Доклинические исследования защитной активности препарата кандидатной рекомбинантной живой коклюшной вакцины интраназального применения

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019

Л.Н.Синяшина, Е.Г.Семин, А.Ю.Медкова, Р.А.Сюндюкова, Г.И.Каратаев

ДОКЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЗАЩИТНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА КАНДИДАТНОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ЖИВОЙ КОКЛЮШНОЙ ВАКЦИНЫ ИНТРАНАЗАЛЬНОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва

Цель. Изучение защитной активности кандидатной рекомбинантной живой коклюшной вакцины (РЖКВ) интраназального применения. Материалы и методы. В работе использованы два метода оценки защитной активности коклюшных вакцин, основанные на определении выживаемости выкцинированных мышей: традиционный — после внутримозгового в тестах внутримоз-гового заражения бактериями B. pertussis 18323 и интраназального заражения вакцинированных мышей вирулентными бактериями рода Eordetella (B.pertussis, B.paraperussis и B.bronchiseptica). Результаты. Предложен оригинальный метод, характеризующий защитную активность коклюшных вакцин, обусловленную мукозальной составляющей иммунитета. Защитная активность сконструированной авторами живой рекомбинантной коклюшной вакцины интраназального применения, определенная двумя методами, превосходила защитную активность коммерческого препарата АКДС. РЖКВ обеспечивала защиту от заражения мышей природными и рекомбинан-тными бактериями рода Eordetella. Заключение. Изученная рекомбинантная живая коклюшная вакцина интраназального применения имеет выраженный защитный потенциал и может быть рекомендована для проведения клинических исследований.

Журн. микробиол., 2019, № 3, С. 60—69

Ключевые слова: живая вакцина, интраназальное применение, защитная активность, выживаемость

L.N.Sinyashina, E.G.Semin, A.Yu.Medkova, R.A.Syundyukova, G.I.Karataev

PRE-CLINICAL STUDY OF PROTECTIVE POTENCY OF CANDIDATE RECOMBINANT LIVE PERTUSSIS VACCINE FOR INTRANASAL ADMINISTRATION

Gamaleya National Research Centre of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia

The aim of present research is studying of protective potency of candidate recombinant live pertussis vaccine (RLPV) for intranasal administration. Materials and methods. Two methods of protective potency assessment, based on mice survival estimating, were used: after intracerebral administration of B.pertussis 18323 bacteria and after intranasal administration of virulent Bordetella spp. bacteria (B.pertussis, B.parapertussis and B.bronchiseptica) to immunized mice. Results. An ingenious method of pertussis vaccine protective potency assessment due to mucosal immunity is suggested. Protective potency of constructed RLPV estimated in two tests of intracerebral and intranasal administration was higher than market image drug of DTP vaccine. RLPV provided protection from infection in mice after administration of both wild type and recombinant Bordetella spp. bacteria. Conclusion. Examined recombinant live pertussis vaccine (RLPV) for intranasal administration has significant protective potential and could be recommended for using in clinical trials.

Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2019, No. 3, P. 60—69

Key words: live pertussis vaccine, intranasal administration, protective potency, survival

