ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ γC-ЦИТОКИНОВ (IL-2, IL-7 И IL-15) НА ЭКСПРЕССИЮ МОЛЕКУЛ ПОЗДНЕЙ АКТИВАЦИИ И АПОПТОЗА (CD95 И HLA-DR) CD4+/CD8+ Т-ЛИМФОЦИТАМИ В ПОПУЛЯЦИИ CD45RA Т-КЛЕТОК IN VITRO

Иммунология. 2018; 39

DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-20-25 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК 612.014.017.1:576.32/.36.83

Юрова К.А., Хазиахматова О.Г., Тодосенко Н.М., Литвинова Л.С.

ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ yC-ЦИТОКИНОВ (IL-2, IL-7 И IL-15) НА ЭКСПРЕССИЮ МОЛЕКУЛ ПОЗДНЕЙ АКТИВАЦИИ И АПОПТОЗА (CD95 И HLA-DR) CD4+/CD8+ Т-ЛИМФОЦИТАМИ В ПОПУЛЯЦИИ CD45RA Т-КЛЕТОК IN VITRO

ФГАОУ ВО «Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта», 236016, г Калининград, Россия

Введение. Активация Т-лимфоцитов является ключевым событием в развитии адаптивного иммунного ответа, завершение которого характеризуется последовательной экспрессией молекул поздней и длительной активации и клеточной гибели (HLA-DR, CD95).

Материал и методы. Методом проточной цитофлюориметрии проанализировано изменение числа клеток, экспрессирующих молекулы поздней активации (HLA-DR) и апоптоза (CD95) в популяциях наивных Т-клеток (CD3+CD45RA+CD62L+) и терминально-дифференцированных лимфоцитов (CD3+CD45RA+CD62L-) под действием yc-цитокинов (IL-2, IL-7, IL-15) in vitro.

Результаты. Показано, что действие yc-цитокинов на наивные лимфоциты сопровождалось увеличением числа CD8+CD95+-клеток, ограничивающих цитокин-индуцированную активацию Т-лимфоцитов посредством запуска Fas-опосредованного апоптоза. В популяции ТЕМКА-клеток было зафиксировано повышение числа CD47CD8+HLA-DR'-лимфоцитов, свидетельствующих о влиянии Yc-цитокинов (IL-2, IL-7, IL-15) на процессы дифференцировки и созревания Т-лимфоцитов, и направленных на подавление антиген-независимой гиперактивации иммунной системы.

Заключение. yc-цитокины IL-2, IL-7 и IL-15 могут инициировать активацию ТЕМКА-клеток, а также антигенне-зависимую дифференцировку и созревание наивных Т-лимфоцитов. Ограничение патологической активации наивных Т-лимфоцитов реализуется посредством запуска Fas-опосредованного апоптоза при длительном воздействии высоких концентраций цитокинов. Подавление цитокинопосредованной гиперактивации ТЕНКА-клеток может осуществляться за счёт участия HLA-DR-позитивных лимфоцитов в механизмах супрессии иммунных реакций.

Ключевые слова: наивные Т-лимфоциты; терминально-дифференцированные лимфоциты; TEMRA, yc-цитокины;

активация; апоптоз; дифференцировка. Для цитирования: Юрова К.А., Хазиахматова О.Г., Тодосенко Н.М., Литвинова Л.С. Оценка влияния yc-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) на экспрессию молекул поздней активации и апоптоза (CD95 и HLA-DR) CD4+/ CD8+ Т-лимфоцитами в популяции CD45RA Т-клеток in vitro. Иммунология. 2018; 39(1): 20-25. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-20-25

Yurova K.A., Khaziakhmatova O.G., Todosenko N.M., Litvinova L.S.

EVALUATION OF THE EFFECT OF rC-CYTOKINES (IL-2, IL-7 AND IL-15) ON EXPRESSION OF THE LATE ACTIVATION MOLECULES AND APOPTOSIS (CD95 AND HLA-DR) CD4+/CD8+ T-LYMPHOCYTES IN A POPULATION OF CD45RAT CELLS IN VITRO

Immanuel Kant Baltic Federal University, 236016, Kaliningrad, Russia

Change in the expression number of late activation (HLA-DR) and apoptosis (CD95) molecules in populations of naive T cells (CD3+CD45RA+CD62L+) and terminal differentiated lymphocytes (CD3+CD45RA+CD62L-) by Yc-cytokines (IL-2, IL-7, IL-15) in vitro was analyzed by flow cytometry. It was shown that the effect of Yc-cytokines on naive lymphocytes was accompanied by an increase in the number of CD8+ CD95+ cells that limit the cytokine-induced activation of T lymphocytes by triggering Fas-mediated apoptosis. In the TEMRA cell population, an increase in the number of CD4+/CD8+HLA-Dr+ cells, indicative of the effect of yc-cytokines (IL-2, IL-7, IL-15) on the differentiation and maturation of T lymphocytes and aimed at suppressing antigen-independent immune activation of the immune system.

Keywords: naive T-lymphocytes; terminal differentiated lymphocytes; TEMRA, yc-cytokines; activation; apoptosis; differentiation.

