Оценка антибактериальной активности лекарственных пленок, содержащих II фракцию углекислотного экстракта цветков гвоздики (Сaryophyllus aromaticus l)

Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2006. №9(49).

УДК 615.33-577.180.62

145

ОЦЕНКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПЛЕНОК, СОДЕРЖАЩИХ II ФРАКЦИЮ УГЛЕКИСЛОТНОГО ЭКСТРАКТА ЦВЕТКОВ ГВОЗДИКИ

© 2006 П.Н. Золотарев1

В ходе исследования изучена антибактериальная активность лекарственных пленок с активной фракцией углекислотного экстракта гвоздики. Установлено, что наибольшей активностью обладают 0,5% лекарственные пленки, изготовленные на комплексной основе хитозана и метилцеллюлозы (1,5:1).

1. Актуальность

В настоящее время в лечении инфекционных заболеваний кожных покровов и слизистых используют большой арсенал современных препаратов. Наиболее перспективными в терапии таких заболеваний представляются препараты, изготовленные на основе природного сырья. Положительную роль в этом направлении играют настойки, экстракты, а также мази, разработанные из биологически активных соединений лекарственных растений и обладающие антимикробной активностью. Привлекательность таких препаратов обусловлена доступностью и дешевизной сырья, их малой токсичностью и мягким терапевтическим эффектом [4].

К недостаткам антимикробных препаратов растительного происхождения можно отнести то, что их антибактериальная активность относительно невелика и равна, как правило, от 30 до 10 мкг/мл [3]. В то же время современное состояние терапии раневой инфекции диктует требования к поиску и разработке препаратов с большей антимикробной активностью. Также значимым недостатком является лекарственная форма ряда современных препаратов. Например, спиртовые растворы оказывают раздражающее воздействие на раневую поверхность за счет спирта этилового. К недостаткам данных препаратов можно отнести, в том числе и отсутствие у них пролонгированного действия и необходимость использования дополнительных перевязочных материалов для фиксации салфеток с раствором на поверхности раны [7].

Таким образом, выявление наиболее активных антимикробных свойств фитосубстанций и лекарственных форм, разработанных на их основе, является перспективным направлением в области современной микробиологии.

1 Золотарев Павел Николаевич (zolotareff@list.ru), кафедра общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии Самарского государственного медицинского университета, 443099, Россия, г. Самара, ул. Чапаевская, 89.

2. Цель работы

Определение антибактериальных свойств лекарственных пленок, содержащих активную фракцию углекислотного экстракта гвоздики.

В качестве объектов исследования использованы следующие:

1) II фракция углекислотного экстракта гвоздики и её 0,7, 3,5 и 7,0% растворы в этиловом спирте и диметилсульфоксиде. Данная фракция была получена в результате вакуумной дистилляции в токе азота при разряжении давления (40 мм рт. ст.) с постепенным повышением температуры от 147 ± 1,20 до 150 ± 0,70°С. Активная фракция представляет собой прозрачную жидкость желтоватого цвета со специфическим запахом гвоздики, легко растворима в спирте, диметилсульфок-сиде, эфире и не растворима в воде.

2) 3% растворы природных полимеров — пленкообразователей хитозана, метил-целлюлозы и альгината натрия, из которых в стеклянные формы выливали пленки с различным содержанием активной фракции и сушили их при комнатной температуре. Изготовление и сушку пленок проводили в асептических условиях.

Пленки готовили как на каждом полимере отдельно, так и из комбинации хи-тозана и метилцеллюлозы в различных соотношениях и концентрациях фракции в спирте и диметилсульфоксиде. Такая необходимость возникала из-за плохой адгезии хитозановых пленок к поверхности агара и различной активности растворов фракции.

Концентрацию II фракции CO2 — экстракта в пленках рассчитывали с учетом её антимикробной активности. Методом титрования в мясо-пептонный бульон и агар установлено, что фракция проявляет антистафилококковую активность, равную 3,42 ± 0,70 мкг/мл при титровании в бульон, и 3,73 ± 0,93 мкг/мл при титровании в агар [1, 2].

