ПРОИЗВОДНЫЕ ПИРИМИДИЛАМИНОБЕНЗАМИДА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СИНДРОМА ГИПЕРЭОЗИНОФИЛИИ
PYRIMIDYLAMINOBENZAMIDE DERIVATIVES FOR TREATMENT OF HYPER-EOSINOPHILIA

Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к применению производных пиримидиламинобензамида для лечения миелопролиферативных заболеваний, вызванных TEL-PDGFRβ или FIP1L1-PDGFRα, к получению лекарственных средств, предназначенных для лечения миелопролиферативных заболеваний, вызванных TEL-PDGFRβ или FIP1L1-PDGFRα, и к способу лечения теплокровных животных, включая человека, причем производные пиримидиламинобензамида вводят теплокровным животным, страдающим от миелопролиферативных заболеваний, вызванных TEL-PDGFRβ или FIP1L1-PDGFRα, прежде всего от миеломоноцитарного лейкоза, синдрома гиперэозинофилии и хронического эозинофильного лейкоза, и прежде всего синдрома гиперэозинофилии, устойчивого к иматинибу, или миеломоноцитарного лейкоза, устойчивого к иматинибу.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения миеломоноцитарного лейкоза, синдрома гиперэозинофилии, хронического эозинофильного лейкоза и синдрома гиперэозинофилии, устойчивого к иматинибу, или других заболеваний, ассоциированных с TEL-PDGFRβ, FIP1L1-PDGFRα или с аналогичными мутантами, активирующими PDGFR.
Предпосылки создания настоящего изобретения
Гибридная киназа TEL-PDGFRβ ассоциирована с хроническим моноцитарным миелолейкозом (CMML), который является миелопролиферативным нарушением, характеризующимся аномальным миелопоэзом, эозинофилией, миелофиброзом, и который в большинстве случаев прогрессирует с развитием острого миелолейкоза.
Гибридная киназа FIP1L1-PDGFRα ассоциирована с гиперэозинофильным синдромом (HES) или хроническим эозинофильным лейкозом (CEL), и является клональным миелопролиферативным нарушением, связанным с превалирующей эозинофилией крови и повреждением органов.
В настоящее время было установлено, что производные пиримидиламинобензамида проявляют активность против клинических форм гибридных киназ TEL-PDGFRβ и FIP1L1-PDGFRα, которые связаны с миелопролиферативными заболеваниями CMML и HES, соответственно. Более того, такие производные пиримидиламинобензамида проявляют эффективность против миелопролиферативных заболеваний, вызванных TEL-PDGFRβ и/или FIP1L1-PDGFRα. Производные пиримидиламинобензамида с высокой эффективностью подавляют рост клеток Ba/F3, трансформированных обеими гибридными киназами, и могут ингибировать фосфорилирование остатков тирозина в указанных гибридных киназах, а также активацию их сигнальных мишеней. Производные пиримидиламинобензамида провляют также эффективность in vitro в отношении устойчивой к иматинибу мутации T681I в последовательности TEL-PDGFRβ. Указанная аминокислотная замена соответствует T315I в последовательности киназы BCR-ABL, которая придает пациентам устойчивость к иматинибу, при лечении которых возникают значительные проблемы. Иматиниб (международное непатентованное название) является ингибитором тирозинкиназ и выпускается под торговым названием GLEEVEC в США и GLIVEC в Европе.
В настоящее время установлено, что производные пиримидиламинобензамида можно использовать для лечения миелопролиферативных нарушений, опосредованных TEL-PDGFRβ- или FIP1L1-PDGFRα, прежде всего для лечебного и/или профилактического действия при лечении миеломоноцитарного лейкоза, гиперэозинофильного синдрома, хронического эозинофильного лейкоза и гиперэозинофильного синдрома, устойчивых к иматинибу.
Краткое описание сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к применению соединений пиримидиламинобензамида формулы (I)
где
1
R означает водород, (низш.)алкил, (низш.)алкокси(низш.)алкил, ацилокси(низш.)алкил, карбокси(низш.)алкил, (низш.)алкоксикарбонил(низш.)алкил или фенил(низш.)алкил,
2
3
R означает водород, (низш.)алкил, необязательно замещенный одним или более одинаковых или различных радикалов R, циклоалкил, бензоциклоалкил, гетероциклил, арильную группу или моно- или бициклическую гетероарильную группу, не содержащую или содержащую один, два или три атома азота в цикле и не содержащую или содержащую один атом кислорода и не содержащую или содержащую один атом серы, причем группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными,
3
R означает гидрокси, (низш.)алкокси, ацилокси, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, карбамоил, N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил, амино, моно- или дизамещенный амино, циклоалкил, гетероциклил, арильную группу или моно- или бициклическую гетероарильную группу, не содержащую или содержащую один, два или три атома азота в цикле и не содержащую или содержащую один атом кислорода и не содержащую или содержащую один атом серы, причем группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными,
1
2
или где R и R вместе означают алкилен, содержащий четыре, пять или шесть атомов углерода, необязательно моно- или дизамещенный группами: (низш.)алкил, циклоалкил, гетероциклил, фенил, гидрокси, (низш.)алкокси, амино, моно- или дизамещенный амино, оксо, пиридил, пиразинил или пиримидинил; означают бензалкилен, содержащий четыре или пять атомов углерода, оксаалкилен, содержащий один атом кислорода и три или четыре атома углерода, или азаалкилен, содержащий один атом азота и три или четыре атома углерода, причем атом азота незамещен или замещен группами: (низш.)алкил, фенил(низш.)алкил, (низш.)алкоксикарбонил(низш.)алкил, карбокси(низш.)алкил, карбамоил(низш.)алкил, N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил(низш.)алкил, циклоалкил, (низш.)алкоксикарбонил, карбокси, фенил, замещенный фенил, пиридинил, пиримидинил или пиразинил,
4
R означает водород, (низш.)алкил или галоген,
и N-оксида или фармацевтически приемлемой соли такого соединения для получения фармацевтической композиции, предназначенной для лечения миелопролиферативных заболеваний, вызванных FIP1L1-PDGFRα или TEL-PDGFRβ, прежде всего для лечения или профилактики миеломоноцитарного лейкоза, синдрома гиперэозинофилии, хронического эозинофильного лейкоза и синдрома гиперэозинофилии, устойчивого к иматинибу, или миеломоноцитарного лейкоза, устойчивого к иматинибу. Настоящее изобретение также относится к применению соединений формулы I для лечения или профилактики миелопролиферативных заболеваний, вызванных FIP1L1-PDGFRα или TEL-PDGFRβ, прежде всего для лечения или профилактики миеломоноцитарного лейкоза, синдрома гиперэозинофилии, хронического эозинофильного лейкоза и синдрома гиперэозинофилии, устойчивого к иматинибу, или миеломоноцитарного лейкоза, устойчивого к иматинибу.
