Аутоиммунные механизмы паркинсоноподобных нарушений у крыс

УДК 612.017.1

Т.Н. Сергеева, В.Г. Сергеев

АУТОИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПАРКИНСОНОПОДОБНЫХ НАРУШЕНИЙ У КРЫС

Перенос крысам аутологичных макрофагов, предварительно выделенных из брюшной полости и стимулированных in vitro бактериальным липополисахаридом (ЛПС), индуцировал рост в крови антител к альфа-синуклеину. У животных, получивших дополнительную инъекцию ЛПС на пятой неделе после переноса им аутологичных макрофагов, активированных in vitro ЛПС, в 9,4 ± 3,2% дофаминергических нейронов черной субстанции обнаруживались цитоплазматические включения альфа-синуклеина. Полученные данные свидетельствуют о вовлеченности иммунной системы в индукцию паркинсоноподобных нарушений метаболизма альфа-синуклеина в нейронах черной субстанции мозга.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, альфа-синуклеин, нейродегенерация, лимфоциты, макрофаги, липополи-сахарид.

Болезнь Паркинсона (БП) - прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся моторными нарушениями вследствие дегенерации дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции (ЧС) мозга. Ключевую роль в механизмах патогенеза болезни Паркин-сона играет белок альфа-синуклеин. Гиперпродукция или модификация альфа-синуклеина ведет к его полимеризации и образованию внутриклеточных агрегатов, видимых в световой микроскоп и описываемых как тельца Леви. Предполагается, что нарушения метаболизма этого белка запускают цепь событий, приводящих в конечном итоге к нейрональной дегенерации [1].

К сегодняшнему дню накоплен значительный объем экспериментальных и клинических данных о патогенетических и клинических проявлениях паркинсонизма, однако причины, вызывающие это заболевание, остаются неизвестными. Тот факт, что у пациентов, страдающих БП, и у животных в экспериментальных моделях паркинсонизма наблюдаются многочисленные нарушения иммунных функций [2; 3], позволяет выдвинуть предположение о вовлеченности иммунной системы в инициацию и/или развитие БП. В частности, у больных БП наблюдается повышенный уровень циркулирующих в крови антител к альфа-синуклеину [4]. О нейротоксичности этих антител свидетельствуют данные экспериментов по введению иммуноглобулина пациентов с БП в область черной субстанции животных, в результате чего индуцируется селективная гибель дофаминергических нейронов [5]. Для области поражения нервной ткани при БП характерно наличие активированных компонентов антите-лозависимого каскада комплимента и инфильтрация в поврежденный район Т- и В-лимфоцитов [6]. Ранее высказывалось предположение о том, что периферическое воспаление в ответ на бактериальное инфицирование может служить этиологическим фактором БП [7]. Однако следует признать, что до сих пор не выявлены условия, при которых периферическое воспаление может инициировать аутоиммунную деструкцию дофаминергических нейронов мозга, и не изучены возможные молекулярные и клеточные механизмы, которые могут лежать в основе развития этой аутоиммунной патологии.

На наш взгляд, основанием для выдвижения гипотезы о процессах, лежащих в основе этиологии БП, могут служить данные о том, что альфа-синуклеин обнаруживается, помимо нейронов, в макрофагах и лимфоцитах крови [8; 9], причем макрофаги интенсифицируют синтез альфа-синуклеина в ходе процессинга бактериальных антигенов [10]. Логично полагать, что презентация макрофагами эндогенного альфа-синуклеина, экспрессия которого повышается в условиях бактериального инфицирования, может индуцировать гуморальный иммунный ответ не только на бактериальные антигены, но и на сам альфа-синуклеин. Вероятно, при определенных условиях, перечень и параметры которых следует выяснить, эти антитела могут нарушать внутриклеточный метаболизм альфа-синуклеина в нейронах и запускать патогенетический механизм дофаминергической нейродегенерации.

Для проверки этой гипотезы нами была выполнена серия экспериментов, в которых in vivo и in vitro исследовалось влияние ЛПС на интенсивность экспрессии альфа-синуклеина в лимфоцитах и макрофагах лимфатических узлов крыс. Потенциальная возможность активированных макрофагов инициировать гуморальный иммунный ответ против альфа-синуклеина и нарушать метаболизм этого белка в нейронах черной субстанции мозга изучалась в эксперименте с переносом животным аутоло-гичных макрофагов, стимулированных in vitro бактериальным эндотоксином.

