КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ГУМАНИЗАЦИИ И ОПТИМИЗАЦИИ N-ЛИКАН В РАСТЕНИЯХ

1. Гликопротеиновая композиция с гомогенным профилем N-гликозилирования, где, по меньшей мере, 90% N-гликановыми типами, присутствующими в указанном профиле, являются GlcNAc2Man3GlcNAc2 (GO), указанный профиль, включающий небольшое количество предшественника N-гликановых типов, где указанный предшественник N-гликановых типов выбирается из группы, состоящей из Man3GlcNAc2, GlcNaclMan3GlcNAc2, где GlcNacl прикреплен к 1,3 маннозному плечу (MGn), GlcNaclMan3GlcNAc2, где GlcNacl прикреплен к 1,6 маннозному плечу (GnM), и любой комбинации из них.
2. В основном гомогенная гликопротеиновая композиция, в которой, по меньшей мере, 90% гликопротеина, присутствующего в композиции, представлено GO-гликоформой, включающая небольшое количество предшественника гликоформы.
3. Гликопротеиновая композиция по п.1 или 2, в которой указанный гликопротеин представляет собой иммуноглобулин.
4. Гликопротеиновая композиция по п.3, в которой указанный иммуноглобулин включает Fc область, выбранную из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 области.
5. Гликопротеиновая композиция по п.3, в которой указанный иммуноглобулин представляет собой моноклональное антитело.
6. Гликопротеиновая композиция по п.5, в которой указанное моноклональное антитело связывает антиген, выбранный из группы, состоящей из CD20 и ERBB2 (HER2).
7. Гликопротеиновая композиция по п.3, в которой указанный иммуноглобулин проявляет повышенное сродство к связыванию для FcγRIII.
8. Гликопротеиновая композиция по п.3, в которой указанный иммуноглобулин проявляет повышенную антителозависимую клеточную цитотоксичную (ADCC) активность.
9. Гликопротеиновая композиция по п.3, в которой указанный иммуноглобулин проявляет сниженную комплементзависимую цитотоксичную (CDC) активность.
10. Фармацевтическая композиция, включающая гликопротеиновую композицию по любому из пп.1-9.
11. Клетка-хозяин, включающая гликопротеиновую композицию по любому из пп.1-9.
12. Клетка-хозяин по п.11, представляющая собой растительную клетку-хозяина.
13. Клетка-хозяин по п.12, в которой указанным растением является ряска.
14. Способ изменения профиля N-гликозилирования гетерологичного полипептида, образованного в растении ряска или растительной клетке или клубеньке ряски, включающий:
(a) введение в указанное растение ряска или растительную клетку или клубенек ряски полинуклеотидную конструкцию, включающую первую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) в указанном растении ряска или растительной клетке или клубеньке ряски, и в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность функционально связанна с промотором, который функционален в растительной клетке, указанная первая полинуклеотидная последовательность включается в 5'-3' направлении и функционально связывает:
(i) FucT прямой фрагмент, указанный FucT прямой фрагмент, включающий от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательностей с полинуклеотидной последовательностью от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2;
(ii) спейсерную последовательность, включающую от около 200 до около 700 полинуклеотидов, непосредственно дальше от указанного FucT прямого фрагмента;
(iii) и FucT обратный фрагмент, указанный FucT обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным FucT прямым фрагментом, так, что указанная первая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как РНК молекула, способная образовывать шпильковую РНК структуру; или
(i) смысловой полинуклеотидной последовательностью, включающей, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательностей с полинуклеотидной последовательностью из, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов из SEQ ID NO:1; и
(ii) антисмысловой полинуклеотидной последовательностью, включающей, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательностей с комплементом полинуклеотидной последовательности, состоящей из, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов указанной смысловой полинукдеотидной последовательности; в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность транскрибирована как небольшая шпильковая РНК, имеющая длину стебля из спаренных оснований менее чем около 200 пар оснований; и
(b) культивирование указанного растения ряски или растительной клетки или клубенька ряски при условиях, пригодных для экспрессия указанного гетерологичного полипептида.
