Способы и композиции для редактирования генома

1. Способ редактирования генома в клетке-мишени, включающий:
(a) получение двухцепочечных разрывов со ступенчатыми концами в двух локализациях в геноме клетки-мишени, таким образом, получение первого геномного ступенчатого конца и второго геномного ступенчатого конца; и
(b) введение в клетку-мишень линейной двухцепочечной донорной ДНК, имеющей выступающий 5’- или 3’-конец на каждом конце,
где один конец донорной ДНК гибридизуется с первым геномным ступенчатым концом, и другой конец донорной ДНК гибридизуется со вторым геномным ступенчатым концом, таким образом, приводя к вставке линейной двухцепочечной донорной ДНК в геном клетки-мишени.
2. Способ по п. 1, где по меньшей мере один конец донорной ДНК имеет выступающий 5’-конец, и по меньшей мере один из геномных ступенчатых концов имеет выступающий 5’-конец.
3. Способ по п. 1 или 2, где по меньшей мере один конец донорной ДНК имеет выступающий 3’-конец, и по меньшей мере один из геномных ступенчатых концов имеет выступающий 3’-конец.
4. Способ по любому из пп. 1-3, где указанное получение включает введение одной или более специфических для последовательности нуклеаз, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более специфических для последовательности нуклеаз, в клетку-мишень для получения указанных двухцепочечных разрезов.
5. Способ по п. 4, где одна или более специфических для последовательности нуклеаз содержит по меньшей мере одну из: мегануклеазы, эндонуклеазы хоминга, нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN) и подобной активатору транскрипции эффекторной нуклеазы (TALEN).
6. Способ по п. 4, где одна или более специфических для последовательности нуклеаз содержит образующий ступенчатый концевой разрез эффекторный белок CRISPR/Cas.
7. Способ по п. 6, где указанное получение дополнительно включает введение направляющей нуклеиновой кислоты CRISPR/Cas, или нуклеиновой кислоты, кодирующей направляющую нуклеиновую кислоту CRISPR/Cas, в клетку.
8. Способ по любому из пп. 4-7, включающий введение в клетку, как нагрузок одного и того же носителя для доставки: (i) одной или более специфических для последовательности нуклеаз, или одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих одну или более специфических для последовательности нуклеаз, и (ii) линейной двухцепочечной донорной ДНК.
9. Способ по п. 8, где одну или более специфических для последовательности нуклеаз и линейную двухцепочечную донорную ДНК вводят в клетку в форме дезоксирибонуклеопротеинового комплекса или рибо-дезоксирибонуклеопротеинового комплекса.
10. Способ по п. 8 или 9, где в ходе указанного введения, концы донорной ДНК связываются сайт-специфическим образом с одной или более специфическими для последовательности нуклеазами.
11. Способ по любому из пп. 8-10, где носитель для доставки является невирусным.
12. Способ по любому из пп. 8-11, где носитель для доставки представляет собой наночастицу.
13. Способ по п. 12, где в дополнение к (i) и (ii), наночастица содержит кор, содержащий композицию анионного полимера, композицию катионного полимера и композицию катионного полипептида.
14. Способ по п. 13, где указанная композиция анионного полимера содержит анионный полимер, выбранный из поли(глутаминовой кислоты) и поли(аспарагиновой кислоты).
15. Способ по п. 13 или 14, где указанная композиция катионного полимера содержит катионный полимер, выбранный из поли(аргинина), поли(лизина), поли(гистидина), поли(орнитина) и поли(цитруллина).
16. Способ по любому из пп. 13-15, где наночастица дополнительно содержит слущивающийся слой, инкапсулирующий кор.
17. Способ по п. 16, где слущивающийся слой представляет собой анионное покрытие или катионное покрытие.
18. Способ по п. 16 или 17, где слущивающийся слой включает одно или более из: силиката, пептоида, полицистеина, кальция, оксида кальция, гидроксиапатита, фосфата кальция, сульфата кальция, марганца, оксида марганца, фосфата марганца, сульфата марганца, магния, оксида магния, фосфата магния, сульфата магния, железа, оксида железа, фосфата железа и сульфата железа.
19. Способ по любому из пп. 16-18, где наночастица дополнительно содержит поверхностное покрытие, окружающее слущивающийся слой.
20. Способ по п. 19, где поверхностное покрытие содержит катионный или анионный заякоривающий домен, который взаимодействует электростатически со слущивающимся слоем.
21. Способ по п. 19 или 20, где поверхностное покрытие содержит один или более нацеливающих лигандов.
