ОЧИСТКА ПОЛИПЕПТИДОВ
PURIFICATION OF POLYPEPTIDES

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к очистке полипептидов. В частности, настоящее изобретение относится к способам, использующим ионообменную хроматографию, посредством которых могут быть очищены разные гамма-карбоксилированные формы полипептидов.
Предшествующий уровень техники
γ-Карбоксиглутаминовая кислота (Gla) является уникальной аминокислотой, которая связывается с кальцием. Она представляет собой модифицированную форму глутаминовой кислоты (Glu) и может быть получена в результате посттрансляционной модификации in vivo глутаматных остатков. Карбоксилирование глутаминовой кислоты таким способом облегчает связывание с кальцием и делает возможным присоединение таких белков, как прокоагулянты и антикоагулянты, к фосфолипидам. Такая ферментативной опосредованная реакция, известная как γ-карбоксилирование (гамма-карбоксилирование), требует присутствия витамина K в качестве кофактора.
Некоторые зрелые белки содержат домен, обогащенный аминокислотами, которые были превращены в γ-карбоксиглутаминовую кислоту таким способом. Он известен как GLA-домен. Этот GLA-домен часто отвечает за высокоаффинное связывание ионов кальция белком. Такой GLA-домен может быть обнаружен у ряда разных белков. Например, факторы свертывания крови VII, IX и Х и протромбин все включают GLA-домен, который содержит много остатков аминокислоты Gla.
Краткое описание изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что существует возможность разделения или очистки различных вариантов полипептида, отличающихся по степени гамма-карбоксилирования или по количеству остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, которые они содержат. Изобретение относится к конкретному хроматографическому разделению полипептидных вариантов, имеющих различные содержания гамма-карбоксиглутаминовой кислоты.
Таким образом, согласно изобретению предложен способ очистки полипептида, имеющего желаемое содержание гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, из образца, содержащего смесь вариантов указанного полипептида, имеющих различные содержания гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, при этом указанный способ включает стадии:
(a) загрузки указанного образца на анионообменный хроматографический материал;
(b) элюирования указанного полипептида с использованием раствора при рН менее чем 9,0, содержащего по меньшей мере одну соль, выбранную из ацетата аммония, хлорида аммония и ацетата натрия;
(c) отбора фракции, полученной после указанного элюирования, при этом полипептиды в данной фракции имеют желаемое содержание гамма-карбоксиглутаминовых кислот.
Предпочтительный вариант такого способа включает следующие стадии:
(а) уравновешивания анионообменного материала буфером при рН менее 9,0;
(b) загрузки указанного образца на анионообменный материал;
(c) возможно промывки анионообменного материала буфером при рН менее 9,0;
(d) элюирования указанного полипептида из анионообменного материала с использованием раствора при рН менее 9,0, содержащего по меньшей мере одну соль, выбранную из ацетата аммония, хлорида аммония и ацетата натрия; и
(e) отбора фракции, полученной после указанного элюирования, при этом полипептиды в данной фракции имеют желаемое содержание гамма-карбоксиглутаминовых кислот.
Подходящие полипептиды для очистки таким способом включают фактор IX, фактор VII, фактор VIIa, фактор X, протромбин, белок-S, белок-С, белок Z, остеокальцин, матриксный gla-белок, продукты 6 генов блокировки роста, пролин-обогащенный Gla-1, пролин-обогащенный Gla-2, пролин-обогащенный Gla-3 и пролин-обогащенный Gla-4. В предпочтительном способе полипептид представляет собой фактор IX, фактор X, фактор VII или фактор VIIa.
Если полипептид представляет собой фактор IX, то данный способ может включать отбор фракции, полученной после указанного элюирования, которая характеризуется увеличением доли форм (1-11)-Gla и/или (1-12)-Gla фактора IX по сравнению с долей форм (1-11)-Gla и/или (1-12)-Gla фактора IX в образце перед его очисткой.
Если полипептид представляет собой фактор Х или фактор VII, то данный способ может включать отбор фракции, полученной после указанного элюирования, которая характеризуется увеличением доли форм (1-10)-Gla и/или (1-11)-Gla фактора Х или фактора VII по сравнению с долей форм (1-10)-Gla и/или (1-11)-Gla фактора Х или VII в образце перед его очисткой.
Если полипептид представляет собой фактор IX, то данный способ может включать отбор фракции, полученной после указанного элюирования, которая характеризуется уменьшением доли формы (1-10)-Gla фактора IX по сравнению с долей формы (1-10)-Gla фактора IX в образце перед его очисткой.
Если полипептид представляет собой фактор Х или фактор VII, то данный способ может включать отбор фракции, полученной после указанного элюирования, которая характеризуется уменьшением доли формы (1-9)-Gla фактора Х или фактора VII по сравнению с долей формы (1-9)-Gla фактора Х или фактора VII в образце перед его очисткой.
В способах по изобретению могут быть применены любое одно или более чем одно из следующего:
- элюирующий буфер может иметь рН от 5,0 до 8,5;
- ацетат аммония, хлорид аммония или ацетат натрия могут присутствовать в элюирующем буфере в концентрации от 0,1 М до 2,0 М, предпочтительно при приблизительно 0,6 М;
- для ионообменной хроматографии может быть использован уравновешивающий буфер при рН от 5,0 до 8,5.
Настоящее изобретение также распространяется на композиции полипептидов, изготовленные способами, изложенными в данном описании, то есть композиции, в которых количество одного или более вариантов полипептида меняется, при этом данные варианты отличаются по степени гамма-карбоксилирования или по количеству остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, которые они содержат.
Краткое описание графических материалов
На Фиг.1А показана первичная структура фактора IX человека (hFIX) с идентифицированными субдоменами. GLA-домен соответствует аминокислотам 1-46; домен, подобный EGF1 (эпидермальному фактору роста), соответствует аминокислотам 47-83, домен, подобный EGF2, соответствует аминокислотам 84-124, активационный пептид соответствует аминокислотам 146-180 и протеазный домен соответствует аминокислотам 181-415. 12 аминокислот в GLA-домене, представляющие собой потенциальный объект для гамма-карбоксилирования, указаны меткой "γ" и локализованы в положениях 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36 и 40 аминокислот.
На Фиг.1В показано выравнивание части аминокислотных последовательностей полипептидов фактора VII, фактора IX и фактора Х человека. Эти выровненные участки относятся к GLA-домену каждого из этих полипептидов, и локализация остатков Gla указана посредством *.
На Фиг.2 показана хроматограмма, полученная в результате анионообменной хроматографии образца rhFIX (рекомбинантного hFIX), как описано в Примере 2.
На Фиг.3 показан развернутый участок Фиг.2.
На Фиг.4 показан анализ распределения Gla-содержащих вариантов до и после анионообменного хроматографического разделения соединения из Примера 2. "До" относится к распределению Gla-содержащих вариантов в образце rhFIX, использованном в качестве образца для "нанесения" в Примере 2. Этот образец очищали посредством иммуноаффинной адсорбции с получением образца rhFIX с чистотой более 95%. "После" относится к распределению Gla-содержащих вариантов в пуле фракций C12-D3, полученном в Примере 2.
На Фиг.5 показана хроматограмма, полученная в результате анионообменной хроматографии образца rhFIX, как описано в Примере 3.
На Фиг.6 показан развернутый участок Фиг.5.
На Фиг.7 показана хроматограмма, полученная в результате анионообменной хроматографии образца FVII, как описано в Примере 4.
На Фиг.8 показан развернутый участок Фиг.7.
На Фиг.9 показана хроматограмма, полученная в результате анионообменной хроматографии образца rhFIX, как описано в Примере 5.
На Фиг.10 показан развернутый участок Фиг.9.
На Фиг.11 показана хроматограмма, полученная в результате анионообменной хроматографии образца rhFIX, как описано в Примере 6.
На Фиг.12 показан развернутый участок Фиг.11.
На Фиг.13 показана хроматограмма, полученная в результате анионообменной хроматографии образца FX, как описано в Примере 7.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение проистекает из таких обнаруженных фактов, что варианты полипептида, имеющие разные уровни гамма-карбоксилирования, могут иметь разные уровни активности и что такие различные варианты могут быть очищены или разделены с использованием ионообменной хроматографии.
Увеличивая долю более активных вариантов полипептида и/или уменьшая долю менее активных или неактивных вариантов полипептида в образце, можно получить в результате очищенную композицию с повышенной удельной активностью.
"Полипептид" используется в данном описании в его самом широком смысле для обозначения соединения, состоящего из двух или более субъединиц - аминокислот, аминокислотных аналогов или других пептидомиметиков. Таким образом, термин "полипептид" включает в себя короткие пептидные последовательности, а также более длинные полипептиды и белки. Как он использован в данном описании, термин "аминокислота" относится или к природным и/или к неприродным либо синтетическим аминокислотам, включая глицин и оба оптических D- или L-изомера, и аминокислотным аналогам, и пептидомиметикам. "Зрелый" белок представляет собой полипептид, который был подвержен посттрансляционному процессингу, как, например, карбоксилированию, гликозилированию или отщеплению пропептидных участков, таких как направляющие последовательности. Таким образом, полипептид по изобретению, который находится в форме зрелого белка, может быть подвергнут гамма-карбоксилированию, и один или более остатков Glu в его транслированной последовательности могут быть преобразованы в Gla.
Способы, изложенные в данном описании, могут быть использованы для очистки любого полипептида, который является или может являться гамма-карбоксилированным.
Полипептид для применения в способах по изобретению может представлять собой полипептид, который содержит один или более остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты. Такой полипептид может быть идентифицирован посредством изучения аминокислотной последовательности полипептида и определения наличия Gla.
