ЛОКАЛИЗАЦИЯ ОБЩЕГО И ФОСФОРИЛИРОВАННОГО α-СИНУКЛЕИНА В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ ИНТАКТНЫХ КРЫС (ТЕСТИРОВАНИЕ АНТИТЕЛ РАЗНЫХ КЛОНОВ)

Биомедицина • № 2, 2018, С. 22-32

Локализация общего и фосфорилированного а-синуклеина в периферической нервной системе интактных крыс

Д.Н. Воронков, О.В. Сальникова, P.M. Хуцоерков

ФГБНУ «Научный центр неврологии», Москва

Контактная информация: ВоронковДмитрийНиколаевич, voronkovdm@gmail.com

Развитию двигательных симптомов при болезни Паркинсона предшествует накопление а-синуклеина в периферической нервной системе, что позволяет рассматривать а-синуклеин как биомаркер этой патологии. Вместе с тем, для совершенствования экспериментальных моделей и разработки эффективных диагностических тестов требуются более точные знания о локализации а-синуклеина в норме. Иммуногистохимически в периферической нервной системе интактных крыс исследовали локализацию а-синуклеина и вариант его формы, фосфорилированной по остатку серина 129, с помощью панели антител разных производителей и обнаружили его локализацию в пресинаптических нервных окончаниях дорсальных рогов спинного мозга, в телах нейронов пре-вертебральных ганглиев, сплетениях стенок сосудов и ОБАР-негативных глиальных клетках. Разные антитела к фосфорилированному а-синуклеину давали неоднозначную реакцию: у отдельных нейронов спинального ганглия окрашивались тела клеток, их отростки и ядра, но ни одно из изучаемых антител не давало реакцию связывания в мелких ноцицептивных непепетидергических нейронах. Неоднозначность результатов может быть обусловлена как разной доступностью эпитопов, выявляемых антителами при взаимодействий а-синуклеина с другими белками, так и в результате неспецифического связывания антител с неидентифицированными мишенями.

Ключевые слова: а-синуклеин, периферическая нервная система, спинальный ганглий, крыса, иммуногистохимия.

Введение

Альфа-синуклеин (а-Буп) - белок, широко распространенный в нервной системе. Внимание исследователей к роли а-Буп в патогенезе нейродегенера-тивных заболеваний привлекло обнаружение его фрагмента в составе амилоидных бляшек при болезни Альцгеймера [21] и выявление фосфорилированного а-Буп как основного компонента телец Леви - нейрональных включений, характерных для болезни Паркинсона (БП) [5]. Мутации гена а-Буп ^СА) ассоциированы с БП, а его нокаут приводит к синаптической дисфункции в

нигростриатной системе, нарастающей с возрастом [3]. В связи со способностью а-Буп к формированию токсических олигомерных форм и образованию внутриклеточных нерастворимых агрегатов, считается, что прионоподобное распространение патологических форм белка от нейрона к нейрону может являться причиной прогрессирования нейродегенеративного процесса при БП, мультисистемной атрофии и др. заболеваниях, относимых к синуклеино-патиям [5,21].

Функции а-Буп и характер его молекулярных взаимодействий до настоя-

щего времени полностью не выяснены. Обнаружены сплайсинговые варианты белка и посттрансляционные модификации С-концевого фрагмента, в т.ч. и его фосфорилированная форма [8, 17, 18]. Показано взаимодействие а-Буп с белками, ассоциированными с микротрубочками, синаптическими везикулами и митохондриальными мембранами [8, 21]. При этом данные о его внутриклеточной локализации разнятся: наряду с пресинаптической, описывают ядерную, перинуклеарную и митохондри-альную, в зависимости от используемых антител [12, 14, 18, 22, 24]. Медиатор-ные характеристики нейронов, содержащих а-Буп, могут быть различными, что указывает на его локализацию в катехо-ламинергических, холинергических и ГАМК-ергических нервных окончаниях [21,22].

