Анализ связи количества гемопоэтических стволовых клеток крови с лабораторными показателями состояния гепатобилиарной системы у детей с врожденными и наследственными заболеваниями печени

Заключение. Таким образом, разработанная нами методика количественного определения V617F мутантного гена JAK2 с помощью ПЦР РВ является высокоспецифичной, чувствительной и может дополнять морфологические, ци-тогенетические и другие исследования, она позволяет более глубоко изучить динамику минимальной остаточной болезни на фоне лечения различными препаратами у пациентов с ХМПЗ, позволяя не только диагностировать, но и количественно оценить эффективность специфической терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Adamson J. W, Fialkow P. J., Murphy S. et al. // N. Engl. J. Med. - 1976.

- Vol. 295. - Р. 913-916.

2. Barosi G., Birgegard G., Finazzi G. et al. // Blood. - 2009. - Vol. 113. - Р.

4829-4833.

3. Baxter E. J., Scott L. M., Campbell P. J. et al. // Lancet. - 2005. - Vol.

365. - Р. 1054-1061.

4. Dameshek W. // Blood. - 1951. - Vol. 6. - Р. 372.

5. Darnell J. E, Kerr I. M, Stark G. R. // Science. - 1994. - Vol. 264. - Р.

1415-1421.

6. Fialkow P. J., Faguet G. B, Jacobson R. J. et al. // Blood. - 1981. - Vol.

58. - Р. 916-919.

7. Fiedler W, Henke R. P., Ergun S. et al. // Cancer. - 2000. - Vol. 88. - Р.

344-351.

8. Jacobson R. J, Salo A., Fialkow P. J. // Blood. - 1978. - Vol. 51, N 2. - Р.

189-194.

9. James C, Ugo V et al. // Nature. - 2005. - Vol. 434. - Р. 1144-148. 10. James W. Vardiman et al. // Blood. - 2009. - Vol. 114. - Р. 937-951.

11. Jones A. V., Kreil S., Zoi K. et al. // Blood. - 2005. - Vol. 106. - P. 21622168.

12. Jones A. K, Silver R. T., Waghorn K. et al. // Blood. - 2006. - Vol. 107, N 8. - P. 3339-341.

13. KaushanskyK. // Blood. - 2005. - Vol. 105. - P. 4187-4190.

14. KralovicsR., Guana Y, Prchal J. T. // Exp. Hematol. - 2002. - Vol. 30. -P. 229-236.

15. Kralovics R, Passamonti F., Buser A. S. et al. // N. Engl. J. Med. - 2005. - Vol. 352. - P. 1779-1790.

16. Kroger N., BadbaranA., Holler E. et al. // Blood. - 2007. - Vol. 109. - P. 1316-1321.

17. Lacout C, Pisani D. F., TulliezM. et al. // Blood. - 2006. - Vol. 108. - P. 1652-1660.

18. Larsen T. S. et al. // Br. J. Haematol. - 2007. - Vol. 136, N 5. - P. 745-751.

19. Levine R. L, Wadleigh M, Cools J. et al. // Cancer Cell. - 2005. - Vol. 7. - P. 387-397.

20. Lippert E., Girodon F., Hammond E. et al. // Haematologica. - 2009. -Vol. 94, N 1. - P. 38-45.

21. O'Shea J. J., GadinaM, SchreiberR. D. // Cell. - 2002. - Vol. 109. - P. 121-131.

22. Tefferi A. et al. // Blood. - 2007. - Vol. 110, N 4. - P. 1092-1097.

23. Tefferi A., Vardiman J. W. // Leukemia. - 2008. - Vol. 22. - P. 14-22.

24. Tefferi A., Thiele J., Vardiman J. W. et al. // Cancer. - 2009. - Vol. 1. - P. 3842-3847.

25. Wernig G., Mercher T., Okabe R. et al. // Blood. - 2006. - Vol. 107. - P. 4274-4281.

26. YamaokaK., SaharinenP., PesuM. et al. // Genome Biol. - 2004. - Vol. 5. - P. 1-253.

27. Zhao R., Xing S., Li Z. et al. // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280. - P. 22788-22792.

Поступила 30.06.11

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012

УДК 616.36-053.1-055.5/.7-074-078.33

Р. М. Курабекова1,С. А. Луговская2, Е. В. Наумова2, О. М. Цирульникова1, И. Е. Цирульникова1, О. Е. Гичкун1, А. А. Андриянова1, Н. П. Шмерко1, О. П. Шевченко1

