Индукция аутофагии в Т-лимфоцитах периферической крови больных атопической бронхиальной астмой

Индукция аутофагии в Т-лимфоцитах периферической крови больных атопической бронхиальной астмой

Ю.В. Скибо 1, А.А. Пономарева 2, И.Д. Решетникова 3, З.И. Абрамова 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

2 Казанский институт биохимии и биофизики РАН, Казань

3 Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии, Казань

Autophagy induction in peripheral blood T-lymphocytes of atopic asthma patients

Y.V. Skibo 1, A.A. Ponomareva2, I.D. Reshetnikova 3, Z.I. Abramova 1

1 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan

2 Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics of RAS, Kazan

3 Kazan SRI of Epidemiology and Microbiology, Kazan

Аутофагия является фундаментальным процессом, который обеспечивает регуляцию гомеостаза Т-лимфоцитов.

Она может являться единственным механизмом гибели клеток, когда в клетке имеются нарушения в индукции апоптоза. Ранее было показано торможение апоптоза лимфоцитов больных бронхиальной астмой, поэтому основные исследования данной работы были направлены на изучение развития процесса аутофагии в Т-лимфоцитах больных бронхиальной астмой. В статье представлены основные морфологические изменения клеток, связанные с активацией аутофагии (формирование аутофагосом). Помимо морфологических изменений лимфоцитов, приводятся результаты исследования экспрессии маркерного белка аутофагии — LC3B. В работе установлено, что в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой астмы происходит одновременная активация как аутофагии, так и апоптоза, и аутофагия является стимулом к гибели клеток.

Ключевые слова: аутофагия, апоптоз, Т-лимфоциты, астма, LC3B белок.

Autophagy is a fundamental process that ensures the regulation of T-cell homeostasis. In case of apoptosis induction disruption in the cell it could be single mechanism of the cell death. Previously was shown inhibition of lymphocyte apoptosis in patients with bronchial asthma, so the main study of this work has focused on the study development process of autophagy in T-lymphocytes of patients with bronchial asthma. The article presents the main morphological changes in cells associated with activation of autophagy (formation autophagosome). In addition to morphological changes in lymphocytes, we have shown the expression of autophagy marker protein (LC3B). We found that in T-lymphocytes of patients with severe asthma are simultaneous activation of both autophagy and apoptosis, and autophagy is a stimulus to cell death.

Key words: autophagy, apoptosis, T-lymphocytes,

asthma, LC3B protein.

Лимфоциты являются неотъемлемыми регуляторами и эффекторами адаптивной иммунной системы. Вместе с антиген-представляющими иммунными клетками, Т- и В-лимфоциты обеспечивают защитный иммунный ответ на различные патогены и формируют долгосрочную иммунологическую память [1]. Для поддержания целостности иммунной системы, периферический пул зрелых лимфоцитов регулируется посредством постоянного баланса между продукцией, пролиферацией и смертью клеток. Баланс этих процессов описывается как лимфоцитарный гомеостаз [2, 3]. Регуляция пролиферации и гибели лимфоцитов во время иммунного ответа способствует поддержанию гомеостаза в адаптивном иммунном ответе. Несмотря на то, что количество эффекторных Т-клеток при первичном иммунном ответе может увеличиваться в 1000 раз [4], программированная смерть большинства этих клеток ограничивает накопление общего числа клеток [5].

Различные исследования выявили множество факторов, которые регулируют гомеостаз периферических лимфоцитов [2, 3]. Недавно проведенные исследования предполагают, что аутофагия, фундаментальный внутриклеточный процесс, обеспечивает новый механизм регуляции гомеостаза Т-лимфоцитов [6].

e-mail: yuliya_ksu@mail.ru

Бронхиальная астма (БА) в настоящее время рассматривается как хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей с многофакторным патогенезом. Патогенез БА включает в себя бронхоспазм, аллергические реакции, цитокиновый ответ, в том числе вирусно-опосредованное воспаление и ТЬ|2 иммунный ответ, а также наследственную предрасположенность [7]. В последние годы активно изучается роль апоптотического механизма иммуносупрессии в патогенезе бронхиальной астмы. Имеется ряд работ, в которых установлено торможение апоптоза лимфоцитов при развитии астмы [8, 9].