For citation: Yurova K.A., Khaziakhmatova O.G., Todosenko N.M., Litvinova L.S. Evaluation of the effect of yc-cytokines (IL-2, IL-7 and IL-15) on expression of the late activation molecules and apoptosis (CD95 and HLA-DR) CD4+/ CD8+ T-lymphocytes in a population of CD45RA T cells in vitro. Immunologiya. 2018; 39(1): 20-25. DOI: http://dx.doi. org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-20-25

For correspondence: Larisa S. Litvinova, Dr. Sci. Med., Head of Laboratory immunology and cells biotechnology of Immanuel Kant Baltic Federal University. E-mail: larisalitvinova@yandex.ru

Для корреспонденции: Литвинова Лариса Сергеевна, д-р мед. наук, зав. базовой лабораторией иммунологии и клеточных биотехнологий БФУ им. И. Канта, E-mail: larisalitvinova@yandex.ru

ORIGINAL ARTICLE

Information about authors:

Yurova K.A. http://orcid.org/0000-0001-6146-3330 Khaziakhmatova O.G. http://orcid.org/0000-0002-5525-3529 Todosenko N.M. http://orcid.org/0000-0001-7468-4861 Litvinova L.S. http://orcid.org/0000-0001-5231-6910

Conflict of interest. The authors state that there is no conflict of interest. Acknowledgment: Work is performed under the program of increase of competitiveness («road maps») and subsidies «Organization of scientific research 20.4986.2017/6.7» Immanuel Kant Baltic Federal University.

Received 31.05.17 Accepted 16.08.17

Введение

Сущность ответной иммунной реакции заключается в эффективной элиминации различных агентов инфекционной и неинфекционной природы. Ключевое событие в развитии адаптивного иммунного ответа - активация Т-лимфоцитов, в результате которой на клеточной мембране последовательно экспресси-руются молекулы, характеризующие стадии ранней и поздней активации, пролиферации и апоптоза [1, 2].

Согласно современным представлениям, активационное состояние клеток наиболее полно отражает маркер поздней и длительной активации HLA-DR, осуществляющий взаимодействие иммунокомпетентных клеток человека, распознавание ауто- и экзогенных антигенов, запуск и реализацию иммунного ответа, обеспечивая выживание и адаптацию человека как вида в условиях непрерывного воздействия факторов антигенного окружения [2]. Необходимым завершением эффективного иммунного ответа является программированная гибель (апоптоз) активированных клеток, в индукции которой участвуют сигналы, приводящие к активации специализированных «рецепторов смерти» [1, 2-3]. Акцептором летального сигнала может выступать Fas-рецептор (CD95), активирующийся при взаимодействии с лигандом FasL (CD178) [4], который экспрессируется на NK-клетках и активированных Т-лимфоцитах [5]. Инициация апоптоти-ческой гибели может быть опосредована как внеклеточными факторами (цитокины, хемокины, MHC-сигналинг и др.), так и внутриклеточными сигналами [5, 6].

Известно, что цитокины семейства I типа (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 и IL-21), имеющие общую у-цепь рецепторов (CD132), способны оказывать комплексное влияние на клеточный гомеостаз Т-лимфоцитов [7], а также на процессы активации и дифференцировки, при этом чувствительность Т-клеток к иммунорегуляторным цитокинам зависит от стадии их развития [8].

Таким образом, целью настоящего исследования явилось определение экспрессии молекул поздней активации (HLA-DR) и апоптотической гибели (CD95) в популяциях наивных Т-клеток и терминально-дифференцированных лимфоцитов под влиянием ус-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15) в условиях культивирования in vitro.

Материал и методы.

Исследование проводили согласно протоколу Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине 1999 г. и Хельсинкской декларации ВМА 2000 г. Разрешение на проведение исследования №5 от 05.11.2013 г. получено в локальном этическом комитете БФУ им. И. Канта (г. Калининград).

Исследование проводили с использованием фракций CD45RA+ Т-клеток, выделенных из мононуклеарных лейкоцитов венозной крови у 58 условно здоровых доноров (29 мужчин и 29 женщин 22 - 35 лет) методом иммуномагнитной сепарации с помощью автоматического магнитного сепаратора AutoMACS Pro Separator Instrument (Miltinyi Biotec, Германия). Для сепарации использовали моноклональные анти-

тела (МАТ) CD45RA+ с магнитными частицами (MicroBeads human, Miltenyi Biotec, Германия) в соответствии с протоколом производителя. Критерии исключения из исследования: возраст - моложе 18 и старше 35 лет; период обострения хронических воспалительных заболеваний; эндокринные, инфекционные, онкологические, наследственные и психические болезни; алкогольная и наркотическая зависимости.

Выделение мононуклеарных лейкоцитов осуществляли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урографина (1,077 г/см3; Pharmacia, Швеция). Чистоту CD45RA+-популяций определяли с использованием МАТ, конъюгированных с фикоэритрином (PE) или флюорес-цеинизотиоцианатом (FITC) (Abcam, Cambridge, Великобритания). Процентное содержание позитивных клеток выявляли на проточном цитофлюориметре MACSQuantAnalyzer (Miltenyi Biotec, Германия). Содержание целевой CD45RA+-фракции в исследуемых образцах составляло не менее 95%.

