АКТИВАТОР РЕГУЛЯТОРНЫХ T-КЛЕТОК И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
ACTIVATOR OF REGULATORY T CELLS AND USE THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к активатору регуляторных T-клеток и применению активатора регуляторных T-клеток. В частности, изобретение относится к активатору регуляторных T-клеток, фармацевтической композиции для активации регуляторных T-клеток, моноклональному антителу против вспомогательной молекулы 1 DNAX (DNAM-1) человека или его фрагменту, нуклеиновой кислоте, вектору и трансформанту. Настоящая заявка основана и по ней испрашивается приоритет предшествующей японской патентной заявки номер 2016-084170, поданной 20 апреля 2016 года, которая в полном объеме включена в настоящее описание в качестве ссылки.
Уровень техники
[0002] Реакция трансплантат против хозяина (GVHD) может возникать после переливания крови или трансплантата стволовых клеток. Реакция трансплантат против хозяина обусловлена активными T-клетками донорского происхождения, которые присутствуют в трансплантированных клетках, повреждая клетки реципиента. Отторжение может возникать, когда орган донора трансплантируют реципиенту. Например, при трансплантате сердца, сосудистом трансплантате, трансплантате почки и тому подобное, трансплантированное сердце, сосуд или почка временно приживаться, но может постепенно становиться отсоединенной. Соответственно, существует потребность в технологии предотвращения реакции трансплантат против хозяина и отторжения трансплантата.
[0003] Например, в PTL 1 описано, что нейтрализующее антитело против белка DNAM-1 мыши можно использовать в качестве лекарственного средства для поддержания приживления трансплантированного сердца, сосуда или почки у мышей.
[0004] Белок DNAM-1, также известный как CD226, представляет собой молекулу адгезии с молекулярной массой 65 кДа, которая относится к суперсемейству иммуноглобулинов. Белок DNAM-1 экспрессируется различными иммуноцитами человека и мыши, такими как CD4+ T-клетки, CD8+ T-клетки, NK клетки, макрофаги и дендритные клетки. DNAM-1 человека имеет Seq ID NP_001290547. DNAM-1 мыши имеет Seq ID NP_001034238. Авторы изобретения обнаружили, что белок DNAM-1 связывается с CD155, который известен как рецептор полиовирусов. CD155 представляет собой трансмембранный гликопротеин I типа, который относится к суперсемейству иммуноглобулинов.
Список цитируемой литературы
Патентная литература
[0005] PTL 1: JPA 2013-245162
Сущность изобретения
Техническая проблема
[0006] В контексте, приведенном выше, задачей настоящего изобретения является получение технологии снижения иммунного ответа у человека.
Решение задачи
[0007] Настоящее изобретение включает следующие аспекты.
[1] Активатор регуляторных T-клеток, содержащий вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155.
[2] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с [1], в котором вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, представляет собой вещество, которое специфически связывается с DNAM-1, средство, которое ингибирует экспрессию DNAM-1, вещество, которое специфически связывается с CD155, или средство, которое ингибирует экспрессию CD155.
[3] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с [1] или [2], используемый для профилактики или лечения реакции трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, аутоиммунного заболевания, фиброза, воспалительного энтерита или аллергии.
5
[4] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с одним из [1]-[3], где вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, представляет собой вещество, которое специфически связывается с DNAM-1, где DNAM-1 представляет собой DNAM-1 человека, где вещество, которое специфически связывается с DNAM-1, представляет собой антитело или его фрагмент, и где антитело или его фрагмент способны насыщать DNAM-1 человека, активно экспрессированный на поверхностях 1×10 лимфоцитов при реакции с DNAM-1 человека, количество антитела или его фрагмента составляет 100 нг или меньше в отношении полноразмерного антитела типа IgG.
5
[5] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с одним из [1]-[4], где вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, представляет собой вещество, которое специфически связывается с DNAM-1, где DNAM-1 представляет собой DNAM-1 человека, где вещество, которое специфически связывается с DNAM-1, представляет собой антитело или его фрагмент и где, когда антитело или его фрагмент вступает в реакцию после насыщения DNAM-1 человека, который активно экспрессирован на поверхностях 1×10 лимфоцитов, с помощью 1000 нг слитого белка, который формируют посредством слияния CD155 человека с константной областью антитела IgG, антитело или его фрагмент способны полностью ингибировать связывание между слитым белком и DNAM-1 человека с использованием 500 нг или меньше в отношении полноразмерного антитела типа IgG.
[6] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с [4] или [5], где антитело представляет собой антитело человека определенного типа.
[7] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с одним из [4]-[6], где антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую определяющие комплементарность области (CDR) 1-3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, или конкурирует с антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, при связывании с DNAM-1 человека.
[8] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с одним из [4]-[7], где антитело или его фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
[9] Фармацевтическая композиция для активации регуляторных T-клеток, содержащая активатор регуляторных T-клеток в соответствии с одним из [1]-[8] и фармацевтически приемлемый носитель.
5
[10] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент, способные насыщать DNAM-1 человека, активно экспрессированный на поверхностях 1×10 лимфоцитов, с использованием 100 нг или меньше в отношении полноразмерного антитела IgG, когда моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент реагирует с DNAM-1 человека.
5
[11] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент, где, когда DNAM-1 человека, активно экспрессированный на поверхностях 1×10 лимфоцитов, реагирует после насыщения DNAM-1 человека с помощью 1000 нг слитого белка, сформированного с помощью CD155 человека и константной области антитела IgG, моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент способны полностью ингибировать связывание между слитым белком и молекулой DNAM-1 человека с использованием 500 нг или меньше в отношении полноразмерного антитела типа IgG.
[12] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с [10] или [11], которые представляют собой антитело человека определенного типа или его фрагмент.
[13] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с одним из [10]-[12], в которых с CDR1 до CDR3 содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, или с CDR1 до CDR3 конкурируют с антителом, имеющим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, при связывании с DNAM-1 человека.
[14] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с одним из [10]-[13], с CDR1 до CDR3 содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и с CDR1 до CDR3 содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
[15] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с одним из [10]-[14], в которых с CDR1 до CDR3 содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно.
[16] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с одним из [10]-[15], где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
[17] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с [16], где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.
[18] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с одним из [10]-[14], где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
[19] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с [18], где антитело или его фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.
[20] Нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент по любому одному из [10]-[19].
[21] Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту в соответствии с [20].
[22] Трансформант, соответствующий вектору в соответствии с [21].
[0008] (1) Моноклональное антитело против вспомогательной молекулы 1 DNAX (DNAM-1) человека или его фрагмент (фрагмент антитела), имеющие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
(2) Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с (1), имеющие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно.
(3) Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с (1) или (2), имеющие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
(4) Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с одним из (1)-(3), имеющие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8.
(5) Нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с одним из (1)-(4).
(6) Рекомбинантный вектор, имеющий нуклеиновую кислоту в соответствии с (5).
(7) Трансформант, имеющий рекомбинантный вектор в соответствии с (6).
(8) Иммуносупрессант, содержащий моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с одним из (1)-(4) в качестве активного ингредиента.
(9) Иммуносупрессант в соответствии с (8), используемый для предотвращения или лечения реакции трансплантат против хозяина.
(10) Иммуносупрессант в соответствии с (8), используемый для предотвращения или лечения отторжения трансплантата.
Полезные эффекты изобретения
[0009] В соответствии с настоящим изобретением можно предоставлять технологию снижения иммунного ответа у человека.
Краткое описание фигур
[0010] [Фиг. 1] На фиг. 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая выравнивание аминокислотных последовательностей тяжелых цепей моноклонального антитела против DNAM-1 человека No 1-6.
[Фиг. 2] На фиг. 2 представлена диаграмма, иллюстрирующая выравнивание аминокислотных последовательностей легких цепей моноклонального антитела против DNAM-1 человека No 1-6.
[Фиг. 3] Фиг. 3(a)-3(d) представляют собой графики, иллюстрирующие результаты, полученные в тестовом примере 2.
[Фиг. 4] Фиг. 4(a)-4(l) представляют собой графики, иллюстрирующие результаты, полученные в тестовом примере 3.
[Фиг. 5] Фиг. 5(a)-5(e) представляют собой графики, иллюстрирующие реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека No 1-6, которые определяли в тестовом примере 4.
[Фиг. 6] Фиг. 6(a)-6(e) представляют собой графики, иллюстрирующие реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека No 1-6, которые определяли в тестовом примере 5.
[Фиг. 7] Фиг. 7(a)-7(e) представляют собой графики, иллюстрирующие реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека No 1-6, которые определяли в тестовом примере 6.
[Фиг. 8] Фиг. 8(a)-8(e) представляют собой графики, иллюстрирующие реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека No 1-6, которые определяли в тестовом примере 7.
[Фиг. 9] На фиг. 9 представлен график, иллюстрирующий результаты анализа реакции смешанной культуры лимфоцитов, который проводили в тестовом примере 8.
[Фиг. 10] На фиг. 10 представлена диаграмма, иллюстрирующая протокол эксперимента в тестовом примере 9.
[Фиг. 11] На фиг. 11 представлен график, иллюстрирующий коэффициенты выживаемости мышей, которые определяли в тестовом примере 9.
[Фиг. 12] Фиг. 12(a) и 12(b) представляют собой графики, иллюстрирующие функцию печени у мышей, которую определяли в тестовом примере 9.
[Фиг. 13] На фиг. 13 представлена диаграмма, иллюстрирующая протокол эксперимента в тестовом примере 10.
[Фиг. 14] На фиг. 14 представлен график, иллюстрирующий коэффициенты выживаемости мышей, которые определяли в тестовом примере 10.
[Фиг. 15] На фиг. 15 представлен график, иллюстрирующий цитотоксические активности CD8+ T-клеток, реагировавших с моноклональными антителами против DNAM-1 человека, которые определяли в тестовом примере 11.
[Фиг. 16] Фиг. 16(a) представляет собой график, иллюстрирующий пропорции регуляторных T-клеток и CD4+ T-клеток в селезенках мышей, которые определяли на 14 сутки после введения моноклонального антитела номер 1 в тестовом примере 12; и фиг. 16(b) представляет собой график, иллюстрирующий пропорции регуляторных T-клеток и CD4+ T-клеток в периферической крови мышей, которые определяли на 14 сутки после введения моноклонального антитела номер 1 в тестовом примере 12.
[Фиг. 17] Фиг. 17(a) представляет собой график, иллюстрирующий коэффициент заболеваемости энцефаломиелитом, который определяли в тестовом примере 13; и фиг. 17(b) представляет собой график, иллюстрирующий усредненную клиническую оценку, вычисленную в тестовом примере 13.
[Фиг. 18] Фиг. 18(a) представляет собой график, иллюстрирующий количество щелочной фосфатазы, присутствующей в сыворотке, которое определяли в тестовом примере 14; и фиг. 18(b) представляет собой график, иллюстрирующий количество общего билирубина, присутствующего в сыворотке, которое определяли в тестовом примере 14.
[Фиг. 19] Фиг. 19(a) представляет собой микрофотографию ткани печени контрольной мыши, использованной в тестовом примере 14; и фиг. 19(b) представляет собой микрофотографию ткани печени мыши с нокаутом DNAM-1, использованной в тестовом примере 14.
[Фиг. 20] Фиг. 20(a) содержит фотографии срезов почек в трехцветной окраске по Массону, сделанные в тестовом примере 15; и фиг. 20(b) представляет собой график, иллюстрирующий площадь коры почек, как определяли на основе результатов, проиллюстрированных на фиг. 20(a).
