КОМБИНАЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
COMBINATIONS AND THEIR APPLICATION

Настоящая заявка претендует на приоритет по предварительной заявке на патент США №61/705172, поданной 25 сентября 2012 года, и предварительной заявке на патент США №61/774595, поданной 8 марта 2013 года, полное описание которых включено в настоящую заявку в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее раскрытие описывает фармацевтическую комбинацию анти-CD38 антитела и мелфалана.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Множественная миелома представляет собой В-клеточное злокачественное заболевание, характеризующееся латентным накоплением в костном мозге секреторных плазматических клеток с низким пролиферативным индексом и длительным периодом жизни. В итоге, эта болезнь поражает кости и костный мозг, приводя к развитию множественных опухолей и очагов повреждения в костной системе.
Примерно 1% всех видов рака и несколько более 10% злокачественных заболеваний крови имеют связь с множественной миеломой (ММ). Частота развития ММ возрастает при старении, при этом средний возраст, в котором диагностируется это заболевание, составляет примерно 61 год. Используемая в настоящее время терапия множественной миеломы включает химиотерапию, такую как терапия с использованием винкристина, BCNU, мелфалана, циклофосфамида, адриамицина и преднизона или дексаметазона, трансплантацию стволовых клеток, Таломида (Thalomid; талидомид), Велкада (Velcade; бортезомид), Аредии (Aredia; памидронат) и Зометы (Zometa; золедроновая кислота). Применяемые в настоящее время протоколы лечения, которые включают комбинацию химиотерапевтических препаратов, дают полную ремиссию только на уровне 5%, и средний период выживания составляет примерно 36-48 месяцев от момента начала лечения. Введенные в последнее время усовершенствования в эти протоколы, в рамках которых используют высокие дозы химиотерапевтических препаратов, с последующей трансплантацией аутологичного костного мозга или мононуклеарных клеток периферической крови, повысили показатель полной ремиссии и длительность ремиссии. Однако, общий период выживания был продлен незначительно, а также не было данных по излечиванию. Кроме того, у пациентов с ММ часто возникали рецидивы, даже в ходе поддерживающего лечения с использованием интерферона-альфа (IFN-α), одного или в комбинации со стероидами.
2+
2+
CD38 представляет собой пример антигена, экспрессируемого на таких злокачественных клетках плазмы. Считается, что CD38 выполняет функцию рецептора медиации при адгезии и в сигнальных событиях, а также в (экто-)ферментативной активности. Будучи эктоферментом, СD38 использует НАД+ для образования циклической АДФ-рибозы ((цАДФР (cADPR)) и АДФР (ADPR), а также никотинамид и адениндинуклеотидфосфат никотиновой кислоты (NAADP). Было показано, что cADPR и NAADP действуют в качестве вторичных мессенджеров в процессе мобилизации Са. Путем превращения НАД+ в cADPR, CD38 регулирует концентрацию НАД+ и, следовательно, выживание клеток за счет модуляции НАД-индуцированной гибели клеток. Дополнительно, CD38 осуществляет сигнальную функцию не только через путь, связанный с Са, но также через перекрестные взаимодействия с антиген-рецепторными комплексами на Т- и В-клетках, или с другими типами рецепторных комплексов, например, с молекулами МНС, участвуя таким образом в ряде клеточных ответов, а также вовлекаясь в процесс включения и секреции IgG.
В настоящее время в данной области описаны различные подходы, связанные с целевым воздействием на CD38. Например, антитела, специфичные для СВ38, описаны в WO 1999/62526 (Mayo Foundation), WO 200206347 (Crucell Holland), US 2002164788 (Jonathan Ellis), причем указанные работы включены в настоящее описание полностью, в качестве ссылок; WO 2005/103083, регистрационный номер US 10/588568, включенная в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки; WO 2006/15640, регистрационный номер US 11/920830, включенная в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки; и WO 2007/042309, регистрационный номер US 12/089806, включенная в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки (MorphoSys AG); WO 2006099875, регистрационный номер US 11/886932, включенная в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки (Genmab); и WO 08/047242, регистрационный номер US 12/441466, включенная в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки (Sanofi-Aventis). Однако, для повышения эффективности антител против CD38, были разработаны и описаны различные методы лечения, включающие использование комбинации антител, специфичных для CD38, и других агентов, например, WO 200040265, регистрационный номер US 09/226895, включенная в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки (Research Development Foundation), WO 2006099875 и WO 2008037257, регистрационный номер US 11/836932 и 12/442808, включенные в настоящую заявку полностью, в качестве ссылок (Genmab); WO 2012/041800 (MorphoSys AG) и WO 2010061360, регистрационный номер US 13/131389, включенные в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки; WO 2010061359, регистрационный номер US 13130867, включенная в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки; WO 2010061358, регистрационный номер US 13130865, включенная в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки; и WO 2010061357, регистрационный номер US 13/130862, включенная в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки (Sanofi Aventis), причем все указанные работы включены в настоящую заявку полностью.
