СПОСОБ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, СОДЕРЖАЩИХ ЛАКТОБАКТЕРИИ И/ИЛИ БИФИДОБАКТЕРИИ, В ОТНОШЕНИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА
METHOD OF INDIVIDUAL DETECTION OF ANTAGONISTIC ACTIVITY OF PROBIOTIC PREPARATIONS, CONTAINING LACTOBACTERIA AND/OR BIFIDOBACTERIA WITH RESPECT TO OPPORTUNISTIC MICROORGANISMS, ISOLATED DURING DIAGNOSTICS OF INTESTINAL DYSBACTERIOSIS

Изобретение относится к области медицины, а именно к микробиологии и может использоваться в бактериологических лабораториях для выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии в отношении условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника у конкретного пациента.
Существуют 2 основные методики для выявления антагонистической активности пробиотических штаммов: 1) метод штрихов [1]; 2) метод двухслойного агара [2]. Кроме этого, описан метод перевернутого агара [3] и метод прямого совместного культивирования - капельная методика [4], которые широко не применяются.
При использовании метода штрихов по диаметру чашки Петри с питательной средой петлей наносят культуру штамма пробиотического препарата, инкубируют в течение двух суток при 37°С в анаэробных условиях, затем штрихом перпендикулярно выросшим культурам штаммов пробиотических препаратов подсевают тест-штаммы УПМ, инкубируют в аэробных условиях при 37°С, учет результатов проводят через 24 ч по величине зоны задержки роста тест-культур в мм. Контролем роста тест-культур служит параллельный посев на чашки с той же средой, но без пробиотических препаратов, в соответствии с требованиями к штаммам пробиотических препаратов зоны угнетения роста тест-культур должны составлять не менее 20 мм [1].
6
При использовании классического метода изучения антагонистической активности - метода двухслойного агара - в питательную среду вносят штамм пробиотического препарата в определенной концентрации, разливают в чашки Петри, а после застывания на поверхность нижнего слоя наливают второй слой питательной среды. Далее на поверхность верхнего слоя засевают тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов в концентрации 10 КОЕ/мл [2]. Снижение концентрации тест-штаммов в присутствии пробиотического препарата по сравнению с контролем без пробиотического препарата свидетельствует об антагонистической активности пробиотического препарата.
Для оценки взаимного влияния пробиотических препаратов и УПМ можно использовать метод прямого совместного культивирования на поверхности плотной питательной среды (капельная методика) [4]. Суточную культуру штамма пробиотического препарата наносят на поверхность питательной среды бактериологической петлей диаметром 3 мм. Посев оставляют при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносят каплю культуры тестируемого микроорганизма. Растекаясь, вторая капля затекает на пятно культуры штамма пробиотического препарата до половины диаметра. В той части, где произошло наложение капель, возникают конкурирующие отношения культур. Свободные части пятен каждой культуры служат контролем жизнеспособности каждой из культур и всхожести питательной среды. После подсыхания капель чашки инкубируют в анаэростате в микроаэрофильных условиях при 37°С. Наличие антагонизма выявляют визуально по наличию признаков подавления одной культуры другой.
Метод перевернутого агара описан для выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli, в отношении оппортунистических дрожжей [3]. Для этого штаммы Bacillus subtilis и Escherichia coli засевают газоном на плотную питательную среду, через 2 суток агар переворачивают и на его обратную сторону засевают предварительно оттитрованную посевную дозу дрожжей. Инкубируют 24 ч в аэробных условиях при 37°С. Наличие антагонизма выявляют по подавлению роста дрожжей по сравнению с аналогичным посевом без штаммов пробиотического препарата не менее чем на 1 порядок.
Одним из основных показателей качества пробиотических штаммов при выборе кандидатов для создания новых пробиотических препаратов является их антагонистическая активность, определяемая in vitro. Однако их антагонистическая активность в организме человека может быть обусловлена многими факторами: конкуренцией за рецепторы, выработкой биологически активных веществ, бактериоцинов и бактериоциноподобных веществ, лизоцима, молочной, уксусной и других кислот, перекиси водорода. Однако эти механизмы не универсальны для различных штаммов, входящих в состав пробиотических препаратов. Также неизвестно, какой из этих факторов оказывает решающее значение в подавлении тех или иных микроорганизмов. Поэтому выбор методики выявления антагонизма пробиотических культур обычно осуществляется разными авторами произвольно. Вероятно, каждая из предложенных методик не позволяет оценить всю совокупность факторов, влияющих на выраженность антагонизма, а выявляет какую-либо ее составляющую, при этом какую именно, определить не представляется возможным. Анализируя потенциальную эффективность методов определения антагонистической активности пробиотических препаратов, следует отметить ограниченные возможности каждого отдельно взятого способа.
Так, например, достоинством метода штрихов является его очевидная простота. Однако такой подход не позволяет определить мощность антагонистической активности, так как посев проводится не количественно. Кроме этого, эта методика эффективна при выявлении антагонистической активности в отношении патогенных микроорганизмов, по данным литературы [1]. Но при использовании тест-культур условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при дисбактериозе кишечника, выявляемость антагонистической активности, по собственным данным, крайне низкая (табл.1 - Антагонизм лакто- и бифидобактерий пробиотических препаратов в отношении условно-патогенных микроорганизмов (метод штрихов)). Возможно, это связано с тем, что условно-патогенные микроорганизмы приспособлены к сосуществованию с лакто- и бифидобактериями, и такие факторы антагонизма, как закисление среды в процессе культивирования, на них не действуют. Также, возможно, при перпендикулярном подсеве УПМ играет роль феномен «quorum sensing», не дающий реализовать пробиотическим штаммам свои антагонистические возможности.
