Способ диагностики активности воспалительных заболеваний кишечника на основе совокупности электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов
METHOD FOR DIAGNOSING THE ACTIVITY OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASES BASED ON A COMBINATION OF ELECTRICAL AND VISCOELASTIC PARAMETERS OF ERYTHROCYTES

Изобретение относится к способу диагностики активности воспалительных заболеваний кишечника и может быть использовано в медицине, в частности в гастроэнтерологии для диагностики заболеваний кишечника.
Актуальность исследования воспалительных заболеваний кишечника (ВЗК), к которым относится болезнь Крона (БК) и неспецифический язвенный колит (НЯК) обусловлена их высокой социальной значимостью: во всем мире отмечается рост заболеваемости, поражаются преимущественно молодые люди, в большинстве случаев патология протекает тяжело, резко снижая качество жизни, часто приводит к осложнениям и потере трудоспособности, требует огромных затрат на лечение. В ближайшие десятилетия прогнозируется эпидемиологический взрыв ВЗК в Восточной Европе, Азии, в России [Воспалительные заболевания кишечника. Клинические, эндоскопические, морфологические аспекты диагностики. Принципы современной терапии. / Головенко О.В. [и др.]. - М.: Прима Принт, 2017. - 180 с.: ил. - ISBN 978-5-9907557-3-4.].
При верификации диагноза ВЗК одной из важных рубрик является тяжесть настоящей атаки заболевания, которая соответствует понятию «активность» в зарубежной практике. Все системы оценки тяжести атаки называются индексами активности. Термины «клиническая активность» и «тяжесть обострения» эквивалентны, неактивный процесс соответствует ремиссии заболевания. Данный аспект является весьма важным, поскольку он определяет тактику лечения пациента.
Однозначных диагностических критериев БК, НЯК не существует, диагноз выставляется на основании сочетания данных анамнеза, клинической картины и типичных эндоскопических и гистологических изменений ["Клинические рекомендации "Язвенный колит" (утв. Минздравом России) // Российская гастроэнтерологическая ассоциация - Ассоциация колопроктологов России (год утверждения 2020) https://legalacts.ru/doc/klinicheskie-rekomendatsii-iazvennyi-kolit-utv-minzdravom-rossii/; Клинические рекомендации по диагностике и лечению болезни Крона у взрослых (Проект). Колопроктология, том 19, №2, 2020, с. 8-38 https://doi.org/10.33878/2073-7556-2020-19-2-8-381. Синдром эндотоксемии, метаболические расстройства, ассоциированные с ВЗК, сопровождаются изменениями параметров клеток красной крови.
Несмотря на масштабные попытки исследований данной патологии, существуют пробелы в знаниях для полного понимания патогенеза ВЗК. Проведение ранней диагностики по-прежнему является сложной задачей, отсутствуют биомаркеры для быстрого и точного дифференцирования пациентов ВЗК с точки зрения, статуса заболевания (активный и неактивный) и подтипов (болезнь Крона и НЯК) [Soubieres А.А., Poullis A. Emerging Biomarkers for the Diagnosis and Monitiring of Inflammatory Bowel Diseases. Inflamm. Bowel Dis. 2016, 22, 2016-2022; Sandborn WJ, Feagan BG, Hanauer SB, Lochs H, et al. A review of activity indices and efficacy endpoints for clinical trials of medical therapy in adults with Crohn's disease. Gastroenterology 2002; 122:512-30.].
Предшествующий уровень техники. В настоящее время для диагностики ВЗК широко и гибко используются в сочетанном виде следующие основные методы.
Клиническо-эндоскопические - используют индексы:
- активности Беста, индекс активности болезни Крона (ИАБК) [Best WR, Becktel JM, Singleton JW, Kern F Jr. Development of a Crohn's disease activity index. National Cooperative Crohn's Disease Study. Gastroenterology. 1976 Mar; 70(3):439-44.]. Индекс эндоскопической активности БК (CDAI), в соответствии с которым выделяют легкую, среднетяжелую и тяжелую активную фазу, индекс клиники Мейо ["Клинические рекомендации "Язвенный колит" (утв. Минздравом России) // Российская гастроэнтерологическая ассоциация - Ассоциация колопроктологов России (год утверждения 2020) https://legalacts.ru/doc/klinicheskie-rekomendatsii-iazvennyi-kolit-utv-minzdravom-rossii/], критерии, разработанные Обществом по изучению ВЗК [Белоусова Е.А. Рекомендации по диагностике и лечению болезни Крона. Фарматека. 2009; №13, с. 38-44.], критерии Truelove-Witts [Truelove SC et al. Cortisone in ulcerative colitis; final report on a therapeutic trial. Br Med J. 1955; 2: 1041 - 8.]. Последние включают показатели частоты дефекаций с кровью, частоты пульса, температуры тела, уровень гемоглобина, скорость оседания эритроцитов, контактную ранимость слизистой оболочки толстой кишки.
- парциальный индекс (или неполная шкала Мейо), Харви-Брэдшоу [Torres J, Bonovas S, Doherty G, Kucharzik T, et al. ECCO Guidelines on Therapeutics in Crohn's Disease: Medical Treatment. Journal of Crohn's and Colitis. 2020; 4(1): 4-22.], которые состоят только из клинических параметров: общего самочувствия, боль в животе, количества жидкого стула в день, массы живота, осложнения, каждому из которых присваивается определенное количество баллов.
Эндоскопические - используют индекс эндоскопической активности БК (SES CD) [Mary J.Y., Modigliani R. Development and validation of an endoscopic index of the severity for Crohn's disease: a prospective multicentre study. Groupe d, Etudes Therapeutiques des Affections Inflammatores du Tube Digestif (GETAID). Gut 1989; 30(7): 983-9.], он предполагает детализацию картины поражения (наличие глубоких и поверхностных изъязвлений, протяженность поражения, в том числе, с язвенными дефектами), которая затем ранжируется по баллам. Ремиссия соответствует индексу от 0 до 3 баллов, более 3 - активность разной степени. Данный индекс позволяет оценить лишь эндоскопическую картину, не учитывая клинических, биохимических данных.
