СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ МАНИФЕСТНОЙ И АСИМПТОМНОЙ ФОРМ УРЕТРИТА, ОБУСЛОВЛЕННОГО УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ, У МУЖЧИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА
DIFFERENTIAL DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR MANIFEST AND ASYMPTOMATIC FORMS OF URETHRITIS CAUSED BY OPPORTUNISTIC MICROORGANISMS IN MALES OF REPRODUCTIVE AGE

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления и дифференциальной диагностики манифестной и асимтпомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста.
До настоящего времени этиологическая структура негонококковых уретритов (НГУ) окончательно не изучена. С 2001 года в структуре инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), отмечается рост негонококковых уретритов, так, по данным зарубежных и отечественных авторов, ежегодно в мире регистрируется более 90 миллионов новых случаев (НГУ), в России - более 350000. (Aral S.O., Fenton К.A., Holmes K.K., Sexually transmitted diseases in the USA: temporal trends. Sex Transm Infect 2007; 83: 257-66.) (Здоровье населения России и деятельность учреждений здравоохранения в 2000 году (статистические материалы) МЗ РФ, Москва 2001, С.55-56.)
Урогенитальные заболевания мужчин, обусловленные условно-патогенной биотой, являются одной из актуальных проблем современной медицины. По данным Н.А.Лопаткина и соавторов уретриты, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами, занимают от 30 до 50% в структуре всех инфекционных уретритов. (Аполихин О.И. Урология [Текст]. / О.И.Аполихин, Н.А.Лопаткин, А.Г.Пугачев. // ГЭОТАР-Медиа. - 2007. - 520 с.) Зарубежные исследователи (Hanno P.M., Malkowicz S.В., Wein A.J. (ed.) Clinical Manual of Urology, 3rd Edition. McGraw-Hill, N.Y. 2001; Aral S.O., Fenton K.A., Holmes K.K., Sexually transmitted diseases in the USA: temporal trends. Sex Transm. Infect. 2007; 83: 257-66) констатируют факт увеличения числа негонококковых нехламидийных уретритов (НГНХУ) в структуре ИППП развитых стран - Великобритании, США, что связано не только с ростом числа уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, но и высокой эффективностью современных методов лабораторной диагностики, позволяющих выявлять возбудителей инфекционно-воспалительных процессов даже при низких концентрациях последних в клиническом образце, что характерно для асимптомных форм воспаления.
По данным различных авторов уретриты, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами, чаще диагностируются у мужчин репродуктивного возраста от 20 до 35 лет в период наибольшей сексуальной активности и репродуктивной потенции. (Адаскевич В.П. Инфекции, передаваемые половым путем. М.: «НГМД». 2004. - 416 с. Аковбян В.А. Негонококковые уретриты у мужчин: этиология, особенности диагностики и лечения. // Справочник поликлинического врача. - 2007. - №9 - С.58-62.)
Окончательно не решен вопрос количественно-качественного состава нормобиоты уретры мужчин, что не позволяет однозначно и достоверно интерпретировать результаты лабораторного обследования, затрудняет своевременную постановку диагноза, приводит к отсроченной и нерациональной терапии уже на стадии развития осложнений. Данные отечественной и зарубежной литературы, касающиеся количественно-качественного состава нормобиоты уретры здоровых мужчин, противоречивы. Так, по данным отечественных авторов в уретре здоровых мужчин выделяют от 10 до 26 видов микроорганизмов, а по данным зарубежных - более 50. (Овчинников Н.М. Гонококк и лабораторная диагностика гонореи. - М.: 1952; Bacteriology of the urethra in normal men and men with nongonococcal urethritis. W.R.Bowie, H.М.Pollock, P.S.Forsyth, J.F.Floyd, E.R.Alexander, S.P.Wang, and K.K.Holmes, J Clin Microbiol. 1977 November; 6(5): 482-488. H.F.Helmholtz. Determination of the bacterial content of the urethra: a new method, with results of a study of 82 men // J. Urol. 1950; 64: P.158.)
Согласно современным представлениям, нормобиотой уретры здоровых мужчин принято считать факультативно-анаэробные и аэробные микроорганизмы: Peptococcus, Peptostreptococcus, Bacteroides, Eubacterium, Clostridium, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Enterococcus faecalis, Neisseria spp., Escherichia coli, Proteus spp., Corynebacteria, Pseudomonas aeruginosae. (The Normal Flora of Humans (Ken Todar's Microbial World 2006)).
Однако согласно данным результатов бактериологического исследования клинического материала уретры мужчин при (НГНХУ) и простатитах, выполненных в различных лабораториях, в одних случаях идентифицируют E.coli, P.aeruginosae, Serratia, Klebsiella, Proteus spp. (Деревянко И.И. Бактериальный простатит: этиология, клиника, лечение. // Consilium medicum. 2004; Т6. №7. С.497-9.), в других - авторы предполагают роль грамположительных микроорганизмов Streptococcus faecalis, Staphylococcus saprophyticus и др.
Противоречивые результаты исследований убедительно доказывают необходимость изучения состава нормобиоты здоровых мужчин с применением более чувствительных и специфических методов амплификации нуклеиновых кислот, позволяющих идентифицировать также труднокультивируемые микроорганизмы, нередко вызывающие дисбиотические процессы в урогенитальном тракте (Мазо Е.Б. Хронический инфекционный простатит. // Материалы пленума правления Российского Общества урологов. Саратов, 2004. С.267-289; Krieger J. N. et al. Epidemiology of prostatitis: new evidence for a world-wide problem. Wld J. Urol. 2003; 21 (2): 70-74. Krieger J.N., Ross S.O., Riley D.Е. Chronic prostatitis: epidemiology and role of infection. Urology 2002; 60 (6, suppl.): 8-12; discus.: 13). По данным исследователей А.П.Горбунова и Н.И.Скидан (Горбунов А.П., Скидан Н.И. Клиническое течение негонококковых уретритов ассоциированных с условно-патогенной микрофлорой у мужчин. // Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. №1, 2009. С. 32-38) при микробиологическом исследовании отделяемого уретры мужчин с (НГНХУ) в диагностически значимых титрах выявляли представителей семейства Micrococcaceae - Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus haemolyticus и Streptococcaceae, Enterococcus spp., Streptococcus agalacticae, негемолитический Streptococcus, α-гемолитический Streptococcus. Небольшую группу составили факультативные грамотрицательные палочки, бактерии семейства Enterobactehaceae, представленные Е.coli и Klebsiella spp. Из группы прочих возбудителей идентифицировали Gardnerella vaginalis, Corynebacterium spp., Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum и Candida albicans. В качестве возможных возбудителей инфекционно-воспалительного процесса в урогенитальном тракте в литературе описаны Bacteroides, Haemophilus influenza, Haemophilus parainfluenzae, Neisseria meningitides, Staphylococcus saprophyticus, Gardnerella vaginalis, Clostridium difficile, Corinebacterium genitalium. Однако при проведении контрольных исследований нередко оказывается, что данные возбудители чаще выявляются у здоровых лиц, чем у больных (НГНХУ). Кроме перечисленных микроорганизмов при (НГНХУ) определялись Streptococcus (Str.) pneumoniae, Str. viridans, Str. mitis, Str. sanguis, Str. anginosus, Str. agalactiae, Enterococcus faecium, N. subflava, N. per/lava и N. flava, Staphylococcus (Staph.) aureus, Staph. epidermidis, Corynebacterium pseudodiphtheriae, бактерии, входящие в роды Enterobacter Spp., Proteus Spp., Branhamella Spp., Moraxella Spp., Pseudomonas Spp. и их ассоциации.
