ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ К CD40 И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED ON ANTIBODIES AGAINST CD40 AND APPLICATION THEREOF

Данная заявка испрашивает приоритет по заявке на патент Китая № CN201811448238.5, поданной 30 ноября 2018 г., содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте.
Область техники
Настоящее изобретение относится к области фармацевтических препаратов и, в частности, относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело к CD40 и его антигенсвязывающий фрагмент, и ее применению в качестве лекарственного препарата.
Уровень техники
Будучи одним из гликопротеинов, экспрессируемых на клеточной поверхности, CD40 представляет собой характерный мембранный гликопротеин I типа с молекулярной массой 48 кДа, который принадлежит к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухоли (TNFR) и играет важнейшую роль в иммунной системе. Он экспрессируется в различных иммунных клетках, таких как В-клетки, дендритные клетки, моноциты и макрофаги. Если передача сигнала опосредуется CD40, будут активироваться специализированные антигенпрезентирующие клетки. Природный лиганд CD40 обозначается как CD154 или CD40L и, как известно, преимущественно экспрессируется в зрелых Т-лимфоцитах. CD40L-опосредованная передача сигнала может инициировать целый ряд биологических событий в клетке, включая активацию и пролиферацию иммунных клеток, а также продуцирование цитокинов и хемокинов. Передача сигнала с помощью CD40 чрезвычайно важна для иммунных ответов, зависимых от Т-клеток, в частности, в случае опухолевого микроокружения, где дендритные клетки, стимулированные с помощью CD40, способны активировать опухолеспецифические эффекторные Т-клетки, которые потенциально способны уничтожать опухолевые клетки.
Tong et al, Cancer Gene Therapy, 2003, 10: 1-13
van Mierlo et al, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 5561-5566
Экспрессия CD40 была обнаружена у множества нормальных клеток и опухолевых клеток, включая B-лимфоциты. Например, меланома представляет собой одну из опухолей, характеризующихся экспрессией CD40, в то же время 30% - 70% солидных опухолей также экспрессируют CD40. Известно, что активация CD40 эффективно запускает противоопухолевые ответы (), включая иммунную активацию опухолеспецифических Т-клеточных ответов, прямой апоптоз CD40-положительных опухолей и гуморальный ответ в виде ADCC, вызванной стимуляцией. Более того, наблюдаемая эрадикация опухоли тесно ассоциирована с появлением опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов. Между тем, также не следует игнорировать тот факт, что системное введение антител к CD40 обычно ассоциировано с различными побочными эффектами, такими как шоковый синдром и синдром высвобождения цитокинов ().
В настоящее время целый ряд международных фармацевтических компаний разрабатывают моноклональные антитела к CD40, описанные выше, которые специфически стимулируют иммунную активацию, повышая до максимума ответ на опухоли со стороны собственной иммунной системы пациента, за счет чего обеспечивается цель уничтожения опухолевых клеток.. Связанные с этим патенты включают CN 1198647, CN 1369015, CN 1582165, CN 100430419, CN 101014386, CN 101237882, CN 101289510, CN 101490086, CN103842382, CN104918957, WO2002028904, WO2011123489, WO2012149356, WO2013034904, WO 2015091853, WO 2016196314, WO 2017040932 и WO 2017004006 и т. д. До настоящего времени для антител к CD40 от Pfizer (соответствующие продукты использовались на основании лицензии Roche), Alligator и других компаний наблюдали хороший эффект уничтожения опухолей на доклинических моделях на животных.
В WO2018219327 (PCT/CN2018/089252) представлены антитела к CD40 с высокой аффинностью, высокой селективностью и высокой биологической активностью для применения в качестве стимулирующих антител к CD40.
Однако лекарственные средства на основе антител, характеризующиеся большой молекулярной массой и сложной структурой, могут становиться нестабильными вследствие тенденции к деградации, полимеризации или подверженности нежелательным химическим модификациям. Чтобы сделать антитела пригодными для введения и сохраняющими стабильность и превосходные характеристики во время хранения и последующего применения, большое значение имеют исследования стабильных препаратов лекарственных средств на основе антител. Примером патента, относящегося к препарату на основе антитела к CD40, является WO2005063289. В случае нового антитела к CD40 все еще существует потребность в разработке фармацевтических композиций (препаратов), содержащих CD40, которые более подходят для введения.
Содержание настоящего изобретения
В настоящем изобретении представлена фармацевтическая композиция, содержащая антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент и буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер выбран из ацетатного буфера, гистидинового буфера, фосфатного буфера и сукцинатного буфера, предпочтительно представляет собой ацетатный буфер, более предпочтительно буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия.
В альтернативном варианте осуществления антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции содержат LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, и HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно.
В альтернативных вариантах осуществления концентрация антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 1 мг/мл до 120 мг/мл, при этом она может составлять приблизительно 1 мг/мл, 2 мг/мл, 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 12 мг/мл, 14 мг/мл, 16 мг/мл, 18 мг/мл, 20 мг/мл, 22 мг/мл, 24 мг/мл, 26 мг/мл, 28 мг/мл, 30 мг/мл, 35 мг/мл, 40 мг/мл, 45 мг/мл, 50 мг/мл, 55 мг/мл, 60 мг/мл, 65 мг/мл, 70 мг/мл, 75 мг/мл, 80 мг/мл, 85 мг/мл, 90 мг/мл, 95 мг/мл, 100 мг/мл, 105 мг/мл, 110 мг/мл, 115 мг/мл, 120 мг/мл или любое значение между любыми двумя значениями, предпочтительно от 10 мг/мл до 40 мг/мл, наиболее предпочтительно приблизительно 25 мг/мл.
В альтернативных вариантах осуществления концентрация буфера составляет от приблизительно 5 мМ до 30 мМ, предпочтительно от приблизительно 10 мМ до 20 мМ, и в качестве неограничивающих примеров составляет приблизительно 10 мМ, 12 мМ, 14 мМ, 16 мМ, 18 мМ, 20 мМ или любое значение между любыми двумя значениями, наиболее предпочтительно приблизительно 10 мМ.
В альтернативных вариантах осуществления pH буфера в фармацевтической композиции составляет приблизительно 4,5-6,5, предпочтительно приблизительно 5,0-6,0, а в одном неограничивающем варианте осуществления он также может составлять приблизительно 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0 или любое значение между любыми двумя значениями, наиболее предпочтительно приблизительно 5,0 или 5,5.
2
n
В альтернативных вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит сахар. В настоящем изобретении «сахар» включает общепринятые соединения (CHO) и их производные, включая моносахариды, дисахариды, трисахариды, полисахариды, сахарные спирты, редуцирующие сахара, нередуцирующие сахара и т. д. В настоящем изобретении «сахар» может быть выбран из глюкозы, сахарозы, трегалозы, лактозы, фруктозы, мальтозы, декстрана, глицерина, эритрита, глицерола, арабита, силита, сорбита, маннита, мелибиозы, мелезитозы, раффинозы, маннотриозы, стахиозы, мальтозы, лактулозы, мальтулозы, сорбита, мальтита, лактита, изомальтулозы и т. д. Предпочтительный сахар представляет собой нередуцирующий дисахарид, более предпочтительно трегалозу и сахарозу.
В альтернативных вариантах осуществления концентрация сахара в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 40 мг/мл до 95 мг/мл (например, 55 мг/мл), предпочтительно от приблизительно 60 мг/мл до 90 мг/мл. В неограничивающих примерах концентрация сахара составляет 60 мг/мл, 65 мг/мл, 70 мг/мл, 75 мг/мл, 80 мг/мл, 85 мг/мл, 90 мг/мл или любое значение между любыми двумя значениями, более предпочтительно приблизительно 80 мг/мл.
