СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ РЕАКЦИИ "ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА"
METHOD FOR GRAFT-VERSUS-HOST REACTION IDENTIFICATION OR TREATMENT

Область техники
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящее изобретение испрашивает приоритет на основании заявки на патент Японии № 2007-165547 (поданной 22 июня 2007 г.), полное содержание которой включено в настоящее описание путем ссылки.
Область техники
Настоящее изобретение относится к способу и реагенту для диагностики реакции «трансплантат против хозяина», а также к способу и фармацевтической композиции для лечения реакции «трансплантат против хозяина».
Предшествующий уровень техники
Трансплантация гематопоэтических стволовых клеток (HSCT) представляет собой лечение, при котором стволовые клетки от другого индивидуума трансплантируются пациенту для восстановления гематопоэза и иммунной функции, и она была принята в качестве вида лечения при широком диапазоне заболеваний крови, опухолей, метаболизма и иммунных заболеваний. За последние 20 лет иммуносупрессивная терапия после трансплантации достигла значительного прогресса, но реакция «трансплантат против хозяина» (GVHD) продолжает оставаться основным, угрожающим жизни осложнением после трансплантации. Несмотря на профилактическое лечение с использованием иммуносупрессантов, GVHD возникает у 30-80% реципиентов (пациентов) HSCT. Поэтому необходимы ранняя диагностика GVHD, раннее начало лечения и объективный мониторинг эффективности лечения. Кроме того, современные способы лечения не всегда приводят к излечению, и необходима разработка новых способов лечения. Информацию о частоте встречаемости, диагностике и лечении GVHD можно найти в сообщении Sullivan et al. (Sullivan KM. Graft vs. host disease. In: Blume KG, Forman SJ, Appelbaum FR, eds. Thomas' Hematopoietic Cell Transplantation. 3rd ed. Malden, MA: Blackwell Publishing; 2004:635-664).
Однако в настоящее время диагностика GVHD главным образом проводится на основании клинических данных, таких как кожная сыпь, гипербилирубинемия, диарея и т.д., и не существует определяющего биологического маркера, который может отличить GVHD от других аналогичных осложнений (венозной окклюзии, реактивации вирусов, токсичности, связанной со схемой лечения, и тому подобных). Поэтому для дифференциальной диагностики GVHD требуется инвазивный способ, такой как биопсия печени. Однако поскольку биопсия является инвазивным и субъективным диагностическим способом, желательно разработать новый способ, который может содействовать ранней, точной и объективной количественной диагностике GVHD, не основанной на биопсии, приводящей к подходящему лечению по поводу GVHD и улучшению исхода HSCT.
Последние достижения в области науки о белках предоставили несколько способов исследования глобальной экспрессии белка в биологических жидкостях и идентификации нового биологического маркера болезненных или патологических состояний. Один такой способ представляет собой поверхностно усиленную лазерную десорбционную/ионизационную масс-спектрометрию времени пролета (SELDI-TOF MS). Это имеющий высокую пропускную способность высоко чувствительный белковый подход для выделения белков из биологической жидкости со сложным составом, такой как плазма, для генерирования сравнительного белкового профиля. Petricoin et al. (Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet. 2002; 359:572-577) сообщили о биологическом маркере рака яичников на основе белкового анализа с использованием SELDI. При SELDI белкам, полученным из биологического образца, предоставляется возможность селективного связывания с поверхностями с химически модифицированным сродством на белковом чипе ProteinChip (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA), и затем не специфически связанные примеси вымываются. Затем захваченные белки анализируются TOF-MS для получения спектра молекулярной массы каждого белка (m/z) и относительной концентрации (интенсивности). В результате недавно проведенных исследований этот тип технологий успешно применялся для диагностики рака и других заболеваний.
В последних сообщениях описывается белковый анализ биологических жидкостей от пациентов с GVHD. Однако в тестах с использованием полученных у людей клинических образцов неизбежны артефакты, связанные с генетическим фоном и окружающей средой, и это нарушило выявление нового биологического маркера. Это, в частности, справедливо для пациентов после HSCT, у которых имеется широкое разнообразие предсуществующих заболеваний и которые подвергаются различным схемам кондиционирования и профилактике GVHD. Не было сообщений об обнаружении полезного маркера на основе биохимических способов, включая белковый анализ. Например, Kaiser et al. (Kaiser T, Kamal H, Rank A, et al. Proteomics applied to the clinical follow-up of patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2004; 104:340-349) сообщают о своем исследовании маркеров GVHD белковым анализом с использованием в моче качества образца. Были идентифицированы два белка (лейкотриен, т.е. медиатор воспаления, и сывороточный альбумин, т.е. наиболее часто встречающийся белок в сыворотке), но не был обнаружен белок, специфичный для GVHD.
Справочные документы, приведенные в качестве ссылок в настоящем описании, перечислены ниже. Содержания этих публикаций полностью включены в настоящее описание путем ссылки. Однако ни один из этих документов не признан в качестве предшествующего уровня в отношении настоящего изобретения.
Непатентный документ 1: Sullivan KM. Graft vs. host disease. In: Blume KG, Forman SJ, Appelbaum FR, eds. Thomas' Hematopoietic Cell Transplantation. 3rd ed. Malden, MA: Blackwell Publishing; 2004:635-664
Непатентный документ 2: Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, et al. Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer. Lancet. 2002; 359:572-577
Непатентный документ 3: Kaiser T, Kamal H, Rank A, et al. Proteomics applied to the clinical follow-up of patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood. 2004; 104:340-349.
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является предоставление способа и реагента для диагностики GVHD и способа и фармацевтической композиции для лечения GVHD.
Заявители исследовали широкий диапазон белков, которые различным образом экспрессированы у животного с моделью GVHD и у контрольного животного, и обнаружили, что уровень экспрессии CCL8 значительно выше при GVHD. Кроме того, они обнаружили, что существует корреляция между уровнем экспрессии CCL8 и проявлением клинических признаков и течением GVHD, что и составило предмет настоящего изобретения.
Настоящее изобретение относится к способу лечения GVHD, включающему измерение уровня белка CCL8 в образце, полученном у человека или животного, в качестве индикатора для диагностики или течения GVHD. Предпочтительно, диагностика GVHD осуществляется до проявления клинических признаков.
В способе по настоящему изобретению предпочтительно уровень белка CCL8 измеряется с использованием анти-CCL8 антитела. Также предпочтительно уровень белка CCL8 измеряется с использованием способа, выбранного из группы, состоящей из масс-спектрометрии (MS), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и двумерного электрофореза.
Настоящее изобретение также относится к диагностическому реагенту для выявления GVHD, содержащему анти-CCL8 антитело.
