Определение кинетических параметров роста и зависимости окислительной активности от негативных факторов внешней среды у дрожжевых штаммов Candida maltosa и Debaryomyces hansenii

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2009. Вып. 2. С. 203-213 Химия

V. : К 602.4:628.35:664

Определение кинетических параметров роста и зависимости окислительной активности от негативных факторов внешней среды у дрожжевых штаммов Candida maltosa и Debaryomyces hansenii

В.А. Арляпов, С.С. Каманин, Н.Ю. Юдина, В.А. Алферов

Аннотация. Проведено исследование кинетики роста дрожжевых штаммов Candida maltosa ВКМ Y-2359 и Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482. Показано, что дрожжи D. hansenii имеют более длительную лаг-фазу и фазу экспоненциального роста, что приводит к более позднему выходу на стационарную фазу но сравнению с С. maltosa. Получены кинетические параметры роста штаммов С. maltosa и D. hansenii. Для С. maltosa цт составила 3,142 • 1(Г4 с-1, Kg —

4,600 • 10^2 М; для D. hansenii ц,т составила 2,349 • 10-4с-1, Kg —

1,847 • 10^2 М. Исследована зависимость окислительной способности клеток С. maltosa и D. hansenii от pH, ионной силы среды и присутствие в среде ионов Ni2+ и Сг202. Показано, что для биосенсора на основе клеток С. maltosa оптимум pH составляет 6,5, а для сенсора на основе D. hansenii оптимум pH — 7,0. Увеличение ионной силы раствора приводит к снижению окислительной активности клеток штамма С. maltosa и D. hansenii, но дрожжи D. hansenii более устойчивы к негативному влиянию высокой ионной силы раствора. Показано, что присутствие в среде ионов Ni2+ и Сг202^ в диапазоне концентраций 0-6 • 10^4 моль/дм3 не оказывает существенного влияния на окислительную способность ни одного из исследуемых штаммов в ходе измерения.

Ключевые снова: биосенсоры, экологический мониторинг, ВПК, Candida maltosa, Debaryomyces hansenii.

Введение

Экспресс-оценка загрязнения объектов окружающей среды, в частности, определение токсичных органических примесей в поверхностных, грунтовых и сточных водах является актуальной задачей. В настоящее время возрастающее внимание уделяется экспресс-методам контроля, ориентированным на

оценку совокупного воздействия токсикантов на окружающую среду [1]. Для оценки степени загрязненности воды в настоящее время широко применяется параметр, определенный как «индекс ВПК». ВПК отражает количество кислорода в мг/дм^, потребленное при окислении биоразлагаемых органических соединений. Предполагается, что окисление осуществляется микроорганизмами, входящими в состав анализируемой пробы, либо микроорганизмами, внесенными в пробу искусственно [2]. Классический метод определения ВПК основан на тестах, продолжительность которых составляет 5, 10 или 20 суток (ВПК5, БПКдо и БПК2о соответственно). Альтернативой являются экспрессные методы определения ВПК с использованием биосенсорных анализаторов, основанные на применении микроорганизмов, способных метаболизировать широкий спектр органических соединений [3]. В настоящее время за рубежом промышленно выпускаются биосенсорные анализаторы, позволяющие в течение нескольких минут производить определение ВПК в диапазоне 2-500 мг/дм^, в то время как в России анализаторы этого типа промышнснпостью не выпускаются [3, 4].

