КОМПОЗИЦИИ, СПОСОБЫ И НАБОРЫ ДЛЯ ГИБРИДИЗАЦИИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
COMPOSITIONS, METHODS AND KITS FOR NUCLEIC ACID HYBRIDISATION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Представленное изобретение относится к области способов и анализов, которые включают гибридизацию нуклеиновой кислоты.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Двояко-меченые зонды (DLP) включают полинуклеотиды, меченные на одном конце флуоресцентным красителем (репортер) и на противоположном конце молекулой гасителя. Такие зонды часто используются в различных анализах гибридизации, включая ПЦР в реальном времени. В способах, которые используют DLP(ы), когда гаситель зонда находится физически близко к репортеру, флуоресценция гасится по физико-химическим механизмам, согласно которым FRET (перенос энергии флуоресцентного резонанса) является наиболее распространенным.
Т
Т
Гасящая эффективность гасителя может быстро уменьшаются с увеличением расстояния между репортером и гасителем. Расстояние между гасителем и репортером молекул в одной свободной (несвязанной) интактной молекуле DLP может, в частности, зависеть от вторичной структуры DLP, которая зависит от последовательности зонда. Данные DLP с большей вторичной структурой могут существовать в супер-гибкой конформации, где гаситель и репортер находятся в непосредственной близости, и эффективность гашение является высокой. Предполагается, что данные DLP с небольшой или без вторичной структуры существуют в более ненапряженной конформации, где гаситель и репортер находятся дальше друг от друга, и эффективность гашения является пониженной. DLP с более низкой эффективностью гашения может иметь высокий флуоресцентный фон, потому что некоторая флуоресценция репортера "избегает" действия гасителя. Высокий флуоресцентный фон является нежелательным в ПЦР анализах в реальном времени, что приводит к, например, низкому соотношению сигнал-шум, что в результате приводит к низкой чувствительности анализа или уширению сигнала на основании чего флуоресцентный сигнал от отрицательных образцов переходит порог. Когда сигнал от исследуемого образца переходит порог, определяют его С значение. В данных автоматизированного анализа, где дискриминирование образца происходит на основании значений С, отрицательные образцы, показывающие уширение сигнала могут быть классифицированы как положительные, вызывающие ненужную повторную работу.
В литературе сообщалось, что одним из способов преодоления DLP с высоким флуоресцентным фоном является использование прикрепленных универсальных двусторонних зондов (AUDP), вместо DLP. В AUDP, репортер и гаситель присоединены соответственно к 5′ и 3′ концам 2 различных молекул комплекса зонда, которые связываются друг с другом. Таким образом, репортер и гаситель всегда находятся в непосредственной близости, пока зонд, несущий гаситель не смещается и флуоресценция высвобождается. Однако из-за их универсальной природы, AUDP не создает окно дополнительной специфичности для ПЦР-анализов, которые предоставляют DLP.
Существует необходимость преодолеть ограничения, которые обсуждались выше, обычных зондов гибридизации и анализов, в частности, чтобы обеспечить композиции, способы и наборы, которые являются эффективными для повышения производительности зондов нуклеиновых кислот, в частности двояко-меченных зондов нуклеиновых кислот.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте, представленное изобретение предусматривает полинуклеотид, имеющий первый полинуклеотидный сегмент, смежный со вторым полинуклеотидным сегментом, находящимся в прямом направлении к первому, где последовательность первого нуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности первого зондового сегмента зонда для обнаружения мишенной нуклеиновой кислоты, где последовательность второго полинуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности второго зондового сегмента зонда, где второй зондовый сегмент находятся в прямом направлении к первому сегменту зонда.
В другом аспекте, представленное изобретение предусматривает композицию, которая содержит:
a) полинуклеотид, имеющий первый полинуклеотидный сегмент, смежный со вторым полинуклеотидным сегментом, который находятся в прямом направлении к первому; и
b) зонд нуклеиновой кислоты для обнаружения мишенной последовательности, где зонд содержит первый зондовый сегмент и второй зондовый сегмент в прямом направлении к первому зондовому сегменту;
где последовательность первого нуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности первого зондового сегмента, где последовательность второго полинуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности второго зондового сегмента.
В некоторых аспектах, представленное изобретение предусматривает способ определения присутствия мишенной нуклеиновой кислоты в образце. Способ включает контактирование образца с зондом в присутствии полинуклеотида. Полинуклеотид имеет первый полинуклеотидный сегмент, смежный со вторым полинуклеотидным сегментом, находящимся в прямом направлении к первому. Зонд представляет собой зонд нуклеиновой кислоты для обнаружения мишенной нуклеиновой кислоты. Зонд содержит первый зондовый сегмент и второй зондовый сегмент в прямом направлении к первому зондовому сегменту. Последовательность первого нуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности первого зондового сегмента, где последовательность второго полинуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности второго зондового сегмента.