Однако, многие формы рака, включающие CD38-экспрессирующие опухоли, все еще характеризуются плохим прогнозом развития, и применяемая в настоящее время терапия не дает удовлетворительных результатов. Таким образом, имеется потребность в разработке усовершенствованных методов лечения таких форм рака.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Неожиданно было обнаружено, что комбинация конкретного анти-CD38 антитела с мелфаланом демонстрирует синергию по уровню снижения лизиса кости, на in vivo модели клинически проявленной множественной миеломы. За счет этих неожиданных синергических эффектов данная комбинация представляет усовершенствованный и перспективный подход к лечению множественной миеломы у людей.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к синергической комбинации антитела, специфичного для CD38, и мелфалана. В другом аспекте данное раскрытие относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело, специфичное для CD38, и алкилирующий агент хлорметин (азотистый иприт). Такие комбинации используются при лечении тех видов рака, в которые вовлекаются опухолевые клетки, таких как множественная миелома.
Мелфалан представляет собой алкилирующий агент из группы хлорметина, и, в этой связи, другие алкилирующие агенты такой природы, такие как циклофосфамид, мехлоретамин, урамустин, хлорамбуцил, ифосфамид или бендамустин, также могут приводить к появлению синергических эффектов, в случае использования их в комбинации с анти-CD38 антителом.
Другой аспект настоящего изобретения относится к синергическим комбинациям анти-CD38 антитела и хлорметинового алкилирующего агента, применяемым при лечении хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, острого миелогенного лейкоза и/или острого лимфоцитарного лейкоза.
Настоящее изобретение, в одном своем аспекте, относится к комбинации, в которой антитело, специфичное для CD38, включает HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), и мелфалан. В предпочтительных аспектах настоящего изобретения указанная комбинация применяется при лечении множественной миеломы.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
На фиг. 1 представлен сканированный снимок КТ (MicroCT Scan), на котором показано среднее значение общего объема кости, применительно к каждой из испытуемых групп, описанных подробно в разделе, относящемся к примеру 3. В случае каждой из этих групп использовали MOR03087 в дозе 3,0 мг/кг и мелфалан в дозе 4,0 мг/кг.
На фиг. 2 представлен сканированный снимок КТ (MicroCT Scan), на котором показано среднее значение общего объема кости, применительно к каждой из испытуемых групп, описанных подробно в разделе, относящемся к примеру 3. В случае каждой из этих групп использовали MOR03087 в дозе 3,0 мг/кг и мелфалан в дозе 8,0 мг/кг.
На фиг. 3 показано среднее значение концентрации белка М в сыворотке, выделенной у мышей, исследованных в качестве модели ортотопического остеолиза, при использовании антитела против CD38 (MOR03087) и мелфалана, а также их комбинации.
На фиг. 4 показана аминокислотная последовательность MOR202.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Определения
Фраза "фармацевтическая композиция" в контексте настоящего описания обозначает по меньшей мере один активный агент, например, антитело, для целей его терапевтического применения у людей. Фармацевтическая композиция включает также комбинацию активных агентов, например, антитело, подходящее для целей терапевтического применения людьми, и хлорметин (алкилирующий агент из группы азотистых ипритов). Фармацевтическая композиция может включать приемлемые носители или эксципиенты.
Такие термины, как "вводимый" или "введение" (и их грамматические варианты) обозначают, без ограничения, доставку, осуществляемую за счет инъецируемой формы, такую как, например, доставка в рамках внутривенного, внутримышечного, интрадермального или подкожного способа введения, а также путь введения через слизистую оболочку, например, в виде назального спрея или аэрозоля для ингаляции, или в виде принимаемого через рот раствора, капсулы или таблетки.
Термины "синергия", "синергизм" или "синергическая активность" обозначает результат применения комбинации, превосходящий по выраженности простой аддитивный эффект. "Синергию", "синергизм" или "синергическую активность" рассматриваемой здесь комбинации определяют по методу Clarke et al. Смотрите Clarke et al., Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255-278 (1997), где указанная работа включена в настоящее описание полностью, в качестве ссылки.
