METHOD FOR PCR-BASED DETECTION OF RARE DIFFICULT-TO-CULTIVATE FORMS OF AGENTS OF INFLAMMATORY RESPIRATORY DISEASES (CYTOMEGALOVIRUS, CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE, CHLAMYDOPHLA PSITTACI, LEGIONELLA PNEUMOPHILA, MORAXELLA CATARRHALIS)
СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РЕДКИХ ТРУДНОКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ФОРМ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ (CYTOMEGALOVIRUS, CHLAMYDOPHILA PNEUMONIAE, CHLAMYDOPHILA PSITTACI, LEGIONELLA PNEUMOPHILA, MORAXELLA CATARRHALIS) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА ПЦР

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, конкретно воспалительных заболеваний органов дыхания.
Заболевания органов дыхания из-за их широкой распространенности являются одной из самых актуальных проблем современного здравоохранения. Большую тревогу вызывают не только высокий удельный вес респираторной патологии, но и склонность заболеваний к рецидивирующему и хроническому течению [1, 2, 3].
В настоящее время все большее значение в развитии заболеваний респираторного тракта придается так называемым «атипичным» патогенам - Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, которые специфически взаимодействуют с эпителиальными клетками дыхательных путей, нарушая мукоцилиарный клиренс, оказывают иммуносупрессивное действие. Кроме того, они устойчивы к бета-лактамным антибиотикам, наиболее часто применяемым в клинической практике. Эти свойства позволяют им не только длительно сохраняться в организме в виде моноинфекции, но и способствуют формированию смешанной (бактериальной-бактериальной, бактериальной-вирусной) инфекции, поддерживающей постоянный воспалительный процесс на слизистых респираторного тракта [4, 5, 6, 7].
Несмотря на то что частота выявления Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Cytomegalovirus существенно ниже, чем Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae, выявление их при диагностике заболеваний органов дыхания крайне важно, так как при их обнаружении требуется проведение специфического этиотропного лечения.
При проведении лабораторных исследований, как правило, используют комплекс методов - бактериологических, культуральных, иммунологических, серологических. Большинство атипичных возбудителей этими методами детектируются недостаточно надежно, так как являются трудно культивируемыми организмами с высокой антигенной изменчивостью. Сложность диагностики в значительной степени определяется также отсутствием универсального информативного субстрата для исследования, поэтому приходится проводить анализ различных клинических материалов: слюны, мокроты, мазков из горла, зева, носа, бронхоальвеолярного лаважа, плевральной жидкости, биопсийного материала. При этом ни один из субстратов не является предпочтительным для детекции большинства возбудителей. Несмотря на значительные затраты времени и средств в 60% случаев этиологический фактор установить не удается [1, 8, 9].
Наиболее перспективным методом выявления редких форм возбудителей заболеваний органов дыхания является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В настоящее время он широко применяется в практической диагностике инфекционных заболеваний как за рубежом, так и в Российской Федерации. Метод ПЦР благодаря многократному увеличению (амплификации) уникального фрагмента ДНК искомого патогена позволяет достичь высокой чувствительности и выявляет 10-100 клеток или вирионов в пробе. Использование гибридизации нуклеиновых кислот как стартового этапа для ПЦР дает возможность достигать высокой специфичности (до 100%) и избегать ложноположительных результатов. В отличие от микробиологических методов при проведении ПЦР не требуется выделения чистых культур возбудителей. Исследуют непосредственно биопробы от больных. Проведение ПЦР автоматизировано за счет программируемых термостатирующих устройств, что уменьшает продолжительность анализа, снижает его трудоемкость. Использование метода ПЦР позволяет получить результат в течение одного рабочего дня [10].
Анализ данных литературы и результатов собственных исследований позволил определить спектр редких форм возбудителей заболеваний органов дыхания, частота выявления которых, как правило, не превышает 5%: для взрослых - Cytomegalovirus, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis; для детей - Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis.
При детекции редких форм возбудителей заболеваний органов дыхания в большинстве исследований (до 90% случаев) получают отрицательные результаты. ПЦР анализ нескольких биологических субстратов индивидуального пациента по отдельности на 4-5 инфекционных агентов по традиционной схеме, учитывая, что суммарная вероятность положительного результата составляет 10-25%, представляется крайне нерациональным и затратным вариантом исследования. В связи с этим разработка эффективных и экономически целесообразных способов детекции редких форм инфекционных агентов приобретает особую актуальность.