Повышенное содержание в нейронах а-Буп, фосфорилированного по остатку серина 129 (8ег-129), обнаруживается в патологических условиях [19, 21]. Предполагается, что фосфорилирование служит сигналом для протеасомного расщепления а-Буп и снижает образование его нерастворимых агрегатов [4, 8], но увеличивает формирование его токсических олигомерных форм [16]. В нормальных условиях содержание а-Буп в фосфорилированной форме составляет в мозге около 4-5%, и наблюдается динамическое равновесие процесса фос-форилирования и дефосфорилирования белка, по-видимому, имеющее значение для его связывания с мембранами [4, 17]. В целом функциональное значение фосфорилирования а-Буп остается предметом дискуссии [19,21].

Вероятно, накопление а-Буп при иди-опатической БП начинается в структу-

рах периферической нервной системы, в особенности - в энтеральных сплетениях [6], также выявлено образование его агрегатов и в чувствительных нервных окончаниях кожи [11]. В связи с этим предпринимаются попытки клинико-морфологических исследований на би-опсийном материале больных [1, 2, 11] для обоснования возможности ранней патоморфологической диагностики БП.

Учитывая необходимость совершенствования подходов к анализу патологической агрегации a-Syn в эксперименте и особенности его различной локализации, выявленные разными исследователями, целью настоящей работы стало охарактеризовать и уточнить локализацию a-синуклеина и его фосфорилированной формы в спинальных ганглиях и сопоставить результаты, полученные с помощью антител разных производителей.

Материалы и методы

Исследовали интактных самцов крыс Wistar (n=5, масса 280-300 г), полученных из филиала «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. Животные содержались в условиях свободного доступа к воде и корму с 12-часовым циклом освещения. Эксперименты выполняли в соответствии с принципами гуманного обращения с лабораторными животными (директива Совета Европейского Союза от 24.11.1986 г., 86/609/ЕЕС, Национальный стандарт РФ ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики»). Крыс наркотизировали хлоралгидратом («Sigma», 350 мг/кг), декапитировали гильотиной и выделяли тройничный ганглий, спинной мозг со спинальны-ми ганглиями на уровне CVII - ThIII и

чревное сплетение. Образцы нервной ткани фиксировали 24 ч в 4% нейтральном формалине, промывали проточной водой и проводили через изопропанол для заливки в парафин или пропитывали средой Tissue Tek О.С.Т для изготовления замороженных срезов. Срезы толщиной 10-15 мкм готовили на санном микротоме SR2000 («Leica», ФРГ) или криостате Tissue Tek СгуоЗ («Sakura», США) и раскладывали на покрытые желатином стекла.

Антигены в срезах демаскировали, помещая их в цитратный буфер, с помощью тепловой обработки на протяжении 5-ти мин в микроволновой печи при температуре 90-95°С или в концентрированной муравьиной кислоте. Характер окрашивания, полученного при разных методах демаскировки, не различался. Для выявления нефосфорилированного a-Syn применяли поликлональные кроличьи антитела Sigma (S3062). Для выявления a-Syn, фосфорилированного по Ser-129, использовали моноклональные антитела разных производителей:

1) мышиные Abcam (кат. № ab184674) и Biolegend (кат. № 825701), относящиеся к одному клону P-syn/81A;

2) мышиные Wako (кат. № 01525191), обозначаемые производителем как P-syn #64;

3) кроличьи Abcam (кат. № ab51253), клон EP1536Y.

Для всех антител производителями было указано специфическое связывание как с крысиным, так и с человеческим a-Syn. Астроциты выявляли при помощи антител к кислому глиофи-бриллярному белку (GFAP, мышиные, моноклональные, конъюгированные с флуорохромом Cy3, «Sigma»). Субпопуляцию ноцицептивных, непепти-

дергических нейронов локализовали по связыванию с биотинилированным лектином IB4 («Sigma»). Растворы антител и лектина готовили на фосфатном солевом буфере (0,01 М, рН=7,2), содержавшем 0,1% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Тритона Х100. Продукт иммуногистохимической реакции визуализировали посредством соответствующих вторичных антител (1:150, «Sigma»), меченых флуорохро-мами CF448 или CF555, а связывание лектина выявляли при помощи стреп-тавидина, конъюгированного с Texas Red («Sigma»). Все иммуногистохими-ческие реакции проводили в соответствии с рекомендациями производителей антител, часть срезов докрашивали ди-амидинофенилиндолом (DAPI), после чего заключали в среду FluoroShield («Immunobioscience согр.»). При выполнении негативного контроля на срезы наносили только вторичные антитела. Позитивный контроль для антител к a-Syn проводили на аутопсийных срезах черной субстанции мозга человека с БП: все использованные антитела выявляли агрегированный a-Syn в тельцах и нейритах Леви [2]. Препараты исследовали и документировали под микроскопом «Nikon Eclipse Ni-u», оснащенным цифровой фотокамерой «Nikon Ds-Qi1» (1,5 Мп), при увеличении объектива x40 и x100.

