УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ТОКСИЧНОСТИ ИЛИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ИССЛЕДУЕМОГО РАСТВОРА

Устройство для проведения биотестирования токсичности или биологической активности исследуемого раствора.
Область изобретения
Полезная модель относится к устройству для проведения биотестирования. В частности, устройство может быть использовано при определении биологической активности или токсичности компонентов, входящих в состав воды, лекарственных препаратов, продуктов питания или биологических активных добавок (БАД) к пище. Устройство содержит комплекс аппаратно-программных средств на основе компьютера, микроскопа и дополнительных узлов, повышающих воспроизводимость результатов при массовом скрининге исследуемых веществ.
Уровень техники
Известны способы биотестирования в которых в качестве тест-организмов применяют плоских червей - планарий [1, 2, 3].
Для определения воздействия внешней среды на гидробионты измеряют параметры, характеризующие: выживаемость, поведенческие характеристики, морфологические характеристики. Одним из морфологических параметров является скорость регенерации гидробионтов.
Известны методические указания по экспериментальному определению генетической опасности и токсичности отходов, поступающих в окружающую среду [4], основанные на определении выживаемости гидробионтов (планарий) и определении темпов регенерации после декапитации животных (отделения головной части тела), в которых в качестве устройств для декапитации, предлагается использовать чашки Петри.
Известно устройство, с помощью которого изучают поведенческие характеристики тест-организмов [5]. С помощью устройства проводят предварительное обучение тест-организмов, подавая на них световые и токовые раздражители. Устройство позволяет осуществлять измерение скорости перемещения планарий и сравнение скоростей перемещения разных групп регенерирующих планарий, например, регенерирующих в чистой среде и в среде, содержащей исследуемое вещество. Однако методики измерения поведенческих
реакций, в основном, обладают низкой точностью и способны регистрировать лишь высокие концентрации исследуемых растворов.
Известны более совершенные устройства и способы диагностики, связанные с регистрацией динамики регенерации планарий и основанные на способе прижизненной морфометрии регенерации планарий [6]. Прижизненная морфометрия основана на регистрации фотоконтраста между старой (т.е. пигментированной) и новой прозрачной частью тела (бластемой) планарий.
Измерение регенерируемой части тела планарий - бластемы в процессе регенерации проводят либо путем прямого измерения линейных размеров планарий с помощью окуляр-микрометра [4], или размеры бластемы планарий определяют по их фотографиям, либо процесс измерения размеров и/или площадей бластемы и планарий осуществляют с помощью компьютерных методов. Прижизненное исследование позволяет работать с одной и той же группой животных в течение всего процесса регенерации, что повышает качество измерения.
Известно устройство для компьютерного метода измерения морфологических параметров тела планарий с помощью дигитайзера [2]. Более эффективно устройство для измерения морфологических параметров тела планарий, содержащее видеокамеру, подключенную к компьютеру [7, 8]. Экспериментальная установка содержит смонтированную на окуляре бинокулярного микроскопа МБС-2 видеокамеру VAT 127-LH, и подключенную к компьютеру IBM PC 486 AT [7].
К одному из недостатков рассмотренных устройств, в том числе и устройств компьютерной морфометрии, можно отнести то, что декапитацию также проводят в чашках Петри, что не позволяет стандартизовать процедуру декапитации планарий и повысить воспроизводимость процесса декапитации.
Известно [9], что декапитацию проводят под бинокулярным микроскопом при помощи глазного скальпеля. Операцию по перерезке планарий проводят в разных областях тела планарий, перерезая тело впереди или позади глотки планарий [10]. В методических указаниях предлагается проводить декапитацию на уровне глаз [4].
Известные устройства для декапитации выполнены на основе чашки Петри, заполненной слоем воды, в котором размещены планарий. Планарий свободно перемещаются по дну чашки Петри и меняют положение своего тела. При декапитации оператор выбирает особь планарий и ориентируют ее положение в горизонтальной плоскости с помощью вращения чашки Петри с размещенными в ней планариями. При этом оператор находит такое положение чашки Петри, в котором выбранная особь планарий занимает удобное положение для декапитации.
