СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ФОРМИРОВАНИЯ ФИБРОЗНО-ХРЯЩЕВОГО РЕГЕНЕРАТА КОСТНОЙ МОЗОЛИ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
METHOD FOR STIMULATING FORMATION OF FIBROCARTILAGENOUS REGENERATED CLAVUS IN MAMMALS

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарии, а именно к способу стимуляции формирования костной мозоли у млекопитающих: при отсутствии фиксации перелома, при неполной репозиции, при неполном прилежании костных отломков.
В настоящее время методические подходы, основанные на возможности использования клеточных технологий для нужд регенеративной медицины, в частности для ускорения заживления дефектов опорно-двигательного аппарата, становятся все более востребованными. Это связано, в первую очередь, со значительными успехами в исследовании регенеративных потенций мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК).
В различных экспериментальных моделях показана эффективность использования ММСК человека и животных для восстановления костно-хрящевых дефектов, в частности, регенерации мениска [Murphy et al., 2003], костных дефектов [Arinzeh et al., 2003; Ohgushi et al., 2005; Bruder et al., 1998], межпозвонковых дисков [Crevensten et al., 2004], хряща в коленном суставе [Barry, 2003]. Кроме того, ММСК были успешно использованы в ходе I-II фазы клинических испытаний для восстановления больших костных дефектов у пациентов травматолого-ортопедического профиля с нарушениями в ходе заживления переломов [Quarto et al., 2001], а также для восстановления хрящевой ткани [Diduch et al. 2000].
В большинстве исследований по использованию ММСК для нужд регенеративной медицины источником клеток является костный мозг. Однако получение костного мозга чрезвычайно болезненно для пациентов, и выход ММСК низок. Обнаружение ММСК в других тканях в составе стромально-васкулярной фракции клеток (СВФК) расширило спектр источников ММСК для использования в клинической практике. С 2001 года, когда была выделена и охарактеризована СВФ из жировой ткани человека [Zuk et al., 2001], содержащая ММСК, было проведено много исследований, подтвердивших возможность использования СВФК как альтернативного источника мезенхимальных стволовых клеток для нужд тканевой инженерии и регенеративной медицины [Ма et al., 2009; Rada et al., 2009]. Поскольку жировая ткань человека легкодоступна в больших количествах под местной анестезией с небольшим дискомфортом для пациента, она представляет прекрасный альтернативный костному мозгу источник стволовых клеток, жтММСК для восстановления тканей были использованы в моделях in vivo для регенерации костей черепа [Cowan et al., 2004], суставных хондроцитов [Masuoka et al., 2006].
Ранее коллективом заявителей была продемонстрирована эффективность использования ММСК из костного мозга крыс для ускорения ранних этапов формирования костной мозоли после экспериментального перелома малоберцовой кости у крыс [Андреева и др., 2009; Буравкова и др., 2009; патент RU 2404242 от 20.11.2010].
Сращение перелома кости без ее предварительной фиксации происходит за счет образования первичной мозоли, которую некоторые исследователи рассматривают как предварительную фиксацию. Сращение достигается последующим соединением волокнистой соединительной ткани с костной тканью. В таких случаях костное сращение проходит через фазу фиброзно-хрящевой мозоли. Такой тип сращения костной раны наблюдается при подвижности отломков, или при неплотном их прилежании. Динамика остеорепарации в этом случае проходит ряд последовательных фаз [Хэм А., Кормак Д., 1983]. Фазой, характеризующей ранний этап репарации, является формирование фиброзно-хрящевого регенерата. Эффективность образования хрящевой ткани может служить параметром для оценки успешности заживления костного дефекта.
Известен способ восстановления целостности кости при использовании импланта на основе культуры клеток, содержащей клетки-предшественники остеогенеза [RU 2240135 С1]. Однако указанный способ имеет ряд недостатков. Так, в соответствии с данным способом, необходимо предварительное формирование импланта, а также использование индукторов остеогенеза.
