АНТИТЕЛО К АДРЕНОМЕДУЛЛИНУ (ADM) ИЛИ ФРАГМЕНТ АНТИ-ADM АНТИТЕЛА, ИЛИ АНТИ-ADM HE-Ig КАРКАС ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ТЕРАПИИ
ANTIBODY TO ADRENOMEDULLIN (ADM) OR ANTI-ADM ANTIBODY ELEMENT, OR ANTI-ADM HE-IQ FRAMING FOR APPLICATION IN THERAPY

Область техники, к которой относится изобретение
Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, где указанное антитело или фрагмент, или каркас представляет собой не обладающее нейтрализующей активностью антитело (не нейтрализующее антитело).
Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой
½
- стабилизирующее ADM антитело или стабилизирующий ADM фрагмент антитела, или стабилизирующий ADM не-Ig каркас, которое/который удлиняет время полужизни (т.е. время полуудержания t) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на 100%, и/или
- указанное стабилизирующее ADM антитело или указанный стабилизирующий ADM фрагмент антитела, или указанный стабилизирующий ADM не-Ig каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
Указанное выше положение относится к блокированию биологической активности ADM не более чем на 80% или не более чем на 50% соответственно, его следует понимать в смысле ограниченного блокирования биологической активности ADM или снижения биологической активности ADM соответствующим связывающим ADM агентом, представляющим собой стабилизирующее ADM антитело или фрагмент антитела, или не-Ig каркас. Подразумевается, что это означает, что биологическая активность ADM сохраняется. Например, в случае блокирования биологической активности ADM не более чем на 80%, подразумевается, что сохраняется примерно 20% остаточной биологической активности ADM, в случае блокирования биологической активности ADM не более чем 50%, подразумевается, что сохраняется примерно 50% остаточной биологической активности ADM.
Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас связывается с N-концевой областью (ак 1-21) человеческого адреномедуллина.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения объектом изобретения является антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас связывается с N-концом (ак 1) человеческого адреномедуллина.
Предпосылки создания изобретения
Пептид адреномедуллин (ADM) впервые был описан в 1993 г. (Kitamura К. и др., «Adrenomedullin: A Novel Hypotensive Peptide Isolated From Human Pheochromocytoma», Biochemical and Biophysical Research Communications, т. 192, 1993, cc. 553-560) в качестве нового обладающего гипотензивным действием пептида, состоящего из 52 аминокислот, который был выделен из человеческой феохромоцитомы; SEQ ID NO: 21. В этом же году были описаны также кДНК, кодирующая состоящий из 185 аминокислот пептид-предшественник, и полная аминокислотная последовательность указанного пептида-предшественника. Пептид-предшественник, который содержит, в том числе состоящую из 21 аминокислоты сигнальную последовательность на N-конце, обозначают также как «препроадреномедуллин» (пре-проADM). В настоящем описании все специально указанные аминокислотные положения соответствуют пре-проADM, который содержит 185 аминокислот. Пептид адреномедуллин (ADM) представляет собой пептид, который содержит 52 аминокислоты (SEQ ID NO: 21) и который содержит аминокислоты 95-146 пре-проADM, из которого он образуется в результате протеолитического расщепления. К настоящему времени более подробно охарактеризованы лишь несколько фрагментов из пептидных фрагментов, образовавшихся при расщеплении пре-проADM, в частности физиологически активные пептиды адреномедуллин (ADM) и «РАМР», пептид, содержащий 20 аминокислот (22-41), которые расположены после состоящего из 21 аминокислоты сигнального пептида в пре-проADM. Открытие и характеризация ADM в 1993 г. стимулировали интенсивные исследования, результаты которых обобщены в различных обзорных статьях, в контексте настоящего описания ссылка дана прежде всего, на статьи, представленные в выпуске «Peptides», посвященном, в частности, ADM («Adrenomedullin: from a pheochromocytoma to the eyes», под ред. Takahashi К., Peptides, т. 22, 2001, с. 1691, и Eto Т., «А review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides», Peptides, т. 22, 2001, cc. 1693-1711). В качестве дополнительного обзора можно упомянуть публикацию Hinson и др., «Adrenomedullin, а Multifunctional Regulatory Peptide», Endocrine Reviews, т. 21(2), 2000, cc. 138-167. В проведенных к настоящему времени научных исследованиях установлено, среди прочего, что ADM можно рассматривать в качестве многофункционального регуляторного пептида. Он высвобождается в кровоток в неактивной форме, удлиненной глицином (Kitamura К. и др., «The intermediate form of glycine-extended adrenomedullin is the major circulating molecular form in human plasma», Biochem. Biophys. Res. Commun., т. 244(2), 1998, сс. 551-555, только реферат). Обнаружен также связывающий белок (Pio R. и др., «Complement Factor Н is a Serum-binding Protein for adrenomedullin, and the Resulting Complex Modulates the Bioactivities of Both Partners», The Journal of Biological Chemistry, т. 276(15), 2001, сс. 12292-12300), который является специфическим в отношении ADM и вероятно также модулирует действие ADM. В проведенных к настоящему времени исследованиях в качестве наиболее важных физиологических действий ADM, а также РАМР, рассматривались их воздействия на кровяное давление.
Таким образом, ADM является эффективным вазодилататором, и возможно, что гипотензивное действие связано с конкретными пептидными сегментами в С-концевой области ADM. Установлено также, что указанный выше дополнительный физиологически активный пептид РАМР, образованный из пре-проADM, также обладает гипотензивной активностью, даже, если он, вероятно, имеет механизм действия, отличный от механизма ADM (см. помимо указанных выше обзорных статей Eto Т., «А review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides», Peptides, т. 22, 2001, cc. 1693-1711; и Hinson и др., «Adrenomedullin, a Multifunctional Regulatory Peptide», Endocrine Reviews, т. 21(2), 2000, сс. 138-167; см. также Kuwasako К. и др., «Purification and characterization of РАМР-12 (PAMP-20) in porcine adrenal medulla as a major endogenous biologically active peptide», FEBS Lett, т. 414(1), 1997, cc. 105-110, только реферат; и Kuwasaki К. и др., «Increased plasma proadrenomedullin N-terminal 20 peptide in patients with essential hypertension», Ann. Clin. Biochem., т. 36 (Pt. 5), 1999, сс. 622-628, только реферат; или Tsuruda Т. и др., «Secretion of proadrenomedullin N-terminal 20 peptide from cultured neonatal rat cardiac cells», Life Sci., т. 69(2), 2001, cc. 239-245, только реферат; и EP-A20622458). Кроме того, установлено, что концентрации ADM, которые удалось измерить в кровотоке и других биологических жидкостях, при ряде патологических состояний существенно превышают концентрации, обнаруженные у здоровых контрольных индивидуумов. Так, уровень ADM у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, инфарктом миокарда, заболеваниями почек, гипертензивными нарушениями, сахарным диабетом, острой фазой шока и сепсисом и септическим шоком существенно повышается, хотя и в различной степени. Концентрации РАМР также повышаются при некоторых указанных патологических состояниях, но его уровни в плазме ниже по сравнению с ADM (Eto Т., «А review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin и proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides», Peptides, т. 22, 2001, сс. 1693-1711; на с. 1702). Кроме того, известно, что необычно высокие концентрации ADM можно обнаружить при сепсисе, а наиболее высокие концентрации выявлены при септическом шоке (см. Eto Т., «А review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin и proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides», Peptides, т. 22, 2001, cc. 1693-1711; и Hirata и др., «Increased Circulating Adrenomedullin, a Novel Vasodilatory Peptide, in Sepsis», Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, т. 81(4), 1996, cc. 1449-1453, Ehlenz К. и др., «High levels of circulating adrenomedullin in severe illness: Correlation with C-reactive protein and evidence against the adrenal medulla as site of origin», Exp Clin Endocrinol Diabetes, т. 105, 1997, cc. 156-162, Tomoda Y. и др., «Regulation of adrenomedullin secretion from cultured cells», Peptides, т. 22, 2001, cc. 1783-1794; Ueda S. и др., «Increased Plasma Levels of Adrenomedullin in Patients with Systemic Inflammatory Response Syndrome», Am. J. Respir. Crit. Care Med., т. 160, 1999, cc. 132-136 и Wang P., «Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis», Peptides, т. 22, 2001, cc. 1835-1840).
Кроме того, в данной области известен метод идентификации иммунореактивности адреномедуллина в биологических жидкостях для диагностических целей, в частности, для диагностики сепсиса, диагностики сердечных нарушений и диагностики рака. Согласно изобретению срединный пептидный фрагмент (мид-региональный) проадреномедуллина, который содержит аминокислоты (45-92) полного препроадреномедуллина, оценивают количественно, в частности, с помощью иммуноанализа, для осуществления которого используют по меньшей мере одно меченое антитело, которое специфически распознает срединный проADM (WO 2004/090546).
В WO-A1 2004/097423 описано применение антитела к адреномедуллину для диагностики, прогнозирования и лечения сердечнососудистых нарушений. В данной области описано также лечение заболеваний путем блокирования ADM-рецептора (например, в WO-A1 2006/027147, РСТ/ЕР 2005/012844), при этом указанные заболевания могут представлять собой сепсис, септический шок, сердечнососудистые заболевания, инфекции, дерматологические заболевания эндокринные заболевания, метаболические заболевания, желудочно-кишечные заболевания, рак, воспаления, гематологические заболевания, респираторные заболевания, заболевания скелетно-мышечной системы, неврологические заболевания, урологические заболевания.
Известно, что на ранней фазе сепсиса ADM улучшает сердечную функцию и поставку крови в печень, селезенку, почку и тонкий кишечник. ADM-нейтрализующие антитела нейтрализуют указанные выше действия на ранней фазе сепсиса (Wang P., «Adrenomedullin and cardiovascular responses in sepsis», Peptides, т. 22, 2001, сс. 1835-1840).
На более поздней фазе сепсиса, гиподинамической фазе сепсиса, ADM представляет собой фактор риска, в значительной степени ассоциированный с гибелью пациентов при септическом шоке (Schiitz и др., «Circulating Precursor levels of endothelin-1 and adrenomedullin, two endothelium-derived, counteracting substances, in sepsis», Endothelium, 14, 2007, cc. 345-351). Методы диагностики и лечения пациентов на критической стадии болезни, например, на очень поздних фазах сепсиса, и применение эндотелина и агонистов эндотелина, обладающих сосудосуживающей активностью, для приготовления лекарственных средств, предназначенных для лечения пациентов на критической стадии болезни, описано в WO-A1 2007/062676. Кроме того, в WO-A1 2007/062676 описано применение вместо эндотелина и/или агонистов эндотелина или в сочетании с ними антагонистов адреномедуллина, т.е. молекул, которые предупреждают или ослабляют сосудосуживающее действие адреномедуллина, например, путем блокирования соответствующих ему рецепторов, или субстанций, которые предупреждают связывание адреномедуллина с его рецептором (например, специфические связывающие агенты, такие как антитела, которые связываются с адреномедуллином и блокируют сайты связывания его рецептора; «иммунологическая нейтрализация»). Указанное применение или комбинированное применение, включающее последовательное или предварительно разделенное применение, описано в определенных случаях как желательное, например, для повышения успеха терапии, или для избегания нежелательного физиологического стресса или побочных действий. Таким образом, известно, что нейтрализующие ADM антитела можно использовать для лечения сепсиса на поздней стадии сепсиса.
В данной области описано применение ADM в сочетании с ADM-связывающим белком-1 для лечения сепсиса и септического шока. Считается, что лечение страдающих сепсисом животных с помощью ADM и ADM-связывающего белка-1 препятствует переходу в более позднюю фазу сепсиса. Следует отметить, что в живом организме ADM-связывающий белок (фактор комплемента H) присутствует в кровотоке указанного организма в высоких концентрациях (Pio и др., «Identification, characterization, and physiological actions of factor H as an Adrenomedullin binding Protein present in Human Plasma» Microscopy Res. and Technique, 55, 2002, cc. 23-27 и Martinez и др., «Mapping of the Adrenomedullin - Binding domains in Human Complement factor H; Hypertens Res, т. 26, дополнение, 2003, cc. 56-59).
Согласно настоящему изобретению ADM-связывающий белок-1 можно обозначать также как белок-1, связывающий ADM (фактор комплемента H).
Таким образом, введение ADM может оказывать благоприятное действие на ранней стадии болезни, такой, например, как сепсис, но может оказывать вредное воздействие на более поздней стадии сепсиса. В случае введения антител к ADM может иметь место противоположное действие. Кроме того, при применении ADM или антител к ADM решающее значение может иметь дозирование.
В случае других болезней блокирование ADM может оказывать благоприятное действие до определенной степени. Однако полная нейтрализация ADM может также оказывать вредное воздействие, так как определенное количество ADM может требоваться для осуществления некоторых физиологических функций. Во многих публикациях подчеркивается, что введение ADM может быть полезным при некоторых болезнях. В противоположность этому, в других публикациях указывается, что при некоторых обстоятельствах введение ADM может быть опасно для жизни. Известные из существующего уровня техники проблемы можно преодолевать с помощью антител к ADM или фрагментов антител к ADM, или анти-ADM не-Ig каркасов, предлагаемых в настоящем изобретении.
Описание изобретения
Объектом изобретения является антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к ADM, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с адреномедуллином, предназначенные для применения в качестве лекарственного средства, при этом указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой не обладающее/не обладающий нейтрализующей активностью антитело или фрагмент, или каркас (не нейтрализующее/не нейтрализующий антитело или фрагмент, или каркас).
Согласно изобретению «антитела» или «фрагменты антител», или «не-Ig каркасы», предлагаемые в изобретении, обладают способностью связываться с ADM и, таким образом, направлены против ADM, поэтому их можно обозначать как «анти-ADM антитела», «анти-ADM фрагменты антител» или «анти-ADM не-Ig каркасы».
В другом варианте осуществления изобретения антитела к ADM, фрагменты антител к ADM или анти-ADM не-Ig каркасы, представленные в настоящем описании, могут связываться с находящимся в кровотоке (циркулирующим) ADM, и, таким образом, направлены против циркулирующего ADM.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело к ADM, фрагмент антитела к ADM или анти-ADM не-Ig каркас представляют собой не нейтрализующее/не нейтрализующий антитело, фрагмент или не-Ig каркас. Нейтрализующее антитело к ADM, фрагмент антитела к ADM или анти-ADM не-Ig каркас может блокировать биологическую активность ADM примерно на 100%, по меньшей мере более чем на 90%, предпочтительно по меньшей мере более чем на 95%.
В противоположность этому не нейтрализующее/не нейтрализующий антитело к ADM, фрагмент антитела к ADM или анти-ADM не-Ig каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 100%, предпочтительно менее чем на 95%, предпочтительно менее чем на 90%, более предпочтительно менее чем на 80% и еще более предпочтительно менее чем на 50% (относительно основного уровня). Это означает, что остаточная биологическая активность ADM, связанного с не нейтрализующим антителом к ADM, фрагментом антитела к ADM или анти-ADM не-Ig каркасом, должна сохраняться на уровне, превышающем 0%, предпочтительно превышающем 5%, предпочтительно превышающем 10%, более предпочтительно превышающем 20%, более предпочтительно превышающем 50%. Это означает, что блокирование биологической активности ADM составляет не более 80% или не более 50% соответственно, и поэтому должно рассматриваться как ограниченное блокирование биологической активности ADM соответствующим связывающим ADM агентом, таким как антитело к ADM, фрагмент антитела к ADM или анти-ADM не-Ig каркас.
Следует иметь в виду, что указанное ограниченное блокирование биологической активности ADM имеет место даже при избыточной концентрации антитела, фрагмента антитела или не-Ig каркаса, то есть избытка антитела, фрагмента или каркаса относительно ADM. Указанное ограниченное блокирование является свойством, присущим самому связывающему ADM агенту. Это означает, что указанное антитело, указанный фрагмент или каркас обеспечивает максимальное ингибирование, составляющее 80% или 50% соответственно. В приведенном в качестве примера варианте осуществления изобретения указанное антитело к ADM, указанный фрагмент антитела к ADM или указанный анти-ADM не-Ig каркас может блокировать биологическую активность ADM по меньшей мере на 5%. Это означает по смыслу, что сохраняется примерно 95% остаточной биологической активности ADM.
Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, предназначенное/предназначенный для применения при лечении хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой
½
- стабилизирующее ADM антитело или стабилизирующий ADM фрагмент антитела к адреномедуллину, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на 100%, и/или
- где указанное антитело или указанный фрагмент антитела к адреномедуллину блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, предназначенное/предназначенный для применения при лечении хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент связывается с N-концевой областью (ак 1-21) человеческого адреномедуллина.
Предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, предназначенное/предназначенный для применения при лечении хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент связывается с N-концом человеческого адреномедуллина.
В этом контексте молекула(ы), представляющая(ие) собой антитело или фрагмент антитела, или не-Ig каркас, которые «не обладают нейтрализующей анти-ADM активностью», для простоты обозначенные в совокупности в настоящем описании как «не нейтрализующее»/«не нейтрализующий» антитело к ADM, фрагмент антитела или не-Ig каркас, которое/который, например, блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, определяют как
- молекулу или молекулы, связывающуюся(иеся) с ADM, которая(ые) при добавлении в культуру линии эукариотических клеток, экспрессирующих функциональный человеческий рекомбинантный ADM-рецептор, состоящий из CRLR (рецептор, подобный рецептору кальцитонина) и RAMP3 (модифицирующий активность рецептора белок 3), снижает(ют) количество цАМФ, продуцируемого клеточной линией под действием параллельно добавляемого пептида человеческого синтетического ADM, где указанный добавляемый человеческий синтетический ADM вносят в количестве, которое в отсутствии анализируемого не нейтрализующего антитела приводит к стимуляции синтеза цАМФ, составляющей половину от максимальной, где снижение уровня цАМФ указанной(ыми) молекулой(ами), связывающейся(имися) с ADM, достигает уровня, не превышающего 80%, даже в том случае, когда анализируемую(ые) не нейтрализующую(ие) молекулу(ы), связывающуюся(иеся) с ADM, добавляют в количестве, превышающем в 10 раз количество, необходимое для достижения максимального снижения синтеза цАМФ, которое можно получать с помощью анализируемого не нейтрализующего антитела.
Указанное определение применимо и к другим диапазонам: 95%, 90%, 50% и т.д.
Биологическую активность определяют как действие, которое оказывает субстанция на живой организм или ткань или орган или функциональную единицу in vivo или in vitro (например, в анализе) после взаимодействия с ними. В случае определения биологической активности ADM это может быть воздействие ADM в функциональном анализе цАМФ в присутствии человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина. Таким образом, согласно настоящему изобретению биологическую активность определяют с помощью функционального анализа цАМФ в присутствии рецептора адреномедуллина. Для определения биологической активности ADM с помощью указанного анализа можно осуществлять следующие стадии:
- Получают кривую дозовой зависимости для ADM с использованием функционального анализа цАМФ в присутствии человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина.
- Можно рассчитывать концентрацию ADM, вызывающую стимуляцию цАМФ, составляющую половину от максимальной.
- При постоянных концентрациях ADM, вызывающих стимуляцию цАМФ, составляющую половину от максимальной, получают кривые дозовой зависимости (применяя конечную концентрацию вплоть до 100 мкг/мл) при применении стабилизирующего ADM антитела или стабилизирующего адреномедуллин фрагмента антитела или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса соответственно.