В альтернативных вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество, которое может быть выбрано из полисорбата 20; полисорбата 80; полоксамера; Triton; додецилсульфоната натрия; лаурилсульфоната натрия; октилгликозида натрия; лаурил-, миристил-, линолеил-, стеарилсульфобетаина; лаурил-, миристил-, линолеил-, стеарилсаркозина; линолеил-, миристил-, цетилбетаина; лауроамидопропил-, кокаамидопропил-, линолеамидопропил-, миристамидопропил-, пальмамидопропил-, изостеарамидопропилбетаина; миристамидопропил-, пальмамидопропил-, изостеарамидопропилдиметиламина; метилкокоила натрия; метилолеилтаурата натрия; сополимеров полиэтиленгликоля; сополимеров полипропиленгликоля; сополимеров этиленгликоля и сополимеров пропиленгликоля и т. д. Предпочтительное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбаты, такие как полисорбат 80 или полисорбат 20, более предпочтительно полисорбат 80.
В альтернативных вариантах осуществления концентрация поверхностно-активного вещества в фармацевтической композиции составляет от приблизительно 0,02 мг/мл до 0,8 мг/мл (например, 0,1 мг/мл), предпочтительно от приблизительно 0,3 мг/мл до 0,6 мг/мл. В неограничивающих примерах концентрация поверхностно-активного вещества составляет 0,3 мг/мл, 0,35 мг/мл, 0,4 мг/мл, 0,45 мг/мл, 0,5 мг/мл, 0,55 мг/мл, 0,6 мг/мл или любое значение между любыми двумя значениями, более предпочтительно приблизительно 0,4 мг/мл.
В альтернативных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(а) 1-120 мг/мл антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, и HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно,
(b) 5-30 мМ ацетатного буфера.
В альтернативных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(а) 1-120 мг/мл антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, и HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно,
(b) 5-30 мМ ацетатного буфера,
(c) 40-90 мг/мл сахарозы,
(d) 0,02-0,8 мг/мл полисорбата 80, при этом предпочтительно pH фармацевтической композиции составляет 4,5-6,5, более предпочтительно 5,0-6,0, еще более предпочтительно 5,5.
В альтернативных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(а) 1-120 мг/мл антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, и HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно,
(b) 5-30 мМ ацетатного буфера,
(c) 40-95 мг/мл трегалозы,
(d) 0,02-0,8 мг/мл полисорбата 80, при этом предпочтительно pH фармацевтической композиции составляет 4,5-6,5, более предпочтительно 5,0-6,0, еще более предпочтительно 5,5.
Фармацевтическая композиция содержит:
(а) 1-120 мг/мл антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, и HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно, и
(b) 10-20 мМ ацетатного буфера, и при этом pH фармацевтической композиции составляет 5,0-5,5.
В альтернативных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(а) 10-40 мг/мл антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, и HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно,
(b) 10-20 мМ ацетатного буфера,
(c) 60-90 мг/мл сахарозы,
(d) 0,3-0,8 мг/мл полисорбата 80, при этом предпочтительно pH фармацевтической композиции составляет 5,0-6,0.
В альтернативных вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит:
(а) 25 мг/мл антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, где антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент содержат LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, и HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно,
(b) 10-20 мМ буфера на основе уксусной кислоты и ацетата натрия,
(c) 60-90 мг/мл сахарозы,
(d) 0,3-0,8 мг/мл полисорбата 80, при этом предпочтительно pH фармацевтической композиции составляет 5,0-6,0.
В конкретном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит:
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,8;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,6;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,8;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,0;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,5;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 6,0;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,0;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,5;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,8;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 6,0;
25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5;
или 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5.
В конкретных вариантах осуществления, определенных выше, антитело к CD40 содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, представленные под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, и HCDR1, HCDR2 и HCDR3, представленные под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно.
В некоторых вариантах осуществления антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержат вариабельную область тяжелой цепи, представленную под SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, представленную под SEQ ID NO: 2.
QVQLQQPGADLVKPGASVKMSCKASGYILTTYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPGSGSTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLTRLSSEDSAVYYCARRDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO: 1
DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGESPKLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASLVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 2
В альтернативных вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции могут быть выбраны из мышиного антитела, химерного антитела и гуманизированного антитела, предпочтительно представляют собой гуманизированное антитело.
В альтернативных вариантах осуществления FR легкой цепи в вариабельной области легкой цепи и FR тяжелой цепи в вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела в фармацевтической композиции происходят из легкой цепи и тяжелой цепи зародышевого типа человека соответственно или их мутантных последовательностей.
Кроме того, тяжелая цепь гуманизированного антитела к CD40 имеет последовательность, представленную под SEQ ID NO: 17, или ее вариант, и при этом вариант предпочтительно содержит 0-10 аминокислотных вариаций в вариабельной области тяжелой цепи, более предпочтительно мутации в аминокислотных положениях 6 и 8, где предпочтительно в результате мутаций происходит замена на аминокислоты I, A или L; легкая цепь гуманизированного антитела имеет последовательность, представленную под SEQ ID NO: 18, или ее вариант, и при этом вариант предпочтительно содержит 0-10 аминокислотных вариаций в вариабельной области легкой цепи, более предпочтительно мутации в аминокислотных положениях 2 и 3, где предпочтительно в результате мутаций происходит замена на аминокислоты I, V или L.
В альтернативных вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела к CD40 дополнительно содержит FR тяжелой цепи из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или их вариант, предпочтительно содержит FR тяжелой цепи из IgG1, IgG2 или IgG4 человека, и более предпочтительно содержит FR тяжелой цепи из IgG1 или IgG2 человека.
В альтернативных вариантах осуществления аминокислотная последовательность легкой цепи антитела к CD40 характеризуется по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью легкой цепи антитела hu9E5, аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела характеризуется по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88 %, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью тяжелой цепи антитела hu9E5, при этом последовательность легкой цепи антитела hu9E5 представлена под SEQ ID NO: 18, а последовательность тяжелой цепи антитела hu9E5 представлена под SEQ ID NO: 17.
HC hu9E5
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 17
LC hu9E5
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 18
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению характеризуется достаточной стабильностью лекарственного средства и может храниться в стабильном состоянии в течение длительного времени. С другой стороны, для удобства транспортировки лекарственного средства фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть дополнительно преобразована в лиофилизированный препарат.
В настоящем изобретении также представлен способ получения лиофилизированного препарата, содержащего антитело к CD40, который включает стадию лиофилизации фармацевтической композиции, определенной выше.
В альтернативных вариантах осуществления в способе получения препарата, содержащего антитело к CD40, лиофилизация включает последовательные стадии предварительной лиофилизации, первичной сушки и вторичной сушки.
В настоящем изобретении также представлен лиофилизированный препарат, содержащий антитело к CD40, который получен посредством способа получения лиофилизированного препарата, содержащего антитело к CD40, как определено выше.
В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный препарат является стабильным при 2-8°C в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев.
В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный препарат является стабильным при 25°C в течение по меньшей мере 3 месяцев, по меньшей мере 6 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев или по меньшей мере 24 месяцев.
В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный препарат является стабильным при 40°C в течение по меньшей мере 7 дней, по меньшей мере 14 дней или по меньшей мере 28 дней.
В настоящем изобретении также представлен способ приготовления восстановленного раствора лиофилизированного препарата, содержащего антитело к CD40, который включает стадию восстановления лиофилизированного препарата, определенного выше, и при этом раствор, используемый для восстановления, без ограничения выбран из воды для инъекций, физиологического раствора или раствора глюкозы.
В настоящем изобретении также представлен восстановленный раствор лиофилизированного препарата, содержащего антитело к CD40, полученный посредством способа получения восстановленного раствора лиофилизированного препарата, содержащего антитело к CD40, определенное выше.
