Показатели запрограммированной гибели лимфоцитов и нейтрофилов у лиц с алкогольной интоксикацией в динамике терапии препаратом с антиоксидантными свойствами

ПАТОФИЗИОЛОГИЯ

УДК 616. 155. 32 : 616. 89 - 008. 441.13

Е. В. Жернова, Н. М. Вялова, А. Н. Бохан, С. А. Иванова

ПОКАЗАТЕЛИ ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ ЛИМФОЦИТОВ И НЕЙТРОФИЛОВ У ЛИЦ С АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИЕЙ В ДИНАМИКЕ ТЕРАПИИ ПРЕПАРАТОМ С АНТИОКСИДАНТНИМИ СВОЙСТВАМИ

Целью настоящего исследования явилось изучение апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у лиц с алкогольной интоксикацией в динамике терапии препаратом цитофлавин. У лиц, злоупотребляющих алкоголем, выявлено статистически значимое повышение уровня апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов на рецепторном и клеточном уровнях по сравнению со здоровыми донорами. Терапия цитофлавином приводила к положительной динамике экспрессии рецептора СБ95 на лимфоцитах лиц с алкогольной интоксикацией. Отмечена тенденция к нормализации содержания нейтрофилов и лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза. На фоне применения цитофлавина у пациентов с алкоголизмом наблюдалось снижение концентрации кортизола в сыворотке крови.

Ключевые слова: апоптоз, алкоголизм, цитофлавин, нейтрофил, лимфоцит.

В условиях длительной алкоголизации этанол может повреждать любые органы и ткани из-за его мем-бранотропности и способности изменять ключевые звенья клеточного метаболизма, что приводит к повышенной гибели различных клеток [1, 2]. Этанол выступает в качестве индуктора апоптоза, и при развитии алкогольной зависимости наблюдается усиление гибели иммунокомпетентных клеток [3, 4]. При хроническом злоупотреблении алкоголем характерны сдвиг гормонального баланса и длительное повышение уровня глюкокортикоидов, что может быть приравнено к состоянию сильного длительного стресса [5]. Ряд авторов указывают на увеличение в человеческом организме такого важного глюкокортикоида, как кортизол [6]. Отрицательное влияние длительной гип-ресекреции кортизола на нервную систему существенно блокируется другим стероидным гормоном - дегид-роэпиандростероном сульфатом (ДГЭАС) [7]. Как кортизол, так и ДГЭАС участвуют в осуществлении регуляции процессов апоптоза в организме.

Несовершенство лекарственной терапии аддиктив-ных расстройств делает необходимым изыскание и разработку новых, более эффективных фармакологических средств профилактики и лечения аддикций. Представляется перспективным использование препаратов, обладающих особыми нейропротекторными свойствами, оказывающих влияние на основные биологические процессы в организме и имеющих способность купировать зависимость от психоактивного вещества. Одним из возможных таких препаратов является «Цитофлавин» производства НТФФ «Полисан», который обладает антигипоксическим и антиоксидантным действием, оказывая положительный эффект на процессы энергообразования в клетке, уменьшая продукцию свободных радикалов и восстанавливая активность ферментов антиоксидантной защиты [8, 9].

Материалы и методы

Материалом исследования явились нейтрофилы и лимфоциты, сыворотка периферической крови здоровых лиц и лиц с алкогольной интоксикацией. Для этого была обследована группа из 23 мужчин с алкогольной интоксикацией (F10 по МКБ-10) в возрасте 25-60 лет, проходящих курс лечения в отделении ад-диктивных состояний клиник ГУ НИИ психического здоровья ТНЦ СО РАМН. 13 лиц, злоупотребляющих алкоголем, получали цитофлавин, который вводился 2 раза в сутки внутривенно капельно (медленно) по 10.0 мл на 400 мл 0.9 %-ного натрия хлорида в течение 5 дней (основная группа). Данная группа пациентов получала цитофлавин в качестве основной терапии, дополнительно назначались только психотропные препараты для коррекции расстройств сна. 10 пациентов составили группу сравнения и получали традиционную медикаментозную терапию. Стандартная медикаментозная терапия абстинентного синдрома включала дифференцированное назначение следующих основных групп препаратов: психотропные препараты, ноотропы, вегетостабилизаторы и витамины.

Комплексная оценка биологических показателей лиц, злоупотребляющих алкоголем, проводилась в динамике: до назначения лечения на фоне выраженного абстинентного синдрома и через 10 дней после начала терапии.

Контрольную группу для биологического обследования составили 30 психически и соматически здоровых лиц, соответствующих по полу и возрасту обследуемым группам пациентов с алкогольной интоксикацией.

