13С-уреазный дыхательный тест на базе прецизионной изотопной масс-спектрометрии

13С-уреазный дыхательный тест на базе прецизионной изотопной масс-спектрометрии

Веливецкая Т.А. (Velivetskaya@mail.ru), Игнатьев А.В.

Дальневосточный геологический институт ДВО РАН

Введение. В настоящее время интенсивно развивающиеся изотопные методы получили общее признание в области научной и практической медицины. Многие современные методы клинической диагностики и фармологических исследований основаны на применении меченых изотопов. Использование меченых изотопов является в отдельных случаях единственно возможным методом экспериментального исследования проблем, связанных с изучением динамики процессов и путей превращения химических веществ в живом организме. До недавних пор, исследование ряда механизмов функционирования различных органов и систем проводилось в основном с применением радиоактивных изотопов водорода, углерода, фосфора, калия и других элементов. Высокая чувствительность и точность радиоактивных измерений позволяют применять малые количества радиоактивных изотопов. Тем не менее, радиационное воздействие на организм является источником потенциального риска для здоровья человека. Радиационное воздействие недопустимо в диагностических процедурах для беременных женщин, младенцев и детей. В последние годы значительное внимание уделяется методам с применением стабильных изотопов. Преимущество использования стабильных изотопов вполне очевидно - это их полная безопасность, они не радиоактивны и не токсичны [ 1, 2]. Интенсивное внедрение методов стабильных изотопов в практическую медицину стимулировано высоким уровнем современного развития и совершенствования изотопной масс-спектрометрической техники для измерения стабильных изотопов и развитием технологий по производству препаратов, обогащенных стабильными изотопами. Благодаря высокому уровню чувствительности современной аналитической техники для проведения клинических исследований достаточно очень малого количества препарата, меченного стабильными изотопами. Применяемые дозы препаратов сопоставимы по

содержанию стабильных изотопов с поступлением их в организм естественным путем вместе с пищей, водой, воздухом [3]. Кроме того, стабильные изотопы имеют еще одно немаловажное преимущество перед радиоактивными изотопами. Время жизни радиоактивных изотопов мало, по сравнению с некоторыми биологическими процессами протекающими в организме (период полураспада азота -10 мин, кислорода - 124 с), поэтому использовать их в качестве трассеров очень сложно. С помощью стабильных изотопов кислорода [4], азота [5] и др., возможно изучать длительные во времени процессы, дифференцировать механизмы различных превращений веществ в организме, динамику метаболических процессов, распад и синтез различных соединений, участвующих в непрерывном химическом взаимодействии.

Уникальные возможности методов стабильных изотопов позволяют проводить диагностические исследования с высокой достоверностью и получать количественные данные с необходимой точностью, что выгодно отличает их от традиционных методов медицины. В частности, это касается диагностики экзокринной недостаточности поджелудочной железы и последующей коррекции энзимного обмена [6], определения энзимной функции печени [7], активности окисления жирных кислот [8], диагностики заболеваний желудка, тонкой и толстой кишки [9, 10]. В настоящее время существует более 20 видов изотопно обогащенных препаратов, применяемых в диагностике различных заболеваний человека. Препараты имеют в качестве метки природные стабильные изотопы различных элементов - водород, углерод, азот, кислород. Применяемые в диагностических методах дозировки различных изотопно-меченых препаратов безопасны для здоровья.

В последние годы разработан новый метод диагностики инфицированности человека бактериями Helicobacter pylori [11]. Наличие бактерий диагностируют с помощью вещества (мочевина), обогащенного

13

изотопом С. Фермент уреаза, вырабатываемый бактериями Helicobacter pylori, катализирует гидролиз мочевины до СО2, NH3 и Н2О. В результате разложения

13

С-обогащенной мочевины и последующего метаболизма, выдыхаемый

13

углекислый газ обогащается тяжелым изотопом углерода. Оценка степени С-обогащения СО2 позволяет диагностировать степень инфицированности.

Стабильные изотопы углерода и их измерение.