В настоящем изобретении дополнительно представлен продукт или набор, предусматривающие контейнер, содержащий любую стабильную фармацевтическую композицию, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления флакон для инъекций представляет собой стеклянную бутылку, изготовленную из трубки из нейтрального боросиликатного стекла.
В настоящем изобретении также представлено применение фармацевтической композиции, лиофилизированного препарата или восстановленного раствора лиофилизированного препарата, определенного выше, при получении лекарственного препарата для лечения заболеваний или симптомов, связанных с CD40, где заболевания или симптомы предпочтительно представляют собой виды рака, и виды рака выбраны из лимфомы, рака молочной железы, рака яичника, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака почки, рака легкого, рака печени, рака желудка, колоректального рака, рака мочевого пузыря, рабдомиосаркомы, рака пищевода, рака шейки матки, множественной миеломы, видов лейкоза, рака желчного пузыря, глиобластомы и меланомы.
В настоящем изобретении также представлен способ лечения и предупреждения заболеваний или симптомов, связанных с CD40, который включает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, лиофилизированного препарата или восстановленного раствора лиофилизированного препарата, определенных выше, нуждающемуся в этом пациенту, где заболевания или симптомы предпочтительно представляют собой виды рака, которые выбраны из лимфомы, рака молочной железы, рака яичника, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы, рака почки, рака легкого, рака печени, рака желудка, колоректального рака, рака мочевого пузыря, рабдомиосаркомы, рака пищевода, рака шейки матки, множественной миеломы, видов лейкоза, рака желчного пузыря, глиобластомы и меланомы.
В настоящем изобретении также представлен продукт, предусматривающий контейнер, который содержит фармацевтическую композицию, лиофилизированный препарат или восстановленный раствор лиофилизированного препарата, определенные выше.
Следует понимать, что одна, несколько или все характеристики различных вариантов осуществления, описанных в данном документе, могут быть объединены для образования других вариантов осуществления настоящего изобретения. Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области техники. Эти и другие варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно описаны в следующем подробном описании.
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления
1. Определения
Чтобы облегчить специалистам в данной области техники понимание настоящего изобретения, определенные технические и научные термины специально определены ниже. Если иное четко не определено где-либо в другом месте в данном документе, все остальные технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понятное специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение.
«Буфер» относится к буферу, который может противостоять изменениям pH благодаря действию его сопряженных компонентов, представляющих собой кислоту и основание. Примеры буферов, которые контролируют pH в соответствующем диапазоне, включают ацетатные буферы, сукцинатные буферы, глюконатные буферы, гистидиновые буферы, оксалатные буферы, лактатные буферы, фосфатные буферы, цитратные буферы, тартратные буферы, фумаратные буферы, глицилглициновые буферы и буферы на основе других органических кислот.
«Гистидиновый буфер» представляет собой буфер, содержащий ионы гистидина. Примеры гистидинового буфера включают гистидин-гидрохлоридный буфер, гистидин-ацетатный буфер, гистидин-фосфатный буфер, гистидин-сульфатный буфер и т. д., предпочтительно гистидин-гидрохлоридный буфер. Гистидин-гидрохлоридный буфер получают из гистидина и соляной кислоты или гистидина и гидрохлорида гистидина.
«Цитратный буфер» представляет собой буфер, содержащий цитрат-ионы. Примеры цитратного буфера включают буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия, лимонной кислоты и цитрата калия, лимонной кислоты-цитрата кальция, лимонной кислоты и цитрата магния и т. д. Предпочтительный цитратный буфер представляет собой буфер на основе лимонной кислоты и цитрата натрия.
«Сукцинатный буфер» представляет собой буфер, содержащий сукцинат-ионы. Примеры сукцинатного буфера включают буфер на основе сукцината и сукцината натрия, буфер на основе сукцината и сукцината калия, буфер на основе сукцината и сукцината кальция и т. д. Предпочтительный сукцинатный буфером представляет собой буфер на основе сукцината и сукцината натрия.
«Фосфатный буфер» представляет собой буфер, содержащий фосфат-ионы. Примеры фосфатного буфера включают буфер на основе гидрофосфата динатрия и дигидрофосфата натрия, буфер на основе гидрофосфата динатрия и дигидрофосфата калия и т. д. Предпочтительный фосфатный буфер представляет собой буфер на основе гидрофосфата динатрия и дигидрофосфата натрия.
«Ацетатный буфер» представляет собой буфер, содержащий ацетат-ионы. Примеры ацетатного буфера включают буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия, буфер на основе уксусной кислоты и гистидина, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата калия, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата кальция, буфер на основе уксусной кислоты и ацетата магния и т. д. Предпочтительный ацетатный буфер представляет собой буфер на основе уксусной кислоты и ацетата натрия.
«Фармацевтическая композиция» означает смесь, содержащую одно или более из соединений, описанных в данном документе, или их физиологически/фармацевтически приемлемых солей или пролекарств и других химических компонентов, таких как физиологически/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Функция фармацевтической композиции заключается в том, чтобы содействовать введению в организм и облегчать всасывание активных ингредиентов для проявления их биологической активности. В данном контексте «фармацевтическая композиция» и «препарат» не являются взаимоисключающими.
Если не указано иное, фармацевтическая композиция, описанная в настоящем изобретении, находится в форме раствора, при этом растворителем в нем является вода.
«Лиофилизированный препарат» относится к препарату или фармацевтической композиции, полученным путем вакуумной лиофилизации фармацевтической композиции или препарата в виде раствора в форме жидкости или раствора.
Используемый в данном документе термин «приблизительно» означает, что указанное значение находится в пределах допустимого диапазона ошибок для конкретного значения, определенного специалистом в данной области техники, и значение частично зависит от того, как его измеряют или определяют (т. е. предела измерительной системы). Например, «приблизительно» может означать в пределах 1 или более 1 стандартного отклонения, как принято в данной области техники. В качестве альтернативы «приблизительно» или «по существу предусматривает» может означать диапазон не более 20%. Кроме того, в частности в случае биологических систем или процессов, термин может означать не более чем на порядок или не более чем в 5 раз больше значения. Если конкретное значение приведено в настоящей заявке и формуле изобретения, если не указано иное, следует предполагать, что значение «приблизительно» или «по существу предусматривает» находится в пределах допустимого диапазона ошибок для конкретного значения.
Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем изобретении, может обеспечивать стабильный эффект: содержащееся в ней антитело по существу сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность после хранения. Предпочтительно фармацевтическая композиция сохраняет свою физическую стабильность, химическую стабильность и биологическую активность после хранения. Период хранения обычно выбирают на основе заранее определенного срока годности фармацевтической композиции. Существует множество доступных аналитических методик для измерения стабильности белка, с помощью которых можно измерить стабильность после хранения при выбранной температуре в течение выбранного периода времени.
Стабильный фармацевтический препарат на основе антитела представляет собой препарат, в котором не наблюдается значительных изменений при следующих условиях: хранение при температуре холодильного хранения (2-8°C) в течение по меньшей мере 3 месяцев, предпочтительно 6 месяцев, более предпочтительно 1 года и даже более предпочтительно не более 2 лет. Кроме того, стабильные жидкие препараты включают жидкие препараты, которые проявляют требуемые характеристики после некоторого периода времени, включая хранение при 25°C в течение 1 месяца, 3 месяцев или 6 месяцев или хранение при 40°C в течение 1 месяца. Типичный критерий приемлемости для стабильности является следующим: деградируют обычно не более приблизительно 10%, предпочтительно не более приблизительно 5% мономеров антитела, как измерено с помощью SEC-HPLC. Как определено посредством визуального анализа, фармацевтический препарат на основе антитела является бесцветным или имеет цвет от прозрачного до слегка молочно-белого. Концентрация, pH и осмоляльность препаратов меняются не более чем на ±10%. Обычно наблюдают усечения, составляющие не более чем приблизительно 10%, предпочтительно не более чем приблизительно 5%, и обычно образуются агрегаты, составляющие не более чем приблизительно 10%, предпочтительно не более чем приблизительно 5%.
