Препарат гормона роста человека длительного типа
SUSTAINED TYPE HUMAN GROWTH HORMONE PREPARATION

Область техники
Настоящее изобретение относится к композиции конъюгата гормона роста человека длительного действия, содержащей конъюгат гормона роста человека (hGH) длительного действия, в котором физиологически активный гормон роста человека (hGH) в виде физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт, конкретно к лиофилизированной композиции и жидкой композиции конъюгата гормона роста человека длительного действия, к способу получения лиофилизированной композиции, к способу разведения лиофилизированной композиции и к набору, содержащему лиофилизированную композицию и раствор для разведения.
Предшествующий уровень техники
Гормон роста человека (далее упоминаемый как "hGH") является полипептидным гормоном, состоящим из 191 аминокислоты, с молекулярной массой примерно 22000, который секретируется из передней доли гипофиза. Гормон роста человека применяют в основном для лечения педиатрической гипофизарной карликовости. Обычно использовали hGH, экстрагированный из гипофиза человека, но из-за его ограниченной доступности лечили только очень ограниченное количество людей. Кроме того, после того, как появились сообщения о болезни Крейтцфельдта-Якоба, дегенеративного неврологического расстройства, обнаруженного у некоторых пациентов, которых лечили hGH, экстрагированным из гипофиза, применение hGH, экстрагированного из гипофиза, было запрещено. В настоящее время разработка генно-инженерных технологий дала возможность продуцировать hGH в Е. coli и дрожжах, и лекарственные средства на основе биосинтетического hGH, полученного с использованием таких технологий, были разрешены для применения в нескольких странах с 1985 года и стали коммерчески доступными после прохождения токсикологических и клинических испытаний.
Как правило, полипептиды, такие как hGH, имеют низкую стабильность и поэтому легко денатурируются. Они также легко расщепляются под действием сывороточных протеаз и выводятся почками или печенью. Поэтому белковые лекарственные средства, содержащие полипептиды в качестве фармацевтического ингредиента, приходится часто вводить пациентам для поддержания их концентрации и титра в крови. Однако поскольку белковые лекарственные средства часто вводят в форме инъекции, частые инъекции белковых лекарственных средств для поддержания оптимальной концентрации активных полипептидов в крови причиняют сильную боль пациентам. Для решения этой проблемы было предпринято множество попыток увеличения стабильности белкового лекарственного средства в крови и поддержания его концентрации в крови на высоком уровне в течение длительного периода времени, чтобы добиться максимальных терапевтических эффектов лекарственного средства.
Недавно в патенте Кореи №10-0567902 (Конъюгат физиологически активного полипептида, имеющий повышенную стойкость in vivo) и в патенте Кореи №10-0725315 (Белковый комплекс, использующий фрагмент иммуноглобулина, и способ его получения) были раскрыты конъюгаты, полученные путем связывания физиологически активных полипептидов с Fc-фрагментом иммуноглобулина и непептидильным полимером, в качестве длительно действующих композиций белковых лекарственных средств, обеспечивающх как минимальное снижение активности белка, так и увеличение стабильности белка. Согласно этим способам hGH может быть использован в качестве физиологически активного полипептида для получения конъюгата hGH длительного действия. Для коммерциализации конъюгата hGH длительного действия важным является предотвращение физико-химических изменений, таких как денатурация, агрегация, адсорбция или гидролиз, вследствие расщепления, вызываемого светом, теплом или примесями в добавках во время хранения и транспортировки, и одновременно сохранение активности hGH in vivo. Поскольку конъюгат hGH длительного действия имеет более крупные размеры и более высокую молекулярную массу по сравнению с полипептидом hGH, конъюгат трудно стабилизировать.
Лиофилизацию (сублимационную сушку) обычно используют для сохранения белков за счет удаления воды из представляющего интерес белкового препарата. Лиофилизация представляет собой процесс, в результате которого вещество, которое сушат, сначала замораживают, а затем лед или замороженный растворитель удаляют сублимацией. В предварительно лиофилизированную композицию может быть включен эксципиент для поддержания или повышения стабильности белка во время процесса лиофилизации или для повышения стабильности лиофилизированного продукта во время хранения. Однако состав лиофилизированной композиции, подходящий для одного белка, часто не подходит для других белков из-за различия в свойствах белков, которые нужно сохранять. Конкретно, разные свойства могут инактивироваться в разных условиях во время хранения, лиофилизации и разведения из-за их разных химических свойств. То есть, повышение стабильности, обеспечиваемое веществами, используемыми для стабилизации, не является идентичным для разных белков, и, соответственно, подходящие соотношения, концентрации и виды стабилизаторов, используемые для обеспечения стабильности во время хранения, лиофилизации и разведения, варьируют в зависимости от физико-химических свойств белков. При использовании разных стабилизаторов в комбинации может иметь место неожиданный негативный эффект вследствие их конкуренции или неблагоприятных реакций, и неожиданный эффект может иметь место вследствие изменения природы или концентрации белка во время лиофилизации или хранения. Следовательно, стабилизация белка требует больших усилий и мер предосторожности.
В частности, поскольку конъюгат hGH длительного действия с повышенной стойкостью и стабильностью in vivo имеет форму, в которой гормон роста человека в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, его молекулярная масса и размеры сильно отличаются от молекулярной массы и размеров гормона роста человека. Поэтому для стабилизации белка требуется особая композиция. Кроме того, поскольку физиологически активный пептид hGH и Fc-фрагмент иммуноглобулина имеют разные физико-химические свойства, их следует стабилизировать одновременно. Однако, как описано выше, разные пептиды или белки могут постепенно инактивироваться в разной степени и в разных условиях из-за разницы в их физико-химических свойствах. К тому же, при одновременном использовании стабилизаторов, подходящих для каждого пептида или белка, они могут стать причиной неблагоприятных последствий из-за конкурентных взаимодействий между ними и побочных эффектов. Более того, так как свойства и концентрация хранимого белка могут изменяться во время его хранения, стабилизаторы могут проявлять неожиданные побочные эффекты. Поэтому для конъюгата hGH длительного действия трудно найти композицию, подходящую для стабилизатора, способного одновременно стабилизировать и физиологически активный пептид hGH, и Fc-фрагмент иммуноглобулина. Помимо этого, для лиофилизированной композиции способы лиофилизации и разведения следует контролировать различными способами для сохранения стабильности и активности белка после разведения. Эти способы также могут варьировать в зависимости от состава композиции и используемого белка.
Кроме того, когда лиофилизированная композиция содержит белок в высокой концентрации, тогда белок может агрегироваться во время лиофилизации из-за высокой концентрации, и его обработка также становится затруднительной. Поэтому белок в высокой концентрации обычно получают путем приготовления лиофилизированной композиции, содержащей белок в низкой концентрации, с последующим разведением ее небольшим объемом вместо того, чтобы осуществлять лиофилизацию высококонцентрированного белка с последующим разведением. Однако если разводить белок небольшим объемом, то не только белок, но и другие входящие в состав ингредиенты становятся слишком концентрированными и слишком гипертоническими для композиции, которую немедленно вводят пациентам. Соответственно, существует потребность в разработке композиции, которая дает возможность лиофилизировать высококонцентрированный белок как есть.
Недавно были разработаны композиции белков и пептидов, которые для удобства пациентов можно использовать неоднократно. Однако эти композиции многократного использования должны содержать консервант для предотвращения бактериального заражения после повторного введения и до применения. Композиция многократного использования, содержащая консервант, имеет несколько преимуществ по сравнению с однократно используемой композицией. Например, в случае однократно используемой композиции в зависимости от дозировки может быть потеряно большое количество лекарственного средства, но потеря может быть снижена при использовании композиции многократного использования. Более того, композицию многократного использования можно использовать несколько раз, не беспокоясь о росте микроорганизмов в течение данного периода времени, и поскольку она может поставляться в одном контейнере, упаковка может быть минимальной, что дает экономическую выгоду. Однако использование консерванта может неблагоприятно влиять на стабильность белка. Самой общеизвестной проблемой, связанной с использованием консерванта, является образование осадков. Осаждение белка может снижать терапевтический эффект лекарственного средства и индуцировать неожиданный иммунный ответ при введении в организм. Следовательно, крайне важным является выбор подходящего типа и подходящей концентрации консерванта, обеспечивающих защиту от бактериального заражения, не оказывая влияния на стабильность белка.
Как правило, композицию в состоянии раствора предоставляют в форме шприца. Наиболее распространенным типом является предварительно заполненный шприц, и часто также используют более удобный автоинжектор. Кроме того, для гормона роста, инсулина и т.д. используют, как правило, шприц-ручку, который обеспечивает автоматическое инъецирование требуемой дозировки пациенту. Хотя эти инъекционные устройства удобны для введения композиций в состоянии раствора, они не могут быть использованы для лекарственных средств, которые должны быть лиофилизированы из-за низкой стабильности.
Как правило, лиофилизированную композицию получают во флаконе из упрочненного стекла отдельно от растворителя для растворения. Эти два компонента смешивают для растворения лиофилизированной композиции непосредственно перед инъецированием с использованием шприца. Современная тенденция заключается в переходе от лиофилизированного флакона (например, флакона из упрочненного стекла) к шприцу однократного использования или многократного использования для удобства пациентов. Примеры включают двухкамерный картридж Веттера (Германия).