Известны несколько полипептидов, содержащих гамма-карбоксиглутаминовую кислоту. Ряд белков системы свертывания крови и регуляторных белков, включая протромбин, фактор VII (в том числе фактор VIIa), фактор IX, фактор X, белок С и белок S, включают в себя остатки Gla. Эти белки могут содержать 10-12 остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты в GLA-домене, локализованных в пределах первых 40 остатков N-конца зрелого белка. Белки кости, такие как остеокальцин и матриксный Gla-белок, и другие витамин K-зависимые белки млекопитающих, такие как продукты 6 генов блокировки роста (Gas6), белок Z, пролин-обогащенный Gla-1 (PRGP1), пролин-обогащенный Gla-2 (PRGP2), пролин-обогащенный Gla-3 (PRGP3) и пролин-обогащенный Gla-4 (PRGP4), также содержат несколько остатков Gla. Остатки гамма-карбоксиглутаминовой кислоты также обнаружены в белках, не являющихся белками млекопитающих, таких как конопептиды конантокин G и конантокин Т. Любой из этих полипептидов может быть очищен в соответствии с данным изобретением.
Для применения в способах по изобретению полипептид может представлять собой полипептид, который может быть посттрансляционно модифицирован с включением одного или более остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты. Например, такие остатки могут быть образованы в результате гамма-карбоксилирования остатков глутаминовой кислоты в полипептиде. Аминокислотная последовательность полипептида может содержать, таким образом, один или более остатков глутаминовой кислоты (Glu). Полипептид, который может быть посттрансляционно модифицирован таким способом, может представлять собой природный полипептид. Такой полипептид может происходить из любого подходящего организма. Например, полипептид может быть природным полипептидом млекопитающих, таким как полипептид грызунов, приматов, кошек, собак, овец, коров, свиней или других млекопитающих. Предпочтительно полипептид представляет собой полипептид мышей, крыс или человека. Наиболее предпочтительно полипептид представляет собой полипептид человека. Полипептид может происходить из видов, не являющихся млекопитающими. Например, некоторые конотоксины могут содержать гамма-карбоксиглутамат. Таким образом, полипептид может представлять собой природный полипептид из моллюска, такого как брюхоногий моллюск. Брюхоногим моллюском может являться улитка, например коническая улитка. Полипептид, который может быть посттрансляционно модифицирован таким способом, может представлять собой вариант природного полипептида, такой как вариант одного из известных гамма-карбоксилированных белков, рассмотренных выше, искусственно созданным полипептидом, таким как синтетический полипептид, или полученным рекомбинантным способом мутантным белком или вариантом белка.
Полипептид может представлять собой полипептид, который имеет GLA-домен. GLA-домен является белковым доменом, который содержит посттрансляционные модификации множественных остатков глутаминовой кислоты (Glu) с образованием гамма-карбоксиглутамата (Gla). Обычно эти остатки Gla располагаются в единственном участке или домене полипептида. Зачастую он локализован на N-конце полипептида или зрелого белка.
Например, на Фиг.1А показана первичная белковая структура фактора IX человека. Этот белок включает GLA-домен с аминокислотами от 1 до 46. Этот домен включает в себя 12 аминокислотных остатков, которые могут быть модифицированы из состояния глутамата до Gla. Они локализованы в положениях 7, 8, 15, 17, 20, 21, 26, 27, 30, 33, 36 и 40. Ввиду этого он способен содержать до 12 остатков Gla включительно. Таким образом, полипептидом для очистки в соответствии с настоящим изобретением может быть фактор IX. На Фиг.1 В показано выравнивание, основанное на сравнении GLA-домена белков человека - фактора VII, IX и X. Положения аминокислотных остатков, которые могут быть модифицированы из состояния глутамата до Gla в каждой последовательности, идентифицированы посредством *. Таким образом, полипептидом для очистки в соответствии с настоящим изобретением может быть фактор VII или фактор X.
Для применения в данном изобретении полипептид может содержать GLA-домен от известного гамма-карбоксилированного белка, как, например, GLA-домен от фактора IX, фактора VII или фактора X, или от любого из других известных гамма-карбоксилированных белков, рассмотренных выше, как, например, от другого фактора свертывания крови.
Для применения в способах по изобретению полипептид может представлять собой полипептид, который содержит или способен содержать один или более остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты. Например, полипептид может содержать или быть способным содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или более остатков Gla. Предпочтительно полипептид содержит или способен содержать более 1 остатка Gla, как, например, более 1, более 2, более 5 или более 9 остатков Gla. Полипептид может содержать или быть способным содержать до 10, до 12, до 15 или до 20 остатков Gla включительно. Как дополнительно обсуждается ниже, способы по изобретению позволяют проводить очистку различных молекулярных вариантов данного полипептида, в которых встречаются разные уровни гамма-карбоксилирования. Приведенные в настоящем описании цифры представляют собой общее количество остатков Gla, которые могут присутствовать в таком полипептиде. То есть если полипептид является полностью гамма-карбоксилированным, эти цифры указывают на количество имеющихся остатков Gla. Например, для случая гамма-карбоксилирования в GLA-домене эти цифры относятся к общему количеству возможных сайтов гамма-карбоксилирования в этом GLA-домене, как, например, общему количеству остатков Glu в транслированном полипептиде или максимальному количеству остатков Gla, которые могут быть получены под действием фермента, такого как γ-глутамилкарбоксилаза. Также могут существовать дополнительные варианты одного и того же полипептида, в которых имеется меньшее количество остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты по сравнению с этим максимальным количеством.
Таким образом, полипептид может содержать множественные остатки Glu в пределах 40 N-концевых остатков своей транслированной аминокислотной последовательности. Например, аминокислотная последовательность экспрессированного полипептида может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или более остатков Glu в пределах 40 аминокислот, расположенных близко к N-концу полипептида или в пределах 40 аминокислот, расположенных близко к N-концу зрелого белка.
Гамма-карбоксилирование может быть обеспечено путем использования фермента. Так, известно, что в гамма-карбоксилирование многих полипептидов in vivo вовлечен фермент γ-глутамилкарбоксилаза. γ-Глутамилкарбоксилаза представляет собой эндоплазматический фермент, который катализирует посттрансляционную модификацию Glu в Gla в GLA-домене ряда витамин К-зависимых факторов свертывания крови. Таким образом, для применения в настоящем изобретении полипептиды могут быть идентифицированы путем определения того, являются ли они гамма-карбоксилированными под действием γ-глутамилкарбоксилазы.
Считается, что фермент γ-глутамилкарбоксилаза связывается со своим белковым субстратом путем взаимодействия с последовательностью мотива, расположенного с аминоконцевой стороны глутаматных остатков, подлежащих карбоксилированию. Затем фермент может карбоксилировать множественные глутаматные остатки в этой области, например все глутаматные остатки в GLA-домене, после чего субстрат высвобождается. Таким образом, для применения в настоящем изобретении полипептид может содержать мотив или сайт, который распознается γ-глутамилкарбоксилазой или другим ферментом, способным осуществлять гамма-карбоксилирование. Этот сайт распознавания может быть локализован на N-концевом участке полипептида, например в пределах 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35 или 40 аминокислот, расположенных близко к N-концу транслируемого полипептида, или к тому, что будет представлять собой N-конец зрелого белка. Сайт распознавания может быть локализован с аминоконцевой стороны глутаматных остатков, подлежащих карбоксилированию. Например, у многих гамма-карбоксилированных белков природного происхождения фермент γ-глутамилкарбоксилаза распознает сайт в относящемся к пропептиду участке и связывается с ним. Затем этот участок отщепляется от остальной части полипептида в ходе посттрансляционного процессинга. Таким образом, сайт распознавания гамма-карбоксилазой у зрелого белка может отсутствовать.
В протромбине и факторе IX сайт, вовлеченный в распознавание ферментом γ-глутамилкарбоксилазой, определяется остатками -18, -17, -16, -15 и -10. Аналогичный сайт распознавания обнаружен у других гамма-карбоксилированных белков. Фенилаланин в положении -16 и аланин в положении -10 являются крайне консервативными среди пропептидов субстратов карбоксилазы, как и алифатические остатки, такие как изолейцин, лейцин и валин в положениях -17 и -15. Лейцин, валин или лизин в положении -16 также могут способствовать карбоксилированию. Для применения в данном изобретении полипептид может содержать сайт распознавания для гамма-карбоксилирования от известного гамма-карбоксилированного белка, такой как сайт распознавания для гамма-карбоксилирования от фактора IX, фактора X, фактора VII или любого из других известных гамма-карбоксилированных белков, рассмотренных выше. Например, пропептидный участок от любого такого белка, который содержит сайт распознавания для гамма-карбоксилирования, может присутствовать на N-конце транслируемого полипептида для обеспечения подходящего посттрансляционного процессинга полипептида под действием у-глутамилкарбоксилазы.
Полипептид, способный подвергаться гамма-карбоксилированию, предпочтительно удовлетворяет одному или двум следующим критериям:
(1) полипептид содержит сайт распознавания для гамма-карбоксилирования, и
(2) среди 40 остатков сайта распознавания для гамма-карбоксилирования имеются остатки глутаминовой кислоты.
Считается, что фермент γ-глутамилкарбоксилаза проявляет активность в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме. Что касается полипептида, который будет подвержен гамма-карбоксилированию под действием этого фермента, то такой полипептид предпочтительно должен проходить через шероховатый эндоплазматический ретикулум клетки, экспрессирующей фермент γ-глутамилкарбоксилазу. Поэтому данный полипептид может содержать последовательности, создающие возможность перемещению вновь синтезированного полипептида через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Сигнальные последовательности, обладающие способностью направлять полипептид к эндоплазматическому ретикулуму, хорошо известны. Такие сигнальные последовательности часто обнаруживают на аминоконце полипептида, длина их может составлять 16-30 аминокислот, и они могут содержать от 4 до 12 гидрофобных остатков. Такие сигнальные пептиды обычно отщепляются от молекулы полипептида под действием сигнальной пептидазы и поэтому не присутствуют в зрелом белке.
Чтобы осуществилось гамма-карбоксилирование полипептида, этот полипептид предпочтительно должен экспрессироваться в клетке. Для применения в данном изобретении полипептид может быть синтезирован путем экспрессии в такой клетке. Предпочтительно, чтобы клетка, в которой экспрессируется полипептид, включала необходимый клеточный аппарат, обеспечивающий гамма-карбоксилирование полипептида. Например, клетка может экспрессировать γ-глутамилкарбоксилазу. Предпочтительно, чтобы клетка, в которой синтезируется данный белок, имела фермент гамма-карбоксилазу, ассоциированную с шероховатым эндоплазматическим ретикулумом. Клетку можно культивировать в присутствии кофакторов фермента, таких как витамин К. Предпочтительно клетка, в которой синтезируется белок, содержит внутриклеточный витамин К.
