Способ определения угрозы формирования гемической анемии у беременных на третьем триместре гестации при обострении цитомегаловирусной инфекции, подавляющей активность SH-групп в эритроцитах и приводящей к снижению оксигенации гемоглобина
METHOD FOR DETERMINATION OF THREAT OF HEMIC ANEMIA FORMATION DURING PREGNANCY IN THIRD TRIMESTER OF GESTATION IN CASE OF CYTOMEGALOVIRUS INFECTION EXACERBATION, INHIBITING ACTIVITY OF SH-GROUPS IN RED BLOOD CELLS AND LEADING TO DECREASED HEMOGLOBIN OXYGENATION

1. Цель изобретения - разработать способ, позволяющий выявить формирование угрозы развития гемической анемии у беременных на третьем триместре гестации в связи со снижением оксигенации гемоглобина при подавлении в эритроцитах активности SH-групп на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа гистохимическим методом определять в эритроцитах содержание активности SH-групп с целью диагностировать по их снижению угрозу развития гемической анемии.
3. Раскрытие изобретения
В белковой молекуле среди боковых цепей аминокислотных остатков большая роль принадлежит SH-группам. Это объясняется их высокой химической реакционной способностью вступать в разнообразные реакции со многими типами соединений. Огромный интерес привлекает вопрос определения активности SH-групп в эритроцитах, поскольку нарушение их активности приводит к разрушению белково-липидных связей и активизации перекисного окисления, а также нарушению ферментативной активности. Наряду с этим привлекает внимание большое значение SH-групп для специфических функций ряда ферментов, гормонов и других биологически активных белков, способствующих выполнению метаболических процессов в организме [1, 2, 7, 8]. Снижение содержания SH-групп в глобине и геме приводит к нарушению оксигенации гемоглобина, что приводит к угрозе формирования анемии. В настоящее время установлено, что SH-группы играют важную роль во многих физиологических процессах: мышечном сокращении, регуляции проницаемости мембран, окислительном фосфорилировании [3, 4]. Многие реагенты могут оказывать блокирующее влияние на SH-группы [5]. Торможение активности ряда ферментов под влиянием реагентов на SH-группы обусловлено нарушением трехмерной структуры (конформации) этих ферментов. Такое нарушение может происходить либо в результате разрыва внутримолекулярных связей, в образовании которых вовлечены SH-группы, либо в результате деформирующего действия ингибитора, присоединяющегося к SH-группе на соседние участки макромолекулы белка. В роли ингибиторов на белковые молекулы белка клеточных мембран могут выступать антигены многих вирусов, поскольку они, сливаясь с мембраной клеток, в которую они проникают, вызывают нарушение конформации этих белков и подавляют активность SH-групп.
4. Новая техническая задача
Найти способ гистохимического определения SH-групп в эритроцитах, что позволяет определять цитофотометрическим методом их количественное содержание как в норме, так и различных патологических условиях.
5. Об активности SH-групп в эритроцитах биохимическим методом можно было судить только косвенно, так как при разрушении эритроцитов получается субстрат из многих белков. Выявляя наличие SH-групп гистохимическим методом, получается специфическая реакция, измерение которой доступно в каждом эритроците с последующим подсчетом цитофотометрическим методом. По мере снижения активности SH-групп в эритроцитах усиливается процесс нарушения конформации белков гемоглобина и снижения формирования оксигемоглобина.
6. Прототипами для данного изобретения могут служить работы Козловой H.М. [3], Нагиева Э.Р., Газимагомедовой М.М. [4] и Потапова В.Н. (патент РФ №2142135). Все эти исследования выполнены биохимическим методом после разрушения эритроцитов и определения в полученной смеси реакции на SH-группы, что конечно можно отнести к косвенным принципам определения активности SH-групп. В отличие от вышеприведенных прототипов мы прибегли к принципиально иным методам:
1. Содержание SH-групп в мембранах эритроцитов выявляли гистохимической реакцией по Барнетту-Зелигману [9].
2. Эритроциты не разрушались во время выполняемой реакции, что подтверждается микрофотоснимками [фигура 1, 2].
3. После проведенной реакции остается препарат, на котором находятся эритроциты, и их можно фотографировать, а также цитофотометрическим методом определять количество продукта реакции на SH-группы цитофотометрическим методом в каждом отдельно взятом эритроците.
4. Используя эти возможности, предоставляется возможность судить об устойчивости мембран эритроцитов, а также изменении активности SH-групп в эритроцитах как в норме, так и различных патологических условиях.
5. В своем исследовании мы изучали действия цитомегаловируса на активность SH-групп в эритроцитах и отметили, что снижение их активности приводит к уменьшению активности SH-групп эритроцитов и нарушению оксигенации гемоглобина.
7. Осуществление изобретения
7.1. Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания» СО РАМН. Обследовано 20 рожениц в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией в стадии обострения (основная группа) и 10 беременных без патологии (контрольная группа). Диагноз устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности (65%), а также наличия ДНК к цитомегаловирусу (ЦМВ). Исследования проводились с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2008 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства здравоохранении РФ №266 от 19.06.2003 г.
