Способ создания биологической модели системного ювенильного идиопатического артрита в эксперименте
METHOD FOR CREATION BIOLOGICAL MODEL OF SYSTEMIC JUVENILE IDIOPATHIC ARTHRITIS IN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальному моделированию патологических реакций, процессов, состояний и болезней.
Выделяемые формы ювенильного идиопатического артрита (ЮИА) (классификация Durban, 1977) описываются в литературе по-разному. В частности, системная форма ЮИА (сЮИА), осложняемая «синдромом активации макрофагов» (симптомокомплекс, включающий лихорадку, расстройства гемостаза, лимфаденопатию, гепатоспленомегалию и дисфункцию центральной нервной системы), рассматривается многими авторами в последнее время как аутовоспалительное заболевание [Sikora K.А., Grom А.А. Curr Opin Pediatr. 2011; 23 (6): 640-646]. Последний факт исключает использование модели коллаген-индуцированного артрита и его модификаций (в т.ч. с использованием липополисахарида) для изучения артрита с характерными системными проявлениями на крысах линии Wistar, т.к. коллаген-индуцированный артрит связан с выработкой аутоантител и является аутоиммунной, а не аутовоспалительной формой патологии.
При этом традиционное определение «синдром активации макрофагов» на основании результатов современных исследований в области перепрограммирования макрофагов, по всей видимости, представляет собой именно дисбаланс фенотипов макрофагов с преобладанием чрезмерных эффектов M1 фенотипа при некоторой неоднозначности существующих результатов исследований. Основанием этому выводу является факт того, что главную роль при сЮИА играют γ-интерферон, гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкины (ИЛ) 6 и 1, фактор некроза опухолей (ФНО) α. Также подчеркивается, что при определенных формах ЮИА значимую роль играет Th1 иммунный ответ [Алексеева Е.И., Литвицкий П.Ф., 2007], в который интегрированы макрофаги M1 фенотипа.
Для системной формы ЮИА продемонстрированы относительно слабые ассоциации с полиморфизмом генов главного комплекса гистосовместимости. В то же время, обусловленные полиморфизмом генов изменения выработки ИЛ 10 способны оказывать влияние на частоту развития заболевания - при снижении ИЛ 10 - повышая ее, а при увеличении ИЛ 10 - снижая. Роль приобретенного иммунитета при системной форме ЮИА ограничена. В отличие от этого, роль врожденного иммунитета оказалась ведущей. Так, целым рядом исследований показано вовлечение факторов врожденного иммунитета: ИЛ 6, TLR/IL-1 рецептора, рецептора, активируемого пролифераторами пероксисом (PPAR-γ), и его сигнального пути [Sikora K.А., Grom А.А. Curr Opin Pediatr. 2011; 23 (6): 640-646].
С учетом вышеизложенного очевидно, что с ЮИА, а в особенности его осложнение - «синдром активации макрофагов» (как и фатальные исходы при нем), могут управляться путем перепрограммирования макрофагов M1 и М2 in vivo.
При этом считается, что иммуногенные и гистопатологические изменения при адъювантном артрите у крыс (АА) напоминают таковые при ревматоидном артрите и ЮИА [Vercoulen Y. et al. Arthritis Research & Therapy. 2009; 11: 231]. В то же время имеются данные о сходстве отдельных звеньев патогенеза АА с таковыми при реактивном артрите [Van Eden W., Waksman B.H. Arthritis Rheum. 2003; 48 (7): 1788-1796]. Учитывая важную роль при воздействии адъюванта Фрейнда в активации механизмов врожденного звена иммунитета (макрофагов), а также факта использования АА у животных в качестве модели ЮИА именно эта модель представлялась наиболее адекватной из существующих к ювенильному идиопатическому артриту.
