СПОСОБ АДАПТАЦИИ
ADAPTATION METHOD

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, в основном, относится к выращиванию бактерий. Более конкретно, изобретение относится к способу адаптации анаэробных микроорганизмов к окислительной среде и его применению в разработке новых пробиотиков. Настоящее изобретение также относится к новым (адаптированным) штаммам, полученным способами по изобретению.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Микробиота кишечника взрослого человека состоит из до 100 триллионов микроорганизмов, что эквивалентно десяти общим количествам соматических и половых клеток организма. Совокупность геномов микроорганизмов кишечника (микробиом) может содержать более чем в 150 раз больше генов, чем собственный геном человека и наделяет людей физиологическими способностями, которые людям не приходилось развивать самостоятельно. Однако эти сообщества остаются, главным образом, неисследованными, что оставляет почти полностью неизвестным их влияние на развитие, физиологию, иммунитет, питание и здоровье человека. Микробное сообщество обладает неограниченной способностью влиять на биологию носителя и является фундаментальным для развития иммунной системы человека, способности переваривать в ином случае неперевариваемые пищевые полисахариды, в дополнение к тому, что они являются источником для образования витаминов и гормонов и т.д. Микробные сообщества в толстом кишечнике играют жизненно важную роль в регуляции состояния кишечника и патогенезе нескольких заболеваний.
Традиционная микробиология фокусируется на исследовании отдельных видов как изолированных единиц. Однако многие из них, если не большинство, никогда не были успешно выделены как жизнеспособные образцы для анализа, вероятно, из-за того, что их рост зависит от конкретного микроокружения, не воспроизведенного в экспериментальных условиях. Прогресс в технологиях секвенирования ДНК создал новую область исследований, названную метагеномикой, делающую возможной всестороннее исследование микробных сообществ, даже состоящих из некультивируемых организмов. Вместо исследования генома отдельного бактериального штамма, выращенного в лаборатории, метагеномный подход позволяет анализировать генетический материал, полученный из полных микробных сообществ, собранных из естественных сред.
Микробиом кишечника человека служит в качестве ресурса полезных микроорганизмов, потенциальных пробиотиков. Несмотря на профилактическую и стимулирующую роль микробиоты кишечника в таких заболеваниях, как воспалительное заболевание кишечника, сердечно-сосудистое заболевание, диабет и расстройствам аутистического спектра, ни одно из доступных лекарственных средств не содержит новые пробиотики или так называемые пробиотики следующего поколения, что описано в нескольких метагеномных исследованиях. Даже при успешном выделении, для многих микробов, выделенных из кишечника, необходимы строгие анаэробные условия выращивания, и они не могут существовать более пары минут под воздействием окружающего воздуха. Это усложняет разработку стабильных и устойчивых составов пробиотиков. Таким образом, существует потребность в более толерантных к кислороду анаэробных микроорганизмах, и настоящее изобретение относится к способу адаптации анаэробных микроорганизмов, а также новым штаммам микроорганизмов, полученных такими способами.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу адаптации анаэробных микроорганизмов к окислительной среде, таким образом, позволяющему таким организмам быть относительно более толерантными к кислороду под воздействием окружающего воздуха. Он обладает дополнительным преимуществом улучшенного культивирования и хранения микроорганизмов, например, более длительного хранения.
Настоящее изобретение относится к имитационной модели окисления-восстановления в кишечнике человека (SHIRM), в которой происходит поэтапная двойная индукция оксидативного стресса с помощью приложенного напряжения и диффузии кислорода и поэтапного изменения соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта для коррекции окислительно-восстановительного статуса.
Кислород летален для анаэробных микроорганизмов, поэтому растворенный кислород, используемый для оксидативного стресса, (концентрация кислорода) будет повышаться, но сохраняться на уровне сублетальной концентрации при использовании пары антиоксидант/окисленный вариант для коррекции окислительно-восстановительного статуса среды. Оксидативный стресс также индуцируют с помощью приложенного напряжения. Оксидативный стресс повышает толерантность бактерий к окислительной среде и позволяет поддерживать жизнеспособность микроорганизмов в окружающем воздухе в течение относительно более длительных периодов времени.
Подходящие сублетальные концентрации кислорода (концентрации, не приводящие к гибели всех присутствующих бактерий, или, другими словами, концентрации, при которых погибают некоторые, но не все, бактерии) легко можно определять, например, таким образом, что, по меньшей мере, некоторые (но, как правило, не все) бактерии могут выживать, а затем их можно выбирать для следующей стадии способов. Затем выжившие бактерии снова выращивают, например, с повышением оксидативного стресса (например, посредством повышения концентрации растворенного кислорода), таким образом, что снова, по меньшей мере, некоторые (но, как правило, не все) бактерии могут выживать, а затем их можно выбирать для следующей стадии способов. Затем эту стадию повышения оксидативного стресса можно повторять снова столько раз, сколько необходимо или желательно для получения более толерантных к кислороду микроорганизмов.
Настоящее изобретение относится к способу адаптации анаэробных микроорганизмов и селекции более толерантных к кислороду анаэробных микроорганизмов, включающему стадии культивирования указанных микроорганизмов с поэтапной двойной индукцией оксидативного стресса с помощью приложенного напряжения и диффузии кислорода и поэтапным изменением окислительно-восстановительного статуса, где, предпочтительно, происходит поэтапное изменение окислительно-восстановительного статуса при использовании поэтапного изменения соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта для коррекции окислительно-восстановительного статуса.
Настоящее изобретение относится к способу адаптации (или тренировки) анаэробных микроорганизмов и селекции более толерантных к кислороду (например, относительно более толерантных к кислороду) анаэробных микроорганизмов, где микроорганизмы культивируют с комбинацией поэтапной двойной индукции оксидативного стресса с помощью приложенного напряжения и диффузии кислорода и поэтапного изменения соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта для коррекции окислительно-восстановительного статуса.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу улучшенного получения анаэробных микроорганизмов, где микроорганизмы культивируют с комбинированием константы окислительного потенциала/приложенного напряжения, диффузии кислорода и соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта, таким образом, делая возможным селективное давление и получая высокий выход конкретных штаммов микроорганизмов. Указанная культура находится в оптимальных условиях, или, другими словами, комбинацию константы окислительного потенциала/приложенного напряжения, диффузии кислорода и соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта оптимизируют для получения анаэробных микроорганизмов.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
фигуре 1
Напоказана совокупность окисления-восстановления просвета кишечника человека. Несмотря на наличие непрерывного притока кислорода при потреблении пищи и посредством диффузии из слизистой оболочки кишечника, совокупный окислительно-восстановительный потенциал кишечника остается отрицательным, приблизительно -300 мВ.
фигуре 2
Напоказано потенциальное повреждение чувствительных к кислороду ферментов, вызванное оксидативным стрессом, и механизм восстановления.
фигуре 3
Напоказан основной ферментативный путь, используемый микробиотой в кишечнике человека.
Фигура 4a
Сделанная на заказ 3-камерная имитационная модель окисления-восстановления в кишечнике человека (SHIRM).
Фигура 4b
o
Схема потока электронов из бактериальных клеток к акцепторам электронов в SHIRM. Окислительно-восстановительные потенциалы (восстановительный потенциал и окислительный потенциал), измеряемые в (E') вольтах.
Фигура 4c
Схема SHIRM промежуточных соединений, вовлеченных в перенос электронов от бактериальной клетки к акцепторам электронов, включающая окислительно-восстановительные потенциалы.
Фигура 5
Основной ход операций SHIRM.
Фигура 6
Изображение анодной камеры SHIRM, соединенной с небольшим объемом слоя, приблизительно 100 мл, кислородного фидера.
Фигура 7
SHIRM с потреблением воздуха: прямая диффузия кислорода из воздуха в анодную камеру через боковое ответвление.
Фигура 8
Ход операций SHIRM, 10 стадий.
Фигура 9
Селекция адаптированных штаммов.
Фигура 10
Стратегия исследования профилей толерантности адаптированных штаммов к кислороду.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ И ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВАРИАНТЫ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
in vitro
"Адаптация" является динамическим эволюционным процессом, например, результатом естественного отбора, посредством которого организм становится более приспособленным к жизни его естественной среде. Процесс адаптации (или тренировки) микроорганизмов также, предпочтительно, можно осуществлять в ненативной/искусственной/ среде, например, способами по настоящему изобретению.
"Антиоксидант" является средством, предотвращающим образование реактивных форм кислорода, азота, гидроксила и липидов посредством утилизации свободных радикалов или репарации или удаления поврежденных молекул. Антиоксиданты часто могут действовать напрямую как восстановители.
"Восстановитель" является веществом, элементом или соединением, теряющим (или "отдающим") электрон другому средству в окислительно-восстановительной химической реакции. Т.к. восстановитель теряет электроны, говорят, что он окисляется.
"Окисленные варианты" являются химическими веществами, вызывающими удаление электрона из других молекул. Окисленный вариант является окисленной формой антиоксиданта.
"Медиаторы окисления-восстановления" или переносчики электронов являются соединениями, которые могут подвергаться обратимой реакции окисления-восстановления и способствовать переносу электронов к бактериям и от них.
Термины "приложенное напряжение", "внешнее напряжение", "окислительный потенциал", "приложенный электрический окислительный потенциал", "приложенный электродный потенциал", "напряжение" и "потенциал напряжения" можно использовать взаимозаменяемо, и они относятся к напряжению, приложенному к камерам биореактора.
"Диффузия кислорода" является движением молекул кислорода от высокой концентрации к низкой.
