N-[3-ОКСО-ЛУПАНО-28-ИЛ]-ПИПЕРИДИН-СРЕДСТВО С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ, АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКОЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И ЦИТОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
N-[3-OXO-LUPANO-28-YL]-PIPERIDINE - AGENT HAVING ANTI-TUMOUR, ANTI-METASTATIC, ANTI-INFLAMMATORY AND CYTOPROTECTIVE ACTIVITY

Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к N-[3-оксо-лупано-28-ил]-пиперидину формулы (1)
обладающему комплексной активностью - противоопухолевой, антиметастатической, противовоспалительной и цитопротекторной. Соединение может быть использовано в медицине в качестве фармацевтического средства для снижения пролиферации и диссеминации злокачественных клеток и уменьшения выраженности некробиотических нарушений в нормальных клетках, возникающих под влиянием паранеопластических процессов и цитотоксической химиотерапии.
Противоопухолевое действие большинства традиционных химиопрепаратов не избирательно и вызывает тяжелые расстройства на системном и тканевом уровне. Для повышения переносимости противоопухолевой терапии в схемы лечения включают модификаторы биологических реакций (МБР). Эти средства дополнительной терапии обладают регулирующим влиянием на жизненно важные процессы в клетках и тканях, что способствует повышению противоопухолевой резистентности организма и снижению побочного действия высокотоксичной химиотерапии [Трещалина Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения. - М.: Практическая медицина, 2005. - 227 с.]. В качестве МБР чаще всего применяются рекомбинантные формы колониестимулирующих факторов, интерфероны, цитокины, оказывающие в основном гемостимулирующее и иммуномодулирующее действие. Побочные эффекты, имеющиеся у данных пептидных препаратов (появление нейтрализующих антител, влияние на центральную нервную, сердечно-сосудистую системы и др.), ограничивают продолжительность и снижают эффективность лечения [Кадагидзе З.Г. Цитокины // Практическая онкология. 2003, т.4, №3, с.131-139]. Наряду с данными средствами в народной медицине и клинической практике в качестве МБР успешно используются растительные низкомолекулярные соединения и их синтетические аналоги, имеющие комплексные протекторные свойства и обладающие умеренным противоопухолевым действием. В результате широкого фармакологического скрининга установлена эффективность ряда растительных экстрактов, рекомендованных в качестве сопутствующих средств при полихимиотерапии онкологических заболеваний (экстракты побегов и листьев облепихи, ольхи клейкой, подорожника, бадана, родиолы розовой, шлемника байкальского и др.) [Гольберг Е.Д., Зуева Е.П. Препараты из растений в комплексной терапии злокачественных заболеваний. Томск, изд. Томского университета, 2002, 130 с.]. Однако остаются проблемы, связанные с повышением противоопухолевой и антиметастатической эффективности растительных препаратов, поэтому по-прежнему актуален поиск новых МБР среди природных соединений различных классов.
Задачей настоящего изобретения является разработка средства, обладающего противоопухолевой, антиметастатической, противовоспалительной и цитопротекторной активностью, для расширения арсенала такого рода средств.
Поставленная задача решается химическим соединением формулы (1)
а именно, N-[3-оксо-лупано-28-ил]-пиперидином,
- обладающим противоопухолевой и антиметастатической активностью;
- способностью снижать тяжесть патологических изменений в тканях, вызванных паранеопластическими синдромами;
- проявляющим выраженный цитопротекторный эффект в условиях цитостатической полихимиотерапии;
- не стимулирующим пролиферацию и диссеминацию опухоли при комбинированном введении с химиопрепаратами;
- обладающим противовоспалительными свойствами.
Заявленное соединение является новым и относится к тритерпеноидам лупанового ряда, а именно к производным дигидробетулоновой кислоты. Ближайший структурный аналог - бетулоновая кислота - обладает высокой биологической активностью. В частности, у нее и ее амидов имеются антиоксидантные свойства [И.В.Сорокина, Т.Г.Толстикова, Е.Б.Бубнова и др. Изучение антиоксидантных свойств производных бетулоновой кислоты на модели острого токсического гепатита // Научный вестник Тюменской медицинской академии. 2003, №1, с.60-61], а также противоопухолевое и антиметастатическое действие [И.В.Сорокина, Т.Г.Толстикова, Н.А.Жукова и др. Оценка противоопухолевого и антиметастатического эффектов амидов бетулоновой кислоты на мышах с перевиваемой карциномой Льюис // Бюлл. эксп. биол. и мед., 2006, №1, с.69-72]. Амиды бетулоновой кислоты, содержащие фрагменты каприловой, пеларгоновой и ундекановой кислот, ингибируют рост опухолевых клеток в культуре [Покровский А.Г., Шинтяпина А.Б., Н.В.Пронкина, B.C.Кожевников, Плясунова О.А., Шульц Э.Э., Толстиков Г.А. Активация апоптоза производными бетулиновой кислоты в опухолевых клетках человека in vitro // Доклады академии наук. 2006. Т.407. №5. С.698-701]. Дипептид бетулоновой кислоты (N'{N-[3-Оксолуп-20(29)-ен-28-оил]-9-аминононаноил}-3-амино-3-фенилпропионовая кислота) запатентован в качестве агента, обладающего противовирусной (анти-ВИЧ, противогерпесной) и иммуностимулирующей активностью [Патент РФ 2211843 от 25.01.2002 г. по заявке 2002. 102338/04. БИПМ. 2003. №25. 4.3. С.498-499].
Бетулоновая кислота и ее производное [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовая кислота купируют некробиотические поражения печеночной паренхимы у мышей после проведения цитостатической полихимиотерапии злокачественной лимфосаркомы [Н.А.Жукова, Д.Е.Семенов, И.В.Сорокина и др. Влияние бетулоновой кислоты и [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовой кислоты на морфологию печени мышей с лимфосаркомой RLS после полихимиотерапии // Бюлл. эксп. биол. и мед., 2005, т.14, №9, с.348-351].
