Способ получения растений хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) в условиях in vitro
METHOD FOR OBTAINING PLANTS OF CHRYSANTHEMUM DEADRISE (Chrysanthemum carinatum Schousb.) IN THE IN VITRO CONDITIONS

Область применения
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в растениеводстве и для различных биотехнологических исследований в области клеточной инженерии.
Уровень техники
Хризантема - одна из самых популярных декоративных культур, используемых в озеленении городских и приусадебных территорий. Широкое использование однолетних сортов хризантем в озеленении и декоративном садоводстве обуславливает интерес к изучению и получению новых стресс-устойчивых сортов биотехнологическими методами.
2
2
Известен способ получения многолетней хризантемы (Chrysanthemum koreanum). Для ввода в культуру клеток в качестве эксплантов использовали листовые пластинки и лепестки растений различных сортов, экспланты стерилизовали 0,1% раствором HgCl (сулемы). Культивирование листовых пластинок на питательной среде Мурасиге-Скуга (МС), содержащей индолилуксусную кислоту (ИУК) 1 мг/л в сочетании с 6-бензиламинопурином (БАП) в концентрации 0,1 мг/л, приводило к образованию плотной морфогенной каллусной ткани. Однако в дальнейшем были выявлены отклонения у растений по морфологии от исходного материала. Культивирование лепестков с теми же регуляторами роста в среде стимулировало образование рыхлой каллусной ткани, в которой не происходила дифференциация меристематических очагов, дающих начало развитию побегов (Гранда Х.Р.-К. Идентификация В вируса хризантем и создание коллекции in vitro оздоровленного посадочного материала. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2009, 19 с.). Известен способ получения пиретрума цинерариелистного (Chrysanthemum cinerariaefolium) из узловых эксплантов. Стерилизацию узловых эксплантов проводили выдержкой в 70% спирте в течение 2 минут, далее 1% HgCl в течение 2-3 минут, после чего несколько раз промывали стерильной дистиллированной водой. Экспланты культивировали в течение 3 недель на питательной среде  МС с добавлением 0,9% агар-агара, α-нафтилуксусной кислоты (НУК) в концентрации 0,5 мг/л и БАП - 0,5 мг/л и далее регенерация на той же среде, содержащей БАП 0,5 мг/л (Ihsan Ilahi, Musarrat Jabeen, S. Nazneen Sadaf. Rapid clonal propagation of Chrysanthemum through embroyogenic callus formation. Pakistan Journal of Botany, 39(6), 2007: p. 1945-1952).
Однако эти научные работы посвящены хризантеме многолетней, которая по современной классификации относится к иному виду хризантем - дендрантема (Dendranthema), а не к однолетней (Chrysanthemum carinatum Schousb.).
Задача изобретения
Задачей нашего метода было ввести в культуру клеток хризантему килеватую, получить высокий процент каллусообразования и морфогенных каллусов, получить жизнеспособные регенеранты без морфологических отклонений.
Решение задачи
Поставленная задача решается тем, что создан новый способ получения растений хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) в условиях in vitro путем введения в культуру клеток семян с целью получения каллусов и последующей регенерации растений, заключающийся в том, что стерилизованные семена помещают на питательную среду МС с добавлением 0,7% агар-агара, 1 мг/л БАП, 0,1-1 мг/л ИУК, доведенную до 1 литра стерильной дистиллированной водой, культивируют в течение одного пассажа до появления каллуса, не более 26 суток, затем каллусы пересаживают на питательную среду МС с половинной концентрацией всех компонентов и 0,7% агар-агара, добавляют 0,2-1 мг/л БАП и культивируют 2-4 пассажа до появления растений-регенерантов.
Заявленные интервалы определяются следующим образом.
При добавлении в питательную среду, на стадии образования каллуса, менее или более 1 мг/л БАП процент образование каллуса снижается и составляет менее 50%.