Планарии не обладают жестким скелетом и подвижны в растворе, поэтому для ограничения их активности перед началом декапитации снижают температуру окружающей среды (раствора) в чашке Петри, в которой находятся планарии, погружая плашку, с размещенными планариями в раствор со льдом. Охлаждение планарии происходит в течение достаточно длительного периода времени. За это время планарии, в исходном состоянии находящиеся в развернутом и плоском виде, успевают сжаться и сгруппировать свое тело, что значительно затрудняет определение места, в котором должна проводиться декапитация. Это, в свою очередь, приводит к большим ошибкам в определении места декапитации. Планарии с отличными друг от друга положениями декапитации в последующем регенерируют с разной скоростью, что, в свою очередь, приводит к ошибкам при определении параметров регенерации и, следовательно, к ошибкам в диагностике.
Известно устройство для декапитации [9], содержащее бумажный фильтр, размещенный в чашке Петри. На поверхности фильтра предварительно размещают планарий. Перед декапитацией устройство охлаждают на льду для частичного обездвижения планарий. Однако нанесение планарий на фильтр не гарантирует того, что планарии не будут сжиматься при воздействии низкой температуры.
Известно, что для надежного проведения эксперимента и получения воспроизводимых результатов необходимо использовать группу планарий в количестве 25-30 особей. Причем, как и все исследования на гидробионтах, эксперименты необходимо проводить в 3-6 повторностях [10]. Проведение декапитации такого количества планарий является достаточно трудоемкой и длительной процедурой.
Техническая задача заключается в повышении эффективности устройства для биотестирования и экспресс-оценки химических и биологически активных растворов при массовых исследованиях.
Следующей технической задачей является создание блока декапитации, обеспечивающего более высокую воспроизводимость процесса декапитации гидробионтов.
Другой технической задачей является создание устройства, содержащего новый блок декапитации, в котором процесс декапитации гидробионтов проходит в условиях, обеспечивающих самоориентацию планарий в положение удобное для декапитации.
Сущность технического решения
Техническая задача решается тем, что разработано устройство для биотестирования токсичности или биологической активности исследуемого раствора с помощью планарий. Устройство включает предметный столик, оптический микроскоп со встроенной видеокамерой, узел преобразования сигналов, компьютер, а также блок декапитации, содержащий оптический элемент и кювету декапитации, выполненную в виде плоской емкости с раствором для размещения планарий, причем блок декапитации дополнительно содержит узел декапитации и блок управления. Узел декапитации кроме кюветы декапитации дополнительно содержит основание, охлаждаемый элемент, охлаждающий узел. Кювета декапитации размещена на поверхности основания, в корпусе которого размещен источник света и охлаждаемый элемент, который выполнен с возможностью вертикального перемещения между рабочей поверхностью охлаждающего узла и задней поверхностью кюветы декапитации. Входы источника света и охлаждающего узла, подключены к выходам блока управления, входы которого подключены к пульту управления и/или к компьютеру системы, где блок управления дополнительно снабжен источником питания.
Другим аспектом полезной модели является то, что кювета декапитации выполнена в виде планарного элемента, а общий жидкостной объем разделен на три последовательно связанных друг с другом объема глубиной от 0,5 до 3,0 мм, расположенных вдоль центральной оси узла декапитации, выполненных в виде зоны приема, зоны ориентирования и зоны декапитации, где зона ориентирования выполнена в виде канала шириной от 3 до 5 мм. Причем жидкостной выход зоны приема связан с жидкостным входом зоны ориентирования, жидкостной выход которой связан с жидкостным входом зоны декапитации, где зона приема выполнена с возможностью освещения или затемнения, а нижняя поверхность кюветы декапитации, размещенная под зоной декапитации, выполнена с возможностью охлаждения за счет охлаждаемого элемента.
Следующим аспектом полезной модели является то, что кювета декапитации дополнительно содержит верхнюю крышку с возможностью ее горизонтального перемещения над рабочей поверхностью узла декапитации и открывания приемной зоны или зоны декапитации с возможностью ввода и/или вывода растворов и планарии. Причем зона приема выполнена в виде плоских жидкостных объемов, поперечное сечение которых представляет круг, прямоугольник, квадрат, треугольник, многоугольник, эллипс.
