Способ получения водосодержащей суспензии частиц, состоящих из антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы, поликатиона и полианиона
METHOD OF PRODUCING A WATER-CONTAINING SUSPENSION OF PARTICLES CONSISTING OF AN ANTIOXIDANT ENZYME SUPEROXIDE DISMUTASE, A POLYCATION AND A POLYANION

Изобретение относится к области химической энзимологии и касается способа получения водосодержащей суспензии частиц, состоящих из антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы (СОД), поликатиона и полианиона, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона, причем частицы после обработки полимерами дополнительно обработаны водным раствором глутарового альдегида. Данные частицы могут быть использованы в офтальмологии для лечения заболеваний, сопровождающихся окислительным стрессом в глазу.
Известен способ получения водной суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто оболочкой из поликатиона, в качестве которого использован блок - сополимер (СПЛ) полилизина и полиэтиленгликоля (ПЭГ) (патент США 2013/0052154 А1, 2013).
Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как получение водной суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто оболочкой из поликатиона.
Известен способ получения водной суспензии частиц, состоящих из СОД, покрытой оболочкой из СПЛ молочной и гликолевой кислот (патент США 2015/0374798 А1, 2015)
Данный способ содержит признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как получение водной суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто оболочкой из СПЛ.
Наиболее близким к заявляемому является известный способ получения водосодержащей суспензии частиц, состоящих из антиоксидантного фермента СОД, поликатиона и полианиона, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из поликатиона, выбранного из группы, включающей протамин, полилизин и полиаргинин, и внешней оболочкой из полианиона блок-СПЛ полиглутаминовой кислоты (ПГ) и ПЭГ или блок-СПЛ полиаспарагиновой кислоты (ПА) и ПЭГ, причем частицы после обработки полимерами дополнительно обработаны водным раствором глутарового альдегида. Данную суспензию получали путем смешения буферных растворов СОД и поликатиона, перемешивания и выдерживания полученной смеси с последующими добавлением в нее водного буферного раствора полианиона, перемешиванием и выдерживанием полученной смеси, добавлением в нее водного раствора глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 2-10, выдерживанием смеси, добавлением в смесь водного раствора боргидрида натрия и очисткой смеси центрифугированием с использованием мембранной фильтрующей системы с пределом пропускания 50 килодальтон (кДа). При этом использовали буфер на основе 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (ХЕПЕС) (патент RU 2575836 С2, МПК A61K 38/00 (2006.01) - прототип, см. описание).
Из прототипа известно, что полученные частицы могут быть использованы для лечения заболеваний, связанных с неконтролируемым выбросом реактивных свободных радикалов. По мнению авторов прототипа такое взрывообразное высвобождение активных форм кислорода характерно для таких заболеваний, как болезни Альцгеймера и Паркинсона, инфаркт, инсульт, ревматоидный артрит, онкологические и аутоиммунные заболевания и различные травмы спинного и головного мозга. Использование вышеуказанных частиц в офтальмологии в данном патенте не описано. Однако, в других источниках информации отмечалась перспективность применения нативной СОД при офтальмологическом заболевании увейте [de Kozak Y., Nordman J.P., Faure J.P., Rao N.A., Marak G.E. Effect of antioxidant enzymes on experimental uveitis in rats. (1989) Ophtalmic. Res., 21, 230-234. Yamada M., Shichi H., Yuasa Т., Tanouchi Y., Mimura Y. Superoxide in ocular inflammation: human and experimental uveitis. (1986) J. Free Radio. Biol. Med., 2, 111-117], а также при повреждении глаза щелочью [Alio J.L., Ayala M.J., Mulet M.E., Artola A., Ruiz J.M., Bellot. J. Antioxidant therapy in the treatment of experimental acute corneal inflammation. (1995) Ophtalmic. Res., 27, 136-143].
Известный способ имеет признаки, совпадающие с существенными признаками предлагаемого технического решения, такие как смешение буферных растворов СОД и поликатиона, выбранного из группы, включающей протамин, полилизин и полиаргинин, перемешивание и выдерживание полученной смеси с последующими добавлением в нее буферного раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ или блок-сополимера ПА-ПЭГ, перемешиванием и выдерживанием полученной смеси, добавлением в нее водного раствора глутарового альдегида, выдерживанием смеси, добавлением в смесь водного раствора боргидрида натрия и очисткой смеси с использованием мембранной фильтрующей системы.
Для лечения любых воспалительных заболеваний, сопровождающихся (обусловленных) окислительным стрессом, необходимо, чтобы действующее вещество на основе частиц, содержащих антиоксидантный фермент СОД, обладало высоким выходом СОД по суммарной активности у частиц и стабильностью значений активности СОД у них в процессе хранения. Однако, из прототипа известно, что суммарный выход СОД по активности у используемых в прототипе частиц относительно невелик и составляет 28-35%. Что касается стабильности значений активности СОД в процессе хранения, то в прототипе проводили только сравнение этого параметра у используемых в прототипе частиц и у нативной СОД. В прототипе также указано, что полученная дисперсия частиц стабильна при хранении при 4°С в течение 3-х месяцев.