Таким образом, вопросы этиологии (НГНХУ) остаются окончательно нерешенными, что приводит к несвоевременной клинической диагностике, не всегда корректной интерпретации полученных результатов лабораторных исследований, нерациональной терапии, что в свою очередь увеличивает полипрагмазию и ятрогению на разных этапах диагностического и лечебного процесса, повышает риск развития осложнений с нарушениями репродуктивной функции.
Уретрит, обусловленный условно-патогенной биотой не имеет спецефических, патогномоничных клинических симптомов.
Различают две основные формы уретрита - манифестную (острую) с выраженными клиническими симптомами и асимптомную (хроническую) со «стертыми» симптомами. (Тиктинский О.Л., Михайличенко В.В. Андрология. Санкт-Петербург. Медиа Пресс. 1999. С.47-50.)
В последние годы увеличилось число больных уретритом со «стертой» клинической симптоматикой. Данная форма уретрита характерезуется скудностью субъективных и объективных клинических симптомов, а в ряде случаев и их отсутствием, не позволяющим своевременно диагностировать патологический процесс. (Кульчавеня Е.В. «Современная терапия больных хроническим уретритом». Русский медицинский журнал. 2005. Т.13. №25. С.1688-1690; Локшин К.Л. Негонококковые уретриты у мужчин. Трудный пациент №3, том 7, 2009 г. Bradshaw С. et al. Etiologies of Nongonococcal Urethritis: Bacteria, Viruses, and the Association with Orogenital Exposure // J. Infect. Dis. 2006; 193: P. 336-45; Lanjouw E, Ossewaarde JM, Stary A, Boag F, van der Meijden WI European guideline for the management of Chlamydia trachomatis infections. Int J STD AIDS. 2010 Nov; 21(11): 729-37.2010.)
По данным литературы более 20% пациентов имеют «стертые» симптомы, что объясняет позднее обращение пациентов в лечебно-профилактические учреждения (ЛПУ) и приводит к развитию таких осложнений, как орхит, везикулит, эпидидимит, простатит, что повышает риск нарушения репродуктивной функции.
Согласно результатам исследований зарубежных авторов в развитых странах регистрируется снижение фертильности мужчин и ухудшение качества спермы. Фактор мужского бесплодия составляет от 30% до 60% (Е.Е.Брагина, Р.А.Абдумаликов. «Руководство по сперматологии». Москва, 2002 г.).
Как известно, острые воспалительные процессы могут приводить лишь к временному расстройству репродуктивной функции, а хронические, длительно и асимптомно протекающие вызывают более стойкие нарушения, трудно поддающиеся терапии даже с учетом применения антибактериальных препаратов широкого спектра действия. (В.И.Кисина, В.П.Ковалык, Г.Л.Колиева. «Критерии выбора рекомендованных и альтернативных методов лечения урогенитальных инфекций». Трудный пациент. 2005; 3 (2): 3-6; Молочков В.А., Ильин И.И. «Хронический уретрогенный простатит». Медицина, 1998; 2004 гг. (переработанное и дополненное издание); Якубович А.И. Уретрогенный простатит: этиология, патогенез, клиника, современные подходы к терапии [Текст]. А.И.Якубович, А.Е.Чуприн. // Consilium medicum. - 2003. - Т.5, №3. - С.164-167; Krieger J.N. Prostalitis: what is the role of infection [Text]. / J.N.Krieger, D.L Riley // Inl.1 Anlimicrob Agents, - 2002. - №19. - P.475-479.)
Проблема дифференциальной диагностики манифестной и асимптомной форм уретритов, обусловленных условно-патогенной биотой, усугубляется отсутствием стандартов лабораторной диагностики, объективными ограничениями стандартных методов обследования и отсутствием специфических патогномоничных клинических симптомов.
Стандартные методы лабораторного обследования мужчин на урогенитальные заболевания (микроскопия мазков, окрашенных метиленовым синим и по Граму, бактериологическое исследование) не позволяют провести обследование в полном объеме в силу объективных ограничений данных методологий, что в значительной степени затрудняет дифференциальную диагностику на ранних стадиях в короткие сроки до развития осложнений с нарушением репродуктивной функции.
В настоящее время для диагностики и дифференциальной диагностики форм уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, используют комплекс методов клинической и лабораторной диагностики.
Клиническая диагностика включает выяснение и анализ жалоб, сбор анамнеза и физикальный осмотр пациента (Шабад А.Л. 2 Учебное пособие по урологии: - 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1990. - 288 с. 40-49, Бодяжина В.И., Жмакин К.Н. Учебник гинекологии. Второе издание, переработанное и дополненное. Изд-во «Медицина», Москва - 1967. - с.32-55; Василевская Л.Н., Грищенко В.И., Кобзева Н. и соавт. Гинекология. - М.: Медицина, 1985. - с.31-64).
Результаты клинического субъективного и объективного осмотра позволяют установить наличие или отсутствие клинических симптомов воспалительного процесса, степень его выраженности, топику поражений, наличие или отсутствие осложнений.
Однако результаты клинической диагностики при отсутствии клинических симптомов воспаления не позволяют исключить наличие инфекционно-воспалительного процесса в уретре и урогенитальном тракте в целом. Кроме того, клиническое обследование не позволяет установить этиологическую структуру уретритов, которая определяет этиотропное лечение, поскольку этиологические факторы заболевания выявляются исключительно с помощью лабораторных методов исследования.