1. Стабильные изотопы. Одним из наиболее распространенных и важнейших элементов биосферы является углерод. Углерод имеет два

12 13

стабильных изотопа с массовым числом 12 (12С) и массовым числом 13 (13С). В природе средняя распространенность 12С составляет 98,89%,

13

распространенность С составляет 1,11%. В среднем природное изотопное

13 12

отношение С/ Ссоставляет 0,011. Распространенность стабильных изотопов не является постоянной величиной и имеет вариации в различных природных объектах. Вариации возникают вследствие перераспределения (фракционирования) изотопов в результате физических, химических и биологических процессов. Причиной фракционирования является различие изотопов по массам. Различие изотопов по массам обуславливает различие термодинамических свойств молекул, в состав которых входят различные изотопы элементов [12]. Например, связи, образованные легким изотопом, менее прочны и поэтому молекула, содержащая легкий изотоп, более реакционно способна по отношению к аналогичной молекуле, имеющей в своей структуре тяжелый изотоп [13,14]. В результате процессов фракционирования вещества могут обогащаться в разной степени легким изотопом или тяжелым изотопом. Например, растения С4 типа (травы пустынь) имеют обогащение тяжелым изотопом углерода в большей степени, чем растения С3 типа (травы умеренной климатической зоны) [15]. Обогащение обусловлено кинетическим фракционированием изотопов углерода в процессе фотосинтеза и зависит от механизма фотосинтеза.

Помимо фракционирования, соотношение изотопов в веществе зависит от соотношения изотопов в источнике, из которого образуется вещество. При формировании вещество получает изотопную метку своего источника.

13

Например, содержание С изотопа в организме человека определяется

13

поступлением С-изотопно обогащенных веществ вместе с пищей. Естественное обогащение организма тяжелым изотопом углерода происходит в результате потребления С4-типа растительной пищи с высоким содержанием

13

изотопа С. Потребление С3-типа растительной пищи приводит к меньшей степени содержания тяжелого изотопа углерода в организме человека.

Соотношение изотопов углерода выдыхаемого СО2 зависит от преобладания С3

13

или С4 растительной пищи в диете. Содержание С изотопа углерода в организме можно оценить по изотопному составу углекислого газа в выдыхаемом воздухе. Естественное, природное соотношение изотопов углерода выдыхаемого СО2 варьирует в диапазоне (1.10 - 1.08)% [16]. Это соотношение может быть изменено, если поступающие в организм вещества имеют изотопное обогащение значительно отличающееся по величине от природного. Препараты с высокой степенью обогащения стабильными изотопами получают искусственным путем. Так, например, в дыхательном тесте для диагностики

13

инфицированности Helicobacter pylori применяют мочевину, обогащенную С

13

изотопом. Величина С-обогащения выдоха зависит от дозы и степени изотопного обогащения принимаемого препарата, а также от величины

13

метаболического продуцирования СО2. В присутствии бактерий мочевина разлагается с выделением изотопно обогащенного углекислого газа. Образование изотопно меченого СО2 является индикатором процесса разложения мочевины, а значит и присутствия Helicobacter pylori бактерий в организме человека.

2. Измерение изотопов. Для определения отношения изотопов в образце (изотопный анализ) необходимы надежные методы и аналитическая техника с высокой чувствительностью и точностью измерения. В настоящее время анализ стабильных изотопов может быть выполнен масс-спектрометрическим методом или спектрофотометрическими методами. Современные масс-спектрометры

1 3 1 2 -8

позволяют измерять изотопное отношение С/ С с точностью 1 0 %.

На практике результаты измерения изотопного состава представляют с помощью величины 5, которая измеряется в промилле.

5 _ {(К-образца / К-стандарта) — 1 }х1°

где Кобразца -относительное содержание тяжелого и легкого изотопа в образце, К-стандарга - относительное содержание тяжелого и легкого изотопа в стандарте. Следовательно, при измерении изотопов имеют дело не с абсолютными величинами их отношений, а с относительными отклонениями от изотопного состава стандартного образца. Положительные значения 5 указывают на большее содержание тяжелого изотопа углерода в образце относительно

стандарта, а отрицательные значения на обеднение образца тяжелым изотопом по сравнению со стандартом.

Общепринятым международным стандартом для изотопного анализа углерода является стандарт PDB - кальцит окаменелости Belemnitella americana

13 12

мелового возраста из Южной Каролины. Абсолютное значение 13С/12С отношения в этом стандарте было установлено Крейгом и равно 0.0112372 ат.% [17]. Со временем этот стандартный материал был исчерпан. Американским национальным бюро стандартов предложен новый стандарт (морской

13

известняк) NBS19, величина 5С которого была точно установлена относительно PDB в ряде лабораторий. Основываясь на этих определениях, Международное агенство по атомной энергии в 1983 г. ввело новую шкалу -VPDB. С этого момента изотопный состав углерода образца принято сообщать относительно VPDB.

