ПРИМЕНЕНИЕ АДИПОЦИТОВ, ПРЕАДИПОЦИТОВ И СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИЛИ УСКОРЕНИЯ ЗАЖИВЛЕНИЯ РАНЫ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ИХ
APPLICATION OF ADIPOCYTES, PRE-ADIPOCYTES AND STEM CELLS FOR INDUCTION OR ACCELERATION OF WOUND HEALING AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION, CONTAINING THEM

Область и уровень техники изобретения
Данное изобретение относится к способам и фармацевтическим композициям для ускорения процесса заживления ран. В частности, в данном изобретении используются биоактивные молекулы, которые секретируются адипоцитами (адипокины), и биоактивные молекулы, которые регулируют дифференцировку, пролиферацию и/или активность адипоцитов, для индукции и ускорения процесса заживления кожных ран.
Основная задача лечения ран заключается в достижении закрытия раны. Открытые кожные раны представляют собой главную категорию ран и включают в себя ожоговые раны, невропатические язвы, пролежни, язвы при венозном застое и диабетические язвы.
Открытые кожные раны обычно заживают в результате процесса, который включает в себя шесть основных компонентов: (i) воспаление; (ii) пролиферацию фибробластов; (iii) пролиферацию кровеносных сосудов; (iv) образование соединительной ткани; (v) эпителизацию и (vi) сокращение раны. Заживление ран ухудшается, когда названные компоненты, в отдельности или в целом, не функционируют надлежащим образом. Многие факторы могут оказывать влияние на заживление раны, они включают в себя недостаточность питания, инфекцию, фармакологические средства (например, актиномицин и стероиды), престарелый возраст и диабет [Hunt and Goodson in Current Surgical Diagnosis & Treatment (Way; Appleton & Lange), pp.86-98 (1988)]. Также общая проблема заживления ран после хирургических вмешательств в различных участках тела появляется в тех случаях, когда хирургическое вмешательство оказывается успешным, но открытая рана не заживает.
Кожа представляет собой многослойный плоскоклеточный эпителий, клетки которого растут и подвергаются дифференцировке и строгой компартментализации. При физиологических условиях пролиферация ограничивается базальными клетками, которые прикрепляются в базальной мембране. Дифференцировка представляет собой пространственный процесс, в котором базальные клетки утрачивают прикрепление к базальной мембране, перестают синтезировать ДНК и претерпевают ряд морфологических и биохимических изменений. Наконец, стадия созревания представляет собой образование ороговевающего слоя, формирующего защитный барьер кожи (1, 2). Наиболее ранние изменения, наблюдаемые, когда базальные клетки оказываются коммитированными для дифференцировки, связаны со способностью базальных клеток отделяться и мигрировать на некоторое расстояние от базальной мембраны (3). Подобные изменения связаны с процессом заживления раны, когда клетки как мигрируют в область раны, так и повышают пролиферативную способность. Описанные процессы являются обязательными для реструктуризации слоев кожи и индукции надлежащей дифференцировки эпидермальных слоев.
Анализу механизмов регуляции роста, дифференцировки и миграции эпидермальных клеток значительно способствовала разработка культуральных систем для кератиноцитов мышей и человека (2, 4). In vitro, кератиноциты можно поддерживать в виде базальных пролиферирующих клеток с высокой скоростью роста.
Кроме того, дифференцировку можно индуцировать in vitro, следуя характеру созревания в эпидермисе in vivo. Ранние события включают в себя потерю полудесмосомных компонентов (3, 5) и избирательную потерю α6β4-интегрина и клеточного прикрепления к матриксным белкам. Это позволяет предположить, что изменения в экспрессии интегрина являются ранними событиями в дифференцировке кератиноцитов. Ранняя утрата полудесмосомного контакта приводит к супрабазальной миграции кератиноцитов и связана с индукцией кератина 1 (К1) в культивируемых кератиноцитах и в коже (1, 3, 6). Кроме того, дифференцировка до фенотипа зернистого слоя связана с ингибированием экспрессии как β1-, так и β4-интегрина, потерей потенциала прикрепления ко всем матриксным белкам и сопровождается образованием ороговевающей оболочки и клеточной гибелью. Дифференцирующиеся клетки, в конце концов, сходят с культуральной чашки в виде зрелых чешуек (2, 7). Описанная программа дифференцировки in vitro точно следует характеру созревания эпидермиса in vivo.
Заживление раны можно индуцировать in vivo различными биоактивными средствами, которые прямо или косвенно стимулируют рост, дифференцировку и/или миграцию эпидермальных клеток. Так, в патенте США №5591709 и 5461030 описано применение нестероидного анаболического гормона, такого как инсулин, гормон роста, трииодтиронин и тироксин, для индукции заживления раны. В патенте США №5145679 предлагают применение инсулина и панкреатина для индукции заживления раны. В патенте США №6541447 описывают применение смеси факторов роста и гормонов роста для индукции заживления раны, а в международной заявке №PCT/IL01/0065 обсуждают применение средств, модулирующих РКС, для индукции заживления раны. Однако в предыдущем уровне техники в данной области нет никаких указаний относительно применения адипоцитов, модуляторов адипоцитов или молекул, секретируемых адипоцитами, для индукции или ускорения процессов, ассоциированных с заживлением раны.
Таким образом, существует общепризнанная и крайне целесообразная потребность в новых способах стимулирования заживления ран. В данном изобретении представляют новый способ лечения ран посредством применения адипоцитов, клеток, способных дифференцироваться в адипоциты, продуктов, секретируемых адипоцитами, и модуляторов адипоцитов для индукции или ускорения процессов, связанных с заживлением раны.
Раскрытие изобретения
При проведении экспериментов в процессе изучения заживления ран было установлено, что адипоциты тесно связаны с миграцией кератиноцитов к раневому отверстию на ранней стадии процесса заживления, указывая, что адипоциты, модуляторы адипоцитов и адипокины вовлечены в процесс заживления раны и, следовательно, могут быть использованы, чтобы воздействовать на процесс заживления.
При осуществлении практического применения данного изобретения, которое обсуждают в дальнейшем в разделах предпочтительных воплощений и примеров, следующих далее, установлено, что введение в раны адипокина или модулятора адипоцитов действительно значительно и эффективно стимулирует заживление ран.
Следовательно, в соответствии с одним аспектом данного изобретения представлен способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий введение в кожную рану терапевтически эффективного количества адипокина, тем самым, индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
В соответствии с другим аспектом данного изобретения предложен способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий введение в кожную рану терапевтически эффективного количества средства, способного модулировать экспрессию и/или секрецию адипокина, таким образом, индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения предложен способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий введение в кожную рану терапевтически эффективного количества средства, способного модулировать дифференцировку адипоцитов, таким образом, индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
В соответствии со следующим аспектом данного изобретения предложен способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий введение в кожную рану терапевтически эффективного количества средства, способного привлекать адипоциты в кожную рану, таким образом, индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения представлен способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий введение в кожную рану терапевтически эффективного количества средства, способного повышать пролиферацию адипоцитов в кожной ране, таким образом, индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
В соответствии с еще одним дополнительным аспектом данного изобретения представлен способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий имплантацию в кожную рану терапевтически эффективного количества адипоцитов для индуцирования или ускорения процесса заживления кожной раны.
В соответствии со следующим дополнительным аспектом данного изобретения представлен способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий имплантирование в кожную рану терапевтически эффективного количества преадипоцитов, таким образом, индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
В соответствии с другим дополнительным аспектом данного изобретения представлен способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий имплантирование в кожную рану терапевтически эффективного количества стволовых клеток, таким образом, индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
В соответствии с другим аспектом данного изобретения предложен способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий трансформацию клеток кожной раны с тем, чтобы они экспрессировали и секретировали адипокин, таким образом, индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения предложена фармацевтическая композиция для индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, содержащая в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество адипокина и фармацевтически приемлемый носитель, разработанный для местного применения фармацевтической композиции.
