Способ моделирования устойчивой фибрилляции предсердий у животных (варианты)
METHOD FOR MODELING STABLE ATRIAL FIBRILLATION IN ANIMALS (VARIANTS)

Группа изобретений относится к биологии, а именно к созданию модели устойчивой фибрилляции предсердий (ФП) у крупных животных с целью дальнейшего использования при проведении фармакологических исследований лекарственных средств, в качестве полигона для разработки и оптимизации способов лечения ФП, для прогнозирования исходов ФП при применении того или иного способа лечения, для исследования патогенеза различных стадий развития ФП, для обучения врачей-хирургов существующим методикам лечения ФП.
Фибрилляция предсердий представляет самый частый вид наджелудочковой тахиаритмии, встречающийся в клинической практике кардиологов (Krijthe BP, 2013).
При ФП регистрируется хаотическая электрическая активность предсердий с частотой, достигающей 350-700 в минуту с отсутствием Р волны на ЭКГ, при которой отсутствует возможность координированного сокращения миокарда предсердий, которая, как правило, сочетается с нерегулярным ритмом желудочков (Kirchhof P., 2016). Согласно исследованию, проведенному специалистами американской ассоциации кардиологов (Chung, 2020), мерцательная аритмия является самой серьезной угрозой среди всех нарушений сердечного ритма и на 2020 год она имеется более чем у 33 миллионов людей в мире.  К факторам, повышающим риск возникновения и развития ФП, относятся ожирение, наличие диабета, малоподвижный образ жизни, наличие фактов ночного апноэ, ишемической болезни сердца, гипертензии и хронического алкоголизма. Если у пациента имеется хотя бы один фактор риска по развитию сердечно-сосудистых заболеваний (гипертензия, диабет или курение), то вероятность возникновения ФП увеличивается до 38% (Chung, 2020; Staerk L, 2018). У здоровых людей старше 45 лет риск возникновения и развития ФП составляет свыше 20% (Staerk L, 2018).
Процент людей с ФП увеличивается с возрастом: если только 0,1% младше 50 лет страдают этим заболеванием, то уже 4% населения в возрасте 60-70 лет и 14% людей старше 80 лет имеют ФП. Важность ФП как проблемы общественного здравоохранения дополнительно подчеркивается её сильной и независимой связью с повышенным риском развития инсульта, сердечной недостаточности, внезапной смерти, когнитивной дисфункции и снижением качества жизни (Meyre P, 2020; Conen D, 2011; Thrall G, 2006).
Развитие ФП сопровождается формированием изменений структуры предсердий за счет их фиброза. Фибротические изменения возникают вследствие первичного перерастяжения стенок предсердий. Значительно реже причиной фиброза могут являться воспаление и генетические факторы. Перерастяжение предсердий так же может быть следствием повышения давления в желудочках сердца. Причиной этого может быть обусловлено стенозом или недостаточностью, чаще всего, митрального (или трикуспидального) клапана, длительно существующей системной гипертензией или явлением длительной сердечной недостаточности. Причиной фиброзирования миокарда могут быть воспалительные процессы в результате саркоидоза или аутоиммунных заболеваний с наличием антител к белкам, составляющих структуру кардиомиоцитов (КМЦ). При гибели КМЦ стромальные волокна замещают образовавшуюся пустоту, и качество проведения электрического импульса будет страдать. Создавая органический субстрат для возникновения и закрепления патологических кругов возбуждения по механизму re-entry. Процессы фиброзирования развиваются постепенно, и в ходе экспериментальных исследований было показано, что на первом этапе появляются отдельные зоны фиброза в КМЦ предсердий. Это создает органический субстрат для возникновения ФП в виде зон, не способных передавать потенциал действия, которые в дальнейшем могут сливаться в более крупные образования в случае прогрессирования основного патологического состояния (Li M, 2014; Kalogeropoulos A, 2011).
