ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ РИЕМЕРЕЛЛЁЗА, ПАСТЕРЕЛЛЁЗА И САЛЬМОНЕЛЛЁЗА ИНДЕЕК, УТОК И ГУСЕЙ, СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ
POLYVALENT INACTIVATED VACCINE AGAINST RIEMERELLOSIS, PASTEURELLOSIS AND SALMONELLOSIS OF TURKEYS, DUCKS AND GEESE, THE METHOD OF ITS PREPARATION

Группа изобретений относится к области ветеринарии, ветеринарной микробиологии и биотехнологии, и может быть использована ветеринарными специалистами в индейководстве, утководстве и гусеводстве для специфической профилактики инфекционных патологий, вызванных бактериями видов Riemerella anatipestifer, Pasteurella multocida, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis, Salmonella enteritidis. Помимо ветеринарной области применения, изобретение способствует улучшению эпидемиологической ситуации в медицинской практике, так как способствует снижению случаев развития токсикоинфекций у людей, вызванных бактериями вида Salmonella spp., ассоциированных с употреблением пищевой продукции птицеперерабатывающих предприятий.
Инфекционные болезни птиц промышленных видов для сельскохозяйственных производителей и государства в целом, являются причиной существенных экономических потерь, складывающихся из недополучения продукции и финансовых затрат на проведение профилактических и лечебно-оздоровительных мероприятий [Shome, R. An outbreak of Riemerella anatipestifer infection in ducks in Meghalaya. / R. Shome, BR. Shome, H. Rahman, HV. Murugkar, A. Kumar, BP. Bhatt, KM. Bujarbarauah. // Indian J. Comp. Microbiol. Immunol. Infect. Dis. - 2004. - 25. - P. 126-127.]. Интенсивная технология производства приводит к необходимости одновременного содержания большого количества поголовья птицы на ограниченной площади, что увеличивает вероятность возникновения и распространения инфекций [Sandhu, Т. Riemerella anatipestifer infection. / Т. Sandhu, R. Rimler. // Diseases of poultry. - 10th Ed London: Iowa State University Press, Ames Mosby-Wolfe. - 1997]. Помимо этого, риск возникновения инфекционных патологий на птицеводческих предприятиях стоит ассоциировать с импортом в страну племенного инкубационного яйца, не контролируемого по ряду заболеваний, а также с миграциями перелетных птиц, являющихся носителями различных патогенов, в частности возбудителей риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза [Cha, S.Y. Surveillance and characterization of Riemerella anatipestifer from wild birds in South Korea. / S.Y. Cha, H.S. Seo, B. Wei, M. Kang, J.H. Roh, R.H. Yoon, J.H. Kim, H.K. Jang // J. Wild Dis. - 2015. - 2. P. 341-347; Pimenov, N.V. The identification of salmonella infection in hatching eggs and products of turkey-keeping. / N.V. Pimenov, A.I. Laishevtcev, V.V. Pimenova // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2015. №10 (46). P. 9-17].
Риемереллез (синонимы - «инфекционный серозит», «новое заболевание уток», «септицемия уток», «инфлюэнция гусей», «экссудативная септицемия гусей») - заразная болезнь индеек, уток, гусей, характеризующаяся сепсисом, фибринозным перикардитом, перигепатитом, аэросаккулитом, казеозным сальпингитом и менингитом [Laishevtcev, A.I. Clinico-morphological manifestation of waterfowls' riemerellosis and biological features of disease causative agent. // A.I. Laishevtcev, A.V. Kapustin, N.V. Pimenov, V.D. Iliesh // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2017. №11 (71). P. 538-545]. Возбудителем заболевания является бактерия Riemerella anatipestifer. Вспышки заболевания регистрируются во всем мире и приводят к существенным экономическим потерям за счет высокой смертности, снижения темпов роста, плохой конверсии кормов, затрат на лечебно-оздоровительные мероприятия и т.д. [Kardos, G. Development of a novel PCR assay specific for Riemerella anatipestifer. / G. Kardos, J. Nagy, M. Antal, A. Bistyak, M. Tenk, I. Kiss. // Lett Appl Microbiol. - 2007. - 44(2). - P. 145-8]. Наиболее восприимчива к болезни птица в возрасте 3-4-х недель, в некоторых случаях до 8 недель. Переболевшая птица остается носителем, без каких-либо клинических проявлений заболевания, но при этом является основным источником распространения инфекции [Pierce, RL. Pasteurella anatipestifer infection in geese. / RL. Pierce, MW. Vorhies. // Avian Dis. - 1973. - 17. - P. 868-870]. Смертность среди молодняка в неблагополучных предприятиях может достигать 75%, что говорит о высокой значимости данного заболевания для промышленного птицеводства [Sandhu, Т. Riemerella anatipestifer infection. / Т. Sandhu, R. Rimler. // Diseases of poultry. - 10-th Ed London: Iowa State University Press, Ames Mosby-Wolfe. - 1997]. Существенное значение в распространении заболевания по всему миру имеет миграция диких водоплавающих птиц, при этом не только гусей и уток, но и лебедей, журавлей, аистов и т.д. В этом случае передача возбудителя может происходить при непосредственном контакте дикой и домашней птицы на выпасных полях и водоемах [Cha, S.Y. Surveillance and characterization of Riemerella anatipestifer from wild birds in South Korea. / S.Y. Cha, H.S. Seo, B. Wei, M. Kang, J.H. Roh, R.H. Yoon, J.H. Kim, H.K. Jang // J. Wild Dis. - 2015. - 2. P. 341-347].
Пастереллез (холера птиц) - контагиозная болезнь большинства видов животных и птиц, вызываемая бактериями рода Pasteurella. Болезнь может быть в сверхостром, остром, подостром и хроническом течении, кроме-того достаточно часто встречается бессимптомная форма - бактерионосительство. Возбудителем заболевания является бактерия Pasteurella multocida. В Российской Федерации наиболее распространены три типа пастерелл: А, В и D. P. multocida тип А чаще других вызывает пастереллезную инфекцию птиц, кроликов и пушных зверей, а также способствует развитию подострого или хронического течения энзоотической пневмонии у телят и поросят; тип В вызывает геморрагическую септицемию крупного рогатого скота и диких жвачных животных; тип D - пастереллез свиней. Изоляты P. multocida типов Е и F на территории РФ не распространены, при этом являются возбудителями геморрагической септицемии крупного рогатого скота и диких жвачных животных в ряде зарубежных стран [Капустин, А.В. и др. Методические указания: Диагностика пастереллеза сельскохозяйственных животных, птиц и пушных зверей. 29 стр. Москва 2016 г.]. При остром течении заболевания наблюдаются септические процессы, крупозное воспаление легких, плевриты и отеки различной локализации. Подострое и хроническое течение болезни характеризуется гнойно-некротизирующими пневмониями, поражениями суставов, молочных желез, органов зрения и геморрагическим энтеритом [Bisgaard, М. Ecology and significance of Pasteurellaceae in animals. / M. Bisgaard // Zentralbl. Bakteriol., 1993 279, 7-26]. Смертность при остром течении пастереллеза может достигать 90%, при условии отсутствия своевременного лечения [Christensen, J.P. Fowl cholera / J.P. Christensen, M. Bisgaard // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 2000, 19 (2), 626-637].
Сальмонеллез - одна из ведущих проблем промышленного и частного птицеводства. Это инфекционная болезнь птиц и животных, опасная для человека пищевым токсикоинфицированием. Возбудителями сальмонеллеза птиц являются различные сероварианты бактерий вида Salmonella enterica рода Salmonella семейства Enterobacteriaceae. Водоплавающая птица и индейки наиболее восприимчивы к Salmonella typhimurium (группа «В»), Salmonella infantis (группа «С»), Salmonella enteritidis (группа «D»). Безусловно, имеется еще большое количество серотипов сальмонелл, адаптивных к птице, но их распространенность в стране значительно ниже, чем трех упомянутых серотипов [Pimenov, N.V. The role of farming poultry's salmonella pathogens in infection and pathology of human disease. / N.V. Pimenov, A.I. Laishevtcev, V.V. Pimenova // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2017. №2(62). C. 282-289]. При остром и подостром течении основными клиническими признаками являются вялость, малоподвижность, отсутствие аппетита, жажда, диарея. В дальнейшем развивается серозно-слизистый, слизисто-гнойный, а у гусят и утят, иногда, фибринозно-гнойный конъюнктивит. Нередко наблюдаются слизисто-гнойные истечения из носовых отверстий. Кроме того, при подостром течении отмечают затрудненное дыхание, хрипы вследствие развивающегося воспаления легких, а у гусят иногда фиксируют артриты [Lenev, S. Improvement of allocation and identification of Salmonella entericabacteria of Arizonae subspecies / S. Lenev, A. Laishevtsev, N. Pimenov, V. Semykin, I. Pigorev, V. Eremenko, O. Sein, A. Glinushkin, M. Ali Shariati // International Journal of Pharmaceutical Research and Allied Sciences. 2016. №5 (3). C. 342-348]. При вскрытии трупов павшей и вынужденно убитой птицы устанавливают различные по характеру и степени выраженности изменения. Так, при острой сальмонеллезной инфекции в трупе обнаруживают изменения кишечника, особенно тонкого отдела. В его просвете видны скопления слизи и газов. Слизистая оболочка - набухшая, гиперемированная, с петехиальными кровоизлияниями. В толстом отделе кишечника слизистая оболочка покрыта отрубевидным налетом, местами в ней встречаются точечные кровоизлияния и мелкие эрозии. При остром и подостром течении сальмонеллеза в тонком отделе кишечника обнаруживают в разной степени выраженные изменения, характерные для острого серозного или серозно-слизистого катара. В толстом отделе - катарально-фибринозное, реже - дифтеритическое воспаление с развитием некроза покровного эпителия и частично - поверхностного слоя слизистой оболочки с пропитыванием некротических масс фибрином, отслоением слизистой, в результате чего в таких участках образуются эрозии и трудно отделяемые пленки [Пименов, Н.В. Современные аспекты борьбы с сальмонеллезной инфекцией в птицеводстве / Н.В. Пименов, А.И. Лаишевцев // Монография Москва, 2017]. Заболеваемость при сальмонеллезе может составлять 40-50%, при этом летальность колеблется в диапазоне 5-80% [Пименов, Н.В. Методические рекомендации по профилактике и ликвидации сальмонеллезов сельскохозяйственных животных, в том числе птиц / Н.В. Пименов, Е.А. Тинаева, А.И. Лаишевцев, Ю.Н. Колесникова // Москва, 2016].