6
Недостатком метода двухслойного агара, по мнению авторов заявляемого способа, является неудобство посева и учета полученного результата. Метод двухслойного агара требует подтитровки, так как посев тест-культур должен производиться с таким расчетом, чтобы после инкубации количество микроорганизмов было считабельным, т.е. не превышало бы 300 КОЕ на питательной среде. При проведении посева суспензии шпателем в количестве от 10 до 100 мкл с концентрацией микроорганизмов 10 КОЕ/мл, если в процессе инкубации количество микроорганизмов не уменьшится, это приведет к сложности (сплошной рост) и даже невозможности (зарост) учета результата. Это, безусловно, требует подтитровки и дополнительных исследований при тестировании каждого штамма. Подтитровка подразумевает приготовление дополнительных разведений и высев из каждого разведения на отдельную чашку с питательной средой, что влечет за собой дополнительный расход питательных сред и лабораторной посуды.
Кроме этого, по собственным данным, интенсивность антагонистического воздействия на условно-патогенные микроорганизмы при использовании метода двухслойного агара в большинстве случаев недостаточно интенсивна - происходит снижением УПМ на 1 порядок по сравнению с контролем - посевом тех же культур УПМ без пробиотического препарата (табл.2 - Различия в степени антагонистической активности пробиотических препаратов в отношении условно-патогенных микроорганизмов. Метод двухслойного агара). Данная степень подавления ничтожно мала для успешного применения пробиотического препарата. Следовательно, при использовании только метода двухслойного агара может потребоваться дополнительное тестирование с другими пробиотическими препаратами, поскольку единовременно охватить весь спектр имеющихся на рынке препаратов невозможно.
Метод перевернутого агара описан и протестирован для оценки антифунгального действия пробиотических препаратов, содержащих Bacillus subtilis и Escherichia coli [3]. Но оценка антагонистического действия лакто- и/или бифидосодержащих пробиотических препаратов на другие условно-патогенные микроорганизмы (неоппортунистические дрожжи) не производилась. Кроме этого, оригинальная методика подразумевает подбор посевной дозы дрожжей, при которой на агаре вырастало бы не более 70 колоний. Это, безусловно, требует подтитровки и дополнительных исследований при тестировании каждого пробиотического препарата, как и при методе двухслойного агара. При использовании метода перевернутого агара также нередки случаи низкой антагонистической активности, поэтому, применяя только метод перевернутого агара, невозможно дифференцированно подходить к выбору пробиотического препарата или возникает необходимость в дополнительном тестировании с другими пробиотическими препаратами, как и при использовании метода двухслойного агара.
Недостатком метода совместного культивирования, по мнению авторов заявляемого способа, является невозможность соблюдения обязательного условия для применения этого метода - способность обоих тестируемых микроорганизмов - штамма пробиотического препарата и условно-патогенного микроорганизма к росту на используемой питательной среде и в используемой атмосфере инкубации. Так, бифидобактерии не растут в микроаэрофильных условиях, а УПМ при культивировании в анаэробных условиях вырастают в значительно меньшем количестве, чем при культивировании в присутствии кислорода. Поэтому эта методика наиболее подходит для тестирования пробиотических лактобактерий, которые менее требовательны по сравнению с бифидобактериями. Кроме этого, невозможность количественной оценки антагонистической активности в данной методике существенно ограничивает ее применение, т.к. не позволяет дать прогноз успешности применения пробиотического препарата.
Все разработанные на сегодняшний день методики оценки антагонистической активности направлены на определение таковой при выборе производственных штаммов для массового производства пробиотических препаратов. Поэтому пробиотические препараты могут оказаться неэффективны в отношении штаммов условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от конкретного пациента.
В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран метод двухслойного агара.
Техническим результатом изобретения является повышение точности выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника у конкретного пациента и расширение спектра оптимально подобранных пробиотических препаратов для конкретного пациента, а также упрощение посева и учета полученного результата.
Технический результат достигается тем, что выделяют штаммы условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого, затем выделяют лактобактерии и/или бифидобактерии, входящие в состав пробиотических препаратов в чистой культуре, после чего определяют антагонистическую активность лактобактерий и/или бифидобактерий одновременно методом двухслойного агара и методом перевернутого агара, при этом посев осуществляют по Gold и оценивают мощность антагонистического воздействия штаммов пробиотических препаратов по степени интенсивности подавления штаммов условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с контролем: низкая степень - подавление на 1-2 lg КОЕ/мл, средняя степень - на 3-4 lg КОЕ/мл, высокая степень - на 5-9 lg КОЕ/мл, вплоть до полного подавления роста УПМ, и при регистрации антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, двумя способами или хотя бы одним из способов, то есть или методом двухслойного агара, или методом перевернутого агара, антагонистическую активность пробиотического препарата, содержащего лактобактерии и/или бифидобактерии в отношении условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного больного, считают выявленной. При индивидуальном выявлении антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника, при отсутствии антагонистической активности или выявлении низкой или средней степени интенсивности подавления условно-патогенных микроорганизмов антагонистическую активность дополнительно определяют капельной методикой.
Способ осуществляется следующим образом.
Стандартными способами выделяют чистую культуру условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого и чистую культуру пробиотических лактобактерий и/или бифидобактерий.
Оценку антагонистического влияния пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, на условно-патогенные микроорганизмы, выделенные от данного пациента, осуществляют одновременно методом двуслойного агара и методом перевернутого агара, а при необходимости оценку антагонистического влияния пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии, дополнительно осуществляют капельной методикой.
9
Метод двухслойного агара для тестирования штаммов пробиотических препаратов и условно-патогенных микроорганизмов используют в варианте, модифицированном авторами заявляемого способа, то есть используя посев по Gold. Нижний слой среды готовят из колумбийского агара. В расплавленную остывающую среду вносят 1 мл штамма тестируемого пробиотического препарата в конечной концентрации 10 клеток по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича на 1 мл среды, разливают по 10 мл в чашки Петри и оставляют на 1 час в термостате при 37°С. Затем на поверхность нижнего слоя наливают 10 мл колумбийского агара. Приготовленный таким образом двухслойный агар оставляют на 1 час при 37°С. Засеянные лактобактерии и бифидобактерии инкубируют в аэробных условиях. При посеве бифидобактерии в толщу агара и наслаивании сверху дополнительного слоя плотной среды создаются условия культивирования, близкие к анаэробным, поэтому анаэробная техника не используется.
