Редактирование жизненно важных генов с помощью системы CRISPR/Cas9 на модели дрозофилы

УДК 577.218

Редактирование жизненно важных генов с помощью системы CRISPR/Cas9 на модели дрозофилы

И. С. Осадчий, С. О. Камалян, К. Ю. Тумашова, П. Г. Георгиев, О. Г. Максименко*

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена

Российской академии наук, Москва, 119334 Россия

*E-mail: maksog@mail.ru

Поступила в редакцию 08.12.2022

Принята к печати 04.04.2023

DOI: 10.32607/actanaturae.11874

РЕФЕРАТ Система редактирования на основе CRISPR/Cas9 в последние годы стала основным инструментом манипуляций с геномами разных организмов. Однако при использовании данного метода исследователи часто сталкиваются с низкой эффективностью внесения изменений и с разрезами в нецелевых участках генома (off-target). Более того, редактирование жизненно важных генов часто заканчивается неудачей вследствие повышенной летальности при эффективном разрезании обоих аллелей гена интереса (ГИ). В статье предложена новая стратегия геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas9-системы, основанная на том, что чем более важен ген для выживания организма, тем с меньшей эффективностью детектируются успешные случаи его редактирования и параллельно наблюдается все большее число разрезания нецелевых участков, что по сути является «ошибкой выжившего». В представленном методе в геном редактируемого организма предварительно вносят дополнительную копию ГИ, способную обеспечить уровень экспрессии гена, достаточный для выживания организма. Последующее применение CRISPR/Cas9-системы на фоне избыточной экспрессии ГИ позволило получить успешно редактированные линии дрозофилы с делециями трех жизненно важных генов - trf2, mep-1 и top2.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА CRISPR/Cas9, редактирование генома, редактирование жизненно важных генов, гены домашнего хозяйства.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ гРНК - гидовая РНК; Хр - хромосома; TRF2 - родственный ТВР фактор 2 (ТВР related factor 2); Top2 - топоизомераза 2 (Topoisomerase 2); MEP-1 - взаимодействующие с MOG и эктопические Р-гранулы (MOG interacting and ectopic P-granules).

ВВЕДЕНИЕ

Развитие системы CRISPR/Cas9 в качестве программируемого инструмента для внесения двухце-почечных разрывов в ДНК существенно расширило возможности исследования функций генов и ре-гуляторных элементов генома. Наиболее широко CRISPR/Cas9-система используется для получения нокаута гена интереса (ГИ) за счет внесения разрывов, приводящих к сдвигу рамки считывания. Стоит отметить, что ГИ может быть жизненно важным и попытки получить его нокаут при помощи CRISPR/Cas9-системы часто оказываются безуспешными либо из-за летальности успешно редактированных эмбрионов, либо за счет биологической пластичности - появления альтернативного старт-кодона, пропуска дефектного экзона и т.д. [1]. В представленной работе CRISPR/Cas9-система редактирования применена на фоне избыточной экс-

прессии ГИ, что позволило достаточно эффективно получить нокауты трех жизненно важных генов у дрозофилы. Похожий подход был недавно протестирован на клеточной линии человека НЕК293Т [2]. В настоящей работе нами осуществлено внесение достаточно протяженных делеций в кодирующие участки ГИ с сопутствующим встраиванием посадочной платформы, содержащей в своем составе участок для сайт-специфической рекомбинации, позволяющий быстро и эффективно встраивать модифицированные производные ГИ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Представленная стратегия дополняет методы, описанные в статьях [3-5], и подходит для повсеместно экспрессирующихся жизненно важных генов. Предложенный подход состоит из трех этапов (рис. 1):

