СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
METHOD FOR DIFFERENTIAL DIAGNOSIS OF INFECTIOUS MONONUCLEOSIS OF VARIOUS AETIOLOGY

Изобретение относится к области лабораторной диагностики, медицинской вирусологии, молекулярной биологии и эпидемиологии и может быть использовано для дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр и вирусом герпеса человека 6 типа.
Инфекционный мононуклеоз (ИМ) - инфекционное вирусное заболевание, характеризующееся системным лимфопролиферативным процессом доброкачественного характера и сопровождающееся лихорадкой, генерализованной лимфаденопатией, тонзиллитом, гепатолиенальным синдромом и специфическими изменениями гемограммы.
Клинические проявления ИМ чрезвычайно разнообразны, зависят от возраста пациентов и этиологического фактора, что затрудняет своевременную диагностику заболевания. Начало заболевания может быть острым (60-70% случаев) или постепенным. Вирус сохраняется в организме после латентного или манифестного ИМ пожизненно. В связи с этим в ряде случаев ИМ может принимать хроническое рецидивирующее течение, а также трансформироваться в иммунодефицитное состояние.
Совокупность тонзиллита, лимфаденопатии, увеличение печени, селезенки и изменения белой крови в виде лимфоцитоза и атипичных мононуклеаров на фоне лихорадки представляет собой классический мононуклеозный комплекс и характерен для ИМ. Инкубационный период мононуклеоза колеблется в пределах 20-50 дней. Обычно заболевание начинается с продромальных явлений: появляются слабость, миалгия, головная боль, озноб, снижение аппетита, тошнота. Такое состояние может держаться от нескольких дней до 2 недель и может быть интерпретировано как мононуклеозоподоб-ный синдром. Встречается при аденовирусной инфекции, ангине, псевдотуберкулезе, хламидиозе, ВИЧ-инфекции, лимфопролиферативных заболеваниях. ИМ способен принимать образ острого лейкоза.
ИМ является полиэтилогическим заболеванием, вызываемым тремя вирусами из семейства герпесвирусов: вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ), цитомегаловирусом (ЦМВ) и вирусом герпеса человека 6 типа (ВГЧ6).
Ведущим возбудителем ИМ является ВЭБ. При ВЭБ-ассоциированном заболевании наиболее часто развиваются типичные формы ИМ с характерным симптомокомплексом. Однако, по данным разных авторов, до 5-30% случаев инфекционного мононуклеоза, негативного по гетерофильным антителам, приходится на ВГЧ6-мононуклеоз (ВГЧ6-ИМ) [Наследникова И.О. Функциональная активность моноцитов-периферической крови при инфекционном мононуклеозе // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2001. - №3. - С. 64-66.; Шарипова Е.В., Бабаченко И.В. Герпес-вирусные инфекции и инфекционный мононуклеоз (обзор литературы)//Журнал инфектологии. - 2013. - Т. 5, №2. - С. 5-12.]. При этом инфицирование ВГЧ6 происходит в раннем возрасте и носительство составляет от 80 до 100% взрослого населения [Новицкий В.В., Уразова О.И., Помогаева А.П. и др. Фагоцитарная активность моноцитов периферической крови при инфекционном мононуклеозе у детей // Бюллетень СО РАМН. - 2005. - №3 (117). - С. 48-51].
Инфекционный мононуклеоз, вызванный ВГЧ6, имеет сходную клиническую картину с ВЭБ-ассоциированным мононуклеозом. Однако лихорадка носит кратковременный характер, с умеренно выраженным интоксикационным синдромом. Тонзиллит выявляют у всех больных, при этом лишь в 50% случаев с наложениями. Лимфаденопатия в виде множественных мелких лимфоузлов всех групп определяется практически во всех случаях. У половины детей имеется увеличение печени и селезенки, в каждом третьем случае выявляют экзантемы. На практике клинические проявления ИМ чаще всего трактуются как ВЭБ-инфекция [Исаков В.А., Борисова В.В., Исаков Д.В. Герпес: патогенез и лабораторная диагностика: Руководство для врачей. - СПб.: Лань, 1999. - С. 114-127.].
