АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ БЕЛКОВАЯ ГУБКА ДЛЯ ХИМИОТЕРАПИИ ИНФИЦИРОВАННЫХ РАН И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ
ANTIBACTERIAL PROTEIN SPONGE FOR CHEMOTHERAPY OF INFECTED WOUNDS AND METHOD OF ITS PRODUCTION

Изобретение относится к междисциплинарным техническим решениям, объединяющим химию высокомолекулярных соединений, медицину, биотехнологию и разработку функциональных биоматериалов на основе природных биополимеров - белков. Более конкретно изобретение касается обладающих антибактериальной активностью макропористых белковых губок и способов их получения. В частности, заявляемая антибактриальная губка включает или основной белок плазмы крови - сывороточный альбумин, или суммарный белок сыворотки крови, или суммарный белок плазмы крови [Peters Т. All About Albumin: Biochemistry, Genetics, and Medical Application. // London: Academic Press; 1995. 432 p.], а также один или несколько агентов с антибиотической активностью, проявляющих свое действие в отношении патогенных микроорганизмов-возбудителей гнойных воспалений. Наиболее эффективно заявляемый материал может быть использован для биомедицинских целей, например, в качестве средства для лечения гнойно-некротических ран.
В частности, известны различные полимерные губчатые материалы, включая и губки на основе веществ белковой природы, которые используются при лечении ран и ожогов [М.И. Штильман. Введение в технологию полимеров медико-биологического назначения. М.: Из-во РХТУ, 2000. 247 с.]. Эти губки имеют общее специфическое свойство - выраженную сорбционную способность по отношению к жидкому экссудату, выделяемому раной или ожогом [http://www.terra-medica.spb.ru/st1_2003/balin.htm]. Известными примерами белковых материалов такого типа являются гемостатические коллагеновые губки [http://dic.academic.ru/dic.nsf/meditem/486]. Как правило, абсорбционная способность подобных покрытий на раны и ожоги обусловлена системой капилляров, пронизывающих хорошо смачиваемую биологической жидкостью полимерную матрицу. При этом растворимые вещества, первоначально входящие в состав таких губок, например кровоостанавливающие агенты, высвобождаются в жидкую фазу.
Известен ряд материалов биомедицинского назначения на основе сывороточного альбумина, которые получают различными способами, наиболее часто - посредством гелеобразования растворов этого белка, например, вызываемого нагреванием [Gosal W.S., Ross-Murphy S.В. Globular protein gelation // Curr. Opinion Coll. Interface Sci. 2000. V. 5. №3-4. P. 188-194; Clark A.H., Tuffnell C.D. Small-angle X-ray-scattering studies of thermally-induced globular protein gels // Int. J. Peptide Protein Res. 1980. V. 16. №4. P. 339-351], воздействием высокого давления [Galazka V.B., Dickinson E., Ledward D.A. Influence of high pressure processing on protein solutions and emulsions // Curr. Opinion Coll. Interface Sci. 2000. V. 5. №3-4. P. 182-187], денатурацией белка ПАВ'ами или эмульгированием водной фазы в гидрофобных жидкостях [Автушенко С.С., Николаев Б.П., Шляков A.M. Структурирование белков в эмульсиях вода-масло согласно 1Н-ЯМР данным // Колл. ж. 1993. Т. 55. №1. С.3-5], а также ковалентным сшиванием белковых макромолекул химическими кросс-агентами или облучением [Hopwood D. A comparison of the crosslinking abilities of glutaraldehyde, formaldehyde and alpha-hydroxyadipaldehyde with bovine serum albumin and casein. // Histochemistry 1969. V. 17. №2. P. 151-161; Vermonden Т., Censi R., Hennik W.E. Hydrogels for protein delivery // Chem. Revs. 2012. V. 112. №5. P. 2853-2888; Бычкова А.В., Розенфельд M.A., Леонова В.Б., Сорокина О.Н., Ломакин С.М., Коварский А.Л. Свободно-радикальное сшивание молекул сывороточного альбумина на поверхности наночастиц магнетита в водной дисперсии // Колл. ж. 2013. Т. 75. №1. С. 9-16]. Подобные белковые материалы предложено использовать в качестве носителей для контролируемого высвобождения лекарств, а также как биоспецифические сорбенты, сорбционные матрицы экстракорпоральных устройств для детоксикации крови и др. [Lundblad R.L. Biotechnology of Plasma Proteins. // CRC Press, Boca Raton e.a., 2013. P. 83-182].
Структуре такого типа белковых материалов свойственна гелевая микропористость, т.е. если в объем гелевой матрицы включены какие-либо растворимые агенты, проявляющие лекарственное действие, то при помещении такого материала в избыток жидкости (в частности, кровь, экссудат, раневую или ожоговую среду) скорость высвобождения таких лекарственных агентов (например, болеутоляющих средств, антибиотиков и др.) во внешнюю жидкость будет невысокой, определяющейся их медленной диффузией в массе геля и далее из него. Когда же подобный гель, содержащий в своем объеме растворимые вещества, высушивается и лишь затем помещается в избыток жидкости, интенсивность высвобождения лекарства еще в большей степени снижается, т.к. требуется дополнительное время на медленное набухание сухого полимера. Указанные свойства таких гелевых систем, содержащих лекарственные агенты и называемые их «депо-формами», являются недостатком микропористых белковых гелей в случае применения подобных материалов в биомедицинских системах.