Другой аспект полезной модели связан с тем, что оптическая ось источника света, размещенного в основании блока декапитации, совмещена с зоной приема планарий. Источник света формирует световой поток в зоне приема планарий в диапазоне от 300 до 800 нм и интенсивностью от 200 до 2000 люмен.
Следующим аспектом полезной модели является то, что для охлаждения зоны декапитации, узел декапитации снабжен прижимным рычагом для перемещения охлаждаемого элемента между задней поверхностью кюветы декапитации и рабочей поверхностью узла охлаждения. Узел охлаждения выполнен на основе элемента Пельтье или содержит каналы для воздушного или жидкостного охлаждающего потока с возможностью снижения температуры охлаждаемого элемента до значения от -4 до +8°С.
Другим аспектом устройства является то, что материал кюветы декапитации выбирают из стекла и полимера. Причем полимеры выбирают из группы, состоящей из поликарбоната, полиметилметакрилата, При этом толщина кюветы декапитации составляет от 1,0 до 5 мм.
Перечень фигур
Фиг.1. Блок схема устройства для проведения биотестирования.
Фиг.2. Узел декапитации в разрезе. Источник света освещает кювету снизу.
Фиг.3. Вид сверху узла декапитации.
Фиг.4. Внешний вид кюветы декапитации
Описание полезной модели
На фиг.1 приведена блок схема устройства для биотестирования токсичности или биологической активности исследуемого раствора с помощью планарий, с помощью компьютерного метода измерения морфологических параметров тела планарий. В состав устройства входит контейнер 11 для выращивания планарий 1, стаканы 12 с исследуемыми растворами, в которые помещают декапитированные планарий 2, предметный столик 16 на котором размещена чашка Петри 42 с регенерированной планарией 3, микроскоп совмещенный с видеокамерой 17, блок согласования сигналов 18, компьютер 19, дисплей 20 и блок декапитации 10, в состав которого входит узел декапитации 13, оптический элемент 14, блок управления 15. Оптический элемент 14 может быть выполнен на основе бинокулярного микроскопа. Блок управления 15 содержит интерфейс 28 содержащий вход для подключения блока декапитации 10 к компьютеру 19, а также подключен ко входу встроенной или выносной клавиатуры
27 для управления включением источника света 23 и управления узлом охлаждения 25, входящего в узел декапитации 13.
На фиг.2 приведено изображение сечения узла декапитации 13, входящего в состав блока декапитации 10. Узел декапитации 13 содержит: основание 21, кювету декапитации 22, источник света 23, охлаждаемый элемент 24, узел охлаждения 25, радиатор 26.
На фиг.3 приведен вид сверху узла декапитации 13, на котором показано расположение кюветы декапитации 22, которая размещена на рабочей поверхности 29 основания 21 и прижата к основанию с помощью прижимов 30. Упоры 31-34 служат для ограничения перемещения крышки 35 в горизонтальном направлении (см. фиг.2).
На фиг.4 приведен вид рабочей поверхности 36 кюветы декапитации. Конструкция кюветы декапитации 22, в которой осуществляется декапитация планарии, содержит последовательно связанные друг с другом три жидкостные зоны: приемную зону 37, в которой размещают планарию 1, предназначенную к декапитации, зону ориентирования положения планарии 38 и зону декапитации 39. Причем жидкостной выход приемной зоны 37 соединен с жидкостным входом зоны ориентации 38, выход которой соединен со входом зоны декапитации 39, таким образом три последовательно связанных друг с другом объема глубиной от 0,5 до 3,0 мм, расположенных вдоль центральной оси кюветы декапитации. При этом зона приема выполнена с возможностью освещения или затемнения, а нижняя поверхность кюветы декапитации, размещенная под зоной декапитации, выполнена с возможностью охлаждения за счет охлаждаемого элемента. Кювета декапитации выполнена с возможностью ввода и/или вывода растворов и ввода и/или вывода планарий. С этой целью кювета декапитации дополнительно содержит верхнюю крышку с возможностью ее горизонтального перемещения над рабочей поверхностью кюветы декапитации и возможностью открывания приемной зоны или зоны декапитации.