Используемая в индексе Мейо для диагностики НЯК шкала оценки состояния слизистой оболочки по Schroeder [Schroeder KW, Tremaine WJ, Ilstrup DM. Coated oral 5-aminosalicylic acid therapy for mildly to moderately active ulcerative colitis. A randomized study. N Engl J Med. 1987; 317: 1625 - 9.] предполагает выполнение колоноскопии, которая является «золотым стандартом» в оценке эндоскопической активности, но вместе с тем - дорогостоящей процедурой, ассоциированной с риском развития ряда осложнений (кровотечение, повреждение слизистой, перфорация кишки и др.).
Гистологические - характеризует микроскопические признаки воспаления толстой кишки и используют шкалу Гебса (2000) [Geboes K., Riddel R., Jensfelt В., et al. A reproducible grading scale for histological assessment of inflammation in ulcerative colitis. Gut 2000; 47: 404409], которая представляет собой систему классификации, 4 степеней тяжести и подразделяются на 4 подгруппы в зависимости от степени выраженности патологии. При это степень 0 предполагает ремиссию в состоянии НЯК, а более 0 - различные степени тяжести поражения слизистой. Исследование гистологической активности является важным аспектом в оценке статуса при ВЗК, поскольку целью терапии при данной патологии является достижение гистологической ремиссии.
Для диагностики ВЗК используются биомаркеры, в том числе, фекальный кальпротектин - белок, являющийся продуктом нейтрофильных гранулоцитов, обнаружение которых в кале указывает на воспаление стенки кишки.
Исследование данного показателя позволяет исключить функциональные нарушения в кишке, оценить наличие, степень распространенности и воспаления слизистой оболочки кишечника, контролировать реакцию на терапию [Lewis JD. The utility of biomarkers in the diagnosis and therapy of inflammatory bowel disease. Gastroenterology 2011; 140: 1817-1826.e2 [PMID: 21530748 DOI: 10.1053/ j.gastro.2010.11.058]. Предыдущие исследования показали, что кальпротектин может предсказывать активность заболевания, демонстрируя чувствительность от 70% до 100% и специфичность от 44% до 100%, в зависимости от значения точки разделения уровня данного показателя [D'Haens G, Ferrante М, Vermeire S, Baert F, Noman M, Moortgat L, Geens P, Iwens D, Aerden I, Van Assche G, Van Olmen G, Rutgeerts P. Fecal calprotectin is a surrogate marker for endoscopic lesions in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis 2012; 18: 2218-2224 [PMID: 22344983 DOI: 10.1002/ibd.22917]. Чувствительность фекального кальпротектина выше при заболевании толстой кишки по сравнению с поражением подвздошной кишки [Sipponen Т, , Savilahti Е, Kolho KL, Nuutinen Н, Turunen U,  Correlation of faecal calprotectin and lactoferrin with an endoscopic score for Crohn's disease and histological findings. Aliment Pharmacol Ther 2008; 28: 1221-1229 [PMID: 18752630 DOI: 10.1111/ j.1365-036.2008.03835.x] и больше зависит от эндоскопической активности, чем от степени тяжести заболевания. Последние данные свидетельствуют о том, что фекальный кальпротектин более тесно коррелирует с эндоскопической и симптоматической оценкой при ЯК, чем при БК, даже при исключении пациентов с локализацией процесса только в подвздошной кишке при БК [van de Logt F, Day AS. S100A12: a noninvasive marker of inflammation in inflammatory bowel disease. J Dig Dis 2013; 14: 62-67 [PMID: 23146044 DOI: 10.1111/1751-2980.12012].
Известен способ диагностики заболеваний на основании измерения показателей эритроцитов, например, среднего радиуса и среднего корпускулярного объема эритроцитов (СКОЭ), (MCV) [T. Wetterling, R. Kanitz, H. Rumpf, U. Hapke, and D. Fischer. Comparison of CAGe and MAST with the alcohol markers CDT, {gamma}-GT, ALAT, ASAT and MCV. Alcohol. - 1998, v.33: 424-430], который вычисляется как отношение гематокритного показателя к числу эритроцитов в 1 мкл крови. Достоинством этого показателя является доступность, достаточно высокая чувствительность от 29 до 95%, длительное сохранение на прежнем уровне в период абстиненции.
Известен способ измерения диагностики заболеваний на основании измерения вязкоупругих характеристик эритроцитов и устройство для их измерения в электрическом поле, создаваемым высокочастотным генератором между последовательно установленными электродами [H. Engelhardt, E. Sackrnann. On the measurement of shear elastic moduli and viscosities of erythrocyte plasma membranes by transient deformation in high frequency electric fields. Biophys. J. - 1988, v.54: 495-508]. Способ включает заполнение суспензией клеток рабочего объемы измерительной камеры с последовательно установленными в ней электродами, наложение неоднородного переменного электрического поля на суспензию, компьютерное распознавание максимального размера эритроцита, притянувшегося к электроду, расчет силы растягивающей клетку по модели проводящего эллипсоида.
Известен способ и устройство измерения отдельных параметров эритроцитов, например, деформируемости с помощью продавливания через тонкие капилляры [WO, 02/09583, А2, 30.07.2001; SU, 1462201, 28.02.89]. Способ имеет серьезный недостаток, на основании единственного показателя делать какие-либо выводы затруднительно.
Все выше, перечисленные способы, характеризует высокая трудоемкость и стоимость, ограниченный доступ к оборудованию и реагентам, потребность в обширной номенклатуре реактивов, необходимость специального обучения персонала среднего звена, низкая точность. Точность диагностики ВЗК зачастую зависит от субъективной оценки врача, выраженности синдромов, наличия у пациента сопутствующей патологии, противодействия со стороны пациентов и т.д. Эти факторы накладывают ограничения их применения в диагностике, динамическом наблюдении за пациентом.
