ЗАЩИТНАЯ СРЕДА ДЛЯ СТАБИЛИЗАЦИИ КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ В ПРОЦЕССЕ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ СУХИХ ПРЕПАРАТОВ
PROTECTIVE MEDIUM FOR STABILIZATION OF TULAREMIA PATHOGEN DURING PREPARATION AND STORAGE OF DRY PREPARATIONS

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение относится к биотехнологии, в частности составам и рецептурам защитных стабилизирующих сред, предназначенных для сохранения жизнеспособности бактериальных клеток на этапах высушивания и хранения и может быть использовано для получения сухих культур и биопрепаратов, содержащих живые бактерии возбудителя туляремии.
Известно, что в процессе лиофилизации определенная часть микроорганизмов отмирает, большая часть при замораживании, меньшая - при сублимации и досушивании. Процесс хранения сухих препаратов, так же сопровождается постепенной гибелью клеток. Цели сохранения микроорганизмов в жизнеспособном состоянии служат специальные защитные среды, различных составов, широко используемые и гарантирующие определенный уровень выживаемости бактерий на этапах переработки.
Возбудитель туляремии относится к группу бактерий со средней устойчивостью к факторам замораживания и обезвоживания. Выживаемость при высушивании этих микроорганизмов без использования защитных сред колеблется от 10 до 30%. Применение стабилизации клеток средами высушивания повышает выживаемость до 40-60%.
Известна защитная среда высушивания, используемая для получения методом сублимации сухих вакцинных препаратов против чумы, туляремии, бруцеллеза и туберкулеза, содержащая: 10% сахарозы или лактозы, от 0,1 до 0,2% агар-агара, от 1 до 1,5% желатина и от 88,3 до 88,9% воды (дисахаридно-агар-желатиновая среда) [Файбич М.М. Стабилизация вакцинных препаратов в процессе высушивания и хранения // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии - 1968, №2. - С. 59-65]. При использовании вышеуказанной защитной среды, при сублимационном высушивании, выживало до 50% бактерий вакцинной культуры туляремии.
К недостаткам данной среды можно отнести: отсутствие в составе антиок-сидантов - веществ, способных нейтрализовать или замедлить процессы окисления жизненноважных структур клеток (липидов и ферментов) при воздействии на них свободных радикалов кислорода воздуха [Эмануэль Н.М. Свободные радикалы в биологии / Пер. с англ. - М.-.ИХФ АН СССР, 1981. - С. 68-70].
Так же известна защитная среда высушивания, предназначенная для получения сухих туляремийных вакцин, содержащая: 0,3% сахарозы и 5 или 10% желатина [Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. - М.: Медицина, 1975 - С. 67]. При применении указанного состава защитной среды в процессе сублимационного высушивания выживало от 50 до 60% бактериальных клеток вакцины.
К недостаткам данной защитной среды можно отнести: использование желатина в высоких концентрациях придает среде гелеобразную консистенцию, которая создает трудности при смыве культуры с поверхности агара, а так же препятствует равномерному распределению бактерий в объеме среды [Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии - М.: Медгиз, 1961 - С. 170]; отсутствие в данной среде антиоксидантов.
Наиболее близкой к заявленной является защитная среда, представляющая собой водный раствор, содержащий 10% сахарозы, 0,5% тиомочевины, 0,5% аскорбиновой кислоты, 1% желатина, 0,05% пептона и 87,95% дистиллированной воды [Никитин Е.Е., Звягин И.В. замораживание и высушивание биологических препаратов. - М.: Колос, 1971 - С. 264].
Общим с заявленным изобретением является многокомпонентный состав водного раствора и использование в среде тиомочевины и аскорбиновой кислоты.
