Микроразмножение перспективных сортов черешни (Prunus aviumL. ) в условиях in vitro

культур / Под ред. Е.Н. Седова, Т.П. Огольцовой. - Орел: ВНИИСПК, 1999. - 608 с.

7. Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур / Под ред. Е.Н. Седова. - Орел: ВНИИСПК, 1995. - 503 с.

8. Рябов И.Н. Сортоизучение и первичное сортоиспытание косточковых плодовых культур в Государственном Никитском ботаническом саду // Сотроизучение косточковых плодовых культур на юге СССР. - М.: Колос, 1969. - Т. XLI. - С. 5-83.

9. Смыков В.К. Интенсификация селекции и ускорение внедрения новых сортов плодовых культур // Труды Никит. ботан. сада. - Ялта, 1989. - Т. 107. - С. 6-15.

10. Смыков В.К., Смыков А.В. Мобилизация исходного материала для селекции плодовых культур // Труды Никит. ботан. сада. - Ялта, 2004. - Т. 122. - С. 6-8.

11. Список сортов растений, занесенных в Государственный реестр, пригодных для распространения в Украине и рекомендованных для выращивания в Автономной Республике Крым на 2008-2009 годы. - Симферополь, 2008. - 32 с.

МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ПЕРСПЕКТИВНЫХ СОРТОВ ЧЕРЕШНИ (PRUNUS

AVIUML.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Н.В. КОРЗИНА Никитский ботанический сад - Национальный научный центр

Введение

Начало изучению изолированных органов и тканей черешни (Prunus avium L.) в условиях in vitro было положено Tukey в 40-х годах прошлого столетия [20]. Для выведения раносозревающих сортов были проведены опыты с культурой зародышей персика и черешни. На протяжении последующих десятилетий создание новых сортов являлось ведущим направлением биотехнологических исследований косточковых плодовых культур.

В настоящее время в связи с высокой степенью поражения вирусной, бактериальной и грибной инфекцией промышленных насаждений методы биотехнологии активно применяют для получения оздоровленного ценного посадочного материала [3, 5-7, 11]. Так, разными авторами указывается высокая степень поражения сортов черешни (30-90%), едва вступившие в полное плодоношение сады становятся нерентабельными. В частности, в Крыму на черешне обнаружены вирусы некротической кольцевой пятнистости листьев (PNRSV), скручивания листьев черешни (CLRV), мозаики резухи (AMV), хлоротической кольцевой пятнистости листьев (ClRSV) [3-5, 11]. В связи с тем, что вирусы являются облигатными внутриклеточными патогенами растений, прямая борьба с ними практически невозможна. В последние годы исследования по оздоровлению растений интенсивно проводятся в Никитском ботаническом саду-Национальном научном центре [3, 7]. В наших исследованиях, несмотря на использование в опытах отобранных со здоровых растений эксплантов, при их культивировании применялись профилактические мероприятия от патогенов -вводились в питательную среду вироциды.

Получение в условиях in vitro растений является актуальным для видов с низкой способностью к побегообразованию и, в особенности, к ризогенезу. Из литературных источников известно, что черешня относится к трудноразмножаемым культурам. В процессе клонального микроразмножения отмечена низкая способность формирования микропобегов и развития корней [1, 8, 9, 15, 16, 18, 19]. Поэтому, несмотря на имеющиеся экспериментальные работы, многие вопросы культивирования черешни до сих пор остаются малоизученными. Цель данной работы - выявить морфогенетический

потенциал органов и тканей разных генотипов черешни в культуре in vitro и получить полноценные регенеранты.