Полипептиды, которые способны подвергаться гамма-карбоксилированию, можно идентифицировать, проводя их экспрессию в такой клетке и определяя, осуществляется ли гамма-карбоксилирование. Например, полипептид может быть экспрессирован в клетке, как изложено в данном описании, и может быть направлен к шероховатому эндоплазматическому ретикулуму такой клетки, например, посредством использования сигнального пептида, как описано выше. Осуществляя экспрессию полипептида в такой клетке и определяя, содержит ли экспрессированный и подвергнутый посттрансляционному процессингу полипептид остатки Gla, можно идентифицировать полипептид, способный быть гамма-карбоксилированным.
Способы по изобретению включают очистку одного или более вариантов полипептида от других вариантов такого полипептида, имеющего другие степени гамма-карбоксилирования. Если полипептид может быть подвержен гамма-карбоксилированию более чем в одном сайте, то могут встречаться различные варианты этого полипептида, в которых присутствуют разные количества гамма-карбоксиглутаматных аминокислотных остатков или в которых присутствуют гамма-карбоксиглутаматные остатки во всевозможных местах расположения в молекуле данного полипептида.
Например, некоторые варианты полипептида могут быть полностью гамма-карбоксилированными. То есть в результате гамма-карбоксилирования может быть осуществлено превращение глутамата в гамма-карбоксиглутамат во всех остатках в полипептиде, где это возможно, например во всех остатках Glu в GLA-домене. Другие варианты полипептида могут быть частично гамма-карбоксилированными. То есть в результате гамма-карбоксилирования может быть осуществлено превращение глутамата в гамма-карбоксиглутамат в некоторых, но не во всех остатках в полипептиде, где это возможно, как, например, в некоторых, но не во всех остатках Glu в GLA-домене.
Можно идентифицировать целый ряд различных частично гамма-декарбоксилированных вариантов. Их можно классифицировать разными способами. Например, уровень гамма-декарбоксилирования можно определить по тем остаткам в полипептиде, которые являются гамма-декарбоксилированными, или можно определить по общему количеству гамма-карбоксиглутаматных аминокислотных остатков, присутствующих в полипептиде. Последняя классификация может означать, что количество структурно различных молекулярных вариантов полипептида учитываются совместно исходя из общего количества остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты, которые они содержат. Например, вариант полипептида, в котором присутствуют все кроме одного из возможных гамма-карбоксиглутаматных остатков, может содержать много разных подвариантов полипептида, в которых глутамат располагается в разных положениях, которые могли быть подвержены гамма-карбоксилированию.
Обусловленное механизмом действия γ-глутамилкарбоксилазы гамма-карбоксилирование обычно начинается в остатке Glu, расположенном ближе всего к сайту распознавания для гамма-карбоксилирования, и продвигается далее от N-конца полипептида. В том случае, когда полипептид не является полностью гамма-карбоксилированным, причина обычно состоит в том, что гамма-карбоксилирование приостанавливается или фермент отделяется от полипептида до того, как наиболее удаленные остатки Glu будут преобразованы. Обычно это относится к остаткам Glu, наиболее удаленным от сайтов связывания для осуществления гамма-карбоксилирования или наиболее удаленным от N-конца белка, которые не являются гамма-карбоксилированными в частично гамма-карбоксилированном полипептиде.
Например, как показано на Фиг.1, фактор IX человека включает в себя до 12 гамма-карбоксиглутаматных остатков включительно. Реальное количество присутствующих остатков Gla будет варьировать в разных полипептидных молекулах в зависимости от степени посттрансляционной модификации в результате гамма-карбоксилирования, которому данная молекула была подвержена. Это значит, что образец фактора IX человека может содержать варианты фактора IX, которые являются полностью гамма-декарбоксилированными, то есть которые имеют все 12 возможных гамма-карбоксиглутаматных остатков ((1-12)Gla).
Образец также может содержать один или более вариантов фактора IX, имеющих 11 из 12 возможных гамма-карбоксиглутаматных остатков. Для них наиболее вероятной является ситуация, когда 11 остатков Glu, расположенных близко к N-концу полипептида, преобразуются в Gla, а 12-й остаток Glu в положении 40, как показано на Фиг.1, остается в виде Glu. Таким образом, в этой ситуации только остатки Glu от 1 до 11 преобразованы в Gla ((1-11)Gla).
Образец также может содержать один или более вариантов фактора IX, имеющего 10 из 12 возможных гамма-карбоксиглутаматных остатков. Для них наиболее вероятной является ситуация, когда 10 остатков Glu, расположенных близко к N-концу полипептида, преобразуются в Gla, а 11-й и 12-й остатки Glu в положениях 36 и 40, как показано на Фиг.1, остаются в виде Glu. Таким образом, в этой ситуации только остатки Glu от 1 до 10 преобразованы в Gla ((1-10)Gla).
Образец также может содержать один или более вариантов фактора IX, имеющего 9 из 12 возможных гамма-карбоксиглутаматных остатков, как, например, (1-9)Gla. Образец также может содержать один или более вариантов фактора IX, имеющего менее 9, как, например, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, или не имеющего ни одного из 12 возможных гамма-карбоксиглутаматных остатков.
Согласно настоящему изобретению предложены способы очистки такого варианта полипептида. В частности, вариант полипептида можно очистить от других вариантов этого полипептида в образце. Таким образом, способ по изобретению может приводить к увеличению относительной доли представляющего интерес варианта в образце полипептида. Этого можно достичь путем удаления одного или более чем одного другого варианта полипептида из образца и, таким образом, увеличения в целом доли полипептида, образованного из представляющего интерес варианта. Этого можно достичь в результате специального удаления из образца одного или более чем одного конкретного варианта путем удаления из образца одного или более вариантов, не являющихся вариантами, представляющими интерес, или путем удаления фракции образца, в которой доля представляющего интерес варианта ниже, чем в исходном образце. Любой из этих подходов может приводить к увеличению в целом доли варианта, представляющего интерес. Таким образом, способы по изобретению могут приводить к увеличению или уменьшению доли конкретного варианта полипептида в образце, содержащем смесь различных вариантов этого полипептида.
Увеличение доли полипептидного варианта может быть равно увеличению доли этого варианта в образце полипептида в целом на величину до 5%, до 10%, до 20%, до 30% или более. Уменьшение доли полипептидного варианта может быть равно уменьшению доли этого варианта в образце полипептида в целом на величину до 5%, до 10%, до 20%, до 30%, до 50%, до 70%, до 90% или более. Уменьшение доли полипептидного варианта может быть равно уменьшению на величину до 5%, до 10%, до 20%, до 30%, до 50%, до 70%, до 90% или более количества этого варианта, которое присутствует, по сравнению с количеством, присутствующим в исходном образце. Уменьшение доли полипептидного варианта может быть полным или представлять собой существенное уменьшение этого варианта в образце. Например, с использованием способа по изобретению можно очистить образец полипептида путем удаления из образца всего или по существу всего детектируемого полипептида конкретного варианта. Количество такого варианта, остающегося в образце, может составлять менее 10%, менее 5%, менее 2% или менее 1% от количества, присутствующего в исходном образце.
Таким образом, задачей способов по изобретению является обеспечение возможности изменения относительных долей различных вариантов в образце полипептида. Различные варианты могут иметь разные свойства или разные активности. Изменяя количество или долю таких вариантов в образце полипептида, можно изменять свойства или активность образца в целом. Например, в том случае, когда различные варианты полипептида имеют разные уровни активности, путем изменения долей различных вариантов с целью увеличения доли вариантов, имеющих более высокие уровни активности, и/или путем уменьшения доли вариантов, имеющих более низкую активность или не имеющих никакой активности, можно увеличить удельную активность образца, например среднюю активность на одну молекулу полипептида или процент максимально возможной активности для этого количества полипептида.
Например, обнаружено, что полученный рекомбинантным способом фактор IX человека (rhFIX) показывает удельную активность, составляющую приблизительно 50%. Фракционирование такого образца показало, что он содержал индивидуальные варианты rhFIX с преобладанием (1-8)-, (1-9)-, (1-10)-, (1-11)- и (1-12)-Gla. Обнаружено, что (1-11)- и (1-12)-Gla полностью активны в анализе коагулирующей активности и в 2-стадийном анализе активности. Для (1-8)-, (1-9)- и (1-10)-Gla-содержащих вариантов было продемонстрировано уменьшение активности до величины приблизительно 2-5%, 14-22% и 27-36% в зависимости от используемого анализа.
Таким образом, можно видеть, что различные варианты rhFIX, которые варьируют только по степени их гамма-карбоксилирования, показывают отличающиеся уровни активности. Ожидается, что образец с большей долей (1-11)- и/или (1-12)-Gla будет показывать более высокую удельную активность, нежели образец, имеющий более низкую долю этих вариантов. Ожидается, что образец с большей долей (1-8)-, и/или (1-9)-, и/или (1-10)-Gla будет показывать более низкую удельную активность, нежели образец, имеющий более низкую долю этих вариантов.
Таким образом, общую удельную активность образца фактора IX можно менять путем изменения долей таких вариантов в образце. В этом случае можно предсказывать, что общая удельная активность образца фактора IX может быть увеличена посредством любого одного или более чем одного из следующего:
- увеличения доли (1-12)-Gla в образце;
- увеличения доли (1-11)-Gla в образце;
- уменьшения доли (1-10)-Gla в образце;
- уменьшения доли (1-9)-Gla в образце;
- уменьшения доли (1-8)-Gla в образце;
- уменьшения доли (1-7)-Gla в образце;
- уменьшения доли (1-6)-Gla в образце;
- уменьшения доли (1-5)-Gla в образце;
- уменьшения доли (1-4)-Gla в образце;
- уменьшения доли (1-3)-Gla в образце;
- уменьшения доли (1-2)-Gla в образце и
- уменьшения доли (1-1)-Gla в образце.
