СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОССТАНОВИТЕЛЕЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ ДЛЯ СТЕРИЛЬНЫХ ЦИТОПЛАЗМ СОРГО ТИПОВ М35-1А И 9Е
METHOD OF OBTAINING FERTILITY RECOVERING AGENTS FOR STERILE CYTOPLASMS OF SORGHUM TYPES M-35-1A AND 9E

Изобретение относится к генетике и репродуктивной биологии растений и может быть использовано в селекции и в теоретических исследованиях генетического контроля цитоплазматической мужской стерильности и развития мужской генеративной сферы.
Известен способ создания линий-восстановителей фертильности растений (Brown G.G., Formanova N., Dendy С. et al. Nuclear fertility restorer genes and methods of use in plants. US Patent 7,071,375 B2) на основе введения гена-восстановителя в растения с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС) с помощью генетической трансформации. При этом в растения рапса с ЦМС типа Ogura посредством агробактериальной трансформации вводят генетическую конструкцию, несущую ген Rfo с известной нуклеотидной последовательностью, обусловливающий восстановление мужской фертильности в данном типе ЦМС.
Этот способ, однако, не применим для создания восстановителей фертильности для ЦМС типов М35-1А и 9Е сорго, поскольку гены-восстановители фертильности этих типов ЦМС на сегодняшний день не идентифицированы, и получение трансгенных растений сорго пока еще представляет серьезную проблему.
Известен также способ получения стерильных линий и линий-восстановителей фертильности для них (Williams М., Leemans J. Maintenance of male-sterile plants. US Patent 5,977,433 А), основанный на введении генетических конструкций, кодирующих, соответственно, фермент барназу (фермент, обладающий РНК-азной активностью) под тапетум-специфичным промотором и ее ингибитор, фермент барстар.
Этот способ, однако, также не может быть применен для сорго по причине отсутствия надежных высокоэффективных технологий получения трансгенных растений у этой культуры.
Известен также способ введения гена-восстановителя в растения с цитоплазматической мужской стерильностью (Sakai Т., Liu Н., Kurihara Н., Imamura J. Method for introducing a fertility restorer gene and for producing Fl hybrid of Brassica plants thereby. US Patent 5,644,066), позволяющий создавать линии-восстановители мужской фертильности, который основан на соматической гибридизации. При этом протопласты, выделенные из соматических клеток редиса (Raphanus sativus, Kosena radish), сливают с протопластами ЦМС-линии рапса (Brassica napus).
Этот способ, однако, не применим для создания линий-восстановителей сорго в связи с отсутствием методов регенерации растений из протопластов у этой культуры, а также в связи с отсутствием клонированных генов-восстановителей ЦМС типов М35-1А и 9Е.
Наиболее близким к предлагаемому является способ селекции восстановителей, изложенный в работе А.Н. Палиловой и В.П. Ралько (Палилова А.Н., Ралько В.П. Повышение восстановительной способности линий пшеницы под влиянием отбора // Сельскохозяйственная биология. 1983. №4. С. 29-31). Согласно этому способу, среди гибридных популяций пшеницы, созданных на стерильной цитоплазме Triticum timopheevi и несущих гены-восстановители для нее, проводят отбор самофертильных генотипов, которые в скрещиваниях с ЦМС-линиями на цитоплазме Triticum timopheevi способны давать гибриды F1 с частичным восстановлением фертильности.
Однако попытки использовать данный способ-прототип для селекции восстановителей фертильности для стерильных цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е не увенчались успехом: фертильные гибриды от скрещивания линий-доноров генов восстановителей фертильности (Rf) и стерильных линий и полученные от таких скрещиваний константные фертильные линии не обладали способностью к восстановлению фертильности гибридов F1 (тест-кроссов) с ЦМС-линиями (табл. 1), либо восстанавливали фертильность только у части гибридов F1, что свидетельствовало о неэффективности отбора восстановителей фертильности. Фертильность тест-кроссов варьировала в разные сезоны и зависела от уровня осадков в период развития мужской генеративной сферы (табл. 2; фиг.): доля фертильных растений резко падала в сухой сезон и возрастала в дождливый. Следовательно, прототип, основанный на биологическом способе получения линий-восстановителей фертильности, не позволяет создавать такие линии для стерильных цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е.
Таблица 1.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения восстановителей фертильности для стерильных цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение эффективности получения восстановителей мужской фертильности, необходимых для производства фертильных гибридов F1 сорго на основе стерильных цитоплазм типов М35-1А и 9Е, по сравнению с указанным прототипом в применении его к этим типам ЦМС сорго.
