СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ГЛЮКОКОРТИКОСТЕРОИДАМИ
METHOD FOR PREDICTION OF GLUCOCORTICOSTEROID CLINICAL EFFECTIVENESS

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при лабораторных исследованиях для определения показаний к проведению глюкокортикоидной терапии.
На сегодняшний день ключевыми проблемами лечения системных воспалительных заболеваний являются отсутствие надежных и общепринятых критериев оценки активности воспалительного процесса, а также непредсказуемость его естественного течения и результатов противовоспалительной (в первую очередь глюкокортикостероидной) терапии, что не дает возможности обосновать выбранную тактику лечения в каждом случае.
Накопленный к настоящему времени опыт терапии позволяет считать, что в ряде случаев активность текущего воспаления сохраняется несмотря на противовоспалительное лечение глюкокортикостероидами. С течением времени это приводит к формированию необратимых фиброзных изменений в тканях. Данный факт свидетельствует об имеющихся различиях в индивидуальной чувствительности больных к глюкокортикостероидам и согласуется с представлениями о недостаточной эффективности этих препаратов при прогрессирующем фиброзе. В связи с этим поиск прогностических критериев эффективности глюкокортикостероидной терапии является чрезвычайно актуальной научной и практической задачей, одним из методов решения которой может быть индивидуальная оценка чувствительности клеток-участниц (мононуклеарных фагоцитов) воспалительного процесса к стероидам.
Известен способ определения показаний к лечению цитостатиками и глюкокортикоидами (Патент РФ №2112986, МПК G01N 33/536, публ. 1998 г.), основанный на оценке влияния различных терапевтических доз препаратов на мононуклеары крови по результатам реакции Е-розеткообразования. Показано, что при снижении E-розеткообразования на 50% и более по сравнению с контролем препарат считают показанным данному больному.
Недостатками способа является значительная трудоемкость, потребность длительного времени для выполнения исследований, необходимость дополнительных реактивов, в том числе свежеприготовленных эритроцитов барана, низкая точность и объективность.
Известен способ прогнозирования течения саркоидоза органов дыхания на фоне глюкокортикоидной терапии (Патент №2319451, МПК G01N 33/86, публ. 2008 г.), основанный на определении в динамике ряда параметров гемостаза до начала, через месяц и через год после начала лечения глюкокортикостероидами.
К недостаткам этого способа относятся низкая точность прогноза, основыванная на неспецифических показателях гемостаза, которые могут изменяться в широком диапазоне в зависимости от активности любых воспалительных реакций. Кроме того, требуется выполнение нескольких методик с необходимостью значительных затрат дорогостоящих реактивов, оборудования и длительного времени для постановки реакций, что в значительной мере снижает эффективность метода.
-7
-4
Наиболее близким является способ оценки влияния глюкокортикоидов на моноциты периферической крови in vitro по изменению их морфометрических показателей методом компьютерной фазово-интерференционной микроскопии (Терпигорев С.А., Ильченко В.А., Василенко И.А. и др. Соотношение результатов лечения глюкокортикоидами с их влиянием на моноциты in vitro при бронхиальной астме. // Бюл. экспер. биол. и мед. - 2003. - Т. 135, №6. - С.683-687). Способ основан на определении изменений морфометрических показателей моноцитов (диаметр, периметр, высота, площадь, объем) после их инкубации с преднизолоном в концентрации 10 и 10 ммоль/л в течение 60 минут при комнатной температуре. При снижении диаметра, периметра и площади клеток на 10% и более по сравнению с контролем (необработанными клетками) прогнозировали эффективность глюкокортикостероидной терапии.
К недостаткам этого способа относятся необходимость анализа нескольких концентраций препарата, длительное время инкубации клеток с преднизолоном, комплексная оценка целого ряда морфометрических показателей мононуклеаров, которые неспецифически отражают повышение или снижение активности клеток в результате действия любых внешних или внутренних факторов.
Заявляемое изобретение направлено на повышение точности прогнозирования эффективности лечения глюкокортикостероидами, сокращение времени исследования, обеспечение более оперативной и объективной количественной оценки клеточных показателей, что позволяет в режиме реального времени определять чувствительность больного к глюкокортикоидным препаратам и прогнозировать эффективность лечения.