Отсутствие В-лимфоцитов (CD19+) и моноцитов (CD14+) в культурах CD45RA+-клеток до и после культивирования подтверждено c помощью проточной цитофлюориметрии с использованием МАТ, конъюгированных с FITC (CD3), PE (CD14) (Abcam, Великобритания) с конъюгатом РЕ с цианином (PE-Cy7) (CD45RA) или с пиридинхлорофиллом (PerCP) (CD19) (e-Bioscience, США). Анализ поверхностных маркеров проводили на проточном цитофлюориметре MACS Quant (Miltenyi Biotec, Германия) согласно протоколам производителей. В работе использовали культуры клеток, содержание в которых CD3+CD45RA+CD14-CD19- лимфоцитов составляло в среднем 98,5 ± 1,5%.

Клетки CD45RA+ (Г106 кл/мл) культивировали в 48-лу-ночном планшете в бессывороточной среде Искова (Sigma, США), содержащей 0,5% сывороточного альбумина человека (Микроген, Россия), 5 • 10-5 M p-меркаптоэтанола (Acros Organics, США) и 30 мкг/мл гентамицина в присутствии ре-комбинантных форм цитокинов IL-2, IL-7, IL-15 (Miltenyi Biotec, Германия) в разных концентрациях или без них (контроль) в течение 48 ч при 37 0С, во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2.

Варианты культивирования: 1) интактная проба без добавления цитокинов; 2) пробы с добавлением rIL-2; 3) пробы с добавлением rIL-7; 4) пробы с добавлением rIL-15. Исследованы следующие концентрации ус-цитокинов: 0,1 нг/мл; 0,5 нг/мл; 1,0 нг/мл. По истечении срока инкубации произведён подсчёт числа клеток и зарегистрировано процентное содержание жизнеспособных лимфоцитов в исследуемых клеточных культурах с использованием ViaCount Reagent (Millipore, США) методом проточной лазерной цитометрии на проточном цитометре Guava EasyCite Plus (Millipore, США), согласно протоколу производителя.

Количество CD45RА+-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы CD45RA+, CD3+, CD4+, CD8+, CD62L+, HLA-DR, CD95 определяли с помощью проточной цитофлюориметрии с использованием коктейля МАТ, (eВioscience, США; Abcam, Великобритания; Miltenyi Biotec, Германия), приготовленных ex temporo:

CD3-Viablue/ CD4-PE/CD8- FITC/CD45RA-APC/CD62L-PerCp;

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

CD3-Viablue/ CD4-PE/CD8- FITC/CD95-APC/ HLA-DR-PerCp.

Результаты регистрировали на проточном цитофлюори-метре MACSQuant (Miltenyi Biotec, Германия). Все результаты цитометрического анализа анализировали с помощью программы KALUZA Analysis Software (Beckman Coulter, США).

Полученные данные анализировали с помощью пакета статистических программ IBM SPSS Statistics 20 (Statistical Package for the Social Sciences). При выборке данных использовали гипотезу нормальности распределения (Колмогорова-Смирнова). Для каждой выборки вычисляли средневы-борочные характеристики: медиану (Ме), первый и третий квартили (Q1, Q3). Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали критерий для зависимых выборок Вил-коксона. С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ Спирмена. Статистически значимыми считались различия при p < 0,05.

При сравнительном анализе действия yc-цитокинов (IL-2, IL-7, IL-15) на исследуемые характеристики Т-клеток, полученных у условно здоровых лиц, в зависимости от гендерных критериев достоверных различий тестируемых параметров не выявлено.

Результаты и обсуждение

Принято считать, что экспрессия высокомолекулярной изоформы общелейкоцитарного рецептора CD45-CD45RA характерна для «наивных» лимфоцитов, которые прошли антиген-независимую дифференцировку в тимусе. Экспрессия наивными клетками молекул CD62L, CCR7 и CXCR4 позволяет им мигрировать в Т-зоны лимфатических узлов, где происходит презентация антигена дендритными клетками, результатом которой является образование лимфоцитов иммунной памяти с фенотипом CD45R0blightCD45RA- [1, 9].

Однако накопленные к настоящему времени в мировой литературе сведения доказывают, что молекула CD45R0 может замещаться на исходную изоформу - CD45RA [10].

Предполагают, что клетки реэкспрессирующие молекулу CD45RA, - это терминально-дифференцированная популяция лимфоцитов, которые обеспечивают устойчивую иммунологическую память на реинвазию патогенов [9, 10].

На основе дифференциальной экспрессии молекулы L-селектина - CD62L, нами выявлены субпопуляции наивных Т-клеток - CD3+CD45RA+CD62L+ и терминально-дифференцированных лимфоцитов TEMRA - CD3+CD45RA+CD62L-.

По окончании срока культивирования (48 ч) общее количество клеток в контрольных пробах CD3+CD45RA+-Т-лимфоцитов составило 1,08±0,09^106 кл/мл, число жизнеспособных Т-клеток было равным в среднем 75,45 (71,98-78,23)%.

В интактных CD3+CD45RA+ - культурах Т-клеток число наивных лимфоцитов составило 54,61 (48,18 - 71,66)%, причём количество CD4+CD62L+ Т-клеток в 4 раза превышало число CD8+CD62L+ Т-лимфоцитов (р<0,05) и было равным 40,01 (25,32 - 60,00)% и 11,02 (6,62 - 19,93)% соответственно. Содержание лимфоцитов с фенотипом TEMRA 45,39 (28,34 - 51,82)%, из них 6,65 (3,50 - 12,01)% составили CD4+CD62L--лимфоциты, 36,24 (25,64 - 39,02)% -CD8+CD62L--клетки.

