СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КОЛОРЕКТАЛЬНОГО РАКА ИЗ ОБРАЗЦА КАЛА ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР, ПРАЙМЕРОВ И НАБОРА
METHOD FOR DIAGNOSING COLORECTAL CANCER FROM HUMAN FECES SAMPLE BY QUANTITATIVE PCR, PRIMERS AND KIT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области обнаружения колоректального рака (CRC). В частности, оно относится к способам раннего обнаружения, скринингу риска и мониторингу CRC и/или аденоматозных полипов у субъекта-человека на основе количественного определения одной или нескольких последовательностей бактериального гена 16S рДНК в кале. Настоящее изобретение также относится к применению указанных последовательностей бактериального гена в качестве биомаркеров колоректального рака и/или аденоматозных полипов; набору, содержащему реагент и инструкции по количественному определению указанных последовательностей бактериального гена; и нуклеиновым кислотам для количественного определения указанных последовательностей бактериального гена 16S рДНК.
Предпосылки создания изобретения
Колоректальный рак (CRC) является второй ведущей причиной смерти от рака в Европе и США, и является наиболее часто диагностируемым раком в Европе, с более чем 400000 новыми случаями и 200000 смертельными исходами в 2008 году. Эти данные указывают на то, что должны быть предприняты профилактические меры.
Наиболее эффективными и экономичными мерами для снижения случаев заболеваемости CRC и смертности от CRC являются скрининговые и мониторинговые тесты для выявления риска развития CRC. Скрининговые тесты подразделяются на тесты, которые в основном обнаруживают рак на ранней стадии; и тесты, которые могут обнаружить рак на ранней стадии, а также аденоматозные полипы, обеспечивая тем самым большую возможность его предотвращения посредством полипэктомии (то есть удаления полипов), смотри руководства American Cancer Society (ACS) 2008 screening and surveillance guidelines, Levin et al. (CA Cancer J Clinicians, 2008; 58(3)130-160). Существуют различные руководства по скринингу, которые применяют для людей со средним риском и людей с высоким риском
(http://www.cancer.org/cancer/colonandrectumcancer/moreinformation/colonandrectumcancerearlydetection/colorectal-cancer-early-detection-acs-recommendations).
В настоящее время тесты, которые главным образом обнаруживают CRC, представляют собой анализы кала, которые включают: i) анализ на кровь в кале: тест на скрытую кровь в кале ("FOBT") и иммуногистохимический тест на скрытую кровь в кале ("FIT"); и ii) ДНК-анализ стула ("sDNA") (смотри
http://www.cancer.org/cancer/colonandrectumcancer/moreinformation/colonandrectumcancerearlydetection/colorectal-cancer-early-detection-screening-tests-used).
i) Анализы на кровь в кале
Оба анализа FOBT и FIT выявляют CRC путем обнаружения некоторого количества крови в образе кала. Тесты основаны на предположении, что неопластическая ткань, в частности, злокачественная ткань, кровоточит больше, чем типичная слизистая оболочка, при этом количество кровотечения увеличивается с размером полипа и стадией рака. Комплексное тестирование рекомендуется при наличии периодического кровотечения. Несмотря на то, что тесты на кровь в кале могут обнаружить некоторые опухоли ранней стадии в нижнем отделе толстой кишки, они не могут выявить (i) CRC в верхнем отделе толстой кишки, так как любая кровь будет метаболизирована, и/или (ii) мелкие аденоматозные полипы, создавая тем самым ложно-негативные результаты. Любое желудочно-кишечное кровотечение, вызванное геморроем, трещинами, воспалительными заболеваниями (язвенный колит, болезнь Крона), инфекционными заболеваниями, даже бегом на длинные дистанции, будет создавать ложно-негативные результаты (Beg et al., J Indian AcadClin Med, 2002; 3(2)153-158). В современных руководствах (Levin et al., CA Cancer J Clinicians, 2008; 58(3)130-160) содержатся рекомендации о прохождении ежегодно обследования взрослым людям среднего риска в возрасте 50 лет и старше с использованием теста Guaiac-based fecal occult blood test (gFOBT). FOBT является единственным рекомендуемым тестом в Европейском Союзе (Segnan N. et al., 2010, European guidelines for quality assurance in colorectal cancer screening and diagnosis. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities). Оба руководства рекомендуют проведение колоноскопии после любого положительного теста FOBT.
ii) ДНК-анализ стула («sDNA»")
ДНК-тест измеряет различные маркеры ДНК из образца стула. Тест sDNA Cologuard™, доступный в настоящее время от компании Exact Sciences Corp.(Madison, WI), измеряет панель множества маркеров, которая включает отдельные точечные мутации в генах K-ras, АРС и Р53; маркер ВАТ-26; маркер целостности ДНК (DIA); и метилирование гена виментина (Levin et al., CA Cancer J Clinicians,2008; 58(3)130-160). Хотя некоторые руководства рекомендуют sDNA-тестирование, другие руководства являются более консервативными и не рекомендуют его. В одном исследовании вариант теста sDNA превосходил FOBT, но все еще обнаруживал только 15% аденом поздней стадии (Imperiale et al., N Engl J Med, 2004;351:2704-2714).
Тесты, указанные в руководствах ACS как способные обнаруживать аденоматозные полипы и рак, представляют собой структурные тесты, которые включают: (i) колоноскопию, (ii) гибкую сигмоидоскопию ("FSIG"), (in) бариевую клизму с двойным контрастированием ("DCBE"), и (iv) КТ-колонографию ("СТС", виртуальную колоноскопию). Все эти методы требуют очищения кишечника пациента и нагнетание воздуха в толстую кишку для содействия визуализации. Существующие в настоящее время руководства рекомендуют использование тестов, предназначенных для обнаружения рака на ранней стадии и аденоматозных полипов при наличии ресурсов и желании пациентов проходить инвазивные тесты.
Колоноскопия является инвазивным методом, который позволяет осуществлять прямой осмотр всех слизистых оболочек, взятие биопсий и резекцию полипов толстой и прямой кишки за один сеанс. Это не только улучшает прогноз колоректального рака, но предупреждает заболевание. Тем не менее, основными недостатками, связанными с этим методом, являются: высокая стоимость, так как требуется обученный персонал, риск смертельного исхода, связанный с анестезией, и риск прободения кишечника (Garborg K. et al., Ann Oncol., 2013; 24(8):1963-72).
Колоноскопия в руках опытного профессионала является на 100% чувствительным и на 100% специфическим методом, но из-за риска и стоимости до ее проведения находящимся в группе риска пациентам необходимо пройти скрининг с помощью неивазивных тестов на обнаружения крови в стуле, таких как указанные выше анализы кала, то есть gFOBT или FIT, которые, как указано выше, дают важное число ложно-позитивных результатов и, соответственно, такое же число необязательных колоноскопий. Это указывает на потребность в эффективном неинвазивном инструменте для скрининга CRC. В настоящее время отсутствие эффективного инструмента скрининга CRC приводит к длительным очередям (более 6 недель) на колоноскопию и высокому объему экономических ресурсов для проведения ошибочно назначенных колоноскопий. Эта ситуация вызывает для государственного и частного здравоохранения значительные расходы и нагрузку на систему (Allison J. et al., Practical Gastroenterology, 2007, 3: 21-32).
Таким образом, существует потребность в улучшении чувствительности, специфичности, инвазивности и/или экономической эффективности реальных методов раннего обнаружения и мониторинга CRC и/или аденоматозных полипов.
Генетическая основа и естественное течение CRC четко определены, учитывая то, что менее 5% CRC являются наследственными, и большая часть спорадическими, диагностированными у пациентов, не имеющих в личном анамнезе или семейном анамнезе новообразований толстой кишки. Этиология этого заболевания до сих пор остается неизвестной, хотя предполагается многофакторное происхождение, в котором эндогенные и экзогенные факторы активно участвуют в развитие опухоли. Этими факторами являются: возраст, курение, персональная история воспалительного заболевания кишечника, диета, стиль жизни и микрофлора.
Позднее было доказано, что бактериальные сообщества в слизистой оболочке толстого кишечника у пациентов с CRC отличаются от таковых у здоровых индивидуумов, и было сделано предположение о том, что микрофлора кишечника является определяющим фактором в развитии и прогрессировании CRC по его стадиям rChen W et al., PLoS One. 2012; 7(6):e39743; Zhu Q et al., Tumour Biol., 2013; 34(3):1285-300; Ahn J et al., J Natl Cancer Inst, 2013; 105(24):1907-11; Na wu et al., Microbial ecology, 2013; 66(2):462-470).
WO 2012/170478 относится к способам обнаружения аденом и колоректального рака с использованием бактериальной сигнатуры. Проводили пиросеквенирование гена 16 r РНК для характеристики адгезированных бактериальных сообществ из биопсий слизистых оболочек. Рассчитывали относительную численность бактерий у субъектов с аденомой и без аденомы, при этом было сделано заключение о том, что развитие аденомы связано с изменениями в относительной численности различных бактериальных таксонов, присутствующих в слизистой оболочке кишечника. В частности, была установлена численность бактерий рода Fusobacteriumnucleatum в нормальной слизистой оболочке прямой кишки у субъектов, имеющих и не имеющих аденому, путем количественного определения с помощью qPCR гена 16S рРНК (16s ДНК), и был сделан вывод о том, что численность является более высокой в случаях аденомы по сравнению с контролями. В соответствии с указанными данными предлагается использование бактерий рода F.nucleatum в качестве биомаркера колоректального карциногенеза.
Важность микрофлоры кишечника в качестве агента, связанного с развитием и эволюцией CRC по его стадиям, также была подтверждена в исследовании, проведенном одним из авторов изобретения на образцах биопсии слизистой оболочки, в котором была показана связь с численностью фирмикутов, актинобактерий и Escherichia coli у пациентов с колоректальным раком и Faecalibacterium prausnitzi у здоровых пациентов (Mas de Xaxars Т., 2012,  legal: GI. 1664-2012, http://hdl.handle.net/l0803/94513).
Однако в данной области хорошо известно, что существуют различия между составом микрофлоры в биопсиях слизистой оболочки и образцах кала. В работе Lepage et al. (Inflamm Bowel Dis., 2005; 11(5):473-80) показано, что у заданного индивидуума доминирующие виды различаются между микрофлорой, ассоциированной со слизистой оболочкой и микрофлорой кала. Аналогично, в работе Eckburg et al. (Science, 2005; 308(5728): 1635-163 8) описаны статистически значимые различия между филогенетическими линиями, обнаруженными в образцах слизистой оболочки и кала, при этом утверждается, что фекальная микрофлора представляет собой сочетание выделенных («shed») бактерий слизистой оболочки и отдельной неадгезированной просветной популяции.