Настоящее изобретение также относится к способу отбора перспективного вещества в качестве терапевтического средства по поводу GVHD. Этот способ включает стадии: введения тестируемого вещества животному с моделью GVHD, измерения уровня белка CCL8 в образце, полученном у животного с моделированным GVHD, и отбора тестируемого вещества в качестве перспективного вещества в качестве терапевтического средства по поводу GVHD, если уровень экспрессии белка CCL8 ниже, чем уровень без введения тестируемого вещества.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции для лечения GVHDD, содержащей анти-CCL8 антитело в качестве активного ингредиента. Настоящее изобретение также относится к способу лечения GVHDD, включающему введение анти-CCL8 антитела субъекту, у которого имеется реакция «трансплантат против хозяина».
В соответствии с настоящим изобретением, развитие и течение GVHD диагностируется высоконадежным образом, приводя к объективной (а не субъективной, как при обычном способе), количественной диагностике GVHD. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает возможность лечения GVHD, в частности, у пациентов, устойчивых к существующим способам лечения.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показана динамика клинических признаков и балльных оценок патологии у мыши с моделью GVHD;
на фиг.2 показан типичный спектр SELDI от образца, полученного у мыши с моделью GVHD, и средняя нормализованная интенсивность пика 8972 Да в образце в каждую точку времени;
на фиг.3 показан репрезентативный спектр SELDI от образца, полученного у мыши с моделью GVHD, получающей циклоспорин-А (CsA), и средняя нормализованная интенсивность пика 8972 Да в образце в каждую точку времени;
на фиг.4 показан репрезентативный спектр SELDI от образца, полученного у мыши с моделью сингенного трансплантата, и средняя нормализованная интенсивность пика 8972 Да в образце в каждую точку времени;
на фиг.5 показан спектр SELDI фракции ВЭЖХ, содержащей белок 8972 Да, и результаты двумерного электрофореза;
на фиг.6 показан репрезентативный спектр MS/MS пептида, полученного из белка 8972 Да, и идентифицированная аминокислотная последовательность;
на фиг.7 показано выявление белка CCL8 иммуноанализом;
на фиг.8 показана динамика уровня белка CCL8 в клиническом образце, полученном у человека;
на фиг.9 показана динамика уровня белка CCL8 в клиническом образце, полученном у человека;
на фиг.10 показано выявление белка CCL8 в клиническом образце, полученном у человека;
на фиг.11 показано выявление белка CCL8 во множестве клинических образцов, полученных у людей;
на фиг.12 показана динамика уровня белка CCL8 в клиническом образце, полученном у человека;
на фиг.13 показана динамика уровня белка CCL8 в клиническом образце, полученном у человека;
на фиг.14 показана динамика уровня белка CCL8 у мыши, поучающей лиганд TLR, и на модели GVHD у мыши;
на фиг.15 показана динамика клинических признаков и уровня белка CCL8 у мыши с моделью GVHD;
на фиг.16 показано гистохимическое окрашивание у мыши с моделью GVHD, получающей анти-CCL8 антитело; и
на фиг.17 показана патоморфологическая оценка терапевтической эффективности анти-CCL8 антитела у мыши с моделью GVHD.
Предпочтительные варианты осуществления изобретения
Настоящее изобретение включает способ диагностики GVHD и мониторинга течения GVHD измерением уровня экспрессии CCL8 в тестируемом образце, таком как кровь, полученном у субъекта. Как конкретно иллюстрируется в следующих примерах, среди пациентов, которые были подвергнуты трансплантации костного мозга или трансплантации крови пупочного канатика, у пациентов, у которых развивается GVHD, проявляется значительно более высокий уровень экспрессии CCL8, и была обнаружен корреляция между проявлением клинических признаков GVHD и уровнем экспрессии CCL8.
CCL8 представляет собой основной, связывающий гепарин секреторный белок, относящийся к семейству хемокинов, также называемый MCP-2 (№ доступа в генном банке NP_005614). Этот белок продуцируется в моноцитах, фибробластах, эпителиальных клетках и т.д. и, как известно, связывается с рецепторами CCR2, CCR3, CCR5 и CCR11. Было показано, что мишенью CCL8 являются CD4-положительные Т-клетки, CD8-положительные Т-клетки, моноциты, NK-клетки (натуральные киллеры), эозинофилы, базофилы и им подобные. Считается, что GVHD развивается в 3 стадии вслед за трансплантацией гематопоэтических стволовых клеток (HSCT). Первая стадия представляет собой кондиционирование, которое включает воздействие излучения для подготовки хозяина (пациента) к HSCT: вторая стадия представляет собой активацию, пролиферацию и дифференцировку трансплантированных Т-клеток; и третья стадия представляет собой появление клеточно-опосредованных или воспалительных эффекторов (механизмы можно найти в следующих двух обзорах: Reddy P. Pathophysiology of acute graft-versus-host disease. Hematol Oncol. 2003; 21:149-161., Ferrara JL, Reddy P. Pathophysiology of graft-versus-host disease. Semin Hematol. 2006; 43:3-10). На второй стадии представление антигена дендроцитами необходимо для активации трансплантированных Т-клеток. Хемокины, включающие CC/L8, играют важную роль в дифференцировке, пролиферации и активации этих дендроцитов (значение хемокинов на второй стадии описано в публикации Wysocki CA, Panoskaltsis-Mortari A, Blazar BR, Serody JS. Leukocyte migration and graft-versus-host disease. Blood. 2005; 105:4191-4199). Однако роль CCL8 в организме и его роль в регуляции иммунной системы не полностью понятна. Поэтому механизм, лежащий в основе корреляции между экспрессией CCL8 и GVHD, которая была обнаружена в настоящем изобретении, еще неизвестен.
Тестируемый образец, в котором предстоит измерение уровня белка CCL8, включает, например, биологическую жидкость, кровь, сыворотку и плазмы, полученные у человека или животного. Ткань и клетки, собранные у субъекта, могут также использоваться в качестве тестируемого образца.
Количество белка CCL8 в тестируемом образце, полученном у субъекта, можно измерить использованием анти-CCL8 антитела в способах иммунологического анализа, хорошо известных в данной области. Анти-CCL8 антитело может представлять собой поликлональное антитело или моноклональное антител. Различные типы Анти-CCL8 поликлональных антител и моноклональных антител выпускаются промышленностью, и любые из этих антител могут использоваться в настоящем изобретении.
Альтернативно, антитело может быть получено любым из способов, хорошо известных в данной области. Поликлональное антитело, которое связывается с CCL8, может быть получено хорошо известным способом в данной области, который включает иммунизацию животного с использованием CCL8 или его пептидного фрагмента в качестве сенсибилизирующего антигена, выделение антисыворотки, содержащей антитело у иммунизированного животного, и верификацию присутствия антитела с желательной специфичностью связывания анализом ELISA (иммуноферментным анализом), анализом вестерн-блоттингом, радиоиммуноанализом и тому подобными.
Моноклональное антитело, которое связывается с CCL8, может быть получено в соответствии с хорошо известным способом в данной области, который включает иммунизацию животного с использованием CCL8 или его пептидным фрагментом в качестве сенсибилизирующего агента, сбор полученных иммунных клеток и слияние их с клетками миеломы, выбор гибридомы, продуцирующей антитело, и культивирование гибридомы.
