СОСТАВ ДЛЯ ОБРАБОТКИ РАСТЕНИЙ, СОДЕРЖАЩИЙ ДИСПЕРСНЫЙ СИЛИКАТ КАЛЬЦИЯ И CLONOSTACHYS ROSEA И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
COMPOSITION FOR PLANT PROCESSING CONTAINING DISPERSED CALCIUM SILICATE AND CLONOSTACHYS ROSEA AND ITS APPLICATION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Описание относится к составу для обработки растений. В частности, описание относится к составу для обработки растений, который можно распылять на растения посредством направления полета насекомого, такого как направление полета пчел.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] В патенте США номер 5348511 (Gross et al.) подразумевается раскрытие агентов биологической борьбы, распыляемых с целью контроля сельскохозяйственных вредителей посредством Apis mellifera L. с использованием устройства, вставляемого в модифицированную усеченную медовую надставку, интегрированную в качестве опорной части типичного коммерческого пчелиного улья. Устройство обеспечивает отдельные пути входа и выхода, что позволяет пчелам, вылетающим из улья, поверхностно заражаться агентом биологической борьбы на выходе из улья.
[0003] В патенте США номер 5989100 (Kovach) подразумевается раскрытие устройства для распыления пчелами или распылителя, не оказывающего разрушительного воздействия на улей, отличающееся легкостью в установке, перезаправке и удалении и включающее сменный блок, вставляемый в корпус. Устройство разработано для применения непрофессиональным пчеловодом, таким как садовод. Оно вставляется на входе в типичный пчелиный улей с минимальным нарушением порядка улья или колонии. При выходе пчел из улья, они проходят через наклонный переход с сухой суспензией для биологической борьбы и вылетают из улья, перенося и внося агент биологической борьбы на цветы при опылении сельскохозяйственных культур. Когда агент биологической борьбы заканчивается, легко добавляют дополнительный материал посредством поднятия навесной крышки или замены старого сменного блока новым заправленным. Крышка также обеспечивает некоторую защиту от влаги для сбережения от сырости агента биологической борьбы, таким образом, способствуя инокуляции пчел. Распылительное устройство удаляют, просто вынимая его из входа улья при завершении опылительных работ. Удаление на нарушает порядок и не разрешает целостности улья. При установке, перезаправке или удалении устройства в ночное время необходима минимальная защитная одежда.
[0004] В публикации патентной заявки PCT номер WO 2010/136599 (Put et al.) подразумевается раскрытие распыления агентов биологической борьбы или других веществ посредством использования пчел, в частности шмелей. Распылительное устройство можно устанавливать внутри улья или посредством присоединения к улью, и оно содержит агенты биологической борьбы или другие вещества, которые накапливают, переносят и распространяют пчелы при выходе из улья.
СУЩНОСТЬ
[0005] Следующее описание сущности предназначено для ознакомления с различными аспектами основополагающей идеи заявителя, но не для определения какого-либо изобретения.
[0006] По одному из аспектов состав для обработки растений содержит дисперсный силикат кальция, и агент для обработки растений в комбинации с дисперсным силикатом кальция.
[0007] По другому аспекту порошковый состав агента биологической борьбы, применяемый на растения посредством направления полета насекомого, содержит: агент для обработки растений; стабилизатор, связанный с агентом для обработки растений, для стабилизации агента для обработки растений; влагопоглощающий агент для абсорбции влаги в составе; аттрактант для притягивания состава к растениям; и разбавитель.
8
8
[0008] По другому аспекту порошковый состав для обработки растений содержит агент для обработки растений, содержащий споры clonostachys rosea. Состав содержит приблизительно от 2×10 до приблизительно 4×10 спор на грамм состава.
[0009] По другому аспекту способ получения состава для обработки растений содержит: обеспечение суспензии агента для обработки растений в жидкой форме; обеспечение дисперсного силиката кальция; и связывание суспензии с силикатом кальция;
8
8
[0010] По другому аспекту способ получения состава для обработки растений содержит: связывание спор Clonostachys rosea с дисперсным стабилизатором для получения стабилизированных частиц для обработки растений; комбинацию стабилизированных частиц для обработки растений с, по меньшей мере, одной добавкой для получения смеси стабилизированных частиц для обработки растений и добавки; и добавление свободного стабилизатора к смеси для корректировки концентрации спор в составе приблизительно от 2×10 до приблизительно 4×10 спор на грамм состава.
[0011] По другому аспекту состав для обработки растений посредством направления полета насекомого содержит агент для обработки растений и дисперсный влагопоглощающий агент для абсорбции влаги в составе. Влагопоглощающий агент имеет отобранные частицы слишком крупного размера для переноса насекомыми. В некоторых примерах размер влагопоглощающих частиц может быть крупнее размера стабилизированных частиц для обработки растений. В некоторых примерах размер влагопоглощающих частиц может быть крупнее в приблизительно 15-90 раз размера стабилизированных частиц для обработки растений.
[0012] По другому аспекту Clonostachys rosea применяют для обработки серой гнили канолы.
[0013] По другому аспекту Clonostachys rosea применяют для обработки склероциальной гнили канолы.
[0014] В некоторых примерах агент для обработки растений может быть связан с, по меньшей мере, некоторым количеством силиката кальция для образования стабилизированных частиц для обработки растений. Состав может содержать приблизительно от 5% по массе до 15% по массе стабилизированных частиц для обработки растений, более конкретно приблизительно от 7% по массе до 8% по массе стабилизированных частиц для обработки растений.
[0015] В некоторых примерах, по меньшей мере, некоторое количество силиката кальция может не содержать силикат кальция. Состав может содержать приблизительно от 10% по массе и 25% по массе свободного силиката кальция, более конкретно приблизительно от 17% по массе и 18% по массе свободного силикат кальция.
