Салицилатгидроксилазы бактерий и роль горизонтального переноса генов катаболических плазмид в их разнообразии

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НА УКИ

УДК 579.222 + 577.15

САЛИЦИЛАТГИДРОКСИЛАЗЫ БАКТЕРИЙ И РОЛЬ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ПЕРЕНОСА ГЕНОВ КАТАБОЛИЧЕСКИХ ПЛАЗМИД В ИХ РАЗНООБРАЗИИ

И.Ф. Пунтус, И.Ю. Филатова, Т.В. Фунтикова

Рассмотрены ферментные и генетические системы биодеградации салицила-та. Обобщены обширные литературные данные по разнообразию салицилатгидрокси-лаз: их структуре, свойствам, механизму взаимодействия с субстратом. Показана роль плазмид биодеградации в разнообразии салицилатгидроксилаз. Расположение генов салицилатгидроксилаз на конъюгативных плазмидах и наличие в составе плазмид транспозонов приводит в процессе коньюгационного переноса к структурным изменениям генов салицилатгидроксилаз и к изменению субстратной специфичности данных ферментов.

Ключевые слова: салицилатгидроксилазы, катаболические плазмиды, гены, биодеградация, бактерии

1. Роль флавинсодержащих монооксигеназ в деградации ароматических углеводородов

Микробиологическое окисление ароматических соединений является одной из проблем, находящихся в центре внимания исследователей. Это объясняется, с одной стороны, теоретическим интересом, связанным с пониманием механизмов микробного разложения стабильных в химическом отношении ароматических структур, а с другой -вопросами практического характера, касающимися защиты окружающей среды.

Микроорганизмы играют ведущую роль в природном углеродном цикле, так как микробная деградация ароматических соединений приводит к высвобождению углерода из кольцевых структур и, таким образом, к вовлечению его в биологический круговорот. В настоящее время в природный круговорот углерода кроме кольцевых структур биологического происхождения вовлекается значительное количество ароматических соединений, попадающих в биосферу в виде отходов промышленности и в качестве химических средств защиты растений. Многие из этих соединений, включая и полициклические углеводороды, являются физиологически активными и, следовательно, возможная аккумуляция их в биосфере представляет серьезную опасность для живых организмов, а микробный катаболизм абиогенных ароматических соединений приводит к их детоксикации. Для успешного использования микроорганизмов с целью очистки окружающей среды требуется детальное изучение их катаболических путей, а также ключевых

ферментов, катализирующих деструкцию полициклических ароматических углеводородов.

В природе разрушение ароматических углеводородов в аэробных условиях происходит через расщепление ароматического кольца диоксигеназами. Однако диоксигеназы работают лишь в том случае, если в ароматическом кольце имеются две гидроксильные группы в орто- или пара-положении по отношению друг к другу. Поэтому, один из первых шагов в биодеградации ароматических соединений - это введение одной или двух гидроксильных групп в ароматическое кольцо [1]. Введение одной гидроксильной группы в ароматическое кольцо -моногидроксилирование - катализируется монооксигеназами, в то время как одновременное введение двух гидроксильных групп -дигидроксилирование - катализируется диоксигеназами. За превращением исходных соединений в соответствующие дигидроксилированные ароматические соединения следуют реакции, приводящие к разрыву ароматического кольца, т.е. образованию алифатических соединений. Последние, в свою очередь, легко катаболизируются с образованием обычных нетоксичных клеточных метаболитов, таких как ацетил СоА, пируват, сукцинил СоА.

Реакции, приводящие к формированию ароматических диолов, в большинстве случаев требуют активности ферментов, относящихся к подклассу флавинсодержащих монооксигеназ, которые также носят название гидроксилаз. Гидроксилазы ароматических соединений являются объектом биохимических и генетических исследований не только в силу их важной роли в процессах детоксикации, но также как превосходные системы для изучения механизмов ферментативного включения молекулярного кислорода в молекулу субстрата. Большинство монооксигеназ, катализирующих моногидроксилирование ароматического кольца замещенных фенолов, являются однокомпонентными ферментами, хотя также были обнаружены и многокомпонентные монооксигеназы, такие как фенол- и толуол-4-монооксигеназы.

Салицилаты - широко распространенные в природе ароматические углеводороды, типичные метаболиты растений. Кроме того, салицилат является ключевым интермедиатом в путях биодеградации нафталина, фенантрена, антрацена и других токсичных и канцерогенных соединений, загрязняющих окружающую среду. Бактерии рода Pseudomonas могут утилизировать салицилат двумя способами. Превращая его с помощью салицилат-1-монооксигеназы в катехол или окисляя салицилат до гентизиновой кислоты салицилат-5-монооксигеназой.

Биохимические исследования салицилатгидроксилаз в последнее десятилетие были дополнены активными генетическими исследованиями. Использование современных молекулярно-генетических методов для изучения генов салицилатгидроксилаз показало большое их разнообразие.

Целью данного обзора являлось обобщение имеющихся данных по исследованию ферментных и генетических систем биодеградации салицилата и роли плазмид биодеградации в разнообразии салицилатгидроксилаз.

2. Салицилатгидроксилаза: положение и структурные взаимосвязи с другими ароматическими флавиновыми монооксигеназами

Флавиновые монооксигеназы, относящиеся к пара-гидроксибензоатгидроксилазам, разделяют на несколько подгрупп в зависимости от размера их субъединиц. 4-гидроксибензоат-, 4-гидроксифенилацетат-3- и салицилатгидроксилазы имеют молекулярную массу приблизительно 45 кДа [2-4], тогда как масса других гидроксилаз колеблется от 60 до 80 кДа [5-7]. Большинство флавиновых монооксигеназ встраивают новую гидроксильную группу в орто- положение к уже существующей. Также известны ферменты, катализирующие пара-гидроксилирование. 3-гидроксибензоат-6-гидроксилаза штамма Pseudomonas cepacia - мономер массой 44 кДа, тогда как тот же фермент штамма Micrococcus sp. имеет молекулярную массу 70 000 (табл. 1) [8, 9].

Салицилатгидроксилаза, кодируемая генами плазмиды NAH7 штамма Pseudomonas putida, катализирующая окислительное декарбоксилирование 2-гидроксибензоата, на 25 % идентична по последовательности аминокислот с пара-гидроксибензоатгидроксилазой [10]. Аминокислотная последовательность в области связывания с ФАД у этих ферментов является строго консервативной.

Фенолгидроксилаза дрожжей Trichosporon cutaneum [11], 2,4-дихлорфенолгидроксилаза, кодируемая генами плазмиды pJP4 штамма Alcaligenes eutrophus [12], и фенолгидроксилаза Pseudomonas sp.ES-T1001 [13] на 20-30 кДа тяжелее, чем пара-гидроксибензоат- и салицилатгидроксилазы. Дихлорфенол- и фенол- гидроксилазы идентичны на 46 % по последовательности аминокислот, что указывает на их эволюционную связь [3, 14].

3. Механизм взаимодействия пара-гидроксибензоатгидроксилаз

с субстратом

Реакционный цикл инициируется присоединением субстрата к ферменту [18, 19]. Связывание с субстратом вызывает конформационное изменение, которое повышает скорость переноса водорода с НАДФН на позицию N5 флавинового изоаллоксацинового кольца в 100 000 раз. НАДФН окисляется с образованием ФАДН2. Молекула кислорода затем присоединятся к ФАДН2 и восстанавливается посредством двух одноэлектронных переносов. При переносе первого электрона с ФАДН2 на молекулу кислорода образуется супероксидный анион, который затем трансформируется в 4а-гидроксипероксифлавин за счет переноса второго

электрона. Таким образом, неактивная молекула кислорода превращается в активный 4а-гидроксипероксифлавин, который атакует ароматическое кольцо субстрата.