У здоровых лиц и в группе лиц, злоупотребляющих алкоголем, кровь для биологических исследований брали из локтевой вены утром, натощак. Лимфоциты выделяли из гепаринизированной крови обще-

принятым методом на градиенте плотности Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция). Оценку содержания клеток с маркером апоптоза проводили непрямым иммунофлю-оресцентным методом с использованием моноклональных антител к антигену CD95 (Fas-рецептор) (ТОО «Сорбент», Москва). Морфологические изменения нейтрофилов и лимфоцитов, характерные для апоптоза, оценивали методом световой микроскопии в мазках крови. Для исследования влияния цитофлавина на клетки периферической крови in vitro проводили инкубацию клеток с препаратом в течение 4 ч. Концентрацию кортизола и ДГЭАС в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов «Алкор-Био».

Статистический анализ и обработку данных проводили с использованием пакета STATISTICA, версия 6.0 для Windows с использованием непараметрического критерия Краскела-Уоллиса.

Результаты и их обсуждение

Содержание в кровотоке лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы готовности к Fas-зависимому апоптозу, при алкоголизме существенно превышает аналогичный показатель в группе контроля, что отражает процессы активации лимфоцитов (у лиц с алкогольной интоксикацией составляет 17.4±1.9 %, в группе здоровых лиц - 11.7±0.4 %, р<0.05). Сравнительный анализ двух групп пациентов, принимающих цитофлавин или стандартную медикаментозную терапию, показал, что в первой группе пациентов происходит снижение уровня экспрессии рецептора CD95, а во второй группе проводимая терапия не оказывает влияния на этот показатель (рисунок).

Цитологический анализ показал, что у лиц с алкогольной зависимостью до лечения уровень спонтанного апоптоза достоверно отличался от значений, наблюдаемых у здоровых лиц (2.3±1.2 и 0.3±0.2 %

CD95

18

16

14

12

10

8

6

4

2

0

Динамика экспрессии рецептора 0095 у лиц, злоупотребляющих алкоголем, в зависимости от проводимой терапии. 1 - контроль; 2 - пациенты, получающие цитофлавин; 3 - группа сравнения.

* р<0.05 по сравнению с контролем

%

ILL

1 2 3

1 точка  2 точка

соответственно, p<0.05). Число лимфоцитов с фрагментированным ядром также превышало значения, наблюдаемые у здоровых лиц (1.6±0.6 и 0.9±0.2 %), однако полученные результаты не были статистически достоверны.

Инкубация клеток in vitro с цитофлавином вызывала снижение содержания апоптотических нейтрофилов, но повышала число лимфоцитов с фрагментированным ядром (табл. 1).

У лиц, злоупотребляющих алкоголем, после терапии цитофлавином наблюдали тенденцию к снижению содержания в крови лимфоцитов и нейтрофилов с морфологическими признаками апоптоза (табл. 2).

Т аблица 1 Спонтанный и стимулированный апоптоз нейтрофилов и лимфоцитов лиц, злоупотребляющих алкоголем

Условия опыта Доля нейтрофилов с признаками апоптоза, % Доля лимфоцитов с фрагментированным ядром, %

Лица с АИ Здоро- вые лица Лица с АИ Здоро- вые лица

Без инкуба- ции 2.3±1.2* 0.4±0.2 1.6±0.8* 0.9±0.2

Инкубация с цитофлавином 1.6±1.1 0.0±0.0# 7.2±4.3# 1.7±0.6

Примечание: АИ - алкогольная интоксикация; * - р<0.05 по сравнению со здоровыми лицами; # - р<0.05 по сравнению со спонтанным апоптозом.

Т аблица 2

Динамика апоптоза нейтрофилов и лимфоцитов у пациентов, получающих цитофлавин, и в группе лиц, получающих стандартную медикаментозную терапию, %

Основная группа Группа сравнения

Этап Апопто- тические нейтро- филы Лимфоциты с фрагментированным ядром Апопто- тические нейтро- филы Лимфоциты с фрагментированным ядром

До тера- пии 232±022* 1.63±0.80* 1.64±0.80 3.39±0.54*

После тера- пии 0.91±0.61 1.40±0.66 0.29±0.20 1.87±0.57

Конт- роль 038±0.16 0.92±0.20 0.38±0.16 0.92±020

Примечание: * - р<0.05 по сравнению со здоровыми лицами.

сти клеток к апоптозу, но, с другой стороны, повышается количество лимфоцитов с фрагментированными ядрами. Апоптоз нейтрофилов при инкубации с цитофлавином in vitro снижается.

Существенным компонентом комплексного клинического действия цитофлавина является его стресс-протективное воздействие, направленное на снижение концентрации кортизола в сыворотке крови.

Выводы

1. У лиц с алкогольной интоксикацией выявлено статистически значимое увеличение экспрессии рецептора CD95 в состоянии абстинентного синдрома по сравнению с контрольной группой. Терапия цитофлавином приводит к положительной динамике экспрессии рецептора CD95 на лимфоцитах лиц с алкогольной интоксикацией.