Масс-спектрометрический метод является на сегодня основным, применительно к дыхательным тестам на основе изотопно меченых препаратов. Изотопный

13

анализ СО2 выдыхаемого воздуха этим методом требует предварительной подготовки образца выдоха: разделение СО2 от других газовых компонентов в выдохе. Разделение может быть выполнено с применением криогенной системы очистки, или методом газовой хроматографии. Первую систему пробоподготовки применяют в комбинации с двухканальной системой напуска

13 12

газа в масс-спектрометр, отношение С/ С в образце и стандартном газе измеряют последовательно в цикле из 10 раз. Хроматографический способ разделения используют в сочетании с подключением к масс-спектрометру

13

интерфейса OonFlo, регистрацию СО2 в образце и стандарте проводят

13

однократно. Сравнительный анализ измерения выдыхаемого СО2 этими

13

способами показывает точность определения С-обогащенности СО2 <0.02%о для двухканальной системы напуска газа в масс-спектрометр и <0.14% с применением OonFlo интерфейса [18]. Применительно к дыхательным тестам требования к аналитическим характеристикам измерительной аппаратуры не столь высоки, удовлетворительная точность измерения изотопного отношения углерода в выдыхаемом воздухе составляет < 0.5%. Этому условию отвечает специализированный прибор BreathMAT (производства Finnigan МАТ, Германия), широко используемый на практике для проведения дыхательных

тестов. Прибор включает в себя систему автоматической подачи и напуска газа для последовательного измерения порядка 200 образцов, систему пробоподготовки образцов методом хроматографии, масс-спектрометрический детектор, систему управления прибором и обработки данных. Прибор обеспечивает высокую производительность и достоверность результатов анализа.

Спектрофотометрические методы измерения изотопного состава являются альтернативными масс-спектрометрии. В отличие от масс-спектрометрии, оптические методы анализа детектируют поглощение электоромагнитных волн молекулами в инфракрасной (ИК) области спектра. Аналитическая техника, основанная на методах молекулярной спектроскопии, существенно дешевле изотопных масс-спектрометров, но уступает в точности измерения изотопного состава. Использование ИК-спектрометров в медицинской диагностике, с применением меченых 13С-изотопом препаратов, позволило удешевить и упростить реализацию уреазных дыхательных тестов. Клинические испытания ИК-спектрометрической техники для диагностики Helicobacter pylori инфекции и сравнительный анализ полученных данных с масс-спектрометрическими (МС) исследованиями показывают близкую корреляцию между соответствующими данными тестов [19], что отражает равноправность применения ИК и МС техники для определения инфицированности пациентов Helicobacter pylori.

Повышение точности изотопного анализа спектральных методов возможно при использовании лазеров с перестраиваемой частотой. Высокая монохроматичность и мощность лазерного излучения позволяет определять форму спектральных линий с высоким разрешением, повышает чувствительность и точность регистрации спектров. Применительно к диагностике Helicobacter pylori инфекции использование лазерной спектрометрической техники повышает точность изотопного анализа и расширяет диагностические возможности спектральных методов. В частности, применение перестраиваемых диодных лазеров, как источника ИК-излучения, обеспечивает оптимальные условия частоты и мощности излучения лазера для

12 13

одновременной регистрации линий поглощения молекулами СО2 и СО2 с высоким разрешением, что технически упрощает спектральный анализ и

повышает точность определения изотопного отношения углерода в исследуемой газовой среде [20]. Интенсивное развитие методов лазерной спектроскопии способствует созданию аналитических приборов для медицинской диагностики более доступных по цене и удобных в эксплуатации. Анализ данных

13

клинической апробации С-уреазного дыхательного теста на основе диодной лазерной спектроскопии показывает достаточно надежные результаты диагностики инфицированности Helicobacter pylori, позволяет определять степень колонизации бактерии и контролировать эффективность применяемой терапии [21, 22]. Данные лазерной диагностики хорошо коррелируют с результатами масс-спектрометрии.

В настоящее время большая часть исследовательских работ и проведение гастроэнтерологической диагностики на основе анализа изотопного соотношения углерода в выдыхаемой двуокиси углерода осуществляются с применением масс-спектрометрических методов. Серийно производимые масс-спектрометры, специализированные на проведение уреазного дыхательного теста (BreathMAT, Finnigan MAT, Германия), достаточно дороги, что сдерживает широкое распространение изотопных методов диагностики в практической медицине. На сегодня в России имеется только два прибора BreathMAT, находящиеся в клиниках г. Москвы [www.textronica.com]. Между тем многие российские научно-исследовательские центры и организации оснащены изотопными масс-спктрометрами для измерений соотношения стабильных изотопов в газовой фазе. Использование этой техники и проведение совместных работ со специалистами в области гастроэнтерологии и гепатологии дает на сегодня реальную возможность широкого практического освоения изотопных дыхательных тестов и проведения клинико-диагностических исследований, основанных на использовании препаратов, меченых стабильными изотопами.