Существует очень большое число вариантов введения адъюванта Фрейнда в части частоты, дозировки и способа его введения в организм. Общим является способ введения - внутрикожный или внутрисуставной. Наиболее часто используется внутрикожное введение адъюванта Фрейнда в основание хвоста. Из суставов-мишеней преобладают коленный (tibiofemoral joint) и голеностопный (tibiotarsal joint) [Gomes R.P. et al. Einstein. 2013; 11 (1): 76-82].
Одно из первых описаний биологической модели адъювантного артрита принадлежит Pearson С.М. [Pearson С.М. Proc Soc Exp Biol Med. 1956; 91 (1): 95-101] и Newbould B.B. [Newbould B.B. Br J Pharmacol Chemother. 1963; 21: 127-36].
Традиционно ювенильный артрит (как артрит вообще) моделируется на крысах (адъювантный артрит) или собаках [Holm I.E.,  С., Melsen F. A histomorphometric analysis of subchondral bone in juvenile arthropathy of the dog knee. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand A. 1985; 93(6): 299-304; Bunger C., Bunger E.H., Harving S., Djurhuus J.C., Jensen O.M. Growth disturbances in experimental juvenile arthritis of the dog knee. Clin Rheumatol. 1984; 3(2): 181-8.;  C., Hjermind J., Bach P.,  E.H., Myhre-Jensen O. Haemodynamics in acute arthritis of the knee in puppies. Acta Orthop Scand. 1984; 55(2): 197-202.]. В то же время использование этой модели именно для изучения патогенеза артрита с характерными системными проявлениями у человека патогенетически не обосновано.
Известны модели адъювантного артрита, позволяющие получить более выраженные проявления артрита (SU 764661 A1, RU 2351021 С1), однако использовать указанные модели для изучения механизмов и роли активации макрофагов при артритах с характерными системными проявлениями у человека нельзя. Это объясняется тем, что в приведенных выше патентах для моделирования артрита применяли ферментные препараты, вызывающие дезорганизацию межклеточного матрикса (с целью повышения биодоступности используемых для моделирования веществ и облегчения миграции лейкоцитов в зону введения агентов для инициирования артрита), чего не наблюдается при естественном развитии артрита с характерными системными проявлениями у человека. К тому же, дезорганизация межклеточного матрикса сама по себе способна существенно изменить течение патологического процесса: доказано, что не только химические, но и физические факторы, такие, как измененная трехмерная структура волокон межклеточного матрикса, способна изменять фенотип макрофагов, в частности нарушение архитектоники межклеточного матрикса, приводит к альтернативной активации макрофагов М2 фенотипа [Mc Whorter F.Y., Wang Т., Nguyen P., Liu W.F. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110 (43): 17253-8].
Задача изобретения - создание простой и надежной по воспроизведению модели ювенильного идиопатического артрита с характерными системными проявлениями в эксперименте на животных.
Технический результат состоит в максимальном соответствии предлагаемой модели артриту с системными изменениями в организме у человека.
Поставленная задача решается способом создания биологической модели системного ювенильного идиопатического артрита в эксперименте, заключающимся во внутрикожном введении 8-месячным крысам самцам линии Wistar в подошву правой задней лапы в 0 сутки 0,1 мл раствора полного адъюванта Фрейнда (5 мг/мл) и одновременного внутрибрюшинного введения раствора липополисахарида (ЛПС) из расчета 5 мкг/кг массы животного с последующим повторным внутрибрюшинным введением раствора ЛПС на 18 сутки из расчета 10 мкг/кг массы животного, повторного внутрикожного введения в подошву левой задней лапы 0,1 мл раствора полного адъюванта Фрейнда (5 мг/мл) на 39 сутки и одновременного внутрибрюшинного введения раствора ЛПС по 10 мкг каждому животному.