В других аспектах, представленное изобретение предусматривает набор. Набор содержит полинуклеотид, имеющий первый полинуклеотидный сегмент, смежный со вторым полинуклеотидным сегментом, находящимся в прямом направлении к первому, где последовательность первого нуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности первого зондового сегмента зонда для обнаружения мишенной нуклеиновой кислоты, где последовательность второго полинуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности второго зондового сегмента зонда, где второй зондовый сегмент находится в прямом направлении к первому зондовому сегменту.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления "оболочки зонда" представленного изобретения, гибридизованной с зондом.
Фигура 2 представляет собой схематическое изображение одного варианта осуществления представленного изобретения: зонд, имеющий последовательность, как представлено в SEQ ID NO:1, изображен с зондовой оболочкой, имеющей последовательность, как представлено в SEQ ID NO:2. Флуорофор ◊; Гаситель ●.
Фигура 3 представляет собой схематическое изображение, показывающее, в одном варианте осуществления, оболочку зонда и зонда, где зонд гибридизируют с последовательностью-мишенью.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте, представленное изобретение предусматривает полинуклеотид (в данном документе также называется как "оболочка зонда") для гибридизации с зондом нуклеиновой кислоты, используемой для обнаружения последовательностей-мишеней нуклеиновой кислоты. Как правило, оболочка зонда гибридизирует, при определенных условиях, с областями, как в обратном направлении, так и в прямом направлении нуклеиновой кислоты зонда.
ФИГ.1 схематически иллюстрирует один вариант осуществления оболочки зонда 1, гибридизованного с DLP 2 путем комплементарного спаривания основания 3. В варианте осуществления, показанном на ФИГ.1, оболочка зонда представляет собой одноцепочечный полинуклеотид, имеющий первый полинуклеотидный сегмент 4, смежный со вторым полинуклеотидным сегментом 5, который находится в прямом направлении к первому 4. Последовательность первого нуклеотидного сегмента 4 является комплементарной к первой последовательности зонда, которая определяет первый зондовый сегмент 6 зонда 2, который, кроме того, содержит второй зондовый сегмент 7 в прямом направлении к первому зондовому сегменту 6, где второй зондовый сегмент 7 также содержит последовательность нуклеиновой кислоты. Последовательность второго полинуклеотидного сегмента 5 оболочки зонда 1 является комплементарной к последовательности второго зондового сегмента 7 зонда 2. На ФИГ.1, зонд 2 показывают как такой, который, кроме того, содержит репортер 8 и гаситель 9 на своих 5′ и 3′ концах, соответственно.
Как правило, первый зондовый сегмент, второй зондовый сегмент, или оба являются полностью, или в достаточной степени комплементарными к последовательности-мишени, чтобы обеспечить гибридизацию зонда с мишенью в последовательности конкретным образом.
Хотя, в некоторых вариантах осуществления, последовательности первого и второго полинуклеотидных сегментов оболочки зонда являются полностью комплементарными с последовательностями первого и второго зондовых сегментов зонда, в других вариантах осуществления, гибридизация оболочки зонда с зондом не ограничивается выравниванием их соответствующих сегментов последовательностями, которые являются полностью комплементарными. Другими словами, последовательности сегментов выравнивания необязательно могут быть полностью комплементарными при условии, что полинуклеотид (то есть, оболочка зонда) специфически связывается с зондом; могут содержать одно или больше универсальных оснований, например, инозин или 5-нитроиндол; и частично могут содержать основание или последовательность, которая не является комплементарной.
В одном варианте осуществления, последовательность первого нуклеотидного сегмента оболочки зонда является гомологичной к обратному комплементу последовательности первого зондового сегмента зонда. В другом варианте осуществления, процент гомологичности между последовательностью первого нуклеотидного сегмента и обратным комплементом последовательности первого зондового сегмента составляет, по меньшей мере, приблизительно 90%, иллюстративно, от приблизительно 90 до приблизительно 100%, и от приблизительно 94 до приблизительно 96%. В некоторых вариантах осуществления, последовательность первого нуклеотидного сегмента представляет собой обратный комплемент последовательности первого зондового сегмента.