Объекты и методы исследования

Объектом исследования являлись сорта черешни (Призерша, Рубиновая Ранняя, Сказка, Талисман и Анонс) разных сроков созревания плодов. При постановке опытов применяли как общеизвестные методы, так и разработанные в отделе биотехнологии и биохимии растений НБС-ННЦ [2, 8, 10]. Отбор черенков осуществлялся с внешне здоровых и предварительно протестированных на отсутствие вирусов деревьев в зимний (декабрь - февраль), весенний (март, апрель), летний (июнь, август) и осенний (ноябрь) периоды. Тестирование проводили с использованием растений-индикаторов: Chenopodium foetidum Schrad., Nicotiana glutinosa L., Nicotiana tabacum L. ('Samsun'), Cucumis sativus L. ('Delikatess') и методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для освобождения растительного материала от экзогенной бактериальной и грибной инфекций в качестве стерилизующих агентов применяли растворы этанола и гипохлорита натрия. Для гарантии получения здоровых регенерантов в качестве профилактики в питательную среду вводили вироцид - рибовирин в концентрации 1-3 мг/л. Микропобеги культивировали на питательных средах Gamborg и Eveleigh (В5) [14], Murashige и Skoog (MS) [17] и в наших модификациях. Для индукции множественного побегообразования и ризогенеза в питательную среду вводили регуляторы роста: 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрациях 1,0-4,4 мкМ, К6-(2-изопентил)аденин (2ip) -1,97-3,94 мкМ, гибберелловая кислота (ГК3) - 0,15-2,89 мкМ, Р-3-индолилмасляная кислота (ИМК) - 2,46-7,35 мкМ, а-нафтилуксусная кислота (НУК) - 5,37-10,74 мкМ, индолилуксусная кислота (ИУК) - 2,85-5,71 мкМ. Пробирки с микропобегами помещали в культуральную комнату с заданным режимом (интенсивность освещения 2,0-2,5 клк, 16 часовой фотопериод и температура 24±1°С). Статистическую обработку данных проводили на компьютере с использованием программного обеспечения Microsoft Office Exel 2003.

Результаты и обсуждение

В работе с культурой тканей и органов черешни использовали сортообразцы, свободные от вирусной инфекции, предварительно протестированные на отсутствие вирусов с применением методов травянистых растений-индикаторов. Для введения эксплантов в условия in vitro были отработаны режимы стерилизации с применением разных концентрациий гипохлорита натрия и установлено, что почки сортов раннего и раннесреднего сроков созревания плодов (Призерша и Рубиновая Ранняя) наиболее чувствительны к действию стерилизующего агента. Менее повреждались почки сортов Талисман и Сказка.

Для успешной регенерации микропобегов важное значение имеют приемы изолирования первичных эксплантов. Показано, что активно развиваются экспланты всех изучаемых сортов черешни, у которых при введении в стерильные условия на питательные среды MS и В5 срез в базальной (нижней) части проведен под углом 40-45°. В этом случае отмечено появление зачатков листьев через 4 суток культивирования in vitro, в то время как микропобеги с ровным срезом в базальной части только увеличились в размерах (рис. 1).

Отличия в развитии сохраняются на протяжении последующих 1 -2 пассажей: у микропобегов в опытном варианте листья сформированы и увеличились в размерах, в то время как в контрольном варианте (с ровным срезом в базальной части) листовые пластинки еще полностью не раскрыты (рис. 2).

Для снятия апикального доминирования и индукции множественного побегообразования были испытаны регуляторы роста БАП (1,0-4,4 мкМ), 2ip (1,97-3,94 мкМ) и ГК3 (0,15-2,89 мкМ) в разных концентрациях и сочетаниях. Показано, что

экспланты черешни сортов Призерша, Рубиновая Ранняя и Анонс, введенные в условия in vitro, на питательной среде, дополненной 2ip и ГК3, незначительно увеличиваются в размерах и темнеют, при этом на среде с добавлением БАП и ГК3 у эксплантов формируются зеленые листья.

а баб

Рис. 1. Микропобеги черешни через 4 суток культивирования: а - со срезом в базальной части под углом 40-45°; б - с ровным срезом в базальной

части

а б

Рис. 2. Микропобеги черешни через 40 суток культивирования: а - со срезом в базальной части под углом 40-45°; б - с ровным срезом в базальной

части

На этапе собственно микроразмножения высоким морфогенетическим потенциалом обладали микропобеги сортов среднего и позднесреднего сроков созревания плодов (Сказка и Талисман). Формирование конгломератов микропобегов отмечали через 25-30 суток культивирования на модифицированной питательной среде МС, дополненной 1,04,4 мкм БАП и 0,44-2,88 мкМ ГК3. Как показали исследования, коэффициент размножения микропобегов сортов Сказка, Талисман и Анонс (1:16-1:20) был выше, чем у сортов Призерша и Рубиновая Ранняя раннего и раннесреднего сроков созревания плодов (1:1-1:4) (рис. 3).

