СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ЛИПОТОКСИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ
COMPOUNDS FOR REDUCTION IN LIPOTOXIC DAMAGE

Ссылка на родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с предварительной заявкой на выдачу патента США с серийным номером 62/531454, поданной 12 июля 2017 г., содержание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее раскрытие относится к применению ингибиторов липазы для лечения тяжелого панкреатита и/или акне.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Поджелудочная железа вырабатывает ферменты, которые содействуют пищеварению и усвоению пищи; одним из таких ферментов является липаза, которая переваривает жир. Некоторые люди (например, люди, страдающие ожирением) характеризуются повышенным риском развития полиорганной недостаточности при острых воспалительных состояниях, таких как тяжелые ожоги, тяжелые травмы, критическое заболевание и острый панкреатит (AP). Панкреатит связан с выделением разрушительных пищеварительных ферментов из ацинарных клеток поджелудочной железы в саму поджелудочную железу. Когда начинается AP, он может быстро стать тяжелым AP (SAP). Это вызывает беспокойство, потому что SAP приводит к смертности от 40 до 50%, когда осложняется острой почечной недостаточностью, дыхательной недостаточностью, гипокальциемией и другими проявлениями полиорганной недостаточности или большими участками некроза поджелудочной железы. В отсутствие эффективных методов лечения существующим стандартом лечения является поддерживающая терапия и лечение осложнений при их возникновении.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
В настоящем документе предусмотрены новые ингибиторы липазы и способы их применения для лечения панкреатита и/или функциональной недостаточности органов и/или акне, предусматривающие введение нуждающемуся в таком лечении субъекту эффективного количества ингибитора липазы, как предусмотрено в настоящем документе. Предусмотренные в настоящем документе способы основаны, по меньшей мере частично, на открытиях того, что липотоксичность вносит свой вклад в воспаление, полиорганную недостаточность, некротическую гибель ацинарных клеток поджелудочной железы, острый панкреатит, сепсис (например, культурально-негативный сепсис), ожоги, акне и инфекции, и что ингибирование активности липазы способно снижать показатели, ассоциированные с этими состояниями. Соответственно, согласно некоторым вариантам осуществления в настоящем документе предусмотрены способы и композиции для ограничения липотоксичности и, тем самым, снижения вероятности неблагоприятных исходов, связанных с острым панкреатитом и другими тяжелыми системными состояниями.
В настоящем документе предусмотрено соединение, выбранное из группы, состоящей из:
и
или их фармацевтически приемлемой соли. Согласно некоторым вариантам осуществления соединение представляет собой:
или его фармацевтически приемлемую соль. Согласно некоторым вариантам осуществления соединение представляет собой:
или его фармацевтически приемлемую соль.
Дополнительно в настоящем документе предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая одно или несколько предусмотренных в настоящем документе соединений и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
Настоящее раскрытие также относится к способам лечения острого панкреатита у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества предусмотренного в настоящем документе соединения или его фармацевтически приемлемой соли. Согласно некоторым вариантам осуществления острый панкреатит является тяжелым. Согласно некоторым вариантам осуществления степень тяжести острого панкреатита снижается от тяжелой до легкой после введения. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает ожирением. Согласно некоторым вариантам осуществления риск развития шока, почечной недостаточности и/или легочной недостаточности снижается.
Кроме того, в настоящем документе предусмотрен способ лечения акне у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества предусмотренного в настоящем документе соединения или его фармацевтически приемлемой соли.
Дополнительно в настоящем документе предусмотрен способ лечения сепсиса у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества предусмотренного в настоящем документе соединения или его фармацевтически приемлемой соли. Согласно некоторым вариантам осуществления сепсис представляет собой культурально-негативный сепсис.
Настоящее раскрытие также относится к способам лечения ожогов у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества предусмотренного в настоящем документе соединения или его фармацевтически приемлемой соли.
P. auregenosa
S. aureus
B. subtilis
B. cepecia
Кроме того, в настоящем документе предусмотрен способ лечения инфекций у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества предусмотренного в настоящем документе соединения или его фармацевтически приемлемой соли. Согласно некоторым вариантам осуществления инфекция вызвана одним или несколькими организмами, выбранными из группы, состоящей из , ,  и .
Согласно некоторым приведенным выше вариантам осуществления соединение представляет собой:
или его фармацевтически приемлемую соль. Согласно некоторым вариантам осуществления из приведенных выше вариантов осуществления соединение представляет собой:
или его фармацевтически приемлемую соль.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, которое обычно подразумевают специалисты в настоящей области техники, к которой относится настоящее изобретение. Способы и материалы описаны в настоящем документе для использования в настоящем изобретении; также можно использовать другие подходящие способы и материалы, известные в настоящей области техники. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения. Все публикации, заявки на выдачу патентов, патенты, последовательности, записи в базе данных и другие ссылки, упомянутые в настоящем документе, полностью включены посредством ссылки. В случае конфликта настоящее описание, включая в себя определения, будет иметь преимущественную силу.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного раскрытия настоящего изобретения и фигур, а также из формулы изобретения.
Описание графических материалов
Фиг. 1 представляет собой схему структуры орлистата, разделяющую соединение на три основные области.
Фиг. 2 представляет собой схему, подробно описывающую путь синтеза для получения модификаций сложного аминоэфира в ядре орлистата.
На фиг. 3 показаны структуры различных полученных соединений - неформилированных аналогов с модификацией сложного аминоэфира.
На фиг. 4 представлены линейные графики, на которых показаны результаты анализа ингибирования липазы, в котором испытывают соединения - неформилированные аналоги с модификацией сложного аминоэфира. На фиг. 4А представлены результаты свежеприготовленных растворов соединений, а на фиг. 4B представлены результаты растворов, хранящихся в течение ночи.
На фиг. 5 представлена схема, подробно описывающую путь синтеза для получения формилированных аналогов с модификацией сложного аминоэфира.
На фиг. 6 показаны структуры различных полученных соединений - формилированных аналогов с модификацией сложного аминоэфира.
На фиг. 7 представлены линейные графики, на которых показаны результаты анализа ингибирования липазы, в котором испытывают соединения - формилированного аналога с модификацией сложного аминоэфира. На фиг. 7А представлены результаты свежеприготовленных растворов соединений, а на фиг. 7B представлены результаты растворов, хранящихся в течение ночи.
На фиг. 8 представлены гистограммы, на которых подробно показана эффективность выбранных соединений - аналогов в снижении липотоксического повреждения ацинарных клеток при совместном культивировании ацинарных клеток и адипоцитов (фиг. 8А), а также оценка токсичности соединений для этих клеток (фиг. 8В).
На фиг. 9 представлена схема, на которой подробно показана реакция наращивания цепи, используемая для получения аналогов β-цепи.
