Способ ранней диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий (ЦИН) на основе изучения метаболических маркеров
METHOD FOR EARLY DIAGNOSTICS OF CERVICAL INTRAEPITHELIAL NEOPLASIAS (CIN) BASED ON METABOLIC MARKERS STUDY

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и может найти применение в ранней диагностике ЦИН у женщин. Способ позволяет выявлять патологию шейки матки на более ранних этапах путем определения уровня экспрессии метаболических маркеров-предикторов HIF1alpha, GLUT-1, IGFBP-3, HK2 и VDAC1, используя соскоб эпителиальных клеток шейки матки.
Описанные результаты были получены в рамках диссертации на соискание степени кандидата медицинских наук по теме: «Тактика ведения пациенток с цервикальными интраэпителиальными неоплазиями с применением молекулярно-биологических маркеров прогнозирования».
ЦИН являются предраковыми заболеваниями шейки матки. В структуре патологии шейки матки у женщин репродуктивного возраста ЦИН составляют от 17 до 29% и не имеют тенденции к снижению. По данным ВОЗ (2014 г.) распространенность в мире ЦИН 1 степени составляет 30 млн случаев в год, а ЦИН 2-3 степени - 10 млн. Средний возраст пациенток с диагностированным ЦИН всех степеней составляет 34,0±3,0 года. РШМ многие годы занимает лидирующее место по частоте среди злокачественных новообразований органов репродуктивной системы у женщин [1]. Известно, что ежегодно в мире регистрируется около 470000 новых случаев РШМ, и, несмотря на проводимые лечебные мероприятия, 233000 больных умирают от этого заболевания. В 15% случаев РШМ диагностируется у женщин в возрастном диапазоне от 20 до 34 лет [2, 3].
Известно, что выявление ЦИН является сложным процессом, так как не имеют характерной клинической картины. Как правило, протекают бессимптомно. Жалобы обусловлены сопутствующими гинекологическим заболеваниями или вовсе отсутствуют. Диагноз ставиться на основании проведенного комплексного обследования: цитологического, кольпоскопического, при необходимости биопсии и выскабливания цервикального канала, с последующим гистологическим исследованием. На сегодняшний день основным методом диагностики предраковых состояний шейки матки является гистологическое исследование патологически измененных участков шейки матки.
Цитологический метод позволяет осуществлять скрининговые исследования, его применение позволило существенно снизить уровень заболеваемости РШМ, особенно в развитых странах. Специфичность метода по данным разных авторов составляет 69%. А его чувствительность колебается в диапозоне от 66 до 83%, что диктует необходимость частого выполнения повторных скрининговых тестов [4].
Кольпоскопическое исследование - рассматривается как чувствительный метод (80-90%) определения предраковых и раковых заболеваний шейки матки. Однако специфичность данного метода не высока и составляет от 23 до 60% [5].
ВПЧ - тестирование - методы выявления ДНК вируса папилломы человека. Анализ на ВПЧ позволяет выявить на 30-100% больше предраковых заболеваний, чем традиционное цитологическое исследование [6].
Гистологическое обследование при всей своей информативности не может быть применено многократно и его результаты не позволяют определить прогноз заболевания.
Выявление группы молекулярных биомаркеров для диагностики предраковых и раковых заболеваний шейки матки может значительно уменьшить влияние субъективных обстоятельств, которые сопровождают стандартный морфологический подход и даже заменить современные методы диагностики. Обнаружение различных маркеров и определение уровня их экспрессии при прогнозировании течения заболевания позволяет скорректировать подходы по времени прогрессирования и эффективности терапии, а так же отметить пациенток, которые требуют более тщательного наблюдения.
Таким образом, внедрение новых скрининговых технологий открывает новые возможности для профилактики и ранней диагностики ЦИН и РШМ, что является основой для снижения заболеваемости в целом и открывает новые перспективы в сохранении здоровья женщины.
В связи с вышеизложенным появилась необходимость изыскать маркеры для ранней диагностики и прогнозирования течения ЦИН и РШМ, которые позволили бы усовершенствовать алгоритм ведения женщин с диспластическим изменением шейки матки.
