СРЕДСТВО АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЕ НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА МХА СФАГНУМА
ANTIBACTERIAL AGENT BASED ON SPHAGNUM MOSS EXTRACT

Изделие (экстракт) относится к области медицины, а именно к лекарственным средствам, обладающим антибактериальным действием.
Лечение и рациональная антибактериальная терапия раневых поражений определяется назначением различных лекарственных средств с антимикробным действием. На сегодняшний день фармацевтическая промышленность выпускает большое количество антибактериальных и противогрибковых средств в форме мазей, гелей, порошков (метилурациловая мазь, нистатин, сангвиритрин и т.д.), многие из которых обладают побочными эффектами в виде желудочно-кишечных и аллергических реакций [1]. Поэтому разработка нетоксичных препаратов растительного происхождения, позволяющих мягко обеспечить антибактериальный эффект, не оказывая токсического воздействия, является приоритетной задачей.
Известно использование сфагнового мха в народной медицине в основном качестве перевязочного средства, кроме того, в настоящее время проводятся научные исследования по использованию экстрактов мха сфагнума в качестве ранозаживляющего средства.
Наиболее близким к предлагаемому является средство, полученное в лаборатории ГОУ ВПО СибГМУ РОСЗДРАВА, представляющее 20% водно-этанольный экстракт Sphagnum fuscum. Средство получали методом реперколяции по Н.А. Чулкову. Различают два периода: в пусковой период ежедневно загружают по одному перколятору и слива готового продукта не производят.В каждый перколятор загружают равное количество сырья, которое предварительно заливают равным количеством чистого экстрагента (для 1-го перколятора) или извлечением, полученным из предыдущего перколятора (для 2-го и всех последующих перколяторов). Набухшее сырье загружают в первый перколятор, заливают экстрагентом до «зеркала» и оставляют на сутки. На следующий день из первого перколятора сливают извлечения в два приема: первое извлечение - в объеме, равном массе сырья, загруженного в перколятор, используемое для замачивания сырья для второго перколятора, и второе извлечение - в двойном объеме по отношению к массе сырья, используемое для настаивания сырья во втором перколяторе. В это время в первый перколятор подают свежий экстрагент в количестве, равном сумме извлечений. На третий день из второго перколятора собирают также два извлечения: для работы с сырьем, предназначенным для загрузки в третий перколятор. Во второй перколятор подают вытяжки из первого перколятора, а в него снова подают свежий экстрагент. Далее процесс проводится аналогично. Через сутки после загрузки последнего перколятора начинается рабочий период. В это время из последнего перколятора сливают первую порцию готового продукта в объеме, равном массе сырья в этом перколяторе. Одновременно из первого перколятора сливают все вытяжки и подают их во второй перколятор. Сырье в первом перколяторе полностью истощено. Свежий экстрагент подают во второй перколятор, который теперь становится хвостовым. Первый перколятор становится головным. Сбор готового продукта производится ежедневно из головного перколятора, которым является каждый, вновь загруженный сырьем [2].
Прототип имеет следующие недостатки:
• метод, используемый для экстракции более продолжителен, чем метод реперколяции по Босину;
• этиловый спирт является более дорогостоящим экстрагентом растительного сырья по сравнению с бензиловым спиртом.
Новая техническая задача - расширить ассортимент средств на основе растительного сырья, обладающих антибактериальным действием.
Поставленная задача решена следующим образом - антибактериальное средство на основе сфагнового мха, содержащее большое количество бензойной кислоты и ее эфиров, обладающих антисептическим действием.
Средство получали методом реперколяции по Босину. Экстракцию проводили методом реперколяции в 3 перколяторах. Для этого измельченное сырье помещают в перколятор 1, заливают бензиловым спиртом и оставляют на 12 ч. После 12 часов настаивания из перколятора 1 сливают извлечение и заливают им готовое сырье в перколяторе 2 с одновременной подачей в перколятор 1 свежего экстрагента. После 12 часов настаивания из перколяторов 1 и 2 сливают извлечения. При этом перколятор 1 пополняется свежим экстрагентом, а перколятор 2 - извлечением из перколятора 1, перколятор 3 - извлечением из перколятора 2. После 12 часов сливают готовое извлечение из последнего перколятора и объединяют с извлечениями, полученными в рабочий период. Готовый жидкий экстракт фильтруют через бумажный фильтр.
Качественный состав продукта исследовался на газовом хроматографе с масс-спектрометрическим и пламенно-ионизационным детекторами MSClarus 500. Газохроматографический анализ выполняли на капиллярной колонке длиной 60 м внутренним диаметром 0,32 мм SGE-Wax в режиме программирования температуры, газ-носитель гелий. Управление прибором осуществлялось с использованием программы TurboMass. Идентификацию спектров проводили с помощью библиотеки масс-спектров NIST'14.
Информация, характеризующая химический состав сфагнового экстракта мха, полученная в результате исследования представлена в таблице.
Оценку роста микроорганизмов производили с помощью двух методов: диско-диффузионный и фотометрический. В экспериментах использовались штаммы микроорганизмов: S. aureus АТСС 25923, P. Aeruginosa 27853 АТСС, S. Enteritidis 495, С.Albicans 24433 АТСС.
Диско-диффузионный метод заключался в следующем: в стерильные чашки Петри диаметром 10 см наливали по 20 мл расплавленного питательного агара. Для получения равномерного бактериального газона на поверхность агара в чашку добавляли по 0,2 мл взвеси испытуемой культуры. Жидкость равномерно распределяли по поверхности чашки. Избыток жидкости отсасывали пастеровской пипеткой, затем подсушивали агар в термостате при закрытой чашке.
