Исследование кинетики процессов переноса заряда с участием медиаторов электронного транспорта в системах на основе бактерий Gluconobacter oxydans и их мембранных фракций

УДК 543.55:579.222.2

ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕНОСА ЗАРЯДА С УЧАСТИЕМ МЕДИАТОРОВ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА В СИСТЕМАХ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS И ИХ МЕМБРАННЫХ ФРАКЦИЙ

А.С. Илюхина, О.А. Елисеева, А.С. Харькова, С.В. Алферов, В.А. Арляпов

Методом циклической вольтамперометрии с использованием математической модели Николсона и Шайна было исследовано электрохимическое поведение целых клеток и мембранных фракций бактерий Gluconobacter oxydans c различными медиаторами электронного транспорта. Выявлено, что гексацианоферрат (III) калия, тио-нин и нейтральный красный могут выступать в качестве акцепторов электронов для исследуемых биологических систем. Проведен сравнительный анализ констант скорости взаимодействия бактерий и мембранных фракций с медиаторами электронного транспорта, в ходе которого выявлена перспективная система «мембранная фракция G.oxydans - медиатор нейтральный красный».

Ключевые слова: мембранные фракции, бактерии Gluconobacter oxydans, медиаторы электронного транспорта, модель Николсона-Шайна, циклическая вольтампе-рометрия.

Введение

При разработке биосенсоров широко используют медиаторы электронного транспорта, которые способствуют переносу электронов от активного центра фермента на электрод. Нейтральный красный, тионин и гексацианоферрат (III) калия являются одними из наиболее широко используемых при разработке биосенсоров и биотопливных элементов медиаторами, за счет того что их окислительно-восстановительный потенциал близок к окислительно-восстановительным потенциалам процессов, происходящих в клетках, что делает их успешными акцепторами электронов. Использование медиаторов обеспечивает высокую чувствительность метода, короткое время анализа и возможность миниатюризации биосенсорных систем. Вывод о возможности их практического применения в системах делается на основе величины ответа биосенсора, поэтому необходимо знать особенности электрохимического поведения медиатора в исследуемых системах.

Медиатор электронного транспорта может вводиться в измерительную кювету, а затем диффундировать к поверхности электрода [1, 2], либо он связывается с матрицей, используемой для иммобилизации биоматериала, за счет ковалентных взаимодействий [3, 4]. Вне зависимости от конфигурации биоэлектрохимической системы образуется биокаталитический слой, в котором осуществляются реакции, представленные на рис. 1.

Рис. 1. Моделирование процессов переноса электронов в биокаталитическом слое с участием иммобилизованного медиатора совместно с биоматериалом, где х — координата реакции, I — толщина биокаталитического слоя, 1т — толщина полупроницаемой мембраны, Еок и Ев — фермент в окисленной и восстановленной форме, S — субстрат, Р — продукт, Мв и Мок — медиатор в окисленной

и восстановленной форме

Для случая, представленного на рис. 1, биокаталитический слой толщины I удерживается на поверхности электрода полупроницаемой мембраной, толщиной 1т. Субстрат S через полупроницаемую мембрану попадает в биокаталитической слой, подвергается биохимическому превращению в продукт Р. Электроны, полученные в результате ферментативного окисления субстрата, передаются на электрод с помощью медиатора. Практическое использование математических моделей, описывающих процессы переноса электронов в биосенсорах, требуют учета фундаментальных параметров: эффективных констант Михаэлиса для медиатора, коэффициенты диффузии медиатора, а также гетерогенной константы скорости электрохимической реакции.

В ряде работ показано использование метода циклической вольтамперометрии и математической модели Николсона и Шайна [5] для расчета констант взаимодействия биоматериала и медиатора [6 - 8]. В данном случае перенос электронов осложнен биохимической реакцией медиатора с биоматериалом. Для использования модели Николсона и Шайна необходимо удостовериться, что электрохимический процесс контролируется диффузией и происходит быстрее по сравнению со скоростью гомогенной реакции между биоматериалом и медиатором. При избытке концентрации субстрата и низкой концентрации медиатора скорость биохимической стадии взаимодействия медиатора с биоматериалом имеет псевдопервый порядок, что позволяет рассчитать константу скорости взаимодействия биоматериала и медиатора электронного транспорта [5].

