Способ прогнозирования выживаемости у пациентов с аденокарциномой легкого, несущей мутации в гене KRAS
METHOD FOR PREDICTION OF SURVIVAL RATE IN PATIENTS WITH LUNG ADENOCARCINOMA CARRYING A MUTATION IN THE KRAS GENE

mut
Изобретение относится к медицине, а именно к молекулярной онкологии, и позволяет прогнозировать выживаемость пациентов с аденокарциномой легкого, несущей мутации в гене KRAS (KRAS).
Рак легкого занимает первое место по числу смертности среди всех видов рака [1]. В России ежегодно диагностируется около 60 тысяч новых пациентов с раком легкого. Примерно четверть этих пациентов несут мутацию в гене KRAS [2]. Для таких пациентов пока не существует таргетной терапии, а также нет консенсуса на счет наиболее подходящего способа терапии. В связи с этим, наличие прогноза продолжительности жизни каждого конкретного такого пациента является существенным фактором при подборе способа терапии. Однако, имеющиеся прогностические маркеры весьма ограничены и имеют невысокую прогностическую значимость.
mut
mut
Иммунологические маркеры, наряду с генетическими маркерами миграции и пролиферации, являются наиболее значимыми для прогноза онкологических заболеваний [3]. Параметры инфильтрации различными типами лимфоцитов и экспрессия цитокинов часто используется для прогноза выживаемости пациентов с раком легкого и показывают высокую статистическую значимость и надежность. Однако для KRASпациентов экспрессия цитокинов уже не влияет на прогноз [4]. Уровень инфильтрированности лейкоцитами в качестве прогноза выживаемости этих пациентов также снижается [5]. Тем не менее, отдельные субпопуляции лейкоцитов, такие как цитотоксические CD8+ лимфоциты и зрелые дендритные клетки значимо влияют на прогноз выживаемости KRAS пациентов, а медиана выживаемости пациентов, стратифицированных по этим параметрам отличается примерно вдвое [6]. Однако, уровень инфильтрированности лейкоцитами требует количественного иммуногистохимического анализа, который довольно трудоемок, должен проводиться квалифицированным патологом, довольно чувствителен к качеству реагентов и методическим нюансам, а также имеет существенную погрешность и субъективность при выборе областей анализа и подсчете клеток.
Маркеры, связанные с B-клетками, до недавнего времени, не получали должного внимания при оценке противоопухолевого иммунитета и прогнозе выживаемости. Недавние работы показали важность специфичности, клональности, степени гипремутирования и изотипа опухоль-инфильтрирующих В-клеток (TIBs), циркулирующих плазмабластов, а также сывороточных аутореативных и опухоль-специфичных антител во взаимодействие опухоли с иммунной системой [7-11]. В частности, считается, что TIBs и опухоль-инфильтрирующие плазматические клетки или, более корректно, внутриопухолевые В-клетки, т.к. последние могут образовываться непосредственно в локальных опухолевых третичных лимфатических структурах (TLS) [12], играют важную роль в формировании опухолевого микроокружения.
Аутоантитела из плазмы крови против опухоль-ассоциированных собственных антигенов были валидированы для диагностики рака на ранних стадиях [11], а также могут служить важными прогностическими маркерами на более поздних стадиях [13]. Количество В-клеток и плазматических клеток в опухоли, как правило, ассоциировано с положительным прогнозом для разных солидных опухолей [14]. С другой стороны, несколько клинических исследований гепатоцеллюлярной карциномы [15], рака простаты, почек и молочной железы показали, что высокое содержание В- или плазматических клеток ассоциировано с негативным прогнозом. Это подчеркивает возможность В-клеток поддерживать и иммуносупрессорное микроокружение.
Функция антител существенным образом зависит от их изотипа [16]. Известно, что IgA+ плазматические клетки производят преимущественно иммуносупрессорные молекулы IL-10 и PD-L1 в некоторых видах рака [15].
Ранее было показано, что использование относительного содержания разных изотипов антител (иммуноглобулинов) может быть использовано для прогнозирования продолжительности жизни онкологических больных с меланомой [7]. В данном методе после хирургической резекции опухоли из опухолевой ткани выделяли РНК и анализировали её последовательность с помощь секвенирования (RNA-seq). Из данных RNA-seq вычисляли отношение уровня экспрессии тяжелой цепи каждого из изотипов иммуноглобулинов IgG1, IgG2, IgG2, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE и IgM  к уровню экспрессии всех тяжелых цепей иммуноглобулинов IGH. При этом было показано, что для пациентов, у которых соотношение IgG1/IGH менее 0,58 медиана выживаемости составляет 2 года, в то время как для пациентов, у которых этот показатель больше 0,58 – 3 года 9 мес. Небольшое различие в медиане выживаемости этих групп пациентов ограничивает использование данного способа при выборе типа терапии и тактики ведения больного. Кроме того, мы установили, что для больных с раком легкого без дополнительного деления на субкогорты этот способ не позволяет сделать значимый прогноз.
Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования выживаемости у пациентов с аденокарциномой легкого.
Технический результат при использовании изобретения – повышение точности прогноза, оптимизация тактики ведения больных и возможность коррекции лечения на основе полученных данных.
Технический результат достигается тем, что у пациента с аденокарциномой легкого после хирургического удаления опухолевой ткани, берут фрагменты опухолевой ткани, из которых часть используют для выявления наличия мутаций в гене KRAS, а часть - для выделения РНК, в случае обнаружения мутаций в гене KRAS, из образцов РНК готовят библиотеки кДНК для секвенирования и секвенируют, из данных секвенирования определяют нормализованную экспрессию генов константных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHA1, IGHA2, рассчитывают коэффициент К по формуле К=IGHG1/IGH, где IGH=IGHG1+IGHG2+IGHG3+IGHG4+IGHA1+IGHA2, и при значении К>0,14 прогноз считают благоприятным, в противном случае – не благоприятным.
Предполагаемый способ осуществляется следующим образом: у пациента с аденокарциномой легкого после хирургического удаления опухолевой ткани, берут фрагменты опухолевой ткани. Часть опухолевой ткани используют для генетического анализа на наличие мутаций в гене KRAS с целью определения применимости способа. Из другой части не фиксируя выделяют РНК и замораживают (-20°С – -80°С). В случае обнаружения мутации в гене KRAS из образца РНК готовят библиотеку кДНК и секвенируют. Из данных секвенирования определяют нормализованную экспрессию генов константных участков тяжелых цепей иммуноглобулинов IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHA1, IGHA2, рассчитывают коэффициент К по формуле К=IGHG1/IGH, где IGH=IGHG1+IGHG2+IGHG3+IGHG4+IGHA1+IGHA2, при значении К>0,14 прогноз считают благоприятным. В противном случае – не благоприятным.
Способ основан на результатах анализа данных РНК секвенирования (RNA-Seq) из базы данных опухолевых геномов (TCGA), при котором мы вычисляли экспрессию тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулинов в опухолевой ткани для 442 пациентов с аденокарциномой легкого (LUAD). Эти пациенты были разделены на группы на основании присутствия драйверных (вызывающих злокачественное перерождение опухоли) мутаций.
mut
wt
mut
Информация о мутациях была получена с помощью портала GDC (https://portal.gdc.cancer.gov/). После фильтрации данных были идентифицированы следующие группы пациентов по генотипам опухоли: с мутацией в гене KRAS (KRAS) - 122 пациента; и без мутации в гене KRAS (KRAS) - 320 пациента. Общая экспрессия тяжелых цепей иммуноглобулинов (IGH) была рассчитана как суммарная экспрессия генов IGHA1, IGHA2, IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHA1, IGHA2. Экспрессией IGHM, IGHD и IGHE пренебрегали т.к. их совокупное содержание составляет менее 1% от всех IGH. В результате анализа мы выявили ассоциацию между доминирующими изотипами иммуноглобулинов и выживаемостью, но только для пациентов с мутацией в гене KRAS. Для этих пациентов отношение IGHG1/IGH значимо влияло на прогноз выживаемости (p=0,001, отношение шансов=0,36). В пациентах группы без мутации в KRAS, напротив мы наблюдали обратную (однако не значимую) корреляцию. Медиана распределения IGHG1/IGH среди KRAS пациентов составила 0,14.
Поскольку данный маркер представляет собой отношение, а не абсолютное значение некоторого показателя, он практически не зависит от способа и методологических особенностей его измерения.
Среди пациентов с аденокарциномой, несущей мутацию в гене RKAS, и у которых показатель К=IGHG1/IGH превышает 0,14, медиана выживаемости составила 7,5 лет. Для пациентов с показателем К ниже 0,14 медиана выживаемости составила 2 года и 4 месяца. Предложенный способ прогнозирования существенно точнее, чем аналогичный, описанный ранее для меланомы [7] и может быть использован при оптимизации тактики ведения больного, выборе способа терапии и принятии решений о применении инвазивных методов.
