ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ ARTEMISIA ANNUA L.
CULTURE MEDIUM FOR CULTURING ARTEMISIA ANNUA L TYLOSIS CELL CULTURE

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений. Область применения - медицинская промышленность, получение нового вида сырья биологически активных веществ растительного происхождения для получения новых высокоэффективных лекарственных препаратов.
Известна питательная среда для выращивания ткани CILYCCYNILA URALENSIS - продуцента сапонинов (заявка РФ №94026958, А01Н 4/00, публ. 1996.06.10). В известном изобретении для выращивания каллусной ткани CILYCCYNILA URALENSIS используют среду Линсмайера-Скуга с добавлением фитогормонов НУК и 6-БАП.
Известна питательная среда для культивирования каллусной ткани SILENE VULGARIS (MOENCH) GARCKE (патент РФ №2169769, C12N 5/04, публ. 2001/06/27). В известном изобретении агаризованную среду, содержащую макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу, витамины и гормоны роста, модифицируют гормональным составом 6-БАП и 2,4-Д. Среда дополнительно содержит фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Сапантотенат и никотинамид как источник PP. Установление концентраций используемых солей и витаминов позволяет получить каллусную ткань с периодом субкультивирования 21 сутки и с выходом биомассы 7,14-12,77 г/л. Недостатками известных аналогов является их направленность на культивирование определенных видов растений: cilyccynila uralensis, silene vulgaris, следовательно, оптимизированная среда для выращивания этих видов не подойдет для выращивания Artemisia annua L. Вторым недостатком является использование большого количества различных регуляторов роста, таких как фолиевая кислота, биотин и др. Их использование требует значительного капиталовложения.
Известна питательная среда для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. (Ashish Baldi, V.K. Dixit Yeild enhancement strategies for Artemisinin production by suspension cultures of Artemisia annua L. Bioresource technology 99 (2008) 4609-4614), выбранная в качестве прототипа. В указанном изобретении для культивирования каллусной и суспензионной культур Artemisia annua L. применяют среду Мурасиге-Скуга, модифицированную добавлением фитогормонов НУК и кинетина и стимуляторов роста: элиситоров (таких, как метилжасмонат), и предшественников артемизинина (таких, как лактон мевалоновой кислоты).
Недостатками известной питательной среды для культивирования клеточной культуры Artemisia annua L. является то, что в качестве одного из гормонов роста используется кинетин, который может влиять на размеры клеток в сторону их уменьшения и отрицательно влиять на накопление вторичных метаболитов, а также то, что для интенсификации роста суспензионной культуры используют дорогие элиситоры и предшественники артемизинина.
Задачей настоящего изобретения является разработка состава питательной среды для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. с целью ускорение роста каллусной ткани и высокого выхода биомассы. Поставленная задача решается тем, что питательная среда для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. содержит агаризованную среду с макро- и микросолями по Мурасиге и Скугу, фитогормоны, витамины, сахарозу, но в отличие от прототипа в качестве гормона дополнительно добавляют бензоаминопурин (6-БАП) при следующем соотношении компонентов, мг/л:
3
KNO - 1900
4
3
NHNO - 1650
2
2
CaCl·6HO - 332
4
2
MgSO·7HO - 370
2
4
KHPO - 170
4
2
FeSO·7HO - 27,85
2
NаЭДТА - 37,25
3
3
НВО - 6,2
4
2
MnSO·5HO - 24,1
4
2
ZnSO·7HO - 8,6
2
4
NaMoO - 0,25
KI - 0,83
4
2
CuSO·5HO - 0,025
2
2
CoCl·6HO - 0,025
Пиридоксин - 1,0
Тиамин хлорид - 1,0
Никотинамид - 1,0
6-БАП - 0,2
НУК - 0,5-1,0
Сахароза - 30000
Агар - 9000
Вода - До 1 л
Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, Fe-хелата, витаминов. Макро- и микросоли, Fe-хелат, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (6-бензиламинопурин), НУК  сахарозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л и разливают по 150 мл в колбы на 250 мл, добавляя по 1,35 г агара, с последующей стерилизацией в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Каллусную ткань высаживают в возрасте 15-20 суток, инокулюм - 100-200 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С в условиях непрерывной темноты или на белом свету интенсивностью 2000-4000 лк. Основное количество биомассы накапливается к 15 суткам культивирования, затем ткань переходит к фазе замедленного роста и к 20 суткам ее рост практически прекращается. Ниже приведены примеры конкретного осуществления изобретения.
Пример 1
3
4
3
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
2
2
Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO - 1900 мг/л, NHNO - 1650 мг/л, MgSO·7HO - 370 мг/л, КНРO - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (НВО - 6,2 мг/л, MnSO·5HO - 24,1 мг/л, ZnSO·7H0 - 8,6 мг/л, NaMoO·2НO - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO·5HO - 0,025 мг/л, CaCl·6HO - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO·7HO - 27,85 мг/л, NаЭДТА - 37,25 мг/л), СаСl (СаCl·6НO - 332 мг/л), витаминов (Пиридоксин - 1,0 мг/л, Тиамин хлорид - 1,0 мг/л, Никотинамид - 1,0 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (0,2 мг/л), НУК (0,5 мг/л), сахарозу (30000 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л и разливают по 150 мл в колбы на 250 мл, добавляя по 1,35 г агара, с последующей стерилизацией в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Пробирки стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в асептических условиях в них разливают питательную среду. Каллусную ткань высаживают в возрасте 15-20 суток, инокулюм - 100-200 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С в условиях непрерывной темноты или на белом свету интенсивностью 2000-4000 лк.
Пример 2
3
4
3
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
2·
2
2
Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (КNО - 1900 мг/л, NHNO - 1650 мг/л, MgSO·7HO - 370 мг/л, КНPO - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (НВО - 6,2 мг/л, MnSO·5HO - 24,1 мг/л, ZnSO·7HO - 8,6 мг/л, NaMoO·2HO - 0,25 мг/л, KI-0,83 мг/л, CuSO·5H0 - 0,025 мг/л, CoCl·6HO - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO·7HO - 27,85 мг/л, NaЭДТА - 37,25 мг/л), СаСl (CaCl6НO - 332 мг/л), витаминов (Пиридоксин - 1,0 мг/л, Тиамин хлорид - 1,0 мг/л, Никотинамид - 1,0 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют 6-БАП (0,2 мг/л), НУК (1 мг/л), сахарозу (30000 мг/л) и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л и разливают по 150 мл в колбы на 250 мл, добавляя по 1,35 г агара, с последующей стерилизацией в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. Пробирки стерилизуют в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в асептических условиях в них разливают питательную среду. Каллусную ткань высаживают в возрасте 15-20 суток, инокулюм - 100-200 мг. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С в условиях непрерывной темноты или на белом свету интенсивностью 2000-4000 лк.
Ростовые характеристики каллусной культуры Artemisia annua L., выращенной на средах с различным содержанием фитогормонов, представлены в Таблице 1.
Таким образом, настоящее изобретения позволяет культивировать каллусную культуру Artemisia annua L. с максимальным выходом биомассы за короткий период времени по сравнению с прототипом.
Таблица 1.
Ростовые характеристики каллусной культуры Artemisia annua L., выращенной на средах с различным содержанием фитогормонов.
Состав питательной среды
Индекс роста каллусной культуры (по сырой биомассе)
Воздушно-сухой вес ткани, г на 1 л среды
0,5 мг/л НУК 0,2 мг/л БАП
7,3±1,25
23,8000±3,25
1 мг/л НУК 0,2 мг/л БАП
6,76±2,05
25,2000±2,91