После визуальной проверки цвета и/или прозрачности или измерения посредством светорассеяния УФ-излучения, эксклюзионной хроматографии (SEC) и динамического светорассеяния (DLS), если для антитела не показано значительное увеличение агрегации, осаждения и/или денатурации, то антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом препарате. Изменения конформации белка можно оценить посредством флуоресцентной спектроскопии (которая определяет третичную структуру белка) и FTIR-спектроскопии (которая определяет вторичную структуру белка).
Если для антитела не показано значительного химического изменения, то антитело «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтическом препарате. Химическую стабильность можно оценить путем выявления и количественного определения белков с химически измененной формой. Процессы деградации, которые зачастую изменяют химическую структуру белков, включают гидролиз или усечение (оценивают посредством таких методов, как эксклюзионная хроматография и SDS-PAGE), окисление (оценивают посредством таких методов, как пептидное картирование в сочетании с масс-спектрометрией или MALDI/TOF/MS и т. д.), дезаминирование (оценивают посредством таких методов, как ионообменная хроматография, капиллярное изоэлектрическое фокусирование, пептидное картирование, измерение содержания изоаспарагиновой кислоты и т. д.) и изомеризацию (оценивают посредством измерения содержания изоаспарагиновой кислоты, пептидного картирования и т. д.).
Если биологическая активность антитела в данный момент времени находится в пределах заранее определенного диапазона биологической активности, проявляемой в момент получения фармацевтического препарата, то антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтическом препарате. Биологическую активность антитела можно определять, например, с помощью анализа связывания антигена.
Термин «CD40» относится к рецептору клеточной поверхности, который является представителем суперсемейства рецепторов TNF, также известным как TNFRSF5. CD40 повсеместно экспрессируется на поверхности дендритных клеток, В-клеток и макрофагов и представляет собой молекулу, необходимую для выработки и поддержания Т-клеточного иммунитета. Термин «CD40» включает любой вариант или изоформу CD40, которая естественным образом экспрессируется клеткой. Антитела по настоящему изобретению могут быть перекрестно реактивными в отношении CD40 от видов, отличных от человека. В качестве альтернативы антитело может быть специфическим в отношении CD40 человека и может не проявлять перекрестную реактивность в отношении другими видов. CD40 или любой его вариант или изоформа могут быть выделены из клеток или тканей, в которых они экспрессируются естественным путем, или продуцироваться с помощью рекомбинантных методик с применением методик, общеизвестных в данной области техники и описанных в данном документе. Предпочтительно антитело к CD40 нацеливается на CD40 человека с нормальным профилем гликозилирования.
J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)
Трехбуквенный код и однобуквенный код аминокислот, используемые в настоящем изобретении, описаны в .
Упомянутое в настоящем изобретении «антитело» относится к иммуноглобулину, у которого в состав структуры на основе тетрапептидных цепей входит две идентичные тяжелые цепи и две идентичные легкие цепи, соединенные межцепочечными дисульфидными связями.
В настоящем изобретении легкая цепь антитела может дополнительно содержать константную область легкой цепи, которая предусматривает κ-, λ-цепь человека или мыши или их варианты.
В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, которая предусматривает IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или мыши или их варианты.
Вариабельный фрагмент (Fv-область), в состав которого входит приблизительно 110 аминокислот, расположенных вблизи N-конца тяжелых цепей и легких цепей антитела, значительно отличается своей аминокислотной последовательностью. Константная область, в состав которой входит остальная аминокислотная последовательность, расположенная вблизи С-конца антитела, является относительно стабильной. Вариабельная область содержит три гипервариабельные области (HVR) и четыре относительно консервативные каркасные области (FR). Три гипервариабельные области, которые определяют специфичность антитела, также называют определяющей комплементарность областью (CDR). Каждая из вариабельной области легкой цепи (LCVR) и вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца до карбокси-конца в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три CDR легкой цепи обозначаются LCDR1, LCDR2 и LCDR3; а три CDR тяжелой цепи обозначаются HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Количество и положение аминокислотных остатков, составляющих CDR, в LCVR и HCVR антител или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению соответствуют известным критериям нумерации согласно Kabat (LCDR1-3, HCDR2-3) или системе нумерации согласно Kabat и Chothia (HCDR1).
Антитела по настоящему изобретению включают мышиные антитела, химерные антитела и гуманизированные антитела, предпочтительно представляют собой гуманизированные антитела.
В настоящем изобретении термин «мышиное антитело» означает моноклональное антитело, нацеливающееся на CD40 человека, полученное в соответствии со знаниями и навыками в данной области техники. Во время получения подопытному животному вводят инъекцией антиген CD40, а затем выделяют гибридому, экспрессирующую антитело с требуемой последовательностью или функциональными характеристиками.
Термин «химерное антитело» представляет собой антитело, образованное путем слияния вариабельной области мышиного антитела с константной областью человеческого антитела, что может ослаблять иммунный ответ, индуцируемый мышиным антителом. Для конструирования химерного антитела сначала получают гибридому, которая секретирует специфическое моноклональное мышиное антитело, а затем ген вариабельной области клонируют из клетки гибридомы мыши. Затем, при необходимости, клонируют ген константной области человеческого антитела. Ген вариабельной области мыши и ген константной области человека лигируют в химерный ген и затем встраивают в вектор для экспрессии человеческих последовательностей, и, наконец, обеспечивают экспрессию молекулы химерного антитела в производственной системе на основе эукариотических или прокариотических клеток. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения легкая цепь химерного антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента может дополнительно содержать константную область легкой цепи из κ-, λ-цепи человека или их вариантов. Тяжелая цепь химерного антитела к CD40 дополнительно содержит константную область тяжелой цепи из IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или их вариантов.
Термин «гуманизированное антитело», также известное как антитело с привитой CDR, относится к антителу, полученному путем прививания последовательностей CDR мыши в каркасные области вариабельной области человеческого антитела, т. е. каркасные последовательности антитела другого зародышевого типа человека. Это может преодолеть интенсивный иммунный ответ, вызванный химерным антителом, несущим большое количество компонентов мышиного белка. Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных источников, которые включают последовательности генов антител зародышевого типа. Например, последовательности ДНК зародышевого типа для генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека можно найти в базе данных последовательностей зародышевого типа человека "VBase" (доступна на веб-сайте www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), также в Kabat, EA, etc., Human, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition. Чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, вариабельную область человеческого антитела можно подвергать минимальной обратной мутации с целью сохранения активности. Гуманизированные антитела по настоящему изобретению также предусматривают гуманизированные антитела, в которых CDR дополнительно подвергают созреванию аффинности посредством фагового дисплея.
В настоящем изобретении термин «связывание с CD40» относится к способности взаимодействовать с CD40 человека.
Термин «специфическое связывание» относится к определяемому с помощью методик, доступных в данной области техники, таких как конкурентный ELISA, анализ BIACORE или анализ KINEXA. Этот термин также применим, например, если антигенсвязывающий домен антитела по настоящему изобретению является специфичным в отношении конкретного эпитопа, который несут многие антигены, и в этом случае антитело, несущее антигенсвязывающий домен, может специфически связываться с несколькими антигенами, которые несут данный эпитоп.
