Определение суммы флавоноидов в листьях земляники восточной

Литература

1. Вялков А.И. Управление в здравоохранении Российской Федерации. Теория и практика. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. 528 с.

2. Стародубов В.И. // Экономика здравоохранения. 1997. №7. С.11-16.

Официнальным видом рода Fragaria L. является земляника лесная (Fragaria vesca L., семейство Rosaceae — розоцветные), произрастающая в европейской части России, Западной и Восточной Сибири [1, 8].

В научной медицине земляника лесная применяется как мочегонное (листья) и витаминное (плоды) средство. Химический состав этого растения, являющегося в последнее время предметом исследования многих авторов, изучен достаточно подробно [4-7]. Установлено, что основной группой действующих веществ, которая определяет ряд фармакологических эффектов листьев земляники, является комплекс фенольных соединений, в частности флавоноидов [2, 7].

В Дальневосточном государственном медицинском университете на кафедре фармакогнозии и ботаники проводится изучение дальневосточного вида земляники, близкородственного (викарного) официальному — земляники восточной (F. orientalis Losinsk.).

Земляника восточная применяется в народной медицине по тем же показаниям, что и земляника лесная, но для официального признания дальневосточного вида требуется ее дополнительное изучение, в том числе и по вопросам стандартизации сырья.

Цель исследования — разработка методики количественного определения флавоноидов в листьях земляники восточной с использованием дифференциальной спектрофотометрии. Для проведения исследований использовали образцы сырья, собранные в разных районах Амурской области, Хабаровского края, Приморского края и Республики Саха (Якутия). Сырье заготавливали в 2003-2004 гг. в фазу цветения растения.

3. Шевченко Ю.Л. // Экономика здравоохранения. 1999. №11, 12. С.5-13.

4. Щепин О.П. // Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины. 1999. №3. С.7-10.

5. Шильникова Н.Ф., Ходакова О.В. // Здравоохранение. 2004. №10. С.38-42.

Резюме

Разработана спектрофотометрическая методика для количественной оценки суммы флавоноидов в листьях земляники восточной. Определение предложено проводить методом дифференциальной спектрофотометрии с использованием реакции комплексообразования флавоноидов экстракта листьев земляники с раствором алюминия хлорида в кислой среде. Относительная погрешность определения при Р=95% составляет 1,45 %. Установлено, что содержание суммы флавоноцдов в исследованных образцах земляники восточной в пересчете на рутин составляет 2,11-4,22 %.

G.Y. Mechikova, E.V. Zaguzova, Т.А. Stepanova

QUANTITATIVE DETERMINATION OF TOTAL

FLAVONOIDS IN THE LEAVES OF FRAGARIA VESCAL

Far Eastern State Medical University, Khabarovsk Summary

The spectrophotometric method for quantative determination of total flavonoids in the leaves of Fragaria vesca L. is developed. It is suggested to complete the determination by means of differential spectrophometry after the reaction of flavonoid chelat formation of the leaves of Fragaria vesca L. extract with the solution of aluminum chloride in acid bath. The relative error of determination with confidence probability p=0,95% makes 1,45 percent. The amount of total flavonoids in given samples of the leaves of Fragaria vesca L. in rutin equivalent averages 2,11 to 4,22 percent.

Флавоноиды представлены в листьях земляники восточной различными структурными группами, поэтому при выборе стандартного вещества и аналитической длины волны для количественного

УДК 615.322: 582.734.4

Г.Я. Мечикова, Е.В. Загузова, Т.А. Степанова

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММЫ ФЛАВОНОИДОВ В ЛИСТЬЯХ ЗЕМЛЯНИКИ ВОСТОЧНОЙ

Дальневосточный государственный медицинский университет, г. Хабаровск

л

э

0.5

о 4——.—-1--,--.——.-1-I-,-1-'->

350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460

Рис. 1. Дифференциальные спектры поглощения комплексов раствора рутина (1) и флавоноидов экстракта листьев земляники восточной (2) с 10% раствором алюминия хлорида в кислой среде

определения был изучен дифференциальный спектр поглощения алюминиевых комплексов флавоноидов спиртового извлечения из листьев земляники. При регистрации спектра установлено, что дифференциальная кривая имеет максимум поглощения при 410±2 нм, который совпадает с максимумом поглощения комплекса рутина с тем же комплексообразователем (рис. 1). Таким образом, в качестве стандартного образца был выбран рутин.

На этапе предварительных исследований были установлены оптимальные параметры реакции ком-плексообразования — количество добавляемого

Таблица 1

Влияние условий экстракции на выход флавоноидов из листьев земляники

Условия экстракции Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, %

Концентрация спирта, % - 50 2,66

- 70 2,80

-95 1,56

Измельченность сырья, мм -1 2,82

- 2 2,80

- 3 2,81

-5 2,74

П родолжите л ьность экстракции, мин - 15 2,62

-30 2,85

-45 2,81

-60 2,84

Соотношение сырья и экстрагента: - 1:50 2,43

- 1:100 2,80

- 1:150 3,24

- 1:200 3,23

Кратность экстракции: - 1 3,24

- 2 0,12

-3 0,04

0,43 О

0,38--.-г-----.-.-.-<--.

0 12 3 4 5 6 7

Рис. 2. Зависимость оптической плотности от количества добавляемого 10% раствора алюминия хлорида

алюминия хлорида и кислоты уксусной, время образования и устойчивость комплекса. Как видно на рис. 2, минимальное количество 10% раствора алюминия хлорида составляет 3 мл, оптимальное — 5 мл [3]. Реакция образования хелатных комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом развивается в течение 30 мин, и следующие 60 мин комплекс сохраняет стабильность. Для получения оптимального значения рН и воспроизводимых результатов в аналитическую пробу необходимо добавлять 0,2 мл кислоты уксусной.

В ходе разработки методики экспериментально с последующей статистической обработкой результатов было изучено влияние измельченное™ сырья, продолжительности экстракции, соотношение сырья и экстрагента, концентрации спирта на выход флавоноидов (табл. 1). Для выбора оптимальных условий экстракции проводили анализ извлечений, полученных однократной экстракцией на одном образце сырья.

Однофакторный дисперсионный анализ показал влияние концентрации этилового спирта на выход флавоноидов из листьев земляники (Рэксп=406,9; Ё =9,5). Для выбора оптимальной концентрации

кр

спирта проведено сравнение данных по критерию Стьюдента, которое показало достоверность различий между выходом флавоноидов в извлечения на спирте этиловом 95; 70 и 50%. Экстракция флавоноидов происходит достоверно полнее при использовании спирта этилового 70%, который и был выбран в качестве экстрагента.

Аналогичным образом установлено, что оптимальным является соотношение сырья и экстрагента 1:150. Выход флавоноидов из сырья, измельченного до размеров частиц 1-3 мм, достоверно не различается, при 5 мм выход несколько ниже. Время достижения равновесной концентрации при экстрагировании флавоноидов из сырья при нагревании на кипящей водяной бане составляет 30 мин. Исследование влияния кратности экстракции показало, что достаточно двукратной экстракции, при этом второе извлечение целесообразно проводить при соотношении сырья и экстрагента 1:50.

Метрологические характеристики разработанной методики представлены в табл. 2. Результаты статистической обработки проведенных опытов свидетельствуют, что относительная ошибка определения с доверительной вероятностью 95 % составляет 2,00%, ошибка отдельной варианты — 4,90%. Опыты с добавками стандартного образца рутина к

Таблица 2

Метрологическая характеристика методики определения суммы флавоновдов з листьях земляники

п f X Лх S2 Р ..... ё, %

6 5 3,28 0,0656 0,0039 0,0255 95% 4,90 2, 00

Таблица 4

Содержание суммы флавоновдов в льСТЬЯх земляники восточной

№ образца Место И время сбор?. Содержание суммы флавоноидов, %

1 Приморский Пожарский район, п. Лучегорск, 25.05.03 2,88

2 Хабаровский край, г. Хабаровск, Хехцир, 25 км, 10.06.03 3,32

3 Хабаровский край, г. Хабаровск, Хехцир, 25 км, 08.06.04 3,23

4 Хабаровский край, г. Хабаровск, Хехцир, 19 км, 30.05.03 3,55

5 Приморский край, Лазовский район, п. Преображение, 27.05.03 4,22

6 Приморский край, Ольгин-ский район, п. Ольга, 30.05.03 3,07

7 Амурская область, Бочкарев-ский район, п. Бочкаревка, 16.06.03 3,35

8 Амурская область, г. Свободный (40 км), 28.06.03 3,75

9 Приморский край, Чугуевский район, с. Пшеницино, 20.05.03 2,80

10 Приморский край, Чугуевский район, с. Пшеницино, 30.05.04 3,92

11 Амурская область, Октябрьский район, п. Екатерино-славка, 20.06.03 2,11

12 Амурская область, Октябрьский район, 21.06.03 3,80

13 Республика Саха (Якутия), Мегино-Кангаласский улус, с. Хоробут, 10.07.04 2,89

14 Приморский край, Кавалеров-ский район, п. Кавалерово, 25.05.04 4,19

Таблица 3

Определе;,".'!'1 флавоновдов с добавками стандартного «ещества

Определено флавоноидов, мг/мл Добавлено рутина, мг/мл Рассчитано флавоноидов, мг/мл НайД?но флавоноидов, мг/мл Относительная ошио^2,%

0,0175 0,0050 0,0225 0,0223 -0,89

0,0175 0,0101 0,0276 0,0279 + 1,09

0,0175 0,0201 0,0376 0,0381 + 1,33

извлечению показали отсутствие систематической ошибки предлагаемой методики (табл. 3).

Методика спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов в листьях зешяники восточной

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл и добавляют 150 мл 70% этилового спирта. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин с момента закипания экстрагента, периодически встряхивая колбу для смывания частиц сырья со стенок. Колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры. Затем извлечение фильтруют через бумажный фильтр, смоченный в 70% этиловом спирте, в мерную колбу вместимостью 200 мл. Фильтр помещают в колбу для экстрагирования, и экстракцию повторяют еще раз, в течение 30 мин, используя 50 мл 70% этилового спирта. Извлечение охлаждают до комнатной температуры и фильтруют в ту же мерную колбу. Объем извлечения доводят до метки 70% этилового спирта и перемешивают.

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 3 мл извлечения, прибавляют 5 мл 10% раствора алюминия хлорида в спирте этиловом 95%, 0,2 мл кислоты уксусной, доводят объем раствора спиртом этиловым 95% до метки и перемешивают. Через 30 мин измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 3 мл экстракта, 0,2 мл кислоты уксусной и доведенный спиртом этиловым 95% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность раствора PCO рутина, приготовленного аналогично испытуемому раствору.

Содержание суммы флавоноидов в процентах (X) в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

X _ 200• 25• 1 -100 100• £>• т0 _ 20000-Р-Мр ~3 100-25-DQ-m-

где D — оптическая плотность испытуемого раствора; D0 — оптическая плотность раствора PCO рутина; т — масса сырья в граммах; ti\ — масса PCO рутина в граммах; W — потеря в массе при высушивании сырья в процентах.

Приготовление раствора рутина стандартного образца Около 0,05 г (точная навеска) PCO рутина, высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 ч, помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют 85 мл спирта этилового 70% и нагревают на водяной бане до полного растворения. Затем раствор охлаждают, доводят его объем до метки тем же спиртом и перемешивают (раствор А).

В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора А, прибавляют 5 мл 10% раствора алюминия хлорида в спирте этиловом 95%, 0,2 мл кислоты уксусной, доводят объем раствора спиртом этиловым 95% до метки, перемешивают и оставляют на 30 мин (раствор Б). Оптическую плотность

раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм в кювете с толщиной 0Л9.Я Ю мм.

Срок хранения раствора А — 3 мес. Раствор 5 должен быть свежеприготовленным. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 1 мл исходного раствора, 0,2 мл кислоты уксусной и доведенный спиртом этиловым 95% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Приготовление 10% раствора тюминия хлорида в спирте этиловом 95%

18 г алюминия хлорида 6-водного (ГОСТ 3759-75, ч.д.а.) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 70 мл спирта этилового 95%, доводят объем раствора до метки тем же спиртом и перемешивают.

Разработанная методика апробирована на образцах земляники восточной (табл. 4). Как показал анализ полученных данных, содержание фла-воноидов в листьях земляники восточной колес лется от 2,11 до 4,22%, что соответствует таковому в листьях официнального вида.

Выводы

1. Изучены и подобраны оптимальные условия количественного анализа суммы флавоноидов в листьях земляники восточной.

2. На основе метода дифференциальной спек-трофотометрии разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в листьях земляники восточной. Относительная погрешность определения при Р=95% составляет 2,00%.

3. Установлено, что содержание суммы флавоноидов в исследованных образцах земляники восточной в пересчете на рутин составляет 2,11-

4,22%.

Литература

1. Ареалы лекарственных и родственных им растений СССР (Атлас) / Пол ред. В.М. Шмидта. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1983. 208 с.

2. Бубенчикова ВН., Дроздова И.Л., Гончаров Н.Ф. // Российские аптеки. 2003. №3. €.56-

со JO.

3. Булатов М.И., Калинкин И.П Практическое руководство по фотоэлектроколориметричес-ким и спектрофотометрическим методам анализа. Л.: Химия, 1976. 376 с.

4. Воротынцева Н.И. Фармакогностическое изучение растений рода Земляника. Автореф. дис... канд. фарм. наук. Курск, 2002. 23 с.

5 Петухова О.В., Иванова Г.А., Олешко Г.И. и др. // Фармация. 2003. №5. С. 19-20.

6. Петухова О. В. Фармакогностическое изучение листьев земляники лесной и садовой региона Урала. Автореф. дис... канд. фарм. наук. Пермь, 2003. 24 с.

7. Пронченко Г.Е. // Медицинская помощь. 1996. №5. С.39-41.

8. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование Семейства Hydrangeaceae - Haloragaceae. Л.: Наука, 1987. 326 с.