ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНА СЫВОРОТОЧНОГО АМИЛОИДА А ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГЛАУКОМЫ И ИДЕНТИФИКАЦИИ АНТИГЛАУКОМНЫХ АГЕНТОВ
APPLICATION OF SERUM AMYLOID A GENE FOR DIAGNOSIS AND THERAPY OF GLAUCOMA AND IDENTIFICATION OF ANTIGLAUCOMATOUS AGENT

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
По данной заявке испрашивается приоритет заявки США № 11/615454, поданной 22 декабря 2006, которая является частично продолжающейся заявкой США № 11/000757, поданной 1 декабря 2004, по которой испрашивается приоритет предварительной заявки США № 60/530430, поданной 17 декабря 2003.
1. Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области диагностики и лечения глаукомы. Более подробно, изобретение предоставляет способы и композиции для диагностики и лечения глаукомы и для идентификации агентов, потенциально пригодных для лечения глаукомы.
2. Описание предшествующего уровня техники
Существует ряд состояний глаз, которые вызваны или осложнены повреждением диска зрительного нерва, дегенерацией тканей глаза и/или повышенным внутриглазным давлением. Например, "глаукомы" представляют собой группу заболеваний, ослабляющих зрение, которые являются основной причиной необратимой слепоты в США и в других развитых странах. Первичная открытоугольная глаукома ("POAG") представляет собой наиболее часто встречающуюся форму глаукомы. Заболевание характеризуется дегенерацией трабекулярной сети, приводящей к ограничению нормальной способности внутриглазной жидкости покидать глаз без замыкания пространства (например, "угла") между радужкой и роговицей (Vaughan, D. et al., (1992)). Отличительным признаком такого ограничения при данном заболевании является повышенное внутриглазное давление ("IOP"), приводящее к прогрессирующей потере зрения и слепоте при отсутствии соответствующего своевременного лечения. Установлено, что заболевание поражает от 0,4% до 3,3% всех взрослых людей старше 40 лет (Leske, M. C. et al. (1986); Bengtsson, B. (1989); Strong, N. P. (1992)). Кроме того, частота случаев заболевания увеличивается с возрастом более чем на 6% среди лиц в возрасте 75 лет или старше (Strong, N. P., (1992)).
Глаукома поражает три различные ткани глаза. Повышенное IOP, ассоциированное с POAG, связано с морфологическими и биохимическими изменениями в трабекулярной сети (TM), ткани, расположенной в углу между роговицей и радужкой. Большая часть питательной внутриглазной жидкости покидает передний отрезок глаза через TM. Прогрессирующая потеря клеток TM и накопление экстрацеллюлярных инородных веществ в TM глаукоматозных глаз приводит к повышенному сопротивлению оттоку жидкости, при этом возрастает IOP. Повышенное IOP, а также другие факторы, такие как ишемия, вызывают дегенеративные изменения в диске оптического нерва (ONH), приводящие к прогрессирующей экскавации ONH и потере ретинальных ганглиозных клеток и аксонов. Точные молекулярные механизмы, ответственные за глаукоматозное повреждение TM, ONH и ретинальных ганглиозных клеток неизвестны.
Двадцать лет назад в качестве главных факторов, вызывающих прогрессирующую потерю полей зрения при глаукоме, интенсивно обсуждались взаимодействие глазной гипертензии, ишемии и механической деформации диска зрительного нерва. С тех пор другие факторы, включающие эксайтотоксичность, оксид азота, отсутствие жизненно важных нейротрофических факторов, аномальное глиальное/нейронное взаимодействие и генетику, были включены в дегенеративный процесс заболевания. Молекулярная генетика заслуживает обсуждения, поскольку с ее помощью можно в конечном итоге установить механизм клеточной смерти, и обеспечить распознавание различных форм глаукомы. На протяжении последних 10 лет были картированы свыше 15 различных генов глаукомы и идентифицированы 7 генов глаукомы. Они включают шесть картированных генов (GLC1A-GLC1F) и два идентифицированных гена (MYOC и OPTN) первичной открытоугольной глаукомы, два картированных гена (GLC3A-GLC3B) и один идентифицированный ген врождённой глаукомы (CYPlBl), два картированных гена пигментной дисперсионной/пигментной глаукомы и ряд генов развивающихся или синдромных форм глаукомы (FOXCl, PITX2, LMXlB, PAX6).
Таким образом, каждая форма глаукомы может иметь уникальную патологию и, соответственно, для коррекции заболевания может потребоваться различный терапевтический подход. Например, лекарство, которое влияет на экспрессию ферментов, которые разрушают внеклеточный матрикс диска зрительного нерва, вероятно не предотвратило бы гибель RGC, вызванную эксайтотоксичностью. При глаукоме гибель RGC происходит за счет процесса, называемого апоптозом (программируемая клеточная гибель). Полагают, что различные типы повреждений, способных вызывать гибель клеток, могут действовать за счет конвергирования нескольких общих путей. Нацеливание на последующие события общего пути является стратегией, которая может увеличить эффективность лекарства и вероятность его применения в лечении различных форм заболевания. Однако лекарства, которые воздействуют на многочисленные метаболические пути, способны чаще вызвать нежелательные побочные эффекты. С появлением диагностических наборов для идентификации специфических форм глаукомы на основе генов селективные нейропротективные агенты могут быть тестированы с целью уменьшения степени вариации измеряемого ответа.
В настоящее время глаукому диагностируют на основании специфических признаков данного заболевания (характерные изменения диска зрительного нерва и потеря полей зрения). Однако более половины популяции людей, страдающих глаукомой, не знают о том, что они имеют данное приводящее к слепоте заболевание, и к тому времени, когда у них выявлено заболевание, они уже необратимо теряют приблизительно 30-50% своих ретинальных ганглиоцитов. Таким образом, необходимы усовершенствованные способы ранней диагностики глаукомы.
Современное лечение глаукомы направлено на снижение IOP, главного фактора риска в развитии и прогрессии глаукомы. Однако ни один из существующих способов лечения, понижающих IOP, фактически не вмешивается в процесс глаукомного заболевания, ответственный за повышенное IOP, при этом продолжается прогрессирующее повреждение переднего отрезка глаза. Это является одной из возможных причин, почему большинство пациентов становятся "устойчивыми" к общепринятым методам лечения глаукомы. Таким образом, необходим терапевтический способ изменения (с помощью ингибирования или даже обратного развития) процесса заболевания.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение преодолевает указанные и другие недостатки известного уровня техники путем предоставления способов диагностики и композиции для лечения глаукомы. В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения глаукомы путем введения пациенту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей агент, который взаимодействует с геном, кодирующим белок сывороточного амилоида A (SAA), или с последовательностью промотора гена. Взаимодействие между агентом и геном, кодирующим SAA, или с его промоторной последовательностью модулирует экспрессию SAA, обеспечивая лечение глаукоматозного состояния у пациента. В предпочтительных воплощениях агент будет представлять собой белок, пептид, пептидомиметик, низкомолекулярную молекулу или нуклеиновую кислоту.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечения глаукомы путем введения пациенту, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей агент, который ингибирует взаимодействие белка сывороточного амилоида A (SAA) с его рецептором. Предпочтительно агент будет являться агонистами рецептора α (PPARα) активатора пролиферации пероксисом, тахикининовыми пептидами и их непептидными аналогами или α-липоевой кислотой. Наиболее предпочтительно агент будет представлять собой фенофибрат, Wy-14643, (4-хлор-6-(2,3-ксилидино)-2-пиримидинилтиол)-уксусную кислоту), ципрофибрат, 2-бромпальмитиновую кислоту, безафибрат и циглитизон, бафиломицин, конканамицин или псевдолауриновую кислоту В (pseudolaric acid B).
Далее настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для лечения глаукомы, содержащую терапевтически эффективное количество антагониста белка сывороточного амилоида A (SAA) и фармацевтический носитель. Антагонист, содержащийся в композиции, может представлять собой любое из соединений, идентифицированных выше.
