Способ хирургического лечения дефектов роговицы при лимбально-клеточной недостаточности
METHOD FOR SURGICAL TREATMENT OF CORNEAL DEFECTS IN LIMBAL CELL INSUFFICIENCY

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для лечения дефектов роговицы при лимбально-клеточной недостаточности с целью восстановления анатомической целостности роговичного эпителия за счет трансплантации аутологичных прогениторных клеток нероговичного происхождения.
Лимб - это переходная зона между прозрачной роговицей и непрозрачной склерой [Van Buskirk, Е.М. The Anatomy of the Limbus // Eye. 1989., Vol. 3, N. 2. P. 101-108.]. Лимбальные стволовые клетки (ЛСК) - это взрослые унипотенные прогениторные клетки, которые далее дифференцируются в эпителий роговицы [Davanger М., Evensen A. Role of the pericorneal papillary structure in renewal of corneal epithelium // Nature. 1971. 229(5286) P. 560-561.] Функциональные ЛСК необходимы для поддержания целостности поверхности и прозрачности роговицы. При дефиците ЛСК нарушается процесс возобновления эпителия роговицы, что приводит к персистирующим повреждениям роговицы, к утрате естественного барьера между конъюнктивой и эпителием роговицы. В этих условиях происходит инвазия конъюнктивы на поверхность роговицы (конъюнктивизация) и замещение многослойного плоского эпителия роговицы на фиброваскулярную ткань. Изменение поверхности роговицы приводит к снижению зрения, светобоязни, блефароспазму, хроническому болевому синдрому. При персистирующих и рецидивирующих эрозиях роговицы возрастает риск изъязвления и перфорации роговицы [Dua H.S., Saini J.S., Azuara-Blanco A., Gupta P. Limbal stem cell deficiency: concept, aetiology, clinical presentation, diagnosis and management. Indian J. Ophthalmol. 2000. Vol. 48, N. 2, P. 83-92.].
При частичной лимбально-клеточной недостаточности (ЛКН) в качестве хирургического метода лечения применяется механическое удаление конъюнктивального эпителия, после чего восстановление эпителия роговичного типа в дальнейшем возможно из оставшегося интактного лимбального эпителия [Dua H.S., Gomes J.A.P., Singh A. Corneal epithelial wound healing. Br J Ophthalmol. 1994. Vol. 78, P. 401-408].
У пациентов с тотальной лимбально-клеточной недостаточностью для реконструкции поверхности роговицы проводится лимбальная ауто- (limbal autograft transplantation - англ.) или аллотрансплантация (limbal allograft transplantation - англ.), направленная на пересадку нового источника ЛСК [Dua H.S., Saini J.S., Azuara-Blanco A., Gupta P. Limbal stem cell deficiency: concept, aetiology, clinical presentation, diagnosis and management. Indian J. Ophthalmol. 2000. Vol. 48, N. 2, P. 83-92.].
При аутолимбальной транспалнтации из-за аутологичной природы донорского материала отсутствует проблема отторжения трансплантата. Поэтому этот метод признан методом выбора при лечении односторонней ЛКН, когда парный глаз может выступать в качестве источника донорских ЛСК. Однако в данном случае сохраняется риск развития ятрогенной лимбально-клеточной недостаточности на глазу-доноре при заборе лимбальной ткани размером больше четырех часовых меридианов, а в случае возникновения рецидива ЛКН на глазу-реципиенте повторный забор донорской ткани с парного глаза увеличивает этот риск в несколько раз.
При двусторонней лимбально-клеточной недостаточности донорская ткань может быть получена от живого донора-родственника или от кадаверного источника - лимбальный аллотрансплантат [Дубовиков А.С., Гаврилюк И.О., Куликов А.Н., Чурашов С.В., Черныш В.Ф., Безушко А.В. Лимбальная недостаточность: этиология, патогенез, принципы и перспективы хирургического лечения. Российский офтальмологический журнал. 2019. Т. 12, №. 1, С. 103-111]. Однако аллотрансплантация не лишена недостатков, связанных с проблемой гистосовместимости тканей донора и реципиента, которая в определенной степени решается только при помощи системной иммуносупрессии, оказывающей на общее состояние организма негативное влияние. Но стоит отметить, она не исключает проблему рецидивов конъюнктивизации роговицы ввиду остающейся достаточно высокой вероятности отторжения трансплантата.
Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ лечения ЛКН с помощью трансплантации на роговицу культивированных аутологичных лимбальных клеток на вазелиновой марле и мягкой контактной линзе в качестве носителя [Pellegrini G., Traverso С.Е., Franzi А.Т., et al. Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium. Lancet. 1997. V. 349, P. 990-993. doi: 10.1016/S0140-6736(96)11188-0; PMID: 9100626]. Данный способ эффективен для лечения ЛКН, однако его недостатками является, то, что применение данного метода возможно только при односторонней лимбально-клеточной недостаточности, процесс культивирования лимбальных клеток является длительным и дорогостоящим, существует высокий риск возникновения мутаций в клетках в процессе их культивирования, а также сохраняется риск развития ятрогенной ЛКН на глазу-доноре.
Задачей изобретения является совершенствование способа лечения ЛКН путем применения минимально манипулированных клеток буккального эпителия.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является снижение риска возникновения мутаций с ускорением регенерации в зоне лимба.
Технический результат достигается за счет наложения на поверхность роговицы биоконструкции, состоящей из мягкой контактной линзы, минимально манипулированных аутологичных прогениторных клеток буккального эпителия на коллагеновом биосовместимом носителе.
Минимально манипулированные клетки стали использоваться в транспланталогии как клетки, предназначенные для замещения (выполнения) присущих им функций в организме, которые получены (заготовлены) из биологического материала в результате его измельчения, гомогенизации, энзиматической обработки, удаления нежелательных компонентов, селективного отбора клеток, и (или) их обработки с целью удаления консервирующих (пресервирующих) агентов в случае их хранения и которые не содержат иных субстанций (объектов) за исключением воды, кристаллоидов, стерилизующих, консервирующих и (или) пресервирующих агентов, а также биологический материал для их получения (заготовки)» (http://publication.pravo.gov.ru/Document/View/0001202012010034).
Минимально манипулированные клетки используются для восстановления различных тканей вместо культивированных клеток (Ahn, Hyunjun; Lee, Sang Yeon; Jung, Won Ju; Lee, Kye-Ho (2021). "Alopecia treatment using minimally manipulated human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Three case reports and review of literature". World Journal of Clinical Cases. 9 (15): 3741-3751. doi:10.12998/wjcc.v9.il5.3741. Di Matteo, В.; Vandenbulcke, F.; Vitale, N.D.; Iacono, F.; Ashmore, K.; Marcacci, M.; Kon, E. (2019). "Minimally Manipulated Mesenchymal Stem Cells for the Treatment of Knee Osteoarthritis: A Systematic Review of Clinical Evidence". Stem Cells International. 2019: 1735242. doi: 10.1155/2019/1735242).
В предлагаемом способе используются прогениторные минимально манипулированные клетки буккального эпителия.
Слизистая оболочка ротовой полости и эпителий роговицы имеют схожее строение. Низкодифференцированные (прогениторные) клетки базального слоя слизистой оболочки полости рта обладают высокой пролиферативной способностью, низкой иммуногенностью, стимулирующим воздействием на процессы регенерации и репарации при повреждении ткани, а также легкодоступны для выделения. Исходя из этого, применение минимально манипулированных аутологичных клеток буккального эпителия в качестве источника прогениторных клеток является альтернативным методом восстановления глазной поверхности при двусторонней ЛКН. Таким образом, покрытие роговицы эпителием роговичного типа и восстановление прозрачности роговицы происходит за счет паракринного и заместительного действия клеток слизистой оболочки полости рта (буккальных клеток).