Высокая биологическая активность характерна и для производных дигидробетулиновой кислоты. Показано, что гидрирование бетулиновой кислоты повышает активность ее производных по сравнению с аналогичными соединениями, синтезированными на основе бетулиновой кислоты. Например, анти-ВИЧ активность 3-O-глутарилдигидробетулина увеличивается не менее, чем на три порядка, по сравнению с обычным производным бетулина [Kashiwada Y., Sekiya M., (I)keshiro Y., Fujioka T., Kilgore N.R., Wild C.T., Allaway G.P., Lee K.-H. // Bioorgan.Med.Chem.Lett., 2004, V.14, P.5851-5853]. Таким образом, путем гидрирования производных ряда бетулина можно получить потенциально ценные для медицины агенты.
Заявляемое соединение является ранее не известным производным дигидробетулоновой кислоты, создание которого продиктовано целью расширить ассортимент низкомолекулярных МБР на основе тритерпеноидных природных соединений, повышающих противоопухолевую резистентность организма и купирующих некробиотические нарушения в клетках, не затронутых злокачественным перерождением.
Заявляемое соединение (1) получают способом, представленным на схеме 1. В качестве исходного соединения был взят бетулин (4), полученный экстракцией коры березы бензолом. Гидрирование бетулина (4) водородом в автоклаве над N(1)-Ренея дает дигидробетулин (3), который окисляют раствором Физера. Из дигидробетулоновой кислоты (2) получают хлорангидрид, который далее используют без промедления. Взаимодействие хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (2) с двойным избытком пиперидина легко приводит к заявляемому соединению формулы (1).
ИК-спектры соединений записывали на приборе "VECTOR 22" в KBr. Удельное вращение определяли на спектрометре polAAr 3005, концентрация раствора приведена в г/100 мл. Точку плавления определяли на приборе Termosystem FP 900 фирмы Mettler Toledo и на столике Кофлера S 30 A/G (Германия).
1
13
1
1
1
13
13
1
1
13
1
2,3
3
H
C
C,H
C,H
Брутто-формулу определяли из элементного анализа вещества. Спектры ЯМР Н и С регистрировали на спектрометре DRX-500 (500.13 MHz и 125.76 MHz соответственно) фирмы Bruker для растворов веществ в CDCl. В качестве внутреннего стандарта использовали сигналы растворителя (δ 7.24 и δ с 76.9 м.д). Строение полученных соединений устанавливали на основании анализа спектров ЯМР Н с привлечением спектров двойного резонанса Н-Н, а также анализа спектров ЯМР С с использованием стандартных методик записи спектров в режиме J-модуляции (JMOD), с внерезонансным и селективным подавлением протонов, двумерных спектров гетероядерной C-H корреляции на прямых константах спин-спинового взаимодействия (С-Н COSY, J 135 Гц) и двумерных и одномерных спектров гетероядерной C-H корреляции на дальних константах спин-спинового взаимодействия (COLOC, LRJMD, J 10 Гц).
Исследование фармакологической активности N-[3-оксо-лупано-28-ил]-пиперидина (1) включало в себя определение противоопухолевого, антиметастатического и цитопротекторного действия при введении мышам с солидной карциномой легких Льюис. Изучалось также его влияние на противоопухолевый и антиметастатический эффекты полихимиотерапии при их сочетанием введении мышам-опухоленосителям и возможность коррекции ее цитотоксического действия на нормальные клетки внутренних органов, не затронутые злокачественным перерождением. Кроме того, проводили оценку противовоспалительных свойств заявляемого соединения.
В качестве эталона противоопухолевого и антиметастатического эффектов использовали стандартную схему полихимиотерапии АСОР (циклофосфан, доксорубицин, винкристин и преднизолон) [Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов М.А., Акимов А.А. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей. С-Пб.: Сотис, 1999. С.105] в модификации [Грек О.Р., Мишенина С.В., Пупышев А.Б. Протективное действие энтеросгеля на лизосомы печени крыс при введении комплекса цитостатических препаратов // Бюлл. эксп.биол. и мед. 2002. Т.134. №10. С.413-417]. Референсным препаратом при изучении противовоспалительного эффекта являлась субстанция индометацина (Fluka) в дозе 20 мг/кг. Статистическую обработку данных проводили методами параметрической статистики с использованием пакета программ "Statistika 6.0". Результаты считали достоверными при p<0,05 по критерию Стьюдента.
6
Противоопухолевое действие соединения (1) исследовали на мышах самках линии C57BL/6 с перевитой внутримышечно карциномой легких Льюис (2×10 опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора). Соединение (1) вводили через 10 дней после перевивки внутрижелудочно в дозе 20 мг/кг в течение 8 дней. Группе сравнения проводили цитостатическую полихимиотерапию (ПХТ) по схеме АСОР в режиме однократного парентерального введения циклофосфана (50 мг/кг), доксорубицина (4 мг/кг), винкристина (0,1 мг/кг) и преднизолона (5 мг/кг). Контролем являлись животные с опухолью. Результаты оценивали в динамике по проценту торможения роста опухоли. Установлено, что внутрижелудочное введение соединения (1) в дозе 20 мг/кг течение 8 дней вызывает умеренное торможение роста карциномы легких Льюис, по сравнению с цитостатической ПХТ АСОР (см. табл.1, 2).
Антиметастатическую активность соединения (1) определяли у тех же животных в конце периода введения агента путем световой микроскопии срезов обеих долей легких. Площадь метастазов подсчитывали с помощью программы «Видео-Тест». Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ). Показано, что соединение (1) не стимулирует диссеминацию опухоли, проявляя значимый антиметастатический эффект (ИИМ - 75,7%) (см. табл.3).
