НОВЫЕ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NEW LACTIC ACID BACTERIA AND THEIR USE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к Lactobacillus reuteri и Bifidobacterium adolescentis, которые представляют собой новые молочнокислые бактерии и, в частности, к композиции, содержащей новые молочнокислые бактерии, применимой в предупреждении и лечении неврологического психического заболевания или воспалительного заболевания.
Также настоящее изобретение относится к композиции для диагностики неврологического психического заболевания, содержащей средство для измерения уровня микроорганизмов кишечника.
Предпосылки создания изобретения
В современном обществе неврологические психические заболевания, включая тревожность, депрессию, шизофрению и т.д., возрастают из-за быстрого повышения уровней стресса и т.д. В частности, тенденция проявляется в том, что все больше пациентов страдают от психических расстройств, таких как депрессия, тревожность и т. п., по разным причинам, таким как социальные и структурные, и т.д., в нашем современном мире, изобилующем индивидуализмом.
В тяжелых случаях пациенты с психическими расстройствами могут совершать самоубийства. В частности, сообщается, что у более половины пациентов с депрессией возникают мысли о самоубийстве. На самом деле, известно, что от 10% до 15% таких пациентов действительно совершают самоубийство.
Психические расстройства все еще не имеют четких и объективных критериев для определения, поскольку их симптомы могут варьировать в зависимости от соответствующих пациентов. Если существует какое-либо подозрение в отношении психических расстройств, то необходимо лечение в соответствии с точным диагнозом и обследованием. Однако реальность такова, что такое надлежащее лечение не проводится из-за негативного отношения общества к стационарному лечению психических расстройств. Также такие лекарственные средства, как антидепрессанты и т.д., используемые для лечения психических расстройств, не продемонстрировали удовлетворительного терапевтического эффекта и способны вызывать серьезные побочные эффекты, такие как сердечно-сосудистые заболевания, самоубийство и им подобные, поэтому данные лекарственные средства ограничены в применении.
С другой стороны, результатом исследования, включающего применение продуктов природного происхождения, является композиция для лечения психических расстройств с применением экстракта Fomes fomentarius и экстракта Lithospermum erythrorhizon, раскрытая в публикации патента Кореи № 10-2017-0061457, но при этом все еще существует необходимость в непрерывном исследовании эффективных молочнокислых бактерий, способных к лечению психических расстройств.
На фоне этого авторы настоящего изобретения установили, что психические расстройства можно диагностировать по изменению микробных сообществ кишечника при исследовании профилактического и терапевтического средства, предназначенного для лечения психических расстройств, а также установили, что новые молочнокислые бактерии, выделенные из экскрементов человека и мышей, проявляют эффект ингибирования фактора, индуцирующего нейродегенеративное заболевание, снижая проявление тревожного и депрессивного поведения и им подобных, поэтому новые молочнокислые бактерии можно с пользой применять в предупреждении или лечении неврологических психических заболеваний, в частности нейродегенеративных заболеваний и психических расстройств, реализуя тем самым настоящее изобретение.
Ссылки на предшествующий уровень техники
Патентный документ
(Патентный документ 1) публикация патента Кореи №10-2017-0061457
Подробное описание настоящего изобретения
Техническая задача
Целью настоящего изобретения является обеспечение новой молочнокислой бактерии.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение композиции для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания, содержащей новую молочнокислую бактерию.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение композиции для предупреждения или лечения воспалительного заболевания, содержащей новую молочнокислую бактерию.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение композиции для диагностики неврологического психического заболевания, содержащей средство для измерения уровня микроорганизма кишечника.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа диагностики неврологического психического заболевания, предусматривающего стадию измерения уровня микроорганизма кишечника, выделенного из экскрементов индивидуума с подозрением на неврологическое психическое заболевание, и стадию сравнения уровня указанного микроорганизма кишечника с уровнем микроорганизма кишечника в экскрементах контрольной группы, отличной от группы с неврологическим психическим заболеванием.
Решение технической задачи
В одном аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении представлена новая молочнокислая бактерия.
В частности, в настоящем изобретении указанная новая молочнокислая бактерия может представлять собой Lactobacillus reuteri NK33 (депозитарий: Корейский центр культур микроорганизмов (KCCM), дата депонирования: 4 августа 2017 года, номер доступа: KCCM12090P) или Bifidobacterium adolescentis NK98 (депозитарий: KCCM, дата депонирования: 3 августа 2018 года, номер доступа: KCCM12297P).
Lactobacillus reuteri NK33 или Bifidobacterium adolescentis NK98 в соответствии с настоящим изобретением характеризуются тем, что они являются новыми молочнокислыми бактериями, которые идентифицированы и выделены из экскрементов человека или мыши.
Последовательность 16S рДНК при идентификации и классификации Lactobacillus reuteri NK33 в соответствии с настоящим изобретением совпадает с SEQ ID NO: 1, которая приложена к настоящему описанию. Таким образом, Lactobacillus reuteri NK33 в соответствии с настоящим изобретением может содержать 16S рДНК под SEQ ID NO: 1. По результатам анализа указанной последовательности 16S рДНК под SEQ ID NO: 1 видно, что эта последовательность была на 99% гомологична последовательности известных штаммов Lactobacillus reuteri, демонстрируя таким образом наивысшую степень молекулярного филогенетического родства с Lactobacillus reuteri. Таким образом, указанная молочнокислая бактерия была идентифицирована как Lactobacillus reuteri и названа Lactobacillus reuteri NK33, а затем депонирована в KCCM 4 августа 2017 года (номер доступа: KCCM12090P).
Lactobacillus reuteri NK33 по настоящему изобретению является грамположительной бактерией, а по типу клетки бациллой. Более конкретно, физиологические характеристики Lactobacillus reuteri NK33 можно анализировать в соответствии со способом, общепринятым в данной области техники, при этом результаты анализа показаны в следующей таблице 3. В частности, Lactobacillus reuteri NK33 в качестве источника углерода может использовать L-арабинозу, D-рибозу, D-ксилозу, D-галактозу, D-глюкозу, D-фруктозу, D-маннозу, маннит, сорбит, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, целлобиозу, мальтозу, лактозу, мелибиозу, сахарозу, трегалозу, мелецитозу, рафинозу, гентиобиозу, D-туранозу и глюконат.
Последовательность 16S рДНК для идентификации и классификации Bifidobacterium adolescentis NK98 по настоящему изобретению совпадает с SEQ ID NO: 38, которая приложена к настоящему описанию. Таким образом, Bifidobacterium adolescentis NK98 по настоящему изобретению может содержать 16S рДНК под SEQ ID NO: 38. По результатам анализа указанной последовательности 16S рДНК под SEQ ID NO: 38 видно, что эта последовательность была на 98% гомологична последовательности известного штамма Bifidobacterium adolescentis, демонстрируя таким образом наивысшую степень молекулярного филогенетического родства с Bifidobacterium adolescentis. Таким образом, указанная молочнокислая бактерия была идентифицирована как Bifidobacterium adolescentis и названа Bifidobacterium adolescentis NK98, а затем депонирована в KCCM 3 августа 2018 года (номер доступа: KCCM12297P).
Физиологические характеристики Bifidobacterium adolescentis NK98 по настоящему изобретению можно анализировать в соответствии со способом, общепринятым в данной области техники, при этом результаты анализа показаны в следующей таблице 4. В частности, Bifidobacterium adolescentis NK98 в качестве источника углерода может использовать D-глюкозу, D-маннит, D-лактозу, D-сахарозу, D-мальтозу, салицин, D-ксилозу, L-арабинозу, желатин, цитрат железа с эскулином, D-целлобиозу, D-рафинозу и D-трегалозу.
В другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция, предназначенная для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания, содержащая новую молочнокислую бактерию.
В настоящем изобретении указанная новая молочнокислая бактерия может представлять собой Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 или их смесь.
«Lactobacillus reuteri NK33» и «Bifidobacterium adolescentis NK98» по настоящему изобретению являются такими же, которые описаны выше.
В частности, молочнокислая бактерия, содержащаяся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может являться живой бактериальной клеткой, инактивированной бактериальной клеткой, ее культурой, лизатом или экстрактом, но при этом любой тип молочнокислой бактерии можно использовать без ограничения при условии, что он способен обеспечивать профилактический или терапевтический эффект при неврологическом психическом заболевании.
В настоящем изобретении термин «культура» означает объект, полученный путем культивирования молочнокислой бактерии в известной жидкой среде или твердой среде, и он представляет собой понятие, охватывающее новую молочнокислую бактерию в настоящем изобретении.
Неврологическое психическое заболевание в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой нейродегенеративное заболевание или психическое расстройство.
В частности, неврологическое психическое заболевание в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой психическое расстройство, а указанное психическое расстройство может представлять собой одно или более расстройств, выбранных из группы, включающей тревожность, депрессию, аффективное расстройство, инсомнию, бредовое расстройство, обсессивное расстройство, мигрень, стресс, расстройство памяти, когнитивное расстройство и нарушение внимания.
В иллюстративном варианте осуществления по настоящему изобретению было установлено, что при введении Lactobacillus reuteri NK33 или Bifidobacterium adolescentis NK98 модели животного с индуцированным стрессом проявление тревожного и депрессивного поведения, вызванного стрессом, заметно снижалась; ингибировалась активность NF-κB в гиппокампе у модели животного с индуцированным стрессом; экспрессия продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора повышалась; а количества кортикостерона, IL-6, TNF-α и липополисахарида (LPS), которые являются показателями стресса в крови, снижалось. Согласно данным результатам также было установлено, что фармацевтическую композицию, содержащую указанные молочнокислые бактерии, можно с пользой применять для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания, в частности психического расстройства.
В частности, неврологическое психическое заболевание в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой нейродегенеративное заболевание, где указанное нейродегенеративное заболевание может представлять собой одно или более заболеваний, выбранных из группы, состоящей из болезни Паркинсона, болезни Хантингтона, болезни Альцгеймера, бокового амиотрофического склероза, спиноцеребеллярной атрофии, синдрома Туретта, атаксии Фридрейха, болезни Мачадо-Джозефа, деменции, дистонии, прогрессирующего надъядерного паралича и лобно-височной деменции.
В иллюстративном варианте осуществления по настоящему изобретению было установлено, что при обработке нервных клеток указанными молочнокислыми бактериями наряду с гормоном стресса кортикостероном ингибируется активность NF-κB, известного как вещество, индуцирующее нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, и одновременно повышается экспрессия продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF), известного тем, что его уровень снижается при старении, деменции и им подобных (таблицы 5 и 6). Согласно полученным результатам также было установлено, что фармацевтическую композицию, содержащую указанные молочнокислые бактерии, можно с пользой применять для предупреждения и лечения неврологического психического заболевания, в частности нейродегенеративного заболевания.
Также в иллюстративном варианте осуществления по настоящему изобретению было установлено, что при совместном введении Lactobacillus reuteri NK33 и Bifidobacterium adolescentis NK98 эффект улучшения состояния при неврологическом психическом заболевании, в частности эффект снижения уровня стресса, заметно повышался по сравнению с каждой группой введения указанных молочнокислых бактерий по отдельности (таблица 20).
В настоящем изобретении указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать Bifidobacterium adolescentis IM38 KCCM11807P.
Указанная Bifidobacterium adolescentis IM38 KCCM11807P представляет собой известную молочнокислую бактерию, раскрытую в публикации патента Кореи №10-2017-0090359, доступ к которой можно получить в публикации патента Кореи №10-2017-0090359.
В иллюстративном варианте осуществления по настоящему изобретению было установлено, что при совместном введении Lactobacillus reuteri NK33 или Bifidobacterium adolescentis NK98 и Bifidobacterium adolescentis IM38 модели животного с индуцированным стрессом проявление тревожного и депрессивного поведения, вызванного стрессом, заметно снижалось, и количество кортикостерона в крови, который является показателем стресса, снижалось.
В другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения воспалительного заболевания, содержащая Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 или их смесь.
«Lactobacillus reuteri NK33» и «Bifidobacterium adolescentis NK98» по настоящему изобретению являются такими же, которые описаны выше.
В частности, молочнокислая бактерия, содержащаяся в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, может являться живой бактериальной клеткой, инактивированной бактериальной клеткой, ее культурой, лизатом или экстрактом, но при этом любой тип молочнокислой бактерии можно использовать без ограничения при условии, что он способен обеспечивать профилактический или терапевтический эффект при воспалительном заболевании.
В настоящем изобретении термин «культура» означает объект, полученный путем культивирования молочнокислой бактерии в известной жидкой среде или твердой среде, и он представляет собой понятие, охватывающее новую молочнокислую бактерию в настоящем изобретении.
Воспалительное заболевание по настоящему изобретению может представлять собой одно или более заболеваний, выбранных из группы, включающей артрит, подагру, гепатит, астму, ожирение, кератит, гастрит, энтерит, нефрит, колит, диабет, туберкулез, бронхит, плеврит, перитонит, спондилит, панкреатит, боль при воспалении, уретрит, цистит, вагинит, атеросклероз, септицемию, ожог, дерматит, периодонтит и гингивит.