В еще одном воплощении настоящее изобретение предоставляет способ диагностики глаукомы с помощью следующих стадий: a) получение биологического образца у пациента; и b) анализ указанного образца на аберрантный уровень, аберрантную биоактивность или мутации гена, кодирующего белок сывороточного амилоида A (SAA) или его промоторную область или его генные продукты, где указанный ген, кодирующий SAA, содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO:3, где его промоторная область содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, и где SAA содержит последовательность, представленную в SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4; где аберрантно высокий уровень, аберрантно высокая биоактивность или мутации генов SAA или генных продуктов указывают на диагноз глаукомы.
В предпочтительных аспектах биологический образец представляет собой ткань глаза, слезы, внутриглазную жидкость, цереброспинальную жидкость, назальный или щечный мазок или сыворотку крови. Наиболее предпочтительно биологический образец содержит клетки трабекулярной сети.
Альтернативно настоящее изобретение предоставляет способ диагностики глаукомы у пациента с помощью следующих стадий:
a) забор клеток у пациента;
b) выделение нуклеиновой кислоты из клеток;
c) взаимодействие образца с одним или несколькими праймерами, которые специфически гибридизируются по 5' и 3' концу с по меньшей мере одним аллелем SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13 в условиях, при которых происходит гибридизация и амплификация аллеля; и
d) обнаружение продукта амплификации;
где аберрантный уровень или мутации SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13 в образце указывают на диагноз глаукомы.
Настоящее изобретение также предоставляет способ идентификации агентов, потенциально пригодных для лечения глаукомы, с помощью следующих стадий:
a) получение клеток, экспрессирующих SAA (SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2), или клеток, содержащих промоторный/репортерный ген SAA, в которых экспрессируется репортерный ген;
b) добавление вещества-кандидата к клеткам; и
c) определение уровня белка SAA (SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4) или уровня экспрессии гена в клетках;
где увеличение или снижение продукции белка SAA или экспрессии гена в присутствии указанного вещества-кандидата служит признаком агента, потенциально пригодного для лечения глаукомы.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ идентификации агента, потенциально пригодного для лечения глаукомы, с помощью следующих стадий:
a) получение реакционной смеси, содержащей:
(i) белок SAA или клетку, экспрессирующую SAA или репортерный ген, управляемый промотором SAA;
(ii) партнер, связывающий белок SAA; и
(iii) тестируемое соединение; и
b) обнаружение взаимодействия белка SAA и связывающего партнера или уровня продуктов репортерного гена в присутствии тестируемого соединения и в отсутствие тестируемого соединения;
где уменьшение или увеличение взаимодействия белка SAA с его связывающим партнером в присутствии тестируемого соединения, по сравнению с взаимодействием в отсутствие тестируемого соединения служит признаком агента, потенциально пригодного для лечения глаукомы.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способ идентификации агента, потенциально пригодного для лечения глаукомы, с помощью следующих стадий:
a) получение реакционной смеси, содержащей:
(i) клетки, содержащие рекомбинантный белок SAA (SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4) или клетки, содержащие векторы экспресии, содержащие SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3; и
(ii) тестируемое соединение; и
b) обнаружение эффекта на передачу последующих сигналов (IL-8) в присутствии тестируемого соединения и в отсутствие тестируемого соединения;
где уменьшение или увеличение передачи последующих сигналов в присутствии тестируемого соединения по сравнению со взаимодействием в отсутствие тестируемого соединения служит признаком агента, потенциально пригодного для лечения глаукомы.
В предпочтительных аспектах клетки, содержащие белок SAA или векторы экспрессии, будут представлять собой клетки HL-60.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Следующие чертежи составляют часть настоящего описания и включены для дальнейшей иллюстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть лучше понято с помощью ссылок на данные чертежи в комбинации с подробным описанием конкретных воплощений, представленных в настоящем документе.
Фиг. 1. Анализ Q-ПЦР экспрессии SAA в тканях 12 больных глаукомой, в сравнении с тканями TM 11 здоровых доноров. NTM и GTM представляют средний уровень экспрессии гена в группах здоровых доноров и больных глаукомой, соответственно.
Фиг. 2A. Анализ Q-PCR экспрессии SAA в клеточных линиях TM. NTM и GTM представляют средний уровень экспрессии гена в группах здоровых доноров и больных глаукомой, соответственно.
Фиг. 2B. Анализ Q-PCR экспрессии SAA в тканях диска оптического нерва. NTM и GTM представляют средний уровень экспрессии гена в группах здоровых доноров и больных глаукомой, соответственно.
Фиг. 3. Белок SAA в тканях TM здорового донора и больного глаукомой (n=6). Наблюдали значительное увеличение (3-кратное) SAA в тканях TM при глаукоме, по сравнению со здоровой тканью (p=0,05). Столбцы показывают среднее значение +/- s.e.m.
Фиг. 4. Белок SAA, определяемый с помощью метода ELISA во внутриглазной жидкости здорового субъекта и больного глаукомой. Значения представлены в виде среднего SAA внутриглазной жидкости в нг/мл +/- s.e.m. (p=0,0001).
Фиг. 5. Секреция IL-8 клетками HL-60 в ответ на увеличение концентраций rhSAA.
Фиг. 6. Эффект Adv.SAA2 на IOP у мышей при интравитреальной инъекции. Значение IOP измеряли с помощью отражательных тонометров TonoLab.
Фиг. 7. Экспрессия SAA в образцах глаз мышей Balb/c через 28 дней после интравитреальной инъекции (введения в стекловидное тело). Значение SAA измеряли с помощью метода ELISA. Контроль: глаза, инъецированные Adv.null, и не инъецированные глаза (контралатеральные глаза в группе, где проводили инъекцию Adv.SAA2 в глаза; n=16); Adv.SAA: Adv.SAA2-инъецированные глаза (n=17).
Фиг. 8A и 8B. Эффект интравитреальной инъекции Ad.SAA2 + антитела анти-CD40L у мыши Balb/c IOP (фиг. 8A) и гиперемия радужки (фиг. 8B). Данные представлены в виде среднего значения и SEM.
Фиг. 9. Эффект рекомбинантного человеческого сывороточного амилоида A (rhSAA, 1 мкг/мл; обработка начата в момент времени 0) на IOP перфузируемых передних отрезков глаза человека.
Фиг. 10. Эффект рекомбинантного человеческого сывороточного амилоида A (rhSAA, 1 мкг/мл; обработка начата в момент времени 0) на уровень интерлейкина-8 (IL-8) в перфузате перфузируемых передних отрезков глаза человека.
Фиг. 11. Эффект ингибиторов MAP p38 на индукцию IL-8 при обработке SAA (1 мкг/мл) в клетках TM. A: Эффект SB203580 (4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-5-(4-пиридил)-1H-имимдазол). B: Эффект 4-азаиндола и BIRB-796 (1-(5-терт-бутил-2-p-толил-2H-пиразол-3-ил)-3(4-(2- морфолин-4-ил-этокси)нафтален-l-ил)мочевина) в дозе 50 мкМ. Значение IL-8 измеряли в среде с помощью метода ELISA.
50
Фиг. 12. Ингибирование SAA-стимулированной секреции IL-8 с помощью SB203580 в клетках TM и HL-60. Клетки NTM650-03, p9 или HL-60 обрабатывали в DMEM, свободной от сыворотки, в течение 4 часов 1 мг/мл SAA и указанными концентрациями SB202580. Значение IL-8 измеряли в среде с помощью метода ELISA. Рассчитанный IC=15 мкМ в клетках TM и 25 мкМ в клетках HL-60.