В этом анализе биологической активности ADM максимальное ингибирование, составляющее 50%, означает, что указанное антитело к ADM или указанный фрагмент антитела к адреномедуллину, или указанный антиадреномодуллиновый не-Ig каркас соответственно блокирует до 50% биологической активности относительно основных уровней. В этом анализе биологической активности ADM максимальное ингибирование, составляющее 80%, означает, что указанное антитело к ADM или указанный фрагмент антитела к адреномедуллину, или указанный антиадреномодуллиновый не-Ig каркас соответственно блокирует до 80% биологической активности. Это подразумевает, что блокирование биологической активности ADM достигает не более 80%. Это означает, что сохраняется примерно 20% остаточной биологической активности ADM.
Однако в настоящем описании и в приведенном выше контексте выражение «блокирует биологическую активность ADM» касательно указанных в настоящем описании антител к ADM, фрагментов антител к ADM и анти-ADM не-Ig каркасов следует понимать только как снижение биологической активности ADM, предпочтительно снижение биологической активности циркулирующего ADM с 100% с сохранением минимум 20% остаточной биологической активности ADM, предпочтительно снижение биологической активности ADM с 100% с сохранением 50% остаточной биологический биологической активности ADM; но в любом случае должен сохраняться такой уровень биологической активности ADM, который можно определять с помощью подробно описанного выше анализа.
Биологическую активность ADM можно определять с помощью функционального анализа цАМФ в присутствии человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина (биоанализ адреномедуллина), который описан в примере 2.
Антитело к адреномедуллину (ADM) представляет собой антитело, которое специфически связывается с ADM, фрагмент антитела к адреномедуллину представляет собой фрагмент антитела к ADM, при этом указанный фрагмент специфически связывается с ADM. Анти-ADM не-Ig каркас представляет собой не-Ig каркас, который специфически связывается с ADM. Специфическое связывание с ADM допускает связывание также и с другими антигенами. Это означает, что указанная специфичность не должна исключать того, что антитело может давать перекрестную реакцию с другими полипептидами, отличными от тех, к которым оно выработалось. Указанное относится также к специфичности фрагмента антитела к ADM или анти-ADM не-Ig каркаса, предлагаемого в изобретении.
При создании изобретения неожиданного было установлено, что не нейтрализующие антитела к ADM или не нейтрализующие фрагменты антител к ADM, или не нейтрализующие анти-ADM не-Ig каркасы обладают выраженным терапевтическим преимуществом по сравнению с обладающими нейтрализующим действием субстанциями.
½
Согласно одному из конкретных вариантов осуществления изобретения предпочтительным является применение антитела к ADM или фрагмента антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркаса, предлагаемого в настоящем изобретении, если указанное антитело к адреномедуллину или указанный фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас представляет собой стабилизирующее ADM антитело или стабилизирующий адреномедуллин фрагмент антитела, или стабилизирующий адреномедуллин не-Ig каркас, которое/который удлиняет время полужизни (t, т.е. время полуудержания) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
Время полужизни (время полуудержания) ADM можно определять в человеческой плазме в отсутствии или в присутствии стабилизирующего ADM антитела или стабилизирующего адреномедуллин фрагмента антитела, или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса соответственно, используя иммуноанализ для количественной оценки ADM.
Можно осуществлять следующие стадии:
- ADM можно разводить в человеческой цитратной плазме в отсутствии или в присутствии стабилизирующего ADM антитела или стабилизирующего адреномедуллин фрагмента антитела, или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса соответственно и можно инкубировать при 24°C.
- В выбранные моменты времени (например, в течение периода времени, составляющего 24 ч) отбирают аликвоты и расщепление ADM в указанных аликвотах можно прекращать путем замораживания при -20°C.
- Количество ADM можно определять непосредственно с помощью иммуноанализа hADM, если на выбранный анализ не влияет стабилизирующее антитело. Альтернативно этому, аликвоты можно обрабатывать денатурирующими агентами (типа HCl) и после очистки образца (например, центрифугированием) значение pH можно нейтрализовать и определять количество ADM с помощью иммуноанализа ADM. Альтернативно этому, для количественной оценки ADM можно применять технологии, не основанные на использовании иммуноанализа (например, ОФ-ЖХВР).
- Время полужизни ADM рассчитывают для ADM, инкубированного в отсутствии и присутствии стабилизирующего ADM антитела или стабилизирующего адреномедуллин фрагмента антитела, или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса соответственно.
- Удлинение времени полужизни рассчитывают для стабилизированного ADM в сравнении с ADM, который инкубировали в отсутствии стабилизирующего ADM антитела или стабилизирующего адреномедуллин фрагмента антитела, или стабилизирующего адреномедуллин не-Ig каркаса соответственно.
Двукратное увеличение времени полужизни ADM представляет собой удлинение времени полужизни на 100%.
Время полужизни (время полуудержания) определяют как период, во время которого концентрация конкретного химического соединения или лекарственного средства снижается наполовину по сравнению с исходной концентрацией, определенной в общей воде организма или крови.
Анализ, который можно применять для определения времени полужизни (времени полуудержания) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме, описан в примере 3.
1
2
3
4
2
Антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, представляет собой белок, включающий один или несколько специфически связывающихся с антигеном полипептидов, которые кодируются в основном генами иммуноглобулинов. Известные гены иммуноглобулинов включают гены константных областей каппа, лямбда, альфа (IgA), гамма (IgG, IgG, IgG, IgG), дельта (IgD), эпсилон (IgE) и мю (IgM), а также множество генов вариабельных областей иммуноглобулина. Полноразмерные легкие цепи иммуноглобулинов, как правило, имеют молекулярную массу примерно 25 кДа или длину 214 аминокислот. Полноразмерные тяжелые цепи иммуноглобулинов, как правило, имеют молекулярную массу примерно 50 кДа или длину 446 аминокислот. Легкие цепи кодируются геном вариабельной области на NH-конце (длиной примерно 110 аминокислот) и геном константной области каппа или лямбда на СООН-конце. Аналогично этому, тяжелые цепи кодируются геном вариабельной области (длиной примерно 116 аминокислот) и одним из указанных генов константной области.
2
Основной структурной единицей антитела, как правило, является тетрамер, который состоит из двух идентичных пар цепей иммуноглобулина, каждая пара включает одну легкую и одну тяжелую цепь. В каждой паре вариабельные области легкой и тяжелой цепи связываются с антигеном, а константные области опосредуют эффекторные функции. Иммуноглобулины могут также находиться в виде широкого разнообразия других форм, включая, например, Fv, Fab и F(ab'), а также в виде бифункциональных гибридных антител и одноцепочечных антител (см., например, Lanzavecchia и др., Eur. J. Immunol. 17, 1987, с. 105; Huston и др., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 1988, cc. 5879-5883; Bird и др., Science 242, 1988, cc. 423-426; Hood и др., Immunology, Benjamin, N.Y., 2-ое изд., 1984; Hunkapiller и Hood, Nature 323, 1986, cc. 15-16). Вариабельная область легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина включает каркасную область, прерывающуюся тремя гипервариабельными участками, которые называют также определяющими комплементарность участками (CDR) (см., Sequences of Proteins of Immunological Interest, E. Kabat и др., изд-во U.S. Department of Health and Human Services, 1983). Как указано выше, за связывание с эпитопом антигена ответственны прежде всего CDR. Иммунный комплекс представляет собой антитело, такое как моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или человеческое антитело, или функциональный фрагмент антитела, специфически связанное/связанный с антигеном.
Химерные антитела представляют собой антитела, гены легких и тяжелых цепей которых созданы, как правило, с помощью генной инженерии, из генов вариабельных и константных областей иммуноглобулинов, которые принадлежат различным видам. Например, вариабельные сегменты генов из мышиного моноклонального антитела можно соединять с человеческими константными сегментами, такими как каппа и гамма 1 или гамма 3. Так, в качестве одного из примеров, терапевтическое химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из вариабельного или антигенсвязывающего домена из мышиного антитела и константного или эффекторного домена из человеческого антитела, хотя можно применять и другие виды млекопитающих, или вариабельную область можно получать с помощью методик молекулярной биологии. Методы создания химерных антител хорошо известны в данной области (см., например, U.S. №5807715). «Гуманизированный» иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин, включающий человеческую каркасную область и один или несколько CDR из нечеловеческого (например, мышиного, крысиного или синтетического) иммуноглобулина. Нечеловеческий иммуноглобулин, являющийся источником CDR, называют «донором», а человеческий иммуноглобулин, являющийся источником каркасной области, называют «акцептором». В одном из вариантов осуществления изобретения в гуманизированном иммуноглобулине все CDR получают из иммуноглобулина-донора. Присутствие константных областей не является обязательным, но если они имеются, то они должны быть практически идентичны константным областям человеческих иммуноглобулинов, т.е. идентичны по меньшей мере примерно на 85-90%, например, примерно на 95% или более. Таким образом, все части гуманизированного иммуноглобулина, возможно за исключением CDR, практически идентичны соответствующим частям встречающихся в естественных условиях последовательностей человеческого иммуноглобулина. «Гуманизированное антитело» представляет собой антитело, содержащее гуманизированную легкую цепь и гуманизированную тяжелую цепь иммуноглобулина. Гуманизированное антитело связывается с тем же антигеном, что и антитело-донор, которое является источником CDR. Акцепторный каркасный участок гуманизированного иммуноглобулина или антитела может иметь ограниченное количество замен аминокислот, полученных из донорского каркасного участка. Гуманизированные или другие моноклональные антитела могут иметь дополнительные консервативные аминокислотные замены, которые практически не влияют на связывание антигена или другие функции иммуноглобулина. Примерами консервативных замен являются такие замены, как gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; и phe, tyr. Гуманизированные иммуноглобулины можно конструировать с помощью технологий генной инженерии (см., например, U.S. №5585089). Человеческое антитело представляет собой антитело, в котором гены легких и тяжелых цепей имеют человеческое происхождение. Человеческие антитела можно создавать с помощью методов, известных в данной области. Человеческие антитела могут продуцироваться иммортализованной человеческой В-клеток, секретирующей представляющее интерес антитело. Иммортализацию можно осуществлять, например, путем заражения EBV или путем слияния человеческой B-клетки с клеткой миеломы или гибридомы с получением клетки триомы. Человеческие антитела можно получать также с помощью методов фагового дисплея (см., например, Dower и др., публикация РСТ WO 91/17271; McCafferty и др., публикация РСТ WO 92/001047; и Winter, публикация РСТ WO 92/20791) или отбирать из человеческой комбинаторной библиотеки моноклональных антител (см. веб сайт Morphosys). Человеческие антитела можно получать также, используя трансгенных животных, которые несут гены человеческого иммуноглобулина (см., например, Lonberg и др., публикация РСТ WO 93/12227; и Kucherlapati, публикация РСТ WO 91/10741).
Таким образом, антитело к ADM может иметь форматы, известные в данной области. Примерами являются человеческие антитела, моноклональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с трансплантированными CDR. В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, представляют собой полученные методами рекомбинации антитела, такие как IgG, как правило, полноразмерный иммуноглобулин, или фрагменты антител, содержащие по меньшей мере F-(фрагмент) вариабельного домена тяжелой и/или легкой цепи, например, химические сшитые антитела (антигенсвязывающий фрагмент), включая (но, не ограничиваясь только ими) Fab-фрагменты, в том числе Fab минител (минибоди), антитело в виде одноцепочечного Fab, антитело в виде одновалентного Fab с эпитопными метками, например Fab-V5Sx2; двухвалентный Fab (миниантитело), димеризованный с помощью СН3-домена; двухвалентный Fab или мультивалентный Fab, например, полученный путем мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, путем димеризации dHLX-доменов, например, Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные мультивалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические димерные антитела (диабоди), BITE (биспецифические, привлекающие Т-клетки антитела, т.е. антитела, связывающиеся одновременно с антигеном клетки-мишени и Т-клеточным антигеном), трехфункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из класса, отличного G; однодоменные антитела, например, нанотела (нанободи), выведенные из представителей верблюдовых или рыб иммуноглобулины, и многие другие форматы.
Помимо антител к ADM, в данной области хорошо известны другие биополимерные каркасы, которые образуют комплекс с молекулой-мишенью, и они нашли применение для создания биополимеров, обладающих высокой специфичностью в отношении мишеней. Их примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины. Иллюстрации форматов представлены на фиг. 1а, 1б и 1в.
2
В предпочтительном варианте осуществления изобретения формат антитела к ADM выбирают из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, F(ab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения формат антитела выбирают из группы, включающей scFab-фрагмент, Fab-фрагмент, scFv-фрагмент и их оптимизированные с позиций биодоступности конъюгаты, такие как ПЭГилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является формат scFab.
He-Ig каркасы могут представлять собой белковые каркасы и их можно применять в качестве миметиков антител, поскольку они обладают способностью связываться с лигандами или антигенами. He-Ig каркасы можно выбирать из группы, включающей не-Ig каркасы на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), фибронектиновые каркасы (например, описанные в EP 1266025); каркасы на основе липокалина (например, описанные в WO 2011/154420); убикитиновые каркасы (например, описанные в WO 2011/073214), трансферриновые каркасы (например, описанные в US 2004/0023334), каркасы на основе белка A (например, описанные в EP 2231860), каркасы на основе анкириновых повторов каркасы (например, описанные в WO 2010/060748), каркасы на основе микропротеинов (предпочтительно микропротеинов, образующие «цистиновый узел») (например, описанные в EP 2314308), каркасы на основе SH3-домена киназы Fyn (например, описанные в WO 2011/023685) каркасы на основе EGFR-A-домена (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе Kunitz-домена (например, описанные в EP 1941867).
Согласно одному из предпочтительных вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, можно получать следующим образом:
Мышей линии Balb/c иммунизировали с помощью 100 мкг конъюгата ADM-пептид-БСА в день 0 и 14 (эмульгированого в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг в день 21 и 28 (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За три дня до осуществления эксперимента по слиянию животным вводили с помощью одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл физиологического раствора.
Осуществляли слияние спленоцитов, взятых из иммунизированной мыши, и клеток миеломы линии SP2/0 в присутствии 1 мл 50%-ного полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°C. После отмывки клетки высевали в 96-луночные планшеты для культуры клеток. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в НАТ-среде [культуральная среда RPMI 1640, дополненная 20% фетальной телячьей сыворотки и дополненная HAT (гипоксантин-аминоптерин-тимидин)]. Через 2 недели НАТ-среду заменяли НТ-средой, осуществляя три пассажа, а затем возвращали стандартную среду для культуры клеток.
Супернатанты клеточной культуры сначала подвергали скринингу в отношении антигенспецифических антител класса IgG через три недели после слияния. Положительные по данным теста культуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования выбранные культуры клонировали и повторно клонировали, используя метод серийных разведений, и определяли изотипы (см. также Lane R.D., «A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas», J. Immunol. Meth. 81, 1985, cc. 223-228; Ziegler B. и др., «Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies», Horm. Metab. Res. 28, 1996, cc. 11-15).
Антитела можно получать с помощью фагового дисплея согласно следующей процедуре:
Для выделения рекомбинантных одноцепочечных фрагментов вариабельной области (scFv) к пептиду адреномедуллина использовали библиотеки человеческих наивных генов антител HAL7/8. Библиотеки генов антител подвергали скринингу, используя стратегию пэннинга, заключающуюся в применении пептидов, которые содержали биотиновую метку, сцепленную через два различных спейсера с последовательность пептида адреномедуллина. Для минимизации фона неспецифических связывающих агентов применяли комбинацию циклов пэннинга с использованием неспецифически связанного антигена и связанного со стрептавидином антигена. Фаги, элюированные после третьего цикла паэннинга, применяли для получения экспрессирующих моноклональный scFv штаммов E. coli. Для оценки антигена с помощью ELISA применяли непосредственно супернатанты, полученные после культивирования указанных клональных штаммов (см. также Hust М., Meyer Т., Voedisch В., Riilker Т., Thie Н., El-Ghezal A., Kirsch M.L, Schütte М., Helmsing S., Meier D., Schirrmann Т., Dübel S., «A human scFv antibody generation pipeline for proteome research», Journal of Biotechnology 152, 2011, cc. 159-170; Schütte M., Thullier P., Pelat Т., Wezler X., Rosenstock P., Hinz D., Kirsch M.L, Hasenberg M., Frank R., Schirrmann Т., Gunzer M., Hust M., Dübel S., «Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus», PLoS One 4, e6625, 2009).
Гуманизацию мышиных антител можно осуществлять с помощью следующей процедуры: Для гуманизации антитела мышиного происхождения последовательность антитела анализируют в отношении структурных взаимодействий каркасных участков (FR) с гипервариабельным участками (CDR) и антигеном. На основе структурного моделирования отбирают соответствующий FR человеческого происхождения и мышиные последовательности CDR трансплантируют в человеческий FR. Можно интродуцировать вариации в аминокислотную последовательность CDR- или FR-участков для восстановления структурных взаимодействий, которые были элиминированы в результате видовой замены для FR-последовательностей. Для достижения указанного восстановления структурных взаимодействий можно применять неспецифический подход, основанный на использовании фаговых дисплейных библиотек или направленный подход на основе молекулярного моделирования (Almagro J.С, Fransson J., «Humanization of antibodies», Front Biosci., 13, 1 января 2008 г., cc. 1619-1633).
2
В предпочтительном варианте осуществления изобретения формат антитела к ADM выбирают из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, A(ab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения формат антитела выбирают из группы, включающей scFab-фрагмент, Fab-фрагмент, scFv-фрагмент и их оптимизированные с позиций биодоступности конъюгаты, такие как ПЭГилированные фрагменты. Одним из наиболее предпочтительных форматов является формат scFab.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело к ADM, фрагмент антитела к ADM или анти-ADM не-Ig каркас представляет собой полноразмерное антитело, полноразмерный фрагмент антитела или не-Ig каркас.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас направлены на эпитоп, который содержится в ADM, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот, и могут связываться с ним.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас направлены на эпитоп, который содержится в ADM, состоящий по меньшей мере из 4 аминокислот, и могут связываться с ним.
Одним из конкретных вариантов осуществления изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM), связывающееся с адреномедуллином, или фрагмент антитела к ADM, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с адреномедуллином, предназначенные для применения в качестве лекарственного средства, где указанные антитело или фрагмент, или каркас не представляет собой ADM-связывающий белок - 1 (фактор комплемента H).
Одним из конкретных вариантов осуществления изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM), связывающееся с адреномедуллином, или фрагмент антитела к ADM, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с адреномедуллином, предназначенные для применения в качестве лекарственного средства, где указанные антитело или фрагмент, или не-Ig каркас связывается с областью, состоящей предпочтительно по меньшей мере из 4 или по меньшей мере из 5 аминокислот, которая расположена в последовательности ак 1-42 зрелого человеческого ADM:
Одним из конкретных вариантов осуществления изобретения является антитело к адреномедуллину (ADM), связывающееся с адреномедуллином, или фрагмент антитела к ADM, связывающийся с адреномедуллином, или анти-ADM не-Ig каркас, связывающийся с адреномедуллином, предназначенные для применения в качестве лекарственного средства, где указанные антитело или фрагмент, или каркас связывается с областью, состоящей предпочтительно по меньшей мере из 4 или по меньшей мере из 5 аминокислот, которая расположена в последовательности ак 1-21 зрелого человеческого ADM:
Таким образом, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное антитело к ADM или указанный фрагмент антитела к ADM, или указанный анти-ADM не-Ig каркас связывается с областью ADM, которая локализована в N-концевом участке (ак 1-21) адреномедуллина (см. фиг. 2).