В большинстве случаев асимптомные формы уретритов протекают длительно и диагностируются уже на стадии развития осложнений с нарушением репродуктивной функции.
Микроскопическое исследование (Анкирская А.С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища. / Клин. микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. - №2. - Т.3 - с.101-105; Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций.- М.: Мед. книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003.- 336 с.), наряду с многочисленными достоинствами, имеет ряд объективных ограничений, затрудняющих полноценную объективную диагностику и дифференциальную диагностику форм уретритов. Метод не позволяет объективно определять качественно-количественный состав биоты уретры.
Микроскопия мазков, окрашенных метиленовым синим и по Граму, позволяет определять не более 10-ти морфотипов (лактобациллы, гарднереллы, бактероиды, мобилункус, фузобактерии, лептотрихии, вейлонеллы, дрожжеподобные грибы, грамположительные кокки, колиформные палочки) различных микроорганизмов, лейкоцитарную реакцию - ее наличие, степень выраженности, проявление фагоцитоза, его завершенность. По данным Г.А.Дмитриева (2003) чувствительность микроскопии составляет от 45% до 70%, специфичность до 70%, что в значительной степени определяется качеством преаналитического этапа исследования и профессиональной квалификацией врача клинической лабораторной диагностики.
5
5
Принципиальным недостатком метода является то, что при микроскопии можно выявить только те микроорганизмы, которые обладают достаточными размерами для визуализации при световой микроскопии, и их количество в биопробе должно превышать 10 КОЕ/мл. Кроме того, факультативно-анаэробные бактерии, нередко являющиеся ассоциантами воспалительных процессов, могут проявлять свои патогенные свойства при сравнительно небольшом количестве (менее 10 КОЕ/мл), которое не выявляется при микроскопии. Даже если факультативно-анаэробные бактерии обнаруживаются в препарате, то эти морфотипы схожи у многих видов и родов, тогда как их патогенные свойства и чувствительность к антибиотикам могут значительно отличаться. Ряд анаэробных бактерий, например Atopobium vaginae, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis и т.д., не визуализируются при микроскопии.
При отсутствии объективных лабораторных признаков воспаления в мазках, окрашенных метиленовым синим и по Граму, и отсутствии выраженных клинических симптомов невозможно исключить уретрит со «стертыми» клиническими симптомами или асимптомные. Способ не позволяет провести дифференциальную диагностику форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, и выявить этиологическую структуру инфекционно-воспалительного процесса.
Известен способ диагностики уретритов методом микробиологического (культурального) исследования (Скала Л.З., Сидоренко С.В., Нехорошева А.Г., Лукин И.Н., Грудинина С.А. Практические аспекты современной клинической микробиологии. - Тверь: ООО Издательство «Триада», 2004.-312 с.), позволяющего установить видовой состав аэробных, факультативно-анаэробных и некоторых облигатно-анаэробных бактерий, в том числе обнаруженных при микроскопии дрожжевых грибов рода Candida. После количественной оценки роста микроорганизмов на питательных средах определяется их этиологическая значимость у конкретного пациента.
3
5
3
Так, например, при использовании культуральной диагностики принято считать нормобиотой урогенитального тракта мужчины следующие показатели: 1) общая микробная обсемененность - не превышает 10-10 КОЕ/мл; 2) абсолютно преобладают аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы - стрептококки и стафилококки; 3) другие условно-патогенные микроорганизмы определяются в низком титре (10 КОЕ/мл) или отсутствуют.
До настоящего времени этот метод остается «золотым стандартом» лабораторной диагностики любого инфекционно-воспалительного процесса, в том числе и уретритов обусловленных условно-патогенной биотой.
Однако и он не лишен ряда серьезных недостатков. Условно-патогенная биота, являющаяся причиной разнообразных воспалительных процессов, главным образом, представлена анаэробными микроорганизмами. Для культивирования анаэробов требуются специальные лаборатории, оснащенные дорогостоящим лабораторным оборудованием для создания анаэробных условий, высококачественные селективные питательные среды и высококвалифицированные врачи микробиологи. Подавляющее большинство лечебных учреждений практического здравоохранения в настоящее время не имеют подобных высокотехнологичных лабораторий. Кроме того, в последние годы с помощью методов молекулярной диагностики были обнаружены этиологически значимые условно-патогенные микроорганизмы, такие как Atopobium vaginae, Ureaplasma urealiticum, Mycoplasma genitalium и др., относящиеся к группе труднокультивируемых.
Существенным недостатком метода являются также длительные сроки культивирования (в среднем 7 дней) микроорганизмов и необходимость сохранения жизнеспособности микроорганизмов до момента поступления биоматериала в лабораторию, а также отсутствие возможности контроля качества преаналитического этапа, определяющего эффективность любого лабораторного анализа в целом.
Помимо этого, культуральное исследование не позволяет проводить дифференциальную диагностику форм уретритов, даже с учетом выявленных условно-патогенных микроорганизмов.
Известен метод молекулярной диагностики - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Суть метода ПЦР (Mullis K.B. The unusual origin of the polymerase chain reaction // Sci. Am., 1990, 262, 56) состоит в том, что в исследуемый образец, предположительно содержащий тот или иной микроорганизм, вносятся синтезированные в лаборатории нуклеотидные последовательности (праймеры), комплементарные генетическому материалу искомого микроорганизма. Такие праймеры способны специфически взаимодействовать с геномной ДНК (РНК) исследуемого микроорганизма. В процессе амплификации происходит нарастание концентрации специфических молекул ДНК в геометрической прогрессии, и после 30-40 циклов она достигает значений, при которых становится возможной визуальная регистрация молекул ДНК после фракционирования в агарозном или акриламидном гелях.
Способ позволяет в короткие сроки (в течение нескольких часов) выполнить идентификацию любых аэробных и анаэробных условно-патогенных и облигатных микроорганизмов в биопробе, полученной из уретры. Так, например, в соответствии с данными Европейских стандартов диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем (2004), чувствительность ПЦР в диагностике хламидийной инфекции составляет 70-95%, специфичность 97-99%. К достоинствам метода следует отнести возможность тестирования большого количества образцов, использование как инвазивных, так и неинвазивных клинических образцов.
Диагностическая ценность ПЦР признана во всем мире, и данный метод широко используется в лабораторной практике, в том числе для идентификации условно-патогенной микробиоты урогенитального тракта - Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma spp. и т.д.
