СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ НАНОФОРМЫ ТРАНСРЕЗВЕРАТРОЛА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ГОРМОНОЗАВИСИМЫХ ПРОЛИФЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ, В ТОМ ЧИСЛЕ ОПУХОЛЕЙ
METHOD OF APPLYING TRANS-RESVERATROLE NANO-FORM FOR TREATMENT AND PREVENTION OF HORMONE-DEPENDENT PROLIFERATIVE PROCESSES, INCLUDING TUMOURS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области медицины, а именно онкологии, биотехнологии, клинической биохимии, фармакологии. Изобретение основано на применении наноформы трансрезвератрола для лечения и профилактики гормонозависимых опухолей. Изобретение может быть использовано для лечения и профилактики эстроген-зависимых и андроген-зависимых пролиферативных процессов, в том числе с онкологическим потенциалом. Изобретение может применяться для лечения и профилактики заболеваний, выбранных из группы (не ограничивающих объема изобретения): рак молочной железы, рак шейки и тела матки, фибромиомы, рак яичника, рак эндометрия, эндометриоз, аденомиоз, аденома предстательной железы, рак предстательной железы.
Уровень техники
Известна система доставки веществ (в том числе и резвератрола) на основе наночастиц, применяющейся с целью замедления старения (Патент США 7,320,797). Известна система доставки на основе наночастиц веществ, обладающих противовоспалительными свойствами (в том числе и резвератрола) (Патент США №7,179,477). Эти системы доставки используются с другим назначением, в косметике, и не направлены на противоонкологическую защиту или лечение.
Известны системы доставки резвератрола на основе нанолипосом (Wang et al., 2007), и наночастиц из хитозана (Yao et al., 2006). Данные транспортные системы направлены на улучшение биодоступности резвератрола, увеличивая его всасывание в тонком кишечнике. При этом эти системы доставки не направлены на противоонкологическую защиту или профилактику.
Известно применение фитохимической композиции, в состав которой входит резвератрол, для профилактики онкологических заболеваний (Патент США №7,455,860). Недостатком данного способа является то, что в данной композиции трансрезвератрол не используется.
Известно применение композиции, содержащий резвератрол, с целью применения на фоне лечения таких заболеваний, как инфекционные (в том числе вирусные), а также опухоли (патент США №6,767,563). Однако композиция применяется с другим назначением - для коррекции иммунной системы.
Известна транспортная система на основе липосомальных форм резвератрола и куркумина, направленная на лечение рака предстательной железы (Narayanan et al., 2009). Недостатком данной транспортной системы является то, что пероральный прием липосомального варианта неэффективен - лекарство непременно подвергнется деградации в ЖКТ. Поэтому для этого варианта существует ограничение - только внутривенное введение. Кроме того, липосомальный вариант обладает худшей стабильностью, по сравнению с таковой у наночастиц из биодеградируемых материалов.
Известна система доставки резвератрола в опухолевые клетки на основе биодеградируемых наночастиц (Shao et al., 2009). Однако в этих системах не используется трансрезвератрол, что снижает противоопухолевую активность наночастиц.
Доказательства соответствия изобретательскому уровню
Таким образом, известны отдельные косметические композиции и транспортные системы, содержащие резвератрол. Одни из них представлены в виде наночастиц или липосом, но используются с другим назначением. Кроме того, во всех заявленных композициях и системах доставки трансрезвератрол не применяется.
Таким образом, применение трансрезвератрола в виде наноформы на основе наночастиц из биодеградируемых полимеров для лечения и профилактики онкологических заболеваний предложено авторами впервые.
Возможность осуществления изобретения
Резвератрол - широкоизвестное соединение природного происхождения, относящееся к классу фитоалексинов. Данное вещество вызывает широчайший интерес благодаря широчайшему спектру биологических активностей - антиоксидантной, антипролиферативной, противовоспалительной, бактерицидной, иммуностимулирующей и т.д.
