Способ определения 1-гидроксипирена в моче методом хромато-масс-спектрометрического анализа
METHOD FOR DETERMINING 1-HYDROXYPYREN IN URINE BY CHROMATOGRAPHY-MASS-SPECTROMETRIC ANALYSIS

Изобретение относится к области аналитической токсикологии и биологического мониторинга, и может быть использовано при оценке воздействия полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) на организм человека. В подавляющем случае ПАУ присутствуют в виде смесей, одним из основных компонентов по уровню концентрации является пирен. Метаболит пирена - 1-гидроксипирен (Фиг. 1) является стабильным соединением, относительно легко и надежно определяемым в моче.
18
3
3
3
Известный способ определения 1-гидроксипирена в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) включает в себя предварительный ферментативный гидролиз β-глюкуронидазой при 37°С 16 ч, твердофазную экстракцию на картридже С, анализ метанольного экстракта методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектором. Предел обнаружения 0,1 нг/см, нижний предел количественного определения 2 нг/см при объеме пробы 10 см, относительное стандартное отклонение воспроизводимости (RSD) 12,6%, коэффициент корреляции градуировочного графика 0,990, правильность (R) 88±9%. [Jongeneelen F.J., Anzion R.B.M., Henderson Р.Т. Determination of hydroxylated metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in urine // J. of Chromatography. 1987. V. 413. P. 227-232]. К недостаткам данного способа можно отнести большой объем пробы, длительность процедуры ферментативного гидролиза (16 ч) и ВЭЖХ анализа (50 мин), недостаточная чувствительность для определения концентрации 1-гидроксипирена в моче у населения, а также невысокая точность (RSD 12% и R=88%).
При использовании метода ВЭЖХ возникают проблемы из-за ошибок при идентификации зарегистрированных компонентов. Количественное определение их также может быть затруднено вследствие наложения или неполного разделения хроматографических пиков.
Другим подходящим способом (прототип) является определение 1-гидроксипирена в моче газовой хроматографией с масс-селективным детектированием (ГХ-МС) в режиме электронного удара.
3
3
3
Способ включает в себя следующие стадии: ферментативный гидролиз β-глюкуронидазой при 37°С 17-18 ч, твердофазную экстракцию, упаривание экстракта в токе азота, дериватизацию сухого остатка силилирующим реагентом N,O-бис-(триметилсилил) трифторацетамид (БСТФА) при температуре 60°С 40 мин, ГХ-МС анализ в течение 40 мин. Предел обнаружения 0,5 нг/см, нижний предел количественного определения 1 нг/см при объеме пробы 3 см, относительное стандартное отклонение воспроизводимости (RSD) 6,7-13,1%, коэффициент корреляции градуировочного графика 0,995, правильность (R) 88,7%. [С.Schummer, О. Delhomme, B.M.R. Appenzeller. Comparison of MTBSTFA and BSTFA in derivatization reaction of polar compounds prior to GC/MS analysis / Talanta 2009. - V. 77. P. 1473-1482].
Технической задачей предлагаемого способа является повышение точности определения методом ГХ-МС за счет использования изотопно-меченного стандарта 1-гидроксипирена-d9, повышение чувствительности определения за счет увеличения степени экстракции из биологической матрицы, а также значительное сокращение времени пробоподготовки за счет уменьшения продолжительности ее следующих стадий: ферментативного гидролиза, дериватизации 1-гидроксипирена силилирующим реагентом N,O-бис-(триметилсилил) трифторацетамид (БСТФА) (Фиг. 2), ГХ-МС анализа.
Указанная техническая задача достигается путем внесения в анализируемые пробы мочи изотопно-меченного стандарта 1-гидроксипирена-d9, проведения ферментативного гидролиза в течение 1 часа при 55°С, 2-х кратной жидкостно-жидкостной экстракции гексаном, упаривания гексанового экстракта досуха в токе азота, силилирования сухого остатка N,O-бис-(триметилсилил) трифторацетамидом (БСТФА) при температуре 22-25°С в течение 5 мин и проведении газохроматографического анализа на капиллярной колонке с масс-селективным детектированием в течение 20 мин.