Примеры конкретного использования предлагаемого способа
Пример 1
Пациент 1, женщина, 71 год, аденокарцинома в верхнем отделе правого легкого стадии IIA T1bN1MX с морфологической верификацией биопсийного материала. Генетический анализ выявил наличие мутации в гене KRAS (G12C), а также мутацию в гене EGFR и транслокацию а гене ALK. Была проведена торакоскопическая лобэктомия с медиастинальной лимфодиссекцией. Операционный материал был направлен на РНК секвенирование. Из данных РНК секвенирования были получены значения нормализованной экспрессии генов IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHA1 и IGHA2, которые составили 954, 4143, 481, 80, 21901 и 4390 соответственно. Было рассчитано значение К=IGHG1/IGH=954/31949=0,02986, что меньше 0,14, что соответствует неблагоприятному прогнозу продолжительности жизни. Была назначена адъювантная лекарственная противоопухолевая терапия карбоплатином, алимтой и авастином. Даже в условиях интенсивной химиотерапии у пациента наблюдалась прогрессия опухоли. Пациентка скончалась через 6 месяцев после постановки диагноза.
Пример 2
Пациент 2, женщина, 72 года, аденокарцинома в нижнем отделе левого легкого стадии IA T1bN0MX с морфологической верификацией биопсийного материала. Генетический анализ выявил наличие мутации в гене KRAS (G12C). Была выполнена торакоскопическая лобэктомия. Операционный материал был направлен на РНК секвенирование. Из данных РНК секвенирования были получены значения нормализованной экспрессии генов IGHG1, IGHG2, IGHG3, IGHG4, IGHA1 и IGHA2, которая составила 652, 659, 340, 1351, 782 и 24 соответственно. Было рассчитано значение К=IGHG1/IGH=652/3808=0,1712, что больше 0,14 и соответствует благоприятному прогнозу. Было решено не назначать адъювантную терапию. Через два года наблюдается полная ремиссия.
Список источников
1. Злокачественные новообразования в России в 2017 году. / ред. А.Д. Карпин, В.В. Старинский, Г.В. Петрова, - Москва: ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018. – 250с.
2. Martin P. et al. KRAS Mutations as Prognostic and Predictive Markers in Non–Small Cell Lung Cancer // J Thorac Oncol. 2013. Vol. 8, № 5. P. 530–542.
3. Uhlen M. et al. A pathology atlas of the human cancer transcriptome. // Science. 2017. Vol. 357, № 6352. P. eaan2507 13.
4. Dong Y. et al. Systematic assessment of the clinicopathological prognostic significance of tissue cytokine expression for lung adenocarcinoma based on integrative analysis of TCGA data // Sci Rep-uk. 2019. Vol. 9, № 1. P. 6301.
5. Varn F.S. et al. Computational immune profiling in lung adenocarcinoma reveals reproducible prognostic associations with implications for immunotherapy // Oncoimmunology. 2018. Vol. 7, № 6. P. 1 10.
6. Mansuet-Lupo A. et al. Intratumoral Immune Cell Densities Are Associated with Lung Adenocarcinoma Gene Alterations // Am J Resp Crit Care. 2016.
7. Bolotin D.A. et al. Antigen receptor repertoire profiling from RNA-seq data. // Nat Biotechnol. 2017. Vol. 35, № 10. P. 908 911.
8. Gilbert A.E. et al. Monitoring the Systemic Human Memory B Cell Compartment of Melanoma Patients for Anti-Tumor IgG Antibodies // Plos One. 2011. Vol. 6, № 4. P. e19330.
9. Nielsen J.S. et al. CD20+ Tumor-Infiltrating Lymphocytes Have an Atypical CD27− Memory Phenotype and Together with CD8+ T Cells Promote Favorable Prognosis in Ovarian Cancer // Clin Cancer Res. 2012. Vol. 18, № 12. P. 3281–3292.
10. DeFalco J. et al. Non-progressing cancer patients have persistent B cell responses expressing shared antibody paratopes that target public tumor antigens // Clin Immunol. 2018. Vol. 187, № C. P. 37 45.
11. Macdonald I.K., Parsy-Kowalska C.B., Chapman C.J. Autoantibodies: Opportunities for Early Cancer Detection // Trends Cancer. 2017. Vol. 3, № 3. P. 1-16.
12. Germain C., Gnjatic S., Dieu-Nosjean M.-C. Tertiary Lymphoid Structure-Associated B Cells are Key Players in Anti-Tumor Immunity // Front Immunol. 2015. Vol. 6. P. 67.
13. Hirasawa Y. et al. Natural Autoantibody to MUC1 Is a Prognostic Indicator for Non–Small Cell Lung Cancer. 2000. Vol. 161, № 2. P. 589–594.
14. Charoentong P. et al. Pan-cancer Immunogenomic Analyses Reveal Genotype-Immunophenotype Relationships and Predictors of Response to Checkpoint Blockade. // Cell Reports. 2017. Vol. 18, № 1. P. 248-262.
15. Shalapour S. et al. Inflammation-induced IgA+ cells dismantle anti-liver cancer immunity // Nature. 2017. Vol. 551, № 7680. P. 1-36.
16. Schroeder H.W., Cavacini L. Structure and function of immunoglobulins // J Allergy Clin Immun. 2010. Vol. 125, № 2. P. S41–S52.