Разработка нового экспресс-метода оценки физиологического влияния пива

ОСНОВА КАЧЕСТВА ПРОДУКЦИИ

ТЕМА НОМЕРА

УдК 66.663.47

разработка нового экспресс-метода оценки физиологического влияния пива

С. Г. Давыденко,

канд. биол. наук; А. Т. Дедегкаев,

канд. техн. наук

Пивоваренная компания «Балтика»

Т. В. Меледина,

д-р техн. наук, профессор Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики

Пиво — один из древнейших напитков, который используется человечеством на протяжении тысячелетий, что является главным аргументом в пользу того, что при употреблении в умеренном количестве оно не наносит существенного вреда здоровью людей. Тысячелетняя репутация пива — лучшее подтверждение его безопасности при умеренном потреблении. С давних времен пиво использовалось в народной медицине, поскольку считалось, что оно улучшает аппетит, стимулирует лактацию у женщин, оказывает позитивное действие при расстройствах пищеварения. Антисептические свойства хмеля были известны врачам Средневековья [1].

Тема влияния алкогольных напитков на организм человека очень актуальна. Постоянно проводится изучение различных аспектов этой проблемы. Показано, что употребление больших количеств алкоголя приводит к алкогольному гепатиту, жировому перерождению и циррозу печени. Стоит отметить, что высокий коэффициент корреляции был обнаружен между употреблением крепких алкогольных напитков на душу населения и смертностью от цирроза печени. Однако для пива такую зависимость авторам не удалось выявить [1, 2]. Основными кандидатами на роль гепатопротекте-ров в пиве являются бетаин и фолиевая кислота. Пиво стимулирует секрецию поджелудочной железы, желудочного сока и панкреатических ферментов, в результате чего пища усваивается эффективнее. Стимулирующее действие на секреторные процессы оказывают горькие вещества хмеля — гумулоны и лупулины, а также органические

кислоты [1-3]. Пиво является эффективным средством профилактики мочекаменной болезни и снижает риск образования камней в почках [2]. Необходимо отметить, что благодаря изотоническим свойствам и высокому содержанию воды в пиве этанол, поступающий с напитком, не оказывает дегидратирующего действия на организм.

Кроме того, пиво богато кремнием, который участвует в образовании костной ткани. Изо-а-кислоты пива могут предотвращать остеопороз.

Пока нет ясности в вопросе о влиянии пива на сердечно-сосудистую деятельность. Скорее всего это связано с тем, что малые дозы алкоголя оказывают положительное и даже стимулирующее действие, а высокие дозы — отрицательное. Существует много обзорных статей, посвященных влиянию пива на организм человека. Например, А. К. Жанатаев с соавторами рассматривает пиво как функциональный продукт и анализирует данные многих авторов о его влиянии на функции человеческого организма [2]. В статье приводятся данные Хен-некенса с соавторами, показавшими, что среди мужчин, употребляющих 1 л пива в день, смертность от коронарной болезни сердца была более чем в три раза ниже, чем у лиц, мало или совсем не употребляющих алкогольных напитков. В другой работе было продемонстрировано, что у лиц, регулярно потребляющих в неделю по 4-9 л пива, количество инфарктов почти в 3 раза ниже, чем в целом по популяции. Однако положительное действие пива начинает снижаться при употреблении более 1 л напитка в день (цит. по [2]).

26 ПИВО и НАПИТКИ 6 • 2014

б5ЕЗОПАСНОСТЬ — ОСНОВАКАЧЕСТВАПРОДУКЦИИ

Этанол влияет на систему свертывания крови и на процессы липидного обмена. Было показано, что при потреблении пива, с одной стороны, значительно повышается устойчивость липо-протеидов плазмы крови к перекисному окислению, а с другой — происходит снижение гомоцестеина в сыворотке крови на фоне увеличения содержания фолиевой кислоты и бетаина. Изменение липидного обмена и снижение содержания гомоцистеина в крови, приводящего к атеросклерозу сосудов и к артериальной и венозной тромбоэмболии, способствует уменьшению риска атеросклероза и деградации сосудов.

Весьма спорным также является вопрос о канцерогенных и антиканцерогенных свойствах пива. На роль первых прежде всего претендуют нитроза-мины, полициклические ароматические углеводы, остатки пестицидов и гербицидов. Однако их концентрации в пиве очень малы. Например, содержание нитрозаминов в пиве в 5-7 раз ниже, чем в мясе.

