Клиническое значение показателей ДНК-проточной цитофлуорометрии при раке яичников

И. В. Паниченко, В. Н. Богатырев, К. И. Жорданиа,

В. В. Кузнецов, О. А. Анурова КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ДНК-ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРОМЕТРИИ ПРИ РАКЕ ЯИЧНИКОВ

НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Своеобразие клинического течения и трудности при определении прогноза у больных раком яичников заставляют вести поиск объективных биологических критериев, которые помогли бы определить индивидуальную тактику лечения. Одними из таких критериев являются параметры клеточного цикла, определяемые с помощью лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии.

Ключевые слова: рак яичников, ДНК-проточная цитофлуорометрия, прогноз.

В России в 2004 г. рак яичников (РЯ) занимал 7-е ранговое место (4,9%) в структуре заболеваемости женщин злокачественными новообразованиями. Под наблюдением находились 72 500 больных. При этом через год после постановки диагноза умерли 7400 больных (5,7% больных злокачественными новообразованиями). В структуре смертности женщин от злокачественных новообразований РЯ занимал 5-е ранговое место. Прирост заболеваемости за 5 лет составил 4% (15-е ранговое место), или 12 100 больных в год [2].

Среди традиционных клинико-морфологических факторов, определяющих прогноз и выживаемость больных, наиболее важны стадия заболевания, размер остаточной опухоли после хирургического лечения, возраст больных, морфологический вариант и степень дифференцировки опухоли [1; 3; 6]. Исследование опухолей с использованием метода лазерной ДНК-проточ-ной цитофлуорометрии позволяет определить плоид-ность новообразования, распределение клеток опухоли по фазам клеточного цикла и вычислить индекс пролиферации опухоли [1]. Имеющиеся в литературе данные о прогностическом значении количественных показателей, определяемых с помощью данного метода, при РЯ весьма противоречивы и требуют дальнейшего уточнения [4; 5].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование включены 309 больных РЯ I—IV стадий, которым проведено лечение в ГУ РОНЦ им.Н. Н. Блохина РАМН с 1993 по 2002 г. Средний возраст больных составил 53,8±0,6 года (21—77 лет). У 50 (16,2%) больных диагностирована I стадия заболевания, у 34 (11,0%) — II, у 175 (56,6%) — III, у 50 (16,2%) — IV. При послеоперационном гистологическом исследо-

© Паниченко И. В., Богатырев В. Н., Жорданиа К. И., Кузнецов В. В., Анурова О. А., 2007 УДК 618.11-006.6-076.5:616-037

вании у 214 (69,3%) выявлена серозная аденокарцинома, у 28 (9,1%) — муцинозная, у 48 (15,5%) — эндометриоид-ная и у 19 (6,1%) — светлоклеточная.

Исследования проводили на лазерном проточном цитофлуорометре «EPICS-XL» («Coulter», СШA). Полученные данные проанализированы с помощью программы «M^t^yc^», используемой для анализа плоидности и числа клеток опухоли по фазам клеточного цикла («Phoenix Flow Systems», СШA). Количество клеток в разных фазах клеточного цикла выражали в процентах. Индекс ДНК (ИДНК) диплоидных клеток на гистограммах соответствовал 1,0, ИДНК анеуплоидных клеток был больше или меньше 1,0. В качестве диплоидного стандарта использовали лимфоциты крови доноров. Определение количественных параметров клеток проводили параллельно с морфологическим (цитологическим и гистологическим) исследованием.

СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫх

Вычисление и сравнение достоверности различий средних величин, а также сравнение достоверности различий частот событий (с использованием критерия Стьюдента) выполняли с помощью пакета программ «SAS». Параметры ДНК-проточной цитофлуорометрии в большинстве наблюдений подчинялись нормальному распределению, что позволило использовать для статистического анализа параметрический критерий Стьюдента. Статистический анализ и графику выполняли с помощью стандартного пакета «Statistica» (версия 5,0, «Statsoft Inc.», США). Анализ кумулятивной выживаемости больных по методу Каплана—Мейера и сравнение достоверности различий этого показателя проводили с помощью программы «Survival», предоставленной отделом статистики Онкологического центра М. Д. Андерсона (США). Достоверными считали различия с вероятностью не менее 95% (р < 0,05). Определение коэффициентов веса и информативности изучаемых признаков производили по формуле Шеннона с помощью программы «АСТА»,

