Способ генотипирования энтеровирусов методом секвенирования 1A-1B участка генома
METHOD FOR ENTEROVIRUS GENOTYPING BY GENOME REGION 1A-1B SEQUENCING METHOD

Изобретение относится к области молекулярной биологии, лабораторной диагностики, вирусологии и эпидемиологии, и предназначено для определения типовой таксономической принадлежности (генотипирования) энтеровирусов, обнаруженных в образцах клинического материала или в пробах из объектов окружающей среды, методом прямого секвенирования фрагмента структурной части их генома с последующим сравнением полученных в результате этого нуклеотидных последовательностей с нуклеотидными последовательностями структурной части генома ранее генотипированных энтеровирусов, либо с нуклеотидными последовательностями, депонированными в международных базах данных генетической информации, например, NCBI GenBank.
Enterovirus
Picornaviridae
Picornavirales
В соответствии с действующей классификацией, энтеровирусы человека относятся к роду  семейства  порядка , включают в себя более ста типов и разделены на четыре вида (A, B, C, D) (Zell et al., 2017). Клинические проявления инфекции, вызванной энтеровирусами, характеризуются широким спектром, включающим лихорадочное заболевание, конъюнктивит, инфекции верхних и нижних дыхательных путей, гастроэнтерит, менингит, энцефалит и энцефаломиелит (Rotbart et al., 2000).
Определение таксономической принадлежности энтеровирусов, обнаруженных в клиническом материале или в пробах из объектов окружающей среды, с точностью до типа (типирование) необходимо для лабораторного подтверждения клинического диагноза, прогнозирования развития тяжелых форм энтеровирусной инфекции, проведения эпидемиологического анализа. До недавнего времени "золотым стандартом" типирования обнаруженных энтеровирусов оставалась реакция нейтрализации с типоспецифическими сыворотками. Однако, данный метод предполагает предварительное выделение изолятов живого вируса из исследуемого материала с помощью чувствительных клеток, что не всегда возможно вследствие особенностей биологии некоторых энтеровирусов, а также требует значительных затрат времени (до нескольких недель). Внедрение в лабораторную диагностику молекулярно-биологических методов (амплификация нуклеиновых кислот с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирование нуклеиновых кислот и др.) позволило значительно упростить и ускорить процесс генотипирования энтеровирусов, а также сделать его более чувствительным и точным.
Известны следующие способы генотипирования энтеровирусов методом прямого секвенирования фрагмента структурной части их генома, описанные в научных публикациях:
1. Генотипирование энтеровирусов методом секвенирования фрагментов 1В или 1D участка генома, кодирующих белки VP2 или VP1 (Casas I, Palacios GF, Trallero G, Cisterna D, Freire MC, Tenorio A. Molecular characterization of human enteroviruses in clinical samples: comparison between VP2, VP1, and RNA polymerase regions using RT nested PCR assays and direct sequencing of products. J Med Virol. 2001 Sep;65(1):138-48.);
2. Генотипирование энтеровирусов методом секвенирования фрагмента 1A-1B участка генома, кодирующего структурные белки VP4-VP2 (Arola A, Santti J, Ruuskanen O, Halonen P, Hyypiä T. Identification of enteroviruses in clinical specimens by competitive PCR followed by genetic typing using sequence analysis. J Clin Microbiol. 1996 Feb;34(2):313-8.);
3. Генотипирование энтеровирусов методом секвенирования фрагмента 1D участка генома, кодирующего структурный белок VP1 (Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Pallansch MA. Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification. J Virol. 1999 Mar;73(3):1941-8.);
Все эти методы позволяют определить генотип энтеровирусов, обнаруженных в клиническом материале или в пробах из объектов окружающей среды, путем амплификации и прямого секвенирования фрагмента структурной части их генома с последующим сравнением полученных в результате этого нуклеотидных последовательностей с нуклеотидными последовательностями структурной части генома ранее генотипированных энтеровирусов. Однако в качестве целевого фрагмента для амплификации и дальнейшего секвенирования различные методы используют участки структурной части генома, отличающиеся локализацией, вариабельностью и размером, а также разные режимы проведения ПЦР с разными праймерами, что влияет на их чувствительность и специфичность.