В другом варианте осуществления, последовательность второго полинуклеотидного сегмента оболочки зонда является гомологичной к обратному комплементу последовательности второго зондового сегмента зонда. В другом варианте осуществления, процент гомологичности между последовательностью второго полинуклеотидного сегмента и обратным комплементом последовательности второго зондового сегмента составляет, по меньшей мере, приблизительно 90%, иллюстративно, от приблизительно 90 до приблизительно 100%, и от приблизительно 94 до приблизительно 96%. В некоторых вариантах осуществления, последовательность второго полинуклеотидного сегмента представляет собой обратный комплемент последовательности второго зондового сегмента.
В предпочтительных вариантах осуществления, оболочка зонда способна к гибридизации с DLP, имеющей репортер и гаситель.
Например, в некоторых вариантах осуществления, DLP является одноцепочечным полинуклеотидом, меченым на одном конце с флуоресцентным красителем (репортером) и на противоположном конце с молекулой гасителя. Не придерживаясь какой-либо конкретной теории, считается, что, когда гаситель находится физически близко к репортеру, флуоресценция гасится по физико-химическим механизмам, согласно которым перенос энергии флуоресцентного резонанса (FRET) является наиболее распространенным. Оболочка зонда согласно представленному изобретению может гибридизоваться, при определенных условиях, с сегментами, как в обратном направлении, так и в прямом направлении DLP таким образом, позиционируя репортер и гаситель в непосредственной близости друг от друга (Фиг.1). Данная "оболочка" может повышать эффективность гашения флуоресценции молекулой гасителя, таким образом, уменьшая флуоресцентный фон свободной формы DLP (то есть, свободной или незанятой при детектировании мишени), например, во время стадии обнаружения ПЦР цикла. Это в результате приводит к ликвидации или существенному снижению уширения сигнала, которые могут вызвать ложный положительный результат. Кроме того, взаимодействие между DLP и оболочкой зонда является обратимым - например, молекулы разделены в течение стадии денатурации в ПЦР цикле, что обеспечивает доступность DLP для следующего цикла обнаружения мишени.
При конструировании оболочки зонда, например, для использования с DLP, с интерактивными метками (например, репортером/тушителем), сегменты в обратном направлении и в прямом направлении (т.е. первый и второй полинуклеотидные сегменты, соответственно) оболочки зонда должны быть достаточной длины, которые в условиях анализа и при температуре обнаружения, когда DLP не связан с мишенью, оболочка зонда и зонд являются связанными, и фрагменты метки зонда удерживаются в непосредственной близости друг от друга. В зависимости от используемых условий анализа, каждый из первого и второго полинуклеотидных сегментов оболочки зонда, независимо, может составлять, по меньшей мере, приблизительно 3 нуклеотида в длину, иллюстративно, от приблизительно 3 до приблизительно 50 нуклеотидов, от приблизительно 5 до 30 нуклеотидов, от приблизительно 9 до приблизительно 20, и от приблизительно 11 до приблизительно 15 нуклеотидов. В одном варианте осуществления, каждый сегмент, независимо, составляет, от приблизительно 9 до приблизительно 11 нуклеотидов в длину. Кроме того, сегменты оболочки зонда большей длины (например, больше, чем приблизительно 50 нуклеотидов) также могут применяться в зависимости от условий анализа, включая зонд и/или последовательности-мишени. Фактическая длина каждого сегмента полинуклеотида оболочки зонда может быть изменена по отношению к зонду и/или последовательностям-мишеням, таким образом, чтобы остатки зонда связывались с оболочкой зонда в отсутствие мишени во время стадии обнаружения.
Для оболочки зонда/зонда, изображенного на ФИГ. 2, первый и второй полинуклеотидные сегменты оболочки зонда показаны, как такие, каждый из которых имеет длину в 11 нуклеотидов, которые являются полностью комплементарными к соответствующим сегментам зонда, который является одноцепочечным полинуклеотидом, имеющим общую длину 30 нуклеотидов.
В некоторых вариантах осуществления, оболочка зонда связывает DLP, имеющий одну пару меченых фрагментов. В других вариантах осуществления, DLP имеет больше чем одну пару меченных фрагментов. Кроме того, нет необходимости в один-к-одному молекулярном соответствии между членами меченой пары, особенно там, где один член может влиять, или подвергаться влиянию, больше, чем одной молекулы другого члена. Меченые фрагменты могут взаимодействовать таким образом, что, по меньшей мере, один фрагмент может изменять, по меньшей мере, одну физически измеряемую характеристику другого меченого фрагмента по способу близкой зависимости. Характеристический сигнал меченой пары является способным к обнаружению по-разному в зависимости от того, ли зонд связывается с оболочкой зонда или мишенью. В некоторых вариантах осуществления, меченая пара содержит один флуоресцентный фрагмент, спаренный с двумя или больше фрагментами гашения.
