометрический анализ подтвердил отсутствие гипердиплоидии у пациентки.
Пример 2. Пациент Р. поступил в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 15.10.2021. По результатам клинико-лабораторных исследований установлен рецидив заболевания. По данным миелограммы у больного содержание плазматических клеток составило 71,0%. FISH-исследования на наличие цитогенетических аномалий высокого риска выявили t(14;16) у больного. Анализ на наличие полисомий по хромосомам 5, 9 и 15 установил трисомии по хромосомам 5 и 9 у пациента. После выполнения FISH-тестирования проведена оценка диаметров 100 ядер в FISH-препарате. В 26% ядер диаметр составил ≥11,2 мкм, что превышает пороговое значение, равное 11%, подтверждая тем самым данные FISH-анализа о наличии гипердиплоидии у пациента.
Пример 3. У пациента Н. установлен диагноз «множественная миелома» в 2014 г. В октябре 2017 г. у больного зарегистрировано прогрессирование заболевания. По данным миелограммы у пациента отмечено повышенное содержание плазмоцитов (64,8%) в аспирате костного мозга. FISH-исследования на наличие цитогенетических аномалий высокого риска и полисомий по хромосомам 5, 9 и 15 выявили только сверхчисленные аномалии, а именно: трисомии по последним 2 хромосомам. После выполнения FISH-тестирования проведена оценка диаметров 100 ядер в FISH-препарате. Доля ядер, имеющих диаметр ≥11,2 мкм, составила 64%, что превышает пороговое значение, подтверждая тем самым данные FISH-анализа о наличии гипердиплоидии у пациента.
Предлагаемый способ определения гипердиплоидии при ММ может быть использован в гематологических отделениях, патоморфологических и цитогенетических лабораториях.