КОНТРОЛЬНЫЙ ШТАММ N.Gonorrhoeae ДЛЯ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ДИАГНОСТИКИ ГОНОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ КУЛЬТУРАЛЬНЫМ МЕТОДОМ
CONTROL STRAIN OF N Gonorrhoeae FOR CARRYING OUT INTRA-LABORATORY CONTROL OF QUALITY OF GONOCOCCAL INFECTION DIAGNOSTICS BY CULTURE METHOD

Область техники настоящего изобретения
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, дерматовенерологии и лабораторной диагностике и представляет собой контрольный штамм N. gonorrhoeae, который может быть использован для внутрилабораторного контроля качества исследований при проведении лабораторной диагностики гонококковой инфекции культуральным методом. Изобретение может быть использовано для получения качественных и достоверных результатов идентификации возбудителя гонореи - N. gonorrhoeae, а также определения его чувствительности к антимикробным препаратам, что имеет большое значение при установлении этиологического диагноза, назначении лечения больным гонококковой инфекцией и контроле над распространением этого заболевания. Изобретение рекомендуется для применения в лабораториях лечебно-профилактических учреждений субъектов Российской Федерации, осуществляющих диагностику гонококковой инфекции.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Гонорея - инфекция, передаваемая половым путем, оказывающая выраженное негативное влияние на репродуктивное здоровье человека. По данным официальной государственной статистики 2009 года уровень заболеваемости гонококковой инфекцией в Российской Федерации остается высоким и составляет 48,1 случаев на 100000 населения. Большую роль в распространении гонококковой инфекции в настоящее время играют штаммы N. gonorrhoeae, резистентные к антимикробным препаратам. Заболевание, вызванное резистентными штаммами, сопровождается развитием осложнений, увеличением сроков пребывания больных в стационаре и наносит существенный экономический ущерб государству. Как отмечено во многих источниках зарубежной и отечественной литературы, резистентные штаммы N. gonorrhoeae в настоящее время имеют широкое распространение [Global prevalence and incidence of curable STIs overview and estimates. World Health Organization; Geneva2001 (www. ho.int/hiv/pub/sti/who_hiv_aids_2001.02, Naber KG, Schito G, Botto H, Palou J, Mazzei T. Surveillance study in europe and brazil on clinical aspects and antimicrobial resistance epidemiology in females with cystitis (aresc): Implications for empiric therapy. Eur Urol 2008; 54:1164-1178, Andreu A, Alos J, Gobernado M. Etiology and antimicrobial susceptibility among uropathogens causing community-acquired lower urinary tract infections: A nationwide surveillance study. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica 2005; 1:1-3, Vorobieva V, Firsova N, Ababkova. Antibiotic susceptibility of neisseria gonorrhoeae in arkhangelsk, russia. Sexually transmitted infections 2007; 82:133-13], что обусловливает трудности при назначении эмпирической терапии гонореи и вызывает необходимость определения чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам в каждом конкретном случае. Все вышеизложенное обусловливает актуальность повышения качества диагностики гонококковой инфекции, направленной на своевременное выявление больных и прерывание эпидемиологической цепочки распространения заболевания путем назначения пациентам адекватной терапии антимикробными препаратами.
В диагностике гонококковой инфекции ведущую роль играют методы прямой идентификации возбудителя (метод микроскопии, культуральный метод, методы амплификации нуклеиновых кислот). Материалом для исследования на гонококк у мужчин служит отделяемое слизистой уретры и прямой кишки, у женщин - уретры, шейки матки и прямой кишки. Исследованию также подлежат все материалы, подозрительные в отношении наличия гонококка.
Основой лабораторной диагностики гонореи в настоящее время считается культуральный метод, являющийся «золотым стандартом», так как обладает высокой (98-100%) чувствительностью и специфичностью. Использование культурального метода позволяет не только с высокой точностью идентифицировать возбудителя, но и определять чувствительность N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам. Кроме этого, существуют категории пациентов, у которых диагноз гонококковой инфекции может быть осуществлен только при использовании культурального метода. К числу таких лиц относятся пациенты с подозрением на аноректальную, фарингеальную гонорею и другие виды экстрагенитальной гонореи, а также женщины, пожилые люди и дети.
