УСТРОЙСТВО ДЛЯ ОДНОВРЕМЕННОГО КОНТРОЛЯ В РЕАЛЬНОМ МАСШТАБЕ ВРЕМЕНИ МНОЖЕСТВА АМПЛИФИКАЦИЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

Настоящая полезная модель относится к приборам для качественного и количественного анализа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), в которых использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и которые широко используются в медицинской практике и в исследовательских целях:
- при диагностике инфекционных, онкологических и генетических заболеваний человека и животных;
- при молекулярно-биологических исследованиях;
- при генетических исследованиях;
- при мониторинге экспрессии генов с диагностическими и исследовательскими целями и т.д.
Для реализации метода ПЦР разработаны и применяются устройства, объединяющие в себе термоциклер, осуществляющий проведение ПЦР, и флуоресцентный детектор, при помощи которого оценивается количество продукта на любой стадии реакции.
ТМ
Известен прибор Real_Time PCR System Мх3000 компании STRATAGENE, США (URL:
http://www.lajollaneuroscience.org/sr/homepage/microarray/PDFs_Excel/MX3000pBrochure.pdf.), в котором реализован принцип количественных исследований нуклеиновых кислот, основанный на регистрации продукта реакции непосредственно в ходе ПЦР. Прибор объединяет в себе термоциклер, осуществляющий проведение ПЦР, и флуоресцентный детектор. Прибор подключен к персональному компьютеру для конечной обработки полученных результатов. Термоциклер включает в себя пластину с 96 углублениями для пробирок с реакционными смесями. Свет возбуждения от источника излучения, в качестве которого используется галогеновая лампа, передается в каждую из 96 пробирок последовательно с помощью коаксиального волоконно-оптического световода. Свет излучения флуоресценции, последовательно излучаемый из каждой пробирки, возвращается обратно по коаксиальному волоконно-оптическому световоду, спектрально фильтруется и направляется в детектор (фотоэлектронный умножитель).
Описанное устройство обладает следующим основным недостатком: при перемещении световода между пробирками затрачивается значительное время, в течение которого не снимается сигнальная информация, при этом увеличивается время, затраченное на один цикл и на полный анализ.
Ближайшим из известных технических решений аналогичного назначения является устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты (патент на изобретение РФ №2418289, МПК G01N, 21/64, опубл. 10.05.2011, Бюл. №13).
Известное устройство содержит термоциклер 1 (фиг.1), включающий теплопроводящий элемент с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями 2 и термокрышку, оптическую систему 3, включающую источник излучения 4 и детектор флуоресценции 5, устройство автоматического управления температурным режимом 6 и персональный компьютер 7 с программным обеспечением.
Флуориметрический детектор 3 состоит из галогенной лампы 8, двух двухлинзовых конденсоров 9 и 10, между линзами которых установлены интерференционные светофильтры возбуждения 11 и эмиссии 12, коаксиальных световодных жгутов 13 и многоканального фотоприемника 14.
Источник излучения 4 через центральные волоконно-оптические световоды жгутов 13 передает свет возбуждения в пробирку. Внешний волоконно-оптический световод жгута 13 передает излучение флуоресценции из пробирок в детектор.
С каждым температурным циклом количество исследуемых фрагментов нуклеиновой кислоты увеличивается приблизительно в 2 раза. Пропорционально увеличиваются сигналы на выходе детектора флуоресценции. После выполнения до 40 температурных циклов интенсивность сигналов достаточна для получения результатов анализов.
Однако описанное устройство имеет следующие существенные недостатки:
- существующая схема требует применения множества сложных коаксиальных волоконно-оптических световодов, равного числу пробирок;
- в известном устройстве в качестве многоканального фотоприемника применен многоканальный фотоэлектронный умножитель ФЭУ, обладающий существенными недостатками по сравнению с одноканальным ФЭУ (в том числе сложность и высокая стоимость);
- световой поток от источника излучения распределяется сразу на все световоды, что понижает интенсивность возбуждающего излучения для каждой пробирки и ухудшает отношение сигнала к шуму.
Предлагаемая полезная модель решает задачу упрощения конструкции коаксиальных волоконно-оптических световодов, замену многоканального ФЭУ обычным одноканальным ФЭУ, увеличения интенсивности возбуждающего излучения для каждой пробирки и улучшение отношения сигнала к шуму.