В данной работе продемонстрированы результаты практической реализации уреазного дыхательного теста с использованием стандартного изотопного масс-спектрометра в комплектации с двухканальной системой напуска. Представлена методика подготовки проб выдыхаемого воздуха для масс-спектрометрического измерения изотопного состава выдыхаемой

углекислоты. Приведены результаты диагностирования HP- инфекции для 11 тестируемых.

Уреазный дыхательный тест. К 1994 г. было официально признано, что инфицированность человека бактериями Helicobacter pylori (НР) является одной из основных причин возникновения гастритов и язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [23, 24, 25]. Известны биохимические, эндоскопические, иммунологические, микробиологические, изотопные методы диагностики НР-инфекции. В настоящее время предпочтение отдается

13

неинвазивному С-уреазному дыхательному тесту , обладающему высокой диагностической достоверностью. Впервые тест был разработан в 1987г. Д. Грахамом [11]. Диагностическим критерием хеликобактериоза является оценка

13

степени обогащения изотопом углерода С выдыхаемого СО2 при наличии уреазной активности в желудке после перорально принятой дозы мочевины,

13

обогащенной стабильным изотопом С углерода.

В сравнении с традиционными методами диагностики, дыхательный тест наиболее привлекателен, так как прост в исполнении, не инвазивен, безопасен для здоровья, достоверность результатов близка к 1 00%.

Схематически тест можно представить следующим образом:

Для выполнения теста достаточно взять у пациента одну контрольную пробу выдыхаемого воздуха до приема обогащенной мочевины и одну пробу выдыхаемого воздуха спустя 30 минут после приема мочевины. Если есть инфицирование Helicobacter pylori бактериями, то энзим уреаза, находящийся на поверхности бактериальной клетки, расщепляет мочевину до аммиака и углекислого газа. Образованный таким образом СО2, имеет обогащение

13

изотопом С. Продукты распада, проходя по пищевому тракту, всасываются в кровь, из крови в легкие и частично уходят в виде СО2 с выдыхаемом воздухом. В этом случае, соотношение изотопов углерода в выдыхаемом углекислом газе изменится по сравнению с пробой, отобранной непосредственно перед приемом

13

мочевины. Присутствие изотопа углерода С в выдохе выше принятого контрольного уровня является показателем инфицированности (положительный

результат теста). Если бактерий Helicobacter pylori в организме нет, мочевина проходит пищеварительный тракт без разложения и практически не влияет на соотношение изотопов углерода в выдыхаемом воздухе (отрицательный результат теста). Определение величины контрольного уровня для разделения между положительным и отрицательным результатами теста чрезвычайно важно. Величина контрольного уровня определена эмпирически по результатам сравнительного анализа данных дыхательного теста с данными эндоскопии. В результате многочисленных исследований определено значение контрольного уровня в 5% [26, 10]. Значение контрольного уровня не зависит от возраста тестируемого и имеет универсальное применение к любым категориям пациентов.

Высокая точность и чувствительность дыхательного теста позволяет определять степень инфицированности НР и выявлять его малые колонизации (интегральные данные по всему желудку). Осуществлять контроль эрадикации после курса терапии, но не раньше, чем через 28 дней после прекращения приема антихеликобактерных и антисекреторных средств.

13

Аналитическая процедура измерения УС выдоха.

Аналитическая процедура измерения изотопного состава углерода СО2 выдоха включает в следующие позиции.

I. Сбор образца выдыхаемого воздуха в стеклянный пробоотборник.

II. Подготовка образцов к масс-спектрометрическому анализу: криогенное разделение в вакууме СО2 выдоха от других выдыхаемых газов (азот, кислород, вода и др.).

13

III. Измерение изотопного состава о3С СО2 выдоха на масс-спектрометре. I. Пробы выдыхаемого воздуха собирают и хранят в стеклянной емкости рис. 1 . Полный выдох производят в емкость через стеклянную трубку с вентилем. После выдоха вентили 1 и 2 закрывают. Вакуумное уплотнение вентилей исключает обмен образца СО2-выдоха с атмосферной СО2. Образцы выдоха могут храниться длительное время (более 1 0 суток).

^ Выдох

Вентиль 1

рис. 1 Емкость для сбора и хранения образца выдыхаемого воздуха.