Например, известна группа белковых материалов на основе сывороточного альбумина, химически сшитого с пектином, и содержащая ионы меди в качестве антибактериального агента [R. Harris, W. Nasi. Gels for use in wound management // WO 2008015475]. Такого типа обладающий антибактериальной активностью белковый материал получают из содержащего добавки соли меди водного раствора смеси сывороточного альбумина и пектина химическим сшиванием этих биополимеров с помощью водорастворимого карбодиимида. При определенных соотношениях указанных ингредиентов образуются гидрогели, которые предложено использовать для лечения различных, в том числе и инфицированных, ран. Это техническое решение имеет ряд недостатков. Так, получаемый гелевый белковый материал обладает микропористой структурой, которая обеспечивает только медленное диффузионно-ограниченное высвобождение антибактерильного агента, в данном случае - ионов меди, либо их переход в растворимое состояние при биодеградации белковой основы материала под действием протеиназ организма пациента. Поэтому для создания высоких терапевтических концентраций антибактерильного агента, необходимых в случае сильно инфицированных ран, требуется использовать большие объемы гелевого материала, что часто технически осложняет проводимые хирургические процедуры (оперативное вмешательство, перевязки и т.д.), а также дорого с экономической точки зрения. Для гелеобразования через химическое сшивание биополимеров, входящих в состав материала, применяется водорастворимый карбодиимид (конкретно, 1-этил-3-(диметиламинопропил)-карбодимид), непрореагировавшая часть которого так и остается в объеме геля и никак оттуда не удаляется каким-либо промыванием. Поэтому при помещении образовавшего геля в рану возникает опасность токсического воздействия такого карбодиимида на организм пациента за счет нежелательной химической модификации собственных белков и пептидов организма. Поскольку данное техническое решение предусматривает получение конечного белкового материала только во влажном виде, то хранимость подобного изделия невысока, а также резко увеличиваются издержки на транспортировку материала, т.к. в его составе приходится перевозить просто 80-90% воды.
В свою очередь, в тех случаях, когда необходимо быстро обеспечить высокую терапевтическую дозу лекарственного агента, лучше подходят крупнопористые материалы, у которых основная транспортная функция обеспечивается не медленной диффузией, а конвекцией жидкости по системе сообщающихся пор капиллярного размера.
В частности, такой специфической микроструктурой обладают полимерные, в том числе и белковые, материалы, получаемые методами так называемого криоструктурирования - криотропным гелеобразованием, лиофилизацией, криоэкстракцией [Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения // Успехи химии. 2002. Т. 71. №6. С.559-585; Lozinsky V.I., Okay О. Basic principles of cryotropic gelation // Adv. Polym. Sci. 2014. V. 263. Р. 49-101]. Характерная особенность всех типов криогелей и криоструктуратов - их макропористость, формируемая поликристаллами замерзшего растворителя, после или плавления, или сублимации, или криоэкстракции которых в массе образца остаются сообщающиеся поры капиллярной величины [Лозинский В.И. Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения - полимерные криогели. // Известия РАН, Сер. хим. 2008. №5. С.996-1013; Okay О., Lozinsky. V.I. Synthesis, structure-property relationships of cryogels. // Adv. Polym. Sci. 2014. V. 263. Р. 103-157].
Например, в медицинской практике применяется гемостатическая губка из нативной плазмы, получаемая лиофилизацией плазмы крови, главным белковым компонентом которой, как известно, является сывороточный альбумин [Lundblad R.L. Biotechnology of Plasma Proteins. // CRC Press, Boca Raton e.a., 2013. Р. 83-182]. Такая губка обладает выраженным кровоостанавливающим действием, но очень хрупкая и к тому же быстро растворяется в биологической жидкости раны [http://znaiu.ru/art/4002390600.php], что является функциональным недостатком этого и подобных ему материалов.
Известна макропористая альбуминовая лиофилизованная композиция, имеющая текстуру губки и обладающая активностью к индукции иммунного ответа на флавивирус.[Д.К. Веллом, Д.Е. Войсвилло, П. Деджорж, П. Чараметаро. Лиофилизованная композиция для индукции иммунного ответа на флавивирус, композиция и способ ее получения // Пат. РФ №2541784 (2007); Б.И. №5 (2015)]. Данную белковую губку получают из композиции, включающей определенные концентрации живого ослабленного флавивируса (биологически активный ингредиент композиции), стабилизатора (в качестве такового в данном известном изобретении используется сывороточный альбумин), компоненты буферного раствора, лактозу и аморфный маннит. Соответствующую жидкую композицию замораживают в многоступенчатом режиме и высушивают лиофильно, в ходе сушки также ступенчато изменяя параметры (вакуум и температуру) процесса. В результате получают макропористый белковый продукт, представляющий собой альбуминовую губку, содержащую лекарственный агент (в данном случае, ослабленные вирусные частицы), обладающий целевой биологической активностью - способностью индуцировать иммунный ответ организма на заражение флавивирусами. Основными преимуществами такой белковой губки являются устойчивость при транспортировке и хорошая хранимость биологически значимого компонента.
Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому изобретению в отношении типа белковой основы губки, т.е. сывороточного альбумина и содержание в ней лекарственного агента, а также способа получения, предусматривающего лиофилизацию исходной жидкой композиции, принято за прототип.
Однако такая биологически активная белковая губка и способ ее получения имеют ряд недостатков:
1. Одним из основных недостатков является быстрая растворимость альбуминовой губки в физиологических средах (это не позволяет достичь пролонгации проявления биологической активности).
2. Сложный состав замораживаемой композиции с особыми требованиями к типу одного из компонентов - использование исключительно аморфного маннита существенно удорожают конечный продукт.
3. Многостадийный режим замораживания-лиофилизации исходной композиции сильно усложняет способ в целом и снижает его технологичность.