Общие термины, использованные в данном контексте, имеют следующие значения, если не указано иное.
Термин «низш.» означает радикал, содержащий до 7, прежде всего до 4 атомов углерода, с прямой или разветвленной цепью, с одним или несколькими разветвлениями.
При использовании множественного числа соединений, солей и т.п. подразумевается также единственное число.
Любой асимметрический атом углерода существует в (R)-, (S)- или (R, S)-конфигурации, предпочтительно в (R)- или (S)-конфигурации. Соединения существуют в виде смеси изомеров или в виде чистых изомеров, предпочтительно энантиомерно чистых диастереомеров.
Настоящее изобретение также относится к возможным таутомерам соединений формулы I.
(Низш.)алкил предпочтительно означает алкил, содержащий от 1 до 7, предпочтительно от 1 до 4 атомов, с прямой или разветвленной цепью, предпочтительный (низш.)алкил означает бутил, такой как н-бутил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, пропил, такой как н-пропил или изопропил, этил или метил. Предпочтительный (низш.)алкил означает метил, пропил или трет-бутил.
(Низш.)ацил предпочтительно означает формил или (низш.)алкилкарбонил, прежде всего ацетил.
2
Арил означает ароматический радикал, связанный с молекулой через ароматический атом углерода в цикле. Предпочтительный арил означает ароматический радикал, содержащий от 6 до 14 атомов углерода, прежде всего фенил, нафтил, тетрагидронафтил, флуоренил или фенантренил, арил незамещен или замещен одним или более, предпочтительно одним-тремя, прежде всего одним или двумя заместителями, прежде всего выбранными из группы, включающей амино, моно- или дизамещенный амино, галоген, (низш.)алкил, замещенный (низш.)алкил, (низш.)алкенил, (низш.)алкинил, фенил, гидрокси, гидрокси в виде простого или сложного эфира, нитро, циано, карбокси, этерифицированный карбокси, алканоил, бензоил, карбамоил, N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил, амидино, гуанидино, уреидо, меркапто, сульфо, (низш.)алкилтио, фенилтио, фенил(низш.)алкилтио, (низш.)алкилфенилтио, (низш.)алкилсульфинил, фенилсульфинил, фенил(низш.)алкилсульфинил, (низш.)алкилфенилсульфинил, (низш.)алкилсульфонил, фенилсульфонил, фенил(низш.)алкилсульфонил, (низш.)алкилфенилсульфонил, галоген(низш.)алкилмеркапто, галоген(низш.)алкилсульфонил, такой как прежде всего трифторметансульфонил, дигидроксибора (-В(ОН)), гетероциклил, моно- или бициклическая гетероарильная группа и (низш.)алкилендиокси, связанный с соседними атомами углерода в цикле, такой как метилендиокси. Арил более предпочтительно означает фенил, нафтил или тетрагидронафтил, который в каждом случае незамещен или независимо замещен одним или двумя заместителями, выбранными из группы, включающей галоген, прежде всего фтор, хлор или бром, гидрокси, гидрокси, этерифицированный группами (низш.)алкил, например, метил, галоген(низш.)алкил, например, трифторметил, или фенил, арил означает также (низш.)алкилендиокси, связанный с двумя соседними атомами углерода в цикле, такой как метилендиокси, (низш.)алкил, например, метил или пропил, галоген(низш.)алкил, например, трифторметил, гидрокси(низш.)алкил, например, гидроксиметил или 2-гидрокси-2-пропил, (низш.)алкокси(низш.)алкил, например, метоксиметил или 2-метоксиэтил, (низш.)алкоксикарбонил(низш.)алкил, например, метоксикарбонилметил, (низш.)алкинил, такой как 1-пропинил, этерифицированный карбокси, прежде всего (низш.)алкоксикарбонил, например, метоксикарбонил, н-пропоксикарбонил или изопропоксикарбонил, N-монозамещенный карбамоил, прежде всего карбамоил, монозамещенный группой (низш.)алкил, например, метил, н-пропил или изопропил, амино, (низш.)алкиламино, например, метиламино, ди(низш.)алкиламино, например, диметиламино или диэтиламино, (низш.)алкиленамино, например, пирролидино или пиперидино, (низш.)оксаалкиленамино, например, морфолино, (низш.)азаалкиленамино, например, пиперазино, ациламино, например, ацетиламино или бензоиламино, (низш.)алкилсульфонил, например, метилсульфонил, сульфамоил или фенилсульфонил.
Циклоалкил предпочтительно означает циклопропил, циклопентил, циклогексил или циклогептил, причем циклоалкил незамещен или замещен одним или более, прежде всего одним или двумя заместителями, выбранными из группы, указанной выше для заместителей арила, наиболее предпочтительно следующими группами: (низш.)алкил, такой как метил, (низш.)алкокси, такой как метокси или этокси, или гидрокси, а также оксо или конденсированный бензольный цикл, такой как бензоциклопентил или бензоциклогексил.
Замещенный алкил означает алкил, как указано выше, прежде всего (низш.)алкил, предпочтительно метил, причем один или более, прежде всего один-три заместителя выбирают в основном из группы, включающей галоген, прежде всего фтор, амино, N-(низш.)алкиламино, N,N-ди(низш.)алкиламино, N-(низш.)алканоилмино, гидрокси, циано, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил и фенил(низш.)алкоксикарбонил. Прежде всего предпочтителен трифторметил.