Существует два природных изомера резвератрола - транс- и цис-форма. Последняя образуется из трансрезвератрола под действием ультрафиолетового облучения и других про-оксидантных условий, что приводит к образованию изоформы с потерей части биологических функций. Одной из существенных потерь является утрата цис-резвератролом функции стимулирования т.н. «сиртуинов» (SIRT), осуществляющие множество противоопухолевых активностей. Показано, что в опухолях существует дефицит экспрессии сиртуинов, в то время как эндогенная стимуляция их экспрессии способствует ослаблению агрессивности опухолей и их регрессу (Deng, 2009). Поэтому существует реальная необходимость в использовании именно трансрезвератрола.
Как противоопухолевая субстанция, трансрезвератрол обладает избирательной активностью, которая выражается в стимуляции апоптоза (гибели) опухолевых клеток и защитой от апоптоза клеток нормальных (Bishayee, 2009). Одной из наиболее удачных форм для транспорта трансрезвератрола в клетки-мишени является создание наносомального варианта этого вещества. Причиной для создания наноформы является уход от проблемы, связанной с низкой биодоступностью нативного резвератрола in vivo (Walle et al., 2004), а также более высокая цитотоксичность наноформы резвератрола по отношению к опухолевым клеткам по сравнению с его нативным вариантом (Shao et al., 2009).
Транс-резвератрол обладает антиэстрогенным и антиандрогенным эффектами. Антиэстрогеновая активность трансрезвератрола опосредуется через ингибирование ароматазы (Wang et al., 2006), выраженного антагонизма к рецептору эстрогенов (в присутствии эстрона) (Bhat et al., 2001). Кроме того, транс-резвератрол является субстратом для одной из изоформ цитохрома Р450, - CYP1B1. В результате метаболизма резвератрола данным ферментом получается производное, пицеатанол, обладающий про-апоптотическим свойством в отношении гормонозависимых опухолей (Potter et al., 2002).
Антиандрогеновый эффект трансрезвератрола проявляется в блокировании экспрессии рецепторов к андрогенам в опухолевых клетках (Gao et al., 2004; Jones et al., 2005; Harada et al., 2007), ингибировании фосфоинозитол-3-киназного пути (Benitez et al., 2007), множества других пролиферативных путей.
Общий, неспецифический противоопухолевый эффект трансрезвератрола проявляется в блокировании миграции и инвазии опухолевых клеток (Tang et al., 2008), индукции их апоптоза (Bishayee, 2009), блокаде фактора активации транскрипции активных в опухолях генов NF-kB (Benitez et al., 2009).
Постановка задачи
Изобретательской задачей является создание более универсальной и эффективной транспортной формы трансрезвератрола для воздействия на гормонозависимые пролиферативные процессы женской и мужской репродуктивной системы, в том числе и в опухолевых тканях, для профилактики и лечения нежелательной пролиферации в таких органах-мишенях эстрогенов (матка, шейка матки, молочная железа, яичники) и андрогенов (предстательная железа).
Раскрытие изобретения.
Задача решается тем, что предлагается новая транспортная форма на основе наночастиц, в которой активный ингредиент представлен трансрезвератролом.
Трансрезвератрол получают путем де-ацетилирования триацетилированного производного резвератрола, который, в свою очередь, является результатом каталитического превращения продукта реакции между стиреновым производным и 4-бромо-фенолацетатом (DCM Nutritional Products, Ltd, Швейцария).
Заявленную транспортную наноформу трансрезвератрола получают путем соосаждения полимеров в водном растворе поверхностно-активного вещества.
Система доставки трансрезвератрола может быть реализована также с использованием других транспортных систем или коллоидных носителей, не ограничивающих объема изобретения: полимерные матрицы, гели, проницаемые мембраны, осмотические системы, микрочастицы, липосомы, микросферы, либо их комбинация.
Примеры осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение наноформы трансрезвератрола
В работе использовали: Трансрезвератрол - (DCM Nutritional Products, Ltd, Швейцария); сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA, с соотношением звеньев лактид-гликолид 50/50 и характеристической вязкостью в гексафторизопропаноле, равной 0.37 («Absorbable Polymers International», США); полоксамер 188 (Pluronic F68™, «Sigma», США).