50
Фиг. 13. Ингибирование SAA-стимулированной секреции IL-8 ингибиторами p38 MAP киназы, 4-азаиндолом и BIRB-796 в клетках HL60, обрабатанных в среде DMEM без сыворотки в течение 4 часов 1 мкг/мл SAA и указанными концентрациями ингибиторов. Значение IL-8 измеряли в среде с помощью метода ELISA. Рассчитанный IC: для 4-азаиндола = 0,3 мкМ, для BIRB-796 = 0,5 мкМ.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ
Глаукома представляет собой гетерогенную группу оптических нейропатий, которые имеют определенные общие клинические признаки. Потеря зрения при глаукоме происходит вследствие селективной гибели ретинальных ганглиоцитов в невральной сетчатке, которую диагностируют клинически по характерным изменениям в поле зрения, по дефектам слоя нервных волокон и по прогрессирующему образованию чашеобразного углубления ONH. Одним из основных факторов риска развития глаукомы является наличие глазной гипертензии (повышенное внутриглазное давление, IOP). По-видимому, IOP также вовлечено в патогенез глаукомы с нормальным напряжением в тех случаях, когда пациенты имеют то, что часто рассматривается как нормальное IOP. Увеличенное IOP, ассоциированное с глаукомой, обусловлено увеличенным сопротивлением оттоку внутриглазной жидкости в трабекулярной сети (TM), небольшой специализированной ткани, расположенной в радужно-роговичном углу передней камеры глаза. Глаукоматозные изменения TM включают гибель клеток TM, отложение и накопление внеклеточных органических остатков, включающих белковый бляшкоподобный материал. Кроме того, присутствуют также изменения, которые происходят в глаукоматозном диске зрительного нерва (ONH). В глаукоматозных глазах существуют морфологические изменения и изменения подвижности в глиальных клетках ONH. В ответ на увеличенное IOP и/или транзиторные ишемические поражения происходит изменение в композиции экстрацеллюлярного матрикса ONH и изменения в морфологии глиальных клеток и аксонов ретинальных ганглиоцитов.
Авторы настоящего изобретения раскрыли, что регуляция экспрессии мРНК и белка сывороточного амилоида А (SAA) существенно активируется в глаукоматозных тканях и клетках TM. Авторы настоящего изобретения доказали дифференциальную экспрессию мРНК, обнаруживаемую с применением генных чипов Affymetrix путем количественной полимеразной цепной реакции (Q-ПЦР) в реальном времени, и повышенные концентрации белка SAA, обнаруживаемые с помощью метода ELISA. Впервые показана экспрессия SAA в TM.
Человеческий SAA включает ряд небольших, дифференциально экспрессированных аполипопротеинов, которые кодируются генами, расположенными на коротком плече хромосомы 11. Существует четыре изоформы SAA. Изоформа SAA1 (SEQ ID NO:2), кодируемая SEQ ID NO:1, и SAA2 (SEQ ID NO:4), кодируемая SEQ ID NO:3, известны как реактанты острой фазы, подобно C-реактивному белку, т.е. их регуляция резко возрастает под влиянием провоспалительных цитокинов. Также определены 5'UTR промоторные области генов SAAl и SAA2 (SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, соответственно). SAA3 (SEQ ID NO:5) представляет собой псевдоген и SAA4 (SEQ ID NO: 6) является геном с низким уровнем конститутивной экспрессии, кодирующим конститутивный SAA4 (SEQ ID NO:7). SAA2 имеет две изоформы, SAA2α (SEQ ID NO:9), кодированную SEQ ID NO:8, и SAA2β (SEQ ID NO: 11), кодированную SEQ ID NO: 10, которые отличаются только по одной аминокислоте. Белки SAA1 и SAA2 идентичны на 93,5% на аминокислотном уровне (SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, соответственно) и данные гены идентичны на 96,7% на нуклеотидном уровне (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3, соответственно).
SAA представляет собой реактант острой фазы, уровень которого в крови увеличивается приблизительно в 1000 раз, как часть ответа организма на различные повреждения, включая травму, инфекцию, воспаление и неоплазию. Печень рассматривают как первичное место экспрессии реактанта острой фазы. Однако внепеченочная экспрессия SAA была описана в начале в тканях мышей и затем в клетках человека при атеросклеротических повреждениях (O'Hara et al. 2000). В дальнейшем было обнаружено, что мРНК SAA широко экспрессирована во многих гистологически нормальных тканях человека. Локальная экспрессия была отмечена в ряде тканей, включая молочную железу, желудок, тонкий и толстый кишечник, простату, легкие, поджелудочную железу, почки, нёбную миндалину, щитовидную железу, гипофиз, плаценту, эпидермис кожи и нейроны мозга. Экспрессию также наблюдали в лимфоцитах, плазматических клетках и в эндотелиальных клетках. Также сообщалось об экспрессии белка SAA, ко-локализованной с экспрессией мРНК SAA в гистологически нормальных внепеченочных тканях человека (Liang et al. 1997; Urieli-Shoval et al. 1998).
Изоформы SAA представляют собой аполипопротеины, которые становятся главным компонентом липопротеина высокой плотности (HDL) плазмы крови млекопитающих и вытесняют A-I (ApoA-I) и фосфолипид из HDL-частиц (Miida et al. 1999). SAA связывает холестерин и может служить в качестве транзиторного холестерин-связывающего белка. Кроме того, повышенная экспрессия SAA1 или SAA2 приводит к формированию линейных фибрилл в амилоидных отложениях, которые могут приводить к патогенезу (Uhlar and Whitehead 1999; Liang et al. 1997). SAA играет важную роль в инфекциях, воспалении и в стимуляции репарации тканей. Концентрация SAA может возрастать в 1000 раз в результате воспаления, инфекции, некроза и быстро снижаться после выздоровления. Таким образом, концентрацию SAA в сыворотке крови рассматривают как удобный маркер для мониторинга активности воспалительного заболевания. Биосинтез SAA в печени активируется провоспалительными цитокинами, что приводит к ответу острой фазы. Длительно повышенные концентрации SAA являются необходимым условием в патогенезе вторичного амилоидоза, прогрессирующего и иногда смертельного заболевания, характеризующегося отложением в главных органах нерастворимых бляшек, состоящих в основном из протеолитически расщепленного SAA. Тот же самый процесс может приводить к атеросклерозу. Для поддержания гомеостаза необходимы как положительный, так и отрицательный механизмы контроля SAA. Данные механизмы обеспечивают быструю индукцию экспрессии SAA для осуществления функций защиты хозяина, но они также гарантируют быстрое возвращение экспрессии SAA к исходным уровням для предотвращения амилоидоза. Данные механизмы включают модуляцию промоторной активности, включая, например, индукторный ядерный фактор kB (NF-kB) и его ингибитор IkB, активацию факторов транскрипции ядерного фактора семейства интерлейкина-6 (NF-IL6), и репрессоры транскрипции, такие как инь и янь 1 (YYl). Посттранскрипционная модуляция, включающая изменения стабильности мРНК и эффективности трансляции, допускает далее осуществление положительного и отрицательного регуляторного контроля синтеза белка SAA. На поздних стадиях AP-ответа экспрессия SAA эффективно подавляется путем увеличения продукции антагонистов цитокинов, таких как антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-IRa), и растворимых рецепторов цитокинов, приводя к уменьшению сигнальной трансдукции, запускаемой провоспалительными цитокинами (Jensen и Whitehead 1998).