Из уровня техники известен способ стимуляции восстановления костной ткани, заключающийся в введении в область дефекта кости биологически активных агентов, где в качестве стимуляторов используют гликозаминогликаны в сочетании с измельченной аллогенной костью (RU 2071737).
Известен способ репаративного остеогенеза при введении суспензионного клеточного ксенотрансплантата мезенхимальных стволовых клеток человека, включающий введение мезенхимальных стволовых клеток в область дефекта кости, что обеспечивало ускорение и улучшение качества регенерации. При этом на 90-е сутки эксперимента во всех группах в области дефекта сформировался полноценный костный регенерат, и костная ткань успешно встраивалась в костный орган [Фатхутдинов и др., 2005].
Из уровня техники известно решение, раскрытое в RU 2404242, относящееся к способу ускоренного формирования костной мозоли у млекопитающих, включающему введение в область перелома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), взятых из костного мозга и предкультивированных в условиях гипоксии.
Таким образом, в уровне техники не предлагалось способа стимулирования формирования фиброзно-хрящевого регенерата костной мозоли у млекопитающих, заключающегося во введении в область перелома ММСК, взятых из жировой ткани и предкультивированных в условиях гипоксии.
Сущность изобретения заключается в стимуляции формирования фиброзно-хрящевого регенерата костной мозоли у млекопитающих, включающей введение в область перелома предкультивированной в условиях гипоксии стромально-васкулярной фракции клеток (СВФК) из жировой ткани.
2
2
2
2
2
2
Для этого были протестированы клеточные препараты СВФК из жировой ткани, предкультивированные в условиях нормоксии (20% O, 5% CO, 75% N) и пониженного содержания кислорода (5% O, 5% CO, 90% N). Было обнаружено, что у животных, которым в область экспериментального перелома малоберцовой кости были введены СВФК, коэффициент утолщения костной мозоли и доля площади хрящевого регенерата в ней были достоверно больше, чем в контрольных группах.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение достоверно большего коэффициента утолщения, увеличение доли хрящевой ткани в первичной костной мозоли.
Примеры конкретного осуществления изобретения
В работе использовали среду роста: ДМЕМ (ICN, США) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (Gibco, США) и 10% фетальной коровьей сыворотки (ФКС) (Hyclone, США) для культивирования клеток; 20 мM фосфатный буфер (ФБ) (Gibco, США) для отмывки клеток; 0,02% раствор трипсина с 0,05% ЭДТА (Gibco, США) для открепления клеток от подложки.
2
2
2
2
2
2
2
2
Получение и культивирование СВФК из жировой ткани крыс проводили следующим образом. Клетки выделяли из подкожной жировой ткани 1,5 месячной крысы-самца линии Вистар, как описано Wan et al. [2008]. Культивирование выделенных СВФК проводили в CO-инкубаторе (20% O, 5% CO, 75% N). После первого пассажа часть клеток помещали в CO-инкубатор (N-СВФК), а другую часть - в мультигазовый инкубатор, в котором поддерживалась газовая среда 5% O, 5% CO и 90% N (Нур-СВФК).
В экспериментах по изучению регенеративного потенциала СВФ были использованы клетки второго пассажа.
0
Анализ прироста клеток в культуре проводили методом видеомикроскопии, подсчитывая количество клеток в фиксированных полях зрения каждые 24 часа с помощью программы анализа изображения SigmaScan Pro 5.0 Image Analysis Software (SPSS Inc, USA). Количество клеточных удвоений рассчитывали по формуле П=3,32lg(x/x).
Иммунофенотип СВФК на втором пассаже был охарактеризован с помощью моноклональных антител к следующим маркерным молекулам: CD90, CD45, CD54, CD73, CD11b, CD44 (BD Bioscience, США), а жизнеспособность клеток оценивали с помощью набора AnnexinV-FITC Kit (Immunotech, Франция) на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США).