А Сверхэкспрессия гена интереса

ядро

интереса

Инъекция плазмидных векторов

копия ГИ без мишеней для Cas9 + репортерный ген 1

гРНК

эмбрион

CRISPR/Cas9 + гомологичная рекомбинация

ГИ

-Ai

Cas9

У

Cas9

т

ГР

НТО

интрон

Хр I

>

loxP репортер 3 loxP конструкция

ГР

> ^

I

<Ца

loxP репортер 2 loxP attP Плазмидная матрица для ГР

с Модифицированной kohCîPV

attB

-Г

Хр II

репортер 1 копия ГИ без

мишеней для Cas9

attP-attB и CRE-loxP-рекомбинация

Отредактированный ГИ

-г t -

Хр I

loxP

таг attL

Б

ген

В

Г

дикий тип Хр II

Рис. 1. Общая схема редактирования. А - вставка репортерного гена 1 (yellow) и копии гена интереса (ГИ), которая не содержит мишеней для CRISPR/Сas9-системы, в локус типа «тихая гавань» с помощью сайт-специфической рекомбинации. Б - микроинъекция эмбрионов матрицей для гомологичной рекомбинации (ГР) и плазмидами, экспрессирующими Cas9 и гРНК. В - внесение двухцепочечных разрывов в геномный участок интереса с помощью CRISPR/Cas9 и гомологичная рекомбинация с плазмидной матрицей, содержащей репортерный ген 2 (mCherry), окруженный /охР-сайтами, и attP-сайт. Г - интеграция модифицированной последовательности гена интереса с последующим CRE-опосредованным вырезанием репортерных генов 2 (mCherry) и 3 (white) и скрещивание для замены хромосомы с копией ГИ (Хр II) на хромосому дикого типа

1. Встраивание копии ГИ без узнаваемых системой CRISPR/Cas9 последовательностей вместе с репортерным геном 1 в локус без жизненно важных генов («тихая гавань») и находящийся на хромосоме, на которой не представлен нативный ГИ. На данном этапе получается спасающая линия с ге-терологичной экспрессией копии ГИ. В настоящей работе для данного этапа созданы конструкции, содержащие последовательности, кодирующие белки TRF2, Top2 и MEP-1, под контролем промотора гена Ubi-p63E и гена yellow в качестве репортерного гена 1. Нокаут данных генов приводит к эмбриональ-

ной летальности. Конструкции встроены с помощью фC31-опосредованной сайт-специфической рекомбинации в локусы 86Fb (TRF2, ^2) и 38D (MEP-1).

2. Замена протяженного участка кодирующей области нативного ГИ сайтом аИР путем коинъек-ции трех плазмид, кодирующих белок Cas9 и гРНК, а также с матрицей для гомологичной рекомбинации, которая содержит сайт узнавания фC31-интегразы аИР и репортерный ген 2 (mCherry), окруженный сайтами loxP. На данном этапе получается линия с нокаутом ГИ на фоне экспрессии его копии. Для CRISPR/Cas9-опосредованного редакти-

рования ГИ использовали экспрессирующие Cas9 линии мух, полученные из депозитария Bloomington в Университете Индианы: BL54591 (Cas9 под контролем промотора nanos) и BL58492 (Cas9 под контролем промотора Actin5C). В альтернативном варианте в смесь для инъекции добавляли вектор, экспрес-сирующий Cas9 (Addgene #62209). CRISPR-мишени были выбраны с помощью инструмента fly CRISPR Optimal Target Finder (Университет Висконсина) [4] и клонированы в вектор на основе плазмиды pCFD4-U6:1_U6:3tandemgRNAs (Addgene #49411). Для делеции trf2 использовали участки: гРНК1 (tcttcgtgcatactcttagc), гРНК2 (tgcttttcgcttcggtgtcc) и гРНКЗ (accaagtagctagagactta); пара гРНК1/гРНК2 приводит к делеции геномного фрагмента размером 6.7 т.п.н., гРНК1/гРНК3 - 1.1 т.п.н. Для mep-1 использовали гРНК1м (acgaacagcagggcgcgcgc), гРНК2м (cagcaagtgacgctggcttg) и гРНКЗм (aggggatcttcggcctcgca), приводящие к делеции 5.6 т.п.н. (гРНК1м/гРНК2м) и 2 т.п.н. (гРНК1м/гРНК3м). Для делеции top2 использовали гРНК1т (gttcccagta-cagtagcacc) и гРНК2т (tctacggcgtgttcccgctt), приводящие к делеции 2 т.п.н.

Мух, полученных после инъекции (F0), индивидуально скрещивали с мухами линии yJw1118, и потенциальные события редактирования генома в потомстве (F1) выявляли с помощью флуоресценции mCherry. Правильность встраивания посадочной платформы (attP-mCherry) в геном проверяли с помощью ПЦР и секвенирования редактированных участков генома.

3. Встройка в посадочную платформу модифицированных вариантов ГИ вместе с окруженным loxP-сайтами репортерным геном 3 (ген white). Встройка осуществляется за счет коинъекции содержащей attB-сайт конструкции и вспомогательной плазмиды с геном интегразы фС31 (Addgene #26290). Репортерные гены 2 и 3 удаляли при помощи CRE-опосредованной сайт-специфической рекомбинации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

TRF2 - это паралог базального фактора транскрипции TBP, инактивация которого ассоциирована с эмбриональной летальностью [6, 7].

