СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АПОПТОЗ-ИНДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ
AGENT OF APOPTOSIS-INDUCTIVE ACTIVITY

Изобретение относится к области медицины и биологии, а именно к веществам, обладающим апоптоз-индуцирующей активностью, и может быть использовано в онкологии, а также в качестве индуктора апоптоза при работе с клеточными культурами.
Апоптоз является генетически обусловленным механизмом клеточной гибели, играющий важную роль в регуляции дифференцировки клеток и поддержания гомеостаза организма. Процесс позволяет наиболее щадящим для организма путем ликвидировать клетки, имеющие генетические повреждения или метаболические нарушения, не совместимые с нормальной функцией. Апоптоз проявляется в уменьшении размера клетки, конденсации и фрагментации хроматина, уплотнении мембраны без выхода содержимого клетки наружу, и в конечном итоге, распаде клетки на апоптотические тельца, которые фагоцитируются макрофагами или соседними клетками без развития реакций воспаления и повреждения ткани.
Процесс апоптоза продолжает активно изучаться в первую очередь в отношении внутриклеточных механизмов его запуска и регуляции в тканях и отключения апоптоза в опухолях. Установлены основные клеточные рецепторы и гены, ответственные за регуляцию про- и антиапоптотических процессов. Известно, что быстрый неконтролируемый злокачественный рост обусловлен в первую очередь тем, что нарушены процессы запуска апоптоза и, например, раковые клетки не могут уничтожить себя сами обычным для интактных клеток путем.
Известны средства, обладающие апоптоз-индуцирующей активностью, [1], а именно описываются средство и способ индукции апоптоза опухолевых клеток, где заявлено применение донора монооксида углерода - CORM-2 для индукции апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat. Данное средство сложное в производстве, а эффект индукции апоптоза ограничен клеточной линией Jurkat.
Известен индуктор апоптоза [2], предполагающий использование органоспецифических гомеопатических препаратов, стимулирующих миелоидный и лимфоидный ростки кроветворения.
Недостатком данного средства является высокая специфичность методики использования, низкая эффективность индукции апоптоза в клеточных культурах.
Задачей изобретения является расширение арсенала апоптоз-индуцирующих средств.
6
7
6
2
Поставленная задача решается применением аскорбата лития с общей формулой LiCHO⋅2HO в качестве средства, обладающего апоптоз-индуцирующей активностью.
Ранее было известно применение аскорбата лития для повышения активности нейтрофилов [3].
Соли лития используются в медицине в качестве нормотимиков - стабилизаторов настроения [4].
Возможность применения аскорбата лития в качестве индуктора апоптоза (генетически программированная клеточная гибель) была впервые установлена экспериментально. Сочетание известных психостабилизирующих и антиоксидантных свойств аскорбата лития с его вновь выявленными апоптоз-индуцирующими свойствами перспективно для практического применения, в частности в онкологии.
Новые свойства аскорбата лития не вытекают из уровня техники и неочевидны для специалиста.
Исходя из вышеизложенного следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенного к нему чертежа.
На чертеже изображен процент раннего и позднего апоптоза мононуклеаров периферической крови в культуре: (а) инкубация без аскорбата лития, (б) инкубация с 1 ммоль/л аскорбата лития.
Исследование апоптозиндуцирующей активности аскорбата лития в отношении мононуклеаров периферической крови было проведено с использованием набора реактивов «Annexin V & Dead Cell Assay Kit» (Merck Millipore, Германия) на проточном цитометре «Muse Cell Analyzer» (Merck Millipore, Германия).
Метод заключается в дифференцировании живых клеток, клеток в состоянии апоптоза и клеток в состоянии некроза (мертвые клетки). Клетки, экспрессирующие на внешней стороне мембраны фосфатидил-серин и связанный с ним аннексии V, меченный флуоресцентной меткой, определяются как апоптотические. При этом различают клетки в ранней стадии апоптоза (early apoptosis, аннексии V-положительные) и в поздней (late apoptosis, аннексии V-положительные/пропидий иодид положительные). Клетки, содержащие только интерколирующий флуоресцентный краситель пропидий иодид, определяются как мертвые (некротические).
Пример 1
С целью определения апоптоз-индуцирующей активности 100 мг аскорбата лития растворяли в 10 мл дистиллированной воды. Полученный раствор исследовали на наличие апоптоз-индуцирующей активности. Для этого мононуклеары периферической крови здоровых доноров, выделенные на градиенте фиколла, суспендируют в среде RPMI 1640, добавляют раствор аскорбата в среду RPMI 1640 с расчетом на конечную концентрацию в лунке 1,0 ммоль/л. Клетки инкубируют в течение 24 часов при 37°C в среде 5% углекислого газа. Определение степени апоптоза в культуре определялось как сумма долей клеток в раннем апоптозе (early apoptosis) и в позднем (late apoptosis).
Результаты определения уровня апоптоза представлены в таблице 1 в процентах апоптотических клеток после 24 часов инкубации мононуклеаров с аскорбатом лития.
Как видно из таблицы 1 и чертежа процент мононуклеаров периферической крови при инкубации с 1 ммоль/л аскорбата лития был статистически значимо выше по сравнению с контролем (t=-8,311, df=4, р=0,001).
Список литературы
1. Пат. №2488408 Российская Федерация, МПК А61К 47/00, А61Р 35/00, А61Р 43/00. Средство и способ индукции апоптоза опухолевых клеток [Текст] / Старикова Е.Г., Таширева Л.А., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Васильева О.А.; заявитель и патентообладатель: ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России (RU) - №2012111026/15; заявл. 22.03.2012; опубл. 27.07.2013, Бюл. №21.
2. Пат. №2144824 Российская Федерация, А61К 35/00. Индуктор апоптоза [Текст] / Рябов Н.О., Поздеев Н.М., Зиновьев Ю.В., Конышев С.А.; заявитель и патентообладатель: Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (RU) - №98101066/14; заявл. 29.01.1998; опубл. 27.01.2000, Бюл. №3.
3. Пат. №2226391 Российская Федерация, А61К 33/00, А61Р 43/00. Средство для повышения активности нейтрофилов [Текст] / Плотников В.М., Чучалин B.C., Скорик Н.А., Ульянов С.Н., Балашев П.П., Рузаев Л.Н; заявители и патентообладатели: Плотников Владимир Михайлович, Чучалин Владимир Сергеевич, Скорик Нина Алексеевна, Ульянов Сергей Николаевич, Балашев Петр Прокопьевич, Рузаев Леонид Николаевич (RU) - №2002114173/15; заявл. 28.05.2002; опубл. 10.04.2004, Бюл. №10.
4. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в двух частях. 41. - 12 изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1986. - С. 127-129.