ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ АНТИГЕНОВ (CAR), СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ДЛЯ MUC1, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Белковый каркас, содержащий
консенсусную последовательность по меньшей мере одного домена фибронектина типа III (FN3),
где каркас является способным связываться с последовательностью MUC1 человека.
2. Белковый каркас по п. 1, где каркас является способным связываться с последовательностью C-концевого домена MUC1 человека (MUC1-C).
3. Белковый каркас по п. 1 или 2, где каркас является способным связываться с последовательностью внеклеточного домена (ECD) MUC1-C человека.
4. Белковый каркас по любому из пп. 1-3, где по меньшей мере один домен фибронектина типа III (FN3) происходит из белка человека.
5. Белковый каркас по п. 4, где белок человека представляет собой тенасцин-C.
6. Белковый каркас по любому из предшествующих пунктов, где консенсусная последовательность содержит LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO: 1).
7. Белковый каркас по любому из предшествующих пунктов, где консенсусная последовательность является модифицированной в одном или более положениях внутри
(a) петли A-B, содержащей или состоящий из аминокислотных остатков TEDS (SEQ ID NO: 64) в положениях 13-16 консенсусной последовательности;
(b) петли B-C, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков TAPDAAF (SEQ ID NO: 65) в положениях 22-28 консенсусной последовательности;
(c) петли C-D, содержащей или состоящий из аминокислотных остатков SEKVGE (SEQ ID NO: 66) в положениях 38-43 консенсусной последовательности;
(d) петли D-E, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков GSER (SEQ ID NO: 67) в положениях 51-54 консенсусной последовательности;
(e) петли E-F, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков GLKPG (SEQ ID NO: 68) в положениях 60-64 консенсусной последовательности;
(f) петли F-G, содержащей или состоящей из аминокислотных остатков KGGHRSN (SEQ ID NO: 69) в положениях 75-81 консенсусной последовательности; или
(g) в любой комбинации (a)-(f).
8. Белковый каркас по любому из предшествующих пунктов, содержащий консенсусную последовательность по меньшей мере 5 доменов фибронектина типа III (FN3).
9. Белковый каркас по любому из предшествующих пунктов, содержащий консенсусную последовательность по меньшей мере 10 доменов фибронектина типа III (FN3).
10. Белковый каркас по любому из предшествующих пунктов, содержащий консенсусную последовательность по меньшей мере 15 доменов фибронектина типа III (FN3).
D
-9
-10
-11
-12
-13
-14
-15
11. Белковый каркас по любому из предшествующих пунктов, где каркас связывает последовательность MUC1 человека по меньшей мере с одной аффинностью, выбранной из K, меньшей или равной 10M, меньшей или равной 10M, меньшей или равной 10M, меньшей или равной 10M, меньшей или равной 10M, меньшей или равной 10M, и меньшей или равной 10M.
D
12. Белковый каркас по п. 11, где K определяют посредством поверхностного плазмонного резонанса.
13. Химерный рецептор антигена (CAR), содержащий:
(a) эктодомен, содержащий область узнавания антигена, где область узнавания антигена содержит по меньшей мере один белковый каркас по любому из предшествующих пунктов;
(b) трансмембранный домен, и
(c) эндодомен, содержащий по меньшей мере один костимулирующий домен.
14. CAR по п. 13, где эктодомен дополнительно содержит сигнальный пептид.
15. CAR по п. 13 или 14, где эктодомен (a) дополнительно содержит шарнир между областью узнавания антигена и трансмембранным доменом из (b).
16. CAR по любому из пп. 13-15, где трансмембранный домен содержит последовательность, кодирующую трансмембранный домен CD8.
17. CAR по любому из пп. 13-16, где по меньшей мере один костимулирующий домен содержит костимулирующий домен CD28 и/или 4-1BB.
18. CAR по п. 17, где костимулирующий домен 4-1BB локализован между трансмембранным доменом и костимулирующим доменом CD28.
19. Композиция, содержащая белковый каркас по любому из пп. 1-12 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
20. Композиция, содержащая химерный рецептор антигена по любому из пп. 13-18 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
21. Транспозон, содержащий белковый каркас по любому из пп. 1-12.
22. Транспозон, содержащий CAR по любому из пп. 13-18.
