Результаты трансплантации культуры аутогенных стромальных клеток костного мозга в область краевого дефекта длинных трубчатых костей

РЕЗУЛЬТАТЫ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КУЛЬТУРЫ АУТОГЕННЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В ОБЛАСТЬ КРАЕВОГО ДЕФЕКТА ДЛИННЫХ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ

Деев Р.В., Цупкина Н.В.*, Иванов Д.Е., Николаенко Н.С.*, Дулаев А.К., Гололобов В.Г., Пинаев Г.П.*

Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова,

начальник - академик РАМН, д.м.н. профессор Б.В. Гайдар

* Институт цитологии РАН,

директор - д.б.н. профессор В.Н. Парфенов

Санкт-Петербург

Процесс репаративной регенерации костной ткани, как и любой другой биологический процесс, имеет генетически обусловленные временные и пространственные константы. Временные параметры репаративного остеогистогенеза после травмы костного органа имеют биологически обусловленные значения, которые зависят от многих причин. Оптимальным по времени является первичное костное сращение. Однако протекает оно только при благоприятных условиях: репозиции, иммобилизации, васкуляризации и др. [2]. Их обеспечение и является элементом влияния на скорость остеорепарации. В случае формирования переломов или дефектов, консолидирующихся через образование сложного регенерата, в действие вступают иные временные константы. В арсенале травматолога также имеются методы обеспечения оптимального протекания остеогистогенеза - оптимизации сращения.

Многие клиницисты отдают предпочтение сочетанию остеосинтеза с применением ауто- или алллопластики в различных модификациях (ин-тра-, экстра- и интра-экстрамедуллярно), что дает положительные результаты в 70% и 76% случаев соответственно [1, 12, 16, 17]. Механизм действия трансплантатов костной ткани на процесс репарации широко обсуждается. Ряд авторов придают главенствующее значение привнесению в зону повреждения костных клеток - остеобластов и их предшественников (в случае использования свежих ауто- и аллотрансплантатов) [8, 15, 16]. Об этом косвенно свидетельствуют и лучшие результаты пластики губчатой костью по сравнению с компактной, поскольку первая содержит большее количество клеточных элементов и фрагменты костного мозга, в котором среди прочих имеются стволовые стромальные клетки, имеющие потенции к дифференцировке по остеобластическому пути [10, 16, 19, 24].

Применение предшественников костных клеток с целью оптимизации течения репаративных процессов при переломах, дефектах и их осложнениях имеет патогенетическое обоснование. Врачи уже получили положительные результаты, которые свидетельствуют о доступности подобных методик, их приемлемой стоимости и перспективности для лечения дефектов костей [21, 23].

Исходя из теоретических предпосылок, были выполнены экспериментальные исследования по использованию стромальных клеток костного мозга и их дифференцированных производных для лечения заболеваний и повреждений органов опорно-двигательного аппарата [6]. Подтверждено положительное влияние клеточных культур на восстановление специализированной ткани в области дефектов длинных костей конечностей. Первый опыт применения в травматологии и ортопедии культивированных аутогенных клеток принадлежит отечественным специалистам, которые таким образом лечили ложные суставы и дефекты длинных костей конечностей [9]. Одной из сложных проблем является выбор адекватного носителя для культуры клеток [11].

Вне поля зрения исследователей, как правило, остается реакция реципиентного ложа на трансплантацию клеток, свое внимание они концентрируют лишь на восстановлении функции органов и тканей. Остаются неописанными особенности ре-паративного остеогистогенеза при трансплантации культивированных остеогенных клеток.

Цель исследования - изучить репаратив-ный остеогистогенез в области краевого дефекта большеберцовой кости у кролика при трансплантации культуры аутогенных стромальных клеток костного мозга.

Эксперимент выполнен на кроликах обоего пола породы шиншилла после адаптации к усло-

виям вивария. Все манипуляции осуществляли с соблюдением правил гуманного обращения с животными [22]. Перед операцией проводилась стандартная премедикация.

Стромальные клетки выделяли из костного мозга, заключенного в крыльях подвздошных костей. Культивирование осуществляли в соответствии с известными протоколами [12, 14].

