Воздействие излучения диапазона 0,05-1,2 ТГц на мембранный потенциал митохондрий

5

ЛАЗЕРНЫЕ И БИОМЕДИЦИНСКИЕ

ТЕХНОЛОГИИ

УДК 535.14, 57.043

ВОЗДЕЙСТВИЕ ИЗЛУЧЕНИЯ ДИАПАЗОНА 0,05-1,2 ТГЦ НА МЕМБРАННЫЙ

ПОТЕНЦИАЛ МИТОХОНДРИЙ

М.В. Цуркан, И.В. Кудрявцев, М.К. Серебрякова, Ю.С. Несговорова, А.С. Трулёв, И.В. Назарова, О.А. Смолянская, П.Г. Назаров, А.В. Полевщиков

В последние годы стремительно растет область применения источников терагерцового (ТГц) излучения. Так, предполагается его использование в медицинской диагностике заболеваний кожи и рака. Однако разнонаправленные данные по влиянию ТГц излучения ставят под вопрос безопасность его применения. Для оценки воздействия ТГц излучения на клеточном уровне с помощью проточной цитометрии исследовалось его влияние на мембранный потенциал митохондрий и проницаемость клеточной мембраны клеток некоторых перевиваемых культур, а также тимоцитов и спленоцитов мышей. Было показано, что ТГц излучение мощностью 30; 2 и 0,1 мкВт и длительностью 1 мин не оказывает существенного влияния на изменение функциональной активности митохондрий клеток, равно как и не нарушает целостности их билипидных поверхностных мембран. В том числе не обнаружено статистически достоверных изменений в соотношении живых и находящихся на разных стадиях апоптоза клетках.

Ключевые слова: терагерцовое излучение, медицина, биологические эффекты, мембранный потенциал, проницаемость мембраны.

Терагерцовое (ТГц) излучение занимает участок электромагнитного спектра между инфракрасным и микроволновым излучением с диапазоном частот 0,1-10 ТГц (длины волн от 30 мкм до 3 мм). Интерес к ТГц излучению обусловлен характерными свойствами данного излучения: в этом диапазоне находится значительная часть колебательно-вращательного спектра воды и многих органических молекул, в том числе биологически активных макромолекул (белков и нуклеиновых кислот), а также частоты межмолекулярных взаимодействий [1, 2]. Чувствительность ТГц излучения к содержанию воды делает возможным его применение в диагностических целях. Так, было показано, что с помощью ТГц изображения возможно выявить области рака кожи и рака молочной железы, оценивать степень ожоговых ран [3].

В связи с тем, что ТГц излучение имеет низкую энергию фотона, оно считается безвредным для человека, что и позволяет применять его для медицинской диагностики. Однако авторы многих работ отмечают наличие биологических эффектов излучения на различных уровнях биологической организации. Этой теме посвящены несколько подробных обзоров [4, 5]. Разнонаправленные данные по влиянию ТГц излучения ставят под вопрос безопасность его применения для медицинской диагностики, в особенности в вопросе о диагностике рака, так как в этом случае необходимо соблюдать предельную осторожность, чтобы не спровоцировать ускоренное развитие заболевания.

Опираясь на вышесказанное, целью своей работы авторы ставят изучение воздействия широкополосного ТГц излучения диапазона 0,05-1,2 ТГц на мембранный потенциал митохондрий и проницаемость клеточной мембраны некоторых перевиваемых культур, а также тимоцитов и спленоцитов мышей линии СБА с помощью проточной цитометрии.

Рассмотрим работы, посвященные изменению мембранного потенциала клеток и проницаемости мембраны под действием ТГц излучения.

