Анализ генетического разнообразия pоa pratensis L. в условиях нефтяного загрязнения почв с использованием IRAP-маркеров

555^»— Аграрный вестник Урала №1 (80), 2011 г. <

Агрономия

В другие годы исследований средняя урожайность сухой массы бобово-злаковой травосмеси на известкованных почвах составила 4,5-5,3 т/га и превышала контроль на 22-44 %, на минеральном фоне - до 5,4 т/га. Наибольшая урожайность многолетних трав получена при ежегодном внесении полного минерального удобрения на известкованных делянках и составила 6,4-6,7 т/га, что превысило вариант без удобрений на 46-81 %. Урожайность контрольного

варианта - 3,7 т/га. Наши исследования показали, что известь в дозе 1,0 г.к. к 2006 г. способствовала снижению урожая трав до 4,5 т/га, в 2007 г. - до 4,2 т/га, это на 0,2 т/га ниже контроля, что указывает на прекращение действия этой дозы извести.

Большое значение для кормления животных имеет качество получаемой продукции. Наши исследования показали,

что ежегодное применение минеральных удобрений на известкованных делянках повысило содержание сырого протеи- на до 12-14 %, а также фосфора (0,94 %), калия (2,93 %) и кальция (0,79 %). По другим вариантам эти показатели качества многолетних трав были незначите- льно ниже. Содержание

нитратов в корме было в пределах ПДК (95-149 мг/кг, при ПДК 1000 мг/кг).

Установлено, что применение агрохимических средств для удобрения многолетних трав значительно повышало их энергетическую эффективность. Так, использование минеральных удобрений на известкованных почвах повышало энергетический коэффициент до 3,7 -3,9 ед., на известкованных почвах - 2,42,6 ед., в контрольном варианте - 2,0 ед.

Расчеты экономической эффективности ежегодного применения минеральных удобрений на известкованных почвах

способствовали получению значительного дохода - 17-19 тыс. руб., на минеральном фоне - 8,2 тыс. руб., на известкованных почвах - 10-14 тыс. руб. с одного гектара.

Та ки м о б р а з о м , м н о го л е тн и е

исследования, проведенные на дерновоподзолистой слабоокультуренной почве, показали, что оптимальным приемом удобрения многолетних бобово-злаковых травосмесей на дерново-подзолистых слабоокультуренных почвах является ежегодное внесение минеральных удобрений ^60Р75К75) на известкованной почве (доза извести - по 1,0 г.к., один раз в 25 лет). При такой системе применения агрохимических средств получена средняя урожайность 6,4 т/га сухого вещества, энергетический коэффициент составил 3,7, прибыль - 17 тыс. руб. с одного гектара, при значительном повышении плодородия дерново-подзолистых почв.

Литература

1. Авдонин Н. С. Повышение плодородия кислых почв. М. : Колос, 1969. 302 с.

2. Кулаковская Т. Н. Почвенно-агрохимические основы получения высоких урожаев. Минск : Ураджай, 1978. 270 с.

3. Войтович Н. В., Лобода Б. П. Оптимизация минерального питания в агроценозах Центрального Нечерноземья. М., 2005. 193 с.

4. Чеботарев Н. Т. [и др.] Воспроизводство плодородия дерново-подзолистых почв на Севере. Земледелие, 2008, № 3. С. 23—24.

АНАЛИЗ гЕНЕТИЧЕСКОгО РАЗНООБРАЗИЯ POA PRATENSIS \-. В УСЛОВИЯх нефтяного загрязнения ПОЧВ С использованием 1РАР-МАРКЕРОВ

н. м. ДЕвяТовА (фото), студент,

н. н. бельтюкова,

аспирант, Пермский государственный университет,

А. в. нАзАРов,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, институт экологии и генетики микроорганизмов Уро РАн

Биология

614051, г. Пермь, ул Юрша, д. 60, кв. 211; тел. 8-950-444-08-88; e-mail: nazarov@iegm.ru

Ключевые слова: нефтяное загрязнение почв, Poa pratensis L., IRАР-метод, полиморфизм IRAP-маркеров, генетическое разнообразие.

Keywords: Genetic variability level, oily soils, Poa pratensis L., raP-method, raP-markers polymorphism, genetic diversity

Цель и методика исследований.

Вследствие своей производственной и энергетической значимости нефть играет значительную роль в жизни человечества. Но вместе с тем увеличивается и количество нефтяных загрязнений. Опасность данного загрязнителя прежде всего связана с высокой чувствительностью к нему высших растений при том, что они занимают ключевое положение практически во всех наземных экосистемах, определяя существование и состав остальных биологических компонентов биогеоценозов. На чувствительности высших растений основаны методы биоиндикации окружающей среды. Такие методы позволяют оценить комплексное влияние загрязнителей на среду.