Известны способы диагностики заболеваний по показателям эритроцитов.
4
6
Известен способ дифференциальной диагностики заболеваний печени (патент РФ №2296327, МПК G01N33/49, G01N27/00, опубл. 27.03.2007 г.), который заключается в исследовании эритроцитов из суспензии крови здоровых пациентов и пациентов с различными заболеваниями печени (гепатиты и циррозы различной этиологии), измеряют средние скорости движения каждой клетки суспензии, их минимальные, средние и максимальные радиусы через определенные интервалы времени в период воздействия неоднородного переменного электрического поля (НПЭП) с частотой f от 10 кГц до 5 МГц и средней напряженностью Е0 электрического поля в зазоре между электродами в пределах 10-10 Вольт/м и после его отключения. На основании полученных данных определяют вязкоупругие характеристики эритроцитов, из которых формируют массив данных для диагностики заболеваний печени. Затем проводят аналогичные измерения образцов проб эритроцитов пациента с определением вязкоупругих характеристик эритроцитов с последующим сравнением этих характеристик с соответствующими значениями, определенными для различных видов патологии печени. Определяют показатель близости измеряемых характеристик эритроцитов к каждому из имеющихся видов диагноза, по минимальному значению которого делают вывод о наличии той или иной патологии печени.
Указанный способ определяет прогноз заболевания, независимо от этиологии (причины) процесса и требует подтверждения другими более специфическими способами диагностики патологии печени.
5
4
6
4
6
11
13
2
3
4
5
5
6
мин
мах
Известен неинвазивный способ диагностики степени фиброза печени (патент РФ №2567846, МПК G01N33/48, опубл. 10.11.2015 г.), в котором проводят отбор проб эритроцитов пациентов с неясной степенью фиброза, помещают их в 3,65-3,85% цитратный буфер в соотношении 9-10:1-1,5, через интервал времени, равный 10-60 мин, пробы объемом 9,7-12 мкл вносят в 0,25-0,35 молярный раствор сахарозы, разводят с коэффициентом k 0,9-1,1:29-31 и переносят суспензию исследуемых эритроцитов с концентрацией клеток 1,6-1,8⋅10/мкл в измерительную кювету, в кювете формируют неоднородное переменное электрическое поле с частотой f от 5⋅10 Гц до 10 Гц, средней напряженностью Ео электрического поля в зазоре между электродами в пределах от 10 до 10 В/м и градиентом квадрата напряженности  от 10 до 10 в/м, измеряют средние скорости  движения каждой клетки в суспензии и их минимальный диаметр D, средний диаметр D и максимальный диаметр D через определенные интервалы времени в период воздействия электрического поля и после его отключения по истечении времени t от 2 до 4 сек, путем видеозаписи изображения движения клеток и изменения их размера, полученные данные в цифровом виде вводят и обрабатывают в компьютере, имеющем вычислительную программу накопления и обработки данных, в результате чего определяют интервалы значений поляризуемости при 5⋅10 Гц, при 10 Гц, при 5⋅10 Гц, при 10 Гц и интервалы значений относительной поляризуемости, средние значения характеристик xj эритроцитов для данного образца (где j - порядковый номер характеристики от 1 до 13):
1
cp
1
2
n
x=D=(D+D+…+D)/n - средний диаметр клетки,
1
где D - диаметр первой клетки;
2
D - диаметр второй клетки;
n
D - диаметр n-ой клетки;
n - количество клеток;
- скорость поступательного движения клетки в электрическом поле,
где S - расстояние, пройденное клеткой за время t;
- дипольный момент,
кл
где α - поляризуемость клетки;
o
-12
ε - диэлектрическая постоянная 8,85⋅10;
Е - напряженность электрического поля;
4
p1
p
x=ω=(f) - равновесная частота,
- емкость мембраны клетки,
p
p
где ω=(f) - равновесная частота;
м
R - сопротивление мембраны клетки;
cp
R - сопротивление среды;
ср
С - емкость среды;
- электропроводность клетки,
кл
где R - сопротивление клетки;
cp
R - сопротивление среды;
- индекс деструкции клетки,
0
где N - количество клеток в измерительной камере до включения электрического поля;
1
N - количество клеток в измерительной камере после включения электрического поля;
- обобщенный показатель вязкости клетки,
кл
где с - обобщенный показатель жесткости клетки;
и
τ - длительность зондирующего радиоимпульса;
π - постоянная величина, равная 3,14;
кл
r, - радиус клетки в электрическом поле;
m
x - максимальная амплитуда деформации клетки;
- обобщенный показатель жесткости клетки,
кл
где α - поляризуемость клетки;
O
-12
ε - диэлектрическая постоянная, равная 8,85⋅10;
Е - напряженность электрического поля;
кл
r - радиус клетки в электрическом поле;
m
x - максимальная амплитуда деформации клетки;
индекс агрегации клетки,
0
где С - концентрация клеток в измерительной камере до включения электрического поля;
1
C - концентрация клеток в измерительной камере после включения электрического поля;
- максимальная амплитуда деформации клетки, где
- начальный диаметр клетки, до включения НПЭП;
- максимальный диаметр клетки при включенном НПЭП;
- поляризуемость клетки на любой произвольной частоте,
где π - постоянная величина, равная 3,1416;
ср
η, - вязкость среды, в которой находится клетка;
кл
r, - радиус клетки в электрическом поле;
- скорость поступательного движения клетки в электрическом поле;
- градиент квадрата напряженности электрического поля;
O
-12
ε - диэлектрическая постоянная, равная 8,85⋅10;
- относительная поляризуемость клетки (безразмерная величина),
где π - постоянная величина, равная 3,1416;
ср
η, - вязкость среды, в которой находится клетка;
- скорость поступательного движения клетки в электрическом поле;
кл
r, - радиус клетки в электрическом поле;
- градиент квадрата напряженности электрического поля;
o
-12
ε - диэлектрическая постоянная, равная 8,85⋅10;
кл
α - поляризуемость клетки.