4. Кроме того, в составе данного губчатого белкового материала не предусматривает использование каких-либо агентов, обладающих антибактериальной активностью, что усиливает опасность микробной контаминации как самого материала, так и операционного поля, куда он вносится во время хирургического вмешательства в организм.
В этой связи, задачами предлагаемого изобретения являются как собственно создание нового эффективного материала медицинского назначения - антибактериальной белковой губки, предназначенной для химиотерапии инфицированных ран, так и разработка более технологичного по сравнению с аналогами и прототипом способа получения этого материала.
Указанные задачи решаются тем, что заявляемая антибактериальная белковая губка для химиотерапии инфицированных ран содержит один или несколько лекарственных агентов, причем белковая основа губки включает или альбумин сыворотки крови, или общий белок сыворотки крови, или общий белок плазмы крови, а лекарственный агент или агенты обладают антибиотической активностью в отношении патогенных микроорганизмов-возбудителей гнойных воспалений. Заявляемую антибактериальную белковую губку формируют замораживанием раствора, содержащего или альбумин сыворотки крови, или общий белок сыворотки крови, или общий белок плазмы крови, выдерживанием в замороженном состоянии, затем оттаиванием, промывкой образовавшейся белковой губки от не вошедших в ее состав компонентов с последующим механическим отжимом свободной жидкости из промытой белковой губки, набуханием промытой и отжатой белковой губки в растворе одного или нескольких агентов, обладающих антибиотической активностью, далее замораживанием набухшей белковой губки и ее высушиванием лиофилизацией. При этом замораживание раствора, содержащего 3-6 мас. % или альбумина сыворотки крови, или общего белка сыворотки крови, или общего белка плазмы крови, 6-18 мас. % мочевины и 0.1-0.2 мас. % цистеина, проводят при -10…-30°С в течение 6-36 ч, а набухание промытой и отжатой белковой губки в растворе одного или нескольких агентов, обладающих антибиотической активностью и выбранных из группы, включающей ванкомицин, линкомицин, кларитромицин, торбамицин, гентамицин или их смеси, при концентрации таких агентов, равной или выше 2 мас. %, осуществляют при 5-35°С в течение 3-24 ч.
Получаемая указанным способом антибактериальная белковая губка может быть изготовлена любой геометрической формы: в виде блоков, пластин, дисков, гранул, частиц неправильной формы (получаются измельчением блока), трубок и др., а включаемые в ее состав одно или несколько веществ, обладающих антибиотической активностью, не ограничиваются вышеперечисленными вариантами, и их номенклатура может быть легко расширена в зависимости от вида инфекции, для подавления которой предназначается конкретный тип такой антибактериальной губки.
Конкретные параметры заявляемого технического решения определяются следующими факторами:
1) Состав заявляемой антибактериальной белковой губки и растворов, используемых при ее получении.
Белковая основа губки состоит или из альбумина сыворотки крови, или общего белка сыворотки крови, или общего белка плазмы крови, являющихся нетоксичными абсолютно биосовместимыми компонентами, которые не нуждаются в последующем извлечении из раны, могут быть оставлены там, где впоследствии постепенно рассасываются под действием протеолитических ферментов самого организма пациента.
Входящие же в состав такой губки лекарственные вещества, обладающие антибиотической активностью в отношении патогенных микроорганизмов-возбудителей гнойных воспалений, относятся к различным группам антибиотиков, разрешенных отечественной и международными Фармакопеями для использования в медицинской практике.
Концентрация альбумина или суммы белков плазмы и сыворотки в исходном растворе найдена экспериментально и находится в пределах 3-6 мас. %. При меньшем чем 3 мас. % содержании получающаяся белковая губка имеет низкую прочность, плохо сохраняет форму и целостность при манипуляциях в физиологических средах. Если же концентрация белка в исходном растворе превышает 6 мас. %, получающаяся белковая губка, напротив, слишком жесткая и хрупкая в сухом виде, а в водной среде плохо впитывает жидкость из-за недостаточной пористости.
Помимо белковых компонентов в состав исходных растворов вводятся добавки мочевины и цистеина в количестве 6-18 мас. % и 0.1-0.2 мас. % соответственно. Эти вещества необходимы для криотропного гелеобразования белков с образованием межмолекулярных цистиновых мостиков, что обеспечивает целостность губки в водных средах и довольно медленную ее биодеградацию при нахождении в раневом пространстве. Указанные концентрационные диапазоны этих веществ найдены экспериментально: при их содержании в исходном растворе, меньшем чем нижние пределы, белковая губка не сохраняет своей целостности после оттаивания замороженной системы, а при превышении верхних пределов вместо губчатого криогеля получается вязкий мутный коллоидный раствор.
Входящие в состав заявляемой антибактериальной белковой губки лекарственные вещества, обладающие антибиотической активностью в отношении патогенных микроорганизмов-возбудителей гнойных воспалений, вводятся в белковую основу после ее формирования, промывки и отжима от свободной жидкости, а именно на стадии набухания губки в растворе антибиотиков или смеси антибиотиков. Их концентрация в таком растворе также найдена экспериментально и определяется, во-первых, растворимостью конкретного вещества или смеси веществ и, во-вторых, количеством антибиотика или смеси антибиотиков, которое нужно ввести в конечное изделие. Варьированием концентрации такого раствора легко регулировать содержание лекарства в получаемой антибактериальной белковой губке. Согласно предлагаемому техническому решению концентрация антибиотика в растворе для набухания равна 2 мас. % и, когда необходимо, выше. При меньшей концентрации, чем нижнее значение, в губке оказывается количество антибиотика, недостаточное для достижения положительного терапевтического эффекта. Верхний предел концентраций в растворе для набухания губчатой белковой основы зависит от растворимости конкретного антибиотика или их смеси.