Материалы и методика исследований

Исследование выполнено на 48 самцах крыс массой 250-300 г, содержащихся в стандартных условиях. В первой серии экспериментов животным опытной группы (10 крыс) интраперитонеально вводили 1 мл физиологического раствора на фосфатном буфере с растворенным липополисахаридом (ЛПС) Е.соН («Sigma», USA) в концентрации 125 мкг/кг веса. Крысам контрольной группы (10 животных) интраперитонеально вводили 1 мл стерильного забуференного физиологического раствора. Через 4 и 24 часа после введения отбирали по 5 крыс опытной и 5 контрольной групп и под тиопенталовым наркозом вскрывали брюшную полость и иссекали брыжеечные лимфоузлы. Фрагменты узлов расщепляли пинцетами для получения клеточной взвеси. Полученную клеточную взвесь исследовали на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto II., определяя интенсивность свечения иммунореактивного альфа-синуклеина и экспрессию аннексина V (маркер раннего апоптоза).

Во второй серии экспериментов получали взвесь лейкоцитов от 28 крыс методом интраперито-неального смыва. Для этого внутрибрюшинно вводили 20 мл забуференного физиологического раствора и после пятиминутного массажа отбирали его шприцем. Полученную клеточную взвесь (содержащую, главным образом, лимфоциты и макрофаги) помещали в отдельные чашки Петри со средой RPMI в концентрации 1 x 106 клеток на пробу. В половине случаев в питательную среду добавляли ЛПС в концентрации 0,12 мкг/мл. Через 24 часа культивирования клеточные культуры (по 3 от контрольной и экспериментальной групп) исследовали при помощи сканирующей электронной микроскопии. Для этого фиксировали исследуемые клетки добавлением в чашки Петри смеси 3%-го глу-тарового альдегида и 4%-го параформальдегида в 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,4). Промывали клетки в 0,1М фосфатном буфере (рН=7,4), обезвоживали в спиртовых растворах восходящей концентрации, высушивали и напыляли золотом или серебром. Анализ препаратов проводили при помощи сканирующего электронного микроскопа Phillips PSEM -500.

Остальные клетки, культивировавшиеся в чашках Петри, снимали раствором Версена с добавлением 0,25%-го раствора трипсина, отмывали и вводили животному, от которого они ранее были получены. Кровь у животных, перенесших клеточную трансфекцию, забирали один раз в неделю кар-диальной пункцией в течение двух месяцев. При помощи иммуноферментного анализа определяли титр антител к альфа-синуклеину. В дополнение к этому эксперименту 8 крысам через 5 недель после трансфекции активированных ЛПС лимфоцитов и макрофагов вводили интраперитонеально ЛПС в концентрации 250 мкг/кг.

По окончании эксперимента мозг крыс отбирался для иммуногистохимического исследования. Для этого проводили интракардиальную перфузию фиксатором Буэна, извлекали мозг и получали криостатные срезы толщиной 14 мкм. Непрямым иммуногистохимическим методом исследовали экспрессию в срезах иммунореактивных альфа-синуклеина и тирозин-гидроксилазы («Sigma», USA). Препараты исследовали в люминесцентный микроскоп Nikon Eclipse C200 и анализировали интенсивность свечения и количество иммунопозитивных клеток при помощи компьютерной программы обработки изображений «ImagePro Plus 6.0». Статистический анализ проводили при помощи компьютерной программы «Statistica 6.0». Исследуемые величины определяли как среднее арифметическое ± стандартная ошибка средней. Достоверность различий между средними значениями оценивали с помощью t критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Изменение экспрессии альфа-синуклеина и аннексина V (раннего маркера апоптоза) в лимфоцитах и макрофагах крыс лимфатических узлов после интраперитонеального введения липополисахарида

Подсчет числа мононуклеарных клеток брыжеечных узлов крыс, экспрессирующих ранний маркер апоптоза, продемонстрировал зависимость этого показателя от времени, прошедшего после введения бактериального эндотоксина. Через 4 и 24 часа после введения ЛПС число апоптотических клеток в лимфоузлах достоверно превышало контрольные значения на 36,7±2,5% (Р<0,01) и 96,0±3,6% (Р<0,001) соответственно. Нарастание числа апоптотических клеток наглядно иллюстрировалось появлением дополнительного пика на гистограмме распределения клеток, меченных антителами к аннексину (рис. 1а,б). Логическое ограничение (гейт) по ядросодержащим событиям на двумерной гистограмме прямого и углового светорассеяния позволило определить, что рост числа гибнущих клеток наблюдался преимущественно в лимфоцитарной популяции лимфоузлов.