Любое одно или более чем одно из этих изменений может быть выбрано в случае очистки образца фактора IX в соответствии с настоящим изобретением.
Предпочтительный образец фактора IX будет содержать только (1-11)-Gla и (1-12)-Gla, и в нем будут отсутствовать или по существу отсутствовать варианты, имеющие более низкие степени гамма-карбоксилирования, то есть такие, как (1-10)-, (1-9)- и (1-8)-Cla-содержащие варианты.
Этот подход может быть применен к существующим композициям ППХ. Например, как объясняется в данном описании, обнаружено, что hFIX, использованный в Примере 2, имеет 45,6% (1-12)-Gla, 36,0% (1-11)-Gla, 13,6% (1-10)-Gla, 3,3% (1-9)-Gla и 1,6% (1-8)-Gla. rhFIX поступает в продажу от Wyeth под торговым названием Benefix. Benefix имеет содержание (1-10)-, (1-11)- и (1-12)-Gla приблизительно 8-10%, 25-31% и 60-67% соответственно. Можно заметить, что способы, изложенные в данном описании, могут быть использованы для увеличения доли (1-11)-Gla и/или (1-12)-Gla в таких композициях. Способы, изложенные в данном описании, могут быть использованы для уменьшения в таких композициях доли менее гамма-карбоксилированных вариантов, таких как (1-10)-Gla, (1-9)-Gla и (1-8)-Gla. Ожидается, что это приведет к улучшению удельной активности hFIX в такой композиции.
Аналогичный подход можно использовать в отношении других Gla-содержащих полипептидов. Например, фактор VII и фактор Х могут включать в себя до 11 остатков Gla. Как показано в Примере 4, способы по настоящему изобретению можно использовать для изменения долей, например, (1-9)-, (1-10)-или (1-11)-фактора VII. Таким образом, способы, изложенные в данном описании, можно использовать для изменения долей различных вариантов фактора VII в зависимости от содержания в них Gla. Например, способы, изложенные в данном описании, можно использовать для увеличения в таких композициях доли (1-10)-Gla и/или (1-11)-Gla. Способы, изложенные в данном описании, можно использовать для уменьшения доли менее гамма-карбоксилированных вариантов, например, (1-9)-Gla и ниже, в таких композициях.
Аналогично, в Примере 7 показано, что композиция, содержащая несколько вариантов фактора X, может быть подвергнута обработке в соответствии со способом по изобретению с целью изменения долей различных Gla-содержащих вариантов фактора X. Отбирая в процессе анионообменной хроматографии подходящие фракции, можно отобрать образцы, содержащие разные доли различных Gla-вариантов. Например, из Примера 7 можно видеть, что способы, изложенные в данном описании, можно использовать для увеличения доли (1-10)-Gla и/или (1-11)-Gla в таких композициях. Способы, изложенные в данном описании, можно использовать для уменьшения доли менее гамма-карбоксилированных вариантов, таких как (1-9)-Gla и ниже.
Таким образом, согласно изобретению предложены способы, которые дают возможность очистить один вариант полипептида от остальных вариантов того же полипептида, причем данные варианты отличаются по степени, до которой осуществлено их гамма-карбоксилирование, или по количеству остатков Gla в их аминокислотной последовательности.
В способах по изобретению используется анионообменная хроматография. Изобретение относится, в частности, к способам, где представляющий интерес полипептид связывается с анионообменным материалом и элюирование полипептида с анионообменного материала осуществляется с использованием буфера, который содержит ацетат аммония, хлорид аммония или ацетат натрия.
Анионообменный материал представляет собой ионообменный материал, который является положительно заряженным. Ввиду этого он содержит свободные анионы, которые могут обмениваться с анионами в водном растворе, пропускаемом сквозь или через анионообменный материал. Присутствие заряда может быть обеспечено путем присоединения одного или более заряженных лигандов к твердой фазе, или заряд может представлять собой неотъемлемое свойство твердой фазы. Твердой фазой может быть, например, колонка для очистки, частицы или гранулы, мембрана или фильтр. Как правило, анионообменную смолу можно использовать для очистки полипептидов с р1 меньше примерно 7. Имеющиеся в продаже анионообменные материалы, которые могут быть использованы, как изложено в данном описании, включают, например, Q Sepharose Fast Flow, Macroprep 25Q, Poros HQ50, SOURSE 30Q, SOURSE 15Q, Mini Q, Mono Q, предпочтительно Mini Q, Mono Q, Capto Q, Q Sepharose HP, Toyopearl QAE 550C, Unosphere Q, DEAE Sepharose FF, Fratoprep DEAE и Q HyperD 20.
В анионообменном материале может использоваться группа сильного анионообменника, такая как четвертичный амин. В анионообменном материале может использоваться группа слабого анионообменника, такая как диэтиламиноэтил (DEAE). Подходящий анионообменный материал может быть выбран специалистом в зависимости, например, от конкретного полипептида, который необходимо очистить.
Анионообменный материал может быть выбран в зависимости от специфического полипептида, который необходимо очистить, и применяемых условий, таких как рН, буфер, ионная сила и т.д.
Традиционный процесс очистки с использованием анионообменной хроматографии обычно состоит из одной или более стадий, выбранных из: уравновешивания анионообменного материала, нанесения или загрузки образца, одной или более стадий промывки, элюирования и регенерации ионообменного материала. Описание стандартных методов ионообменной хроматографии можно найти, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences.
Перед загрузкой представляющего интерес полипептида анионообменную смолу предпочтительно уравновешивают. Цель этой стадии уравновешивания заключается в подведении условий, в которых находится анионообменный материал, к условиям, наиболее близким тем, которые будут использоваться на следующих стадиях способа. Чтобы избежать изменений состава подвижной фазы во время хроматографии, анионообменный материал должен быть уравновешен до рН и ионного состава (например, проводимости, состава буфера) стартового буфера. Например, ионная сила (например, проводимость, рН) уравновешивающего буфера может быть выбрана такой, чтобы она была как можно более близкой ионной силе буферов, которые будут использоваться на более поздних стадиях способа, таких как буфер, используемый для загрузки полипептида и/или буфер(ы) для промывки.
Таким образом, анионообменный материал может быть уравновешен с использованием буфера, близкого к буферам или композициям, которые будут использованы на последующих стадиях. Например, один и тот же буфер может быть использован для уравновешивания анионообменного материала и для загрузки образца. Один и тот же буфер может быть использован для уравновешивания анионообменного материала и для промывки анионообменного материала после загрузки образца. Уравновешивающий буфер может иметь то же значение рН, что и загружаемая композиция и/или буфер для промывки. Уравновешивающий буфер может иметь ту же проводимость, что и загружаемая композиция и/или буфер для промывки. В уравновешивающем буфере можно использовать то же буферное вещество, что и в загружаемой композиции и/или буфере для промывки. Уравновешивающий буфер может содержать буферное вещество в той же концентрации, что и в загружаемой композиции и/или буфере для промывки. Уравновешивающий буфер может содержать дополнительные компоненты, также присутствующие в загружаемой композиции и/или буфере для промывки, такие как детергенты.
Значение рН уравновешивающего буфера может быть задано в зависимости от конкретного полипептида, который необходимо очистить. Например, для ряда полипептидов, таких как фактор IX, значение рН 9,0 или выше не является оптимальным, поскольку при этих значениях рН может наблюдаться автокатализ и/или деградация полипептида.
Уравновешивающий буфер, подходящий для применения в настоящем изобретении, может быть изготовлен, например, с рН от примерно 5,0 до примерно 8,5, как, например, от рН 5,0 до рН 8,5. рН уравновешивающего буфера может быть больше примерно 5,0, больше примерно 5,5, больше примерно 6,0, больше примерно 6,5, больше примерно 7,0, больше примерно 7,5 или больше примерно 8,0. рН уравновешивающего буфера может быть меньше примерно 8,5, меньше примерно 8,0, меньше примерно 7,5, меньше примерно 7,0, меньше примерно 6,5, меньше примерно 6,0 или меньше примерно 5,5. Может быть образована любая комбинация таких начальных и конечных точек. Например, рН уравновешивающего буфера может быть больше примерно 7,0 и меньше примерно 8,5. рН может составлять, например, приблизительно рН 7,0, 7,5, 8,0 или 8,5.
Буферы с этими значениями рН могут подходить для уравновешивания анионообменных материалов с целью очистки полипептидов, как изложено в данном описании, таких как фактор IX, фактор VII или фактор X.
Подходящие компоненты для уравновешивающего буфера могут включать буферное вещество, например трис, фосфат, MES (N-морфолинэтансульфонат), Hepes (N-2-гидроксиэтил-пиперазин-N-2-этансульфоновая кислота) или карбонат. Для метода анионообменной хроматографии предпочтительным является такой положительно заряженный, обладающий буферными свойствами ион, как, например, трис-ион. Такое буферное вещество можно использовать для поддержания уравновешивающего буфера при значениях рН, которые определены выше. В одном из воплощений на протяжении всей процедуры анионообменной хроматографии используют одно и то же буферное вещество и одну и ту же концентрацию буферного вещества. Например, уравновешивающий буфер, буфер(ы) для промывки и элюирующий буфер, все они могут содержать одно и то же буферное вещество в одной и той же концентрации буферного вещества. Концентрация буферного вещества должна быть достаточной для поддержания буферной емкости и постоянства рН во время процедуры анионообменной хроматографии. Например, буферное вещество и концентрация буферного вещества могут быть выбраны для поддержания стабильного значения рН и буферной емкости в процессе нанесения образца и в процессе элюирования. Подходящая концентрация буферного вещества может составлять, например, от 5 мМ до 50 мМ, как, например, от 10 мМ до 40 мМ. Подходящая концентрация буферного вещества может составлять, например, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ или 25 мМ.