[0016] В некоторых примерах агент для обработки растений может содержать микробный агент. Например, агент для обработки растений может содержать спору гриба, такого как Clonostachys rosea. В качестве дополнительного примера, агент для обработки растений может содержать Beauveria bassiana.
9
9
9
[0017] В некоторых примерах агент для обработки растений может содержать спору гриба, и спора гриба может быть связана с, по меньшей мере, некоторым количеством силиката кальция. Агент для обработки растений может иметь плотность приблизительно от 1×10 до 4×10 спор на грамм силиката кальция, с которым он связан, более конкретно приблизительно 2×10 спор на грамм силиката кальция, с которым он связан.
8
8
[0018] В некоторых примерах состав может содержать приблизительно от 2×10 до приблизительно 4×10 спор на грамм состава.
[0019] В некоторых примерах дисперсный силикат кальция может содержать частицы, остающиеся на сите с размером отверстий приблизительно от 45 микрон до приблизительно 75 микрон, более конкретно приблизительно 45 микрон.
[0020] В некоторых примерах влагопоглощающий агент можно смешивать с дисперсным силикатом кальция и агентом для обработки растений. Влагопоглощающий агент может содержать силикагель. Силикагель может содержать частицы, остающиеся на сите с размером отверстий приблизительно от 700 микрон до 4000 микрон, более конкретно приблизительно 840 микрон. Состав может содержать приблизительно от 0,5% по массе до 5% по массе влагопоглощающего агента, более конкретно приблизительно 1% по массе влагопоглощающего агента.
[0021] В некоторых примерах состав может дополнительно содержать аттрактант, смешанный с дисперсным силикатом кальция и агентом для обработки растений, для притягивания состава к растениям и/или направления полета насекомого. Аттрактант может иметь чисто положительный электростатический заряд. Аттрактант может содержать смесь минералов. Состав может содержать приблизительно от 5% по массе до приблизительно 20% по массе аттрактанта, более конкретно приблизительно 10% по массе аттрактанта. Аттрактант может иметь частицы, остающиеся на сите с размером отверстий приблизительно от 35 микрон до приблизительно 75 микрон, более конкретно приблизительно 45 микрон.
[0022] В некоторых примерах состав может дополнительно содержать разбавитель, смешанный с дисперсным силикатом кальция и агентом для обработки растений. Разбавитель может содержать муку, такую как, по меньшей мере, одну из ржаной муки, пшеничной муки, спельтовой муки, рисовой муки и кукурузной муки. В одном конкретном примере разбавитель содержит кукурузную муку. Состав может содержать приблизительно от 50% по массе до 75% по массе разбавителя, более конкретно приблизительно 64% по массе разбавителя. Разбавитель может иметь частицы, остающиеся на сите с размером отверстий приблизительно от 75 микрон и приблизительно 250 микрон, более конкретно приблизительно 125 микрон.
[0023] В некоторых примерах состав может дополнительно содержать средство против слеживания. Средство против слеживания может содержать оксид магния. Состав может содержать приблизительно от 0,75% по массе до 5,0% по массе оксида магния, более конкретно приблизительно от 1% по массе до приблизительно 1,5% по массе оксида магния. Средство против слеживания может иметь частицы, остающиеся на сите с размером отверстий приблизительно от 75 микрон до приблизительно 150 микрон, более конкретно приблизительно 125 микрон.
[0024] В некоторых примерах состав можно применять для обработки, по меньшей мере, одной склероциальной гнили, серой гнили и гриба Monilinia vaccinii-corymbosi у растения.
[0025] В некоторых примерах состав можно применять для лечения заболевания, по меньшей мере, одного из саженцев канолы и саженцев подсолнечника.
[0026] В некоторых примерах состав можно применять для повышения скорости прорастания сельскохозяйственной культуры.
[0027] В некоторых примерах состав можно применять в качестве средства для направления полета пчел.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0028] Далее приведено описание различных приборов, процессов и/или составов для обеспечения примера варианта осуществления каждого описываемого в заявке изобретения. Ни один из вариантов осуществления, описанных ниже, не ограничивает какое-либо описываемое в заявке изобретение, и любое описываемое в заявке изобретение может охватывать приборы, процессы и/или составы, отличные от тех, которые описаны ниже. Описываемые в заявке изобретения не ограничиваются приборами, процессами и/или составами со всеми характеристиками любого прибора, процесса и/или состава, описанного ниже, или характеристиками, свойственными многим или всем приборам, процессам и/или составам, описанным ниже. Возможно, что прибор, процесс и/или состав, описанный ниже, не является вариантом осуществления какого-либо исключительного права, предоставленного выдачей данной патентной заявки. Любое изобретение, которое раскрыто в приборе, процессе и/или составе, описанном ниже, и для которого исключительное право не предоставляется выдачей данной патентной заявки, может быть объектом изобретения другого охранного документа, например, продолжающей патентной заявки, и предполагается, что посредством раскрытия в данном документе какого-либо такого изобретения заявители, авторы изобретения или владельцы не лишаются, не отказываются от права или не делают его всеобщим достоянием.
[0029] Иллюстративные составы для обработки растений включают агент для обработки растений (т.е. агент, полезный для сельскохозяйственной культуры), и один или несколько добавок. Например, агент для обработки растений может способствовать росту, мощности и урожайности растений; повышать скорость прорастания и/или качество семян сельскохозяйственной культуры; повышать устойчивость к заболеванию, сельскохозяйственным вредителям и/или воздействию окружающей среды, такому как неблагоприятные погодные или почвенные условия; контролировать или противодействовать заболеванию или сельскохозяйственным вредителям; или способствовать восстановлению растений от повреждений и/или инфекции.