100 мг трансрезвератрола растворяли в 2 мл этанола. PLGA в количестве 505.7 мг растворяли в 7 мл ацетона. Растворы смешивали до образования прозрачной гомогенной органической фазы. Это раствор при постоянном перемешивании добавляли к 20 мл 1% раствора полоксамера 188, перемешивание продолжали 3-4 часа при небольшом нагревании (около +40°С) до полного удаления растворителей. Образовавшуюся суспензию фильтровали через пористый фильтр и замораживали (-20°С).
Пустые (контрольные) наночастицы получали аналогично, без использования трансрезвератрола.
Пример 2. Оценка антипролиферативной активности наносомальной формы трансрезвератрола в отношении опухолевых клеток (на примере MCF-7).
Суспензии наночастиц размораживали непосредственно перед экспериментом до комнатной температуры (+22°С).
Через 24 часа после внесения RSV-PLGA при визуальном наблюдении характер роста клеток MCF-7 в опыте не отличался от положительного и отрицательного контроля.
Через 48 часов в клетках MCF-7 наблюдали ингибирование пролиферативной активности (при визуальном наблюдении количество клеток в лунках, обработанных RSV-PLGA, стало значительно меньше в сравнении с контрольными лунками. Помимо этого, изменилась морфология клеток (появилась зернистость и вакуолизация цитоплазмы) и характер прикрепления к субстрату. Изменение характера прикрепления MCF-7 клеток выражено в уменьшении площади их распластывания, что косвенно свидетельствует об ослаблении их адгезивных свойств.
Через 72 часа в лунках, обработанных RSV-PLGA, остаются единичные группы распластанных клеток, что свидетельствует о подавлении пролиферативной активности клеток. В положительном и в отрицательном контроле к третьим суткам (72 часа) клетки MCF-7 формируют сливной монослой, что говорит об отсутствии цитотоксического воздействия как со стороны культуральной среды, так и вспомогательных компонентов, на основе которых изготавливались наночастицы.
Результаты влияния наносомальной формы трансрезвератрола в отношении опухолевых клеток MCF-7 в сравнении с контролем приведены на Фиг.1.
При культивировании MCF-7 клеток в присутствии наноформы трансрезвератрола Res-PLGA наблюдали подавление пролиферативной активности клеток, в сравнении с положительным (Control) и отрицательным (PLGA) контролем. Помимо снижения скорости роста в опытных образцах, также менялась морфология клеток, появлялась зернистость и вакуолизация цитоплазмы. Менялся характер прикрепления клеток к поверхности роста. Клетки постепенно округлялись, что свидетельствует о снижении их адгезивных свойств и жизнеспособности.
Пример 3. Доза-зависимый эффект наноформы трансрезвератрола на рост опухолевых клеток MCF-7.
Целью эксперимента являлась оценка влияния наноформы трансрезвератрола (в зависимости от концентрации) на рост опухолевых клеток - эстроген-зависимой линии MCF-7. Оценивались следующие концентрации трансрезвератрола: 10 µМ, 50 µМ, 100 µМ. В качестве контроля использовались клетки MCF-7, не подвергшиеся влиянию образцов (Фиг.2). В результате получены следующие результаты. Рост клеток в контроле почти не отличался от такового в эксперименте с концентрацией 10 µМ (Фиг.2А, 2В, соответственно). При использовании концентрации 50 µM наблюдается существенное подавление роста опухолевых клеток (Фиг.2С), а при использовании концентрации в 100 µМ - тотальное подавление опухолевой активности и числа живых клеток (Фиг.2D). Таким образом, наноформа резвератрола обладает доза-зависимьм эффектом и при адекватной дозировке проявляет сильную противоопухолевую активность.