Результаты и их обсуждение

Поликлональные антитела Sigma на общий a-Syn выявили его преимущественно в телах малых и средних размеров нейронов тройничного и спинального ганглиев (рис. 1А). Наиболее интенсивно окрашивалась цитоплазма в телах и отростках норадренергических нейро-

нов чревного сплетения. Также а-Буп обнаружили в нервных сплетениях стенок сосудов, в цитоплазме сателлитной глии и в глиальных клетках нервных пучков. При этом совместную локализацию ОБАР и а-Буп не выявили (рис. 1Г).

В спинном мозге локализация а-Буп соответствовала пресинаптическим

окончаниям сенсорных нейронов спи-нального ганглия дорсальных рогов спинного мозга: окрашивались нервные окончания в 1-11 пластинах Рекседа (рис. 2). При совместном окрашивании на а-Буп и лектин 1В4 выявили, что области окрашивания перекрывались лишь частично (рис. 2Г-Е). Согласно

Рис. 1. Различия внутриклеточной локализации а-Буп и его фосфорилированной формы, выявляемой разными антителами в спинальном ганглии: А - перинуклеарное окрашивание, реакция с антителами к общему а-Буп; Б - ядерное окрашивание, реакция с антителами БупР#64 к фосфорилированному а-Буп; В - перинуклеарное окрашивание, реакция с антителами Р-8уп/81Ак фосфорилированному а-Буп; Г - окрашивание ОБАР-негативных глиоцитов, реакция с антителами к общему а-Буп (зеленым), ОБАР (красным). Обозначения: Н - а-Буп позитивные нейроны; * - а-Буп негативные нейроны; Гл - а-Буп позитивные глиоциты; А - отростки ОБАР-позитивной глии; стрелками показаны а-Буп негативные нейроны. Ядра клеток на А, Б, Г докрашены БАР1 (синим). Ув. х40.

25

БютеШете . № 2, 2018

Рис. 2. Пресинаптическая локализация а-Буп и его фосфорилированной формы, выявляемая в дорсальных рогах спинного мозга: А - реакция с антителами к нефосфорилированному а-Буп; Б - реакция с антителами ЕР1536У к фосфорилированному а-Буп ; В - реакция с антителами Р-8уп/81А к фосфорилированному а-Буп; Г, Д, Е - локализация 1В4-позитивных окончаний и а-Буп в дорсальных рогах спинного мозга (Г - красный канал, лектин 1В4, Д - совмещенное изображение, зеленый канал - нефосфорилированный а-Буп, Е - фрагмент рис. Д, ув. х100). Обозначения: I, II - пластины по Рекседу. А, Б, В,Г,Д- ув. х40.

нашим результатам, отростки нейронов, связывающих 1В4, в основном приходят во внутреннюю часть пластины II дорсальных рогов спинного мозга, тогда как распределение а-Буп преимущественно соответствует Ш4-негативным окончаниям, приходящим во внешнюю часть пластины II и первую пластину Рекседа, что, по данным литературы, согласуется с проекциями пептидерги-ческих нейронов [7]. Следовательно, окончания большинства пептидергиче-ских (1В4-негативных) нейронов, по-видимому, характеризуются высоким содержанием а-Буп, тогда как в популяции

непептидергических нейронов его экспрессия незначительна или отсутствует.

