НЕ ЯВЛЯЮЩИЕСЯ ЧЕЛОВЕКОМ ЖИВОТНЫЕ С ДЕФИЦИТОМ ДПНРНК

1. Не являющееся человеком животное, содержащее в своем геноме нокаут по меньшей мере одного модифицированного эндогенного локуса длинной некодирующей РНК (днРНК), при этом не являющееся человеком животное демонстрирует фенотип, связанный с укзанным нокуатом.
2. Не являющееся человеком животное по п. 1, отличающееся тем, что указанный локус днРНК представляет собой локус длинной промежуточной некодирующей РНК (дпнРНК).
3. Не являющееся человеком животное по п. 2, отличающееся тем, что указанный нокаут включает удаление одного или большего количества экзонов, которые кодируют указанную днРНК или ее часть.
4. Не являющееся человеком животное по п. 3, отличающееся тем, что указанный нокаут включает
(a) удаление одного или большего количества экзонов в составе локуса днРНК, включая второй экзон указанного локуса днРНК;
(b) удаление второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса днРНК;
(c) удаление одного или большего количества экзонов в составе локуса днРНК, включая первый экзон указанного локуса днРНК; или
(d) удаление всей кодирующей области РНК указанного локуса днРНК.
5. Не являющееся человеком животное по п. 3, отличающееся тем, что указанный нокаут включает
(a) замену локуса днРНК или его части встраиваемой нуклеиновой кислотой;
(b) замену второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса днРНК встраиваемой нуклеиновой кислотой; или
(c) замену всей кодирующей области РНК указанного локуса днРНК встраиваемой нуклеиновой кислотой.
6. Не являющееся человеком животное по п. 5, отличающееся тем, что указанный локус днРНК представляет собой локус дпнРНК.
7. Не являющееся человеком животное по п. 5, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота содержит первую нуклеотидную последовательность, которая кодирует репортер, и/или вторую нуклеотидную последовательность, которая кодирует селектируемый маркер.
8. Не являющееся человеком животное по п. 7, отличающееся тем, что указанная первая нуклеотидная последовательность и/или указанная вторая нуклеотидная последовательность функционально связана с промотором, который управляет экспрессией указанного репортера.
9. Не являющееся человеком животное по п. 7, отличающееся тем, что указанная первая нуклеотидная последовательность, которая кодирует репортер, находится в локусе днРНК в функциональной связи с эндогенным промотором днРНК, при этом указанный эндогенный промотор днРНК управляет экспрессией указанной нуклеотидной последовательности.
10. Не являющееся человеком животное по п. 9, отличающееся тем, что экспрессия указанной последовательности нуклеиновой кислоты подчиняется паттерну экспрессии днРНК.
11. Не являющееся человеком животное по п. 7, отличающееся тем, что указанная первая нуклеотидная последовательность содержит консенсусную последовательность Козак.
12. Не являющееся человеком животное по п. 7, отличающееся тем, что указанный репортер представляет собой любой из β--галактозидазы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), церулеума, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы или их комбинации.
13. Не являющееся человеком животное по п. 7, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота содержит участки сайт-специфической рекомбинации, фланкирующие сегмент, кодирующий репортер, и/или сегмент, кодирующий селектируемый маркер.
14. Не являющееся человеком животное по п. 1, отличающееся тем, что указанная днРНК включает Pint, Celrr, Crnde, Eldr, Fendrr, Halr1, Hotair, Hottip, Hoxa11os, Pantr1, Pantr2, Ptgs2os2, lincenc1, Trp53cor1, lincppara, Mannr, Haglr, Peril, Kantr, Tug1 или их комбинацию.
15. He являющееся человеком животное по п. 1, отличающееся тем, что указанное не являющееся человеком животное является гомозиготным по нокауту в локусе днРНК.
16. Не являющееся человеком животное по п. 1, отличающееся тем, что указанное не являющееся человеком животное представляет собой грызуна.
17. Не являющееся человеком животное по п. 1, отличающееся тем, что указанное не являющееся человеком животное представляет собой крысу или мышь.
18. Не являющееся человеком животное по любому из пп. 1-17, отличающееся тем, что указанное не являющееся человеком животное представляет собой мышь.
19. Не являющееся человеком животное по п. 18, отличающееся тем, что указанный локус дпнРНК представляет собой Pint, Pantr2, Fendrr, HOTTIP, Haglr, Kantr, Peril или Tug1.
20. He являющееся человеком животное по п. 19, отличающееся тем, что указанный фенотип представляет собой:
(a) связанный с преждевременным старением фенотип;
(b) летальность;
(c) дефект развития легких;
(d) морфологический или функциональный порок скелета и/или мышечной ткани;
(e) потеря мышечной массы в одной или нескольких тканях;
(f) дефект развития мозга; или
(g) комбинация любых подпунктов из (а)-(f).