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанное антитело к адреномедуллину или указанный фрагмент антитела к ADM, или указанный анти-ADM не-Ig каркас распознает и связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина. Это означает, что находящаяся на N-конце аминокислота 1, представляющая собой «Y» в SEQ ID NO: 21 или SEQ ID NO: 23, является обязательной для связывания антитела. Указанное антитело к ADM или фрагмент антитела к ADM или анти-ADM не-Ig каркас не должны связываться ни с удлиненным на N-конце, ни с модифицированным на N-конце адреномедуллином, ни с расщепленным на N-конце адреномедуллином.
½
Предпочтительно также применять антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, предлагаемые в настоящем изобретении, если указанное антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину представляет собой стабилизирующее ADM антитело или стабилизирующий ADM фрагмент антитела к адреномедуллину, которое/который удлиняет время t, т.е. время полуудержания адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%. Анализ, который можно использовать для определения времени полуудержания адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме, описан в примере 3.
Предпочтительно также применять антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, предлагаемые в настоящем изобретении, если указанное антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
½
В предпочтительном варианте осуществления изобретения модулирующее антитело или моделирующий фрагмент антитела к адреномедуллину применяют для лечения сепсиса. Модулирующее антитело или модулирующий фрагмент антитела к адреномедуллину повышает биологическую активность ADM на ранней фазе сепсиса и снижает повреждающие действия ADM на поздней фазе сепсиса. «Модулирующее» антитело или «модулирующий» фрагмент антитела к адреномедуллину представляет собой антитело или фрагмент антитела к адреномедуллину, которое/который удлиняет время t, т.е. время полуудержания адреномедуллина в сыворотке, крове, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100% и блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело к ADM или фрагмент антитела к ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, предлагаемое/предлагаемый в изобретении, не связывается с C-концевой областью ADM, т.е. с ак 43-52 ADM
В конкретном варианте осуществления изобретения модулирующее антитело к ADM или модулирующий фрагмент антитела к адреномедуллину, или модулирующий анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, применяют для обработки индивидуумов с целью предупреждения или лечения заболеваний или состояний, например, применяют для профилактики или терапии хронического или острого заболевания или острого состояния у индивидуума.
Указанное модулирующее антитело к ADM или указанный модулирующий фрагмент антитела к адреномедуллину, или указанный модулирующий анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас наиболее предпочтительно можно применять для лечения сепсиса. Модулирующее антитело к ADM или модулирующий фрагмент антитела к адреномедуллину, или модулирующий анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас повышает биологическую активность ADM на ранней фазе сепсиса и снижает повреждающие действия ADM на поздней фазе сепсиса.
½
«Модулирующее» антитело или «модулирующий» фрагмент антитела к адреномедуллину или «модулирующий» анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас представляет собой антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас, которое/который удлиняет время полужизни (t, т.е. время полуудержания) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100% и блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50% и при этом, после блокирования сохраняется по меньшей мере 5% биологической активности ADM. Подразумевается, что количественные параметры времени полужизни и блокирования относятся к количественным параметрам, полученным с использованием вышеописанных анализов. Подразумевается, что модулирующее антитело или модулирующий фрагмент антитела к адреномедуллину, или модулирующий анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас представляет собой антитело, фрагмент или не-Ig каркас, которое/который связывается с ADM.
Следует понимать, что при блокировании биологической активности ADM не более чем на 80% подразумевается, что остаточная биологическая ADM составляет 20%. Аналогично этому, при блокировании биологической активности ADM не более чем на 50% остаточная биологическая активность ADM составляет 50%.
Объектом настоящего изобретения является антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой
½
- стабилизирующее ADM антитело или стабилизирующий адреномедуллин фрагмент антитела или стабилизирующий ADM не-Ig каркас, которое/который удлиняет время полудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на 100%, и/или
- при этом указанное антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или указанный анти-ADM не-Ig каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
Вышеуказанное означает, что блокирование биологической активности ADM не превышает 80% или не превышает 50% соответственно, и это рассматривается как ограниченное блокирование биологической активности ADM соответствующим связывающим ADM агентом, представляющим собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент антитела, или каркас соответственно.
Преимуществом указанного модулирующего антитела или модулирующего фрагмента антитела к адреномедуллину или модулирующего анти-адреномедуллинового не-Ig каркаса является то, что их дозирование при применении является более легким. Комбинация частичного блокирования или частичного снижения биологической активности адреномедуллина и удлинения времени полужизни in vivo (повышение биологической активности адреномедуллина) обеспечивает обладающую преимуществом простоту дозирования антитела к адреномедуллину или фрагмента антитела к адреномедуллину или анти-адреномедуллинового не-Ig каркаса. В ситуации, когда имеет место избыток эндогенного адреномедуллина (максимальная стимуляция, поздняя фаза сепсиса, шок, гиподинамическая фаза), активность, выражающаяся в понижающем действии, является основным воздействием антитела или фрагмента, или каркаса, ограничивающим (отрицательное) действие адреномедуллина. В случае присутствия низких или нормальных концентраций эндогенного адреномедуллина биологическое действие антитела к адреномедуллину или фрагмента антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркаса представляет собой комбинацию снижения (путем частичного блокирования) и увеличения (путем удлинения времени полужизни адреномедуллина) активности. Если воздействие, зависящее от времени полужизни, является более сильным, чем блокирующее действие, то чистая биологическая активность эндогенного адреномедуллина повышается, что является благоприятным на ранних фазах сепсиса (низкий уровень адреномедуллина, гипердинамическая фаза). Таким образом, не нейтрализующее и модулирующее антитело к адреномедуллину или не нейтрализующий и модулирующий фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-адреномедуллиновый не-Ig каркас действует подобно буферу биологической активности ADM для поддержания биологической активности ADM в определенном физиологическом диапазоне.
Таким образом, дозы антитела/фрагмента/каркаса, например, при сепсисе, можно выбирать из избыточных концентраций, поскольку в случае модулирующего эффекта избыток антитела к ADM или фрагмента антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркаса оказывает благоприятное действие на лечение на обеих фазах сепсиса (ранняя и поздняя фаза). Избыток (избыточное количество) означает следующее: концентрация антитела к адреномедуллину или фрагмента антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркаса выше, чем концентрация эндогенного адреномедуллина во время поздней фазы (шок), например, сепсиса. Это подразумевает, что в случае модулирующего антитела или модулирующего фрагмента антитела, или модулирующего не-Ig каркаса можно применять следующие дозы:
Концентрация адреномедуллина при септическом шоке составляет 226±66 фмолей/мл (Nishio и др., «Increased plasma concentrations of adrenomedullin correlate with relaxation of vascular tone in patients with septic shock», Crit Care Med., 25(6), 1997, cc. 953-957), эквимолярная концентрация антитела или фрагмента, или каркаса составляет 42,5 мкг/л крови, (исходя из объема крови 6 л/веса тела 80 кг) 3,2 мкг/кг веса тела. Избыток означает по меньшей мере удвоенную (в среднем) концентрацию по сравнению с концентрацией адреномедуллина при септическом шоке, по меньшей мере, составляющую >3 мкг антитела к адреномедуллину или фрагмента антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркаса/кг веса тела, предпочтительно по меньшей мере 6,4 мкг антитела к адреномедуллину или фрагмента антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркаса/кг веса тела. Предпочтительной является концентрация >10 мкг/кг, более предпочтительной >20 мкг/кг, наиболее предпочтительно >100 мкг антитела к адреномедуллину или фрагмента антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркаса/кг веса тела.
Вышеуказанное можно отнести также к другим серьезным и острым состояниям, отличным от септического шока.
Кроме того, согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас является моноспецифическим. Моноспецифическое антитело к адреномедуллину (ADM) или моноспецифический фрагмент антитела к адреномедуллину, или моноспецифический анти-ADM не-Ig каркас означает, что указанное антитело или указанный фрагмент антитела, или указанный не-Ig каркас связывается с одной конкретной областью, которая состоит предпочтительно по меньшей мере из 4 или по меньшей мере из 5 аминокислот в ADM-мишени. Моноспецифическое антитело к адреномедуллину (ADM) или моноспецифический фрагмент антитела к адреномедуллину или моноспецифический анти-ADM не-Ig каркас представляют собой антитела к адреномедуллину (ADM) или фрагменты антител к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркасы, которые все обладают аффинностью к одному и тому же антигену. В другом конкретном варианте осуществления изобретения антитело к ADM или фрагмент антитела, связывающийся с ADM, представляет собой моноспецифическое антитело. Моноспецифический означает, что указанное антитело или указанный фрагмент связывается с одной конкретной областью, которая состоит предпочтительно по меньшей мере из 4 или предпочтительно по меньшей мере из 5 аминокислот в ADM-мишени. Моноспецифические антитела или фрагменты представляют собой антитела или фрагменты, которые все обладают аффинностью к одному и тому же антигену. Моноклональные антитела являются моноспецифическими, но моноспецифические антитела можно получать также путями, отличными от тех, которые применяют для их получения из общей зародышевой клетки.
В конкретном варианте осуществления изобретения антитело представляет собой моноклональное антитело или его фрагмент. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к ADM или фрагмент антитела к ADM представляет собой человеческое или гуманизированное антитело или его производное, в одном конкретном варианте осуществления изобретения один или несколько (мышиных) CDR трансплантируют в человеческое антитело или фрагмент антитела.
Одним из объектов настоящего изобретения является человеческое антитело с трансплантированным CDR или фрагмент указанного антитела, которое/который связывается с ADM, где человеческое антитело с трансплантированным CDR или фрагмент указанного антитела содержит тяжелую цепь антитела (Н-цепь), содержащую:
и/или дополнительно содержит легкую цепь антитела (L-цепь), содержащую:
Одним из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения является человеческое моноклональное антитело, которое связывается с ADM, или фрагмент указанного антитела, в котором тяжелая цепь содержит по меньшей мере один CDR, выбранный из группы, включающей:
и в котором легкая цепь содержит по меньшей мере один CDR, выбранный из группы, включающей:
Более конкретным вариантом осуществления изобретения является человеческое моноклональное антитело, которое связывается с ADM, или фрагмент указанного антитела, в котором тяжелая цепь содержит последовательности
и в котором легкая цепь содержит последовательности
В еще более конкретном варианте осуществлении изобретения антитело к ADM имеет последовательность, выбранную из группы, включающей: SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14.
-7
-8
-9
-10
Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, обладает аффинностью к человеческому ADM, а именно аффинностью, превышающей 10 M, предпочтительно 10 M, предпочтительно аффинностью, превышающей 10 M, наиболее предпочтительно превышающей 10 M. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что можно компенсировать более низкую аффинность путем применения соединений в более высокой дозе, и что эту меру не следует рассматривать как выходящую за пределы объема изобретения. Константы аффинности можно определять согласно методу, описанному в примере 1.
Антитела или фрагменты, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в комбинации с другими агентами, такими, например, как так называемый ADM-связывающий белок, согласно представленным в настоящем описании вариантам применения.
Подразумевается, что понятие «ADM-связывающий белок» относится к ADM-связывающему белку-1 (фактор комплемента H), который при этом не представляет собой не нейтрализующее и/или модулирующее антитело к ADM, не нейтрализующий и/или модулирующий фрагмент антитела или не-Ig каркас, предлагаемое/предлагаемый в изобретении.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело к ADM, фрагмент антитела к ADM или анти-ADM не-Ig каркас применяют для снижения риска смерти при хроническом или остром заболевании или остром состоянии пациента.
Хроническое или острое заболевание или острое состояние согласно настоящему изобретению может представлять собой заболевание или состояние, выбранное из группы, включающей серьезные инфекции, например, менингит, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), сепсис; другие заболевания, такие как диабет, рак, острые и хронические сосудистые заболевания, такие, например, как сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, «удар», атеросклероз; шок, такой, например, как септический шок, и дисфункцию органов, например, почечную дисфункцию, печеночную дисфункцию, ожоги, хирургическое вмешательство, травматическое отравление, связанные с химиотерапией поражения. Наиболее предпочтительным является применение антитела или фрагмента, или каркаса, предлагаемого в настоящем изобретении, для снижения риска смерти при сепсисе и септическом шоке, т.е. на поздних фазах сепсиса.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас применяют для лечения или предупреждения хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента согласно настоящему изобретению, где указанный пациент представляет собой пациента, находящегося в отделении интенсивной терапии (ICU-пациента). В другом варианте осуществления изобретения антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас применяют для лечения или предупреждения хронического или острого заболевания у пациента согласно настоящему изобретению, где указанный пациент представляет пациента на критической стадии заболевания. Критическая стадия заболевания означает заболевание или состояние, при котором смерть является возможной или близкой.
Антитела, фрагменты антител и не-Ig каркасы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для обработки индивидуумов с целью предупреждения или лечения заболеваний или состояний, например, для применения с целью предупреждения или лечения хронического или острого заболевания или острого состояния у индивидуума. Указанное заболевание можно выбирать из группы, включающей серьезные инфекции, например, менингит, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), сепсис; другие заболевания, такие как диабет, рак, острые и хронические сосудистые заболевания, такие, например, как сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, «удар», атеросклероз; шок, такой, например, как септический шок, и дисфункцию органов, например, почечную дисфункцию, печеночную дисфункцию, ожоги, хирургическое вмешательство, травмы. Наиболее предпочтительным является применения антитела или фрагмента, или каркаса, предлагаемого в настоящем изобретении, для снижения риска смерти при сепсисе и септическом шоке, т.е. на поздних фазах сепсиса.
Ниже определены клинические критерии для SIRS, сепсиса, серьезного сепсиса, септического шока.
1) Синдром системной воспалительной реакции (SIRS) характеризуется наличием по меньшей мере двух следующих симптомов
- для пациентов характерна гипотензия (среднее артериальное давление составляет <65 мм рт. столба),
- повышенный уровень лактата в сыворотке, который составляет >4 ммоля/л,
- уровень глюкозы в крови составляет >7,7 ммоля/л (в отсутствии диабета),
- центральное венозное давление не находится в пределах 8-12 мм рт.столба,
-1
- выход мочи составляет <0,5 мл×кг×ч,
- насыщение кислородом центральной венозной крови (верхняя полая вена) составляет <70% или смешанной венозной крови составляет <65%,
- частота сердечных сокращений составляет >90 ударов/мин,
- температура <36°C или >38°C,
- частота дыхания составляет >20/мин,
9
- количество белых клеток крови <4 или >12×10 /л (лейкоциты); >10% незрелых нейтрофилов.
2) Сепсис
Наличие по меньшей мере двух симптомов, указанных в разделе 1), и дополнительных клинических признаков, позволяющих подозревать наличие новой инфекции, которые представляют собой:
- кашель/мокроту/боль в области грудной клетки,
- боль в брюшной области/вздутие/диарею,
- линейную инфекцию,
- эндокардит,
- дизурию,
- головную боль с ригидностью затылочных мышц,
- целлюлит/рану/инфекционное поражение суставов,
- положительную микробиологическую пробу на любую инфекцию.
3) Серьезный сепсис
Выявленный сепсис у пациента и дополнительные клинические признаки, позволяющие подозревать наличие дисфункции любого органа, которые заключаются в том, что:
- систолическое кровяное давление <90/среднее; <65 мм рт.столба,
- уровень лактата >2 ммоля/л,
- уровень билирубина >34 мкмоля/л,
- выход мочи <0,5 мл/кг/ч в течение 2 ч,
- уровень креатинина >177 мкмолей/л,
9
- количество тромбоцитов <100×10 /л,
2
2
- SpO (норма насыщения крови кислородом) >90%, если не вводить O.
4) Септический шок
Проявление по меньшей мере одного признака дисфункции конечного органа, указанного в разделе 3). Наличие септического шока подтверждается, если присутствует резистентная гипотензия, которая не реагирует на лечение, и только внутривенное введение жидкости является недостаточным для поддержания кровяного давления у пациента на уровне выше гипотензивного, при этом показано также введение антитела к ADM или фрагмента антитела к ADM, или анти-ADM не-Ig каркаса, предлагаемого в настоящем изобретении.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения пациент не страдает SIRS, серьезной инфекцией, сепсисом, шоком, например, септическим шоком. Указанная серьезная инфекция обозначает, например, менингит, синдром системной воспалительной реакции (SIRS), сепсис, серьезный сепсис и шок, например, септический шок. В этом плане серьезный сепсис характеризуется наличием сепсиса у указанного пациента и дополнительно клиническими признаками, позволяющими подозревать наличие дисфункции любого органа, которые заключаются в том, что:
- систолическое кровяное давление <90/среднее; <65 мм рт.столба,
- уровень лактата >2 ммоля/л,
- уровень билирубина >34 мкмоля/л,
- выход мочи <0,5 мл/кг/ч в течение 2 ч,
- уровень креатинина >177 мкмолей/л,
9
- количество тромбоцитов <100×10 /л,
2
2
- SpO>90%, если не вводить O.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения указанное острое заболевание или острое состояние не представляет собой сепсис, серьезный сепсис или не представляет собой SIRS, или не представляет собой шок, или септический шок.
В другом варианте осуществления изобретения указанное острое заболевание или острое состояние не представляет собой сепсис.
Антитела или фрагменты, или каркасы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять в комбинациях с другими агентами, такими, например, как так называемый ADM-связывающий белок, для представленных в настоящем описании вариантов применения. ADM-связывающий белок также присутствует в естественных условиях в кровотоке указанного пациента.
Подразумевается, что понятие «ADM-связывающий белок» относится к ADM-связывающему белку-1 (фактор комплемента H), который, однако не представляет собой не нейтрализующее и/или модулирующее антитело к ADM, не нейтрализующий и/или модулирующий фрагмент антитела, или не-Ig каркас, предлагаемое(ый) в изобретении.
Объектом настоящему изобретения является также антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, предназначенное/предназначенный для лечения или предупреждения хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента, указанного в настоящем изобретении, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас предназначено/предназначен для применения в комбинации с другими действующими веществами.
Объектом изобретения является также антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, предназначенное/предназначенный для применения в комбинации с другим действующим веществом, которое представляет собой лекарственное средство, например, применяемое в качестве первичного лекарственного средства, где указанная комбинация предназначена для применения для лечения и профилактики хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента для стабилизации кровообращения у указанного пациента, в частности, системного кровообращения у указанного пациента.
Первичное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, которое действует на первичную причину указанного заболевания или состояния. В случае инфекций указанное первичное лекарственное средство может представлять собой антибиотик.
В конкретном варианте осуществления изобретения, касающемся вышеуказанных комбинаций, применяемые комбинации включают сосудосуживающие средства, например катехоламин, при этом указанная дополнительная комбинация предназначена для применения для лечения или предупреждения хронического или острого заболевания или состояния у пациента.
В одном из вариантов осуществления изобретения для указанного пациента, имеющего хроническое или острое заболевание или хроническое состояние, характерна потребность во введении сосудосуживающих средств, например, введении катехоламина.
Таким образом, в одном из конкретных вариантов осуществления изобретения антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас предназначено/предназначен для применения в комбинации с ADM-связывающим белком и/или дополнительными действующими веществами для использования в терапии или профилактике пациента, который нуждается в лечении сосудосуживающими средствами, например, лечении катехоламином.