Для создания биораспознающих элементов ВПК сенсоров используют либо чистые культуры с определенными потребительскими свойствами (широкий спектр окисляемых субстратов, устойчивость к воздействию негативных факторов окружающей среды, или специфичность в отношении определенных стоков), либо смесь идентифицированных микроорганизмов (искусственные ассоциации), либо индуцируемый консорциум микроорганизмов, либо активный ил и даже термически убитые бактерии. Каждый из этих подходов имеет свои преимущества и недостатки [5]. Обычно ВПК биосенсоры на основе чистой культуры имеют преимущество в стабильности функционирования биосенсорной системы. В то же время такие биосенсоры могут показывать заниженное значение ВПК из-за ограниченного спектра окисляемых одним штаммов субстратов. В качестве биокатализаторов используют целые клетки бактерий (Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Pseudomonas putida) и дрожжей (Arxula adeninivorans, Hansenula anomala, Klebsiella, Candida, Tri-chosporon, Serratia marcescens, Saccharomyces cerevisiae) [6]. Дрожжи являются более предпочтительным биоматериалом для биосенсоров почти всех типов, поскольку устойчивы к негативным факторам окружающей среды и могут функционировать в распознающем элементе биосенсора длительное время. В то же время дрожжевые культуры подвержены контаминации.

Развитие биосенсорных методов анализа предъявляет новые требования к качеству БПК-сспсоров и точности измерений. В данной ситуации перспективным направлением для исследований является изучение возможности применения в этих целях новых штаммов микроорганизмов, которые позволят улучшить качество производимых измерений. Работа с раннее не изученными микроорганизмами предполагает изучение их роста с целью получение биомассы культур с заданными метаболическими характеристиками для использования в качестве основы рецепторного элемента биосенсора. А

также изучение влияния различных факторов окружающей среды на их окислительную активность.

Целью данной работы являлся расчет параметров роста штаммов микроорганизмов Candida maltosa и Debaryomyces hansenii и выявление влияния на окислительную способность этих штаммов неблагоприятных условий среды.

1. Материалы и методы

Биосенсорные измерения. В работе использовали многоканальный биосенсорный анализатор «Мультибио-01», управляемый с помощью персонального компьютера. Для регистрации и обработки сигналов сенсоров использовали специализированное программное обеспечение Biolan-1011 (Кро-нас, Россия). Датчиками являлись кислородные электроды Кларка с иммобилизованными клетками микроорганизмов. Средняя величина тока, соответствующая содержанию кислорода в дистиллированной воде 9,2 мг/дм3, составляла 30 нА при шуме ±0,25 нА.

Все измерения проводили в проточном режиме при скорости протока 0,5 см3/'мин, объем отбираемой пробы 300 мкл. Первичная обработка данных, снимаемых с установки, включала сглаживание и последующее дифференцирование кривой I(t). Измеряемым параметром (ответом биосспсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов.

Культивирование клеток микроорганизмов. Клетки штаммов Candida maltosa и Debaryomyces hansenii были получены во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино).

Клетки штамма Candida maltosa ВКМ Y-2359 выращивали на богатой минеральной среде (жидкая глюкозо-пептонная питательная среда). Состав жидкой среды: глюкоза — 10 г/дм3, пептон — 5 г/дм3, дрожжевой экстракт —

0,5 г/дм3 (Sigma, США), дистиллированная вода — 200 см3. Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1 атмосферу в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29 °С. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре при 8000 об/мин 10 минут. Далее центрифугат промывали 20 мМ фосфатным буфером pH 6,8. Осевшие клетки рассуспсндировали в свежей порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 3 минуты при 8000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при +4 °С.

Дрожжевые клетки штамма Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482 выращивали аналогичным образом.

Формирование рецепторного элемента. Выращенные клетки микроорганизмов промывали фосфатным буферным раствором (20 мМ, pH 6,8),

центрифугировали (2000 об/мин, 10 мин), осадок сырой массы клеток взвешивали и разбавляли определенным количеством раствора буфера до концентрации 150 мг/см3. Полученную смесь наносили на стекловолоконный фильтр (Whatman GF/A, Sigma) в количестве 3 мкл. Элемент (3x3 мм) подсушивали на воздухе в течение 15 минут при 20°С. Подготовленный биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и фиксировали с помощью нейлоновой сетки.