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является метод генотипирования энтеровирусов с помощью однораундовой амплификации и прямого секвенирования фрагмента 1A-1B участка генома, кодирующего структурные белки VP4-VP2. Указанный метод использует для амплификации целевого участка генома однораундовую ПЦР с одной из двух комбинаций праймеров: 5' TCCTCCGGCCCCTGAATG 3' и 5' GGCAACTTCCACCACCACCC 3', либо 5' TACTTTGGGTGTCCGTGTTTC 3' и 5' GGCAACTTCCACCACCACCC 3'. (Arola A, Santti J, Ruuskanen O, Halonen P, Hyypiä T. Identification of enteroviruses in clinical specimens by competitive PCR followed by genetic typing using sequence analysis. J Clin Microbiol. 1996 Feb;34(2):313-8.). Учитывая высокую изменчивость энтеровирусов, использование для амплификации целевого фрагмента однораундовой ПЦР с описанными устаревшими праймерами существенно снижает чувствительность данного метода при генотипировании современных штаммов энтеровирусов человека разных видов.
Техническим результатом заявляемого изобретения является разработка более чувствительного метода генотипирования всех известных, на сегодняшний день, энтеровирусов.
Указанный технический результат достигается тем, что для амплификации целевого фрагмента вместо однораундовой ПЦР используется "полувложенная" ПЦР с использованием вырожденного праймера. Первый раунд "полувложенной" ПЦР проводится с комбинацией праймеров: 5' TCCTCCGGCCCCTGAATG 3' и 5' GGIARYTTCCAIYACCAICC 3', а второй раунд "полувложенной" ПЦР с комбинацией праймеров: 5' TACTTTGGGTGTCCGTGTTTC 3' и 5' GGIARYTTCCAIYACCAICC 3'.
Заявляется способ генотипирования энтеровирусов методом секвенирования 1A-1B участка генома, отличающийся тем, что выделяют вирусную РНК, получают кДНК, которую используют в качестве матрицы при постановке реакции "полувложенной" ПЦР, для проведения первого раунда "полувложенной" ПЦР готовят 25 мкл реакционной смеси, включающей: 2 ед. ДНК-полимеразы, 0,2 mM смесь dNTP, 5 pmol праймера 5' TCCTCCGGCCCCTGAATG 3', 20 pmol праймера 5' GGIARYTTCCAIYACCAICC 3', реакционный буфер: 67 mM Трис-HCl, pH 8,3, 2,0 mM MgCl2 и 10 мкл кДНК, ПЦР проводят по следующей схеме: 1 цикл - 95°С, 5 минут; 42 цикла - 95°С, 20 секунд, 55°С, 1,5 минуты, 72°С, 40 секунд; и заключительный цикл - 72°С, 5 минут, во втором раунде "полувложенной" ПЦР используют аналогичную реакционную смесь с праймерами 5' TACTTTGGGTGTCCGTGTTTC 3', 5 pmol и 5' GGIARYTTCCAIYACCAICC 3', 20 pmol, и 1 мкл амплификата, полученного в предыдущей реакции, схема проведения второго раунда: 1 цикл - 95°С, 5 минут; 30 циклов 95°С, 20 секунд, 58°С, 1 минута, 72°С, 40 секунд; 1 цикл - 72°С, 5 минут, секвенирование ампликонов проводят по прямой и обратной последовательности с праймерами 5' TACTTTGGGTGTCCGTGTTTC 3' для прямой последовательности и 5' GGIARYTTCCAIYACCAICC 3' для обратной последовательности на автоматическом генетическом анализаторе 3130 Genetic Analyzer, генотипирование обнаруженных энтеровирусов проводят методом сравнительного анализа последовательностей, полученных после секвенирования ампликонов, с последовательностями геномов энтеровирусов из международной базы генетических данных NCBI GenBank.