В соответствии со следующим аспектом данного изобретения представлена фармацевтическая композиция для индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, содержащая в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество средства, способного модулировать экспрессию и/или секрецию адипокина, и фармацевтически приемлемый носитель, разработанный для местного применения фармацевтической композиции.
В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения предложена фармацевтическая композиция для индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, содержащая в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество средства, способного модулировать дифференцировку адипоцитов, и фармацевтически приемлемый носитель, разработанный для местного применения фармацевтической композиции.
В соответствии со следующим аспектом данного изобретения предложена фармацевтическая композиция для индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, содержащая в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество средства, способного привлекать адипоциты в кожную рану, и фармацевтически приемлемый носитель, разработанный для местного применения фармацевтической композиции.
В соответствии с другим аспектом данного изобретения представлена фармацевтическая композиция для индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, содержащая в качестве активного ингредиента терапевтически эффективное количество средства, способного повышать пролиферацию адипоцитов, и фармацевтически приемлемый носитель, разработанный для местного применения фармацевтической композиции.
В соответствии с еще одним аспектом данного изобретения, предложен способ определения способности адипокина или модулятора адипоцитов индуцировать или ускорять процесс заживления раны, включающий введение адипокина или модулятора адипоцитов в рану, и оценку раны относительно миграции кератиноцитов и/или эпидермального закрытия раны, чтобы, таким образом, определить способность адипокина или модулятора адипоцитов индуцировать или ускорять заживление ран.
В соответствии с другими признаками в предпочтительных воплощениях данного изобретения, описанных ниже, адипокин выбирают из группы, состоящей из адипсина, адипонектина, резистина, лептина, липопротеинлипазы, ангиотензиногена, ангиотензин-подобного 4, 1-бутирилглицерина, матриксной металлопротеиназы 2, матриксной металлопротеиназы 9, фактора роста эндотелия сосудов, интерлейкина 6 и α-фактора некроза опухоли. Предпочтительно, адипокин представляет собой адипсин.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях средством, модулирующим адипоциты, является регулятор PPAR, предпочтительно антагонист PPAR-γ, более предпочтительно GW9662.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях адипоциты представляют собой адипоциты человека. Предпочтительными являются аутогенные адипоциты человека.
В соответствии со следующими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях преадипоциты представляют собой преадипоциты человека. Предпочтительными являются аутогенные преадипоциты человека.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях стволовые клетки представляют собой стволовые клетки человека. Предпочтительными являются аутогенные стволовые клетки человека.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях имплантирование дополнительно включает модулирование экспрессии и/или секреции адипокина.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях модулирование осуществляется в результате дифференцировки.
В соответствии со следующими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях дифференцировка происходит при экспозиции преадипоцитов с веществом, способным повышать дифференцировку преадипоцитов в адипоциты.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях стимуляция дифференцировки происходит при экспозиции стволовых клеток с веществом, способным повышать дифференцировку стволовых клеток в адипоциты.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях рану выбирают из группы, состоящей из язвы, ожога, рваной раны и хирургического разреза.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях носитель для фармацевтической композиции выбирают из группы, состоящей из водного раствора, геля, крема, пасты, лосьона, спрея, суспензии, порошка, дисперсии, бальзама и мази.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях фармацевтическая композиция включает твердую основу.
В соответствии с еще одними признаками в описываемых предпочтительных воплощениях модулятор адипоцитов является модулятором дифференцировки адипоцитов или модулятором активности адипоцитов.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях рана представляет собой резаную рану, которую делают у экспериментальных животных.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях введение адипокина или модулятора адипоцитов осуществляют в одной или более концентрациях.
В соответствии с другими признаками в описываемых предпочтительных воплощениях введение адипокина или модулятора адипоцитов осуществляют посредством одного или более применений.
В данном изобретении представлены новые фармацевтические композиции и способы лечения ран с использованием адипоцитов, клеток, способных дифференцироваться в адипоциты, модуляторов адипоцитов и молекул, секретируемых адипоцитами, для индукции или ускорения заживления ран.
Если не указано особо, все используемые в описании технические и научные термины имеют такое же значение, которое обычно подразумевает любой из специалистов в данной области, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным способам и материалам, можно использовать при практическом применении или проверке данного изобретения, ниже описывают подходящие способы и материалы. В случае противоречия, описание патента, включающее в себя определения, будет являться контролем. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными, и они не предназначены для ограничения сферы действия изобретения.
Краткое описание чертежей
Изобретение представлено только как пример со ссылкой на сопровождающие его чертежи. Со ссылкой на конкретные чертежи в деталях, подчеркивается, что подробности представлены только в качестве примера и с целью иллюстративного обсуждения предпочтительных воплощений данного изобретения и ради представления того, что, как полагают, является наиболее полезным и легко понимаемым изображением принципов и концептуальных аспектов изобретения. В этом отношении не делают никаких попыток показать конструктивные детали изобретения более подробно, чем это необходимо для фундаментального понимания изобретения, данное описание вместе с чертежами делает понятным специалистам в данной области, как некоторые формы изобретения можно применять на практике. На чертежах:
Фиг.1 иллюстрирует действие инсулина на рекрутмент адипоцитов и миграцию эпидермальных клеток к раневой области. Раны наносили на спину мышей C57BL, делая разрез. Раны лечили ежедневно местным применением инсулина, индуцирующего заживление, (1 мкМ) в течение шести дней, затем мышей умерщвляли, а их раны исследовали относительно миграции эпидермальных клеток и рекрутмента адипоцитов. Миграцию эпидермальных клеток определяли по окрашиванию антителами К14 и считали положительной, если рана была окрашена положительно по всему раневому отверстию. Рекрутмент адипоцитов оценивали по окрашиванию Н&Е и считали положительным, если определяли адипоциты внутри грануляционной ткани. Темные столбики изображают обработку инсулином, а светлые столбики изображают обработанный буфером контроль. Результаты представлены как процент закрытых (позитивных) ран, а каждый столбик представляет среднюю величину из шести повторов ± стандартное отклонение.
Фиг.2А-В представляют собой гистохимические микрофотографии, иллюстрирующие ассоциацию адипоцитов с процессом заживления раны. Раны наносили на спину мышей C57BL с помощью разреза. Мышей умерщвляли через семь дней после ранения, затем делали срезы и окрашивали антителами К14, чтобы ярко высветить мигрирующие эпидермальные клетки. Микрофотографии показывают, что рекрутированные адипоциты присутствуют в раневом отверстии в большом количестве на ранней стадии процесса заживления раны (Фигура 2А, разрешение ×20; фигура 2В, разрешение ×10).
На фиг.3 иллюстрируют влияние антагониста PPAR-γ (GW9662) на миграцию первичных кератиноцитов in vitro. Культивируемые кератиноциты или не обрабатывали (контроль), или обрабатывали 2 мкМ GW9662. За миграцией кератиноцитов наблюдали под световым микроскопом. Верхние панели представляют собой микрофотографии предварительно обработанных (0 день) культур, а нижняя часть слева и панели представляют собой полученный контроль и обработанные культуры соответственно (2 день). Голубые линии обозначают края мигрирующих кератиноцитов, а стрелки указывают на повышенную миграцию культур, обработанных GW9662, по сравнению с необработанным контролем.
Фиг.4 представляет собой диаграмму, иллюстрирующую влияние антагониста PPAR-γ (GW9662) и адипсина на заживление ран in vivo. Раны производили на спине мышей C57BL с помощью разреза, а затем раны измеряли (0 день). Области ран обрабатывали ежедневно посредством местного применения PBS (контроль), адипсина или GW9662, 2 мкМ, в течение шести дней. Затем мышей умерщвляли и измеряли области их ран (6 день). Часть раневой области, которая сократилась за шесть дней по сравнению с исходной раневой областью, рассчитывали (% сокращения раны) для каждого случая лечения. Диаграмма показывает, что как GW9662, так и адипсин стимулировали значительное уменьшение раны по сравнению с контролем, обработанным буфером.