Антимикробную активность изученных объектов исследовали диско-диффуз-ным методом и методом колодцев.

В эксперименте были использованы бактериальные штаммы Американской коллегии типовых культур (АТСС), полученные из Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Видовой состав был представлен следующими микроорганизмами: Staphylococcus aureus (ATCC 25923); Escherichia coli (ATCC 25922); Bacillus cereus (ATCC 10702); Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

Инокулят готовили из 18-20 часовой агаровой культуры в мясо-пептонном бульоне, доводя по мутности до 0,5 стандарта McFarland. Полученную бульонную культуру разводили ещё в 10 раз стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, что соответствовало конечной концентрации 1-2  107 КОЕ/мл.

Для нанесения инокулята на чашки Петри с плотной питательной средой использовали стерильные ватные тампоны. Тампон погружали в суспензию микроорганизмов. Избыток влаги удаляли, отжимая тампон о стенку пробирки. Инокуляцию на поверхность агаровой среды проводили штриховыми движениями, периодически поворачивая чашку Петри на 60°.

На засеянную поверхность стерильным пинцетом наносили диски, изготовленные из лекарственных пленок, диаметром 6,0 ± 01 мм. Концентрация активной фракции на один диск колебалась в зависимости от эксперимента от 0,7 до 7,0%.

В качестве объектов сравнения использовали диски, изготовленные из пленко-образователей без активной фракции (плацебо), диаметром 6,0 ± 0,1 мм.

После нанесения дисков чашки помещали в термостат и инкубировали 18-20

часов при 37°С. По окончании инкубации проводили подсчет задержки зоны роста. При измерении зоны ориентировались на полную ингибицию видимого роста

[5, 6, 8].

Метод колодцев применяли для определения микробиологической активности рабочих растворов, изготовленных из активной фракции углекислотного экстракта.

Приготовление инокулята, а также его нанесение на чашки Петри идентичны данным процедурам в диско-диффузном методе. Затем на засеянный агар помещали полый цилиндр диаметром 6,0 ± 0,1 мм, что позволяло создать колодцы заданной глубины и диаметра. В колодцы помещался исследуемый раствор объемом 0,05 мл, изготовленный из активной фракции углекислотного экстракта гвоздики.

В качестве объектов сравнения использовали растворители, применяемые при изготовлении раствора (96% спирт этиловый и диметилсульфоксид). После внесения раствора в колодцы чашки помещали в термостат и инкубировали 18-20 часов при 37°С. По окончании инкубации проводили подсчет задержки зоны роста. При измерении зоны ориентировались на полную ингибицию видимого роста [5].

3. Результаты и их обсуждение

В ходе проведенных исследований по созданию лекарственной формы первоначально был получен рабочий 0,7% спиртовой раствор активной фракции, приготовленный на 96% этиловом спирте. Полученный раствор проверяли на антиста-филококковую активность (Staphylococcus aureus (ATCC 25923). В качестве объекта сравнения был использован 96% спирт этиловый, применяемый для изготовления раствора.

В результате эксперимента установлено, что 0,7% спиртовой раствор активной фракции проявляет антибактериальную активность, задерживая рост культуры Staphylococcus aureus. Зона задержки роста составляла 31 мм, тогда как исследования по изучению антистафилококковой активности 96% спирта этилового показали отсутствие задержки роста. Полученные результаты показали возможность изготовления лекарственных пленок из разных пленкообразователей на основе 0,7% спиртового раствора активной фракции.

В результате использования технологических методик по получению лекарственных форм были получены лекарственные пленки на разных полимерах, содержащих 0,05% активной фракции. Результаты изучения антимикробной активности представлены в табл. 1

По результатам эксперимента установлено, что антибактериальной активностью обладают пленки на основе хитозана и метилцеллюлозы. Наибольшей активностью обладают пленки в отношении Staphylococcus aureus (ATCC 25923) и Bacillus cereus (ATCC 10702). Пленки, изготовленные на основе альгината натрия, активностью не обладают.