Например, со ссылкой на ФИГ.1, предпочтительные меченые фрагменты являются одной FRET парой, более предпочтительно флуорофором 8 и гасителем 9. В данном варианте осуществления характеристичным сигналом является флуоресценция на определенной длине волны. Когда зонд связан с оболочкой зонда, фрагмент гасителя способен гасить флуоресценцию от фрагмента репортера, в котором, если фрагмент репортера возбуждается соответствующей частотой света, флуоресцентный сигнал определяется на первом уровне, который может быть относительно низким или приблизительно ноль. Когда зонд не связан с оболочкой зонда, фрагмент гасителя не может погасить флуоресценцию от фрагмента репортера также эффективно, как, когда зонд и оболочка зонда связаны друг с другом, причем, если фрагмент репортера возбуждается соответствующей частотой света, флуоресцентный сигнал может быть определен на втором уровне, который, предпочтительно, является большим, чем первый уровень. Кроме того, если последовательность-мишень присутствует, сигнал на третьем уровне может быть определенным, где третий уровень является большим, чем первый или второй уровень.
В некоторых вариантах осуществления, оболочка зонда, в условиях проведения анализа, обратимо достаточно сильно связывается с зондом в условиях обнаружения в отсутствие последовательности-мишени, но достаточно слабо, чтобы гибридизация зонда и его последовательности-мишени, если присутствует, являлись термодинамически выгодными по сравнению с взаимодействием оболочки зонда с зондом.
В некоторых вариантах осуществления, флуоресцентные красители включают, но не ограничиваются этим, FAM, BODIPY FL, Cy3™, Cy3.5™, Cy5™, Cy5.5™, EDANS, флуоресцеин, HEX, IAEDANS, JOE, Орегоновый зеленый™, (LC)Red640, (LC)Red705, ROX, TAMRA, TET, тетраметилродамин, Техасский красный™, или их комбинации.
В других вариантах осуществления, красители гасителя включают, но не ограничиваются этим, BHQ-1™, BHQ-2™, BHQ-3™, DABCYL, металлические кластеры, такие как наночастицы золота, и QSY7™.
В одном варианте осуществления, интерактивные метки включают, но не ограничиваются этим, донорные/акцепторные пары, такие как, например, FAM/BHQ-1, флуоресцеин/тетраметилродамин, флуоресцеин/флуоресцеин, флуоресцеин/QSY7, флуоресцеин/LC RED640, флуоресцеин/LC Red705 IAEDANS/флуоресцеин, EDANS/DABCYL, BODIPY FL/BODIPY FL, TET/BHQ-1, JOE/BHQ-1, HEX/BHQ-1, Oregon Green/BHQ-1, TAMRA/BHQ-2, ROX/BHQ-2, Cy3/BHQ-2, Cy3.5/BHQ-2, Техасский красный/BHQ-2, Техасский красный/BHQ-2, Cy5/BHQ-3 и Cy5.5/BHQ-3.
Другие приемлемые пары меток включают репортерный фрагмент и соответствующий ингибитор.
В другом варианте осуществления, оболочка зонда является способной к гибридизации DLP, имеющей 5′ и 3′ конец, меченый FAM и BHQ1, соответственно.
Хотя второй сегмент является смежным с и находится непосредственно в прямом направлении первого сегмента, как показано на ФИГ.1, в других вариантах осуществления, оболочка зонда может дополнительно содержать спейсер между первым полинуклеотидным сегментом и вторым полинуклеотидным сегментом.