ВВЕДЕНИЕ

Коклюш — тяжелое инфекционное заболевание, передающееся воздушно-капельным путем и относящееся к категории управляемых инфекций, контролируемых с помощью вакцинопрофилактики. С начала 1950-хх годов вакцинацию против коклюша во всем мире проводят цельноклеточными коклюшными вакцинами (ЦКВ) в составе АКДС. В начале 1990-х годов в ряде экономически развитых стран ЦКВ заменили на менее реактогенные бесклеточные (ацелюлярные) коклюшные вакцины (БКВ) в составе АаКДС. Однако, несмотря на успехи вакцинопрофилактики коклюша, заболеваемость во всем мире неуклонно растет [9]. Все чаще выявляют коклюш у подростков и взрослых, растет число атипичных форм заболевания и, так называемого, бессимптомного носительства. Клинические изоляты возбудителя коклюша содержат измененные новые генотипы бактерий B. pertussis, позволяющие нивелировать поствакцинальный иммунитет [1,14]. Краткосрочность протективного иммунитета, индуцированного современными коклюшными вакцинами, также отражается на увеличении заболеваемости в атипичных формах и распространенности коклюша в разных возрастных группах. Сложившаяся эпидемиологическая картина диктуют необходимость совершенствования применяемых коклюшных вакцин, а также создания новых, позволяющих эффективно иммунизировать младенцев и ревакцинировать подростков и взрослых. В НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи разработана инновационная рекомбинантная живая коклюшная вакцина (РЖКВ) для интрана-зального применения. РЖКВ содержит генетически модифицированные бактерии B. pertussis 4М^, несущие две мутации в опероне ptx и точечную мутацию в его про-моторной области, а также нокаутную мутацию гена dnt. Бактерии B. pertussis 4М^, также как и сконструированные ранее аттенуированные бактерии, продуцируют нетоксичную форму коклюшного токсина (КТ) и не синтезируют дермонекротичес-кий токсин (ДНТ) [4,5]. Рекомбинантные бактерии B. pertussis 4М^ в результате сайт-направленного мутагенеза промоторной зоны оперона ptx приобрели наиболее распространенный в настоящее время в популяции возбудителя коклюша генотип ptxP3, характеризующийся повышенной экспрессией КТ в сравнении с бактериями генотипа ptxP1[4,6]. Целью настоящей работы было изучение защитной активности кандидатной рекомбинантной живой коклюшной вакцины интраназального применения в тестах внутримозгового и интраназального заражения вакцинированных мышей вирулентными бактериями рода Вordetella (B. pertussis, B. paraperussis и B. bronchiseptica).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактерии B. pertussis, B.paraperussis и B. bronchiseptica культивировали на твердой питательной среде КУА с добавлением 10% дефибринированной крови барана при температуре 35о-37оС в течение 24-36 ч. После интраназального заражения у эвтана-зированных мышей извлекали легкие, гомогенизировали в 0,85% растворе хлорида натрия рН 7.2-7.4, инкубировали при температуре 350С 15 мин и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5-10 мин. По 0,1 мл супернатанта высевали на три чашки Петри с селективной средой. Для выделения ДНК супернатанты гомогенатов легких обрабатывали раствором гуанидинтиоцианата с последующей сорбцией ДНК на магнитном сорбенте фирмы «Promega» США [2]. Использована разработанная нами тест-система для ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) [2]. Защитную активность РЖКВ и субстанции — аттенуированных бактерий В. pertussis 4MKS определяли после однократного интраназального введении трех пятикратных разведений

препарата, начиная с дозы 0,750 МЕ в 0,025 мл 20 мышам. Коммерческий препарат АКДС разводили в соответствии с инструкцией до концентрации 0,750 МЕ в 0,5 мл и вводили внутрибрюшинно однократно 20 мышам. Спустя 17-20 суток после иммунизации мышей заражали интрацеребрально вирулентными бактериями В.pertussis 18323. В экспериментах использовали мышей линии Balb/d обоего пола весом 1012 г. Одновременно из этой же партии использовали мышей для титрования ЛД50 штамма B. pertussis 18323. Тест считали положительным, если препарат обеспечивал выживаемость более 70 % мышей при заражении их не менее 100 ЛД50 [3].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Существующие в настоящее время для профилактики коклюша вакцины АКДС и АаКДС применяют парентерально (внутримышечно), и методы изучения их защитной активности предполагают подкожное или внутрибрюшинное однократное введение тестируемых препаратов мышам. Для доклинического исследования живых коклюшных вакцин нами отработан метод интраназального введения бактерий B. pertussis лабораторным животным. Для иммунизации и экспериментального заражения суспензию бактерий B. pertussis вводили интраназально, используя краткосрочный наркоз, обеспечивающий свободное дыхание животного. Обездвиживание мышей достигалось внутримышечным введением раствора золетила (Франция) в количестве 0,2-0,4 мг. После наркоза каплю суспензии на конце иглы шприца Гамильтон (20-25 мкл) подносили к носу мыши, добиваясь ее полного вдыхания без разбрызгивания. Для определения эффективной дозы было определено количество бактерий B. pertussis в респираторном тракте мыши через час после интраназального введения препарата. С этой целью гомогенат легких мышей в разведениях высевали на среду КУА с кровью и параллельно определяли количество геном—эквивалентов B. pertussis с помощью ПЦР РВ. Установлено, что через один час после интраназаль-ной инокуляции около 109 бактерий B. pertussis методом ПЦР РВ в легких мышей регистрируется около 106 ГЭ B. pertussis, а бактериологическим методом 105 КОЕ.