2. У лиц, злоупотребляющих алкоголем, уровень лимфоцитов и нейтрофилов с морфологическими признаками апоптоза статистически значимо выше, чем у здоровых лиц. Терапия цитофлавином приводит к нормализации содержания нейтрофилов и лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза. В экспериментальных пробах in vitro при инкубации с цитофлавином у здоровых доноров обнаружено статистически значимое снижение уровня апоптоти-ческих нейтрофилов.

3. В сыворотке крови лиц, злоупотребляющих алкоголем, на фоне выраженного абстинентного синдрома установлено повышение концентрации кортизола. Уровень ДГЭАС у пациентов до терапии сравним со значениями, выявленными у здоровых лиц, и значимо не изменяется в ходе проводимой терапии.

Таблица 3

Динамика некоторых показателей гормональной системы больных алкоголизмом

Г ормоны Контроль Основная группа Группа сравнения

до лечения после лечения до лечения после лечения

Кортизол (нмоль/л) 445.13±21.4 528.00±65.19 471.20±51.85 417.66±27.8 680.50±99.5*P

ДГЭАС (мкг/мл) 2.33±0.14 2.62±0.59 1.65±0.32 1.74±0.68 1. 5 9±0. 81

Примечание: Р - достоверность уровня различий результатов в группе пациентов до и после терапии.

Список литературы

1. Бохан Н. А., Прокопьева В. Д. Молекулярные механизмы влияния этанола и его метаболитов на эритроциты in vitro и in vivo. Томск, 2004. 166 с.

2. Halliwell D. B., Gutteridg J. M. Free Radicals in Biology and medicine // Oxford University Press. 1999. P. 936.

3. Freund G. Apoptosis and gene expression: perspectives on alcoholinduced brain damage // Alcohol. 1994. V. 11. P. 385-387.

4. Olney J. W. et al. Glutamate signaling and the fetal alcohol syndrome // Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 2001. № 7. Р 267-275.

5. Adinoff B., Iranmanesh А., Veldhuis J., Fisher L. Disturbances of the stress response: the role of the HPA axis during alcohol withdrawal and abstinence // Alcohol Health Res World. 1998. V. 22. № 1. P. 67-72.

6. Adinoff R., Ruether K., Krebaum S., Williams M. Increased salivary cortizol concentrations during chronic alcohol concentrations in a

naturalistic clinical sample of men // Alcohol. Clin. Exp. Res. 2003. V 27. P 1420-1427.

7. Кочетков Я. А. Депрессия и гипоталамо-гипофизарная надпочечниковая система: новые стратегии изучения // Современные проблемы психиатрической эндокринологии. 2004. Т. 5. С. 161-174.

В группе лиц с алкогольной интоксикацией, получающих стандартную медикаментозную терапию, не обнаружено достоверных различий в содержании клеток крови с признаками апоптоза до и после терапии.

При определении концентрации гормонов в основной группе обследованных пациентов на фоне выраженного абстинентного синдрома выявлена тенденция к увеличению уровня кортизола в сыворотке крови до 528.00±65.19 нмоль/л (табл. 3). При анализе распределения обследованных лиц в зависимости от концентрации кортизола индивидуальные значения колебались от 225 до 871 нмоль/л. Большая часть больных имели значения от 400 до 700 нмоль/л, в то время как в группе психически и соматически здоровых лиц средние значения составили 445.13±21.45 нмоль/л. Уровень ДГЭА-сульфата у больных алкоголизмом статистически не отличался от показателей в группе психически и соматически здоровых лиц.

В динамике терапии концентрация кортизола в группе больных, получающих цитофлавин, имела тенденцию к снижению, а в группе сравнения наблюдалось статистическое повышение данного показателя.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что терапия цитофлавином приводит к положительной динамике экспрессии рецептора CD95 на лимфоцитах лиц с алкогольной интоксикацией, отмечается тенденция к нормализации содержания нейт-рофилов и лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза. В экспериментальных пробах с имму-нокомпетентными клетками показано, что на лимфоциты цитофлавин оказывает неоднозначное воздействие: с одной стороны, снижается экспрессия FAS-рецептора, что свидетельствует о снижении готовно-

8. Антиоксидантное и нейротрофическое действие цитофлавина при хронических цереброваскулярных заболеваниях / 3. А. Суслина, М. М. Танашян, И. Н. Смирнова и др. // Вестн. СПб. гос. мед. акад. 2002. № 3. С. 110-114.

9. Применение цитофлавина при токсической и постгипоксической энцефалопатии: Пособие для врачей / Г. А. Ливанов, Б. В. Батоцыренов, С. И. Глушков и др. СПб., 2004. 44 с.