На сегодняшний день признанным «золотым стандартом» лечения фибрилляции предсердий является метод радиочастотной катетерной аблации (2017 HRS / EHRA / ECAS / APHRS /SOLAECE expert consensus statement on catheter and surgical ablation of atrial fibrillation: Executive summary. Heart Rhythm. 2017. Vol.14(10), e445-e494). При аблации происходит коагуляция пораженного миокарда с дальнейшим превращением его в рубцовую ткань не способную к проведению импульса.
Однако способ катетерной аблации обладает и недостатками, в том числе:
1. Низкая проникающая способность термоэлектрического воздействия аблационного катетера (не более 7-8 мм);
2. Высокая морфологическая гетерогенность тканей после аблации, что в отдаленном периоде наблюдения сильно снижает терапевтическую эффективность лечения ФП;
3. Трудоемкость и сложность процедуры, которая обусловлена в преодолении неоднородности поверхности сердца (синусы, анатомические особенности), что приводит к невозможности выполнить непрерывные аблационные линии, отграничивающие целевую зону по периметру и на всю глубину миокарда;
4. Значительный процент интра- и послеоперационных осложнений, который связан с длительностью процедуры, развитием перфораций сердца, воспалительным синдромом, с частыми летальными случаями;
5. Социально-экономическая сторона комплексного лечения ФП связана с большими затратами и может превышать 1 млн рублей на человека (с учетом стоимости имплантируемых устройств).
Таким образом, учитывая постоянно повышающуюся актуальность профилактики и лечения ФП у человека, недостаточную эффективность существующих методик лечения ФП, высокие требования к опыту врача-аритмолога и техническому оснащению аритмологической операционной, становится необходимым разработка модели ФП у крупного животного, максимально приближенного к человеку по своим патофизиологическим, функциональным, клиническим, морфо-гистологическим и массо-габаритным показателям. Данная модель необходима для проведения расширенного и углубленного изучения патофизиологических причин возникновения, протекания и исходов ФП, для разработки и апробации новых способов лечения ФП, при исследовании новых фармакологических субстанций для лечения нарушений ритма, а также в качестве учебного стенда для отработки навыков в ходе обучения врачей способам хирургического лечения ФП.
Возможность использования свиньи в качестве модельного объекта в медико-биологических экспериментах предопределяется ее чрезвычайным сходством с человеком по целому набору анатомо-физиологических характеристик и биологических свойств. Сходство отмечается по морфологии и функционированию внутренних органов и систем, в частности сердечно-сосудистой, пищеварительной, выделительной, эндокринной и нервной включая мозг и органы чувств, по организации метаболических процессов и т.д.
Известен способ электрофизиологического картирования предсердий и моделирования ФП у свиней путем высокочастотной стимуляции через пластинчатые эпикардиальные электроды (Jiunn-Lee Lin, Ling-Ping Lai · Chih-Shen Lin et al. Electrophysiological Mapping and Histological Examinations of the Swine Atrium with Sustained (≥24 h) Atrial Fibrillation: A Suitable Animal Model for Studying Human Atrial Fibrillation. Cardiology 2003;99:78-84). Недостатком данного способа является использование трансторакального доступа с открытием грудной клетки и применением массивных пластин игольчатых электродов, которые накладываются непосредственного на поверхность сердца, прокалывают эпикард и травмируют сердце. Этот способ не позволяет обеспечить длительную, более 30 суток, стимуляцию миокарда чтобы получить релевантную человеческой модель ФП.
Задачей представленной группы изобретений является разработка способа моделирования устойчивой фибрилляции предсердий у крупных животных, имеющей все электрофизиологические, функциональные и гистологические признаки, характерные для длительной персистирующей фибрилляции предсердий у человека.
Технический результат - разработан способ моделирования устойчивой фибрилляции предсердий (ФП) у животных (на примере свиней) путем эндоваскулярной или эпикардиальной имплантации биполярного электрода в предварительно определенную зону с последующей длительной высокочастотной стимуляцией имплантируемым кардиостимулятором, с получением признаков, характерных для длительной персистирующей фибрилляции предсердий у человека.