Получение кривых роста дрожжевых штаммов. Культивирование бактерий проводили путем перекрывания интервалов времени, в течение которых проводилась оценка оптической плотности. Измерения оптической плотности суспензии проводили спсктрофотомстрическим методом на спектрофотометре СФ-103 при длине волны 540 нм и толщине кюветы 1 см относительно кюветы с дистиллированной, каждые 2 часа в течение 2 суток. По полученным данным зависимости оптической плотности от времени была построена кривая роста клеток микроорганизмов.

2. Результаты и обсуждение

Расчет кинетических параметров роста. В работе были использованы дрожжевые штаммы Candida maltosa ВКМ Y-2359 и Debaryomyces hansenii ВКМ Y-2482. Согласно литературным данным штаммы дрожжей Candida maltosa и Debaryamyces hansenii обладают широкой субстратной специфичностью и способны окислять многие спирты, углеводы, аминокислоты и другие органические вещества. Штамм Candida maltosa обладает устойчивостью к тяжелым металлам, и в частности, к присутствию хроматов, и используется для биологической очистки нефтепродуктов от загрязнителей. Так же в литературе показано, что штамм Debaryamyces hansenii устойчив к высоким концентрациям солей [7]. Данные особенности позволяют использовать эти микроорганизмы для анализа технологических сточных и избежать возможного ингибирования дыхательной активности негативными факторами окружающей среды.

На первом этапе работы представляло интерес получение кривых роста дрожжевых штаммов Candida maltosa и Debaryomyces hansenii (рис. 1, 2). Кривую роста микроорганизмов регистрировали спсктрофотомстрическим методом, снимая зависимость оптической плотности культуральной жидкости во времени. Хотя закон Бугера-Ламберта-Бэра, связывающий концентрацию раствора с поглощением, строго не применим для растворов, сильно рассеивающих свет, но существует линейная зависимость между поглощением света бактериальной суспензией и количеством клеток в ней в диапазоне оптической плотности примерно до 0,3. Измерение роста клеток после достижения фазы линейного роста затруднено еще и увеличением количества мертвых клеток, что соответственно приводит к увеличению ошибки при определении роста. Однако, зависимость оптической плотности от времени достоверно показывает общий характер роста культуры микроорганизмов.

2,5

О --------9 t Т '=Т-—г—1—,---------------------------------------------------------------------------------------r-J— -,-1-,-,-,-,-,

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Время, t, ч

Рис. 1. Кривая роста штамма Candida maltosa

1,8

О 2 4 6 8 1 0 12 14 16 18 20 2 2 24 26 28 30 32 34 36 38 4С

Время, t, ч

Рис. 2. Кривая роста штамма Debaryomyces hansenii

Графическая зависимость оптической плотности культуральной жидкости от времени имеет сигмоидальную форму и является типичной кривой роста дрожжевых штаммов. На кривых роста дрожжевых штаммов можно выделить несколько фаз роста (табл. 1).

Проводя сравнительный анализ кривых роста можно отмстить, что дрожжи D. hansenii имеют более длительную лаг-фазу и фазу экспоненциального роста, что приводит к более позднему выходу на стационарную фазу по сравнению с С. maltosa.

На основе полученных данных для исследуемых штаммов были рассчитаны следующие кинетические параметры роста:

ц — удельная скорость роста клеточной культуры.

Таблица 1. Фазы роста дрожжей штаммов Candida maltosa и Debaryamyces

hansenii

Фаза роста Candida maltosa Debaryamyces hansenii

Лаг-фаза 0-8 0-18

Фаза экспоненциального роста 8-11 18-23

Фаза линейного роста 11-15 23-27

Фаза замедленного роста 15-20 27-30

Стационарная фаза 20-30 30-40

цт — предельная максимальная удельная скорость роста. Верхний предел скорости роста клеточных популяций связан со скоростью процессов репликации ДНК в S-фазс клеточного цикла, нижний — с малой жизнеспособностью медленно растущих популяций. Величины цт варьируют в пределах 10-2 — 10-5 с-1, среднее значение цт составляет порядка 10-4 с-1.

