Способ одновременного получения деминерализованного дентина и минерально-органического компонента из зубов
METHOD FOR SIMULTANEOUS PRODUCTION OF DEMINERALIZED DENTIN AND MINERAL-ORGANIC COMPONENT FROM TEETH

Изобретение относится к медицине, биотехнологиям, а именно - к изготовлению биоматериалов для регенеративной медицины - одновременному получению деминерализованного дентина и минерально-органического компонента из зубов человека и животных.
Известен способ изготовления костно-протезного материала, в котором получают предшественники трикальцийфосфатных (TCP) частиц; проводят их многоэтапное спекание при различных температурных режимах с получением ансамблей TCP-частиц диаметром в заданном диапазоне от 5 до 400 мкм [1]. Недостатком способа является интенсивная термическая обработка материала с потерей или резким снижением в процессе производства его остеоиндуктивных и остеокондуктивных свойств, связанных с нарушением его структуры.
Известен способ получения биоматериала на основе подложки из фосфата кальция, пропитанного раствором, по меньшей мере, одного коагулянта, представляющего собой производное кальция.[2]. Недостатком способа является отсутствие в материале органического матрикса и коллагеновых структур, влияющих на его регенеративные свойства.
Известен способ получения минерально-органического компонента костной ткани, заключающийся в том, что в качестве сырья используют солевой раствор, являющийся отходом производства костных трансплантатов, который фильтруют через бумажный фильтр, нейтрализуют, доводя его рН до 7,2-7,4; образующийся после нейтрализации осадок отделяют центрифугированием, промывают дистиллированной водой, после чего снова центрифугируют и промывают водой и фосфатным буфером с рН 7,4±0,5 в течение 30 минут. После трехкратного промывания водой полученный материал замораживают при температуре - 50°С, лиофилизируют и разделяют на две фракции в соотношении 1:1; одну из фракций перемалывают на шаровой мельнице; обе фракции равномерно перемешивают, расфасовывают и стерилизуют материал радиационным способом [3].
Недостатком технологии является то, что она не предполагает использования в качестве материалов зубов; забора их как у живых людей (животных), так и кадаверов. Технология не предполагает получения одновременно и деминерализованного дентина и минерально-органического компонента; отсутствуют первичная стерилизация будущих материалов с помощью ультразвука, промежуточные этапы контроля материала и эффективности деминерализации с помощью оптического метода.
Целью изобретения является разработка способа одновременного получения деминерализованного дентина и минерально-органического компонента из зубов.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Эта цель достигается тем, что здоровые зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям или донорские кадаверные зубы человека или животных обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% перекисью водорода; убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением; подвергают материал низкочастотной ультразвуковой обработке с частотой 24-40 кГц; перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, которое имеет значение от 8 до 20, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, которое имеет значение от 2,5 до 5; деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты; после деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, которое принимает значение от 0,5 до 2, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, которое принимает значение от 0,5 до 1,5; далее солевой раствор используют для получения минерально-органического компонента, а деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и стерилизуют радиационным способом.
Предлагаемый способ предполагает использование в качестве материалов зубов. Это могут быть здоровые зубы человека и животных, в том числе удаленные по ортодонтическим показаниям. Данный материал достаточно распространен и может быть использован для заготовки биоматериалов. Кадаверный материал также может быть забран у трупов-доноров или у животных после их забоя, например, в процессе экспериментального исследования.
Способ предполагает получения одновременно и деминерализованного дентина и минерально-органического компонента. При этом низкочастотная ультразвуковая обработка с частотой 24-40 кГц позволяет выполнить первичную стерилизацию будущих биоматериалов. Этапный контроль эффективности деминерализации материала с помощью оптического метода исследования позволяет судить о возможности продолжения дальнейшего эффективного производства минерально-органического компонента из солевого раствора и деминерализованного дентина. Спектральная оценка поверхностей дентина до и после деминерализации стандартизирует характеристики получаемого продукта.
Предлагаемый способ одновременного безотходного получения деминерализованного дентинного материала и минерально-органического компонента дентина значительно оптимизирует производственный цикл, снижает время, расход сырья и трудозатраты, позволяя получить продукты, обладающие оптимальными остеоиндуктивными и остеокондуктивными свойствами для успешной регенерации костной ткани.
Способ реализуется следующим образом. В качестве сырья используют здоровые зубы, удаленные по ортодонтическим показаниям или донорские кадаверные зубы человека или животных. Материал обрабатывают 3% раствором гипохлорита натрия, 3% перекисью водорода. Убирают эмаль, цемент, обнажают околопульпарный дентин с помощью алмазного бора с водяным охлаждением. Первично стерилизуют материал, осуществляя его низкочастотную ультразвуковую обработку с частотой 24-40 кГц.
-1
-1
-1
-1
Перед деминерализацией проводят контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, которое имеет значение от 8 до 20, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, которое имеет значение от 2,5 до 5.
-1
-1
-1
-1
Деминерализуют материал в 2,4Н-4,8Н растворе соляной кислоты. После деминерализации оценивают ее эффективность, исследуя поверхности материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния, определяя отношение интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, которое принимает значение от 0,5 до 2, и отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, которое принимает значение от 0,5 до 1,5.
