Изучение состояния воды у покоящихся форм Artemia salina

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ИЗУЧЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ВОДЫ У ПОКОЯЩИХСЯ ФОРМ ARTEMIA SALINA

Ю.Г. Николаева

Государственный океанографический институт Федеральная служба по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды Пер. Кропоткинский, 6, 119034 Москва, Россия

Г.М. Николаев, К.Н. Тимофеев

Кафедра биофизики Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Воробьёвы горы, 119992 Москва, Россия

В.А. Фролов, А.В. Сыроешкин

Кафедра общей патологии и патологической физиологии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8,117198 Москва, Россия

Изучен ряд метаболических характеристик у живых цист Artemia salina L., цист, облученных потоком термализованных нейтронов и деактивированных нагревом сухих цист. Были измерены подвижность протонов, а также концентрации парамагнитных ионов и свободных радикалов. Было отмечено, что подвижность протонов липидной и водной фракций живых цист в 2,5 раза выше, чем у мертвых образцов. Облучение живых цист потоком нейтронов привело к значительному увеличению времени спин-спиновой релаксации протонов (Т2) по сравнению с необлученными, при этом концентрации парамагнитных ионов и свободных радикалов в образцах практически не изменились.

Методика исследования

Толстоскорлуповые цисты A. salina лиофильно высушили и приготовили три образца: №1 — живые цисты; №2 — живые цисты облученные потоком термализованных нейтронов (20 н/(схсм2)); №3 — мертвые цисты, которых умерщвляли нагреванием в сушильном шкафу при 150°С в течение 9 ч.; № 4 — воздушно-сухие цисты собранные в естественных условиях (23% ОВ), взятые для идентификации протонных фракций, дающих вклад в ЯМР-резонанс. Масса одного образца составляла 0,5 г.

Методика облучения цист потоком термализованных нейтронов радиоактивного нейтронами источника 252Cf приведена в работе [1]. Цисты A. salina для всех трех образцов взяты из одной партии сбора.

Исследование состояния внутриклеточной воды проводили с помощью метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР-сгшновое эхо). Система спинов, ориентированных в постоянном внешнем магнитном поле, возбуждается импульсом радио-

частотного поля и тем самым выводится из равновесия. В методе используется два или более импульсов, один из которых выводит спиновую систему из состояния равновесия, а другие устраняют нарушения когерентности в движении спинов из-за различия локальных полей, связанных с отличием химических сдвигов для разных групп или с неоднородностью постоянного магнитного поля в пределах образца. Применяя различные последовательности импульсов, можно регистрировать, с одной стороны, процесс возвращения спинов к исходной ориентации с восстановлением продольной намагниченности с характерным временем спин решеточной релаксации (ТО, а с другой — спад поперечной намагниченности с характерным временем спин-спиновой релаксации (Т2). Для исключения влияния диффузии протонов использовали метод Carr-Purcell-Meibooom-Gill (90° — п 180°) [3]. Амплитуда сигнала равна числу ядер, дающих вклад в резонанс. Частота работы установки около 20 МГц. Точность измерений не хуже 7%. Линейность работы установки постоянно контролировалась по эталонным образцам CuS04. Для измерений в стеклянную ампулу с пробкой помещали 0,5 г образца. Определение липидов в сухих цистах проводили по методу Фолча.

Снятие спектров электронного парамагнитного резонанса' всех трех образцов проводили на установке ЭПР-РЭ-1307 в 3-сантиметровом диапазоне СВЧ при 18°С ± 1°С. Точность измерений ЭПР-характеристик не хуже 10%. Управление установкой ЭПР осуществлялось с помощью РС. При снятии спектра свободных радикалов СВЧ = 0,5 мвт, спектров парамагнитных ионов - 10 мВт, Постоянная времени - 0,1 с, напряженность магнитного поля для свободных радикалов 3340 ± 10 эрстед, для парамагнитных ионов 3340 ±150 эрстед.

Цисты проращивали в искусственной морской воде (100-200 спор в 150 мл) следующего состава: NaCl - 0,46 М, MgS04 - 28 мМ, MgCl2 - 26 мМ, КС1 - 9,2 мМ, СаС12 - 6,9 мМ, NaHC03 - 2,3 мМ, SrCl2 - 0,15 мМ, MnS04 - 6 мкМ, LiCl - 24 мкМ, Na2Mo04 - 4 мкМ, KJ - 0.5 мкМ, A12(S04)3 - 3 мкМ, КВг - 0,8 мМ, FeCl3 - 0,7 мкМ, CoS04 - 0,6 мкМ, RbN03 - 1 мкМ, CuS04 - 4 нМ, ZnS04 - 0,4 мкМ, Na2Si03 - 0,4 мМ, NaF - 50 мкМ, NaH2P04 - 23 мкМ.

Результаты исследования. Высушенные цисты жаброногого рачка A. salina сохраняют жизнеспособность при хранении в течение 10 лет, потому что высыхают не полностью, в них остается около 4% воды. Следует отметить, что треть этой воды по своим физическим характеристикам весьма близка к воде, которая присутствует в полностью увлажненных образцах. Важно выяснить приспособительный смысл и условия вхождения и пребывания цист в дормантное состояние с последующим выходом из него, в этом процессе важную роль играет вода. Исследование состояния внутриклеточной воды проводили с помощью метода ЯМР - спиновое эхо. Использование разновидности спектроскопии ЯМР - метода, где изменение магнитной восприимчивости в биологических системах практически не влияет на наблюдаемую естественную ширину линии, позволяет выделить вклад от воды из суммарной резонансной линии.

Для образца №4 была получена 3-компонентная кривая спада амплитуд спинового эха (рис. 1).