Интраназальное введение РЖКВ проводили по описанной выше методике. Результаты экспериментов представлены на рис. Установлено, что мыши, интрана-зально иммунизированные РЖКВ в дозе 0,75х109 м.к. (0,75 МЕ), выживали в 100% случаев при заражающей дозе в 300 ЛД50. В среднем 89,7 % выживаемости мышей обеспечивала доза вакцины 0,15 МЕ и 59% — 0,03 МЕ. Таким образом, предполагаемая защитная доза РЖКВ, обеспечивающая выживание более 70% вакцинированных мышей, близка к 0,15 МЕ. В качестве сравнения были выбраны: коммерческий препарат АКДС С1252/ААП/15 НПО «Микроген» и изогенные аттенуированные бактерии B. pertussis 4М генотипа ptxP1. АКДС защищала только 85% мышей даже при иммунизации максимальной дозой. Выживаемость при дозе 0,15 МЕ составляла 60%, а при минимальной дозе выживало 10 % мышей, интрацеребрально зараженных вирулентными бактериями B. pertussis 18323. Интраназальная иммунизация живыми бактериями B. pertussis 4М обеспечивала 60% выживаемости мышей при дозе равной 0,15 МЕ, в то время как тот же уровень защиты обеспечивали бактерии B. pertussis 4М^ (РЖКВ) в дозе в 5 раз меньшей — 0,03 МЕ.

Ранее нами были сконструированы рекомбинантные бактерии B. bronchiseptica 8220-17, продуцирующие коклюшный токсин (КТ) [6]. КТ, продуцируемый реком-бинантными бактериями B.bronchiseptica 8220-17, обладает свойствами нативного КТ, экспрессируемого вирулентными бактериями B.pertussis. Следует отметить, что помимо описанных ранее иммунобиологических характеристик, интраназальное введение бактерий B.bronchiseptica 8220-17 макакам резус сопровождалось развити-

ем лейкоцитоза и выработкой специфических антител к КТ, взаимодействующих с нативным КТ (не опубликовано).

Бактерии B.pertussis 475 выращивали на среде КУА с кровью в течение 24—30 часов, B.pаrареrtussis 504 — 18-20 ч, B.bronchiseptica 8220-17 — 12-16 ч. Культуру собирали с чашек, суспендировали в 0,85% растворе хлорида натрия до концентрации 120 МЕ (1,2х10и м.к. в мл) и по 25 мкл суспензии в соответствующих разведениях вводили мышам. Для инокуляции использовали исходную культуру и два 3-кратные разведения, содержащие 3х109, 1х109 и 3х108 МЕ, соответственно. Контролем служили мыши, которым интраназально вводили по 25 мкл 0,85% раствора хлорида натрия. Определение количества бактерий в легких животных через час после введения показало, что при интраназальном введении 3х109 м.к. регистрировали от 106 до 107 ГЭ бактерий, при введении дозы 3х108 — высевали порядка 105 КОЕ. Рассчитанное из количества инокулированных бактерий рода Bordetella значение ЛД50 составляло (0,25-0,47) х109 м.к. Результаты представлены в табл. 1. Наибольшую гибель мышей наблюдали в период с 3 по 17 дни, при введении 3х109 м.к. погибало 100% мышей и 80-100% при дозе 109 м.к. Доза

0 3х109 м к вызывяяя гибель 60- Таблица 1. Офек™ шружштости fernem B.per-°,3х1° м.к. вызывала гибель 60- tussis 475, B.pаrареrtussis 504 и B.bronchiseptica 8220-17 80% мышей. Инфицированные

мыши теряли в весе, изменялся шерстяной покров (выпадение, взъерошенность и т.п.), снижалась двигательная активность (сбивались в кучу, сидели без движения). Через 20 дней состояние выживших мышей приходило в норму. В контрольной группе все мыши оставались живыми. Срок наблюдения 30 суток.

Интраназальную иммунизацию мышей проводили тремя сериями РЖКВ. ЛД50 вирулентных бактерий B. bronchiseptica 8220 и 8220-17 (рекомбинантный штамм продуцирующий нативный КТ), B. pertussis 475, B. pаrареrtussis 504 определены в соответствии с результатами, представленными в табл. 1. Иммунизированных РЖКВ мышей заражали интра-назально разрешающей дозой (3-5)х109 м.к., что соответствовало 7-12 ЛД50 для использван-ных вирулентных бактерий рода Bordetella. Результаты эксперимента приведены в табл. 2.

В настоящем сообщении представлены результаты изучения защитной активности РЖКВ интраназального применения.