Раскрытие изобретения
Техническая задача
Исходя из этого уровня техники, авторы настоящего изобретения предприняли усилия для разработки лиофилизированной композиции, способной сохранять стабильность конъюгата гормона роста человека длительного действия во время процесса лиофилизации и способной обеспечивать его хранение в течение длительного периода времени, и жидкой композиции, способной обеспечивать хранение в стабильном состоянии конъюгата гормона роста человека длительного действия. В результате, авторы изобретения обнаружили, что при использовании стабилизатора, содержащего буфер, сахарный спирт и неионное поверхностно-активное вещество, стабильность конъюгата hGH длительного действия увеличивается во время лиофилизации и хранения, и, следовательно, может быть получена эффективная по стоимости и стабильная жидкая композиция. Было подтверждено также, что когда концентрация конъюгата hGH длительного действия составляет 10-58,5 мг/мл, может быть создана не содержащая хлорида натрия жидкая композиция с превосходной стабильностью. Более того, было подтверждено, что лиофилизированная композиция по настоящему изобретению не только стабильна во время хранения и транспортировки, но она также имеет подходящее осмотическое давление и стабильность для подкожного инъецирования после разведения. Кроме того, было подтверждено, что лиофилизированную композицию можно использовать в качестве композиции многократного использования, поскольку она сохраняет стабильность даже когда в состав входит консервант.
Техническое решение
Настоящее изобретение направлено на создание композиции конъюгата гормона роста человека длительного действия, содержащей конъюгат гормона роста человека (hGH) длительного действия, в котором гормон роста человека (hGH) в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
Настоящее изобретение также направлено на создание лиофилизированной композиции конъюгата hGH длительного действия, содержащей лиофилизированную смесь водного раствора, содержащего конъюгат гормона роста человека длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминового раствора, содержащего буфер, неионное поверхностно-активное вещество исахарный спирт.
Настоящее изобретение также направлено на создание жидкой композиции конъюгата hGH длительного действия, содержащей фармацевтически эффективное количество конъюгата hGH длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминовый стабилизатор, где стабилизатор содержит буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
Настоящее изобретение также направлено на создание способа получения этих композиций.
Настоящее изобретение также направлено на создание способа разведения лиофилизированной композиции, включающего добавление раствора для разведения в лиофилизированную смесь водного раствора, содержащего конъюгат гормона роста человека длительного действия, в котором гормон роста человека в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминового раствора, содержащего буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
Настоящее изобретение также направлено на создание набора, содержащего лиофилизированную композицию конъюгата hGH длительного действия.
Преимущественные эффекты
Поскольку композиция конъюгата hGH длительного действия по настоящему изобретению не содержит сывороточный альбумин человека или какие-либо потенциально опасные факторы, не стоит беспокоиться о вирусном заражении. Кроме того, композиция обеспечивает высокую стабильность конъюгата hGH длительного действия, который получен в результате связывания полипептида hGH с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и поэтому имеет более высокую молекулярную массу по сравнению с диким типом и повышенную стойкость in vivo. В частности, лиофилизированная композиция обеспечивает превосходную стабильность не только во время лиофилизации, но и после разведения, а также сохраняет стабильность даже тогда, когда она содержит консервант, что делает ее полезной в качестве композиции для многократных введений.
Описание графических материалов
На Фиг. 1 показан температурный градиент, использованный в процессе лиофилизации по настоящему изобретению.
На Фиг. 2 показан температурный градиент, использованный в процессе лиофилизации по настоящему изобретению, где первичная сушка разделена на два этапа.
На Фиг. 3а показан флакон из упрочненного стекла, использованный в настоящем изобретении.
На Фиг. 3d показан двухкамерный картридж Веттера.
Лучший вариант осуществления изобретения
В одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция конъюгата гормона роста человека длительного действия, содержащая конъюгат гормона роста человека (hGH) длительного действия, в котором гормон роста человека (hGH) в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена лиофилизированная композиция конъюгата гормона роста человека длительного действия, содержащая лиофилизированную смесь водного раствора, содержащего конъюгат hGH длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминового раствора, содержащего буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
В иллюстративном воплощении буфер представляет собой ацетатный буфер, гистидиновый буфер или цитратный буфер.
В другом иллюстративном воплощении буфер представляет собой ацетатный буфер.
В другом иллюстративном воплощении ацетат представляет собой ацетат натрия, и цитрат представляет собой цитрат натрия.
В другом иллюстративном воплощении рН буфера находится в диапазоне от 5,0 до 6,0.
В другом иллюстративном воплощении сахарный спирт представляет собой маннит или сорбит.
В другом иллюстративном воплощении сахарный спирт содержится в концентрации в диапазоне от 1% (масс./об.) до 10% (масс./об.) от общего объема водного раствора.
В другом иллюстративном воплощении сахарный спирт содержится в концентрации в диапазоне от 2,5% (масс./об.) до 5% (масс./об.).
В другом иллюстративном воплощении неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.
В другом иллюстративном воплощении концентрация неионного поверхностно-активноного вещества находится в диапазоне от 0,001% (масс./об.) до 0,05% (масс./об.) от общего объема водного раствора.
В другом иллюстративном воплощении безальбуминовый раствор дополнительно содержит по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из сахара, многоатомного спирта и аминокислоты.
В другом иллюстративном воплощении аминокислота представляет собой гистидин или глицин.
В другом иллюстративном воплощении концентрация гистидина находится в диапазоне от 1 до 10 мМ.
В другом иллюстративном воплощении концентрация конъюгата hGH длительного действия находится в диапазоне от 10 до 100 мг/мл.
В другом иллюстративном воплощении безальбуминовый раствор дополнительно содержит изотонический агент.
В другом иллюстративном воплощении изотонический агент представляет собой хлорид натрия.
В другом иллюстративном воплощении концентрация хлорида натрия находится в диапазоне от 0 до 200 мМ.
В другом иллюстративном воплощении контейнер для лиофилизированной композиции представляет собой флакон, двухкамерный картридж или двухкамерный шприц.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена жидкая композиция конъюгата hGH длительного действия, содержащая фармацевтически эффективное количество конъюгата hGH длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминовый стабилизатор, где стабилизатор содержит буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
В иллюстративном воплощении жидкая композиция не содержит изотонический агент.
В другом иллюстративном воплощении буфер представляет собой цитратный буфер, ацетатный буфер или гистидиновый буфер.
В другом иллюстративном воплощении сахарный спирт представляет собой маннит или сорбит.
В другом иллюстративном воплощении сахарный спирт содержится в концентрации в диапазоне от 2% (масс./об.) до 4,5% (масс./об.).
В другом иллюстративном воплощении сахарный спирт содержится в концентрации 4% (масс./об.).
В другом иллюстративном воплощении рН буфера находится в диапазоне от 5,0 до 6,0.
В другом иллюстративном воплощении рН буфера равен 5,2.
В другом иллюстративном воплощении неионное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.
В другом иллюстративном воплощении концентрация неионного поверхностно-активного вещества находится в диапазоне от 0,001% (масс./об.) до 0,05% (масс./об.) от общего объема композиции.
В другом иллюстративном воплощении конъюгат hGH длительного действия содержится в композиции в концентрации в диапазоне от 5,0 мг/мл до 60,0 мг/мл.
В другом иллюстративном воплощении hGH имеет такую же аминокислотную последовательность, как аминокислотная последовательность hGH дикого типа.
В другом иллюстративном воплощении Fc-фрагмент иммуноглобулина представляет собой Fc-фрагмент, имеющий происхождение из иммуноглобулина IgG, IgA, IgD, IgE или IgM.
В другом иллюстративном воплощении каждый домен Fc-фрагмента иммуноглобулина представляет собой гибрид доменов разного происхождения из иммуноглобулина, выбранного из группы, состоящей из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM.
В другом иллюстративном воплощении Fc-фрагмент иммуноглобулина представляет собой димер или мультимер, состоящий из одноцепочечного иммуноглобулина, состоящего из доменов одинакового происхождения.
В другом иллюстративном воплощении Fc-фрагмент иммуноглобулина представляет собой Fc-фрагмент иммуноглобулина IgG4.
В другом иллюстративном воплощении Fc-фрагмент иммуноглобулина представляет собой агликозилированный Fc-фрагмент иммуноглобулина IgG4 человека.
В другом иллюстративном воплощении конъюгат находится в такой форме, в которой hGH связан с Fc иммуноглобулина посредством непептидильного полимера в качестве линкера или посредством генетической рекомбинации.
В другом иллюстративном воплощении непептидильный полимер выбран из группы, состоящей из биоразлагаемого полимера, такого как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сополимер этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированный полиол, поливиниловый спирт, полисахарид, декстран, поливинилэтиловый эфир, полиакриловая кислота (PLA) и полиакриловая-гликолевая кислота (PLGA), липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинации.
В другом иллюстративном воплощении непептидильный полимер представляет собой полиэтиленгликоль.