Моноклональное анти-CCL8 антитело, используемое в настоящем изобретении, охватывает не только антитела, продуцируемые гибридомами, но также рекомбинантные антитела, продуцируемые трансформантами, трансфецированными вектором экспрессии, несущим ген антитела. Рекомбинантное антитело может быть получено клонированием кДНК, кодирующей моноклональное антитело, которое связывается с CCL8 из продуцирующей антитело гибридомы, вставкой кДНК в вектор экспрессии, трансформацией клетки животного или клетки растения вектором и культивирование трансформанта. Альтернативно, ген, кодирующий анти-CCL8 антитело, может быть введен в трансгенное животное для получения анти-CCL8 антитела, продуцируемого у трансгенного животного.
Для использования при лечении человека-пациента предпочтительно, чтобы анти-CCL8 антитело по настоящему изобретению было человеческим химерным антителом или гуманизированным антителом. Человеческое химерное антитело представляет собой антитело, сконструированное из вариабельной области тяжелой цепи антитела и вариабельной области легкой цепи животного, кроме человека, и константной области тяжелой цепи и константной области легкой цепи человеческого антитела. Гуманизированное антитело сконструировано из области, определяющей комплементарность антитела (CDR), происходящей из животного, кроме человека, и каркасной области (FR) и области С, происходящей из человеческого антитела. Человеческие химерные антитела и гуманизированные антитела имеют сниженную антигенность в организме человека и поэтому могут использоваться в качестве активного ингредиента фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Обычные методики генной рекомбинации для получения человеческих химерных антител и гуманизированных антител, и способы оценки активности связывания этих антител хорошо известны в данной области. Альтернативно, человеческое анти-CCL8 антитело может быть получено введением CCL8 в организм трансгенного животного, имеющего полный репертуар генов человеческих антител.
2
Кроме того, фрагмент антитела может также использоваться в настоящем изобретении. Фрагмент антитела относится к пептиду, который лишен части всего анти-CCL8 антитела, но еще имеет способность связывания CCL8. Примеры фрагментов антител включают Fab, Fab', F(ab')2, Fv и тому подобные. Фрагмент антитела может быть получен ферментной обработкой антитела для получения фрагментов. Фрагмент антитела по настоящему изобретению также включает фрагменты антител и их димеры, сконструированные соединением VL (вариабельной легкой) цепи и VH (вариабельной тяжелой) цепи анти-CCL8 антитела с линкером. Примеры включают ScFv, диатело, sc(Fv) и тому подобные.
Белок CCL8 в тестируемом образце, полученном у человека или животного, анализируется иммунологическим методом с использованием антитела, полученного таким образом. Анализ может быть качественным или количественным. Иммуноанализ для выявления экспрессии CCL8 в образце, полученном у субъекта, может проводиться с использованием радиоиммуноанализа, ELISA, иммунопреципитации, иммуноагглютинации, вестерн-блоттинга и тому подобных.
В качестве типичного примера сандвич ELISA может проводиться следующим образом. Периферическую кровь берут у субъекта и получают плазму, добавляют в планшет или чип, где иммобилизовано анти-CCL8 антитело, и инкубируют в течение подходящего периода времени. После промывания планшета или чипа для удаления несвязанных компонентов добавляется другое анти-CCL8 антитело. Антитело может быть выявляемо мечено ферментом, флуоресцентным красителем, хемолюминесцентным веществом, биотином, радиоактивным соединением и тому подобными. После инкубации в течение подходящего периода времени планшет или чип промывают, и метку выявляют флюоресценцией, люминесценцией, радиоактивностью и тому подобными методами. Необязательно, после связывания анти-CCL8 антитела с белком может быть добавлено вторичное антитело (например, козье анти-мышиное антитело) для усиления сигнала. Вторичное антитело может быть выявляемо мечено ферментом, флуоресцентным красителем, хемолюминесцентным веществом, биотином, радиоактивным соединением и тому подобными. Количество белка CCL8 в плазме, полученной у субъекта, может быть измерено таким образом.
В другом аспекте белок CCL8 может быть выявлен с использованием способа выявления, включающим реакцию агглютинации. При этом способе CCL8 может быть выявлен с использованием носителя, например, латексных частиц, несущих анти-CCL8 антитело. Когда латексные частицы, несущие анти-CCL8 антитело, смешиваются с тестируемым образцом и инкубируются в течение заданного периода времени, частицы будут агглютинироваться, если CCL8 содержится в образце. CCL8 в образце может быть выявлен наблюдением степени агглютинации невооруженным глазом или количественным анализом с использованием спектрофотометра.
В еще одном аспекте белок CCL8 может быть выявлен с применением биологического датчика, в котором используется феномен поверхностного резонанса плазмона. Биологический датчик на основе феномена поверхностного резонанса плазмона обеспечивает возможность мониторинга межбелковых взаимодействий в виде сигнала поверхностного резонанса плазмона. Например, связывание между белком CCL8 и анти-CCL8 антителом может быть выявлено с использованием биологического датчика, такого как BIAcore (Pharmacia). Конкретнее, тестируемый образец приводится в контакт с сенсорным чипом, имеющим анти-CCL8 антитело, и белок CCL8, связанный с анти-CCL8 антителом, может быть выявлен в виде изменения резонансного сигнала.
В другом варианте осуществления тестируемый образец частично очищается (обогащается) с использованием агента, образующего хелаты металлов, и аффинного носителя, такого как гепарин, и белок CCL8 может быть выявлен и количественно анализирован MS, как показано в примере 2. Кроме того, белок CCL8 может быть выявлен и количественно анализирован ВЭЖХ, как показано в примере 3, или он может быть выявлен и количественно анализирован двумерным электрофорезом и окрашиванием серебром.
Настоящее изобретение также относится к диагностическому реагенту для выявления GVHD, содержащий анти-CCL8 антитело. Диагностический реагент для выявления GVHD по настоящему изобретению может быть предоставлен в форме набора для тестирования. Набор для тестирования содержит реагент для выявления CCL8, например, анти-CCL8 антитела, в качестве активного ингредиента. Набор может также содержать подходящие реагенты, необходимые для анализа, такие как буферный раствор, разбавитель, раствор для прекращения реакции, раствор для промывания, контрольный образец и тому подобные.
В настоящем изобретении уровень белка CCL8, измеренный таким образом, может использоваться в качестве индикатора для диагностики GVHD. В соответствии с настоящим изобретением, GVHD может быть объективно диагностирована путем использования белка CCL8 в качестве маркера, а не в зависимости от таких наблюдений как визуальное обследование и количество диареи, и, таким образом, может осуществляться мониторинг развития и течения GVHD. Способ диагностики по настоящему изобретению можно использовать, например, для диагностики до проявления GVHD (ранняя диагностика), окончательного диагноза развития, балльной оценки тяжести, мониторинга течения заболевания, оценки терапевтической эффективности и прогноза. В частности, как показано на фиг.14, уровень экспрессии CCL8 не увеличивается через путь, опосредованный TLR (Toll-подобный рецептор), что обеспечивает возможность дифференциальной диагностики между GVHD и бактериальной или вирусной инфекцией с использованием белка CCL8 в качестве маркера.