Однако ПЦР дает возможность только качественной характеристики (позволяет идентифицировать микроорганизмы до вида), без определения количественной характеристики исследуемого условно-патогенного микроорганизма и их ассоциаций, поэтому невозможно установить этиологию уретрита и дифференцировать формы, даже в совокупности с микроскопией мазков, окрашенных метиленовым синим и по Граму, наличии или отсутствии клинических симптомов. Полноценная и объективная дифференциальная диагностика форм уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, позволит избежать диагностических ошибок и назначения нерациональной, патогенетически необоснованной терапии, которая усугубляет течение уретрита.
Кроме того, в процессе проведения ПЦР возможно получение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Основной причиной ложноположительных результатов является так называемая перекрестная контаминация продуктами амплификации. Ложноотрицательные результаты регистрируются из-за наличия в исследуемой пробе ингибиторов реакции. Процент ошибочных результатов ПЦР исследования повышается при использовании некачественных диагностических наборов и лабораторного оборудования, нарушении санитарно-эпидемиологического режима, а также при недостаточной квалификации персонала, выполняющего лабораторное исследование. (Пособие для врачей. Полимеразная цепная реакция в диагностике урогенитальных инфекций. Москва. - 2000. - 16 с.)
Совершенствование методов молекулярно-генетических исследований привело к созданию метода ПЦР в «реальном времени». Известен способ диагностики дисбаланса микробиоты различных биотов человека и степени его выраженности (RU 2362808, МПК C12Q 1/68, 2009 г.), заключающийся в том, что с помошью метода полимеразной цепной реакции в «реальном времени» в исследуемой биопробе определяют общее число геномов микроорганизмов, характерных для конкретного биотопа, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты, полученные величины сравнивают между собой, определяют соотношение между числом геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты. По значению полученного показателя выставляют вариант нормы или диагностируют дисбаланс, устанавливают степень его выраженности путем определения соотношения геномов нормобиоты и общим числом геномов микроорганизмов, присутствующих в исследуемой биопробе, а также между числом геномов условно-патогенной биоты и нормобиоты. Данную методику используют для диагностики дисбаланса микробиоты и степени его выраженности у женщин.
Однако метод ПЦР в «реальном времени» не использовался для проведения дифференциальной диагностики форм уретритов и выявления этиологической структуры уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами у мужчин репродуктивного возраста.
В доступной литературе авторами не найдено источников информации с описанием способа дифференциальной диагностики манифестной и асимптомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста.
Задачей изобретения является создание доказательного способа дифференциальной диагностики манифестной и асимптомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста, позволяющего на ранних стадиях заболевания назначать адекватную этиотропную терапию, предупреждать развитие осложнений, в том числе бесплодие.
4,5-5.0
4,5-5.0
4,5-5.0
Сущность изобретения состоит в том, что способ дифференциальной диагностики манифестной и асимтпомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста, характеризуется тем, что проводят клинический осмотр пациента, для установления наличия или отсутствия клинических симптомов уретрита и степени их выраженности, после чего методом микроскопии проводят исследование взятых из уретры биопроб, в которых определяют не более 10 морфотипов микроорганизмов, наличие или отсутствие лабораторных признаков воспаления по количеству лейкоцитов в полях зрения и при наличии выраженных клинических симптомов и количестве ПМЯЛ более 5 предполагают наличие манифестной формы уретрита, а при отсутствии или слабой степени выраженности клинических симптомов и количестве ПМЯЛ менее 5 судят о наличии стертых клинических симптомов уретрита неясной этиологии, затем методом ПЦР у пациента исследуют биоту на наличие облигатных микроорганизмов, при отсутствии которых методом ПЦР в «реальном времени» определяют этиологическую структуру инфекционно-воспалительного процесса, для чего в биопробе из уретры определяют общее число геномов микроорганизмов, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты, полученное значение величины общего числа геномов микроорганизмов сравнивают с показателем нормы, установленной для мужчин репродуктивного возраста - 10, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты сравнивают с общим числом геномов микроорганизмов и между собой, и при общем числе геномов микроорганизмов не более 10, числе геномов нормобиоты, равном общему числу геномов микроорганизмов или меньшем его не более чем в 10 раз, числе геномов условно-патогенных микроорганизмов меньшем общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 раз, и превышении числа геномов нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты более чем в 10 раз или при отсутствии геномов условно-патогенной биоты определяют состояние нормы биоты уретры, оценивая данный показатель как вариант нормы, при общем числе геномов микроорганизмов более 10, числе геномов нормобиоты, меньшем его более чем в 10 раз, числе геномов условно-патогенной биоты, равном общему числу геномов или меньшем его менее чем в 10 раз, и превышении числа геномов условно-патогенных микроорганизмов числа геномов нормобиоты более чем в 10 раз устанавливают дисбиоз биоты и диагностируют уретрит, обусловленный условно-патогенными микроорганизмами, при этом на фоне выраженных клинических симптомов и количестве ПМЯЛ более 5 в результатах микроскопии диагностируют его манифестную форму, на фоне отсутствия или недостаточной степени выраженности клинических симптомов и количестве ПМЯЛ более 5 в результатах микроскопии диагностируют его асимптомную форму, а при варианте нормы по данным ПЦР на фоне отсутствия каких-либо клинических симптомов и количестве ПМЯЛ более 5 в результатах микроскопии биопробы диагностируют норму.
Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.
Впервые разработан способ дифференциальной диагностики манифестной и асимптомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста, который является высокоэффективным и доказательным. Он дает возможность провести достоверную дифференциальную диагностику манифестной и асимптомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенной биотой, и выявить этиологическую структуру уретрита.
Метод ПЦР в «реальном времени», обладающий более высокой информативностью (чувствительностью и специфичностью), объективностью в сравнении с другими методами лабораторной идентификации условно-патогенных микроорганизмов, позволяет контролировать качество выполнения преаналитического этапа лабораторного исследования, предотвращая тем самым вероятность диагностических ошибок.
Способ обладает высокой точностью, информативностью, объективностью и доказательностью, опираясь на количественные и качественные критерии. Он позволяет в короткие сроки, в течение суток, провести дифференциальную диагностику форм уретритов, выявить этиологическую структуру на основании объективных и точных результатов исследования пациента, назначить своевременное этиотропное лечение, а также осуществлять динамическое наблюдение за эффективностью проводимой терапии. Своевременно назначенная терапия позволяет предупредить развитие осложнений, связанных с нарушением репродуктивной функции (простатит, орхит, эпидидимит), и, как их следствие, бесплодия.