"Приток кислорода" является количеством кислорода, поступающим в камеру за единицу времени, например, анодную камеру, содержащую микроорганизмы.
Микробиота кишечника вместе с поступающими с пищей окислительно-восстановитальными активными соединениями и донорами электронов, такими как углеводы и белки, играют роль в поддержании восстановительной среды в кишечнике. Это означает, что микробиота кишечника адаптирована к тому, чтобы справляться с притоком растворенного кислорода в просвете кишечника (фигура 1). Растворенный кислород в высоких концентрациях может быть летальным для большого количества микроорганизмов кишечника, и восстановительная среда помогает им восстанавливаться от оксидативного повреждения (фигура 2). Более подробно, на фигуре 3 показан основной ферментативный путь, используемой микробиотой в кишечнике человека. Диспропорция электронов при анаэробном росте сбалансирована ферментацией с образованием смеси органических кислот и образованием газа. Некоторые микроорганизмы отдают электроны внеклеточным акцепторам электронов, таким как нитрат, сульфат или нерастворимый комплекс металла. Кроме того, кислород может действовать в качестве непрямого акцептора электронов, т.к. некоторые из микроорганизмов кишечника могут потреблять кислород в небольших количествах. Окислительно-восстановительные активные соединения, такие как галлаты, рутин, ресвератрол, кофеин и флавины, присутствуют в обычной пище, вероятно, в форме, окисленной в пищеварительном тракте, они также могут действовать как акцепторы электронов (фигура 1). Окислительно-восстановительный статус кишечника может влиять на биодоступность конкретных лекарственных средств или метаболитов. Несмотря на наличие непрерывного притока кислорода при потреблении пищи и посредством диффузии из слизистой оболочки кишечника совокупный окислительно-восстановительный потенциал кишечника остается отрицательным, приблизительно -300 мВ. Эта восстановительная среда с недостаточностью кислорода способствует росту определенных анаэробных микроорганизмов в просвете кишечника.
in vitro
Высокая чувствительность к кислороду является характерным признаком многих микроорганизмов кишечника, что делает крайне затруднительным культивирование и хранение этих микроорганизмов в течение длительного периода времени. Другим препятствием при выделении и культивировании представителей микробиоты кишечника для разработки новых потенциальных пробиотиков является сложность кишечной среды в терминах различных ниш и мест обитания. Состав пробиотика должен быть стабильным в окружающем воздухе в течение нескольких месяцев, но это затруднительно, учитывая чувствительность многих микроорганизмов кишечника к кислороду. Некоторые микроорганизмы кишечника перекрестно питаются от других микроорганизмов, и для них также могут потребоваться некоторые факторы роста носителя, что затрудняет имитацию этих условий .
Faecalibacterium prausnitzii
F. prausnitzii
F. prausnitzii
является примером потенциального пробиотика с противовоспалительными свойствами при различных метаболических заболеваниях. Они составляют более 5% бактерий в кишечнике человека, что делает их одними из наиболее многочисленных бактерий в микробиоте кишечника.  продуцирует относительно большие количества бутирата, играющего важную роль в физиологии кишечника и являющегося основным метаболитом в просвете толстого кишечника. Бутират также стимулирует пролиферацию клеток и способствует секреции слизи из слизистой оболочки толстого кишечника. является крайне чувствительной к кислороду бактерией и живет всего несколько минут при воздействии окружающего воздуха.
F. prausnitzii
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаруживали новый способ адаптации анаэробных микроорганизмов к кислороду и в настоящем описании описывают способ указанной адаптации к кислороду, таким образом, позволяющий таким организмам становиться относительно более толерантными к кислороду и, таким образом, стабильными и устойчивыми при хранении и применении в качестве пробиотических штаммов и в составах или композициях пробиотиков для воздействия на млекопитающих. Новый способ, в частности, сделает возможными разработку и применение  в качестве пробиотического штамма с устойчивыми характеристиками так, что они будут толерантными при получении в промышленных масштабах и способными адаптироваться к среде кишечника человека в условиях кишечных нарушений, для которых основным признаком является оксидативный стресс.
in vitro.
Настоящее изобретение относится к способу адаптации анаэробных микроорганизмов и селекции относительно более толерантных к кислороду анаэробных микроорганизмов, где микроорганизмы культивируют с использованием комбинации поэтапной двойной индукции оксидативного стресса посредством приложенного напряжения и диффузии кислорода и поэтапного изменения соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта для коррекции окислительно-восстановительного статуса. Таким образом, способы по изобретению, как правило, осуществляют
Двойная индукция оксидативного стресса повышает толерантность микроорганизмов к окислительной среде, таким образом, позволяя микроорганизмам быть более, или относительно более, толерантными к кислороду (например, при воздействии окружающего воздуха). Термин "микроорганизмы, более (или относительно более) толерантные к кислороду (например, при воздействии окружающего воздуха)" может относиться к сравнению с начальными штаммами (или родительскими штаммами), используемыми в способах адаптации по изобретению.
Повышенная толерантность к кислороду позволяет сохранять жизнеспособность микроорганизмов в окружающем воздухе в течение относительно более длительных периодов времени, что очевидно является преимуществом.
Приложенное напряжение или приложенное внешнее напряжение, как правило, прикладывают к аноду, например, аноду из графита, графитового войлока, или углеродного войлока, или углеродного волокна, например, через потенциостат, и повышают его поэтапно. Для приложения напряжения к микроорганизмам, их помещают в подходящую анодную камеру или другой сосуд, например, биореактор, к которому прикладывают напряжение. Цепь замыкают, например, соединяя катодную камеру с анодной камерой, например, с помощью одной бокового ответвления анодной камеры, предпочтительно, разделенной ионообменной мембраной (например, катион-селективной мембраной или протонообменной мембраной). Приложенное напряжение можно повышать (предпочтительно, поэтапно повышать) до максимума 0,6 В, более конкретно - 0,6 В относительно Ag/AgCl.
Как правило, способы включают использование диффузии кислорода, например, с помощью притока кислорода к микроорганизмам. Приток кислорода (например, приток кислорода через анодную камеру) можно поддерживать, продувая кислородный фидер чистым газообразным кислородом или воздухом таким образом, чтобы достигать желаемых концентраций растворенного кислорода (в частности, желаемых концентраций растворенного кислорода, контактирующего с микроорганизмами). Растворенный кислород будет диффундировать через кислородный фидер к анодной камере, таким образом, создавая диффузию кислорода (или приток кислорода) описываемыми способами. Приток (или диффузию) кислорода, например, можно контролировать любыми подходящими способами, например, соединяя кислородный фидер или другой источник кислорода с анодной камерой, например, другим боковым ответвлением анодной камеры, разделенной, например, переменной перегородкой (например, переменной мембраной, такой как полупроницаемая мембрана), имеющей другие константы диффузии кислорода. Дополнительно или альтернативно, приток кислорода можно контролировать, изменяя объем слоя кислородного фидера. Например, на фигурах представлены кислородные фидеры объемом 100 мл и 250 мл (см. фигуры 6 и 4a). Кислородный фидер также можно удалять, делая возможной прямую диффузию кислорода в анодную камеру, как показано, например, на фигуре 7. Мембрану, например, мембранную перегородку, между анодной камерой и кислородным фидером (или источником кислорода) можно дополнительно покрывать муциновым агаром, чтобы сделать возможной лучше контролируемую диффузию кислорода из кислородного фидера в анодную камеру.
Кроме того, восстановители или антиоксиданты, присутствующие в среде, будут удалять растворенный кислород и, таким образом, влиять на кинетику диффузии кислорода и, таким образом, приток кислорода. Например, в способах по настоящему изобретению антиоксиданты (в частности, количество или уровень антиоксидантов), присутствующие в среде для культивирования микроорганизмов, можно использовать для удаления кислорода и, таким образом, в качестве средств для контроля уровней, или количества, или концентрации кислорода (растворенного кислорода), присутствующего в культуре микроорганизмов. Например, низкий (или более низкий) уровень антиоксиданта в культуре микроорганизмов, как правило, означает, что доступно больше кислорода (или имеет место более высокий оксидативный стресс), в то время как высокий (или более высокий) уровень антиоксиданта, как правило, будет означать, что доступно меньше кислорода (или низкий уровень кислорода) (или имеет место более низкий оксидативный стресс).
Любой из этих способов контроля диффузии или притока кислорода, или их комбинацию, легко можно использовать для достижения желаемого количества или концентрации растворенного кислорода в среде для культивирования микроорганизмов и, таким образом, достижения поэтапного изменения (предпочтительно, поэтапного повышения) диффузии кислорода, притока кислорода или концентрации растворенного кислорода (или количества или уровня растворенного кислорода), используемых для индукции оксидативного стресса в способах по настоящему изобретению.
Таким образом, в способах по изобретению начальные условия, предпочтительно, представляют собой низкий (или нулевой) приток кислорода (или диффузию кислорода или концентрацию кислорода), и способы включают поэтапное повышение притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислород), например, вплоть до высокого притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислорода). Термин "нулевой приток кислорода" (или диффузия кислорода или концентрация кислорода) относится к 0 молям кислорода, присутствующего в среде для культивирования микроорганизмов (например, в анодной камере). Пример низкого притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислорода) относится к до приблизительно 10 мкМ растворенного кислорода, присутствующего в среде для культивирования микроорганизмов (например, в анодной камере), например, диффундирующего в среду для культивирования микроорганизмов/анодную камеру в час. Пример высокого притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислорода) относится к приблизительно 50-250 мкМ растворенного кислорода, присутствующего в среде для культивирования микроорганизмов (например, в анодной камере), например, диффундирующего в среду для культивирования микроорганизмов/анодную камеру в час.