К5 — параметр, характеризующий сродство субстрата к клеткам культуры, его величины практически полностью соответствуют наблюдаемым значениям константы Михаэлиса и обычно находятся в диапазоне 10-2-10-8 М.

Для получения численных значений кинетических параметров роста в начале строили график зависимости In D(t), в котором отсекаемый участок — логарифм начального количества биомассы Dо, а тангенс угла наклона прямой — удельная скорость роста д. Затем по графику зависимости D(t) асимптотически находили значение М„г — максимальный уровень накопления

биомассы. После этого, имея все необходимые данные, строили график зави-

ln D/Do ( In (1 -М/Мт) \ симости ----j—- I —5--j1—^ 1, в котором отсекаемый участок равнялся параметру ц = i а тангенс угла наклона прямой — параметру Ф =

Из данных выражений находили параметры цт и I<s (табл. 2).

Таблица 2. Кинетические параметры роста штаммов Candida maltosa и

Debaryamyces hansenii

Параметр Candida maltosa Debaryomyces hansenii

fJL, C_1 1,7 • 10^4 is-ur4

I І 3. 3,1 • 10^4 2,3 • КГ4

Ks, м 4,6 • 10^2 1,8 • 10^2

Представляет особый интерес сравнение числовых параметров цт и К5, так как оно может дать представление о времени культивирования штаммов и выборе субстрата. Из полученных данных видно, что у С. maltosa сродство к субстрату выше, чем у D. hansenii, что обуславливает их более высокую предельную максимальную скорость роста и быстрый выход на стационарную фазу роста.

3. Определение зависимости окислительной активности микроорганизмов от условий внешней среды

Зависимость от pH среды. pH среды является одним из факторов, влияющих на активность клеточных ферментов и на чувствительность биорецептора к различным субстратам. В данной работе исследован характер изменения откликов биосснсоров при изменении pH от 5,4 до 7,8; нижней и верхней границами возможных pH буферной системы KH2P04/'NaH2P04. В качестве субстрата была выбрана глюкозо-глютаматная смесь, которую применяют в качестве стандарта в Российской Федерации и в международной практике при определении БПК5. Была выявлена зависимость окислительной способности клеток штаммов Candida maltosa и Debaryomyces hansenii от pH среды (рис. 3, 4).

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0

pH

Рис. 3. Зависимость окислительной активности клеток штамма С. maltosa

от pH среды

Показано, что максимум чувствительности биосснсора, включающего в себя клетки С. maltosa наблюдается при pH 6,5, а для D. hansenii оптимум pH составляет 7,0. Кроме того, из полученных данных отчетливо видно, что распределение чувствительности по pH в случае С. maltosa имеет более широкий характер в противоположность узкому распределению у D. hansenii.

Зависимость от ионной силы раствора. Ионная сила раствора прежде всего влияет на давление внутри клетки и данная зависимость отражает способность клеток к окислению в средах с высоким осмотическим давлением. Для исследований использовалась буферная система K^PCU/'Na^PCU со значением pH 6,8 и диапазоном концентраций 16,5 — 132 мМ. Зависимость окислительной способности клеток штамма С. maltosa от ионной силы раствора представлена на рис. 5. Зависимость окислительной способности клеток штамма D. hansenii от ионной силы раствора имеет аналогичный характер.

10,5 10,0

9.5

I 9'°

г

1 8.5

0

и

8 8.0 и s

1 7,5

7.0

6.5

6.0

5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0

pH

Рис. 4. Зависимость окислительной активности клеток штамма D. hansenii

от pH среды

70 60 i 50

I

* 40 К

8

8 зо í

1 20

10

о -о

Рис. -5. Зависимость окислительной способности клеток штамма С. maltosa

от ионной силы раствора

Из полученных данных видно, что зависимость окислительной активности клеток от ионной силы раствора носит практически линейный характер. Кроме того, сравнение углов наклона прямых показывает, что штамм D. hansenii лучше сопротивляется возрастающей ионной силе раствора, что может быть объяснено более эффективной системой регуляции внутриклеточного осмотического давления, чем у С. maltosa.