9
Далее на поверхность верхнего слоя засевают мерно по Gold тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов, выделенные от обследуемого. Для этого готовят суспензию культуры условно-патогенного микроорганизма в конечной концентрации 10 клеток по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Методика проведения посева градуированной петлей штриховым методом по Gold заключается в следующем: бактериологической петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл производят посев исследуемого материала на сектор А чашки Петри с питательной средой (30-40 штрихов). После этого петлю прожигают и делают 4 штриховых посева из сектора А в сектор 1, аналогично из первого во второй, из второго в третий, каждый раз прожигая петлю. После инкубации подсчитывают число колоний, выросших на разных секторах питательной среды. Количество бактерий в 1 мл суспензии определяют по расчетной таблице 3 (Расчетная таблица для определения количества бактерий в мл жидкости) [5].
Контролем служат чашки с такой же питательной средой без пробиотических препаратов, на которые засевают УПМ в таком же количестве, как и в опыте. Засев тест-культур может осуществляться уже через 2 часа после начала инкубации. Кроме этого, появляется возможность культивировать тест-культуры с различными потребностями, варьируя состав второго слоя.
Антагонистическими активными считают пробиотические препараты, при тестировании которых с использованием метода двухслойного агара происходит снижение роста условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с контролем. Авторами заявляемого способа предлагается оценивать мощность антагонистического воздействия пробиотических препаратов по степени интенсивности подавления штаммов УПМ по сравнению с контролем: 1 степень (низкая) - подавление на 1-2 lg КОЕ/мл, 2 степень (средняя) - на 3-4 lg КОЕ/мл, 3 степень (высокая) - на 5-9 lg КОЕ/мл, вплоть до полного подавления роста УПМ (Таблица 2).
9
9
Метод перевернутого агара для тестирования штаммов и условно-патогенных микроорганизмов используют в варианте, модифицированном авторами заявляемого способа, то есть используя посев по Gold. Пробиотические препараты лактобактерий и/или бифидобактерий в концентрации 1×10 по стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича в количестве 50 мкл засевают газоном на колумбийский агар. Предполагаемые антагонистические метаболиты штаммов пробиотических препаратов диффундируют в толщу агара и в дальнейшем влияют на рост тест-культур. Инкубируют в анаэробных условиях при 37°С 48 ч. Затем агар переворачивают с помощью стерильного деревянного шпателя и засевают тест-культуры условно-патогенных микроорганизмов с обратной стороны в концентрации 10 клеток/мл, используя количественный посев УПМ мерной петлей по Gold для простоты дальнейшего подсчета (табл.3 - Расчетная таблица для определения количества бактерий в мл жидкости).
Инкубируют 24 ч в аэробных условиях при 37°С. Для контроля штаммы условно-патогенных микроорганизмов высевают на колумбийский агар без пробиотических препаратов по Gold.
Антагонистическую активность данного пробиотического препарата считают выявленной с использованием метода перевернутого агара, если происходит снижение количества условно-патогенных микроорганизмов на питательной среде по сравнению с контролем. Оценивают мощность антагонистического воздействия пробиотических препаратов по степени интенсивности подавления штаммов УПМ по сравнению с контролем: низкая степень - подавление на 1-2 lg КОЕ/мл, средняя степень - на 3-4 lg КОЕ/мл, высокая степень - на 5-9 lg КОЕ/мл, вплоть до полного подавления роста УПМ (табл. 4 - Различия в степени антагонистической активности пробиотических препаратов в отношении условно-патогенных микроорганизмов. Метод перевернутого агара).
В случае выявления низкой или средней степени интенсивности подавления условно-патогенных микроорганизмов или полного отсутствия антагонистической активности изучаемого лактосодержащего пробиотического препарата используют капельную методику, дающую качественную оценку наличия антагонизма. Суточную культуру пробиотических лактобактерий, выращенных в жидкой среде Шедлера, наносят на поверхность колумбийского агара бактериологической петлей диаметром 3 мм. Посев оставляют при комнатной температуре до полного впитывания капли. После этого, отступив 1-2 мм от края первого пятна, наносят каплю культуры тестируемого условно-патогенного микроорганизма, предварительно выращенного в мясо-пептонном бульоне (МПБ). Растекаясь, вторая капля затекает на пятно культуры штамма пробиотического препарата до половины диаметра. В той части, где произошло наложение капель, возникают конкурирующие отношения культур. Свободные части пятен каждой культуры служат контролем жизнеспособности каждой из культур и всхожести питательной среды. После подсыхания капель чашки инкубируют в анаэростате в микроаэрофильных условиях при 37°С. Чтобы исключить возможность влияния последовательности наслоения капель тест-штаммов условно-патогенных микроорганизмов и культур лактобактерий, каждый опыт ставят в двух вариантах, меняя очередность посева культур. Наличие антагонизма выявляют визуально по наличию признаков подавления одной культуры другой. При задержке или отсутствии роста одной из культур (при росте контрольных) взаимоотношения между ними рассматривают как антагонистические.
При регистрации антагонистической активности хотя бы одним способом, антагонистическую активность пробиотического препарата, содержащего лактобактерии и/или бифидобактерии, в отношении условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного больного, считают выявленной. При этом наиболее эффективными в отношении штамма УПМ, выделенного от конкретного пациента, считают пробиотические препараты с третьей (высокой, сильной) степенью интенсивности антагонистического воздействия.
Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются:
- выделяют штаммы условно-патогенных микроорганизмов из фекалий обследуемого, выделяют лактобактерии и/или бифидобактерии, входящие в состав пробиотических препаратов в чистой культуре и определяют антагонистическую активность лактобактерий и/или бифидобактерий в отношении условно-патогенных микроорганизмов одновременно методом двухслойного агара и методом перевернутого агара;
- посев осуществляют по Gold и оценивают мощность антагонистического воздействия штаммов пробиотических препаратов по степени интенсивности подавления штаммов условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с контролем: низкая степень - подавление на 1-2 lg КОЕ/мл, средняя степень - на 3-4 lg КОЕ/мл, высокая степень - на 5-9 lg КОЕ/мл, вплоть до полного подавления роста УПМ;
- при выявлении низкой или средней степени интенсивности подавления условно-патогенных микроорганизмов или при ее отсутствии антагонистическую активность лактобактерий дополнительно определяют капельной методикой;
- при регистрации антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, двумя способами или хотя бы одним из способов, то есть или методом двухслойного агара, или методом перевернутого агара, антагонистическую активность пробиотического препарата, содержащего лактобактерии и/или бифидобактерии в отношении условно-патогенного микроорганизма, выделенного от данного больного, считают выявленной.
Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом.
- Каждый пробиотический штамм действует за счет разного набора факторов и обладает индивидуальным спектром антагонистического действия. Антагонистическая активность изучаемого препарата в зависимости от используемого метода может варьировать, что не характеризует метод как низко- или высокоэффективный. Такие вариации объясняются разной природой антагонизма: накоплением в среде культивирования органических кислот (молочной, муравьиной, уксусной) и изменением рН, разной скоростью размножения микробных популяций, конкуренцией за пищевой субстрат, выработкой лизоцима, бактериоцинов и других биологически активных веществ [6, 7, 8, 9, 10, 2, 1, 11]. Поэтому методы для выявления антагонизма также могут быть разнообразны.
Так, например, при использовании метода прямого антагонизма (метод штрихов), когда осуществляется одновременный посев пробиотического препарата и тестируемых культур, бактериоцины не успевают выработаться и диффундировать в среду и, очевидно, действуют другие механизмы, например изменение физико-химической среды. Но этот механизм не универсален, так как в кишечнике человека могут и не произойти подобные изменения.
При прямом совместном культивировании (капельная методика) происходит непосредственное взаимодействие штамма пробиотического препарата и испытуемой культуры.
При использовании метода перевернутого агара метаболиты штамма пробиотического препарата в течение 2 суток инкубации насыщают питательную среду и влияют на рост тест-штамма.
В методе двухслойного агара штаммы пробиотических препаратов растут в условиях, близких к анаэробным, и могут максимально проявлять свои свойства, однако при этом нет прямого взаимодействия с индикаторными культурами.
Антагонистическая активность одного и того же пробиотического штамма может быть обусловлена несколькими одновременно действующими механизмами. Поэтому, применяя один метод определения антагонизма пробиотического препарата, затруднительно судить о достоверности получаемых результатов, а отрицательный результат не означает отсутствие активности. Таким образом, применяя только один метод выявления антагонистической активности пробиотических лактобактерий и/или бифидобактерий, можно добиться искусственного ограничения успешного применения конкретного препарата в отношении штамма, выявленного у данного пациента. Одновременное использование нескольких методов определения антагонистической активности повышает эффективность выбора препарата для коррекции дисбиоза. При этом в случае даже одного положительного результата можно говорить о наличии антагонистической активности пробиотического препарата к изучаемому штамму микроорганизма.
Для выбора оптимального метода, комбинаций или последовательности методов авторами исследована антагонистическая активность пяти лактосодержащих и пяти бифидосодержащих пробиотических препаратов в отношении штаммов УПМ, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника. При этом активность лактосодержащих пробиотических препаратов изучалась четырьмя методами: штрихов, перевернутого агара, двухслойного агара, капельной методикой. Активность бифидосодержащих пробиотических препаратов изучалась тремя методами: штрихов, перевернутого агара, двухслойного агара. Было проведено 500 серий тестов в отношении пробиотических бифидобактерий со ста культурами УПМ и использованием пяти штаммов пробиотических препаратов в трех методах. Таким образом, общее количество опытов с пробиотическими бифидобактериями составило 1500 (Таблица 5 - Выявление антагонистической активности бифидосодержащих пробиотических препаратов разными методами). В отношении пробиотических лактобактерий было проведено 500 серий тестов со ста культурами УПМ и использованием пяти штаммов пробиотических препаратов в четырех методах. Таким образом, общее количество опытов с пробиотическими лактобактериями составило 2000 (Таблица 6 - Выявление антагонистической активности лактосодержащих пробиотических препаратов разными методами).
9
Тестировали антагонистическую активность десяти пробиотических культур, входящих в препараты: 1) «Бифидумбактерин сухой» «Микроген» г.Пермь; 2) «Бифидумбактерин» ЗАО «Экополис», Ковров; 3) «Бификол» ОАО «Биомед» имени Мечникова, Московская область; 4) «Нормофлорин-Б» ООО «Бифилюкс», Москва; 5) «Бифиформ» «Ferrosan», Дания; 6) «Лактобактерин» НПО «Микроген», Пермь; 7) «Лактобактерин» НПО «Имбио», Нижний Новгород; 8) «Лактобактерин» НПО «Иммунопрепарат»; 9) «Нормофлорин-Л» ООО «Бифилюкс», Москва; 10) йогурт «Актимель». Все коммерческие лиофилизированные культуры пробиотических препаратов предварительно оживляли путем трехкратного пассажа на жидкой среде Шедлера так, чтобы их концентрация составляла 10 КОЕ/мл.
В качестве тест-культур изучали 100 штаммов УПМ, изолированных от больных с дисбактериозом толстого кишечника - по 20 штаммов Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., S.aureus, «атипичной» E.coli. Культуры предварительно выращивали на ГМФ-бульоне при 37°С в течение 16-18 часов.