В иллюстративном варианте осуществления по настоящему изобретению было установлено, что при обработке макрофага, выделенного у мыши, указанными молочнокислыми бактериями наряду с липополисахаридом (LPS), индуктором воспалительной реакции, воспалительная реакция заметно подавлялась (таблицы 5 и 6). Согласно полученным результатам также было установлено, что фармацевтическую композицию, содержащую указанные молочнокислые бактерии в соответствии с настоящим изобретением, можно с пользой применять для предупреждения и лечения воспалительного заболевания.
В частности, воспалительное заболевание может представлять собой колит.
В иллюстративном варианте осуществления по настоящему изобретению было установлено, что при введении Lactobacillus reuteri NK33 или Bifidobacterium adolescentis NK98 модели животного с колитом, индуцированным стрессом, длина его толстой кишки, которая является показателем колита, восстанавливалась до значений нормального уровня, и количества миелопероксидаз COX-2 и iNOS, которые являются показателями колита, снижаются, при этом также снижалась активность TNF-α (фиг. 15 и таблица 15). Согласно полученным результатам также было установлено, что фармацевтическую композицию, содержащую указанные Lactobacillus reuteri NK33 или Bifidobacterium adolescentis NK98, можно с пользой применять для предупреждения и лечения воспалительного заболевания, в частности колита.
Фармацевтическую композицию, предназначенную для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания, или фармацевтическую композицию, предназначенную для предупреждения или лечения воспалительного заболевания в соответствии с настоящим изобретением, можно получать в виде фармацевтической лекарственной формы с помощью способа, хорошо известного в данной области техники, таким образом, чтобы активный компонент такой композиции мог быть обеспечен путем быстрого, замедленного или пролонгированного высвобождения после введения млекопитающему. При получении лекарственной формы фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель в таком количестве, чтобы этот носитель не подавлял активность новой молочнокислой бактерии.
Фармацевтически приемлемый носитель может включать без ограничения традиционно используемые носители, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния, минеральное масло и т. п. Также фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать разбавитель или вспомогательное вещество, как, например, наполнитель, сухой разбавитель, связующее, увлажняющее средство, разрыхлитель, поверхностно-активное вещество и т. д. и другие фармацевтически приемлемые добавки.
2
11
Дозировка фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением должна представлять собой фармацевтически эффективное количество. «Фармацевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для предупреждения или лечения неврологических психических заболеваний или воспалительных заболеваний при приемлемом соотношении польза/риск, применимом для медицинского применения. Эффективный уровень дозы может быть различным образом выбран специалистом в данной области техники в соответствии с такими факторами, как способ составления, состояние и вес пациента, пол пациента, возраст и тяжесть заболевания, форма лекарственного средства, путь и период введения, скорость экскреции, чувствительность реакции и т. д. Эффективное количество можно варьировать в зависимости от пути лечения, применения вспомогательного вещества и возможности применения с другими лекарственными средствами, что известно специалистам в данной области техники. Однако в случае получения c целью перорального введения для обеспечения предпочтительного эффекта композицию в соответствии с настоящим изобретением можно в общем случае вводить взрослому в количестве от 0,0001 до 100 мг/кг в сутки, предпочтительно от 0,001 до 100 мг/кг в сутки из расчета на 1 кг веса тела. Если при таком получении введение осуществляют так, как это указано выше, то Lactobacillus reuteri NK33 или Bifidobacterium adolescentis NK98 в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в количестве от 1x10 КОЕ/60кг до 1x10 КОЕ/60кг в сутки. Такое введение можно осуществлять один раз в сутки или разделять на несколько раз в сутки. Указанная дозировка не ограничивает объем настоящего изобретения в любом аспекте.
Фармацевтическую композицию, предназначенную для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания, или фармацевтическую композицию, предназначенную для предупреждения или лечения воспалительного заболевания в соответствии с настоящим изобретением, можно вводить таким млекопитающим, как мыши, домашний скот, люди и т. д., посредством различных путей. В частности, фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить перорально или парентерально (например, применять или вводить путем инъекции внутривенно, подкожно или интраперитонеально), но предпочтительно может быть пероральное введение. Твердый препарат для перорального введения может включать порошок, гранулу, таблетку, капсулу, мягкую капсулу, пилюлю и т. д. Жидкий препарат для перорального введения может включать суспендирующее средство, жидкость для приема внутрь, эмульсию, сироп, аэрозоль и т. д., но также может включать различные вспомогательные вещества, например, увлажняющее средство, подсластитель, ароматизатор, консервант и т. д., в дополнение к воде и жидкому парафину, которые представляют собой часто используемые простые разбавители. Препарат для парентерального введения можно применять при составлении в лекарственную форму препарата для наружного применения и стерилизованного препарата для введения путем инъекции, такого как стерилизованный водный раствор, жидкость, неводный растворитель, суспендирующее средство, эмульсия, глазные капли, глазная мазь, сироп, суппозиторий, аэрозоль и т. д., в соответствии с соответствующими общепринятыми способами, и его предпочтительно можно использовать в получении фармацевтической композиции в виде крема, геля, повязки, спрея, мази, пластыря, лосьона, линимента, глазной мази, глазных капель, пасты или припарки, но не ограничиваясь этим. Препарат для местного введения может быть в безводной или водной форме в зависимости от клинического назначения. В качестве вышеуказанных неводного растворителя и суспендирующего средства можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, как, например, оливковое масло, сложный эфир для инъекций, как, например, этилолеат и т. д. В качестве основы для вышеуказанных суппозиториев можно применять витепсол, макрогол, твин 61, масло какао, лауриновое масло, глицерожелатин и т. д.
В другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении представлен способ предупреждения или лечения неврологического психического заболевания, предусматривающий стадию введения индивидууму Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 или их смеси.
В другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении представлен способ предупреждения или лечения воспалительного заболевания, предусматривающий стадию введения индивидууму Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 или их смеси.
Термины «Lactobacillus reuteri NK33», «Bifidobacterium adolescentis NK98», «введение», «неврологическое психическое заболевание», «воспалительное заболевание» и т. п. в соответствии с настоящим изобретением являются такими же, которые описаны выше.
Индивидуум относится к животному и, как правило, может представлять собой млекопитающее, в отношении которого лечение с применением новой молочнокислой бактерии по настоящему изобретению может оказывать благоприятный эффект. Предпочтительный пример такого индивидуума может включать приматов, таких как человек, а также крысу, мышь, обезьяну, собаку, кошку, корову, лошадь, свинью, овцу или козу. Также такие индивидуумы могут включать всех индивидуумов, имеющих симптом неврологического психического заболевания или воспалительного заболевания, или имеющих риск возникновения такого симптома.
В другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении представлен функциональный оздоровительный пищевой продукт, предназначенный для предупреждения или улучшения в отношении неврологического психического заболевания, содержащий Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 или их смесь.
В другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении представлен функциональный оздоровительный пищевой продукт, предназначенный для предупреждения или улучшения в отношении воспалительного заболевания, содержащий Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 или их смесь.
Термины «Lactobacillus reuteri NK33», «Bifidobacterium adolescentis NK98», «введение», «неврологическое психическое заболевание», «воспалительное заболевание» и т. п. в соответствии с настоящим изобретением являются такими же, которые описаны выше.
Функциональный оздоровительный пищевой продукт, который усиливает модулирующую функцию пищи в организме, представляет собой пищевой продукт, которой придана дополнительная ценность с помощью физического, биохимического или биоинженерного способа таким образом, чтобы пищевой продукт мог действовать для проявления своих функций для конкретной цели. Компонент такого функционального оздоровительного пищевого продукта разрабатывают и обрабатывают для полного осуществления его модулирующей функции в организме in vivo, принимающей участие в защите живого организма, корректировке ритмов организма, предупреждении заболевания, и способствует восстановлению после заболевания, а также может содержать дополнительные пищевые добавки, которые приемлемы в качестве пищи, подсластителей или функциональных сырьевых материалов.
В случае применения Lactobacillus reuteri NK33 или Bifidobacterium adolescentis NK98 в соответствии с настоящим изобретением в качестве функционального оздоровительного пищевого продукта (или добавок к функциональным оздоровительным напиткам), указанные молочнокислые бактерии можно добавлять в том виде,в котором они используются наряду с другой пищей или пищевыми компонентами, или соответствующим образом использовать в соответствии с общепринятым способом. Смешанное количество указанных молочнокислых бактерий можно соответствующим образом определять в зависимости от цели их применения (предупреждение, оздоровление, улучшение или терапевтическое применение).
Функциональный оздоровительный пищевой продукт может предусматривать различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), ароматизаторы, такие как синтетические ароматизаторы, натуральные ароматизаторы и т. п., красители и усилители вкуса (сыр, шоколад и т. д.), пектиновую кислоту и ее соли, органическую кислоту, защитные коллоидные загустители, регуляторы кислотности, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирт, карбонизаторы, используемые для газированных напитков, и т. д. Также функциональная оздоровительная продукция в соответствии с настоящим изобретением может содержать мякоть для получения напитков на основе фруктов и овощей. Такие компоненты можно использовать по отдельности или в комбинации, при этом соотношение таких добавок обычно выбирают из диапазона от 0,001 до 50 частей по весу из расчета на общий вес композиции.
Тип функционального оздоровительного пищевого продукта не имеет конкретного ограничения. В качестве пищи, в которую можно добавлять указанные молочнокислые бактерии, используют колбасу, мясо, хлеб, шоколад, закуски, конфеты, кондитерские изделия, рамен, пиццу, другую лапшу, жевательные резинки, молочные продукты, включая мороженое, различные супы, напитки, чай, оздоровительные напитки, спиртные напитки, витаминные комплексы и т.д. В случае составления в виде напитков жидкий компонент, который добавляют в напитки в дополнение к новым молочнокислым бактериям, может включать без ограничения разные ароматизаторы, натуральные углеводы или им подобные в качестве дополнительного компонента, такого же, который содержится в обычных напитках. Вышеуказанные натуральные углеводы могут представлять собой моносахарид (например, глюкозу, фруктозу и т. д.), дисахарид (например, мальтозу, сахарозу и т. д.) и полисахарид (например, обычный сахар, такой как декстрин, циклодекстрин и т. д.), а также сахароспирт, такой как ксилит, сорбит, эритрит и т.д.
В другом аспекте для достижения указанных целей в настоящем изобретении представлена композиция для диагностики неврологического психического заболевания, содержащая средство для измерения уровня микроорганизмов кишечника.
Такие термины, как «неврологическое психическое заболевание» и т.д., в соответствии с настоящим изобретением являются такими же, как описано выше.
В настоящем изобретении термин «микроорганизм кишечника» относится к микроорганизму, присутствующему в пищеварительном тракте, в частности к микроорганизму, присутствующему конкретно в кишечнике, где такой микроорганизм кишечника может представлять собой один или более микрооргназимов, выбранных из группы, включающей Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes, Bifidobacteria, Lactobacilli, β-Рroteobacteria, δ-Рroteobacteria, γ-Рroteobacteria, ε-Рroteobacteria и Enterobacteriaceae.
В частности, с помощью композиции для диагностики в соответствии с настоящим изобретением можно диагностировать неврологическое психическое заболевание, если повышен уровень одного или более микроорганизмов , выбранных из группы микроорганизмов кишечника, включающей β-Рroteobacteria, δ-Рroteobacteria, γ-Рroteobacteria, ε-Рroteobacteria и Enterobacteriaceae; с помощью такой композиции можно диагностировать неврологическое психическое заболевание, если снижен уровень какого-либо из микроорганизмов, выбранных из группы микроорганизмов кишечника, включающей Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes, Bifidobacteria и Lactobacilli; и с помощью такой композиции можно диагностировать неврологическое психическое заболевание, если повышен уровень одного или более микроорганизмов, выбранных из группы микроорганизмов кишечника, включающей β-Рroteobacteria, δ-Рroteobacteria, γ-Рroteobacteria, ε-Рroteobacteria и Enterobacteriaceae, и если снижен уровень одного из микроорганизмов, выбранных из группы микроорганизмов кишечника, включающей Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes, Bifidobacteria и Lactobacilli.
В частности, указанный микроорганизм кишечника из Еnterobacteriaceae, уровень которого повышен, может представлять собой один или более микроорганизмов кишечника, выбранных из группы, включающей Klebsiella oxytoca, Escherichia coli и Morganella morganii.
Также, указанный микроорганизм кишечника из рода Lactobacilli, уровень которого снижен, может представлять собой один или более микроорганизмов кишечника, выбранных из группы, включающей Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus rhamnosus, при этом указанный микроорганизм кишечника из рода Bifidobacteria, уровень которого снижен, может представлять собой Bifidobacterium animalis.
Композиция для диагностики неврологического психического заболевания, представленная в настоящем изобретении, содержит средство, обеспечивающая возможность измерения уровня микроорганизма кишечника, где возникновение неврологического психического заболевания у индивидуума можно идентифицировать путем измерения уровня микроорганизма кишечника в экскрементах, выделенных у индивидуума, который нуждается в идентификации в отношении возникновения неврологического психического заболевания с помощью средства, содержащегося в указанной композиции. Указанный индивидуум может представлять собой животное, предпочтительно млекопитающее, например, примата, такого как человек, а также крысу, мышь, обезьяну, собаку, кошку, корову, лошадь, свинью, овцу или козу.
Препарат можно применять для идентификации того, возникло неврологическое психическое заболевание у индивидуума или нет, путем измерения уровня микроорганизма кишечника, выделенного из экскрементов указанного индивидуума.