2) Режимы осуществления заявляемого технического решения
Процесс получения заявляемой антибактериальной белковой губки включает следующие стадии:
- приготовление исходного раствора;
- его замораживание, выдерживание в замороженном состоянии в течение определенного времени с последующим оттаиванием;
- промывку образовавшейся белковой губки от не вошедших в ее состав компонентов;
- механический отжим свободной жидкости из промытой губки;
- набухание отжатого материала в растворе одного или нескольких веществ, обладающих антибиотической активностью;
- замораживание набухшей губки и ее высушивание лиофилизацией.
Данная технологическая схема обеспечивает получение заявляемого материала, при этом предпочтительнее проведение указанных стадий в стерильных условиях.
Режимы замораживания исходных растворов и их выдерживания в замороженном состоянии определены экспериментально. Заявляемый способ получения антибактериальной белковой губки предусматривает осуществление этих процессов при -10…-30°С в течение 6-36 ч. Верхний предел заявляемого температурного диапазона обусловлен тем, что при более высокой минусовой температуре из-за эффектов переохлаждения композиции заявляемого состава часто не замерзают, а использование температур ниже -30°С нецелесообразно, т.к. при этом резко падает эффективность криотропного гелеобразования в данных системах, что проявляется в снижении выхода сшитого белкового криогеля и в ухудшении его губчатой текстуры.
Промывание полученной белковой губки от не вошедших в ее состав белковых компонентов, а также от добавок мочевины и цистеина проводят известными приемами предпочтительнее с использованием стерильной воды. Отжим свободной жидкости из промытой губки осуществляют при нагрузках, не приводящих к раздавливанию и разрушению мягкого губчатого белкового материала.
Заявляемые условия набухания промытой и отжатой от свободной жидкости белковой губки в растворе одного или смеси нескольких антибиотиков обусловлены потребностями конкретного технологического процесса. Если желательно провести процесс быстро, но не добиваться достижения равновесия набухания и максимального насыщения губки лекарством, можно осуществить набухание при умеренном нагревании (т.е. при 30-35°С) в течение 3-5 ч. Если необходимо максимально возможное насыщение губки антибиотиком, то предпочтителен более продолжительный период набухания (до 24 ч) и его проведение при пониженной (10…5°С) положительной температуре.
Замораживание набухшей в растворе антибиотика белковой губки и ее лиофильное высушивание проводится в известных режимах; основное условие этой стадии заявляемого способа - строгое предотвращение размораживания образцов и сохранение их стерильности при сбросе вакуума по окончании сушки.
Заявляемая антибактериальная белковая губка, предназначенная для химиотерапии инфицированных ран; способ получения такого материала, а также заявляемое сочетание признаков, ранее известны не были, то есть предлагаемое техническое решение отвечает критерию «новизна».
Ниже описываются типичные примеры реализации заявляемого технического решения, которые иллюстрируют, но не ограничивают его объем, остальные примеры суммированы в таблице, а приводимые ниже рисунки содержат следующую информацию:
Фиг. 1. Результаты определения активности in vitro (диско-диффузионный метод) антибактерильных белковых губок, полученных по примеру 1(а-в) из бычьего сывороточного альбумина (БСА) и нагруженных ванкомицином (В), гентамицином (Г) и кларитромицином (К); тест-культура - Staphylococcus aureus MRSA.
Фиг. 2. In-vivo-биотестирование антибактерильных белковых губок, полученных по примеру 1(а-б) из бычьего сывороточного альбумина (БСА) и нагруженных гентамицином и ванкомицином:
а) Фиксация лабораторного животного на предметном столике и удаление участка волосяного покрова.
б) Подготовка участка для введения тефлонового кольца.
в) Внешний вид операционного поля после имплантации тефлонового кольца.
г) Инфицирование раны патогенной культурой метицеллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus MRSA.
д) Изолирование раны от внешней среды с помощью ватно-марлевого тампона.
е) Внешний вид раны через 5 суток и отбор пробы на микробиологический анализ.
ж) Внесение в инфицированную рану БСА-губки, нагруженной гентамицином.
з) Внесение в инфицированную рану БСА-губки, нагруженной ванкомицином.
и) Внешний вид операционного поля с БСА-губкой, нагруженной гентамицином, через 10 суток после начала лечения.
к) Отбор пробы на микробиологический анализ из операционного поля с БСА-губкой, нагруженной гентамицином, через 10 суток после начала лечения.
л) Внешний вид операционного поля с БСА-губкой, нагруженной ванкомицином, через 10 суток после начала лечения.
м) Отбор пробы на микробиологический анализ из операционного поля с БСА-губкой, нагруженной ванкомицином, через 10 суток после начала лечения.
Фиг. 3. Результаты определения активности in vitro (диско-диффузионный метод) антибактерильных белковых губок, полученных по примеру 2(б-г) из общего белка сыворотки крови овцы (ССО) и нагруженных ванкомицином (В), гентамицином (Г) и кларитромицином (К); тест-культура - Escherichia coli sp.
Фиг. 4. Результаты определения активности in vitro (диско-диффузионный метод) антибактерильных белковых губок, полученных по примеру 3(в-д) из общего белка плазмы крови человека (ОПЧ) и нагруженных ванкомицином (В), гентамицином (Г) и кларитромицином (К); тест-культура - Pseusomonas aeruginosaEscherichia coli sp.
