СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПЕРЕХОДНОКЛЕТОЧНОГО РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR UROTHELIAL BLADDER CANCER

Изобретение относится к медицине, точнее к генетике и онкоурологии, и может найти применение для неинвазивной диагностики рака мочевого пузыря.
Рак мочевого пузыря (РМП) является одним из наиболее распространенных онкоурологических заболеваний. В структуре онкологической заболеваемости России РМП занимает 8-е место у мужчин, 18-е у женщин и составляет 4,6% среди всех опухолей. Факторами риска являются курение, производственные вредности (анилиновые красители, резина), длительно текущие или хронические воспалительные заболевания мочевыводящих путей, предшествующая химиотерапия циклофосфамидом, облучение. Заболевание возникает чаще у пожилых, среди заболевших РМП в течение года от момента установления диагноза погибают от основного заболевания до 20-25%.
Выделяют две группы опухолей мочевого пузыря: поверхностные и инвазивные формы, которые, в основном, представляют собой переходноклеточный рак (90-95%), реже - плоскоклеточный рак (6-7%), аденокарцинома (1-2%), крайне редко диагностируются другие гистологические разновидности РМП.
Неинвазивными считаются опухоли, не достигающие мышечного слоя мочевого пузыря. К ним относятся папиллярная карцинома (Ta) и карцинома in situ (Tis), которые затрагивают лишь эпителиальные и субэпителиальные слои. Папиллярная карцинома часто рецидивирует, но редко развивается в инвазивную форму, карцинома in situ - агрессивна и быстро превращается в инвазивный рак, ее наличие является неблагоприятным фактором прогноза, в связи с чем своевременная диагностика этого заболевания имеет принципиальное значение для адекватного лечения и, как следствие, для судьбы пациента.
Для диагностики РМП используются лучевые и эндоскопические методы. Наиболее доступным и широко применяемым является ультразвуковое исследование, обеспечивающее визуализацию полости и стенок мочевого пузыря. Активно применяется рентгеновская компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, позволяющие определить глубину поражения стенки мочевого пузыря и состояние остальных органов малого таза.
Основным методом диагностики рака мочевого пузыря является цистоскопия с последующим гистологическим исследованием биоптатов. Будучи «золотым стандартом» метод, однако, имеет ряд недостатков. Он является инвазивным, процедура обследования больного болезненна и травматична, осмотр позволяет выявлять опухоль, но не дает информации о степени ее инвазии. Кроме того, сравнение результатов флуоресцентной цистоскопии с использованием 5-аминолевулиновой кислоты с результатами обычной цистоскопии показали, что последняя упускает достаточное количество опухолей, в основном Ta и Tis, поскольку их трудно отличить от воспалительных очагов в уротелии [J. Urol. 171: 135-138, 2004]. Об этом свидетельствует и высокая частота рецидивов после удаления всех видимых опухолей Ta и Tis. Вышеперечисленные недостатки метода значительно снижают его ценность и не позволяют считать универсальным.
В качестве дополнительного метода диагностики РМП используется цитологическое исследование клеток осадка мочи, основным достоинством которого является неинвазивность и высокая специфичность. Однако метод имеет малую чувствительность при низкой степени злокачественности опухолей и субоптимальную - при высокой [JAMA 293: 810-816, 2005].
Следует отметить, что как цистоскопический, так и цитологический методы диагностики РМП основаны на субъективной оценке морфологических особенностей тканей и клеток. В то же время фенотипические отклонения в клетках при РМП, как и при других формах рака, являются результатом генетических нарушений, которые могут быть выявлены с помощью современных молекулярно-генетических методов: сравнительной геномной гибридизации, микросателлитного анализа, анализа плоидности ДНК с помощью проточной цитометрии. Эти методы позволяют выявить количественные и структурные хромосомные нарушения, характерные для РМП.
Одним из наиболее информативных цитогенетических методов оказался метод FISH - флуоресцентная in situ гибридизация [J. Mol. Diagn. - 2000. - V.2, N.3. - P.116-123]. Он основан на специфическом связывании меченных разными флуорохромами ДНК-зондов с различными участками хромосом. ДНК-зонды, гибридизующиеся с центромерными участками, позволяют по количеству различных цветовых сигналов в интерфазном ядре определить число копий каждой хромосомы, а связывающиеся с определенными хромосомными локусами - установить наличие или отсутствие этих локусов на хромосоме.
