СОСТАВ ПОЛИЭПИТОПНОГО БЕЛКА ДЛЯ ИНДУКЦИИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ЯЩУРА
POLYEPITOPE PROTEIN COMPOSITION FOR INDUCING IMMUNE RESPONSE AGAINST FOOT-AND-MOUTH DISEASE VIRUS

Область техники, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к области иммунологии, белковой инженерии и биотехнологии. Оно может быть использовано для создания полиэпитопных вакцинных белков для иммунизации животных против ящура.
Актуальность
1) Инфекционный агент ящура
Вирус ящура является типовым представителем семейства Picornaviridae и рода Aphthovirus. Его геном представлен однонитевой линейной (+) РНК с двунитевыми участками общим размером около 8500 нуклеотидов. Геномная РНК кодирует протяженный белок - предшественник, который протеолитически процессируется на промежуточные и зрелые структурные и неструктурные белки. Вирус имеет икосаэдрический капсид, составленный из четырех структурных белков - VP1, VP2, VP3 и VP4. Вирионы нестабильны при рН ниже 6,5 и легко диссоциируют с образованием 12S пентамеров. Серологическими методами удается различить семь серотипов вируса: А, О, С, Азия-1, SAT (Территории Южной Африки) -1, -2 и -3. Также установлено более 60 подтипов вируса. На территории стран СНГ обычно встречаются вирусы серотипов О и А.
2) Заболевание
Вспышки заболевания происходят во всех странах мира, где в сельском хозяйстве используется парнокопытный скот. Основной причиной распространения ящура считается международная торговля домашними животными. Наиболее восприимчивы к заболеванию ящуром крупный рогатый скот, менее восприимчивы свиньи, овцы, козы, более 70 видов диких животных и человек. Вирус передается от заболевших животных к здоровым воздушно-капельным путем. Первые признаки заболевания могут появляться через 2-3 дня после заражения. У зараженных животных появляется жар, нарушение походки, хромота, афтозное поражение слизистой оболочки ротовой полости, кожи, вымени и межкопытной щели конечностей. Несмотря на то что заболевание ящуром не приводит к высокому уровню смертности среди взрослых животных, оно проявляется в потере веса, резком понижении молочной продуктивности. Смертельный исход чаще происходит у молодых животных с ослабленным иммунитетом. У них наблюдаются нарушения функций сердечно-сосудистой системы и скелетной мускулатуры. Крупный рогатый скот, а также овцы и козы могут быть бессимптомными носителями вируса, приобретая при этом способность заражать других животных в течение 2-3 лет.
3) Экономический ущерб
При эпизоотии вируса серотипа О на Тайване в 1997 г. возникло более 6 тыс. очагов, пало или было забито свыше 4 миллионов свиней, общий экономический ущерб составил около 10 миллиардов долларов США. Последняя вспышка ящура в Великобритании в 2001 году привела к потерям в размере около 6 миллиардов фунтов стерлингов. При возникновении очагов ящура А-22 в балканских странах в 1996 году экономический ущерб превысил 300 миллионов долларов. Ликвидация очага этого заболевания в Московской области в 1995 году обошлась примерно в 14,6 миллионов рублей в ценах того периода, а в Приморском крае в 2000 году - в 8,7 миллионов рублей.
Уровень техники
1) Разработанные методы контроля заболевания
В конце 19-го и начале 20-го веков единственным способом контроля ящура был забой заболевших животных. В 30-х годах прошлого столетия в Германии была создана первая вакцина против вируса ящура. Такую вакцину получали путем инактивации «живого» вируса формалином в присутствии гидроксида алюминия. Вирус для нее получали, собирая ткани эпителия и жидкость из афт зараженных животных. Этот метод получения вакцины не мог предоставить достаточное количество материала для иммунизации, необходимое для контроля заболевания. Такое положение сохранялось до того момента, когда в середине прошлого века во Франции был разработан первый метод размножения вируса в клетках эпителия языка здоровых коров и был налажен первый коммерческий выпуск вакцины против вируса ящура. Современную вакцину производят из вируса, полученного в клеточной культуре, обработкой бинарным этиленимином. В конце 90-х годов мировое производство такой вакцины составляло около 1 миллиарда доз в год [1]. В РФ упреждающее вакцинирование препаратами инактивированного вируса является основой контроля ящура в поголовье восприимчивых сельскохозяйственных животных. Для упреждающего вакцинирования необходимо осуществлять постоянный мониторинг эпидемиологической ситуации внутри страны и прилегающих к границам странах. В случае возникновения очага заболевания вакцинированию подвергаются восприимчивые сельскохозяйственные животные в соседствующих областях.