Фиг.5 представляет собой гистохимическую микрофотографию, иллюстрирующую влияние антагониста PPAR-γ (GW9662) и адипсина на закрытие ран in vivo. Раны наносили на спину мышей C57BL с помощью разреза, а затем измеряли области ран (0 день). Раны обрабатывали ежедневно в течение шести дней посредством местного применения PBS (контроль), адипсина 1 мкМ или GW9662 2 мкМ. Потом мышей умерщвляли, их раны фиксировали параформальдегидом и исследовали под бинокулярным микроскопом при разрешении ×5. Микрофотография показывает, что области ран, леченных GW9662 или адипсином, были значительно меньше, чем область раны контроля, обработанной буфером.
На фиг.6 иллюстрируют влияние адипсина на миграцию эпидермальных клеток и закрытие ран. Раны производили на спине мышей C57BL с помощью разреза. Раны лечили ежедневно местным применением 1 мкМ адипсина в течение семи дней, затем мышей умерщвляли, делали срезы и исследовали закрытие раны эпидермоцитами и миграцию эпидермальных клеток при окрашивании антителами К14. Эпидермальное закрытие раны считали позитивным, если рана была окрашена позитивно по всему раневому отверстию. Эпидермальную миграцию рассматривали как позитивную, если рана была окрашена позитивно, но не полностью по раневому отверстию. Диаграмма из столбиков показывает, что адипсин значительно повышал как эпидермальное закрытие, так и эпидермальную миграцию. Каждый столбик представляет собой среднюю величину шести повторов.
Фиг.7 представляет собой гистохимическую микрофотографию, иллюстрирующую влияние антагониста PPAR-γ (GW9662) и адипсина на закрытие ран (сокращение). Раны производили на спине мышей C57BL с помощью разреза и раны обрабатывали ежедневно в течение шести дней адипсином (1 мкМ), GW9662 (2 мкМ) или не обрабатывали (контроль). Леченых мышей умерщвляли через шесть дней после нанесения раны. Делали гистохимические срезы ран, окрашивали Н&Е (верхняя панель) или антителами К14 (нижняя панель) и исследовали под световым микроскопом при разрешении ×5.
Сокращение считали позитивным, если обе стороны кожной раны (отмеченные черными линиями) можно было наблюдать в одном поле. Область открытой раны на срезе необработанного контроля (справа) была слишком большой, чтобы помещаться в одном поле (таким образом, рассматривали как негативное дермальное сокращение), тогда как срезы после лечения адипсином (слева) и срезы после лечения GW9662 (центр) демонстрировали позитивные дермальные сокращения.
Фиг.8 иллюстрирует влияние агониста PPAR-γ (троглитазона) на миграцию первичных кератиноцитов in vitro. Культивируемые кератиноциты или не обрабатывали (контроль), или обрабатывали 100 мкМ троглитазона, а их миграцию исследовали под световым микроскопом. Верхние панели (время 0) представляют собой микрофотографии предварительно обработанных культур, а в нижней части слева и на правых панелях представлены полученный контроль и обработанные культуры, соответственно, за 48 часов. Линии обозначают края культивируемых кератиноцитов и указывают на значительно ингибированную миграцию культивируемых кератиноцитов, обработанных троглитазоном, по сравнению с необработанным контролем.
Фиг.9 представляет собой микрофотографию, иллюстрирующую влияние инсулина и агониста PPAR-γ (троглитазона) на закрытие ран in vivo. Раны производили на спине мышей C57BL с помощью разреза, и раны обрабатывали ежедневно в течение шести дней местным применением PBS (контроль), инсулина (10 нМ), троглитазона (100 мкМ) или комбинированным применением троглитазона (100 мкМ) + инсулин (10 нМ). Мышей затем умерщвляли, их раны фиксировали параформальдегидом и исследовали под бинокулярным микроскопом при разрешении ×5. Микрофотография показывает, что область раны, обработанной инсулином, значительно меньше, чем область контроля, обработанного буфером, тогда как раны, обработанные троглитазоном и троглитазоном + инсулин, были значительно больше, чем область контрольной раны, обработанной буфером.
На фиг.10 иллюстрируют влияние инсулина и агониста PPAR-γ (троглитазона) на частоту закрытия ран. Раны производили на спине мышей C57BL с помощью разреза. Раны обрабатывали ежедневно в течение шести дней местным применением PBS (контроль), инсулина (10 нМ), троглитазона (100 мкМ) или комбинированным применением троглитазона (100 мкМ) + инсулин (10 нМ), затем мышей умерщвляли, делали срезы и исследовали закрытие ран. Закрытие ран определяли окрашиванием антителами К14 и К1. Закрытие ран считали позитивным, если раны окрашивались позитивно на протяжения всего раневого отверстия. Каждый столбик представляет собой среднюю величину шести повторов.
Описание предпочтительных воплощений
В данном изобретении представляют способы и фармацевтические композиции для ускорения процесса заживления ран. Точнее, в данном изобретении применяют адипоциты, клетки, способные дифференцироваться в адипоциты, биоактивные молекулы, секретируемые адипоцитами (адипокины) и модуляторы адипоцитов для ускорения процесса заживления ран кожи.
Прежде чем объяснять подробно, по крайней мере, одно воплощение изобретения, следует понять, что изобретение не ограничивают в заявке подробностями истолкования и расположения компонентов, изложенных в следующем описании или проиллюстрированных в разделе примеров. Изобретение допускает другие воплощения или осуществление на практике или выполнение другими способами. Также следует понимать, что используемую фразеологию или терминологию предназначают для целей описания и используемую фразеологию не следует рассматривать как ограничение.
Зрелая кожа заключает в себе два слоя, ороговевающий многослойный эпидермис и расположенный под ним толстый слой богатой коллагеном дермальной соединительной ткани, обеспечивающей опору и питание. Кожа служит защитным барьером против внешнего мира. Поэтому любое повреждение или разрыв в коже должен быть быстро и эффективно устранен. Как описывают в основном разделе выше, первая стадия кожного заживления достигается образованием сгустка, который закупоривает исходную рану. С этого времени воспалительные клетки, фибробласты и капилляры проникают в сгусток для образования грануляционной ткани. Следующие стадии вовлекают реэпителизацию раны, когда базальные кератиноциты утрачивают свои полудесмосомные контакты и мигрируют в грануляционную ткань, чтобы закрыть рану. После кератиноцитной миграции кератиноциты начинают пролиферативный рост, который позволяет восполнить клетки, утраченные во время образования раны. После того как рана покрывается монослоем кератиноцитов (то есть происходит эпидермальное закрытие), образуется новый многослойный эпидермис, а новая базальная мембрана повторно восстанавливается (8-11).
При проведении экспериментов в ходе исследования заживления ран неожиданно обнаружили, что адипоциты тесно связаны с миграцией кератиноцитов в область раны во время ранней стадии процесса заживления раны. Таким образом, пример 1 из раздела примеров, который следующим образом иллюстрирует, что появление мигрирующих кератиноцитов в раневом отверстии прямо коррелирует с появлением рекрутментированных адипоцитов в той же самой области. Кроме того, обработанные инсулином раны обновляют больше адипоцитов в раневом отверстии и впоследствии быстрее заживают, чем контрольные необработанные раны. Эта недавно обнаруженная ассоциация адипоцитов и мигрирующих кератиноцитов в заживающих ранах, связанная с прямой корреляцией, наблюдаемой между количеством рекрутментированных адипоцитов и эффективностью заживления раны, показывает, что адипоциты, модуляторы адипоцитов и продукты адипоцитов (адипокины), вовлеченные в процесс заживления раны, можно использовать, чтобы оказывать влияние на упомянутый процесс.
Адипоциты секретируют ряд биоактивных молекул, известных как адипокины, которые играют роль в поддержании энергетического гомеостаза посредством регуляции секреции инсулина, действия инсулина, метаболизма глюкозы и липидов, энергетического баланса, воспаления и репродукции.
