Влияние волоконного ВКР-лазера на эритроциты крыс

УДК577.344.3

ВЛИЯНИЕ ВОЛОКОННОГО ВКР-ЛАЗЕРА НА ЭРИТРОЦИТЫ КРЫС

Л.В. Полуднякова1, Т.П. Генинг1, Л. А. Белозерова2

Ульяновский государственный университет,

Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова

Исследовалось влияние волоконного ВКР-лазера на эритроциты крыс. Установлено, что лазерное излучение с используемыми дозами усиливает процессы липопероксидации мембран эритроцитов и стимулирует активность клеточных ферментов антиоксидант-ной защиты.

Ключевые слова: эритроциты, высокоинтенсивное лазерное излучение, перекисное окисление липидов, антиоксиданты.

Введение. К настоящему времени лазерное излучение прочно вошло в медицинскую практику. Прежде всего это высокоинтенсивное лазерное излучение, используемое в хирургии для нанесения поверхностных и глубоких разрезов, испарения поверхностных дефектов кожи, коагуляции и карбонизации тканей, их стерилизации. Достаточно высока терапевтическая эффективность низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ), наблюдаемая при лечении самого широкого круга заболеваний. В сочетании с фотосенсибилизатором НИЛИ применяется для избирательного разрушения опухолей (фотодина-мическая терапия [3]). Однако метод фотоди-намической диагностики и терапии в силу ряда вполне объективных причин остается уделом единичных специализированных учреждений. В основе причин ограничения широкого использования этого метода лежат: 1) необходимость введения экзогенных фотосенсибилизаторов; 2) высокая их фототоксичность; 3) длительность периода накопления фотосенсибилизатора опухолью (24-48 часов) и длительность снижения его концентрации в здоровой ткани; 4) относительная тропность к некоторым доброкачественным опухолям; 5) возможность аллергических реакций и высокая стоимость фотосенсибилизаторов [9]*.

*

Работа поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России 2009-2013 гг.»

В течение ряда лет защищается идея, согласно которой инфракрасный свет (^=1264±4 нм) может напрямую возбуждать молекулы кислорода в биологических системах и тем самым вызывать регулирование метаболизма или даже гибель клеток («светокислородный эффект») [4; 5]. Исследования в этом направлении основываются на гипотезе профессора Р.В. Амбарцумяна о механизме генерации синглетного кислорода при возбуждении линий поглощения молекулярного кислорода [1].

Для подтверждения гипотезы была проведена серия экспериментов на суспензиях эритроцитов, микробах, клеточных культурах опухолей и солидных опухолях животных [4; 5; 6; 7]. Авторы отмечают, что наиболее высокая биологическая активность лазерного воздействия, особенно на опухоли, наблюдается на длине волны 1268 нм. Для получения устойчивого цитотоксического эффекта требуется увеличение плотности импульсной мощности [7]. Полученные данные являются обоснованием для совершенно нового метода лечения онкологических заболеваний - прямой фотохимической деструкции опухолей без использования экзогенных сенсибилизаторов.

Для создания мощных источников возбуждения синглетного кислорода наиболее простым представляется ВКР-преобразова-ние излучения иттербиевого волоконного лазера [8]. Эффект вынужденного комбинаци-

онного рассеяния (ВКР) - нелинейный эффект, который становится сильным в протяженных волоконных световодах за счёт концентрации интенсивного излучения на большой длине [2].

Научным центром волоконной оптики РАН совместно с Ульяновским государственным университетом разработан уникальный непрерывный иттербиевый волоконный ВКР-лазер с рабочей мощностью до 5,5 Вт и длиной волны 1,26-1,27 мкм. Его характеристики должны помочь реализовать идею прямой фотодинамической терапии [8].

Для эффективного и безопасного лечения необходимы четкие представления о механизме действия этого физического фактора на биологическую систему. Эффекты лазерного излучения часто изучаются на стандартном модельном объекте - эритроцитах. О состоянии их мембран можно судить по системе «перекисное окисление липидов (ПОЛ) -антиоксиданты (АО)». Литературных данных, посвященных воздействию ВКР-лазеров на эритроциты, мы не обнаружили.

Цель исследования. Оценка уровня ПОЛ и активности ферментов антиоксидант-ной системы защиты в эритроцитах при высокоинтенсивном непрерывном лазерном воздействии.