Устройство для биотестирования токсичности или биологической активности исследуемого раствора с помощью планарий работает следующим образом. Планарии 1 содержат в контейнерах 11 с объемом 3-5 литров при температуре культуральной воды от 19 до 20°С. Культуральная вода представляет собой смесь дистиллированной и водопроводной воды в соотношении 2:1. Средой содержания планарий может быть вода, подвергнутая воздействию физических факторов, в том
числе магнитных полей, электромагнитных полей и излучений, световых излучений, звуковых воздействий, радиационного излучения или их комбинаций.
Для диагностики используют планарии после 5-8-дневного голодания, более предпочтительно после 7-дневного голодания. Планарии 1 отбирают из контейнера 11 и помещают в приемную зону 37 кюветы декапитации 22. С помощью крышки 35 закрывают приемную зону 37 и зону ориентирования 38 от влияния внешнего освещения. Планария успокаивается, после чего оператор включает источник света 23. При этом световое воздействие в зоне приема осуществляют световым потоком в диапазоне от 300 до 800 нм и интенсивностью от 200 до 2000 люмен.
Планария покидает освещенный участок зоны 37 кюветы декапитации и через зону ориентирования 38 поступает в зону для декапитации 39. Оператор охлаждает зону декапитации 39, с помощью охлаждаемого элемента 24, который прижимается к задней поверхности кюветы декапитации 41 в зоне декапитации с помощью рычага 40 для перемещения охлаждаемого элемента между задней поверхностью кюветы декапитации и рабочей поверхностью узла охлаждения. Узел охлаждения выполнен на основе элемента Пельтье или содержит каналы для воздушного или жидкостного охлаждающего потока с возможностью снижения температуры охлаждаемого элемента до значения от -4 до +8°С.
Снижение температуры раствора в зоне декапитации 39 относительно окружающей среды происходит до значения от +4 до +15°С. От действия пониженной температуры планария замирает, и оператор, наблюдая через оптический элемент микроскопа 14, точно определяет место декапитации, которое наиболее оптимально проходит по траектории глаз планарии. После окончания декапитации охлаждаемый элемент 24 с помощью рычага 40 возвращается в исходное состояние и прижимается к рабочей поверхности узла охлаждения 25.
Декапитированных планарий 2 размещают в стаканах 12 с исследуемыми жидкостями, в которых происходит процесс их регенерации. В качестве исследуемых растворов могут быть использованы растворы, содержащие химические или биологически активные вещества, входящие в состав лекарственных препаратов, биологически активные добавки к пище, ветеринарные препараты, гомеопатические средства. В качестве исследуемых растворов могут быть использованы вытяжки из пищевых продуктов или добавок к ним, образцов почвы, а также вытяжки из полимерных материалов, косметических товаров, атмосферных загрязнений, вытяжки из растительного сырья. В качестве исследуемого раствора могут быть использованы разные типы воды, в том числе и бутилированной, а также
растворы загрязнителей окружающей среды и их смесей, в том числе промышленные и коммунальные стоки, содержащие нефтепродукты и тяжелые металлы, что позволяет проводить мониторинг экологического состояния окружающей среды.
За счет пролиферации клеток в процессе регенерации планарии происходит рост бластемы. Для определения параметров регенерации, регенерирующих планарий 3 помещают в чашки Петри 42, размещенные на предметном столике 16 микроскопа 17, оснащенного видеокамерой. Аналоговый выход видеокамеры подключен ко входу согласующего узла 18, выход которого связан с компьютером 19. Вместо аналоговой камеры можно использовать цифровую видеокамеру, используя цифровой вход компьютера. Полученное видеоизображение регенерирующей планарии запоминается и передается на дисплей 20 и в базу данных. По изображению на дисплее оператор выбирает наиболее подходящий кадр и сохраняет данные о конкретной планарии, присвоив ей номер. С помощью программного обеспечения оператор определяет величину площади старой (остаточной) и регенерированной (новой) части тела планарии и рассчитывает показатель «критерий регенерации», представляющий собой отношение площади бластемы к общей площади планарии. Критерий регенерации (выражается в процентах) вычисляется по формуле: R=s/S, где s - площадь бластемы, S - площадь всего тела регенерируемой планарии в данный момент времени.
