Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О N2311/Забайкальский/2016 генотипа О/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного "сэндвич"-варианта ИФА
METHOD FOR RAPID QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE LEVEL OF HUMORAL IMMUNITY OF ANIMALS TO STRAIN O N2311/ZABAIKALSKY/2016 OF GENOTYPE O/ME-SA/Ind-2001 OF FOOT AND MOUTH DISEASE VIRUS AFTER VACCINATION USING LIQUID-PHASE "SANDWICH" ELISA

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, разработке способа быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
1
2
3
4
Ящур - особо опасное, карантинное, высококонтагиозное заболевание парнокопытных и мозоленогих животных, которое вызывает РНК(+)-содержащий вирус порядка Picornavirales семейства Picornaviridae рода Aphthovirus с длиной нуклеиновой кислоты около 8500 н.о. [1]. При репродукции вируса ящура в биологических системах формируются 146S компонент (полные частицы, основной иммуногенный компонент), состоящий из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP-VP-VP-VP [2].
1
Существует 7 серотипов ящура, а именно, О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [3].
В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Считается, что антитела против одного серотипа не обеспечивают иммунную защиту против другого серотипа и тем более некоторых других генетических линий. Однако вирусы ящура могут демонстрировать частичную перекрестную защиту в пределах одного серотипа [4].
Наблюдаемая генетическая вариация в геноме вируса ящура является результатом двух процессов. Во-первых, это ошибки, которые возникают в результате репликации вирусной РНК и отсутствия репарации кодируемой РНК-зависимой РНК-полимеразы. Во-вторых, конкурентный отбор, который воздействует на геном. В природной среде в результате будут преобладать изоляты новых генетических линий, которые включают в свой геном требуемые для данной среды характеристики [5].
В РНК-содержащих вирусах вариациям в геноме благоприятствуют высокие частоты мутаций во время репликации вируса, а возникающие линии и сублинии обусловлены частичными нуклеотидными заменами и рекомбинацией. Рекомбинация представляет собой обмен генетическим материалом между двумя несегментированными РНК-геномами. Она происходит между вирусами одного и того же серотипа [6]. Рекомбинации в нуклеиновой кислоте вируса ящура происходят легче в 3'-части генома, чем в участках, кодирующих структурные вирусные белки. Мутации в результате рекомбинации могут привести к обмену генетическим материалом и образованию новых антигенных вариантов, которые зачастую приводят к изменениям тропизма клеток [4]. Одна или несколько аминокислотных замен на поверхности вирусных частиц могут привести к изменению распознавания и использования рецепторов. В результате один и тот же вирус может приобретать способность проникать в клетки с использованием альтернативных рецепторов [1, 2].
Антигенные вариации возникают из-за аминокислотных мутаций, которые изменяют распознавание вирусных белков иммунной системой организма. Поверхностно открытые структуры вируса особенно подвержены иммунной атаке. Процесс появления новых антигенных форм определяется сложным взаимодействием вирусных факторов и поверхностных белков клеток-хозяев. Изменения в генах, кодирующих капсидные белки, путем мутации могут привести к антигенным изменениям и появлению новых генетических линий [1, 2].
1
1
1
1
Наиболее вариабельным из всех белков вируса ящура является VP, поскольку на него приходится около 90% мутаций всех структурных генов. Самыми вариабельными областями являются участки 40-60, 130-160 и 190-213 а.о. [1]. Участок поверхностного белка VP в регионе 130-160 а.о. отличается высокой вариабельностью, поскольку участвует в процессе связывания с рецепторами клетки-хозяина [4]. Изменчивость данного региона дает возможность вирусу ящура взаимодействовать с рецепторами клеток разных типов и облегчает переход от одного вида хозяина к другому. Серотипы вируса ящура в среднем на 86% имеют идентичные последовательностей, хотя VP значительно более вариабелен. Нуклеотидные последовательности кодирующей области VP используются для генетической характеристики штаммов ящура из-за их значимости для прикрепления и проникновения вируса в клетку, защитного иммунитета и специфичности серотипа.
В базе данных GenBank представлены нуклеотидные последовательности для различных генетических линий и сублиний [7]. В данном анализе нам интересен серотип О вируса ящура, который является наиболее изученным и распространенным во всем мире. Он разделен на 11 следующих топотипов: EAST AFRICA 1-4 (Восточная Африка) (ЕА-1-4), SOUTHEAST ASIA (Юго-Восточная Азия) (SEA), EUROPE-SOUTH AMERICA (Европа-Южная Америка) (EURO-SA), INDONESIA-1 и 2 (Индонезия-1 и 2) (ISA-1 and -2), CATHAY (Китай), MIDDLE EAST-SOUTH ASIA (ME-SA) (Ближний Восток-Южная Азия) и WEST AFRICA (Западная Африка) (WA) [4].
Для изготовления вакцин и диагностических наборов для определения уровня гуморального иммунитета применяются различные штаммы типа О вируса ящура уже более 65 лет [8]. В 1957 году в Волгоградской области РФ выделен штамм О №194/Волгоградский/67 (генотип О/EURO-SA), в 1966 году был получен штамм О/Чечено-Ингушский/66 (генотип O/EURO-SA), которые активно использовали для изготовления инактивированных культуральных вакцин и разработки способов определения уровня гуморального иммунитета.
В апреле 2000 г. от свиней в ОПХ «Степное» с. Элитное Уссурийского района Приморского края выделен штамм О/Приморский/2000 (генотип O/ME-SA/PanAsia) вируса ящура. Известны штаммы О/Тайвань/97 и О №2222/Тайвань/2012 вируса ящура (генотип O/CATHAY/Cam 94). В 2012 г. от больного крупного рогатого скота в селе Усачевка Хорольского района Приморского края выделен штамм О №2147/Приморский/2012 (генотип O/ME-SA/PanAsia). В мае 2014 г. в деревне Прохоры Спасского района Приморского края в буферной зоне РФ была зарегистрирована вспышка ящура, вызванная вирусом ящура генотипа O/SEA/Mya-98 штаммом О №2212/Приморский/14.
В период с 2015 по 2016 гг. на территории Саудовской Аравии, Объединенных Арабских Эмиратов, Непале, Иране, Таиланде, Армении, Турции впервые обнаружен вирус ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001. В РФ вспышки ящура данного генотипа регистрируются с 2016 г. Из буферной зоны Российской Федерации в ноябре 2016 г. выделен вирус ящура данного генотипа, штамм которого получил название О №2311/Забайкальский/2016 [9]. На территории РФ данный штамм выделен впервые. В настоящее время все перечисленные выше штаммы хранятся в Государственной коллекции штаммов микроорганизмов федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).
По результатам сравнительного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей штамм генотипа O/ME-SA/Ind-2001 значительно отличается от ранее применяемых вакцинных штаммов других генотипов. Вакцины, полученные с применением антигена перечисленных выше штаммов, не позволяют достичь защитного уровня гуморального иммунитета против штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура.
