ВЕЩЕСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИАНГИОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ
SUBSTANCE WITH ANTI-ANGIOGENIC ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и касается применения описанного ранее [С.Б. Середенин, Т.А. Гудашева. Патент РФ №2410392] низкомолекулярного пептидного миметика фактора роста нервов: амида N-сукцинил-L-глутамил-L-лизина - соединения ГК-1, обладающего антиангиогенной активностью.
Изобретение относится к разделу Экспериментальная медицина и в дальнейшем может быть использовано для создания нового оригинального высокоэффективного лекарственного средства для подавления неоангиогенеза при различных патологических состояниях.
В настоящее время неоангиогенез рассматривают как сложный многостадийный процесс формирования новой капиллярной сети из эндотелиальных клеток, выстилающих внутреннюю поверхность артериол и венул [Chung A.S., Ferrara N., Annu. Rev. Cell. Dev. Biol, 2011; 27:563-584; Chu H., Wang Y., Ther. Deliv., 2012; 3(6):693-714 и др.]. В нормальных физиологических условиях неоангиогенез имеет основополагающее значение в реализации таких важных биологических процессов, как эмбриогенез [Roman B.L, Pekkan K., Biochem. Model. Mechanobiol., 2012; 11(8):1149-1168; Portal-Nunez S. et al., Histol. Histopathol., 2012; 27(5):559-566] и развитие фолликулов в яичниках [Chaves R.N. et al., Reprod. Fertil. Dev., 2012; 24(7):905-915; Pate J.L. et al., Rerprod. Domest. Anim., 2012; Suppl.4:297-303]. He менее важное значение этот феномен имеет и в адаптивных процессах, например в заживлении ран [Best T.M. et al., Br. J. Sports. Med., 2013; 47(9):556-560; Yuan Т. et al., Curr. Pharm. Biotechnol., 2012; 13(7):1173-1184] и развитии коллатерального кровообращения при инфаркте миокарда [Seiler С., Eur. J. Clin. Invest., 2010; 40(5):465-476; Silvestre J.S., Thromb. Res., 2012; Suppl.1:S90-S94]. Вместе с тем аномальное новообразование кровеносных сосудов, т.е. патологический неоангиогенез, является одним из ключевых звеньев патогенеза диабетической ретино- [Forlenza G.P., Stewart M.W., Pediatri. Endocrmol. Rev., 2012; 10(2):217-226; Virgili G. et al., Cochrane Database Syst. Rev., 2012; 12:CD007419] и нефропатии [Advani A., Gilbert R.E, Semin. Nephrol., 2012; 32(2): 199-207; Dei Cas A., Gnudi L., Metabolism, 2012; 61(12):1666-1673], глаукомы [Olmos L.C., Lee R.K., Int. Ophthalmol. Clin., 2011; 51(3):27-36; Mathew R., Barton K., Am. J. Ophthalmol., 2011; 152(1):10-15], псориаза [Armstrong A.W. et al., J. Dermatol. Sci., 2011; 63(1):1-9; Crawshaw A.A. et al., Expert. Opin. Investig. Drugs, 2012; 21(1):33-43], и, что особенно важно, злокачественных новообразований [Eveno С., Pocard M., Cell. Adh. Migr., 2012; 6(6):569-573; Perrot-Applanat M., Benedetto M., Cell. Adh. Migr., 2012; 6(6):547-553].
Фундаментальные исследования, посвященные изучению патологического ангиогенеза, составили теоретическую основу для поиска лекарственных средств, обладающих антиангиогенной активностью. Наиболее перспективным в этом плане представляется разработка и внедрение в клиническую практику модифицированных экзогенных аналогов эндогенных биологически активных веществ и/или химических соединений, обладающих способностью подавлять ангиогенную активность эндогенных факторов роста сосуда. Исторически большинство исследований было направлено на создание веществ, подавляющих и/или препятствующих реализации ангиогенных эффектов фактора роста эндотелия сосудов - VEGF [Meadows K.L., Hurwitz H.I., Cold. Spring. Harb. Perspect. Med., 2012; 2(10):pii: a006577; Kaiser P.K. et al., Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol., 2012; 250(11):1563-1571], поскольку последний рассматривали как основной сигнальный белок, активирующий ангиогенез [Breuss J.M., Uhrin P., Cell. Adh. Migr., 2012; 6(6):535-615; Bautch V.L., Cold. Spring. Harb. Perspect. Med., 2012; 2(9):a006452]. Однако в последнее время получены убедительные данные, свидетельствующие о том, что помимо VEGF одна из ключевых ролей в регуляции ангиогенеза принадлежит другому сигнальному белку - фактору роста нервов - NGF [Sone Y. et al., Yakugaku Zasshi, 2012; 132(2):157-160; Karatzas A. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 2013; 62(3):270-277]. He менее важным представляется и тот факт, что NGF не только инициирует ангиогенез посредством активации специфичных для него TrkA рецепторов, но и активирует сигнальные каскады, опосредованные VEGF [Nakamura K. et al., Mol. Cell. Neurosci., 2011; 46(2):498-506; Kim Y.S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2013, 431(4):740-745].