Использованные нами моноклональ-ные антитела к фосфорилированному а-Буп не всегда давали однотипную реакцию (рис. 1). Сходную локализацию с общим а-Буп наблюдали при применении антител ЕР1536У, однако интенсивность окрашивания пресинаптических окончаний (рис. 2Б) и тел сенсорных нейронов при этом была более слабой, хотя тела глиальных клеток выявлялись отчетливо. У части нейронов спи-нального ганглия антитела ЕР1536У и Р-вуп#64 давали однотипную реакцию

с компонентами клеточных ядер, но в др. структурах ПНС антитела Р-вуп#64 при исследовании сходных разведений реакции связывания не выявляли. В то же время антитела Р-зуп/81А (рис. 3) разных фирм («АЬсат» и «Вю^епё») не связывались с пресинаптическими окончаниями в дорсальных рогах спинного мозга (рис. 1) и ядрами нейронов, но выявляли часть 1В4-негативных нейронов спинального ганглия с отростками (рис. 3), причем окрашивались нейроны разных размеров. Следовательно, наиболее близкие результаты по сравнению с окрашиванием на общий а-Буп показали антитела ЕР1536У, тогда как характер окрашивания антителами Р-вуп/81А предполагает наличие неспецифического связывания, кроме того, все использованные антитела демонстрировали избирательное связывание с популяцией 1В4-негативных нейронов.

Таким образом, локализация а-Буп в ПНС интактных животных различа-

ется в зависимости от типа нейронов и может быть как пресинаптической, так и цитоплазматической (табл.). В спинальном ганглии и спинном мозге распределение а-Буп соответствовало пептидергическим (1В4-негативным) ноцицептивным нейронам и их окончаниям. Антитела к фосфорилирован-ному а-Буп также продемонстрировали разный характер связывания, но, как и антитела к общему а-Буп, избирательно выявляли клеточные структуры 1В4-негативных сенсорных нейронов спинального ганглия. За исключением клона Р-вуп/81А, все антитела связывались с периферическими ОБАР-нега-тивными глиальными клетками.

В целом наши результаты продемонстрировали широкое распределение а-Буп и его фосфорилированной формы в ПНС и согласуются с результатами др. работ, показавших их наличие в нейронах спинального ганглия и их отростках, приходящих в наружные пластины дор-

Рис. 3. Раздельное цитоплазматическое окрашивание крупных БупР-129 позитивных нейронов (клон антител Р-8уп/81А, зеленым) и 1В4-позитивных нейронов (красным) спинального ганглия: А - ув. х10,Б- ув. х40.

27

Бюте&ете . № 2, 2018

Таблица

Локализация связывания антител к а-8уп и его фосфорилированной по 8ег-129 форме в структурах периферической нервной системы интактных крыс

Исследованные структуры Использованные антитела

Антитела к а-Буп («51дта», э3062) (1:200 -1:1000) Антитела к а-Буп-Р-129

ЕР1536У

Нейроны ганглия дорсальных рогов спинного мозга (цитоплазма) ++ + +++ -

Нейроны ганглия дорсальных рогов спинного мозга (ядра) - + - +++

Пресинаптические окончания +++ ++ - -

Нервные волокна - - +++ -

Глиальные клетки ++ ++ - +

Нейроны вегетативных превертебральных ганглиев (цитоплазма) +++ + ++ не исследовали

Нервные сплетения сосудов ++ - ++ -

Обозначения: «-» - отсутствие окрашивания, «+» - визуальная интенсивность окрашивания от слабой до интенсивной.

сальных рогов спинного мозга [13, 20, 23]. Высокое содержание а-Буп в структурах, участвующих в болевой чувствительности, важно для лучшего понимания патогенеза БП, т.к. у человека при БП описано образование патологических агрегатов синуклеина в этих структурах, что связывают с наблюдаемой у пациентов болевой симптоматикой [6, 9]. Также выявлено повреждение тонких нервных волокон и изменение температурной и болевой чувствительности [15]. При исследовании биоптатов кожи при БП были найдены агрегаты а-Буп в пептидергических нервных волокнах [12], что подтверждает наши результа-

ты. Патологическое накопление а-Буп в олигодендроглии обнаруживают при БП и мультисистемной атрофии [10]. Полученные нами данные о наличии а-Буп в ОБАР-негативных глиальных клетках у интактных животных согласуются с работой [10], продемонстрировавшей экспрессию этого белка на разных стадиях созревания олигодендроглии.