Таблица 1

Семейство ароматических монооксигеназ__

Организм Размер

Фермент или плазмида субъединиц, кофактор ссылка

Семейство

и-гидроксибензоатгидроксилаз

п-гидроксибензоат-3-гидроксилаза Pseudomonas 45 кДа, 3

(ЕС 1.14.13.2) fluorescens FAD

Салицилатгидроксилаза NAH7 10

Семейство фенол-2-гидроксилаз

2,4-дихлорфенол-6-монооксигеназа (ЕС 1.14.13.20) pJP4 65 кДа 12

Фенол-2-гидроксилаза Pseudomonas 13

(ЕС 1.14.13.7) EST1001

Неклассифицированные

флавопротеиновые

монооксигеназы

о-нитрофенолгидроксилаза Pseudomonas 65 кДа, 7

putida B2 FAD

4-гидроксифенилацетат-3- Pseudomonas 44 кДа, 2

гидроксилаза (ЕС 1.14.13.3) putida FAD

2,4- дихлорфеонксиацетатмонооксигеназа pJP4 32 кДа 15

Pseudomonas 44 кДа,

3-гидроксибензоат-6-гидроксилаза cepacia; Micrococcus sp. FAD 70 FAD кДа, 9 8

Семейство мультикомпонентных

фенол-2-гидроксилаз

Фенол-2-гидроксилаза Pseudomonas 16

(ЕС 1.14.13.7) sp. CF600

Толуол-4-монооксигеназа Pseudomonas 17

mendocina

На следующем этапе 4а-гидропероксифлавин превращается в короткоживущий интермедиат, а субстрат гидроксилируется. Химическая структура этого короткоживущего интермедиата пока еще не установлена [20, 21]. Если субстратный аналог, не содержащий электрондонорного заместителя в ароматическом кольце, такой как бензоат или 6-

гидроксиникотинат, связывается с ферментом, ферментативная реакция происходит не полностью: образуется 4а-гидропероксифлавин, который медленно разлагается с образованием пероксида водорода, но субстрат не гидроксилируется. Продуктами гидроксилирования являются 3,4-дигидроксибензоат и флавин-4а-гидроксид, который нестабилен и спонтанно превращается в ФАД [3].

Гидроксильная группа субстрата в положении 4 ароматического кольца связывается водородными связями с гидроксильной группой Tyr201 фермента, которая также связана водородными связями с гидроксильной группой Tyr385. Чтобы исследовать роль этих водородных связей был использован сайт-направленный мутагенез по замене этих тирозинов на фенилаланины. Оба замещения снижали скорость восстановления ФАДа НАДФН. К тому же субстратное гидроксилирование проходило не полностью в реакции с ферментом, у которого Tyr201 был замещен на фенилаланин. В случае замещения Tyr385 на фенилаланин фермент не только гидроксилировал пара-гидроксибензоат, но и 3,4-дигидроксибензоат. Поэтому тирозин в положении 385 является определяющим в субстратной специфичности [22].

4. Механизм взаимодействия салицилат-1-монооксигеназы

Салицилатгидроксилаза штамма Pseudomonas putida S-1 была первой охарактеризованной флавинсодержащей монооксигеназой [23].

Салицилатгидроксилаза или 1-монооксигеназа (салицилат, НАДН: кислород оксидоредуктаза; КФ 1.14.13.1) относится к классу оксидоредуктаз, содержит ФАД в качестве кофактора, и катализирует декарбоксилирование и одновременное гидроксилирование салицилата в положении 1 в присутствии НАДН, приводящее к образованию катехола.

В последующем этот фермент был очищен из трех других штаммов псевдомонад. Pseudomonas sp. ATCC 29352 [24] Pseudomonas sp. ATCC 29351 [25] и Pseudomonas cepacia [26]. Все эти салицилатгидроксилазы содержали ФАД в качестве кофактора и катализировали декарбоксилирование и одновременное гидроксилирование салицилата с образованием катехола:

салицилэт-гидроксилаза ^kjh

+ СО2

ХЮС- НАДН НАД+

салицилат + 02 + 2Н+ + Н20

Формирование катехола в данной реакции сопряжено с окислением НАДН. Салицилатгидроксилаза штамма Pseudomonds putida S-1 использовала только НАДН в качестве кофактора, имела молекулярную массу 57 кДа и являлась мономером. Салицилатгидроксилазы штаммов

Pseudomonas sp. ATCC 29352, Pseudomonas sp. ATCC 29351 и Pseudomonas cepacia являлись гомодимерами с молекулярной массой холофермента 91 кДа, и проявляли различия в кинетических и спектральных свойствах.

Изучение механизма работы салицилатгидроксилазы, изолированной из Pseudomonas cepacia, показало, что первым шагом в окислении салицилата является связывание салицилата и НАДН, что приводит к освобождению НАД+ и восстановлению фермент-субстратного комплекса, который, в свою очередь, связывается с кислородом, приводя к гидроксилированию субстрата, образованию СО2 и воды [26]. Механизм работы салицилатгидроксилаз штаммов Pseudomonas putida S-1 и Pseudomonas sp. ATCC 29351 [25] был иным и заключался в последовательном связывании ферментом кофактора и салицилата.

5. Субстратная специфичность салицилат-1-монооксигеназ

Для многих салицилатгидроксилаз показана широкая субстратная специфичность [23-25, 27]. Салицилатгидроксилаза, выделенная Yamamoto с соавт. из штамма Pseudomonas putida S-1, проявляла большую активность к 2,5-дигидроксибензоату и п-аминосалицилату (134% и 120% скорости с салицилатом соответственно). В отношении 2,3-, 2,4-, 2,6-дигидроксибензоата, а также к 1-гидрокси-2-нафтоату активность проявлялась в меньшей степени [23].

White-Stevens и Kamin показали широкую субстратную специфичность салицилатгидроксилазы, выделенной из штамма Pseudomonas sp. ATCC 29352. Для этого использовались различные замещенные бензоаты, салицилаты и другие ароматические соединения. Фермент проявлял активность по отношению к аналогам салицилата: п-амино- и п-гидроксисалицилату, 163% и 196% от скорости реакции с салицилатом соответственно. Активность фермента в отношении к другим аналогам субстрата: 3,4-, 3,5-дигидроксибензоат, 3-гидрокси-2-нафтоат, метилсалициловый эфир, 1-гидрокси-2-нафтоат и сульфосалицилат, была ниже [24].

Huabing с соавт. изучали салицилатгидроксилазу штамма-деструктора нафталина Pseudomonas sp. ND6 (NahU), несущего гены негомологичных салицилатгидроксилаз nahU и nahG. Соответствующие им ферменты проявляли широкую субстратную специфичность и метаболизировали салицилат, сульфосалицилат, аспирин, метилсалицилат, хлорсалицилат и 3,5-динитросалицилат. Однако относительные скорости, с которыми трансформировались замещенные аналоги, существенно отличались. Для большинства субстратов в этом эксперименте NahU оказалась более эффективной, за исключением сульфосалицилата. Также NahU не трансформировала 3,5-динитросалицилат, несмотря на то, что NahG его трансформировала, но со скоростью, меньшей чем салицилат. Сульфосалицилат трансформировался NahG с высокой скоростью, но

NahU трасформировал его со скоростью 7% от скорости с салицилатом. Обе салицилатгидроксилазы: и NahU, и NahG являлись, по-видимому, эффективными катализаторами трансформации аспирина и проявляли высокую активность по отношению к 3- и 5-метилсалицилатам и более низкую к 5-хлорсалицилату [28].

Салицилатгидроксилаза штамма Pseudomonas sp. NT1, способного утилизировать 4- и 5-хлорсалицилаты, проявляла широкую субстратную специфичность по трансформации различных монозамещенных салицилатов, сильно не отличающуюся от описанных ранее. 4- и 5-метилсалицилаты трансформировались с большей скоростью, чем салицилат, в то время как 4- и 5-хлорсалицилаты трансформировались менее эффективно [29].