В изобретении RU 2332233 (2008.08.27) описан способ изготовления вакцины против ящура, включающий культивирование вируса в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при температуре 36-37°С, очистку вирусной суспензии от балластных примесей, инактивацию, концентрирование полученного антигена вируса и соединение концентрата антигена с адъювантом. Вакцина против ящура, полученная данным способом, может содержать антигенный материал вируса типа А, О или Азия-1 в эффективном количестве 146S компонента, гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду. Несмотря на то что вакцинирование подобными препаратами инактивированного вируса ящура довольно эффективно, такая вакцина не производится во многих странах мира с развитым животноводством по следующим причинам:
1. обеспокоенность возможностью заражения животных или людей вирусом в результате утечки инфекционного материала в процессе его производства или его неполной инактивации;
2. сложность быстрой наработки вакцины в чрезвычайных ситуациях возникновения очага заболевания;
3. для производства вакцины необходимы дорогостоящие специально оборудованные лаборатории, обеспечивающие высокую биобезопасность производства;
4. вирусные препараты, используемые для производства вакцины, это надосадочная жидкость клеточной суспензии, инфицированной вирусом ящура. Такие препараты, в зависимости от качества производства, могут содержать различное количество вирусных неструктурных белков, загрязняющих вакцину. У привитых такой вакциной животных, наряду с антителами против структурных белков вируса ящура, вырабатываются антитела против загрязняющих неструктурных белков. Присутствие антител против неструктурных белков делает сложным достоверное различие вакцинированных животных от зараженных с помощью иммунологических методов диагностики заболевания;
5. вакцина нестабильна при высоких температурах, что осложняет ее транспортировку и хранение.
Таким образом, для разрешения вышеописанных проблем необходимо создание новых вакцин, которые не требуют наработки патогена, просты в получении и относительно недороги.
2) Разрабатываемые методы контроля заболевания
В качестве вакцин могут быть использованы ослабленные варианты вируса, утратившие патогенность в результате мутаций исходных штаммов и не требующие инактивации. Главным преимуществом «живых» вакцин является то, что они активируют гуморальный и клеточный компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный иммунный ответ. Кроме того, такие вакцины относительно дешевы, так как для иммунизации требуется небольшая доза вируса, поскольку он способен размножаться в зараженном организме.
Ослабленный вирус ящура, обладающий некоторой степенью иммуногенности, классическим методом получают его пассажами в нечувствительных к ящуру животных (мыши, кролики) [2, 3]. Однако получение вируса, ослабленного в невосприимчивом виде животных, одновременно обладающего иммуногенностью, низкой патогенностью и инфекционного для вакцинируемого вида животных, является сложной технической задачей. Существенным недостатком вакцин на основе ослабленного вируса также является его генетическая нестабильность, способная приводить к приобретению вирулентности. Для усовершенствования вакцин на основе «живого» вируса исследователи пытались изменить геном вируса. В этом случае принцип ослабления был основан на делегировании или модификации участков геномной РНК, влияющих на инфекционные характеристики вируса [4-6]. Однако существенных положительных результатов в этих работах получено не было.
Одним из подходов к созданию противоящурных вакцин является получение «пустых капсидов» или вирусподобных частиц (ВПЧ). Неинфекционные ВПЦ ящура, лишенные геномной РНК, образуются в некотором количестве в культурах клеток животных инфицированных вирусом. Такие ВПЧ содержат полный набор антигенных участков вирусного капсида и иммунологически идентичны интактным вирионам. Для разработки технологии получения ВПЧ необходима совместная экспрессия генов предшественников капсидных белков и вирусной процессирующей протеазы 3С. ВПЧ ящура удается получить с помощью рекомбинантного бакуловируса, экспрессирующего необходимые белковые компоненты в клетках шелкопряда [7]. Препараты таких ВПЧ способны индуцировать протективный иммунитет у свиней, однако стоимость таких препаратов довольно высока.
Заявка WO 2006063445 (2006.06.22) описывает создание рекомбинантной противоящурной вакцины, основанной на экспрессии в клетках животных модифицированного гена предшественника структурных белков вируса ящура, кодирующие последовательности которых разделены искусственно путем введения сайтов протеолиза для клеточной протеазы невирусного происхождения, обеспечивающей процессинг предшественника капсидных белков для сборки ВПЧ. Недостатком такого подхода является относительно низкий выход иммуногенных ВПЧ и высокая стоимость препарата.
5
50
Другим направлением исследования возможностей получения безопасных альтернативных вакцин против вируса ящура является использование индивидуальных вирусных белков или пептидов. Такие вакцины называют субъединичными. Поскольку иммунодоминантный эпитоп вирусной частицы расположен в G-H петле капсидного белка VP1 [8], субъединичные вакцины против вируса ящура обычно представляют собой препараты этого белка или его фрагментов [9-13]. Недостатком существующих разрабатываемых субъединичных вакцин является невысокая эффективность иммунизации для защиты животных против заражения. Для индукции протективного иммунного ответа препаратами капсидного белка VP1 у свиней, инокулированных 10-кратной дозой вируса ящура, вызывающей заражение 50% клеток культуры ткани (TCID), требовались три иммунизации (одна затравочная и две усиливающие) по 3 и 2 мг белка соответственно [14], которые производились в течение двух с половиной месяцев.
VP1 и его антигенные пептиды были получены в бактериальной, дрожжевой и растительной системах экспрессии белка, а также в культурах тканей животных. Некоторые работы посвящены созданию синтетических вакцин, использующих различным образом конъюгированные пептиды VP1 [15], либо получению живых рекомбинантных вакцин с использованием векторов на основе вируса осповакцины [16, 17] либо аденовируса [18, 19]. Такие вакцины способны индуцировать нейтрализующие антитела у лабораторных животных, однако протективность таких препаратов для сельскохозяйственных животных, как правило, невелика.