Моно- или дизамещенный амино прежде всего означает группу амино, замещенную одним или двумя радикалами, независимо выбранными из группы, включающей (низш.)алкил, такой как метил, гидрокси(низш.)алкил, такой как 2-гидроксиэтил, (низш.)алкокси(низш.)алкил, такой как метоксиэтил, фенил(низш.)алкил, такой как бензил или 2-фенилэтил, (низш.)алканоил, такой как ацетил, бензоил, замещенный бензоил, причем фенил прежде всего замещен одним или более, прежде всего одним или двумя заместителями, выбранными из группы, включающей нитро, амино, галоген, N-(низш.)алкиламино, N,N-ди(низш.)алкиламино, гидрокси, циано, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил и карбамоил, и фенил(низш.)алкоксикарбонил, причем фенил незамещен или прежде всего замещен одним или более, прежде всего одним или двумя заместителями, выбранными из группы, включающей нитро, амино, галоген, N-(низш.)алкиламино, N,N-ди(низш.)алкиламино, гидрокси, циано, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил и карбамоил, и предпочтительно N-(низш.)алкиламино, такой как N-метиламино, гидрокси(низш.)алкиламино, такой как 2-гидроксиэтиламино или 2-гидроксипропил, (низш.)алкокси(низш.)алкил, такой как метоксиэтил, фенил(низш.)алкиламино, такой как бензиламино, N,N-ди(низш.)алкиламино, N-фенил(низш.)алкил-N-(низш.)алкиламино, N,N-ди(низш.)алкилфениламино, (низш.)алканоиламино, такой как ацетиламино, или заместитель выбирают из группы, включающей бензоиламино и фенил(низш.)алкоксикарбониламино, причем фенил в каждом случае незамещен или прежде всего замещен группами нитро или амино, или также галоген, амино, N-(низш.)алкиламино, N,N-ди(низш.)алкиламино, гидрокси, циано, карбокси, (низш.)алкоксикарбонил, (низш.)алканоил, карбамоил или аминокарбониламино. Дизамещенный амино также означает (низш.)алкиленамино, например, пирролидино, 2-оксопирролидино или пиперидино, (низш.)оксаалкиленамино, например, морфолино, или (низш.)азаалкиленамино, например, пиперазино или N-замещенный пиперазино, такой как N-метилпиперазино или N-метоксикарбонилпиперазино.
Галоген прежде всего означает фтор, хлор, бром или иод, прежде всего фтор, хлор или бром.
8
20
Этерифицированный гидрокси (в виде простого эфира) прежде всего означает С-Салкилокси, такой как н-децилокси, (низш.)алкокси (предпочтительный), такой как метокси, этокси, изопропилокси или трет-бутилокси, фенил(низш.)алкокси, такой как бензилокси, фенилокси, галоген(низш.)алкокси, такой как трифторметокси, 2,2,2-трифторэтокси или 1,1,2,2-тетрафторэтокси, или (низш.)алкокси, который замещен моно- или бициклическим гетероарилом, содержащим один или два атома азота, предпочтительно (низш.)алкокси, который замещен имидазолилом, таким как 1Н-имидазол-1-ил, пирролил, бензимидазолил, такой как 1-бензимидазолил, пиридил, прежде всего 2-, 3- или 4-пиридил, пиримидинил, прежде всего 2-пиримидинил, пиразинил, изохинолинил, прежде всего 3-изохинолинил, хинолинил, индолил или тиазолил.
Этерифицированный гидрокси (в виде сложного эфира) прежде всего означает (низш.)алканоилокси, бензоилокси, (низш.)алкоксикарбонилокси, такой как трет-бутоксикарбонилокси или фенил(низш.)алкоксикарбонилокси, такой как бензилоксикарбонилокси.
Этерифицированный карбокси (в виде сложного эфира) прежде всего означает (низш.)алкоксикарбонил, такой как трет-бутоксикарбонил, изопропоксикарбонил, метоксикарбонил или этоксикарбонил, фенил(низш.)алкоксикарбонил или фенилоксикарбонил.
Алканоил в основном означает алкилкарбонил, прежде всего (низш.)алканоил, например, ацетил.
N-моно- или N,N-дизамещенный карбамоил прежде всего замещен одним или двумя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей (низш.)алкил, фенил(низш.)алкил и гидрокси(низш.)алкил, или (низш.)алкилен, окса(низш.)алкилен или аза(низш.)алкилен, необязательно замещенный по концевому атому азота.
Моно- или бициклическая гетероарильная группа, не содержащая или содержащая 1, 2 или 3 атома азота в цикле, а также не содержащая или содержащая 1 атом кислорода и не содержащая или содержащая 1 атом серы, причем группы в каждом случае являются незамещенными или моно- или полизамещенными, означает гетероциклический остаток, который является ненасыщенным и связывает гетероарильный радикал с молекулой формулы I, и предпочтительно означает цикл, причем в связующем цикле, но необязательно в любом конденсированном цикле, по крайней мере один атом углерода заменен на гетероатом, выбранный из группы, включающей азот, кислород и серу, причем связующий цикл предпочтительно содержит 5-12, более предпочтительно 5 или 6 атомов в цикле и является незамещенным или замещенным одним или более, прежде всего одним или двумя заместителями, выбранными из группы, указанной выше для заместителей арила, наиболее предпочтительно включающей (низш.)алкил, такой как метил, (низш.)алкокси, такой как метокси или этокси, или гидрокси. Предпочтительно моно- или бициклическую гетероарильную группу выбирают из следующих групп: 2Н-пирролил, пирролил, имидазолил, бензимидазолил, пиразолил, индазолил, пуринил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, 4Н-хинолизинил, изохинолил, хинолил, фталазинил, нафтиридинил, хиноксалил, хиназолинил, хиннолинил, птеридинил, индолизинил, 3Н-индолил, индолил, изоиндолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, триазолил, тетразолил, фуразанил, бензо[d]пиразолил, тиенил и фуранил. Более предпочтительно моно-или бициклическую гетероарильную группу выбирают из группы, включающей пирролил, имидазолил, такой как 1H-имидазол-1-ил, бензимидазолил, такой как 1-бензимидазолил, индазолил, прежде всего 5-индазолил, пиридил, прежде всего 2-, 3- или 4-пиридил, пиримидинил, прежде всего 2-пиримидинил, пиразинил, изохинолинил, прежде всего 3-изохинолинил, хинолинил, прежде всего 4- или 8-хинолинил, индолил, прежде всего 3-индолил, тиазолил, бензо[d] пиразолил, тиенил и фуранил. В одном предпочтительном варианте настоящего изобретения пиридил замещен группой гидрокси в ортоположении по атому азота и следовательно существует по крайней мере частично в форме соответствующего таутомера пиридин-(1Н)2-она. В другом предпочтительном варианте настоящего изобретения пиримидинил замещен группой гидрокси в положениях 2 и 4 и следовательно существует в нескольких таутомерных формах, например, в форме пиримидин-(1Н,3Н)2,4-диона.