[Фиг. 21] Фиг. 21(a) представляет собой микрофотографию типичного тканевого среза почки контрольной мыши с иммунным окрашиванием антителом против α-SMA в тестовом примере 15; фиг. 21(b) представляет собой микрофотографию типичного тканевого среза почки мыши с нокаутом DNAM-1 с иммунным окрашиванием антителом против α-SMA в тестовом примере 15; и фиг. 21(c) представляет собой график, иллюстрирующий площадь α-SMA-положительного участка в ткани почки мышей, относящихся к каждой из групп, подсчитанных в тестовом примере 15.
[Фиг. 22] На фиг. 22 представлен график, иллюстрирующий массы контрольных мышей и мышей с нокаутом DNAM-1, используемых в тестовом примере 16.
[Фиг. 23] Фиг. 23(a) представляет собой фотографию толстой кишки мыши с нокаутом DNAM-1, которую брали у мыши на девятые сутки после инициации теста в тестовом примере 16; фиг. 23(b) представляет собой фотографию толстой кишки контрольной мыши, которую брали у мыши на девятые сутки после инициации теста в тестовом примере 16; и фиг. 23(c) представляет собой график, в числовой форме представляющий результаты, приведенные на фиг. 23(a) и 23(b).
Описание вариантов осуществления
[0011] [Активатор регуляторных T-клеток]
Вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает активатор регуляторных T-клеток, содержащий вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155.
[0012] Как описано далее в примерах, авторы изобретения обнаружили, что регуляторные T-клетки можно активировать посредством ингибирования связывания между DNAM-1 и CD155. Следовательно, вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, можно использовать для активации регуляторных T-клеток.
[0013] Примеры вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, включают вещество, которое специфически связывается с DNAM-1, средство, которое ингибирует экспрессию DNAM-1, вещество, которое специфически связывается с CD155, и средство, которое ингибирует экспрессию CD155.
2
[0014] Вещество, которое специфически связывается с DNAM-1, и вещество, которое специфически связывается с CD155, может представлять собой любое вещество, способное ингибировать связывание между DNAM-1 и CD155. Примеры такого вещества включают антитело, фрагмент антитела и аптамер. Антитело можно получать посредством иммунизации животного, такого как мышь, или посредством скрининга библиотеки антител, такой как фаговая библиотека. Примеры фрагмента антитела включают F(ab'), Fab', Fab, Fv и scFv. Примеры аптамера включают аптамер из нуклеиновой кислоты и пептидный аптамер.
[0015] Вещество, которое специфически связывается с DNAM-1, может представлять собой солюбилизированный CD155. Примеры солюбилизированного CD155 включают слитый белок, образованный посредством слияния CD155 с константной областью антитела, и тому подобное. Вещество, которое специфически связывается с CD155, может представлять собой солюбилизированную DNAM-1. Примеры солюбилизированной DNAM-1 включают слитый белок, образованный посредством слияния DNAM-1 с константной областью антитела, и тому подобное.
[0016] Средство, которое ингибирует экспрессию DNAM-1, и средство, которое ингибирует экспрессию CD155, может представлять собой любое вещество, способное снижать экспрессию DNAM-1 или CD155 и, следовательно, ингибировать связывание между DNAM-1 и CD155. Примеры такого вещества включают миРНК, мшРНК, мкРНК, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту и низкомолекулярное соединение. миРНК, мшРНК, мкРНК, рибозим и антисмысловая нуклеиновая кислота могут содержать различные химические модификации для того, чтобы увеличивать стабильность и активность. Например, остаток фосфата можно заменить на химически модифицированный остаток фосфата, такой как фосфотиоат, метилфосфонат или фосфородитиоат, чтобы предотвращать разрушение гидролазой, такой как нуклеаза. По меньшей мере его часть может состоять из аналога нуклеиновой кислоты, такого как пептидо-нуклеиновая кислота (PNA).
[0017] Регуляторная T-клетка представляет собой определенный тип T-клеток и также известна как Treg. Установлено, что регуляторные T-клетки отвечают за ингибирующий контроль иммунного ответа. Примеры регуляторных T-клеток включают CD4+ CD25+ T-клетку, Foxp3+ CD25+ T-клетку и CD4+ Foxp3+ клетку.
[0018] Термин «активация регуляторных T-клеток», используемый в настоящем описании, относится, например, к увеличению числа регуляторных T-клеток, увеличению количества ингибирующего цитокина, такого как TGF-β или IL-10, экспрессируемого регуляторными T-клетками, ингибированию иммунного ответа с помощью T-клеток или ингибированию общего иммунного ответа.
[0019] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с этим вариантом осуществления можно использовать для предотвращения или лечения заболевания, симптомы которого можно снижать посредством активации регуляторных T-клеток. Примеры такого заболевания включают реакцию трансплантат против хозяина, отторжение трансплантата, аутоиммунное заболевание, фиброз, воспалительный энтерит и аллергию.
[0020] Примеры аутоиммунных заболеваний включают ревматизм, сахарный диабет I типа и аутоиммунный энцефаломиелит. Фиброз представляет собой заболевание, при котором происходит замена ткани органа, такого как легкое, сердце, печень или почка, на коллаген I типа или тому подобное. Примеры фиброза включают цирроз, диабетическую нефропатию и фиброз легких. Примеры аллергии включают аллергический ринит и атопический дерматит.
[0021] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с этим вариантом осуществления может представлять собой, например, вещество, которое специфически связывается с DNAM-1. Вещество со специфическим связыванием может представлять собой антитело или его фрагмент. DNAM-1 может представлять собой DNAM-1 любого биологического вида, регуляторные T-клетки которого подлежат активации. Например, DNAM-1 может представлять собой DNAM-1 человека. Другими словами, активатор регуляторных T-клеток в соответствии с этим вариантом осуществления может представлять собой антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент.
5
[0022] Антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент предпочтительно обладает реактивностью, при которой DNAM-1 человека, активно экспрессированный на поверхностях 1×10 лимфоцитов, можно насыщать, когда антитело или его фрагмент вступает в реакцию с DNAM-1 человека с использованием 100 нг или меньше, предпочтительно 80 нг или меньше, более предпочтительно 50 нг или меньше, еще более предпочтительно 40 нг или меньше и особенно предпочтительно 30 нг или меньше антитела против DNAM-1 человека или его фрагмента в отношении полноразмерного антитела IgG. Как описано далее в примерах, антитело против DNAM-1 человека, имеющее такую реактивность, имеет высокую способность активировать регуляторные T-клетки.
[0023] В случае, когда целевое антитело представляет собой, например, фрагмент антитела, реактивность фрагмента антитела вычисляют посредством преобразования полноразмерного антитела IgG. В этом случае, преобразование масс можно создавать, например, на основе молекулярных масс фрагмента антитела и полноразмерного антитела IgG.
5
[0024] Когда DNAM-1 человека, активно экспрессированный на поверхностях 1×10 лимфоцитов, насыщают с использованием 1000 нг слитого белка, образованного CD155 человека с константной областью антитела IgG, и затем антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент вступает в реакцию с лимфоцитами, антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент, используемые предпочтительно в качестве активатора регуляторных T-клеток, в соответствии с этим вариантом осуществления может иметь реактивность, которая ингибирует связывание между слитым белком и молекулой DNAM-1 человека на поверхности лимфоцитов, с использованием 500 нг или меньше, предпочтительно 400 нг или меньше, более предпочтительно 300 нг или меньше, еще более предпочтительно 200 нг или меньше и особенно предпочтительно 100 нг или меньше антитела против DNAM-1 человека или его фрагмента в отношении массы полноразмерного антитела IgG.
[0025] Другими словами, антитело против DNAM-1 человека, имеющее такую реактивность, способно разрушать связывание между DNAM-1 и CD155, даже когда DNAM-1 связана с CD155. Как описано далее в примерах, антитело против DNAM-1 человека, имеющее такую реактивность, имеет высокую способность активировать регуляторные T-клетки.
5
[0026] Выражение «полностью ингибировать», используемое в настоящем описании, обозначает, что ингибирование может быть по существу полным. Например, в случае, когда молекулу DNAM-1 человека, присутствующую на поверхностях 1×10 лимфоцитов, на которых DNAM-1 человека активно экспрессирована, насыщают с использованием 1000 нг слитого белка, образованного посредством слияния CD155 человека с константной областью антитела IgG, и затем проводят реакцию с лимфоцитами, происходит диссоциация 80% или больше, предпочтительно 90% или больше, более предпочтительно 95% или больше и еще более предпочтительно 99% или больше слитого белка, связанного с поверхностями лимфоцитов, и происходит связывание DNAM-1 человека, присутствующей на поверхностях лимфоцитов.
[0027] Активатор регуляторных T-клеток в соответствии с этим вариантом осуществления может представлять собой антитело против CD155 человека или его фрагмент.
[0028] В активаторе регуляторных T-клеток в соответствии с этим вариантом осуществления антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент или антитело против CD155 человека или его фрагмент предпочтительно представляет собой антитело человека определенного типа или его фрагмент.
[0029] Когда активатор регуляторных T-клеток представляет собой антитело человека определенного типа или его фрагмент, возникновение побочных эффектов, таких как анафилактический шок, можно снижать, даже когда его вводят человеку, по причине низкой иммуногенности. Примеры антитела человека определенного типа включают химерное антитело, гуманизированное антитело, полностью антитело человека определенного типа и тому подобное.
[0030] Термин «химерное антитело», используемый в настоящем описании, относится к антителу, содержащему вариабельную область, полученную от не относящегося к человеку животного, и константную область по меньшей мере, часть которой получают у человека. Термин «гуманизированное антитело», используемый в настоящем описании, относится к антителу, в котором только определяющие комплементарность области (CDR) тяжелых и легких цепей получают у не относящегося к человеку животного, а константную область и каркасную область получают у человека. Термин «полностью антитело человека определенного типа», используемый в настоящем описании, относится к антителу, которое полностью, включая определяющие комплементарность области, получают у человека.
[0031] В активаторе регуляторных T-клеток в соответствии с этим вариантом осуществления антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
[0032] Термин «несколько», используемый в настоящем описании, относится к 4, 3 или 2 в контексте CDR1 или CDR2 вариабельной области тяжелой цепи. Термин «несколько», используемый в настоящем описании, относится к 2 в контексте CDR3 вариабельной области тяжелой цепи. Термин «несколько», используемый в настоящем описании, относится к 4, 3 или 2 в контексте CDR1 или CDR3 вариабельной области легкой цепи. Термин «несколько», используемый в настоящем описании, относится к 2 в контексте CDR2 вариабельной области легкой цепи.
[0033] Примеры антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, включают моноклональное антитело номер 1, описанное далее в примерах, и антитело, получаемое посредством гуманизации моноклонального антитела номер 1.
[0034] Антитело против DNAM-1 человека не ограничено моноклональным антителом номер 1; любое антитело против DNAM-1 человека, имеющее реактивность, сравнимую с или превышающую таковую у моноклонального антитела номер 1, можно использовать в качестве активатора регуляторных T-клеток в соответствии с этим вариантом осуществления. То есть антитело против DNAM-1 человека может представлять собой антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот. Примеры такого антитела включают моноклональное антитело №№ с 2 до 6 и антитела, получаемые посредством гуманизации моноклонального антитела №№ с 2 до 6, описанные далее в примерах.
[0035] Антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент также может представлять собой антитело или его фрагмент, которые конкурируют с антителом, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, при связывании с DNAM-1 человека. Другими словами, антитело против DNAM-1 человека может представлять собой антитело, которое конкурирует с моноклональным антителом номер 1, описанным далее в примерах, при связывании с DNAM-1 человека. Антитело, которое конкурирует с моноклональным антителом номер 1, имеет реактивность, сравнимую с или превышающую таковую у моноклонального антитела номер 1 при связывании с DNAM-1 человека.