Затем сравнивают полученные данные с соответствующими значениями, определенными для группы условно здоровых обследуемых (F0), и при наличии 60% и более отличающихся параметров от группы условно здоровых обследуемых (F0) и входящих в границы интервалов значений, указанных в таблице 1, у больных диагностируют умеренную (F1-F2) степень фиброза печени или выраженную (F3-F4) степень фиброза печени.
Указанный способ определяет прогноз заболевания, независимо от этиологии (причины) процесса и требует подтверждения другими более специфическими способами диагностики степени фиброза печени. Кроме того, недостатком указанного способа диагностики диффузных заболеваний печени является низкая достоверность диагностики заболеваний из-за широкого перечня измеряемых параметров эритроцитов (х1-х13), который является избыточным и маскирует дифференциальную точность искомого результата.
Наиболее близким аналогом по назначению (прототипом) является неинвазивный способ диагностики воспалительных поражений желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), позволяющий проводить специфическое измерение антигена кальпротектина иммуноферментным методом иммунохроматографии (ELISA). [Масевич Ц.Г. Современная фармакотерапия хронических воспалительных заболеваний кишечника / Ц.Г. Масевич, С.И. Ситкин // AquaVitae. - 2001. - №1. - С. 37-41.]. Данный способ недостаточно точен и объективен и требует подтверждения результатов исследования другими способами диагностики.
Раскрытие изобретения
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение специфичности и точности анализа ВЗК на более ранних стадиях с определением вариантов его доклинических проявлений за счет выбора и измерения наиболее значимых электрических и вязкоупругих показателей эритроцитов в сочетании с определением уровня фекального кальпротектина.
4
6
4
6
11
13
2
3
o
Указанный технический результат достигается тем, что в способе диагностики степени активности ВЗК, включающем определение уровня фекального кальпротектина, согласно изобретению, проводят отбор проб эритроцитов пациентов, помещают пробы в 3,65-3.85% цитратный буфер в соотношении 9:1 через 5-20 минут пробу объемом 9-11 мкл вносят в 0,3 М раствор сахарозы объемом 285-295 мкл и перемешивают, полученную клеточную суспензию объемом 5-10 мкл вносят в измерительную ячейку, где в течении 2-5 секунд формируют неоднородное переменное электрическое поле с частотой ƒ 5⋅10-10 Гц и средней напряженностью E электрического поля в зазоре между электродами в пределах 10-10 В/м и  градиентом квадрата напряженности электрического поля 10-10 [В/м] и производят видеозапись поведения клеток в измерительной камере между электродами и его вводят в измерительно-вычислительный комплекс (ИВК) компьютера, далее  производят расчет параметров эритроцитов:
1
cp
1
2
n
х=D=(D+D+…+D)/n - средний диаметр эритроцита,
1
где D - диаметр первой клетки;
2
D - диаметр второй клетки;
n
D - диаметр n-ой клетки;
n - количество клеток.
- скорость поступательного движения эритроцита в электрическом поле,
где S - расстояние, пройденное клеткой за время t.
поляризуемость,
где  - модуль квадрата градиента напряженности электрического поля между электродами измерительной ячейки.
4
p1
p
х=ω=(ƒ) - равновесная частота.
- электропроводность эритроцита.
кл
где R - сопротивление клетки;
cp
R - сопротивление среды;
- обобщенный показатель вязкости эритроцита,
кл
где с - обобщенный показатель жесткости эритроцита;
и
τ - длительность зондирующего радиоимпульса;
π - постоянная величина равная 3,14;
кл
r, - радиус клетки в электрическом поле;
m
x - максимальная амплитуда деформации клетки.
- обобщенный показатель жесткости клетки,
кл
где α - поляризуемость клетки;
O
-12
ε - диэлектрическая постоянная равная 8,85⋅10;
Е - напряженность электрического поля;
кл
r, - радиус клетки в электрическом поле.
m
x - амплитуда деформации клетки;
- максимальная амплитуда деформации клетки,
где  - начальный диаметр клетки, до включения неоднородного переменного электрического поля (НПЭП);
- максимальный диаметр клетки при включенном НПЭП,
затем сравнивают полученные данные с соответствующими значениями уровня фекального кальпротектина и показателями эритроцитов, определенными для группы пациентов условно здоровых без патологий и, при наличии 60% и более отличающихся параметров от группы условно здоровых обследуемых без патологий и входящих в границы значений, указанных в таблице 1 описания, у больных диагностируют активное или неактивное воспалительное заболевание кишечника.
Для забора крови и разработки способа привлекались волонтеры с одобрения Этического Комитета Научно-исследовательского института терапии и профилактической медицины - филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук" (17.12.2018, протокол №120). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266.
Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена блок-схема измерительно-вычислительного комплекса (ИВК) для реализации предлагаемого способа. На фиг. 2 приведена схема измерительной ячейки. На фиг. 3 приведен внешний вид основной формы, представляющей графический пользовательский интерфейс. На фиг. 4 представлен пример результата работы на интерфейсе формы «Предпросмотр».
