ПРИМЕНЕНИЕ ТРИГЛИКОЗИДОВ ИЗОРАМНЕТИНА
APPLICATION OF ISORHAMNETIN TRIGLYCOSIDES

Настоящее изобретение относится к применению тригликозидов изорамнетина и экстрактов, содержащих эти тригликозиды, для лечения или профилактики неврологических и психических заболеваний, ассоциируемых со снижением повседневной активности и/или связанных с нарушением умственных функций, влияющих на повседневную активность, и/или с нарушением внимательности и состояниями возбуждения, и для улучшения памяти. Кроме того, данное изобретение относится к григликозиду изорамнетина 2 и к растительным экстрактам, содержащим этот гликозид.
Неврологические заболевания, такие как так называемый "синдром дефицита внимания с гиперактивностью" (сокращенно ADHD), с большим успехом подвергаются лечению лекарствами, которые сами по себе стимулируют моторную активность, например метилфенидатом и метамфетамином.
Кроме того, множество других неврологических и психических болезней ассоциируется со значительным снижением повседневной активности. Люди с депрессией или повышенной тревожностью часто сообщают о наличии трудностей в обычной жизни при работе или во время отдыха. Эти трудности приводят к потере социальных контактов и все более прогрессирующему ухудшению клинической картины. Если бы на это неконтактное поведение положительно влияла медикаментозная терапия, это могло бы привести к росту числа социальных контактов и тем самым к улучшению клинической картины. Следовательно, лекарства, применяемые до сих пор для лечения таких психических расстройств (антидепрессанты/анксиолитики), которые часто оказывают успокоительное действие и тем самым увеличивают пассивность пациентов, могли бы использоваться эффективно. Часто люди, в особенности пожилые, у которых уже проявляется дефицит умственных способностей, характеризуются снижением повседневной активности, и повышение активности и усиление умственных функций может привести к улучшению качества жизни больных людей.
Следовательно, цель данного изобретения состоит в создании лекарства, которое увеличивает мотивационно обусловленное поведение и, кроме того, вызывает улучшение умственных способностей и поэтому пригодно для лечения или профилактики неврологических и психических заболеваний, ассоциируемых со снижением повседневной активности и/или связанных с нарушением умственных способностей, влияющих на повседневную активность и/или нарушение внимания и состояния возбуждения, и для улучшения качества жизни.
Эта цель достигается при применении тригликозидов изорамнетина общей формулы 1 для получения лекарства и пищевых продуктов и при применении тригликозидов изорамнетина общей формулы 1 в качестве лекарства и в качестве пищевого продукта, соответственно,
где в формуле 1 R1=α-L-rha или α-L-rha-(l->4)-α-L-rha, R2=β-D-xy1 или Н и R3= или , для лечения или профилактики неврологических и психических заболеваний, ассоциируемых со снижением повседневной активности и/или связанных с нарушением умственных функций, влияющих на повседневную активность и/или нарушение внимания и состояние возбуждения. Предпочтительным является применение следующих соединений: 3-[(О-6-дезокси-α-L-маннопиранозил-(1->6)-O-[β-D-ксилопиранозил-(1->2)]-β-D-галактопиранозил)окси]-5,7-дигидрокси-2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-она (соединение 2, R1=α-L-rha, R2=β-D-xyl, R3=), 3-[(O-6-дезокси-α-L-маннопиранозил-(1->4)-O-6-дезокси-α-L-маннопиранозил-(1->6)-β-D-глюкопиранозил)окси]-5,7-дигидрокси-2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-она (соединение 3, R1=α-L-rha-(1->4)-α-L-rha, R2=Н, R3=) и 3-[(O-6-дезокси-α-L-маннопиранозил-(1->6)-O-[β-D-ксилопиранозил-(1->2)]-β-D-глюкопиранозил)окси]-5,7-дигидрокси-2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-она (соединение 4, R1=α-L-rha, R2=β-D-xy1, R3=). Предпочтительно, когда соединение общей формулы 1 (в особенности соединения 2,3 и 4) является ингредиентом растительного экстракта (особенно экстракта из цветов опунции-фикуса индика). Неожиданно было установлено, что пероральное применение тригликозидов изорамнетина 2 и 3 для мышей приводит к значительному и зависящему от дозы и статистически значимому увеличению познавательного инстинкта без изменения других параметров поведения (Таблица 2). Кроме того, длительное усиление действия на препаратах срезов мозга крыс (модель LTP) происходит под влиянием тригликозидов изорамнетина 2 и 4 по сравнению с контрольными опытами с буферным раствором (Фигуры 2 и 3). Следовательно, соединения общей формулы 1 обычно пригодны для лечения или профилактики неврологических и психических заболеваний, ассоциируемых со снижением повседневной активности и/или связанных с нарушением умственных способностей, влияющих на повседневную активность и/или нарушение внимания и состояние возбуждения, такие как синдром дефицита внимания с гиперактивностью (ADHD), депрессивные состояния настроения, синдром хронической усталости, состояние истощения, неврастения, расстройство соматизации, синдром деменции, болезнь Альцгеймера, сосудистая деменция, ухудшение памяти от других причин и спутанность сознания. Более того, тригликозиды изорамнетина согласно данному изобретению могут быть использованы для улучшения памяти.