В работе Nechvatal et al. (J Microbiol Methods., 2008; 72(2):124-32) показано, что фекальная ДНК может быть использована в качестве источника для эпидемиологических исследований кишечных бактерий и маркеров рака у человека. В частности, описано количественное определение с помощью количественной PCR в режиме реального времени бактериальных и человеческих последовательностей в ДНК-экстрактах из кала человека. В работе Balamurugan et al. (J GastroenterolHepatol., 2008; 23:1298-303) описано количественное определение с помощью количественной PCR в режиме реального времени специфических бактерий с продуктами метаболизма, которые, как известно, обладают защитным эффектом (то есть Eubacterium rectale и Faecalibacterium prausnitzii, которые представляют собой продуцирующие бутират бактерии) или являются токсичными, или канцерогенными (то есть Desulfovibrio (сульфатредуцирующие бактерии) и Enterococcus faecaelis (которые вырабатывают внеклеточный супероксид) в кале пациентов с колоректальным раком. Однако в обеих работах отсутствует определение диагностической или прогностической ценности таких бактериальных последовательностей в качестве биомаркеров CRC.
В US 2014/0024036, Wang et al. описывают способ обнаружения CRC, включающий количественное определение гена nusG F.nucleatum (FNN) путем qPCR из человеческого кала пациентов с CRC и контролей, обнаружение CRC с чувствительностью 57% и специфичностью 89,5%.
Несмотря на то, что были описаны методы обнаружения и/или количественного определения биомаркеров ДНК для CRC в кале, по-прежнему существует потребность в надежных методах ранней диагностики, скрининга риска или мониторинга на CRC у субъекта-человека из образцов кала. Наличие такого метода позволит эффективно предотвращать CRC путем раннего обнаружения и уменьшить число ненужных структурных исследовательских тестов, таких как колоноскопии, которые в настоящее время проводятся у индивидуумов с подозрением на CRC чаще, чем это необходимо из-за низкой точности тестов FOBT и FIT, которые являются стандартными методами скрининга для обнаружения CRC.
Краткое описание изобретения
Первый аспект настоящего изобретения относится к способу скрининга колоректального рака (CRC) и/или аденоматозных полипов у человека, который включает:
i. количественное определение по меньшей мере одной последовательности бактериального гена 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, или комплементарной ей последовательности 16S рРНК из образца кала от указанного субъекта; и
ii. диагностику, раннее обнаружение, определение повторного возникновения, определение риска развития или прогнозирование CRC и/или полипов у субъекта- человека; или определение необходимости проведения колоноскопии у указанного субъекта-человека; или определение прогноза, при этом указанный субъект-человек представляет собой пациента, у которого диагностирован CRC и/или полипы; или проведение терапии у пациента с CRC и/или полипами, исходя из количественно определенных уровней по меньшей мере одной из указанных последовательностей.
Во втором аспекте изобретение относится к использованию по меньшей мере одной последовательности бактериального гена 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, или комплементарной ей последовательности 16S рРНК в качестве биомаркера для диагностики, раннего обнаружения, определения повторного возникновения, определения риска развития или прогнозирования CRC и/или полипов у субъекта-человека; или определения необходимости проведения колоноскопии у субъекта-человека; или определения прогноза, при этом у указанного субъекта-человек диагностирован CRC и/или полипы; или проведения терапии у пациента с CRC и/или полипами, при этом указанные последовательности бактериального гена количественно определяют из образцов кала указанного субъекта-человека.
В третьем аспекте изобретение относится к набору, содержащему:
a. реагент, выбранный из группы, состоящей из:
i. нуклеиновокислотных зондов, способных к специфической гибридизации по меньшей мере с одной последовательностью 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, или комплементарной ей последовательностью 16S рРНК;
ii. пару нуклеотидных праймеров, способных к специфической амплификации по меньшей мере одной последовательности 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10; и
b. инструкции по количественному определению уровней одной или нескольких из указанных последовательностей из образцов человеческого кала в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.
В четвертом аспекте изобретение относится к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, или последовательности, обладающей по меньшей мере 90% идентичностью с указанными последовательностями.
В пятом аспекте изобретение относится к применению нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; или последовательности, обладающей по меньшей мере 90% идентичностью с указанными последовательностями, в способе скрининга согласно изобретению.
Краткое описание чертежей
Следующие символы используются в фигурах с 1 по 7 со следующими значениями:
- * обозначает, что статистическая значимость р=0,05
- ** означает, что статистическая значимость р=0,01
- *** означает, что статистическая значимость р=0,005
На фигурах с 8 по 26 статистическая значимость представлена символом * и p-величина представлена в соответствующих таблицах.
Фигура 1. Соотношение величин Ct для 2-х последовательностей: SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 4. «CRC» обозначает величины, полученные из образцов кала пациентов с колоректальным раком, и «С» обозначает контрольные величины, полученные от здоровых пациентов.
Фигура 2. Соотношение величин Ct для 2-х последовательностей: SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 4. «CRC» обозначает величины, полученные из образцов кала пациентов с колоректальным раком, и «С» обозначает контрольные величины, полученные от здоровых пациентов.
Фигура 3. Соотношение величин Ct для 2-х последовательностей: SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1. «CRC» обозначает величины, полученные из образцов кала пациентов с колоректальным раком, и «С» обозначает контрольные величины, полученные от здоровых пациентов.
Фигура 4. Абсолютные величины Ct для последовательности SEQ ID NO: 4. «CRC» обозначает величины, полученные из образцов кала пациентов с колоректальным раком, и «С» обозначает контрольные величины, полученные от здоровых пациентов.
Фигура 5. Абсолютные величины Ct для последовательности SEQ ID NO: 7. «CRC» обозначает величины, полученные из образцов кала пациентов с колоректальным раком, и «С» обозначает контрольные величины, полученные от здоровых пациентов.
Фигура 6. Соотношение величин Ct для 2-х последовательностей: SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1. «CRC» обозначает величины, полученные из образцов кала пациентов с колоректальным раком, «Высокий риск» обозначает величины, полученные от индивидуумов с синдромом Линча, которые имели полипы по результатам последней колоноскопии и имеют повышенный риск развития колоректального рака, «Низкий риск» обозначает величины, полученные от индивидуумов с синдромом Линча, которые не имели полипов по результатам последней колоноскопии.
Фигура 7. Абсолютные величины Ct для последовательности SEQ ID NO: 4. «CRC» обозначает величины, полученные из образцов кала пациентов с колоректальным раком, «Высокий риск» обозначает величины, полученные от индивидуумов с синдромом Линча, которые имели полипы по результатам последней колоноскопии и имеют повышенный риск развития колоректального рака, «Низкий риск» обозначает величины, полученные от индивидуумов с синдромом Линча, которые не имели полипов по результатам последней колоноскопии.
Фигура 8. Валидация праймеров для В3 амплификации. Графики амплификации (8а) и кривая диссоциации (8b).
Фигура 9. Валидация праймеров для В10 амплификации. Графики амплификации (9а) и кривая диссоциации (9b).
Фигура 10. Валидация праймеров для В41 амплификации. Графики амплификации (10а) и кривая диссоциации (10b).
Фигура 11. Валидация праймеров для В46 амплификации. Графики амплификации (11а) и кривая диссоциации (11b).
Фигура 12. Валидация праймеров для В48 амплификации. Графики амплификации (12а) и кривая диссоциации (12b).
Фигура 13. Валидация праймеров для В50 амплификации. Графики амплификации (13а) и кривая диссоциации (13b).
Фигура 14. Абсолютные величины Ct для В3 в группах «CRC» и «С».
Фигура 15. Абсолютные величины Ct для В48 в группах «CRC» и «С».
Фигура 16. Абсолютные величины Ct для В10 в группах «CRC» и «С».
Фигура 17. Абсолютные величины Ct для В46 в группах «CRC» и «С».
Фигура 18. Абсолютные величины Ct для В3 в группах «CRC», «L» и «С».
Фигура 19. Абсолютные величины Ct для В48 в группах «CRC», «L» и «С».
Фигура 20. Абсолютные величины Ct для В10 в группах «CRC», «L» и «С».
Фигура 21. Абсолютные величины Ct для В46 в группах «CRC», «L» и «С».
Фигура 22. Абсолютные величины Ct для В3, В10, В46 и В48 в «CRC+L» в сравнении с «С».
Фигура 23. Соотношение В48/В10 абсолютных величин Ct в группах «CRC», «Высокий риск L», «Низкий риск L» и «С».
Фигура 24. Соотношение В3/В10 абсолютных величин Ct в группах «CRC», «Высокий риск L», «Низкий риск L» и «С».
Фигура 25. Соотношение В46/В10 абсолютных величин Ct в группах «CRC», «Высокий риск L», «Низкий риск L» и «С».
Фигура 26. Соотношение В3/В10 абсолютных величин Ct в группах «CRC», «Высокий риск L», «Низкий риск L» и «С».
Фигура 27. ROC-кривые для анализа В3, В10, В46 и В48 у здоровых субъектов в сравнении с группой «CRC».
Фигура 28. ROC-кривые для анализа В3, В10, В46 и В48 у здоровых субъектов в сравнении с группой «синдром Линча».
Фигура 29. ROC-кривые для анализа В3, В10, В46 и В48 у здоровых субъектов в сравнении с «CRC» + «синдром Линча».
Фигура 30. ROC-кривые для анализа В3, В10, В46 и В48 у субъектов в группе «CRC» в сравнении с группой «синдром Линча».
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении идентифицированы специфические последовательности бактериального гена, связанные с диагностикой, ранним обнаружением, скринингом риска и мониторингом CRC и/или аденоматозных полипов.
Первый аспект изобретения относится к способу скрининга колоректального рака (CRC) и/или аденоматозных полипов у субъекта-человека, который включает: i. количественное определение по меньшей мере одной последовательности бактериального гена 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, или комплементарной ей последовательности 16S рРНК из образца кала от указанного субъекта; и
ii. диагностику, раннее обнаружение, определение повторного возникновения, определение риска развития или прогнозирование CRC и/или полипов у субъекта- человека; или определение необходимости проведения колоноскопий у указанного субъекта-человека; или определение прогноза, при этом указанный субъект-человек представляет собой пациента с диагностированным CRC и/или полипами; или проведение терапии у пациента с CRC и/или полипами исходя из количественно определенных уровней по меньшей мере одной из указанных последовательностей.