Биотестирование химических и/или биологически активных веществ преимущественно осуществляют с помощью гидробионтов, входящих в группу планарий Dugesia (Girardia) tigrina, Schmidtea mediterranea. Данные анализа сравниваются с данными регенерации планарий, которые помещаются в стакан с чистой водой. Результаты биотестирования получают, анализируя данные расчета показателя «критерий регенерации» от 20 до 30 особей планарий. Далее определяют среднюю величину критерия регенерации в контрольной и диагностируемых группах и делают выводы о токсичности или биологической активности (регенеративной способности) исследуемого раствора.
Данные о результатах исследований заносятся в компьютер 19, что позволяет создавать проблемно-ориентированные банки данных, которые можно использовать при разработке и испытании новых лекарственных средств, биологически активных добавок к пище, а также создавать базы данных для прогнозирования возможных экологических ситуаций.
Представленный на фиг.4 вариант размещения и формы зон в кювете декапитации включает, но не ограничивает других вариантов. Например, приемная зона 37 может быть выполнена в виде круга, прямоугольника, квадрата, треугольника, многоугольника или эллипса. Ширина зоны декапитации 38 может быть равной или превышать ширину зоны ориентирования 39.
Материал кюветы декапитации 22 выбирают из стекла или полимера. Толщина кюветы декапитации составляет от 1,0 до 5 мм. В качестве материала кюветы декапитации предпочтительно использовать полимеры.
Выбор материала кюветы декапитации осуществляют исходя из возможности штамповки или формирования в расплавленном состоянии объемов жидкостных зон на поверхности кюветы декапитации, а также исходя из возможности материала кюветы декапитации выдерживать температурные циклы. Термопластичные пластмассы обеспечивают возможность штамповки и формирования выбранной формы планарного элемента из расплава полимера. Полимеры входят в группу, состоящую из поликарбоната, полиметилметакрилата. Предпочтительно использовать полиметилметакрилат и прозрачный материал кюветы.
Кювета декапитации 22 установлена на рабочую поверхность 29 основания 21, снабженного выступами 32, 34, ограничивающими положение кюветы декапитации 22. Прижим кюветы декапитации 22 к поверхности основания 29 осуществляют с помощью зажимов 30, внешний вид которых приведен на фиг.3. При установке кюветы декапитации 22 оптическая ось 43 источника света 23 находится в приемной зоне 37, а ось 44 охлаждаемого элемента 24 совмещена с зоной декапитации 39.
Особенностью рассматриваемого узла декапитации является то, что в процессе декапитации охлаждается не вся кювета декапитации 22 с размещенной в ней планарией, а только незначительная часть кюветы декапитации, расположенной в зоне 39 декапитации. Причем для обездвижения планарии 1 использовано не длительное воздействие пониженной температуры, а импульсное низкотемпературное воздействие охлаждаемого элемента 24 на зону декапитации 39 кюветы декапитации 22.
При включении источника света 23 и освещении зоны 37 планария, избегая освещения, перемещается в зону ориентирования 38 и перемещается вдоль зоны головой вперед. Ориентация планарии параллельно оси 45 кюветы декапитации 22 способствует повышению точности и воспроизводимости операции по декапитации.
Пример 1. Проверка разброса экспериментальных данных при проведении декапитации планарий на уровне глаз по сравнению с результатом декапитации на других участках головного конца тела планарий
Планарию помещают в описанное выше устройство для декапитации и проводят операцию по удалению переднего конца тела планарий. Операция декапитации проводят под контролем бинокулярного микроскопа глазным скальпелем в нестерильных условиях. Операцию проводят в момент проползания планарий в поле зрения бинокулярного микроскопа, когда она замирает от быстрого охлаждения воды после включения элемента Пелтье.