На фиг. 10 представлена схема, на которой подробно показан путь синтеза аналогов β-цепи.
На фиг. 11 представлена схема, на которой подробно показан путь синтеза аналогов β-цепи.
На фиг. 12 представлена схема, на которой подробно показан путь синтеза аналогов β-цепи.
На фиг. 13 представлена схема, на которой подробно показан путь синтеза аналогов β-цепи.
На фиг. 14 показаны структуры различных полученных аналогов β-цепи.
На фиг. 15 представлена линейная диаграмма, на которой показаны результаты анализа ингибирования липазы, в котором испытывают аналоги β-цепи в свежеприготовленных растворах.
На фиг. 16 представлена схема, на которой подробно показан путь синтеза аналогов α-цепи.
На фиг. 17 представлены линейные графики, на которых показаны результаты анализа ингибирования липазы, в котором испытывают аналоги α-цепи. На фиг. 17А представлены результаты свежеприготовленных растворов соединений, а на фиг. 17B представлены результаты растворов, хранящихся в течение ночи.
На фиг. 18 представлены линейные графики, на которых показаны результаты анализа, в котором исследуют образование свободной жирной кислоты в % (FFA). На фиг. 18А представлены результаты свежеприготовленных растворов соединений, тогда как на фиг. 18B представлены результаты растворов, хранящихся в течение ночи.
На фиг. 19 показаны таблицы значений, полученных из исследований токсичности в клетках поджелудочной железы мыши.
На фиг. 20 представлены линейные графики, на которых показаны результаты анализа, в котором исследуют образование FFA в %. На фиг. 20А представлены результаты с липазой hPLRP2, тогда как на фиг. 20B представлены результаты с липазой hCEL.
На фиг. 21 представлена сводная таблица исследований in vitro, описанных в настоящем документе.
На фиг. 22 представлена сводная информация о применении орлистата для уменьшения тяжелого панкреатита.
На фиг. 23 представлены результаты испытания соединения 767 in vivo. На фиг. 23А представлена хронология исследования; на фиг. 23В представлена гистограмма концентрации липазы в сыворотке; на фиг. 23C представлен график, на котором показаны содержания азота мочевины в сыворотке крови в различные моменты времени; на фиг. 23D представлен график, на котором показаны содержания кальция в сыворотке в различные моменты времени; и на фиг. 23E представлен график, на котором показана защита от синдрома системного воспалительного ответа (SIRS); на фиг. 23F представлен график, на котором показана защита от шока, а на фиг. 23G представлен график, на котором показана улучшенная выживаемость.
На фиг. 24 приведены фотографии получивших лечение мышей.
На фиг. 25 представлена сводная таблица исследований in vivo с соединением 767 и орлистатом.
P. acnes
На фиг. 26 представлен линейный график, на котором показано образование FFA в % в среде .
P. acnes
На фиг. 27 представлены изображения агара со спиртовом голубым, инокулированного  и подвергаемого воздействию как орлистата, так и соединения 767.
На фиг. 28 показана эффективность 10 мМ агентов в снижении утечки LDH из ацинарных клеток, инкубированных с 600 мМ GTL.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
В настоящее время тяжелый панкреатит часто лечат путем введения одобренного FDA ингибитора липазы орлистата. Хотя ингибирование липазы снижает тяжесть панкреатита, использование орлистата осложняется необходимостью повторного введения дозы (например, 50 мг/кг два раза в сутки в течение двух дней) во время панкреатита и гипертриглицеридемией, связанной с применением этого соединения. В настоящем документе предусмотрены соединения, которые обеспечивают терапевтические эффекты при панкреатите без необходимости повторного введения дозы или осложнений, связанных с орлистатом.
Предусмотренные в настоящем документе соединения включают в себя соединения, описанные в таблице 1.
Таблица 1.
Номер соединения
Структура
728
<img file="00000004.jpg" he="33" wi="64" img-content="undefined" img-format="jpg" />
731
<img file="00000005.jpg" he="31" wi="64" img-content="undefined" img-format="jpg" />
729
<img file="00000006.jpg" he="34" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
727
<img file="00000007.jpg" he="45" wi="78" img-content="undefined" img-format="jpg" />
725
<img file="00000008.jpg" he="43" wi="75" img-content="undefined" img-format="jpg" />
716
<img file="00000009.jpg" he="42" wi="73" img-content="undefined" img-format="jpg" />
718
<img file="00000010.jpg" he="38" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
717
<img file="00000011.jpg" he="38" wi="73" img-content="undefined" img-format="jpg" />
726
<img file="00000012.jpg" he="41" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
724
<img file="00000013.jpg" he="37" wi="76" img-content="undefined" img-format="jpg" />
732
<img file="00000014.jpg" he="36" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
733
<img file="00000015.jpg" he="33" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
734
<img file="00000016.jpg" he="37" wi="75" img-content="undefined" img-format="jpg" />
738
<img file="00000017.jpg" he="29" wi="73" img-content="undefined" img-format="jpg" />
736
<img file="00000018.jpg" he="33" wi="73" img-content="undefined" img-format="jpg" />
737
<img file="00000019.jpg" he="33" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
741
<img file="00000020.jpg" he="40" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
739
<img file="00000021.jpg" he="32" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
740
<img file="00000022.jpg" he="31" wi="52" img-content="undefined" img-format="jpg" />
743
<img file="00000023.jpg" he="36" wi="74" img-content="undefined" img-format="jpg" />
742
<img file="00000024.jpg" he="25" wi="76" img-content="undefined" img-format="jpg" />
762
<img file="00000025.jpg" he="29" wi="71" img-content="undefined" img-format="jpg" />
763
<img file="00000026.jpg" he="30" wi="71" img-content="undefined" img-format="jpg" />
760
<img file="00000027.jpg" he="38" wi="71" img-content="undefined" img-format="jpg" />
767
<img file="00000028.jpg" he="43" wi="64" img-content="undefined" img-format="jpg" />
768
<img file="00000029.jpg" he="44" wi="46" img-content="undefined" img-format="jpg" />
или их фармацевтически приемлемая соль. Согласно некоторым вариантам осуществления соединение представляет собой
или его фармацевтически приемлемую соль. Согласно некоторым вариантам осуществления соединение представляет собой
или его фармацевтически приемлемую соль.
Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренное в настоящем документе соединение является стабильным в водном растворе. Например, предусмотренное в настоящем документе соединение может являться более стабильным, чем орлистат в водном растворе. Согласно некоторым вариантам осуществления соединение представляет собой
или его фармацевтически приемлемую соль. Согласно некоторым вариантам осуществления соединение представляет собой
или его фармацевтически приемлемую соль.