Осуществление изобретения.
В качестве материала использовали фекальные экстракты, ликвор, носоглоточные смывы, плазму крови и др. Выделение вирусной РНК из исследуемой пробы проводили с помощью коммерческих наборов реагентов, предназначенного для этих целей, например, методом сорбции на силикагелевом носителе с помощью набора реагентов "РИБО-сорб" (Интерлабсервис, Москва) или методом сорбции на магнитной силике с помощью комплекта реагентов "Магно-сорб" (Интерлабсервис, Москва). Далее суммарную РНК использовали в реакции обратной транскрипции для синтеза кДНК с использованием набора реагентов, предназначенного для этих целей, например, "РЕВЕРТА-L-100" (Интерлабсервис, Москва). Далее полученная кДНК использовалась в качестве матрицы при постановке реакции "полувложенной" ПЦР. Для проведения первого раунда "полувложенной" ПЦР готовили 25 мкл реакционной смеси, включающей: 2 ед. ДНК-полимеразы, 0,2 mM смесь dNTP, 5 pmol праймера 5' TCCTCCGGCCCCTGAATG 3', 20 pmol праймера 5' GGIARYTTCCAIYACCAICC 3', реакционный буфер (67 mM Трис-HCl (pH 8,3), 2,0 mM MgCl2) и 10 мкл кДНК. ПЦР проводили по следующей схеме: 1 цикл - 95°С - 5 минут; 42 цикла - 95°С - 20 секунд, 55°С - 1,5 минуты, 72°С - 40 секунд; и заключительный цикл - 72°С - 5 минут. Во втором раунде "полувложенной" ПЦР использовали аналогичную реакционную смесь с праймерами 5' TACTTTGGGTGTCCGTGTTTC 3' (5 pmol) и 5' GGIARYTTCCAIYACCAICC 3' (20 pmol), и 1 мкл амплификата, полученного в предыдущей реакции. Схема проведения второго раунда: 1 цикл - 95°С - 5 минут; 30 циклов - 95°С - 20 секунд, 58 гр. С - 1 минута, 72°С - 40 секунд; 1 цикл - 72°С - 5 минут. Для анализа продуктов амплификации использовали электрофорез в 2% агарозном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием (0,5 мг/мл) и детекцией в ультрафиолетовом трансиллюминаторе. Секвенирование ампликонов проводили по прямой и обратной последовательности с праймерами 5' TACTTTGGGTGTCCGTGTTTC 3' (для прямой последовательности) и 5' GGIARYTTCCAIYACCAICC 3' (для обратной последовательности) на автоматическом генетическом анализаторе 3130 Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific, США), следуя рекомендациям производителя. Выравнивание последовательностей нуклеотидов и аминокислот, а также филогенетический и молекулярно-эволюционный анализ и статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы MEGA, версия 3.1 (Kumar S. et al.). Генотипирование обнаруженных энтеровирусов проводили с помощью программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) методом сравнительного анализа последовательностей, полученных после секвенирования ампликонов, с последовательностями геномов энтеровирусов из международной базы генетических данных NCBI GenBank.
Способ разработан и апробирован в лаборатории энтеральных вирусных инфекций ФБУН "Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций" Роспотребнадзора.
Литература
1. Zell R., Delwart E., Gorbalenya A.E. et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Picornaviridae. J. Gen. Virol. 2017, 98(10): 2421-2422.
2. Rotbart H.A., Hayden F.G. Picornavirus infections: a primer for the practitioner. Arch Fam Med 2000; 9: 913 - 8.
3. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics. 2004 (5): 150-163.
4. Arola A, Santti J, Ruuskanen O, Halonen P, Hyypiä T. Identification of enteroviruses in clinical specimens by competitive PCR followed by genetic typing using sequence analysis. J Clin Microbiol. 1996 Feb;34(2):313-8.