СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПСЕВДОЭКСФОЛИАТИВНОГО МАТЕРИАЛА НА РАННИХ СТАДИЯХ ЗАБОЛЕВАНИЯ ГЛАЗА
METHOD OF DETECTING PSEUDOEXFOLIATION MATERIAL AT EARLY STAGES OF EYE DISEASE

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для выявления псевдоэксфолиативного материала (ПЭМ) на поверхности структур глазного яблока.
В клинической офтальмологии диагноз псевдоэксфолиативного синдрома (ПЭС) выставляется на основании визуализации ПЭМ белесовато-серого цвета на передней капсуле хрусталика, что характерно для поздних, развитых стадий ПЭС с глубокими структурными и системными нарушениями, трудно поддающимися коррекции. По данным исследователей в процессе развития синдрома ПЭМ сначала последовательно появляется на структурах, обращенных в заднюю камеру глаза (на отростках цилиарного тела, задней поверхности радужки, цинновой связке, экваториальной и периэкваториальной зонах капсулы хрусталика), с перераспределением в последнюю очередь на переднюю капсулу хрусталика, заднюю поверхность роговицы, на структуры угла передней камеры. Таким образом, на ранних стадиях заболевания передняя капсула хрусталика остается клинически интактной, в связи с чем затруднена диагностика ПЭС.
В медицине существуют два основных метода морфологического исследования биологических образцов: гистологический и цитологический.
Гистологический метод предназначен для изучения структуры фрагмента тканей, представляющих единый объект.
При гистологическом методе исследования объектом выступает фрагмент тканей, который после забора погружается в фиксирующий раствор для стабилизации тканей, далее подвергается стандартной гистологической проводке, при которой происходит обезвоживание и обезжиривание путем последовательного переноса этого фрагмента тканей по спиртам восходящей концентрации, пропитывание и уплотнение (заливка парафином, целлоидином или др.) с приготовлением гистологических срезов и их последующей окраской одной из гистологических окрасок, дифференцирующей клетки и ткани исследуемого фрагмента [«Микроскопическая техника» Ромейс Б., М.: Изд. ИЛ. - 1953. - 718 с.; «Практическое руководство по патогистологической технике для офтальмологов» Архангельский В.Н., М.: Медгиз. - 1957. - 111 с.]. При этом в исследуемом образце после гистологической проводки сохраняются лишь структуры, которые крепятся между собой при помощи элементов стромы и межклеточных взаимоотношений, а гистологическая окраска дает четкую визуализацию этих структур и позволяет оценить процессы, происходящие в них.
При цитологическом методе есть возможность исследовать отдельные клетки, биологические жидкости и другие бесструктурные образцы (аспираты при тонкоигольной биопсии (ТИАБ) опухолей, кровь, соскобы, слизь, мокроту и т.д.) [Руководство по цитологии, т.1-2, М. - Л., 1965-1966 гг.]. Для этой методики достаточно разместить исследуемый объект на предметном стекле (мазок, отпечаток тканей, капля и др.), высушить его на воздухе и окрасить одним из способов цитологической окраски (по методике Паппенгейма, по методике Лейшмана и др.). Метод не требует предварительной фиксации образца, так как она осуществляется в процессе самой окраски за счет метилового спирта, на котором готовятся красители. Этот способ позволяет только визуализировать клетки, волокнистые структуры, форменные элементы крови и другие объекты, входящие в состав исследуемого образца, но, так как окраски неспецифичны, ценность его ограничивается информативностью лишь в отношении структуры и внешнего вида клеток.
Каждый из описанных методов обладает отрицательными моментами в отношении исследования ПЭМ, так как она не имеет плотной фиксации с подлежащими структурами. Поэтому при попытке выявления гистологическим методом данного материала происходит его механическое вымывание из исследуемого образца. При исследовании мазка-отпечатка по стандартной цитологической методике удается только сохранить его в образце, но неспецифичность окраски делает невозможным отдифференцировать ПЭМ и другие неклеточные структуры, входящие в состав исследуемого мазка. Эти проблемы создают значительные трудности в изучении структуры ПЭМ, вызывают сложности в исследовании этиопатогенеза ПЭС и затрудняют раннюю диагностику этого синдрома.
Авторам не известен способ выявления ПЭМ на ранних стадиях заболевания глаза.
Техническим результатом является расширение средств диагностики, выявление ПЭМ на поверхности структур глазного яблока с целью дальнейшего определения метода лечения ПЭС и профилактики осложнений, связанных с ним.
Технический результат достигается тем, что у пациентов с катарактой проводят ультразвуковую биомикроскопию (УБМ), и если в результате выявляют точечные включения на поверхности структур, обращенных в заднюю камеру глаза, то далее во время проведения факоэмульсификации (ФЭК) после парацентеза роговицы берут соскоб в зоне расположения точечных включений, из которого выполняют мазок-отпечаток, затем полученный мазок-отпечаток высушивают на воздухе до полного испарения влаги, окрашивают краской-фиксатором Май-Грюнвельда по методике Паппенгейма, далее докрашивают методом гистологической окраски по Маллори и при обнаружении на мазке-отпечатке фибриллярно-гранулярных структур темно-синего цвета констатируют наличие ПЭМ.
Изобретение поясняется изображением мазков-отпечатков с ПЭМ на фиг.1, 2.
Фиг.1. Мазки-отпечатки донорских глаз с поверхности цилиарных отростков. Окраска - по Паппенгейму-Маллори. Увеличение ×200.
Фиг.2. Мазок-отпечаток передней капсулы хрусталика. Окраска - по Паппенгейму-Маллори. Увеличение ×50.