Излучение на частоте 2,5 ТГц вызывает нарушение морфологии мембран и внутриклеточных структур и падение мембранного потенциала нейронов [6], а излучение на частоте порядка 2,31 ТГц может вызывать обратимые нарушения барьерных свойств мембраны нейронов [7]. Однако другими исследователями на этом же объекте при облучении излучением с частотой порядка 0,6 и 0,75 ТГц было показано, что все изменения являются следствием исключительно повышения температуры [8]. Эффект повышения проницаемости клеточной мембраны был получен при воздействии ТГц излучения с частотой 2,52 ТГц, 227 мВт/см2 свыше 12 с, а понижения - при уменьшении длительности облучения [9].

Липидный бислой показал увеличение проницаемости мембраны при использовании импульсного источника (0,13 ТГц, 7 Гц, 7,7 мВт/см2, 2 мин) и отсутствие каких-либо эффектов при источнике непрерывного излучения [10].

Исследователи наблюдали как блокирование, так и усиление нейронной активности при воздействии излучения на частоте 0,06 ТГц в течение 1 мин при низкой плотности мощности (0,07, 0,28, 0,56 и 0,74 мкВт/см2) [11]. Также этими авторами было показано, что излучение с частотой порядка 0,05 ТГц (15 мВт/см2, 2 мин) индуцирует открытие ионных каналов во время воздействия и их запечатывание спустя 3 мин после окончания воздействия [12].

Введение

Состояние исследований в данной области

Таким образом, приведенные исследования свидетельствуют о том, что ТГц излучение повышает проницаемость мембраны и приводит к изменению мембранного потенциала. Однако большинство этих данных было получено с использованием непрерывных источников излучения, и вопрос влияния импульсного широкополосного ТГц излучения остается открытым. Этим и обусловлена актуальность проводимой нами работы.

Материалы и методы

Оптическая схема экспериментальной установки ТГц фотометра представлена на рис. 1. Излучение фемтосекундного лазера 1 попадает через систему зеркал на кристалл 1пАб 5. Часть излучения, прошедшая через светоделительную кремниевую пластину 7, фокусируется на оптико-акустический приемник 11 для оперативного слежения за выходной мощностью (ТГц) без прерывания облучения объектов. Другая часть излучения, отраженная от кремниевой пластины, попадает на второе параболическое зеркало 8, которое направляет излучение (сходящийся пучок) вверх на объект 9. Такая схема разработана нами для облучения объектов, находящихся в жидкой среде. Потери ТГц излучения на планшете, в котором находились клетки, составили 20%. Генерируемое ТГц излучение имело полосу частот 0,05-1,2 ТГц. Мощность ТГц излучения варьировалась с помощью фильтров и с учетом поглощения планшетом составляла 30; 2; 0,1 мкВт. Площадь облучения составляла 3,14 см2, соответственно плотность мощности -9,55; 0,63; 0,03 мкВт/см2. Длительность импульса - 2,5 пс. Эксперименты проводились при температуре 20 °С. Длительность облучения составляла 1 мин. Для каждой культуры клеток было проведено 3 серии экспериментов. В каждой серии облучение на каждой мощности проводилось 3 раза. Таким образом, на каждой мощности каждая культура клеток была облучена 9 раз, и ей соответствовали по 3 контрольных лунки, которые не подвергались действию облучения.

Рис. 1. Блок-схема ТГц фотометра: вид сверху (а); элементы 8, 9, вид сбоку (б): 1 - фемтосекундный лазер; 2, 4 - зеркала; 3 - механический модулятор; 5 - магнит с размещенным внутри кристаллом InAs (угол падения излучения 45°); 6, 8 - параболические зеркала; 7 - светоделительная кремниевая пластина; 9 - объект, помещенный в ячейку планшета; 10 - линза; 11 - оптико-акустический приемник; 12 - синхронный усилитель; 13 - персональный компьютер

Культуры клеток перевиваемых линий и условия культивирования клеток

В качестве объектов исследования были выбраны культуры клеток следующих перевиваемых линий:

- адгезионные культуры - А-549 (клетки карциномы легкого человека);

- BT-20 (клетки аденокарциномы молочной железы);

- COLO 320 HSR (клетки карциномы сигмовидной кишки);

- суспензионные культуры - НМС-1 (линия клеток, обладающая свойствами незрелых тучных клеток);

- U937 (клеточная линия лейкоза гистиоцитов человека),

- HL-60 (клетки промиелоидной лейкемии человека).