Для понимания механизмов возникновения и развития ЦИН и РШМ необходимо подробное изучение клеточных изменений, происходящих при данной патологии. В метаболизме опухолевых клеток существуют особенности, дающие им существенные преимущества по сравнению с нормальными клетками. Отличительным свойством раковых клеток является состояние их метаболического репрограммирования, на начальной стадии возникновения злокачественного новообразования играющее роль патогенетического триггера [7-9].
По данным исследований последних лет выявлено, что в предопухолевых процессах наблюдается повышенная экспрессия белка HIF-1α (гипоксия индуцируемый фактор, а так же в клетках при раке молочной железы, эндометрия, пищевода, желудка, легких, полости рта, гортани, яичников, поджелудочной железы, кишечника) [10]. В нормальных клетках подобного явления нет. Эти данные позволяют высказать предположение, что HIF-1α участвует в опухолевой прогрессии [11].
Имеются работы, авторы которых исследовали эндогенный маркер гипоксии - глюкозный транспортер Glut-1 и выявили, что данный белок обнаруживается на исходном уровне в нормальных клетках и в клетках доброкачественных опухолей, в то время как в злокачественных опухолях, в том числе при РШМ, наблюдается значительное повышение его экспрессии. Так же существуют данные, что увеличение уровня экспрессии GLUT1 коррелирует с пролиферативной активностью клеток опухоли и с ее более агрессивным поведением [12, 13]. В связи с этим мнение большинства исследователей склоняется к признанию данного белка в качестве прогностически значимого маркера для раннего выявления ЦИН и РШМ.
В литературе существуют данные, что опухолевые клетки синтезируют IGF1 (инсулиноподобный фактор роста) и IGFBP3 (IGF-связывающий белок-3) и могут влиять на рост, метастазирование и антиапоптотические ответы опухолевых клеток [14]. Опубликованные результаты некоторых исследований свидетельствуют о том, что IGF-1 и IGFBP3 играют определенную роль в развитии рака предстательной железы и рака молочной железы, яичников и рака легкого, однако их роль при РШМ практически не изучена [15].
Гексокиназа 2 (НK-2) - фермент, являющийся катализатором в процессе превращения глюкозы в глюкозо-6-фосфат и ее регулятором является отношение АТФ/АДФ. Без достаточного количества АТФ вначале происходит существенное угнетение жизнедеятельности, а затем наступает гибель клетки. Тканевое дыхание в раковых клетках во многом ограничивается этапом гликолиза, а окислительное фосфорилирование в митохондриях сведено к минимуму. В настоящее время известно, что НK-2 редко встречается в нормальных клетках, однако его экспрессия резко повышается при различных онкологических заболеваниях, включая рак желудка, глиобластому, гепатоцеллюляоную карциному, рак молочной железы и рак гортани. Важно отметить, что недавно были получены данные об увеличение экспрессии данного белка при РШМ [16].
В норме белок наружной митохондриальной мембраны (VDAC) обеспечивает АТФ-АДФ обмен в клетке. Прямое ингибирующее действие на открытие этих пор оказывают белки семейства Bcl-2. Белок VDAC является необходимым условием индукции апоптоза. В настоящее время изучены уровни экспрессии VDAC1 при раке щитовидной железы, легких, яичников, пожделудочной железы, при меланоме, глиобластом, а так же РШМ [17]. Таким образом, VDAC1 может быть использован в качестве молекулярного маркера ранней диагностики, прогнозирования развития и течения рака, а так же для определения эффективности лечения. Однако роль VDAC1 в развитии ЦИН и РШМ начинает только изучаться.
Целью изобретения является создание способа ранней диагностики ЦИН на основе изучения метаболических маркеров в соскобе эпителиальных клеток шейки матки, отличающегося тем, что выявляют патологию шейки матки на более ранних этапах.
Поставленная цель достигается определением уровня экспрессии маркеров-предикторов HIF1alpha, GLUT-1, IGFBP-3, HK2 и VDAC1 в соскобе клеток эпителия шейки матки у женщин с ЦИН с использованием вестерн-блот анализа с детекцией хемилюминисценции и методики ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ).