Данный метод находит широкое применение для расчета константы взаимодействия медиаторов с различными ферментами [6 - 8]. Таким образом, циклическая вольтамперометрия является полезным

инструментом для исследования механизмов электродных реакций, а также нахождения констант скорости отдельных стадий.

Целью данной работы стало определение констант скорости переноса заряда в системе «биоматериал - медиатор» для выявления наиболее перспективного медиатора и биоматериала при создании биосенсоров.

Материалы и методы

Реактивы. Рабочий электролит - фосфатный буферный раствор (рН 6,8). Рабочий электролит приготавливали следующим образом: к 1/15 моль/л раствору №2НРО4*12Н2О (ч.д.а.) приливали 1/15 моль/л раствор КН2РО4 (ч.д.а.) в соотношении 1:1 соответственно. Растворы фосфатов приготовлялись растворением навесок кристаллических солей в бидистиллированной воде.

В качестве медиаторов применяли окислительно-восстановительные индикаторы: нейтральный красный (ч.д.а.), гексацианоферрат (III) калия (ч.д.а.) и тионин (ч.д.а.). При проведении экспериментов использовались различные концентрации растворов медиаторов, которые приготовлялись растворением навесок этих веществ в рабочем электролите.

Все реактивы были предоставлены фирмой «ДИАЭМ» (Россия).

Штамм микроорганизмов. В работе использовали бактерии Gluconobacter oxydans subsp. \ndustrius (ВКМ В-1280), полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН.

Культивирование клеток бактерий Gluconobacter oxydans. В работе были использованы бактерии Gluconobacter oxydans subsp. \ndustrius (ВКМ В-1280) из Всероссийской коллекции микроорганизмов РАН. Клетки бактерий выращивали при рН 5,2-5,5 на среде, содержащей: D-сорбит - 200 г/л; дрожжевой экстракт - 20 г/л, дистиллированная вода -100 мл. Культивирование проводили в колбах объемом 500 мл при температуре 28 оС в течение 18 ч. Клетки подвергали центрифугированию при 2800 g в течение 15 мин, промывали дважды 20 мМ натрий-фосфатным буферным раствором (рН 6,0) и центрифугировали 15 мин при 2800 g. Полученные бактериальные клетки подсушивали при температуре 20 - 23°С и замораживали для длительного хранения при температуре -15 °С.

Получение мембранных фракций бактерий Gluconobacter oxydans. Клетки бактерий разрушали ультразвуковым диспергатором УЗД11-0,1/22 («Ультразвуковая Техника», Россия) в натрий-фосфатном буферном растворе (рН 6,0). Время воздействия ультразвуком насчитывало 2 минуты при входной мощности 100 Вт и рабочей частоте 22 кГц. Полученный лизат центрифугировали при 4000 g в течение 20 мин.

Мембранные дегидрогеназы содержались в надосадочной жидкости. Затем производили центрифугирование при 14000 g, что вызывало осаждение мембранной фракции бактерий. Полученные осадки, подсушивали в микропробирках при температуре 20 - 23°С.

Электроды. В качестве рабочего электрода были использованы угольно-пастовые электроды, приготовленные заполнением пластиковой трубки площадью 6,3 мм2 пастой на основе графитовой пудры (<^1ика», Германия) и минерального масла (<Мика», Германия) в соотношении 100 мг пудры : 40 мкл масла. Указанную немодифицированную пасту использовали для формирования электродов на основе растворимых медиаторов. Суспензию микроорганизмов или мембранные фракции помещали на поверхность электрода, высушивали и закрывали мембраной. В качестве вспомогательного использовали платиновый ЭПЛ-02 («Эконикс-эксперт», Россия), а электродом сравнения стал насыщенный хлорид серебряный электрод ЭВЛ-1М4 («Эконикс-эксперт», Россия).