Приведенные выше данные, а также проведенный контрольный опыт (см. пример 7) показал, что недостатками известного технического решения являются относительно низкий выход СОД по суммарной активности у полученных частиц, недостаточная стабильность значений активности СОД у частиц в процессе хранения и недостаточная стабильность их размеров в процессе хранения, а также относительно высокая раздражающая способность известной суспензии при ее введении в глаз.
Техническая проблема изобретения заключается в разработке способа получения водосодержащей суспензии частиц, лишенного указанных выше недостатков.
Технический результат изобретения состоит в увеличении суммарного выхода СОД по активности у частиц, повышении стабильности значений активности СОД у частиц в процессе их хранения и повышении стабильности размеров частиц в процессе их хранения.
Предварительно были проведены эксперименты с различными частицами, содержащими СОД, которые показали, что указанный технический результат достигается в том случае, когда в способе получения водосодержащей суспензии частиц, состоящих из антиоксидантного фермента СОД, поликатиона и полианиона, путем смешения буферных растворов СОД и поликатиона, выбранного из группы, включающей протамин, полилизин и полиаргинин, перемешивания и выдерживания полученной смеси с последующими добавлением в нее буферного раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ или блок-сополимера ПА-ПЭГ, перемешиванием и выдерживанием смеси, добавлением в нее водного раствора глутарового альдегида, выдерживанием смеси, добавлением в смесь водного раствора боргидрида натрия и очисткой смеси с использованием мембранной фильтрующей системы, в качестве буфера используют буферный раствор с рН 5-8, содержащий, по крайней мере, гидрофосфат натрия и ди-гидрофосфат натрия, глутаровый альдегид добавляют в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с аминогруппами поликатиона 0,3-1,5, и используют фильтрующую систему с пределом пропускания 90-130 кДа.
Предлагаемый способ является новым и не описан в патентной и научно-технической литературе.
Все реагенты и расходные материалы (фильтрующие мембраны), использованные в заявленном способе, коммерчески доступны. Так, СОД коммерчески доступна (http://sodferment.ru, ООО НПП «Ферментные технологии», Россия) и является известным антиоксидантным ферментом, инактивирующим супероксидные радикалы [McCord J. М., Fridovich I. Superoxide dismutase an enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) //Journal of Biological chemistry. - 1969. - T. 244. - №. 22. - C. 6049-6055].
2
В предложенном способе водную суспензию частиц, как и в прототипе, получают путем смешения водных буферных растворов СОД и поликатиона, однако вместо использованного в прототипе буферного раствора на основе ХЕПЕС и 150 мМ NaCl в предлагаемом способе используют экспериментально подобранный буферный раствор с рН 5-8, не содержащий ХЕПЕС, но содержащий, по крайней мере, гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия. Совместное использование гидрофосфата натрия и дигидрофосфата натрия дает возможность получать фосфатные буферные растворы, которые кроме вышеуказанных соединений могут также содержать различные целевые добавки, например, такие как NaCl, CaCl, глюкоза, KCl и др. Замена ранее использованного буферного раствора на другой обусловлена тем, что при использовании описанной в прототипе водной суспензии полученных частиц в офтальмологии в качестве средства, инактивирующего супероксидные радикалы в передних структурах глаза, таких как конъюнктивальный мешок и передняя камера глаза, использованный в прототипе буфер ХЕПЕС вызывает нежелательное раздражение глаз. При использовании предложенных буферных растворов этого не происходит, что приводит к снижению раздражающей способности суспензии частиц при их введении в глаз. Также известно [Lepe-Zuniga J. L. Toxicity of light-exposed Hepes media //J. Immunol. Methods. - 1987. - T. 103. - C. 145.], что буферный раствор ХЕПЕС является фототоксичным, т.е. под воздействием света в данном буфере образуется перекись водорода, которая негативно влияет на структуры глаза, и так находящиеся при постоянном воздействии света.
При осуществлении предлагаемого способа концентрация СОД в использованном буферном растворе может быть различной и составлять, например, 2,5-10,0 мг/мл. Концентрация коммерчески доступных (Sigma-Aldrich, США) поликатионов в буферном растворе также может варьироваться и составлять, например, 2,5-10,0 мг/мл. Следует отметить, что при получении частиц раствор поликатиона следует по каплям добавлять к раствору СОД при перемешивании. Если вышеуказанные растворы смешивать не по каплям, а, например, за один прием, то возрастает вероятность образования частиц с широким распределением по размеру, что нежелательно, поскольку это затрудняет очистку суспензии частиц. При этом количество использованных СОД и поликатиона может варьироваться, однако заряд СОД после модификации поликатионом должен быть положительным для обеспечения возможности последующего покрытия частиц слоем одного из вышеуказанных полианионов. После смешения компонентов полученную смесь необходимо выдерживать при перемешивании в течение, например, 25-40 мин для обеспечения возможности получение более однородных по размеру частиц, затем по каплям добавлять в нее буферный раствор блок-СПЛ. Если растворы смешивать не по каплям, а, например, за один прием, то возрастает вероятность образования частиц с широким распределением по размеру, что нежелательно. Используемые при этом блок-сополимеры ПА-ПЭГ и ПГ-ПЭГ коммерчески доступные (http://www.alamanda-polymers.com/, Alamanda Polymers, США). При проведении данной стадии синтеза концентрация блок-СПЛ в буферном растворе может варьироваться и составлять, например, 2,5-10,0 мг/мл. При этом общее количество ранее обработанной поликатионом СОД и блок-СПЛ может варьироваться, однако после повторной модификации заряд полученных частиц, должен поменять знак, т.е. стать отрицательным.