В настоящем изобретении «антигенсвязывающий фрагмент» относится к Fab-фрагменту, Fab'-фрагменту, F(ab')2-фрагменту и scFv-фрагменту, которые связываются с CD40 человека, а также другим фрагментам, которые могут связываться с CD40 человека, образованным с использованием VH- и VL-областей антител, которые могут связываться с CD40 человека. Он содержит одну или более CDR антител, описанных в настоящем изобретении, выбранных из SEQ ID NO: 7, 13, 9, 10, 11 и 12. Fv-фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, но не содержит константную область и представляет собой самый маленький фрагмент антитела со всеми антигенсвязывающими сайтами. Обычно Fv-антитело также содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который может образовывать структуру, необходимую для связывания антигена. Различные линкеры также можно использовать для соединения двух вариабельных областей антител в полипептидную цепь, которая называется одноцепочечным антителом или одноцепочечным Fv (sFv).
Термин «эпитоп» относится к части молекулы, которая может распознаваться и связываться антителом с одной или более антигенсвязывающими областями антитела.
Molecular Biology of the Gene
«Консервативная модификация» или «консервативная замена или замещение» относятся к замене аминокислот в белках другой аминокислотой со сходными характеристиками (например, зарядом, размером боковой цепи, гидрофобностью/гидрофильностью, конформацией и жесткостью остова и т. п.), так что изменения зачастую можно осуществлять без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области техники известно, что обычно замена одной аминокислоты в несущественной области полипептида не изменяет существенно его биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) , The Benjamin/Cummings Pub. Co., стр. 224, (4-е издание)). Кроме того, при заменах на структурно или функционально подобные аминокислоты нарушение их биологической активности является маловероятным.
Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 and Altschul et al. (1977) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402
«Идентичность» или «гомология» аминокислотной последовательности относится к сходству последовательностей между двумя полипептидными последовательностями. Когда оба положения в двух сравниваемых последовательностях заняты одним и тем же аминокислотным остатком, например, если одно и то же положение каждого из двух полипептидов занято одной и той же аминокислотой, тогда молекулы являются идентичными по этому положению. Примерами алгоритмов, подходящих для определения процента идентичности последовательностей и процента сходства последовательностей, являются алгоритмы BLAST и BLAST2.0, которые описаны в . Программное обеспечение для выполнения анализа BLAST общедоступно в Национальном центре биотехнологической информации (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны из предшествующего уровня техники, как, например, из разделов 5-8 и 15, «Using Antibodies A Laboratory Manual, опубликованного Cold Spring Harbor. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент, определенные в настоящем изобретении, подвергнуты генной инженерии для добавления одной или более FR человека в CDR от организма, отличного от человека. Последовательность FR зародышевого типа человека можно получить путем выравнивания в базе данных генов вариабельных областей антител зародышевого типа человека IMGT с помощью программного обеспечения MOE на сайте ImMunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr или из Journal of Immunoglobulins, 2001ISBN012441351.
Сконструированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены и очищены с помощью традиционных способов. Например, последовательность кДНК, кодирующая тяжелую цепь и легкую цепь, может быть клонирована и рекомбинирована в вектор экспрессии GS. Клетки СНО могут быть стабильно трансфицированы рекомбинантным вектором экспрессии иммуноглобулина. В качестве более рекомендуемого способа, хорошо известного в данной области техники, системы экспрессии на основе клеток млекопитающих приводят к гликозилированию антител, в частности, на высококонсервативном N-конце Fc. Стабильные клоны получают путем экспрессии антител, которые специфически связываются с антигенами человека. Для получения антител позитивные клоны размножают в бессывороточной среде в биореакторе. Культуральную среду, в которую секретируется антитело, можно очищать и собирать с помощью традиционных методик. Например, для очистки применяют колонку с белком A или G-сефарозой FF с подобранным буфером для вымывания неспецифически связанных компонентов. Затем связанные антитела элюируют за счет градиента pH и фрагменты антител выявляют с помощью SDS-PAGE, а затем собирают. Антитела можно концентрировать путем фильтрации традиционным способом. Растворимые смеси и мультимеры также можно удалить традиционными способами, такими как молекулярные сита и ионный обмен. Полученный продукт необходимо немедленно заморозить, как, например, при температуре -70°, или лиофилизировать.
in vitro
ex vivo
При применении в отношении животного, человека, экспериментального субъекта, клетки, ткани, органа или биологической жидкости термин «введение» и «лечение» относится к приведению экзогенного лекарственного средства, терапевтического средства, диагностического средства или композиции в контакт с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. «Введение» и «лечение» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клеток включает приведение реагентов в контакт с клетками, а также приведение реагентов в контакт с жидкостью, при этом жидкости находятся в контакте с клетками. «Введение» и «лечение» также означает обработку, например, клеток  и  с помощью реагентов, средств диагностики, связывающих композиций или другого типа клеток. «Лечение», при применении к человеку, ветеринарному или исследовательскому субъекту, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, к исследовательским и диагностическим путям применения.
«Терапия» означает введение терапевтического средства для внутреннего или наружного применения, содержащего, например, любую композицию, которая может связывать соединения по настоящему изобретению, пациенту, имеющему один или более симптомов заболевания, в отношении которого, как известно, терапевтическое средство обладает терапевтическим эффектом. Обычно терапевтическое средство вводят в количестве, которое эффективно облегчает симптомы одного или более заболеваний у субъекта или популяции, подлежащих лечению, для индукции ослабления таких симптомов или подавления прогрессирования таких симптомов до любой клинически неизмеряемой степени. Количество терапевтического средства (также называемого «терапевтически эффективным количеством»), эффективного для ослабления симптомов какого-либо конкретного заболевания, может варьироваться в зависимости от множества факторов, таких как стадия заболевания, возраст и вес пациента, а также способности лекарственного средства вызывать требуемый эффект у пациента. Насколько были ослаблены симптомы заболевания, можно оценить с помощью любого способа клинического теста, обычно применяемого врачом или другими специалистами в области здравоохранения для оценки тяжести или прогрессирования состояния. Хотя варианты осуществления настоящего изобретения (например, терапевтические способы или препараты) могут не быть эффективными в ослаблении симптомов заболевания у каждого целевого объекта, они будут облегчать симптомы заболевания целевых объектов у статистически значимого числа пациентов, что определяется с помощью любых методов статистического анализа, известных в данной области техники, таких как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (H-критерий), критерий Джонкхира-Терпстры и критерий Уилкоксона.
«Эффективное количество» включает количество, достаточное для уменьшения интенсивности или предупреждения симптома или состояния при медицинском заболевании. Эффективное количество также означает количество, достаточное для того, чтобы обеспечивать или облегчать диагностику. Эффективное количество для конкретного пациента или ветеринарного субъекта может варьироваться в зависимости от следующих факторов: например, состояния, подлежащего лечению, общего состояния здоровья пациента, пути и дозировки введения, а также тяжести побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или схему введения дозы, позволяющие избежать значительных побочных эффектов или токсических эффектов.
«Значение Tm» относится к температуре термической денатурации белка, то есть температуре, при которой половина белковой молекулы разворачивается, когда пространственная структура белка разрушается. Следовательно, чем выше значение Tm, тем выше термическая стабильность белка.
2. Примеры и тестовые примеры
Настоящее изобретение дополнительно подробно поясняется следующими примерами. Эти примеры служат только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Экспериментальные методы, для которых конкретные условия не указаны в примерах по настоящему изобретению, обычно соответствуют стандартным условиям; или соответствуют условиям, предполагаемым производителями сырья или товаров. Реагенты, для которых не указаны конкретные источники, представляют собой коммерчески приобретенные стандартные реагенты.
Способы получения и очистки антигена и антитела к CD40 для настоящей заявки были описаны в патентном документе под номером заявки WO2018219327, содержание которого может быть включено в данный документ во всей своей полноте.
Пример 1. Иммунные антигены, последовательности антигенов для скрининга и их получение
Меченный гистидином рекомбинантный белок CD40 человека (h-CD40-his), Fc-меченный рекомбинантный белок CD40 человека (h-CD40-Fc), меченный гистидином рекомбинантный белок CD40 мыши (m-CD40-his) и меченный гистидином рекомбинантный белок CD40 макака-резуса (rhesus-CD40-his) (№CD0-C52H7) представляли собой очищенные коммерческие белковые реагенты, приобретенные в Acrobiosystems. Источник для каждой последовательности показан в таблице 1. Белок может применяться в каждом эксперименте следующих примеров.