Фиг. 5. In-vivo-биотестирование антибактерильных белковых губок, полученных по примеру 3(в-д) из общего белка плазмы крови человека (ПКЧ) и нагруженных гентамицином и ванкомицином:
а) Фиксация лабораторного животного на предметном столике и удаление участка волосяного покрова на задней нижней конечности.
б) Внешний вид фиксированного ранорасширителем продольного разреза после рассечения мышечной фасции.
в) Инфицирование раны патогенной культурой метицеллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus MRSA.
г) Внешний вид раны через 3 суток после инфицирования.
д) Внесение в инфицированную рану ПКЧ-губки, нагруженной гентамицином.
е) Внесение в инфицированную рану ПКЧ-губки, нагруженной ванкомицином.
ж) Внешний вид ушитой раны с имплантированной ПКЧ-губкой, нагруженной гентамицином.
з) Внешний вид ушитой раны с имплантированной ПКЧ-губкой, нагруженной ванкомицином.
и) Внешний вид рубца (без признаков воспаления) в области оперативного вмешательства через 12 суток после имплантации в рану ПКЧ-губки, нагруженной гентамицином.
к) Внешний вид рубца (без признаков воспаления) в области оперативного вмешательства через 12 суток после имплантации в рану ПКЧ-губки, нагруженной ванкомицином.
л) Декапитация рубца для микробиологического контроля модели гнойной раны, подвергнутой лечению имлантированной ПКЧ-губкой, нагруженной гентамицином.
м) Декапитация рубца для микробиологического контроля модели гнойной раны, подвергнутой лечению имлантированной ПКЧ-губкой, нагруженной ванкомицином.
н) Отбор пробы на микробиологический анализ из декапитацированного рубца после лечения модели гнойной раны с помощью имлантированной ПКЧ-губки, нагруженной гентамицином.
о) Отбор пробы на микробиологический анализ из декапитацированного рубца после лечения модели гнойной раны с помощью имлантированной ПКЧ-губки, нагруженной ванкомицином.
Пример 1. Антибактериальная белковая губка, сформированная согласно протоколу №1(а-в) таблицы примеров.
А) Получение губчатой белковой основы
Водный раствор, содержащий 4 мас. % бычьего сывороточного альбумина (БСА), 12 мас. % мочевины и 0.1 мас. % цистеина, наливают слоем высотой 0.5 см в плоскодонные стеклянные флаконы с внутренним диаметром 1 см, которые помещают в камеру ультракриостата F-32 (Julabo, Германия), где замораживают содержимое флаконов при -20°С в течение 18 ч, а затем оттаивают при комнатной температуре. Сформированные таким образом губчатые альбуминовые диски промывают от растворимых компонентов стерильной водой.
Б) Насыщение белковой губки лекарственным вещестом, обладающим антибиотической активностью в отношении патогенных микроорганизмов-возбудителей гнойных воспалений
Каждый набухший в воде диск помещают на стеклянный фильтр и отжимают несвязанную жидкость под вакуумом водоструйного насоса в течение 1 мин. Затем диски помещают в или водный раствор (4 мас. %) ванкомицина (Elli Lilly, США), или гентамицинина (Борисовский завод медпрепаратов, Республика Беларусь), или кларитромицина (Abbott, Франция), где инкубируют 6 ч при 10°C с периодическим перемешиванием. Набухшие в растворе антибиотика губчатые диски переносят на чашку Петри, замораживают известными приемами и высушивают лиофильно с помощью сублимационной установки ALPHA 1-2 LD plus (Martin Christ, Германия). Полученные сухие препараты хранят в герметичной таре при -20°С.
В) Биотестирование антибактериальной белковой губки in vitro
Для оценки антимикробной активности образцов альбуминовых губок, полученных по пр. 1а-в, использовали тест-культуру метицеллин-резистентного микроорганизма, относящегося к виду: Staphylococcus aureus. Микробную взвесь готовили на физиологическом растворе в концентрации, соответствующей стандарту мутности 0,5 Мак Фарланд, а затем наносили на поверхность агара Мюллера-Хинтона в чашках Петри. Равномерно распределяли и подсушивали идентично способу определения антибиотикорезистентности микроорганизмов диско-диффузным методом. Исследуемые образцы альбуминовых губок (диаметр 10 мм, толщина 8 мм), нагруженных антибиотиками, наносили на поверхность агара. Чашки инкубировали в термостате при температуре 35°С в течении 18-24 часов. Результаты учитывали путем измерения (в мм) зоны задержки роста тест-культуры микроорганизма вокруг исследуемого образца. Найдено (фиг. 1), что вокруг альбуминовой губки с ванкомицином задержка роста клеток St. aureus MRSA составила 27 мм, губки с гентамицином - 24 мм; губки с кларитромицином - 0 мм (это было обусловлено резистентностью культуры к данному антибиотику).
Г) Биотестирование антибактериальной белковой губки in vivo
Экспериментальные исследования выполнялись на нелинейных крысах-самцах породы Wistar, массой 250±10 г, у которых моделировалась гнойная рана для констатации и объективной оценки раневого процесса.