Согласно данным некоммерческой организации «Российский птицеводческий союз», суммарное поголовье индеек, уток и гусей в России, по состоянию на 2018 год составило 38,84 млн голов, из которых 21,16 млн уток, 9,0 млн гусей и 8,67 млн индеек, что в общей структуре поголовья птицы в стране составляет 3,9%, 1,7% и 1,6% соответственно. Несмотря на то, что поголовье индеек, уток и гусей в РФ составляет лишь 7,2% от общего поголовья, данный объем является существенным для экономики страны. Подробные данные по поголовью птицы за 2016-2018 годы приведены в таблице №1.
Уровень техники
Ввиду существующих рисков развития и распространения риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза, влекущих за собой высокую смертность птицы, обеспечение эпизоотического благополучия птицеводческих предприятий является важной задачей для ветеринарной службы РФ. В свою очередь, данная задача может быть решена двумя способами, первым из которых является использование антибактериальных препаратов при возникновении заболевания, а второй способ подразумевает использование средств специфической профилактики. На фоне широкого распространения антибиотикорезистентности, использование первого варианта является малоэффективным [Якимова, Э.А. Антибиотикорезистентность возбудителя риемереллеза водоплавающей птицы / Э.А. Якимова Э.А. // Ветеринария и кормление. 2018. №7. С.25-28; Пименова, В.В. Основные направления оздоровительных мероприятий при сальмонеллезе птиц: принципы и недостатки антибиотикообработок / В.В. Пименова, А.И. Лаишевцев, Н.В. Пименов // Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2017. №11 (71). C. 496-510; Лаишевцев, А.И. Сравнительный анализ антибиотикочувствительности коллекционных штаммов Pasteurella multocida, выделенных в период до 1990 г., с полевыми изолятами, выделенными в течение 2014-2016 гг.от крупного и мелкого рогатого скота на территории Российской Федерации / А.И. Лаишевцев, А.В. Капустин, A.M. Гулюкин // Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2016. №63. С.132-138]. Таким образом, использование средств специфической профилактики в борьбе с риемереллезом, пастереллезом и сальмонеллезом является более перспективным, чем антибиотикотерапия.
Для специфической профилактики пастереллеза индеек, уток и гусей зарегистрированы:
- вакцина против пастереллеза птиц инактивированная сорбированная производства ВНИВИП - филиал ФНЦ ВНИТИП РАН;
- вакцина против сальмонеллеза, колибактериоза и пастереллеза птиц инактивированная "АВИВАК - САЛЬМО - КОЛИ - ПАСТОВАК", производства ООО «НПП «Авивак».
Кроме-того известна вакцина против пастереллеза птиц инактивированная эмульгированная (Холерин Трипл), производства ABIC Biological Laboratories, Ltd., которая позволяет проводить специфическую профилактику пастереллеза у индеек и гусей.
Для специфической профилактики сальмонеллеза уток и гусей зарегистрированы:
- вакцина против сальмонеллеза водоплавающей птицы живая сухая, производства ФКП «Ставропольская биофабрика». Недостатком данного препарата можно считать ограниченную специфическую активность, так как вакцина содержит только антиген Salmonella typhimurium, что не позволяет использовать препарат для борьбы с Salmonella infantis и Salmonella enteritidis.
Для специфической профилактики сальмонеллеза индеек и уток зарегистрированы:
- вакцина против сальмонеллеза птиц живая сухая (АвиПро САЛЬМОНЕЛЛА DUO), производства «Lohmann Animal Health GmbH». Препарат содержит в своем составе два аттенуированных штамма Salmonella enteritidis и Salmonella typhimurium, но не Salmonella infantis. Препарат не предусматривает вакцинацию гусей.
Зарегистрированных ветеринарных препаратов, предназначенных для специфической профилактики риемереллеза водоплавающих птиц, в стране нет. Тем не менее, ранее на Российском рынке присутствовали препараты компании «Biovac», предназначенные для специфической профилактики риемереллеза:
- Вирсин 424 - препарат изготовлен из инактивированных антигенов Pasteurella multocida штаммов Pm-1,3 и 4-7-12, и Riemerella anatipestifer штамма RA.
- Вирсин 424а - препарат изготовлен из инактивированных антигенов Pasteurella multocida штаммов Pm-1.3 и 4, и Riemerella anatipestifer штамма RA.
- Вирсин 570 - препарат изготовлен из инактивированных антигенов вируса болезни Ньюкасла птиц штамм "VH", Pasteurella multocida штаммы Pm-1,3 и 4-7-12, и Riemerella anatipestifer штамма RA.
- Вирсин 765 - препарат изготовлен из инактивированных антигенов Pasteurella multocida штаммов Pm-1,3 и 4, Riemerella anatipestifer штамма RA, и 3 штаммов бактерии Ornithobacterium rhinotracheale.
Приведенные препараты применялись в промышленном утководстве и гусеводстве, но не в индейководстве, и с апреля 2017 года не реализуются на территории страны и не могут быть использованы для профилактики болезни. Кроме того, недостатком приведенных средств стоит считать узкую специфическую активность в отношении возбудителя риемереллеза, так как содержат в своем составе лишь один серотип.
Помимо зарегистрированных препаратов против пастереллеза известна живая вакцина против пастереллеза (холеры) птиц из слабовирулентного штамма "К" для накожной вакцинации [авторское свидетельство SU 119657 А1 опубл. 1959.01.01]. Недостатком данного средства является то, что оно не предназначено для вакцинации уток и гусей, а также не содержит в своем составе антигены Riemerella anatipestifer и сальмонелл. Кроме того, недостатком предлагаемого средства, стоит считать небольшую продолжительность иммунитета у двукратно вакцинированной птицы.
Известен способ изготовления вакцины против пастереллеза сельскохозяйственных животных и птиц [патент RU 2129015 С1 опубл. 1999.04.20]. Недостатком данного способа является большой расход питательных сред при проведении непрерывно-проточного культивирования пастерелл. Кроме того, разработчиками сделан акцент на использовании предложенного способа исключительно для культивирования штамма Pasteurella multocida «К», используемого для производства живой вакцины, что обозначено в цели заявляемого изобретения и приведенных примерах.
Морфологическая характеристика и жизнеспособность пастерелл не является параметром, влияющим на антигенную и иммунную активность инактивированных вакцин против пастереллеза, а следовательно, и их качество. Помимо этого, в данной разработке отсутствует этап концентрирования пастереллезных антигенов, необходимый для получения инактивированных вакцин, в следствии чего в препарат с необходимыми бактериальными антигенами попадают белки самой питательной среды. В случае перорального или аэрозольного использования живых пастереллезных вакцин, наличие в них балластных остатков питательных сред, чаще всего не способствует каким-либо реактогенным реакциям. В случае же инъекционного использования данных препаратов, содержащих остатки питательных веществ, это может сказаться на их безвредности, поскольку вещества, входящие в состав питательных сред - белки, в отношении которых могут образовываться антитела.
Известен способ изготовления вакцины против пастереллеза (холеры) птиц [авторское свидетельство SU 135595 А1 опубл. 1961.01.01]. Недостатком данного способа является то, что он предназначен для производства исключительно живых биопрепаратов против пастереллеза. Предложенный способ не используется для производства инактивированных вакцин. Кроме того, метод предусматривает использование полужидкого мясопептонного агара для культивирования в толще среды, в то время как предлагаемый способ ориентирован на использование питательных бульонов для глубинного культивирования. Данный подход позволяет повысить концентрацию бактериальных клеток в единице объема среды, тем самым влияет на стоимость готового средства.
Известен способ изготовления вакцин против пастереллеза животных и птиц [патент RU 2129440 С1 опубл. 1999.04.27]. Данный способ ориентирован на использование сухого белкового гидролизата из отходов мясного производства, с целью замены полноценного пищевого мясного сырья. Недостатком такого способа стоит считать то, что для культивирования штаммов пастерелл рекомендуется конкретная среда, в то время как существует ряд питательных сред, обладающих лучшими ростообеспечивающими свойствами, например, сердечно-мозговой бульон, триптон-соевый бульон, эугоник бульон и т.д. Кроме того, питательную среду, изготовленную из отходов мясного производства, сложнее стандартизировать, чем изготовленную из стандартного сырья.
Известен способ изготовления вакцины против пастереллеза птиц [авторское свидетельство SU 1566533 А1 опубл. 1994.11.15]. Недостатком способа является то, что он ориентирован лишь для производства живых пастереллезных вакцин, и не предусмотрен для использования с целью производства инактивированных средств.
Известен способ изготовления эмульсионной противопастереллезной вакцины [патент RU 2162339 С1 опубл. 2001.01.27]. Способ производства предлагаемого биопрепарата ограничивается только бульоном Хоттингера для культивирования штаммов пастерелл, в то время как для получения большей концентрации бактериальных клеток целесообразнее использовать сердечно-мозговой бульон, триптон соевый бульон и т.д., обладающие лучшими ростообеспечивающими свойствами для пастерелл.
Известна поливалентная иммунизирующая и/или терапевтическая композиция для применения при бактериальных инфекциях или пищевом отравлении, в частности сальмонеллезе, способ получения этой композиции, ее применение и вакцина, содержащая эту композицию [патент RU 2683027 С2 опубл. 2019.03.26]. Способ отличается трудоемкостью получения препарата, так как изначально предусматривает получение не только вакцинного препарата, но и гипериммунных сывороток.
Известны: вакцина против Salmonella [патент RU 2596208 С2 опубл. 2016.08.27]; вакцина против Salmonella [патент RU 2455023 С2 опубл. 2012.07.10]; вызывающие перекрестный иммунитет вакцины против сальмонелл [патент RU 2679039 С2 опубл. 2019.02.05]. Недостатком данных изобретений стоит считать ограниченный антигенный состав препаратов, не позволяющий одновременно бороться с несколькими инфекционными патологиями.
Известен: способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных и птиц [патент RU 2124366 С1 опубл. 1999.01.20]. Недостатком приведенного изобретения является узкий охват технологии производства, ограничивающимся получением только сальмонеллезных препаратов.
