Влияние кадмия на экспрессию генов транскрипционных факторов CBF1 и DREB1 в листьях проростков пшеницы

Труды Карельского научного центра РАН № 2. 2012. С. 113-118

УДК 581.1

ВЛИЯНИЕ КАДМИЯ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНОВ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ CBF1 И DREB1 В ЛИСТЬЯХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ

Н. С. Репкина, В. В. Таланова, Л. В. Топчиева,

Ю. В. Батова, А. Ф. Титов

Институт биологии Карельского научного центра РАН

В условиях контролируемой среды изучали влияние кадмия на экспрессию генов, кодирующих транскрипционные факторы CBF1 и DREB1, в листьях проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) с. Московская 39. Установлено, что в первые 5 ч воздействия кадмия (100 мкМ) на корни проростков его содержание в листьях практически не увеличивается, но через 1 сут резко возрастает, продолжая повышаться в течение всего опыта (7 сут). В отличие от этого, уровень экспрессии генов CBF1 и DREB1 существенно увеличивался уже через 15 мин воздействия кадмия на проростки и достигал максимума через 1 ч. В дальнейшем (через 5 ч) экспрессия гена DREB1 несколько снижалась, но оставалась на повышенном уровне до конца эксперимента (7 сут). Содержание транскриптов гена CBF1 снижалось через 5-48 ч воздействия кадмия, а затем вновь возрастало и сохранялось на достигнутом уровне (3-7 сут). Высказано предположение об участии генов транскрипционных факторов CBF1 и DREB1 в неспецифических защитно-приспособительных реакциях растений пшеницы на действие ионов кадмия.

Ключевые слова: Triticum aestivum L., содержание кадмия, экспрессия генов, транскрипционный фактор.

N. S. Repkina, V. V. Talanova, L. V. Topchieva, Yu. V. Batova, A. F. Titov. EFFECT OF CADMIUM ON GENE EXPRESSION OF THE TRANSCRIPTION FACTORS CBF1 AND DREB1 IN WHEAT SEEDLING LEAVES

We studied the effect of cadmium on the expression of genes encoding the transcription factors CBF1 and DREB1 in leaves of cv. Moscovskaya 39 winter wheat (Triticum aestivum L.) seedlings in a controlled environment. In the first 5 h of cadmium impact (100 цМ) on the roots of the seedlings its content in the leaves remained nearly unchanged, but after 1 day of the impact it rose sharply and continued to grow throughout the experiment (7 full days). Contrastingly, the level of CBF1 and DREB1 gene expression rose significantly after just 15 min of the cadmium impact on the seedlings, and peaked in an hour. Further on (in 5 h) DREB1 gene expression decreased somewhat, but remained elevated until the end of the experiment (7 full days). The content of CBF1 gene transcripts decreased in the 5th-48th h of the cadmium impact, and then rose again to remain at the level reached thereafter (3-7 full days). The assumption was made that CBF1/DREB1 transcription factor genes take part in nonspecific protective and adaptive responses of wheat plants to cadmium ion impact.

Key words: Triticum aestivum L., cadmium content, gene expression, transcription factor.

Введение

Исследования многих авторов показывают, что важную роль в процессах адаптации растений к неблагоприятным факторам внешней среды играют подавление экспрессии генов и соответственно торможение синтеза белков, характерных для жизнедеятельности клетки в обычных условиях, и активизация генов, кодирующих белки, которые принимают участие в адаптивных реакциях [Титов и др., 2006; Колупаев, Карпец, 2010]. В последние годы такие данные появились в литературе, посвященной воздействию на растения различных по своей природе стрессоров, включая тяжелые металлы. В них, в частности, рассматривается влияние тяжелых металлов на экспрессию генов, кодирующих транспортные белки [Morel et al., 2009], металлотионеины [Cobett, Goldsbrough,

2002], ферменты синтеза фитохелатинов [Wojas et al., 2008] и глутатиона [Bogs et al.,

2003].

