СПОСОБЫ, СИСТЕМЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Способ обработки или анализа молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий:
(а) обеспечение (i) указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты и (ii) двухцепочечного адаптера, имеющего сайт образования ника внутри смысловой цепи или антисмысловой цепи указанного двухцепочечного адаптера;
(b) соединение указанного двухцепочечного адаптера с указанной молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты; и
(c) циклизацию указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты, связанной с указанным двухцепочечным адаптером, с образованием молекулы кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
2. Способ по п.1, где указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты и указанный двухцепочечный адаптер являются гетерологичными друг другу.
3. Способ по п.1, где указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты и указанный двухцепочечный адаптер находятся в бесклеточной композиции.
4. Способ по п.1, где стадии (b) или (c) выполняются в бесклеточных условиях.
5. Способ по п.1, где указанное связывание включает (i) связывание указанной смысловой цепи указанного двухцепочечного адаптера со смысловой цепью указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты или (ii) связывание указанной антисмысловой цепи указанного двухцепочечного адаптера с антисмысловой цепью указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
6. Способ по п.1, где указанный сайт образования ника представляет участок смысловой цепи или антисмысловой цепи указанной молекулы кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
7. Способ по п.1, дополнительно включающий секвенирование указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты от указанного сайта образования ника указанного двухцепочечного адаптера.
8. Способ по п. 7, где указанное секвенирование включает (i) подвергание указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты реакции удлинения из указанного сайта образования ника указанного двухцепочечного адаптера для генерации растущей цепи, имеющей комплементарность последовательности, по меньшей мере, с участком цепи указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты и (ii) получение информации о последовательности, по меньшей мере, участка указанной растущей цепи.
9. Способ по п.8, где получение указанной информации о последовательности включает детектирование указанной, по меньшей мере, указанного участка указанной растущей цепи.
10. Способ по п.8, где указанная реакция удлинения включает приведение указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты в контакт с нуклеотидом, связанным с меткой, в условиях, достаточных для включения указанного нуклеотида в указанную растущую цепь, и где получение указанной информации о последовательности включает детектирование указанной метки.
11. Способ по п.10, дополнительно включающий высвобождение указанной метки из указанного нуклеотида после включения указанного нуклеотида в указанную растущую цепь.
12. Способ по п.8, где указанную реакцию удлинения проводят без использования олигонуклеотидного праймера.
13. Способ по п.8, где указанная реакция удлинения включает амплификацию по механизму катящегося круга.
14. Способ по п.7, где указанное секвенирование включает (i) подвергание указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты реакции расщепления от указанного сайта образования ника указанного двухцепочечного адаптера для расщепления, по меньшей мере, участка цепи указанной молекулы нуклеиновой кислоты и (ii) получение указанной информации о последовательности, по меньшей мере, указанного участка, указанной цепи.
15. Способ по п.14, где получение указанной информации о последовательности включает указанное детектирование, по меньшей мере, указанного участка, указанной цепи.
16. Способ по п.1, где указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает последовательность узнавания, дополнительно включающий обогащение указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты из пула случайных молекул нуклеиновой кислоты на основе, по меньшей мере, частично указанной последовательности узнавания.
17. Способ по п.16, где указанное обогащение включает (i) связывание фрагмента узнавания, имеющего комплементарность с указанной последовательностью узнавания, с указанной молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты с образованием комплекса узнавания и (ii) экстракцию указанного комплекса узнавания.
18. Способ по п.1, где указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты происходит или получена из биологического образца субъекта.
19. Способ по п.18, где указанный биологический образец включает бесклеточный биологический образец указанного субъекта.
20. Способ по п.18, где указанный биологический образец включает образец ткани указанного субъекта.
21. Способ по п.1, где указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает ДНК, комплементарную ДНК, их производное или их комбинацию.
22. Способ по п.1, где указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты включает РНК.
23. Реакционная смесь для обработки или анализа молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащая:
композицию, содержащую (i) указанную молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты и (ii) двухцепочечный адаптер, имеющий сайт образования ника внутри смысловой цепи или антисмысловой цепи указанного двухцепочечного адаптера; и
по меньшей мере, один фермент, который (i) связывает указанный двухцепочечный адаптер с указанной молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты и (ii) циклизует указанную молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты, связанную с указанным двухцепочечным адаптером, с генерацией молекулы кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
24. Реакционная смесь по п.23, где указанная реакционная смесь представляет собой бесклеточную реакционную смесь.
