Молекулярное ПЦР-типирование токсинов изолятов Clostridium perfringens и Clostridium difficile, полученных от крупного рогатого скота

Молекулярное ПЦР-типирование токсинов изолятов Clostridium perfringens и Clostridium difficile, полученных от крупного рогатого скота

М.К. Оссипранди1, доктор ветеринарной медицины, Л. Зербини1, доктор ветеринарной медицины,

Е.М. Болдырева2, кандидат ветеринарных наук

1 Университет г. Пармы (Parma, Italy).

2 Российский университет дружбы народов (Москва).

Ключевые слова: Clostridium perfringens, Clostridium difficile, крупный рогатый скот, ПЦР, типирование токсинов

Сокращения: ЖКТ — желудочно-кишечный тракт, КРС — крупный рогатый скот, п.н. — пары нуклеотидов, ПЦР — полимеразная цепная реакция, b.p. — base pair

Введение

Clostridium perfringens — грамположительная, спорообразующая анаэробная бактерия, энтеропатогенный агент человека и животных. Это одна из наиболее широко распространенных потенциально патогенных бактерий, высеваемых из образцов почвы; она также заселяет ЖКТ большинства видов животных, что связывают с развитием острой, нередко тяжело протекающей диареи у человека, лошадей, собак и кошек. Бактерия вызывает газовую гангрену и пищевое отравление у человека, а также ряд заболеваний, сопровождающихся энтеротоксемией, у домашних [18] и диких животных [15, 26, 28].

C. perfringens может вырабатывать по меньшей мере 30 различных токсинов, основные из которых (a, b, e and i) обуславливают ее способность вызывать широкий спектр энтеро- и гистопатогенных инфекций [12,

13, 21]. В 1997 г был впервые описан ранее неизвестный токсин, вырабатываемый C. perfringens, и кодирующий его ген cpb2 *: они были получены из штамма, изолированного от поросенка с некротическим энтеритом [12]. Ученые полагают, что токсин CPB2 участвует в развитии неонатального энтерита свиней, вызванного C. perfringens [10], тифлоколита у лошадей и собак, энтеротоксемии КРС и желудочно-кишечного заболевания у человека [12].

Несмотря на то, что имеются эффективные им-мунопрофилактические продукты, серьезной проблемой остаются клостридиальные инфекции ЖКТ у телят. Вакцинация — основной способ профилактики и контроля неонатальной диареи КРС на фермах, чему следует уделять большое внимание. Для успешной профилактики и контроля вакцина должна производиться из штаммов, имеющих клиническое значение. Таким образом, идентификация токсинотипов и под-

* Прописные буквы используются для обозначения токсинов (CPA, CPB2), строчные — для обозначения генов (plc/cpe).

Адрес для контакта с М.К. Оссипранди mariacristina.ossiprandi@unipr.it

типов C. perfringens имеет очень большое значение как в эпидемиологических исследованиях, так и для разработки и эффективного проведения профилактических мероприятий, в том числе вакцинации [8].

Clostridium difficile — грамположительная анаэробная бактерия, споры которой способны сохраняться во внешней среде. Этот патоген вызывает заболевание у разных видов животных, включая собак, лошадей, а также у молодняка — телят, ягнят, новорожденных поросят. В последнее время появились сообщения об эпидемических вспышках инфекции C. difficile, вызванных гипервирулентным штаммом (риботип 027), в больницах разных стран [1].

Поражения у млекопитающих животных сходны с таковыми у человека, но их тяжесть и локализация в ЖКТ в значительной степени варьируются. Эти вариации наблюдают у разных видов и различных возрастных групп каждого вида [11].

Вирулентные штаммы C. difficile вырабатывают два токсина: энтеротоксин TcdA (токсин A) и цитотоксин TcdB (токсин B) [1, 17]. Некоторые штаммы также образуют бинарный токсин, который кодируется генами cdtA и cdtB, расположенными вне так называемого локуса патогенности PaLoc. В настоящее время ведутся исследования роли бинарного токсина в патогенезе заболевания [17].

Надлежащий учет большого разнообразия токси-генных штаммов, выделяемых от КРС, может способствовать лучшему пониманию патогенеза клостриди-оза у этого вида животных и разработке эффективных методов контроля вспышек данного заболевания [1].

