Цитоэмбриологическая оценка тетраплоидов яблони для гетероплоидных скрещиваний

Вестник ОрелГАУ, 6(57), Декабрь 2015, http://dx.doi.org/10.15217/issn1990-3618.2015.6.55 УДК / UDK 634.11:575.22:631.527.003.12

ЦИТОЭМБРИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ТЕТРАПЛОИДОВ ЯБЛОНИ ДЛЯ ГЕТЕРОПЛОИДНЫХ СКРЕЩИВАНИЙ

CYTOEMBRYOLOGICAL ESTIMATION OF APPLE TETRAPLOIDS FOR HETEROPLOID

CROSSINGS

Седышева Г.А., доктор с.-х. наук.

Sedysheva G.A., agr. sci. doctor.

Горбачева Н.Г., научный сотрудник.

Gorbacheva N.G., researcher.

Мельник С.А., младший научный сотрудник.

Melnik S.A., junior researcher.

ФГБНУ Всероссийский НИИ селекции плодовых культур (ВНИИСПК) All Russia Research Institute of Fruit Crop Breeding (VNIISPK) E-mail: info@vniispk.ru

АННОТАЦИЯ

Яблоня ведущая плодовая культура средней полосы России. Постоянное совершенствование ее стандартного сортимента является непременным условием сохранения промышленного значения культуры, что актуально при постоянном усложнении экологической обстановки. Для пополнения стандартного сортимента требуются сорта, характеризующиеся не только высокой урожайностью, товарными и потребительскими качествами плодов, но и устойчивостью к биотическим и абиотическим стрессорам. Решению этой проблемы способствует целенаправленная селекция с использованием полиплоидных исходных форм. Чтобы обеспечить широкий спектр генетического разнообразия триплоидных гибридов необходимо располагать большим набором тетраплоидных форм - доноров диплоидных гамет. Поэтому получение новых тетраплоидных форм яблони, изучение цитоэмбриологических особенностей их генеративной сферы необходимы для рациональной постановки работ по селекции яблони на полиплоидном уровне и для предварительного прогнозирования результатов этих работ.Установлено, что мейоз у формы 25-37-47 характеризуется достаточно правильным течением. Количество нарушений составляет 8,7-34,1%. На завершающих стадиях мейоза отмечено 89,1% нормальных тетрад. Основная масса пыльцы- около 70% представлена одномерными пыльцевыми зернами.тК особенностям формирования женского гаметофита относятся: наличие мощного археспориального комплекса (до 13 клеток), формирование дополнительных тетрад в 86,5% проанализированных семяпочек. Однако в подавляющем большинстве случаев у формы 25-37-47 развивается только один зародышевый мешок. С развитием зародышевого мешка активность археспория и дополнительных тетрад постепенно затухает. Аномалии, встречающиеся при развитии женского гаметофита: увеличенное число ядер в зародышевом мешке, аномальная дифференциация отдельных элементов зародышего мешка и другие, в большинстве случаев не препятствуют нормальному оплодотворению.

На основании цитоэмбриологической характеристики тетраплоидной формы 25-37-47 можно утверждать, что она является ценным комплексным донором для использования в селекции на полиплоидном уровне, так как содержит ген иммунитета к парше Vm. и обеспечивает высокий выход диплоидных гамет.

ABSTRACT

Apple is a leading fruit crop in the middle zone of Russia. The constant improvement of its standard assortment is a bound facility for maintaining industry significance of the crop that is urgent in the continuous environmental worsening. Cultivars that are characterized not only by high productivity, and high marketable and consumer qualities but also resistance to biotic and abiotic stressors are demanded for standard assortment replenishment. Target breeding with using polyploids is inductive to solve this problem. It is necessary to have available a large number of

tetraploids - donors of diploid gametes in order to provide a wide spectrum of genetic diversity of triploid hybrids. Therefore, it is necessary to obtain new apple tetraploids and to study cytoembryological features of their generative sphere for rational apple breeding with polyploidy using and for preliminary forecast of this work. It has been stated that meiosis in tetraploid 25-3747 is characterized by a quite correct course. A number of disorders is 8,7 - 34,1%. In the final stages of meiosis 89,1% of normal tetrads has been noted. 70% of the pollen is represented by pollen grains of one size. The features of the female gametophyte formation are: the presence of a massive archespore complex (up to 13 cells); the formation of additional tetrads in 86,5% of analyzed ovules. However, in 25-37-47 only just one embryo sac is developed in a great majority of cases. With the development of an embryo sac the activity of archesporium and additional tetrads gradually goes out slowly. Anomalies that are found during female gametophyte development, such as an increased number of nuclei in the embryo sac, abnormal differentiation of separate elements of the embryo sac, etc. do not impede normal fertilization. On the ground of cytoembryological characteristics it may be stated that tetraploid 25-37-47 is a valuable complex donor for breeding with polyploidy using, since it has scab immunity gene Vf and provides a high output of diploid gametes.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

яблоня, полиплоидия, мейоз, микроспорогенез, гаметы, макроспорогенез, зародышевый мешок, археспорий, тетрады.