25. Реакционная смесь по п.23, где указанный, по меньшей мере, один фермент связывает (i) указанную смысловую цепь указанного двухцепочечного адаптера со смысловой цепью указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты или (ii) указанную антисмысловую цепь указанного двухцепочечного адаптера с антисмысловой цепью указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
26. Реакционная смесь по п.23, где указанный, по меньшей мере, один фермент лигирует указанный двухцепочечный адаптер с указанной молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
27. Реакционная смесь по п.23, где указанный, по меньшей мере, один фермент включает лигазу, рекомбиназу, полимеразу, их функциональный вариант или их комбинацию.
28. Реакционная смесь по п.23, где указанный сайт образования ника представляет собой участок смысловой цепи или антисмысловой цепи указанной молекулы кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
29. Реакционная смесь по п.23, дополнительно содержащая, по меньшей мере, второй фермент, который катализирует реакцию удлинения для генерации растущей цепи, имеющей комплементарность последовательности, по меньшей мере, с участком цепи указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
30. Реакционная смесь по п.29, где до связывания указанного двухцепочечного адаптера с указанной молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты указанный, по меньшей мере, указанный второй фермент генерирует указанную растущую цепь.
31. Реакционная смесь по п.29, где после связывания указанного двухцепочечного адаптера с указанной молекулой двухцепочечной нуклеиновой кислоты указанный, по меньшей мере, указанный второй фермент катализирует указанную реакцию удлинения от указанного сайта образования ника указанного двухцепочечного адаптера с генерацией указанной растущей цепи.
32. Реакционная смесь по п.31, дополнительно содержащая, по меньшей мере, один нуклеотид, связанный с меткой, где указанный, по меньшей мере, указанный второй фермент включает указанный нуклеотид в указанную растущую цепь.
33. Реакционная смесь по п.32, где указанный, по меньшей мере, указанный второй фермент высвобождает указанную метку из указанного нуклеотида после включения указанного нуклеотида в указанную растущую цепь.
34. Реакционная смесь по п.31, где указанный, по меньшей мере, указанный второй фермент, катализирует указанную реакцию удлинения без использования олигонуклеотидного праймера.
35. Реакционная смесь по п.23, дополнительно содержащая, по меньшей мере, третий фермент, который катализирует реакцию расщепления от указанного сайта образования ника указанного двухцепочечного адаптера для расщепления, по меньшей мере, участка цепи указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
36. Реакционная смесь по п.23, где указанная молекула двухцепочечной нуклеиновой кислоты содержит последовательность узнавания.
37. Реакционная смесь по п. 36, дополнительно содержащая фрагмент узнавания, который связывается с указанной последовательностью узнавания для обогащения, по меньшей мере, указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты из пула случайных молекул нуклеиновой кислоты в указанной композиции на основе, по меньшей мере, частично указанной последовательности узнавания.
38. Библиотека молекул кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, содержащая (i) домен двухцепочечной нуклеиновой кислоты, который связан с (ii) доменом двухцепочечного адаптера, который содержит сайт образования ника в смысловой цепи или антисмысловой цепь указанного домена двухцепочечного адаптера, где каждая молекула кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, составляющая, по меньшей мере, 5% указанной библиотеки, содержит последовательность узнавания.
39. Библиотека по п. 38, где указанный сайт образования ника находится в указанном домене двухцепочечного адаптера до связывания указанного домена двухцепочечного адаптера с указанным доменом двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
40. Библиотека по п. 38, где указанный домен двухцепочечной нуклеиновой кислоты и указанный домен двухцепочечного адаптера являются гетерологичными друг другу.
41. Библиотека по п.38, где указанная библиотека находится в бесклеточной композиции.
42. Библиотека по п.38, где каждая молекула кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, составляющая, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% указанной выбранной библиотеки, включает указанную последовательность узнавания.
43. Способ обработки или анализа молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты, включающий:
(а) обеспечение бесклеточной композиции, содержащей указанную молекулу кольцевой нуклеиновой кислоты, которая включает (i) область-мишень и (ii) сайт образования ника на известном расстоянии от указанной области-мишени; и
(b) генерацию ника в указанном сайте образования ника указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты.