Синтез
Описанные в настоящем документе соединения можно получить, например, в соответствии с процедурами, описанными в примерах и на соответствующих фигурах.
Advances in Heterocyclic Chemistry
Journal of Heterocyclic Chemistry
et al
Science of Synthesis
et al
Comprehensive Organic Functional Group Transformations
et al
Comprehensive Organic Functional Group Transformations II
et al
Comprehensive Heterocyclic Chemistry
et al
Comprehensive Heterocyclic Chemistry II
et al
March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure
et al.
Comprehensive Organic Synthesis
е
е
Специалисту в настоящей области техники должно быть понятно, что описанные способы не являются исключительным средством, с помощью которого можно синтезировать предусмотренные в настоящем документе соединения, и что широкий спектр синтетических органических реакций доступен для потенциального применения в синтезе предусмотренных в настоящем документе соединений. Специалист в настоящей области техники знает, как выбрать и реализовать подходящие пути синтеза. Подходящие способы синтеза исходных материалов, промежуточных соединений и продуктов можно определить, обращаясь к литературе, включая в себя такие справочные источники, как:, Vols. 1-107 (Elsevier, 1963-2012);  Vols. 1-49 (Journal of Heterocyclic Chemistry, 1964-2012); Carreira, . (Ed.) , Vols. 1-48 (2001-2010) и Knowledge Updates KU2010/1-4; 2011/1-4; 2012/1-2 (Thieme, 2001-2012); Katritzky, . (Ed.) , (Pergamon Press, 1996); Katritzky . (Ed.);  (Elsevier, 2 изд., 2004); Katritzky . (Ed.),  (Pergamon Press, 1984); Katritzky .,, (Pergamon Press, 1996); Smith ., , 6 изд. (Wiley, 2007); Trost  (Ed.),  (Pergamon Press, 1991).
Реакции получения описанных в настоящем документе соединений можно проводить в подходящих растворителях, которые могут быть легко выбраны специалистом в области органического синтеза. Подходящие растворители могут по существу не вступать в реакцию с исходными материалами (реагентами), промежуточными соединениями или продуктами при температурах, при которых проводят реакции (например, при температурах, которые могут варьироваться от температуры замерзания растворителя до температуры кипения растворителя). Данную реакцию можно провести в одном растворителе или в смеси более чем одного растворителя. В зависимости от конкретной стадии реакции специалист в настоящей области техники может выбрать подходящие растворители для конкретной стадии реакции.
Protective Groups in Organic Synthesis
е
Получение описанных в настоящем документе соединений может предусматривать прикрепление и снятие защитной группы с различных химических групп. Необходимость в прикреплении и снятии защитной группы, а также выбор подходящих защитных групп может быть легко определен специалистом в настоящей области техники. Химию защитных групп можно найти, например, в T. W. Greene and P. G. M. Wuts, , 3 изд., Wiley & Sons, Inc., New York (1999).
1
13
Реакции можно подвергать мониторингу в соответствии с любым подходящим способом, известным в настоящей области техники. Например, образование продукта можно подвергать мониторингу с помощью спектроскопических средств, таких как спектроскопия ядерного магнитного резонанса (например, H или C), инфракрасная спектроскопия, спектрофотометрия (например, в УФ и видимом диапазоне спектра), масс-спектрометрия, или хроматографических способов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), жидкостная хроматомасс-спектроскопия (ЖХ/МС) или тонкослойная хроматография (ТСХ). Соединения могут быть очищены специалистами в настоящей области техники с помощью различных способов, включая в себя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и нормально-фазовую хроматографию на силикагеле.
Подразумевается, что используемый в настоящем документе термин «соединение» включает в себя все стереоизомеры, геометрические изомеры, таутомеры и изотопы изображенных структур. Предполагается, что соединения, идентифицированные в настоящем документе по названию или структуре как одна конкретная таутомерная форма, включают в себя другие таутомерные формы, если не указано иное.
Предусмотренные в настоящем документе соединения также включают в себя таутомерные формы. Таутомерные формы возникают в результате замены одинарной связью смежной двойной связью вместе с сопутствующей миграцией протона. Таутомерные формы включают в себя прототропные таутомеры, которые являются изомерными состояниями протонирования, характеризующимися одинаковой эмпирической формулой и общим зарядом. Примеры прототропных таутомеров включают в себя пары кетон - енол, пары амид - имидная кислота, пары лактам - лактим, пары енамин - имин и кольцевые формы, где протон может занимать два или больше положений гетероциклической системы, например, 1H- и 3H-имидазол, 1Н-, 2Н- и 4Н-1,2,4-триазол, 1Н- и 2Н-изоиндол и 1Н- и 2Н-пиразол. Таутомерные формы могут находиться в равновесии или являться стерически замкнутыми в одну форму путем соответствующего замещения.
R
S
D
L
правовращающие
левовращающие
цис/транс
E/Z
Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе соединения могут содержать один или несколько асимметричных центров и, таким образом, могут встречаться в виде рацематов и рацемических смесей, энантиомерно обогащенных смесей, отдельных энантиомеров, отдельных диастереомеров и диастереомерных смесей (например, включая в себя ()- и ()-энантиомеры, диастереомеры, ()-изомеры, ()-изомеры, (+) () формы, (-) () формы, их рацемические смеси и другие их смеси). Дополнительные асимметричные атомы углерода могут присутствовать в заместителе, таком как алкильная группа. Все такие изомерные формы, а также их смеси этих соединений специально включены в настоящее описание. Описанные в настоящем документе соединения могут также или дополнительно содержать связи, в которых вращение связи ограничено относительно этой конкретной связи, например, ограничение в результате присутствия кольца или двойной связи (например, углерод-углеродные связи, углерод-азотные связи, такие как амидные связи). Соответственно, все  и  изомеры и поворотные изомеры специально включены в настоящее описание. Если не упомянуто или не указано иное, химическое обозначение соединения включает в себя смесь всех возможных стереохимически изомерных форм этого соединения.
Оптические изомеры можно получить в чистом виде с помощью стандартных процедур, известных специалистам в настоящей области техники, они включают в себя без ограничения образование диастереомерных солей, кинетическое оптическое расщепление и асимметричный синтез. См., например, Jacques, et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen, S.H., et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972), каждый из которых полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, следует понимать, что описанные в настоящем документе соединения включают в себя все возможные региоизомеры и их смеси, которые можно получить в чистом виде с помощью стандартных процедур разделения, известных специалистам в настоящей области техники, они включают в себя без ограничения колоночную хроматографию, тонкослойную хроматографию и высокоэффективную жидкостную хроматографию.