Материалы и методы. Исследования проводились на эритроцитах белых крыс. Рабочая взвесь эритроцитов ресуспендирова-лась в 0,85 % №С1 в соотношении 1:1 и помещалась в пластиковую кювету. Облучение велось волоконным ВКР-лазером (Х=1265 нм) непрерывно с максимальной выходной мощностью 5,5 Вт. При этом дозы, получаемые суспензией эритроцитов составили: 7,8; 10,8; 39; 54; 78; 108; 156 и 216 Дж/см2. Интенсивность ПОЛ оценивалась спектрофотометрически с учетом разведения (1:100). В эритроцитах определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) по Л. И. Андреевой (1988); активность каталазы, глутатион-8-трансферазы (ГТ) по А.И. Карпищенко (1999) и супероксиддисмутазы (СОД) по №зЫЫш1 (1972). В надосадочной жидкости гемогло-бинцианидным методом определялся уровень

гемоглобина. Статистическая значимость полученных результатов оценивалась с помощью критерия Стьюдента (в 81а1а 6.0). Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

Результаты и обсуждение. Результаты представлены в табл. 1. Важным показателем функционального состояния мембран клеток является интенсивность процессов липопе-роксидации в них. Нами было изучено влияние высокоинтенсивного непрерывного облучения на процессы липопероксидации мембран эритроцитов по уровню МДА. Проведенные исследования показали, что значения МДА при лазерном облучении в дозах 7,8, 39 и 78 Дж/см2 остаются на уровне контрольных значений. При других используемых нами параметрах облучения наблюдается выраженное усиление липопероксидации эритроцитарных мембран, о чем свидетельствует достоверно значимое повышение МДА по сравнению с контролем.

Высокоинтенсивное лазерное излучение активизировало ферментативное звено анти-оксидантной защиты. Наиболее выраженным и достоверным оказалось повышение уровня активности СОД, катализирующей дисмута-цию супероксида в кислород и пероксид водорода. При этом динамика дозозависимого изменения активности фермента носила волнообразный характер. Активность глутатион-8-трансферазы эритроцитов также возрастает при всех используемых дозах высокоинтенсивного ВКР-лазерного облучения. При этом уровень данного фермента постепенно нарастает и достигает максимума при дозе воздействия 39 Дж/см2, а затем постепенно снижается, достигая контрольного уровня при дозе 216 Дж/см2. В результате исследования было установлено, что облучение ВКР-лазером при дозе 7,8 Дж/см2 не активизировало каталазу. Более высокие дозы высокоинтенсивного лазерного облучения вызывают повышение активности данного антиоксидантного фермента.

Возможно, в инициации наблюдаемого свободно-радикального окисления участвует синглетный кислород, образовавшийся в результате прямой фотогенерации:

302 (3£ё> = 0) + Ь 102 (‘Дё или V) - !02 (‘Дё,у = 0) -> 302 (31ё> = 0) + биоэффекты.

Таблица 1

Состояние системы «ПОЛ - АО» в эритроцитах при воздействии ВКР-лазером

Доза излучения

Контроль 152,15±11,41 9,25±0,73 0,033±0,007 0,421±0,048 1,57±0,13

7,8 150,35±8,93 9,06±0,71 0,041±0,004 1,733±0,330* 3,35±0,53*

10,8 192,38±8,98* 11,57±0,52* 0,046±0,007* 1,357±0,405* 4,15±0,47*

39 156,35±12,25 11,36±1,18 0,057±0,005* 1,858±0,494* 3,55±0,32*

54 184,16±5,76* 12,32±0,57* 0,050±0,006* 1,653±0,387* 4,20±0,54*

78 148,91±12,92 10,91±0,91 0,048±0,005 2,032±0,537* 3,76±0,75*

108 221,57±9,63* 10,99±0,63 0,047±0,004* 1,207±0,289* 4,30±0,46*

156 208,91±11,71* 15,10±0,97* 0,050±0,002 2,033±0,460* 2,92±0,38*

216 215,81±15,19* 10,89±0,60 0,034±0,010 1,410±0,336* 3,31±0,51*

Примечание. * - различия с контрольной группой статистически значимы (р<0,05).