23. Транспозон по п. 22, где транспозон содержит индуцируемый полипептид каспазы, содержащий
(a) область связывания лиганда,
(b) линкер, и
(c) укороченный полипептид каспазы 9,
где индуцируемый полипептид каспазы не содержит не относящуюся к человеку последовательность.
24. Композиция, содержащая транспозон по любому из пп. 21-23.
25. Композиция по п. 24, дополнительно содержащая плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую фермент транспозазу.
26. Композиция по п. 25, где последовательность, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность мРНК.
27. Транспозон или композиция по любому из пп. 21-26, где транспозон представляет собой транспозон piggyBac.
28. Композиция по любому из пп. 25-27, где транспозаза представляет собой транспозазу piggyBac.
29. Композиция по п. 28, где транспозаза piggyBac содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 4.
30. Композиция по п. 28 или 29, где транспозаза piggyBac представляет собой гиперактивный вариант, и где гиперактивный вариант содержит замену аминокислоты в одном или более из положений 30, 165, 282 и 538 из SEQ ID NO: 59.
31. Композиция по п. 30, где замена аминокислоты в положении 30 из SEQ ID NO: 59 представляет собой замену валином (V) изолейцина (I) (I30V).
32. Композиция по п. 30, где замена аминокислоты в положении 165 из SEQ ID NO: 59 представляет собой замену серином (S) глицина (G) (G165S).
33. Композиция по п. 30, где замена аминокислоты в положении 282 из SEQ ID NO: 59 представляет собой замену валином (V) метионина (M) (M282V).
34. Композиция по п. 30, где замена аминокислоты в положении 538 из SEQ ID NO: 59 представляет собой замену лизином (K) аспарагина (N) (N538K).
35. Композиция по любому из пп. 28-34, где транспозаза представляет собой транспозазу Super piggyBac (sPBo).
36. Композиция по п. 35, где транспозаза Super piggyBac (sPBo) содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 60.
37. Вектор, содержащий CAR по любому из пп. 13-18.
38. Вектор по п. 37, где вектор представляет собой вирусный вектор.
39. Вектор по п. 38, где вирусный вектор содержит последовательность, выделенную или происходящую из ретровируса, лентивируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса или любой их комбинации.
40. Вектор по п. 38 или 39, где вирусный вектор содержит последовательность, выделенную или происходящую из аденоассоциированного вируса.
41. Вектор по любому из пп. 38-40, где вирусный вектор представляет собой рекомбинантный вектор.
42. Вектор по п. 37, где вектор представляет собой вектор на основе наночастиц.
43. Вектор по п. 42, где вектор на основе наночастиц содержит нуклеиновую кислоту, аминокислоты, полимеры, мицеллу, липид, органическую молекулу, неорганическую молекулу или любую их комбинацию.
44. Вектор по любому из пп. 37-43, где вектор содержит индуцируемый полипептид каспазы, содержащий
(a) область связывания лиганда,
(b) линкер, и
(c) укороченный полипептид каспазы 9,
где индуцируемый полипептид каспазы не содержит не относящуюся к человеку последовательность.
45. Композиция, содержащая вектор по любому из пп. 37-44.
46. Клетка, содержащая белковый каркас по любому из пп. 1-12.
47. Клетка, содержащая CAR по любому из пп. 13-18.
48. Клетка, содержащая транспозон или транспозазу по любому из пп. 21-36.
49. Клетка, содержащая вектор по любому из пп. 37-44.
50. Клетка по любому из пп. 46-49, где клетка экспрессирует CAR на поверхности клетки.
51. Клетка по любому из пп. 46-50, где клетка представляет собой иммуноцит.
52. Клетка по п. 51, где иммуноцит представляет собой T-клетку, клетку естественного киллера (NK), подобную естественному киллеру (NK) клетку, гематопоэтическую клетку-предшественника, полученную из периферической крови (PB) T-клетку или полученную из пуповинной крови (UCB) T-клетку.
53. Клетка по п. 51, где иммуноцит представляет собой T-клетку.
54. Клетка по любому из пп. 46-50, где клетка представляет собой искусственную антигенпредставляющую клетку.
55. Клетка по любому из пп. 46-50, где клетка представляет собой клетку опухоли.