Фактически, оксидативный стресс, достигаемый с помощью притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислорода), также зависит от наличия антиоксидантов в среде для выращивания. Например, если присутствуют сильные антиоксиданты, высокий приток кислорода будет приводить к меньшему оксидативному стрессу. Если присутствуют очень слабые антиоксиданты в среде, небольшой приток кислорода может приводить к высокому оксидативному стрессу. И снова, контроль этих условий для достижения поэтапной индукции оксидативного стресса находится в пределах навыков специалиста в этой области.
Для контроля начальной концентрации растворенного кислорода (например, для снижения начальной концентрации кислорода до низкого (или нулевого) уровня) среду для выращивания можно дегазировать в отношении кислорода, например, продувая несодержащим кислород азотом.
Антиоксидант включают в среду для культивирования для защиты микроорганизмов от летальных концентраций кислорода и для имитации окислительно-восстановительной среды кишечника. Например, антиоксидант может являться цистеином, глутатионом, аскорбиновой кислотой, дитиотреитолом или галловой кислотой. Антиоксидант, например, цистеин или любой другой подходящий антиоксидант, будут использовать, чтобы влиять или корректировать окислительно-восстановительный потенциал или окислительно-восстановительный статус. Для многих бактерий необходим цистеин в качестве источника серы. Если цистеин снижен, как в некоторых из способов по данному изобретению, это будет приводить к снижению общего содержания серы в среде для выращивания. Для компенсации этого снижения добавляют окисленный вариант, например, цистин (в случае цистеина). Другими окисленными вариантами (например, в случае антиоксидантов, приведенных выше), при необходимости, могут являться окисленный глутатион, дегидроаскорбат, окисленный дитиотреитол или окисленный галловая кислота. Кроме того, в среды для культивирования также можно включать подходящие медиаторы окисления-восстановления.
Поэтапное изменение окислительно-восстановительного статуса, например, поэтапного изменения соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта, осуществляют для коррекции окислительно-восстановительного статуса среды для выращивания. Окислительно-восстановительный потенциал можно вычислять с использованием уравнения Нернста (a). Его можно использовать для любого подходящего антиоксиданта и его окисленного варианта.
(a)
где:
h=
Eокислительно-восстановительный потенциал (В)
o
E=Стандартный окислительно-восстановительный потенциал пары (Восстановитель/Антиоксидант)/Окисленный вариант
-1
-1
R=Универсальная газовая постоянная=8,31451 Дж K моль
F=Постоянная Фарадея=96,485 Кл/моль
T=Абсолютная температура (K)
n=Количество задействованных электронов.
h
Таким образом, специалист в этой области легко может вычислять окислительно-восстановительные потенциалы любого соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта. В качестве примера, значения окислительно-восстановительного потенциала (E), вычисленные для различных концентраций окислительно-восстановительной пары цистеин/цистин, представлены в таблице 1.
o
E для пары цистин/цистеин=0,25 В при pH 7,4, и n=2.
При использовании цистеина/цистина в качестве пары антиоксидант/окисленный вариант предпочтительную начальную концентрацию цистеина можно вычислять в соответствии с уравнением реакции (b).
2
2
4R-SH+O→2R-SS-R+HO (b)
В соответствии с уравнением (b), 4 моля цистеина (R-SH) реагируют с одним молем кислорода с образованием 2 молей цистина (R-SS-R).
Концентрация растворенного кислорода в воде при 25°C составляет приблизительно 200 мкМ, и, если среду для выращивания не продувают азотом перед экспериментом, приблизительно 800 мкМ цистеина будут реагировать с 200 мкМ кислорода, образуя 400 мкМ цистина.
Таким образом, в случае среды для выращивания, содержащей 8 мМ цистеина, будут наблюдать начальный окислительно-восстановительный потенциал приблизительно -223 мВ. Однако полное дегазирование кислорода в среде для выращивания с использованием несодержащего кислород азота приводит к окислительно-восстановительному потенциалу приблизительно -283 мВ, близкому к окислительно-восстановительному потенциалу в просвете кишечника (приблизительно -300 мВ). Таким образом, если в качестве пары используют цистеин/цистин, предпочтительная начальная концентрация цистеина (или другого антиоксиданта) составляет 8 мМ. Это является примером высокой концентрации антиоксиданта, когда в качестве пары используют цистеин/цистин, однако, следует понимать, что легко можно вычислять эквивалентные высокие концентрации антиоксидантов для других пар. Кроме того, предпочтительная начальная концентрация цистина (или другого окисленного варианта) составляет 0 мМ или является иной низкой концентрацией для достижения желаемого начального окислительно-восстановительного потенциала. Также предпочтительно полностью дегазировать используемую среду для выращивания от кислорода (или полностью удалять кислород из среды для выращивания). Другими словами, предпочтительные условия выбирают так, чтобы как можно больше приблизиться к окислительно-восстановительному потенциалу просвета кишечника -300 мВ в качестве начальных условий способа. При осуществлении способов предпочтительно осуществлять поэтапное снижение концентрации антиоксиданта в комбинации с поэтапным повышением концентрации окисленного варианта для общего поэтапного повышения окислительно-восстановительного потенциала. В частности, для цистеина/цистина (или другой пары антиоксидант/окисленный вариант) оно может являться поэтапным снижением концентрации цистеина на 1 мМ и повышением концентрации цистина на 1 мМ. Однако также можно использовать другие поэтапные повышения/снижения при условии, что осуществляют поэтапное изменение окислительно-восстановительного статуса.
Этот принцип можно адаптировать к любой подходящей паре антиоксидант/окисленный вариант. При снижении концентрации антиоксиданта, ее балансируют эквивалентным количеством соответствующего окисленного варианта.
Способ, в частности, можно осуществлять в подходящем биореакторе, и, как правило, он включает несколько стадий пересева бактериальной культуры (например, в новые среды для культивирования). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления изобретения каждая стадия поэтапного изменения или индукции, как представлено в настоящем описании, например, поэтапной двойной индукции оксидативного стресса с помощью приложенного напряжения и диффузии кислорода, и поэтапного изменения соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта для коррекции окислительно-восстановительного статуса, например, каждую стадию поэтапного снижения концентрации антиоксиданта в комбинации с поэтапным повышением концентрации окисленного варианта, поэтапным повышением приложенного напряжения и поэтапного повышения притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислорода), может включать пересев. Термин "пересев" в настоящем описании также может относиться к стадии субкультивирования или стадии культивирования.
Сначала отдельную колонию бактерий можно сеять в подходящие среды для культивирования, как известно в этой области, и позволять им расти до достижения культурой стационарной фазы. Начальные условия могут представлять собой одно или несколько, или все, из низкого притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислорода), предпочтительно, нулевого притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислорода), низкого приложенного напряжения, предпочтительно, 0,1 В, более конкретно - 0,1 В относительно Ag/AgCl, высокой концентрации антиоксиданта (см. уравнение Нернста выше), низкой концентрации или нулевой концентрации окисленного варианта (см. уравнение Нернста выше). В случае последующих пересевов можно осуществлять поэтапное снижение концентрации антиоксиданта, повышение окисленного варианта, повышение приложенного напряжения и повышение притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислорода).
-1
-1
Если рост микроорганизмов значительно снижен, условия можно сохранять постоянными в достигнутых оптимизированных (или конечных) условиях, примером которых могут являться 3 мМ цистеина, 5 мМ цистеина, 0,6 В относительно Ag/AgCl и 0,2 нмоль⋅млмин,соответственно (см. фигуры 5 и 8), чтобы позволить штаммам адаптироваться. Другими словами, когда поэтапные изменения приводят к значительному снижению роста микроорганизмов, эти поэтапные изменения прекращают и культивируют микроорганизмы в течение одной или нескольких стадий с использованием постоянных условий (или оптимизированных или конечных условий), соответствующих условиям, достигаемым к концу поэтапных изменений. Эти постоянные стадии позволяют штаммам адаптироваться. После повторных посевов при постоянных условиях, когда штамм адаптирован, в некоторых вариантах осуществления посевы можно продолжать с использованием одного или нескольких (или, предпочтительно, всех) из дополнительного поэтапного снижения концентрации антиоксиданта, повышения окисленного варианта, повышения приложенного напряжения и повышения притока кислорода (или диффузии кислорода или концентрации кислорода) (см. фигуру 5).
2
3
4
5
Все субкультуры, полученные на каждой стадии способа, можно анализировать одновременно для селекции наиболее адаптированного штамма или субкультуру можно анализировать непосредственно после получения, чтобы решить, необходимо ли продолжать посевы или нет. Если субкультура не адаптирована, тогда следует продолжать посевы, в ином случае, если штамм адаптирован, можно выбирать этот штамм и прекращать осуществление способа (см., например, фигуру 8). Например, полученные субкультуры можно анализировать на толерантность к кислороду и, если они демонстрируют желаемый уровень толерантности к кислороду, например, повышенный (предпочтительно, значительно повышенный) уровень толерантности к кислороду по сравнению с соответствующим контрольным штаммом (например, начальным или родительским штаммами) или достаточный уровень стабильности (например, время хранения) при воздействии кислорода (например, в окружающем воздухе), то штамм адаптирован и можно его выбирать. Можно измерять толерантность к кислороду, оценивая рост микроорганизмов в аэробных условиях (например, при воздействии окружающего воздуха). Например, можно осуществлять измерение количества колониеобразующих единиц (КОЕ), если штаммы подвергают воздействию кислорода, например, в форме измерения КОЕ/мл. Примеры адаптированных (толерантных к кислороду) штаммов будут иметь по меньшей мере 1×10 или 1×10 КОЕ/мл, предпочтительно - по меньшей мере 1×10или 1×10 КОЕ/мл, при воздействии кислорода, например, окружающего воздуха. Соответствующий способ описывают в примерах (см., например, таблицу 3). Если штамм не адаптирован, то посевы можно продолжать.