Пример 2. Получение гибридомы, вырабатывающей антитела
Моноклональные антитела к CD40 человека получали путем иммунизации мышей, которые представляли собой экспериментальных мышей C57BL/6, самок возрастом 6-8 недель [Zhao Yan (Suzhou) New Drug Research Center Co., Ltd., номер лицензии на производство животных: 201503259]. Кормовая среда: уровень SPF. Мышей приобретали и кормили в лабораторных условиях в течение 1 недели регуляцией цикла 12/12 часов свет/темнота при температуре 20-25° и влажности 40-60%. Мышей, которые адаптировались к среде, разделили на 2 клетки по 5 мышей в каждой клетке.
Иммунный антиген представлял собой Fc-меченный модифицированный рекомбинантный белок CD40 человека (h-CD40-Fc, составленный в фосфатном буфере при концентрации 1 мкг/мкл). Адъювант Фрейнда (Sigma, № партии: F5881/F5506) применяли для эмульгирования, при этом полный адъювант Фрейнда (CFA) применяли для первичной иммунизации, а адъювант на основе нуклеиновой кислоты (CpG, Sangon Biotech) и алюминий для инъекций (Imject Alum), Thermo, № партии: PH203866) для оставшейся бустерной иммунизации. Иммунизацию проводили в день 0, день 14, день 28, день 42, день 56 и день 70. Кровь собирали в день 21, 35, 49, 63 и 77 для проведения анализа крови, и сыворотку крови мышей подвергали ELISA для определения титра антител в сыворотке крови мышей.
in vitro
После четвертой иммунизации для мышей, у которых титр антител был высоким и демонстрировал тенденцию к стабильности в сыворотке крови, выполняли слияние клеток селезенки. Бустерную иммунизацию проводили за 3 дня до слияния и 10 мкг раствора антигена, составленного с фосфатным буфером, вводили внутрибрюшинной (IP) инъекцией каждой мыши. Лимфоциты селезенки сливали с клетками Sp2/0, представляющими собой клетки миеломы (ATCC CRL-8287TM), с применением оптимизированного PEG-опосредованного слияния для получения клеток гибридомы, и отбирали моноклональные линии клеток гибридомы с надлежащей активностью .
Пример 3. Клонирование и секвенирование антитела к CD40
Отбирали субклоны гибридом, продуцирующих антитела, которые прошли вышеописанный скрининг и идентификацию, и собирали клетки гибридомы, находящиеся в логарифмической фазе роста. РНК экстрагировали с применением тризола (Invitrogen, 15596-018) в соответствии с инструкцией из набора и осуществляли обратную транскрипцию (обратная транскриптаза PrimeScript™, Takara, № по кат. 2680A). Затем полученную кДНК амплифицировали с помощью ПЦР с применением набора праймеров для Ig мыши (Novagen, TB326 Rev. B 0503) и отправили для секвенирования в компанию, осуществляющую секвенирование. Наконец, получили последовательность мышиного антитела.
Последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи 9E5 являются следующими:
HCVR 9E5
QVQLQQPGADLVKPGASVKMSCKASGYILTTYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPGSGSTKYNEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLTRLSSEDSAVYYCARRDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO: 1
LCVR 9E5
DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGESPKLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASLVPWTFGGGTKLEIK
SEQ ID NO: 2
Последовательности CDR 9E5 показаны в таблице 2 ниже.
in vitro
Полученные последовательности вариабельной области прививали на последовательности константной области человеческого антитела IgG1 соответственно с получением последовательности химерного человеческого-мышиного антитела, и последовательность химерного антитела встраивали в вектор экспрессии pCP (приобретенный у MabSpace biology Co., Ltd.) с помощью методики молекулярного клонирования. Эти последовательности секвенировали и идентифицировали после амплификации с помощью ПЦР (молекулярно-биологические операционные методы, такие как молекулярное клонирование, выполняют в соответствии со стандартными операционными условиями и, в частности, можно сослаться на « Molecular Cloning: A Laboratory Manual»), и систему экспрессии на основе клеток HEK293 можно применять для получения химерного человеческого-мышиного антитела 9E5-C. Выполняли различные анализы активности  для определения характеристик химерных антител, очищенных с помощью аффинной хроматографии MabSelect SuRe (GE Lifesciences). Данные приведены в таблице 3.
Пример 4. Гуманизация мышиного антитела
Основываясь на типичной структуре CDR VH/VL полученного мышиного антитела 9E5, последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепей сравнивали с базой данных антител зародышевого типа для получения матриц зародышевого типа человека с высокой гомологией. Среди них каркасная область легкой цепи зародышевого типа человека получена из гена легкой κ-цепи человека, а каркасная область легкой цепи антитела по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой матрицу легкой цепи зародышевого типа человека Vk2-28/JK4 (9E5). Каркасная область тяжелой цепи зародышевого типа человека получена из тяжелой цепи человека, и каркасная область тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой матрицу тяжелой цепи зародышевого типа человека VH1-2/JH6 (9E5), показанную ниже.
Каркасная область тяжелой цепи 9E5 предпочтительно представляет собой матрицу тяжелой цепи зародышевого типа человека IGHV1-2 (SEQ ID NO: 9):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR.
Каркасная область легкой цепи 9E5 предпочтительно представляет собой матрицу легкой цепи зародышевого типа человека IGkV2-28 (SEQ ID NO: 10):
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP.
CDR мышиного антитела прививали к выбранным гуманизированным матрицам для замены гуманизированных вариабельных областей, а затем рекомбинировали с соответствующей константной областью IgG человека (предпочтительно тяжелая цепь представляет собой IgG1, а легкая цепь представляет собой κ-цепь). Затем, основываясь на трехмерной структуре мышиного антитела, встроенные остатки, остатки, которые прямо взаимодействуют с CDR, и остатки, которые оказывают значительное влияние на конформацию VL и VH, подвергали обратной мутации, а химически лабильные аминокислотные остатки CDR оптимизировали для получения конечных гуманизированных молекул.
hu9E5-H1a (SEQ ID NO: 11):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS
hu9E5-H1b (SEQ ID NO: 12):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS
hu9E5-H1c (SEQ ID NO: 13):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS
hu9E5-L1a (SEQ ID NO: 14):
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK
hu9E5-L1b (SEQ ID NO: 15):
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK
hu9E5-L1c (SEQ ID NO: 16):
DVLMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK
Конечные молекулы гуманизированного антитела hu9E5 (содержащие тяжелую цепь H1c и легкую цепь L1a) отбирали с помощью вышеуказанных тестов экспрессии и сравнения количества обратных мутаций в комбинациях легких цепей и тяжелых цепей, а также полных последовательностей легких цепей и тяжелых цепей, которые представлены под SEQ ID NO: 17-18 соответственно.
HC hu9E5
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 17
LC hu9E5
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO: 18
Пример 5. Данные тестирования гуманизированного антитела
Активность связывания, активность блокирования и подобные характеристики гуманизированных антител hu9E5 по настоящему изобретению в отношении CD40 человека и макака-резуса показаны в таблице 4.