анализ связи количества гемопоэтических стволовых клеток крови с лабораторными показателями состояния гепатобилиарной системы у детей с врожденными и наследственными заболеваниями печени

1ФГБУ ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В. И. Шумакова Минздравсоцразвития РФ, 2ГБОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Минздравсоцразвития РФ, кафедра клинической лабораторной диагностики, Москва

Исследовано содержание CD34/CD45dim-no3umueHbix клеток в периферической крови детей, страдающих врожденными и наследственными заболеваниями гепатобилиарной системы, и проведен анализ связи содержания исследуемых клеток с уровнем C-реактивного белка, sCD40L, sCD30, НП и лабораторных параметров, отражающих функции печени. Содержание CD34-позитивных ГСК у детей с циррозом печени коррелировало с уровнем СРБ, альбумина, концентрацией гемоглобина и количеством эритроцитов крови, но не было связано с уровнями sCD40L, sCD30 и НП. Количество исследованных клеток у детей с заболеваниями печени было выше, чем у здоровых взрослых доноров.

Ключевые слова: CD34/CD45+-клетки, гемопоэтические стволовые клетки, мобилизация стволовых клеток, заболевания гепатобилиарной системы, трансплантация печени

R.M. Kurabekova, S.A. Lugovskaya, Ye.V. Naumova, O.M. Tzyrulnikova, I.Ye. Tzyrulnikova, O.Ye. Gitchkun, A.A. Andriyanova,

N.P. Shmerko, O.P. Shevtchenko THE ANALYSIS OF RELATIONSHIP BETWEEN NUMBERS OF HEMOPOIETIC HEMATOBLASTS AND LABORATORY INDICATORS OF STATE OF HEPATOBILIARY SYSTEM IN CHILDREN WITH CONGENITAL AND HEREDITARY DISEASES OF LIVER The content of CD34/CD45dim-positive cells in peripheral blood of children with congenital and hereditary diseases of hepatobiliary system is studied. The analysis of relationship between numbers of studied cells and level of C-reactive protein, sCD40L, sCD30 and laboratory parameters specific to liver functions is applied. The number of CD34-positive hemopoietic hematoblasts in children with hepatocirrhosis correlated with the level of C-reactive protein, albumin, hemoglobin concentration and quantity of blood erythrocytes. No relationship was established with the levels of sDC40L and sDC30. The number of studied cells in children with liver diseases was higher than in healthy adult donors.

Key words: CD34/CD45-positive cells, hemopoietic hematoblasts, mobilization of hemopoietic hematoblasts, diseases of hepatobiliary system, transplantation of liver

гематология

Под действием различных фармакологических агентов, а также при стрессе, воспалении или повреждении некоторых органов гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) костного мозга способны мобилизоваться в периферический кровоток [5]. Исследование пациентов с циррозом печени, а также после резекции или трансплантации печени показало, что содержание ГСК в периферической крови таких пациентов может увеличиваться [6, 8, 9]. Хотя роль и значение мобилизации стволовых клеток костного мозга пока точно не установлены [2, 7], предполагается, что биологический смысл повышения ГСК в кровотоке состоит в сохранении популяции стволовых клеток в условиях повреждающего воздействия различных факторов, а также в участии этих клеток в восстановлении поврежденных органов [4].

Наиболее исследованной популяцией стволовых клеток костного мозга являются клетки-предшественники, обладающие фенотипом CD34+/CD45dim+. Данные кластеры дифференцировки характеризуют гемопоэтические клетки-предшественники, включая мультипотентные стволовые клетки [10]. Такие клетки имеют высокий потенциал к слиянию и способность к дифференцировке в различные клеточные линии всех трех эмбриональных слоев. В частности показано, что, кроме гемопоэтического потенциала, данные клетки обладают способностью дифференцироваться в клетки с гепатоцитарной морфологией и фенотипом in vitro, что позволяет предполагать их участие в восстановлении печени in vivo [11].