Для культивирования клеток линии А-549 и BT-20 использовали аналогичные пластиковые флаконы объемом 50 мл, использовали среду DMEM («Биолот», Санкт-Петербург) с добавлением 10% инак-тивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («Биолот», Санкт-Петербург), 50 мкг/мл гента-мицина («Биолот», Санкт-Петербург) и 2 мМ L-глутамина («Биолот», Санкт-Петербург). Для ведения клеток использовали пластиковые флаконы объемом 50 мл («Sarstedt», Германия). Клетки пересевали каждые 3-4 дня. Инкубацию осуществляли при 37°С в атмосфере 5% СО2. Для постановки эксперимен-

тов клетки пересевали в лунки 24-луночных плоскодонных планшета («Sarstedt», Германия), инкубировали до формирования конфлюэнтного монослоя.

Культивирование клеток линии COLO 320 HSR осуществляли при следующих условиях: среда RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург) с добавлением 10% инактивированной ЭТС («Биолот», Санкт-Петербург), 50 мкг/мл гентамицина («Биолот», Санкт-Петербург) и 2 мМ L-глутамина («Биолот», Санкт-Петербург). Пересев производили каждые 2-3 дня. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2. Для постановки экспериментов клетки пересевали в лунки 24-луночного плоскодонного планшета («Sarstedt», Германия), инкубировали до формирования монослоя. После облучения к монослою клеток указанных выше линий добавляли по 500 мкл соответствующей полной культуральной среды (ПКС) и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 ч. Для дезинтеграции монослоя добавляли раствор аккутазы («Sigma-Aldrich», США). По завершении инкубации лунки планшетов промывали забуфе-ренным фосфатами физиологическим раствором (ЗФР, рН 7,2-7,4), содержащим 2% ЭТС. Полученную суспензию клеток переносили в пробирки для центрифугирования и дважды отмывали избытком ЗФР (300g в течение 8 мин). Полученную суспензию клеток использовали для постановки экспериментов, описанных ниже.

Культивирование клеток линий THP-1, HL-60 и U-937 осуществляли с использованием среды RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной ЭТС, 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глутамина (указанных выше производителей). Пересев производили каждые 2-3 дня. Ведения клеток проводили по описанной выше методике.

Для культивирования клеток линии НМС-1 использовали среду Iscove (Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM, «Hyclone», США) с добавлением 10% обогащенной ионами железа ЭТС («Hyclone», США), 1,2 мМ монотиоглицерола («Sigma», США) и 40 мкг/мл гентамицина («Биолот», Санкт-Петербург). При постановке экспериментов в лунки 24-луночного плоскодонного планшета вносили 200 мкл клеточной суспензии (3*106 клеток/мл) в соответствующей ПКС. После облучения к клеткам указанных выше линий добавляли по 500 мкл соответствующей ПКС и инкубировали их при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 ч. По завершении инкубации лунки планшетов промывали охлажденным ЗФР, содержащим 2% ЭТС. Затем суспензию клеток переносили в пробирки для центрифугирования объемом 15 мл и дважды отмывали избытком ЗФР (300g в течение 8 мин). Полученную суспензию клеток использовали для постановки экспериментов, описанных ниже.