[0030] В некоторых примерах агент для обработки растений может включать один или несколько микробов, таких как бактерии, вирус или гриб, или спору гриба. Один пример подходящей споры гриба включает Clonostachys rosea, которая может контролировать патогенные микроорганизмы, такие как склероциальная гниль, гриб Monilinia vaccinii-corymbosi и/или серая гниль у различных сельскохозяйственных культур, включая канолу, подсолнечник, малину, чернику, клубнику, яблоню, грушевое дерево, киви, арбуз, кофейное дерево, манговое дерево, авокадо, вишню, сливу, миндаль, персиковое дерево, анакард, гуаву, люцерну, гречиху, клевер, фасоль, горох, лук, соевый боб, хлопок, горчицу, ежевику, крыжовник, перец, баклажан и смородину. Другой пример подходящей споры гриба включает Beauveria bassiana, которая может контролировать личинки мухи-пестрокрылки у сельскохозяйственных культур клюквы. Один пример подходящей бактерии является Bacillus Thuringiensis, которая может контролировать насекомых-вредителей различных сельскохозяйственных культур.
8
8
[0031] Концентрация агента для обработки растений в составе может варьироваться в зависимости от, например, особенностей агента для обработки растений, и/или условий, при которых состав подлежит применению (например, климат, целевое растение и т.д.). В одном конкретном примере, в котором агент для обработки растений включает споры Clonostachys rosea, состав может включать приблизительно от 2×10 до 4×10 спор на грамм состава.
[0032] Состав может включать различные добавки в комбинации с агентом для обработки растений. В некоторых примерах добавки включают один или несколько стабилизаторов, влагопоглощающий агент, аттрактант, разбавитель, и/или средство против слеживания, как будет также более подробно описано ниже.
[0033] Как правило, стабилизаторы служат для предотвращения и сведения к минимуму распада, разложения или активации агента для обработки растений до доставки агента для обработки растений на целевое растение. Например, в случаях, при которых агентом для обработки растений является спора гриба, стабилизатор может абсорбировать воду для относительного сбережения от сырости споры гриба, и таким образом, стабилизировать споры в состоянии покоя и предотвратить или минимизировать прорастание спор до доставки спор на растение.
[0034] В одном примере стабилизатор является дисперсный силикат кальция (продаваемый под торговым наименованием Micro-cel). Частицы силиката кальция могут оставаться на сите с размером отверстий приблизительно от 45 микрон (приблизительно 325 меш) до приблизительно 75 микрон (приблизительно 200 меш). В одном конкретном примере частицы силиката кальция остаются на сите с размером отверстий приблизительно 45 микрон (325 меш).
9
9
9
[0035] В некоторых примерах агент для обработки растений может быть связан с, по меньшей мере, некоторым количеством стабилизатора для получения стабилизированных частиц для обработки растений. Например, суспензией спор гриба в воде можно опрыскивать частицы силиката кальция таким образом, что, как правило, споры гриба прилипают к частицам силиката кальция. Суспензию спор гриба можно получать, как описано в публикации патентной заявки США номер 2012/0021906 (Sutton et al.), полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки. Стабилизированные частицы для обработки растений могут обладать плотностью спор приблизительно от 1×10 до приблизительно 4×10 спор на грамм силиката кальция, с которым споры связаны. В одном конкретном примере стабилизированные частицы для обработки растений имеют плотность спор приблизительно 2×10 спор на грамм силиката кальция, с которым споры связаны.
[0036] В некоторых примерах состав может включать приблизительно от 5% по массе до приблизительно 15% по массе стабилизированных частиц для обработки растений, более конкретно приблизительно от 7% по массе до приблизительно 8% по массе стабилизированных частиц для обработки растений. В одном конкретном примере состав может включать 7,5% по массе стабилизированных частиц для обработки растений.
8
8
[0037] В некоторых примерах, по меньшей мере, некоторое количество стабилизатора можно смешивать в составе без связывания его с агентом для обработки растений. Таким стабилизатором может быть обозначаемый как свободный стабилизатор. Количество свободного стабилизатора в составе можно необязательно выбирать для выхода состава с определенной концентрацией агента для обработки растений. Например, компоненты состава можно смешивать, а затем к составу можно добавлять свободный стабилизатор до достижения концентрации спор в составе приблизительно от 2×10 до 4×10 спор на грамм состава. В таких примерах состав может включать приблизительно от 10% по массе до приблизительно 25% по массе свободного стабилизатора, более конкретно приблизительно от 17% по массе до приблизительно 18% по массе свободного стабилизатора. В одном конкретном примере состав может включать приблизительно 17,5% по массе свободного стабилизатора.
[0038] Влагопоглощающий агент может абсорбировать влагу в составе для относительного сбережения состава от сырости и предотвращения слеживания или комкования состава. Примеры влагопоглощающих агентов включают поглотители влаги, такие как частицы или шарики силикагеля, и суперпоглощающие полимеры, такие как полиакрилат натрия. Дополнительные примеры влагопоглощающих агентов включают деревянную стружку и глиняные катуны. В некоторых примерах состав может включать приблизительно от 0,5% по массе до 5% по массе влагопоглощающего агента. В одном конкретном примере состав может включать приблизительно 1% по массе влагопоглощающего агента.