7.2. Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), методами ПЦР на аппарате ДТ-96 (Россия) с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).
7.3. Монослойные мазки периферической крови приготовляли на центрифуге Stat-Sprin М 700-22 (USA).
8. Выявление SH-групп в эритроцитах.
8.1. SH-группы в эритроцитах периферической крови определяли гистохимическим методом [9] путем помещения эритроцитов в инкубационный раствор, взятых у беременных, перенесших обострение цитомегаловирусной инфекции, а также у здоровых, не болевших на всем протяжении гестации.
8.2. Приготовление инкубационного раствора и этапы проведения реакции.
Состав инкубационного раствора состоял из смеси: 1-25 мг дигидрокси-динафтилдисульфида в 15 мл абсолютного спирта и 2-35 мл ОДМ веронал-ацетатного буфера при рН 8,5. От этой смеси отбирают 500 мкл в пробирку и к ней добавляют 200 мкл цельной крови, взятой накануне у пациентов в пробирку с коагулянтом.
Инкубационный раствор с кровью выдерживают в термостате в течение 1 часа при температуре 56°. После инкубации пробирку извлекают из термостата и выдерживают в течение 10 мин при комнатной температуре. Центрифугируют, надосадочную жидкость убирают и осадок промывают в дистиллированной воде, а затем дважды 0,01% растворе уксусной кислоты. Затем дважды промывают осадок по 2 минуты в сменяемом 96° этиловом спирте, вслед за этим содержат 5 минут в эфире, а затем прополаскивают 96° спиртом и вслед за этим дистиллированной водой. В промытый осадок добавляют на 10 мин 1 мл раствора прочного синего (диазония), приготовленного путем растворения прочного синего - 1 мг/мл - в ОДМ фосфатном буфере рН 7,6-7,8. Центрифугируют, надосадочную жидкость убирают и в течение 2 мин промывают водопроводной водой, а потом дистиллированной. Реакция после этого - выполнена. Центрифугируют, прополаскивают дистиллированной водой, отбирают большую часть надосадочной жидкости, остальное взбалтывают, капли взвешенных эритроцитов наносят на предметное стекло и изготовляют монослойный мазок на центрифуге Diff Spin Slide Spinner M 700-722 (USA). Подсушивают и изучают под цифровым микроскопом, связанным с компьютером для изучения полученных данных по цитофотометрической программе «Scion» (USA), позволяющей определять автоматически количество продуктов реакции (в данном случае SH-групп) в каждом эритроците (фигура 1). В расчет брали 100 эритроцитов от каждого случая.
9. Содержание оксигемоглобина у пациентов определяли по методу Эвелина и Мэллой [6].
10. Статистическая обработка проводилась параметрическим критерием Стьюдента.
2
2
В процессе исследования установлено, что обострение хронической цитомегаловирусной инфекции до титра антител к цитомегаловирусу 1:1600 на третьем триместре гестации приводит к снижению количества SH-групп в эритроцитах периферической крови у беременной на третьем триместре гестации до 3,0±0,02 пикселей/ммк (фигура 1); контроль - 18,00±0,35 пикселей/ммк (фигура 2). Это приводит к снижению оксигемоглобина у беременных на третьем триместре гестации до 86,50±1,2%, что создает угрозу формирования у беременной гемической анемии.
Литература
1. Ильин B.C., Титова Г.В. Химические факторы регуляции активности и биосинтеза ферментов. М.: Медицина. 1969. 360 с.
2. Кленова Н.А., Кленов P.O. Механизмы генерации пептидов эритроцитами человека // Вестник Сам ГУ Естеств. серия. 2006. №7(47). С. 75-79.
3. Козлова Н.М., Касько Л.П., Кутько А.Г., Петрович В.А., Сержан Т.А., Слобожанина Е.И. Активность ферментов антиоксидантной защиты и окисление мембранных белков в эритроцитах женщин при некоторых патологиях беременности // Институт биофизики и клеточной инженерии НАЛ Беларуси. 2010. С. 1-10.
4. Нагиев Э.Р., Газимагомедова М.М. Структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов при остром отравлении метафосом и введении перфторана // Биомед. химия. 2003. Т. 49. №2. С. 138-144.
5. Потапов В.Н. Способ диагностики преморбидного состояния. Патент RU 2142135. Ин-т медицинской климатологии и восстановительное лечения СО РАМН.
6. Покровский А.А. Биохимические методы исследования. Справочник. М.: Медицина. 1969. 337 с.
7. Торчинский Ю.М. Сульфгидрильные и дисульфидные группы белков. М.: Наука. 1971. 228 с.
8. Baker B.R. Design of active site directed irreversible enzyme inhibitors. N.Y.J. wiley and Sons. 1967. P. 202.
9. Kiszely. Gyakorlati mikrotechnika ES HISZTOKEMIA. Medicina . Budapest. 1958. 399 p.