Минимально манипулированные аутологичные клетки буккального эпителия размещают на повязке на основе коллагена типа I лиофилизированный (регистрационное удостоверение от 14.12.2009 №ФСР 2009/06370), поскольку коллагеновые материалы характеризуется низкой иммуногенностью, отсутствием видоспецифичности, стимулирующим влиянием на процессы репаративной регенерации в тканях. Ускорение процессов ранозаживления происходит за счет создания оптимальной для заживления раны среды, ускорения появления в тканях раны «прорегенераторных» М2-макрофагов, секретирующих различные факторы роста, снижения выраженности воспаления. Также коллаген может с умеренной аффинностью связывать и, тем самым, защищать от расщепления стимулирующие репарационный процесс ростовые факторы [Somasundaram R, Schuppan D. Type I, II, III, IV, V, and VI collagens serve as extracellular ligands for the isoforms of platelet-derived growth factor (AA, BB, and AB). Journal of Biological Chemistry. 1996;43(271):26884-26891]. Еще один механизм действия связан со способностью образующихся при расщеплении коллагена пептидов стимулировать репарационные процессы [Misiura М, Miltyk W. Proline-containing peptides - New insight and implications: A Review. BioFactors. 2019;45:6:857-866. https://doi.org/10.1002/biof.1554]. Таким образом, лиофилизированная повязка на основе коллагена I типа является не только биосовместимым носителем буккальных клеток, но и способствует в сочетании с минимально манипулированными клетками скорейшему ранозаживлению.
Контактная линза, как и в ближайшем аналоге, фиксирует конструкцию.
Способ осуществляют следующим образом.
На роговице размещают мягкую контактную линзу в качестве носителя биоконструкции из 500 мкл суспензии минимально манипулированных прогениторных клеток буккального эпителия в количестве 500 тыс.клеток на основе в виде лиофилизированного коллагена 1 типа сроком на 5 суток. При сохранении обширного дефекта манипуляцию повторяют.
Были проведены экспериментальные исследования на 12 экспериментальных кроликах.
2
Получение ткани осуществляли из слизистой щеки у кроликов породы шиншилла весом 2-2,5 кг. Забор биоптата проводили в состоянии медикаментозного сна животного (Раствор Тилетамина гидрохлорида 250 мг и золазепама гидрохлорида 250 мг (золетил 100) в дозе 15 мг/кг, 2% раствор ксилазина гидрохлорида (рометара) в дозе 5,0 мг/кг в/м). Производили иммобилизацию верхней губы кролика с помощью халязионного пинцета по Десмарру. Слизистую оболочку отслаивали путем введения 2,0 мл раствора лидокаина 2%, затем скальпелем выкраивали лоскут 5×5 мм. Лоскут отсекали от подлежащей ткани и помещали в стерильный контейнер с питательной средой. В месте выкраивания лоскута производили гемостаз механическим прижатием стерильной марлевой салфеткой. Образцы биоптата щеки инкубировали в 0,25% растворе диспазы в течение 8 часов при температуре 4°С. Далее механически отделяли эпителиальный пласт, который подвергали ферментативной обработке с помощью 0,25% раствора трипсина и дополнительно измельчали с помощью скальпеля и путем многократного пипетирования. Действие трипсина инактивировали добавлением культуральной сыворотки, затем проводили двукратное центрифугирование при 300 g в течение 10 минут. Супернатант удаляли, а осадок клеток ресуспендировали в 0,5 мл культуральной среды DMEM/F12 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки и антибиотика-антимикотика. Общее число клеток составляло 500 тысяч. Данное количество клеток обусловлено необходимостью достижения наиболее плотного заполнения клетками коллагеновой подложки без нарушения их структурной целостности. Было показано, что 500 мкл суспензии клеток является достаточной для пропитывания всей площади коллагеновой подложки на линзе, при большем объеме часть суспензии не контактирует с подложкой и теряется. В процессе морфофункционального исследования было показано, что при пропитывании 500 мкл суспензии общее количество клеток буккального эпителия на подложке составляет 500-600 тыс. Было проведено исследование цитокинового состава клеток буккального эпителия, а также их секретома (факторов, выделенных в процессе культивирования). Было показано, что после 3 суток культивирования клетки буккального эпителия практически не выделяют в среду ростовых факторов, при этом в составе клеток ростовые факторы присутствуют. Уровень фактора роста FGF (фактор роста фибробластов) составлял 28 [17; 30] пг/мл в пересчете на 100 тыс.клеток буккального эпителия, уровень тромбоцитарного фактора роста PDGF - 57 [50; 70] пг. По нашим данным, репаративный и регенеративный эффект проявляется, если общий расчетный уровень PDGF в биоконструкции составляет от 300 пг и выше. При содержании клеток буккального эпителия 500 тыс. уровень будет составлять от 285 до 342 пг, что является достаточным для стимуляции репаративных процессов. Таким образом, было доказано, что количество клеток на подложке должно составлять 500 тысяч клеток в 500 мкл суспензии.
Получение биоконструкции.
Биоконструкция состоит из трех основных компонентов: подложка (мягкая контактная линза), биосовместимый носитель (лиофилизированная коллагеновая повязка из коллагена I типа), минимально манипулированные клетки буккального эпителия.
Из лиофилизированной коллагеновой повязки (коллаген I типа) формировали трансплантат округлой формы диаметром 2 см, который помещали на контактную линзу. Суспензию клеток буккального эпителия кролика (500 тысяч клеток) в 500 мкл питательной среды DMEM/F12 наносили на подготовленные контактные линзы.
2
2
Биоконструкцию с минимально манипулированными клетками помещали в СО инкубатор при 37°С и 5% СО на 15-20 минут. После этого биоконструкция была готова для применения.
Для изучения влияния трансплантации полученной комбинированной биоконструкции на поврежденную ткань роговицы использовали экспериментальную модель механической лимбально-клеточной недостаточности. Для этого выполняли тотальное механическое удаление роговичного эпителия скребком. Контроль качества деэпителизации проводили с помощью прокрашивания роговичной поверхности 1% раствором флюоресцеина натрия. Далее микрохирургическим алмазным лезвием с регулируемой микроподачей на 2,0 мм центральнее лимба выполняли круговой надрез роговицы на глубину 0,2 мм. Затем проводили круговую перитомию конъюнктивы периферичнее лимба на 2,0 мм. После этого в пределах этих двух круговых надрезов отсепаровывали роговично-конъюнктивальный лоскут в виде ленты толщиной около 0,2 мм и шириной 4,0 мм. Затем производили удаление мигательной перепонки. Для предупреждения присоединения вторичной инфекции в послеоперационном периоде инсталлировали в конъюнктивальную полость антисептик (Бактавит) и антибиотик (Левофлоксацин). Через 1 месяц формировался фиброваскулярный паннус - модель ЛКН. Затем выполняли поверхностную кератэктомию путем отсепаровки паннуса от стромы роговицы до прозрачных слоев. На область дефекта укладывали комбинированную биоконструкцию, содержащую клетки буккального эпителия на лиофилизированной коллагеновой повязке, уложенной на мягкую контактную линзу. После наложения биоконструкции, лабораторному животному производили временную латеральную блефарорафию одним П-образным швом нитью 8/0 на 5 суток. Наблюдали за процессом регенерации поврежденной роговицы по сравнению с контролем.
Экспериментальный пример:
Кролик №1 вес 2,5 кг.
Наркоз SoLRometari 0,4 Sol.Zoletili 0,4.
OD - опытный глаз.
При помощи ножа-кератома 2,3 мм и роговичного пинцета выполняли поверхностную кератэктомия путем отсепаровки фиброваскулярного паннуса от стромы роговицы до прозрачных слоев и отсечения паннуса единым лоскутом с помощью роговичных ножниц. После проведения кератэктомии на опытные глаза помещали комбинированную биоконструкцию, содержащую 500 мкл суспензии с минимально манипулированными буккальными клетками - 500 тыс. клеток. Некровавая блефарорафия.
OS - контроль.
При помощи ножа-кератома 2,3 мм и роговичного пинцета выполняли поверхностную кератэктомию путем отсепаровки фиброваскулярного паннуса от стромы роговицы до прозрачных слоев и отсечения паннуса единым лоскутом с помощью роговичных ножниц. После проведения кератэктомии на опытные глаза помещали только мягкую контактную линзу. Некровавая блефарорафия.
В течение 14 дней в оба глаза проводили инсталляции антибактериальных капель - Левофлоксацин для профилактики вторичного инфицирования.
Через 5 суток сняли швы с контрольного и опытного глаз, удалили мягкую контактную линзу, объективно: эпителизация отсутствует, прозрачность роговицы составила 7 баллов согласно шкале Войно-Ясенецкого, неоваскуляризация 3 балла (по Inatomi Т., 2006 г.). В течение последующих 14 дней инсталлировали в оба глаза антибактериальные капли, в контрольный глаз еще и кератопротектор (декспантенол). На 14 сутки после операции площадь деэпителизированной поверхности роговицы на опытном глазу составила 22,73%, неоваскуляризация роговицы 2 балла, прозрачность 5 баллов. На контрольном глазу площадь дефекта составила 61,01%, неоваскуляризация 4 балла, прозрачность 6-7 баллов. На 30 сутки в опытном глазу эрозия сократилась до 4,27%, неоваскуляризация - 2 балла, прозрачность 6 баллов, на контрольном глазу площадь эрозии составила 12,7%, неоваскуляризация - 4 балла, прозрачность - 7-8 баллов. На 60 сутки отмечался рецидив эрозии на контрольном глазу, площадь деэпителизированной поверхности роговицы составила 18,84% на контрольном глазу и 2,5% в опыте, неоваскуляризация соответствовала 3 баллам на контрольном и 2 баллам на опытном глазах, а прозрачность роговицы в опыте была равна 5 баллам, а в контроле - 7 баллам.
Анализ показал наличие явных различий в скорости эпителизации дефекта роговицы, неоваскуляризации и прозрачности роговицы при применении биоконструкции с минимально манипулированными клетками буккального эпителия.
Экспериментальные исследования послужили обоснованием для применения способа в клинических условиях.
Клинический пример 1
Пациент Р., 35 лет. Диагноз: Лимбально-клеточная недостаточность - рецидивирующая эрозия, частичный фиброваскулярный паннус, последствие химического (щелочной) ожога роговицы и конъюнктивы правого глаза Со слов пациента шесть месяцев месяца назад в правый глаз попал растворитель, появилась боль, зрение резко снизилось, глаз покраснел. В тот же день по скорой помощи был доставлен в больницу по месту жительства, где был выставлен диагноз: Химический ожог роговицы и конъюнктивы правого глаза. Пациент проходил длительное лечение в стационаре по поводу ожоговой эрозии роговицы. Получал противовоспалительную, репаративную терапию, проведено хирургическое лечение в виде амниопластики с временной тарзорафией. На фоне проводимого лечения отмечалась положительная динамика в виде эпителизации роговицы, однако в последующем неоднократно возникали рецидивирующие эрозии, появилась конъюнктивизация роговицы. Лечился консервативно по месту жительства. Через 6 месяцев в период очередного рецидива эрозии обратился в кабинет неотложной помощи «НМИЦ ГБ имени Гельмгольца», откуда был госпитализирован по неотложным показаниям с диагнозом: Лимбально-клеточная недостаточность, рецидивирующая эрозия, последствие химического (щелочной) ожог роговицы и конъюнктивы 3 ст. правого глаза.
При поступлении пациент предъявлял жалобы на снижение зрения, боли в глазу, светобоязнь, умеренный блефароспазм. Острота зрения правого глаза - 0,05 эксцентрично н/к. Конъюнктива умеренно гиперемирована, роговица отечная в нижне-наружном квадранте, где определяется эрозия 5.0×4.0 мм, в верхней половине определяется фиброваскулярный паннус. В день поступления у пациента произвели забор лоскута слизистой щеки для изготовления биоконструкции с 500 мкл суспензии минимально манипулированных аутологичных клеток буккального эпителия - 500 тыс. клеток. На следующий день в условиях операционной на правом глазу провели снятие фиброваскулярного паннуса с поверхности роговицы с последующим наложением на мягкой контактной линзе комбинированной биоконструкции с суспензией аутологичных прогениторных клеток буккального эпителия - 500 тыс. клеток на основе из лиофилизированного коллагена 1 типа, сроком на 5 суток. В послеоперационном периоде проводилась местная антибактериальная и противовоспалительная терапия. Через 5 суток швы с век сняты, биоконструкция удалена. Отмечали улучшение в виде значительного сокращения площади эрозии, отсутствия конъюнктивизации. Сохранялся отек роговицы. К 14 суткам после лечения биоконструкцией удалось добиться полной эпителизации роговицы и повышения остроты зрения правого глаза до 0,15-0,2 н/к на фоне консервативной терапии. Пациент выписан для динамического наблюдения.