Кроме того, было установлено, что экстракт из опунции, содержащий указанные вещества, приводит к значительному улучшению познавательных способностей, особенно пространственного обучения, в животной модели ("Morris Watermaze").
Соединение 2 представляет собой вещество, до сих пор не описанное, а именно 3-[(O-6-дезокси-α-L-маннопиранозил-(1->6)-O-[β-D-ксилопиранозил-(1->2)]-β-D-галактопиранозил)окси]-5,7-дигидрокси-2-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-4Н-1-бензопиран-4-он (соответствует 3-{α-L-rha-(l->6)-[β-D-xy1-(l->2)]-β-D-gal}-изорамнетину). Это новое соединение 2 также является объектом данного изобретения. Более того, объектом данного изобретения являются также растительные экстракты, содержащие тригликозид изорамнетина 2. При этом предпочтительными являются экстракты из опунции и особенно предпочтительным является экстракт из цветов опунции-фикуса индика.
Далее, объектом данного изобретения являются лекарства, пищевые продукты и другие составы, содержащие один или несколько тригликозидов изорамнетина 2, 3 и 4 и растительные экстракты, содержащие один или более тригликозидов изорамнетина 2, 3 и 4, применяемые в комбинации с другими веществами, такими как активные вещества и/или эксципиенты. Под пищевыми продуктами в данной заявке следует понимать диетические пищевые продукты, лечебные пищевые продукты и диетические добавки.
Объектами данного изобретения являются в особенности следующие варианты:
1. Применение тригликозидов изорамнетина общей формулы 1
, где
R1=α-L-rha или α-L-rha-(l->4)-α-L-rha,
R2=β-D-xy1 или Н и
R3= или ,
для лечения или профилактики неврологических и психических заболеваний, ассоциируемых со снижением повседневной активности и/или связанных с нарушением умственных функций, влияющих на повседневную активность, и/или с нарушением внимательности и состояниями возбуждения, и для улучшения памяти.
2. Применение тригликозидов изорамнетина общей формулы 1
, где
R1=α-L-rha или α-L-rha-(l->4)-α-L-rha,
R2=β-D-xy1 или Н и
R3= или ,
для получения лекарства для лечения или профилактики неврологических и психических заболеваний, ассоциируемых со снижением повседневной активности и/или связанных с нарушением умственных функций, влияющих на повседневную активность, и/или с нарушением внимательности и состояниями возбуждения, и для улучшения памяти.
3. Применение тригликозидов изорамнетина общей формулы 1
, где
R1=α-L-rha или α-L-rha-(l->4)-α-L-rha,
R2=β-D-xy1 или Н и
R3= или ,
для получения пищевого продукта или в качестве пищевого продукта для лечения или профилактики неврологических и психических заболеваний, ассоциируемых со снижением повседневной активности и/или связанных с нарушением умственных функций, влияющих на повседневную активность, и/или с нарушением внимательности и состояниями возбуждения, и для улучшения памяти.
4. Соединение общей формулы 1
, где
R1=α-L-rha или α-L-rha-(l->4)-α-L-rha,
R2=β-D-xy1 или Н и
R3= или ,
для применения в качестве лекарства для лечения или профилактики неврологических и психических заболеваний, ассоциируемых со снижением повседневной активности и/или связанных с нарушением умственных функций, влияющих на повседневную активность, и/или с нарушением внимательности и состояниями возбуждения, и для улучшения памяти.