2
Термин "антитело" обозначает моноклональные антитела, включающие любой изотип, такие как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Антитело IgG состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, которые соединены дисульфидными связями. Каждая тяжелая и легкая цепи содержат константный участок и вариабельный участок. Каждый вариабельный участок содержит три сегмента, называемых "участки, определяющие комплементарность" ("CDR") или "гипервариабельные участки", которые в основном ответственны за связывание с эпитопом антигена. Они обозначаются как CDR1, CDR2 и CDR3, где указанная нумерация идет от N-конца. Более консервативные части вариабельных участков, находящиеся за пределами CDR, обозначаются как "каркасные области". Термин "фрагмент антитела" включает в область своего определения фрагмент Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab', F(ab'), а также другой фрагмент, который содержит по меньшей мере один вариабельный участок тяжелой цепи или один вариабельный участок легкой цепи, и где каждый из них содержит CDR и каркасные участки. Термин "антиген-связывающий фрагмент" обозначает фрагмент антитела, который специфически связывается с рассматриваемым антигеном, например CD38.
Термин "моноклональное антитело" в контексте настоящего описания относится к препарату молекул антитела, где рассматриваемая композиция включает молекулы одного типа. Композиция на основе моноклонального антитела характеризуется уникальной специфичностью по связыванию и сродством к одному конкретному эпитопу.
Термин "VH" относится к вариабельному участку тяжелой цепи иммуноглобулина антитела или фрагмента антитела. Термин "VL" относится к вариабельному участку легкой цепи иммуноглобулина антитела или фрагмента антитела.
Термин "CD38" относится к белку, известному под названием CD38.
CD38 человека имеет аминокислотную последовательность, показанную ниже:
MANCEFSPVSGDKPCCRLSRRAQLCLGVSILVLILVWLAVWPRWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAFKGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKlLLWSRIKDLAHQFrQVQRDMFI'LEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNNPVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKJFDKNSTFGSVEVHNLQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESnSKRNIQFSCKNIYRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI (SEQ ID NO: 11).
Аминокислотная последовательность и последовательность ДНК "MOR202" анти-CD38 антитела показаны на фиг. 4. "MOR202" и "MOR03087" используются взаимозаменяемо, как синонимы, описывающие антитело, показанное на фиг. 4. MOR03087 описан в патенте США №8088896, который включен в настоящую заявку в качестве ссылки, в полном объеме.
Термин "эпитоп" относится к участку молекулы, который специфически распознается иммуноглобулином или T-клеточным рецептором или за счет другого способа взаимодействия. В основном, эпитопы представляют собой химически активные группировки, расположенные на поверхности молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи углеводов или сахаров, и, как правило, могут характеризоваться специфической для них трехмерной структурой, а также определенными показателями зарядов.
Термин "перекрестная конкуренция" используется применительно к антителу или другому связывающему агенту, который демонстрирует ту же самую способность по связыванию со специфичным участком антигена. В контексте настоящего описания, антитело или другой связывающий агент, которые демонстрируют "перекрестную конкуренцию", обладают способностью препятствовать связыванию другого антитела или другого связывающего агента с CD38, в рамках стандартного теста на конкурентное связывание. Такое антитело может, в соответствии с принципом неограничительного подхода, связываться с тем же самым или родственным или расположенным рядом (т.е. в соответствии со структурным сходством или за счет близкого пространственного положения) эпитопом с белком CD38, как и антитело, с которым оно/он вступает в конкурентное взаимодействие.
Перекрестная конкуренция имеет место в том случае, если антитело A снижает связывание антитела В по меньшей мере на 60%, конкретно, по меньшей мере на 70%, и более конкретно, по меньшей мере на 80%, и наоборот, если сравнивать с положительным контролем, который не содержит одно из указанных антител. Как это очевидно для специалистов в данной области, указанная конкуренция может быть оценена в рамках разных систем тестирования. Один такой подходящий тест включает использование технологии Biacore (которая основана на использовании набора BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Швеция)), который позволяет измерять длительность взаимодействия по методу поверхностного плазмонного резонанса. Другой тест, используемый для оценки перекрестной конкуренции, включает подход, основанный на методе ELISA (смотрите, в частности, пример 4). Кроме того, эффективный способ, основанный на "сортировке" антител, осуществляемый с учетом их перекрестной конкуренции, описан в заявке на международный патент (International Patent Application № WO 2003/48731). Перекрестная конкуренция имеет место в том случае, если исследуемое антитело снижает связывание MOR202 с CD38 на 60% или более, конкретно, на 70% или более, и более конкретно, на 80% или более, или если MOR202 снижает связывание указанного антитела с CD38 на 60% или более, конкретно, на 70% или более, и более конкретно, на 80% или более. Термин "хлорметин" или "алкилирующий агент хлорметин", в контексте настоящего описания, включает, без ограничения, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, меклоретамин, урамустин, хлорамбуцил или бендамустин. Циклофосфамид может вводиться, например, в том виде, в котором он поставляется на рынок, в частности, под торговой маркой CYCLOSTIN; и ифосфамид в виде HOLOXAN. Мелфалан в настоящее время поставляется на фармацевтический рынок под торговой маркой Алкеран (Alkeran) для применения при лечении множественной миеломы. Мелфалан также известен под синонимами, такими как аланин-хлорметин, L-фенилаланин-хлорметин, L-сарколизин, L-сарколизин-фенилаланин-хлорметин, L-сарколизин-фенилаланин-хлорметин, фенилаланин-хлорметин или сокращенно L-PAM. Мелфалан представляет собой фенилаланиновое производное хлорметина (азотистого иприта), обладающее антинеопластической активностью, где указанное средство, по имеющимся данным, алкилирует ДНК в положении N7 гуанина и индуцирует межцепочечные сшивки ДНК, с последующим ингибированием синтеза ДНК и РНК, а также индукцией цитотоксичности, как против делящихся, так и неделящихся опухолевых клеток. Мелфалан относится к классу алкилирующих агентов хлорметиновой природы.