Указанная задача решается за счет того, что в известное устройство, содержащее термоциклер, включающий теплопроводящий элемент с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, термокрышку и устройство автоматического управления температурным режимом, а также оптическую систему, включающую источник излучения, коаксиальный волоконно-оптический световод для передачи света возбуждения от источника к пробиркам и от пробирок с реакционными смесями к детектору для детектирования флуоресценции, и детектор для детектирования флуоресценции, снабжено оптическим коммутатором, связанным с устройством управления световыми потоками, при этом источник излучения и детектор соединены с коммутатором одним волоконно-оптическим световодом, а пробирки с реакционными смесями соединены с оптическим коммутатором множеством световодов, равным числу пробирок.
Волоконно-оптические световоды могут быть выполнены из полимерного материала.
Концы световодов, входящие в термокрышку, имеют тепловой контакт с охлаждающим радиатором, расположенным над термокрышкой.
Полезная модель поясняется фиг.2, на которой представлена принципиальная схема заявляемого устройства для лабораторной и функциональной диагностики путем количественного анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Предлагаемое устройство содержит термоциклер 1, включающий теплопроводящий элемент с расположенными в нем углублениями для пробирок 2 с реакционными смесями и термокрышку, оптическую систему 3, включающую источник излучения 4 и детектор флуоресценции 5, устройство автоматического управления температурным режимом 6, персональный компьютер 7 с программным обеспечением, оптический коммутатор 15, устройство управления световыми потоками 16, волоконно-оптические световоды 17 и охлаждающий радиатор 18.
Флуориметрический детектор 3 состоит из галогенной лампы 8, двух двухлинзовых конденсоров 9 и 10, между линзами которых установлены интерференционные светофильтры возбуждения 11 и эмиссии 12, световодного жгута 13 и одноканального фотоприемника 14.
Оптический коммутатор 15 содержит центральное зеркало 19, расположенное на оси вращения двигателя устройства управления световыми потоками 16, вращающегося зеркала 20, световая ось которого поочередно совпадает с каждым волоконно-оптическим световодом 17, и фокусирующую линзу 21.
Работает предлагаемое устройство следующим образом. Источник излучения 4 через центральный волоконно-оптический световод 13 передает свет возбуждения на центральное зеркало 19 оптического коммутатора 15. Через фокусирующую линзу 21, вращающееся зеркало 20 и оптический световод 17 свет возбуждения подается на одну из пробирок 2 с реакционными смесями. Излучение флуоресценции одной из пробирок 2 передается в обратном направлении через оптический световод 17, оптический коммутатор 15, внешнюю часть волоконно-оптического световода 13 на вход одноканального фотоприемника 14. При каждом температурном цикле с помощью оптического коммутатора 15 и устройства управления световыми потоками происходит возбуждение и детектирования флуоресценции поочередно от каждой пробирки.
В предложенном устройстве нет необходимости использовать множество коаксиальных волоконно-оптических световодов, равное числу пробирок, используется только один коаксиальный волоконно-оптический световод.
В предложенном устройстве применен более простой и дешевый одноканальный фотоприемник (ФЭУ).
Световой поток от источника излучения полностью используется для возбуждения излучения для каждой пробирки с реакционными смесями, таким способом улучшается отношение сигнала к шуму. Интенсивность сигналов на выходе фотоприемника пропорциональна световому потоку от источника излучения и времени наблюдения. Например, при использовании в предложенном устройстве 32 пробирок, по сравнению с известным устройством приблизительно в 32 раза увеличивается световой поток от источника излучения и одновременно во столько же раз уменьшается время наблюдения. Поэтому интенсивность сигналов на выходе фотоприемника не изменяется. Однако при сокращении времени наблюдения в 32 раза шумы уменьшаются в √32=5,7 раз.
Выполнение волоконно-оптических световодов из полимерного материала позволяют снизить их стоимость. Использование охлаждающего радиатора при температуре, близкой к комнатной, исключает возможность разрушения световодов за счет перегрева от тепловой крышки.
Предложенные технические решения позволяют упростить конструкцию устройства, снизить себестоимость, повысить чувствительность устройства и тем самым добиться уменьшения необходимого для проведения ПЦР количество реакционной смеси.
Источники информации
ТМ
1. Прибор Real_Time PCR System Мх3000 компании STRATAGENE, США (URL: http://www.lajollaneuroscience.org/sr/homepage/microarray/PDFs_Excel/MX3000pBrochure.pdf.).
2. Патент на изобретение РФ №2418289, МПК G01N, 21/64, опубл. 10.05.2011, Бюл. №13. Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты (прототип).