ИВК включает следующие приборы и устройства (фиг. 1):
- компьютер (1): Процессор Intel Core™ i7 6700K (3,4GHz) Мат. плата Asus Z170 PRO GAMING. Fire Wire/1394; для регистрации потока видеоизображения и обработки потока информации от видеокамеры, расчета характеристик электрического поля в измерительной камере, расчета параметров клетки, хранения видеофайлов и результатов расчета параметров клетки, управления работой (включение/выключение) видеозаписи по заданной программе;
- монитор. (2) 23'' ASUS BE239QLB;
- генератор (3) переменного напряжения ГСПФ-053, обеспечивающий генерацию переменного напряжения U с заданной амплитудой и частотой;
- осциллограф (4) Актаком ADS2111MV для регистрации параметров переменного напряжения на электродах измерительной ячейки;
- измеритель универсальный (5) Актаком ADS-2061 М;
- комплекс визуализации (6) видеокамера цифровая МС-12 ЛОМО для трансляции потока видеоизображения клетки через микроскоп в компьютер о динамике ее движения в измерительной камере;
- микроскоп (7) Микмед - 2.26 для наблюдения за клеткой и ее реакцией в измерительной камере в ответ на действие НПЭП;
- частотомер измерения равновесной частоты клетки (8);
- согласующее устройство (9) для выведения ГСПФ-053 в рабочий режим по постоянному току;
- измерительная ячейка (10) с металлическими электродами в которую помещаются эритроциты и создается электрическое поле;
- вольтметр (11) для измерения величины напряжения на электродах измерительной ячейки.
В состав ИВК входит также (на чертежах не показаны):
- объект микрометры ОМ-О, ОМ-П для калибровки ИВК и измерения линейных размеров клетки, расстояния между электродами измерительной камеры;
- усилитель переменного напряжения Г3 112/1, обеспечивающий генерацию переменного напряжения U с заданной амплитудой от генератора ГСПФ-053;
- вспомогательное оборудование и инструменты (кондуктометр EC/TDS/Temp СОМ 100 для измерения проводимости клеточной суспензии, термоизмеритель ТМ-12.4, дозаторы с переменным объемом, одноканальные 10, 100 мкл, пинцет медицинский 100 мм. ГОСТ 21241-89).
Измерительная ячейка (10) содержит (фиг. 2): основание, выполненное в виде стеклянной пластины (12), на которой расположены металлические электроды (13 и 14) с зазором относительно друг друга для образования измерительной камеры. Электроды (13, 14) с измерительной камерой накрыты покровным стеклом (15).
Вариант осуществления изобретения.
При подготовке к выполнению измерений проводят следующие подготовительные работы.
Размещают на столе оборудование, необходимое для выполнения измерений. Проверяют тумблеры питания оборудования и питающей сети, которые должны находиться в выключенном положении. Проводят соединение средств измерений и вспомогательного оборудования согласно схеме, представленной на фиг 1.
Подготовка микроскопа
Для выполнения измерений на микроскоп устанавливают объектив Plan 100*1,25 ЛОМО.
Общую подготовку микроскопа осуществляют согласно инструкции по эксплуатации. На экране монитора компьютера должно наблюдаться сфокусированное изображение граней электродов с выраженной яркостью, контрастностью и равномерно освещенных. Микроскоп после настройки обеспечивает разрешающую способность d=0,23 мкм при условии использования объектива с увеличением 100* и апертурой 1,25:
d=λ/2A,
где λ - длина волны 550 нм;
А - апертура объектива 1,25.
Подготовка видеокамеры
Видеокамеру МС-12 из комплекта визуализации устанавливают в оптический ход микроскопа (тринокулярный путь) и жестко фиксируют. Подготовку к работе осуществляют согласно инструкции по эксплуатации.
Подготовка измерительной ячейки
Измерения осуществляют с использованием чистой измерительной ячейки (10). Чистота достигается путем ее промывки дистиллированной водой и сушкой при температуре 120°С в течение часа. Измерительную ячейку (10) устанавливают на подвижном столе микроскопа (7) и жестко фиксируют на нем так, чтобы ее измерительная камера (пространство между электродами 13 и 14) находилась в центре поля зрения микроскопа. К электродам измерительной ячейки подключают контактные проводники с выхода генератора ГСПФ 053.
Подготовка компьютера и программы к работе
Перед началом работы оператор должен внимательно изучить «Инструкцию пользователя программного комплекса СИМ-Э» версии 1.3.0.0 который является составной частью ИВК. Компьютер (1) включается в сеть. Оператор должен дождаться полной загрузки операционной системы. Измерение осуществляют при температуре 20,0-25,0°С клеточной суспензии.
Выполнение измерений
При выполнении измерений параметров эритроцитов осуществяют следующие операции.
Значение вязкости для суспензии эритроцитов принимают тождественной воде, с учетом температуры в лаборатории. В диапазоне температур от 20,0 до 25,0°С значение вязкости принимают согласно следующим данным:
-3
-3
При температуре измерительной ячейки 20°С значение вязкости воды 1,002⋅10 Па⋅с, а при +25,0°С значение вязкости воды 0,890⋅10 Па⋅с.
Измерение температуры измерительной ячейки (10) в районе металлических электродов (13, 14) осуществляют с помощью прецизионного термоизмерителя ТМ-12.4.
Напряжение на электродах (13, 14) измерительной ячейки измеряют с помощью вольтметра (в составе универсального измерителя (5) Актаком ADS-2061M) согласно инструкции по его эксплуатации.
Для измерения скорости поступательного движения и радиуса микроклетки (эритроцита) используют программный комплекс «СИМ-Э» версии 1.3.0.0, входящего в состав ИВК.
Вначале осуществляют забор цельной крови из пальца пациента. Кровь помещают в 3,65-3.85% нитратный буфер в соотношении 9:1 через от 5 до 20 минут пробу объемом от 9 до 11 мкл вносят в 0,3 М раствор сахарозы с объемом от 285 до 295 мкл и перемешивают.
Сразу после разведения каждой пробы суспензию эритроцитов в 0.3 М растворе сахарозы вносят дозатором в пространство между электродами измерительной ячейки в объеме (3-5) мм3 и накрывают покровным стеклом.
Пинцетом слегка придавливают покровное стекло. В случае появления воздушных пузырей между электродами, пинцетом слегка передвигают покровное стекло, так чтобы пузыри полностью исчезли.
Оптическую систему микроскопа фокусируют на эритроциты, расположенные между электродами измерительной ячейки.
Электроды должны располагаться в поле зрения монитора компьютера строго горизонтально. Оператор наблюдает за динамикой течения суспензии (клеток) между электродами измерительной ячейки. После того, как прекратится течение суспензии, оператор запускает компьютерную программу двойным щелчком левой кнопки мыши по пусковому ярлыку (иконке) «СИМ-Э».