Как показано в следующих примерах, уровень экспрессии CCL8 у пациентов значительно выше после развития GVHD, чем до ее развития. Пример 8 демонстрирует, что на модели трансплантации костного мозга у мыши величина экспрессии CCL8 начала увеличиваться за 2 дня до того, как были распознаны клинические признаки GVHD. Кроме того, как показано на фиг.8 и 9, величина экспрессии CCL8 также начинает увеличиваться у людей, перед тем как наблюдаются клинические признаки GVHD, указывая на то, что способ по настоящему изобретению обеспечивает возможность ранней диагностики GVHD. Кроме того, способ по настоящему изобретению может использоваться для оценки эффективности лечения. Как показано на фиг.8 и 9, поскольку клинические признаки GVHD уменьшаются, наблюдалось уменьшение уровня экспрессии CCL8. При устойчивой к лечению GVHD обычное лечение метилпреднизолоном неэффективно, и требуется более агрессивное лечение. Ввиду того, что такое лечение часто сопровождается нежелательными побочными эффектами, то благоприятен подбор дозы и контроль лечения при подходящем мониторинге эффективности лечения способом по настоящему изобретению.
Кроме того, как показано на фиг.11, уровень экспрессии CCL8 коррелируется с тяжестью и прогнозом GVHD, таким образом, способ по настоящему изобретению обеспечит возможность ранней идентификации пациентов с тяжелыми состояниями и применения подходящих соответствующих способов лечения.
Кроме того, способ по настоящему изобретению может применяться для разработки и усовершенствования видов лечения по поводу GVHD. Как показано на фиг.11, пациентов с устойчивой к лечению GVHD можно идентифицировать измерением уровня экспрессии CCL8. Нет принятого вида лечения таких пациентов. Подходящий вид лечения может быть разработан изучением эффективности комбинированного лечения множественными средствами при мониторинге уровня CCL8 у пациентов.
Кроме того, ввиду того, что в настоящее время нет магического препарата по поводу GVHD, то настоящее изобретение можно также применять при скрининге для выявления перспективных веществ, которые могли бы быть активным лекарственным средством для лечения GVHD на основании уровня экспрессии CCL8 в качестве индикатора. Скрининг проводится введением тестируемого вещества животному с моделью GVHD и измерением количества белка CCL8 в тестируемом образце, полученном у животного с моделью GVHD. Например, анти-CCL8 антитело может применяться в качестве тестируемого вещества. Тестируемое вещество может быть также получено из библиотеки, такой как библиотека различных синтетических или естественно встречающихся соединений, комбинаторной библиотеки, олигонуклеотидной библиотеки, пептидной библиотеки и тому подобных. Тестируемое вещество может также включать экстракт натурального вещества или частично очищенного продукта, полученного из бактерий, грибов, водорослей, растений, животных и тому подобных. Если уровень белка CCL8 ниже у животных, получающих тестируемое вещество, то тестируемое вещество может быть выбрано в качестве перспективного вещества для терапевтического средства по поводу GVHD. Другими словами, способ диагностики по настоящему изобретению предоставляет основу для разработки новых видов лечения по поводу GVHD.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения GVHD, содержащей анти-CCL8 антитело в качестве активного ингредиента. А также к способу лечения GVHD, включающему введение анти-CCL8 антитела. Как показано ниже в примере 9, когда анти-CCL8 антитело было введено животному с моделью GVHD, при оценке патологических состояний наблюдалось снижение инфильтрации воспалительными клетками дермоэпидермального соединения в коже и облегчение повреждения волосяных фолликулов и сальных желез, демонстрирующие, что введение анти-CCL8 антитела эффективно при лечении GVHD.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть составлена способом, известным в данной области. Например, композиция может составляться соответствующим объединением с фармацевтически приемлемым носителем или эксципиентом, таким как стерильная вода и физиологический солевой раствор, растительное масло, эмульгатор, суспендирующий агент, поверхностно-активное вещество, стабилизатор, отдушка, наполнитель, носитель, консервант, связывающий агент и тому подобные, и компаундированием их в стандартную лекарственную форму, требуемую для общепризнанного фармацевтического производства.
Для перорального введения соединение по настоящему изобретению может быть составлено в таблетку, пилюлю, драже, капсулу, жидкость, гель, сироп, кашицеобразную массу, суспензию и тому подобные формы смешиванием с фармацевтически приемлемым носителем, хорошо известным в данной области.
Для парентерального введения соединение по настоящему изобретению может быть составлено в раствор для инъекций, аэрозольный спрей, продукт для дермального введения и тому подобные с использованием фармацевтически приемлемого носителя, хорошо известного в данной области.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить пациенту пероральным или парентеральным введением. Предпочтительно парентеральное введение. Примеры пути введения включают внутривенную инъекцию, внутримышечную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, подкожную инъекцию, интраректальное введение, трансназальное введение, транспульмональное введение, чрескожное введение и тому подобные. Дозировку можно выбрать из диапазона от 0,0001 мг до 1000 мг/кг массы тела для одной дозы. Путь введения и доза могут быть выбраны по необходимости лечащим врачом с учетом возраста пациента, тяжести симптомов, сопутствующих лекарственных средств и тому подобного.
Содержание всех патентов и справочных документов, приведенных в настоящем описании, полностью включены в него путем ссылки.
Настоящее изобретение описано более детально ниже посредством следующих примеров, но оно ни в коей мере не ограничивается этими примерами.
Пример 1
Трансплантация костного мозга (ВМТ)
d
b
d
Острая GVHD была вызвана у мышей посредством аллотрансплантации костного мозга. Мышей BALB/c (H-2) использовали в качестве реципиентов, мышей C57BL/6 (H-2) использовали в качестве доноров аллогенного BMT и мышей BALB/c (H-2) использовали в качестве доноров сингенного BMT. Возраст всех мышей составлял от 7 до 12 недель (Sankyo Labo Service Corporation, Japan).
7
6
В день ВМТ мышей-доноров умерщвляли смещением шейных позвонков. Клетки донорского костного мозга собирали промывкой тела бедренной кости и большеберцовой кости. Клетки помещали в модифицированную среду Eagle, содержащую 2% фетальную телячью сыворотку/1% пенициллина-стрептомицина и полученную в виде одноклеточной суспензии. Клетки ополаскивали средой RPMI 1640 и ресуспендировали в той же среде. Инокулят клеток костного мозга получали с содержанием 2×10 клеток костного мозга/200 мкл для аллогенного BMT и 1×10 клеток костного мозга/100 мкл для сингенных BMT.
Мышей-реципиентов BALB/c выращивали на кислотной воде в течение, по меньшей мере, 7 дней перед BMT для предотвращения сепсиса после летальной дозы облучения. Мыши-реципиенты получали всего 8,5 Гр общего облучения тела со скоростью 0,34 Гр/мин, и в пределах 3 часов после облучения донорские клетки костного мозга внутривенно инъецировали через хвостовую вену.
