Способ получения генетически модифицированных древесных растений
METHOD FOR GENETICALLY MODIFIED TREES PRODUCTION

Изобретение относится к области биотехнологии растений, использующей методы генной инженерии, и может быть применено для получения генетически модифицированных древесных растений, экспрессирующих гетерологичные гены.
Древесные растения, относящиеся как к плодовым культурам, так и к лесным породам имеют очень большое экономическое значение. Сборы плодов в России исчисляются миллионами тонн, а объемы лесозаготовок - десятками миллионов кубометров. Появление генетически модифицированных деревьев с новыми признаками, которые невозможно придать методами традиционной селекции, может значительно повысить эффективность как сельского, так и лесного хозяйства. Однако, в силу биологических особенностей древесных растений, эффективность их генетической трансформации значительно ниже, чем у травянистых растений.
Первая трансгенная лесная порода, гибрид тополя с осиной, была получена в 1987 году (Fillatti J.J., Sellmer J., McCown В., Haissig В., Comai L. Agrobacterium mediated transformation and regeneration of Populus. Mol. Gen. Genet. 1987. 206:192-199), а первая трансгенная плодовая культура, яблоня, - в 1989 году (James D.J., Passey A.J., Barbara D.J. Genetic transformation of apple (Malus pumila Mill.) using a disarmed Ti-binary vector. Plant Cell Rep.1989. 7:658-661), то есть всего через несколько лет после получения первых трансгенных растений в 1983 году. Однако в настоящее время древесные трансгенные растения распространены несоизмеримо меньше, чем травянистые. В 2014 году трансгенные растения занимали в мире более 181 млн га (James С. 2014. Global Status of Commercialized Biotech / GM Crops: 2014. IS AAA Brief No. 49. ISAAA: Ithaca, NY), и из них на долю трансгенных деревьев, тополя и папайи, приходились, в лучшем случае, только десятки тысяч гектаров. Не в последнюю очередь такое положение дел связано с низкой эффективностью трансформации древесных растений.
Эффективность (частота) трансформации рассчитывается как отношение количества первичных трансгенных растений (для которых подтверждено наличие вставки в геноме) к количеству эксплантов, используемых для трансформации, и представляется в процентах. Трансформацию древесных растений в большинстве случаев (за исключением хвойных) осуществляют агробактериальным способом и на ее эффективность может влиять большое количество факторов, связанных как с растением и его культивированием, так и с агробактериями. Эти факторы включают генотип растения, тип экспланта, его физиологическое состояние, состав питательной среды, бактериальный штамм и/или вектор и ряд других.
Стандартный процесс генетической трансформации растительных эксплантов с помощью агробактерий включает в себя несколько стадий: подготовку эксплантов, инокуляцию эксплантов в агробактериальной суспензии, кокультивацию эксплантов с агробактериями, отмывку эксплантов от излишка агробактерий, регенерацию растений из эксплантов на селективной среде. Стадии кокультивации и регенерации проходят на твердых питательных средах, которые, как правило, содержат одинаковый набор минеральных солей, углеводов, регуляторов роста растений и отличаются только содержанием бактериостатических антибиотиков и селективных агентов (в средах для кокультивации они отсутствуют). Все остальные манипуляции с эксплантами (подготовка, инокуляция, отмывка) проводятся в жидкости, в качестве которой выступает вода или жидкая питательная среда. Известно, что минеральные соли и углеводы, входящие в состав питательных сред, оказывают влияние на рост клеток растений не только потому, что являются для них источником питания, но также благодаря своим осмотическим свойствам. Таким образом, периодическое размещение растительных эксплантов в процессе генетической трансформации в условиях с различным осмотическим давлением способно вызывать осмотический стресс у растительных клеток, тем самым снижая их жизнеспособность и, следовательно, способность к генетической трансформации и последующей регенерации в целые растения. Это особенно важно для эксплантов древесных растений, которые характеризуются достаточно низкой частотой трансформации. Для предотвращения негативного влияния осмотического стресса следует обеспечить пребывание растительных эксплантов в течение всего процесса генетической трансформации в схожих осмотических условиях.