2
Для этого проводят исследования in vitro моноцитов периферической крови, обработанных преднизолоном методом фазово-интерференционной микроскопии. Определяют морфометрические параметры моноцитов, а об эффективности судят на основании анализа полученных результатов. Новым является то, что перед обработкой преднизолоном моноциты активируют в течение 10-20 минут гелий-неоновым лазером при мощности 1-2 Вт/см, в качестве морфометрических параметров моноцитов регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов, затем обрабатывают моноциты преднизолоном и повторно регистрируют оптическую толщину ядер моноцитов, и при увеличении этого показателя на 30% и более прогнозируют эффективность лечения глюкокортикостероидами.
Известно, что доминирующим компонентом в лимфоците является ядро, которое имеет чаще всего округлую или овальную форму, иногда - бобовидную и, очень редко, неправильную. Гетерохроматин располагается в ядре равномерно с эухроматином или образует крупные конгломераты по периферии и в центре ядра. В процессе активации и дифференцировки клеток меняются свойства хроматина их ядер. При этом конденсированный хроматин метаболически менее активен в отношении синтеза ДНК по сравнению с его диффузной формой.
Поэтому оценка изменений оптической толщины циркулирующих мононуклеарных фагоцитов при инкубации с различными концентрациями преднизолона методом фазово-интерференционной микроскопии может быть полезной для предварительной оценки чувствительности больных к противовоспалительной терапии и составления прогноза кортикостероидной терапии.
Способ осуществляется следующим образом.
При поступлении больного в стационар из локтевой вены производят забор крови в объеме 5,0 мл. Мононуклеарные клетки выделяют стандартным методом на градиенте плотности (1,077). Клетки отмывают центрифугированием в среде 199. Надосадок сливают, разводят средой 199 до концентрации 2×106.
Витальную оценку морфофункционального состояния клеток проводят с помощью фазово-интерференционного микроскопа. Комплексный алгоритм морфометрии обеспечивает автоматическое определение заданных размерных параметров отдельных клеток, статистическую обработку данных на популяционном уровне и документирование результатов в виде цитограмм.
3
2
Каплю клеточной взвеси помещают в стандартную счетную камеру Горяева с зеркальным напылением. Активируют облучением гелий-неонового лазера в течение 10-20 минут при мощности (0,5-1)10 Вт/см, регистрируют оптическую толщину ядер 30-100 клеток, получают среднее значение и цитограмму распределения моноцитов по величине анализируемого показателя - оптической толщине.
Затем к моноцитам добавляют преднизолон в концентрации 0,01 г/л, регистрируют оптическую толщину ядер 30-100 клеток, получают среднее значение и цитограмму, сравнивают с результатами активированных лазером моноцитов. При увеличении показателя на 30% и более по сравнению с активированными моноцитами прогнозируют эфективность лечения глюкокортикостероидами, при отсутствии изменений - лечение неэффективно.
Обследованы 48 пациентов с различными хроническими иммунопатологическими системными заболеваниями, основу патогенетического лечения которых составляют препараты с противовоспалительной активностью, в первую очередь - глюкокортикостероиды. У 16 больных прогноз лечения глюкокортикостероидами был отрицательным, что в дальнейшем на 100% был подтверждено клинико-лабораторными исследованиями в процессе лечения глюкокортикостероидами. Остальные 32 пациента получили лечение в полном объеме с положительным результатом, что и было спрогнозировано при исследованиях по предлагаемому способу.
Пример 1.
Пациентка Р., 52 года, некурящая, без профессиональных вредностей в анамнезе, до настоящего заболевания была здорова. За 3 месяца до обращения в клинику стала отмечать периодический субфебрилитет, непродуктивный кашель, умеренные боли в грудной клетке разного характера, не связанные с нагрузкой. Примерно через месяц от начала заболевания появилась умеренная одышка при нагрузке. При рентгенологическом обследовании (рентгенография и компьютерная томография высокого разрешения грудной клетки) выявлено увеличение внутригрудных лимфоузлов и мелкоочаговая диссеминация. Диагноз саркоидоза был морфологически верифицирован после исследовании биоптата, полученного при трансбронхиальной биопсии. Изменение лабораторных показателей заключались в умеренном увеличении СОЭ (до 35 мм в час), уровня фибриногена плазмы крови (до 4,6 ммоль/л), что указывает на активность гранулематозного воспаления.
При исследовании функции внешнего дыхания выявлено необратимое в пробе с бета-2 агонистами снижение ОФВ1 и ФЖЕЛ (на 82% и 86% должной величины, соответственно). При бодиплетизмографии обнаружено снижение ООЛ до 80% должной, что соответствует нарушениям вентиляции умеренной степени по рестриктивному типу. Диффузионная способность легких была снижена до 75% должной величины.