Бактерии Заражающая доза

B. bronchiseptica 8220-17 3,0 0/10 0,25

1,0 1/10

0,3 2/10

B. pertussis 475 3,0 0/10 0,29

1,0 0/10

0,3 4/10

B. pаrареrtussis 504 3,0 0/10 0,44

1,0 2/10

0,3 4/10

B. bronchiseptica 8220 3,0 0/10 0,47

1,0 1/10

0,3 3/10

П р и м е ч а н и е. № — количество выживших мышей; N0 — количество мышей в эксперименте (здесь и в табл. 2).

Таблица 2. Защитная активность РЖКВ в тесте интра-назальнго заражения мышей живыми бактериями B.pertussis 475, B.bronchiseptica 8220-17 и B.pаrареrtussis 504

Препарат Доза (х109 м.к.) №/Nq и % выживших мышей

B.p. 475 B.b. 8220-17 B^. 504

РЖКВ, 0,75 10/10 9/10 10/10

серия 3.1 0,15 10/10 9/10 10/10

0,03 8/10 7/10 7/10

РЖКВ, 0,75 10/10 10/10 10/10

серия 0,15 9/10 8/10 9/10

1.1.10 0,03 8/10 8/10 7/10

РЖКВ, 0,75 9/10 10/10 10/10

серия 0,15 10/10 10/10 8/10

1.1.11 0,03 8/10 8/10 9/10

Вакцина 0,75 9/10 7/10 10/10

АКДС 0,15 7/10 6/10 8/10

0,03 4/10 3/10 4/10

63

4

О серия 3.1  серия 1.1.10 Д серия 1.1.11 ХАКДС О B.pertussis 4 М

Защитная активность РЖКВ после внутримозгового заражения мышей вирулентными бактериями B. pertussis 18323.

РЖКВ — серии 3.1, 1.1.10, 1.1.11; АКДС — серия С1252/ААП/15; B. pertussis 4М — аттенуирован-ные бактерии B. pertussis генотипа Ptx P1; горизонтальная линия: контрольный уровень 70% выживания мышей; иммунизирующие дозы: 1 — 0,75 х109 м.к.; 2 — 0,15 х109 м.к.; 3 — 0,03 х109 м.к.

Для оценки защитной активности ЦКВ, в соответствии с рекомендациями ВОЗ, как правило, используют тест внутримозгового (интрацеребрального) заражения иммунизированных мышей вирулентными бактериями тестового штамма B. pertussis 18323 [3,17]. Защитную активность новых препаратов БКВ в Европе и США определяют по иммуногенности — способности индуцировать выработку специфических противококлюшных антител, в сравнении с лицензированными препаратами. В Японии, Китае, Корее для оценки БКВ используют разные модификации теста интрацеребрального заражения (ICN или MICA). Применяется также методика сравнительной оценки скорости выведения вирулентных бактерий B. pertussis из легких мышей после интраназального заражения контрольных и вакцинировнных животных (INCA) [17]. Именно такой метод использован для оценки протективнос-ти живых аттенурованных бактерий B. pertussis BPZE1, сконструированных французскими учеными [13]. Основные трудности при определении защитной активности новых вакцинных препаратов состоят в сложности стандартизации предлагаемых методов и сопоставлении полученных результатов [17]. Нам представляется, что метод определения защитной активности коклюшных вакцин в тесте интрацереб-рального заражения мышей, несмотря на его трудоемкость, достаточно воспроизводим, хорошо коррелирует с защитной активностью ЦКВ и пригоден для оценки протективности рекомбинантных живых коклюшных вакцин. Для того, чтобы оценить протективность живой вакцины при естественном для коклюша интраназаль-ном введении вирулентных бактерий, нами разработан метод, предполагающий определение выживаемости контрольных и интраназально вакцинированных мышей после их интраназального заражения вирулентными бактериями рода Bordetella [6]. Описание подобного метода в современной литературе не встречается.

Проведенные исследования показали, что внутримышечное введение золетила в дозе 0,2-0,4 мг приводит к краткосрочному (5-10 мин) обездвиживанию мышей (крысят) и сохраняет равномерное дыхание животных. В таком состоянии они способны вдохнуть 20-25 мкл суспензии (108- 109 МОЕ) в виде капли на конце иглы

100

80-

60-

40"

20"