В результате проведенных в различных клинических лабораториях исследований из всех встречающихся генетических аномалий при переходноклеточном РМП, которому посвящено заявленное нами исследование, была определена комбинация из 4-х наиболее информативных. Это увеличение по сравнению с нормой числа копий 3, 7 и 17 хромосом (гиперплоидия) и потеря локуса p21 на 9 хромосоме, где находится ген p16 - онкосупрессор. Эти нарушения можно определить не только в клетках самой опухоли, но и в слущенных опухолевых клетках осадка мочи.
Компанией Abbott Molecular [Abbott Laboratories, IL, USA] был создан «кит», т.е. набор разноцветных флуоресцирующих ДНК-зондов к центромерным участкам 3, 7 и 17 хромосом и локусу р21 на 9 хромосоме (UroVysion), позволяющий среди слущенных клеток уротелия в осадке мочи выявить те, в которых наблюдаются эти нарушения, т.е. злокачественные. Этот набор был одобрен FDA (Food and Drug Association, USA) в 2001 году и рекомендован для клинического применения с целью раннего выявления РМП и его рецидивов. В настоящее время UroVysion-тест широко применяется в урологических клиниках Европы и Америки, практически заменив рутинную цитологическую диагностику на молекулярно-цитогенетическую.

Более близкими к предлагаемому являются способы диагностики рака мочевого пузыря с использованием ДНК-зондов «UroVysion», описанные в инструкции к набору для диагностики [UroVysionBladder Cancer Kit, Abbott Molecular, Des Plaines, IL] и в публикациях [J. Mol. Diagn. - 2000. - V.2, N.3. - P.116-123; Онкоурология. - №4. - 2008. - С.61-65; Онкоурология. - №1. - 2011. - С.73-78].

В качестве прототипа выбран способ диагностики, описанный в статье А.В.Севанькаева и др. [Севанькаев А.В., Лушников Е.Ф., Карякин О.Б. и др. Клиническое применение Fish-метода в ранней диагностике поверхностного рака мочевого пузыря. // Онкоурология. - №4. - 2008. - С.61-65], выполненный согласно инструкции к набору [UroVysionBladder Cancer Kit, Abbott Molecular, Des Plaines, IL] с небольшими изменениями.
Диагностика РМП с применением данного способа основана на выявлении генетических изменений в эпителиальных клетках мочи пациента, характерных для переходноклеточного рака, и осуществляется следующим образом.
В 50-мл пробирку, содержащую 17 мл консерванта (2% раствора полиэтиленгликоля в 50% этаноле), добавляют 33 мл мочи от первого мочеиспускания, перемешивают, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, сливают надосадочную жидкость, оставляя примерно 5 мл. Осадок ресуспензируют, добавляют к нему 10 мл раствора фосфатного буфера (pH 7.0), переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при тех же условиях. Затем полностью сливают надосадочную жидкость, медленно ресуспензируют осадок, постепенно по каплям добавляя фиксатор Карноя (метанол:уксусная кислота в соотношении 3:1) до объема 5-10 мл, после чего помещают пробирки в холодильник при температуре -20°C на 30 мин. Затем образцы снова центрифугируют, сливают надосадочную жидкость и добавляют фиксатор Карноя. На предметное стекло наносят от 30 до 120 мкл клеточной суспензии, в зависимости от ее плотности. Стекла высушивают на воздухе, просматривают под световым микроскопом (объектив ×20) и отбирают предметное стекло с количеством клеток 100-200. Препараты высушивают в термостате