Клинический пример 2
Пациентка А., 41 год. Диагноз: Лимбально-клеточная недостаточность - тотальный фиброваскулярный паннус, последствие термохимического (горячая кислота) ожога роговицы и конъюнктивы правого глаза.
Со слов пациентки 1 год назад в левый глаз на производстве попала горячая серная кислота. С жалобами на сильную боль, резкое снижение зрения по скорой помощи была доставлена в больницу по месту жительства, где был выставлен диагноз: термохимический ожог роговицы и конъюнктивы левого глаза. При поступлении проведена ПХО, некрэктомия, трансплантация амниотической мембраны. В последующем пациентка проходила длительное и неоднократное лечение в стационаре по поводу ожоговой болезни. Получала противовоспалительную, репаративную терапию, проводилось хирургическое лечение в виде амниопластики с временной блефарорафией. На фоне проводимого лечения на роговице сформировался тотальный фиброваскулярный паннус (тотальная конъюнктивизация роговицы). Через 12 месяцев после ожога обратилась в «НМИЦ ГБ имени Гельмгольца», для определения дальнейшей тактики лечения. Госпитализирована в плановом порядке с диагнозом: Лимбально-клеточная недостаточность - тотальный фиброваскулярный паннус, последствие термохимического ожога роговицы и конъюнктивы левого глаза.
При поступлении пациентка предъявляла жалобы на значительное снижение зрения. Острота зрения левого глаза - pr.l.certa н/к. Конъюнктива бледно-розовая, всю площадь роговицы покрывает фиброваскулярный паннус. В день поступления у пациентки выполнили забор лоскута слизистой щеки для изготовления биоконструкции, содержащей суспензию с минимально манипулированными аутологичными клетками буккального эпителия. На следующий день в условиях операционной на левом глазу провели снятие фиброваскулярного паннуса с поверхности роговицы с последующим наложением комбинированной биоконструкции с 500 мкл суспензии, содержащей 500 тыс. аутологичных прогениторных клеток буккального эпителия на основе из лиофилизированного коллагена 1 типа, размещенной на МКЛ сроком на 5 суток. В послеоперационном периоде проводилась местная антибактериальная и противовоспалительная терапия. Через 5 суток биоконструкция удалена. Отмечали улучшение в виде повышения прозрачности роговицы до 6 баллов (по шкале прозрачности роговицы Войно-Ясенецкого), начальной периферической эпителизации, улучшения остроты зрения до 0,05 н/к. В связи с сохранившемся обширным дефектом эпителия через 10 суток после хирургического лечения было принято решение о повторной трансплантации комбинированной биоконострукции сроком на 5 суток. К 14 суткам после повторного лечения биоконструкцией удалось добиться полной эпителизации роговицы и повышения остроты зрения правого глаза до 0,1 н/к на фоне консервативной терапии. Пациентка выписана для динамического наблюдения.
Таким образом, предложенный способ лечения лимбально-клеточной недостаточности с помощью биоконструкции, содержащей суспензию минимально манипулированных прогениторных клеток буккального эпителя на основе в виде лиофилизированного коллагена 1 типа с размещением на мягкой контактной линзе получить удовлетворительный лечебный эффект без использования культуры лимбальных клеток, процесс получения которой является длительным и дорогостоящим, а также позволяет исключить риск возникновения мутаций в клетках в процессе их культивирования и возможность использования на обоих глазах, культивирования лимбальных клеток является длительным и дорогостоящим, существует высокий риск возникновения мутаций в клетках в процессе их культивирования, а также сохраняется риск развития ятрогенной ЛКН на глазу-доноре.