0

О

X

Иммунизирующие дозы

шприца «Гамильтон» без разбрызгивания и потери материала. Эвтаназия животных через час после введения препарата показала, что в легких регистрируется около (105-106) ГЭ, что значительно меньше количества инокулированных бактерий. Результат одинаков для вирулентных и аттенуированных бактерий B. pertussis, реком-бинантных бактерий B. bronchiseptica 8220-17 и природных изолятов B. bronchiseptica 8220 и B. pаrареrtussis 504. Этот показатель важен для определения дозы препарата РЖКВ, формирующей определенный защитный эффект, и его следует учитывать при оценке результатов как в экспериментах с животными, так и при планировании вакцинирующей дозы в клинических исследованиях РЖКВ. Защитную активность РЖКВ при вакцинации мышей интраназальным способом проверяли в двух тестах. Интрацеребральное заражения мышей вирулентными бактериями B.pertussis 18323 продемонстрировало высокую протективность препарата РЖКВ, превосходящую защитную активность коммерческого препарата АКДС серии С1252/ААП/15 НПО «Микроген». Препарат РЖКВ, согласно критериям, применяемым для ЦКВ, может быть использован для иммунизации мышей в дозе 0,15 КОЕ. Полученный нами результат является тем более убедительным после оценки количества коклюшных микробных клеток, выявленных в легких мышей через час после иммунизации РЖКВ. По-видимому, реальная доза живых рекомбинантных бактерий В. pertussis 4MKS, формирующая иммунный ответ при интраназальном введении, в сотни (100-1000) раз меньше, чем инактивированных вирулентных бактерий В. pertussis в составе АКДС вакцины, вводимой парентерально. Аналогичные результаты описаны нами ранее для генетически аттенуированных бактерий, сконструированных на основе других реципиентов B.pertussis [5].

Результаты сравнительного определения защитной активности аттенуирован-ных бактерий B. pertussis 4MKS в составе РЖКВ, содержащих новый генотип ptxP3, и изогенных бактерий B. pertussis 4M генотипа ptxP1 выявили тенденцию увеличения защитной активности у бактерий B.pertussis 4MKS. Действительно, на фоне некоторого общего снижения выживаемости с уменьшением количества МЕ в иммунизирующей дозе выживаемость мышей в пределах 60% обеспечивается дозой, равной 0,15 МЕ для штамма B. pertussis 4M (ptx P1) и 0,03 МЕ — B. pertussis 4MKS (ptx P3). Этот результат, скорее всего, указывает на то, что пороговая 70% выживаемость мышей после интрацеребрадьного заражения обеспечивается достоверно меньшей иммунизирующей дозой аттенуированных бактерий B. pertussis 4М^. Следует понимать, однако, что защитная активность аттенуированных бактерий B. pertussis является интегральной характеристикой и 2—3-кратное увеличение уровня продукции одного, пусть даже и самого важного, протективного антигена КТ*, может быть недостаточным для значительного усиления защитной активности, измеряемой в мышиной модели. Более полное заключение о потенциале защитной активности рекомбинантных аттенуированных бактерий B. pertussis 4М^ в сравнении с изогенными бактериями B. pertussis 4М довакцинного генотипа ptx P можно сделать после сравнительного анализа защитной активности нескольких экспериментальных серий РЖКВ и B. pertussis 4М, определенных в тестах интраце-ребрального и интраназального заражения. Таким образом, препарат РЖКВ интра-назального применения обладал защитной активностью, превосходящую таковую у вакцины АКДС в тесте интрацеребрального заражения иммунизированных мышей вирулентными бактериями B. pertussis 18323.

Особый интерес представляет определение защитной активности РЖКВ инт-раназального применения по выживаемости мышей зараженных интраназально вирулентными бактериями. Такой тест в максимальной степени приближен к ес-

тественному заражению людей при коклюшной инфекции, но в литературе не описан. Описанные в литературе результаты определения вирулентности бактерий рода Bordetella при экспериментальном интраназальном заражении мышей немногочисленны, не содержат описания процедуры инокуляции бактерий, и с нашей точки зрения не могут быть экстраполированы на условия наших экспериментов. Анализ литературы показывает, что разные штаммы бактерий рода Bordetella имеют большой разброс значений ЛД50 при интраназального заражения мышей [7, 8], что связано, вероятно, как со свойствами самих бактерий, так и с используемыми линиями мышей, зависит от способа заражения и учета количества бактерий Bordetella в инфицирующей дозе. Так, например, для бактерий B. bronchiseptica RB50 ЛД50 составляет около 107, а для B. bronchiseptica 253 — около106 на мышах линии C57BL/6 [7,8]. Поэтому изучению защитной активности РЖКВ в тесте экспериментальной интраназальной инфекции мышей вирулентными бактериями B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 в наших экспериментах предшествовало определение их вирулентности (ЛД50) на нативных лабораторных мышах Balb/O. Приведенные в работе результаты показывают, что использованные нами штаммы имели высокую степень вирулентности, вызывающую гибель интраназаль-но инфицированных мышей в дозах равных или меньше 106 м.к., регистрируемых в легких через час после заражения. Также как и в экспериментах с аттенуированными бактериями B.pertussis, наблюдали разницу в количестве интраназально инокулиро-ванных и зарегистрированных в легких мышей бактерий сразу после инфицирования.