Средство, обеспечивающее возможность измерения указанного уровня микроорганизма кишечника, может, в частности, представлять собой праймер, зонд или им подобные, обеспечивающие возможность измерения уровня конкретного гена микроорганизма кишечника; может представлять собой антитело, аптамер или им подобные, обеспечивающие возможность измерения уровня белка, экспрессирующегося с указанного конкретного гена; может представлять собой праймер, зонд или им подобные, предназначенные для количественного анализа последовательности 16S рДНК микроорганизма кишечника; и может представлять собой средство для пиросеквенирования и т.д., предназначенное для количественного анализа последовательности геномной ДНК микроорганизма кишечника, но, в частности, без ограничения при условии, что средство можно использовать для количественного анализа микроорганизма кишечника, выделенного из экскрементов индивидуума.
В частности, праймер, специфичный для указанного микроорганизма кишечника из категории Firmicutes, может представлять собой пару праймеров, состоящую из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3; праймер, специфичный для категории Bacteroidetes, может представлять собой пару праймеров, состоящую из SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5; праймер, специфичный для категории β-Рroteobacteria, может представлять собой пару праймеров, состоящую из SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7; праймер, специфичный для категории δ/γ-Рroteobacteria, может представлять собой пару праймеров, состоящую из SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 9; праймер, специфичный для категории ε-Рroteobacteria, может представлять собой пару праймеров, состоящую из SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11; праймер, специфичный для категории Actinobacteria, может представлять собой пару праймеров, состоящую из SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13; и праймер, специфичный для категории Enterobacteriaceae, может представлять собой пару праймеров, состоящую из SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.
В иллюстративном варианте осуществления по настоящему изобретению уровни микроорганизмов кишечника измеряли путем проведения пиросеквенирования с помощью средства для пиросеквенирования, содержащего баркодированный праймер под от SEQ ID NO: 2 до SEQ ID NO: 19 в таблице 1 (экспериментальный пример 3).
Композиция в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать средство, предназначенное для измерения количества липополисахарида (LPS). В частности, средство, предназначенное для измерения количества указанного липополисахарида (LPS), может представлять собой средство, обычно используемое для измерения количества липополисахарида (LPS), более конкретно средство без ограничения включено в набор для анализа на основе лизата амебоцитов мечехвоста (LAL).
В иллюстративном варианте осуществления по настоящему изобретению было установлено, что по результатам анализа экскрементов модели животного с индуцированным психическим расстройством количество липополисахарида (LPS) повышено (фигуры 1, 2, 7 и 11).
В другом аспекте в настоящем изобретении представлен набор для диагностики неврологического психического заболевания, содержащий указанную композицию.
Набор в соответствии с настоящим изобретением может включать в себя контейнер для сбора, с помощью которого можно собирать экскременты индивидуума, подлежащего идентификации в отношении возникновения у него неврологического психического заболевания путем применения указанной композиции; буферный раствор для экстрагирования из экскрементов микроорганизма кишечника; средство для измерения, используемое для измерения уровня микроорганизма кишечника, и им подобные.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлен способ диагностики неврологического психического заболевания, предусматривающий стадию измерения уровня микроорганизма кишечника в экскрементах, выделенных у индивидуума с подозрением на неврологическое психическое заболевание; и стадию сравнения уровня указанного микроорганизма кишечника с уровнем микроорганизма кишечника в экскрементах контрольной группы, отличной от группы с неврологическим психическим заболеванием.
Также в настоящем изобретении представлен информативный способ диагностики неврологического психического заболевания, предусматривающий стадию измерения уровня микроорганизма кишечника, выделенного из экскрементов индивидуума с подозрением на неврологическое психическое заболевание; и стадию сравнения уровня указанного микроорганизма кишечника с уровнем микроорганизма кишечника в экскрементах контрольной группы, отличной от группы с неврологическим психическим заболеванием.
Экскременты означают экскременты, выделенные и собранные у индивидуума в качестве образца для измерения уровня микроорганизма кишечника.
В частности, микроорганизм кишечника может представлять собой один или более микроорганизмов кишечника, выбранных из группы, включающей Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes, Bifidobacteria, Lactobacilli, β-Рroteobacteria, δ-Рroteobacteria, γ-Рroteobacteria, ε-Рroteobacteria и Enterobacteriaceae.
С помощью способа диагностики неврологического психического заболевания или предоставления информации о нем в соответствии с настоящим изобретением можно диагностировать, возникает ли неврологическое психическое заболевание или имеется ли риск его возникновения, путем идентификации микроорганизма, уровень которого повышен, среди указанных микроорганизмов кишечника.
В частности, способ диагностики неврологического психического заболевания или предоставления информации о нем может дополнительно предусматривать стадию определения индивидуума, у которого повышен уровень микроорганизма кишечника, как имеющего неврологическое психическое заболевание путем сравнения уровня микроорганизма кишечника в экскрементах индивидуума с подозрением на неврологическое психическое заболевание с уровнем микроорганизма кишечника в экскрементах контрольной группы, отличной от группы с неврологическим психическим заболеванием.
микроорганизм кишечника, уровень которого повышен, может представлять собой один или более микроорганизмов кишечника, выбранных из группы, включающей β-Рroteobacteria, δ-Рroteobacteria, γ-Рroteobacteria, ε-Рroteobacteria и Еnterobacteriaceae.
В частности, Enterobacteriaceae может представлять собой один или более микроорганизмов, выбранных из группы, включающей Klebsiella oxytoca, Escherichia coli и Morganella morganii.
Также с помощью способа диагностики неврологического психического заболевания или предоставления информации о нем в соответствии с настоящим изобретением можно диагностировать, возникает ли неврологическое психическое заболевание или имеется ли риск его возникновения путем идентификации микроорганизма, уровень которого снижен, среди указанных микроорганизмов кишечника.
Такие термины, как «неврологическое психическое заболевание» и т.д., в соответствии с настоящим изобретением являются такими же, как описано выше.
В частности, способ диагностики неврологического психического заболевания или предоставления информации о нем может дополнительно предусматривать стадию определения индивидуума, у которого снижен уровень микроорганизма кишечника, как имеющего неврологическое психическое заболевание путем сравнения уровня микроорганизма кишечника в экскрементах индивидуума с подозрением на неврологическое психическое заболевание с уровнем микроорганизма кишечника в экскрементах контрольной группы, отличной от группы с неврологическим психическим заболеванием.
микроорганизм кишечника, уровень которого снижен, может представлять собой один или более микроорганизмов кишечника, выбранных из группы, включающей Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes, Bifidobacteria и Lactobacilli.
Также микроорганизм кишечника из рода Lactobacilli может представлять собой один или более микроорганизмов, выбранных из группы, включающей Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus rhamnosus, и при этом микроорганизм кишечника из рода Bifidobacteria может представлять собой Bifidobacterium animalis.
В иллюстративном варианте осуществления по настоящему изобретению в результате выявления изменения микробного сообщества кишечника с использованием экскрементов, выделенных у модели животного с индуцированным стрессом, таким как иммобилизационный стресс, антибиотический стресс или им подобные, было установлено, что уровни β-Рroteobacteria, δ-Рroteobacteria, γ-Рroteobacteria, ε-Рroteobacteria и Enterobacteriaceae повышались, а уровни Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes, Bifidobacteria и Lactobacilli снижались по сравнению с моделью животного без стресса (фигуры 2, 6, 8, 10 и 12). В частности, было установлено, что среди определенных Enterobacteriaceae, уровень которых повышен, встречаются Klebsiella oxytoca, Escherichia coli и Morganella morganii; среди определенных Lactobacilli, уровень которых снижен, встречаются Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii и Lactobacillus rhamnosus; и среди определенных Bifidobacteria, уровень которых снижен, встречается Bifidobacterium animalis.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлено применение новой молочнокислой бактерии для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания. В частности, в настоящем изобретении представлено применение Lactobacillus reuteri NK33 для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания. Также в настоящем изобретении представлено применение Bifidobacterium adolescentis NK98 для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлено применение новой молочнокислой бактерии для предупреждения или лечения воспалительного заболевания. В частности, в настоящем изобретении представлено применение Lactobacillus reuteri NK33 для предупреждения или лечения воспалительного заболевания. Также в настоящем изобретении представлено применение Bifidobacterium adolescentis NK98 для предупреждения или лечения воспалительного заболевания.
В другом аспекте в настоящем изобретении представлено применение композиции, содержащей новую молочнокислую бактерию, для получения лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания. В частности, в настоящем изобретении предусмотрено применение композиции, содержащей Lactobacillus reuteri NK33, для получения лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания. Также в настоящем изобретении представлено применение композиции, содержащей Bifidobacterium adolescentis NK98, для получения лекарственного средства, предназначенного для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания.
Термины «Lactobacillus reuteri NK33», «Bifidobacterium adolescentis NK98», «неврологическое психическое заболевание», «воспалительное заболевание» и им подобные в соответствии с настоящим изобретением являются такими же, которые описаны выше.
Числовые значения, описанные в настоящем описании, должны интерпретироваться как включающие диапазон их эквивалентов, если не указано иное.
Далее в данном документе настоящее изобретение будет описано подробно с помощью предпочтительных примеров для лучшего понимания настоящего изобретения. Однако следующие примеры представлены лишь с целью иллюстрации настоящего изобретения, поэтому настоящее изобретение ими не ограничивается.
Преимущественные эффекты
Новая молочнокислая бактерия в соответствии с настоящим изобретением, т.е. Lactobacillus reuteri NK33 или Bifidobacterium adolescentis NK98, оказывает эффект в виде подавления фактора, индуцирующего нейродегенеративное заболевание, и снижает проявление тревожного и депрессивного поведения. Таким образом, новую молочнокислую бактерию в соответствии с настоящим изобретением можно применять в качестве композиции для предупреждения или лечения неврологического психического заболевания, и в частности, она эффективна для предупреждения и лечения нейродегенеративного заболевания и психического расстройства.
Также новая молочнокислая бактерия в соответствии с настоящим изобретением эффективна для подавления воспалительной реакции, поэтому ее можно применять в композиции, предназначенной для предупреждения или лечения воспалительного заболевания, и поэтому она эффективна для предупреждения и лечения колита.
Кроме того, композиция для измерения уровня микроорганизмов кишечника в соответствии с настоящим изобретением эффективна в диагностике неврологического психического заболевания путем измерения уровня микроорганизмов кишечника.
Краткое описание графических материалов
На фиг. 1 показаны результаты определения тревожного поведения и маркеров в крови у мышей (IS), подвергнутых иммобилизационному стрессу; (a) представляет собой график, демонстрирующий, что время, проведенное в открытых рукавах (OT), и число заходов в открытые рукава (OE) сокращались при проведении теста с приподнятым крестообразным лабиринтом; (b) представляет собой график, демонстрирующий, что время, проведенное в освещенном отсеке, сокращалось при проведении теста «черно-белая камера»; (c) представляет собой график, демонстрирующий, что поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывание шариков» проявлялось чаще; (d) представляет собой изображение, демонстрирующее, что активность NF-κB (p-p65/p65) увеличивалась в гиппокампе, а уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) уменьшался; (e) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень кортикостерона в крови увеличивался; (f) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень IL-6 в крови увеличивался; (g) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень TNF-α в крови увеличивался; и (h) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень липополисахарида (LPS) в крови увеличивался.
Фиг. 2 (a) представляет собой диаграмму, демонстрирующую изменение микробного сообщества кишечника в экскрементах мышей (IS), подвергнутых иммобилизационному стрессу; а фиг. 2 (b) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня липополисахарида (LPS) в экскрементах мышей (IS), подвергнутых иммобилизационному стрессу.
На фиг. 3 показаны результаты измерения маркеров колита у мышей (IS), подвергнутых иммобилизационному стрессу; (a) представляет собой график, демонстрирующий уменьшение длины толстой кишки у мышей (IS), подвергнутых иммобилизационному стрессу; (b) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня миелопероксидазы в толстой кишке; (c) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня TNF-α в толстой кишке; (d) представляет собой изображение, демонстрирующее повышение активности NF-κB (p-p65/p65) и повышение уровня экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке; и (e) представляет собой изображение снижения уровней окклюдина и клаудина-1 в толстой кишке.
На фиг. 4 показаны результаты, демонстрирующие состояние модели животного (FIS), которой вводили фекалии животной модели с индуцированным иммобилизационным стрессом; (a) представляет собой график, демонстрирующий сокращение времени, проведенного в открытых рукавах (OT), и числа заходов в открытые рукава (OE) в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом; (b) представляет собой график, демонстрирующий сокращение времени, проведенного в освещенном отсеке, в тесте «черно-белая камера»; (c) представляет собой график, демонстрирующий, что более частое проявление поведения, проявляющегося закапыванием шариков, в тесте с закапыванием шариков; (d) представляет собой изображение, демонстрирующее, что активность NF-κB (p-p65/p65) в гиппокампе повышается, и уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) уменьшается; (e) представляет собой график, демонстрирующий, что длина толстой кишки уменьшается; и (f) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень миелопероксидазы в толстой кишке повышается.