Термин "терапевтически эффективное количество", используемый применительно к соединению или его комбинированной форме (комбинации с другим агентом), относится к количеству, которое будет достаточным для излечивания, ослабления или частичной приостановки клинических проявлений заболевания или расстройства или их осложнений. Количество, которое будет эффективным для достижения конкретной цели лечения, зависит от тяжести заболевания или поражения, а также от веса и общего состояния здоровья субъекта. Следует, в этой связи, отметить, что определить подходящую для этого дозировку можно с использованием стандартных методов, путем создания матрицы значений и тестирования разных точек в этой матрице, и все эти процедуры известны специалисту со средним уровнем знаний в данной области, врачу или клиническому исследователю.
Настоящее изобретение относится к комбинациям, фармацевтическим средствам и фармацевтическим композициям, содержащим указанные комбинации.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к комбинации, которая включает антитело, специфичное для CD38, и хлорметин. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанное хлорметиновое соединение (соединение из группы азотистых ипритов) представляет собой мелфалан. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанная комбинация представляет собой синергическую комбинацию.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, антитело, специфичное для CD38, включает HCDR1, где указанная последовательность представляет собой GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2, где указанная последовательность представляет собой GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3, где указанная последовательность представляет собой DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1, где указанная последовательность представляет собой SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2, где указанная последовательность представляет собой GDSKRPS (SEQ ID NO: 5), и LCDR3, где указанная последовательность представляет собой QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, рассматриваемое антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 9).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанная комбинация применяется для лечения различных форм рака, например, таких форм рака, которые вовлекают раковые клетки. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанная форма рака, вовлекающая опухолевые клетки, включает множественную миелому. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанная форма рака выбрана из хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, острого миелогенного лейкоза и острого лимфоцитарного лейкоза.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанное антитело представляет собой моноклональное антитело. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанное антитело представляет собой IgG1.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанная комбинация включает фрагмент антитела, специфичного для CD38. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный фрагмент антитела, специфичного для CD38, включает HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный фрагмент антитела включает вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 9).
2
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный фрагмент антитела выбран из фрагментов Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' и F(ab').
Два компонента синергической комбинации по настоящему изобретению, такие как, например, антитело, специфичное для CD38, и мелфалан, могут вводиться вместе, по отдельности, в одно и то же время или в разное время. Указанные комбинации не ограничиваются теми комбинациями, которые были получены путем физического объединения составляющих компонентов, но также включает такие комбинации, которые позволяют осуществлять раздельное введение, что может осуществляться либо в одно и то же время, либо по истечении какого-то периода времени. В случае совместного введения, оба этих компонента могут вводиться в состав одной фармацевтической композиции, которая может включать фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. Альтернативно, оба указанных компонента могут быть введены в состав разных фармацевтических композиций. В этом случае оба рассматриваемых компонента могут вводиться одновременно или последовательно. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, мелфалан вводят до введения и/или вводят отдельно относительно введения антитела, специфичного для CD38, например MOR202. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, мелфалан вводят по меньшей мере за 72 часа до введения антитела, специфичного для CD38, например MOR202.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанную фармацевтическую композицию вводят внутривенно или подкожно. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанную фармацевтическую композицию вводят в терапевтически эффективном количестве.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанная фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтически приемлемые стерильные растворы или суспензии. Стерильные водные растворы могут представлять собой растворы активных ингредиентов в воде.