5
[0036] Выражение «целевое антитело конкурирует» обозначает, что, например, когда молекула DNAM-1 человека, присутствующая на поверхностях 1×10 лимфоцитов, где DNAM-1 человека активно экспрессирована, реагирует с моноклональным антителом номер 1, описанным далее в примерах, и затем целевая молекула реагирует с лимфоцитами, можно диссоциировать по меньшей мере часть связывания между моноклональным антителом номер 1 и DNAM-1 человека и можно связывать DNAM-1 человека.
5
[0037] Выражение «по меньшей мере часть», используемое в настоящем описании, может относиться к 10% или больше, 30% или больше, 50% или больше, 70% или больше и 90% или больше от общего количества DNAM-1 человека, присутствующей на поверхностях 1×10 лимфоцитов.
[0038] [Фармацевтическая композиция для активации регуляторных T-клеток]
Другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает фармацевтическую композицию для активации регуляторных T-клеток, которая содержит описанный выше активатор регуляторных T-клеток и фармацевтически приемлемый носитель.
[0039] Примеры фармацевтически приемлемого носителя включают носители, широко используемые для получения лекарственных средств, такие как основа, стабилизатор и растворитель для инъекций. Примеры растворителя для инъекций включают изотонический раствор, содержащий вспомогательное средство, такое как физиологический солевой раствор, глюкоза, D-сорбит, D-манноза, D-маннит или хлорид натрия.
[0040] Фармацевтическая композиция в соответствии с этим вариантом осуществления дополнительно может содержать добавку, отличную от описанного выше активатора регуляторных T-клеток или фармацевтически приемлемого носителя. Примеры другой добавки включают регулятор pH, улучшитель вязкости, красящее вещество и стероид и иммуносупрессант, которые используют для лечения реакции трансплантат против хозяина или отторжения трансплантата.
[0041] Примеры дозированной формы фармацевтической композиции в соответствии с этим вариантом осуществления включают, но не ограничиваясь этим, лиофилизированное лекарственное средство, порошкообразное лекарственное средство, растворенное лекарственное средство, содержащее буферный раствор с контролируемым pH и микроинкапсулированное лекарственное средство для инъекции.
[0042] Фармацевтическую композицию в соответствии с этим вариантом осуществления вводят пациенту, например, в форме инъекционного или инстилляционного лекарственного средства, или посредством внутривенного введения или тому подобного. Дозу фармацевтической композиции, путь введения и рецепт фармацевтической композиции можно определять надлежащим образом в соответствии с симптомами, массой, возрастом, полом пациента и тому подобное.
[0043] Доза фармацевтической композиции в соответствии с этим вариантом осуществления варьирует вместе с симптомами, массой, возрастом, полом пациента и тому подобное, и не может быть определена безусловно. Фармацевтическую композицию в соответствии с этим вариантом осуществления можно вводить пациенту-человеку, нуждающемуся в лечении, от одного до нескольких раз в сутки в определенных количествах так, что количество активного ингредиента (вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155) фармацевтической композиции на килограмм массы тела составляет, например, от 1 мкг до 100 мг или от 50 мкг до 50 мг на дозу.
[0044] [Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент]
5
Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент, которые способны насыщать молекулу DNAM-1 человека, активно экспрессированную на поверхностях 1×10 лимфоцитов, при реакции с DNAM-1 человека, с использованием 100 нг или меньше, предпочтительно 80 нг или меньше, более предпочтительно 50 нг или меньше, еще более предпочтительно 40 нг или меньше и особенно предпочтительно 30 нг или меньше моноклонального антитела против DNAM-1 человека или его фрагмента в отношении полноразмерного антитела IgG.
[0045] Как описано далее в примерах, антитело против DNAM-1 человека, имеющее такую реактивность, можно использовать, например, для активации регуляторных T-клеток и смягчения симптомов реакции трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, аутоиммунного заболевания, фиброза, воспалительного энтерита или тому подобного.
[0046] В случае, когда антитело, реактивность которого подлежит определению, представляет собой, например, фрагмент антитела, реактивность антитела можно определять в отношении полноразмерного антитела IgG. В этом случае, массу фрагмента антитела можно преобразовывать в полноразмерное антитело IgG на основе молекулярных масс фрагмента антитела и полноразмерного антитела IgG. Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с этим вариантом осуществления может отличаться от известных антител или их фрагментов.
5
[0047] Когда DNAM-1 человека, активно экспрессированный на поверхностях 1×10 лимфоцитов, насыщают с использованием 1000 нг слитого белка, образованного CD155 человека с константной областью антитела IgG, и затем антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент вступает в реакцию с лимфоцитами, антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с этим вариантом осуществления может иметь реактивность, которая ингибирует связывание между слитым белком и молекулой DNAM-1 человека на поверхности лимфоцитов, с использованием 500 нг или меньше, предпочтительно 400 нг или меньше, более предпочтительно 300 нг или меньше, еще более предпочтительно 200 нг или меньше и особенно предпочтительно 100 нг или меньше антитела против DNAM-1 человека или его фрагмента в отношении полноразмерного антитела IgG.
[0048] Другими словами, антитело против DNAM-1 человека, имеющее такую реактивность, способно разрушать связывание между DNAM-1 и CD155, даже когда DNAM-1 связана с CD155. Выражение «полностью ингибировать», используемое в настоящем описании, имеет такое же значение, как описано выше.
[0049] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с этим вариантом осуществления может представлять собой антитело человека определенного типа или его фрагмент. Антитело человека определенного типа является тем же, что описано выше.
[0050] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с этим вариантом осуществления может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, или аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, модифицированные делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот.
[0051] Выражение «несколько», используемое в контексте CDR1 или CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, обозначает 4, 3 или 2. Выражение «несколько», используемое в контексте CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, обозначает 2. Выражение «несколько», используемое в контексте CDR1 или CDR3 вариабельной области легкой цепи, обозначает 4, 3 или 2. Выражение «несколько», используемое в контексте CDR2 вариабельной области легкой цепи, обозначает 2.
2
3
[0052] Термин «фрагмент антитела», используемый в настоящем описании, относится, например, к Fab, F(ab') и одноцепочечному Fv (scFv), получаемому посредством соединения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи с использованием достаточного линкера. Примеры линкера в scFv включают пептиды, такие как (GGGGS) (SEQ ID NO:21).
[0053] Как описано далее в примерах, моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с этим вариантом осуществления подходящим образом связывается с белком DNAM-1 человека и тем самым снижает иммунный ответ у человека in vivo и in vitro. Соответственно, моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с этим вариантом осуществления можно использовать в качестве иммуносупрессанта.
[0054] Антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в соответствии с этим вариантом осуществления также может представлять собой антитело или его фрагмент, которые конкурируют с антителом, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, при связывании с DNAM-1 человека. Другими словами, антитело против DNAM-1 человека может представлять собой антитело, которое конкурирует с моноклональным антителом номер 1, описанным далее в примерах, при связывании с DNAM-1 человека. Антитело, которое конкурирует с моноклональным антителом номер 1, имеет реактивность, сравнимую с или превышающую таковую у моноклонального антитела номер 1 при связывании с DNAM-1 человека. Конкуренция антител представляет собой то же, что описано выше.
[0055] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, и вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно. Примеры вышеуказанного антитела включают моноклональное антитело номер 1, описанное далее в примерах, и антитело, получаемое посредством гуманизации моноклонального антитела номер 1.
[0056] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8. Примеры такого антитела включают моноклональное антитело номер 1, описанное далее в примерах, и антитело, получаемое посредством гуманизации моноклонального антитела номер 1.
[0057] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10. Примеры такого антитела включают моноклональное антитело номер 2, описанное далее в примерах, и антитело, получаемое посредством гуманизации моноклонального антитела номер 2.
[0058] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, до тех пор пока моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент обладает реактивностью к DNAM-1 человека.
[0059] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент может содержать вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10, модифицированную делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот, до тех пор пока моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент обладает реактивностью к DNAM-1 человека.
[0060] Выражение «несколько», используемое в отношении вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи, обозначает 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 или 2. Примеры такого антитела включают моноклональное антитело №№ с 3 до 6 и антитела, получаемые посредством гуманизации моноклонального антитела №№ с 3 до 6, описанных далее в примерах.
[0061] [Нуклеиновая кислота, кодирующая моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент]
Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую описанное выше моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент.
[0062] Примеры такой нуклеиновой кислоты включают ген, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи описанного выше моноклонального антитела против DNAM-1 человека, ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела против DNAM-1 человека, ген, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи и часть константной области моноклонального антитела против DNAM-1 человека, ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи и часть константной области моноклонального антитела против DNAM-1 человека, ген, кодирующий полноразмерную тяжелую цепь моноклонального антитела против DNAM-1 человека, ген, кодирующий полноразмерную легкую цепь моноклонального антитела против DNAM-1 человека, и ген, кодирующий scFv, образуемый посредством слияния вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела против DNAM-1 человека с использованием достаточного линкера.
[0063] Ген, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, может представлять собой ген, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO:19. Ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи, может представлять собой ген, имеющий последовательность оснований SEQ ID NO:20.
[0064] Ген, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, может представлять собой ген, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, а каркасная область, отличная от CDR, может представлять собой ген, который извлекают из антитела не мыши. Ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи, может представлять собой ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, и каркасная область, отличная от CDR, может представлять собой ген, который извлекают из антитела не мыши. Примеры антитела не мыши включают антитело человека определенного типа.
[0065] Нуклеиновая кислота в соответствии с этим вариантом осуществления предпочтительно представляет собой комбинацию гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи моноклонального антитела против DNAM-1 человека, или гена, получаемого из него, и гена, кодирующего вариабельную область легкой цепи моноклонального антитела против DNAM-1 человека, или гена, получаемого из него.
[0066] Примеры гена, получаемого из гена, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи, включают ген, кодирующий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-3, соответственно, и каркасную область, отличную от CDR, которую извлекают из антитела не мыши. Аналогичным образом, примеры гена, получаемого из гена, кодирующего вариабельную область легкой цепи, включают ген, кодирующий вариабельную область легкой цепи, содержащую с CDR1 до CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:4-6, соответственно, и каркасную область, отличную от CDR, которую извлекают из антитела не мыши.
[0067] [Вектор]
Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает рекомбинантный вектор, содержащий описанную выше нуклеиновую кислоту. Рекомбинантный вектор в соответствии с этим вариантом осуществления может представлять собой экспрессирующий вектор. Когда вектор в соответствии с этим вариантом осуществления представляет собой экспрессирующий вектор, возможно получать моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент, вводя вектор в организм-хозяин и вызывая экспрессию гена.
[0068] В рекомбинантном векторе в соответствии с этим вариантом осуществления, ДНК, кодирующую последовательность метки, такой как гистидиновая метка, метка FLAG или метка GST, можно прикреплять к 5'-концу или 3'-концу описанной выше нуклеиновой кислоты. Примеры экспрессирующего вектора включают клеточный вектор, который экспрессирует моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в клетках-хозяевах, и бесклеточный вектор, который экспрессирует моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент в системе трансляции белка, которая содержит компонент, обладающий способностью к синтезу белка, которую извлекают из подходящих клеток.