Методика исследования
Определение уровня экспрессии метаболических маркеров производилось в лаборатории митохондриальной медицины «НЦАГиП им. Академика В.И. Кулакова» МЗ РФ. Протокол методики вестер-блот анализ с детекцией хемилюминисценции: соскоб, взятый с шейки матки жесткой щеткой, помещался в пробирку по типу «эппендорф» с 0,3 мл фосфатно-солевого буфера, дополненного смесью протеазных ингибиторов (Roche, Германия), препятствующих деградации белков. Далее пробирку плотно закрывали, маркировали и транспортировали в лабораторию. В пробирку добавляли лизирующий буфер и буфер для нанесения образцов. Разделение белков проводилось методом электрофореза в 10% полиакриламидном геле с дальнейшим переносом белков на нитроцеллюлозную мембрану в соответствии с протоколом производителя (Millipore, США). Для блокировки сайтов неспецифического связывания антител проводили инкубацию мембраны в 5% обезжиренном молоке, приготовленном на основе трис-солевого буфера, в течение 1 часа при комнатной температуре. Окрашивание белок-специфичными и антивидовыми антителами проводили в тех же условиях (все-Abcam, США). Проявка мембраны осуществлялась набором Novex ECL (Invitrogen) в автоматизированном приборе ChemiDoc (Biorad,США). Анализ интенсивности флуоресценции проводился в программном обеспечении ImageLab.
Методика ПЦР в реальном времени с реакцией обратной транскрипции: жесткой щеткой брали соскоб с шейки матки, помещали щетку в пробирку по типу «эппендорф» с транспортной средой, тщательно прополаскивали ее и извлекали. Далее пробирку плотно закрывали, маркировали и транспортировали в лабораторию. Выделение РНК из образцов проводилось отработанной в лаборатории методикой в системе тризол/хлороформ реагентом RNA Extract Reagent в соответствии с протоколом производителя (Евроген, Россия). Концентрацию РНК рассчитывали по ODλ260 на приборе DS-11 (DeNovix, США). Далее следовало проведение обратной транскрипции набором MMLV-Mint по протоколу производителя (Евроген, Россия). Последующая полимеразная цепная реакция в реальном времени проводилась в пробирке, свободной от РНКаз, в которой смешивали следующие компоненты: 10-100 нг кДНК матрицы, по 0.4 мкл прямого и обратного праймера (100 пмоль), 2 мкл 5xqPCRmixHS SYBR. Объем реакционной смеси доводили до 10 мкл водой, свободной от РНКаз. После перемешивания добавляли минеральное масло для предотвращения испарения. Пробирку помещали в детектирующий амплификатор DTprime ДТ96 (ДНК-технология, Россия). Специфичность полученного продукта проверяли с помощью 2% агарозного электрофореза. Данные обрабатывали с помощью программы QGENE (2-ΔCt метод). Нормировка экспрессии каждого гена проводилась на ген «домашнего хозяйства» бета-актина (АСТВ).
В результате статистической обработки полученных данных выявлена ассоциация уровня экспрессии метаболических маркеров (HIF1alpha, GLUT-1, IGF1, IGFBP-3, HK2, VDAC1 и hOGG) со степенью тяжести ЦИН у женщин.
Было выявлено увеличение уровня экспрессии GLUT1 в группе женщин с ASCUS по сравнению с контрольной группой, но не значительно (фиг. 1). В группах женщин с цитологическим диагнозом LSIL и HSIL мы наблюдали 2,2 раза и 3,2-кратное увеличение этого показателя, соответственно, и эти различия были статистически значимыми (р<0,05).
Проанализирован изофермент - HK2 - в собранных образцах эпителиальных клеток шейки матки, где также наблюдалось значительное увеличение уровня экспрессии данного белка в группах женщин с HSIL и LSIL (фиг. 2).
При статистическом анализе белка VDAC1, мы не выявили существенных различий в уровне его экспрессии среди женщин исследуемых групп (фиг. 3).
Что касается белка IGFBP3, нами не было выявлено статистически значимых различий в уровнях его экспрессии у женщин исследуемых групп (фиг. 4).
При изучении и статистической обработке данных относительно белка HIF1a выявлено, что уровень его экспрессии был значительно ниже в группе женщин с ASCUS и в группе женщин с HSIL (р<0.05) (фиг. 5).