5. Соединение общей формулы 1
, где
R1=α-L-rha или α-L-rha-(l->4)-α-L-rha,
R2=β-D-xy1 или Н и
R3= или ,
для применения в качестве пищевого продукта для лечения или профилактики неврологических и психических заболеваний, ассоциируемых со снижением повседневной активности и/или связанных с нарушением умственных функций, влияющих на повседневную активность, и/или с нарушением внимательности и состояниями возбуждения, и для улучшения памяти.
6. Применение по пп.1, 2 или 3 и соединение для применения по п.4 или 5, соответственно, где неврологические и психические заболевания, ассоциируемые со снижением повседневной активности и/или связанные с нарушением умственных функций, влияющих на повседневную активность, и/или с нарушением внимательности и состояниями возбуждения, выбраны из следующих болезней: синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (ADHD), депрессивных состояний настроения, синдрома хронической усталости, состояния истощения, неврастении, расстройства соматизации, синдрома деменции, болезни Альцгеймера, сосудистой деменции, ухудшения памяти от других причин и спутанности сознания.
7. Применение и соединение для применения, соответственно, по любому из пп.1-6, где тригликозид изорамнетина общей формулы 1 выбран из соединений 2, где R1=α-L-rha, R2=β-D-xy1, R3=.
8. Применение и соединение для применения, соответственно, по любому из пп.1-6, где тригликозид изорамнетина общей формулы 1 выбран из соединений 3, где R1=α-L-rha-(l->4)-α-L-rha, R2=Н, R3=.
9. Применение и соединение для применения, соответственно, по любому из пп.1-6, где тригликозид изорамнетина общей формулы 1 выбран из соединений 4, где R1=α-L-rha, R2=β-D-xy1, R3=.
10. Применение и соединение для применения, соответственно, по любому из пп.1-9, где одно или более соединений общей формулы 1 содержатся в растительном экстракте.
11. Применение и соединение для применения, соответственно, по п.10, где растительный экстракт представляет собой экстракт из опунции.
12. Применение и соединение для применения, соответственно, по п.11, где растительный экстракт представляет собой экстракт из цветов опунции-фикуса индика.
13. Применение и соединение для применения, соответственно, по п.12, где растительный экстракт из цветов опунции-фикуса индика получен с помощью 10-90% вес. этанола в качестве растворителя для экстракции.
14. Применение и соединение для применения, соответственно, по п.12, где растительный экстракт из цветов опунции-фикуса индика получен с помощью 50-70% вес. этанола в качестве растворителя для экстракции.
15. Применение и соединение для применения, соответственно, по любому из пп.10-14, где концентрация одного из соединений общей формулы 1 в сухом веществе растительного экстракта находится в пределах от 0,01 до 10% по весу.
16. Применение и соединение для применения, соответственно, по п.15, где концентрация одного из соединений общей формулы 1 в сухом веществе растительного экстракта находится в пределах от 0,05 до 5% по весу.
17. Тригликозид изорамнетина общей формулы 1
где R1=α-L-rha, R2=β-D-xy1 и R3= (соединение 2).
18. Растительный экстракт, содержащий тригликозид изорамнетина 2 по п.17.
19. Растительный экстракт по п.18, который представляет собой экстракт из вида опунции.
20. Растительный экстракт по п.19, который представляет собой экстракт из цветов опунции-фикуса индика.
21. Растительный экстракт по п.20, в котором растительный экстракт из цветов опунции-фикуса индика получен с помощью 10-90% вес. этанола в качестве растворителя для экстракции.
22. Растительный экстракт по п. 21, в котором растительный экстракт из цветов опунции-фикуса индика получен с помощью 50-70% вес. этанола в качестве растворителя для экстракции.
23. Растительный экстракт по любому из пп.18-22, в котором концентрация соединения формулы 2 в сухом веществе растительного экстракта находится в пределах от 0,01 до 10% по весу.
24. Растительный экстракт по п.23, в котором концентрация соединения формулы 2 в сухом веществе растительного экстракта находится в пределах от 0,05 до 5% по весу.
25. Растительный экстракт по любому из пп.18-24, который представляет собой сухой экстракт.
26. Лекарство, содержащее, по меньшей мере, одно из соединений общей формулы 1 по пп.1, 7, 8 или 9.
27. Пищевой продукт, содержащий, по меньшей мере, одно из соединений общей формулы 1 по п.п.1,7,8 или 9.
28. Лекарство или пищевой продукт по п.26 или 27 в качестве орального фармацевтического препарата, содержащего подходящие эксципиенты.
29. Лекарство или пищевой продукт по п.26 или 27, состоящие из растительного экстракта по любому из пп.18-25 и подходящих эксципиентов в качестве орального фармацевтического препарата.
Краткое описание фигур:
На Фигуре 1 показана структура соединения, а также результаты НМВС (гетероядерной многополосной корреляции).
На Фигуре 2 показано влияние тригликозида изорамнетина 2 и контрольного раствора, соответственно, на размер "популяционных спайков" (POP) после повторной индукции LTP.
На Фигуре 3 показано влияние тригликозида изорамнетина 4 и контрольного раствора, соответственно, на размер POP спайков после повторной индукции.
Вещество подавали через 10 мин после первой индукции LTP.
На Фигуре 4 показана частота случаев обнаружения платформы под водой в % на 9 день эксперимента по Примеру 5.
Новое соединение 2 было выделено в виде чистого вещества из экстракта из опунции путем применения метода распределения между двумя жидкостями, хроматографии на колонке и выделения с помощью HPLC (ЖХВР) (Пример 2). Структура, полученная при комбинации измерений с помощью метода HSQCGP (гетероядерной квантовой когерентности единичного состояния), позволяет достичь однозначной атрибуции протонов у связанных атомов углерода. При этом, применяя методы COSY (корреляционной спектроскопии) и селективной TOCSY (полной корреляционной спектроскопии) с различным временем смешения, можно выяснить последовательность расположения протонов водорода в соответствующем остатке сахара и, принимая во внимание константы сочетания, осуществить однозначную атрибуцию каждого фрагмента сахара. Затем методом НМВС (гетерогенной многополосной корреляции) определяли связи колец друг с другом и агликоном (Фигура 1). Наконец, предложенная структура была проверена на когерентность с помощью метода ROESY (Таблица 1). В случае очень похожих химических сдвигов протонов Н-2''' и Н-3''' при стимуляции шаблона сочетания в спектре TOCSY была получена точная величина констант сочетания и химических сдвигов. Для верификации абсолютной конфигурации звеньев сахара проводили кислый гидролиз и идентифицировали мономеры как звенья D-галактозы, D-ксилозы и L-рамнозы методом HPLC-MS и путем сравнения с эталонными соединениями.
Подобным образом были выделены соединения 3 и 4 (Пример 2) и охарактеризованы как производные изокверцитина. Соединение 3 было выделено из Eschscholtzia califomica (M.-A.Beck and H.Haberlein, Phytochemistry 50 (1999), 329-332, указано соединение 6), но его биологические свойства не были определены. Соединение 4 уже было обнаружено в скорлупе арахиса, были исследованы его свойства поглощать радикалы и действие против диабета (Н.Lou et al., "Alkanoids and Flavanoids from Peanut Skins", Planta Med. 67 (2001) 345-349).
Экстракты из различных видов опунции или, предпочтительно, экстракты из цветов опунции-фикуса индика по данному изобретению могут быть получены известными способами с помощью различных растворителей, таких как вода, метанол, этанол, ацетон и т.д., и их смесей при температурах от комнатной до 70°С при смешении, а именно при мацерации в течение промежутка времени от 10 мин до 24 ч или, альтернативно, путем перколяции при комнатной температуре в течение промежутка времени от 1 до 24 ч. При этом предпочтительными растворителями для экстракции являются смеси этанола и воды в отношении этанол/вода, равном от 10/90 до 90/10 (вес/вес), особенно предпочтительно, в отношении от 50/50 до 70/30 (вес/вес). Например, при получении экстракта мелкоизмельченные высушенные цветы опунции-фикуса индика экстрагировали два раза с помощью 7-кратного количества (по весу), 60%этанола в течение 30-120 мин (например, 60 мин) при температуре от 50 до 70°С (например, при 60°С) и растворы затем отфильтровывали. Затем соединенные фильтраты в основном освобождали от органического растворителя под вакуумом при температуре 40°С, оставшуюся водную фазу высушивали.
Для обогащения соединений 2, 3 и 4 согласно данному изобретению можно осуществить дальнейшие стадии концентрации, например, методом распределения между жидкостями с помощью, например, смеси 1-бутанол/вода или этилацетат/вода, методом адсорбции-десорбции с помощью ионообменной смолы Sephadex LH20, Diaion HP20 и других смол или методом хроматографического разделения на RP18 с силикагелем и т.п. Если желательна дальнейшая обработка с целью получения сухих экстрактов, это осуществляют известными способами при испарении растворителя при повышенной температуре и/или пониженном давлении, или при сушке замораживанием. При этом сухие экстракты обычно содержат сухой остаток в количестве, по меньшей мере, 95% по весу согласно European pharmacopoeia.