Однако возможное вовлечение секретируемых адипоцитами биоактивных молекул в заживление ран не обсуждали и не предполагали ранее в данной области.
На основании описанных выше исходных данных и, кроме того, в процессе осуществления данного изобретения, предполагали, а потом установили, что типичный адипокин, адипсин, который был выбран из списка известных адипокинов, значительно ускоряет миграцию кератиноцитов in vitro и эффективно стимулирует заживление кожных ран in vivo (смотри в примере 3 раздела примеров, который следует).
Таким образом, в соответствии с одним аспектом данного изобретения представляют способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий в себя введение в кожную рану терапевтически эффективного количества адипокина, тем самым, индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
Используемый в описании термин «рана» имеет отношение вообще к повреждениям в коже и подкожной ткани, инициированным любым из целого ряда способов (например, пролежни при продолжительном постельном режиме, раны, индуцированные травмой, порезы, язвы, ожоги, хирургические разрезы и тому подобные) и отличающимися по свойствам.
Раны обычно классифицируют в один из четырех классов в зависимости от глубины раны: (i) Класс I: раны, ограниченные эпителием; (ii) Класс II: раны, проникающие в дерму; (iii) Класс III: раны, проникающие в подкожную ткань; и (iv) Класс IV (или раны на всю толщину): раны, при которых обнажены кости (например, точка костного давления, такая как большой вертел или крестец).
Используемый в описании термин «рана, проникающая на часть толщины» имеет отношение к ранам, которые охватывают Классы I-III; примеры ран, проникающих на часть толщины, включают в себя ожоговые раны, пролежни, варикозные язвы вен и диабетические язвы.
Используемый в описании термин «глубокая рана» включает в себя раны как класса III, так и класса IV.
Используемый термин «хроническая рана» имеет отношение к ране, которая не заживает в течение тридцати дней.
Термин «заживление» применительно к ране имеет отношение к процессу заживления раны посредством образования рубца.
В данном изобретении рассматривают лечение всех типов ран, включая глубокие раны и хронические раны.
Используемый в описании термин «адипокин» имеет отношение к любой биоактивной молекуле, которая секретируется адипоцитами in vivo или in vitro, включая секретируемые адипоцитами ферменты, факторы роста, цитокины и гормоны, не ограничиваясь перечисленными молекулами. Предпочтительно, адипокин данного изобретения выбирают из группы, состоящей из факторов комплемента D (адипсин), С3 и В; фактора роста эндотелия сосудов (VGEF), адипонектина (Acrp30); резистина; лептина; липопротеинлиразы (LPL); ангиотензиногена; ангиотезин-подобного 4; 1-бутирилглицерина (монобутирин); матриксных металлопротеиназ 2 и 9; фактора-α некроза опухоли (TNF-α) и интерлейкина 6. Предпочтительным адипокином является адипсин.
Кроме введения адипокинов в раны заживление ран можно индуцировать или ускорять в соответствии с определенными воплощениями данного изобретения модулятором адипоцитов.
Используемая в описании фраза «модулятор адипоцитов» имеет отношение к любой молекуле, способной модулировать экспрессию и/или секрецию адипокинов адипоцитами, дифференцировку адипоцитов, пролиферацию адипоцитов, миграцию адипоцитов или привлечение адипоцитов к отверстию раны.
Адипоциты дифференцируются из преадипоцитов в процессе, известном как адипогенез. В культуре, адипогенез полностью зависит от инсулина, дексаметазона и изобутилметилксантина, что подчеркивает вовлечение путей метаболизма инсулина, глюкокортикоида и цАМФ.
Тогда как многие сигнальные и биохимические пути играют императивную роль в этом процессе, большинство из известных изменений, которые имеют место во время адипогенеза, происходят на уровне транскрипции гена. Ключевые транскрипционные факторы, вовлеченные в адипогенный процесс, включают в себя белки, принадлежащие к фактору ССААТ/семейству белков, связывающих энхансер, фактор 1 детерминации и дифференцировки адипоцитов (также известный как стероловый регуляторный элемент связывающий белок 1) и активируемый пероксисомными пролифераторами рецептор-γ (Rangwala and Lazar, Ann. Rev. Nutt. 20:535-539, 2000).
Активируемые пероксисомными пролифераторами рецепторы (PPARs) включают в себя три типа, PPARα, PPARβ и PPARγ. Они представляют собой лиганд-индуцибельные ядерные рецепторы, которые непосредственно модулируют активность гена посредством связывания с определенными нуклеотидными последовательностями в промоторной области генов-мишеней. PPARγ играет решающую роль в терминальной дифференцировке посредством трансактивации адипоцит-специфических генов. Последние данные позволяют предположить перекрестное сообщение ("talk") между PPARs и метаболическим путем холестерина в эпидермисе. Все изоформы PPAR экспрессируются в эмбриональной и зрелой коже. Экспрессия PPARγ драматически возрастает на последних стадиях созревания плода. В коже послеродового периода, а также в зрелой коже экспрессия PPARγ снижается. Высказано предположение относительно важной роли PPARβ и PPARα в дифференцировке кератиноцитов во время образования эпидермиса (Wabli W., Swiss Med. Wkly. 132: 83-91, 2002). Также показано, что PPARβ и PPARα активируются по краям раненной кожи и что у бестимусных мышей, имеющих названные изоформы, заживление ран протекает хуже (Michalnik et al., J. Cell Biol. 154: 799-814, 2001). Однако вовлечение PPARγ в процесс заживления ран не был описан и не предполагался в данной области в предыдущем уровне техники.
В патенте США №6403656 описывают применение активаторов PPARγ для лечения кожных нарушений, связанных с аномалией дифференцировки клеток эпидермиса. Кроме того, в международной патентной заявке №PCT/US99/28101 обсуждают применение активаторов PPARγ, таких как простагландин J2 или D2, для лечения ожирения и диабета. Однако ни в одной из упомянутых заявок не заявляют или предлагают применение активаторов или ингибиторов PPARγ при заживлении ран.
Еще на стадии доведения данного изобретения до практического применения было установлено, что активность PPARγ обратно пропорционально связана с процессом заживления ран. Соответственно пример 2 из раздела примеров, который следует ниже, показывает, что введение троглитазона, агониста PPARγ, ингибирует сокращение ран. С другой стороны, введение GW9662, который является антагонистом PPARγ, стимулирует уменьшение ран.
Таким образом, в соответствии с другим аспектом данного изобретения представляют способ индукции или ускорения процесса заживления кожной раны, включающий введение в кожную рану терапевтически эффективного количества средства, способного модулировать дифференцировку адипоцитов, тем самым индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны. Средство в соответствии с упомянутым аспектом данного изобретения может быть любым агонистом или антагонистом любого фактора, такого как фактор транскрипции, который вовлечен в дифференцировку адипоцитов, включающий в себя белок, принадлежащий к ССААТ/семейству белков, связывающих энхансер, фактор 1 детерминации и дифференцировки адипоцитов и PPARγ, не ограничиваясь указанными факторами. Предпочтительным средством является антагонист PPARγ, более предпочтительно - GW9662.
Кроме модуляторов дифференцировки адипоцитов процесс заживления ран можно стимулировать, применяя другие модуляторы адипоцитов. Так, согласно доктрине данного изобретения, процесс заживления раны можно индуцировать или ускорять введением в кожную рану терапевтически эффективного количества средства, которое способно: (i) модулировать экспрессию и/или секрецию адипокина адипоцитом, (ii) усиливать пролиферацию адипоцитов, (iii) усиливать миграцию адипоцитов или (iv) привлекать адипоциты в область раны.
Легко осуществляемый специалистом в соответствующей области анализ, следует ли предлагать конкретное средство, например адипокин или модулятор адипоцита, проводят в контексте данного изобретения, чтобы решить, является ли действительно любое такое конкретное средство индуктором или ускорителем процесса заживления ран.