В настоящей заявке последовательность, идентифицированная как SEQ ID NO: 1, также идентифицирована как «В3». Аналогично, последовательность SEQ ID NO: 4 также идентифицирована как «В10», последовательность SEQ ID NO: 7 также идентифицирована как «В46» и последовательность SEQ ID NO: 10 также идентифицирована как «В48», и эти обозначения используются взаимозаменяемо. В3, В10, В46 и В48 являются названиями, используемыми авторами изобретения в настоящей заявке для идентификации последовательностей во время выполнения всех экспериментов, проводимых в соответствии с настоящим изобретением. Последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO: 1, 4, 7 и 10, доступны в базе данных EMBL-EBI под следующими номерами доступа: GQ411111.1 (SEQ ID NO: 1), GQ411118.1 (SEQ ID NO: 4), GQ411150.1 (SEQ ID NO: 7), GQ411152.1 (SEQ ID NO: 10).
Последовательности В3, B10, B46 и B48 соответствуют полосам геля в электрофорезе в градиенте денатурирующего геля (DGGE), ранее выделенным из некультивированных бактериальных изолятов. Анализы BLAST проводили с целью идентификации соответствующих видов бактерий:
наилучшее совпадение BLAST для В3 16S рДНК: Collinsella aerofaciens;
наилучшее совпадение BLAST для В10 16S рДНК: Faecalibacterium prausnitzii;
наилучшее совпадение BLAST для В46 16S рДНК: Faecalibacterium prausnitzii, Subdoligranulum variabil;
наилучшее совпадение BLAST для В48 16S рДНК: Ruminococcus, Roseburia, Coprococcus.
Используемый здесь термин «колоректальный рак», «CCR» или «CRC» используется для рака, который начинается в толстой или прямой кишке. Эти виды рака могут также называться по отдельности как рак толстой кишки или рак прямой кишки в зависимости от того, где они начались. Рак толстой кишки и рак прямой кишки имеют много схожих признаков.
Согласно ACS несколько видов рака может развиваться в толстой или прямой кишке. Более 95% случаев колоректального рака относятся к виду рака, известному как аденокарцинома. Эти виды рака начинают развиваться в клетках, образующих железы, которые осуществляют смазывание внутренней части толстой кишки и прямой кишки. Другие, менее распространенные типы опухолей также могут начать развиваться в толстой и прямой кишке. К ним относятся: карциноидные опухоли, гастроинтестинальные стромальные опухоли (GIST), лимфомы и саркомы.
Целью скрининга рака является снижение смертности за счет снижения числа случаев заболевания поздней стадии. С этой целью современный скрининг CRC может достичь этой цели посредством обнаружения аденокарцином на ранней стадии и обнаружения и удаления аденоматозных полипов, которые обычно считаются необязательными предшествующими поражениями.
«Аденоматозный полип» представляет собой нераковый рост аномальных железистых клеток на внутренней слизистой оболочке органа, такого как толстая кишка. Например, три типа аденоматозных полипов, которые могут расти в толстой кишке, представляют собой тубулярную, ворсинчатую и трубулярно-ворсинчатую аденому. Аденоматозные полипы распространены у людей старше 50 лет, но большая часть полипов не будет развиваться в аденокарциному; гистологии и размер определяют их клиническое значение.
Согласно ACS тесты, которые имеют наилучший шанс обнаружить как полипы, так и рак, являются предпочтительными, поскольку обнаружение и удаление полипов защищает некоторых людей от развития колоректального рака. Предпочтительно способ согласно изобретению представляет собой способ скрининга CRC и аденоматозных полипов.
В конкретном варианте осуществления способ согласно изобретению представляет собой способ скрининга для диагностики или обнаружения CRC и/или аденоматозных полипов, предпочтительно для раннего обнаружения CRC и/или аденоматозных полипов. Выражение «раннее обнаружение» относится к обнаружению до наличия клинических признаков. Термины «обнаружение» и «диагностика» используются взаимозаменяемо в настоящей заявке. Способ согласно изобретению представляет собой мощный инструмент для предупреждения возникновения колоректального рака посредством диагностики заболевания на ранней стадии.
В конкретном варианте осуществления способ скрининга согласно изобретению проводится у субъектов в возрасте 50 лет и старше. Женщин и мужчин среднего риска в возрасте 50 лет и старше отбирали для проведения скрининговых тестов на колоректальный рак (смотри таблицу 2 в работе Levin et al., СА Cancer J Clinicians, 2008; 5 8(3) 130-160, которая включена здесь посредством ссылки).
В другом варианте осуществления способ скрининга согласно изобретению проводят у субъектов повышенного и/или высокого риска. Имеются конкретные руководства по применению для пациентов с повышенным или высоким риском.
Согласно ACS (смотри таблицу 3 в работе Levin et al., СА Cancer J Clinicians, 2008; 58(3) 130-160, которая включена здесь посредством ссылки), субъекты с повышенным или высоким риском включают следующих:
Повышенный риск:
- субъекты, имеющие историю полипов по результатам предшествующей колоноскопии;
- субъекты с колоректальным раком; и
- субъекты, имеющие семейную историю колоректального рака или аденоматозных полипов.
Высокий риск:
- субъекты с семейным аденоматозным полипозом (FAP), диагностированным путем генетического тестирования, или предполагаемым FAP без генетического тестирования;
- субъекты с наследственным неполипозным раком толстой кишки (HNPCC или синдром Линча), или повышенным риском HNPCC на основе семейной истории без генетического тестирования; и
- субъекты с воспалительным заболеванием кишечника, таким как хронический язвенный колит или болезнь Крона.
Одной из целей настоящего изобретения является обеспечение инструмента предварительной диагностики. В частности, настоящее изобретение обеспечивает способ диагностики колоректального рака до появления клинических признаков путем идентификации субъектов, предрасположенных или имеющих риск развития CRC или аденоматозных полипов.
В конкретном варианте осуществления способ скрининга согласно настоящему изобретению представляет собой способ определения риска развития CRC или аденоматозных полипов у субъекта-человека, который включает:
i. количественное определение по меньшей мере одной последовательности бактериального гена 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, или комплементарной ей последовательности 16S рРНК из образца кала указанного субъекта; и
ii. определение риска развития CRC и/или аденоматозных полипов из количественно определенных уровней по меньшей мере одной из указанных последовательностей.
В предпочтительном варианте осуществления способ скрининга согласно настоящему изобретению представляет собой способ определения риска развития CRC и/или аденоматозных полипов у субъектов с повышенным и/или высоким риском, предпочтительно носителей синдрома Линча.
Термин «синдром Линча» относится к наследственному неполипозному колоректальному раку или HNPCC, который представляет собой передаваемое по наследству заболевание, которое значительно повышает риск развития колоректального рака у субъекта, а также рака внутреннего слоя матки (рак эндометрия), рака яичников и некоторых других типов рака. Люди с этим заболеванием имеют тенденцию к развитию рака в молодом возрасте, часто без предварительного наличия множественных полипов.
Метод скрининга согласно изобретению показал в примере 4 (таблицы 3 и 4) способность проводить различие статистически значимым образом между пациентами с синдромом Линча с полипами (популяция высокого риска) и без полипов (популяция низкого риска). Количественное определение SEQ ID NO: 4 (В10) и определение соотношения SEQ ID NO: 7 (В46) / SEQ ID NO: 4 (B10) оказались удовлетворительными показателями согласно результатам, представленным в примере 4. Таким образом, SEQ ID NO: 4 (B10) и соотношение SEQ ID NO: 7 (В46) / SEQ ID NO: 4 (B10) являются предпочтительными биомаркерами для применения в способе согласно изобретению для скрининга присутствия полипов.
У субъектов, имеющих в анамнезе полипы согласно результатам предшествующей колоноскопий или имеющих в анамнезе колоректальный рак после резекции рака, скрининговые тесты проводятся с целью мониторинга или наблюдения, то есть для обнаружения рецидивов рака и/или аденоматозных полипов у указанных субъектов - людей.
В еще одном конкретном варианте осуществления способ скрининга согласно настоящему изобретению представляет собой способ мониторинга для выявления колоректального рака (CRC) и/или аденоматозных полипов у субъекта-человека с наличием в анамнезе полипы и/или колоректальный рака, который включает:
i. количественное определение по меньшей мере одной последовательности бактериального гена 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, или комплементарной ей последовательности 16S рРНК из образца кала указанного субъекта; и
ii. определение повторного возникновения CRC и/или аденоматозных полипов на основании количественно определенных уровней по меньшей мере одной из указанных последовательностей.
Метод скрининга согласно изобретению в примере 8 (таблице 8) показал способность проводить различие статистически значимым образом между пациентами, имеющими синдром Линча имеющим в анамнезе CRC и полипы по результатам последней колоноскопии (популяция высокого риска), и пациентами, имеющими синдром Линча без наличия в анамнезе CRC и без полипов по результатам последней колоноскопии (популяция низкого риска). Особенно значимые результаты были получены при количественном определении соотношений SEQ ID NO: 1/ SEQ ID NO: 4 (B3/B10), SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 7 (B10/B46), SEQ ID NO: 1/ SEQ ID NO: 10 (B3/B48) и SEQ ID NO: 10/ SEQ ID NO: 4 (B48/B10).
Таким образом, соотношения SEQ ID NO: 1/ SEQ ID NO: 4 (B3/B10), SEQ ID NO: 4/ SEQ ID NO: 7 (B10/B46), SEQ ID NO: 1/ SEQ ID NO: 10 (B3/B48) и SEQ ID NO: 10/ SEQ ID NO: 4 (B48/B10) являются предпочтительными биомаркерами для использования в способе согласно изобретению для скрининга/мониторинга наличия полипов, предпочтительно у пациентов повышенного или высокого риска, таких как пациенты, имеющие синдром Линча с наличием в анамнезе CRC.
В еще одном конкретном варианте осуществления способ скрининга согласно настоящему изобретению представляет собой способ определения необходимости проведения колоноскопии у субъекта-человека, при этом способ включает:
i. количественное определение по меньшей мере одной последовательности бактериального гена 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, или комплементарной ей последовательности 16S рРНК из образца кала указанного субъекта; и
ii. определение необходимости проведения колоноскопии у указанного субъекта-человека на основании количественно определенных уровней по меньшей мере одной из указанных последовательностей.
