СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИ ПРОЦЕССИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ

1. Применение протеолитически активного полипептида в производстве протеолитически процессированного полипептида, где протеолитически активный полипептид является Lys-C или его гомологом, имеющим по меньшей мере 60% идентичность последовательности с ним;
где протеолитически процессированный полипептид является двухцепочечным ботулиническим нейротоксином серотипа А (BoNT/A), и где указанный протеолитически активный полипептид гидролизует одноцепочечный ботулинический нейротоксин серотипа А (BoNT/A) для образования двухцепочечного ботулинического нейротоксина серотипа А (BoNT/A).
C
C
2. Применение по п. 1, где одноцепочечный ботулинический нейротоксин серотипа А (BoNT/A) является встречающимся в естественных условиях нейротоксином, рекомбинантным нейротоксином или модифицированным нейротоксином, таким как нейротоксин, лишенный нативного H домена, или его части, или производные с другими аминокислотными остатками, заменяющими H домен нейротоксина.
3. Применение по п. 2, где одноцепочечный ботулинический нейротоксин серотипа А (BoNT/A) включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50% идентичность последовательности с полипептидной последовательностью, выбранной из любой из SEQ ID NO: с 3 по 10;
предпочтительно где протеолитически активный полипептид гидролизует одноцепочечный ботулинический нейротоксин серотипа А (BoNT/A) по положению сразу к С-концу от основного аминокислотного остатка внутри указанной последовательности из любой из SEQ ID NO: с 3 по 10.
4. Способ производства протеолитически процессированного полипептида, включающий стадию приведения в контакт:
(а) первого полипептида, указанного первого полипептида, являющегося Lys-C или его гомологом, имеющим по меньшей мере 60% идентичность последовательности с ним;
с
(b) вторым полипептидом, указанным вторым полипептидом, подверженным протеолизу указанным первым полипептидом;
где указанный контакт приводит к протеолитическому процессингу указанного полипептида до по меньшей мере двух продуктов расщепления;
где второй полипептид является одноцепочечным ботулиническим нейротоксином серотипа А (BoNT/A), и где указанный первый полипептид гидролизует одноцепочечный ботулинический нейротоксин серотипа А (BoNT/A) для образования двухцепочечного ботулинического нейротоксина серотипа А (BoNT/A).
C
C
5. Способ по п. 4, где указанный одноцепочечный ботулинический нейротоксин серотипа А (BoNT/A) является встречающимся в естественных условиях нейротоксином, рекомбинантным нейротоксином или модифицированным нейротоксином, таким как нейротоксин, лишенный нативного H домена, или его части, или производные с другими аминокислотными остатками, заменяющими H домен нейротоксина.
6. Способ по п. 5, где второй полипептид включает аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 50% идентичность последовательности с полипептидной последовательностью, выбранной из любой из SEQ ID NO: с 3 по 10;
предпочтительно где первый полипептид протеолитически расщепляет второй полипептид в положении сразу к С-концу от основного аминокислотного остатка внутри указанной последовательности из любой из SEQ ID NO: с 3 по 10.
7. Применение по любому из пп. 1-3, где С-конец L-цепи и N-конец H-цепи двухцепочечного ботулинического нейротоксина серотипа А (BoNT/A) идентичны соответствующему двухцепочечному ботулиническому нейротоксину серотипа А (BoNT/A), выделенному из клостридий дикого типа.
8. Применение по любому из пп. 1-3, где двухцепочечный клостридиальный нейротоксин серотипа А (BoNT/A) имеет идентичную аминокислотную последовательность при сравнении с соответствующим двухцепочечным полипептидом ботулинического нейротоксина серотипа А (BoNT/A), образованным из такого же одноцепочечного полипептида ботулинического нейротоксина
серотипа А (BoNT/A) в клостридиях дикого типа.
9. Способ по любому из пп. 4-6, где указанный контакт происходит внутри клетки, в клеточном лизате, в очищенном клеточном лизате или в объекте.
10. Применение способа по любому из пп. 4-6 для оценки качества продукта или для производства лекарственного средства.
11. Композиция, получаемая способом по любому из пп. 4-6;
предпочтительно где композиция является фармацевтической композицией, включающей процессированный полипептид, получаемый способом по любому из пп. 4-9, и фармацевтически приемлемый носитель.
12. Композиция по п. 11, где указанная композиция включает смесь процессированного и непроцессированного второго полипептида, указанную смесь, содержащую менее чем 5% непроцессированного второго полипептида.
13. Композиция по п. 11, где указанную композицию составляют в твердой, жидкой или аэрозольной (газообразной) форме.