Механизмы протективного иммунитета против вируса ящура недостаточно изучены. Ряд данных указывает на то, что в защите от инфекции помимо гуморального иммунитета важную роль играет Т-клеточный иммунитет. В недавней работе методами компьютерного анализа было предсказано потенциальное участие N-концевой последовательности неструктурного белка вируса ящура 2С в его распознавании клетками иммунной системы [20]. Хотя такой пептид не обладает протективным действием, включение его в состав белка для иммунизации может быть целесообразным. В другой работе [21] иммуногенные Т-клеточные эпитопы были идентифицированы в составе белка, выполняющего функцию РНК-зависимой РНК полимеразы 3D. Было показано, что рекомбинантный вирус осповакцины, экспрессирующий ген 3D, способен обеспечивать частичную защиту свиней от инфекции вирусом ящура при отсутствии гуморального ответа. Было проведено картирование Т-клеточных эпитопов в составе белка 3D с использованием набора пептидов по их способности к индукции специфических пролиферативных ответов и синтезу гамма-интерферона. Идентифицированные белковые последовательности могут быть перспективны для включения в состав синтетических вакцин против вируса ящура.
В изобретении RU 2202613 (1996.09.18) описаны иммуногенные пептиды вируса ящура с последовательностями, включающими не менее восьми аминокислот, соответствующих фрагментам неструктурных белков, которые были отобраны благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу ящура антителам или благодаря иммунореактивности со специфичными к вирусу Т-лимфоцитами. Основными недостатками этого подхода является относительно высокая стоимость вакцинного препарата и ограниченность набора эпитопов, предоставляемых иммунизируемому животному, размером аминокислотной цепи иммуногенного пептида.
В заявке CN 1270839 (2000.10.25) предлагается вакцина против ящура, основанная на плазмидной конструкции химерного антитела, несущего эпитоп белка VP1, встроенного в вариабельную область тяжелой и легкой цепи иммуноглобулинов свиньи. Такой плазмидой трансфецируют клетки млекопитающих и получают линии, продуцирующие химерные антитела с высоким выходом. Недостатком этого подхода является относительно высокая стоимость конечного продукта и присутствие в вакцинном белке потенциальных невирусспецифических эпитопов антитела.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает высокоэффективную рекомбинантную кандидатную вакцину против ящура. В основе изобретения лежит принцип увеличения эффективности индукции и сбалансированности иммунитета при использовании субъединичной вакцины иммуногенным белком, образованным набором наиболее действенных эпитопов вируса ящура в составе одной полипептидной цепи. Вакцинация такими полиэпитопными белками, содержащими комбинацию хорошо изученных В- и Т-клеточных эпитопов вируса, приводит к улучшению иммунного ответа у животного и способствует более эффективной защите.
Изобретение включает в себя:
а) дизайн конструкций для экспрессии рекомбинантного полиэпитопного белка вируса ящура,
б) синтез гена, кодирующего рекомбинантный полиэпитопный белок Н-РЕ, включающего эпитопы структурных белков VP4 и VP1 и неструктурных 2С и 3D, разделенных глицинбогатыми линкерами, а также шести аминокислотных остатков гистидина (6×His), позволяющих аффинную очистку белка, на N-конце,
в) создание штамма Е.coli - продуцента рекомбинантного полиэпитопного белка Н-РЕ,
г) разработку протокола выделения и очистки рекомбинантного полиэпитопного белка Н-РЕ из бактерий и растений,
д) результаты испытаний полученных препаратов на лабораторных животных, свидетельствующие о высокой иммуногенности рекомбинантного полиэпитопного белка Н-РЕ, обуславливающей защиту животных от ящура.
Таким образом, первым аспектом настоящего изобретения является дизайн полиэпитопных белков для иммунизации животных против вируса ящура различных серотипов и подтипов. Рекомбинантный полиэпитопный белок состоит из фрагментов структурных белков VP4 и VP1 и неструктурных 2С и 3D, разделенных гибкими глицинбогатыми линкерами. Общая формула таких белков VP4(X1-X2)-GRL-VP1(X3-X4)-GRL-VP1(X5-X6)-GRL-2C(X7-X8)-GRL-3D(X9-X10)-GRL-3D(X11-X12) представлена на Фиг.1, где GRL обозначает глицинбогатый линкер, состоящий из последовательности четырех аминокислотных остатков глицина и двух серина или последовательности четырех аминокислотных остатков глицина, двух серина, глутаминовой кислоты и фенилаланина, следующих один за другим, a Xn-Xm - целые числа, отражающие номера аминокислотных остатков соответствующего белка вируса ящура (VP4, VP1, 2С, 3D) начиная со стартового метионина в последовательности белка-предшественника, закодированного в геноме вируса ящура данного серотипа. Аминокислотный состав индивидуальных фрагментов и числа X1-X12 индивидуальны и определяются исходя из множественного выравнивания известных белковых последовательностей вируса ящура и белковой последовательности вируса ящура, для которого создается субъединичная вакцина на основе полиэпитопного белка по принципу, описанному в данном изобретении (Фиг.2). Например, для дизайна полиэпитопного вакцинного белка против вируса ящура подтипа О/Тайвань/99 (аминокислотная последовательность Генбанка CAD62369) числа Х1-Х2, Х3-Х4, Х5-Х6, Х7-Х8, Х9-Х10 и Х11-Х12 равны 222-241, 859-883, 924-937, 1175-1183, 1863-1977 и 2283-2322 соответственно. Для возможности аффинной очистки рекомбинантного полиэпитопного белка на N- или С-конец последовательности могут быть добавлены аминокислотные последовательности из шести остатков гистидина, хитинсвязывающий домен и т.д.