Методы и критерии оценки влияния нефтяного загрязнения на растения довольно разнообразны. Морфологическую изменчивость оценивают по длине и ширине листьев, длине проростков [1], биомассе [2]. М. В. Аниськина [3] рассмотрела генетическую изменчивость по критерию частоты нарушений в волосках тычиночных нитей Tradescantia (с1оп 02). Также весьма распространенным критерием оценки влияния нефти на растения является всхожесть семян [4, 5, 6, 7, 8]. Влияние нефтяного загрязнения на полиморфизм растений практически не изучено.

В области изучения влияния загрязнения нефтью на полиморфизм ДНК растений интересным является

использование ретротранспозонов в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции (PCR). Известно, что в растениях мобильные элементы составляют более половины ДНК [9]. В качестве повторяющихся последовательностей ретротранспозоны рассеяны по всему геному; в связи с этим они удобны для ДНК-генотипирования растений [10].

Сбор материала для изучения влияния нефтяного загрязнения на растения производился на опытном стационаре института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь) в д. Ключи Добрянского района Пермского края. Экспериментальные площадки были заложены в дерново-подзолистой почве злаково-разнотравного лугового

Биологий it

биоценоза. В 1996 и 1999 г. площадки площадью 1 м2 были перекопаны с уборкой растительности и залиты нефтью концентрацией 24 л/м2 [11]. Также для исследования был взят материал с контрольных площадок.

На этих же экспериментальных площадках проводились исследования структуры и разнообразия микробных сообществ. В опубликованных работах [12, 13] описано изменение качественного и количественного состава микроорганизмов, влекущее за собой изменения в микробно-растительных взаимодействиях. Разработаны рекомендации по биорекультивации нефтезагрязненных почв.

Для исследования был выбран распространенный в луговых сообществах вид Poa pratensis L. из семейства Poaceae. Злаки по данным Назарова с соавторами [11] относятся к одним из наиболее устойчивых по сравнению с остальными растениям. Вид был представлен на всех площадках разного года загрязнения, а также на контрольных площадках.

Целью нашей работы являлось непосредственное изучение генетического разнообразия растений, произрастающих в условиях нефтезагрязненных почв, с применением IRAP-метода на примере P. pratensis.

Для разработки и апробации методики молекулярно-генетического анализа из листьев P. pratensis была выделена ДНК. Всего было взято 90 особей P. pratensis. 30 особей с площадок 1996 г., 30 - с площадок 1999 г. и 30 особей - с контрольных площадок, не загрязненных нефтью. Для выделения ДНК брали пробы из 100 мг листьев по методике [14] с незначительными модификациями.

При исследовании генетического разнообразия растений был избран IRAP-метод (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism). IRAP-метод представляет собой анализ полиморфных участков ДНК, амплифици-рованных между ретротранспозонами [15, 16]. Ретротранспозоны - мобильные генетические элементы, широко распространенные в геномах эукариот, в некоторых случаях число их копий может составлять более 70 % ядерного генома [10]. Для создания праймеров использовались последовательности

LTR (Long Terminal Repeats - длинные концевые повторы).

Амплификация проводилась с использованием 5 IRAP-праймеров в термоциклерах «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Москва) и MJ Mini Cycler (Bio-Rad, USA). Всего была проведена амплификация 450 проб ДНК. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 2,0 %-ном агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды.

Для определения длины фрагментов ДНК использовали маркер молекулярной массы (100 bp + 1.5 + 3 КЬ DNA Ladder) («ООО-СибЭнзим-М», Москва), определение длин фрагментов проводилось с использованием программы «Quantity One» в системе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad, USA).

Для проведения компьютерного анализа молекулярно-генетического полиморфизма были использованы программа Popgen32 и макрос GenAlEx6. Параметры, взятые для исследования: доля полиморфных локусов (р0,95) [17], общее число аллелей (na), эффективное число аллелей (ne) [18], ожидаемая гетерозиготность (He) [19]. Уровень вну-трипопуляционного разнообразия оценен через показатели среднего числа морф (|j) и доли редких морф (h) [20].

Достоверность различий между показателями генетической изменчивости определялась по критериям Стьюдента, Фишера и Уилкоксона при уровне достоверности 0,95 [21].

Результаты исследований.

Для проведения анализа генетической изменчивости растений при нефтяном загрязнении на примере P. pratensis рекомендуется методика выделения ДНК [14] с применением СТАВ, которая позволила выделить ДНК без примесей фенолов. Для амплификации ДНК отобраны 5 наиболее информативных IRAP-праймеров из 20, синтезированных в ЗАО «Синтол» и «Евроген» (Москва).