Зависимость от концентрации ионов Ni2+ и . Ионы тя-

желых металлов обладают как бактсриос-татичным, так и бактерицидным действием. Механизмы их взаимодействия с ферментами различны: замещение физиологически важных катионов и нсмсталлсодсржащих оксианионов в активных центрах ферментов, связывание функциональных сульфидгид-рильных групп и др.

Для изучения данного эффекта была исследована зависимость окислительной способности клеток штаммов Candida maltosa и Debaryomyces hansenii

20 40 60 80 100 120 140

Ионная сила раствора, мМ

от присутствия в растворе ионов Ni2+ и СггО2 в диапазоне концентраций 0-6 • 10-4 моль/дм3 (для сточных вод ПДК Ni2+ составляет 3,4 • 10-7 моль/л, для СггО2- ПДК = 2 • 10-7). Зависимость окислительной активности клеток штамма D. hansenii в присутствия ионов Ni2+ приведены на рис. 6. Зависимости окислительной активности D. hansenii в присутствия ионов СггО2-и окислительной активности С. maltosa в присутствии ионов Ni2+ и СггО2-имели аналогичный вид.

18

16

* и

s

2

О -------.--------.---------------1-----------------

О 0.0001 0.0002 0,0003 0,0004 0,0005 0,0006

Концентрация Ni*, мояь/дма

Рис. 6. Влияние присутствия ионов Ni2+ в растворе на работу биосенсора, включающего в себя клетки штамма D. hansenii

Таким образом, было показано, что присутствие тяжелых металлов в растворе в диапазоне концентраций, выбранном для анализа, не оказывает значительного влияния ни на один из исследуемых штаммов. Это может быть объяснено устойчивостью исследуемых штаммов к данным ионам, а также малым временем контакта пробы с рецепторным элементом (30 с).

Выводы

Спсктрофотомстричсским методом анализа были получены кривые роста дрожжевых штаммов Candida maltosa и Debaryomyces hansenii и определена длительность каждой стадии роста. Показано, что дрожжи D. hansenii имеют более длительную лаг-фазу и фазу экспоненциального роста, что приводит к более позднему выходу на стационарную фазу по сравнению с С. maltosa.

Получены кинетические параметры роста штаммов С. maltosa и D. hansenii. Для С. maltosa цт составила 3,142 • 10-4с-1, К5 — 4,600 • 10-2 М; для D. hansenii цт составила 2,349 • 10-4с-1, К5 — 1,847 • 10-2 М. При помощи этих параметров были объяснены различия в кривых роста этих штаммов.

Исследована зависимость окислительной способности клеток С. maltosa и D. hansenii от pH раствора и показано, что для биосснсора на основе клеток

C. maltosa оптимум pH составляет 6,5. Для сенсора на основе D. hansenii оптимум pH — 7,0.

Экспериментально доказано, что увеличение ионной силы раствора приводит к снижению окислительной активности клеток штамма С. maltosa и

D. hansenii, но дрожжи D. hansenii более устойчивы к негативному влиянию высокой ионной силы раствора.

Показано, что присутствие в среде ионов Ni2+ и СггО2- в диапазоне концентраций 0 — 6 • 10-4 моль/дм3 не оказывает существенного влияния на окислительную способность ни одного из исследуемых штаммов в ходе измерения.

Благодарности

Работа выполнена в рамках НИОКР по теме «Разработка способа био-сснсорной детекции компонентов бродильных производств, отличающегося высокой селективностью и точностью» по государственному контракту № 6369р/ 8866 в рамках программы УМНИК Фонда содействию развития малых форм предприятий в научно-технической сфере.

