СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА

1. Способ получения представляющего интерес белка, включающий введение вектора экспрессии белка, который включает генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего; интегрирование генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок; и суспензионное культивирование клетки млекопитающего.
2. Способ получения представляющего интерес белка, включающий следующие этапы от (A) до (C):
(A) этап одновременного введения следующих векторов экспрессии (a) и (b) в суспензионную клетку млекопитающего:
(a) вектор экспрессии, включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента,
(b) вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую транспозазу, которая распознает транспозонные последовательности и обладает активностью переноса генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому,
(B) этап временной экспрессии транспозазы с вектора экспрессии, введенного на этапе (A), для интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения суспензионной клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок, и
(C) этап суспензионного культивирования суспензионной клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок, полученной на этапе (B), для получения представляющего интерес белка.
3. Способ получения суспензионной клетки млекопитающего, способной экспрессировать представляющий интерес белок, включающий введение вектора экспрессии белка, который включает генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего; и интегрирование генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором суспензионная клетка млекопитающего представляет собой клетку, способную выживать и пролиферировать в бессывороточной среде.
5. Способ по любому из пп.1-3, в котором суспензионная клетка млекопитающего представляет собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из суспензионной клетки CHO, адаптированной к суспензионному культивированию, клетки PER.C6, клетки крысиной миеломы YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (или также называемой YB2/0) и суспензионной клетки мышиной миеломы NS0, адаптированной к суспензионному культивированию.
6. Способ по п.5, в котором клетка CHO представляет собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 и CHO-S.
7. Способ по любому из пп.1-3, в котором ген селектируемого маркера представляет собой ген устойчивости к циклогексимиду.
8. Способ по п.7, в котором ген устойчивости к циклогексимиду представляет собой ген, кодирующий мутант человеческого рибосомного белка L36a.
9. Способ по п.8, в котором мутант представляет собой мутант, в котором пролин в положении 54 человеческого рибосомного белка L36a заменен на другую аминокислоту.
10. Способ по п.9, в котором другая аминокислота представляет собой глутамин.
11. Способ по любому из пп.1-3, в котором пара транспозонных последовательностей представляет собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов ДНК-типа, функционирующих в клетке млекопитающего.
12. Способ по п. 11, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов ДНК-типа, представляют собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, или нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2.
13. Способ по п.12, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2, представляют собой нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3.
14. Способ по п. 12, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15.
15. Суспензионная клетка млекопитающего, способная продуцировать представляющий интерес белок, в которую введен вектор экспрессии белка, который включает генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, для интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому.
16. Суспензионная клетка млекопитающего, способная продуцировать представляющий интерес белок, в которую введен вектор экспрессии (a), включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента, и вектор экспрессии (b), содержащий ДНК, кодирующую транспозазу (трансферазу), которая распознает транспозонные последовательности и обладает активностью переноса генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому для интегрирования генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому.
17. Клетка по п.15 или 16, способная выживать и пролиферировать в бессывороточной среде.
18. Клетка по любому из пп.15 или 16, представляющая собой по меньшей мере одну суспензионную клетку млекопитающего, выбранную из суспензионной клетки CHO, адаптированной к суспензионному культивированию, клетки PER.C6, клетки крысиной миеломы YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (или также называемой YB2/0) и суспензионной клетки мышиной миеломы NS0, адаптированной к суспензионному культивированию.
19. Клетка по п.18, где клетка СНО представляет собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из CHO-K1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 и CHO-S.
20. Клетка по любому из пп.15 или 16, в которой ген селектируемого маркера представляет собой ген устойчивости к циклогексимиду.
21. Клетка по п.20, в которой ген устойчивости к циклогексимиду представляет собой ген, кодирующий мутант человеческого рибосомного белка L36a.
22. Клетка по п.21, в которой мутант представляет собой мутант, в котором пролин в положении 54 человеческого рибосомного белка L36a заменен на другую аминокислоту.
23. Клетка по п.22, в которой другая аминокислота представляет собой глутамин.
24. Клетка по любому из пп.15 или 16, в которой пара транспозонных последовательностей представляет собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов ДНК-типа, функционирующих в клетке млекопитающего.
25. Клетка по п.24, в которой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов ДНК-типа, представляют собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, или нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2.
26. Клетка по п.25, в которой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3.
27. Клетка по п.25, в которой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15.
28. Вектор экспрессии белка, включающий генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую представляющий интерес белок, и ген селектируемого маркера, а также транспозонные последовательности на обоих концах генного фрагмента.
29. Вектор экспрессии белка по п.28, в котором пара транспозонных последовательностей представляет собой нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, или нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2.
30. Вектор экспрессии белка по п.29, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol2, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3.
31. Вектор экспрессии белка по п.29, в котором нуклеотидные последовательности, происходящие из пары транспозонов Tol1, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15.