21. Не являющееся человеком животное по п. 18, отличающееся тем, что указанная днРНК представляет собой Pint, и указанный нокаут приводит к получению мыши демонстрирующей:
(a) меньшую скорость роста по сравнению с контролем дикого типа;
(b) снижение мышечной силы;
(c) фиброз;
(d) меньшее содержание жировой ткани в организме по сравнению с контролем дикого типа;
(e) меньшую костную минеральную плотность и костную массу бедренной кости по сравнению с контролем дикого типа;
(f) пониженную мышечную массу по сравнению с контролем дикого типа;
(g) снижение средней продолжительности жизни;
(h) лордокифоз;
(i) атрофию органов;
(j) фенотип преждевременного старения;
(k) дефект развития мозга; или
(l) комбинацию любых подпунктов из (a)-(k).
22. Не являющееся человеком животное по п. 21, отличающееся тем, что указанный нокаут включает делецию геномной последовательности локуса Pint между геномными координатами Хромосома 6: 31166026-31197846.
23. Не являющееся человеком животное по п. 21, отличающееся тем, что указанный нокаут дополнительно включает
(a) замену второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса Pint встраиваемой нуклеиновой кислотой; или
(b) замену всей кодирующей области РНК указанного локуса Pint встраиваемой нуклеиновой кислотой.
24. Не являющееся человеком животное по п. 23, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота замещает геномную последовательность между геномными координатами Хромосома 6: 31166026-31197846.
25. Не являющееся человеком животное по п. 18, отличающееся тем, что указанная дпнРНК представляет собой Pantr2 и указанный нокаут приводит к получению мыши, демонстрирующей дефект развития мозга и/или связанный с преждевременным старением фенотип.
26. Не являющееся человеком животное по п. 25, отличающееся тем, что указанный нокаут включает делецию геномной последовательности локуса Pantr2 между геномными координатами Хромосома 1: 42707143-42713698.
27. Не являющееся человеком животное по п. 25, отличающееся тем, что указанный нокаут дополнительно включает
(a) замену второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса Pantr2 встраиваемой нуклеиновой кислотой; или
(b) замену всей кодирующей области РНК указанного локуса Pantr встраиваемой нуклеиновой кислотой.
28. Не являющееся человеком животное по п. 27, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота замещает геномную последовательность между геномными координатами Хромосома 1: 42707143-42713698.
29. Не являющееся человеком животное по п. 18, отличающееся тем, что указанная дпнРНК представляет собой Fendrr и указанный нокаут приводит к получению мыши, демонстрирующей перинатальную летальность и/или дефект развития легких.
30. Не являющееся человеком животное по п. 29, отличающееся тем, что указанный нокаут включает делецию геномной последовательности локуса Fendrr между геномными координатами Хромосома 8: 121054882-121074065.
31. Не являющееся человеком животное по п. 29, отличающееся тем, что указанный нокаут дополнительно включает
(a) замену второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса Fendrr встраиваемой нуклеиновой кислотой; или
(b) замену всей кодирующей области РНК указанного локуса Fendrr встраиваемой нуклеиновой кислотой.
32. Не являющееся человеком животное по п. 31, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота замещает геномную последовательность между геномными координатами Хромосома 8: 121054882-121074065.
33. Не являющееся человеком животное по п. 18, отличающееся тем, что указанная дпнРНК представляет собой HOTTIP и указанный нокаут приводит к получению мыши, демонстрирующей по меньшей мере один морфологический или функциональный дефект в скелете и/или мыщцах.
34. Не являющееся человеком животное по п. 33, отличающееся тем, что указанный нокаут содержит делецию геномной последовательности локуса HOTTIP между геномными координатами Хромосома 6: 52262834-52267603 или Хромосома 6: 52265374-52267603.
35. Не являющееся человеком животное по п. 33, отличающееся тем, что указанный нокаут дополнительно включает
(a) замену второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса HOTTIP встраиваемой нуклеиновой кислотой; или
(b) замену всей кодирующей области РНК указанного локуса HOTTIP встраиваемой нуклеиновой кислотой.
36. Не являющееся человеком животное по п. 35, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота замещает геномную последовательность между геномными координатами Хромосома 6: 52262834-52267603 или Хромосома 6: 52265374-52267603.
37. Не являющееся человеком животное по п. 18, отличающееся тем, что днРНК представляет собой Haglr и указанный нокаут приводит к получению мыши, демонстрирующей летальность.
38. Не являющееся человеком животное по п. 37, отличающееся тем, что указанный нокаут включает делецию геномной последовательности локуса Haglr между геномными координатами Хромосома 2: 74750433-74762886.