Преимуществом данного устройства является стабильная остановка планарий в поле зрения микроскопа, что позволяет сделать точный разрез и обеспечить воспроизводимость процедуры отделения головы от тела планарий. Операция проводится в стандартном месте: на уровне глаз планарии.
Важность обеспечения воспроизводимости и точности проведения операции декапитации отражена в результатах эксперимента, представленных в таблице 1.
Как видно из таблицы 1, при проведении операции в «стандартном» (по уровню глаз) и «нестандартном месте», величины критерия регенерации статистически значимым образом (Р<0,02) различались между собой.
За счет точности проведения операции обеспечивается также уменьшение разброса экспериментальных данных. Так, стандартная ошибка среднего арифметического значения (m) для показателя «критерий регенерации» уменьшилась с 0,065 (декапитация в «нестандартном месте», до 0,039 (декапитация на уровне глаз).
Таким образом, данные результаты подчеркивают важность воспроизводимости и точности проведения операции декапитации, которую обеспечивает конструкция узла декапитации.
Таблица 1.
Морфометрические показатели регенерации планарий после декапитации по уровню глаз или при декапитации в «нестандартном месте»
Морфометрические показатели
Статистические показатели
Декапитация на уровне глаз (n=24)
Декапитация в «нестандартном месте» (n=27)
Площадь декапитированных планарий, усл.ед.
М±m
8212,0±276,5
8173,6±365,8
t
0,08
Р
Площадь бластемы,
М±m
99,90±4,2
114,9±7,3
t
1,72
усл.ед.
Р
Критерий регенерации, %
М±т
1,22±0,039
1,41±0,065
t
2,39
Р
<0,02
n - число животных в группе;
М - среднее арифметическое значение;
m - стандартная ошибка среднего арифметического;
t - величина критерия t Фишера-Стьюдента;
Р - показатель уровня значимости различий между контролем и опытом.
Промышленная применимость
Устройство удобно в работе и обеспечивает эффективное и воспроизводимое тестирование исследуемых растворов, содержащих химические или биологически активные вещества. Устройство обеспечивает возможность самоориентации планарий, их выход в зону декапитации в положении, удобном для проведения декапитации, и возможность быстрого обездвиживания планарий за счет охлаждения зоны декапитации.
Литература
1. Тирас Х.П. Морфогенез и способы регенерации планарий. //Журнал общей биологии. - 1986. - Т. 48, №1. - С.103-109.
2. Тирас Х.П., Хачко В.И. Критерии и способы регенерации планарий. //Онтогенез. - 1990. - Т. 21, №6. - С.620-624.
3. Пройнова В.А., Тирас Х.П., Рожнов Г.И. Биотестирование на планариях Dugesia tigrina - возможности и перспективы для гигиены окружающей среды.// В кн.: 2-й съезд токсикологов России. (10-13 ноября 2003 г.). Тезисы докладов. - М. - Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ. - 2003. - С.211-213.
4. Методические основы биотестирования и определения генетической опасности отходов, поступающих в окружающую среду. Методические указания РД-64-085-89 (01.06.1990).
5. Levin M. Methods and apparatuses for conducting assays in animals. US Patent Applic. 20070031962 (February 8, 2007).
6. Тирас Х.П., Сахарова Н.Ю. Прижизненная морфометрия регенерации планарий. //Онтогенез. - 1984. - Т. 15, №1. - С.41-48.
7. Карагодин В.П., Черткоева З.А Возможность использования биотестирования для предварительной оценки эффективности БАД. (http://www.sds-bio.org/bb/bb10-06.doc) (2006).
8. Ермаков А.М. и др. Модуляция пролиферативной активности стволовых клеток регенерирующих планарий с помощью магнитных полей и фармакологических агентов. Тезисы доклада. Москва (http://www.cmbt.su/rus/science/science252.html) (2007.).
9. Шейман И.М. и др. Морфогенез у планарий. //Онтогенез. - 2004. - Т. 35, №4.- С.285-290.
10. Шейман И.М. и др. Ресурсы регенерации у планарий. //Онтогенез. - 2006. -Т.37, №1. - С.27-31.