В другом иллюстративном воплощении композиция предназначена для лечения гипофизарной карликовости, дефицита гормона роста, синдрома Прадера-Вилли или идиопатической низкоросл ости.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена лиофилизированная композиция конъюгата hGH длительного действия, содержащая лиофилизированную смесь водного раствора, содержащего конъюгат hGH длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминового раствора, содержащего ацетатный буфер, полисорбат 80 и маннит.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена жидкая композиция конъюгата hGH длительного действия, содержащая фармацевтически эффективное количество конъюгата hGH длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминовый стабилизатор, содержащий цитратный буфер, полисорбат 80 и маннит, причем стабилизатор не содержит изотонический агент.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения лиофилизированной композиции, включающий лиофилизацию конъюгата hGH длительного действия, в котором гормон роста человека в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминового раствора, содержащего буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ разведения лиофилизированной композиции, включающий добавление раствора для разведения в лиофилизированную смесь водного раствора, содержащего конъюгат hGH длительного действия, в котором гормон роста человека (hGH) в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминового раствора, содержащего буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт, включенного в состав лиофилизированной композиции.
В иллюстративном воплощении раствор для разведения представляет собой воду для инъекций.
В другом иллюстративном воплощении раствор для разведения дополнительно содержит консервант.
В другом иллюстративном воплощении консервант представляет собой бензиловый спирт, мета-крезол или фенол.
В другом иллюстративном воплощении композиция, разведенная данным способом, содержит конъюгат hGH длительного действия в концентрации в диапазоне от 10 до 100 мг/мл.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен набор, содержащий лиофилизированную композицию конъюгата hGH длительного действия.
Форма изложения изобретения
В одном арпекте настоящего изобретения предложена композиция конъюгата гормона роста человека длительного действия, содержащая конъюгат гормона роста человека (hGH) длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
В данном описании термин "конъюгат гормона роста человека (hGH) длительного действия" относится к конъюгату, в котором физиологически активный пептид гормона роста человека связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и физиологическая активность которого имеет повышенную продолжительность in vivo по сравнению с hGH дикого типа. Термин "длительного действия" в данном описании означает, что физиологическая активность имеет более длительную продолжительность, чем hGH дикого типа. В данном описании термин "конъюгат" относится к форме, в которой гормон роста человека связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина.
Конкретно, композиция может представлять собой лиофилизированную композицию конъюгата hGH длительного действия, содержащую лиофилизированную смесь водного раствора, содержащего конъюгат hGH длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминового раствора, содержащего буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
В данном описании термин "лиофилизированная композиция конъюгата hGH длительного действия" относится к лиофилизированной композиции, содержащей конъюгат hGH длительного действия. Этот термин охватывает композицию, содержащую вещества, существующие в твердом состоянии, полученную лиофилизацией конъюгата hGH длительного действия, и вещество для стабилизации, такое как эксципиент. В настоящем изобретении лиофилизированная композиция содержит само лиофилизированной вещество. Лиофилизированное вещество может также упоминаться как лиофилизированный осадок.
Лиофилизированную композицию получают путем осуществления лиофилизационного процесса сублимации воды из предварительно приготовленной композиции, содержащей конъюгат hGH длительного действия и эксципиент для стабилизации конъюгата hGH длительного действия. В настоящем изобретении лиофилизированная композиция конъюгата hGH длительного действия может содержать терапевтически эффективное количество конъюгата hGH длительного действия, и это терапевтически эффективное количество hGH может быть помещено в контейнер однократного использования или контейнер многократного использования, хотя ими не оганичивается.
Лиофилизированная композиция может быть помещена во флакон (например, флакон из упрочненного стекла), двухкамерный картридж или двухкамерный шприц, хотя ими не ограничивается.
Лиофилизированная композиция по настоящему изобретению имеет состав, способный стабилизровать конъюгат hGH длительного действия во время процесса лиофилизации и способный сохранять стабильность композиции при ее разведении после хранения. В частности, лиофилизированная композиция по настоящему изобретению способна обеспечивать стабильность даже тогда, когда конъюгат hGH длительного действия содержится в высокой концентрации в диапазоне от 10 мг/мл до 100 мг/мл.
Лиофилизированную композицию конъюгата hGH длительного действия можно хранить в контейнере и разводить, когда ее необходимо вводить субъекту.
В данном описании термин "разведение" означает, что лиофилизированное вещество в твердом состоянии переводят в жидкое состояние, чтобы иметь возможность вводить конъюгат hGH. Концентрация конъюгата hGH длительного действия в лиофилизированной композиции по настоящему изобретению находится в диапазоне от 1 мг/мл до 150 мг/мл, конкретно от 10 мг/мл до 120 мг/мл, более конкретно от 10 мг/мл до 100 мг/мл, на момент разведения, хотя не ограничивается этими диапазонами.
Разведение можно проводить путем растворения лиофилизированного вещества путем добавления растворителя во флакон, содержащий лиофилизированное вещество, или путем добавления растворителя к лиофилизированному веществу, содержащемуся в шприце однократного использования или в шприце многократного использования, но не ограничивается конкретно ими.
Лиофилизированная композиция конъюгата hGH длительного действия по настоящему изобретению имеет преимущество по сравнению с существующей жидкой композицией в том, что конъюгат hGH может стабильно храниться, и эффективную концентрацию конъюгата можно контролировать. Концентрация после разведения может быть идентичной концентрации предварительно лиофилизированной композиции во время процесса лиофилизации или может отличаться от концентрации предварительно лиофилизированной композиции во время процесса лиофилизации.
Лиофилизированная композиция по настоящему изобретению содержит лиофилизированную смесь водного раствора, содержащего конъюгат hGH длительного действия, и безальбуминового раствора, содержащего буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
В данном документе термин "безальбуминовый раствор" относится к веществу, которое способно обеспечивать стабильное хранение конъюгата hGH длительного действия и поддерживать его стабильность во время процессов лиофилизации и разведения. В частности, безальбуминовый раствор относится к водному раствору, который содержит конъюгат hGH длительного действия и эксципиент, стабилизирующий этот конъюгат, и, следовательно, обеспечивает стабильность конъюгата hGH длительного действия во время процесса лиофилизации и дает возможность получать лиофилизированную композицию, стабильную при хранении. Конкретно, этот водный раствор содержит буфер, сахарный спирт и неионное поверхностно-активное вещество. Кроме того, изотонический агент может быть включен в состав композиции для регулирования осмотического давления. Для белков, таких как конъюгат hGH длительного действия, стабильность при хранении важна не только для того, чтобы гарантировать точную вводимую дозировку, но и для подавления потенциального образования антигенных веществ против конъюгата hGH длительного действия. В настоящем изобретении термин "безальбуминовый раствор" может быть использован взаимозаменяемым образом с термином "прекомпозиция".
Поскольку концентрацию конъюгата hGH длительного действия можно контролировать путем регулирования объема раствора для разведения, добавляемого в лиофилизированную композицию, концентрация конъюгата hGH длительного действия в безальбуминовом растворе конкретно не ограничивается. Однако композиция по настоящему изобретению имеет преимущество в том, что даже безальбуминовый раствор, содержащий конъюгат hGH длительного действия в высокой концентрации, 10-100 мг/мл или выше, может быть стабильно лиофилизирован, полученную лиофилизированную композицию можно быстро растворить в пределах 3 минут, и стабильность конъюгата hGH длительного действия может быть сохранена в разведенном растворе.
Водный раствор не содержит сывороточный альбумин человека. Поскольку сывороточный альбумин человека, который может быть использован в качестве стабилизатора белка, получают из сыворотки крови человека, существует риск заражения патогенными вирусами, привносимыми от человека. Кроме того, желатин или бычий сывороточный альбумин может вызывать заболевания или может вызывать аллергическую реакцию у некоторых пациентов. Так как белки безальбуминового раствора по настоящему изобретению не содержат гетерологичных белков, таких как сывороточный альбумин человека или животного или очищенный желатин, риск вирусной инфекции отсутствует.
В данном документе термин "буфер" относится к раствору, который содержится в безальбуминовом растворе по настоящему изобретению и осуществляет поддержание стабильного уровня рН композиции после лиофилизации или разведения с целью предотвращения резкого изменения рН композиции для сохранения стабильной активности конъюгата hGH длительного действия. Буфер может содержать соль щелочного металла (например, фосфат натрия или калия или их одноосновные или двухосновные соли), цитрат (например, цитрат натрия или лимонную кислоту), ацетат (например, ацетат натрия или уксусную кислоту), гистидин, любой другой фармацевтически приемлемый рН буферный агент, известный в данной области, или их комбинацию. Буфер конкретно может представлять собой ацетатный буфер, гистидиновый буфер или цитратный буфер, более конкретно ацетатный буфер или цитратный буфер, хотя не ограничивается ими.
Концентрация цитрата или ацетата, который составляет буфер, конкретно находится в диапазоне от 5 до 100 мМ, более конкретно в диапазоне от 10 до 50 мМ, хотя не ограничивается этими диапазонами. рН буфера конктерно находится в диапазоне от 4,0 до 7,0, более конкретно в диапазоне от 5,0 до 6,0, еще более конкретно в диапазоне от 5,2 до 6,0, хотя не ограничивается этими диапазонами.
В данном документе термин "сахарный спирт" относится к гидрогенизированному углеводу, который содержится в лиофилизированной композиции по настоящему изобретению и осуществляет защиту белка конъюгата hGH длительного действия во время процесса лиофилизации и повышает стабильность конъюгата hGH длительного действия после разведения. Концентрация сахарного спирта, используемого в настоящем изобретении, может находиться в диапазоне от 1 до 10% (масс./об.) от общего объема композиции, хотя не ограничивается этим диапазоном. Конкретно, концентрация сахарного спирта может находиться в диапазоне от 2,5 до 5% (масс./об.). Когда концентрация сахарного спирта находится в этом диапазоне, разведенная композиция, полученная путем разведения с использованием раствора для разведения такого же объема, как и объем прекомпозиции, может иметь осмотическое давление, соответствующее осмотическому давлению изотонического раствора, хотя не ограничивается этим.
