Способ прогнозирования степени риска отрицательных результатов экстракорпорального оплодотворения
METHOD FOR PREDICTING THE DEGREE OF RISK OF NEGATIVE RESULTS OF IN VITRO FERTILIZATION

Предполагаемое изобретение относится к медицине, а именно к акушерству и гинекологии, инфекционным болезням, и касается способа лабораторной диагностики прогноза эффективности экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) при напряженности иммунитета к токсоплазмозу, и может быть использовано в качестве выбора тактики ведения пациенток, планирующих процедуру ЭКО с целью снижения количества попыток ЭКО. Токсоплазмоз - это убиквитарная инфекция, вызываемая зоонозным паразитом Toxoplasma gondii, который, в зависимости от географического положения, может заразить от 10% до 90% людей (Borges Μ и соавт., 2019). Большое количество исследований было сосредоточено на понимании иммунного ответа на токсоплазмоз при планировании беременности методом ЭКО (Авдеева М.Г. и соавт., 2017; Кончакова Α.Α., Авдеева М.Г., 2014). Инфицированность токсоплазмозом может быть связана с более низкой частотой преждевременных родов у пациенток, перенесших ЭКО/ИКСИ, поэтому необходимость скрининга IgG в процедуре ЭКО может быть полезна для выработки стратегии и индивидуального подхода к этим пациенткам (Yifeng Liu, и соавт., 2020). Ежегодно увеличивается число беременностей и родов, наступивших после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Вероятность наступления беременности после одной попытки ЭКО, по данным разных исследований, составляет 25-40%. По данным всемирного отчета, только 73% беременностей после применения вспомогательных репродуктивных технологий заканчивается рождением живых детей, доля преждевременных родов составляет 33%, частота спонтанных абортов в сроки беременности до 20 недель 21% (Исмайлова М.К. и соавт., 2013). Большое количество исследований было сосредоточено на понимании иммунного ответа на токсоплазмоз при планировании беременности методом ЭКО. (Авдеева М.Г. и соавт., 2017; Кончакова А.А., Авдеева М.Г., 2014). Недостаточно изучено влияние токсоплазменной инфекции на результаты ЭКО. В большинстве имеющихся работ не всегда учитываются клиническая форма заболевания, вид микроорганизма и иммунный ответ макроорганизма. На сегодняшний день, очевидно, что в исходе беременности важную роль играют иммунологические взаимоотношения между материнским организмом и плодом, однако причины замирания беременности и последствия перенесенного токсоплазмоза до настоящего времени остаются спорными (Кончакова А.А., Авдеева М.Г., 2014; Кончакова А.А. и соавт., 2016).
Тем не менее, отсутствуют надежные прогностические лабораторные тесты по исходам ЭКО у женщин, страдающих хроническим приобретенным токсоплазмозом.
Аналог: исходы экстракорпорального оплодотворения, как мультифакторная проблема клинической репродуктологии. (Журнал. Медицинский совет, №9, 2015; Е.Б. Рудакова, Л.Ю. Замаховская, Т.В. Стрижова, О.Б. Трубникова, Л.В. Татаринова).
Авторы предлагают исследовать пациенток, планирующих процедуру ЭКО по клиническим и эмбриологическим критериям. Выявлено, что исход индуцированной беременности ассоциирован с такими факторами, как возраст пациентки, индекс массы тела, наличие синдрома поликистозных яичников, гиперандрогенизм, врожденная тромбофилия, патология эндометрия, выкидыши в анамнезе, количество эмбрионов высшего качества в овариальной когорте.