Цитофлюориметрический анализ молекулы поздней активации позволил определить, что в популяции наивных лимфоцитов экспрессия HLA-DR детектировалась на неопределяемом уровне, тогда как в популяции ТЕ1ЖД-клеток почти 18% CD4+ и 32% CD8+-лимфоцитов экспрессировали на своей поверхности маркер поздней активации (рис. 1). Известно, что экспрессия HLA-DR наиболее характерна для Т-клеток, подвергшихся антигензависимой дифференцировке [1].

Это свидетельствует, что все выявленные нами CD3+HLA-DR+-Т-клетки являются терминально-дифференцированными лимфоцитами [12].

Согласно полученным данным, 2,3% CD4+ и 5,6% CD8+ наивных лимфоцитов несли на своей поверхности молекулу CD95. В популяции ТЕ1ЖД-клеток 89% CD8+-лимфоцитов экспрессировали маркер апоптоза CD95, тогда как число CD4+CD95+-клеток составило 10,98% (рис. 2).

60

50 -

а: 40

о

<с.

о

0)

к

в

а:

30

20

ю

iff

1 23456789 10

È

ï

If

Й

a

Щ Интактная проба

а IL-2,0,1 нг

а IL-2,0,5 нг

и IL-2,1,0 нг

s IL-7,0,1 нг

и IL-7,0,5 нг

и IL-7,1,0 нг

и IL-15,0,1 нг

и IL-15,0,5 нг

m IL-15,1,0 нг

1 23456789 10 ри-1—1—1—1 1 I —————————— Г ' —......=

CD45RA+CD3+CD4+CD62L- CD45RA+CD3+CD4+CD62L+ CD45RA+CD3+CD8+CD62L- CD45RA+CD3+CD8+CD62L+

Рис.1. Относительное содержание (%) СD4+/СD8+HLA-DR+ лимфоцитов в CD62L+ и CD62L" популяциях СD3+CD45RA+- культур, в условиях культивирования in vitro, с добавлением разных концентраций ус-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15). * - достоверность результатов по отношению к интактной пробе (р<0,05).

ORIGINAL ARTICLE

п н — —i п ! П

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

n-reirm-5Tgrn-8Tgliol

3 4

10

Ш Инташая проба

0 0 И 0 И И И 0 ш

L-2,0,1 нг L-2,0,5 нг L-2,1,0 нг L-7,0,1 нг L-7,0,5 нг L-7,1,0 нг L-15,0,1 нг И 5,0,5 нг И 5,1,0 нг

CD45RA+CD3+CD4+CD62L- CD45RA+CD3+CD4+CD62L+ CD45RA+CD3+CD8+CD62L- CD45RA+CD3+CD8+CD62L+

Рис. 2. Относительное содержание (%) CD4+/CD8+CD95+ лимфоцитов в CD62L+ и CD62L- популяциях CD3+CD45RA+- культур, в условиях культивирования in vitro, с добавлением разных концентраций ус-цитокинов (IL-2, IL-7 и IL-15). * - достоверность результатов по отношению к интактной пробе (р<0,05).

Интересен тот факт, что все CD3+HLA-DR+-T-KreTra несли на своей поверхности молекулу CD95, однако не все СЭ3+СЭ95+-Т-лимфоциты экспрессировали маркер HLA-DR+. По мнению Jaleco S. и соавт [13], экспрессия CD95 не всегда является признаком чувствительности Т-клеток к Fas-опосредованной апоптотической гибели. В исследованиях, проведённых Robertson M.J. показано, что периферические Т-клетки иммунной памяти, несмотря на высокий уровень экспрессии CD95, оказались устойчивы к апоптозу, индуцированному добавлением МАК к a-Fas [14]. Согласно современным представлениям, экспрессия CD95 на клеточной мембране эффекторных клеток и Т-лимфоцитов памяти может служить маркером их созревания и дифференцировки [15]. Вероятно, высокая поверхностная экспрессия маркеров HlA-DR и CD95 ТЕМ-клетками может являться признаком терминальной фазы дифференцировки и созревания лимфоцитов.

Добавление в среду культивирования CD3+CD45RA+-клеток IL-2 (независимо от концентрации) приводило к статистически достоверному увеличению (в среднем, на 20%) числа клеток в мл. Максимальная концентрация цитокина (1 нг/мл) снижала количество живых клеток в среднем на 22%.

В популяции наивных лимфоцитов действие IL-2 было направлено преимущественно на цитотоксические лимфоциты: отмечено повышение числа CD8+CD95+ Т-клеток на фоне снижения содержания CD8+CD62L+-лимфоцитов (см. рис. 2). Этот тезис подтверждён сильной корреляционной взаимосвязью между числом CD62L+ Т-клеток и CD95+ лимфоцитов (r= -0,86; p<0,05) при действии максимальной концентрации IL-2 (1,0 нг/мл). Экспрессия маркера поздней активации HLA-DR оставалась на уровне контрольных значений (см. рис. 1).

