СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ
METHOD OF BACTERIA RECOVERY AND IDENTIFICATION

Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии и медицины и касается идентификации бактерий, вобудителей инфекционных болезней.
Предшествующий уровень техники.
В медицине, санитарии, микробиологической и других отраслях промышленности, использующих биотехнологические процессы, стоит задача быстрого определения микроорганизмов, находящихся в исследуемом образце. В настоящее время задача решается в основном двумя способами: анализом ДНК (метод ПЦР) и анализом результатов реакции антиген-антитело (иммунохимический метод). Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью, однако подготовительные процедуры (выделение и очистка ДНК) достаточно трудоемки и длительны (Маккреди Б.Дж., Чимера Д.А. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами. Молекулярная клиническая диагностика. Методы // М.: Мир, 1999, С.496-506). Иммунохимический метод сейчас бурно развивается в плане его автоматизации. Разрабатываются установки для создания биочипов (калиграферы) и их анализа (ридеры). Иммунохимический метод идентификации бактерий можно методологически разделить на два этапа - выделение определяемых микроорганизмов из образца и детекция выделенных биоагентов. Выделение целевых бактерий из образца производится с помощью антител, которые либо сами связаны с неподвижной фазой (колонки, поверхность биочипа), что допускает последующую отмывку, либо пришиты к магнитным частицам, что также предполагает возможность в присутствии магнитного поля отмывки от несвязавшихся компонентов образца. Определение связавшихся с антителами микроорганизмов осуществляется обычно с помощью флуоресцентной метки (например, флуоресцеин изотиоционата - FITS), предварительно пришитой к антителам. Для этого используется флуоресцентный микроскоп - флуориметр или созданный специально для биочипов «ридер». Возможно также использование радиоактивной метки (В.Д.Самуилов. Иммуноферментный анализ. // Соросовский образовательный журнал, 1999, №12, С.9-15).
Для нахождения бактериальных клеток в образце, а также для определения концентрации и описания морфометрических свойств микроорганизмов применяется электрооптический метод анализа. Этот метод не требует применения ни флуоресцентной, ни радиоактивной метки для обнаружения бактерий.
В основе электрооптического анализа лежит эффект Керра. Суть эффекта состоит в изменении оптических свойств суспензии, в частности суспензии клеток, при воздействии на нее электрического поля.
а
Воздействие электрического поля на суспензию клеток вызывает появление на суспендированных клетках индуцированных зарядов. Их распределение и величина определяются действующим механизмом поляризуемости (С.Г.Игнатов, А.Г.Волошин, В.Д.Бунин, И.А.Дятлов. Электрооптический анализ в микробиологии. // Оболенск: ФГУН ГНЦ ПМБ, 2007, 159 с.). При объемном механизме поляризуемости индуцированные заряды появляются на границах раздела двух сред с различными комплексными диэлектрическими проницаемостями. Границами раздела структур клеток являются поверхности соприкосновения двойного электрического слоя и клеточной стенки, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, цитоплазматической мембраны и цитоплазмы. Величина индуцированных на границах разделов зарядов пропорциональна напряженности электрического поля и зависит от соотношения диэлектрических проницаемостей структур. Интегральным параметром, описывающим процесс поляризуемости, является тензор  поляризуемости клетки. Тензор поляризуемости несферической клетки имеет, по крайней мере, две отличающиеся компоненты. Продольная компонента совпадает с длинной осью клетки, а поперечная - ортогональная ей. Распределенные по объему клетки индуцированные заряды разных знаков образуют диполь. Диполь взаимодействует с электрическим полем и вызывает появление вращающего момента. Возникает преобладающее направление ориентации клеток, которое изменяет равновероятный характер распределения клеток по углам ориентации, описываемого функцией Больцмана. Угол ориентации клетки отсчитывается от направления падающего светового потока к направлению длинной оси клетки.