22. Способ по п. 19 или 20, где поверхностное покрытие содержит один или более нацеливающих лигандов, выбранных из группы, состоящей из: фрагмента гликопротеина вируса бешенства (RVG), ApoE-трансферрина, лактоферрина, меланоферритина, овотрансферритина, L-селектина, E-селектина, P-селектина, сиалированных пептидов, полисиалированных O-связанных пептидов, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, рецептора смерти-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, фактора стволовых клеток (SCF), CD70, содержащего домен SH2 белка 1A (SH2D1A), эксендина, эксендина-S11C, GLP1, RGD, лиганда трансферрина, фрагмента FGF, лиганда α5β1, IL2, Cde3-эпсилон, пептида-HLA-A*2402, CD80, CD86, янтарной кислоты, бисфосфоната, хемотактического липида гематопоэтической стволовой клетки, сфингозина, церамида, сфингозин-1-фосфата, церамид-1-фосфата и активного нацеливающего фрагмента любого из вышеуказанных.
23. Способ по п. 19 или 20, где поверхностное покрытие содержит один или более нацеливающих лигандов, обеспечивающих нацеленное связывание с мишенью, выбранной из: CD3, CD8, CD4, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD3-эпсилон, CD3-гамма, CD3-дельта; константных областей TCR-альфа, TCR-бета, TCR-гамма и/или TCR-дельта; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL2R, IL7R, IL10R, IL12R, IL15R, IL18R, TNFα, IFNγ, TGF-β и α5β1.
24. Способ по п. 19 или 20, где поверхностное покрытие содержит один или более нацеливающих лигандов, обеспечивающих нацеленное связывание с клетками-мишенями, выбранными из: клеток костного мозга, гематопоэтических стволовых клеток (HSC), гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC), мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), миелоидных клеток-предшественников, лимфоидных клеток-предшественникиов, T-клеток, B-клеток, клеток NKT, клеток NK, дендритных клеток, моноцитов, гранулоцитов, эритроцитов, мегакариоцитов, тучных клеток, базофилов, эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, эритроидных клеток-предшественников, мегакариоцитарно-эритроидных клеток-предшественников (MEP), общих миелоидных клеток-предшественников (CMP), мультипотентых клеток-предшественников (MPP), гематопоэтических стволовых клеток (HSC), короткоживущих HSC (ST-HSC), IT-HSC, долгоживущих HSC (LT-HSC), эндотелиальных клеток, нейронов, астроцитов, клеток поджелудочной железы, клеток β-островков поджелудочной железы, клеток печени, клеток мышц, клеток скелетных мышц, клеток сердечной мышцы, гепатоцитов, жировых клеток, клеток кишечника, клеток ободочной кишки и клеток желудка.
25. Способ по любому из пп. 8-10, где носитель для доставки представляет собой нацеливающий лиганд, конъюгированный с нагрузкой, где нацеливающий лиганд обеспечивает нацеленное связывание с белком поверхности клетки.
26. Способ по любому из пп. 8-10, где носитель для доставки представляет собой нацеливающий лиганд, конъюгированный с заряженным полимерным полипептидным доменом, где нацеливающий лиганд обеспечивает нацеленное связывание с белком поверхности клетки, и где заряженный полимерный полипептидный домен является конденсированным с нагрузкой нуклеиновой кислоты и/или является взаимодействующим электростатически с нагрузкой белка.
27. Способ по п. 25 или 26, где нацеливающий лиганд представляет собой пептид, ScFv, F(ab), аптамер нуклеиновой кислоты или пептоид.
28. Способ по п. 26, где заряженный полимерный полипептидный домен имеет длину в диапазоне от 3 до 30 аминокислот.
29. Способ по любому из пп. 26-28, где носитель для доставки дополнительно содержит анионный полимер, взаимодействующий с нагрузкой и заряженным полимерным полипептидным доменом.
30. Способ по п. 29, где анионный полимер выбран из поли(глутаминовой кислоты) и поли(аспарагиновой кислоты).
31. Способ по любому из пп. 25-30, где нацеливающий лиганд имеет длину от 5 до 50 аминокислот.
32. Способ по любому из пп. 25-31, где нацеливающий лиганд обеспечивает нацеленное связывание с белком поверхности клетки, выбранным из сопряженного с G-белком рецептора (GPCR) семейства B, рецепторной тирозинкиназы (RTK), гликопротеина поверхности клетки и молекулы межклеточной адгезии.