Образование на частицах СОД слоя поликатиона в ходе вышеуказанной обработки антиоксидантного фермента буферным раствором поликатиона, а также образование дополнительного внешнего слоя блок-СПЛ в ходе обработки модифицированных частиц СОД буферным раствором блок-СПЛ подтверждено контрольными примерами 8-10 и 11-16, соответственно.
После смешения вышеуказанных компонентов полученную смесь перемешивают и выдерживают в течение, например, 25-40 мин для обеспечения возможности получение более однородных по размеру частиц. При этом для обеспечения сохранности активности фермента выдерживание целесообразно проводить при пониженной относительно комнатной температуре, например, в холодильнике при 3-8°С.
После окончания данной стадии синтеза в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют свежеприготовленный водный раствор глутарового альдегида, который, как известно, выступает в качестве неизбирательного сшивающего агента химических соединений, содержащих первичные аминогруппы [Migneault I. et al. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking //Biotechniques. - 2004. - T. 37. - №. 5. - C. 790-802.]. При этом экспериментально было показано, что для увеличения суммарного выхода СОД по активности у частиц, повышения стабильности значений активности СОД у частиц в процессе их хранения и повышения стабильности размеров частиц в процессе их хранения в отличие от прототипа необходимо добавлять водный раствор глутарового альдегида, взятого в количестве, обеспечивающем его мольное соотношение с первичными аминогруппами поликатиона 0,3-1,5. При этом концентрация раствора глутарового альдегида может быть различна. Затем для обеспечения полноты протекания ковалентного связывания (сшивки) аминогрупп полученную смесь необходимо выдерживать, например, в течение 8-12 ч при пониженной относительно комнатной температуре, например, в холодильнике при 3-8°С. После чего для повышения стабильности полученных частиц в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют избыток свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с целью восстановления неустойчивых двойных связей между углеродом и азотом в полученных основаниях Шиффа с образованием стабильной ковалентной связи. При этом концентрация раствора боргидрида натрия также может варьироваться и составлять, например, 1-2 мг/мл.
Ковалентное связывание глутарового альдегида с частицами СОД/поликатион/полианион подтверждено контрольным примером 17.
Полученную суспензию частиц очищают от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов с использованием мембранной фильтрующей системы. При этом можно использовать мембранную фильтрующую систему, например, в комбинации с перистальтическим насосом, подающим полученную суспензию частиц на мембрану (фильтр) под давлением, или применять центрифугирование с использованием помещенного в пробирку центрифуги ультрафильтрационного фильтра (мембраны). В последнем случае скорость вращения ротора центрифуги может варьироваться и составлять, например, 3000-4000 оборотов (об) /мин. В отличие от прототипа при этом используют мембранную фильтрующую систему с пределом пропускания 90-130 к Да. То есть, например, мембрана с пределом пропускания 90 кДа пропускает вещества с молекулярной массой менее 90 кДа. Следует отметить, что использование в предлагаемом способе описанной в прототипе ультрафильтрационной мембраны с пределом пропускания 50 к Да не позволяет провести надлежащую очистку полученных частиц в связи с забивкой пор в мембране.
При использовании центрифугирования в пробирку центрифуги помещают фильтр на основе ультрафильтрационной мембраны, заполненный аликвотой вышеописанной суспензии, с последующим введением перед каждой стадии центрифугирования свежей порции буферного раствора с физиологически приемлемыми для офтальмологии значениями рН 6,8-7,6.
При использовании поточной фильтрующей системы в накопительную емкость наливают полученную суспензию частиц. Далее фильтруемая суспензия из накопительной емкости с помощью перистальтического насоса под давлением подается на фильтрационный картридж с мембраной с пределом пропускания 90-130 кДа и двигается вдоль мембраны. Часть жидкости с низкомолекулярными побочными продуктами и не вступившими в реакцию реагентами проходит сквозь поры фильтрующей системы и накапливается в емкости. Очищенные от низкомолекулярных компонентов частицы, не прошедшие сквозь мембрану, потоком жидкости рециркулируются обратно в накопительную емкость, где смешиваются с постоянно поступающим вышеописанным буферным раствором. В результате общая концентрация низкомолекулярных побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов в накопительной емкости уменьшается. На завершающем этапе фильтрации останавливают подачу жидкости в накопительную емкость, и может быть осуществлено концентрирование очищенной суспензии (уменьшают ее объем), например, в 2-4 раза.
Предлагаемый способ дает возможность получать водную суспензию частиц СОД / поликатион / полианион с определенным методом динамического светорассеяния средним гидродинамическим диаметром 90-200 нм. При этом погрешность измерений составляет не более 4%. Размер получаемых частиц можно варьировать изменением рН и ионной силы использованного буферного раствора, например, изменением в буферном растворе концентрации NaCl.