KEY WORDS

apple, polyploidy, meiosis, microsporogenesis, gametes, macrosporogenesis, embryo sac, archesporium, tetrads.

Использование в селекции яблони в качестве исходных форм полиплоидов дает возможность увеличить диапазон генетического разнообразия гибридного потомства и увеличить вероятность получения новых форм, отвечающих требованиям современного интенсивного адаптивного садоводства.

Наиболее эффективным методом создания большого гибридного фонда триплоидов яблони является скрещивание разнохромосомных форм типа: диплоид * тетраплоид, тетраплоид * диплоид.

Оптимальным уровнем плоидности у яблони считается триплоидный уровень [1, 2, 3]. Триплоидные сорта характеризуются высокой продуктивностью, высокими товарными и потребительскими качествами плодов, регулярным плодоношением, а по зимостойкости и устойчивости к болезням не уступают диплоидным сортам [4, 5, 6, 7]. По данным Н. И. Ненько с сотрудниками [8] перспективные триплоидные сорта в условиях СевероКавказского региона обладают лучшей способностью адаптироваться к засухе, чем изученные ими диплоидные сорта.

Целенаправленная селекция с целью получения триплоидного потомства является методом, стимулирующим возрастание генетической изменчивости среди полового потомства от разнохромосомных скрещиваний и увеличение отбора адаптивных, перспективных сортов, удовлетворяющих требованиям интенсивного садоводства.

Объектом для цитоэмбриологической оценки послужила тетраплоидная форма, полученная во ВНИИСПК в процессе реализации программы исследований по селекции яблони на полиплоидном уровне 25-37-47 [SR0523 * Антоновка плоская (4х)] [9]. Форма 2537-47 несет в своем генотипе ген высокой устойчивости к парше Vm. Следовательно, она представляет собой ценный комплексный донор - донор диплоидных гамет и высокой устойчивости к парше.

Для определения плоидности гибридного потомства фиксировали точки роста и эмбриональные листочки с каждого сеянца яблони. Фиксатором служил уксусный алкоголь (3:1) - три части 96% этилового спирта и одна часть ледяной уксусной кислоты. Для окраски применялся пропионово-лакмоидный метод [10, 11, 12].

Мейоз при микроспорогенезе изучали на временных давленых препаратах, приготовленных ускоренным ацето-гематоксилиновым методом [13].

Состояние эмбриональных структур женской генеративной сферы изучалось на постоянных препаратах в соответствии с классическими методиками [14, 15]. Срезы

изготовляли толщиной 20-25 микронов в зависимости от величины объекта. Постоянные препараты красили гематоксилином по Гейденгайну.

Препараты изучали с использованием микроскопа Nikon 50i при увеличении 10 х 1,5 х 40; 10 х 1,5 х 100. Фотографии выполнены с помощью фотокамеры DS - Fi 1.

Результаты исследований:

1. Первым этапом в селекции с использованием полиплоидии являются гетероплоидные скрещивания типа 2х х 4х, 4х х 2х.

В семье 23-14-122 (2х) х 25-37-47 (4х) было получено 65 растений. При подсчете хромосом оказалось 10 растений имели диплоидный набор хромосом (2п=2х=34), что составляет 15,4% и 55 растений - триплоидный (2п=3х=51). Это составляет 84,6%. Таким образом в скрещивании с формой 25-37-47 выход триплоидных растений составляет существенную велечину.

2. Состояние генеративных структур тетраплоидных исходных форм представляет интерес для установления пригодности использования их в гетероплоидных скрещиваниях. Эти сведения способствуют рациональному планированию работ по селекции на полиплоидном уровне: подбор комбинаций скрещивания, определение объема гибридизации, предполагаемые результаты.

Микроспорогенез. Анализ последовательных стадий мейоза свидетельствует, что в большинстве случаев мейоз протекает правильно (рис. 1) и только на некоторых стадиях отмечены отклонения от нормы. Для метафазы первого и второго делений характерно преждевременное забегание отдельных хромосом к полюсам веретена деления (рис.2 а, б), выбросы хромосом за пределы веретена в цитоплазму микроспороцита (рис.2 в).

Для анафазы-II основным нарушением является отставание одной или нескольких хромосом в центре веретена деления (рис. 2 г). Единичны случаи образования мостов и сверхчисленных веретен.