Апоптоз Контр ЛПС

Рис.1. Экспрессия аннексина V (а, б) и альфа-синуклеина (в, г) в клетках лимфатических узлов крыс контрольной группы и животных опытной группы через 24 часа после введения бактериального эндотоксина

Как в контрольной, так и экспериментальной группе животных в лимфоузлах обнаруживались клетки с низкой и высокой интенсивностью экспрессии альфа-синуклеина, однако их соотношение менялось на разных сроках после введения бактериального эндотоксина (рис.1 в,г). Введение ЛПС приводило к нарастанию числа клеток с высоким уровнем экспрессии альфа-синуклеина. Через 4 часа после введения ЛПС таковых было больше на 19,2±4,1% (Р<0,05), а через 24 часа - на 125,9±7,3% (Р<0,001) по сравнению с контролем. Следует отметить, что увеличение числа клеток с повышенной экспрессией иммунореактивного альфа-синуклеина наблюдалось как в лимфоцитарной, так и макро-фагической популяциях.

Полученные в наших экспериментах данные свидетельствуют о том, что интраперитонеальное введение ЛПС повышает экспрессию альфа-синуклеина в части лимфоцитов и клетках макрофагиче-ской линии лимфатических узлов крыс. Обнаруженная индукция экспрессии альфа-синуклеина в лимфоцитах коррелировала с активацией в этих узлах программируемой гибели лимфоцитов. Известно, что апоптоз лимфоцитов может вызываться действием многих факторов, секретируемых в ходе иммунной реакции организма на введение бактериального эндотоксина, таких как глюкокорти-коиды [11], фактор некроза опухолей [12], простагландины [13]. Кроме того, известен феномен акти-вационно-индуцируемой смерти лимфоцитов, индуцируемой образованием комплекса Fas/FasL на поверхности стимулированных лимфоцитов [14]. Таким образом, альфа-синуклеин может рассматриваться как участник внутриклеточного механизма удаления активированных лимфоцитов, проявляющих клональную экспансию в ходе иммунологического ответа.

Повышение экспрессии альфа-синуклеина в макрофагах не сопровождалось интенсификацией апоптоза в этой клеточной популяции. Логично полагать, что в макрофагах альфа-синуклеин выполняет иные функции, нежели в лимфоцитах. Например, повышенная продукция альфа-синуклеина может сопровождать клеточную активацию, которая проявляется в изменении миграционной под-

вижности и интенсификации синтетических процессов, необходимых для осуществления антигенпре-зентативной функции и последующей инициации иммунного ответа.

Влияние бактериального эндотоксина на межклеточную кооперацию лейкоцитов в условиях in vitro

Сканирующая электронная микроскопия лейкоцитов интраперитонеального смыва, культивируемых in vitro с добавлением ЛПС, продемонстрировала достоверное увеличение количества лимфоцитов, прикрепляющихся к поверхности макрофагов по сравнению с лейкоцитами, не испытывавшими антигенной стимуляции. В среднем к одному ЛПС-стимулированному макрофагу прикреплялось 9-14 лимфоцитов, в то время как в контроле на поверхности макрофагов насчитывалось не более 3-4 лимфоцитов (рис.2). Известно, что в условиях бактериального инфицирования активированные макрофаги презентируют процессированные чужеродные антигены лимфоцитам, что инициирует гуморальный иммунный ответ на презентированный антиген. Исходя из этого, логично полагать, что наблюдаемое в нашем эксперименте увеличение числа взаимодействующих иммунных клеток может отражать феномен усиления антигенпрезентирующей функции макрофагов под воздействием бактериального эндотоксина.

