Определение мутагенности нового вещества с антидиабетическим действием в микропланшетном варианте теста Эймса

НОВЫЕ МЕТОДЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ И КЛИНИКЕ

Н. А. Колобродова, Г. Л. Снигур, Д. В. Куркин

Волгоградский государственный медицинский университет, кафедра биологии

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАГЕННОСТИ НОВОГО ВЕЩЕСТВА С АНТИДИАБЕТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ В МИКРОПЛАНШЕТНОМ ВАРИАНТЕ ТЕСТА ЭЙМСА *

УДК 615.03

Была изучена способность нового средства для лечения сахарного диабета 2-го типа на основе агонистов GPR119 рецептора индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов в микропланшетном варианте теста Эймса (Ames MPF™ Penta I). Оценивалась способность тестируемого вещества к индукции мутаций по типу замены пар оснований GC у штаммов Salmonella typhimurium ТА100 и ТА1535 и способность к индукции мутаций по типу сдвига рамки считывания на штаммах Salmonella typhimurium ТА98 и ТА1537. Было показано отсутствие мутагенной активности изучаемого вещества в изученных концентрациях для используемых штаммов в рамках данного теста.

Ключевые слова: сахарный диабет, диабет 2-го типа, противодиабетические средства,

агонисты GPR119 рецептора, мутагенность, тест Эймса.

N. A. Kolobrodova, G. L. Snigur, D. V. Kurkin

ASSESSMENT OF MUTAGENICITY OF A NEW ANTIDIABETIC AGENT USING MICROPLATE FORMAT MUTAGENICITY ASSAY

Mutagenicity of a new antidiabetic agent (GPR119 receptor agonist) for type 2 diabetes was investigated. Microplate format mutagenicity assay (Ames MPF™ Penta I) was used. Salmonella typhimurium TA100 and TA1535 strains were used for the detection of base substitution mutations (Gc base pairs) and TA98 and TA1537 strains were used for the detection of frameshift mutations. As a result, the tested compound showed no mutagenic activity in Ames MPF™ Penta I.

Key words: diabetes mellitus, type 2 diabetes, antidiabetic agents, GPR119 receptor agonists, mutagenicity, Ames test.

Исследование мутагенности является обязательной частью программы доклинического изучения безопасности применения новых фармакологических средств и предусматривает оценку способности к индукции разных типов мутаций в зародышевых и соматических клетках. С этой целью используют комплекс методов, выполняемых на разных объектах, в том числе и тест на индукцию генных мутаций (тест Эймса), предназначенный для быстрого тестирования и определения мутагенного эффекта соединений [2].

В последние годы наиболее востребованным в экспериментальной практике является микропланшетный формат этого теста, ключевыми преимуществами которого служат использование качественных и сертифицированных штаммов, небольшое количество исследуемого

Исследование выполнено при поддержке гранта ГБОУ

химического соединения, требуемое для проведения теста, а также возможность введения автоматизированной стадии для проведения больших скрининговых программ [1].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Выявить способность нового средства для лечения сахарного диабета 2-го типа на основе агонистов GPR119 рецептора индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов в микропланшетном варианте теста Эймса (Ames MPF™ Penta I).

Изучить способности тестируемого вещества к индукции мутаций по типу замены пар оснований GC у штаммов Salmonella typhimurium ТА100 и ТА1535.

ВолгГМУ Минздрава России.

Изучить способности тестируемого вещества к индукции мутаций по типу сдвига рамки считывания на штаммах Salmonella typhimurium ТА98 и ТА1537.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Ночные культуры индикаторных штаммов подвергались воздействию тестируемого вещества в 6 концентрациях в течение 90 минут в среде, содержащей гистидин в количестве, достаточном для прохождения двух клеточных делений. Через 90 минут экспонированные культуры разводились в рН-индикаторной среде, не содержащей гистидин, и разливались по лункам 384-луночной мик-ротитровальной планшеты. В течение двух дней бактерии, претерпевшие реверсию к прототрофно-сти по данной аминокислоте, формировали колонии. Продукты метаболизма бактерий снижали значение pH индикаторной среды, что приводило к изменению ее цвета в лунках. Для каждой концентрации тестируемого вещества проводился подсчет количества лунок с ревертантными колониями, а полученные показатели сравнивались с показателем для негативного контроля (растворитель). Для статистической обработки данных каждая концентрация исследовалась в трех повторностях.

