Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы

Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы

Ф.А. Шамилов1, Я.В. Вишневская2, В.Ю. Сельчук1, Е.М. Погодина2,

Д.И. Зернов2, Н.В. Чхиквадзе2, В.В. Тимошенко2, Д.А. Рябчиков2, Н.Н. Тупицын2

Кафедра онкологии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет

им. А.И. Евдокимова» Минздрава России;

2ФГБУ«РОНЦим. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

Контакты: Фархад Азерович Шамилов farhad8282@rambler.ru

Проведено исследование субпопуляций интратуморальных лимфоцитов, выделенных из материала кор-биопсии у больных раком молочной железы (РМЖ) (п = 19). Использован метод многопараметровой проточной цитометрии с двумя 4-цветными комбинациями антител: СВ4/СВ25/СВ3/СВ45 и СВ8/СВ56/СВ3/СВ45. Преобладающим типом лимфоцитов в опухолевой ткани были зрелые Т-клетки (СВ3+) — 88,2 %>, далее следовали СВ4+-лимфоциты (45,1 %>) и Т-цитотоксические (СВ8+) клетки (40,4 %). Среднее содержание NK-клеток и СВ4+СВ25+-лимфоцитов было невысоким — 1,6 %> и 4,1 %> соответственно. Соотношение СВ8/СВ4 в 53 % случаев было < 1. Пропорция СВ8+ клеток была более высокой в случаях умеренной и выраженной инфильтрации опухоли СВ45++-лимфоцитами (р = 0,007).

Ключевые слова: рак молочной железы, субпопуляции интратуморальных лимфоцитов, кор-биопсия, проточная цитометрия

Possibilities of investigating intratumoral lymphocyte subpopulations by flow cytometry of tumor core biopsy specimens in patients with breast cancer

F.A. Shamilov1, Ya.V. Vishnevskaya2, V.Yu. Selchuk1, E.M. Pogodina2,

D.I. Zernov2, N.V. Chkhikvadze2, V.V. Timoshenko2, D.A. Ryabchikov2, N.N. Tupitsyn2

department of Oncology, Moscow State University of Medicine and Dentistry;

2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

Study of tumor-infiltrating lymphocyte subpopulations was performed in 19 patients with breast cancer (core biopsy material). Two probes were used in multiparameter flow cytometry: CD4/CD25/CD3/CD45 and CD8/CD56/CD3/CD45. Mean percentage of different cell types within lymphocytes (CD45++ SSCLow) was as follows: CD3 - 88.2 %o, CD4 - 45.1 %,, CD8 - 40.4 %,, NK (CD3-CD56+) - 1.6 %,, CD4+CD25+ - 4.1 %>. Ratio CD8/CD4 was less than 1 in 53 %> of cases. In cases of prominent and moderate CD45 infiltration percentage of CD8+ lymphocytes was significantly higher than in cases with low infiltration, p = 0.007.

Key words: breast cancer, subpopulations of tumor-infiltrating lymphocytes, core-biopsy, flow cytometry

Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы (РМЖ) имеет важное клиническое значение. При операбельном раке на основании этих данных возможно выделение групп пациенток с благоприятным и неблагоприятным прогнозом [1, 2, 4-6].

Это может являться основанием для расширения показаний для иммунологических исследований, их проведения на этапе диагностики по материалу кор-биопсии, так же, как это делается для морфологической верификации диагноза, определения рецепторов эстрогенов и прогестерона, экспрессии HER2 и пролиферативного индекса Ю-67.

Роль изучения интратуморальных лимфоцитов при РМЖ была подтверждена иммуногистохимией и проточной цитометрией на материале хирургически уда-

ленной опухоли [1-6]. Исследования кор-биопсии не нашли широкого применения, так как считается, что материала, получаемого при кор-биопсии, недостаточно для иммунологического анализа. Вместе с тем, именно данные, получаемые при кор-биопсии, могли бы быть использованы для планирования и проведения лечебных мероприятий (иммунотерапия, химиотерапия (ХТ)) в неоадъювантном режиме у больных с неблагоприятным прогнозом.

В работе Н.А. Субботиной и соавт. [3] показано, что иммуногистохимический анализ материала кор-биопсии с использованием люминесцентной микроскопии позволяет в полной мере охарактеризовать субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов. Иммуногистохимическая оценка позволяет оценить уровни интратуморальных лимфоцитов лишь

Маммология

Маммология

полуколичественно, что является менее точным при оценке динамики изменений после проведенного лечения.

Метод многопараметровой проточной цитометрии дает возможность оценить экспрессию целого ряда маркеров на уровне одной клетки, что открывает перспективы исследований даже при получении очень маленьких образцов опухолевой ткани.