На фиг. 5 показаны результаты измерения индикаторов в крови у модели животного (FIS), которой вводили фекалии модели животного с индуцированным иммобилизационным стрессом; (a) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня кортикостерона в крови; (b) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня IL-6 в крови; и (c) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня TNF-α в крови.
На фиг. 6 показаны результаты идентификации изменения маркеров колита и микробного сообщества кишечника в модели животного (FIS), которой вводили экскременты модели животной с индуцированным иммобилизационным стрессом; (a) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня TNF-α; (b) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня IL-6 в толстой кишке; (c) представляет собой график, демонстрирующий снижение уровня IL-10 в толстой кишке; (d) представляет собой изображение, демонстрирующее повышение активности NF-κB (p-p65/p65) и повышение уровней экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке; и (e) представляет собой диаграмму, демонстрирующую изменение микробного сообщества кишечника в экскрементах.
На фиг. 7 показаны результаты определения тревожного поведения и маркеров в крови у мышей (AP), подвергнутых антибиотическому стрессу; (a) представляет собой график, демонстрирующий, что время, проведенное в открытых рукавах (OT), и число заходов в открытые рукава (OE) сокращались при проведении теста с приподнятым крестообразным лабиринтом; (b) представляет собой график, демонстрирующий, что время, проведенное в освещенном отсеке, сокращалось при проведении теста «черно-белая камера»; (c) представляет собой график, демонстрирующий, что поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывание шариков» проявлялось чаще; (d) представляет собой изображение, демонстрирующее, что активность NF-κB (p-p65/p65) увеличивалась в гиппокампе, а уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) уменьшался; (e) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень кортикостерона в крови увеличивался; (f) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень IL-6 в крови увеличивался; (g) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень TNF-α в крови увеличивался; и (h) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень липополисахарида (LPS) в крови увеличивался.
Фиг. 8 (a) представляет собой диаграмму, демонстрирующую изменение микробного сообщества кишечника в экскрементах мышей (AP), подвергнутых антибиотическому стрессу; и фиг. 8 (b) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня липополисахарида (LPS) в экскрементах мышей (AP), подвергнутых антибиотическому стрессу.
На фиг. 9 показаны результаты измерения маркеров колита у мышей (AP), подвергнутых антибиотическому стрессу; (a) представляет собой график, демонстрирующий уменьшение длины толстой кишки; (b) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня миелопероксидазы в толстой кишке; (c) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня TNF-α в толстой кишке; (d) представляет собой изображение, демонстрирующее повышение активности NF-κB (p-p65/p65) и повышение уровней экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке; и (e) представляет собой изображение, демонстрирующее уменьшение уровней окклюдина и клаудина-1 в толстой кишке.
Фиг. 10 (A) представляет собой диаграмму, демонстрирующую, уровень какой бактерии повышен при культивировании экскрементов мышей (IS), подвергнутых иммобилизационному стрессу, и экскрементов мышей (AP), подвергнутых антибиотическому стрессу, в селективной среде; и фиг. 10 (B) представляет собой диаграмму, демонстрирующую уровень какой бактерии снижен при культивировании экскрементов мышей (IS), подвергнутых иммобилизационному стрессу, и экскрементов мышей (AP), подвергнутых антибиотическому стрессу, в селективной среде.
На фиг. 11 показаны результаты определения показателей тревожного поведения и маркеров в крови у мышей (AP), которым вводили микроорганизм, уровень которого повышался в экскрементах мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу и антибиотическому стрессу; (a) представляет собой график, демонстрирующий заметное сокращение времени, проведенного в открытых рукавах (OT), и числа заходов в открытые рукава (OE) в группе, которой вводили Klebsiella oxytoca, при проведении теста с приподнятым крестообразным лабиринтом и у мышей, которым вводили Klebsiella oxytoca (KO), Escherichia coli (EC), Aerococcus urinaeequi (AU) и Morganella morganii (MM); (b) представляет собой график, демонстрирующий сокращение времени, проведенного в открытых рукавах (OT), и числа заходов в открытые рукава (OE) при проведении теста с приподнятым крестообразным лабиринтом и у мышей, которым вводили Klebsiella oxytoca (KO); (c) представляет собой график, демонстрирующий сокращение времени, проведенного в освещенном отсеке, при проведении теста «черно-белая камера»; (d) представляет собой график, демонстрирующий, что поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывание шариков» проявлялось чаще; (e) представляет собой изображение, демонстрирующее, что активность NF-κB (p-p65/p65) увеличивалась в гиппокампе, а уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) уменьшался; (f) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень кортикостерона в крови увеличивался; (g) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень IL-6 в крови увеличивался; (h) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень TNF-α в крови увеличивался; и (i) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень липополисахарида (LPS) в крови увеличивался.
Фиг. 12 (a) представляет собой диаграмму, демонстрирующую изменение в микробном сообществе кишечника в экскрементах мышей (KO), которым вводили Klebsiella oxytoca; и фиг.12 (b) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня липополисахарида (LPS) в экскрементах мышей (KO), которым вводили Klebsiella oxytoca.
На фиг. 13 показаны результаты измерения маркеров колита у мышей (KO), которым вводили Klebsiella oxytoca; (a) представляет собой график, демонстрирующий уменьшение длины толстой кишки; (b) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня миелопероксидазы в толстой кишке; (c) представляет собой график, демонстрирующий повышение уровня TNF-α в толстой кишке; (d) представляет собой изображение, демонстрирующее повышение активности NF-κB (p-p65/p65) и повышение уровней экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке; и (e) представляет собой изображение, демонстрирующее уменьшение уровней окклюдина и клаудина-1 в толстой кишке.
На фиг. 14 показаны результаты измерения показателей тревожного поведения и маркеров крови у группы (IS), в которой мышам, подвергнутым иммобилизационному стрессу, вводили физиологический солевой раствор, и сравнение этих показателей с группой, которой вводили Lactobacillus reuteri NK33 (IS+LR), новую молочнокислую бактерию; (a) представляет собой график, демонстрирующий сокращение времени, проведенного в открытых рукавах (OT), и числа заходов в открытые рукава (OE) при проведении теста с приподнятым крестообразным лабиринтом в группе, которой вводили Lactobacillus reuteri NK33 (IS+LR), новую молочнокислую бактерию; (b) представляет собой график, демонстрирующий сокращение времени, проведенного в освещенном отсеке, при проведении теста «черно-белая камера»; (c) представляет собой график, демонстрирующий, что поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывание шариков» проявлялось чаще; (d) представляет собой изображение, демонстрирующее, что активность NF-κB (p-p65/p65) ингибируется в гиппокампе, а уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) уменьшался; (e) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень кортикостерона в крови уменьшался; (f) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень IL-6 в крови уменьшался; и (g) представляет собой график, демонстрирующий, что уровень TNF-α в крови уменьшался.
На фиг. 15 показаны результаты измерения маркеров колита в группе (IS), в которой мышам, подвергнутым иммобилизационному стрессу, вводили физиологический солевой раствор, и в группе, которой вводили Lactobacillus reuteri NK33 (IS+LR), новую молочнокислую бактерию; (a) представляет собой график, демонстрирующий восстановление длины толстой кишки; (b) представляет собой график, демонстрирующий снижение уровня миелопероксидазы в толстой кишке; (c) представляет собой график, демонстрирующий уменьшение уровня TNF-α в толстой кишке; и (d) представляет собой изображение, демонстрирующее уменьшение активности NF-κB (p-p65/p65) и уменьшение уровня экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке.
Принцип изобретения
Далее в данном документе настоящее изобретение будет описано подробно с помощью предпочтительных примеров и экспериментальных примеров для лучшего понимания настоящего изобретения. Однако следующие примеры и экспериментальные примеры представлены лишь с целью иллюстрации настоящего изобретения, поэтому настоящее изобретение ими не ограничено.
Экспериментальный пример 1. Модель животного с индуцированным психическим расстройством
(1) Иммобилизационный стресс
Для того, чтобы вызвать психическое расстройство, такое как тревожность, депрессия, стресс или им подобные, мышь фиксировали в аппарате цилиндрической формы размером 3x10 см, предназначенном для индуцирования иммобилизационного стресса, таким образом, чтобы мышь вообще не могла в нем двигаться.
В частности, с целью получения у мыши состояния тревожности, индуцированной иммобилизационным стрессом, указанную мышь, которая была закреплена в аппарате, повторно подвергали иммобилизационному стрессу пять раз таким образом, что мышь удерживали с поднятой головой в течение двух часов один раз через день, а затем проводили поведенческий эксперимент через два часа после завершающего иммобилизационного стресса.
Также с целью получения у мыши депрессии, индуцированной иммобилизационным стрессом, указанную мышь, которая была закреплена в аппарате, повторно подвергали непрерывному иммобилизационному стрессу один раз в сутки в течение двух дней путем удерживания мыши с поднятой головой в течение 12 часов. Молочнокислую бактерию вводили один раз в сутки в течение пяти дней, а поведенческий эксперимент проводили через один час после последнего введения.
(2) Антибиотический стресс
Для того, чтобы вызвать психическое расстройство, такое как тревожность, депрессия, стресс или им подобные, мыши вводили ампициллин (100 мг/кг) в течение двух последовательных дней. Через 10 дней после введения оценивали тревожное поведение.
(3) Экспериментальный способ на модели животного с индуцированным психическим расстройством
Модели мыши с индуцированным иммобилизационным стрессом вводили молочнокислую бактерию или физиологический солевой раствор в зависимости от экспериментальной группы один раз в сутки в течение трех дней с дня 7 после индуцирования иммобилизационного стресса. Модели мыши с индуцированным антибиотическим стрессом вводили молочнокислую бактерию или физиологический солевой раствор в зависимости от экспериментальной группы один раз в сутки в течение трех дней с дня 7 после индуцирования антибиотического стресса.
Тревожное поведение оценивали через пять часов после введения молочнокислой бактерии или физиологического солевого раствора, при этом определенные маркеры в крови (кортикостерон, IL-6, TNF-α и т. д.) измеряли путем отбора крови через один час после окончания теста с приподнятым крестообразным лабиринтом.
Экспериментальный пример 2. Способ оценки поведения для диагностики стресса
(1) Тест «приподнятый крестообразный лабиринт» (EPM)
Приподнятый крестообразный лабиринт представляет собой экспериментальный аппарат для определения степени психического расстройства, такого как стресс, тревожность или им подобных. Экспериментальный аппарат приподнятый крестообразный лабиринт, используемый в данном эксперименте, представляет собой аппарат из черного плексигласа, в котором два открытых рукава (30 x 7 см) и два закрытых рукава (30 x 7 см) со стенами высотой 20 см расположены на высоте 50 см от пола, каждый из которых простирается на 7 см от центральной платформы. В данном тесте мышь помещали в приподнятый крестообразный лабиринт в отсеке, где на высоте была установлена видеокамера с чувствительностью 20 люкс, а затем регистрировали движение мыши.
В частности, мышь C57BL/6 (самец, 19-22 г) помещали в середину приподнятого крестообразного лабиринта таким образом, чтобы голова мыши была обращена к открытому рукаву. Время, проведенное в открытых и закрытых рукавах, а также число заходов в рукав измеряли в течение пяти минут. Заход в рукав определяли как случай, при котором мышь заходила в рукав полностью всеми четырьмя конечностями.
Из общего времени теста время, проведенное в открытых рукавах (OT), рассчитывали как [время, проведенное в открытых рукавах (OT)/(время, проведенное в открытых рукавах (OT) + время, проведенное в закрытых рукавах)] x 100. А число заходов в открытые рукава (OE) рассчитывали как [число заходов в открытые рукава (OE)/(число заходов в открытые рукава (OE) + число заходов в закрытые рукава)] x 100. После завершения каждого поведенческого эксперимента оставшийся запах удаляли с помощью 70% этанола.
В соответствии с существующей интерпретацией результатов теста было установлено, что симптом психического расстройства, такой как тревожность, депрессия или им подобные, возникает в том случае, если OT и OE уменьшаются.
(2) Тест «черно-белая камера»
Аппарат, используемый для теста «черно-белая камера», состоял из освещенного отсека (21 x 42 x 25 см, белый диод с освещенностью 390 люкс) и темного отсека (21 x 42 x 25 см, 2 люкс), которые были разделены дверью, размер которой составлял 7,5 x 7,5 см. Мышь помещали в освещенный отсек и наблюдали в течение пяти минут, в течение которых измеряли время, проведенное в освещенном отсеке, и число переходов в освещенный отсек. После завершения каждого поведенческого эксперимента оставшийся запах удаляли с помощью 70% этанола.
В соответствии с существующей интерпретацией результатов теста было установлено, что симптом психического расстройства, такой как тревожность, депрессия или им подобные, возникал в том случае, если время, проведенное в освещенном отсеке, и число переходов в освещенный отсек сокращались.
(3) Тест «закапывание шариков»
Мышь помещали в прозрачную клетку, заполненную опилками на высоту 5 см, и оставляли там на 15 минут. Затем 25 шариков (прозрачных, диаметром 2 см) помещали на опилки с промежутком 5 см. Мышь снова помещали в середину одной стороны и измеряли число шариков, которые мышь закапывала в течение 30 минут.
В соответствии с существующей интерпретацией результатов теста было установлено, что симптом психического расстройства, такой как тревожность, депрессия или им подобные, возникал в том случае, если мышь чаще проявляла поведение, при котором она закапывает и прячет шарики.
