СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРИРОДНЫХ КЛЕТОК-КИЛЛЕРОВ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

1. Способ размножения природных клеток-киллеров (NK) в культуре, включающий: выделение одноядерных клеток периферической крови (РВМС) из образца крови; выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ из PBMC; и совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии по меньшей мере двух цитокинов; при этом комбинация питающих клеток содержит облученные клетки Jurkat и облученные клетки непрерывной линии лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV-LCL), а по меньшей мере двумя цитокинами являются IL-2 и IL-21.
2. Способ по п. 1, в котором выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ из РВМС проводят с применением хотя бы одной из микросфер CD56 и микросфер CD3.
3. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере два цитокина дополнительно содержат один или более цитокинов, выбранных из группы, состоящей из IL-2, IL-21, IL-15, Flt3-L, SCF, IL-7, IL-18, IL-4, интерферона типа I, GM-CSF, IGF 1 и их комбинации.
4. Способ по п. 1, в котором IL-2 добавляют в концентрации 50-1000 МЕ/мл.
5. Способ по п. 1, в котором IL-21 добавляют в концентрации 10-100 нг/мл.
6. Способ по п. 1, в котором соотношение облученных клеток Jurkat и облученных клеток EBV-LCL составляет приблизительно 1:0,1-5 или 0,1-5:1.
7. Способ по п. 1, в котором совместное культивирование представляет собой совместное культивирование в течение 1-50 дней.
8. Способ по п. 1, в котором совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток проводят при соотношении 1:1-100 клеток CD56+ и/или клеток CD3-/CD56+ и питающих клеток.
9. Способ по п. 1, который дополнительно включает: совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии IL-2 в течение первого периода; и совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии IL-21 в течение второго периода.
10. Способ по п. 9, в котором IL-21 добавляют больше одного раза в течение дня 0-6 второго периода.
11. Способ по п. 9, в котором второй IL-21 и комбинацию питающих клеток добавляют больше одного раза в течение дня 0-6 второго периода.
12. Способ по п. 9, в котором IL-21 добавляют больше одного раза в течение первых шести дней каждого четырнадцатидневного цикла в течение второго периода.
13. Композиция, изготовленная способом по п. 1.
14. Способ размножения NK-клеток в культуре, включающий: выделение одноядерных клеток периферической крови (РВМС) из образца крови, выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ из PBMC; и совместное культивирование по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ с комбинацией питающих клеток в присутствии по меньшей мере двух цитокинов; при этом комбинация питающих клеток содержит облученные клетки Jurkat и облученные клетки непрерывной линии лимфоцитов, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (EBV-LCL), а по меньшей мере двумя цитокинами являются IL-2 и IL-21 и при этом питающие клетки и цитокины добавляют через определенные промежутки времени на протяжении всего размножения в культуре.
15. Способ по п. 14, в котором выделение по меньшей мере одной из клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+ из РВМС проводят с применением хотя бы одной из микросфер CD56 и микросфер CD3.
16. Способ по п. 14, в котором IL-21 добавляют в концентрации 10-100 нг/мл.
17. Способ по п. 14, в котором IL-21 добавляют один раз или больше в течение каждого из следующих периодов: День 0-6; День 14-20 и День 28-34.
18. Способ по п. 14, в котором совместное культивирование включает совместное культивирование в течение 1-50 дней.
19. Клеточная терапевтическая композиция, содержащая: эффективное количество по меньшей мере одной из NK-клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+, при этом чистота NK-клеток в клеточной терапевтической композиции составляет по меньшей мере 90% относительно других клеток в клеточной терапевтической композиции; IL-2 в концентрации 50-50000 МЕ/мл; и фармацевтически приемлемый носитель, при этом клеточная терапевтическая композиция составлена в форме, пригодной для введения пациенту-человеку, нуждающемуся в NK-клеточной терапии.
20. Композиция по п. 19, в которой IL-2 присутствует в количестве 50-1000 МЕ/мл.
21. Композиция по п. 20, которая не содержит IL-21.
22. Композиция по п. 21, которая находится при температуре 2-8°C.
23. Композиция по п. 22, которая находится при температуре приблизительно 4°C.
24. Композиция по п. 19, в которой IL-2 присутствует в количестве приблизительно 500 МЕ/мл.
6
11
25. Композиция по п. 19, в которой терапевтически эффективное количество составляет от 1·10 до 1·10 NK-клеток на кг массы тела человека.
26. Композиция по п. 25, которая находится при температуре приблизительно 4°C.
6
11
27. Мешок, содержащий клеточную композицию, которая содержит: от 1·10 до 1·10 NK-клеток на кг массы тела человека, при этом NK-клетки являются клетками CD56+ и/или CD3-/CD56+, полученными из одноядерных клеток периферической крови (РВМС), имеют чистоту по меньшей мере приблизительно 90%, при этом меньше чем 1% клеток в мешке являются Т-клетками; IL-2 в концентрации 50-50000 МО/мл; и фармацевтически приемлемый носитель, содержащий раствор Гартмана, альбумин, DMSO, и не содержит IL-21.
28. Клеточная композиция, содержащая, по меньшей мере, одну из NK-клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+, при этом чистота NK-клеток составляет по меньшей мере 90% относительно других клеток в клеточной композиции; IL-2 в концентрации 50-50000 МЕ/мл; и фармацевтически приемлемый носитель, содержащий DMSO, и не содержит IL-21, при этом клеточная композиция составлена в форме, пригодной для введения пациенту-человеку.
29. Композиция по п. 28, в которой IL-2 присутствует в количестве 50-1000 МЕ/мл.
30. Композиция по п. 29, которая дополнительно содержит раствор Гартмана.
31. Композиция по п. 30, которая дополнительно содержит альбумин.
32. Композиция по п. 31, в которой альбумин присутствует в количестве 1%.
33. Композиция по п. 31, в которой IL-2 присутствует в количестве 500 МЕ/мл
34. Композиция по п. 31, которая находится при температуре 2-8°C.
35. Композиция по п. 31, которая находится при температуре приблизительно 4°C.
36. Клеточная композиция, содержащая по меньшей мере одну из NK-клеток CD56+ и/или CD3-/CD56+, при этом чистота NK-клеток составляет по меньшей мере 90% относительно других клеток в клеточной композиции; IL-2 в концентрации 50-50000 МЕ/мл; и фармацевтически приемлемый носитель, при этом клеточная композиция составлена в форме, пригодной для введения пациенту-человеку.
37. Композиция по п. 36, в которой клетки сохраняются по меньшей мере 24 часа.
38. Композиция по п. 36, в которой клетки сохраняются по меньшей мере 48 часов.