Число положительных результатов при тестировании пробиотических бифидобактерий с использованием комбинации из трех методов составило 413 из 500 проведенных тестов (Таблица 5 - Выявление антагонистической активности бифидосодержащих пробиотических препаратов разными методами). Не выявлено антагонистической активности ни одним методом лишь в 87 сериях тестов. При тестировании пробиотических лактобактерий с использованием комбинации из четырех методов число положительных результатов составило 327 из 500 проведенных тестов (Таблица 6 - Выявление антагонистической активности лактосодержащих пробиотических препаратов разными методами). Не выявлено антагонистической активности ни одним методом лишь в 173 сериях тестов. Полученные результаты свидетельствуют то, что зачастую антагонизм, не выявленный одним методом, выявлялся другим методом. Т.е. в разных методиках выявления антагонистической активности выявляются разные чувствительные штаммы условно-патогенных микроорганизмов, не обязательно повторяющиеся в каждой из них (Таблицы 7, 8, 9 - Антагонистическая активность пробиотических препаратов, выявленная различными методиками в отношении штаммов УПМ, выделенных при исследовании на дисбактериоз). Таким образом, не существует универсальной стандартизированной методики определения антагонистической активности. Используя несколько вариантов определения антагонистической активности, можно охватить большее количество восприимчивых тест-штаммов. Применяя только один метод выявления антагонистической активности пробиотических бифидобактерий и лактобактерий, можно добиться искусственного ограничения успешного применения конкретного препарата в отношении штамма, выявленного у данного пациента (Таблицы 7, 8, 9, 10, 11). Как видно из таблицы 10 (Сравнительная характеристика двух подходов выявления антагонистической активности пробиотических препаратов в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выявленных при диагностике дисбактериоза кишечника), доля случаев невыявленной антагонистической активности при использовании какого-либо одного метода составляет 60,6% при тестировании бифидобактерий и 78,65% при тестировании лактобактерий. В то же время при одновременном использовании нескольких методик процент невыявленных случаев резко снижается и составляет 17,4% для бифидобактерий и 34,6% для лактобактерий. Во избежание неоправданного сужения выбора пробиотических препаратов рекомендуется использовать несколько методик определения антагонизма, и в случае выявления даже одного положительного результата в одном из методов можно говорить о наличии антагонистической активности данного пробиотического препарата к данному штамму микроорганизма.
Авторами проанализирована значимость каждой из методик и предложена последовательность их применения при тестировании пробиотических бифидобактерий и лактобактерий. При сравнении эффективности каждого метода в отдельности показано, что наименьшей эффективностью обладает метод штрихов. Выявляемость антагонизма методом штрихов составила 1,2±2,6% (9 положительных результатов из 500 опытов) для бифидобактерий и для 4,6±2,6% (23 положительных результата из 500 опытов) - для лактобактерий. Статистически достоверна неэффективность этого метода (Фиг.1, Фиг.2).
При этом в 5 случаях антагонистическая активность бифидобактерий была выявлена и другими методами. Таким образом, только 4 результата (0,9% от общего числа положительных результатов) могут быть «упущены», если отказаться от метода штрихов. Очевидно, что его использование не оправдывает затрат. Наибольшая эффективность при тестировании пробиотических бифидобактерий в отношении УПМ зафиксирована в отношении метода перевернутого агара - 42,4±1,5%. При этом статистически достоверно различие с другими применяемыми методами (Фиг.2). Использование метода перевернутого агара как основного метода при оценке антагонистической активности пробиотических бифидобактерий в отношении УПМ оправдано. Однако это не позволяет отказаться от применения дополнительного метода, так как при использовании нескольких методик статистически достоверно повышается выявляемость антагонизма - до 65,4±3,4% (Фиг.2). Поэтому показано одновременное применение методов перевернутого и двухслойного агара.
При анализе значимости каждой из методик при выборе препаратов, содержащих лактобактерии, также показана низкая эффективность метода штрихов - 4,6±2,6% (23 положительных результата из 500 опытов). При этом антагонистическая активность пробиотических лактобактерий в 12 случаях была выявлена и другими методами. Таким образом, только 11 результатов (3,4% от общего числа положительных результатов) могут быть не зарегистрированы в случае отказа от метода штрихов. Наибольшая эффективность при тестировании пробиотических лактобактерий в отношении УПМ зафиксирована в отношении метода двухслойного агара - 46,6±1,5%. Статистически достоверно различие с другими применяемыми методами (Фиг.1). Использование метода двухслойного агара как основного метода при оценке антагонистической активности пробиотических лактобактерий в отношении УПМ оправдано. Однако это не позволяет отказаться от применения других методов, так как при использовании нескольких методик статистически достоверно повышается выявляемость антагонизма - до 65,4±3,4%, что иллюстрируют диаграммы выявлямости антагонизма пробиотических лактобактерий с использованием двух подходов (одним методом и комплексной методикой из 4-х методов) на Фиг.1.
- Выбор дополнительного метода при тестировании лактобактерий не очевиден, так как количество выявленных случаев антагонизма методом перевернутого агара и капельной методикой практически совпадает - 19,4±1,1% и 18,2±1,2% соответственно. Различия статистически недостоверны (Фиг.1). Для выбора приоритетного метода из двух вышеозначенных были проанализированы совпадения при изучении антагонизма этими методиками (Таблица 11 - Совпадения при выявлении антагонистической активности лактосодержащих пробиотических препаратов в отношении УПМ методом перевернутого агара и капельной методикой). Лишь в 5,8% от общего числа положительных результатов (в 3,8% протестированных случаях) получены совпадения в капельной методике и методе перевернутого агара (Таблица 11). А в 38,6% (20,4%+18,2%) от всех положительных результатов (28,4% протестированных случаев) требуется использование двух методик одновременно для выявления антагонистической активности лактобактерий. Однако, учитывая тот факт, что капельная методика носит качественный характер, ее применение должно носить дополнительный характер, в случае отсутствия антагонизма в других методах или при слабой и средней степеней антагонистической активности пробиотических препаратов.
Метод прямого совместного культивирования на поверхности плотной питательной среды (капельная методика) проводят только для лактобактерий. В отличие от метода перевернутого агара, где культивирование пробиотических культур и УПМ разобщено во времени и используются сначала анаэробные, а затем аэробные условия, при методе совместного культивирования оба микроорганизма (пробиотический штамм и штамм УПМ) должны культивироваться одновременно в одинаковых условиях. Бифидобактерии не растут в микроаэрофильных условиях, а УПМ при культивировании в анаэробных условиях вырастают в значительно меньшем количестве, чем при культивировании в присутствии кислорода, поэтому эта методика наиболее подходит для тестирования пробиотических лактобактерий, которые менее требовательны по сравнению с бифидобактериями.