(4) Тест принудительного плавания (FST)
В соответствии со способом Porsolt et al. (Porsolt RD, Le Pichon, Jalfre M (1977) Depression: A new animal model sensitive to antidepressant treatments, Nature, Vol. 266; pp. 730-732) водой с температурой 25±1°C заполняли емкость для воды высотой 40 см и диаметром 20 см до тех пор, пока уровень воды не достигал высоты 25 см. Лабораторную мышь помещали в каждую емкость и оставляли там в течение шести минут, из которых первые две минуты являлись временем адаптации, а затем в течение последних четырех минут измеряли время неподвижности лабораторного животного. Неподвижность означает состояние, при котором мышь плавает в воде неподвижно за исключением незначительного движения для поддержания головы только над водой.
(5) Тест «подвешивание за хвост» (TST)
В соответствии со способом Steru et al. (Steru L, Chermat R, Thierry B, Simon P (1985) The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice, Psychopharmacology, Vol. 85; pp. 367-370) мышь подвешивали в контейнере диаметром 35 см и высотой 50 см посредством помещения фиксирующего устройства примерно в 1 см от кончика хвоста мыши таким образом, чтобы мышь была подвешена на высоте 50 см от пола. Время неподвижности лабораторного животного измеряли в общей сложности в течение шести минут.
Экспериментальный пример 3. Эксперимент по идентификации микробного сообщества кишечника
ПЦР в режиме реального времени или пиросеквенирование 454 проводили для определения доли Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes и им подобных в микробном сообществе кишечника.
В частности, ДНК из экскрементов, полученных от модели животного, выделяли с помощью набора QIAamp DNA stool mini kit (Qiagen, Германия). Пиросеквенирование проводили с помощью баркодированного праймера (к доменам от V1 до V3 бактериального гена 16S рДНК). qPCR-анализ с использованием праймера, показанного в следующей таблице 1.
Экспериментальный пример 4. Способ измерения уровня липополисахарида
(1) Способ измерения уровня липополисахарида в экскрементах
Фекалии (20 мг) суспендировали в 30 мл PBS, затем микроорганизмы в них разрушали с помощью ультразвуковой обработки в течение одного часа, а затем центрифугировали при 500 об/мин в течение 15 минут. Полученный супернатант фильтровали с помощью фильтра с диаметром пор 0,45 мкм, затем снова фильтровали с помощью фильтра с диаметром пор 0,22 мкм, затем подвергали обработке с помощью температуры 70℃ в течение 10 минут, а затем использовали в качестве образца. В указанном образце уровень липополисахарида измеряли с помощью набора для анализа на основе лизата амебоцитов мечехвоста (LAL) (Cape Cod Inc., Ист-Фолмаут, Массачусетс, США).
(2) Способ измерения уровня липополисахарида в крови
Кровь разбавляли в 10 раз с помощью PBS, затем центрифугировали, а затем полученный супернатант выдерживали при температуре 0℃ в течение 10 минут. Полученный супернатант фильтровали с помощью фильтра с диаметром пор 0,45 мкм, затем снова фильтровали с помощью фильтра с диаметром пор 0,22 мкм, а затем использовали в качестве образца. В указанном образце уровень липополисахарида измеряли с помощью набора для анализа на основе лизата амебоцитов мечехвоста (LAL) (Cape Cod Inc., Ист-Фолмаут, Массачусетс, США).
Экспериментальный пример 5. Способ измерения маркеров колита
(1) Измерение миелопероксидазной активности
2
2
2
2
200 мкл 10 мМ фосфатно-калиевого буфера, pH 7,0, содержащего 0,5% бромид гексадецилтриметиламмония, добавляли к 100 мг ткани толстой кишки, а затем подвергали гомогенизации. Полученную смесь центрифугировали в течение 10 минут при 4℃ и 10000 g таким образом, чтобы получить супернатант. Добавляли 50 мкл супернатанта к 0,95 мл реакционного раствора (содержащего 1,6 мМ тетраметилбензидин и 0,1 мМ HO), затем осуществляли реакцию при 37℃ и измеряли оптическую плотность при 650 нм. Активность указанной миелопероксидазы (MPO) рассчитывали с помощью полученного реагента HO, 1 мкмоль/мл = 1 единица.
(2) Измерение маркеров воспаления
Уровень биомаркеров воспаления, таких как p-p65, p65, iNOS, COX-2 и β-актин, измеряли с помощью вестерн-блоттинга. В частности, отбирали 50 мкг супернатанта, который был получен при помощи того же способа, который показан в указанном эксперименте измерения миелопероксидазной активности (MPO), а затем с ним проводили иммуноблоттинг. Также уровень экспрессии цитокинов измеряли с помощью набора для ELISA, и LPS измеряли с помощью набора для анализа LAL.
Пример 1. Идентификация состояния модели животного с индуцированным иммобилизационным стрессом
В соответствии с экспериментальными примерами 2-5 эксперимент проводили на мыши (IS), которая была подвергнута иммобилизационному стрессу один раз через день в общей сложности пять раз при помощи того же способа, который показан в экспериментальном примере 1-(1) выше.
В результате проведения экспериментального примера 2 было установлено, что время, проведенное в открытых рукавах (OT), и число заходов в открытые рукава (OE), сокращались в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом; время, проведенное в освещенном отсеке, сокращалось в тесте «черно-белая камера»; и чаще возникало поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывания шариков» (фигуры 1 (a)-(c)).
Также в результате идентификации с помощью вестерн-блоттинга было установлена, что активность NF-κB (p-p65/p65) в гиппокампе повышалась; уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) снижался (фиг. 1 (d)); а количества кортикостерона, IL-6, TNF-α и липополисахарида в крови повышались (фигуры 1 (e)-(h)).
В результате проведения экспериментального примера 3 было установлено, что количество Bacteroidetes, Actinobacteria и Firmicutes в экскрементах уменьшалось, а количество δ, γ-Рroteobacteria и ε-Рroteobacteria повышалось. В результате проведения экспериментального примера 4 было установлено, что уровень липополисахарида в экскрементах повышался (фиг. 2).
В результате проведения экспериментального примера 5 было установлено, что в качестве маркеров колита длина толстой кишки уменьшалась; уровень миелопероксидазы повышался; уровень TNF-α в толстой кишке повышался; уровни экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке повышались; активность NF-κB повышалась; а уровни окклюдина и клаудина-1, белков плотных контактов, снижались (фигуры 3 (a)-(e)).
Пример 2. Идентификация состояния модели животного, которой вводили экскременты модели животного с индуцированным иммобилизационным стрессом
В соответствии с экспериментальными примерами 2-4 эксперимент проводили на мыши (FIS), которой вводили экскременты мыши, которая была подвергнута иммобилизационному стрессу один раз через день в общей сложности пять раз при помощи того же способа, который показан в экспериментальном примере 1-(1) выше.
В результате проведения экспериментального примера 2 было установлено, что OT и OE сокращались в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом; время, проведенное в освещенном отсеке, сокращалось в тесте «черно-белая камера»; и чаще возникало поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывания шариков» (фигуры 4 (a)-(c)).
В результате идентификации с помощью вестерн-блоттинга было установлено, что активность NF-κB (p-p65/p65) в гиппокампе повышена; уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) снижен (фиг. 4 (d)); а количества кортикостерона, IL-6 и TNF-α в крови повышены (фигуры 5 (a)-(c)).
В результате проведения экспериментального примера 5 было установлены, что в качестве маркеров колита длина толстой кишки уменьшалась; уровень миелопероксидазы повышался (фигуры 4 (e) и (f); уровни TNF-α и IL-6 в толстой кишке повышены; уровень IL-10 в толстой кишке снижен; уровни экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке повышены; и активность NF-κB повышена (фигуры 6 (a)-(d)).
В результате проведения экспериментального примера 3 было установлено, что количество Bacteroidetes, Actinobacteria и Firmicutes в экскрементах уменьшалось, а количество δ, γ-Рroteobacteria и ε-Рroteobacteria повышалось (фигура 6 (e)).
Пример 3. Идентификация состояния модели животного с индуцированным антибиотическим стрессом
В соответствии с экспериментальными примерами 2-5 эксперимент проводили на мыши (AP), которая была подвергнута антибиотическому стрессу посредством введения ампициллина (100 мг/кг) в течение двух последовательных дней при помощи того же способа, который показан в экспериментальном примере 1-(2) выше.
В результате проведения экспериментального примера 2 было установлено, что OT и OE сокращались в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом; время, проведенное в освещенном отсеке, сокращалось в тесте «черно-белая камера»; и чаще возникало поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывания шариков» (фигуры 7 (a)-(c)).
Было установлено, что активность NF-κB (p-p65/p65) в гиппокампе повышена; уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) снижен (фиг. 7 (d)); а количества кортикостерона, IL-6, TNF-α и липополисахарида в крови повышены (фигуры 7 (e)-(h)).
В результате проведения экспериментального примера 3 было установлено, что количество Bacteroidetes, Actinobacteria и Firmicutes в экскрементах уменьшалось, а количество δ, γ-Рroteobacteria и ε-Рroteobacteria повышалось. В результате проведения экспериментального примера 4 было установлено, что уровень липополисахарида в экскрементах повышался (фигуры 8 (a) и (b)).
В результате проведения экспериментального примера 5 было установлено, что в качестве маркеров колита длина толстой кишки уменьшалась; уровень миелопероксидазы повышался; уровень TNF-α в толстой кишке повышался; уровни экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке повышались; активность NF-κB повышалась; а уровни окклюдина и клаудина-1, белков плотных контактов, снижались (фигуры 9 (a)-(e)).
Пример 4. Идентификация состояния модели животного, которой вводили микроорганизмы, выделенные из экскрементов животной модели с индуцированным стрессом
(1) Выделение микроорганизмов из экскрементов модели животного с индуцированным стрессом
Экскременты мыши, подвергнутой иммобилизационному стрессу, и экскременты мыши, подвергнутой антибиотическому стрессу соответственно, культивировали в селективной среде. В результате было установлено, что количество Enterobacteriaceae, выращиваемых в среде DHL, повышалось, и, в частности, количество Klebsiella oxytoca, Escherichia coli и Morganella morganii повышалось (фигура 10 (A)).
В то же время было установлено, что количество Bifidobacteria и Lactobacilli, выращенных в среде BL, уменьшалось, и, в частности, уменьшалось количество Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus и Bifidobacterium animalis (фиг. 10 (B)).
(2) Идентификация состояния модели животного, которой вводили микроорганизмы
9
После введения каждой мыши 1x10 КОЕ Klebsiella oxytoca, Escherichia coli и Morganella morganii соответственно, количество которых было повышенным в экскрементах мыши, подвергнутой иммобилизационному стрессу, и мыши, подвергнутой антибиотическому стрессу, проводили тест с приподнятым крестообразным лабиринтом в соответствии с экспериментальным примером 2-(1) выше. В результате было установлено, что OT и OE заметно уменьшались в группе, которой вводили Klebsiella oxytoca, по сравнению с группой, которой вводили другие микроорганизмы (фиг. 11 (a)).
После этого в соответствии с экспериментальными примерами 2-5 эксперимент проводили на мыши (KO), которой вводили Klebsiella oxytoca.
В результате проведения экспериментального примера 2 было установлено, что OT и OE сокращались в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом; время, проведенное в освещенном отсеке, сокращалось в тесте «черно-белая камера»; и чаще возникало поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывания шариков» (фигуры 11 (b)-(d)).
Было установлено, что активность NF-κB (p-p65/p65) в гиппокампе повышалась; уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) уменьшался (фиг. 11 (e)); а количества кортикостерона, IL-6, TNF-α и липополисахарида в крови повышались (фигуры 11 (f)-(i)).
В результате проведения экспериментального примера 3 было установлено, что количество Bacteroidetes, Actinobacteria и Firmicutes в экскрементах уменьшалось, а количество δ, γ-Рroteobacteria и ε-Рroteobacteria в экскрементах повышалось. В результате проведения экспериментального примера 4 было установлено, что уровень липополисахарида в экскрементах повышался (фигуры 12 (a) и (b)).
В результате проведения экспериментального примера 5 было установлено, что в качестве маркеров колита длина толстой кишки уменьшалась; уровень миелопероксидазы повышался; уровень TNF-α в толстой кишке повышался; уровни экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке повышались; активность NF-κB повышалась; а уровни окклюдина и клаудина-1, белков плотных контактов, снижались (фигуры 13 (a)-(e)).
Пример 5. Выделение и идентификация молочнокислых бактерий
(1) Выделение молочнокислых бактерий из экскрементов человека и мыши
Свежие фекалии человека и мыши вносили и суспендировали соответственно в жидкой среде GAM (бульон GAM; Nissui Pharmaceutical, Япония). После этого супернатант отбирали и вносили в MRS, BHI (сердечно-мозговой экстракт) или агаровую среду BL (Nissui Pharmaceutical, Япония), затем культивировали в анаэробных условиях при 37℃ в течение от приблизительно 48 часов до 72 часов, а затем штаммы, образующие колонию, выделяли из нее.