Мониторинг GVHD
Мышей-реципиентов наблюдали ежедневно для выявления клинических признаков GVHD, т.е. потери массы тела, согнутого положения тела, эритемы кожи, облысения и диареи. У мышей с аллотрансплантатом ВМТ клинические признаки острой GVHD, например диарея и взъерошенная шерсть, появлялись в пределах 7 дней, а кожная эритема и облысение появлялись в пределах 21 дня. Гибель некоторых животных обнаруживалась через 14 и 21 день после трансплантации.
Патогистологический анализ
Мышей-реципиентов умерщвляли на 7, 14, 21 и 28 день после трансплантации. Кожу, печень и тонкую кишку удаляли и фиксировали в 10% забуференном формалине. Фиксированную ткань заливали в парафин, получали срезы и окрашивали гематоксилином/эозином, и затем наблюдения проводили под оптическим микроскопом. Гистологические изменения, считающиеся соответствующими GVHD в типичных органах, были следующие: кожи (мононуклеарная инфильтрация в дермоэпидермальное соединение и повреждение волосяных фолликулов или сальных желез); печени (мононуклеарная инфильтрация вокруг воротной вены и печеночноклеточный некроз); и тонкой кишки (апоптоз клеток крипт и расширение или уплощение ворсинок). Для каждого из этих изменений в органах, по системе балльной оценки, балльная оценка «ноль» бы присвоена отрицательным данным, а балльная оценка 1 – положительным данным (максимально возможная балльная оценка для каждой мыши была 6). На фиг.1 показана средняя балльная оценка патологии в каждую точку времени вместе с наблюдаемыми клиническими признаками. Эти результаты были типичны во всех 5 независимых исследованиях. У мышей-реципиентов имелись патоморфологические признаки GVHD во все точки времени после трансплантации, и балльная оценка патологии была самой высокой на 14-й день. Балльная оценка патологии соответствовала клиническим данным по GVHD в каждую точку времени.
Образцы плазмы
Образцы крови брали перед ВМТ и на 7, 14, 21 и 28 день после ВМТ. Образцы крови брали с использованием покрытой гепарином капиллярной трубки из хвостовых вен живых мышей и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин в пределах 30 мин для получения плазмы. Образцы плазмы хранили при −80°C до анализа.
Пример 2
Белковый анализ с использованием микрочипа SELDI
4
К 10 мкл каждого образца плазмы добавляли 20 мкл раствора, содержащего 9 моль/л мочевины и 10 г/л CHAPS в Tris-HCl (pH 7,4). Смесь смешивали в течение 15 мин при 4ºC вихревой мешалкой и затем разбавляли до 1:40 в Tris-HCl. Чипы с 8 рядами пятен иммобилизованного металла для аффинного захвата (IMAC-30) активировали 50 ммоль/л CuSo. Разбавленные образцы (50 мкл) наносили на каждое пятно белкового микрочипа и инкубировали в течение 1 ч на вибростенде. После промывания тем же Tris-HCl чип осторожно споласкивали водой, и 0,5 мкл насыщенной синапиновой кислоты (SPA) наносили дважды на каждое пятно и затем сушили воздухом. Спектры массы/заряда (m/z) белков, связанных с хелатированным металлом, измеряли с использованием масс-спектрометра Ciphergen Protein Biology System II Time-Of-Flight (PBS II, Ciphergen Biosystems, Inc.). Данные рассчитывали усреднением 65 лазерных облучений, полученных при интенсивности лазерного излучения 200 и чувствительности детектора 8.
Статистический анализ SELDI-TOF MS
Все спектры составляли и данные предварительно анализировали с использованием программного обеспечения Ciphergen Protein Chip Software 3.2.0. Для образцов плазмы использовали 50 образцов из группы GVHD (на 7, 14, 21 и 28 день после трансплантации), и 28 образцов из контрольной группы (перед ВМТ) при общем количестве образцов, равном 78. Всего были выявлены 169 пиков, которые представлялись отличными от контроля, в диапазоне m/z=2 k до 200 k. Когда экстрагировали пики с 5-кратным или более изменением интенсивности, и уровнем статистической значимости <0,05 сравнением двух групп с использованием программного обеспечения Biomarker Pattern's Software, то в группе GVHD было 10 пиков, которые были выше, и 9 пиков, которые были ниже, чем в контроле.
Профилирование белка SELDI-TOF MS
169 пиков в указанном выше диапазоне массы от 2,0 до 200 кДа далее анализировали с использованием максимальных величин интенсивности. Используя все 169 пиков, процедурой перекрестной вариации построено классификационное древо с использованием программного обеспечения (BPS, Ciphergen Biosystems, Inc.). Для упрощения, в классификационном древе, данные разделены на два узла с использованием каждый раз одного правила в форме вопроса. В этом исследовании решения о разделении были основаны на нормализованном уровне интенсивности пиков или кластеров, идентифицированных по профилю экспрессии белка SELDI. Другими словами, каждый пик или кластер, идентифицированный по профилю SELDI, становится переменной величиной в процессе классификации. Процесс разделения продолжался до тех пор, пока ни достигались конечные узлы, и далее разделение не давало прибавки данных классификации.
Было генерировано множество классификационных древ с использованием этого способа, и древо с наилучшим выполнением задачи выбирали на основании анализа классификационного древа. В результате, пик при 8972 Да был выбран в качестве одного пика, который был значительно выше у группы GVHD, чем у контрольной группы. Пик 8972 Да обеспечивал дифференцировку группы GVHD и контрольной группы при 100% с точки зрения чувствительности и специфичности.
На фиг.2 показан пример пика 8972 Да. На фиг.2А показаны репрезентативные спектры SELDI из нормального контрольного образца (перед ВМТ, перед трансплантацией) и образца GVHD (7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни после трансплантации), полученные от одного и того же индивидуума в диапазоне от 6000 до 10000 Да. Часть, окруженная линией, показывает пик при средней массе 8972 Да. Этот пик избыточно проявлен в плазме GVHD, по сравнению с нормальной плазмой, и интенсивность пика на 7-й день и далее была значительно выше, чем в контроле. И тканевая балльная оценка, и интенсивность пика уменьшились на 8-й день. На фиг.2В показаны средние нормализованные величины интенсивности пика 8972 Да в образцах в различные точки времени (n=9 в каждой точке). Среднее проявление пика в образце GVHD была значительно выше, чем среднее проявление в контрольном образце (перед ВМТ, перед трансплантацией).
Модель лечения CsA
Циклоспорин-A (CsA) (Novartis Pharma), лекарственное средство для лечения по поводу GVHD, разводили до 1,67 мг/мл в 0,9% растворе NaCl. CsA вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг ежедневно с 8-го по 13-й день после трансплантации. На фиг.3 показано изменение пика 8972 Да у одних и тех же индивидуумов, получавших лечение CsA, и средняя нормализованная величина интенсивности пика 8972 Да в образце в каждой точке времени (n= 4 в каждой точке). У мышей с GVHD, получавших лечение CsA, интенсивность пика 8972 Да была высокой на 7-ой день и затем падала после введения CsA.