В качестве объектов исследования были использованы мыши линии СВА, массой 18-20 г. Для получения образцов тимоцитов и спленоцитов животных умерщвляли методом цервикальной дислокации и сразу же извлекали тимус и селезенку. Полученные органы гомогенизировали, полученную клеточную суспензию фильтровали через фильтры с диаметром поры не более 100 мкм, после чего тимоциты и спленоциты дважды отмывали избытком ЗФР (300g в течение 8 мин). Далее клетки переводили в полную культуральную среду, приготовленную на основе DMEM с добавлением 10% инактивированной ЭТС, 50 мкг/мл гентамицина и 2 мМ L-глутамина. При постановке экспериментов в лунки 24-луночного плоскодонного планшета вносили 200 мкл клеточной суспензии (5*106 клеток/мл) в ПКС. После облучения к культурам спленоцитов и тимоцитов добавляли по 250 мкл ПКС и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО2 в течение 3 ч. По завершении инкубации в лунки планшетов вносили охлажденный ЗФР, содержащий 2% ЭТС. Затем суспензию клеток переносили в пробирки для центрифугирования, дважды отмывали избытком ЗФР (300g в течение 8 мин). Полученную суспензию клеток использовали для постановки экспериментов, описанных ниже.

Оценка мембранного потенциала митохондрий и проницаемости клеточной мембраны

при помощи проточной цитометрии

Принцип метода. Метод основан на использовании двух флуоресцентных красителей - йодида 3,3'-дигексилоксакарбоцианина (DiOC6(3)) и йодистого пропидия (PI). DiOC6(3) относится к группе ка-тионных липофильных красителей, которые в литературе получили название «митохондриальных зондов», так как применяются для изучения мембранного потенциала митохондрий клеток [13]. Благодаря своим липофильным свойствам DiOC6(3) способен свободно проникать через билипидные мембраны клетки (поверхностную мембрану клетки, а также внешнюю и внутреннюю мембраны митохондрий), а благодаря катионным свойствам этот краситель накапливается в областях с высокой концентрацией протонов, т.е. под внутренней мембраной митохондрий. Этот эффект сопровождается изменением интенсивности флуоресценции клеток в зеленой части спектра, что и регистрируют при анализе на проточном цитофлуориметре [14]. В том случае, если концентрация протонов снижена, как это имеет место на начальных этапах физиологической смерти клетки - апоптоза, то краситель будет накапливаться в них менее эффективно, и, как следствие, интенсивность его флуоресценции будет снижена. Тем самым, можно отличить живые клетки с эффективно функционирующими митохондриями (и, как следствие, высокой интенсивностью флюоресценции) от гибнущих или мертвых клеток, в которых функционирование митохондрий нарушено. Как следствие, такие клетки обладают пониженной интенсивностью флюоресценции.

В том случае, если деполяризация митохондрий рассматривается как «раннее» событие при запуске апоптоза, то нарушение целостности поверхностной мембраны (т.е. ее фрагментация) обычно характерно для клеток, находящихся на терминальных стадиях гибели. В связи с этим для выявления разных стадий апоптоза, помимо DiOC6(3), клетки дополнительно окрашиваются PI - красителем, способным взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами клеток. PI не способен диффундировать через билипидные мембраны и, как следствие, не способен связаться с ДНК клеток. Однако по мере фрагментации цитоплазма-тической и ядерной мембран краситель проникает в клетку и взаимодействует с РНК и ДНК. Следствием подобного взаимодействия является накопление красителя в цитоплазме и ядре, и клетка обретает флуоресценцию в красной части спектра.

Таким образом, живые клетки будут обладать яркой флуоресценций по каналу, предназначенному для детекции DiOC6(3), но не будут накапливать йодистый пропидий (фенотип DiOC6(3)brightPI). Клетки, находящиеся на ранних стадиях апоптоза (митохондриальный потенциал снижен, но плазматическая мембрана еще сохраняет свою целостность и непроницаемость для йодистого пропидия) будут иметь фенотип DiOC6(3)dim-to-negPI). Вместе с тем, клетки, находящиеся на поздней стадии апоптоза или уже погибшие (некроз), не будут эффективно накапливать DiOC6(3), но будут окрашиваться PI - фенотип DiOC6(3)dim-to-negPI+.