Специалисту с данной области известно несколько способов и устройств для количественного определения и анализа бактериальных маркеров согласно настоящему изобретению. Термин «количественное определение» относится к способности определить количество специфической нуклеотидной последовательности в образце. Методы, существующие в молекулярной биологии для измерения количества целевых нуклеотидных последовательностей хорошо известны в данной области. Эти методы включают, но без ограничения, ПЦР с детекцией в «конечной точке», конкурентную ПРЦ, ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR), количественную ПЦР (qPCR), количественную ПЦР с обратной транскриптазой (RT-qPCR), PCR-ELISA, ДНК- микрочипы, анализы гибридизации in situ, такие как дот-блот или анализ флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), анализ разветвленных цепей ДНК (Nolte, Adv. Clin. Chem., 1998, 33:201-235) и множество вариантов указанных способов (смотри, например, Andoh et al., Current Pharmaceutical Design, 2009; 15, 2066-2073). Предпочтительные праймеры и/или зонды взаимодействуют предсказуемым образом, обычно путем прямого и линейного ответа на возрастающие количества бактериальных нуклеотидных последовательностей. Путем получения и сравнения с соответствующими стандартами можно легко определить количество заданной нуклеотидной последовательности в образце.
Предпочтительно, чтобы указанная нуклеотидная последовательность представляла собой последовательность 16S рДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10.
Одним из наиболее предпочтительных способов количественного определения является FISH, который сочетает в себе гибридизацию зонда с флуоресцентной микроскопией, конфокальной лазерной микроскопией или проточной цитометрией для прямого количественного определения отдельных бактериальных последовательностей. Для обзора методологии FISH смотри, например, Harmsen et al.,Appl Environ Microbiol, 2002; 68 2982-2990, Kalliomaki et al., J AllergClinImmunol, 2001; 107 129-134; Tkachuk et al., Genet. Anal. Tech. Appl., 1991; 8: 67-74; Trask et al., Trends Genet, 1991; 7 (5): 149-154; и Weier et al., Expert Rev. Mol. Diagn., 2002, 2(2): 109-119; и патент США 6174681.
Другим особенно предпочтительным методом количественного определения является количественная ПЦР (qPCR), также известная как ПЦР в режиме реального времени. Процесс ПЦР хорошо известен в данной области и поэтому не описан подробно в настоящем документе. Обзор технологии qPCR и протоколы доступны от таких поставщиков, как Sigma-Aldrich, по применению SYBR Green qPCR, смотри, например, на http://www.sigmaaldrich.com/teclm или http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biologv/pcr/quantitative-pcr/qpcr-technical-guide.html. Для обзора методов qPCR для количественного определения относительного содержания и экспрессии маркеров бактериальных генов смотри, например, Smith CJ и Osborn AM., FEMS Microbiol Ecol., 2009; 67(1):6-20.
Термин «количественно определенные уровни» может означать концентрацию (количество ДНК на единицу объема), количество ДНК на число клеток, величину порогового цикла (величину Ct) или любое их математическое преобразование. В предпочтительном варианте осуществления количественное определение указанных последовательностей бактериального гена выполняется с помощью qPCR. В более предпочтительном варианте осуществления количественное определение указанных последовательностей бактериального гена выполняется с помощью qPCR, и количественно определенные уровни представляют собой величину Ct. Величина Ct (пороговый цикл) определяется как число циклов qPCR, при которых флуоресцентный сигнал превышает пороговое значение. Уровни Ct обратно пропорциональны количеству целевой нуклеиновой кислоты в образце (то есть чем ниже уровень Ct, тем больше количество целевой нуклеиновой кислоты в образце).
Количественное определение содержания целевой нуклеотидной последовательности (например, SEQ ID NO: 1) в образце кала может быть абсолютным или относительным. Относительное количественное определение основано на одном или нескольких внутренних эталонных генах, то есть генах 16S рРНК из эталонных штаммов, например, определение общих бактерий (Eubacteria) с использованием универсальных праймеров и выражение содержания целевой нуклеотидной последовательности в виде процента от Eubacteria (например, отношение SEQ ID NO: 1/Eubacteria). Абсолютное количественное определение дает точное число целевых молекул путем сравнения с ДНК- стандартами.
В конкретном варианте осуществления способ согласно изобретению дополнительно включает стадию i) сравнения уровней в образце от субъекта с уровнями в контрольном образце, при этом наличие отклонения (предпочтительно статистически значимого отклонения) уровней одной или нескольких последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, от уровней соответствующей последовательности(ей) в контрольном образце свидетельствует о CRC и/или аденоматозных полипах. Например, когда количественно определенные уровни показывают отклонение от медианы (порогового значения) плюс(+)/минус(-) стандартное отклонение от соответствующего уровня(ей), измеренного в контрольном образце, это свидетельствует о CRC и/или аденоматозных полипах.
В предпочтительном варианте осуществления, в котором уровни концентрации одной или нескольких из указанных последовательностей в указанном образце субъекта ниже, чем медиана (пороговое значение) минус стандартное отклонение от уровней соответствующей последовательности(ей), измеренных в контрольном образце, это свидетельствует о CRC и/или аденоматозных полипах. В другом предпочтительном варианте осуществления, в котором уровни Ct одной или нескольких из указанных последовательностей в образце указанного субъекта выше, чем медиана (пороговое значение) плюс стандартное отклонение от уровней соответствующей последовательности(ей), измеренных в контрольном образце, это свидетельствует о CRC и/или аденоматозных полипах.
Термин «контрольный образец» может относиться к набору контрольных образцов от популяции сравнения, например, контрольные образцы могут представлять собой образцы от здоровых субъектов, от субъектов без аденоматозных полипов, от субъектов без наличия в анамнезе аденоматозных полипов и/или колоректального рака и их комбинации.
Классификация субъектов-людей на одну из указанных выше популяций сравнения осуществляется с помощью колоноскопий. Например, «здоровые субъекты» представляют собой таких субъектов, которые по результатам предыдущей колоноскопий не показали аденоматозных полипов или колоректального рака.
Предпочтительно способ согласно изобретению включает количественное определение 2, 3 или 4 последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, предпочтительно всех 4 последовательностей.
В одном конкретном варианте осуществления способ согласно изобретению включает количественное определение по меньшей мере двух последовательностей, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, и определение взаимосвязи между по меньшей мере двумя из указанных последовательностей. Предпочтительно определение взаимосвязи между двумя, тремя или четырьмя из указанных последовательностей (например, соотношение, многовариантный анализ и т.д.).
В предпочтительном варианте осуществления соотношение между этими по меньшей мере двумя последовательностями получают путем деления количественно определенных уровней первой последовательности на количественно определенные уровни второй последовательности. Например, соотношение концентрации последовательностей SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 4 получают путем деления концентрации последовательности SEQ ID NO: 10 на концентрацию последовательности SEQ ID NO: 4. Соотношение SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 4 может быть также получено путем деления величины Ct последовательности, идентифицированной как SEQ ID NO: 10, на величину Ct последовательности, идентифицированной как SEQ ID NO: 4.
В еще одном варианте осуществления способа согласно изобретению по меньшей мере две из указанных последовательностей бактериального гена количественно определяют на стадии i) и определяют по меньшей мере одно из соотношений уровней указанных последовательностей в образце от субъекта, при этом способ дополнительно включает сравнение по меньшей мере одного из указанных соотношений у указанного субъекта с соответствующим соотношением(ями) в контрольном образце, при этом отклонение от соотношения в указанном контрольном образце (предпочтительно статистически значимое отклонение) свидетельствует о CRC и/или аденоматозных полипах. Например, когда одно или более из указанных соотношений представляют отклонение от медианы (порогового значения) плюс(+)/минус(-) стандартное отклонение от соответствующего соотношениями), измеренного в контрольном образце, это свидетельствует о CRC и/или аденоматозных полипах.
Термин «статистическое значимое» в отношении различий между тестируемыми образцами и контрольным образцом, относится к условию, когда при использовании подходящего статистического анализа вероятность того, что группы будут одинаковыми, составляет менее 5%, например, р<0,05. Другими словами, вероятность получения таких же результатов на случайной основе составляет менее 5 из 100 попыток. Специалист в данной области будет знать, как выбрать соответствующий статистический анализ. Как правило, подходящие статистические анализы выбирают исходя из того, имеет ли подлежащая исследованию переменная нормальное распределение, например, с помощью теста Колмогорова-Смирнова. В тех случаях, когда присутствует нормальное распределение, предпочтительно использовать параметрическую модель, такую как t-тест или тест ANOVA; и когда нормальное распределение отсутствует, может быть использована непараметрическая модель, такая как U-критерий Манна-Уитни или критерий Крускала-Уоллиса.
В конкретном варианте осуществления для описания способа скрининга согласно изобретению используют результаты анализа чувствительности, специфичности, точности, ROC или их комбинацию. В частности, их применяют для количественной оценки качества и надежности метода.
Существует несколько терминов, которые обычно используют вместе с описанием чувствительности, специфичности и точности. Они представляют собой истинно- позитивные (TP), истинно-негативные (TN), ложно-негативные (FN) и ложно-позитивные (FP). Если доказано, что заболевание присутствует у пациента, данный скрининговый тест также указывает на наличие заболевания, результаты теста считаются истинно- позитивными. Аналогично, если доказано, что заболевание отсутствует у пациента, скриниговый тест также показывает, что заболевание отсутствует, то результаты теста являются истинно-негативными (TN). Оба, истинно-позитивные и истинно-негативные подразумевают непротиворечивый результат между скрининговым тестом и подтвержденным состоянием (также называется стандартом истины). Однако ни один медицинский тест не является идеальным. Если скрининговый тест указывает на наличие заболевания у пациента, который на самом деле не имеет такого заболевания, результаты теста являются ложно-позитивными (FP). Аналогично, если результаты скринингового теста показывают, что заболевание отсутствует у пациента, точно имеющего заболевание, результат теста является ложно-негативным (FN). Оба, ложно-позитивный и ложно-негативный указывают на то, что результаты теста противоречат фактическому состоянию.
Чувствительность, специфичность и точность описаны в терминах TP, TN, FN и FP.
Чувствительность = ТР/(ТР+FN) = (Число истинно-позитивных оценок)/(Число всех позитивных оценок);
Специфичность = TN/(TN+FP) = (Число истинно-негативных оценок)/(Число всех негативных оценок);
Точность = (TN+TP)/(TN+TP+FN+FP) = (Число правильных оценок)/(Число всех оценок).