- Методика посева по Gold позволяет отказаться от предварительной подтитровки посевной дозы и легко рассчитать подавляемое количество микроорганизмов с использованием расчетной таблицы, тогда как при посеве шпателем, особенно в случае интенсивного роста, подсчет всех колоний на питательной среде занимает несоизмеримо большее время. Например, при использовании способа-прототипа, то есть метода двухслойного агара, для посева используется сразу несколько чашек, и в итоге можно потратить 30-60 минут на учет полученного результата. Используя методику посева по Gold, затрачивается 2-3 минуты.
- Мощность антагонистического воздействия штаммов пробиотических препаратов оценивают по степени интенсивности подавления штаммов условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с контролем: низкая степень - подавление на 1-2 lg КОЕ/мл, средняя степень - на 3-4 lg КОЕ/мл, высокая степень - на 5-9 lg КОЕ/мл, вплоть до полного подавления роста УПМ.
Таким образом, наиболее целесообразно пошаговое определение антагонистической активности пробиотических лактобактерий в отношении УПМ, выделенных при диагностике дисбактериоза. Сначала определяют антагонистическую активность лактобактерий в отношении УПМ одновременно методом двухслойного агара и методом перевернутого агара. Оценивают мощность антагонистического воздействия пробиотических препаратов степени интенсивности подавления штаммов условно-патогенных микроорганизмов по сравнению с контролем. При отсутствии антагонистической активности, а также при низкой или средней степени интенсивности подавления условно-патогенных микроорганизмов антагонистическую активность дополнительно определяют одновременно капельной методикой и выявляют наличие антагонистической активности в отношении условно-патогенного микроорганизма, выделенного от конкретного больного, при выявлении антагонистической активности пробиотического препарата одним из этих методов или двумя.
Закономерностей в эффективности подавления различных условно-патогенных микроорганизмов тем или иным биопрепаратом также не выявлено. Один и тот же препарат может проявлять мощное антагонистическое воздействие против одних штаммов и быть не активным в отношении других, что делает необходимым индивидуальное выявление антагонистической активности пробиотических препаратов в отношении штаммов, выделенных от обследуемого при бактериологической диагностике дисбактериоза (Таблицы 7, 8, 9 - Антагонистическая активность пробиотических препаратов, выявленная различными методиками в отношении штаммов УПМ, выделенных при исследовании на дисбактериоз).
Совокупность отличительных существенных признаков является новой и повышает точность выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии, в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника у конкретного пациента, и расширяет спектр оптимально подобранных пробиотических препаратов для конкретного пациента, а также упрощает посев и учет полученных результатов.
Примеры конкретного выполнения заявляемого способа.
6
Пример 1. При бактериологическом исследовании кала на дисбиоз кишечника (№846) обнаружено повышенное содержание условно-патогенной микрофлоры (Staphylococcus aureus - 10 lg КОЕ/мл). Определяли антагонистическую активность десяти лактосодержащих и бифидосодержащих пробиотических препаратов в отношении выделенного микроорганизма (Таблица 7 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов, выявленная различными методиками в отношении Staphylococcus aureus, выделенного при исследовании на дисбактериоз №846).
При тестировании лактосодержащих пробиотических препаратов с использованием метода двухслойного агара выявили антагонистическую активность третьей степени (высокую) пробиотического препарата «Лактобактерин» (Пермь) и активность первой степени (низкую) пробиотического препарата «Лактобактерин» (Н.Новгород). Пробиотический препарат «Лактобактерин» (Пермь) не нуждается в дальнейших исследованиях и может применяться даже при третьей степени дисбактериоза, как в данном случае. При необходимости выбора среди оставшихся препаратов и объективной оценки перспективности использования данных препаратов в отношении УПМ, выделенного от данного пациента, требуется сравнение результатов, полученных методом двухслойного и перевернутого агара, а также дополнительного исследования капельной методикой. Присутствие антагонистической активности пробиотического препарата «Лактобактерин» (Н.Новгород) подтверждено капельной методикой. Однако ввиду того, что этот метод - качественный, а не количественный, оценку степени антагонистического воздействия дать нельзя, а применение данного препарата может быть с равной вероятностью эффективным и малоэффективным (не полностью подавлять выделенный УПМ). Капельной методикой выявлена также антагонистическая активность пробиотического препарата «Нормофлорин-Л», применение которого может быть также либо эффективным, либо вызывать лишь незначительное подавление УПМ. Антагонистическая активность пробиотических лактобактерий йогурта «Актимель» выявлена только методом перевернутого агара (средняя степень подавления) и капельной методикой. Степень подавления этого штамма позволяет снизить количество УПМ, выделенных от данного пациента на 3-4 порядка, что недостаточно, учитывая нормативы ОСТа, согласно которым Staphylococcus aureus должен отсутствовать в фекалиях. Таким образом, потенциально наиболее эффективным лактосодержащим пробиотическим препаратом в отношении штамма Staphylococcus aureus, выделенного от данного пациента, может рассматриваться «Лактобактерин» (Пермь).
При тестировании бифидосодержащих пробиотических препаратов с использованием метода перевернутого агара выявили высокую степень антагонистической активности пробиотического препарата «Бифидумбактерин» («Микроген», Пермь), среднюю степень пробиотического препарата «Нормофлорин-Б». Методом двухслойного агара выявили высокую степень антагонистической активности у пробиотического препарата «Бифиформ», средней степени - у пробиотического препарата «Нормофлорин-Б», низкой степени - у пробиотического препарата «Бифидумбактерин» («Экополис», Ковров).
В данном случае наиболее целесообразно применение бифидосодержащих пробиотических препаратов с высокой степенью активности в отношении данного штамма Staphylococcus aureus - «Бифидумбактерин» («Микроген», Пермь) или «Бифиформ», а также лактосодержащего пробиотического препарата «Лактобактерин» (Пермь).