44. Способ по п.43, где стадия (b) выполняется в бесклеточных условиях.
45. Способ по п.43, где указанная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулу двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
46. Способ по п.45, где указанный сайт образования ника представляет собой участок смысловой цепи или антисмысловой цепи указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты.
47. Способ по п.43, дополнительно включающий определение указанного сайта образования ника, по меньшей мере, частично на основе положения указанного сайта-мишени относительно, по меньшей мере, одной референсной последовательности.
48. Способ по п.47, где указанный сайт образования ника является эндогенным по отношению к указанной молекуле кольцевой нуклеиновой кислоты.
49. Способ по п.47, где указанный сайт образования ника является экзогенным по отношению к указанной молекуле кольцевой нуклеиновой кислоты, и где указанное определение включает инсерцию указанного экзогенного сайта образования ника в указанную молекулу кольцевой нуклеиновой кислоты.
50. Способ по п.43, дополнительно включающий секвенирование указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты.
51. Способ по п. 50, где указанное секвенирование включает (i) подвергание указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты реакции удлинения от указанного ника для генерации растущей цепи, имеющей комплементарность последовательности, по меньшей мере, с участком цепи указанной молекулой кольцевой нуклеиновой кислоты и (ii) получение информации о последовательности, по меньшей мере, участка указанной растущей цепи.
52. Способ по п.51, где получение указанной информации о последовательности включает указанное детектирование, по меньшей мере, указанного участка, указанной растущей цепи.
53. Способ по п.51, где указанная реакция удлинения включает приведение указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты в контакт с нуклеотидом, связанным с меткой, в условиях, достаточных для включения указанного нуклеотида в указанную растущую цепь, и где получение указанной информации о последовательности включает детектирование указанной метки.
54. Способ по п.53, дополнительно включающий высвобождение указанной метки из указанного нуклеотида после включения указанного нуклеотида в указанную растущую цепь.
55. Способ по п.51, где указанную реакцию удлинения проводят без использования олигонуклеотидного праймера.
56. Способ по п.51, где указанная реакция удлинения включает амплификацию по механизму катящегося круга.
57. Способ по п. 50, где указанное секвенирование включает (i) подвергание указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты реакции расщепления от указанного ника для расщепления, по меньшей мере, участка цепи указанной молекулы двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и (ii) получение информации об указанной последовательности, по меньшей мере, указанного участка, цепи.
58. Способ по п.57, где получение указанной информации о последовательности включает указанное детектирование, по меньшей мере, указанного участка, указанной цепи.
59. Способ по п.43, где указанная молекула кольцевой нуклеиновой кислоты содержит последовательность узнавания, дополнительно включающий обогащение указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты из пула случайных молекул нуклеиновой кислоты на основе, по меньшей мере, частично указанной последовательности узнавания.
60. Способ по п.59, где указанное обогащение включает (i) связывание фрагмента узнавания, имеющего комплементарность с указанной последовательностью узнавания, с указанной молекулой кольцевой нуклеиновой кислоты с образованием комплекса узнавания и (ii) экстракцию указанного комплекса узнавания.
61. Реакционная смесь для обработки или анализа молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты, содержащая:
бесклеточную композицию, содержащую указанную молекулу кольцевой нуклеиновой кислоты, которая включает (i) сайт-мишень и (ii) сайт образования ника на известном расстоянии от указанного сайта-мишени; и
по меньшей мере, один фермент, который генерирует ник в указанном сайте образования ника указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты.
62. Реакционная смесь по п.61, где указанная реакционная смесь представляет собой бесклеточную реакционную смесь.
63. Реакционная смесь по п.61, где указанный ник находится в смысловой цепи или антисмысловой цепи указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты.
64. Реакционная смесь по п.61, где указанный сайт образования ника является эндогенным по отношению к указанной молекуле кольцевой нуклеиновой кислоты.
65. Реакционная смесь по п.61, где указанный сайт образования ника является экзогенным по отношению к указанной молекуле кольцевой нуклеиновой кислоты.