Мониторинг содержания ГСК в периферической крови пациентов до и после трансплантации и резекции доли печени может способствовать пониманию возможной роли этих клеток в процессах восстановления печени.

Целью исследования был анализ связи содержания CD34+-клеток в периферической крови детей, страдающих врожденными и наследственными заболеваниями печени, с маркерами воспаления (значения С-реактивного белка), активации иммунной системы (показатели растворимого СD40-лиганда, растворимой формы CD30 и неоптерина) и лабораторными параметрами состояния гепатобилиарной системы.

Материалы и методы. Материалом исследования служила венозная кровь детей-реципиентов и взрослых доноров фрагмента печени. Были исследованы образцы крови 13 детей в возрасте от 5 до 60 мес (медиана 8 мес) - 7 мальчиков и 6 девочек со средней массой тела 9 ± 4 кг и ростом 78 ± 19 см. Все дети страдали циррозом печени в исходе врожденных и наследственных заболеваний ге-патобилиарной системы. Группа сравнения состояла из 12 здоровых взрослых родственных доноров фрагмента печени, возраст которых составлял в среднем 29 ± 5 лет, - 5 мужчин и 7 женщин со средней массой тела 68 ± 12 кг и ростом 168 ± 10 см.

Количество СD34/СD45dim+-клеток в периферической крови определяли методом проточной цитометрии с помощью набора реагентов для определения стволовых клеток ("Beckman Coulter", США) на цитометре FC 500 Cytomics ("Beckman Coulter", США) согласно прилагаемой инструкции. Сбор данных включал не менее 500 000 событий. Абсолютное количество CD34-позитивных клеток крови рассчитывали, исходя из числа лейкоцитов, полученных при исследовании на гематологическом анализаторе Пентра-60 (АВХ), количества событий в гейте CD45+-клеток и затем ко-

Для корреспонденции:

Курабекова Ривада Мусабековна, ст. науч. сотр. лаб. клин. и

эксперимент. биохимии

Адрес: 123182, Москва, ул. Щукинская, 1

Тел.: 8(499)190-24-30

E-mail: kourabr@yandex.ru

личества событий в гейте CD34+, полученного в результате многоэтапного гейтирования [3].

Концентрацию С-реактивного белка (СРБ) в плазме крови определяли методом иммунотурбидиметрии с усилением латексом («DiaSys", Германия). С помощью иммунофермент-ного анализа определяли содержание растворимого CD40-лиганда (sCD40L) ("Bender MedSystems", США), растворимой формы CD30 (sCD30) ("Bender MedSystems", США) и неоптерина (НП) ("IBL", Германия). Плановое лабораторное обследование пациентов предусматривало общий и биохимический анализ крови, который включал такие лабораторные показатели, как содержание креатинина, общего и свободного билирубина, альбумина, общего белка, активности щелочной фосфатазы, АЛТ, АСТ, ГГТ, гемоглобина, количества лейкоцитов и эритроцитов.

Данные представлены в виде медианы распределения и интервала значений для непараметрических выборок и как среднее арифметическое и стандартное отклонение при нормальном распределении значений. Статистическую обработку данных, не отвечающих требованиям нормального распределения, проводили с помощью методов непараметрической статистики, анализа корреляций по Спирмену. Статистически значимыми считали различия, при которых вероятность ошибки составляла не более 0,05.

Результаты и обсуждение. Содержание СD34+-клеток у детей, страдающих врожденными и наследственными заболеваниями печени (2,098 (1,097-11,363) кл/мкл), было выше, чем у здоровых доноров (1,340 (0,530-2,712) кл/ мкл) (p < 0,05) (рис. 1). Уровень лейкоцитов в крови детей (7,4 ± 3,6 • 109/л) статистически не отличался от количества лейкоцитов у доноров (5,9 ± 1,4 • 109/л), количество же эритроцитов у детей (3,6 ± 0,8 • 1012/л) было достоверно ниже, чем у доноров (4,6 ± 0,3 • 1012/л) (p = 0,01) (см. рис. 1). По-видимому, более высокое содержание СD34+-клеток в периферической крови детей до операции по сравнению с таковым у взрослых доноров может быть связано как с возрастом пациентов, так и/или с имеющимся у них заболеванием печени. Более низкий уровень эритроцитов у детей, очевидно, также является следствием заболевания гепатобилиарной системы.