Большой спектр субстратов для исследования субстратной специфичности салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas putida BS202-P1 был предложен в работе Балашовой [30]. Большую, чем к салицилату, активность фермент проявлял к 4- и 5-аминосалицилату и 5-гидроксисалицилату (гентизат); к различным монозамещенным хлорсалицилатам, метилсалицилатам активность проявлялась в меньшей степени и совсем низкая была в отношении 5-сульфосалицилата, 1- и 2-нафтоата, а также 2-гидрокси-3-нафтоата и 2-гидрокси-1-нафтоата.

Bosh с соавт. исследовали салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas stutzeri AN10. В этом штамме было идентифицировано два гена, nahG и nahW, кодирующие две негомологичные салицилатгидроксилазы. Гены nahG и nahW штамма Pseudomonas stutzeri AN10 индуцибельные и экспрессируются под действием салицилата, а ферменты, которые они кодируют, NahG и NahW, включены в метаболизм нафталина и салицилата. Оба фермента проявляли широкую субстратную специфичность и метаболизировали салицилат, метилсалицилаты и хлорсалицилаты. Однако относительные скорости, с которыми трансформировались субстратные аналоги, значительно отличались. Фермент NahW был более эффективен по отношению 3-хлорсалицилату, в то время как NahG P. stutzeri AN10 - к метилсалицилатам. Относительные скорости потребления салицилата и его производных для P. stutzeri AN10 находились между значениями для каждой отдельной салицилатгидроксилазы, клонированной в E. coli. Таким образом, скорость потребления салицилата P. stutzeri AN10, по-видимому, обусловлена экспрессией обеих салицилатгидроксилаз, NahG и NahW, и является такой же, как и значения, полученные для NahG плазмиды NAH7. Однако, NahG штамма P. stutzeri AN10 трансформирует 3-метилсалицилат с высокой скоростью (почти 100% от скорости салицилата), в то время как NahG P. putida G7 катализирует его превращение только на 20 % от скорости, наблюдаемой для салицилата [27].

В тоже время было показано, что не все субстраты подвергаются гидроксилированию при окислении салицилата. При связывании фермента с так называемыми псевдосубстратами, одним из которых является бензоат, гидроксилирования не происходит, а весь кислород восстанавливается до Н2О2. Скорость восстановления НАДН при взаимодействии фермента с псевдосубстратом как правило выше, чем при взаимодействии фермента с салицилатом [26]. Изучение взаимодействия фермента с различными замещенными бензоатами и салицилатами выявило ряд соединений, которые по своим свойствам занимают промежуточное положение между реальными субстратами и псевдосубстратами: хотя эти соединения и подвергаются гидроксилированию, часть используемого кислорода восстанавливается до Н2О2 [24]. Wang исследовал кинетический механизм

салицилатгидроксилазы Pseudomonas cepacia [31] и показал, что процент активности, не связанной с трансформацией субстрата, у 3-метилсалицилата 4 %, 2,3-, 2,3- и 2,6-дигидроксибензоата около 5 %, п-аминосалицилата 40 %, п-гидроксибензоата 69 %.

6. Разнообразие салицилат-1-монооксигеназ

В последние годы появились сообщения о новых охарактеризованных салицилатгидроксилазах [27, 28, 30, 32].

Сходство между некоторыми бактериальными

салицилатгидроксилазами отражено на рис. 1.

Особого внимания заслуживают работы по изучению салицилатгидроксилазы, обнаруженной в штамме Pseudomonas putida PpG7, содержащего архетипическую плазмиду биодеградации нафталина NAH7. Было показано, что салицилатгидроксилаза этого штамма является мономером с молекулярной массой 45 кДа, определена N-концевая аминокислотная последовательность белка. Теми же исследователями была определена нуклеотидная последовательность nahG-гена, кодирующего синтез салицилатгидроксилазы плазмиды NAH7 [4].

Изучение нафталин-деградирующих штаммов показало, что в некоторых из них возможен синтез двух различных салицилатгидроксилаз. В штамме P.stutzeri AN10 два гена, ответственные за синтез различных салицилатгидроксилаз, активны. Штамм BS202 содержит плазмиду биодеградации нафталина NPL-1. Гены "верхнего" пути биодеградации нафталина, а также "молчащий" ген салицилатгидроксилазы в этом штамме локализованы на плазмиде NPL-1, функционирующий ген салицилатгидроксилазы и гены орто-пути расщепления катехола - на хромосоме [33]. В штамме Pseudomonas sp. strain ND6 функционируют две негомологичные салицилатгидроксилазы NahU и NahG. По-видимому, наличие в штаммах двух салицилатгидроксилаз с различающейся

субстратной специфичностью позволяет бактериям использовать более широкий спектр субстратов.

NCIB9316 NahG

- G7 NahG

- ND6 NahU

- - - S-1 NahG

* - AJ1 NahG

--- AN10 NahW

- P.fluorescens NahG

p AN10 NahG КГ715 NahG

NCIB9316-4 NahG

ND6 NahG 0.1

Рис. 1. Дендрограмма сходства между 11 бактериальными салицилатгидроксилазами. Линия соответствует 10 % идентичности. Были использованыг следующие салицилатгидроксилазы: P. stutzeri AN10 NahW(GenBank accession №AF039534), Sphingomonas sp. AJNahG (AB000564), P. stutzeri AN10 NahG (AF039534), P. putida G7 NahG (M60055), P. putida KF715 NahG (S80995), P. putida NCIB9816 NahG (X83926), P. putida NCIB9816-4 NahG (AF491307), Pseudomonas sp. ND6 NahG (AY208917), P. fluorescens NahG (AY048764), P. putida S-1

NahG(D67098), Pseudomonas sp. ND6NahU (AY208917) [28]

Апо-форма салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas putida S-1 массой 54 кДа с использованием сульфата аммония была закристаллизована. Образовавшиеся кристаллы имели крупные размеры (десятые доли миллиметра) и принадлежали к гексагональной группе симметрии [37].

Салицилатгидроксилазы, выделенные из различных бактериальных штаммов, представлены в табл. 2.

7. Разнообразие генов салицилат-1-монооксигеназ

Биохимические исследования салицилатгидроксилаз в последнее десятилетие были дополнены активными генетическими исследованиями [38]. В настоящее время для изучения разнообразия генов салицилатгидроксилаз используют современные молекулярно-генетические методы (ПЦР, ПДРФ, ARDRA). Показано большое разнообразие генов салицилатгидроксилаз.

Таблица 2

Салицилатгидроксилазы, охарактеризованные для различных __бактериальных штаммов__

Штамм Сведения о ферменте Ссылка

Pseudomonas putida S-1 57 кДа, мономер, одна молекула FAD на молекулу фермента, обладает широкой субстратной специфичностью [23]

Pseudomonas sp. ATCC 29352 91 кДа, димер из двух идентичных субъединиц, по одной молекуле FAD на субъединицу, обладает широкой субстратной специфичностью [24]

Pseudomonas sp. ATCC 29351 91 кДа, димер из двух идентичных субъединиц, по одной молекуле FAD на субъединицу, обладает широкой субстратной специфичностью [25]

Pseudomonas cepacia 91 кДа, димер из двух идентичных субъединиц, по одной молекуле FAD на субъединицу [26]

Pseudomonas putida PpG7 45 кДа, мономер. Ген салицилатгидроксилазы (nahG) плазмиды NAH7 клонирован, определена нуклеотидная последовательность. [10]

Pseudomonas putida UUC-1 ~ 43 кДа, использовался для создания биосенсора [34]

Pseudomonas putida KF715 Клонирован хромосомный ген салицилатгидроксилазы, определена нуклеотидная последовательность. Предсказываемый продукт - белок размером 48 кДа [31]

Pseudomonas stutzeri AN 10 Клонированы гены nahG и nahW, кодирующие две различные салицилат гидроксилазы с молекулярной массой 46 кДа (NahG) и 43кДа (NahW), оба фермента имеют широкую субстратную специфичность и участвуют в метаболизме нафталина и салицилата. [27]