2
2
2
Достоверным фактором риска прерывания беременности в I триместре после ЭКО явился превышающий норму индекс массы тела (выше 25 кг/м). Средний индекс массы тела у пациенток с благополучным исходом беременности составил 24,21±0,56 кг/м, а у пациенток с замершей беременностью - 28,73±0,91 кг/м. Вероятность вынашивания беременности снижают и врожденные тромбофилии. Частота встречаемости мутаций гемостаза у пациенток с ранними потерями беременности оказалась выше в сравнении с группами пациенток с нормально развивающейся беременностью. Наиболее часто у обследованных пациенток выявлялись: мутации гена MTHFR С677Т (в 71% случаев) и тромбогенный полиморфизм PAI-1 (в 64% случаев), также имели место в анамнезе мутации Лейдена, MTR, фибриногена. Так же потери беременности в I триместре достоверно чаще сочетались с патологией эндометрия и выкидышами в анамнезе. Эндокринологическими факторами замирания беременности выступили синдром поликистозных яичников и гиперандрогения, в том числе скорректированная медикаментозно до начала программы ЭКО. Инфекционный фактор (пролеченные в анамнезе инфекции, передаваемые половым путем) не явился доказуемым в этом исследовании. При изучении факторов, влияющих на исход программ ВРТ, помимо тех, которые исследованы и являются также факторами риска потери естественной беременности, была выявлена интересная закономерность, характерная только для программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), а именно достоверная зависимость исхода программ ЭКО от количества эмбрионов высшего качества на овариальную когорту. Для этого сравнили несколько эмбриологических параметров: количество полученных ооцитов, количество перенесенных эмбрионов и количество эмбрионов высшего качества на овариальную когорту. Подробному анализу подвергнуты данные только тех программ ЭКО, в которых на третий день развития формировался хотя бы один 6-8-клеточный эмбрион высшего качества, и в таком случае вполне обоснованным было ожидание наступления беременности. Установлен факт: в группе пациенток с развивающиеся беременностью количество эмбрионов высшего качества составило 2,8±1,2, а в группе пациенток с замершей беременностью - 4,9±2,5 на овариальную когорту, что количественно почти в два раза выше.
2
Недостатки: данный способ основан на проведении исследования у женщин, у которых индекс массы тела превышает норму (выше 25 кг/м), что не позволяет прогнозировать риск невынашивания беременности у женщин, у которых индекс массы тела не превышает допустимых значений. Этот способ неспецифичен для пациенток, имеющих в анамнезе антитела к токсоплазмозу, а касается преимущественно хронической соматической патологии, в связи с этим риск осложнений у матери и ребенка в случае имеющейся токсоплазменной инфекции не определяется. Кроме того, способ выявления эмбрионов высшего качества в овариальной когорте, а так же врожденные тромбофилии и генетические изменения базируется на оценке состояния большого количества показателей, что делает его трудоемким и дорогостоящим. Инфекционный фактор (а именно пролеченные в анамнезе инфекции, только передаваемые половым путем) не явился доказуемым в этом исследовании.
Ближайший аналог: способ прогнозирования риска прерывания беременности в раннем сроке после экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов у пациенток с бесплодием трубно-перитонеального генеза, патент 2015 года №2567731 С1.
Изобретение относится к области медицина, а именно акушерство и гинекология, репродуктология. Используется в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и переноса эмбрионов (ПЭ), а так же служит прогноза риск прерывания беременности после ЭКО в первом триместре.
Сущность метода заключается в определении в сперме мужа содержания ПАМГ-2 (плацентарный альфа-2 микроглобулин), и при его уровне менее или равном 8 мкг/мл прогнозируют неблагоприятный исход беременности в 95% случаев.
Способ осуществляют следующим образом: исследование ПАМГ-2 происходит методом двойной иммунодиффузии в агаре со стандартной тест-системой против ПАМГ-2. Антисыворотку против ПАМГ-2 получают путем иммунизации кроликов фракцией ретроплацентарной крови. Способ полуколичественный.
Недостатки: предложенные в данном способе метод определения в сперме мужа содержания ПАМГ-2, можно считать недостатком метода, так как идет исключение из обследования женщин, страдающих токсоплазмозом. Предложенный способ позволяет прогнозировать невынашивание при физиологическом течении беременности, вне связи с течением хронической паразитарной инфекцией, которой является токсоплазмоз, и его использование при наличии токсоплазмоза у женщин с прогностической целью становится невозможным. В то время, как токсоплазмоз имеет доказанные особенности в отношении неблагополучного течения и исхода родов, данный способ не позволяет оценить особенности влияния токсоплазмоза на беременность. Способ неспецифичен для токсоплазмоза.
Задачи:
1. прогноз рождения здоровых детей у женщин, инфицированных токсоплазмозом, планирующих ЭКО;
2. выявление степени риска развития неудачных попыток ЭКО;
3. снижение стрессов у женщин после неудачных попыток ЭКО;
4. сокращение неоправданных попыток ЭКО;
5. учет степени риска с целью предварительной подготовки женщины к ЭКО.