Процедура окрашивания клеток. Для оценки мембранного потенциала митохондрий к 100 мкл клеточной суспензии (2-3*106 клеток/мл) добавляли 20-кратный рабочий раствор DiOC6(3) («Invitrogen», США), получая конечную концентрацию красителя, равную 20 нМ [15]. Рабочий раствор готовили ex tempete, добавляя к 10 мкл стокового раствора (стоковый - 1 мг/мл ДМСО (диметилсульфоксид), дозировали по 10 мкл и хранили при -20°С до использования) 4900 мкл ЗФР. После внесения красителя образцы тщательно перемешивали и инкубировали в течение 20 мин при 37°С в атмосфере 5% СО2 в защищенном от света месте. По завершении инкубации образцы отмывали избытком ЗФР, содержащим 2% ЭТС (8 мин при 300g), после чего надосадок удаляли, а клеточный осадок переводили в 100 мкл свежего ЗФР. В полученную клеточную суспензию вносили 10 мкл раствора йодистого пропидия («Sigma-Aldrich», США), получая финальную концентрацию PI, равную 1 мкг/мл, после чего образцы инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. По завершении инкубации в образцы вносили по 200 мкл ЗФР и проводили цитометрический учет. Для каждого из образцов анализировали не менее 50000 одиночных клеток. Чтобы отличить одиночные клетки от слипшихся (агрегатов) и затем дискриминировать агрегаты из анализа, использовали следующие сочетания сигналов по прямому (величина, пропорциональная размеру клеток) и боковому (величина, характеризующая структуру клеток) светорассеянию: интенсивность пикового против интенсивности интегрального сигналов по FS или SS, а также время полета против интенсивности интегрального сигналов FS или SS. Анализ полученных результатов проводили при помощи программного обеспечения Kaluza™ («Beckman Coulter», США).

Результаты. Для анализа результатов проточной цитофлуориметрии были построены гистограммы интенсивности флуоресценции DIOC6(3), увеличение интенсивности флуоресценции которого зависит от мембранного потенциала митохондрий. На рис. 2 для каждой из культур клеток, применявшихся в эксперименте, приведено по одному типичному примеру такой гистограммы. Полученные из гистограмм данные были обработаны и сведены в таблице, где в процентном соотношении приведены живые и находящиеся на ранних и поздних стадиях апоптоза клетки.

Из результатов видно, что ни одна из культур клеток вне зависимости от используемой нами мощности облучения не показала статистически достоверного изменения мембранного потенциала и не вызвала изменений в проницаемости мембраны по сравнению с контролем.

Заключение

Таким образом, мы показали, что воздействие широкополосного терагерцового излучения диапазона 0,05-1,2 ТГц мощностью 30; 2; 0,1 мкВт как на адгезионные культуры (клетки карциномы легкого человека, клетки аденокарциномы молочной железы, клетки карциномы сигмовидной кишки), так и суспензионные культуры (линия клеток, обладающая свойствами незрелых тучных клеток, клеточная линия лейкоза гистиоцитов человека, клетки промиелоидной лейкемии человека), а также клетки первичных культур (тимоциты и спленоциты мышей линии СВА) не оказывает существенного влияния на изменение функциональной активности митохондрий клеток, равно как и не нарушает целостности их били-пидных поверхностных мембран. Однако отсутствие влияние может быть обусловлено тем, что клетки находятся в водной среде, которая имеет большое поглощение в ТГц диапазоне спектра. Однако данное предположение не объясняет отсутствие какого-либо эффекта на клетки адгезионных культур в составе монослоя, прилегающего плотно к поверхности подложки. Исходя из этого, необходимы дополнительные исследования с культурами клеток, варьируя длительность и мощность облучения.

Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (ГК № 14.512.11.0020).

