СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ И ИХ ПРОИЗВОДНЫХ

1. Способ получения рекомбинантного бифункционального белка из клетки-хозяина млекопитающего, трансформированной экспрессионным вектором, содержащим кДНК, кодирующую бифункциональный белок или его производное, где способ включает культивирование клетки-хозяина млекопитающего в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата, где бифункциональный белок содержит мутантный белок фактора роста фибробластов 21 (FGF21); биологически активный белок, или его мутант или фрагмент; и Fc-область иммуноглобулина, где мутантный белок FGF21 содержит, по меньшей мере, одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из мутаций (1)-(7), приведенных ниже:
(1) замена аминокислот в положениях 98-101 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью EIRP (SEQ ID NO: 53);
(2) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAV (SEQ ID NO: 54);
(3) замена аминокислот в положениях 170-174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотной последовательностью TGLEAN (SEQ ID NO: 55);
(4) замена аминокислоты в положении 170 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;
(5) замена аминокислоты в положении 174 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой N;
(6) замена аминокислоты в положении 180 от N-конца белка FGF21 дикого типа аминокислотой E вместе с одной или более мутациями (1)-(5), приведенными выше; и
(7) мутация 1-10 аминокислот для снижения иммуногенности белка FGF21 дикого типа.
2. Способ по п.1, где биологически активный белок выбран из группы, состоящей из инсулина, С-пептида, лептина, глюкагона, гастрина, желудочного ингибирующего полипептида (GIP), амилина, кальцитонина, холецистокинина, пептида YY, нейропептида Y, костного морфогенетического белка 6 (BMP-6), костного морфогенетического белка 9 (BMP-9), оксинтомодулина, окситоцина, глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1), глюкагоноподобного пептида-2 (GLP-2), ирисина, фибронектина типа III, содержащего домен белка 5 (FNDC5), апелина, адипонектина, C1q и белка, связанного с фактором некроза опухолей (семейство CTRP), резистина, висфатина, оментина, ретинол-связывающего белка 4 (RBP-4), глицентина, ангиопоэтина, интерлейкина-22 (IL-22), эксендина-4 и гормона роста.
3. Способ по п.1, где бифункциональный белок может включать биологически активный белок, Fc-область иммуноглобулина и мутантный белок FGF21, связанные в таком порядке от N-конца к С-концу.
4. Способ по п.1, где декстрана сульфат имеет среднемассовую молекулярную массу от 20 до 5000 кДа.
5. Способ по п.1, где культуральная среда содержит декстрана сульфат в концентрации от 0,01 до 10 г/л.
6. Способ по п.1, где культивирование включает:
стадию первичного культивирования клетки-хозяина млекопитающего при 34-37°С в культуральной среде с добавлением декстрана сульфата; и
стадию вторичного культивирования первичной культуральной среды при 28-33°С.
7. Способ по п.6, где первичное культивирование проводят в течение от 24 до 144 ч.
8. Способ по п.1, где вторичное культивирование проводят при температуре от 31°С до 33°С.