При этом происходит изменение всех оптических характеристик суспензии: величины двулучепреломления, характер светорассеяния и величины оптической плотности суспензии вследствие изменения сечения G(t) рассеяния клеток. При напряженности Е электрического поля, соответствующего слабой ориентации клеток, зависимость изменения оптической плотности от квадрата напряженности имеет линейный характер.
В зависимости от частоты электрического поля и электрических свойств клеток направление преобладающей ориентации клеток может совпадать с направлением вектора электрического поля или быть ортогональным ему. Ориентация клеток длинной осью вдоль светового потока будет приводить к увеличению сечения рассеяния и уменьшению интенсивности светового потока, а ориентация поперек светового потока - к уменьшению сечения рассеяния и соответственно к увеличению светового потока.
Известен способ электрооптического анализа клеток в суспензии и устройство для его осуществления. Патент RU 2070919 от 27 июля 1996 г.
min
max
Способ осуществляется следующим образом: на исследуемую суспензию воздействуют переменным электрическим полем, характеризующимся постоянными напряженностью Е и частотой f и изменяемой частотой F изменений направления вектора напряженности электрического поля дискретно на 90° от F до F по формуле:
i±1
i±1
2
max
min
M
F=F/2, где i(0,…, i-1), (j-1,…, 0), j=1/M*log(F/F),
и одновременно с электрическим воздействием пропускают через указанную суспензию световые потоки, измеряют интенсивность прошедших через суспензию световых потоков и определяют их разность как величину электрооптического сигнала с последующим определением зависимости анизотропии поляризуемости клеток от частоты f электрического поля. Эта зависимость является очень характерной для живых бактериальных клеток в диапазоне 100-10000 кГц и отсутствует у однородных механических частиц.
Недостатком способа, с точки зрения идентификации микроорганизмов, является слабая вариабельность частотной дисперсии анизотропии поляризуемости (ЧДАП) для разных видов бактерий.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ выделения и идентификации бактериальных клеток. Патент RU 2330292 от 27 июля 2008 г.
Способ осуществляется следующим образом: к подготовленному материалу добавляют 0,1 мл суспензии, содержащей ферромагнитные микрочастицы, на поверхности которых закреплены иммуноглобулины к соответствующим возбудителям бактериальных инфекций, и неинтенсивно перемешивают в течение 50-60 с. После добавления суспензии ферромагнитных частиц с закрепленными иммуноглобулинами материал инкубируют при комнатной температуре, неинтенсивно перемешивают на шейкере в течение 30-60 мин, а затем осаждают в течение 20-30 мин, помещая пробирку в магнитный штатив со встроенными блоками постоянного магнита.
После подготовки диагностического материала в пробирку вводят магнитный зонд-пробоотборник, имеющий сердечник из постоянного магнита и сменный немагнитный наконечник, на поверхности которого зафиксированы иммуноглобулины, аналогичные зафиксированным на поверхности ферромагнитных микрочастиц. Под действием магнитного поля сердечника зонда-пробоотборника к поверхности наконечника притягиваются все введенные в образец ферромагнитные микрочастицы. При этом на его поверхности фиксируются только частицы, образовавшие комплекс с бактериальной клеткой, что происходит за счет неиспользованных связей клетки с иммуноглобулинами. Остальные частицы удерживаются у поверхности наконечника только за счет действия магнитного поля. Далее зонд-пробоотборник переносят в заполненную фосфатно-солевым буфером отмывочную емкость и создают вихревые потоки жидкости. На дне отмывочной емкости установлен постоянный магнит. После извлечения магнитного сердечника все ферромагнитные микрочастицы, не связанные с бактериальными клетками и через них с поверхностью наконечника, отделяются от нее потоками жидкости и под действием магнитного поля собираются на дне отмывочной емкости.
Извлеченный из отмывочной емкости наконечник зонда-пробоотборника, на поверхности которого закрепились ферромагнитные частицы, обладающие радиоактивностью и связанные с соответствующими бактериальными клетками, переносятся к устройству, регистрирующему радиоактивное излучение, по наличию которого делается вывод о том, что из диагностического образца выделены бактериальные клетки, являющиеся возбудителями соответствующего инфекционного заболевания.