11
18
Если специально не указано, предусмотренные в настоящем документе соединения также могут включать в себя все изотопы атомов, присутствующих в промежуточных или конечных соединениях. Изотопы включают в себя те атомы, которые характеризуются одинаковым атомным номером, но разными массовыми числами. Если не указано иное, когда атом обозначается как изотоп или радиоизотоп (например, дейтерий, [C], [F]), считается, что атом содержит изотоп или радиоизотоп в количестве, по меньшей мере большем, чем природное содержание изотопа или радиоизотопа. Например, когда атом обозначен как «D» или «дейтерий», подразумевается, что в положении присутствует дейтерий с содержанием, которое по меньшей мере в 3000 раз превышает естественное содержание дейтерия, которое составляет 0,015% (т.е. по меньшей мер, 45% включения дейтерия).
Все соединения и их фармацевтически приемлемые соли можно обнаружить вместе с другими веществами, такими как вода и растворители (например, гидраты и сольваты), или они могут являться выделенными.
Согласно некоторым вариантам осуществления получение соединений может включать в себя добавление кислот или оснований для воздействия, например, на катализ требуемой реакции или образование солевых форм, таких как соли присоединения кислоты.
Иллюстративные кислоты могут являться неорганическими или органическими кислотами и включают в себя без ограничения сильные и слабые кислоты. Некоторые примеры кислот включают в себя соляную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, фосфорную кислоту, п-толуолсульфоновую кислоту, 4-нитробензойную кислоту, метансульфоновую кислоту, бензолсульфоновую кислоту, трифторуксусную кислоту и азотную кислоту. Некоторые слабые кислоты включают в себя без ограничения уксусную кислоту, пропионовую кислоту, бутановую кислоту, бензойную кислоту, винную кислоту, пентановую кислоту, гексановую кислоту, гептановую кислоту, октановую кислоту, нонановую кислоту и декановую кислоту.
Иллюстративные основания включают в себя гидроксид лития, гидроксид натрия, гидроксид калия, карбонат лития, карбонат натрия, карбонат калия и бикарбонат натрия. Некоторые примеры сильных оснований включают в себя без ограничения гидроксид, алкоксиды, амиды металлов, гидриды металлов, диалкиламиды металлов и ариламины, причем алкоксиды включают в себя литиевые, натриевые и калиевые соли метил-, этил- и трет-бутилоксидов; амиды металлов включают в себя амид натрия, амид калия и амид лития; гидриды металлов включают в себя гидрид натрия, гидрид калия и гидрид лития; и диалкиламиды металлов включают в себя литиевые, натриевые и калиевые соли метил-, этил-, н-пропил-, изопропил-, н-бутил-, трет-бутил-, триметилсилил- и циклогексилзамещенных амидов.
Фраза «фармацевтически приемлемый» используют в настоящем документе для обозначения тех соединений, материалов, композиций и/или лекарственных форм, которые по результатам тщательной клинической оценки подходят для использования в контакте с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем или осложнений, соразмерно с разумным соотношением «риск/польза».
Remington's Pharmaceutical Sciences
Journal of Pharmaceutical Science
Handbook of Pharmaceutical Salts
Properties, Selection and Use
Настоящая заявка также включает в себя фармацевтически приемлемые соли описанных в настоящем документе соединений. Используемый настоящем документе термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к производным раскрытых соединений, причем исходное соединение модифицировано путем превращения существующего кислотного или основного фрагмента в его солевую форму. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают в себя без ограничения соли неорганических или органических кислот и основных остатков, таких как амины; щелочные или органические соли кислотных остатков, таких как карбоновые кислоты; и тому подобное. Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящей заявке включают в себя общепринятые нетоксические соли исходного соединения, образованные, например, из нетоксических неорганических или органических кислот. Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящей заявке можно синтезировать из исходного соединения, которое содержит основной или кислотный фрагмент, с помощью общепринятых химических способов. Как правило, такие соли можно получить путем реакции форм этих соединений в виде свободной кислоты или основания со стехиометрическим количеством подходящего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе или в их смеси; как правило, предпочтительными являются неводные среды, такие как простой эфир, этилацетат, спирты (например, метанол, этанол, изопропанол или бутанол) или ацетонитрил (MeCN). Перечни подходящих солей можно найти в , 17-е изд., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 и , 66, 2 (1977). Общепринятые способы получения солевых форм описаны, например, в : , Wiley-VCH, 2002.
Фармацевтические композиции
При использовании в качестве фармацевтических средств предусмотренные в настоящем документе соединения и их фармацевтически приемлемые соли можно вводить в форме фармацевтических композиций. Эти композиции можно получить, как описано в настоящем документе или где-либо еще, и можно вводить различными путями в зависимости от того, требуется ли местная или системная терапия, и от области, подлежащей лечению. Введение может являться местным (включая в себя трансдермальное, эпидермальное, офтальмологическое введение и введение на слизистые оболочки, включая в себя интраназальную, вагинальную и ректальную доставку), пульмонарным (например, путем ингаляции или инсуффляции порошков или аэрозолей, включая в себя посредством небулайзера; внутритрахеального или интраназального введения), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает в себя внутривенное, внутриартериальное, подкожное, интраперитонеальное, внутримышечное введение или инъекцию или инфузию; или внутричерепное (например, интратекальное или интравентрикулярное введение). Парентеральное введение можно осуществить в форме однократной болюсной дозы или можно осуществить, например, с помощью непрерывного перфузионного насоса. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе соединения или их фармацевтически приемлемые соли являются подходящими для парентерального введения. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе соединения являются подходящими для внутривенного введения. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе соединения являются подходящими для перорального введения. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе соединения являются подходящими для местного введения.
Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать в себя без ограничения трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Общепринятые фармацевтические носители, водные, порошкообразные или масляные основы, загустители и тому подобное могут являться необходимыми или желательными. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе фармацевтические композиции являются подходящими для парентерального введения. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе соединения можно составить для местной доставки (например, для лечения акне). Иллюстративный состав включает в себя следующее:
приблизительно 10 - приблизительно 50 мM предусмотренного в настоящем документе соединения (например, соединения 767)
приблизительно 50% (объемн./объемн.) 99,5 - 100% этанола или изопропанола
приблизительно 0,25 - приблизительно 2% (масс./объемн.) карбомера (например, карбомера 934 или карбомера 940)
приблизительно 0,5 - приблизительно 1% (масс./объемн.) троламина
вода (до 100%).
Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе фармацевтические композиции являются подходящими для внутривенного введения. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе фармацевтические композиции являются подходящими для перорального введения. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе фармацевтические композиции являются подходящими для местного введения.
