Регенерация гепатопанкреаса речных раков после трансплантации клеток костного мозга мышей-доноров

Биомедицина • № 2, 2015, С. 53-57

Регенерация гепатопанкреаса речных раков после трансплантации клеток костного мозга мышей-доноров

Г.И. Пронина1, Н.Ю. Корягина2, А.О. Ревякин1, Г.Д. Капанадзе1, О.И. Степанова1, Ж.О. Курищенко1, Н.В. Петрова1

1 - ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область

2 - ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ирригационного рыбоводства», Московская область

Контактная информация: к.б.н. РевякинАртем Олегович, scbmt@yandex.ru

Эксперимент показал успешную регенерацию гепатопанкреаса речных раков после ксенотранс-плантации им стволовых клеток мышей-доноров.

Ключевые слова: стволовые клетки, гидробионты, речные раки, гепатопанкреас.

Введение

Регенеративная терапия с использованием своих или чужих стволовых клеток на сегодняшний день уже стала реальностью. Выявлено, что стволовые клетки обладают высокой миграционной и регенеративной способностью. Принцип действия стволовых клеток заключается в их уникальных свойствах: стимулирование ангиогенеза, способность к практически бесконечному воспроизведению себе подобных, возможность дифференцироваться в зависимости от микроокружения.

В основном, источником стволовых клеток является костный мозг и пупо-винная кровь. Пролиферативный потенциал эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и способность к дифференци-ровке делает их уникальными. Вместе с ЭСК появилась возможность изучения процессов дифференцировки клеток на ранних этапах развития эмбрионов, внесения генетических изменений в развивающийся организм, создания модель-

ных животных для разработки методов лечения различных заболеваний. Впервые эмбриональные стволовые клетки человека были получены в работе [10]. Дифференцированные производные ЭСК человека могут быть использованы для восстановления функциональности тканей при широком спектре заболеваний, связанных с утратой клетками возможности нормально функционировать. Сюда относятся нейродегенеративные заболевания, повреждения ЦНС, заболевания сердца, диабет и другие [7, 9, 3].

Выявлено, что у беспозвоночных животных с бесполым размножением стволовые клетки тотипотентны и, тем самым, подобны половым. Подобны их общая морфология, включая и ультраструктурный уровень (герминальные тела), экспрессия гена vasa, активность щелочной фосфатазы и, вероятно, тело-меразная активность, обеспечивающие тотипотентность и потенциальное бессмертие этих клеток. Активность теломе-разы показана для самообновляющихся

клеток колониальной асцидии Во&уПш зсЫояяеп [5, 6]. Получены свидетельства общности и эволюционного консерватизма морфологических и функциональных характеристик тотипотентных стволовых клеток представителей различных таксонов многоклеточных животных: книдарии, турбеллярии, корнеголовые ракообразные и млекопитающие [8, 4, 1].

Целью нашей работы являлось моделирование патологии у альтернативных биомоделей - беспозвоночных гидроби-онтов, выявление возможности межвидовой трансплантации клеток костного мозга (ККМ) мышей пойкилотермным гидробионтам, а также коррекция патологии гепатопанкреаса речных раков с помощью стволовых клеток.

Решение проблемы межвидовой трансплантации стволовых клеток систематически отдаленных видов позволит в перспективе найти другие источники стволовых клеток, такие как циркулирующие жидкости пойкилотермных гидробионтов.

Материалы и методы

Объектами настоящего эксперимента являлись длиннопалые речные раки Pоntastacus lеptоdactylus.

Раки содержались в аквариумах объемом 160 л, с принудительной аэрацией и водоочисткой. Температура воды находилась в пределах 16-17°С; рН - 6,9-7,1. Кормление раков производилось личинками хирономид по поедаемости.

Мечение раков проводили лаком для ногтей (рис. 1).

Группы речных ра

Рис. 1. Речной рак с метками на карапаксе.

Раки были распределены на 4 группы (см. табл. 1).

Все работы по выделению клеток и их культивированию проводились в соответствии с общими принципами культуральных исследований на живых и трупных донорах (срок гибели животных - 30-40 мин). Исследовали жизнеспособность клеток гемопоэтической и стромальной фракций ККМ по окраске трипановым синим.

Забор ККМ проводили у мышей-доноров, содержащих ген зеленого белка (ОБР), под эфирным наркозом. Стерильно иссекали кости предплечья, плеча, голени и бедра вместе с суставами и отделяли их от мышц. Далее кости обрабатывали в 70% спирте, стерильно ножницами отсекали суставы и с помощью шприца (1 мл и 2 мл) вымывали ККМ раствором Хенкса (без Са2+ и Mg2+) из костномозгового канала.

