СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО МЕТОДОМ КУЛЬТУРЫ ПОЧЕК IN VITRO
METHOD OF REPRODUCTION OF TRANSGENIC PLANTS OF MEADOW CLOVER BY BUD CULTURE IN VITRO

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано для получения и поддержания коллекции трансгенных растений клевера лугового с ценными признаками, в исследованиях по физиологии и генетике растений.
Известен способ регенерации растений клевера лугового при генетической трансформации [1].
5
5
5
Регенерацию растений осуществляют из культивируемой трансформированной морфогенной культуры клевера на питательной среде Гамборга В с добавлением канамицина и цефотаксима, причем морфогенную культуру получают без образования дедифференцированной ткани путем культивирования гипокотиля на питательной среде Гамборга В с добавлением с 4,0 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП), 1,0 мг/л кинетина и 0,05 мг/л α-нафтилуксусной кислоты (НУК) с дальнейшей пересадкой эксплантов на свежую среду того же состава с 2,0 мг/л БАП, а эпикотильную часть проростков сохраняют путем культивирования на среде Гамборга В без гормонов или путем микроразмножения на среде того же состава с добавлением 2,0 мг/л БАП.
К недостаткам данного способа можно отнести следующее. Использование как эпикотильной, так и гипокотильной частей проростков для размножения созданных трансгенных растений невозможно, так как полученные растения были бы следующего семенного поколения. Получение же растений-регенерантов из морфогенных культур 24-х и более пассажей иногда невозможно в связи с их гибелью в результате инфицированности. В связи с этим возникает необходимость повторного введения в культуру вегетирующих трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro.
5
Имеются методические указания по регенерации и размножению клевера лугового в культуре in vitro [2]. Регенерация растений клевера лугового осуществляется путем выделения почек из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2,0 см с пазушными почками вегетирующих растений клевера лугового и помещения их на агаризованную питательную среду Гамборга В.
К недостаткам этого способа можно отнести следующее. Питательная среда содержит уменьшенную вдвое концентрацию всех входящих в ее состав компонентов. Это способствует быстрой регенерации интактных растений клевера лугового с корнями, но не обеспечивает образования морфогенной ткани, необходимой для длительного поддержания в культуре in vitro коллекции трансгенных растений клевера лугового. Кроме того, размножение данным способом осуществляется на питательных средах, не содержащих селективный фактор - канамицин. Это значительно увеличивает риск получения в процессе размножения нетрансгенных растений.
Цель изобретения - разработка способа размножения трансгенных растений клевера лугового методом культуры почек in vitro, позволяющего повторно вводить в культуру in vitro трансгенные растения клевера лугового, получать длительно культивируемую морфогенную ткань, изучать экспрессию введенных генов в вегетативно размноженных трансгенных растениях клевера лугового.
5
5
5
В предлагаемом способе поставленная цель достигается тем, что выделенные из поверхностно стерилизованных в течение 5 мин в 0,1%-ном водном растворе диоцида и 4-5 раз промытых в стерильной воде отрезков стеблей длиной 1,5-2,0 см с пазушными почками вегетирующих трансгенных растений клевера лугового почки помещают на агаризованную питательную среду Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и культивируют до размера не менее 4,0 мм, а затем 4 пассажа на агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина до образования морфогенной ткани только с зелеными побегами, при этом размноженными трансгенными (канамицин устойчивыми) растениями считаются зеленые регенераты клевера лугового, образовавшие корни не менее 50 мм на агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.
Способ осуществляется следующим образом.
5
Отрезки стеблей с пазушными почками длиной 1,5-2,0 см промывали в проточной водопроводной воде (10 мин) и поверхностно стерилизовали в течение 5 минут в 0,1%-ном водном растворе диоцида (при встряхивании). После стерилизации отрезки стеблей 4-5 раз промывали автоклавированной (стерильной) водой. Затем от них отделяли пазушные почки, которые помещали на агаризованную питательную среду Гамборга В с 2,0 мг/л БАП. После 3-4-х недель культивирования почки размером не менее 4 мм и без видимых признаков инфицированности помещали на питательную среду того же состава, но с добавлением 50 мг/л канамицина (селективного фактора). Морфогенную ткань, образующуюся из почек на селективной среде, делили на части, отбраковывая альбиносные побеги. После 4-х пассажей на селективной среде отбирали морфогенную ткань только с зелеными побегами. Образовавшиеся из них на селективной среде растения с корнями не менее 50 мм высаживали в вегетационные сосуды с почвой.
Пример 1.
Влияние размера эксплантов на выживаемость почек клевера лугового в культуре in vitro.
