СПОСОБ ОТБОРА IN VITRO КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ ФОРМ КЛЕВЕРА ЛУГОВОГО
METHOD OF IN VITRO SELECTION OF ACID-RESISTANT FORMS OF CLOVER

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции растений для создания исходного материала клевера лугового с повышенной устойчивостью к кислотности почв, в исследованиях по физиологии и генетике растений.
Известен способ отбора кислотоустойчивых форм клевера лугового методом рулонной культуры [1].
К недостаткам данного способа можно отнести следующее. Способ ограничен отбором кислотоустойчивых форм, но не содержит сведений о вегетативном размножении полученных форм и не обеспечивает длительное сохранение ценных кислотоустойчивых форм, что снижает воспроизводимость контролируемых скрещиваний и проведение генетических исследований признака кислотоустойчивости у такого строгого перекрестноопыляемого растения, как клевер луговой.
В литературе имеются сведения о способе отбора кислотоустойчивых форм клевера лугового по рН клеточного сока [2].
К недостаткам данного способа следует отнести то, что он не содержит сведения о микроразмножении ценных кислотоустойчивых генотипов клевера лугового. Это не позволяет длительно сохранять отобранные формы.
5
В литературе имеются сведения о способе регенерации морфогенной ткани клевера лугового из эпикотилей на селективной среде Гамборга В с канамицином в процессе генетической трансформации [3].
К недостаткам этого способа можно отнести следующее. Канамицин, используемый в качестве селективного фактора, не пригоден для отбора кислотоустойчивых форм. Для регенерации при генетической трансформации используют только генотипы с высокой регенерационной способностью.
Цель изобретения - разработка метода отбора in vitro кислотоустойчивых генотипов клевера лугового.
5
3+
3+
3+
В предлагаемом способе поставленная цель достигается тем, что морфогенную культуру клевера лугового получают путем проращивания семян и культивирования полученных проростков на питательной агаризованной среде Гамборга В с 2,0 мг/л 6-бензиламинопурина и 100 мг/л Al при субкультивировании на среду того же состава, но без Al эпикотилей проростков, образовавших корешки не менее 4-5 мм на селективной среде с 100 мг/л Аl, а оценку кислотоустойчивости проводят по длине образовавшихся через 3-4 недели корней.
На фиг. 1 изображены растения клевера лугового в вегетационном опыте на почвах с нормальной и повышенной кислотностью.
3+
3+
5
Способ осуществляется следующим образом: из сортообразцов клевера лугового с низкой устойчивостью к почвенной кислотности проводили отбор in vitro генотипов, выдерживающих концентрацию 100 мг/л Аl в питательной среде Гамборга В с селективным фактором Аl в концентрации 100 мг/л. Среду и соль алюминия стерилизовали раздельно автоклавированием в течение 30 минут при 1,25 атм., а затем смешивали в стерильных условиях до застывания среды.
Эпикотили проростков клевера лугового, образовавшие через 7-10 дней в селективных условиях корешки длиной не менее 4-5 мм, пересаживали на свежую агаризованную питательную среду того же состава, но без ионов алюминия. При этом в качестве кислотоустойчивых растений клевера лугового отбирали растения с длиной корней не менее 50 мм.
Пример 1.
3
5
2
3+
3+
3+
Проводили отбор in vitro из F потомства 4-х клонов клевера лугового на селективной среде со 100 мг Аl на 1 литр агаризованной среды Гамборга В. Для отбора in vitro использовали сортообразцы клевера лугового с низкой (30 - ВИК7, Т - Трио, К7 - Кретуновский) и повышенной (Топ - Топаз) устойчивостью к почвенной кислотности (табл. 1). Для чего скарифицированные асептические семена после их набухания помещали на селективную среду со 100 мг Аl на 1 л среды и на среду того же состава без Аl (контроль).
3
2
2
3+
В табл. 1 представлены результаты изучения кислотоустойчивости in vitro F потомства четырех клонов клевера лугового, различающихся по степени полевой кислотоустойчивости на почвах с 10-15 мг подвижного алюминия в 100 г воздушно-сухой почвы и рН 3,6-4,0. В условиях in vitro устойчивость к Аl по отношению к контролю (вариант без алюминия) составляла у Топ - 87,2%; К7 - 56,5%; Т - 37,5%; 30-23,9% и к стандарту Топ (st) - 100%; К7 - 71,3%; Т - 43,8%; 30-18,0%.