Уравновешивающий буфер может содержать один или более чем один дополнительный компонент. Уравновешивающий буфер может содержать вспомогательное вещество, такое как этиленгликоль, этанол, мочевина или детергент, используемые для повышения растворимости белка. Детергент, используемый в анионообменной хроматографии, должен быть нейтрально заряженным или иметь тот же заряд, что и анионообменный материал. Неионные детергенты, такие как твин 80, твин 20 или тритон Х100, можно использовать в концентрации, например, меньше 1%, меньше 0,5%, меньше 0,1% или меньше 0,01%. Для подведения ионной силы буфера можно использовать не обладающую буферными свойствами соль, такую как NaCl.
Образец, содержащий представляющий интерес полипептид, загружают на анионообменный материал. Это обеспечивается приведением во взаимодействие образца с анионообменным материалом в соответствующих условиях (как, например, проводимость и/или рН), для того, чтобы происходила иммобилизация полипептида внутри анионообменного материала или на его поверхности. Такая иммобилизация или такое связывание обеспечивается ионными взаимодействиями между полипептидом и заряженными группами анионообменного материала. Обычно такое связывание имеет место, когда ионная сила подвижной фазы, соприкасающейся с анионообменным материалом, уменьшена до такой точки, что ионные группы представляющего интерес полипептида начинают служить в качестве противоионов для заряженных групп на анионообменном материале.
Образец, подлежащий очистке в способе по изобретению, может представлять собой любой образец, содержащий полипептид, описанный выше. Предпочтительно, чтобы образец содержал больше одного различного варианта одного и того же полипептида, причем варианты отличаются по степени и/или локализации их гамма-карбоксилирования.
Как упомянуто выше, представляющий интерес полипептид может быть получен с использованием любой общепринятой методики. Например, полипептид может быть получен из источника in vivo, как, например, из животного, или может быть произведен in vitro, например, в ткани или клетке. Представляющий интерес полипептид может быть получен рекомбинантным способом, например, путем индукции экспрессии полипептида в клетке. Например, представляющий интерес полипептид может быть произведен в клетке-хозяине, подвергнутой трансформации или трансфекции полинуклеотидом, который кодирует данный полипептид, и способной экспрессировать его. Такую клетку-хозяина можно культивировать в условиях, обеспечивающих экспрессию полипептида. Затем полипептид может быть извлечен из культуральной среды или из самих клеток хозяина.
Предпочтительно полипептид очищают до того, как наносят на анионообменную смолу. Например, полипептид можно подвергнуть одной или более чем одной стадии очистки, такой как осаждение, иммунопреципитация, изоэлектрическое фокусирование, фильтрование, центрифугирование или хроматография, как, например, другая анионообменная хроматография.
Такую очистку можно использовать, чтобы удалить, частично или полностью, одну или более примесей из образца и тем самым увеличить степень чистоты представляющего интерес полипептида. Примесью может быть любая молекула, не являющаяся представляющим интерес полипептидом. Например, примесью может быть другой полипептид, нуклеиновая кислота или эндотоксин. Примесью может быть такой вариант представляющего интерес полипептида, как укороченный или более длинный полипептид, деамидированная форма полипептида, некорректно свернутый полипептид или форма полипептида, характеризующаяся нежелательным гликозилированием. Примесью может быть молекула, которая могла бы мешать проведению ионообменной хроматографии.
Предпочтительно, чтобы представляющий интерес полипептид был чистым по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или больше. Наиболее предпочтительно, чтобы полипептид был чистым по меньшей мере на 90%, например, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 97% или по меньшей мере на 99%. Предполагается, что термин "чистота" обозначает долю от общей массы сухого вещества, в состав которого входит представляющий интерес полипептид. Образец может содержать примеси, которые описаны выше, в количестве меньше 25% по массе, как, например, белки, отличающиеся от представляющего интерес полипептида, в количестве меньше 25% по массе, более предпочтительно меньше 20%, меньше 10%, меньше 5%, меньше 3% или меньше 1%. Образец может представлять собой чистый или по существу чистый образец представляющего интерес полипептида. Образец может представлять собой выделенный или по существу выделенный образец представляющего интерес полипептида.
Такой образец полипептида можно наносить на анионообменный материал в форме, полученной непосредственно при синтезе полипептида, как, например, в форме образца из культуральной среды клеток, продуцирующих полипептид рекомбинантным образом, или образца лизированных клеток, которые экспрессировали данный полипептид. Образец полипептида можно наносить на анионообменный материал в очищенной или частично очищенной форме, как изложено в данном описании. Перед нанесением на анионообменный материал можно провести дополнительную подготовку образца, описанного в данном изобретении. Например, если полипептид (или очищенный полипептид) представлен в твердой форме, его можно приготовить в виде жидкой композиции для нанесения на анионообменный материал. Например, его можно приготовить в воде, буфере или другом растворителе. Предпочтительно, чтобы жидкая композиция была водной. Если полипептид или очищенный полипептид представлен в жидкой или водной форме либо если твердый образец полипептида был приготовлен в жидкой форме, как описано выше, композицию образца можно скорректировать перед нанесением ее на анионообменный материал.
Например, проводимость и/или рН образца или подготовленного образца можно скорректировать, используя общепринятые методы. рН образца можно подвести до точно такого же значения или по существу до точно такого же значения, что и у буферов, используемых для уравновешивания анионообменного материала и/или промывки анионообменного материала. Проводимость образца можно подвести до точно такого же значения или по существу до точно такого же значения, что и у буферов, используемых для уравновешивания анионообменного материала и/или промывки анионообменного материала. Можно приготовить композицию образца вместе с буферным веществом, таким как любое из буферных веществ, рассмотренных выше в отношении состава уравновешивающего буфера. Можно приготовить композицию образца в том же самом буфере, который используется для уравновешивания анионообменного материала и/или промывки анионообменного материала. Можно приготовить композицию образца вместе с тем же буферным веществом и/или с использованием той же концентрации буферного вещества, и/или того же значения рН, и/или той же проводимости, что и у буфера, который используется для уравновешивания анионообменного материала и/или промывки анионообменного материала. В одном из воплощений подготовку представляющего интерес полипептида для нанесения на анионообменный материал осуществляют путем добавления его к буферу, идентичному уравновешивающему буферу, который используется.
Затем осуществляют загрузку полипептида на ионообменный материал путем пропускания релевантной композиции полипептида сквозь или через анионообменный материал в условиях, обеспечивающих связывание полипептида с анионообменным материалом. Такие способы являются общепринятыми в данной области техники.
После того как представляющий интерес полипептид загружен на анионообменную колонку, колонку можно подвергнуть одной или более промывкам. Промывание обеспечивается пропусканием соответствующего раствора через или сквозь анионообменный материал. Цель таких промывок может включать удаление любого полипептида или других компонентов, которые не связываются с анионообменным материалом; удаление любого полипептида или других компонентов, которые только слабо связываются с анионообменным материалом; удаление загрязняющих веществ, которые связываются с анионообменным материалом с более низкой аффинностью, чем представляющий интерес полипептид.
В одном из воплощений после загрузки полипептида на анионообменный материал этот анионообменный материал промывают буфером с целью удаления любого несвязавшегося полипептида, примесей или загрязняющих веществ. Например, буфер для промывки может быть идентичным или по существу идентичным буферу, в котором готовят композицию полипептида для загрузки на анионообменный материал. Буфер для промывки может быть идентичным или по существу идентичным уравновешивающему буферу. Например, промывка может быть осуществлена с использованием того же буфера, что и уравновешивающий буфер, или того же самого буфера, который используется для приготовления композиции полипептида. Промывку можно осуществить, используя буфер с тем же или по существу тем же рН и/или с той же или по существу той же проводимостью, что и у уравновешивающего буфера или буфера, который используется для приготовления композиции полипептида. Промывку можно осуществить, используя буфер, содержащий то же буферное вещество в той же или по существу той же концентрации, которые используются в уравновешивающем буфере или для приготовления композиции полипептида.
Альтернативно или в дополнение к этому могут быть осуществлены другие промывки с использованием буферов, отличающихся от уравновешивающего буфера. Например, возможно это может быть сделано для удаления примесей из анионообменного материала, которые связываются с анионообменным материалом с меньшей силой, нежели представляющий интерес полипептид. Такие примеси будут высвобождаться из анионообменного материала легче, чем представляющий интерес полипептид. Например, анионообменный материал можно промывать буфером, характеризующимся более высокой проводимостью или ионной силой по сравнению с уравновешивающим буфером и/или композицией, в которой загружают полипептид. Увеличением ионной силы буфера можно добиться элюирования компонентов из анионообменного материала. Предпочтительно буфер для промывки выбирают или используют в достаточно небольшом объеме с тем, чтобы представляющий интерес полипептид по существу не элюировался из анионообменного материала.
Буферы для промывки могут быть выбраны специалистом в данной области в зависимости от природы конкретного образца и представляющего интерес полипептида. Например, можно выбрать буферы с конкретными значениями рН или проводимости, чтобы обеспечить удаление конкретных полипептидов или загрязняющих веществ, которые будут связываться со смолой с меньшей силой, чем представляющий интерес полипептид. Такие буферы могут быть выбраны, и их применение может быть оптимизировано с помощью простых общепринятых экспериментов, например путем мониторинга состава раствора, выходящего с колонки.
Значение рН буфера для промывки может быть задано в зависимости от конкретного полипептида, который необходимо очистить. Например, для ряда полипептидов, таких как фактор IX, значение рН 9,0 или выше не является оптимальным, поскольку при этих значениях рН может наблюдаться автокатализ и/или деградация полипептида.
Буфер для промывки, подходящий для применения в настоящем изобретении, может быть изготовлен, например, с рН от примерно 5,0 до примерно 8,5, как, например, от рН 5,0 до рН 8,5. рН буфера для промывки может быть больше примерно 5,0, больше примерно 5,5, больше примерно 6,0, больше примерно 6,5, больше примерно 7,0, больше примерно 7,5 или больше примерно 8,0. рН буфера для промывки может быть меньше примерно 8,5, меньше примерно 8,0, меньше примерно 7,5, меньше примерно 7,0, меньше примерно 6,5, меньше примерно 6,0 или меньше примерно 5,5. Может быть образована любая комбинация таких начальных и конечных точек. Например, рН буфера для промывки может быть больше примерно 7,0 и меньше примерно 8,5. рН может составлять, например, приблизительно рН 7,0, 7,5, 8,0 или 8,5.