Целью настоящей работы явилась оценка возможности изучения субпопуляционного состава интрату-моральных лимфоцитов у больных РМЖ на материале кор-биопсии.

Материалы и методы

Исследование проведено среди больных операбельным РМЖ, у которых в процессе комплексного обследования с целью верификации диагноза проводилась кор-биопсия опухолевой ткани (п = 19). Диагноз РМЖ во всех случаях был подтвержден морфологически.

Для иммунологических исследований клетки опухоли дезагрегировали с использованием скальпеля и иглы, в ряде случаев применяли аппарат «Medimashin» (Becton Dickinson, США), специально разработанный для выделения лимфоцитов из опухолевой ткани.

Окраску клеток проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител, меченых флуорохромами. Количество проб, изучаемых иммунологически, было сведено до 2, учитывая крайне малое количество материала кор-биопсии:

1) CD4-FITC/CD25-PE/CD3-ECD/CD45-PE.Cy5;

2) CD8/FITC/CD56-PE/CD3-ECD/CD45-Pe.Cy5. Эти комбинации антител позволяли оценить общий уровень инфильтрации опухоли лимфоцитами, пропорцию Т-клеток среди лимфоцитов, субпопуляции CD4- и CD8-клеток, активационные маркеры (CD25) и, в частности, CD4+CD25+ T-регуляторные клетки, TNK-лимфоциты (CD3+CD56+) и естественные киллеры (CD3CD56+).

Сбор клеток проводили на проточном цитометре EPICS XL MCL, общее количество набираемых событий — от 75 000 до 500 000.

Анализ цитометрических данных проводили с использованием программ MDI или FCS (версия 3). При статистической обработке данных использовали программу SPSS.

Результаты и обсуждение

В большинстве случаев полученного материала кор-биопсии хватало для окраски обеих проб. Уровень лимфоидной инфильтрации опухолевой ткани колебался от незначительного до выраженного. На рис. 1 представлена умеренная лимфоидная инфильтрация ткани РМЖ лимфоцитами. Анализ субпопуляций лимфоцитов проводили в гейте R1.

СО

CN

О

10° 101 102 103 104

CD45Pc_5

Рис. 1. Умеренная инфильтрация РМЖ лимфоцитами

Количественная характеристика субпопуляций лимфоцитов по материалу кор-биопсии представлена в табл. 1.

В материале кор-биопсии больных РМЖ преобладали зрелые Т-клетки (CD3+), количество которых достигало 95 % от числа лимфоцитов, в среднем 88,2 ± 1,6 %. Количество CD4-лимфоцитов незначительно преобладало над количеством цитотоксических лимфоцитов (CD8+) — в среднем 45,1 % и 40,4 % соответственно. Соотношение CD8/CD4 в целом по группе составило 0,96. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, незначительным и не превышал 4,12 %. Т-регулятор-

Таблица 1. Субпопуляции лимфоцитов ткани РМЖ

Субпопуляция (CD) Описательные статистики

n % клеток

min max среднее стандартная ошибка среднего

CD3 18 72,90 95,0 88,0578 1,58944

CD8 17 25,38 57,38 40,3612 2,15794

CD4 18 24,49 60,82 45,1067 2,36914

CD8/CD4 17 0,43 1,43 0,9565 0,07670

CD4+CD25+ 14 0,58 9,13 4,0943 0,77425

CD3+CD56+ 17 0,59 28,00 4,4676 1,56628

CD3-CD56+ 17 0,00 4,12 1,5929 0,34319

% CD45++SSCLow 19 0,10 9,54 2,1121 0,67986

102

CD45Pc_5

101 102 103

sCD3_ECD

Рис. 2. Выраженная инфильтрация опухоли СВ8-лимфоцитами, соотношение СВ8/СВ4 = 1,19: а — уровень общей лимфоцитарной инфильтрации очень высокий, в гейте К1 — 9,2 % клеток от общего числа событий (158 533); б — большинство лимфоцитов представлены зрелыми Т-клетками (91 %); в — среди тумор-инфильтрирующихлимфоцитов преобладают СВ8+-клетки (51 %); г — содержание СВ4+-лимфоцитов — 43 %

ные клетки находились в диапазоне от 0,58 до 9,13 %, в среднем — 4,1 ± 0,8 %.

Эти данные подтверждают результаты предшествующих исследований относительно главенствующей роли Т-лимфоцитарного звена иммунитета в инфильтрации опухолевой ткани РМЖ [1-4]. Впервые количественно подтверждено, что среди тумор-инфильтрирую-щих лимфоцитов CD4-клетки (44,1 %) преобладают над цитотоксическими CD8+-лимфоцитами (40,4 %), и соотношение CD8/CD4 не достигает единицы (0,96). Учитывая тот факт, что преобладание CD4-клеток является фактором неблагоприятного прогноза [5, 6], можно считать обоснованным рассмотрение возможности разработки методов повышения уровней CD8-лимфоцитов и соотношения CD8/CD4 в опухолевой ткани больных РМЖ.