при температуре 37°C в течение ночи. Затем на предметное стекло наносят 200 мкл 0,01% раствора рибонуклеазы - РНКазы в цитратном буфере и инкубируют во влажной камере при 37°C в течение 1 часа. После этого стекло промывают в фосфатном буфере (pH 7.0) в течение 5 мин при комнатной температуре, обрабатывают препарат в 10% растворе пепсина при 37°C в течение 5 мин, затем при комнатной температуре промывают в фосфатном буфере (pH 7.0) в течение 5 мин, 1% растворе формальдегида - 5 мин и снова в фосфатном буфере (pH 7.0) 5 мин, проводят дегидратацию в 70%, 85% и 100% этаноле по 3 мин и высушивают. Гибридизацию образцов с ДНК-зондами проводят в соответствии с инструкцией следующим образом: «кит» UroVysion, хранившийся при -20°C, прогревают до комнатной температуры и в количестве 3 мкл наносят в выбранную целевую лунку предметного стекла. Сразу после нанесения раствора лунку накрывают покровным стеклом (18×18 мм), которое фиксируют на предметном стекле резиновым цементом. Препарат помещают в термостат «THERMOBRITE» для денатурации и гибридизации по следующей температурно-временной программе: 73°C - 2 мин, затем 39°C - 4-16 часов. По истечении указанного времени резиновый клей с покровными стеклами удаляют, а препараты выдерживают 2 мин в смеси цитратного буфера (0.4×SSC) и детергента (0.3%NP-40) при 73±1°C, затем от 5 сек до 1 мин в растворе цитратного буфера и детергента (2×SSC/0.1%NP-40). Препараты вынимают из промывочного раствора и высушивают на воздухе. Затем добавляют 10 мкл контрастирующего раствора 4',6-диамино-2-фенилиндола (DAPI) в жидкости, предотвращающей выгорание флуорохромов (125 нг/мл), накрывают покровным стеклом, после чего проводят микроскопию образца на флуоресцентном микроскопе при увеличении ×100 с фильтрами RED, GREEN, GOLD, AQUA, DAPI, позволяющими наблюдать красную (3 хромосома), зеленую (7 хромосома), бирюзовую (17 хромосома) и желтую (локус 9p21) флуоресценцию, соответственно. Анализируют только морфологически аномальные клетки. Признаками аномалии считают большой размер ядра; неправильную форму ядра; «пятнистость» ядра при DAPI окраске; наличие клеточных кластеров. Анализируют не менее 25 морфологически аномальных клеток. Если как минимум в 4-х из них обнаруживают больше 2-х перицентромерных сигналов не менее чем в двух хромосомах из трех: 3, 7 и 17-й и/или в 12-ти из 25 клеток отсутствует сигнал по локусу 9р21, делают заключение о наличии генетических изменений в эпителиальных клетках мочевого пузыря, характерных для рака, и диагностируют рак мочевого пузыря.
Достоинствами метода является неинвазивность, более высокая точность (80-90%) по сравнению с рутинным цитологическим методом, возможность ранней диагностики рецидивов РМП.
В то же время способ не лишен недостатков, основным из которых является высокая стоимость анализа - 8000-10000 руб. за каждый образец мочи, что делает метод доступным лишь для крупных научных центров и практически недоступным для большей части пациентов.
Технический результат настоящего изобретения состоит в усовершенствовании способа диагностики переходноклеточного РМП за счет сокращения расходования дорогостоящих ДНК-зондов и изменения ряда этапов способа и условий их выполнения, позволяющих без снижения точности использовать способ в широкой клинической практике.