Кроме того, предусмотрены фармацевтические композиции, которые содержат в качестве активного ингредиента предусмотренное в настоящем документе соединение или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями (например, вспомогательными веществами). При получении предусмотренных в настоящем документе фармацевтических композиций активный ингредиент, как правило, смешивают с вспомогательным веществом, разбавляют вспомогательным веществом или заключают в такой носитель в форме, например, капсулы, саше, бумаги или другого контейнера. Когда вспомогательное вещество служит разбавителем, он может представлять собой твердый, полутвердый или жидкий материал, который действует в качестве несущей среды, носителя или среды для активного ингредиента. Таким образом, композиции могут находиться, например, в форме таблеток, пилюль, порошков, пастилок, саше, крахмальных капсул, эликсиров, суспензий, эмульсий, растворов, сиропов, аэрозолей (в виде твердого вещества или в жидкой среде), мазей, мягких и твердых желатиновых капсул, суппозиториев, стерильных растворов для инъекций и стерильных упакованных порошков.
Некоторые примеры подходящих вспомогательных веществ включают в себя без ограничения лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, крахмалы, аравийскую камедь, фосфат кальция, альгинаты, трагакант, желатин, силикат кальция, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, целлюлозу, воду, сироп и метилцеллюлозу. Составы могут дополнительно включать в себя без ограничения смазывающие средства, такие как тальк, стеарат магния и минеральное масло; смачивающие средства; эмульгирующие и суспендирующие средства; консерванты, такие как метил- и пропилгидроксибензоаты; подсластители; ароматизаторы или их комбинации.
Активное соединение может являться эффективным в широком диапазоне доз и, как правило, его вводят в эффективном количестве. Тем не менее, следует понимать, что количество фактически введенного соединения, как правило, будет определять врач в соответствии с соответствующими обстоятельствами, включая в себя состояние, подлежащее лечению, выбранный путь введения, фактическое введенное соединение, возраст, массу тела и реакцию отдельного субъекта, тяжесть симптомов субъекта и тому подобное.
Предусмотренные в настоящем документе композиции можно вводить от одного или нескольких раз в день до одного или нескольких раз в неделю; включая в себя один раз в два дня. Специалисту в настоящей области техники понятно, что определенные факторы могут влиять на дозировку и интервалы введения, необходимые для эффективного лечения субъекта, включая в себя без ограничения тяжесть заболевания или нарушения, предшествующее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие присутствующие болезни. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством описанного в настоящем документе соединения может включать в себя однократное лечение или серию введений. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе композиции вводят в виде однократной дозы.
50
50
50
50
Дозировку, токсичность и терапевтическую эффективность предусмотренных в настоящем документе соединений можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD (доза, летальная для 50% популяции) и ED (доза, терапевтически эффективная в 50% популяции). Соотношение дозы между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический показатель, и его можно выразить как соотношение LD/ED. Соединения, проявляющие высокие терапевтические показатели, являются предпочтительными. Наряду с тем, что можно использовать соединения, которые проявляют токсические побочные эффекты, следует позаботиться о разработке системы доставки, которая направляет такие соединения на участок пораженной ткани, чтобы минимизировать потенциальное повреждение неинфицированных клеток и, таким образом, уменьшить побочные эффекты. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе соединения проявляют более низкую токсичность по сравнению с аналогичными дозировками орлистата. Оценку токсичности можно определить, например, с использованием способов, таких как те, что описаны в настоящем документе.
Способы лечения
Согласно настоящему раскрытию дополнительно предусмотрены способы лечения нарушений, ассоциированных с повышенными концентрациями липидов (например, липотоксичность). Ряд таких нарушений известен в настоящей области техники и может быть легко идентифицирован специалистом в настоящей области техники. Согласно некоторым вариантам осуществления способы предусматривают способ ингибирования липаз сыворотки у нуждающегося в этом субъекта, причем способ предусматривает введение субъекту терапевтически эффективного количества предусмотренного в настоящем документе соединения или его фармацевтически приемлемой соли. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе соединения снижают концентрации липазы в сыворотке. Согласно некоторым вариантам осуществления липаза представляет собой панкреатическую липазу, такую как триацилглицеролипаза поджелудочной железы человека (hPNLIP), связанный с панкреатической липазой белок 2 человека (hPLRP2) и колипаза человека (hCEL). Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе соединения могут снижать или ингибировать образование свободных жирных кислот. Например, предусмотренные в настоящем документе соединения могут уменьшать концентрации свободных жирных кислот в сыворотке.
Используемый в настоящем документе термин «субъект» относится к любому животному, включая в себя млекопитающих. Например, термин «субъект» включает в себя без ограничения мышей, крыс, других грызунов, кроликов, собак, кошек, свиней, крупного рогатого скота, овец, лошадей, приматов и людей. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой человека. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает ожирением. Используемый в настоящем документе термин «страдающий ожирением» относится к субъекту, характеризующемуся индексом массы тела, превышающим 23, 25 и, в частности, превышающим или равным 30. Альтернативно, он может представлять собой увеличение содержания брюшного жира или обхвата тела больше, чем нормальный показатель для этой расы, этнической группы, пола или национальности индивидуума.
in vitro
Согласно некоторым вариантам осуществления описанные в настоящем документе способы могут предусматривать способы , например, приведение в контакт образца (например, клетки или ткани) с предусмотренным в настоящем документе соединением или его фармацевтически приемлемой солью.
Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой острый панкреатит. Например, острый панкреатит может являться тяжелым. Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе способы могут являться применимыми для снижения степени тяжести острого панкреатита от тяжелого случая до легкого случая панкреатита. Согласно настоящему раскрытию предусмотрены способы лечения одного или нескольких симптомов панкреатита у нуждающегося в этом субъекта путем введения терапевтически эффективного количества предусмотренного в настоящем документе соединения или его фармацевтически приемлемой соли для лечения одного или нескольких симптомов острого панкреатита. Иллюстративные симптомы острого панкреатита включают в себя боль в животе, боль в спине, вздутие живота, тошноту, рвоту, лихорадку, учащенный пульс, одышку, низкую температуру тела и тому подобное.