II Подготовка образцов СО2 выдоха к масс-спектрометрическому анализу была выполнена на вакуумной установке рис.2. Установка включает следующие элементы: систему откачки до 10-5 мм.рт.ст.; датчики высокого давления; V-образную ловушку для разделения газовой смеси; вентиль с емкостью для вымораживания чистого СО2. Все элементы установки выполнены из стекла и соединены между собой с помощью вакуумных переходников. Емкость с образцом выдоха подсоединяют через переходник к вакуумной линии. Во всей системе, исключая емкость с образцом, создают давление 10-5 мм.рт.ст. После чего закрывают от системы откачки вакуумную линию и открывают емкость с образцом, распуская газ в V-образную ловушку. Вентиль между ловушкой и емкостью закрывают, замораживают ловушку жидким азотом (-1960С) и подключают к откачке. В процессе откачки азот и кислород полностью удаляются из системы, СО2 и Н2О, имеющие низкое парциальное давление при данной температуре, остаются замороженными на стенках ловушки. После откачки ловушку термостатируют -(70^80)°С при помощи охлажденного азотом спирта, СО2 полностью переходит в газовую фазу, а вода остается замороженной. Чистый СО2 собирают в емкость и подают на масс-

13

спектрометрическе измерение 5 С. Вся процедура подготовки занимает 5-6 минут.

Рис.2 Схема вакуумной установки для подготовки выдыхаемого углекислого газа к масс-спектрометрическому изотопному анализу.

III Измерения изотопного состава СО2 выдоха были проведены на масс-спектрометре Finnigan MAT, Бремен, Германия, модель МАТ 252. Измерения проведены относительным методом с использованием стандартной двойной системы напуска изотопов. Измерения проведены относительно рабочего стандартного газа СО2, откалиброванного по международным

сертифицированным стандартам NBS19, NBS18, IAEA-CO-8. Результаты

13

измерения 5 С СО2-выдоха представлены относительно международного стандарта VPDB.

Результаты исследований Проведена серия экспериментов по реализации уреазного дыхательного теста на оборудовании лаборатории стабильных изотопов ДВГИ ДВО РАН. В тестировании принимало участие 11 пациентов (мужчин - 7, женщин - 4, средний возраст 42±17 лет) с диагнозом хронического гастрита ассоциированного с Helicobacter pylori. Диагноз хронического гастрита поставлен на основе фиброгастродуоденоскопического исследования, морфологического изучения биоптатов слизистой и диагностики НР-инфекции с применением быстрого уреазного (CLO) теста. Обследование пациентов проведено на базе городской клинической больницы №2 г.Владивостока. Для эрадикации Helicobacter pylori была использована схема трехкомпонентной терапии, рассчитанной на 1 4 дней.

13

С-уреазный дыхательный тест был проведен согласно общепринятому протоколу [9, 10] в следующей последовательности.

Отбор пробы выдыхаемого воздуха до приема меченого препарата (базовая

13

проба). Прием пациентом дозы С-мочевины, растворенной в 100 мл воды или сока. Отбор пробы выдыхаемого воздуха через 30 минут после приема меченого препарата (контрольная проба).

Сбор проб поизводится в стеклянные емкости с герметичным уплотнением. Для этого тестируемый делает глубокий вдох, задерживает дыхание на 1 0 секунд, делает полный выдох через трубку в емкость и герметично ее закрывает. Отобранные пробы поступают на изотопный анализ в течение первых суток.

13

Для выполнения теста использована мочевина, с обогащением С (99.1 атомн. %), изготовитель ISOTEC Inc. A Matheson, USA Company, сертификат соответствия получен в лаборатории экотоксикологии Института проблем

13

экологии и эволюции РАН. Применяемая доза С-мочевины определена из расчета 1мг препарата на 1 кг массы тела [26, 27, 28]. Изменение изотопного

13

состава 513С СО2 выдоха между базовым и контрольным значениями более чем на 5% принято за положительный результат теста [26, 10].

13

1 3С-уреазный дыхательный тест был применен к испытуемой группе пациенов до лечения хеликобактериоза и спустя 1 месяц после терапии ( в одном случае срок между окончанием лечения и тестированием составил 1 2 месяцев).

Данные изотопных анализов, полученные при тестировании пациентов до

13

лечения, сведены в табл. 1 . Показаны две серии результатов С-уреазного дыхательного теста. Первая серия содержит данные первичного обследования пациентов (тест1), вторая серия - данные, полученные через 10 дней при повторном обследовании этих пациентов (тест 2). Между тестами лечение не

проводилось.