Клеточные препараты
Препараты СВФК готовили из культивируемых клеток, прошедших 2 пассажа после выделения. Клетки открепляли от пластика с помощью раствора трипсин-ЭДТА, затем инактивировали фермент добавлением среды роста, после чего клетки ресуспендировали в необходимом количестве культуральной среды, не содержащей ФКС. Транспортировку и хранение клеточных препаратов осуществляли на льду в течение 2-4 часов при температуре +4°С. Перед введением клеточного препарата клетки ресуспендировали и отбирали необходимую для введения аликвоту.
Экспериментальная модель операционного перелома малоберцовой кости крыс
В эксперименте были использованы крысы-самцы линии Вистар (24 особи весом около 200 г). Разрешение на проведение эксперимента получено от Комиссии ГНЦ РФ - ИМБП РАН по медицинской биоэтике физиологической секции Российского национального комитета по биоэтике.
2
Крыс декапитировали на 14-е сутки после одностороннего оперативного перелома малоберцовой кости в средней ее трети. Оперативный перелом костей осуществляли в стерильных условиях у наркотизированных животных. В качестве наркотического средства использовали "Золитил-100" в дозе 8 мг/кг массы тела. Первую (контрольную группу) (П) составили животные, у которых вызывали перелом малой берцовой кости. Во вторую группу вошли крысы, которым после перелома малоберцовой кости в область перелома вводили 0,25 мл культуральной среды, которую использовали при выращивании СВФК из жировой ткани (группа П+С). Культуральная среда состояла из ДМЕМ (фирма ICN), к которой были добавлены пенициллин/стрептомицин (100 мг/мл), 2 мМ глутамина и 1 мМ пирувата натрия (фирма Gibco). Третьей и четвертой группам крыс после оперативного перелома малоберцовой кости в область перелома вводили по 0,25 мл культуральной среды, содержащей по 500 тысяч СВФК, причем крысам третьей группы вводили СВФК, которые во время культивирования находились в нормоксической среде (21% O) (группа П+N-СВФК), а крысам четвертой группы - СВФК, которые во время культивирования находились в гипоксической среде с 5% кислорода (группа П+Нур-СВФК). После окончания оперативного вмешательства и введения СВФК операционную рану ушивали. Оперативный перелом и введение клеток не оказывали влияния на опорную и двигательную функцию оперированной конечности, и после прекращения действия наркоза крысы свободно перемещались по клетке, пили воду и поедали корм. В процессе 14-дневного послеоперационного периода животные прибавляли в весе, и гибели крыс не наблюдалось.
Гистологический анализ
При визуальном осмотре малоберцовых костей освобожденных от мягких тканей было установлено, что во всех группах животных на костях, подвергнутых оперативному перелому, сформировалась веретенообразная костная мозоль, которая достаточно прочно скрепляла дистальные костные отломки.
Микроскопическое исследование позволило установить, что сращение костных отломков во всех группах шло по типу вторичного заживления с образованием фиброзно-хрящевого регенерата. Новообразованная ретикулофиброзная кость располагалась проксимально и дистально относительно хряща.
Для группы П+С было характерно наличие толстой надкостницы, богатой фибробластами, от которой отходили тяжи рыхлой неоформленной соединительной ткани. Перекладины ретикулофиброзной костной ткани в основном, мелкие, в крупных перекладинах встречаются замурованные изогенные группы. Все перекладины новообразованной ретикулофиброзной костной ткани покрывали активные остеобласты. В эндостальной костной мозоли происходил некроз пластинчатых костей активными остеокластами. Некрозированные участки замещались рыхлой неоформленной соединительной тканью.
В группе П+N-СВФК костную мозоль покрывала более толстая надкостница, богатая фибробластами. В центральной части костной мозоли наблюдалось скопление рыхлой неоформленной соединительной ткани. Длинных тяжей соединительной ткани от надкостницы не было обнаружено. Перекладины ретикулофиброзной костной ткани крупные, покрыты активными остеобластами. В некоторых трабекулах присутствовали замурованные остеогенные группы. Обнаружено много активных остеокластов, разрушающих пластинчатую кость.