Для достижения технического результата используют два варианта моделирования устойчивой фибрилляции предсердий (ФП) у животных с выполнением имплантации биполярного электрода, один конец которого устанавливают в правое предсердие эндоваскулярным способом или эпикардиально (с помощью торакотомии с межреберным минидоступом): 1) имплантация эндокардиально (миниинвазивная) биполярного электрода в правое предсердие с доступом через яремную или подключичную вену в целевую зону - синоатриальный узел, являющуюся очагом первичного возбуждения предсердий, определяемую путем электрофизиологического исследования (ЭФИ); 2) имплантация эпикардиально биполярного электрода в правое предсердие в целевую зону со стороны эпикарда, являющуюся очагом первичного возбуждения предсердий, определяемую путем ЭФИ, под визуальным контролем зрения с выполнением минидоступа в 3-4 межреберье. Затем, и в первом и во втором вариантах, противоположный конец электрода проводят подкожно в область шеи и подключают к имплантируемому электрокардиостимулятору, запрограммированному в режиме высокочастотной стимуляции, с последующей программной стимуляцией в течение 30 суток.
Электрод представляет собой несколько токопроводящих элементов (проволоки), объединенных диэлектрической оболочкой. При установке концы электрода определяют по местоположению относительно сердца, далее по тексту проксимальным концом назван устанавливаемый в правое предсердие, а дистальным - удалённый от сердца, устанавливаемый в область шеи. Проксимальный конец электрода, выполненный в форме штопора, вкручивается в ткань миокарда, что позволяет осуществить контакт токопроводящих элементов с тканями сердца, в результате чего происходит передача электрического импульса от электрокардиостимулятора (ЭКС). Дистальный конец электрода снабжен разъемом, который подсоединяется к ЭКС и герметизируется для предотвращения короткого замыкания.
Стимуляцию предсердия осуществляют с помощью имплантируемого ЭКС. Режим стимуляции для каждого животного подбирают индивидуально так, чтобы гарантированно достичь ФП, но не вызвать нарушения ритма сокращения желудочков.
Значения частоты стимуляции выбирали из диапазона, при котором достигается от 350 до 700 уд/мин, предпочтительно 450 уд/мин. Значения менее 350 уд/мин и более 700 уд/мин не использовали из-за неэффективности данного режима стимуляции сокращений предсердия. Значения амплитуды напряжения выбирали из диапазона от 1 до 10 Вольт, предпочтительно 4 Вольта. Значения менее чем 1 Вольт были неэффективны и не приводили к навязыванию ритма, значения более 10 Вольт были избыточны и оказывали негативное влияние на ритм сокращения желудочков, что приводило к фибрилляции желудочков и остановке сердца.
Подготовка к операции включает контроль электрокардиографии, инвазивный контроль артериального давления, контроль насыщения периферической крови кислородом, инфузионную поддержку кровообращения.
Имплантация биполярного электрода при варианте 1 включает выделение яремной или подключичной вены, установку интродьюсера, проведение катетера-электрода для регистрации электрофизиологических сигналов, выполнение электрофизиологического исследования (ЭФИ) предсердий, установку проксимального конца биполярного электрода в правое предсердие под контролем рентгеноскопии. Для точной локализации очага первичного возбуждения предсердий (синоатриального узла) используется метод активационного ЭФИ. Затем дистальный конец электрода проводят в предсформированное ложе для ЭКС в область шеи и подключают к имплантированному электрокардиостимулятору с последующим программированием в режиме высокочастотной стимуляции. При этом постепенно увеличивают режим стимуляции: напряжение плавно увеличивают, начиная от 1 Вольт доводя до 4 Вольт, а частоту стимуляции начинают от 300 уд/мин, доводя до 450 уд/мин, чтобы достичь постоянной фибрилляции предсердий (ФП), с последующей программной стимуляцией - 450 уд/мин при значении напряжения 4 Вольта в течение 30 суток.