Технический результат: предлагаемый способ позволяет прогнозировать рождение здоровых детей у женщин, планирующих процедуру ЭКО, выявить снижение степени риска развития неудачных попыток ЭКО, снижение стрессов после неудачных попыток ЭКО, обоснованное сокращение количества попыток ЭКО, на основе вычисления по формуле коэффициента степени риска отрицательных результатов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у женщин, планирующих беременность методом ЭКО, инфицированных токсоплазмозом.
TOXO
Сущностью изобретения является определение титра антител IgG к токсоплазменному антигену в сыворотке крови и количества предшествующихпопыток с последующим прогнозированием по формуле коэффициента степени риска (КСР) отрицательных результатов ЭКО: КСР=IgG × (КПНП+1),
где:
КПНП - количество предшествующих неудачных попыток ЭКО;
TOXO
IgG - уровень титров иммуноглобулина G к токсоплазменному антигену в сыворотке крови, ед.изм. - ед/мл;
1 - величина, позволяющая определить достоверность результата, так как при умножении на ноль получается ноль.
При КСР равной 7-507, считают риск отрицательных результатов ЭКО низкий, при КСР равной 508-1647 - средний, а при КСР более 1648 - высокую степень риска отрицательных результатов ЭКО:
Способ апробирован в течение 1 года у пациенток, находившихся на обследовании в условиях клиники. При этом исследование проведено у 79 женщин, планирующих процедуру ЭКО.
Низкая степень риска отрицательных результатов ЭКО
Средняя степень риска отрицательных результатов ЭКО
Высокая степень риска отрицательных результатов ЭКО
Примечание: в графе вероятность невынашивания и отрицательных результатов ЭКО «+» отмечены положительные результаты ЭКО и вынашивание беременности, «-» - отрицательные результаты ЭКО и вынашивание беременности. Способ осуществляют следующим образом:
TOXO
Количественное определение антител к токсоплазмозу (IgG) проводят в сыворотке венозной крови или в образцах плазмы крови, полученной с использованием в качестве антикоагулянта цитрата натрия, гепарина, ЭДТА женщины, взятой в период планирования беременности методом ЭКО, путем пункции локтевой вены сухой острой короткой иглой с широким просветом (без шприца). Для получения сыворотки кровь оставляют при комнатной температуре на 15 минут, затем тонкой стеклянной палочкой отделяют сгусток от стенок пробирки и центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин. Сразу после центрифугирования отделяют сыворотку от сгустка. Образцы сыворотки (плазмы) крови хранят при температуре (2-8)°С не более 5 суток или при температуре минус 18°С и ниже, если требуется более длительное хранение. После размораживания образцы следует тщательно перемешать. Образцы сыворотки или плазмы крови, содержащие взвешанные частицы, очищают центрифугированием. Анализ проводят иммуноферментным методом с помощью наборов «Вектор-Бест» (г. Новосибирск). Метод определения антител класса IgG к токсоплазмозу основан на двухстадийном «непрямом» варианте твердофазного иммуноферментного анализа. На первой стадии анализа содержащиеся в исследуемых образцах специфические антитела (в том числе IgG) связываются с иммобилизированными на поверхности лунок планшета антигеном Toxoplasma gondii. На второй стадии конъюгат моноклональных антител к IgG человека с пероксидазой хрена взаимодействует с комплексами «антиген-IgG». При инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках, содержащих образовавшиеся комплексы «aнтиген-IgG-конъюгат». Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации IgG к Toxoplasma gondii в анализируемом образце. После остановки реакции добавлением стоп-реагента результаты анализа регистрируют измерением оптической плотности в лунках планшета.
Учет реакции и построение калибровочных графиков проводят в спектрофотометре вертикального сканирования FC (Китай), с помощью програмного обеспечения ADAP Software.
Примеры:
TOXO
1. Пациентка Г., 42 года, находилась на обследовании перед планированием беременности методом ЭКО и сопутствующим диагнозом Хронический приобретенный токсоплазмоз, латентное течение. Диагноз подтвержден методом иммуноферментного анализа (ИФА). В анамнезе 3 неудачные попытки ЭКО. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: антитела к токсоплазмозу IgG уровень которых составил 1,7 ед/мл. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитанный по формуле: КСР=IgG*(КПНП+1), КСР=1,7*(3+1), КСР составил: 7. Согласно уровню КСР, пациентка отнесена к низкой степени риска неудачных попыток ЭКО. Токсоплазмоз не оказывает негативного влияния на процесс оплодотворения и течения беременности. Исход настоящего 4-го ЭКО - наступление беременности, срочные роды (Кесарево сечение) на 37 неделе беременности.