(2) Идентификация выделенных молочнокислых бактерий
Анализировали физиологические характеристики и последовательности 16S рДНК штаммов, выделенных из экскрементов человека или мыши, затем проводили видовую идентификацию штаммов, а затем штаммам присваивали названия. Названия, присвоенные штаммам молочнокислых бактерий, приведены в следующей таблице 2. В частности, молочнокислые бактерии, выделенные из экскрементов человека или мыши, представляли собой 9 типов Lactobacillus spp. и 22 типа Bifidobacterium spp.
(3) Физиологические характеристики Lactobacillus reuteri NK33, новой молочнокислой бактерии
Среди штаммов, описанных в таблице 2 выше, было установлено, что Lactobacillus reuteri NK33 (номер доступа KCCM12090P) является грамположительной бациллой. Также было показано, что 16S рДНК Lactobacillus reuteri NK33 имеет последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 1. В результате сравнения последовательностей 16S рДНК Lactobacillus reuteri NK33 с помощью поиска BLAST штаммов Lactobacillus reuteri с такой же последовательностью 16S рДНК выявлено не было, при этом было подтверждено, что данный штамм имеет последовательность 16S рДНК, которая на 99% гомологична последовательности 16S рДНК известного штамма Lactobacillus reuteri.
Среди физиологических характеристик Lactobacillus reuteri NK33 анализировали усвояемость источника углерода с помощью теста ферментации сахаров с использованием набора API 50 CHL (BioMerieux’s, CША). Результаты показаны в следующей таблице 3. В таблице 3 ниже «+» указывает на то, что усвояемость источника углерода является положительной, а «-» указывает на то, что усвояемость источника углерода является отрицательной.
(4) Физиологические характеристики Bifidobacterium adolescentis NK98, новой молочнокислой бактерии
Среди штаммов, описанных в таблице 2 выше, было показано, что 16S рДНК Bifidobacterium adolescentis NK98 (номер доступа KCCM12297P) имеет последовательность под SEQ ID NO: 38. В результате сравнения последовательностей 16S рДНК Bifidobacterium adolescentis NK98 с помощью поиска BLAST штаммов Bifidobacterium adolescentis NK98 с такой же последовательностью 16S рДНК выявлено не было, при этом было подтверждено, что данный штамм имеет последовательность 16S рДНК, которая на 98% гомологична последовательности 16S рДНК известного штамма Bifidobacterium adolescentis.
Среди физиологических характеристик Bifidobacterium adolescentis NK98 анализировали усвояемость источника углерода с помощью теста ферментации сахаров с использованием набора API (API 20A, BioMerieux’s, США). Результаты показаны в следующей таблице 4. В таблице 4 ниже «+» указывает на то, что усвояемость источника углерода является положительной, а «-» указывает на то, что усвояемость источника углерода является отрицательной.
Пример 7. Сравнение активности выделенных молочнокислых бактерий
(1) Антиоксидантная активность (in vitro)
8
DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил) растворяли в этаноле для достижения концентрации 0,2 мМ, таким образом готовили раствор DPPH. Суспензию молочнокислых бактерий (1×10 КОЕ/мл) или раствор витамина C (1 г/мл) добавляли к 0,1 мл указанного раствора DPPH, а затем культивировали при 37℃ в течение 20 минут. Для получения супернатанта культуральную жидкость центрифугировали при 3000 об/мин в течение пяти минут. После этого измеряли коэффициент поглощения супернатанта при 517 нм, а затем соответственно рассчитывали антиоксидантную активность выделенных молочнокислых бактерий. Антиоксидантная активность каждой молочнокислой бактерии показана в следующей таблице 5 (Lactobacillus spp.) и таблице 6 (Bifidobacterium spp.).
(2) Измерение уровня маркеров воспаления у макрофагов
6
Мышам C57BL/6 (самцы, возраст 6 недель, 20-23 г) интраперитонеально вводили 2 мл стерильного 4% тиогликолята. Через 96 часов мышей анестезировали, а затем им интраперитонеально вводили 8 мл среды RPMI 1640. Через 5-10 минут среду RPMI (макрофаги) интраперитонеально отбирали у мышей, затем центрифугировали при 1000 g в течение 10 минут, а затем дважды промывали снова средой RPMI 1640. Указанные макрофаги распределяли в 24-луночный планшет по 0,5×10 клеток на лунку, затем обрабатывали выделенными молочнокислыми бактериями Lactobacillus spp. и липополисахаридом, индуктором воспалительной реакции, в течение 2 или 24 часов, а затем получали супернатант и клетки. Полученные клетки добавляли в буфер RIPA (Gibco) и гомогенизировали. Уровень экспрессии цитокинов, как, например, TNF-α, измеряли в культуральном супернатанте, который обрабатывали в течение 24 часов, а затем с помощью иммуноблоттинга измеряли уровни экспрессии p65 (NF-κB), p-p65 (фосфорилированного NF-κB) и β-актина в клетках, полученных посредством обработки в течение двух часов. Уровни экспрессии маркеров воспаления для каждой молочнокислой бактерии Lactobacillus spp. показаны в следующей таблице 5.
(3) Измерение маркеров воспаления в микроглии
6
Клетки микроглии A BV-2 распределяли в 24-луночный планшет по 0,5 × 10 клеток на лунку, затем обрабатывали выделенными молочнокислыми бактериями Bifidobacterium spp. и липополисахаридом, индуктором воспалительной реакции, в течение 2 или 24 часов, а затем получали супернатант и клетки. Полученные клетки добавляли в буфер RIPA (Gibco) и гомогенизировали. Уровни экспрессии p65 (NF-kB), p-p65 (фосфорилированного NF-κB) и β-актина измеряли с помощью способа иммуноблоттинга в клетках, полученных путем обработки в течение двух часов. Уровни экспрессии маркеров воспаления для каждой молочнокислой бактерии Bifidobacterium spp. показаны в следующей таблице 6.
(4) Влияние экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) и активации NF-κB на клетки SH-SY5Y
6
4
Клетки SH-SY5Y, которые являются нервными клетками, приобретали в Корейском банке клеточных линий, затем культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS и 1% антибиотиков, а затем распределяли в 12-луночный планшет по 2×10 клеток на лунку. После этого кортикостерон добавляли в каждую лунку в концентрации 300 мг/мл наряду с молочнокислыми бактериями (1 × 10 КОЕ/мл), далее культивировали, а затем с помощью иммуноблоттинга измеряли уровни экспрессии NF-κB (p65, p-p65) и продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF). Уровни экспрессии BDNF и уровни активации NF-κB для каждой молочнокислой бактерии показаны в следующей таблице 5 (Lactobacillus spp.) и таблице 6 (Bifidobacterium spp.).
* -, <10%; +, 10-30%; ++, 30-50%; +++, >50%
(5) Экспериментальные результаты
В результате оценки активности выделенных молочнокислых бактерий было установлено, что среди выделенных молочнокислых бактерий Lactobacillus spp. или Bifidobacterium spp. Lactobacillus reuteri NK33 и Bifidobacterium adolescentis NK98, описанные в данном документе, оказывают значительное влияние на усиление антиоксидантной активности и подавление воспалительных реакций. В частности, было установлено, что Lactobacillus reuteri NK33 и Bifidobacterium adolescentis NK98 подавляют активность NF-κB, известного как вещество, индуцирующее связанные со старением заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, подавляют воспалительную реакцию в микроглии, имеющую место при старении, деменции и им подобных, и повышают экспрессию продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF), который продуцируется нервными клетками головного мозга, но уровень которого снижен при старении, деменции и им подобных (таблицы 5 и 6).
Пример 8. Оценка иммунорегуляторного влияния выделенных молочнокислых бактерий Bifidobacterium spp.
Для оценки иммунорегуляторного влияния молочнокислых бактерий Bifidobacterium spp., выделенных из экскрементов, измеряли влияние молочнокислых бактерий Bifidobacterium spp. на иммунную реакцию макрофагов и клеток селезенки.
(1) Иммунная реакция макрофагов
6
Мышам C57BL/6 (самцы, возраст 6 недель, 20-23 г, Raonbio Co., Ltd.) интраперитонеально вводили 2 мл стерильного 4% тиогликолята. Через 96 часов после введения мышей анестезировали, а затем мышам интраперитонеально вводили 8 мл среды RPMI 1640. Через 5-10 минут среду RPMI (включающую макрофаги) интраперитонеально отбирали у мышей, далее центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут, а затем дважды промывали снова средой RPMI 1640. Указанных макрофагов распределяли в 24-луночный планшет по 0,5×10 клеток на лунку, затем культивировали в течение 24 часов, а затем удаляли неприкрепившиеся клетки и использовали их далее.
4
Указанную культуральную жидкость с макрофагами обрабатывали с помощью Bifidobacterium adolescentis NK98 и липополисахарида, индуктора воспалительной реакции, в течение 2 или 24 часов, а затем получали супернатант и клетки, при этом концентрация молочнокислых бактерий для обработки составляла 1×10 КОЕ/мл. Полученные клетки добавляли в буфер RIPA (Gibco) и гомогенизировали. Уровень экспрессии TNF-α в полученном супернатанте измеряли с помощью набора ELISA, а затем с помощью иммуноблоттинга измеряли уровни экспрессии p65 (NF-κB), p-p65 (фосфорилированного NF-κB) и β-актина в полученных клетках. В частности, отбирали 50 мкг супернатанта и подвергали электрофорезу в SDS-содержащем 10% (вес/объем) полиакриламидном геле в течение полутора часов. Подвергнутый электрофорезу образец переносили на нитроцеллюлозную бумагу в условиях при 100 В и 400 мА в течение одного часа и 10 минут. Нитроцеллюлозную бумагу, на которую переносили образец, блокировали с помощью 5% обезжиренного молока в течение 30 минут, затем промывали с помощью PBS-Tween три раза в течение пяти минут каждый раз, а затем в течение ночи подвергали реакции с первичными антителами (Santa Cruz Biotechnology, США) в соотношении 1:100. После этого данную бумагу промывали три раза в течение 10 минут каждый раз и подвергали реакции с вторичными антителами (Santa Cruz Biotechnology, США) при соотношении 1:1000 в течение одного часа и 20 минут. Затем такую бумагу промывали три раза в течение 15 минут каждый раз, затем подвергали флуоресценции и люминесценции, затем проявляли, а затем измеряли интенсивность хромофорной полосы, результаты измерения которой показаны в следующей таблице 7.
(2) Иммунная реакция клеток селезенки
5
Селезенку мышей C57BL/6 (самцы, возраст 6 недель, 20-22 г, OrientBio Co., Ltd.) выделяли и гомогенизировали, а затем суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 10% FCS. CD4 T-клетки выделяли из нее с помощью набора для выделения CD4 T-клеток (MiltenyiBiotec, Бергиш Гладбах, Германия), а затем выделенные CD4 T-клетки распределяли в 12-луночный планшет по 5 × 10 клеток на лунку.
5
Клетки культивировали с добавлением антитела к CD3, антител к CD28, IL-2 и IL-12 для индуцирования дифференцировки T-клеток в Th1-клетки; антитела к CD3, антител к CD28, IL-2 и IL-4 для индуцирования дифференцировки T-клеток в Th2-клетки; антитела к CD3, антител к CD28, IL-6 и TGF-β для индуцирования дифференцировки T-клеток в Th17-клетки; и антитела к CD3, и антитела к CD28 для индуцирования дифференцировки T-клеток в Treg-клетки, затем к ним добавляли молочнокислые бактерии по 1 × 10 КОЕ/мл на лунку, а затем культивировали в течение четырех дней.
После этого определяли эффективность дифференцировки T-клеток, выделенных из селезенки, в Th1-клетки, Th2-клетки, Th17-клетки и Treg-клетки. В частности, клетки из культуральной жидкости окрашивали с помощью антитела к FoxP3 или антитела к IL-17A, а затем анализировали распределение Th1-клеток, Th2-клеток, Th17-клеток и Treg-клеток с помощью устройства для FACS (сортировки флуоресцентно-активированных клеток) (C6 Flow Cytometer System, Сан-Хосе, Калифорния, США). Результаты распределения показаны в следующей таблице 8.
Также измеряли уровни экспрессии транскрипционных факторов и цитокинов у Th1-клеток, Th2-клеток, Th17-клеток и Treg-клеток, выделенных из популяции T-клеток селезенки. В частности, уровни экспрессии T-bet, IFN-γ и IL-12 в культуральной жидкости, индуцирующей дифференцировку в Th1-клетки; GATA3 и IL-5 в культуральной жидкости, индуцирующей дифференцировку в Th2-клетки; RORγt и IL-17 в культуральной жидкости, индуцирующей дифференцировку в Th17-клетки; и Foxp3, и IL-10 в культуральной жидкости, индуцирующей дифференцировку в Treg-клетки, анализировали с помощью qRT-PCR, при этом результаты анализа показаны в следующей таблице 9.
* Показатель ингибирования: -, <10%; +, 10-30%; ++, 30-60%; +++, >60
* Показатель повышения: -, <10%; +, 10-50%; ++, 50-100%; +++, >100%
Как указано в таблицах 8 и 9 выше, было установлено, что Bifidobacterium adolescentis NK98 характеризуется высоким показателем ингибирования дифференцировки T-клеток в Th1-клетки, Th2-клетки и Th17-клетки и, в частности, характеризуется высоким показателем повышения дифференцировки T-клеток в Treg-клетки, эффективно ингибируя таким образом воспалительную реакцию и эффективно улучшая состояние при воспалительном заболевании соответственно.