Гумулоны хмеля и фоливая кислота обладают антиканцерогенными и антипролиферативными эффектами по отношению к опухолевым клеткам. Блокируя активность цитохрома Р450 печени, гумулоны препятствуют переходу проканцерогенов в канцерогены. Фоливая кислота участвует в синтезе S-аденозилметионина — донора ме-тильных групп для процесса метилирования ДНК и РНК, регулирующего экспрессию генов, включая опухолевые супрессоры и онкогены [1-3].

Существует мнение, что во время брожения дрожжи могут выделять в пиво и другие напитки вещества, токсичные для человеческого организма. Это прежде всего высшие алифатические спирты (пропиловый, изобутиловый, изоамиловый и др.) и высшие ароматические спирты (2-фенилэтанол, цис-3-гексанол и др.). Ароматические соединения хмелевого масла представлены терпенами (мирценом, гуму-леном, фарнезеном, р-кариофилленом и др.) и терпеновыми спиртами (лина-лоуолом, гераниолом). Биологическое действие этих веществ мало изучено. Из полифенолов в пиве в основном представлены антоцианидины, кате-хины, эпикатехины, кверцетин, феру-ловая кислота и т. д. Показано, что эти вещества оказывают положительное антиоксидантное действие, предупреждают образование тромбов и нормализуют липидный обмен. Горькие вещества хмеля — гумулоны, лупулины

и др. оказывают седативное и бактерицидное действие.

Задачей данной работы явилось создание экспресс-метода оценки токсичности напитков, основанного на изменении активности брожения дрожжей в зависимости от токсичности изучаемого вещества с использованием в качестве тест-объекта дрожжей Saccha-romyces cerevisiae Y-3194 [4].

Культивирование микроорганизмов проводили на стандартных средах. Среда YEPD содержит 10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л пептона, 20 г/л глюкозы, 20 г/л агара. Использовали компоненты для сред фирмы Difco.

Ранее нами был разработан метод оценки активности пивных дрожжей по определению интенсивности образования CO2 [4].В чашке Петри смешивали 0,25 мл 8-кратной среды YPD, 0,5 мл 400 г/ л раствора глюкозы, 0,05 мл воды и 1 мл суспензии дрожжей c концентрацией клеток 2,0108 кл./мл. Добавляли 0,2 мл исследуемого дегазированного напитка. Позитивным контролем была вода, а к негативной пробе добавляли 0,2 мл 96%-ного этилового спирта. Получившуюся суспензию набирали в одноразовый медицинский шприц объемом 10 мл. В случае образования воздушных пузырей вытесняли попавший воздух с помощью поршня, оставляя в шприце 2 мл исследуемой суспензии. Нижний конец шприца герметично запаивали (начинающий расплавляться при нагревании в пламени в течение 10 с пластиковый конец шприца зажимали металлическим пинцетом). Перемешивали растворы 5-кратным переворачиванием шприцев, и помещали шприцы в термостат в горизонтальном положении. Затем инкубировали 120 мин при 30 °С и измеряли высоту поднятия поршня. Влияние напитка на тест-объект вычисляли по формуле

A =

эксп контр ' контр ' '

где A — влияние напитка; H — вы-

1 эксп

сота поднятия поршня при добавлении исследуемого вещества, см; H — вы-

контр

сота поднятия поршня при добавлении воды, см.

Если Л<100%, то исследуемое вещество токсично. Если Л >100%, то вещество положительно влияет на физиологическую активность дрожжей.

Дыхательную активность определяли с помощью иодонитротетразолиум хлорида (iodonitrotetrazoliumchloride) (INT) [4]. Дрожжи центрифугировали 5 мин при 3000 об./мин, сливали надо-

садочную жидкость и снова ресуспен-зировали в физиологическом растворе до конечной концентрации 1Т07 клеток/мл. Добавляли к 0,2 мл этой суспензии 0,08 мл 0,4%-ного раствора ио-донитротетразолиум хлорида (Sigma) в стерильной пробирке и инкубировали 30 мин при 30 °С. В присутствии INT живые клетки образуют красные гранулы, которые детектируются при ми-кроскопировании в светлом поле. Использовали микроскоп Axioskop 40 фирмы Zeizz, объектив х100, масло нефлюоресцирующее (Zeiess). Проводили подсчет клеток с большим и сниженным количеством гранул формазина, а также c их отсутствием.

Результаты

В наших экспериментах по оценке токсичности мы использовали 3 показателя: скорость брожения и обмена веществ пивоваренных дрожжей S. cere-visiae, активность фермента оксидоре-дуктазы (окраска INT) у дрожжей и их жизнеспособность.