Буферы с этими значениями рН могут подходить для промывания анионообменных материалов с целью очистки полипептидов, как изложено в данном описании, таких как фактор IX, фактор VII или фактор X.
Подходящие компоненты для буфера для промывки могут включать буферное вещество, например трис, фосфат, MES, Hepes или карбонат. Для метода анионообменной хроматографии предпочтительным является такой положительно заряженный, обладающий буферными свойствами ион, как, например, трис-ион. Такое буферное вещество можно использовать для поддержания буфера для промывки при значениях рН, которые определены выше. Подходящая концентрация буферного вещества может составлять, например, от 5 мМ до 50 мМ, как, например, от 10 мМ до 40 мМ. Подходящая концентрация буферного вещества может составлять, например, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ или 25 мМ.
Буфер для промывки может содержать один или более чем один дополнительный компонент. Буфер для промывки может содержать вспомогательное вещество, такое как этиленгликоль, этанол, мочевина или детергент, используемые для повышения растворимости белка. Детергент, используемый в анионообменной хроматографии, должен быть нейтрально заряженным или иметь тот же заряд, что и анионообменный материал. Неионные детергенты, такие как твин 80, твин 20 или тритон Х100, можно использовать в концентрации, например, меньше 1%, меньше 0,5%, меньше 0,1% или меньше 0,01%. Для подведения ионной силы буфера можно использовать не обладающую буферными свойствами соль, такую как NaCl.
Элюирование молекулы из анионообменного материала означает удаление молекулы из анионообменного материала. Обычно этого добиваются путем изменения ионной силы буфера, окружающего анионообменный материал, с тем чтобы буфер стал конкурировать с молекулой за заряженные группы анионообменного материала. Следовательно, сила связывания молекулы с анионообменным материалом уменьшается, и она отсоединяется. В некоторых случаях элюирование из анионообменного материала также может быть обеспечено посредством использования молекулы, которая изменяет конформацию представляющего интерес полипептида, снижая тем самым силу связывания и приводя к высвобождению полипептида из анионообменного материала.
Значение рН элюирующего буфера может быть задано в зависимости от конкретного полипептида, который необходимо очистить. Например, для ряда полипептидов, таких как фактор IX, значение рН 9,0 или выше не является оптимальным, поскольку при этих значениях рН может наблюдаться автокатализ и/или деградация полипептида.
Элюирующий буфер, подходящий для применения в настоящем изобретении, может быть изготовлен, например, с рН от примерно 5,0 до примерно 8,5, как, например, от рН 5,0 до рН 8,5. рН элюирующего буфера может быть больше примерно 5,0, больше примерно 5,5, больше примерно 6,0, больше примерно 6,5, больше примерно 7,0, больше примерно 7,5 или больше примерно 8,0. рН элюирующего буфера может быть меньше примерно 8,5, меньше примерно 8,0, меньше примерно 7,5, меньше примерно 7,0, меньше примерно 6,5, меньше примерно 6,0 или меньше примерно 5,5. Может быть образована любая комбинация таких начальных и конечных точек. Например, рН элюирующего буфера может быть больше примерно 7,0 и меньше примерно 8,5. рН может составлять, например, приблизительно рН 7,0, 7,5, 8,0 или 8,5.
Буферы с этими значениями рН могут подходить для элюирования анионообменных материалов с целью очистки полипептидов, как изложено в данном описании, таких как фактор IX, фактор VII или фактор X.
Подходящие компоненты для элюирующего буфера могут включать буферное вещество, например трис, фосфат, MES, Hepes или карбонат. Для метода анионообменной хроматографии предпочтительным является такой положительно заряженный, обладающий буферными свойствами ион, как, например, трис-ион. Такое буферное вещество можно использовать для поддержания элюирующего буфера при значениях рН, которые определены выше. Подходящая концентрация буферного вещества может составлять, например, от 5 мМ до 50 мМ, как, например, от 10 мМ до 40 мМ. Подходящая концентрация буферного вещества может составлять, например, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ или 25 мМ.
Элюирующий буфер может содержать один или более чем один дополнительный компонент. Элюирующий буфер может содержать вспомогательное вещество, такое как этиленгликоль, этанол, мочевина или детергент, используемые для повышения растворимости белка. Детергент, используемый в анионообменной хроматографии, должен быть нейтрально заряженным или иметь тот же заряд, что и анионообменный материал. Неионные детергенты, такие как твин 80, твин 20 или тритон Х100, можно использовать в концентрации, например, меньше 1%, меньше 0,5%, меньше 0,1% или меньше 0,01%. Для подведения ионной силы буфера можно использовать не обладающую буферными свойствами соль, такую как NaCl.
Для применения в соответствии с настоящим изобретением элюирующий буфер предпочтительно будет содержать одну или более чем одну хаотропную соль, например одну или более солей, выбранных из ацетата аммония, хлорида аммония и ацетата натрия. Хаотропная соль, такая как ацетат аммония, хлорид аммония и/или ацетат натрия, может присутствовать в элюирующем буфере в концентрации по меньшей мере 0,1 М, по меньшей мере 0,2 М, по меньшей мере 0,5 М, по меньшей мере 1,0 М или по меньшей мере 1,5 М. Хаотропная соль, такая как ацетат аммония, хлорид аммония и/или ацетат натрия, может присутствовать в концентрации до 2,0 М, до 1,9 М, до 1,5 М или до 1,0 М включительно. Можно создавать комбинации любых из этих нижних конечных точек с любыми из этих верхних конечных точек с образованием подходящего диапазона концентраций.
Хаотропная соль, такая как ацетат аммония, хлорид аммония и/или ацетат натрия, может присутствовать в любой концентрации до примерно 2,0 включительно. Например, хаотропная соль, такая как ацетат аммония, хлорид аммония и/или ацетат натрия, может присутствовать в концентрации до примерно 0,1, примерно 0,2, примерно 0,3, примерно 0,4, примерно 0,5, примерно 0,6, примерно 0,7, примерно 0,8, примерно 0,9, примерно 1,0, примерно 1,1, примерно 1,2, примерно 1,3, примерно 1,4, примерно 1,5, примерно 1,6, примерно 1,7, примерно 1,8, примерно 1,9 или примерно 2,0 М, наиболее предпочтительно в концентрации примерно 0,6 М.
В одном из воплощений элюирующий буфер имеет тот же состав, что и буфер для промывки и/или уравновешивающий буфер, за исключением того, что элюирующий буфер дополнительно содержит хаотропную соль. Предпочтительной хаотропной солью является одна или более чем одна соль из ацетата аммония, хлорида аммония и/или ацетата натрия, как описано выше. Таким образом, элюирующий буфер может иметь любой состав, приведенный в данном описании для буфера для промывки или уравновешивающего буфера, но может дополнительно содержать ацетат аммония, хлорид аммония и/или ацетат натрия.
В одном из воплощений уравновешивающий буфер и буфер для промывки идентичны друг другу, а элюирующий буфер отличается от них только тем, что элюирующий буфер также содержит ацетат аммония, хлорид аммония или ацетат натрия.
Элюирование может быть осуществлено с использованием изократического или линейного градиента хаотропной соли, такого как изократический или линейный градиент ацетата аммония, хлорида аммония или ацетата натрия. Элюирование может быть осуществлено с использованием ступенчатого изменения концентрации хаотропной соли в буфере. Элюирование может быть обеспечено любой комбинацией этих способов элюирования. Например, за изократическим элюированием при заданной концентрации хаотропной соли может следовать увеличение концентрации соли либо в форме градиента, либо в форме одной или более ступенек.
При любом таком способе элюирования различные компоненты будут высвобождаться из анионообменного материала в разное время в зависимости от силы их связывания. Компоненты, которые связываются с меньшей силой, будут иметь тенденцию высвобождаться в более ранние моменты времени или в буфере с более низкой проводимостью, как, например, при более низкой концентрации соли. Компоненты, которые связываются более сильно, будут иметь тенденцию задерживаться на анионообменном материал в течение более длительного времени или до более высокой концентрации соли. Можно проводить мониторинг элюата, проходящего сквозь или через анионообменный материал, чтобы идентифицировать, когда будут элюироваться конкретные компоненты. Сбор элюата можно провести в разные временные точки и проанализировать каждый пул с целью определения того, в котором пуле присутствуют какие компоненты. Затем можно провести отбор конкретных пулов, которые имеют желаемый состав, например повышенные концентрации конкретных вариантов полипептида или сниженные концентрации других вариантов полипептида.
Для изократического элюирования, как изложено в данном описании, используют фиксированную или неизменную концентрацию соли. Используют элюирующий буфер, который содержит такую концентрацию соли, как, например, любая из концентраций, рассмотренный выше. Элюирующий буфер пропускают сквозь или через анионообменный материал и проводят мониторинг элюата с целью идентификации осуществления элюирования. При использовании изократического элюирования компоненты с более низкой аффинностью связывания в отношении анионообменного материала будут высвобождаться раньше, при этом будет использован меньший объем элюирующего буфера, чем компоненты с более высокой аффинностью связывания, для которых может потребоваться пропускание сквозь или через анионообменный материал более значительных объемов элюирующего буфера. Отбирая конкретные пулы или партии элюата, полученные в разные периоды времени, можно получить образцы с разными составами полипептидных вариантов.
Градиентное элюирование может быть обеспечено путем увеличения концентрации соли в буфере до конечной максимальной концентрации, такой как концентрация, рассмотренная выше. Например, для линейного градиента можно использовать от 0% до 100% конечной концентрации хаотропной соли. Этот градиент можно наносить на анионообменный материал в течение периода времени, например в течение прохождения 10, 20, 30 40, 50, 70, 100, 150 или более объемов колонки. При использовании такого градиентного элюирования компоненты с более низкой аффинностью связывания в отношении анионообменного материала будут высвобождаться раньше, при более низкой концентрации соли, чем компоненты с более высокой аффинностью связывания, для элюирования которых может потребоваться более высокая концентрация соли. Отбирая конкретные пулы или партии элюата, полученные в разные периоды времени, можно получить образцы с разными составами полипептидных вариантов.