При амплификации ДНК P. pratensis с 5 IRAP-праймерами было выявлено 77 фрагментов ДНК, с помощью одного

Рисунок 1

ГАР-спектр особей Роа prаtensis L с праймером 2165, произрастающих на экспериментальных площадках 1999 г. Цифрами обозначены номера проб; М - маркер молекулярного веса; стрелками указаны некоторые полиморфные фрагменты

^АР-праймера в среднем было ампли-фицировано 15 фрагментов ДНК (рис. 1). Число амплифицированных фрагментов ДНК на праймер варьировало от 11 (праймер 2159) до 21 (праймеры 2165) (табл. 1). Число амплифицированных фрагментов ДНК Р. pratensis с каждым из праймеров по годам загрязнений и в контроле было одинаковым. Амплифицированные фрагменты ДНК были отнесены к моно-морфным, если частота их встречаемости была >0,95 [22]. Фрагменты с меньшей частотой встречаемости были отнесены к полиморфным. Доля полиморфных фрагментов ДНК оказалась недостоверно выше в контрольных образцах по сравнению с образцами, взятыми с опытных площадок (р0 95 < 1,96).

Матрицы бинарных признаков, в которых наличие или отсутствие в ^АР-спектрах одинаковых по размеру фрагментов рассматривалось, соответственно, как состояние 1 или 0, были обработаны в компьютерных программах Рордеп32 и специализированном макросе GenAlEx6 для MS-Excel для определения показателей генетического разнообразия (табл. 2).

Предпринята попытка оценки генетического разнообразия в исследуемых выборках посредством показателя ^ - среднее число морф в выборке. Исходными данными для этого анализа являются частоты морф (в нашем

Таблица 1

Характеристика амплифицированных фрагментов ДНК Р. pгatensis при нефтяном загрязнении почв

Праймер Нуклеотидная Pазмеры Число амплифицированных фрагментов ДНК Доля полиморфных фрагментов

последовательность (5'-3') фрагментов 1996г 1999г Контроль

Х5 GGA ATG ATA GGC CTT GCC 460-2720 13 0,9231 0.8461 0,9231

2151 ACA ACT CCA CGC TTG TCC GCT CC 180-1100 12 0,7500 0,6667 0.8333

2159 AGC GAA TCA ACA GGG GCT GCC CGA 250-1370 11 0.8182 0,8182 0,8182

2165 GTTCTCCTTACTAGCCGATGTGGGA 370-2680 21 0,7000 0,8000 0,8500

2182 GTGTCTTTGCACTAGGTAGAGGACC 260 - 3230 20 0,8095 0,8095 0,8571

всего 77 0,8002 0,7881 0,8563

Биология

случае частоты проявления фрагмента ДНК). Наряду со средним числом морф определена доля редких морф (Ь|). Этот показатель дает новую, в сравнении с информацию о характере генразнообра-зия. В то время как ^ дает оценку степени разнообразия выборки, показатель Ь| оценивает структуру этого разнообразия (табл. 2). Достоверность отличий между показателями ^ и Ь| оценивали с помощью и-критерия [20]. Значение ^ для контрольных образцов оказалось достоверно выше значения ^ для образцов, взятых с площадок 1996 г загрязнения, и недостоверно выше ^ образцов, взятых с площадок 1999 г. загрязнения, значения этого показателя для площадок разной давности загрязнения оказались отличными на достоверно значимом уровне (и > 1,96). Значения показателя Ь| на контрольных и опытных площадках отличаются на уровне ниже достоверно значимого.

Функцией от доли полиморфных локусов, числа аллелей на локус и выравненности частот аллелей является эффективное число аллелей (пе) и, таким образом, оно является мерой генетического разнообразия. Эффективное число аллелей оценивает величину, обратную гомозиготности, и представляет собой такое число аллелей, при одинаковой частоте которых гетерозиготность будет равна фактической. Абсолютное и эффективное число аллелей на локус (в нашем случае на фрагмент ДНК) оказалось

Таблица 2

Сравнение показателей генетического разнообразия Р. pratensis в условиях нефтяного загрязнения почв

Давность n n He Показатели разнообразия

загрязнения h

1996 1,8442

1999 1,8312

Контроль 1,8571

Примечание: па - абсолютное число аллелей на локус; пе гетерозиготность; в скобках даны стандартные отклонения

недостоверно выше в контрольных образцах (табл. 2).

Выводы. Рекомендации.