Цель исследования

Изучить молекулярные характеристики различных штаммов C. perfringens и C. difficile, изолированных от здорового и имеющего признаки диареи КРС, путем анализа генов, кодирующих выработку токсинов.

Материалы и методы

Пробы. В период с начала 2008 г. до конца 2011 г. с различных ферм КРС в провинциях г. Парма и Реджо-Эмилия (Италия) методом расслоенного случайного отбора проб было взято 119 образцов материала (всего от 115 животных): 108 проб — фекалии после дефекации, 11 — фекалии из прямой кишки. При этом 59 проб фекалий (после дефекации) были взяты от живот-

ных без признаков диареи (23 дойные коровы, 19 стельных телок, 13 телок и 4 теленка); 60 (после дефекации и фекалий из прямой кишки) — у 56 животных с признаками диареи (34 теленка, 18 коров и 4 телки); от 1 коровы и 3 телят получили оба вида проб фекалий.

Оба вида проб фекалий исследовали в течение 3 ч после их взятия. Сразу же после анализа температуру хранения проб поддерживали на уровне —20°C.

Культивирование клостридий, полученных из проб фекалий. Бактерий из обоих видов проб фекалий культивировали на чашках с предварительно редуцированным агаром Шадлера («Oxoid», Англия), и одновременно материал вносили в приготовленный мясной бульон («Oxoid», Англия). Для изоляции C. difficile также выполняли посев на предварительно редуцированную селективную среду — циклосерин-цефокситин-фруктозный агар. Посевы инкубировали в анаэробной среде при 37 °C в течение 48...72 ч. После3 дней инкубации в приготовленном мясном бульоне культуры подвергали действию теплового шока при 100 °C в течение 5 мин с целью формирования спор, после чего пересевали на агар Шадлера и/или чашки с цик-лосерин-цефокситин-фруктозным агаром.

Анаэробные, грамположительные, палочковидные изоляты, окруженные двойной зоной гемолиза на кровяной среде, были предварительно отнесены к виду C. perfringens. На колониях выполняли обратный CAMP-тест (Christie-Atkins-Munch-Peterson) [4], с одновременными положительными контролями (Streptococcus agalactiae ATCC 27956 и внутренний контроль C. perfringens, разработанный Институтом профилактики и исследований заболеваний животных Ломбардии и Эмилии Романьи, Отделение в г. Парме, Италия).

Предварительная идентификация C. difficile была основана на морфологии колонии, запахе (навоз лошадей), неспособности бактерий выживать в аэробной среде и на результатах клеточной морфологии после окрашивания по Граму. Видовую принадлежность подтверждали с помощью быстрой реакции латекс-агглютинации на слайдах (C. difficile, «Oxoid», England) и экспресс-теста Rapid ID32A («bioMerieux SA», France).

Все изоляты хранили на криоконсервированных гранулах (MAST Diagnostics, D.I.D, «Diagnostic International Distribution S.p.A.», Италия) при температуре —70°C.

Референтные штаммы для ПЦР. В качестве положительного контроля для дуплекс- и мультиплекс-ПЦР использовали штамм C. perfringens ATCC 12917 cpa+/cpe+. Штаммы C. perfringens NCTC 8346, ATCC 373 и ATCC 27324 использовали при мультиплекс-ПЦР в качестве контролей cpa+/etx+, cpa+/cpb+/cpb2+ и cpa+/iap+/cpe+/cpb2+, соответственно. Штаммы C. difficile VPI 10463 и 51377 служили контролем C. difficile tcdA+/tcdB+ и cdtA+/cdtB+, соответственно.

Выделение ДНК C. perfringens и C. difficile. Для каждого штамма C. perfringens или C. difficile смешивали 100 мкл суспензии клеток в стерильной воде, инкубировали при 100 °C в течение 5 и 10 мин, соответственно, и центрифугировали при 12000 g (Microliter Centrifuge, Hermle Z 233 M-2, «Delchimica Scientific Glassware s.r.l.») в течение 2 мин. Затем 5 мкл полученного супернатанта ис-

пользовали как образец ДНК для всех ПЦР. Все ПЦР выполняли с помощью ДНК-термоциклера Techne TC-32 («Barloworld Scientific Ltd», Италия).