Объективно обоснованная дифференциальная диагностика манифестной и асимптомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, в том числе при сниженном иммунном ответе, позволит модифицировать терапевтические подходы с определением степени необходимого лекарственного вмешательства от местной терапии на уровне выявленных нарушений до системной лекарственной терапии.
Объективное определение этиологического значения конкретного условно-патогенного микроорганизма или их ассоциации в развитии уретрита позволяет минимизировать лекарственную терапию согласно принципу «необходимости и достаточности», избежать проведения дополнительного обследования, тем самым снизить риск развития ятрогении и полипрагмазии.
Технический результат достигается за счет новой технологии, разработанной авторами, в которой для дифференциальной диагностики манифестной и асимптомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста впервые использован метод ПЦР в «реальном времени», заключающийся в диагностике дисбаланса микробиоты различных биотопов человека и степени его выраженности (RU 2362808, МПК C12Q 1/68, 2009 г.), а также за счет совокупности его использования, и анализа полученных результатов исследований методами клинического осмотра, и микроскопии мазков отделяемого уретры.
Метод ПЦР в «реальном времени» является более информативным, точным и достоверным в сравнении с другими методами обследования за счет определения в биопробе уретры конкретного образца общего числа геномов бактерий, характерных для здоровых мужчин, числа геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты.
На основании сопоставления клинико-анамнестических данных, результатов лабораторных исследований и результатов статистического анализа авторами разработаны количественные и качественные критерии, позволяющие диагностировать нормобиоту и состояния дисбаланса биоты при уретрите, обусловленном условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста, что позволяет проводить объективную дифференциальную диагностику форм уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами.
В качестве количественного критерия предложен разработанный авторами показатель соотношения между общим числом геномов бактерий, характерных для мужчин репродуктивного возраста, числом геномов нормобиоты и отдельных условно-патогенных микроорганизмов у исследуемого пациента, позволяющий диагностировать нормобиоту или уретрит.
4,5-5.0
3
4,5
Авторы определили критерии нормобиоты уретры, характерные для здоровых мужчин репродуктивного возраста методом ПЦР в «реальном времени» с качественно-количественным определением условно-патогенной биоты: общее число геномов микроорганизмов (общая бактериальная масса) - не более 10 (5,0), например, для микроорганизмов Staphylococcus spp,. Streptococcus spp., Corynebacterium spp., Clostridium spp., Mobiluncus spp. показатель равен 10-10 (3,0-4,5).
3
При значениях нормобиоты, равных или меньших значений общего числа геномов микроорганизмов не более чем в 10 раз (-1), и превышении числа геномов представителей нормобиоты числа геномов представителей условно-патогенной биоты более чем в 10 раз и числе геномов условно-патогенных микроорганизмов, меньшем значения общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 раз (-2) в исследуемом образце; другие факультативно аэробные и анаэробные микроорганизмы не более 10 (3,0).
4,5-5.0
Аналогично, с помощью метода ПЦР в «реальном времени» разработаны критерии дисбаланса при уретрите: общая бактериальная масса более 10 (более 4,5-5,0); перечисленные микроорганизмы (Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Atopobium vaginae, Peptostreptococcus spp., Eubacterium spp., Candida spp, и другие микроорганизмы) в исследуемом образце, значения которых равны или меньше значений общего числа геномов микроорганизмов не более чем в 10 раз (-1), и превышают значения микроорганизмов нормобиоты более чем в 10 раз.
На основании результатов клинического осмотра, учитывая субъективные и объективные данные, устанавливают наличие или отсутствие клинических симптомов уретрита, степень выраженности симптомов, наличие или отсутствие осложнений со стороны органов урогенитального тракта.
На основании результатов микроскопии мазков устанавливают соответствие степени выраженности лабораторных признаков инфекционно-воспалительного процесса его субъективным и объективным клиническим симптомам за счет выявления лейкоцитарной реакции (более 5 полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) в полях зрения CDC, 2006) или ее отсутствие. Однако метод не позволяет определить этиологическую структуру инфекционно-воспалительного процесса, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, что затрудняет назначение своевременной этиотропной терапии.
При отсутствии клинических симптомов или их слабой степени выраженности результаты микроскопии неинформативны и в случае отсутствия лейкоцитарной реакции в результатах мазков исключить инфекционно-воспалительный процесс в уретре невозможно, что требует проведения дополнительного лабораторного обследования.
Результаты микроскопии не позволяют исключить асимптомные или «стертые» формы инфекционно-воспалительного процесса при наличии нормальных (менее 5 ПМЯЛ в полях зрения) лабораторных результатов, учитывая субъективизм данного критерия и возможность наличия у пациента сниженного иммунного ответа на инфекционный агент. Кроме того, на основании только результатов микроскопии установить этиологическую структуру уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, невозможно в силу объективных ограничений данного метода.
Использование метода ПЦР в «реальном времени» позволяет объективно точно и достоверно дифференцировать состояния нормобиоты и асимптомные формы уретритов, выявлять этиологическую структуру, за счет разработанных авторами критериев качественно-количественного состава нормобиоты и условно-патогенной биоты уретры, при информативной недостаточности микроскопии и клинического осмотра, что дает возможность своевременно назначить этиотропную терапию на ранних стадиях до развития осложнений с нарушением репродуктивной функции.
На основании совокупности и анализа полученных результатов клинического осмотра, микроскопии мазков, а главным образом объективных результатов исследования биоматериала уретры методом ПЦР в «реальном времени» с качественно-количественным определением условно-патогенной биоты достигается возможность провести с высокой точностью и в короткие сроки дифференциальную диагностику манифестной и асимптомной форм уретрита, установить этиологическую структуру уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, или констатировать состояние нормобиоты уретры у мужчин репродуктивного возраста.
Способ осуществляется следующим образом.
Пациенту проводят клинический осмотр, включающий: выяснение жалоб, сбор анамнеза, проведение общего объективного осмотра и пальпаторное исследование органов мошонки, предстательной железы (по показаниям).
При выполнении клинического осмотра у пациента выявляют наличие или отсутствие субъективных и объективных клинических симптомов: жалобы на зуд/жжение в уретре, выделения различного характера и степени выраженности, боль при мочеиспускании, отечность/гиперемия губок уретры, и/или головки полового члена, и/или крайней плоти, определяют топику поражений, возможные осложнения со стороны органов урогенитального тракта.
Учитывая субъективные и объективные данные, полученные при проведении клинического осмотра у пациента, устанавливают наличие или отсутствие клинических симптомов уретрита, степень их выраженности, наличие или отсутствие осложнений со стороны органов урогенитального тракта.