Иммунизация является эффективным инструментом борьбы с заболеванием. Для изготовления вакцин против ящура типа О используют производственные штаммы вируса ящура. В связи с появлением представителя нового генотипа вируса ящура и необходимостью защиты животных от него в ФГБУ «ВНИИЗЖ» разработали вакцину, в состав которой входит антиген штамма О/Забайкальский/16 вируса ящура [10].
Возникла необходимость создания способа быстрого определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура (генотип O/ME-SA/Ind-2001) с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА.
1
2
3
4
2
Уровень гуморального иммунитета вакцинированного поголовья определяется путем выявления антител, специфичных к структурным белкам вируса ящура VP, VP, VP, VP. В соответствии с рекомендациями Руководства МЭБ (OIE) [6] для определения иммунного статуса животных применяют реакцию нейтрализации и иммуноферментный анализ (ИФА). Реакция нейтрализации имеет ряд ограничений, в частности, большая продолжительность времени постановки реакции (не менее 3 суток), высокая стоимость процедуры, связанная с применением клеточной линии, наличие СО-инкубатора, а также предполагает использование неинактивированного вируса ящура, который является биологическим агентом II группы патогенности. При этом ИФА обладает многими преимуществами, включая экспрессность, высокую специфичность и чувствительность, пригодность для крупномасштабного скрининга полевых образцов и отсутствие требований к специальным лабораторным условиям, например, культуре клеток или среде с углекислым газом. Исходя из этого метод ИФА целесообразно применять для определения уровня гуморального иммунитета у вакцинированных животных.
В настоящее время выделяют прямой и непрямой варианты ИФА. Преимущества прямого варианта ИФА заключаются в быстроте анализа, поскольку используется только один вариант иммуноглобулинов G и устраняется перекрестная реактивность вторичных антител. При этом имеются и некоторые недостатки, а именно, снижение иммунной активности первичных антител вследствие отрицательного влияния ферментов или меток, отсутствие гибкости в выборе первичной метки антител в зависимости от задачи исследования, а также минимальное усиление сигнала.
Непрямой вариант ИФА имеет заметные преимущества по сравнению с прямым, а именно: 1) наличие большого разнообразия меченых вторичных антител, 2) универсальность (многие первичные антитела могут быть получены у одного вида, и одно и то же меченое вторичное антитело может быть использовано для обнаружения), 3) максимальная иммунная активность основного антитела сохраняется, поскольку оно не маркировано, 4) повышение чувствительности, т.к. каждое первичное антитело содержит несколько эпитопов, которые могут быть связаны меченым вторичным антителом, что позволяет усиливать детектируемый сигнал [11, 12].
В настоящее время широко применяют «сэндвич»-вариант ИФА, который обычно требует использования пар подобранных антител, где каждое антитело специфично для другого, неперекрывающегося эпитопа антигена. Первые антитела принято называть сенсибилизирующими и предназначены для захвата антигена. Вторые антитела - детекторные, необходимы для обнаружения антигена. Преимуществами «сэндвич»-варианта ИФА являются: 1) высокая специфичность; 2) подходит для неочищенных образцов сывороток крови животных; 3) высокая чувствительность реакции; 4) возможность количественного анализа.
ИФА также разделяют на твердофазные и жидкофазные варианты. В настоящее время твердофазный вариант широко распространен по причине удобства применения и быстроте проведения анализа. На первом этапе реакции для твердофазного варианта адсорбируют антитела на твердой фазе. При этом не связавшиеся с твердой фазой реагенты легко удаляются отмыванием. В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. При этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные комплексы. Не связавшиеся компоненты удаляют отмыванием. При добавлении конъюгата и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом активный центр фермента остается доступным для последующего взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии, выраженность окрашивания можно оценить визуально или по оптической плотности.
Жидкофазный блокирующий непрямой вариант ИФА наиболее приближен к реакции нейтрализации, являющейся «золотым стандартом» для определения уровня вирусонейтрализующих антител. В данном варианте ИФА антиген не прикреплен к субстрату, его эпитопы наиболее доступны в пространстве для применяемых специфичных антител, и это позволяет получать наиболее приближенные результаты к реакции нейтрализации в клеточной линии; обладает высокой специфичностью и чувствительностью, общей диагностической точностью [13].
В последние 6 лет широко распространяется вирус ящура нового генотипа O/ME-SA/Ind-2001 [14, 15, 16]. Референтная последовательность нуклеотидов и аминокислот для штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 представлена в GenBank [7] (Фиг. 4).
Sharma G.K. и др. предложили способ для определения антител против вируса ящура типов А, О, Азия-1 с помощью жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА [17]. Данная методика позволяет идентифицировать широкий спектр противоящурных антител, но при этом специфичность по отношению к вирусу ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001 низкая (не более 40%), а, следовательно, точное выявление иммуноглобулинов не представляется возможным. Следует заметить, что данный способ предполагал применение в качестве блокирующего компонента не иммунная сыворотка лошади, которая содержит различные белковые соединения, в том числе, возможно, гомологичные участки аминокислотных последовательностей относительно антигенных детерминант. Для разработки данного способа применяли моноклональные антитела, использование которых увеличивает спектр выявления различных генетических линий вируса ящура в рамках одного серотипа, но при этом существенно снижается специфичность относительно выявления антител против изолятов/штаммов конкретного генотипа, в частности O/ME-SA/Ind-2001. В качестве красителя использовали тетраметилбензидин (ТМВ), являющийся агрессивным канцерогеном и нестабильным компонентом для проведения цветной реакции. Для остановки реакции применяли серную кислоту, являющуюся опасным соединением.
В свою очередь на мировом рынке в настоящее время имеются европейские наборы для детекции антител против вируса ящура типа О -IZSLER (Италия) и PrioCHECK (Нидерланды) [18].
Способ определения уровня гуморального иммунитета с помощью набора IZSLER предназначена для детекции противоящурных антител с помощью твердофазного прямого «сэндвич»-варианта ИФА. В наставлении к предлагаемым наборам указано, что процент ингибиции в лунках с положительным контролем сыворотки с разведением 1:10 должен быть ≥90%, для разведений 1:30 ->50%. Спектрофотометрические показания должны быть ≥0,800 о.е. в лунках отрицательного контроля.
Интерпретация результатов следующая:
- если процент ингибиции в лунках с разведениями 1/10 и 1/30 ≥80%, то сыворотки являются сильно положительными;
- если процент ингибиции находится в диапазоне 50-80% для разведений сыворотки 1/10 и 1/30, то сыворотки являются среднеположительными;
- если процент ингибиции ≤50% для сывороток с разведениями 1/10 и 1/30, то сыворотки слабоположительные.
Следовательно, данная методика позволяет проводить полуколичественный анализ уровня гуморального иммунитета животных против вируса ящура.
Титр антител рассчитывают, как крайнее разведение сыворотки крови с процентом ингибиции не менее 50%. Данные представлены в инструкции производителя.