Дуплекс-ПЦР для выявления генов, кодирующих фосфолипазу С и CPE, в изолятах C. perfringens. Все изоляты C. perfringens и референтный штамм ATCC 12917 были исследованы в ПЦР на наличие генов, кодирующих фосфолипазу С и CPE, согласно Fach и Popoff [7]. Амплифицированные продукты подвергали электрофорезу в 1,5%-м агарозном геле (120 вольт, 1 ч), затем окрашивали их бромидом этидия и исследовали визуально при ультрафиолетовом освещении.

Мультиплекс-ПЦР для выявления генов, кодирующих токсины C. perfringens. Все изоляты C. perfringens, а также 4 референтных штамма были исследованы в ПЦР с целью выявления генов, кодирующих токсины a (cpa), b (cpb), e (etx), CPE (cpe), i (iap) и b2 (cpb2), согласно Baums et al. [2]. Продукты реакции подвергали электрофорезу в агарозном геле, как описано выше.

Дуплекс-ПЦР для выявления генов, кодирующих токсины TcdA/B и бинарный токсин, в изолятах C. difficile. Все изоляты C. difficile и референтные штаммы исследовали в ПЦР с целью выявления генов, кодирующих TcdA/B (фрагменты tcdA 624 п.н. и tcdB 412 п.н.), согласно Spi-gaglia и Mastrantonio [24], а также кодирующих бинарный токсин (фрагменты cdtA 375 п.н. и cdtB 510 п.н.), согласно Stubbs et al. [25]. Продукты реакции подвергали электрофорезу в агарозном геле, как описано выше.

Результаты

Из 119 проб, полученных от КРС, 53 (44,5 %) были положительными при культивировании: 37 на C. perfringens (31,1 %) и 16 на C. difficile. В двух пробах, полученных от телят и положительных на C. perfringens, была также изолирована бактерия C. difficile: всего 18 изолятов C. difficile (15,1 %). От одной коровы и трех телят C. perfringens изолировали из образца фекалий после дефекации и образца фекалий из прямой кишки; у одного теленка бактерия была изолирована из пробы фекалий, взятой из прямой кишки. Все пробы, положительные на C. perfringens (32 пробы фекалий после дефекации и 5 из прямой кишки) были получены от 33 животных с диареей (23 теленка, 8 коров и 2 телки).

Из 37 изолятов, положительных на C. perfringens, 27 (73,0 %) были от телят (23 пробы фекалий после дефекации и 4 из прямой кишки). В частности, C. perfringens была выделена в пробах от 67,6 % телят, имевших признаки диареи (n=23 из 34).

Все выделенные изоляты C. perfringens относились к типу A. При дуплекс-ПЦР выявлено, что ни один из 37 изолятов C. perfringens не был положителен на энтеротоксин (plc+/cpe-). Этот результат подтвердился мультиплекс-ПЦР (cpa+/cpe-), в ходе которой не были обнаружены гены, отвечающие за образование других токсинов (рис.).

Из 18 изолятов C. difficile 11 (61,1 %) были получены из фекалий дойных коров без признаков диареи, 4 (22,2 %) — из фекалий телят с признаками диареи, и 3 (16,7 %) — из фекалий коров с признаками диареи. Результаты ПЦР всех 18 изолятов C. difficile были отрицательными на tcdA/tcdB и cdtA/cdtB.

РВЖ • СХЖ • № 3/2013

М.К. Оссипранди, Л. Зербини, Е.М. Болдырева

Обсуждение

Clostridium perfringens является одним из наиболее распространенных патогенов. Эту бактерию обычно высевают из образцов почвы и содержимого кишечника здорового человека и животных [8].

C. perfringens типа A, часто обуславливающая развитие газовой гангрены (некроза мышц) и заболеваний пищевого происхождения у человека [8], вырабатывает токсин CPA, а также несколько других токсинов, включая CPE и CPB2. CPE вызывает заболевание ЖКТ у человека, а также у собак, лошадей, свиней и нескольких других видов животных. Отмечен один случай энтерита у козы, вызванного C. perfringens типа A, положительного на cpe [27]. Выделение при диарее из фекального материала штаммов типа А, не являющихся энтеротоксигенными, не исключает их возможного участия в патогенезе заболевания, так как имеется множество других, не учитываемых вирулентных факторов. Один из них — недавно исследованный токсин C. perfringens CPB2, который также связывают с развитием некротического энтерита у поросят, лошадей и КРС [21, 22] и тифлоколита у лошадей [2, 5].