Для улучшения выхода активной фракции из лекарственных форм была заменена основа рабочего раствора. Так, 96% спирт этиловый заменили на диме-тилсульфоксид. Вследствие замены полученный раствор первично проверяли на антистафилококковую активность (Staphylococcus aureus (ATCC 25923). В качестве препарата сравнения был использован диметилсульфоксид, применяемый для изготовления раствора фракции.

После определения активности установлено, что раствор проявляет антистафи-

Таблица 1

Средние значения зон задержки роста микроорганизмов дисками из лекарственных пленок на основе 0,7% спиртового раствора активной фракции и пленок плацебо

№ Содержание пленки Значения диаметра зоны задержки роста

Staphylococcus aureus

1 Хитозан + 0,7% раствор фракции 10,1 ±0,53 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 8,1 ±0,41

2 Хитозан + спирт этиловый 7,5 ±0,61 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 8, 3 ± 0, 35

3 Метилцеллюлоза + 0,7% раствор фракции 9,0 ± 0, 34 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 8,2 ± 0, 30

4 Метилцеллюлоза + спирт этиловый 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00

5 Альгинат натрия + 0,7% раствор фракции 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00

6 Альгинат натрия + спирт этиловый 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00

лококковую активность, задерживая рост культуры с зоной, равной 37 мм, тогда как диметилсульфоксид активности не проявляет.

Эти данные явились основанием для изготовления лекарственных пленок на основе 0,7% диметилсульфоксидного раствора активной фракции, который составил в пленках на различных основах 0,05%.

На основе вышеприведенных данных были даны рекомендации для получения 0,05% лекарственных пленок, состоящих из хитозана, метилцеллюлозы и альгината натрия. В качестве сравнения были использованы пленки, содержащие ди-метилсульфоксид без добавления активной фракции (плацебо). Результаты антимикробной активности пленок приводятся в табл. 2

В результате эксперимента было установлено, что антибактериальной активностью обладают пленки на основе хитозана и метилцеллюлозы, тогда как препараты на основе альгината натрия активностью не обладают. Данные пленки обладают наибольшей активностью в отношении Staphylococcus aureus (ATCC 25923) и Bacillus cereus (ATCC 10702). Пленки, изготовленные на основе альгината натрия, активностью не обладают.

В отличие от пленок, изготовленных на основе спиртового раствора, данные препараты проявляют повышенную активность в отношении Staphylococcus aureus (ATCC 25923) и Bacillus cereus (ATCC 10702), а также проявляется активность в отношении Escherichia coli (ATCC 25922) и Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).

Приведенные выше результаты явились основанием для выбора диметилсуль-фоксида в качестве растворителя активной фракции.

Таблица 2

Средние значения зон задержки роста микроорганизмов дисками из лекарственных пленок на основе 0,7% диметилсульфоксидного раствора активной фракции и пленок плацебо

№ Содержание пленки Значения диаметра зоны задержки роста

Staphylococcus aureus

1 Хитозан + 0,7% раствор фракции 11,9 ±0,41 7,1 ±0,21 6,9 ±0,11 9,2 ± 0, 34

2 Хитозан + диметилсуль-фоксид 8,1 ±0,51 6,8 ± 0,23 6,9 ± 0,24 8,1 ± 0,12

3 Метилцеллюлоза + 0,7% раствор фракции 10,2 ±0,51 7,8 ± 0,24 7,2 ± 0,42 10,2 ±0,12

4 Метилцеллюлоза + диметилсуль-фоксид 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00

5 Альгинат натрия +0,7% раствор фракции 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00

6 Альгинат натрия + диме-тилсульфоксид 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00 0,0 ± 0,00

Пленки на комбинированной основе также изучали на антибактериальную активность. Результаты активности представлены в табл. 3.

По данным, приведенным в табл. 3, видно, что лекарственные пленки, изготовленные на комбинированной основе, проявляют большую бактерицидную активность по сравнению с пленками, изготовленными только на основе одного хи-тозана или одной метилцеллюлозы.

