Ферментативная активность ксиланаз и целлюлаз пробиотических штаммов Bacillussubtilis

VA ЕТЕРННЛРНЫЙ

ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ, ЭПИЗООТОЛОГИЯ Jf РАЧ

12. Efficasy of allicin from garlic against Ascaridia galli infection in chickens/ F.C.Velkers [et al.] // Poultry Sci. - 2011. -Vol. 90.-P. 364-368.

13. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans / S.Brenner // Genetics. -1974. - Vol. 77. - P. 71-94.

14. Bargmann, C.I. Genetic and cellular analysis of behavior in C. elegans / C.I.Bargmann //Annu. Rev. Neurosci. -1993.-Vol. 16.-P. 47-71.

15. Opposite responses of the cholinergic nervous system to moderate heat stress and hyperthermia in two soil nematodes/T.B.Kalinnikova [et al.] //J. Therm. Biol. - 2016. - Vol. 62. - P. 37-49.

16. Mahoney, T.R. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay / T.R.Mahoney, S.Luo, M.LNonet // Nat. Protoc. - 2006. - Vol. 1. - P. 1772-1777.

17. A neuronal acetylcholine receptor regulates the balance of muscle excitation and inhibition in Caenorhabditis elegans / M.Jospin [et al.] // PLoS Biology. - 2009. - Vol. 7.

18. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, and ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans /YSambongi [et al.] // Neuro Report. -1999. - Vol. 10. - P. 753-757.

19. Hilliard, M.A. C.elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail / M.A.Hilliard, C.I.Bargmann, P.Bazzicalupo//Curr. Biol. - 2002. - Vol. 12. - P. 730-734.

УДК: 579.852.

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ КСИЛАНАЗ И ЦЕЛЛЮЛАЗ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ BACILLUS SUBTIUS

Риш.С. Мухаммадиев-кандидат биологических наук, н.с.;Рин.С. Мухаммадиев-кандидат биологических наук, н.с.; Л. Р. Валиуллин - кандидат биологических наук, зав сектором;

В.В.Бирюля - кандидат биологических наук, вед.н.с.;

Е.В.Скворцов - кандидат биологических наук, ст.н.с.

ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань (420075, г.Казань, Научный городок-2, тел. +7(843) 239-53-20, e-mail: vnm@mail.ru).

Проведено исследование 6 изолятов бактерий, принадлежащих виду Bacillus subtilis, на способность продуцировать ксиланазы и целлюлазы в условиях глубинного выращивания. Штаммы культивировали на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода 1%-ный березовый ксилан или 1%-ную фильтровальную бумагу. Определение активности ферментов проводили методом, который основан на процессе взаимодействия динитросалициловой кислоты с редуцирующими сахарами, образующимися при гидролизе субстрата под влиянием полиферментных систем бактерий. Прослежена динамика образования ксиланазного и целлюлазного комплексов Bacillus subtilis, установлены значительные отличия активности гидролаз культуральной жидкости в зависимости от бактериального штамма. Показано, что у всех исследуемых штаммов на первые сутки культивирования наблюдали резкое повышение активности ферментов. Максимальное значение активности ксиланаз и целлюлаз в культуральной жидкости достигалось на 2-ые и 3-й сутроста бактерий. Наибольшей целлюлазной активностью обладали штаммы B.subtilis 10 и B.subtilis42(0,407±0,012 ед./мл и 0,364±0,016 ед./мл, соответственно). У других изолятов активность внеклеточных целлюлаз была ниже по сравнению с вышеперечисленными штаммами. Исследование интенсивности продукции ксиланазного комплекса изолятами в условиях глубинного культивирования показало, что активность ксиланаз находилась в пределах 2,8-6,7ед./мл, при этом уровень активности этих ферментов у штамма B.subtilis 42 превышал таковой у остальных в 1,1-2,4 раза. Обсуждается потенциальная возможность применения изучаемых штаммов Bacillus subtilis в различных отраслях человеческой деятельности, включая животноводство и птицеводство, в качестве многофункциональной кормовой добавки.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: спорообразующие бактерии, Bacillus subtilis, активность, ксиланаза, целлюлаза.

001:10.33632/1998-698Х.2019-3-19-24

В последнее время в ветеринарной микробиологии появились сведения, которые обосновывают необходимость использования сапрофитной микрофлоры для нормализации физиологических, биохимических и иммунологических процессов в организме животных [1,2,3].