Известен: Способ приготовление бактериальной жидкости для вакцины против Riemerella anatipestifer (Method for preparing bacteria liquid for Riemerella anatipestifer vaccine) [патент - CN 101967458 A, опубл. 2011.12.14, Китай]. Недостатком данного изобретения стоит считать отсутствие полной технологии производства самой вакцины. Основной акцент сделан на культивирование реймерелл; вопросы инактивации, концентрирования, компоновки не были затронуты.
Известны: инактивированная вакцина Riemerella anatipestifer, трехвалентная и способ ее получения (Riemerella anatipestifer tervalence inactivated vaccine and preparation method thereof) [патент - CN 102908616 B, опубл. 2016.01.06, Китай]; масляная эмульсионная вакцина против Riemerella anatipestifer 1, 2 и 4 серотипа (Riemerella anatipestifer serum 1 type, 2 type and 4 type trivalent oil emulsion inactivated vaccine) [патент CN 102309753 A, опубл. 2012.01.11, Китай]. Недостатком указанных препаратов является то, что входящие в их состав серотипы реймерелл наиболее распространены именно в Китае, а подтверждений того, что в России циркулируют аналогичные серотипы нет. Таким образом нельзя ожидать высокой эффективности рассматриваемых изобретений на территории РФ.
Известны: способ получения двухвалентной инактивированной вакцины против инфекционного серозита уток (Production method for bivalent inactivated vaccine for infectious serositis of ducks) [патент - CN102125687B, опубл. 2013.07.17]; способ получения вакцины против Riemerella anatipestifer на основе капсульного антигена и прополиса (Method for preparing Riemerella anatipestifer capsular antigen and propolis vaccine) [патент - CN 103656636 A, опубл. 2015.08.12]. Предлагаемые способы ограничены технологией производства монокомпонентных препаратов, т.е. не раскрывает сущность производства комбинированных препаратов, предназначенных для одновременной профилактики нескольких заболеваний птицы. Кроме того, предложенные технологии производства препаратов имеют подтвержденные данные по безвредности и эффективности на утках и гусях, но не на индейках.
3
3
3
Согласно вышеприведенным характеристикам на существующие и/или ранее используемые на территории РФ вакцины, препарат Вирсин-424 [ссылка в сети «Интернет» http://www.biovac.co.il/BioVac//userdata/SendFile.asp?DBID=l&LNGID=3&GID=506] является наиболее близким аналогом (прототипом), предлагаемой вакцине. В качестве основных действующих компонентов вакцина содержит инактивированные формалином антигены Pasteurella multocida штаммов Pm-1,3 и 4-7-12, и Riemerella anatipestifer штамма RA. В качестве вспомогательных средств в препарат включены: минеральное масло 0,32 см, моносорбат Т80 - 0,01 см, сорбинат моолеат А80 - 0,03 см и тиомерсал 0,05 мг. Тем не менее приведенный препарат имеет существенные недостатки, в частности, содержит в своем составе лишь один серотип Riemerella anatipestifer, в то время как было доказано, что в стране циркулирует как минимум три гетерологичных серотипа, а также препарат не предназначен для использования на индейках [Лаишевцев, А.И. Опыт разработки первой отечественной вакцины против риемереллеза / А.И. Лаишевцев, Э.А. Якимова, А.В. Капустин // Ветеринария. 2018. №8. С.24-29].
Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемому способу получения вакцины против риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза индеек, уток и гусей является способ получения двухвалентной инактивированной вакцины против инфекционного серозита уток (Production method for bivalent inactivated vaccine for infectious serositis of ducks) [патент - CN102125687B, опубл. 2013.07.17]. Сущность прототипа подразумевает глубинное культивирование штаммов реймерелл на триптон соевом бульоне при температуре 37-38°С и рН 7,2, в течении 9-10 часов. Последующая инактивация культуральной жидкости производится путем добавления 0,3% объемов формалина (содержащего не менее 37% формальдегида). Экспозиция инактивации составляет 20 часов. Следующий этап изготовления вакцины подразумевает подготовку водной и масляной фазы для эмульсионной вакцины. Водную фазу готовят с использованием 4 частей Твин-80 и 96 частей антигена которые смешивали в стерильной емкости, до полного растворения твина. Масляную фазу готовят путем смешивания 94 частей белого масла с 6 частями стеарата алюминия при постоянном смешивании в течении 30 минут, при поддержании температуры 30°С. Следующий этап получения вакцины подразумевал объединение водной и масляной фазы, для этого их в равном количестве смешивали в эмульгаторе в течении 30 минут при 4000 оборотов в минуту.
Приведенный способ ограничен технологией производства монокомпонентных препаратов, т.е. не раскрывает сущность производства комбинированных препаратов, предназначенных для одновременной профилактики нескольких заболеваний птицы. Кроме того, новый предлагаемый способ культивирования реймерелл предусматривает не только глубинный метод культивирования, но и поверхностный, что позволяет использовать его для снижения энергозатрат и использовать при малотоннажном биопроизводстве.
Поскольку риемереллезу, пастереллезу и сальмонеллезу подвергнуты птицы всех трех упомянутых видов, то имеется целесообразность разработки одного ассоциированного средства специфической профилактики против перечисленных заболеваний, наиболее полно охватывающих серотиповой состав возбудителей, циркулирующих на территории РФ. Так, проведенные на базе ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН исследование подтверждают широкое циркулирование на утководческих и гусеводческих, а также индейководческих предприятиях страны, возбудителей риемереллеза как минимум трех серотипов, а также возбудителей пастереллеза, относящиеся к типу «А», и сальмонелл. Полученные данные подтверждаются ФГБУ «ВНИИЗЖ» [Потехин, А. Новые угрозы в птицеводстве требуют новых стратегий / А. Потехин // Ветеринария и Жизнь. - 2018. - 3(10)].
Таким образом, предлагаемое изобретение в полной мере реализуется в рамках следующих положений «Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года», утвержденной распоряжением Правительства РФ от 25.09.17 г. No 2045-р, Стратегии национальной безопасности Российской Федерации, утв. Указом Президента РФ от 31.12.15 г. No 683 "О Стратегии национальной безопасности Российской Федерации", и Основ государственной политики в области обеспечения химической и биологической безопасности Российской Федерации на период до 2025 года и дальнейшую перспективу, утв. Президентом РФ от 01.11.13 г. № Пр-2573, а также положений Политической декларации заседания высокого уровня Генеральной Ассамблеи по проблеме устойчивости к противомикробным препаратам, принятой на 71-ой сессии Генеральной Ассамблеи ООН (резолюция A/RES/71/3 от 05.10.16 г.), и Глобального плана действий по борьбе с устойчивостью к противомикробным препаратам, принятого на 68-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения (резолюция WHA68.7 от 26.05.15 г.), определяющих комплексный и межсекторальный подход для отраслей, где используются противомикробные препараты (здравоохранение, сельское хозяйство, в том числе растениеводство, животноводство, разведение аквакультуры, а также производство пищевой продукции и очистка воды).
Технической проблемой, на решение которой направлена данная группа изобретений, является необходимость создания безопасной вакцины против риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза индеек, уток и гусей, на основе сбалансированного антигенного состава, содержащего наиболее распространенные на территории РФ серотипы бактерий вида Riemerella anatipestifer, Pasteurella multocida и Salmonella и необходимость в расширении арсенала поливалентных инактивированных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней индеек, уток и гусей.
Раскрытие сущности изобретения Техническим результатом предлагаемой группы изобретений является повышении стабильности, антигенной и иммуногенной активности вакцины и создании продолжительного и напряженного иммунитета у вакцинированной птицы (индеек, уток и гусей) против риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза, расширении арсенала поливалентных инактивированных вакцин, направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней сельскохозяйственной птицы, создание вакцины с повышенной стабильностью, антигенной и иммуногенной активностью, расширении подходов и способов изготовления поливалентных инактивированных вакцин направленных на специфическую профилактику инфекционных болезней сельскохозяйственной птицы.
Поливалентная инактивированная вакцина против риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза индеек, уток и гусей
3
3
Заявляемая поливалентная вакцина против риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза индеек, уток и гусей содержит в своем составе следующие компоненты из расчета на 1 см препарата: инактивированный формалином протективный антиген штамма Riemerella anatipestifer №549-ВИЭВ - 2 млрд мкр кл.; инактивированный формалином протективный антиген штамма R. anatipestifer №566-ВИЭВ - 2 млрд мкр кл.; инактивированный формалином протективный антиген штамма R. anatipestifer №571-ВИЭВ - 2 млрд мкр кл.; инактивированный формалином протективный антиген штамма Pasteurella multocida №367-ВИЭВ - 2 млрд мкр кл.; инактивированные формалином протективный антиген штаммов Salmonella enteritidis №162-ВИЭВ - 1 млрд мкр кл., Salmonella typhimurium №178-ВИЭВ - 1 млрд мкр кл., Salmonella infantis №1827-ВИЭВ -1 млрд мкр кл., а также фармацевтически приемлемые целевые добавки. Иммунизирующая доза, рекомендованная к однократному применению, составляет 0,5 см.
В качестве фармацевтически приемлемых целевых добавок вакцина, помимо антигенов, содержит:
- Инактивант, необходимый для обеззараживания бактериальных антигенов. В качестве данного средства используется формалин из расчета 0,3% к объему бульонной культуры, содержащий не менее 37% формальдегида;
- Консервант, необходимый для производства многодозовых фасовок препарата. В качестве стандартного консерванта используется водный раствор мертиолята натрия 10%, вводимый в препарат из расчета 1:10000;
- Разбавитель, необходимый для разведения концентрированного бактериального антигена до требуемой концентрации. В качестве стандартных растворителей могут быть использованы - стерильный физиологический раствор, стерильный PBS - фосфатно буферный солевой раствор, вода для инъекций;
- Адъювант, необходимый для осаждения бактериальных компонентов в вакцине и для неспецифического усиления иммунного ответа к антигенам. В качестве целевой добавки предлагаемая вакцинная композиция может содержать ПЭГ-6000 (полиэтиленгликоль-6000) в объеме 10% от компонуемой серии препарата; ГОА (гидроокись алюминия) в концентрации 3% в объеме 10% от компонуемой серии препарата; масляный адъювант в объеме 50% от компонуемой серии препарата и т.д.;
Дополнительно, с целью нормализации уровня водородных ионов в препарате, необходимо использование 10% гидроксида натрия (едкого натра). Оптимальным уровнем рН препарата стоит считать 7,0-7,6 для варианта вакцины, выполненной на ГОА и ПЭГ-6000. Уровень рН препарата, выполненного на масляном адъюванте, дополнительно не регулируется.
В зависимости от используемого адъюванта внешний вид вакцины может иметь следующие вариации:
- При использовании ПЭГ-6000 и ГОА - по внешнему виду вакцина представляет собой суспензию светло-серого цвета с серо-белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.
- При использовании масляных адъювантов - по внешнему виду вакцина представляет собой эмульсию белого цвета, иногда с желтоватым оттенком. При длительном хранении возможно незначительное расслоение препарата, которое при встряхивании переходит в первоначальное состояние гомогенной эмульсии.
Срок годности вакцины - 18 месяцев с даты выпуска, вне зависимости от используемого адъюванта, при соблюдении соответствующих условий хранения при температуре 2-8°С.
Вакцина предназначена для родительского, ремонтного и товарного поголовья птицы. Вакцина вызывает формирование иммунитета к риемереллезу, пастереллезу и сальмонеллезу индеек, уток и гусей через 12-14 дней после повторного введения, который сохраняется не менее 8 недель по риемереллезному компоненту, и не менее 6 месяцев по пастереллезному и сальмонеллезному компонентам. Несмотря на то, что продолжительность иммунитета к Riemerella anatipestifer достаточно низкая, данного периода достаточно для обеспечения сохранности восприимчивого поголовья, так как наиболее подвержена инфекции птица в возрасте от 1 до 4 недель. Трансовариальный иммунитет у молодняка, полученного от иммунизированных птиц, сохраняется до 14 дней.
Входящие в состав вакцины бактериальные штаммы Riemerella anatipestifer №549-ВИЭВ, №566-ВИЭВ и №571-ВИЭВ; Pasteurella multocida №367-ВИЭВ и Salmonella enteritidis №162-ВИЭВ, Salmonella typhimurium №178-ВИЭВ, Salmonella infantis №1827-ВИЭВ являются новыми производственными культурами и впервые используются в составе вакцинных препаратов для широкого применения. Ранее, на этапе доклинических и клинических испытаний, была подтверждена пригодность данных культур для использования в качестве производственных штаммов микроорганизмов.
Все вновь предложенные штаммы бактерий депонированы во Всероссийской коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных ФГБНУ Федеральный Научный Центр Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук. Все культуры идентифицированы на базе лаборатории микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Характеристика штаммов Riemerella anatipestifer
В соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии Riemerella anatipestifer не относятся ни одной из четырех групп патогенности.
2
Все культуры риемерелл имеют типичные для вида морфологические, тинкториальные и культуральные свойства: Riemerella anatipestifer является неподвижной, не спорообразующей грамотрицательной палочкой средними размерами 0,3-0,5*1-2,5 мкм. В мазках клетки располагаются одиночно, парно или в виде небольших цепочек. На плотных питательных средах при культивировании в 5-10%-ной СО атмосфере в течение 48 и более часов и температуре 37°С, наблюдается рост гладких, непигментированных колоний, мукоидной консистенции. При культивировании на средах, содержащих дефибринированную кровь барана, гемолиз может являться переменным свойством для описываемого вида бактерий. При этом в ходе выполнения работы было установлено, что рост Riemerella anatipestifer на агаризированных средах может проявляться в виде крупных отдельных колоний средним размером 2-5 мм на 2-ой день культивирования или в виде сплошного роста.
Условия культивирования штаммов реймерелл: микроорганизм растет на триптиказо-соевом бульоне и на агаризированных средах, содержащих дефибринированную кровь.
1) Производственный штамм Riemerella anatipestifer №549-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1252
Дата, источник и место выделения: Утководческое предприятие Рязанской области. В 2017 году из тканей гусенка.
Биохимические свойства: Культура оксидазо-, каталазо-, альфа-галактозидазо-, а-мальтозидаза, а-химотрипсин положительная. Бета-глюкозидаза- и аргининдекарбоксилазо- отрицательная. Штамм не образует пигмент на кровяном агаре. Разжижает желатин, и не гидролизует эскулин, не образует индол. Культура ферментирует глюкозу, мальтозу, фруктозу, маннозу, декстрин, и не ферментирует трегалозу. CAMP тест отрицательный, реакция Фогес-Проскауэра положительная. Образует уреазу.
50
7
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 2,20*10 мкр кл. для 10-ти дневных утят.
2) Производственный штамм Riemerella anatipestifer №566-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1251. Штамм имеет синонимичное название - «Riemerella anatipestifer Уфа» [Лаишевцев, А.И. Опыт разработки первой отечественной вакцины против риемереллеза / А.И. Лаишевцев, Э.А. Якимова, А.В. Капустин // Ветеринария. 2018. №8. С.24-29].
Дата, источник и место выделения: Утководческое предприятие Республики Башкортостан. В 2017 году из тканей утенка.
Биохимические свойства: Культура оксидазо-, каталазо-, альфа-галактозидазо-, а-мальтозидаза, а-химотрипсин положительная. Бета-глюкозидаза- и
аргининдекарбоксилазо- отрицательная. Штамм не образует пигмент на кровяном агаре. Разжижает желатин, и не гидролизует эскулин, но образует индол. Культура ферментирует глюкозу, мальтозу, фруктозу, маннозу, декстрин, и не ферментирует трегалозу. CAMP тест отрицательный, реакция Фогес-Проскауэра положительная. Не образует уреазу.
50
7
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 5,31*10 мкр кл. для 10-ти дневных утят.
3) Производственный штамм Riemerella anatipestifer №571-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1253. Штамм имеет синонимичное название - «Riemerella anatipestifer Казань» [Лаишевцев, А.И. Опыт разработки первой отечественной вакцины против риемереллеза / А.И. Лаишевцев, Э.А. Якимова, А.В. Капустин // Ветеринария. 2018. №8. С.24-29].
Дата, источник и место выделения: Утководческое предприятие Республики Татарстан. Штамм выделен в 2017 году из тканей утенка.
Биохимические свойства: Культура оксидазо-, каталазо-, альфа-галактозидазо-, а-мальтозидаза, а-химотрипсин положительная. Бета-глюкозидаза- и аргининдекарбоксилазо- отрицательная. Штамм не образует пигмент на кровяном агаре. Разжижает желатин, и не гидролизует эскулин, но образует индол. Культура ферментирует глюкозу, мальтозу, фруктозу, маннозу, декстрин, и не ферментирует трегалозу. CAMP тест отрицательный, реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Образует уреазу.
50
8
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 1,74*10 мкр кл. для 10-ти дневных утят.
Характеристика штаммов Pasteurella multocida
1) Производственный штамм Pasteurella multocida №367-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1242
Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии вида Pasteurella multocida относятся к третьей группе опасности.
Дата, источник и место выделения: Утководческое предприятие Республики Башкортостан. Штамм выделен в 2017 году из тканей утенка.
Где идентифицирована культура: лаборатория микробиологии с музеем типовых культур ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН и на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Методы идентификации: посредством изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств и определением нуклеотидной последовательности гена 16S rRNA.
Морфологические признаки: мелкие грамотрицательные, часто овоидные палочки, располагаются изолированно, иногда парами и реже цепочками, неподвижные, спор не образуют. В мазках из крови и органов окрашиваются биполярно, иногда с выраженной капсулой. Нити и другие инволюционные формы должны отсутствовать.
Культуральные особенности: образуют в бульоне Хоттингера равномерное помутнение среды; на агаре Хоттингера в чашках Петри через 18-24 часа культивирования - мелкие, круглые, выпуклые, полупрозрачные, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии - «5»-форма. На ПЖА - рост по уколу.
Биохимические свойства: свойственны для Pasteurella multocida. Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа глюкозу, сахарозу, галактозу, манит, сорбит. Не ферментирует дульцит, арабинозу, мальтозу, раффинозу, лактозу. Оксидазо, - и каталазоположительная культура. Не свертывают молоко и не разжижают желатин. Образуют индол и сероводород.
Серологические свойства: тип А.
50
8
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 3,98×10 мкр кл. для белых мышей. Гибель животных наступает не позднее 24 часов после заражения.
Условия культивирования: микроорганизм растет на большинстве бульонных питательных сред, используемых в биопроизводстве, в частности на бульоне Хоттингера, сердечно-мозговом бульоне, триптон соевом бульоне и т.д. МПБ, МПА, бульон и агар Хоттингера с добавлением 5%-10% стерильной дефибринированной крови барана, М-144 (HiMedia) при рН-7,2 с температурой 37°С в течении 18-24 часов. Не более 21 суток на 0,25% ПЖА.
Характеристика штаммов Salmonella spp.
В соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактерии вида Salmonella enterica серовара Enteritidis, Typhimurium и Infantis относятся к IV группе патогенности.
Все культуры производственных и контрольных штаммов сальмонелл имеют типичные для вида морфологические, тинкториальные и культуральные свойства, а именно: по морфологии представляют из себя мелкие грамотрицательные палочки, не образующие спор и капсул, подвижны. Штаммы ферментируют с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, сорбит, арабинозу, маннит, рамнозу и дульцит, не ферментируют лактозу и сахарозу. Образуют сероводород, не образуют индол, не свертывают молоко, не разжижают желатин. Оксидазная активность отрицательная, каталазная активность положительная, реакция Фогеса-Проскауэра отрицательна.
Условия культивирования штаммов сальмонелл: для культивирования штаммов Salmonella spp. используют различные питательные среды, обладающие необходимыми ростообеспечивающими свойствами: МПБ, бульон Хоттингера, триптон-соевый бульон, агар Хоттингера, Эугоник и др. Образуют в МПБ и бульоне Хоттингера равномерное помутнение среды; на МПА и агаре Хоттингера в чашках Петри через 16-24 часа культивирования - круглые, выпуклые, полупрозрачные, с гладкой поверхностью и ровными краями колонии - «S»-форма.
1) Производственный штамм Salmonella enterica серовар Enteritidis №162-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1257
Дата, источник и место выделения: выделен из фекалий кур в 2017 году в Московской области
Серологические свойства: 1,9,12 g, m
50
5
Вирулентность для лабораторных животных: Патогенен для мышей. LD -10*10 мкр кл.
2) Производственный штамм Salmonella enterica серовар Typhimurium №178-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1258
Дата, источник и место выделения: выделен из кишечника утят в 2018 году в Республике Башкортостан
Серологические свойства: 1,4, [5], 1,2 i 1,2
50
6
Вирулентность для лабораторных животных: Патогенен для мышей. LD -10*10 мкр кл.