39. Не являющееся человеком животное по п. 37, отличающееся тем, что указанный нокаут дополнительно включает
(a) замену второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса Haglr встраиваемой нуклеиновой кислотой; или
(b) замену всей кодирующей области РНК указанного локуса Haglr встраиваемой нуклеиновой кислотой.
40. Не являющееся человеком животное по п. 39, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота замещает геномную последовательность между геномными координатами Хромосома 2: 74750433-74762886.
41. Не являющееся человеком животное по п. 18, отличающееся тем, что указанная дпнРНК представляет собой Kantr и указанный нокаут приводит к получению мыши, демонстрирующей дефект развития мозга и/или связанный с преждевременным старением фенотип.
42. Не являющееся человеком животное по п. 41, отличающееся тем, что что указанный нокаут включает делецию геномной последовательности локуса Kantr между геномными координатами Хромосома X: 152298544-152327475.
43. Не являющееся человеком животное по п. 41, отличающееся тем, что указанный нокаут дополнительно включает
(a) замену второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса Kantr встраиваемой нуклеиновой кислотой; или
(b) замену всей кодирующей области РНК указанного локуса Kantr встраиваемой нуклеиновой кислотой.
44. Не являющееся человеком животное по п. 43, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота замещает геномную последовательность между геномными координатами Хромосома X: 152298544-152327475.
45. Не являющееся человеком животное по п. 18, отличающееся тем, что указанная дпнРНК представляет собой Peril, и указанный нокаут приводит к получению мыши, демонстрирующей дефект развития мозга, связанный с преждевременным старением фенотип и/или перинатальную летальность.
46. Не являющееся человеком животное по п. 45, отличающееся тем, что указанный нокаут включает делецию геномной последовательности локуса Peril между геномными координатами Хромосома 3: 34767849-34782292.
47. Не являющееся человеком животное по п. 45, отличающееся тем, что указанный нокаут дополнительно включает
(a) замену второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса Peril встраиваемой нуклеиновой кислотой; или
(b) замену всей кодирующей области РНК указанного локуса Peril встраиваемой нуклеиновой кислотой.
48. Не являющееся человеком животное по п. 47, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота замещает геномную последовательность между геномными координатами Хромосома 3: 34767849-34782292.
49. Не являющееся человеком животное по п. 18, отличающееся тем, что указанная дпнРНК представляет собой локус Tug1, и указанный нокаут приводит к получению мыши, демонстрирующей дефект развития мозга и/или связанный с преждевременным старением фенотип.
50. Не являющееся человеком животное по п. 49, отличающееся тем, что указанный нокаут включает делецию геномной последовательности локуса Tug1 между геномными координатами Хромосома 11: 3639794-3648758 или Хромосома 11: 3639794-3645518.
51. Не являющееся человеком животное по п. 49, отличающееся тем, что указанный нокаут дополнительно включает
(а) замену второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса Tug1 встраиваемой нуклеиновой кислотой; или
(b) замену всей кодирующей области РНК указанного локуса Tug1 встраиваемой нуклеиновой кислотой.
52. Не являющееся человеком животное по п. 51, отличающееся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота замещает геномную последовательность между геномными координатами Хромосома 11: 3639794-3648758 или Хромосома 11: 3639794-3645518.
53. Клетка, ткань или эмбрион, происходящая из не являющегося человеком животного по любому из пп. 1-17 и 19-52.
54. Направленный вектор, содержащий встраиваемую нуклеиновую кислоту, фланкированную с 5'- и 3'-стороны гомологичными фрагментами, которые могут подвергаться гомологичной рекомбинации с представляющим интерес локусом днРНК для удаления по меньшей мере второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами локуса днРНК.
55. Направленный вектор по п. 54, отличающийся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует репортер.
56. Направленный вектор по п. 55, отличающийся тем, что после гомологичной рекомбинации с представляющим интерес локусом днРНК первая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует репортер, функционально связана с эндогенным промотором, который управляет экспрессией днРНК в локусе днРНК.
57. Направленный вектор по любому из пп. 54-55, отличающийся тем, что указанный репортер представляет собой любой из β--галактозидазы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, усиленного желтого флуоресцентного белка (EYFP), Emerald, CyPet, голубого флуоресцентного белка (CFP), церулеума, T-Sapphire, люциферазы, щелочной фосфатазы или их комбинации.
58. Направленный вектор по п. 57, отличающийся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота также содержит вторую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует селектируемый маркер, при этом указанная вторая нуклеиновая кислота функционально связана с промотором.
59. Направленный вектор по п. 58, дополнительно содержащий участки сайт-специфической рекомбинации, фланкирующие сегмент, кодирующий репортер, и/или сегмент, кодирующий селектируемую маркерную нуклеиновую кислоту.
60. Направленный вектор по любому из пп. 55-56 и 58-59, отличающийся тем, что указанная первая и/или указанная вторая последовательность нуклеиновой кислоты дополнительно содержит консенсусную последовательность Козак.
