Универсальная синтетическая среда для выращивания патогенных и пробиотических микроорганизмов при получении биопрепаратов

УНИВЕРСАЛЬНАЯ СИНТЕТИЧЕСКАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ПАТОГЕННЫХ И ПРОБИОТИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ПОЛУЧЕНИИ БИОПРЕПАРАТОВ

Д.А. Евглевский, Ан.А. Евглевский, В.В. Семенютин, И.И. Смирнов, К.В. Татарников

Аннотация. Разработанная синтетическая среда с лимонной и янтарной кислотами с успехом может быть использована для выращивания патогенных и пробиотических микроорганизмов.

Ключевые слова', синтетическая среда, мясопептон-ный бульон, стафилококки, микобактерии туберкулеза, сальмонеллы, кишечная и синегнойная палочки, янтарная, лимонная кислота, пробиотика.

По своему происхождению питательные среды делят на естественные (кровяные, молочные, картофельные, яичные), искусственные с использованием универсального источника азота и углерода - пептонов, полученных путем неполного расщепления белков с помощью ферментов (пепсина, трипсина) - это различные гидролизаты: рыбные, казеиновые, мясные, дрожжевые - и синтетические питательные среды, приготовленные из сбалансированных химических компонентов (ЕСоротяев АИ., Бабичев С.А, 1998).

Известно, что мясопептонный бульон (МПБ), а в дальнейшем с глицерином является пригодным для выращивания многих микроорганизмов. В то же время для выращивания микобактерий туберкулеза используется ряд синтетических питательных сред (Лонга, Сатона, Линниковой, Дорсета). В настоящее время проводятся исследования по разработке синтетических сред вместо МПБ (ЕСоротяев А.И., 1998; Лазовская A.JL, 1964; Коваленко А.М., 2001).

Однако для получения стрептококкового, стафилококкового анатоксина, колибактериозных, сальмо-неллезных анатоксин-вакцин, синегнойной вакцины и т.д. для ветеринарных и медицинских целей по-

прежнему используются мясогидролизатные или ка-зеиногидролизатные бульоны для выращивания указанных микроорганизмов. Существенным их недостатком является непостоянство состава, незначительное накопление микроорганизмов и возможные аллергические проявления у вакцинированных животных и людей.

Изучено, что рост и развитие микроорганизмов на питательной среде зависит от ее качества, адаптации, привыкания. Практически выращивание микобактерий туберкулеза для получения туберкулезного аллергена - туберкулина и вакцины БЦЖ проводится исключительно на синтетических средах при полном исключении, изъятии мясопептонного глицериновою бульона или мясощдролизатов Хоттингера.

При этом следует учитывать, что микобактерии туберкулеза наиболее сложные микроорганизмы, содержащие в своем составе липиды, воск, полисахариды, протеины, обеспечивающие их устойчивость к антибиотикам, дезвеществам и способные расти на поверхности жидких питательных сред, в отличие от других микроорганизмов, выращиваемых глубинным способом, т.е. внутри питательной среды биобутылей и реакторов. В то же время ряд микроорганизмов выращивают на мясопептонном глицериновом бульоне, а не синтетических питательных средах.

С учетом масштабного производственного опыта выращивания микобактерий туберкулеза провели исследования по разработке состава синтетической среды, пригодной для выращивания стафилококков, сальмонелл, кишечной и синегнойной палочки.

В основу исследований положено изучение энергетической и питательной функции ряда ди- и

трикарбоновых кислот цикла Кребса, в частности с разным содержанием лимонной, янтарной, винной, пировиноградной, яблочной (изоянтарной) кислот отдельно, и в сочетании друг с другом, аспарагином - амидом аспарагиновой кислоты, глицином, цитратом аммония, сернокислым цинком и другими химическими компонентами.

Первоначально исходными экспериментальными вариантами синтетических сред являлись пригодные для максимального накопления микобактерий туберкулеза, а затем других микроорганизмов с учетом их физиологической потребности.