3) Производственный штамм Salmonella enterica серовар Infantis №1827-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1259
Дата, источник и место выделения: выделен из фекалий цыплят в 2016 году в Калужской области
Серологические свойства: 6,7,14 r 1,5
50
8
Вирулентность для лабораторных животных: Патогенен для мышей. LD -1,4*10 мкр кл.
Способ получения вакцины против риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза индеек, уток и гусей.
Получение заявляемого препарата подразумевает реализацию следующих последовательных этапов:
1) Культивирование производственных штаммов глубинным и/или поверхностным методом;
2) Инактивацию культуральной жидкости;
3) Концентрирование антигенов;
4) Определение полноты инактивации антигенов;
5) Составление серии вакцины;
6) Контроль стерильности вакцины;
7) Определение иммуногенной активности вакцины.
Для глубинного культивирования бактерий вида Riemerella anatipestifer могут быть использованы триптиказо-соевый бульон (с декстрозой) и триптон-соевый бульон (на иных средах рост культур реймерелл не наблюдается). Для поверхностного культивирования рекомендуемыми питательными средами являются сердечно-мозговой агар, триптиказо-соевый агар, мясопептонный агар, триптон-соевый агар, агар Хоттингера, агар Мюллера-Хинтона с добавление 10% дефибринированной крови барана.
Для глубинного культивирования бактерий вида Pasteurella multocida и Salmonella spp., при производстве вакцины, могут быть использованы триптиказо-соевый бульон (с декстрозой), триптон-соевый бульон, эугоник бульон, мясопептонный бульон, бульон Хоттингера, и иные среды, обладающие необходимыми ростообеспечивающими свойствами. Для поверхностного культивирования рекомендуемыми средами являются сердечно-мозговой агар, триптиказо-соевый агар, мясопептонный агар, триптон-соевый агар, агар Хоттингера, агар Мюллера-Хинтона с добавление 10% дефибринированной крови барана.
Для получения антигенов Riemerella anatipestifer может быть использован один из двух предлагаемых методов культивирования:
2
2
2
3
3
первый вариант подразумевает использование поверхностного метода культивирования с использованием сердечно-мозгового агара, триптиказо-соевого агара, мясопептонного агара, триптон-соевого агара, агара Хоттингера или агара Мюллера-Хинтона с добавление к ним 10% дефибринированной крови барана. Рекомендуемый порядок проведения поверхностного культивирования риемерелл следующий: в первый день проводится подготовка первой генерации штаммов путем ресуспендирования лиофилизированной культуры MSB (Master Seed Bacteria - главного посевного материала) в пробирке с последующим посевом на кровяной агар; культивирование продолжается в течение 48 часов в условиях 5-10% СO атмосферы и температуре 37°С. На третий день культивирования, в случае соответствия роста культур по морфологическим и тинкториальным свойствам Riemerella anatipestifer, а также отсутствия роста посторонней микрофлоры, культуру необходимо смыть стерильным физиологическим раствором в объеме 15 мл. В этот же день полученная суспензия бактериальных клеток должна быть засеяна на ранее подготовленные культуральные матрасы с кровяным агаром, площадью 225 см. Объем засевной (маточной) бактериальной суспензии на каждый матрас должен составлять по 5 мл. Матрасы культивируются в СО - инкубаторе в течение 48 часов, после чего бактериальную массу смывают физиологическим раствором в объеме 50 мл. Полученная суспензии контролируется на отсутствие контаминации посторонней микрофлорой, тинкториальные свойства и концентрацию. Таким образом, можно получить 50 см суспензии бактериальных клеток с концентрацией 40-60 млрд м.к./см.
2
3
3
- второй вариант подразумевает проведение глубинного культивирования с использованием коммерческой питательной среды - триптиказо-соевого бульона (с декстрозой), или триптон-соевого бульона. В первой вариации метода глубинного культивирования могут быть использованы бутыли соответствующего объема, помешивающихся на шейкере в СО инкубаторе в 5%-ной атмосфере углекислого газа с температурным режимом 37°С. Подготовка матровой расплодки выполняется согласно вышеописанной методике. При этом, объем матровой расплодки должен составлять не менее 10% к общему объему питательного бульона, находящегося в бутылях. Данный способ культивирования на 2-ые сутки позволяет добиться накопления до 4,0 млрд м.к./см. Вторая вариация метода глубинного культивирования подразумевает использование биореактора любой модели, обладающего возможностью автоматически контролировать обогащение среды кислородом, регулировать уровень углекислого газа, поддерживать заданный уровень рН 7,4-7,8, подкармливать культуру глюкозой. Культивирование в ферментере позволяет достичь накопления до 6,6 млрд мкр кл./см через 24-26 ч культивирования.
3
3
Для получения антигенов Pasteurella multocida и Salmonella spp. применяется глубинный метод культивирования, описанным ранее. Отличие заключается в том, что для культивирования может быть использован не только триптиказо-соевый бульон, но и другие питательные среды, применяемые в био производстве. Кроме того, культивирование проводится без поддержания уровня углекислого газа, при поддержании уровня рН 7,0-7,8 для пастерелл и 7,4-7,6 для сальмонелл. Концентрация микробных клеток пастерелл по итогу культивирования на сердечно-мозговой среде может достигать 12 млрд м.к./см и более. Концентрация микробных клеток сальмонелл по итогу культивирования на сердечно-мозговой среде может достигать 30 млрд м.к./см и более.
Инактивацию культуральной жидкости, содержащей клетки Riemerella anatipestifer и Pasteurella multocida, проводят путем добавления формалина (содержащего не менее 37% формальдегида) в объеме 0,3% к объему инактивируемой жидкости, в течении 3 суток, и в течении 21 суток для культуральной жидкости, содержащей клетки Salmonella spp., при комнатной температуре.
Концентрирование культур проводят центрифугированием при 3-6 тыс.об. мин. в течении 1-3 часов или сепарированием при 10-15 тысячах оборотах в зависимости от используемого оборудования.
3
Полноту инактивации оценивают по отсутствию жизнеспособных клеток в концентрированном антигене и скомпонованном препарате путем посева на ростобеспечивающие питательные среды, а также по безвредности инактивированной бактериальной массы в био пробе на лабораторных мышах массой 16-18 гр. при подкожном введении антигенов Pasteurella multocida и Salmonella spp., и в биопробе на 10-ти дневных мускусных утятах, при внутримышечном способе введения для антигенов Riemerella anatipestifer, в однократной дозе объемом 0,5 см. Для оценки безвредности каждой серии антигена Pasteurella multocida и Salmonella spp., используется по три подопытные мыши, а для контроля антигена Riemerella anatipestifer по три мускусных утенка. Наблюдение за опытными животными продолжается в течение 10 суток. Препарат считается инактивированным в случае отсутствия роста культуры Riemerella anatipestifer, Pasteurella multocida, Salmonella spp., и иных микроорганизмов на питательных средах, а также отсутствия каких-либо местных и системных реакций, в том числе гибели, у подопытных животных.
Составление серии вакцины.
Как было упомянуто ранее, для производства предлагаемой вакцины могут быть использованы различные адъюванты, ввиду этого, этапы составления серии вакцины могут варьировать. Варианты составления серии, приведены ниже. Приведены расчеты производства серии вакцины объемом 100 литров (200 тысяч доз).
Вариант №1. - компоновка вакцины с использованием полиэтиленгликоля-6000 или гидроокиси алюминия.
3
3
3
В стерильном реакторе проводиться смешивание инактивированных бактериальных антигенов семи производственных культур (ранее установленной концентрации) с разбавителем, адъювантом (10%) и мертиолятом натрия, таким образом чтобы получить концентрацию бактериальных антигенов равной 11 млрд мкр кл./см (по 2 млрд мкр кл./см каждого штамма риемерелл и пастерелл, и по 1 млрд мкр кл./см каждого штамма сальмонелл). После получения при постоянном помешивании однородной суспензии, устанавливается рекомендуемый уровень водородных ионов (7,0-7,6). Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки приведена в таблице №2.
Вариант №2. - компоновка вакцины с использованием масляного адъюванта (например, Montanide ISA 70).
3
3
3
В стерильном реакторе проводиться смешивание инактивированных бактериальных антигенов семи производственных культур в ранее установленной концентрации с разбавителем, адъювантом (50%), и мертиолятом натрия, таким образом чтобы получить концентрацию бактериальных антигенов равной 11 млрд мкр кл. см (по 2 млрд мкр кл./см антигена каждого штамма риемерелл и пастерелл, и по 1 млрд мкр кл./смантигена каждого штамма сальмонелл). Получение гомогенной эмульсии проводят при помощи диспергирующей машины при 6000-8000 об/мин. Полученная данным образом серия вакцины имеет среднее значение рН - 6,0. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки, приведена в таблице №3.
Контроль стерильности вакцины выполняется в соответствии с ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения».
Определение иммуногенной активности вакцины проводят с использованием мускусных утят и белых мышей:
50
- Определение иммуногенной активности риемереллезного компонента вакцины проводят с использованием 10-дневных мускусных утят. Для реализации поставленной цели формируется шесть групп 10-ти дневных утят, три из которых опытные, и три контрольные. Количество птицы в каждой группе должно быть не менее 10. Утят опытной группы вакцинируют двукратно с интервалом 14-16 дней. Через 14-15 дней после двукратной вакцинации каждую группу иммунизированных птиц подвергают инфицированию контрольным штаммом риемерелл в дозе 5LD. Параллельно заражают птиц контрольных групп всеми контрольными штаммами риемерелл. Наблюдение за птицей устанавливают на период 10 дней, или до момента гибели. Вакцина считается иммуногенной, если после заражения в опытных группах выжило не менее 80% птицы, в то время как в контроле должно погибнуть не менее 80% утят.