Сахарный спирт, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой по меньшей мере один спирт, выбранный из группы, состоящей из маннита и сорбита, конкретно маннит, но не ограничивается конкретно ими. Будучи включенным в состав композиции по настоящему изобретению, сахарный спирт, такой как маннит, может служить для регулирования осмотического давления. Конкретно, композиция, полученная в результате разведения лиофилизированной композиции по настоящему изобретению, может быть изотонической. Однако гипертоническая или гипотоническая композиция также является подходящей в настоящем изобретении.
В данном документе термин "неионное поверхностно-активное вещество" относится к веществу, которое снижает поверхностное натяжение белкового раствора для предотвращения адсорбции белка на гидрофобную поверхность или агрегации после разведения. Конкретные примеры неионного поверхностно-активного вещества, которое может быть использовано в настоящем изобретении, включают неионное поверхностно-активное вещество типа полисорбата, неионное поверхностно-активное вещество типа полоксамера и их комбинацию. Более конкретно, может быть использовано неионное поверхностно-активное вещество типа полисорбата. Примеры неионного поверхностно-активного вещества типа полисорбата включают полисорбат 20, полисорбат 40, полисорбат 60 и полисорбат 80, и среди них предпочтительным является полисорбат 80, хотя не ограничиваются ими. Добавление неионного поверхностно-активного вещества в композицию в высокой концентрации может быть нецелесообразным, поскольку неионное поверхностно-активное вещество в высокой концентрации может вызывать интерференционные эффекты, когда белок анализируют для определения концентрации или стабильности белка аналитическими методами, такими как УФ-спектрометрический метод или изоэлектрическое фокусирование (IEF), и, следовательно, может затруднять точное определение стабильности белка. Таким образом, лиофилизированная композиция по настоящему изобретению может содержать неионное поверхностно-активное вещество в низкой концентрации, конкретно 0,1% (масс./об.) или меньше, более конкретно в диапазоне от 0,001 до 0,1% (масс./об.) и еще более конкретно в диапазоне от 0,001 до 0,05% (масс./об.), хотя не ограничивается этими диапазонами.
Конкретно, безальбуминовый раствор может дополнительно содержать по меньшей мере одно вещество, выбранное из группы, состоящей из сахара, многоатомного спирта и аминокислоты. Авторами настоящего изобретения было подтверждено, что при добавлении гистидина в качестве аминокислоты скорость растворения может быть увеличена, и разведение может быть осуществлено без пенообразования.
Конкретные примеры сахара, который может быть дополнительно включен в состав композиции для увеличения стабильности при хранении конъюгата hGH длительного действия, включают моносахариды, такие как манноза, глюкоза, фруктоза и ксилоза, и полисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза, раффиноза и декстран. Конкретные примеры полиспирта включают пропиленгликоль, низкомолекулярный полиэтиленгликоль, глицерин, низкомолекулярный полипропиленгликоль и их комбинацию. Примеры аминокислоты включают гистидин или глицин, хотя не ограничиваются ими. Гистидин и т.д. может присутствовать в водном растворе в концентрации в диапазоне от 1 до 10 мМ, хотя не ограничивается этим диапазоном.
Безальбуминовый раствор может дополнительно содержать изотонический агент для контролирования осмотического давления.
В данном документе термин "изотонический агент" относится к агенту, который поддерживает подходящее осмотическое давление, когда конъюгат hGH длительного действия вводят в организм после разведения. Изотонический агент может оказывать эффект дополнительной стабилизации конъюгата hGH длительного действия в растворе. Например, изотонический агент может представлять собой водорастворимую неорганическую соль, конкретно хлорид натрия, хотя не ограничивается им. Концентрация хлорида натрия, используемого в настоящем изобретении, конкретно находится в диапазоне от 0 до 200 мМ, хотя не ограничивается этим диапазоном. Кроме того, в зависимости от типа и количества веществ, содержащихся в композиции, количество изотонического агента можно регулировать, чтобы композиция в растворе, содержащая все ингредиенты, была изотонической.
Безальбуминовый раствор может быть лиофилизирован после разбавления 1/2-кратно, 1/4-кратно или сверх того. Авторы настоящего изобретения подтвердили, что время растворения можно сократить, если лиофилизировать безальбуминовый раствор после 1/2-кратного или 1/4-кратного разбавления (Тестовый пример 1-(5)).
Лиофилизированная композиция по настоящему изобретению, содержащая лиофилизированную смесь, демонстрирует превосходное время растворения. Время растворения является одним из важных свойств лиофилизированного вещества. Если время растворения является длительным, то белок будет подвергаться воздействию концентрированного раствора в течение длительного времени, и за это время он может денатурироваться. К тому же, поскольку неполностью растворенный продукт нельзя вводить, короткое время растворения может создавать удобства и для пациентов, и для лечащих врачей. Однако время растворения неизбежно увеличивается по мере увеличения концентрации белка. Соответственно, разработка композиции с коротким временем растворения может быть важным делом для высококонцентрированной лиофилизированной композиции.
Авторы настоящего изобретения подтвердили, что лиофилизированная композиция по настоящему изобретению растворяется самое быстрое за 10 секунд и не дольше 3 минут, даже когда она содержит конъюгат hGH длительного действия в высокой концентрации, 10 мг/мл или выше.
Желаемая дозировка лиофилизированного продукта может быть достигнута в результате лиофилизации целевого белка в желаемой концентрации и последующего разведения до такого же объема, как объем прекомпозиции, хотя не ограничивается конкретно этим. Альтернативно, прекомпозиция может быть лиофилизирована в увеличенном объеме посредством разбавления и затем может быть разведена с использованием раствора для разведения меньшего объема. Однако если прекомпозиция чрезмерно разбавлена, то цикл лиофилизации (в частности, время первичной сушки) может быть пролонгирован, и поэтому стоимость производства может увеличиться. Соответственно, композиция по настоящему изобретению также имеет преимущество в том, что даже высококонцентрированный конъюгат hGH длительного действия может быть лиофилизирован без излишнего разбавления.
Кроме того, лиофилизированная композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать другие ингредиенты или вещества, которые известны в данной области, в дополнение к вышеописанным буферу, изотоническому агенту, сахарному спирту, неионному поверхностно-активному веществу и консерванту, входящим в состав раствора для разведения, если они не уменьшают эффект настоящего изобретения.
Авторы настоящего изобретения получили, в качестве прекомпозиции, лиофилизированную композицию, содержащую конъюгат hGH длительного действия и безальбуминовый раствор, содержащий буфер, сахарный спирт и поверхностно-активное вещество, и повысили ее стабильность и скорость растворения. Конкретно, конъюгат hGH длительного действия лиофилизировали в концентрации 19,5 мг/мл или 78,0 мг/мл с использованием прелиофилизированной композиции, содержащей 20 мМ цитратного буфера с рН 5,2 или рН 5,6, 150 мМ хлорида натрия, 5% маннита и 0,005% полисорбата 80, и затем перерастворяли дистиллированной водой. Стабильность была превосходной при вышеуказанных концентрациях. В частности, стабильность была лучше при более высокой концентрации 78,0 мг/мл. Хорошая стабильность также достигалась при рН 5,2 и 5,6 (Тестовый пример 1-(1)). В добавление к этому, когда конъюгат hGH длительного действия растворяли в предварительно лиофилизированной композиции, содержащей 20 мМ ацетатного буфера с рН 5,2 или рН 5,6, 150 мМ NaCl, 5% маннита и 0,005% полисорбата 80, и затем перерастворяли раствором для разведения, содержащим мета-крезол, бензиловый спирт или фенол в качестве консерванта, стабильность сохранялась. Этот результат подтверждает, что разведенная композиция с сохраненной активностью может быть получена в результате разведения лиофилизированного вещества раствором для разведения, содержащим консервант. В частности, при использовании водного ацетатного раствора превосходная стабильность могла достигаться без осаждения, даже если разведение проводили с использованием раствора для разведения, содержащего консервант (Тестовый пример 1-(2)). Более того, было подтверждено, что время растворения полученной лиофилизированной композиции увеличивается при увеличении концентрации конъюгата с 19,5 мг/мл до 39,0 мг/мл до 58,5 мг/мл и до 70,0 мг/мл (Тестовый пример 1-(3)). Кроме того, превосходные время растворения и стабильность достигались, даже если безальбуминовый раствор не содержал соль, и скорость растворения могла увеличиваться при увеличении концентрации маннита. И при добавлении гистидина было возможно сократить время растворения без увеличения концентрации маннита (Тестовый пример 1-(4)). Авторы изобретения также обнаружили, что скорость растворения дополнительно увеличивается, когда прекомпозицию разбавляют для снижения плотности (Тестовый пример 1-(5)), и разработали оптимизированные условия сушки, при которых лиофилизированная вещество может быть высушено полностью (Тестовый пример 1-(6)). Было также продемонстрировано, что присутствие маннита сильно влияет на время растворения (Тестовый пример 1-(7)), и что изотоническое осмотическое давление может быть достигнуто при времени растворения 30 секунд или меньше, когда маннит присутствует в концентрации 4-4,5%, даже для высококонцентрированного конъюгата hGH длительного действия 58,5 мг/мл (Тестовый пример 1-(8)). К тому же, стабильность сохранялась почти постоянной даже после хранения полученных лиофилизированных композиций при 4°С или 25°С в течение 6 месяцев. Стабильность также сохранялась даже после хранения лиофилизированных композиций при 25°С в течение 2 недель после разведения (Тестовый пример 1-(9)).