Ранее, несмотря на использование разных источников Cas9 (экспрессия с инъецированного в эмбрион плазмидного вектора или использование линии мух с конститутивной экспрессией Cas9) и двух комбинаций гРНК, нам не удалось заменить ген trf2 на посадочную платформу для последующей сайт-специфической встройки мутантных вариантов гена [8]. Последовательность всего гена trf2 составляет около 25 т.п.н., в то время как его кодирующая часть укладывается в 7 т.п.н. Использованные комбинации

А

trf2

Cas9

Y

Cas9

У

6700 п.н.

Хр I

ГР

500

матрица для рекомбинации

ГР

700

trf2

Cas9 Cas9

Y Y

Хр I

ГР 1100 п.н. 500

матрица для рекомбинации

ГР 500

Cas9

V 1

mep-1

—Г

Cas9

Y

Хр III

5600 п.н.

ГР

900

матрица для рекомбинации

ГР

800

Cas9 Cas9

Y Y

mep-1

Хр III

2000 п.н.

ГР

900

матрица для рекомбинации

ГР 700

top2

Cas9

Y

Cas9

Y

Хр II

2053 п.н.

ГР

ГР

520

матрица для рекомбинации

576

Рис. 2. Схемы замены ГИ - М2 (А), тер-1 (Б), Ор2 (В) - на посадочную платформу (affP-сайт и репортер-ный ген mCherry) при частичной или полноразмерной делеции

гРНК приводят к образованию двух двухцепочеч-ных разрывов ДНК на расстоянии 6.7 или 1.1 т.п.н. для того, чтобы заменить всю кодирующую часть гена или участок, содержащий только старт-кодон, на платформу (рис. 2А).

Результаты, полученные при использовании разных схем замены гена ^2 с помощью CRISPR/Cas9, показаны в табл. 1.

Б

В

Таблица 1. Результаты микроинъекций смеси плазмид для замены гена на посадочную платформу для генов М2, тер-1 или 1ор2

Линия мух Источник Cas9 Делеция, п.н. Инъецировано эмбрионов Вылетело из куколок, F0 Линии F1 mCherry+ Нецелевые встройки

y!w1118 Инъекция Cas9 вектора 6700 200 100 - -

СК1 54591 Cas9 под промотором nanos 6700 250 140 1 +

tó Ен 58492 Cas9 под промотором 6700 200 80 - -

Actin5C 1100 250 120 - -

y1w1118 + Инъекция Cas9 6700 100 80 5 2

сверхэкспрессия TRF2 вектора 1100 100 80 5 2

y1W1118 Инъекция Cas9 2000 5600 300 150 160 90 1 -

И § y1w1118 + сверхэкспрессия MEP-1 вектора 5600 240 175 4 -

СК1 а, 1 1118 У w Инъекция Cas9 2053 150 100 - -

о Ен y1w1118 + сверхэкспрессия Top2 вектора 2053 150 80 3 -

Полученные после инъекции эмбрионы F0 без сверхэкспрессии ^2 имели низкий уровень выживаемости. При этом экспрессия репортера т^етту в развивающихся особях варьировала по интенсивности от места инъекции по всему телу. Эмбрионы с наиболее ярким свечением mCherry погибали на последующих стадиях развития. В результате после скрещивания F0 с мухами дикого типа нами была получена только одна линия, которая имела вставку аИР-сайта и репортерного гена т^етту по 5ч-разрыву без удаления кодирующей части ^2.

Для того чтобы нивелировать эффект, связанный с высокой летальностью при делеции ^2, мы создали линию со сверхэкспрессией ^2 посредством сайт-специфической встройки его короткой изофор-мы в линию мух, содержащую а££Р-сайт в локусе 86Fb.

Инъекция смеси плазмид для редактирования не приводила к снижению выживаемости эмбрионов со сверхэкспрессией ^2. В результате нами получено по пять линий со встройкой репортерного гена т^етту как для делеции размером 6.7 т.п.н., так и 1.1 т.п.н.

Дополнительно мы протестировали данный подход на двух других генах, тер-1 и ^р2.

Белок МЕР-1 способствует привлечению комплекса ремоделирования хроматина и деацетили-рования гистонов (dNuRD) к значительному числу промоторов [9, 10]. Белок МЕР-1 является важным регулятором раннего развития дрозофилы, и инак-

тивация гена тер-1 приводит к эмбриональной летальности.

Как и в случае ^2, мы использовали две пары гРНК, производящих разрывы на расстоянии 5.6 и 2 т.п.н., для полноразмерной делеции и делеции только участка, содержащего старт-кодон, соответственно (рис. 2Б). Результаты, полученные при использовании разных схем замены гена тер-1 с помощью CRISPR/Cas9, представлены в табл. 1.