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один аспект настоящего изобретения относится к синергической комбинации антитела, специфичного для CD38, включающего HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), и мелфалана, применяемой для лечения множественной миеломы.
В другом варианте осуществления, настоящее изобретение относится к синергической комбинации антитела, специфичного для CD38, где указанное антитело включает вариабельный домен тяжелой цепи с последовательностью QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYYMNWVRQAPGKGLEWVSGISGDPSNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDLPLVYTGFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 7) и вариабельный домен легкой цепи с последовательностью DIELTQPPSVSVAPGQTARISCSGDNLRHYYVYWYQQKPGQAPVLVIYGDSKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAEDEADYYCQTYTGGASLVFGGGTKLTVLGQ (SEQ ID NO: 9) и мелфалана, для лечения множественной миеломы.
Другой аспект настоящего изобретения относится к комбинации антитела, специфичного для CD38, и алкилирующего агента из группы хлорметина. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, рассматриваемая комбинация включает алкилирующий агент хлорметиновой природы, выбранный из группы, которая включает, без ограничения, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан (АЛКЕРАН (ALKERAN)), бендамустин (ТРЕАКИСИМ (TREAK1SYM), РИБОМУСТИН (RIBOMUSTIN) и ТРЕАНДА (TREANDA)), мехлоретамин, урамустин и хлорамбуцил. В еще одном варианте указанный хлорметиновый агент представляет собой мелфалан.
Другой аспект настоящего изобретения относится к комбинации, которая включает антитело, специфичное для CD38, которое демонстрирует перекрестную конкуренцию с антителом, включающим HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6) с последовательностью. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанная комбинация включает хлорметиновый алкилирующий агент, который выбран из группы, включающей, без ограничения, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан (АЛКЕРАН (ALKERAN)), бендамустин (ТРЕАКИСИМ (TREAKISYM), РИБОМУСТИН (RIBOMUSTIN) и Треанда (TREANDA)), мехлоретамин, урамустин и хлорамбуцил. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный хлорметиновый агент представляет собой мелфалан.
Другой аспект настоящего изобретения относится к комбинации, включающей антитело, специфичное для CD38, которое включает HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), и мелфалан. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, мелфалан вводят до введения антитела, специфичного для CD38. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, мелфалан вводят за 72 часа до введения антитела, специфичного для CD38.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, рассматриваемая комбинация включает антитело, специфичное для CD38, которое включает HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ IDN0: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), и хлорметиновый алкилирующий агент. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный хлорметиновый агент представляет собой мелфалан.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения множественной миеломы у индивидуума, нуждающегося в таком лечении, где указанный способ включает введение антитела, специфичного для CD38, включающего HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), и хлорметинового алкилирующего агента индивидууму с множественной миеломой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, указанный хлорметиновый алкилирующий агент выбран из группы, включающей, без ограничения, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан (Алкеран (Alkeran)), меклоретамин, бендамустин (ТРЕАКИСИМ (TREAKISYM), РИБОМУСТИН (RIBOMUSTIN) и ТРЕАНДА (TREANDA)), урамустин и хлорамбуцил. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный алкилирующий агент представляет собой мелфалан.
Другой аспект настоящего изобретения относится к лечению множественной миеломы у индивидуума, при наличии в этом потребности, где указанный способ включает введение антитела, специфичного для CD38, включающего HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), и мелфалана индивидууму, имеющему множественную миелому.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу лечения множественной миеломы у индивидуума, нуждающегося в таком лечении, где указанный способ включает введение антитела, специфичного для CD38, которое демонстрирует перекрестную конкурентность с антителом, включающим HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), и хлорметинового алкилирующего агента индивидууму с множественной миеломой. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, указанный хлорметиновый алкилирующий агент выбран из группы, включающей, без ограничения, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан (Алкеран (Alkeran)), меклоретамин, бендамустин (ТРЕАКИСИМ (TREAKISYM), РИБОМУСТИН (RIBOMUSTIN) и ТРЕАНДА (TREANDA)), урамустин и хлорамбуцил. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный алкилирующий агент представляет собой мелфалан.
Другой аспект настоящего изобретения относится к комбинации антитела, специфичного для CD38, которое демонстрирует перекрестную конкурентность с антителом, включающим HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), с хлорметиновым алкилирующим агентом, применяемому для лечения множественной миеломы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, указанный хлорметиновый алкилирующий агент выбран из группы, включающей, без ограничения, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан (Алкеран (Alkeran)), меклоретамин, бендамустин (ТРЕАКИСИМ (TREAKISYM), РИБОМУСТИН (RIBOMUSTIN) и ТРЕАНДА (TREANDA)), урамустин и хлорамбуцил. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанный алкилирующий агент представляет собой мелфалан.