Достоинством данного набора является применение моноклональных антител, однако они были получены до появления нового генотипа O/ME-SA/Ind-2001 и не позволяют с высокой точностью детектировать специфические антитела в сыворотках крови животных. Специфичность и чувствительность именно этого метода для выявления антител против вируса ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001 составляет не более 40%, что подтверждают данные реакции нейтрализации в чувствительной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Иными словами, применяемая тест-система не позволяет получать точных результатов в отношении изолятов и штаммов вируса ящура вновь появившегося генотипа.
Наиболее близким прототипом для разработанного нами способа является методика, проводимая с помощью тест-системы PrioCHECK (Prionics Lelystad B.V., Netherlands) для выявления антител к вирусу ящура серотипа О.
Комплектующие для соответствующего набора представлены ниже: Компонент 1 - Планшеты иммунологические.
Компонент 2 - Конъюгат (30х). Разбавленный конъюгат не стабилен, готовят
непосредственно перед применением.
Компонент 3 - Буфер для разведения (5х).
Компонент 4 - Не иммунная сыворотка крови лошади.
Компонент 5 - Деминерализованная вода.
Компонент 6 - Промывочный буфер (200х).
Компонент 7 - Референтная сыворотка 1 (позитивная) (жидкая).
Компонент 8 - Референтная сыворотка 2 (менее позитивная) (жидкая).
Компонент 9 - Референтная сыворотка 3 (еще менее позитивная) (жидкая).
Компонент 10 - Референтная сыворотка 4 (отрицательный контроль) (жидкая).
Компонент 11 - Субстрат хромогена (ТМВ).
Компонент 12 - Стоп-раствор (1 N раствор серной кислоты). Данные отражены в инструкции производителя.
450cp blank
450 ср
blank
450
450 corrected
450
450
450 max
450 max
Основные этапы проведения реакции ИФА для применения данного способа определения уровня гуморального иммунитета представлены ниже. Проводят приготовление восстановленной не иммунной сыворотки лошади, рабочего буферного раствора, ИФА-буфера на основе не иммунной сыворотки лошади и буфера для разведения, разведения исследуемой сыворотки крови животного 1:5. На следующем этапе анализа проводят инкубацию планшета с исследуемыми и контрольными сыворотками крови в течение 1 ч при температуре 37±0,5°С, промывают лунки планшета с помощью буфера. Инкубируют содержимое планшета с конъюгатом, разбавленным до рабочего разведения, в течение 60 мин. Лунки планшета промывают, инкубируют с хромогеном в течение 15 мин при температуре 20±0,5°С без доступа световых лучей, останавливают реакцию стоп-раствором и проводят расчет оптических плотностей с помощью планшетного спектрофотометра-ридера при длине волны 450 нм. Вычисляют среднее значение OD содержимого лунок А1 и В1 с положительной сывороткой. OD должно быть<0,350. Вычисляют скорректированный OD для всех образцов путем вычитания (OD=OD×S - ODblank). Вычисляют среднее значение оптической плотности для содержимого лунок G1 и H1 с отрицательной сывороткой (OD). Данное значение должно быть ≥1,000. Если значение OD ниже 1,000, то, вероятнее всего, хромоген был очень холодным. В таком случае инкубируют еще 30 минут.
Процент ингибиции (PI) эталонных и тестовых сывороток рассчитывают в соответствии с приведенной ниже формулой:
450 corrected
450 max
PI=100-(OD/OD)×100
450
2
3
Рассчитывают среднее значение OD для лунок с референтными сыворотками 2 и 3. Процент ингибиции для S должен быть >60%, для S<40%.
Данный способ позволяет за 4-5 ч получить результаты исследования. Диагностикум включает в себя конъюгат, который представляет собой меченые моноклональные антитела против вируса ящура серотипа О, исходя из этого является типоспецифичным, но без более узкой дифференциации.
1
Разработан прототипный способ и соответствующая ему тест-система в конце 90-гг XX в. Тогда же были получены антитела с использованием антигенов вируса ящура различных генотипов, кроме активно циркулирующего с 2016 г. генотипа O/ME-SA/Ind-2001. Изоляты и штаммы данной линии имеют существенные отличия от других линий серотипа О. Анализируя нуклеотидную и аминокислотную последовательность высоко вариабельного белка VP (ген 1D, примерно 3260…3893 н.о.) вируса ящура, ученые пришли к выводу о наличии достаточного количества существенных замен, позволяющих отнести вирус к иному генотипу. Произошли существенные замены в эпитопах поверхностных белков капсида вируса ящура, в частности в самых вариабельных областях (40-60, 130-160 и 190-213 а.о.) [14, 15, 16]. Исходя из выше отраженного, прототипный способ с применяемой тест-системой не является высокочувствительным и специфичным по отношению к штамму О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура (генотип O/ME-SA/Ind-2001). Исходя из этого требуется разработать высокочувствительный, высокоспецифичный способ быстрого определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА.
Прототипный метод предполагает использовать тест-систему, основанную на твердофазном конкурентном «сэндвич»-варианте ИФА. Однако этот формат реакции находится дальше от реакции нейтрализации относительно возможностей улавливания антигенных сайтов по сравнению с жидкофазным блокирующим непрямым «сэндвич»-вариантом ИФА.
Прототипный вариант предполагает использование нативных контрольных сывороток крови животных, что снижает сохранность компонентов тест-системы в течение длительного периода времени и есть риск контаминации микроорганизмами.
Прототипный вариант не предусматривает проведения контроля конъюгата, что не позволяет получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура.
В прототипном способе применяется прямой конъюгат, что удобно в применении, однако при этом повышается вероятность шумовых фоновых явлений, что может привести к снижению точности определения уровня гуморального иммунитета животных против ящура.
В прототипном способе для проявления цветной реакции используют тетраметилбензидин ТМВ, который является сильным канцерогеном, а также для остановки реакции применяют серную кислоту, рабочий раствор которой готовят с применением концентрата, негативно влияющего на слизистые органов дыхания и зрения.
Специфичность и чувствительность именно этого метода для выявления антител против вируса ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001 составляет не более 45-50%, что подтверждают данные реакции нейтрализации в чувствительной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Иными словами, применяемая тест-система не позволяет получать точных результатов в отношении изолятов и штаммов вируса ящура вновь появившегося генотипа.
Учитывая найденные ограничения в применении имеющихся способов, в том числе прототипного, для проведения достоверного исследования гуморального иммунитета животных после инокуляции противоящурными вакцинами, содержащими инактивированный антиген вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001, актуальной является разработка способа быстрого определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА с учетом выше приведенных недостатков.
В настоящее время в мире по литературным данным не обнаружен способ количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта.
Целью изобретения является разработка способа быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура (генотип O/ME-SA/Ind-2001) с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА.