Как показывают подобные исследования, ключевую роль в активации генов и синтезе стрессовых белков под влиянием тех или иных стресс-факторов, в том числе тяжелых металлов, играют транскрипционные факторы. К ним, например, относятся и продукты генов CBF1 и DREB1 - CBFs (С-repeat-binding factors) и DREB1s (dehydration-responsive element-binding factors 1) [Purdy et al., 2011]. На модельном генетическом объекте Arabidopsis thaliana L. установлена роль этих генов в индукции транскрипции за счет связывания с регуляторным элементом CRT/DRE (C-repeat/dehydration responsive element), расположенным в промоторном участке многих регулируемых стресс-факторами генов [Medina et al., 2011]. В частности, появились данные об участии генов CBF1 и DREB1 в процессах адаптации растений к действию холода [Gilmour et al., 1998; Fowler, Thomashow, 2002; Van Buskirk, Thomashow, 2006] и засухи [Haake et al., 2002; De Leonardis et al., 2007]. Показано также, что транскрипция других генов этого семейства транскрипционных факторов (AP2/ERF), таких как DREB2A и DREB2B, регулируется засолением [Dubouzet et al., 2003; Matsui et al., 2008], высокими температурами [Kang et al., 2011] и обезвоживанием [Nakashima et al., 2000]. Однако сведения об экспрессии генов этого семейства, в том числе транскрипционных факторов CBF1 и DREB1 в условиях действия на растения тяжелых металлов, в известной нам литературе отсутствуют.

Исходя из этого целью нашей работы явилось исследование влияния кадмия на экспрессию генов транскрипционных факторов CBF1 и DREB1 у проростков пшеницы.

Материал и методы

Эксперименты проводили с проростками озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Московская 39, выращенными в рулонах фильтровальной бумаги на питательном растворе Кнопа (рН 6,2-6,4) в камере искусственного климата при температуре воздуха 25 °С, его относительной влажности 60-70 %, освещенности 10 клк и фотопериоде 14 ч. По достижении недельного возраста проростки подвергали действию сульфата кадмия (100 мкМ) в течение 7 сут при сохранении прочих условий неизменными.

Реакцию растений на действие кадмия оценивали по изменению ростовых параметров, таких как длина побега и длина 1-го листа.

Содержание кадмия в листьях растений определяли методом инверсионной вольтампе-рометрии с использованием полярографа АВС-1.1. («Вольт», Россия). Разложение растительных образцов проводили в смеси HNO3 и Н2О2 в соотношении 4:1 с использованием микроволновой системы пробоподготовки МС-6 («Вольта»).

Для выделения РНК навеску листьев пшеницы (50 мг) растирали в жидком азоте. Тотальную РНК выделяли с помощью набора Yellow Solve («Силекс», Россия). кДНК синтезировали, используя набор для обратной транскрипции с М-MLV обратной транскриптазой и случайными (random) гексапраймерами («Силекс»). Количество и качество кДНК проверяли спектрофотометрически на приборе SmartSpec Plus («Bio-Rad», США). Уровень экспрессии генов в листьях пшеницы анализировали методом ПЦР в режиме реального времени. Амплификацию проводили в приборе iCycler с оптической приставкой iQ5 («Bio-Rad», США), используя набор для амплификации с интеркалирующим красителем SYBR Green («Синтол», Россия). Смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 1 мкл кДНК (100 нг), 10 мкл реакционной смеси, по 1 мкл прямого и обратного праймера, 1 мкл MgCl2 и 17 мкл деионизованной воды, свободной от нуклеаз. Для ПЦР в режиме реального времени использовали праймеры («Синтол», Россия), представленные в табл. 1. В качестве референсного гена использовали актин. Протокол ПЦР: 5 мин при 95 °С, 30 с при 56 °С, 30 с при 72 °С (40 циклов). Специфичность продуктов амплификации

проверяли плавлением ПЦР фрагментов: 1 мин ОУЭ = 2 Ст (контрольный) - Ст (тестовый образец),

при 95 °С, 1 мин при 56 °С, 10 с при 56 °С где ОУЭ - относительный уровень экспрессии;

(80 циклов, повышая в каждом цикле температу- Ст - значение пороговых циклов.

ру на 0,5 °С). Относительный уровень экспрес- В качестве контрольных образцов были вы-

сии генов растений, подвергнутых воздействию браны кДНК, выделенные из растений, не под-

кадмия (100 мкМ), вычисляли по формуле: вергнутых воздействию металла.

Таблица 1. Праймеры для проведения ПЦР в режиме реального времени

Ген Нуклеотидная последовательность

прямого праймера 5' ...3' обратного праймера 5' ...3'

DREB1 GTGGCTAATCTCAGGAA GCCCGATAATAAGCACATA

CBF1 T CGCCATACT GCCGTT CC CCT GAAT CACTGCCCAC

Actin GGACCCACGGATAATCTAATG AACCT CCACT GAGAACAACATTAC

На рисунках приведены средние арифметические значения из двух независимых опытов и их стандартные отклонения. Повторность при анализе ростовых показателей 50-кратная, при химическом анализе - 3-кратная, а при проведении ПЦР-анализа - 2-кратная. В статье обсуждаются величины, достоверные при Р< 0,05.

