Селективная питательная среда для выделения аэромонад из водных объектов
SELECTIVE NUTRIENT MEDIUM FOR ISOLATING AEROMONADS FROM WATER BODIES

Изобретение относится к области микробиологии, более конкретно к сфере санитарной микробиологии и может быть использовано учреждениями, осуществляющими надзор и контроль качества воды сточных, питьевых вод и поверхностных водоемов, в том числе имеющих рыбохозяйственное значение.
Известен способ выделения и идентификации аэромонад с использованием питательных сред А1 и А2, в соответствии с рекомендациями «Методы исследований объектов окружающей среды и патологического материала на аэромонады» (Методы исследования объектов окружающей среды и патологического материала на аэромонады: Метод. рекомендации / М-во здравоохранения РСФСР, Гл. упр. н.-и. ин-тов и координации науч. исслед.; [Составители Г. П. Калина, Т. И. Графова]. - М. : Б. и., 1980. - 11 с), разработанные в Московском научно-исследовательском институте гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана, и методическими указаниями по санитарно-бактериологической оценке рыбохозяйственных водоемов (Методические указания по санитарно-бактериологической оценке рыбохозяйственных водоемов Методические указания Минсельхоза России от 27.09.1999 № 13-4-2/1742).
Жидкая среда накопления А-1 имеет следующий состав (г/л):
Магния сульфат
0,2
Крахмал растворимый
2
Желатин
10
Калия гидрофосфат
1
Водный раствор кристаллического фиолетового 0,01%
20 см<sup>3</sup>
pH 7,2 - 7,4
Стерилизация 112 +/- 1 в течение 15 мин
Селективность среды А-1 обусловлена действием кристаллического фиолетового в отношении большинства грамположительных бактерий.
Известна питательная среда для обнаружения аэромонад по авторскому свидетельству SU № 544674 от 24.07.1975 на изобретение. Питательная среда для обнаружения аэромонад в объектах окружающей среды, содержащая крахмал и дистиллированную воду, причем с целью ускорения процесса выращивания аэромонад, она дополнительно содержит натрий-аммоний фосфорнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, кристаллический фиолетовый и все ингредиенты взяты в следующих соотношениях, вес. %:
Натрий-аммоний фосфорнокислый
0,1-0,2
Калий фосфорнокислый однозамещенный
0,05-0,1
Магния сульфат
0,01-0,03
Крахмал
0,5-1,5
Кристаллический фиолетовый
0,0002-0,00025
Дистиллированная вода
Остальное
При выращивании аэромонад в этой среде почти полностью отсутствует рост посторонней микрофлоры. Недостатком среды для выделения аэромонад является наличие в составе только одного источника питательных веществ (крахмала), кроме того отмечается слабое подавление роста энтеробактеров и энтерококков, а при высоком фекальном загрязнении воды может наблюдаться рост кишечной палочки.
Aeromonas
Задача заявленного изобретения состояла в разработке жидкой питательной среды для выделения аэромонад из воды, которая смогла бы обеспечить достаточный рост бактерий рода  при полном подавлении эшерихий, сальмонелл, стафилококков и энтерококков. Технический результат заключается в повышении накопительных и селективных свойств среды для выделения аэромонад из водных объектов. Данный технический результат достигается за счет всей совокупности предложенных компонентов среды.