Отклонения на стадиях телофазы-I и II представлены наличием микроядер, сверхчисленных ядер (рис. 2 д, е) которые, в свою очередь, на следующем этапе образуют спорады, с числом микроспор больше нормы (рис.2 з). В отдельных микроспороцитах в телофазе между ядрами сохраняются мосты в виде нитей, сформировавшиеся еще на предыдущих стадиях (рис. 2ж). Количество нарушений на разных стадиях мейоза составляет от 8,7 до 34,1%.Разнообразие нарушений не отличается широким спектром (рис. 2). Количество нарушений на разных стадиях мейоза составляет от 8,7 до 34,1%. Разнообразие нарушений не отличается широким спектром (рис. 2).

Рисунок 1 - Нормальный микроспорогенез у тетраплоидной формы яблони25-37-47(а -

метафаза-I; б - анафаза-I; в - телофаза-I; г - метафаза-II; д - анафаза-II; е - телофаза-II; ж - тетрады; з - пыльца.)

е ж з

Рисунок 2 - Нарушения в микроспорогенезе у тетраплоидной формы яблони 25-37-47

На завершающих стадиях мейоза отмечено значительное количество нормальных тетрад (89,1%) (рис. 1ж), распадающихся после созревания на нормальные микроспоры, содержащие диплоидный набор хромосом. Иногда в микроспорах присутствуют микроядра от одного до четырех. Вследствие чего и на стадии одноядерной пыльцы отмечаются пыльцевые зерна с дополнительными микронуклеусами. Основная масса пыльцы - это около 70% является одномерной правильной (рис. 1з).

Эти данные свидетельствует о том, что данный тетраплоид, является хорошим опылителем и вполне пригоден для получения триплоидного гибридного потомства.

Макроспорогенез. Для тетраплоидной формы яблони 25-37-47 характерна общая схема развития женского гаметофита, свойственная представителям рода Malus.

Семяпочки в большинстве случаев (97,1%) имеют нормальное типичное для яблони строение. В центральной части располагается нуцеллус, сверху одетый интегументами.

Обычно в нуцеллусе одна из клеток археспория увеличивается в размерах, цитоплазма становится светлой, ядро более крупным, просвечивается темное ядрышко, археспориальная клетка превращается в материнскую клетку макроспор (рис. 3а). Из этой клетки после двух делений мейоза образуется тетрада макроспор (рис. 3б). Одна из клеток тетрады превращается в материнскую клетку зародышевого мешка (рис. 3в), и после трех митотических делений формируется восьмиядерный зародышевый мешок.

У формы 25-37-47 помимо основной тетрады макроспор отмечали наличие дополнительных тетрад (рисунок 3 г). Иногда в нуцеллусе одной семяпочки насчитывалось до четырех тетрад. Из 37 семяпочек в пяти семяпочках развивалось по одной тетраде (13,5%), в остальных присутствовали дополнительные тетрады - 86,5%. Образование нескольких тетрад можно объяснить высокой степенью активности женского археспория. Данная форма характеризуется довольно мощным археспориальным комплексом, максимальное число клеток которого достигает 13. Основная масса археспориальных клеток в большинстве семяпочках располагается вокруг халазального конца зародышевого мешка. Как правило, в активном состоянии находится 1-4 клетки археспория (рис. 3д).

Рисунок 3 - Особенности формирования женского гаметофита, 25-37-47

К моменту, когда в семяпочке наблюдается нормально дифференцированный зрелый зародышевый мешок, активность археспориальных клеток обычно затухает, и наоборот, в аномальных семяпочках, в семяпочках с дегенерирующей генеративной тканью, или в семяпочках, содержащих многоядерный зародышевый мешок, присутствуют несколько клеток активного археспория. Возможно, из них в дальнейшем разовьются нормальные зародышевые мешки.

У формы 25-37-47 чаще формируются тетрады линейного типа (63,1%).

Одна из клеток тетрады превращается в материнскую клетку зародышевого мешка, и в результате трех последовательных делений образуется восьмиядерный зародышевый мешок. Через некоторое время эмбриональные структуры зародышевого мешка дифференцируются, и все элементы зародышевого мешка приобретают типичное для яблони строение. В микропилярном конце зародышевого мешка находится яйцевой аппарат, состоящий из яйцеклетки и двух синергид, в халазальном конце располагаются три клетки -антиподы в центре два полярных ядра.

Встречаются случаи нарушения дифференциации отдельных элементов зародышевого мешка: все три клетки яйцевого аппарата или антиподы дифференцируются по типу синергид.

В ядрах зародышевых мешков наряду с основными ядрышками могут присутствовать дополнительные, обычно меньшего размера, чем основные.