Pseudomonas putida BS 202 В штамме Pseudomonas putida BS 202 присутствуют два гена салицилат-1-монооксигеназы, один из которых является негомологичным «классическим» генам nahG. Гены nahG и nahU кодируют две различные салицилатгидроксилазы. Ген nahG отноститя к типу pDTGl и является нефункционирующим. Продукт гена nahU - 45 кДа, мономер, одна молекула FAD на молекулу фермента, обладает широкой субстратной специфичностью. [30]

Pseudomonas cepacia ATCC 29351 Фермент молекулярной массой 46 кДа очищен путем комбинации ионообменной и гидрофобной хроматографии [35]

Pseudomonas sp. ND6 Два гена nahU и nahG, клонированы в Escherichia coli. Показано, что NahU содержит 429 аминокислотных остатка, а NahG - 434 аминокислотных остатка. Молекулярная масса и NahG, и NahU около 47 кДа. [28]

Pseudomonas sp. MT1 Фермент молекулярной массой 48 кДа очищен на 80% путем комбинации ионообменной хроматографии и гель-фильтрации [29]

Pseudomonas sp. 142NF (pNF142) Фермент молекулярной массой 46 кДа очищен путем комбинации ионообменной, гидрофобной хроматографии и гель-фильтрации [36]

В лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина был проведен анализ генов nahG салицилатгидроксилаз штаммов-деструкторов [39] и было показано, что практически во всех проанализированных образцах прошла амплификация генов nahG со специфичными праймерами. Разнообразие генов nahG в штаммах оценивали по продуктам амплификации размером 893 п.н., которые подвергали обработке эндонуклеазами рестрикции RsaI и MspI. Полученные фрагменты разделяли в агарозном геле и сравнивали с картой рестрикции известных последовательностей nahG. Оказалось, что в 32 изучаемых штаммах присутствует ген салицилатгидроксилазы, аналогичный nahG плазмиды pDTGl (тип pDTGl), у четырех штаммов - хромосомному гену у штамма P. stutzeri AN10 (тип AN10), у четырех - P. putida KF715 (тип KF715) и только у двух (37NF и А24) - NAH7 (тип NAH7). Кроме того, у трех изучаемых штаммов (NKNS3, NKNS5, NKNS7) картина гидролиза ампликонов nahG полностью идентична гидролизу фрагмента гена nahG из штамма P. putida KF715 только при обработке эндонуклеазой MspI, в то время как при обработке RsaI наблюдаются различия (рис.2, 3).

Полученные результаты показали наличие большого разнообразия генов салицилатгидроксилаз. Кроме того, было показано, что большинство исследованных генов nahG из различных штаммов флюоресцирующих псевдомонад гомологичны гену nahG плазмиды pDTDl штамма Pseudomonas putida 9816-4.

. 104 101 131 II i 201 i 356 , NAH7

| I I I j 104 , 101 , 219 102 i lxJtm ii 356 I ' j pDTGl

I ' 1 « 104 232 l I i 190 11 l i 356 | A88

1 1 j 205 , 131 104 , i i 97 i 124 132 | 100 I AN10

I ' « S 336 , I 104 , i 97 . 1 124 , 132 , 100 I I NKNS3

! * I 205 , 131 , l 104 , 1 97 , 1 124 , 129 I , 100 I IKF715

Рис. 2. Карта рестрикции ПЦР-продуктов амплификации гена nahG эндонуклеазой RsaI штаммов: P. putida G7 (NAH7), P. putida NCIB9816 (pDTGl), P. fluorescens A88, P. stutzeri AN10 (ANW), P.fluorescens NKNS3

и Р. putida KF715 [39]

1 161 26 I 532 42 70 40 NAH7

1 1 183 26 1 I 361 i 171 42 70 i ; ! 40 | PDTG1

1 1 61- 122 ! 269 175 231 А88

! ' | 183 26 { f 243 118 "1- » 57 4— i 114 33 79 1 t 40 \ AN10

I ! 183 1 269 118 i57. 114 33 79 1- § .40 NKNS3

I I ...... 181 ! _ 269 118 ,57, 111 ,33, 79 ,40 ..... I KF715

Рис. 3. Карта гидролиза ПЦР-продуктов амплификации гена nahG эндонуклеазой MspI штаммов: P. putida G7 (NAH7), P. putida NCIB9816 (pDTGl), P. fluorescens A88, P. stutzeri AN10 (AM0), P. fluorescens NKNS3

и Р. putida KF715 [39]

Когда в базе данных появилась полная нуклеотидная последовательность плазмиды pND6-1 штамма-деструктора нафталина P.putida ND6 (GenBank Асс. № AY208917), то N-концевой участок выведенной аминокислотной последовательности салицилатгидроксилазы NahU оказался идентичен на 100 % N-концевому участку салицилат гидроксилазы штамма P. putida BS202-P1, ранее определенному Балашовой с соавторами [30]. Особенностью данной плазмиды pND6-1 является наличие двух негомологичных друг другу функциональных генов салицилат гидроксилаз, nahU и nahG. На основании последовательности гена nahU в лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН были подобраны праймеры nahGU_244f и nahU_898r. ПЦР-продукты присутствовали во всех проанализированных образцах. Чтобы подтвердить, что именно ген nahU отвечает за Sal+ фенотип в штамме P. putida BS3701, проводили ОТ-ПЦР (обратнотранскриптазная цепная полимеразная реакция) с транскриптов клеток штамма P. putida BS3701. ПЦР-продукты соответствующих размеров были получены как в случае гена nahAc, так и nahU. Амплификация генов nahAc и nahU не наблюдалась с тотальной РНК исследуемого штамма, если данную РНК предварительно не обрабатывали обратной транскриптазой.

Полиморфизм гена салицилат гидроксилазы nahU исследовали путем RFLP-анализа. У исследуемых штаммов обнаружены два варианта последовательностей гена nahU(HD6 и g20f) (рис. 4). Вариант g20f обнаружен впервые.

MI 23456789 10 ИМ

Рис. 4. Электрофорегр^марестрикции ттликонов гена nahU размером 654 п.н. эндонуклеазой рестрикции Rsal: М - ДНК-маркер

50 п.н. ("Fermentas", Литва), 1 - P. putida gl5f, 2 - P. putidag20f, 3 - P. putida g24f, 4 - P. putida NS7, 5 - P. putida NS11, 6 - P. putida NS12, 7 - P. putida NS15, 8 - P. putida NS17, 9 - P. putida NS18,10 - P. putida 202, 11 - P. putida 3701,12- P. putida 3790 [40]

Ген nahU штамма P.putida ND6, так же как и ген салицилат гидроксилазы nahW штамма P.putida AN10 (AF039534), располагается обособленно от па^Ь2-оперона и функционально дублирует в этих штаммах ген «классической» салицилат гидроксилазы nahG [40].

8. Салицилат-5-монооксигеназа

У ряда микроорганизмов описан альтернативный путь деградации нафталина и салицилата через гентизиновую кислоту при участии салицилат-5-гидроксилазы (рис. 5), который у флуоресцирующих псевдомонад является менее распространенным, в отличие от хорошо изученного пути деградации салицилата через катехол [41, 42].

Наиболее изучен катаболизм нафталина через гентизат у штамма Ralstonia sp. U2 [41]. Салицилат 5-гидроксилаза штамма Ralstonia sp. U2 предположительно состоит из двух неидентичных субьединиц: аир. Большая (а) субъединица салицилат 5-гидроксилазы содержит комплекс Риске [2Fe-2S], а также консервативные аминокислотные остатки Asp-205, His-208 и His-213, координирующие ион железа. Данный белок демонстрирует отдаленное родство с а субъединицей оксигеназного компонента нафталиндиоксигеназы. Салицилат 5-гидроксилаза действует как гидроксилирующая монооксигеназа. Она является конечным звеном в совместной цепи транспорта электронов от НАДН, которая включает также ферредоксин редуктазу (NagAa) и ферредоксин (NagAb). Ферредоксин в данном случае служит посредником при передаче

электронов как на терминальную оксигеназу (NagAc), так и на салицилат 5-гидроксилазу [41].