Культуральный метод исследования биологического материала на присутствие в нем N. gonorrhoeae включает этапы:
1. Предварительной идентификации N. gonorrhoeae, которая проводится путем:
- визуальной оценки вида колоний. При соблюдении всех условий через 24-48 часов инкубации наблюдается рост N. gonorrhoeae (при макроскопическом исследовании колонии могут достигать размеров 0,5-1,0 мм в диаметре, округлой формы, непрозрачные, выпуклые, с блестящей поверхностью);
- окраски подозрительных колоний по Граму. Наблюдают скопления грамотрицательных диплококков. Также в культуре отмечается полиморфизм кокков как по форме, так и по величине, что зависит от возраста культуры и происходящих процессов лизиса. Интенсивность окраски кокков также зависит от фазы роста. Одновременно отмечают степень чистоты изучаемой культуры;
- проведения оксидазного теста. Принцип метода основан на том, что в присутствии цитохромоксидазы и кислорода бесцветные вещества подвергаются оксидации и образуют индофенол синий.
2. Подтверждающей идентификации N. gonorrhoeae, для которой используются:
- изучение ферментативной активности N. gonorrhoeae (быстрый карбогидратный тест, энзим-субстратные тесты);
- иммунологические тесты (прямая иммунофлюоресценция, коагглютинация);
- молекулярно-биологические методы (ПЦР) [Протоколы лабораторной диагностики гонорейной инфекции Кубанова А.А., Фриго Н.В., Савичева А.М., Соколовский Е.А., Брилене Т., Дэак Д., Баллард Р., Исон К., Халлен А., Домейка М., Унемо М. Вестник дерматологии и венерологии; 2008, №1: 83-98].
Для определения чувствительности N. gonorrhoeae к антибиотикам наиболее распространенным диско-диффузионным методом используется гонококковая агаровая основа (GCII - agar base, BBL) и 1% комплексная ростовая добавка (без гемоглобина). На поверхность питательной среды, засеянной микроорганизмами, помещают стандартные бумажные диски, пропитанные антибиотиком, способным диффундировать в агар и вызывать задержку роста бактерий. Учет и интерпретация результатов исследования антибиотикочувствительности исследуемого и контрольного штамма N. gonorrhoeae диско-диффузионным методом производится через 18 часов инкубации. Для измерения зон подавления роста N. gonorrhoeae антибактериальными препаратами используют автоматическую линейку, либо прозрачную линейку со скошенным краем и четкими рисками, кронциркуль или шаблон, возможно использование специальных бумажных линеек.
Рекомендуемый перечень антибактериальных препаратов для определения чувствительности/резистентности гонококка с помощью диско-диффузионного метода включает:
- препараты группы пенициллина: пенициллин, ампициллин;
- препараты группы тетрациклина: тетрациклин, доксициклин;
- препараты группы макролидов: эритромицин, азитромицин;
- препараты группы фторхинолонов: ципрофлоксацин, офлоксацин;
- препараты группы цефалоспоринов: цефтриаксон, цефотаксим;
- спектиномицин.
К числу обязательных для исследования относятся диски с пенициллином, тетрациклином, цефтриаксоном, ципрофлоксацином, азитромицином, спектиномицином. Диски с остальными антимикробными средствами являются дополнительными.