Результаты и обсуждение

Исследования показали, что кадмий в концентрации 100 мкМ отрицательно влияет на рост проростков пшеницы. Так, за 7 сут эксперимента прирост побега у обработанных кадмием проростков составил всего 7 %, в то время как у проростков контрольного варианта - 26 % (табл. 2). Увеличение длины 1-го листа составило в опытном варианте 9 %, а в контрольном -12 %. Таким образом, кадмий ингибировал рост проростков пшеницы, хотя их видимого повреждения при этом не происходило.

Таблица 2. Влияние кадмия на рост проростков пшеницы

Концентрация кадмия, мкМ Прирост по отношению к исходному уровню, %

Экспозиция, сут

0 1 2 3 6 7

Длина побега

0 100 100 101 101 125* 126*

100 100 100 101 101 106* 107*

Длина 1 го листа

0 100 100 100 103* 111* 112*

100 100 100 100 101 109* 109*

Примечание. * - различия с исходным уровнем достоверны при Р < 0,05.

Анализ содержания кадмия в листьях показал следующее. В первые 1-5 ч воздействия кадмия на корни проростков его концентрация в листьях практически не повышалась. Спустя 1 сут содержание кадмия в листьях возрастало с 0,03 до 0,2 мкг/г сырой массы (рис. 1) ив дальнейшем продолжало нарастать, достигая максимального значения (2,59 мкг/г сырой массы) на 7-е сутки эксперимента.

Крайне важно, что уже 15-минутное воздействие кадмия на проростки пшеницы приводило к существенному усилению (в 1,5-2 раза по сравнению с исходным уровнем) экспрессии как CBF1, так и DREB1 генов в листьях (рис. 2). Через 1 ч уровень экспрессии гена CBF1 возрастал в 4 раза, а гена DREB1 - в 5,5 раза и достигал максимального уровня. В дальнейшем (через 5 ч) содержание транскриптов гена DREB1 несколько снижалось, но даже через 67 сут от начала эксперимента оно примерно в 3 раза превышало исходные значения. Содержание транскриптов гена CBF1 в последующие 5-48 ч действия кадмия снижалось, однако на третьи сутки вновь возрастало до максимального уровня и в дальнейшем оставалось неизменным до конца опыта.

Установленный нами при воздействии кадмия на проростки пшеницы сходный характер изменения экспрессии генов CBF1 и DREB1 может объясняться тем, что они относятся к одной подгруппе (DREB1/CBF) генов AP2/ERF семейства транскрипционных факторов. Как показывает геномный анализ A. thaliana, CBF гены организованы в тандемы (DRB1A/CBF3, DREB1B/CBF1 и DREB1C/CBF2) на 4-й хромосоме [Medina et al., 2011]. Полученные нами результаты о повышении уровня экспрессии генов транскрипционных факторов CBF1 и DREB1 уже в самый начальный период действия кадмия (15-30 мин) и достижении его максимального значения через 1 ч согласуются с данными, полученными на растениях A. thaliana, подвергнутых охлаждению. В частности, у A. thaliana гены CBF1 и DREB1 также экспрессируются уже через 15 мин от начала действия температуры 4 °С, достигая максимального значения через 2 ч [Fowler, Thomashow, 2002]. Как известно, CBF транскрипционные факторы арабидопсиса играют ключевую роль в процессах адаптации к низким температурам, контролируя экспрессию более 100 генов, обеспечивающих повышение морозоустойчивости [Canella et al., 2010].

£ о

i 9-

от J3

S y

Q. i-

0)

* 4

О ^

О

Экспозиция,ч

Рис. 1. Влияние продолжительности воздействия кадмия (100 мкМ) на его содержание в листьях проростков пшеницы

Рис. 2. Влияние продолжительности воздействия кадмия (100 мкМ) на экспрессию генов, кодирующих транскрипционные факторы СБР1 (А) и ОЯЕБ1 (В) в листьях проростков пшеницы

Уровень экспрессии генов у растений контрольного варианта (без обработки кадмием) принят за единицу

Обнаружено, что транскрипционные факторы, кодируемые генами CBF1 и DREB1, содержат AP2/ERF DNA-binding домены, которые распознаются CRT/DRE элементом, находящимся в промоторном участке COR генов (cold-regulated), продуктами которых являются COR белки, участвующие в процессе формирования высокой морозоустойчивости [Gilmour al., 1998; Purdy et al., 2011].

