СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВА МОЛОКА И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
METHOD OF DETERMINING QUALITY OF MILK AND DAIRY PRODUCTS

Изобретение относится к аналитической химии и может использоваться при определении афлатоксина М1 в молоке и молочных продуктах при контроле качества продуктов на загрязнение микотоксинами.
В современной практике для полуколичественного и качественного определения афлатоксина М1 широко применяются различные иммуноферментные методы анализа.
Наиболее распространенным методом является твердофазный иммуноферментный иммуноанализ, основанный на гетерогенной реакции связанных с твердой поверхностью иммунореагентов с иммунореагентами и аналитами в растворе. Обычно проводится в формате микропланшета с 96 ячейками (Rosi P., Borsari A., Lasi G., Lodi S., Galanti A., Fava A., Girotti S., Ferri E. Aflatoxin М1 in milk: Reliability of the immunoenzymatic assay. International Dairy Journal 17 (2007) 429-435; Velasco M.L.R., Delso M.M.C., Escudero D.O. ELISA and HPLC determination of the occurrence of Aflatoxin М1 in row cow's milk. Food Addit. Contam. 20 (2003) 276-280).
Недостатком данного метода является длительность его проведения (2-48 часов), большое количество стадий анализа и инкубирования, необходимость проведения пробоподготовки и использования специальной аппаратуры для регистрации результатов анализа.
Известен способ определения микотоксинов, основанный на использовании мембран с ковалентно связанными антителами (см. ЕР патент №0893690, МПК G01N 33/543K; G01N 33/569F).
Данный способ, как и остальные иммунофильтрационные тесты на основе мембран, не позволяют достичь необходимой чувствительности.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ определения афлатоксина М1 в молоке (Sibanda L., De Saeger S., Van Peteghem C. Development of a portable field immunoassay for the detection of aflatoxin М1 in milk. Intern. J. Food Microbiology 48 (1999) 203-209). Способ заключается в следующем: жидкое молоко нагревали на магнитной обогреваемой мешалке и фильтровали через фильтр Ватман №4 для удаления жиров. Экстракцию афлатоксина М1 из молока проводили с помощью иммуноаффинных колонок Aflaprep  M (Rhone-Diagnostics Technologies, Glasgow, UK). 50 мл фильтрованного молока медленно пропускали через колонку, затем колонку промывали дистиллированной водой. Афлатоксин М1 элюировали 1,25 мл метанола и 1,25 мл фосфатно-солевого буфера. Полученный раствор (2,5 мл, 50% метанола) разводили фосфатно-солевым буфером до объема 8,33 мл для снижения содержания метанола до 15%. На мембрану наносили вторичные кроличьи антимышиные антитела, высушивали, затем блокировали раствором казеина и снова высушивали. Мембрану фиксировали над кусочком хлопковой ваты, наносили первичные антитела, промывали фосфатно-солевым буфером, добавляли аликвоту анализируемого молока, затем конъюгат афлатоксина В1 с пероксидазой хрена, вновь промывали и добавляли субстрат. Интенсивность развивающейся окраски контролировали визуально.
Недостатком данного способа является использование иммуноаффинных колонок для повышения чувствительности и снижения матричного эффекта, что усложняет процедуру анализа, увеличивает его продолжительность и стоимость.
Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение, снижение продолжительности и себестоимости способа иммуноферментного определения афлатоксина М1 в молоке при одновременном повышении чувствительности определения.
Данный технический результат достигается за счет объединения стадий очистки, концентрирования и определения непосредственно в иммуноаффинном носителе.
Сущность изобретения состоит в том, что в способе иммуноферментного определения афлатоксина М1 в молоке и молочных продуктах, включающем иммуноаффинное концентрирование и иммуноферментное определение афлатоксина М1, мембрана заменена на гель с привитыми антителами, при этом иммуноаффинное концентрирование и иммуноферментное определение афлатоксина М1 проводятся непосредственно в объеме геля, что позволяет снизить временные и экономические затраты на проведение анализа, а также повысить чувствительность определения.
Изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 изображена детектирующая колонка, на фиг.2 - схема проведения иммунохимического определения афлатоксина М1. Позициями на фигурах обозначены: 1 - колонка: 2 иммуноаффинный гель; 3 - пористые фильтры (фриты); 4 - проба; 5 - конъюгат; 6 - промывка; 7 - субстрат; 8 - отрицательный образец; 9 - положительный образец.
Способ реализуется следующим образом. На дно колонки 1 помещают пористый фильтр 3, поверх которого наливают иммуноаффинный гель 2 с привитыми специфическими антителами и сверху еще один пористый фильтр 3 для фиксации геля. Пробу 4 пропускают через колонку 1 сверху вниз, затем снизу вверх вводят конъюгат 5. Для удаления излишков конъюгата 5 используется стадия промывки 6. Затем в колонку 1 добавляют субстрат 7 и наблюдают развитие окраски. В случае появления окраски результат считают отрицательным образцом 8, в случае отсутствия окраски - образец положительный 9.
Рассмотрим пример осуществления заявленного способа иммуноферментного определения афлатоксина М1 в молоке и молочных продуктах (иммунохроматографический анализ с пробоподготовкой и концентрированием).
Для определения афлатоксина М1 использовали колонку емкостью 1 мл, в которую помещали детектирующий иммунослой, представляющий собой смесь геля с привитыми специфическими антителами (для аффинной очистки и связывания аналита) и геля с блокированными центрами связывания (для пробоподготовки образца). Гель готовили на основе сефарозы с активированными CNBr группами, разбавленный 1:3 раствором фосфатно-солевого буфера. Приготовленный гель (200-400 мкл) помещали на пористый фильтр (фрит) в основании колонки; сверху иммуноаффинного геля помещали еще один пористый фильтр для фиксации в колонке.
Пробоподготовка цельного, гомогенизированного молока, молочно-кислых продуктов заключалась в отделении жиров центрифугированием в течение 5-10 минут при 5000-10000 оборотах в минуту. Для анализа использовали обезжиренную водную часть. Для проведения определения аликвоту (10 мл) анализируемого молока пропускали через колонку с иммуноаффинным гелем с помощью шприца, затем конъюгат аналита с пероксидазой хрена. Конъюгат оставляли в колонке на 3-5 минут, затем удаляли промыванием колонки 5-10 мл фосфатно-солевого буфера с добавкой Твин 20. Последним шагом определения являлось добавление в колонку субстрата на основе тетраметилбензидина, после чего в течение нескольких минут наблюдалось развитие синей окраски (при отсутствии афлатоксина М1 в пробе). При присутствии афлатоксина М1 выше предела обнаружения иммуноаффинный гель остается белым. Развитие окраски фиксировали визуально. Отсутствие окраски в течение выбранного времени интерпретировали как положительный образец (концентрация афлатоксина М1 выше предельно допустимой). Развитие синей окраски интерпретировали как отрицательный образец (концентрация афлатоксина М1 ниже предельно допустимой).
Использование данного способа позволило достичь чувствительности определения афлатоксина М1 на уровне 0,05 нг/мл, что соответствует требованиям ЕС по контролю качества пищевых продуктов.