Известны способы генетической трансформации древесных растений, в которых вода применяется для приготовления агробактериальной суспензии (Matsunaga Е., Sugita K., Ebinuma Н. An asexual production of selectable marker-free transgenic woody plants, vegetatively propagated species. Mol Breed. 2002. 10: 95-106) или отмывки от избытка агробактерий (US Patent 5,922,928. Chiang et al. An Agrobacterium-mediated transformation and regeneration method for plants including a transformation method to produce transgenic plants with an altered lignin composition. July 13, 1999). Недостатком этих способов является то, что используемая в них химически чистая (дистиллированная) вода имеет наивысшую величину водного потенциала, которая сильно отличается от водных потенциалов используемых питательных сред для кокультивации/регенерации - MS (Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 1962. 15: 473-497) или WPM (Lloyd G., McCown B.H. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, (Kalmia latifolia) by use of shoot tip culture. Int. Plant Prop.Soc, Comb. Proc. 1980. 30: 421-427) соответственно.
Известны также способы генетической трансформации, в которых для приготовления агробактериальной суспензии или отмывки от избытка агробактерий используются различные жидкие питательные среды. Например, для приготовления агробактериальной суспензии при трансформации семечковых (US Patent 6,100,453. Aldwinckle et al. Transgenic pomaceous fruit with fire blight resistance. August 8, 2000) использовалась среда 1/2 MS, а при трансформации груши (Matsuda N., Gao M., Isuzugawa K., Takashina Т., Nishimura K. Development of an Agrobacterium-mediated transformation method for pear (Pyrus communis L.) with leaf-section and axillary shoot-meristem explants. Plant Cell Rep. 2005. 24: 45-51) - среда 1/10 NN (Nitsch J.P., Nitsch C. Haploid plants from pollen grains. Science. 1969. 163: 85-87). Для отмывки эксплантов от избытка агробактерий при трансформации березы ( K., Pappinen A., von Weissenberg K. Comparisons of the efficiency of some promoters in silver birch (Betula pendula). Plant Cell Rep. 1998. 17: 356-361) применяли среду MS. Недостатком этих способов является то, что минеральный состав питательных сред для инокуляции и отмывки отличался от состава сред для кокультивации/регенерации. Кроме того, среды для инокуляции и отмывки по сравнению со средами для кокультивации/регенерации или не содержали углеводов вообще (Aldwinckle et al., 2000;  et al., 1998), или содержали их в 3 с лишним раза более высокой концентрации (Matsuda et al., 2005).
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ генетической трансформации яблони (Szankowski I., Briviba K., Fleschhut J.,  J., Jacobsen H.J., Kiesecker H. Transformation of apple (Malus domestica Borkh.) with the stilbene synthase gene from grapevine (Vitis vinifera L.) and a PGIP gene from kiwi (Actinidia deliciosa). Plant Cell Rep. 2003. 22: 141-149), в котором для инокуляции, отмывки, кокультивации/регенерации использовалась одна и та же среда - MS. Недостатком ближайшего аналога является то, что среды для инокуляции и отмывки не содержали углеводов, тогда как среда для кокультивации/регенерации содержала 3% сорбитола. Кроме того, перед однократной отмывкой эксплантов от избытка агробактерий средой MS проводилась их двукратная отмывка водой, что подвергало растительные клетки воздействию осмотического стресса.
Задачей изобретения является повышение частоты генетической трансформации путем выдерживания растительных эксплантов в ходе всего процесса в условиях со схожими осмотическими свойствами.
Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе генетической трансформации, включающем: а) получение и подготовку к инокуляции растительных эксплантов штамма Agrobacterium tumefaciens, содержащего предназначенный для введения в растение селективный, маркерный и/или полезный гены; б) получение и подготовку к инокуляции штаммом A. tumefaciens растительных эксплантов; в) инокуляцию эксплантов штаммом A. tumefaciens в жидкой среде; г) кокультивацию эксплантов с агробактериями на среде без селективных агентов и бактериостатических антибиотиков; д) отмывку эксплантов от агробактерий; е) помещение эксплантов на среду, содержащую селективные агенты и бактериостатические антибиотики, с целью получения регенерантов непосредственно из тканей эксплантов или через стадию каллуса; ж) отбор полученных на селективной среде регенерантов путем их тестирования на наличие полноразмерной копии целевого гена, предусмотрено следующее отличие - проведение подготовки растительных эксплантов к инокуляции в культуральной среде, содержащей все компоненты среды для кокультивации, селекции и регенерации, за исключением гелеобразующих веществ, регуляторов роста растений, бактериостатических антибиотиков и селективных агентов, а также содержащей дополнительно, но не обязательно, вещества, служащие аттрактантами для агробактерий, например ацетосирингон. Кроме того, предложенный способ отличается тем, что: а) инокуляция эксплантов агробактериями проводится в культуральной среде, содержащей все компоненты среды для кокультивации, селекции и регенерации, за исключением гелеобразующих веществ, регуляторов роста растений, бактериостатических антибиотиков и селективных агентов; б) отмывка эксплантов от агробактерий проводится в культуральной среде, содержащей все компоненты среды для кокультивации, селекции и регенерации, за исключением гелеобразующих веществ, регуляторов роста растений и селективных агентов; в) древесные растения выбраны из группы, включающей абрикос, айву, алычу, вишню, грушу, персик, сливу, черешню, яблоню, березу, бук, вяз, иву, каштан, клен, липу, осину, тополь, ясень.
Осуществление изобретения
Примеры в детальном описании приводятся для подвоя груши ГП 217, генотипа березы бп3ф1 и генотипа осины Pt.
Однако перечень растений для использования в данном изобретении не ограничивается указанными растениями.
В качестве эксплантов для трансформации, в частности, используют материал in vitro: листья груши и березы, междоузлия осины.
Примеры в детальном описании приводятся для маркерного гена gus.
Возможность осуществления предлагаемого способа подтверждается представленными примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1. Подготовка штаммов бактерий A. tumefaciens СВЕ21 (рСВЕ21, pBI121) для трансформации растений
4
3
3
Для трансформации растений используют ночную культуру бактерий A. tumefaciens. Для этого 100 мкл суспензии клеток бактерий A. tumefaciens СВЕ21 (рСВЕ21, pBI121) добавляют к 50 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мг/л канамицина, и инкубируют в течение ночи на термостатируемом орбитальном шейкере при 28°С и 120-150 об/мин, после чего центрифугируют полученную суспензию 5 минут при 4000 об/мин, осадок промывают жидкой средой MS и повторяют центрифугирование и промывание. После осаждения клеток надосадочную жидкость сливают и добавляют 50 мл или жидкой среды MS без углеводов (стандартный вариант), или жидких сред NN, MS, MSm (модифицированная среда MS, содержащая 10 мМ NHNO и 30 мМ KNO), содержащих 30 г/л сахарозы (варианты для трансформация груши, березы, осины, соответственно), после чего ресуспендируют.
Пример 2. Трансформация растений груши клетками бактерий A. tumefaciens СВЕ21 (рСВЕ21, pBI121)
А) Подготовка растительного материала
4
3
Для трансформации растений груши используют листовые экспланты с укорененных растений in vitro. Размножение культуры груши проводят на питательной среде, содержащей минеральные соли QL (Quoirin М, Lepoivre P. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. Acta Hort. 1977. 78: 437-442), витамины JS (Jacobini A., Standardi A. La moltiplicazione in vitro del melo cv. Wellspur. Rivisia della Ortoflorofrutticoltura Italiana. 1982. 66: 217-229), 1,5 мг/л БАП, 0,2 мг/л ИМК, 0,3 мг/л ГК, 100 мг/л мезоинозита, 20 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Укоренение побегов груши проводят на питательной среде, содержащей минеральные соли QL с уменьшенным вдвое содержанием NHNO, витамины MS, 0,5 мг/л ИМК, 10 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Растения выращивают при фотопериоде 16/8 часов, температуре 22-24°С и освещенности 3000-3500 люкс.