Неоднозначность результатов, полученных нами при локализации фос-форилированного а-Буп, может быть обусловлена неспецифическим связыванием антител с мишенями, которые еще не идентифицированы, в т.ч. с др. белками семейства. В литературе от-

мечены различия в локализации а-Буп, выявляемого разными клонами антител [21, 24] или у разных видов животных [13], что вызывает вопросы относительно его истинной локализации в клетке [21]. Так, утверждается, что ядерное окрашивание нейронов на а-Буп имеет неспецифическую природу [14], хотя др. авторы предполагают, что различия во внутриклеточной локализации белка, выявляемого разными клонами антител, могут быть связаны с особенностями его пространственной структуры [18, 24]. Предполагается [18], что фосфорилиро-вание и др. пострансляционные модификации а-Буп изменяют доступность выявляемых антителами эпитопов, что приводит к различиям в результатах окрашивания и отражает внутриклеточную динамику фосфорилированного и нефосфорилированного а-Буп, а также его взаимодействия с молекулярными мишенями в ядре и цитоплазме [18, 21].

Таким образом, проведенное исследование показало, что в нейронах ПНС в зависимости от исследуемых структур наблюдается как пресинаптическая, так и цитоплазматическая локализация а-Буп. В спинальном ганглии а-Буп преимущественно экспрессируется пепти-дергическими сенсорными нейронами и обнаруживается в их терминалях в дорсальных рогах спинного мозга. Высокая экспрессия а-Буп выявляется и в телах и отростках нейронов превертебральных ганглиев, а также в сплетениях стенок сосудов и в цитоплазме ОБАР-негатив-ных глиальных клеток. а-Буп, фосфори-лированный по 8ег-129, в норме также обнаруживается в сенсорных нейронах спинального ганглия, однако антитела разных производителей значительно отличаются характером связывания и де-

монстрируют разную внутриклеточную локализацию, что может быть обусловлено как неспецифической реакцией, так и структурными особенностями исследуемого белка.

Выводы

1. Альфа-синуклеин и его фосфори-лированная форма широко распространены в периферической нервной системе интактных крыс и обнаруживаются в телах нейронов и пресинаптических окончаниях.

2. В спинальном ганглии альфа-си-нуклеин экспрессируется преимущественно пептидергическими сенсорными нейронами и локализован в их окончаниях, приходящих в дорсальные рога спинного мозга.

3. Выявлена неоднотипность связывания антител разных клонов с фос-форилированным альфа-синуклеином, что необходимо учитывать при оценке патологической агрегации белка на экспериментальных моделях болезни Паркинсона и при исследовании пато-морфологического материала больных паркинсонизмом.

Благодарность

Выражаем благодарность Соболеву Валерию Борисовичу за методическую помощь.

Список литературы

1. Пчелина С.Н. Альфа-синуклеин как биомаркер болезни Паркинсона // Анналы клинической и экспериментальной неврологии. 2011. Т.5.№4. С. 46-51.

2. Соболев В.Б., Худоерков P.M. Иммуногисто-химическое выявление а-синуклеина в слюнной железе как биомаркер болезни Паркинсона // Бюллетень Национального общества по изучению болезни Паркинсона и расстройств движений. 2017. № 2. С. 16-23.

3. Anwar S., Peters O., Millership S., Ninkina N., Doig N., Connor-Robson N., Threlfell S., Kooner G., Deacon R.M., Bannerman D.M., Bolam J.P., Chandra S.S., Cragg S.J., Wade-Martins R., Buchman V.L. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family II J. of Neurosci. 2011. No. 31(20). Pp. 7264-7274.

4. Arawaka S., Sato H., Sasaki A., Koyama S., Kato T. Mechanisms underlying extensive Ser129-phosphorylation in alpha-synuclein aggregates II Acta Neuropathologica Communications. 2017. No. 1(5). P. 48.

5. Braak H., Del Tredici K., Rüb U., de Vos R.A., Jansen Steur E.N., Braak E. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease II Neurobiol. Aging. 2003. No. 24(2). Pp. 197-211.

6. Braak H., Sastre M., Bohl J.R., de Vos R.A., Del Tredici K. Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons II ActaNeuropathol. 2007. No. 113(4). Pp. 421-429.

7. Braz J.M., Nassar M.A., Wood J.N., Basbaum A.I. Parallel "pain" pathways arise from subpopulations of primary afferent nociceptor II Neuron. 2005. Vol. 47(6). Pp. 787-793.