2
5
3+
Среди вариантов К7, Т и 30 были отобраны проростки клевера лугового, контрастные по корнеобразовательной способности (с корешками длиной не менее 4-5 мм, менее 4-5 мм и без них) после 7-10 дней культивирования на селективной среде. Эпикотили отобранных проростков субкультивированы на свежую агаризованную среду Гамборга В того же состава, но без добавления Аl (в связи с токсическим последействием трехвалентного алюминия при последующем пассаже).
Через 3-4 недели культивирования оценку кислотоустойчивости проводили по длине образовавшихся корней (табл. 2). При этом в качестве кислотоустойчивых растений клевера лугового отбирали растения с длиной корней не менее 50 мм.
Пример 2.
3+
Проводили сравнительную оценку в вегетационном опыте кислотоустойчивости растений исходного клона клевера лугового (Кретуновский) и растений-регенерантов клона (К7) на почвах с нормальной и повышенной кислотностью (табл. 3). Наибольшее токсическое действие ион алюминия (Аl) оказывал на корневую систему. При этом масса корней более чем в 3 раза у прошедших отбор in vitro растений-регенерантов клона К7 превышали таковую у исходных растений (Кретуновский). Тогда как длина корней снижалась на почвах с повышенной кислотностью в среднем не более чем на 10%. По длине и массе побегов отобранные растения-регенеранты превосходили контрольные в среднем на 20%.
1. Отбор in vitro кислотоустойчивого F3 потомства различных образцов клевера лугового
2. Регенерационная способность in vitro F3 потомства различных образцов клевера лугового
3. Кислотоустойчивость растений клевера лугового в вегетационном опыте на почвах с нормальной и повышенной кислотностью
На фиг. 1 представлены: 1 - исходное растение клевера лугового сортоообразца Кретуновский, выращенное на почве с нормальной кислотностью; 2 - растение-регенерант клевера лугового (К7), выращенное на почве с нормальной кислотностью после отбора in vitro; 3 - растение-регенерант клевера лугового (К7), выращенное на почве с повышенной кислотностью (рН 3,6-3,8); 4 - исходное растение клевера лугового сортоообразца Кретуновский, выращенное на почве с повышенной кислотностью (рН 3,6-3,8).
Растения-регенеранты (К7), прошедшие отбор in vitro, имеют хорошо развитую корневую систему как при выращивании на почвах с нормальной кислотностью (2), так и на почвах с повышенной кислотностью (3), тогда как корневая система у исходного растения сортоообразца Кретуновский (4) значительно меньше развита на почве с повышенной кислотностью, чем у исходного растения (1), выращенного на почве с нормальной кислотностью.
3+
Таким образом, предлагаемый способ отбора in vitro кислотоустойчивых форм клевера лугового позволяет получать кислотоустойчивые генотипы. Проводить их микроразмножение до необходимого количества, создавать длительно сохраняемые in vitro коллекции ценных генотипов, на их основе проводить скрещивания в различных комбинациях и получать селекционные образцы с повышенной устойчивостью к кислотности на почвах с 10-15 мг Аl в 100 г воздушно-сухой почвы и рН 3,6-3,8.
Источники информации
1. Онучина О.Л., Тумасова М.И. Методы и результаты селекции клевера лугового на повышенную кислотоустойчивость // Кормопроизводство. - 2007. - №4. - с. 27-28.
2. Пат. 2138154 РФ, МПК А01Н 1/04. Способ отбора кислотоустойчивых форм клевера лугового / Новоселов М.Ю., Пайвин С.Г. (РФ) - №9810620/13; заявлено 15.01.1998; опубл. 27.09.1999. - Бюл. №27. - 5 с.
3. Пат. 2305931 РФ, МПК А01Н 4/00, А01Н 5/00, A01G 7/00. Способ регенерации растений клевера лугового при генетической трансформации / Солодкая Л.А., Агафодорова М.Н., Куренина Л.В., Лапотышкина Л.И. (РФ) - №2005117826/13; заявлено 09.06.2005; опубл. 20.09.2007. - Бюл. №26. - 6 с.