Этот результат достигается тем, что в известном способе диагностики переходноклеточного рака мочевого пузыря, включающем выявление генетических изменений в эпителиальных клетках, характерных для переходноклеточного рака, путем исследования образца утренней мочи, к которому добавляют раствор полиэтиленгликоля, после перемешивания центрифугируют, к осадку, содержащему суспензию эпителиальных клеток, добавляют фосфатный буфер pH 7.0, вновь центрифугируют, осадок обрабатывают фиксатором Карноя, выдерживают при температуре - 20°C 30 мин, после чего повторяют центрифугирование и обработку фиксатором Карноя, суспензию раскапывают на предметное стекло до получения необходимой для анализа плотности клеток, высушивают, добавляют раствор РНК-азы, инкубируют, после чего обрабатывают раствором протеолитического фермента и промывают последовательно фосфатным буфером pH 7.0, 1.0% раствором формальдегида, фосфатным буфером и этиловым спиртом с восходящей концентрацией от 70% до 100%, в лунку с необходимой плотностью эпителиальных клеток (целевую лунку) добавляют смесь флуоресцирующих ДНК-зондов «UroVysion» к перицентромерным участкам 3, 7 и 17 хромосом и к локусу 9p21, накрывают покровным стеклом и нагревают, предметное стекло затем промывают последовательно растворами 0,3% и 0,1% детергента в цитратном буфере, после чего в лунку добавляют контрастирующий раствор 4',6-диамино-2-фенилиндола (DAPI), вновь накрывают покровным стеклом и анализируют на флуоресцентном микроскопе, оценивая не менее 25 морфологически аномальных клеток, и если как минимум в 4-х из них обнаружено больше 2-х перицентромерных сигналов не менее чем в двух хромосомах из 3, 7 и 17-й хромосом и/или в 12-ти из 25 клеток отсутствует сигнал по локусу 9p21, диагностируют переходноклеточный рак мочевого пузыря, при этом согласно изобретению для проведения анализа используют мочу от второго мочеиспускания, предметные стекла - с лунками диаметром 10 мм, необходимая плотность эпителиальных клеток в целевой лунке составляет 10-20 клеток в поле зрения, предметное стекло перед обработкой РНКазой помещают в термостат на 2-4 часа при температуре 39°C, раствор РНКазы используют подогретым до 37°C в концентрации 0.005%, инкубацию осуществляют при температуре 37°C в течение 30 мин, предварительно накрыв предметное стекло покровным размером 24×50 мм и перевернув его покровным стеклом вниз, в качестве ДНК-зондов используют смесь из 0,5 мкл ДНК-зондов «UroVysion» и 1 мкл гибридизационного буфера, целевую лунку накрывают покровным стеклом диаметром 10 мм, последующее нагревание осуществляют при температуре 74°C в течение 5 мин и затем при 37°C 18-24 часа, после чего приступают к обработке растворами детергента.
Разработка предлагаемого способа была обусловлена, как отмечено нами, необходимостью его удешевления и повышения доступности для широкой клинической сети и пациентов с целью как первичной диагностики РМП, так и раннего выявления рецидива заболевания и мониторирования в процессе лечения.
Имея многолетний опыт использования FISH-метода для реализации цитогенетических исследований, мы попробовали изменить некоторые этапы осуществления известного способа и условия их проведения.
Для решения поставленной задачи нами предварительно было проведено исследование образцов мочи 10 пациентов с установленным диагнозом РМП. Замена дорогостоящих реактивов, в первую очередь ДНК-зондов, на более доступные, изменения ряда этапов способа и условий их выполнения осуществлялись при сравнении получаемых результатов с контрольными, которыми служили результаты, получаемые по способу-прототипу как общепринятому и разрешенному для диагностики РМП. Таким способом были определены все заявляемые нами режимы и условия выполнения способа, т.е. найдены они опытным путем. Разработанный таким образом новый способ не уступал по точности прототипу, но был значительно дешевле и потому доступнее широкой клинической сети и пациентам в процессе их длительного лечения. После достаточно широкой клинической апробации он и предложен нами в качестве настоящего изобретения.
Использование мочи от второго мочеиспускания обусловлено тем, что она содержит существенно меньше дополнительных примесей клеточных элементов, чем от первого мочеиспускания, что способствует лучшей визуализации клеток уротелия.
Использование предметных стекол с лунками диаметром 10 мм и покровных стекол, равных им по диаметру, способствует лучшему прилипанию последних к лунке, что сделало возможным сократить расход ДНК-зондов до 0,5 мкл и тем самым значительно удешевить способ.
Количество эпителиальных клеток в целевой лунке 10-20 в поле зрения оказалось необходимым и достаточным для хорошей визуализации и осуществления способа с точностью диагностики, не уступающей прототипу.