Самая медленная компонента спада (Т2 = 16,6 мсек) составляла около 1,5% от веса образца. Самая быстрая компонента спада (Т2= 0,1 мсек) по величине составляла около 6% от веса образца. Компонента спада амплитуд спинового эха с Т2 = 1,2 мсек — около 4% от веса образца. Как было показано нами раньше на пекарских дрожжах с помощью дейтерозамещения протонов, компонента с Т2= 1,2 мсек принадлежит протонам липидной фракции, присутствующей в образце [3]. В быст-

рую компоненту спада спинового эха вносят протоны воды сорбированной на полярных группах белков, присутствующих в цистах. За счет взаимодействия протонов с полярными группами белков в образце появляется так называемая «связанная» вода с Т2 = 0,1 мсек. Содержащийся в цистах Л. salina а-кристаллин обладает высокой способностью связывать воду [3; 5]. Именно в первую компоненту кривой спада спинового эха, протоны которой прочно связаны (Т2 = 0,1 мсек), отчасти вносят вклад протоны воды, сорбированной а-кристаллином.

Было установлено, что в цистах A. salina, используемых в настоящей работе, содержится 8,6% липидов. По-видимому, протоны липидной фракций вносят вклад в компоненту с Т2 = 1,2 мсек.

А(0отн.ед

мсек

Рис. 1. Суммарная кривая спада амплитуд спинового эха от протонов образца №4:

а: 1 - суммарная кривая спада и быстрые компоненты спада 2 - Т2 - 1,2 мсек, 3 - Т-г = 0,1 мсек, б: медленная компонента спада 4 - Т2 = 16,6 мсек.

Самая медленная компонента спада сигналов спинового эха принадлежит протонам относительно подвижной воды, которая играет существенную роль в сохранении жизнеспособности цист, переживающих анабиоз.

В сухих образцах наблюдались всего две компоненты спада.

В табл. 1 представлены результаты измерений характеристик подвижности протонов, вклада свободных радикалов и парамагнитных ионов у трех образцов (№1, 2, 3). Первая быстрая компонента кинетики изменения сигнала в методе ЯМР-спиновое эхо относится к протонам связанной воды, которые взаимодействуют с полярными группами белков, поэтому все три первые компоненты одинаковы по величине.

Таблица 1

Метаболические характеристики цистА. salina

№ п/п Сухие цисты A. salina Время спин-спиновой релаксации протонов, мсек Вклад свободных радикалов, % Вклад парамагнитных ионов (Mn2+;Cu2+; Fe2+; Fe3+), %

первая компонента вторая компонента

1 Живые неактиви- рованные 1,75 ±0,12 24,0 ±1,7 14,04 ± 1,4 0,136 ±0,14

2 Живые + нейтроны 1,7 ±0,11 36,0 ± 2,5 15,31 ± 1,53 0,11 ±0,011

3 Мертвые 1,75 ±0,12 14,0 ±1,0 18,16 ± 1,82 0,078 ± 0,0078

Особо следует отметить, что вторая, медленная, компонента спада ЯМР-сигнала, связанная с протонами подвижной воды и липидов, для цист, облученных потоком тепловых нейтронов, увеличивается в 2,5 раза по сравнению с подвижностью протонов мертвых цист, при этом концентрации парамагнитных ионов и свободных радикалов в образцах практически не изменились.

Таким образом, результатом воздействия потока тепловых нейтронов является активация цист, что отражается на возрастании подвижности протонов более чем в два раза, причем скорость развития цист A. salina возрастает в 4 раза.

Следует отметить, что нейтрон-зависимая активация цист, применённая в настоящей работе, моделирует усиление корпускулярного потока при солнечной вспышке и иных астрогеофизических событиях [1]. «Метаболическое воздействие» такой активации слабым корпускулярным потоком сравнимо по интенсивности с тепловым умерщвлением цист и противоположно по результату.

ЛИТЕРАТУРА

1 .Матвеева КС., Смирнов А.Н., Воденников БД. Попов И.М., Семенов Д.С. Колесников М.В., Сыроешкин А.В. // Бюлл. экспер. биол. и медицины. — 2004. — Т. 138. —№11. —С. 530-534.

2. Барнс Р., Кейлоу П., Олив П., Голдинг Д. Безпозвоночные. Обобщенный подход. — М., 1992.

3. Babizhaev М.А., Nikolayev G.M., Goryachev S.N., Bours J. II BBA. — 2002. — № 1598, —P. 46-54.

4. Jakson., Clegg J.S. II Dev. Grouth. Differ. — 1996. — Vol. 38. — P. 153-160.

5. Liang P., Amons R., Macre T., Glegg J. II Eur. J. Biochem. — 1997. — Vol. 243. — P. 225-235.

THE STUDY OF WATER STATE IN THE CYSTAE OF ARTEMIA SAUNA

Y.G. Nikolaeva

The State Oceanographic Institute Rosgidromet SOI Kropotkin side 4, 119034 Moscow, Russia

G.M. Nikolaev, K.N. Timofeev

Department of Biophysics M.V. Lomonosov Moscow State University

Lenin hills, 119992 Moscow, Russia

V.A. Frolov, A.V. Syroeshkin

Department of Hospital Therapy Peoples’ Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya st. 8, 117198 Moscow, Russia

The set of characteristic properties of normal cystae of Artemia salina was investigated comparatively to the some properties of cysts irradiated by thermolyzed neutrons and inactivated by heating. It was shown, that the mobility of protons in water and lipids phases in alive cystae was 2.5 as large that for cystae inactivated by heating. The irradiation of alive cystae be the beam of neutrons resulted in significant increasing of the spin-spin relaxation time (T2) of protons comparatively to T2 for alive cystae. As this takes place, the concentration of paramagnetic ions and free radicals was not influenced by neutrons irradiation.