Способ осуществляют следующим образом: в 0 сутки интактным крысам самцам линии Wistar в возрасте 8 месяцев вводят внутрикожно в правую заднюю лапу (подошву) 0,1 мл раствора полного адъюванта Фрейнда (5 мг/мл, DIFCO LABORATORIES, Michigan, USA) и сразу после этого - внутрибрюшинно раствор липополисахарида (Пирогенал, 10 мкг/мл, Медгамал - филиал ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия) из расчета 5 мкг/кг массы тела животного.
Внутрибрюшинное введение липополисахарида (ЛПС) повторяют на 18 сутки (из расчета 10 мкг/кг массы тела животного). В контроле вместо ЛПС вводят эквивалентные объемы физиологического раствора хлорида натрия 0,9% (ОАО «Борисовский завод медицинских препаратов», Республика Беларусь, г. Борисов).
На 39 сутки моделируют дополнительную активацию системы иммунобиологического надзора тех же крыс путем повторного введения (теперь в левую заднюю лапу) 0,1 мл раствора полного адъюванта Фрейнда (5 мг/мл, DIFCO LABORATORIES, Michigan, USA). Сразу после этого внутрибрюшинно вводят раствор липополисахарида (Пирогенал, 10 мкг/мл, Медгамал - филиал ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия) из расчета 10 мкг каждому животному.
Статистически достоверное (р<0,05) повышение локальной температуры над плюсневыми суставами задних конечностей (в группе ЛПС + адъювант Фрейнда по сравнению с температурой в группе адъюванта) было выявлено сразу после введения ЛПС и сохранялось как минимум пять суток. При этом стоит отметить, что на 42 сутки были отмечены достоверные различия температур (р=0,019) и между задними лапами животных в группе ЛПС + адъювант. Это позволяет связать повышение температуры не только с пирогенным эффектом ЛПС, а именно с активностью процесса воспаления в области суставов.
Оценка динамики изменения горизонтальных диаметров плюсневых суставов задних конечностей показала, что также на протяжении как минимум 5 суток исследования (после 39 суток) горизонтальные диаметры плюсневых суставов левых задних конечностей были достоверно больше (р<0,05) увеличены в группе ЛПС + адъювант. В другие сутки наблюдения горизонтальные диаметры плюсневых суставов левых задних конечностей достоверно не отличались от таковых у крыс только с введением в кожу стопы адъюванта Фрейнда (р>0,05), однако эти размеры всегда были больше по абсолютному значению).
Выраженность боли с 39 суток (оценка производилась по методике Darvish S.F. et al. PLoS One. 2013; 8 (11): e79284, Bush K.A., Kirkham B.W., Walker J.S. Rheumatology (Oxford). 2001; 40 (9): 1013-1021): при этом 0 означал нормальное передвижение животного по клетке, 1 - небольшая хромота при движении, 2 - хромота и перемещение крысы только с опорой на мыски (weight bearing on toes only), 3 - невозможность перемещения животного). Более высокая выраженность показателей боли с 39 суток статистически достоверно чаще определялась в группе животных с введением ЛПС + адъювант, р<0,05.
Показатели оценки выраженности артрита с 39 суток (оценивали по методике Darvish S.F. et al. PLoS One. 2013; 8 (11): e79284: 0 - означал отсутствие признаков воспаления, 1 - наличие отека и/или эритемы пальцев, 2 - наличие отека и/или эритемы не только пальцев, но не всей конечности, 3 - отек и эритема всей конечности, 4 - сильный отек, эритема, грубые деформации пястных/плюсневых суставов и расстройства движения всей конечности в целом). Большая выраженность артрита с 39 суток статистически достоверно чаще определялась в группе животных с введением ЛПС + адъювант, р<0,05.
Таким образом, разработанная биологическая модель сЮИА в эксперименте у крыс линии Wistar является простой и надежной по воспроизведению, не требует затратного материального обеспечения.
Разработанная биологическая модель артрита с характерными системными проявлениями у крыс линии Wistar максимально приближена, в отличие от существующих моделей, к системной форме ювенильного идиопатического артрита у человека.