В нескольких работах высказывалось предположение, что первичный амилоидоз может быть ассоциирован с глаукомой. Например, было обнаружено, что амилоид откладывается в различных тканях глаза, включая стекловидное тело, сетчатку, сосудистую оболочку глаза, радужку, хрусталик и TM пациентов с первичным системным амилоидозом (Schwartz et al. 1982). Ermilov et al. (1993) сообщал, что в 478 глазах 313 пациентов в возрасте от 25 до 90 лет, с катарактой, глаукомой и/или сахарным диабетом, 66 (14%) глаз содержали псевдоэксфолиативный амилоид (PEA). По сообщению Krasnov et al. (1996) у 44,4% из 115 пациентов с открытоугольной глаукомой были обнаружены внеклеточные отложения амилоида. Амилоидоз был выявлен в склере в 82% случаев и в радужке в 70% случаев. При ряде клинических состояний, включая болезнь Альцгеймера, показано абберантное амилоидное тканевое депонирование, ассоциированное с заболеванием. Однако амилоиды молекулярно гетерогенны и кодируются разными амилоидными генами. В предыдущих работах не установлено, какой амилоид (амилоиды) может быть ассоциирован с глаукомой. Авторы настоящего изобретения впервые показали, что экспрессия гена SAA значительно возрастает в глаукоматозных тканях TM. Увеличение SAA может быть вовлечено в формирование повышенного IOP и повреждение зрительного нерва, приводящее к потере зрения у пациентов с глаукомой. Настоящее изобретение предоставляет способы применения открытия повышенной экспрессии SAA для диагностики глаукомы. Настоящее изобретение далее предоставляет способы скрининга агентов, которые изменяют экспрессию или функционирование SAA, чтобы идентифицировать потенциальные антиглаукоматозные агенты. В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способы и композиции применения агентов, которые противодействуют влиянию SAA и/или взаимодействиям с другими белками для лечения глаукомы.
Диагностика глаукомы
На основании открытия авторов изобретения, что некоторые субъекты с глаукомой имеют повышенные уровни экспрессии SAA, настоящее изобретение предоставляет ряд способов диагностики глаукомы. Некоторые способы изобретения могут обнаруживать мутации в последовательностях нуклеиновой кислоты, которые приводят к несоответственно повышенным уровням белка SAA. Данные диагностические средства могут быть разработаны на основе известной последовательности нуклеиновой кислоты SAA человека, или кодируемой аминокислотной последовательности (см. Miller 2001). Другие способы могут быть разработаны на основе геномной последовательности SAA человека или последовательности генов, которые регулируют экспрессию SAA. Другие способы могут быть разработаны на основе изменения на уровне экспрессии гена SAA на уровне мРНК.
В альтернативных воплощениях способы изобретения могут обнаруживать активность или уровень сигнальных белков SAA или генов, кодирующих сигнальные белки SAA. Например, могут быть разработаны способы, которые обнаруживают несоответственно сниженную сигнальную активность SAA, включая, например, мутации, которые приводят к несоответствующему функционированию сигнальных компонентов SAA, включая SAA-индукцию IL-8. Кроме того, технологии на основе ненуклеиновых кислот могут быть применены для обнаружения изменения количества или специфической активности любого из данных сигнальных белков SAA.
В настоящее время специалисту в данной области техники доступен ряд способов для обнаружения аберрантных уровней или активностей генов или продуктов генов. Данные способы хорошо известны и являются рутинными для специалиста в данной области техники. Например, для обнаружения специфических аллелей в полиморфных локусах человека применимы многие способы. Предпочтительный способ обнаружения специфического полиморфного аллеля будет зависеть, в частности, от молекулярной природы полиморфизма. Различные аллельные формы полиморфного локуса могут отличаться по одной паре оснований ДНК. Данные однонуклеотидные полиморфизмы (или SNPs) вносят основной вклад в генетическую изменчивость, включая приблизительно 80% всех известных полиморфизмов, и установлено, что их плотность в геноме человека составляет, в среднем, 1 на 1000 пар оснований. Доступен ряд способов для обнаружения определенного однонуклеотидного полиморфного аллеля у субъекта. Продвижения в данной области обеспечивают точное, простое и недорогое крупномасштабное SNP-генотипирование. См., например, патент США № 4656127; патент Франции 2650840; заявку PCT № WO91/02087; заявку PCT № WO92/15712; Komher et al. 1989; Sokolov 1990; Syvanen et al. 1990; Kuppuswamy et al. 1991; Prezant et al. 1992; Ugozzoli et al. 1992; Nyren et al. 1993; Roest et al. 1993; и van der Luijt et al. 1994).
in situ
in situ
Любой тип клеток или тканей может быть использован для получения образцов нуклеиновой кислоты для применения в способе диагностики, описанном в настоящем документе. В предпочтительном воплощении образец ДНК получают из жидкости организма, например из крови, получаемой с помощью известных техник (например, венопункция), или из буккальных клеток. Наиболее предпочтительно образцы для применения в способах настоящего изобретения будут получены из крови или буккальных клеток. Альтернативно тесты нуклеиновой кислоты могут быть выполнены на сухих образцах (например, волосы или кожа). Диагностические процедуры также могут быть выполнены  непосредственно на срезах (фиксированных и/или замороженных) тканей пациента, полученных в результате биопсии или резекции, так что очистка нуклеиновой кислоты не является необходимой. Реагенты для нуклеиновой кислоты могут быть использованы в качестве зондов и/или праймеров для данных процедур  (см., например, Nuovo 1992).
В дополнение к способам, которые направлены, главным образом, на определение одной последовательности нуклеиновой кислоты, в данных схемах обнаружения также могут быть оценены профили. Профили "отпечатков пальцев" могут быть созданы, например, путем применения процедуры дифференциального дисплея, анализа Нозерн-блоттинга и/или ОТ-ПЦР.
Предпочтительным способом обнаружения является аллель-специфическая гибридизация с применением зондов, перекрывающих область, по меньшей мере, одного аллеля сигнального компонента SAA, который указывает на глаукому и имеет приблизительно 5, 10, 20, 25 или 30 соседних нуклеотидов около участка мутации или полиморфного участка. В предпочтительном воплощении изобретения несколько зондов, способных специфически гибридизироваться с другими аллельными вариантами, вовлеченными в глаукому, прикрепляют к твердофазной подложке, например к "чипу" (который может содержать приблизительно до 250000 олигонуклеотидов). Олигонуклеотиды могут быть связаны с твердой подложкой с помощью ряда способов, включая литографию. Анализ обнаружения мутации с применением данных чипов, содержащих олигонуклеотиды, также называемых "наборы ДНК-зондов", описан, например, Cronin et al. (1996). В одном воплощении чип содержит все аллельные варианты по меньшей мере одного полиморфного участка гена. Затем твердофазную подложку вводят в контакт с изучаемой нуклеиновой кислотой и выявляют гибридизацию со специфическими зондами. Таким образом, идентичность многочисленных аллельных вариантов одного или более генов может быть установлена в простом эксперименте гибридизации.
Данные методики дополнительно могут включать стадию амплификации нуклеиновой кислоты перед анализом. Способы амплификации известны специалистам в данной области техники и включают без ограничения клонирование, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию (ASA), лигазную цепную реакцию (LCR), "вложенную" полимеразную цепную реакцию, самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (Guatelli et al. 1990), систему транскрипционной амплификации (Kwoh et al. 1989) и Q-бета репликазу (Lizardi, et al. 1988).
Продукты амплификации могут быть оценены с помощью ряда способов, включая анализ размеров, рестрикционное расщепление с последующим анализом размеров, обнаружение специфических меченых олигонуклеотидных праймеров в продуктах реакции, аллель-специфическую олигонуклеотидную (ASO) гибридизацию, аллель-специфическое 5'-экзонуклеазное обнаружение, секвенирование, гибридизацию, SSCP и т.д.
Способы обнаружения на основе ПЦР могут включать мультиплексную амплификацию множества маркеров одновременно. Например, указанный метод хорошо известен в данной области техники для выбора ПЦР-праймеров для производства ПЦР-продуктов, которые не перекрываются по размерам и которые могут быть проанализированы одновременно. Альтернативно можно амплифицировать различные маркеры с праймерами, которые помечены дифференциально, и, следовательно, каждый из них может быть обнаружен дифференциально. Как уже говорилось, способы обнаружения на основе гибридизации позволяют провести дифференциальное обнаружение многочисленных продуктов ПЦР в образце. В данной области техники известны другие способы, которые обеспечивают мультиплексные анализы множества маркеров.