Таким образом, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения начальные условия выбирают из одного или нескольких, или всех, из: 8 мМ цистеина (или эквивалентной концентрации альтернативного антиоксиданта), 0 мМ цистина (или альтернативного окисленного варианта), приложенного напряжения 0,1 В и нулевого или низкого притока кислорода. В таких вариантах осуществления поэтапные изменения можно продолжать до достижения одного или нескольких, или всех, из: минимальной концентрации цистеина 3 мМ (или эквивалентной концентрации альтернативного антиоксиданта), максимальной концентрации цистина 5 мМ (или эквивалентной концентрации альтернативного окисленного варианта), максимального приложенного напряжения 0,6 В и высокого притока кислорода.
Таким образом, в предпочтительных способах по изобретению приложенное напряжение не превышает 0,6 В, и/или концентрация цистеина составляет не менее 3 мМ, и/или концентрация цистина не превышает 5 мМ, и/или концентрацию растворенного кислорода в среде для культивирования поддерживают на уровне сублетальной концентрации.
Как видно из представленного выше описания, в некоторых вариантах осуществления изобретения после завершения поэтапных изменений способ включает одну или несколько дополнительных стадий культивирования (субкультивирования) указанных микроорганизмов в конечных (оптимизированных или постоянных) условиях приложенного напряжения, диффузии кислорода (притока кислорода или концентрации кислорода) и соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта, достигаемых после поэтапных изменений (см., например, фигуру 8).
В других вариантах осуществления способ дополнительно включает последующие стадии, на которых осуществляют дальнейшие поэтапные изменения (см., например, фигуру 5).
Количество стадий поэтапных изменений, подлежащих осуществлению, может определять специалист в этой области посредством мониторинга поведения микроорганизмов или скрининга микроорганизмов (например, как представлено где-либо в настоящем описании) в то время, как они проходят адаптацию. Например, предпочтительные варианты осуществления способов по настоящему изобретению могут включать до 5 или 6 стадий поэтапных изменений, например, 3, 4, 5 или 6 стадий поэтапных изменений или по меньшей мере 5 стадий поэтапных изменений, например, до 10 стадий поэтапных изменений, например 7, 8, 9 или 10 стадий.
Общее количество стадий, например стадий культивирования (включая стадии поэтапных изменений и стадии, подлежащие осуществлению в постоянных или оптимизированных условиях), для достижения адаптации анаэробных микроорганизмов и селекции более толерантных к кислороду анаэробных микроорганизмов может определять специалист в этой области посредством мониторинга поведения микроорганизмов или скрининга микроорганизмов (например, как представлено где-либо в настоящем описании) в то время, как они проходят адаптацию. Например, предпочтительные варианты осуществления способов по настоящему изобретению могут включать до 6, 7, 8, 9, 10 или 12 стадий или до 15, 20, 25, 30 или 35 стадий.
В способах, включающих стадии культивирования, подлежащие осуществлению в постоянных или оптимизированных условиях, количество стадий, например, стадий культивирования, подлежащих осуществлению, может определять специалист в этой области посредством мониторинга поведения микроорганизмов или скрининга микроорганизмов (например, как представлено где-либо в настоящем описании) в то время, как они проходят адаптацию. Например, предпочтительные варианты осуществления способов по настоящему изобретению могут включать до 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 12 стадий или до 15, 20, 25, 30 или 35 стадий, осуществляемых в постоянных или оптимизированных условиях.
В некоторых вариантах осуществления адаптации анаэробных микроорганизмов и селекции более толерантных к кислороду анаэробных микроорганизмов можно достигать к концу этих стадий, осуществляемых в постоянных или оптимизированных условиях (или фактически иногда к концу стадий поэтапных изменений). Таким образом, специалист в этой области легко может определять количество таких стадий, подлежащих осуществлению, например, посредством мониторинга достижения значительной, или достаточной, или максимальной адаптации (толерантности к кислороду).
-1
-1
Способ также можно использовать для получения адаптированного и выбранного штамма (например, для получения или выращивания микроорганизма, выбранного этим способом). В таких способах условия культивирования сохраняют постоянными в оптимальных условиях, например, оптимизированных (или постоянных) условиях, определенных описанными выше способами по изобретению, например, 3 мМ антиоксиданта, 5 мМ окисленного варианта, 0,6 В и 0,2 нмоль⋅млмин. Это приводит к высокому выходу выбранного бактериального штамма.
Faecalibacterium prausnitzii)
Faecalibacterium prausnitzii,
Faecalibacterium prausnitzii
Способ, в частности, осуществляют в биореакторе под названием "Имитационная модель окисления-восстановления в кишечнике человека" (SHIRM), фигура 4a, b и c. В SHIRM двойного оксидативного стресса достигают посредством внешнего напряжения (приложенного напряжения) и диффузии кислорода (притока кислорода) и окислительно-восстановительный потенциал/окислительно-восстановительный статус системы контролируют с помощью пары антиоксидант/окисленный вариант. Т.к. кислород летален для культивируемых организмов, растворенный кислород будет повышаться, но сохраняться на уровне сублетальной концентрации, в то время как поэтапное изменение соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта используют для коррекции окислительно-восстановительного статуса среды (см., например, фигуру 5 или фигуру 8, на которых представлены примеры концентраций цистеина/цистина, которые легко можно адаптировать к другим парам антиоксидант/окисленный вариант). Оксидативный стресс посредством приложенного напряжения и диффузии кислорода повышает толерантность бактерий к окислительной среде, и клетки повторно подвергают воздействию новых оксидативных условий (например, фигура 5 или фигура 8). Адаптированные или улучшенные штаммы подвергают скринингу на толерантность к кислороду. Штаммы также можно подвергать скринингу на метаболические характеристики, такие как профиль жирных кислот (например, продукция бутирата в случае бутират-продуцирующих бактерий, таких как ,и оценке кинетики роста для селекции наиболее адаптированного штамма. Таким образом, адаптированные или улучшенные штаммы адаптируют для лучшей толерантности (например, чем у соответствующих начальных или родительских микроорганизмов) к кислород-содержащей среде или для лучшей толерантности к стрессовым условиям, таким как воздействие окружающего воздуха (оксидативный стресс) или, например, солей желчных кислот. Таким образом, если, например, штаммы представляют собой выбирают штаммы, в которых метаболические характеристики, такие как продукция бутирата или других жирных кислот, сохраняют или улучшают, но штаммы демонстрируют улучшенную толерантность к кислороду (например, по сравнению с соответствующим начальным или родительским штаммом).
В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу адаптации анаэробных микроорганизмов и селекции относительно более толерантных к кислороду анаэробных микроорганизмов, где микроорганизмы культивируют с использованием комбинации поэтапной двойной индукции оксидативного стресса посредством приложенного напряжения и диффузии кислорода и поэтапного изменения соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта для коррекции окислительно-восстановительного статуса.
В другом предпочтительном варианте осуществления способ адаптации анаэробных микроорганизмов к кислороду осуществляют с использованием биореактора под названием "Имитационная модель окисления-восстановления в кишечнике человека" (SHIRM), и он включает, в качестве неограничивающих примеров, следующие стадии:
a) Посев отдельной колонии бактерий в среды для культивирования (как известно в этой области), включающие подходящие медиаторы окисления-восстановления и восстановители для защиты бактериальных клеток от летальных концентраций кислорода и для имитации окислительно-восстановительной среды кишечника.
b) Когда культура достигает поздней экспоненциальной фазы, одну часть культуры можно использовать для анализа, а другую часть можно использовать для возможного пересева в реактор SHIRM.
c) Посев культуры в реакторе SHIRM, содержащем те же среды для культивирования, которые использовали при первичном выделении и рутинном культивировании бактериального штамма. Среда для выращивания теперь имеет название "среда для культивирования Shirm Bed" (SBCM).
I. Концентрация восстановителя/антиоксиданта, в качестве неограничивающих примеров, цистеина, глутатиона, аскорбиновой кислоты, дитиотреитола и галловой кислоты, снижена и сбалансирована эквивалентным количеством соответствующего "окисленного варианта", в качестве неограничивающих примеров, цистина, окисленного глутатиона, дегидроаскорбата, окисленного дитиотреитола и окисленной галловой кислоты.
II. Приложенные электрические окислительные потенциалы поддерживают посредством внешнего напряжения, например, на аноде из графита, графитового войлока, или углеродного войлока, или углеродного волокна с помощью потенциостата. Цепь замыкают, например, соединяя катодную камеру с одним боковым ответвлением анодной камеры, разделенной протонообменной мембраной.
III. Приток кислорода контролируют, соединяя кислородный фидер с другим боковым ответвлением анодной камеры, разделенной переменной перегородкой, имеющей разные константы диффузии кислорода. Текущий приток кислорода измеряют, например, с помощью датчика растворенного кислорода Кларка, см. фигуру 4A.
IV. Приток кислорода поддерживают, продувая кислородный фидер чистым газообразным кислородом или воздухом, и достигают желаемых концентраций растворенного кислорода, следуя закону растворимости газов Генри. Затем растворенный кислород диффундирует через кислородный фидер в анодную камеру.