[0039] В примерах, в которых состав подлежит доставке посредством направления полета насекомого, частицы влагопоглощающего агента можно отбирать таким образом, чтобы они были слишком крупного размера для переноса насекомыми, и, таким образом, как правило, они останутся в распылителе для продолжения абсорбции влаги в составе. Например, частицы могут оставаться на сите с размером отверстий приблизительно от 700 микрон (25 меш) до приблизительно 4000 микрон (5 меш). В одном конкретном примере силикагель может быть в форме частиц, остающихся на сите с размером отверстий приблизительно 840 микрон (20 меш).
[0040] Аттрактант может способствовать притягиванию состава к растениям и/или направлению полета насекомых. Например, аттрактант может иметь чисто положительный электростатический заряд для электростатического притягивания к растениям и/или направлению полета насекомых, имеющим чисто отрицательный электростатический заряд. В некоторых примерах аттрактант может включать минерал или смесь минералов. В одном конкретном примере аттрактант может включать минеральную смесь, продаваемую Agri-Dynamics (Martins Creek, штат Пенсильвания) под наименованием DYNA-MIN™, которая включает следующие минералы: диоксид кремния, оксид алюминия, кальций, железо, магний, калий, натрий, фосфор, титан, марганец, стронций, цирконий, литий, рубидий, бор, цинк, ванадий, хром, медь, иттрий, никель, кобальт, галлий, цезий, скандий, олово, молибден и дополнительные микроэлементы. В другом примере аттрактант может включать кальциевый известняк.
[0041] В некоторых примерах состав может включать приблизительно от 5% по массе до приблизительно 20% по массе аттрактанта. В одном конкретном примере состав может включать приблизительно 10% по массе аттрактанта. В некоторых примерах аттрактант может иметь частицы, остающиеся на сите с размером отверстий приблизительно от 35 микрон (приблизительно 350 меш) до приблизительно 75 микрон (приблизительно 200 меш). В одном конкретном примере аттрактант может иметь частицы, остающиеся на сите с размером отверстий приблизительно 45 микрон (приблизительно 325 меш).
[0042] Разбавителем может быть подходящий крахмал или мука. В примерах, в которых состав необходимо доставить посредством направления полета насекомого, разбавитель можно выбирать таким образом, чтобы он не раздражал или не причинял вреда насекомым, и чтобы он не стал пищей насекомых. Разбавитель можно также выбрать таким образом, чтобы он не впитывал значительного количества влаги с целью предотвращения комкования разбавителя. Примеры разбавителей, которые могут быть подходящими для направления полета насекомого, включают кукурузную муку и муку из зерна, такую как ржаная, пшеничная, рисовая мука и спельтовая мука. В альтернативных примерах разбавителем может быть каолин. В других примерах разбавитель может содержать порошковое молоко или тальк. Они могут быть особенно пригодны в примерах, в которых состав доставляют способом, отличным от направления полета насекомого, таким как опрыскивание.
[0043] В некоторых примерах состав может включать приблизительно от 50% по массе и приблизительно 75% по массе разбавителя. В одном конкретном примере состав может содержать приблизительно 64% по массе разбавителя. В некоторых примерах разбавитель может иметь частицы, оставшиеся на сите с размером отверстий приблизительно от 75 микрон (приблизительно 200 меш) до приблизительно 250 микрон (приблизительно 60 меш). В одном конкретном примере разбавитель может иметь частицы, оставшиеся на сите с размером отверстий приблизительно 125 микрон (приблизительно 125 меш).
[0044] Состав может включать любое подходящее средство против слеживания. Одним конкретным примером средства против слеживания является оксид магния. Состав может включать приблизительно от 0,75% по массе до приблизительно 5,0% по массе средства против слеживания, и более конкретно, приблизительно от 1% по массе и приблизительно 1,5% по массе средства против слеживания. В одном конкретном примере состав может включать 1,25% по массе средства против слеживания. В некоторых примерах средство против слеживания может иметь частицы, оставшиеся на сите с размером отверстий приблизительно от 75 микрон (приблизительно 200 меш) до приблизительно 150 микрон (приблизительно 100 меш). В одном конкретном примере средство против слеживания может иметь частицы, оставшиеся на сите с размером отверстий приблизительно 125 микрон (приблизительно 125 меш).
8
8
[0045] Состав для обработки растений можно получать различными способами. В одном примере стабилизированные частицы для обработки растений получают, как описано выше, посредством связывания агента для обработки растений, такого как спора гриба, со стабилизатором. Стабилизированные частицы для обработки растений можно также совмещать с добавками, такими как один или несколько влагопоглощающих агентов, аттрактантов, разбавителей и средств против слеживания. Например, добавку(и) можно смешивать со стабилизированными частицами для обработки растений. Необязательно затем к смеси можно добавить дополнительный свободный стабилизатор для корректировки концентрации спор до необходимого значения. Например, свободный стабилизатор можно добавлять для корректировки концентрации спор приблизительно от 2×10 до приблизительно 4×10 спор на грамм состава.
[0046] В некоторых примерах после помещения состава в распылитель или иного обеспечения к нему доступа насекомых для направления полета насекомого, срок хранения состава может составлять от 4 до 5 суток. В альтернативных примерах срок хранения может быть дольше, например, до 10 суток. Срок хранения состава может варьироваться в зависимости от различных факторов, включая, например, влажность окружающей среды и температуру.
[0047] Состав, описанный выше, может быть особенно пригоден в направлении полета насекомого. Однако состав можно распылять другими способами, такими как опрыскивание.