Несмотря на высокую чувствительность и специфичность культурального метода при идентификации возбудителя гонореи, при его использовании возможны ошибки, приводящие к ложноотрицательным результатам. Это может быть обусловлено «прихотливостью» N. gonorrhoeae к условиям транспортировки и культивирования. N. gonorrhoeae - «труднорастущий» микроорганизм. При адекватном сохранении материала в транспортных средах с последующим посевом на селективные питательные среды (не позднее, чем в течение 24 часов с момента помещения материала в транспортную среду) выделяют типичные культуры N. gonorrhoeae. Чувствительность культурального метода при несоблюдении этих условий может снизиться до 40-70% [Ison CA. Laboratory methods in genitourinary medicine. Methods of diagnosing gonorrhoea. Genitourin Med. 1990 Dec; 66(6):453-9]. Ложноотрицательные результаты также могут быть получены из-за того, что некоторые штаммы N. gonorrhoeae, чувствительные к антибиотику, добавленному в среду, не вырастают [Mirrett S, Reller LB, Knapp JS. Neisseria gonorrhoeae strains inhibited by vancomycin in selective media and correlation with auxotype. J Clin Microbiol. 1981 Jul; 14(1):94-9, Ison CA. Laboratory methods in genitourinary medicine. Methods of diagnosing gonorrhoea. Genitourin Med. 1990 Dec; 66(6):453-9, Bonin P, Tanino TT, Handsfield HH. Isolation Neisseria gonorrhoeae on selective and nonselective media in a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol. 1984 Feb; 19(2):218-20]. Кроме того, к ингибированию роста N. gonorrhoeae в культуре может приводить использование антибактериальных препаратов пациентами [Ison CA. Laboratory methods in genitourinary medicine. Methods of diagnosing gonorrhoea. Genitourin Med. 1990 Dec; 66 (6):453-9].
Ошибки при проведении культурального исследования могут быть также обусловлены:
- нарушениями техники забора биологического материала;
- неправильным нанесением материала на питательную среду;
- несвоевременно проведенным посевом материала на среду;
- токсичностью агара;
- дегидратацией среды;
- неправильно рассчитанным количеством среды на чашку;
- неправильно подобранными концентрациями антимикробных препаратов;
2
- нарушениями условий инкубации (температура, влажность, концентрация CO).
Во избежание получения ложных результатов культурального исследования на гонорею при каждом проведении такого исследования, наряду с тестируемыми образцами, полученными от больных, в каждую постановку должен включаться контрольный штамм N. gonorrhoeae, имеющий известные физико-химические, биологические характеристики и чувствительный к стандартному набору антимикробных препаратов, применяемых при определении чувствительности N. gonorrhoeae к антибиотикам. Включение такого штамма в исследование и воспроизведение всех его известных характеристик позволяет сделать заключение о том, что исследование проведено правильно.
Контрольный штамм N. gonorrhoeae должен быть также использован:
- для контроля каждой новой партии питательной среды на способность поддерживать рост гонококков;
- для контроля качества проведения окраски мазка по Граму, которая используется при проведении микроскопического исследования на гонорею;
- для оценки качества оксидазного реагента, используемого при первичной идентификации N. gonorrhoeae;
- для оценки качества видовой идентификации N. gonorrhoeae (при изучении ферментативной активности N. gonorrhoeae постановке энзимсубстратных тестов и иммунологических/антигенных методов идентификации).
Включение контрольного штамма N. gonorrhoeae во все перечисленные этапы культурального исследования является основой внутрилабораторного контроля качества диагностики гонококковой инфекции культуральным методом [Протоколы лабораторной диагностики гонорейной инфекции. Кубанова А.А., Фриго Н.В., Савичева А.М., Соколовский Е.А., Брилене Т., Дэак Д., Баллард Р., Исон К., Халлен А., Домейка М., Унемо М. Вестник дерматологии и венерологии; 2008, №1: 83-98].
Однако несмотря на высокий уровень заболеваемости гонококковой инфекцией в России, культуральный метод исследования на гонорею применяется не повсеместно, а лишь в 75% лабораторий, осуществляющих диагностику гонококковой инфекции, чему препятствует низкая материально-техническая оснащенность лабораторий, отсутствие квалифицированных специалистов, недоступность и дороговизна реагентов и отсутствие разрешенных к медицинскому применению отечественных контрольных штаммов N. gonorrhoeae [Лабораторная диагностика ИППП в Российской Федерации. Результаты национального исследования Н.В.Фриго, С.В.Ротанов, И.Н.Лесная, О.А.Полетаева, С.А.Полевщикова. Вестник дерматологии и венерологии; 2008, №5: 33-41].