15. Способ изменения профиля N-гликозилирования гетерологичного полипептида, продуцированного в растении ряске или растительной клетке или клубеньке ряски, включающий:
(а) введение в указанное растение ряски или растительную клетку или клубенек ряски полинуклеотидной конструкции, включающей первую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в указанном растении ряске или растительной клетке или клубеньке ряски, и в котором указанная первая полинуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который является функциональным в растительной клетке, указанная первая полинуклеотидная последовательность, включающая в направлении 5'-3' и функционально связанная:
(i) прямой фрагмент XyIT, указанный прямой фрагмент XyIT, включающий от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью, состоящей из от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов из SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:21;
(ii) спейсерную последовательность, включающую от около 200 до около 700 полинуклеотидов, непосредственно ниже указанного прямого фрагмента XyIT;
(iii) обратный фрагмент XyIT, указанный обратный фрагмент XyIT, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным прямым фрагментом XyIT, так, что указанная первая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как РНК RNA молекула, способная формировать шпильковую РНК структуру; или
(i) смысловую полинуклеотидную последовательность, включающую, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью, состоящей, по меньшей мере, из 19 соседних полинуклеотидов из SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:19; и
(ii) антисмысловую полинуклеотидную последовательность, включающую, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с комплементом полинуклеотидной последовательности, состоящей из, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов указанной смысловой полинуклеотидной последовательности из вышеуказанного пункта(а); в котором указанная полинуклеотидная последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование указанного XyIT, транскрибирована как малая шпильковая РНК, имеющая стебель из спаренных оснований длиной менее около 200 пар оснований; и
(b) культивирование указанного растения ряски или растительной клетки или клубенька ряски при условиях, пригодных для экспрессия указанного гетерологичного полипептида.
16. Способ изменения профиля N-гликозилирования гетерологичного полипептида, продуцированного в растение ряску или растительную клетку или клубенек ряски, включающий:
(а) введение в указанное растение ряску или растительную клетку или клубенек ряски полинуклеотидной конструкции, включающей слитый полинуклеотид, который способен ингибировать экспрессию или функционирование α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) и β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в указанном растении ряске или растительной клетке или клубеньке ряски, в котором указанный слитой полинуклеотид функционально связан с промотором, который функционален в растительной клетке, указанный слитой полинуклеотид, включающий в направлении 5'-3' и функционально связанный:
(i) химерный прямой фрагмент, указанный химерный прямой фрагмент включающий или:
(a) первый фрагмент, включающий от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью, включающей от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанный FucT; и
(b) второй фрагмент, включающий от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанный XyIT; или
(a) первый фрагмент, включающий от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью, включающей от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанный XyIT; и
(b) второй фрагмент, включающий от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанный FucT;
(ii) спейсерную последовательность, включающую от около 200 до около 700 полинуклеотидов, непосредственно ниже указанного второго фрагмента указанного химерного прямого фрагмента;
(iii) и обратный фрагмент, указанный обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным химерным прямым фрагментом, так, что указанный слитой полинуклеотид транскрибируется как РНК молекула, способный формировать шпильковую РНК структуру; и
(b) культивирование указанного растения ряски или растительной клетки или клубенька ряски при условиях, пригодных для экспрессии указанного гетерологичного полипептида.