Цитопротекторные свойства соединения (1) оценивали по его влиянию на клетки печени мышей линии C57BL/6 с карциномой легких Льюис. Для этого проводили патоморфологическое исследование ткани печени методом световой микроскопии. Соединение (1) вводили, как указано выше; референсной группе проводили однократную ПХТ по схеме АСОР; контролем являлись животные с опухолью. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень и подвергали стандартной гистологической обработке. Показано, что введение соединения (1) снижает тяжесть некробиотических повреждений гепатоцитов, вызванных опухолевым ростом, и улучшает состояние печеночной паренхимы. В референсной группе с ПХТ наблюдали изменения, связанные с усилением дегенеративных и альтеративных процессов, а также фиксировали наличие грубых некробиотических нарушений в структуре печени.
Изучение влияния соединения (1) на противоопухолевый и антиметастатический эффекты цитостатической полихимиотерапии проводили на мышах самках линии C57BL/6 с перевиваемой карциномой легких Льюис. Через 10 дней после перевивки животным вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР: доксорубицин (4 мг/кг), циклофосфан (50 мг/кг), винкристин (0,1 мг/кг), преднизолон (5 мг/кг). Через сутки после полихимиотерапии животным в течение 8 дней вводили внутрижелудочно соединение (1) в дозе 20 мг/кг. Референсной группой являлись животные с ПХТ АСОР, контролем - животные с опухолью. Противоопухолевый эффект определяли в динамике по индексу торможения роста опухоли (ТРО), антиметастатический - в конце периода введения путем подсчета площади метастазов, частоты метастазирования и индекса ингибирования метастазирования. Установлено, что введение соединения (1) в условиях ПХТ не оказывает пролиферирующего действия на трансплантаты карциномы легких Льюис (см. табл.5, 6) и не оказывает существенного влияния на противоопухолевую эффективность химиопрепаратов.
При комбинированном введении соединения (1) и противоопухолевых препаратов, имитирующих полихимиотерапию, диссеминация опухоли не усиливается, антиметастатическое действие химиотерапии сохраняется (см. табл.7).
Цитопротекторные свойства соединения (1) изучали на тех же животных путем патоморфологического исследования печени методом световой микроскопии, Выявлено, что под действием соединения (1), вводимого на фоне ПХТ, уменьшается степень дистрофических и некротических поражений гепатоцитов, вызванных развитием опухоли, в то время как морфологическая картина в референсной группе характеризуется усиление альтеративных процессов, сопровождающихся ростом клеточных некрозов и тяжести дистрофии.
Введение соединения (1) в дозе 50 мг/кг мышам с карциномой Льюис уменьшает тяжесть некробиотических повреждений тканей, вызванных развитием опухоли, в то время как морфологическая картина в референсной группе обусловлена усилением степени всех альтеративных процессов (дистрофии, некрозы).
Противовоспалительную активность соединения (1) оценивали по снижению воспалительного отека лапы мышей, вызванного субпланарным введением 0,1% раствора гистамина. Соединение (1) в виде водно-твиновой взвеси вводили в желудок в дозе 20 мг/кг за 1 час до флогогена. Референсный препарат индометацин (Fluka) вводили аналогично в той же дозе. Величину отека определяли через 6 час после введения соединения по разности в массе воспаленной и здоровой лап. Установлено, что заявленное соединение обладает умеренной противовоспалительной активностью, которая в 1,5 раза меньше, чем у нестероидного противовоспалительного средства индометацина (см. табл.4).
Таким образом, новое соединение - N-[3-оксо-лупано-28-ил]-пиперидин формулы (1) можно рассматривать как перспективное средство, обладающее противоопухолевым, антиметастатическим, противовоспалительным и цитопротекторным действием, направленным на снижение некробиотических нарушений в тканях, вызванных паранеопластическими процессами и цитостатической полихимиотерапией.
К преимуществам заявляемого соединения следует отнести:
- умеренную противоопухолевую и выраженную антиметастатическую активность;
- способность снижать выраженность некробиотических повреждений нетрансформированных клеток, обусловленных паранеопластическими процессами;
- выраженное цитопротекторное действие при применении на фоне цитостатической полихимиотерапии;
- отсутствие стимулирующего влияния на пролиферацию и диссеминацию опухоли при цитостатической полихимиотерапии;
- наличие противовоспалительной активности.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение луп-20(29)-ен-3β,28-диола-бетулина (4).
Измельченную кору березы (344 г) кипятят в бензоле (1.6 л) с обратным холодильником 8 ч, далее горячий раствор декантируют. В оставшуюся кору добавляют еще 1 л бензола, кипятят 1 ч, горячий раствор снова декантируют. Выпавший из бензола осадок отфильтровывают, высушивают и получают 52 г бетулина-сырца. После перекристаллизации в изопропаноле получают 38 г бетулина с т.пл. 260-262°С (лит.т.пл. 258-260°С [Hayek E.W.H., Jordis U., Moche W., Sauter F. // Phytochem. 1989, 28, P.2229]). Выход бетулина на исходную кору составляет 11%.
Пример 2. Получение лупан-3β,28-диола - дигидробетулина (3).
Гидрирование бетулина (4) проводят аналогично известной методике [Ruzicka L., Brener M., Rey E. // Helv. Chim. Acta, 1941, 24, P.515-529]. В 5 л автоклав с мешалкой помещают 132 г бетулина (4), 13.2 г N(1)-Ренея и 2.5 л этанола, далее все перемешивают в атмосфере водорода (100 атм) при 180°С в течение 14 ч. Освобождаются от катализатора горячим фильтрованием в диоксане, после отгонки растворителя получают 124 г дигидробетулина (3) (выход - 93%). Т.пл. 282-284°С (из спирта). Лит.т.пл. 278-280°С [Ruzicka L., Brener M., Rey E. // Helv. Chim. Acta, 1941, 24, P.515-529].