Поставленная цель достигается тем, что предлагаемый способ предполагает исследование сывороток крови в разведениях с минимальным шагом для определения титра антител против штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура (генотип O/ME-SA/Ind-2001) с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА и использование следующих компонентов: культуральный инактивированный вирус ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 (лиофилизированный); сенсибилизирующие антитела - иммуноглобулины G кролика против вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 (лиофилизированные); детекторные антитела-иммуноглобулины G морской свинки против вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 (лиофилизированные); контроль 1 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 (с процентом ингибиции ≥75%); контроль 2 - лиофилизированная положительная сыворотка крови крупного рогатого скота к вирусу ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 (с процентом ингибиции от 50% до 75%); контроль 3 - лиофилизированная сыворотка крови крупного рогатого скота, не содержащая антитела к вирусу ящура; лиофилизированную фетальную сыворотку крови крупного рогатого скота нормальная для блокирования открытых сайтов связывания на дне лунок планшета; антивидовой конъюгат - иммуноглобулины кролика против IgG морской свинки, конъюгированные с пероксидазой хрена. Предлагаемая тест-система содержит неспецифические компоненты: карбонатно-бикарбонатный буфер (рН 9,5-9,6) для разведения антигена (в виде капсул), концентрат (20х) буферного раствора, хромогенный субстрат ABTS (2,2-азино-ди-(3-этилбензоаминосульфоновая кислота), «стоп»-раствор - 1%-ный раствор додецилсульфата натрия.
Цель достигается также благодаря тому, что метод жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА наиболее приближен к реакции нейтрализации в естественных условиях, поскольку все антигенные сайты полных вирионов вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 находятся в свободном состоянии в жидкой фазе, открыты для связывания со специфическими сенсибилизирующими и детекторными антителами кролика и морской свинки, соответственно. Реакция основана на взаимодействии исследуемой сыворотки крови животного и инактивированного вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 в жидкой фазе в лунках круглодонного планшета с образованием иммунных комплексов. Параллельно с этим проводится сенсибилизация лунок плоскодонного планшета иммуноглобулинами G кролика против вируса ящура того же генотипа. После этого сенсибилизированные лунки блокируют с помощью фетальной сыворотки крови телят, добавляют полученные иммунные комплексы из круглодонного планшета, инкубируют, вносят детекторные антитела. Образовавшийся сложный иммунный комплекс выявляют с помощью антител против IgG морской свинки, конъюгированных с пероксидазой хрена, и хромогенного субстрата.
Технический результат от изобретения заключается в разработке быстрого (4 ч), высокоспецифичного и чувствительного способа количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА, вследствие применения инактивированного вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 и при получении специфических компонентов реакции в жидкой фазе.
В отличии от прототипа разработанный способ предполагает применение культурального инактивированного вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001, который представлен в лиофилизированном состоянии. Это позволяет детектировать именно антитела против вируса ящура указанного генотипа с высокими показателями диагностической чувствительности (более 99%) и специфичности (100%), что более чем на 50-55% выше по сравнению с прототипом. Кроме того, лиофильно высушенный компонент остается стабильным не менее 3 лет, чем антиген в нативном состоянии, что является преимуществом в использовании данной тест-системы. Активность полученного антигена вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 составляет 1:4000.
В отличии от прототипа применяются сенсибилизирующие и детекторные антитела кролика и морской свинки, соответственно, высокоспецифичные по отношению к антигену вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001, поскольку были получены с применением высокоочищенного антигена. Разработанный способ предполагает применение иммуноглобулинов G кролика и морской свинки против вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 в виде лиофилизата, что позволяет антителам находится в стабильном состоянии не менее 3 лет с активностью не менее 1:12000 и 1:4000, соответственно.
В отличии от прототипа сыворотки крови телят, контроль 1 и 2, получены против высокоочищенного инактивированного антигена вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001, что позволяет достичь высокой диагностической специфичности и чувствительности при контроле. Указанные компоненты представлены в лиофилизированном состоянии, что позволяет хранить их не менее 3 лет с сохранением высокой активности в ИФА. Для контроля 1 - не менее 1:4000, для контроля 2 - не менее 1:2500.
В отличии от прототипа для блокирования открытых сайтов связывания применяется фетальная сыворотка телят, белковые составляющие которой обеспечивают полное закрытие пустых участков на дне иммунологического планшета. Данный компонент также представлен в виде лиофилизата, что позволяет хранить его в данном состоянии не менее 3 лет.
В отличии от прототипного варианта разработанный способ предусматривает использование контроля антигена и конъюгата, что дает возможность учитывать фоновые значения и, тем самым, получать более достоверные данные по оптическим плотностям и титру антител против вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001.
В отличии от прототипа разработанный способ предполагает применение непрямого конъюгата, что позволяет снижать вероятность шумовых фоновых явлений и получать более достоверные результаты определения уровня гуморального иммунитета против вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 в сыворотках крови животных. Активность конъюгата составляет 1:2500.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА.
Фиг. 2 - Спектральный профиль фракций антигена вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001.
Фиг. 3 - Электрофореграмма для инактивированного вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 в 12% полиакриламидном геле. Примечание: 1-3 - фракции №№1-3 в градиенте плотности сахарозы (50%); 4-8 - фракции №№4-8 в градиенте плотности сахарозы (40%); 9-13 - фракции №№9-13 в градиенте плотности сахарозы (30%); 14-18 - фракции №№14-18 в градиенте плотности сахарозы (20%). Исследован 100%-ный концентрат антигена.
Фиг. 4 - Филогенетическая принадлежность штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
1
SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура;
1
SEQ ID NO: 2 представляет последовательность аминокислот белка VPштамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура.
Разработанный способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальекий/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА основан на специфическом блокировании антигена вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) антителами, содержащимися в исследуемой пробе сыворотки в жидкой фазе. Смесь «исследуемая сыворотка/антиген» переносится в лунки планшета, предварительно иммобилизованного сенсибилизирующими антителами. Наличие антител к вирусу ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) в исследуемой пробе будет выражаться в образовании иммунного комплекса и уменьшении количества свободного антигена, который связывается иммобилизованными на планшете сенсибилизирующими антителами. Фиксированный в лунках антиген взаимодействует с детекторными антителами, которые выявляются в реакции с иммунопероксидазным конъюгатом против IgG морской свинки и последующим окрашиванием с помощью хромогенного субстрата ABTS. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации специфических антител в исследуемой пробе. Интенсивность цветной реакции учитывают с помощью спектрофотометра-ридера. Принципиальная схема жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА представлена на фиг.1.
До начала работы проводят приготовление рабочих растворов.
3
Раствор №1. Карбонатно-бикарбонатный буферный (КББ) раствор, рН 9,5-9,6, для сенсибилизации планшетов. Содержимое капсулы КББ растворяют в 100 см дистиллированной воды и тщательно перемешивают.
3
Раствор №2. Раствор используется для приготовления рабочего раствора для межэтапной промывки планшетов и подготовки проб для исследования, а так же как основа для приготовления рабочего буферного раствора для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата. Для этого содержимое флакона с концентратом (20х) буферного раствора переливают в мерную посуду, добавляют дистиллированную воду до 2000 см и тщательно перемешивают.Значение рН раствора №2 должно быть в пределах 7,4-7,6.