В предпочтительном варианте осуществления способ скрининга согласно настоящему изобретению обеспечивает диагностику, раннее обнаружение, определяет повторное возникновение, определяет риск развития или прогнозирует CRC и/или полипы у субъекта-человека; или определяет необходимость проведения колоноскопии у указанного субъекта-человека; или прогнозирует, является ли субъект-человек пациентом с диагнозом CRC и/или полипами; или определяет проведение терапии у пациента с CRC или полипами статистически значимым образом с чувствительностью и/или специфичностью по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или предпочтительно 100%.
Согласно указанным выше уравнениям используемый здесь термин «чувствительность» относится к доле истинно-позитивных результатов, которые правильно идентифицированы скрининговым тестом. Он показывает, насколько удовлетворительным является тест в отношении выявления заболевания. Чувствительность («sens») может находиться в диапазоне 0 (0%)<sens<1 (100%) и в идеальном случае число ложно-негативных результатов равно нулю или близко нулю, и чувствительность равна единице (100%) или близка единице (100%). Предпочтительно он имеет чувствительность от 70% до 90%, от 75% до 95%, от 80% до 95%, от 85% до 100% или 90% до 100%. Более предпочтительно способ согласно изобретению имеет величины чувствительности, равные по меньшей мере 85%, такие как около 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.
Используемый здесь термин «специфичность» относится к доле истинно- негативных результатов, правильно идентифицированных скрининговым тестом. Указанный термин означает, насколько удовлетворительным является тест в отношении идентификации нормального (негативного) состояния. Специфичность («spec») может находиться в пределах 0 (0%)<spec<1 (100%) и в идеальном случае число ложно- позитивных результатов равно нулю или близко к нулю, и специфичность равная единице (100%) или близка единице (100%). Предпочтительно он имеет специфичность от 70% до 90%, от 75% до 95%, от 80% до 95%, от 85% до 100% или 90% до 100%. Более предпочтительно способ согласно изобретению имеет величины специфичности, равные по меньшей мере 85%, такие как около 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.
Используемый здесь термин «точность» представляет собой долю истинных результатов у популяции, либо истинно-позитивных или истинно-негативных. Он измеряет степень достоверности скринингового теста в отношении состояния, то есть насколько правильным является определение и исключение данного состояния. Точность («асc») может находиться в диапазоне 0 (0%)<асс<1 (100%) и в идеальном случае число ложно-позитивных результатов равно нулю или близко нулю, и точность равна единице (100%) или близка единице (100%). Предпочтительно точность способа согласно изобретению равна по меньшей мере 60%, по меньшей мере 65%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или предпочтительно 100%. В предпочтительном варианте осуществления он имеет точность от 70% до 90%, от 75% до 95%, от 80% до 95%, от 85% до 100% или 90% до 100%. Предпочтительно способ согласно изобретению имеет величины точности, равные по меньшей мере 85%, такие как около 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%.
«ROC-кривая» представляет собой графическое изображение взаимосвязи между чувствительностью и специфичностью, и помогает определить оптимальную модель путем определения наилучшего порогового значения (оптимального отсечения) для скринингового теста. Площадь под ROC-кривой (AUC) обеспечивает способ измерения точности скринингового теста. Предпочтительно значения в диапазоне AUC способа согласно изобретению находятся в диапазоне от 0,6 до 1, более предпочтительно от 0,7 до 1, более предпочтительно значения находятся в диапазоне от 0,8 до 1, более предпочтительно от 0,9 до 1. В конкретном варианте осуществления AUC составляет от 0,6 до 0,8, такое как от 0,6 до 0,75 или от 0,65 до 0,75.
Кроме того, чувствительность, специфичность и точность представляют собой доли, таким образом, соответствующие доверительные интервалы могут быть рассчитаны с использованием хорошо известных в данной области стандартных способов для долей. Два типа 95% доверительных интервалов обычно определяют вокруг долей. Точный доверительный интервал определяют путем использования биноминального распределения для достижения точной оценки. Асимптотический доверительный интервал вычисляют путем допуска нормальной аппроксимации распределения образцов. Специалист в данной области будет знать, как определить соответствующий доверительный интервал. Выбор доверительного интервала того или иного типа, как правило, зависит от того, является ли доля выборки удовлетворительным приближением к нормальному распределению.
В конкретном варианте осуществления способа согласно изобретению до количественного определения указанных бактериальных последовательностей осуществляют экстракцию ДНК из образца кала. Известно несколько способов экстракции ДНК из образцов кала, все из которых основаны на химическом или механическом разрушении, лизисе с использованием детергентов или комбинации этих подходов (Kennedy A. et al., PLoS One, 2014; 9(2):e88982). Способы экстракции бактериальной ДНК из образцов кала известны, например, из работ М Const et al., Journal of Microbiological Methods, 2002; 50(2):131-139, Whitney D et al., Journal of Molecular Diagnostics, American Society for Investigative Pathology, 2004; 6(4):386-395 и WO 2003/068788.
Предпочтительно в способах использовать комбинацию механического разрушения, такого как экстракция путем высокоскоростного измельчения с помощью шариков, химического лизиса и конечной стадии очистки, предпочтительно с использованием колонки с кремниевой мембраной, такой как включенная в коммерчески доступные наборы для экстракции ДНК "MobioPowerSoil DNA extraction procedure"(Mo-Bio Laboratories Inc.,), FastDNA SPIN Kit for soil procedure (MP biomedicals) и NucleoSpin Soil (Macherey-Nagel Gmbh& Co. KG). Присутствие ингибиторов ПЦР в экстрактах ДНК из образцов кала, таких как билирубины, соли желчных кислот и сложные углеводы, представляет одну из трудностей, с которым сталкиваются при определении биомаркеров ДНК в экстрактах ДНК из кала (Fleckna et al., Mol Cell Probes, 2007; 21(4):282-7). Предпочтительные способы экстракции ДНК представляют собой такие способы, которые обеспечивают экстракты кала с низким количеством ингибиторов ПЦР, таким как менее чем 5%, предпочтительно менее чем 2%, более предпочтительно менее чем 1%, даже более предпочтительно менее чем 0,5%, такое как менее чем 0,25%, 0,1%, 0,05% или 0,01%.
В конкретном варианте осуществления способ согласно изобретению включает: (а) определение с помощью количественной ПЦР из указанного образца кала уровней по меньшей мере одной последовательности бактериального гена 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, при этом уровни SEQ ID NO: 1 определяют с использованием праймеров по меньшей мере с 90% идентичностью относительно уровней SEQ ID NO: 2-13, уровни SEQ ID NO: 4 определяют с использованием праймеров по меньшей мере с 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 5-6, уровни SEQ ID NO: 7 определяют с использованием праймеров по меньшей мере с 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 8-9 и уровни SEQ ID NO: 10 определяют с использованием примеров по меньшей мере с 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 11-12; и/или
(b) определение с помощью количественной ПЦР из указанного образца кала уровней по меньшей мере двух последовательностей бактериального гена 16S рДНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, как указано для стадии а), и определение по меньшей мере одного из соотношений, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 10/SEQ ID 1.
В одном предпочтительном варианте осуществления способ скрининга CRC и/или аденоматозных полипов из образца кала человека согласно изобретению включает:
(a) определение с помощью количественной ПЦР из указанного образца кала человека концентрации по меньшей мере одной из последовательностей бактериального гена 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, при этом концентрацию SEQ ID NO: 1 определяют с использованием праймеров по меньшей мере с 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 2-13, концентрацию SEQ ID NO: 4 определяют с использованием праймеров по меньшей мере с 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 5-6, концентрацию SEQ ID NO: 7 определяют с использованием праймеров по меньшей мере с 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 8-9 и концентрацию SEQ ID NO: 10 определяют с использованием праймеров по меньшей мере с 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 11-12; и/или
(b) при необходимости, определение количественной ПЦР из указанного образца кала человека уровней по меньшей мере двух последовательностей бактериального гена 16S рДНК, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, как указано для стадии а), и определение по меньшей мере одного из соотношений концентраций, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 10/SEQ ED 1, и
(c) диагностику, определение риска или определение повторного возникновения CRC и/или аденоматозных полипов на основании концентрации по меньшей мере одной из последовательностей на стадии (а) и/или величины по меньшей мере одного соотношения, полученного на стадии (b).
В другом варианте осуществления способа согласно изобретению указанные праймеры, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 2-13, представляют собой праймеры, обладающие по меньшей мере 95% идентичностью относительно SEQ ID NO: 2-13; указанные праймеры, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 5-6, представляют собой праймеры, обладающие по меньшей мере 95% идентичностью относительно SEQ ID NO: 5-6; указанные праймеры, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 8-9, представляют собой праймеры, обладающие по меньшей мере 95% идентичностью относительно SEQ ID NO: 8-9; и указанные праймеры, обладающие по меньшей мере 90% идентичностью относительно SEQ ID NO: 11-12, представляют собой праймеры, обладающие по меньшей мере 95% идентичностью относительно SEQ ID NO: 11-12.
В особенно предпочтительном варианте осуществления указанные праймеры, обладающие по меньшей мере 95% идентичностью относительно SEQ ID NO: 2-13, представляют собой праймеры, идентифицированные как SEQ ID NO: 2-13; указанные праймеры, обладающие по меньшей мере 95% идентичностью относительно SEQ ID NO: 5-6, представляют собой праймеры, идентифицированные как SEQ ID NO: 5-6; указанные праймеры, обладающие по меньшей мере 95% идентичностью относительно SEQ ID NO: 8-9, представляют собой праймеры, идентифицированные как SEQ ID NO: 8-9; и указанные праймеры, обладающие по меньшей мере 95% идентичностью относительно SEQ ID NO: 11-12, представляют собой праймеры, идентифицированные как SEQ ID NO: 11-12.
В настоящей заявке представляющая интерес последовательность обладает 95% идентичностью относительно определенной последовательности, если 95% остатков представляющей интерес последовательности идентичны остаткам определенной последовательности.