Нагревание предметного стекла в течение 2-4 часов при 39°C перед нанесением на него РНКазы, а также предварительный подогрев самой РНКазы до 37°C обеспечивают возможность сокращения времени созревания препарата, сокращая тем самым время выполнения анализа. А использование 0.005% раствора РНКазы и инкубация в течение 30 мин при температуре 37°C создает условия для более мягкого удаления РНК-содержащих клеточных компонентов, что позволяет ДНК-зондам лучше взаимодействовать с ДНК хромосом. Проведение инкубации предметного стекла с препаратом в перевернутом состоянии предотвращает повреждение клеток, находящихся на предметном стекле, создавая хорошие условия для осуществления дальнейшей гибридизации.
Добавление в целевую лунку 0,5 мкл ДНК-зонда «UroVysion» в смеси с 1 мкл гибридизационного буфера не ухудшает качество визуализации, что показано нами при проведении многочисленных анализов, но обеспечивает экономию ДНК-зондов, удешевляя исследование.
Температурные и временные режимы нагревания препарата после добавления ДНК-зондов, найденные нами опытным путем, способствуют полной денатурации и гибридизации его, обеспечивая необходимое качество препарата для последующей микроскопии.
Сущность способа заключается в следующем.
В 50-мл пробирку, содержащую 17 мл консерванта (2% раствора полиэтиленгликоля в 50% этаноле), добавляют 33 мл мочи от второго мочеиспускания, перемешивают, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин, сливают надосадочную жидкость, оставляя примерно 5 мл. Осадок ресуспензируют, добавляя к нему 10 мл раствора фосфатного буфера (рН 7.0), переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при тех же условиях. Затем полностью сливают надосадочную жидкость, медленно ресуспензируют осадок, постепенно по каплям добавляя фиксатор Карноя до объема 5-10 мл, после чего помещают пробирки в холодильник при температуре -20°C на 30 мин. Затем образцы снова центрифугируют, сливают надосадочную жидкость и добавляют фиксатор Карноя. Клеточную суспензию раскапывают по 10 мкл в лунки диаметром 10 мм на предметном стекле. Образец высушивают на воздухе, затем просматривают стекла под световым микроскопом, объектив ×20. Для анализа используют лунку, плотность клеток в которой в поле зрения составляет примерно 10-20 клеток. Если плотность клеток мала, в лунку добавляют еще 10 мкл клеточной суспензии, просушивают стекло на воздухе и вновь просматривают под микроскопом. Если плотность клеток слишком высока, клеточную суспензию разводят фиксатором Карноя и вновь наносят в следующую лунку предметного стекла, до достижения необходимой концентрации клеток. Предметные стекла затем выдерживают в термостате при температуре 39°C в течение 2-4 часов. По истечении этого времени на предметное стекло наносят 200 мкл 0,005% РНКазы, подогретой до 37°C, накрывают покровным стеклом размером 24×50 мм, переворачивают покровным стеком вниз и инкубируют во влажной камере при 37°C 30 мин. Затем промывают в фосфатном буфере (pH 7.0) в течение 5 мин при комнатной температуре, обрабатывают препарат в 10% растворе пепсина при 37°C в течение 5 мин, после чего при температуре 20°C промывают в фосфатном буфере (pH 7.0) 5 мин, в 1% растворе формальдегида в течение 5 минут и снова в фосфатном буфере (pH 7.0) 5 мин, проводят дегидратацию в 70%, 85% и 100% этаноле по 3 мин и высушивают. Гибридизацию образцов с ДНК-зондами проводят следующим образом: «кит» UroVysion, хранившийся при -20°C, прогревают до комнатной температуры. В целевую лунку предметного стекла наносят раствор, состоящий из 0,5 мкл ДНК-зонда «UroVysion» и 1 мкл гибридизационного буфера (10% декстран сульфата, 50% формамида в цитратном буфере - 2×SSC). Сразу после нанесения раствора лунку накрывают покровным стеклом диаметром 10 мм, которое фиксируют на предметном стекле резиновым цементом. Препарат помещают в термостат «THERMOBRITE» для денатурации и гибридизации по следующей температурно-временной программе: 74°C - 5 мин, затем 37°C - 18-24 ч. По истечении указанного времени резиновый клей с покровными стеклами удаляют, а препараты выдерживают 2 мин в смеси цитратного буфера(0.4×55С) и детергента (0.3%NP-40) при 73±1°C, затем от 5 сек до 1 мин в растворе цитратного буфера и детергента (2×SSC/0.1%NP-40). Препараты вынимают из промывочного раствора и высушивают на воздухе. Затем в целевую лунку добавляют 10 мкл контрастирующего раствора 4',6-диамино-2-фенилиндола (DAPI) в жидкости, предотвращающей выгорание флуорохромов, накрывают покровным стеклом, после чего проводят микроскопию образца на флуоресцентном микроскопе соответствующими фильтрами (RED, GREEN, AQUA, GOLD, DAPI). Анализируют только морфологически аномальные клетки. Признаками аномалии считают большой размер ядра; неправильную форму ядра; «пятнистость» ядра при DAPI окраске; наличие клеточных кластеров. Анализируют не менее 25 морфологически аномальных клеток. Если как минимум в 4-х из них обнаруживают больше 2-х перицентромерных сигналов не менее чем в 2-х хромосомах из 3, 7 и 17-й хромосом и/или в 12-ти из 25 клеток отсутствует сигнал по локусу 9p21, делают заключение о наличии генетических изменений в эпителиальных клетках мочевого пузыря, характерных для переходноклеточного рака, и диагностируют рак мочевого пузыря.