Снижение содержания жизнеспособных клеток наряду с увеличением числа CD8+CD95+ может быть обусловлено способностью IL-2 in vivo (в естественных условиях) в отсутствии антигенного стимула инициировать апоптотиче-скую гибель цитотоксических эффекторов [16]. Известно, что IL-2 способен усиливать экспрессию проапоптотических белков: TRAIL, каспаза-3, DAP и STK 17B [17]. Выявлено, что реализация апоптозиндуцирующего действия IL-2 на лимфоциты крови осуществляется при определённом пороге концентрации цитокина (исследование in vitro) [18]. Кроме

того, одной из причин гибели Т-лимфоцитов может быть IL-2-опосредованное угнетение экспрессии IL-7Ra (CD127) -ключевого фактора модуляции Т-клеточного гомеостаза [19]. Система IL-2/IL-7 регулирует поддержание равновесия между иммунитетом и толерантностью, функционируя как переменный цикл подавления и активации Т-клеточных ответов. Нарушение баланса может инициировать развитие иммунопатологических состояний [20].

Отсутствие выраженных эффектов в популяции CD4+-наивных Т-клеток в ответ на аппликацию в среду культивирования экзогенного IL-2, вероятно, обусловлено сниженной мембранной экспрессией компонентов рецепторного комплекса: IL-2Ra и IL-2RP [21].

Действие IL-2 на ТЕМКД-лимфоциты, напротив, сопровождалось увеличением пула цитотоксических Т Д-эффекторов и ростом числа HLA-DR-позитивных лимфоцитов в популяциях CD8+/CD4+CD62L--клеток (см. рис. 1). Содержание СЭ95+-лимфоцитов статистически достоверно не изменялось (см. рис. 2). Вероятно, IL-2-зависимое увеличение числа CD3+CD45RA+-Т-клеток может быть обусловлено пролиферацией цитотоксических T кД-лимфоцитов. Этот тезис согласуется с данными о способности к пролиферации in vitro CD8+HLA-DR+ -лимфоцитов, выделенных из периферической крови взрослых доноров [22].

Снижение числа CD8+CD62L+-лимфоцитов на фоне одновременного увеличения содержания CD8+CD62L-HLA-DR+ Т-клеток может свидетельствовать об участии IL-2 в дифференцировке и созревании наивных лимфоцитов в T Д в условиях in vitro. Ранее нами был обнаружен факт IL-2-индуцированной дифференцировки цитотоксических CD45RA+CD27+CD62L+-Т-клеток в терминально-дифференцированные эффекторы CD45RA+CD27-CD62L- [23]. В мировой литературе также представлены данные о цитокинопосредованной дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в клетки центральной (CD45RA-CD45R0+CD62L+CCR7+CD27+CD28+) и/или эффекторной (CD45RA-CD45R0+CD62L-CCR7-) памяти [24].

Внесение в среду культивирования наивных CD3+CD45RA+-Т-клеток максимальных концентраций (1,0 нг/мл) IL-7 и IL-15 способствовало повышению числа

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

CD8+CD95+-лимфоцитов (см. рис. 2), не оказывая при этом значимого влияния на жизнеспособность Т-клеток. IL-7 и IL-15 являются ключевыми медиаторами гомеостатической регуляции клеток, основная физиологическая роль которых заключается в сохранении жизнеспособности Т-лимфоцитов [1]. В научной периодике представлены данные о способности IL-7 и IL-15 оказывать антиапоптогенное действие на Т-клетки через JAK/STAT и PDK/AKT-сигнальные пути [25] или за счёт поддержания баланса про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2 [1, 26].

Известно, что IL-7 участвует в рекомбинации локуса у-цепи TCR [1] и может служить критическим модулятором низкоаффинной пептид-индуцирующей пролиферации [1, 27].

Исследование, проведённое Fluur C. и соавт. [28], показало, что IL-2, IL-7 и IL-15 могут инициировать экспрессию Fas на мембранах наивных лимфоцитов и Т-клеток памяти в условиях культивирования in vitro, не сопровождающуюся инициацией дифференцировочного процесса и клеточной гибели. Отсутствие изменений экспрессии Fas на уровне отдельных клеток отвергает идею повышенной продукции маркера апоптоза в ответ на воздействие yc-цитокинов [28]. Авторы предполагают, что цитокинзависимое увеличение экспрессии CD95 может быть связано с перераспределением молекул Fas из внутриклеточного пространства на поверхность клетки. Таким образом, описанный механизм может способствовать увеличению чувствительности Т-клеток к Fas-опосредованному апоптозу. Однако это возможно только при повышенной экспрессии FasL, наблюдающейся при хронической активации иммунной системы, в частности, в условиях персистирующей вирусной инфекции (ВИЧ) [28].

В популяции T A при действии IL-7 (1,0 нг/мл) и IL-15 (0,1-1,0 нг/мл) наблюдали достоверное увеличение числа CD4+/CD8+ лимфоцитов, экспрессирующих маркер длительной активации HLA-DR+, число жизнеспособных клеток оставалось на уровне контрольных значений (см. рис. 1).

Отсутствие корреляционных взаимосвязей между числом наивных и ТЕМКД-лимфоцитов, подвергшихся апоптозу, и ци-токин-индуцированным повышением числа CD95+ и HLA-БЯ+-Т-клеток свидетельствуют о запуске неспецифических активационных механизмов, не приводящих к клеточной гибели Т-лимфоцитов.