50
50
Анализ активности СОД в образцах проводят с использованием метода, в основе которого лежит реакция ингибирования автоокисления пирогаллола под действием СОД [Marklund S., Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase //European journal of biochemistry. - 1974. - T. 47. - №. 3. - C. 469-474]. Измерения проводят в 96-луночном планшете. Для одного образца используют 8 лунок (один столбец). Последовательным разбавлением получают 8 точек объемом 20 мкл с концентрациями СОД от 1000 до 0,45 мкг/мл. В каждую из лунок добавляют 160 мкл 50 мМ Трис-буфера с рН 8,2 и 20 мкл раствора пирогаллола, полученного растворением навески пирогаллола в рассчитанном объеме ацетона с получением раствора с концентрацией 5 мг/мл и его разбавлением в 10 раз водой. Затем в течение 5 мин через каждые 30 сек с помощью спектрофотометра определяют изменение оптической плотности раствора от времени в результате окисления пирогаллола растворенным в воде кислородом в отсутствии и присутствии СОД и строят график зависимости скорости окисления пирогаллола от концентрации СОД в логарифмическом масштабе. С помощью программного обеспечения Origin 8.1 полученную зависимость аппроксимируют кривой «доза-ответ» и находят концентрацию, соответствующую 50%-ному ингибированию реакции (ЕС, мкг/мл). Далее рассчитывают активность СОД по формуле: А=1000000/(20 * ЕС) [Ед/мг]. Выход СОД по активности у частиц определяют как отношение активности СОД у частиц к начальной активности используемого в синтезе раствора СОД и измеряют в процентах. Следует отметить, что активность зависит от концентрации раствора СОД и снижается с ее уменьшением, а также от строения частиц и реагентов, используемых при их получении. Поэтому корректное сравнение значений активности СОД в частицах можно проводить с учетом только вышеуказанных условий. Стабильность частиц в суспензии в процессе их хранения и использования определяют по изменению их активности и размеров.
+
2+
Определение концентрации белка в образцах проводят с помощью набора Micro ВСА™ Protein Assay Kit в соответствии с инструкцией производителя. Метод основан на колориметрическом определении комплекса бицинхониновой кислоты с ионами Cu, образующегося путем восстановления ионов Cu белками. Выход СОД по белку (ферменту) определяют как отношение конечной массы белка в суспензии частиц к начальной массе используемого белка в синтезе.
Суммарный выход СОД по активности вычисляют как произведение выхода СОД по активности и выхода СОД по белку.
Раздражающую способность суспензии частиц при ее введении в глаз определяют на группах кроликов линии серая шиншилла, самцов, массой 2,0-2,5 кг, в возрасте 6 месяцев. Выбор данного вида лабораторных животных связан с крупным размером их глаз и возможностью детального наблюдения за реакцией различных структур глаза на вводимые вещества. Исследуемые суспензии частиц инсталлируют (закапывают) в конъюнк-тивальный мешок глаза кролика с помощью автоматического дозатора в количестве 50 мкл. Для оценки реакции инсталляции проводят в режиме терапевтической для человека кратности инсталляций: 3 раза в день в течение 5 дней по 0,05 мл в оба глаза, что соответствует 0,3 мл суспензии в сутки на животное. Биомикроскопию проводят перед первой инсталляцией и на пятые сутки через 30 мин после последней инсталляции. Метод биомикроскопии, основанный на прижизненном получении так называемых оптических срезов путем освещения глаза с использованием щелевой диафрагмы и увеличении изображения, позволяет визуально исследовать оптические среды и ткани глаза.
По данным биомикроскопии оценивают отек и гиперемию век, отек и гиперемию бульбарной конъюнктивы, фолликулярную реакцию, расширение сосудов лимба, наличие краевых точечных инфильтратов в роговице, наличие дефектов эпителия роговицы (витальное окрашивание 0,5%-ным раствором флуоресцеина), прозрачность оптических сред глаза (роговица, хрусталик, влага передней и задней камер, стекловидное тело). При этом ставят оценки выраженности признака в баллах: 0 - отсутствие признака; 1 - слабо выраженный признак; 2 - средне выраженный признак; 3 - ярко выраженный признак. Затем оценивают общий балл выраженности признаков и сравнивают с общим баллом группы кроликов, не подвергавшихся действию водной суспензии частиц.
Полученную суспензию частиц хранят при пониженной температуре в холодильнике, например, при 3-8°С.
Преимущества предлагаемого способа иллюстрируют следующие примеры.
Пример 1.
В пластиковую пробирку объемом 15 мл помещают 1,8 мл раствора СОД с концентрацией 5,00 мг/мл в буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,57 мг/мл и 0,11 мг/ мл соответственно, с рН 7,4 с добавлением NaCl с концентрацией 130 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 1,0 мл раствора поликатиона протамина с концентрацией 5,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 32,8 мкмолям аминогрупп протамина, и полученную смесь выдерживают в течение 30 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 1,1 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 5,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 30 мин при 4°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,9 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,4% по объему (39,6 мкмоль), что соответствует его мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 1,2, и полученную смесь выдерживают в течение 10 ч при 4°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,2 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 1,00 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц используют поточную мембранную фильтрующую систему. Полученную суспензию наливают в накопительную емкость, откуда суспензия с помощью перистальтического насоса поступает на фильтрационный картридж, содержащий мембрану с пределом пропускания 90 кДа, и двигается вдоль мембраны. Часть буферного раствора с низкомолекулярными побочными продуктами и не вступившими в реакцию реагентами проходит сквозь поры мембраны и накапливается в емкости. Остальная часть суспензии частиц, не прошедшая сквозь мембрану, рециркулируется обратно в накопительную емкость, где смешивается с постоянно поступающим буферным раствором с рН 7,4.