V. Кроме того, приток кислорода контролируют, изменяя объем слоя кислородного фидера. Кислородный фидер также можно удалять, чтобы сделать возможной прямую диффузию кислорода в анодную камеру.
VI. Мембранную перегородку между анодной камерой и кислородным фидером можно дополнительно покрывать муциновым агаром, чтобы сделать возможной лучше контролируемую диффузию кислорода из кислородного фидера в анодную камеру.
VII. SHIRM содержит среды для культивирования Shirm Bed (SBCM), продуваемые не содержащим кислород азотом для удаления растворенного кислорода.
VIII. Биореактор SHIRM включен до достижения культурой стационарной фазы.
d) Одну часть первой субкультуры используют для посева в реактор SHIRM.
e) Начинают пересев в реактор SHIRM, имея поэтапно сниженную концентрацию антиоксиданта, повышенную концентрацию окисленного варианта и повышенное приложенное напряжение (максимум 0,6 В). Меньшее количество антиоксиданта будет удалять меньше кислорода, таким образом, будет доступно больше кислорода, и клетки испытают больше оксидативного стресса. Кислородный фидер дополнительно регулирует диффузию или приток кислорода.
Эту стадию повторяют до снижения роста.
f) Сохраняя все условия постоянными, повторяют пересевы и анализируют новую субкультуру на сравнительные метаболические характеристики, кинетику роста, стабильность и толерантность. Если результаты анализа являются удовлетворительными, то эту субкультуру выбирают, а если нет, то повторяют стадию f).
В таких способах каждую субкультуру можно анализировать до последующего пересева (или анализировать после каждой стадии), и прекращают осуществление способа, если штамм соответствующим образом адаптирован к кислороду. Затем выбирают этот штамм. В таких способах перед прекращением осуществления способа можно анализировать до приблизительно 30 субкультур или до приблизительно 10 субкультур (или другое количество субкультур, как представлено где-либо в настоящем описании).
При необходимости, одну или несколько из указанных выше стадий можно использовать в любом из способов по изобретению, как представлено в настоящем описании.
В другом предпочтительном варианте осуществления получают приблизительно 30 субкультур (см., например, фигуру 5), или получают приблизительно 10 субкультур (см., например, фигуру 8), или получают любое количество субкультур (как представлено где-либо в настоящем описании), а затем все из них анализируют, чтобы найти наиболее подходящий штамм. Таким образом, не обязательно анализировать субкультуры после каждой стадии, вместо этого все анализы можно осуществлять одновременно, например, для оценки того, какая субкультура наиболее адаптирована или толерантна к кислороду. Способ адаптации анаэробных микроорганизмов к кислороду осуществляют с использованием биореактора под названием "Имитационная модель окисления-восстановления в кишечнике человека" (SHIRM), и он включает, в качестве неограничивающих примеров, следующие стадии:
a) Посев отдельной колонии бактерий в общепринятые среды для культивирования, как известно в этой области, включающие подходящие медиаторы окисления-восстановления и восстановители для защиты бактериальных клеток от летальных концентраций кислорода и для имитации окислительно-восстановительной среды кишечника.
b) Когда культура достигает поздней экспоненциальной фазы, одну часть культуры используют для посева в реактор SHIRM, а другую часть оставляют для анализа.
c) Посев культуры в реактор SHIRM, содержащий те же среды для культивирования, которые использовали при первичном выделении и рутинном культивировании бактериального штамма. Среда для выращивания теперь имеет название "среда для культивирования Shirm Bed" (SBCM).
I. Концентрация восстановителя/антиоксиданта, в качестве неограничивающих примеров, цистеина, глутатиона, аскорбиновой кислоты, дитиотреитола и галловой кислоты, снижена и сбалансирована эквивалентным количеством соответствующего "окисленного варианта", в качестве неограничивающих примеров, цистина, окисленного глутатиона, дегидроаскорбата, окисленного дитиотреитола и окисленной галловой кислоты.
II. Приложенные электрические окислительные потенциалы поддерживают посредством внешнего напряжения, например, на аноде из графита, графитового войлока, или углеродного войлока, или углеродного волокна с помощью потенциостата. Цепь замыкают, например, соединяя катодную камеру с одним боковым ответвлением анодной камеры, разделенной протонообменной мембраной.
III. Приток кислорода контролируют, соединяя кислородный фидер с другим боковым ответвлением анодной камеры, разделенной переменной перегородкой, имеющей разные константы диффузии кислорода. Текущий приток кислорода измеряют, например, с помощью датчика растворенного кислорода Кларка, см. фигуру 4A.
IV. Приток кислорода поддерживают, продувая кислородный фидер чистым газообразным кислородом или воздухом, и достигают желаемых концентраций растворенного кислорода, следуя закону растворимости газов Генри. Затем растворенный кислород диффундирует через кислородный фидер в анодную камеру.
V. Кроме того, приток кислорода контролируют, изменяя объем слоя кислородного фидера. Кислородный фидер также можно удалять, чтобы сделать возможной прямую диффузию кислорода в анодную камеру.
VI. Мембранную перегородку между анодной камерой и кислородным фидером можно дополнительно покрывать муциновым агаром, чтобы сделать возможной лучше контролируемую диффузию кислорода из кислородного фидера в анодную камеру.
VII. SHIRM содержит среды для культивирования Shirm Bed (SBCM), продуваемые несодержащим кислород азотом для удаления растворенного кислорода.
Z
Z
VIII. Затем SBCM, используемую для первого посева, можно обозначать как SBCM X,Y/V,где X относится к концентрации антиоксиданта (мМ), Y относится к концентрации окисленного варианта (мМ), и V относится к приложенному напряжению относительно Ag/AgCl (V). Биореактор SHIRM включен до достижения культурой стационарной фазы.
IX. Культуру, полученную после первой инкубации, можно обозначать как "популяция P1".
d) Следующий посев в реактор SHIRM начинают, имея сниженную концентрацию антиоксиданта, повышенную концентрацию окисленного варианта и повышенное приложенное напряжение. Меньшее количество антиоксиданта будет удалять меньше кислорода, таким образом, будет доступно больше кислорода, и клетки испытают больше оксидативного стресса. Кислородный фидер дополнительно регулирует диффузию или приток кислорода.
e) Пересевы продолжают до получения приблизительно 6-й субкультуры, см., например, фигуры 5 и 8 (когда комбинированный эффект антиоксидантов/медиаторов окисления-восстановления, притока кислорода и напряжения значительно влияет (снижает) на рост).
f) Приложенное напряжение, как правило, не будут повышать выше 0,6 В относительно Ag/AgCl из-за избытка напряжения. Более высокие потенциалы могут вызывать загрязнение электродов и, кроме того, летальное окисление цитохромов микроорганизмов, например, цитохром a3 имеет восстановительный потенциал приблизительно +0,385 В относительно SHE.
g) Сохраняя все условия постоянными, осуществляли повторные посевы до получения приблизительно 27-ой субкультуры (см., например, фигуру 5) или приблизительно 10-ой субкультуры (см., например, фигуру 8), более точного количества субкультур (для повышения вероятности адаптации) до адаптации штамма к условиям, при этом для каждой субкультуры использовали свежую среду.
h) После 27-ой субкультуры продолжали посевы до приблизительно 30-ой субкультуры, как показано на фигуре 5. Альтернативно, после 10-ой субкультуры посевы прекращали, как показано на фигуре 8.
i) При получении всех субкультур их анализируют на сравнительные метагеномные, метаболические характеристики, кинетику роста, стабильность и толерантность к оксидативному стрессу для выбора наиболее адаптированного штамма.
При необходимости, одну или несколько из указанных выше стадий можно использовать в любом из способов по изобретению, как представлено в настоящем описании.
В еще одном варианте осуществления способ адаптации анаэробных микроорганизмов к кислороду осуществляют с использованием биореактора под названием "Имитационная модель окисления-восстановления в кишечнике человека" (SHIRM), и он включает, в качестве неограничивающих примеров, следующие стадии:
a) Посев отдельной колонии бактерий в общепринятые среды для культивирования, как известно в этой области. Цистеин используют для имитации окислительно-восстановительного потенциала толстого кишечника в среде для выращивания, а резазурин используют в качестве индикатора окисления-восстановления.
b) Когда культура достигает поздней экспоненциальной фазы, одну часть культуры используют для посева в реактор SHIRM, а другую часть оставляют для анализа.
c) Посев культуры в реактор SHIRM, содержащем те же среды для культивирования, которые использовали при первичном выделении и рутинном культивировании бактериального штамма. Среда для выращивания теперь имеет название "среда для культивирования Shirm Bed" (SBCM).
I. Концентрация восстановителя/антиоксиданта, цистеина, снижена и сбалансирована эквивалентным количеством соответствующего "окисленного варианта", цистина.
II. Приложенные электрические окислительные потенциалы поддерживают посредством внешнего напряжения, например, на аноде из графита, графитового войлока, или углеродного войлока, или углеродного волокна с помощью потенциостата. Цепь замыкают, например, соединяя катодную камеру с одним боковым ответвлением анодной камеры, разделенной протонообменной мембраной.
III. Приток кислорода контролируют, соединяя кислородный фидер с другим боковым ответвлением анодной камеры, разделенной переменной перегородкой, имеющей разные константы диффузии кислорода. Текущий приток кислорода измеряют, например, с помощью датчика растворенного кислорода Кларка, см. фигуру 4A.