он н

nah А

Нафталин

nah Е

СНО

С алициповый альдегид

nah F

nah Б

Нафталин цис-1,2- 1,2-Дигидрокси--дигидродиап ОН

СООН

ОН

Т ране- о- гидр окси-

б ензипид ен пир ое и-ноградная кислота

ОН

2 -Гидр оксих ромен- 2-кар6оксиповал кислота

ОН

С апициповал кислота СООН

nah G

1

ОН

СООН

Г ентиз иное ая кислот а

он

Мета-расщепление

nah HILNJK / /

Пируват +

ацет альдегид

Катехоп ^

ОН

\ Орго-расщеппение

СукщшмСоА п

+ +

^tmiCoA фумарат

Рис 5. Биохимические пути деградации нафталина различными

микроорганизмами

Взаимосвязь между двумя ветвями цепи транспорта электронов, а также взаимозаменяемость NagAa, NagAb и NahAa, NahAb была продемонстрирована in vitro [41].

На данный момент генетический контроль «гентизатного» пути деградации салицилата детально изучен только у представителей ß-протеобактерий (Ralstonia, Polaromonas и Achromobacter). Однако впервые деградация салицилата через гентизат была описана Старовойтовым с соавторами именно у псевдомонад еще в 1975 году на примере деструктора нафталина Р. fluorescens [43], тем не менее, его генетическая организация не была исследована.

В лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН исследовали генетический контроль деградации нафталина штаммом Pseudomonas putida AK5 (pAK5), который катаболизирует салицилат через

гентизат [42]. Измалковой с соавторами было обнаружено, что за деградацию нафталина до салицилата в штамме АК5 отвечает «классический» nahl-оперон под контролем регуляторного гена nahR, подобный nahl-оперонам плазмид катаболизма нафталина pDTGl, pND6-1. В отличие от вышеназванных плазмид, в штамме АК5 отсутствует nah2-оперон, отвечающий за деградацию салицилата через мета-путь расщепления катехола до интермедиатов цикла Кребса. Данный оперон либо был утерян плазмидой рАК5, либо не приобретался вовсе.

Гены катаболизма салицилата через гентизат, в отличие от штаммов Ralstonia sp. U2 и Polaromonas naphthalenivorans CJ2, локализованы отдельно от генов «верхнего» пути деградации нафталина и имеют оперонную структуру. Исследован оперон деградации салицилата, названный sg^-оперон (salicylate-gentisate pathway), который включает 6 структурных генов, sgpAIKGHB, кодирующих четыре субъединицы салицилат 5-гидроксилазы (SgpAGHB), гентизат 1,2-диоксигеназу (SgpI) и фумарилацетоацетат гидролазу (SgpK).

P. putida АК5 является первым природным штаммом, в котором было обнаружено сочетание оперона деградации салицилата через гентизат с «классическим» nahl-опероном. Исследованная организация генов деградации нафталина и салицилата в штамме P. putida AK5 отличается как от организации «классических» катаболических оперонов плазмид NAH7 и pDTGl, так и от nag-генов штаммов Ralstonia sp. U2 и Polaromonas naphthalenivorans CJ2 [38, 42].

Было показано, что идентичность установленной нуклеотидной последовательности фрагмента гена nagG из штамма P. putida AK5 составила 80% с nagG из Ralstonia sp. U2 и 72% с hybB из P. aeruginosa JB2. Выведенную аминокислотную последовательность ампликона сравнивали с последовательностями, имеющимися в базе данных [44]. Результаты кластерного анализа показали, что NagG из штамма АК5 образует группу с салицилат-5-гидроксилазами из штаммов Ralstonia sp. U2 KF715, P. aeruginosa JB2, Pigmentiphaga sp. NDS-2, а также с Orf2 из Burkholderia sp. DNT и салицилат-5-гидроксилазой патогена растений R. solanacearum GM1000 (рис. 6). Гомология аминокислотной последовательности с данными салицилат 5-гидроксилазами составляет от 76 до 83% [45].

Плазмиды являются важнейшими элементами генетического пула (генома) бактерий, обеспечивая адаптацию микроорганизмов к изменяющимся условиям окружающей среды. Им принадлежит ключевая роль в эволюции таких фенотипических признаков, как устойчивость к антибиотикам и деградация сложных органических соединений. Катаболические гены часто находятся в составе больших коньюгативных плазмид, которые обеспечивают широкое распространение биодеградативных признаков среди микроорганизмов [46]. К настоящему

времени у псевдомонад описаны плазмиды, принадлежащие к 14 различным группам несовместимости. Однако, известно, что изученные плазмиды биодеградации нафталина и других ароматических соединений, как правило, относятся к группам несовместимости Р-2, Р-7 и Р-9 [47]. Принадлежность плазмиды к определенной группе несовместимости связана с организацией её базового репликона (область плазмиды, необходимая для процесса репликации (удвоения) плазмиды) и определяет круг её бактериальных хозяев, а также возможность сосуществования различных плазмид и, следовательно, возможность совмещения различных признаков в одном штамме микроорганизмов.

0.1

i-1

66

78

100

97

100

— Orf2 Burkholderia sp. DNT NagG Ralstonia sp. U2

NagG R.solanacearum GMI1000

HybB P.aeruginasa JB2

NdsB Pigmentiphaga sp. NDS-2

- NagG P.putida. AK5

BphAlc N.aromaticivorans F199

Рис.6. Дендрограмма, иллюстрирующая эволюционные взаимоотношения между аминокислотными последовательностями

большую субъединиц салипилат-5-гидроксилаз разных штаммов бактерий. Номера использованных последовательностей в GenBank:

Burkholderia sp. DNT (AAB09764), Ralstonia sp. U2 (AF036940), R. solanacearum GMI1000 (NP519211), P.aeruginosa JB2 (AF087482), Pigmentiphaga sp. NDS-2 (AB098505), Novosphingobium aromaticivorans

F199(AAD04009) [45]

8. Роль плазмид биодеградации нафталина в разнообразии генов

салицилатгидроксилаз

Плазмиды деградации нафталина (NAH плазмиды) широко распространены среди штаммов-деструкторов рода Pseudomonas [48, 49]. В 1973 году Данн в штамме P. putida G7 обнаружил плазмиду, обозначенную как NAH, определяющую способность данного штамма к росту на нафталине и салицилате в качестве единственного источника углерода и энергии и кодирующую мета-путь расщепления катехола [50]. Плазмида NAH кодирует ферменты полного пути окисления нафталина, в частности, ключевые ферменты: нафталиндиоксигеназу,

салицилатгидроксилазу и катехол-2,3-диоксигеназу.

Исследование транспозонных мутантов позволили локализовать гены, кодирующие ферменты биодеградации нафталина, на плазмиде NAH7 [51]. Гены окисления нафталина организованы в два оперона.

"Верхний" путь окисления нафталина (nah1-оперон) включает гены nahABCDEF, контролирующие конверсию нафталина в салицилат с освобождением пирувата. "Нижний" путь окисления нафталина, контролируется генами nahGHIJK (nah2-оперон), кодирующими синтез ферментов окисления салицилата через мета-расщепление катехола до ацетальдегида и пирувата. В результате инактивации первого оперона теряется способность к утилизации нафталина (Nah- Sal+ - фенотип), при инактитивации второго - к утилизации салицилата (Nah+Sal- - фенотип).