Суспензию из накопительной емкости переносят в пластиковую пробирку и хранят при 4°С. Получают 2,5 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из протамина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 90 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии, определенная вышеописанным методом, равна 13500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц составляет 52%. После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 7%, а размер частиц в суспензии практически не изменился.
Раздражающую способность суспензии частиц при ее введении в глаз определяют на группах кроликов линии серая шиншилла по вышеуказанной методике. До начала исследования состояние структур переднего отдела глаза у всех животных соответствовало физиологической норме: конъюнктива - видны единичные сосуды, гиперемия отсутствует; конъюнктива век розовая, гладкая, неотечная, отделяемое отсутствует; роговица гладкая, блестящая, без помутнений; флуоресцеиновая проба отрицательная; радужка равномерно пигментирована, зрачок круглый, реагирует на свет; внутренние среды глаза прозрачны.
В процессе эксперимента животные не проявляли беспокойства и негативной реакции на инстилляции.
По данным флуоресцеиновой пробы нарушений целостности эпителия роговицы не выявлено: после закапывания 0,5% раствора флуоресцеина определяется равномерное зеленоватое свечение всей поверхности роговицы (флуоресцеиновая проба отрицательная). Оптические среды глаз во всех группах оставались прозрачными.
Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной суспензии не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.
Пример 2.
В пластиковую пробирку объемом 15 мл помещают 1,8 мл раствора СОД с концентрацией 2,50 мг/мл в буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,03 мг/мл и 0,57 мг/ мл, соответственно, с рН 5 с добавлением NaCl с концентрацией 140 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 1,0 мл раствора поликатиона полилизина с концентрацией 2,50 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 16,4 мкмолям аминогрупп поликатиона, и полученную смесь выдерживают в течение 25 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 1,1 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 2,50 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 25 мин при 3°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,45 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,1% по объему (4,92 мкмоль), что соответствует его мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 0,3, и полученную смесь выдерживают в течение 8 ч при 3°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,2 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 1,00 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц используют поточную мембранную фильтрующую систему. Полученную суспензию наливают в накопительную емкость, откуда суспензия с помощью перистальтического насоса поступает на фильтрационные картриджи, содержащие мембраны с пределом пропускания 130 к Да и с большой скоростью двигается вдоль мембран. Часть буферного раствора с низкомолекулярными побочными продуктами и не вступившими в реакцию реагентами проходит сквозь поры мембраны и накапливается в емкости. Остальная часть суспензии частиц, не прошедшая сквозь мембрану, рециркулируется обратно в накопительную емкость, где смешивается с постоянно поступающим вышеописанным буферным раствором.
Суспензию из накопительной емкости переносят в пластиковую пробирку и хранят при 3°С. Получают 2,4 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из полилизина внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, равен 123 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии, определенная вышеописанным методом, составляет 6500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 55%. После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 6%, а размер частиц суспензии практически не изменился.
Раздражающую способность суспензии частиц при ее введении в глаз кроликам определяют аналогично примеру 1. В процессе эксперимента животные не проявляли беспокойства и негативной реакции на инсталляции. Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной суспензии не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.
Пример 3.
В пластиковую пробирку объемом 15 мл помещают 1,8 мл раствора СОД с концентрацией 10,00 мг/мл в буферном растворе, содержащем гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,58 мг/мл и 0,04 мг/ мл, соответственно, с рН 8 с добавлением NaCl с концентрацией 150 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 1,0 мл раствора поликатиона полиаргинина с концентрацией 10,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 65,6 мкмолям аминогрупп поликатиона, и полученную смесь выдерживают в течение 40 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 1,1 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 10,00 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 40 мин при 8°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,9 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 0,5% по объему (99,4 мкмоль), что соответствует его мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 1,5, и полученную смесь выдерживают в течение 12 ч при 8°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,2 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 2,00 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов в пробирку центрифуги помещают фильтр с ультрафильтрационной мембраной с пределом пропускания 100 кДа, затем фильтр вначале заполняют 5,0 мл полученной суспензии частиц, после чего туда добавляют 10,0 мл буферного раствора, содержащего гидрофосфат натрия и дигидрофосфат натрия с концентрациями 0,58 мг/мл и 0,04 мг/ мл соответственно, с рН 8 с добавлением NaCl с концентрацией 150 мМ, пробирку с фильтром помещают в центрифугу и проводят центрифугирование в течение 12 мин при скорости вращения ротора центрифуги 3500 об/мин. После этого в пробирку повторно добавляют 10,0 мл буферного раствора с рН 8, снова помещают в центрифугу и проводят повторное центрифугирование, затем снова добавляют 10,0 мл буферного раствора и осуществляют третье центрифугирование. Находящуюся над фильтром очищенную суспензию переносят в пластиковую пробирку и хранят при 8°С.
В итоге получают 2,6 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из полиаргинина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 196 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии, определенная вышеописанным методом, составляет 26200±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 47%. После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 8%, а размер частиц суспензии практически не изменился.
Раздражающую способность суспензии частиц при ее введении в глаз кроликам определяют аналогично примеру 1.В процессе эксперимента животные не проявляли беспокойства и негативной реакции на инсталляции. Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной суспензии не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.