14. Композиция по п. 11, где указанная композиция является лекарственным средством или косметической композицией.
15. Композиция по любому из пп. 11-14 для применения в лечении заболевания или нарушения, выбранного из произвольной мышечной силы, фокальной дистонии, включая цервикальную, краниальную дистонию, и доброкачественного идиопатического блефароспазма, гемифациального спазма и фокальной спастичности, желудочно-кишечных расстройств, повышенного потоотделения, и косметической коррекции морщин, в следующем аспекте также блефароспазма, оромандибулярной дистонии, дистонии размыкания челюсти, дистонии смыкания челюсти, бруксизма, синдрома Мейжа, лингвальной дистонии, апраксии века, открытой цервикальной дистонии, антеколлиса, ретроколлиса, латероколлиса, тортиколлиса, фарингеальной дистонии, ларингиальной дистонии, спастической дистонии/аддукторного типа, спастической дистонии/абдукторного типа, спастической одышки, дистонии конечностей, дистонии плеча, профессиональной дистонии, писчего спазма, спазма музыканта, спазма игрока в гольф, дистонии ног, аддукции бедра, сгибания колена при абдукции бедра, разгибания
колена, сгибания стопы, разгибания стопы, эквиноваруса, дистонии деформированной стопы, спонтанного тонического разгибания большого пальца стопы, сгибания пальца стопы, разгибания пальца стопы, аксиальной дистонии, синдрома "Пизанской башни", дистонии брюшной стенки, сегментной дистонии, односторонней дистонии, генерализованной дистонии, Х-сцепленной дистонии-паркинсонизма, дистонии при кортико-базальной дегенерации, Х-сцепленной дистонии-паркинсонизма, поздней дистонии, дистонии при спинально-церебеллярной атаксии, дистонии при паркинсонизме, дистонии при хорее Хантингтона, дистонии при болезни Галлевордена-Шпатца, ДОФА-индуцированных дискинезий/ДОФА-индуцированной дистонии, поздних дискинезий/поздней дистонии, пароксизмальных дискинезий/дистоний, кинезиогенного, некинезиогенного вызванного действиями нистагма мягкого неба, миоклонической миокимия, ригидности, слабых мышечных судорог, наследственного тремора подбородка, парадоксальной активности жевательных мышц, односторонних спазмов жевательных мышц, гипертрофической бранхиальной миопатии, гипертрофии жевательной мышцы, гипертрофии передней большеберцовой мышцы, нистагма, осциллопсийного надъядерного паралича взора, эпилепсии парциальной непрерывной, планирования операции спастической кривошеи, паралича абдуктора голосовых связок, не поддающейся лечению мутантной дисфории, дисфункции верхнего сфинктера пищевода, гранулемы голосовых связок, синдрома Жиля де ла Туретта с заиканием, миоклонии среднего уха, защитного закрывания глотки, постларингэктомии, нарушения речи, защитного опущения верхнего века, энтропиона, дисфункции сфинктера Одди, псевдоахалазии, не связанного с ахалазией расстройства пищевода, моторных расстройств пищевода, вагинизма, послеоперационной иммобилизации, тремора, дисфункции мочевого пузыря, детрузорно-сфинктерной диссинергии, спазма сфинктера мочевого пузыря, гемифациального спазма, реиннервационных дискинезий, морщин в уголках глаз из-за применения косметики, асимметрии мимических
мышц, ямочек на подбородке, синдрома мышечной скованности, столбняка, гиперплазии предстательной железы, ожирения, лечения косоглазия при детском церебральном параличе, сопутствующего смешанного паралича, состояния после операции по поводу отслоения сетчатки, состояния после операции катаракты, афакии с миозитным косоглазием, миопатического косоглазия, диссоциированного вертикального смещения, в качестве вспомогательного средства при операции косоглазия, эзотропии, экзотропии, ахалазии, анальных трещин, гиперактивности экзокринных желез, синдрома Фрея, парадоксального слезотечения, усиленного потоотделения, аксиллярного, ладонного, подошвенного, ринореи, относительной гиперсаливации при инсульте, при паркинсонизме, при спастических состояниях при боковом амиотрофическом склерозе, при аутоиммунных процессах при энцефалите и миелите, множественном склерозе, поперечном миелите, болезни Девика, вирусных инфекций, бактериальных инфекций, паразитарных инфекций, грибковых инфекций, при наследственном спастическом парапарезном постапоплектическом синдроме, полушарном инфаркте, инфаркте ствола мозга, инфаркте спинного мозга, мигрени, при травме центральной нервной системы, поражении полушарий, поражении ствола мозга, поражении спинного мозга, кровоизлиянии в центральной нервной системе, кровоизлиянии в мозг, субарахноидальном кровоизлиянии, субдуральном кровоизлиянии, интраспинальном кровоизлиянии, при неоплазиях, опухолях полушарий, опухолях ствола мозга, опухолях спинного мозга, храпе.