Для лабораторного подтверждения ВЭБ-инфекции используют тест на выявление гетерофильных антител (ГФАТ), относящихся в основном к классу иммуноглобулинов (IgM), в его современной модификации (с латексным носителем гетероантигенов). Недостатком данного теста является его низкая эффективность у детей. Приблизительно у 40% детей до 4-летнего возраста ГФАТ не вырабатываются при первичной ВЭБ-инфекции [Horwitz СА, Henle W, Henle G et al. Clinical and laboratory evaluation of infants and children with Epstein-Barr virus-induced infectious mononucleosis: report of 32 patients (aged 10-48 months) // Blood. - 1981. - Vol. 57. - P. 933-938.]. Кроме того, ГФАТ неспецифичны, вследствие чего они могут выявляться при инфекциях, вызванных другими возбудителями, аутоиммунных и онкологических заболеваниях, а в небольшом количестве (титре) ГФАТ могут определяться в крови до года после инфицирования и развития ИМ.
Серологические методы позволяют не только подтвердить диагноз ИМ, но и определить стадию инфекции. Антитела к вирусному капсидному антигену (VCA) класса IgM являются маркером острой инфекции, они вырабатываются первыми и сохраняются в крови до 3 месяцев у 75% больных. IgG к VCA вырабатываются несколько позже и определяются в течение всей жизни, служа лабораторным маркером перенесенной ВЭБ-инфекции. Однако известны случаи ложноположительного выявления ВЭБ IgM VCA, что наиболее типично при ЦМВ-инфекции [Guerrero-Ramos A, Patel М, Kadakia K et al. Performance of the architect EBV antibody panel for determination of Epstein-Barr virus infection stage in immunocompetent adolescents and young adults with clinical suspicion of infectious mononucleosis // Clin Vaccine Immunol. - 2014. - Vol. 21. - P. 817-23.]. IgG к ядерному антигену ВЭБ (EBNA) начинают определяться с 3-6 месяца от начала заболевания, свидетельствуют об окончании острой стадии инфекции и сохраняются в течение всей жизни. IgG к ранним антигенам (ЕА) появляются в начале болезни, однако считаются наименее специфичными маркерами ВЭБ-инфекции, так как они выявляются только у 60-80% больных в острую фазу заболевания. Зачастую сохраняются пожизненно и могут быть обнаружены у 20% здоровых людей, перенесших ВЭБ [Crowley A., Connell J., Schaffer K. et al. Is there diagnostic value in detection of immunoglobulin g antibodies to the epstein-barr virus early antigen? // Biores Open Access. - 2012. - Vol. 1, №6. - P. 291-6.].
Для этиологической диагностики ИМ используют обнаружение ДНК герпесвирусов (ВЭБ, ЦМВ, ВГЧ-6) как в сыворотке крови, так и в слюне, причем в последней герпесвирусы выявлялись в разы чаще [Шарипова Е.В. Клинико-лабораторная характеристика и возрастные особенности инфекционного мононуклеоза у детей. Автореф. дис. … канд. мед. наук. СПбГПМА. Санкт-Петербург, 2012.]. Однако наличие ДНК ВЭБ в слюне может свидетельствовать как об острой инфекции, так и о перенесенной ранее инфекции. Учитывая, что в большинстве случаев инфицирование ВЭБ протекает бессимптомно, определение только ДНК, как правило, представляет лишь эпидемиологический интерес. Исследование биологических образцов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) остается высокочувствительным вспомогательным способом диагностики ВЭБ ИМ. Однако из-за способности герпесвирусов к пожизненной персистенции, ДНК вирусов можно обнаружить и при бессимптомном вирусоносительстве или латентной инфекции [Перадзе Х.Д. Клинико-лабораторные особенности острых и хронических форм Эпштейна-Барр вирусной инфекции (инфекционного мононуклеоза) у подростков и лиц молодого возраста: автореф. дис. … канд. мед. наук - СПб, 2003, 23 с.]. С другой стороны, гетерофильные антитела, подтверждающие диагноз ВЭБ-ассоциированногомононуклеоза, не являются диагностическим критерием ВГЧ-6- или ЦМВ-мононуклеоза, что, в свою очередь, требует проведение дополнительных исследований, таких как иммуноферментный анализ (ИФА) и ПЦР [Е.В. Новосад Инфекционный мононуклеоз, ассоциированный с вирусом герпеса 6 типа: автореф. дис. … канд. мед. наук - Москва, 2010, 22 с.]. Подтверждением острой ВЭБ-инфекции предлагается считать обнаружение ГФАТ, IgM VCA и IgG VCA при отсутствии EBNA, а также ДНК ВЭБ в плазме крови или периферических лимфоцитах и слюне при отсутствии EBNA, а острой ВГЧ-6-инфекции - обнаружение IgM при отсутствии IgG либо сероконверсию IgG, обнаружение ДНК ВГЧ-6 в плазме крови или периферических лимфоцитах и слюне при отсутствии IgG [М.А. Никольский, Е.Д. Соколова, Д.А. Лиознов Ошибки диагностики инфекционного мононуклеоза у детей// Консилиум-Медикум. Педиатрия. - 2016. - №3. - С. 24-28].
Задача изобретения - информативный и доказательный способ дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр и вирусом герпеса человека 6 типа, позволяющего назначать адекватную терапию и предупреждать развитие осложнений.
Поставленная задача решается определением в лейкоцитах периферической крови пациентов с диагнозом «инфекционный мононуклеоз» уровней экспрессии мРНК FADD, транскрипта 2 CIRBP и транскрипта 2 TRAF3 и при снижении экспрессии диагностируют ВЭБ-ассоциированный, а при повышении экспрессии - ВГЧ-6-ассоциированный инфекционный мононуклеоз.
Сущность способа иллюстрируется рисунками.
ФИГ. 1. Средний уровень экспрессии мРНК транскриптов генов в лейкоцитах периферической крови у здоровых доноров и пациентов с инфекционным мононуклеозом, ассоциированным с вирусом Эпштейна-Барр * - статистически значимые отличия по сравнению с нормой, q<0,05.
ФИГ. 2. Средний уровень экспрессии мРНК транскриптов генов в лейкоцитах периферической крови у здоровых доноров и пациентов с инфекционным мононуклеозом, ассоциированным с вирусом герпеса человека 6 типа * - статистически значимые отличия по сравнению с нормой, q<0,05.
ФИГ. 3. Средний уровень экспрессии мРНК транскриптов генов в лейкоцитах периферической крови у здоровых доноров и пациентов с инфекционным мононуклеозом, ассоциированным с вирусом Эпштейна-Барр, и с инфекционным мононуклеозом, ассоциированным с вирусом герпеса человека 6 типа * - статистически значимые отличия по сравнению с нормой, q<0,05.
Осуществление способа.
В изобретении представлены наборы биомаркеров ВЭБ- и ВГЧ-6-ассоциированного инфекционного мононуклеоза, включающие гены и транскрипты, регулирующие активацию, пролиферацию и апоптоз иммунокомпетентных клеток, выявленные в лейкоцитах периферической крови, сравнение экспрессии которых позволило выявить изменения, позволяющие дифференцировать патогены. Выбор биомаркеров проводили на основе анализа транскриптома лейкоцитов периферической крови детей и подростков в возрасте 7-18 лет с подтвержденным диагнозом «ВЭБ-ассоциированный инфекционный мононуклеоз» и «ВГЧ-6-ассоциированный инфекционный мононуклеоз» с помощью сплайсинг-ориентированных биочипов. В качестве группы сравнения выступали практически здоровые доноры сопоставимого возраста без клинических и лабораторных признаков заболевания.
Материалом для исследования послужили образцы периферической крови, из которых была выделена лейкоцитарная фракция. Далее из лейкоцитов был получен пул тотальной РНК, которую подвергали реакции обратной транскрипции с получением кДНК. кДНК гибридизовали на ДНК-биочип собственного дизайна для получения амперометрического сигнала, который принимали за уровень экспрессии гена или транскрипта.
Селекцию дискриминирующих зондов, являющихся функциональной основой биочипа, производили с использованием алгоритма "Splice variants microarray design pipeline" [Солнцев Л.А., Старикова В.Д., Сахарнов Н.А. и др. Стратегия подбора зондов для изучения совокупности мРНК участников рецептор-опосредованного сигналинга апоптоза // Молекулярная биология. - 2015. - Т. 49, №3. - С. 515-524]. Всего было выбрано 1115 зондов: 403 для оценки экспрессии генов, 712 для детекции уровней представленности индивидуальных транскриптов. Синтез зондов на биочип осуществлялся in situ с помощью оборудования В3 Synthesizer и соответствующего комплекта реагентов в соответствии с рекомендациями производителя (CustomArray Inc., USA).
Обработку результатов гибридизации проводили с применением бинарной классификации и Т-теста с поправкой на ожидаемую долю ложных отклонений. В качестве дифференцирующих ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ маркеров рассматривали гены и транскрипты, которые обладали высокой важностью для классификации, а также характеризовались высоким, статистически значимым (q<0,05) изменением экспрессии при патологии по сравнению с нормой. Пороговое значение важности и изменения уровня экспрессии устанавливали эмпирически исходя из распределения данных. Для обоих показателей пороговое значение составило 75-ый процентиль. Другим важным критерием явилось разнонаправленное изменение уровней экспрессии дифференцирующих маркеров при ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ (таблица 2).
Полученные результаты свидетельствовали об активации различных молекулярных механизмов регуляции пролиферации и апоптоза клеток в лейкоцитах крови пациентов с ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ (таблица 1). Так, развитие ВЭБ-инфекции сопровождалось снижением экспрессии промоторов пролиферации транскрипта 5 рецептора стероидных гормонов AR, транскрипта 4 ASCC1 и гена CAD, мРНК адаптерной молекулы FADD, играющей ключевую роль в цитотоксическом иммунном ответе и апоптозе, и повышением экспрессии транскрипта 4 RIPK1 и транскрипта 2 HLA-DPA1. У пациентов с ВГЧ6-ИМ экспрессия маркеров ВЭБ-ИМ соответствовала таковой у здоровых доноров за исключением мРНК FADD, экспрессия которой возрастала. Функциональная роль маркеров ВГЧ6-инфекции преимущественно - активация транскрипции и подавление апоптоза в клетках. Так, обнаружено повышение экспрессии активаторов NF-kB транскрипта 2 TRAF3 и транскрипта 2 CHUK на фоне роста уровня экспрессии мРНК ингибитора митохондриального пути апоптоза AVEN и некодирующего транкрипта 2 проапоптотического фактора CIRBP, а также снижение экспрессии важного медиатора врожденного иммунного ответа транскрипта 10 IRAK4. У пациентов с ВЭБ-ИМ экспрессия вышеперечисленных маркеров не изменялась, за исключением транскрипта 2 CIRBP и транскрипта 10 IRAK4, уровни представленности которых снижались в острую фазу инфекции. Выявленные изменения обусловлены различиями в молекулярных механизмах патогенеза двух вирусных инфекций. На основании проведенных исследований для дифференциальной диагностики инфекционного мононуклеоза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр и вирусом герпеса человека 6 типа предложено определять уровни экспрессии мРНК FADD, транскрипта 2 CIRBP и транскрипта 2 TRAF3, которые дифференциально экспрессируются при ВЭБ-ИМ и ВГЧ6-ИМ по сравнению с контрольными значениями (таблица 2).