СПОСОБ ОПТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ПАТОЛОГИЙ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ
METHOD OF OPTICAL DIAGNOSTICS OF PATHOLOGIES IN BIOLOGICAL TISSUES

Изобретение относится к области медицины, онкологии и может быть использовано для диагностики возникновения злокачественных новообразований в тканях.
0
1
0
1
1
1
1
2
2
-6
-3
3
1
В ткань вводят экзогенные молекулы - зонды. Такими зондами могут служить молекулы органических красителей, способные излучать замедленную флуоресценцию (ЗФ) и фосфоресценцию. Затем введенные в ткань молекулы возбуждают импульсами лазерного излучения в основной полосе поглощения S→S, где S - основное состояние молекулы, S - первое возбужденное синглетное состояние. В результате интеркомбинационной конверсии S→Т из первого возбужденного синглетного состояния, появляются молекулы красителей в триплетном T состоянии (которые характеризуются большими значениями времени жизни 10 - 10 с). Триплетные состояния молекул эффективно тушатся молекулярным кислородом О с образованием синглетного кислорода О.
В работе [«Журнал физической химии», 2013, том. 87, №9, с. 1602-1607] показано, что в биотканях в присутствии синглетного и молекулярного кислорода возможны следующие каналы релаксации триплетных состояний молекул:
1
1
1
1
0
ЗФ
- термоинициированная обратная T→S интеркомбинационная конверсия с последующей замедленной флуоресценцией T→S→S+hν (в дальнейшем будем называть этот тип замедленной флуоресценции - ТЗФ);
1
2
1
1
2
2
1
0
ЗФ
1
1
3
- синглет-триплетная аннигиляция T+O, сопровождающаяся возникновением S состояний молекул с последующей замедленной флуоресценцией T+О→О+S→S+hν (в дальнейшем будем называть этот тип замедленной флуоресценции - СТА ЗФ);
1
0
ФОС
- фосфоресценция T→S+hν.
1
3
2
2
Авторами настоящей заявки ["Вестник ОГУ", 2015, №13, С. 175-180; Journal of Photochemistry & Photobiology, В: Biology 163 (2016) 232-236] показано, что в злокачественных опухолях, в отличие от нормальных тканей, при импульсно-периодическом возбуждении, из-за разности скоростей расходования фотосенсибилизированного синглетного О кислорода внутри ткани и поступления О кислорода из внешней среды в ткань в промежутке между возбуждающими импульсами, наблюдается эффект тушения СТА ЗФ. В работе ["Вестник ОГУ", 2015, №13, С. 175-1802] этот эффект предложено использовать для диагностики возникновения опухолей на ранней стадии.
ЗФ
Интегральный измеряемый сигнал замедленной флуоресценции зондов в биотканях представляет собой суперпозицию двух типов свечения - ТЗФ и СТА ЗФ. Интенсивность замедленной флуоресценции I (площадь под кинетической кривой ЗФ) определяется выражением:
1
2
где А и А - постоянные коэффициенты;
Δ
n(t) - концентрация синглетного кислорода;
T
n(t) - концентрация зондов в триплетном состоянии.
Первое слагаемое в (1) представляет вклад СТА ЗФ в общий сигнал, второе - вклад ТЗФ.
Тушение СТА ЗФ в опухолях происходит потому, что при возбуждении в строб-режиме для каждого последующего импульса концентрация молекул кислорода в ткани оказывается меньшей, чем для предыдущего импульса. Уменьшение концентрации кислорода в ткани влечет за собой уменьшение
Δ
величины n(t) в выражении (1) и, как следствие, уменьшение вклада первого слагаемого в общий сигнал ЗФ.
T
Другой причиной тушения ЗФ может быть фотохимическое обесчвечивание красителей в тканях при лазерном возбуждении, т.е. уменьшение величины n(t) в выражении (1). Для учета возможной фотохимической деградации красителей предлагается при каждом отдельном измерении кинетики ЗФ зондов одновременно измерять кинетику их фосфоресценции.
Ф0С
Интенсивность фосфоресценции I равна:
3
где A - постоянный коэффициент.
T
Измерения фосфоресценции зондов позволяет контролировать изменение величины n(t). Практически эта задача решается введением в установку дополнительного фотоприемника, регистрирующего свечение в спектральном диапазоне, соответсвующем фосфоресценции зондов. Величина разностного интегрального сигнала фосфоресценции, определяемого во временном интервале 0-15 мкс, добавляется к интегральному сигналу замедленной флуорисценции. Врезультате описаной процедцры получаем скорректированные данные о кинетике СТА ЗФ, что повышает достоверность процедуры диагностики паталогии биологических тканей.