56. Клетка по любому из пп. 46-55, где клетка является аутологичной.
57. Клетка по любому из пп. 46-55, где клетка является аллогенной.
58. Композиция, содержащая клетку по любому из пп. 46-57.
59. Способ получения белкового каркаса по любому из пп. 1-12, включающий
(a) модификацию одной или более аминокислот консенсусной последовательности и
(b) отбор белкового каркаса, избирательно связывающего последовательность MUC1 человека.
60. Способ по п. 59, где стадия модификации включает сайт-направленный мутагенез или случайный мутагенез.
61. Способ по п. 60, где случайный мутагенез включает полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с пониженной точностью, перетасовку ДНК или их комбинацию.
62. Способ по любому из пп. 59-61, где стадии (a) и (b) повторяют по меньшей мере один раз.
63. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп. 19, 20, 24, 25, 26, 45, или 58.
64. Способ по п. 63, включающий введение субъекту композиции по п. 48, где клетка или популяция клеток является аутологичной.
65. Способ по п. 63, включающий введение субъекту композиции по п. 48, где клетка или популяция клеток является аллогенной.
66. Способ модификации клеточной терапии для нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту композиции, содержащей клетку, содержащую транспозон по любому из пп. 21-36, где апоптоз можно избирательным образом индуцировать в клетке посредством приведения клетки в контакт с индуцирующим средством.
67. Способ модификации клеточной терапии для нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту композиции, содержащей клетку, содержащую вектор по любому из пп. 37-44, где апоптоз можно избирательным образом индуцировать в клетке посредством приведения клетки в контакт с индуцирующим средством.
68. Способ по п. 66 или 67, где клетка является аутологичной.
69. Способ по п. 66 или 67, где клетка является аллогенной.
70. Способ по любому из пп. 66-69, где клеточная терапия представляет собой адоптивную клеточную терапию.
71. Способ по п. 66 или 67, где модификация представляет собой остановку клеточной терапии.
72. Способ по п. 66 или 67, где модификация представляет собой истощение части клеток, предоставленных для клеточной терапии.
73. Способ по п. 66 или 67, дополнительно включающий стадию введения ингибитора индуцирующего средства для ингибирования модификации клеточной терапии, таким образом, восстановления функции и/или эффективности клеточной терапии.
74. Химерный рецептор антигена (CAR), содержащий:
(a) эктодомен, содержащий область узнавания антигена, где область узнавания антигена содержит по меньшей мере один из центирина, VHH и scFv, которые специфически связываются с последовательностью MUC1 человека;
(b) трансмембранный домен, и
(c) эндодомен, содержащий по меньшей мере один костимулирующий домен.
75. CAR по п. 74, где область узнавания антигена содержит по меньшей мере один центирин.
76. CAR по п. 74, где область узнавания антигена содержит по меньшей мере один VHH.
77. CAR по п. 74, где область узнавания антигена содержит по меньшей мере один scFv.
78. CAR по любому из пп. 74-77, где эктодомен дополнительно содержит сигнальный пептид.
79. CAR по любому из пп. 74-78, где эктодомен (a) дополнительно содержит шарнир между областью узнавания антигена и трансмембранным доменом из (b).
80. CAR по любому из пп. 74-79, где трансмембранный домен содержит последовательность, кодирующую трансмембранный домен CD8.
81. CAR по любому из пп. 74-80, где по меньшей мере один костимулирующий домен содержит костимулирующий домен CD28 и/или 4-1BB.
82. CAR по п. 81, где костимулирующий домен 4-1BB локализован между трансмембранным доменом и костимулирующим доменом CD28.
83. Композиция, содержащая химерный рецептор антигена по любому из пп. 74-82 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.
84. Транспозон, содержащий CAR по любому из пп. 74-82.
85. Транспозон по п. 84, где транспозон содержит индуцируемый полипептид каспазы, содержащий
(a) область связывания лиганда,
(b) линкер, и
(c) укороченный полипептид каспазы 9,
где индуцируемый полипептид каспазы не содержит не относящуюся к человеку последовательность.
86. Композиция, содержащая транспозон по п. 84 или 85.