Электрохимические исследования. Анализатор «Экотест-ВА» (Эконикс-Эксперт, Россия) использовался для регистрации циклических вольтамперограмм. Температура измерений составляла 22 °С. Управление прибором проводилось с помощью встроенной программы «Экотест-ВА». Электроды помещали в измерительную ячейку с калий-натрий фосфатным буферным раствором с рН = 6,8 (концентрация солей 33 мМ), перед измерением в систему добавляли раствор медиатора и регистрировали вольтамперограмму при скорости развертки от 10 до 50 мВ/сек. После окончания измерений в систему добавляли раствор глюкозы и при той же скорости развёртки снимали вольтамперограмму, сравнивая предельный анодный ток до и после введения субстрата. Затем эксперимент повторяли при других скоростях развертки, каждый раз используя свежую порцию буферного раствора.

Определение констант скорости. Для расчета константы скорости применяли уравнение Николсона-Шайна (1).

h _ \ke3am[EW_,

Id V nFv

где Ik - предельный ток в присутствие субстрата, Id - предельный ток в отсутствие субстрата, квзаим - константа скорости взаимодействия медиатора и биоматериала, [E] - титр клеток, R - универсальная газовая постоянная, Т - температура, n - число электронов, F - число Фарадея, v -скорость развертки.

Для расчета констант принимали, что для тионина и нейтрального красного n = 2, а для гексацианоферрата (III) калия n = 1.

Результаты и их обсуждения

В данной работе исследовали электрохимическое поведение целых клеток и мембранных фракций бактерий Gluconobacter oxydans с различными медиаторами электронного транспорта для определения констант взаимодействия. В качестве медиаторов были выбраны гексацианоферрат (III) калия, тионин и нейтральный красный, так как они наиболее часто используются в качестве акцепторов электронов для создания медиаторных биосенсоров и биотопливных элементов. Гексацианоферрат (III) калия является достаточно эффективным акцептором электронов для прокариот. Он может взаимодействовать с НАДФН-дегидрогеназой, расположенной в плазматической мембране, так как медиатор липофобен. Тионин и нейтральный красный, относящиеся к классу феназинов, по своей структуре являются электроактивными соединениями и способны образовывать полимеры, благодаря чему находят широкое применение в качестве окислительно-восстановительных медиаторов в биоэлектрохимии [9]. Выбор бактерий G.oxydans и их мембранных фракций обусловлен тем, что они имеют мембранную локализацию основных ферментов, что облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта, тем самым являются удобными объектами для изучения биоэлектрохимических закономерностей в присутствии медиаторов электронного транспорта для создания биотопливных элементов.

На рис. 2 в качестве примера представлена циклическая вольтамперограмма биоэлектрода на основе мембранной фракции G. oxydans с медиатором тионином в присутствии и отсутствии глюкозы. Циклические вольтамперограммы остальных исследуемых электродов имели аналогичный вид.

Сила предельного анодного тока с добавлением глюкозы увеличилась, что вызвано регенерацией восстановленной формы медиатора в каталитическом цикле, что связано с протеканием в присутствии клеток (мембранной фракции) и субстрата электрокаталитического процесса, в ходе которого окисленная форма медиатора взаимодействует с восстановленными сайтами бактериальных клеток, переходя при этом в восстановленную форму. Увеличение концентрации восстановленной формы и уменьшение концентрации окисленной формы вызывает наблюдаемый рост анодного пика и уменьшение катодного. Согласно схематической модели процесса окисления субстрата ферментами бактериальных клеток в присутствии медиаторов электронного транспорта субстрат проникает через наружную мембрану к ферменту клетки, расположенными в цитоплазматической мембране, и взаимодействует с ним. В результате фермент восстанавливается и, в свою очередь, отдает электроны молекуле медиатора непосредственно или через определенный сайт дыхательной

цепи. Медиатор окисляется на электроде и вступает в новый цикл взаимодействия с ферментными системами бактериальных клеток. При использовании вместо клеток их мембранной фракции процесс взаимодействия медиаторов с клеточными ферментами должен значительно облегчаться.

