СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РЕЦИДИВОВ БАКТЕРИАЛЬНОГО ВАГИНОЗА
METHOD FOR PREDICTION OF BACTERIAL VAGINOSIS RECURRENCES

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, медицинской микробиологии, акушерству и гинекологии, и может быть использовано для прогнозирования рецидивов бактериального вагиноза (БВ). предназначено для врачей акушеров-гинекологов амбулаторного звена, занимающихся проблемами вагинальных инфекций, и для врачей клинической лабораторной диагностики и микробиологов, осуществляющих диагностику БВ.
БВ - это распространенное заболевание влагалища женщин репродуктивного возраста, которое может протекать как с развитием характерной симптоматики, так и бессимптомно. Примерно у 50% женщин может появиться неприятный запах из влагалища, выделения, зуд, а также повышение рН влагалища. БВ ассоциируют с целым рядом неблагоприятных исходов, связанных как с беременностью, так и с фертильностью [Leitich Н, Kiss Н., 2007; Mania-Pramanik J, Kerkar SC, Salvi VS, 2009]. БВ также может увеличить риск заражения многими возбудителями инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), такими как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), Neisseria gonorrheae (NG), Chlamydia trachomatis (CT), Trichomonas vaginalis (TV), вирус простого герпеса-2 (HSV-2) [Shipitsyna E, Khusnutdinova T et al., 2020]. В литературе также описывается связь между БВ и вирусом папилломы человека (HPV) [Schwebke JR, Desmond R., 2007].
В большинстве случаев заболевание поддается лечению с использованием доступных препаратов, включая пероральный и интравагинальный метронидазол и/или клиндамицин, а также тинидазол, однако эти методы оказываются неэффективными в долгосрочной перспективе. Частота возникновения рецидивов после эпизодов БВ может достигать 80% через три месяца после эффективного лечения [Oduyebo ОО, Anorlu RI, Ogunsola FT., 2009]. До 50% женщин с БВ испытывают рецидив в течение 1 года после начала лечения от первичного эпизода [Sobel JD, Schmitt С et al., 1993; Bradshaw CS, Morton AN et al., 2006]. В ряде случаев причинами рецидива может быть нарушение режима терапии и прекращение приема препаратов пациентками, резистентность основных микроорганизмов-возбудителей БВ к метронидазолу или клиндамицину, а также развитие антибиотикоустойчивости БВ-ассоциированных микроорганизмов.
Кроме того, рецидив заболевания может развиться из-за образования биопленки, которая защищает бактерии, вызывающие БВ, от антимикробной терапии [Castro J, Alves Р et al., 2015; Swidsinski A, Loening-Baucke V et al., 2015].
БВ - это полимикробное заболевание, однако основным возбудителем БВ является Gardnerella vaginalis [Alves Р, Castro J et al., 2014]. Этот микроорганизм характеризуется исключительным фенотипическим и генотипическим разнообразием. На основании изучения биохимических свойств различают от 8 до 17 метаболических биотипов G. vaginalis [Piot Р et al., 1984; Benito R, Vazquez JA et. al., 1986].
Генотипическое разнообразие G. vaginalis было продемонстрировано с использованием молекулярных методов, таких как рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК. Используя этот метод, были идентифицированы три различных генотипа G. vaginalis, два из которых продуцировали сиалидазу. Хотя связь с продуцированием сиалидазы была показана для определенных генотипов ARDRA G. vaginalis, четкой связи между БВ и любым из генотипов ARDRA выявлено не было. В другом исследовании были описаны различные генетические варианты G. vaginalis, основанные на сравнительном геномном анализе, и сообщалось о существенных различиях в метаболическом и вирулентном потенциале между генотипами микроорганизма, но ассоциации с БВ установлено не было [Santiago GL, Deschaght Р et al., 2011; Paramel JT, Schellenberg JJ, Hill JE., 2012; Ahmed A, Earl J et al., 2012].