[0069] Клеточный вектор может представлять собой любой известный экспрессирующий вектор, подходящих для клеток-хозяев. В случае, когда Escherichia coli используют в качестве организма-хозяина, примеры вектора включают плазмиды ColE, такие как производное pBR322; плазмиды pACYC с точкой начала репликации p15A; плазмиды pSC; плазмиды mini-F, полученные из фактора F, например, плазмиды Bac; и экспрессирующие векторы, содержащие триптофановый промотор (например, trc или tac), промотор lac, промотор T7, промотор T5, промотор T3, промотор SP6, арабинозный индуцибельный промотор, промотор холодового шока или тетрациклиновый индуцибельный промотор. В случае, когда организм-хозяин отличен от Escherichia coli, примеры вектора включают плазмиды pAUR, используемые для экспрессии в дрожжах, плазмиды pIEx, используемые для экспрессии в клетках насекомого, и плазмиды pBApo-CMV, используемые для экспрессии клеток животного.
[0070] Примеры бесклеточного вектора включают экспрессирующий вектор, имеющий промотор T7, и экспрессирующий вектор, имеющий промотор T3, которые описаны выше в качестве примеров клеточного вектора; и бесклеточный вектор пшеницы для синтеза белка, такой как плазмида pEU, имеющая промотор SP6 или промотор T7.
[0071] Когда белок синтезируют с использованием бесклеточного вектора, сначала синтезируют мРНК с помощью транскрипционной системы, отвечающей за транскрипцию гена SesA. Примеры транскрипционной системы включают известные транскрипционные системы, способные осуществлять транскрипцию с использованием РНК-полимеразы. Примеры РНК-полимеразы включают РНК-полимеразу T7 и полимеразу SP6.
[0072] Затем мРНК транслируют с использованием бесклеточной системы синтеза белка, то есть трансляционной системы, чтобы синтезировать белок. Эта система содержит различные элементы, необходимые для трансляции, такие как рибосома, фактор инициации трансляции, фактор элонгации трансляции, освобождающий фактор и аминоацил-тРНК-синтетаза. Примеры вышеуказанной системы трансляции белка включают экстракт E. coli, экстракт ретикулоцитов кролика, экстракт зародышей пшеницы и восстановленную бесклеточную систему синтеза белка, которая содержит только факторы, необходимые для трансляции, которые очищали индивидуально.
[0073] Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент можно использовать, с помощью очистки от синтезируемого белка при использовании клеточного вектора или бесклеточного вектора. Примеры способа очистки включают способ, в котором используют белок A, белок G или тому подобное. В случае, когда экспрессирующий вектор разрабатывают для того, чтобы экспрессировать последовательность метки, такой как гистидиновая метка, на N-конце или C-конце целевого белка, очистку можно осуществлять с использованием аффинной колонки с веществом, таким как никель или кобальт, имеющим аффинность к метке. Чистоту моноклонального антитела против DNAM-1 человека или его фрагмента можно повышать, надлежащим образом выполняя очистку с использованием ионообменной хроматографии, гель-проникающей хроматографии и тому подобное в комбинации.
[0074] [Трансформант]
Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает трансформант, содержащий описанный выше рекомбинантный вектор. Моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент можно получать с использованием трансформанта в соответствии с этим вариантом осуществления или среды или тому подобное от трансформанта.
[0075] Трансформант в соответствии с этим вариантом осуществления можно получать посредством введения описанного выше рекомбинантного вектора в организм-хозяин. Примеры трансформанта включают клетки культуры, такие как Escherichia coli, дрожжи, клетки растения, клетки насекомого и клетки животного, в которые вводили описанный выше рекомбинантный вектор; живое насекомое, такое как шелковичный червь, которому вводили описанный выше рекомбинантный вектор; и растительный организм, такой как табак и тому подобное, которому вводили описанный выше рекомбинантный вектор.
[0076] Введение рекомбинантного вектора в организм-хозяин (трансформацию) можно осуществлять с помощью общеизвестного способа, такого как способ с компетентными клетками, в котором используют клетки, обработанные кальцием, и электропорация. Вместо использования плазмидного вектора, трансформацию можно альтернативно выполнять посредством инфицирования организма-хозяина фаговым вектором, вирусным вектором или тому подобным.
[0077] [Иммуносупрессант]
Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает иммуносупрессант, который содержит описанное выше моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент, служащие в качестве активного ингредиента.
[0078] Как описано далее в примерах, иммуносупрессант в соответствии с этим вариантом осуществления способен ингибировать пролиферацию CD8+ T-клеток в анализе реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR).
[0079] Кроме того, как описано далее в примерах, в модели реакции трансплантат против хозяина на мышах подтверждали, что иммуносупрессант в соответствии с этим вариантом осуществления эффективен при предотвращении и лечении реакции трансплантат против хозяина.
[0080] Соответственно, иммуносупрессант в соответствии с этим вариантом осуществления может представлять собой лекарственное средство для предотвращения или лечения реакции трансплантат против хозяина. Иммуносупрессант в соответствии с этим вариантом осуществления может представлять собой лекарственное средство для предотвращения или лечения отторжения трансплантата.
[0081] Иммуносупрессант в соответствии с этим вариантом осуществления может представлять собой фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель и другие добавки. Примеры фармацевтически приемлемого носителя включают основу, стабилизатор и растворитель для инъекций. Примеры растворителя для инъекций включают изотонический раствор, содержащий вспомогательное средство, такое как физиологический солевой раствор, глюкоза, D-сорбит, D-манноза, D-маннит или хлорид натрия. Примеры других добавок включают регулятор pH, улучшитель вязкости, красящее вещество и стероид и иммуносупрессант, который используют для лечения реакции трансплантат против хозяина или отторжения трансплантата.
[0082] Примеры дозированной формы иммуносупрессанта в соответствии с этим вариантом осуществления и описанной выше фармацевтической композиции включают, но не ограничиваясь этим, лиофилизированное лекарственное средство, порошкообразное лекарственное средство, растворенное лекарственное средство с контролируемым pH, содержащее буферный раствор, и микроинкапсулированное лекарственное средство для инъекции.
[0083] Иммуносупрессант в соответствии с этим вариантом осуществления или описанную выше фармацевтическую композицию вводят пациенту в форме инъекции, инстилляционного лекарственного средства или тому подобного посредством внутривенного введения или тому подобного. Дозу иммуносупрессанта или фармацевтической композиции, путь введения и рецепт иммуносупрессанта или фармацевтической композиции можно определять надлежащим образом в соответствии с симптомами, массой, возрастом, полом пациента и т.д.
[0084] Доза иммуносупрессанта в соответствии с этим вариантом осуществления или описанной выше фармацевтической композиции варьирует вместе с симптомами, массой, возрастом, полом пациента и т.д., и не может быть определена безусловно. Иммуносупрессант или фармацевтическую композицию можно вводить пациенту-человеку, нуждающемуся в лечении, от одного до нескольких раз в сутки в определенных количествах так, что количество активного ингредиента (моноклонального антитела против DNAM-1 человека или его фрагмента) на килограмм массы тела составляет, например, от 1 мкг до 100 мг или от 50 мкг до 50 мг на дозу.
[0085] [Другие варианты осуществления]
Другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает способ активации регуляторных T-клеток, который включает введение эффективного количества вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, пациенту, нуждающемуся в лечении. Примеры вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, представляют собой то, что описано выше.
[0086] Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, которое используют для активации регуляторных T-клеток. Примеры вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, представляют собой то, что описано выше.
[0087] Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, которое используют для получения активатора регуляторных T-клеток. Примеры вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, представляют собой то, что описано выше.
[0088] Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает способ предотвращения или лечения реакции трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, аутоиммунного заболевания, фиброза, воспалительного энтерита или аллергии, который включает введение эффективного количества вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, пациенту, нуждающемуся в лечении. Примеры вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, представляют собой то, что описано выше.
[0089] Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, которое используют для предотвращения или лечения реакции трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, аутоиммунного заболевания, фиброза, воспалительного энтерита или аллергии. Примеры вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, представляют собой то, что описано выше.
[0090] Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает вещество, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, которое используют для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения реакции трансплантат против хозяина, отторжения трансплантата, аутоиммунного заболевания, фиброза, воспалительного энтерита или аллергии. Примеры вещества, которое ингибирует связывание между DNAM-1 и CD155, представляют собой то, что описано выше.
[0091] Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает способ лечения или предотвращения реакции трансплантат против хозяина или отторжения трансплантата, который включает введение эффективного количества описанного выше моноклонального антитела против DNAM-1 человека или его фрагмента пациенту, нуждающемуся в лечении.
[0092] Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает описанное выше моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент, которые используют для лечения или предотвращения реакции трансплантат против хозяина или отторжения трансплантата.
[0093] Еще один другой вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает описанное выше моноклональное антитело против DNAM-1 человека или его фрагмент, которые используют для получения лекарственного средства для лечения или предотвращения реакции трансплантат против хозяина или отторжения трансплантата.
ПРИМЕРЫ
[0094] Настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на тестовые примеры, приведенные далее. Настоящее изобретение не ограничено тестовыми примерами, приведенными далее.
[0095] [Тестовый пример 1]
(Получение моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
Ген DMAM-1 человека вводили в клеточную линию BW5147, которую получали из лимфоцитов мыши, чтобы экспрессировать белок DMAM-1 человека. Мышь иммунизировали с использованием клеток в качестве антигена, и получали гибридому обычным образом. Из получаемой гибридомной линии получали клоны, которые продуцировали конкретное одно из моноклональных антител против DNAM-1 человека No 1-6, в соответствии с реактивностью к белку DNAM-1 человека.
[0096] Клонировали гены, кодирующие тяжелые цепи антител, и гены, кодирующие легкие цепи антител, которые получали из гибридомной линии, созданной обычным образом, и идентифицировали аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей антител. На фиг. 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая выравнивание аминокислотных последовательностей тяжелых цепей моноклонального антитела против DNAM-1 человека No 1-6. С CDR1 до 3 подчеркнуты на фиг. 1. На фиг. 2 представлена диаграмма, иллюстрирующая выравнивание аминокислотных последовательностей легких цепей моноклонального антитела против DNAM-1 человека No 1-6. С CDR1 до 3 подчеркнуты на фиг. 2. В таблице 1 обобщено соответствие между аминокислотными последовательностями тяжелых и легких цепей каждого из моноклональных антител и SEQ ID №№, приведенные в списке последовательностей.
[0097] [Таблица 1]
Антитело
Полноразмерная вариабельная область тяжелой цепи
Полноразмерная вариабельная область легкой цепи
номер 1
SEQ ID NO:7
SEQ ID NO:8
номер 2
SEQ ID NO:9
SEQ ID NO:10
№ 3
SEQ ID NO:11
SEQ ID NO:12
№ 4
SEQ ID NO:13
SEQ ID NO:14
№ 5
SEQ ID NO:15
SEQ ID NO:16
№ 6
SEQ ID NO:17
SEQ ID NO:18
[0098] [Тестовый пример 2]
(Исследование 1 реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
5
Определяли реактивности моноклональных антител №номер 1 и 2, полученных в тестовом примере 1. В частности, проводили реакцию клеточной линии BW5147 (далее в настоящем описании можно обозначать как «BW»), которую получали из лимфоцитов мыши, и клеточной линии BW5147, в которой экспрессировали белок DMAM-1 человека (далее в настоящем описании эту клеточную линию BW5147 можно обозначать как «DNAM-1/BW») с моноклональным антителом номер 1 или 2 и выполняли анализ посредством проточной цитометрии с использованием контрольного антитела IgG1 в качестве эталона. Проводили реакцию 30 нг антитела с 1×10 клеток каждой клеточной линии. Реакцию антитела проводили на льду в течение 30 минут.