8. Burre J., Sharma M., Sudhof T. C. Cell Biology and Pathophysiology of alpha-Synuclein II Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2017. pii: a024091. doi: 10.1101Icshperspect.a024091.

9. Del Tredici K., Braak H. Spinal cord lesions in sporadic Parkinson's disease II Acta Neuropathol. 2012. No. 124(5). Pp. 643-64.

10. Djelloul M., Holmqvist S., Boza-Serrano A., Azevedo C., Yeung M.S., Goldwurm S., Frisen J., Deierborg T., Roybon L. Alpha-Synuclein Expression in the Oligodendrocyte Lineage: an In Vitro and In Vivo Study Using Rodent and Human Models II Stem Cell Reports. 2015. No. 5(2). Pp. 174-84.

11. Donadio V., Incensi A., Rizzo G., Scaglione C., Capellari S., Fileccia E., Avoni P., Liguori R. Spine Topographical Distribution of Skin a-Synuclein Deposits in Idiopathic Parkinson Disease II J. of Neuropathology & Experimental Neurology. 2017. No. 5(76). Pp. 384-389.

12. Doppler K., Ebert S., Üqeyler N, Trenkwalder C., Ebentheuer J., Volkmann J., Sommer C. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology II Acta Neuropathol. 2014. No. 128(1). Pp. 99-109.

13. Giasson B.I., Duda J.E., Forman M.S., Lee V.M., Trojanowski J.Q. Prominent perikaryal expression of alpha- and beta-synuclein in neurons of dorsal root ganglion and in medullary neurons II Exp. Neurol. 2001. No. 172(2). Pp. 354-362.

14. Huang Z., Xu Z., Wu Y., Zhou Y. Determining nuclear localization of alpha-synuclein in mouse brains II Neuroscience. 2011. No. 199. Pp. 318-32.

15. Lin C.H., Chao C.C., Wu S.W., Hsieh P.C., Feng F.P., Lin Y.H., Chen Y.M., Wu R.M., Hsieh S.T. Pathophysiology of Small-Fiber Sensory System in Parkinson's Disease: Skin Innervation and Contact Heat Evoked Potential II Medicine (Baltimore). 2016. No. 95(10). E3058. doi: 10.1097IMD.0000000000003058.

16. Ma M.R., Hu Z.W., Zhao Y.F., Chen Y.X., Li Y.M. Phosphorylation induces distinct alpha-synuclein strain formation II Scientific Reports. 2016. No. 6. P. 37130. doi: 10.1038I srep37130.

17. Muntane G., Ferrer I., Martinez-Vicente M.

a-synuclein phosphorylation and truncation are normal events in the adult human brain II Neuroscience. 2012. No. 200. Pp. 106-119.

18. Nam M.K., Han J.H., Jang J.Y., Yun S.E., Kim G.Y., Kang S., Rhim H. A novel link between the conformations, exposure of specific epitopes, and subcellular localization of alpha-synuclein II Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 2015. No. 12(1850). Pp. 2497-2505.

19. Oueslati A. Implication of Alpha-Synuclein Phosphorylation at S129 in Synucleinopathies: What Have We Learned in the Last Decade? II J. Parkinsons Dis. 2016. No. 6(1). Pp. 39-51.

20. Papachroni K., Ninkina N., Wanless J., Kalofoutis A.T., Gnuchev N.V., Buchman V.L. Peripheral sensory neurons survive in the absence of alpha- and gamma-synucleins II J. Mol. Neurosci. 2005. No. 25(2). Pp. 157-64.

21. Surguchov A. Intracellular Dynamics of Synucleins: "Here, There and Everywhere" II Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2015. No. 320. Pp. 103169.

22. Taguchi K., Watanabe Y., Tsujimura A., Tanaka M. Brain region-dependent differential expression of alpha-synuclein II J. Comp. Neurol. 2016. No. 524(6). Pp. 1236-58.

23. Tiunova A.A., Anokhin K.V., Saha A.R., Schmidt O., Hanger D.P., Anderton B.H., Davies A.M., Ninkina N.N., Buchman V.L. Chicken synucleins: cloning and expression

EnoMeAHu;HHa • № 2, 2018 30

in the developing embryo // Mech. Dev. 2000. No. 99(1-2). Pp. 195-198.