Гетероциклил прежде всего означает 5-, 6- или 7-членную гетероциклическую систему, содержащую один или два гетероатома, выбранные из группы, включающей азот, кислород и серу, причем система является ненасыщенной или полностью или частично насыщенной, незамещенной или замещенной прежде всего следующими группами: (низш.)алкил, такой как метил, фенил(низш.)алкил, такой как бензил, оксо или гетероарил, такой как 2-пиперазинил, гетероциклил прежде всего означает 2- или 3-пирролидинил, 2-оксо-5-пиролидинил, пиперидинил, N-бензил-4-пиперидинил, N-(низш.)алкил-4-пиперидинил, N-(низш.)алкилпиперазинил, морфолинил, например, 2- или 3-морфолинил, 2-оксо-1Н-азепин-3-ил, 2-тетрагидрофуранил или 2-метил-1,3-диоксолан-2-ил.
Соли прежде всего означают фармацевтически приемлемые соли соединений формулы I.
В качестве солей используют, например, кислотно-аддитивные соли, предпочтительно органических или неорганических кислот и соединений формулы I, содержащих основный атом азота, прежде всего фармацевтически приемлемые соли. Пригодные неорганические кислоты включают, например, галогенводородные кислоты, такие как хлористо-водородная кислота, серная кислота или фосфорная кислота. Пригодные органические кислоты включают, например, карбоновые, фосфоновые, сульфоновые или сульфаминовые кислоты, такие как, например, уксусная кислота, пропионовая кислота, октановая кислота, декановая кислота, додекановая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, фумаровая кислота, янтарная кислота, адипиновая кислота, пимелиновая кислота, субериновая кислота, азелаиновая кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, аминокислоты, такие как глютаминовая кислота или аспарагиновая кислота, малеиновая кислота, гидроксималеиновая кислота, метилмалеиновая кислота, циклогексанкарбоновая кислота, адамантанкарбоновая; кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, фталевая кислота, фенилуксусная кислота, миндальная кислота, коричная кислота, метан- или этансульфокислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, этан-1,2-дисульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 1,5-нафталиндисульфоновая кислота, 2-, 3- или 4-метилбензолсульфоновая кислота, метилсерная кислота, этилсерная кислота, додецилсерная кислота, N-циклогексилсульфаминовая кислота, N-метил-, N-этил- или N-пропилсульфаминовая кислота, или другие органические протонные кислоты, такие как аскорбиновая кислота.
В присутствии отрицательно заряженных радикалов, таких как карбокси или сульфо, образуются также соли оснований, например, соли металлов или аммония, такие как соли щелочных или щелочно-земельных металлов, например, натрия, калия, магния или кальция, или соли аммония или пригодных органических аминов, таких как третичные моноамины, например, триэтиламина или три(2-гидроксиэтил)амина, или гетероциклических оснований, например, N-этилпиперидина или N,N'-диметилпиперазина.
Если основная и кислотная группы присутствуют в одной молекуле, соединение формулы I образует внутренние соли.
Для выделения или очистки соединений применяют также фармацевтически неприемлемые соли, например, пикраты или перхлораты. Для терапевтического применения пригодны только фармацевтически приемлемые соли или свободные соединения (если их можно использовать в виде фармацевтических препаратов), которые являются предпочтительными.
В связи с родственной структурой новых соединений в свободной форме и в форме их солей, указанные соли можно применять в качестве промежуточных соединений, например, для очистки или идентификации новых соединений, и любые ссылки на свободные соединения в данном контексте относятся также к соответствующим солям.
Соединения, включенные в объем формулы I и способ их получения описаны в заявке WO 04/005281, опубликованной 15 января 2004 года, которая включена в объем настоящей заявки в качестве ссылки. Предпочтительное соединение означает 4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]-N-[5-(4-метил-1Н-имидазол-1-ил)-3-(трифторметил)фенил]бензамид и N-оксид и фармацевтически приемлемые соли формулы (II)
В каждом случае при ссылке на патентные заявки или научные публикации прежде всего при описании соединений формулы I, предмет в отношении конечных продуктов, фармацевтических препаратов и пунктов формулы изобретения включен в настоящую заявку со ссылкой на указанные публикации.
Структуру активных агентов, определенную кодовыми, общими и торговыми названиями, можно найти в текущем издании справочника "The Merk Index" или в базе данных (например. Patents International (например, IMS World Publications). Соответствующее содержание включено в настоящее описание в качестве ссылок.
В настоящее время было неожиданно установлено, что соединения формулы I характеризуются терапевтическими свойствами, которые позволяют их использовать прежде всего в качестве ингибитора PDGFRα (тромбоцитарного фактора роста или также сокращенно PDGRA) и прежде всего для лечения и профилактики заболеваний, опосредованных TEL-PDGFRβ- или FIP1L1-PDGFRα, таких как HES, CEL и HES, устойчивый к иматинибу.
Сокращение FIP1L1-PDGFRα, использованное в настоящем контексте, означает продукт слияния генов FIP1L1 (FIP1, подобный1) и PDGFRα. Сокращение TEL-PDGFRβ, использованное в настоящем контексте, означает продукт слияния генов TEL и PDGFRβ.
Соединение (II) ингибирует клетки Ba/F3, трансформированные TEL-PDGFRβ, и эффективно ингибирует автофосфорилирование тирозина в TEL-PDGFRβ, а также фосфорилирование известного сигнального промежуточного производного PDGFRβ, включая PLCγ и PI3K. Соединение (II) ингибирует также клетки Ba/F3, трансформированные мутированной формой TEL-PDGFRβ Т6811, которая является гомологичной мутации Т3151 в последовательности BCR-ABL и соответствует устойчивости к иматинибу.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению соединений формулы (I) для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения миелопролиферативных заболеваний, опосредованных FIP1L1-PDGFRα или TEL-PDGFRβ, или других заболеваний, связанных с FIP1L1-PDGFRα- или TEL-PDGFRβ или с аналогичными мутациями, активирующими PDGFR.
Термин «миелопролиферативное заболевание, опосредованное FIP1L1-PDGFRα», использованный в данном контексте, включает, без ограничения перечисленным, хронический эозинофильный лейкоз, гиперэозинофильный синдром и гиперэозинофильный синдром, устойчивый к иматинибу. Указанный термин прежде всего включает заболевания, вызванные мутацией FIP1L1-PDGFRα, прежде всего мутацией FIP1L1-PDGFRαT674I.
Настоящее изобретение прежде всего относится к применению соединений формулы (I) для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения миеломоноцитарного лейкоза, хронического эозинофильного лейкоза, гиперэозинофильного синдрома CMML, гиперэозинофильного синдрома, устойчивого к иматинибу, и миеломоноцитарного лейкоза, устойчивого к иматинибу.
В другом варианте осуществления изобретения предлагается способ лечения миелопролиферативного заболевания, опосредованного FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ, который заключается в том, что млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, вводят терапевтически эффективное количество соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей или пролекарств.