Пример 9. Влияние Lactobacillus reuteri NK33 на снижение уровня стресса
9
На 7 день после начала процесса иммобилизационного стресса в отношении мышей, которые были подвергнуты иммобилизационному стрессу так, как это показано в экспериментальном примере 1 выше, 1×10 КОЕ Lactobacillus reuteri NK33, новой молочнокислой бактерии, или физиологический солевой раствор вводили мышам один раз в сутки в течение пяти дней. В соответствии с экспериментальными примерами 2-5 эксперимент проводили на мышах, описанных выше.
В результате проведения экспериментального примера 2 в группе (IS), которой вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что OT и OE сокращались в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом; время, проведенное в освещенном отсеке, сокращалось в тесте «черно-белая камера»; и чаще возникало поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывания шариков». Однако в группе (IS+LR), которой вводили Lactobacillus reuteri NK33, было установлено, что OT и OE увеличиваются; время, проведенное в освещенном отсеке, сокращалось; и реже возникает поведение, проявляющееся закапыванием шариков, в тесте «закапывания шариков» (фигуры 14 (a)-(c)).
В группе (IS), которой вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что активность NF-κB (p-p65/p65) в гиппокампе увеличивалась; уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) снижался; а количества кортикостерона, IL-6, TNF-α и липополисахарида в крови увеличивались. Однако в группе (IS+LR), которой вводили Lactobacillus reuteri NK33, было установлено, что активность NF-κB (p-p65/p65) ингибировалась; уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) повышался; а количества кортикостерона, IL-6, TNF-α и липополисахарида в крови уменьшались (фигуры 14 (d)-(g)).
В результате проведения экспериментального примера 5 в группе (IS), которой вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что в качестве маркеров колита длина толстой кишки уменьшалась; уровень миелопероксидазы повышался; уровень TNF-α в толстой кишке повышался; уровни экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке повышались; и активность NF-κB повышалась. Однако в группе (IR), которой вводили Lactobacillus reuteri NK33, было установлено, что длина толстой кишки восстанавливалась до нормального уровня; уровень миелопероксидазы снижался; уровень TNF-α в толстой кишке снижался; уровни экспрессии COX-2 и iNOS в толстой кишке снижался; и активность NF-κB ингибировалась (фигуры 15 (a)-(d)).
Согласно данным результатам было установлено, что Lactobacillus reuteri NK33, новая молочнокислая бактерия, оказывает значительное влияние на улучшение течения психического расстройства, такого как тревожность, депрессия, стресс и им подобные.
Пример 10. Влияние Bifidobacterium adolescentis NK98 на снижение уровня стресса
9
9
На 7 день после начала процесса иммобилизационного стресса в отношении мышей, которая были подвергнуты иммобилизационному стрессу так, как это показано в экспериментальном примере 1 выше, 1 x 10 КОЕ Bifidobacterium adolescentis NK98 (NK98), 1 x 10 КОЕ Bifidobacterium adolescentis IM38 (IM38), физиологический солевой раствор (IS) или 1 мг/кг буспирона вводили мышам один раз в сутки в течение трех дней. Затем в соответствии с экспериментальными примерами 2 и 5 выше проводили эксперимент.
(1) Тест с приподнятым крестообразным лабиринтом
Наряду с проведением теста с приподнятым крестообразным лабиринтом в экспериментальном примере 2-(1) выше измеряли количество кортикостерона (BC) в крови, при этом результаты измерений показаны в следующей таблице 10.
Как указано в таблице 10 выше, в группе (IS) моделей с иммобилизационным стрессом, которым вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что как OT, так и OE уменьшались в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом по сравнению с нормальной контрольной группой без иммобилизационного стресса. Однако в группе, которой вводили Bifidobacterium adolescentis NK98, было установлено, что время, проведенное в открытых рукавах (OT), и частота заходов в открытые рукава (OE) увеличивались; и количество кортикостерона в крови заметно уменьшалось, демонстрируя таким образом более значительный эффект по сравнению с Bifidobacterium adolescentis IM38.
(2) Тест «черно-белая камера»
В соответствии с экспериментальным примером 2-(2) выше проводили тест «черно-белая камера» и его результаты показаны в следующей таблице 11.
Как указано в таблице 11 выше, в группе (IS) моделей с иммобилизационным стрессом, которым вводили физиологический солевой раствор, было установлено,что время, проведенное в освещенном отсеке, уменьшалось по сравнению с нормальной контрольной группой без иммобилизационного стресса, но в группе, которой вводили Bifidobacterium adolescentis NK98, время, проведенное в освещенной области, увеличивалось по сравнению с группой, которой вводили Bifidobacterium adolescentis IM38.
(3) Тест с принудительным плаванием
В соответствии с экспериментальным примером 2-(4) выше проводили тест с принудительным плаванием и его результаты показаны в следующей таблице 12.
Как указано в таблице 12 выше, в группе (IS) мышиных моделей с депрессией, которым вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что время неподвижности повышалось по сравнению с нормальной контрольной группой без иммобилизационного стресса, и в группе, которой вводили Bifidobacterium adolescentis NK98, время неподвижности уменьшалось по сравнению с группой, которой вводили Bifidobacterium adolescentis IM38.
(4) Тест «подвешивание за хвост» (TST)
В соответствии с экспериментальным примером 2-(5) выше проводили тест «подвешивание за хвост» (TST) и его результаты показаны в следующей таблице 13.
Как указано в таблице 13 выше, в группе моделей мышей с депрессией, которым вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что время неподвижности увеличивалось по сравнению с нормальной контрольной группой без иммобилизационного стресса, но в группе, которой вводили Bifidobacterium adolescentis NK98, время неподвижности уменьшалось.
(5) Измерение уровня биомаркеров
Через два часа после проведения последнего поведенческого эксперимента на мышах с депрессией мышей подвергали анестезии и измеряли уровень кортикостерона в крови с помощью ELISA, а также измеряли уровень продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF), и уровень NF-kB в головном мозге, и уровень NF-kB в толстой кишке с помощью иммуноблоттинга посредством такого же способа, который показан на экспериментальном примере 5 выше, при этом результаты измерений показаны в следующей таблице 14.
Как указано в таблице 14 выше, в группе (IS), которой вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что активность NF-κB (p-p65/p65) в гиппокампе повышена; уровень экспрессии продуцируемого в головном мозге нейротрофического фактора (BDNF) снижен; а количество кортикостерона в крови увеличено. Однако в группе, которой вводили NK98, было установлено, что активность NF-kB ингибировалась; уровень экспрессии BDNF повышался; а количество кортикостерона в крови уменьшалось, где такое влияние является значительным по сравнению с группой, которой вводили IM38.
(6) Эффект в виде улучшения состояния при колите
Через два часа после проведения последнего поведенческого эксперимента на мышах с тревожностью в экспериментальном примере 1, мышей анестезировали и измеряли длину толстой кишки и уровни активации MPO, COX-2, TNF-α и NF-Kb посредством того же способа, который показан в экспериментальном примере 5, при этом результаты измерений показаны в следующей таблице 15.
Как указано в таблице 15 выше, в группе (IS) моделей с иммобилизационным стрессом, которым вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что длина толстой кишки уменьшалась, а уровни MPO и маркеров воспаления повышались по сравнению с нормальной контрольной группой без иммобилизационного стресса, но в группе, которой вводили Bifidobacterium adolescentis NK98, длина толстой кишки восстанавливалась, а ингибиторная способность MPO, а также уровень маркеров воспаления нормализовались.
(7) Эффект в виде снижения уровня стресса, индуцированного антибиотиками
В соответствии с экспериментальными примерами 2-5 эксперимент проводили на мышах, которых подвергли антибиотическому стрессу посредством введения ампициллина (100 мг/кг) в течение последовательных двух дней посредством того же способа, который показан в экспериментальном примере 1-(2) выше, при этом результаты показаны в следующих таблицах 16-17.
Как указано в таблице 16 выше, в группе моделей со стрессом, индуцированным антибиотиком, которым вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что OT и OE уменьшались по сравнению с нормальный контрольной группой в тесте с приподнятым крестообразным лабиринтом, а в группе, которой вводили Bifidobacterium adolescentis NK98, OT и частота OE увеличивались, и при этом количество кортикостерона в крови заметно уменьшалось, при этом такой эффект являлся значительным по сравнению с Bifidobacterium adolescentis IM38.
Как указано в таблице 17 выше, в группе (IS) моделей со стрессом, индуцированным антибиотиками, которым вводили физиологический солевой раствор, было установлено, что длина толстой кишки уменьшалась по сравнению с нормальной контрольной группой, а уровни MPO и индикаторов воспаления повышались, но в группе, которой вводили Bifidobacterium adolescentis NK98, длина толстой кишки восстанавливалась, а ингибиторная способность MPO, а также уровень маркеров воспаления нормализовались.
Пример 11. Влияние Bifidobacterium adolescentis NK98 на улучшение когнитивной функции
На следующий день после интраперитонеального введения мышам LPS, выделенного из E. coli (0,5 мг/кг/день), в течение пяти дней им вводили молочнокислые бактерии и анализировали влияние молочнокислых бактерий на улучшение когнитивной функции посредством выполнения теста на распознавание объектов и теста с Y-образным лабиринтом, при этом уровень BDNF в гиппокампе измеряли с помощью иммуноблоттинга, а результаты измерения показаны в следующей таблице 18.
В частности, в способе с проведением теста на распознавание объектов использовали два объекта (A, A') одинаковой формы и размера, которые фиксировали в коробке (40 × 40 × 40 см), изнутри которой не видно, что происходит снаружи, затем мыши позволяли начинать движение в центре коробки, а затем регистрировали число касаний к двум объектам в течение 10 минут. Через 24 часа одного из двух объектов заменяли новым (A, B), а затем регистрировали и подсчитывали число касаний к старому объекту и новому объекту.
Также в способе с проведением теста с Y-образным лабиринтом аппарат для проведения теста состоял из трех идентичных рукавов (длиной 8 см, шириной 30 см, высотой 14 см), каждый из которых располагался под определенным углом 120°. Мышь помещали в конец одного рукава и позволяли свободно передвигаться в Y-образном лабиринте в течение восьми минут, после чего определяли число и порядок заходов в соответствующие рукава таким образом, чтобы оценить спонтанное изменение (%). Изменение определяли символами в алфавитном порядке, при котором мышь последовательно заходила в три рукава, т.е. ABC, BCA, CAB и т.д.
% изменения = [общее число изменений]/[общее число заходов в рукава -2] x 100
Как указано в таблице 18 выше, в группе, которой вводили Bifidobacterium adolescentis NK98, с помощью теста на распознавание объектов и теста с Y-образным лабиринтом было установлено, что когнитивная функция улучшалась, а экспрессия BDNF повышалась.
Пример 12. Влияние в отношении снижения стресса при совместном введении двух типов молочнокислых бактерий
Lactobacillus reuteri NK33, новую молочнокислую бактерию, Bifidobacterium adolescentis IM38 (номер доступа: KCCM11807P), бактерию, раскрытую в публикации патента Кореи №10-2017-0090359, или их смесь сравнивали друг с другом в отношении влияния на снижение стресса.
9
9
9
В частности, физиологический солевой раствор (IS), 1x10 КОЕ Lactobacillus reuteri NK33 (NK33), 1x10 КОЕ Bifidobacterium adolescentis IM38 (IM38) или комбинацию указанных молочнокислых бактерий (NK33+IM38) по 0,5x10 КОЕ каждой вводили модели с индуцированным иммобилизационным стрессом так, как это показано в экспериментальном примере 1-(1) выше, а затем проводили тест с приподнятым крестообразным лабиринтом. После этого у животных каждой группы отбрила кровь, а затем измеряли количество кортикостерона в крови, при этом результаты измерения показаны в следующей таблице 19.
Как указано в таблице 19 выше, в группе с совместным введением было установлено, что время, проведенное в открытых рукавах, и число заходов в открытые рукава увеличивались, а количество кортикостерона в крови заметно уменьшалось по сравнению с группой, которой вводили молочнокислые бактерии по отдельности.
Также влияние смеси Lactobacillus reuteri NK33 и Bifidobacterium adolescentis NK98 в отношении снижения стресса сравнивали посредством такого же способа, который показан в эксперименте с совместным введением NK33 и IM38 выше, при этом его результаты показаны в следующей таблице 20.
Как указано в таблице 20 выше, в группе с совместным введением было идентифицировано, что время, проведенное в открытых рукавах, и число заходов в открытые рукава увеличивались, а количество кортикостерона в крови заметно уменьшалось по сравнению с группой, которой вводили молочнокислые бактерии по отдельности.
<Информация о регистрации и доступе к молочнокислым бактериям>
Авторы настоящего изобретения осуществили депонирование Lactobacillus reuteri NK33 с целью патентования в Корейском центре культур микроорганизмов, сертифицированном депозитарии (адрес: Юлим Билдинг, 45, Хондже-2га-гил, Сеодемун-гу, Сеул, Южная Корея) 4 августа 2017 года и получили номер доступа KCCM12090P.