флуоресценция ШОСДЗ)

Рис. 2. Исследование мембранного потенциала митохондрий при помощи флуоресцентного красителя ОЮСб

Культура клеток Мощность облучения, мкВт Живые клетки, % Ранний апоптоз, % Поздний апоп-тоз/некроз, %

А-549 Контроль 95,9±0,5 1,2±0,7 2,8±0,3

0,1 96,2±0,3 1,2±0,4 2,6±0,3

2 96,3±0,4 0,7±0,2 3,0±0,3

30 96,4±0,4 0,7±0,2 2,9±0,2

ВТ-20 Контроль 93,3±0,2 2,6±0,5 4,1±0,4

0,1 93,1±0,2 2,5±0,4 4,4±0,6

2 93,3±0,3 2,4±0,5 4,3±0,3

30 93,2±0,3 2,7±0,5 4,1±0,2

НМС-1 Контроль 97,3±0,4 0,8±0,2 1,9±0,6

0,1 97,5±0,1 0,9±0,2 1,6±0,2

2 97,5±0,2 0,8±0,2 1,7±0,4

30 97,4±0,1 0,8±0,3 1,7±0,2

HL-60 Контроль 65,2±7,7 4,1±1,2 30,7±8,4

0,1 66,4±7,7 4,3±1,4 29,3±8,7

2 66,6±8,5 3,9±1,3 29,6±9,5

30 67,7±7,3 4,0±1,2 28,4±8,1

U-937 Контроль 56,3±8,6 2,4±0,3 41,3±6,5

0,1 55,9±6,4 2,5±0,3 41,6±6,5

2 56,4±6,7 2,8±0,3 40,8±6,5

30 58,1±6,5 2,3±0,3 39,7±6,6

Тимоциты мыши Контроль 84,1±1,3 11,4±1,3 4,5±0,4

0,1 83,8±1,4 11,2±1,4 5,0±0,5

2 83,9±1,2 11,3±1,2 4,8±0,6

30 84,1±1,3 11,6±1,3 4,3±0,5

Спленоциты мыши Контроль 53,6±0,4 25,5±0,9 20,9±1,0

0,1 53,5±0,6 26,6±1,1 19,9±0,8

2 52,2±0,8 26,5±1,0 21,3±0,8

30 53,6±0,5 26,1±1,0 20,3±0,8

Таблица. Результаты оценки мембранного потенциала митохондрий и целостности поверхностной мембраны клеток при помощи проточной цитометрии (Xs, n>4 для каждой из культур,

для спленоцитов и тимоцитов n=8)

Литература

1. Globus T.R., Woolard D.L., Khromova T., Crowe T.W., Bykhovskaia M., Gelmont B.L., Hesler J. and Samuels A.C. THz-spectroscopy of biological molecules // J. Bio. Phys. - 2003. - V. 29. - № 2. - P. 89-100.

2. Цуркан М.В., Собакинская Е.А., Смолянская О.А., Беспалов В.Г., Вакс В.Л., Балбекин Н.С. Исследование спектра молекулы ДНК в терагерцовой области частот // Научно-технический вестник информационных технологий, механики и оптики. - 2012. - № 1 (77). - С. 15-19.

3. Sun Y., Sy M.Y., Wang Y.X., Ahuja A.T., Zhang Y.T., Pickwell-Macpherson E. A promising diagnostic method: Terahertz pulsed imaging and spectroscopy // World J. Radiol. - 2011. - V. 3. - № 3. - P. 55-65.

4. Федоров В.И. Исследование биологических эффектов электромагнитного излучения субмиллиметровой части терагерцового диапазона // Биомед. радиоэлектроника. - 2011. - № 2. - С. 17-27.

5. Wilmink G.J., Grundt J.E. Invited review article: current state of research on biological effects of terahertz radiation // J. Infrared Millimeter Terahertz Waves. - 2011. - V. 32. - № 10. - P. 1074-1122.