разработанной ранее в лаборатории медицинской кибернетики ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание ДНК в опухолевых клетках изучено у 309 больных РЯ, из них только у 77 (24,9%) выявлены диплоидные опухоли, а у 232 (75,1%) — анеуплоидные. Группа анеуплоидных новообразований (п = 232) была крайне неоднородна по своему составу. У 53 (22,8%) больных отмечена анеуплоидия с потерей хромосом (ИДНК < 1,0), у 146 (62,9%) — анеуплоидия в пределах митотического цикла (ИДНК = 1,1—1,9), у 8 (3,5%) — тетраплоидные опухоли (ИДНК = 2,0), у 7 (3,0%) — гиперанеуплоидные (ИДНК > 2,1) и у 18 (7,8%) — многоклоновые.

Закономерным является вопрос о том, имеется ли зависимость между стадией заболевания и плоидностью опухоли у больных РЯ. Полученные результаты позволяют сделать следующее заключение: с увеличением стадии количество диплоидных новообразований уменьшается, а анеуплоидных — увеличивается (табл. 1).

Анализ клеточного цикла и индекса пролиферации опухолей в пределах каждой клинической стадии показал, что у больных РЯ III и IV стадий среднее количество клеток в S-фазе клеточного цикла статистически достоверно больше, чем у больных РЯ I стадии (р < 0,05) (табл. 2).

При анализе плоидности опухоли с учетом ее морфологического варианта оказалось, что анеуплоидные новообразования чаще всего определялись среди светлоклеточных (94,8%) и серозных (76,6%) опухолей, в то время как диплоидные — среди муцинозных (39,3%).

На следующем этапе исследования проанализирована эффективность химиотерапии у больных РЯ в зависимости от количественных параметров клеток опухоли. В группе больных, которым на II этапе лечения проводили химиотерапию по схемам, включавшим препараты платины

Таблица 1

Распределение больных РЯ в зависимости от стадии заболевания и плоидности опухолиа

Плоидность Стадия

1

Анеуплоидные 29 (58,0) 22 (64,7) 137 (78,3)е 44 (88,0)в

Диплоидные 21 (42,0) 12 (35,3) 38 (21,7)е 6 (12,0)в

а В скобках указаны проценты.

б Различия статистически достоверны при сравнении I и III стадий (Р < 0,05).

в Различия статистически достоверны при сравнении IV с I и со II стадиями (р < 0,05).

Таблица 2

Распределение клеток опухоли по фазам клеточного цикла и стадиям заболевания,%

Стадия Фазы клеточного цикла Индекс пролиферации

в 0/1 Б 02 + М

I (п=50) 83,6+1,1 8,0+0,6 8,4+0,3 16,4+1,1

II (п=34) 83,0+1,3 8,7+0,7 8,3+0,7 17,0+1,2

III (п=175) 80,4+0,7 10,2+0,3а 9,4+0,4 19,6+2,5

IV (п=50) 80,4+1,0 10,3+0,5а 9,5+0,7 19,7+1,0а

а Различия статистически достоверны при сравнении с аналогичными показателями у больных РЯ I стадии (р < 0,05).

пациенток (р < 0,05). Прогрессирование основного заболевания отмечено только у 4 (7,3%) больных с диплоидными опухолями и у каждой четвертой пациентки с анеуплоид-ными опухолями (44 больные, 25,9%) (табл. 3).

При учете общего эффекта химиотерапии (сумма полного и частичного эффектов) в группе больных с диплоидными опухолями он наблюдался у 92,4%, что статистически достоверно выше, чем в группе больных с анеуплоидными новообразованиями (67,0%). Таким образом, общий эффект при проведении химиотерапии производными платины у больных РЯ связан с плоидностью опухолей: при диплоидных опухолях он статистически достоверно выше.

При анализе распределения клеток по фазам клеточного цикла в зависимости от эффекта лечения оказалось, что у больных с полным эффектом среднее число клеток опухоли, находящихся в фазе покоя ^0/1), статистически достоверно выше, чем в группе больных, у которых отмечено прогрессирование заболевания

Таблица 3

Эффективность химиотерапии производными платины у больных РЯ с учетом плоидности опухолейа

Плоидность Эффект

Полный Частич- ный Стаби- лизация Прогрес- сирова- ние

Анеуплоидные (п = 170) 97 (57,0)’’ 17 (10,0) 12 (7,1) 44 (25,9)*’

Диплоидные

а В скобках указаны проценты.