Для отработки метода были выбраны напитки, отличающиеся по своему токсическому действию. Литературные данные свидетельствуют о токсичности высоких концентраций этанола. В эксперименте мы использовали 0,2 мл пробы с этанолом в следующих концентрациях: 96%, 40%, 4,7%, а также светлое пиво (4,7%) и светлое безалкогольное пиво (0,5%) на общий объем пробы, равный 2 мл. На рис. 1а видно, что суспензия с 0,2 мл 96%-ного этанола (9,6% этанола в конечной пробе) убивает практически все находящиеся в ней дрожжевые клетки (рис. 1 а, фото 2). Мертвые клетки окрашиваются метиленовым синим в синий цвет. 20% мертвых клеток появляется в пробе, содержащей 0,2 мл 40%-ного этанола (4% этанола в конечной пробе) (рис. 1а, фото 3), в то время как в пробах, содержащих 0,2 мл легкого и безалкогольного пива, содержание мертвых клеток такое же как в позитивном контроле (рис. 1а, фото 1, 4, 5).

Четко видно, что окислительно-восстановительные процессы (активность фермента оксидоредукта-зы (окраска INT) в клетках с 0,2 мл 96%-ного этанола (9,6% этанола в конечной пробе) практически полностью блокированы (рис. 16, фото 2). Такая концентрация спирта в конечной пробе полностью блокирует оксидоредуктазу, ни одна клетка не содержит красных гранул, образующихся в результате работы этого фермента.

0

1 <

§

ш I-

6•2014

ПИВО и НАПИТКИ 27

ш h

БЕЗОПАСНОСТЬ-ОСНОВАКАЧЕСТВАПРОДУКЦИИ'

Как можно было ожидать, токсичное действие этанола оказало негативное влияние на физиологическую активность дрожжей, используемых в качестве тест-объекта (рис. 2, пробирки 2, 3).

Для выявления потенциально токсичных веществ в пиве мы сравнивали действие воды, светлого и безалкогольного пива, а также 4,7%-ного этанола (рис. 3, дорожки 1, 4, 5 и 6) на интенсивность выделения С02

дрожжами. Видно, что 4,7%-ный этанол (0,47% в конечной пробе) оказывает слабое токсическое действие: уровень поршня к контрольной пробе (дорожка 1) и в пробе с пивом (дорожка 4) чуть выше, чем в пробе 6. Следовательно, пиво не содержит дополнительных токсических веществ, существенно влияющих на активность используемого нами тест-объекта. В то же время заметное ингибирую-щее действие оказывает добавление

в пробу 96%-ного и 40%-ного этанола (при этом конечная концентрация этанола в пробе невысока — соответственно 9,6 и 4% этанола V/ V) (рис. 3, дорожки 2, 3).

Безалкогольное пиво (рис. 3, дорожка 5), содержащее все обычные вещества напитка, кроме этанола, даже оказывает стимулирующее действие на тест-объект, в основном благодаря содержанию в нем дополнительного количества сахаров по сравнению

4 14 im

f , А

*  9

*

:

•Л *

у 1

А 2 Л ( ti 1 (Т

Г* 'V' Ml * - * .  £ ' ' *

* 1 1 *1 . 4 . if j A

Ф I d # 1 •

с г

£ 5 0 * T

Рис. 1. Токсичное воздействие этанола на дрожжи: а — окраска метиленовым синим; б — окраска

иодонитротетразолиум хлоридом (INT). 1 — вода; 2 — 96%-ный этанол; 3 — 40%-ный этанол; 4 — светлое пиво с 4,7% V/V ; 5 — безалкогольное пиво с 0,5% V/V

' ' этанола' ' ' этанола

б

4

28 ПИВО и НАПИТКИ 6 • 2014

б5ЕЗОПАСНОСТЬ — ОСНОВАКАЧЕСТВАПРОДУКЦИИ

Рис. 2. Токсичное воздействие этанола на дрожжи.

Окраска иодонитротетразолиум хлоридом (INT). Пробирки: 1 — вода; 2 — 96%-ный этанол; 3 — 40%-ный этанол; 4 — 4,7%-ный этанол; 5 — светлое пиво с 4,7% V/V ; 6 — безалкогольное

' ' этанола ^ ^

пиво с 0,5% V//этанш]а

Рис. 3. Тест на интенсивность выделения С02 при 30 °С в течение 2 ч. Дорожки: 1 — вода; 2 — 96%-ный этанол;

3 — 40%-ный этанол;

4 — светлое пиво 4,7% ^ДЭТанола;

5 — безалкогольное пиво 0,5% И/И,танола;

6 — 4,7%-ный этанол

ш

I-

с обычным пивом и водными растворами. То есть содержание ингибирующих веществ в пиве настолько мало, что оно даже не выявляется по сравнению с контрольной пробой, где вместо пива содержится вода (рис. 3, соответственно дорожки 1 и 4).