Более подробно полученные данные исследуемых групп женщин представлены в таблице №1.
Данное изобретение иллюстрировано рисунками:
Фиг. №1 «Уровень экспрессии маркера GLUT1»;
Фиг. №2 «Уровень экспрессии маркера HK2»;
Фиг. №3 «Уровень экспрессии маркера VDAC1»;
Фиг. №4 «Уровень экспрессии маркера IGFBP3»;
Фиг. №5 «Уровень экспрессии маркера HIF1alpha».
Нижеследующие примеры иллюстрируют способ по изобретению.
Пример №1. Пациентка О., 27 лет, обратилась для профилактического осмотра в научно-поликлиническое отделение Центра. Жалоб не предъявляла. Был проведен общий и гинекологический осмотр пациентки, взят цитологический мазок с шейки матки и ВПЧ-тест, произведена расширенная кольпоскопия. Для определения уровня метаболических маркеров взят соскоб с эпителия шейки матки. При сборе анамнеза: гинекологические заболевания пациентка не отмечала. Менархе с 13 лет, менструации по 5-6 дней через 36-37 дней, умеренные, безболезненные. Дебют половой жизни в 24 года. Количество половых партнеров в анамнезе: 2. Соматический анамнез и аллергоанамнез не отягощены.
При гинекологическом осмотре: патологических отклонений размеров, положения, консистенции матки и придатков не выявлено. По данным цитологического исследования: атипические клетки не выявлены. NILM. ВПЧ-типирование: ВПЧ не выявлен. Расширенная кольпоскопия: нормальная ЗТ-1. Уровень экспрессии метаболических маркеров составил: HIF1 - 0,016, GLUT-1 составил 360,0, IGFBP-3 - 0,0014, HK2 - 19 и VDAC1 - 52, что позволило отнести данную пациентку в группу здоровых женщин. Этот вывод совпадает с клиническим и цитологическим диагнозами.
Пример №2. Пациентка Л., 30 лет обратилась в научно-поликлиническое отделение Центра для планирования беременности. При сборе анамнеза установлено, что гинекологические заболевания пациентка не отмечала. Менархе с 13 лет, менструации по 5 дня через 28-32 дня, умеренные, безболезненные. Половая жизнь с 19 лет. Количество половых партнеров: 1. Соматический анамнез и аллергоанамнез не отягощены.
При гинекологическом осмотре: патологических отклонений размеров, положения, консистенции матки и придатков не выявлено. В ходе обследования по цитологическому исследованию выявлен HSIL. ВПЧ типирование: 16 к 56 типы. Расширенная кольпоскопия: ненормальная ЗТ-3.Уровень экспрессии метаболических маркеров: HIF1 - 0,03, GLUT-1 составил 1154,2, IGFBP-3 - 0,02, HK2 - 44,9 и VDAC1 - 87. Учитывая данные обследования, больной была проведена радиоволновая конизация шейки матки под контролем кольпоскопии. По результатам гистологического исследования был поставлен диагноз ЦИН 3. Данный диагноз совпадает с предварительным диагнозом, выставленным по данным, полученным при исследовании уровня экспрессии метаболических маркеров в соскобе эпителиальных клеток шейки матки.
Пример №3. Пациентка Т., 36 лет, обратилась в научно-поликлиническое отделение Центра для консультации по поводу состояния шейки матки. По месту жительства установлен предварительный диагноз: подозрение на тяжелую дисплазию шейки матки. Из анамнеза: жалобы на сукровичные выделения из половых путей в течение последних 5 месяцев. При гинекологическом осмотре: взят мазок для цитологического исследования, мазок на ВПЧ-типирование и соскоб для определения уровня экспрессии метаболических маркеров. Сделана расширенная кольпоскопия. Цитологическое заключение: LSIL. При типировании ВПЧ выявлен 44(55) тип. Расширенная кольпоскопия: ненормальная зона трансформации-1. Уровень экспрессии метаболических маркеров: HIF1 - 0,029, GLUT-1 782, IGFBP-3 - 0,038, HK2 - 36,4 и VDAC1 - 70. Произведена прицельная биопсия шейки матки с измененного участка эпителия шейки матки под контролем кольпоскопа, гистологическое заключение: ЦИН1, признаки ВИЧ-инфекции. Заключение: поставлен диагноз дисплазия легкой степени на фоне ВПЧ-инфекции, что совпадает с предварительным диагнозом, поставленным по данным, полученным при исследовании уровня экспрессии метаболических маркеров.
