Исследование параметров сенсора для детекции этанола на основе метилотрофных дрожжей Pichia angusta BKM Y-2518

ИССЛЕДОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ СЕНСОРА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ЭТАНОЛА НА ОСНОВЕ МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖЕЙ Р1СН1А АШШТА ВКМ У-2518

Воронова Е.А.. Ильясов П.В., Решетилов А.Н.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Annotation

In the present work a microbial sensor based on cells of methylotrophic yeast Pichia angusta has been created and it's characteristics have been investigated. It was demonstrated that the sensor is characterized by the lower limit of ethanol detection equal to 0.012 mM in the batch mode and 0.13 mM in the flow mode. The optimal conditions for the sensor operation were found to be as follows: pH of the base solution 7.2-7.6, the salt concentration 30 mM and the temperature of the receptor storage 4 °C. Under this temperature, the loss of the activity of immobilized cells makes up not more than 5% during 7 days. The model created was tested on the alcohol beverages samples; the tests demonstrated a high correlation of the results with the actual alcohol concentration.

Перспективным подходом для детекции спиртов является развитие биосенсорной техники, позволяющей выполнять их быстрый и дешевый анализ. Преимущественно используемыми ферментами при создании биосенсоров для анализа этанола являются ЫАО+-зависимая алкогольдегидрогеназа и алкогольоксидаза (АО). Однако коммерческие препараты ферментов имеют высокую стоимость, что увеличивает цену анализа. Кроме того, отмечена относительная нестабильность работы ферментных сенсоров для определения спиртов.

Поскольку источником получения АО являются клетки метилотрофных дрожжей, логично рассматривать данные микроорганизмы в качестве потенциальных биокатализаторов.

Целью данной работы является исследование каталитических свойств биорецептора микробного сенсора на основе клеток штамма метилотрофных дрожжей Pichia angusta ВКМ Y-2518.

Нами выполнено исследование чувствительности биорецептора. Для данной модели нижний предел детекции этанола составляет 0.012 мМ при измерении в кювете открытого типа и 0.13 мМ - при измерении в проточном режиме.

Для оптимизации работы сенсора на основе дрожжевых клеток P. angusta ВКМ Y-2518 была произведена оценка зависимости сигнала сенсора от ионной силы и рН буферного раствора. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что оптимальным рН является рН 7.2-7.6, а оптимальной концентрацией солей - 30 мМ.

Исследование стабильности биорецептора на основе адсорбированных на мембране GF/A дрожжевых клеток P. angusta ВКМ Y-2518 продемонстрировало стабильность мембраны в течение 5 дней.

Была исследована стабильность клеток при хранении в буфере (суспензия) при 4 °С и в иммобилизованном виде при 20 °С, 4 °С и -10 °С. При хранении клеток в иммобилизованном виде при 20 °С на 7 сутки активность клеток падает на 50%. В то же время при хранении иммобилизованных клеток при 4 °С и при -10 °С падение активности рецептора за тот же срок составляет не более 5 %. При хранении клеток в виде суспензии при 4 °С падения активности не наблюдалось в течение 7 суток. Таким образом, хранение клеток в виде суспензии при 4 °С является оптимальным.

Выполнено тестирование сенсора на основе штамма P. angusta ВКМ Y-2518 на образцах спиртных напитков. Показана высокая степень совпадения данных с фактическим содержанием этанола (доверительная вероятность совпадения результатов, определенная по Стьюденту, составила 0.99). Созданная модель биосенсора может рассматриваться в качестве прототипа промышленно выпускаемого анализатора для оценки этанола в образцах различной природы, в том числе ферментационных средах, спиртных напитках, крови и выдыхаемом воздухе.