Штамм типа A, основным токсином которого является только CPA, принадлежит к нормальной флоре теплокровных животных, и его выделяют из среды, контами-нированной фекалиями. Однако при соответствующем составе генотипа и благоприятных условиях этот микроорганизм может вызывать газовую гангрену, пищевое отравление и заболевание ЖКТ у человека, некротический энтерит у цыплят, некротизирующий энтерит у поросят, а также абомазит, тимпанию и геморрагический энтерит у телят [8, 20, 23].

Хотя C. perfringens типа A у телят и коров связывают с воспалением сычуга и образованием в нем язв, а также некротическим энтеритом, и гены, кодирующие выработку CPA и CPB2, были выявлены в некоторых из этих случаев, бактерию также изолировали из содержимого кишечника здоровых животных. Следовательно, ее роль как кишечного патогена пока полностью не определена [16].

Clostridium difficile имеет убиквитарное распространение в окружающей среде. C. difficile выделяют у человека, а также телят, страусов, цыплят, слонов, собак, лошадей и свиней, но ее роль в заражении животных и патогенезе очень мало изучена и, возможно, недооценена [9, 19, 29].

Эта бактерия очень часто вызывает кишечные заболевания у человека: ее наиболее часто диагностируют как возбудителя госпитальной диареи и диареи, связанной с применением антимикробных препаратов. Что касается животных, то данных, подтверждающих взаимосвязь между применением антибактериальных препаратов и заселением ЖКТ бактерией C. difficile, а также развитием диареи, пока недостаточно для однозначных выводов, хотя имеются сообщения о развитии диареи у собак и кошек вследствие их инфицирования бактерией C. difficile во время пребывания в клинике в отделении для интенсивного ухода [6]. В одном экспериментальном исследовании также было продемонстрировано, что назначение эритромицина может вызвать сильный колит, ассоциированный с ростом C. difficile у взрослых лошадей [3, 9].

Согласно результатам недавних исследований, C. difficile может стать важным внебольничным патогеном:

1 23456789 10

Рис. Типирование отдельных изолятов Clostridium perfringens с помощью мультиплекс-ПЦР.

Дорожки 1...7: штаммы типа A (cpa+); дорожка 8: положительный контроль C. perfringens

бактерия была обнаружена в мясе, реализуемом в розницу. Это вызвало опасения в отношении роли контаминации пищевых продуктов в эпидемиологии внеболь-ничных инфекций, обусловленных данным микроорганизмом [29].

В нашем исследовании около 67,6 % изолятов C. per-fringens были получены от телят с признаками диареи (n=23 из 34). Микроорганизм не был выделен из фекалий 4 телят, не страдающих диареей, или других здоровых животных. Эта разница статистически значима (двусторонний критерий Фишера р=0,018). То, что C. perfringens часто выделяют от больных животных, неудивительно, поскольку у них имелись признаки диареи, а штаммы типа A обычно присутствуют в кишечнике (даже у новорожденных животных), и есть мнения, что изоляции этих микроорганизмов от телят с энтеритом не следует придавать этиологическое значение.

Мы проанализировали типы токсинов 37 (31,1 %) изолятов C. perfringens из 119 проб фекалий животных как с признаками диареи, так и здоровых. Как указано выше, все 37 изолятов C. perfringens были получены от животных с диареей, в частности телят, при ПЦР они были отнесены к типу A и содержали ампликоны plc/cpa, что подтверждает результаты других исследователей [8].

В ходе исследования не были изолированы другие типы C. perfringens и ни одного штамма, содержащего cpe или гены, кодирующие другие токсины: cpb2-положитель-ный тип A бактерии C. perfringens не был выделен, хотя появляется все больше данных о связи токсина cpb2 у C. perfringens с энтеротоксемией КРС, особенно у телят [5, 12, 14, 28].

Все 23 пробы, полученные от дойных коров без признаков диареи, не содержали C. perfringens, но C. difficile была выделена из многих проб (47,8%: n=11 изо-лятов от 23 здоровых коров). В целом, 61,1 % штаммов

C. difficile (n=11 из 18 изолятов) были получены от здорового КРС. Однако все 18 штаммов C. difficile были неток-сигенными (отрицательными на tcdA/tcdB cdtA/cdtB).