В конкретном варианте осуществления изобретения, касающемся вышеуказанных комбинаций, указанные комбинации предназначены для применения в сочетании с водимыми внутривенно жидкостями, где указанная комбинация предназначена для применения для лечения или профилактики хронического или острого заболевания или состояния у пациента для стабилизации кровообращения, в частности, системного кровообращения.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный пациент, имеющий хроническое или острое заболевание или хроническое состояние, при котором необходимо стабилизировать кровообращение, характеризуется тем, что ему необходимо внутривенно вводить жидкости.
Таким образом, в одном из конкретных вариантов осуществления изобретения антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас предназначено/предназначен для применения в комбинации с ADM-связывающим белком и/или дополнительными действующими веществами в терапии или профилактике пациента, который нуждается во внутривенном введении жидкостей. Подразумевается, что пациент нуждается во внутривенном введении жидкостей для регулирования системного баланса жидкости.
Подразумевается, что понятие «ADM-связывающий белок» относится также к ADM-связывающему белку-1 (фактор комплемента Н), который, однако не представляет собой не нейтрализующее и/или модулирующее антитело к ADM, не нейтрализующий и/или модулирующий фрагмент антитела, или не-Ig каркас, предлагаемое(ый) в изобретении.
Согласно изобретению ADM-связывающий белок-1 можно обозначать также как белок-1, связывающий ADM (фактор комплемента Н).
Указанное антитело к ADM или фрагмент антитела к ADM, или анти-ADM не-Ig каркас или их комбинации с ADM-связывающим белком и/или дополнительными действующими веществами можно применять в сочетании с сосудосуживающими средствами, например, катехоламином, и/или вводимыми внутривенно жидкостями при хроническом или остром заболевании или остром состоянии у пациента для стабилизации кровообращения, в частности, для стабилизации системного кровообращения.
Объектом изобретения является также антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении, которое/который можно применять в комбинации с антителами к TNF-альфа. Антитела к TNF-альфа, предназначенные для лечения пациентов, поступают в продажу.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения антитело к ADM или фрагмент антитела к ADM, или анти-ADM не-Ig каркас применяют для снижения риска смерти при хроническом или остром заболевании пациента, где указанное заболевание выбирают из группы, включающей сепсис, диабет, рак, острые и хронические сосудистые заболевания, такие, например, как сердечная недостаточность, шок, такой, например, как септический шок, и дисфункция органов, такая, например, как почечная дисфункция. Наиболее ценным является применение антитела или фрагмента, или каркаса, предлагаемого в настоящем изобретении, для снижения риска смерти при сепсисе или септическом шоке, т.е. на поздних фазах сепсиса.
Антитела, фрагменты антител, каркасы и комбинации, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять при лечении или предупреждении хронического или острого заболевания у пациента:
- для предупреждения дисфункции органа или недостаточности органа, прежде всего дисфункции почки или почечной недостаточности, и/или
- для стабилизации кровообращения, например, для снижения потребности указанного пациента в сосудосуживающих средствах, например, катехоламине, и/или
- для регулирования жидкостного баланса у указанного пациента,
- для снижения риска смерти указанного пациента.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас применяют для лечения или предупреждения хронического или острого заболевания у пациента согласно настоящему изобретению, где указанный пациент представляет собой ICU-пациента. В другом варианте осуществления изобретения антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас применяют для лечения или предупреждения хронического или острого заболевания или хронического состояния у пациента согласно настоящему изобретению, где указанный пациент находится на критической стадии заболевания. Критическая стадия заболевания означает заболевание или состояние, при котором смерть является возможной или близкой.
Объектом настоящего изобретения является также антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, предназначенное/предназначенный для применения для лечения или предупреждения хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента согласно настоящему изобретению, где указанное антитело или указанны фрагмент, или каркас можно применять в комбинации с ADM-связывающим белком.
Объектом настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, содержащая антитело к ADM или фрагмент антитела к ADM, или анти-ADM не-Ig каркас, предлагаемое/предлагаемый в настоящем изобретении.
Объектом настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к употреблению раствор.
Указанную фармацевтическую композицию можно вводить внутримышечно. Указанную фармацевтическую композицию можно вводить внутрисосудисто. Указанную фармацевтическую композицию можно вводить посредством инфузии.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, где указанная фармацевтическая композиция находится в высушенном состоянии для восстановления перед применением.
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является также фармацевтическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, где указанная фармацевтическая композиция находится в состоянии, полученном сушкой вымораживанием.
В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию, предлагаемую в изобретении, которую можно вводить внутримышечно, внутрисосудисто или посредством инфузии, предпочтительно вводят пациенту системно.
Таким образом, в другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, следует вводить пациенту системно.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
1. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента для регулирования жидкостного баланса.
2
2. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п.1, где формат антитела выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc.
3. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 1 или п. 2, где указанное антитело или указанный фрагмент связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
4. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-3, где указанное антитело или указанный фрагмент распознает и связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина.
½
5. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-4, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой стабилизирующее ADM антитело или стабилизирующий ADM фрагмент антитела, удлиняющее/удлиняющий время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
6. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-5, где указанное антитело или указанный фрагмент блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
7. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-6, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сепсис, диабет, рак, сердечную недостаточность, шок и почечную дисфункцию.
8. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-7, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанный пациент представляет собой ICU-пациента.
½
9. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-7, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой модулирующее антитело или модулирующий фрагмент, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100% и которое/который блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент по одному из п.п. 1-9.
11. Фармацевтическая композиция по п. 10, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к употреблению раствор.
12. Фармацевтическая композиция по п. 10, где указанная фармацевтическая композиция находится в состоянии, полученном сушкой вымораживанием.
13. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 10-11, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.
14. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 10-11, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисосудисто.
15. Фармацевтическая композиция по п. 14, где указанную фармацевтическую композицию вводят посредством инфузии.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
1. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента для регулирования жидкостного баланса.
2. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 1, где указанное антитело к ADM или указанный фрагмент антитела к адреномедуллину, или указанный анти-ADM не-Ig каркас представляет собой не нейтрализующее антитело к ADM или не нейтрализующий фрагмент антитела к адреномедуллину или не нейтрализующий анти-ADM не-Ig каркас.
3. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 1 или п. 2, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания или острого состояния для предупреждения или уменьшения отека у указанного пациента.
2
4. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-3, где формат антитела выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc.
5. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-4, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
6. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-5, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас распознает и связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина.
½
7. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-6, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой стабилизирующее ADM антитело или стабилизирующий ADM фрагмент антитела, или стабилизирующий ADM не-Ig каркас, которое/который удлиняет время полужизни (время полуудержания t) адреномедуллина в сыворотке, крови плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
8. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-7, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
9. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-8, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей SIRS, сепсис, диабет, рак, сердечную недостаточность, шок и почечную дисфункцию.
10. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-9, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM, или фрагмент антитела, тяжелая цепь которого содержит последовательности
и легкая цепь которого содержит последовательности
11. Человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM, или фрагмент антитела по п. 10, где указанное антитело или фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, включающей:
12. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-9, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого состояния у пациента, где указанный пациент представляет собой ICU-пациента.
13. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-12, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой модулирующее/модулирующий антитело или фрагмент, или каркас, которое/который удлиняет время полужизни (время полуудержания 11/2) адреномедуллина в сыворотке, крови плазмы по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100% и блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
14. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-13, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, которое/который можно применять в комбинации с катехоламином и/или вводимыми внутривенно жидкостями.
15. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-13, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, или комбинация по п. 12, которые можно применять в комбинации с ADM-связывающим белком и/или дополнительными действующими веществами.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент, или каркас по одному из п.п. 1-15.
17. Фармацевтическая композиция по п. 16, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к употреблению раствор.
18. Фармацевтическая композиция по п. 16, где указанная фармацевтическая композиция находится в состоянии, полученном сушкой вымораживанием.
19. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 16-17, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.
20. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 16-17, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисосудисто.
21. Фармацевтическая композиция по п. 20, где указанную фармацевтическую композицию вводят посредством инфузии.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
1. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента для стабилизации кровообращения.
2. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 1, где указанное антитело или указанный фрагмент снижает потребность указанного пациента в катехоламине.
2
3. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 1 или п. 2, где формат антитела выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc.
4. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-3, где указанное антитело или указанный фрагмент связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
5. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-4, где указанное антитело или указанный фрагмент распознает и связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина.
½
6. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-5, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой стабилизирующее ADM антитело, удлиняющее время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
7. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-6, где указанное антитело или указанный фрагмент блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
½
8. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-7, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой модулирующее ADM антитело или модулирующий ADM фрагмент, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100% и которое/который блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
9. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-8, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сепсис, диабет, рак, острые и хронические сосудистые заболевания, такие, например, как сердечная недостаточность, шок, такой, например, как септический шок, и дисфункцию органа, такую, например, как почечная дисфункция.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент по одному из п.п. 1-9.
11. Фармацевтическая композиция по п. 10, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к употреблению раствор.
12. Фармацевтическая композиция по п. 10, где указанная фармацевтическая композиция находится в состоянии, полученном сушкой вымораживанием.
13. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 10-11, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.
14. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 10-11, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисосудисто.
15. Фармацевтическая композиция по п. 14, где указанную фармацевтическую композицию вводят посредством инфузии.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
1. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания или состояния у пациента для стабилизации кровообращения.
2. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 1, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас снижает потребность в сосудосуживающем средстве, например, потребность в катехоламине, у указанного пациента.
3. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 1 или п. 2, где указанное антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти ADM не-Ig каркас представляет собой не нейтрализующее ADM антитело или не нейтрализующий адреномедуллин фрагмент антитела, или не нейтрализующий ADM не-Ig каркас.
2
4. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-3, где формат антитела выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc.
5. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-4, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
6. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-5, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас распознает и связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина.
½
7. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-6, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент, или каркас, которое/который удлиняет время полужизни (время полуудержания t) адреномедуллина в сыворотке, крови плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
8. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-7, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
½
9. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-8, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой модулирующее ADM антитело или модулирующий адреномедуллин фрагмент антитела или каркас, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100% и которое/который блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
10. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-9, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM, или фрагмент антитела, тяжелая цепь которого содержит последовательности
и легкая цепь которого содержит последовательности
11. Человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM, или фрагмент антитела по п.10, где указанное антитело или указанный фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, включающей:
12. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-11, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей SIRS, сепсис, диабет, рак, острые и хронические сосудистые заболевания, такие, например, как сердечная недостаточность, шок, такой, например, как септический шок, и дисфункцию органа, такую, например, как почечная дисфункция.
13. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-12, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, которое/который можно применять в комбинации с катехоламином и/или вводимыми внутривенно жидкостями.
14. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-13, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, или комбинация по п. 10, которые можно применять в комбинации с ADM-связывающим белком и/или дополнительными действующими веществами.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент, или каркас по одному из п.п. 1-14.
16. Фармацевтическая композиция по п. 15, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к употреблению раствор.
17. Фармацевтическая композиция по п. 15, где указанная фармацевтическая композиция находится в состоянии, полученном сушкой вымораживанием.
18. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 15-16, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.
19. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 14-16, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисосудисто.
20. Фармацевтическая композиция по п. 16, где указанную фармацевтическую композицию вводят посредством инфузии.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
½
1. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент, которое/который удлиняет t, т.е. время полуудержания адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на 100%, и указанное антитело блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
½
2. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой модулирующее/модулирующий ADM антитело или фрагмент, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на 100%, и указанное антитело блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
3. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 1 или п. 2, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
4. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 3, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент связывается с N-концом адреномедуллина.
½
5. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-4, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на 100%.
6. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-5, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
7. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-6, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей SIRS, сепсис, септический шок, диабет, рак, сердечную недостаточность, шок, недостаточность органа, почечную дисфункцию, острый жидкостной дисбаланс и низкое кровяное давление.
8. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-7, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное заболевание представляет собой септический шок или сепсис.
9. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-8, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент регулирует жидкостной баланс у указанного пациента.
10. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-9, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное или указанный фрагмент применяют для предупреждения дисфункции органа или недостаточности органа.
11. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 10, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания, где указанное антитело или указанный фрагмент применяют для предупреждения почечной дисфункции или почечной недостаточности.
12. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину по п.п. 1-11, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания у пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент применяют для стабилизации кровообращения.
13. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 12, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания у пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент снижает потребность в катехоламине у указанного пациента.
14. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-13, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания у пациента для снижения риска смерти указанного пациента.
15. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-14, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания у пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент можно вводить в дозе, составляющей по меньшей мере 3 мкг/кг веса тела.
16. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент по одному из п.п. 1-15.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
1. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, где указанное антитело или указанный фрагмент, или каркас представляет собой не нейтрализующее антитело.
½
2. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, где указанное антитело или указанный фрагмент, или каркас представляет собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент, или каркас, которое/который удлиняет время полужизни (время полуудержания t) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на 100%, и/или где указанное/указанный антитело или фрагмент, или каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
½
3. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой модулирующее/модулирующий ADM антитело или фрагмент, или каркас, которое/который удлиняет время полужизни (время полуудержания t) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на 100% и блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
4. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 1 или п. 2, где указанное антитело или указанный фрагмент, или каркас связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
5. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 3, где указанное антитело или указанный фрагмент, или каркас связывается с N-концом адреномедуллина.
½
6. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-4, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент, или каркас, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на 100%.
7. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-6, предназначенное/предназначенный для применения в качестве фармацевтического действующего вещества.
8. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-7, предназначенное/предназначенный для применения при лечении хронического или острого заболевания или острого состояния, где указанное заболевание или состояние выбрано из группы, включающей серьезные инфекции, такие, например, как менингит, синдром системной воспалительной реакции (SIRS) сепсис; другие заболевания, такие как диабет, рак, острые и хронические сосудистые заболевания, такие, например, как сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, «удар», атеросклероз; шок, такой, например, как септический шок, и дисфункция органа, такая, например, как почечная дисфункция, печеночная дисфункция, ожоги, хирургическое вмешательство и травмы.
9. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-8, предназначенное/предназначенный для применения при лечении хронического ил острого заболевания или острого состояния, где указанное заболевание представляет собой септический шок или сепсис.
10. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-9, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM, или фрагмент антитела, тяжелая цепь которого содержит последовательности
и легкая цепь которого содержит последовательности
11. Человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM или фрагмент антитела по п. 10, где указанное антитело или фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, включающей:
12. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-11, предназначенное/предназначенный для регулирования жидкостного баланса у пациента, который имеет хроническое или острое заболевание или острое состояние.
13. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-11, предназначенное/предназначенный для предупреждения или снижения дисфункции органа или недостаточности органа у пациента, который имеет хроническое или острое заболевание или острое состояние.
14. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 10, где орган представляет собой почку или печень.
15. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-14, предназначенное/предназначенный для стабилизации кровообращения у пациента, который имеет хроническое или острое заболевание или острое состояние.
16. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 15, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания у пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент снижает потребность в катехоламине у указанного пациента.
17. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-16, которое/который можно применять в комбинации с сосудосуживающими средствами, например, катехоламином.
18. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-17, которое/который можно применять в комбинации с вводимой внутривенно жидкостью.
19. Антитело к адреномедуллину или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-18, которое/который можно применять в комбинации с антителом к TNF-альфа.
20. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-19, предназначенное/предназначенный для применения для лечения пациента, который нуждается в этом, где указанное антитело или указанный фрагмент можно вводить в дозе, составляющей по меньшей мере 3 мкг/кг веса тела.
21. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент, или каркас по одному из п.п. 1-20.
22. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-20, предназначенное/предназначенный для применения для лечения хронического или острого заболевания или хронического состояния.
23. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 22, где указанное заболевание представляет собой сепсис.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
1. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, предназначенное/предназначенный для применения в терапии серьезного хронического или острого заболевания у пациента для снижения риска смерти указанного пациента.
2
2. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п.1, где формат антитела выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc.
3. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 1 или п. 2, где указанное антитело или указанный фрагмент связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
4. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-3, где указанное антитело или указанный фрагмент распознает и связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина.
½
5. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-4, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
6. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-5, где указанное антитело или указанный фрагмент блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
7. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-6, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сепсис, диабет, рак, сердечную недостаточность, шок и почечную дисфункцию.
8. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-7, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанный пациент представляет собой ICU-пациента.
9. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-8, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где риск смерти снижают путем предупреждения нежелательного явления, где последнее выбрано из группы, включающей SIRS, сепсис, септический шок, недостаточность органа, почечная недостаточность, жидкостной дисбаланс и низкое кровяное давление.
10. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-8, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент можно применять в комбинации с ADM-связывающим белком.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент по одному из п.п. 1-10.
12. Фармацевтическая композиция по п. 11, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к употреблению раствор.
13. Фармацевтическая композиция по п. 11, где указанная фармацевтическая композиция находится в состоянии, полученном сушкой вымораживанием.
14. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 11-12, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.
15. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 11-12, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисосудисто.
16. Фармацевтическая композиция по п. 15, где указанную фармацевтическую композицию вводят посредством инфузии.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
1. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, предназначенное/предназначенный для применения в терапии серьезного хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента для снижения риска смерти указанного пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой не нейтрализующее антитело к ADM или не нейтрализующий фрагмент антитела к адреномедуллину, или не нейтрализующий анти-ADM не-Ig каркас.
2
2. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 1, где формат антитела выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc.
3. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 1 или п. 2, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
4. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-3, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина.
½
5. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-4, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент, или каркас, которое/который удлиняет время полужизни (время полуудержания t) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей на 10%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
6. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-5, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
7. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-6, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей серьезные инфекции, например, менингит, синдром системной воспалительной реакции (SIRS) сепсис; другие заболевания, такие как диабет, рак, острые и хронические сосудистые заболевания, такие, например, как сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, «удар», атеросклероз; шок, такой, например, как септический шок, и дисфункцию органа, такую, например, как почечная дисфункция, печеночная дисфункция; ожоги, хирургическое вмешательство, травмы.
8. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-7, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей SIRS, серьезную инфекцию, сепсис, шок, например, септический шок.
9. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-8, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанный пациент представляет собой ICU-пациента.
10. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-9, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где риск смерти снижают путем предупреждения нежелательного явления, где последнее выбрано из группы, включающей SIRS, сепсис, шок, например, септический шок, острые и хронические сердечные заболевания, такие, например, как острая сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, «удар»; недостаточность органа, такую, например, как почечная недостаточность, печеночная недостаточность, жидкостной дисбаланс и низкое кровяное давление.
11. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1 to 10, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM, или фрагмент антитела, тяжелая цепь которого содержит последовательности
и легкая цепь которого содержит последовательности
12. Человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM или фрагмент антитела по п. 11, где указанное антитело или указанный фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, включающей:
13. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-12, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, которое/который можно применять в комбинации с сосудосуживающими средствами, например, катехоламином, и/или вводимыми внутривенно жидкостями.
14. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-12, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, или комбинация по п. 13, которые можно применять в комбинации с ADM-связывающим белком и/или другими действующими веществами.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент, или каркас по одному из п.п. 1-14.
16. Фармацевтическая композиция по п. 15, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к употреблению раствор.
17. Фармацевтическая композиция по п. 15, где указанная фармацевтическая композиция находится в состоянии, полученном сушкой вымораживанием.
18. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 15-16, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.
19. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 15-16, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисосудисто.