б Различия статистически достоверны по сравнению с аналогичными показателями в группе больных с анеуплоидными опухолями (р = 0,001).

(табл. 4). Аналогичные результаты получены и при анализе клеточного цикла у больных с диплоидными опухолями.

Таким образом, чем больше клеток опухоли находится в фазе G0/1 и чем ниже пролиферативная активность опухоли, тем выше эффективность химиотерапии комбинациями с включением производных платины. Данные результаты легко объяснимы, если вспомнить механизм действия производных платины, которые нарушают конформацию ДНК в G0/1-фазах клеточного цикла.

При сопоставлении отдаленных результатов лечения больных РЯ с количественными параметрами клеток опухоли оказалось, что 5-летняя выживаемость больных диплоидным РЯ (п = 77) составила 66,8±6,6%, а больных анеуплоидным РЯ (п = 232) — всего лишь 24,4±3,3% (р < 0,05). Мы рассмотрели полученные результаты в пределах каждой клинической стадии. Описанная выше зависимость подтвердилась и здесь: у больных диплоидными РЯ 5-летняя общая выживаемость оказалась более чем в 2 раза выше таковой у больных анеуплоидным РЯ в пределах каждой клинической стадии (табл. 5). Следует отметить, что медиана продолжительности жизни больных диплоидным РЯ I—II стадий не была достигнута (период наблюдения составил 5 лет), при III и IV стадиях она составила 53,2±2,3 и 15,4±1,6 мес соответственно. Это статистически достоверно выше по сравнению с аналогичным показателем при анеуплоидном РЯ III и IV стадии (34,5±1,6 и 20,9±1,2 мес соответственно) (р < 0,05).

Пятилетнюю общую выживаемость больных РЯ статистически достоверно снижало высокое содержание клеток в S-фазе клеточного цикла. Так, у больных анеуплоидным РЯ III стадии с содержанием клеток в S-фазе более 10% (п = 76) 5-летняя общая выживаемость составила 9,6±3,5%, в то время как аналогичный показатель в группе больных, у которых содержание клеток в S-фазе не превышало 10%, составил 21,0±6,0% (р < 0,05). Аналогичная тенденция отмечена и при диплоидном РЯ.

Таблица 4

Распределение клеток по фазам клеточного цикла у больных анеуплоидным РЯ в зависимости от эффективности лечения комбинациями на основе производных платины, %

а Различия статистически достоверны по сравнению с аналогичными показателями в группе больных с прогрессированием заболевания (р < 0,05).

Таблица 5

Пятилетняя общая выживаемость больных РЯ в зависимости от плоидности опухоли и стадии заболевания, %

Плоидность Стадия

1

Анеуплоидные (п = 232) 54,7+10,2а 33,1 +11,9а 20,5+4,1а 12,8+5,8а

Диплоидные (п = 77) 100,0 88,9+10,4 42,1+11,8 24,3+5,2

а Различия статистически достоверны по сравнению с аналогичными показателями в группе больных диплоидным РЯ (р < 0,05).

Одним из количественных параметров клеток опухоли, определяемых с помощью лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии, является индекс пролиферации, представляющий собой сумму числа клеток в S- и G2 + M-фазах клеточного цикла. Если индекс пролиферации более 16%, 5-летняя общая выживаемость больных ане-уплоидным РЯ III стадии (п = 96) составляет 16,0±3,3%, если индекс пролиферации не превышает 16% (п = 41), то 26,9±4,2% (р < 0,05).

Сходная картина получена и при анализе выживаемости больных диплоидным РЯ. При индексе пролиферации более 16% 5-летняя общая выживаемость больных диплоидным РЯ III стадии (п = 13) составляет 67,1±10,8%, при индексе пролиферации, не превышающем 16% (п = 25) — 41,8±11,2% (р < 0,05).

Таким образом, выживаемость больных РЯ зависит от плоидности опухоли, распределения клеток опухоли по фазам клеточного цикла, а также от индекса пролиферации. Неблагоприятными факторами прогноза, приводящими к статистическому достоверному снижению отдаленных результатов лечения, являлись анеуп-лоидия опухоли, содержание клеток в S-фазе клеточного цикла более 10%, а также индекс пролиферации более 16%. Перечисленные показатели отражают биологические особенности и злокачественный потенциал отдельной опухоли. Нельзя не отметить тот факт, что полный эффект химиотерапии статистически достоверно чаще наблюдается у больных диплоидным РЯ, в то время как прогрессирование заболевания на фоне проводимого лечения чаще отмечалось у пациенток с анеуплоидным РЯ.