Полученную смешанную суспензию клеток центрифугировали вместе с ли-зирующем раствором (114 тМ МН4С1; 7,5 тМ КНСО3; 100 мкМ ЕБТА) из рас-

Таблица 1

ов в эксперименте

Группа 1 п=7 Группа 2 п=12 Группа 3 п=12 Группа 4 п=12

Интактный контроль Без патологии С искусственно вызванной патологией гепатопанкреаса

Введение стволовых клеток в дозе 10 млн ККМ Без введения ККМ

чета 1:4 в течение 5 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре 22°С. Затем надосадочную фазу удаляли путем отсасывания. Отмытую от эритроцитов и полученную смесь клеток ресуспендирова-ли в питательной ростовой среде DMEM (ПанЭко), содержащей 25мМ HEPES; 0,58 г/л глютамина; 100 мкг/л гентамицина; 10% бычьей эмбриональной сыворотки (HyClone, USA); 5 мкг/л инсулина. Клетки культивировали во флаконах при +37°С в СО2-инкубаторе, атмосфере с 5% СО2 и 95% влажности в течение 3-х суток [2].

Через 3 суток культура ККМ мышей содержала до 50% свободно плавающих в суспензии с питательной средой округлых неприкрепившихся гемопоэтических клеток на разных сроках дифференцировки (гемопоэтические клетки, лимфоциты, моноциты) и до 50% прикрепившихся к пластику распластанных фибробластопо-добных клеток - мультипотентных мезен-химальных стромальных клеток.

Полученная смешанная культура из гемопоэтических и стромальных ККМ мышей-доноров вводилась в вентральный синус речных раков в дозе 8-10 млн ККМ на 15-е сутки после создания модели патологии гепатопанкреаса.

Вскрытие опытных объектов производилось под хлороформным наркозом на 7-й, 14-й и 21-й дни после введения ККМ.

Индекс гепатопанкреаса рассчитывали как отношение массы органа к массе тела и выражали в процентах.

Гистологические исследования проводили с помощью цифровой микроскопии препаратов, которые готовили следующим образом. Внутренние органы фиксировались в 10% растворе формалина. Затем после обезвоживания и заливки в парафин готовились гистологические срезы при помощи микротома с последующим окрашиванием гематоксилин-эозином.

Результаты и их обсуждение

На 9-14-й день после введения ал-локсана (группы 3 и 4) погибли 4 рака (1 самец и 3 самки). Консистенция гепатопанкреаса - от плотной до дряблой, цвет светло-коричневый или желто-коричневый (рис. 2А, Б).

При плановом вскрытии раков (рис. 2В, Г) обнаружено, что цвет гепатопанкреаса в разных группах был различным. Индексы гепатопанкреаса в опытных группах не имели достоверных отличий от контроля (табл. 2).

В Г

Рис. 2. Вскрытие речных раков. А - самка, гонады буро-серого цвета; Б - самка, гепатопан-креас желто-коричневый; В - самка, гонады светло-коричневые, гепатопанкреас болотно-зеленого цвета; Г - самец, гонады белые, гепатопанкреас коричневый.

Таблица 2

Показатели гепатопанкреаса в эксперименте

Показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4

Цвет органа Зелено-серый Зелено-серый Темно-зеленый, коричневатый, в одном случае с желтоватыми очагами Темно-зеленый, иногда с черными очагами или ярко-желтый

Индекс, % 4,24±1,06 4,26±1,64 4,34±0,20 4,19±0,14

Гистологические исследования пока- ция гемоцитами интертубулярной стромы

зали, что при моделировании патологии (от незначительной до умеренной). Отек

аллоксаном в дозе 50 мг/кг в гепатопанкре- стромы (от умеренного до выраженного).

асе речных раков происходят следующие На 14-е сутки после введения аллоксана

изменения: усиление вакуолизации Я-кле- гепатопанкреас представлен отдельно рас-

ток, местами некроз групп этих клеток положенными трубочками, выстланными

плоть до некроза единичных трубочек. Б- и уплощенными эпителиальными клетками,

В-клетки просматриваются плохо, либо во- просвет резко расширен, заполнены гу-

обще не дифференцируются; инфильтра- стым секретом (рис. 3).

Рис. 3. Гистологические исследования.

А - выраженная вакуолизация Я-клеток, снижение количества В-клеток, отек интратубу-лярной стромы. Окраска гематоксилином-эозином. Ув. х200.

Б - вакуолизация Я-клеток, местами разрушение стенок В-клеток. Окраска гематоксилином-эозином. Ув. х400.

В - выраженная вакуолизация Я-клеток, В-клетки единичные, отек интратубулярной стромы. Окраска гематоксилином-эозином. Ув. х400.

Г - гепатопанкреас рака на 14-е сутки после введения аллоксана. Окраска гематоксилином-эозином. Ув. х200.

Регенерация

После введения стволовых клеток речным ракам (через 14 суток) мы наблюдали картину восстановления гепатопанкреаса: вакуолизация цитоплазмы Я-клеток уменьшалась (большинство вакуолей мелкие). Форма и положение ядра не изменены. Местами отек (от незначительного до умеренного) интертубуляр-ной стромы с неравномерно выраженной, преимущественно незначительной инфильтрацией рыхло расположенными гемоцитами. Б-клетки просматриваются плохо. Просветы трубочек в большинстве полей зрения свободны (рис. 4).

... ^ ,

• ____ »

Рис. 4. Признаки регенерации патологически измененного гепатопанкреаса речного рака. Снижение вакуолизации Я-клеток (снижение как количества, так и величины вакуолей). В-клетки хорошо просматриваются, их количество не уменьшено. Окраска гематоксилином-эозином. Ув. х400.

Заключение

Таким образом, после введения клеток костного мозга мышей в организме речных раков с искусственно вызванной аллоксаном патологией происходит восстановление гепатопанкреаса.

Список литературы

1. Исаева В.В., Шукалюк А.И., Ахмадиева А.В.

Стволовые клетки беспозвоночных животных с репродуктивной стратегией, включающей бесполое размножение II Биология моря. 2007. Т. 33.№1.С. 3-1.

2. Касинская Н.В., Степанова О.И., Каркищен-ко Н.Н., Каркищенко В.Н., Семенов Х.Х., Бескова Т.Е., КапанадзеГ.Д., Ревякин А.О., День-гина С.Е. Ген зеленого белка как маркер при трансплантации стволовых и прогениторных клеток костного мозга II Биомедицина. 20ll.№ 2. С. 30-34.

3. Прыжкова М.В., Лагарькова М.А. Стволовые клетки: современные тенденции исследований II Онтогенез. 2004. № 6. Т. 35. С. 473-475.

4. Akhmadieva A.V., Shulalyuk A.I., Isaeva V.V. Interstitial cells in reproductive strategy of colonial hydroid Obelia longissima II Amer. Soc. Cell Biol. 45th Annu. Meet. (San Francisco, December, 2005): Molecular Biology of the Cell. 2005. Vol. 16. No. 11 (suppl.). P. 752.

5. Federico Quaini M.D., Konrad Urbanek M.D., Antonio P., Beltrami M.D., Nicoletta Finato M.D., Carlo A Beltrami M.D., Bernardo Nadal-Ginard M.D., Ph.D. Jan Kajstura Ph.D. Annarosa LeriM.D., Piero Anversa M.D. Chimerism of the Transplanted Heart II N. Engl. J. Med. 2002; 346:5-15.

6. Laird D.J., Weissmanl.L. Telomerase maintained in self-renewing tissues during serial regeneration of the urochordate Botryllus schlosseri II Develop. Biol. 2004. Vol. 273. P. 185-194.

7. Reya Т., Morrison S.J., Clarke M.F., Weissman I.L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 2001.414: 105-111.

8. Rybakov A.V., Shukalyuk A.I.Thylacoplethus a new species of colonial rhizocephalans (Crustacea: Rhizocephala: Thompsoniidae) parasitic on a northwest Pacific hermit crab Pagurus trigonocheirus (Stimpson) II J. Mar. Biol. Assoc. UK. 2004. Vol. 84. P. 1009-1017.

9. Stojkovic M., Lako M., Strachan Т., Murdoch A. Derivation, growth and applications of human embryonic stem cells II Reproduction. 2004. N. 128. P. 259-267.

10. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts II Science. 1998. N. 282. P. 1145-1147.

Regeneration hepatopancreas of crayfish after transplantation of stem cells from mice-donors

G.I. Pronina, N.Yu. Koryagina, A.O. Revyakin, G.D. Kapanadze, O.I. Stepanova, Zh.O. Kurischenko, N.V. Petrova

The experiment showed successful regeneration ofhepatopancreas ofcrawfishesafteraxenotransplantation of stem cells from mice-donors.

Key words: stem cells, hydrobionts, crawfishes, hepatopancreas.