IV. Приток кислорода поддерживают, продувая кислородный фидер чистым газообразным кислородом или воздухом, и достигают желаемых концентраций растворенного кислорода, следуя закону растворимости газов Генри. Затем растворенный кислород диффундирует через кислородный фидер в анодную камеру.
V. Кроме того, приток кислорода контролируют, изменяя объем слоя кислородного фидера. Кислородный фидер также можно удалять, чтобы сделать возможной прямую диффузию кислорода в анодную камеру.
VI. Мембранную перегородку между анодной камерой и кислородным фидером можно дополнительно покрывать муциновым агаром, чтобы сделать возможной лучше контролируемую диффузию кислорода из кислородного фидера в анодную камеру.
VII. SHIRM содержит SBCM, продуваемые не содержащим кислород азотом для удаления растворенного кислорода.
0,1
VIII. Затем SBCM, используемую для первого посева, можно обозначать как SBCM 8,0/V, где первый из показателей означает концентрацию цистеина, в то время как последний означает концентрацию цистина в мМ, и "V" означает приложенное напряжение относительно Ag/AgCl. Биореактор SHIRM включен до достижения культурой стационарной фазы при окислительном потенциале +100 мВ.
IX. Культуру, полученную после первой инкубации, можно обозначать как "популяция P1".
d) Следующий посев в реактор SHIRM начинают, имея сниженную концентрацию цистеина, повышенную концентрацию цистина и повышенное приложенное напряжение, см. фигуру 5 и фигуру 8. Меньшее количество антиоксиданта будет удалять меньше кислорода, таким образом, будет доступно больше кислорода, и клетки испытают больше оксидативного стресса. Кислородный фидер дополнительно регулирует диффузию или приток кислорода.
e) Пересевы продолжают до получения приблизительно 6-ой субкультуры. На этой стадии концентрацию антиоксиданта снижают до 3 мМ, а концентрацию "окисленного варианта" повышают до 5 мМ, в то время как окислительный потенциал составляет 0,6 В (относительно Ag/AgCl). Потенциальное напряжение не будут повышать выше 0,6 В относительно Ag/AgCl из-за избытка напряжения. Более высокие потенциалы могут вызывать загрязнение электродов и, кроме того, летальное окисление цитохромов микроорганизмов, например, цитохром a3 имеет восстановительный потенциал приблизительно +0,385 В относительно SHE.
f) Сохраняя все условия постоянными, осуществляли повторные посевы до получения приблизительно 27-ой субкультуры (фигура 5) или 10-ой субкультуры (фигура 8), при этом для каждой субкультуры использовали свежую среду.
g) В ситуации, представленной на фигуре 5, после 27-ой субкультуры продолжали посевы до приблизительно 30-ой субкультуры, как показано на фигуре 5. Альтернативно, например, как показано на фигуре 8, после 10-й субкультуры посевы прекращали.
При необходимости, одну или несколько из указанных выше стадий можно использовать в любом из способов по изобретению, как представлено в настоящем описании.
Поэтапное изменение соотношения концентраций антиоксиданта/окисленного варианта для коррекции окислительно-восстановительного статуса соответствует уравнению Нернста. Далее представлен пример для окислительно-восстановительной пары цистеин/цистин:
h
o
2
E=E+RT/2Fln([Цистин]/[Цистеин]) (a)
Где:
h=
Eокислительно-восстановительный потенциал (В)
Eo=Стандартный окислительно-восстановительный потенциал пары цистин/цистеин=0,25 В при pH 7,4
-1
-1
R= Универсальная газовая постоянная=8,31451 Дж K моль
F= Постоянная Фарадея=96,485 Кл/моль
T=Абсолютная температура (K).
h
Значения окислительно-восстановительного потенциала (E), вычисленные для различных концентраций окислительно-восстановительной пары цистеин/цистин, представлены в таблице 1.
Таблица 1
Цистеин
Цистин
E<sub>h</sub>
мМ
мВ
7,2
0,4
-223
Насыщенная кислородом среда
7,995
0,005
-283
Лишенная кислорода среда для выращивания, полученная посредством продувания азотом
7
1
-211
6
2
-198
5
3
-188
4
4
-178
3
5
-168
2
6
-155
1
7
-135
0,01
8
-13
2
2
4R-SH+O→2R-SS-R+HO (b)
В соответствии с уравнением (b), 4 моля цистеина (R-SH) реагируют с одним молем кислорода с образованием 2 молей цистина (R-SS-R).
Концентрация растворенного кислорода в воде при 25°C составляет приблизительно 200 мкМ, и, если среду для выращивания не продувают азотом перед экспериментом, приблизительно 800 мкМ цистеина будут реагировать с 200 мкМ кислорода с образованием 400 мкМ цистина. Таким образом, в случае среды для выращивания, содержащей 8 мМ цистеина, будут наблюдать начальный окислительно-восстановительный потенциал приблизительно -223 мВ. Однако полное дегазирование кислорода в среде для выращивания с использованием несодержащего кислород азота приводит к окислительно-восстановительному потенциалу приблизительно -283 мВ, близкому к окислительно-восстановительному потенциалу просвета кишечника (приблизительно -300 мВ).
Настоящее изобретение дополнительно относится к примерам адаптированных микроорганизмов, полученных способами по настоящему изобретению.
F. prausnitzii.
Таким образом, дополнительный аспект изобретения относится к микроорганизму (адаптированному микроорганизму), например, штамму микроорганизма, полученному, получаемому, идентифицированному или выбранному способами по изобретению. Такие штаммы могут являться пробиотическим микроорганизмом или бактериальным штаммом. В рамках изобретения, термин "пробиотик" относится к микроорганизмам, приносящим пользу здоровью при их потреблении. Например, Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН определяет пробиотики как "живые микроорганизмы, которые при введении в адекватных количествах приносят пользу здоровью носителя". Такие микроорганизмы или штаммы могут быть выделенными штаммами или чистыми культурами и не будут соответствовать природным микроорганизмам или штаммам, т.к. они подвергнуты способам адаптации по изобретению. Предпочтительными микроорганизмами или штаммами являются
F. prausnitzii,
Примерами адаптированных штаммов, полученных и т.д. способами адаптации по настоящему изобретению, являются штаммы обозначенные в настоящем описании как TCS1, OCS-1 и OCS-2. Эти штаммы депонированы в соответствии с Будапештским договором в DSMZ (Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany) на 12 октября 2016 года под регистрационными номерами DSM 32380, DSM 32378 и DSM 32379, соответственно.
Микроорганизмы или штаммы, полученные и т.д. способами по изобретению (например, один или несколько депонируемых штаммов), могут иметь форму соединения (средства) или композиции, например, фармацевтического соединения или композиции или пищевого соединения или композиции.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к композиции или составу, содержащим:
(i) микроорганизм или штамм, полученный, получаемый, идентифицированный или выбранный способом по изобретению, или микроорганизм или штамм по изобретению, иным образом определенный в настоящем описании (например, один или несколько депонируемых штаммов); и
(ii) по меньшей мере один дополнительный компонент, выбранный из группы, состоящей из носителя, дилюента или эксципиента (например, фармацевтически приемлемого носителя, дилюента или эксципиента), продукта питания, или пищевой добавки, или дополнительного терапевтического или пищевого средства. Таким образом, указанные композиции можно составлять в виде фармацевтических композиций или пищевых композиций, например, пищевого продукта.
Настоящее изобретение также относится к терапевтическому применению микроорганизмов, штаммов, композиций и составов по изобретению, как определено в настоящем описании (например, одного или нескольких депонируемых штаммов).
Подходящий способ введения и состав микроорганизмов, штаммов, композиций, составов и т.д. выбирают в зависимости от локализации заболевания. Предпочтительными способами введения являются пероральный или ректальный, однако, в равной степени могут подходить внутривенные или внутримышечные инъекции.
4
12
5
10
6
8
8
10
Специалист в этой области легко может выбирать или определять подходящие дозы микроорганизмов, штаммов, композиций и составов по изобретению, как определено в настоящем описании, в зависимости от нарушения, подлежащего лечению, способа введения и рассматриваемого состава. Например, дозу и схему введения выбирают таким образом, что микроорганизмы, штаммы, композиции или составы по изобретению, вводимые индивидууму, могут приносить терапевтическую пользу или пользу здоровью. Например, можно использовать суточные дозы микроорганизмов от 10 до 10, например, от 10 до 10, или от 10 до 10, или от 10 до 10КОЕ бактерий.
Таким образом, настоящее изобретение относится к продуктам, или композициям, или составам, или наборам, содержащим более толерантные к кислороду анаэробные микроорганизмы, полученные и т.д. способами по настоящему изобретению или иным образом определенные в настоящем описании. Преимущественно, такие продукты имеют увеличенный срок годности или более длительное время хранения.
Предпочтительные продукты или композиции содержат замороженные, лиофилизированные или высушенные бактерии (также см. примеры) и, предпочтительно, имеют формат однократной дозы, например, капсулы, таблетки или геля. Подходящие дозы (например, в форме количества бактерий или КОЕ) для применения в таких продукта, и т.д. описывают где-либо в настоящем описании и в примерах. В такие продукты также можно включать другие компоненты и т.д., например, консерванты (например, глицерин), стабилизаторы, гелеобразующие средства и/или криопротекторы. В некоторых вариантах осуществления такие дополнительные компоненты являются неприродными средствами.
Если в настоящем описании упоминают сниженные концентрации, уровни или рост, то, предпочтительно, такое снижение (и, фактически, другое снижение или отрицательные эффекты, как указано где-либо в настоящем описании) является измеряемым снижением, более предпочтительно - значительным снижением, предпочтительно - статистически значимым снижением, например, с вероятностью ≤0,05, при сравнении с соответствующим уровнем или значением.