В настоящем изобретении предпочтительно предлагается способ лечения млекопитающих, прежде всего человека, страдающих от миелопролиферативного заболевания, опосредованного FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ, который заключается в том, что млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении, вводят количество 4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]-N-[5-(4-метил-1Н-имидазол-1-ил)-3-(трифторметил)фенил]бензамида, соединения (II), или его фармацевтически приемлемой соли, ингибирующее FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ.
Указанный способ предпочтительно используют для лечения миелопролиферативного заболевания, опосредованного FIP1L1-PDGFRα.
Более предпочтительно указанный способ используют для лечения гиперэозинофильного синдрома или гиперэозинофильного синдрома, устойчивого к иматинибу.
В другом варианте осуществления изобретения предлагается применение соединений формулы (I) для получения фармацевтической композиции, предназначенной для применения при лечении миелопролиферативного заболевания, опосредованного FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ, более предпочтительно при лечении миеломоноцитарного лейкоза, хронического эозинофильного лейкоза, гиперэозинофильного синдрома или гиперэозинофильного синдрома, устойчивого к иматинибу.
Термин «лечение», использованный в настоящем описании, включает профилактическое или лечебное действие, а также лечебное или подавляющее заболевание действие, включая лечение пациентов группы риска, предрасположенных к заболеванию или у которых предполагается предрасположенность к заболеванию, так же как и страдающих от заболевания пациентов. Указанный термин кроме того включает лечение с целью замедления прогрессирования заболевания.
Термин «лечебный», использованный в настоящем контексте, означает эффективность действия при лечении развивающихся эпизодов, включающих миелопролиферативные заболевания, опосредованные FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ.
Термин «профилактический» означает предупреждение развития или рецидива заболеваний, включая миелопролиферативные заболевания, опосредованные FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ.
Термин «замедление прогрессирования», использованный в данном контексте, означает введение активного соединение пациентам, которые находятся в предварительной стадии или на ранней стадии заболевания, предназначенного для лечения, причем, например, указанным пациентам установлен диагноз предварительной стадии заболевания или указанные пациенты находятся в состоянии, например, проходят курс лечения, или в состоянии после несчастного случая, когда существует риск развития соответствующего заболеваниия.
Указанный непредсказуемый диапазон свойств означает, что применение соединений формулы (I) представляет особый интерес в области получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний, включая миелопролиферативные заболевания, опосредованные FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ.
Указанное действие прежде всего имеет значение в клинике при лечении пациентов, страдающих от гиперэозинофильного синдрома или гиперэозинофильного синдрома, устойчивого к иматинибу.
Чтобы подтвердить возможность применения соединений формулы (I) прежде всего для лечения миелопролиферативных заболеваний, опосредованных FIP1L1-PDGFRα или TEL-PDGFRβ, с высоким терапевтическим индексом и другими преимуществами, проводят клинические испытания известным способом.
Точная дозировка соединений формулы (I), используемых для ингибирования активности FIP1L1-PDGFRα или TEL-PDGFRβ или для лечения миелопролиферативных заболеваний, опосредованных FIP1L1-PDGFRα или TEL-PDGFRβ, зависит от множества факторов, включая организм хозяина, природу и тяжесть состояния, подлежащего лечению, способа введения. Соединение формулы (I) можно вводить любым способом, включая пероральный, парентеральный, например, внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутриопухолевый или ректальный или энтеральный способы. Предпочтительно соединение формулы (I) вводят перорально, предпочтительно в суточной дозе 1-300 мг/кг массы тела или для самых крупных приматов в суточной дозе 50-5000, предпочтительно 500-3000 мг. Предпочтительная пероральная суточная доза составляет 1-75 мг/кг массы тела или для наиболее крупных приматов суточная доза составляет 10-2000 мг, причем соединение вводят в виде однократной дозы или разделенных доз, например два раза в сутки.
Обычно сначала вводят небольшую дозу и затем постепенно ее повышают до достижения оптимальной дозы для данного организма хозяина в ходе определенного курса лечения. Верхний предел дозы определяется побочными действиями и его определяют при испытаниях на организме хозяина, проходящего курс лечения.
Соединения формулы (I) можно смешивать с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями и необязательно с одним или более другими стандартными фармацевтиескими адьювантами и вводить их энтерально, например, перорально, в форме таблеток, капсул, микротаблеток и т.п. или парентерально, например, внутрибрюшинно или внутривенно, в форме стерильных инъекционных растворов или суспензий. Энтеральные и парентеральные композиции получают по стандартным методикам.
Соединения формулы (I) можно использовать в отдельности или совместно по крайней мере с одним другим фармацевтически активным соединением, предназначенным для лечения указанных заболеваний. Указанные активные соединения можно включать в один и тот же фармацевтический препарат или включать в «набор компонентов», и в этом случае компоненты комбинации можно вводить независимо или при использовании различных фиксированных комбинаций, содержащих различное количество компонентов комбинации, то есть одновременно или через различные периоды времени. Компоненты «набора компонентов», например, можно вводить одновременно или поочередно, то есть в различные периоды времени с равными или различными интервалами для каждого компонента набора. Примеры соединений, без ограничения перечисленным, которые можно использовать в комбинации с соединениями формулы (I), включают цитотоксические химиотерапевтические лекарственные средства, такие как цитозинарабинозид, даунорубицин, доксорубицин, циклофосфамид, VP-16 или иматиниб и т.п. Кроме того, соединения формулы (I) можно использовать в комбинации с другими ингибиторами передачи сигнала или другими лекарственными средствами для доставки в онкоген-мишень, чтобы по возможности обеспечить значительное синергетическое действие.
Настоящее изобретение относится также к комбинации соединений формулы (I), описанных в данном контексте, с иматинибом для лечения описанных в данном контексте заболеваний и состояний. Такие комбинации можно вводить в одно и то же время, например, в форме фиксированных, комбинированных фармацевтических композиции или препарата, или последовательно, или поочередно через определенные промежутки времени. В настоящее время предпочтительно вводить соединения формулы (I) в виде лекарственной формы, описанной выше, и иматиниб в виде коммерческого препарата GLEEVEC или в Европе US/GLIVEC в известном для таких лекарственных форм диапазоне доз.
Лечение миелопролиферативных заболеваний, опосредованных FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ, описанной выше комбинацией может включать так называемое первичное лечение, то есть лечение пациента с недавно установленным диагнозом без предварительного курса химиотерапии, или так называемое вторичное лечение, то есть лечение заболевания после предварительного курса лечения иматинибом или соединениями формулы (I) в зависимости от тяжести или стадии заболевания, а также в зависимости от общего состояния пациента и т.п.