Многофакторный анализ риска прогрессирования РЯ продемонстрировал, что наиболее значимыми факторами прогноза являются (в порядке убывания) стадия заболевания, плоидность опухоли, ИДНК, индекс пролиферации, размер остаточной опухоли после операции, содержание клеток опухоли в S-фазе клеточного цикла, содержание анеуплоидных клеток в опухоли, степень дифференцировки опухоли, содержание клеток в G0/1-фазе клеточного цикла, морфологический вариант новообразования и возраст больной (рис. 1). Точность данного

Эффект Фазы клеточного цикла Индекс пролиферации

в0/1 Б 02 + М

Полный (п = 97) 84,8+0,8 9,7+0,4 7,5+1,8 15,2+0,8а

Частичный (п = 17) 78,5+2,2 10,9+1,1 10,6 + 1,9 21,5+2,2

Стабилизация (п = 12) 80,5+2,3 9,0+1,2 10,5+1,8 19,4+2,3

Прогрессирование (п = 44) 79,8+1,2 10,6+0,6 9,6+0,9 20,2+1,0

Стадия

Плоидность

ИДНК

Индекс пролиферации Размер остаточной опухоли Содержание клеток в S-фазе Содержание анеуплоидных клеток Степень дифференцировки Морфологический тип Возраст

0,0207

0,0155

0,1512

0,1388

0,1331

0,1112 0,0970

0,0707

0,0611

0,0592

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16

Рисунок 1. Информативность признаков при прогнозе прогрессирования РЯ (n = 39).

анализа составила 86,4%, специфичность 87,0%, чувствительность 86,3%. Полученные данные позволяют с достаточной степенью вероятности выделить группу больных с высоким риском прогрессирования РЯ и индивидуально планировать лечение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение хотелось бы отметить, что с совершенствованием методов исследования, применяемых в онкологии, появляется все больше данных, свидетельствующих о чрезвычайно сложном механизме возникновения и развития злокачественных опухолей. Метод лазерной ДНК-проточной цитометрии, безусловно, не отвечает на все вопросы, но дает существенную информацию для оценки клеточного цикла опухоли при применении разных режимов химиотерапии и объективной оценки прогноза заболевания.

ЛИТЕРАТУРА

1. Винокуров В. Л. Рак яичников: закономерности метастазирова-ния и выбор адекватного лечения больных. — С.-Пб.: Фолиант, 2004. — С. 170—173.

2. Давыдов М. И., Аксель Е. М. Статистика злокачественных новообразований в России и странах СНГ в 2004 г. // Вестн. РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 2006. — Т. 17, №3 (прил. 1). — С. 47, 49, 60.

3. Kaern J., Aghmesheh M., Nesland J. M. et al. Prognostic factors in ovarian carcinoma stage III patients. Can biomarkers improve the prediction of short- and long-term surviors? // Int. J. Gynecol. Cancer. — 2005. — Vol. 15, N 6. — P. 1014—1022.

4. Kristensen G. B., Kildal W., Abeler V. M. et al. Large-scale genomic instability predicts long-term outcome for women with invasive stage I ovarian cancer // Ann. Oncol. — 2003. — Vol. 14. — Р. 1494—1500.

5. Skirnisdottir R., Karlsson M., Sorbe B. et al. Prognostic importance of DNA ploidy and p53 in early stages of epithelial ovarian carcinoma // Int. J. Oncol. — 2001. — Vol. 19. — P. 1295—1302.

6. Tingulstad S., Skjelstad F. E., Hagen B. The effect of centralization of primary surgery on survival in ovarian cancer patients // Obstet. Gynecol. — 2003. — Vol. 102. — P. 499—505.

Поступила 15.12.2006

I. V. Panichenko, V. N. Bogatyrev, K. I. Zhordania, V. V. Kuznetsov, O. A. Anurova CLINICAL SIGNIFICANCE OF DNA FLOW CYTOFLUOROMETRY

IN OVARIAN CANCER

Clinical Oncology Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow

The specific clinical course and difficulty in prognosis of ovarian cancer necessitate search for new objective biological markers to individualize treatment policy. Cell cycle parameters as determined by laser DNA flow cytofluorometry may be used as such markers.

Key words: ovarian cancer, DNA flow cytofluorometry.