Выводы

Мы можем сделать вывод, что поскольку C. perfringens и C. difficile часто выделяют у клинически здоровых животных, сам факт изоляции этих микроорганизмов имеет небольшое диагностическое значение. Необходимо молекулярное генотипирование/типиро-вание токсинов, что позволит поставить окончательный диагноз и оценить в полной мере эпидемиологическое значение этих результатов, в особенности в пробах от здоровых животных.

1000 Ьр

100 Ьр

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Чинцию Ревер-бери и Роберто Луризи за техническую поддержку, а также сотрудников Института профилакти-

Библиография

1. Baker A.A., Davis E., Rehberger T., Rosener D. Prevalence and diversity of toxigenic Clostridium perfringens and Clostridium difficile among swine herds in the Midwest // Appl. Environm. Microbiol., 2010; 76:2961-2967.

2. Baums C.G., Shotte U., Amtsberg G., Goethe R. Diagnostic multiplex PCR for toxin genotyping of Clostridium perfringens isolates // Vet. Microbiol., 2004; 100: 11-16.

3. Baverud V. Clostridium difficile infections in animals with special reference to the horse. A review // Vet. Q., 2002; 24: 203-219.

4. Buchanan A.G. Clinical laboratory evaluation of a reverse CAMP test for presumptive identification of Clostridium perfringens // J. Clin. Microbiol., 1982; 16: 761-762.

5. Bueschel D.M., Jost B.H., Billington S.J., Trinh H.T., Songer J.G. Prevalence of cpb2, encoding beta2 toxin, in Clostridium perfringens field isolates: correlation of genotype with phenotype // Vet. Microbiol., 2003; 94:121-129.

6. Cloten J., Kruth S., Arroyo L., Weese J.S. Prevalence and risk factors for Clostridium difficile colonization in dogs and cats hospitalized in an intensive care unit // Vet. Microbiol., 2008; 129: 209-214.

7. Fach P., Popoff M.R. Detection of enterotoxigenic Clostridium perfringens in food and faecal samples with a duplex PCR and the slide latex agglutination test // Appl. Environ. Microbiol., 1997; 63: 4232-4236.

8. Ferrarezi M.C., Cardoso T.C., Dutra I.S. Genotyping of Clostridium perfringens isolated from calves with neonatal diarrhea // Anaerobe, 2008; 14:328-331.

9. Freeman J., Bauer M.P., Baines S.D., Corver J., Fawley W.N., Goorhuis B., Kuijper E.J., Wilcox M.H.. The changing epidemiology of Clostridium difficile infections // Clin. Microbiol. Reviews, 2010; 23: 529-549.

10. Gibert M., Jolivet-Reynaud C., Popoff M.R. Beta2 toxin, a novel toxin produced by Clostridium perfringens // Gene, 1997; 203: 65-73.

11. Keel M.K., Songer J.G. The comparative pathology of Clostridium difficile-associated disease // Vet. Pathol., 2006; 43: 225-240.

12. Lebrun M., Filee P., Mousset B., Desmecht D., Galleni M., Mainil J.G., Linden A. The expression of Clostridium perfringens consensus beta2 toxin is associated with bovine enterotoxaemia syndrome // Vet. Microbiol., 2007; 120: 151-157.

13. Lebrun M., Mainil J.G., Linden A. Cattle enterotoxaemia and Clostridium perfringens: description, diagnosis and prophylaxis // Veterinary Record, 2010; 167:13-22.

14. Manteca C., Daube G., Jauniaux T., Linden A., Pirson V., Detilleux J., Ginter A., Coppe P., Kaeckenbeeck A., Mainil J.G. A role for the Clostridium perfringens beta2-toxin in bovine enterotoxaemia? // Vet. Microbiol., 2002; 86:191-202.

15. Marks S.L., Kather E.J. Bacterial-associated diarrhoea in the dog: a critical appraisal // Vet. Clin. Small Anim., 2003; 33:1029-1060.

ки и исследований заболеваний животных Ломбардии и Эмилии Романьи, Отделение в г. Парме, Италия, за предоставление некоторых штаммов С. рег-fringens.