Вторым аспектом настоящего изобретения является рекомбинантная ДНК с нуклеотидной последовательностью гена Н-РЕ (Фиг.3), которая кодирует рекомбинантный полиэпитопный вакцинный белок для вируса ящура серотипа О/Тайвань/99, имеющий формулу 6H-VP4(222-241)-4G2S-VP1(859-883)-4G2S-VP1(924-937)-4G2SEF-2C(1175-1183)-4G2S-3D(1863-1977)-4G2S-3D(2283-2322), где 6Н - последовательность шести аминокислотных остатков гистидина, a 4G2S и 4G2SEF - глицинбогатые линкеры, состоящие из последовательности четырех аминокислотных остатков глицина и двух серина или последовательности четырех аминокислотных остатков глицина, двух серина, глутаминовой кислоты и фенилаланина, следующих один за другим соответственно.
Третьим аспектом настоящего изобретения является рекомбинантная плазмида рЕТ-23а(+)-НРЕ, обеспечивающая синтез гибридного полиэпитопного вакцинного белка для вируса ящура серотипа О/Тайвань/99 в клетках бактерий Е.coli, состоящая из модифицированной в области полилинкера плазмиды рЕТ-23а(+) вставкой рекомбинантной ДНК гена Н-РЕ (Фиг.4).
Четвертым аспектом настоящего изобретения является рекомбинантная плазмида pA7248-AMV-H-PE, обеспечивающая синтез гибридного полиэпитопного вакцинного белка для вируса ящура серотипа О/Тайвань/99 в растениях Nicotiana benthamiana, состоящая из модифицированной в области полилинкера плазмиды рА7248-AMV [22] вставкой рекомбинантной ДНК с последовательностью гена Н-РЕ (Фиг.5).
Пятым аспектом настоящего изобретения является рекомбинантный штамм бактерий E.coli, продуцента гибридного полиэпитопного вакцинного белка Н-РЕ против вируса ящура серотипа О/Тайвань/99.
Шестым аспектом настоящего изобретения является состав раствора сольвента для вакцины против вируса ящура на основе полиэпитопного белка для иммунизации по принципу, описанному в данном изобретении. В качестве сольвента используется водный раствор, содержащий 10 мМ трис(гидроксиметил)аминометан - соляная кислота (Трис-HCl) рН 8,0 и 4 М мочевину.
Седьмой аспект настоящего изобретения представлен результатами испытаний полученных препаратов полиэпитопных белков на лабораторных животных. При этом было показано, что (1) иммунизация морских свинок приводит к индукции иммунного ответа против вируса ящура серотипа О/Тайвань/99 и (2) иммунизация морских свинок препаратами полиэпитопных белков обеспечивает их защиту от заражения вирусом. Таким образом, полиэпитопные белки могут быть использованы в качестве основы вакцины против вируса ящура.
Краткое описание фигур
Фиг.1 - Формула рекомбинантного полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура. GRL обозначает глицинбогатый линкер, состоящий из последовательности четырех аминокислотных остатков глицина и двух серина или последовательности четырех аминокислотных остатков глицина, двух серина, глутаминовой кислоты и фенилаланина, следующих один за другим, a Xn-Xm - целые числа, отражающие номера аминокислотных остатков соответствующего белка вируса ящура (VP4, VP1, 2С, 3D) начиная со стартового метионина в последовательности белка-предшественника, закодированного в геноме вируса ящура данного серотипа.
Фиг.2 - Множественные выравнивания аминокислотных последовательностей белков-предшественников вируса ящура серотипов А, О, С, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3 (FMDV_A, FMDV_O, FMDV_C, FMDV_Asia1, FMDV_SAT1, FMDV_SAT2 и FMDV_SAT3 соответственно) и эпитопов вируса ящура О/Тайвань/99 (HPE_VP4, HPE_VP1_1, HPE_VP1_2, HPE_2C, HPE_3D_1 и HPE_3D_2), составляющих рекомбинантный вакцинный белок по формуле VP4(X1-X2)-GRL-VP1(X3-X4)-GRL-VP1(X5-X6)-GRL-2C(X7-X8)-GRL-3D(X9-X10)-GRL-3D(X11-X12) и принципу, описанному в данном изобретении. Для дизайна полиэпитопного вакцинного белка против вируса ящура О/Тайвань/99 числа Х1-Х2, Х3-Х4, Х5-Х6, Х7-Х8, Х9-Х10 и Х11-Х12 равны 222-241 (А), 859-883 (Б), 924-937 (В), 1175-1183 (Г), 1863-1977 (Д) и 2283-2322 (Е) соответственно. Для иллюстрации множественного выравнивания последовательностей белков-предшественников вируса ящура О/Тайвань/99 и серотипов А, О, С, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3 были использованы аминокислотные последовательности генбанка CAD62369 и Р03306, ААТ01748, Р03305, АСР44144, ААТ01786, ААТ01791 и ААТ01796 соответственно.
Фиг.3 - Нуклеотидная и аминокислотная последовательности рекомбинантного белка Н-РЕ.
Фиг.4 - Структура рекомбинантной вектора экспрессии рЕТ-23а(+)-Н-РЕ.
Фиг.5 - Структура рекомбинантной плазмиды pA7248-AMV-H-PE.