Чем выше концентрация этанола в пробе, тем меньший объем С02 выде-

ляется и выталкивает поршень на меньшее расстояние. Кроме того, преимущество предложенного нами метода — возможность количественной оценки интенсивности выделения CO2 (рис. 3).

Таким образом, выраженным токсическим действием в наших экспериментах обладают пробы с 0,2 мл 40% V/ V и 0,2 мл 96 % V/ V , при этом

' ' 11 этанола' *

120100 -806040200--

0

-20-40-60-

99,8

98

45

Вода 96%-ный этанол 40%-ный этанол Светлое пиво, 4,7% Безалкогольное

а пиво, 0,5%

-------------------------------------------------------------------------- 70 ------------------

20

Вода шш Безалкогольное 6%-ный этанол 40%-ный этанол Светлое пиво, 4,7% пиво, 0,5%

0 0 0 ' ^ — 0 1 0 -20 -20 -10

-64

-75

-100-100 -100

б

Физиологический тест с CO2 мм Доля живых клеток, % Доля клеток с формазаном, %

Рис. 4. Сравнение влияния напитков на физиологическую активность дрожжей: а — физиологическая активность дрожжей; б — доля влияния для всех трех тестов, %

конечная концентрация этанола в пробах в 10 раз ниже — 4% V/ V и 9,6% V/ V соответственно. При более внимательном рассмотрении видна разница между контрольной пробой и пробой, содержащей 0,2 мл 4,7% V/V

, г ' этанола

(0,47% V/ Ктанола в пробе) (рис. 3, дорожки 1 и 6).

Следовательно, предлагаемый нами метод обладает достаточно высокой чувствительностью. Хотелось бы подчеркнуть тот факт, что проба со светлым пивом имеет еще менее заметный эффект по сравнению с пробой, содержащей 0,2 мл 4,7% V/ V , и прак-

этанола

тически не отличается по токсическому действию от контрольной пробы (рис. 3, дорожки 4, 6 и 1, соответственно). Следовательно, содержащиеся в пиве вещества брожения не оказывают заметного ингибирующего влияния на тест-объект, в то время как в пробах с 0,2 мл 40% V/ V и 0,2 мл 96% V/ V на-

этанола

блюдается явный негативный эффект, обусловленный высоким содержанием этанола (рис. 3, дорожки 2 и 3).

Для более наглядного выявления тенденции влияния веществ процент влияния для всех трех тестов вычисляли по формуле (1).

Данные экспериментов о влиянии пива и этанола на физиологичекую активность тест-объекта представлены на рис. 4.

Несмотря на последние тенденции, формирующие у населения негативное отношение, пиво остается популярным продуктом на рынке. Оно является одним из наиболее сложных по составу алкогольных напитков. Кроме основных компонентов пива — воды, углеводов, этилового спирта и азотсодержащих веществ, — в нем содержатся минеральные соединения, витамины, органические кислоты, фе-

99

79

62

53

40

36

29

16

9

000

6 • 2014 ПИВО и НАПИТКИ 29

БЕЗОПАСНОСТЬ-ОСНОВАКАЧЕСТВАПРОДУКЦИИ'

Ш

S

0

1 <

§

ш h

нольные и ароматические вещества, амины, фитоэстрогены, горькие вещества и т. д. В процессе брожения синтезируются альдегиды, высшие спирты и эфиры. Как уже обсуждалось, потенциально они могут оказывать как позитивное, так и негативное влияние на организм человека. Мы использовали созданный нами ранее экспресс-метод оценки физиологической активности дрожжей [3], чтобы продемонстрировать, увеличивают ли подобные вещества общую токсичность пива по сравнению с водным раствором этанола той же концен-

трации. В результате выполненных экспериментов нам удалось показать что вещества брожения не оказывают заметного ингибирующего влияния на тест-объект и, следовательно, содержание потенциально токсичных веществ в проанализированном нами светлом и безалкогольном пиве, по всей вероятности, минимально, так как пробы практически не отличаются от контроля с водой. В то же время повышенное содержание этанола приводит к существенному угнетению метаболизма и даже гибели использованного нами тест-объекта.

ЛИТЕРАТУРА

1. Biendl, M. Hops and Health / М. Biendl, С. Pinzl // Publications of the German Hop Museum Wolnzach. — 2008. — № 7. — 123 с.

2. Пиво как функциональный продукт и его влияние на здоровье / А. К. Жанатаев [и др.] // Хранение и переработка сельхозсырья. — 2003. — № 4. — С. 24-32.