Заключительным этапом микроразмножения in vitro является укоренение полученных микропобегов. Для индукции ризогенеза были испытаны как агаризированные, так и жидкие питательные среды, которые являлись модификациями среды MS с уменьшенным вдвое содержанием макросолей, дополненные регуляторами роста ауксинового ряда.

Успешное укоренение микропобегов происходило на питательных средах, содержащих 2,85-5,7 мкМ ИУК и 5,37-10,7 мкМ НУК соответственно.

« q

с

о

а: с> "S

о ^

о ю о с о

а:

О

аз

q о

а:

20 18 16 14 12 |jo 8 6 4 2 0

1

2

6

7

3 4 5

номер пассажа

Рис. 3. Влияние генотипа на коэффициент размножения микропобегов черешни

Присутствие в среде ИМК ускоряло появление корней у микропобегов на 4-6 суток по сравнению с контрольным вариантом, однако полученные регенераты не развивались в нестерильнык условиях. Показано, что у микропобегов черешни сорта Сказка корни формировались как на жидкой, так и на агаризированной питательный средах. Однако на среде с агаром корни были многочисленные, в то время как на жидкой среде развилось не более 3-4 корней на микропобег (рис. 4).

а б

Рис. 4. Развитие корней у микропобегов черешни: а - на жидкой питательной среде; б - на агаризованной питательной среде

В ходе опытов наблюдали явление спонтанного ризогенеза у микропобегов сорта Сказка на питательной среде, не содержащей регуляторов роста ауксинового ряда. Из базальной части регенерантов развились тонкие корни (1-3 шт/микропобег), при этом на них формировались корни второго порядка. Подобное явление не характерно для древесных культур и некоторыми авторами объясняется как накопление эндогенных ауксинов в растительных тканях в результате их длительного культивирования (рис. 5).

Полученные регенеранты с развитыми корнями высаживали в стерильный субстрат (смесь торфа, перлита, песка в разных соотношениях) для адаптации в условия in vivo.

Рис. 5. Спонтанный ризогенез у микропобегов черешни

Выводы

Показано, что лучшее развитие и дифференциацию первичных эксплантов черешни наблюдали в том случае, когда срез в базальной части проведен под углом 40-45°С. Установлено, что микропобеги сортов среднего (Сказка) и среднепозднего (Талисман) сроков созревания плодов обладали более высоким морфогенетическим потенциалом, чем микропобеги сортов с ранним (Призерша), раннесредним (Рубиновая Ранняя) и поздним (Анонс) сроками созревания плодов. Определены регуляторы роста и их концентрации, повышающие эффективность микроразмножения и индукцию корнеобразования. Получены полноценные регенеранты сортов черешни.

Список литературы

1. Бленда А.В. Мкроклональне розмноження in vitro представниюв пщродини Prunoidae // Физиология и биохимия культурных растений. - 2000. - Т. 32, № 5. - С. 428-434.

2. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М.: Наука, 1964. - 272 с.

3. Биотехнологические системы оздоровления косточковых плодовых культур и получение безвирусного посадочного материала / Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Чирков С.Н., Смыков А.В., Вожегова Р.А. // Фактори експериментально'1 еволюцп органiзмiв: Зб. наук. пр. / Укр. т-во генетиюв i селекцiонерiв iм. М.1. Вавилова. - К.: Логос, 2008. - Т. 5. -2008. - С. 410-415.

4. Вердеревская Т.Д., Маринеску В.Г. Вирусные и микоплазменные заболевания плодовых культур и винограда. - Кишинев: Штиинца, 1985. - 311 с.

5. Вирусы, поражающие косточковые плодовые культуры, и биотехнологиеские пути создания устойчивых форм / Митрофанова О.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Митрофанова И.В., Кузнецова Н.В. // Бюресурси та вiруси: V Мiж. конф., 10-13 вересня 2007. - К., 2007. - С. 182.

6. Высоцкий В.А. Культура изолированных тканей и органов плодовых растений, оздоровление и клональное микроразмножение // С.-х. биология. -1983. - № 7. - С. 42-47.