Имплантация биполярного электрода при варианте 2 включает выполнение миниторакотомии в 3-4 межреберье, накладывание ранорасширителя, выполнение перикардотомии и выделение поверхности правого предсердия. Далее выполняется выделение бедренной вены, установка интродьюсера, проведение катетера-электрода для регистрации электрофизиологических сигналов, выполнение электрофизиологического исследования (ЭФИ) предсердий. C помощью катетера-электрода и системы для ЭФИ точно локализуется очаг первичного возбуждения предсердий, для чего используется метод активационного ЭФИ. После этого в найденную область - очаг первичного возбуждения предсердий - со стороны эпикарда под визуальным контролем выполняют установку проксимального конца биполярного электрода. Затем дистальный конец электрода проводят подкожно в область шеи и подключают к имплантируемому ЭКС с последующим программированием в режиме высокочастотной стимуляции. При этом постепенно увеличивают режим стимуляции: напряжение постепенно увеличивают, начиная от 1 Вольт доводя до 4 Вольт, а частоту стимуляции начинают от 300 уд/мин, доводя до 450 уд/мин, чтобы достичь постоянной фибрилляции предсердий (ФП), с последующей программной стимуляцией - 450 уд/мин при значении напряжения 4 Вольта в течение 30 суток.
Фиг.1 иллюстрирует динамику ЭКГ до начала стимуляции (А), в ходе выполнения стимуляции (Б), через 30 суток постоянной стимуляции после отключения электродов (В). Иллюстрируемая динамика ЭКГ отражает два способа моделирования ФП у свиней.
Экспериментальная работа осуществлялась согласно этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных в соответствии с международными и российскими нормативно-правовыми документами («Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST № 123» от 18 марта 1986 г. Страсбург, 1986; Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации» № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» от 01.04.2016 г.; Межгосударственный стандарт ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»; Euroguide on the accommodation and care of animals used for experimental and other scientific purposes. 2007. FELASA: Federation of European Laboratory Animal Science Associations, 25 Shaftesbury Avenue, London W1D 7EG, UK).
Изобретение подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Способ моделирования ФП путем эндокардиальной (миниинвазивной) имплантации электрода в правое предсердие животных
Исследование проводили на группе из 3 мини-свиней «Минисибс» селекции ИЦиГ СО РАН. Подготовку к операции производили следующим способом. Утром в день операции ветеринарный врач выполнял премедикацию комбинацией препаратов атропин, золетил-100 и кетамин. Дозировку в каждом конкретном случае выбирали исходя из веса животного. После наступления сна животное тщательно моют, выбривают щетину на ушах, грудной клетке, на внутренней поверхности бедра и на хвосте, взвешивают. На операционном столе животное закрепляют в положении «на спине». В краевую вену уха устанавливают периферический катетер для инъекций подходящего размера, к грудной клетке прикрепляют датчики для электрокардиографии. Плетизмографический датчик для контроля насыщения периферической крови кислородом крепили на хвост. Для контроля артериального давления в левую бедренную артерию пункционным способом устанавливали артериальный катетер, через который присоединяли систему инвазивного контроля давления. Все критически важные витальные параметры - пульс, артериальное давление, температуру в глотке, ЭКГ, насыщение крови кислородом - фиксировали в режиме «реального времени» системой мониторинга V26E (Philips, Германия). Интубацию трахеи трубкой диаметром 8-9 мм проводили на фоне миорелаксации  после в/в введения 4 мг адруана. Раздувают обтурирующую манжету, подсоединяют наркозно-дыхательный аппарат Julian Plus (Draeger, Германия), начинают принудительную вентиляцию 60% кислородом, содержащим 3% севофлюрана (по объему) с частотой 12-14 циклов в минуту. Дыхательный объем подбирают индивидуально в зависимости от веса животного. Через установленный ранее периферический катетер проводят инфузионную поддержку кровообращения кристаллоидными (раствор Рингера, изотонический раствор) и/или коллоидными (гелафузин, полиглюкин) растворами. Объем инфузии определяется врачом-ветеринаром согласно весо-ростовым показателям и данным объективного мониторинга витальных функций экспериментального животного. При необходимости для контроля диуреза устанавливают мягкий мочевой катетер. Перед операцией выполняют чрезпищеводное ультразвуковое исследование (УЗИ), оценивают показатели фракции выброса (ФВ) левого желудочка, конечный систолический (КСР) и диастолический размер (КДР) левого желудочка (ЛЖ), размеры левого предсердия (ЛП).