Если в настоящем описании упоминают повышенные концентрации, уровни, напряжение, толерантность или рост и т.д., например, поэтапное повышение, или повышение оксидативного стресса, притока кислорода (или диффузии или концентрации), или толерантности к кислороду, то, предпочтительно, такое повышение (и, фактически, другое повышение или положительные эффекты, как указано где-либо в настоящем описании), является измеряемым повышением, более предпочтительно - значительным повышением, предпочтительно - статистически значимым повышением, например, с вероятностью ≤0,05, при сравнении с соответствующим уровнем или значением.
Фактически, если в настоящем описании приведены значительные изменения, предпочтительно, чтобы такие изменения являлись статистически значимыми изменениями, например, с вероятностью ≤0,05, при сравнении с соответствующим уровнем или значением.
Далее следуют некоторые примеры изобретения, предназначенные не для ограничения изобретения в настоящем описании, а для подробной демонстрации практических примеров того, как можно использовать изобретение.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Адаптация анаэробного микроорганизма к окисленной среде
Faecalibacterium prausnitzii
2
2
2
2
600
600
Om
Om
2
4
2
4
600
-1
-1
-6
2
-4
Штамм  выделяли из экскрементов здорового добровольца микробиологическим способом чистой культуры в строгих анаэробных условиях (5% H, 15%CO и 80% N), используя камеру от Coy, и называли его FBT-22 (DSM 32186). (FBT-22 депонирован в соответствии с Будапештским договором в DSMZ (Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany) на 20 октября 2015 года под регистрационным номером DSM32186). Общепринятая среда для культивирования, используемая для выделения, содержит следующее (г/л); дрожжевой экстракт: 2,5; казитон: 10; глюкозу: 4,5; хлорид натрия: 0,9; гидроортофосфат калия: 0,45; дигидроортофосфат калия: 0,45; сульфат аммония: 1,32; бикарбонат натрия: 4 г; цистеин: 1, резазурин: 0,001; гемин: 0,01. Смесь витаминов содержит: 10 мкг биотина, 10 мкг кобаламина, 30 мкг p-аминобензойной кислоты, 50 мкг фолиевой кислоты и 150 мкг пиридоксамина. Конечные концентрации жирных кислот с короткой цепью (SCFA) в среде составляли 33 мМ ацетата, 9 мМ пропионата и по 1 мМ каждого из изобутирата, изовалерата и валерата. Все компоненты добавляли асептически, в то время как пробирки обрабатывали струей CO. Термолабильные витамины стерилизовали фильтрацией с использованием фильтра 0,22 мкм и добавляли после автоклавирования среды для получения конечной концентрации 0,05 мкг⋅мл тиамина и 0,05 мкг⋅млрибофлавина. Конечный pH среды доводили до 7,2±0,2 с использованием 1 Н NaOH или 1 Н HCl. Среды автоклавировали при 100 кПа, 121°C в течение 15 мин. Цистеин использовали для имитации окислительно-восстановительного потенциала толстого кишечника в среде для выращивания, и резазурин использовали в качестве индикатора окисления-восстановления. Посевной материал для биореактора SHIRM получали посредством посева отдельной колонии в 7 мл среды для культивирования. После 12-16 ч. инкубации при 37°C культура достигала поздней экспоненциальной фазы (OD~0,7). Две пробирки с приблизительно 0,5 мл основной культуры хранили в 20% глицерине при -80°C и обозначали как FFR. Эти стоки FFR обозначали как FFR-M1.1 и FFR-M1.2. FFRM1.1 и напрямую высевали в 7 мл среды для культивирования без размораживания. Посевные материалы инкубировали анаэробно в течение 12-16 ч. при 37°C, когда культура достигала поздней экспоненциальной фазы (OD~0,7), 2,5 мл культуры высевали в 250 мл биореактора SHIRM. Долю этой основной культуры сохраняли в двух экземплярах (как указано выше) и обозначали как FFR-M2.1 и FFR-M2.2. В случае любой контаминации или неудачи эксперимент можно продолжить с использованием соответствующих культур FFRM. Композиция среды для культивирования SHIRM Bed (SBCM) является такой же, как использовали для первичного выделения штамма FBT-22 (DSM 32186); впоследствии концентрацию цистеина снижали и сбалансировали эквивалентным количеством цистина. Приложенные электрические окислительные потенциалы поддерживали посредством внешнего напряжения на графитовом аноде (8,5 см × 0,25 см × 2,5 см) с помощью потенциостата. Цепь замыкали, соединяя катодную камеру с одним боковым ответвлением, разделенную протонообменной мембраной. Приток кислорода контролировали, соединяя кислородный фидер с анодной камерой, разделенной переменной перегородкой, имеющей разные постоянные диффузии кислорода. Текущий приток кислорода измеряли с использованием датчика растворенного кислорода Кларка. Приток кислорода контролируют, продувая кислородный фидер чистым кислородом, диффундирующим в анодную камеру через полупроницаемую мембрану. Коэффициенты диффузии (D) и постоянные переноса массы (K) кислорода для мембраны составляют 2,4×10 см/с и 1,3×10см/с, соответственно. Кроме того, приток кислорода контролировали, изменяя объем слоя кислородного фидера, например, 250 мл или 100 мл, как показано на фигуре 6. Кислородный фидер также можно удалять, чтобы сделать возможной прямую диффузию кислорода в анодную камеру, как показано на фигуре 7. Покрытие мембранной перегородки муциновым агаром дополнительно позволяет контролировать диффузию кислорода в анодную камеру. Муциновый агар получали посредством растворения и автоклавирования следующих компонентов (г/л): агар: 2; NaCl: 8; KCl: 0,2; NaHPO: 1,42; KHPO: 0,24; муцин типа II: 5. Среды автоклавировали при 100 кПа, 121°C в течение 15 мин. SHIRM содержит SBCM, продуваемую не содержащим кислород азотом в течение 15 мин для удаления растворенного кислорода. Конечную концентрацию клеток в реакторе SHIRM доводили до приблизительно OD~0,005.
0,1
Затем SBCM, используемую для первого посева FFR-M2.1, обозначали как SBCM 8,0/V, где первый из показателей ("8") означает концентрацию цистеина (мМ), последний ("0") - концентрацию цистина (мМ), и "V" означает приложенное напряжение относительно Ag/AgCl. Каждый эксперимент будут начинать с нулевого притока кислорода, и кислород диффундирует из кислородного фидера с заранее определенной постоянной скоростью. Биореактор SHIRM был включен в течение 24 ч при 37°C до достижения культурой стационарной фазы при окислительном потенциале +100 мВ.
0,2
Культуру, полученную после первой инкубации, можно обозначать как "популяция P1", и она имеет возраст приблизительно 5 поколений. Замороженные стоки из этой партии обозначали как FFR-P1.1 и FFR-P1.2. 2,5 мл FFR-P1.1 высевали в новый реактор SHIRM, содержащий SBCM 7,1/V. Пересевы продолжали до получения 6-й субкультуры FFR-P6 и соответствующую FFR-P сохраняли на стадии каждой промежуточной субкультуры. На этой стадии концентрация цистеина снижалась до 3 мМ, и концентрация цистина повышалась до 5 мМ, в то время как окислительный потенциал составлял 600 мВ относительно Ag/AgCl. На этой стадии повторные посевы осуществляли до 27-ой субкультуры, сохраняя все условия постоянными, при этом для каждой субкультуры использовали свежую среду. После 27-ой субкультуры посевы продолжали до 30-й субкультуры, как показано на фигуре 5.
ПРИМЕР 2
Селекция улучшенного штамма, адаптированного к окислительной среде
Различные FFR-P из примера 1 анализируют для селекции штамма, адаптированного к окислительной среде и кислорода, который можно использовать для дальнейшего получения.
Анализ основан на сравнительных метагеномных, метаболических характеристиках, кинетике роста, стабильности и толерантности.
Сравнительную метаболическую характеризацию осуществляют посредством профилирования жирных кислот, более конкретно - продукции бутирата на различных пребиотиках, таких как инулин и резистентный крахмал.
Сравнительную характеризацию кинетики роста, включающую выходы биомассы и скорость роста, осуществляют в нормальных средах для культивирования с солями желчных кислот и пребиотиками или без них.
Сравнительную характеризацию стабильности и толерантности осуществляют в присутствие имитации жидкости желудка/имитации жидкости кишечника с ферментами или без них и воздействием окружающего воздуха в течение 30 мин.
Тестовый раствор (TS) имитации жидкости желудка получают в соответствии с руководствами Фармакопеи США (USP), растворяя 2,0 г хлорида натрия и 3,2 г очищенного пепсина (полученного из слизистой оболочки желудка свиньи, с активностью от 800 до 2500 единиц на мг белка) в 7,0 мл соляной кислоты и воде объемом до 1000 мл. Этот тестовый раствор имеет pH приблизительно 1,2.
Тестовый раствор (TS) имитации жидкости кишечника в соответствии с USP получают, растворяя 6,8 г дигидроортофосфата калия в 250 мл воды, а затем добавляя 77 мл 0,2 Н гидроксида натрия и 500 мл воды. Добавляют 10,0 г панкератина и полученный раствор доводят до pH 6,8±0,1 с использованием 0,2 Н гидроксида натрия или 0,2 Н соляной кислоты и, в конечном итоге, разводят до 1000 мл.