Независимо от наличия или отсутствия объективных и/или субъективных данных методом микроскопии проводят исследование взятых из уретры мазков, окрашенных метиленовым синим и по Грамму (Дмитриев Г.А. Лабораторная диагностика бактериальных урогенитальных инфекций. М.: Мед. книга, Н. Новгород: Издательство НГМА, 2003 г., с.336, Энциклопедия клинических лабораторных тестов./ Под ред. Н.У.Тица. Издательство "Лабинформ", - М. - 1997 - 942 с).
В мазках определяют не более 10 морфотипов микроорганизмов, наличие или отсутствие лабораторных признаков воспаления: количество лейкоцитов более 5 в полях зрения.
При наличии выраженных клинических симптомов: жалоб на зуд/жжение в уретре, выделений различного характера и степени выраженности, боли при мочеиспускании, отечности и гиперемии губок уретры, и/или головки полового члена, и/или крайней плоти и выявленных лабораторных признаков воспаления по результатам микроскопии: количестве ПМЯЛ более 5 в полях зрения предполагают наличие манифестной формы уретрита неясной этиологии.
При отсутствии или слабой степени выраженности субъективных и/или объективных клинических симптомов и лабораторных признаков воспаления по результатам микроскопии: количестве ПМЯЛ менее 5 в полях зрения судят о наличии стертых клинических симптомов уретрита.
Методом ПЦР (Mullis K.B. The unusual origin of the polymerase chain reaction // Sci. Am., 1990, 262, 56) исследуют биоматериал из уретры пациента на наличие инфекционно воспалительного процесса, обусловленного облигатными патогенами (Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Herpes simplex virus, Human papillomavirus).
При отсутствии облигатных патогенов определяют этиологическую структуру инфекционно-воспалительного процесса для выявления наличия уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, и его формы путем проведения лабораторного исследования методом ПЦР в «реальном времени» с качественно-количественным определением условно-патогенных микроорганизмов.
Биоматериал из уретры для ПЦР в «реальном времени» получают при помощи стерильных, одноразовых уретральных зондов, помещают в пробирку типа Эппендорф с транспортной средой.
Из полученных образцов любыми стандартными методами, обеспечивающими достаточную очистку от веществ, ингибирующих ПЦР, выделяют суммарные нуклеиновые кислоты. Полимеразная цепная реакция выполняется на приборах, обеспечивающих техническую возможность постановки реакции ПЦР в режиме «реального времени» с наборами реагентов, обеспечивающих возможность исследования урогенитального тракта: реагенты для определения общего количества микроорганизмов; реагенты для определения представителей биоты урогенитального биотопа (например, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Corynebacterium spp., Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Atopobium vaginae, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma hominis и др.); реагенты для определения геномной ДНК человека (например, гена гормона роста).
По номеру цикла ПЦР в режиме «реального времени», на котором значения флуоресценции начинают фиксироваться прибором (чем больше искомой ДНК микроорганизма в образце, тем раньше флуоресцентный сигнал фиксируется прибором для проведения ПЦР в режиме «реального времени»), определяют общее количество геномов бактерий и геномов того или иного микроорганизма, как показатель контроля качества получения исследуемой биопробы определяют число геномов человека в исследуемом образце.
5
5
Для удобства сравнения количеств геномов представителей биоты, математическим путем значения номера цикла переводят в значения Log 10 геномов по формуле 50-Ct/3,4. В результате этой операции количество геномов микроорганизмов будет выражено в привычной для врача форме 10 в степени «n». Например: общее количество бактерий - 10, Streptococcus spp. - <10 и т.д.
Методом ПЦР в «реальном времени» в биопробе из уретры определяют общее число геномов микроорганизмов, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты.
4,5-5.0
Полученное значение величины общего числа геномов микроорганизмов сравнивают с показателем нормы, установленной для мужчин репродуктивного возраста - 10, число геномов нормобиоты и условно-патогенной биоты сравнивают с общим числом геномов микроорганизмов и между собой.
4,5-5.0
В качестве критерия нормы для мужчин репродуктивного возраста приняты установленные авторами значения: общее число геномов микроорганизмов (общая бактериальная масса) - не более 10 (5,0).
4,5-5.0
При общем числе геномов микроорганизмов не более 10, числе геномов нормобиоты, равном общему числу геномов микроорганизмов или меньшем его не более чем в 10 (-1) раз, числе геномов условно-патогенных микроорганизмов, меньшем общего числа геномов микроорганизмов более чем в 100 (-2) раз, и превышении числа геномов нормобиоты относительно числа геномов условно-патогенной биоты более чем в 10 (-1) раз, или при отсутствии геномов условно-патогенной биоты определяют состояние нормы биоты уретры, оценивая данный показатель как вариант нормы.
4,5-5.0
При общем числе геномов микроорганизмов более 10, числе геномов нормобиоты, меньшем его более чем в 10 раз, числе геномов условно-патогенной биоты, равном общему числу геномов или меньшем его менее чем в 10 раз, и превышении числа геномов условно-патогенных микроорганизмов числа геномов нормобиоты более чем в 10 (-1) раз устанавливают дисбиоз и диагностируют уретрит, обусловленный условно-патогенными микроорганизмами.
Затем для постановки дифференциального диагноза между манифестной и асимптомной формами уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, проводят сопоставление и анализ результатов ПЦР в «реальном времени» с данными клинической картины и микроскопического исследования биопробы из уретры.
При наличии уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, в результатах ПЦР в «реальном времени» на фоне выраженных клинических симптомов и количестве ПМЯЛ более 5 в полях зрения в результатах микроскопии устанавливают его манифестную форму.
Назначают этиологически направленную терапию на основании идентифицированных условно-патогенных микроорганизмов в результатах ПЦР в «реальном времени» согласно разработанным критериям.
При наличии уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами, по результатам ПЦР в «реальном времени» на фоне отсутствия или недостаточной степени выраженности клинических симптомов, количестве ПМЯЛ более 5 в полях зрения в результатах микроскопии устанавливают асимптомную форму уретрита.
Назначают этиологически направленную терапию на основании идентифицированных методом ПЦР в «реальном времени» микроорганизмов, согласно разработанным критериям.
При наличии состояния нормы по результатам ПЦР в «реальном времени», отсутствии каких-либо клинических симптомов и количестве ПМЯЛ более 5 в полях зрения в результатах микроскопии биопробы диагностируют вариант нормы.