Имплантацию электродов и ЭКС выполняют следующим способом. В положении на левом боку пунктируют иглой правую яремную или подключичную вену, заводят проволочный проводник и устанавливают интродьюсер размером 8Fr для установки электродов. Пунктируют иглой левую бедренную вену, заводят проволочный проводник и устанавливают еще один интродьюсер размером 8Fr для катетера ЭФИ. Проводники убирают. В интродьюсер на нижней конечности вводят катетер-электрод для электрофизиологических исследований типа Navistar (Biosence Webster, США) или аналогичный, с помощью С-дуги OEC9800 (GE Healthcare, США) под контролем ренгеноскопии продвигают катетер до правого предсердия через правый желудочек, периодически выполняя контрольную артериографию введением 5-20 мл рентген-контрастного препарата, чтобы удостовериться в правильности положения катетера. Производят активационное ЭФИ и определяют область первичного возбуждения предсердий. Через интродьюсер на шее проводят систему доставки и устанавливают в предсердии проксимальный конец эндокардиального биполярного электрода типа Plexa (Biotronik, США) или аналогичный. Дистальный конец электрода проводят подкожно в боковую область шеи в районе позвоночника где ее коммутировали с электрокардиостимулятором типа Edora (Biotronik, США) или аналогичным, с возможностью записи данных ЭКГ. Всю систему размещают в подкожной клетчатке так, чтобы не создавалось напряжение тканей, после этого области доступа ушивают не рассасывающимися нитками и обрабатывают антисептиком. Затем регистрируют нормальный синусовый ритм сердца, после чего с помощью индукционного беспроводного программатора осуществляют стимуляцию ЭКС, при этом постепенно увеличивают режим стимуляции: частоту стимуляции начинают от 300 уд/мин доводя до 450 уд/мин, а напряжение плавно увеличивают, начиная от 1 Вольт доводя до 4 Вольт, так, чтобы достичь постоянной фибрилляции предсердий (ФП). Результат контролировали по ЭКГ в течение 30 минут. После этого животное выводят из наркоза, активизируют и перемещают в вольер для наблюдения. Спустя 30 суток выключают ЭКС и прекращают стимуляцию, в результате было зарегистрировано сохранение ФП по ЭКГ в течение 7 суток. Перед выведением животного из эксперимента выполняют чрезпищеводное УЗИ, в ходе которого оценивают новые показатели ФВ, КСР и КДР левого желудочка, размеры левого предсердия (ЛП). После выведения забирают образцы для гистологических исследований.
В результате исследования было показано, что постоянная эндокардиальная стимуляция предсердий у минисвиней через 30 суток приводит к формированию устойчивой фибрилляции предсердий. УЗИ установлено увеличение размера ЛП (26 ± 4 мм и 33 ± 4 мм до и после стимуляции соотв., р=0,009), сохранение фракции выброса ЛЖ (72 ± 8 % и 69 ± 11% до и после стимуляции соотв., р=0,34), сохранение КСР ЛЖ (28 ± 4 мм и 29 ± 5 мм до и после стимуляции соотв. р=0,89) и КДР ЛЖ (44 ± 8 мм и 48 ± 7 мм до и после стимуляции соотв., р=0,41). Летальных исходов среди экспериментальных животных отмечено не было. Микроскопический анализ гистологических изменений миокарда ЛП выявил выраженную лимфоцитарную инфильтрацию, распространенный фиброз миокарда, липоматоз тканей ЛП с признаками жировой дистрофии, увеличение числа мышечных волокон на единицу площади предсердия более чем на 40%, гипертрофию и гиперхроматоз ядер кардиомиоцитов.
Пример 2. Способ моделирования при «открытой» операции - ФП путем эпикардиальной имплантации электрода в правое предсердие животных
Исследование проводили на группе из 3 мини-свиней «Минисибс» селекции ИЦиГ СО РАН. Подготовку к операции и анестезиологическое обеспечение было аналогично описанному выше. Перед операцией выполняли чрезпищеводное ультразвуковое исследование, оценивали показатели ФВ, КСР и КДР левого желудочка, размеры ЛП.