Согласно данным научной периодики, экспрессия молекулы HLA-DR является одним из механизмов ограничения иммунного ответа, направленного на инициацию апоптоти-ческой гибели активированных Т-лимфоцитов, утративших способность к экспрессии молекулы Fas [29]. Предполагают, что Т-лимфоциты, экспрессирующие молекулу HLA-DR на своей мембране, представляют собой зрелые регуляторные Т-клетки с высокой супрессивной активностью [22, 30], механизмы которой опосредованы контактными взаимодействиями между соседними клетками, включая CTLA-4-сигнализацию [22].

Выявлено, что повышение экспрессии маркера HLA-DR сопровождает многие аутоиммунные заболевания [31]. Природа ассоциаций аутоиммунных процессов с молекулами HLA-DR основана на степени сродства пептидсвязывающей щели молекул HLA к иммуногенным пептидам конкретного аутоантигена: чем она больше, тем выше риск развития иммунного ответа [1]. Повышенная экспрессия маркера HLA-DR в ответ на введение высоких концентраций экзогенных цитокинов (IL-7, IL-15) свидетельствует об участии этих медиаторов в активации иммунной системы [32].

Для предотвращения избыточной продукции белка экспрессия IL-7 и IL-15 строго регулируется на уровне транскрипции и трансляции [31], однако многие авторы показали, что IL-7 и/или IL-15 по неизвестным причинам конститутивно экпрессируется при аутоиммунных патологиях (так же как миокардит, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, витилиго и др.), регулируя деструкцию тканей посредством

воздействия на дендритные клетки и тканерезидентные эф-фекторные цитотоксические Т-лимфоциты [2, 31].

IL-15, несмотря на общность строения рецепторов с IL-2 и схожими биологическими активностями, обладает также и противоположными функциями, подавляя IL-2-опосредованную активацию Heg, контролирующих гиперактивацию иммунной системы, и ингибируя активационный апоптоз [31]. Свойства IL-15, определяющие его защитные эффекты против патогена, вероятно, играют ключевую роль в патогенезе органоспецифических аутоиммунных расстройств, при которых нарушается регуляция его экспрессии. По данным многих исследователей, роль IL-7 и IL-15 в патогенезе аутоиммунных заболеваний ассоциирована с повышенной экспрессией NKG2D на клеточной поверхности Т-лимфоцитов [33].

NKG2D представляет собой костимулирующий рецептор, экспрессирующийся на apCD3+CD8+/CD4+-Т-клетках, у5Т-клетках, NK-клетках, NKT-клетках [34], распознающий стрессорные молекулы, которые кодируются генами MHC I класса - MICA, MICB, ULBP и сигнализируют о нарушениях физиологического состояния клеток [35, 36].

Известно также, что IL-15 на определённом этапе клеточного развития является необходимым фактором, регулирующим образование молекулы NKG2D [1]. Maasho K. и соавт. [36] в исследовании in vitro показали, что добавление высоких концентраций гомеостатических цитокинов IL-7 и IL-15 в среду культивирования лимфоцитов, полученных от здоровых доноров, не только усиливает пролиферацию Т-клеток, но также повышает экспрессию корецептора NKG2D.

Хроническое увеличение уровней гомеостатических цитокинов свидетельствует о нарушениях клеточного и/ или тканевого гомеостаза, в результате чего повышение экспрессии корецепторной молекулы NKG2D, распознающей трансформированные или подвергшиеся стрессорному воздействию клетки [1], вероятно, является необходимым этапом, приводящим к антигеннезависимой активации Т-лимфоцитов, способных обеспечить клиренс изменённых клеток.

Повышенная экспрессия маркера поздней активации HLA-DR на поверхностной мембране T^^-лимфоцитов в ответ на введение в среду культивирования высоких доз экзогенных IL-7 и IL-15 (1,0 нг/мл) может быть направлена на супрессию иммунного ответа, вызванного цитокин-инду-цированным увеличением экспрессии корецептора NKG2D.

Заключение. Таким образом, в популяции наивных Т-клеток CD3+CD45RA+CD62L+ действие yc-цитокинов IL-2, IL-7, IL-15 (1,0 нг/мл) направлено преимущественно на цитотоксические лимфоциты и сопровождалось увеличением числа клеток, экспрессирующих рецептор CD95 (Fas) (без изменения содержания мёртвых/живых клеток), что может отражать процессы активации наивных лимфоцитов. Вместе с тем, экспрессия CD95+ на поверхностной мембране лимфоцитов может ограничивать повышенную пролиферацию лимфоцитов через запуск Fas-опосредованного апоптоза в случае патологической активации иммунной системы при длительном воздействии высоких концентраций гомеостатических цитокинов (IL-7, IL-15). В популяции терминально-дифференцированных CD3+CD45RA+CD62L-лимфоцитов IL-2 (1,0 нг/мл), IL-7 (1,0 нг/мл) и IL-15 (0,1 - 1,0 нг/мл) способствовали увеличению числа HLA-DR-позитивных лимфоцитов, что может свидетельствовать не только о цитокин-опосредованном запуске процессов дифференцировки и созревания клеток, но также об участии HLA-DR-позитивных лимфоцитов в подавлении гиперактивации иммунной системы.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Финансирование. Работа выполнена в рамках программы повышения конкурентоспособности («дорожной

карты») и субсидии «Организация проведения научных исследований 20.4986.2017/6.7» Балтийского федерального

университета им. Иммануила Канта.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2010.