Таким образом, способность адипокина или модулятора адипоцитов индуцировать или ускорять процесс заживления кожной раны можно установить при введении в кожную рану адипокина или модулятора адипоцитов, о котором идет речь, и при оценке раны, которую лечат, по миграции кератиноцитов и/или эпидермальному закрытию.
Предпочтительно, кожную рану делают на спине мыши C57BL с помощью разреза, и лечат одной или более аппликациями, каждая из которых содержит одну или более концентраций адипокина.
По прошествии требуемого периода времени после ранения, предпочтительно приблизительно 6 дней, мышь умерщвляют и берут биопсии из ран. Биопсии из ран затем анализируют относительно миграции кератиноцитов в раневое отверстие и/или эпидермального закрытия раневого отверстия, применяя способы, известные в данной области, предпочтительно используя способы, описываемые в разделе примеров, следующем ниже.
Значительное увеличение в распространенности миграции кератиноцитов и/или эпидермального закрытия по сравнению с необработанным контролем будет указывать, что тестируемый адипокин или модулятор адипоцитов способен индуцировать или ускорять процесс заживления кожной раны.
В соответствии с другим аспектом данного изобретения адипоциты, предпочтительно аутогенные адипоциты, имплантируют в рану с тем, чтобы индуцировать или ускорить процесс заживления кожной раны.
Адипоциты можно получать из жировой ткани из любого животного источника, предпочтительно от донора человека, наиболее предпочтительно из аутогенного источника для человека. Образцы жировой ткани можно брать из подкожных или периферических участков, предпочтительно из подкожных участков, используя общепризнанные протоколы, такие как хирургические способы, отсасывание, липосакция, пенникулэктомия и с помощью биопсии. Адипоцитные клетки предпочтительно выделяют из образца жировой ткани, используя ферменты, которые разрушают физические клеточные контакты (например, коллагеназы), или используя механическое перемешивание, звуковую или ультразвуковую энергию и тому подобное. Выделенные адипоциты можно культивировать, используя подходящие способы культуры ткани, известные в данной области, например, такие как описанные подробно в международной патентной заявке PCT/US00/30623. Культивируемые адипоциты оставляют расти до тех пор, пока не будет достигнут близкий к конфлуентности слой, затем их удаляют осторожным соскабливанием из ростовой среды и имплантируют в рану.
Адипоциты также можно получать из культивируемых преадипоцитов. Используемый в описании термин «преадипоцит» имеет отношение к любой клетке, которая способна дифференцироваться в адипоцит. Предпочтительно, преадипоциты представляют собой адипоциты человека, более предпочтительно аутогенные адипоциты, выделенные из собственной жировой или другой ткани пациента. Образец жировой ткани можно брать из подкожных или периферических участков, используя общепризнанные протоколы, такие как хирургические способы, отсасывание, липосакция, пенникулэктомия, или с помощью биопсии. Преадипоцитные клетки также можно выделять из взятых образцов ткани, используя такие способы, как описаны Rodbell et al. (Meth. Enzymol. 31: 103-114, 1974). Выделенные преадипоциты можно выращивать, размножать и дифференцировать в адипоциты in vitro, используя способы и процедуры, которые описывают Hauner et al. (Journal Clin. Invest., 34: 1663-1670, 1989), Digby et al., (Diabetes 5: 138-141, 1998) и в международной патентной заявке №PCT/US00/02208. Дифференцированные адипоциты можно собирать из культуральной среды, используя способы сбора, такие как описаны Freshney (Culture of Animal Cells pp.310-312, 3nd Ed., 1994), и имплантировать в рану предпочтительно через трансплантационную камеру, которую описывают в международной патентной заявке №PCT/US97/0061. Трансплантационную камеру можно удалять из раны, по крайней мере, через 1 день, предпочтительно, по крайней мере, через 1 неделю после имплантации адипоцитов. Возможно, имплантированные адипоциты подвергают действию модулятора адипоцитов, такого как антагонист PPARγ, предпочтительно GW9662, не ограничиваясь названным средством.
В соответствии с другим аспектом данного изобретения преадипоциты имплантируют в рану с тем, чтобы индуцировать или ускорить процесс заживления кожной раны. Преадипоциты можно выделять, выращивать и размножать in vitro, используя такие способы и процедуры, которые описаны для адипоцитов выше, но пропуская стадию дифференцировки. Недифференцированные преадипоциты собирают из культуральной среды и имплантируют в рану, используя процедуры, такие как описаны для адипоцитов выше. Возможно, имплантированные преадипоциты подвергают действию модулятора адипоцитов, такого как антагонист PPARγ, предпочтительно GW9662, не ограничиваясь названным средством.
Адипоциты и/или преадипоциты также можно получать из культивируемых стволовых клеток. Используемое в описании выражение «стволовые клетки» имеет отношение к эмбриональным или зрелым клеткам, которые не претерпели терминальную дифференцировку, которые могут делиться без ограничения и делиться с образованием клеток, которые или являются стволовыми клетками, или которые необратимо дифференцируют с образованием нового типа клеток, таких как преадипоциты или адипоцит.
Выделение и размножение ex vivo стволовых клеток можно проводить, используя способы, хорошо известные в данной области. Например, Van Epps et al. (Blood Cells 20: 411, 1994) и Emerson S.G. (Blood 87: 3082, 1996) описывают способы выделения гемопоэтических стволовых клеток человека из костного мозга, периферической крови или крови из пуповины новорожденных и их размножения в культуре. Эмбриональные стволовые клетки человека (hESC) можно получать из бластоцитов человека, выделенных из эмбрионов человека, предварительно имплантированных in vivo, или оплодотворенных in vitro эмбрионов человека, используя способы, которые описывают в патенте США №5843780 и Reubinoff et al. (Nature Biotech. 18:399, 2000). Мезенхимальные стволовые клетки человека (hMSC) можно выделять и размножать, используя способы, такие как описанные в патенте США №5197985, 5486359 и 6214369. hMSC обнаружены в костном мозге, крови, коже и надкостнице, которые способны дифференцироваться в любой из специальных типов мезенхимальных тканей, таких как жировая ткань.
Стволовые клетки можно вводить непосредственно в кожную рану и оставлять для дифференцировки в адипоциты in vivo с или без одновременного введения факторов, способствующих такой дифференцировке. Альтернативно, стволовые клетки могут быть дифференцированы в преадипоциты или адипоциты ex vivo, a затем имплантированы в рану.
В культивируемых hMSC можно индуцировать адипогенную дифференцировку, используя способы, такие как описанные в патенте США №6322784. Соответственно адипоциты можно получать из первичных hMSC, подвергая клетки действию глюкокортикоида и соединения, способного активировать продукцию цАМФ, или ингибируя деградацию цАМФ таким веществом, как ингибитор фосфодиэстеразы. Полученные из стволовых клеток адипоциты впоследствии собирают и имплантируют в раны, используя процедуры, такие как описанные выше, с тем, чтобы индуцировать или ускорить процесс заживления кожной раны.
В альтернативном воплощении данного изобретения клетки раны трансформируют с тем, чтобы они экспрессировали и секретировали адипокин, тем самым индуцируя или ускоряя процесс заживления кожной раны.
Клетки раны могут принадлежать к любому типу клеток, которые вовлечены в процесс заживления раны, таким как кепатиноциты, адипоциты или преадипоциты. Клетки можно трансформировать полинуклеотидом, кодирующим адипокин, такой как адипсин, адипонектин, резистин, лептин, липопротеинлипаза, ангиотензиноген, ангиотензин-подобный 4, 1-бутирилглицерин, матриксная металлопротеиназа 2, матриксная металлопротеиназа 9 и фактор-α некроза опухоли. Альтернативно, клетки можно трансформировать полинуклеотидом, кодирующим полипептид, проявляющий активность адипокина, таким как полинуклеотид, кодирующий адипсин/комплемент D, что описывают в патенте США 5223425.