Недостатком способа является сложная процедура приготовления пробы для идентификации бактерий, а также использование радиоактивности в качестве идентифицирующего агента, что сильно ограничивает его использование.
Техническим результатом осуществления изобретения является упрощение способа индикации возбудителей инфекционных болезней.
Технический результат достигается тем, что предлагаемый способ включает перевод бактерий из образца в фосфатно-солевой буферный раствор, добавление к ним суспензии магнитных частиц с зафиксированными на них антителами к определенным видам бактерий, инкубацию при перемешивании, введение магнитного зонда-пробоотборника со сменным немагнитным наконечником в инкубационную емкость с последующей отмывкой наконечника магнитного зонда-пробоотборника вместе со сконцентрированными на его поверхности магнитными частицами и комплексами магнитная частица-антитело-антиген в дистиллированной воде, затем зонд-пробоотборник переносят в емкость с 3 мл дистиллированной воды, немагнитный наконечник отделяют от магнитного зонда и смесь магнитных частиц и комплексов магнитная частица-антитело-антиген переходят в водную среду, которую помещают в измерительную ячейку электрооптического анализатора, где под воздействием переменного электрического поля регистрируют изменения оптических свойств суспензии в виде частотной дисперсии анизотропии поляризуемости (ЧДАП), на основании которой судят о наличии или отсутствии в образце целевых бактерий при появлении или отсутствии пика на ЧДАП в диапазоне от 100 до 10000 кГц соответственно.
Способ осуществляется следующим образом.
Исходный образец с помощью центрифугирования или путем отмывки на фильтре переводят в фосфатно-солевой буфер (рН 7,4) и объем его доводят до 1 мл. Сюда же добавляют 50 мкл суспензии магнитных частиц, с поверхностью которых ковалентно связаны очищенные антитела к интересующим бактериям. В ходе инкубации при 37°С антитела, фиксированные на частицах, специфически связываются с целевыми бактериями. Затем в инкубационную емкость вводят магнитный зонд-пробоотборник со сменным немагнитным наконечником. Под воздействием магнитного поля зонда-пробоотборника ферромагнитные частицы собираются в одном месте и легко извлекаются из среды. Далее зонд-пробоотборник переносят в емкость с дистиллированной водой и осуществляют промывку, в ходе которой удаляются бактерии, не связавшиеся с антителами на магнитных частицах. Для окончательного ресуспендирования зонд-пробоотборник переносят в емкость с 3 мл дистиллированной воды и сменный немагнитный наконечник отсоединяют от магнитного зонда-пробоотборника. Это приводит к тому, что комплекс магнитные частицы-антитела-бактерии отделяется от поверхности наконечника и переходит в водную среду. Полученную суспензию помещают в измерительную ячейку электрооптического анализатора, где она подвергается воздействию переменного электрического поля напряженностью 700-7000 в/м в диапазоне частот 10-30000 кГц. Одновременно через ячейку пропускают свет (λ=640 нм).
Электрооптический анализ заключается в регистрации оптических изменений, происходящих в исследуемой суспензии под воздействием переменного электрического поля. Фактически происходит измерение оптической плотности суспензии на длине волны 640 нм в момент включения, действия и отключения напряжения на электродах измерительной ячейки. Такие измерения проводятся в широком диапазоне частот подаваемого электрического поля (10-30000 кГц). Объектом дальнейшего анализа является полученная таким образом частотная дисперсия анизотропии поляризуемости (ЧДАП). Параметры поля (частота, напряженность, время действия) определяются электрофизическими и морфометрическими характеристиками целевых бактерий. Поскольку электрооптический сигнал в диапазоне от 100 до 10000 кГц у однородных механических частиц (какими являются магнитные частицы с присоединенными к ним антителами) практически отсутствует, его появление говорит о присутствии в суспензии бактерий.