Микробную топливную батарею и флавин-зависимое восстановление 5,5'-дитиобис-2-нитробензоата использовали для оценки экспрессии цитохромов в популяциях клеток FFR-M и FFR-P, в то время как активность диафоразы тестировали с использованием соли нитросинего тетразолия.
Выбирают наиболее адаптированный штамм.
ПРИМЕР 3
Дополнительный пример адаптации анаэробного микроорганизма к окисленной среде
0,2
Следовали всем стадиям примера 1 до стадии получения культуры после первой инкубации, обозначенной как "популяция P1", возраст которой составляет приблизительно 5 поколений. Замороженные стоки из этой партии обозначали как FFR-P1.1 и FFR-P1.2. 2,5 мл FFR-P1.1 высевали в новый реактор SHIRM, содержащий SBCM 7,1/V. Пересевы продолжали до 6-ой субкультуры, получая FFR-P6, и соответствующую FFR-P сохраняли на стадии каждой промежуточной субкультуры. На этой стадии концентрация цистеина снижалась до 3 мМ, и концентрация цистина повышалась до 5 мМ, в то время как окислительный потенциал составлял 600 мВ относительно Ag/AgCl.
Но в этом примере 3, по сравнению с примером 1, эту стадию повторных посевов осуществляли всего до 10-ой субкультуры, сохраняя все условия постоянными, при этом для каждой субкультуры использовали свежую среду, как показано на фигуре 8.
ПРИМЕР 4
Селекция улучшенного штамма из примера 3
Различные FFR-P из примера 3 анализируют для селекции штамма, адаптированного к окислительной среде и кислорода, который можно использовать для дальнейшего получения.
Селекция адаптированного штамма основана на следующих стадиях:
a. На каждой стадии, представленной на фигуре 8, отбирали аликвоту 100 мкл.
3
b. Образец "стадии a" серийно разводили (до 10) в насыщенном воздухом фосфатно-солевом буфере (PBS), как показано на фигуре 9, и инкубировали в воздухонепроницаемых сосудах при температуре окружающей среды.
c. Сосуды помещали в анаэробную камеру и аликвотой 50 мкл высевали среду YCFAG (таблица 4).
d. Планшеты инкубировали анаэробно в течение 24-72 ч.
e. После инкубации визуально оценивали количество жизнеспособных клеток.
f. В зависимости от морфологического типа колоний, любой вариант, полученный после улучшения, выбирали и очищали классическим способом чистой культуры.
g. Адаптированные штаммы проверяли на чистоту с помощью окрашивания по Граму.
h. Пять адаптированных штаммов, выбранных на стадии f, обозначали как TCS1, LTCS, STCS, OCS-1 и OCS-2.
i. Подробности о выделенных адаптированных штаммах, включающие соответствующие условия и стадии выделения, представлены в таблице 2.
F. prausnitzii
j. Предварительная идентификация адаптированных штаммов основана на окрашивании по Граму, метаболическом фенотипировании (профилях жирных кислот с короткой цепью) и количественной ПЦР (qPCR) с использованием специфичных для праймеров.
k. Идентификацию штаммов подтверждали с помощью секвенирования рибосомальной ДНК 16S.
1
2
3
4
5
l. Толерантность к кислороду и стабильность адаптированных штаммов оценивали, как показано на фигуре 10. Соответствующие адаптированные штаммы анаэробно культивировали в среде YCFAG в течение 12-14 ч. и серийно разводили до 10,10,10, 10 и/или 10. 100 мкл или 50 мкл серийно разведенных культур высевали на чашках со средой YCFAG в двух параллелях. Один набор чашек инкубировали в анаэробных условиях, и он служил в качестве контроля, в то время как другой набор инкубировали аэробно в течение 20 мин. В течение 20 мин воздействия окружающего воздуха кислород полностью диффундирует в чашку с агаром, изменяя ее цвет на розовый. Индикатор окисления-восстановления, краситель резазурин, являющийся бесцветным в восстановленном состоянии, становится розовым после окисления. Это обеспечивает полную диффузию кислорода в культуральную среду в чашке. После соответствующих обработок, изображенных на фигуре 10, тестовые и контрольные чашки инкубировали в анаэробных условиях в течение 48-72 ч. и визуально оценивали количество жизнеспособных клеток.
F. prausnitzii
m. После подтверждения штамма посредством секвенирования рибосомальной ДНК 16S, выбирали адаптированные штаммы TCS1, OCS-1 и OCS-2 с учетом их толерантности к кислороду, и их депонируют в соответствии с Будапештским договором в DSMZ (Leibniz Institute DSMZ - German Collection of Microorganisms and Cell Cultures,Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany) под регистрационными номерами DSM 32380, DSM 32378 и DSM 32379, соответственно.
F. prausnitzii
n. Толерантность к кислороду штамма типа , родительского штамма и адаптированных штаммов приведена в таблице 3.
Таблица 2: Выделенные адаптированные штаммы на различных циклах
Код штамма
Полное название
Условия выделения
1
TCS1
Полупрозрачные однородные колонии
6-ой цикл 3,5/V<sub>0,6 </sub>(1:100)
2
LTCS
Крупные полупрозрачные однородные колонии
10-ый цикл 3,5/V<sub>0,6 </sub>(1:1000)
3
STCS
Небольшие полупрозрачные однородные колонии
10-ый цикл 3,5/V<sub>0,6 </sub>(1:1000)
4
OCS-1
Непрозрачные однородные колонии
10-ый цикл 3,5/V<sub>0,6 </sub>(1:10)
5
OCS-2
Непрозрачные однородные колонии
10-ый цикл 3,5/V<sub>0,6 </sub>(1:10)
Таблица 3: Профили стабильности адаптированных штаммов после воздействия воздуха
Обработка
Анаэробная
Аэробная
КОЕ/мл
<i>Faecalibacterium prausnitzii </i>A2-165 (DSM 17677)
1,0E+0,8
0
<i>Faecalibacterium prausnitzii </i>FBT-22 (DSM 32186)
1,5E+0,7
0
<i>Faecalibacterium prausnitzii </i>TCS1 (DSM 32380)
7,0E+0,7
1,0E+03
<i>Faecalibacterium prausnitzii </i>OCS1 (DSM 32378)
6,5E+0,7
1,0E+05
<i>Faecalibacterium prausnitzii </i>OCS2 (DSM 32379)
7,5E+0,7
7,0E+05
F. prausnitzii
Таблица 4: среда YCFAG для
г/л
Казитон
10
Совместное автоклавирование
Дрожжевой экстракт
2,5
NaCl
0,9
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>
0,45
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
0,45
NaHCO<sub>3</sub>
4
CaCl<sub>2,</sub>2H<sub>2</sub>O
0,12
MgSO<sub>4,</sub>7H<sub>2</sub>O
0,09
Глюкоза
4,5
Ацетат натрия
2,7
цистеин
1
Аммоний сульфат
1,32
Резазурин
0,001
Гемин
0,01
Витамины
мкг/л
Добавление после автоклавирования
Биотин (B7)
10
Стерилизация посредством фильтрации
Кобаламин (B12)
10
PABA
30
Фолиевая кислота
50
Пиридоксамин
150
Рибофлавин (B2)
50
Тиамин (B1)
50
SCFA
мМ
Добавление после автоклавирования
пропионат
9
Стерилизация посредством фильтрации
изобутират
1
изовалерат
2
валерат
3
Скорректированный конечный pH составляет приблизительно 7,2.
ПРИМЕР 5
Генетическая характеризация улучшенных штаммов
Улучшенные штаммы, полученные при каждом субкультивировании в примере 1, охарактеризовывают с помощью секвенирования нового поколения (NGS). FFR-M и все культуры FFR-P подвергают NGS для тщательного геномного анализа для выявления любых возможных мутаций, возникающих у потомства улучшенных/адаптированных FFR-P. Различия между штаммами FFR-M и FFR-P также исследуют на транскриптомном уровне посредством секвенирования РНК.
ПРИМЕР 6
Повышенная продукция анаэробного микроорганизма
Условия получения будут включать оптимизированные условия, достигнутые в примере 1. Условия культивирования микроорганизмов из примера 2 будут теми же, что и в примере 1, но будут включать лишь одну стадию с фиксированными условиями окисления, включающими напряжение, пару цистеин/цистин и приток кислорода.
Om
-4
-1
-1
Оптимизированные условия ферментации являются следующими: мембранная перегородка, имеющая коэффициент переноса массы (K) кислорода 1,3×10см/с и скорость диффузии кислорода в анодную камеру приблизительно 0,2 нмоль⋅млмин, приложенное напряжение 0,6 В относительно Ag/AgCl, цистеин 3 мМ, цистин 5 мМ и начальный окислительно-восстановительный потенциал среды для выращивания SBCM приблизительно -188 мВ.
Стадию ферментации осуществляют в 150-литровом электрически изолированном сосуде, сделанном из пластикового материала на основе фторполимера, с тройной конфигурацией камер. Фигура 4c. Его высевали с использованием препарата, как в примере 2 выше.
Суспензию клеток при ферментации разделяют с помощью центрифуги непрерывного действия от Alfa Laval и смешивают со стандартными криопротекторами, как известно в этой области. Стадию промывки осуществляют, чтобы избежать снижения точки замерзания при лиофилизации.
Faecalibacterium prausnitzii
При лиофилизации суспензию клеток наливают на каждую чашку в лиофилизаторе. Суспензия клеток  имеет содержание сухого вещества 18%, и ее лиофилизируют в течение от четырех до пяти дней.
В ином случае ферментацию и лиофилизацию микроорганизма осуществляют, как известно в этой области.