[0048] Несмотря на то, что приведенное выше описание относится к примерам одного или нескольких процессов, составов или приборов, следует понимать, что в объеме прилагаемой формулы изобретения могут быть другие процессы, составы или приборы.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Получение состава для обработки растений
[0049] Получали состав для обработки растений со следующей композицией:
9
7,5% по массе стабилизированных частиц для обработки растений Clonostachys rosea, связанных с Microcel (325 меш, 44 микрон) при плотности 2×10 спор на грамм микроклеток;
17,5% по массе свободного Microcel (325 меш, 44 микрон);
1,25% по массе оксида магния (125 меш, 125 микрон);
10% по массе Dyna-min™ (325 меш, 44 микрон);
64% по массе кукурузной муки (125 меш, 125 микрон);
1% по массе силикагеля (приблизительно 20 меш, от 700 до 1000 микрон).
8
[0050] Состав получали посредством опрыскивания частиц Microcel суспензией Clonostachys rosea. Полученные в результате частицы смешивали с оксидом магния, dyna-min™, кукурузной мукой и силикагелем. Затем добавляли свободный Microcel для корректировки концентрации спор до приблизительно 3×10 спор на грамм состава.
Пример 2: Поглощение агента для обработки растений шмелями на выходе из улея посредством распылительных устройств
[0051] Каждый из ульев для шмелей, в котором была колония шмелей (Bombus impatiens), оборудовали распылительным устройством, через которое направляли полет пчел при выходе из улья.
[0052] Улья размещали на полке в опытно-экспериментальной теплице. Пчел удерживали внутри больших сетчатых клеток. Новые колонии отдельно оставляли для акклиматизации и привыкания к новым окружающим условиям в течение 24 часов. По прошествии 24 часового периода, распылительное устройство заправляли составом, описанным в примере 1, для направления пчел к проходу через слой состава при выходе из улья.
[0053] Отдельных шмелей забирали на выходе из улья. Каждую пчелу помещали внутрь 1,5 мл микроцентрифужной («микроцентрифужной») пробирки и закрывали прилагаемой крышкой. Пробирки с забранными пчелами хранили в холодильнике в течение нескольких часов (2-12 часов), а затем подвергали процессу обработки для оценки количества спор, прилипших к каждой пчеле.
[0054] Каждую пчелу промывали в известном объеме воды (включая промывку с внутренней стороны микроцентрифужной пробирки), содержащем поверхностно-активное вещество (0,01% Triton X-100 об./об.), и энергично встряхивали пять раз (приблизительно в течение 5 секунд каждый раз) на Vortex (Fisher Genie 2). Воду и пчелу оставляли в течение 10 минут до серийного разбавления «промывочной воды».
[0055] Аликвоты объемом 0,5 мл «промывочной воды» серийно разбавляли (10-кратным разбавлением), и 0,1 мл каждого раствора наносили на PDTSA (картофельно-декстрозный агар с внесенным Triton X-100 (0,01% или приблизительно 8 капель/л) для снижения процента роста колоний (и для разделения колоний для произведения подсчетов) и сульфат стрептомицина при 100 ч/млн для сдерживания роста бактерий) в чашках Петри. Для каждой пчелы проводили 3 серийных разбавлений, и три аликвоты объемом 0,1 мл каждого раствора высевали на PDTSA. Чашки Петри инкубировали в течение 4-5 суток при приблизительно 22-24 C (70-74 F или комнатной температуре), по прошествии этого времени разрослись колонии Clonostachys rosea, и произвели подсчет колоний. Число колоний увеличивали с помощью соответствующего коэффициента разбавления, увеличивали в 10 раз (в связи с тем, что высевали только 0,1 мл) и корректировали согласно общего объема воды, используемого для промывки пчелы. В результате получили расчетное количество жизнеспособных (колониеобразующих) единиц Clonostachys rosea на пчелу. Как показано в таблице 1, пчелы в этих испытаниях, как правило, переносили приблизительно от 100000 до 125000 жизнеспособных спор Clonostachys rosea при каждом проходе через распылительное устройство на пути к выходу из улья.
Таблица 1
№ испытания
Количество колониеобразующих единиц/пчелу(среднее значение из трех серийных разбавлений на пчелу)
Пчела #1
Пчела #2
Пчела #3
Пчела #4
1
1,14×10<sup>5</sup>
1,02×10<sup>5</sup>
1,21×10<sup>5</sup>
0,99×10<sup>5</sup>
2
1,25×10<sup>5</sup>
1,18×10<sup>5</sup>
1,11×10<sup>5</sup>
-
3
0,97×10<sup>5</sup>
1,09×10<sup>5</sup>
1,09×10<sup>5</sup>
1,23×10<sup>5</sup>
[0056] Микроскопическое исследование пчел выявило присутствие частиц порошка в особенности на лапках и нижней части пчел (все из них покрыты волосками).
Пример 3: Оценка подсолнечника, обработанного Clonostachys rosea и Bacillus Thuringiensis с помощью направления полета шмелей
ПОЛЕ 1:
8
[0057] Первый испытательный участок включал 20-акровое поле подсолнечника (поле 1), шириной 200 м, границы которого проходили от проселочной дороги вдоль восточной стороны поля. Пять групп из четырех жилищ для шмелей (четверки) установили на поле в июле 2011 года. Места жилищ расположили с равными интервалами вблизи дороги на краю территории, занятой подсолнечником, и, таким образом, они были легкодоступны. Каждое жилище оборудовали для вмещения подложки, содержащей порошковый состав для обработки растений на пути к выходу из поселения. Планшеты, содержащие состав для обработки растений, вставляли в жилища. Состав получали, как описано в примере 1, он также включал Bacillus Thuringiensis (2×10 спор на грамм состава). Планшеты вставляли в жилища в июле 2011 года и заменяли через приблизительно каждые 3 суток до августа 2011 года.
[0058] Согласно наблюдениям, период цветения рано посаженного подсолнечника на поле сократился в связи с жаркой погодой (при ежедневной максимальной температуре 35-38ºC) во второй половине июля.