В иллюстративном воплощении способ включает стадии (i) забора образца клеток пациента, (ii) выделения нуклеиновой кислоты (например, геномной, мРНК или обеих нуклеиновых кислот) из клеток образца, (iii) взаимодействия образца нуклеиновой кислоты с одним или более праймерами, которые специфически гибридизируются по 5' и 3' с по меньшей мере одним аллелем SAA, который характерен для глаукомы, при таких условиях, что происходит гибридизация и амплификация аллеля, и (iv) обнаружения продукта амплификации. Данные схемы определения особенно эффективны для обнаружения молекул нуклеиновой кислоты, если указанные молекулы представлены в очень небольших количествах.
В предпочтительном воплощении рассматриваемого анализа, аберрантные уровни или активности SAA, которые характерны для глаукомы, идентифицируют по изменениям в образцах расщепления ферментами рестрикции. Например, выделяют ДНК образца и контроля, амплифицируют (по желанию), обрабатывают одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, и определяют с помощью электрофореза в геле размер длины фрагментов.
В еще одном воплощении любая реакция из множества реакций секвенирования, известных в данной области техники, может быть применена непосредственно к последовательности аллеля. Типичные секвенирующие реакции включают реакции, основанные на методах, разработанных Maxim и Gilbert (1977) или Sanger (1977). Также предполагается, что любой способ из множества автоматических способов секвенирования может быть применен для выполнения рассматриваемых анализов, включая секвенирование с помощью масс-спектрометрии (см., например WO94/16101; Cohen et al. 1996; Griffin et al. 1993). Специалисту в данной области техники понятно, что в определенных воплощениях необходимо определить в реакции секвенирования присутствие только одного, двух или трех оснований нуклеиновой кислоты. Например, в случае, если выявляют только одну нуклеиновую кислоту, могут быть выполнены A-трек и т.п.
В другом воплощении может быть применена защита от расщепляющих агентов (таких как нуклеаза, гидроксиамин или тетраоксид осмия и пипередин) для обнаружения гетероциклических оснований, спаренных вопреки принципу комплементарности, в гетеродуплексах РНК/РНК или РНК/ДНК или ДНК/ДНК (Myers et al. 1985b; Cotton et al. 1988; Saleeba et al. 1992). В предпочтительном воплощении контрольная ДНК или РНК может быть помечена для обнаружения.
В еще одном воплощении реакции расщепления в сайтах ошибочных нуклеотидов задействованы один или несколько белков, которые распознают неправильно спаренные пары нуклеотидов в двухцепочечной ДНК (так называемые ферменты "репарации ошибочно спаренных нуклеотидов"). Например, фермент mutY E. coli расщепляет A в сайте ошибочного спаривания G/A и тимидин-ДНК-гликозилаза клеток HeLa расщепляет T в сайте ошибочного спаривания G/T (Hsu et al. 1994; патент США № 5459039).
В других воплощениях изменения электрофоретической подвижности применяют для идентификации аберрантных уровней или активностей SAA, которые характерны для глаукомы. Например, одноцепочечный конформационный полиморфизм (SSCP) может быть использован для обнаружения различий в электрофоретической подвижности между мутантным и диким типами нуклеиновой кислоты (Orita et al. 1989; Cotton 1993; Hayashi 1992; Keen et al. 1991).
В еще одном воплощении анализируют перемещение аллелей в полиакриламидных гелях, содержащих градиент денатурирующего агента, с помощью электрофореза в градиенте денатурирующего геля (DGGE) (Myers et al. 1985a). В другом воплощении применяют температурный градиент вместо градиента денатурирующего агента для определения разницы в подвижности контрольной ДНК и ДНК образца (Rosenbaum and Reissner 1987).
Примеры других методов обнаружения аллелей включают без ограничения селективную олигонуклеотидную гибридизацию, селективную амплификацию или селективное удлинение праймера. Например, можно приготовить олигонуклеотидные праймеры, несущие в центре известную мутацию или нуклеотидное различие (например, в аллельных вариантах), и затем гибридизовать их с целевой ДНК в условиях, обеспечивающих гибридизацию только при полном соответствии (Saiki et al. 1986; Saiki et al. 1989). Данные методы аллель-специфической олигонуклеотидной гибридизации могут быть применены для проверки одной мутации или одного полиморфного участка за одну реакцию, в случае если олигонуклеотиды гибридизируют с ПЦР-амплифицированной целевой ДНК или для проверки ряда различных мутаций или полиморфных участков, в случае если олигонуклеотиды прикрепляют к гибридизирующей мембране и гибридизируют с меченой целевой ДНК.
Альтернативно в связи с настоящим изобретением можно применить метод аллель-специфической амплификации, которая зависит от селективной ПЦР амплификации. Олигонуклеотиды, применяемые в качестве праймеров для специфической амплификации, могут нести мутацию или полиморфный участок, представляющие интерес, в центре молекулы (так что амплификация зависит от дифференциальной гибридизации) (Gibbs et al. 1989) или в наиболее удаленном 3'-конце одного праймера, где при соответствующих условиях ошибочное спаривание оснований может предотвратить или уменьшить удлинение цепи полимеразой (Prossner 1993). Дополнительно может быть желательным поместить новый сайт рестрикции в участок мутации, чтобы производить обнаружение на основе расщепления (Gasparini et al. 1992). Предполагается, что в определенных воплощениях амплификация также может быть выполнена с помощью Taq-лигазы для амплификации (Barany 1991). В таких случаях лигирование будет происходить, только если есть полное соответствие в 3'-конце 5'-последовательности, делая возможным обнаружение присутствия известной мутации в специфическом сайте путем поиска наличия или отсутствия амплификации.
В другом воплощении идентификацию аллельного варианта осуществляют с помощью метода лигирования олигонуклеотидов (OLA), как описано, например, в патенте США № 4998617 и Landegren et al. 1988). Nickerson et al. описал метод обнаружения нуклеиновой кислоты, который объединяет свойства ПЦР и OLA (Nickerson et al. 1990). В указанном методе ПЦР применяют для получения экспоненциальной амплификации искомой ДНК, которую затем обнаруживают с помощью OLA.
Разработано несколько способов, основанных на данном методе OLA, которые могут быть использованы для обнаружения аберрантных уровней или активностей SAA, которые являются характерными для глаукомы. Такие часто применяемые способы описаны, например, в патенте США № 5593826 и Tobe et al. (1996).
В одном воплощении фенофибрат, агонист рецептора α (PPARα), активируемого пролифератором пероксисом, может быть включен в фармацевтически приемлемую композицию и использован для лечения глаукомы путем модулирования экспрессии SAA. Исследования показали, что лечение фенофибратом и WY 14643 снижает концентрацию SAA в плазме крови (Yamazaki et al. 2002). Считают, что другие агонисты PPARα, например ципрофибрат, 2-бромогексадекановая кислота, безафибрат, ципрофибрат и циглитизон, также могут быть применены для лечения глаукомы.
in vivo
50
50
В другом воплощении ингибиторы p38 MAP-киназы могут быть применены для лечения глаукомы или глазной гипертензии и для снижения внутриглазного давления у пациента, имеющего повышенное внутриглазное давление, путем модулирования SAA-индуцированной экспрессии IL-8 и нисходящих сигнальных событий. Авторы изобретения показали, что SAA стимулирует секрецию IL-8 в клетках и тканях трабекулярной сети. Один путь повышающей регуляции IL-8 проходит через активацию MAP-киназ. Далее авторы изобретения показали, что ингибиторы p38 MAP-киназы блокируют SAA-индукцию IL-8 в клетках TM, в перфузионных культурах глаз человека, и  в глазах грызунов. Было обнаружено, что соединения, представляющие различные классы ингибиторов MAPK в клетках TM, являются эффективными ингибиторами SAA-индуцированной экспрессии IL-8 (таблица 3). Самыми эффективными из данных соединений были ингибиторы p38 MAPK, SB203580, 4-азаиндол и BIRB-796 (фиг. 11). Кривые зависимости доза - ответ для ингибирования SB203580 SAA-индуцированного IL-8, полученные на клетках TM и HL60, давали сходные результаты (IC=15 мкМ в клетках TM и 25 мкМ в клетках HL60, фиг. 12). Кривые ингибирования 3-(4-фторфенил)-2-(пиридин-4-ил)-1H-пирроло[3,2-b]пиридином (также обозначаемого в описании как 4-азаиндол) и BIRB0796, проводимого в клетках HL60, показали, что оба указанных соединения приблизительно в 10 раз более эффективны, чем SB203580 (IC=0,3 для 4-азаиндола и 0,5 мкМ для BIRB-796 (фиг. 13)).