Эффективность соединений формулы (I) при лечении миелопролиферативных заболеваний, опосредованных FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ, оценивают по результатам испытаний, описанных в следующих примерах, которые только иллюстрируют изобретение и не ограничивают его объем.
Конструкции
Последовательности TEL-PDGFRβ [Т/Р], FIP1L1-PDGFRα [F/P] и FIP1L1-PDGFRα T674I клонировали в MSCV-IRES-GFP [MSCV-GFP], а последовательности TEL-PDGFRβ, TEL-PDGFRβ T681I и TEL-FGFR3 [T/F] клонировали в MSCV-неомицин [MSCV-neo]. Мутантную замену D842V включали в кДНК PDGFRA дикого типа и клонировали в MSCV-пуромицин [MSCV-puro].
Клеточная культура, продуцирование ретровируса и трансдукция клеток Ba/F3
Клетки 293Т культивировали в модифицированной среде Дубелько-Игла (DMEM) + 10% эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС). Клетки Ba/F3 культивировали в среде RPMI+10% ЭТС+1 нг/мл мышиный интерлейкин (IL-3). Супернатанты ретровируса собирали и использовали для трансдукции клеток Ba/F3. Клеточные линии Т/Р MSCV-neo и T/F MSCV-neo отбирали при инкубации в присутствии 1 мг/мл G418 и IL-3 в течение 8-10 сут. Клеточные линии F/P MSCV-GFP отбирали при инкубации в среде RPMI в отсутствии IL-3 в течение 7-10 сут. Клеточные линии PDGFRα D842V MSCV-puro отбирали при инкубации в присутствии 2 мкг/мл пуромицина в течение 7-14 сут. Трансформированные клетки Ba/F3 культивировали в среде RPMI в отсутствии IL-3.
Анализ независимой от IL-3 пролиферации клеток
Действие соединений на жизнеспособность и пролиферацию клеток оценивали с использованием набора для люминесцентного анализа АТФ ATPLife фирмы Perkin Elmer Life Science (№по каталогу 6016947) по методике фирмы-производителя. Указанный анализ основан на испускании света (люминесценции) в результате реакции АТФ с добавленными люциферазой и D-люциферином.
2
Клеточные линии Ba/F3 FIP-PDGFRα и Ba/F3 TEL-PDGFRβ, культивированные в суспензии RPMI 1640 (Invitromex, номер по каталогу L0501), 10% ЭТС (Amimed, номер по каталогу 2-01F86-I), 2 мМ L-глютамин (Gibco), высеивали в лунки 96-луночного планшета черного цвета (Packard) при плотности 10000 клеток в лунке в 50 мкл полной среды, затем немедленно добавляли по 50 мкл двукратных серийных разведений концентрированного раствора соединений (2х, в двойном повторе). В качестве контроля использовали клетки в отсутствии соединения, а для определения фонового сигнала использовали среду в отсутствии клеток. Через 70 ч инкубации (37°С, 5% СО) клетки лизировали при добавлении 50 мкл в лунку раствора для лизиса клеток млекопитающих (влючен в состав набора) и встряхивании в течение 5 мин на качалке для планшет при 700 об/мин. Затем добавляли по 50 мкл раствора субстрата (люцифераза и D-люциферин), встряхивали в течение 5 мин и планшеты выдерживали в темноте в течение 10 мин, затем измеряли испускание света на приборе Packard TopCount.
Активность соединений определяли по общему подавлению роста (TGI) клеточных культур, которую определяли следующим образом: после вычитания фонового сигнала полученную величину сигнала контрольных клеток принимали за 100%, и действие соединения выражали в процентах снижения контрольного сигнала. Величину TGI50 определяли по кривой зависимости ответной реакции от дозы методом графической экстраполяции.
Соединение (II) подавляет пролиферацию клеток Ba/F3 FIP-PDGFRα и Ba/F3 Tel-PDGFRR, а величина IC50 составляет <100 нМ.
Мутация T315I в последовательности BCR-ABL придает устойчивость к иматинибу и указанная мутантная форма не ингибируется ни одним из известных низкомолекулярных ингибиторов тирозинкиназ. Гомологичной мутацией в последовательности Tel-PDGFRβ является замена T681I, которая также придает устойчивость к иматинибу. Соединение (II) подавляет рост клеток Ba/F3, трансформированных мутантом Tel-PDGFRβ T681I, величина IC50 составляет <25 нМ аналогично немутированной форме гибридной последовательности Tel-PDGFRβ.
Анализ методом вестерн-блоттинга
2
3
4
Для F/P: клетки Ba/F3 инкубировали в растворе соединения (II) при указанных концентрациях в течение 4 ч в среде RPMI в отсутствии ЭТС или IL-3. Клетки лизировали в буферном растворе для лизиса (ФСБ, содержащий 1М NaEDTA, 1М NaF, 0,1% Triton X-100, 200 мМ NaVO, 200 мМ оксида фениларсина и таблетки, содержащие полный набор ингибиторов протеаз (Roche)). 50 мкг белка лизата смешивали с буферным раствором для нанесения в полиакриламидный гель (ПААГ) для электрофореза в восстанавливающих условиях в присутствии ДСН и дитиотреита (Cell Signaling), затем наносили в 10-12% ДСН-ПААГ (Трис-HCl, готовые гели, Bio-Rad), проводили электрофорез и зоны переносили на нитроцеллюлозные мембраны. Для проявления зон использовали антитела фосфо-PDGFRα (Tyr 720), PDGFRα 951, Stat5-b (Santa Cruz); фосфо-Stat5 (Tyr 694) (Cell Signaling); конъюгат антикроличьих атител с пероксидазой (Amersham Pharmacia Biotech).
Для Т/Р: клетки Ba/F3, стабильно экспрессирующие Т/Р или T/F, обрабатывали в обедненной среде в простой сыворотке RPMI 1640 в течение 4 ч, затем лизировали. Клеточные экстракты осветляли центрифугированием и использовали для имунопреципитации или иммуноблоттинга. Анализ методом ИФА проводили по описанной методике. Для анализа использовали следующие антитела: кроличья сыворотка анти-PDGFRβ (Pharmingen); кроличья сыворотка анти-РI3К (р85); мышиные антитела к фосфотирозину 4G10 (Upstate Biotechnology); антитела к FGFR3, фосфо-РI3К р85 (Tyr-508) (Santa Cruz Biotechnology); PLCγ, phospho-PLCγ (Tyr-783) (Cell Signaling).