24. Vivacqua G., Casini A., Vaccaro R., Fornai F., Yu S., D'Este L. Different subcellular localization of alpha-synuclein in the C57BL\6J mouse's central nervous system by two novel monoclonal antibodies // J. Chem. Neuroanat. 2011.No. 41(2). Pp. 97-110.

References

1. Pchelina S.N. Alfa-sinuklein kak biomarker bolezni Parkinsona [Alpha-synuclein as biomarker of Parkinson's disease]. Annaly klinicheskoj i ehksperimental'noj nevrologii [Annals of clinical and experimental neurology]. 2011. T. 5. No. 4. Pp. 46-51. (InRussian).

2. Sobolev V.B., Khudoerkov R.M. Immunogistohimicheskoe vyavlenie a-sinukleina v slyunnoj zheleze kak biomarker bolezni Parkinsona [Immunohistochemical detection of alpha-synuclein in salivary gland as biomarker of Parkinson disease]. Byulleten' Nacionalnogo obshchestva po izucheniyu bolezni Parkinsona i rasstrojstv dvizhenij [Bulletin of the National Society for the Study of Parkinson's Disease and Movement Disorders]. 2017. No. 2. Pp. 16-23. (In Russian).

3. Anwar S., Peters O., Millership S., Ninkina N., Doig N., Connor-Robson N., Threlfell S., Kooner G., Deacon R.M., Bannerman D.M., Bolam J.P., Chandra S.S., Cragg S.J., WadeMartins R., Buchman V.L. Functional alterations to the nigrostriatal system in mice lacking all three members of the synuclein family. J. of Neurosci. 2011.No. 31(20). Pp. 7264-7274.

4. Arawaka S., Sato H., Sasaki A., Koyama S., Kato T. Mechanisms underlying extensive Ser129-phosphorylation in alpha-synuclein aggregates. Acta Neuropathologica Communications. 2017. No. 1(5). P. 48.

5. Braak H., Del Tredici K., Rüb U., de Vos R.A., Jansen Steur E.N., Braak E. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 2003. No. 24(2). Pp. 197-211.

6. Braak H., Sastre M., Bohl J.R., de Vos R.A., Del Tredici K. Parkinson's disease: lesions in dorsal horn layer I, involvement of parasympathetic and sympathetic pre- and postganglionic neurons. ActaNeuropathol. 2007. No. 113(4). Pp. 421-429.

7. Braz J.M., Nassar M.A., Wood J.N., Basbaum A.I. Parallel "pain" pathways arise from subpopulations of primary afferent

nociceptor. Neuron. 2005. Vol. 47(6). Pp. 787-793.

8. Burre J., Sharma M., Sudhof T.C. Cell Biology and Pathophysiology of alpha-Synuclein. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2017. pii: a024091. doi: 10.1101/ cshperspect.a024091.

9. Del Tredici K., Braak H. Spinal cord lesions in sporadic Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 2012. No. 124(5). Pp. 643-64.

10. Djelloul M., Holmqvist S., Boza-Serrano A., Azevedo C., Yeung M.S., Goldwurm S., Frisen J., Deierborg T., Roybon L. Alpha-Synuclein Expression in the Oligodendrocyte Lineage: an In Vitro and In Vivo Study Using Rodent and Human Models. Stem Cell Reports. 2015. No. 5(2). Pp. 174-84.

11. Donadio V., Incensi A., Rizzo G., Scaglione C., Capellari S., Fileccia E., Avoni P., Liguori R. Spine Topographical Distribution of Skin a-Synuclein Deposits in Idiopathic Parkinson Disease. J. of Neuropathology & Experimental Neurology. 2017. No. 5(76). Pp. 384-389.

12. Doppler K., Ebert S., Ügeyler N., Trenkwalder C., Ebentheuer J., Volkmann J., Sommer C. Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology. Acta Neuropathol. 2014. No. 128(1). Pp. 99-109.

13. Giasson B.I., Duda J.E., Forman M.S., Lee V.M., Trojanowski J.Q. Prominent perikaryal expression of alpha- and beta-synuclein in neurons of dorsal root ganglion and in medullary neurons. Exp. Neurol. 2001. No. 172(2). Pp. 354-362.