Апоптоз является наиболее изученной формой программированной клеточной гибели. В качестве второго типа программированной гибели клеток в настоящее время выделяют гибель клеток, при которой запускается программа аутофагии [10]. Стимулами к запуску процессов аутофагии в клетках многоклеточных животных являются нехватка питательных веществ, наличие в цитоплазме поврежденных орга-нелл, например, митохондрий и т.д. [11].

Поскольку ранее было показано торможение апоптоза лимфоцитов больных бронхиальной астмой, мы предположили, что это может быть связано с индукцией другого процесса — аутофагии. Поэтому

цель работы: исследовать развитие процесса аутофагии в Т-лимфоцитах больных атопической бронхиальной астмой (АБА) с легкой и тяжелой формой заболевания.

Материал и методы

Объектом изучения послужили т-лимфоциты периферической крови 10 здоровых доноров и 20 больных АБА (10 пациентов с АБА легкого перси-стирующего течения и 10 пациентов с АБА тяжелого персистирующего течения). Диагноз и степень тяжести астмы верифицировали согласно критериям «Глобальной стратегии диагностики, профилактики и лечения астмы» (GINA, 2008). Больные находились под наблюдением в поликлинике аллергических заболеваний. Все исследования проводились в соответствии с правилами комитета по этике Хельсинкской декларации.

Выделение Т-лимфоцитов. Лимфоциты выделяли по стандартной методике на градиенте плотности фи-колла (р = 1,077) (ПанЭко, Россия). Для получения чистой популяции Т-лимфоцитов использовали метод иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Untouched Human T cells, Dynal, Invitrogen, США). Подсчет клеток проводили в камере Горяева, окрашенных 0,1% раствором трипанового синего (ПанЭко, Россия).

Культивирование лимфоцитов. Т-лимфоциты (2х10в кл./мл.) суспендировали в среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия), пенициллин/ стрептомицин (5000 ед/мл/5000 мкг/мл) (ПанЭко, Россия) и 1% L-глутамин (ПанЭко, Россия). Клетки инкубировали в течение 3 сут. при 37°С в инкубаторе во влажной атмосфере, содержащей 5 % СО2.

Визуализация аутофагосом методом электронной микроскопии. Суспензию лимфоцитов фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида (Serva, Германия) на фосфатном буфере (рН 7,2) и 1% раствором OsO4 (Serva, Германия) на том же буфере. Образцы дегидратировали в этаноле восходящей концентрации, ацетоне и окиси пропилена (Serva, Германия). Материал заливали эпоксидной смолой Эпон — 812 (Serva, Германия). Полимеризовали образцы в течение трёх суток в термостате при температуре 37, 45 и 60°С, соответственно.

Срезы получали на ультрамикротоме LKB-III (Швеция), контрастировали насыщенным водным раствором уранилацетата (Serva, Германия) и раствором цитрата свинца. Препараты просматривались на электронном микроскопе Hitachi-125 (Япония).

Определение экспрессии LC3B белка методом флуоресцентной микроскопии. Визуализацию аутофа-госом проводили после 3 сут. культивирования с применением антител, меченых FITC против белка LC3B (LC3B Antibody Kit for Autophagy, Molecular Probes) на флуоресцентном микроскопе Carl Zeiss AxioScope A1 (оснащенном видеокамерой AxioCam MRc5).

Определение экспрессии LC3B белка методом проточной цитофлуориметрии. Экспрессию LC3B белка определяли на проточном цитометре BD FACSCalibur (Becton Dickinson) с применением первичных моноклональных антител (LC3B rabbit monoclonal antibody, Invitrogen, Molecular Probes) и вторичных меченых FITC антител (Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG, Invitrogen, Molecular Probes). Детекцию флуоресценции проводили в FL1 канале. В каждом образце было собрано и проанализировано

10 тыс. событий.

Визуализация лизосом для флуоресцентной микроскопии. Визуализацию лизосом проводили окрашиванием клеток после 3 сут. культивирования акридиновым оранжевым (ПанЭко, Россия), приготовленным на буфере Макильвейна [12]. Лизосомы живых клеток флуоресцируют оранжевым цветом.

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ STATISTICA 6.0. При анализе данных были использованы общепринятые методы параметрической и непараметрической статистики. Различия считались достоверными при значении р < 0,05.