Соединения общей формулы 1 согласно изобретению и экстракты, содержащие, по меньшей мере, одно из этих соединений, соответственно, могут вводиться, предпочтительно, перорально в виде порошков, гранул, таблеток, таблеток с покрытием или капсул, или в виде раствора.
При этом доза соединения в день составляет от 0,1 до 250 мг, предпочтительно, от 0,3 до 50 мг одного или более соединений 2, 3 и 4. Для получения таблеток, по меньшей мере, одно из соединений общей формулы 1, особенно одно или более соединений 2, 3 и 4 и их соответствующий экстракт, соответственно, смешиваются с подходящими фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как лактоза, целлюлоза, двуокись кремния, кроскармеллоза и стеарат магния, и прессуются для получения таблеток, которые при желании покрывают подходящим составом для покрытий, например, на основе гидроксиметилпропилцеллюлозы, полиэтиленгликоля, красителей (например, двуокиси титана, окиси железа) и талька.
Примеры
Пример 1: Получение экстракта из цветов опунции-фикуса индика
500 г мелкоизмельченных и высушенных цветов опунции-фикуса индика подвергали экстракции два раза с помощью 7-кратного количества 60% (вес) этанола в течение 60 мин при температуре 60°С, полученные растворы фильтровали через фильтр Seitz supra 1500. Затем полученные объединенные фильтраты освобождали в основном от органического растворителя под вакуумом при температуре 40°С, а оставшуюся водную фазу сушили при замораживании, получали 96,2 г вещества (19,2% по отношению к высушенному растительному материалу). Экстракт содержит 0,10% соединения 2, 0,13% соединения 3 и 0,24% соединения 4.
Количественное определение тригликозидов 2-4:
Для количественного определения тригликозидов экстракт обрабатывали 50% МеОН (1 мг/мл), полученную смесь отфильтровывали и использовали 10 мкл (10,000 нг) для количественного определения соединений методом HPLC-MS. Это количество определяли при калибровке по 4 точкам от 0,1 до 1% (10-100 нг/впрыск) очищенных гликозидов.
2
2
t
t
+
+
Условия HPLC: Колонка Phenomenex Luna 5 мк С18(2) (250×4,6 мм); элюент А: MeCN/HO/HCOOH - 5:95:0,3, элюент В: MeCN/HO/HCOOH=59:41:0,3; градиент: 8 мин, изократический 100% А в течение 22 мин -50% А; скорость истечения: 0,6 мл/мин. Для количественной расшифровки LC-MS-хроматограммы проводили анализ выбранных треков ионов псевдомолекул. Для соединения применяли 3 m/z (M+H)=771 Да при R=5,4 мин, для соединений 4 и 2 m/z (M+H)=757 Да при R=5,9 и 6,2 мин, соответственно.
Пример 2: Выделение тригликозидов 2-4
2
500,2 г (60% по весу) этанольного экстракта из цветов опунции-фикуса индика (полученного по примеру 1) распределяли в 10 л HO и 6,7 л этилацетата, водную фазу отфильтровывали, фильтрат помещали над слоем (d=14 cm, h=40 см) Diaion HP20 и концентрат элюировали водой. Водный элюат (11 л) подвергали воздействию вакуума при температуре 40°С и остаток подвергали лиофилизации. Оставшийся твердый продукт (132,2 г) обрабатывали 50% метанолом и осуществляли хроматографию на колонке с Sephadex LH-20 (d=7,8 cm, h=169 см; примерно 50 мл на стекло). Фракции похожей композиции соединяли:
F9 (стекла 91-102): 2,5 г концентрированного соединения 3;
F10 (стекла 103-125) соединения 3 и 4: 6,1 г;
F11 (стекла 126-142): соединения 2 and 4: 5,3 г;
F12 (стекла 143-148): соединения 2 and 4: 1,5 г.
2
С целью дальнейшей очистки фракции выделяли частями с помощью препаративной RP HPLC (колонка: Synergi Hydro RP, d=2,5 см, 1=25 см; мобильная фаза: изократическая смесь MeOH/MeCN/HO=4/14/82; УФ-детектирование: 254 им; скорость истечения: 35 мл/мин): 0,24 г (0,05%) соединения 3; 0,45 г (0,09%) соединения 4 и 0,08 г (0,02%) соединения 2.