66. Реакционная смесь по п.61, дополнительно содержащая, по меньшей мере, второй фермент, который катализирует реакцию удлинения от указанного ника для генерации растущей цепи, имеющей комплементарность последовательности, по меньшей мере, с участком указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты.
67. Реакционная смесь по п.66, где указанная молекула кольцевой нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и где указанная растущая цепь имеет комплементарность последовательности, по меньшей мере, с участком цепи указанной молекулой кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
68. Реакционная смесь по п.66, где указанный, по меньшей мере, указанный второй фермент катализирует указанную реакцию удлинения без использования олигонуклеотидного праймера.
69. Реакционная смесь по п. 66, где указанный, по меньшей мере, указанный второй фермент включает полимеразу.
70. Реакционная смесь по п.61, дополнительно содержащая, по меньшей мере, третий фермент, который катализирует реакцию отщепления от указанного ника для расщепления, по меньшей мере, участка указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты.
71. Реакционная смесь по п.61, где указанная молекула кольцевой нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты, и где указанный, по меньшей мере, указанный третий фермент расщепляет, по меньшей мере, участок цепи указанной молекулы кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты.
72. Реакционная смесь по п.61, где указанная молекула кольцевой нуклеиновой кислоты содержит последовательность узнавания.
73. Реакционная смесь по п. 72, дополнительно содержащая фрагмент узнавания, который связывается с указанной последовательностью узнавания, для обогащения, по меньшей мере, указанной молекулы кольцевой нуклеиновой кислоты из пула случайных молекул нуклеиновой кислоты в указанной композиции на основе, по меньшей мере, частично указанной последовательности узнавания.
74. Реакционная смесь по п.73, где указанный фрагмент узнавания включает, по меньшей мере, один олигонуклеотид, имеющий комплементарность, по меньшей мере, с указанной последовательностью узнавания.
75. Бесклеточная библиотека молекул кольцевых нуклеиновых кислот, где каждая отдельная молекула кольцевой нуклеиновой кислоты, составляющая не менее 5% указанной библиотеки, включает (i) сайт-мишень и (ii) ник на известном расстоянии от указанного сайта-мишени.
76. Бесклеточная библиотека по п.75, где каждая отдельная молекула кольцевой нуклеиновой кислоты составляющая, по меньшей мере, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% указанной библиотеки, включает (i) указанный сайт-мишень и (ii) указанный ник на указанном известном расстоянии от указанного сайта-мишени.
77. Бесклеточная библиотека по п.75, где указанная отдельная молекула кольцевой двухцепочечной нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность узнавания.
78. Бесклеточная библиотека по п.75, где (i) первый сайт-мишень первой отдельной молекулы нуклеиновой кислоты и (ii) второй сайт-мишень второй отдельной молекулы нуклеиновой кислоты являются одинаковыми.
79. Бесклеточная библиотека по п. 78, где (i) первое известное расстояние между первым ником и первым сайтом-мишенью указанной первой отдельной молекулы нуклеиновой кислоты и (ii) второе известное расстояние между вторым ником и вторым сайтом-мишенью указанной второй отдельной молекулы нуклеиновой кислоты являются одинаковыми.
80. Бесклеточная библиотека по п. 78, где (i) первое известное расстояние между первым ником и первым сайтом-мишенью указанной первой отдельной молекулы нуклеиновой кислоты и (ii) второе известное расстояние между вторым ником и вторым сайтом-мишенью указанной второй отдельной молекулы нуклеиновой кислоты являются разными.
81. Бесклеточная библиотека по п.75, где (i) первый сайт-мишень первой отдельной молекулы нуклеиновой кислоты и (ii) второй сайт-мишень второй отдельной молекулы нуклеиновой кислоты являются разными.
82. Бесклеточная библиотека по п.81, где (i) первое известное расстояние между первым ником и первым сайтом-мишенью указанной первой отдельной молекулы нуклеиновой кислоты и (ii) второе известное расстояние между вторым ником и вторым сайтом-мишенью указанной второй отдельной молекулы нуклеиновой кислоты являются одинаковыми.
83. Бесклеточная библиотека по п.81, где (i) первое известное расстояние между первым ником и первым сайтом-мишенью указанной первой отдельной молекулы нуклеиновой кислоты и (ii) второе известное расстояние между вторым ником и вторым сайтом-мишенью указанной второй отдельной молекулы нуклеиновой кислоты являются разными.