Поставленная задача достигается тем, что по предлагаемому способу получения восстановителей фертильности для стерильных цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е, включающему опыление ЦМС-линий пыльцой доноров генов Rf, выделение фертильных форм в потомстве гибридов, несущих гены Rf, оценку их восстановительной способности в анализирующих скрещиваниях (тест-кроссах) с ЦМС-линиями, для получения восстановителей стерильных цитоплазм типов М35-1А и 9Е осуществляют устройство стабильных искусственных селективных фонов: «засушника», используемого для выделения фертильных форм и оценки их восстановительной способности в тест-кроссах с ЦМС-линиями, и «влажника», устраиваемого и используемого для оценки выделенных фертильных форм, причем селективные фоны устраивают в период формирования генеративной сферы у растений-доноров генов Rf, гибридов F1, их самоопыленного потомства и тест-кроссов на протяжении числа вегетации, достаточного для достижения практически приемлемой восстановительной способности восстановителя мужской фертильности в тест-кроссе.
Так, согласно известным данным, для максимально возможной и практически приемлемой завязываемости семян на метелках растений с ЦМС достаточно иметь 50% фертильных растений в посеве. Например, при высеве на участке гибридизации растений ЦМС-линии и линии-восстановителя фертильности в соотношении 1:1 (6 рядов ЦМС-линии и 6 рядов восстановителя фертильности) наблюдается максимальная завязываемость семян на метелках ЦМС-линии (Шепель Н.А. Селекция и семеноводство гибридного сорго. - Ростов-на-Дону: Ростовский университет, 1985 - с. 256; см. Табл. 71). Следовательно, создаваемый восстановитель фертильности может быть пригодным для использования в случае, если в тест-кроссе будет присутствовать не менее 50% фертильных растений.
Доказательства соответствия предлагаемого способа критериям «промышленная применимость» и «новизна». Данный способ позволяет создавать не просто фертильные растения, как таковые, а линии со стабильно наследуемой восстановительной способностью. При этом следует подчеркнуть, что эти линии являются и гомозиготными по генам, контролирующим хозяйственно-ценные признаки. Такая гомозиготность у сорго достигается в результате самоопыления гибрида F1 в течение, как минимум, пяти поколений (House L.R. А Guide to Sorghum Breeding. Second Edition. ICRISAT. Patancheru, A.P. India. 1985. P. 38). В этой связи промышленная применимость восстановителя фертильности может быть оценена не ранее F5, в котором сочетается приемлемый уровень способности к восстановлению мужской фертильности с приемлемым уровнем гомозиготности по генам, контролирующим хозяйственно-ценные признаки.
В науке и технике не известна совокупность признаков, эквивалентная приведенной в формуле предлагаемого изобретения, необходимая и достаточная для решения поставленной задачи и достижения технического результата. В известном способе получения фертильных растений (Эльконин Л.А. и др. Наследуемая активация генов-восстановителей фертильности стерильной цитоплазмы сорго типа «9Е» условиями выращивания растений // Аграрный вестник Юго-Востока, 2009, №2, с. 4-8.) отсутствуют признаки проявления мужской фертильности в тест-кроссах отобранных в условиях «засушника» фертильных растений с ЦМС-линиями, а приведены лишь результаты тест-кроссов гибридов F1 (т.е. ВС1). Результаты этих тест-кроссов однозначно свидетельствуют об идентичности реакции на условия «засушника» гибридов F1 и ВС1, а именно существенное снижение уровня фертильности в условиях дефицита влагообеспеченности растений, что как раз и подтверждает необходимость последовательного отбора в течение нескольких поколений самоопыления фертильных гибридов в условиях «засушника». В этой связи этот аналог решает иную задачу: первичной активации генов-восстановителей фертильности, но не задачу получения линий-восстановителей фертильности, способных к восстановлению мужской фертильности ЦМС-линий, и гомозиготных по генам хозяйственно-ценных признаков, как это позволяет предлагаемый способ.
Предлагаемый способ получения восстановителей фертильности для стерильных цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е иллюстрируется одной фигурой. На фигуре отображены следующие показатели: 1 - доля фертильных форм в самоопыленных потомствах фертильных растений из гибридной популяции М35-1АЛСВВ-97; 2 - доля фертильных растений в тест-кроссах фертильных растений из этой популяции с ЦМС-линией [М35] Пищевое 614; 3 - сумма осадков в течение 3 недель до начала цветения.