Таблица 1: Данные ЯМР для соединения 2
#
Сахар
δ <sup>1</sup>H множеств. J [Гц]
δ <sup>13</sup>С
НМВС H# -> C#
ROESY Н# -> Н#
2
158.2
3
134.7
4
179.2
5
162.8
6
6.22 d 2.0
99.6
С-7, С-5, С-10, С-8
7
165.6
8
6.43 d 2.0
94.5
С-7, С-9, С-10, С-6
9
158.1
10
105.5
1'
122.9
2'
7.98 d 2.0
114.2
С-2, С-3', С-4', С-6'
ОМе
3'
148.2
4'
150.9
5'
6.94 d 8.5
115.8
С-4', С-3', С-1'
Н-6'
6'
7.62 dd 2.0, 8.5
123.8
С-2, С-4', С-2'
Н-5'
Оме
4.00s
С-3'
1''
β-D-гал
5.51 d 7.8
101.1
С-5'', С-3
Н-3", Н-4", Н-5", Н-6"а, Н-6"b
2''
β-D-гал
4.05 dd 7.8, 9.5
79.1
С-1''', С-1'', С-3''
н-1''',
3''
β-D-гал
3.77 dd 3.3, 9.5
74.9
C-2''
H-1", H-6"b,
4''
β-D-гал
3.82 dd 1.1, 3.3
69.9
C-3'', C-2''
H-1",H-1'",H-4'"
5''
β-D-гал
3.68 ddd 1.1, 5.7, 6.8
75.1
C-6", C-4", C-1"
H-1", H-1"",
6''
β-D-гал
a) 3.75 dd 5.7,10.2 b) 3.49 dd 6.8,10.2
66.9
C-2'' (примесь) C-1'''', C-5''
H-1",H-1"",H-6"b H-1",H-1"",H-6"a
1'''
β-D- ксил
4.83 d 6.7
104.6
C-3"', C-2",
H-5'"b,H-2"
2'''
β-D- ксил
3.426 dd 6.7, 8.2
74.1
C-3''',
H-5'"a
3'''
β-D- ксил
3.413 dd 8.6, 8.2
76.3
C-2'''
Н-1'''
4'''
β-D- ксил
3.51 ddd 8.9, 8.6, 4.7
70.7
H-5"
5'''
β-D-ксил
a) 3.98 dd 4.7,11.8 b) 3.25 dd 8.9,11.8
66.0
C-3''',C-1''',C-4''', C-1'''
H-2"',H-5"'b H-5'"a, H-1'"
1''''
α-L-рамн
4.56 d 1.7
101.6
C-6", C-5"", С-3''''
H-5", H-6"a, H-6"b, H-2'''',
2''''
α-L-рамн
3.60 dd 1.7, 3.3
71.8
C-4'''', C-3''''
H-1""
3''''
α-L-рамн
3.52 dd 3.3, 9.5
72.0
C-4''''
4''''
α-L-рамн
3.2919.5
73.6
C-5'''', C-3'''', C-6''''
H-6""
5''''
α-L-рамн
3.55 dq 6.3, 9.5
69.4
C-4''''
H-6"", H-6"a
6''''
α-L-рамн
1.20d6.2
17.8
C-5'''', C-4''''
H-4"",H-5""
Пример 3: Эффективность действия тригликозидов изорамнетина 2,3 и 4 на мышей
Повышение активности лабораторных животных с помощью тригликозидов изорамнетина 2, 3 и 4 было изучено в так называемой системе "бокс для работы в режиме свет-темнота".
Принцип работы указанной системы для испытаний состоит в том, чтобы изучить у мышей поведенческую парадигму, предусматривающую два противоположных образца поведения. Бокс состоит из двух отделений, меньшее более темное отделение отделено от более светлой и большей части стенкой. В центре стенки находится маленькое отверстие, позволяющее лабораторному животному перемещаться между отделениями. Эксперимент начинался с помещения мыши в помещение со светом. Врожденное предпочтительное поведение в темноте заставляет мышей перейти в темное отделение после небольшого латентного периода. Однако вскоре любопытство (исследовательское поведение), которое также является сильным, заставляет мышей снова перейти в отделение со светом. Следовательно, два врожденных типа поведения, а именно предпочтение к нахождению в темноте (как защита от хищников) и исследовательское поведение (являющееся важным при поиске пищи, поиске партнеров)? находятся в конфликте, что фиксируется в течение 3 мин. Лекарства, проявляющие успокаивающее фармакологическое действие, приводят к уменьшению частоты перемещения между отделениями, в то время как лекарства со стимулирующей активностью увеличивают частоту такого перемещения. Следовательно, частота перемещений является показателем контролируемого активностью исследовательского поведения как индекса привычки (М.Bourin, and M.Hascoet, "The mouse light/dark box test", Eur. J.Pharmacol. 463 (2003) 55-65). При этом экспериментальная модель позволяет наблюдать параметры поведения, которые пригодны для измерения и оценки степени активности.