Конкретно, композиция может представлять собой жидкую композицию конъюгата hGH длительного действия, содержащую конъюгат hGH длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминовый стабилизатор, где стабилизатор содержит буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
Конъюгат hGH длительного действия является таким, как описано выше.
В данном документе термин "жидкая композиция конъюгата hGH длительного действия" относится к жидкой композиции, которая содержит конъюгат hGH длительного действия. Жидкая композиция включает жидкие композиции, предназначенные как для внутреннего, так и наружного применения. В настоящем изобретении жидкая композиция конъюгата hGH длительного действия может содержать фармацевтически эффективное количество конъюгата hGH длительного действия. Как правило, фармацевтически эффективное количество hGH соответствует примерно 1-3 мг во флаконе однократного использования, но не ограничивается этими значениями.
И концентрация конъюгата hGH длительного действия, содержащегося в жидкой композиции по настоящему изобретению, находится в диапазоне конкретно от 5,0 до 60,0 мг/мл, хотя не ограничивается этим диапазоном.
Жидкая композиция конъюгата hGH длительного действия содержит фармацевтически эффективное количество конъюгата hGH длительного действия и безальбуминовый стабилизатор.
В данном документе термин "стабилизатор" относится к веществу, которое дает возможность хранить конъюгат hGH длительного действия в стабильном состоянии. Конкретно, стабилизатор содержит буфер, сахарный спирт и неионное поверхностно-активное вещество. В отношении белков, таких как конъюгат hGH длительного действия, стабильность при хранении важна для гарантирования точности дозы и подавления образования потенциальных антигенов против конъюгата hGH длительного действия.
В данном документе термин "буфер" относится к раствору, который содержится в стабилизаторе по настоящему изобретению и осуществляет поддержание стабильного уровня рН композиции, тем самым предотвращая резкое изменение рН для сохранения стабильной активности конъюгата hGH длительного действия. Описание буфера, приведенное выше для лиофилизированной композиции, в данном случае также применимо.
Буфер может представлять собой цитратный буфер, ацетатный буфер или гистидиновый буфер, конкретно цитратный буфер, хотя не ограничивается ими. Концентрация соли, которая составляет буфер, конкретно находится в диапазоне от 5 до 100 мМ, более конкретно в диапазоне от 10 до 50 мМ, хотя не ограничивается этими диапазонами. рН буфера находится в диапазоне от 4,0 до 7,0, более конкретно в диапазоне от 5,0 до 6,0, еще более конкретно в диапазоне от 5,2 до 6,0, наиболее конкретно 5,2, хотя не ограничивается этими значениями.
В данном документе термин "сахарный спирт" относится к гидрогенизированному углеводу, который содержится в жидкой композиции по настоящему изобретению и повышает стабильность конъюгата hGH длительного действия. Концентрация сахарного спирта, используемого в настоящем изобретении, находится конкретно в диапазоне от 1 до 10% (масс./об.) от общего объема композиции и более конкретно в диапазоне от 2% (масс./об.) до 4,5% (масс./об.), еще более конкретно 4% (масс./об.), хотя не ограничивается этими диапазонами. Сахарный спирт, используемый в настоящем изобретении, может представлять собой по меньшей мере один сахарный спирт, выбранный из группы, состоящей из маннита и сорбита, конкретно маннит, хотя не ограничивается конкретно ими.
В данном документе термин "неионное поверхностно-активное вещество" относится к веществу, которое снижает поверхностное натяжение белкового раствора для предотвращения адсорбции белка на гидрофобной поверхности и агрегации. Конкретными примерами неионного поверхностно-активного вещества, которое может быть использовано в настоящем изобретении, являются неионные поверхностно-активные вещества, которые описаны выше.
Композиция по настоящему изобретению может представлять собой композицию, не содержащую изотонический агент.
Изотонический агент является таким, как описано выше.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что композиция, содержащая водный раствор ацетата или цитрата с рН 5,2 в качестве буфера и содержащая 4% (масс./об.) маннита, но не содержащая изотонический агент, демонстрирует превосходную стабильность. В частности, композиция, содержащая водный раствор цитрата с рН 5,2 в качестве буфера и содержащая 4% (масс./об.) маннита, но не содержащая изотонический агент, показала наивысшую стабильность при концентрации конъюгата hGH длительного действия 10,0 мг/мл.
Конкретными примерами сахара, который может быть дополнительно включен в состав композиции для увеличения стабильности при хранении конъюгата hGH длительного действия, являются сахара, которые описаны выше. Кроме того, жидкая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать другие ингредиенты или вещества, которые известны в данной области, в дополнение к описанным выше буферу, сахарному спирту и неионному поверхностно-активному веществу, если они не уменьшают эффект настоящего изобретения.
В частности, жидкая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать консервант.
Было обнаружено, что композиция конъюгата hGH длительного действия, не содержащая изотонический агент, демонстрирует наилучшую стабильность конъюгата hGH длительного действия в буфере при рН 5,2, когда она содержит 4% маннита (масс./об.). В частности, наилучшая стабильность достигалась при концентрации конъюгата hGH длительного действия концентрация 10,0 мг/мл при использовании ацетатного буфера (Тестовый пример 2).
Композиция по настоящему изобретению может быть предназначена для лечения гипофизарной карликовости, дефицита гормона роста, синдрома Прадера-Вилли или идиопатической низкорослости, и ее после разведения можно инъецировать для лечения этих заболеваний.
Далее приведено подробное описание конъюгата hGH длительного действия.
В данном документе термин "гормон роста человека (hGH)" относится к пептидному гормону, который стимулирует рост, репродукцию и регенерацию клеток у людей. Информацию о последовательности hGH можно найти в общедоступной базе данных, такой как NCBI GenBank. Кроме того, hGH в настоящем изобретении охватывает белок, имеющий аминокислотную последовательность, имеющую гомологию последовательности 70% или выше, конкретно 80% или выше, более конкретно 90% или выше, еще более конкретно 95% или выше и наиболее конкретно 98% или выше с аминокислотной последовательностью hGH дикого типа, при условии, что он обладает активностью hGH. К тому же, при условии, что его биологическая активность существенно не изменяется, любой мутант, полученный из hGH дикого типа в результате замены, делеции или вставки аминокислотных остатков, может быть использован в настоящем изобретении.
hGH, полезный в настоящем изобретении, может иметь аминокислотную последовательность hGH дикого типа, его варианта, его производного или его фрагментов.
В данном документе термин "вариант hGH" относится к пептиду, имеющему по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотных последовательностей hGH дикого типа, и демонстрирующему при этом активность hGH. Вариант hGH может быть получен в результате замены, присоединения, делеции или модификации некоторых аминокислот hGH дикого типа или их комбинации.
В данном документе термин "производное hGH" относится к пептиду, имеющему по меньшей мере 80%-ную гомологию аминокислотной последовательности с последовательностью hGH дикого типа и проявляющему активность hGH, в котором некоторые группы аминокислотных остатков химически замещены (например, альфа-метилирование, альфа-гидроксилирование), удалены (например, деаминирование) или модифицированы (например, N-метилирование).
В данном документе термин "фрагмент hGH" относится к пептиду, в котором по меньшей мере одна аминокислота добавлена или удалена на N-конце или С-конце hGH, при этом активность hGH остается. Добавленная аминокислота может представлять собой аминокислоту, которая не встречается в природе (например, D-аминокислоту).
Кроме того, hGH, используемый в настоящем изобретении, может быть получен из нативного или рекомбинантного белка. Конкретно, это может быть рекомбинантный hGH, полученный с использованием Е. coli в качестве клетки-хозяина, хотя не ограничивается этим.
Н
L
Н
Н
Н
L
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
Н
В данном документе термин "Fc-фрагмент иммуноглобулина" относится к части иммуноглобулина, за исключением вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, константной области 1 тяжелой цепи (С1) и константной области 1 легкой цепи (C1) иммуноглобулина. Fc-фрагмент иммуноглобулина может представлять собой константную область 2 тяжелой цепи (С2) и константную область 3 тяжелой цепи (С3) иммуноглобулина и может дополнительно содержать шарнирную область в константной области тяжелой цепи, хотя этим не ограничивается. К тому же, Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может представлять собой расширенный Fc-фрагмент, который содержит часть или всю константную область 1 тяжелой цепи (С1) и/или константную область 1 легкой цепи (С1), за исключением вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, при условии, что он имеет по существу такой же или повышенный эффект по сравнению с белком дикого типа. Fc-фрагмент иммуноглобулина может представлять собой также фрагмент, где существенно длинный участок аминокислотной последовательности, соответствующей С2 и/или С3, исключен посредством делеции. То есть, Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может содержать 1) домен С1, домен С2, домен С3 и домен С4, 2) домен С1 и домен С2, 3) домен С1 и домен С3, 4) домен С2 и домен С3, 5) комбинацию по меньшей мере одного домена и шарнирной области иммуноглобулина (или участка шарнирной области) и 6) димер домена константных областей тяжелой цепи и константной области легкой цепи, хотя этим не ограничивается.
Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению содержит нативную аминокислотную последовательность и производную от нее аминокислотную последовательность (мутант). Производное аминокислотной последовательности относится к последовательности, имеющей последовательность, отличающуюся от нативной последовательности, получаемое в результате делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка нативной аминокислотной последовательности или их комбинаций. Например, в Fc иммуноглобулина IgG аминокислотные остатки в положениях с 214 до 238, с 297 до 299, с 318 до 322 или с 327 до 331, которые, как известно, являются важными для связывания белка, могут быть подходящими мишенями для модификации.
Другие типы производных также могут быть использованы, в том числе производные, в которых область, способная образовывать дисульфидную связь, исключена посредством делеции, несколько аминокислотных остатков на N-конце нативного Fc, элиминированы, или метиониновый остаток добавлен в N-конец нативного Fc. Дополнительно, для того чтобы элиминировать функцию эффектора, комплемент-связывающий сайт, например C1q-связывающий сайт или сайт антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), может быть исключен посредством делеции. Методы получения таких производных последовательностей Fc-фрагмента иммуноглобулина раскрыты в WO 97/34631 и WO 96/32478.
Замена аминокислот в белках и пептидах, активность которых в целом не изменяется, известна в данной области (Н. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Самыми распространенными заменами являются Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly в обоих направлениях. В некоторых случаях Fc-фрагмент может быть модифицирован посредством фосфорилирования, сульфатирования, акрилирования, гликозилирования, метилирования, фарнезилирования, ацетилирования, амидирования и т.п. Вышеупомянутые производные Fc демонстрируют такую же биологическую активность, как и Fc-фрагмент по настоящему изобретению, и они обладают повышенной структурной устойчивостью к теплу, рН и т.п.
2
Кроме того, эти Fc-фрагменты могут быть получены из нативных белков, выделенных из людей или других животных, включая коров, коз, свиней, мышей, кроликов, хомяков, крыс и морских свинок, или могут представлять собой рекомбинанты, полученные из трансформированных клеток животных или микроорганизмов, или их производные. В данном документе способ получения Fc-фрагментов из нативного иммуноглобулина может включать выделение цельных иммуноглобулинов из организма человека или животного и обработку их пртеазой. Когда для расщепления иммуноглобулинов используют папаин, тогда они расщепляются на Fab- and Fc-фрагменты, а когда используют пепсин, тогда иммуноглобулин расщепляется на pF'c and F(ab). Эти фрагменты могут быть разделены методом эксклюзионной хроматографии с выделением Fc или pF'c. Конкретно, Fc-фрагмент человеческого происхождения представляет собой рекомбинантный Fc-фрагмент иммуноглобулина, полученный из микроорганизма.
Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина по настоящему изобретению может быть в форме нативных сахарных цепей, более длинных сахарных цепей, чем у нативной формы, более коротких сахарных цепей, чем у нативной формы или в дегликозилированной форме. Удлинение или удаление сахарных цепей Fc иммуноглобулина может быть выполнено общепринятыми в данной области способами, включая химические способы, ферментативные способы и генно-инженерный способ, используя микроорганизм. Удаление сахарных цепей из Fc-фрагмента иммуноглобулина приводит к резкому снижению его аффинности связывания с C1q первого компонента-комплемента С1, и поэтому антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность снижается или ликвидируется, и можно избежать возникновения ненужных иммунных ответов in vivo. В этом отношении дегликозилированный или агликозилированный Fc-фрагмент иммуноглобулина является более предпочтительной формой в качестве носителя лекарственного средства для объекта по настоящему изобретению.
Кроме того, Fc-фрагмент иммуноглобулина может представлять собой Fc-фрагмент, имеющий происхождение из IgG, IgA, IgD, IgE и IgM или их комбинации или гибрида. Конкретно, он имеет происхождение из иммуноглобулина IgG или IgM, которые относятся к наиболее широко распространенным белкам в крови человека, и более конкретно из иммуноглобулина IgG, который, как известно, повышает срок жизни лиганд-связывающего белка. Fc иммуноглобулина может быть образован путем обработки нативного IgG определенной протеазой или с помощью трансформированных клеток с использованием генетической рекомбинантной технологии. Конкретно, Fc иммуноглобулина представляет собой рекомбинантный Fc иммуноглобулина человека, продуцированный в Е. coli.
В данном случае термин "комбинация", использованный в данном документе, относится к конъюгированию полипептида, кодирующего одноцепочечные Fc-фрагменты иммуноглобулинов одинакового происхождения, с одноцепочечным полипептидом другого происхождения при образовании димера или мультмера. То есть, димер или мультмер может быть образован из двух или более фрагментов, выбранных из группы, состоящей из Fc-фрагментов иммуноглобулинов IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc и IgE.
Н
Н
Н
Н
В данном документе термин "гибрид" относится к присутствию по меньшей мере двух последовательностей, соответствующих Fc-фрагментам иммуноглобулина разного происхождения, в одноцепочечном Fc-фрагменте иммуноглобулина. В настоящем изобретении могут быть использованы различные типы гибридов. То есть, гибрид доменов может состоять из одного-четырех доменов, выбранных из группы, состоящей из С1, С2, С3 и С4 Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE и Fc IgD, и может содержать шарнирную область.
Между тем, IgG может быть также разделен на подклассы, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и их комбинация или гибрид также возможны в настоящем изобретении, конкретно подклассы IgG2 и IgG4 и наиболее конкретно Fc-фрагмент иммуноглобулина IgG4, который лишен эффекторной функции, такой как комплемент-зависимая цитотоксичность. Другими словами, наиболее предпочтительным Fc-фрагментом иммуноглобулина конъюгата по настоящему изобретению является негликозилированный Fc-фрагмент иммуноглобулина IgG4 человека. Fc-фрагмент человеческого происхождения является предпочтительным по сравнению с Fc-фрагментом иного происхождения, который может действовать как антиген в организме человека и вызывать нежелательные иммунные ответы, такие как продуцирование новых антител против антигена.
Конъюгат hGH длительного действия по настоящему изобретению может быть получен путем связывания hGH, полученного из нативной или рекомбинантной формы любым способом, и Fc-фрагмента иммуноглобулина, полученного в результате обработки IgG дикого типа определенной протеазой или полученного из трансформированной клетки с использованием рекомбинантного метода.
В качестве способа связывания, используемого для этой цели, конъюгат может быть получен в результате поперечного связывания hGH и Fc-фрагмента иммуноглобулина с использованием непептидильного полимера или может быть получен в виде слитого белка, где hGH и Fc-фрагмент иммуноглобулина связаны с использованием рекомбинантного метода. То есть, конъюгат может быть получен в форме, где hGH и Fc иммуноглобулина связаны посредством непептидильного линкера, или в форме слитого белка hGH и Fc иммуноглобулина. Слитый белок представляет собой форму, где hGH и Fc иммуноглобулина связаны посредством пептидильного линкера, хотя этим не ограничивается.
В данном документе термин "непептидильный полимер" относится к биосовместимому полимеру, в котором два или более повторяющихся звеньев соединены, и повторяющиеся звенья связаны друг с другом посредством ковалентной связи, за исключением пептидной связи. В настоящем изобретении термин "непептидильный полимер" может быть использован взаимозаменяемо с термином "непептидильный линкер".
Непептидильный полимер, использованный для поперечного связывания, может быть выбран из группы, состоящей из биоразлагаемого полимера, включая полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, сополимер этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированный полиол, поливиниловый спирт, полисахарид, декстран, поливинилэтиловый эфир, полиакриловую кислоту (PLA) или полиакриловую-гликолевую кислоту (PLGA), липидного полимера, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинации. Конкретно, может быть использован полиэтиленгликоль (PEG), хотя им не ограничивается. Кроме того, их производные, которые уже известны в данной области, и производные, которые легко могут быть получены способом, известным в данной области, могут входить в объем настоящего изобретения.
В отношении получения конъюгата hGH длительного действия по настоящему изобретению источники информации, такие как патент Кореи №0725315, раскрыты в настоящем изобретении в виде процитированных ссылок. Специалисты в данной области могут получить конъюгат hGH длительного действия по настоящему изобретению, обратившись к таким источникам информации, без ограничения ими.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена лиофилизированная композиция конъюгата hGH длительного действия, содержащая лиофилизированную смесь водного раствора, содержащего конъюгат hGH длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминового раствора, содержащего ацетатный буфер, полисорбат 80 и маннит.
hGH, Fc-фрагмент иммуноглобулина, конъюгат hGH длительного действия, безальбуминовый раствор, лиофилизация и лиофилизированная композиция такие, как описано выше.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена жидкая композиция конъюгата hGH длительного действия, содержащая фармацевтически эффективное количество конъюгата hGH длительного действия, в котором hGH в качестве физиологически активного пептида связан с Fc-фрагментом иммуноглобулина, и безальбуминовый стабилизатор, содержащий цитратный буфер, полисорбат 80 и маннит, причем стабилизатор не содержит изотонический агент.
hGH, Fc-фрагмент иммуноглобулина, конъюгат hGH длительного действия, безальбуминовый стабилизатор и жидкая композиция описаны выше.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения лиофилизированной композиции, включающий лиофилизацию конъюгата hGH длительного действия и безальбуминового раствора, содержащего буфер, неионное поверхностно-активное вещество и сахарный спирт.