50
- Определение иммуногенной активности пастереллезного и сальмонеллезных компонентов вакцины на белых мышах. Для реализации поставленной цели формируется восемь групп по 10 мышей в каждой, массой 18-20 гр. Четыре группы являются опытной (на каждый заражающий штамм), и четыре группы являются контрольными (на каждый заражающий штамм). Мышей предварительно вакцинируют, двукратно с интервалом 14-16 дней. На 14-15 день после двукратной вакцинации, мышей опытной и контрольной группы подвергают инфицированию контрольным штаммом Pasteurella multocida №1231, Salmonella enteritidis №1807-ВИЭВ, Salmonella infantis №1841-ВИЭВ, Salmonella typhimurium №371 в дозе 5LD. Наблюдение за животными устанавливают на период 10 дней, или до момента их гибели. Вакцина считается иммуногенной если после заражения в опытных группах выжило не менее 80% мышей, в то время как в контроле должно погибнуть не менее 80% голов.
50
Контрольные штаммы Riemerella anatipestifer №602-ВИЭВ, №490-ВИЭВ и №513-ВИЭВ являются хорошо изученными культурами, с известным значением показателя LD, что позволяет использовать их в качестве штаммов «пробойников» при контроле иммуногенной активности предложенного препарата. С целью контроля иммуногенной активности сальмонеллезных компонентов вакцины предложены два новых контрольных штамма Salmonella enteritidis №1807-ВИЭВ и Salmonella infantis №1841-ВИЭВ с хорошо изученными характеристиками и свойствами. Для контроля сальмонеллезного компонента вакцины, относящегося к группе «В», предлагается использовать известный штамм Salmonella typhimurium №371 (депонированный во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» ФГБУ «ВГНКИ»), который широко применяется при изготовлении и контроле сальмонеллезных вакцин и лечебных сывороток [Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза свиней RU 2162340 С1 опубл. 2001.01.27]. Для контроля иммуногенной активности пастереллезного компонента вакцины предусмотрено использование хорошо изученного и распространенного штамма Pasteurella multocida №1231 (депонированного во Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве ФГБУ «ВГНКИ»), применяемого при изготовлении пастереллезных вакцин и лечебных сывороток [Вакцина против пастереллеза животных. RU 2414929 С1 опубл. 2011.03.27].
Характеристика контрольных штаммов:
1) Контрольный штамм Riemerella anatipestifer №602-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1254
Дата, источник и место выделения: Утководческое и гусеводческое предприятие Курганской области. Штамм выделен в 2017 году из тканей гусенка.
Биохимические свойства: Культура оксидазо-, каталазо-, альфа-галактозидазо-, а-мальтозидаза, а-химотрипсин положительная. Бета-глюкозидаза- и аргининдекарбоксилазо- отрицательная. Штамм не образует пигмент на кровяном агаре. Разжижает желатин, и не гидролизует эскулин, но образует индол. Культура ферментирует глюкозу, мальтозу, фруктозу, маннозу, декстрин, и трегалозу. CAMP тест отрицательный, реакция Фогес-Проскауэра положительная. Не образует уреазу.
50
9
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 1,08*10 мкр кл. для 10-ти дневных утят.
2) Контрольный штамм Riemerella anatipestifer №490-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1255. Штамм имеет синонимичное название - «Riemerella anatipestifer Казань» [Лаишевцев, А.И. Опыт разработки первой отечественной вакцины против риемереллеза / А.И. Лаишевцев, Э.А. Якимова, А.В. Капустин // Ветеринария. 2018. №8. С.24-29].
Дата, источник и место выделения: Утководческое предприятие Ростовской области. Штамм выделен в 2018 году из тканей утенка.
Биохимические свойства: Культура оксидазо-, каталазо-, альфа-галактозидазо-, а-мальтозидаза положительная, а-химотрипсин - отрицательная. Бета-глюкозидаза- и аргининдекарбоксилазо-отрицательная. Штамм не образует пигмент на кровяном агаре. Разжижает желатин, и не гидролизует эскулин, но образует индол. Культура ферментирует глюкозу, мальтозу, фруктозу, декстрин, и не ферментирует маннозу и трегалозу. CAMP тест отрицательный, реакция Фогес-Проскауэра положительная. Образует уреазу.
50
7
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 8,25*10 мкр кл. для 10-ти дневных утят.
3) Контрольный штамм Riemerella anatipestifer 513-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1256
Дата, источник и место выделения: Утководческое и гусеводческое предприятие Краснодарского края. Штамм выделен в 2017 году из тканей утенка.
Биохимические свойства: Культура оксидазо-, каталазо-, альфа-галактозидазо-, а-мальтозидаза, а-химотрипсин положительная. Бета-глюкозидаза- и аргининдекарбоксилазо- отрицательная. Штамм не образует пигмент на кровяном агаре. Разжижает желатин, и не гидролизует эскулин, но образует индол. Культура ферментирует глюкозу, фруктозу, маннозу, декстрин, и не ферментирует мальтозу и трегалозу. CAMP тест положительный, реакция Фогес-Проскауэра положительная. Образует уреазу.
50
8
Вирулентность для лабораторных животных: величина LD - 4,95*10 мкр кл. для 10-ти дневных утят.
4) Контрольный штамм Salmonella enterica серовар Enteritidis №1807-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1260
Дата, источник и место выделения: выделен из слепых отростков кишечника утенка в 2016 году в Псковской области
Серологические свойства: 1,9,12 g, m
50
6
Вирулентность для лабораторных животных: Патогенен для мышей. LD -3,5*10 мкр кл.
5) Контрольный штамм Salmonella enterica серовар Infantis №1841-ВИЭВ характеризуется следующими признаками и свойствами:
Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: В-1261
Дата, источник и место выделения: выделен из фекалий индюшат в 2016 году в Тверской области
Серологические свойства: 6,7,14 r 1,5
50
8
Вирулентность для лабораторных животных: Патогенен для мышей. LD -1,2*10 мкр кл.
Произведенные таким образом серии вакцины были апробированы в условиях вивария ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, а также на утководческих, гусеводческих и индейководческих предприятиях, неблагополучных по риемереллезу, пастереллезу и сальмонеллезу. В рамках апробации была подтверждена безвредность препарата и его протективная эффективность.
Предложенную вакцину начинают применять с ремонтного поголовья птицы за 42-45 дней до начала яйцекладки внутримышечно в область бедра в дозе 0,5 мл двукратно: первый раз - за 42-45 суток до начала яйцекладки, второй раз спустя 14-16 дней после первой вакцинации. В последующее родительское поголовье вакцинируется однократно, каждые 6 месяцев.
Молодняку, ранее полученному как от вакцинированной, так и не вакцинированной птицы, вакцину вводят на 7-10 день жизни, двукратно с интервалом 14-16 дней. В случае, если молодняк планируется использовать как ремонтный, его в последующем вакцинируют каждые 6 месяцев, однократно.
Осуществление изобретения
Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.
Пример №1. Культивирование производственных штаммов Riemerella anatipestifer поверхностным методом
3
3
3
2
3
3
2
Получение антигенов риемерелл проводили методом поверхностного культивирования производственных штаммов на сердечно-мозговом агаре в состав которого дополнительно была внесена дефибринированная кровь барана в объеме 10%. В первый день работы подготавливали первую генерацию главного посевного материала каждого производственного штамма. Для этого, в ампулу с лиофильно высушенным штаммом риемерелл вносили питательный бульон (бульон Хоттингера) в объеме 1 мл, необходимом для восстановления лиофильной массы до первоначального объема. Полученную суспензию в объеме 0,5 см переносили пастеровской пипеткой в пробирку с бульоном Хоттингера (7 мл среды). После этого, из пробирки проводили рассев суспензии клеток в чашки Петри, содержащие по 20 см сердечно-мозгового агара, по методу Дригальского. Из одной пробирки было подготовлено 5 чашек Петри (количество чашек может варьировать в зависимости от необходимого объема получения матровой расплодки). Полученные чашки с посевами в течении 48 часов культивировали в СО инкубаторе при постоянном присутствии 5% углекислого газа. Температура инкубирования составляла 37°С. После подтверждения культуральных, морфологических и тинкториальных свойств выращенных культур, визуальным методом и методом микроскопирования окрашенных по Граму мазков, культуры были смыты в физиологический раствор, из расчета 15 см на чашку. Суммарный объем полученной суспензии каждого штамма составил 75 мл. Полученной суспензией бактериальных клеток засевали матрасы площадью 225 см, содержащие сердечно-мозговой агар с 10% дефибринированной кровью барана, из расчета 5 см суспензии на матрас. Таким образом было получено 15 матрасов с каждым штаммом. Культивирование матрасов проводили в течении 48 часов, при температуре 37°С в присутствии 5% углекислого газа. После культивирования проводили смыв бактериальных культур с поверхности агара в матрасах физиологическим раствором из расчета 50 см на 1 матрас. В результате было получено 750 мл бактериальной суспензии каждого штамма. Бактериальные суспензии контролировались на типичность тинкториальных и морфологических свойств культур микроскопированием окрашенных по Граму мазков, а также на отсутствие иных морфологических форм бактерий.
Все суспензии штаммов риемерелл содержали типичными для вида клетки, и не содержали посторонних включений.
Пример №2. Культивирование производственных штаммов Riemerella anatipestifer глубинным методом.
3
3
3
2
2
2
Культивирование штаммов риемерелл проводили с использованием 3-ех литровых бутылей с триптиказо-соевым бульоном (по 2,5 литра). Подготовка главного посевного материала производилась согласно методике, описанной в примере №1, с некоторыми отличиями. Так, на первый день работы проводили подготовку первой генерации главного посевного материала, для чего в ампулу с лиофильно высушенным штаммом риемерелл вносили питательный бульон (триптиказо-соевый бульон) в объеме 1 мл, необходимом для восстановления лиофильной массы до первоначального объема. Затем полученную суспензию в объеме 0,5 см пастеровской пипеткой переносили в пробирку с триптиказо-соевым бульоном, и параллельно проводили рассев суспензии клеток на чашки Петри, содержащие по 20 см триптон-соевого агара с 10% дефибринированной крови барана, по методу Дригальского. Полученные пробирки и чашки культивировали в течении 24 часов при температуре 37°С в условиях СO инкубатора с 5% углекислого газа. После культивирования чашек Петри проводили изучение полученных колоний риемерелл по культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам, с целью определения типичности роста и отсутствия роста посторонней микрофлоры. Бульонная культура в пробирках также подвергали микроскопированию после окрашиванию по методу Грама. В случае подтверждения свойств производственных штаммов и отсутствия посторонней микрофлоры на чашках Петри и в пробирках, полученные культуры риемерелл пересеивали во флаконы с триптиказо-соевым бульоном (1 пробирка на 250 см питательной среды) для последующего реакторного культивирования. Для засева объем матровой расплодки подготавливается из расчета 10% к объему питательной среды в бутыли (2,5 л). Полученные флаконы в дальнейшем культивировали в течении 24 часов при температуре 37°С, в условиях СО инкубатора с 5% углекислого газа, для получения второй генерации штамма. После культивирования флаконов, перед засевом в бутыли, бульонную культуру риемерелл контролировали по культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам, с целью определения типичности роста и отсутствия роста посторонней микрофлоры. Культивирование бутылей с третьей генерацией риемерелл проводили в течении 48 часов, при температуре 37°С, в условиях СО инкубатора с 5% углекислого газа. В течении обозначенного периода уровень рН питательной среды поддерживался в диапазоне 7,4-7,8. Дополнительно в зависимости от выраженности роста культур, проводили подкормки глюкозой до концентрации 0,5% от объема.