Результаты

Культивирование клеток в течение 3 сут. сопровождается истощением питательных веществ в среде, что служит стимулирующим фактором для запуска аутофагии. Для определения аутофагии в Т-лимфоцитах был применен метод электронной микроскопии, позволяющий визуализировать аутофа-госомы в клетках. Аутофагосомы — двухмембранные структуры, формирующиеся вокруг различных белков и органелл клетки, подлежащие удалению [11].

Большая часть лимфоцитов условно здоровых доноров обладает морфологией, соответствующей апоптотическим изменениям на ранней стадии процесса, а именно потеря клеточной мембраной микроворсинок (характерный морфологический признак апоптоза) и конденсация хроматина по периферии ядра (рис. 1А, В).

В процессе культивирования большая часть лимфоцитов в группе с легкой формой АБА сохраняет типичную морфологию пролиферирующих клеток. Хорошо различимы крупное ядро с диффузным хроматином, митохондрии, аппарат Гольджи и эндоплаз-матический ретикулум (рис. 1С). Кроме того, на микрофотографиях клеток обнаружены аутофагосомы, внутри которых достаточно хорошо детерминированы различные клеточные компоненты, находящиеся на стадии переработки (рис. 1й).

Большинство лимфоцитов в препаратах больных с тяжелой формой АБА имеют морфологию подобную морфологии лимфоцитов группы больных с легкой формой (рис. 1Е). Клетки имеют правильную округлую форму, ядро с конденсированным хроматином, как правило, занимает большую часть клетки, округлой формы, расположено центрально. В цитоплазме имеется большое количество митохондрий, с хорошо различимыми кристами, рибосомы, аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум. Отмечено повышенное содержание вакуолей и аутофаго-сом. Вакуолизация цитоплазмы и конденсация хроматина входят в число основных морфологических признаков апоптоза. С другой стороны, присутствие значительного количества аутофагосом в клетках свидетельствует об индукции аутофагии. Таким образом, в клетках происходит активация как апоптоза, так и аутофагии.

LC3B белок — специфический маркер аутофагии, экспрессирующийся на активированной мембране аутофагосом [13]. В нашем исследовании экспрессия LC3B белка была обнаружена как в группе с легкой, так и в группе с тяжелой формой АБА, однако количество аутофагосом и интенсивность экспрессии белка выше в группе больных с тяжелой формой АБА (рис. 2).

А

<-___________________•

Рис. 1. Лимфоциты периферической крови больных с различными формами атопической бронхиальной астмы (АБА). Индукция аутофагии в процессе культивирования (72 ч.):

А, Б - лимфоциты здорового донора; В - лимфоцит больного легкой формой АБА;

Г - аутофагосома с клеточным материалом, подлежащим «перевариванию»;

Д - лимфоцит больного тяжелой формой АБА;

Е - аутофагосома, сформированная вокруг клеточного материала, подлежащего «перевариванию». Стрелками показаны аутофагосомы.

Трансмиссионная электронная микроскопия.

Ув.: А-Д х 10000; Г, Е х12000

III мхм

Б

•

• г

+

10 мої

В

Г

Рис. 2.

Т-лимфоциты периферической крови больных с различными формами атопической бронхиальной астмы (АБА). Определение экспрессии LC3B белка в процессе культивирования (72 ч.):

А - отсутствие экспрессии LC3B белка в лимфоцитах здорового донора;

Б - экспрессия LC3B белка аутофагосом в лимфоцитах больных легкой формой АБА;

В - экспрессия LC3B белка аутофагосом в лимфоцитах больных тяжелой формой астмы;

Г - количественная оценка и интенсивность экспрессии LC3B белка в Т-лимфоцитах больных легкой (1) и тяжелой (2) формами АБА.

Стрелками показаны аутофагосомы с LC3B белком. Иммунофлуоресцентная реакция с антителами к LC3B белку, Г - проточная цитометрия

Для переваривания клеточных компонентов, подлежащих удалению, необходимо слияние аутофаго-сом с лизосомами, содержащими гидролазы. Для обнаружения лизосом в клетках был использован краситель акридиновый оранжевый, тропный к лизо-сомам, который способен свободно проникать через