Описаны две формы существования гарднерелл - «рассеянная (dispersed))) форма G. vaginalis, рассредоточенная среди другой микрофлоры и «сцепленная (cohesive))) форма G. vaginalis, адгезированная на клетках эпителия и образующая «ключевые)) клетки. Дисперсная форма была обнаружена у 10-18% случайно отобранных женщин, 3-4% мужчин и 10% детей и не имела связи с сексуальными контактами. Сцепленная форма присутствовала у всех пациентов с подтвержденным БВ и их сексуальных партнеров, но не была выявлена ни у одного из здоровых людей или детей [Swidsinski A, Doerffel Y et al., 2010].
В более поздних исследованиях было подтверждено генетическое разнообразие гарднерелл, и с 2019 г. предложена принципиально новая таксономическая классификация, устанавливающая, что Род Gardnerella включает как минимум 13 отдельных видов. В дополнении к виду G.vaginalis были описаны три новых вида: G. piotii, G. swidsinskii и G. leopoldii, на основе сравнения полногеномных последовательностей, биохимических свойств и матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF). Остальные 9 геномных видов не были названы и описаны, предположительно из-за отсутствия достаточного количества изолятов, чтобы иметь веские основания для их обозначения [Vaneechoutte М, Guschin A et al., 2019].
Несмотря на получение новых знаний о генотипах и видах гарднерелл, до сих пор обсуждаются проблемы частого рецидивирования бактериального вагиноза, особенностях его диагностики и терапии [Faught ВМ, Reyes S., 2019]. Ключевую роль в развитии рецидивирующих форм БВ отводят образованию бактериальных пленок, которые чаще всего формируют корпоративные формы гарднерелл.
Технический результат изобретения заключается в разработке способа прогнозирования рецидивов бактериального вагиноза, основанного на интегральной оценке количественных данных определенных генотипов G. vaginalis, высокая степень точности прогноза.
Указанный технический результат достигается в способе прогнозирования рецидивов бактериального вагиноза, в котором исследуют вагинальный биотоп методом ГТЦР в реальном времени с помощью набора реагентов ДНК-сорб-АМ, определяют концентрации ДНК Gardnerella vaginalis генотипов 1,2,4, рассчитывают вероятность развития БВ по следующим формулам:
Z - вероятность развития рецидивов БВ;
Y - вероятность, что рецидивы БВ не разовьются;
1
X - десятичный логарифм концентрации ДНК Gardnerella vaginalis-генотип 1,
2
Х - десятичный логарифм концентрации ДНК Gardnerella vaginalis-генотип 2,
3
Х - десятичный логарифм концентрации ДНК Gardnerella vaginalis-генотип 4,
4
Х - десятичный логарифм суммы концентрации ДНК всех выявленных генотипов Gardnerella vaginalis,
при Z > Y прогнозируют развитие рецидивов бактериального вагиноза с вероятностью 84%. при Z < Y с вероятностью 95% рецидивирующий БВ не разовьется.
Способ основан на результатах обследования 299 женщин репродуктивного возраста (от 18 до 54 лет), обратившихся в лечебные учреждения гинекологического профиля Санкт-Петербурга с жалобами на выделения из половых путей. Было сформировано две группы пациенток: I - женщины, у которых в вагинальном биотопе может быть обнаружена дисперсная форма G. vaginalis, и II - женщины с рецидивирующим БВ, у которых во влагалище наиболее часто выявляется сцепленная форма G. vaginalis. Клиническим материалом для исследования служило отделяемое влагалища, которое получали с помощью дакроновых тампонов. ДНК Gardnerella vaginalis из образцов клинического материала для исследования методом ПЦР в реальном времени выделяли с помощью набора реагентов ДНК-сорб-АМ (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва) в соответствии с инструкцией производителя.
3
5
7
9
Обнаружение ДНК четырех генотипов (1,2,3 и 4) G. vaginalis было выполнено с использованием мультиплексного ПЦР-анализа в реальном времени с ранее описанными праймерами и зондами [Balashov SV, Mordechai Е, Adelson ME, Gygax SE., 2014]. Для количественного определения амплифицированных ПЦР-фрагментов были сконструированы стандартные количественные образцы путем клонирования фрагментов ПЦР-генов-мишеней pGEM-T Vector Systems (Promega, Madison, USA). Концентрацию ДНК в плазмидных препаратах тестировали с использованием количественной ПЦР с теми же специфическими праймерами и зондами в цифровой системе ПЦР QX100 Droplet (BioRad, США). Стандартные кривые были получены путем тестирования количественных стандартных образцов (в двух повторениях) в концентрациях 10, 10, 10 и 10 геном эквивалент (ГЭ)/мл для всех мишеней. Концентрации экстракта ДНК в клинических образцах выражали в ГЭ/мл.