Пример 3. Получение 3-оксо-лупан-28-овой кислоты - дигидробетулоновой кислоты (2).
2
4
2
1
13
Суспензию 10 г (22.5 ммоля) дигидробетулина (3) в 165 мл ледяной уксусной кислоты и 110 мл ацетона охлаждают при 0°С, и в течение 1 ч при перемешивании прибавляют свежеприготовленный раствор Физера (11 г, 0.11 моля хромового ангидрида в 12 мл ледяной уксусной кислоты и 15 мл НО). Выдерживают при комнатной температуре 3 ч. По окончании реакции добавляют 50 мл метанола, прибавляют 300 мл бензола и 300 мл 10% раствора NaCl. Бензольный слой отделяют, а водный экстрагируют 2×150 мл бензола. Объединенные экстракты промывают 3×200 мл 10% раствором NaCl, сушат MgSO, осушитель отфильтровывают, бензол отгоняют приблизительно до 100 мл и выливают в 200 мл 5% раствора КОН. Осадок калиевой соли дигидробетулоновой кислоты (2) отфильтровывают и высушивают. Сухую соль растворяют в 50 мл этанола, не растворившуюся часть отфильтровывают, фильтрат выливают в 250 мл 5% раствор НСl. Выделившуюся кислоту (2) отфильтровывают, промывают НO, высушивают. В итоге получают 5.5 г (54% от теории) дигидробетулоновой кислоты (2). Точка плавления и спектры ЯМР Н и С соответствуют литературным [Wahab A., Ottosen M., Bachelor F.W. // Can.J.Chem., 1991, 69, P.570-577].
Пример 4. Получение N-[3-оксо-лупано-28-ил]-пиперидина (1).
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
35
57
2
D
3
18a,13a
18a,19
5а,6a
5a,6е
12e,12a
20,19
16е,16а
16e,15a
16e,15e
19.18a
19,21a
19,21β
19,20
2а,2е
2е,1a
2e,1e
2a,2e
2a,1a
2a,1e
13a,12a
13a,18a
13a,12e
-1
22
1
29
30
25
27
26
24
23
12a
15e
22a или 22β
18a
5a
4'
12e
20
22α или 22β
16e
19
20a или 2e
2a или 2e
13a
2'
6'
13
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
4'
3',5'
2',6'
К раствору 0.48 г (1.05 ммоля) дигидробетулоновой кислоты (2) в 40 мл безводного СНСl добавляют 0.3 мл (3.44 ммоля) оксалилхлорида и выдерживают при комнатной температуре 4 ч. После отгонки растворителя к остатку прибавляют два раза по 20 мл СНСl и столько же раз упаривают. Хлорангидрид сразу же вводят в дальнейшую реакцию. К раствору 0.5 г (1.05 ммоля) хлорангидрида дигидробетулоновой кислоты (2) в 40 мл сухого СНСl при перемешивании прибавляют 0.19 г (2.2 ммоля) пиперидина. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 18-20 ч, затем разбавляют CHCl до 100 мл, промывают 3×20 мл НО, высушивают MgSO, осушитель отфильтровывают, растворитель отгоняют. Остаток перекристаллизовывали в изопропиловом спирте, получают 0.40 г (71%) продукта с т.пл. 254-255°С. Найдено (%): С, 80.26; Н, 10.90; N, 2.73. СНNO. Вычислено (%): С.80.25; Н 10.97; N, 2.67. ИК-спектр (КВr), v/см: 1629 (CON); 1708 (С=O). [α] =-31.8 (С 0.18). Спектр ЯМР Н (СОСl, δ, м.д.,.J/Гц): 0.68 (д, 3Н, Н, J=6.8); 0.78 (д, 3Н, Н, J=6.8); 0.88 (с, 3Н, Н); 0.89 (с, 3Н, Н); 0.92 (с, 3Н, Н); 0.96 (с, 3Н, Н); 1.01 (с, 3Н, Н); 1.02-1.12 (м, 3Н, Н, H, Н); 1.22 (дд, 1Н, Н, J=10.8, J=10.8); 1.26 (дд, 1Н, Н, J=11.7, J=2.7); 1.58 (м, 2Н, Н); 1.63 (дм, 1Н, Н, J=11.0); 1.72 (септет д, 1Н, Н, J=6.8, J=2.7); 1.82-1.90 (м, 1Н, Н; 2.07 (ддд, 1Н, Н, J=13.0, J=3.6, J=3.0); 2.16 (дддд, 1Н, Н, J=10.8, J=10.2, J=4.0, J=2.7); 2.34 (ддд, 1Н, Н, J=15.5, J=7.5, J=4.4); 2.44 (ддд, 1Н, H, J=15.5, J=9.7, J=7.6); 2.94 (ддд, 1Н, Н, J=12.7, J=10.8, J=3.7); 3.43 (уш.с, 2Н, Н); 3.47 (уш.с, 2Н, Н). Сигналы остальных протонов (16Н) наблюдаются в области 1.28-1.52 м.д. Спектр ЯМР С, δ, м.д.: 39.48 т (С), 33.97 т (С), 217.92 с (С), 47.14 с (С) 54.90 д (С), 19.49 т (С), 33.63 т (С), 40.45 с (С), 49.83 д (С), 36.74 с (С), 21.57 т (С), 27.02 т (С), 36.57 д (С), 41.88 с (С), 29.73 т (С), 32.17 т (С), 54.89 с (С), 52.21 д (С), 42.67 д (С), 29.66 д (С), 23.39 т (С), 35.98 т (С), 26.44 к (С), 20.85 к (С), 15.77 к (С), 15.77 к (С), 14.27 к (С), 173.27 с (С), 14.52 к (С), 22.77 к (С), 24.62 т (С), 26.06 т (С). Сигналы (С) сильно уширены и наблюдаются в области 46.2 м.д.