К недостаткам данной среды высушивание можно отнести: использование сахарозы, способной к гидролизу с образованием глюкозы и фруктозы, что снижает ее стабилизирующую эффективность [Аккерман Ю. Биофизика / Пер. с англ. В.А. Отрощенко, В.Н. Сойфера. - М.: Мир - С. 338]; присутствие желатина, ведущее к гелеобразованию в защитной среде; не самое оптимальное содержание в среде антиоксидантов - тиомочевины и аскорбиновой кислоты [Звягин И.В., Хорьков И.А. методические рекомендации по разработке режимов замораживания- высушивания бактериальных препаратов. М.: Главмикроббиопром, 1981. - С. 35]; использование гидроскопичных веществ сахарозы, желатина и пептина ведет к необходимости понижения температуры замораживания стабилизированной суспензии до минус 40°С, при этом повышенное содержание гидрофильных веществ затягивает процесс сушки и может создать повышенную остаточную влажность в сухой культуре [Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии - М.: Медгиз, 1961 - С. 164].
Задачей изобретения является разработка состава защитной среды для стабилизации клеток возбудителя туляремии, обеспечивающее сокращение времени высушивания и высокую выживаемость бактерий при лиофилизации и хранении сухих препаратов в широком диапазоне температур.
Поставленная задача решается благодаря тому, что компонентный состав защитной среды сбалансирован и оптимизирован для клеток возбудителя туляремии, в составе среды высушивания предусмотрены следующие отличия: сахароза заменена на лактозу, желатин на полиглюкин, исключен пептон и увеличено содержание тиомочевины и аскорбиновой кислоты.
Использование лактозы и полиглюкина, являющихся структурообразователями и криопротекторами, дает возможность сформировать структуру высушиваемого материала, регулировать скорость дегидратации микробных клеток и значительно снизить их деструкцию при замораживании и обезвоживании. Исключение из состава среды сахарозы, желатина и пептона позволит проводить замораживание стабилизированной суспензии клеток при температуре минус 28°С (против минус 40°С с использованием среды по прототипу), при этом процесс высушивания сократится с 45 до 36 часов. Это, в комплексе с увеличением содержания тиомочевины и аскорбиновой кислоты, повышающих защиту липидов и ферментов клеток от кислорода воздуха и свободных радикалов, обеспечит выживаемость микробов при высушивании на уровне 80-90%, при низкотемпературном хранении - 80-85%, при хранении при комнатной температуре - не менее 50%.
Состав защитной среды, процент (по массе): лактоза - 10; тиомочевина -3,3; аскорбиновая кислота - 1,8; полиглюкин - 0,8; дистиллированная вода 84,1. Величина рН среды от 7,0 до 7,2 ед. рН.
Защитную среду готовят в следующем порядке. Расчетные навески компонентов взвешивают с точностью до 0,1 г, дистиллированную воду берут по объему.
Навеску полиглюкина замачивают в воде (1/6 часть от расчетного объема) и выдерживают при комнатной температуре в течение не менее четырех часов (до полного растворения). Навеску аскорбиновой кислоты растворяют в воде (1/6 часть от расчетного объема) при нагревании на водяной бане до температуры не более 30°С и перемешивании. Полученный раствор аскорбиновой кислоты охлаждают на воздухе до температуры 20-25°С и с помощью 40% раствора едкого натрия подводят его водородный показатель до значений 6,7-6,9 ед. рН.
Навеску лактозы растворяют в оставшейся дистиллированной воде при нагревании на водяной бане до температуры не более 80°С и перемешивании. Затем раствор лактозы охлаждают на воздухе до температуры 40°С и растворяют в нем навеску тиомочевины.
В охлажденный раствор лактозы и тиомочевины вносят растворы полиглюкина и аскорбиновой кислоты, перемешивают и определяют величину рН. При необходимости величину рН среды корректируют 5% раствором едкого натрия до значений 7,0-7,2 ед. рН. Готовая защитная среда представляет собой светлую, прозрачную жидкость. Среду не хранят, готовят и используют в день смыва колоний возбудителя туляремии, выращенных на поверхности плотной питательной среды.
Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигнутым техническим результатом показано в таблице 1.
Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.
Пример 1.
Готовили две среды высушивания, следующих составов:
1) защитная среда прототипа, процент (по массе):
сахароза - 10;
тиомочевина - 0,5;
аскорбиновая кислота - 0,5;
желатин - 1;
пептон - 0,05;
дистиллированная вода - 87,95;
2) заявляемая защитная среда, процент (по массе):
лактоза - 10;
тиомочевина - 3,3;
аскорбиновая кислота - 1,8;
полиглюкин - 0,8;
дистиллированная вода - 84,1.