Фиг.6 - Экспрессия, выделение и очистка Н-РЕ белка, полученного в Е.coli. 1 - Маркер молекулярного веса; 2 - Суммарный белок клеток культуры, не трансформированной экспрессионной плазмидой; 3 - Суммарный белок клеток культуры, трансформированной плазмидой рЕТ-23а(+)-Н-РЕ.
Фиг.7 - Экспрессия белка Н-РЕ в растениях N.benthamiana. 1 - Маркер молекулярного веса; 2 - суммарный белок клеток культуры Е.coli, трансформированной плазмидой рЕТ-23а(+)-Н-РЕ, на геле примерно 0,5 мкг белка Н-РЕ; 3 - образец ткани листа из зоны, агроинокулированной смесью культур клеток, трансформированных pA7248-AMV-GUS и HCPro; 4 - образец ткани листа из зоны, агроинокулированной смесью культур клеток, трансформированных pA7248-AMV-H-PE и HCPro; 5 - препарат очищенного белка Н-РЕ, выделенный из растений.
Осуществление изобретения
Пример 1. Рекомбинантная белковая молекула Н-РЕ и кодирующая ее рекомбинантная нуклеиновая кислота.
Для создания нуклеотидной последовательности ДНК рекомбинатного гена, кодирующего белок, состоящий из эпитопов вируса ящура, были использованы аминокислотные последовательности известных В-клеточных эпитопов структурных белков и Т-клеточных эпитопов неструктурных белков вируса ящура серотипа О/Тайвань/99, перечисленные далее. В-клеточные эпитопы: VP4 (222-241) [23], VP1 (859-883) [24] и (924-937) [25]; и Т-клеточные эпитопы: 2С (1175-1183) [26], 3D (1863-1977) и (2283-2322) [27]. Во избежание потенциальных проблем сворачивания белка эпитопы были разделены «гибкими» глицинбогатыми линкерами G4S2. Для того чтобы повысить эффективность экспрессии рекомбинантного белка, кодоновый состав кодирующей последовательности ДНК был оптимизирован для экспрессии в растениях рода Nicotiana. Для клонирования гена в экспрессионные вектора на 5'-конец этой ДНК были добавлены последовательности сайтов рестрикции AscI и NdeI, а на 3'-конец - последовательности сайтов XhoI и XmaI. Между последовательностями, кодирующими В-клеточные и Т-клеточные эпитопы, была добавлена последовательность сайта EcoRI. ДНК гена была синтезирована компанией Евроген (Россия).
При помощи метода ПЦР и праймеров m13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), M13R (CAGGAAACAGCTATGAC), pHisPE (ACCTTGGGCGCGCCCATATGCATCATCACCATCACCATATAATCAATAACTATTATATG) на N-конец такой химерной последовательности была добавлена аминокислотная последовательность шести аминокислотных остатков гистидина для возможности выделения белка. ПЦР проводили при следующих условиях: (1) 98°С - 10 сек, (2) 56°С - 30 сек, (3) 72°С - 30 сек, шаги 1-3 повторяли 30 раз.
Полученный ПЦР продукт использовали для получения фрагмента, содержащего рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Н-РЕ. Для этого его обрабатывали рестриктазами NdeI и XhoI, выделяли фрагмент размером 0,77 т.п.н., представляющий собой искомую рекомбинантную нуклеиновую кислоту.
Пример 2. Создание рекомбинантного вектора экспрессии и штамма Е.coli - продуцента рекомбинантного белка Н-РЕ.
Для создания рекомбинантного вектора экспрессии рекомбинантную нуклеиновую кислоту, представляющую собой фрагмент ДНК размером 0,77 т.п.н., вырезанный из ПЦР продукта с помощью рестриктаз NdeI и XhoI, клонировали в экспрессионном векторе рЕТ-23а(+) по сайтам рестрикции NdeI и XhoI. Полученный рекомбинантный вектор экспрессии был обозначен как рЕТ-23а(+)-Н-РЕ. В этом векторе рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая Н-РЕ, находится под контролем Т7 промотора, что обеспечивает ее экспрессию в клетке бактерии Escherichia coli методом самоиндукции. В результате рестрикционного анализа полученных клонов была обнаружена искомая плазмида, содержащая вставку нужного размера. Правильность нуклеотидной последовательности вставки плазмиды была подтверждена секвенированием.
Полученная плазмида (рЕТ-23а(+)-Н-РЕ) была использована для трансформации штамма E.coli Rosetta2 с плазмидой pRARE2, позволяющей эффективную трансляцию редких кодонов. Экспрессия белка Н-РЕ была произведена методом самоиндукции [28]. Трансформировали клетки Rosetta2 и сеяли на LB агар с 1% глюкозой и инкубировали в течение 12 часов при 37°С. Одиночные колонии переносили в среду ZYP-0.8G, культуры растили 7 часов при температуре 37°С при постоянном перемешивании. Культуру клеток пересевали в среду ZYP-5052 и растили при температуре 37°С в течение 12-48 часов. Определение уровня экспрессии рекомбинантного белка Н-РЕ проводили путем анализа суммарных белковых препаратов, выделенных из бактериальных культур с помощью SDS-PAGE. Максимальный уровень продукции рекомбинантного белка Н-РЕ составлял около 80% общего клеточного белка (Фиг.6).
Пример 3. Выделение и очистка рекомбинантного белка Н-РЕ
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
Бактериальный белок с шестью аминокислотными остатками выделяли в денатурирующих условиях с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA сефарозе (Promega) в колонке (QIAGEN, Германия) по модифицированным методикам 10 и 17 из руководства The QIAexpressionist™ компании QIAGEN (Германия). Для этого экспрессирующую клеточную культуру центрифугировали при 13000 об/мин 5 минут и осадок ресуспендировали в буфере А рН 8.0, содержащего 100 мМ NaHPO, 10 мМ Tris·Cl, 6 М GuHCl из расчета 1 мл буфера на 80 мг осадка, перемешивали на вращающейся мешалке в течение 30 мин. Клеточный лизат центрифугировали при 14000 об/мин 15 мин и отбирали супернатант. Супернатант инкубировали с уравновешенной в буфере А суспензией Ni-NTA сефарозы в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Переносили смесь лизата и сорбента в колонку. Промывали сорбент буфером А, двукратно буфером В рН 8.0, содержащим 100 мМ NaHPO, 10 мМ Tris·Cl, 8 М мочевина, двукратно буфером С рН 6.3, содержащим 100 мМ NaHPO, 10 мМ Tris·Cl, 8 М мочевина, буфером D рН 5.9, содержащим 100 мМ NaHPO, 10 мМ Tris·Cl, 8 М мочевина, буфером Е рН 4.5, содержащим 100 мМ NaHPO, 10 мМ Tris·Cl, 8 М мочевина. Элюировали белок буфером F, содержащим 6 М GuHCl, 0.2 М уксусной кислоты. Фракции элюата, содержащие максимальное количество белка, диализовали против раствора 4 М мочевины, 10 мМ Tris-HCl рН 8.0. Из 65 мг клеточного осадка выделяли примерно 1 мг Н-РЕ белка с достаточно высоким уровнем очистки - не менее 95%.
Пример 4. Иммуногенность кандидатной вакцины на основе Н-РЕ, полученного в Е.coli.
Для характеристики иммуногенности и протективного действия бактериального Н-РЕ белка масляную эмульсию вводили 3 группам морских свинок (каждая группа по 8 животных) внутримышечно в задние конечности с белками в разных дозах: первой группе по 350 мкг белка; второй - по 120 мкг; третьей - по 40 мкг. Препарат для иммунизации готовили из 30 частей водной фазы, содержащей Н-РЕ белок в 4 М мочевине, 10 мМ Tris рН 8.0 и 70 частей масляного адъюванта Montanide ISA 70 фирмы SEPPIC (Франция). Четвертая группа была контрольной - 8 морских свинок, которым белок не вводили.
Через 17 сут после иммунизации у животных были отобраны сыворотки крови, которые тестировали с помощью реакции микронейтрализации (РМН) (табл.1).
Таблица 1
Результаты исследования иммуногенной и протективной активности бактериального H-РЕ белка на морских свинках
Номер группы
Количество вводимого белка
Результаты активности белка
РМН
контрольное заражение: количество защищенных животных/количество животных в опыте
1
350 мкг
<1:45
8/8
2
120 мкг
<1:32
8/8
3
40 мкг
<1:16
4/8
4
не вводили
>1:16
0/8
50
2
2
50
6
3
РМН проводили на культуральных 96-луночных планшетах фирмы "Costar" в перевиваемой культуре клеток почки свиньи IB-RS-2 против 100 ТЦД культурального вируса ящура типа О/Тайвань/99. Перед постановкой реакции сыворотки крови морских свинок разводили 1:4 поддерживающей средой Игла и инактивировали при температуре 56°С 30 мин для удаления неспецифических ингибиторов. Сыворотки титровали двукратным шагом, начиная с разведения 1:16, добавляли равный объем рабочей дозы вируса ящура и выдерживали 1 ч при 37°С. Затем в лунки планшета вносили суспензию культуры клеток с концентрацией 0,8×10 клеток/см. Планшеты выдерживали 48 ч в СО-инкубаторе при 5% CO и температуре 37°С. Реакцию учитывали под инвертированным микроскопом, титр сыворотки рассчитывали по методу Кербера. Вируснейтрализующим титром антител исследуемой сыворотки считали предельное разведение сыворотки, при котором происходила нейтрализация инфекционного действия 100 ТЦД вируса в 50% зараженной культуры клеток IB-RS-2. Положительными считали сыворотки с активностью антител в разведении 1:45 и выше.
4,0
3
50
Через 21 сут после иммунизации группы морских свинок были подвергнуты контрольному заражению адаптированным к этим животным вирусом ящура О/Тайвань/99 гомологичным вакцинному штамму интрадермально в плантарную поверхность задних конечностей в дозе 10 ГД/0,2 см. Учет результатов заражения проводили через 7 суток и оценивали по генерализации ящурного процесса. Генерализацией считали образование вторичных афт на передних конечностях, в которые не вводили вирус. Контроль вакцины считали действительным, если из 8 невакцинированных свинок генерализованной формой заболевали не менее 7 животных.
Однократная иммунизация морских свинок эмульсионной вакциной, содержащей в прививном объеме бактериальный Н-РЕ белок в количествах 350 мкг и 120 мкг, индуцировала у животных формирование вируснейтрализующих антител к вирусу ящура типа О/Тайвань/99, выявляемых в РМН. Данные по протективности животных согласуются с данными РМН их сывороток. У всех иммунизированных такими дозами белка животных не происходило появления вторичных афт на передних лапах через 7 сут после заражения. У группы свинок иммунизированных бактериальным Н-РЕ в количестве 40 мкг вторичные афты регистрировали у 4 из 8 свинок. Симптомы ящура появлялись у 8 неиммунизированных (контрольных) морских свинок.