Следует отметить, что нами было выявлено повторное значительное повышение содержания транскриптов гена СВР1 на третьи сутки воздействия кадмия. Учитывая это, можно предположить, что увеличение экспрессии гена СВР1 в листьях проростков пшеницы связано с их реакцией не только на кратковременное (минуты, часы) воздействие кадмия, но и на более продолжительное (сутки), когда за ука-

занный период времени происходит значительное накопление металла в листьях. Не исключено, что в дальнейшем это может привести к усилению экспрессии генов COR белков. Подчеркнем, однако, что в известной нам литературе данные, касающиеся динамики экспрессии гена CBF1 при длительных (суточных) воздействиях стресс-факторов, включая низкую температуру, отсутствуют.

Отметим также, что имеющиеся в литературе данные о роли генов CBF1 и DREB1 в адаптивных реакциях растений на действие низких температур [Gilmour et al., 1998; Van Buskirk et al., 2006] и засухи [Haake et al., 2002; Matsui et al., 2008] касаются в основном A. thaliana. Между тем гены AP2/ERF семейства и гомологи CBF генов обнаружены и у других видов растений, например CBF1 - у картофеля [Pennycooke et al., 2008], HvCBF2 - у ячменя [Xue, 2003], DREB1/CBF - у риса [Dubouzet et al., 2003], DREB1A - у пшеницы [De Leonardis et al., 2007], CBF - у огурца [Таланова и др., 2008].

Таким образом, анализ полученных нами результатов и данных других авторов позволяет заключить, что возрастание уровня экспрессии генов транскрипционных факторов CBF1 и DREB1 можно рассматривать как свидетельство их участия в неспецифических защитноприспособительных реакциях растений пшеницы на действие ионов кадмия.

Литература

Колупаев Ю. Е., Карпец Ю. В. Формирование адаптивных реакций растений на действие абиотических стрессоров. Киев: Основа, 2010. 352 с.

Таланова В. В., Титов А. Ф., Топчиева Л. В., Малышева И. Е. Влияние стресс-факторов на экспрессию гена транскрипционного фактора CBF у растений огурца // Докл. АН. 2008. Т. 423, № 2. С. 283285.

Титов А. Ф., Акимова Т. В., Таланова В. В., Топчиева Л. В. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур. М.: Наука, 2006. 143 с.

Bogs J., BourboulouxA., Cagnac O. et al. Functional characterization and expression analysis of a glutathione transporter, BjGT1 from Brassica jncea: evidence for regulation by heavy metal exposure // Plant Cell Environ. 2003. Vol. 26. P. 1703-1711.

Canella D., Gilmour S. J., Kuhn L. A., Thomashow M. F. DNA binding by the Arabidopsis CBF1 transcription factor requires the KKP/RAGRxKFxTRHP signature sequence // Biochim. Biophys. Acta. 2010. Vol. 1799. P.454-462.

Cobett C., Goldsbrough P. Phytochelatins and metallothioneins: roles in heavy metal detoxification and homeostasis // Annu. Rev. Plant Biol. 2002. Vol. 53. P.159-182.

De Leonardis A. M., Marone S., Mazzucotelli E. et al. Durum wheat genes up-regulated in the early phases of cold stress are modulated by drought in a developmental and genotype dependent manner // Plant Scie. 2007. Vol. 172. P. 1005-1016.

Dubouzet J. G., Sakuma Y., Ito Y. et al. OsDREB genes in rice, Oryza sativa L., encode transcription activators that function in drought-, high-salt- and cold - responsive gene expression // Plant J. 2003. Vol. 33. P. 751-763.

Fowler S., Thomashow M. F. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway // Plant Cell. 2002. Vol. 14. P. 1675-1690.

Gilmour S. J., Zarka D. G., Stockinger E. J., Salazar M. P., Houghton J. M., Thomashow M. F. Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression // Plant J. 1998. Vol. 16, N 6. P. 433-442.

Haake V., Cook D., Riechmann J. L. et al. Transcription factor CBF4 is regulator of drought adaptation in Arabidopsis // Plant Physiol. 2002. Vol. 130. P. 639-648.

Kang H.-G., Kim J., Kim B. et al. Overexpression of FTL1/DDF1, AN AP2 transcription factor, enhances tolerance to cold, drought, and heat stresses in Arabidopsis thaliana // Plant Scie. 2011. Vol. 180. P.634-641.