33. Способ по любому из пп. 25-31, где нацеливающий лиганд выбран из группы, состоящей из: фрагмента гликопротеина вируса бешенства (RVG), ApoE-трансферрина, лактоферрина, меланоферритина, овотрансферритина, L-селектина, E-селектина, P-селектина, сиалированных пептидов, полисиалированных O-связанных пептидов, TPO, EPO, PSGL-1, ESL-1, CD44, рецептора смерти-3 (DR3), LAMP1, LAMP2, Mac2-BP, фактора стволовых клеток (SCF), CD70, содержащего домен SH2 белка 1A (SH2D1A), эксендина, эксендина-S11C, GLP1, RGD, лиганда трансферрина, фрагмента FGF, лиганда α5β1, IL2, Cde3-эпсилон, пептида-HLA-A*2402, CD80, CD86, янтарной кислоты, бисфосфоната, хемотактического липида гематопоэтической стволовой клетки, сфингозина, церамида, сфингозин-1-фосфата, церамид-1-фосфата и активного нацеливающего фрагмента любого из вышеуказанных.
34. Способ по любому из пп. 25-31, где нацеливающий лиганд обеспечивает нацеленное связывание с мишенью, выбранной из: CD3, CD8, CD4, CD28, CD90, CD45f, CD34, CD80, CD86, CD3-эпсилон, CD3-гамма, CD3-дельта; константных областей TCR-альфа, TCR-бета, TCR-гамма и/или TCR-дельта; 4-1BB, OX40, OX40L, CD62L, ARP5, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR3, CXCR4, CD94/NKG2, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2H, NKG2D, NKG2F, NKp44, NKp46, NKp30, DNAM, XCR1, XCL1, XCL2, ILT, LIR, Ly49, IL2R, IL7R, IL10R, IL12R, IL15R, IL18R, TNFα, IFNγ, TGF-β и α5β1.
35. Способ по любому из пп. 25-31, где нацеливающий лиганд обеспечивает связывание с типом клеток, выбранным из группы, состоящей из: клеток костного мозга, гематопоэтических стволовых клеток (HSC), долгоживущих HSC, короткоживущих HSC, гематопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников (HSPC), мононуклеарныхе клеток периферической крови (PBMC), миелоидных клеток-предшественников, лимфоидных клеток-предшественников, T-клеток, B-клеток, клеток NKT, клеток NK, дендритных клеток, моноцитов, гранулоцитов, эритроцитов, мегакариоцитовs, тучных клеток, базофилов, эозинофилов, нейтрофилов, макрофагов, эритроидных клеток-предшественников (например, клеток HUDEP), мегакариоцитарно-эритроидных клеток-предшественников (MEP), общих миелоидных клеток-предшественников (CMP), мультипотентых клеток-предшественников (MPP), гематопоэтических стволовых клеток (HSC), короткоживущих HSC (ST-HSC), IT-HSC, долгоживущих HSC (LT-HSC), эндотелиальных клеток, нейронов, астроцитов, клеток поджелудочной железы, клеток β-островков поджелудочной железы, клеток мышц, клеток скелетных мышц, клеток сердечной мышцы, гепатоцитов, жировых клеток, клеток кишечника, клеток ободочной кишки и клеток желудка.
36. Способ по любому из пп. 1-35, где, перед получением двухцепочечных разрезов в указанных двух локализациях в геноме клетки-мишени, две локализации отделены 1000000 парами оснований или менее.
37. Способ по любому из пп. 1-35, где, перед получением двухцепочечных разрезов в указанных двух локализациях в геноме клетки-мишени, две локализации отделены 100000 парами оснований или менее.
38. Способ по любому из пп. 1-35, где первый и второй геномные ступенчатые концы получены в локусе TCR альфа или в локусе TCR бета.
39. Способ по любому из пп. 1-35, где по меньшей мере один из первого и второго геномных ступенчатых концов получен (1) с использованием одной или более из последовательностей направляющей РНК (нРНК) CRISPR/Cas, изображенных на фигуре 59, и/или (2) посредством нацеливания на одну или более из последовательностей для TALEN, изображенных на фигуре 59.
40. Способ по любому из пп. 1-35, где донорная ДНК имеет всего от 10 пар оснований (п.о.) до 100 тысяч пар оснований (т.п.о.).
41. Способ по любому из пп. 1-40, где вставка донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей белок T-клеточный рецептор (TCR).