Для решения данной проблемы предлагается вариант ПЦР исследования, названный методом «двойных микропулов». Этот метод наиболее близок и является дальнейшим развитием ранее предложенного метода, основанного на пулировании субстратов одного пациента (патент №2271003 по заявке №2003132188). В патенте предлагался вариант, позволяющий повысить эффективность выявления часто встречающихся, труднокультивируемых микроорганизмов (Chlamidia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Cytomegalovirus, Herpes symplex I/II), но он непригоден для детекции редких форм инфекционных агентов (Cytomegalovirus, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis). Целью предлагаемого изобретения является оптимизация, повышение эффективности и снижение себестоимости комплексного ПЦР-обследования (на 4-5 видов редких форм возбудителей: Cytomegalovirus, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis) детей и взрослых - пациентов с воспалительными заболеваниями органов дыхания.
Новизна предлагаемого метода заключается в том, что обследуются одновременно 3-5 больных. У каждого проводят отбор субстратов: мокроты, бронхоальвеолярного лаважа, мазка со слизистой задней стенки глотки и носоглотки, слюны. Субстраты одного пациента смешивают в равных объемах, из смеси выделяют ДНК. ДНК от 3-5 пациентов смешивают в равных объемах и проводят исследование этого микропула на 4-5 инфекционных агентов. При выявлении в пуле какого-либо из инфекционных агентов проводят исследование на этот инфекционный агент всех компонентов пула.
Способ осуществляют следующим образом.
Пример 1.
У трех-пяти обследуемых пациентов (детей или взрослых) отбирают мокроту, бронхоальвеолярную жидкость (лаваж), мазок со слизистой задней стенки глотки и носоглотки в отдельные одноразовые пластиковые пробирки. Этот вариант смеси оптимален для исследования. Мазок отбирают одноразовым тампоном, который помещают в 300 мкл стерильного 0,9% раствора NaCl. Смешивают по 66,5 мкл каждого субстрата.
Выделения нуклеиновых кислот из смеси субстратов проводят сорбционным методом с использованием набора реактивов «ДНК-сорб В» разработки и производства Центрального НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.
К 200 мкл смеси добавляют 600 мкл лизирующего раствора, 15 мкл внутреннего контрольного образца, 30 мкл сорбента из набора «ДНК-сорб В». Продолжительность лизиса при 65°С - 8 минут. Последующие стадии обработки не модифицировались, их проводят в соответствии с инструкцией по применению «ДНК-сорб В».
ДНК, выделенную из смеси субстратов пациентов, смешивают в равных объемах (по 2 мкл от пяти человек; по 2,5 - от четырех; по 3,3 мкл от трех) до получения общего объема 10 мкл.
Для ПЦР детекции Cytomegalovirus используют тест-систему серии «АмплиСенс» разработки и производства Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ, для выявления Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis используют тест-системы фирмы «ИзоГен» (Москва).
Выявление продукта амплификации проводят методом электрофореза в агарозном геле [11]. Визуализацию электрофореграмм осуществляют с использованием системы для компьютерной обработки изображений «Биотест».
При выявлении в микропуле одного или нескольких инфекционных агентов на их наличие обследуют все компоненты пула. Используют те же тест-системы и электрофоретический способ детекции продуктов ПЦР.
Пример 2.
Поскольку отбор бронхоальвеолярной жидкости является инвазивной процедурой, которая проводится под общим наркозом и зачастую недоступна многим практическим лечебным учреждениям, можно ограничиться анализом смеси мокроты и мазка со слизистой задней стенки глотки и носоглотки от трех-пяти обследуемых пациентов (детей или взрослых). Эти субстраты смешивают по 100 мкл.
Для выделения ДНК из смеси также используют набор реактивов «ДНК-сорб В». Дальнейшие этапы исследования проводят аналогично Примеру 1.
Пример 3.
При отсутствии бронхоальвеолярной жидкости и мокроты исследованию подвергают смесь мазка со слизистой задней стенки глотки и носоглотки, слюны от трех-пяти обследуемых пациентов (детей или взрослых). Субстраты смешивают по 100 мкл и дальнейшее исследование проводят согласно Примеру 1.
С целью проверки чувствительности и эффективности метода «двойных микропулов» были проведены сравнительные исследования 50-ти образцов с известным содержанием инфекционных агентов. Предлагаемый метод сопоставлен с индивидуальным ПЦР-исследованием всех образцов. Для получения максимального разведения инфекционного агента пулы были составлены из одного положительного и четырех отрицательных образцов. Результаты исследований обоими вариантами совпали в 100% случаев. Показано, что разведение при смешивании 3-5 образцов не оказывает значительного влияния на эффективность выявления инфекционного агента.