2. Литвинова Л.С., Гуцол А.А., Сохоневич Н.А., Шуплецова В.В., Кофанова К.А., Хазиахматова О.Г. и др. Основные поверхностные маркеры функциональной активности Т-лимфоцитов. Медицинская иммунология. 2014; 6(1): 7-26.

4. Барышников А.Ю., Шишкин А.Ю. Иммунологические проблемы апоптоза. М.: Эдитория; 2002.

5. Пекарева Е.В., Никонова Т.В., Смирнова О.В. Роль апоптоза в патогенезе сахарного диабета 1 типа. Сахарный диабет. 2010; 1: 45-9.

9. Кудрявцев И.В. Т-клетки памяти: основные популяции и стадии дифференцировки. Российский иммунологический журнал. 2014; 8(17): 947-64.

15. Хайдуков С.В., Холоденко И.В., Литвинов И.С. Иономицин-рези-стентная субпопуляция CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови человека. Функциональная характеристика. Биологические мембраны. 2003; 20(4): 333-40.

18. Сазонова Е.В., Чечина О.Е., Биктасова А.К., Жукова О.Б. Дозоза-висимые эффекты IL-2 на программированную гибель лимфоци-тарных клеток. Материалы Межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии». СПб; 2009: 96-7.

23. Сохоневич Н.А., Литвинова Л.С. Эффекты цитокинов, имеющих общую у-цепь рецепторов (IL-2, lL-7 и IL-15), на содержание CD3+CD4+/CD8+HLA-DR+ Т-клеток в CD45RA- и CD45RO - культурах in vitro. Сборник статей по материалам международная конференция "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация". М.; 2015: 31-4.

REFERENCES

1. Yarilin A.A. Immunology [Immunologiya]. Moscow: GEOTAR-Media; 2009.

2. Litvinova L.S., Gutsol A.A., Sokhonevich N.A., Kofanova K.A., Khazi-akhmatova O.G. et al. Basic surface markers of functional activity T-lym-phocytes. Meditsinskaya immunologiya. 2014; 6

3. Krampe B., Al-Rubeai M. Cell death in mammalian cell culture: molecular mechanisms and cell line engineering strategies. Cytotechnol-ogy. 2010; 62(3): 175-88.

4. Baryshnikov A.Yu., Shishkin A.Yu. Immunological problems of apopto-sis. [Immunologicheskie problemy apoptoza]. Moscow: Editoriya; 2002.

5. Pekareva E.V., Nikonova T.V., Smirnova O.M. The role of apoptosis in pathogenesis of type 1 diabetes mellitus. Sakharnyy diabet. 2010; 1: 45-9.

6. Prabhu S.B., Khalsa J.K., Banerjee H., Das A., Srivastava S., Mattoo H.R. et al. Role of apoptosis-inducing factor (Aif) in the T cell lineage. Indian J. Med. Res. 2013; 138(5): 577-90.

7. Lee B., Hong C. The role of soluble common gamma chain in autoimmune. Anat. Cell Biol. 2015; 48(1): 10-5.

8. Geginat J., Campagnaro S., Sallusto F., Lanzavecchia A. TCR-indepen-dent proliferation and differentiation of human CD4+ T cell subsets induced by cytokines. Adv. Exp. Med. Biol. 2002; (512): 107-12.

9. Kudryavtsev I.V. T cells: major populations and stages of differentiation. Russkiy immunologicheskiy zhurnal. 2014; 8

10. Carrasco J., Godelaine D., Van Pel A., Boon T., van der Bruggen P. CD45RA on human CD8 T cells is sensitive to the time elapsed since the last antigenic. Blood. 2006; 108: 2897-905.

11. Corneau A., Cosma A., Even S., Katlama C., Le Grand R., Frachet V. et al. Comprehensive Mass Cytometry Analysis of Cell Cycle, Activation, and Coinhibitory Receptors Expression in CD4 T Cells from Healthy and HIV-infected Individuals. Cytometry B Clin. Cytom. 2017; 92(1): 21-32.

12. Sallusto F., Geginat J., Lanzavecchia A. Central memory and effector memory T cell subsets: function, generation, and maintenance. Ann. Rev. Immunol. 2004; 22: 745-63.

13. Jaleco S., Swainson L., Dardalhon V., Burjanadze M., Kinet S., Taylor N. Homeostasis of naive and memory CD4+ T cells: IL-2 and IL-7 differentially regulate the balance between proliferation and Fas-mediated apoptosis. J. Immunol. 2003; 171(1): 61-8.

14. Robertson M.J., Manley T.J., Pichert G., Cameron C., Cochran K.J., Levine H. et al. Functional consequences of APO-1/Fas (CD95) antigen expression by normal and neoplastic hematopoietic cells. Leuk Lymphoma. 1995; 17(1-2): 51-61.

ORIGINAL ARTICLE

15. Khaidukov S.V., Kholodenko I.V., Litvinov I.S. The Ionomycin-resistant Subset of CD4 + T Cells Within Human Peripheral Blood. A functional Features. Biologicheskie membrany. 2003; 20

16. Kamimura D., Ueda N., Sawa Y., Hachida S., Atsumi T., Nakagawa T. et al. Evidence of a novel IL-2/15R beta-targeted cytokine involved in homeostatic proliferation of memory CD8+ T cells. J. Immunol. 2004; 173(10): 6041—9.