[0099] Фиг. 3(a) представляет собой график, иллюстрирующий результаты, которые получали, когда проводили реакцию клеток BW с моноклональным антителом номер 1. Фиг. 3(b) представляет собой график, иллюстрирующий результаты, которые получали, когда проводили реакцию клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом номер 1. Фиг. 3(c) представляет собой график, иллюстрирующий результаты которые получали, когда проводили реакцию клеток BW с моноклональным антителом номер 2. Фиг. 3(d) представляет собой график, иллюстрирующий результаты, которые получали, когда проводили реакцию клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом номер 2.
[0100] Вышеприведенные результаты показывали, что оба моноклональных антител №номер 1 и 2 специфически распознавали белок DNAM-1, экспрессируемый клетками BW.
[0101] [Тестовый пример 3]
(Исследование 2 реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
Определяли реактивности моноклональных антител №номер 1 и 2, полученных в тестовом примере 1, к белку DNAM-1, присутствующему на поверхностях лимфоцитов периферической крови человека.
5
[0102] Определяли реактивности моноклональных антител №номер 1 и 2 к CD3+ CD4+ клеткам (CD4+ T-клеткам), CD3+ CD8+ клеткам (CD8+ T-клеткам), CD3- CD19+ клеткам (B-клеткам), CD3- CD56+ клеткам (NK клеткам), CD3+ CD56+ клеткам (NKT-клеткам) и CD14+ клеткам (моноцитам), присутствующим в лимфоцитах периферической крови человека. Контрольное антитело IgG1 использовали в качестве эталона. Проводили реакцию 1×10 лимфоцитов периферической крови с 100 нг моноклонального антитела номер 1 или 2. Реакцию антитела проводили на льду в течение 30 минут.
[0103] Фиг. 4(a) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 1 к CD4+ T-клеткам. Фиг. 4(b) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 1 к CD8+ T-клеткам. Фиг. 4(c) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 1 к B-клеткам. Фиг. 4(d) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 2 к CD4+ T-клеткам. Фиг. 4(e) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 2 к CD8+ T-клеткам. Фиг. 4(f) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 2 к B-клеткам. Фиг. 4(g) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 1 к NK клеткам. Фиг. 4(h) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 1 к NKT-клеткам. Фиг. 4(i) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 1 к моноцитам. Фиг. 4(j) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 2 к NK клеткам. Фиг. 4(k) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 2 к NKT-клеткам. Фиг. 4(l) иллюстрирует реактивность моноклонального антитела номер 2 к моноцитам.
[0104] Вышеуказанные результаты показывали, что оба моноклональных антитела номер 1 и номер 2 имели реактивность к белку DNAM-1, присутствующему на поверхностях CD4+ T-клеток, CD8+ T-клеток, B-клеток, NK клеток, NKT-клеток и моноцитов.
[0105] [Тестовый пример 4]
(Исследование 3 реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
5
Осуществляли конкурентный анализ с использованием моноклональных антител с номер 1 до № 6, полученных в тестовом примере 1. В частности, проводили реакцию клеток DNAM-1/BW (1×10 клеток) с 100 нг моноклонального антитела номер 2 (предварительная обработка). Впоследствии, проводили реакцию клеток DNAM-1/BW с одним из конкретных моноклональных антител №номер 1 и с 3 до 6, разведенных последовательно. Реакцию антитела проводили на льду в течение 30 минут. Также определяли реактивности антител к клеткам DNAM-1/BW, которые не подвергали предварительной обработке.
[0106] Фиг. 5(a) представляет собой график, иллюстрирующий реактивность моноклонального антитела номер 1. Фиг. 5(b) представляет собой график, иллюстрирующий реактивность моноклонального антитела № 3. Фиг. 5(c) представляет собой график, иллюстрирующий реактивность моноклонального антитела № 4. Фиг. 5(d) представляет собой график, иллюстрирующий реактивность моноклонального антитела № 5. Фиг. 5(e) представляет собой график, иллюстрирующий реактивность моноклонального антитела № 6.
[0107] Результат, проиллюстрированный на фиг. 5(a), подтверждал, что моноклональное антитело номер 1 даже имело хорошую реактивность к клеткам DNAM-1/BW, которые реагировали с моноклональным антителом номер 2. Это доказывает, что моноклональное антитело номер 1 имело более высокую реактивность к белку DNAM-1, чем моноклональное антитело номер 2.
[0108] Результат, проиллюстрированный на фиг. 5(b) подтверждал, что моноклональное антитело № 3 имело низкую реактивность к клеткам DNAM-1/BW, которые реагировали с моноклональным антителом номер 2. Это доказывает, что моноклональное антитело номер 2 имело более высокую реактивность к белку DNAM-1, чем моноклональное антитело № 3.
[0109] Результаты, проиллюстрированные на фиг. 5(c), подтверждали, что моноклональное антитело № 4 имело низкую реактивность к клеткам DNAM-1/BW, которые реагировали с моноклональным антителом номер 2. Это доказывает, что моноклональное антитело номер 2 имело более высокую реактивность к белку DNAM-1, чем моноклональное антитело № 4.
[0110] Результат, проиллюстрированный на фиг. 5(d), подтверждал, что моноклональное антитело № 5 имело реактивность к клеткам DNAM-1/BW, которые реагировали с моноклональным антителом номер 2. Также с учетом результатов, полученных в тестовом примере 5 далее, полагают, что эпитопы моноклонального антитела № 5 и номер 2 не конкурируют друг с другом.
[0111] Результат, проиллюстрированный на фиг. 5(e), схож с таковым на фиг. 5(d). Также с учетом результатов, полученных в тестовом примере 5 далее, полагают, что эпитопы моноклонального антитела № 6 и номер 2 не конкурируют друг с другом.
[0112] [Тестовый пример 5]
(Исследование 4 реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
5
Тест проводили как в тестовом примере 4, за исключением того, что меняли тип антитела, которое реагировало с клетками DNAM-1/BW. В частности, клетки DNAM-1/BW (1×10 клеток) реагировали с насыщающим количеством одного из конкретных моноклональных антител №номер 1 и с 3 до 6 (предварительная обработка). Используемые количества моноклональных антител №номер 1 и с 3 до 6 составляли 30, 300, 300, 500 и 1000 нг, соответственно.
5
[0113] Следует отметить, что, минимальные количества моноклональных антител No 1-6, необходимые для насыщения антитела DNAM-1 человека, экспрессируемого на поверхностях 1×10 клеток DNAM-1/BW, составляли 30, 50, 100, 100, 300 и 300 нг, соответственно. Впоследствии проводили реакцию клеток DNAM-1/BW с каждым последовательным разведением моноклонального антитела номер 2. Реакцию антитела проводили на льду в течение 30 минут. Также определяли реактивности антител к клеткам DNAM-1/BW, которые не подвергали предварительной обработке.
[0114] Фиг. 6(a) представляет собой график, иллюстрирующий результаты теста, в котором использовали моноклональное антитело номер 1. Фиг. 6(b) представляет собой график, иллюстрирующий результаты теста, в котором использовали моноклональное антитело № 3. Фиг. 6(c) представляет собой график, иллюстрирующий результаты теста, в котором использовали моноклональное антитело № 4. Фиг. 6(d) представляет собой график, иллюстрирующий результаты теста, в котором использовали моноклональное антитело № 5. Фиг. 6(e) представляет собой график, иллюстрирующий результаты теста, в котором использовали моноклональное антитело № 6.
[0115] Результат, проиллюстрированный на фиг. 6(a), подтверждал, что моноклональное антитело номер 2 имело низкую реактивность к клеткам DNAM-1/BW, которые реагировали с моноклональным антителом номер 1. Также с учетом результатов, полученных в тестовом примере 4 выше, это подтверждает тот факт, что моноклональное антитело номер 1 имело более высокую реактивность к белку DNAM-1, чем моноклональное антитело номер 2.
[0116] Результат, проиллюстрированный на фиг. 6(b), подтверждал, что моноклональное антитело номер 2 даже имело относительно хорошую реактивность к клеткам DNAM-1/BW, которые реагировали с моноклональным антителом № 3. Также с учетом результатов, полученных выше в тестовом примере 4, это подтверждает тот факт, что моноклональное антитело номер 2 имело более высокую реактивность к белку DNAM-1, чем моноклональное антитело № 3.
[0117] Результат, проиллюстрированный на фиг. 6(c), подтверждал, что моноклональное антитело номер 2 даже имело относительно хорошую реактивность к клеткам DNAM-1/BW, которые реагировали с моноклональным антителом № 4. Также с учетом результатов, полученных выше в тестовом примере 4, это подтверждает тот факт, что моноклональное антитело номер 2 имело более высокую реактивность к белку DNAM-1, чем моноклональное антитело № 4.
[0118] Результат, проиллюстрированный на фиг. 6(d), подтверждал, что моноклональное антитело номер 2 имело реактивность к клеткам DNAM-1/BW, которые реагировали с моноклональным антителом № 5. Также с учетом результатов, полученных выше в тестовом примере 4, полагают, что эпитопы моноклонального антитела номер 2 и № 5 не конкурируют друг с другом.
[0119] Результат, проиллюстрированный на фиг. 6(e), схож с таковым на фиг. 6(d). Также с учетом результатов, полученных выше в тестовом примере 4, полагают, что эпитопы моноклонального антитела номер 2 и № 6 не конкурируют друг с другом.
[0120] [Тестовый пример 6]
(Исследование 5 реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
Известно, что белок DNAM-1 и белок CD155 взаимодействуют друг с другом. Соответственно, определяли, способны ли или нет моноклональные антитела с номер 1 до № 6, полученные в тестовом примере 1, ингибировать взаимодействие между белком DNAM-1 и белком CD155.
[0121] Сначала получали солюбилизированный белок CD155 человека. В частности, слитый белок, образованный посредством слияния белка CD155 человека с константной областью антитела IgG человека (далее в настоящем описании этот слитый белок можно обозначать как «hCD155-Fc»), получали стандартным образом. Белок CD155 человека имеет RefSeq ID NP_001129240.
5
[0122] Затем предварительно проводили реакцию клеток DNAM-1/BW (1×10 клеток) с насыщающим количеством (1000 нг) белка hCD155-Fc. Впоследствии проводили реакцию клеток DNAM-1/BW с одним конкретным из моноклональных антител с номер 1 до № 6, разведенных последовательно. Реакцию проводили на льду в течение 30 минут.
[0123] Фиг. 7(a)-7(e) представляют собой графики, иллюстрирующие результаты тестов, в которых использовали моноклональные антитела №номер 1 и с 3 до 6, соответственно. Результаты теста, в котором использовали моноклональное антитело номер 2, также представлены на фиг. 7(a)-7(e) для сравнения.
[0124] Результат, проиллюстрированный на фиг. 7(a), подтверждал, что моноклональное антитело номер 1 способно подходящим образом реагировать с клетками DNAM-1/BW, которые реагировали с белком hCD155-Fc, и реактивность была выше таковой у моноклонального антитела номер 2.
[0125] Результат, проиллюстрированный на фиг. 7(b), подтверждал, что моноклональное антитело № 3 способно подходящим образом реагировать с клетками DNAM-1/BW, которые реагировали с белком hCD155-Fc, и реактивность сравнима с таковой у моноклонального антитела номер 2.
[0126] Результат, проиллюстрированный на фиг. 7(c), подтверждал, что моноклональное антитело № 4 способно подходящим образом реагировать с клетками DNAM-1/BW, которые реагировали с белком hCD155-Fc, и реактивность сравнима с таковой у моноклонального антитела номер 2.