Б) Генетическая трансформация эксплантов растений груши
Для трансформации используют листья с укорененных растений, которые находились на среде для укоренения в течение 1,5-2 месяцев. Листья срезают и помещают в чашки Петри, содержащие или воду (стандартный вариант), или жидкую среду NN с 30 г/л сахарозы. У листьев удаляют черешки и верхушки (у крупных листьев - также и боковые стороны) и наносят несколько надрезов перпендикулярно центральной жилке, не доводя их до краев листа. Подготовленные таким образом экспланты помещают на 40-50 минут в суспензию агробактерий, после чего осушают стерильными бумажными фильтрами и размещают на бумажных фильтрах, расположенных в чашках Петри на поверхности среды для кокультивации, содержащей минеральные соли NN, витамины JS, 3 мг/л ТДЗ, 0,5 мг/л НУК, 0,1 мг/л ГК, 100 мг/л мезоинозита, 100 мг/л гидролизата казеина, 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. В каждую чашку помещают по 10-15 эксплантов. Кокультивацию эксплантов с агробактериями проводят в темноте при температуре 23°С в течение трех суток. После кокультивации экспланты отмывают от избытка агробактерий или в воде, содержащей 500 мг/л цефотаксима (стандартный вариант), или в жидкой среде NN, содержащей 30 г/л сахарозы и 500 мг/л цефотаксима. Отмытые экспланты подсушивают на бумажных фильтрах и переносят на среду для регенерации и селекции трансформантов того же состава, что и среда для кокультивации, содержащую дополнительно 25 мг/л канамицина и 500 мг/л цефотаксима. На этой среде экспланты выдерживают в течение 4-6 субкультиваций по четыре недели в темноте при температуре 23°С. Регенерированные побеги пересаживают на среду для размножения, содержащую 25 мг/л канамицина и 250 мг/л цефотаксима.
Пример 3. Трансформация растений березы клетками бактерий A. tumefaciens СВЕ21 (рСВЕ21, pBI121)
А) Подготовка растительного материала
Для трансформации растений березы используют листовые экспланты с растений in vitro. Размножение культуры березы проводят на питательной среде WPM, содержащей 0,6 мг/л БАП, 0,1 мг/л ИМК, 20 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Растения выращивают при фотопериоде 16/8 часов, температуре 22-24°С и освещенности 3000-3500 люкс.
Б) Генетическая трансформация эксплантов растений березы
Для трансформации используют листья с растений in vitro возрастом один месяц. Листья срезают и помещают в чашки Петри, содержащие или воду (стандартный вариант), или жидкую среду MS с 30 г/л сахарозы. У листьев удаляют черешки и верхушки (у крупных листьев - также и боковые стороны) и наносят несколько надрезов перпендикулярно центральной жилке, не доводя их до краев листа. Подготовленные таким образом экспланты помещают на 40-50 минут в суспензию агробактерий, после чего осушают стерильными фильтрами и размещают на фильтрах, расположенных в чашках Петри на поверхности среды для кокультивации, содержащей минеральные соли MS, 5 мг/л зеатина, 5 мг/л БАП, 0,2 мг/л ИМК, 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. В каждую чашку помещают по 10-15 эксплантов. Кокультивацию эксплантов с агробактериями проводят в темноте при температуре 23°С в течение трех суток. После кокультивации экспланты отмывают от избытка агробактерий или в воде, содержащей 500 мг/л цефотаксима (стандартный вариант), или в жидкой среде MS, содержащей 30 г/л сахарозы и 500 мг/л цефотаксима. Отмытые экспланты подсушивают на бумажных фильтрах и переносят на среду для регенерации и селекции трансформантов того же состава, что и среда для кокультивации, содержащую дополнительно 50 мг/л канамицина и 500 мг/л цефотаксима. На этой среде экспланты выдерживают в условиях 16-часового светового дня при 22-23°C с пересадкой каждые 4 недели. Регенерированные побеги пересаживают на среду для размножения, содержащую 50 мг/л канамицина и 250 мг/л цефотаксима.
Пример 4. Трансформация растений осины клетками бактерий A. tumefaciens СВЕ21 (рСВЕ21, pBI121)
А) Подготовка растительного материала
Для трансформации растений осины используют междоузлия растений in vitro. Размножение культуры осины проводят на безгормональной питательной среде WPM, содержащей 1 мг/л витаминов MS, 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Растения выращивают при фотопериоде 16/8 часов, температуре 22-24°С и освещенности 3000-3500 люкс.