Подходящий полинуклеотид можно вводить в клетки любым из целого ряда способов, известных в данной области. Такие способы обычно можно обнаружить, описанными в: Sambrook et al., [Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989,1992)]; Ausubel et al., [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)]; Chang et al., [Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, MI (1995)]; Vega et al., [Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor MI (1995)]; Vectors [A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston MA (1988)] and Gilboa et al., [Biotechniques 4 (6): 504-512 (1986)] and include, for example, stable or transient transfection, и способы включают в себя, например, стабильную и транзиторную трансфекцию, липофекцию, электропорацию и заражение рекомбинантными вирусными векторами. Кроме того, смотри патент Соединенных Штатов 4866042 относительно векторов, затрагивающих центральную нервную систему, а также патенты Соединенных Штатов 5464764 и 5487992 относительно способов позитивно-негативной селекции для индукции гомологичной рекомбинации.
Предпочтительным подходом для внедрения полинуклеотида, кодирующего адипокин, в клетки раны, является применение вирусного вектора. Вирусные векторы дают определенные преимущества, включающие в себя более высокую эффективность трансформации и таргетирование на определенные типы клеток и размножение в них. Вирусные векторы также можно модифицировать специальными рецепторами или лигандами, чтобы изменить специфичность мишени при помощи специфических клеточных рецепторов, таких как рецепторы раковых клеток.
Ретровирусные векторы представляют собой один класс векторов, подходящих для использования данным изобретением. Дефектные ретровирусы обычно используют для переноса генов в клетки млекопитающих [для ознакомления смотри Miller, A.D., Blood 7 6: 271 (1990)]. Рекомбинантные ретровирусы, включающие в себя полинуклеотид, кодирующий адипокин, можно конструировать, используя хорошо известные молекулярные методы. Части ретровирусного генома можно удалять, чтобы сделать ретровирусную репликацию дефектной, а реплицированные дефектные ретровирусы затем можно упаковывать в вирионы, которые можно использовать, чтобы инфицировать клетки-мишени посредством применения хелперных вирусов и при применении стандартных способов. Протоколы продукции рекомбинантных ретровирусов и для инфицирования клеток in vitro или in vivo такими вирусами можно найти, например, у Ausubul et al., [eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)]. Ретровирусы использовали, чтобы внедрить целый ряд генов в многочисленные различные типы клеток, включающие в себя эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, лимфоциты, миобласты, гепатоциты и клетки костного мозга.
Другим подходящим экспрессирующим вектором может быть аденовирусный вектор. Аденовирус широко изучают и обычно используют как вектор переносчик гена. Основные преимущества аденовирусного вектора включают в себя относительно высокую эффективность трансдукции делящихся и покоящихся клеток, природный тропизм к большому разнообразию эпителиальных тканей и легкую продукцию высоких титров [Russel, W.C. [J. Gen. Virol. 81: 57-63 (2000)]. ДНК аденовируса перемещается к ядру, но не объединяется с ним. Таким образом, минимизируется риск мутагенеза с аденовирусными векторами, тогда как кратковременная экспрессия особенно подходит для лечения раковых клеток, таких как раковые клетки, резистентные ко многим лекарственным средствам. Аденовирусные векторы, используемые при экспериментальном лечении рака, описывают Seth et al. [Adenoviral vectors for cancer gene therapy. In: P. Seth (ed.) Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy, Landes, Austin, TX, (1999) pp.103-120].
Особенности, которые лимитируют экспрессию определенных типов клеток, также следует рассмотреть. Такие особенности включают в себя, например, промоторные и регуляторные элементы, которые являются специфическими для требуемого типа клеток. Вирусный вектор также может заключать в себе нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнал для секреции фрагмента антитела за пределы клетки. Секреторные сигналы обычно содержат короткую последовательность (7-20 остатков) гидрофобных аминокислот. Секреторные сигналы, подходящие для применения в данном изобретении, имеются в большом количестве и хорошо известны в данной области, смотри, например, von Heijne [J. Mol. Biol. 184: 99-105 (1985)] и Lej et al., [J. Bacteriol. 169:4379 (1987)].
Рекомбинантный вектор можно вводить несколькими способами. Если применяют вирусный вектор, в способе можно использовать их направленную специфичность и, следовательно, такие векторы не следует вводить местно в участок опухоли. Однако местное введение может обеспечить более быстрое и более эффективное лечение. Введение вирусных векторов субъекту также можно осуществлять, например, внутривенной или подкожной инъекцией. После инъекции вирусные векторы будут циркулировать до тех пор, пока они не распознают клетки хозяина с соответствующей направленной специфичностью относительно инфекции.
Согласно данному изобретению адипокин или модулятор адипоцитов можно использовать в терапии per se или как активный ингредиент фармацевтической композиции.
Используемое в описании выражение «фармацевтическая композиция» имеет отношение к препарату из одного или более активных ингредиентов, обсуждаемых в описании, с другими химическими компонентами, такими как физиологически подходящие носители и наполнители. Назначение фармацевтической композиции заключается в облегчении введения соединения в организм.
Далее, фразы «физиологически приемлемый носитель» и «фармацевтически приемлемый носитель», которые могут быть использованы взаимозаменяемо, имеют отношение к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения в организме и не нейтрализует биологическую активность и свойства введенного активного ингредиента. Приведенные фразы охватывают и адъювант.
Используемый термин «наполнитель» имеет отношение к инертному веществу, добавленному в фармацевтическую композицию, чтобы еще способствовать введению активного ингредиента. Примеры наполнителей, без ограничения, включают в себя карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтиленгликоли.
Технологии приготовления и введения лекарственных средств можно найти в "Remington Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, самое последнее издание, которое включено в описание цитированием.
Фармацевтические композиции по данному изобретению можно производить способами, хорошо известными в данной области, например способами общепринятого смешивания, растворения, гранулирования, приготовления драже, отмучивания, эмульгирования, капсулирования, улавливания в ловушку и/или лиофилизации.
Фармацевтические композиции для применения согласно данному изобретению, таким образом, можно приготовить по общепринятому способу, используя один или более физиологически подходящих носителей, содержащих наполнители и вспомогательные вещества, которые способствуют превращению активных ингредиентов в препараты, которые можно использовать фармацевтически.
Согласно данному изобретению фармацевтически приемлемый носитель подходит для местного применения и может представлять собой, например, гель, крем, пасту, лосьон, спрей, суспензию, порошок, дисперсию, бальзам и мазь, не ограничиваясь перечисленным, которые подробно рассматривают ниже. Твердые основы также можно использовать для пролонгированного высвобождения активного ингредиента в рану.
Фармацевтические композиции, пригодные для применения в контексте данного изобретения, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели. Точнее, терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов, эффективное, чтобы индуцировать или ускорить заживление раны.
Установление терапевтически эффективного количества вполне соответствует возможностям специалиста в данной области, особенно в свете представленного подробного описания рассмотренного в описании исследования и раздела примеров, который следует далее.
Для любого препарата, используемого в способах изобретения, терапевтически эффективное количество или доза первоначально может быть установлено при исследовании кожной раны с использованием экспериментальных животных, как описано выше. Такую информацию можно использовать, чтобы более точно определить эффективные дозы для человека.
Токсичность и терапевтическую эффективность рассматриваемых в описании активных ингредиентов можно устанавливать стандартными фармацевтическими способами in vitro в культурах клеток и на экспериментальных животных. Данные, полученные in vitro и в исследованиях на культурах клеток и животных, можно использовать при составлении диапазона доз для применения человеку. Дозировка в большой степени может зависеть от применяемой лекарственной формы и используемого способа введения. Точную пропись, способ введения и дозировку может выбрать индивидуальный врач, учитывая состояние пациента (смотри, например, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1).
Дозы и интервал можно индивидуально скорректировать с количеством активного ингредиента, которое оказывается достаточным, чтобы, например, индуцировать заживление раны (минимальная эффективная концентрация, МЕС). МЕС варьирует для каждого препарата, однако МЕС может быть установлена на основании данных, полученных in vitro. Дозы, необходимые для достижения МЕС, зависят от особенностей индивидуума и способа введения.