Группа П+Нур-СВФК также характеризовалась толстой, богатой фибробластами надкостницей, от которой, если и отходили тяжи соединительной ткани, то они были короткие и не уходили далеко в межтрабекулярное пространство. В эндостальной костной мозоли между отломками располагалась большая зона рыхлой неоформленной соединительной ткани. Отломки пластинчатой костной ткани активно разрушали остеокласты. Перекладины ретикулофиброзной костной ткани крупные, покрыты активными остеобластами.
Гистоморфометрия
Через 14 суток после экспериментального перелома морфометрический анализ выявил достоверное превышение значений коэффициента утолщения (соотношение толщины вновь образованной костной мозоли и толщины исходной кости) в группах животных, которым были введены клеточные препараты (табл.1). В этих группах доля площади, занятая хрящевой тканью, в 2 и более раз превышала аналогичный показатель в группах П и П+С (табл.1).
Таблица 1
Гистоморфометрический анализ вновь образованной костной мозоли в малоберцовой кости крыс через 14 дней после экспериментального перелома
Группа
Доля хрящевой ткани в костной мозоли, %
Коэффициент утолщения
П
3,90±0,71
2,65±0,18
П+С
4,43±0,97
2,80±0,12<sup>*</sup>
П+N-СВФК
12,73±0,68*<sup>,</sup> **
3,50±0,20*<sup>,</sup> **
П+Нур-СВФК
8,38±0,10*<sup>,</sup> **
3,35±0,2*<sup>,</sup> **
Обозначения:
<sup>*</sup> - достоверные различия по отношению к группе П;
<sup>**</sup> - достоверные различия по отношению к группе П+С.
Суммируя данные гистологических и гистоморфометрических исследований, можно констатировать, что у крыс с переломом малоберцовой кости, которым вводили СВФК из жировой ткани, были увеличены размер развившейся костной мозоли и доля хрящевой ткани в этой мозоли. Эти результаты свидетельствуют о более эффективном заживлении перелома кости, чем у животных, которым не вводили клетки, т.к. фазой, характеризующей ранний этап репарации, является формирование фиброзно-хрящевого регенерата. Эффективность образования хрящевой ткани может служить параметром для оценки успешности заживления костного дефекта.
Ранее авторы показали, что у животных, имевших больший размер костной мозоли после введения ММСК костного мозга на ранних сроках восстановления (14 суток), более эффективно восстанавливался изначальный размер кости на поздних сроках регенерации (30 суток) [Андреева и др., 2009]. В настоящей заявке авторы продемонстрировали, что СВФК жировой ткани, экспансия которых ex vivo проведена как в нормоксических, так и в гипоксических условиях, так же эффективно ускоряют восстановление костной ткани после перелома, что и ММСК костного мозга. При этом СВФК более доступны, а использование гипоксического протокола для их экспансии позволяет получить большее количество клеточного препарата за более короткий период времени.
Таким образом, проведенное исследование продемонстрировало эффективность введения суспензии СВФК, предварительная экспансия которых проведена ex vivo в условиях различного содержания кислорода, для улучшения формирования фиброзно-хрящевого регенерата на раннем этапе формирования костной мозоли при экспериментальном переломе малоберцовой кости у крыс.
Литература:
2
1. Андреева Е.Р., Капланский А.С., Валюшкина М.П., Логинов В.И., Анохина Е.Б., Буравкова Л.Б. Использование культивируемых при различном содержании О мезенхимальных стромальных клеток из костного мозга крыс для регенерации костной ткани. В сборнике: Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные исследования и перспективы клинического применения. Под ред. В.А.Ткачука. - М.: Литтерра, 2009. - С.91-109.