Анализ динамики содержания ГСК, лейкоцитов и эритроцитов у детей с заболеваниями гепатобилиарной системы до и после трансплантации показал, что количество CD34+-клеток до операции статистически не отличалось от такового в 1-4-й (1,568 (0,325-3,021) кл/мкл) и 5-7-й день (1,732 (0,427-5,298) кл/мкл) после трансплантации печени, количество лейкоцитов крови достоверно увеличивалось в 1-4-й день после трансплантации печени (12,3 ± 6,8 • 109/л) (p = 0,02), а затем в 5-7-й день (9,2 ± 3,7 • 109/л) снижалось до уровня, близкого к дооперационному. Уровень эритроцитов

20000 15000 10000 5000

CD34/CD45+ 105кл/л

WBC, 109кл/л

RBC, 1012кл/л

I Дети

Доноры

Рис. 1. Содержание CD34/CD45dim+-клеток, лейкоцитов (WBC) и эритроцитов (ДВС) в периферической крови детей с заболеваниями печени и здоровых доноров.

20000

15000

РВС,

1012кл/л

С034/СЭ45+ WBC, 105кл/л -1091сл/л

И До операции ^ 1 -4-й день после операции Н 5-7-й день после операции

Рис. 2. Содержание СD34/СD45dim+-клеток, лейкоцитов (WBC) и эритроцитов (ЯВС) в периферической крови детей - реципиентов печени до и после операции.

ш о.

40-,

35- о •

30-

25- •

20-

15- о*~

ю-

8

5-

о

о- I I

г 48

-46

-44

-42

Я

-40

-38 х"

-36 5

> ю

-34 1

-32

-30

-28

-26

-1 01 23456789 СД34/СД45+, кл/мкл —•— СРБ -о- Альбумин

Рис. 3. Корреляция содержания CD34/CD45+-клеток с уровнем СРБ и альбумина у детей с заболеваниями печени (р < 0,05).

105 и

100 -

п X

1 2 3 СД34/СД45+, кл/мкл -•- НЬ -о- РВС

Рис. 4. Корреляция содержания СD34/СD45+-клеток с уровнем гемоглобина и количеством эритроцитов у детей с заболеваниями печени (р < 0,05).

у реципиентов до и после операции (3,2 ± 0,6 • 1012/л и 3,1 ± 0,4 • 1012/л в 1-4-й и 5-7-й день соответственно) практически не изменялся (рис. 2). Таким образом, у детей после

трансплантации доли печени живого родственного донора не наблюдалось увеличение количества ГСК костного мозга в периферической крови.

При анализе связи содержания СD34+-клеток с уровнями маркера воспаления СРБ, биомаркерами активации иммунной системы: костимулирующего фактора активации Т-клеток sСD40L, маркера активации Т-хелперных клеток 2-го типа (№-2) sСD30, маркера активации макрофагов НП и лабораторных показателей (содержание креатинина, общего и свободного билирубина, альбумина, общего белка, гемоглобина, активности щелочной фосфатазы, АЛТ, АСТ, ГГТ, количества лейкоцитов и эритроцитов) в крови детей с заболеваниями печени (см. таблицу) обнаружены достоверные (р < 0,05) корреляции содержания исследуемых клеток и уровня СРБ (г = -0,69), альбумина (г = 0,64), гемоглобина (Г = 0,70), а также количества эритроцитов (^ = 0,73).

Связь содержания СD34+-клеток и уровня СРБ, альбумина (рис. 3), гемоглобина и эритроцитов (рис. 4) является линейной корреляцией высокой степени. Для других исследованных параметров статистически значимые корреляции с содержанием изучаемых клеток не были обнаружены. Наличие указанных корреляций может являться косвенным подтверждением взаимозависимости уровня ГСК в периферической крови и активности воспаления (уровень СРБ), функции печени (уровни альбумина и гемоглобина) и эритропоэза (количество эритроцитов).

При анализе корреляций содержания СD34+ ГСК и указанных выше биохимических маркеров у здоровых взрослых доноров фрагмента печени не выявлены статистически значимые корреляции содержания исследуемых клеток и лабораторных параметров. Отсутствие связи содержания изучаемых клеток и биохимических маркеров воспаления и функции печени у здоровых взрослых в отличие от детей с заболеваниями печени может свидетельствовать об обусловленности таких взаимосвязей заболеваниями гепатобилиар-

Эначения лабораторных параметров крови детей с заболеваниями печени и коэффициенты корреляции содержания CD34/ CD45+-клеток с исследованными параметрами

Параметр Значение Коэффициент корреляции

СРБ, мг/л 12,4 ± 8,6 -0,69*

sСD40L, нг/мл 3,2 ± 2,4 -0,05

sСD34, нг/мл 111,1 ± 51,6 0,29

НП, нм/л 14,4 (4,9-129,0) -0,32

Глюкоза, ммоль/л 4,0 ± 1,0 0,52

Мочевина, ммоль/л 4,7 ± 2,2 0,29

Креатинин, мкмоль/л 22,0 ± 13,2 0,14

Альбумин, г/л 37,3 ± 5,5 0,64

Свободный билирубин, мкмоль/л 188,7 ± 121,6 -0,12

Общий билирубин, мкмоль/л 341,0 ± 212,5 0,03

Общий белок, г/л 76,8 ± 8,9 0,04

НЬ, г/л 89,9 ± 8,7 0,70*

ЩФ, ЕД/л 486,8 ± 281,0 -0,02

АЛТ, ЕД/л 113,8 ± 44,9 0,27

АСТ, ЕД/л 199,3 ± 114,9 -0,08

ГГТ, ЕД/л 122,0 ± 113,6 0,38

WBС • 109/л 7,4 ± 3,6 0,31

ЯВС, • 1012/л 3,6 ± 0,8 0,73*

*Жирным шрифтом отмечены р < 0,05.

коэффициенты корреляции с

гематология

ной системы или возрастом пациентов.

Анализ корреляций содержания исследуемых клеток и биохимических маркеров в крови детей в 1-4-й и 5-7-й день после трансплантации фрагмента печени не позволил обнаружить статистически значимые корреляции. Возможно, отсутствие связи содержания CD34+-клеток и маркеров воспаления и функции печени после операции может косвенно указывать на обусловленность таких взаимосвязей заболеваниями гепатобилиарной системы.

Выводы. 1. Содержание CD34+ ГСК в периферической крови детей, страдающих циррозом печени в исходе врожденных и наследственных заболеваний гепатобилиарной системы, коррелирует с концентрацией СРБ, альбумина, гемоглобина и количеством эритроцитов в плазме крови.

2. Содержание CD34+ ГСК в периферической крови детей с циррозом печени не связано с уровнями биомаркеров активации иммунной системы: костимулирующего фактора активации Т-клеток sCD40L, маркера активации №-2 клеток sCD30 и маркера активации макрофагов НП.

3. Количество CD34+ ГСК в периферической крови детей с заболеваниями печени выше, чем у здоровых взрослых доноров и не изменяется в 1-4-й и 5-7-й день после трансплантации печени.

ЛИТЕРАТУРА

1. Готье С. В., Константинов В. А., Цирульникова О. М. Трансплантация печени. - М., 2008.

2. КурабековаР. М., Цирульникова О. М., Шевченко О. П. // Вестн. трансплантол. и искусственных органов. - 2010. - Т. 12, № 4. -С. 86-92.

3. Луговская С. В., Почтарь М. Е., Долгов В. В. Гематологические анализаторы. Интерпретация анализа крови. - М., 2008.

4. AlisonM. R., IslamS, LimS. // J. Pathol. - 2009. - Vol. 217, N 2. - P. 282-298.

5. Baccarani U., Donini A., Risaliti A. et al. // Lancet. - 2001. - Vol. 357, N 9274. - P. 2137.

6. De Silvestro G., Vicarioto M., Donadel C. et al. // Hepatogastroenterology. - 2004. - Vol. 51. - P. 805-810.

7. Eguchi S., Kanematsu T. // Surg. Today. - 2009. - Vol. 39, N 1. - P. 1-4.

8. Gaia S., Smedile A., Omede P. et al. // J. Hepatol. - 2006. - Vol. 45, N 1. - P. 13-19.

9. Lemoli R. M., Catani L., Talarico S. et al. // Stem Cells. - 2006. - 24, N 12. - P. 2817-2825.

10. Sutherland D. R., Keating A. // J. Hematother. - 1992. - Vol. 1, N 2. - P. 115-129.

11. Zhao Y., Glesne D., Huberman E. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003. - Vol. 100, N 5. - P. 2426-2431.

Поступила 20.12.11

© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2012 УДК 616.155.194.17-055.5/.7-074

Ю. А. Прохорова1, Е. Е. Зуева2, Н. Е. Соколова3

применение метода проточной цитомЕтрии в диагностике наследственного сфероцитоза

1Санкт-Петербургский государственный университет; 2лаборатория клинической иммунологии и молекулярной диагностики Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова; 3ДГБ № 1, Санкт-Петербург

Предложенный в 2000 г. метод связывания флюоресцентного красителя эозин-5 малеимида (э5м) с лизином-430 первой внеклеточной петли белка полосы 3 мембран эритроцитов позволяет выявлять дефекты цитоскелета эритроцитов как биологическую основу патогенеза наследственного сфероцитоза. Исследованы образцы периферической крови 125 взрослых и 18 детей с доказанным отсутствием гематологических нарушений, а также образцы периферической крови 19 пациентов с верифицированным наследственным сфероцитозом. Методом проточной цитометрии проведена регистрация средней интенсивности флюоресценции э5м (СИФ). Снижение СИФ э5м эритроцитов больных НС по сравнению с данными в группах сопоставления отмечено во всех случаях.

Ключевые слова: наследственный сфероцитоз, цитоскелет эритроцитов, проточная цитометрия, средняя интенсивность флюоресценции, эозин-5 малеимид

Yu.A. Prokhorova, Ye.Ye. Zuyeva, N.Ye. Sokolova

THE APPLICATION OF METHOD OF FLOW CYTOMETRY IN DIAGNOSTICS OF HEREDITARY SPHEROCYTOSIS (EOSIN-5 MALEIMID BINDING TEST) The technique of binding eosin-5 maleimidfluorescent dye with lysine-430 of first extracellular protein bulge of band 3 of erythrocytes' membranes makes it possible to detect the defects ofcytoskeleton oferythrocytes as a biological foundation ofpathogenesis ofhereditary spherocytosis. The samples of peripheral blood from 125 adult persons and 18 children with established absence of hematologic disorders were analyzed. The samples of peripheral blood from 19 patients with verified hereditary spherocytosis were analyzed too. The method offlow cytometry was applied to register the average intensity offluorescence of eosin-5 maleimid. The decrease of average intensity offluorescence of eosin-5 maleimid of erythrocytes ofpatients with hereditary spherocytosis as compared with data from comparison groups was established in all cases.

Key words: hereditary spherocytosis, cytoskeleton of erythrocytes, flow cytometry, average intensity offluorescence, eosin-5 maleimid

Для корреспонденции:

Прохорова Юлия Александровна, аспирант каф. цитологии и гистологии

Адрес: 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого. 6/8

Телефон: 8-921-866-63-73

E-mail: immunology. spbgmu@gmail.ru

Традиционные методы лабораторной диагностики мем-бранопатий эритроцитов - тест на осмотическую хрупкость и морфологический анализ - не всегда информативны, требуют много времени и по меньшей мере 2 мл периферической крови для исследования, что затрудняет диагностику у новорожденных.