Сущность изобретения заключается в том, чтопитательная селективная среда для выделения аэромонад из водных объектов содержит пептон, экстракт кормовых дрожжей, аргинин, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат магния, хлорид натрия, дезоксихолат, гидроксид натрия, бромтимоловый синий, тимоловый синий, ампициллин и воду дистиллированную при следующем соотношении компонентов, г/л:
Пептон ферментативный
10
Экстракт кормовых дрожжей
3
L-аргинин солянокислый
3,5
Натрий хлорид
9
Калий фосфорнокислый однозамещенный
1
Магния сульфат
0,2
Дезоксихолат натрия
2
Гидроксид натрия
0,35±0,05
Бромтимоловый синий
0,03
Тимоловый синий
0,03
Ампициллин
0,005
Дистиллированная вода
до 1000 мл
Aeromonas
Aeromonas
Бактерии рода  относятся к семейству Aeromonadaceae. Это факультативно-анаэробные грамотрицательные палочки, чаще подвижные, оксидазоположительные и каталазоположительные. По сбраживанию углеводов, образованию сероводорода и гидролиза мочевины отмечается вариация признаков. В естественных условиях они способны размножаться при температуре от 4°С до 45°С, а также при pH среды от 4,5 до 9,8. Аэромонадышироко распространены в пресных и соленых водоемах, могут обнаруживаться в сточных водах, донных отложениях и в микрофлоре гидробионтов. Cреди них имеются виды патогенные для морских, пресноводных рыб, земноводных и пресмыкающихся. Поскольку рыбохозяйственные водоемы часто располагаются вблизи населенных пунктов и сельскохозяйственных предприятий, в них поступают различные стоки (коммунальные, животноводческие и др.), что приводит к бактериальному загрязнению вод, результатом которого является эпизоотическое неблагополучие водных объектов. Некоторые из видов аэромонад могут инициировать заболевания человека, связанные как с водным, так и с алиментарным фактором. Аэромонады известны как микроорганизмы образующие обширные колонии в системах водоснабжения. Имеются сведения об обнаружении этих бактерий в системах распределения водопроводной воды, прошедшей систему водоподготовки и в биопленках распределительных систем, где могут быть устойчивыми к хлорированию. В связи с вышеизложенным проводится анализ воды, включающий индикацию и количественный учет бактерий рода . В качестве основного источника азота в предлагаемой среде используется пептон, в качестве факторов роста - экстракт кормовых дрожжей и L-аргинин солянокислый, для придания изотонических свойств среды - хлорид натрия, в качестве фосфатного буфера - калий фосфорнокислый однозамещенный и кофактора для различных метаболических реакций - сульфат магния, селективными факторами являются дезоксихолат натрия и ампициллин, индикаторами - бромтимоловый синий, тимоловый синий и дистиллированная вода при следующем соотношении компонентов, г/л:
Пептон ферментативный
10 г
34,35 %
Экстракт кормовых дрожжей
3 г
10,30 %
L-аргинин солянокислый
3,5 г
12,02 %
Натрий хлорид
9 г
30,91 %
Калий фосфорнокислый однозамещенный
1 г
3,43 %
Магния сульфат
0,2 г
0,69 %
Дезоксихолат натрия
2 г
6,87 %
Гидроксид натрия
0,35±0,05 г
1,21 %
Бромтимоловый синий
0,03 г
0,10 %
Тимоловый синий
0,03 г
0,10 %
Ампициллин
0,005 г
0,02 %
Дистиллированная вода
до 1000 мл
рН 8,3±0,2 при 25°С
Внесение в питательную среду дезоксихолата натрия способствует ингибиции грамположительных бактерий. Добавление ампициллина полностью подавляет рост сальмонелл, кишечной палочки и чувствительные к нему энтерококки, тем самым создаются благоприятные условия для роста аэромонад. Высокая щелочность среды (рН 8,3±0,2) способствует подавлению роста энтеробактерий и синегнойных палочек. При действии аргининдегидролазы аэромонад на L-аргинин среды образуются щелочные продукты реакции, которые изменяют окраску среды с исходного зеленого на голубой.
Подбор концентраций ингредиентов в составе предлагаемой питательной среды для аэромонад, при использовании разных концентраций пептона, экстракта кормовых дрожжей, L-аргинина солянокислого, дезоксихолата натрия, ампициллина и индикаторов (таблица 2).
