Методологические подходы к идентификации технологически значимой микрофлоры сырокопчёных колбас с использованием ПЦР

МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ИДЕНТИФИКАЦИИ

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИ ЗНАЧИМОЙ МИКРОФЛОРЫ СЫРОКОПЧЁНЫХ КОЛБАС С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЦР

К. А. Курбаков, М. Ю. Минаев, канд. техн. наук, Д. С. Батаева, канд. техн. наук ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова

П данной статье описываются методологические В подходы к идентификации технологически значимых микроорганизмов с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанных на подборе родо, группо- и видоспецифических праймеров с высокой разрешающей способностью.

УДК 637.524.5:579 Ключевые слова:

ПЦР, микрофлора сырокопчёных колбас, методы контроля

Введение

В настоящее время большинство сырокопчёных колбас вырабатываются по ускоренной технологии с применением стартовых культур, в состав которых могут входить микроорганизмы различных родов, в том числе Lactobacillus spp., Pediococcus spp., Staphylococcus spp., Micrococcus spp..

Мясное сырье, используемое при производстве сырокопченых колбас не подвергается предварительной пастеризации как молоко перед приготовлением кисломолочных продуктов. Оно содержит большой спектр индигенной микрофлоры, включая молочнокислые микроорганизмы (МКБ), которые могут оказывать существенное влияние на процессы созревания сырокопчёных колбас, в том числе и негативное. Известно, что гетероферментативные МКБ, в частности микроорганизмы рода Leuconostocus обладают широким спектром неблагоприятной для процессов созревания колбас биохимической активности: они активно образуют газ, перекиси, вырабатывают биогенные амины и, что самое главное, могут подавлять развитие собственно стартовых культур.

Таким образом требуются быстрые и достоверные методы контроля качества как самих бактериальных препаратов, так и методы контроля развития стартовой культуры в самом продукте на всех этапах его производства. Такие методы обеспечат необходимый уровень прослеживаемости процессов, выявление критических точек производства, позволят вовремя предпринять корректирующие мероприятия.

В настоящее время контроль бакпрепарата или мясного сырья на наличие молочнокислых микроорганизмов может

проводиться по ГОСТ 10444.11-89 [1] и ГОСТ Р 54065-2010 [2]. Однако методы данных ГОСТ требуют длительного культивирования и выделения чистой культуры. При этом возможно выявление только преобладающей культуры, что не позволит идентифицировать состав мультиштам-мовых препаратов.

Эффективных методов идентификации и контроля количества всех стартовых культур в препарате, динамики развития МКБ индигенной микрофлоры не разработаны, в связи с чем возникает необходимость в новом методологическом подходе.

Для этих целей целесообразно использовать метод ПЦР. При подборе родо, группо- и видоспецифических праймеров с высокой разрешающей способностью можно установить наличие искомых родов или видов микроорганизмов в продукте без выделения чистой культуры. Однако метод ПЦР имеет определенные ограничения при установлении наличия в продукте того или иного заведомо неизвестного вида микроорганизма. Проводить в этом случае анализ микрофлоры с использованием прай-меров для идентификации всех возможных видов технологически значимых микроорганизмов не представляется рациональным. Поэтому при выявлении технологически значимых микроорганизмов в мясной продукции методом ПЦР возникает необходимость в поэтапном проведении анализа.

На первом этапе целесообразно определение рода или филогенетической группы исследуемых микроорганизмов для дальнейшего выбора видовых праймеров микроорганизмов, входящих в эту группу или род.

Целью данной работы является разработка пар прай-меров для идентификации рода или филогенетической группы исследуемых микроорганизмов методом ПЦР в реальном времени технологически значимых микроорганизмов в ферментированной пищевой продукции.

Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Сгруппировать по филогенетическому родству виды микроорганизмов, используемых в мясной промышленности.

2. Подобрать участки генов и произвести дизайн прай-меров для групповой и видовой идентификации исследуемых микроорганизмов.

3. Отработать метод ПЦР с использованием полученных праймеров и на чистых культурах микроорганизмов и пищевой продукции.

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили:

1. Международная база данных геномов NCBI;

2. Штаммы целевых микроорганизмов Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sakei, Staphylococcus carnosus;

3. Пищевая продукция, произведенная с применением стартовых культур.

Анализ генома молочнокислых бактерий с выбором в нем участков, обладающих различной разрешающей способностью осуществляли при помощи международной базы данных геномов NCBI, дизайн праймеров по выбранному фрагменту ДНК - с использованием программы Primer Express, оптимизацию реакции - на основе градиента концентрации температуры плавления. ДНК выделяли набором «ДНК-сорб-АМ» компании ИнтерЛабСервис. ПЦР в реальном времени осуществляли на анализаторе АНК-32

Рисунок 1. Кривые амплификации ДНК с праймерами для обнаружения микроорганизмов рода Staphylococcus. 1 - ПКО (St. carnosus); 2 - сырокопчёная колбаса, выработанная с применением стартовой культуры, в состав которой входит St. carnosus; 3,4 - стартовые культуры, в состав которых входит St. carnosus; 5-6 - сырокопчёные колбасы, выработанные без применения стартовой культуры.