При создании изобретения методика была изначально отработана на донорских глазах, у которых были обнаружены белесоватые отложения на цилиарных отростках и задней поверхности радужки при макромикроскопическом их препарировании. С поверхностей этих структур брали мазки-отпечатки и исследовали при помощи стандартного метода приготовления цитологических мазков по методике Паппенгейма с красителем-фиксатором Май-Грюнвальда, описанной в учебной литературе «Цитология и общая гистология», автор Быков В.Л. - Sotis, СПб., 2002. - 519 с. (с.49-51). Далее мазок-отпечаток докрашивали методом окраски по Маллори.
В результате на окрашенном мазоке-отпечатоке была обнаружена аномальная фибриллярно-гранулярная структура темно-синего цвета, что указывает белковую природу, сходную с коллагеновой и ретикулярной тканью ПЭМ (фиг.1).
Таким образом, была разработана методика, по которой мазок-отпечаток с ПЭМ проходит приготовление цитологического препарата, включающее фиксацию и частичную окраску с сохранением ПЭМ в исследуемом образце, и, не проходя все этапы стандартной гистологической обработки, окрашивается гистологической окраской по Маллори в темно-синий цвет, что делает возможным изучение структуры ПЭМ.
Данный метод использован для выявления диагноза ПЭС в трупных донорских глазах, его применение позволило изучить ранние морфологические признаки этого процесса и определить их клиническое соответствие для повышения точности установления диагноза ПЭС у офтальмологических пациентов.
Использование разработанного метода цитогистологического исследования для выявления ПЭМ на ранних стадиях заболевания глаза является необходимым, так как он отличается высокой информативностью и точностью.
При приготовлении мазка-отпечатка используется цитологический метод фиксации образца (соскоб) с сочетанием двух методик окрашивания: по методике Паппенгейма и по методике Маллори, что приводит к сохранению ПЭМ в исследуемом мазке-отпечатке для дальнейшего изучения его структуры.
Применяя методику гистологического окрашивания по Маллори, выявляют фибриллярно-гранулярные структуры, окрашенные специфически в темно-синий цвет, и таким образом подтверждают диагноз ПЭС.
Фибриллярно-гранулярная структура, окрашенная в темно-синий цвет, подтверждает его белковую природу, сходную с коллагеновой и ретикулярной тканью, но не амилоидной природы (как предполагалось ранее), так как при данной окраске амилоид приобретает красно-сиреневый цвет (фиг.2).
Способ осуществляется следующим способом.
Всем пациентам с осложненной катарактой проводят УБМ. В случаях обнаружения точечных включений на поверхности структур, обращенных в заднюю камеру глаза, с целью определения характера этих включений во время проведения ФЭК после выполнения парацентеза берут соскоб в зоне их расположения, который наносят на чистое предметное стекло, при этом образуют мазок-отпечаток. Полученный мазок- отпечаток высушивают на воздухе при комнатной температуре примерно в течение 2 часов. Подсохший на воздухе препарат окрашивают краской-фиксатором Май-Грюнвальда по методике Паппенгейма в течение 3 мин, далее, не сливая краски, к ней добавляют дистиллированную воду, увеличивая объем вдвое, через 1 минуту краску с мазка сливают и, не ополаскивая ее, приступают к гистологической окраске по методике Маллори. Наносят на мазок 10 капель Карболфуксин по Цилю, оставляют на 10 мин. Промывают в дистиллированной воде, наносят на мазок 10 капель кислотного буфера, оставляют на 10 сек, промывают в дистиллированной воде и наносят 10 капель раствора фосфорномолибденовой кислоты, оставляют на 5 мин. Далее, не промывая, наносят 10 капель полихромного раствора Маллори, оставляют на 1 мин; промывают в дистиллированной воде; обезводят в трех емкостях 96-градусного спирта по 1 минуте; просветляют в ксилоле и заключают в бальзам под покровное стекло. В результате получают мазок-отпечаток, на котором визуализируются фибриллярно-гранулярные структуры, окрашенные в темно-синий цвет, что подтверждает наличие ПЭМ.
Изобретение подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1.
Пациент Р., возраст 58 лет, поступил в клинику с диагнозом: осложненная катаракта правого глаза, подвывих хрусталика 1 степени. На УБМ были отмечены множественные точечные включения в периэкваториальной зоне капсулы хрусталика, в связи с чем при выполнении ФЭК после осуществления парацентеза роговицы шпателем с передней капсулы хрусталика был взят соскоб, из чего сформировали мазок-отпечаток, который исследовали согласно изобретению. В результате обнаружили фибриллярно-гранулярную структуру, окрашенную в темно-синий цвет, что подтверждает наличие ПЭМ.
Пример 2.
Пациент С., возраст 69 лет, поступил в клинику с диагнозом: осложненная катаракта левого глаза, миопия средней степени. На УБМ были отмечены множественные точечные включения относительно высокой акустической плотности на задней поверхности радужки. С целью выяснения природы данных включений при выполнении ФЭК после проведения парацентеза роговицы взяли соскоб с задней поверхности радужки, который отправили на цитогистологическое исследование. С данного фрагмента сделали мазок-отпечаток на предметном стекле и исследовали согласно изобретению. Фибриллярно-гранулярной структуры, окрашенной в темно-синий цвет, на данном мазке-отпечатке не обнаружили, что свидетельствует об отсутствии ПЭМ.
Точный и высокоинформативный разработанный способ позволяет выявить ПЭМ на поверхности структур глазного яблока на ранних стадиях заболевания, изучить его структуру, что в дальнейшем дает возможность определить методы лечения ПЭС и профилактики связанных с ним осложнений.