17. Kovanen P.E., Leonard W.J. Cytokines and immunodeficiency diseases: critical roles of the gamma(c)-dependent cytokines interleukins 2, 4, 7, 9, 15, and 21, and their signaling pathways. Immunol Rev. 2004; 202: 67-83.

18. Sazonova E.V., Chechina O.E., Biktasova A.K., Zhukova O.B. Dose-dependent effects of IL-2 on the programmed death of lymphocytic cells.

Materials of intercity conference of young scientists «Actual problems of pathophysiology». [Materialy Mezhgorodskoy konferentsii molodykh uchenykh «Aktual'nye problemy patofiziologii»]. St. Petersburg; 2009: 96-7.

19. Cai Z., Liu H., Wu X. Forkhead-box transcription factor 1 affects the apoptosis of natural regulatory T cells by controlling Aven expression. BMC Immunol. 2017; 18(1):16.

20. KatzmanS.D.,HoyerK.K.,DoomsH.,GratzI.K.,RosenblumM.D.,PawJ.S. et al. Opposing functions of IL-2 and IL-7 in the regulation of immune responses. Cytokine. 2011; 56: 116-21.

21. Moses C.T., T.horstenson K.M., Jameson S.C., Khoruts A. Competition for self ligands restrains homeostatic proliferation of naive CD4 T cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 1185-90.

22. Arruvito L., Payaslian F., Baz P., Podhorzer A., Billordo A., Pandolfi J. et al. Identification and clinical relevance of naturally occurring human CD8+HLA-DR+ regulatory T cells. J. Immunol. 2014; 193(9): 4469-76.

23. Sokhonevich N.A., Litvinova L.S. Effects of cytokines with a common Y-chain of receptors

24. Surh C.D., Sprent J. Homeostasis of Naive and Memory T Cells. Immunity. 2008; 29 (6): 848-62.

25. Shenoy A.R., Kirschnek S., Hacker G. IL-15 regulates Bcl-2 family members Bim and Mcl-1 through JAK/STAT and PI3K/AKT pathways in T cells. Eur. J. Immunol. 2014; 44(8): 2500-7.

26. Cai K., Wei R. Interleukin-7 expression in tears and orbitaltissues of patients with Graves' ophthalmopathy. Endocrine. 2013; 44(1): 140-4.

27. Fry TJ., Mackall CL. Interleukin-7: from bench to clinic. Blood. 2002; 99(11): 3892-904.

28. Fluur C., De Milito A., Fry T.J., Vivar N., Eidsmo L., Atlas A. et al. Potential role for IL-7 in Fas-mediated T cell apoptosis during HIV infection. J. Immunol. 2007; 178(8): 5340-50.

29. Bertho N., Drenou B., Laupeze B., Berre C.L., Amiot L., Grosset J.M. et al. HLA-DR-mediated apoptosis susceptibility discriminates differentiation stages of dendritic/monocytic APC. J. Immunol. 2000; 164: 2379-85.

30. Imamichi H., Lempicki R.A., Adelsberger J.W., Hasley R.B., Rosenberg A., Roby G. et al. The CD8+ HLA-DR+ T cells expanded in HIV-1 infection are qualitatively identical to those from healthy controls. Eur. J. Immunol. 2012; 42(10): 2608-20.

31. Jabri B., Abadie V. IL-15 functions as a danger signal to regulate tissue-resident T cells and tissue destruction. Nat. Rev. Immunol. 2015; 15(12): 771-83.

32. Amu S., Lantto G.R, Bekele Y., Nasi A., Bengtsson C., Rethi B. et al. Rethi BDysfunctional phenotypes of CD4+ and CD8+ T cells are comparable in patients initiating ART during early or chronic HIV-1 infection. Medicine (Baltimore). 2016; 95(23). Available at: https://www.ncbi.nlm. nih.gov/pmc/articles/PMC4907649/

33. Xing L., Dai Z., Jabbari A., Cerise J.E., Higgins C.A., Gong W., et al. Alopecia areata is driven by cytotoxic T lymphocytes and is reversed by JAK inhibition. Nat. Med. 2014; 20: 1043-9.

34. Talebian L., Fischer D.A., Wu J., Channon J.Y., Sentman C.L., Ernstoff M.S., et al. The natural killer-activating receptor, NKG2D, on CD3+CD8+ T cells plays a critical role in identifying and killing autologous myeloma cells. Transfusion. 2014; 54(6): 1515-21.

35. Bratanic N., Smigoc Schweiger D., Mendez A., Bratina N., Battelino T., Vidan-Jeras B. An influence of HLA-A, B, DR, DQ, and MICA on the occurrence of Celiac disease in patients with type 1 diabetes. Tissue Antigens. 2010; 76(3): 208-15.

36. Maasho K., Opoku-Anane J., Marusina A.I., Coligan J.E., Borrego F. NKG2D is a costimulatory receptor for human naive CD8+ T cells. J. Immunol. 2005; 174(8): 4480-4.

Поступила 31.05.17 Принята в печать 16.08.17