В предпочтительном варианте осуществления способ согласно настоящему изобретению представляет собой способ диагностики колоректального рака, и колоректальный рак диагностируется на стадии (с), если величина Ct SEQ ID NO: 1 выше порогового значения Ct, равного 37,2, или если величина Ct SEQ ID NO: 4 выше порогового значения Ct, равного 16,56, или если величина Ct SEQ ID NO: 7 выше порогового значения Ct, равного 22,97, или если величина Ct SEQ ID NO: 10 выше порогового значения Ct, равного 19,24, или если величина соотношения SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 4 ниже порогового значения, равного 1,16, или если величина соотношения SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 4 ниже порогового значения, равного 1,40, или если величина соотношения SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1 выше порогового значения, равного 0,44, или если величина соотношения SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 1 выше порогового значения, равного 0,62, или если величина соотношения SEQ ID NO: 10/SEQ ID: 1 выше порогового значения, равного 0,52, или если SEQ ID NO: 10/SEQ ID: 7 выше порогового значения, равного 1,2.
В другом предпочтительном варианте осуществления способ согласно настоящему изобретению представляет собой способ диагностики риска развития колоректального рака, при этом риск развития колоректального рака диагностируется на стадии (с), если величина Ct SEQ ID NO: 1 выше пороговой величины Ct, равной 36,34, или если величина Ct SEQ ID NO: 4 выше пороговой величины Ct, равной 14,02, или если величина Ct SEQ ID NO: 7 выше пороговой величины Ct, равной 24,76, или если величина Ct SEQ ID NO: 10 выше пороговой величины Ct, равной 21,42, или если величина соотношения SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 4 ниже пороговой величины, равной 1,56, или если величина соотношения SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 4 ниже пороговой величины, равной 1,78, или если величина соотношения SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1 выше пороговой величины, равной 0,38, или если величина соотношения SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 1 выше пороговой величины, равной 0,68, или если величина соотношения SEQ ID NO: 10/SEQ ID 1 выше пороговой величины, равной 0,59, или если величина соотношения SEQ ID NO: 10/SEQ ID: 7 выше пороговой величины, равной 1,16.
В другом варианте осуществления способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает обнаружение и/или количественное определение одного или нескольких молекулярных биомаркеров, которые, как известно, свидетельствуют о CRC. В предпочтительном варианте используется панель из множества маркеров. Указанная панель из множества маркеров может содержать определение точечных мутаций, присутствующих в одном или нескольких из следующих генов: АРС, K-ras, BRAF, р53, NRAS, РIK3СА, CDK8, CMYC, CCNE1, CTNNB1, NEU (HER2), MYB, FBXW7, PTEN, SMAD4, SMAD2, SMAD3, TGFβ11R, TCF7L2, ACVR2 и ВАХ (Fearon, Е.R., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis., 2011;6:479-507). Другими известными маркерами CRC, которые могут быть определены, являются островки метилирования CpG, количество человеческой ДНК на единицу массы кала, и количество общей ДНК на единицу массы кала.
В еще одном варианте осуществления способ согласно настоящему изобретению дополнительно включает хранение результатов определения на машиночитаемом носителе. Используемый здесь термин «машиночитаемый носитель» может представлять собой любое устройство, которое может включать в себя, хранить, взаимодействовать, распространять или переносить результаты определения в способе согласно изобретению. Носитель может представлять собой электронную, магнитную, оптическую, электромагнитную, инфракрасную или полупроводниковую систему (или прибор или устройство) или среду распространения.
Во втором аспекте изобретение относится к использованию по меньшей мере одной последовательности бактериального гена 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, или комплементарной ей последовательности рРНК в качестве биомаркера для диагностики, раннего обнаружения, определения повторного возникновения, определения риска развития или прогнозирования CRC и/или полипов у субъекта-человека; или определения необходимости проведения колоноскопии у указанного субъекта-человека; или определения прогноза, при этом указанный субъект-человек представляет собой пациента, диагностированного с CRC и/или полипами; или проведения терапии у пациента с CRC и/или полипами, при этом указанные последовательности бактериального гена количественно определяют из образца кала указанного субъекта-человека.
Предпочтительно, чтобы указанная нуклеотидная последовательность представляла собой последовательность 16S рДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10.
Используемый здесь термин «биомаркер» относится к маркерам заболевания, которые, как правило, представляют собой вещества, обнаруженные в образце, полученном из организма человека, которые могут быть легко измерены. Измеренная величина может коррелировать с лежащей в основе заболевания патофизиологией, такой как наличие или отсутствие CRC и/или полипов, или вероятность возникновения CRC и/или полипов в будущем. У пациентов, получающих лечение по поводу их заболевания, измеренное количество будет также коррелировать с отвечаемостью на терапию.
В третьем аспекте изобретение относится к набору, включающему:
a. реагент, выбранный из группы, состоящей из:
i) нуклеиновокислотных зондов, способных к специфической гибридизации по меньшей мере с одной последовательностью 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, или комплементарной ей последовательностью рРНК; или
ii) пару праймеров, содержащих нуклеиновые кислоты, способные к специфической амплификации по меньшей мере одной последовательности 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10; и
b. инструкции для количественного определения уровней одной или нескольких из указанных последовательностей из образца кала человека в соответствии со способом согласно настоящему изобретению.
Используемый здесь термин «зонд» относится к полученным синтетически или биологически нуклеиновым кислотам длиной от 10 до 285 пар оснований, которые содержат специфические нуклеотидные последовательности, которые обеспечивают возможность специфической и предпочтительной гибридизации в заданных условиях для направленного воздействия на нуклеотидные последовательности, и необязательно содержат фрагмент для обнаружения или повышения производительности анализа. Как правило, минимум десять нуклеотидов требуется для статистического получения специфичности и образования стабильных продуктов гибридизации, и максимум 285 нуклеотидов, как правило, представляют собой верхний предел по длине, при этом параметры реакции могут быть легко отрегулированы для определения несовпадающих последовательностей и предпочтительной гибридизации. Зонды могут необязательно содержать определенные компоненты, которые способствуют их надлежащему или оптимальному функционированию в определенных условиях анализа. Например, зонды могут быть модифицированы для повышения их устойчивости к деградации нуклеазами (например, путем концевого кэширования), чтобы нести лиганды обнаружения (например, флуоресцеин) или для облегчения их захвата на твердом носителе (например, поли- деоксиаденозиновые «хвосты»).
Используемый здесь термин «праймеры» относится к олигонуклеотидам, которые могут быть использованы в методе амплификации, таком как полимеразная цепная реакция («ПЦР»), для амплификации нуклеотидной последовательности. Праймеры сконструированы на основе полинуклеотидной последовательности конкретной целевой мишени, например, одной специфической последовательности 16S рДНК.
Конструирование и валидация праймеров и зондов хорошо известны в данной области. Методы количественной ПЦР в реальном времени смотри, например, в Rodriguez A et al. (Methods Mol Biol., 2015, 1275:31-56).
Используемый здесь термин «специфическая» означает, что нуклеотидная последовательность гибридизуется с предварительно определенной целевой последовательностью и ее амплифицирует, и не будет значительно гибридизироваться с нецелевой последовательностью или ее амплифицировать в условиях анализа, как правило, в жестких условиях.
Используемый здесь термин «гибридизация» относится к процессу, посредством которого при заданных условиях реакции две частично или полностью комплементарные цепочки нуклеиновой кислоты сближаются антипараллельным образом с образованием двухцепочечной нуклеиновой кислоты со специфическими и стабильными водородными связями, следуя четким правилам, согласно которым нуклеотидные основания могут соединяться друг с другом.
«Значительная гибридизация» означает, что объем наблюдаемой гибридизации будет таким, что наблюдаемые результаты можно считать позитивными по отношению к данным гибридизации в позитивных и негативных контролях. Данные, которые считаются «фоновым шумом», не являются значительной гибридизацией.
Выражение «жесткие условия гибридизации» означает приблизительно от 35°С до 65°С в приблизительно 0,9 молярном растворе NaCl. Жесткость также может определяться такими параметрами реакции, как концентрация и тип ионных частиц, присутствующих в гибридизационном растворе, типы и концентрации присутствующих денатурирующий агентов, и температура гибридизации. Как правило, поскольку условия гибридизации становятся более жесткими, более длинные зонды являются предпочтительными, если должны быть сформированы устойчивые гибриды. Как правило, жесткость условий, при которых происходит гибридизация, будет определять некоторые характеристики предпочтительных зондов, подлежащих использованию.
Предпочтительно, чтобы указанная нуклеотидная последовательность представляла собой последовательность 16S рДНК, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10.
В конкретном варианте осуществления указанный набор используют для диагностики, раннего обнаружения, определения повторного возникновения, определения риска развития или прогнозирования CRC и/или полипов у субъекта-человека; или для определения необходимости проведения колоноскопии у указанного субъекта-человека; или для определения прогноза у пациента с диагнозом CRC и/или полипами; или для определения терапии у пациента с CRC и/или полипами. В предпочтительном варианте осуществления набор может дополнительно содержать средства для экстракции ДНК, средства для проведения гибридизации и/или амплификации, средства обнаружения, и/или один или несколько контейнеров для сбора и/или содержания биологического образца.
В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору для диагностики колоректального рака из образца кала человека, содержащему по меньшей мере одну пару праймеров для ПЦР, выбранных из группы пар праймеров, состоящей из SEQ ID NO: 2-13, SEQ ID NO: 5-6, SEQ ID NO: 8-9 и SEQ ID NO: 11-12.
В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; или последовательности, обладающей по меньшей мере 90% идентичностью, предпочтительно 95% идентичностью, более предпочтительно 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичностью указанным последовательностям. В предпочтительном варианте указанные ДНК-последовательности используют в качестве праймеров в анализе амплификации (таком как количественная ПЦР) или в качестве нуклеотидных зондов в анализе гибридизации для количественного определения по меньшей мере одной последовательности 16S рДНК, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10.
В конкретном варианте осуществления указанная нуклеотидная последовательность представляет собой пару праймеров для ПЦР, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2-13, SEQ ID NO: 5-6, SEQ ID NO: 8-9 и SEQ ID NO: 11-12. В другом конкретном варианте осуществления указанная нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидный зонд, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.
В пятом аспекте изобретение относится к применению нуклеотидной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12; или последовательности, обладающей по меньшей мере 90% идентичностью указанным последовательностям, в способе скрининга согласно изобретению, при этом SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 13 используют для количественного определения SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 5 и/или SEQ ID NO: 6 используют для количественного определения SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 8 и/или SEQ ID NO: 9 используют для количественного определения SEQ ID NO: 7; и SEQ ID NO: 11 и/или SEQ ID NO: 12 используют для количественного определения SEQ ID NO: 10.