5
5
Проводили микроразмножение вегетирующих трансгенных растений клонов LGVac2 и Tr Топ12 клевера лугового, созданных с помощью генетических конструкций, содержащих селективный ген канамицинустойчивости [3]. Отрезки стеблей с почками брали с вегетирующих растений в фазе цветения. Поверхностно простерилизованные пазушные почки помещали по 30 шт. в чашки Петри с питательной агаризованной средой Гамборга В с 2,0 мг/л БАП. После 3-х недель культивирования часть неинфицированных эксплантов пересаживали на агаризованную среду Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина и без него. Все почки клевера лугового размером менее 4,0 мм на селективной среде к 20-му дню культивирования погибли (табл. 1), тогда как почки не менее 4,0 мм на той же среде оставались зелеными.
1. Влияние размера эксплантов на выживаемость почек клевера лугового в культуре in vitro
Таким образом, чем больше размер эксплантов (почки), помещенных на селективную среду с канамицином, тем больше (в 4,4-9,5 раз) выживших эксплантов к 3-4 неделе культивирования. При этом несколько возрастает число инфицированных эксплантов у LGVac2 и Tr Топ12 1,4-1,8 раз на селективной среде и в 1,7-2,2 раза в контроле (без канамицина). Однако в вариантах с эксплантом размером меньше 4,0 мм у LGVac2 не было ни одного зеленого экспланта и только 0,1% - у Tr Топ12, в то время как в вариантах с эксплантами не менее 4,0 мм как у LGVac2, так и у Tr Топ12 к 3-4 неделе культивирования на селективной среде число зеленых эксплантов отличалось от контроля на 15,4 и 0,2% соответственно.
Пример 2
5
Получение морфогенной ткани с зелеными побегами у трансгенных растений клевера лугового на селективной питательной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина.
5
Для получения морфогенной ткани с зелеными побегами на агаризованную питательную среду Гамборга В с 2 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина помещали почки зеленого цвета не менее 4,0 мм и субкультивировали несколько пассажей на среде того же состава до получения морфогенной ткани с зелеными побегами.
5
Почки зеленого цвета после повторного культивирования на агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина формировали в зависимости от пассажа морфогенную ткань со смешанными (зелеными и альбиносными) или только зелеными побегами (табл. 2).
2. Получение морфогенной ткани с зелеными побегами у трансгенных растений клевера лугового на селективной среде с 50 мг/л канамицина
При каждом последующем пассаже на селективную среду того же состава помещали части морфогенной ткани только с зелеными побегами, которые через 20-25 дней культивирования формировали различное число морфогенных культур клевера лугового.
Количество морфогенных культур со смешанными побегами (зелеными и альбиносными) возрастало к 3-му пассажу с 0% до 43,4% и 39,1% и уменьшалось к 4-му до 8,3% и 10,1% у LGVac2 и Tr Топ12, соответственно, т.е. химерность морфогенных культур проявлялась только ко 2 и 3-му пассажу.
5
В связи с этим в 1-м пассаже наблюдались культуры только с зелеными побегами. При этом их число уменьшалось к 3-му пассажу до 49,1% и 59,4% в связи с проявлением химерности, а так как для каждого последующего пассажа отбирали части морфогенной ткани только с зелеными побегами, отбраковывая альбиносные побеги, то их число возрастало до 91,9% и 89,3% LGVac2 и у Tr Топ12 соответственно. После 4-х пассажей на селективной среде отбирали морфогенную ткань только с зелеными побегами. Образующиеся из них на селективной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП и 50 мг/л канамицина растения-регенеранты с корнями не менее 50 мм высаживали в вегетационные сосуды с почвой для получения семян.
5
Таким образом, для получения канамицинустойчивых трансгенных растений клевера лугового почки поверхностно стерилизуют и сначала культивируют на агаризованной питательной среде Гамборга В с 2,0 мг/л БАП в течение 3-4 недель без селективного фактора, а затем 4 пассажа на среде того же состава, но с добавлением 50 мг/л селективного фактора канамицина. Растения-регенеранты с корнями не менее 50 мм получают на селективной среде из зеленых побегов морфогенной ткани, не имеющей альбиносных побегов из 4-го пассажа.
Разработанный способ позволяет повторно вводить в культуру in vitro трансгенные растения клевера лугового, получать длительно культивируемую морфогенную ткань, изучать экспрессию введенных генов в вегетативно размноженных трансгенных растениях клевера лугового.
Источники информации
1. Пат. 2305931 РФ, МПК А01Н 4/00, А01Н 5/00, A01G 7/00. Способ регенерации растений клевера лугового при генетической трансформации / Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н., Куренина Л.В., Лапотышкина Л.И. (РФ). - №2005117826/13: заявлено 09.06.2005; опубл. 20.09.2007. - Бюл. №26. - 6 с.
2. Мезенцев А.В., Любавина Л.А. Методические указания по регенерации и размножению клевера лугового в культуре in vitro. – М., 1983. - 17 с.
3. Пат. 2420060 РФ, МПК А01Н 4/00. Способ генетической трансформации растений селекционно-ценных образцов клевера лугового. / Солодкая Л.А.. Лапотышкина Л.И., Клименко И.А., Агафодорова М.Н. (РФ). - №200914286/10: заявлено 18.11.2009; опубликовано 10.06.2011. - Бюл. №16. - 8 с.