Пример №3. Инактивация бактериальной массы штаммов Riemerella anatipestifer
3
Инактивацию полученной бактериальной суспензии риемерелл (пример №1 и 2) проводили путем внесения 0,3% формалина, содержащего не менее 37% формальдегида, к объему культуральной жидкости. Таким образом, к 750 мл суспензии клеток, полученных поверхностным методом культивирования, было добавлено 2,25 см формалина, а к 2750 мл бульонной культуры, полученной методом глубинного культивирования, добавлялось 8,25 мл формалина. Инактивация производилась в течении 72 часов при температуре 21-22°С.
Пример №4. Концентрирование бактериальной массы Riemerella anatipestifer, полученной при культивировании поверхностным методом
3
3
3
Концентрирование полученной бактериальной суспензии риемерелл после инактивации (пример №3) проводили путем центрифугирования на оборудовании MPW-380R в течении 1 часа при 3 тысячах оборотах, RCF - 1861. После центрифугирования и отделения надосадочной жидкости (фугата), бактериальная масса собиралась в отдельную стерильную емкость (флакон) для дальнейшего использования. На данном этапе проводили определение концентрации бактериальной массы и ее объема. Определение концентрации суспензии проводили с использованием стандартов мутности - набор ОСО мутности бактериальных взвесей ГКПМ ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. Результаты поверхностного культивирования и концентрирования бактериальной массы трех производственных штаммов риемерелл показали следующие результаты: Riemerella anatipestifer №549-ВИЭВ - 352 мл с концентрацией 76 млрд мкр кл./см; Riemerella anatipestifer №566-ВИЭВ - 390 мл с концентрацией 84 млрд мкр кл./см; Riemerella anatipestifer №571-ВИЭВ - 337 мл с концентрацией 84,5 млрд мкр кл./см.
3
3
3
Результаты глубинного культивирования и концентрирования бактериальной массы трех производственных штаммов риемерелл показали следующие результаты: Riemerella anatipestifer №549-ВИЭВ - 430 мл с концентрацией 21,3 млрд мкр кл./см; Riemerella anatipestifer №566-ВИЭВ - 520 мл с концентрацией 14,0 млрд мкр кл./см; Riemerella anatipestifer №571-ВИЭВ - 435 мл с концентрацией 25,9 млрд мкр кл./см.
Пример №5. Определение полноты инактивации антигенов риемерелл, пастерелл и сальмонелл
2
Полноту инактивации антигенов оценивали по отсутствию жизнеспособных клеток в бактериальной массе путем посева образцов на ростобеспечивающие питательные среды в соответствии с ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности». Дополнительно, при контроле стерильности антигенов Riemerella anatipestifer, посевы производили на кровяной агар, с последующим культивированием в СО инкубаторе в течении 7 дней при температуре 37°С.
3
3
Также полноту инактивации антигенов Pasteurella multocida и Salmonella spp. оценивали по безвредности инактивированной бактериальной массы в биопробе на лабораторных мышах массой 16-18 гр. при подкожном введении в объеме 0,5 см. Полноту инактивации антигенов Riemerella anatipestifer проводили с использованием 10-ти дневных утят, при внутримышечном введении антигенов, в объеме 0,5 см. Для оценки безвредности каждой серии антигена Pasteurella multocida и Salmonella spp., использовалось по три подопытные мыши, а для контроля антигена Riemerella anatipestifer по три мускусных утенка.
Пример №6. Культивирование штамма Pasteurella multocida глубинным методом
3
3
3
3
Культивирование штамма Pasteurella multocida проводили с использованием реактора Sartorius BIOSTAT-A на триптон-соевом бульоне. Подготовка главного посевного материала проводилась согласно методике, описанной в примере №1, с некоторыми отличиями. Так, в первый день работы проводили подготовку первой генерации главного посевного материала, для этого в ампулу с лиофильно высушенным штаммом пастерелл вносили питательный бульон (триптон-соевый бульон) в объеме 1 мл, необходимом для восстановления лиофильной массы до первоначального объема. Затем полученную суспензию в объеме 0,1 см, пастеровской пипеткой переносили в три пробирки с триптон-соевым бульоном и параллельно рассевали суспензии клеток на чашки Петри, содержащие 20 см сердечно-мозгового агара, по методу Дригальского. Культивирование полученных пробирок и чашек проводили в течении 18 часов при температуре 37°С. После культивирования чашек Петри проводили изучение полученных колоний пастерелл по культуральным, морфологическим и тинкториальным свойствам, с целью определения типичности роста и отсутствия роста посторонней микрофлоры. Бульонная культура из пробирок также была подвергнута микроскопированию после окрашиванию по методу Грама. В случае подтверждения свойств производственного штамма и отсутствия посторонней микрофлоры на чашках Петри и в пробирках, полученную культуру пастерелл засевали во флаконы с триптон-соевым бульоном (1 пробирка на 350 см питательной среды) для последующего реакторного культивирования. При этом объем матровой расплодки подготавливается из расчета 10% к объему питательной среды реактора (3,5 л). Реакторное культивирование проводилось при температуре 37°С и рН 7,0-7,8 в течении 16 часов, по достижению которых увеличение концентрации бактериальных клеток в бульоне прекратилось. В процессе культивирования уровень водородных ионов питательной среды регулировался за счет щелочи, а наличие питательных веществ в среде поддерживалось глюкозой. Описанная схема культивирования позволила добиться концентрации бактериальной суспензии 7,3 млрд мкр кл./см.
3
Пример №7. Инактивация бактериальной массы штамма Pasteurella multocida Инактивацию культуры Pasteurella multocida проводили согласно методу, приведенному в примере №3. Таким образом, к 3850 мл, культуральной жидкости было добавлено 11,55 см формалина.
Пример №8. Концентрирование бактериальной массы Pasteurella multocida, полученной при культивировании глубинным методом
3
Концентрирование полученной бактериальной суспензии после инактивации проводили по методу, описанному в примере №4. Таким образом, было получено 307 мл антигена Pasteurella multocida №367-ВИЭВ с концентрацией 86,2 млрд мкр кл./см.
Контроль полноты инактивации антигенов Pasteurella multocida проводили согласно методике, описанной в примере №5.
Пример №9. Культивирование штаммов Salmonella spp. глубинным методом
3
3
3
Культивирование штаммов сальмонелл проводили аналогично методу, описанному в примере №7, но с некоторыми отличиями. А именно, при поддержании рН 7,4-7,6 в течении 10 часов, по достижению которых увеличение концентрации бактериальных клеток в бульоне прекращалось. В течении культивирования уровень водородных ионов регулировался за счет щелочи, а наличие питательных веществ в среде поддерживалось глюкозой. Данная схема культивирования позволила получить концентрацию бактериальных клеток 24,2 млрд мкр кл./см для штамма Salmonella enteritidis №162-ВИЭВ; 29,6 млрд мкр кл./см для штамма Salmonella typhimurium №178-ВИЭВ; 25,5 млрд мкр кл./см для штамма Salmonella infantis №1827-ВИЭВ.
Пример №10. Инактивация антигенов Salmonella spp.
3
3
Инактивацию полученной бактериальной суспензии сальмонелл (пример №9) проводили путем внесения к ее объему 0,3% формалина, содержащего не менее 37% формальдегида. Таким образом, к 750 мл суспензии было добавлено 2,25 см формалина, к 3850 мл культуральной жидкости было добавлено 11,55 см формалина. Инактивация проводилась в течении 21 дня при температуре 21-22°С.
Пример №11. Концентрирование антигенов Salmonella spp.
3
3
3
Концентрирование полученной бактериальной суспензии после инактивации проводили по методу, описанному в примере №3. Таким образом, было получено 530 мл антигена Salmonella enteritidis №162-ВИЭВ с концентрацией 125,7 млрд мкр кл./см; 620 мл антигена Salmonella typhimurium №178-ВИЭВ с концентрацией 143,0 млрд мкр кл./см; 480 мл антигена Salmonella infantis №1827-ВИЭВ с концентрацией 166,7 млрд мкр кл./см.
Определение полноты инактивации антигенов сальмонелл проводили согласно методу, приведенном в примере №5.
Пример №12. Составление серии №1 поливалентной инактивированной вакцины против риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза индеек, уток и гусей с использованием физиологического раствора в качестве разбавителя и полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) в качестве адъюванта
3
3
3
При составлении серии вакцины, в стерильной емкости проводили смешивание инактивированных бактериальных антигенов семи производственных культур с физиологическим раствором в качестве разбавителя, полиэтиленгликолем-6000 в качестве адъюванта, и мертиолятом натрия в качестве консерванта, устанавливая концентрацию бактериальных антигенов 11 млрд мкр кл./см (по 2 млрд мкр кл./см каждого штамма риемерелл и пастерелл, и по 1 млрд мкр кл./см каждого штамма сальмонелл). Компоненты перемешивали до получения однородной суспензии, после чего устанавливали рН серии вакцины на уровне 7,4. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки, приведена в таблице №4. Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 5 тысяч доз - 2,5 литра препарата.
Полученная таким образом вакцина по внешнему виду представляет собой суспензию светло-серого цвета с серо-белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.