Пример 4.
Опыт проводят аналогично примеру 1, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА-ПГ.
Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 153 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии составляет 13500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 52%. После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 9%, а размер частиц суспензии практически не изменился.
Ежедневное применение вышеописанной суспензии не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.
Пример 5.
Опыт проводят аналогично примеру 2, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА-ПГ.
Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 118 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 7200±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 47%. После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 7%, а размер частиц суспензии практически не изменился.
Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной суспензии не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.
Пример 6.
Опыт проводят аналогично примеру 3, однако в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА-ПГ.
Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 186 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии равна 24900±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 49%. После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 7%, а размер частиц суспензии практически не изменился.
Опыт показал, что ежедневное применение вышеописанной суспензии не оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз.
Пример 7 (контрольный, по прототипу)
В пластиковую пробирку объемом 15 мл помещают 1,8 мл раствора СОД с концентрацией 5 мг/мл в 0,01 М буферном растворе ХЕПЕС с рН 7,4 с добавлением NaCl с концентрацией 150 мМ, затем туда при перемешивании по каплям добавляют 1,0 мл раствора поликатиона протамина с концентрацией 5 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, что соответствует 32,8 мкмолям аминогрупп протамина, и полученную смесь выдерживают в течение 30 мин при перемешивании. После этого в полученный раствор при перемешивании по каплям добавляют 1,1 мл раствора полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ с концентрацией 5 мг/мл в вышеописанном буферном растворе, и полученную смесь при перемешивании выдерживают в течение 30 мин при 4°С. Затем в полученную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,9 мл свежеприготовленного водного раствора глутарового альдегида с концентрацией 1,0% по объему (98,4 мкмоль), что соответствует его мольному соотношению с аминогруппами поликатиона 3,0, и полученную смесь выдерживают в течение 10 ч при 4°С. После этого в вышеуказанную смесь при перемешивании по каплям добавляют 0,1 мл свежеприготовленного водного раствора боргидрида натрия с концентрацией 1 мг/мл. Для очистки суспензии полученных частиц от побочных продуктов и не вступивших в реакцию реагентов в пробирку центрифуги помещают фильтр с ультрафильтрационной мембраной с пределом пропускания 50 кДа, затем фильтр вначале заполняют 4,8 мл полученной суспензии частиц, после чего туда добавляют 10,0 мл буферного раствора ХЕПЕС, пробирку с фильтром помещают в центрифугу и проводят центрифугирование в течение 15 мин при скорости вращения ротора центрифуги 4000 об/мин. После этого в пробирку повторно добавляют 10,0 мл буферного раствора ХЕПЕС, снова помещают в центрифугу и проводят повторное центрифугирование, затем снова добавляют 10,0 мл буферного раствора ХЕПЕС и осуществляют третье центрифугирование. Находящуюся над фильтром очищенную суспензию переносят в пластиковую пробирку и хранят при 4°С. Получают 2,5 мл суспензии частиц, у которых ядро из СОД покрыто внутренней оболочкой из протамина и внешней оболочкой из блок-СПЛ. Диаметр полученных частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 52 нм. Активность СОД у частиц в полученной суспензии, определенная вышеописанным методом, составляет 11500±1000 Ед/мл. Суммарный выход СОД по активности у частиц равен 35%. После трехмесячного хранения при 4°С активность СОД у частиц снижалась на 20%, а размер частиц суспензии практически увеличился на 15%.
Раздражающую способность суспензии частиц при ее введении в глаз кроликам определяют аналогично примеру 1.
В процессе эксперимента животные проявляли беспокойство и негативную реакцию на инсталляции. Было обнаружено раздражающее действие на конъюнктиву.
По данным флуоресцеиновой пробы нарушений целостности эпителия роговицы не выявлено. Оптические среды глаз во всех группах оставались прозрачными.
Опыт показал, что водосодержащая суспензия частиц на основе буфера ХЕПЕС оказывает местное раздражающее действие на слизистую оболочку глаз, что не позволяет ее использование в офтальмологических целях.
Сравнение результатов, описанных в примере 1 и контрольном примере 7, в которых были использованы одни и те же реагенты, взятые в одинаковых концентрациях, показывает, что предлагаемый способ увеличивает суммарный выход СОД по активности с 35 до 55%, повышает в 3 раза стабильность значений активности СОД у частиц в процессе хранения, а также повышает стабильность размеров частиц в процессе хранения.
Пример 8 (контрольный, с обработкой частиц СОД буферным раствором поликатиона протамина)
Для определения взаимодействия между положительно заряженным протамином с отрицательно заряженной СОД ее модифицируют с помощью флуоресцентного красителя Alexa 488 (А20000, ThermoFisher, США) и наблюдают тушение флуоресценции при добавлении протамина. Используемый метод тушения флуоресценции является одним из удобных и информативных методов для исследования полиэлектролитных реакций.
С целью проверки модификации протамином на первом этапе к раствору СОД с концентрацией 5 мг/мл добавляют раствор флуоресцентного красителя Alexa 488 с концентрацией 10 мг/мл, далее проводят очистку от непрореагировавших молекул красителя с использованием колонки NAP-10 (GE Healthcare, США). Далее к раствору СОД, помеченному с помощью красителя, добавляют раствор протамина. С помощью флуоресцентного спектрометра измеряют интенсивность флуоресценции и рассчитывают уменьшение (тушение) интенсивности флуоресценции раствора, связанное с взаимодействием молекул протамина с молекулами СОД.