Также авторы настоящего изобретения депонировали Bifidobacterium adolescentis NK98 с целью патентования в Корейском центре культур микроорганизмов, сертифицированном депозитарии (адрес: Юлим Билдинг, 45, Хондже-2га-гил, Сеодемун-гу, Сеул, Южная Корея) 3 августа 2018 года и получили номер доступа KCCM12297P.
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫМЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА
Кому Донг-Хён Ким26, Кенхеде-ро,Донгдемун-гу,Сеул 02447,Республика Корея
РАСПИСКА О ПОЛУЧЕНИИ В СЛУЧАЕ ПЕРВОНАЧАЛЬНОГО ДЕПОНИРОВАНИЯ,выданная в соответствии с Правилом 7.1МЕЖДУНАРОДНЫМ ОРГАНОМ ПО ДЕПОНИРОВАНИЮ, определенная в нижней части данной страницы
I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
Идентификационная ссылка, присвоенная ДЕПОЗИТОРОМ:Lactobacillus reuteri NK33
Номер доступа, присвоенный МЕЖДУНАРОДНЫМ ОРГАНОМ ПО ДЕПОНИРОВАНИЮ: KCCM12090P
II. НАУЧНОЕ ОПИСАНИЕ И/ИЛИ ПРЕДЛАГАЕМОЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
К микроорганизму, идентифицированному в п. I выше, приложены: научное описание предлагаемое таксономическое определение(Отметить крестиком, где применимо)
III. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИЕМ
Данный Международный орган по депонированию принимает микроорганизм, идентифицированный в п. I выше, который был получен им 04 августа 2017 года (дата первоначального депонирования).<sup>1</sup>
IV. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ОРГАН ПО ДЕПОНИРОВАНИЮ
Название: Корейский центр культур микроорганизмовАдрес: Юрим B/D   45, Хондже-2га-гил   Сеодемун-гу   Сеул 120-861   Республика Корея
Подпись(и) лица(лиц), уполномоченных представлять Международный орган по депонированию, или уполномоченного представителя(представителей)Дата: 04 августа 2017 года
1
В случае применения Правила 6.4(d), такой датой является дата, на которую был приобретен статус международного органа по депонированию.
Форма BP/4 (одна страница)
БУДАПЕШТСКИЙ ДОГОВОР О МЕЖДУНАРОДНОМ ПРИЗНАНИИ ДЕПОНИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПАТЕНТНОЙ ПРОЦЕДУРЫМЕЖДУНАРОДНАЯ ФОРМА
Кому Донг-Хён Ким26, Кенхеде-ро,Донгдемун-гу,Сеул 02447,Республика Корея
РАСПИСКА О ПОЛУЧЕНИИ В СЛУЧАЕ ПЕРВОНАЧАЛЬНОГО ДЕПОНИРОВАНИЯ,выданная в соответствии с Правилом 7.1МЕЖДУНАРОДНЫМ ОРГАНОМ ПО ДЕПОНИРОВАНИЮ, определенная в нижней части данной страницы
I. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМА
Идентификационная ссылка, присвоенная ДЕПОЗИТОРОМ:Bifidobacterium adolescentis NK98
Номер доступа, присвоенный МЕЖДУНАРОДНЫМ ОРГАНОМ ПО ДЕПОНИРОВАНИЮ: KCCM12297P
II. НАУЧНОЕ ОПИСАНИЕ И/ИЛИ ПРЕДЛАГАЕМОЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
К микроорганизму, идентифицированному в п. I выше, приложены: научное описание предлагаемое таксономическое определение(Отметить крестиком, где применимо)
III. ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИЕМ
Данный Международный орган по депонированию принимает микроорганизм, идентифицированный в п. I выше, который был получен им 04 03. 2018 года (дата первоначального депонирования).<sup>1</sup>
IV. МЕЖДУНАРОДНЫЙ ОРГАН ПО ДЕПОНИРОВАНИЮ
Название: Корейский центр культур микроорганизмовАдрес: Юрим B/D   45, Хондже-2га-гил   Сеодемун-гу   СЕУЛ 03641   Республика Корея
Подпись(и) лица(лиц), уполномоченного представлять Международный орган по депонированию, или уполномоченного представителя(представителей)Дата: 03 08. 2018.
1
В случае применения Правила 6.4(d), такой датой является дата, на которую был приобретен статус международного органа по депонированию.
Форма BP/4 (одна страница)
--->
<110>    ЮНИВЕРСИТИ-ИНДАСТРИ КООПЕРЕЙШН ГРУП ОФ КЮН
ХЕЕ ЮНИВЕРСИТИ
НАВИФАРМ КО, ЛТД
<120>    Новые молочнокислые бактерии и их применение
<130>    P17-120-REA-KHU
<160>    38
<170>    KoPatentIn версии 3.0
<210>    1
<211>    1490
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    16S рДНК NK33
<400>    1
tatggctcag gatgaacgcc ggcggtgtgc ctaatacatg caagtcgtac gcactggccc         60
aactgattga tggtgcttgc acctgattga cgatggatca ccagtgagtg gcggacgggt        120
gagtaacacg taggtaacct gccccggagc gggggataac atttggaaac agatgctaat        180
accgcataac aacaaaagcc acatggcttt tgtttgaaag atggctttgg ctatcactct        240
gggatggacc tgcggtgcat tagctagttg gtaaggtaac ggcttaccaa ggcgatgatg        300
catagccgag ttgagagact gatcggccac aatggaactg agacacggtc catactccta        360
cgggaggcag cagtagggaa tcttccacaa tgggcgcaag cctgatggag caacaccgcg        420
tgagtgaaga agggtttcgg ctcgtaaagc tctgttgttg gagaagaacg tgcgtgagag        480
taactgttca cgcagtgacg gtatccaacc agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag        540
ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag        600
gcggttgctt aggtctgatg tgaaagcctt cggcttaacc gaagaagtgc atcggaaacc        660
gggcgacttg agtgcagaag aggacagtgg aactccatgt gtagcggtgg aatgcgtaga        720
tatatggaag aacaccagtg gcgaaggcgg ctgtctggtc tgcaactgac gctgaggctc        780
gaaagcatgg gtagcgaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgagt        840
gctaggtgtt ggagggtttc cgcccttcag tgccggagct aacgcattaa gcactccgcc        900
tggggagtac gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt        960
ggagcatgtg gtttaattcg aagctacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcttgcg       1020
ctaaccttag agataaggcg ttcccttcgg ggacgcaatg acaggtggtg catggtcgtc       1080
gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttacta       1140
gttgccagca ttaagttggg cactctagtg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg       1200
gggacgacgt cagatcatca tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac       1260
ggtacaacga gtcgcaagct cgcgagagta agctaatctc ttaaagccgt tctcagttcg       1320
gactgtaggc tgcaactcgc ctacacgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat       1380
gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat ggggagtttg       1440
taacgcccaa agtcggtggc ctaaccttta tggagggagc cgcctaaggc                  1490
<210>    2
<211>    25
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Firmicutes
<400>    2
ggagyatgtg gtttaattcg aagca                                               25
<210>    3
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Firmicutes
<400>    3
agctgacgac aaccatgcac                                                     20
<210>    4
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Bacteroidetes
<400>    4
gtttaattcg atgatacgcg ag                                                  22
<210>    5
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Bacteroidetes
<400>    5
ttaasccgac acctcacgg                                                      19
<210>    6
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для бета-протеобактерий
<400>    6
aacgcgaaaa accttaccta cc                                                  22
<210>    7
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для бета-протеобактерий
<400>    7
tgccctttcg tagcaactag tg                                                  22
<210>    8
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для дельта/гамма-протеобактерий
<400>    8
gctaacgcat taagtryccc g                                                   21
<210>    9
<211>    18
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для дельта/гамма-протеобактерий
<400>    9
gccatgcrgc acctgtct                                                       18
<210>    10
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для эпсилон-протеобактерий
<400>    10
taggcttgac attgatagaa tc                                                  22
<210>    11
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для эпсилон-протеобактерий
<400>    11
cttacgaagg cagtctcctt a                                                   21
<210>    12
<211>    18
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Actinobacteria
<400>    12
tgtagcggtg gaatgcgc                                                       18
<210>    13
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Actinobacteria
<400>    13
aattaagcca catgctccgc t                                                   21
<210>    14
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для TM
<400>    14
aytgggcgta aagagttgc                                                      19
<210>    15
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для TM
<400>    15
tacggytacc ttgttacgac tt                                                  22
<210>    16
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Verrucomicrobia
<400>    16
tcakgtcagt atggccctta t                                                   21
<210>    17
<211>    23
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер Verrucomicrobia
<400>    17
cagttttyag gatttcctcc gcc                                                 23
<210>    18
<211>    25
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Enterobacteriaceae
<400>    18
cattgacgtt acccgcagaa gaagc                                               25
<210>    19
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Enterobacteriaceae
<400>    19
ctctacgaga ctcaagcttg c                                                   21
<210>    20
<211>    24
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Escherichia coli
<400>    20
cgcgtactat acgccatgaa cgta                                                24
<210>    21
<211>    22
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Escherichia coli
<400>    21
accgttgatc acttcggtca gg                                                  22
<210>    22
<211>    24
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Klebsiella spp.
<400>    22
gatacggagt atgcctttac ggtg                                                24
<210>    23
<211>    24
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Klebsiella spp.
<400>    23
tagcctttat caagcggata ctgg                                                24
<210>    24
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Klebsiella oxytoca
<400>    24
gttaatacct ttgctcattg a                                                   21
<210>    25
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Klebsiella oxytoca
<400>    25
accagggtat ctaatcctgt t                                                   21
<210>    26
<211>    25
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Morganella morganii
<400>    26
ctcgcaccat cagatgaacc catat                                               25
<210>    27
<211>    29
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Morganella morganii
<400>    27
caaagcatct ctgctaagtt ctctggatg                                           29
<210>    28
<211>    16
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Lactobacillus reuteri
<400>    28
gaacgcaytg gcccaa                                                         16
<210>    29
<211>    19
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Lactobacillus reuteri
<400>    29
tccattgtgg ccgatcagt                                                      19
<210>    30
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Lactobacillus johnsonii
<400>    30
cactagacgc atgtctagag                                                     20
<210>    31
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Lactobacillus johnsonii
<400>    31
agtctctcaa ctcggctatg                                                     20
<210>    32
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Lactobacillus plantarum
<400>    32
tcatgattta catttgagtg                                                     20
<210>    33
<211>    21
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Lactobacillus plantarum
<400>    33
gaccatgcgg tccaagttgt t                                                   21
<210>    34
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер для Lactobacillus rhamnosus
<400>    34
cgcccttaac agcagtcttc                                                     20
<210>    35
<211>    20
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер для Lactobacillus rhamnosus
<400>    35
gccctccgta tgcttaaacc                                                     20
<210>    36
<211>    52
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    F_праймер к бактериальной 16S рДНК
<400>    36
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggtgccag cmgccgcggt aa                 52
<210>    37
<211>    54
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    R_праймер к бактериальной 16S рДНК
<400>    37
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagggacta chvgggtwtc taat               54
<210>    38
<211>    1460
<212>    ДНК
<213>    Искусственная последовательность
<220>
<223>    16S рДНК NK98
<400>    38
ctcaggatga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt cgaacgggat cccaggagct         60
tgctcctggg tgagagtggc gaacgggtga gtaatgcgtg accgacctgc cccatacacc        120
ggaatagctc ctggaaacgg gtggtaatgc cggatgctcc agttggatgc atgtccttct        180
gggaaagatt catcggtatg ggatggggtc gcgtcctatc agcttgatgg cggggtaacg        240
gcccaccatg gcttcgacgg gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ttgggactga        300
gatacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc        360
ctgatgcagc gacgccgcgt gcgggatgac ggccttcggg ttgtaaaccg cttttgactg        420
ggagcaagcc cttcggggtg agtgtacctt tcgaataagc accggctaac tacgtgccag        480
cagccgcggt aatacgtagg gtgcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagggctcg        540
taggcggttc gtcgcgtccg gtgtgaaagt ccatcgctta acggtggatc cgcgccgggt        600
acgggcgggc ttgagtgcgg taggggagac tggaattccc ggtgtaacgg tggaatgtgt        660
agatatcggg aagaacacca atggcgaagg caggtctctg ggccgtcact gacgctgagg        720
agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg        780
gatgctggat gtggggacca ttccacggtc tccgtgtcgg agccaacgcg ttaagcatcc        840
cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaagaaa ttgacggggg cccgcacaag        900
cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg cttgacatgt        960
tcccgacagc cccagagatg gggcctccct tcggggcggg ttcacaggtg gtgcatggtc       1020
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgccc       1080
tgtgttgcca gcacgtcgtg gtgggaactc acgggggacc gccggggtca actcggagga       1140
aggtggggat gacgtcagat catcatgccc cttacgtcca gggcttcacg catgctacaa       1200
tggccggtac aacgggatgc gacactgtga ggtggagcgg atcccttaaa accggtctca       1260
gttcggattg gagtctgcaa cccgactcca tgaaggcgga gtcgctagta atcgcggatc       1320
agcaacgccg cggtgaatgc gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca agtcatgaaa       1380
gtgggtagca cccgaagccg gtggcccaac ctttttgggg ggagccgtct aaggtgagac       1440
tcgtgattgg gactaatcta                                                   1460
<---