Наибольшую активность проявляют пленки на основе хитозана-метилцеллюло-зы (1,5:1) в отношении всех представленных микроорганизмов. Наибольшая активность у данной пленки проявляется к Staphylococcus aureus (ATCC 25923) с зоной задержки роста, равной 16,1 ± 041 мм.

Следовательно, из всех вышеуказанных образцов наибольшей активностью обладает лекарственная пленка, изготовленная из 0,7% диметилсульфоксидного раствора активной фракции на основе комбинации пленкообразователя ”хито-зан-метилцеллюлоза” (1,5:1). Однако для дальнейшего изучения в опыте in vivo, её активность всё же остается низкой.

Для решения этой проблемы мы увеличили содержание активной фракции в рабочем растворе диметилсульфоксида в 5 раз. Полученный 3,5% диметил-сульфоксидный раствор активной фракции проверяли на антистафилококковую активность (Staphylococcus aureus (ATCC 25923). В качестве объекта сравнения был использован диметилсульфоксид, применяемый для изготовления раствора фракции. Установлено, что 3,5% диметилсульфоксидный раствор активной

Таблица 3

Средние значения зон задержки роста микроорганизмов дисками из лекарственных пленок, содержащих 0,05% активной фракции и пленок плацебо

№ Содержание пленки Значения диаметра зоны задержки роста

Staphylococcus aureus

1 Хитозан-метил-целлюлоза (1/1) + 0,7% раствор фракции 14,0 ± 0,59 9,1 ± 0,23 9,0 ±0,36 8,9 ±0,41

2 Хитозан-метил-целлюлоза (1/1) + диме-тилсульфоксид (плацебо) 8,1 ±0,23 7,2 ±0,36 6,9 ± 0,26 7,9 ±0,51

3 Хитозан-метил-целлюлоза (1,5:1) + 0,7% раствор фракции 16,1 ± 0,41 10,0 ±0,58 8,0 ±0,56 10, 3 ± 0, 35

4 Хитозан-метил-целлюлоза (1,5:1) + диме-тилсульфоксид (плацебо) 8,9 ±0,41 8, 8 ±0,32 7,1 ±0,58 7,0 ±0,71

5 Хитозан-метил-целлюлоза (1:1,5) + 0,7% раствор фракции 11,2 ± 0,31 7,0 ± 0,45 7,2 ± 0,34 8,0 ±0,41

6 Хитозан-метил-целлюлоза (1:1,5) + диме-тилсульфоксид (плацебо) 8,0 ± 0,34 7,1 ±0,23 7,0 ± 0,00 6,9 ±0,23

фракции проявляет антибактериальную активность, задерживая рост культуры Staphylococcus aureus. Зона задержки роста равна 43 мм. При изучении активности диметилсульфоксида, из которого был изготовлен рабочий раствор, бактерицидный эффект не выявлен.

Вышеуказанные данные являются основанием для создания лекарственных пленок из 3,5% диметилсульфоксидного раствора активной фракции на основе природных пленкообразователей в разных комбинациях.

Полученные 0,25% лекарственные пленки изучали только на антистафилокок-ковую активность, так как изучение активности в отношении других микроорганизмов, по нашим оценкам, является малоперспективным. Результаты активности представлены в табл. 4.

Таблица 4

Средние значения зон задержки роста Staphylococcus aureus (ATCC 25923) под действием дисков из 0,25% лекарственных пленок и пленок плацебо