На современном этапе для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных применяют пробиотики -препараты, в основу которых входят живые культуры различных бактерий [2,3,4]. Пробиотические препараты обладают выраженной антитоксической, проти-

вомикробной и иммуномодулирующей активностями, повышают барьерные функции, положительно воздействуют на моторику и экскреторную активность кишечника [3,4,5,6,7].

Одной из перспективных групп аэробных спо-рообразующих бактерий, входящих в поколение так называемых самоэлиминирующихся антагонистов, является род Bacillus [2, 8]. Бактерии данной группы способны продуцировать различные по происхождению и механизму действия антибиотические соединения, атакже полисахаридные комплексы, обладающие адъювантными и иммуномодулирующими действиями, пептиды, гидролитические ферменты, аминокислоты и витамины [1, 3, 9,10,11]. При использовании бацилл в качестве пробиотических компонентов, они имеют преимущества в отличие от молочнокислых бактерий: характеризуются более высоким уровнем и широким спектром антагонизма к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, устойчивы к влиянию неблагоприятной среды желудочно-кишечного тракта, могут длительное время сохранять активность и жизнеспособность, безопасны для макроорганизма и окружающей среды [12].

Перспективным направлением, которое может найти широкое применение в животноводстве, является использование бактерий рода Bacillus в кормовых добавках в качестве источника гидролаз [13]. В настоящее время для увеличения питательной ценности кормов путем повышения их перевариваемости уже используются известные ферментные препараты на основе бацилл, такие как амилосубтилин, протосубтилин, моноспорин, протомезентерин и бацелл. Показано их позитивное действие на процессы пищеварения и обмена веществу сельскохозяйственных птиц и животных [14,15]. В некоторых европейских государствах в промышленном птицеводстве и животноводстве как альтернативу антибиотикам для улучшения показателей кормовой конверсии и продуктивности молодняка применяется немецкий высокоэффективный пробиотик БиоПлюс2Б фирмы «Био-хем ЛТД», созданный на основе штаммов Bacillus subtilis и Bacilluslicheniformis [14,15].

Микробная конверсия ксилан, целлюлозосодержа-щих, а также других высокоструктурных веществ кормов в связи с отсутствием в организме животных необходимых для их разложения гидролаз до сих пор остается одним из основных направлений в биотехнологии.

В настоящей работе представлены результаты исследований по установлению способности штаммов B.subtilis продуцировать ферменты ксиланазного и целлюлазного комплекса.

Материалы и методы. Объектами исследований были штаммы Bacillus subtilis, выделенные из образцов различных экологических ниш Республики Татарстан. Культуру бактерий поддерживали на твердой мясо-пептонной среде с агаром (МПА) при температуре 4°С.

В качестве исходной, для глубинного культивирования штаммов-продуцентов, использовали пита-

тельную среду следующего состава (г/л): натрия цитрат - 1,29; (NH4)2HP04 - 4,75; КН2Р04 - 9,6; MgS04 *7Н20 - 0,18; кукурузный экстракт - 5,0; рН 7,0+0,2 [16]. Для получения ксиланазы вносили 1%-ный березовый ксилан, для целлюлазы - 1%-ную фильтровальную бумагу. Продуценты культивировали при температуре 37°С в конических колбах объемом 500 мл с 50 мл среды на шейкере (скорость вращения 180 об./мин). Отбор проб осуществляли каждые 24 ч, длительность культивирования составила 4 сутки. Культуральную жидкость штаммов получали путем центрифугирования при 7 тыс. об./мин в течение 10 мин, полученный супернатант оценивали на активность гидролитических ферментов.

Для определения активности целлюлазы в качестве субстрата использовали хроматографическую бумагу Whatman № 1. В пробирку помещали полоску бумаги для хроматографии массой 100 мг, вносили 2 мл 0,1 М ацетатном буферном растворе с рН 4,7 и 2 мл исследуемого фильтрата культуральной жидкости, перемешивали и инкубировали при 50°С в течение 60 минут. Содержание редуцирующих Сахаров в полученных гидролизатах устанавливали по ГОСТ 31662-2012 «Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности целлюлазы».

За единицу целлюлазной активности принимали определенное количество фермента, которое катализирует процесс гидролиза целлюлозы хроматографи-ческой бумаги с образованием 1 мкмоля восстанавливающих Сахаров за 1 ч при температуре 50°С и рН 4,7.