Таблица 2
Состав питательной среды в г/л:
1 вариант
2 вариант
3 вариант
Пептон ферментативный
5,0
10,0
10,0
Экстракт кормовых дрожжей
1,0
3,0
3,0
L-аргинин солянокислый
2,0
3,5
3,5
Натрий хлорид
9,0
9,0
9,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный
1,0
1,0
1,0
Магния сульфат
0,2
0,2
0,2
Дезоксихолат натрия
3,0
2,5
2,0
Гидроксид натрия
0,22±0,05
0,35±0,05
0,35±0,05
Бромтимоловый синий
0,03
0,03
0,03
Тимоловый синий
-
-
0,03
Ампициллин
-
-
0,005
рH при 25°С
7,4±0,2
8,3±0,2
8,3±0,2
Pseudomonas aeruginosa
Salmonella
paratyphi
E. coli
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Aeromonas caviae
Aeromonas veronii
Aeromonas hydrophila
Aeromonas salmonicida
9
-4
-5
-6
-7
-8
-9
При подборе концентраций ингредиентов использовали тест-штаммы:  10145;  B 506;  3912/41;  6538;  29212,  ВКШМ-Б-297М;  ВКШМ-Б-307М;  ВКШМ-Б-301М,  ВКШМ-Б-307М. Для приготовления микробных взвесей суточные агаровые культуры тест-штаммов смывают 0,9 % стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, доводят взвеси до 10 ед. по оптическому стандарту мутности, что соответствует 10 микробных клеток в 1 мл. Затем серийными десятикратными разведениями доводят до содержания 100 тыс. (10), 10 тыс. (10), 1 тыс. (10), 100 (10), 10 (10) и 1 (10) микробных клеток в 1 мл взвеси. Высев производят из каждого разведения по 1 мл в 9 мл опытной среды (варианты среды 1-3) в трех повторностях и инкубируют при температуре 28±2°С в течение 18-24 час. Высев производят из пробирок с вариантами опытных сред, в которых наблюдался рост бактерий, на чашки с питательными средами (рыбо-пептонный агар, Эндо агар, кровяной агар).
Данные по ростовым свойствам среды представлены в таблицах 3 и 4.
Taблица 3
Зависимость роста тест-штаммов микроорганизмов от концентрации ингредиентов в опытной среде
Микроорганизмы
Разведения
Варианты опытной среды
1
2
3
P. aeruginosa
10<sup>-1</sup>
+
+
+
10<sup>-2</sup>
+
-
-
10<sup>-3</sup>
-
-
-
10<sup>-4</sup>
-
-
-
S. paratyphi B
10<sup>-1</sup>
+
+
-
10<sup>-2</sup>
+
+
-
10<sup>-3</sup>
+
-
-
10<sup>-4</sup>
+
-
-
E. coli
10<sup>-1</sup>
+
+
-
10<sup>-2</sup>
+
+
-
10<sup>-3</sup>
+
-
-
10<sup>-4</sup>
-
-
-
S. aureus
10<sup>-1</sup>
-
-
-
10<sup>-2</sup>
-
-
-
10<sup>-3</sup>
-
-
-
10<sup>-4</sup>
-
-
-
E. faecalis
10<sup>-1</sup>
+
+
-
10<sup>-2</sup>
-
-
-
10<sup>-3</sup>
-
-
-
10<sup>-4</sup>
-
-
-
Taблица 4
Зависимость роста аэромонад от концентрации ингредиентов в опытной среде
Микроорганизмы
Разведения
Варианты опытной среды
1
2
3
А. hydrophila
10<sup>-6</sup>
+
+
+
10<sup>-7</sup>
-
+
+
10<sup>-8</sup>
-
+
+
10<sup>-9</sup>
-
-
-
А. veronii
10<sup>-6</sup>
+
+
+
10<sup>-7</sup>
+
+
+
10<sup>-8</sup>
-
+
+
10<sup>-9</sup>
-
-
+
А. salmonicida
10<sup>-6</sup>
+
+
+
10<sup>-7</sup>
+
+
+
10<sup>-8</sup>
-
+
+
10<sup>-9</sup>
-
-
-
А. caviae
10<sup>-6</sup>
+
+
+
10<sup>-7</sup>
-
+
+
10<sup>-8</sup>
-
+
+
10<sup>-9</sup>
-
-
-
Aeromonas
E. coli, S. paratyphi B, S. aureus, E. faecalis
