НОВЫЙ СПОСОБ ПЦР-СЕКВЕНИРОВАНИЯ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В ГЕНОТИПИРОВАНИИ HLA

1. Способ определения нуклеотидной последовательности представляющей интерес нуклеиновой кислоты в образце, где указанный способ включает:
1) получение n образцов, где n представляет собой целое число ≥1, а указанные образцы предпочтительно берут у млекопитающего, более предпочтительно, у человека, в частности, такими образцами являются пробы человеческой крови; причем необязательно указанные n образцов, предназначенные для анализа, разделяют на m групп, где m представляет собой целое число и n≥m≥1;
2) амплификацию, где пару или множество пар индексированных праймеров используют для каждого образца, если от этого образца имеются матрицы; ПЦР-амплификацию осуществляют в условиях, подходящих для амплификации представляющей интерес нуклеиновой кислоты, где каждая пара индексированных праймеров состоит из прямого индексированного праймера и обратного индексированного праймера (оба эти праймера могут быть вырожденными), содержащих праймерные индексы, где праймерные индексы, присутствующие в прямом индексированном праймере и в обратном индексированном праймере, могут быть одинаковыми или различными, то есть индексы праймеров в парах индексированных праймеров, используемых для различных образцов, являются различными;
3) объединение в пул, где если n>1, то ПЦР-продукты от каждого образца объединяют в один пул;
4) фрагментирование, где амплифицированные продукты подвергают неполному фрагментированию, очистке и выделению;
5) секвенирование, где выделенную ДНК-смесь подвергают секвенированию методом секвенирования второго поколения, предпочтительно парно-концевым методом (например, Illumina GA, Illumina Hiseq 2000), с получением последовательностей фрагментированной ДНК; и
6) сборку, где данные секвенирования, полученные для образцов, последовательно сопоставляют по уникальному праймерному индексу для каждого образца; риды каждой последовательности сопоставляют путем выравнивания с эталонной последовательностью ДНК, соответствующей ПЦР-продуктам, с помощью программы выравнивания (такой как программа Blast, BWA); сборку полноразмерной последовательности представляющей интерес нуклеиновой кислоты осуществляют из последовательностей фрагментированной ДНК по перекрыванию и характеру сцепления последовательностей, где
предпочтительно указанный способ имеет один или более отличительных признаков, выбранных из группы, состоящей из следующих признаков:
а) где каждая пара праймерных индексов и пара ПЦР-праймеров образует пару индексированных праймеров, где прямой и обратный ПЦР-праймеры имеют индекс прямого праймера и индекс обратного праймера у 5'-конца (или, необязательно, присоединенный посредством линкерной последовательности), соответственно;
b) где указанными ПЦР-праймерами являются ПЦР-праймеры для амплификации гена HLA, в частности, ПЦР-праймеры для амплификации гена HLA-A/B, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и 4 HLA-A/B и экзона 2 HLA-DRB1, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и 4 HLA-A/B, как показано в таблице 1 или в таблице 2, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 HLA-DRB1, как показано в таблице 7;
c) где указанными ПЦР-праймерами являются ПЦР-праймеры для амплификации гена HLA, в частности, ПЦР-праймеры для амплификации гена HLA-С, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и/или 4 HLA-С, где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 3 или в таблице 4;
d) где указанными ПЦР-праймерами являются ПЦР-праймеры для амплификации гена HLA, в частности, ПЦР-праймеры для амплификации гена HLA-DQB1, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 и/или 3 гена HLA-DQB1; где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 5;
е) где указанные праймерные индексы были сконструированы для ПЦР-праймеров, предпочтительно для ПЦР-праймеров, используемых для амплификации специфического гена HLA, более предпочтительно для ПЦР-праймеров, используемых для амплификации экзонов 2, 3 и 4 HLA-A/B и экзона 2 для HLA-DRB1, в частности, для ПЦР-праймеров, представленных в таблице 1, в таблице 2 или в таблице 7, где указанные праймерные индексы, в частности, содержат по меньшей мере 10, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 30, или по меньшей мере 40, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 60, или по меньшей мере 70, или по меньшей мере 80, или по меньшей мере 90 или все 95 пар из 95 пар праймерных индексов, представленных в таблице 6 (или набор праймерных индексов, состоящий из 10-95 пар (например, 10-95 пар, 20-95 пар, 30-95 пар, 40-95 пар, 50-95 пар, 60-95 пар, 70-95 пар, 80-95 пар, 90-95 пар или 95 пар) из 95 пар праймерных индексов, представленных в таблице 6); и где
набор индексированных праймеров предпочтительно включает по меньшей мере PI-1 - PI-10, или PI-11 - PI-20, или PI-21 - PI-30, или PI-31 - PI-40, или PI-41 - PI-50, или PI-51 - PI-60, или PI-61 - PI-70, или PI-71 - PI-80, или PI-81 - PI-90, или PI-91 - PI-95 из 95 пар праймерных индексов, представленных в таблице 6, или комбинации любых двух или более из указанных пар;
f) где указанное фрагментирование ДНК включает методы химического фрагментирования и методы физического фрагментирования, где методами химического фрагментирования является ферментативное расщепление, а методами физического фрагментирования являются методы ультразвукового фрагментирования или методы механического фрагментирования;
g) где после указанного фрагментирования ДНК, все ДНК-полосы, имеющие длину между максимальной длиной ридов в секвенаторе и максимально приемлемой длиной ДНК в секвенаторе, очищают и выделяют, где указанными методами очистки и выделения являются, но не ограничиваются ими, выделение путем электрофореза и разрезания геля, и выделение на магнитных сферах; и
h) где указанный способ, помимо стадий 1)-4), описанных выше, включает следующие стадии:
5) конструирование библиотеки, где конструирование PCR-FREE-библиотеки для секвенирования осуществляют с использованием библиотеки фрагментированных ПЦР-продуктов, где различные адаптеры библиотеки могут быть добавлены для распознавания различных PCR-FREE-библиотек для секвенирования, и где все ДНК-полосы, имеющие длину между максимальной длиной ридов в секвенаторе и максимально приемлемой длиной ДНК в секвенаторе, предпочтительно ДНК-фрагменты длиной 450-750 п.н., очищают и выделяют;
6) секвенирование, где выделенную ДНК-смесь подвергают секвенированию методом секвенирования второго поколения, предпочтительно парно-концевым методом (например, Illumina GA, Illumina Hiseq 2000), с получением последовательностей фрагментированных ДНК; и
7) сборка, где данные секвенирования, полученные для образцов, последовательно сопоставляют по различным последовательностям адаптеров библиотеки и по уникальному праймерному индексу для каждого образца; каждую последовательность рида сопоставляют путем выравнивания с эталонной последовательностью ДНК, соответствующей ПЦР-продуктам, с помощью программы выравнивания (такой как программа Blast, BWA); а сборку полноразмерной последовательности представляющей интерес нуклеиновой кислоты осуществляют из последовательностей фрагментированной ДНК по перекрыванию и характеру сцепления последовательностей.
2. Применение способа по п.1 в HLA-типировании, где указанный способ отличается тем, что он включает секвенирование взятого у пациента образца (в частности, пробы крови) указанным способом по п.1 и сопоставление результатов секвенирования с данными о последовательностях экзонов HLA, предпочтительно экзонов 2, 3, 4 HLA-A/B, экзонов 2, 3 и/или 4 HLA-C, экзона 2 и/или 3 гена HLA-DQB1 и/или экзона 2 HLA-DRB1 в базе данных HLA (такой как профессиональная база данных HLA IMGT); где если результат выравнивания последовательностей дает 100% соответствие, то это означает, что HLA-генотип соответствующего образца был точно определен.
3. Набор праймерных индексов, содержащий по меньшей мере 10, или по меньшей мере 20, или по меньшей мере 30, или по меньшей мере 40, или по меньшей мере 50, или по меньшей мере 60, или по меньшей мере 70, или по меньшей мере 80, или по меньшей мере 90, или все 95 пар из 95 пар праймерных индексов, представленных в таблице 6 (или указанный набор праймерных индексов, состоящий из 10-95 пар (например, 10-95 пар, 20-95 пар, 30-95 пар, 40-95 пар, 50-95 пар, 60-95 пар, 70-95 пар, 80-95 пар, 90-95 пар или 95 пар) из 95 пар праймерных индексов, представленных в таблице 6); и где
указанный набор индексированных праймеров предпочтительно включает по меньшей мере PI-1 - PI-10, или PI-11 - PI-20, или PI-21 - PI-30, или PI-31 - PI-40, или PI-41 - PI-50, или PI-51 - PI-60, или PI-61 - PI-70, или PI-71 - PI-80, или PI-81 - PI-90, или PI-91 - PI-95 из 95 пар праймерных индексов, представленных в таблице 6, или комбинации любых двух или более из указанных пар.