14. Huang Z., Xu Z., Wu Y., Zhou Y. Determining nuclear localization of alpha-synuclein in mouse brains. Neuroscience. 2011. No. 199. Pp. 318-32.

15. Lin C.H., Chao C.C., Wu S.W., Hsieh P.C., Feng F.P., Lin Y.H., Chen Y.M., Wu R.M., Hsieh S.T. Pathophysiology of Small-Fiber Sensory System in Parkinson's Disease: Skin Innervation and Contact Heat Evoked Potential. Medicine (Baltimore). 2016. No. 95(10). E3058. doi: 10.1097/MD.0000000000003058.

16. Ma M.R., Hu Z.W., Zhao Y.F., Chen Y.X., Li Y.M. Phosphorylation induces distinct alpha-synuclein strain formation. Scientific Reports. 2016. No. 6. P. 37130. doi: 10.1038/ srep37130.

17. Muntane G., Ferrer I., Martinez-Vicente M.

a-synuclein phosphorylation and truncation are normal events in the adult human brain. Neuroscience. 2012. No. 200. Pp. 106-119.

18. Nam M.K., Han J.H., Jang J.Y., Yun S.E., Kim G.Y., Kang S., Rhim H. A novel link between the conformations, exposure of specific epitopes, and subcellular localization of alpha-synuclein. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 2015. No. 12(1850). Pp. 2497-2505.

19. Oueslati A. Implication of Alpha-Synuclein Phosphorylation at S129 in Synucleinopathies: What Have We Learned in the Last Decade? J. Parkinsons Dis. 2016. No. 6(1). Pp. 39-51.

20. Papachroni K., Ninkina N., Wanless J., Kalofoutis A.T., Gnuchev N.V., Buchman V.L. Peripheral sensory neurons survive in the absence of alpha- and gamma-synucleins. J. Mol. Neurosci. 2005. No. 25(2). Pp. 157-64.

21. Surguchov A. Intracellular Dynamics of Synucleins: "Here, There and Everywhere".

Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2015. No. 320. Pp. 103-169.

22. Taguchi K., Watanabe Y., Tsujimura A., Tanaka M. Brain region-dependent differential expression of alpha-synuclein. J. Comp. Neurol. 2016. No. 524(6). Pp. 1236-58.

23. Tiunova A.A., Anokhin K.V., Saha A.R., Schmidt O., Hanger D.P., Anderton B.H., Davies A.M., Ninkina N.N., Buchman V.L. Chicken synucleins: cloning and expression in the developing embryo. Mech. Dev. 2000. No. 99(1-2). Pp. 195-198.

24. Vivacqua G., CasiniA., VaccaroR.,FornaiF., Yu S., D'Este L. Different sub-cellular localization of alpha-synuclein in the C57BL\6J mouse's central nervous system by two novel monoclonal antibodies. J. Chem. Neuroanat. 2011. No. 41(2). Pp. 97-110.

Localization oftotal and Ser 129 phosphorylated a-synuclein in the rat peripheral nervous system

D.N. Voronkov, O.V. Salnikova, R.M. Khudoerkov

The deposition of a-synuclein (a-Syn) in the peripheral nervous system precedes the motor symptoms of Parkinson's disease and is considered as a pathological sign and biomarker. However, data on the localization of a-Syn in the intact nervous system require clarification for the future development of experimental models and diagnostic tests. Localization of a-Syn and its the remainder of serine 129 phosphorylated form in peripheral nervous system of intact rats were studied by immunohistochemistry with use of different commercially available antibodies. a-Syn were found in presynaptic terminals of spinal dorsal horn, neuronal somata of prevertebral ganglia, nerve plexuses of vascular wall and GFAP-negative glial cells. Different antibodies to phosphorylated a-Syn shown uneven binding. Staining of processes, somata or nuclei of certain dorsal root ganglia neurons were found. No one of used antibodies detected small nociceptive IB4-positive neurons. The ambiguity of the obtained results can be related both to the different availability of epitopes detected by antibodies as a result of a-Syn interactions with other proteins, and with non-specific binding of antibodies to unidentified targets.

Key words: a-synuclein, peripheral nervous system, dorsal root ganglion, rat, immunohistochemistry.

EnoMeAHu;HHa • № 2, 2018

32