Результаты фазово-интерференционной микроскопии моноцитов периферической крови по предлагаемому способу были следующими:
3
2
средняя величина оптической толщины ядер моноцитов после активации клеток гелий-неоновым лазером при облучении в течение 10 минут с мощностью 1,0×10 Вт/см составила 1,45±0,1 мкм; после инкубации с преднизолоном - 2,01±0,2 мкм (M±σ). Показатель увеличился на 38,6%.
Заключение: мононуклеары больной чувствительны к действию кортикостероидов, прогноз эффективности кортикостероидной терапии благоприятный.
Больной был назначен преднизолон в суточной дозе 0,5 мг на кг веса в течение 45 дней, с последующим снижением суточной дозы в 2 раза и приемом ее в течение 75 дней.
Эффективность терапии оценивалась по субъективным ощущениям, результатам компьютерной томографии грудной клетки, динамике лабораторных тестов, показателей функции внешнего дыхания и измерению диффузионной способности легких.
Результаты терапии: в течение 10-15 дней исчезли болевые ощущения, значительно уменьшилась одышка, стойко нормализовалась температура. В конце срока лечения при повторном обследовании была отмечена нормализация лабораторных и функциональных параметров и исчезновение рентгенологических симптомов заболевания.
Таким образом чувствительность циркулирующих моноцитов к преднизолону in vitro у этой больной сочеталась с быстрым исчезновением клинико-функциональных и рентгенолических симптомов болезни и нормализацией лабораторных показателей активности воспаления.
Пример 2
Больная О., 47 лет, некурящая, до настоящего заболевания была здорова. Профессиональных вредностей не было. За 8 месяцев до обращения в клинику появился затяжной сухой кашель и незначительная одышка при нагрузке. На рентгенограмме и компьютерной томограмме высокого разрешения была выявлена мелкоочаговая легочная диссеминация лимфогенного типа и внутригрудная лимфаденопатия. В анализе крови отмечено незначительное увеличение СОЭ (до 25 мм в час), другие лабораторные показатели были в норме. При исследовании функции внешнего дыхания выявлено умеренное снижение ОФВ1 и ФЖЕЛ (80% и 88% должной величины, соответственно), снижение ООЛ до 87% должной, что соответствовало рестриктивному синдрому умеренной степени выраженности. Диффузионная способность легких была незначительно снижена (78% должной). Диагноз саркоидоза верифицирован при помощи трансбронхиальной биопсии.
3
2
Результаты фазово-интерференционной микроскопии моноцитов периферической крови были следующими: средняя величина оптической толщины ядер моноцитов после активации клеток гелий-неоновым лазером при облучении в течение 15 минут с мощностью 0,5×10 Вт/см составила 1,67±0,2 мкм; после инкубации с преднизолоном - 1,78±0,2 мкм (M±σ). Показатель увеличился на 6,6%. Заключение: моноциты больной нечувствительны к действию кортикостероидов, прогноз эффективности кортикостероидной терапии неблагоприятный.
Терапия преднизолоном и оценка эффективности терапии проводились аналогично первому случаю.
Результаты терапии. Отмечалось постепенное уменьшение кашля и одышки к третьему месяцу терапии. В конце срока лечения отмечена нормализация лабораторных показателей и уменьшение (но не исчезновение) количества мелкоочаговых теней в легочной паренхиме при сохранении признаков внутригрудной лимфаденопатии. Достоверной динамики функциональных параметров дыхания обнаружено не было.
Таким образом, низкая чувствительность циркулирующих моноцитов к преднизолону in vitro у этой больной сочеталась с отсроченным и неполным эффектом терапии: более поздним нежели в первом случае уменьшением кашля и одышки, а также стойкими нарушениями функции внешнего дыхания. Кроме того, рентгенологические изменения оказались лишь частично обратимыми (уменьшение выраженности легочной диссеминации при сохранении внутригрудной лимфаденопатии) несмотря на длительное лечение преднизолоном.
Полученные результаты позволяют предполагать существенную прогностическую значимость подобной морфометрической оценки морфофункционального состояния моноцитов периферической крови при характеристике степени подавления глюкокортикоидами активации клеток, вызванной облучением гелий-неоновым лазером, что демонстрируется визуально и позволяет оценить количественно чувствительность клеток больного к действию глюкокортикоидной терапии.
Применение предлагаемого способа исследования перед началом лечения глюкокортикостероидами позволяет избежать неоправданного назначения этих препаратов, поскольку даже кратковременное их применение может привести к различным осложнениям.