42. Способ по п.41, где донорная ДНК кодирует аминокислоты области CDR1, CDR2 или CDR3 белка TCR.
43. Способ по любому из пп. 1-40, где донорная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую химерный рецептор антигена (CAR), и где вставка указанной донорной ДНК приводит к функциональной связи нуклеотидной последовательности, кодирующей CAR, с эндогенным промотором T-клетки.
44. Способ по любому из пп. 1-40, где донорная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором и кодирующую химерный рецептор антигена (CAR).
45. Способ по любому из пп. 1-40, где донорная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую специфический для клеток нацеливающий лиганд, который является связанным с мембраной и представленным вне клеток, и где вставка указанной донорной ДНК приводит к функциональной связи нуклеотидной последовательности, кодирующей специфический для клеток нацеливающий лиганд, с эндогенным промотором.
46. Способ по любому из пп. 1-40, где донорная ДНК содержит промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей специфический для клеток нацеливающий лиганд, который является связанным с мембраной и представленным вне клеток.
47. Способ по любому из пп. 1-40, включающий
получение двухцепочечных разрывов со ступенчатыми концами в четырех локализациях в геноме клетки-мишени, таким образом, получение третьего геномного ступенчатого конца и четвертого геномного ступенчатого конца, в дополнение к первому и второму геномным ступенчатым концам; и
введение двух линейных двухцепочечных донорных ДНК, каждая из которых имеет выступающий 5’- или 3’-конец на каждом конце,
где концы одной донорной ДНК гибридизуются с первым и вторым геномными ступенчатыми концами, и концы другой донорной ДНК гибридизуются с третьим и четвертым геномными ступенчатыми концами,
таким образом, приводя к вставке указанных двух донорных ДНК в геном клетки-мишени.
48. Способ по п. 47, где
(1) вставка одной донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей субъединицу альфа или дельта T-клеточного рецептора (TCR), и вставка другой донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей субъединицу бета или гамма TCR; или
(2) вставка одной донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей субъединицу альфа или гамма T-клеточного рецептора (TCR), и вставка другой донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей субъединицу бета или дельта TCR; или
(3) вставка одной донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей цепь κ белка IgA, IgD, IgE, IgG или IgM, и вставка другой донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей цепь λ белка IgA, IgD, IgE, IgG или IgM.
49. Способ по п. 47, где вставка одной донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей константную область субъединицы альфа или дельта T-клеточного рецептора (TCR), и вставка другой донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, кодирующей константную область субъединицы бета или гамма TCR.
50. Способ по п. 47, где
(1) вставка одной донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, которая функционирует как промотор субъединицы альфа или дельта T-клеточного рецептора (TCR), и вставка другой донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, которая функционирует как промотор субъединицы бета или гамма TCR; или
(2) вставка одной донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, которая функционирует как промотор субъединицы альфа или гамма T-клеточного рецептора (TCR), и вставка другой донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, которая функционирует как промотор субъединицы бета или дельта TCR; или
(3) вставка одной донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, которая функционирует как промотор для цепи κ белка IgA, IgD, IgE, IgG или IgM, и вставка другой донорной ДНК возникает в пределах нуклеотидной последовательности, которая функционирует как промотор для цепи λ белка IgA, IgD, IgE, IgG или IgM.
51. Способ по любому из пп. 1-50, где вставка указанной донорной ДНК приводит к функциональной связи вставленной донорной ДНК с эндогенным промотором T-клеточного рецептора (TCR) альфа, бета, гамма или дельта.
52. Способ по любому из пп. 1-50, где донорная ДНК содержит кодирующую белок нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором TCR альфа, бета, гамма или дельта.
53. Способ по любому из пп. 1-50, где вставка указанной донорной ДНК приводит к функциональной связи вставленной донорной ДНК с промотором, выбранным из группы, состоящей из: (i) специфического для T-клетки промотора; (ii) промотора CD3; (iii) промотора CD28; (iv) специфического для стволовой клетки промотора; (v) специфического для соматической клетки промотора; (vi) промотора T-клеточного рецептора (TCR) альфа, бета, гамма или дельта; (v) специфического для B-клетки промотора; (vi) промотора CD19; (vii) промотора CD20; (viii) промотора CD22; (ix) промотора B29; и (x) специфического для V(D)J T-клетки или B-клетки промотора.
54. Способ по любому из пп. 1-50, где донорная ДНК содержит кодирующую белок нуклеотидную последовательность, функционально связанную со специфическим для T-клетки промотором.
55. Способ по любому из пп. 1-50, где донорная ДНК содержит кодирующую белок нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором.
56. Способ по любому из пп. 1-50, где вставка указанной донорной ДНК приводит к функциональной связи вставленной донорной ДНК со специфическим для стволовой клетки или специфическим для соматической клетки эндогенным промотором.
57. Способ по любому из пп. 1-56, где донорная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую репортерный белок (например, репортерный белок для ближней ИК-области спектра и/или дальней ИК-области спектра, например, для оценки эффективности редактирования генов).
58. Способ по п. 57, где вставка указанной донорной ДНК приводит к функциональной связи вставленной донорной ДНК с эндогенным промотором.
59. Способ по п. 57, где донорная ДНК содержит промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей репортерный белок.
60. Способ по любому из пп. 1-59, где донорная ДНК содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую (i) белок T-клеточный рецептор (TCR); (ii) белок IgA, IgD, IgE, IgG или IgM; или (iii) цепи κ или λ белка IgA, IgD, IgE, IgG или IgM.
61. Способ по любому из пп. 1-60, где донорная ДНК содержит кодирующую белок нуклеотидную последовательность, не имеющую интронов.
62. Способ по п.61, где нуклеотидная последовательность, не имеющая интронов, кодирует весь или часть белка TCR или иммуноглобулина.
63. Способ по любому из пп. 1-62, где донорная ДНК имеет по меньшей мере один аденилированный 3’-конец.
64. Способ по любому из пп. 1-63, где клетка-мишень представляет собой клетку млекопитающего.
65. Способ по любому из пп. 1-64, где клетка-мишень представляет собой клетку человека.
66. Набор или композиция содержащие
(a) линейную двухцепочечную донорную ДНК, имеющую выступающий 5’- или 3’-конец на каждом конце; и
(b) специфическую для последовательности нуклеазу или нуклеиновую кислоту, кодирующую специфические для последовательности нуклеазы,
где (a) и (b) представляют собой нагрузки как часть одного и того же носителя для доставки.
67. Набор или композиция по п. 66, где носитель для доставки представляет собой наночастицу.
68. Набор или композиция по п. 67, где наночастица содержит кор, содержащий (a), (b), композицию анионного полимера, композицию катионного полимера и композицию катионного полипептида.
69. Набор или композиция по п. 67 или 68, где наночастица содержит нацеливающий лиганд, который нацеливает наночастицу на белок поверхности клетки.
70. Набор или композиция по любому из пп. 66-69, где линейный двухцепочечный донор и специфическая для последовательности нуклеаза связываются друг с другом, формируя дезоксирибонуклеопротеиновый или рибо-дезоксирибонуклеопротеиновый комплекс.
71. Набор или композиция по любому из пп. 66-70, где носитель для доставки представляет собой нацеливающий лиганд, конъюгированный с заряженным полимерным полипептидным доменом, где нацеливающий лиганд обеспечивает нацеленное связывание с белком поверхности клетки, и где заряженный полимерный полипептидный домен является взаимодействующим электростатически с нагрузками.
72. Набор или композиция по п. 71, где носитель для доставки дополнительно содержит анионный полимер, взаимодействующий с нагрузкой и заряженным полимерным полипептидным доменом.
73. Набор или композиция по любому из пп. 66-70, где носитель для доставки представляет собой нацеливающий лиганд, конъюгированный с (a) и/или (b), где нацеливающий лиганд обеспечивает нацеленное связывание с белком поверхности клетки.
74. Набор или композиция по любому из пп. 69-73, где белок поверхности клетки представляет собой CD47.
75. Набор или композиция по п. 74, где нацеливающий лиганд представляет собой миметик белка SIRPα.
76. Набор или композиция по любому из пп. 69-75, где носитель для доставки дополнительно содержит запускающий эндоцитоз лиганд.
77. Набор или композиция по любому из пп. 66-70, где носитель для доставки включает нацеливающий лиганд, покрытый поверх эмульсионной частицы вода-масло-вода, поверх эмульсионной мицеллярной частицы масло-вода, поверх многослойной эмульсионной частицы вода-масло-вода, поверх многослойной частицы или поверх ДНК-оригами-нанобота.
78. Способ по любому из пп. 69-74, где нацеливающий лиганд представляет собой пептид, ScFv, F(ab), аптамер нуклеиновой кислоты или пептоид.
79. Набор или композиция по любому из пп. 66-70, где носитель для доставки является невирусным.