17. Нуклеотидная конструкция, включающая первую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) в растении, и вторую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в растении, в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность функционально связана с первым промотором, который функционален в растительной клетке, и в которой указанная вторая полинуклеотидная последовательность функционально связана со вторым промотором, который функционален в растительной клетке, в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность включает в направлении 5'-3' и функционально связана:
(a) FucT прямой фрагмент, указанный FucT прямой фрагмент, включающий от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов, имеющих, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов из SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2;
(b) спейсерную последовательность, включающую полинуклеотидный фрагмент последовательности, указанной в SEQ ID NO:1;
(c) и FucT обратный фрагмент, указанный FucT обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным FucT прямым фрагментом, так, что указанная первая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как РНК молекула, способная формировать шпильковую РНК структуру; или
(a) смысловую полинуклеотидную последовательность, включающую, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов из SEQ ID NO:1; и
(b) антисмысловую полинуклеотидную последовательность, включающую, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с комплементом полинуклеотидной последовательность из, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов указанной смысловой полинуклеотидной последовательности; в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как малая шпильковая РНК, имеющая стебель из спаренных оснований длиной менее около 200 пар оснований.
18. Нуклеотидная конструкция, включающая первую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) в растении, и вторую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в растении, в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность функционально связана с первым промотором, который функционален в растительной клетке, и в которой указанная вторая полинуклеотидная последовательность функционально связана со вторым промотором, который функционален в растительной клетке, в которой указанная вторая полинуклеотидная последовательность включает в направлении 5'-3' и функционально связана или:
(a) XyIT прямой фрагмент, указанный XyIT прямой фрагмент, включающий от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов из SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:19 или SEQ ID NO:20;
(b) спейсерной последовательности, включающей полинуклеотидный фрагмент последовательности, указанной в SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:19;
(c) и XyIT обратный фрагмент, указанный XyIT обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным XyIT прямым фрагментом, так, что такая указанная вторая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как РНК молекула, способная формировать шпильковую РНК структуру, или
(a) смысловую полинуклеотидную последовательность, включающую, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов, имеющая, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью из, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов из SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:19; и
(b) антисмысловую полинуклеотидную последовательность, включающую, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с комплементом полинуклеотидной последовательности, состоящей из, по меньшей мере, 19 соседних полинуклеотидов указанной смысловой полинуклеотидной последовательности вышеуказанного пункта (а);
где указанная вторая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как малая шпильковая РНК, имеющая стебель из спаренных оснований длиной менее около 200 пар оснований.
19. Нуклеотидная конструкция, включающая слитой полинуклеотид, который способен ингибировать экспрессию или функционирование α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) и β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в указанном растении ряске или растительной клетке или клубеньке ряски, в которой указанный слитой полинуклеотид функционально связан с промотором, который функционален в растительной клетке, указанный слитой полинуклеотид, включающий в направлении 5'-3' и функционально связанный:
(a) химерный прямой фрагмент, указанный химерный прямой фрагмент, включающий:
(i) первый фрагмент, включающий от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов из полинуклеотида, кодирующего указанный FucT; и
(ii) второй фрагмент, включающий от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательность из от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов из полинуклеотида, кодирующего указанный XyIT;
(b) спейсерную последовательность включающую фрагмент указанного полинуклеотида, кодирующего указанный XyIT, указанный фрагмент состоит из от около 200 до около 700 полинуклеотидов в длину
(c) и обратный фрагмент, указанный обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным химерным прямьм фрагментом, так, что указанный слитой полинуклеотид транскрибируется как РНК молекула, способная формировать шпильковую РНК структуру; или
(а) химерный прямой фрагмент, указанный химерный прямой фрагмент, включающий:
(i) первый фрагмент, включающий от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов из полинуклеотида. кодирующего указанный XyIT; и
(ii) второй фрагмент, включающий от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательность из от около 500 до около 650 соседних полинуклеотидов из полинуклеотида, кодирующего указанный FucT;
(b) спейсерную последовательность включающую фрагмент указанного полинуклеотида, кодирующего указанный XyIT, указанный фрагмент состоит из от около 200 до около 700 полинуклеотидов в длину
(c) и обратный фрагмент, указанный обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным химерным прямым фрагментом, так, что указанный слитой полинуклеотид транскрибируется как РНК молекула, способная формировать шпильковую РНК структуру.