На Фиг. 1 показано, что при увеличении количества добавляемого раствора протамина происходит уменьшение интенсивности флуоресценции раствора, что связано с взаимодействием протамина с меченной СОД. При этом цифрой 1 обозначено изменение интенсивности флуоресценции раствора СОД, меченной красителем. Из Фиг. 1. следует, что СОД взаимодействует с протамином, который образует оболочку на СОД, тем самым уменьшает флуоресценцию красителя, связанного с СОД.
Пример 9 (контрольный, с обработкой частиц СОД буферным раствором поликатиона полилизина)
Опыт проводят аналогично примеру 8, однако, в качестве поликатиона используют, полилизин. Были получены результаты, аналогичные примеру 8, которые показали, что СОД взаимодействует с полилизином с образованием слоя поликатиона на СОД.
Пример 10 (контрольный, с обработкой частиц СОД буферным раствором поликатиона полиаргинина)
Опыт проводят аналогично примеру 8, однако в качестве поликатиона используют полиаргинин. Были получены результаты, аналогичные примеру 8, из которых следует, что СОД взаимодействует с полиаргиниом с образованием на частицах СОД оболочки из поликатиона.
Пример 11 (контрольный, с обработкой частиц СОД, покрытых оболочкой из поликатиона протамина, раствором полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ)
Для определения включения блок-СПЛ в состав частиц блок-сополимера ПГ-ПЭГ модифицируют с помощью флуоресцентного красителя флуоресцеина изоционата (F2181, ThermoFisher, США) и добавляют к раствору с СОД, покрытой оболочкой из протамина. С целью проверки модификации блок-сополимера ПГ-ПЭГ к раствору блок-СПЛ с концентрацией 5 мг/мл добавляют раствор флуоресцентного красителя с концентрацией 10 мг/мл, далее проводят очистку от непрореагировавших молекул с использованием колонки NAP-10 (GE Healthcare, США).
Далее раствор блок-СПЛ, помеченный красителем, добавляют по каплям при перемешивании к раствору СОД, покрытой оболочкой из протамина. С помощью флуоресцентного спектрометра измеряют уменьшение (тушение) интенсивности флуоресценции, связанное с взаимодействием молекул блок-сополимера ПГ-ПЭГ с СОД, покрытой оболочкой из протамина.
На Фиг. 2 показано, что при увеличении количества добавляемого блок-СПЛ, вначале происходит уменьшение флуоресценции (кривая 2) относительно начального значения уровня флуоресценции раствора (кривая 3). Уменьшение (тушение) флуоресценции происходит за счет взаимодействия СОД, модифицированного поликатионом, и меченного красителем блок-СПЛ, однако при избытке блок-СПЛ, наблюдается увеличение уровня флуоресценции (кривая 2), что связано с избытком блок-СПЛ по отношению к СОД, покрытой оболочкой из протамина. Количество отрицательно заряженных групп молекул блок-СПЛ превышает общее количество положительно заряженных групп в частицах СОД, модифицированных протамином, поэтому молекулы блок-СПЛ, меченные красителем, находятся в свободной форме в растворе, увеличивая интенсивность флуоресценции раствора.
Из Фиг. 2 следует, что полианион блок - СПЛ вступает во взаимодействие с СОД, покрытой протамином, при этом по данным, полученным с помощью метода динамического светорассеяния, наблюдается формирование частиц диаметром 90 нм, что также подтверждает факт взаимодействия, поскольку исходный размер частиц СОД, покрытых поликатионом, составляет 70 нм.
Пример 12 (контрольный, с обработкой частиц СОД, покрытых оболочкой из поликатиона полилизина, раствором полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ)
Опыт проводят аналогично примеру 11, однако в качестве поликатиона используют полилизин. Были получены результаты, аналогичные примеру 11, из которых следует, что блок-СПЛ вступает во взаимодействие с СОД, покрытой полилизином, с образованием на ней слоя полианиона. При этом по данным, полученным с помощью метода динамического светорассеяния, наблюдается формирование частиц диаметром 125 нм, что также подтверждает факт взаимодействия.
Пример 13 (контрольный, с обработкой частиц СОД, покрытых оболочкой из поликатиона полиаргинина раствором полианиона блок-сополимера ПГ-ПЭГ)
Опыт проводят аналогично примеру 8, однако в качестве поликатиона используют полиаргинин. Были получены результаты, аналогичные примеру 11, из которых следует, что блок - СПЛ вступает во взаимодействие с СОД, покрытой полиаргинином, с образованием на ней слоя полианиона. При этом по данным, полученным с помощью метода динамического светорассеяния, наблюдается формирование частиц диаметром 196 нм, что также подтверждает факт взаимодействия.
Пример 14 (контрольный, с обработкой частиц СОД, покрытых оболочкой из поликатиона протамина раствором полианиона блок-сополимера ПА-ПЭГ)
Опыт проводят аналогично примеру 8, однако в качестве полианиона используют блок- сополимер ПА-ПЭГ. Были получены результаты, аналогичные примеру 11, из которых следует, что блок - СПЛ вступает во взаимодействие с СОД, покрытой протамином, с образованием на ней слоя полианиона. При этом по данным, полученным с помощью метода динамического светорассеяния, наблюдается формирование частиц диаметром 153 нм.