Обсуждение

Недавние исследования показали, что аутофагия может являться новым регулятором численности лимфоцитов в периферической крови [14]. Появление различных стимуляторов (глюкокортикоидов, активных форм кислорода) или же снижение необходимых питательных компонентов в окружающей среде может послужить сигналом запуска программированной гибели клеток [9]. В этом случае, клетки, подлежащие удалению, аккуратно фрагментируются на части (апоптотические тельца) и фагоцитируются макрофагами или соседними клетками посредством апоптоза. Однако активация апоптоза происходит не всегда. Перед тем как запустить необратимый процесс смерти, в клетках активируется другой процесс — аутофагия [10]. Так в период клеточного «голодания» поддерживается необходимый уровень тех соединений, которые нужны ей для жизнедеятельности. Но при ликвидации большого числа органелл клеткой принимается решение о запуске программы «самоуничтожения». В том случае, если имеются нарушения в индукции апоптоза, аутофагия является единственным механизмом гибели, действуя в качестве резервного механизма исполнения смертного приговора, когда апоптоз в клетке заинги-бирован. Отношения между аутофагией и апоптозом являются сложными. Погибнет клетка путем апоптоза или по другому механизму по-прежнему остаётся неясным.

В представленной работе описывается активация аутофагии в лимфоцитах больных АБА в процессе культивирования. Результаты показали, что в отличие от группы контроля, в лимфоцитах больных легкой и тяжелой формой АБА происходит активация аутофагии (формирование аутофагосом, экспрессия LC3-белка и лизосом).

биологические мембраны в незаряженном состоянии. Его протонированные формы накапливаются в лизосомах, где он, образуя агрегаты, светится ярко оранжевым цветом. В нашем эксперименте лизосо-мы были обнаружены в обеих исследуемых группах больных бронхиальной астмой (рис. 3).

Тип II программированной клеточной смерти или аутофагия определяется посредством аккумуляции аутофагических вакуолей [15, 16]. В представленной работе было показано, что формирование ау-тофагосом в Т-лимфоцитах больных астмой происходит через 72 ч культивирования. В отличие от них, в клетках здоровых доноров инициируется ПКГ 1-типа или апоптоз, на что указывают конденсация хроматина и отсутствие микроворсинок на плазматической мембране клеток. Подобные морфологические изменения наблюдаются и у больных с тяжелой формой астмы. То есть в данном случае можно предположить, что снижение питательных веществ в культуральной среде является сигналом инициации как апоптоза, так и аутофагии. Полученные данные согласуются с ранее проведенными нами исследованиями по изучению процесса апоптоза лимфоцитов при развитии атопической бронхиальной астмы (легкой и тяжелой формы) [17]. В частности, на 6 сут. культивирования (144 ч) наибольшее содержание лимфоцитов с поздними признаками апоптоза было у больных с тяжелой формой АБА и в группе контроля. Что интересно, в случае больных астмой, большая часть клеток подверглась деградации и превратилась в апоптотические тельца, значительная часть которых состоит из аутофагосом.

Ранее было показано, что ТЬ|2-поляризованные Сй4+ Т-лимфоциты погибают либо путем аутофа-гии, либо нуждаются в ней для запуска апоптоза при истощении необходимых факторов роста [14]. Согласно этим исследованиям, аутофагия представляется более важной для выживания Сй8 + , чем Сй4+ Т-лимфоцитов, а ТЬ|2-поляризованные Сй4+ Т-клетки более чувствительны к гибели через аутофагию, чем ТЬ|1-поляризованные клетки. В этом контексте

А

Б

В

Рис. 3.

Т-лимфоциты периферической крови больных с различными формами атопической бронхиальной астмы (АБА). Активация лизосом в Т-лимфоцитах в процессе культивирования (72 ч.): А - отсутствие лизосом в лимфоцитах здорового донора;

Б -лизосомы в лимфоцитах больных легкой формой АБА;

В - лизосомы в лимфоцитах больных тяжелой формой АБА. Стрелками обозначены лизосомы.

Окраска: акридиновый оранжевый

следует отметить, что астма является результатом переключения с Th1- на ^З-хелперный ответ. Ранее были получены результаты, свидетельствующие об увеличении количества CD4+ лимфоцитов в группе с тяжелой формой АБА, в то время как в группе с легкой формой астмы отсутствовали изменения в численности данной субпопуляции [18]. Поэтому мы можем сделать вывод, что в условиях стресса в Т-лимфоцитах больных тяжелой формой АБА происходит одновременная активация I и II типа ПКГ (ау-тофагии и апоптоза) и аутофагия является стимулом к гибели клеток.