Трансплантаты костного мозга и медикаментозное лечение мышей
6
6
Эксперименты по пересадке костного мозга мышей проводили, как описано ранее. Супернатанты ретровируса MSCV-GFP титровали при трансдукции клеток Ba/F3 супернатантом (плюс полибрен, 10 мкг/мл) с последующим определением процентного содержания клеток GFP + методом проточной цитометрии через 48 ч после трансдукции. Донорным мышам Balb/C (Taconic) вводили внутрибрюшинно 5-фторурацил (150 мг/кг) в течение 5-6 суток. Клетки костного мозга донорных мышей извлекали, обрабатывали буферным раствором для лизиса эритроцитов и культивировали в течение 24 ч в среде для трансплантации (RPMI + 10% ЭТС + 6 нг/мл IL-3 + 10 нг/мл IL-6 и 10 нг/мл фактора стволовых клеток). Клетки инфицировали (инфекция при центрифугировании) супернатантами ретровируса (1 мл супернатанта на 4×10 клеток плюс полибрен) и центрифугировали при 2500 об/мин в течение 90 мин. Через 24 ч инфицирование повторяли, затем клетки промывали, ресупендировали в растворе Хенка и вводили инъекцией в латеральную хвостовую вену облученных летальной дозой (2×450 рад) мышей-реципиентов (Tatonic) в количестве 0,5-1×10 клеток на 1 мышь. Соединение (II) получали в виде порошка, который растворяли в NMP (N-метил-2-пирролидоне, фирмы Aldrich), при этом получали исходный раствор, который перед инъекцией разбавляли полиэтиленгликолем 300 (фирмы Sigma). Начиная с дня 11 после трансплантации животных лечили соединением (II) в дозе 75 мг/кг/сут или плацебо (полиэтиленгликоль в объеме, равном раствору соединения (II)), каждые 24 ч через желудочный зонд с иглой размером 22. Животных забивали, если при пальпации у них обнаружена спленомегалия или зарегистрирован летальный исход, или, если они оставались живы, через 7 дней после гибели последнего животного из группы плацебо.
Оценка миелопролиферативного заболевания у мышей
Периферическую кровь отбирали из ретроорбитальной полости с использованием гепаринизированных стеклянных капилляров и проводили полный анализ крови и дифференциальный подсчет лейкоцитов на автоматическом анализаторе (анализ мазков проводили после проявления красителем Райта и Гимзы). Суспензии отдельных клеток селезенки и костного мозга получали продавливанием ткани через фильтр для клеток с последующим лизисом эритроцитов. Клетки замораживали в 90% ЭТС, 1-% ДМСО.
Для гистопатологического анализа ткани фиксировали в течение по крайней мере 72 ч в 10% нейтральном буферном растворе на основе формалина, дегидратировали а спирте, очищали в ксилоле и инфильтровали в парафин на автоматическом процессоре (Leica). Кусочки ткани (4 мкм), вырезанные из парафиновых блоков с включенными тканями, помещали на стекла и удаляли парафин в ксилоле, повторно гидратировали при погружении в растворы спирта с постепенно изменяющейся концентрацией и проявляли гематоксилином и эозином.
Для цитометрии клетки промывали в ФСБ, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА), блокировали раствором Fc-Block (BD Pharmingen) в течение 10 мин на ледяной бане и проявляли моноклональными антителами в ФСБ, содержащем 1% БСА, в течение 20 мин на ледяной бане. С этой целью использовали следующие антитела: конъюгаты Gr1, CD19 и TCRB с аллофикоцианином (АРС), конъюгаты Mac-1, B220 и CD3 с фикоэтрином (РЕ) (BD Pharmingen). Анализ проточной цитометрией проводили на приборе FACSCalibur с использованием программного обеспечения CellQuest. Жизнеспособность клеток оценивали при инкубации клеток в растворе 7AAD (BD Pharmingen) в течение 5 мин перед проточной цитометрией. Клетки сортировали по жизнеспособности (с использованием двухмерного сканера и 7AAD) и по позитивности к GFP, и 10000 случаев анализировали из указанного подмножества для определения экспрессии маркера.
Статистическую значимость различия между действием соединения (II) и плацебо в соответствующих группах по времени выживания, числу лейкоцитов и массе селезенки оценивали с использованием двухфакторного анализа Манна-Витни и критерия U (критерий ранговой суммы по Вилкоксону (Wilcoxon)).
Соединение (II) проявляет эффективность при лечении миелопролиферативного заболевания, опосредованного FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ на модели мышей с трансплантатом костного мозга (ВМТ)
Модель миелопролиферативного заболевания у мышей, опосредованного FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ, получали с использованием методики пересадки костного мозга у мышей. При ретровирусной трансдукции указанных гибридных киназ в клетки костного мозга донорных мышей, обработанных 5FU, и последующей трансплантации облученным летальной дозой реципиентам быстро развивается летальный миелопролиферативный фенотип, характеризующийся лейкоцитозом с преобладанием клеток миелоидного ряда, спленомегалии и экстрамедуллярного гематопоэза.
Клетки костного мозга донора трансдуцировали мышиным ретровирусным вектором, экспрессирующим FIP1L1-PDGFRα или TEL-PDGFRβ, и трансплантировали реципиентам. Мышей с трансплантами Т/Р или F/P разделяли на две группы, которым в день 11 после пересадки вводили один раз в сутки перорально через желудочный зонд плацебо или соединение (II) в дозе 150 мг/кг/сут.
6
6
В группе плацебо TEL-PDGFRβ развивается полностью проницаемое миелопролиферативное заболевание со средней латентностью 17 сут, причем всех обработанных животных Т/Р забивали в день 18 из-за прогрессирования заболевания. Напротив, все животные в группе, леченной соединением (II), выживали в течение 7 сут после забоя животных из группы плацебо. Таким образом, в группе леченных соединением (II) животных наблюдается статистически значимое продление жизни (26 сут, р<0,001). По сравнению с животными из группы плацебо в группе животных, леченных соединением (II), наблюдается также статистически значимое снижение общего числа лейкоцитов (WBC) (563,7×10 клеток/мл для плацебо, по сравнению с 18,6×10 клеток/мл для соединения (II), р<0,05) и массы селезенки (802,5 мг для плацебо по сравнению с 350,0 мг для соединения (II), р<0,01), см. табл.1.