20. Фармацевтическая композиция по п. 19, где указанную фармацевтическую композицию вводят посредством инфузии.
21. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина, предпочтительно человеческого ADM.
22. Антитело или фрагмент, или каркас по п. 21, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас распознает и связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
1. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента для предупреждения дисфункции органов или недостаточности органов.
2. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 1, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания, где указанный орган представляет собой почку.
2
3. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по п. 1, где формат антитела выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc.
4. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-3, где указанное антитело или указанный фрагмент связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
5. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-4, где указанное антитело или указанный фрагмент распознает и связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина.
½
6. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-5, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей на 10%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%.
7. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-6, где указанное антитело блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
8. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-7, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сепсис, диабет, рак, сердечную недостаточность и шок.
9. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-8, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанный пациент представляет собой ICU-пациента.
½
10. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-9, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой модулирующее/модулирующий антитело или фрагмент, которое/который удлиняет время полуудержания t адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100%, и блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
11. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент по одному из п.п. 1-10.
12. Фармацевтическая композиция по п. 11, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к употреблению раствор.
13. Фармацевтическая композиция по п. 11, где указанная фармацевтическая композиция находится в состоянии, полученном сушкой вымораживанием.
14. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 11-12, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.
15. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 11-12, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисосудисто.
16. Фармацевтическая композиция по п. 15, где указанную фармацевтическую композицию вводят посредством инфузии.
Ниже изложены другие варианты осуществления изобретения, подпадающие под объем настоящего изобретения:
1. Антитело к адреномедуллину (ADM) или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента для предупреждения или снижения дисфункции органа или предупреждения недостаточности органа у указанного пациента.
2. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по п. 1, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания или острого состояния, где указанный орган представляет собой почку или печень.
3. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину или анти-ADM не-Ig каркас по п. 1 или п. 2, где указанное антитело к ADM или указанный фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас представляет собой не нейтрализующее антитело к ADM или не нейтрализующий фрагмент антитела к адреномедуллину, или не нейтрализующий анти-ADM не-Ig каркас.
2
4. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п. 1 или п. 3, где формат антитела выбран из группы, включающей Fv-фрагмент, scFv-фрагмент, Fab-фрагмент, scFab-фрагмент, (Fab)-фрагмент и слитый белок scFv-Fc.
5. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-4, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас связывается с N-концевой областью (ак 1-21) адреномедуллина.
6. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-5, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас распознает и связывается с N-концом (ак 1) адреномедуллина.
½
7. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-6, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой стабилизирующее/стабилизирующий ADM антитело или фрагмент, или каркас, которое/который удлиняет время полужизни (время полуудержания t) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на>50%, наиболее предпочтительно на >100%.
8. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-7, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
9. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-8, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента, где указанное заболевание выбрано из группы, включающей сепсис, диабет, рак, сердечную недостаточность и шок.
10. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину по одному из п.п. 1-9, где указанное антитело или указанный фрагмент представляет собой человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM, или фрагмент антитела, тяжелая цепь которого содержит последовательности
и легкая цепь которого содержит последовательности
11. Человеческое моноклональное антитело или фрагмент, которое/который связывается с ADM или фрагмент антитела по п. 10, где указанное антитело или указанный фрагмент содержит последовательность, выбранную из группы, включающей:
½
12. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-11, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания у пациента, где указанное антитело или указанный фрагмент, или указанный каркас представляет собой модулирующее/модулирующий антитело или фрагмент, или каркас, которое/который удлиняет время полужизни (время полуудержания t) адреномедуллина в сыворотке, крови, плазме по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, более предпочтительно на >50%, наиболее предпочтительно на >100% и блокирует биологическую активность ADM менее чем на 80%, предпочтительно менее чем на 50%.
13. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-12, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента, которое/который можно применять в комбинации с сосудосуживающими средствами, например, катехоламином, и/или вводимыми внутривенно жидкостями.
14. Антитело к ADM или фрагмент антитела к адреномедуллину, или анти-ADM не-Ig каркас по одному из п.п. 1-13, предназначенное/предназначенный для применения в терапии хронического или острого заболевания или острого состояния у пациента или комбинации по п. 13, которые можно применять в комбинации с ADM-связывающим белком и/или дополнительными действующими веществами.
15. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или фрагмент по одному из п.п. 1-13.
16. Фармацевтическая композиция по п. 15, где указанная фармацевтическая композиция представляет собой раствор, предпочтительно готовый к употреблению раствор.
17. Фармацевтическая композиция по п. 15, где указанная фармацевтическая композиция находится в состоянии, полученном сушкой вымораживанием.
18. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 15-16, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутримышечно.
19. Фармацевтическая композиция по одному из п.п. 15-16, где указанную фармацевтическую композицию вводят внутрисосудисто.
16. Фармацевтическая композиция по п. 19, где указанную фармацевтическую композицию вводят посредством инфузии. Примеры
Как должно быть очевидно, антитела, фрагменты антител и не-Ig каркасы, приведенные в качестве примера в настоящем изобретении, связываются с ADM и поэтому их следует рассматривать в качестве анти-ADM антител/фрагментов антител/не-Ig каркасов.
Пример 1
Создание антител и определение их констант аффинности
Получали несколько человеческих и мышиных антител и определяли их константы аффинности (см. таблицы 1 и 2).
Пептиды/конъюгаты, применяемые для иммунизации:
Пептиды, применяемые для иммунизации (см. таблицу 1), синтезировали (фирма JPT Technologies, Берлин, Германия) с дополнительным N-концевым остатком цистеина (если цистеин отсутствовал в выбранной последовательности ADM) для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Пептиды ковалентно связывали с БСА, используя для сочетания Sulfolink-гель (фирма Perbio-science, Бонн, Германия). Процедуру сочетания осуществляли согласно руководству фирмы Perbio.
Мышиные антитела создавали согласно следующему методу:
Мышей линии Balb/c иммунизировали, используя 100 мкг конъюгата пептид-БСА (эмульгированный в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) в день 0 и день 14 и 50 мкг (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда) в день 21 и день 28. За три дня до осуществления эксперимента по слиянию животным вводили по 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл физиологического раствора посредством одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Спленоциты, взятые из организма иммунизированной мыши, и клетки миеломы линии SP2/0 сливали, используя 1 мл 50%-ного полиэтиленгликоля, в течение 30 с при 37°C. После отмывки клетки высевали в 96-луночные планшеты для культуры ткани. Гибридные клоны отбирали по признаку роста в среде HAT (культуральная среда RPMI 1640, дополненная 20% фетальной телячьей сыворотки и дополненная HAT). Через 2 недели НАТ-среду заменяли НТ-средой, осуществляя три пассажа, а затем возвращали стандартную среду для культуры клеток.
Супернатанты клеточной культуры сначала подвергали скринингу в отношении антигенспецифических антител класса IgG через три недели после слияния. Положительные по данным теста микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования выбранные культуры клонировали и повторно клонировали, используя метод серийных разведений, и определяли изотипы (см. также Lane R.D., «A short-duration polyethylene glycol fusion technique for increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas», J. Immunol. Meth. 81, 1985, cc. 223-228; Ziegler В. и др., «Glutamate decarboxylase (GAD) is not detectable on the surface of rat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependent antibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies», Horm. Metab. Res. 28, 1996, cc. 11-15).
Получение мышиных моноклональных антител:
Антитела получали с использованием стандартных методов получения антител (Marx и др., Monoclonal Antibody Production, ATLA 25, 1997, с.121) и очищали на белке А. Чистота антител составляла >95% по данным анализа методом гель-электрофореза в присутствии ДСН.
Человеческие антитела
Человеческие антитела получали с помощью фагового дисплея согласно следующей процедуре:
Для выделения рекомбинантных одноцепочечных фрагментов вариабельной области (scFv) к пептиду адреномедуллина применяли библиотеки человеческих наивных генов антител HAL7/8. Библиотеки генов антител подвергали скринингу, используя стратегию пэннинга, предусматривающую применение пептидов, которые содержали биотиновую метку, сцепленную через два различных спейсера с последовательностью пептида адреномедуллина. Для минимизации фона неспецифических связывающих агентов применяли комбинацию циклов пэннинга с использованием неспецифически связанного антигена и связанного со стрептавидином антигена. Фаги, элюированные после третьего цикла пэннинга, применяли для получения экспрессирующих моноклональный scFv штаммов E. coli. Для оценки антигена с помощью ELISA использовали непосредственно супернатанты, полученные после культивирования указанных клональных штаммов (см. также Hust М., Meyer Т., Voedisch В., Riilker Т., Thie Н., El-Ghezal A., Kirsch M.L., Schütte М., Helmsing S., Meier D., Schirrmann Т., Dübel S., «A human scFv antibody generation pipeline for proteome research», Journal of Biotechnology 152, 2011, cc. 159-170; Schütte M., Thullier P., Pelat Т., Wezler X., Rosenstock P., Hinz D., Kirsch M.I., Hasenberg M., Frank R., Schirrmann Т., Gunzer M., Hust M., Dübel S., «Identification of a putative Crf splice variant and generation of recombinant antibodies for the specific detection of Aspergillus fumigatus», PLoS One 4, e6625, 2009).
Позитивные клоны отбирали на основе ELISA-сигнала, положительного в отношении антигена, и отрицательного в отношении сенсибилизированных стрептавидином титрационных микропланшетов. Для дополнительной характеризации открытую рамку считывания scFv клонировали в экспрессионной плазмиде рОРЕ107 (Hust и др., J. Biotechn., 2011), выделяли из супернатанта культуры с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом и очищали с помощью гель-фильтрации.
Константы аффинности
Для определения аффинности антител к адреномедуллину оценивали кинетику связывания адреномедуллина с иммобилизованным антителом с помощью метода резонанса поверхностного плазмона, не включающего метку, используя систему Biacore 2000 (фирма GE Healthcare Europe GmbH, Фрейбург, Германия). Для осуществления обратимой иммобилизации антител применяли антитело к мышиному Fc, ковалентно связанное с высокой плотностью с сенсорным СМ5-чипом согласно инструкциям производителя (набор мышиных антител для иммобилизации; фирма GE Healthcare), см. Lorenz и др., «Functional Antibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host Immune Response and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy»; Antimicrob Agents Chemother. 55(1), январь 2011 г., cc. 165-173.
Получали моноклональные антитела к указанным ниже областям ADM человеческого и мышиного ADM соответственно. Ниже в таблице представлены антитела, отобранные из полученных антител, которые применяли в других экспериментах. Выбор был основан на области-мишени:
Ниже представлен перечень других полученных моноклональных антител: Перечень антител к АРМ
Получение фрагментов антител путем ферментативного расщепления:
2
2
2
Для получения Fab- и F(ab)-фрагментов применяли ферментативное расщепление мышиного полноразмерного антитела NT-M. Антитело NT-M расщепляли, используя а) набор на основе пепсина для получения F(ab) (фирма Pierce, 44988) и б) набор на основе папаина для получения Fab (фирма Pierce, 44985). Процедуры фрагментации осуществляли согласно инструкциям, предоставленным поставщиком. В случае F(ab)-фрагментации процедуру осуществляли в течение 8 ч при 37°C. Расщепление с получением Fab-фрагментов осуществляли в течение 16 ч соответственно.
Процедура получения и очистки Fab:
Иммобилизованный папаин уравновешивали путем отмывки смолы с помощью 0,5 мл буфера для расщепления и центрифугирования на колонке при 5000 × g в течение 1 мин. После этого буфер отбрасывали. Подготавливали обессоливающую колонку путем удаления раствора, в котором она хранилась, и отмывки ее буфером для расщепления с последующим центрифугированием ее каждый раз при 1000 × g в течение 2 мин. В трубу вращающейся колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный папаин, добавляли по 0,5 мл полученного образца IgG. Расщепляемую реакционную смесь инкубировали в течение 16 ч на лабораторном шейкере при 37°C. Колонку центрифугировали при 5000 × g в течение 1 мин для отделения продукта расщепления от иммобилизованного папаина. Затем смолу отмывали с помощью 0,5 мл ЗФР и центрифугировали при 5000 × g в течение 1 мин. Полученную при отмывке фракцию добавляли к расщепленному антителу, в результате общий объем образца составлял 1,0 мл. Колонку, заполненную Nab-белком А, уравновешивали ЗФР и буфером для элюции IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 мин для удаления раствора, в котором осуществляли хранение (содержащем 0,02% азида натрия), и уравновешивали, добавляя 2 мл ЗФР, вновь центрифугировали в течение 1 мин и отбрасывали прошедший через колонку элюат. Образец вносили на колонку и ресуспендировали путем переворачивания. Инкубацию проводили при комнатной температуре, осуществляя смешение путем переворачивания в течение 10 мин. Колонку центрифугировали в течение 1 мин, получая элюат, содержащий Fab-фрагменты.
(Ссылки: Coulter А. и Harris R., J. Immunol. Meth. 59, 1983, cc. 199-203; Lindner I. и др., {alpha}2-Macroglobulin inhibits the malignant properties of astrocytoma cells by impeding {beta}-catenin signaling, Cancer Res. 70, 2010, cc. 277-287; Kaufmann В. и др., Neutralization of West Nile virus by cross-linking of its surface proteins with Fab fragments of the human monoclonal antibody CR4354. PNAS, 107, 2010, cc. 18950-18955; Chen X. и др., Requirement of open headpiece conformation for activation of leukocyte integrin α×β2, PNAS, 107, 2010, cc. 14727-14732; Uysal H. и др., Structure and pathogenicity of antibodies specific for citrullinated collagen type II in experimental arthitis, J. Exp.Med. 206, 2009, cc. 449-462; Thomas G. M. и др., Cancer cell-derived microparticles bearing P-selectin glycoprotein ligand 1 accelerate thrombus formation in vivo, J. Exp. Med. 206, 2009, cc. 1913-1927; Kong F.h др., Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand, J. Cell Biol. 185, 2009, cc. 1275-1284.)
2
Процедура получения и очистки F(ab')-фрагментов:
Иммобилизованный пепсин уравновешивали путем отмывки смолы с помощью 0,5 мл буфера для расщепления и центрифугировали на колонке при 5000 × g в течение 1 мин. После этого буфер отбрасывали. Подготавливали обессоливающую колонку путем удаления раствора, в котором она хранилась, и отмывки ее буфером для расщепления с последующим центрифугированием каждый раз при 1000 × g в течение 2 мин. В трубу вращающейся колонки, содержащую уравновешенный иммобилизованный пепсин, добавляли по 0,5 мл полученного образца IgG. Расщепляемую реакционную смесь инкубировали в течение 16 ч на лабораторном шейкере при 37°C. Колонку центрифугировали при 5000 × g в течение 1 мин для отделения продукта расщепления от иммобилизованного пепсина. Затем смолу отмывали с помощью 0,5 мл ЗФР и центрифугировали при 5000 × g в течение 1 мин. Полученную при промывке фракцию добавляли к расщепленному антителу, в результате общий объем образца составлял 1,0 мл. Колонку, заполненную Nab-белком А, уравновешивали ЗФР и буфером для элюции IgG при комнатной температуре. Колонку центрифугировали в течение 1 мин для удаления раствора, в котором осуществляли хранение (содержащего 0,02% азида натрия), и уравновешивали, добавляя 2 мл ЗФР, вновь центрифугировали в течение 1 мин и отбрасывали прошедший через колонку элюат. Образец вносили на колонку и ресупендировали путем переворачивания. Инкубацию проводили при комнатной температуре, осуществляя смешение путем переворачивания в течение 10 мин. Колонку центрифугировали в течение 1 мин, получая элюат, содержащий Fab-фрагменты.
(Ссылки: Mariani М. и др., A new enzymatic method to obtain high-yield F(ab')2 suitable for clinical use from mouse IgG1, Mo1. Immunol. 28, 1991, cc. 69-77; Beale D., Molecular fragmentation: Some applications in immunology. Exp Comp Immunol 11, 1987, cc. 287-296; Ellerson J.R. и др., A fragment corresponding to the CH2 region of immunoglobulin G (IgG) with complement fixing activity, FEBS Letters 24(3), 1972, cc. 318-322; Kerbel R.S. и Elliot B.E., Detection of Fc receptors. Meth Enzymol 93, 1983, cc. 113-147.; Kulkarni P.N. и др., Conjugation of methotrexate to IgG antibodies and their F(ab')2 fragments and the effect of conjugated methotrexate on tumor growth in vivo, Cancer Immunol Immunotherapy 19, 1985, cc. 211-214; Lamoyi E., Preparation of F(ab')2 fragments from mouse IgG of various subclasses, Meth Enzymol 121, 1986, cc. 652-663; Parham P. и др., Monoclonal antibodies: purification, fragmentation and application to structural and functional studies of class I MHC antigens, J Immunol Meth 53, 1982, cc. 133-173; Raychaudhuri G. и др., Human IgGl and its Fc fragment bind with different affinities to the Fc receptors on the human U937, HL-60 and ML-1 cell lines, Mol Immunol 22(9), 1985, cc. 1009-1019; Rousseaux J. и др., The differential enzyme sensitivity of rat immunoglobulin G subclasses to papain an pepsin, Mol Immunol 17, 1980, cc. 469-482; Rousseaux J. и др., Optimal condition for the preparation of Fab and F(ab')2 fragments from monoclonal IgG of different rat IgG subclasses, J Immunol Meth 64, 1983, cc. 141-146; Wilson K.M. и др., Rapid whole blood assay for HIV-1 seropositivity using an Fab-peptide conjugate, J Immunol Meth 138, 1991, cc. 111-119).
Гуманизация фрагмента антитела NT-H
Фрагмент антитела гуманизировали методом трансплантации CDR (Jones Р. Т., Dear Р.Н., Foote J., Neuberger M.S. и Winter G., Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse, Nature 321, 1986, cc. 522-525).
Для получения гуманизированной последовательности осуществляли следующие стадии:
Экстракция общей РНК: Общую РНК экстрагировали из NT-H-гибридом, используя набор фирмы Qiagen.

Первый цикл ОТ-ПЦР: Применяли набор QIAGEN OneStep RT-PCR (каталожный №210210). ОТ-ПЦР осуществляли с использованием набора праймеров, специфических в отношении тяжелых и легких цепей. Для каждого образца РНК осуществляли ОТ-ПЦР-реакции для 12 индивидуальных тяжелых цепей и 11 легких цепей, используя смесь вырожденных «прямых» праймеров, перекрывающих лидерные последовательности вариабельных областей. «Обратные» праймеры локализовали в константных областях тяжелых и легких цепей. В праймеры не встраивали никакие сайты рестрикции.

Набор для осуществления реакции: 5 × буфер из набора QIAGEN OneStep RT-PCR, 5,0 мкл; смесь дНТФ (содержащая по 10 мМ каждого дНТФ), 0,8 мкл; набор праймеров, 0,5 мкл; смесь ферментов из набора QIAGEN OneStep RT-PCR, 0,8 мкл; матричная РНК, 2,0 мкл; не содержащая РНКазу вода до 20,0 мкл; общий объем 20,0 мкл.
Условия осуществления ПЦР: обратная транскрипция: 50°C, 30 мин; начальная активация ПЦР: 95°C, 15 мин.
Программа циклической реакции: 20 циклов при 94°C, 25 с; 54°C, 30 с; 72°C, 30 с; конечное удлинение: 72°C, 10 мин.
Второй цикл с использованием «полугнездовой» ПЦР: ОТ-ПЦР-продукты, полученные с помощью первого цикла реакций, дополнительно амплифицировали с использованием второго цикла ПЦР. Осуществляли ОТ-ПЦР-реакции для 12 индивидуальных тяжелых цепей и 11 легких цепей с использованием наборов «полугнездовых» праймеров, специфических в отношении вариабельных областей антител.
Набор для осуществления реакции: 2 × смесь для ПЦР, 10 мкл; набор праймеров, 2 мкл; продукт, полученный в первом цикле ПЦР, 8 мкл; общий объем 20 мкл; отчет о клонировании полученных с использованием гибридомы антитела (Hybridoma Antibody Cloning Report).
Условия осуществления ПЦР: начальная денатурация в течение 5 мин при 95°C; 25 циклов при 95°C в течение 25 с, 57°C в течение 30 с, 68°C в течение 30 с; конечное удлинение в течение 10 мин при 68°C.
После завершения ПЦР осуществляли анализ образцов, полученных с помощью ПЦР-реакций, в агарозном геле для визуализации амплифицированных ДНК-фрагментов. После секвенирования более 15 клонированных ДНК-фрагментов, амплифицированных с помощью «гнездовой» ОТ-ПЦР, клонировали несколько тяжелых и легких цепей мышиных антител, и они оказались правильными. С помощью сравнительного анализа белковой последовательности и анализа CDR идентифицировали одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. После сравнительного анализа с гомологичными человеческими каркасными последовательностями определяли полученную в результате гуманизирования последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая представлена на фиг. 6 (поскольку аминокислоты в положениях 26, 40 и 55 в вариабельной области тяжелой цепи и аминокислота в положении 40 в вариабельной области легкой цепи имеют решающее значение для способности к связыванию, их можно превращать вновь в исходные мышиные аминокислоты. Полученные кандидаты представлены ниже) (Padlan Е.А., А possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand-binding properties, Mol. Immunol. 28, 1991, cc. 489-498; Harris L. и Bajorath J., Profiles for the analysis of immunoglobulin последовательность: Comparison of V gene subgroups, Protein Sci. 4, 1995, cc. 306-310).
Аннотация к последовательностям фрагментов антител (SEQ ID NO: 7-14): выделены жирным шрифтом и подчеркнуты CDR 1, 2, 3, расположенные в хронологическом порядке; курсивом обозначены константные области; шарнирные области выделены жирным шрифтом, а гистидиновая метка выделена жирным шрифтом и курсивом; точечная мутация в каркасном участке выделена серым фоном.
Пример 2
Воздействие отобранных антител к АРМ на биологическую активность АРМ
Воздействие отобранных антител к ADM на биологическую активность АРМ тестировали с использованием функционального анализа цАМФ в присутствии человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина (биологический анализ адреномедуллина).
Тестирование антител, мишенью которых является человеческий или мышиный адреномедуллин с помощью функционального анализа цАМФ в присутствии человеческого рекомбинантного рецептора адреномодуллина (биологический анализ адреномедуллина)
Материалы:
Клеточная линия: СНО-К1.
Рецептор: адреномедуллиновый (CRLR+RAMP3).
Регистрационный номер клеточной линии, несущей рецептор: CRLR: U17473; RAMP3: AJ001016.
4
2
4
2
Клетки линии СНО-К1, экспрессирующие человеческий рекомбинантный адреномедуллиновый рецептор (FAST-027C), выращенные до тестирования в среде без антибиотиков, отделяли путем осторожной отмывки с помощью ЗФР-ЭДТК (5 мМ ЭДТК), выделяли центрифугированием и ресуспендировали в буфере для анализа (KRH: 5 мМ KCl, 1,25 мМ MgSO, 124 мМ NaCl, 25 мМ HEPES, 13,3 мМ глюкоза, 1,25 мМ KHPO, 1,45 мМ CaCl, 0,5 г/л БСА).
Параллельно получали кривые дозовой зависимости для агонистов-эталонов (hADM или mADM).
Тестирование антагонистов (96-луночный планшет):
Для тестирования антагонистов смешивали 6 мкл агониста-эталона (человеческий (5,63 нМ) или мышиный (0,67 нМ) адреномедуллин) с 6 мкл тестируемых образцов, включающих различные разведения антагонистов; или с 6 мкл буфера. После инкубации в течение 60 мин при комнатной температуре добавляли 12 мкл клеток (2500 клеток/лунку). Планшеты инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. После добавления буфера для лизиса определяли процент DeltaF (изменение флуоресценции) согласно спецификации производителя с использованием набора для HTRF (метод (оценки связывания рецептора с лигандом) на основе гомогенной флуоресценции с разрешением по времени) фирмы Cis-Bio International (каталожный №62АМ2 РЕВ). В качестве антагониста-эталона применяли hADM 22-52.
Тестирование антител с помощью цАМФ-HTRF-анализа
Антитело к человеческому hADM (NT-H, MR-H, СТ-Н) тестировали в отношении антагонистической активности с помощью функционального анализа цАМФ с использованием человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина (FAST-027C) в присутствии 5,63 нМ человеческого ADM 1-52, используя следующие конечные концентрации антител: 100, 20, 4, 0,8, 0,16 мкг/мл.
Антитела к mADM (NT-M, MR-M, СТ-М) тестировали в отношении антагонистической активности с помощью функционального анализа цАМФ с использованием человеческого рекомбинантного рецептора адреномедуллина (FAST-027C) в присутствии 0,67 нМ мышиного ADM 1-50, используя следующие конечные концентрации антител: 100, 20, 4, 0,8, 0,16 мкг/мл. Строили график зависимости ингибирования от концентрации антагониста (см. фиг. 3а-3м). Данные о максимальном уровне ингибирования индивидуальными антителами представлены в таблице 3.
Таблица 3
Антитело
Максимальное ингибирование биоактивности ADM (ADM-биоанализ) (%)
NT-H
38
MR-H
73
СТ-Н
100
NT-M FAB
26
NT-M FAB2
28
NT-M
45
MR-M
66
СТ-М
100
неспецифический мышиный IgG
0
Пример 3
Данные о стабилизации hADM антителом к АРМ
Стабилизирующее воздействие на человеческий АРМ человеческими антителами к АРМ тестировали с использованием иммуноанализа hAPM.
Иммуноанализ для количественной оценки человеческого адреномедуллина
Применяли технологию люминисцентного иммуноанализа на основе мечения сложным эфиром акридиния с использованием покрытой «сэндвичем» пробирки.
Меченое соединение (метка (трейсер)):

100 мкг (100 мкл) антитела СТ-Н (1 мг/мл в ЗФР, pH 7,4, фирма AdrenoMed AG, Германия) смешивали с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, фирма InVent GmbH, Германия) (ЕР 0353971) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченое СТ-Н очищали ЖХВР-гель-фильтрацией с использованием Bio-Sil SEC 400-5 (фирма Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенное СТ-Н разводили (300 ммолей/л фосфата калия, 100 ммолей/л NaCl, 10 ммолей/л Na-ЭДТК, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, рН 7,0). Конечная концентрация составляла примерно 800000 относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминисценцию сложного эфира акридиния измеряли с помощью устройства AutoLumat LB 953 (фирма Berthold Technologies GmbH & Co, KG).
Твердая фаза:
Полистироловые пробирки (фирма Greiner Bio-One International AG, Австрия) покрывали (18 ч при комнатной температуре) антителом MR-H (фирма AdrenoMed AG, Германия) (1,5 мкг MR-H/0,3 мл 100 ммолей/л NaCl, 50 ммолей/л Трис/HCl, pH 7,8). После блокирования 5%-ным бычьим сывороточным альбумином пробирки промывали ЗФР, pH 7,4 и сушили в вакууме.
Калибровка:
Для калибровки в анализе использовали разведения hAPM (фирма ВАСНЕМ AG, Швейцария) в 250 ммолей/л NaCl, 2 г/л Тритон Х-100, 50 г/л бычьего сывороточного альбумина, 20 таблеток/л коктейля ингибиторов протеаз (фирма Roche Diagnostics AG, Швейцария))
Иммуноанализ hADM:
50 мкл образца (или калибратора (эталона)) вносили пипеткой в покрытые пробирки после добавления меченого СТ-Н (200 мкл), пробирки инкубировали в течение 4 ч при 4°C. Несвязанную метку удаляли путем 5-кратной отмывки (каждый раз по 1 мл) отмывочным раствором (20 м ЗФР, pH 7,4, 0,1% Тритон X-100).
Связанную с пробиркой хемилюминесценцию измеряли, используя устройство LB 953.
На фиг. 4 представлена типичная кривая зависимости сигнала от дозы hADM, а также кривая зависимости сигнала от дозы hADM в присутствии 100 мкг/мл антитела NT-H.
NT-H не оказывало влияния на результат описанного иммуноанализа hADM.
Стабильность человеческого адреномедуллина:
Человеческий ADM разводили в человеческой цитратной плазме (конечная концентрация 10 нМ) и инкубировали при 24°C. В выбранные моменты времени расщепление hADM прекращали путем замораживания при -20°C. Инкубацию осуществляли в отсутствии или в присутствии NT-H (100 мкг/мл). Оставшийся hADM оценивали количественно с помощью описанного выше иммуноанализа hADM.
На фиг. 5 представлены данные о стабильности hADM в человеческой (цитратной) плазме в отсутствии и в присутствии антитела NT-H. Время полужизни hADM при его анализе индивидуально составляло 7,8 ч, а в присутствии NT-H время полужизни оставляло 18,3 ч (повышение стабильности в 2,3 раза).
Пример 4
Связанная с сепсисом смертность (ранняя обработка)
Созданная на животных модель
В опыте использовали самцов мышей линии С57 В1/6 возрастом 12-15 недель (фирма Charles River Laboratories, Германия). Перитонит индуцировали хирургическим путем под легкой анестезией изофлюраном. Делали разрезы в левом верхнем квадранте брюшной полости (в норме - область локализации слепой кишки). Слепую кишку обнажали и накладывали плотную лигатуру вокруг слепой кишки с наложением швов дистально относительно входа тонкой кишки. В слепой кишке делали одну полученную с помощью прокола рану с использованием иглы 24 размера, и небольшое количество содержимого слепой кишки выдавливали через рану. Слепую кишку возвращали в брюшную полость и область лапаротомии закрывали. И, наконец, животных возвращали в их клетки, в которых они имели свободный доступ к корму и воде. Для замещения жидкости вводили s.c. 500 мкл соляного раствора.
Обработка соединением и дозы соединения (NT-M, MR-M, СТ-М)
Мышей обрабатывали сразу после CLP (ранняя обработка). CLP - это сокращенное обозначение процедуры наложения лигатуры и прокола слепой кишки (cecal ligation and puncture (CLP)).
Исследуемые группы
Тестировали три соединения в сравнении с обработкой наполнителем и в сравнении с обработкой контрольным соединением. Через 1 день в каждой группе у 5 мышей осуществляли отбор крови для определения BUN (азот мочевины крови). В каждой группе осуществляли наблюдение еще за десятью мышами в течение 4 дней.
Группы обработки, доза (10 мкл/г веса тела)/ последующее наблюдение:
1: NT-M, 0,2 мг/мл, выживаемость в течение 4 дней.
2: MR-M, 0,2 мг/мл, выживаемость в течение 4 дней.
3: СТ-М, 0,2 мг/мл, выживаемость в течение 4 дней.
4: Неспецифический мышиный IgG, 0,2 мг/мл, выживаемость в течение 4 дней.
5: Контроль - ЗФР, 10 мкл/г веса тела, выживаемость в течение 4 дней.
Клиническое химическое обследование
Концентрации азота мочевины крови (BUN) для оценки почечной функции измеряли в исходный момент времени и через 1 день после CLP. Образцы крови получали из пещеристого синуса с помощью капилляра под легкой анестезией (диэтиловым) эфиром. Измерения осуществляли с использованием мультианализатора AU 400 Olympus. Данные о смертности в течение 4 дней представлены в таблице 4. Средние концентрации BUN представлены в таблице 5.
Таблица 4
Смертность в течение 4 дней
Выживаемость (%)
ЗФР
0
неспецифический мышиный IgG
0
СТ-М
10
MR-M
30
NT-M
70
Таблица 5
Средняя величина по 5 животным
BUN до CLP (мМ)
BUN в день 1 (мМ)
ЗФР
8,0
23,2
неспецифический мышиный IgG
7,9
15,5
СТ-М
7,8
13,5
MR-M
8,1
24,9
NT-M
8,8
8,2
Как продемонстрировано в таблице 4, антитело NT-M в значительной степени снижало смертность. Через 4 дня выживало 70% мышей, обработанных антителом NT-M. При обработке антителом MR-M через 4 дня выживало 30% животных, а при обработке антителом СТ-М выживало 10% животных. В отличие от этого, все мыши, обработанные неспецифическим мышиным IgG, погибали через 4 дня. Такой же результат получен в контрольной группе, в которой мышам вводили ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор).
Для оценки почечной функции применяли тест на азот мочевины крови или BUN-тест, помогающий диагностировать болезнь почек и позволяющий осуществлять мониторинг пациентов с острой или хронической почечной дисфункцией или недостаточностью.
Результаты S-BUN-теста подтвердили, что антитело NT-M оказалось наиболее эффективным в отношении защиты почек.
Связанная с сепсисом смертность (поздняя обработка)
Созданная на животных модель
В опыте использовали самцов мышей линии C57B 1/6 возрастом 12-15 недель (фирма Charles River Laboratories, Германия). Перитонит индуцировали хирургическим путем под легкой анестезией изофлюраном. Делали разрезы в левом верхнем квадранте брюшной полости (в норме - область локализации слепой кишки). Слепую кишку обнажали и накладывали плотную лигатуру вокруг слепой кишки с наложением швов дистально относительно входа тонкой кишки. В слепой кишке делали помощью прокола одну рану с использованием иглы 24 размера и небольшое количество содержимого слепой кишки выдавливали через рану. Слепую кишку возвращали в брюшную полость и область лапаротомии закрывали. И, наконец, животных возвращали в их клетки, в которых они имели свободный доступ к корму и воде. Для замещения жидкости вводили s.c. 500 мкл соляного раствора.
Обработка соединением и дозы соединения (NT-M FAB2)
Тестировали соединение NT-M FAB2 в сравнении с обработкой наполнителем и контрольным соединением. Обработку осуществляли после полного развития сепсиса, т.е. через 6 ч после CLP (поздняя обработка). В каждую группу входило по 4 мыши и за ними осуществляли наблюдение в течение 4 дней.
Группы обработки:
1: NT-M, FAB2, 0,2 мг/мл, выживаемость в течение 4 дней.
2: Контроль: неспецифический мышиный IgG, 0,2 мг/мл, выживаемость в течение 4 дней.
3: Наполнитель - ЗФР, 10 мкл/г веса тела, выживаемость в течение 4 дней.
Таблица 6
Смертность в течение 4 дней
Выживаемость (%)
ЗФР
0
неспецифический мышиный IgG
0
NT-M FAB2
75
Как продемонстрировано в таблице 6, антитело NT-M FAB 2 в значительной степени снижало смертность. Через 4 дня выживало 75% мышей, обработанных антителом NT-M FAB. В отличие от этого, все мыши, обработанные неспецифическим мышиным IgG, погибали через 4 дня. Такой же результат был получен в контрольной группе, в которой мышам вводили ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор).
Пример 5
Добавочное (положительное) воздействие антитела к АРМ на CLP-животных, дополняющее лечение антибиотиками, и на стабилизацию кровообращения с использованием катехоламинов, а также на регуляцию жидкостного баланса
Созданная на животных модель
В опыте использовали самцов мышей линии C57B 1/6 (возраст 8-12 недель, вес 22-30 г). В качестве модели для изучения септического шока применяли полимикробный сепсис, вызванный путем наложения лигатуры и прокола слепой кишки (CLP) (Albuszies G. и др., Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory blood flow, oxygenation, and metabolism in hyperdynamic murine septic shock, Crit Care Med, 33, 2005, cc. 2332-2338; Albuszies G. и др., The effect of iNOS deletion on hepatic gluconeogenesis in hyperdynamic murine septic shock, Intensive Care Med, 33, 2007, cc. 1094-1101); Barth E. и др., Role of iNOS in the reduced responsiveness of the myocardium to catecholamines in a hyperdynamic, murine model of septic shock, Crit Care Med, 34, 2006, cc. 307-313; Baumgart К. и др., Effect of SOD-1 over-expression on myocardial function during resuscitated murine septic shock, Intensive Care Med, 35, 2009, cc. 344-349; Baumgart К. и др., Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled H2S in anesthetized and ventilated mice, Crit Care Med, 38, 2010, cc. 588-595; Simkova V. и др., The effect of SOD-1 over-expression on hepatic gluconeogenesis and whole-body glucose oxidation during resuscitated, normotensive murine septic shock, Shock, 30, 2008, cc. 578-584; Wagner F. и др., Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock, Shock, в печати; Wagner F. и др., Effects of intravenous H2S after murine blunt chest trauma: a prospective, randomized controlled trial, Crit Care, статья представлена для публикации, 2011).
После взвешивания мышей подвергали анестезии путем внутрибрюшинной инъекции кетамина в концентрации 120 мкг/г, мидазолама в концентрации 1,25 мкг/г и фентанила в концентрации 0,25 мкг/г. Во время хирургической процедуры температуру тела поддерживали на уровне 37-38°C. Для получения доступа к слепой кишке делали разрез длиной 1 см по срединной брюшной линии. Затем на слепую кишку вблизи ее основания накладывали лигатуру с помощью шелковой нити размера 3-0 и осуществляли один прокол с помощью иглы 18 размера. Слепую кишку возвращали на место, и разрез вновь зашивали (нить размера 4-0). Для компенсации потери жидкости в процессе операции инъецировали подкожно в кожу спины 0,5 мл лактированного раствора Рингера с 1 мкг/г бупренорфина в качестве аналгетика. Для антибиотического воздействия (антибиоз) мышам вводили подкожно в нижние конечности цефтриаксон (30 мкг/г) и клиндамицин (30 мкг/г).
После CLP-хирургии животных выдерживали в нагретой соответствующим образом среде, при этом животные имели свободный доступ к воде и корму.
Восполнение потребности в жидкости обеспечивали подкожными инъекциями в спину 0,5 мл лактированного раствора Рингера, дополненного глюкозой в концентрации 4 мкг/г и бупренорфином в концентрации 1 мкг/г, которые осуществляли с 8-часовым циклом после кратковременной анестезии изофлюраном. Кроме того, антибиоз поддерживали с помощью подкожных инъекций в нижние конечности цефтриаксона (30 мкг/г) и клиндамицина (30 мкг/г).
Дозирование тестируемых субстанций
Обработка на ранней стадии (ранняя обработка)
Сразу после CLP-хирургии и закрытия разреза вводили в качестве тестируемой субстанции антитело NT-M в концентрации 500 мкг/мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР) путем инъекции в пенисную вену в дозе 2 мг на кг веса тела (объем дозы 88-120 мкл) (5 животных).
Обработка на поздней стадии (поздняя обработка)
После полного развития сепсиса, т.е. через 15,5 ч после CLP-хирургии, животных повергали анестезии согласно описанному выше методу и вводили NT-M в концентрации 500 мкг/мл в забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР) путем инъекции в пенисную вену в дозе 2 мг на кг веса тела (объем дозы 88-120 мкл) (3 животных).