№ Содержание пленки Значения диаметра зоны задержки роста Staphylococcus aureus

1 Хитозан + 3,5% раствор фракции 21,2 ± 0, 30

2 Хитозан + диметилсульфоксид (плацебо) 8,1 ±0,51

3 Метилцеллюлоза + 3,5% раствор фракции 22, 8 ± 0, 30

4 Метилцеллюлоза + диметилсульфоксид (плацебо) 0,0 ± 0,00

5 Хитозан-метилцеллюлоза (1 /1) + 3,5% раствор фракции 22,0 ± 0, 36

6 Хитозан-метилцеллюлоза (1 /1) + диметилсульфоксид (плацебо) 8,1 ±0,23

7 Хитозан-метилцеллюлоза (1,5:1) + 3,5% раствор фракции 35,1 ± 0,23

8 Хитозан-метилцеллюлоза (1,5:1) + диметилсульфоксид (плацебо) 8,9 ±0,41

9 Хитозан-метилцеллюлоза (1:1,5) + 3,5% раствор фракции 21,9 ± 0,43

10 Хитозан-метилцеллюлоза (1:1,5) + диметилсульфоксид (плацебо) 8,0 ± 0,34

Из табл. 4 видно, что лекарственные пленки, изготовленные из различных пленкообразователей, обладают антистафилококковой активностью в разной степени. Так, наименьшей активностью обладает пленка на основе хитозана + 3,5% раствора фракции (21 мм), а наибольшей — пленка на основе хитозана-метилцел-люлозы (1:1,5) + 3,5% раствора фракции (35,1 + 0,23 мм).

Из результатов эксперимента также можно отметить, что лекарственные пленки, содержащие 3,5% раствора фракции, по истечении суточного инкубирования в термостате набухают и незначительно увеличиваются в диаметре на 1, 52+0,69 мм. Это свойство обусловлено способностью пленок впитывать влагу из окружающей среды и увеличиваться в размерах. Способность влагопоглощения мы оцениваем как дополнительное положительное свойство лекарственных пленок.

Приведенные выше данные являются основанием для заключения об активности лекарственной пленки, изготовленной из 3,5% диметилсульфоксидного раствора активной фракции на основе хитозана-метилцеллюлозы (1,5:1). Однако результаты, приведенные в табл. 4, не позволяют отнести полученный препарат к

I I

о -I——I——I——I——I

0,7%

Рис. Значения задержки роста Staphylococcus aureus под действием рабочих растворов разной концентрации и с разными растворителями

группе высокоэффективных. Для решения этой проблемы мы усилили активность препарата путем увеличения в 5 раз концентрации активной фракции. В результате эксперимента был получен рабочий раствор диметилсульфоксида, содержащий 7% активной фракции. Представленный образец проверяли на антистафилокок-ковую активность (Staphylococcus aureus (ATCC 25923). В качестве объекта сравнения был использован диметилсульфоксид, применяемый для изготовления раствора. Установлено, что 7,0% диметилсульфоксидный раствор активной фракции оказывает антистафилококковую активность и зона задержки роста Staphylococcus aureus под действием раствора равна 51 мм.

Сравнительные данные по зонам задержки роста микроорганизма в зависимости от концентрации активной фракции и используемого растворителя представлены на рисунке.

Таким образом, данные, представленные на рисунке, свидетельствуют о перспективности создания лекарственного препарата в виде пленки на основе 7,0% диметилсульфоксидного раствора активной фракции с использованием пленкооб-разователей в разных комбинациях.

Полученные 0,5% лекарственные пленки изучались на антистафилококковую активность методом дисков. Результаты активности представлены в табл. 5.

Из результатов, приведенных в табл. 5, видно, что образцы лекарственных пленок обладают разной антистафилококковой активностью. Наибольшей активностью обладает 0,5% лекарственная пленка, изготовленная на основе хитозана-метилцеллюлозы (1,5:1). Её активность на 25% превосходит активность аналогичной пленки, изготовленной из 3,5% диметилсульфоксидного раствора активной фракции, и выражается в задержке роста диаметром 43,9 ± 0,63 мм.

