Способ определения аминогликозидных антибиотиков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии
METHOD FOR DETERMINATION OF AMINOGLYCOSIDE ANTIBIOTICS BY REVERSE-PHASE HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в контрольно-аналитических, клинических лабораториях для определения концентрации аминогликозидных антибиотиков, для стандартизации и контроля качества лекарственных средств, для определения антибиотиков в образцах биологического происхождения с целью изучения фармакокинетики, лекарственного мониторинга для регулирования введения оптимальных доз антибиотиков при лечении различных инфекционных заболеваний.
Для качественного и количественного анализа антибиотиков в фармацевтических формах и биологических жидкостях наиболее перспективным является использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазном режиме. Метод отличается селективностью, точностью и воспроизводимостью, а также высоким уровнем автоматизации.
Уровень техники
Аминогликозиды это группа сильнодействующих антибиотиков широкого спектра действия, которые часто используются против аэробных грамотрицательных бактериальных инфекций. Они представляют собой большой и разнообразный класс антибиотиков, которые содержат две или более аминокислот, связанных с аминоциклитовым ядром полярности, нелетучести и отсутствия сильно поглощающего хромофора. Количественный анализ аминогликозидов требует дериватизации, хроматографического разделения, специализированных детекторов и / или использования фторированных агентов.
Известен способ, в котором сходные растворы (1 мг/мл) гентамицина, тобрамицина и амикацина готовили в деионизированной воде. Стандартные растворы (1-100 000 нг/мл) гентамицина, тобрамицина и амикацина для метода FIA-SIM готовили путем последовательного разведения с использованием деионизированной воды в качестве разбавителя. Для построения калибровочной кривой использовались стандарты гентамицина (10-10 000 нг/ мл), каждый из которых содержал 1000 нг/мл тобрамицина. Для тобрамицина (10-10 000 нг/мЛ) в качестве внутреннего стандарта использовали 1000 нг/мл гентамицина. Для каждого уровня концентрации были подготовлены и проанализированы пять повторяющихся калибровочных стандартов для разработки калибровочных кривых. Коммерческие растворы фармацевтических препаратов для инъекций (40 мг/мл гентамицина и тобрамицина) извлекали из флаконов с помощью шприца (3 мл). Растворы разбавляли до конечной концентрации приблизительно 400 нг/мл с использованием деионизированной воды в качестве разбавителя.
Для удаления органических примесей кремниевые пластины подвергали ультрафиолетовому облучению в течение 2 ч, обрабатывали концентрированной серной кислотой в течение 20 мин, промывали деионизированной водой и сушили в потоке азота. Послойное нанесение с помощью отжима наносили на пластину с помощью машины для отжима Laurel WS-650-23NNP/UD3/UD3B со скоростью вращения 3000 об/мин. Для улучшения адгезии многослойных пленок к поверхности пластины раствор BPEI (0,5 мг/мл в 0,01 М фосфатном буфере с рН 5,5) первоначально осаждали в течение 15 мин с использованием 40-секундного цикла осаждения. На слой BPEI наносили раствор дубильной кислоты (0,5 мг/мл в 0,01 М фосфатном буфере с рН 7,5), а затем раствор гентамицина (0,1 мг/мл в 0,01 М фосфатном буфере с рН 7,5). После каждого этапа осаждения субстраты тщательно промывали фосфатным буфером с рН 7,5 (0,01 М) и высушивали. Скорость и вращение на стадии промывки были идентичны тем, которые использовались для нанесения пленки.
Для количественной оценки количества гентамицина, выделяемого из послойных пленок, была сгенерирована калибровочная кривая для четырех калибровочных стандартов (5, 10, 20, 30 мкг/мл растворов гентамицина, каждый из которых содержит 50 мкг/ мл тобрамицина) с использованием тобрамицина в качестве внутреннего стандарта. Для количественных расчетов использовалась интегрированная площадь масс-спектральных пиков m/z 322 и 324, которые характерны для гентамицина и тобрамицина (внутренний стандарт) соответственно. Кремниевые пластины, покрытые 300 послойными пленками таниновой кислоты/гентамицина, подвергали в течение 48 ч воздействию 0,01 М фосфатных буферных растворов со значениями рН от 7,5 до 5,5, и аликвоты буфера подвергали анализу. Калибровочные стандарты и растворы, содержащие гентамицин (с добавлением 50 мкг/мл тобрамицина), вводили непосредственно в изократический поток растворителя ацетонитрил-вода-муравьиная кислота (10:90:0,01, v/v/v) со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-спектры получали непрерывным образом. Для каждого образца /стандарта использовали средний масс-спектр, полученный в результате 120 сканирований, и области профилей масс-спектральных пиков для m/z 322 и 324 были объединены с использованием программного обеспечения Analyst 1.4.2.