[0127] Результат, проиллюстрированный на фиг. 7(d), подтверждал, что моноклональное антитело № 5 способно реагировать с клетками DNAM-1/BW, которые реагировали с белком hCD155-Fc, но реактивность ниже таковой у моноклонального антитела номер 2.
[0128] Результаты, проиллюстрированные на фиг. 7(e), подтверждали, что моноклональное антитело № 6 способно реагировать с клетками DNAM-1/BW, которые реагировали с белком hCD155-Fc, но реактивность ниже таковой у моноклонального антитела номер 2.
[0129] [Тестовый пример 7]
(Исследование 6 реактивности моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
После того, как клетки DNAM-1/BW, предварительно реагировавшие с белком hCD155-Fc, реагировали с одним конкретным из моноклональных антител с номер 1 до № 6, разведенных последовательно в тестовом примере 6, обнаруживали белок hCD155-Fc, связанный с белком DNAM-1, присутствующим на поверхностях клеток DNAM-1/BW. Обнаружение белка hCD155-Fc проводили с использованием антитела против IgG человека. Реакцию проводили на льду в течение 30 минут.
[0130] Фиг. 8(a)-8(e) представляют собой графики, иллюстрирующие результаты тестов, в которых использовали моноклональные антитела №номер 1 и с 3 до 6, соответственно. Результаты теста, в котором использовали моноклональное антитело номер 2, также представлены на фиг. 8(a)-8(e) для сравнения.
[0131] Результат, проиллюстрированный на фиг. 8(a), подтверждал, что остатки белка hCD155-Fc после реакции клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом номер 1 снижались таким образом, который зависит от концентрации моноклонального антитела номер 1.
[0132] Также подтверждали, что количество белка hCD155-Fc по существу составляло ноль в диапазоне, где концентрация реагировавшего моноклонального антитела была высокой. Это доказывает, что оба моноклональных антитела номер 1 и номер 2 способны полностью ингибировать взаимодействие между белком DNAM-1 и белком CD155. Количество моноклонального антитела номер 1, необходимое для полного ингибирования взаимодействия между белком DNAM-1 и белком CD155, составляло меньше количества моноклонального антитела номер 2, необходимого для полного ингибирования взаимодействия между белком DNAM-1 и белком CD155. В частности, количества моноклональных антител номер 1 и номер 2, необходимые для полного ингибирования взаимодействия между белком DNAM-1 и белком CD155, составляли 100 и 300 нг, соответственно.
[0133] Результат, проиллюстрированный на фиг. 8(b), подтверждал, что остатки белка hCD155-Fc после реакции клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом № 3 снижались таким образом, который зависит от концентрации моноклонального антитела № 3.
[0134] Также подтверждали, что в диапазоне, где концентрация моноклонального антитела, реагировавшего с клетками DNAM-1/BW, была низкой, остатки белка hCD155-Fc после реакции клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом № 3 были меньше, чем таковые у белка hCD155-Fc после реакции клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом номер 2. Это доказывает, что в диапазоне, где концентрация моноклонального антитела, реагировавшего с клетками DNAM-1/BW, была низкой, моноклональное антитело № 3 имело более высокую активность ингибирования взаимодействия между белком DNAM-1 и белком CD155, чем моноклональное антитело номер 2. В диапазоне, где концентрация моноклонального антитела, реагировавшего с клетками DNAM-1/BW, была высокой, разность в вышеуказанной реактивности между моноклональными антителами №номер 2 и 3 была маленькой. Количество моноклонального антитела № 3, необходимое для полного ингибирования взаимодействия между белком DNAM-1 и белком CD155, составляло 300 нг.
[0135] Результат, проиллюстрированный на фиг. 8(c), подтверждал, что остатки белка hCD155-Fc после реакции клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом № 4 снижались таким образом, который зависит от концентрации моноклонального антитела № 4.
[0136] Также подтверждали, что остатки белка hCD155-Fc после реакции клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом № 4 были больше, чем таковые у белка hCD155-Fc после реакции клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом номер 2. Это доказывает, что моноклональное антитело номер 2 имело более высокую активность ингибирования взаимодействия между белком DNAM-1 и белком CD155, чем моноклональное антитело № 4. Количество моноклонального антитела № 4, необходимое для полного ингибирования взаимодействия между белком DNAM-1 и белком CD155, составляло 1000 нг.
[0137] Результат, проиллюстрированный на фиг. 8(d) подтверждал, что количество белка hCD155-Fc не снижалось достаточно даже после реакции клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом № 5. Это доказывает, что моноклональное антитело № 5 имело низкую активность ингибирования взаимодействия между белком DNAM-1 и белком CD155. Не было возможно полностью ингибировать взаимодействие между белком DNAM-1 и белком CD155, даже когда использовали 3000 нг моноклонального антитела № 5.
[0138] Результат, проиллюстрированный на фиг. 8(e), подтверждал, что количество белка hCD155-Fc не снижалось достаточно, даже после реакции клеток DNAM-1/BW с моноклональным антителом № 6. Это доказывает, что моноклональное антитело № 6 имело низкую активность ингибирования взаимодействия между белком DNAM-1 и белком CD155. Не было возможно полностью ингибировать взаимодействие между белком DNAM-1 и белком CD155, даже когда использовали 3000 нг моноклонального антитела № 6.
[0139] [Тестовый пример 8]
(Функциональный анализ 1 моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
Анализ реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR) проводили в присутствии моноклонального антитела номер 1 или номер 2, полученных в тестовом примере 1, чтобы определять влияние моноклонального антитела на пролиферацию T-клеток.
5
[0140] В MLR анализе измеряют пролиферацию T-клеток, которая возникает, когда аллогенные стимулирующие клетки смешивают с T-клетками. В частности, сначала брали образцы CD14+ клеток (5×10 клеток) из лимфоцитов периферической крови человека и культивировали в течение 1 недели в присутствии интерлейкина(IL)-4 (40 нг/лунка) и GM-CSF (50 нг/лунка) для того, чтобы индуцировать дендритные клетки. Культивирование CD14+ клеток проводили с использованием 24-луночного планшета. Образцы CD8+ T-клеток брали из лимфоцитов периферической крови человека, полученной от другого донора.
2
2
2
4
3
[0141] Проводили реакцию CD8+ T-клеток с определенным количеством (1 мкг/мл) F(ab') моноклонального антитела номер 1, F(ab') моноклонального антитела номер 2 или F(ab') контрольного IgG (эталон), которое было равно или превышало насыщающее количество. Затем CD8+ T-клетки совместно культивировали с дендритными клетками. Число CD8+ T-клеток составляло 5×10. Число дендритных клеток составляло 5×10.
[0142] Через 48 часов после начала совместного культивирования вышеуказанное антитело снова добавляли в количестве 1 мкг/мл. Через 72 часа после начала совместного культивирования добавляли бромдезоксиуридин (BrdU). Через 96 часов после начала совместного культивирования осуществляли окрашивание с использованием антитела против BrdU для того, чтобы измерять пролиферацию CD8+ T-клеток.
[0143] На фиг. 9 представлен график, иллюстрирующий результаты MLR анализа. На фиг. 9 символ «*» обозначает, что между ними имело место значимое различие с уровнем значимости меньше 5%. Подтверждено, что пролиферация CD8+ T-клеток значительно ограничено, даже когда добавляли любое одно из моноклональных антител номер 1 и номер 2. Вышеуказанные результаты показывают, что моноклональные антитела номер 1 и номер 2 могут влиять на функции T-клеток человека.
[0144] [Тестовый пример 9]
(Функциональный анализ 2 моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
Функции моноклонального антитела номер 1, полученного в тестовом примере 1, анализировали с использованием модели реакции трансплантат против хозяина на мышах.
[0145] Модель реакции трансплантат против хозяина на мышах, используемая в тестовом примере 9, представляла собой модель, в которой мышей hCD155Tg/NOG, созданных скрещиванием мыши NOG (мышь NOD/Shi-scid, IL-2 Rγnull), которая представляют собой иммунодефицитную мышь, с мышью с трансгеном CD155 человека, экспонировали для облучения, впоследствии мышам трансплантировали лимфоциты периферической крови человека и определяли симптомы реакции трансплантат против хозяина на основе изменения массы и коэффициента выживаемости.
6
2
[0146] На фиг. 10 представлена диаграмма, иллюстрирующая протокол эксперимента в тесте. За сутки до инициации теста мышей hCD155Tg/NOG (самка, в возрасте 8 недель) экспонировали для облучения 1,2 Гр. В начальные сутки теста лимфоциты периферической крови человека по 2,5×10 клеток/мышь трансплантировали мышам посредством инъекции в хвостовую вену. Затем мышам (n=6) интраперитонеально вводили 300 мкг/0,2 мл F(ab') моноклонального антитела номер 1. Мышей, которым фосфатный буферный раствор (PBS) вводили вместо антитела, использовали в качестве эталона (n=6). Изменения массы мышей и коэффициенты выживаемости мышей измеряли для того, чтобы определять симптомы реакции трансплантат против хозяина. Антитело вводили мышам интраперитонеально в том же количестве, как описано выше, на 3, 7, 11, 14, 18 и 21 сутки после инициации теста.
[0147] На фиг. 11 представлен график, иллюстрирующий коэффициенты выживаемости мышей. Коэффициент выживаемости мышей, которым вводили моноклональное антитело номер 1, значительно повышен. Это доказывает, что введение моноклонального антитела номер 1 может предотвращать реакцию трансплантат против хозяина.
[0148] Ухудшение функции печени у мышей определяли посредством измерения активности глутамат-пируват-трансаминазы (ALT) и активности глутамат-оксалоацетат-трансаминазы (AST) в крови. Увеличение активностей ALT и AST в крови указывает на ослабление функции печени.
[0149] Фиг. 12(a) представляет собой график, иллюстрирующий результат измерения активности ALT. Фиг. 12(b) представляет собой график, иллюстрирующий результат измерения активности AST. Подтверждено, что подавляли ухудшение функции печени у мышей, которым вводили моноклональное антитело номер 1.
[0150] [Тестовый пример 10]
(Функциональный анализ 3 моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
Функции моноклонального антитела номер 1, полученного в тестовом примере 1, анализировали с использованием той же модели реакции трансплантат против хозяина на мышах, как в тестовом примере 9, за исключением того, что протокол эксперимента меняли относительно тестового примера 9. Определяли эффект моноклонального антитела номер 1, оказываемый на лечение реакции трансплантат против хозяина.
6
2
[0151] На фиг. 13 представлена диаграмма, иллюстрирующая протокол эксперимента в тесте. За сутки до инициации теста, мышей hCD155Tg/NOG (самка, в возрасте 8 недель) экспонировали для облучения 1,2 Гр. В начальные сутки теста лимфоциты периферической крови человека трансплантировали мышам по 2,5×10 клеток/мышь посредством инъекции в хвостовую вену. Затем измеряли изменения массы мышей и коэффициенты выживаемости мышей для того, чтобы определять симптомы реакции трансплантат против хозяина. В 10, 13, 17 и 20 сутки после инициации теста мышам интраперитонеально вводили 300 мкг/0,2 мл F(ab') моноклонального антитела номер 1. Моноклональное антитело номер 1 вводили каждой из мышей два раза в неделю на непрерывной основе до гибели мыши. Мышей, которым PBS вводили вместо антитела, использовали в качестве эталона.
[0152] На фиг. 14 представлен график, иллюстрирующий коэффициенты выживаемости мышей. Как результат, коэффициент выживаемости мышей, которым вводили моноклональное антитело номер 1, значительно увеличен. Это доказывает, что введение моноклонального антитела номер 1 позволяет лечить реакцию трансплантат против хозяина.