Этот вопрос необходимо рассматривать индивидуально, учитывая особенности субпопуляционного со-

става лимфоцитов в ткани кор-биопсии РМЖ. Действительно, у 9 из 15 пациенток, у которых было изучено соотношение CD8/CD4 в опухолевой ткани, значение индекса составляло < 1 (min 0,4), однако в 8 случаях Т-цитотоксические лимфоциты преобладали — от 1,14 до 1,4. Пример высокого содержания CD8-лимфоци-тов представлен на рис. 2.

Содержание TNK-клеток и естественных киллеров было, как правило, невысоким. На рис. 3 представлены эти субпопуляции интратуморальных лимфоцитов.

Важное значение в исследованиях противоопухолевого иммунитета имеет анализ Т-регуляторных клеток — субпопуляции CD4+CD25++-лимфоцитов, способной подавлять иммунный ответ на опухолевые антигены. Пример выраженной пропорции CD4+CD25+ интрату-моральных лимфоцитов в материале кор-биопсии РМЖ представлен на рис. 4.

зСО3_ЕСй

Рис. 3. Субпопуляции ТNK-клеток и естественных киллеров в ткани РМЖ (материал кор-биопсии). Анализ в гейте СВ45++/ЗЗС1оп лимфоцитов (выделение гейта см. на рис. 1). Отчетливо видны субпопуляция TNK-клеток (СВ56+СВ3 +) — 1,0 % и субпопуляция естественных киллеров (СВ56+СВ3—) — 1,07 %

о

ее Ъ

з'

и

. : : -• t .' 8,09 % .'Jz,c: v • $$№

V;: 4,75 %

10° 101 102 103

CD25_PE

104

Рис. 4. Экспрессия СВ25 на СВ4+ Т-лимфоцитах и на СВ4-негативных Т-клетках. Анализ в гейте СВ45++/ЗЗС1оп СВ3-позитивных лимфоцитов. Количество СВ3+СВ4+СВ25+-лимфоцитов — 8,09 %

б

а

в

г

Маммология

Маммология

-

о

и

8,09% • '  ^ '

101 102 103

СР45 БСР

104

100

101

102 СР45 БСР

103

104

Рис. 5. Низкое содержание тумор-инфильтрирующихлейкоцитов в материале кор-биопсии РМЖ(а), существенное преобладание СВ4+-лимфо-цитов (б). Содержание клеток в гейте лимфоцитов составило всего 0,34 % от общего числа событий. Более 90 % из них представлены Т-клет-ками (СВ3+), из которых 68 % — СВ4+-клетки, соотношение СВ8/СВ4 « 0,5

Как видно на рис. 4, уровни экспрессии CD25 на CD4+ Т-клетках примерно такие же, как и на CD4-негативных Т-клетках, что не позволяет отнести их

Таблица 2. Процентное содержание субпопуляций клеток в пределах интратуморальных СВ45++-лимфоцитов в зависимости от общего уровня лимфоидной инфильтрации опухолевой ткани

Популяция клеток (CD) Уровень инфильт- рации п Средний процент Стандартная ошибка среднего P

0,00* 7 86,8729 6,63905 0,57

С-^^3 1,00 11 88,8118 7,01793

0,00 6 32,9833 2,68878 0,007

CDo 1,00 11 44,3855 8,51905

0,00 7 43,8943 12,71022 0,7

Си4 1,00 11 45,8782 8,55217

CD8/CD4 0,00 6 0,8500 0,33009 0,32

1,00 11 1,0145 0,30826

CD4+CD25+ 0,00 5 5,2640 2,93215 0,28

1,00 9 3,4444 2,82996

CD3+CD56+ 0,00 6 8,6467 9,93105 0,045

1,00 11 2,1882 1,10516

CD3-CD56+ 0,00 6 1,7150 1,70007 0,81

1,00 11 1,5264 1,32085

*0 — низкие уровни инфильтрации, 1 — умеренная и высокая инфильтрация.

однозначно к регуляторным Т-клеткам. Подобный фенотип более характерен для активированных CD4+-лимфоцитов (активированных Т-хелперов).

Наибольший интерес представляют случаи РМЖ, которые на основании субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов могут быть расценены как прогностически неблагоприятные. Подобное наблюдение с минимальной инфильтрацией опухоли лимфоцитами и низким содержанием Т-цитотокси-ческих (CD8+) клеток представлено на рис. 5.