Далее всем животным формировали краевой дефект в верхней трети большеберцовой кости протяженностью до 2,0 см и на 1/3 окружности диафиза. Костный мозг удаляли. Животных делили на две серии: контрольную (I) - 12 и основную (II) - 18 (табл.). У животных I серии заживление дефекта большеберцовой кости происходило без дополнительных лечебных манипуляций. Животным II серии через 2 - 4 суток после формирования дефекта местно инъекци-онно вводили культивированные аутогенные костномозговые стромальные клетки в коллагено-вом геле, в количестве не менее 106. Во всех случаях иммобилизацию не осуществляли.

Таблица

Распределение животных по экспериментальным сериям и срокам наблюдения

Серии Сроки наблюдения, сутки Всего

опытов 3 7 15 30 90 120

I (контроль) 2 2 2 2 2 2 12

II 3 3 3 3 3 3 18

Итого 5 5 5 5 5 5 30

Процессы заживления оценивали по данным динамического клинического наблюдения, при помощи рентгенографии и морфологических методов: световой микроскопии, сканирующей электронной микроскопии через 3, 7, 15, 30, 90, 120 суток. По истечении сроков наблюдений животных выводили из эксперимента путем трехкратной передозировки наркотических веществ. Выделенные костные фрагменты фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, декальцинировали в перенасыщенном растворе трилона Б, распиливали во фронтальной и сагиттальной плоскостях (рис. 1). После традиционной проводки и заливки в парафин изготавливали серийные срезы толщиной 8 мкм. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином по Майеру и эозином, а также трехкомпонентными красителями для элективного выявления различных видов соединительной ткани по Маллори, по Румянцеву в модификации Л.А. Алексиной.

Для сканирующей электронной микроскопии кусочки тканей фиксировали в 2,5% растворе глу-тарового альдегида. Инкубировали в 2,5% растворе трипсина при 370 в течение 12 часов, затем в 5% растворе гипохлорида натрия - 30 минут. В дальнейшем препараты обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, напыляли золотом и

изучали в растровом электронном микроскопе 1ЕОЬ ^М - 35С при ускоряющем напряжении 15 кУ.

Рис. 1. Плоскости распилов костного фрагмента.

У животных I серии через 3 суток после операции зона дефекта была заполнена гематомой с элементами разрушенного желтого костного мозга, что проявлялось обнаружением дискретных скоплений адипоцитов. Гематома была умеренно инфильтрирована полиморфноядерными лейкоцитами. При изучении костных краев дефекта реактивных изменений не обнаруживали. Отсутствовало запустевание остеоцитарных лакун, являющееся типичным признаком нарушения кровоснабжения костной ткани, развивающегося в первые трое суток. Пролиферация камбиальных элементов со стороны периоста и эндоста не отмечалась.

Первые признаки некробиотических процессов были зафиксированы через 15 суток после операции. Они проявлялись в незначительном количестве погибших остеоцитов у краев костного дефекта. При изучении поперечных срезов глубина залегания пустых остеоцитарных лакун в отдельных местах достигала диаметра 1,5 ос-теонов. Со стороны периоста и эндоста проли-феративных изменений не наблюдалось. Более того, регистрировались изменения со стороны этих структур, проявлявшиеся в гибели клеток и частичной отслойке вблизи дефектов (рис. 2).

На 30 сутки эксперимента отмечали активный процесс репаративного остеогистогенеза, что выражалось в локальном утолщении периоста вблизи краев дефекта за счет пролиферации его остеогенного слоя. Со стороны эндоста наблюдали формирование небольшого количества тра-бекул ретикулофиброзной костной ткани на границе с организованной гематомой.

Рис. 2. Край костного дефекта большеберцовой кости кролика контрольной серии: 1 — периост; 2 — костномозговой канал; 3 — просвет дефекта. Окраска по Румянцеву-Алексиной. Увеличение х 100.

Гематома была разделена на множество участков тяжами волокнистой соединительной ткани. Со стороны краев костных дефектов выраженных пролиферативных изменений не обнаруживали. Наблюдалось расширение некоторых каналов остеонов, заполнение их реактивно измененной соединительной тканью, неоваскулоге-нез, локальные отложения остеоида в некоторых просветах гаверсовых систем.

Через 60 суток дефект оставался незаполненным костной тканью. Дефект и костномозговой канал были выполнены организованной гематомой. Края костного дефекта имели признаки остеоге-неза, который оставался весьма невыраженным.