20. Нуклеотидная конструкция, включающая первую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование α1,3-фукозилтрансферазы (FucT) в растении, в котором указанная первая полинуклеотидная последовательность включает в направлении 5'-3' и функционально связана:
(a) FucT прямой фрагмент, указанный FucT прямой фрагмент, включающий от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанный FucT;
(b) спейсерную последовательность, включающую фрагмент указанного полинуклеотида, кодирующего указанный FucT, указанный фрагмент состоит из от около 200 до около 700 полинуклеотидов в длину; и
(c) и FucT обратный фрагмент, указанный FucT обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным FucT прямым фрагментом, так, что указанная первая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как РНК молекула, способная формировать шпильковую РНК структуру; в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который функционален в растительной клетке.
21. Нуклеотидная конструкция, включающая первую полинуклеотидную последовательность, которая способна ингибировать экспрессию или функционирование β1,2-ксилозилтрансферазы (XyIT) в растении, в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность включает в направлении 5'-3' и функционально связана:
(a) XyIT прямой фрагмент, указанный ХуIT прямой фрагмент, включающий от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности с полинуклеотидной последовательностью из от около 500 до около 800 соседних полинуклеотидов полинуклеотида, кодирующего указанный XyIT;
(b) спейсерную последовательность, включающую фрагмент указанного полинуклеотида, кодирующего указанный XyIT, указанный фрагмент состоит из от около 200 до около 700 полинуклеотидов в длину; и
(c) и XyIT обратный фрагмент, указанный XyIT обратный фрагмент, имеющий достаточную длину и достаточную комплементарность с указанным XyIT прямым фрагментом, так, что указанная первая полинуклеотидная последовательность транскрибируется как РНК молекула, способная формировать шпильковую РНК структуру; в которой указанная первая полинуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который функционален в растительной клетке.
22. Нуклеотидная конструкция по любому из пп.17-21, дополнительно включающая, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, в которой указанный полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, представляющий интерес, функционально связан с промотором, который функционален в растительной клетке.
23. Способ стабильного трансформирования высшего растения для экспрессирования гетерологичного полипептида, представляющего интерес, имеющего измененный профиль N-гликозилирования, включающий введение в указанное высшее растение нуклеотидной конструкция по п.22.
24. Способ получения гетерологичного гликопротеина млекопитающих в высшем растении, в котором указанный гетерологичный гликопротеин млекопитающих имеет снижение прикрепления α1,3-фукозных остатков и β1,2-ксилозных остатков к N-гликанам указанного гликопротеина, когда продуцируется в указанном высшем растении, включающий:
(a) введение в указанное растение экспрессионной кассеты, включающей последовательность, кодирующую полипептид млекопитающих, который посттрансляционно образован как указанный гликопротеин, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную конструкцию по любому из пп.17-19; и
(b) культивирование указанного растения при условиях, пригодных для экспрессии указанного гликопротеина.
25. Способ снижения гетерогенности профиля N-гликозилирования гликопротеина, продуцированного в высшем растении, включающий введение в указанное растение нуклеотидной конструкции по любому из пп.17-21, и культивирование указанного растения при условиях, пригодных для экспрессии указанного гликопротеина.
26. Способ снижения одного или более побочных эффектов, связанных с активацией комплемента при введении антитела, включающий введение указанного антитела в форме в основном гомогенной антительной композиции, в которой, по меньшей мере, 90% указанного антитела, присутствующего в композиции, представлено GO-гликоформой, указанная композиция, включающая небольшое количество указанного антитела, представленного предшественником гликоформы, в котором указанное антитело в указанной композиции снижает активность комплементзависимой цитотоксичности (CDC).
27. Способ по п.26, в котором указанное антитело является моноклональным антителом.
28. Способ по п.27, в котором указанное моноклональное антитело связывает CD20 антиген.
29. Способ по любому из пп.26-28, в котором указанное антитело проявляет повышенное сродство к связыванию для FcγRIII.
30. Композиция, включающая гликопротеин, полученный в соответствии со способом по любому из пп.24 и 25.