Для обработки исходных данных теста в таблицу калькуляций файла Excel (Xenometrix) вносили необходимую информацию (название тестируемого агента, исследуемые концентрации, единицы измерения, тестовый штамм, метаболическая активация и т. д.). Затем вносили численные значения (количество позитивных лунок отдельно для каждой повторности) из заполненных выше таблиц в соответствующие ячейки таблиц файла. Рассчитывали среднее число позитивных лунок на концентрацию, которое составляло среднее значение числа позитивных лунок от трех повторностей на одну тестируемую концентрацию. Также рассчитывали стандартное

Среднее число позитивных

отклонение показателя числа позитивных лунок на концентрацию. Оно представляло стандартное отклонение среднего значения числа позитивных лунок на тестируемую концентрацию, и кратность превышения относительно нулевой линии, которое определялось как отношение среднего значения числа позитивных лунок на тестируемую концентрацию к нулевой линии негативного контроля (растворитель). При этом нулевая линия вычислялась сложением среднего значения числа позитивных лунок для негативного контроля и значения стандартного отклонения.

Если нулевая линия была менее 1,0, для расчетов брали значение 1,0. Кратность превышения числа ревертантов относительно нулевой линии менее чем 2,0 не рассматривалась как позитивный эффект, поскольку различия не считались достоверными. Образец, для которого выявленная концентрационная зависимость эффекта или кратность превышения относительно нулевой линии составила более чем 2,0, классифицировался как мутаген.

Для определения достоверности различий использовали t-test Стьюдента (односторонний, непарный). Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При анализе среднего числа позитивных лунок для всех исследуемых штаммов без активации фракцией S9 увеличения числа ревер-тантных колоний по сравнению с негативным контролем выявлено не было (см. табл. 1-4). Кратность превышения числа ревертантов относительно нулевой линии во всех случаях была менее чем 2,0, что свидетельствовало об отсутствии мутагенного эффекта во всех концентрациях.

Таблица 1

гнок для штамма ТА98 - S9

Концентрация, мг/мл n Среднее число позитивных лунок Корр. сред. SD Нулевая линия Кратность п ре вышения

Негативный контроль 3 1,67 1,67 1,15 2,82

0,00625 3 2,00 1,73 0,71 0,3976

0,0125 3 1,00 1,00 0,35 0,2459

0,025 3 3,67 2,52 1,30 0,1395

0,05 3 0,67 0,58 0,24 0,1254

0,1 3 2,67 2,08 0,95 0,2536

0,2 3 1,00 0,00 0,35 0,1870

Позитивный контроль 3 46,00 1,73

Таблица 2

Среднее число позитивных лунок для штамма TA100 - S9

Концентрация, мг/мл n Среднее число позитивных лунок Корр. сред. SD Нулевая линия Кратность превышения

Негативный контроль 3 2,00 2,00 1,73 3,73

0,00625 3 3,33 1,15 0,89 0,1647

0,0125 3 5,00 2,00 1,34 0,0605

0,025 3 4,00 1,00 1,07 0,0792

0,05 3 2,33 0,58 0,63 0,3838

0,1 3 3,33 2,08 0,89 0,2209

0,2 3 5,00 1,73 1,34 0,0506

Позитивный контроль 3 48,00 0,00

Таблица 3

Среднее число позитивных лунок для штамма ТА1535 - S9

Концентрация, мг/мл n Среднее число позитивных лунок Корр. сред. SD Нулевая линия Кр а тность превышения

Негативный контроль 3 2,67 2,67 1,53 4,19

0,00625 3 2,00 1,00 0,48 0,2807

0,0125 3 4,67 3,06 1,11 0,1839

0,025 3 2,33 1,15 0,56 0,3890

0,05 3 2,33 0,58 0,56 0,3708

0,1 3 1,67 1,53 0,40 0,2338

0,2 3 0,67 0,58 0,16 0,0506

Позитивный контроль 3 48,00 0,00

Таблица 4

Среднее число позитивных лунок для штамма ТА1537 - S9

Концентрация, мг/мл n Среднее число позитивных лунок Корр. сред. SD Нулевая линия Кратность п ре вышения