4
Условием проведения исследования методом ПЦР в «реальном времени» с качественно-количественным определением условно-патогенной биоты является определение геномной ДНК человека в количестве не менее чем 10 геномов в исследуемом образце. В противном случае результат считается недостоверным вследствие нарушения техники получения биоматериала и непригодности биопробы для проведения лабораторного анализа.
Пример №1. Мужчина 26 лет, обратился к врачу с жалобами на выделения из уретры, чувство жжения при мочеиспускании.
При проведении клинического осмотра выявлены выделения из уретры слизистого характера серовато-желтоватого цвета, вязкой консистенции, губки уретры гиперемированы/отечны, уретра пальпаторно уплотнена, со стороны других органов урогенитального тракта патологии не выявлено.
На основании результатов клинического осмотра и результатов микроскопии (20-25 ПМЯЛ в тяже до 50 в полях зрения, грамположительная коккобацилярная биота) предположили наличие манифестной формы уретрита неясной этиологии.
Результаты культурального исследования не информативны, рост микроорганизмов не выявлен. Методом ПЦР наличие облигатных микроорганизмов (Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Herpes simplex virus, Human papillomavirus) не выявлено.
С целью определения этиологической структуры уретрита выполнено исследование методом ПЦР в «реальном времени» с качественно-количественным определением условно-патогенных микроорганизмов выявлено: 1) контроль взятия биоматериала составил 4,9 при норме от 4,0, общая бактериальная масса - 5,6 при норме не более 5,0; 2) показатели нормобиоты Staphylococcus spp. - 2,9; Streptococcus spp. - 3,6 меньше показателя общей бактериальной массы более чем в 10 раз; Corynebacterium spp. - 5,0 меньше значений общей бактериальной массы менее чем в 10 раз; 3) показатели условно-патогенной биоты: Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. - 5,3 (относительный показатель = 0,3, т.е. характеризуется как значимый и составляет разницу менее 10 (-1) по сравнению с общей бактериальной массой и превышает показатели Staphylococcus spp., Streptococcus spp. более чем в 10 раз), Peptostreptococcus spp. - 4,3 (относительный показатель = 1,3, т.е находится в пределах нормы), Eubacterium spp. - 4,9 (относительный показатель = 0,7, т.е. характерезуется как значимый и состовляет разницу менее 10 (-1) по сравнению с общей бактериальной массой и превышает значения Staphylococcus spp., Streptococcus spp. более чем в 10 раз), Atopobium vaginae - 2,2 (относительный показатель = 3,1, т.е разница состовляет более 100 (-2) по сравнению с общей бактериальной массой, расценивается как в пределах нормы), Megasph.spp/Veilon.spp/Dialist.spp. - 4,0 (относительный показатель = 1,3, т.е разница состовляет более 100 (-2) по сравнению с общей бактериальной массой, расценивается как в пределах нормы), Mycoplasma spp., Ureaplasma spp. не выявлены.
У пациента диагностирован уретрит, обусловленный условно-патогенными микроорганизмами: Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp., обнаружены объективные лабораторные критерии инфекционно-воспалительного процесса в уретре.
Проведен комплексный анализ и сопоставление результатов ПЦР в «реальном времени», микроскопии мазков и данных клинического осмотра, с учетом выраженных клинических симптомов, результатов микроскопии (20-25 ПМЯЛ в тяже до 50 в полях зрения, грамположительная коккобацилярная биота). У пациента репродуктивного возраста диагностирована манифестная форма уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами (Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium spp.).
Пациенту назначена своевременная этиотропная терапия.
Пример №2. Мужчина 35 лет, обратился к врачу с жалобами на чувство дискомфорта в уретре, периодически возникающие чувство жжения при мочеиспускании. При осмотре объективных клинических симптомов не выявлено.
Результаты микроскопии мазков, окрашенных метиленовым синим и по Граму в пределах нормы (0-1-2 ПМЯЛ в полях зрения, грамм + кокки и палочки).
Результаты культурального исследования не информативны, рост микроорганизмов не выявлен. Методом ПЦР наличие облигатных микроорганизмов не выявлено.
Таким образом, на основании стандартных методов диагностики предположить или опровергнуть наличие инфекционно-воспалительного процесса - выявить этиологическую структуру - не удалось.
4
3
4
4
После чего проведено исследование биоматериала уретры методом ПЦР в «реальном времени» с качественно-количественным определением условно-патогенных микроорганизмов, было выявлено: 1) биоматериал был взят в достаточном количестве (5,6) при норме от 4,0; общая бактериальная масса = 6,0 превышает норму (норма не более 5,0); 2) показатели микроорганизмов (Staphylococcus spp,. Streptococcus spp., Corynebacterium spp) не превышали 4,0 (10), т.е. снижены по сравнению с общей бактериальной массой более чем в 10 (-1) раз; 3) показатели условно-патогенной биоты: Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas spp. - 5,2 (относительный показатель = 0,8, т.е. расценивается как значимый, т.к. разница с общей бактериальной массой менее чем в 10 (-1) раз и превышает (Staphylococcus spp,. Streptococcus spp., Corynebacterium spp.) более чем в 10 раз; Eubacterium spp. - 5,1 (относительный показатель = 0,9, т.е. расценивается как значимый, т.к. разница с общей бактериальной массой менее 10 (-1) раз и превышает (Staphylococcus spp,. Streptococcus spp., Corynebacterium spp.) более чем в 10 раз; Sneath.spp / Lept.spp / Fusobac.spp - 5,4 (относительный показатель = 0,6, т.е. расценивается как значимый, т.к. разница с общей бактериальной массой менее чем в 10 (-1) и превышает (Staphylococcus spp,. Streptococcus spp., Corynebacterium spp.) более чем в 10 раз, кроме перечисленных микроорганизмов были выявлены Megasph.spp / Veilon.spp / Dialist.spp., Atopobium vaginae, Peptostreptococcus spp. в значениях 10-10, данные показатели находились в пределах нормы. Кроме установленных изменений абсолютных и относительных показателей условно-патогенных микроорганизмов у пациента были выявлены Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum в диагностически значимых величинах 10.
У пациента диагностирован уретрит, обусловленный условно-патогенными микроорганизмами: Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas spp., Sneath.spp / Lept.spp / Fusobac.spp., Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, обнаружены объективные лабораторные критерии инфекционно-воспалительного процесса в уретре.
Проведен комплексный анализ и сопоставление результатов ПЦР в «реальном времени», микроскопии мазков и данных клинического осмотра, с учетом «стертых» клинических симптомов, результатов микроскопии (0-1-2 ПМЯЛ в полях зрения, грамположительные кокки и палочки).