Таблица 3Классы соединений, отобранные для ингибирования SAA-индуцированной секреции IL-8 в клетках TM
Соединение
Мишень
Селективность
% ингибирования SAA-индуцированной секреции IL-8
100 мкМ
50 мкМ
25 мкМ
10 мкМ
1 мкМ
SB203580
МАРК
р38МАРкиназа
98,7
73,8
61,0
38,1
16,3
SB202190
МАРК
р38МАРкиназа
38,2
43,3
17,2
BIRB-796
МАРК
р38МАРкиназа
78,1
28,9
4-азаиндол
МАРК
р38МАРкиназа
94,3
22,6
PD98059
МАРК
МЕК
34,0
U0126
МАРК
МЕК
53,0
50,6
30,9
Фенофибрат
SAA
агонист PPARα
57,2
52,7
59,9
Химические названия соединений, указанных в таблице 3, представляют собой следующее:
SB203580: 4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-5-(4-пиридил)-1H- имидазол;
SB202190: 4-[4-(4-фторфенил)-5-(4-пиридинил)-1H-имидазол-2-ил]фенол;
BIRB-796: l-(5-терт-бутил-2-p-толил-2H-пиразол-3-ил)-3(4-(2-морфолин-4-ил-этокси)нафтален- 1-ил)мочевина;
4-азаиндол: 3-(4-фторфенил)-2-(пиридин-4-ил)-1H-пирроло[3,2-b]пиридин;
PD98059: 2'-амино-3'-метоксифлаон;
UO 126: 1,4-диамино-2,3-дициано-1,4-бис(2-аминофинилтио)бутадиен;
CalBio506126: 2-(4-хлорфенил)-4-(4-фторфенил)-5- пиридин-4-ил-l,2-дигидропиразол-3-он.
in vitro
in vivo
7
Анализы  показали, что некоторые ингибиторы p38MAPK в значительной степени блокируют SAA-индукцию IL-8. Один из наиболее эффективных ингибиторов p38 MAPK, 3-(4-фторфенил)-2-(пиридин-4-ил)-1H-пирроло[3,2-b]пиридин, оценивали по снижению IOP у мышей путем местного применения 1% суспензии после интравитреальной инъекции Ad.SAA2 (2×l0КОЕ/глаз)+antiCD40L. Adv.SAA2 вызывал существенное увеличение IOP, которое достигало максимума в дни 10-12 при увеличении до 10-12 мм рт.ст. от исходного значения с последующим медленным снижением. На 24-й день IOP составлял 6-7 мм рт.ст. выше исходного уровня. Глазную гипертензию блокировали путем местного нанесения 4-азаиндола (1%; два раза в день). После прекращения введения 4-азаиндола на 7-й день IOP возвращалось на тот же уровень, какой наблюдали в группе, получавшей плацебо после инъекции Ad.SAA2. После того как введение лекарства возобновляли на 13-й день, IOP вновь снижался до исходного уровня в течение 3 дней (фиг. 8). При повторении данного эксперимента были получены сходные результаты. Данные, полученные , показывают, что ингибитор p38MAPK, 4-азаиндол, может нейтрализовать глазную гипертензию, вызванную Ad.SAA2.
Предпочтительные соединения для данного воплощения изобретения представляют собой классы соединений, перечисленные в таблице 3, и распространяются на дополнительные классы соединений, которые демонстрируют ингибиторные свойства в отношении p38MAP-киназ, как описано в указанных примерах, и включают SB202190, SB203580, SB220025, PD 169316, SB 239063, 4-азаиндол, BIRB-796, CalBio506126, RO3201195, R1487.
anterior uvea
Авторы настоящего изобретения далее постулируют, что агенты, которые предотвращают амилоид-индуцированную клеточную гибель, могут быть применены для защиты TM и других клеток глаза в  и в задней части глаза, особенно ретины и диска зрительного нерва.
Соединения настоящего изобретения могут быть включены в офтальмические композиции различных типов для введения в глаза (например, местно, вовнутрь камеры глаза или посредством имплантата). Данные соединения предпочтительно вводят в состав офтальмических композиций для местного применения для их доставки в глаза. Указанные соединения могут быть объединены с офтальмически приемлемыми консервантами, поверхностно-активными веществами, агентами, повышающими вязкость, агентами, повышающими проницаемость, буферами, хлоридом натрия или с водой в целях получения водной стерильной офтальмической суспензии или стерильного водного офтальмического раствора. Офтальмические препараты в виде растворов могут быть получены путем растворения соединения в физиологически приемлемом изотоническом водном буфере. Кроме того, офтальмический раствор может включать офтальмически приемлемое поверхностно-активное вещество для улучшения растворения этого соединения. Кроме того, офтальмический раствор может содержать агент, повышающий вязкость, такой как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон или т.п., для увеличения времени пребывания указанного препарата в конъюнктивальном мешке. Могут быть также использованы гелеобразующие агенты, которыми являются, но не ограничиваются ими, геллан и ксантановая камедь. Для получения стерильных офтальмических препаратов в виде мази активный ингредиент объединяют с консервантом в подходящем носителе, таком как минеральное масло, жидкий ланолин или белое вазелиновое масло. Стерильные офтальмические композиции в виде геля могут быть получены путем суспендирования указанного соединения в гидрофильном основании, полученном в результате объединения, например, с карбополом-974, или т.п., в соответствии с опубликованными формулами аналогичных офтальмических препаратов; в указанные препараты могут быть включены консерванты и агенты, придающие тоничность.
Соединения предпочтительно включают в композицию в виде местных офтальмических суспензий или растворов с величиной pH приблизительно от 4 до 8. Конкретная схема введения доз для каждого индивидуума может быть установлена по усмотрению лечащего врача. Соединения обычно содержатся в указанных композициях в количестве от 0,01% до 5% масс., но предпочтительно в количестве от 0,05% до 2% и наиболее предпочтительно в количестве 0,1 до 1,0% масс. Лекарственная форма может представлять собой раствор, суспензию, микроэмульсию. Так, например, при местном нанесении на поверхность глаза необходимо закапывать 1-2 капли данных препаратов 1-4 раза в день в соответствии с назначением лечащего врача.
2
Данные соединения могут быть также использованы в комбинации с другими агентами, применяемыми для лечения глаукомы, и такими агентами являются, но не ограничиваются ими, β-блокаторы, простагландины, ингибиторы карбонангидразы, α-агонисты, миотические средства и нейропротектанты.
Нижеследующие примеры включены в описание, чтобы показать предпочтительные воплощения изобретения.
Следует отметить, что специалистам в данной области техники следует принимать во внимание, что указанные способы представляют собой примеры предпочтительных вариантов осуществления изобретения. Однако специалисту в данной области техники, с учетом настоящего раскрытия изобретения, понятно, что можно внести в изобретение различные модификации, не выходящие за рамки существа и объема настоящего изобретения.
Пример 1. Увеличение экспрессии SAAl и SAA2 в клетках и тканях TM при глаукоме.