На основании полученных данных выстроена прогностическая модель вероятности развития рецидивирующего бактериального вагиноза по концентрации ДНК разных генотипов G. vaginalis в составе вагинального биотопа женщин репродуктивного возраста.
Был проведен многофакторный анализ частоты встречаемости и концентрации ДНК различных генотипов Gardnerella vaginalis у женщин из двух сравниваемых групп - женщин, у которых в вагинальном биотопе может выявляться дисперсная форма G. vaginalis, не образующая биопленки, и женщин с рецидивирующим БВ, в вагинальном биотопе которых наиболее часто выявляется сцепленная форма G. vaginalis, образующая бактериальные пленки. Именно бактериальные пленки, сформированные G. vaginalis, поддерживают инфекционный процесс во влагалище, способствуют рецидивированию БВ, так как микроорганизмы в составе биопленки не доступны к воздействию антибактериальных препаратов. В результате анализа была составлена математическая модель вероятности развития рецидивирующего бактериального вагиноза путем подстановки значений концентраций ДНК различных генотипов Gardnerella vaginalis в следующие формулы:
1
2
3
4
где X - десятичный логарифм концентрации ДНК генотипа 1 Gardnerella vaginalis, Х - десятичный логарифм концентрации ДНК генотипа 2 Gardnerella vaginalis, Х - десятичный логарифм концентрации ДНК генотипа 4 Gardnerella vaginalis, Х - десятичный логарифм простой суммы концентрации ДНК всех выявленных генотипов Gardnerella vaginalis.
При показателе Z > Y прогноз развития рецидивирующего БВ можно ожидать с вероятностью 84%. При значении Z < Y, с вероятностью 95% рецидивирующий БВ не разовьется.
Способ подтверждается следующими клиническими примерами.
7
7
5
7
Пример 1. В образце женщины была обнаружена ДНК G. vaginalis следующих генотипов: генотип 1 - 50200000 (5×10) ГЭ/мл, генотип 2 - 12560000 (1,3×10) ГЭ/мл и генотип 4 - 943000 (9,4×10) ГЭ/мл. Простая сумма концентрации ДНК всех генотипов составила 63703000 (6,4×10) ГЭ/мл. Десятичные логарифмы этих значений, высчитанные с помощью калькулятора, - 7,7; 7,1; 5,98 и 7,8 соответственно.
Подставляем значения в формулы:
-12,58+0,49×7,7+1,04×7,1+0,95×5,98+0,78×7,8=10,358
-3,32-0,26×7,7-0,04×7,1+0,03×5,98+1,46×7,8=5,96
Получаем: 10,358>5,96.
Таким образом, с вероятностью в 84% разовьется рецидив заболевания.
3
4
4
Пример 2. В образце женщины была обнаружена ДНК G. vaginalis следующих генотипов: генотип 1 - 3880 (3,9×10) ГЭ/мл и генотип 4 - 23300 (2,3×10) ГЭ/мл. Генотип 2 не был обнаружен. Простая сумма концентрации ДНК всех генотипов составила 27180 (2,7×10) ГЭ/мл. Логарифмы этих значений, высчитанные с помощью калькулятора, - 3,6; 4,37 и 4,34 соответственно.
Подставляем значения в формулы:
- 12,58+0,49×3,6+1,04×0+0,95×4,37+0,78×4,34= -3,28
- 3,32-0,26×3,6-0,04×0+0,03×4,37+1,46×4,34=2,2
Получаем: -3,28<2,2.
Таким образом, с вероятностью в 95% рецидивирующий БВ не разовьется.
Способ позволяет прогнозировать рецидивы бактериального вагиноза с высокой степенью точности прогноза.