Линейные динамические диапазоны были определены как от 10 до 1000, от 25 до 2500 и от 10 до 1000 нг/мл для гентамицина, тобрамицина и амикацина соответственно. (Rapid determination of aminoglycosides in pharmaceutical preparations by electrospray ionization mass spectrometry / Freneil B. Jariwala, John A. Hibbs, Iryna Zhuk, Svetlana A. Sukhishvili & Athula B. Attygalle // Journal of Analytical Science and Technology volume 11, 2 (2020)).
Недостатками данного способа являются невысокая специфичность, также могут возникать помехи из-за ионов изобарической матрицы.
Известен способ для количественного анализа образцов носителей гентамицина высокоэффективным жидкостным хроматографическим УФ-методом. Образцы калибровочной кривой готовили в физиологическом солевом растворе, который применяли в качестве среды для растворения лекарств. Калибровочная кривая находится в диапазоне 1-100 мкг / мл. Подвижная фаза состояла из метанол-водно-ацетатного буфера (0,02 М раствора ацетата аммония, доведенного куб. см аммиака до рН = 9), обратной фазы, Zorbax Rx-C-18 2. Использовалась колонка 1 × 150 мм, 5 мкм. Исследованы линейность, специфичность, точность и точность внутри- и межсуточной точности, надежность, пределы обнаружения и количественное определение. (Determination of Gentamicin Released from Orthopedic Carrier System by a Novel HPLC Method / M. Laki, Krisztina Ludányi, Semmelweis University, M. Hajdú, I. Klebovich, I. Antal, Akos Zahar, HELIOS Kliniken, M. Szendrői // March 2011 Journal of Chromatographic Science 49(3) DOI:10.1093/chrsci/49.3.177).
Недостатком способа являются низкие показатели по воспроизводимости, разделению и надежности.
Известен способ для оценки сисомицина в фармацевтической композиции гентамицина с ультрафиолетовым детектированием хроматографическим методом. Гентамицин имеет слабый УФ-хромофор, который невозможно обнаружить с помощью УФ-детектора. Следовательно, для обнаружения этих веществ был применен метод дериватизации. Хроматографическое разделение осуществлялось с помощью колонки Hypersil Gold (150 x 4,6 мм) и размера частиц 5 мкм в качестве стационарной фазы путем изократического элюирования метанолом: вода: ледниковая уксусная кислота: сульфонат гексана натрия в соотношении 70:25:5:3% v/v/v/w в качестве подвижной фазы. Сисомицин был обнаружен при 330 нм в течение 25 мин со скоростью потока 0,5 мл/мин. Параллельные результаты получены в разработанном аналитическом методе, основанном на измерении суммарной погрешности.
(Implementation of Total Error Perception in the Analytical Method Validation for Quantification of Related Substance in Pharmaceutical Formulation / Islam Sofiqul*, Murugan V, Prema Kumari KB // Journal of Young Pharmacists, Vol 13, Issue 2, 2021 118-123).
К недостаткам данного способа можно отнести низкие показатели специфичности и чувствительности.
Известен способ определения гентамицина и тобрамицина методом ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометром. Сепарация проводилась при 50°C на реверсивно-фазной колонне Lichrospher C860 RP, 250 мм × 4 мм. Выбранный расход составил 0,5 мл/мин. Ионизацию проводили в положительном режиме мониторинга выбранных ионов (SIM); значения ионов m/z составляли 468,20 для гентамицина и 478,30 для тобрамицина. Капиллярное напряжение составляло 4000 В, а напряжение фрагментатора - 140 В. Температура составляла 350°C, а сухой газ (12 л/мин) и газ небулайзера (60 фунтов на кв. дюйм). В качестве подвижной фазы использовался линейный градиент PFPA (20 мМ в сверхчистой воде) и метанола. Для хроматографической количественной оценки гентамицина все образцы, полученные в результате экстракции или клеточных исследований, обрабатывали одинаково (разбавляли одинаковым объемом раствора с пропорцией PFPA:метанол 1:1) и либо 1, либо 25 мкл вводили в колонку ВЭЖХ, поддерживая постоянное количество введенного тобрамицина. Проводили дериватизацию и флуориметрический анализ. Стандартные концентрации гентамицина получали путем серийных разведений в борной кислоте 0,4 М, рН 9,7 и добавляли к 96-луночной микропластине. Образцы также разбавляли, когда это было необходимо, борной кислотой. Затем к стандартным растворам добавляли флуориметрический пробирный раствор [0,04%о-фталальдегида, 0,1% (v/v) диэтилового эфира, 0,2% (v/v) β-меркаптоэтанола в борной кислоте]. Флуоресценцию немедленно измеряли в флуориметре Tecan GENios (возбуждение 340 нм, излучение 450 нм), а концентрации образцов рассчитывали с помощью стандартной кривой. (Determination of gentamicin in different matrices by a new sensitive high-performance liquid chromatography-mass spectrometric method / Concepción Lecároz, Miguel A. Campanero, Carlos Gamazo, María J. Blanco-Prieto // Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Volume 58, Issue 3, September 2006, Pages 557-563, https://doi.org/10.1093/jac/dkl258)
Основными недостатками этого способа являются трудоемкая пробоподготовка, низкая специфичность.