Внешний вид основной формы, представляющей графический пользовательский интерфейс, приведен на фиг 3.
На основной форме расположено 5 элементов.
Элемент «Задача». В элементе «Задача» размещен единственный пункт «Новое исследование», в котором необходимо указать параметры эксперимента: выбрать оператора, материал микрочастиц, амплитудное напряжение, поданное на электроды, частоту электрического сигнала, зазор ячейки, время работы генератора.
Элемент «База данных». Содержит два пункта - «Образцы», «Операторы». Пункты предназначены для ввода новых и редактирования существующих образцов и операторов соответственно.
Элемент «Источник данных». Содержит два пункта «Загрузить изображения» и «Видеозахват».
Пункт «Загрузить изображения» предназначен для загрузки ранее отснятой последовательности фотофайлов.
Пункт «Видеозахват» предназначен для захвата изображения с камеры. Оператор указывает значение расстояния между электродами измерительной ячейки, которое представлено в паспорте, время работы генератора, амплитудное значение напряжения, частоту сигнала, задержку камеры относительно генератора и режим работы оборудования, предусмотренные в ПК:
- «включить генератор» - предназначен для проверки работоспособности генератора;
- «включить запись с камеры» - предназначен видеорегистрации съемки последовательности фотофайлов без приложенного к электродам напряжения;
- «включить генератор с камерой» - предназначен для съемки последовательности фотофайлов с напряжением, поступающим от генератора.
Элемент «Справка» содержит информацию о программе. Для обработки фотофайлов выполняют следующие операционные процедуры:
- выбирают источник данных «Видеозахват»;
- в открывшейся форме «Управление оборудованием» задают параметры работы генератора: время работы генератора; амплитудное напряжение; частоту сигнала. При необходимости указывают задержку начала съемки камерой относительно запуска генератора;
- нажимают кнопку «Включить генератор с камерой»;
- после завершения съемки переходят в пункт основной формы «Задача», выбирают пункт «Новое исследование», в открывшейся форме выбирают оператора, материал микрочастиц, параметры, при которых работал генератор: напряжение, частоту, указывают зазор ячейки;
- нажимают кнопку «Далее»;
- в открывшейся форме «Предпросмотр», изменяя параметры к применяемым фотофайлам: «Порог дискриминации шума», «Степень размытия изображения», «Градиент сигнал - фон», добиваются обводки распознанных объектов;
- нажимают кнопку «Старт».
Пример результата работы на форме «Предпросмотр» представлен на фиг 4.
После завершения обработки данных результаты будут представлены в формате файла Excel, в котором представлены теоретические и экспериментальные значения эритроцитов. На основании данного файла оформляют результаты измерений.
По окончании процесса измерения, предметный столик опускают рукояткой фокусировки микроскопа, пинцетом снимают покровное стекло с измерительной ячейки и отправляют в емкость для сбора отходов.
Одновременно с определением показателей электрических и вязкоупругих характеристик эритроцитов пациента анализируют у него пробу кала методом иммуноферментного анализа на содержание маркера кальпротектина. По мере нарастания степени активности ВЗК уровень фекального кальпротектина увеличивается.
Амплитуда деформации А; скорость поступательного  движения поляризуемость эритроцитов уменьшаются.
кл
кл
Увеличиваются показатели обобщенной вязкости η и жесткости с электропроводности σ эритроцита, равновесной частоты.
cp
j
Наблюдается тенденция к снижению среднего диаметра эритроцитов D. При наличии 60% и более параметров x отличающихся от группы условно здоровых обследуемых определяют степень активности ВЗК.
Ниже приведены клинические примеры 1 и 2 осуществления малоинвазивного способа определения активности ВЗК, демонстрирующие возможность эффективного применения вязкоупругих и электрических параметров эритроцитов в сочетании с уровнем фекального кальпротектина в диагностической практике для установления статуса заболевания у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника с неясной активностью.
Пример 1.
Пациент Н., 27 лет, программист, обратился по поводу слабости, субфебрилитета, эпизодов жидкого стула 2-3 раза в день с примесью слизи. Со слов больного, ухудшение состояния связано с психо-эмоциональными перегрузками в течение последней недели.
В течение 5 лет наблюдается по поводу болезни Крона с поражением илеоцекальной зоны, дебютом с 18 лет, с минимальной персистирующей активностью, с ультразвуковыми исследованиями (УЗИ) признаков стриктуры в терминальном отделе подвздошной кишки, с длительным субфебрилитетом, эпизодом повышения фекального кальпротектина до 600 мкг/г, быстрым снижением массы тела на 10 кг, гиполактазией взрослого типа, синдромом избыточного бактериального роста с выраженным метеоризмом и флатуленцией.
В процессе наблюдения предполагалось исключить протяженное поражение тонкой кишки с синдромом мальабсорбции и дефицитом жирорастворимых витаминов, витамина В12, фолиевой кислоты, магния.
На момент обращения пациент не принимал препаратов аминосалициловой кислоты, придерживался диеты.
При осмотре язык с минимальным беловатым налетом. Живот мягкий, печень, селезенка - без особенностей. Отмечена минимальная болезненность по ходу сигмы и терминального отдела подвздошной кишки. Дополнительных образований, симптомов тревоги нет. Минимальная желтушность склер.
12
9
9
Состав крови больного на момент обращения (количество эритроцитов - 5,03⋅10/л, содержание гемоглобина - 157 г/л, цветовой показатель - 0,96, количество лейкоцитов - 5,9⋅10 /л, формула не изменена, количество тромбоцитов - 285⋅10/л, СОЭ - 3 мм/ч., гликемия натощак - 5,1 ммоль/л, общий билирубин - 17,0 мкмоль/л, связанный (прямой) - 3,2 мкмоль/л, свободный (непрямой) - 13,8 мкмоль/л, щелочная фосфатаза (ЩФ) - 154,6 U/1 (норма до 290 U/1), гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТП) - 18,5 U/1 (норма до 49 U/1), АЛТ - 21 U/1 (норма до 40 U/1), ACT - 23 U/1 (норма до 37 U/1), общий белок - 72 г/л, мочевина - 5,5 мг/дл, фибриноген - 2,8 г/л, СРБ 0,3 мг/л).