На поверхность засеянного агара на расстоянии 2 см от края чашки и на ровном расстоянии друг от друга раскладывали пинцетом по одному бумажные диски, пропитанные экстрактом. На дне чашки подписывали название экстракта, которым пропитан диск. Чашки помещали в термостат на 24 часа. Для учета результатов определяли диаметр зоны задержки роста микроорганизма вокруг дисков, используя миллиметровую линейку, циркуль, миллиметровую бумагу, или же специальный измеритель [3].
Отсутствие задержки роста указывают на резистентность исследуемого микроорганизма к данному экстракту. Зоны, диаметр которых не превышают 15 мм, свидетельствуют о слабой чувствительности к экстракту. Зоны от 15 до 25 мм встречаются у чувствительных микроорганизмов.
В результате проведенного эксперимента выявлено, что бензиловый экстракт сфагнового мха, наиболее чувствителен к S. aureus диаметр задержки роста составил 21 мм и С.albicans 23 мм.
Для выявления антилизоцимной активности (АЛА) микроорганизмов использовали фотометрический метод О.В. Бухарина. Биомассу исследуемых культур стандартной бактериологической петлей засевали в 3 мл жидкой питательной среды. Посевы факультативных анаэробов культивировали в термостате при 37°С в течении 24 часов. Затем производили измерения оптической плотности (Do) бульонной культуры против бульона (Y) на фотометре Multiskan FC, длина волны 450 нм. Супернатант отделяли от микробных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 минут. В качестве тест-штамма для определения АЛА, использовали ацетонированную агарную культуру Micrococcus luteus АТСС 158307. Культуру растворяли в физиологическом растворе, доводили до оптической плотности тест-штамма до 0,300 (0,28-0,32). На 1/5 М фосфатном буфере (рН=6,2) готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл.
Супернатант исследуемых микроорганизмов объемом 0,9 мл смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали 60-120 мин при 37°С. Затем 50 мкл смеси супернатанта с лизоцимом помещали в полистеролловый планшет по вертикальным рядам. Верхняя и нижняя лунки - контроли: смесь питательного бульона и лизоцима. В лунки каждого ряда планшета вносили по 200 мкл суспензии микрококка многоканальной пипеткой. Замер оптической плотности проводи через 30 и 150 секунд после внесения в лунки микрококка [4, 5].
Из представленных данных, экстракт сфагнового мха способствует увеличению АЛА у S. aureus, из этого следует что, несмотря на подавление роста микроорганизма данный экстракт нельзя применять по отношению к нему, так как он повышает устойчивость микроорганизма к одному из факторов местной защиты организма человека и животных. По отношению к P. aeruginosa и С. albicans экстракт способствует снижению АЛА на 1,08 мкг/мл*OD и 1,39 мкг/мл*OD.
Экспериментальные исследования гемолитической активности микроорганизмов проводились с использованием стандартного штамма: S. aureus АТСС 25923, P. Aeruginosa 27853 АТСС, S. Enteritidis 495, С. Albicans 24433 АТСС. Исходный уровень гемолитической активности (ГА) определяли фотоэлектроколориметрически по способности супернатантов, изучаемых микроорганизмов лизировать эритроциты человека 0 (I) группы Rh (+) [6]. Все растворы и питательные среды готовили на деионизированной воде. Изучение влияния экстракта мха на ГА бактерий проводили на Шедлер бульоне.
Бактерии для эксперимента выращивали в течение 24 ч на скошенном мясопептонном агаре при 37°С, смывали физиологическим раствором, полученную микробную взвесь титровали до оптической плотности 0,500-0,510 опт. ед.
В 2 мл стерильного бульона Шедлер вносили 0,2 мл экстракта, 0,2 мл 5% взвеси эритроцитов человека 0 (I) группы Rh (+) в физиологическом растворе и 0,1 мл микробной взвеси. В контрольные пробирки вместо микробной взвеси вносили 0,1 мл стерильного физиологического раствора. Посевы культивировали при 37°С в течение 2 часов и центрифугировали 15 мин при 3000 g. Оптическую плотность над осадочной жидкости измеряли относительно воды (λ=543 нм). ГА выражали в %.
Снижение гемолитической активности наблюдается у S. aureus на 6,4%; у P. aeruginosa 3,9%. На гемолитическую активность по отношению к S. enteritidis, экстракт не влияет.
Источники информации
1. Галимзянов Ф.В. Местное лечение и рациональная антибактериальная терапия инфицированных ран. Учебное пособие. - Екатеринбург, 2013. - 75 с.
2. Пономарев В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья. - М.: Медицина, 1976. - 202 с.
3. МУК 4.2.1890-04 Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам.
4. Бухарин О.В., Валышев А.В., Елагина Н.Н. и др. Фотометрическое определение антилизоцимной активности микроорганизмов // ЖМЭИ. - 1997. - №4. - С. 117-120.
5. Бухарин О.В., Васильев Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. - Томск: Изд-во Томского университета, 1974. - С. 207.
6. Бухарин О.В., Стадников А.А., Усвяцов Б.Я., Ханина Е.А. Особенности взаимодействия бактерий с эритроцитами и их роль в развитии инфекционной анемии // Журн. микробиол. 2006. №4. - С. 25-28.