Модель сингенной трансплантации
На модели сингенной трансплантации с использованием мышей BALB/c с трансплантатом костного мозга, трансплантированным от мыши BALB/c, GVHD не вызывалась, и не было обнаружено значимое различие среднего проявления пика между образцами перед трансплантацией и после трансплантации (фиг.4А и 4В).
Пример 3
Отделение белков
Три наиболее многочисленных белка в плазме (альбумин, IgG, трансферрин) удаляли из объединенного образца плазмы хроматографией иммунного истощения (Колонка множественного аффинного удаления MS-3, внутренний диаметр 4,6 мм×50 мм; Agilent). Получали 5-кратное разведение 50 мкл плазмы в буфере А (Agilent) и инъецировали в колонку иммунного истощения. Проточные фракции собирали и далее отделяли высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ). Разделительная колонка, используемая при ВЭЖХ, представляла собой колонку Inertsil™ Ph (5 мкм, внутренний диаметр 4,6 мм×150 мм; GL Sciences, Japan). Профиль градиента элюирования был следующий: (1) Растворитель элюирования A: 2% ACN/0,1% TFA, растворитель B: 80% ACN/0,1% TFA; (2) Линейный градиент: от 0 до 100% для растворителя B в течение 50 мин; скорость потока 1,0 мл/мин.
Фракции собирали через 30-секундные интервалы, 2 мкл каждой фракции наносили на золотой чип Au (Cipheragen), обрабатывали матрицей SPA, и мониторинг композиции каждой фракции осуществляли SELDI-TOF MS. Фракцию ВЭЖХ от 31,0 до 31,5 мин (приблизительно 38% ацетонитрила) собирали на основании мониторинга SELDI-TOF MS. Большое количество белка 8972 Да содержалось в образце GVHD, но он почти отсутствовал в контрольном образце (фиг.5А). Эту фракцию лиофилизировали и растворяли в 200 мкл буфера солюбилизации (7 М мочевины, 2 М тиомочевины 50 мМ DTT (дитиотрейтола), 2% амфолина, 3% CHAPS, 1% Triton X-100).
Затем образец концентрировали таким образом и разделяли двумерным электрофорезом. После обработки ультразвуком растворы образца загружали на гелевые полоски IPG (pH 3-11, NL, длиной 11 см, Amersham Bioscience), и полоски повторно гидрировали в течение 10 мин при 30 В. Первое размерное разделение изоэлектрическим фокусированием (IEF) выполняли при 20ºC всего в течение 12 кВ/ч с использованием устройства IPGphor (Amersham Bioscience). После IEF полоски IPG уравновешивали в течение 15 мин в 50 мМ Tris-HCl (pH 8,8), содержащем 6M мочевины, 2% SDS (додецилсульфата натрия), 30% глицерина, 0,002% бромфенолсинего и 1% дитиотрейтола. Затем полоски уравновешивали в течение 15 мин в том же буфере, за исключением замещения дитииотрейтола 2,5% йодацетамидом. Для второго размерного разделения SDS-PAGE (Электрофорез в полиакриламидным геле с додецилсульфатом натрия) выполняли с использованием полиакриламидного геля с 8-20% градиентом при постоянном токе 40 мА/гель. После двумерного электрофореза белки делали видимыми окрашиванием нитратом серебра. Путем сравнения изображений двух гелей из образцов GVHD и контроля было идентифицировано пятно, расположенное в участке от 6500 Да до 12300 Да, которое было сильно проявлено в образце GVHD (фиг.5B и 5C).
Идентификация белка
4
3
4
3
2
4
3
Пятно перспективного белка 8972 Да переваривали в геле. Вкратце, гелевое пятно вырезали и промывали 100% ACN и 100 мМ NHHCO, сушили в вакууме и инкубировали при 37ºC в течение 16 часов в 5 мкл раствора трипсина (12,5 нг/мкл в 50 мМ NHHCO и 5 мМ CaCl). Полученные пептиды экстрагировали однократно в 20 мкл 20 мМ NHHCO и три раза в 20 мкл 5% муравьиной кислоты в 50% ACN. Собранные экстракты сушили в вакууме приблизительно до 40 мкл и анализировали HPLC-ESI-MS/MS (ВЭЖХ-электрораспылительной тандемной масс-спектрометрией) в нанопотоке. Для ВЭЖХ использовали устройство DiNa (KYA Technology), и переваренные трипсином образцы разделяли на колонке HIQsil™ C18 (внутренний диаметр 75 мкм×50 мм; KYA Technology). Условия разделения были следующие: Растворитель элюирования A: 0,1% муравьиная кислота, растворитель B: 0,1% муравьиная кислота в 70% ACN; градиент: от 0 до 100% для растворителя В в течение 40 мин; скорость потока: 200 нл/мин. Свойства разделенных пептидов определяли с использованием масс-спектрометра QSTAR XL Q-TOF (Applied Biosystems). Поиск в белковой базе данных NCBI выполняли программным обеспечением MASCOT (Matrix Science Inc.), используя полученные масс-спектральные данные.
Результат исследования показал, что частичная аминокислотная последовательность белка 8972 Да соответствовала последовательности предшественника CCL8. На фиг.6 показан типичный спектр MS/MS пептида, отделенного от белка 8972 Да. Этот пептид был идентифицирован нано LC-MS/MS в виде пептида 68-69 CCL8 (QGMSLCVDPTQK). Аналогичным образом были идентифицированы 11 пептидов, которые соответствовали теоретической массе. Когда эти пептидные последовательности объединяли, были покрыты 52% аминокислотной последовательности предшественника CCL8 (подчеркнуто).
1 MKIYAVLLCL LLIAVPVSPE KLTGPDKAPV TCCFHVLKLK IPLRVLKSYE
51 RINNIQCPME AVVFQTKQGM SLCVDPTQKW VSEYMEILDQ KSQILQP (SEQ ID NO: 1)
Прогнозированная масса предшественника CCL8 составляет 11017 Да, а прогнозируемая pI (изоэлектрическая точка) составляет 8,64. Предшественник CCL8 содержит сигнальный пептид из 19 аминокислот со следующей последовательностью зрелого CCL8 из 78 аминокислотных остатков. Прогнозируемая масса зрелого CCL8 составляет 8972 Да, а прогнозируемая pI составляет 8,45. Эти цифры согласуются с данными, полученными SELDI-TOF MS и двумерным электрофорезом (2D-PAGE).