К настоящему времени указанным способом проведено обследование 72 больных, из них у 29 человек диагноз РМП был нами установлен впервые, 38 человек наблюдались после лечения РМП на предмет выявления рецидивов, у 5 человек диагноз РМП не установлен.
Следует отметить, что у пациентов с первичным диагнозом РМП точность предлагаемого FISH-анализа составляет 82%, у 38 пациентов, проходивших обследование по поводу возможного рецидива заболевания, точность проведенного нами FISH-анализа - 90%, у 5 пациентов, не имевших по другим методам исследования РМП, результат FISH анализа, проведенного в качестве контрольного, был отрицательный - точность метода можно считать как 100%.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью неинвазивного FISH-метода в разработанной нами модификации по цитогенетическим изменениям в слущенных уротелиальных клетках мочи можно успешно диагностировать как первичные опухоли мочевого пузыря, так и их рецидивы. Общая чувствительность метода независимо от стадии и степени злокачественности опухоли составила в нашем исследовании 82%, что находится в рамках приводимых в литературе значений.
В нашем исследовании наблюдалась тенденция к более высокой чувствительности способа при ранних стадиях РМП (87,5%) по сравнению с более продвинутыми стадиями (76,2%). Это может иметь важное клиническое значение, так как лечение, начатое на ранней стадии, позволяет уменьшить вероятность перехода опухоли в мышечно-инвазивную форму. В литературе имеются данные о том, что иногда при отрицательном результате цистоскопии результат UroVysion-теста бывает положительным. Он квалифицируется клиницистами как «предварительно-позитивный». Однако, в большинстве случаев, у таких пациентов спустя 4-6 месяцев и на морфологическом уровне обнаруживают рак. Это свидетельствует о высокой прогностической ценности FISH-метода. В нашей работе у 3 человек при первичном выполнении цистоскопии не было обнаружено признаков РМП (один имел диагноз железистый цистит, у другого - не было выявлено патологических изменений уротелия). В то же время результат UroVysion-теста был положительным. Эти пациенты, на наш взгляд, нуждаются в систематическом наблюдении и дополнительных методах обследования. Впоследствии, у одного их этих пациентов при повторном цистоскопическом исследовании был выявлен РМП и проведено соответствующее лечение.
Приведенные достоинства FISH-метода, свидетельствующие о необходимости широкого клинического использования его, повышают значимость разработанного нами способа, поскольку именно он доступен для любой лаборатории и пациентов, которым он необходим на протяжении длительного лечения и наблюдения.
Предлагаемый способ по сравнению с известными имеет ряд преимуществ, основным из которых является значительное сокращение стоимости анализа: исследование одного образца мочи составляет 1400 руб. (по прототипу - 8-10 тыс. рублей), что повышает доступность способа.
Способ разработан в лаборатории радиационной генетики РНЦРХТ и к настоящему времени прошел клиническую апробацию у 72 пациентов с положительным результатом.