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ определения цефотаксима методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, в котором изократический режим элюирования с использованием хроматографической колонки, заполненной сорбентом с размером частиц 5 мкм, в качестве подвижной фазы используют смесь раствора ацетата аммония с ацетонитрилом, хроматографическое разделение производится на колонке размером 250×3 мм, заполненной сорбентом С18, с использованием в качестве подвижной фазы смеси 0,02 М раствора ацетата аммония рН=4,7 с ацетонитрилом в соотношении 90:10 с применением ультрафиолетового детектора при длине волны 252 нм и объеме вводимой пробы 10 мкл.
Недостатками метода являются небольшая чувствительность и ограниченность способа только одним представителем группы антибактериальных веществ.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является разработка способа определения аминогликозидных антибиотиков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющего расширение функциональных возможностей за счет расширения спектра исследуемых объектов - аминогликозидных антибиотиков, например, гентамицина в лекарственных формах и биологических жидкостях.
Технический результат достигается с помощью способа определения аминогликозидных антибиотиков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, в котором изократический режим элюирования с использованием хроматографической колонки, с применением ультрафиолетового детектора и объеме вводимой пробы 10 мкл, при этом заранее проводят дериватизацию гентамицина, к 100 мкл образца добавляют 25 мкл раствора карбоната натрия (5% в воде) и 25 мкл раствора фенилизотиоцианата (5% в ацетонитриле), смесь интенсивно перемешивают на вортексе в течение 30 секунд и нагревают в течение 15 минут при 50°С в твердотельном термостате, затем реакционную смесь разбавляют 850 мкл смеси ацетонитрил/20 мМ ацетат натрия, рН 4,70 в соотношении 20:80, длина волны ультрафиолетового детектора 250 нм.
Сущность способа определения аминогликозидных антибиотиков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, включающий изократический режим элюирования с использованием хроматографической колонки, с применением ультрафиолетового детектора и объеме вводимой пробы 10 мкл, при этом заранее проводят дериватизацию гентамицина, к 100 мкл образца добавляют 25 мкл раствора карбоната натрия (5% в воде) и 25 мкл раствора фенилизотиоцианата (5% в ацетонитриле), смесь интенсивно перемешивают на вортексе в течение 30 секунд и нагревают в течение 15 минут при 50°С в твердотельном термостате, затем реакционную смесь разбавляют 850 мкл смеси ацетонитрил/20 мМ ацетат натрия, рН 4,70 в соотношении 20:80, длина волны ультрафиолетового детектора 250 нм.
Краткое описание чертежей и их материалов
На фиг. 1, способ определения аминогликозидных антибиотиков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, калибровочная кривая гентамицина.
На фиг. 2, способ определения аминогликозидных антибиотиков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, концентрация гентамицина в биологических жидкостях организма при внутримышечном введении.
Осуществление изобретения
Примеры конкретного выполнения способа определения аминогликозидных антибиотиков методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Пример 1.
200 мкл плазмы крови смешивается с 800 мкл смеси 0,02 М раствора ацетата аммония (рН=4,70) с ацетонитрилом в соотношении 90:10, фильтруется через 0,2 мкм фильтр и анализируется на приборе «Ultimate 3000» Dionex с ультрафиолетовым детектором при длине волны 252 нм, хроматографической колонкой размером 250×3 мм, заполненной сорбентом С18с размером частиц 5 мкм. Режим элюирования изократический, с использованием в качестве подвижной фазы смеси 0,02 М раствора ацетата аммония (рН=4,70) с ацетонитрилом в соотношении 90:10, температура термостата колонки 25°С, объем вводимой пробы 10 мкл. Проводится не менее пяти измерений для каждого раствора.
Недостатком примера является низкая детекция гентамицина, связанная с низким поглощением УФ-излучения гентамицином.
Пример 2.
Выполняется аналогично примеру №1, но заранее проводят дериватизацию гентамицина, к 100 мкл образца добавляют 25 мкл раствора карбоната натрия (5% в воде) и 25 мкл раствора фенилизотиоцианата (5% в ацетонитриле), смесь интенсивно перемешивают на вортексе в течение 30 секунд и нагревают в течение 15 минут при 50°С в твердотельном термостате, затем реакционную смесь разбавляют 850 мкл смеси ацетонитрил/20 мМ ацетат натрия, рН 4,70 в соотношении 20:80, анализируется с ультрафиолетовым детектором при длине волны 250 нм. Проводится не менее пяти измерений для каждого раствора. Предел обнаружения составляет 0,04 мкг/мл, время удерживания 9,42±0,12 мин.
Концентрацию гентамицина определяли в плазме крови при внутримышечном введении (табл.1) с использованием калибровочной кривой зависимости площади пика аналита от концентрации (фиг. 1).
Таким образом, оптимальным является пример 3.
Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:
- высокая чувствительность, специфичность метода и способность различать примеси, которые потенциально могут оказывать как антибиотическое действие, так и непреднамеренные побочные эффекты;
- расширение функциональных возможностей способа за счет расширения спектра исследуемых объектов.