Существует следущая общая модель координированной регуляции экспрессии nah-генов (рис. 7). Для клеток, содержащих плазмиду NAH7, в отсутствии салицилата наблюдается низкий конститутивный (постоянный) уровень экспрессии nah1-, nah2-, nahR-областей. Добавление в среду роста салицилата (или нафталина, который медленно метаболизируется в салицилат за счет низкого уровня конститутивной экспрессии генов nah1-оперона) приводит к активации транскрипции nah-оперонов, опосредованной предсинтезированным NahR-белком. Белок NahR предположительно связывается с салицилатом и, согласно представлениям в рамках модели позитивной регуляции оперонов, переходит в активную форму активатора транскрипции nah-оперонов. Анализ транспозонных мутантов с нарушенной регуляцией nah-генов позволил локализовать nahR локус на карте плазмиды NAH7 в непосредственной близости nahG гену. Анализ транспозонных мутантов с использованием клонированного nahR локуса показал, что nahR кодирует продукт, являющийся активатором обоих оперонов [48].

Большая работа по изучению плазмид биодеградации нафталина проводится в лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН, Пущино под руководством чл.-корр. РАН Боронина А.М. [33, 52-54]. Сравнительное изучение свойств плазмид биодеградации нафталина показало, что они отличаются между собой как по размерам, так и по способности к конъюгационному переносу и признаку несовместимости. Кроме того, было показано, что плазмиды детерминируют различные пути катаболизма нафталина. Плазмиды pBS3, pBS211, pBS213, pBS215, pBS218, pBS219, pBS242 и pBS243 контролируют полное окисление нафталина через салициловую кислоту с использованием мета-пути окисления катехола. Боронин с соавт. показали, что плазмиды pBS2, pBS216, pBS217 содержат молчащие гены мета-пути деградации катехола, а неконъюгативная плазмида pBS4 детерминирует окисление нафталина через гентизиновую кислоту [43]. В последние годы в лаборатории интенсивно ведется работа по изучению генетических систем деградации салицилата у флуоресцирующих псевдомонад [39].

Рис. 7. Схмла организации и регуляции экспрессии nah-генов плазмиды NAH7. Ген nahR транскрибируется конститутивно. Продукт гена nahR - белок NahR, взаимодействуя с салицилатом, активирует оба nah-оперона. Стрелками указано направление транскрипции [48]

Известно, что NAH плазмиды могут контролировать деградацию не только нафталина, но и более высокомолекулярных ПАУ. Плазмиды pKAl, pKA2 и рКА3 размером около 100 т.п.н., изолированные из трех различных штаммов Pseudomonas, а также архетипическая плазмида NAH7 кодируют гены, ответственные за утилизацию нафталина, фенантрена и антрацена [39, 55]. Таким образом, одна бактериальная популяция может быть достаточна для деградации значительной фракции ПАУ в почве.

К настоящему времени описано 2 альтернативных пути деградации фенантрена: сначала фенантрен в результате последовательных реакций трансформируется до 1-гидрокси-2-нафтойной кислоты. Дальнейшие биохимические пути деградации этого соединения могут быть различны: 1-гидрокси-2-нафтойная кислота метаболизируется либо через салицилат и катехол, либо через образование о-фталата и протокатехата. Катехол и протокатехат далее расщепляются по орто - или мета - пути до интермедиатов цикла Кребса [56].

В работе Балашовой с соавторами было показано, что салицилатгидроксилаза Pseudomonas putida BS202-P1 участвует в гидроксилировании 1-гидрокси-2-нафтоата [30].Удельная активность фермента по отношению к данному субстрату составляла 30% от удельной активности в отношении салицилата. По данным лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН ген данной салицилатгидроксилазы относится к типу NahU. Однако было не понятно салицилатгидроксилаза типа NahG тоже выполняет роль 1-гидрокси-2-нафтоатгидроксилазы, которая играет

важную роль в деградации фенантрена, а переключения с одного субстрата на другой зависит от индуцибельного характера гена салицилатгидроксилаз, или же для деградации фенантрена все же надо присутствие гена nahU. Поэтому в лаборатории биологии плазмид была проведена очистка салицилатгидроксилазы из штамма P. putida NF142 (pNF142), ген которой относится к типу pDTG-подобных NahG, и изучена субстратная специфичность данного фермента. Было показано, данная салицилатгидроксилаза тоже выполняет роль 1-гидрокси-2-нафтоатгидроксилазы [36].

Обширную группу мобильных генетических элементов образуют транспозоны, сегменты ДНК, способные к внутри или межхромосомным перемещениям. Транспозоны II класса несут короткие концевые инвертированные повторы и переносятся в репликативном режиме при участии транспозаз и резольваз. Наличие транспозонов и IS-элементов в составе плазмид биодеградации не является редкостью. Показано наличие транспозонов II класса в составе плазмид NAH7 (Tn4655), pND6 [57-60]. Транспозоны наряду с плазмидами играют важную роль в горизонтальном переносе генов биодеградации внутри и между бактериальными популяциями. в ростовой среде салицилата. Сопряжение экспрессии катаболических и транспозонных генов может обеспечивать быстрое распространение катаболических генов в микробных популяциях за счет увеличения частоты рекомбинационных событий как ответ на присутствие ПАУ в окружающей среде.

В процессе изучения разнообразия генов салицилатгидроксилаз из штаммов P. fluorescens в лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина были выявлены новые типы генов nahG. Было показало, что картина гидролиза ампликонов nahG штаммов P. fluorescens NKNS3, NKNS5, NKNS7 полностью идентична гидролизу фрагмента гена из штамма P. putida KF715 только при обработке эндонуклеазой MspI, в то время как при обработке RsaI наблюдаются различия. Для штаммов A88, A89, A96 картины гидролиза эндонуклеазами рестрикции RsaI и MspI ампликонов были полностью идентичны друг другу и отличались от картины гидролиза известных nahG генов [39]. Поскольку были обнаружены два новых рестрикционных профиля гена nahG, отличающиеся от описанных ранее, то было выбрано по одному представителю из каждой группы - NKNS3 и А88 - для определения нуклеотидной последовательности ампликона nahG. Используя программы "BLAST" и "CLUSTAL", нуклеотидные последовательности фрагментов генов nahG NKNS3 и А88 и выведенные аминокислотные последовательности сравнивали с последовательностями, имеющимися в базе данных [44]. Анализ нуклеотидной последовательности фрагмента гена nahG штамма NKNS3 (AY429511) показал, что, последовательность nahG NKNS3 является близкородственной хромосомным генам nahG

штаммов P. putida KF715 и P. stutzeri AN10. Различия в трех этих последовательностях возникли за счет точечных замен и делеций триплетов. Точечная замена привела к исчезновению сайта рестрикции RsaI в положении 205, по сравнению с nahG KF715, а также к замене валина (GTA) на аланин (GCA). Таким образом, в результате объединения RsaI-фрагментов размером 205 п.н. и 131 п.н. появляется новый фрагмент размером 336 п.н. (рис. 2, 3). Степень идентичности аминокислотной последовательности фрагмента гена nahG штамма NKNS3 составляет 96% с аналогичной последовательностью как KF715, так и AN10, и 87% или менее с остальными известными салицилат 1-монооксигеназами.

Идентичность аминокислотной последовательности ампликона nahG A88 составляет 86-88 % с аналогичными последовательностями известных к настоящему времени салицилат 1-монооксигеназ. Результаты кластерного анализа показали, что в то время как NahG из штамма NKNS3 образует группу с хромосомными салицилат 1-монооксигеназами из штаммов KF715 и AN10, NahG из P. fluorescens А88 занимает обособленное положение [39].

Таким образом, расположение генов салицилатгидроксилаз на конъюгативных плазмидах и наличие в составе плазмид транспозонов приводит в процессе коньюгационного переноса к структурным изменениям, инсерциям (вставка) или делециям (выпадение части ДНК), что приводит к изменениям структуре генов салицилатгидроксилаз, приводящих и к изменению субстратной специфичности данных ферментов.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта «У.М.Н.И.К.» № 9950ГУ2/2015 и Казахстанско-Российского проекта № 142 «Разработка концепции мониторинга загрязненных нефтью почв Приаральского региона и технологий их очистки с использованием новых биопрепаратов».