Пример №13. Составление серии №2 поливалентной инактивированной вакцины против риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза индеек, уток и гусей с использованием воды для инъекций в качестве разбавителя и гидроокиси алюминия (ГОА) в качестве адъюванта
3
3
3
При составлении серии вакцины, в стерильной емкости проводили смешивание инактивированных бактериальных антигенов семи производственных культур на основе воды для инъекций в качестве разбавителя и гидроокиси алюминия в качестве адъюванта, и мертиолята натрия в качестве консерванта, таким образом, чтобы получить концентрацию бактериальных антигенов равной 11 млрд мкр кл./см (по 2 млрд мкр кл./см каждого штамма риемерелл и пастерелл, и по 1 млрд мкр кл./см каждого штамма сальмонелл). Компоненты перемешивали до получения однородной суспензии, после чего устанавливали рН серии вакцины на уровне 7,3. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки приведена в таблице №5. Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 5 тысяч доз - 2,5 литра препарата.
Полученная таким образом вакцина по внешнему виду представляет собой
суспензию светло-серого цвета с серо-белым осадком, легко разбивающимся при взбалтывании в гомогенную взвесь.
Пример №14. Составление серии №3 поливалентной инактивированной вакцины против риемереллеза, пастереллеза и сальмонеллеза индеек, уток и гусей с использованием фосфатно-буферного раствора в качестве разбавителя и масляного адъюванта Montanide ISA 70
3
3
3
В стерильной емкости проводится подготовка предэмульсии. Для этого в смесителе при постоянном помешивании (250 об/мин. в течении 1,5 часов) проводили смешивание инактивированных бактериальных антигенов семи производственных культур на основе PBS - буфера в качестве разбавителя, Montanide ISA 70 в качестве адъюванта, мертиолята натрия в качестве консерванта, таким образом, чтобы получить концентрацию бактериальных антигенов равной 11 млрд мкр кл./см (по 2 млрд мкр кл./см каждого штамма реймерелл и пастерелл, и по 1 млрд мкр кл./см каждого штамма сальмонелл). Для получения финального варианта вакцины используют гомогенизатор типа «Silverson L5M-A». Эмульгирование проводится в течении 3 часов при 6 тыс.об/мин. Пропись состава вакцины при использовании данного варианта компоновки, приведена в таблице №6. Состав приведен из расчета объема выпускаемой серии 5 тысяч доз - 2,5 литров препарата.
Полученная таким образом вакцина по внешнему виду представляет собой эмульсию белого цвета, иногда с желтоватым оттенком. При длительном хранении наблюдалось незначительное расслоение препарата, которое при встряхивании переходит в первоначальное состояние гомогенной эмульсии.
Пример №15. Определение стерильности вакцины
2
3
3
3
Контроль стерильности вакцины проводили согласно ГОСТ 28085-2013 «Средства лекарственные биологические для ветеринарного применения. Метод бактериологического контроля стерильности». Так, из каждого флакона (каждой серии) с лекарственным средством проводили посев на жидкие питательные среды - Сабуро, МПБ и МППБ (среда Китт-Тароцци) и на твердые питательные среды - Сабуро и МПА. На посев из каждого флакона использовалось по три пробирки и две чашки с питательной средой. При посеве на среду Китт-Тароцци высев делали на две пробирки и два флакона. Дополнительно проводился посев на кровяной агар, с последующим культивированием в СО инкубаторе в течении 7 дней при температуре 37°С. Для выявления аэробных микроорганизмов и факультативно-анаэробных микроорганизмов высевали по 0,5 см посевного материала в одну пробирку и 1-2 см в один флакон, а для выявления анаэробных микроорганизмов - соответственно по 1 и 5 см. Пробирки и флаконы с посевами на всех средах, кроме среды Сабуро, выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С, на среде Сабуро - при температуре (22,5±2,5)°С, в течение 7 сут (для анаэробов - 14 сут). По истечении указанного срока делали пересев, за исключением посевов на МПА. Пересевали пробы на те же питательные среды и в тех же объемах, что и при посеве. Вторичные посевы также выдерживали 7 сут (для анаэробов - 14 сут). В результате проведенного контроля трех серий препарата была установлена их стерильность. Ни на одной из используемых сред роста посторонней микрофлоры не выявлено.
50
Пример №16. Определение значение показателя LD штаммов риемерелл, пастерелл и сальмонелл.
9
8
7
6
3
Для определения вирулентности штаммов риемерелл используют 10-ти дневных мускусных утят. Инфицирование утят проводят путем внутримышечного введения десятикратно раститрованной суспензии бактериальных культур в концентрациях: 1,5*10 м.к., 1,5*10 м.к., 1,5*10 м.к., 1,5*10 м.к. в объеме 0,5 см. На каждую заражающую концентрацию используется 4-6 утят. Наблюдение за утятами устанавливают на период 10 дней, или до момента их гибели. Полученные результаты интерпретируют с использованием пробит-анализа при помощи программного обеспечения BioStat 2009, или формулы Кербера в модификации Ашмарина-Воробьева.
Исследование пастерелл и сальмонелл проводят согласно обозначенной методике, но в качестве модели используют не мускусных утят, а белых мышей.
Проведенные исследования позволили установить значение вирулентности контрольных штаммов микроорганизмов, используемых при оценке иммуногенной активности предложенной вакцины. В результате исследований получены следующие результаты значения LD50 для контрольных штаммов:
50
9
Riemerella anatipestifer №602-ВИЭВ LD - 1,08*10 мкр кл.;
50
7
Riemerella anatipestifer №490-ВИЭВ LD - 8,25* 10 мкр кл.;
50
8
Riemerella anatipestifer 513-ВИЭВ LD- 4,95*10 мкр кл.;
50
8
Pasteurella multocida №1231 LD - 3,98×10 мкр кл.;
50
6
Salmonella enterica серовар Enteritidis №1807-ВИЭВ LD - 3,5*10 мкр кл.;
50
8
Salmonella enterica серовар Infantis №1841-ВИЭВ LD - 1,2*10 мкр кл.;
50
4
Salmonella enterica серовар typhimurium №371 LD - 1,8*10 мкр кл.
Пример №17. Определение иммуногенной активности риемереллезного компонента вакцины на 10-ти дневных мускусных утятах.
50
Определение иммуногенной активности риемереллезного компонента предлагаемой вакцины проводится с использованием мускусных утят. Для реализации поставленной цели формируется шесть групп 10-ти дневных утят, три из которых опытные, и три контрольные. Количество птицы в каждой группе должно быть не менее 10 голов. Утят опытной группы двукратно вакцинируют с интервалом 14 дней. На 15 день после двукратной вакцинации птицу подвергают инфицированию контрольными штаммами риемерелл, в дозе 5LD. Наблюдение за птицей устанавливают в течение 10 дней, или до момента гибели. Вакцина считается иммуногенной, если после заражения в опытных группах выживает не менее 80% птицы, в то время как в контроле должно погибнуть не менее 80% утят.
Результаты определения иммуногенной активности риемереллезного компонента трех серий предлагаемой вакцины, приведены в таблице №7.
Как видно из результатов, представленных в таблице №7, предлагаемая вакцина соответствует требованиям по иммуногенной активности. Так, в контрольной группе погибло 100% птицы, а в опытных выжило 90% (указано минимально полученное значение).
Пример №18. Определение иммуногенной активности пастереллезного и сальмонеллезных компонентов вакцины на белых мышах.
50
Определение иммуногенной активности пастереллезного и сальмонеллезных компонентов предлагаемой вакцины проводится с использованием белых мышей. Для реализации поставленной цели формируется восемь групп по 10 мышей в каждой, массой 18-20 гр. Четыре группы являются опытными (на каждый заражающий штамм), и четыре группы - контрольными (на каждый заражающий штамм). Мышей предварительно вакцинируют двукратно с интервалом 14 день. На 15 день после двукратной вакцинации, мышей опытной и контрольной групп подвергают инфицированию контрольным штаммом Pasteurella multocida №1231, Salmonella enteritidis №1807-ВИЭВ, Salmonella infantis №1841-ВИЭВ, Salmonella typhimurium №371 в дозе 5LD. Наблюдение за животными устанавливают на период 10 дней, или до момента их гибели. Вакцина считается иммуногенной, если после заражения в опытных группах выживает не менее 80% мышей, в то время как в контроле должно погибнуть не менее 80% животных.
Результаты определения иммуногенной активности пастереллезного и сальмонеллезного компонента трех серий предлагаемой вакцины, приведены в таблице №8.
При проведении данного исследования были получены результаты, свидетельствующие, что выживаемость животных опытных групп вне зависимости от использованной серии препарата, составила 90%, в то время как 90% (указано минимальное значение по трем группам) животных контрольных групп погибли в течение 1-2 суток после инфицирования, что говорит о высоком уровне иммуногенной активности вакцины.
Пример №19. Оценка протективной эффективности вакцины.
Для оценки протективной эффективности предложенной вакцины проведены полевые испытания в утководческом предприятии Ставропольского края, неблагополучном по риемереллезу и пастереллезу. Для проведения опыта было сформировано две группы птиц. Оценку эффективности препарата проводили на утятах в возрасте 7 дней, которых вакцинировали двукратно с интервалом 14 дней. Наблюдение проводили до наступления 4-ех месячного возраста (120 дней). Оценка эффективности предложенного препарата проводилась по параметрам падежа и однородности среди птицы. Результаты испытания отражены в таблице №9. С целью обеспечения сохранности поголовья птицы, в случае возникновения инфекционной патологии, назначались антибактериальные препараты.
Как видно из данных таблицы №9, количество павших и выбракованных утят после применения вакцины в опытной группе на 7,17% меньше, чем в контрольной группе. Вместе с тем отмечено повышение однородности поголовья в опытной группе на 3,8% в сравнении с контрольной группой. За наблюдаемый период выращивания контрольных утят затраты на 1 голову, составили 24,89 руб., а в случае расчетной стоимости двух доз вакцины равной 3,6 руб. экономия составила 21,29 руб. на 1 голову.
С целью оценки влияния предлагаемого средства на родительское поголовье и его производственные показатели, были сформированы две группы уток в возрасте 150 дней. Птицу вакцинировали двукратно с интервалом 14 дней. Результаты оценки сохранности и продуктивности двукратно вакцинированного поголовья уток приведены в таблице №10.
Анализируя данные таблицы №10, можно сделать заключение, что среднее значение количества падежа в опытной группе на 2,33% ниже, чем в контрольной группе. Среднее значение количества выбракованной птицы в опытной группе на 1,69% меньше аналогичного показателя в контрольной группе. Среднее значение показателя общего отхода в опытной группе за наблюдаемый период на 4,02% ниже данного значения в контрольной группе. Среднее значение продуктивности птиц вакцинированных групп на 2,5% выше аналогичного значения показателя контрольной группы.