Контрольной группе (6 животных) сразу после CLP-хирургии вводили в соответствующем количестве наполнитель, т.е. раствор ЗФР без антитела (4 мкл/г, 88-120 мкл).
Исследуемые группы и схема эксперимента
Осуществляли тщательный мониторинг на созданной на мышах модели септического шока:

2
2
Мониторинг проводили в трех группах, включающих 3, 5 и 6 животных. Группе 1 (5 животных) вводили антитело NT-M через 15,5 ч после CLP, группе 2 вводили NT-M сразу после CLP-хирургии, а группе 3 вводили соответствующее количество ЗФР (4 мкл/г). После 16-часовой инкубации после осуществления CLP (что позволяло развиться полимикробному сепсису) эксперимент продолжали, осуществляя мониторинг и вмешательства, соответствующие режиму интенсивной медицинской помощи. Для этого после взвешивания животных подвергали анестезии согласно методу, описанному в разделе, касающемся CLP-хирургии (за исключением подвергавшихся поздней обработке животных, которых анестезировали перед обработкой). Температуру тела поддерживали на уровне 37-38°C в течение остальной фазы эксперимента. После трахеотомии и интубации осуществляли мониторинг дыхания и поддерживали его с помощью лабораторного легочного вентилятора для животных Flexivent (фирма Emka Technologies, FiO 0,5, PEEP 10 HO, VT 8 мкл/г, I:E 1:1,5, AF 70-140 в зависимости от температуры).

Анестезию поддерживали в течение эксперимента путем канюлирования наружной правой яремной вены с непрерывной инфузией кетамина из расчета 30 мкг/г × ч и фентанила из расчета 0,3 мкг/г × ч. Кроме того, канюлировали правую сонную артерию для постоянного мониторинга частоты сердечных сокращений и среднего артериального давления (MAP). Среднее артериальное давление поддерживали на уровне MAP >65 мм рт.столба путем внутривенной (V. jugularis (яремная вена)) инфузии коллоидов (80 мкл/г × ч, Hextend) и при необходимости норадреналина, растворенного в коллоидах, в качестве сосудосуживающего средства. Через канюлированную сонную артерию (А. carotis) отбирали образцы крови (120 мкл) в момент времени 0 и через 4 ч для определения креатинина. Делали прокол мочевого пузыря и собирали мочу через катетер, введенный в мочевой пузырь. Эксперимент завершали либо через 6 ч, либо до этого срока, если не удавалось поддерживать MAP на уровне >65 мм рт. столба (V. jugularis) путем введения сосудосуживающего средства.
Измеряемые параметры
Измеряли и анализировали следующие параметры: общее поглощение норадреналина (мкг NA/г), скорость поглощения норадреналина (мкг NA/г/ч), общий объем мочи, собранной в течение эксперимента, концентрация креатинина (мкг/мл) в конце эксперимента и средний клиренс креатинина (мкл/мин).
Таблица 7
Общее поглощение норадреналина (мкг NA/г) (среднее значение)
Скорость поглощения норадреналина (мкг NA/г/ч) (среднее значение)
контроль (мышиный IgG) (N=6)
0,17 мкг/г
0,032 мкг/ч/г
NT-M (N=5), ранняя обработка
0,07 мкг/г
0,012 мкг/ч/г
относительное изменение (ранняя обработка, ослабление)
59% (59%)
62,5% (62,5%)
NT-M (N=3), поздняя обработка
0,04 мкг/г
0,0075 мкг/ч/г
относительное изменение (поздняя обработка, ослабление)
76,5% (76,5%)
76,5% (76,5%)
Потребность в катехоламине оценивали после введения либо неспецифического мышиного IgG всем 6 мышам из контрольной группы, либо мышиного антитела NT группе из 5 мышей сразу после CLP (ранняя обработка), либо мышиного антитела NT группе из 3 мышей через 15,5 ч после CLP (поздняя обработка).
Снижение потребности в катехоламине является мерой стабилизации кровообращения. Таким образом, данные продемонстрировали, что антитело к ADM, прежде всего антитело NT-M, обеспечивало значительную стабилизацию кровообращения и значительное снижение потребности в катехоламине. Стабилизирующее кровообращение действие проявлялось при ранней обработке (сразу после CLP) и при обработке после полного развития сепсиса (поздняя обработка) (см. фиг. 7).
Регулирование жидкостного баланса
Более высокий положительный жидкостной баланс как имеющий место сразу после того, как животные приходят в сознание, так и кумулятивный баланс в течение 4 дней, ассоциирован с повышенным риском смерти при септическом шоке. Контроль жидкостного баланса имеет самое важное значение в процессе болезни пациентов с сепсисом (см. Boyd и др., 2011). Контроль жидкостного баланса пациентов, находящихся на критической стадии заболевания, остается важной задачей при оказании интенсивной медицинской помощи. Как продемонстрировано в таблице 8, обработка мышей после CLP (см. экспериментальные процедуры в разделе «Созданная на животных модель») антителом NT-M приводила к повышению общего объема экскретированной мочи. Объем секретируемой мочи был примерно в три раза выше у обработанных NT-M животных, чем у необработанных мышей. Положительное действие лечения обнаружено как при ранней, так и при поздней обработке. Жидкостной баланс улучшался примерно на 20-30% как при ранней, так и при поздней обработке. Таким образом, данные свидетельствуют о том, что применение антитела к ADM, прежде всего применение антитела NT к ADM, обладает преимуществом для регулирования жидкостного баланса у пациентов (см. таблицу 8 и фиг. 8 и 9).
Таблица 8
Средний объем мочи/г веса тела
Средний объем требуемой для баланса жидкости/г веса тела
контроль (мышиный IgG) (N=6)
0,042 мл/г
0,23 мл/г
NT-M (N=5), ранняя обработка
0,12 мл
0,18 мл/г
относительное изменение после ранней обработки
+186%
-21,7%
NT-M (N=3), поздняя обработка
0,125 мл
0,16 мл/г
относительное изменение после поздней обработки
+198%
-30,5%
Улучшение почечной функции
Присутствие комбинации острой почечной недостаточности и сепсиса ассоциировано с 70%-ной смертностью, по сравнению со смертностью, составляющей 45% среди пациентов, страдающих только острой почечной недостаточностью (Schrier и Wang, «Mechanisms of Disease Acute Renal Failure and Sepsis», The New England Journal of Medicine; 351, 2004, cc. 159-169). Концентрация креатинина и клиренс креатинина представляют собой стандартные лабораторные параметры для мониторинга почечной (дис)функции (Jacob, «Acute Renal Failure», Indian J. Anaesth., 47 (5), 2003, cc 367-372). Данные о концентрации креатинина и клиренсе креатинина, полученные в вышеописанном эксперименте на животных (ранняя обработка), представлены в таблице 9.
Таблица 9
Почечная функция
Концентрация креатинина (мкг/мл)
Средний уровень клиренса креатинина (мкл/мин)
контроль, мышиный IgG (MW)
2,6 мкг/мл
174 мкл/мин
NT-M (MW)
1,5 мкг/мл
373 мкл/мин
относительное изменение (ослабление)
-42% (42%)
+114% (114%)
По сравнению с контрольными страдающими сепсисом животными в результате обработки NT-M концентрация креатинина снижалась на 42%, а клиренс креатинина улучшался более чем на 100% (таблица 9). Данные демонстрируют, что введение антитела к ADM, прежде всего NT-M, приводило к улучшению почечной функции.
Улучшение воспалительного статуса печени
32
Ткань печени контрольных животных и животных, подвергнутых ранней обработке, гомогенизировали и лизировали в буфере для лизиса. Для получения клеточного экстракта клетки ресуспендировали, лизировали на льду и центрифугировали. Супернатант (белковый экстракт) хранили при -80°C. Активацию ядерного фактора энхансера гена легкой каппа-цепи в B-клетках (NF-κВ) определяли согласно описанному ранее методу, используя анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) (1, 2). Клеточные экстракты (10 мкг) инкубировали на льду с поли-дезоксиинозиновой-дезоксицитидиловой кислотой (poly-dI-dC) и меченным с помощью P двухцепочечным олигонуклеотидом (фирма Biomers, Ульм, Германия), содержащим NF-κB (HIV KBsite) . Комплексы разделяли в нативных полиакриламидных гелях, сушили и экспонировали на рентгеновские пленки. Для количественной оценки методом денситометрии радиоактивно меченого NF-κB применяли устройство для визуализации фосфора (phosphorimager) и программу для анализа изображений (устройство для анализа изображений AIDA; фирма Raytest). Для сравнения индивидуальных гелей интенсивность каждой полосы соотносили с полосой для одновременно внесенного экстракта, полученного для контрольных животных, которых не подвергали хирургическому вмешательству и CLP. При этом полученные с помощью EMSA данные выражали в виде кратности увеличения относительно контрольных величин.
Статистическая обработка: Все данные представлены в виде медианных значений (диапазон), если не указано иное, статистические различия между двумя группами анализировали с помощью критерия ранговых сумм Манна-Уитни для несвязанных выборок.
Результаты: У животных, обработанных NT-M, в ткани печени выявлено выраженное ослабление активации NF-κB (2,27 (1,97-2,53)) по сравнению с обработанными наполнителем животными (2,92 (2,50-3,81)) (p<0,001) (см. фиг. 10).
Ссылки:
1. Wagner F., Wagner К., Weber S., Stahl В., Knöferl M.W., Huber-Lang M., Seitz D.H., Asfar P., Calzia E., Senftleben U., Gebhard F., Georgieff M., Radermacher P., Hysa V., inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock», Shock 35(4), 2011, cc. 396-402.
2. Wagner F., Scheuerle A., Weber S., Stahl В., McCook O., Knöferl M.W., Huber-Lang M., Seitz D.H., Thomas J., Asfar P., Szabo C., Möller P., Gebhard F., Georgieff M., Calzia E., Radermacher P., Wagner K., «Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice», J Trauma 71(6), 2011, cc. 1659-1667.
Пример 6
Определение побочного действия антитела NT-M in vivo
В опыте использовали самцов мышей линии C57B 1/6 возрастом 12-15 недель (фирма Charles River Laboratories, Германия). Шесть мышей обрабатывали антителом NT-M в дозе 0,2 мг/мл (10 мкл/г веса тела), шесть мышей обрабатывали ЗФР (10 мкл/г веса тела). Осуществляли мониторинг выживаемости и физического состояния в течение 14 дней. В обеих группах смертность составляла 0, не было обнаружено различий в физическом состоянии между группой, обработанной NT-M, и контрольной группой.
Пример 7
Индуцированная гентамицином нефротоксичность
Создавали модель несептического острого поражения почек, основанную на индуцируемой гентамицином нефротоксичности (Chiu P.J.S., «Models used to assess renal functions», Drug Develop Res 32, 1994, cc. 247-255). Указанную модель применяли для решения вопроса о том, может ли обработка антителом к адреномедуллину улучшать функцию почек.
Эксперимент проводили следующим образом:
Воздействие NT-M на индуцируемую гентамицином нефротоксичность у крыс
План опыта
Группа
Тестируемый продукт
Путь введения
Концентрация мг/мл
Доза
Крысы<sup>Г</sup> (самцы)
мкл/кг
мг/кг
1
гентамицин<sup>а</sup> + наполнитель<sup>б</sup>
IV
NA × 4<sup>В</sup>
8
2
гентамицин<sup>а</sup> + NT-M
IV
× 4<sup>В</sup>
8
<sup>а</sup>гентамицин в дозе 120 мг/кг внутримышечно в течение 7 дней (дни 0-6);
<sup>б</sup>наполнитель; инъецировали внутривенно (i.v.) за 5 мин до введения гентамицина в день 0, затем инъекции осуществляли в дни 2, 4 и 6;
<sup>в</sup>NT-M инъецировали внутривенно (i.v.) в дозе 4 мг/кг за 5 мин до введения гентамицина в день 0, затем в дозе 2 мг/кг i.v. в дни 2, 4 и 6;
<sup>г</sup>образцы плазмы собирали в обработанные ЭДТК пробирки (в дни 1 и 3 перед введением тестируемых и контрольных соединений; 100 мкл; день 7: начинали 24-часовой сбор мочи, 120 мкл на льду, после введения гентамицина в день 0, затем в дни 2 и 6; сбор образцов крови осуществляли в дни 1, 3 и 7.
+
+
+
+
Опыт проводили на группах, состоящих из 8 самцов крыс линии Sprague-Dawley весом 250±20 г. Животных обрабатывали гентамицином в дозе 120 мг/кг i.m. в течение семи последовательных дней (группы 1 и 2). Тестируемое соединение (антитело к адреномедуллину NT-M) и наполнитель (забуференный фосфатом физиологический раствор) инъецировали внутривенно за 5 мин до введения гентамицина в день 0, после чего осуществляли его инъекцию в дни 2, 4 и 6. Ежедневно осуществляли мониторинг веса тела и клинических признаков. 24-часовые сборы мочи на льду осуществляли в дни 0, 2 и 6. В образцах мочи оценивали концентрации Na и K и креатинина. Образцы крови для клинического химического анализа собирали в дни 1 (до обработки гентамицином), 3 (до обработки гентамицином) и 7. Основными анализируемыми веществами, которые оценивали при мониторинге почечной функции, являлись электролиты сыворотки (Na и K), креатинин и BUN. Образцы плазмы собирали в содержащие ЭДТК пробирки (дни 1 и 3:100 мкл; день 7:120 мкл). Рассчитывали клиренс креатинина. Объем мочи, уровень электролитов и креатинина в моче выражали в виде экскретированного количества на 100 г веса тела животного. Всех животных умерщвляли в день 7. Почки взвешивали.
Сбор мочи.
+
+
Животных помещали в индивидуальные клетки, в которых мочу собирали в течение 24 ч в день 0, день 2 и день 6. Измеряли объем мочи, уровень Na, K и креатинина.
Клиренс эндогенного креатинина (CCr) рассчитывали следующим образом:
CCr(мл/24 ч)=[UCr(мг/мл) × V(мл/24 ч)]/SCr(мг/мл).
+
Экскрецию натрия (Na) в 24-часовой моче рассчитывали следующим образом:
UNaV(мкэкв/24 ч) = UNa(мкэкв/мл) × V(мл/24 ч).
Аналогичным образом рассчитывали экскрецию NAG и NGAL в собранной в течение 24-часов моче.
+
+
Na
Фракциональная экскреция Na(FE) или процент фильтруемого натрия, выделившегося в конечную мочу, является мерой способности клубочков к реабсорбции Na. Ее рассчитывали следующим образом:
Na
Na
Na
Cr
FE(%)=100 × [U(мкэкв/мл) × V(мл/24 ч)]/P(мкэкв/мл) × C(мл/24 ч).
+
Обработка антителом к адреномедуллину улучшала некоторые критерии почечной функции в день 7 по сравнению с наполнителем: сывороточный креатинин 1,01 мг/дл (NT-M) по сравнению с 1,55 мг/дл (наполнитель) (фиг. 11), BUN 32,08 мг/дл (NT-M) по сравнению с 52,41 мг/дл (наполнитель) (фиг. 12), клиренс эндогенного креатинина 934,43 мл/24 ч (NT-M) по сравнению с 613,34 мл/24 ч (наполнитель) (фиг. 13), фракциональная экскреция Na 0,98% (NT-M) по сравнению с 1,75% (наполнитель) (фиг. 14).
Пример 8
На описанной выше мышиной CLP-модели изучали воздействие обработки антителом к адреномедуллину NT-M на некоторые параметры функции почек.
NT-M вызывало 3-й 2-кратное повышение диуреза и клиренса креатинина соответственно, что в результате снижало концентрацию креатинина, мочевины и NGAL в крови в конце эксперимента (см. таблицу 10). Кроме того, концентрации продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС) в почке значительно снижались после обработки NT-M (фиг. 15).
Таблица 10 Параметры почечной функции у обработанных наполнителем (n=11) и NT-M (n=9) животных. Концентрации в крови измеряли в образцах, взятых в конце эксперимента. NGAL обозначает желатиназо-ассоциированный липокалин. Все данные представляют собой медианные величины (квартили).
Наполнитель
NT-M
р-значение
выделение мочи (мкл⋅г<sup>-1</sup>⋅ч<sup>-1</sup>)
4,4 (3,5; 16,5)
15,2 (13,9; 22,5)
0,033
клиренс креатинина (мл⋅мин<sup>-1</sup>)
197 (110; 301)
400 (316; 509)
0,006
уровень креатинина (мкг⋅мл<sup>-1</sup>)
1,83 (1,52; 3,04)
1,28 (1,20; 1,52)
0,010
уровень мочевины (мкг⋅мл<sup>-1</sup>)
378 (268; 513)
175 (101; 184)
0,004
NGAL (мкг⋅мл<sup>-1</sup>)
16 (15; 20)
11 (10; 13)
0,008
Эксперименты осуществляли следующим образом:
Креатинин. мочевина и нейтрофильный желатиназо-ассоциированный липокаин (NGAL)
2
3
Концентрации NGAL в крови оценивали, используя поступающий в продажу набор для ELISA (мышиный NGAL, RUO 042, фирма BioPorto Diagnostics A/S, Гентофте, Дания). Концентрации мочевины и креатинина измеряли с помощью снабженной капиллярной колонкой (Optima-5MS, фирма Macherey-Nagel, Дюрен, Германия) системой для газовой хроматографии/масс-спектрометрии (Agilent 5890/5970, Беблинген, Германия) используя H-креатинин (фирма CDN Isotope, Пуант-Клер, провинция Квебек, Канада) и метилмочевину (фирма FlukaChemikalien, Букс, Швейцария) в качестве внутренних стандартов. После депротеинизации с помощью ацетонитрила, центрифугирования и упаривания досуха супернатант восстанавливали в муравьиной кислоте и экстрагировали на анионообменной колонке со слабыми анионообменными взаимодействиями (WCX, фирма Phenomenex, Ашаффенбург, Германия). Добавление ацетонитрила плюс N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида и N-(трет-бутилдиметилсилил)-N-метилтрифторацетамида приводило к образованию трет-бутилдиметилсилильного и креатининтриметилсилильного производных мочевины соответственно. Осуществляли мониторинг ионов m/z 231 и 245 и m/z 329 и 332 для мочевины и креатинина в качестве анализируемых субстанций и внутренних стандартов соответственно. Исходя из выхода мочи и концентраций креатинина в плазме и моче, рассчитывали клиренс креатинина с помощью стандартной формулы.
Получение образцов
Почку, хранившуюся при -80°C, измельчали с помощью гомогенизатора в ЗФР и лизировали в имеющем двукратную концентрацию буфере для лизиса цельных клеток (100 мМ Трис, pH 7,6; 500 мМ NaCl; 6 мМ ЭДТК; 6 мМ EGTA (этиленклиголевая тетраацетиловая кислота); 1% Тритон-Х-100; 0,5% NP 40; 10% глицерина; ингибиторы протеаз (β-глицерофосфат, 2 мМ; ДТТ, 4 мМ; лейпептин, 20 мкМ; ортованадат натрия, 0,2 мМ)) и затем центрифугировали. Из супернатанта получали лизат цельных клеток; дебрис, содержащий остатки клеток, отбрасывали. Количество белка определяли фотометрически с помощью поступающего в продажу набора для анализа белков (фирма Bio-Rad, Геркулес, шт. Калифорния) и обрабатывали образцы таким образом, чтобы конечная концентрация белка составляла 4 мкг/мл. Образцы для мультиплексного анализа (цитокинов) и EMSA-анализа разводили в соотношении 1:1 буфером для EMSA (10 мМ Hepes; 50 мМ KCl; 10% глицерина; 0,1 мМ ЭДТК; 1 мМ ДТТ), образцы для иммуноблоттинга разводили в соотношении 1:1 2-кратным буфером для образцов (2% ДСН; 125 мМ Трис-HCl (pH 6,8 при 25°C); 10% глицерина; 50 мМ ДТТ; 0,01% бромфенолового синего).