Из патентной и научно-технической литературы нам неизвестны способы количественного определения 1-гидроксипирена в моче, содержащие совокупность предложенных нами признаков, что позволяет сделать вывод о новизне заявляемого технического решения.
Кроме того, из существующего уровня техники нам неизвестно использование существенных признаков, характеризующих предлагаемый способ, для достижения описываемого технического результата.
Способ осуществляют следующим образом:
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
К 2 см мочи в центрифужной пробирке вместимостью 10 см вносят 20 мм раствора 1-гидроксипирена-d9 в ацетонитриле (5 мкг/см), 1 см ацетатно-уксусного буфера с рН=5, 20 мм водного раствора β-глюкуронидазы (активность >85000), нагревают 1 ч при 55°С, затем охлаждают 20 мин до температуры 20-25°С, добавляют 0,5 г сульфата магния, 2 см гексана и интенсивно встряхивают на мультивортексе 2 мин, после этого разделяют фазы на центрифуге при 4000 об/мин 10 мин, отделяют гексановый экстракт, перенося его во флакон вместимостью 5 см с коническим дном, снова вносят 2 см гексана, интенсивно встряхивают на мультивортексе 2 мин, разделяют фазы на центрифуге при 4000 об/мин 10 мин, отделяют гексановый экстракт, объединяя с первым экстрактом. Объединенный гексановый экстракт упаривают досуха в небольшом токе азота при температуре водяной бани 60°С, затем к сухому остатку вносят 100 мм реагента БСТФА и выдерживают 5 мин.
Основное же преимущество метода ГХ-МС по сравнению с ВЭЖХ - это более лучшее разделение компонентов и возможность применения изотопно-меченного стандарта 1 -гидроксипирен-d9 (дейтерированный стандарт).
Хромато-масс-спектрометрический анализ осуществляют в следующих условиях (табл. 1).
Идентификацию на хроматограммах 1-гидроксипирена и 1-гидроксипирена-d9 в виде производных (триметилсиланов) проводят по времени удерживания и соотношению интенсивностей регистрируемых ионов (таблица 2).
3
Количественное определение по предлагаемому способу проводят методом внутреннего стандарта по растворам известной концентрации 1-гидроксипирена в моче от 0,1 до 100 нг/см, предварительно обработанным аналогично анализируемым пробам. При градуировке процедуру ферментативного гидролиза допускается не проводить.
При реакции силилирования 1-гидроксипирена реагентом БСТФА, содержащим 1% триметилхлорсилана, установлено, что температура и время реакции не оказывают значимого влияния на аналитический сигнал, особенно если в качестве аналитического сигнала выступает относительная площадь (высота) пика (табл. 3).
Данные показывают, что силилирование достаточно проводить при комнатной температуре 20-25°С в течение 5 мин и с внутренним стандартом, так как величина RSD самая минимальная.
Экспериментальным путем установлено, что при твердофазной экстракции (ТФЭ) степень экстракции 1-гидроксипирена из мочи составляет 8%, а при жидкостно-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) гексаном около 90% (табл. 4).
18
2
Несмотря на то, что ТФЭ более современный способ, чем ЖЖЭ, степень извлечения аналита данным способом очень низкая. Это объясняется не тем, что аналит плохо адсорбируется на сорбент C и/или плохо элюируется с него метанолом, а тем, что в образце мочи присутствует большое количество полярных соединений, содержащие в своем составе ОН, СООН, NH, NH группы, и гораздо в больших концентрациях, чем наш аналит. Эти компоненты оказывают мешающее влияние при силилировании 1-гидроксипирена реагентом БСТФА. Получается, что реакцию силилирования вступает очень малое количество 1-гидроксипирена. При ЖЖЭ гексаном извлекаются в основном соединения неполярной или малополярной природы, которые не оказывают мешающее влияние при дериватизации БСТФА. Поэтому, подходящим способом извлечения 1-гидроксипирена из биологической матрицы является 2-х кратная ЖЖЭ гексаном.