2
7
9
Под внутримышечным калипсоловым наркозом животное фиксировали на предметном столике, удаляли волосяной покров на участке размером 3×3 см (фиг. 2а и 2б), иссекали кожу и подкожно жировую клетчатку диаметром 2 см (314 мм) и к месту кожного дефекта подшивали тефлоновое кольцо с бортиком 1 см такого же диаметра (фиг. 2в). После чего фасция и предлежащая мышечная ткань, внутри колпачка, раздавливали кохером. В полость колпачка шприцом вводили около 1 мл раствора с патогенной флорой метицеллин-резистентного золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus MRSA) в количестве 10 клеток (фиг. 2г), после чего кольцо изолировали от внешней среды (фиг. 2д). На 5-е сутки с момента моделирования гнойной раны все животные были вялыми, заторможенными, со сниженной агрессией на внешние раздражители, аппетит понижен. Местно отмечался перифокальный отек, гиперемия предлежащей кожи по краю раны. В области раны выраженное гнойное отделяемое, фибринозный налет с участками некроза (фиг. 2е). При микробиологическом исследовании биоптатов из области раневого покрытия выявлено, что степень обсемененности Staphylococcus aureus MRSA на грамм ткани была 10 клеток и соответствовала выраженному гнойному процессу. После этого у животных после обработки поверхности раны физиологическим раствором начато местное лечение гнойных ран губками из альбумина, нагруженными гентамицином (фиг. 2ж) и ванкомицином (фиг. 2з).
При динамическом наблюдении за животными, на 4-е сутки от начала лечения, выявлено, что у животных сохранялась контурная инфильтрация вокруг ран, умеренная гиперемия, незначительный отек, незначительное гнойное отделяемое, наблюдались участки некроза по периметру раны. Но все эти симптомы были менее выражены по сравнению с периодом до нанесения губки. На 4-е, 10-е и 15-е сутки с момента начала лечения производили планиметрию ран. В эти же сроки забирали биопсийный материал для микробиологического исследования. Средние сроки очищения ран от гнойных и некротических масс при использовании раствора трипсина в первой фазе травматического воспаления (контрольная группа) составили 14±0.5 суток, а сроки полного заживления - 17±0.3 суток. В группе животных, при лечении которых использовались альбуминовые губки с гентамицином, раны очищались на 6±0.3 сутки, а заживление происходило к 13±0.4 дню. К 11±0.6 суткам в группе животных, где для лечения использовались альбуминовые губки с ванкомицином, раны полностью очищались от гнойно-некротических масс. На 5±0.4 сутки у животных этой группы на фоне очищения ран имели место появление мелкозернистой грануляционной ткани. Животные в эти сроки были более активны, в ответ на агрессию большинство крыс энергично сопротивлялись, потребление пищи возрастало. К 4.5±0.5 суткам наблюдения гиперемия вокруг ран не отмечалась, кожа легко собиралась, т.е. было отмечено уменьшение диаметра. На 10 сутки стала отмечаться краевая эпителизация, при этом было выявлено значительное уменьшение размера губок почти на 70% как с гентамицином, (фиг. 2и и 2к), так и с ванкомицином (фиг. 2л и 2м), т.е. их постепенное рассасывание. При исследовании микробиологического материала рост патологической микрофлоры не был обнаружен. Таким образом, продемонстрирована эффективность применения альбуминовых губок, нагруженных антибиотиками, для химиотерапии инфицированных ран.
Пример 2. Антибактериальная белковая губка, сформированная согласно протоколу №2(б-г) таблицы примеров.
А) Получение губчатой белковой основы
Свежеполученную сыворотку крови овцы с содержанием общего белка 7.6 мас. % разбавляют стерильной водой таким образом, чтобы концентрация белка составляла 4.5 мас. %. В полученный раствор вносят мочевину и цистеин в количестве, отвечающем их концентрации в смеси 14 и 0.18 мас. % соответственно. Такую жидкую систему порциями 0.4 мл дозируют в 10-мм лунки пластикового планшета, которые помещают в морозильную камеру RL 48RRCSW (Samsung, Ю. Корея), где замораживают содержимое лунок при -18°С в течение 24 ч, а затем оттаивают при комнатной температуре. Сформированные таким образом губчатые белковые диски промывают от растворимых компонентов стерильной водой.
Б) Насыщение белковой губки лекарственным вещестом, обладающим антибиотической активностью в отношении патогенных микроорганизмов-возбудителей гнойных воспалений
Промытые белковые диски отжимают от несвязанной воды на фильтровальной бумаге и помещают или в водный раствор (3.5 мас. %) ванкомицина (Teva, Израиль), или гентамицинина (Борисовский завод медпрепаратов, Республика Беларусь), или кларитромицина (Abbott, Франция), где инкубируют 24 ч при 5°C с периодическим перемешиванием. Набухшие в растворе антибиотика губчатые диски переносят на чашку Петри, замораживают известными приемами и высушивают лиофильно с помощью сублимационной установки ALPHA 1-2 LD plus (Martin Christ, Германия). Полученные сухие препараты хранят в герметичной таре при -20°С.
В) Биотестирование антибактериальной белковой губки in vitro Для оценки антимикробной активности образцов белковых губок, полученных по пр. 2б-г, используют тест-культуру микроорганизма, относящегося к виду Escherichia coli sp. Дальнейшие манипуляции осуществляют аналогично методикам, изложенным в п. "В" примера 1. Найдено (фиг. 3), что вокруг белковой губки с гентамицином задержка роста клеток Escherichia coli sp. составила 36 мм, а губки с ванкомицином и кларитромицином показали минимальный эффект, это обусловлено с высокой резистентностью кишечной микрофлоры к данным антибиотикам. Таким образом, показана эффективность белковых губок, приготовленных из суммарного белка сыворотки крови и нагруженных антибиотиком, активным в отношении кишечных микроорганизмов, при использовании таких депо-форм в качестве антибактериальных препаратов.
Пример 3. Антибактериальная белковая губка, сформированная согласно протоколу №3в-д таблицы примеров.
А) Получение губчатой белковой основы
Быстрозамороженную плазму крови человека с содержанием общего белка 7.8 мас. % оттаивают при 30°С и разбавляют стерильной водой таким образом, чтобы общая концентрация белка составляла 4 мас. %. В полученный раствор вносят мочевину и цистеин в количестве, отвечающем их концентрации в смеси 13 и 0.13 мас. % соответственно. Такую жидкую систему порциями 0.15 мл дозируют в конические пластиковые флаконы, которые герметизируют и помещают в камеру ультракриостата Proline RP 1840 (Lauda, Германия), где замораживают содержимое флаконов при -17.5°С в течение 12 ч, а затем оттаивают при 4°С. Сформированные таким образом белковые губки, которые имеют форму конуса, промывают от растворимых компонентов стерильной водой.
Б) Насыщение белковой губки лекарственным вещестом, обладающим антибиотической активностью в отношении патогенных микроорганизмов-возбудителей гнойных воспалений
Промытые белковые губки отжимают от несвязанной воды на фильтровальной бумаге и помещают или в водный раствор ванкомицина (Teva, Израиль) (5 мас. %), или гентамицинина (Борисовский завод медпрепаратов, Республика Беларусь) (4 мас. %), или кларитромицина (Abbott, Франция) (6 мас. %), где инкубируют 18 ч при 18°C с периодическим перемешиванием. Набухшие в растворе антибиотика белковые губки помечают на чашку Петри, замораживают известными приемами и высушивают лиофильно с помощью сублимационной установки Freezone 1L (Labconco, США). Полученные сухие препараты хранят в герметичной таре при -20°С.
В) Биотестирование антибактериальной белковой губки in vitro
Для оценки антимикробной активности образцов белковых губок, полученных по пр. 3(в-д), используют тест-культуру синегнойной палочки Pseusomonas aeruginosa. Дальнейшие манипуляции осуществляют аналогично методикам, изложенным в п. "В" примера 1. Найдено (фиг.4), что вокруг белковой губки с гентамицином задержка роста клеток Ps. aeruginosa составила 44 мм, губки с кларитромицином - 23 мм. Препарат белковой губки, нагруженной ванкомицином, не оказывал воздействия на тест-культуру, что обусловлено с высокой резистентностью синегной палочки к этому антибиотику. Таким образом, показана эффективность белковых губок, приготовленных из общего белка плазмы крови и нагруженных антибиотиками, активными в отношении гнилостных микроорганизмов, при использовании таких депо-форм в качестве антибактериальных препаратов.
Г) Биотестирование антибактериальной белковой губки in vivo
Экспериментальные исследования выполнялись на нелинейных крысах-самцах породы Wistar, массой 250±10 г, у которых моделировалась гнойная рана для констатации и объективной оценки раневого процесса.
7
9
Под внутримышечным калипсоловым наркозом животное фиксировали на предметном столике и удаляли волосяной покров на задней нижней конечности (бедро) (фиг. 5а). Далее скальпелем выполняли продольный разрез кожи длиной 1 см, рассекали мышечную фасцию и осуществляли доступ к мышцам. Рану в открытом виде фиксировали ранорасширителем. (фиг. 5б). В полость раны шприцом вводили около 1 мл раствора патогенной микрофлорой метицелин-резистентного золотистого стафилококка St. aureus MRSA в количестве 10 клеток (фиг. 5в) и выполняли перевязку инфицированной конечности. Через 72 ч повязку снимали и отбирали пробу на микробиологическое исследование, показавшее степень обсемененности патогенной микрофлорой St. aureus MRSA на уровне 10 клеток на грамм ткани, что соответствовало выраженному гнойному процессу (фиг. 5г). Полость раны промывали 20 мл физиологического раствора, после чего осуществляли имплантацию белковых губок с гентамицином (фиг. 5д) и с ванкомицином (фиг. 5е) в раневую полость. Далее рану ушивали послойно хирургическим шовным материалом полигликолид-ко-лактид, плетенный фиолетовый, USP 1(4metric) (фиг. 5ж и 5з).
При динамическом наблюдении за животными со следующего дня от начала лечения выявлено, что животные были активны, со 2-3 дня почти все животные в ответ на агрессию энергично сопротивлялись, потребление пищи возрастало. К 5±0.5 суткам наблюдения гиперемия вокруг ран не отмечалась; через неделю признаки воспаления уменьшились. Через 7 дней швы были сняты, поверхность кожи через день после снятия швов стала гладкой. Через 12 суток все животные полностью восстановились, наблюдалась картина полного заживления, рубцы в области оперативного вмешательства были без признаков воспаления (фиг. 5и и 5к). Далее все животные были выведены из эксперимента, под эфирным наркозом произведена декапитация (фиг. 5л и 5м) для микробиологического контроля подвергнутой лечению модели гнойной раны (фиг. 5н и 5о). После 14 суток при микробиологическом исследовании материала рост патологической микрофлоры не обнаружен, а сама губка подверглась биодеградации почти на 95-100%.
Проведенные наблюдения за клиникой экспериментальных гнойных ран показали, что использованные в экспериментах белковые губки, нагруженные гентамицином и ванкомицином, а также другими антибитотиками или их смесями (таблица примеров), обладают большей клинической эффективностью. Таким образом, продемонстрирована применимость таких антибактериальных белковых губок, нагруженных антибиотиками, для химиотерапии инфицированных ран.