В результате фундаментальных исследований в ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН синтезирован ряд пептидных миметиков NGF, один из которых - амид N-сукцинил-L-глутамил-L-лизина - соединение ГК-1, - проявляет антагонистические свойства в отношении TrkA рецепторов [Гудашева Т.А. Доклады Академии наук, 2010, 434 (4); 549-551] и обладает антиангиогенной активностью.
Следующие примеры иллюстрируют антиангиогенную активность амида N-сукцинил-L-глутамил-L-лизина - соединения ГК-1.
Пример 1. Изучение влияния соединения ГК-1 на формирование трубчатых структур (тубулогенез) в культуре клеток эндотелия человека HUVEC.
Оценку антиангиогенной активности соединения ГК-1 в экспериментах in vitro проводили на культуре изолированных клеток эндотелия человека HUVEC. Такой подход обусловлен тем, что согласно литературным данным образование трубчатых структур (тубулогенез) является начальной стадией ангиогенеза [De Smer F. et al., Atheroscler Thromb Vase Biol 2009; 29:639-649].
-5
Клетки эндотелия человека рассаживали в среде ДМЕМ, содержащей 20 мМ Hepes, 2 мМ L-глутамина, гепарин (5 Ед/мл), ECGF (20 мкг/мл), 10% FBS с плотностью 3,5 тыс. на 96-луночные планшеты, покрытые полилизином. Соединение ГК-1 (10 М) вносили через 30 мин после рассеивания клеток на планшеты и затем каждые 48 часов (всего 3 внесения). После чего для оценки влияния соединения ГК-1 на формирование трубчатых структур эндотелиальные клетки фотографировали с использованием фотокамеры Canon инвертированного микроскопа Nikon Eclips TS-100F. Для обработки данных, полученных при оценке интенсивности тубулогенеза, использовали программу Image J. Измеряли длину микротрубочек в 5 полях зрения каждой лунки.
-5
-5
-8
В отдельной серии экспериментов оценивали влияния соединения ГК-1 (10 М) на стимулированный ангиогенез. Для стимуляции ангиогенеза использовали агонист TrkA рецепторов низкомолекулярный дипептидный миметик NGF соединение ГК-2 [Гудашева Т.А. Доклады Академии наук, 2010, 434 (4); 549-551], который по своей ангиогенной активности не уступает эталонному сигнальному белку NGF [заявка на патент РФ №2013122696]. В этом случае соединение ГК-1 (10 М) вносили в среду на фоне предварительного внесения стимулятора ангиогенеза соединения ГК-2 (10 М). Эксперименты и обработку результатов проводили так же, как и в первой серии.
Как следует из полученных данных (см. табл.1), соединение ГК-1 статистически значимо подавляет как базальный (р≈0,012), так и стимулированный (р≈0,015) ангиогенез.
Таким образом, результаты экспериментов in vitro свидетельствуют о том, что антагонист TrkA рецепторов низкомолекулярный пептидный миметик NGF соединение ГК-1 проявляет выраженную антиангиогенную активность, т.е. обладает способностью подавлять новообразование сосудов.
Пример 2. Изучение антиангиогенной активности соединения ГК-1 в экспериментах in vivo.