Другой аспект настоящего изобретения относится к комбинации антитела, специфичного для CD38, которое демонстрирует перекрестную конкурентность с антителом, включающим HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), и мелфалана, применяемому для лечения множественной миеломы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, указанная комбинация представляет собой синергическую комбинацию.
Другой аспект настоящего изобретения относится к комбинации антитела, специфичного для CD38, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело, включающее HCDR1 с последовательностью GFTFSSYYMN (SEQ ID NO: 1), HCDR2 с последовательностью GISGDPSNTYYADSVKG (SEQ ID NO: 2), HCDR3 с последовательностью DLPLVYTGFAY (SEQ ID NO: 3), LCDR1 с последовательностью SGDNLRHYYVY (SEQ ID NO: 4), LCDR2 с последовательностью GDSKRPS (SEQ ID NO: 5) и LCDR3 с последовательностью QTYTGGASL (SEQ ID NO: 6), и мелфалана, применяемой для лечения множественной миеломы.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения, компоненты рассматриваемой комбинации, антитело, специфичное для CD38, и хлорметиновый алкилирующий агент, вводят по отдельности. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, хлорметиновый алкилирующий агент вводят до введения антитела, специфичного для CD38. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, хлорметиновый алкилирующий агент вводят за 72 часа до введения антитела, специфичного для CD38.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения, компоненты рассматриваемой комбинации, антитело, специфичное для CD38, и мелфалан, вводят по отдельности. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, мелфалан вводят до введения антитела, специфичного для CD38. В одном варианте осуществления настоящего изобретения, мелфалан вводят за 72 часа до введения антитела, специфичного для CD38.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, указанную комбинацию применяют для лечения рака, вовлекающего опухолевые клетки. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, указанный вид рака выбран из множественной миеломы, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелогенного лейкоза, острого миелогенного лейкоза и острого лимфоцитарного лейкоза.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Экспрессия CD38 на поверхности клеток из различных клеточных линий. Клеточные линии, показанные в таблице 1, исследовали с целью определения уровней экспрессии CD38.
Таблица 1
LP1
Клеточная линия множественной миеломы, DSMZ #ACC 41
NCI-H929
Клеточная линия множественной миеломы, DSMZ #ACC 163
RPMI8226
Клеточная линия множественной миеломы, DSMZ #ACC 402
Клетки окрашивали с использованием непосредственно меченного QuantiBRITETM CD38-PE антитела (Becton Dickinson GmbH, Clone HB7, по каталогу #342371), где указанное окрашивание специфично для CD38. Параметр, указывающий на количество "антител, связанных клеткой" (ABC), определяли с использованием метода проточной цитометрии, основанного на системе QuantiBRITETM, который позволяет определять среднее геометрическое значение (GeoMean), в расчете на одну клетку. Использовали программное обеспечение GraphPad PRISMTM для преобразования значения геометрического среднего (GeoMean) в соответствующий показатель ABC на клетку. Как считается, значения ABC коррелируют с числом молекул CD38, в расчете на одну клетку, поскольку QuantiBRITE™ CD38-PE переносит одну молекулу PE на антитело. Полученные результаты показаны в таблице 2.
Таблица 2
Эксперимент
Клеточная линия
ABC
4SSR6
LP1
125000
NCI-H929
195000
RPMI8226
>677000
Пример 2: Синергическая комбинация MOR202 и мелфалана в рамках ортотопической модели остеолизиса
Исследуют 70 самок мышей SCID с целью определения эффективности мелфалана и MOR03087, применяемых, каждого из них, по отдельности и в комбинации, в отношении клеток множественной миеломы человека NCI-H929.
Используемый для разбавления (при анализе мелфалана) растворитель (цитрат натрия, пропиленгликоль, этанол (96%) и вода), подбирался с целью его пригодности для внутривенного введения. Мелфалан, поставляемый в виде лиофилизированного порошка (50 мг в ампуле) восстанавливали в 5 мл растворителя и далее разбавляли солевым раствором для последующего внутривенного введения.
Получали MOR202 в буфере для готового продукта с целью его последующего внутрибрюшинного введения.
6
На 7 день всем исследуемым мышам (70 самок линии SCID) проводили инокуляцию 2,5×10 клеток NCI-H929 (при 5 pl), ортотопически, в правую голень с использованием полудюймовой иглы 27 размера и шприца 50 pi Hamilton.