Рис.2. Прикрепление лимфоцитов (Л) к поверхности макрофага (М) под воздействием бактериального липополисахарида в условиях in vitro. Длина линии = 10 мкм

Кинетика титра антител к альфа-синуклеину после трансфекции аутологичных макрофагов предварительно культивированных в присутствии липополисахарида

Перенос крысам аутологичных макрофагов, предварительно культивированных в присутствии ЛПС, вызывал достоверный рост титра антител к альфа-синуклеину с достижением максимальных значений на 5-й неделе (рис. 3). Перенос животным клеток, инкубированных без добавления бактериального эндотоксина, так же как и его интраперитонеальное введение не вызывали подобного эффекта. Таким образом, полученный результат свидетельствует о том, что прямая активация бактериальным эндотоксином интраперитонеальных макрофагов в условиях in vitro и перенос их обратно в организм может индуцировать специфический гуморальный иммунный ответ на эндогенный белок макрофагов, каковым является альфа-синуклеин. Отсутствие иммунного ответа на альфа-синуклеин при непосредственном введении ЛПС животным можно объяснить тем, что в условиях целостного организма реакция активации на рассматриваемый аутологичный белок может ингибироваться уже на первых стадиях инициации ответа за счет действия регуляторных воздействий, которые отсутствуют при активации макрофагов в клеточной культуре.

•kick -kick -kick -kick **

— 2 .... з

недели

Рис.3. Кинетика антител к альфа-синуклеину после переноса крысам аутологичных макрофагов, предварительно инкубированных в присутствии ЛПС

>

N

V

<

Рис.4. Иммуногистохимическое выявление альфа-синуклеина (а), тирозин-гидроксилазы (б) и обоих маркеров в нейронах черной субстанции крыс. Стрелкой обозначено цитоплазматическое включение альфа-синуклеина. Длина линии = 20 мкм

Накопление альфа-синуклеина в дофаминергических нейронах крыс после переноса им аутологичных ЛПС- активированных макрофагов

Иммуногистохимическое исследование срезов мозга животных, которым переносились аутоло-гичные макрофаги, культивируемые в различных условиях, не обнаружило снижения количества до-фаминэргических нейронов или накопления в нейронах иммунореактивного альфа-синуклеина в виде цитоплазматических включений. Однако в дополнительной группе крыс, получивших однократную инъекцию высокой дозы ЛПС через 5 недель после введения стимулированных in vitro аутологичных макрофагов, в цитоплазме некоторых дофаминэргических нейронов черной субстанции обнаруживались включения из иммунореактивного альфа-синуклеина (рис. 4). В среднем число иммунопозитив-ных клеток составило 9,4 ± 3,2% от числа дофаминергических нейронов черной субстанции, подсчитанных на одном срезе. Появление цитоплазматических включений альфа-синуклеина свидетельствует о нарушениях метаболизма этого белка в нейронах черной субстанции в предложенной экспериментальной модели. Важно отметить, что подобная патологическая реакция наблюдалась только в группе животных, получавших дополнительную инъекцию ЛПС на пике выработки антител к альфа-

синуклеину после переноса им аутологичных макрофагов, активированных бактериальным эндотоксином. Известно, что высокие дозы ЛПС повышают проницаемость гематоэнцефалического барьера [15]. Логично полагать, что в этой ситуации циркулирующие антитела к альфа-синуклеину могут проникать в нервную ткань и нарушать метаболизм альфа-синуклеина в нейронах. Многочисленные данные экспериментальных и клинических исследований доказывают, что нарушение внутриклеточного обмена альфа-синуклеина запускает многостадийный механизм дегенерации дофаминергиче-ских нейронов, лежащих в основе развития паркинсонизма [4; 9; 16].

Выводы

1. Интраперитонеальное введение крысам бактериального эндотоксина достоверно увеличивает в лимфоузлах количество лимфоцитов и макрофагов с высокой экспрессией альфа-синуклеина. Усиление экспрессии этого белка в лимфоцитах коррелирует с активацией в них процесса апоптоза. Макрофаги, повышающие синтез альфа-синуклеина, демонстрируют усиление антигенпрезентирующей функции.

2.Перенос животным аутологичных макрофагов, стимулированных in vitro бактериальным эндотоксином, индуцирует гуморальный иммунный ответ против альфа-синуклеина, с достижением максимума титра антител на 5-й неделе после клеточного переноса.

3.Введение высокой дозы ЛПС животным, перенесшим трансфекцию аутологичных ЛПС-стимулированных макрофагов, вызывает нарушение метаболизма альфа-синуклеина в дофаминерги-ческих нейронах черной субстанции мозга.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Zhang W., Wang T., Pei Z. et al. Aggregated alpha-synuclein activates microglia: a process leading to disease progression in Parkinson's disease // FASEB J. 2005. Vol. 19. P. 533-542.