Пример 6. Подавление роста опухоли у мышей с помощью антитела к CD40
+
+
7
+
+
+
+
Отбирали нормальную периферическую кровь человека и выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности PBMC здорового человека. Моноциты сортировали с применением набора микрогранул для CD14 клеток, и CD14 моноциты выделяли в соответствии с протоколом, прилагаемым к набору, т. е. 20 мкл микрогранул с антителом к CD14 добавляли на каждые 10 клеток и инкубировали при 4°C в течение 15 минут. Затем клетки вносили в магнитную колонку и промывали трижды. Собирали клетки из магнитной колонки, то есть CD14 моноциты. К CD14 моноцитам добавляли среду RPMI 1640, содержащую 10 нг/мл IL4 и 100 нг/мл GM-CSF, при этом моноциты культивировали в течение 6 дней (метод культивирования является традиционным методом в данной области техники) для осуществления индуцирования культуры клеток MoDC. К оставшимся клеткам добавляли RPMI 1640, содержащую IL-2, и суспендированные клетки собирали после культивирования (метод культивирования и метод сбора клеток являются традиционными в данной области техники). Т-клетки сортировали с применением набора микрогранул для CD3 клеток. Через шесть дней собирали клетки MoDC и CD3 Т-клетки соответственно и смешивали с клетками Raji (клеточный банк Шанхайского института биотехнологии, культивировали в среде RPMI1640, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки) при соотношении 1:5:20, и инокулировали каждой мыши NOG (Nanjing Galaxy Biopharma, адаптивное кормление в течение 5 дней) подкожно. Экспериментальных животных содержали в отдельном вентилируемом боксе с постоянными температурой и влажностью. Температура в помещении для разведения составляла 18,0-26,0°C, влажность составляла 40-70%, вентиляцию проводили 10-20 раз/час, а режим смены дня и ночи составлял 12 ч/12 ч.
3
2
Экспериментальные группы включали контрольную группу с антителом IgG1, hu9E5 и эталонным антителом G12, все из которых вводили в дозе 3 мг/кг. Пяти мышам в каждой группе клетки вводили один раз в неделю в течение шести недель с помощью трех последовательных введений. На протяжении всего эксперимента диаметр продольной оси и диаметр поперечной оси опухоли измеряли дважды в неделю с применением штангенциркуля и рассчитывали объем опухоли (мм) = 0,5 × (диаметр продольной оси опухоли × диаметр поперечной оси опухоли ). Относительную степень подавления опухоли TGI (%) рассчитывали с помощью следующего уравнения: TGI% = (1-T/C) × 100%. T/C% - относительная скорость роста опухоли, то есть процент относительного объема опухоли или вес опухоли в группе обработки и контрольной группе в определенный момент времени. Т и С - объем опухоли (TV) или вес опухоли (TW) в определенный момент времени в группе обработки и контрольной группе с IgG1 соответственно.
Результаты показали, что гуманизированное антитело к CD40 hu9E5 продемонстрировало очень значительный противоопухолевый эффект по сравнению с контрольным IgG1, при этом происходила почти полная элиминация опухоли после 21 дня введения.
Иллюстративный способ получения фармацевтической композиции на основе антитела (получение)
Первая стадия: антитело к CD40 (такое как hu9E5) и стабильный препарат получали в виде нерасфасованного препарата, содержащего антитело к CD40.
После фильтрации из нерасфасованного продукта отбирали пробу для теста на стерильность. Затем нерасфасованный продукт фильтровали через фильтрующий элемент из PVDF с размером пор 0,22 мкм и фильтрат собирали.
Вторая стадия: объем заполнения доводили до 1,1 мл и фильтратом заполняли флакон на 2 мл с пробками. Образцы отбирали в начале, середине и конце заполнения для измерения разницы в объеме заполнения.
Третья стадия: включали закаточную машину для выполнения закатки алюминиевой крышки.
Четвертая стадия: с помощью визуального осмотра подтверждали, что товар не имеет дефектов, таких как неправильное заполнение. Следующим шагом печатали и помещали этикетку на флакон. Затем печатали этикетку для картонной коробки, пока выполняли сворачивание картонной коробки. Продукт упаковывали. Наконец, на коробку наклеили этикетку для коробки.
Пример 7. Скрининг значения pH буферной системы для препарата на основе антитела к CD40
Следующие буферы составляли для получения препарата на основе антитела с концентрацией антитела к CD40, составляющей 50 мг/мл, и отбирали образцы для исследования стабильности при высокой температуре (40°C):
1) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,0;
2) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5;
3) 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, pH 5,0;
4) 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, pH 5,5;
5) 10 мМ янтарной кислоты-сукцината натрия, pH 6,0;
6) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5;
7) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
8) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 6,5.
Результаты показывают, что оптимальный диапазон pH для антител к CD40 составляет 5,0-6,0. В данном диапазоне pH отличия по каждой из SEC и CE между тремя буферными системами являются небольшими, а разброс по ICE находится в диапазоне 14,0% - 24,1%, что является более стабильным, чем в случае буферной системы (буфера) с pH 6,5.
Пример 8. Скрининг поверхностно-активных веществ для препаратов на основе антитела к CD40
Буферные системы на основе 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5, и 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, выбирали для получения препаратов на основе антитела к CD40, содержащих 50 мг/мл белка, 75 мг/мл сахарозы и различные типы поверхностно-активных веществ. Исследовали стабильность внешнего вида при 25°C следующих составов:
1) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5, содержащий 0,4 мг/мл полисорбата 80;
2) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5, содержащий 0,4 мг/мл полисорбата 20;
3) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 0,4 мг/мл полисорбата 80;
4) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 0,4 мг/мл полисорбата 20.
Результаты показывают, что полисорбат 80 является предпочтительным поверхностно-активным веществом.
Пример 9. Скрининг концентрации сурфактанта для препаратов на основе антитела к CD40
Буферную систему, содержащую 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, выбирали для получения препаратов на основе антитела к CD40, содержащих 50 мг/мл белка, 75 мг/мл сахарозы и полисорбат 80 в различных концентрациях:
1) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 0,1 мг/мл полисорбата 80;
2) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 0,2 мг/мл полисорбата 80;
3) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 0,4 мг/мл полисорбата 80;
4) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 0,6 мг/мл полисорбата 80;
5) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 0,8 мг/мл полисорбата 80.
Образцы разбавляли с помощью 0,9% раствора хлорида натрия для инъекций до концентрации белка, составляющей 0,5 мг/мл, соответственно,. Результаты по наличию нерастворимых частиц показали (см. таблицу 3), что при концентрации полисорбата 80, составляющей 0,1 мг/мл - 0,8 мг/мл, белок антитела к CD40 характеризовался хорошей совместимостью с хлоридом натрия, что свидетельствует о том, что вышеописанная концентрация полисорбата 80 характеризуется хорошим стабилизирующим действием; а затем вышеописанный образец помещали в инкубатор-встряхиватель (25°C, 300 об/мин) на 5 дней. Исходя из внешнего вида, выбрали концентрацию полисорбата 80, составляющую 0,4-0,8 мг/мл, предпочтительно 0,4 мг/мл.
Пример 10. Скрининг концентрации сахара для препаратов на основе антитела к CD40
Буферную систему, содержащую 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, выбирали для получения препаратов на основе антитела к CD40, содержащих 50 мг/мл белка, 0,4 мг/мл полисорбата 80 в различных концентрациях:
1) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 55 мг/мл сахарозы;
2) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 65 мг/мл сахарозы;
3) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 70 мг/мл сахарозы;
4) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 75 мг/мл сахарозы;
5) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5, содержащий 80 мг/мл сахарозы;
Результаты по осмотическому давлению для каждого образца показывают (см. таблицу 8), что препарат является изотоническим, когда концентрация сахарозы составляет 80 мг/мл.
Пример 11. Стабильность различных буферных систем для антитела к CD40
Следующие буферные системы применяли для получения препаратов на основе антитела к CD40, содержащих 50 мг/мл белка, 80 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80 и исследовали их стабильность при 25°C и 2-8°C.
1) 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5;
2) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5.
3) 10 мМ гистидина и уксусной кислоты, pH 5,5.