Следует понимать, что конкретные варианты осуществления, описанные в примерах, показаны в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения изобретения. Основные отличительные признаки настоящего изобретения могут быть использованы в различных вариантах осуществления без отступления от объема настоящего изобретения. Специалистам в данной области будет понятно или они смогут установить с использованием рутинных экспериментов многочисленные эквиваленты конкретным процедурам, описанным здесь. Предполагается, что такие эквиваленты входят в объем настоящего изобретения и охвачены формулой изобретения.
Все публикации и патентные заявки, упомянутые в описании, указывают на уровень квалификации специалистов в данной области техники, к которой относится данное изобретение. Все публикации и патентные заявки включены в данное описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно указана как включенная в качестве ссылки.
Использование неопределенного артикля может означать «один», но это также согласуется со значением «один или несколько», «по меньшей мере один» и «один или более чем один».
По всему описанию термин «около» означает указанную величину ±5% от ее значения, предпочтительно указанную величину ±2% от ее значения, наиболее предпочтительно термин «около» означает конкретно указанное значение (±0%).
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Материалы и методы
1. Биологические образцы
Образцы кала получали от 27 пациентов, у которых на текущий момент был диагностирован колоректальный рак (CRC) (стадия 0-I), 24 пациентов с синдромом Линча (L) и 19 здоровых индивидуумов (С). Все пациенты проходили колоноскопию по меньшей мере за 15 дней до сбора образцов.
Все пациенты подписали соответствующее информированное согласие. Критерии исключения включали лечение антибиотиками в течение 1 месяца до начала исследования и возраст до 18 лет.
2. Последовательности бактериального гена 16S рДНК:
Последовательности В3, B10, В41, В46, В48 и В50, соответствующие полосам денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE), предварительно выделяли из некультивированных бактериальных изолятов;
- последовательность бактериального гена 16S рДНК SEQ ID NO: 1 (В3), опубликованная в базе данных European Nucleotide Archive (ENA) EMBL-EBI под номером GQ411111.1;
- последовательность бактериального гена 16S рДНК SEQ ID NO: 4 (B10), опубликованная в базе данных European Nucleotide Archive (ENA) EMBL-EBI под номером GQ411118.1;
- последовательность бактериального гена 16S рДНК SEQ ID NO: 7 (В46), опубликованная в базе данных European Nucleotide Archive (ENA) EMBL-EBI под номером GQ411150.1;
- последовательность бактериального гена 16S рДНК SEQ ID NO: 10 (В48), опубликованная в базе данных European Nucleotide Archive (ENA) EMBL-EBI под номером GQ411152.1;
- последовательность бактериального гена 16S рДНК В41, опубликованная в базе данных European Nucleotide Archive (ENA) EMBL-EBI под номером GQ411145.1; и
- последовательность бактериального гена 16S рДНК В50, опубликованная в базе данных European Nucleotide Archive (ENA) EMBL-EBI под номером GQ411154.1.
3. Сбор образцов, сохранение и хранение
Образцы кала 24 ч собирали в контейнеры для кала и хранили при -20°С в течение одного месяца и переносили в морозильную камеру при -80°С в условиях ISO 9001.
4. Обработка образцов и экстракция ДНК
Для экстракции 16s-ДНК использовали NucleoSpin Soil (Macherey-Nagel).
В безопасных биологических условиях класса II 200 мг-500 мг образца кала помещали в электронно-лучевую трубку Nucleospin. В электронно-лучевую трубку добавляли 700 мкл SL1 и 150 мкл Enhancer SX.
5. После этого ДНК экстрагировали и очищали, следуя инструкциям изготовителя, и элюировали 50 мкл элюирующего буфера или 10 мМ Tris НС1, рН - 7.4.
6. Расчет концентрации ДНК
Концентрацию ДНК экстракта определяли путем флуоресцентного анализа с помощью флуориметра Qubit 2.0 Fluorometer, номер по каталогу Q32866 с использованием набора Quant-IT dsDNA Broad-Range Assay Kit. Данный способ является высоко селективным для дцДНК в отношении РНК и обеспечивает точную количественную оценку в диапазоне от 2 нг до 1000 нг. В этом диапазоне флуоресценция находится в прямой зависимости от концентрации ДНК. Измерения ДНК проводили на 5 мкл экстракта.
7. Количественная ПЦР в режиме реального времени (qPCR) ДНК, экстрагированной из образцов кала
ДНК из фекальных образцов анализировали с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени. В частности, оценивали количество четырех популяций бактерий на образец: В3, В10, В48 и В46. Последовательности бактериального гена количественно оценивали с использованием количественной ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентным окрашиванием дцДНК. В этой работе использовали pre-mix BRYT от компании Promega (Madison, USA). Эубактерии амплифицировали, следуя процедуре, описанной Furet.et al.(.FEMS Microbiol Ecol., 2009; 68(3):351-62).
Численность бактерий для каждого образца выражали в виде величины Ct, нормализованной к общей концентрации ДНК.
Величину Ct (пороговый цикл) определяли как число циклов количественной ПЦР, при которых флуоресцентный сигнал превышает пороговое значение. Уровни Ct обратно пропорциональны логарифму концентрации целевой нуклеиновой кислоты в образце (то есть чем ниже уровень Ct, тем больше количество целевой нуклеиновой кислоты в образце). Анализы в режиме реального времени проходили 40 циклов амплификации.
8. Методы статистического анализа
Статистическое нормальное распределение данных анализировали с помощью теста Колмогорова-Смирнова. В соответствии с тем, было ли статистически нормальное распределение данных, использовали подходящий статистический тест для сравнения следующих групп.
Анализировали следующие группы: группу CRC в сравнении с группой здоровых пациентов; группу CRC в сравнении с группой синдрома Линча и в сравнении с группой здоровых пациентов; группу CRC + синдром Линча в сравнении с группой здоровых пациентов; и группу CRC в сравнении с группой высокого риска синдрома Линча в сравнении с группой низкого риска синдрома Линча в сравнении с группой здоровых пациентов.
Для этих групп анализировали следующие переменные:
- количественное определение четырех последовательностей бактериального гена, выраженное в Ct;
- количественное определение соотношения четырех последовательностей бактериального гена;
- масса; и
- концентрация ДНК.
С использованием анализов бинарной регрессии и ROC определяли корреляцию количественно определенной последовательности(ей) бактериального гена между здоровым состоянием и CRC, риск (в одном и разделенном на два состояния риска), а также чувствительность и специфичность теста.
Никаких различий между группами не наблюдалось по ДНК и массе. Было обнаружено, что количество эубактерий (Eub) различается между пациентами в группах синдрома Линча и CRC + синдром Линча, и здоровых пациентов (С), но это считалось нормальным, так как состояние заболевания подразумевает изменение филогенетического ядра, которое включает бактерии с меньшим количеством копий ДНК. Это не вызывает уменьшения количества общих бактерий (смотри, например, Sobhani et al., PLoS One, 2011,27; 6(1):el6393). По этой причине количественное определение Eub не использовали в качестве внутреннего стандарта для нормализации.
Пример 2. Конструирование и валидация праймеров
Праймер для количественного определения маркеров бактериального гена B3, В10, В46, В48, В41 и В50 в биопсии конструировали на основании сравнительного анализа с последовательностями, полученными ранее из филогенетических групп, с использованием биоинформационных инструментов: ClustalX от компании European Bioinformatics Institute (www.ebi.ac.uk), Netprimer (Premier Biosoft) и PrimerExpress (Life Tecnologies-Thermo Fischer).
Выбранная система обнаружения представляла собой SybrGreen. Набор праймеров с менее чем 3 положениями, отличающимися от расположенных рядом групп, исключали. Набор праймеров с величинами Tm на кривых диссоциации, отличающихся от предполагаемых, также исключали. Валидацию праймеров выполняли на образце биопсии и образце кала. Кривую диссоциации определяли для анализа характеристик праймеров.
На фигурах с 8а по 13b показаны графики амплификации и кривые диссоциации для валидации сконструированных праймеров для амплификации В3, B10, В46, В48, В41 и В50, соответственно. Праймеры, показывающие нормальную кривую диссоциации (один пик для каждого набора праймеров), отбирали для количественного определения бактериального гена 16S рДНК в образцах кала. Следует отметить, что были выбраны праймеры, амплифицирующие В3, В10, В46 и В48, представленные в таблице 9 ниже. В51 и В40 были исключены из-за отсутствия специфичности (множество пиков для каждого набора праймеров на кривых плавления).
Пример 3: Анализ биомаркеров 16S рДНК у пациентов с колоректальным раком в сравнении со здоровыми субъектами
Всего анализировали 16 образцов кала у 7 контрольных пациентов и 9 пациентов с колоректальным раком. Количественное определение каждого из бактериальных маркеров, указанных в примере 1, в анализируемых образцах кала выражали в виде величины Ct. Величину Ct (пороговый цикл) определяли как число циклов количественной ПЦР, при которых флуоресцентный сигнал превышает пороговое значение. Уровни Ct обратно пропорциональны логарифму концентрации целевой нуклеиновой кислоты в образце (то есть чем ниже уровень Ct, тем больше количество целевой нуклеиновой кислоты в образце). Анализы в режиме реального времени проходили 40 циклов амплификации. Полученные результаты показаны ниже в таблицах 1 и 2. В таблице 1 показаны абсолютные величины Ct, и в таблице 2 показаны соотношения Ct. Применяли двухвыборочный t-тест.
Чувствительность и специфичность метода диагностики колоректального рака составляет 75 и 71% для отношения SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 4; 77% и 71% для отношения SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 4, соответственно; 100% и 100% для отношения SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1, соответственно; 100% и 100% для отношения SEQ ID NO: 7/ SEQ ID NO: 1, соответственно; и 75% и 75% для отношения SEQ ID NO: 10/ SEQ ID NO: 1, соответственно.
Фигуры 1, 2 и 3 представляют собой графическое изображение соотношений величин Ct (SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1).
Фигуры 4 и 5 представляют собой графические изображения абсолютных величин Ct (SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7).
Пример 4. Анализ биомаркеров 16S рДНК у пациентов с синдромом Линча: группа CRC в сравнении с группой Высокого риска (с полипами) в сравнении с группой Низкого риска (без полипов)
Целью данного анализа является определение прогностической величины биомаркеров для обнаружения риска развития колоректального рака до появления клинических признаков.