МО -«СЮ -300 -ЯШ -100 С 100 300 300

Потенциал, мВ

Рис. 2. Циклическая вольтамперограмма биоэлектрода на основе мембранной фракции G. oxydans с медиатором тионином.

1 - вольтамперограмма с добавлением глюкозы, 2 - вольтамперограмма без глюкозы

Для определения констант скорости были получены зависимости отношения предельных анодных токов в присутствии и в отсутствии субстрата (Ik/Id) от 1/v1/2. Пример зависимости отношения предельных токов в присутствии и в отсутствии субстрата от обратной величины корня скорости развертки 1/v1/2 в системе «мембранная фракция бактерий G. oxydans - медиатор тионин» представлен на рис. 3.

По тангенсу угла наклона полученной линейной регрессии

Jk [ E]RT

вз —) находили константу взаимодействия. Полученные

nF

результаты представлены в таблице.

Полученные результаты сопоставимы с данными, полученными этим же методом для других микроорганизмов [10]. Следует отметить, что наиболее эффективным медиатором для микроорганизмов G. oxydans и их мембранной фракции является нейтральный красный. Константа взаимодействия данного медиатора с мембранной фракцией несколько выше, чем с целыми клетками микроорганизмов. Для медиатора гексацианоферрата (III) калия наблюдается значительное увеличение константы скорости взаимодействия при переходе от целых клеток к мембранной фракции. Вероятно, ферментные системы целых клеток

бактерий О. oxydans труднодоступны для данного медиатора в отличие от мембранной фракции.

1,04

0,97 ->-,-,-,-г

5 6 7 3

Рис. 3. Зависимость отношения анодного тока с глюкозой и без глюкозы от обратной величины корня из скорости взаимодействия. Медиатор тионин

Константы взаимодействия бактерий G. oxydans и их мембранной фракции с исследуемыми медиаторами

Медиатор Константа взаимодействия квзаим, дм3/

Бактерии О. oxydans Мембранная фракция бактерий О. oxydans

Тионин 0,026±0,005 0,022±0,009

Нейтральный красный 0,16±0,02 0,21±0,09

Гексацианоферрат (III) 0,032±0,003 0,08±0,02

калия

Для медиатора тионина увеличение константы скорости взаимодействия при переходе от микроорганизмов к мембранной фракции не наблюдается. Скорее всего, это связано с высокой доступностью ферментных систем целых клеток О. oxydans для феназиновых производных.

Заключение

Предложено использование метода циклической

вольтамперометрии и модели Николсона и Шайна для расчета кинетических параметров процесса переноса заряда и количественной оценки эффективности биокатализаторов (целых клеток и их мембранных фракций) и выбора медиатора электронного транспорта. Установлено, что

нейтральный красный является наиболее эффективным акцептором электронов для мембранной фракции бактерий G. oxydans (kesami = 0,21±0,09 дм3/(гхс)), предложена наиболее перспективная система «мембранная фракция бактерий G. oxydans - нейтральный красный» для дальнейшей разработки биосенсоров и биотопливных элементов.

Список литературы

1. Interconversion between formate and hydrogen carbonate by tungsten-containing formate dehydrogenase-catalyzed mediated bioelectrocatalysis / K. Sakai, B. Hsieh, A. Maruyama [et al] //Sensing and bio-sensing research. 2015. V. 5. P. 90-96.

2. Electrochemical Study on the Extracellular Electron Transfer Pathway from Shewanella Strain Hac319 to Electrodes /R. Takeuchi, Yu Sugimoto, Yu. Kitazumi [et al] //Analytical Sciences. V. 34. №. 10. P. 1177-1182.

3. Muthuramalingam R., Lakshmanan R. Theoretical analysis of the enzyme reaction processes within the multiscale porous biocatalytic electrodes //Russian Journal of Electrochemistry. 2016. V. 52. №. 2. P. 143-153.