3
3
3
Раствор №3. Рабочий буферный раствор для разведения детекторных антител и иммунопероксидазного конъюгата (рН 7,4-7,6) готовится из раствора №2 с добавлением 10% фетальной сыворотки КРС.Для этого к 36 см раствора №2 следует добавить 4,0 см фетальной сыворотки КРС, восстановленной из лиофилизированного препарата путем добавления к содержимому флакона с сывороткой 4,0 см дистиллированной воды. Готовится непосредственно перед использованием.
Перед началом работы лиофилизированные препараты (антиген вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001), конъюгат, контроли, фетальную сыворотку крови телят) восстанавливают, добавляя по 1 мл дистиллированной воды. В случае с фетальной сывороткой - 4 мл воды.
Разработанный способ включает в себя этапы, представленные ниже. Сенсибилизация планшетов.
Суспензию сенсибилизирующих антител готовят в разведении 1:12000 с помощью раствора №1 (см. выше). Во все лунки иммунологического полистиролового 96-луночного планшета вносят по 100 мкл суспензии сенсибилизирующих антител, накрывают крышкой и инкубируют в течение 18±0,1 ч при температуре (2-8)°С.
Промывание лунок планшета.
Промывание производят с использованием автоматических устройств, либо вручную. При этом содержимое лунок планшета удаляют, затем заполняют лунки раствором №2 (см. выше) и сбрасывают интенсивным встряхиванием. Процедуру повторяют два раза.
Иммунное связывание в жидкой фазе.
3
3
3
Параллельно с сенсибилизацией планшета проводят иммунную реакцию связывания антигена с испытуемыми и контрольными пробами сыворотки крови. Готовят следующие разведения сывороток крови животных: 1:12, 1:16, 1:24, 1:32, 1:45, 1:64, 1:90, 1:128, 1:181, 1:256, 1:362, 1:512, 1:724, 1:1024 в растворе №2. Для этого во все лунки иммунологического планшета за исключением лунок Н 1-6, которые оставляют для контроля антигена (КА) и контроля конъюгата (КК), вносят по 0,047 см (47 мкл) буферного раствора и 0,003 см (3 мкл) пробы. В лунки Н 1-6 вносят по 0,05 см (50 мкл) буферного раствора. Испытуемые и контрольные пробы располагают на планшете согласно таблице 1.
В качестве контроля 1 используют положительную сыворотку крови КРС против штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура (процент ингибиции ≥75%), контроля 2 - положительную сыворотку крови КРС против штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура (процент ингибиции от 50% до 75%), контроля 3 - нормальную сыворотку телят.
3
Затем во все лунки планшета добавляют по 0,05 см (50 мкл) рабочего разведения антигена в растворе №2 в соответствии с разведением 1:4000. После перемешивания содержимого лунок планшета при помощи шейкера или легким встряхиванием вручную планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 18±0,1 ч при температуре (2-8)°С.
Улавливание антигена.
3
В промытые лунки сенсибилизированного планшета вносят по 0,05 см (50 мкл) смеси контрольных и испытуемых проб и антигена, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре (37±0,5)°С.
Промывание лунок планшета.
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяют 4 раза. Внесение детекторных антител.
3
3
Во все лунки планшета, за исключением лунок с КК (контроль конъюгата), куда добавляют по 0,05 см (50 мкл) раствора №3, вносят по 0,05 см (50 мкл) рабочего разведения детекторных антител в растворе №3 в соответствии с разведением 1:4000, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре (37±0,5)°С.
Промывание лунок планшета.
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяют 4 раза. Внесение пероксидазного конъюгата.
3
Во все лунки планшета вносят по 0,05 см (50 мкл) рабочего разведения конъюгата в растворе №3 в соответствии с разведением 1:2500, планшет закрывают крышкой и инкубируют в течение 1 часа при температуре (37±0,5)°С.
Промывание лунок планшета.
Проводят, как представлено выше. Процедуру повторяют 4 раза. Проявление цветной реакции.
3
Во все лунки планшета вносят по 0,05 см (50 мкл) хромогенного субстрата ABTS, закрывают крышкой и выдерживают 15-20 минут при температуре (18-25)°С.
Остановка реакции.
3
Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку планшета 0,05 см (50 мкл) «стоп»-раствора. Учет результатов ИФА.
Результаты анализа учитывают инструментальным способом. Сразу после остановки реакции измеряют оптическую плотность (ОП) продуктов реакции в каждой лунке при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр-ридер для микропланшетов с вертикальным лучом света. Значения ОП (оптических единицах (о.е.)) контрольных и исследуемых проб переводят в значение процента ингибиции (PI) по формуле:
пробы
где, ОП - среднее значение оптической плотности смеси исследуемой или контрольной пробы с инактивированным антигеном вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001);
КА
ОП - среднее значение оптической плотности контроля антигена;
КК
ОП - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.
Реакция считается достоверной, если удовлетворяет следующим критериям:
КА
КК
- (ОП-ОП)≥0,4 о.е.;
- контроль 1 имеет значение PI>75%;
- контроль 2 имеет значение PI в пределах 50-75%;
- контроль 3 имеет значение PI<50%.
2
Пробы, демонстрирующие значение PI≥50%>, считают положительными, а животные, от которых получены данные пробы сыворотки крови, иммунными к ящуру, вызванного вирусом штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001). Значение PI<50% является отрицательным, что свидетельствует об отсутствии специфических антител к ящуру, вызванного вирусом штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) в сыворотке крови обследуемых животных. Исходя из полученных данных берут последнее разведение сыворотки, для которого процент ингибиции составляет ≥50%. Это разведение считают титром антител против ящура, вызванного вирусом штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001). Уровень гуморального иммунитета в количеством значении выражают в log/мл.
В результате проведенных экспериментов были оптимизированы условия постановки реакции. Концентрация детекторных антител, определенная в непрямом варианте ИФА, составила 1:4000, антивидового конъюгата - 1:2500; рабочее разведение сенсибилизирующих антител, определенное путем постановки жидкофазного блокирующего непрямого «сэндвич»-варианта ИФА, составило 1:12000. С использованием разработанной тест-системы проведено исследование образцов сывороток крови животных с определением титра антител и проведен сравнительный анализ с результатами реакции нейтрализации в чувствительной монослойной клеточной линии почки свиньи (IB-RS-2) [2].
Разработанный способ позволяет тестировать одновременно в формате 96-луночного планшета до 6 проб сывороток в разведениях с 1:12 до 1:1024.
В качестве рабочего штамма применяли штамм О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура.
Контроль штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура на специфичность.
Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура, был выделен от КРС на территории СП «Молодежнинское» Приаргунсского района Забайкальского края. Специфичность определена с помощью ОТ-ПЦР с последующим секвенированием 1D-гена, соответствующего белку VPi, отвечающему за изменчивость вируса ящура. По результатам исследования нуклеотидной последовательности (представлена в приложении) указанного гена была выявлена принадлежность штамма О №2311/Забайкальский/2016 к генотипу O/ME-SA/Ind-2001. Данная последовательность наиболее близка к нуклеотидной последовательности, представленной в GenBank под номером MG972584.1 [7]. Расчет проводился в соответствии с Байесовской теорией вероятности и значениями бут-стрепа. Специфичность подтверждена также в реакции связывания комплемента со штаммоспецифической сывороткой. Концентрация общего вирусного белка в исследуемом антигене вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 составила 2,85 мкг/мл, концентрация 146S компонента - 1,83 мкг/мл, 75S компонента - 2,56 мкг/мл, 12S - 0,29 мкг/мл.
По сравнению с известными штаммами штамм О №2311/Забайкальский/2016 обладает более высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью.
Экспериментально подтверждена возможность использования штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура для контроля антигенной и иммуногенной активности, а также для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура серотипа О.
Морфологические признаки
Штамм О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, серотипу А, генотипу O/ME-SA/Ind-2001 и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура относится к генотипу O/ME-SA/Ind-2001. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой и не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в ИФА и реакции нейтрализации.
При гипериммунизации морских свинок концентрированный антиген из инактивированного вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 индуцирует образование вирусоспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:2500.
Антигенное родство штамма О №2311/Забайкальский/2016 с имеющимися производственными штаммами вируса ящура серотипа О исследовано в перекрестной реакции нейтрализации. Штамм О №2311/Забайкальский/2016 антигенно отличается от производственных штаммов О №2222/Тайвань/2012, О №2147/Приморский/2012, О №2212/Приморский/2014, О №2047/Саудовская Аравия/2008.
1
1
1
Результаты исследований в реакции нейтрализации представлены в таблице 2. Антигенное соответствие (r) составило для О №2222/Тайвань/2012 - 0,12, О №2147/Приморский/2012 - 0,27, О 1734/Приморский/2000 - 0,29, О №2356/Пакистан/2018 - 0,19. При значении r ≥0,3 полевой изолят и производственный штамм являются близкородственными, и вакцина из производственного штамма будет защищать от эпизоотического полевого вируса, при значении r<0,3 полевой изолят отличается от производственного штамма, и вакцина из данного штамма не защищает от эпизоотического полевого вируса.
Биотехнологические характеристики
50
3
Штамм О №2311/Забайкальский/2016 репродуцируется в перевиваемых монослойных клеточных линиях почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи IB-RS-2, почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, и в течение 12-15 часов инкубирования вируса в указанных культурах клеток накапливается от 6,50 до 7,75 lg ТЦД/см.
Генотаксономическая характеристика.
6
Штамм О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура типа О является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10 Да.
6
1
2
3
4
Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой с молекулярной массой 2,8×10 Да. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP, VP, VP и VP.
1
66a
Основным антигенным белком является VP. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.
Физические свойства.
-18
3
Масса вириона составляет 8,4×10 г. Плавучая плотность вирионов в растворе сахарозы 1,45 г/см.
Устойчивость к внешним факторам.
Штамм О №2311/Забайкальский/2016 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и другим органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,8. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам.
Дополнительные признаки и свойства. Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.
Антигенная активность - введение антигена вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 морским свинкам индуцирует образование вирусоспецифических антител.
Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.
Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения).
Сущность изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение инактивированного вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016
50
3
Для получения инактивированного вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 для диагностических целей проводили суспензионное культивирование вируса в клеточной линии ВНК-21 в течение 12-14 ч с получением вирусной суспензии с титром инфекционной активности не ниже 6,5 lg ТЦД/см. Полученную вирусную суспензию инактивировали с помощью аминоэтилэтиленимина и осветляли благодаря полигексаметиленгуанидина.
Инактивированную культуральную жидкость, содержащую антиген вирус ящура, осветляли в течение 30 мин. при 6000 об/мин и 4°С на центрифуге типа Bekman J2-21 или Avanti J-26 ХР (Beckman Coulter, USA). Надосадочную жидкость отбирали.
В надосадочную жидкость добавляли ПЭГ-6000 до конечной концентрации 8% и NaCl до конечной концентрации 0,85%, интенсивно перемешивали и выдерживали при температуре 4±2°С в течение 18-24 часов. Вирусную суспензию осаждали при 6000 об/мин в течение 60 мин., осадок растворяли в 1/15 М растворе ФСБ, концентрируя приблизительно в 100 раз (1/100 от первоначального объема).
К полученному преципитату добавляли 50% хлороформа, интенсивно перемешивали и фракционируя в течение 30 мин. при 3000 об/мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, содержащую антиген вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016. Небольшое количество (50-100 мкл) переносили в криопробирку и замораживали при температуре минус 20±2°С для последующего электрофоретического анализа в полиакриламидном геле.
На следующем этапе проводили получение 146S компонента вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 (данный компонент является иммуногенным и наиболее важным в иммунизации животных, поскольку представляет собой полные вирионы).
Перед помещением в градиент сахарозы антиген вируса ящура обрабатывали детергентом NP-40 в концентрации 1,5%.
Для выделения 146S компонента готовили линейный градиент сахарозы с концентрациями 10, 20, 30, 40, 50%. Обработанный с помощью NP-40 антиген вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 наливали по 13-15 мл в центрифужные пробирки, затем последовательно подслаивали растворы сахарозы, начиная с 10%-го и заканчивая 50%-м раствором. Пробирки помещали в металлические центрифужные стаканы и после тщательно выполненного уравновешивания откручивали при температуре 4°С в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин.
Фракционирование градиента сахарозы производили с помощью перистальтического насоса, отбирая фракции по 1 мл в отдельные пробирки.
При использовании перистальтического насоса сначала оценивали визуально пробирку с градиентом сахарозы. Белковая полоса, содержащая 146S компонент, располагается приблизительно в 30%-м слое сахарозы, и выделяется опалесценцией. Отбирали фракции с 50, 40, 30 и 20% сахарозы. Результаты электрофореза в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях представлены на фиг. 3.
Затем 146S компонент переосаждали с помощью ультрацентрифугирования в течение 4 часов при скорости 25000 об/мин. и температуре 4±0,5°С и ресуспендировали осадок в 1/15 М растворе фосфатного буфера.
Результаты спектрометрического исследования полученных фракций антигена вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 в виде антигенного профиля представлены на фиг. 2.
Пример 2. Получение гипериммунной сыворотки крови кроликов (сенсибилизирующие антитела)
Для получения специфических сывороток крови против вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 применяли клинически здоровых кроликов средней упитанности массой 2,5-3,0 кг.