6. Olshevskaya J.S., Ratushnyak A.S., Petrov A.K., Kozlov A.S., Zapara T.A. Effect of terahertz electromagnetic waves on neurons systems // Computational Technologies in Electrical and Electronics Engineering, 2008. SIBIRCON 2008; IEEE Region 8 International Conference. - 2008. - P. 210-211.

7. Olshevskaya J.S., Kozlov A.S., Petrov A.K., Zapara T.A., Ratushnyak A.S. Cell membrane permeability under the influence of terahertz (submillimeter) laser radiation // Vestnik Novosibirsk State University. -2010. - № 5. - № 4. - C. 177-181.

8. Alekseev S.I., Ziskin M.C. Effects of millimeter waves on ionic currents of Lymnaea neurons // Bioelectromagnetics. - 1999. - V. 20. - № 1. - P. 24-33.

9. Gerald J. Wilmink, Bennett L. Ibey, Caleb L. Roth, Rebecca L. Vincelette, Benjamin D. Rivest, Christopher B. Horn, Joshua Bernhard, Dawnlee Roberson, William P. Roach. Determination of Death Thresholds and Identification of Terahertz (THz)-Specific Gene Expression Signatures // Proc. SPIE. 2010. - V. 7562. -P. 75620K-1-75620K-8.

10. Ramundo Orlando A., Gallerano G.P. Terahertz radiation effects and biological applications // J. Infrared Millimeter and Terahertz Waves. - 2009. - V. 30. - P. 1308-1318.

11. Siegel P.H., Pikov V. Can neurons sense millimeter waves? // SPIE Photonics West, BiOS. - 2010. -P. 7562-17.

12. Siegel P.H., Pikov V. Impact of low intensity millimeter-waves on cell membrane permeability // Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves, (2009), IRMMW-THz (2009), 34th International Conference. - 2009. -V. 1. - № 1. - P. 21-25.

13. Cottet-Rousselle C., Ronot X., Leverve X., Mayol J.F. Cytometric assessment of mitochondria using fluorescent probes // Cytometry A. - 2011. - V. 79. - № 6. - P. 405-425.

14. Wlodkowic D., Telford W., Skommer J., Darzynkiewicz Z. Apoptosis and beyond: cytometry in studies of programmed cell death // Methods Cell Biol. - 2011. - V. 103. - P. 55-98.

15. Castedo M., Ferri K., Roumier T., Metivier D., Zamzami N., Kroemer G. Quantitation of mitochondrial alterations associated with apoptosis // J. Immunol. Methods. - 2002. - V. 265. - № 1-2. - P. 39-47.

Цуркан Мария Валериевна - Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет

информационных технологий, механики и оптики, аспирант, tsurkan.maria@yandex.ru

Кудрявцев Игорь Владимирович - ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, Дальнево-

сточный федеральный университет, Санкт-Петербургский государственный университет; кандидат биологических наук, доцент; igorek1981@yandex.ru

Серебрякова Мария Константиновна - Санкт-Петербургский государственный университет, студент,

m-serebryakova@yandex.ru

Несговорова Юлия Сергеевна - Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет

информационных технологий, механики и оптики, студент, yulyanesgovorova@yandex.ru

Трулев Андрей Сергеевич - ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, научный

сотрудник, trulioff@gmail.com

Назарова Инга Валерьевна - Санкт-Петербургский государственный университет, студент,

oblaka12@mail.ru

Смолянская Ольга Алексеевна - Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет

информационных технологий, механики и оптики, кандидат физ.-мат. наук, доцент, o_smolyanskaya@mail.ru

Назаров Петр Григорьевич - ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, зав. лабо-

раторией; Санкт-Петербургский государственный университет; доктор медицинских наук, профессор, peter_nazarov@mail.ru

Полевщиков Александр Витальевич - Дальневосточный федеральный университет, зав. кафедрой; ФГБУ

«НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН, вед. научный сотрудник; доктор биологических наук, профессор; Alexpol512@yandex.ru