[0153] [Тестовый пример 11]
(Функциональный анализ 4 моноклонального антитела против DNAM-1 человека)
Выполняли сравнение между функциями моноклональных антител номер 1 и номер 2, полученных в тестовом примере 1. В частности, CD8+ T-клетки отделяли от моноцитов периферической крови человека и культивировали в присутствии антитела против CD3 (№ по каталогу 555336, произведено в BD Bioscience, 0,25 мкг/мл), антитела против CD28 (№ по каталогу 555725, произведено в BD Bioscience, 1 мкг/мл) и IL-2 (№ по каталогу 554603, произведено в BD Bioscience, 0,02 мкг/мл) в течение 7 сутки с тем, чтобы активировать.
6
[0154] Затем к активированным CD8+ T-клеткам добавляли контрольное антитело IgG1 (эталон), моноклональное антитело номер 1 или моноклональное антитело номер 2 в пропорции 10 мг/10 клеток для того, чтобы связывать антитело с активированными CD8+ T-клетки посредством инкубации при 4°C в течение 30 минут.
[0155] Затем CD8+ T-,клетки обработанные антителом, смешивали с hCD155-экспрессирующими клетками, которые служили в качестве клеток-мишеней, в соотношении CD8+ T-клетки:hCD155-экспрессирующие клетки 1:5. Затем совместное культивирование осуществляли при 37°C в течение 4 часов. Использованные hCD155-экспрессирующие клетки представляли собой клетки BW5147, на которых активно экспрессирован hCD155.
[0156] Определяли цитотоксическую активность каждой из субпопуляций CD8+ T-клеток. Цитотоксическую активность CD8+ T-клеток определяли на основе экспрессии CD107a на CD8+ T-клетках. CD107a представляет собой маркер дегрануляции CD8+ T-клеток.
[0157] На фиг. 15 представлен график, иллюстрирующий результаты исследования. На фиг. 15 проиллюстрирована пропорция клеток, на которых экспрессировали CD107a, и CD8+ T-клеток, которые обрабатывали одним конкретным из моноклонального антитела номер 1 или моноклонального антитела номер 2, где 100% составляет пропорцию клеток, на которых экспрессировали CD107a, и CD8+ T-клеток, которые обрабатывали контрольным антителом IgG1 (эталон).
[0158] На фиг. 15 «p=0,002» обозначает, что между ними имело место значимое различие с уровнем значимости меньше 0,2%; «p=0,004» обозначает, что между ними имело место значимое различие с уровнем значимости меньше 0,4%; и «p=0,02» обозначает, что между ними имело место значимое различие с уровнем значимости меньше 2%.
[0159] Как результат, подтверждено, что, когда связывание между DNAM-1, присутствующим на CD8+ T-клетках, и hCD155, присутствующим на клетках-мишенях, ингибировали с использованием антитела против DNAM-1, ингибировали цитотоксическую активность CD8+ T-клеток. Также подтверждали, что степень ингибирования цитотоксической активности, достигаемая с использованием моноклонального антитела номер 1, значительно больше таковой, достигаемой с использованием моноклонального антитела номер 2.
[0160] [Тестовый пример 12]
(Исследование регуляторных T-клеток)
Функции моноклонального антитела номер 1, полученного в тестовом примере 1, анализировали с использованием той же модели реакции трансплантат против хозяина на мышах, как в тестовом примере 9.
6
2
[0161] В частности, сначала, за сутки до инициации теста, мышей hCD155Tg/NOG (самка, в возрасте 8 недель), созданных скрещиванием мыши NOG (мышь NOD/Shi-scid, IL-2 Rγnull), которая представляет собой иммунодефицитную мышь, с мышью с трансгеном CD155 человека, экспонировали для облучения 1,2 Гр. Затем в начальные сутки теста лимфоциты периферической крови человека трансплантировали мышам по 2,5×10 клеток/мышь посредством инъекции в хвостовую вену. Затем мышам интраперитонеально вводили F(ab') моноклональное антитело номер 1 300 мкг/0,2 мл (n=6). Мышей, которым вводили фосфатный буферный раствор (PBS) вместо антитела, использовали в качестве эталона (n=6). Антитело вводили интраперитонеально мышам в том же количестве, как описано выше, в 3, 7 и 11 сутки после инициации теста.
[0162] Затем на 14 сутки после инициации теста брали образцы селезенки и периферической крови у каждой из мышей и проводили анализ посредством проточной цитометрии для того, чтобы определять пропорцию регуляторных T-клеток в селезенке и периферической крови. CD4+ Foxp3+ клетки обнаруживали как регуляторные T-клетки.
[0163] Фиг. 16(a) представляет собой график, иллюстрирующий результаты для пропорции регуляторных T-клеток и CD4+ T-клеток в селезенке каждой из мышей, которые определяли на 14 сутки после введения моноклонального антитела номер 1. Фиг. 16(b) представляет собой график, иллюстрирующий пропорцию регуляторных T-клеток и CD4+ T-клеток в периферической крови каждой из мышей, которую определяли на 14 сутки после введения моноклонального антитела номер 1.
[0164] Как результат, подтверждено, что введение моноклонального антитела номер 1 значительно увеличивало пропорцию регуляторных T-клеток.
[0165] [Тестовый пример 13]
(Исследование аутоиммунного заболевания)
Функции антитела против DNAM-1 определяли с использованием модели экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. В частности, сначала за сутки до инициации теста мышам C57BL/6J (n=8) интраперитонеально вводили 100 мкг/0,2 мл антитела против DNAM-1 мыши. Мышей C57BL/6J, которым интраперитонеально вводили 100 мкг/0,2 мл контрольного антитела IgG, использовали в качестве эталона (n=9).
[0166] Впоследствии, при инициации теста, 50 мкг/0,2 мл пептида, который эквивалентен последовательности аминокислот между 33-й и 55-й в миелин-олигодендроцитарном гликопротеине (MOG), вводили подкожно в спину каждой из мышей. Затем мышам интраперитонеально вводили 200 нг/0,2 мл токсина коклюша. Кроме того, каждой из мышей также интраперитонеально вводили 200 нг/0,2 мл токсина коклюша на вторые сутки после инициации теста.
[0167] Затем в 1, 3, 7, 11 и 13 сутки после инициации теста мышам вводили 100 мкг/0,2 мл антитела против DNAM-1 мыши или 100 мкг/0,2 мл контрольного антитела IgG.
[0168] Коэффициент заболеваемости энцефаломиелитом и клиническую оценку определяли посредством мониторинга мышей после инициации теста. Клиническая оценка представляет собой усредненное для оценок, которые определяли в соответствии со следующими критериями.
(Клиническая оценка)
0: Норма
1: Снижение тонуса хвоста
2: Полностью мягкий хвост
3: Отклонение походки от нормы
4: Полная слабость задних лап
5: Полная слабость задних лап с параличом передних лап
6: Гибель
[0169] Фиг. 17(a) представляет собой график, иллюстрирующий результат измерения коэффициента заболеваемости энцефаломиелитом. Фиг. 17(b) представляет собой график, иллюстрирующий результат для усредненной вычисленной клинической оценки. На фиг. 17(a) и 17(b) горизонтальная ось показывает время (сутки), прошедшее с инициации теста. Как результат, подтверждено, что введение антитела против DNAM-1 усовершенствовало клиническую оценку аутоиммунного энцефаломиелита.
[0170] [Тестовый пример 14]
(Исследование фиброза печени)
Исследование фиброза печени проводили с использованием мышей с нокаутом гена DNAM-1 (далее в настоящем описании можно обозначать как «DNAM-1KO») вместо введения антитела против DNAM-1. Мышей дикого типа использовали в качестве эталона. В тесте использовали модель с перевязыванием желчных протоков (BDL).
[0171] В частности, сначала открывали перитонеальную полость каждой из мышей и перевязывали общий желчный проток при инициации теста для того, чтобы получать модель BDL. Затем, в 3, 7, 14 и 21 сутки после инициации теста, брали образцы крови из орбитального синуса каждой из мышей. Затем от полученного образца крови отделяли сыворотку и определяли количества щелочной фосфатазы и общего билирубина, присутствующих в сыворотке, с использованием клинического химического анализатора (модель: «DRI-CHEM», произведено в FUJIFILM Holdings Corporation). Следует отметить, что, щелочная фосфатаза и общий билирубин являются показателями повреждения печени и желчных путей.
[0172] На 21 сутки после инициации теста перфузировали целый организм каждой из мышей и у мыши брали печень. Каждую взятую печень фиксировали и заливали парафином. Затем получали тканевые срезы. Тканевые срезы окрашивали сириусом красным и рассматривали под микроскопом. Сириус красный представляет собой краситель, который связывается с тройной спиралью коллагена.
[0173] Фиг. 18(a) представляет собой график, иллюстрирующий результат определения количества щелочной фосфатазы, присутствующей в сыворотке. На фиг. 18(a) «WT» обозначает результаты для мышей дикого типа; «DNAM-1 KO» обозначает результаты для мышей с нокаутом DNAM-1; и «наивные» обозначает результаты для мышей, которых не подвергали перевязыванию желчных протоков. По горизонтальной оси представлено время (сутки), прошедшее с инициации теста. Как результат, подтверждено, что количества щелочной фосфатазы, присутствующей в сыворотках мышей с нокаутом DNAM-1, значительно меньше таковых у контрольных мышей дикого типа.
[0174] Фиг. 18(b) представляет собой график, иллюстрирующий результат определения количества общего билирубина, присутствующего в сыворотке. На фиг. 18(b) «WT» обозначает результаты для мышей дикого типа; «DNAM-1 KO» обозначает результаты для мышей с нокаутом DNAM-1; и «наивные» обозначает результаты для мышей, которых не подвергали перевязыванию желчных протоков. По горизонтальной оси представлено время (сутки), прошедшее с инициации теста. Как результат, подтверждено, что количества общего билирубина, присутствующего в сыворотках мышей с нокаутом DNAM-1, значительно меньше таковых у мышей дикого типа.
[0175] Фиг. 19(a) и 19(b) представляют собой микрофотографии ткани печени. Фиг. 19(a) представляет собой фотографию ткани печени одной из контрольных мышей дикого типа (WT). Фиг. 19(b) представляет собой фотографию ткани печени одной из мышей с нокаутом DNAM-1 (DNAM-1 KO). Обе микрофотографии выполнены с 20-кратным увеличением. Как результат, подтверждено, что фиброз печени значительно снижен у мыши с нокаутом DNAM-1 по сравнению с мышью дикого типа.
[0176] Вышеприведенные результаты показывают, что введение антитела против DNAM-1 в живой организм позволяет снижать фиброз печени.
[0177] [Тестовый пример 15]
(Исследование фиброза почек)
Исследование фиброза почек проводили с использованием мышей с нокаутом гена DNAM-1 вместо введения антитела против DNAM-1. Мышей дикого типа использовали в качестве эталона. В тесте использовали модель односторонней обструкции мочеточника (UUO).
[0178] В частности, сначала, при инициации теста, открывали перитонеальную полость каждой из мышей и перевязывали правый мочеточник для того, чтобы получать модель UUO. Левую почку оставляли без обработки. Затем, на седьмые сутки после инициации теста перфузировали целый организм каждой из мышей и у каждой из мышей брали обе почки. Затем собранные почки фиксировали формалином и заливали парафином для того, чтобы получать тканевые срезы. Тканевые срезы окрашивали с использованием трехцветной окраски по Массону и рассматривали. Почки, фиксированные параформальдегидом, заливали соединением OCT для того, чтобы получать тканевые срезы. Затем проводили иммунное окрашивание тканевых срезов. Вычисляли площадь участка, положительного по α-актину гладких мышц (α-SMA), которая является показателем фиброза.