Пример 4
Верификация экспрессии CCL8 иммуноанализом
Тот факт, что маркер 8972 Да представляет собой CCL8, верифицировали иммуноанализом SELDI с использованием специфического кроличьего антитела против мышиного CCL8. В каждое пятно на PS20 (предварительно активированной поверхности) чипа ProteinChip (Ciphergen Biosystems) добавляли 0,1 мкг антитела против мышиного CCL8, и чип инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре в увлажненной камере. После блокировки остаточных активных участков в течение 30 мин 5 мкл 1М этаноламина (рН 8,0) пятна промывали три раза 0,5% Triton X-100 в PBS (солевом растворе с фосфатным буфером) и дважды PBS. Образец плазмы разводили 1:75 в PBS, наносили на иммобилизованные антителом пятна на чипе PS20 и инкубировали в течение 2 часов при осторожном смешивании при комнатной температуре с использованием биопроцессора. Каждое пятно дважды промывали 0,5% Triton X-100 в PBS и дважды PBS. После кратковременного промывания 5 мМ HEPES добавляли матрицу SPA, и масс-спектрометрический анализ выполняли с использованием считывающего устройства PBS II ProteinChip. CCL8 был выявлен в образце плазмы GVHD, но он был выявлен лишь в незначительном количестве в контрольном образце (фиг.7).
Пример 5
Экспрессия CCL8 в человеческих клинических образцах
Плазму, полученную у пациентов, повергнутых трансплантации костного мозга, разбавляли 1:25 в PBS и использовали для человеческих клинических образцов. Как в примере 4, чип PS20 ProteinChip использовали вместе с антителом против человеческого CCL8 для исследования экспрессии CCL8 у людей-пациентов иммуноанализом SELDI.
Пациент 1 (фиг.8)
Пятилетний мальчик
Диагноз: Анемия Фанкони
Лечение: Трансплантация стволовых клеток крови пупочного канатика от неродственного донора (CBSCT (UR))
Профилактика: CsA+MMF (индуктор пролиферации макрофагов)
Течение: GVHD впервые развилась на 13-й день после трансплантации в виде кожной сыпи, и терапию метилпреднизолоном (mPSL) начинали в тот же день. CCL8 был выявлен на 10-й день после трансплантации до клинического проявления GVHD. При этом лечении уровень GVHD временно снизился. Однако величина экспрессии GVHD снова возрастала вместе с рецидивом GVHD. Сначала пациент реагировал на лечение, но в конечном счете, он умер вследствие GVHD, устойчивой к лечению. Величина экспрессии GVHD коррелировалась с развитием GVHD и эффективностью лечения. Уровень CCL8 больше не падал после развития устойчивости к лечению.
Пациент 2 (фиг.9)
Десятилетний мальчик
Диагноз: Хронический миелогенный лейкоз (CML)
Лечение: Трансплантация костного мозга от неродственного донора (BMT (UR))
Профилактика: FK+MTX (такролимус+метотрексат)
Течение: GVHD впервые развилась на 19-й день после транспалантации в виде кожной сыпи, и терапию метилпреднизолоном (mPSL) начинали в тот же день. В этот день уровень CCL8 проявил отчетливый подъем. GVHD временно прогрессировала со стадии 2 в стадию 3, но при лечении было отмечено улучшение, и высокий уровень экспрессии CCL8 затем не обнаруживался.
Пациентка 3 (фиг.10)
Трехлетняя девочка
Диагноз: Острый лимфобластический лейкоз (ALL)
Лечение: Трансплантация костного мозга от подобранного сибса (ВМТ (подобранный сибс))
Профилактика: МТХ
Течение: GVHD не развивалась. В любое врем в течение наблюдения не была обнаружена экспрессия CCL8.
Пациентка 4 (фиг.12)
Одиннадцатилетняя девочка
Диагноз: Острый лимфобластический лейкоз (ALL)
Лечение: Трансплантация костного мозга от подобранного сибса-донора (MSD-BMT)
Профилактика: Кратковременное применение MTX
Течение: GVHD развилась на 11-й день после трансплантации. Уровень экспрессии CCL8 не проявлял увеличения. В тот же день вводили циклоспорин-А непрерывным внутривенным вливанием (C.I.V.). На 14-й день симптомы GVHD уменьшились, и уровень экспрессии CCL8 упал.
Пациентка 5 (фиг.13)
2
19-летняя девушка с тяжелой апластической анемией была подвергнута трансплантации стволовых клеток костного мозга от одного из родителей без подбора по антигену HLA-1. Пациентка была подвергнута предтрансплантационному кондиционированию, состоящему из применения 150 мг/м флударабина (Flu), 120 мг/кг циклофосфамида (CY) и 24 мг/кг анти-тимоцитарного глобулина (ATG), и профилактики GVHD такролимусом. На 10-й день у пациентки развилась высокая лихорадка, а на 16-й день появилась атипичная кожная сыпь на конечностях и туловище, но без диареи. На 20-й день проявилось отчетливое увеличение уровня CCL8. На 23-й день выполняли биопсию кожной сыпи и начинали лечение метилпреднизолоном (mPSL). На 31-й день симптомы GVHD уменьшились, и уровень экспрессии CCL8 упал.
Пример 6
Концентрация CCL8 в плазме у пациентов с GVHD и здоровых индивидуумов
Количество CCL8 определяли в плазме здоровых индивидуумов и среди пациентов после HSCT, в плазме индивидуумов, у которых развилась GVHD и у которых она не развилась. Фиг.11 показывает результаты. Числовые единицы представляют пкг/мл. У пациентов, которые были подвергнуты HSCT, концентрация CCL8 в плазме у индивидуумов, у которых не развилась GVHD, составила от 6,92 до 48,0 пкг/мл, а средняя величина составила 23,3 пкг/мл. Концентрация CCL8 в плазме у индивидуумов, у которых развилась GVHD, составила от 52,0 до 333,6 пкг/мл, а средняя величина составила 133,3 пкг/мл, что было явно более высокой концентрацией. Кроме того, в двух случаях GVHD, устойчивых к лечению, концентрации составили 333,6 мкг/мл и 290,4 пкг/мл, которые представляли крайне высокие концентрации. Эти два пациента были устойчивы к лечению GVHD и умерли. У здоровых индивидуумов концентрация CCL8 в плазме составила от 0 до 32,6 пкг/мл, а средняя величина составила 18,9 пкг/мл, что представляло крайне низкую величину. По этим данным было установлено, что количество CCL8 в плазме пациентов, у которых развилась GVHD, было значительно выше, чем у здоровых индивидуумов. А у устойчивых к лечению пациентов с GVHD оно было резко выше.
Представленные выше результаты ясно указывают на то, что имеется сильная корреляция между величиной экспрессии CCL8 и развитием и течением GVHD у людей-пациентов.
Пример 7
Инфекция и дифференциальная диагностика
Уровень экспрессии CCL8 измеряли у мышей после введения лиганда TLR.
d
Самцов мышей BALB/c (H-2) закупали у Sankyo Labo Service Corporation (Tokyo, Japan). В начале тестирования возраст мышей составлял от 6 до 10 недель. При отсутствии других указаний все реагенты были закуплены у компании SIGMA/ALDRICH (Tokyo, Japan).