Таблица 1. Результаты изотопных анализов 13С-уреазного дыхательного теста у Helicobacter pylori-инфицированных пациентов до проведения эрадикации

Тест 1 Тест 2

№ пациента Базовый анализ 5 Сров, %° Контрольный анализ 5 Сров, %° (контрольный - базовый) А13 С, %% Базовый анализ 5 Сров, %° Контрольны й анализ 5 Сров, %° (контрольный - базовый) А13С, %%

1 -24.7 -16.9 7.8 -23.5 -16.2 7.3

2 -23.2 -9.1 14.1 -23.4 -9.7 13.7

3 -23.6 -12.5 11.1 -24.0 -10.8 13.2

4 -23.1 -12.9 10.2 -22.9 -10.7 12.2

5 -24.1 -12.1 12.0 -23.2 -12.3 10.9

6 -22.2 -10.1 12.1 -22.3 -7.2 15.1

7 -23.0 -10.1 12.9 -23.3 -9.0 14.3

8 -23.6 2.3 25.9

9 -24.0 -0.2 23.8

10 -22.1 -2.7 19.4

Анализ изотопного отношения углерода выдыхаемого воздуха

13

показывает, что у всех пациентов разница между измеренным значением 513С

13 13

СО2-выдоха до и после приема С-мочевины (А С) превышает контрольный

13

уровень в 5%о. Максимальная разность 5"С СО2 выдоха между базовым и контрольным значениями у пациентов в данной серии составила 25.9%, минимальная 7.8%. Полученные данные можно оценивать как положительный результат теста, что полностью согласуется с результатами гастроскопических и

13

морфологических исследований. Различие значений С-обогащения СО2 в выдохе между отдельными пациентами отражает разную степень бактериального инфицирования этих пациентов. Группа пациентов у которых

13

наблюдалось сравнительно небольшое увеличение содержания 13СО2 в контрольной пробе была протестирована повторно (тест 2). Сравнение

результатов теста 1 и 2 показало небольшие вариации изотопного отношения

13

углерода в выдыхаемом воздухе. Максимальное отклонение величины теста 1 от соответствующего значения теста 2 составляет 3.0%, минимальное

13

0.4%. Наблюдаемые вариации обусловлены изменением 5 С метаболического СО2 и естественными колебаниями размеров колонизации Helicobacter pylori. В целом, данные тестирований 1 и 2 показывают близкое совпадение, свидетельствуя о высокой достоверности получаемых результатов.

Данные изотопных анализов, полученные при тестировании испытуемой группы пациентов после эрадикационной терапии, сведены в табл. 2. Десять пациентов были протестированы через 1 месяц по завершению терапевтического курса и 1 пациент - через 12 месяцев. В первом случае у 8-и пациентов результаты тестирования показали, что разница между измеренным

13 13

значением 5 С СО2 выдоха до и после приема С-мочевины не превышает

13

контрольный уровень. Максимальное отклонение контрольного значения

5 С

от базового составило 1.4%. Эти данные можно оценивать как отрицательный результат теста. Для двух пациентов получен положительный результат. У

13

одного из них А С составила 6.8 % (табл.2, №9), что на 17% меньше соответствующего результата, полученного до лечения (табл.1, №9). У другого

13

пациента А С составила 16.3% (табл.2, №10), в сравнении с результатом до лечения (табл.1, №10), снижение составило 3.1%. Для пациента, прошедшего тестирование через 12 месяцев после окончания лечения (табл.2, №11), результат оказался отрицательный. Полученные данные позволяют контролировать эффективность применяемой антибактериальной терапии надежным не инвазивным методом.

Таблица 2. Результаты изотопных анализов 13С-уреазного

дыхательного теста у Helicobacter pylori-инфицированных

пациентов после проведения эрадикации

№ пациента Базовый анализ 5 Сров, Контрольный анализ 513СРСВ, % (контрольный-базовый) А13 С, %

1 -24.2 -23.6 0.6

2 -23.8 -22.7 1.1

3 -23.1 -21.7 1.4

4 -23.6 -22.7 0.9

5 -24.4 -24.1 0.3

6 -23.1 -23.3 -0.2

7 -22.9 -21.9 1.0

8 -22.7 -22.3 0.4

9 -23.5 -16.7 6.8

10 -23.2 -6.9 16.3

11 -24.2 -23.5 0.7

13

Для отражения динамики изменения 5 С выдыхаемой СО2, были проанализированы образцы выдоха, которые собирали через каждые 5 минут в течение 3-х часов с момента приема 13С-мочевины. Типичная динамика