Хирургический доступ и оперативный прием осуществляют в следующей последовательности. В положении на левом боку выполняют правостороннюю миниторакотомию в 3-4 межреберье, накладывают ранорасширитель для разведения краев раны, производят перикардотомию, листки перикарда разводят на держалках и визуализируют поверхность предсердий. Далее пунктируют иглой правую яремную или подключичную вену, заводят проволочный проводник и устанавливают интродьюсер размером 8Fr. Затем проводник убирают. В интродьюсер вводят катетер-электрод для электрофизиологических исследований типа Navistar (Biosence Webster, США) или аналогичный, с помощью С-дуги OEC9800 (GE Healthcare, США) под контролем ренгеноскопии продвигают катетер до правого предсердия через правый желудочек, периодически выполняя контрольную артериографию введением 5-20 мл рентген-контрастного препарата, чтобы удостовериться в правильности положения катетера. Производят активационное ЭФИ и определяют область первичного возбуждения предсердий. Катетер оставляют в найденной области с легким надавливанием (или проталкиванием), чтобы кончик катетера контурировался (определялся) со стороны эпикарда. В этот район под визуальным контролем устанавливают проксимальную часть биполярного электрода типа Plexa (Biotronik, США) или аналогичный. Дистальную часть электрода проводят подкожно в боковую область шеи в районе позвоночника, где ее коммутировали с электрокардиостимулятором типа Edora (Biotronik, США) или аналогичным, с возможностью записи данных ЭКГ. Всю систему размещали в подкожной клетчатке так, чтобы не создавалось напряжение тканей. Торакотомную рану и остальные области доступа ушивают не рассасывающимися нитками и обрабатывают антисептиком. Затем регистрируют нормальный синусовый ритм сердца, после чего с помощью индукционного беспроводного программатора осуществляют стимуляцию ЭКС, при этом постепенно увеличивают режим стимуляции: частоту стимуляции начинают от 300 уд/мин, доводя до 450 уд/мин, а напряжение постепенно увеличивают, начиная от 1 вольт доводя до 4 вольт, так, чтобы достичь постоянной фибрилляции предсердий (ФП). Результат контролируют по ЭКГ в течение 30 минут. После этого животное выводят из наркоза, активизируют и перемещают в вольер для наблюдения. Спустя 30 суток выключают ЭКС и прекращают стимуляцию. В результате далее регистрировали сохранение ФП по ЭКГ в течение 7 суток. Затем перед выведением животного из эксперимента выполняют чрезпищеводное ультразвуковое исследование, в ходе которого оценивают новые показатели ФВ, КСР и КДР левого желудочка, размеры левого предсердия (ЛП). После выведения забирали образцы для гистологических исследований.
В результате показано, что постоянная эпикардиальная стимуляция предсердий у минисвиней через 30 суток приводит к формированию устойчивой фибрилляции предсердий (фиг.1). УЗИ установлено увеличение размера ЛП (25 ± 4 мм и 30 ± 5 мм до и после стимуляции соотв., р=0,01), сохранение фракции выброса ЛЖ (68 ± 9 % и 65 ± 10% до и после стимуляции соотв., р=0,23), сохранение КСР ЛЖ (27 ± 3 мм и 30 ± 5 мм до и после стимуляции соотв., р=0,66) и КДР ЛЖ (46 ± 6 мм и 50 ± 8 мм до и после стимуляции соотв., р=0,78). Летальных исходов среди экспериментальных животных отмечено не было. Микроскопический анализ гистологических изменений миокарда ЛП выявил выраженную лимфоцитарную инфильтрацию, повсеместный фиброз, очаги липоматоза с переходом в жировую дистрофию тканей, увеличение более чем на 50% числа мышечных волокон на единицу площади предсердия, гипертрофию и гиперхроматоз ядер кардиомиоцитов.