По данным УЗИ выявлены деформация в области шейки желчного пузыря. По данным ФГС выявлена признаки очагового хронического гастрита антрального отдела (степень 0-1) без атрофии желез (стадия 0).
На ЭКГ выявлены умеренные метаболические изменения.
По данным эндовидеоколоноскопии патологических изменений терминального отдела подвздошной кишки и толстого кишечника не обнаружено. Гистологическое исследование выявило картину хронического проктита вне обострения (степень 0-1). Исследование тонкого и толстого кишечника с помощью метода гидро-МРТ позволило выявить МР-признаки терминального илеита, баугинита. УЗИ кишечника позволило установить наличие УЗИ-признаков трансмурального воспаления терминального отдела подвздошной кишки.
В связи с наличием диссонанса в результатах обследований возникли вопросы по поводу активности заболевания.
Пациенту проведено исследование параметров x1-x8 эритроцитов и определение уровня фекального кальпротектина х9 методом иммуноферментного анализа (ИФА) (R-Biopharm, Германия). Результаты исследований показателей приведены в таблице 1. Полученные данные сравнивали с дифференцирующими значениями электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов, фекального кальпротектина у группы условно здоровых и групп с активными и неактивными ВЗК (таблица 1).
1
8
кл
3
p
4
2
5
кл
7
кл
6
-6
-6
-6
-6
-6
-6
6
-15
3
-15
-15
3
4
4
4
-5
-5
-5
-6
-6
-6
Результаты исследований показали, что средний диаметр эритроцитов D (x) находился в пределах значений для группы условно здоровых обследуемых (7,5⋅10÷7,7⋅10 м) и составлял 7,58⋅10 м. Деформабильность эритроцитов была снижена, при частоте f равной 1 МГц и напряжении U равном 10В амплитуда деформации А эритроцитов (x) составляла 6,71⋅10 м, что находилось в границах величин для группы пациентов с неактивными ВЗК (6,3⋅10÷7,1⋅10 м). Поляризуемость (α) на частоте 10 Гц (х) составила 6,3⋅10 м, что входило в границы значений для условно здоровых лиц (6,3⋅10÷7,5⋅10 м). Равновесная частота f (x) находилась в низкочастотном диапазоне и составляла 4,1⋅10 Гц, и входила в границы значений для группы пациентов с неактивными ВЗК (3,9⋅10÷4,2⋅10 Гц). Скорость поступательного движения  эритроцитов кэлектродам (х) составляла 5,1 мкм/с и находилась пределах значений для группы пациентов с ВЗК в состоянии ремиссии (4,6÷5,6 мкм/с). Электропроводность клетки σ (x) повышена и составляла 6,42⋅10 см/м, входя в границы значений для неактивных ВЗК (5,1⋅10÷6,9⋅10 см/м). У пациента определены повышенные обобщенные показатели жесткости с (x) равные 8,72⋅10 Н/м и вязкости η (х) равные 0,68 Па⋅с, что соответствовало значениям для группы пациентов с неактивными ВЗК (8,3⋅10÷9,1⋅10 Н/м для жесткости и 0,67÷0,71 Па⋅с для вязкости, соответственно).
9
Уровень фекального кальпротектина (x), составивший 60 мкг/г, находился в пределах границ значений для пациентов с неактивными ВЗК (51÷200 мкг/г).
Таким образом, у обследуемого 7 исследованных показателей из 9 находились в пределах значений для группы пациентов с неактивными ВЗК, что составило 77,8% (т.е. более 60%), что позволило сделать заключение о высокой вероятности отсутствия активности заболевания у данного пациента. Определенные впоследствии уровни таких маркеров воспаления как высокочувствительного С-реактивного протеина, составившего 3 мг/л (норма менее 5 мг/л), и ферритина, составившего 110 мкг/л (норма 20-250 мкг/л), подтвердила полученные данные о стадии ремиссии заболевания.
Пример 2.
Пациент С., 42 года, обратился по поводу проявлений астенического синдрома, периодически - кашицеобразного стула (3-4 раза в сутки) без патологических примесей (со слов больного). С 2001 года страдает язвенным колитом, левосторонним, с рецидивирующим течением с системными проявлениями - серонегативным спондилоартритом, сакроилеитом, коксартрозом с эпизодами высокой активности в 2012 году. Стаж болезни составил 17 лет. Последний раз колоноскопия была выполнена 6 лет назад. Отмечен низкий комплайенс (с 2012 года пациент не наблюдается, практически не лечится). Кроме того, выявлена плохая переносимость сульфасалазина.
Пациенту рекомендовано комплексное обследование в связи с необходимостью назначения терапии, в рамках которого было проведено исследование электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов.