Таким образом, заявляемый способ ранней диагностики ЦИН, основанный на определении уровня экспрессии метаболических маркеров в соскобе эпителия шейки матки, позволяет:
- выявлять данную патологию на ранних этапах канцерогенеза, при отрицательных результатах других видов обследования (цитологического, ВПЧ-типирования, расширенной кольпоскопии и гистологического);
- выявить и сформировать группы пациенток с риском развития и прогрессии ЦИН;
- мониторировать состояние эпителия шейки матки у женщин, входящих в группы риска, а также использовать данный способ для контрольного обследования после проведенного лечения;
- усовершенствовать алгоритм и тактику ведения пациенток с ЦИН.
Литература
1. Сухих Г.Т., Прилепская В.Н., ред. Профилактика рака шейки матки: Руководство для врачей. 3-е изд. М.: МЕДпресс-информ; 2012. 192 с.
2. СА Cancer, J Clin. 2015 Mar; 65(2): 87-108. doi: 10.3322/caac.21262. Epub 2015 Feb 4. Global cancer statistics, 2012. Torre LA.
3. zur Hausen H. Papillomaviruses in the causation of human cancers - A brief historical account. Virology 384(2): 260-268. 2009.
4. Kulasingam S.L., Hughes J.P., Kiviat N.B. et al. 2002. Ronco G., Giorgi-Rossi P., Carozzi F. et al. 2008.
5. E.J.M. American Society for Colposcopy and Cervical Pathology J. Thomas Cox, J.T.C.M.D. E.J. Mayeaux Jr. MD DABFP FAAFP, Modern Colposcopy Textbook and Atlas, 3 edition, Lippincott Williams & Wilkins, 2011.
6. C. Meijer, J. Berkhof, P. Castle et al. Guidelines for human papillomavirus DNA test requirements for primary cervical cancer screening in women 30 years and older. Int. J. Cancer: 124, 516-520, 2009.
7. T.A. Bhat, S. Kumar, A.K. Chaudhary, N. Yadav, D. Chandra, Restoration of mitochondria function as a target for cancer therapy., Drug Discov. Today. 20 (2015) 635-43. doi:10.1016/j.drudis.2015.03.001.
8. Hanahan, D. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011. - Vol. 144. - P. 646-674.
9. Vallejo CG et al. Evaluation of mitochondrial function and metabolic reprogramming during tumor progression in a cell model of skin carcinogenesis. Biochimie. 2013 Jun; 95(6): 1171-6.
10. Semenza G.L. Defining the role of hypoxia-inducible factor 1 in cancer biology and therapeutics // Oncogene. - 2010. - N. 29(5). - P. 625-34.
11. Kim BW. Et al. Prognostic assessment of hypoxia and metabolic markers in cervical cancer using automated digital image analysis of immunohistochemistry. J Transi Med. 2013 Aug 8; 11:185.
12. Kati C. Carvalho et al. GLUT1 expression in malignant tumors and its use as an immunodiagnostic marker J. Clinical science CLINICS 2011; 66(6):965-972.
13. Macheda M.L. et al. Molecular and cellular regulation of glucose transporter (GLUT) proteins in cancer. J. Cell Physiol. - 2005. - Vol. 202. - P. 654-662.
14. Samani A.A., Yakar S., LeRoith D. et al. The role of the IGF system in cancer growth and metastasis: overview and re- cent insights // Endocr. Rev. 2007. V.28, No. 1. P. 20-47.
15. Pollak M.N., Schernhammer E.S., Hankinson S.E. Insulin like growth factors and neoplasia // Nat. Rev. Cancer. 2004. V.4. P. 505-518.
16. Guo-Qing P. et al. A study of association between expression of hOGG1, VDAC1, HK-2 and cervical carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2010; 29:129.
17. Peng Guo-Qing et al. A study of association between expression of hOGG1, VDAC1, HK-2 and cervical carcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2010 Sep 17; 29:129.