Пулы РНК тканей TM, полученные от 13 здоровых доноров и 9 субъектов с глаукомой, использовали для определения экспрессии генов с помощью набора Affymetric GeneChips (РТ.СТ.-U133). Обнаружили, что при глаукоме экспрессия амилоида A2 была увеличена в 4 раза, по сравнению с нормальными тканями TM. Для подтверждения данного результата, проводили QPCR с применением 12 индивидуальных образцов РНК глаукоматозных тканей ТМ и 11 образцов нормальных тканей ТМ. Пять из 12 глаукоматозных образцов тканей TM (42%) показали существенное увеличение экспрессии SAA 1/2. Среднее значение экспрессии SAA в 12 образцах глаукоматозных тканей TM было в 5,4 раза выше по отношению к среднему значению экспрессии SAA в 11 нормальных образцах TM (фиг. 1). Кроме того, при глаукоме наблюдали сходное изменение дифференциальной экспрессии SAA в клетках TM или в тканях диска зрительного нерва. Наблюдали среднее увеличение в клетках ТМ при глаукоме в 5,4 раза (14 образцов с глаукомой и 11 нормальных образцов клеточной линии TM, фиг. 2A) и 118-кратное увеличение в тканях диска зрительного нерва при глаукоме (14 образцов с глаукомой и 12 нормальных образцов, фиг. 2B), по сравнению с нормальными тканями, соответственно. Анализ SAA, проведенный с помощью метода ELISA в тканях TM 6 здоровых доноров и 6 субъектов с глаукомой, показал, что белок SAA также был существенно повышен в тканях TM при глаукоме по сравнению с нормальными тканями. Обнаружено 3-кратное увеличение концентрации SAA в глаукоматозной ткани по сравнению с нормальной тканью (11,3 и 3,8 мкг/мг белка, соответственно). Результаты представлены на фиг. 3.
Далее показали ассоциацию повышенной экспрессии с глаукомой во внутриглазной жидкости человека. Белок SAA измеряли с помощью метода ELISA во внутриглазной жидкости 16 здоровых доноров и 20 субъектов с глаукомой. Обнаружили, что содержание SAA было почти в 3 раза выше во внутриглазной жидкости субъектов с глаукомой, чем в образцах здоровых доноров (10,0 нг/мл против 3,7 нг/мл, соответственно). Результаты представлены на фиг. 4.
Пример 2. Композиция фенофибрата для местного применения
Суспензия фенофибрата 1% для местного применения для снижения SAA и уменьшения IOP глаза.
<b>Название</b>
<b>Концентрация</b>
<b>Единицы измерения</b>
<b>назначение</b>
Фенофибрат, NOC
1%
масс/об %
активный инградиент
Гидроксипропилметилцеллюлоза
0,5%
масс/об %
модификатор вязкости(2910) (Е4М), USP
Двухосновный фосфат натрия
0,2%
масс/об %
буферный агент, фармакопея США
Хлорид натрия, фармакопея США
0,75%
масс/об %
агент, придающий тоничность
Динатрий-EDTA
0,01%
масс/об %
хелатирующий агент (динатрия эдетат), фармакопея США
Полисорбат 80
0,05%
масс/об %
увлажняющий агент
Хлорид бензалкония, нанофильтрация
0,01%
масс/об %
консервант
Гидроксид натрия, нанофильтрация
дост.кол. рН
масс/об
доведение рН
Соляная кислота, нанофильтрация
дост.кол. рН
масс/об
доведение рН
Очищенная вода, фармакопея США
дост.кол. до 100%
масс/об %
носитель
Пример 3. Метод скрининга и идентификации соединений, которые изменяют экспрессию мРНК SAA или белков SAA
in vitro,
Один из методов, который может быть использован для скрининга агентов, которые изменяют экспрессию и функцию SAA, представляет собой определение изменений уровня белка SAA. Наборы для анализа  применяемые для количественного обнаружения сывороточного амилоида A (SAA) в сыворотке и плазме крови животных и человека, буферные растворы, среды для клеточных культур и экстракты тканей или клеток являются коммерчески доступными. Анализ представляет собой твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Лунки титрационного микропланшета покрывали моноклональном антителом, специфическим к SAA. Образцы, включая стандарты с известным содержанием SAA, или образцы с неизвестным содержанием SAA добавляли в указанные лунки вместе с вторичным антителом, конъюгированным со щелочной фосфатазой или пероксидазой. Антитела сконструированы таким образом, что они не влияют на связывающие эпитопы друг друга. В микропланшете SAA захватывается иммобилизованным антителом и метится конъюгированным вторичным антителом в ходе одной стадии. После окончания периода инкубации микропланшет отмывают для удаления несвязанного материала и добавляют субстрат (PNPP или пероксид). Интенсивность окраски продукта пропорциональна концентрации SAA в экспериментальном образце.
Пример 4.
Индукция SAA в культивируемых клеточных линиях для скрининга соединений, которые изменяют экспрессию мРНК или белка SAA.
Клеточную линию гепатомы человека HepG2 широко применяют в исследованиях индукции SAA с помощью цитокинов, трансфекции плазмидами и в анализах с использованием репортеров. Синтез мРНК SAA и белка может быть вызван различными цитокинами в нескольких клеточных линиях гепатомы человека, включая PCL/PRF/5, HepB и HepG2 (Uhlar и Whitehead 1999). Синтез SAA гладкомышечными клетками аорты человека (HASMC) вызывается глюкокортикоидными гормонами и не вызывается провоспалительными цитокинами, IL-1, IL-6 и TNF-α, которые стимулируют продукцию SAA гепатоцитами (Kumon et al. 2002b; Kumon et al. 2001; Thorn and Whitehead 2002). SAA стимулировал хемотаксическую миграцию HASMC в дозозависимым образом, в анализе, проведенном в культуральной камере Chemotaxicell (Kumon et al. 2002a). Показана экспрессия мРНК SAA и продукция белка в первичных культурах синовиоцитов при ревматоидном артрите (O'Hara et al. 2000).
Пример 5. Функциональный анализ SAA в культивируемых клетках.
in vitro
Цитокин-подобные свойства SAA включают индукцию секреции IL-8 нейтрофилами (Furlaneto and Campa, 2002; He et al. 2003). Установлено, что клетки HL-60 промиелоцитарной клеточной линии отвечают на SAA увеличением секреции IL-8 и могут быть использованы для анализа функции SAA . Клетки HL-60 обрабатывали в течение четырех часов возрастающими концентрациями рекомбинантного SAA человека и измеряли IL-8 в среде с помощью метода ELISA. Секреция IL-8 возрастала дозозависимым образом (фиг. 5). Клетки HL-60 могут быть использованы в качестве клеточной линии-имитатора в функциональных анализах для определения агентов, которые изменяют функцию SAA и уровни экспрессии.
Пример 6. Аденовирус-опосредованная экспрессия SAA увеличивает IOP и ингибитор p38 MAPK снижает вызванное IOP у мышей.
Исследовали способность активированной аденовирусом экспрессии SAA увеличивать IOP и эффективность ингибиторов p38 MAPK блокировать вызванное IOP у мышей.
1. Повышенная регуляция экспрессии SAA увеличивает IOP у мышей
7
Один глаз каждой мыши Balb/c был интравитреально инъецирован Adv.SAA2 (обработка) или Adv.null (носитель) в дозе 7×10 КОЕ/глаз/2 мкл. Контралатеральный глаз каждого животного не инъецировали. В дополнение к Adv, каждое животное получало интраперитониальную инъекцию анти-CD40L (0,5 мг/инъекция) в дни -1, 0, 1, 2, 5, 9 и 14 для продления периода экспрессии Adv.SAA2. Измеряли IOP у мышей с помощью Tonolab, с применением маски. Среднее значение IOP для каждого глаза получали из 18-30 измерений. Интравитреальная инъекция Adv.SAA2 в значительной степени увеличивала IOP у мышей (49% или 5,8 мм рт.ст., n=6-8, p<0,05) (фиг. 6). Экспрессия SAA была существенно выше во всех глазах, обработанных Adv.SAA2, чем в глазах контрольной группы, включая глаза, обработанные носителем, и контралатеральные глаза без инъекции (p<0,0001; n=16) (фиг. 7). Полученные результаты показали, что повышенная регуляция экспрессии SAA может увеличить IOP у мышей, что доказывает связь SAA с патогенезом глаукомы.