TOXO
2. Пациентка П., 37 лет, находилась на обследовании перед планированием беременности методом ЭКО и сопутствующим диагнозом Хронический приобретенный токсоплазмоз, латентное течение. Диагноз подтвержден методом иммуноферментного анализа (ИФА). В анамнезе 1 неудачная попытка ЭКО. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: антитела к токсоплазмозу IgG, уровень которых составил 253,5 ед/мл. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитанный по формуле: КСР=IgG*(КПНП+1), КСР=253,5*(1+1), КСР составил: 507. Согласно уровню КСР, пациентка отнесена к низкой степени риска неудачных попыток ЭКО. Токсоплазмоз не оказывает негативного влияния на процесс оплодотворения и течения беременности. Исход настоящего 2-го ЭКО - наступление беременности, срочные роды (Кесарево сечение) на 39 неделе беременности.
TOXO
3. Пациентка Я., 34 года, находилась на обследовании перед планированием беременности методом ЭКО и сопутствующим диагнозом Хронический приобретенный токсоплазмоз, латентное течение. Диагноз подтвержден методом иммуноферментного анализа (ИФА). В анамнезе 1 неудачная попытка ЭКО. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: антитела к токсоплазмозу IgG, уровень которых составил 101,5 ед/мл. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитанный по формуле: КСР=IgG*(КПНП+1), КСР=101,5*(4+1), КСР составил: 508. Согласно уровню КСР, пациентка отнесена к средней степени риска неудачных попыток ЭКО. Токсоплазмоз не оказывает негативного влияния на процесс оплодотворения и течения беременности. Исход настоящего 5-го ЭКО - наступление беременности, срочные роды (Кесарево сечение) на 39 неделе беременности.
4. Пациентка О., 32 года, находилась на обследовании перед планированием беременности методом ЭКО и сопутствующим диагнозом Хронический приобретенный токсоплазмоз, латентное течение. Диагноз подтвержден методом иммуноферментного анализа (ИФА). В анамнезе 3 неудачных попыток ЭКО. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: антитела к токсоплазмозу IgG, уровень которых составил 411,8 ед/мл.
TOXO
Коэффициент степени риска (КСР) рассчитанный по формуле: КСР=IgG*(КПНП+1), КСР=411,8*(3+1), КСР составил: 1647. Согласно уровню КСР, пациентка отнесена к средней степени риска неудачных попыток ЭКО. Токсоплазмоз не оказывает негативного влияния на процесс оплодотворения и течения беременности. Исход настоящего 4-го ЭКО - наступление беременности, срочные роды (Кесарево сечение) на 36 неделе беременности. Однако беременность завершилась риском невынашивания.
TOXO
5. Пациентка В., 34 года, находилась на обследовании перед планированием беременности методом ЭКО и сопутствующим диагнозом Хронический приобретенный токсоплазмоз, латентное течение. Диагноз подтвержден методом иммуноферментного анализа (ИФА). В анамнезе 4 неудачных попыток ЭКО. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: антитела к токсоплазмозу IgG, уровень которых составил 329,6 ед/мл. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитанный по формуле: КСР=IgG*(КПНП+1), КСР=329,6*(4+1), КСР составил: 1648. Согласно уровню КСР, пациентка отнесена к высокой степени риска неудачных попыток ЭКО. Токсоплазмоз не оказывает негативного влияния на процесс оплодотворения и течения беременности. Исход настоящего 5-го ЭКО - беременность не наступила.
TOXO
6. Пациентка М., 32 лет, находилась на обследовании перед планированием беременности методом ЭКО и сопутствующим диагнозом Хронический приобретенный токсоплазмоз, латентное течение. Диагноз подтвержден методом иммуноферментного анализа (ИФА). В анамнезе 4 неудачных попыток ЭКО. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: антитела к токсоплазмозу IgG, уровень которых составил 330 ед/мл. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитанный по формуле: КСР=IgG*(КПНП+1), КСР=330*(4+1), КСР составил: 1650. Согласно уровню КСР, пациентка отнесена к высокой степени риска неудачных попыток ЭКО. Токсоплазмоз не оказывает негативного влияния на процесс оплодотворения. Исход настоящего 5-го ЭКО - наступление беременности, замирание плода на 8 неделях.