Введение лимонной и янтарной кислот (ди-, три-карбоновые кислоты цикла Кребса) способствует повышению обмена веществ у микроорганизмов, улучшению растворимости химических ингредиентов и образованию цитрата аммония при нейтрализации лимонной кислоты 5-10% раствором аммиака. Образование цитрата аммония как азотистого соединения, необходимого для построения белковых молекул микроорганизмов, способствует улучшению обмена веществ и росту микробной биомассы. Введение в состав питательной среды глицина в сочетании с аспарагином (амид аспарагиновой кислоты) улучшает биосинтез белковых структур микроорганизмов, а хлористый натрий и фосфорнокислый натрий двухзамещенный повышают буферность среды, способствуют сохранению pH среды при длительном выращивании микобактерий туберкулеза и стафилококков.

Испытанию были подвергнуты синтетические питательные среды, содержащие аспарагина от 3-х до 10 граммов на 1 литр дистиллированной воды отдельно и в смеси с лимонной, янтарной, изоянтарной, пировиноградной карбоновыми кислотами, цитратом аммония, с другими химическими ингредиентами.

После дополнительных проверок был определен состав синтетической питательной среды, обеспечивающей стабильное максимальное накопление бактериальной массы микобактерий туберкулеза до 12±1,0 г/литр сухой массы или 120±10,0 г отжатой через несколько слоев марли после автоклавирова-ния.

При этом состав среды включал две карбоновые кислоты цикла Кребса: 3,0 г/л янтарной и 10,0 г/л лимонной кислоты при снижении содержания дефицитного цитрата аммония в связи с его образованием при нейтрализации лимонной кислоты 5-10% раствором аммиака.

В последующем определено содержание аспарагина до 4 г/лигр дистиллированной воды при увеличении содержания сернокислого цинка до 0,5-0,7 г/лигр.

При замене 4,0 г/литр аспарагина на 5,0 г/литр глицином накопление и исходный рост микобактерий туберкулеза был одинаковым.

Увеличение аспарагина и глицина до 10-12 г/л, но без лимонной, янтарной кислот на 1 литр дистиллированной воды не обеспечивало хороший рост и накопление микобактерий туберкулеза. В то же время внесение в состав среды комплекса ди-, трикарбоновых кислот цикла Кребса по 2-3 г каждой кислоты (янтарной, изоянтарной, лимонной, винной, фумаровой, пировиноградной) позволяет исключить внесение дорогостоящих аспарагина и глицина. Установление необходимого количества сернокислого цинка проводили приготовлением вариантов сред, содержащих в 1 литре 0,1; 0,5; 1,0 грамма.

На вариантах питательных сред, содержащих 0,5 и 1,0г сернокислого цинка, рост и накопление микобактерий туберкулеза был одинаковый.

Содержание сухой бактериальной массы составляло 12-1 Зг с 1 литра среды, а в контрольном варианте без сернокислого цинка - 8-9г, но практически в 50% биобутылей происходило потопление пленки микобактерий туберкулеза с поверхности среды и рост микроорганизмов прекращался

В последующем были проведены исследования по приготовлению синтетической среды из предварительно смешанных ингредиентов в сухом ввде и определению значения показателя исходной реакции среды (pH) на рост и накопление микобактерий туберкулеза

При этом установлено, что оптимальным показателем реакции среды является pH 6,8-7,0, а при сдвиге pH среды в щелочную сторону свыше 7,2 исходный рост микобактерий туберкулеза не происходит.

Приготовление жидкой синтетической среды из предварительно смешанных ингредиентов в сухом виде не вызывало образования солевого осадка, помутнения среды и не влияло на рост и накопление микобактерий туберкулеза в течение 2-х месячного периода выращивания.

Многократное приготовление и выращивание микобактерий туберкулеза в 2-х литровых биобутылях с объемом среды, равной 1 литру, на разных вариантах состава синтетической среды, способов приготовления и Рн среды позволили определить оптимальный состав ингредиентов, обеспечивающих стабильное максимальное накопление микобактерий туберкулеза для получения нативного или «очищенного» туберкулезного аллергена (туберкулина) и туберкулезного анатоксина.

Предложенная жидкая синтетическая среда с успехом была использована для выращивания кишечных, синегнойных микроорганизмов, сальмонелл, а в дальнейшем стафилококков, протейной культуры, пробиотиков - лактобакгерий, бифидобактерий и сенной тпочки-Baccillus subtilis.