Пациенту проведено исследование параметров x1-x8 эритроцитов. Результаты исследований показателей приведены в таблице 1.
cp
1
кл
3
8
кл
6
кл
7
5
-6
-6
-6
6
-15
3
-15
-15
3
-6
-6
-6
-6
-6
-6
-5
-5
-5
Исследование показало, что эритроциты имели параметры, уровень которых значительно отличался от таковых у здоровых лиц. Средний диаметр D эритроцита (x) составлял 7,50⋅10 м, находясь в пределах значений для группы с неактивными ВЗК (7,3⋅10÷7,5⋅10 м). Поляризуемость на частоте 10 Гц (α) (х) составила 5,2⋅10 м, входя в границы значений для ВЗК в стадии ремиссии - 5,1⋅10÷5,7⋅10 м. Эритроциты обладали сниженной пластичностью. Амплитуда деформации А эритроцитов (x) составляла 5,72⋅10 м, что входило в пределы значений пациентов с активностью заболевания (5,6⋅10÷6,3⋅10 м) на фоне повышенного обобщенного показателя вязкости η (х), равного 0,75 Па⋅с (что находилось в границах значений для пациентов с активными ВЗК - 0,73÷0,77 Па⋅с), как и обобщенного показателя жесткости с (x), равного 9,71⋅10 Н/м, значение которого также находилось в границах величин для активного заболевания - 9,5⋅10÷10,0⋅10 Н/м. Была выявлена повышенная электропроводность клеток (x) σ равная 6,96⋅10 см/м, отражающая выраженные изменения ее структуры. Значения электропроводности также входили в границы значений для пациентов с наличием активности ВЗК - 6,9⋅10÷8,9⋅10 см/м.
2
p
4
9
5
5
5
6
9
9
Эритроциты обладали низким поверхностным зарядом, который «экранируется» крупномолекулярными воспалительными белками, иммуноглобулинами, иммунными комплексами, связанных с наличием у пациента иммуно-воспалительного синдрома. Это отражали низкие показатели скорости поступательного движения эритроцитов  к электродам (х) равную 3,8 мкм/с, значения которой входили в диапазон значений для активных ВЗК - 2,8÷3,9 мкм/с. Равновесная частота f (x) была резко смещена в высокочастотный диапазон и составила 12,5⋅10 Гц, отражая степень токсического воздействия на эритроциты. Эта величина также находилась в пределах значений для пациентов с активными ВЗК - 9,7⋅10÷12,8⋅10 Гц. Уровень фекального кальпротектина (х) методом ИФА (тест-система R-Biopharm, Германия), составивший 262 мкг/г, находился в пределах значений для пациентов с активными ВЗК (более 200 мкг/г). Таким образом, у обследуемого 7 исследованных показателей из 9 находились в пределах значений для группы пациентов с активными ВЗК, что составило 77,8% (т.е. более 60%), что свидетельствует о наличии обострения язвенного колита у данного пациента. Отклоняющиеся параметры, входящие в пределы значений для группы пациентов с неактивными ВЗК, средний диаметр эритроцита и поляризуемость на частоте 10 Гц, возможно, изменяются в более отдаленные сроки от начала обострения. Данные, полученные при исследовании вязкоупругих параметров эритроцитов, были подтверждены маркерами активного воспаления - высокими уровнями высокочувствительного С-реактивного белка 28 мг/л (норма менее 5 мг/л), лейкоцитов 12,7⋅10/л (норма 4,2 до 9×10/л), СОЭ 21 мм/ч (норма 0-15 мм/ч), низким уровнем гемоглобина 94 г/л (норма 130-160 г/л).
Диагностическая эффективность предлагаемого малоинвазивного способа определения наличия активности ВЗК и его пригодность подтверждается результатами биохимических, инструментальных исследований. Обобщенный анализ данных исследования вязкоупругих и электрических параметров эритроцитов в сочетании с уровнем фекального кальпротектина для определения активности ВЗК сравнивают с комплексными данными биохимических, инструментальных исследований. Результаты оценки приведены в таблице 2.
Данные по распределению больных на группу пациентов с активными ВЗК и группу пациентов с неактивными ВЗК, полученные при исследовании вязкоупругих и электрических параметров эритроцитов в сочетании с уровнем фекального кальпротектина, были сопоставлены с результатами биохимических, инструментальных исследований у тех же пациентов. По данным исследования эритроцитов было получено 59 случаев с активными ВЗК и 32 случая с неактивными ВЗК. В то время как по данным комплексного биохимического, инструментального обследования, количество пациентов с активными ВЗК составило 62 случая, а с неактивными ВЗК - 29 случаев, т.е. 2 случая оказались ложно положительными для группы с неактивными ВЗК, в то время, как 27 случаев были истинно положительными для группы с неактивными ВЗК. Для группы пациентов с активными ВЗК ложно отрицательными были 5 случаев, а истинно положительными 57 случаев. Исходя из полученных данных, по формулам, приведенным в издании (Гринхальд Т. Основы доказательной медицины. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2006 г. - 240 с.), были получены следующие показатели (показатель чувствительности заявленного способа составил 91,9%, показатель специфичности составил 93,1%, показатель прогностической ценности «+» результата составил 96,6%, т.е. выявление случаев с активными ВЗК, показатель прогностической ценности «-» результата составил 84,3%, показатель - индекс точности составил 92,3%).
Данные результаты свидетельствуют о том, что данный малоинвазивный способ эффективен и пригоден в определении активности воспалительных заболеваний кишечника.
Преимущество предложенного способа по сравнению с существующими заключается в том, что данный способ определения наличия активности заболевания позволяет определить статус ВЗК для определения тактики терапии в короткие сроки. Носит малоинвазивный характер (не связанный с проведением колоноскопии), что предотвращает возможные серьезные осложнения в состоянии здоровья пациента. Пациенту не требуется госпитализация. Оценка показателей исследования объективна и не зависит от квалификации и опыта специалиста, производящего данные исследования. Способ позволяет установить наличие обострения или ремиссии независимо от варианта воспалительного заболевания кишечника. Используются недорогие общедоступные реактивы, тем самым повышается доступность данного способа для массовой диагностики. У способа низкие трудоемкость и стоимость. Высокая чувствительность, специфичность и четкие критерии оценки наличия активности ВЗК, высокая диагностическая точность повышают ценность заявленного способа. Ограничения для применения заявленного способа, связанные с физическим и психологическим состоянием пациента, отсутствуют. Заявленный способ обеспечивает хорошую физическую и психологическую переносимость исследования пациентом.
Неинвазивный способ определения активности ВЗК реализуется на предлагаемом устройстве, которое может быть изготовлено как на промышленном производстве, так и на малом предприятии с использованием стандартного оборудования, современных технологий и материалов.