В зависимости от тяжести и чувствительности раны, которую лечат, система дозирования может представлять собой однократное введение или многократные введения с курсом лечения, продолжающимся от нескольких дней до нескольких недель или до достижения уменьшения раны.
Количество композиции, которое следует вводить, конечно, зависит от субъекта, которого лечат, тяжести поражения, способа введения, рекомендации лечащего врача и так далее.
Композиции данного изобретения, при необходимости, могут быть в упаковке или в распределяющем приспособлении, таком как утвержденный FDA набор, который может содержать в себе одну или более стандартных лекарственных форм, содержащих активные ингредиенты. Упаковка, например, может содержать металлическую или пластиковую фольгу, образующую тюбик для распределения препаратов для местного применения. Упаковку или распределяющее приспособление могут сопровождать инструкции для применения. Упаковку или распределяющее приспособление также может сопровождать уведомление, прилагаемое к контейнеру, в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, применение или сбыт фармацевтических средств, уведомление, которое отражает одобрение агентством формы композиций или применения человеку или в ветеринарии. Такое уведомление, например, может быть этикеткой, одобренной Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов, медикаментов и косметических средств США для предписанных лекарственных средств, или вкладышем к одобренному продукту. Композиции, содержащие препарат изобретения, приготовленный в совместимом фармацевтическом носителе, также можно получать, помещать в подходящий контейнер и маркировать для лечения указанного состояния, которое подробно описано выше.
Следует оценить, что предпочтительным способом введения активных ингредиентов данного изобретения является местное локальное введение, однако не исключают системное введение, с помощью подходящих способов введения, таких как пероральный, внутримышечный, внутривенный, подкожный, чрезкожный, внутрибрюшинный способ и тому подобные, используя соответствующие прописи, хорошо известные в данной области.
Таким образом, в данном изобретении представляют новые способы и композиции для применения при лечении ран, используя адипоциты, клетки, которые могут дифференцироваться в адипоциты, модуляторы адипоцитов и молекулы, секретируемые адипоцитами, для индукции или ускорения заживления ран безопасно и эффективно.
Дополнительные объекты, преимущества и новые признаки данного изобретения станут очевидными обычному специалисту в данной области при рассмотрении следующих примеров, которые не предназначают для ограничения сферы действия изобретения. Кроме того, каждое из различных воплощений и аспектов данного изобретения, которые описаны выше и которые заявлены в разделе формулы изобретения ниже, находят экспериментальное подтверждение в следующих примерах.
ПРИМЕРЫ
Теперь приводят следующие примеры, которые вместе с вышеизложенными описаниями иллюстрируют изобретение без ограничения.
Вообще, используемая в описании номенклатура и лабораторные методики, применяемые в данном изобретении, включают в себя молекулярные, биохимические и микробиологические методы и технологию рекомбинантной ДНК. Названные методы подробно описаны в литературе. Смотри, например, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook et al. (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методы, которые изложены в патентах США №4666828, 4683202, 4801531, 5192659 и 5272057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Ceffis, J.E, ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N.Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J.E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W.H.Freeman and Co., New York (1980); имеющиеся иммунологические анализы широко обсуждают в патентах и научной литературе, смотри, например, патенты США №3791932; 3839153; 3850752; 3850578; 3853987; 3867517; 3879262; 3901654; 3935074; 3984533; 3996345; 4034074; 4098876; 4879219; 5011771 и 5281521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M.L, ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D.5 and Higgins S.J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B.D., and Higgins S.J., eds. (1984); "Animal Cell Culture", Freshney, R.L, ed (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B, (1984) and "Methods in Enzymology", Vol.1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); все из которых включены в описание цитированием в их полном объеме. Другие общие ссылки указывают по всему данному документу. Используемые способы, как полагают, хорошо известны в данной области и их описывают для удобства читателя. Вся содержащаяся здесь информация включена в описание цитированием.
Материалы и экспериментальные способы
Материалы: Все стандартные химические вещества получены от (Sigma-Aldrich, St.Louis, USA). Парапластную среду-заливку также закупали у формы Sigma. Антикератин-14-антитела и антикератин-1 поликлональные антитела закупали у фирмы Bacto-Covance (Richmond, CA, USA). Биотинилированные противокроличьи антитела козы и стрептавидин-пероксидазу хрена (HRP) закупали у фирмы ZYMED Laboratories Inc. (San Francisco, CA USA). GW9662 закупали у фирмы Cayman Chemicals (Ann Arbor Michigan USA). Адипсин (комплементирующий фактор D) получали от фирмы Calbiochem (San Diego CA USA). Гематоксилин закупали у фирмы DAKO corp. (Carpinteria CA USA), эозин получали у фирмы ICN Biomedicals Inc. (Aurora Ohaio USA) и энтеллан закупали у фирмы MERCK (Darmstadt Germany).
2+
Выделение и культивирование мышиных кератиноцитов: Первичные кератиноциты выделяли из кожи новорожденных животных, как описывают в ссылке 18. Кератиноциты культивировали в минимальной поддерживающей среде Игла (ЕМЕМ), содержащей 8% хелекс (Chelex-100, BioRad), обработанной фетальной бычьей сывороткой. Для поддержания пролиферативного фенотипа базальных клеток конечную концентрацию Са приводили к 0,05 мМ. Эксперименты проводили через пять - семь дней после посева.
Исследование миграции кератиноцитов: Первичные кератиноциты мыши не обрабатывали или обрабатывали антагонистом PPARγ GW9662 (мкМ) или агонистом PPARγ троглитазоном (мкМ). Исследование раневой экскориации проводили через 24 часа после обработки, а репрезентативные участки фотографировали сразу после нанесения раны (0 день) и через 48 часов (2 дня). Среднюю величину заживления раны выражали как процент по сравнению с шириной раневой экскориации (% сокращения раны).
Исследование заживления раны: Раны производили на спинах мышей C57BL посредством 20 мм разреза и лечили ежедневно в течение 6 дней различными средствами. Мышей умерщвляли через шесть дней после нанесения раны. Брали биопсии из ран, обрабатывали и морфологически и/или гистохимически исследовали в отношении различных параметров заживления ран, то есть уменьшения раны, миграции и дифференцировки адипоцитов, миграции эпидермоцитов и эпидермального закрытия.
Исследование уменьшения раны: Область раны измеряли до и после лечения и рассчитывали процент уменьшения области раны.
Приготовление пропитанных парафином срезов ран: Биопсии ран фиксировали в 4% параформальдегиде, затем обезвоживали возрастающими концентрациями этанола (50-100%). Обезвоженные препараты погружали сначала в раствор 50% парафина и 50% ксилола, затем в чистый парафин. Потом на микротоме делали срезы парафиновых блоков, а из срезов готовили гистологические препараты среза на предметных стеклах Super Frost+™.
Окрашивание Н&Е: Пропитанные парафином препараты среза ран инкубировали при 60°С в течение 60 минут и удаляли парафин промыванием препаратов дважды толуолом (100%) в течение 10 минут, один раз 100% этанолом в течение 15 минут и один раз 100% этанолом в течение 10 минут. Депарафинированные препараты срезов окрашивали гематоксилином (раствором, готовым для применения) в течение 10 минут, промывали водой, окрашивали эозином (0,5% в DDW) в течение 5 минут, затем промывали 70% этанолом в течение 1 минуты. После этого препараты срезов обезвоживали промыванием один раз 95% этанолом в течение 5 минут, дважды 100% этанолом в течение 5 минут и дважды ксилолом (100%) в течение 10 минут, затем герметизировали, используя энтеллан (MERCK Darmstadt Germany).