с использованием флуоресцентного красителя EVAGreen.

Культивирование молочнокислых микроорганизмов проводили на агаризованной среде MRS, микроорганизмов рода Staphylococcus - на Байд-Паркер агаре.

Результаты исследований

Был проанализирован видовой состав стартовых культур на основании доступной технической документации и данных при государственной регистрации продукции. Установлено, что используются микроорганизмы следующих видов: L. plantarum, L. pentosus, L. sakei, L. curvatus, St. carnosus, St. xylosus, P. pentosaceus, P. acidilactici.

В связи с тем, что согласно ГОСТ Р 55456-2013 «Колбасы сырокопченые. Технические условия» при изготовлении сырокопченых колбас запрещено использовать стартовые культуры содержащие микроорганизмы рода Staphylococcus, для его выявления нами был подобран характерный для всего рода Staphylococcus участок ДНК, который использовали в качестве матрицы для дизайна родоспецифичных праймеров.

Данные праймеры были апробированы на чистой культуре St. carnosus и на продукции выработанной как с применением микроорганизмов рода Staphylococcus, так и без их применения Результаты реакций представлены на рисунке 1.

Из рисунка 1 видно, что данные праймеры обладают достаточной специфичностью и разрешающей способностью. Достоверность полученных результатов подтверждалась кривыми плавления, т.к. подобные тест-системы основаны на применении интеркалирующего красителя (EVAGreen).

Как видно из рисунка 1 (кривая аплификации 2), логарифмический рост кривой амплификации происходит на достаточно раннем цикле, что свидетельствует о значительном количестве микроорганизмов рода Staphylococcus в образце. Микробиологические исследования показали наличие St. carnosus в количестве 2*107 КОЕ/г, что нехарактерно для сырокопчёных колбас, выработанных традиционным методом. Соответственно, можно предположить, что при производстве данной колбасы была использована стартовая культура рода Staphylococcus.

В настоящее время по степени сходимости генома 16S РНК молочнокислые микроорганизмы делятся на несколько групп, из которых для мясной промышленности имеют значение группа L. plantarum (L. plantarum, L. pentosus) и группа L. sakei (L. curvatus, L. sakei, L. graminis) [3].

Так, анализ сходимости гена proA РНК-полимеразы показал наличие участков ДНК по которым можно осуществить дизайн праймеров по указанным выше группам. В результате поиска групп-специфических участков ДНК, характеризующих род Lactobacillus, были подобраны 2 пары праймеров с необходимой разрешающей способностью. Данные прай-меры были проверены на музейных штаммах, доказана их специфичность. Результаты показаны на рисунках 2, 3.

2014 | №4 ВСЕ О МЯСЕ

Рисунок 2. Кривые амплификации ДНК с использованием праймеров для обнаружения микроорганизмов группы L. р!а^ашт. 1 - ПКО р!а^ашт), 2 - сырокопчёная колбаса, выработанная с применением мультиштаммовой стартовой культуры, в состав которой входил L. р!а^агит.

Рисунок 3. Кривые амплификации ДНК с использованием праймеров для обнаружения микроорганизмов группы L. sakei. 1 - ПКО sakei); 2 - сырокопчёная колбаса №1, выработанная с применением стартовой культуры, в состав которой входит L. sakei и L.cuгvatus; 3 - сырокопчёная колбаса №2, выработанная с применением стартовой культуры, в состав которой входит L. sakei.

Из рисунков 2 и 3 видно, что данные группоспецифи-ческие праймеры обладают достаточной специфичностью и разрешающей способностью. С их помощью было подтверждено наличие тех групп микроорганизмов в колбасных изделиях, применение которых было заявлено, таких как группа L. plantarum

Для более детального изучения технологически значимых культур, а именно установление их вида необходимо использовать методом ПЦР в реальном времени с применением TaqMan-зондов. Это является вторым этапом при идентификации.

Выводы

На основе анализа литературных данных подобраны участки генов и произведен дизайн праймеров для родовой и групповой идентификации технологически значимых микроорганизмов, определены и сгруппированы по филогенетическому родству виды микроорганизмов, используемых в мясной промышленности.

Праймеры для определения микроорганизмов филогенетических групп L. sakei и L. plantarum и рода Staphylococcus были апробированы на ферментированной мясной продукции. Экспериментально установлено нали-

чие в исследуемои продукции тех групп технологически значимых микроорганизмов, которые входили в состав используемых бактериальных препаратов.