Через 90 суток после начала эксперимента в костной ране были обнаружены признаки выраженного остеогистогенеза. Костномозговой канал был заполнен ретикулофиброзной костной тканью, организованной в виде многочисленных ветвящихся трабекул. Межтрабекулярные пространства были заполнены соединительной тканью. Со стороны периоста наблюдали формирование развитого костного регенерата, по своему строению сходному с эндостальным. Несмотря на признаки выраженного остеогенеза, края костного дефекта не были сомкнуты, и между ними оставался видимый макроскопически дефект диафиза.

Через 120 суток наблюдали смыкание краев дефекта. На этот срок как со стороны периоста, так и со стороны костномозгового канала сохранялся выраженный костный регенерат, что подтверждается и рентгенологическими данными (рис. 3). Однако канал в проекции дефекта был заполнен трабекулами ретикулофиброзной костной ткани, в промежутках между которыми располагалась волокнистая соединительная ткань с редкими очага-

ми кроветворения. Сама костная ткань диафиза, образованная на месте дефекта, обладала существенными отличиями в своих тинкториальных свойствах: преимущественно не имела остеонной организации; возникшие остеоны располагались хаотично; количество слоев костных пластинок было незначительным (1 - 3).

Рис. 3. Рентгенограмма костей задней конечности кролика контрольной серии спустя 120 суток после повреждения. В верхней трети большеберцовой кости — мощно развитый регенерат в области сегментарного дефекта.

При изучении препаратов от животных II серии установлено, что трансплантация культуры аутогенных стромальных клеток имеет существенное влияние на ход восстановления костной ткани, что, прежде всего, выражалось в более раннем наступлении этапов репаративного процесса. Фаза ранних посттравматических изменений к 15 суткам сменялась пролиферативной фазой регенерации. Остеогенные клетки периоста и эндоста дифференцировались по остеоб-ластическому пути, что приводило к формированию костной ткани регенерата. Регенерат был представлен петлистыми трабекулами костной ткани, промежутки между которыми заполнялись элементами красного костного мозга. Развитие регенерата наблюдалось как со стороны костномозгового канала, так и со стороны периоста. Новообразованные трабекулы ретикулофиброз-ной костной ткани анастомозировали в области края дефекта (рис. 4). Костномозговой канал в проекции дефекта был заполнен реактивно измененной соединительной тканью, разобщенной формирующимися трабекулами костной ткани.

Через 30 суток на препаратах наблюдали выраженное развитие всех частей костного регенерата - периостальной, эндостальной, интер-медиарной (рис. 5 - 7), что приводило к упрочнению кости в области дефекта. Обращало на себя внимание то, что весь костномозговой канал был заполнен короткими, анастомозирующи-ми трабекулами. Компактное вещество кости в проекции дефекта было образовано ретикуло-фиброзной костной тканью, однако четко про-

слеживалась тенденция к остеонной организации новой костной ткани. Аналогичная картина остеогенеза наблюдалась у контрольных животных лишь на 90 сутки.

а б

Рис. 5. Периостальный костный регенерат спустя 30 суток после повреждения. Окраска: а — по Маллори; б — по Румянцеву-Алексиной. Увеличение: а х 32, б х 100.

Рис. 7. Костный регенерат вблизи зоны дефекта большеберцовой кости спустя 30 суток: 1 — периос-тальная часть; 2 — интермедиарный регенерат; 3 — эндостальная часть. В поперечно срезанном компактном веществе диафиза обнаруживаются расширенные ремоделирующиеся каналы остеонов (>). СЭМ. Увеличение х 55.

К 60 суткам область дефекта была практически восстановлена. В бывшей ране превалировали процессы адаптивной перестройки костного регенерата - ремоделирования, что преимущественно выражалось в резорбции избыточного количества костных трабекул в костномозговом канале. Их уменьшение со стороны периоста приводило к видимому уменьшению объема наружной ее части. Образованная костная ткань дефекта практически полностью «закрывала» место бывшего дефекта.

Следует особо отметить, что ее гистологическая организация отличалась от таковой у животных контрольной серии. В воссозданном участке диафиза наблюдали большое количество сформированных остеонов; остеоны новообразованной кости составляли ее основной объем и лишь в некоторых местах были разобщены незначительными прослойками ретикулофиброзной костной ткани или костными пластинками (рис. 8).