Пример 5. Создание рекомбинантного вектора экспрессии рекомбинантного белка Н-РЕ в растениях Nicotiana benthamiana.
Для создания рекомбинантного вектора для экспрессии Н-РЕ белка в клетках Nicotiana benthamiana рекомбинантную нуклеиновую кислоту, представляющую собой фрагмент ДНК размером 0,77 т.п.н., вырезанный из ПНР продукта с помощью рестриктаз AscI и XmaI, клонировали в бинарном векторе pA7248-AMV по сайтам рестрикции AscI и XmaI. Полученный рекомбинантный вектор экспрессии был обозначен как pA7248-AMV-Н-РЕ. Правильность нуклеотидной последовательности вставки плазмиды была подтверждена секвенированием. Полученная плазмида pA7248-AMV-H-PE была использована для трансформации Agrobacterium tumefaciens штамма ЕНА105. Трансформацию осуществляли по стандартным методикам [31]. На ледяной бане к компетентным клеткам добавляли 0,5 мкг плазмидной ДНК. Клетки выдерживали 5 мин при 37°С, затем добавляли 500 мкл среды LB и растили 4 часа при 28°С при постоянном перемешивании. Клетки высевали на LB-агар и инкубировали при 28°С в течение 3-4 дней. Колония агробактерий, трансформированных конструкцией pA7248-AMV-H-PE, была отобрана с помощью ПНР скрининга с парой специфичных праймеров PVXseq456 (GAGAGAAATTGGCAAGGGCT) и PVXdAvr (CAGTCAGGCGCATAATTGAT). ПЦР проводили при следующих условиях: (1) 94°С - 30 сек, (2) 42°С - 30 сек, (3) 72°С - 2 мин, шаги 1-3 повторяли 25 раз.
Для повышения эффективности транзиентной экспрессии целевого белка растения агроинокулировали смесью культур, трансформированных вектором с целевым геном и вектором-продуцентом супрессора РНК сайленсинга - белка р24 вируса, ассоциированного со скручиванием листьев винограда 2 (GLRaV-2) или HCPro вируса мозайки турнепса, клонированные в модифицированную плазмиду pCambia2301. В этих плазмидах нуклеотидная последовательность Т-ДНК, фланкированная участками, необходимыми для ее переноса в ядро, была заменена на следующие последовательности: сайт узнавания рестриктазы AscI, последовательность 35S промотера, сайт узнавания рестриктазы PmeI, последовательность открытой рамки считывания, кодирующей белок-супрессор, сайты узнавания рестриктаз PstI и StuI, последовательности nos и 35S терминаторов транскрипции. Полученные конструкции были названы рССар24 и pCCaHCPro и использовали для трансформации Agrobacterium tumefaciens штамма ЕНА105.
4
600
Культуры клеток агробактерии, трансформированной конструкциями рА7248-AMV-H-PE, pA7248-AMV-GUS (см. далее), pCCaHCPro или рССар24, выращивали в среде LB с антибиотиками (канамицин, рифампицин, гентамицин) и с 10 мМ MES (2-(N-Морфолино)-этансульфоновая кислота) 12 часов на качалке при 28°С. Клетки осаждали при 4000 об/мин в течение 5 минут, осадок ресуспендировали в индуцирующем буфере, содержащем 10 мМ MgSO, 10 мМ MES. Определяли оптическую плотность, готовили суспензию клеток в индуцирующем буфере с оптической плотностью (ОП) 0,2. Добавляли раствор ацетосирингона (конечная концентрация 150 мкМ) и выдерживали 3 часа при комнатной температуре. Суспензии клеток агробактерии, трансформированных конструкцией, кодирующей целевой ген (pA7248-AMV-H-PE), и конструкцией супрессора РНК сайленсинга (HCPro или р24) смешивали и вводили шприцем без иглы в межклеточное пространство листьев растений.
В качестве отрицательного контроля была использована ткань того же листа, инфильтрированная культурой агробактерий, трансформированных конструкцией pA7248-AMV-GUS, несущей последовательность β-глюкуронидазы. Для получения вектора pA7248-AMV-GUS последовательность, кодирующая β-глюкуронидазу, была клонирована в плазмиду pA7248-AMV по сайтам рестрикции AscI и XhoI.
Клетки растений, агроинокулированных конструкцией pA7248-AMV-H-PE и HCPro или р24, были способны экспрессировать белок с электрофоретической подвижностью, как у белка Н-РЕ, экспрессированного в бактериях (Фиг.7). Доля белка Н-РЕ в растении составляла 0,7-1% от общего количества белка листа.
Выделение и очистку Н-РЕ белка из растения проводили по методике, аналогичной выделению белка Н-РЕ из бактерий. Из 120 г свежей растительной ткани выделяли примерно 8 мг Н-РЕ белка (67 мг белка из 1 кг растительной ткани).
Пример 6. Иммуногенность кандидатной вакцины на основе Н-РЕ, полученного в растениях.
Для характеристики иммуногенности и протективного действия бактериального Н-РЕ белка, полученного в растительной системе экспрессии путем иммунизации морских свинок в концентрациях, аналогичных при вакцинации бактериальным белком Н-РЕ (300, 120 и 40 мкг).