Термин "спейсер" в данном документе касается молекулы, которая имеет первый конец, присоединенный к первому полинуклеотидному сегменту, и второй конец, присоединенный ко второму полинуклеотидному сегменту оболочки зонда. Таким образом, молекула спейсера разделяет первый и второй сегменты, но является присоединенной к обоим. Спейсеры могут быть синтезированными непосредственно или предпочтительно присоединенными как целое к оболочка зонда в определенных местах. Связывания в пределах спейсера могут включать, но не ограничиваются, углерод-углеродные простые связи, углерод-углеродные двойные связи, углерод-азот одинарные связи или углерод-кислородные одинарные связи. Спейсеры пригодные для использования в представленном изобретении, включают, например, нуклеотиды, которые содержат аденин, цитозин, гуанин и тимин, как основания, и дезоксирибозу, как структурный элемент. Кроме того, нуклеотид, однако, может также содержать какое-либо искусственное основание, известное в данной области, которое способно к основному спариванию с использованием, по меньшей мере, одного из вышеизложенных оснований (например, инозин). Предпочтительные спейсеры, кроме того, содержат тимидиновые спейсеры, которые могут иметь переменную длину. Спейсер, кроме того, может иметь соответствующие реакционноспособные группы, предпочтительно на каждом конце для прикрепления к первому и второму сегментам. Такие реакционноспособные группы могут содержать, например, гидрокси-, тиол-, альдегидные, амидные и тиоамидные группы. Кроме того, спейсер может иметь боковые цепи или другие замещения. Активная группа может быть подвергнута взаимодействию согласно подходящим способам, известным в данной области с уровня техники, например, предпочтительно, чтобы образовать ковалентную связь между спейсером и сегментом оболочки зонда, где единая непрерывная молекула оболочки зонда имеет спейсер между первым и вторым сегментом оболочки зонда.
В одном варианте осуществления, оболочка зонда имеет 3′ конец, который является модифицированным, чтобы предотвратить удлинение полимеразы с помощью полимеразы. В другом варианте осуществления, оболочка зонда содержит 3′ конец, модифицированный фосфатной группой, фосфатным сложным эфиром или обращенной 3′--3′ связью. Другие способы и типы блокирования известны квалифицированному специалисту в данной области и могут быть легко использованы с оболочкой зонда, чтобы предотвратить удлинение полимеразы ее 3′ конца.
Неограничивающие примеры оболочек зонда и DLP представлены в таблице 1.
Таблица 1
Примеры последовательностей DLP и оболочек
Олигонуклеотидная функция
Олигонуклеотидная последовательность (5′ к 3′)
ВИЧ Детекторный зонд 1
FAM/ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGAT/BHQ-1 (SEQ ID NO:1)
ВИЧ Оболочка зонда 1
TCATTGATGGTATCCCATTCTGфосфат (SEQ ID NO:2)
Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что поведение молекул нуклеиновой кислоты в комплексных растворах не всегда можно предсказать с уверенностью, таким образом, эмпирическая проверка является очень полезной при подборе оболочек зондов и/или зондов, согласно изобретению, для оптимального выполнения при определенных условиях анализа.
В других аспектах, представленное изобретение предусматривает композицию, которая содержит оболочку зонда и зонд.
В некоторых вариантах осуществления, композиция содержит:
a) оболочку зонда, где оболочка зонда представляет собой полинуклеотид, имеющий первый полинуклеотидный сегмент, смежный со вторым полинуклеотидным сегментом, находящимся в прямом направлении к первому; и
b) зонд нуклеиновой кислоты для обнаружения последовательности-мишени, где зонд содержит первый зондовый сегмент и второй зондовый сегмент в прямом направлении к первому зондовому сегменту;
где последовательность первого нуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности первого зондового сегмента, где последовательность второго полинуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности второго зондового сегмента.
В одном варианте осуществления, последовательность первого нуклеотидного сегмента представляет собой обратный комплемент последовательности первого зондового сегмента. В другом варианте осуществления, последовательность второго полинуклеотидного сегмента оболочки зонда является гомологичной к обратному комплементу последовательности второго зондового сегмента зонда.
m
m
В предпочтительных вариантах осуществления, цепь нуклеиновой кислоты зонда, при условиях гибридизации при температуре обнаружения, в частности, обратимо гибридизуется с цепью нуклеиновой кислоты оболочки зонда в отсутствие цепи нуклеиновой кислоты-мишени с образованием комплекса зонд/оболочка зонда, имеющий зонд/оболочка зонда T, где в присутствии цепи нуклеиновой кислоты-мишени, цепь нуклеиновой кислоты зонда предпочтительно гибридизуется с цепью нуклеиновой кислоты-мишени с образованием зонд/мишень T.
m
m
m
Предпочтительно, зонд/мишень T является большей, чем зонд/оболочка зонда T. В другом варианте осуществления, зонд/оболочка зонда T является большей, чем температура обнаружения.
В некоторых вариантах осуществления, где зонд содержит сигнал генерирующий репортер (например, флуорофор), сигнал репортера на первом уровне может быть определен, когда зонд гибридизирован с оболочкой зонда. В других вариантах осуществления, первый уровень является меньшим, чем сигнал, определенный, когда присутствует последовательность-мишень.
В одном варианте осуществления, зонд, кроме того, содержит репортер и гаситель.