Раскрытие настоящего изобретения
Задачей изобретения является получение контрольного штамма N. gonorrhoeae, который может быть использован для внутрилабораторного контроля качества исследований при проведении лабораторной диагностики гонококковой инфекции культуральным методом при исследовании биологического материала (отделяемое и соскобы слизистой оболочки урогенитального тракта, прямой кишки, глотки и миндалин больных гонококковой инфекцией), полученного от больного с подозрением на гонококковую инфекцию, и при определении чувствительности N. gonorrhoeae к антимикробным препаратам. Патентуемый штамм N. gonorrhoeae в настоящее время в Российской Федерации не производится промышленностью и будет являться первым отечественным референс-штаммом для внутрилабораторного контроля качества исследований при лабораторной диагностике гонококковой инфекции.
Характеристика полученного штамма и штамма-прототипа
Контрольный штамм N. gonorrhoeae выделен от больного К. с неосложненной гонококковой инфекцией до начала его лечения антимикробными препаратами. Полученный штамм депонирован в государственную коллекцию микроорганизмов ФГУП «НИИ стандартизации и контроля биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора» под №283. Определение культуры N. gonorrhoeae приведено по определителю Берги ("Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 241, The Williams and Wilkins Company, Baltimore, 1980).
Контрольный штамм N. gonorrhoeae обладает всеми свойствами, присущими микроорганизму рода Neisseria, вида Gonorrhoeae. При длительности культивирования на специальных питательных средах для культуральной диагностики гонореи он через 24 часа инкубации при температуре 35-37°С в условиях избытка углекислого газа (5-10%) образует типичные по морфологическим и тинкториальным свойствам колонии. Штамм грамотрицателен, оксидазоположителен, ферментирует с образованием кислоты глюкозу, не ферментирует мальтозу, сахарозу, левулезу и лактозу. По результатам видовой идентификации штамма на автоматическом бактериологическом анализаторе «Кристал Авторидер» (Бектон Диккинсон, США) он принадлежит к виду N. gonorrhoeae.
Штамм чувствителен к антимикробным препаратам: пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, цефтриаксону, спектиномицину. При определении чувствительности контрольного штамма N. gonorrhoeae к антибиотикам методом серийных разведений в агаре минимальная подавляющая концентрация (МПК) антибиотиков в соответствии с критериями интерпретации результатов CLSI (Институт клинических и лабораторных стандартов, США) составляет: для пенициллина - 0,015 мг/мл, тетрациклина - 0,12 мг/мл, ципрофлоксацина - 0,002 мг/мл, цефтриаксона - 0,002 мг/мл, спектиномицина - 2 мг/мл. При определении профиля антибиотикорезистентности штамма диско-диффузионным методом величина зоны задержки роста составляет: по отношению к пенициллину - 28 мм, тетрациклину - 34 мм, ципрофлоксацину - 38 мм, спектиномицину - 22 мм, цефтриаксону - более 40 мм.
За прототип принят штамм бактерий АТСС 31953 (US 19810317023 19811030), который используется как контрольный штамм при диагностике гонококковой инфекции.
Культурально-морфологическая характеристика штамма-прототипа
Грамотрицательные кокки, размером 0,6-1,0 мкм в диаметре, встречаются поодиночке, а часто и в парах, в которых соприкасающиеся стороны клеток утолщены. Делятся в двух взаимно перпендикулярных плоскостях, что иногда ведет к образованию тетрад. Эндоспор не образуют; неподвижны. Могут иметь капсулы и фимбрии. Тип колоний - колонии округлой формы, непрозрачные, выпуклые, с блестящей поверхностью.
Физиолого-биохимическая характеристика штамма-прототипа
Условия культивирования - повышенное содержание углекислого газа (5-10%) и влажности, сохранение стабильного температурного режима (культивирование при температуре +36°С - 37°С). Образует каталазу и цитохромоксидазу.
Недостатками данного штамма при его использовании для внутрилабораторного контроля качества лабораторной диагностики гонококковой инфекции в Российской Федерации являются: его высокая стоимость и трудность транспортировки из-за рубежа, связанная с длительным получением и/или невозможностью получения.