3
Для гипериммунизации животных применяли концентрированный очищенный антиген вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016, полученный как описано в примере 1, из которого готовили эмульсию с использованием масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG (в соотношении адъювант/антиген=60/40 по массе). Полученную вакцину вводили в мышцу задних конечностей кролика на 0, 21 и 42 дни в объеме 0,5 см. Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливали и получали сыворотку крови - содержащую сенсибилизирующие антитела, которую лиофильно высушивали и хранили при температуре 4-8°С.
Пример 3. Получение гипериммунной сыворотки крови морских свинок (детекторные антитела)
Для гипериммунизации морских свинок использовали эмульсию очищенного препарата концентрированного антигена штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура, полученного как описано в примере 1. Приготовление вакцины и схема иммунизации такая, как в примере 2.
Пример 4. Определение активности антигена штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура, сенсибилизирующих и детекторных антител
Индивидуальные пробы сывороток проверяли на активность и специфичность в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте варианте ИФА. Был проведен подбор оптимальных рабочих разведений указанных компонентов для получения достоверных результатов в ИФА. Полученные данные анализа представлены в таблицах 3, 4, 5.
2
Для анализа исследовали следующие разведения сенсибилизирующих антител: 1:8000, 1:10000, 1:12000, 1:14000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:4000, для детекторных антител 1:4000, конъюгата - 1:2500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 3 следует, что при разведении сенсибилизирующих антител 1:12000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log/мл). При меньших разведения антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.
2
Для анализа исследовали следующие разведения детекторных антител: 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для антигена - 1:4000, для сенсибилизирующих антител -1:12000, конъюгата - 1:2500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 4 следует, что при разведении детекторных антител 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log/мл). При меньших разведения антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.
2
Для анализа исследовали следующие разведения антигена: 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:5000. Разведения остальных компонентов были постоянны: для детекторных антител - 1:4000, для сенсибилизирующих антител -1:12000, конъюгата - 1:2500. В качестве контрольных сывороток для анализа применяли сыворотки, специфичные к определенным штаммам вируса ящура с активностью 1:256. Их таблицы 5 следует, что при разведении антигена 1:4000 достигалось получение достоверного результата (1:256 или 8 log/мл). При меньших разведения антител наблюдали высокие фоновые значения, что не позволяло получить корректный результат. При большем разведении наблюдали снижение детектируемого значения титра антител в сыворотках крови животных. При исследовании неспецифических и отрицательных сывороток отмечали отрицательные результаты, что свидетельствовало о высокой специфичности разработанного способа.
Таким образом, в ходе лабораторных исследований доказано, что рабочие разведения антигена штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура, сенсибилизирующих и детекторных антител составило 1:4000, 1:12000, 1:4000, соответственно.
Пример 5. Применение способа быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура после вакцинации с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА
Исследовали 6 сывороток крови КРС и 6 сывороток крови свиней, полученных после иммунизации животных противоящурными культуральными инактивированными эмульсионными вакцинами, содержащими 146S компонент вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 генотипа O/ME-SA/Ind-2001 не менее 3,0 мкг/доза.
Определены значения титра антител с применением разработанного способа, а также данные сыворотки были исследованы в реакции нейтрализации в чувствительной монослойной клеточной линии IB-RS-2, в соответствии с рекомендациями Руководства МЭБ (OIE) [2]. Полученные результаты отражены в таблице 6, из которой следует, что степень корреляции результатов разработанного способа (предлагаемое изобретение) и классического метода (реакция нейтрализации) составляет 100%.
Пример 6. Определение степени корреляции результатов разработанного способа с данными реакции нейтрализации и тест-системы ИФА (PrioCHECK) при исследовании большого количества сывороток крови животных
Для анализа использовали 595 сывороток крови животных содержащих антитела против 146S компонента вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 с титрами специфических антител 1:16-1:1024. Данные сыворотки исследовали в реакции нейтрализации в соответствии с рекомендациями Руководства МЭБ (OIE), с помощью тест-системы ИФА (PrioCHECK) и с помощью разработанного способа в жидкофазном блокирующем непрямом «сэндвич»-варианте ИФА (предлагаемое изобретение) для определения уровня гуморального иммунитета против вируса ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001).
Выявили, что данные (n=595), полученные с помощью разработанной тест-системы, коррелировали с данными реакции нейтрализации на 99,01%) для сывороток крови животных с титром антител 1:16 (n=85), на 99,14% для сывороток крови животных с титром антител 1:32 (n=85), на 99,24% для сывороток крови животных с титром антител 1:64 (n=85), на 99,09% для сывороток крови животных с титром антител 1:128 (n=85), на 99,52%) для сывороток крови животных с титром антител 1:256 (n=85), на 99,58% для сывороток крови животных с титром антител 1:512 (n=85), на 99,80% для сывороток крови животных с титром антител 1:1024 (n=85). Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанного быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА после вакцинации по сравнению с реакцией нейтрализации.
При исследовании данных сывороток с помощью тест-системы PrioCHECK в ИФА (прототип) обнаружили, что детектируемые значения титров антител животных против антигена штамма О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура (генотип O/ME-SA/Ind-2001) были на 50-55% ниже по сравнению с данными реакции нейтрализации и разработанного способа (предлагаемое изобретение).
Таким образом, разработанный способ позволяет достоверно количественно определять уровень гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА.
Пример 7. Исследование сывороток крови животных против других штаммов генотипа O/ME-SA/Ind-2001 с помощью разработанного способа
Для доказательства того, что разработанный способ является не только высокочувствительным и специфичным, но и универсальным для количественного определения уровня гуморального иммунитета животных против различных штаммов вируса ящура генотипа O/ME-SA/Ind-2001 проводили исследование 142 сывороток крови против антигена производственных штаммов того же генотипа. Выяснили, что степень корреляции с результатами реакции нейтрализации составила 99,01-99,79%, что позволяет сделать вывод о возможности применения разработанного способа для определения титра антител против антигена вируса ящура различных штаммов, принадлежащих к генотипу O/ME-SA/Ind-2001.
Пример 8. Определение диагностических показателей разработанного способа быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА
Для исследования разработанного способа (предлагаемое изобретение) быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА исследовали стандартные диагностические показатели. Для определения чувствительности предложенной тест-системы анализировали 520 сывороток крови животных, которые являлись заведомо положительными по данным реакции нейтрализации в чувствительной клеточной линии почки свиньи IB-RS-2. Титр антител для данных сывороток крови находилась в диапазоне 1:32-1:1024. Постановку ИФА проводили, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 520 образцов сывороток крови 519 определены в качестве положительных, а 1 -в качестве отрицательной (титр 1:16). Для исследования специфичности метода тестировали 305 отрицательных сывороток крови. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 305 проб сывороток отрицательные. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,81% (в 95%-ном доверительном интервале: 98,94-100,00%)), диагностическая специфичность (DSp) - 100%) (в 95%-ном доверительном интервале: 98,80-100,0%), k-критерий - 0,997; прогностичность положительного результата (PPV) - 100%, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,67% (в 95%-ном доверительном интервале: 97,73-99,95%), общая точность (DAc) - 99,88%) (в 95%-ном доверительном интервале: 99,33-100,00%) (таблица 7).