2
2
Опыты проводили на беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Животных содержали в индивидуальных клетках в виварии в соответствии с приказом МЗ РФ №267 от 09.06.2003 «Об учреждении правил лабораторной практики» с предоставлением брикетированного корма ad libitum при регулируемом 12/12 световом режиме. Животных рандомизировали на 2 группы: контрольную (n=23) и основную (n=18). Ишемию задних конечностей у анестезированных крыс (тиопентал натрия, 50 мг/кг, в/б) вызывали путем одномоментной резекции участка бедренной артерии, после чего рану послойно ушивали. Изучаемое соединение (4 мг/кг) вводили внутрибрюшинно в течение 14 дней от момента резекции бедренной артерии. Первую инъекцию осуществляли через 1 час после окончания операции. Контрольным животным по аналогичной схеме внутрибрюшинно вводили 0,3 мл изотонического раствора натрия хлорида. Через сутки после последней инъекции животных забивали и извлекали икроножную мышцу из ишемизированной конечности. Для визуализации капилляров за 5 минут до забоя животных вводили 1% раствор синьки Эванса. После фиксации мышцы в 10% растворе формалина с помощью микротома готовили срезы, которые окрашивали гематоксилин-эозином. Срезы изучали при помощи световой микроскопии в проходящем свете. На каждом срезе оценивали по 3 поля зрения, для каждого поля зрения рассчитывали суммарную длину сосудов и их количество в 1 мм. О степени васкуляризации судили по величине индекса васкуляризации, за который принимали произведение длины капилляров на их количество в 1 мм ишемизированной ткани. При статистической обработке результатов с помощью критерия Шапиро-Уилка определяли нормальность распределения. Так как распределение всех анализированных показателей значительно отличалось от нормального, статистическую значимость различий между выборок рассчитывали с помощью двухстороннего критерия Манна-Уитни. Различия считали статистически значимыми при р≤0,05. Выборки описывали с помощью медиан и нижнего и верхнего квартилей.
Согласно данным световой микроскопии у контрольных животных основу ткани составляет некробиотически измененная мышца с участками восковидного некроза. Саркоплазма ярко окрашена, гомогенна, поперечная исчерченность отсутствует. Отмечается большое количество воспалительных инфильтратов. Ядра поперечно-полосатых мышц мелкие, гиперхромные или отсутствуют. Сосуды полнокровны, околососудистый отек хорошо выражен, капилляры извитые, мелкие, тонкие, плохо различимы. Таким образом, в результате удаления участка бедренной артерии в икроножной мышце наблюдаются выраженные некротические и некробиотические изменения, сопровождающиеся воспалительной реакцией и расстройством кровообращения. У животных, получавших соединение ГК-1, в микроскопической картине икроножной мышцы также преобладают некробиотические процессы, однако количество и площадь участков восковидного некроза у них существенно больше.
2
2
Данные морфометрии свидетельствуют о том, что у животных, получавших соединение ГК-1, плотность капиллярного русла статистически значимо (р<0,001) меньше, чем у контрольных животных - 8053 (5683÷10851) и 14383 (11323÷16318) мкм/мм соответственно (см. табл.2). Количество сосудов в 1 мм ишемизированной ткани у животных, получавших соединение ГК-1, также было меньше, чем в контроле - 35 (21÷35) и 57 (50÷71) соответственно (р<0,011; см. табл.2). Математический анализ полученных результатов свидетельствует о том, что интенсивность васкуляризации ишемизированной ткани у животных, получавших соединение ГК-1, практически в 3 раза ниже, чем в контроле - 5051 (2540÷7862) и 16425 (11236÷20559) соответственно (р<0,001; см. табл.2).
Таким образом, полученные данные свидетельствует о том, что соединение ГК-1 проявляет выраженную антиангиогенную активность и потенциально может быть использовано для создания нового оригинального лекарственного средства для подавления патологического неоангиогенеза при диабетической ретино- и нефропатии, глаукоме, псориазе, злокачественных новообразованиях и др.
Таблица 1
Влияние соединения ГК-1 (10<sup>-5</sup> М) и композиции ГК-1+ГК-2 (10<sup>-5</sup> М и 10<sup>-8</sup> М, соответственно) на формирование микротрубочек в культуре изолированных клеток эндотелия человека - HUVEC (указаны средние арифметические и их стандартные ошибки)
Показатель
Экспериментальные группы
Контроль, n=9
ГК-1, n=16
ГК-1+ГК-2, n=15
Суммарная длина микротрубочек, мкм
34,5±3,2
26,4±2,0
25,5±1,5
р≈0,012
р≈0,015
р - указано по отношению к контролю
Таблица 2
Влияние соединения ГК-1 (4 мг/кг/сутки в течение 14 дней, в/б) на ангиогенез в икроножной мышце крыс в условиях ишемии (указаны медианы, нижний и верхний квартили)
Группа
n
Плотность сосудистого русла в мкм/мм<sup>2</sup>
Кол-во сосудов на 1 мм<sup>2</sup>
Индекс васкуляризации
контроль
23
14383
57
16425
11323÷16318
50÷71
11236÷20559
ГК-1
18
8053
35
5051
5683÷10851
21÷35
2540÷7862
р<0,001
p=0,011
р=0,001
р - указано по отношению к контролю