4. Применение указанного набора праймерных индексов по п.3 в методах ПЦР-секвенирования, где, в частности, каждая пара праймерных индексов и пара ПЦР-праймеров для амплификации представляющей интерес тестируемой последовательности образует пару индексированных праймеров, где прямой и обратный ПЦР-праймеры имеют индекс прямого праймера и индекс обратного праймера у 5'-конца (или, необязательно, присоединенный посредством линкерной последовательности), соответственно;
предпочтительно, где указанными ПЦР-праймерами являются ПЦР-праймеры для амплификации специфического гена HLA, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3, 4 HLA-A/B и экзона 2 HLA-DRB1, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и 4 HLA-A/B, как показано в таблице 1 или в таблице 2, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 HLA-DRB1, как показано в таблице 7, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и/или 4 HLA-С, где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 3 или в таблице 4, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 и/или 3 гена HLA-DQB1, где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 5.
5. Набор индексированных праймеров, содержащий указанный набор праймерных индексов по п.3 и пару ПЦР-праймеров для амплификации представляющей интерес тестируемой последовательности, где пара индексированных праймеров содержит пару праймерных индексов и пару ПЦР-праймеров, где прямой и обратный ПЦР-праймеры имеют индекс прямого праймера и индекс обратного праймера у 5'-конца (или, необязательно, присоединенный посредством линкерной последовательности), соответственно,
предпочтительно, где указанными ПЦР-праймерами являются ПЦР-праймеры для амплификации специфического гена HLA, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и 4 гена HLA-A/B и экзона 2 HLA-DRB1, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и 4 HLA-A/B, как показано в таблице 1 или в таблице 2, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 HLA-DRB1, как показано в таблице 7, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и/или 4 HLA-С, где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 3 или в таблице 4, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 и/или 3 гена HLA-DQB1, где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 5.
6. Применение указанных индексированных праймеров по п.5 в методах ПЦР-секвенирования.
7. Способ HLA-типирования, включающий:
1) получение n образцов, где n представляет собой целое число ≥1, а указанные образцы предпочтительно берут у млекопитающего, более предпочтительно у человека, в частности, такими образцами являются пробы человеческой крови;
2) разделение анализируемых n образцов на m групп, где m представляет собой целое число и n≥m≥1;
3) амплификацию, где пару индексированных праймеров используют для каждого образца, если от этого образца имеются матрицы; ПЦР-амплификацию осуществляют в условиях, подходящих для амплификации представляющей интерес нуклеиновой кислоты, где каждая пара индексированных праймеров состоит из прямого индексированного праймера и обратного индексированного праймера (оба эти праймера могут быть вырожденными), содержащих праймерные индексы, где праймерные индексы, присутствующие в прямом индексированном праймере и в обратном индексированном праймере, могут быть одинаковыми или различными, то есть индексы праймеров в парах индексированных праймеров, используемых для различных образцов, являются различными;
4) объединение в пул, где продукты ПЦР-амплификации от каждого образца объединяют в один пул с получением библиотек ПЦР-продуктов;
5) фрагментирование, где полученные библиотеки ПЦР-продуктов подвергают неполному фрагментированию;
6) конструирование библиотек, где PCR-FREE-библиотеки для секвенирования конструируют из библиотеки фрагментированных ПЦР-продуктов методом индексирования адаптеров библиотеки, где различные адаптеры библиотеки могут быть добавлены для распознавания различных PCR-FREE-библиотек для секвенирования, и где все ДНК-полосы, имеющие длину между максимальной длиной ридов в секвенаторе и максимально приемлемой длиной ДНК в секвенаторе, предпочтительно ДНК-фрагменты длиной 450-750 п.н., выделяют;
7) секвенирование, где выделенную ДНК-смесь подвергают секвенированию методом секвенирования второго поколения, предпочтительно парно-концевым методом (например, Illumina GA, Illumina Hiseq 2000), с получением последовательностей фрагментированных ДНК;
8) сборку, где данные секвенирования, полученные для образцов, последовательно сопоставляют по различным последовательностям адаптеров библиотеки и по уникальному праймерному индексу для каждого образца; каждую последовательность-рид сопоставляют путем выравнивания с эталонной последовательностью ДНК, соответствующей ПЦР-продуктам, с помощью программы выравнивания (такой как программа Blast, BWA); и сборку полноразмерной последовательности представляющей интерес нуклеиновой кислоты осуществляют из последовательностей фрагментированной ДНК по перекрыванию и характеру сцепления последовательностей; и