Интраназальное заражение лабораторных мышей бактериями B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 и B. pаrареrtussis 504 приводило к развитию легочной инфекции и гибели животных в первые 17 дней. У выживших особей наблюдали значительную потерю массы тела, изменение шерстяного покрова и нарушение двигательной активности. Необходимо отметить, что использованные для анализа природные и рекомбинантные бактерии рода Bordetella отличались продукцией коклюшного токсина. Бактерии B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17 продуцировали нативный КТ, а у B. bronchiseptica 8220 и B. pаrареrtussis 504 синтез КТ отсутствовал. Тем не менее, мыши, инфицированные всеми использованными штаммами, погибали примерно в одни и те же сроки с характерными клиническими проявлениями заболевания. Общей для всех изученных штаммов Bordetella была способность продуцировать аденилатциклазный токсин, дермонекротический токсин, гемагглютинин, пертактин и другие факторы вирулентности. В настоящее время роль каждого из перечисленных факторов вирулентности в патогенезе коклюша изучена недостаточно. Наиболее вероятно, гибель мышей в первые дни после инфекции была обусловлена действием ДНТ. В пользу такого предположения говорят результаты определения остаточной вирулентности, специфической и общей токсичности аттенуированных бактерий B.pertussis 4MKS [6]. Они не проявляли токсических свойств даже при интраназальном введении 1010 МЕ суспензии мышатам, крысятам и взрослым мышам и отличались от вирулентных бактерий B.pertussis 475, B.bronchiseptica 8220-17, B.pаrареrtussis 504 и B.bronchiseptica 8220 — отсутствием продукции ДНТ и активного КТ. Таким образом, по-видимому, гибель мышей, инфицированных перечисленными штаммами бактериями рода Bordetella, по крайней мере, отчасти обусловлена действием ДНТ на легкие животных.

Основываясь на значениях ЛД50 бактерий B. pertussis 475, B. bronchiseptica 8220-17, B. bronchiseptica 8220 и B. pаrареrtussis 504, нами определены заражающие летальные дозы, составляющие (7-12) ЛД50 для определения защитной активности

РЖКВ. Такие исследования представляют интерес как для определения защитного потенциала коклюшных вакцин против близкородственных микроорганизмов, так и для выбора оптимального штамма для тестирования эффективности препаратов. Полученные нами результаты показали, что интраназальная иммунизация РЖКВ защищает мышей от интраназальной инфекции вирулентными бактериями возбудителя бронхосептикоза у животных (B. bronchiseptica), паракоклюша (B. parapertussi) и коклюша (B. pertussis). Показана защитная активность РЖКВ после экспериментальной инфекции мышей вирулентными бактериями B. pertussis 475. Этот результат совпадает с выводами аналогичных исследований [10 — 12] и вполне ожидаем, поскольку бактерии рода Bordetella близки друг к другу по структуре и последовательности геномов, продукции большого числа общих факторов вирулентности. Они имеют одинаковую регуляцию экспрессии основных генов вирулентности, а бактерии B. pertussis и B. parapertussis эволюционировали из разных клонов B. bronchiseptica [15]. Менее предсказуема выявленная нами защитная активность коммерческого препарата АКДС от интраназального заражения мышей бактериями B. pertussis. Этот результат совпадает с результатами тестирования бактериальной нагрузки в носоглотке вакцинированных ЦКВ павианов анубис после их экспериментального заражения вирулентными бактериями возбудителя коклюша. В работе [16] продемонстрирована ускоренная по отношению к невакцинированным животным элиминация бактерий у обезьян, инъекционно вакцинированных ЦКВ.

Зависимость защитной активности от вакцинирующей дозы в наших экспериментах качественно не отличаются при использовании внутримозговом заражении мышей бактериями B. pertussis 18323 и их интраназального заражения вирулентными бактериями рода Bordetella. Однако были выявлены некоторые количественные отличия. В тесте интраназального заражения бактериями B. pertussis 475, B. pаrа-реrtussis 504 и B. bronchiseptica 8220-17 защита животных не менее 70% обеспечивалась при иммунизации дозой аттенуированных бактерий B. pertussis равной 3х107 МЕ в 5 раз меньшей, чем в тесте внутримозгового заражения мышей B. pertussis 18323. Процент выживаемости мышей, иммунизированных коммерческим препаратом АКДС вакцины, был выше по сравнению с внутримозговым заражением B. pertussis 18323, но более низкий, чем у РЖКВ в обоих этих тестах. Эти результаты согласуются с предположением о способности ЦКВ при парентеральном введении индуцировать некоторый мукозальный иммунный ответ, продемонстрированный недавно в экспериментах с приматами [16].

Так как ДНТ, с одной стороны, согласно существующим представлениям, не является протективным антигеном, а с другой стороны, не синтезируется аттенуиро-ванными бактериями B. pertussis, справедливо предположить, что высокий уровень защиты мышей после интраназальной иммунизации обеспечивается мукозальной, а не антитоксической составляющей противококлюшного иммунного ответа, защищающего на стадии адгезии и инвазии. Этот вывод согласуется с результатами сравнительного измерения защитной активности в тестах внутримозгового заражения B. pertussis 18323 и интраназального заражения. Защита мышей не менее 70% от инт-раназального инфицирования обеспечивалась иммунизирующей дозой аттенуиро-ванных бактерий B. pertussis в 5 раз меньшей, чем при использовании теста внутри-мозгового заражения. Таким образом, предлагаемая нами модель интраназального заражения для оценки защитной активности РЖВК позволяет определять противо-бактерийную мукозальную составляющую поствакцинального противококлюшного иммунитета. Более детальное изучение корреляции результатов интраназального и внутримозгового заражения мышей, иммунизированных разными коклюшными

вакцинами, позволит определить применимость предложенной экспериментальной модели. В наших экспериментах не было выявлено существенной разницы в результатах тестирования РЖКВ, полученных при использовании бактерий B. pertussis 475, B. pаrареrtussis 504 и B. bronchiseptica 8220-17. Если этот результат подтвердится в последующих экспериментах, предлагаемый тест и сконструированные нами рекомбинантные бактерии B.bronchiseptica 8220-17 могут быть хорошей альтернативой используемому в настоящее время трудоемкому, требующему достаточно высокой квалификации методу внутримозгового заражения мышей прихотливыми, медленно растущими, требующими стандартных сред с добавлением крови бактериями B. pertussis 18323. Представленные результаты показали, что препарат РЖКВ интраназального применения защищал мышей от инфицирования вирулентными бактериями других патогенных для человека видов рода Bordetella. Наши результаты согласуются с данными доклинического изучения аттенуированных бактерий B.pertussis BPZE1, сконструированных французскими исследователями [11,13] и позволяют констатировать, что разработанная кандидатная рекомбинантная живая коклюшная вакцина будет защищать не только от коклюша, но и паракоклюша и бронхосептикоза.

Исследования последнего десятилетия в разных странах, в том числе и в России, показали, что в настоящее время на фоне массовой вакцинации против коклюша штаммы циркулирующих бактерий B. pertussis содержат измененные последовательности генов вирулентности — ptx, fga, prn, отличающиеся от таковых в довакци-нальном периоде. Высказываются предположения, что одна из причин роста заболеваемости коклюшем связана с циркуляцией возбудителя с новыми генотипами [1, 6, 14]. Для совершенствования современных коклюшных вакцин рассматривается возможность замены вакцинных штаммов довакцинного генотипа на новые, относящиеся к современным генотипам. Рекомбинантные бактерии B. pertussis 4М^ с новым генотипом ptxP3, сконструированные на основе изогенных аттенуирован-ных бактерий B. pertussis 4М довакцинного генотипа ptxP1, сохраняют стабильность генома и заданные биологические характеристики, продуцируют большее количество токсоида [4,6]. Представленные в настоящем сообщении результаты позволяют констатировать, что регуляторная мутация в опероне ptxP1, увеличивающая экспрессию оперона ptx, привела к усилению защитной активности аттенуированных бактерий B. pertussis. Разработанная нами генетическая методология может быть использована для необходимой модификации бактерий B. pertussis довакцинных генотипов с целью создания вакцинных препаратов на основе регламентированных производственных штаммов. Использование предполагаемого подхода позволит своевременно реагировать на необходимость замены генотипов в вакцинных штаммах, согласно с превалированием новых генотипов в популяции B. pertussis, сэкономить время и средства на разработку эффективных препаратов для профилактики коклюша.

Л ИТЕРАТУРА

1. Борисова О.Ю., Пименова А.С., Попова О.П. и др. Структура популяции штаммов возбудителя коклюша на территории России. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016, 4:22-27.

2. Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н. и др. Выявление инсерционных авирулентных Bvg- мутантов Bodetella pertussis у больных коклюшем, острой респираторной вирусной инфекцией и у практически здоровых людей. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010, 4:9-13.

3. Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунологические лекарственные препараты) под ред. А. Н. Миронова. М., 2012.

4. Семин Е. Г., Синяшина Л.Н., Медкова А.Ю. и др. Конструирование рекомбинантных аттену-ированных бактерий Bordetella pertussis генотипа ptxP3. Журн. микробиол. 2018, 4:33-42

5. Синяшина Л.Н., Синяшина Л.С., Семин Е.Г. и др. Конструирование генетически аттенуиро-ванных бактерий Bordetella pertussis, утративших активность дермонекротического токсина и продуцирующих измененную нетоксичную форму коклюшного токсина. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2010, 3:31-36.

6. Синяшина Л.Н. Молекулярно-генетическая модификация бактерий рода Bordetella для создания рекомбинантных препаратов для профилактики коклюша. Дисс. докт. мед. наук, М., 2017.

7. Ahuja U., Liu M., Tomida S. et al. Phenotypic and Genomic Analysis of Hyper virulent Human-associated Bordetella bronchiseptica. BMC Microbiol. 2012, 6 (12):167 doi: 10.1186/1471-2180-12-167.

8. Buboltz A.M., Nicholson T.L., Parette M.L. et al. Replacement ofAdenylate Cyclase Toxin in a Lineage of Bordetella bronchiseptica. J. Bacteriol. 2008,190(15):5502-5511.

9. Carbonetti N.H., Wirsing von Kunig C. H., Lan R. et al. Highlights of the 11th International Bordetella Symposium: from Basic Biology to Vaccine Development. Clinical and Vaccine Immunology. 2016, 23(11) :842-850.

10. Feunou P.F., Bertout J., Locht C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 2010, 15; 5(4):e10178. doi: 10.1371/journal.pone. 0010178.

11. Kammoun H., Feunou P.F., Foligne B. et al. Dual mechanism of protection by live attenuated Вordetella pertussis BPZE1 against Bordetella bronchiseptica in mice. Vaccine. 2012, 31; 30(40): 5864-5870. doi: 10.1016/j.

12. Liko J., Robison S.G., Cieslak P.R. Do Pertussis Vaccines Protect Against Bordetella parapertussis? Clin Infect Dis. 2017, 64(12):1795-1797. doi: 10.1093/cid/cix221.

13. Mielcarek N., Debrie A.S., Raze D. et al. Live attenuated B. pertussis as a single-dose nasal vaccine against whooping cough. PLoS Pathog. 2006, 2(7) :0662-0670.

14. Mooi F.R. Bordetella pertussis and vaccination: the persistence of a genetically monomorphic pathogen. Infect. Genet. Evol. 2010, 10 (1) :36-49.

15. Park J., Zhang Y., Buboltz A. M. et al. Comparative genomics of the classical Bordetella subspecies: the evolution and exchange of virulence-associated diversity amongst closely related pathogens. BMC Genomics. 2012, 13:545.

16. Warfel J. M., Zimmerman L.I., Merkel Tod J. Comparison of Three Whole-Cell Pertussis Vaccines in the Baboon Model of Pertussis. Clin. Vaccine Immunol. 2015, 11;23(1):47-54. doi: 10.1128/ CVI.00449-15.

17. World Health Organization 2011. Expert committee on biological standardization Geneva, 17-21 October 2011.

Поступила 14.11.18

Контактная информация: Синяшина Л.Н.,

123098, Москва, ул. Гамалеи, 18, р.т. (495)193-30-01

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2019 Е.В.Сорокина1,2, Н.К.Ахматова1, Н.Б.Егорова1

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ ФИГУРНЫХ И ПАРАИНФЕКЦИОННЫХ ЭРИТЕМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ И MNRI

'НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, 2Академия постдипломного образования ФНКЦ ФМБА России, Москва

Цель. Углубленное изучение этиопатогенеза эритем, сравнительное изучение клинической эффективности применения комбинированной терапии с применением иммуномодуляторов при эритемах, изучение динамики иммунологических показателей в результате терапии. Материалы