Чаще чем использование плавного градиента для увеличения концентрации хаотропной соли, может быть использовано ступенчатое увеличение. То есть концентрацию такой соли можно увеличивать до конечной максимальной концентрации в течение прохождения одной или нескольких отдельных ступенек. Это может быть использовано для того, чтобы воспроизвести эффекты градиентного элюирования, где различные компоненты высвобождаются при разных концентрациях и, таким образом, на разных ступеньках. Альтернативно, ступенчатое элюирование можно объединить с изократическим элюированием. Например, увеличение на каждой ступеньке концентрации соли в элюирующем буфере можно поддерживать на протяжении нескольких объемов колонки, что позволяет осуществлять изократическое элюирование при такой концентрации с элюированием различных компонентов по мере использования возрастающих объемов буфера. Также можно использовать последующие дополнительные ступеньки по концентрации соли.
В тех воплощениях, где элюирующий буфер отличается от буфера для промывки только присутствием в элюирующем буфере соли, такой как ацетат аммония, хлорид аммония или ацетат натрия, элюирующий буфер для изократического элюирования может быть приготовлен путем добавления количества соли в буфер для промывки, градиентное элюирование может быть обеспечено путем постепенного добавления соли в раствор буфера для промывки, а ступенчатое элюирование может быть обеспечено путем добавления количеств соли в буфер для промывки с целью увеличения концентрации соли в буфере на отдельных ступеньках.
Примеры
Пример 1. Анализ активности различных гамма-карбоксилированных вариантов FIX
Рекомбинантный фактор IX человека (FIX) получали в клетках яичника китайского хомячка (СНО). Измеренная удельная активность FIX составляла приблизительно 50%.
Было проведено фракционирование индивидуальных вариантов FIX с преобладанием (1-8)-, (1-9)-, (1-10)-, (1-11)- и (1-12)-Gla.
Анализ коагулирующей активности использовали для измерения в зависимости от активности FIX времени, необходимого для образования фибринового сгустка. Контактный активатор (эллаговую кислоту в реагенте для определения АРТТ (активированного частичного тромбопластинового времени)) использовали для стимуляции продуцирования FXIIa и далее реакцию инициировали посредством рекальцификации и добавления фосфолипидов. Активности измеряли против BeneFIX и собранной нормальной плазмы крови человека, которую калибровали против стандарта от ВОЗ (Всемирной организации здравоохранения) для FIX человека.
2+
Имеющийся в продаже набор для анализа, известный как "Набор для определения хромогенного фактора IX от Hyphen BioMed (Aniara)", использовали для оценки уровня активности rhFIX. В этом анализе фактор XIa активирует фактор IX, превращая его в фактор IXa, который вместе с активированным фактором VIII:C, фосфолипидами и Са активирует фактор X, превращая его в фактор Ха. Количество образованного фактора Ха измеряли при 405 нм по количеству pNA (пара-нитроанилина), высвобождаемого из специфичного к фактору Ха хромогенного субстрата SXa-11.
Было обнаружено, что (1-11)- и (1-12)-Gla-содержащие варианты сохраняли полную активность в анализе коагулирующей активности и 2-стадийном анализе активности. Активность (1-8)-, (1-9)- и (1-10)-Gla-содержащих вариантов уменьшалась приблизительно до 2-5%, 14-22% и 27-36% соответственно в зависимости от используемого вида анализа.
Пример 2. Очистка и анализ различных гамма-карбоксилированных вариантов FIX
Для разделения различных гамма-карбоксилированных форм рекомбинантного фактора IX человека (rhFIX) использовали анионообменную хроматографию. В данном методе использовали колонку SOURSE 15Q (GE Healthcare) с объемом слоя 6 мл, скорость потока 3 мл/мин и температуру 4°С.
На колонку загружали образец ("загружаемый образец") rhFIX. Суммарно загружали приблизительно 13 мг. Значение рН загружаемого образца подводили до 8,0, используя 0,1М NaOH.
Использовали следующие буферы:
- уравновешивающий буфер: 20 мМ Трис/NaOH, рН 8,0, с 0,01% Твина 80;
- элюирующий буфер: 20 мМ Трис/HCl, 1,5 М ацетат аммония, рН 8,0, с 0,01% Твина 80;
CIP: 1 М NaOH (CIP=очистка на месте (от англ. cleaning-in-place)).
Использовали следующую процедуру анионообменной хроматографии:
Стадия
Буфер
CV
% элюирующего буфера
Уравновешивание
Уравновешивающий буфер
10
0%
Нанесение
Промывка
Уравновешивающий буфер
5
0%
Элюирование
Элюирующий буфер
5
20% (изократическое)
Элюирование
Элюирующий буфер
20
20-40% (градиентное)
Элюирование
Элюирующий буфер
5
65% (изократическое)
Элюирование
Элюирующий буфер
5
100% (изократическое)
CIP1
NaOH
5
0%
CIP2
Элюирующий буфер
10
100% (изократическое)
Повторное уравновешивание
Уравновешивающий буфер
20
0%
CV = объем колонки (от англ. column volume).
Результаты этой анионообменной хроматографии показаны на Фиг.2 и 3.
Отбирали пул фракций C12-D3, получая 9,6 мг/74%. Содержание Gla для этого пула сравнивали с таковым исходного образца, используемого в качестве загружаемого образца, упомянутого выше.
Анализы содержания Gla для индивидуальных фракций проводили, используя HPLC-систему от Agilent. Результаты анализов содержания Gla, основанные на методе HPLC, коррелировали с результатами анализов содержания Gla с использованием N-концевого секвенирования и аминокислотного анализа с применением щелочного гидролиза. Для HPLC использовали колонку MiniQ РС3.2/3 (№ по каталогу GE Healthcare 17-0686-01) при скорости потока 0,18 мл/мин. В этой системе использовали следующие буферы:
буфер А: 20 мМ Трис/NaOH, рН 9,0;
буфер В: 20 мМ Трис/HCl, рН 9,0; 1,5 М ацетат аммония.
280
В этой системе измеряли следующие сигналы: УФ и сигнал флуоресценции (длины волн возбуждения: 280 нм/излучения: 340 нм).
Использовали следующую процедуру HPLC:
0-5 мин 0-30% В,
5-55 мин 30-55% В,
55-65 мин 55-100% В.
Сравнение распределения Gla до и после разделения с использованием анионообменной хроматографии, условия которой описаны выше, показано на Фиг.4. Эти результаты также можно представить следующим образом.
Количество Gla, %
До
После
BeneFIX, вкл. для сравнения
%(1-8)
1,6
0
0
%(1-9)
3,3
0
3
%(1-10)
13,6
6,7
10
%(1-11)
36,0
40,7
27
%(1-12)
45,6
52,6
60
Таким образом, очистка с использованием анионообменной хроматографии, как показано выше, приводит к удалению всех детектируемых форм (1-8)- и (1-9)-Gla из исходного образца FIX. Также наблюдается уменьшение наличия (1-10)-Gla и вытекающее из этого увеличение долей (1-11)- и (1-12)-Gla.
Кроме того, в конечном очищенном пуле удельная активность увеличивалась приблизительно до 110% по сравнению с Benefix (2-стадийный анализ активности, расчеты данных не показаны).
ПРИМЕР 3. Очистка и анализ различных гамма-карбоксилированных вариантов FIX
Для разделения различных гамма-карбоксилированных форм использовали анионообменную хроматографию для рекомбинантного человеческого FIX. В данном методе использовали колонку SOURSE 30Q (GE Healthcare) с объемом слоя 6 мл, скорость потока 2 мл/мин и температуру 4°С.
На колонку загружали образец ("загружаемый образец") FIX. Суммарно загружали приблизительно 2,5 мг. Значение рН загружаемого образца подводили до 8,0, используя 0,1 М NaOH.
Использовали следующие буферы:
- уравновешивающий буфер: 20 мМ Трис/NaOH, рН 8,0, с 0,01% Твина 80;
- элюирующий буфер: 20 мМ Трис/HCl, 1,5 М ацетат аммония, рН 8,0, с 0,01% Твина 80;
- CIP: 1 М NaOH.
Использовали следующую процедуру анионообменной хроматографии:
Стадия
Буфер
CV
% элюирующего буфера
Уравновешивание
Уравновешивающий буфер
10
0%
Нанесение
Промывка
Уравновешивающий буфер
5
0%
Элюирование
Элюирующий буфер
5
25% (изократическое)
Элюирование
Элюирующий буфер
20
25-45% (градиентное)
Элюирование
Элюирующий буфер
5
100% (изократическое)
CIP1
NaOH
5
0%
CIP2
Элюирующий буфер
10
100% (изократическое)
Повторное уравновешивание
Уравновешивающий буфер
20
0%
Результат этой анионообменной хроматографии показан на Фиг.5 и 6. Отбирали пул фракций C12-D3, получая приблизительно 1,75 мг/70%. Содержание Gla для этого пула сравнивали с таковым исходного образца, используемого в качестве загружаемого образца, упомянутого выше. Анализы содержания Gla для индивидуальных фракций проводили, используя HPLC-систему от Agilent, как описано в Примере 2.
Сравнение распределения Gla до и после разделения с использованием анионообменной хроматографии, условия которой описаны выше, показано в приведенной ниже таблице.
Количество Gla, %
До
После
BeneFIX, вкл. для сравнения
% (1-8)
1,0
0
0
% (1-9)
3,3
0
3
%(1-10)
12,7
2,3
10
%(1-11)
32,2
25,7
27
%(1-12)
50,8
72,0
60
Таким образом, очистка с использованием анионообменной хроматографии, как показано выше, приводит к удалению всех детектируемых форм (1-8)- и (1-9)-Gla из исходного образца FIX. Также наблюдается уменьшение наличия (1-10)-Gla и вытекающее из этого увеличение долей (1-11)- и (1-12)-Gla.