При инъекции смеси плазмид для редактирования мухи без сверхэкспрессии тер-1 имеют средний уровень летальности в течение развития. После индивидуальных скрещиваний мух F0 получена одна линия для полноразмерной делеции при использовании эмбрионов мух дикого типа и четыре линии на фоне сверхэкспрессии МЕР-1. Таким образом, делеция тер-1 не является полностью летальной, однако, поскольку его сверхэкспрессия при де-леции увеличивает выживаемость инъецированных эмбрионов, наблюдается увеличение эффективности редактирования.

Топоизомераза 2 (Тор2) - фермент, снимающий топологическое напряжение с молекулы ДНК и способствующий поддержанию стабильности генома, участвует в ключевых клеточных процессах, таких, как репликация, транскрипция, рекомбинация [11].

Для замены участка гена ^р2 на посадочную платформу были выбраны гРНК на расстоянии 2 т.п.н. в интроне 5'-нетранслируемой области и эк-зоне 3. Смесь векторов для замены гена на платформу инъецировали в эмбрионы линии у^1118.

В потомстве от индивидуальных скрещиваний мух F0 с мухами дикого типа трансформантов не обнаружено. Однако при редактировании после встройки последовательности, кодирующей Тор2, в локус 86Fb получены три линии (табл. 1).

Использование Cas9 для редактирования генома часто приводит к возникновению дополнительных мутаций в других генах. В этом случае экспрессия ГИ на другой хромосоме позволяет оценить наличие дополнительных нецелевых мутаций в линии, гомозиготной по делеции ГИ. С помощью такого скрининга можно отобрать линии дрозофилы, которые не содержат дополнительных нецелевых мутаций.

Полученные линии Д£г/2, Дтер-1 или \top2 ле-тальны в гомозиготном состоянии без дополнитель-

ной введенной копии ГИ, что свидетельствует о необходимости продуктов этих генов для выживания и дает первичное подтверждение успешной замены гена на айР-платформу. Встройка восстанавливающих конструкций (кодирующих нативные варианты генов) в линии с соответствующими посадочными платформами с дальнейшим удалением репортер-ных генов приводила к восстановлению жизнеспособности мух в гомозиготном состоянии. Таким образом, получены платформы для трех генов дрозофилы, которые позволяют детально исследовать ключевые белки TRF2, Тор2 и МЕР-1.

Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, грант № 19-74-30026.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Smits A.H., Ziebell F., Joberty G., Zinn N., Mueller W.F., Clauder-Münster S., Eberhard D., Fälth Savitski M., Grandi P., Jakob P., et al. // Nat. Methods. 2019. V. 16. № 11.

P. 1087-1093.

2. Wang B., Wang Z., Wang D., Zhang B., Ong S.G., Li M., Yu W., Wang Y. // J. Biol. Eng. BioMed Central. 2019. V. 13. № 1. P. 35.

3. Gratz S.J., Ukken F.P., Rubinstein C.D., Thiede G., Donohue L.K., Cummings A.M., O'Connor-Giles K.M. // Genetics. 2014. V. 196. № 4. P. 961-971.

4. Zolotarev N., Georgiev P., Maksimenko O. // Biotechniques. Future Science. 2019. V. 66. № 4. P. 198-201.

5. Bischof J., Maeda R.K., Hediger M., Karch F., Basler K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. № 9. P. 3312-3317.

6. Kedmi A., Zehavi Y., Glick Y., Orenstein Y., Ideses D.,

Wachtel C., Doniger T., Waldman Ben-Asher H., Muster N., Thompson J., et al. // Genes Dev. 2014. V. 28. № 19. P. 2163-2174.

7. Duttke S.H.C. // Trends Biochem. Sci. 2015. V. 40. № 3. P. 127-129.

8. Osadchiy I.S., Georgiev P.G., Maksimenko O.G. // Dokl. Biochem. Biophys. 2019. V. 486. № 1. P. 224-228.

9. Reddy B.A., Bajpe P.K., Bassett A., Moshkin Y.M., Kozhevnikova E., Bezstarosti K., Demmers J.A., Travers A.A., Verrijzer C.P. // Mol. Cell. Biol. Am. Soc. Microbiol. 2010. V. 30. № 21. P. 5234-5244.

10. Kunert N., Wagner E., Murawska M., Klinker H., Kremmer E., Brehm A. // EMBO J. 2009. V. 28. № 5. P. 533-544.

11. Sutormin D.A., Galivondzhyan A.K., Polkhovskiy A.V., Kamalyan S.O., Severinov K.V., Dubiley S.A. // Acta Naturae. 2021. V. 13. № 1. P. 59-75.