Технический результат изобретения заключается в возможности осуществлять внутрилабораторный контроль качества диагностики гонококковой инфекции культуральным методом путем использования контрольного штамма N. gonorrhoeae на всех этапах культурального исследования.
Это достигается за счет того, что у больного с подозрением на гонококковую инфекцию стандартным способом получают биологический материал, доставляют его в лабораторию и подготавливают к культуральному исследованию путем нанесения материала на чашки Петри с селективной средой.
Для оценки правильности проведения исследований по выявлению возбудителя гонококковой инфекции у пациентов культуральным методом и контроля качества лабораторной диагностики гонореи посев контрольного штамма, обладающего всеми свойствами N. gonorrhoeae, на неселективную и селективную гонококковую питательную среду проводится одновременно с посевом полученного от пациента биологического материала. При этом на всех этапах исследования проводится сравнение результатов, полученных в результате культивирования и проведения видовой идентификации исследуемого и контрольного штамма. Полное воспроизведение типичных свойств контрольного штамма (физико-химических и морфологических) служит показателем правильности проведения культурального исследования и корректности результатов, полученных при исследовании испытуемого штамма N. gonorrhoeae, полученного от больного.
Наряду с проверкой правильности проведения культурального исследования на выявление в клиническом материале от больного штамма N. gonorrhoeae, контрольный штамм N. gonorrhoeae может быть использован для оценки правильности проведения определения чувствительности исследуемого штамма N. gonorrhoeae (выделенного от больного гонококковой инфекцией) к антибиотикам диско-диффузионным методом или методом серийных разведений в агаре. Полное воспроизведение типичных свойств контрольного штамма (чувствительность ко всем антимикробным препаратам, включенным в исследование) служит показателем правильности определения антибиотикочувствительности и корректности результатов, полученных при исследовании антибиотикочувствительности испытуемого штамма N. gonorrhoeae, полученного от больного.
Пример
2
У больной А., 27 лет, с подозрением на гонококковую инфекцию стандартным способом получили биологический материал (уретра, шейка матки, прямая кишка), доставили биологический материал в лабораторию и подготовили его к культуральному исследованию путем нанесения материала на чашки Петри с селективной средой. Параллельно осуществили посев контрольного штамма на эту же среду. Непосредственно сразу после посева биоматериала чашки Петри поместили в CO-инкубатор, который обеспечил сохранение стабильной атмосферы повышенного содержания углекислого газа (5-10%) и влажности. Через 24 часа инкубации чашки Петри перенесли в ламинарный шкаф и произвели контрольный просмотр засеянных чашек на наличие или отсутствие роста колоний микроорганизмов. Колонии достигли размеров 0,5-2,0 мм в диаметре, округлой формы, непрозрачные, выпуклые, с блестящей поверхностью. Окраска колоний: от белого до серого цвета. Параллельно изучена морфологическая характеристика контрольного штамма. При микроскопии клетки контрольного штамма были представлены диплококками, которые имели бобовидную форму и парное расположение: снаружи кокки имели выпуклую поверхность, вогнутой стороной они были обращены друг к другу; расположение диплококков напоминало форму кофейного зерна. Дифференциальным признаком гонококка является отношение к форменным элементам: диплококки были расположены внутриклеточно по отношению к лейкоцитам и поверхностно по отношению к клеткам плоского эпителия. На клетках плоского эпителия диплококки были расположены рядами, под углом или перпендикулярно друг к другу внутри ряда. Таким образом, по морфологическим признакам колоний контрольный штамм и штамм, выделенный от больного, соответствовали признакам, характерным для N. gonorrhoeae.