Для установления активности ксиланазы в качестве субстрата использовали 1%-ный раствор березового ксилана в 0,1М ацетатном буферном растворе с рН 4,7. К исследуемому образцу объемом 1 мл вносили 1 мл раствора субстрата, после чего смесь выдерживали на водяной бане при 50°С в течение 20 минут. Содержание восстанавливающих Сахаров определяли с применением реагента 3,5-динитросалициловой кислоты по построенным калибровочным графикам по ксилозе (ГОСТ 31488-2012). Измерение абсорбции производили на спектрофотометре Ulab 101 при 540 нм.

Опыты проводили в 3-х биологических и 3-х аналитических повторностях. Статистическую обработку экпериментальных данных осуществляли путем нахождения средних арифметических значений и их стандартных ошибок с использованием стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2013. Достоверность различий оценивали с помощью t-теста Стью-дента, различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследований. Способность пробиотических микроорганизмов продуцировать комплекс гидролаз, расщепляющих растительные субстраты с большим содержанием ксилана, целлюлозы, и других высокоструктурных веществ, является очень важным, поскольку совместное действие различных ферментов делают данные субстраты более доступными. Так, при одновременном ис-

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ

№3/2019

ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ, ЭПИЗООТОЛОГИЯ ^РД Ч

пользовании таких гидролитических ферментов, как целлюлаза и ксиланаза, на растительные отходы сельского хозяйства, например, подсолнечная лузга, кукурузная кочерыжка, происходит образование существенно большего количества легкодоступных Сахаров, чем при отдельном их применении [17].

На первом этапе исследования были осуществлены эксперименты по изучению образования ксиланаз штаммами В.БиЬШБ в процессе их роста. Культивирование продуцентов проводили на жидкой питательной среде, включающий в качестве источника углеродного питания ксилан в концентрации 1% (рис. 1).

с 6 м

ГО с х 5 пз

5 4

ас

£ з

0

£ 2 х

1 1

-В-бБ -В.510 -В.521 -В.527 В.Б35 -В.542

24

48

72

96

Рис. 1. Динамика образования ксиланазного комплекса изолятов В.зиЬИНз в условиях глубинного культивирования.

Как видно из рисунка 1, у всех исследуемых изолятов на 1-е сут культивирования наблюдалось резкое повышение активности ксиланаз. Максимальное значение ксиланазной активности в куль-туральной жидкости штаммов достигалось на 2-е и 3-й сут роста бактерий.

Для глубокого гидролиза клеточных стенок растительного сырья, в практике наиболее значимо, чтобы

пробиотические культуры наряду с активностью ксила-назы обладали также и высокой активностью фермента целлюлазы. В связи с этим следующим этапом было изучение целлюлазной активности культуральной жидкости изолятов В.зиЬйИз. Культивирование продуцентов осуществляли на жидкой среде, содержащей в качестве источника углерода фильтровальную бумагу в концентрации 1% (рис. 2).

г

СИ

т гс

I

01 я

л

I-

и О X

со

£ <

0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 ОД 0,05 О

-В.58

-B.SK)

-В.521

-В.527

-В.зЗБ

-В.542

24

48

72

96 Ч

Рис.2. Динамика образования целлюлазного комплекса изолятов В.5иЫ//ю в условиях глубинного культивирования.

Изучение целлюлазной активности изолятов В.зиЬШ в условиях глубинного культивирования показало резкое повышение активности на 1-е сут, как и в случае с ксиланазной активностью. Однако наибольшая целлюлазная активность, за исключением штам-

ма В.зиЬйНэ 42, отмечена на 3-й сут культивирования, после чего активность ферментов резко снижалась.

Результаты исследования наибольшей ферментативной активности изолятов В-виШв представлены в таблице.

Таблица

Максимальная ферментативная активность культуральной жидкости штаммов B.subtilis

Изолят Активность ксиланаз, ед./мл Активность целлюлаз, ед./мл

B.subtilis 8 5,44±0,21 0,216±0,009

B.subtilis 10 5,92±0,24 0,407±0,012

B.subtilis 21 2,78±0,32 0,155±0,014

B.subtilis 27 4,25±0,36 0,232±0,01

B.subtilis 35 3,58±0,23 0,189±0,008

B.subtilis 42 6,74±0,27 0,364±0,016

Как видно из таблицы, наиболее высокую ксила-назную активность наблюдали у штамма В.виЬШз 42 (6,74 ± 0,27 ед./мл). По уровню ферментативной активности данный штамм превышал в 1,1 -2,4 раза уровень ксиланазы остальных продуцентов.