Пример 4. Оценка антипролиферативной активности наносомальной формы трансрезвератрола в отношении нормальных фибробластов человека
Суспензии наночастиц размораживали до комнатной температуры (+22°С) непосредственно перед экспериментом.
При визуальном наблюдении за характером роста клеток ФБЧ отличий между опытом и контрольными лунками не выявлено. Результаты активности наносомальной формы трансрезвератрола в отношении нормальных фибробластов человека в сравнении с контролем приведены на Фиг.3.
При культивировании клеток ФБЧ в присутствии Res-PLGA не было обнаружено отрицательного влияния исследуемых веществ на пролиферативную активность и жизнеспособность клеток. Таким образом, трансрезвератрол не обладает цитотоксическим эффектом в отношении нормальных клеток, и, с учетом вышеописанных результатов, демонстрирует избирательную цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток.
Отсутствие апоптотического эффекта на клетках при добавлении «пустых наночастиц» также свидетельствует об отсутствии токсического эффекта вспомогательных компонентов, используемых для изготовления наноформы трансрезвератрола.
Пример 5. Оценка антипролиферативной активности наносомальной формы транс-резвератрола в отношении андроген-зависимых опухолевых клеток (на примере LnCap).
LnCap (клетки аденокарциномы предстательной железы) культивировали в пластиковых культуральных сосудах площадью 25 кв. см в ростовой среде RPMI:DMEM (1:1) в присутствии 10% эмбриональной фетальной сыворотки и 5% лошадиной сыворотки с добавлением антибиотиков. Для тестирования образцов клетки высаживали в 96-луночные планшеты в концентрации 4 тыс клеток на лунку и через сутки вносили исследуемые образцы в концентрации 100 мкм. Через 24 часа после внесения образцов заметных различий в опытных и контрольных лунках не наблюдалось. На 48 часов в опытной лунке с RES-PLGA наблюдалась тенденция к «округлению» клеток с последующим апоптозом, что свидетельствует о подавлении пролиферативной активности клеток-мишеней. На 72 часа наблюдали в контрольных лунках конфлюэнтный монослой, что свидетельствует о сохранении жизнеспособности клеток и их высокой пролиферативной активности. В опытных лунках с RES-PLGA оставалось незначительное количество живых клеток (около 50% от изначального их уровня). Результаты влияния наносомальной формы трансрезвератрола в отношении клеток LnCap в сравнении с контролем приведены на Фиг.4.
Перечень фигур чертежей.
Фиг.1. Влияние Res-PLGA в концентрации 100 µМ на жизнеспособность клеток MCF-7 через 24, 48 и 72 часа после внесения (МТТ-тест). Условные обозначения даны в тексте.
Фиг.2. Сравнительная оценка роста клеток MCF-7 под влиянием различных концентраций наноформы трансрезвератрола на 72-й час эксперимента. Фиг.2А - клетки MCF-7, не подвергшиеся воздействию транс-резвератрола (контроль). Фиг.2В - клетки MCF-7, подвергшиеся воздействию наноформы трансрезвератрола в концентрации 10 µМ; Фиг.2С - клетки MCF-7, подвергшиеся воздействию наноформы трансрезвератрола в концентрации 50 µМ; Фиг.2D - клетки MCF-7, подвергшиеся воздействию наноформы трансрезвератрола в концентрации 100 µM. На Фиг.2С и 2D видны потери контуров клеток, сжатие и потеря прозрачности цитоплазмы, поджатие клеточной мембраны, появление грануляций. Данные морфологические признаки свидетельствуют о коммитировании опухолевых клеток к апоптозу (увеличение - ×200, инвертированный микроскоп «Олимпус», Япония).
Фиг3. Влияние Res-PLGA в концентрации 100 µM и PLGA на жизнеспособность клеток ФБЧ через 24, 48 и 72 часа (МТТ-тест). Условные обозначения даны в тексте.
Фиг.4. Влияние Res-PLGA в концентрации 100 µМ и PLGA на жизнеспособность клеток LnCap через 24, 48 и 72 часа (МТТ-тест). Условные обозначения даны в тексте.