Добавление, на стадии образования каллуса, менее 0,1 мг/л ИУК увеличивает время образования каллуса, а более 1 мг/л снижает процент образования морфогенного каллуса при дальнейшем культивировании.
Культивирование каллуса в течение одного пассажа недостаточно для получения регенерантов, а культивирование более 4 пассажей приводит к существенному снижению укореняемости регенерантов. Культивирование при длительности одного пассажа более 26 дней приводит к накоплению фенольных соединений в клетках, вследствие этого к потемнению и гибели каллусов.
Если на стадии образования регенерантов в среду добавить менее 0,2 мг/л БАП или более 1 мг/л БАП, снижается процент регенерации.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, результаты которых представлены в таблицах 1, 2.
3
Для введения в культуру клеток хризантемы килеватой (Chrysanthemum carinatum Schousb.) использовались семена растений. Предварительно семена стерилизуют однократной обработкой спиртом с последующей стерилизацией раствором, содержащим гипохлорит натрия (с содержанием активного хлора 75-95 г/дм), в течение 10-20 минут. Затем их три раза промывают стерильной дистиллированной водой. Стерилизация семян в растворе, содержащем гипохлорит натрия, менее 10 минут была неэффективной, наблюдалась высокая зараженность семян при культивировании на питательной среде; более 20 минут - семена обесцвечивались и теряли жизнеспособность.
Пример 1. Каллус формируется из семян растений хризантемы килеватой сорта Эльдорадо на среде МС с добавлением 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИУК (таблица 1). Затем каллусы культивируют 2 пассажа на среде МС с половинной концентрацией всех компонентов ( концентрации МС) и добавлением 0,2 мг/л БАП (таблица 2).
Пример 2. Каллус формируется из семян растений хризантемы килеватой на среде МС сорта Эльдорадо с добавлением 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИУК. Затем каллусы культивируют 3 пассажа на среде  концентрации МС с добавлением 0,5 мг/л БАП (таблица 2).
Пример 3. Каллус формируется из семян растений хризантемы килеватой сорта Эльдорадо на среде МС с добавлением 1 мг/л БАП и 0,5 мг/л ИУК (таблица 1). Затем каллусы культивируют 4 пассажа на среде  концентрации МС с добавлением 1 мг/л БАП (таблица 2).
Пример 4. Каллус формируется с высокой частотой из семян растений хризантемы килеватой сорта Радость на среде МС с добавлением 1 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИУК (таблица 1). Затем каллусы культивируют 2 пассажа на среде  концентрации МС с добавлением 0,2 мг/л БАП (таблица 2).
Пример 5. Каллус формируется с высокой частотой из семян растений хризантемы килеватой сорта Радость на среде МС с добавлением 1 мг/л БАП и 0,5 мг/л ИУК (таблица 1). Затем каллусы культивируют 3 пассажа на среде  концентрации МС с добавлением 0,5 мг/л БАП.
Пример 6. Каллус формируется с высокой частотой из семян растений хризантемы килеватой сорта Радость на среде МС с добавлением 1 мг/л БАП и 1 мг/л ИУК (таблица 1). Затем каллусы культивируют 4 пассажа на среде  концентрации МС с добавлением 1 мг/л БАП.
Результаты изобретения.
Результаты таблиц 1, 2 показывают, что предлагаемый метод является эффективным. Достигнут высокий процент каллусообразования для хризантемы килеватой сортов Эльдорадо - 45,1-71,4% и Радость - 48,2-78,2%, а также достигнут высокий процент регенерации хризантемы килеватой у сорта Эльдорадо 42,3-61,0% и у сорта Радость 49,2-64,7%
Введены в культуру клеток семена хризантемы килеватой и получены растения-регенеранты. Достигнут высокий процент каллусообразования и регенерации. Все полученные регенеранты жизнеспособны и не имеют морфологических отклонений. Данные регенеранты адаптированы к почвенным условиям и получены семена.