Неограничивающие варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают способ снижения риска функциональной недостаточности органов у субъекта, страдающего от острого панкреатита, предусматривающий введение субъекту эффективного количества ингибитора панкреатической липазы. Органы, для которых риск функциональной недостаточности органа может быть снижен, включают в себя почку (при этом недостаточность называется почечная недостаточность), легкое (при этом недостаточность называется легочная недостаточность), шок с низким кровяным давлением или увеличением частоты сердечных сокращений или появлением отека легких (отмечается как влажные хрипы при аускультации, или на рентгене грудной клетки, или при КТ-сканировании), а также полиорганную недостаточность (например, синдром полиорганной недостаточности, затрагивающий по меньшей мере эти два органа). Состояние этих органов можно определить с использованием клинических методов, хорошо известных в настоящей области техники. Например, без ограничения, функцию почек (и развитие почечной недостаточности) можно оценивать по повышенным содержаниям азота мочевины в крови, повышенному креатинину, уменьшенному диурезу и/или гистологическим данным; функцию легких и развитие легочной недостаточности можно оценивать с помощью исследования функции внешнего дыхания, содержания газов крови (содержания кислорода и углекислого газа), по потребностям в кислородной поддержке (например, носовая канюля или маска для лица или аппарат искусственной вентиляции легких, с различными процентными показателями и расходами кислорода) и/или гистологическим данным; (в отношении показателей функциональной недостаточности органов см. J. Wallach, 1978, Interpretation of Diagnostic Tests, Third Edition, Little, Brown and Co., Boston, и/или J. Wallach, 2006, Interpretation of Diagnostic Tests, Eighth Edition, Lippincott Williams & Wilkins, оба документа полностью включены в настоящий документ посредством ссылки). Аналогично, показатель системного воспаления представляет собой увеличение содержаний одного или нескольких медиаторов воспаления, включая в себя без ограничения CRP или части критериев синдрома системного воспалительного ответа (SIRS), фактор некроза опухоли альфа, хемотаксический белок 1 моноцитов и/или интерлейкин 6. Эти варианты осуществления подтверждаются, по меньшей мере частично, приведенными ниже рабочими примерами, которые показывают эффективность ингибиторов панкреатической липазы в снижении риска полиорганной недостаточности.
Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотренные в настоящем документе соединения являются применимыми для снижения риска вторичных эффектов острого панкреатита у нуждающегося в этом субъекта. Например, риск развития шока может снижаться. Согласно некоторым вариантам осуществления риск развития почечной недостаточности снижается. Согласно некоторым вариантам осуществления риск развития легочной недостаточности снижается.
P. auregenosa
S. aureus
B. subtilis
B. cepecia
Ann Surg
Trauma Mon
J Trauma
J Chin Med Assoc
Chest
Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой акне. Согласно другим вариантам осуществления нарушение представляет собой травму, кровоизлияние, критическое заболевание или сепсис. Например, сепсис представляет собой культурально-негативный сепсис. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой ожог. Согласно другим вариантам осуществления нарушение представляет собой инфекцию. Например, инфекция может быть вызвана одним или несколькими организмами, выбранными из группы, состоящей из , ,  и . См., например, Ryan CM, Sheridan RL, Schoenfeld DA, Warshaw AL, Tompkins RG: Postburn pancreatitis.  1995, 222(2):163-170; Subramanian A, Albert V, Mishra B, Sanoria S, Pandey RM: Association Between the Pancreatic Enzyme Level and Organ Failure in Trauma Patients.  2016, 21(2):e20773; Malinoski DJ, Hadjizacharia P, Salim A, Kim H, Dolich MO, Cinat M, Barrios C, Lekawa ME, Hoyt DB: Elevated serum pancreatic enzyme levels after hemorrhagic shock predict organ failure and death.  2009, 67(3):445-449; Lee CC, Chung WY, Shih YH: Elevated amylase and lipase levels in the neurosurgery intensive care unit.  2010, 73(1):8-14; и Manjuck J, Zein J, Carpati C, Astiz M: Clinical significance of increased lipase levels on admission to the ICU.  2005, 127(1):246-250.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение и испытание неформилированных аналогов аминокислот
Получали ряд неформилированных аналогов аминокислот, в которых сложный аминоэфир L-лейцина заменен заместителями. Стадии синтеза, включенные в этот процесс, описаны на фиг. 2. Как показано на фиг. 3, полученные соединения включали в себя соединения, где сложный аминоэфир L-лейцина (№ 723, который также является орлистатом) заменяли заместителями, такими как N-метиллейцин (№ 724) или более полярными или более короткими заместителями, включая в себя L-аланин (№ 716), N- ацетил-L-цистин (№ 717), L-аспартат (№ 718), L-гистидин (№ 725), L-метионинсульфон (№ 726), L-аргинин (№727), L-диаминопимелиновая кислота (№ 728) L-серин (№ 729), L-орнитин (№ 731) или N-ацетиллейцин (№ 732).
Для испытания эффективности этих соединений агенты растворяли в виде 20 мМ маточного раствора в этаноле и дополнительно разбавляли до PBS в виде 600 мкмоль рабочего маточного раствора (3,3% этанола). Его использовали либо сразу, либо оставляли при комнатной температуре на 16-20 часов в течение ночи перед повторным испытанием эффективности. Агенты инкубировали с лизатом поджелудочной железы в последовательных 1/3 разведениях в диапазоне от 200 до 0,3 мкмоль в течение 30 минут. Затем 5 мкл этих смесей использовали для измерения активности липазы с использованием коммерческого анализа липазы (Pointe Scientific), содержащего моноацилглицероллипазу в реагенте. Анализ липазы проводили с использованием реагентов пропорционально рекомендованному протоколу. Значения представляли как % максимальной липазной активности в лунке без какого-либо ингибитора. Как можно видеть, не наблюдали повышения эффективности неформилированных аналогов орлистата по сравнению с эффективностью орлистата (фиг. 4).
Пример 2. Получение и испытание формилированных аналогов аминокислот
Получали ряд формилированных аналогов аминокислот, в которых сложный аминоэфир L-лейцина заменен заместителями. Стадии синтеза, включенные в этот процесс, описаны на фиг. 2 и фиг. 5.
Sci Transl Med
50
Эти агенты (№ 733, 734, 738, 739, 740, 742, 743, как показано на фиг. 6) первоначально испытывали, как описано в примере 1. Отметили, что соединения 741, 736, 743 характеризовались приблизительно в 10 раз улучшением стабильности и эффективности по сравнению с орлистатом после хранения в течение ночи (фиг. 7). Далее соединения испытывали в отношении эффективности в снижении липотоксического повреждения ацинарных клеток в совместной культуре ацинарных клеток и адипоцитов, как описано в Navina S, Acharya C, DeLany JP, Orlichenko LS, Baty CJ, Shiva SS, Durgampudi C, Karlsson JM, Lee K, Bae KT et al: Lipotoxicity causes multisystem organ failure and exacerbates acute pancreatitis in obesity.  2011, 3(107):107ra110 (фиг. 8A), и хотя все агенты являлись эффективными в концентрации, составляющей 66 мкмоль (ближайшая концентрация к IC орлистата после инкубации в течение ночи), отметили, что соединение 743 является токсическим для ацинарных клеток (фиг. 8В) и соединение 741 являлось наименее токсическим при этой концентрации, сохраняя при этом свою эффективность. Соединение 736 также сохранило свою эффективность при низкой токсичности.