Предлагаемый способ получения восстановителей фертильности для стерильных цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е осуществляют следующим образом. Метелки ЦМС-линии, несущей стерильную цитоплазму типа М35-1А или 9Е, опыляют пыльцой линии, несущей гены-восстановители фертильности (Rf). Семена гибридов F1 высевают в двух параллельных грядках одинакового размера. На одну из грядок на стадии появления у растений флагового листа устанавливают «засушник» - укрытие, изготовленное из прозрачного материала (к примеру, поликарбоната), препятствующее попаданию на нее атмосферных осадков, но не снижающее в значительной степени поток солнечного света и газообмен с окружающей средой. Другую грядку («влажник») на стадии появления у растений флагового листа подвергают дополнительному поливу, тем самым, используя ее в качестве контрольного участка для проверки эффективности отбора восстановителей фертильности. Среди гибридов F1 отбирают фертильные растения. Их потомство (гибриды F2) выращивают в следующем сезоне в «засушнике». С фертильных растений берут пыльцу и опыляют ею метелки растений ЦМС-линии с тем же типом цитоплазмы, т.е. производят тестерное скрещивание. На следующий сезон семена тест-кроссных гибридов и самоопыленное потомство их отцовских родителей (семьи F3) выращивают в «засушнике» и во «влажнике». По результатам оценки фертильности тест-кроссных семей отбирают гибриды F3, которые дали наибольший процент фертильных растений в тестерных скрещиваниях в условиях «засушника». Эти гибриды самоопыляют (для получения F4) и параллельно проводят их тестерные скрещивания с ЦМС-линией. На следующий сезон вновь в условиях «засушника» проводят оценку тест-кроссов и отбирают гибриды F4, давшие наибольший процент фертильных растений в тестерных скрещиваниях. Гибриды F4 самоопыляют для получения F5 и проводят контрольное тестерное скрещивание. В результате последующего самоопыления гибридов F5, несущих гены-восстановители фертильности (Rf) в гомозиготном состоянии, получают восстановители фертильности, которые оказываются эффективными как в засушливые, так и во влажные сезоны.
Таким образом, в предлагаемом способе получения восстановителей фертильности для стерильных цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е присутствуют как биологические приемы (скрещивания, отборы), так и технические приемы (устройство и использование специальных селективных фонов: «засушника» и «влажника»), которые в совокупности дают новый неочевидный эффект. Такая совокупность технико-биологических приемов является не очевидной для специалиста в данной технической области, не известна из уровня науки и техники, позволяет решить поставленную задачу по получению восстановителей ЦМС типов М35-1А и 9Е и достичь искомого технического результата в виде повышения эффективности получения восстановителей мужской фертильности, необходимых для производства фертильных гибридов F1 сорго на основе стерильных цитоплазм типов М35-1А и 9Е.
Примеры осуществления предлагаемого способа.
2
Пример 1. Для проверки эффективности предлагаемого способа на опытном участке были устроены две грядки, одна из которых служила «засушником», другая - «влажником». На грядку, служившую «засушником», в момент появления флагового листа у растений устанавливали раму с закрепленными на ней листами прозрачного поликарбоната. Такая конструкция препятствовала увлажнению почвы грядки дождевыми осадками в течение всего периода развития соцветий, цветения и завязывания семян, образуя «крышу» над грядкой. На период дождя «засушник» с боков закрывали полиэтиленовой пленкой, которую поднимали сразу по окончании дождя. Грядку, служившую «влажником», подвергали дополнительному поливу, начиная с появления флагового листа у растений (12-25 л/м 2 раза в неделю), в течение всего периода развития соцветий, цветения и завязывания семян.
Пыльцой созданной нами ранее линии КВВ 45 - восстановителя фертильности ЦМС-индуцирующей цитоплазмы типа М35-1А - опыляли метелки ЦМС-линии [М35] Пищевое 614. Среди гибридов F1, выращенных в условиях «засушника», отобрали полностью фертильные растения, потомство которых (F2) также выращивали в условиях «засушника». Растения F2, характеризовавшиеся комплексом селекционно-ценных признаков и отобранные для дальнейшего самоопыления в качестве родоначальников новых линий-восстановителей, были проанализированы на способность к восстановлению фертильности в тестерном скрещивании с ЦМС-линией с цитоплазмой М35-1А([М35] Пищевое-614). Обнаружено, что доля фертильных растений в этих тестерных скрещиваниях составляла 64% при выращивании тест-кроссных гибридов в условиях «засушника» и 51% при выращивании тест-кроссных гибридов в условиях «влажника» (Табл. 3), что доказывает, что тестированные растения F2 несли гены-восстановители фертильности и могли тем самым служить основой для создания линии-восстановителя фертильности. При этом самоопыленное потомство отобранных растений (поколение F3) проявило высокий уровень фертильности как в условиях «засушника», так и «влажника».