[0059] Исследование планшетов проводили 10 августа 2011 года. Согласно наблюдениям, порошковый состав для обработки растений был сухим и не скомковался.
[0060] Образцы подсолнечника были взяты 10 августа 2011 года. Согласно наблюдениям, приблизительно крупные периферийные лепестки опали у 75-80% цветов. Во время предшествующих 1-3 суток (поверхность почвы была влажной) прошел небольшой дождь.
[0061] ОТБОР ОБРАЗЦОВ: Образцы головок подсолнечника отбирали в отношении четверки #2 (т.е. второй от дороги) и четверки #4 (т.е. четвертой от дороги). Головки собирали на пяти расстояниях (3 м, 40 м, 80 м, 120 м и 160 м) от четверки в трансекте, проложенном вдоль поля в правых углах вблизи дороги. Четыре головки отбирали на каждом расстоянии отбора образцов, помещали в склеиваемые пластиковые пакеты и перевозили в лабораторию.
[0062] ПРОЦЕСС ОБРАБОТКИ ОБРАЗЦОВ: Частоту возникновения Clonostachys rosea у собранных цветков из головок подсолнечника определяли с помощью помещения цветков на агар параквата и хлорамфеникола (PCA), и позднее проверяли на спорообразование гриба в соответствии со следующей методикой:
[0063] Общее количество, составляющее приблизительно 160-200 цветков, срывали с использованием повторно простерилизованных щипцов с приблизительно 12-15 произвольно выбранных областей каждой головки подсолнечника. Каждая область находилась в зоне созревания семян (т.е. не из центра головок) и приблизительно 1,0-1,5 см в ширину. Приблизительно половина цветков с каждой головки засевали (отдельно, если это было целесообразно) на PCA в каждой из двух чашек Петри. Чашки Петри с цветками помещали в полупрозрачные пластиковые коробки и инкубировали вдали от прямого солнечного света. Цветки были несколько рассыпчатыми и не соприкасались вплотную с агаровой средой, но, тем не менее, старели биологически и стали равномерно бледно-коричневого цвета («совместно»).
[0064] Головки подсолнечника, из которых удаляли цветки, помещали в холодное помещение.
[0065] Высеянные цветки визуально проверяли на спорообразование Clonostachys rosea спустя 5 и 7 суток инкубации и оценивали при помощи микроскопа через 8 суток и снова спустя дополнительные 18 суток. Во время каждой оценки цветки в каждой чашке оценивали в совокупности на частоту возникновения спорообразования Clonostachys rosea с использованием следующей шкалы равных дробей: 0 = без спорообразования; 1=1-10% цветков со спорообразованием; 2=11-20%; 3=21-30% …. 10=91-100%. В приведенных ниже таблицах 2 и 3 эти значения представлены в колонках для чашек Петри A и B для каждой из четырех головок подсолнечника. Средние точки диапазона (т.е. 0%, 5%, 15%, 25% … 95%) на шкале использовали для получения расчетного % значений. Средние % значения на головку получали из значений средних точек для оценки колонок A и B. Средние % значения для четырех головок, собранных при указанных расстояниях от жилищ, обеспечили общее расчетное среднее % значение цветков, на которых образовались споры Clonostachys rosea (значения, выделенные жирным шрифтом в правой колонке каждой таблицы).
[0066] РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ – 8 СУТОК ПОСЛЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ: В приведенных ниже таблицах 2 и 3 представлены результаты проведенной оценки через 8 суток после культивирования. В этих таблицах представлена оценка среднего процента цветков с Clonostachys rosea, что является мерой успеха в направлении агента для обработки растений на цветы.
[0067] Было обнаружено спорообразование Clonostachys rosea на различных (или всех) частях цветков.
[0068] Незначительный рост (т.е. мицелий и/или спорообразование) других грибов был обнаружен на цветках со спорообразованием Clonostachys rosea. Это является отличием от цветков с отсутствием Clonostachys rosea. Это было очевидным для цветков в чашке Петри, в которой агар был предположительно заражен спорами Clonostachys rosea перед использованием. В этом случае отмечалось обильное спорообразование Clonostachys rosea на все цветках, но почти полностью отсутствовал рост других грибов. Открытие того, что другие грибы были в скудном количестве или отсутствовали на цветках со спорообразованием Clonostachys rosea, позволяет предположить, что, как правило, Clonostachys rosea образовывался первым (предположительно эндофитно) в цветках и предотвращал последующее порождение и рост других. Это также указало на то, что с экологической точки зрения Clonostachys rosea очень хорошо приспособлен для образования цветков подсолнечника.
[0069] Цветки, на которых не образовывались споры Clonostachys rosea, покрывались большим количеством мицелия и спорообразованием других грибов при проведении оценки на 8 сутки (и ранее). Эти грибы являются видами, которые очень распространены для различного рода биологически стареющих тканей растений и включали: Alternaria alternata (в избытке); Cladosporium spp. (в избытке); Penicillium spp и Aspergillus spp. (оба распространены); Epicoccum sp. (низкая частота встречаемости); Fusarium spp. (низкая частота встречаемости); и Rhizopus (встречается не часто). Эти грибы могли присутствовать в качестве спор (или других побегов) на поверхности цветков при отборе саженцев подсолнечника на поле и при высевании цветков на PCA. Они не считаются эндофитами. Rhizopus может вызывать гниение основания стебля и головки подсолнечника (была обнаружена одна головка в соседнем поле с гниением головки и основания стебля, причиной которого оказался Rhizopus при посеве в лаборатории)
[0070] Предположительно, найденный в цветках Clonostachys rosea был направлен на головки подсолнечника шмелями. Частота возникновения Clonostachys rosea, полученного из головок подсолнечника, составляла 35% для трансекта #1 и 55% для трансекта 2. Частота возникновения цветков (включая цветки из головок с необнаруженным Clonostachys rosea), как правило, была низкой (приблизительно 2-6% для трансекта 1 и 0-11% для трансекта 2).