9) типирование, где результаты секвенирования сопоставляют с данными о последовательностях экзонов HLA, предпочтительно экзонов 2, 3, 4 HLA-A/B, экзонов 2, 3 и/или 4 HLA-C, экзона 2 и/или 3 гена HLA-DQB1 и/или экзона 2 HLA-DRB1 в базе данных HLA (такой как профессиональная база данных HLA IMGT); и если результат выравнивания последовательностей дает 100% соответствие, то это означает, что HLA-генотип соответствующего образца был точно определен;
предпочтительно указанный способ имеет один или более отличительных признаков, выбранных из группы, состоящей из следующих признаков:
а) где пара индексированных праймеров содержит пару праймерных индексов и пару ПЦР-праймеров, где прямой и обратный ПЦР-праймеры имеют индекс прямого праймера или индекс обратного праймера у 5'-конца (или, необязательно, присоединенный посредством линкерной последовательности), соответственно;
b) где указанными ПЦР-праймерами являются ПЦР-праймеры для амплификации специфического гена HLA, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и 4 гена HLA-A/B и экзона 2 HLA-DRB1, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и 4 HLA-A/B, как показано в таблице 1 или в таблице 2, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 HLA-DRB1, как показано в таблице 7, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и/или 4 HLA-С, где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 3 или в таблице 4, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 и/или 3 гена HLA-DQB1, где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 5;
c) где указанные праймерные индексы определены по п.1;
d) где указанное фрагментирование ДНК включает методы химического фрагментирования и методы физического фрагментирования, где методами химического фрагментирования является ферментативное расщепление, а методами физического фрагментирования являются методы ультразвукового фрагментирования или методы механического фрагментирования;
е) где указанными методами очистки и выделения являются, но не ограничиваются ими, выделение путем электрофореза и разрезания геля, и выделение на магнитных сферах; и
f) где конструирование PCR-FREE-библиотек для секвенирования из библиотек фрагментированных ПЦР-продуктов методом индексирования адаптера библиотеки включает добавление m адаптеров библиотеки к m библиотек ПЦР-продуктов, полученных в стадии 2), где в каждой библиотеке ПЦР-продуктов используется другой адаптер библиотеки, и конструирование m библиотек индексированных адаптеров для секвенирования; объединение в пул m библиотек индексированных адаптеров для секвенирования в равном молярном соотношении с получением смеси библиотек индексированных адаптеров для секвенирования, где указанный способ присоединения адаптеров библиотек означает прямое связывание посредством ДНК-лигазы без проведения ПЦР.
8. ПЦР-праймеры для HLA-генотипирования, где указанные праймеры отличаются тем, что они представляют собой ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3, 4 гена HLA-A/B и экзона 2 HLA-DRB1, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и 4 HLA-A/B, как показано в таблице 1 или в таблице 2, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 HLA-DRB1, как показано в таблице 7, предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзонов 2, 3 и/или 4 HLA-С, где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 3 или в таблице 4, или предпочтительно ПЦР-праймеры для амплификации экзона 2 и/или 3 гена HLA-DQB1, где предпочтительные указанные ПЦР-праймеры представлены в таблице 5.
9. Способ секвенирования с использованием ПЦР-праймеров по п.8, где указанный способ включает:
получение образца, в частности, пробы крови, где указанную пробу крови берут предпочтительно у млекопитающего, в частности, у человека;
амплификацию: амплификацию ДНК из пробы крови с использованием ПЦР-праймеров с получением ПЦР-продуктов и очистку этих ПЦР-продуктов;
секвенирование: секвенирование ПЦР-продуктов, где методом секвенирования может быть метод секвенирования по Сэнгеру или метод секвенирования второго поколения (такой как метод Hiseq 2000, Illumina GA и Roche454).
10. Применение ПЦР-праймеров по п.8 для HLA-генотипирования, отличающееся тем, что оно включает использование указанных ПЦР-праймеров по п.8, сборку и анализ путем сопоставления результатов, полученных вышеуказанным способом по п.9, и сравнение результатов секвенирования, полученных с использованием стандартных последовательностей, имеющихся в базе данных, с получением результатов HLA-генотипирования.
11. Набор для HLA-генотипирования, содержащий ПЦР-праймеры по п.8.
12. Набор для HLA-генотипирования или ПЦР-секвенирования, содержащий набор индексированных праймеров по п.5.