СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯ МОЛОЧНО-КИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
METHOD OF LACTIC BACTERIA FREEZING

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам замораживания молочнокислых бактерий.
Любая практическая область применения микроорганизмов нуждается в стабильных, долгоживущих, максимально специализированных и экологически безопасных культурах этих микроорганизмов. В настоящее время в России производятся лиофилизированные закваски и бактериальные концентраты. Их применение в производстве кисломолочных продуктов требует восстановление активности клеток; при непосредственном внесении в смесь для сквашивания увеличивается время сквашивания, что нерентабельно для производителя.
В настоящее время широко используются закваски прямого внесения (ЗПВ), они вносятся непосредственно в смесь для сквашивания и не нуждаются в активации. ЗПВ, реализуемые в стране, имеют исключительно зарубежное происхождение. Вместе с тем, сведения об использовании методов криозамораживания бактерий для длительного сохранения носят ограниченный характер.
На практике используют эмпирические подходы для подбора режимов замораживания конкретных объектов, так как выживаемость и стойкость микроорганизмов при замораживании в среде жидкого азота зависит от ряда факторов. Например: вид клеток и их концентрация в суспензии (чувствительность бактерий к замораживанию и оттаиванию сильно варьирует в зависимости от их принадлежности к тому или иному виду. Немаловажное значение имеют физико-химический свойства, количественное содержание бактерий и ряд других свойств микробной биомассы, подлежащей замораживанию); состав защитной среды для криозамораживания (для сохранения микроорганизмов при замораживании существенным является выбор защитной среды, природы и химического строения присутствующего в ней криопротектора и физико-химических особенностей его взаимодействия с компонентами жидкой и твердой фаз клетки); режим охлаждения (при замораживании происходит образование микрокристаллов льда внутри и снаружи клеток. Характер этих изменений зависит от свойств продукта и криопротектора, но главным образом, от скорости охлаждения. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, приводящее к обезвоживанию клетки до того, как будет достигнута точка замерзания цитоплазмы. При быстром охлаждении клетки быстрее замораживаются изнутри, медленнее обезвоживаются, что приводит к образованию кристаллов льда внутри клетки. Наилучший эффект достигается обычно при замораживании в среде жидкого азота при температуре - 196°С. Одним из преимуществ быстрого охлаждения является то, что в этих условиях действие концентрированных солевых растворов после выделения льда занимает менее продолжительный период до достижения их эвтектической точки); режим хранения (при температуре - 40°С хранение замороженных микроорганизмов оказывается весьма успешным. Лучшие результаты достигаются при хранении при температуре от -80 до -100°С в сжиженных парах азота или в жидком азоте при температуре - 196°С).
Криопротекторы - вещества, способные предотвращать развитие повреждений биологических объектов при охлаждении, замораживании и последующем отогреве. Механизм защитного действия криопротекторов основан, главным образом, на их способности создавать более прочные связи с молекулами воды, чем связи молекул воды между собой, что препятствует формированию правильной кристаллической решетки льда и задерживает начало роста кристаллов. Криопротекторы могут оказывать на клетки токсическое действие, величина которого зависит от температуры и длительности экспозиции клеток с криопротектором. Поэтому, как правило, сразу после оттаивания удаляют криопротектор из клеток и среды путем последовательных отмываний и центрифугирования. При создании защитных сред для производства бактериальных концентратов, используемых в пищевой промышленности, в качестве криозащитных веществ должны применяться соединения, имеющие статус пищевых.
Известен способ замораживания бактерий в гранулах, для этого готовят стерильный 10%-ный раствор желатины на 0,86% NaCl. Суспензию микробных клеток смешивают с расплавленным 10%-ным раствором желатины в отношении 1:1. Присутствие желатины в растворе позволяет формировать при замораживании желатиновые шарики с достаточным количеством клеток. Через подготовленный таким образом раствор с клетками продувают азот для создания анаэробных условий. Далее при помощи дозатора суспензию клеток раскапывают по 50 и/или 100 мкл на охлажденную в парах жидкого азота фторопластовую пластину. Замороженные гранулы "сбрасывают" в жидкий азот, собирают в находящиеся в азоте промаркированные пластиковые пробирки с завинчивающимися крышками и переносят на хранение в сосуды Дьюара с жидким азотом (криохранилище) (см. патент РФ №2123044).
Недостатком данного способа является то, что предусмотрено хранение в среде жидкого азота, а это требует наличие криохранилищ, и не применимо при производстве бактериальных концентратов.
Наиболее близким к заявленному по совокупности существенных признаков является способ замораживания бактерий, предусматривающий отделение бактерий центрифугированием, смешивание суспензии бактерий с защитной средой в соотношении 1:1, содержащей глицерин, сахарозу, лимоннокислый натрий, замораживание полученной смеси в жидком азоте в виде гранул. Бактериальный концентрат, полученный этим способом, сохраняет свою активность в течение 6 месяцев при температуре не выше -18°С (см. авторское свидетельство СССР №457727).
Недостаток этого изобретения заключается в том, что происходит слипание гранул в процессе хранения.
Задачей изобретения является создание способа замораживания молочнокислых бактерий, обеспечивающего исключение слипания гранул молочнокислых бактерий.
Поставленная задача достигается путем создания способа замораживания молочнокислых бактерий, предусматривающего смешивание в соотношении 1:1 молочнокислых бактерий с защитной средой, содержащей глицерин и лимоннокислый натрий, замораживание полученной смеси в жидком азоте в виде гранул, отличием которого согласно изобретению является то, что защитную среду готовят на основе фосфатного буфера с рН 7,2, дополнительно вводят в нее лактозу и желатин, при следующем соотношении компонентов мас.%:
глицерин
15-20
лактоза
10-40
лимоннокислый натрий
1-10
желатин
1-10
фосфатный буфер с рН 7,2
остальное.
Целесообразно, чтобы после смешивания молочнокислых бактерий с защитной средой полученную смесь выдерживали при температуре от 17 до 27°С в течение 15-20 минут, затем еще раз перемешивали и подавали на замораживание.
При реализации заявленного способа достигается технический результат, заключающийся в улучшении реологических свойств бактериального концентрата и повышении его стойкости при хранении за счет внесения дополнительных компонентов, в частности желатина, выдержки после смешивания биомассы с защитной средой, для взаимодействия проникающего криопротектора (глицерин) с микробной клеткой, а также определение оптимальных соотношений компонентов защитной среды.
Заявленный способ осуществляют следующим образом.
Получают суспензию молочнокислых бактерий. Для этого молочнокислые бактерии, после центрифугирования смешивают с защитной средой, которая основана на фосфатном буфере с рН 7,2 с добавлением глицерина (в %) 15-20, лактозы 10-40, лимоннокислого натрия 1-10, желатина 1-10, при этом биомассу с защитной средой смешивают в соотношении 1:1, выдерживают, затем перемешивают и подают на замораживание в жидком азоте в виде гранул. Замораживание длится не более одного часа.
Полученную биомассу после смешивания с защитной средой целесообразно выдерживать в течение 15-20 минут при температуре от 17 до 27°С, затем еще раз перемешивают и замораживают в виде гранул в жидком азоте в течении 30 минут. После чего расфасовывают в полистирольные стаканчики и хранят при температуре -40°С, но не выше -18°С.
Использование в качестве криопротекторов глицерина, лактозы, лимоннокислого натрия в предложенном соотношении обеспечивает наиболее полное сохранение микроорганизмов. Внесение желатина предотвращает слипание гранул в процессе хранения. Предложенные криопротекторы нетоксичны для организма человека и разрешены к применению, поэтому не требуется процедура удаления криопротектора из клеток и среды путем последовательных отмываний и центрифугирования. Полученные результаты свидетельствуют, что описанный метод криозамораживания молочнокислых бактерий в среде жидкого азота и при последующем хранении при температуре -40°С, но не выше -18°С, позволяет сохранять жизнеспособность микроорганизмов в полученном бактериальном концентрате молочнокислых бактерий и обеспечить его стабильность в хранении.
3
3
3
3
3
Пример 1. Для получения 1000 см защитной среды берут 400 смфосфатного буфера, растворяют в нем 350 грамм лактозы смешанной с 5 граммами желатина, 5 грамм лимоннокислого натрия, добавляют 150 смглицерина, доводят до метки фосфатным буфером. Полученную после центрифугирования биомассу смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, выдерживают 15-20 минут при температуре от 17 до 27°С, затем еще раз перемешивают и замораживают в виде гранул в жидком азоте в течении 30 минут. После чего расфасовывают в полистирольные стаканчики по 160±5 грамм (доза внесения на 1 тонну сквашиваемой смеси), после чего хранят при температуре -40°С, но не выше -18°С. Замороженный концентрат содержит 300-500 млрд КОЕ/см. При хранении замороженного концентрата в течение 6 месяцев при температуре -40°С, но не выше -18°С, количество клеток было в пределах 270-470 млрд КОЕ/см, гранулы не слиплись и поэтому оставались в виде отдельных гранул весь срок хранения.
3
3
Пример 2. Для получения защитной среды смешивают 20% лактозы, 10% водного раствора желатина, 5% лимоннокислого натрия, и 20% глицерина, доводят до 100% фосфатным буфером, приготовленном на основе однозамещенного фосфорнокислого калия с рН 7,2. Полученную после центрифугирования биомассу смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, выдерживают 15-20 минут при температуре от 17 до 27°С, затем еще раз перемешивают и замораживают в виде гранул в жидком азоте в течение 30 минут. После чего расфасовывают в полистирольные стаканчики по 160±5 грамм (доза внесения на 1 тонну сквашиваемой смеси) и хранят при температуре -40°С. Замороженный концентрат содержит 300-500 млрд КОЕ/см. При хранении замороженного концентрата в течение 6 месяцев при температуре -40°С количество клеток было в пределах 270-470 млрд КОЕ/см, гранулы не слиплись и поэтому оставались в виде отдельных гранул весь срок хранения.
Таким образом, предлагаемый способ замораживания молочнокислых бактерий позволяет получать бактериальный концентрат молочнокислых бактерий с высоким содержанием молочнокислых бактерий, стойкий в хранении, что представляет большой интерес для отечественной биотехнологии в решении практических задач при производстве бактериальных концентратов.