7. Изучение вирусов и вирусных болезней косточковых плодовых культур на юге Украины и особенности оздоровления растений in vitro / Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Ежов В.Н., Лесникова-Седошенко Н.П., Лукичева Л.А., Смыков А.В., Сенин В.В., Литвинова Т.В. // Бюл. Никит. ботан. сада. - 2005. - Вып. 91 - С. 111-120.

8. Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. - К.: Наукова думка, 1992. - 232 с.

9. Кузнецова Н.В. Влияние регуляторов роста на эффективность регенерации растений при клональном микроразмножении черешни (Prunus avium L.) // Бюл. Никит. ботан. сада. - 2008. - Вып. 97. - С. 52-55.

10. Методы биотехнологии в селекции и размножении субтропических и плодовых культур / Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Смыков А.В., Лесникова Н.П. // Труды Никит. ботан. сада. - 1999. - Т. 118. - С. 188-189.

11. Митрофанова О.В., Михайлов А.П., Чехов А.В. Биотехнологические аспекты освобождения от вирусов и клонального микроразмножения некоторых экономически важных многолетних культур // Труды Никит. ботан. сада - 1997. - Т. 119. - С. 7-34.

12. Митрофанова О.В., Митрофанова И.В. Состояние и перспективы биотехнологических исследований садовых культур на юге Украины // Садiвництво: Мжвщомчий тематичний науковий збiрник. - 2000. - Вип. 50. - С. 269-281.

13. Фомина Е.Г., Жук Н.Г. Клональное микроразмножение районированных в Беларуси сортов Cerasus // Плодоводство. - 1994. - Т. 9. - С. 64-74.

14. Gamborg O.L., Eveleigh D.E. Culture methods and detection of glucanases in cultures of wheat and barley // Can. J. Biochem. - 1968. - V. 46, № 5. - Р. 417-421.

15. Gregor Osters, Luthar Zlata, Stampak Franci. The importance of the sterilization proceducing vigorous cherry plants (Prunus sp.) in vitro // Acta agriculturae slovenica - 2004. -V. 83. - P. 45-51.

16. Kuznetsova N.V., Mitrofanova O.V Investigation of regeneration ability of four cultivars of sweet cherry (Prunus avium L.) in conditions in vitro // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: IX междунар. конф. Звенигород, 8-12 сентября 2008 г. -Звенигород, 2008. - С. 60.

17. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15, № 3. - P. 473-497.

18. Sauer Annemarie. In vitro - Vermehrung verschiedener genotypen von Prunus avium L. // Gartenbauwissenschaft. - 1983. - Bd. 48. - S. 124-127.

19. Snir Iona. In vitro micropropagation of sweet cherry cultivars // HortScience. - 1982.

- V. 17, № 2. - P. 735-736.

20. Tukey H.B. Embryo abortion in early-riponing varieties of Prunus avium // Bot. Gaz.

- 1933. - V. 94. - P. 433-468.

АЙВА ЗВИЧАЙНА (CYDONIA OBLONGA MILL.) В Л1СОСТЕПУ УКРА1НИ: П1ДСУМКИ ШТРОДУКЦП I СЕЛЕКЦП

С.В. КЛИМЕНКО, доктор бюлог1чних наук Нацюнальний боташчний сад iм. М.М. Гришка НАН Украши, Кшв

Вступ

Айва звичайна (Cydonia oblonga Mill.) - визнана сировина для одержання желюючих продукпв, завдяки високому вмюту пектинових речовин - природних сорбешив [2, 13]. Плоди айви полiвiтамiннi [18, 22]. Айва звичайна - основна карликова пщщепа для грушi [19].

Айву культивують бшьш шж у 40 крашах св^у, однак насадження п у бшьшосп краш невелию [26]. ФАО не публшуе даних про виробництво плодiв у крашах св^у [1]. Питома вага айви в Укрш'ш серед зерняткових культур за площами насаджень складае 0,33%. Щодо валових зборiв, то за 1995-2005 рр. айва в структурi садiв зерняткових становить 0,42%. Урожайшсть айви в крш'ш становить 100-250 ц/га залежно вщ ^матичних умов вирощування, сортових i агротехшчних властивостей. Зараз айву вирощують переважно у приватних господарствах. Вона займае близько 1000 га, або