61. Направленный вектор по п. 60, отличающийся тем, что указанная встраиваемая нуклеиновая кислота дополнительно содержит промотор, который управляет экспрессией указанного репортера.
62. Способ получения не являющегося человеком животного по п. 1, причем указанный способ включает:
(a) приведение плюрипотентной клетки в контакт с направленной конструкцией, содержащей встраиваемую нуклеиновую кислоту, фланкированную с 5'- и 3'-стороны гомологичными фрагментами; при этом указанная направленная конструкция подвергается гомологичной рекомбинации с локусом дпнРНК в геноме указанной клетки с формированием модифицированной плюрипотентной клетки;
(b) введение модифицированной плюрипотентной клетки в эмбрион-хозяина; и
(c) вынашивание эмбриона-хозяина суррогатной матерью, отличающееся тем, что указанная суррогатная мать дает потомство, содержащее модифицированный локус днРНК,
при этом указанная генетическая модификация приводит к нокауту по меньшей мере одной днРНК, таким образом, что не являющееся человеком животное демонстрирует связанный с преждевременным старением фенотип.
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что указанная днРНК представляет собой дпнРНК.
64. Способ по любому из пп. 62-63, отличающийся тем, что указанный нокаут включает делецию по меньшей мере второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами локуса дпнРНК.
65. Способ по п. 64, отличающийся тем, что указанная днРНК включает Pint, Celrr, Crnde, Eldr, Fendrr, Halr1, Hotair, Hottip, Hoxa11os, Pantr1, Pantr2, Ptgs2os2, lincenc1, Trp53cor1, lincppara, Mannr, Haglr, Peril, Kantr, Tug1 или их комбинацию.
66. Способ модификации локуса днРНК в плюрипотентной клетке, включающий
(a) введение в плюрипотентную клетку направленной конструкции, содержащей встраиваемую нуклеиновую кислоту, фланкированную с 5'- и 3'-стороны гомологичными фрагментами, которые могут подвергаться гомологичной рекомбинации с локусом днРНК; и
(b) идентификацию модифицированной плюрипотентной клетки, содержащей направленную генетическую модификацию в локусе днРНК,
при этом указанная генетическая модификация приводит к потере функции днРНК, и делеция по меньшей мере второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами локуса дпнРНК приводит к потере функции днРНК.
67. Способ по п. 66, отличающийся тем, что указанная плюрипотентная клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную клетку (иПСК) человека.
68. Способ по п. 66, отличающийся тем, что указанная плюрипотентная клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ЭС) клетку мыши или крысы.
69. Способ по любому из пп. 66-68, отличающийся тем, что указанная днРНК включает Pint, Celrr, Crnde, Eldr, Fendrr, Halr1, Hotair, Hottip, Hoxa11os, Pantr1, Pantr2, Ptgs2os2, lincenc1, Trp53cor1, lincppara, Mannr, Haglr, Peril, Kantr, Tug1 или их комбинацию.
70. Способ получения клетки, ткани или эмбриона, включающий
получение клетки, ткани или эмбриона из мыши, геном которой содержит нокаут эндогенного локуса длинной некодирующей РНК (днРНК), при этом указанный нокаут приводит к получению мыши, демонстрирующей связанный с преждевременным старением фенотип.
71. Способ получения профиля генной экспрессии для локуса длинной промежуточной некодирующей РНК (дпнРНК) не являющегося человеком животного, который является информативным в отношении структуры и/или функции дпнРНК, кодируемой указанным локусом дпнРНК, при этом способ включает
получение не являющегося человеком животного по п. 1, при этом указанный нокаут дополнительно включает замену по меньшей мере второго экзона, последнего экзона и всех экзонов между вторым и последним экзонами указанного локуса дпнРНК репортерным геном, и при этом эндогенный промотор локуса дпнРНК контролирует экспрессию указанного репортерного гена;
экспрессирование указанного репортерного гена в не являющемся человеком животном; и
получение профиля генной экспрессии для указанного локуса дпнРНК за счет наблюдения экспрессии репортерного гена, при этом корреляция пространственного и/или временного паттерна экспрессии репортерного гена с феонотипом, который демонстрирует не являющееся человеком животное, подтверждает структуру и/или функцию указанного локуса дпнРНК.
72. Способ по п. 71, отличающийся тем, что получение профиля экспрессии для указанного локуса дпнРНК включает определение по меньшей мере одного типа клеток, экспрессирующих указанный репортерный ген.
73. Способ по п. 71 или 72, отличающийся тем, что получение профиля экспрессии для указанного локуса дпнРНК включает наблюдения экспрессии репортерного гена в течение эмбриогенеза не являющегося человеком животного на протяжении жизни не являющегося человеком животного до смерти не являющегося человеком животного или их комбинации.