На 4 день, через 3 дня после инокуляции, 60 животных распределяли в случайном порядке, на основании веса тела, по 6 группам (из 10) для акклиматизации. Данные 4 дня используют в качестве базового значения для всех дальнейших оценок веса тела в ходе дальнейших исследований. На 2 день проводят дополнительное определение веса тела животных.
Лечение начинают в 1 день (через 6 дней после инокуляции) в контрольной группе, в которой животным вводят мелфалан/носитель в качестве контроля, и в 0 день в группе животных, которым вводят MOR03087, и продолжают введение в течение 6 недель.
Мелфалан, в дозе 4 мг/кг или 8 мг/кг, вводят внутривенно 3 раза в неделю, в течение 6 недель. MOR202 (3 мг/кг) вводят внутрибрюшинно, 3 раза в неделю, в течение 6 недель. В группе введения носителя животным вводят разбавитель, 2 раза в неделю.
Далее, всем исследуемым мышам, в каждой группе, было проведено ретро-орбитальное кровопускание в 2 временных точках, через 15-30 минут после 4-го и 8-го введения мелфалана, и через 25 часов после 5-го и 11-го введения MOR03087, с целью получения сыворотки для анализа. Отбирали аликвоты образцов в 3 ампулы (25 мкл + 25 мкл + остаток) и хранили при температуре -80°C.
Взвешивание животных проводят 3 раза в неделю, во временных точках, соответствующих +/-1 час, относительно исходной временной точки. Длительность лечения составляет 6 недель, после чего лечение прекращают.
После завершения лечения (42 день), всем животным проводят завершающее кардиальное кровопускание (с умерщвлением), для получения сыворотки крови. Далее, у всех животных отбирают левые и правые голени и фиксируют их в 10% нейтральном забуференном формалине для последующего анализа микроКТ (microCT). Полученные при проведении анализа микроКТ результаты проиллюстрированы на фиг. 1 (4 мг/кг мелфалана) и фиг. 2 (8 мг/кг мелфалана). Применительно к обоим экспериментам, было видно, что достигается более высокий эффект, если мелфалан и MOR202 использовали в комбинации, за счет синергизма. Статистический анализ подтверждал синергический эффект комбинированной терапии с использованием MOR202 и мелфалана, где указанный анализ проводился с использованием подхода теоремы Кларка (Clarke Theorem) и описан в таблице 3. В эксперименте, включавшем применение 8 мг/кг, анализ синергического эффекта был не актуален, поскольку уже один мелфалан полностью снижал лизис кости (фиг. 2).
Синергизм, по Clarke et al.
Наличие синергизма оценивают по методам, описанным в работе Clarke et al. Смотрите Clarke et al. Issues in experimental design and endpoint analysis in the study of experimental cytotoxic agents in vivo in breast cancer and other models, Breast Cancer Research and Treatment 46:255-278 (1997), где указанная работа включена в настоящую заявку полностью, в качестве ссылки.
Полученные результаты анализировали следующим образом:
Антагонистический вариант = (АВ)/С<(А/С)×(В/С)
Аддитивный вариант = (А/С)×(В/С)
Синергический вариант = (АВ)/С>(А/С)×(В/С)
Где A обозначает реакцию на лечение 1; В обозначает реакцию на лечение 2; С обозначает реакцию на введение носителя; AB относится к результату объединенного использования A и B.
Таблица 3Расчет для определения наличия синергизма с использованием теоремы Кларке (Clarke Theorem), на основании данных, показанных на фиг. 1
Общий лизис кости [%]
A: Один мелфалан [4 мг/кг]
61,3
B: Один MOR03087 [3 мг/кг]
27,6
C: Носитель в качестве контроля
100,0
AB: Комбинация
12,1
(AB)/С [%] = наблюдаемый комбинаторный эффект
12,1
(A/C)×(B/C) [%] = теоретический аддитивный эффект
16,9
Вывод
Синергия
Вывод: Поскольку 16,9 ((А/С)×(B/C)) больше, чем 12,1 ((AB)/C), согласно Clarke et al., имеется синергический эффект объединения MOR03087 и мелфалана.
Пример 3: Определение концентрации белка M в сыворотке, взятой у мышей на 42 день, с использованием ортотопической модели остеолизиса
Дополнительно, в образцах сыворотки, выделенных после окончания испытания, определяли содержание белка M с использованием метода ELISA. В отличие от образцов сыворотки, взятых у мышей, которым вводили только носитель, в случае мышей, которым вводили мелфалан, MOR202 или их комбинацию, концентрация белка M значительно снижалась во взятых у этих животных образцах сыворотки. Полученные результаты проиллюстрированы на фиг. 3.