Пример 5. Изучение противоопухолевого действия соединения (1) на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюис.
6
Противоопухолевое действие N-[3-оксо-лупано-28-ил]-пиперидина (1) исследовали на мышах самках линии C57BL/6 массой 25-30 г, которым перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномы легких Льюис в объеме 2×10опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. Через 10 дней после перевивки мышей делили на 3 группы (по 10 особей в каждой). Опытной группе мышей ежедневно в течение 8 дней вводили внутрижелудочно соединение (1) в виде водно-твиновой взвеси в дозе 20 мг/кг (по 0,2 мл на 10 г массы тела). Эталоном эффекта являлась группа животных, которым проводилась цитостатическая полихимиотерапия (ПХТ) по стандартной схеме АСОР, адаптированной для мышей: однократное парентеральное введение циклофосфана (50 мг/кг), доксорубицина (4 мг/кг), винкристина (0,1 мг/кг) и преднизолона (5 мг/кг). Контролем являлись животные с опухолью. Контроль и референсная группа с полихимиотерапией получали в течение 8 дней водно-твиновую взвесь. В период введения агентов во всех группах оценивали динамику роста опухоли путем измерения ее размеров штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных отношениях. Величину противоопухолевого эффекта определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО) как разность средних размеров опухолей в контрольной и опытной группах, отнесенная к среднему размеру опухолей в контроле.
В таблице 1 приведены абсолютные и относительные размеры опухолевых узлов во время введения агента. Относительные значения объемов опухоли (в процентах от их фоновых значений в группе) позволяют более корректно сравнивать результаты между опытной и референсной группами, так как фоновые размеры опухолей (до введения агента) в них могут отличаться. Установлено, что соединение (1) вызывает умеренное торможение роста опухолевого узла: максимальный эффект наблюдался в конце курсового введения в виде 1,5-кратного уменьшения опухоли относительно контроля. В референсной группе в эти сроки отмечалась 2-кратная разница с контролем (см. табл.1).
Показано, что в опытной группе показатель торможения роста опухоли (ТРО) в начале курсового введения соединения (1) отстает, а в конце приближается к показателю референсной группы (см. табл.2).
Сделан вывод о том, что внутрижелудочное введение соединения (1) в течение 8 дней в дозе 20 мг/кг вызывает умеренное торможение роста карциномы легких Льюис, по сравнению с цитостатической ПХТ АСОР.
Пример 6. Изучение антиметастатического действия соединения (1) на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Антиметастатические свойства соединения (1) изучали на мышах самках линии C57BL/6 массой 25-30 г с солидной карциномой легких Льюис в условиях эксперимента, описанного в примере 5. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали легкие и после стандартной гистологической обработки исследовали методом световой микроскопии. Антиметастатический эффект определяли с помощью световой микроскопии срезов обеих долей легких. Площадь метастазов определяли с помощью программы «Видео-Тест». Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ)
,
к
к
где А - частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, В - площадь метастазов у животных контрольной группы, В - площадь метастазов у животных опытной группы.
Установлено, что соединение (1) заметно уменьшает площадь метастазов опухоли в легких (в 4 раза относительно контроля). Введение химиотерапевтических препаратов АСОР уменьшает количество метастатических поражений в 6 раз и несколько снижает частоту метастазирования (см. табл.3). Несмотря на то, что заявленное соединение уступает по активности цитостатической химиотерапии, выраженность антиметастатического эффекта в опытной группе свидетельствует о значимом антиметастатическом эффекте соединения (1). На это указывает и высокое значение индекса ИИМ.
Таким образом, установлено, что соединение (1) не стимулирует диссеминацию опухоли, проявляя значимый антиметастатический эффект.
Пример 7. Исследование противовоспалительной активности соединения (1) на модели гистаминового воспаления.
Противовоспалительную активность соединения (1) оценивали по снижению воспалительного отека лапы мышей, вызванного субпланарным введением 0,1% раствора гистамина. Соединение (1) в виде водно-твиновой взвеси вводили в желудок в дозе 20 мг/кг за 1 час до флогогена. Контрольным животным вводили тем же способом водно-твиновую взвесь. Референсным препаратом являлась субстанция индометацина (Fluka) в дозе 20 мг/кг. Величину отека определяли через 6 час после введения агента по разности масс воспаленной и здоровой лап. Для каждого животного рассчитывали индекс воспаления как отношение этой разности к массе здоровой лапы. Различия считали достоверными с вероятностью p<0,05. Для опытной и референсной группы рассчитывали величину отека относительно контроля, который принимали за 100%. За противовоспалительный эффект принимали разность относительной величины отека в контрольной группе и соответствующим значением в опытных группах.
Установлено (см. табл.4), что заявляемое соединение обладает умеренной противовоспалительной активностью. По выраженности эффекта он уступает индометацину в 1,5 раза.
Таким образом, заявляемое соединение обладает умеренной противовоспалительной активностью.
Пример 8. Влияние соединения (1) на паранеопластические нарушения в печени мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Влияние соединения (1) на патоморфологические нарушения, вызванные опухолевым ростом, изучали на 3 группах мышей самок линии C57BL/6, которым перевивали внутримышечно солидную карциному легких Льюис, как указано выше. Через 10 дней после перевивки опытной группе в течение 8 дней вводили внутрижелудочно соединение (1) в виде водно-твиновой взвеси в дозе 20 мг/кг, референсной группе проводили однократную ПХТ по схеме АСОР, как указано выше. Контролем являлись животные с опухолью, в качестве физиологической нормы брали группу интактных животных без опухоли. Контрольные животные и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество водно-твиновой взвеси. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень, фиксировали ее в 4% параформе, с последующей стандартной гистологической обработкой на комплексе «MICROM». Срезы толщиной 3-4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином с последующим исследованием методом микроскопии в проходящем свете. Степень поражения печени оценивали по следующим критериям:
наличие дистрофий (жировая, гиалиново-капельная, гидропическая и баллонная) и некрозов гепатоцитов (моноцеллюлярные, очаговые, сливные, мостовидные), их размеры и локализация. Также оценивали степень полнокровия, вид клеточной инфильтрации синусоидов, портальных трактов, расширение синусоидов, желчных протоков, метастазы, их размер, локализация. На основании анализа данных вычисляли показатель морфологических изменений печени, соответствующий легкой, средней, тяжелой степени повреждения (Муратов А.В., Сухоруков В.П., 2002).