13 13

изменения

513С

выдоха после принятия 13С-мочевины для инфицированных и неинфицированных пациентов представлена на рис.3. У неинфицированных

13

пациентов отмечаются незначительные изменения 5 С выдоха во времени, в то время как для инфицированных пациентов уже в первые минуты после приема мочевины отмечено существенное утяжеление изотопного состава углерода в

-15

о

о" 2 -20 Ю

-25

0 20 40 60 80 100 130

^ мин

13

выдыхаемом воздухе. Увеличение 5 С продолжается в течение 25-30 минут, достигая своего максимального значения. Через 35-40 начинается плавное

13 13

снижение 5 С, продолжающееся в течение 2-3 часов. В итоге, значение 5 С

13

выдоха стремится к своему базовому значению. Скорость С-обогащения выдыхаемой СО2 может варьировать в зависимости от степени бактериальной

13

инфицированности пациента, но пик максимального 13С-обогащения выдыхаемой СО2 регистрируется через 25-35 минут после приема пациентом

13

С-мочевины.

13 13

рис.3. Динамика изменения 5 С выдыхаемого СО2 после приема 70мг С-мочевины у инфицированного (квадраты) и неинфицированного (круги) пациентов. Точность результатов составляет ±0.1%.

Для определения диапазона вариаций естественного природного содержания

13 13

изотопа С в СО2 выдоха проведена серия измерений 5 С СО2 в выдыхаемом воздухе у 16 испытуемых в возрасте 35±25 лет. В целом, полученные значения

13

5С варьируют в пределах от -22.1% до -24.7%. Наблюдаемые природные вариации незначительны, что обусловлено однотипным составом пищи в

13

рационе тестируемых. Среднее значение 5 С СО2 в выдохе данной группы лиц составляет -23.2%. Однако принимать в дыхательном тесте среднюю величину как универсальное значение естественного содержания 13С изотопа в выдохе у пациентов недопустимо. Полученное в данной серии измерений отклонение

13

513С

различных образцов выдоха от их среднего значения составило более 1 %. Такое отклонение может явиться критичным при постановке диагноза. Очевидно, что при тестировании следует определять естественное природное

13

С -обогащение выдыхаемого углекислого газа для каждого пациента индивидуально.

Заключение. На базе аналитического оборудования лаборатории стабильных изотопов ДВГИ ДВО РАН проведена апробация уреазного дыхательного теста. Применяемый комплекс аппаратуры для пробоподготовки и масс-спектрометрического измерения изотопного состава позволяет выполнять изотопные анализы углерода СО2 выдыхаемого воздуха с высокой точностью и производительностью. Продемонстрированы результаты практической реализации уреазного дыхательного теста с использованием меченой изотопом

13

13С мочевины. Аналогичное масс-спектрометрическая оборудование, имеющееся в распоряжении многих российских научно-исследовательских центров и организаций, может быть предложено на сегодняшний день, как альтернатива специализированным, но малодоступным по ряду причин приборам для проведения дыхательных тестов. Сотрудничество специалистов в области изотопной масс-спектрометрии с гастроэнтерологами и гепатологами дает на сегодня реальную возможность широкого практического освоения в Россиии изотопных дыхательных тестов и проведения клинико-диагностических исследований, основанных на использовании препаратов, меченых стабильными изотопами. Литература.

1. Bier DM. The use of stable isotopes in metabolic investigation. Baillieres Clin Endocrinol Metab 1987, 1(4) 817-836

2. Thomson GN, Pacy PJ, FordGC, Halliday D. Practical considerations in the use of stable isotope labelled compaunds as tracers in clinical studies. Biomed Environ Mass Spectrom 1989, 18(5) 321-327

3. Koletzko B, Sauerwald T, Demmelmair H. Safety of stable isotope use. Eur J Pediatr 1997, 156 (Suppl. 1) 12-17

4. Trowbridge FL, Graham GG, Wong WW. Body water measurements in

18

premature and older infants using H2 O isotopic determinations. Pediatr Res 1984, 18, 524-527

5. Jones PJ, Leatherdale ST. Stable isotope in clinical reseach: Safety reaffirmed(editorial). Clin Sci 1991, 80(4), 277-280

13

6. Weaver LT, Amarri S, Swart G. C mixed triglyceride breath test. Gut 1998, 43(suppl 3), 13-19

13

7. Becker M. C breath tests for measurement of liver function. Gut 1998, 43(suppl 3), 25-27

8. Heinonen OJ, Takala J. Moderate carnitine deplition and long-chain fatty acid oxidation, exeercise capaciti, and nitrogen balance in the rat. Pediatr Res 1994, 36, 282-292

9. Logan RPH, Dill S, Bauer FE, Walker MM, Hirschl AM, Gummett PA, Good D,

13

Mossi S. The European C-urea breath test for the detection of Helicobacter pylori. Eur J Gastroenterol Hepatol 1991, 3, 915-921.