Matsui A., Ishida J., Morosawa T. et al. Arabidopsis transcriptome analysis under drought, cold, high-salinity and ABA treatment conditions using a tiling array // Plant Cell Physiol. 2008. Vol. 49. P. 1135-1149.

Medina J., Catala R., Salinas J. The CBFs: Three Arabidopsis transcription factors to cold acclimate // Plant Sci. 2011. Vol. 180. P. 3-11.

Morel M., Crouzet., Gravot A. et al. AtHMA3, a P1B-ATPase Allowing Cd/Zn/Co/Pb Vacuolar Storage in Arabidopsis1™ // Plant Physiol. 2009. Vol. 149. P. 894-904.

Nakashima K., Shinwari., Sakuma Y. et al. Organization and expression of two Arabidopsis DREB2 genes encoding DRE-binding proteins involved in dehydration- and high-salinity-responsive gene expression // Plant Mol. Biol. 2000. Vol. 42. P. 657665.

Pennycooke J. C., Cheng H., Roberts S. M. et al. The low temperature-responsive, Solanum CBF1 genes maintain high identity in their upstream regions in genomic environment undergoing gene duplications, deletions, and rearrangements // Plant. Mol. Biol. 2008. Vol. 67. P. 483-497.

Purdy S. J., John D. B., Nelson D. C. et al. A nuclear-localized protein, KOLD SENSITIV-1, affects the expression of cold-responsive genes during prolonged chilling in Arabidopsis // J. Plant Physiol. 2011. Vol. 168. P. 263-269.

Van Buskirk H. A., Thomashow M. F. Arabidopsis transcription factors regulating cold acclimation // Physiol. Planta. 2006. Vol. 126, N 1. P. 72-80.

Wojas S., Clemens S., Hennig J. et al. Overexpression of phytohelatatin synthase in tobacco: distinctive effects of AtPCS1 and CePCS genes on plant

response to cadmium // J. Exp. Bot. 2008. Vol. 59, N. 8. P.2205-2219.

Xue G. P. The DNA-binding activity of an AP2 transcriptional activator HvCBF2 involved in regulation

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Репкина Наталья Сергеевна

аспирант

Институт биологии Карельского научного центра РАН

ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия,

Россия, 185910

эл. почта: nrt9@ya.ru

тел.: (8142) 762712

Таланова Вера Викторовна

ведущий научный сотрудник, д. б. н.

Институт биологии Карельского научного центра РАН ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185910

эл. почта: talanova@krc.karelia.ru тел.: (8142) 762712

Топчиева Людмила Владимировна

старший научный сотрудник, к. б. н.

Институт биологии Карельского научного центра РАН ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185910

эл. почта: topchieva@krc.karelia.ru тел. (8142) 571879

Батова Юлия Валерьевна

научный сотрудник, к. б. н.

Институт биологии Карельского научного центра РАН ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия, Россия, 185910

эл. почта: batova@krc.karelia.ru тел.: (8142) 762706

Титов Александр Федорович

председатель КарНЦ РАН, чл.-корр. РАН, д. б. н.

Институт биологии Карельского научного центра РАН

ул. Пушкинская, 11, Петрозаводск, Республика Карелия,

Россия, 185910

эл. почта: krcras@krc.karelia.ru

тел.: (8142) 769710

of low-temperature responsive genes in barley is modulated by temperature // Plant J. 2003. Vol. 33. P. 373-383.

Repkina, Natalia

Institute of Biology, Karelian Research Centre,

Russian Academy of Sciences

11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: nrt9@ya.ru tel.: (8142) 762712

Talanova, Vera

Institute of Biology, Karelian Research Centre,

Russian Academy of Sciences

11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: talanova@krc.karelia.ru tel.: (8142) 762712

Topchieva, Lyudmila

Institute of Biology, Karelian Research Centre,

Russian Academy of Sciences

11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: topchieva@krc.karelia.ru tel.: (8142) 571879

Batova, Yulia

Institute of Biology, Karelian Research Centre,

Russian Academy of Sciences

11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: batova@krc.karelia.ru tel.: (8142) 762706

Titov, Alexandr

Institute of Biology, Karelian Research Centre,

Russian Academy of Sciences

11 Pushkinskaya St., 185910 Petrozavodsk, Karelia, Russia e-mail: krcras@krc.karelia.ru tel.: (8142) 769710