По сравнению с интактными, практически у всех контрольных животных выявлена умеренно выраженная мелкоочаговая гидропическая дистрофия преимущественно в центролобулярных зонах. Фокальные коагуляционные клеточные некрозы развились в основном вокруг мелкоочаговых метастазов в перипортальных зонах. У всех животных наблюдались множественные диффузные клеточные и мелкоочаговые синусоидальные метастазы без четкой локализации, а также перипортальные мелкоочаговые метастазы, не выходящие за пределы пограничной пластинки. Опухолевые клетки находились в активном митотическом делении. В просвете синусоидов на фоне умеренно выраженного венозного полнокровия выявлялись увеличенные в размере купферовские клетки с липидными гранулами, умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов, свидетельствующая о воспалительном процессе. Также у всех животных отмечалось незначительное зональное расширение желчных протоков.
Таким образом, у контрольных животных с карциномой легких Льюис на фоне метастатического поражения печени развился неспецифический реактивный гепатит с превалированием дистрофического поражения и макрофагальной инфильтрацией над некротическими изменениями гепатоцитов.
В референсной группе с ПХТ наблюдались признаки токсического повреждения в виде выраженного синдрома регенераторно-пластического дефицита. По сравнению с контролем в гепатоцитах у всех животных отмечалось увеличение площади и степени дистрофического поражения в виде диффузной мелко- и средневезикулярной липидной инфильтации, крупноочаговой гидропической и баллонной дистрофии.
По сравнению с контрольной группой визуально также отмечалось и увеличение площади некрозов гепатоцитов. Моноцеллюлярные (коагуляционные) некрозы гепатоцитов локализовались по периферии метастатических очагов и в центролобулярных отделах долек. Мелкоочаговые некрозы гепатоцитов локализовались как в перипортальных, так и в центролобулярных зонах. Перипортально у всех животных выявлялись гигантские клетки с пенистой цитоплазмой, содержащие бледные тени ядер. У одного животного отмечено сочетание моноцеллюлярных фокальных, крупноочаговых, мостовидных некрозов, инфильтрированных полиморфноядерными лейкоцитами и макрофагами.
У половины животных выявлено зональное, а у остальных диффузное расширение синусоидов. В просвете синусоидов определялись увеличенные купферовские и клетки с липидными включениями в цитоплазме, макрофаги, клеточный детрит, а также гомогенная субстанция бледно-розового цвета (фибрин). У всех животных, так же, как и в контроле, диффузные клеточные метастазы локализовались преимущественно в синусоидах, а мелкоочаговые как в центролобулярных, так и в перипортальных зонах.
Введение соединения (1) животным-опухоленосителям привело к уменьшению степени тяжести синдрома регенераторно-пластического дефицита. В гепатоцитах выявлялась преимущественно фокальная мелковезикулярная липидная инфильтрация и лишь у отдельных животных мелкоочаговая гидропическая дистрофия. Моноцеллюлярные коагуляционные некрозы гепатоцитов локализовались, в основном, по периферии мелкоочаговых метастазов в перипортальных зонах. В синусоидах на фоне незначительного венозного полнокровия выявлялись преимущественно купферовские клетки и небольшое количество липидсодержащих клеток. У всех животных, так же, как и в контроле, диффузные клеточные метастазы локализовались в синусоидах, а мелкоочаговые как в центролобулярных, так и в перипортальных зонах.
Таким образом, введение соединения (1) в дозе 50 мг/кг мышам с карциномой Льюис уменьшает тяжесть некробиотических повреждений тканей, вызванных развитием опухоли, в то время как морфологическая картина в референсной группе обусловлена усилением степени всех альтеративных процессов (дистрофии, некрозы).
Пример 9. Изучение влияния соединения (1) на противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Мышей самок линии C57BL/6 делили на 3 группы по 10 особей в каждой. Всем животным перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномой легких Льюис, как указано выше. Через 10 дней после перевивки двум группам животным вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР: доксорубицин (4 мг/кг), циклофосфан (50 мг/кг), винкристин (0,1 мг/кг), преднизолон (5 мг/кг). Одной из этих групп через сутки после полихимиотерапии вводили внутрижелудочно соединение (1) в виде водно-твинового взвеси по 0,2 мл на 10 г массы тела в дозе 20 мг/кг, вторая группа с ПХТ АСОР являлась референсной. Контролем являлись животные с опухолью. Введение соединения (1) опытным мышам продолжали 8 дней. Контроль и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество воды с твином. Величину противоопухолевого эффекта определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО) как разность средних размеров опухолей в контрольной и опытной группах, отнесенную к среднему размеру опухолей в контроле.
В таблице 5 показана динамика роста опухоли в процессе лечения. Представлены абсолютные и относительные (в % относительно фона) значения объема трансплантатов, позволяющие нивелировать разницу в их размерах до лечения. Установлено, что соединение (1), вводимое на фоне ПХТ, не стимулирует развития опухоли: в опытной и референсной группах наблюдался достоверный противоопухолевый эффект относительно контроля.
В результате сравнительной оценки размеров опухолевых трансплантатов в опытной и референсной группах показано, что их абсолютные значения не имели достоверных различий (см. табл.5). Относительные размеры опухолей несколько отличались вследствие различий в фоновых показателях (табл.5).