Мыши BALB/c дикого типа получали внутрибрюшинную инъекцию 5 мкг липополисахарида (LPS) (Escherichia coli), 5 мкг поли(I:C) (GE Healthcare Bio-sciences, Tokyo, Japan) и 20 мг D-GalN, 100 мг пептидгликана (PGN (Staphylococcus aureus) (Invitrogen, CA, USA), 20 мг Zymosan-A (Invitrogen, CA, USA) и 20 нмоль Cpg-ODN (Invitrogen, CA, USA) в 500 мкл PBS. Контрольные мыши получали внутрибрюшинную инъекцию 500 мкл PBS. Через 4 часа после инъекции брали образец плазмы. Дозы LPS, poly(I:C), PGN, Zymosan-A и CpG-ODN определяли предварительными экспериментами.
Через 4 часа после инъекции образцы крови брали с использованием покрытого гепарином шприца. И центрифужное разделение крови выполняли в течение 7 мин при 5000 об/мин в пределах 30 мин после взятия пробы для получения плазмы. Разделенные образцы плазмы хранили при −80ºC до анализа. Образцы крови брали у людей-добровольцев и пациентов, получали образцы плазмы и разделенные образцы хранили при −80ºC до анализа.
Уровень CCL8 у людей измеряли ферментным иммуносорбентным анализом (ELISA). Набор ELISA для определения человеческого CCL8 закупали у компании RayBiotech (Norcross, GA), и соблюдали последователь операций, рекомендуемую изготовителем. Планшеты считывали считывающим устройством для планшетов при 450 нм (Multiskan JX, Thermo Labsystems, Helsinki, Finland).
Результаты выражались в виде средней величины ±S.E. (стандартная ошибка). Статистический анализ для выявления значимости различий выполняли с использованием или двухстороннего, или одностороннего критерия t. Уровень значимости был установлен на p<0,05. Для множественных сравнений использовали коррекцию Бонферрони. Показанные результаты представляют репрезентативные данные для серии тестов.
Как показано на фиг.14, ясно продемонстрировано, что уровень CCR8 не увеличивается введением лиганда TLR. Эти данные показывают, что уровень экспрессии CCL8 не увеличивается бактериальной или вирусной инфекцией и указывают на то, что дифференциальную диагностику между GVHD и инфекцией можно осуществить использованием экспрессии CCL8 в качестве индикатора.
Пример 8
Диагностика до проявления GVHD
Как в примере 1, сингенную BMT выполняли у мышей, кровь брали в 1-й, 3-й, 5-й и 7-й дни после трансплантации и получали гепаринизированные образцы плазмы. Количественное определение концентрации CCL8 в плазме осуществляли с использованием ELISA для определения мышиного CCL8.
Изменение массы в 0-7-й дни после сингенной ВМТ и потерю массы, согнутое положение тела, состояние шерстяного покрова, кожи и диарею на 7-ой день оценивали по 3-этапной шкале из 0, 1 или 2 пунктов. Балльная оценка 0 была присвоена потере массы тела <10%; балльная оценка 1 – потере массы от 10% до <25% и балльная оценка 2 – потере массы тела ≥25%. Для согнутого положения тела балльная оценка 0 была присвоена нормальному положению; балльная оценка 1 – слегка согнутому положению тела и балльная оценка 2 – очень согнутому положению тела. Для шерстяного покрова балльная оценка 0 была присвоена нормальному покрову; балльная оценка 1 – слегка взъерошенной шерсти и балльная оценка 2 - взъерошенной шерсти всего тела при почти отсутствующем поведении в виде чистки шерсти. Для кожи балльная оценка 0 была присвоена нормальной коже, балльная оценка 1 – видимому склерозу на хвосте и ногах и балльная оценка 2 – мышам с пятнистым облысением. Для диареи балльная оценка 0 была присвоена нормальной дефекации, балльная оценка 1 – незначительной диарее и балльная оценка 2 – профузной диарее. Клиническая балльная оценка GVHD представляет общее число пунктов для каждого критерия, и максимальное число пунктов составляет 10.
На фиг.15 показана динамика изменений концентрации CCL8 в плазме. Концентрация CCL8 в плазме увеличилась вскоре после трансплантации костного мозга и была значительно выше через 5 дней. Напротив, до 6-го дня не наблюдались клинические проявления GVHD. Клиническая оценка GVHD составила приблизительно 2,5 пунктов на 7-ой день, что представляет раннюю стадию GVHD. Затем признаки GVHD прогрессировали у всех мышей, начиная на 7-ой день, и балльная оценка на 28-ой день составила 6,3.
На основании этих данных считалось, что количественное определение белка CCL8 в крови может использоваться для преклинической диагностики или диагностики ранней стадии GVHD у мышей.
Пример 9
Лечение GVHD анти-CCL8 антителом
Кроличье антитело против мышиного CCL8 получали введением синтезированного пептида CCL8 кролику и очисткой фракции анти-CCL8 IgG из полученной антисыворотки с использованием аффинной колонки. Фракцию IgG из сыворотки здорового кролика использовали в качестве нормального контроля кроличьего антитела.
Трансплантацию костного мозга выполняли на мышах как в примере 1. Кроличье антитело против мышиного CCL8 или нормальное кроличье антитело вводили в дозе 100 мкг мыши-реципиенту через хвостовую вену в течение 3 последовательных дней, считая со дня перед аллогенной ВМТ. Каждой из трех мышей вводили антитело против мышиного CCL8 (группа лечения) и антитело здорового кролика (контрольная группа). На 14-й день после ВМТ мышей умерщвляли смещением шейных позвонков. Кожу, печень и тонкую кишку удаляли и фиксировали в 10% забуференном формалине. Фиксированную ткань заливали в парафин, получали срезы и окрашивали гематоксилином/эозином и затем осуществляли наблюдения под оптическим микроскопом для поиска патологических признаков, считающихся показателями GVHD. Способ балльной оценки был следующий: кожа (моноцитарная инфильтрация дермоэпидермального соединения и повреждение фолликулов или сальных желез); печень (мононуклеарная инфильтрация вокруг воротной вены и печеночноклеточный некроз); и тонкая кишка (апоптоз клеток крипт и расширение или уплощение ворсинок). Данные были представлены в виде интерпретации как положительные (+), промежуточные (+/−) или отрицательные (-) по 3-этапной шкале.
Типичное изображение окрашенной кожной ткани показано на фиг.16 при (а) показывающем введение антитела против мышиного CCL8 и (b) показывающем введение нормального кроличьего антитела (контроль). Повреждение (острие стрелки) сальных желез и лимфоцитарная инфильтрация (стрелка) дермоэпидерального соединения, которые являются признаками GVHD в коже, видны в группе, которой вводили нормальное кроличье антитело, но они не обнаруживаются у группы, которой вводили антитело против мышиного CCL8.
На фиг.17 показаны результаты использования описанной выше системы балльной оценки. Уменьшение инфильтрации воспалительными клетками дермоэпидерального соединения и облегчение повреждения волосяных фолликулов и сальных желез в коже отмечались только у мышей, получавших лечение антителом против CCL8. Эти данные указывают на то, что лечение антителом против CCL8 эффективно при лечении GVHD.
Промышленная применимость
Настоящее изобретение можно применять для диагностики, мониторинга течения и лечения GVHD.