Таким образом, использование методов колодцев и дисков позволило определить антибактериальные свойства различных лекарственных пленок, изготовленных из активной фракции углекислотного экстракта гвоздики, а также выявить, что наилучшим растворителем для активной фракции является диметилсульфок-сид, а рабочий 7,0% раствор активной фракции оптимально подходит для изготовления 0,5% лекарственной пленки на основе хитозана-метилцеллюлозы (1,5:1). Полученные результаты являются прямым доказательством того, что при разработке лекарственной формы препаратов, подлежащих использованию для лечения наружных гнойно-воспалительных инфекций, необходимо использовать микробио-

Таблица 5

Средние значения зон задержки роста Staphylococcus aureus (ATCC 25923) дисками из 0,5% лекарственных пленок и пленок плацебо

№ Содержание пленки Значения диаметра зоны задержки роста Staphylococcus aureus

1 Хитозан + 7,0% раствор фракции 34,9 ± 0,53

2 Хитозан + диметилсульфоксид (плацебо) 8,1 ±0,51

3 Метилцеллюлоза + 7,0% раствор фракции 40,1 ± 0,63

4 Метилцеллюлоза + диметилсульфоксид (плацебо) 0,0 ± 0,00

5 Хитозан-метилцеллюлоза (1 /1) + 7,0% раствор фракции 28,1 ± 0,51

6 Хитозан-метилцеллюлоза (1 /1) + диметилсульфоксид (плацебо) 8,1 ±0,23

7 Хитозан-метилцеллюлоза (1,5:1) + 7,0% раствор фракции 43,9 ± 0,63

8 Хитозан-метилцеллюлоза (1,5:1) + диметилсульфоксид (плацебо) 8,9 ±0,41

9 Хитозан-метилцеллюлоза (1:1,5) + 7,0% раствор фракции 34,1 ± 0,53

10 Хитозан-метилцеллюлоза (1:1,5) + диметилсульфоксид (плацебо) 8,0 ± 0,34

логические методики оценки их эффективности и терапевтической эквивалентности.

Литература

[1] Баронец, Н.Г. Влияние экстрактов лекарственных растений на рост микроорганизмов / Н.Г. Баронец, Г.П. Адлова, В.А. Мельникова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. - №5. - С. 71-72.

[2] Золотарев, П.Н. Антимикробные свойства химических соединений растительного происхождения: материалы 71-й итоговой Республиканской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием. - Уфа.: Изд-во ГОУ ВПО ”БГМУ Росздрава”, 2006. - С. 124-125.

[3] Золотарев, П.Н. Определение чувствительности микроорганизмов к ряду фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды: Аннотации докладов и материалов Дня науки молодых ученых РостГМУ. - Ростов н/Д.: Изд-во РостГМУ, 2006. - С. 44.

[4] Красильников, А.П. Справочник по антисептике / А.П. Красильников. -Минск: Вышэйшая школа, 1995. - 367 с.

[5] Лабинская, А.С. Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская, Л.П. Блинкова, А.С.Ещина. - М.: Медицина, 2004. - 576 с.

[6] Методические указания по изучению противомикробной активности фармакологических веществ / Т.А. Гуськова [и др.] // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. -М.: Ремедиум, 2000. - С. 264-272.

[7] Антибактериальная активность некоторых аппликационных лекарственных форм с растительными компонентами / П.Г. Мизина [и др.] // Растительные ресурсы. - 2001. - Вып. 4. - С. 97-99.

[8] Поляк, М.С. Теория и практика определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам диско-диффузным методом (лекция) / М.С. Поляк // Клиническая лабораторная диагностика. - 2003. - №1. -С. 25-32.

Поступила в редакцию 26/ VIII/2006; в окончательном варианте — 26/VIII/2006.

ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF MEDICINE FILMS WITH THE SECOND FRACTION OF СARYOPHYLLUS AROMATICUS L. CO2-EXTRACTS

© 2006 P.N. Zolotarev2

In the paper the antibacterial activity of medicine films with the active fraction of Сaryophyllus aromaticus L. CO2-extracts is studied. It is found that 0,5% medicine films made at the complex chitosan and methilcellulose base (9/6) have the highest activity level.

Paper received 26/VIII/2006. Paper accepted 26/VIII/2006.

2Zolotarev Pavel Nicolaevich (zolotareffaiist.ru), Dept. of General and Clinical Microbiology, Immunology and Allergology, Samara State Medical University, Samara, 443099, Russia.