При развитии фотоотклика клетки происходит смена трех последовательных стадий, которые при достаточно большой дозе воздействия проявляются последовательно одна за другой. Реакция клетки на воздействие облучения начинается стереотипным возбуждением и проявляется в синхронном увеличении мембранной лабильности. Продолжающееся облучение приводит к нарастанию в клетке окисления, что вынуждает клетку перейти к активной самозащите (ферментативная борьба с окислением молекулярных структур). При возрастании фотодинамиче-ской нагрузки наступает третья фаза фотоотклика клетки - повреждение системы ионного транспорта и осмотическое набухание клетки. В результате уменьшается концентрация всех молекул и тормозятся биохимические процессы. Продолжающееся воздействие приводит к критическому набуханию клетки и наступает ее разрыв [4].

О повреждении мембран эритроцитов при лазерном воздействии свидетельствует достоверное повышение уровня гемоглобина в надосадочной жидкости. Следует отметить небольшой спад уровня гемоглобина в надо-садке при дозе облучения 156 и 216 Дж/см2 по сравнению с более низкими дозами воздействия, что может быть связано с термиче-

ской денатурацией гемоглобина при данных режимах воздействия [9].

Заключение. Воздействие высокоинтенсивного непрерывного лазерного излучения с используемыми параметрами усиливает процессы липопероксидации мембран эритроцитов и стимулирует активность ферментов антиоксидантной защиты.

1. Амбарцумян, Р. В. Лазерная фотохимическая деструкция злокачественных опухолей без экзогенных сенсибилизаторов / Р.В. Амбарцумян,

B.И. Кишко, В.Г. Соколов // V Международный форум «Высокие технологии XXI века». - М., 2004. - С. 339.

2. Бабин, С.А. Волоконные лазеры: достижения и перспективы / С.А. Бабин // Наука Сибири. Еженедельная газета сибирского отделения РАН. - №50 (2785). 23 декабря 2010 г.

3. Владимиров, Ю.А. Лазерная терапия: настоящее и будущее / Ю.А. Владимиров // Соро-совский образовательный журн. - 1999. - №12. -

C. 2-8.

4. Захаров, С.Д. Светокислородный эффект в клетках и перспективы его применения в терапии опухолей / С.Д. Захаров, А.В. Иванов // Квантовая электроника. - 1999. - №9. - С. 192-214.

5. Захаров, С.Д. Структурные перестройки в водной фазе клеточных суспензий и белковых растворов при светокислородном эффекте / С.Д. Захаров и др. // Квантовая электроника. - 2003. -Т. 33, №3. - С. 149-162.

6. Иванов, А.В. Физические основы лазерных методов в онкологии : дис. ... д-ра физ.-мат. наук / А.В. Иванов. - М., 2003. - 359 с.

7. Корси, Л.В. Лазерный способ фотохимической деструкции опухолей без экзогенных сенсибилизаторов / Л.В. Корси, В.Г. Соколов // Лазерно-оптические системы и технологии : сб. ст. -М., 2009. - С. 101-106.

8. Курков, А.С. Волоконный ВКР-лазер для прямой фотодинамической терапии / А. С. Курков. -Режим доступа : phch.mrsu.ru/2009-2/pdf/2Kurkov.pdf.

9. Прокопьев, В.Е. Биофизические механизмы воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на биологические ткани и оптические методы диагностики их состояния : дис. ... д-ра физ.-мат. наук / В.Е. Прокопьев. - Томск, 2004. -282 с.

10. Ямайкина, И.В. Денатурация гемоглобина - первая стадия термогемолиза эритроцитов / И.В. Ямайкина, Е.А. Черницкий // Биофизика. -1989. - Т. 34, №4. - С. 656-659.

THE EFFECT OF FIBER RAMAN-LASER ON ERYTHROCYTES

OF RATS

L.V. Poludnyakova1, T.P. Gening1, L.A. Belozerova2

Ulyanovsk State University,

2Ulyanovsk State Pedagogical University

The effect of fiber RAMAN-laser on erythrocytes of rats was investigated. It was established that laser irradiation with doses used increases lipid peroxidation in membranes of red blood cells and stimulates the activity of cellular antioxidant enzymes.

Keywords: red blood cells, RAMAN-laser irradiation, lipid peroxidation, antioxidants.