87. Композиция по п. 86, дополнительно содержащая плазмиду, содержащую последовательность, кодирующую фермент транспозазу.
88. Композиция по п. 87, где последовательность, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность мРНК.
89. Транспозон или композиция по любому из пп. 84-88, где транспозон представляет собой транспозон piggyBac.
90. Композиция по любому из пп. 87-89, где транспозаза представляет собой транспозазу piggyBac.
91. Композиция по п. 90, где транспозаза piggyBac содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 4.
92. Композиция по п. 90 или 91, где транспозаза piggyBac представляет собой гиперактивный вариант, и где гиперактивный вариант содержит замену аминокислоты в одном или более из положений 30, 165, 282 и 538 из SEQ ID NO: 59.
93. Композиция по п. 92, где замена аминокислоты в положении 30 из SEQ ID NO: 59 представляет собой замену валином (V) изолейцина (I) (I30V).
94. Композиция по п. 92, где замена аминокислоты в положении 165 из SEQ ID NO: 59 представляет собой замену серином (S) глицина (G) (G165S).
95. Композиция по п. 92, где замена аминокислоты в положении 282 из SEQ ID NO: 59 представляет собой замену валином (V) метионина (M) (M282V).
96. Композиция по п. 92, где замена аминокислоты в положении 538 из SEQ ID NO: 59 представляет собой замену лизином (K) аспарагина (N) (N538K).
97. Композиция по любому из пп. 87-96, где транспозаза представляет собой транспозазу Super piggyBac (sPBo).
98. Композиция по п. 97, где транспозаза Super piggyBac (sPBo) содержит аминокислотную последовательность, содержащую SEQ ID NO: 60.
99. Вектор, содержащий CAR по любому из пп. 74-82.
100. Вектор по п. 99, где вектор представляет собой вирусный вектор.
101. Вектор по п. 100, где вирусный вектор содержит последовательность, выделенную или происходящую из ретровируса, лентивируса, аденовируса, аденоассоциированного вируса или любой их комбинации.
102. Вектор по п. 100 или 101, где вирусный вектор содержит последовательность, выделенную или происходящую из аденоассоциированного вируса.
103. Вектор по любому из пп. 100-102, где вирусный вектор представляет собой рекомбинантный вектор.
104. Вектор по п. 99, где вектор представляет собой вектор на основе наночастиц.
105. Вектор по п. 104, где вектор на основе наночастиц содержит нуклеиновую кислоту, аминокислоты, полимеры, мицеллу, липид, органическую молекулу, неорганическую молекулу или любую их комбинацию.
106. Вектор по любому из пп. 99-105, где вектор содержит индуцируемый полипептид каспазы, содержащий
(a) область связывания лиганда,
(b) линкер, и
(c) укороченный полипептид каспазы 9,
где индуцируемый полипептид каспазы не содержит не относящуюся к человеку последовательность.
107. Композиция, содержащая вектор по любому из пп. 99-106.
108. Клетка, содержащая CAR по любому из пп. 74-82.
109. Клетка, содержащая транспозон или транспозазу по любому из пп. 84-92.
110. Клетка, содержащая вектор по любому из пп. 99-106.
111. Клетка по любому из пп. 108-110, где клетка экспрессирует CAR на поверхности клетки.
112. Клетка по любому из пп. 108-111, где клетка представляет собой иммуноцит.
113. Клетка по п. 112, где иммуноцит представляет собой T-клетку, клетку естественного киллера (NK), подобную естественному киллеру (NK) клетку, гематопоэтическую клетку-предшественника, полученную из периферической крови (PB) T-клетку или полученную из пуповинной крови (UCB) T-клетку.
114. Клетка по п. 112, где иммуноцит представляет собой T-клетку.
115. Клетка по любому из пп. 108-111, где клетка представляет собой искусственную антигенпредставляющую клетку.
116. Клетка по любому из пп. 108-111, где клетка представляет собой клетку опухоли.
117. Клетка по любому из пп. 108-116, где клетка является аутологичной.
118. Клетка по любому из пп. 108-116, где клетка является аллогенной.
119. Композиция, содержащая клетку по любому из пп. 108-118.
120. Способ лечения злокачественной опухоли у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту композиции по любому из пп. 83, 86-98, 107 или 119.