16. Morris W.E., Venzano A.J., Elizondo A., Vilte D.A., Mercado E.C., Fernandez-Miyakawa M.E. Necrotic enteritis in young calves // J. Vet. Diagn. Invest., 2011; 23: 254-259.

17. Rodriguez-Palacios A., Stampfli H.R., et al. Clostridium difficile PCR ribotypes in calves, Canada // Emerg. Infect. Dis., 2006; 12: 1730-1736.

18. Rood J.I. Virulence genes of Clostridium perfringens // Annual Review of Microbiology, 1998; 52:333-360.

19. Rupnik M. Is Clostridium difficile-associated infection a potentially zoonotic and foodborne disease? // Clin. Microbiol. Infect., 2007; 13:457-459.

20. Sawires Y.S., Songer J.G. Clostridium perfringens: insight into virulence evolution and population structure // Anaerobe, 2006; 12: 23-43.

21. Schotte U., Truyen U., Neubauer H. Significance of b2-toxigenic Clostridium perfringens infections in animals and their predisposing factors. A Review // J. Vet. Med., 2004; 51: 423-426.

22. Slavic D., Boerlin P., Fabri M., Klotins K.C., Zoethout J.K., WeirP.E., Bateman

D. Antimicrobial susceptibility of Clostridium perfringens isolates of bovine, chicken, porcine, and turkey origin from Ontario // Canadian J. Vet. Research, 2011; 75:89-97.

23. Songer J.G. Clostridial enteric diseases of domestic animals // Clin. Microbiol. Rev., 1996; 9: 216-234.

24. Spigaglia P., Mastrantonio P. Molecular analysis of the pathogenicity locus and polymorphism in the putative negative regulator of toxin production (TcdC) among Clostridium difficile clinical isolates // J. Clin. Microbiol., 2002; 40:3470-3475.

25. Stubbs S., Rupnik M., Gilbert M., Brazier J., Duerden B., Popoff M. Production of actin-specific ADP-ribosyltransferase (binary toxin) by strains of Clostridium difficile // FEMS Microbiol. Lett., 2000; 186: 307-312.

26. Uzal F.A., Songer J.G. Diagnosis of Clostridium perfringens intestinal infections in sheep and goats // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2008; 20: 253-265.

27. Uzal F.A., Fisher D.J., Saputo J., Sayeed S., McClane B.A., Songer G., Trinh H.T., Fernandez Miyakawa M.E., Gard S. Ulcerative enterocolitis in two goats associated with enterotoxin- and beta2 toxin-positive Clostridium perfringens type D // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2008; 20:668-672.

28. van Asten A.J.A.M., Nikolaou G.N., Grone A. The occurrence of cpb2-toxigenic Clostridium perfringens and the possible role of the ?2-toxin in enteric disease of domestic animals, wild animals and humans. A review // The Vet. J., 2010; 183:135-140.

29. Weese J.S., Avery B.P., Rousseau J., Reid-Smith R.J. Detection and enumeration of Clostridium difficile spores in retail beef and pork // Appl. Environm. Microbiol., 2009; 75: 5009-5011.

Summary

M.C. Ossiprandi, L. Zerbini, E.M. Boldyreva. Molecular Toxinotyping of Clostridium perfringens and Clostridium difficile Cattle isolates by PCR Assays. Clostridium perfringens and C. difficile are common causes of enteritis and enterotoxaemia in humans and domestic and wild animals. The purpose of this study was to investigate the enterotoxigenity of Clostridium cattle isolates by PCR assays. One hundred and nineteen bovine (faecal and intestine) samples were analyzed by culture assay. All C. perfringens isolates were screened for the characterization of the toxinotype. C. difficile strains were PCR-tested for the presence of tcdA/tcdB and cdtA/cdtB genes. Overall, 53 bovine samples tested positive: 37 for C. perfringens and 16 for C. difficile. In two C. perfringens-positive diar-rhoeic samples, C. difficile was also isolated. All C. perfringens isolates were type A; C. difficile strains resulted tcdA/tcdB and cdtA/cdtB-negative. Understanding the diversity of toxigenic strains may lead to a greater understanding of the pathogenesis in cattle and aid in the development of effective intervention methods for controlling clostridial disease outbreaks.

РВЖ • СХЖ • № 3/2013