СПОСОБЫ СЕЛЕКЦИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫЙ БЕЛОК

1. Способ селекции по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт, включающий по меньшей мере следующие стадии:
(а) получения множества эукариотических клеток-хозяев, жизнеспособность которых зависит от потребления фолата, причем указанные эукариотические клетки-хозяева включают по меньшей мере
(i) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и
(ii) интродуцированный полинуклеотид, кодирующий фермент дигидрофолатредуктазу (ДГФР),
(б) культивирования указанного множества эукариотических клеток-хозяев в селективной культуральной среде, включающей по меньшей мере ингибитор ДГФР и фолат в предельно допустимой концентрации,
(в) отбора по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт.
2. Способ по п.1, в котором селективная культуральная среда включает ингибитор ДГФР в концентрации 500 нМ или менее и фолат в концентрации 500 нМ или менее.
3. Способ по п.1 или 2, в котором селективная культуральная среда включает ингибитор ДГФР в концентрации 200 нМ или менее и/или включает фолат в концентрации 2,5-100 нМ.
4. Способ, в котором селективная культуральная среда включает в качестве фолата фолиевую кислоту в концентрации 12,5-50 нМ вместе с метотрексатом (МТК) в качестве ингибитора ДГФР в концентрации 10-100 нМ.
5. Способ по меньшей мере по п.1 или 2, в котором фермент ДГФР означает такой фермент ДГФР, который обладает пониженной чувствительностью к ингибитору ДГФР по сравнению с ферментом ДГФР, эндогенно экспрессированным клеткой-хозяином.
+
6. Способ по п.1 или 2, в котором указанная эукариотическая клетка-хозяин является клеткой-хозяином СНО, предпочтительно клеткой ДГФР (плюс).
+
7. Способ по п.1 или 2, в котором клетку-хозяина ДГФР (плюс) применяют вместе с интродуцированным ферментом ДГФР, который менее чувствителен к МТК, чем фермент ДГФР, эндогенно экспрессированный клеткой-хозяином.
8. Способ по п.1, в котором полинуклеотид, кодирующий целевой продукт, и полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, интродуцированы по меньшей мере одним вектором экспрессии.
9. Способ по п.1, в котором клетка-хозяин включает по меньшей мере два интродуцированных полинуклеотида, кодирующих целевой продукт, причем предпочтительно по меньшей мере один полинуклеотид кодирует тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина, а другой полинуклеотид кодирует легкую цепь молекулы иммуноглобулина.
10. Способ по п.1, в котором интродуцированный полинуклеотид (полинуклеотиды), кодирующий целевой продукт, и интродуцированный полинуклеотид, кодирующий фермент ДГФР, включены в разные кассеты экспрессии, и в котором кассета (кассеты) экспрессии для индукции экспрессии полинуклеотида (полинуклеотидов), кодирующего целевой продукт, включает более сильный промотор и/или энхансер по сравнению с кассетой экспрессии для индукции экспрессии полинуклеотида, кодирующего фермент ДГФР.
11. Способ получения целевого продукта, включающий по меньшей мере следующие стадии:
(а) осуществления способа селекции по одному из пп.1-10 для отбора по меньшей мере одной эукариотической клетки-хозяина, экспрессирующей целевой продукт, и
(б) культивирования по меньшей мере одной выбранной эукариотической клетки-хозяина в условиях, которые допускают экспрессию целевого продукта.
12. Способ по п.11, включающий по меньшей мере одну из следующих стадий:
(в) выделения целевого продукта из указанной среды для культивирования клеток и/или из указанной эукариотической клетки-хозяина, и/или
(г) дополнительного процессинга выделенного целевого продукта.
13. Способ по п.11 или 12, в котором целевой продукт является молекулой иммуноглобулина или ее функциональным фрагментом.
14. Применение селективной культуральной среды, включающей ингибитор ДГФР в концентрации 500 нМ или менее и фолат в предельно допустимой концентрации 500 нМ или менее в способе по одному из пп.1-10.
15. Применение по п.14, в котором селективная культуральная среда обладает одним или несколькими из следующих свойств:
а) селективная культуральная среда включает фолат в предельно допустимой концентрации 2,5-100 нМ и/или ингибитор ДГФР в концентрации 200 нМ или менее, и/или
б) селективная культуральная среда включает фолиевую кислоту в концентрации 12,5-50 нМ вместе с МТК в концентрации 10-100 нМ.