Согласно современным представлениям, больные с выраженным преобладанием CD4+-лимфоцитов в опухолевой ткани характеризуются неблагоприятным прогнозом [5, 6]. Отбор этих случаев на этапе диагностики (кор-биопсии) позволяет планировать лечебные мероприятия, например, иммунотерапевтические в неоадъювантном режиме.

Таким образом, материала кор-биопсии в большинстве случаев достаточно для оценки субпопуля-ционного состава интратуморальных лимфоцитов. Для минимизации количества необходимого для исследования материала необходимо использовать много-параметровую (4-цветную) проточную цитометрию, позволяющую количественно оценить как уровни инфильтрации опухоли Т-лимфоцитами, так и субпопуляции наиболее значимых эффекторных клеток противоопухолевого иммунитета: зрелые Т-лимфоциты, Т-хел-перы, активированные Т-лимфоциты, Т-регуляторные клетки, Т-цитотоксические лимфоциты, ККТ-клетки и КК-клетки.

На представленном нами материале уровни инфильтрации РМЖ лимфоцитами можно разделить на низкие (< 0,5 % лимфоцитов от общего числа событий) — 7 из 19 больных (36,8 %), умеренные (0,5-2 %) — 8/19 (42,1 %) и высокие (> 2 %) - 4/19 (21,1 %). Преобладают случаи с низкой и умеренной лимфоидной инфильтрацией (79 %).

б

а

В составе интратуморальных лимфоцитов РМЖ до 95 % составляют зрелые Т-клетки (CD3+). Их субпо-пуляционный состав характеризуется преобладанием Т-хелперов (CD4+) над Т-цитотоксическими лимфоцитами (CD8+), соотношение CD8/CD4 < 1 — 53 % случаев, > 1 - 47 % случаев.

При сравнении группы больных с низкими и очень низкими уровнями лимфоидной инфильтрации РМЖ с группой больных, у которых наблюдается умеренная и выраженная инфильтрация, получены интересные данные (табл. 2).

Из числа проанализированных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов только Т-цитотоксичес-кие (CD8+) клетки имели взаимосвязь с общим уровнем лимфоидной инфильтрации. При умеренной и высокой инфильтрации процентное содержание Т-цитотоксических клеток было достоверно более высоким: 44,4 % и 33 %, р = 0,007 (см. табл. 2). Это позволяет предположить, что именно CD8+-лимфоциты во многом определяют общий уровень лимфоидной инфильтрации РМЖ. Подобное заключение о существовании положительной взаимосвязи между общим

уровнем лимфоидной инфильтрации РМЖ и уровнем инфильтрации Т-цитотоксическими (CD8+) лимфоцитами было сделано ранее с использованием полуколи-чественного иммуногистохимического метода [1, 2], а в нашей работе получило строго количественное подтверждение. Взаимоотношения общего уровня лимфоидной инфильтрации (CD45++/SSCLow) с процентом ТКК-клеток были иными: более высокое содержание ТКК-клеток отмечено при низкой лимфоидной инфильтрации опухоли.

Заключение

Представленные результаты свидетельствуют о возможности количественного исследования субпопуляци-онного состава интратуморальных лимфоцитов РМЖ на материале кор-биопсии. Эти данные могут быть использованы для разработки протоколов иммунокоррекции в прогностически неблагоприятных группах. Разумеется, дальнейшие исследования необходимо проводить с учетом иммунофенотипических особенностей опухоли, в частности, молекул рецепторов, опосредующих взаимодействия с клетками иммунной системы.

1. Артамонова Е.В. Роль иммунофеноти-пирования опухолевых клеток в диагностике и прогнозе рака молочной железы. Иммунология гемопоэза 2009;6(1):8-51.

2. Артамонова Е.В., Огнерубов Н.А., Тупицын Н.Н., Летягин В.П. Рак молочной железы: иммунологические факторы прогноза. Издательство Воронежского государственного университета, 2005. 240 с.

ЛИТЕРАТУРА

3. Субботина А.А., Летягин В.П.,

Тупицын Н.Н., Ермилова В.Д.,

Высоцкая И.В. Роль иммунофенотипиро-вания рака молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии. Иммунология гемопоэза 2009;6(1):52-78.

4. Тупицын Н.Н. Иммунофенотип рака молочной железы. Рак молочной железы. Под ред. Н.Е. Кушлинского,

С.М. Портного, К.П. Лактионова.

М.: РАМН, 2005. С. 174-97.

5. DeNardo D.G., Drennan D.J., Rexhepaj E. et al. Leucocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. Cancer Discovery 2011;1(1):54-67.

6. Ruffel B., Au A., Rugo H.S. et al. Leucocyte composition of human breast cancer. PNAS 2012;109(8):2796-801.

Маммология