Список литературы

1. Harayama S., Timmis K. N. Catabolism of aromatic hydrocarbons by Pseudomonas / In D.A. Hopwood and K. Charier (ed.), Genetics of Bacterial Diversity, cel., New York: Academic Publishers, 1989. P. 151-174.

2. Purification and properties of 4-hydroxyphenylacetic acid 3-hydroxylase from Pseudomonas putida / S.G. Raju, A.V. Kamath, C.S. Vaidyanathan [at al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1988. V. 154. P. 537543.

3. Molecular modeling reveals the possible importance of a carbonyl oxygen binding pocket for the catalytic mechanism of p-hydroxybenzoate

hydroxylase/ H.A. Schreuder, W.G.J. Hoi, J. Drenth [at al.] // J. Biol. Chem 1988. V. 263. P. 3131-3136.

4. Очистка салицилатгидроксилазы штамма Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) / Е.П. Власова, И.Ф. Пунтус, А.П. Соколов [и др.] // Известия ТулГУ. 2009. Естественные науки. Вып. 2. С 230-238.

5. Raag R., Poulos T.L. Crystal structures of cytochrome P-450CAM complexed with camphane, thiocam-phor, and adamantane: factors controlling P-450 substrate hydroxylation // Biochemistry. 1991. V. 30. P. 2674-2684.

6. Organization and sequence analysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase and di-chlorocatechol oxidative operons of plasmid pJP4 / E.J. Perkins, M.P. Gordon, O. Caceres [et al.] // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 23512359.

7. Zeyer J., Kocher H.P. Purification and characterization of a bacterial nitrophenol oxygenase which converts ortho-nitrophenol to catechol and nitrite // Bacteriol. 1988. V. 170. P. 1789-1794.

8. Substrate-mediated purification and characterization of a 3-hydroxybenzoic acid-6-hydroxylase from Micrococcus / S. Rajasekharan, R. Rajasekharan, C.S. Vaidyanathan [at al.] // Arch. Biochem. Biophys. 1990. V. 278. P. 21-25.

9. Pseudomonas cepacia 3-hydroxybenzoate 6-hydroxylase: induction, purification, and characterization / L.-H. Wang, R.Y. Yu.Y. Hamzah, [et al.] // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 1099-1104.

10. Purification and characterization of salicylate hydroxylase from Pseudomonasputida PpG7 / I.-S. You, R.I. Murray, D. Jollie [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Common. 1990. V. 169. P.1049-1054.

11. Arginyl residues in the NADPH-binding sites of phenol hydroxylase / Sejlitz T., Neujahr, H.Y. // J. Protein Chem. 1991. V. 10. P. 43-48.

12. Organization and sequence analysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase and di-chlorocatechol oxidative operons of plasmid pJP4 / E.J. Perkins, M.P. Gordon, O. Caceres [et al.] // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 23512359.

13. Sequence of the gene (pheA) encoding phenol monooxygenase from Pseudomonas sp. EST1001: expression in Escherichia coli and Pseudomonas putida / A. Nurk, L. Kasak, M. Kivisaar [et al.] // Gene. 1991. V. 102. P. 13-18.

14. Rubredoxin reductase of Pseudomonas oleovorans. Structural relationship to other flavoprotein oxidoreductases based on one NAD and two FAD fingerprints / G. Eggink, H. Engel, G. Vriend [et al.] // J. Mol. Biol. 1990. V. 212. P. 135-142.

15. Analysis, cloning, and high-level expression of 2,4-dichloro-phenoxyacetate monooxygenase gene tfdA of Alcaligenes eutrophus JMP134 / W.R. Streber, K.N. Timmis, M.H. Zenk [et al.] // J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 2950-2955.

16. Complete nucleotide sequence and polypeptide analysis of multi-component phenol hydroxylase from Pseudomonas sp. strain CF600 / I. Nordlund, J. Powlowski, V. Shingler [et al.] // J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 6826-6833.

17. Cloning and characterization of a Pseudomonas mendocina KR1 gene cluster encoding toluene-4-monooxy-genase / K.-M. Yen, M.R. Karl, L.M. Blatt [et al.] // J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 5315-5327.

18. Catalytic function of tyrosine residues in parahydroxybenzoate hydroxylase as determined by the study of site-directed mutants / B. Entsch, B.A. Palfey, D.P. Ballou [et al.] // J. Biol. Chan. 1991. V. 266. P.1734-1749.

19. Analysis of the active site of the flavoprotein p-hydroxybenzo-ate hydroxylase and some ideas with respect to its reaction mechanism / H.A. Schreuder, W.G.J. Hoi, J. Drenth [et al.] // Biochemistry. 1990. V. 29. P. 31013108.

20. Taylor M.G., Massey V. Decay of the 4a-hydroxy-FAD intermediate of phenol hydroxylase // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 13687-13694.

21. Taylor M.G., Massey V. 6-Mercapto-FAD and 6-thiocyanato-FAD as active site probes of phenol hydroxylase // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 8281-8290.

22. Functional and evolutionary relationships among diverse oxygenases / S. Harayama, M. Kok, E.L. Neidte [et al.] // Annu. Rev. Microbiol. 1992. V. 46. P. 565-601.

23. Salicylate hydroxylase, monooxygenase requiring flavin adenine dinucleotide. Purification and general properties / S. Yamamoto, M. Katagiri, H. Maeno [et al.] // J. Biol. Chem. 1945. V. 230. P. 3408-3413.

24. White-Stevens R.H., Kamin H. Studies of a flavopritein, salicylate hydroxylase. Preparation, properties, and the uncoupling of oxygen reduction from hydroxylation // J. Biol. Chem. 1972. V. 247. P. 2358-2370.

25. Presswood R.P., Kamin H. Flavins and flavoproteins. Springer: Elsevier. Amsterdam. 1976. P. 145-154.

26. Apoenzyme of Pseudomonas cepacia salicylate hydroxylase / L.-H. Wang, S.-C. Tu, R.C. Lusk [et al.] // J. Biol. Chem. 1984. V. 259. P. 11361142.

27. NahW, a Novel, inducible salicylate hydroxylase involved in mineralization of naphthalene by Pseudomonas stutzeri AN10 / R. Bosch, E.R.B. Moore, E. Garcia-Valdes [et al.] // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 23152322.

28. Overexpression, purification and characterization of a new salicylate hydroxylase from naphthalene-degrading Pseudomonas sp.strain ND6 / Zh. Huabing, Ch. Defu, L. Yongjun [et al.] // Microbiol. Res. 2005. V. 160. P. 307 -313.

29. A gene cluster involved in degradation of substituted salicylates via orto cleavage in Pseudomonas sp. Strain MT1 encodes enzymes specifically

adapted for transformation of 4-methylcatechol and 3-methylmuconate /

B. Camara, P. Bielecki, F. Kaminski [et al.] // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 1664-1674.

30. Purification and characterization of a salicylate hydroxylase involved in 1-hydroxy-2-naphthoic acid hydroxylation from the naphthalene and phenanthrene-regarding bacterial strain Pseudomonas putida BS202-P1 / N.V. Balashova, A. Stolz, H-J. Knackmuss [et al.] // Biodegradation. 2001. V. 12. № 3. P. 179-188.

31. Wang L.H., Tu S.C. The Kinetic mechanism of salicylate hydroxylase as studied by initial rate measurement, rapid reaction kinetics, and isotope effects // J. Biochem. 1984. V. 259. № 17. P. 10682-10688.

32. Nucleotide sequence of salicylate hydroxylase gene and its 5'-flanking region of Pseudomonas putida KF715 / J. Lee, J. Oh, K.R. Min [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1990. V. 218. № 2. P 544-548.