Таблица 1Влияние соединения (II) на характеристики миелопролиферативного заболевания, опосредованного FIP1L1-PDGFRα и TEL-PDGFRβ
TEL-PDGFRβПлацебо
TEL-PDGFRβСоединение (II)
FIP1L1-PDGFRαПлацебо
FIP1L1-PDGFRαСоединение (II)
WBC (×10<sup>6</sup>/мл)
Средняя величина
563,7
18,6
569,7
5,6
Стандартное отклонение
96,0
8,8
88,2
2,3
TEL-PDGFRβПлацебо
TEL-PDGFRβСоединение (II)
FIP1L1-PDGFRαПлацебо
FIP1L1-PDGFRαСоединение (II)
Медианная величина
583,4
15,9
613,2
4,7
Диапазон
459,3-648,3
10,9-33,5
452,8-659,2
4,0-9,6
n
3
5
5
5
Масса селезенки (мг)
Средняя величина
802,5
35,0
731,8
88,0
Стандартное отклонение
214,8
89,0
120,0
21,7
Медианная величина
800
340
700
100
Диапазон
380-1130
250-470
575-880
50-100
n
8
8
5
5
Масса печени (мг)
Средняя величина
1746,3
1492,5
1666,4
1128,0
Стандартное отклонение
546,9
103,3
135,5
90,9
Медианная величина
1910
1535
1596
1090
Диапазон
590-2410
1320-1590
1550-1830
1080-1290
n
8
8
5
5
Данные гистопатологического анализа кроветворных органов мышей с индуцированным TEL-PDGFRβ миелопролиферативным заболеванием из группы плацебо свидетельствуют об обширной инфильтрации зрелых миелоидных форм, которая полностью уничтожает нормальную структуру селезенки. Дополнительное исследование свидетельствует о наличии костного мозга со значительным уровнем клеток и полном преобладании зрелых миелоидных форм. Экстрамедуллярный гематопоэз наблюдается в печени, а значительный лейкоцитоз в периферической крови. Данные гистопатологического анализа органов у мышей TEL-PDGFRβ, леченных соединением (II), свидетельствуют о значительно меньшей степени тяжести миелопролиферативного заболевания по сравнению с животными из группы плацебо, хотя все еще наблюдается распространение миелоидных структур. В то время как структура селезенки мышей TEL-PDGFRβ, леченных соединением (II), нарушена, наблюдается относительное сохранение красной и белой пульпы селезенки по сравнению с селезенкой животных из группы плацебо. Дополнительный анализ селезенки животных, леченных соединением (II), также свидетельствует о том, что красная пульпа селезенки пронизана примесью обоих зрелых миелоидных форм и эритроидных элементов в отличие от преобладающей популяции миелоидных структур в группе плацебо. Аналогичные изменения наблюдаются также в костном мозге животных, леченных соединением (II), хотя несмотря на наличие значительного уровня клеток, у этих животных наблюдается примесь обоих миелоидных и эритроидных элементов по сравнению с полностью преобладающей миелоидной формой костного мозга у животных из группы плацебо. И наконец, значительно сниженная опухолевая масса у мышей TEL-PDGFRβ, леченных соединением (II), также отражается в участках печени этих животных, у которых наблюдаются только фокальные очаги экстрамедуллярного гематопоэза по сравнению с обширным вовлечением печени у животных из группы плацебо.
Анализ селезенки животных Т/Р из группы плацебо методом FACS свидетельствует о значительном увеличении клеток Grl+/Macl+ и снижении лимфоидных клеток В (В220+, CD19+) по сравнению с нормальной селезенкой. По данным гистопатологического анализа у животных, леченных соединением (II), наблюдается аналогичная форма миелопролиферации, но при этом значительно снижается процент клеток Grl+/Macl+ и незначительное увеличение процента клеток (B220+/CD19+) по сравнению с группой плацебо.
6
6
Данные эксперимента по пересадке костного мозга FIP1L1-PDGFRα свидетельствуют о более значительном различии между группами соединения (II) и плацебо. У животных в группе плацебо быстро развивается летальное миелопролиферативное заболевание, аналогичное ранее описанному для животных FIP1L1-PDGFRα. В то время как все животные в группе плацебо погибают от заболевания в день 24, все животные, леченные соединением (II), остаются живыми и здоровыми до дня 33, когда завершаются испытания. По сравнению с группой плацебо лечение соединением (II) приводит к значительному снижению общего числа лейкоцитов (WBC) (569,7×10 клеток/мл для плацебо, по сравнению с 5,6×10 клеток/мл для соединения (II), р<0,01) и массы селезенки (731,8 мг для плацебо по сравнению с 88,0 мг для соединения (II), р<0,01), см. табл.1.
Гистопатологические исследования и анализ методом FACS свидетельствуют о развитии тяжелой степени миелопролиферативного заболевания животных FIP1L1-PDGFRα из группы плацебо, то есть наблюдается обширная инфильтрация зрелых миелоидных элементов в селезенку и костный мозг, а также избыточная степень экстрамедуллярного гематопоэза в печени животных из группы плацебо. И наоборот, исследование кроветворных органов из группы животных, леченных соединением (II), свидетельствует о неожиданном сохранении нормальной структуры селезенки и о значительно сниженном числе зрелых миелоидных элементов в красной пульпе, что подтверждается данными анализа проточной цитометрии спленоцитов, выделенных из указанных животных. Участки костного мозга, выделенного из животных, леченных лекарственным средством, также свидетельствуют о значительном улучшении по сравнению с группой плацебо, кроме того в этих участках снижается уровень клеток и снова появляются участки жира, а также нормализуются соотношения миелоидные/эритроидные элементы. И наконец, эффективность соединения (II) в группах, леченных лекарственным средством, демонстрируется достоверным при отсутствии любого экстрамедуллярного гематопоэза в печени этих животных.
Клинические испытания
В ходе испытаний оценивали действие соединения (II) на уровень транскриптов FIP1L1-PDGFRα и наличие мутаций c-kit/ PDGFR в злокачественных опухолевых клетках из крови и/или костного мозга.
Заболевания HES, SM и CEL могут быть вызваны новой гибридной киназой, FIP1L1-PDGFRα. SM может быть также вызван активирующей мутацией в гене KIT. Уровень транскриптов FIP1L1-PDGFRα, определенный методом Q-OT-ПЦР, равен базовой линии в день 15, цикл 1, в день 28, циклы 1, 2, 3 и при завершении испытаний каждый 3-й цикл. Анализ мутаций c-kit, PDGFRα. Три отдельных группы, каждая включает следующие популяции пациентов: конечные параметры HES/CEL: показатель ответной реакции через 3 месяца лечения.