Наряду с этим опытом, потомство тех же фертильных гибридов F1 одновременно выращивали в условиях «влажника». Фертильные растения из F2, выращенного в условиях «влажника», также были проанализированы на способность к восстановлению фертильности в тестерном скрещивании с ЦМС-линией с цитоплазмой М35-1А ([М35] Пищевое-614). Было обнаружено, что доля фертильных растений в этом тестерном скрещивании была значительно ниже, чем в тестерном скрещивании, в котором была использована пыльца фертильных растений F2, выращенных в условиях «засушника» (Табл. 3). Особенно значительная разница наблюдалась между тест-кроссами, полученными при использовании пыльцы гибридов F2 из «засушника» и «влажника» и выращенными в условиях «засушника». Эти данные убедительно доказывают необходимость выращивания растений-доноров генов-восстановителей фертильности стерильной цитоплазмы типа М35-1А (т.е. родоначальников новых линий-восстановителей этого типа цитоплазмы) в условиях «засушника».
Растения F3, выращенные в условиях «засушника», были вновь подвергнуты анализу на наличие у них способности к восстановлению мужской фертильности в тестерном скрещивании с ЦМС-линией М35-1А Пищевое-614. В тест-кроссе, выращенном в условиях «засушника», доля фертильных растений составляла 84.6% (Табл. 3).
В результате дальнейшего самоопыления в течение двух поколений была получена линия, выровненная по морфологическим признакам и по способности к восстановлению фертильности. Тест-кроссы этой линии с разными ЦМС-линиями на цитоплазме М35-1А показали, что данная линия является эффективным восстановителем мужской фертильности (доля фертильных растений среди гибридов F1 составляет 92-100%, см. Табл.4) и может использоваться для получения гибридов F1 с ЦМС-линиями на этой цитоплазме, что также подтверждает соответствие предлагаемого решения критерию «промышленная применимость».
Пример 2. Растения образца IS12603 - донора ЦМС-индуцирующей цитоплазмы, типа 9Е и несущего гены-восстановители этой цитоплазмы, выращивали в условиях «засушника». Пыльцой этих растений опыляли метелки ЦМС-линии [9Е] Пищевое 614 и гибриды от такого анализирующего скрещивания также выращивали в условиях «засушника», т.е. тем самым среди исходного образца-донора генов-восстановителей проводили отбор на способность к восстановлению фертильности в условиях засухи. Обнаружено, что доля растений, фертильность которых превышала 5%, в тест-кроссах, выращенных в условиях «засушника», была значимо выше при использовании пыльцы донорных растений, выращенных в условиях «засушника», чем донорных растений, выращенных в условиях «влажника» (Табл. 5). Этот факт также убедительно доказывает необходимость выращивания растений-доноров генов-восстановителей фертильности стерильной цитоплазмы типа 9Е в условиях «засушника», что является основой для создания линии-восстановителя мужской фертильности.
Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет получать восстановители мужской фертильности для ЦМС-индуцирующих цитоплазм сорго типов М35-1А и 9Е и, в этой связи, может использоваться в селекции и семеноводстве для получения гетерозисных гибридов сорго. Существенное отличие данного способа от прототипа в приложении к сорго (Табл.1) заключается в использовании технических приемов - создания специальных селективных фонов: «засушника», в котором проводится отбор эффективных комбинаций генов-восстановителей фертильности, и «влажника», используемого для сравнительной оценки эффективности отбора. Именно использование этих технических приемов, которые позволяют оценивать стабильность функционирования генов-восстановителей в условиях засухи, в совокупности с использованием биологических приемов (скрещиваний и отборов) позволяет решить поставленную задачу создания восстановителей фертильности сорго для ЦМС типов М35-1А и 9Е.
По сравнению с прототипом доля фертильных растений в тест-кроссе по предлагаемому способу превышает 90%, тогда как при использовании прототипа в приложении к ЦМС типа М35-1А сорго - 11% (Табл. 6), что не позволяет применять прототип в промышленных целях для получения гибридов F1 сорго на основе стерильных линий с ЦМС типа М35-1 А.