Окрашивание кератином 4 и кератином 14: Пропитанные парафином препараты срезов ран депарафинировали, как описано выше для окрашивания Н&Е, и инкубировали в блокирующем растворе (5% BSA и 5% твин 20™ в PBS) в течение 1 часа. Препараты срезов затем инкубировали или с противокератиновыми 1, или с противокератиновыми 14 антителами (Babco-Covance) в (1:1000) блокирующем растворе (5% BSA и 5% твин 20™ в PBS) при 4°С в течение ночи. После этого препараты срезов промывали пять раз буфером (5% твин 20™ в PBS) с последующей инкубацией с биотинилированными противокроличьими антителами козы (ZYMED Laboratories Inc.), суспендированными (1:200) в блокирующем растворе (5% BSA и 5% твин 20™ в PBS) в течение 1 часа. Препараты срезов затем промывали три раза буфером для промывки с последующей инкубацией с вторичными биотинилированными стрептавидин-антителами в блокирующем растворе (1:300) в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого, препараты срезов промывали дважды буфером для промывки в течение 5 минут, один раз PBS в течение 5 минут и один раз трис-буфером (0,05 М в PBS) с последующей инкубацией в реагенте DAB (2 таблетки: 1 золотая, 1 серебряная, растворенные в DDW) для развития окраски. Реакцию завершали погружением препаратов срезов в воду с последующим контрастирующим окрашиванием эозином (ICN, 0,5% в DDW).
Результаты экспериментов
Пример 1
Ассоциация адипоцитов с миграцией кератиноцитов во время процесса заживления раны
Мигрирующие эпидермальные клетки (кератиноциты) и рекрутментированные адипоциты исследовали в ткани семидневной раны (Фигуры 2А-В). Исследуемые рекрутированные адипоциты оказались по существу лишенными накопленного жира (то есть ранние адипоциты). Как можно видеть на фигуре 1, мигрирующие кератиноциты наблюдали по всему отверстию раны приблизительно в 60% необработанных ранах, тогда как рекрутментированные адипоциты также присутствовали приблизительно в 60% необработанных ран. На фигуре 1 также показано, что мигрирующие кератиноциты и рекрутированные адипоциты присутствовали приблизительно в 90% и 80% обработанных инсулином ран, соответственно.
Полученные результаты показывают, что миграция кератиноцитов в область раневого отверстия тесно связана с рекрутментом адипоцитов в той же самой области во время ранней стадии процесса заживления раны. Таким образом, результаты указывают, что мигрирующие адипоциты, которые не полностью дифференцировали в жировые накапливающиеся клетки, вовлечены в процесс заживления раны.
Пример 2
Влияние модуляторов PPARγ на миграцию кератиноцитов и уменьшение раны
Влияние ингибирования или повышения активности активируемого пероксисомными пролифераторами гамма-рецептора (PPARγ) на миграцию кератиноцитов оценивали in vitro. Как можно видеть на фигуре 3, обработка культивируемых первичных кератиноцитов мыши антагонистом PPARγ GW9662 стимулировала миграцию кератиноцитов. С другой стороны, обработка культивируемых кератиноцитов агонистом PPARγ троглитазоном приводила к ингибированию миграцию кератиноцитов (Фигура 8).
Влияние ингибирования или повышения активности PPARγ при использовании антагониста и агониста PPARγ, соответственно, на заживление ран также оценивали in vivo. Соответственно резаные раны делали на спине мышей C57BL и обрабатывали ежедневно в течение 6 дней PBS-буфером (контроль) или различными средствами. Мышей умерщвляли через шесть дней после нанесения раны и затем исследовали раны. Как можно видеть на фигурах 4, 5 и 6, обработка GW9662 (антагонист PPARγ) стимулировала сокращение раны по сравнению с контролем. С другой стороны, подобная обработка троглитазоном (агонист PPARγ) приводила к торможению уменьшения раны (Фигура 9). Кроме того, троглитазон ухудшал заживление раны, индуцированной диабетом (Фигуры 9 и 10).
Следовательно, результаты четко указывают, что активность PPARγ препятствует заживлению ран и что ингибирование PPARγ может эффективно ускорять процесс заживления ран. Соответственно результаты показывают, что антагонисты PPARγ, такие как GW9662, можно использовать, чтобы эффективно ускорять заживление ран.
Пример 3
Влияние адипсина на миграцию кератиноцитов и уменьшение раны
Влияние адипсина (комплементирующего фактора D, который секретируется адипоцитами) на заживление ран оценивали in vivo. Соответственно резаные раны делали на спине мышей C57BL и раны обрабатывали ежедневно в течение 6 дней PBS-буфером (контроль) или 1 мкМ адипсина. Мышей умерщвляли через шесть дней после нанесения раны и затем исследовали раны. Как можно видеть на фигурах 4, 5 и 7, адипсин значительно стимулировал сокращение раны (фигуры 4, 5 и 7). Кроме того, адипсин повышал эпидермальное закрытие раны приблизительно от 15% до 30% и усиливал миграцию кератиноцитов приблизительно от 30% до 65% по сравнению с контролем, обработанным буфером (Фигура 6).
Полученные результаты демонстрируют, что адипокин, такой как адипсин, может эффективно индуцировать или ускорять заживление ран.
Следует оценить, что определенные признаки изобретения, которые для ясности описывают в контексте отдельных воплощений, также могут быть представлены в комбинации в одном воплощении. Наоборот, различные признаки изобретения, которые для краткости описывают в контексте одного воплощения, также могут быть представлены раздельно или в любой подходящей субкомбинации.
Хотя изобретение рассматривают вместе с его специальными воплощениями, ясно, что многочисленные альтернативы, модификации и вариации станут очевидными специалистам в данной области. Соответственно предполагают включить все такие альтернативы, модификации и вариации, которые соответствуют идее и широкой сфере действия прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки и последовательности, идентифицированные по их названию и/или номерам поступления в базу данных, упомянутые в данной спецификации, включены в описание цитированием в их полном объеме в одинаковой степени, как если бы каждая индивидуальная публикация, патент, патентная заявка или последовательность была бы специально и индивидуально включена в описание цитированием. Кроме того, цитирование или идентификация любой ссылки в данной заявке не следует рассматривать как предположение, что такая ссылка существует как предыдущий данному изобретению уровень техники.
Ссылки, цитируемые под номерами
(Дополнительные ссылки, которые цитируют в тексте)
1. Hennings, H., Michael, D., Cheng, С, Steinert, P., Holbrook, K., and Yuspa, S.H, Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Cell, 19:245-254, 1980.
2. Yuspa, S.H., Kilkenny, A.E., Steinert, P.M., and Roop, D.R. Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro. J. Cell Biol., 109; 1207-1217, 1989.
3. Fuchs, E. Epidermal differentiation: the bare essentials. J. Cell Biol., 111: 2807-2814, 1990.
4. Yuspa, S. BL The pathogenesis of squamous cell cancer; lessons learned from studies of skin carcinogenesis - Thirty-third G.H.A. Clowes Memorial Award Lecture. Cancer Res., 54; 1178-1189, 1994.
5. Hennings, H. and Holbrook, K.A. Calcium regulation of cell-cell contact and differentiation of epidermal cells in culture. An ultrastructural study. Exp. Cell Res., 143: 127-142, 1983.
6. Tennenbaum, Т., Li, L., Belanger, A.J., De Luca, L.M., and Yuspa, S.H. Selective changes in laminin adhesion and a6β4 integrin regulation are associated with the initial steps in keratinocyte maturation. Cell Growth Differ., 7: 615-628, 1996.
7. Tennenbaum, Т., Belanger, A.J., Quaranta, V., and Yuspa, S.H. Differential regulation of integrins arid extracellular matrix binding in epidermal differentiation and squamous tumor progression. J. Invest. Dermatol., 1: 157-161, 1996.
8. Weinstein, M.L., Update on wound healing: a review of the literature. Mil. Med., 163: 620-624, 1998.
9. Singer, A.J. and dark, R.A. Cutaneous wound healing. N. Engl. J. Med., 341: 738-746, 1999.
10. Whitby, D.J. and Ferguson, M.W. Immunohistochemical localization of growth actors in fetal wound healing. Dev. Biol, 147: 207-215, 1991.
11. Kiritsy, C.P., Lynch, В., and Lynch, S.E, Role of growth factors in cutaneous wound healing; a review. Crit. Rev. Oral Biol. Med., 4: 729-760, 1993.