Солевой раствор, полученный после деминерализации дентина фильтруют через бумажный фильтр, нейтрализуют, доводя его рН до 7,2-7,4. Образующийся после нейтрализации осадок отделяют центрифугированием, промывают дистиллированной водой, после чего снова центрифугируют и промывают водой и фосфатным буфером с рН 7,4±0,5 в течение 30 минут. После трехкратного промывания водой полученный материал замораживают при температуре - 50°С, лиофилизируют, расфасовывают и вторично стерилизуют радиационным способом.
Деминерализованный дентин промывают в апирогенной воде, замораживают при температуре -60°С, лиофилизируют, расфасовывают, упаковывают и вторично стерилизуют радиационным способом.
Способ иллюстрируется клиническими примерами.
Пример 1. Пациент М, 29 лет обратился в клинику с жалобами на «прикусывание» слизистой оболочки полости рта, образование язв в области зуба мудрости 1.8. Диагноз: дистопированный зуб мудрости (код по МКБ-10 - К07.3), принято решение об его удалении. Пациенту была проведена медикаментозная обработка полости рта и места инъекции анестезии и удаления. Интраоперационно полученный утильный материал - дистопированный здоровый зуб мудрости был соответствующим образом транспортирован на производство костных биоимплантатов. По предложенному способу он был использован для изготовления деминерализованного дентина и минерально-органического компонента костной ткани. При этом первичную стерилизацию материала осуществляли его низкочастотной ультразвуковой обработкой с частотой 24 кГц.
-1
-1
-1
-1
Перед деминерализацией контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния выявил значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, равное 20, а отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, равное 5. Деминерализацию выполняли в 2,4Н растворе соляной кислоты.
-1
-1
-1
-1
После деминерализации значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см составило 0,5, и значение отношения интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см было равно 0,5. Это свидетельствовало об эффективности обработки и деминерализации дентина и получении соответствующего солевого раствора. Далее по разработанному способу были получены деминерализованный дентин и минерально-органический компонент костной ткани из солевого раствора.
Пример 2. У трупа скоропостижно скончавшегося здорового мужчины, 29 лет, в рамках забора тканей и органов для трансплантации выполнен забор первых и вторых моляров. По предложенному способу они были использованы для изготовления деминерализованного дентина и минерально-органического компонента костной ткани. При этом первичную стерилизацию материала осуществляли его низкочастотной ультразвуковой обработкой с частотой 40 кГц.
-1
-1
-1
-1
Перед деминерализацией контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния выявил значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, равное 8, а отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, равное 2,5. Деминерализацию выполняли в 4,8Н растворе соляной кислоты.
-1
-1
-1
-1
После деминерализации значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см составило 2, и значение отношения интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см было равно 1,5. Это свидетельствовало об эффективности обработки и деминерализации дентина и получении соответствующего солевого раствора. Далее по разработанному способу были получены деминерализованный дентин и минерально-органический компонент из солевого раствора.
-1
-1
-1
-1
Пример 3. При доклиническом экспериментальном исследовании на свиньях выполнено удаление у живых животных под наркозом малых коренных зубов. По предложенному способу они были использованы для изготовления деминерализованного дентина и минерально-органического компонента костной ткани. При этом первичную стерилизацию материала осуществляли его низкочастотной ультразвуковой обработкой с частотой 24 кГц. Перед деминерализацией контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния выявил значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, равное 20, а отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, равное 5. Деминерализацию выполняли в 2,4Н растворе соляной кислоты.
-1
-1
-1
-1
После деминерализации значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см составило 0,5, и значение отношения интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см было равно 0,5. Это свидетельствовало об эффективности обработки и деминерализации дентина и получении соответствующего солевого раствора. Далее по разработанному способу были получены деминерализованный дентин и минерально-органический компонент костной ткани из солевого раствора.
Пример 4. При доклиническом экспериментальном исследовании на свиньях после выполнения гинекологических операций животных выводили из эксперимента на сроках 2,4 и 6 недель после операции. После забоя у животных были забраны малые коренные зубы. По предложенному способу они были использованы для изготовления деминерализованного дентина и минерально-органического компонента костной ткани. При этом первичную стерилизацию материала осуществляли его низкочастотной ультразвуковой обработкой с частотой 40 кГц.
-1
-1
-1
-1
Перед деминерализацией контроль состояния поверхностей материала с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния выявил значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, равное 8, а отношение интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см, равное 2,5. Деминерализацию выполняли в 4,8Н растворе соляной кислоты.
-1
-1
-1
-1
После деминерализации значение отношения интенсивности линии фосфат-иона 960 см к интенсивности линии Амида I 1660 см составило 2, и значение отношения интенсивности линии карбонат-иона 1070 см к интенсивности линии Амида I 1660 см было равно 1,5. Это свидетельствовало об эффективности обработки и деминерализации дентина и получении соответствующего солевого раствора. Далее по разработанному способу были получены деминерализованный дентин и минерально-органический компонент из солевого раствора.
Предлагаемый способ может быть использован в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии, регенеративной хирургии опорных тканей.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Патент РФ 2010154147/15, 06.05.2009. Костно-протезный материал и способ его изготовления // Патент России №2457000. 2012. / Такамаса С., Рюити М.
2. Патент РФ 2011102372/15, 22.06.2009. Биоматериалы на основе фосфата кальция // Патент России №2 501 571. 2013. / Балаге Т., Роше Н., Карль Ж.
3. Патент РФ на изобретение №2704114 от 24.10.2019 / Способ получения минерально-органического компонента костной ткани // Волова Л.Т., Писарева Е.В., Власов М.Ю., Долгушкин Д.А., Максименко Н.А.