2. Nagatsu T. et al. Changes in cytokines and neurotrophins in Parkinson's disease // J. Neural Trancp. Suppl. 2000. Vol. 60. P. 277-290.

3. Teismann P., Tieu K., Choi D. et al. Cyclooxygenase-2 is instrumental in Parkison's disease neurodegeneration // Proc Natl Acad Sci USA. 2003. Vol. 100. P. 5473-5478.

4. Papachroni K. K., Ninkina N., Papapanagiotou A. et al. Autoantibodies to alpha-synuclein in inherited Parkinson's disease // Journal of Neurochemistry. 2006. Vol. 101, № 3. P. 749-756.

5. Huber V.C. et al. Serum antibodies from Parkinson's disease patients react with neuronal membrane proteins from a mouse dopaminergic cell line and affect its dopamine expression // J. Neuroinflammation. 2006. Vol. 3. Р. 1-10.

6. Chen A., Zhang B., Hernan M.A., et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and the risk of Parkinson's disease // Arch. Neurol. 2003. Vol. 60. P. 1059-1064.

7. Dobbs SM. et al. // Link between Helicobacter pylori infection and idiopathic parkinsonism. 2000. Vol.55, №2. P. 93-98.

8. Kim S., Jeon B.S., Heo C. et al. a-Synuclein induces apoptosis by altered expression in human peripheral lymphocytes in Parkinson's disease // FASEB J. 2004(0ct). Vol. 18, №13. P. 1615-1617.

9. Ueda K. et al. Tissue-dependent alternative splicing of mRNA for NACP, the precursor of non-Ab component of Alzheimer's disease amyloid // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994.Vol.205. P. 1366-1372.

10. Tanji K., Mori F., Imaizumi T. Upregulation of a-synuclein by lipopolysaccharide and interleukin-1 in human macrophages // Pathology International. 2002.Vol. 52, №9. Р. 572-577.

11. Dauer W., Przedborski S. Parkinson's disease: mechanisms and models // Neuron. 2003. Vol.39. P. 889-909.

12. Baba Y., Kuroiwa A., Uitti R.G., Wszolek Z.K., Yamada T. Alterations of T-lymphocyte populations in Parkinson disease // Parkinsonism Relat. Disord. 2005.Vol. 11. P. 493-498.

13. Benner E.J., et al. Nitrated a-synuclein immunity accelerates degeneration of nigral dopaminergic neurons // PloS ONE. 2008. Vol.3. P.1376.

14. Giuliani F. et al. Vulnerability of human neurons to T cell-mediated cytotoxicity // J. Immunol.2003. Vol.171. P.368-379.

15. Maries E., Dass B., Collier T.J. et al. The role of alpha-synuclein in Parkinson's desease, insights from animal models // Nat.Rev.Neurosci. 2003. Vol.4. P.727-738.

16. Wahner A.D. et al. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs may protect against Parkinson disease // Neurology. 2007. Vol.69. P.1836-1842.

Поступила в редакцию 18.01.11

T.N. Sergeeva, V.G. Sergeev

Autoimmune mechanisms of Parkinson-like violations in rats

Transfer of autologous intraperitoneal rat macrophages preliminary stimulated in vitro by bacterial lipopolisacchride (LPS), results to blood alpha-synuclein antibodies increasing. Inclusions of alpha-synuclein in cytoplasm of 9,4 ± 3,2% dopaminergic neurons of substance nigra were only in rats with transfer of LPS-stimulated macrophages and additional injection of LPS on the fifth week of the experiment. The obtained data testify to an involvement of immune system in the induction of Parkinson-like disturbances of alpha- synuclein metabolism in neurons of substance nigra.

Keywords: Parkinson disease, alpha-synuclein, lymphocytes, macrophages, lipopolysacharid.

Сергеева Татьяна Николаевна, старший преподаватель ГОУВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп.1) E-mail: tnbio@ya.ru

Сергеев Валерий Георгиевич, доктор биологических наук, профессор ГОУВПО «Удмуртский государственный университет», 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп.1) E-mail: cellbio@ya.ru

Sergeeva T.N., senior lecturer Udmurt State University

462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya str., 1/1 E-mail: tnbio@ya.ru

Sergeev V.G., doctor of biology, professor Udmurt State University

462034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya str., 1/1 E-mail: cellbio@ya.ru