Таким образом, в нашем исследовании уровня генетического разнообразия P. pratensis с 5 IRAP-праймерами мы выявили повышенные значения показателей генразнообразия у особей P. pratensis контрольных площадок по сравнению с особями площадок, загрязненных нефтью в 1996 и 1999 гг., на недостоверно высоком уровне. На данных особях, произрастающих на тех же экспериментальных площадках, также были проведены исследования на выявление изменений уровня генразнообразия с применением ISSR-метода (Inter-Simple

- эффективное число аллелей на локус; He - ожидаемая ^-среднее число морф; h-доля редких морф

Sequence Repeat) [работа в печати]. В данных исследованиях при использовании двух разных методов изучались разные участки генома P. pratensis, были получены схожие закономерности при разных уровнях достоверности: показатели генетического разнообразия выше у образцов P. pratensis контрольных площадок по сравнению с образцами, взятыми с площадок, загрязненных нефтью в 1996 и 1999 гг., на достоверно значимом уровне с использованием ISSR-метода и на уровне ниже достоверно значимого при применении IRAP-метода.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 07-04-96016-р_урал_а.

Литература

1. Киреева Н. А., Мифтахова A. M., Кузяхметов Г Г Влияние загрязнения нефтью на фитотоксичность серой лесной почвы //

Агрохимия. 2001. № 5. С. 64—69.

2. Шилова И. И. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таежной зоны II Восстановление нефтезагрязнен-ных почвенных экосистем. М. : Наука, 1988. С. 159—168.

3. Аниськина М. В. Мутагенный и токсический эффекты у растений Tradescantia (clon 02) и Arabidopsis thaliana (L.) Heynh., индуцированные нефтью и нефтепродуктами: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Сыктывкар, 2006. 20 с.

4. Невзоров В. М. О вредном воздействии нефти на почву // Изв. вузов. Лесн. журн. 1976. № 2. С. 164—165.

5. Blankenship D. W. Plant growth inhibition by the water extract of a crude oil // Water, Air and Soil Pollut. 1978. V. 10. № 4. P. 471—472.

6. Киреева Н. А., Мифтахова A. M., Кузяхметов Г Г. Влияние загрязнения нефтью на фитотоксичность серой лесной почвы // Агрохимия. 2001. № 5. С. 64—69.

7. Назаров А. В., Иларионов С. А., Сергеев В. А. Способ фиторекультивации нефтезагрязненных почв / Патент РФ № 2225086 С1. 2004.

8. Назаров А. В. Влияние нефтяного загрязнения почвы на растения // Вестн. Перм. ун-та. 2007. Вып. 5. С. 134—141.

9. Гвоздев В. А. Подвижная ДНК эукариот. Роль в регуляции активности генов и эволюции генома // Соросовский образовательный журн. 1998. № 8. С. 15—21.

10. Kumar A., Bennetzen J. Plant retrotransposons // Annu. Rev.Genet. 1999. V. 33. P. 479—532.

11. Назаров А. В., Азизова Э. А., Иларионов С. А. Формирование растительности на экспериментальных загрязненных площадках // Вестн. Перм. ун-та. 2000. Вып. 2. С. 80—84.

12. Назаров А. В., Иларионов С. А. Потенциал использования микробно-растительного взаимодействия для биоремедиации // Биотехнология. 2005. № 5. С. 54—62.

13. Назаров А. В., Иларионов С. А., Изучение причин фитотоксичности нефтезагрязненных почв // Альтернативная генетика и экология. 2006. №1. С. 60—65.

14. Torres A. M, Weeden N. F., Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba // Theor Appl. Genet. 1993.

V. 5. P. 937—945.

15. Kalendar R., Grob T., Regina M. [et al.] IRAP and REMAP: Two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques // Theor. and Applied Genetics. 1999. V. 98. P. 704—711.

16. Kalendar R., Schulman A. IRAP and REMAP for retrotransposon-based genotyping and fingerprinting // Nature Protocols. 2006.

V. 1. № 5. P. 2478—2484.

17. Williams J. G. K., Kubelik A. R., Livak K. J. [at al]. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucl. Acids Res. 1990. V. 18. P. 6531—6535.

18. Kimura M., Crow J. F. The number of alleles that can be maintained in a finite population // Genetics (US). 1964, Vol. 49. P. 725—738.

19. Nei M. Molecular evolutionary genetics. New York: Columbia Univ. press, 1987. 512 p.

20. Животовский Л. А. Показатель внутрипопуляционного разнообразия // Журн. общ. биологии. 1980. T 41. № 6. C. 828—836.

21. Лакин Г. Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М. : Высш. шк., 1990. 352 с.

22. Хедрик Ф. Мир биологии: генетика популяций. М. : Техносфера, 1964. 592 с.