Конъюгат hGH длительного действия, буфер, неионное поверхностно-активное вещество, сахарный спирт, безальбуминовый раствор, лиофилизация и лиофилизированная композиция твкие, как описано выше.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ разведения лиофилизированной композиции, включающий добавление раствора для разведения в лиофилизированную композицию.
Лиофилизированная композиция и разведение такие, как описано выше.
В данном документе термин "раствор для разведения" относится к раствору, который добавляют к лиофилизированному веществу в твердом состоянии для его разведения. Раствор для разведения может представлять собой воду для инъекций, например стерилизованную дистиллированную воду, но ею не ограничивается.
Раствор для разведения может также содержать консервант.
В данном документе термин "консервант" относится к веществу, которое существенно снижает бактриальное или грибковое заражение композиции. В основном его включают в состав композиции, чтобы способствовать получению композиции для многократного ведения доз. Примеры консерванта включают хлорид октадецилдиметилбензиламмония, хлорид гексаметония, хлорид бензалкония (смесь хлорида алкилбензилдиметиламмония, который имеет длинную алкильную цепь) и хлорид бензетония. Другие типы консервантов включают: ароматические спирты, такие как фенол, бутиловый спирт и бензиловый спирт; алкилпарабен, такой как метилпарабен или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и мета-крезол, но ими не ограничиваются. Консервант в жидкой композиции по настоящему изобретению представляет собой конкретно бензиловый спирт, мета-крезол или фенол, более конкретно бензиловый спирт, хотя ими не ограничивается. Концентрация консерванта находится конкретно в диапазоне от 0,001 до 0,9% (масс./об.), более конкретно в диапазоне от 0,1 до 0,9% (масс./об.), хотя этими диапазонами не ограничивается.
Композиция по настоящему изобретению, разведенная, как описано выше, может содержать конъюгат hGH длительного действия в концентрации в диапазоне от 10 до 100 мг/мл, хотя этим диапазоном не ограничивается.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен набор, содержащий лиофилизированную композицию и раствор для разведения.
Лиофилизированная композиция такая, как описано выше.
Набор содержит лиофилизированную композицию и раствор для разведения и может дополнительно содержать композицию, раствор или устройство, в которых содержится по меньшей мере один другой ингредиент, подходящий для разведения.
Далее приведено более подробное описание настоящего изобретения со ссылкой на примеры. Однако эти примеры приведены только в иллюстративных целях, и изобретение не ограничено этими примерами.
Пример получения: Получение конъюгата гормона роста человека (hGH) длительного действия
ALD-PEG-ALD, который представляет собой полиэтиленгликоль с молекулярной массой примерно 3,4 кДа, имеющий альдегидные группы на обоих концах, конъюгировали с гормоном роста человека (hGH, молекулярная масса 22 кДа), а затем связывали с N-концом агликозилированного Fc-фрагмента (примерно 50 кДа), имеющего происхождение из иммуноглобулина lgG4 человека. В результате был получен и очищен конечный продукт, конъюгат hGH-PEG-Fc (далее упоминаемый как "конъюгат hGH длительного действия"), который является репрезентативным конъюгатом hGH длительного действия по настоящему изобретению.
Тестовый пример 1: Оценка лиофилизированной композиции конъюгата hGH длительного действия
(1) Анализ стабильности лиофилизированной композиции конъюгата hGH длительного действия в зависимости от концентрации и буфера
После получения лиофилизированных композиций, содержащих конъюгат hGH длительного действия в концентрациях, указанных в Таблице 1, анализировали стабильность после разведения. Анализировали также влияние буфера и рН на стабильность конъюгата hGH длительного действия.
Как указано в Таблице 1, конъюгат hGH длительного действия лиофилизировали в данной концентрации с использованием предварительно лиофилизированной композиции, содержащей буфер, хлорид натрия (NaCl), маннит и полисорбат 80, и затем перерастворяли дистиллированной водой. Лиофилизация включала проведение стадии первичной сушки и стадии вторичной сушки. Температурный градиент лиофилизации установливали на замораживание с последующей первичной сушкой (4°С) и вторичной сушкой (20°С), как показано на Фиг. 1. Разведение проводили путем растворения лиофилизированной композиции дистиллированной водой такого же объема, как объем композиции перед лиофилизацией. Разведенную жидкую композицию хранили при 40°С в течение 4 недель, и стабильность анализировали ионообменной хроматографией (IE-HPLC). Результат представлен в Таблице 2. В Таблице 2 IE-HPLC (%) показывает чистоту конъюгата hGH длительного действия в указанное время.
Как видно из Таблицы 2, жидкая композиция конъюгата hGH длительного действия продемонстрировала отсутствие разницы в стабильности в зависимости от концентрации после хранения при 40°С в течение 4 недель. Соответственно, было подтверждено, что стабильность может быть обеспечена даже при высокой концентрации конъюгата hGH длительного действия. Было подтверждено также, что стабильность сохраняется при изменении буфера и рН (сравните Примеры 2 и 3).
(2) Анализ стабильности и растворимости лиофилизированной композиции конъюгата гормона роста человека (hGH) длительного действия в зависимости от консерванта
Используя композиции Примера 2 (20 мМ цитрата натрия, рН 5,2, 150 мМ хлорида натрия, 5% маннита, 0,005% полисорбата 80) и Примера 3 (20 мМ ацетата натрия, рН 5,6, 150 мМ хлорида натрия, 5% маннита, 0,005% полисорбата 80) из Тестового примера 1-(1) и изотоническую композицию, полученную из композиции Примера 3 (20 мМ ацетата натрия, рН 5,6, 4% маннита, 0,005% полисорбата 80), конъюгат hGH длительного действия смешивали в концентрациях 68,25 мг/мл и 58,5 мг/мл, как указано в Таблице 3, и затем лиофилизировали. После разведения раствором для разведения, содержащим консерванты, указанные в Таблице 3, измеряли время растворения и стабильность. Итоговое состояние сравнивали невооруженным глазом. Лиофилизацию и разведение проводили способом, описанным в Тестовом примере 1-(1). Разведенную жидкую композицию хранили при 25°С в течение 4 недель, и затем стабильность оценивали ионообменной хроматографией (IE-HPLC) и визуальным осмотром. Результат представлен в Таблице 4. В Таблице 4 IE-HPLC (%) показывает чистоту конъюгата hGH длительного действия в указанное время.
Как видно из Таблицы 4, стабильность конъюгата hGH длительного действия сохранялась лучше в Примерах 6 и 7, чем в Примерах 4 и 5. Однако, как можно видеть из результатов для Примеров 6-9, отсутствовала разница в стабильности конъюгата hGH длительного действия в зависимости от вида консерванта. Но когда использовали раствор для разведения, содержащий мета-крезол, полученная жидкая композиция была замутненной во время растворения.
(3) Анализ растворимости лиофилизированной композиции конъюгата hGH длительного действия в зависимости от концентрации конъюгата
Получали лиофилизированные композиции, содержащие конъюгат hGH длительного действия в разных концентрациях, и оценивали состояние продуктов и растворимость при разведении. Используя композицию Примера 1 (20 мМ цитрата натрия, рН 5,2, 150 мМ хлорида натрия, 5% маннита, 0,005% полисорбата 80) из Тестового примера 1-(1), конъюгат hGH длительного действия смешивали в разных концентрациях, как указано в Таблице 5, и затем лиофилизировали. После разведения дистиллированной водой измеряли время растворения. Лиофилизацию и разведение проводили способом, описанным в Тестовом примере 1-(1). Итоговое состояние сравнивали невооруженным глазом. Разведение осуществляли с использованием автошейкера, установленного на 60°С и 30 об/мин. Время, необходимое для полного растворения, приведено в Таблице 6.
Хотя итоговое состояние лиофилизированного вещества было стабильным независимо от концентрации, более твердые осадки можно было наблюдать при более высоких концентрациях. Как видно из Таблицы 6, время растворения увеличивается с концентрацией.
(4) Анализ стабильности и растворимости лиофилизированной композиции конъюгата гормона роста человека (hGH) длительного действия в зависимости от стабилизатора
Лиофилизированные композиции конъюгата hGH длительного действия получали с использованием разных стабилизаторов, и оценивали время их растворения, состояние при растворении и стабильность конъюгата hGH длительного действия. Получали прекомпозиции с составами, указанными в Таблице 7, и затем их использовали для сублимационной сушки конъюгата hGH длительного действия при 78,0 мг/мл. После разведения дистиллированной водой измеряли время растворения. Лиофилизацию и разведение проводили способом, описанным в Тестовом примере 1-(1). Итоговое состояние сравнивали невооруженным глазом. Разведение осуществляли с использованием автошейкера, установленного на 60° и 30 об/мин. Время, необходимое для полного растворения, приведено в Таблице 8.
Кроме того, после хранения разведенной жидкой композиции при 40°С в течение 4 недель стабильность оценивали ионообменной хроматографией (IE-HPLC). В Таблице 9 IE-HPLC (%) показывает остаточный уровень конъюгата hGH длительного действия в указанное время относительно исходного значения.