Всего анализировали 8 индивидуумов с синдромом Линча (с генетически повышенным риском развития колоректального рака). Все индивидуумы прошли колоноскопию в течение максимум одного года до сбора образца кала. В соответствии с эндоскопическим исследованием 4 из них имели злокачественные полипы (названные как Высокий риск) и 4 не имели полипов (названные как Низкий риск).
Количественное определение каждого из бактериальных маркеров, указанных в примере 1, в образцах кала человека проводили с использованием праймеров, описанных в примере 2, и выражали в виде величин Ct.
Полученные результаты показаны ниже в таблицах 3 и 4. В таблице 3 представлены абсолютные величины Ct и в таблице 4 представлены соотношения Ct. Применяли двухвыборочный t-тест.
Соотношения микробиологических маркеров могут выделить группу индивидуумов с Высоким риском развития колоректального рака (пациентов с синдромом Линча и полипами). Чувствительность и специфичность обнаружения колоректального рака в группе высокого риска составили 80% и 100% для SEQ ID NO: 4; 75% и 75%, соответственно, для соотношения SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1; 80% и 100%, соответственно, для соотношения SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 4; 75% и 75%, соответственно, для соотношения SEQ ID NO: 7/SEQ ID NO: 1; и 75% и 75% для соотношения SEQ ID NO: 10/SEQ ID NO: 1.
Фигура 6 представляет собой графическое изображение соотношения величин Ct (SEQ ID NO: 4/SEQ ID NO: 1) и фигура 7 представляет собой графическое изображение абсолютных величин Ct (SEQ ID NO: 4).
Пример 5: Анализ биомаркеров 16S рДНК у пациентов с колоректальным раком в сравнении со здоровыми субъектами
Образцы кала получали от 27 пациентов, у которых недавно был диагностирован колоректальный рак (CRC) (стадия 0-1), и здоровых индивидуумов (С). Все пациенты прошли колоноскопию в течение по меньшей мере 15 дней до взятия образца.
Все из них подписали соответствующее информированное согласие. Критерии исключения включали лечение антибиотиками в течение 1 месяца до начала исследования и возраст до 18 лет.
В таблице 5 (смотри ниже) показано, что количественное определение четырех последовательностей бактериального гена показало значительное увеличение Ct в кале у пациентов с CRC. Этот факт означает наличие более низкой нагрузки четырех бактерий в этой группе.
Значительно пониженная нагрузка этих четырех бактерий может являться мощным инструментом для скрининга пациентов с CRC. При раздельном анализе эффективности бактериальных биомаркеров наилучшие результаты были получены для В3, который идентифицировал пациентов с CRC с 94%-ной специфичностью и 48%-ной чувствительностью и точностью 0,7; и на втором месте В46 с 84%-ной специфичностью и 61,5%-ной чувствительностью и точностью 0,698.
В48 и В10 также показали точность, равную 0,69, но 100%-ную специфичность и 36%-ную чувствительность, и 57%-ную специфичность и 89,5%-ную чувствительность, соответственно.
Рассчитывали соотношение между Ct последовательностей бактериального гена. Хотя статистически значимых различий не наблюдалось, авторы полагают, что применение этого соотношения для увеличенной выборки может быть полезным алгоритмом для полного скрининга CRC. Таким образом, комбинация четырех последовательностей также должна быть рассмотрена для повышения чувствительности и специфичности теста.
На фигурах с 14 по 17 представлено графическое изображение абсолютных величин Ct для В3, B10, В46 и В48, соответственно, в группах CRC и здоровых пациентов (С).
На фигуре 27 показаны ROC-кривые для анализа В3, В10, В46 и В48 у здоровых пациентов в сравнении с пациентами, имеющими CRC.
Пример 6: Анализ биомаркеров 16S рДНК у пациентов с CRC в сравнении с синдромом Линча (без клинических признаков) в сравнении со здоровыми индивидуумами
Целью данного анализа является определение прогнозируемой величины биомаркеров для обнаружения риска развития колоректального рака до появления клинических признаков.
Образцы кала получали от 27 пациентов, у которых недавно был диагностирован колоректальный рак (CRC) (стадия 0-I), 24 пациентов с синдромом Линча (L) и 19 здоровых индивидуумов (С).
Все пациенты прошли колоноскопию по меньшей мере за 15 дней до взятия образцов.
Все из них подписали письменное информированное согласие. Критерии исключения включали терапию антибиотиками в течение 1 месяца до начала исследования и возраст до 18 лет.
Количественно определяли четыре последовательности бактериального гена в образцах кала здоровых индивидуумов, пациентов, у которых недавно был диагностирован CRC, и носителей синдрома Линча. Носители синдрома Линча генетически предрасположены к развитию рака, особенно колоректального рака. Эта группа состоит из индивидуумов без новообразований и клинических признаков колоректального рака, и рассматривается как группа риска развития колоректального рака.
Наблюдалось, что в группе синдрома Линча присутствует значительное увеличение величины Ct В3 и В48 по сравнению с группами здоровых пациентов. Таким образом, в группе синдрома Линча имеется более низкая бактериальная нагрузка В3 и В48 в образцах кала.
Действительно, группа синдрома Линча не показала какого-либо статистического различия количественно определенных последовательностей бактериального гена по сравнению с группой CRC, за исключением В10. Это означает, что микробиологический профиль группы синдрома Линча является сходным с группой CRC, хотя никаких клинических признаков и новообразований в этой группе не наблюдаются. Этот факт означает, что обнаружение одной или нескольких из этих четырех последовательностей бактериального гена может являться мощным инструментом для скрининга людей с риском развития CRC и которым возможно потребуется проведение колоноскопии.
На фигурах с 18 по 21 представлено графическое изображение абсолютных величин Ct в группах CRC, L и С последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10, соответственно.
На фигуре 28 показаны ROC-кривые для В3, B10, В46 и В48 в анализах здоровых индивидуумов (С) в сравнении с группой Линча (L).
На фигуре 30 показаны ROC-кривые для В3, B10, В46 и В48 в анализах группы CRC в сравнении с группой Линча.
Пример 7: Анализ биомаркеров 16S рДНК для группы CRC + синдром Линча в сравнении со здоровыми индивидуумами
В соответствии с анализом в примере 6 носители синдрома Линча имеют схожий с пациентам, имеющими CRC, микробиологический профиль в кале. Таким образом, в этом эксперименте целью являлось тестирование возможности использования количественного обнаружения четырех последовательностей бактериального гена для скрининга риска развития колоректального рака у здоровых индивидуумов и индивидуумов, имеющих риск развития колоректального рака (CRC+L), до проведения колоноскопического исследования.
В таблице 7 представлено количественное определение последовательностей бактериального гена, выраженное в Ct.
Наблюдалось, что В3, В48 и В46 значительно увеличивают величину Ct в группе риска развития колоректального рака (CRC+L). Таким образом, уровень этих бактерий в кале является пониженным.
В10 в CRC+L также показывает более низкий уровень, хотя статистически значимых различий не наблюдалось (р=0,137).
Оценка эффективности количественного определения бактериального гена в обнаружении колоректального рака показала, что В3 и В48 имеют наилучшую точность (0,7) и, соответственно, чувствительность 56,2% - специфичность 88,9% и чувствительность 51% - специфичность 84%.
Во-вторых, В46 имеет точность 0,665 и чувствительность 94,7%-специфичность 23,12%.
В заключение, В 10 имеет точность 0,58 и чувствительность 44,9%-специфичность 89,5%.
Рассчитывали соотношение между Ct последовательностей бактериального гена. Несмотря на то, что статистически значимых различий не наблюдалось (В3/В46 р=0,061 с помощью U-критерия Манна-Уитни; В10/В3 р=0,132 с помощью двухвыборочного t-теста; В46/В10 с помощью двухвыборочного t-теста р=0,127), авторы полагают, что применение этого соотношения к увеличенному размеру выборки может являться полезным алгоритмом для полного скрининга CRC.
Таким образом, комбинация из четырех последовательностей также должна быть рассмотрена для повышения чувствительности и специфичности теста.
На фигуре 22 представлено графическое изображение абсолютных значений Ct последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10 в группах CRC + Линча (L) и здоровых субъектов (С), соответственно.
На фигуре 29 показаны ROC-кривые для В3, B10, В46 и В48 у здоровых субъектов в сравнении с группой CCR + синдром Линча.
Пример 8. Анализ биомаркеров 16S рДНК в группе CRC в сравнении с группой L-Высокого риска в сравнении с группой L-Низкого риска в сравнении со здоровыми индивидуумами
В этом примере целью являлось определение различных степеней риска развития колоректального рака с использованием количественного определения последовательностей бактериального гена у носителей синдрома Линча.
Авторы классифицировали носителей синдрома Линча с высоким риском (L-Высокий риск) и низким риском (L-Низкий риск) развития колоректального рака в соответствии с наличием исходного колоректального новообразования и аденомы по результатам последней колоноскопий. Имелось 6 индивидуумов с Высоким риском и 18 индивидуумов с Низким риском.
Выполняли количественное определение четырех последовательностей бактериального гена, и статистически значимых различий между различными группами не было обнаружено. Только для уровней B3 наблюдалась тенденция к снижению величины Ct по сравнению с группой С в сравнении с группой L-Низкого риска (р=0,088, критерий Крускала-Уоллиса) и группой С в сравнении с L-Высокого риска (р=0,143, критерий Крускала-Уоллиса).
Рассчитывали соотношение между величинами Ct количественно определенных последовательностей бактериального гена.
Применяли критерий Крускала-Уоллиса, и соотношения В3/В10 и В10/В46 представляют существенное различие между группами С и L-Низкого риска. Соотношение В3/В48 показывает существенное различие по сравнению с группой С в сравнении с группой L-Высокого риска. Соотношения В3/В10 и В48/В10 значительно различались в группе CRC в сравнении с группой L-Высокого риска.
ROC-анализы не были выполнены из-за размера выборки, но с учетом статистического анализа можно прогнозировать, что наилучшим соотношением может являться В3/В10 из-за способности различать группу L-Низкого риска.
В этой связи комбинация из четырех последовательностей также должна быть рассмотрена для повышения мощности теста, и анализ многофакторной логистической регрессии должен быть выполнен, но требуется увеличение размера выборки.
На фигурах с 23 по 26 представлено графическое изображение следующих соотношений абсолютных величин Ct В48/В10, В3/В10, В46/В10 и В3/В48 в группах CRC, Высокого риска L, Низкого риска L и С, соответственно.