Пример 3. Получение и испытание аналогов β-цепи
Для дальнейшего изучения вариантов повышения эффективности аналогов бета-цепь 741 изменяли, чтобы сделать ее более гидрофильной. Для этого соединения 760, 762, 763 получали, как описано на фиг. 9-14. Модификации в этом положении были связаны с отсутствием улучшения эффективности ингибирования липазы, и, фактически, наблюдалось снижение эффективности. См. фиг. 15.
Пример 4. Получение и испытание аналогов α-цепи
Серию аналогов получали на основе модификаций альфа-цепи, как показано на фиг. 16, создавая соединения 767 и 768. Хотя эти агенты характеризовались эквивалентной эффективностью в анализе активности липазы по отношению к орлистату в свежем виде, агент 767 значительно сохранял свою эффективность в виде раствора при хранении в течение ночи. См. фиг. 17.
Пример 5. Ингибирование образования свободных жирных кислот (FFA), токсичность и эффективность при ингибировании рекомбинантной триацилглицеролипазы поджелудочной железы человека [hPNLIP], связанного с панкреатической липазой белка 2 человека (hPLRP2) и карбоксиэфирлипазы человека (hCEL)
50
50
Эффективность выбора полученных аналогов исследовали для определения их способности ингибировать образование свободных жирных кислот (FFA) из рекомбинантных липаз человека при сохранении стабильности. Для испытания этих характеристик аналоги растворяли в этаноле (200 мМ маточный раствор) и дополнительно разбавляли до 600 мкмоль (0,3% этанола) рабочего маточного раствора в PBS. Агенты инкубировали с рекомбинантными ферментами в серийных 1/3 разведениях в диапазоне от 200 до 0,3 мкмоль в течение 30 минут, а затем добавляли к субстрату 1 мМ глицерилтрилинолеата (GTL) в PBS, pH 7,4 вместе с кофактором колипазой (CLPS; 0,5 мкг/мл). Как видно на фиг. 18, агенты 767, 733, 734, 740 и 743 характеризовались IC против рекомбинантной триацилглицеролипазы поджелудочной железы человека [PNLIP; hPTL, в присутствии колипазы (CLPS)], которые были в 50 раз ниже, чем орлистат, или 741, сохраняя IC <2 мкмоль при хранении в течение ночи. В частности, соединения 767 и 740 показали лучшую стабильность.
Исследования токсичности соответствующих соединений также проводили с использованием разбавления 200 мМ исходного маточного раствора в этаноле в инкубационной среде для ацинарных клеток (буфер HEPES, pH 7,4, как описано Navina с соавт.) до 600 мкмоль маточных растворов соединений в 0,3% этаноле в PBS. Их добавляли к ацинарным клеткам в 1/3 разведениях, начиная с 200 мкмоль. Содержания ATP поджелудочной железы мыши и утечку LDH измеряли в течение 4 часов и сравнивали с контролем. Любое число, положительное по сравнению с контролем, указывает на % повреждения больше, чем у контрольных ацинарных клеток. Агент 743 (см. фиг. 8B) и 733, тем не менее, являлись токсичными для ацинарных клеток, вызывая падение ATP и утечку LDH (см. фиг. 19) при концентрациях в диапазоне 20-200 мкмоль - концентрациях, относящихся к применению in vivo.
50
Эти соединения дополнительно испытывали в отношении эффективности в снижении рекомбинантного связанного с липазой поджелудочной железы белка 2 человека (hPLRP2) и карбоксиэфирлипазы человека (hCEL), как показано на фиг. 20. Эти липазы составляют 15-30% панкреатических липаз. Агенты 740, 734 и 767 снова показали IC, составляющие 2 мкмоль или менее. Относительная активность и токсичность обобщенно показаны в таблице на фиг. 21. Отмечая это, наряду с сильными сторонами 767, т.е. а) более высокой эффективностью в отношении лизатов поджелудочной железы мыши (фиг. 7 и 17), б) более высокой эффективностью в отношении наиболее распространенной липазы (hPTL) (фиг. 18), с) лучшей стабильностью в водной среде (фиг. 17 и 18) и d) более низкой токсичностью (фиг. 19), соединение 767 выбрали для продолжения исследований in vivo. Кроме того, агенты 740 и 767 в концентрации, составляющей 10 мкмоль, являлись менее токсичными и более эффективными в снижении вызванного GTL повреждения ацинарных клеток, чем орлистат (фиг. 28).
Пример 6. In vivo исследования соединения 767
Цель этого исследования in vivo состояла в том, чтобы узнать, можно ли снизить тяжесть летального панкреатита у мышей, когда соединение 767 вводят в виде однократной терапевтической дозы, и может ли это соединение избежать ограничений орлистата, например, введения повторных высоких доз и гипертриглицеридемии. См. фиг. 22.
Соединение 767 или орлистат растворяли в виде 1 мг/10 мкл этанола, который разбавляли до 400 мкл с помощью солевого раствора (конечная концентрация 2,5% этанола). Использовали страдающих генетическим ожирением самцов мышей ob/ob (50-60 г) и забор крови осуществляли из хвостовой вены для определения исходного содержания в сыворотке липазы, триглицеридов и BUN (азот мочевины крови). Хронология показана на фиг. 23А. Тяжелый панкреатит индуцировали путем подкожной имплантации насоса Alzet, содержащего 2,5 мг/мл церулеина, который вводили в дозе, составляющей 50 мкг/кг/час. Через шесть часов образец крови из хвостовой вены (50 мкл) анализировали в отношении содержания липазы в сыворотке, чтобы подтвердить увеличение, составляющее более чем в 3 раза от исходного уровня. Как видно на фиг. 23B, это было достигнуто (P = 0,003).
Затем агенты вводили в виде интраперитонеальной дозы (20 мг/кг однократной дозы [n=8 для 767 или орлистат n=7]. Животным вводили физиологический раствор интраперитонеально 1 мл два раза в день, жизненно важные органы подвергали мониторингу ежедневно, обращая внимание на тяжесть (температура при лихорадке или гипотермия и пульс при шоке.) Они соответственно являются частью SIRS и пересмотренной атлантской классификации критериев тяжести (Классификация острого панкреатита - 2012: пересмотр атлантской классификации и определений по международному консенсусу. (Classification of acute pancreatitis--2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus) Gut 2013, 62(1):102-111)). Образцы крови из хвостовой вены собирали в отношении параметров тяжести (BUN в сыворотке, содержание кальция в сыворотке и общее количество лейкоцитов), которые являются частью критериев Рэнсона и Глазго) и содержания триглицеридов. Животных умерщвляли, если они испытывали агонию.