Использование данных праИмеров позволит определить род или филогенетическую группу исследуемых микроорганизмов для дальнейшего выбора видовых праИмеров. |

КОНТАКТЫ

Константин Андреевич Курбаков Михаил Юрьевич Минаев Дагмара Султановна Батаева

+7 (495)676-60-1 1

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Государственная программа развития сельского хозяйства и регулирования рынков сельскохозяйственной продукции, сырья ГОСТ 10444.11-89 Продукты пищевые. Методы определения молочнокислых микроорганизмов;

2. ГОСТ Р 54065-2010 Средства лекарственные для ветеринарного применения пробиотические. Методы определения пробио-тических микроорганизмов Окончательная редакция ГОСТ Р «Колбасы сырокопченые. Технические условия».

3. Машенцева Н.Г., Хорольский В.В., Функциональные стартовые культуры в мясной промышленности // М.: ДеЛи принт, 2008, 336 с.

НА ПРАВАХ РЕКЛАМЫ

ИНТЕРВЬЮ СО СПЕЦИАЛИСТОМ

Та самая «Докторская», но по стандартам халяль

На вопросы пресс-службы отвечает Трофимов Максим Сергеевич, отраслевой технолог мясного направления ГК«СОЮЗСНАБ».

Мясная продукция с маркировкой «халяль» набирает сегодня все большую популярность на рынке. Значение термина халяль для большинства потребителей давно ассоциируется не только с религиозными традициями, но и с высоким качеством выпускаемой продукции. Сегодня многие популярные в России колбасы выпускаются под маркировкой «халяль». Среди них и колбаса «Докторская». О том, как произвести данный продукт без свинины с высокими качественными характеристиками и низкой себестоимостью мы расспросили Трофимова Максима Сергеевича — отраслевого технолога ГК «СОЮЗСНАБ» мясного направления.

Максим Сергеевич, вы разработали рецептуру колбасы «Докторской» халяль. Насколько она отличается по вкусу от традиционного продукта, выработанного с использованием свинины?

М.С.: По вкусу вареная колбаса, выработанная по нашей рецептуре, полностью идентична классической «Докторской». Эта «та самая» колбаса из советского прошлого, по которой сегодня ностальгируют многие представители старшего поколения. Согласно требованиям к халяльной продукции мы заменили в рецептуре свинину на говядину и куриное филе. А вкус и аромат сформирован благодаря использованию Комплексной добавки Оригинальная Del'Ar 10.07.100 В. Именно на этом ингредиенте мне хотелось бы сделать акцент. Так как вкус является основным преимуществом продукта, вырабатываемого по нашей рецептуре.

Вкус, безусловно, - один из важнейших факторов выбора продукции потребителем, но покупателя волнует еще

и цена. Какова она у продукта, разработанного по вашей рецептуре?

М.С.: Нам удалось разработать продукт с невысокой себестоимостью -в среднем 106 рулей за 1 килограмм, благодаря 30% замене мясного сырья. В качестве замены мы используем эмульсию из конского жира на основе Стабилизатора Гелеон 188 М-М. Данная эмульсия позволяет сохранить нежную консистенцию продукта и снизить его себестоимость.

Кстати о консистенции вареной колбасы... Традиционная «Докторская» отличается плотной структурой, ровным срезом. Вам удалось добиться таких результатов?

М.С.: Да. Мы включили в рецептуру комплекс стабилизаторов Гелеон™, которые отлично связывают свободную влагу в продукте, позволяют регулировать реологические свойства фаршевой системы, снижают риск образования жировых отеков и выделения влаги при хранении колбасы в вакуумной упаковке. Разработанная нами рецептура успешно протестирована и внедрена на ряде предприятий мясной отрасли. На дегустациях производители особенно отмечают высокое качество и классический вкус «Докторской» колбасы. И хотя, как говорится, «на вкус и цвет товарища нет», в отношении нашего продукта, мнения у специалистов сходятся. Уверен, что с ними согласны и потребители. От предприятий, где внедрена рецептура, в ГК «СОЮЗСНАБ» поступают постоянные заказы на закупку ингредиентов, значит наша «Докторская» халяль пользуется спросом!

Пресс-служба ГК«СОЮЗСНАБ»

Готовое для внедрения на Вашем предприятии решение. Свяжитесь с менеджером «СОЮЗСНАБ».

Колбаса

«Докторская» халяль

Вареная колбаса, не содержащая в составе свинины. Классический вкус «Докторской», высокие органолептические характеристики, низкая себестоимость.

Средняя сырьевая себестоимость

1 кг - 106 руб.

Плотная консистенция, отличная «кусаемость».

iiiiiI  Классический мясной

вкусоароматический профиль «Докторской» колбасы с нотой перца и муската.

Рецептура эффективного решения доступна на сайте info.ssnab.ru

СОЮЗСНАБИНФО W

ИНФОРМАЦИОННЫЙ РЕСУРС Д/1

для зарегистрированных клиентов

ГК «СОЮЗСНАБ»

+7(495) 937 8772 www.ssnab.ru e-mail: mail@ssnab.ru