В случае легкой формы АБА, мы можем предположить, что изначально в клетках активируется аутофагия и предшествует апоптозу, который, исходя из ранее полученных результатов, заторможен. То есть в данном случае не совсем понятно, либо аутофагия способствует выживаемости лимфоцитов, которые после выполнений своей функции должны погибнуть, что может оказать негативное воздействие на весь организм, либо является стимулятором их гибели. В работе G. Kroemer с соавт. (2ВД5) было показано, что аутофагия зачастую предшествует апоптозу,

ЛИТЕРАТУРА:

1. Бростофор Д., Мейл Д., Ройтт А. и др. Иммунология. Москва: Логосфера; 2007.

2. Jameson S.C. Maintaining the norm: T-cell homeostasis. Nat. Rev. Immunol. 2002; 2: 547—56.

3. Plas D.R., Rathmell J.C., Thompson C.B. Homeostatic control of lymphocyte survival: potential origins and implications. Nat. Immunol. 2002; 3(6): 515-21.

4. Blattman J.N., Antia R., Sourdive D.J. et al. Estimating the precursor frequency of naive antigen-specific CD8 T cells. J. Exp. Med. 2002; 195(5): 657-64.

5. Badovinac V.P., Harty J.T. Programming, demarcating, and manipulating CD8+ T-cell memory. Immunol. Rev. 2006; 211: 67-80.

6. Pua H.H., Dzhagalov I., Chuck M. et al. A critical role for the autophagy gene Atg5 in T cell survival and proliferation. J. Exp. Med. 2007; 204: 25-31.

7. Walter M.J., Holtzman M.J. A centennial history of research on asthma pathogenesis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2005; 32: 483-9.

8. Бойчук С.В., Мустафин И.Г. Fas-рецептор и его роль при атопических заболеваниях. Иммунология 2001; 3: 24-8.

9. O'Sullivan S., Cormican L., Burke C.M. Fluticasone induces T cell apoptosis in the bronchial wall of mild to moderate asthmatics. Asthma 2004; 59(8): 657-61.

10. Lockshina R.A., Zakerib Z. Apoptosis, autophagy and more. Int. J. Biochem. Cell B. 2004; 36(12): 2405-19.

являясь для клеток последней попыткой спастись от гибели [19]. В то же время H. Pua с соавт. (2007) показали, что аутофагия требуется для гибели клеток, особенно когда апоптотический механизм находится под угрозой [6].

Полученные результаты показали, что в условиях снижения питательных веществ в среде происходит стимуляция смерти Т-лимфоцитов через аутофа-гию у больных с тяжелой формой астмы, являясь следствием Th2-хелперного ответа у таких больных. В случае легкого течения заболевания вопрос остается открытым: либо аутофагия способствует выживаемости лимфоцитов, либо является стимулятором их гибели? Поэтому представляется перспективным исследование механизма возможного переключения между апоптозом и аутофагией.

Благодарности

Авторы выражают благодарность лаборатории Биоматериалов и наноматериалов Казанского (Приволжского) федерального университета за помощь в работе на флуоресцентном микроскопе.

11. Klionsky D.J. The molecular machinery of autophagy: unanswered questions. Cell Science 2005; 118: 7-18.

12. Paglin S., Hollister T., Delohery T. et al. A novel response of cancer cells to radiation involves autophagy and formation of acidic vesicles. Cancer Res. 2001; 61: 439-44.

13. Kabeya Y., Mizushima N., Ueno T. et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EmBo 2000; 19: 5720-8.

14. Li C., Capan E., Zhao Y. et al. Autophagy Is Induced in CD4-T Cells and Important for the Growth Factor-Withdrawal Cell Death. Immunology 2006; 177(8): 5163-8.

15. Bursch W. The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ. 2001; 8(6): 569-81.

16. Edinger A.L., Thompson C.B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Current Opinion in Cell Biology 2004; 16: 663-9.

17. Скибо Ю.В., Курмаева Н.Ш. Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой. Практическая медицина 2012. В печати.

18. Скибо Ю.В., Курмаева Н.Ш., Цибулькина В.Н. и др. Структура основных популяций лимфоцитов у больных атопической бронхиальной астмой разной степени тяжести. Практическая медицина 2012. В печати.

19. Kroemer G., Jaattela M. Lysosomes and autophagy in cell death control. Nat. Rev. Cancer. 2005; 5: 886-97.

Поступила 10.08.2012