Не придерживаясь какой-либо конкретной теории, считается, что разделение цепи зонд/оболочка зонда происходит посредством термодинамики образования зонд/мишень спирали. Образование зонд/мишень спирали может преодолеть силы притяжения пары зонд/оболочка зонда в условиях анализа.
Молекулы нуклеиновой кислоты представленного изобретения, включая оболочки зондов и зонды, могут быть получены из ДНК, РНК, или их комбинации. Кроме того, в дополнение к одноцепочечным сегментам, которые принимают участие в гибридизации с последовательностями зонда, в других вариантах осуществления, молекулы нуклеиновой кислоты также могут содержать области нуклеиновой кислоты, которые являются двуцепочечными. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты могут включать модифицированные нуклеотиды. Модифицированные внутринуклеотидные связи являются приемлемыми в молекулах нуклеиновой кислоты, которые содержат дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды, чтобы изменить, например, силу и устойчивость гибридизации к неспецифическому разложению и нуклеазам. Связи между нуклеотидами могут включать связи другие, чем фосфодисложноэфирные связи, например, пептидные связи. Модифицированные внутринуклеотидные связи хорошо известны в данной области с уровня техники и включают метилфосфонатные, фосфоротионатные, фосфородитионатные, фосфороамидитные и фосфатсложноэфирные связи. Безфосфорные связи также являются известными, например, мостики, между нуклеотидами и включают силоксановые, карбонатные, карбоксиметилсложноэфирные, ацетамидатные, карбаматные и тиоэфирные мостики. "Пластичные ДНК," имеющие, например, N-винильные, метакрилоксиэтильные, метакриламидные или этилениминные внутринуклеотидные связи также могут быть использованы в молекулах нуклеиновой кислоты представленного изобретения. "Пептидная нуклеиновая кислота" (ПНК) является особенно пригодной из-за своей устойчивости к разложению нуклеазами, и потому что она образует более сильный гибрид с природными нуклеиновыми кислотами.
В еще следующих аспектах, представленное изобретение предусматривает способ определения присутствия, по меньшей мере, одной цепи нуклеиновой кислоты-мишени в образце. Способ включает: контактирование образца с зондом в присутствии оболочки зонда.
В одном варианте осуществления, оболочка зонда представляет собой полинуклеотид, имеющий первый полинуклеотидный сегмент, смежный со вторым полинуклеотидным сегментом, находящимся в прямом направлении к первому; и зонд представляет собой зонд нуклеиновой кислоты для обнаружения последовательности-мишени, где зонд содержит первый зондовый сегмент и второй зондовый сегмент в прямом направлении к первому зондовому сегменту; где последовательность первого нуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности первого зондового сегмента, где последовательность второго полинуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности второго зондового сегмента, где зонд дополнительно содержит FRET пару, включающую флуорофор и гаситель.
m
m
В другом варианте осуществления, первый и второй зондовые сегменты, в условиях гибридизации при температуре обнаружения, являются способными специфически и обратимо гибридизировать, соответственно, с первым и вторым полинуклеотидными сегментами оболочки зонда в отсутствие цепи нуклеиновой кислоты-мишени с образованием комплекса зонд/оболочка зонда, имеющий зонд/оболочка зонда T, тогда как в присутствии цепи нуклеиновой кислоты-мишени, зонд является способным предпочтительно гибридизировать с цепью нуклеиновой кислоты-мишени с образованием зонд/мишень T.
В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает определение изменения в флуоресцентном сигнале зонда при температуре обнаружения.
В других вариантах осуществления, флуоресцентный сигнал на первом уровне определяют при температуре обнаружения, когда зонд гибридизирован с оболочкой зонда, где флуоресцентный сигнал при температуре обнаружения является большим, чем первый уровень, когда в образце присутствует цепь нуклеиновой кислоты-мишени.
В еще следующих вариантах осуществления, анализы в соответствии с данным изобретением могут быть объединены, то есть больше, чем одна нуклеиновая кислота-мишень, которые анализируются, могут быть обнаружены в одном анализе. Как правило, в объединенном анализе, к смеси, которую анализируют, добавляют больше чем одну определенную нуклеиновую кислоту зонда, которая может различаться в природе своими ковалентно-присоединенными красителями. Красители могут выбирать так, чтобы получать различимые флуоресцентные сигналы от каждой конкретной нуклеиновой кислоты зонда. Сигналы комбинаций различных красителей нуклеиновых кислот зонда могут быть записаны одновременно, чтобы обнаружить и/или количественно определить соответствующие нуклеиновые кислоты-мишени в одно и то же время.