Для исследования влияния тригликозидов изорамнетина 2, 3 и 4 на активность мышей им вводили один раз различные высокие дозы флавонов. Для сравнения некоторым животным вводили или седативный бензодиазепин лоразепам, или повышающий активность препарат метамфетамина, или неэффективный контрольный раствор. Через 60 мин животных помещали в светлое отделение описанного выше бокса и наблюдали за ними в течение трех минут. Измеряли частоту перемещений как степень активности. Пероральное однократное введение тригликозидов изорамнетина 2 с дозой 3 и 10 мг/кг приводило к четко выраженному значительному повышению частоты переходов в "боксе для работы в режиме свет-темнота". В случае введения 30 мг/кг это действие прекращается (похоже на введение стандартного стимулянта "метамфетамина" (Таблица 3).
Таблица 2: Действие тригликозидов изорамнетина 2 и 3 в сравнении с анксиолитиком лоразепамом. Измеряли количество переходов по сравнению с контрольным носителем.
Вещество
2% от контрольной величины
3% от контрольной величины
Лоразепам % от контрольной величины
0,3 мг/кг п.о.
-46
3 мг/кг п.о.
+92
+15
10 мг/кг п.о.
+100#
+54#
30 мг/кг п.о.
+38
+52#
# возможность ошибки, р<0,05 по сравнению с контролем, п.о. = перорально
Таблица 3: Сравнительное вещество метамфетамин:
Метамфетамин приводит к выраженному и зависящему от дозы изменению частоты переходов. При средней величине дозы (3,0 мг/кг) дальнейшее увеличение эффекта являлось невозможным, так как лабораторные животные характеризовались значительным нарушением поведения из-за побочного действия вещества, а при самой высокой испытанной дозе (10 мг/кг) побочные эффекты были такими сильными, что лабораторные животные больше не переходили из отделения в отделение.
Вещество
Доза, мг/кг перорально
Количество переходов
Величина изменения, % от контр. величины
контроль
7±1,9
0
метамфетамин
0,3
7,5±2,1
+7%
метамфетамин
1,0
10,6±1,6##
+51%
метамфетамин
3,0
10,9±3,3#
+56%
метамфетамин
10,0
0,6±1.2##
-91%
# возможность ошибки, р<0.05 по сравнению с контрольн. величиной
## возможность ошибки, р<0.001 по сравнению с контрольн. Величиной.
Пример 4: Эффективность тригликозидов изорамнетина 2 и 4 в препаратах срезов мозга крыс. Для определения влияния тригликозидов изорамнетина 2 и 4 на ментальные функции использовали индукцию так называемого длительного потенцирования (LTP). В препаратах срезов мозга позвоночных LTP служит клеточной моделью познавательных процессов, особенно в системе рабочей памяти (Т. V. Р. Bliss, and G. L. Collingridge, „A synaptic model of memory: Long-term potentiation in the hippocampus". Nature 361 (1993) 31-39). При повторяющемся раздражении нейронов индуцируется длительное усиление синаптической передачи, которое появляется в результате стабилизации или активации так называемых "молчаливых" синапсов с образованием новых связей (процесс обучения). Область мозга, которую лучше всего изучать при изучении LTP, представляет собой гиппокамп, который играет центральную роль при обучении, однако, LTP происходит также в других участках мозга (G.A.Kerchner, and R.A.Nicoll, „Silent synapses and the emergence of a postsynaptic mechanism for LTP", Nat. Rev. Neurosci. 9 (2008) 813-825). У крыс и других грызунов длительное потенцирование в особенности связано с развитием пространственного обучения (J.R.Whitlock, A.J.Heynen, M.G.Shuler и M.F.Bear, "Learning induced long-term potentiation in the hippocampus". Science 313 (2006) 1093-1097).