4. Kirthiga M., Rajendran L., Fernandez C. Theoretical treatment of diffusion and kinetics of osmium redox polymer mediated glucose oxidase enzyme electrodes: Analytical expression of current density for varying potential //Electrochimica acta. 2017. V. 230. P. 89-97.

5. Nicholson R. S., Shain I. Theory of stationary electrode polarography. Single scan and cyclic methods applied to reversible, irreversible, and kinetic systems //Analytical Chemistry. 1964. V. 36. №. 4. P. 706-723.

6. Unsubstituted phenothiazine as a superior water-insoluble mediator for oxidases / A. Sekretaryova, M. Vagin, V. Beni [et al] //Biosensors and Bioelectronics. 2014. V. 53. P. 275-282.

7. The Role of the n Acceptor Character of Polypyridine Ligands on the Electrochemical Response of Co (II) Complexes and its Effect on the Homogenous Electron Transfer Rate Constant with the Enzyme Glucose Oxidase /V. Ramírez-Delgado, M .Cruz-Ramirez, L. Hernández-Ayala [et al] /Journal of the Mexican Chemical Society. 2015. V. 59. №. 4. P. 282-293.

8. Heller A. Electrochemical glucose sensors and their application in diabetes management // Applications of Electrochemistry in Medicine: MAOE book series. - New York: Springer, 2013. P. 121-187.

9. Phenazines and polyphenazines in electrochemical sensors and biosensors / R. Pauliukaite, M. Ghica, M. Barsan [et al] //Analytical Letters. 2010. V. 43. №. 10-11. P. 1588-1608.

10. A mediator microbial biosensor for assaying general toxicity / A.S. Kharkova, V.A. Arlyapov, A.D. Turovskaya [et al] // Enzyme and Microbial Technology. 2020. V. 132. P. 55-61.

Илюхина Анастасия Сергеевна, студент, ilyuhina.nastya'amail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Елисеева Ольга Андреевна, студент, oly021999@yandex.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Харькова Анна Сергеевна, ассистент кафедры химии, Anyuta Zaytse vaaimaiL ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Алферов Сергей Валерьевич, канд. хим. наук, доц., s.v.alferov'gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Арляпов Вячеслав Алексеевич, канд. хим. наук, доц., v.a.arlyapov'gmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет

RESEARCH OF KINETICS OF CHARGE TRANSFER PROCESSES WITH PARTICIPATION OF ELECTRONIC TRANSPORT MEDIATORS IN SYSTEMS BASED ON GLUCONOBACTER OXYDANS BACTERIA AND THEIR MEMBRANE FRACTIONS

Ilyukhina A.S., Eliseeva O.A., Kharkova A.S., Alferov S. V., Arlyapov V.A.

Using the method of cyclic voltammetry and the mathematical model of Nicholson and Shine, we studied the electrochemical behavior of whole cells and membrane fractions of Gluconobacter oxydans bacteria with various electron transport mediators. It was revealed that mediators such as potassium hexacyanoferrate (III), thionine, and neutral red can act as electron acceptors for the biological systems under study. A comparative analysis of the rate constants of the interaction of bacteria and membrane fractions with electron transport mediators was carried out, during which a promising «G.oxydans membrane fraction - neutral red mediator» system was identifiedfor the development of biofuel elements..

Key words: membrane fractions, Gluconobacter oxydans bacteria, electron transport mediators, Nicholson-Shine model, cyclic voltammetry.

Ilyukhina Anastasia Sergeevna, student, ilyuhina. nastyaaimail. ru, Tula, Russia, Tula State University,

Eliseeva Olga Andreyevna, student, 0ly021999@yandex.ru, Russia, Tula, Tula State University,

Kharkova Anna Sergeevna, assistant of the Department of Chemistry, Anyuta ZaytsevaaimaiLru, Tula, Tula State University, Russia,

Alferov Sergey Valerievich, candidate of chemical sciences, assistant professor, s.v.aferovaigmaiL com, Russia, Tula, Tula State University,

Arlyapov Vyacheslav Alekseevich, candidate of chemical sciences, associate professor, v. a. arlyapov'gmail. com, Russia, Tula, Tula State University