[0071] Clonostachys был направлен на, по меньшей мере, 160 м в трансекте 1 и на 120 м в трансекте 2.
[0072] Нет никаких четких признаков существования соответствующих градиентов в наведенных трансектах (таких как уменьшение при удаленности от ящиков с колониями шмелей). Данные частоты возникновения позволяют предположить, что наведение было достаточно равномерным.
[0073] РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ – 18 СУТОК ПОСЛЕ ПОСЕВА: В приведенных ниже таблицах 4 и 5 представлены результаты проведенной оценки через 18 суток после посева. В этих таблицах показана оценка среднего процента цветков с Clonostachys rosea, что является мерой успеха в направлении агента для обработки растений на цветы.
[0074] Спорообразование Clonostachys rosea было намного более обильным на 18 сутки, чем спустя 8 суток инкубации.
[0075] Непатогенные микроорганизмы (Cladosporium и Alternaria) выросли на многих цветках. Clonostachys rosea часто рос над мицелием непатогенных микроорганизмов и очевидно в качестве паразита (т.е. в качестве микопаразита, «пожирающего» другие грибы).
[0076] Botrytis cinerea (серая плесень) была обнаружена на нескольких цветках (это может быть патогенный микроорганизм, вызывающий гниение головки во влажную погоду).
[0077] Поражение экскрементами (относительно крупные участки цилиндрической формы) присутствовали и были в изобилии на нескольких слоях питательной среды. Многие цветки в этих слоях питательной среды были частично съедены и по внешнему виду были очень влажными. Никаких личинок насекомых не было обнаружено.
[0078] Чем выше % частоты возникновения Clonostachys rosea на цветках через 18 суток инкубации по сравнению с 8 сутками, возможно, указывает на то, что цветкам необходимо более 8 суток на PCA для достаточного биологического старения, чтобы возникло полное спорообразование Clonostachys rosea. Производили тщательный учет некоторого распространения Clonostachys rosea среди цветков во время инкубации.
[0079] Частота возникновения спорообразования Clonostachys rosea в двух трансектах повысилась многократно относительно значений в течение 8 суток инкубации. Исходя из этих данных, 8 суток инкубации были достаточным сроком для охвата спорообразования Clonostachys rosea в полной мере (и подразумеваемого образования цветков). Для многих видов тканей растений, таких как плоские части листьев, которые в основном контактируют с паракватной средой, 8 суток является достаточным сроком. Но контакт цветков «с ворсинками» обычно только ограниченный, по меньшей мере вначале, и поэтому для их биологического старения может потребоваться более долгий период времени.
[0080] Средняя частота возникновения спорообразования Clonostachys rosea на цветках головок подсолнечника в трансекте 2 составила приблизительно 33% по сравнению с только 14% для трансекта 1.
[0081] По меньшей мере, несколько цветков с Clonostachys rosea было обнаружено на всех головках подсолнечника трансекта 2, но 10% головок было недостаточное количество Clonostachys rosea в трансекте 1.
[0082] Не было существенных признаков, свидетельствующих о каком-либо градиенте в случае появления Clonostachys rosea на цветках (и, таким образом, об успехе наведения) в трансекте 1, но было очевидным сокращение частоты возникновения после 80 м в трансекте 2.
ПОЛЕ 2
[0083] Второй испытательный участок включал поле подсолнечника (поле 2), состоящий из 6 акров, которые были продолжением поля 1, но там насаждения были проведены позднее чем на поле 1 в связи с влажными почвенными условиями. Согласно наблюдениям, 10 августа 2011 года только начинался период. Четверку шмелей перевели с поля 1 на поле 2 в тот же день, 10 августа 2011 года.
[0084] Приблизительно 6 цветов с поля 2 искусственно инокулировали составом для обработки растений, описанного в примере 1, 10 августа 2011 года.
[0085] 26 августа 2011 года цветы собирали с трансекта на поле 2 (на том же расстоянии от четверки, как на поле 1). Также собирали цветы, инокулированные вручную порошковым составом.
[0086] Головки и листву на поле #2 осматривали на наличие заболеваний, плесени и насекомых, и образцы забирали в лабораторию для постановки диагноза.
[0087] Цветки с отобранных в качестве образцов цветов высевали на PCA 27 августа 2011 года, как описано выше в отношении поля 1. Дополнительные образцы головок хранили в открытых склеиваемых пакетах для последующего исследования.
[0088] РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ – 9 СУТОК ПОСЛЕ ПОСЕВА
[0089] В приведенной ниже таблице 6 представлены результаты проведенной оценки через 9 суток после посева. В этой таблице показана оценка среднего процента цветов с Clonostachys rosea.
[0090] РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ – 15 СУТОК ПОСЛЕ ПОСЕВА: В приведенной ниже таблице 7 представлены результаты проведенной оценки через 15 суток после посева. В этой таблице показана оценка среднего процента цветков с Clonostachys rosea.
[0091] РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ – HAND INOCULATED HEADS IN FIELD 2: В таблице 8 представлены результаты для головок подсолнечника, инокулированных вручную. В этой таблице показана оценка среднего процента цветков с Clonostachys rosea.