10. Graham DY, Klein PD. What you should know about the methods, problems, interpretations, and use of urea breath tests. Am J Gastroenterol 1991, 86, 1118-1122

11. Graham DY, Klein PD, Evans-DJ Jr, Evans-DG, Alpert LC, Opekun AR,

13

Boutton TW. Campylobacter pylori detected noninvasively by the C-urea breath test. Lancet 1987, i: 1174-1177

12. Urey H.C. The thermodynamik properties of isotopic substances. J.Chem.Soc. 1947, 562-581

13. Bigeleisen J., Mayer M.J. Calculation of equilibrium constants for isotopic exchange reactions. J.Chem. Phys. 1948, 15, 261-267

14. Bigeleisen J. The effects of isotopic substitutions on the rates of chemical reactions. J. Phys.Chem. 1952, 56, 823-824

13 12

15. Smith B.N., Epstein S. Two categories of C/ C ratios for higher plants. Plant Physiol. 1971, 47, 380-384

16. Nakamura K, Schoeller D.A., Winkler F.J., Schmidt H.L. Geographical variations in the carbon isotope composition of the diet and hair in contemporary man. Biomed. Mass. Spectrom. 1982, 9(9), 390-394

17. Craig H. Isotopic standards for carbon and oxygen and correction factors for mass-spectrometric analysis of carbon dioxide. Geochim Cosmochim Acta 1957, 12, 133-149

13

18. Stellaard F., Geypens B. European interlaboratory comparison of breath CO2 analysis. Gut, 1998, (suppl 3), 2-6

19. Savarino V., Mela G.S., Zentilin P., Bisso G., Pivari M., Mansi C., Mele M.R., Biliardi C., Vigneri S., Celle G. Comparison of isotope rati mass spectrometry and nondispersive isotope-selective infrared spectroscopy for C-13-urea breath test. Am. J. Gastroenterology

20. Степанов Е.В. Лазерный анализ изотопического отношения углерода

13 12 13C/12C

в СО2 выдыхаемого воздуха. Квантовая электроника. 2002, 32, 981-986

21. Ивашкин В.Т., Никитина Е.И., Понуровский Я.Я., Селиванов Ю.Г., Степанов Е.В. C-13 уреазный дыхательный тест на основе лазерной спектроскопии: клиническая апробация. Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 1999, T.IX, № 2, стр.53-60

22. Ивашкин В.Т, Никитина Е.И., Степанов Е.В., Миляев В. А., Зырянов П.В.

13

Основы лазерного С-уреазного дыхательного теста и практика клинического применения. В сборнике "Helicobacterl Pylori: Революция в гастроэнтерологии", Москва, 1999, стр. 130-159

23. NIH Consensus Conference. Helicobacter pylori in peptic ulcer disease. NIH Consensus Development panel on Helicobacter pylori in pepttic ulcer disease. JAMA 1994, 272, 65-69

24. Tytgat GNJ, Rauws EAJ. Campylobacter pylori and its role in peptic ulcer disease. Gastroenterol Clin North Am. 1990, 19, 183-196.

25. McGowan CC, Cover TL, Blaser MJ. Helicobacter pylori and gastric acid: biological and therapeutic implication. Gastroenterology 1996, 110, 926-938

26. Logan RPH, Polson RJ, Misiewicz JJ, Rao G, Karim NQ, Newell D, Johnson P,

13

Wadsworth J, Walker MM, Baron JH. Simplified single sample Carbon urea breath

test for Helicobacter pylori: comparison with histology, culture and ELISa serology. Gut 1991, 32,1461-1464

27. Eggers RH, Kulp A, Tegeler R, Ludtke FE, Lepsien G, Meyer B, Bauer FE A

13

methodological analysis of the C-urea breath test for the detection of Helicobacter

13

pylori infection: high sensitivity and specificity within 30 min using 75 mg of C-urea. Eur J Gastroenterol Hepatol 1990, 2, 437-444

28. Atherton JC, Spiller RC. The urea breath test for Helicobacter pylori. Gut 1994, 35, 723-725