Как видно из Таблицы 8, высокая скорость растворения достигалась, когда концентрация маннита была высокой. Было подтверждено также, что добавление 5 мМ гистидина приводит к повышению скорости растворения. Композиции Примеров 15 и 17 продемонстрировали сильное вспенивание во время разведения по сравнению с композицией Примера 19. Как видно из Таблицы 9, стабильность после растворения была сходной для каждой композиции. Но при включении в состав композиции хлорида натрия в качестве стабилизатора стабильность конъюгата hGH длительного действия была немного выше.
(5) Анализ растворимости лиофилизированной композиции в зависимости от плотности лиофилизированного вещества и концентрации конъюгата hGH длительного действия
Используя композицию Примера 19 (20 мМ цитрата натрия, рН 5,2, 5% (масс./об.) маннита, 5 мМ гистидина, 0,005% (масс./об.) полисорбата 80) из Тестового примера 1-(4), анализировали растворимость лиофилизированного вещества в зависимости от концентрации конъюгата hGH длительного действия. Получали прекомпозиции с составами, указанными в Таблице 10, и затем их лиофилизировали. Во время лиофилизации прекомпозицию разбавляли 1-кратно, 1/2-кратно и 1/4-кратно дистиллированной водой. Лиофилизация включала проведение стадии первичной сушки и стадии вторичной сушки. Температурный градиент лиофилизации показан на Фиг. 1. Разведение проводили путем растворения лиофилизированной композиции дистиллированной водой такого же объема, как объем композиции перед лиофилизацией. Разведение осуществляли с использованием автошейкера, установленного на 60° и 30 об/мин. Время, необходимое для полного растворения, указано в Таблице 11.
Как видно из Таблицы 11, было подтверждено, что скорость растворения повышается при снижении плотности лиофилизированного вещества в результате разбавления. Кроме того, скорость растворения аналогично повышается по мере увеличения концентрации конъюгата hGH длительного действия в композиции (20 мМ цитрата натрия, 5% маннита, 5 мМ гистидина, 0,005% полисорбата 80) с 39,0 мг/мл до 48,8 мг/мл и до 58,5 мг/мл.
(6) Установка температурного градиента для процесса лиофилизации
Температурный градиент в Тестовом примере 1-(1) (Фиг. 1) изменяли, увеличивая время первичной сушки с 10 часов до 20 часов и подразделя температуру стадии первичной сушки (4°С) на два этапа -20°С и -5°С (Фиг. 2). При первом температурном градиенте происходил распад лиофилизированного вещества, поскольку 3-5% воды оставалось в лиофилизированном веществе. При изменении температурного градиента на градиент, который показан на Фиг. 2, полная лиофилизация могла достигаться даже при большем объеме (-5 мл).
(7) Анализ растворимости лиофилизированной композиции конъюгата hGH длительного действия, принимая во внимание осмотическое давление
Используя композицию (20 мМ ацетата натрия, рН 5,6, 5% (масс./об.) маннита, 150 мМ хлорида натрия, 0,005% (масс./об.) полисорбата 80) из Тестового примера 1-(1) и (2), концентрацию стабилизатора устанавливали с учетом осмотического давления, и анализировали растворимость лиофилизированного вещества. Прекомпозиции получали, как описано в Таблице 12, и затем лиофилизировали.
Во время лиофилизации прекомпозицию разбавляли 1/2-кратно дистиллированной водой. Лиофилизация включала проведение стадии первичной сушки и вторичной сушки. Температурный градиент лиофилизации устанавливали такой, как показано на Фиг. 2. Разведение проводили дистиллированной водой, содержащей 0,9% бензилового спирта, которая имела такой же объем, как и объем композиции перед разбавлением.
Разведение осуществляли с использованием автошейкера при 60° и 30 об/мин. Время, необходимое для полного растворения, и осмотическое давление измеряли после разведения, как указано в Таблице 13.
Как видно из Таблицы 13, время растворения сильно увеличивалось, когда удаляли маннит. Осмотическое давление было выше, чем изотонический диапазон 280-320 мОсмоль/кг, когда концентрация маннита составляла 5% (масс./об.).
(8) Анализ растворимости и осмотического давления лиофилизированной композиции конъюгата hGH длительного действия в зависимости от концентрации маннита
Используя композицию (20 мМ ацетата натрия, рН 5,6, 5% (масс./об.) маннита, 0,005% (масс./об.) полисорбата 80) из Тестового примера 1-(7), анализировали растворимость и осмотическое давление лиофилизированного вещества в зависимости от концентрации маннита.
Прекомпозиции получали, как указано в Таблице 14, и затем лиофилизировали. Методы и условия лиофилизации и разведения были такими же, как описано в Тестовом примере 1-(7). Время, необходимое для полного растворения, и осмотическое давление, измеренные после разведения, указаны в Таблице 15.
Как видно из Таблицы 15, изотоническое осмотическое давление наблюдалось, когда концентрация маннита находилась в диапазоне от 4 до 4,5%. Хотя время растворения было длительнее, когда концентрация маннита была ниже, изменение было меньше по сравнению с изменением, когда в состав входил хлорид натрия.
(9) Анализ стабильности при хранении лиофилизированной композиции конъюгата hGH длительного действия при 4°С и 25°С
Используя композицию (20 мМ ацетата натрия, рН 5,6, 4% (масс./об.) маннита, 0,005% (масс./об.) полисорбата 80) из Тестового примера 1-(8), стабильность при хранении лиофилизированного вещества анализировали при 4°С и 25°С. После хранения лиофилизированной композиции при 4°С и 25°С в течение 6 месяцев стабильность оценивали ионообменной хроматографией (IE-HPLC) после разведения. Исходный раствор для разведения хранили при 25°С в течение 4 недель в жидком состоянии и затем оценивали ионообменной хроматографией (IE-HPLC) после разведения. В Таблице 16 IE-HPLC (%) показывает чистоту конъюгата hGH длительного действия в лиофилизированном веществе в указанное время. В Таблице 17 IE-HPLC (%) показывает чистоту конъюгата hGH длительного действия в разведенной жидкой композиции.
Как видно из Таблицы 16, стабильность лиофилизированного вещества сохранялась даже после хранения при 4°С и 25°С в течение 6 месяцев. Стабильность разведенной композиции сохранялась даже после хранения при 25°С в течение 2 недель.
Тестовый пример 2: Оценка жидкой композиции конъюгата hGH длительного действия
(1) Анализ стабильности жидкой композиции конъюгата hGH длительного действия в зависимости от рН, буфера, изотонического агента и концентрации сахарного спирта
Тестировали влияние буфера, изотонического агента и концентрации сахарного спирта на стабильность конъюгата hGH длительного действия. Композиции полученные, как описано в Таблице 18, хранили при 25°С в течение 0-4 недель и затем анализировали ионообменной хроматографией и эксклюзионной хроматографией. В Таблицах 19 и 20 IE-HPLC (%) и SE-HPLC (%) показывают остаточный уровень конъюгата hGH длительного действия относительно исходного значения соответственно (площадь %/исходная площадь %).
Результат IE-HPLC показал, что конъюгат hGH длительного действия демонстрирует хорошую стабильность в присутствии 20 мМ ацетата натрия (рН 5,2). И результат SE-HPLC показал, что конъюгат hGH длительного действия был самым стабильным в присутствии 20 мМ ацетата натрия (рН 5,2) и 4% (масс./об.) маннита.
(2) Анализ стабильности жидкой композиции конъюгата hGH длительного действия в зависимости от буфера
Тестировали влияние буфера в качестве стабилизатора на стабильность конъюгата hGH длительного действия. Используя композицию (рН 5,2, 4% маннита, 0,005% полисорбата 80) из Тестового примера 2-(1), композиции получали, как описано в Таблице 21. После хранения при 25°С в течение 0-4 недель стабильность анализировали методами IE-HPLC и SE-HPLC. В Таблицах 22 и 23 IE-HPLC (%) и SE-HPLC (%) показывают, что остаточный уровень конъюгата hGH длительного действия относительно исходного значения соответственно (площадь % / исходная площадь %).
Результат IE-HPLC показал, что конъюгат hGH длительного действия в концентрации 10,0 мг/мл был наиболее стабильным в присутствии цитрата натрия. И результат SE-HPLC показал, что конъюгат hGH длительного действия в концентрации 10,0 мг/мл продемонстрировал хорошую стабильность в присутствии гистидина и цитрата натрия.
Результат IE-HPLC показал, что конъюгат hGH длительного действия 58,5 мг/мл продемонстрировал хорошую стабильность в присутствии ацетата натрия и цитрата натрия. И результат SE-HPLC показал, что конъюгат hGH длительного действия 58,5 мг/мл продемонстрировал хорошую стабильность в присутствии гистидина и цитрата натрия.
Когда концентрация конъюгата hGH длительного действия находилась в диапазоне от 10 мг/мл до 58,5 мг/мл, наилучшая стабильность наблюдалась в присутствии 20 мМ цитрата натрия (рН 5,2), 4% маннита и 0,005% полисорбата 80.
Для специалистов в данной области будет очевидным, что различные модификации и изменения могут быть сделаны, не выходя за пределы объема и замысла изобретения. Следовательно, необходимо понимать, что вышеуказанное воплощение не является ограничительным, а является иллюстративным во всех аспектах. Объем изобретения определен прилагаемой формулой изобретения, а не описанием, предшествующим ей, и поэтому все изменения и модификации, которые попадают в пределы и границы формулы изобретения или эквиваленты таких пределов и границ, считаются, следовательно, охваченными формулой изобретения.