У пациента репродуктивного возраста диагностирована асимптомная форма уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами (Gardnerella vaginalis / Prevotella bivia / Porphyromonas spp., Sneath.spp / Lept.spp / Fusobac.spp., Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum).
Пациенту назначена своевременная этиотропная терапия.
Пример №3. Мужчина 24 года, обратился к врачу с целью профилактического обследования на ИППП. Жалоб при обращении не предъявлял. При объективном клиническом осмотре симптомов инфекционно-воспалительного процесса в органах урогенитального тракта не выявлено.
Результаты микроскопии мазков, окрашенных метиленовым синим и по Граму, в пределах нормы (0-1 ПМЯЛ в полях зрения, грам - палочки, грам + коккоки незначительно). Бактериологическое исследование не проводилось. Методом ПЦР облигатные микроорганизмы не выявлены.
5
4
2
После чего пациенту выполнили исследование методом ПЦР в «реальном времени» с качественно-количественным определением условно-патогенной биоты, определено: биоматериал был взят в достаточном количестве (10); общая бактериальная масса 10; показатели Streptococcus spp. -. 3,1 (относительный показатель = 0,9 в пределах нормы разница с общей бактериальной массой менее чем в 10 раз и превышает значения (Enterobacterium spp., Candida spp.,) более чем в 10 раз; Mobiluncus spp. / Corynebacterium spp. - 3,5 (относительный показатель = 0,5 в пределах нормы, т.к. разница с общей бактериальной массой менее чем в 10 раз; Enterobacterium spp., Candida spp., не превышали 10, т.е. разница с общей бактериальной массой более чем в 100 (-2) раз; других микроорганизмов у данного пациента не выявлено.
Выявленные микроорганизмы и их абсолютные и относительные значения менее чем в 10 раз (-1) превышали значение общей бактериальной массы и более чем в 10 раз значения микроорганизмов (Enterobacterium spp., Candida spp.), что позволило диагностировать вариант нормы.
Таким образом, при проведении профилактического обследования пациента на ИППП с использованием метода ПЦР в «реальном времени» с качественно-количественным определением условно-патогенных микроорганизмов удалость достоверно, объективно точно констатировать состояние нормобиоты и установить диагноз «практически здоров».
Полученные результаты свидетельствуют о высокой точности, объективности, информативности предложенного способа дифференциальной диагностики манифестной и асимптомной форм уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами у мужчин репродуктивного возраста.
В отличие от стандартных методов диагностики с помощью предлагаемого способа удалось: 1) достоверно и объективно дифференцировать манифестную или асимптомную форму уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами; 2) выявить этиологическую структуру уретрита; 3) назначать адекватную этиотропную терапию с применением различных групп антибактериальных препаратов.
Способ прошел клинические испытания на базе ГУЗ КВД №19 г.Москвы.
Обследовано 92 мужчины в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст составил 22±4,8 лет), обратившихся в КВД №19 г.Москвы с целью профилактического обследования или с лечебной целью.
На основании результатов стандартного обследования (клинический осмотр, результаты микроскопии) у 45 (48,9%) мужчин не выявлены признаки инфекционно-воспалительного процесса, у 14-ти (15,2%) мужчин полученные данные обследования позволили предположить наличие манифестной формы инфекционно-воспалительного процесса со стороны органов урогенитального тракта, у 33-х (35,9%) пациентов предположить или исключить инфекционно-воспалительный процесс не удалось в силу стертости клинической симптоматики и неинформативных результатов стандартных методов лабораторной диагностики.
В спектр обязательных диагностических мероприятий входило обследование на облигатные патогены (Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Herpes simplex virus, Human papillomavirus). Результаты РМП (реакция микроприципетации на сифилис), ИФА (иммуноферментный анализ) на ВИЧ, гепатит В и С были отрицательными.
Методом ПЦР в «реальном времени» с количественно-качественным определением условно-патогенной биоты было исследовано 92 образца отделяемого уретры мужчин.
Результаты исследования продемонстрировали наличие высокой эффективности, точности, информативности данного способа дифференциальной диагностики форм уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста.
Комплексное использование клинического осмотра, микроскопии мазков, окрашенных метиленовым синим и по Граму, ПЦР в «реальном времени» позволяют дифференцировать манифестную и асимптомную («стертые») формы уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами.
4
В ходе проведенного исследования состояние нормобиоты верифицировано у 28-ми (30,4%) из числа обследованных мужчин (n=92; 100%). У 64 (69,6%) мужчин методом ПЦР в «реальном времени» диагностированы объективные лабораторные признаки уретрита, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами. У 12 мужчин из 64-х, при отсутствии каких-либо клинических симптомов патологического процесса со стороны урогенитального тракта и наличии объективных признаков состояния нормобиоты, установленных методом ПЦР в «реальном времени», выявлены Mycoplasma hominis и/или Ureaplasma urealyticum в значениях 10, так как по данным литературы данные микроорганизмы могут определяться у здоровых лиц и входить в состав нормальной биоты уретры, пациенты были исключены из группы, хотя по результатам статистической проверки с использованием теста Манн-Уитни, различий между этими 12-ю пациентами и мужчинами с асимптомными или «стертыми» формами уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, не выявлены (Р=0,37), в отличие от группы мужчин с нормобиотой, где по результатам теста различия между 12-ю мужчинами и группой «практически здоровы» выявлены (Р=0,00).
Таким образом, манифестная форма уретрита была верефицирована у 14 (15,2%) мужчин, в остальных 38 (41,3%) случаях диагностированы асимптомные («стертые») уретриты, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами.
Полученные результаты исследования свидетельствуют о высокой точности и информативности способа дифференциальной диагностики манифестных и главным образом асимптомных или «стертых» форм уретритов, обусловленных условно-патогенными микроорганизмами, у мужчин репродуктивного возраста с помощью метода ПЦР в «реальном времени». Помимо этого методом ПЦР в «реальном времени» установлена этиологическая структура инфекционно-воспалительного процесса, что позволило назначить своевременную этиотропную терапию на ранних стадиях до развития осложнений.
Интерпретация результатов ПЦР в «реальном времени» с качественно-количественным определением условно-патогенных микроорганизмов не вызывает сложностей у врача, что повышает качество диагностического процесса, сокращает время постановки диагноза, позволяет назначать адекватную объективно обоснованную этиотропную терапию на ранних стадиях до развития осложнений с нарушением репродуктивной функции даже в ситуациях, когда применение стандартных методов обследования оказалось неинформативным.