Для проведения микроскопического исследования колоний из чашек с признаками роста культур стерильной бактериологической петлей сняли наиболее характерные для гонококка колонии, перенесли материал на поверхность предметного стекла и круговыми движениями суспендировали в капле воды или физиологического раствора; при этом как у контрольного штамма, так и у штамма, полученного от больной, был отмечен характерный для гонококка признак колоний - слизистая консистенция бактериальной суспензии. Препарат был окрашен по методу Грама. При изучении мазков контрольного и исследуемого штамма, окрашенных по методу Грама, наблюдали скопления грамотрицательных диплококков, имевших более компактное расположение микроорганизмов в центре и разреженное и неравномерное их распределение по периферии. Далее был проведен оксидазный тест, в результате проведения которого колонии контрольного штамма и штамма, полученного от больной, были окрашены в синий цвет, что явилось дополнительным подтверждающим признаком гонококка.
Подтверждающая идентификация N. gonorrhoeae была осуществлена с помощью биохимических тестов. В результате исследования ферментативной активности контрольного штамма N. gonorrhoeae и исследуемого штамма, полученного от больной, было установлено, что оба штамма ферментировали с образованием кислоты глюкозу, не ферментировали мальтозу, сахарозу, левулезу и лактозу, что соответствовало характерным признакам N. gonorrhoeae. В результате видовой идентификации обоих штаммов на автоматическом бактериологическом анализаторе «Кристал Авторидер» (Бектон Диккинсон, США) было подтверждено, что контрольный штамм и штамм, полученный от больной, принадлежали к виду N. gonorrhoeae.
Далее методом серийных разведений в агаре и диско-диффузионным методом была определена чувствительность контрольного и исследуемого штамма, полученного от больной, к антимикробным препаратам. Было установлено, что контрольный штамм чувствителен к антимикробным препаратам: пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, цефтриаксону, спектиномицину. При определении чувствительности контрольного штамма N. gonorrhoeae к антибиотикам методом серийных разведений в агаре МПК антибиотиков в соответствии с критериями интерпретации результатов CLSI, составила: для пенициллина - 0,015 мг/мл, тетрациклина - 0,12 мг/мл, ципрофлоксацина - 0,002 мг/мл., цефтриаксона - 0,002 мг/мл, спектиномицина - 2 мг/мл. При определении профиля антибиотикорезистентности контрольного штамма диско-диффузионным методом величина зоны задержки роста составили: по отношению к пенициллину - 28 мм, тетрациклину - 34 мм, ципрофлоксацину - 38 мм, спектиномицину - 22 мм, цефтриаксону - более 40 мм.
При исследовании штамма, полученного от больной с подозрением на гонококковую инфекцию, было установлено, что штамм не чувствителен к антимикробным препаратам: пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, и чувствителен к цефтриаксону и спектиномицину. При определении чувствительности штамма, полученного от больной, к антибиотикам методом серийных разведений в агаре МПК антибиотиков в соответствии с критериями интерпретации результатов CLSI, составила: для пенициллина - 2 мг/мл, тетрациклина - 4 мг/мл, ципрофлоксацина - 8 мг/мл, цефтриаксона - 0,004 мг/мл, спектиномицина - 8 мг/мл. При определении профиля антибиотикорезистентности контрольного штамма диско-диффузионным методом величина зоны задержки роста составили: по отношению к пенициллину - 20 мм, тетрациклину - 28 мм, ципрофлоксацину - 26 мм, спектиномицину - 24 мм, цефтриаксону - более 38 мм.
Таким образом, при проведении культурального исследования у больной с подозрением на гонококковую инфекцию был идентифицирован возбудитель гонококковой инфекции - N. gonorrhoeae и установлен диагноз гонококковой инфекции, что было подтверждено результатами предварительной и окончательной идентификации микроорганизма, а также результатами параллельного тестирования контрольного штамма N. gonorrhoeae. Было установлено, что штамм N. gonorrhoeae, выделенный от пациентки, не чувствителен к антимикробным препаратам: пенициллину, тетрациклину, ципрофлоксацину, и чувствителен к цефтриаксону и спектиномицину, что позволило обосновать выбор препаратов для лечения гонококковой инфекции у данной пациентки. Корректные результаты (соответствовавшие первоначально полученным характеристикам штамма), полученные при тестировании контрольного штамма N. gonorrhoeae, позволили убедиться в том, что культуральное исследование было проведено правильно.