2. Буравкова Л.Б., Капланский А.С., Андреева Е.Р., Валюшкина М.П., Дурнова Г.Н., Логинов В.И., Анохина Е.Б. Особенности формирования костной мозоли у крыс после введения в область перелома мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, культивируемых при различном содержании кислорода. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2009, 4(3), С.52-57.
3. Фатхутдинов Т.Х., Гольдшгейн Д.В., Пулин А.А., и др. Особенности репаративного остеогенеза при транстлангации мезенхимальных стволовых клеток. Бюл. эксперим. биол. и мед. 2005; 140[7]: С.109-113.
4. Хэм А., Кормак Д. Гистология в томах, Москва, Мир, 1983.
5. Arinzeh T.L., Peter S.J., Archambault M.P., van den В.С., Gordon S., Kraus K., Smith A., Kadiyala S. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect. J. Bone Joint Surg. Am. 2003; 85-A(10): С.1927-1935.
6. Barry F.P. Mesenchymal stem cell therapy in joint disease. Novartis Found. Symp. 2003; 249: С.86-96.
7. Bruder S.P., Kraus K.H., Goldberg V.M., Kadiyala S. The effect of implants loaded with autologous mesenchymal stem cells on the healing of canine segmental bone defects. J Bone Joint Surg. 1998; 80(7): С.985-996.
8. Cowan C.M., Shi Y.Y., Aalami O.O., Chou Y.F., Mari C., Thomas R., Quarto N., Contag C.H., Wu B., Longaker M.T. Adipose derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nat Biotechnol. 2004; 22(5): С.560-567.
9. Crevensten G., Walsh A.J., Ananthakrishnan D., Page P., Wahba G.M., Lotz J.C., Berven S. Intervertebral disc cell therapy for regeneration: mesenchymal stem cell implantation in rat intervertebral discs. Ann. Biomed. Eng. 2004; 32(3): С.430-434.
10. Diduch D.R., Jordan L.C., Mierisch C.M., Balian G. Marrow stromal cells embedded in alginate for repair of osteochondral defects. Arthroscopy. 2000; 16(6): С.571-577.
11. Ma T., Grayson W.L., Frohlich M., Vunjak-Novakovic G. Hypoxia and Stem Cell-Based Engineering of Mesenchymal Tissues. Biotechnol Prog. 2009; 25(1): С.-42.
12. Masuoka K., Asazuma T., Hattori H., Yoshihara Y., Sato M., Matsumura K., Matsui T., Takase B., Nemoto K., Ishihara M. Tissue engineering of articular cartilage with autologous cultured adipose tissue-derived stromal cells using atelocollagen honeycomb-shaped scaffold with a membrane sealing in rabbits. J Biomed Mater Res. 2006; 79(1): С.-34.
13. Murphy J., Fink D.J., Hunziker E., Barry F. Stem cell therapy in a caprine model of osteoarthritis. Arthritis Rheum. 2003; 48(12): С.64-3474.
14. Ohgushi H., Kotobuki N., Funaoka H., Machida H., Hirose M., Tanaka Y., Takakura Y. Tissue engineered ceramic artifical joint-ex vivo osteogenic differentiation of patient mesenchymal cells on total ankel joints for treatment of osteoarthritis. Biomaterials. 2005; 26(22): С.54-4661.
15. Quarto R., Mastrogiacomo M., Cancedda R., Kutepov S.M., Mukhachev V., Lavroukov A., Kon E., Marcacci M. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells. New Engl. J. Med. 2001; 344(5): С.5-386.
16. Rada T., Reis R.L., Gomes M.E. Adipose tissue-derived stem cells and their application in bone and cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. 2009 Jun; 15(2): С.113-25.
17. Wan C.D., Cheng R., Wang H.B., Liu T. Immunomodulatory effects of mesenchymal stem cells derived from adipose tissues in a rat orthotopic liver transplantation model. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2008 Feb; 7(1): С.29-33.
18. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., Huang J., Futrell J.W., Katz A.J., Benhaim P., Lorenz H.P., Hedrick M.H. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001; 7(2): С.211-228.