Через 17 сут после вакцинации у 24 иммунизированных разными дозами антигена и 4 контрольных морских свинок были отобраны пробы крови. Полученные сыворотки крови морских свинок были протестированы в непрямом варианте иммунного ферментного анализа (ИФА) с антигеном вируса ящура О/Тайвань/99 (тест-система ФГУ «ВНИИЗЖ») и с использованием набора О FMDV Ab PrioCHECK (табл.2).
Таблица 2.
Результаты исследования иммуногенной и протективной активности растительного Н-РЕ белка на морских свинках
Номер группы
Количество вводимого белка
Результаты активности белка
O FMDV Ab PrioCHECK PI (РI<sub>пол</sub>≥50%)
тест-система ФГУ «ВНИИЗЖ»
контрольное заражение: количество защищенных животных/количество животных в опыте
1
350 мкг
78±14,7%
>100
8/8
2
120 мкг
70±22,7%
>100
8/8
3
40 мкг
58,5±19,7%
>50
6/8
4
Не вводили
16,3±6,5%
<50
0/8
Непрямой вариант ИФА проводили по стандартной схеме с некоторыми модификациями. Антигены вируса ящура штаммов О/Приморский/ОО, О/Маниса и О/Тайвань/99 получали из суспензии зараженной перевиваемой культуры клеток ПГСК-30 в процессе преципитации инактивированных вирусных частиц 8% раствором полиэтиленгликоля (м.м. 6000 Д) с добавлением NaCl до конечной концентрации 0,9% и обработки хлороформом с последующей очисткой и концентрированием антигена ультрацентрифугированием через 20% раствор сахарозы. Анализ препаратов антигена вируса ящура проводили в 12%-15% ПААГ [29].
Концентрированный и очищенный антиген вируса ящура адсорбировали в лунках 96-луночного полистиролового планшета фирмы "Nunc" MaxiSorp (Дания) в карбонатнобикарбонатном буфере (рН 9,6) в количестве 1-2 мкг белка на лунку. Несвязавшиеся с антигеном участки в лунках планшета блокировали буфером БСА-ТБСТ (0,02 М Трис-HCl, 0,15 М NaCl, 0,05% Твин-20, 1% БСА). Пробы наносили на планшет в буфере ТБСТ с 5% фетальной сывороткой (ФС-ТБСТ) методом двукратных последовательных разведений. Инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После четырехкратного промывания планшета буфером ТБСТ в каждую лунку вносили по 50 мкл антивидового иммунопероксидазного конъюгата (филиал «МЕДГАМАЛ» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН), разведенного в ФС-ТБСТ 1:1000. Инкубировали еще 30 мин при 37°С. Затем планшет снова промывали. Окрашивание производили с помощью субстратной смеси ABTS (МР Biomedicals, США). Через 10-15 мин реакцию останавливали 1% Ds-Na. Реакцию учитывали с помощью многоканального спектрофотометра путем измерения оптической плотности (ОП) при длине волны 405 нм. Титром сыворотки считали конечное разведение, в котором ОП лунки было меньше или равно удвоенному среднему значению ОП отрицательного контроля.
В качестве референтного теста для выявления антител против вируса ящура типа О использовали коммерческий набор О FMDV Ab PrioCHECK (Нидерланды). Постановку реакции проводили согласно инструкции производителя, а положительным значением считали процент ингибирования (PI) ≥50%.
Через 17 сут после однократной иммунизации морских свинок дозой препарата в 350 мкг выработка антител, определяемая согласно референтному тесту О FMDV Ab PrioCHECK, индуцировалась у всех привитых животных.
Однократная иммунизация свинок вакциной, изготовленной на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70 с содержанием в прививном объеме растительный Н-РЕ белок в количествах 350 мкг и 120 мкг, вызывала образование у животных вируснейтрализующих антител к вирусу ящура типа О/Тайвань/99, выявляемых в ИФА. У всех иммунизированных такими дозами белка животных не происходило появления вторичных афт на передних лапах через 7 суток после заражения. У группы свинок, иммунизированных растительным Н-РЕ в количестве 40 мкг, вторичные афты появлялась у 2 из 8 свинок. Симптомы ящура появлялись у 8 неиммунизированных морских свинок.
Результаты оценки иммуногенности бактериального и растительного полиэпитопных белков Н-РЕ на морских свинках свидетельствуют о том, что при однократной иммунизации дозой 120 мкг в комбинации масляным адъювантом Montanide ISA 70, он способен индуцировать иммунный ответ у животных, детектируемый методами ИФА и РМН, а также вызывать устойчивость к контрольному заражению гомологичным адаптированным вирусом ящура типа О/Тайвань/99. Следовательно, полученный препарат может рассматриваться в качестве кандидата на вакцину против вируса ящура.
Полученные результаты на морских свинках позволяют экстраполировать достигнутый эффект и на сельскохозяйственных животных.
Полученные данные об эффективности кандидатной вакцины против вируса ящура на основе белка, состоящего из эффективных эпитопов вируса, позволяют предположить, что данный подход может быть успешно использован в создании других (противовирусных вакцин) препаратов для иммунизации животных против вируса ящура различных серотипов и подтипов.
При осуществлении изобретения, помимо методов, раскрытых в данных примерах, использовали хорошо известные специалистам методики, описанные в руководствах по молекулярной биологии и генетической инженерии [30, 31].