in vivo
Как видно на фиг. 23,  у всех не получивших лечение мышей развилась почечная недостаточность (BUN 85 ± 18 мг/дл) фиг. 23C, гипокальциемия (содержание кальция в сыворотке 4,9 ± 0,2 мг/дл) фиг. 23D, SIRS фиг. 23Е, шок фиг. 23F и 100% смертность фиг. 23G. Агент 767 являлся более эффективным, чем орлистат, в нормализации BUN (пик 18,5 ± 0,9 по сравнению с орлистатом 50 ± 4,4 мг/дл, р <0,05) фиг. 23C, содержания кальция в сыворотке (8,8 ± 1,0 мг/дл по сравнению с 4,2 ± 0,3 мг/дл, р <0,05) фиг. 23D, UFA (2,4 ± 0,4 мМ по сравнению с 5,4 ± 0,9 мМ), предотвращении шока (PD: 290 ± 20 мкм по сравнению с 171 ± 21 мкм, р <0,05) фиг. 23F, лейкопении (у 0/8 мышей по сравнению с 4/7 мышей, р <0,03, см. фиг. 25), гипотермии (94,1 ± 0,8 по сравнению с 86 ± 0,9°F, р <0,01; фиг. 23E) и улучшении 5-дневной выживаемости (8/8 по сравнению с 2/7, р <0,01) фиг. 23G. В группе, которой вводили несущую среду, смертность составляла 8/8 (среднее время 44 часа), в группе, которой вводили орлистат - 5/7. Макроскопическую картину для двух агентов сравнивали на фиг. 24. Как можно видеть, у животного, получавшего орлистат, наблюдался гораздо более обширный жировой некроз. Эта защита с помощью агента 767 была достигнута без гипертриглицеридемии, связанной с дозировкой, необходимой для защиты с помощью орлистата (фиг. 25). Результаты обобщенно представлены в таблице на фиг. 25.
Пример 7. Создание FFA в среде P. acnes
Вызванный P. acnes липолиз ингибировался с помощью 767 (фиг. 26 и фиг. 27).
Бульонная культура P. acnes:
P. acnes
Для среды: 2,0 г ферментативного гидролизата казеина (№ по кат. 12855, Affymetrix Inc, Огайо, США), 1,0 г дрожжевого экстракта (№ по кат. 61180-5000, Acros organics, Нью-Джерси, США) и 0,03 г Victoria Blue B (№ по кат. sc-216055, Santa Crutz Biotechnology Inc, Калифорния, США) полностью растворяли в 200 мл дважды дистиллированной воды при слабом нагревании. Смешанный раствор стерилизовали в автоклаве при давлении 15 фунтов (121°C) в течение 15 минут. Автоклавированному раствору давали остыть до 50°C, затем медленно добавляли 6 мл эмульгированного липазного субстрата при непрерывном перемешивании для получения равномерного распределения и хранили при 4°C для культуры .
Получение липазного субстрата: Липазный субстрат получали путем смешивания 200 мкл Tween 80 (№ по кат. P4780, Sigma, Сент-Луис, США) в 100 мл теплой дважды дистиллированной воды и 25 мл масла семян хлопчатника (№ по кат. C0145, Spectrum chemical, Калифорния, США). Смесь энергично перемешивали с последующей обработкой ультразвуком (импульс 10 сек × 5 раз) для получения эмульсии.
Среда для культивирования-размножения P. acnes, условия хранения, размер инокулята, используемого в среде.
Propionibacterium acnes
Небольшую часть лиофилизированных  (штамм VPI0389, ATCC) добавляли в среду и давали возможность расти при 37°C в течение 48 часов в стандартном инкубационном контейнере BD GasPak EZ (№ по кат. 260671, Beckton Dickinson, MD, США) с двумя анаэробными саше (№ по кат. 260683, Beckton Dickinson, MD, США), которые поддерживали анаэробные условия в контейнере. Через 48 ч культивирования количество бактерий измеряли турбидиметрическим методом (ОП 600 нм). Количество секретируемой липазы и производимой FFA измеряли в супернатанте культуры.
P. acnes
P. acnes
Для хранения  культивированные бактерии в 1,5 мл автоклавированной микроцентрифуге Эппендорфа (1 мл/микроцентрифуга) центрифугировали при 5 об/мин в течение 5 минут, удаляли отработанную среду, осажденные бактерии ресуспендировали в содержащей 15% глицерин среде культивирования  (1 мл/микроцентрифуга) без субстрата и хранили при -80°C для дальнейшего использования.
P acnes
P acnes
P. acnes
Для дальнейшего культивирования  один аликвотированный концентрат  извлекали из -80°C и оттаивали во льду. Почти 30 мкл концентрата  (1 × 10°/30 мкл) добавляли в 1 мл среды культивирования с липазным субстратом в каждую 2 мл микроцентрифугу Эппендорфа и инкубировали при 37°C в течение 48 часов в анаэробных условиях.
Испытание эффективности или ингибиторы липазы против P. acnes:
Орлистат или агент 767 (маточный раствор 200 мМ в этаноле) добавляли в указанных концентрациях в начале инкубации. В конце инкубационного периода часть хорошо перемешанной среды удаляли и анализировали образование свободных жирных кислот с использованием набора HR Series NEFA-HR(2) от Wako Diagnostics (Richmond Virginia).
Агаровая культура P. acnes
Агар со спиртовым голубым: поставщик, № по каталогу. Получение, хранение. Размер инокулята культуры, условия культивирования.
P. acnes
Для получения планшета 3,215 г агара со спиртовым голубым (№ по кат. M445, HiMedia Laboratories Pvt Ltd, Мумбаи, Индия) растворяли в 100 мл дважды дистиллированной воды, автоклавировали, оставляли охлаждаться до 55°C, добавляли 3 мл теплого липазного субстрата и хорошо перемешивали. В теплом состоянии смесь выливали в планшеты для тканевых культур (6-луночные, 12-луночные планшеты) в асептических условиях. Планшеты с отвержденным агаром обертывали парафильмом и выдерживали при 37°С в течение ночи, чтобы подтвердить отсутствие загрязнения. Дополнительные планшеты хранили при 4°C в морозильной камере для дальнейшего использования. Оттаявшие концентраты , извлеченные из -80°C, либо распределяли (30 мкл/лунку) в 6-луночные/12-луночные планшеты, либо инокулировали по всей лунке с помощью инокуляционных петель. Затем планшеты хранили при 37°C в камере BD GasPak EZ с одним анаэробным саше и ожидали 5-7 дней, чтобы увидеть бактериальные колонии. Затем их визуализировали и фотографировали на транс-осветителе.
Другие варианты осуществления
Следует понимать, что, хотя настоящее изобретение описано в сочетании с его подробным раскрытием, вышеприведенное описание предназначено для иллюстрации, а не для ограничения объема настоящего изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах объема приведенной ниже формулы изобретения.