Негативный контроль 3 0,67 1,00 1,15 1,82

0,00625 3 1,00 1,00 0,55 0,3623

0,0125 3 0,33 0,58 0,18 0,3389

0,025 3 0,67 0,58 0,37 0,5000

0,05 3 0,67 1,15 0,37 0,5000

0,1 3 0,67 1,15 0,37 0,5000

0,2 3 1,67 1,15 0,92 0,1743

Позитивный контроль 3 48,00 0,00

При анализе среднего числа позитивных лунок для всех индикаторных штаммов с активацией фракцией S9 увеличения числа ревер-тантных колоний по сравнению с негативным контролем также выявлено не было (табл. 5-8). При этом в лунках с концентрацией опытного вещества 0,025 мг/мл при исследовании на штамме ТА100 было отмечено снижение числа

Среднее число позитивных

ревертантных колоний по сравнению с негативным контролем, что может рассматриваться как проявление некоторого цитотоксического эффекта (табл. 6). Кратность превышения числа ревертантов относительно нулевой линии во всех случаях также была менее чем 2,0, что свидетельствовало об отсутствии мутагенного эффекта во всех концентрациях.

Таблица 5

лунок для штамма ТА98 + S9

Концентрация, мг/мл n Среднее число позитивных лунок Корр. сред. SD Нулевая линия К ратность п р е вышения

Негативный контроль 3 2,33 2,33 1,15 3,49

0,00625 3 2,00 1,00 0,57 0,3623

0,0125 3 1,33 1,53 0,38 0,2084

0,025 3 3,00 1,73 0,86 0,3043

0,05 3 2,00 1,00 0,57 0,3623

0,1 3 1,00 1,00 0,29 0,1026

0,2 3 3,33 2,08 0,96 0,2536

Позитивный контроль 3 48,00 0,00

Таблица 6

Среднее число позитивных лунок для штамма ТА100 + S9

Концентрация, мг/мл n Среднее число позитивных лунок Корр. сред. SD Нулевая линия Кратность п ре вышения

Негативный контроль 3 4,00 4,00 0,00 4,00

0,00625 3 3,67 0,58 0,92 0,1870

0,0125 3 3,33 2,08 0,83 0,3043

0,025 3 2,00 1,00 0,50 0,0129

0,05 3 3,00 2,00 0,75 0,2177

0,1 3 4,33 0,58 1,08 0,1870

0,2 3 3,33 1,15 0,83 0,1870

Позитивный контроль 3 48,00 0,00

Таблица 7

Среднее число позитивных лунок для штамма ТА1535 + S9

Концентрация, мг/мл n Среднее число позитивных лунок Корр. сред. SD Нулевая линия Кратность п р е вышения

Негативный контроль 3 2,00 2,00 1,00 3,00

0,00625 3 1,00 1,00 0,33 0,1439

0,0125 3 1,00 1,00 0,33 0,1439

0,025 3 2,00 1,73 0,67 0,5000

0,05 3 1,33 0,58 0,44 0,1870

0,1 3 0,67 0,58 0,22 0,0581

0,2 3 2,33 1,15 0,78 0,3623

Позитивный контроль 3 30,00 4,36

Таблица 8

Среднее число позитивных лунок для штамма ТА1537 + S9

Концентрация, мг/мл n Среднее число позитивных лунок Корр. сред. SD Нулевая линия Кратность п ре вышения

Негативный контроль 3 3,00 3,00 1,73 4,73

0,00625 3 2,00 0,00 0,42 0,1870

0,0125 3 1,00 1,00 0,21 0,0792

0,025 3 2,00 2,00 0,42 0,2742

0,05 3 1,00 1,73 0,21 0,1151

0,1 3 2,67 1,53 0,56 0,4075

0,2 3 3,00 1,00 0,63 0,5000

Позитивный контроль 3 48,00 0,00

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, данные, полученные в ходе проведения микропланшетного варианта теста Эймса (Ames MPF™ Penta I) на штаммах Salmonella typhimurium ТА98, ТА100, ТА1535 и ТА1537, свидетельствуют об отсутствии мутагенной активности лекарственного средства для лечения сахарного диабета 2-го типа на основе агонистов GPR119 рецептора для используемых

штаммов 5. typhimurium в рамках данного теста в изученных концентрациях.

ЛИТЕРАТУРА_

1. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч. 1 / Под ред. А. Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.

2. Teasdale /к. // WNey-BlackweN. - 2011. - Р. 452.