Б) Генетическая трансформация эксплантов растений осины
Для трансформации используют междоузлия растений возрастом 3-4 недели, нарезанные на сегменты 5-10 мм. Подготовленные таким образом экспланты помещают на 30 минут в суспензию агробактерий, после чего осушают стерильными фильтрами и размещают на фильтрах, расположенных в чашках Петри на поверхности среды для кокультивации, содержащей минеральные соли MSm, витамины MS, 0,5 мг/л 2,4-Д, 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. В каждую чашку помещают по 20 эксплантов. Кокультивацию эксплантов с агробактериями проводят в темноте при температуре 23°С в течение трех суток. После кокультивации экспланты отмывают от избытка агробактерий или в воде, содержащей 500 мг/л цефотаксима (стандартный вариант), или в жидкой среде MSm, содержащей 30 г/л сахарозы и 500 мг/л цефотаксима. Отмытые экспланты подсушивают на бумажных фильтрах и переносят на среду для регенерации и селекции трансформантов того же состава, содержащую вместо 0,5 мг/л 2,4-Д 0,5 мг/л зеатина и дополнительно 30 мг/л канамицина и 500 мг/л цефотаксима. На этой среде экспланты выдерживают в условиях 16-часового светового дня при 22-23°C с пересадкой каждые 4 недели. Регенерированные побеги пересаживают на среду для размножения, содержащую 30 мг/л канамицина и 250 мг/л цефотаксима.
Пример 5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) на присутствие фрагмента последовательности гена gus
Присутствие гена gus в трансгенных растениях груши, березы и осины подтверждают методом ПЦР с праймерами 35S (SEQ ID NO: 1) и uidA-low (SEQ ID NO: 2), специфичными для последовательности промотора CaMV 35S и внутренней части маркерного гена.
4
2
4
Геномную ДНК из растений груши, березы и осины выделяют по методу Rogers and Bendich (Rogers S.O., Bendich A.J. Extraction of total cellular DNA from plants, algae and fungi. In: Plant Molecular Biology Manual. Gelvin S.B., Schilperoort R.A. (Eds.). Kluwer Academic Publisher, 1994. D1:1-8). Для выделения используют листья растений in vitro (около 100 мг). Полученную растительную ДНК используют в качестве матрицы в ПЦР-анализах. Реакционная смесь содержит 16 мМ (NH)SO, 0,01% BSA, 200 мкМ каждого дНТФ, 0,4 мкМ каждого олигонуклеотида, 0,05 единиц/мкл Taq полимеразы, 1-5 нг/мкл геномной ДНК. Реакцию проводят в объеме 50 мкл при следующих условиях: 96°С - 3 мин; 30 циклов: 94°С - 1 мин, 60°С - 1 мин, 72°С - 1 мин, затем 72°С - 5 мин.
Продукты ПЦР анализируют в 1,8% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Гель фотографируют в ультрафиолете при длине волны 260-280 нм. Появление продукта ПЦР (ДНК размером 1149 н.п.) при использовании указанных праймеров, а также при условии отсутствия его в реакциях, поставленных на контрольной ДНК, свидетельствует о присутствии искомого гена в ДНК исследуемых растений (Фиг. 1, Фиг. 2 и Фиг. 3).
Пример 6. Сравнение различных способов генетической трансформации
Генетическую трансформацию груши, березы и осины геном gus проводят или стандартным способом, когда подготовка эксплантов и их отмывка от агробактерий проходит в воде, а инокуляция в жидкой среде MS, или модифицированным способом, когда подготовка, инокуляция и отмывка эксплантов груши проходит в жидкой среде NN, содержащей 30 г/л сахарозы, эксплантов березы - в жидкой среде MS, содержащей 30 г/л сахарозы, а эксплантов осины - в жидкой среде MSm, содержащей 30 г/л сахарозы. Регенераты, полученные с эксплантов соответствующих вариантов, проверяют на наличие последовательностей гена gus, как описано в примере 5. Результаты трансформации различными способами представлены в таблице 1.
Из представленных данных можно сделать вывод о наличии причинно-следственной связи между выдерживанием эксплантов древесных видов растений в ходе генетической трансформации в условиях со схожими осмотическими свойствами, что предотвращает осмотический стресс, и эффективностью генетической трансформации. Повышение частоты трансформации при вышеуказанных условиях наблюдалось для различных видов древесных растений, что свидетельствует об универсальности предложенного способа.
Таким образом, изобретение позволяет повысить эффективность генетической трансформации древесных растений путем предотвращения осмотического стресса у клеток эксплантов благодаря их нахождению в ходе всего процесса генетической трансформации в условиях со схожими осмотическими свойствами.