3. Нужный, В. П. Пиво: химический состав, пищевая ценность, биологическое действие и потребление http://sovet.cnt.ru/analit/pivo. htm.

4. Давыденко, С. Г. Создание и применение нового экспресс-метода оценки качества семенных дрожжей/ С. Г. Давыденко // Пиво и напитки. — 2012. — № 5. — С. 20-23. <S

Разработка нового экспресс-метода оценки физиологического влияния пива

Ключевые слова

дрожжи; здоровье; напитки; пиво; токсичность. Реферат

Пиво — один из наиболее сложных по составу алкогольных напитков. Кроме основных компонентов — воды, углеводов, этилового спирта и азотсодержащих веществ — в нем содержатся минеральные соединения, витамины, органические кислоты, фенольные и ароматические вещества, амины, фитоэстрогены, горькие вещества и т. д. В процессе брожения синтезируются альдегиды, высшие спирты и эфиры. Потенциально они могут оказывать как позитивное, так и негативное влияние на организм человека. Ранее нами был создан экспресс-метод оценки физиологической активности пивоваренных дрожжей, основанный на изменении интенсивности выделения углекислого газа при брожении в зависимости от условий внешней среды, влияющих на метаболизм тест-объекта. Результаты применения нового метода хорошо коррелировали с результатами других известных методов, характеризующих жизнеспособность дрожжевых культур.

Нам удалось показать, что находящиеся в пиве вещества брожения не оказывают заметного ингибирующего влияния на метаболизм дрожжей и, следовательно, содержание потенциально токсичных веществ в светлом и безалкогольном пиве минимально. Полученные результаты были подтверждены методом, характеризующим интенсивность окислительно-восстановительных процессов в дрожжевой клетке. В то же время повышенное содержание этанола приводило к существенному угнетению метаболизма, уменьшению выделения диоксида углерода, снижению оксидазной активности и даже к гибели использованного нами тест-объекта.

Предлагаемый метод прост в исполнении, не требует наличия дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Результаты, получаемые этим методом, хорошо коррелирует с результатами других методов. Следовательно, применяя его, можно быстро делать предварительную оценку потенциальной опасности тех или иных продуктов, в первую очередь воды и напитков.

Авторы

Давыденко Светлана Геннадьевна, канд. биол. наук; Дедегкаев Александр Тазаретович, канд. техн. наук Пивоваренная компания «Балтика»,

198330, Санкт-Петербург, б-й Верхний пер., д. 3, davydenko@spb.baltika.ru Меледина Татьяна Викторовна, д-р техн. наук, профессор Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, 197101, Санкт-Петербург, Кронверкский пр., д. 49, meledina07@mail.ru

Development of a New Express Method of Beer Physiological Influence Assessment

Key words

yeast; health; drinks; beer; toxicity. Abstract

Beer is one of the most complex alcoholic beverages. Except the main components: water, carbohydrates, ethyl alcohol and nitrogen-containing substances, it contains vitamins, organic acids, mineral, phenolic and aromatic substances, amines, phytoestrogens, bitter substances, etc. Aldehydes, highest alcohols and ethers are synthesized during fermentation. Potentially they can have both positive and negative influence on a human metabolism.

Earlier we created an express method of brewing yeast physiological activity assessment, based on intensity of carbon dioxide production during fermentation depending on the environmental conditions influencing metabolism of the test object. Results of application of a new method well correlated with the results of other known methods characterizing viability of yeast cultures.

We managed to show that, fermentation substances have no noticeable inhibiting impact and, therefore, the content of potentially toxic substances in light and nonalcoholic beer is very low.

The received results were confirmed by the method characterizing intensity of oxidation-reduction processes in yeast cells. At the same time the high content of ethanol led to essential oppression of yeast metabolism, reduction of carbon dioxide production, decrease in oxidase activity and even the test object's cells death.

The described method is simple performed, doesn't demand expensive equipment and highly skilled personnel. The results received by this method well correlate with results of other methods. Therefore, it is possible to quickly preliminary estimate the potential danger of investigated products, first of all water and drinks.

Authors

Davydenko Svetlana Gennadievna, Candidate of Biological Science; Dedegkayev Aleksandr Tazaretovich, Candidate of Technical Science JSC Baltic Brewery,

3, 6 Verkhny per., St. Petersburg, 194292, Russia, davydenko@spb.baltika.ru Meledina Tatiana Viktorovna, Doctor of Technical Science, Professor St. Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics

49 Kronverksky ave., St. Petersburg, 197101, Russia, meledina07@mail.ru

30 ПИВО и НАПИТКИ 6 • 2014