Таким образом предлагаемый «Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА» является высокоспецифичным и чувствительным, позволяющей быстро в течение 4 часов провести анализ сывороток крови животных с количественным определением уровня антител после вакцинации против ящура, вызванного вирусом ящура штамма О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001).
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ быстрого количественного определения уровня гуморального иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 (генотип O/ME-SA/Ind-2001) вируса ящура с помощью жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА»:
1. Ящур / X. Ререр; пер. с нем. Г.А. Суриковой; под ред. П.В. Малярца - М., 1971. - 432 с.
2. Ящур / А.Н. Бурдов, А.И. Дудников, П.В. Малярец [и др.]; под ред. А.Н. Бурдова. - М.: Агропромиздат.- 1990, - 320 с.
3. Willems Т. FMD vaccine matching: Inter laboratory study for improved understanding of r1 values // J Virol. Methods. - 2020 Feb. - V. 276:113786.
4. WRLFMD // URL: https://www.wrlfmd.org/foot-and-mouth-disease (Дата обращения: 01.02.2022).
5. Груздев К.H. Программа совместных действий по профилактике и борьбе с ящуром животных в странах СНГ / К.Н. Груздев, В.М. Захаров, A.M. Рахманов // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 3-13.
6. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. -Paris, 2018. - Chapter 2.1.8.
7. GenBank FMDV. - URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=FMDV (Дата обращения: 11.12.2021).
8. Гуленкин В.М. Экономическая эффективность проведения профилактической вакцинации животных против ящура на территории Российской Федерации / В.М. Гуленкин // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2012. - Т. 10. - С.31-41.
9. Российский патент RU 2 658 608, 02.11.2017 по МПК C12N 7/00 A61K 39/135. Штамм О №2311/Забайкальский/2016 вируса ящура Aphtae epizooticae типа О для изготовления биопрепаратов и специфической профилактики ящура типа О.
10. Российский патент RU 2665849, 15.12.2017 МПК C12N 7/00 Вакцина инактивированная эмульсионная против ящура типа О.
11. Oem J.K., Park J.H., Lee K.N., Kim Y.J., Куе S.J., Park J.Y., Song H.J. (2007) Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA. Vaccine 25(20):4112-412.
12. Hamblin C, Barnett I.Т., Hedger R.S. (1986) A new enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against foot-and-mouth disease virus. I. Development and method of ELISA. J. Immunol. Methods 93(1):115-121.
13. Basagoudanavar S.H., Hosamani M., Tamil Selvan R.P., Sreenivasa B.P., Saravanan P., Chandrasekhar Sagar B.K., Venkataramanan R. Development of a liquid-phase blocking ELISA based on foot-and-mouth disease virus empty capsid antigen for seromonitoring vaccinated animals. Arch Virol. 2013 May;158(5):993-1001.
14. Lee G, Hwang JH, Park JH, Lee MJ, Kim B, Kim SM. Vaccine strain of O/ME-SA/Ind-2001e of foot-and-mouth disease virus provides high immunogenicity and broad antigenic coverage. Antiviral Res. 2020 Oct;182:104920.
15. Hemida MG, Rizk El-Ghareeb W, Al-Hizab F, Ibrahim A. Foot-and-mouth disease virus O/ME-SA/Ind 2001 lineage outbreak in vaccinated Holstein Friesian cattle in Saudi Arabia in 2016. Vet Q. 2018 Dec;38(l):88-98.
16. Qiu Y, Abila R, Rodtian P, King DP, Knowles NJ, Ngo LT, Le VT, Khounsy S, Bounma P, Lwin S, Verin ВС, Widders P. Emergence of an exotic strain of serotype О foot-and-mouth disease virus O/ME-SA/Ind-2001d in South-East Asia in 2015. Transbound Emerg Dis. 2018 Feb;65(l):el04-el12.
17. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India / Sharma G.K., Mahajan S., Matura R., Subramaniam S., Ranjan R., Biswal J., Rout M., Mohapatra J.K., Dash B.B., Sanyal A., Pattnaik B. Diagnostic assays developed for the control of foot-and-mouth disease in India. World J Virology 2015; 4(3): 295-302.
18. PrioCHECK™ FMDV NS Antibody ELISA Kit. - URL: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/7610440 (Дата обращения: 14.12.2021).
--->
Перечень последовательностей
<110> Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр
охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Federal Governmental
Budgetary Institution «Federal Centre for Animal Health»
(FGBI «ARRIAH»)
<120> Способ быстрого количественного определения уровня гуморального
иммунитета животных к штамму О №2311/Забайкальский/2016 генотипа
O/ME-SA/Ind-2001 вируса ящура после вакцинации с помощью
жидкофазного «сэндвич»-варианта ИФА
<160>    2
<210>    1
<211>    639
<212>    РНК
<213>    вирус ящура
<400>    1
ACCACCTCCA CAGGTGAGTC CGCTGATCCC GTGACCACCA CCGTTGAGAA CTACGGTGGA    60
GAGACACAGG TCCAGAGACG TCAACACACC GACGTTTCTT TCATTTTGGA CAGATTTGTG    120
AAAGTAACAC CGAAAGACCA AATCAATGTG TTGGACCTGA TGCAAACCCC TGCTCACACT   180
TTGGTAGGCG CACTCCTCCG CACCGCCACT TACTACTTCG CAGACCTAGA AGTGGCAGTG     240
AAGCACGAGG GCAACCTCAC CTGGGTCCCG AACGGGGCGC CCGAGGCGGC GCTGGACAAC 300
ACCACCAACC CGACGGCCTA CCACAAGGCA CCGCTCACCC GTCTTGCTCT GCCTTACACA     360
GCACCACACC GTGTTCTGGC TACCGTTTAC AACGGGAACT GCAAGTATGG CGAGGGCGCT     420
GTGACCAACG TGAGGGGTGA CTTGCAAGTG TTGGCTCAGA AGGCAGCAAG AACGCTGCCC    480
ACCTCCTTTA ACTACGGTGC CATCAAGGCT ACCCGGGTGA CTGAACTGCT TTACCGCATG       540
AAGAGGGCCG AAACATACTG CCCTCGGCCT CTGCTGGCCA TTCACCCGGA ACAAGCCAGA    600
CACAAGCAGA AGATTGTGGC ACCTGTGAAA CAGTTGTTG                                                                639
<210>    2
<211>    213
<212>    ПРТ
<213>    вирус ящура
<400>    2
1     Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val            15
16    Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr        30
31    Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys          45
46    Asp Gln Ile Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr         60
61    Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp        75
76    Leu Glu Val Ala Val Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro        90
91    Asn Gly Ala Pro Glu Ala Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr       105
106   Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr       120
121   Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys      135
136   Tyr Gly Glu Gly Ala Val Thr Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val     150
151   Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Tyr       165
166   Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met       180
181   Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Ile His        195
196   Pro Glu Gln Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys          210
211   Gln Leu Leu                                                                                          213
<---