Через 90 суток дефект большеберцовой кости был полностью замещен костной тканью. Костномозговой канал освобожден от избыточного количества трабекул ретикулофиброзной костной ткани. Периостальная часть регенерата была подвергнута ремоделированию, что подтверждалось и рентгенологическими данными (рис. 9). К концу эксперимента (через 120 суток) наблюдались те же признаки. При изучении поперечных срезов вновь образованной кости на месте бывшего дефекта удавалось выявить границу с бывшим краем дефекта (рис. 10), однако большая часть воссозданного участка кости имела остеонную организацию.

Не наблюдали образования островков костной ткани по ходу канала либо вне связи с источниками рассредоточенного камбия - периоста, эндоста, собственно костной ткани диафиза.

Рис. 6. Эндостальный костный регенерат спустя 30 суток после повреждения. Окраска: а — по Маллори, б — по Румянцеву-Алексиной. Увеличение: а х 100, б х 250.

Рис. 4. Край дефекта большеберцовой кости после трансплантации культуры клеток в коллагеновом геле через 15 суток, поперечный срез: 1 — периостальный регенерат; 2 — эндостальный регенерат; 3 — компактное вещество диафиза. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 32.

процесса в отличие от консолидации переломов той же локализации. Дефект кости является особым видом повреждения, при котором костная ткань отсутствует на протяжении более 1,0 см. Несмотря на это, в репаративном гистогенезе при заращении дефекта наблюдаются те же основные фазы, которые описаны для повреждения костных органов [4, 5].

Таким образом, посттравматический остеоги-стогенез в области протяженного краевого дефекта длинных трубчатых костей протекает на основе известных закономерностей и претерпевает три фазы развития: ранних посттравматических изменений, регенерации и функциональной адаптации. Однако последняя фаза не явилась основой восстановления органотипической архитектоники большеберцовой кости, так как в конце наблюдения (120 сут) дефект оставался заполненным ретикулофиброзной костной тканью; структурно-функциональные единицы кости (остеоны) существенно отличались от таковых в интактной кости. Все это свидетельствовало о том, что через 120 суток процессы адаптивной перестройки не завершались.

В регенерате практически отсутствовала хрящевая ткань, в то время как при заживлении механических и огнестрельных переломов именно хрящ формирует первичный регенерат, призванный экстренно стабилизировать зону патологической подвижности [5]. Поскольку в случае краевого дефекта патологическая подвижность отсутствует, то репаративный процесс изначально направлен на гистотипическую регенерацию -воссоздание утраченного фрагмента костной ткани, минуя механизм энхондрального остеогисто-генеза. Эта закономерность была подмечена еще A.A. Заварзиным [7], а объяснение ей было дано позже [13].

Данные, полученные при изучении репаратив-ного процесса у животных контрольной серии, в целом согласуются с ранее описанными закономерностями, показанными на модели краевого дефекта у собак [20]. Хрящевую ткань обнаруживали в регенератах только при наличии в области дефекта перелома (2 наблюдения) и формировании патологической подвижности. В обоих случаях консолидация наступала без иммобилизации.

Сведения об остеогистогенезе у животных, которым в область краевого дефекта пересаживали культуру клеток, свидетельствуют в пользу оптимизирующего воздействия на течение этого процесса.

Привнесенная культура костномозговых стро-мальных клеток в коллагеновом геле приводит к тому, что динамика посттравматических изменений костной ткани характеризуется большей скоростью, хотя и включает те же стереотипные изменения. Так, по нашим данным, наступление

Рис. 9. Рентгенограмма костей задней конечности кролика через 90 суток после трансплантации культуры клеток в область дефекта большеберцовой кости. Целостность кости и проходимость костномозгового канала восстановлены.

Рис. 10. Воссозданная костная ткань в области бывшего дефекта через 120 суток. Граница между старой и воссозданной костной тканью Окраска по Румянцеву-Алексиной. Увеличение х 250.

Изучение посттравматического остеогистоге-неза в области краевого дефекта большеберцовой кости свидетельствует об особенности этого

Рис. 8. Воссозданная костная ткань в области бывшего дефекта спустя 60 суток. Формирование структур по типу первичных остеонов. Окраска: по Румянцеву-Алексиной. Увеличение х 250.