Ближайшим по техническому решению к предлагаемому способу является способ определения патологий в биологических тканях на основе измерения тушения СТА ЗФ молекулярных зондов в тканях в режиме импульсно-периодического возбуждения [Journal of Photochemistry & Photobiology, В: Biology, 163, 2016, 232-236]. Недостатком способа является отсутствие контроля изменения концентрации триплетных состояний фотосенсибилизаторов (зондов) после каждого возбуждающего импульса, что вносит неточность в интерпретацию результатов измерений.
Техническим результатом изобретения является повышение точности и обеспечение корректности способа диагностики онкологических заболеваний основанного на тушении замедленной флуоресценции зондов при импульсно-периодическом возбуждении, путем создания возможности контроля изменения концентрации триплетных состояний молекул зондов непосредственно в процессе измерения кинетики затухания замедленной флуоресценции. Задача решается тем, что в экспериментальную установку вводится дополнительный канал регистрации свечения и одновременно с замедленной флуоресценцией измеряется кинетика фосфоресценции молекулярных зондов после каждого возбуждающего импульса. По изменениям, происходящим в кинетике фосфоресценции, контролируется концентрация триплетных состояний молекул зондов в ткани и производится (при необходимости) корректировка данных измерений кинетики замедленной флуоресценции.
Реализация способа оптической диагностики патологий в биологических тканях с одновременным контролем концентрации триплетных состояний молекул зондов непосредственно в процессе измерения кинетики затухания замедленной флуоресценции приведена в следующем примере.
2
max
max
Измерения проводились in vitro в тканях здоровых и больных раком молочной железы мышей линии BYRB и раком желудка крыс линии Wistar. Образцы тканей окрашивались ксантеновыми красителями (молекулярными зондами, фотосенсибилизаторами) - эритрозином, эозином или бенгальским розовым и подвергались облучению серией лазерных импульсов с плотностью мощности 0,5 МВт/см и длительностью импульса 15 нс. Импульсы следовали через равные промежутки времени в 200 мс. Обычно в серии было от 5 до 7 импульсов. После каждого импульса измерялись кинетические кривые замедленной флуоресценции (λ=570 нм) и фосфоресценции (λ=680 нм).
На фиг. 1а приведены кинетические кривые ЗФ, а на фиг. 1б кинетические кривые фосфоресценции эритрозина, измеренные после первого (линия 1) и седьмого (линия 2) импульсов возбуждения. Видно, что после седьмого импульса наблюдается заметное тушение СТА ЗФ, что свидетельствует о наличии патологии в исследуемом образце ткани.
Для контроля концентрации триплетных состояний молекулярных зондов осуществляли измерение кинетики фосфоресценции. На фиг. 1б видно, что интенсивность фосфоресценции фотосенсибилизатора (эритрозина) при выбранном режиме облучения во временном интервале 0-15 мкс не изменяется, что свидетельствует об отсутствии фотохимической деградации красителя.
На фиг. 2 представлены кинетические кривые замедленной флуоресценции и фосфоресценции красителя бенгальского розового в злокачественной опухоли ткани желудка крысы линии Wistar. На фиг. 2а видно, что имеет место сильное тушение ЗФ бенгальского розового. Это свидетельствует о возможном наличии в исследуемой ткани патологии.
Однако измерения кинетики фосфоресценции красителя показывают, что от импульса к импульсу происходит уменьшение интенсивности фосфоресценции. На фиг. 2б приведены кинетические кривые после 1-го и после 7-го импульсов. Этот результат указывает на то, что имеет место фотохимическая деградация фотосенсибилизатора, которая также приводит к уменьшению интенсивности ЗФ бенгальского розового.
В данном случае, для корректной диагностики наличия патологии в исследуемой ткани, следует скорректировать кинетическую кривую ЗФ путем учета фотохимических процессов. Результаты процедуры корректировки показаны на фиг. 3. Здесь приведена гистограмма сравнительных изменений интенсивности замедленной флуоресценции и фосфоресценции бенгальского розового, внедренного в ткани желудка больной и здоровой крысы линии Wistar при импульсно-периодическом возбуждении с частотой 5 Гц (гистограмма построена по площади под кинетическими кривыми, регистрируемыми после каждого импульса во временном интервале 0-15 мкс). По оси абсцисс отложен порядковый номер возбуждающего импульса.
Ряд 1 - интегральная интенсивность ЗФ бенгальского розового в ткани здоровой крысы (небольшое уменьшение интенсивности ЗФ обусловлено фотохимической деградацией красителя);
Ряд 2 - интегральная интенсивность ЗФ бенгальского розового в ткани больной крысы (без учета фотохимической деградации красителя);
Ряд 3 - интенсивность СТА ЗФ бенгальского розового в ткани больной крысы с учетом фотохимической деградации красителя.
Из фиг. 3 видно, что к седьмому импульсу интенсивность сигналов СТА ЗФ (Ряд 3) красителя, внедренного в испытуемую ткань желудка, уменьшается на 60%, что надежно и достоверно свидетельствует о наличии в ней патологии.