ПРИМЕР 4. Очистка и анализ различных гамма-карбоксилированных вариантов FVII
Для разделения различных гамма-карбоксилированных форм использовали анионообменную хроматографию рекомбинантного фактора Vila человека (FVII). В данном методе использовали колонку SOURSE 15Q (GE Healthcare) с объемом слоя 1,7 мл, скорость потока 0,75 мл/мин и температуру 4°С.
На колонку загружали образец ("загружаемый образец") FVII, полученный в клетках СНО. Суммарно загружали приблизительно 1,8 мг. В загружаемый образец добавляли 50 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусную кислоту) из концентрированного 1 М раствора и значение рН подводили до 8,0, используя 0,1 М NaOH.
Использовали следующие буферы:
- уравновешивающий буфер: 20 мМ Трис/NaOH, рН 8,0;
- элюирующий буфер: 20 мМ Трис/HCl, 1,5М ацетат аммония, рН 8,0;
- CIP: 1 М NaOH.
Использовали следующую процедуру анионообменной хроматографии:
Стадия
Буфер
CV
% элюирующего буфера
Уравновешивание
Уравновешивающий буфер
5
0%
Нанесение
Промывка
Уравновешивающий буфер
5
0%
Элюирование
Элюирующий буфер
100
0-100% (градиентное)
Элюирование
Элюирующий буфер
5
100% (изократическое)
CIP1
NaOH
5
0%
CIP2
Элюирующий буфер
10
100% (изократическое)
Повторное уравновешивание
Уравновешивающий буфер
10
0%
Результат этой анионообменной хроматографии показан на Фиг.7 и 8. Анализы содержания Gla для индивидуальных фракций (от 22 до 27) проводили, используя HPLC-систему от Agilent, как описано в Примере 2.
Сравнение распределения разделенных Gla-содержащих вариантов FVII с использованием анионообменной хроматографии, условия которой описаны выше, показано в приведенной ниже таблице.
Gla-содержащий вариант* (%)
Фракции
До разделения (загружаемый образец)
22
23
24
25
26
27
%(1-8)
100,0
100,0
11,0
-
-
-
<1%
%(1-9)
-
-
89,0
100,0
69,2
36,7
65
%(1-10)
-
-
-
-
30,8
63,3
34
* Отметим, что FVII в целом содержит только 10 остатков Gla.
Очистка с использованием анионообменной хроматографии, как показано выше, приводит к четкому разделению Gla-содержащих вариантов FVIIa. Таким образом, экспериментатором может быть изготовлена композиция Gla-содержащих вариантов FVII необходимого состава.
ПРИМЕР 5. Очистка и анализ различных гамма-карбоксилированных вариантов FIX
Для разделения различных гамма-карбоксилированных форм использовали анионообменную хроматографию для рекомбинантного человеческого FIX. В данном методе использовали колонку SOURSE 150 (GE Healthcare) с объемом слоя 1,7 мл, скорость потока 0,75 мл/мин и температуру 4°С.
На колонку загружали образец ("загружаемый образец") FIX. Суммарно загружали приблизительно 2 мг. Значение рН загружаемого образца подводили до 8,5, используя 0,1М NaOH.
Использовали следующие буферы:
- уравновешивающий буфер: 20 мМ Трис/NaOH, рН 8,5;
- элюирующий буфер: 20 мМ Трис/NaOH, 1,0 М хлорид аммония, рН 8,5;
- CIP: 1 М NaOH.
Использовали следующую процедуру анионообменной хроматографии
Стадия
Буфер
CV
% элюирующего буфера
Уравновешивание
Уравновешивающий буфер
5
0%
Нанесение
Промывка
Уравновешивающий буфер
5
0%
Элюирование
Элюирующий буфер
100
0-100% (градиентное)
Элюирование
Элюирующий буфер
5
100% (изократическое)
CIP1
NaOH
5
0%
CIP2
Элюирующий буфер
10
100% (изократическое)
Повторное уравновешивание
Уравновешивающий буфер
10
0%
Результат этой анионообменной хроматографии показан на Фиг.9 и 10. Анализы содержания Gla для индивидуальных фракций (от Е7 до F12) проводили, используя HPLC-систему от Agilent, как описано в Примере 2.
Сравнение распределения разделенных Gla-содержащих вариантов FIX с использованием анионообменной хроматографии, условия которой описаны выше, показано в приведенной ниже таблице.
Gla-содержащий вариант(%)
До разделения (загружаемый образец)
Фракции
Benefix
Е7
Е8
Е9
ЕЮ
Е11
Е12
F12
Gla (8)
1,0
-
-
-
-
-
-
-
-
Gla (9)
3,3
-
-
-
-
-
-
-
3
Gla (10)
12,7
18,9
-
-
-
-
-
-
10
Gla (11)
32,2
81,1
73,7
46,3
22,6
13,4
10,4
7,1
27
Gla (12)
50,8
-
26,3
53,7
77,4
86,6
89,6
92,9
60
Очистка с использованием анионообменной хроматографии, как показано выше, приводит к четкому разделению Gla-содержащих вариантов FIX. Таким образом, экспериментатором может быть изготовлена композиция Gla-содержащих вариантов FIX необходимого состава.
ПРИМЕР 6. Очистка и анализ различных гамма-карбоксилированных вариантов FIX
Для разделения различных гамма-карбоксилированных форм использовали анионообменную хроматографию для рекомбинантного FIX человека. В данном методе использовали колонку SOURSE 15Q (GE Healthcare) с объемом слоя 1,7 мл, скорость потока 0,75 мл/мин и температуру 4°С.
На колонку загружали образец ("загружаемый образец") FIX. Суммарно загружали приблизительно 2 мг. Значение рН загружаемого образца подводили до 8,0, используя 0,1М NaOH.
Использовали следующие буферы:
- уравновешивающий буфер: 20 мМ Трис/NaOH, рН 8,0;
- элюирующий буфер: 20 мМ Трис/HCl, 1,0 М ацетат натрия, рН 8,0;
- CIP: 1 М NaOH.
Использовали следующую процедуру анионообменной хроматографии:
Стадия
Буфер
CV
% элюирующего буфера
Уравновешивание
Уравновешивающий буфер
10
0%
Нанесение
Промывка
Уравновешивающий буфер
5
0%
Элюирование
Элюирующий буфер
5
10% (изократическое)
Элюирование
Элюирующий буфер
40
10-60% (градиентное)
Элюирование
Элюирующий буфер
5
100% (изократическое)
CIP1
NaOH
5
0%
CIP2
Элюирующий буфер
10
100% (изократическое)
Повторное уравновешивание
Уравновешивающий буфер
10
0%
Результат этой анионообменной хроматографии показан на Фиг.11 и 12. Анализы содержания Gla для индивидуальных фракций (от D5 до Е1) проводили, используя HPLC-систему от Agilent, как описано в Примере 2.
Сравнение распределения разделенных Gla-содержащих вариантов FIX с использованием анионообменной хроматографии, условия которой описаны выше, показано в приведенной ниже таблице.
Gla-содержащий вариант (%)
До разделения (нанесение)
Фракции
Benefix
D5
D4
D3
D2
D1
Е1
Gla (8)
1,1
-
-
-
-
-
-
-
Gla (9)
2,7
16,5
3,1
-
-
-
-
3
Gla (10)
12,5
49,8
27,8
6,0
5,1
4,4
5,0
10
Gla (11)
26,1
12,2
42,4
26,8
18,5
19,1
18,7
27
Gla (12)
57,5
21,5
26,8
67,2
76,4
76,5
76,4
60
Очистка с использованием анионообменной хроматографии, как показано выше, приводит к частичному разделению Gla-содержащих вариантов FIX. Таким образом, экспериментатором может быть изготовлена композиция Gla-содержащих вариантов FIX необходимого состава.
ПРИМЕР 7. Очистка и анализ различных гамма-карбоксилированных вариантов FX
Для разделения различных гамма-карбоксилированных форм использовали анионообменную хроматографию конструкции на основе рекомбинантного FX человека, в которой активационный пептид FX заменен на активационный пептид фибринопептида A (DFLAEGGGVR) и к С-концу добавлена метка НРС4 (DQVDPRLIDGK). В данном методе использовали колонку SOURSE 15Q (GE Healthcare) с объемом слоя 1,7 мл, скорость потока 0,75 мл/мин и температуру 4°С.
На колонку загружали образец ("загружаемый образец") указанной конструкции FX. Суммарно наносили приблизительно 2,5 мг. Значение рН загружаемого образца подводили до 8,0, используя 0,1 М NaOH.
Использовали следующие буферы:
- уравновешивающий буфер: 20 мМ Трис, рН 8,0;
- элюирующий буфер: 20 мМ Трис/HCl, 1,5 М ацетат аммония, рН 8,0;
- CIP: 1 М NaOH.
Использовали следующую процедуру анионообменной хроматографии:
Стадия
Буфер
CV
% элюирующего буфера
Уравновешивание
Уравновешивающий буфер
5
0%
Нанесение
Промывка
Уравновешивающий буфер
5
0%
Элюирование
Элюирующий буфер
100
0-100% (градиентное)
Элюирование
Элюирующий буфер
5
100% (изократическое)
CIP1
NaOH
5
0%
CIP2
Элюирующий буфер
10
100%(изократическое)
Повторное уравновешивание
Уравновешивающий буфер
10
0%
Результат этой анионообменной хроматографии показан на Фиг.13. Анализы содержания Gla для индивидуальных фракций проводили, используя HPLC-систему от Agilent, как описано в Примере 2.
Сравнение на основе анализа фракций распределения разделенных Gla-содержащих вариантов FX до и после использования анионообменной хроматографии, условия которой описаны выше, показано в приведенной ниже таблице.
Gla-содержащий вариант (%)
До разделения ("загружаемый образец")
После разделения
pdFX
Gla-(8) и меньше
3
-
-
Gla-(9)
30
-
-
Gla-(10)
42
59
40
Gla-(11)
25
41
43
Таким образом, получали композицию конструкции FX с повышенным количеством Gla-(10) и Gla-(11).