Рост бактерий рода  в количестве, соответствующем посевной дозе микроорганизма, отмечен на среде с минимальным и оптимальным содержанием питательной основы (пептон ферментативный, экстракт кормовых дрожжей, L-аргинин). Преимущественный рост аэромонад регистрировали при оптимальном содержании питательной основы. При этом видимый эффект изменения цвета среды c исходного зеленого на голубой проявлялся при повышении содержания L-аргинина с 2,0 г до 3,5 г. При использовании в среде одного индикатора бромтимоловый синий изменение цвета среды (вариант среды 2) на голубой при культивировании аэромонад не достигается. В процессе роста синегнойные палочки не изменяют исходный зеленый цвет среды. Рост других микроорганизмов () зависит от посевной дозы микроорганизма и на среде с дезоксихолатом натрия и ампициллином наблюдали отсутствие или значительное угнетение роста. Увеличение количества до 3 г дезоксихолата натрия не влияет на рост энтерококков и золотистого стафилококка, по сравнению с указанными параметрами. При этом снижение количества ингибирующего вещества удешевляет стоимость среды. Питательная среда обладает хорошими ростовыми и накопительными свойствами, эффективность накопления на порядок выше чем в ГРМ-бульоне (таблица 5).
Taблица 5
Сравнение чувствительности питательных сред накопления для выделения аэромонад из водных объектов
Тест-штаммы
Опытная среда
ГРМ-бульон
Разведение
Разведение
10<sup>-7</sup>
10<sup>-8</sup>
10<sup>-9</sup>
10<sup>-7</sup>
10<sup>-8</sup>
10<sup>-9</sup>
А. hydrophila
+
+
-
+
-
-
A. veronii
+
+
+
+
+
-
A. salmonicida
+
+
-
+
-
-
A. caviae
+
+
-
+
-
-
Способ приготовления питательной среды для выделения аэромонад заключается в следующем: в химически чистую стеклянную термостойкую колбу, например, двухлитровую круглую плоскодонную или коническую колбу по ГОСТ 25336-82 добавляют навески в г/л: ферментативного пептона - 10,0; хлористого натрия - 9,0; экстракт кормовых дрожжей - 3,0; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,0 г (в соответствии с ГОСТ 4198-73 ЧДА); магния сульфат - 0,2 г и вносят дистиллированную воду до 1 литра с последующим перемешиванием до полного растворения. Затем полученную смесь нагревают с последующим перемешиванием до их полного растворения. После чего добавляют навески в г/л: L-аргинин солянокислый (в соответствии с ТУ 6-09-2100-78) - 3,5 г, спиртовой раствор бромтимолового синего водорастворимый (в соответствии с ТУ 6-09-07-1602-87) - 0,03 г (в виде 1,6 % спиртового раствора - 1,88 мл), тимоловый синий (в соответствии с ТУ 6-09-3501-78) - 0,03 г и гидроксид натрия (в соответствии с ГОСТ4328-77 ЧДА) - 0,35±0,05 г (в соответствии с ГОСТ 4328-77 ХЧ). Далее устанавливают рН 8,3±0,2 при помощи 20% водного раствора гидроокиси натрия. После чего стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм. (121°С) в течение 10 мин. Затем в охлажденную среду вносят дезоксихолата натрия 2,0 г и ампициллина 0,005 г. Разливают в стерильные флаконы и пробирки и культивируют при температуре 28 ± 2°С в течение 18-24 часов.