Основными факторами, влияющими на эффективность жидкостно-жидкостной экстракции являются тип экстрагента, продолжительность экстракции, число экстракций, природа и количество высаливающего агента. Опытным путем установлено, что гексан, является более удобным экстрагентом чем, диэтиловый эфир и толуол, так как меньше мешающих влияний при дериватизации. В качестве высаливающего агента подходит сульфат магния, чем сульфат натрия, так как выше процент извлечения аналита. Оптимальные условия проведения ЖЖЭ 1-гидрокиспирена из мочи сводятся к следующим: масса сульфата магния 0,5 г, время экстракции 1-2 мин, кратность экстракции 2.
В таблице 5 приведены результаты анализа реальных образцов мочи работников алюминиевого производства, при двух вариантах ферментативного гидролиза.
Сравнивая два варианта ферментативного гидролиза, видно, что концентрации 1-гидроксипирена не сильно различаются, при втором варианте концентрации аналита даже выше, поэтому ферментативный гидролиз β-глюкуронидазой лучше проводить при температуре 55°С в течение 60 мин (1 ч).
Установлены валидационные характеристики: предел обнаружения, предел количественного определения, линейный диапазон, повторяемость, внутрилабораторная прецизионность, правильность, матричный эффект, селективность.
3
3
3
3
Предел обнаружения и предел количественного определения составили 0,02 и 0,1 нг/см соответственно. Линейный диапазон установили по 6 модельным образцам мочи с разными концентрациями 1-гидроксипирена (0.1, 2, 10, 20, 40, 100 нг/см), коэффициент корреляции r>0.999. Приемлемый критерий для r не ниже 0,990. Таким образом, линейный диапазон составил от 0,1 до 100 нг/см. Прецизионность и точность оценивали для 4 образцов мочи с веденными концентрациями 0,5; 2; 20 и 40 нг/см, каждый образец анализировали 2 раза 5 дней. По результатам анализа рассчитали относительное стандартное отклонение (RSD, %) повторяемости и внутрилабораторной прецизионности, точность как отношение значения найденной концентрации к значению веденной концентрации (табл. 6).
Все значения правильности, лежащие в диапазоне от 96,5 до 102% от номинальной концентрации анализируемого вещества, соответствовали приемлемому критерию (100±7%). Повторяемость (RSD, %) лежит в интервале 1.0-4.4% и внутрилабораторная прецизионность (RSD, %) 6.0-6.4%, также в соответствии с приемлемыми критериями (не выше 12%). Введенные концентрации перекрываются с доверительными интервалами найденных концентраций.
МЕ
s
m
Матричный эффект оценивали в виде относительного смещения В, сравнивая относительные сигналы аналита введенного в органический растворитель (A) определенного количества и того же количества веденного в образец мочи (A) (табл. 10). Расчет осуществляли по следующей формуле (2)
Максимальный матричный эффект составляет 3,9% и не превышает приемлемый критерий 6%.
3
На рисунке (фиг. 3) приведены масс-хроматограммы холостого образца и 3-х образцов с разными концентрациями 1-гидроксипирена (0.1, 0.5, 39 нг/см).
Пик ТМС-1-гидроксипирена узкий (полуширина пика 1.5 с), симметричный, мешающие пики отсутствуют. Таким образом, достигается отличная селективность определения. Значение RSD измерения времен удерживания составляет 0,027%.
3
3
Данный способ количественного определения 1-гидроксипирена был апробирован на образцах мочи работников (31 человек) производства алюминия. Интервал содержания составил от 0,31 до 263 нг/см. Также были проанализированы и образцы мочи работников других производств (14 человек), где в производственной воздушной среде отсутствуют ПАУ. Здесь с концентрации лежат от 0,08 до 0,9 нг/см.
3
3
Таким образом, предлагаемым способом с удовлетворительным пределом количественного определения 0.1 нг/см можно определять 1-гидроксипирен в моче при более малом объеме анализируемой пробы 2 см не только у работников производств алюминия, но и у лиц, не занятых в данном производстве. Применение данного способа позволяет уменьшить продолжительность анализа за счет уменьшения продолжительности ее следующих стадий: ферментативного гидролиза, дериватизации 1-гидроксипирена реагентом БСТФА, ГХ-МС анализа по сравнению с прототипом. Также применение способа позволяет повысить точность определения за счет использования изотопно-меченного стандарта 1-гидроксипирена-d19, повысить чувствительность определения за счет увеличения степени экстракции из биологической матрицы.