[0179] Фиг. 20(a) представляет собой фотографии срезов почек, окрашенных с использованием трехцветной окраски по Массону. Фиг. 20(b) представляет собой график, иллюстрирующий результат определения площади коры почек на основе результатов, проиллюстрированных на фиг. 20(a). На фиг. 20(a) и 20(b), «UUO» обозначает результаты для правой почки с перевязанным мочеточником, тогда как «CON» обозначает результаты для левой почки без обработки; и «WT» обозначает результаты, полученные в тестах, в которых использовали мышей дикого типа, тогда как «DNAM-1 KO» обозначает результаты, полученные в тестах, в которых использовали мышей с нокаутом DNAM-1. На фиг. 20(b) символ «*» обозначает, что между ними имело место значимое различие с уровнем значимости меньше 5%; символ «**» обозначает, что между ними имело место значимое различие с уровнем значимости меньше 1%; и «N.S.» обозначает, что между ними значимое различие отсутствовало. Как результат, подтверждено, что разрушение ткани почки в результате перевязывания мочеточника значительно снижено у мышей с нокаутом DNAM-1 по сравнению с мышами дикого типа.
[0180] Фиг. 21(a) и 21(b) представляют собой микрофотографии среза ткани почки с иммунным окрашиванием антителом против α-SMA. Фиг. 21(a) иллюстрирует типичный тканевой срез правой почки с перевязанным мочеточником у контрольной мыши дикого типа, тогда как фиг. 21(b) иллюстрирует типичный тканевой срез правой почки с перевязанным мочеточником у мыши с нокаутом DNAM-1. Фиг. 21(c) представляет собой график, иллюстрирующий результат вычисления площади участка ткани почки, положительного по α-SMA, у каждой из мышей.
[0181] На фиг. 21(a)-21(c) «WT» обозначает результаты, полученные в тестах, в которых использовали мышей дикого типа, тогда как «DNAM-1 KO» обозначает результаты, полученные в тестах, в которых использовали мышей с нокаутом DNAM-1. На фиг. 21(c) «CON» обозначает площадь участка, положительного по α-SMA, в левой почке без обработки. Как результат, подтверждено, что фиброз ткани почки в результате перевязывания мочеточника значительно снижен у мышей с нокаутом DNAM-1 по сравнению с мышами дикого типа.
[0182] Вышеприведенные результаты показывают, что введение антитела против DNAM-1 в живой организм позволяет снижать фиброз почек.
[0183] [Тестовый пример 16]
(Исследование воспалительного энтерита)
Исследование воспалительного энтерита проводили с использованием мышей с нокаутом гена DNAM-1 вместо введения антитела против DNAM-1. Мышей дикого типа использовали в качестве эталона. В тесте использовали модель индуцированного декстрансульфатом (DSS) колита на мышах.
[0184] Сначала мышей с нокаутом DNAM-1 (n=5) и мышей дикого типа (n=5) вскармливали и приучали с 3 суток перед инициацией теста. На этом этапе мышам давали простую воду. После инициации теста мышей вскармливали 2% водным раствором DSS вместо воды и измеряли изменения массы мышей. Мышей умерщвляли на девятые сутки после инициации теста. У мышей брали толстую кишку и измеряли ее длину.
[0185] На фиг. 22 представлен график, иллюстрирующий результаты измерения массы контрольных мышей дикого типа (WT) и мышей с нокаутом DNAM-1 (KO). На фиг. 22 символ «*» обозначает, что между ними имело место значимое различие с уровнем значимости меньше 5%. По горизонтальной оси представлено время (сутки), прошедшее с инициации теста. Как результат, подтверждено, что снижение массы в результате воспалительного энтерита значительно снижено у мыши с нокаутом DNAM-1 по сравнению с мышью дикого типа.
[0186] Фиг. 23(a) представляет собой фотографию толстой кишки мышей с нокаутом DNAM-1, взятой на девятые сутки после инициации теста. Фиг. 23(b) представляет собой фотографию толстой кишки контрольных мышей дикого типа, взятой на девятые сутки после инициации теста. На фиг. 23(c) в графической форме представлены численные результаты, приведенные на фиг. 23(a) и 23(b). На фиг. 23(a)-23(c) «WT» обозначает результаты, полученные в тесте, в котором использовали мышей дикого типа, тогда как «DNAM-1 KO» обозначает результаты, полученные в тесте, в котором использовали мышей с нокаутом DNAM-1; и «наивные» обозначает результаты, полученные в тесте, в котором мышам давали воду вместо 2% водного раствора DSS. На фиг. 23(c) «N.S.» обозначает, что между ними значимое различие отсутствовало. Как результат, подтверждено, что уменьшение длины кишечника в результате воспалительного энтерита значительно снижено у мышей с нокаутом DNAM-1 по сравнению с мышами дикого типа.
[0187] Вышеприведенные результаты показывают, что введение антитела против DNAM-1 в живой организм может снижать симптомы воспалительного энтерита.
Промышленная применимость
[0188] В соответствии с настоящим изобретением можно предоставлять технологию снижения иммунного ответа у человека.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ЮНИВЕРСИТИ ОФ ЦУКУБА
<120>  АКТИВАТОР РЕГУЛЯТОРНЫХ T-КЛЕТОК И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
<130>  PC-23378
<150>  JP2016-084170
<151>  2016-04-20
<160>  21
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  CDR1 тяжелой цепи mAb номер 1
<400>  1
Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr
1               5
<210>  2
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  CDR2 тяжелой цепи mAb номер 1
<400>  2
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn
1               5
<210>  3
<211>  2
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  CDR3 тяжелой цепи mAb номер 1
<400>  3
Ala Arg
1
<210>  4
<211>  6
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  CDR1 легкой цепи mAb номер 1
<400>  4
Gln Ser Val Ser Asn Asp
1               5
<210>  5
<211>  3
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  CDR2 легкой цепи mAb номер 1
<400>  5
Tyr Ala Ser
1
<210>  6
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  CDR3 легкой цепи mAb номер 1
<400>  6
Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro
1               5
<210>  7
<211>  122
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область тяжелой цепи mAb номер 1
<400>  7
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
1               5                   10                  15
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
20                  25                  30
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro
35                  40                  45
Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
50                  55                  60
Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Cys Ala Arg Ala Tyr Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Tyr Phe Asp Val
85                  90                  95
Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro
100                 105                 110
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Lys
115                 120
<210>  8
<211>  108
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область легкой цепи mAb номер 1
<400>  8
Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val
1               5                   10                  15
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
20                  25                  30
Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser
35                  40                  45
Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu
50                  55                  60
Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr
65                  70                  75                  80
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
85                  90                  95
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Thr
100                 105
<210>  9
<211>  126
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область тяжелой цепи mAb номер 2
<400>  9
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
1               5                   10                  15
Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
20                  25                  30
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Pro
35                  40                  45
Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
50                  55                  60
Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Cys Ala Glu Leu Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val
85                  90                  95
Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala
100                 105                 110
Pro Gly Asn Leu Asn Ser Ser Thr Ser Phe Ser Ser Leu Gly
115                 120                 125
<210>  10
<211>  150
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область легкой цепи mAb номер 2
<400>  10
Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Ser
20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg Ser Trp Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Asn His Glu Phe
115                 120                 125
Trp Ile Arg Tyr Val Thr Arg Leu Gln His Ala Trp Tyr Arg Ala Phe
130                 135                 140
Pro Ile Gly Val Asp Glu
145                 150
<210>  11
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область тяжелой цепи mAb № 3
<400>  11
Glu Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Leu
1               5                   10                  15
Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asp
20                  25                  30
Ile Tyr Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly
35                  40                  45
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
50                  55                  60
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Asn
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Tyr Arg Tyr Lys Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
85                  90                  95
Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu
100                 105                 110
Ala Pro Leu
115
<210>  12
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область легкой цепи mAb № 3
<400>  12
Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn
1               5                   10                  15
Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
20                  25                  30
Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp
35                  40                  45
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
50                  55                  60
Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
85                  90                  95
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
100                 105                 110
<210>  13
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область тяжелой цепи mAb № 4
<400>  13
Lys Trp Gly Leu Ser Glu Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
1               5                   10                  15
Thr Asp Tyr Asn Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu
20                  25                  30
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn
35                  40                  45
Gln Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser
50                  55                  60
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
65                  70                  75                  80
Tyr Tyr Cys Ala Gly Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr
85                  90                  95
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
100                 105                 110
Leu Ala Pro Trp Lys
115
<210>  14
<211>  109
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область легкой цепи mAb № 4
<400>  14
Glu Lys Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
20                  25                  30
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
35                  40                  45
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
50                  55                  60
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Trp
65                  70                  75                  80
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
85                  90                  95
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Arg
100                 105
<210>  15
<211>  113
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область тяжелой цепи mAb № 5
<400>  15
Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile
1               5                   10                  15
Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr
20                  25                  30
Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile
35                  40                  45
Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val
50                  55                  60
Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Val Met
65                  70                  75                  80
Ile Thr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
85                  90                  95
Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly
100                 105                 110
Lys
<210>  16
<211>  112
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область легкой цепи mAb № 5
<400>  16
Ser Ala Leu Trp Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu
1               5                   10                  15
Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile
20                  25                  30
Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys
35                  40                  45
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
50                  55                  60
Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
85                  90                  95
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
100                 105                 110
<210>  17
<211>  121
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область тяжелой цепи mAb № 6
<400>  17
Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr
1               5                   10                  15
Ser Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu
20                  25                  30
Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro
35                  40                  45
Ser Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln
50                  55                  60
Phe Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Val Met Ile Thr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp
85                  90                  95
Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro
100                 105                 110
Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Lys
115                 120
<210>  18
<211>  97
<212>  Белок
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область легкой цепи mAb № 6
<400>  18
Arg Ala Ser Gly Asn Ile His Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
1               5                   10                  15
Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala
20                  25                  30
Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr
35                  40                  45
Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr
50                  55                  60
Cys Gln His Phe Trp Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
65                  70                  75                  80
Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro
85                  90                  95
Pro
<210>  19
<211>  379
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область тяжелой цепи mAb номер 1
<400>  19
cagccgctac ttctcagtct ctgtctctca cctgctctgt cactggctac tccatcacca       60
gtggttatta ctggaactgg atccggcagt ttccaggaaa caaactggaa tggatgggct      120
acataagcta cgacggtagc aataactaca acccatctct caaaaatcga atctccatca      180
ctcgtgacac atctaagaac cagtttttcc tgaagttgaa ttctgtgact actgaggaca      240
cagctacata ttactgtgca agggcctact atggtaacta cgtggggtac ttcgatgtct      300
ggggcgcagg gaccacggtc accgtctcct cagccaaaac gacaccccca tcggtctatc      360
cactggcccc tggaaaaaa                                                   379
<210>  20
<211>  339
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  прочие признаки
<223>  вариабельная область легкой цепи mAb номер 1
<400>  20
gttcagcagg agacagggtt accataacct gcaaggccag tcagagtgtg agtaatgatg       60
tagcttggta ccaacagaag ccagggcagt ctcctaaact gctgatatac tatgcatcca      120
atcgctacac tggagtccct gatcgcttca ctggcagtgg atatgggacg gatttcactt      180
tcaccatcag cactgtgcag gctgaagacc tggcagttta tttctgtcag caggattata      240
gctctccgct cacgttcggt gctgggacca agctggagct gaaacgggct gatgctgcac      300
caactgtatc catcttccca ccatccagtg agcagagag                             339
<210>  21
<211>  15
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Линкер scFv
<400>  21
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<---