8
8
Пример 2. При бактериологическом исследовании кала на дисбиоз кишечника (№578) обнаружено повышенное содержание условно-патогенной микрофлоры (Enterobacter agglomerans - 10 lg КОЕ/мл). Определяли антагонистическую активность десяти пробиотических препаратов в отношении выделенного микроорганизма (Таблица 8 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов, выявленная различными методиками в отношении Enterobacter agglomerans, выделенного при исследовании на дисбактериоз №578). Методом двуслойного агара антагонистическая активность средней степени выявлена только при тестировании пробиотических лактобактерий йогурта «Актимель». Однако данной силы антагонизма недостаточно для подавления Enterobacter agglomerans в количестве 10 lg КОЕ/мл, т.к. даже при снижении числа микроорганизмов на 3-4 lg КОЕ/мл концентрация УПМ останется высокой, в результате чего дисбактериоз будет поддерживаться или усугубляться. Методом перевернутого агара выявили высокую степень антагонистической активности пробиотического препарата «Лактобактерин» (Н.Новгород). «Нормофлорин-Л» проявил антагонистические свойства в капельной методике, однако качественным методом оценить мощность антагонизма и потенциальную эффективность применения этого пробиотического препарата не представляется возможным. Таким образом, высока вероятность того, что наиболее эффективным окажется пробиотический препарат «Лактобактерин» (Н.Новгород).
При выявлении антагонистической активности бифидосодержащих пробиотических препаратов методом перевернутого агара выявили высокую степень антагонистической активности пробиотического препарата «Нормофлорин-Б». Методом двухслойного агара выявили антагонистическую активность средней степени у пробиотического препарата «Бифидумбактерин» («Экополис», Ковров), низкой степени - пробиотического препарата «Бифиформ». В данном случае наиболее целесообразно применение пробиотических препаратов с высокой степенью активности в отношении данного штамма Enterobacter agglomerans - «Нормофлорин-Б» и «Лактобактерин» (Н.Новгород).
6
Пример 3. При бактериологическом исследовании кала на дисбиоз кишечника (№628) обнаружено повышенное содержание условно-патогенной микрофлоры (Klebsiella pneumoniae - 10 lg КОЕ/мл). Определяли антагонистическую активность десяти лактосодержащих и бифидосодержащих пробиотических препаратов в отношении выделенного микроорганизма (Таблица 9 - Антагонистическая активность пробиотических штаммов, выявленная различными методиками в отношении Klebsiella pneumoniae, выделенного при исследовании на дисбактериоз №628). При тестировании с использованием метода двухслойного агара антагонистическая активность в отношении данного штамма Klebsiella pneumoniae отсутствовала у всех лактосодержащих препаратов, за исключением лактобактерий, входящих в йогурт «Актимель». Высокая степень активности, выявленная при этом, позволяет использовать йогурт «Актимель» даже при 3-й степени дисбактериоза, как в данном примере. Однако при необходимости выбора среди указанных препаратов ввиду отсутствия активности оставшихся четырех лактосодержащих препаратов в двухслойном методе необходимо учитывать результаты метода перевернутого агара, а также использовать дополнительный метод - капельную методику. Методом перевернутого агара активность лактосодержащих пробиотических препаратов не выявлена. В капельной методике выявлена антагонистическая активность лишь у пробиотического препарата «Лактобактерин» (Уфа). Этот метод является качественным, а не количественным, поэтому мощность антагонистического воздействия пробиотического препарата оценить нельзя, а его применение может быть как эффективным, так и вызывать лишь незначительное подавление.
Антагонистическая активность бифидобактерий, выявленная методом двухслойного агара, варьировала: у пробиотического препарата «Бифиформ» активность высокой степени, у пробиотического препарата «Бифидумбактерин» («Экополис», Ковров) - средней степени, у пробиотического препарата «Бифидумбактерин» («Микроген», Пермь) - низкой степени. Методом перевернутого агара выявили среднюю степень антагонистической активности у пробиотического препарата «Нормофлорин-Б», низкую степень - у пробиотического препарата «Бифидумбактерин» («Экополис», Ковров).
Таким образом, применение пробиотического препарата «Бифиформ» в данном случае предполагается наиболее эффективным из бифидосодержащих препаратов, а «Актимель» - из лактосодержащих пробиотических препаратов.
Нами тестировалась антагонистическая активность десяти пробиотических культур, входящих в пробиотические препараты: 1) «Лактобактерин» НПО «Микроген», Пермь; 2) «Лактобактерин» НПО «Имбио», Нижний Новгород; 3) «Лактобактерин» НПО «Иммунопрепарат», Уфа; 4) «Нормофлорин-Л» ООО «Бифилюкс», Москва; 5) йогурт «Актимель»; 6) «Бифидумбактерин сухой» «Микроген» г.Пермь; 7) «Бифидумбактерин» ЗАО «Экополис», Ковров; 8) «Бификол» ОАО «Биомед» имени Мечникова, Московская область; 9) «Нормофлорин-Б» ООО «Бифилюкс», Москва; 10) «Бифиформ» «Ferrosan», Дания. В качестве тест-культур изучали 100 штаммов УПМ, изолированных от больных с дисбактериозом толстого кишечника - по 20 штаммов Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., S.aureus, «атипичной» E.coli. Было проведено 2000 опытов с использованием четырех методик по отдельности и 500 опытов по предложенному авторами способу с использованием трех методов для лактосодержащих пробиотических препаратов и 1500 опытов с использованием трех методик по отдельности и 500 опытов по предложенному авторами способу с использованием двух методов для бифидосодержащих пробиотических препаратов.
При использовании метода двухслойного агара антагонизм был выявлен в отношении 233 культур лактобактерий (63,5% от всех полученных положительных опытов). При этом в 48 случаях была выявлена третья (высокая) степень антагонистической активности, поэтому дальнейшее тестирование пробиотического препарата не потребовалось, и результаты метода перевернутого агара были не важны (Таблица 2). В 267 случаях антагонистическая активность методом двухслойного агара не была выявлена вообще. Поэтому исследование, проведенное методом перевернутого агара, а также дополнительно капельной методикой, было особенно важно. Оно позволило дополнительно выявить антагонистическую активность пробиотических лактобактерий методом перевернутого агара в 41 случае, капельной методикой - в 43, в 9 случаях - двумя перечисленными методами.