Встречаются многоядерные зародышевые мешки, с количеством ядер от девяти до 18. Дополнительные ядра могут располагаться в разных участках женского гаметофита. Чаще отмечены случаи наличия сверхчисленных ядер у микропилярного конца зародышевого мешка, реже у халазального. Например, в одиннадцатиядерном мешке шесть ядер было расположено в апикальной части, три в базальной и два полярных ядра в центре женского гаметофита.

Количество аномальных семяпочек у формы яблони 25-37-47 незначительное, всего 2,9%. Это сидячие семяпочки, семяпочки с одним или недоразвитыми интегументами. Часто в таких семяпочках генеративная ткань дегенерирует.

Перечисленные аномалии женского гаметофита в большинстве случаев не препятствуют осуществлению двойного оплодотворения. Поэтому данная полиплоидная форма яблони пригодна для ее использования в гибридизации в качестве материнской формы.

Таким образом, согласно цитоэмбриологическому изучению, тетраплоидная форма 2537-47 является ценным комплексным донором для использования в селекции на

полиплоидном уровне.

БИБЛИОГРАФИЯ

I.Бавтуто, Г. А. Новые методы в селекции плодово-ягодных культур / Г. А. Бавтуто. - Минск: Высшая школа, 1977. - 188 с.

2.Singh, R. Intravarietal polyploidy in the apple (Malus pumila Mill) / R. Singh, B. A. Wafai // Euphytica, 1984. - V. 33. - № 1. - P. 209-214.

3.Седов, Е. Н. Селекционная оценка гетероплоидных скрещиваний при создании триплоидных сортов яблони / Е. Н. Седов, Г. А. Седышева, З. М. Серова, Н. Г. Горбачева, С. А. Мельник // Вавиловский журнал генетики и селекции.- 2013. - Т. 17. - № 3. - С. 499507.

4.Лозицкий, А. Я. Биологическая и хозяйственная характеристика полиплоидных сортов яблони и груши / А. Я. Лозицкий. - Автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. -Л., 1970. - 20 с.

5. Дутова, Л. И. Цитологическая и анатомо-морфологическая характеристика сортов яблони

разного уровня плоидности / Л. И. Дутова // Селекция яблони на улучшение качества плодов: сб. ст. - Орел: 1985. - С. 202-206.

6.Пономаренко, В. В. Полиплоидия видов рода Malus Mill. / В. В. Пономаренко // Селекция яблони на улучшение качества плодов: сб. ст. - Орел, 1985. - С. 163-168.

7.Седов, Е. Н. Основные направления селекции яблони во ВНИИСПК и обновления сортимента / Е. Н. Седов, Г. А. Седышева, З. М. Серова, М.А. Макаркина, С.А. Корнеева // Селекция и сорторазведение садовых культур: сб. науч. работ. Т-2. Конкурентоспособные сорта и технологии для высокоэффективного садоводства: материалы междунар. науч.-практич. конф., посвящ. 170-летию ВНИИСПК, 2015.-С. 178180.

8.Ненько, Н.И. Засухоустойчивость перспективных сортов яблони разной плоидности в Южном регионе России / Г.К. Киселёва, А.В. Караваева, Е.В. Ульяновская // Современные сорта и технологии для интенсивных садов: материалы междунар. науч-практ. конф. (15-18 июля 2013 г. Орел) Орел ВНИИСПК, 2013. - С. 158-160.

9.Седов, Е. Н. Селекция яблони на полиплоидном уровне / Е. Н. Седов, Г. А. Седышева, З. М. Серова. - Орел: ВНИИСПК, 2008.- 368 с.

10.Каптарь, С. Г. Ускоренный пропионово-лакмоидный метод приготовления и окрашивания временных цитологических препаратов для подсчета хромосом у растений / С. Г. Каптарь // Цитология и генетика, 1967. - Т. 1, № 4.- С. 87-90.

II.Руденко, И. С. Простой и быстрый метод приготовления временных препаратов для цитологических исследований плодовых / И. С. Руденко, Г. Д. Дудукал // Цитология и генетика, 1972. - Т. 6. - № 3. - С. 266-268.

12.Седышева, Г. А. К методике окраски соматических хромосом у плодовых растений / Г. А. Седышева // Сорта и технология для современного сада: сб. ст. - Тула: Приок. кн. изд-во, 1990. - С. 24-27.

13.Топильская, Л. А. Изучение соматических и мейотичеоких хромосом смородины на ацето-гематоксилиновых давленых препаратах / Л. А. Топильска, С. В. Лучникова, Н. П. Чувашина // Бюллетень ЦГЛ им. И. В. Мичурина, 1975. - Вып. 22. - С. 58-61.

14.Рыбин, В. А. Цитологический метод в селекции плодовых / В. А. Рыбин. - М.: Колос, 1967. - 216 с.

15.Паушева, 3. П. Практикум по цитологии растений / З. П. Паушева // М.: Колос, 1980. - 304 с.