Пример 15 (контрольный, с обработкой частиц СОД, покрытых оболочкой из поликатиона полилизина раствором полианиона блок-сополимера ПА-ПЭГ)
Опыт проводят аналогично примеру 8, однако в качестве поликатиона используют полилизин, а в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА-ПЭГ. Были получены результаты, аналогичные примеру 11, из которых следует, что блок - СПЛ вступает во взаимодействие с СОД, покрытой полилизином, с образованием на ней слоя полианиона. При этом по данным, полученным с помощью метода динамического светорассеяния, наблюдается формирование частиц диаметром 118 нм.
Пример 16 (контрольный, с обработкой частиц СОД, покрытых оболочкой из поликатиона полиаргинина раствором полианиона блок-сополимера ПА-ПЭГ)
Опыт проводят аналогично примеру 8, однако в качестве поликатиона используют полиаргинин, а в качестве полианиона используют блок-сополимер ПА - ПЭГ. Были получены результаты, аналогичные примеру 11, из которых следует, что блок - СПЛ вступает во взаимодействие с СОД, покрытой полиаргинином. При этом по данным, полученным с помощью метода динамического светорассеяния, наблюдается формирование частиц диаметром 186 нм.
Пример 17 (контрольный, с обработкой частиц глутаровым альдегидом)
Для определения степени удерживания СОД в частицах, полученных в примере 1, а также оценки стабильности частиц в растворе используют диализные капсулы с пределом пропускания 100 кДа марки Float-А-Lyzer G2 (Spectrum Laboratories, США). Каждую капсулу заполняют 1 мл либо раствора нативной СОД с концентрацией 1 мг/мл, либо суспензией частиц до обработки глутаровым альдегидом, либо суспензией частиц после обработки глутаровым альдегидом. Далее каждую капсулу опускают в емкость с описанным в примере 1 фосфатным буфером с рН 7,4 объемом 30 мл и отбирают пробы из каждой капсулы через заданные промежутки времени. Затем в пробах измеряют активность СОД. Если составляющие частицы не связаны ковалентно, то СОД способна высвобождаться из оболочки и диффундировать сквозь мембрану диализной капсулы, тем самым понижая общую активность внутри капсулы.
На Фиг 3. показано, что частицы, обработанные водным раствором глутарового альдегида (кривая 4), обладают более высокой стабильностью, благодаря ковалентному связыванию полимеров и фермента в частице. Из Фиг. 3 также видно, что СОД в частицах, обработанных глутаровым альдегидом, удерживается лучше, чем в необработанных. Так, после 24 ч процент оставшейся активности СОД в частицах, обработанных глутаровым альдегидом (кривая 4), значительно выше, чем в образцах, необработанных глутаровым альдегидом (кривая 5), и в образцах раствора СОД (кривая 6).
Суспензии частиц, полученные по примерам 2-6 с обработкой глутаровым альдегидом также обладают большей стабильностью, по сравнению с частицами без обработки глутаровым альдегидом.
Пример 18 (контрольный, со сравнением выхода по активности СОД в различных буферах)
Получают частицы с использованием фосфатного буфера по примеру 1 и буфера ХЕПЕС по примеру 7. Для определения степени удерживания СОД в частицах, а также оценки стабильности частиц в растворе в процессе их хранения используют диализные капсулы с мембраной с пределом пропускания 100 кДа марки Float-A-Lyzer G2 (Spectrum Laboratories, США). Каждую капсулу заполняют водосодержащей суспензией частиц, полученных в различных буферах, затем помещают в пробирку с 30 мл соответствующего буфера и после чего отбирают из капсул аликвоты с течением времени с целью оценки оставшейся активности СОД в частицах. Если составляющие частицы недостаточно ковалентно связаны между собой, то СОД способна высвобождаться из оболочки и диффундировать сквозь мембрану диализной капсулы, поскольку молекулярная масса СОД гораздо ниже величины пропускания использованной мембраны. При этом понижается общая активность СОД внутри капсулы.
На Фиг. 4 показано, что процент оставшейся активности в диализной капсуле с частицами, полученными в вышеописанном буфере ХЕПЕС (кривая 7), значительно ниже, чем в суспензиях частиц, полученных в фосфатных буферах по примеру 1 (кривая 8), что свидетельствует о более быстром высвобождении СОД из частиц, полученных с использованием буферного раствора ХЕПЕС.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что выбор фосфатного буферного раствора более оправдан как ввиду повышенной стабильности частиц, так и малой раздражающей способностью фосфатного буфера по сравнению с буфером ХЕПЕС.
Таким образом, из приведенных примеров видно, что предложенный способ действительно дает возможность получать частицы на основе антиоксидантного фермента СОД, покрытые внутренней оболочкой из поликатиона и внешней оболочкой из полианиона, пригодные для лечения офтальмологических заболеваний, у которых суммарный выход СОД по активности возрастает с 35 до 55%, в 2,5-3 раза повышается стабильность значений активности СОД у частиц в процессе их хранения и размер частиц в процессе их хранения в отличие от прототипа практически не меняется, что свидетельствует о повышении стабильности размеров частиц, а также снижается раздражающая способность суспензии частиц при ее введении в глаз.