Наиболее высокие значения активности внеклеточных целлюлаз отмечали в изолятах Б^иШю 10 и В.эиЬЙ/з 42. Целлюлазная активность у обоих штаммов находилась примерно на одном уровне и составила 0,407 ± 0,012 ед./мл и 0,364 ± 0,016 ед./мл, соответственно. У остальных изолятов активность данного фермента была ниже по сравнению с выше перечисленными штаммами.

Все это говорит в пользу того, что исследуемые изоляты В.зиЬШ обладают активным комплексом гидролитических ферментов, и несомненно, способны разрушать труднодоступные для организма соединения растительного корма, а при применении этих культур в корм животным будут повышать его усваиваемость в целом.

Литература

Заключение. В процессе глубинного культивирования штаммы В.зиЬЙк продуцируют внеклеточные ксиланазы и целлюлазы, способные гидролизовать по-лисахаридные субстраты. Полученные результаты свидетельствуют о специфичности уровня экспрессии гидро-лаз в зависимости от штамма микроорганизма. В связи с этим исследуемые культуры бактерий могут дополнять друг друга по спектру секретируемых щцролитических ферментов, существенно увеличивая эффективность гидролиза ими ксилан-, целлюлозосодержащих соединений в кормах, и, тем самым, нормализуя процесс пищеварения, положительно влияя на рост, развитие и продуктивность сельскохозяйственных животных.

Дальнейшее исследование гидролазной активности данных штаммов открывает возможность их обширного использования и в других отраслях человеческой деятельности, включая целлюлозно-бумажную и пищевую промышленности, пивоварение, получение спирта, преобразование отходов, содержащих целлюлозу.

1. Бакулина, Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих штаммов рода Bacillus и их использование в ветеринарии / Л.Ф.Бакулина, И.В.Тимофеев, Н.Г.Перминова // Биотехнология. - 2001. - № 2. - С. 48-56.

2. Похиленко, В.Д. Пробиотики на основе спорообразующих бактерий и их безопасность / В.Д.Похиленко, В.В. Перелыгин //Химическая и биологическая безопасность. - 2007. - № 2 (3). - С. 20-41.

3. Пробитики на основе бактерий рода Bacillus в птицеводстве / Н.В.Феоктистова, А.М.Марданова, Г.Ф.Хадиева, М.Р.Шарипова // Ученые записки Казанского университета. Естественные науки. - 2017. -Том 159, Кн. 1,-С. 85-107.

4. Гено- и фенотипическая характеристика штаммов бацилл-компонентов эндоспорина / Л.А.Сафронова [и др.] // Микробиологический журнал. - 2012. - Том 74, № 5. - С. 55-66.

5. Mazmanian, S.K. A microbial symbiosis factor prevents Inflammatory disease / S.K.Mazmanian, J.L.Round, D.Kaspe // Nature. - 2008. - Vol. 453. - P. 620-625.

6. Morelli, L. FAO/WHO guidelines on probiotics: 10 years later / L.Morelli, L.Capurso//J. Clin. Gastroenterol. -2012. -Vol. 46 (Suppl). - P. 1-2.

7. Probiotics, gut microbiota, and their influence on host health and disease / B.Sanchez [et al.] // Mol. Nutr. Food Res. - 2017. - Vol. 61, №1. - P. 58-69.

8. Probiotics, their health benefits and applications for developing healthier foods: A review / R.Nagpal [et al.] // FEMS Microbiol. Lett. - 2012. - Vol. 334, № 1. - P. 1 -15.

22

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ

№3/2019

VA ЕТЕРННЛРНЫЙ

ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ, ЭПИЗООТОЛОГИЯ Jf РАЧ

9. Мазанкова, Л.Н. Пробиотики: характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике/ Л.Н.Мазан-кова, Е.А. Лыкова //Дет. Инфекции. - 2004. - № 1. - С. 18-23.

10. Spore probiotics/ I.G.Osipova [et al.] //Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunol. - 2003. - Vol.3. - P. 113-119.

11. Смирнов, B.B. Бактерии рода Bacillus - перспективный источник биологически активных веществ / В.В.Смирнов, И.Б.Сорокулова, И.В.Пинчук// Мкробюл. журн. - 2001. - Том 63, № 1. - С. 72-78.

12. Sorokulova, I. Preclinical testing in the development of probiotics: regulatory perspective with bacillus strains as an example / I.Sorokulova / Clin. Infect. Dis. - 2008. - № 46. - P. 92-95.