Однако при выращивании стафилококков на синтетической среде необходимо было проводить корректировку в сторону увеличения Рн среды до 7,5-7,6, т.е. до слабощелочной и повышением содержания хлористого натрия с 0,5 грамма до 5-6г/л.

Выращивание сальмонелл, кишечных, синегнойных микроорганизмов (Escherihia coli, Bacillus au-ruginosa) и пробиотиков в 2-х литровых биобутылях с объемом среды равной 1 литру в течение 2-3 суток обеспечивало высокое накопление бактериальной массы до концентрации 70-90 миллиардов микробных клеток в 1мл, а для обеспечения концентрации стафилококков до 11-12 миллиардов в 1мл необходимо увеличить длительность выращивания до 12-15 суток.

Исходя из полученных результатов был определен оптимальный состав и способы приготовления практически универсальной синтетической среды для выращивания микобактерий туберкулеза, стафилококков, сальмонелл, кишечной, синегнойной палочки, пробиотических микроорганизмов для получения анатоксинов, анатоксин-вакцин и пробиотиков (эу-биотиков).

Разработанная универсальная синтетическая среда в 1 литре дистиллированной воды содержит следующие ингредиенты в г/л: лимонной кислоты - 8,0; цитрата аммония - 2,0; янтарной кислоты - 3,0; аспарагина или глицина - 2,0; фосфорнокислого калия 2-х замещенного - 5,0; сернокислого магния - 0,5; сернокислого цинка - 0,3; фосфорнокислого натрия 2-х замещенного - 3,0; хлористого натрия - 0,5; сернокислого железа-0,1; глицерина - 40-50.

Реакцию среды устанавливают 5-10% раствором аммиака до 7,0-7,1 до автоклавирования. Для выра-

щивания стафилококков реакцию среды устанавливают до слабощелочной pH - 7,5-7,6 и при увеличении хлористого натрия до 5-6 г/л.

Результаты роста и накопления микроорганизмов на синтетической среде в 2-х литровых биобутылях с объемом среды, равной 1 литру, представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Накопление бактериальной массы при выращивании микроорганизмов на синтетической среде_________________________________________

№п/п Наименование микроорганизмов Сроки выращи- вания Накопление (концентрация) микроорганизмов

1 Микобактерии туберкулеза (бычьего вида) 30 суток 60 граммов авто-клавированной и отжатой бакмассы

60 суток 120 граммов авто-клавированной и отжатой бакшссы

2 Стафилококки (Золотистый) 7 суток 7-8 млрд/мл

12 суток 12±1,0 млрд/мл

3 Сальмонеллы 2-3 суток 70±10 млрд/мл

4 Кишечная палочка 2-3 суток 70±10 млрд/мл

5 Синегнойная палочка 2-3 суток Густая слизеподобная масса

6 Сенная палочка -ВассШин шЬиНэ 2-3 суток Густая слизеподобная масса

7 Лактобактерии 2-3 суток Густая слизеподобная масса

Из полученных данных следует, что синтетическая среда, содержащая в своем составе лимонную, янтарную кислоты с аспарагином, глицином и мик-

роэлементами, обеспечивает стабильное высокое накопление микобактерий туберкулеза, стафилококков, кишечной, синегнойной палочки, сальмонелл, ряда пробиотических микрорганизмов и получение высокоактивных биопрепаратов.

Список использованных источников

1 Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология/ А.И. Коротяев, С.А. Бабичев. -СПб.: Специальная литература, 1998.-558с.

2 Лазовская, А.Л. Значение цикла трикарбоновых кислот в жизнедеятельности микобактерий туберкулеза// Труды 1-го Всесоюзного биохимического съезда. - Л., 1964.-С.174-175.

3 Коваленко, А.М. Синтетическая среда для культивирования микобактерий туберкулеза и БЦЖ/ А.М. Коваленко// Патент №35088А. Украина; МКИ с 12№; 1/20; 2001.

Информация об авторах

Евглевский Дмитрий Анатольевич, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник Курского НИИ АПП.

Евглевский Анатолий Алексеевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры эпизоотологии радиобиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».

Семенютин Владимир Владимирович, доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Белгородская ГСХА».

Смирнов Игорь Иванович, аспирант ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».

Татарников Кирилл Викторович, аспирант ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».