Заявляемое техническое решение имеет следующие преимущества перед аналогами и прототипом:
1. По сравнению с аналогами антибактериальных депо-форм на основе мелкопористых белковых гелей заявляемые широкопористые антибактериальные губки, нагруженные антибиотиками, позволяют быстро достичь высоких концентраций лекарства в инфицированной ране, что создает условия для интенсивного уничтожения в ней гнойной микрофлоры и способствует эффективному очищению раны. Это обеспечивается специфической структурой заявляемых губок с большим количеством сообщающихся макропор капиллярного размера, что и позволяет добиваться высоких терапевтических концентраций антибактерильного агента, необходимых в случае сильно инфицированных ран, и при этом не требуется использовать большие (как в случае аналогов) объемы материала, а это существенно упрощает проводимые хирургические процедуры (оперативное вмешательство, перевязки и т.д.), а также снижает затраты на лечение.
2. В отличие от известных аналогов, где для гелеобразования через химическое сшивание биополимеров, входящих в состав материала, применяется водорастворимый карбодиимид, непрореагировавшая часть которого остается в объеме геля и никак оттуда не удаляется, т.е. имеется опасность токсического воздействия такого карбодиимида на организм пациента за счет нежелательной химической модификации собственных белков и пептидов организма, в заявляемом способе применяются только нетоксичные, фактически биогенные, ингредиенты (белок, мочевина, цистеин), растворимая часть которых удаляется промывкой губки после ее формирования. Таким образом, исключается опасность привнесения токсических веществ с материалом губки, а ее последующее нагружение разрешенными к биомедицинскому применению антибиотиками определяется только допустимыми концентрациями этих веществ.
3. В противоположность известному аналогу, предусматривающему получение конечного белкового материала только во влажном виде, заявляемое техническое решение обеспечивает приготовление сухой формы антибактериальной белковой губки, что резко улучшает показатели хранимости конечного изделия и снижает издержки на его транспортировку.
4. В противоположность содержащим лекарственные компоненты быстро растворяющимся альбуминовым губкам на основе просто лиофильно-высушенного альбумина как в прототипе заявляемое техническое решение позволяет получать белковые губки не только из изолированного сывороточного альбумина, но и из экономически более доступных сыворотки крови и цельной плазмы крови, а также обеспечивает медленное рассасывание белковой губки в условиях in vivo, т.е. обладает пролонгированным действием.
5. В заявляемом техническом решении не используются какие-либо особые формы предшественников типа исключительно аморфного маннита, как в способе-прототипе, что упрощает процесс получения целевого продукта.
6. Присутствие в заявляемых белковых губках высоких концентраций веществ с антибактериальной активностью, в частности антибиотиков, обеспечивает надежную защиту препаратов от микробного заражения.
7. К достоинствам заявляемых антибактериальных белковых губок также относятся: а) простота и удобство в использовании для врачей и пациентов; б) эффективность применения, безопасность и атравматичность смены повязок; в) способность таких препаратов разрушать бактериальную биопленку как на имплантах, так и на биологических тканях; г) возможность обеспечивать высокую концентрацию антибиотика в областях с низкой перфузией крови в тканях; д) за счет высокой концентрации аминогликозидов и циклических гликопептидов (например, гентамицина, ванкомицина или кларитромицина) не позволять развиваться в ранах устойчивым штаммам бактерий; д) наблюдаемое в экспериментах местное гемостатическое действие; е) поскольку заявляемые белковые губки являются биодеградируемыми материалами, то их применение не требует дальнейших манипуляций по удалению губок из рубца уже подвергнутой лечению раны.
8. Заявляемые антибактериальные белковые губки проявляют дюрантное действие благодаря медленному выходу активных компонентов (антибиотиков) по мере биодеградации белковой основы. Обладая сорбционными, некролитическими, антибактериальными, стимулирующими свойствами, препараты способствуют многокомпонентному направленному действию на процессы репаративной регенерации гнойных ран, что позволяет рекомендовать такие антибактериальные белковые губки для клинического применения.
Технический результат
Новая биосовместимая, нетоксичная, со временем рассасывающаяся в ране и эффективно очищающая ее от патогенных микроорганизмов антибактериальная белковая губка, а также удобный и экономичный способ получения такого материала.
Наиболее эффективно заявляемое техническое решение и получаемые согласно ему антибактериальные белковые губки могут быть использованы в следующих областях
практической медицины: а) в гнойной хирургии (лечение абсцессов и флегмон); б) травматологии-ортопедии (профилактика и лечение посттравматического и гематогенного остеомиелита - для заполнения полостей после трепанационной и резекционной секвестронекрэктомии пораженных костей, инфекционное поражение мягких тканей, парапротезные инфекции крупных и мелких суставов); в) в медицине катастроф и комбустологии; г) в общей хирургии (мастэктомии, при лечение диабетических стоп, трофических язв, при гепатэктомии и панкреотомии с целью профилактики и лечения послеоперационных инфекционных осложнений; при проведении операций удалении части желудочно-кишечного тракта, гепатэктомии, панкреотомии и аппендэктомии); д) в кардиохирургии (профилактика и лечение остеомиелита грудины и медиастенита, а также разных инфекционных осложнений); е) в отоларингологии и стоматологии.
* БСА - бычий сывороточный альбумин; ССА - сывороточный альбумин свиньи; ЧСА - альбумин сыворотки крови человека; СКС - общий белок сыворотки крови крупного рогатого скота; СКО - общий белок сыворотки крови овцы; СКЧ - общий белок сыворотки крови человека; ПКТ - общий белок плазмы крови теленка; ПКЛ - общий белок лошади; ПКЧ - общий белок плазмы крови человека.
** Данные по определению активности in vitro (диско-диффузионный метод) антибактерильных белковых губок (тест-культура/диаметр области задержки роста клеток).
*** Указано время заживления модели наружной гнойной раны (МНГР) или модели полостной гнойной раны (МПГР), инфицированных метицелин-резистентным штаммом золотистого стафилококка St. aureus MRSA.
**** Эксперименты не проводились.