пролиферативной фазы у животных можно было наблюдать уже на 7 сутки, в отличие от контроля, где они отчетливо регистрировались лишь на 30. Развитие мощного костного регенерата с выраженными эндостальной, периостальной и интермедиарной частями наблюдали на 30 сутки опыта. В контроле подобные изменения наступали лишь на 60 - 90 сутки. Редукционная резорбция ретикулофиброзных трабекул костной ткани с восстановлением проходимости костномозгового канала и полное «закрытие» дефекта диафиза наблюдается у животных при внесении культуры клеток на 30 суток раньше, чем в контроле. Причем за 120 суток опыта полного восстановления целостности кости у контрольных животных так и не произошло.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что пересаженная культура стромальных клеток костного мозга обладает отчетливым индуцирующим и оптимизирующим влиянием на течение остеорепаративных процессов. В качестве механизмов воздействия на посттравматическую регенерацию можно предложить: индуцирующее воздействие культуры стромальных клеток костного мозга на клеточные элементы костной раны с остеогенной детерминацией и на клетки потенциально способные к остеогенной дифференцировке; непосредственное участие в остеогистогенезе трансплантированных стро-мальных клеток путем их дифференцировки в остеогенные клетки, а затем в остеобласты - продуценты костной ткани. Возможность такой диф-ференцировки показана в экспериментах in vitro, а также in vivo на мышах [18, 21].

Следует отметить, что экспериментальные исследования по оптимизации остеогенеза при тотальном дефекте длинной кости конечности, выполненные на кроликах, в целом демонстрируют тенденцию на усиление репаративного ос-теогенеза даже при инъекционном введении взвеси культивированных стромальных клеток [6].

Пересаженные в коллагеновом геле клетки в большей степени реализуют свои оптимизирующие свойства, что связано как с непосредственным воздействием компонентов геля, так и с трехмерной организацией культуры, которая необходима стро-мальным клеткам для реализации своих остеоб-ластических потенций. Коллагеновый гель при этом выступает не только как химический индуктор и организатор трехмерного расположения клеток, но и препятствует чрезмерному распространению пересаженной культуры по внутреннему объему дефекта или ходу костномозгового канала.

Таким образом, репаративный остеогистогенез в области краевого дефекта длинной трубчатой кости после пересадки культивированных костномозговых стромальных клеток в коллагено-вом геле характеризуется рядом особенностей.

На 30 суток сокращаются сроки восстановления целостности костной ткани на месте дефекта: кость и костномозговой канал восстановились к 90 суткам. В данном эксперименте наблюдалась ранняя гистотипическая организация пластинчатой костной ткани воссозданного участка с организацией остеонов - основных структурно-функциональных единиц компактного вещества длинных трубчатых костей.

Литература

1. Богданов, Ф.Р. О хирургическом лечении больных с осложненными ложными суставами и дефектами большеберцовой кости / Ф.Р. Богданов, И.Г. Анто-нюк // Ортопедия, травматология. — 1965. — № 3.

— С. 9-14.

2. Виноградова, Т.П. Регенерация и пересадка костей / Т.П. Виноградова, Г.И. Лаврищева. — М. : Медицина, 1974. — 247 с.

3. Выделение и культивирование стромальных клеток костного мозга с целью их дальнейшего использования в лечении дефектов костной ткани / Н.С. Николаенко [и др.] // Трансплантология. — 2003.

— Т. 4. — С. 169—171.

4. Гололобов, В.Г. Регенерация костной ткани при заживлении огнестрельных переломов / В.Г. Гололо-бов. — СПб. : Петербург XXI, 1997. — 160 с.

5. Гололобов, В.Г. Посттравматическая регенерация костной ткани. Современный взгляд на проблему / В.Г. Гололобов // Фундаментальные и прикладные проблемы гистологии. Гистогенез и регенерация тканей : труды ВМедА. — СПб. : ВМедА, 2004. — Т. 257. — С. 94—109.

6. Денисов-Никольский, Ю.И. Актуальные проблемы теоретической и клинической остеоартрологии / Ю.И. Денисов-Никольский, С.П. Миронов, Н.П. Омельяненко, И.В. Матвейчук. — М. : Новости, 2005.