Положительный эффект
Использование для исследования смеси субстратов пациента, а не одного из субстратов повышает эффективность выявления возбудителей на 10-20% и в 2-3 раза снижает затраты по сравнению с исследованием всех субстратов смеси по отдельности.
Пулирование ДНК от 3-5 человек и проведение на первом этапе анализа микропула одновременно на 5 инфекционных агентов у взрослых и 4 у детей уменьшает стоимость исследования от 2 до 5 раз в зависимости от результата исследования пула. Чаще всего на этом этапе получается отрицательный результат или выявляется один из инфекционных агентов, следовательно, второй этап или не требуется, или больные, входящие в пул, проверяются на один инфекционный агент. Для развернутого исследования 5 человек на 5 инфекционных агентов требуется проведение 25 ПЦР исследований. При использовании микропулирования в подавляющем большинстве случаев удается обойтись 5 или 10 исследованиями. Случаи выявления 2 и более инфекционных агентов единичны, но даже при выявлении в пуле 2 инфекционных агентов потребуется суммарно 15 ПЦР исследований, а 3 инфекционных агентов - 20 ПЦР исследоваий.
В лаборатории молекулярно-генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н.Блохиной было проведено реальное обследование 100 пациентов методом «двойных микропулов» на наличие пяти инфекционных агентов: Cytomegalovirus, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis. Сформировано 20 микропулов по 5 человек, у каждого из пациентов анализировалась смесь из трех субстратов.
В 13 пулах инфекционных агентов не было выявлено. В пяти пулах выявлено по 1 возбудителю (у одного из пяти пациентов обнаружены Chlamydophila pneumoniae). В двух пулах выявлено по 2 инфекционных агента (у одного из пяти пациентов обнаружены Cytomegalovirus и Chlamydophila pneumoniae).
Для получения этих результатов при использовании метода «двойных микропулов» потребовалось 145 ПЦР исследований. При проведении развернутого исследования всех субстратов от каждого больного на 5 инфекционных агентов потребовалось бы проведение 1500 ПЦР исследований; при анализе смеси субстратов без микропулирования - 500 ПЦР исследований. Следовательно, применение метода «двойных микропулов» позволяет снизить стоимость исследования в 3,4-10,3 раза.
Список литературы
1. Чучалин А.Г. Пневмония / А.Г.Чучалин, А.И.Синопальников, Л.С Страчунский. - М.: МИА. - 2006. - 464 с.
2. Барлет Джон Дж. Инфекции дыхательных путей. Пер. с англ. / Джон Дж. Барлет. - М.: Бином. - 2000. - 192 с.
3. Синопальников А.И. Тяжелая внебольничная пневмония: этиологическая структура / А.И.Синопальников, О.В.Фесенко, Ю.Г.Тихонов, В.К.Дуганов // Антибиотики и химиотерапия. - 2001. - Т.46, №6. - С.6-11.
4. Егоров A.M. Хламидии: молекулярная организация клетки и некоторые особенности патогенеза инфекций / A.M.Егоров, Ю.О.Сазыкин // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - Т.45, №4. - С.3-5.
5. Манзенюк И.Н. Пневмония, вызванная Chlamydophila pneumoniae: клиника, диагностика и лечение / И.Н.Манзенюк, М.С.Воробьева, С.С.Ямникова // Антибиотики и химиотерапия. - 2001. - Т.46. - №1. - С.22-29.
6. Белоцерковская Ю.Г. Роль Chlamydophila pneumoniae в бронхолегочной патологии человека / Ю.Г.Белоцерковская, А.И.Синопальников // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2008. - Т.10. - №1. - С.15-24.
7. Тартаковский И.С. Современные подходы к диагностике атипичных пневмоний. / И.С.Тартаковский // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000. - Т.2. - №6. - С.60-68.
8. Gonzales R. Uncomplicated acute bronchitis / R.Gonzales, M.A.Sande // Ann. Intern. Med. - 2000. - V.133. - P.981-991.
9. Schneeberger P.M. Diagnosis of atypical pathogens in patients hospitalized with community-acquired respiratory infection / P.M.Schneeberger, J.W.Dorigo-Zetsma, A. van der Zee et al. // Scand. J. Infect. Dis. - 2004. - V.36. - №4. - P.269-273.
10. Медицинские и лабораторные технологии. Справочник. Т.2. Под ред. Карпищенко А.И. - Спб.: Интермедика. - 1999. - 654 с.
11. Маниатис Т. Молекулярное клонирование / Т.Маниатис, Э.Фрич, Д.Сэмбрук / М.: Мир, - 1984. - 480 с.
12. Патент №2271003; G01N 33/48, C12Q 1/68, заявка №2003132188 от 3 ноября 2003 г.