Показатели торможения роста опухоли в опытной и референсной группах не имели существенных различий (см. табл.6). Уменьшение индекса ТРО, выявленное на 4-е сутки в референсной группе, связно с высоким фоновым значением размеров опухоли в группе ПХТ (табл.5).
Результаты эксперимента свидетельствуют о том, что при введении на фоне ПХТ соединение (1) не стимулирует пролиферацию опухоли и не оказывает существенного влияния на противоопухолевую эффективность химиопрепаратов.
Пример 10. Изучение влияния соединения (1) на антиметастатический эффект цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Антиметастатические свойства изучали на мышах самках линии C57BL/6 массой 25-30 г с солидной карциномой легких Льюис в условиях эксперимента, описанного в примере 5. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали легкие и после стандартной гистологической обработки исследовали методом световой микроскопии. Антиметастатический эффект определяли путем анализа срезов обеих долей легких. Площадь метастатических очагов определяли с помощью программы «Видео-Тест». Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ) [Архипов С.А. и др., 1984]
к
к
где А - частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, В - площадь метастазов у животных контрольной группы, В - площадь метастазов у животных опытной группы.
Установлено, что в обеих группах с введением цитостатических препаратов наблюдается достоверное снижение площади метастазов по сравнению с контролем (см. табл.7). Химиотерапия сама по себе вызывает 6-кратное уменьшение площади метастазов и несколько снижает частоту метастазирования относительно контроля (табл.7). Введение соединения (1) на фоне ПХТ приводит к более значительному сокращению площади метастатических поражений - в 9 раз, но не влияет на частоту метастазирования. В результате выраженность антиметастатического эффекта в обеих группах практически одинакова, о чем свидетельствуют близкие значения ИИМ.
Таким образом, при комбинированном введении соединения (1) и противоопухолевых препаратов, имитирующих полихимиотерапию, не усиливается диссеминация опухоли, антиметастатическое действие химиотерапии сохраняется.
Пример 11. Изучение цитопротекторных свойств соединения (1) в условиях цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.
Цитопротекторные свойства соединения (1) изучали путем патоморфологического исследования печени мышей с перевитой карциномой легких Льюис после проведения ПХТ. Условия эксперимента описаны в примере 5. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень, фиксировали ее в 4% параформе, с последующей стандартной гистологической обработкой на комплексе «MICROM». Срезы толщиной 3-4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином с последующим исследованием методом микроскопии в проходящем свете. Степень поражения печени оценивали по следующим критериям: наличие дистрофий (жировая, гиалиново-капельная, гидропическая и баллонная) и некрозов гепатоцитов (моноцеллюлярные, очаговые, сливные, мостовидные), их размеры и локализация. Также оценивали степень полнокровия, вид клеточной инфильтрации синусоидов, портальных трактов, расширение синусоидов, желчных протоков, метастазы, их размер, локализация. На основании анализа данных вычисляли показатель морфологических изменений печени, соответствующий легкой, средней, тяжелой степени повреждения (Муратов А.В., Сухоруков В.П., 2002).
В результате патоморфологического анализа в печени контрольных животных в условиях прогрессивного опухолевого роста отмечено развитие неспецифического реактивного гепатита, характерными признаками которого являются сочетание синдрома регенераторно-пластического дефицита (дистрофии и некрозы) с наличием метастатического поражения и макрофагальной инфильтрации синусоидов и портальных трактов, а также нарушение кровообращения (венозное полнокровие и утолщение синусоидальных стенок).
Практически у всех животных дистрофические поражения в центролобулярных зонах выявлялась лишь в виде мелкоочаговой гидропической дистрофии. Фокальные коагуляционные клеточные некрозы развились преимущественно вокруг мелкоочаговых метастазов в перипортальных зонах. У всех животных выявлялись множественные диффузные клеточные и мелкоочаговые синусоидальные метастазы без четкой локализации, а также перипортальные мелкоочаговые метастазы, не выходящие за пределы пограничной пластинки. Опухолевые клетки находились в активном митотическом делении. Стенки синусоидов были утолщены с признаками плазматического пропитывания. В просвете синусоидов на фоне умеренно выраженного полнокровия выявлялись увеличенные в размере клетки с липидными гранулами в цитоплазме, умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация портальных трактов. Также у всех животных отмечалось незначительное зональное расширение желчных протоков (см. рис.1).
Сочетание морфологических изменений печени в группе соответствует поражению средней тяжести.
Введение комплекса цитостатиков привело к развитию токсического повреждения в виде выраженного синдрома регенераторно-пластического дефицита. По сравнению с контролем в гепатоцитах у всех животных отмечалось увеличение площади и степени дистрофического поражения в виде диффузной мелко и средневезикулярной липидной инфильтации, очаговой гидропической и баллонной дистрофии (см. рис.2).
По сравнению с контрольной группой визуально также отмечалось и увеличение площади некрозов гепатоцитов. Моноцеллюлярные (коагуляционные) некрозы гепатоцитов локализовались по периферии метастатических очагов и в центролобулярных отделах долек. Мелкоочаговые некрозы гепатоцитов локализовались как в перипортальных, так и в центролобулярных зонах. Перипортально у всех животных выявлялись гигантские клетки с пенистой цитоплазмой, содержащие бледные тени ядер (см. рис.2). У одного животного отмечено сочетание моноцеллюлярных фокальных, крупноочаговых, мостовидных некрозов, инфильтрированных полиморфноядерными лейкоцитами и макрофагами.