3
Матрацы, с выросшими на поверхности плотной питательной среды колониями возбудителя туляремии, перед смывом делили на две равные группы. Из матрацев, в асептических условиях удаляли конденсат. Затем в каждый матрац вносили стерильные фарфоровые шары диаметром 7 мм (по 10 г в каждый), также с помощью стерильной пипетки вносили по 10 см защитной среды. При этом в первую группу матрацев вносили защитную среду прототипа. Во вторую группу вносили заявляемую защитную среду. Матрацы закрывали ватно-марлевыми пробками и путем покачивания их вручную производили смыв колоний с поверхности плотной питательной среды. Полученные суспензии микробных клеток собирали в две стерильные колбы.
Стабилизированные суспензии клеток, разливали высотой не более 8 мм в металлические кюветы, которые устанавливали на полках сублимационной камеры установки типа МАСС-5-02 (ООО «Биомашприбор», г. Йошкар-Ола).
Получение сухих препаратов, серии 1 (заявляемая среда) и серии 2 (среда прототипа), на основе возбудителя туляремии проводили при температуре замораживания суспензий минус 28°С по следующему режиму:
температура замораживания стабилизированной суспензии - минус 28°С,
продолжительность выдержки материала при температуре замораживания до начала создания разрежения в сублимационной камере - 4 часа;
температура конденсатора - вымораживателя - от минус 52 до минус 60°С;
величина рабочего вакуума в сублимационной камере - от 30 до 20 Па;
скорость повышения температуры материала - не более 3°С/ч;
температура материала при высушивании - 24°С;
общая продолжительность высушивания - 36 часов.
В сухих культурах определяли концентрацию клеток (бактериологическим методом) и рассчитывали выживаемость бактерий при высушивании. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Препарат серии 2 не соответствовал требованиям, предъявляемым к сухим бактериальным препаратам по показателю остаточной влажности, значения которой от 1 до 6%, являются наиболее безопасным для жизнеспособности бактерий [Бланков Б.И., Клебанов Д.Л. Применение лиофилизации в микробиологии. -М.: Медгиз, 1961. - С. 164].
Пример 2.
Состав защитных сред и порядок получения стабилизированных суспензий с использованием среды по прототипу и заявляемой среды представлены в примере 1.
Получение сухих препаратов, серии 3 (заявляемая среда) и серии 4 (среда прототипа), на основе возбудителя туляремии проводили при температуре замораживания суспензий минус 40°С по следующему режиму:
температура замораживания стабилизированной суспензии - минус 40°С,
продолжительность выдержки материала при температуре замораживания до начала создания разрежения в сублимационной камере - 4 часа;
температура конденсатора - вымораживателя - от минус 52 до минус 60°С;
величина рабочего вакуума в сублимационной камере - от 30 до 20 Па;
скорость повышения температуры материала - не более 3°С/ч;
температура материала при досушивании - 24°С;
общая продолжительность высушивания - 45 часов.
Результаты анализа свойств сухих препаратов представлены в таблице 2.
Из представленных в таблице 2 результатов видно, что заявляемый состав защитной среды позволяет получать при высушивании качественный продукт, с остаточной влажностью от 2,9 до 4,2% при выживаемости клеток от 86 до 92% в более короткий срок.
Пример 3.
Полученные сухие препараты, серий 1-4, хранили в металлических герметичных стаканах в стационарных условиях в трех температурно-временных режимах:
температура от минус 15 до минус 9°С в течение 3 месяцев;
температура от 0 до 4°С в течение 1 месяца;
температура от 18 до 22°С в течение 3 суток.
После хранения в препаратах определяли концентрацию живых клеток (бактериологическим методом) и рассчитывали выживаемость бактерий после хранения. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Представленные в таблице 2 данные свидетельствуют о том, что заявляемый состав защитной среды позволяет сохранять до 85% жизнеспособных клеток при температуре от минус 15 до минус 9°С в течение 3 месяцев, до 69% клеток при температуре от 0 до 4°С в течение 1 месяца и до 53% клеток при температуре от 18 до 22°С в течение 3 суток.