2. Ингибитор p38 MAPK снижает Adv.SAA2-вызванное IOP у мышей
:
in vitro
7
После того как было установлено, что 4-азаиндол, ингибитор P38 MAPK, ингибирует SAA-индуцированную экспрессию IL-8 , авторы изобретения проверили действие соединения на IOP у мышей после интравитреальной инъекции Ad.SAA2 (2×10 КОЕ)+antiCD40L путем местного введения 5 мкл 1% 4-азаиндола или носителя в оба глаза, два раза в день, от дня -1 до дня 7 и от дня 13 до дня 17. И в данном случае интравитреальная инъекция Adv.SAA2 существенно увеличивала IOP у мышей в дни 4-24 (группа, получавшая носитель). Местное введение дозы 4-азаиндола в значительной степени ингибировало Adv.SAA2-индуцированное IOP во время периода лечения (дни от -1 до 7 и дни от 13 до 17). В неинъецированных глазах 4-азаиндол не влиял на IOP (фиг. 8A). Во всех Ad.SAA2-инъецированных глазах наблюдали гиперемию радужки после 4-го дня и ее медленное снижение в течение второй недели после инъекции (фиг. 8B). В инъецированных глазах 4-азаиндол не оказывал влияния на гиперемию, что указывало на то, что IOP-понижающее действие 4-азаиндола происходило не в результате рассеивания гиперемии радужки. Полученные результаты показали потенциал ингибиторов p38 MAPK в лечении глазной гипертензии.
Пример 7. Рекомбинантный SAA снижал способность к оттоку при перфузии культивируемых человеческих глаз
Пять пар человеческих глаз перфузировали средой, содержащей либо рекомбинантный SAA (1 мкг/мл) (экспериментальный глаз) или равный объем носителя (контрольный глаз). В конце периода культивирования 4 квадранта каждого глаза обследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии для определения жизнеспособности ткани TM. Перфузат каждого глаза собирали и использовали для измерения уровня IL-8 с помощью метода ELISA. Все пять глаз имели повышенное IOP в течение 24 часов обработки (фиг. 9). Во всех пяти перфузатах был повышен уровень IL-8 (фиг. 10). Изменение IOP коррелировало с SAA-индуцированным увеличением интерлейкина-8 в перфузатах. Все пять пар глаз имели удовлетворяющие требованиям постперфузионные показатели жизнеспособности TM. Полученные результаты показали, что повышенный уровень SAA может увеличивать IOP при перфузии культивируемых человеческих глаз.
Все композиции и/или способы, описанные и заявленные в настоящей заявке, могут быть получены и разработаны без дополнительного экспериментирования, лишь исходя из описания настоящего изобретения. Хотя композиции и способы настоящего изобретения были описаны на предпочтительных вариантах его осуществления, однако очевидно, что в описанные здесь композиции и/или способы, а также в стадии или в последовательность стадий данного способа могут быть внесены изменения, не выходящие за рамки существа, объема и идеи настоящего изобретения. Более конкретно следует отметить, что описанные здесь агенты могут быть заменены некоторыми химически и структурно-родственными агентами, дающими аналогичные результаты. Для каждого специалиста очевидно, что такие замены и модификации не должны выходить за рамки существа, объема и идеи настоящего изобретения, определенные в прилагаемой формуле изобретения.
Ссылки
Нижеследующие работы, в которых проиллюстрированы процедуры или другие конкретные аспекты, помимо уже описанных в данной заявке, вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
Другие публикации
Furlenato, CJ, and Campa A, A novel function of serum amyloid A: a potent stimulus for the release of tumor necrosis factor-alpha, interleukin-1 beta, and interleukin-8 by human blood neutrophil, BiOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN 268: 405-408 (2002).
He, R, Sang H, Ye, RD, Serum amyloid A induces IL-8 secretion through a G protein-coupled receptor, FPRL1/LXA4R, BLOOD 101: 1572-1581 (2003).
Jensen LE and Whitehead AS, BlOCHEM. J. 334: 489-503 (1998).
Jordat MS, et al., PLANTA MED. 68: 667-71 (2002).
Kane et al., J. NEUROCHEM., 72: 1939-1947 (1999).
Kumon, Y., Hosokawa, T., Suehiro, T., Ideda, Y., Sipe, J.D., and Hashimoto, K., Acute-phase, but not constitutive serum amyloid A (SAA) is chemotactic for cultured human aortic smooth muscle cells, AMYLOID 9:237-241 (2002a).
Kumon, Y., Suehiro, T., Faulkes, D.J., Hosakawa, T., Ideda, Y., Woo, P., Sipe, J.D., and Hashimoto, K., Transcriptional regulation of Serum Amyloid Al gene expression in human aortic smooth muscle cells involves CCAAT/enhancer binding proteins (C/EBP) and is distinct from HepG2 cells, SCAND. J. IMMUNOL. 56: 504-511 (2002b).
Kumon, Y., Suehiro, T., Hashimoto, K., and Sipe, J.D., Dexamethasone, but not IL-I alone, upregulates acute-phase serum amyloid A gene expression and production by cultured human aortic smooth muscle cells, SCAND J. IMMUNOL. 53:7-12 (2001).
Lambert et al., PROC. NAT. ACAD. SCI. USA 95: 6448-6453 (1998).
Liang, J.S., Sloane, J.A., Wells, J.M., Abraham, C.R., Fine, R.E., and Sipe, J.D., Evidence for local production of acute phase response apolipoprotein serum amyloid A in Alzheimer's disease brain, NEUROSCI. LETT. 225:73-76 (1997).
Liu et al., J. NEUROCHEM. 69: 2285-2293 (1997).
Miida T., Yamada, T., Yamadera, T., Ozaki, K., Inano, K., Okada, M., Serum amyloid A protein generates pre-beta 1 high-density lipoprotein from alpha-migrating high-density lipoprotein, BlOCHEM. 38(51): 16958-16962 (1999).
http://genomebiology.com/2001/3/l/reviews/3001.1
Miller, Genome Biology 3(l): reviews 3001.1-3001.15 (2001) (also at )
Nakagami et al., EUR. J. PHARMACOL. 457: 11-17 (2002a).
Nakagami et al., BR. J. PHARMACOL., 137: 676-682 (2002b).
O'Hara, R., Murphy, E.P., Whitehead, A.S., FitzGerald, O., and Bresnihan, B., Acute- phase serum amyloid A production by rheumatoid arthritis synovial tissue, ARTHRITIS RES. 2: 142-144 (2000).
Pike et al., J. NEUROSCI. 13: 1676-1687 (1993).
Thorn, CF. and Whitehead, A.S., Differential glucocorticoid enhancement of the cytokine-driven transcriptional activation of the human actue phase serum amyloid A genes, SAAl and SAA, J. IMMUNOL. 169: 399-406 (2002).
Uhlar, CM., and Whitehead, A.S., Serum amyloid A, the major vertebrate acute-phase reactant, EUR. J. BlOCHEM. 265: 501-523 (1999).
Urieli-Shoval, S., Cohen, P., Eisenberg, S., and Matzner, Y., Widespread expression of serum amyloid A in histologically normal human tissue. Predominant localization to the epithelium, J. HISTOCHEM. CYTOCHEM. 46: 1377-1384 (1998).
Yamazaki et al., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RES. COMM., 290: 1114-1122 (2002).
Yankner et al., SCIENCE 250: 279-282 (1990).
Zhang et al., NEUROSCI. LETT. 312: 125-128 (2001).