ПОЛЕ 3
[0092] Третий испытательный участок включал поле подсолнечника, состоящее из приблизительно 9 акров. Поле 3 находилось приблизительно в середине фазы цветения. Четверку, как описано в отношении поля 1, помещали на дороге, разделяющей поле пополам, и расположенной рядом с подсолнечниками в одной половине поля. Цветы собирали из трансекта на поле 3 в соответствии с такой же методикой отбора и на таких же расстояниях от четверки, как на полях 1 и 2.
[0093] Головки и листву на поле #3 осматривали на наличие заболеваний, плесени и насекомых, и образцы забирали в лабораторию для постановки диагноза.
[0094] Цветки отобранных в качестве образцов цветов высевали на PCA 29 августа 2011 года, как описано выше.
[0095] РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ – 7 СУТОК ПОСЛЕ ПОСЕВА: В приведенной ниже таблице 9 представлены результаты проведенной оценки через 7 суток после посева. В этой таблице показана оценка среднего процента цветков с Clonostachys rosea.
[0096] РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ – 13 СУТОК ПОСЛЕ ПОСЕВА: В приведенной ниже таблице 10 представлены результаты проведенной оценки через 15 суток после посева. В этой таблице показана оценка среднего процента цветков с Clonostachys rosea.
[0097] Как для поля 2, так и для поля 3, головки хранили в склеиваемых пакетах, используемых для отбора образцов (открытых пакетах) после удаления цветков. При проведении исследования на 9 сутки, было обнаружено некоторое спорообразование Clonostachys rosea на различных частях некоторых головок, включая в некоторых случаях центральную часть с отсутствием семян. Спорообразование было самим обильным (как и ожидалось с учетом примененного большого количества порошка), но неравномерным на инокулированных вручную головках. Определенные другие грибы (Cladosporium) обильно образовывали споры; они могут иметь необычайно большое количество инокулята, поэтому «имеют начальное преимущество». Незрелое зерно, случайно посеянное с засеянным цветком, было полностью покрыто спорообразованием.
Пример 4: Оценка семян подсолнечника, обработанного Clonostachys Rosea и Bacillus Thuringiensis посредством направления полета пчел, и необработанных контрольных саженцев подсолнечника
[0098] Получали образцы семян с поля 1, описанных в примере 3, и семян необработанных саженцев подсолнечника. Дополнительные образцы каждой группы семян высевали на агарной среде для проведения испытания на: способность семян к полноценному прорастанию; присутствие/отсутствие Clonostachys rosea; присутствие других грибов на семенах, включая патогенные микроорганизмы, вызывающие заболевание.
[0099] Пятнадцать дополнительных образцов по 40-50 семян каждой группы (т.е. поля #1 и контрольного поля) высевали на PCA среду в чашках Петри. Среда содержала паракват для ускорения биологического старения ткани и воспроизводства Clonostachys rosea, хлорамфеникол (антибактериальный антибиотик), но не содержала микробных питательных веществ. Большинство дополнительных образцов содержало несколько черноватых фрагментов других частей головок подсолнечника. Чашки инкубировали в пластмассовых коробках и исследовали в интервалах на протяжении 2 недель с использованием секционного микроскопа и биологического микроскопа по необходимости.
[00100] РЕЗУЛЬТАТЫ:
[00101] Прорастание семян: контрольные семена подсолнечника –70,7%; семена подсолнечника с поля 1-89,7%.
[00102] Таким образом, прорастание семян при обработке посредством направления полета пчел, описанной выше, было приблизительно на 27% выше, чем у необработанных контрольных образцов.
[00103] Средние значения включают только те семена, которые образовали жизнеспособные корни. Те, которые не образовывали корней или образовывали корни с немедленной остановкой роста (например, были коричневого цвета на всходе) оценивались как непроросшие.
[00104] Фактические значения для невсхожести:
[00105] Контрольные: 10/48, 16/56, 10/42, 20/49, 14/38, 10/40, 14/44, 4/28, 16/40, 12/36, 8/30, 6/28, 12/39, 13/45, 12/41. 177/604=29,3%
[00106] С направленным полетом пчел: 4/32, 8/46, 10/54, 4/51, 2/28, 4/48, 2/41, 4/62, 6/44, 4/49, 9/50, 2/36, 2/35, 3/35, 4/49. 68/660=10,3%
[00107] Воспроизводство Clonostachys Rosea: Clonostachys rosea не образовал споры ни на одном из семян подсолнечника в рамках 14-суточного периода наблюдений. Clonostachys rosea образовал споры на нескольких фрагментах ткани, которые предположительно были из головок подсолнечника, но только на материалах посредством направления полета пчел.
[00108] На этой стадии представляется, что Clonostachys не образуется на семенах подсолнечника, или образуется, но растет с трудом.
[00109] Другие грибы: было очевидно, что плесневые грибы присутствовали в большем изобилии на семенах с контрольного поля, чем на семенах с поля 1. В контрольных семенах: Fusarium spp – очень распространен; Penicillium spp – распространен; Botrytis cinerea – умеренно распространен; другие плесневые грибы без спор (только мицелий, поэтому не были определены). В семенах с поля 1: Fusarium spp, Penicillium spp и некоторые Rhizopus, но все намного менее часто встречаются, чем в контрольных образцах. Botrytis не обнаружен.
[00110] В обоих образцах у некоторых семян были признаки остановки роста в связи с одним или несколькими из этих грибов.
[00111] Cladosporium и Alternaria часто встречались на испытуемых семенах («шелухи» или «оболочки») обеих партий семян, но не причиняли видимых проблем.
[00112] Данные открытия указывают на то, что обработка, описываемая в настоящем документе, повышала прорастание семян подсолнечника на 27% и в значительной степени снижала уровень присутствия грибов (плесневых грибов).