Пример 4: Тест для оценки перекрестной конкуренции с использованием метода ELISA
Перекрестная конкуренция анти-CD38 антитела или другого CD38-связывающего агента может быть выявлена с использованием для анализа метода ELISA, проводимого по описанной ниже стандартной процедуре.
Основной принцип теста, проводимого по методу ELISA, связан с внесением в ячейки микротитрационного планшета покрывающего слоя с анти-CD38 антителом. Затем добавляют в раствор (т.е. в отсутствие связывания с микротитрационным планшетом) избыточное количество вторичного, потенциально обладающего способностью к перекрестной конкуренции анти-CD38 антитело. После этого к ячейкам добавляют ограниченное количество CD38-Fc.
Антитело, которое вносили для покрытия ячеек, и антитело в растворе будут конкурировать за связывание с имеющимися в ограниченном количестве молекулами CD38. Далее, планшет промывают для удаления молекул CD38, которые не связывались с нанесенным для покрытия антителом, а также для удаления второго антитела, находящегося в растворе, и любых комплексов, сформированных между вторым антителом в фазе раствора и CD38. Далее, определяют количество связанного CD38, с использованием соответствующего реагента для детекции CD38. С этой целью, CD38 может быть слит с меткой, такой как, например, Fc, Flag и т.п., которая может быть детектирована с помощью соответствующего комплекса метка-конкретное антитело.
Находящееся в фазе раствора антитело, которое обладает способностью к перекрестной конкуренции с нанесенным на поверхность ячеек антителом, будет вызывать снижение числа молекул CD38, которое нанесенное для покрытия ячеек антитело может связать, в сравнении с числом молекул CD38, которое нанесенное для покрытия ячеек антитело может связать в отсутствие второго антитела в фазе раствора.
Указанный тест описан более подробно ниже, применительно к двум антителам, обозначенных как Ab-X и Ab-Y. В том случае, когда антитело Ab-X выбрано для применения его в варианте иммобилизации, указанное антитело вносят в ячейки микротитрационного планшета для ELISA, после чего микротитрационные планшеты блокируют с использованием соответствующего блокирующего раствора, для целей минимизации неспецифического связывания реагентов, которые позже будут добавлены. Затем в микротитрационный планшет для ELISA вносят избыточное количество антитела Ab-Y, так чтобы число молей сайтов связывания Ab-Y с CD38, в расчете на ячейку, по меньшей мере в 10 раз превосходило число молей сайтов связывания Ab-X с CD38, которое используется, в расчете на ячейку, для нанесения покрытия на микротитрационный планшет для ELISA. Затем добавляют CD38, так чтобы число молей добавленного CD38, в расчете на ячейку, было по меньшей мере в 25 раз меньше, чем число молей сайтов связывания Ab-X с CD38, которое используется для нанесения покрытия в каждую ячейку. По окончании соответствующего периода инкубации, микротитрационный планшет для ELISA промывают, и добавляют реагент для детекции CD38, с целью определения количества молекул CD38, которое было специфически связано нанесенным для покрытия ячеек анти-CD38 антителом (в данном случае, Ab-X). Фоновый сигнал для данного теста определяют как сигнал, полученный в ячейках, содержащих нанесенное для покрытия антитело (в данном случае, Ab-X), второе антитело в фазе раствора (в данном случае, Ab-Y), только буфер для CD38 (т.e. без CD38) и реагенты для детекции CD38. Положительный контрольный сигнал для данного теста определяют как сигнал, полученный в ячейках, содержащих нанесенное для покрытия антитело (в данном случае, Ab-X), только буфер для второго антитела в фазе раствора (т.e. без второго антитела в фазе раствора), CD38 и реагенты для детекции CD38. Тест по методу ELISA следует проводить таким образом, чтобы имелся положительный контрольный сигнал, который по меньшей мере в 6 раз превосходит фоновый сигнал.
С тем чтобы избежать разного рода артефактов (таких как, например, значительно различающееся сродство между Ab-X и Ab-Y к CD38), связанных с выбором того, какое из антител использовать в качестве антитела, применяемого для покрытия, и какое использовать в качестве второго (конкурирующего) антитела, тест на перекрестную блокировку следует проводить в двух форматах: 1) формат 1, в котором Ab-X представляет собой антитело, которое вносят в ячейки микротитрационного планшета для ELISA с целью покрытия ячеек, и Ab-Y представляет собой конкурентное антитело, находящееся в фазе раствора; и 2) формат 2, в котором Ab-Y представляет собой антитело, которое вносят в ячейки микротитрационного планшета для ELISA с целью покрытия ячеек, и Ab-X представляет собой конкурентное антитело, которое находится в фазе раствора.