13. Сапего, В.И. Биологически активные вещества и естественная резистентность телят / В.И.Сапего, Е.В. Берник // Ветеринария. - 2002. - № 5. - С. 44-46.

14. Марченко, Ф. Комплексный подход к применению кормового пробиотика БиоПлюс2Б в сочетании с ан-тибиотикотерапией / Ф.Марченко, А.Сунгуров, О.Башкиров // Ефективне птахвництво та тваринництво. - 2004. -№3.-С. 29-30.

15. Преображенский, Л.Н. Фармакодинамические основы и перспективы применения ферментных препаратов в животноводстве/Л.Н.Преображенский // Ветеринария с.-х. животных. - 2006. - № 1. - С. 71-75.

16. Авдеева, Л.В. Биосинтез целлюлаз пробиотическими штаммами Bacillus subtilis при совместном выращивании / Л.В.Авдеева, А.И.Осадчая, М.А.Хархота // Мкробюлопя i бютехнолопя. - 2010. - № 4. - С. 80-89.

17. Родионова, H.A. Ксиланазная система и факторы, стимулирующие биосинтез ее компонентов / Н.А.Родионова, И.В. Итомлинский // Микробиология и научно-технический прогресс: тез. докл. 4 съезда Всесоюз. Микро-биол. общества. - Минск: Наука и техника, 1971. - С. 133-134.

ENZYMATIC ACTIVITY OF XYLANASES AND CELLULASES OF PROBIOTIC STRAINS BACILLUS SUBTILIS

Mukhammadiev Rish.S. - Candidate of Biological Sciences; MukhammadievRin.S. - Candidate of Biological Sciences; Valiullin L.R. - Candidate of Biological Sciences; Biryulya V.V. - Candidate of Biological Sciences; SkvortsovE. V. - Candidate of Biological Sciences.

Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnM@mail.ru).

In the present study, six isolates of bacteria belonging to Bacillus subtilis, has been tested for production xylanases and cellulases in submerged fermentation. The strains were cultivated on a medium containing as a carbon source 1% birch xylan or 1 % filter paper. The enzyme activity was determined by a method based on the interaction of dinitrosalicylic acid with reducing sugars, which are formed during the hydrolysis of the substrate under the influence of multienzyme systems of bacteria. There has been followed the dynamics of biosynthesis by Bacillus subtilis ofxylanase and cellulase complexes. There has been found significant differences of hydrolases of culture fluid depending on bacterial strain. All the studied strains on the Urst day of cultivation are shown to have a sudden increase in the activity of enzymes. The maximum activity of xylanases and cellulases in the culture fluid was achieved on the 2nd and 3rd dayofbacterialgrowth. The strains B.subtilis 10 and B.subtilis 42 had the highest cellulase activity (0.407 ±0.012 U/ml and 0.364 ±0.016 U/ml, respectively). In other isolates, the activity of extracellular cellulases was lower as compared with the above listed strains. The study of the intensity of production of the xylanase complex by isolates in submerged fermentation showed that xylanase activity was within 2.8-6.7 U/ml, while the activity of these enzymes in B.subtilis 421.1-2.4 times exceeded that of the other. The potential use of the studied Bacillus subtilus strains in various branches of human activity, including animal husbandry and poultry farming, as a multifunctional feed additive is currently being discussed.

KEYWORD: spore-forming bacteria, Bacillus subtilis, activity, xylanase, cellulase.

References

1. Bakulina, L.F. Probiotiki na osnove sporoobrazuyushchikh shtammov roda Bacillus i ikh ispolzovanie v veterinarii [Probiotics based on spore-forming strains of the genus Bacillus and their use in veterinary medicine] / LF.Bakulina, I.V.Timofeev, N.G.Perminova// Biotekhnologiya. - 2001. - № 2. - P. 4856.

2. Pokhilenko, V.D. Probiotiki na osnove sporoobrazuyushchikh bakteriy i ikh bezopasnost [Probiotics based on spore-forming bacteria and their safety] / V.D.Pokhilenko, V.V. Perelygin // Khimicheskaya i biologicheskaya bezopasnost. -2007.-№2(3).-P. 2041.

3. Probitiki na osnove bakteriy roda Bacillus v pticevodstve [Probiotics based on bacteria from the genus Bacillus in poultry breeding] / N.V.Feoktistova, A.M.Mardanova, G.F.Khadieva, M.R.Sharipova // Uchenye zapiski Kazanskogo universiteta. Estestvennye nauki. - 2017. - Vol. 159, Book. 1. - P. 85-107.