Список цитируемой литературы
Benitez DA, Hermoso MA, Pozo-Guisado E, Femandez-Salguero PM, Castellon EA. Regulation of cell survival by resveratrol involves inhibition of NFkappaB-regulated gene expression in prostate cancer cells. Prostate. 2009 Mar 19; 69(10):1045-1054.
Benitez DA, Pozo-Guisado E, Clementi M, Castellon E, Femandez-Salguero PM. Non-genomic action of resveratrol on androgen and oestrogen receptors in prostate cancer: modulation of the phosphoinositide 3-kinase pathway. Br J Cancer. 2007 May 21; 96(10):1595-604.
Bhat KP, Lantvit D, Christov K, Mehta RG, Moon RC, Pezzuto JM. Estrogenic and antiestrogenic properties of resveratrol in mammary tumor models. Cancer Res. 2001 Oct 15; 61(20):7456-63.
Bishayee A. Cancer prevention and treatment with resveratrol: from rodent studies to clinical trials. Cancer Prev Res (Phila Pa). 2009 May; 2(5):409-18.
Bishayee A. Cancer prevention and treatment with resveratrol: from rodent studies to clinical trials. Cancer Prev Res (Phila Pa). 2009 May; 2(5):409-18.
Deng CX. SIRT1, is it a tumor promoter or tumor suppressor? Int J Biol Sci. 2009; 5(2):147-52.
Gao S, Liu GZ, Wang Z. Modulation of androgen receptor-dependent transcription by resveratrol and genistein in prostate cancer cells. Prostate. 2004 May 1; 59(2):214-25.
Jones SB, DePrimo SE, Whitfield ML, Brooks JD. Resveratrol-induced gene expression profiles in human prostate cancer cells. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005 Mar; 14(3):596-604.
Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65(1-2):55-63.
Narayanan NK, Nargi D, Randolph C, Narayanan BA. Liposome encapsulation of curcumin and resveratrol in combination reduces prostate cancer incidence in PTEN knockout mice. Int J Cancer. 2009 Jul 1; 125(1):1-8.
Narayanan NK, Nargi D, Randolph C, Narayanan BA. Liposome encapsulation of curcumin and resveratrol in combination reduces prostate cancer incidence in PTEN knockout mice. Int J Cancer. 2009 Jul 1; 125(1):1-8.
Potter GA, Patterson LH, Wanogho E, Perry PJ, Butler PC, Ijaz T, Ruparelia КС, Lamb JH, Farmer PB, Stanley LA, Burke MD. The cancer preventative agent resveratrol is converted to the anticancer agent piceatannol by the cytochrome P450 enzyme CYP1B1. Br J Cancer. 2002 Mar 4; 86(5):774-8.
Tang FY, Su YC, Chen NC, Hsieh HS, Chen KS. Resveratrol inhibits migration and invasion of human breast-cancer cells. Mol Nutr Food Res. 2008 Jun; 52(6):683-91. Harada N, Murata Y, Yamaji R, Miura T, Inui H, Nakano Y. Resveratrol down-regulates the androgen receptor at the post-translational level in prostate cancer cells. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 2007 Dec; 53(6):556-60.
Walle T, Hsieh F, DeLegge MH, Oatis JE Jr, Walle UK. High absorption but very low bioavailability of oral resveratrol in humans. Drug Metab Dispos. 2004 Dec; 32(12):1377-82.
Wang Y, Lee KW, Chan FL, Chen S, Leung LK. The red wine polyphenol resveratrol displays bilevel inhibition on aromatase in breast cancer cells. Toxicol Sci. 2006 Jul; 92(l):71-7.
Shao J, Li X, Lu X, Jiang C, Hu Y, Li Q, You Y, Fu Z. Enhanced growth inhibition effect of Resveratrol incorporated into biodegradable nanoparticles against glioma cells is mediated by the induction of intracellular reactive oxygen species levels. Colloids Surf В Biointerfaces. 2009 Aug 1; 72(1):40-7.