Результаты показали, что после 6 месяцев хранения при 25℃ буферная система на основе 10 мМ уксусной кислоты и ацетата натрия немного превосходила другие буферные системы, в то время как отличие между буферными системами на основе 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида и 10 мМ гистидина и уксусной кислоты было незначительным; после 6 месяцев хранения при 2-8℃ значительное отличие по качеству трех систем отсутствовало.
Пример 12. Влияние концентрации белка в препарате на стабильность
Буферную систему, содержащую 10 мМ гистидина и гидрохлорида, pH 5,5, выбирали для получения препаратов на основе антитела к CD40, содержащих 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и белок в различных концентрациях, составляющих 50 мг/мл, 25 мг/мл и 1 мг/мл. Исследовали высокотемпературную стабильность при 40°C для следующих составов:
1) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5, при концентрации белка, составляющей 50 мг/мл;
2) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5, при концентрации белка, составляющей 25 мг/мл;
3) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5, при концентрации белка, составляющей 1 мг/мл.
Результаты показывают, что концентрация белка в препаратах будет воздействовать на чистоту, при этом концентрации белка, составляющие 50 мг/мл и 25 мг/мл, характеризуются небольшим эффектом на чистоту, а стабильность препарата с концентрацией белка, составляющей 1 мг/мл, очевидно является низкой.
Пример 13. Полный скрининг ингредиентов препарата
Чтобы дополнительно оптимизировать концентрацию белка, концентрацию полисорбата 80 и pH, для дизайна DOE использовали программное обеспечение JMP, а модель RSM применяли для получения серии рецептур (см. ниже). Поскольку не было особо значительного отличия между данными о стабильности буферных систем на основе гистидина и гистидина гидрохлорида (His-HCl) и гистидина и уксусной кислоты (His-AA), а диапазон pH буфера на основе His-HCl превышает 5,5, His-AA выбирали в качестве буфера для DOE-эксперимента по скринингу. В буферной системе, содержащей 10 мМ гистидина и уксусной кислоты (His-AA), получали препараты на основе антитела к CD40 с различными концентрациями белка, различными концентрациями полисорбата 80 и 80 мг/мл сахарозы, и образцы для анализа стабильности хранили при 40°C:
(1) 0,4 мг/мл полисорбата 80, pH 5,0, содержащий 40 мг/мл CD40;
(2) 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5, содержащий 10 мг/мл CD40;
(3) 0,4 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5, содержащий 25 мг/мл CD40;
(4) 0,4 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5, содержащий 25 мг/мл CD40;
(5) 0,4 мг/мл полисорбата 80, pH 5,0, содержащий 10 мг/мл CD40;
(6) 0,6 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0, содержащий 40 мг/мл CD40;
(7) 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 5,0, содержащий 25 мг/мл CD40;
(8) 0,2 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0, содержащий 40 мг/мл CD40;
(9) 0,6 мг/мл полисорбата 80, pH 5,0, содержащий 25 мг/мл CD40;
(10) 0,4 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5, содержащий 40 мг/мл CD40;
(11) 0,6 мг/мл полисорбата 80, pH 5,5, содержащего 10 мг/мл CD40;
(12) 0,4 мг/мл полисорбата 80, pH 6,0, содержащий 10 мг/мл CD40.
Результаты показывают, что при значении pH от 5,0 до 6,0, концентрации полисорбата 80 от 0,2 до 0,6 мг/мл и концентрация белка от 10 до 40 мг/мл, колебания вышеуказанных параметров не оказывали большого влияния на стабильность. Диапазон pH, указанный в рецептуре, составлял 5,0-6,0, поэтому среднее значение, составляющее 5,5, приняли за конечное значение pH, а 0,4 мг/мл за конечную концентрацию полисорбата 80 с общим учетом результатов предыдущего скрининга, и концентрацию белка установили как 25 мг/мл.
Пример 14. Стабильность антитела к CD40 в различных буферных системах при лиофилизации
Поскольку буферная система на основе уксусной кислоты (ацетата натрия) может сдвигать значение pH после восстановления из-за испарения во время лиофилизации, она не подходит для применения в качестве буферной системы для лиофилизированных препаратов. Два типа буферов, как, например, на основе 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида (His-HCl), pH 5,5, и 10 мМ гистидина и уксусной кислоты (His-AA), pH 5,5 выбрали для получения препаратов на основе антитела к CD40, содержащих 50 мг/мл белка, 80 мг/мл сахарозы и 0,4 мг/мл полисорбата 80. Объем заполнения составлял 1,2 мл/бутыль, а процесс лиофилизации является таким, как показано в таблице 13.
1) 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5;
2) 10 мМ гистидина и уксусной кислоты, pH 5,5.
Лиофилизированный продукт имел надлежащую форму лепешки, после восстановления внешний вид был прозрачным, и не наблюдали никаких явных изменений pH и чистоты, это свидетельствует о том, что процесс лиофилизации прошел хорошо. Результаты показывают, что два типа буферов, такие как буферы на основе 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5, и 10 мМ гистидина и уксусной кислоты, pH 5,5, оба подходят для использования в качестве буферных систем для препаратов на основе антитела к CD40.
Пример 15. Другие альтернативные препараты
Кроме того, в настоящем изобретении также представлены фармацевтические препараты на основе антитела к CD40 с другими препаратами, включая без ограничения:
(1) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,5;
(2) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,8;
(3) 25 мг/мл антител к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
(4) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,6;
(5) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 5,8;
(6) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ гистидина и гистидина гидрохлорида, pH 6,0;
(7) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,0;
(8) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,5;
(9) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 6,0;
(10) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,0;
(11) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,5;
(12) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 5,8;
(13) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе гистидина и уксусной кислоты, pH 6,0;
(14) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,4 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5;
(15) 25 мг/мл антитела к CD40, 80 мг/мл сахарозы, 0,6 мг/мл полисорбата 80 и 10 мМ буфера на основе уксусной кислоты и ацетата натрия, pH 5,5.
Результаты экспериментов показывают, что препараты на основе антитела к CD40 с препаратами, определенными выше, характеризуются надлежащей стабильностью и могут применяться для получения лекарственных препаратов на основе антитела к CD40.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДИСИН КО., ЛТД;
ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД
<120>  ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛ К CD40 И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  P19404528C
<150>  CN201811448238.5
<151>  2018-11-30
<160>  18
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Домовая мышь (Mus musculus)
<400>  1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Thr Arg Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100                 105                 110
<210>  2
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Домовая мышь (Mus musculus)
<400>  2
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Glu Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  3
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Домовая мышь (Mus musculus)
<400>  3
Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr Trp Ile Thr
1               5                   10
<210>  4
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Домовая мышь (Mus musculus)
<400>  4
Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ser
<210>  5
<211>  3
<212>  БЕЛОК
<213>  Домовая мышь (Mus musculus)
<400>  5
Arg Asp Tyr
1
<210>  6
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Домовая мышь (Mus musculus)
<400>  6
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
<210>  7
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Домовая мышь (Mus musculus)
<400>  7
Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>  8
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Домовая мышь (Mus musculus)
<400>  8
Phe Gln Ala Ser Leu Val Pro Trp Thr
1               5
<210>  9
<211>  98
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg
<210>  10
<211>  100
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro
100
<210>  11
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100                 105                 110
<210>  12
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100                 105                 110
<210>  13
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100                 105                 110
<210>  14
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  15
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  15
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  16
<211>  112
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  16
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  17
<211>  442
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr
20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
100                 105                 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
115                 120                 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
130                 135                 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
165                 170                 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
180                 185                 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
195                 200                 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
210                 215                 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225                 230                 235                 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245                 250                 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
260                 265                 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275                 280                 285
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
290                 295                 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305                 310                 315                 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
325                 330                 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
340                 345                 350
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355                 360                 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370                 375                 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385                 390                 395                 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405                 410                 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420                 425                 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440
<210>  18
<211>  219
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<400>  18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<---