В одном варианте осуществления, способ представляет собой ПЦР в реальном времени. В другом варианте осуществления, способ представляет собой объединенный анализ, который включает несколько оболочек зонда, зонды и/или мишени в одном и том же анализе. В некоторых вариантах осуществления, способ представляет собой объединенный ПЦР в реальном времени, который включает два или больше различных зонда и их соответствующие оболочки зонда в соответствии с представленным изобретением.
В дополнение к гомогенному анализу, молекулы нуклеиновой кислоты согласно представленному изобретению могут, в других вариантах осуществления, быть использованы в анализах, которые проводят на микроматрицах нуклеиновой кислоты при условии, что аналит нуклеиновой кислоты-мишени может быть смесью последовательностей нуклеиновой кислоты, состоящей из вплоть до сотен последовательностей нуклеиновой кислоты, и, в некоторых случаях, вплоть до десятков тысяч последовательностей нуклеиновой кислоты. Данный случай особенно применим к анализу экспрессии, где анализируют большинство или все мРНК последовательности, которые присутствуют в биологической системе, например, в определенном типе клетки из клеточной культуре. Как правило, мРНК последовательности могут быть амплифицированы, используя ПЦР с обратной транскрипцией с универсальными праймерами перед их использованием в качестве аналитов в анализе. В данном режиме все последовательности нуклеиновой кислоты, присутствующие в аналите одновременно применяют к микроматрице вместе с соответствующей оболочкой(ами) зонда(ов), таким образом позволяя взаимодействие всех последовательностей нуклеиновых кислот в аналите со всеми нуклеиновыми кислотами, которые присутствуют в матрице. В других случаях, аналит с нуклеиновой кислотой-мишенью содержит ограниченное количество вплоть до сотни последовательностей нуклеиновых кислот и, в некоторых случаях, только одну последовательность нуклеиновой кислоты. Как правило, в анализе на микроматрицах, сгенерированные флуоресцентные сигналы преобразуют в конкретные результаты последовательности по известной зависимости от местоположения пятна на матрице и последовательности зонда, присоединенного к нему.
Применение молекул нуклеиновой кислоты, согласно представленному изобретению, включает области in vitro диагностики, включая клиническую диагностику, исследования в областях молекулярной биологии, высокопроизводительный скрининг лекарственных средств, ветеринарную диагностику, сельскохозяйственное генетическое исследование, исследование окружающей среды, исследование продуктов питания, контролирование промышленного процесса, судебно-медицинскую экспертизу и страховые исследования. In vitro диагностика и клиническая диагностика связаны с анализом образцов нуклеиновой кислоты, взятых с организма, чтобы обнаружить существование патогена (например, вируса, бактерий), заболевания или состояния, на стадии его развития и/или степень опасности, и реакцию пациента на лечение. В высокопроизводительном скрининге лекарственных средств и разработке нуклеиновых кислот используют подобные к другим агентам, таким как, антигены, антитела, рецепторы и т.д., чтобы анализировать реакцию в биологических системах при воздействии одного или нескольких соединений на большое количество образцов, что приводит к идентификации действия лекарственного средства. Ветеринарная диагностика и сельскохозяйственное генетическое исследование включают образцы от животного, кроме человека, или виды растений, подобные диагностикам in vitro и предусматривают способы контроля качества сельскохозяйственных генетических продуктов и процессов. В исследовании окружающей среды, организмы и их токсины, которые показывают загрязнение окружающей среды, например, почвы, воды, воздуха и т.д., могут быть проанализированы. Исследование продуктов питания включает количественное определение организмов, например, бактерий, грибков и т.д., как способ контроля качества. При осуществлении контролирования промышленного процесса, нуклеиновые кислоты обнаруживают и/или количественно определяют, чтобы показать надлежащий контроль производственного процесса и/или чтобы генерировать сигнал, если такие процессы выходят из-под контроля. В страховом исследовании, организмы и/или их токсины определяют в скрининг-тестах для определения категории риска клиента или помочь утвердить кандидатов. Квалифицированному специалисту в данной области с уровня техники будет понятно, что оболочки зонда и зонды согласно представленному изобретению могут быть использованы для различных других применений обнаружения и/или количественного определения нуклеиновых кислот, и новые применения постоянно разрабатываются.