Пример 1. Обнаружение клеток Salmonella enteriditis
1) К 1 мл суспензии бактерий Salmonella enteriditis в фосфатно-солевом буфере добавляют 50 мкл суспензии магнитных частиц, покрытых стрептовидином, с ковалентно пришитыми антителами к Salmonella Enteriditis. Полученную смесь инкубируют 20 минут при 37°С при легком помешивании. Затем в инкубационную емкость вводят магнитный зонд-пробоотборник со сменным немагнитным наконечником из полимерного материала, с помощью которого собирают магнитные частицы. После промывки водой наконечник переносят в емкость с 3 мл дистиллированной воды, где отделяют его от магнитного зонда-пробоотборника. В отсутствие магнитного поля все частицы с поверхности наконечника переходят в водную суспензию. Полученную суспензию помещают в измерительную ячейку электрооптического анализатора. Под действием переменного электрического поля (напряженность Е=1000 в/м; время действия t=2 сек; диапазон частот f=10-30000 кГц) происходят изменения оптических свойств суспензии, которые регистрируют в виде ЧДАП.
2) Аналогичные процедуры производили с суспензией бактерий Escherichia coli и теми же магнитными частицами со связанными с ними антителами к Salmonella enteriditis.
3) Аналогичные процедуры производили с магнитными частицами в дистиллированной воде - то есть в отсутствие любых микроорганизмов.
Полученные результаты ЧДАП магнитных частиц, связанных с антителами к Salmonella enteriditis, после их инкубации с бактериями представлены на фиг.1.
1 - магнитные частицы - клетки Salmonella enteriditis
2 - магнитные частицы - клетки Escherichia coli
3 - чистые магнитные частицы
На фиг.1 видно, что электрооптический сигнал в диапазоне от 100 до 10000 кГц позволяет уверенно определять наличие целевых бактерий (в данном случае Salmonella enteriditis) и указывает на их отсутствие как в случае чистых магнитных частиц, так и в случае присутствия посторонней микрофлоры.
Пример 2. Обнаружение клеток Escherichia coli
1) К 1 мл суспензии бактерий Escherichia coli в фосфатно-солевом буфере добавлют 50 мкл суспензии магнитных частиц, покрытых стрептовидином, с ковалентно пришитыми антителами к Escherichia coli. Полученную смесь инкубируют 20 минут при 37°С и легком помешивании. Затем в инкубационную емкость вводят магнитный зонд-пробоотборник со сменным немагнитным наконечником из полимерного материала, с помощью которого собирают магнитные частицы. После промывки водой наконечник переносят в емкость с 3 мл дистиллированной воды, где отделяют его от магнитного зонда-пробоотборника. В отсутствие магнитного поля все частицы с поверхности наконечника переходят в водную суспензию. Полученную суспензию помещают в измерительную ячейку электрооптического анализатора. Под действием переменного электрического поля (напряженность Е=1000 в/м; время действия t=2 сек; диапазон частот f=10-30000 кГц) происходят изменения оптических свойств суспензии, которые регистрируют в виде ЧДАП.
2) Аналогичные процедуры производили с суспензией бактерий Salmonella enteriditis и теми же магнитными частицами со связанными с ними антителами к Escherichia coli.
3) Аналогичные процедуры производили с магнитными частицами в дистиллированной воде, то есть в отсутствие любых микроорганизмов.
Полученные результаты ЧДАП магнитных частиц, связанных с антителами к Escherichia coli, после их инкубации с бактериями представлены на фиг.2.
1 - магнитные частицы - клетки Escherichia coli
2 - магнитные частицы - клетки Salmonella enteriditis
3 - чистые магнитные частицы
На фиг.2 видно, что электрооптический сигнал в диапазоне от 100 до 10000 кГц позволяет уверенно определять наличие целевых бактерий (в данном случае Escherichia coli) и указывает на их отсутствие, как в случае чистых магнитных частиц, так и в случае присутствия посторонней микрофлоры.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет выделять целевые бактерии из исследуемого образца и быстро определять их наличие электрооптическим методом без применения флуоресцентной или радиоактивной метки.