У половины животных выявлено зональное, а у остальных диффузное расширение синусоидов. В просвете синусоидов определялись увеличенные купферовские и клетки с липидными включениями в цитоплазме, макрофаги, клеточный детрит, а также гомогенная субстанция, визуально определяемая как фибрин (рис.2), что является показателем нарушения транссинусоидального обмена. У всех животных так же, как и в контроле, диффузные клеточные метастазы локализовались преимущественно в синусоидах, а мелкоочаговые как в центролобулярных, так и в перипортальных зонах. Таким образом, сочетание морфологических признаков в печени животных референсной группы соответствуют тяжелой степени поражения, по сравнению с контролем.
Введение животным соединения (1) на фоне полихимиотерапии оказало выраженное положительное влияние на течение патологического процесса. Под действием (1) отмечалось уменьшение степени тяжести синдрома регенераторно-пластической недостаточности: в гепатоцитах выявлялись единичные мелкие очаги мелковезикулярной липидной инфильтрации и гиалиново-капельной дистрофии, локализующиеся преимущественно в центролобулярных отделах (см. рис.3, 4). Единичные моноцеллюлярные некрозы гепатоцитов и апоптотические тельца (Каунсилмена) локализовались преимущественно вокруг мелкоочаговых метастазов.
Также имело место восстановление просвета синусоидов с заменой инфильтрации липидсодержащих клеток (Ито) купферовскими и мононуклеарными клетками (рис.3). Визуально не отмечалось изменений объема метастатического поражения печени по сравнению с референсной группой.
Таким образом, введение соединения (1) на фоне полихимиотерапии приводит к улучшению морфологических показателей печени, по сравнению с контрольной и референсной группой.
Полученные данные свидетельствуют о том, что заявляемое соединение N-[3-оксо-лупано-28-ил]-пиперидин (1) может применяться как средство, предназначенное для подавления роста и диссеминации опухолевых клеток и коррекции цитотоксических повреждений в тканях при злокачественном росте и цитостатической химиотерапии, оно обладает следующими преимуществами:
- проявляет противоопухолевую и антиметастатическую активность;
- снижает тяжесть цитотоксических изменений в тканях, вызванных паранеопластическими синдромами;
- проявляет выраженный цитопротекторный эффект в условиях цитостатической полихимиотерапии;
- не стимулирует пролиферацию и диссеминацию опухоли при комбинированном введении с химиопрепаратами;
- обладает противовоспалительными свойствами.
Таблица 1
Динамика роста карциномы легких Льюис и выживаемость мышей в период внутрижелудочного введения соединения (1)
Группа
Объем опухоли, см<sup>3 </sup>(и в % относительно фоновых значений)
Сутки после полихимиотерапии
0 (фон)
4
6
8
Контроль
0,62±0,06
2,05±0,17
3,21±0,17
3,64±0,29
0%
230%
418%
487%
ПХТ
0,79±0,13
1,82±0,28
2,42±0,20*
2,68±0,18*
0%
130%
206%
239%
(1), 20 мг/кг
0,67±0,10
1,94±0,16
2,82±0,26
2,85±0,28
0%
190%
321%
325%
*Р<0,05; **Р<0,001; ***Р<0,0001 различия с контролем достоверны
#Р<0,05 различия с группой сравнения достоверны
Таблица 2
Значения индекса торможения роста карциномы легких Льюис (ТРО) у мышей в период введения соединения (1)
Группа
ТРО, % (по объему опухоли)
Сутки после полихимиотерапии
0 (фон)
4
6
8
ПХТ
0
11
25
26
(1), 20 мг/кг
0
5
12
22
Таблица 3
Показатели метастазирования карциномы легких Льюис в легких мышей после 8-дневного введения соединения (1)
Группа
Площадь метастазов (мкм)
Частота метастазирования
ИИМ %
Конт роль
319,78±51,36
100
-
ПХТ
50,66±9,15***
88
86,0
(1)
77,62+25,37***
100
75,7
* Р<0,05, ***Р<0,001 различия с контролем достоверны; ЧМ - частота метастазирования; ИИМ - индекс ингибирования метастазирования.
Таблица 4
Противовоспалительный эффект соединения (1) в модели гистаминового отека лапы
Агент
Индекс воспаления, %
Величина отека относительно контроля, %
Противовоспалительный эффект, %
Контроль
26,±1,8
100
0
(1)
18,9±1,4*
72
28
Индометацин
15,7±0,77*
59
41
**Р<0,01 относительно контроля; ###Р<0,001 относительно референс-препарата
Таблица 5
Изменение динамики роста карциномы легких Льюис и выживаемости мышей под влиянием введения соединения (1) на фоне цитостатической полихимиотерапии (ПХТ)
Группа
Объем опухоли, см<sup>3 </sup>(и в % относительно фоновых значений)
Сутки после полихимиотерапии
0 (фон)
4
6
8
Контроль
0,62±0,06
2,05±0,17
3,21±0,17
3,64±0,29
0%
230%
418%
487%
ПХТ
0,79±0,13
1,82±0,28
2,42±0,20*
2,68±0,18*
0%
130%
206%
239%
ПХТ+(1)
0,66±0,09
1,63±0,20
2,45±0,27*
2,50±0,36*
0%
147%
271%
279%
*Р<0,05; **Р<0,001; ***Р<0,0001 различия с контролем достоверны
Таблица 6
Значения индекса торможения роста карциномы легких Льюис (ТРО) у мышей в период введения соединения (1) на фоне полихимиотерапии (ПХТ)
Группа
ТРО, %
Сутки после полихимиотерапии
4
6
8
ПХТ
11
25
26
ПХТ+(1), 20 мг/кг
21
24
31
Таблица 7
Показатели метастазирования карциномы легких Льюис в легких мышей после 8-дневного введения соединения (1) на фоне полихимиотерапии (ПХТ)
Группа
Площадь метастазов (мкм)
Частота метастазирования
ИИМ %
Контроль
319,78±51,36
100
-
ПХТ
50,66±9,15***
88
86,0
ПХТ+(1)
34,78+3,68***
100
89,1