— 336 с.

7. Заварзин, А.А. Очерки эволюционной гистологии крови и соединительной ткани / А.А. Заварзин. — М.-Л. : изд-во АН СССР, 1953. — Т. 4. — 720 с.

8. Макажанов, Х.Ж. Аутопластика при ложных суставах / Х.Ж. Макажанов, О.Х. Макажанов. — Алма-Ата : Казахстан, 1977. — 112 с.

9. Осепян, И.А. Лечение несращений, ложных суставов и дефектов трубчатых костей трансплантацией аутологичных костномозговых фибробластов, выращенных in vitro и помещенных на спонгиозный костный матрикс / И.А. Осепян, Р.К. Чайлахян, Е.С. Гарибян // Ортопедия, травматология. — 1982. — № 9. — С. 59 — 61.

10. Остеогенные клетки и их использование в травматологии / А.К. Дулаев [и др.] // Медицинский академический журн. — 2003. — Т. 3, № 3. — С. 59 — 66.

11. Перспективы применения в стоматологии материалов «Биоматрикс» и «Алломатрикс-имплант» в сочетании с остеогенными клетками-предшественниками костного мозга / С.Ю. Иванов [и др.] // Клиническая имплантология и стоматология. — 2001.

— № 3/4. — С. 37 — 40.

12. Савельев, В.И. Аллотрансплантация формалинизи-рованной костной ткани в травматологии и орто-

педии / В.И. Савельев, Н.В. Корнилов, Д.Е. Иван-кин, С.А. Линник. - СПб. : Морсар АВ, 2001. -208 с.

13. Участие трансфузированных клеток костного мозга в репаративном остеогистогенезе / Р.В. Деев [и др.] // Цитология. - 2005. - Т. 46. - С. 755-759.

14. Формирование и морфофункциональная характеристика остеобластического фенотипа в клеточных культурах in vitro / Р.В. Деев [и др.] // Цитология. - 2004. - Т. 46. - С. 185-190.

15. Хэм, А. Гистология / А. Хэм, Д. Кормак. - М. : Мир, 1983. - Т. 3. - 293 с.

16. Чаклин, В.Д. Костная пластика / В.Д. Чаклин. - М. : Медицина, 1971. - 228 с.

17. Brighton, C.T. Tibial nonunion treated with direct current, capacitive coupling, or bone graft / C.T. Brighton, P. Shaman, R.B. Heppenstall // Clin. Orthop. - 1995. -N 321. - Р. 223-234.

18. Kuznetsov, S.A. A look at the history of bone marrow stromal cells / S.A. Kuznetsov, P.G. Robey // Graft. -2000. - Vol. 3, N 6. - P. 278-283.

19. Long, M.W. Regulation of human bone marrow-derived osteoprogenitor cells by osteogenic growth factors / M.W. Long, J.A. Robinson, E.A. Ashcraft, K.G. Mann // J. Clin. Invest. - 1995. - Vol. 2. - P. 881-887.

20. Mesdows, T.H. Effect of weight-bearing on healing of cortical defects in the canine tibia / T.H. Mesdows, J.T. Bronk, E.Y.S. Chao, P.J. Kelly // J. Bone Joint Surg. - 1990. - Vol. 72-A, N 7. - P. 1074-1080.

21. Pedicled bone flap formation using transplanted bone marrow stromal cells / M.H. Mankani [et al.] // Arch. Surg. - 2001. - Vol. 136, N 3. - P. 263-270.

22. Report of the AVMA Panel on Euthanasia // JAMA.

- 2001. - Vol. 218, N 5. - P. 669-696.

23. Schaefer, D.J. Tissue engineering with mesenchymal stem cells for cartilage and bone regeneration / D.J. Schaefer, C. Klemt, X.H. Zhang, G.B. Stark // Chirurg.

- 2000. - Vol. 79, N 9. - P. 1001 -1008.

24. Triffitt, J.T. Osteogenesis: Bone development from primitive progenitors / J.T. Triffitt, C.J. Joyner, R.O.C. Oreffo, A.S. Virdi // Biochem. Soc. Trans. - 1998. -Vol. 26, N 1. - P. 21-26.