Концентрации продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС) определяли с помощью набора для мультиплексного анализа мышиных цитокинов (Bio-Plex Pro Cytokine Assay, фирма Bio-Rad, Геркулес, шт. Калифорния), анализ осуществляли с использованием системы мультиплексного анализа суспензий Bio-plex согласно инструкциям производителя (см. также Wagner F., Wagner К., Weber S., Stahl В., Knöferl M.W., Huber-Lang M., Seitz D.H., Asfar P., Calzia E., Senftleben U., Gebhard F., Georgieff M., Radermacher P., Hysa V., inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock», Shock, 35, 2011, cc. 396-402; и Wagner F., Scheuerle A., Weber S., Stahl В., McCook O., Knöferl M.W., Huber-Lang M., Seitz D.H., Thomas J., Asfar P., Szabó C, Möller P., Gebhard F., Georgieff M., Calzia E., Radermacher P., Wagner K., «Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice», J Trauma, 71, 2011, cc. 1659-1667). В целом, метод состоял в следующем: в фильтрующий планшет добавляли соответствующие стандарты цитокинов и образцы. Образцы инкубировали с антителами, химически связанными с флуоресцентно мечеными микрогранулами. Затем в каждую лунку добавляли предварительно смешанные идентифицирующие антитела, после этого добавляли стрептавидин-фикоэритрин. После этого гранулы ресуспендировали и содержащую цитокины реакционную смесь оценивали количественно с помощью планшет-ридера, предназначенного для определения белка, Bio-Plex. Данные автоматически обрабатывали и анализировали с помощью программы Bio-Plex Manager 4.1, используя стандартную кривую, полученную с применением стандартов рекомбинантных цитокинов. Для статистической обработки уровни, более низкие, чем предел обнаружения анализа, принимали за ноль.
Пример 9
На описанной выше мышиной CLP-модели изучали воздействие обработки антителом к адреномедуллину NT-M на печень.
NT-M вызывало существенное снижение концентраций продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС) в печени (фиг. 16).
Измерение концентрации продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС) осуществляли аналогично методу, описанному в примере 8 (для почек).
Пример 10
На описанной выше мышиной CLP-модели изучали воздействие обработки антителом к адреномедуллину NT-M на некоторые цитокины и хемокины в циркулирующей крови (плазма).
Концентрации цитокинов и хемокинов
Определяли концентрации в плазме фактора некроза опухолей (TNF)-α, интерлейкина (IL)-6, моноцитарного хемоаттрактантного белка (МСР)-1 и продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС), используя набор для мультиплексного анализа мышиных цитокинов (Bio-Plex Pro Cytokine Assay, фирма Bio-Rad, Геркулес, шт. Калифорния), анализ осуществляли с использованием системы мультиплексного анализа суспензий Bio-plex согласно инструкциям производителя (см. также Wagner F., Wagner К., Weber S., Stahl В., Knöferl M.W., Huber-Lang M., Seitz D.H., Asfar P., Calzia E., Senftleben U., Gebhard F., Georgieff M., Radermacher P., Hysa V., «Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock», Shock, 35, 2011, cc. 396-402; и Wagner F., Scheuerle A., Weber S., Stahl В., McCook O., Knöferl M.W., Huber-Lang M., Seitz D.H., Thomas J., Asfar P., Szabó C., Moller P., Gebhard F., Georgieff M., Calzia E., Radermacher P., Wagner K., «Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice», J Trauma, 71, 2011, cc. 1659-1667). В целом, метод состоял в следующем: в фильтрующий планшет добавляли соответствующие стандарты цитокинов и образцы. Образцы инкубировали с антителами, химически связанными с флуоресцентно мечеными микрогранулами. Затем в каждую лунку добавляли предварительно смешанные идентифицирующие антитела, после этого добавляли стрептавидин-фикоэритрин. После этого гранулы ресуспендировали и содержащую цитокины реакционную смесь оценивали количественно с помощью планшет-ридера, предназначенного для определения белка, типа Bio-Plex. Данные автоматически обрабатывали и анализировали с помощью программы Bio-Plex Manager 4.1, используя стандартную кривую, полученную с применением стандартов рекомбинантных цитокинов. Для статистической обработки уровни, более низкие, чем предел обнаружения анализа, принимали за ноль.
Уровни в плазме и концентрации в ткани почки фактора некроза опухолей (TNF)-α, интерлейкина (IL)-6 и IL-10, моноцитарного хемоаттрактантного белка (МСР)-1 и продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС) определяли, используя поступающий в продажу набор «Multiplex Cytokine Kit» (Bio-Plex Pro Precision Pro Cytokine Assay, фирма Bio-Rad, Геркулес, шт. Калифорния), который позволяет определять несколько параметров, используя один образец. Индивидуальные рабочие стадии анализа осуществляли согласно инструкциям производителя (см. также Wagner F., Wagner К., Weber S., Stahl В., Knöferl M.W., Huber-Lang M., Seitz D.H., Asfar P., Calzia E., Senftleben U., Gebhard F., Georgieff M., Radermacher P., Hysa V., «Inflammatory effects of hypothermia and inhaled H2S during resuscitated, hyperdynamic murine septic shock», Shock, 35, 2011, cc. 396-402; и Wagner F., Scheuerle A., Weber S., Stahl В., McCook O., Knöferl M.W., Huber-Lang M., Seitz D.H., Thomas J., Asfar P., Szabó C., Möller P., Gebhard F., Georgieff M., Calzia E., Radermacher P., Wagner K., «Cardiopulmonary, histologic, and inflammatory effects of intravenous Na2S after blunt chest trauma-induced lung contusion in mice», J Trauma, 71, 2011, cc. 1659-1667).
-1
-1
В целом, метод состоял в следующем: флуоресцентно меченые микросферы («гранулы») вносили в 96-луночный планшет, затем осуществляли две стадии промывок, добавляли внутренние стандарты и добавляли образцы плазмы и гомогената почек. В процессе последующей инкубации индивидуальные цитокины связывались с антителами, сцепленными с полистироловыми гранулами. После добавления специфических для цитокина меченных с помощью биотина антител, которые предназначены для идентификации индивидуальных цитокинов, и дополнительного периода инкубации, добавляли меченный фикоэритрином стрептавидин. После дополнительного периода инкубации гранулы ресуспендировали и планшеты можно считывать с помощью специфического проточного цитометра (Bio-Plex suspension array system (системы мультиплексного анализа суспензий), фирма Bio-Rad, Геркулес, шт. Калифорния). Данные автоматически обрабатывали и анализировали с помощью программы Bio-Plex Manager 4.1, используя стандартную кривую, полученную с применением стандартов рекомбинантных цитокинов. Для определения уровней в плазме концентрацию выражали в виде пг×мл, концентрацию в гомогенатах почки превращали в соответствующую концентрацию белка и выражали в виде пг×мг белка.
NT-M вызывало существенно снижение концентраций в плазме IL-6 (фиг. 17), IL-10 (фиг. 18), продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС) (фиг. 19), моноцитарного хемоаттрактантного белка (МСР)-1 (фиг. 20), TNF-альфа (фиг. 21).
Пример 11
Острое почечное повреждение, индуцированное ишемией/реперфузией Создавали другую модель несептического острого повреждения почки, в которой острое почечное повреждение индуцировали ишемией/реперфузией (Nakamoto M., Shapiro J.I., Shanley P.F., Chan L. и Schrier R.W., «In vitro and in vivo protective effect of atriopeptin III on ischemic acute renal failure», J Clinlnvest 80, 1987, cc. 698-705; Chintala M.S., Bernardino V. и Chiu PJS, «Cyclic GMP but not cyclic AMP prevents renal platelet accumulation following ischemia-reperfusion in anesthetized rats», J Pharmacol ExpTher 271, 1994, cc. 1203-1208). Эту модель применяли для решения вопроса о том, может ли обработка антителом к адреномедуллину улучшать почечную функцию.
Эксперимент осуществляли следующим образом:
Воздействие NT-M на острое повреждение почек, индуцированное ишемией/реперфузией у крыс
План опыта
Группа
Тестируемый продукт
Путь введения
Концентрация мг/мл
Доза
Крысы<sup>Г</sup> (самцы)
мкл/кг
мг/кг
1
I-R + наполнитель
IV
5
NA × 3<sup>В</sup>
8
2
I-R + NT-M
IV
5
×3<sup>В</sup>
8
<sup>а</sup>наполнитель; инъецировали внутривенно (i.v.) за 5 мин до осуществления реперфузии в день 0, затем инъекции осуществляли в дни 1 и 2;
<sup>б</sup>NT-M инъецировали внутривенно (i.v.) в дозе 4 мг/кг за 5 мин до осуществления реперфузии в день 0, затем в дозе 2 мг/кг i.v. в дни 1 и 2;
<sup>в</sup>сбор мочи осуществляли в дни -1,0, 1 и 2, химический анализ крови и анализ мочи проводили в дни 0, 1, 2 и 3 соответственно. Образцы плазмы собирали в обработанные ЭДТК пробирки (в дни 0 (сразу после осуществления хирургического вмешательства), 1, 2 по 100 мкл перед введением наполнителя или ТС; в день 3: 120 мкл.
Клинические обследования: ежедневно перед осуществлением хирургического вмешательства и в период проведения опыта.
Использовали группы из 8 самцов крыс линии Sprague-Dawley весом 250-280 г.Животных выдерживали при световом цикле 12 ч света/12 ч темноты, и они имели свободный доступ к стандартному корму и дистиллированной воде. Животные получали пищевые добавки (0,9% NaCl и 5% декстрозы/1:1, 10 мл/кг р.о.) за 30 мин до хирургического вмешательства (день 0). Крыс подвергали анестезии пентобарбиталом (50 мг/кг, i.p.). Брюшную полость обнажали через разрез по срединной линии, после этого вводили внутривенно гепарин (100 ед./кг, i.v.) и обе почечные артерии пережимали на 45 мин с помощью зажимов для сосудов. Немедленно после удаления почечных скобок почки обследовали в течение еще 1 мин для гарантии изменения цвета, свидетельствующего о реперфузии крови. Тестируемое соединение (NT-M) и наполнитель (забуференный фосфатом физиологический раствор) инъецировали внутривенно за 5 мин до реперфузии, а затем ежедневно инъецировали в дни 1 и 2.
Сбор мочи: 24-часовой сбор мочи на льду начинали за 24 ч до ишемии/реперфузии в день -1 (-24 ч до 0 ч) и осуществляли в день 0 (0-24 ч), день 1 (24-48 ч) и день 2 (48-72 ч) после реперфузии.
+
+
Сбор крови: Собирали по 0,4 мл крови из хвостовой вены в содержащие ЭДТК пробирки в 0 ч (перед первым (I) хирургическим вмешательством для ишемии/реперфузии (И/Р)), 24 ч (перед обработкой наполнителем или тестируемым соединение (ТС), 48 ч (перед обработкой наполнителем или ТС) и 72 ч для определения в плазме уровня креатинина/Na/K и BUN; по 2 мл крови собирали через концевую часть полой вены.
+
+
Животных помещали в отдельные клетки, в которых собирали мочу в течение 24 ч в день -1 (-24 ч-0 ч), день 0 (0-24 ч), день 1 (24-48 ч) и день 2 (48-72 ч) после реперфузии в день 0. Измеряли объем мочи, уровень Na, K в моче и креатинина.
Клиренс креатинина (CCr) рассчитывали следующим образом:
CCr(мл/24 ч)=[UCr(мг/мл) × V(мл/24 ч)]/PCr (мг/мл).
+
Экскрецию натрия (Na) в 24-часовой моче рассчитывали следующим образом:
UNaV(мкэкв/24 ч) = UNa(мкэкв/мл) × V (мл/24 ч).
+
+
Na
Фракциональная экскреция Na(FE) или процент фильтруемого натрия, выделившегося в конечную мочу, является мерой способности клубочков к реаабсорбции Na. Ее рассчитывали следующим образом:
Na
Na
Na
FE(%)=100 × [U(мкэкв/мл) × V(мл/24 ч)]/P(мкэкв/мл) × CCr(мл/24 ч).
Обработка антителом к адреномедуллину улучшала некоторые критерии почечной функции:
Обнаружено значительное повышение уровня азота мочевины крови (BUN) в обработанной наполнителем группе (0 ч: 17,49 мг/дл, 24 ч: 98,85 мг/дл, 48 ч: 109,84 мг/дл, 72 ч: 91,88 мг/дл), это оказалось менее выраженным при обработке NT-M (0 ч: 16,33 мг/дл, 24 ч: 84,2 мг/дл, 48 ч: 82,61 мг/дл, 72 ч: 64,54 мг/дл) (фиг. 22).
Аналогично происходило изменение уровня сывороточного креатинина: обработанная наполнителем группа (0 ч: 0,61 мг/дл, 24 ч: 3,3 мг/дл, 48 ч: 3,16 мг/дл, 72 ч: 2,31 мг/дл), обработанная NT-M группа: (0 ч: 0,59 мг/дл, 24 ч: 2,96 мг/дл, 48 ч: 2,31 мг/дл, 72 ч: 1,8 мг/дл) (фиг. 23).
Клиренс эндогенного креатинина резко снижался в день 1, а затем в большей степени улучшился в обработанной NT-M группе по сравнению с обработанной наполнителем группой. Обработанная наполнителем группа: (0 ч: 65,17 мл/ч, 24 ч: 3,5 мл/ч, 48 ч: 12,61 мл/ч, 72 ч: 20,88 мл/ч), обработанная NT-M группа: (0 ч: 70,11 мл/ч, 24 ч: 5,84 мл/ч, 48 ч: 21,23 мл/ч, 72 ч: 26,61 мл/ч) (фиг. 24).
Описание чертежей На чертежах показано:
на фиг. 1а - иллюстрация форматов антител: Fv- и scFv-варианты;
на фиг. 1б - иллюстрация форматов антител: гетерологичные слияния и бифункциональные антитела;
на фиг. 1в - иллюстрация форматов антител: двухвалентные антитела и биспецифические антитела;
на фиг 2 -
hADM 1-52 (SEQ ID NO: 21),
mADM 1-50 (SEQ ID NO: 22),
ак 1-21 человеческого ADM (SEQ ID NO:. 23),
ак 1-42 человеческого ADM (SEQ ID NO: 24),
ак 43-52 человеческого ADM (SEQ ID NO: 25),
ак 1-14 человеческого ADM (SEQ ID NO: 26),
ак 1-10 человеческого ADM (SEQ ID NO: 27),
ак 1-6 человеческого ADM (SEQ ID NO: 28),
ак 1-32 зрелого человеческого ADM (SEQ ID NO: 29),
ак 1-40 зрелого мышиного ADM (SEQ ID NO: 30),
ак 1-31 зрелого мышиного ADM (SEQ ID NO: 31);
на фиг. 3 -
а: кривая дозовой зависимости человеческого ADM. Максимальную стимуляцию цАМФ регулировали до достижения 100%-ной активации;
б: кривая дозовой зависимости человеческого ADM 22-52 (антагонист ADM-рецептора) в присутствии 5,63 нМ hADM;
в: кривая зависимости ингибирования от дозы СТ-Н в присутствии 5,63 нМ hADM;
г: кривая зависимости ингибирования от дозы MR-H в присутствии 5,63 нМ hADM;
д: кривая зависимости ингибирования от дозы NT-H в присутствии 5,63 нМ hADM;
е: кривая дозовой зависимости мышиного ADM. Максимальную стимуляцию цАМФ регулировали до достижения 100%-ной активации;
ж: кривая зависимости ингибирования от дозы ADM 22-52 (антагонист ADM-рецептора) в присутствии 0,67 нМ mADM;
з: кривая зависимости ингибирования от дозы СТ-М в присутствии 0,67 нМ mADM;
и: кривая зависимости ингибирования от дозы MR-M в присутствии 0,67 нМ mADM;
к: кривая зависимости ингибирования от дозы NT-M в присутствии 0,67 нМ mADM;
2
л: продемонстрировано ингибирование ADM с помощью F(ab) NT-M и Fab NT-M;
2
м: продемонстрировано ингибирование ADM с помощью F(ab) NT-M и Fab NT-M;
на фиг. 4 - типичная кривая зависимости сигнала от дозы hADM, и кривая зависимости сигнала от дозы hADM в присутствии антитела NT-H в концентрации 100 мкг/мл;
на фиг. 5 - данные о стабильности hADM в человеческой плазме (цитратной) в отсутствии и в присутствии антитела NT-H;
на фиг. 6 - сравнительный анализ структуры Fab с гомологичными человеческими каркасными последовательностями;
на фиг. 7 - данные о потребности в норадреналине при ранней и поздней обработке NT-M;
на фиг. 8 - данные о производстве мочи после ранней и поздней обработки NT-M;
на фиг. 9 - данные о жидкостном балансе после ранней и поздней обработки NT-M;
на фиг.10 - данные об активации в ткани печени ядерного фактора энхансера гена легкой каппа-цепи в В-клетках (NF-κВ), полученные с помощью анализа сдвига электрофоретической подвижности (EMSA). # означает p<0,001 относительно наполнителя;
на фиг. 11 - данные об изменении уровня сывороточного креатинина в течение времени. Представлены средние значения ± С.К.О.;
на фиг. 12 - данные об изменении азота мочевины крови (BUN) в течение времени. Представлены средние значения ± С.К.О.;
на фиг. 13 - данные об изменении клиренса эндогенного креатинина в течение времени. Представлены средние значения ± С.К.О.;
+
на фиг. 14 - данные об изменении фракциональной секреции Na в течение времени. Представлены средние значения ± С.К.О.;
на фиг. 15 - данные об уровнях продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС), определенных относительно общего белка, экстрактированного почками. Белой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки наполнителем, серой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки NT-M;
на фиг. 16 - данные об уровнях продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС), определенных относительно общего белка, экстрактированного почками. Белой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки наполнителем, серой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки NT-M;
на фиг. 17 - данные об уровнях IL-6 в плазме. Белой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки наполнителем, серой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки NT-M;
на фиг. 18 - данные об уровнях IL-10 в плазме. Белой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки наполнителем, серой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки NT-M;
на фиг. 19 - данные об уровнях в плазме продуцируемого кератиноцитами хемокина (КС). Белой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки наполнителем, серой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки NT-M;
на фиг. 20 - данные об уровнях в плазме моноцитарного хемоаттрактантного белка (МСР-1). Белой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки наполнителем, серой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки NT-M;
на фиг. 21 - данные об уровнях в плазме TNF-альфа. Белой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки наполнителем, серой коробчатой диаграммой обозначены результаты, полученные после обработки NT-M;
на фиг. 22 - данные об изменении уровня азота мочевины крови (BUN) в течение времени. Представлены средние значения +/- С.К.О.;
на фиг. 23 - данные об изменении уровня сывороточного креатинина в течение времени. Представлены средние значения +/- С.К.О.;
на фиг. 24 - данные об изменении клиренса эндогенного креатинина в течение времени. Представлены средние значения +/- С.К.О.