В 153 случаях методом двухслойного агара была выявлена слабая степень антагонистической активности лактобактерий, в 32 - средняя. В этом случае метод перевернутого агара позволил выявить и уточнить степень антагонистической активности лактобактерий. Так, слабая степень была подтверждена в 79 случаях, средняя - в 4, сильная - в 4 (Таблица 3).
При использовании способа-прототипа - метода двухслойного агара антагонизм бифидобактерий был выявлен в отношении 119 культур. При этом в 91 случае была выявлена высокая степень антагонистической активности, поэтому дальнейшее тестирование пробиотического препарата не потребовалось (Таблица 2). В 219 случае антагонистическая активность с использованием способа-прототипа - методом двухслойного агара не была выявлена вообще. Поэтому применение двух методов особенно важно. Это позволило дополнительно выявить антагонистическую активность бифидобактерий способом аналога - методом перевернутого агара в 101 случае, в 52 случаях - двумя перечисленными методами. В качестве «выявленной» антагонистической активности бифидобактерий рассматривались только результаты со средней или высокой активностью.
В 162 случаях способом-прототипом - методом двухслойного агара - была выявлена слабая степень антагонистической активности пробиотических бифидобактерий. В 196 случаях одним из способов-аналогов - методом перевернутого агара - не была выявлена антагонистическая активность пробиотических бифидобактерий, а в 151 случае выявлена слабая степень антагонистической активности. Поэтому эти два метода взаимно дополняют друг друга при выявлении антагонистической активности пробиотических бифидобактерий.
Доля случаев невыявленной антагонистической активности при использовании какого-либо одного метода (метода двухслойного агара или метода перевернутого агара, то есть способа-прототипа или аналога) составляет 60,6% при тестировании бифидобактерий и 78,65% при тестировании лактобактерий. В то же время при одновременном использовании нескольких методик, то есть при применении заявляемого способа, процент невыявленных случаев резко снижается и составляет 17,4% для бифидобактерий и 34,6% для лактобактерий.
Заявляемый способ позволяет также существенно расширить спектр оптимально подобранных пробиотических препаратов для данного конкретного пациента (Фиг.3), в отличие от прототипа и аналога, благодаря тому, что во внимание принимаются различные механизмы антагонистического воздействия.
Таким образом, вышеприведенные данные подтверждают то, что заявляемый способ повышает точность выявления антагонистической активности пробиотических препаратов, содержащих лактобактерии и/или бифидобактерии в отношении условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза кишечника у конкретного пациента по сравнению со способом-прототипом, а также с аналогом. Заявляемый способ позволяет также существенно расширить спектр оптимально подобранных пробиотических препаратов для конкретного пациента в отличие от прототипа и аналога, и упростить посев и учет полученных результатов.
Список литературы
1. Постникова Е.А., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. Поиск перспективных штаммов бифидобактерий и лактобацилл для разработки новых биопрепаратов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2004. - №2. С.64-69.
2. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2004. - №5. - С.94-98.
3. Арзуманян В.Г., Михайлова Н.А., Гайдеров А.А., Баснакьян И.А., Осипова И.Г. Количественный способ оценки отсроченного антагонизма пробиотических культур против оппортунистических дрожжей // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №5. С.53-54.
4. Глушанова Н.А., Блинов А.И., Бахаев В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2004. - №6. С.37-39.
5. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов иследования в клинико-диагностических лабораториях: приложение 1 к приказу Минздрава СССР №535. - 1986.
6. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г., Поспелова В.В., Лагода И.В. К механизму антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 1989. - №2. - С.3-8.
7. Jack R.W., Tagg J.R., Ray В. Bacteriocins of gram-positive bacteria // Microbiol. Rev. - Jun 1995. - Vol.59. - No.2. - p.171-200.
8. Anderssen E.L., Dzung B.D., Ingolf F.N., Eijsink V.G.H., Nissen-Meyer J. Antagonistic Activity of Lactobacillus plantarum С11: Two New Two-Peptide Bacteriocins, Plantaricins EF and JK, and the Induction Factor Plantaricin A // Appl. Environ. Microbiol. - 1998 June. - vol.64(6). - p.2269-2272.
9. Eijsink V.G.H., Skeie M., Middelhoven P.H., Brurberg M.B., Nes I F. Comparative Studies of Class IIa Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria. // American Society for Microbiology. Applied and Environmental Microbiology - September 1998. - Vol.64. - No.9. - p.3275-3281.
10. Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2003. - №3. - С.109-113.
11. Рыбальченко О.В., Бондаренко В.М., Вербицкая Н.Б. Проявление антагонистического действия бактериоциногенных Lactobacillus acidophilus на клетки Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii и Proteus mirabilis // Журнал микробиологии, вирусологии и иммунологии. - 2006. - №7. - С.8-11.
Таблица 3
Расчетная таблица для определения количества бактерий в мл жидкости
А
I
II
III
К-во в 1 мл
1-6
-
-
-
<1000
8-20
-
-
-
3000
20-30
-
-
-
5000
30-60
-
-
-
10000
70-80
-
-
-
50000
100-150
5-10
-
-
100000
не сосч.
20-30
-
-
500000
-''-
40-60
-
-
1 млн
-''-
100-150
10-20
-
5 млн
-''-
не сосч.
30-40
-
10 млн
-''-
-''-
60-80
Единичные колонии
100 млн
Таблица 11
Совпадения при выявлении антагонистической активности пробиотических лактобактерий в отношении УПМ методом перевернутого агара и капельной методикой
Положительные результаты, выявленные
Количество чувствительных штаммов УПМ, выявленных данной методикой, абс. (% от числа всех положительных результатов)
только капельной методикой
75 (20,4)
только методом перевернутого агара
67 (18,2)
двумя методиками одновременно
19 (5,8)