В одном варианте осуществления, молекулы нуклеиновой кислоты, согласно представленному изобретению, включая оболочки зонда и зонды, могут быть использованы в анализах для исследования донорской плазмы и/или производства плазмы. Например, в некоторых вариантах осуществления, анализы включают ПЦР исследования донорской и/или производимой плазмы на присутствие или отсутствие инфекционных агентов, таких как, но не ограничиваясь этим, ВИЧ, HCV, паровирус, бактерии, дрожжи и т.д.
В некоторых вариантах молекулы РНК (например, мРНК, вирусная геномная РНК) из биологического источника (например, крови, спермы, слюны, мочи, спинномозговой жидкости, кожи) обнаруживают и/или количественно определяют. Как правило, молекулы РНК, если они присутствуют, будут преобразованы в молекулы кДНК и/или далее амплифицированы с помощью ПЦР, чтобы обеспечить аналит нуклеиновой кислоты-мишени, которые определяются.
В других вариантах осуществления, анализы проводят с образцами мРНК, полученными из биологической системы при различных условиях окружающей среды, таких как воздействие варьирующей концентрации кандидата на лекарственное средство или смесей кандидатов на лекарственное средство, которые могут обеспечить данные по эффективности, профиль безопасности, механизм действия и другие свойства кандидатов на лекарственное средство, которые необходимы в разработке лекарственных средств.
В некоторых вариантах осуществления, молекулы нуклеиновой кислоты, согласно представленному изобретению, могут использоваться для обнаружения или количественного определения ДНК мишеней (например, вирусной геномной ДНК, полиморфизмов ДНК), которые могут присутствовать в образце.
В еще следующих аспектах, представленное изобретение предусматривает набор. Например, в некоторых вариантах осуществления, наборы для анализа согласно данному изобретению включают, по меньшей мере, одну оболочку зонда, созданную для использования с зондом. Оболочка зонда может быть полинуклеотидом, имеющим первый полинуклеотидный сегмент, смежный со вторым полинуклеотидным сегментом, находящимся в прямом направлении к первому, где последовательность первого нуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности первого зондового сегмента зонда, где последовательность второго полинуклеотидного сегмента является комплементарной к последовательности второго зондового сегмента зонда, где второй зондовый сегмент находится в прямом направлении к первому зондовому сегменту.
Наборы, кроме того, могут включать зонд, инструкции для выполнения анализа, и/или реагенты для анализа, например, соли, буферные растворы, ингибиторы нуклеазы, ферменты рестрикции и денатурирующие средства. Наборы, кроме того, могут включать отрицательные и положительные контроли. Более того, наборы для анализа амплификации могут включать, в дополнение к некоторым или всему указанному выше, праймеры, нуклеотиды и/или полимеразы.
Компоненты в наборе могут или быть полученными коммерчески или сделанными в соответствии с хорошо известными в данной области с уровня техники способами. Кроме того, компоненты набора могут быть в растворе или лиофилизированными, в случае необходимости. В одном варианте осуществления, компоненты находятся в одном отсеке, и в другом варианте осуществления, компоненты находятся в разных отсеках.
Следующие примеры представлены только для иллюстрации.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Определение ВИЧ
Присутствие РНК ВИЧ определяли в образцах плазмы, используя ПЦР технологию в реальном времени (РТ-ПЦР), используя стандартные протоколы. Нормальные образцы плазмы крови человека негативные на ВИЧ были использованы в качестве отрицательных контролей.
2+
РНК ВИЧ, экстрагированные из плазмы, подвергали действию одностадийной обратной транскриптазы ПЦР амплификации в режиме реального времени в присутствии основной смеси, содержащей буферы, ионы Mg, dNTPs, ДМСО, MMLV обратной транскриптазы, Taq-полимеразу, ВИЧ-специфические праймеры и зонд 1, с или без оболочки зонда 1. Обратная транскриптаза, реакция ПЦР в режиме реального времени проводили, используя АВ 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA) в условиях термической циклизации в соответствии с температурами плавления зонда/оболочки зонда. Следующая ПЦР амплификация, генерируемый флуоресцентный сигнал анализировали, используя программное обеспечение системы обнаружения последовательности (SDS) (Applied Biosystems, Foster City, CA), известные в данной области с уровня техники.
Т
Т
Результаты показывают обнаружение ВИЧ в образцах ВИЧ-положительной плазмы с С значениями ниже, чем 40. Отрицательные контроли имели низкий флуоресцентный фон, сохраняющийся ниже заданного порога в присутствии оболочки зонда. В отсутствие оболочки зонда, флуоресцентный фон в отрицательных контролях был высоким в некоторых образцах, пересекая установленный порог значения С ниже, чем 40, получая ошибочные результаты.