33. Структурная и функциональная вариабельность генетических систем катаболизма полициклических ароматических углеводородов у штаммов Pseudomonas putidа / И.А. Кошелева, Т.Ю. Измалкова,

C.Л. Соколов [и др.] // Генетика. 2003. Т.39. № 9. С. 997-1004.

34. Production, partial characterization, and potential diagnostic use of salicylate hydroxylase from Pseudomonas putida UUC-1 / I.M. Banat, A. Marchant, P. Nigam [et al.] // Enzyme Microb. Technol. 1994. V. 16. P. 665670.

35. Production and purification of salicylate monooxygenase from Pseudomonas cepacia ATCC 29351 / J.R. Ramsay, I.D. McEntee, P.M. Hammond // Bioseparation. 1992. V. 2. P. 375-383.

36. Свойства негомологичных салицилатгидроксилаз бактерий рода Pseudomonas / И.Ф. Пунтус, Е.П. Власова, А.П. Соколов [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2015. Т. 51. № 2. С. 213-220.

37. Crystallization and preliminary X-ray analysis of salicylate hydroxylase from Pseudomonas putida S-l / T. Yabuuchi, K. Suzuki, T. Sato [et al.] // J. Biochem. 1996. V. 119. P. 829-831.

38. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonas fluorescens / Т.Ю. Измалкова, О.И. Сазонова, С.Л. Соколов [и др.] // Микробиология. 2005. Т. 74. № 1. С. 70-78.

39. Измалкова Т.Ю. Разнообразие генетических систем катаболизма нафталина штаммов флуоресцирующих псевдомонад: дис....канд. биол. наук. Пущино, 2004. 129 с.

40. Деградация салицилата штаммами Pseudomonas putida без участия «классического» NAЯ2-оперона / О.И. Сазонова, Т.Ю. Измалкова, И.А. Кошелева [и др.] // Микробиология. 2008. Т. 77. № 6. С. 798-804.

41. Salicylate 5-hydroxylase from Ralstonia sp. strain U2: a monooxygenase with close relationships to and shared electron transport

proteins with naphthalene dioxygenase / N.-Y. Zhou, J. Al-Dilaymi, M.S. Baird [et al.] // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 1547-1555.

42. The organization of naphthalene degradation genes in Pseudomonas putida strain AK5 / T.Y. Izmalkova, O.I. Sazonova, M.O. Nagornih [et al.] // Res. Microbiol. 2013. V. 164. № 3. P. 244-53.

43. Скрябин Г.К, Старовойтов И.И. Альтернативный путь катаболизма нафталина Pseudomonas fluorescens // Докл. АН СССР. 1975. Т. 221. С. 493-495.

44. Basic local alignment search tool / S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller [et al.] // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 403-410.

45. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci, 1994. V. 10. P. 569-570.

46. Top E.M., Moenne-Loccoz Y., Pembroke T., Thomas, C.M. The horizontal gene pool. Harwood Academic Publishers: Amsterdam, 2000. P. 249285.

47. Плазмида pBS241 Pseudomonas putida, контролирующая деградацию бифенила / В.В. Кочетков, И.И. Старовойтов, А.М. Боронин [и др.] // Докл. АН СССР. 1985. Т. 226. С.241.

48. Yen K.M., Serdar C.M. Genetic of naphthalene catabolism in pseudomonads // CRC Crit. Rev. Microbiol. 1988. V. 15. P. 247-268.

49. Natural horizontal transfer of a naphthalene dioxygenase gene between bacteria native to a coal tar-contaminated field site / J.B. Herrick K.G. Stuart-Keil, W.C. Ghiorse [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 63. P. 2330-2337.

50. Dunn N.W., Gunsalus I.C. Transmissible plasmid coding early enzymes of naphthalene oxidation in Pseudomonas putida // J. Bacteriol. 1973. V. 114. P. 974-979.

51. Yen K.M., Gunsalus I.C. Plasmid gene organization: naphthalene/salicylate oxidation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. V. 79. P. 874.

52. Diversity of IncP-9 plasmids of Pseudomonas / Y.R. Sevastsyanovich, R. Krasowiak, L.E.H. Bingle [et al.] // Microbiology, 2008. V. 154. P. 2929-2941.

53. Molecular classification of IncP-9 naphthalene degradation plasmids / T.Yu. Izmalkova, D.V. Mavrodi, S.L. Sokolov [et al.] // Plasmid. 2006. V. 56. № 1. P. 1-10.

54. Phylogenetic analysis of the genes for naphthalene and phenanthrene degradation in Burkholderia sp. strains / T.Y. Izmalkova, O.I. Sazonova, I.A. Kosheleva [et al.] // Genetika. 2013. V. 49. № 6. P. 703- 11.

55. Plasmid-Mediated Mineralization of Naphthalene, Penanthrene, and Anthracene / J. Sanseverino, B.M. Applegate, J.M. Henry King [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 6. P. 1931-1937.

56. Phenanthrene degrading phenotype of Alcaligenes faecalis AFK2 / H. Kiyohara, K. Nagao, K. Kouno [et al.] // Appl. Environ. Microbiol. 1982. V. 43. P. 458-461.

57. Tsuda M., Iino T. Naphthalene degrading genes on plasmid NAH7 are on a defective transposon // Mol Gen Genet. 1990. V. 223. № 1. P. 33-39.

58. Влияние транспозонов на экспрессию генов биодеградации нафталина у штамма Pseudomonas putida BS202 (NPL-1) и его производных / С.Л. Соколов, И.А. Кошелева, А.Е. Филонов [и др.] // Микробиология. 2005. Т.74. № 1. С. 79 - 86.

59. Tan H.-M. Bacterial catabolic trasposons // Appl.Microbiol.Biotechnol. 1999. V. 51. P.1-12.

60. Complete nucleotide sequence and organization of the naphthalene catabolic plasmid pND6-1 from Pseudomonas sp. strain ND6 / Wei Li, Jiandang Shi, Xuegang Wanga [et al.] // Gene. 2004. V. 336. P. 231-240.

Пунтус Ирина Филипповна, канд. биол. наук, научный сотрудник, puntus66(@,mail. ru, Россия, Пущино Московской области, Институт биохимиии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина,

Филатова Ирина Юрьевна, м.н.с., irishka semenova'amail.ru, Россия, Пущино Московской области, Институт биохимиии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина,

Фунтикова Татьяна Вячеславовна, аспирант, dujmo(@,mail.ru, Россия, Пущино Московской области, Институт биохимиии физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина

BACTERIAL SALICYLATE HYDROXYLASES AND THE ROLE OF HORIZONTAL TRANSFER OF CATABOLIC PLASMID GENES IN THEIR

DIVERSITY I.F. Puntus, I.Yu. Filatova, T.V. Funtikova

Enzymatic and genetic systems of salicylate biodegradation are considered. Extensive literature data on the diversity of salicylate hydroxylases are summarized: their structure, properties, the mechanism of interaction with the substrate. The role ofplasmids of biodegradation in the diversity of salicylate hydroxylases is shown. The presence of the salicylate hydroxylase genes and transposons into conjugative plasmids lead to structural changes in the salicylate hydroxylase genes during the conjugation transfer process and to a change in the substrate specificity of these enzymes.

Key words: salicylate hydroxylase, catabolic plasmids, genes, biodegradation, bacteria

Puntus Irina Filippovna, PhD Biol. Sci., Research Scientist, puntus66(@,mail. ru, Russia, Pushchino, Moscow Region, G.K. Scryabin Institute of Biochemistry and Physiology ofMicroorganisms,

Filatova Irina Yurevna, Research Scientist, irishka semenovaamail.ru, Russia, Pushchino, Moscow Region, G.K. Scryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms,

Funtikova Tatyana Vyacheslavovna, graduate student, dujmo'amail. ru, Russia, Pushchino, Moscow Region, G.K. Scryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms