СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ ИММУНОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ ПОСЛЕ СПЛЕНЭКТОМИИ ПО МАССЕ CD8+T-ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ
METHOD FOR PREDICTION OF CLINICAL COURSE OF POST-SPLENECTOMY IMMUNE THROMBOCYTOPENIA BY SPLENIC CD8+T-LYMPHOCYTE WEIGHT

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и может быть использовано для прогнозирования течения иммунной тромбоцитопении после спленэктомии путем определения массы селезенки, морфометрической оценки количества CD8+ Т-лимфоцитов в гистологичнских срезах селезенки после иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания и вычисления их массы.
Иммунная тромбоцитопения (ИТП) - аутоиммунное гематологическое заболевание, характеризующееся снижением содержания тромбоцитов крови и повышением риска кровотечений (А.А. Масчан, А.Г. Румянцев, Л.Г. Ковалева [и др.] / Рекомендации Российского совета экспертов по диагностике и лечению больных первичной иммунной тромбоцитопенией // Онкогематология. - 2010 - №3. - С. 36-45; F. Rodeghiero, R. Stasi, T. Gemsheimer [et al.] / Standartization of terminology, definitions and autcome criteria in immune thrombocytopenic purpura of adults and children: report from an international working group // Blood. - 2009. - Vol. 113, No 11. - P. 2386-2393).
Длительное время основным звеном в патогенезе ИТП считалось разрушение тромбоцитов аутоантителами. В последние годы при более углубленном исследовании появились сообщения о Т-клеточном механизме деструкции кровяных пластинок с участием макрофагов селезенки. Спленэктомия входит в программу стандартной терапии у больных ИТП. Развитие данного заболевания не может не отражаться на структуре этого лимфоидного органа. Способа прогнозирования течения ИТП после спленэктомии по массе CD8+ Τ-лимфоцитов селезенки не существует. Встречаются лишь единичные работы, свидетельствующие о активации CD8+ Т-клеток в селезенке у больных ИТП, не отвечающих на иммуносуперссивную терапию ритуксимабом, и участии этой клеточной популяции в альтерации тромбоцитов при ИТП (S. Audia, M. Samson, M. Mahevas [et al.] / Preferential splenic CD8+ T-cell activation in rituximab-nonresponder patients with immune thrombocytopenia // Blood. - 2013. - Vol. 122. - P. 2477-2486).
Целью изобретения является разработка способа прогнозирования течения ИТП после спленэктомии по массе CD8+ T-лимфоцитов селезенки.
Аналогом является известный способ активации CD8+ Т-клеток в селезенке у больных ИТП, не отвечающих на терапию ритуксимабом (S. Audia, M. Samson, M. Mahevas [et al.] / Preferential splenic CD8+ T-cell activation in rituximab-nonresponder patients with immune thrombocytopenia // Blood. - 2013. - Vol. 122. - P. 2477-2486).
Отличия заявляемого способа от аналога включают:
1. В заявляемом способе морфометрически подсчитывают содержание CD8+ Т-лимфоцитов в селезенке, вычисляют их массу и прогнозируют отдельные варианты течения ИТП по массе CD8+ T-лимфоцитов селезенки после спленэктомии.
2. В аналоге цитофотометрическим методом по относительному количеству (%) CD8+ Т-клеток в селезенке и крови оценивают результаты лечения ИТП у пациентов, не отвечающих на иммуносупрессивную терапию ритуксимабом, метод также не позволяет прогнозировать варианты течения ИТП.
В процессе проведения патентно-информационного поиска не выявлено источников, порочащих новизну предлагаемого изобретения.
Заявляемое изобретение разработано в лаборатории патоморфологии крови ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России в соответствии с планом НИР.
Способ осуществляется следующим образом:
Исследования выполнены на гистологических срезах селезенки от 24 больных ИТП после спленэктомии в возрасте от 21 до 65 лет (11 - мужского пола и 13 - женского). Группу сравнения составили образцы селезенок, взятых от 20 лиц, не имевших в анамнезе заболеваний системы крови.
После удаления селезенки определяют ее массу, выполняют гистологическую проводку образцов послеоперационного материала общепринятым способом. Для идентификации CD8+ Т-лимфоцитов селезенки используют метод ИГХ окрашивания. Исследования проводят на гистологических срезах, приготовленных из парафиновых блоков селезенок толщиной 3-5 мкм. Иммунореактивность первичных антител («Dako») выполняют с помощью вторичных антител, коньюгированных с пероксидазой, входящей в набор реактивов EnVISION+ («Dako»). Постановку ИГХ реакции осуществляют по стандартной методике в соответствии с протоколом системы визуализации «Dako». Морфометрическую оценку количества CD8+ Т-лимфоцитов осуществляют на световом микроскопе со встроенной фото- и видеокамерой фирмы «Leica» с помощью программного обеспечения анализа изображений ImageScope Color, версии Μ, с окуляром ×10, при объективе ×100. Исследования проводят в 20 полях зрения для каждого образца, начиная от капсулы вглубь лимфоидного органа. Исходя из полученных результатов вычисляют массу CD8+ Т-лимфоцитов селезенки по формуле:
М=m×D/100%,
m - масса селезенки, г;
D - количество CD8+ Т-лимфоцитов, %;
Μ - масса CD8+ Т-лимфоцитов, г.
После выполнения спленэктомии у больных ИТП определяют массу селезенки, в гистологических срезах лимфоидного органа после ИГХ окрашивания выполняют морфометрическую оценку и подсчитывают в селезенке количество CD8+ Т-лимфоцитов, вычисляют их массу и при значениях CD8+ Т-лимфоцитов ≥9,75 г, прогнозируют рефрактерную форму течения ИТП, а при <9,75 г констатируют вариант ИТП с благоприятным течением заболевания после спленэктомии. В ходе обработки данных рассчитана средняя масса CD8+ Т-лимфоцитов селезенки у больных ИТП после спленэктомии. По результатам анализа у 11 пациентов прогнозируют рефрактерную форму течения ИТП и 13 больных - вариант ИТП с благоприятным течением заболевания после спленэктомии.
Результаты исследований представлены в примерах, подтверждающих возможность заявляемого способа прогнозировать варианты течения ИТП после спленэктомии по массе CD8+ Т-лимфоцитов селезенки.
Пример 1
12
9
9
л
л
л
Больная Т., 46 лет, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 02.02.2008 г. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 105 г/л, эритроциты 3,4×10/, лейкоциты 6,2×10/, тромбоциты 8×10/. Диагноз при поступлении: ИТП, тяжелая форма, плохо контролируемая лекарственными препаратами. Через 11 месяцев выполнена операция (16.01.2009 г.): лапароскопическая спленэктомия - без осложнений. Масса селезенки больной (m) составила 179,0 г. Проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов в гистологических срезах селезенки по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено количество CD8+ Т-лимфоцитов (D) - 7,5%. Вычислена масса (М) CD8+ Т-лимфоцитов по ранее приведенной формуле: 13,4 г. Установленная величина получена в ходе следующего расчета: Μ=179,0 г × 7,5%/100.
12
9
9
л
л
л
Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа установлено, что у больной рефрактерная форма течения ИТП. При динамическом наблюдении за пациенткой, уже спустя 13 месяцев после спленэктомии прогноз был подтвержден лабораторными показателями (20.09.10): гемоглобин 124 г/л, эритроциты 4,3×10/, лейкоциты 4,6×10/, тромбоциты 60×10/. Пациентка до настоящего времени нуждается в поддерживающей терапии.
Пример 2
12
9
9
л
л
л
Больная К., 21 год, поступила в гематологическое отделение ФГБУН КНИИГиПК ФМБА России 01.12.2009 г. Анализ крови при поступлении: гемоглобин 88 г/л, эритроциты 4,3×10/, лейкоциты 4,5×10/, тромбоциты 15×10/. Диагноз при поступлении: ИТП, тяжелая форма, плохо контролируемая лекарственными препаратами. Через 13 месяцев выполнена операция (19.01.2010 г.): лапароскопическая спленэктомия - без осложнений. Масса селезенки больной (m) составила 162,0 г. Проведено ИГХ окрашивание лимфоцитов в гистологических срезах селезенки по стандартной методике. С помощью морфометрического исследования определено количество CD8+ Т-лимфоцитов (D) - 2,0%. Вычислена масса (М) CD8+ Т-лимфоцитов по ранее приведенной формуле: 3,2 г. Установленная величина получена в ходе следующего расчета: Μ=162,0 г × 2,0%/100.
12
9
9
л
л
л
Заключение: по результатам ИГХ и морфометрического анализа установлено, что у больной ИТП благоприятный вариант течения заболевания после спленэктомии. При динамическом наблюдении за пациенткой прогноз был подтвержден лабораторными показателями, значения которых находились в пределах нормы в течение 24 месяцев после спленэктомии (20.03.12): гемоглобин 121 г/л, эритроциты 4,2×10/, лейкоциты 6,2×10/, тромбоциты 111×10/. В настоящее время пациентка не нуждается в поддерживающей терапии.
Заявляемое изобретение обладает новизной, существенными отличиями, дает возможность по массе CD8+ Т-лимфоцитов селезенки прогнозировать вариант течения ИТП после спленэктомии. Более высокие величины массы CD8+ Т-лимфоцитов свидетельствуют о рефрактерной форме ИТП, напротив, более низкие - по сравнению с группой сравнения - о благоприятном течении заболевания после спленэктомии. Предлагаемый способ информативен, может быть использован в гематологических отделениях, морфологических и гистологических лабораториях в качестве дополнительного критерия при прогнозировании течения ИТП после спленэктомии и дифференцированного подхода при назначении терапии.