16. Применение протеолитически активного полипептида для образования полипептидных фрагментов для применения в способе масс-спектрометрии, где протеолитически активный полипептид является Lys-C или его гомологом, имеющим по меньшей мере 60% идентичность последовательности с ним;
где указанный протеолитически активный полипептид гидролизует полипептид для образования полипептидных фрагментов.
17. Способ образования полипептидных фрагментов для
применения в способе масс-спектрометрии, включающем стадию приведения в контакт:
(а) первого полипептида, указанного первого полипептида, являющегося Lys-C или его гомологом, имеющим по меньшей мере 60% идентичность последовательности с ним;
с
(b) вторым полипептидом, указанным вторым полипептидом, подверженным протеолизу указанным первым полипептидом;
где указанный контакт приводит к протеолитическому процессингу указанного второго полипептида до по меньшей мере двух полипептидных фрагментов.
18. Протеолитически активный укороченный вариант полипептида-предшественника, где указанный полипептид-предшественник состоит из полипептида, имеющего по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2, где указанный протеолитически активный укороченный вариант лишен одного или более аминокислотных остатков к N-концу от аминокислотного положения 249 в SEQ ID NO: 2, и где указанный протеолитически активный укороченный вариант способен гидролизовать ботулинический или столбнячный нейротоксин для образования двухцепочечного ботулинического или двухцепочечного столбнячного нейротоксина.
19. Протеолитически активный укороченный вариант по п. 18, где указанный полипептид-предшественник состоит из полипептида, имеющего по меньшей мере 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2.
20. Протеолитически активный укороченный вариант по п. 18 или 19, где указанный протеолитически активный укороченный вариант включает SEQ ID NO: 1.
21. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую протеолитически активный укороченный вариант по любому из пп. 18-20 и, необязательно, регуляторные элементы.
22. Вектор, включающий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 21.
23. Клетка, включающая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 21 или вектор по п. 22.
24. Способ производства протеолитически активного
укороченного варианта по любому из пп. 18-20, включающий стадии:
(а) химического синтеза или трансляции с нуклеотидной последовательности полипептида по любому из пп. 18-20; и
(b) очистку полипептида со стадии (а).
25. Применение антитела, специфично связывающегося с протеолитически активным укороченным вариантом по любому из пп. 18-20, для аффинной хроматографии, иммунопреципитации, иммунолокализации или для мониторинга наличия протеолитически активного укороченного варианта по любому из пп. 18-20.
26. Способ производства протеолитически процессированного полипептида, включающий стадию приведения в контакт:
(а) первого полипептида, указанного первого полипептида, включающего протеолитически активный укороченный вариант по любому из пп. 18-20,
с
(b) вторым полипептидом, указанным вторым полипептидом, подверженным протеолизу указанным первым полипептидом;
где указанный контакт приводит к протеолитическому процессингу указанного второго полипептида до по меньшей мере двух продуктов расщепления.
27. Способ по п. 26, где второй полипептид имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с полипептидной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: с 3 по 25, и где второй полипептид расщепляется к С-концу от основного аминокислотного остатка внутри указанной последовательности любой из SEQ ID NO: с 3 по 25.
28. Способ по п. 26 или 27 для оценки качества продукта или производства лекарственного средства.
29. Способ скрининга ингибитора протеолитически активного укороченного варианта по любому из пп. 18-20, включающий стадию
(а) приведения протеолитически активного укороченного варианта по любому из пп. 18-20 в контакт с известным субстратом и, необязательно, с предполагаемым ингибитором; и
(b) определения эффекта предполагаемого ингибитора на превращение субстрата в продукт расщепления,
где снижение количества продукта расщепления является
показателем ингибирующего эффекта предполагаемого ингибитора.
30. Способ по п. 29, где ингибитор является антителом, специфично связывающимся с протеолитически активным укороченным вариантом по любому из пп. 18-20.
31. Применение протеолитически активного укороченного варианта по любому из пп. 18-20 в производстве терапевтических нейротоксинов.
32. Композиция, включающая протеолитически активный укороченный вариант по любому из пп. 18-20 и фармацевтический носитель.