Список литературы

1. Riedel К. Application of biosensors to environmental samples // Commercial biosensors: applications to clinical, bioprocess, and environmental samples. N. Y.: Wolpert Polymers, Inc Wiley-Interscience, 1998. P. 267-294.

2. Bourgeois W., Burgess J.E., Stuetz R.M. On-line monitoring of wastewater quality: a review // J. of Chemical Technology and Biotechnology. 2001. V. 76. P. 337-348.

3. D’Souza S.F. Microbial biosensors // Biosensors & Bioelectronics. 2001. V. 16. P. 337-353.

4. Jing Liu, Bo Mattiasson Microbial BOD sensors for wastewater analysis // Water Research. 2002. V. 36. P. 3786-3802.

5. Sara Rodriguez-Mozaz, Maria J. Lopez de Alda, Damia Barceld Biosensors as useful tools for environmental analysis and monitoring // Anal Bioanal Chem. 2006.

6. Walmsley R.M., Keenan P. The Eukaryote Alternative: advantages of using yeasts in place of bacteria in microbial biosensor development // Biotechnology. BioProcess. Engineering. 2000. V. 5. P. 387-394.

7. Голубев В.И. Таксономическая характеристика дрожжей, используемых в гидролизно-дрожжевых производствах // Прикладная биохимия и микробиология. 1994. Т. 30, выи. 1. С. 132-136.

Поступило 05.06.2009

Арляпов Вячеслав Алексеевич (gwinblcidd@ramblcr.ru), ассистент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Каманин Станислав Сергеевич (i-Asc@mail.ru), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Юдина Наталья Юрьевна (tysia21-05-90@mail.ru), студент, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Алферов Валерий Анатольевич (chcm@tsu.tula.ru), к.х.н., профессор, зав. кафедрой, кафедра химии, Тульский государственный университет.

Investigation of the growth kinetics and the oxidative activity dependence from negative factor of the external ambience for yeasts strains Candida maltosa and Debaryomyces hansenii

V.A. Arlyapov, S.S. Kamanin, N.Yu. Yudina, V.A. Alferov

Abstract. Investigation of the growth kinetics for yeasts strains Candida maltosa BKM Y-2359 and Debaryomyces hansenii BKM Y-2482 has been carried out. It was shown that D. hansenii has more prolonged lag-phasc and exponential growth that is lead to the later entry on the stationary phase compared with C. Maltosa. Kinetic growth parameters for C. maltosa and D. hansenii have been obtained. For C. maltosa цт was 3,142 • 10-4 s-1 and К5 — 4,600 • 10-2 M, and for D. hansenii цт — 2,349 • 10-4 s-1, К5 — 1,847 • 10-2 M respectively. The oxidative activity dependence for C. maltosa and D. hansenii from pH, ionic strength and presence of Ni2+ and СГ2О2- has been investigated. For biosensor based on the C. maltosa pH optimum was around 6.5 and for biosensor based on the D. hansenii pH optimum was around 7.5. Augmentation of the ionic strength leads to the decrease of the oxidative activity for C. maltosa and D. hansenii but in the same time D. hansenii was more resistant to the negative affect of the high ionic strength. It was shown that the presence of Ni2+ and СГ2О2- in the range of concentrations from 0-6 • 10-4 mol/'dm3 did not demonstrate any considerable effect on the oxidative activity of both strains.

Keywords: biosensors, ecological monitoring, BPK, Candida maltosa, Debaryomyces hansenii.

Arlyapov Vyacheslav (gwinblcidd@ramblcr.ru), assistant, department of chemistry, Tula State University.

Kamanin Stanislav (i-Asc@mail.ru), student, department of chemistry, Tula State University.

Yudina Natalya (tysia21-05-90@mail.ru), student, department of chemistry, Tula State University.

Alferov Valeriy (chcm@tsu.tula.ru), candidate of chemical sciences, professor, head of department, department of chemistry, Tula State University.