Эксперименты проводили на препаратах срезов гиппокампа самок крыс породы Wistar (Вистар) в возрасте 8-12 нед. Образцы срезов мозга выдерживали в камере для измерений и опрыскивали питательным раствором. В дендритный участок пирамидального слоя (СА1) помещали стеклянные микроэлектроды для регистрации "популяционных спайков" (всплесков, POP spikes) (когда несколько клеток одновременно генерируют потенциал действия). Биполярные раздражающие электроды из платиновой проволоки стимулировали коллатерали Шеффера, полученные потенциалы действия (всплески POP) измеряли. Настоящий опыт начинался после выравнивания образцов в течение 60 мин, когда срезы мозга не подвергали обработке. Затем вводили электроды и начинался процесс стимулирования коллатералей Шеффера при увеличивающейся интенсивности тока. После получения максимального ответа на раздражение снижали интенсивность тока таким образом, чтобы достигалась только 50% от максимально возможной величины. При этом во время следующего опыта можно было проверить, возможно ли достичь увеличения ответа на раздражение. Этот ответ стимулировался каждые 10 с при силе раздражения меньше максимальной, при этом регистрировались популяционные спайки. Первое LTP начиналось при повторяющемся раздражении (100 Гц в течение 1 с). После первой стимуляции следовала новая единичная стимуляция (каждые 10 с с силой меньше максимальной) в течение 10 мин. Эта первая стимуляция служила для проверки наличия ответа среза мозга на стимуляцию при индукции LTP. Через первые 10 мин вводили испытуемое вещество и в течение дальнейших 10 мин регистрировали POP спайки. Затем каждые 20 мин осуществляли новую индукцию LTP, каждая с регистрацией, длящейся 20 мин (всего 5 раз). Испытуемое вещество и контрольный раствор вводили непрерывно, начиная с 10-й минуты первой индукции LTP.
Тригликозиды изорамнетина 2 и 4 испытывали в сравнении с используемым растворителем. Тригликозиды изорамнетина 2 и 4 приводили к выраженному повышению ответа на стимуляцию после стимуляции LTP.
На Фигуре 2 показано действие тригликозида изорамнетина 2 и контрольного раствора, соответственно, на величину POP спайков после повторяющейся индукции LTP. Введение испытуемого вещества начиналось через 10 мин после первой индукции LTP.
На Фигуре 3 показано влияние тригликозида изорамнетина 4 и контрольного раствора, соответственно, на величину POP спайков после повторяющейся индукции LTP.
Пример 5: действие экстракта по Примеру 1 на крыс
Для изучения влияния испытуемого экстракта из опунции по Примеру 1 на ментальные функции крысам вводили этот экстракт и наблюдали за состоянием памяти у крыс в так называемом "водном лабиринте Морриса" ("Morris Watermaze"). Для этой цели крысам в течение 6 дн вводили или экстракт из опунции, или только контрольный раствор носителя. В дни 7, 8 и 9 делали то же самое, но после введения веществ крыс помещали в бассейн, заполненный водой, где животные должны были найти платформу, расположенную под водой.
Для изучения влияния на ментальные функции крыс крысам вводили антихолинергическое вещество скополамин и определяли влияние действия носителя и испытуемого экстракта на действие скополамина. Скополамин часто применяют для неврологических исследований когнитивных функций, так как он ингибирует активность височных долей головного мозга, которые являются важными для пространственного обучения. В модели Морриса применение скополамина приводило к отчетливому ухудшению пространственного обучения, которое вызывало более редкое обнаружение островка, расположенного под водой. Определяли, может ли оральное введение экстракта опунции противодействовать действию скополамина.
Экстракт опунции вызывал выраженное уменьшение ухудшения обучения, вызванного приемом скополамина (Фигура 4).
На Фигуре 4 показано следующее. Лабораторным животным вводили экстракт опунции в двух независимых опытах в течение 9 дн по Примеру 1 (500 мг/дн п.о.). В три последних дня животным дополнительно вводили подкожно скополамин или также подкожно вводили физиологический раствор, применяемый в качестве носителя, и изучали качество их обучения в модели Морриса.
На Фигуре 4 показана частота обнаружения платформы в процентах на 9 день эксперимента.
Животные, которым вводили скополамин, находили платформу, находящуюся под водой, значительно реже по сравнению с контрольными животными. В случаях, когда животным дополнительно вводили экстракт опунции, они гораздо чаще находили платформу.