СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИШЕНЕЙ ДЛЯ ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКОВ ПРИ ПОМОЩИ КОМПЛЕМЕНТАРНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ

1. Способ идентификации жизненно важного гена, который служит мишенью для антибиотика в бактерии, указанный способ, включает этапы:
R
(а) создания устойчивого к антибиотику мутанта указанной бактерии при помощи способа, включающего этап отбора на основании способности к росту в присутствии указанного антибиотика для получения клона устойчивого к антибиотикам мутанта (мутант Ab);
R
(б) трансформации мутанта Ab: (i) одним или более жизненно важными генами указанной бактерии; и (ii) транспозоном, который при встраивании инактивирует ДНК бактерии, с получением совокупности транспозонных мутантов, которые меродиплоидны по указанному одному или более жизненно важным генам;
(в) выращивания бактерий из указанной меродиплоидной совокупности в присутствии различных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования; и
(г) сравнения распределения вставок транспозонов между культурами для тестирования с целью идентификации предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для действия указанного антибиотика в указанной бактерии.
5
5
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная меродиплоидная совокупность содержит по меньшей мере 0,5×10 мутантов, например по меньшей мере 1×10 мутантов.
6
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная меродиплоидная совокупность содержит по меньшей мере 5×10 мутантов.
6
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная меродиплоидная совокупность содержит по меньшей мере 1×10 мутантов.
6
6
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная меродиплоидная совокупность содержит от 0,5×10 до 2×10 мутантов.
6
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что указанная меродиплоидная совокупность содержит приблизительно 1×10 мутантов.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансформация транспозоном на этапе (б) приводит к уровню встраивания равному по меньшей мере одному транспозону на 50 пар оснований бактериальной ДНК.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансформация транспозоном на этапе (б) приводит к уровню встраивания по меньшей мере одному транспозону на 30 пар оснований бактериальной ДНК.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансформация транспозоном на этапе (б) приводит к уровню встраивания равному по меньшей мере одному транспозону на 25 пар оснований бактериальной ДНК.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансформация транспозоном на этапе (б) приводит к уровню встраивания равному по меньшей мере одному транспозону на 15 пар оснований бактериальной ДНК.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что трансформация транспозоном на этапе (б) приводит к уровню встраивания равному по меньшей мере одному транспозону на 10 пар оснований бактериальной ДНК.
12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что бактериальная ДНК на этапе (б) является геномной ДНК.
13. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что бактериальная ДНК на этапе (б) является плазмидной ДНК или смесью геномной и плазмидной ДНК.
R
14. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что мутант Аb получают при помощи способа, который дополнительно включает мутагенез указанной бактерии перед отбором на основании способности к росту в присутствии указанного антибиотика.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что этап мутагенеза является (а) химическим мутагенезом; и/или (б) радиационным мутагенезом.
16. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанная бактерия является грамположительной бактерией.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанная бактерия выбрана из: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и Neisseria gonorrhoeae;
18. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанная бактерия является грамотрицательной бактерией.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанная бактерия выбрана из: Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Escherichia coli, штаммов E. coli ST 131, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes и Neisseria gonorrhoeae.
7
9
8
20. Способ по пп. 1-11, 15, 17 или 19, отличающийся тем, что указанную бактерию выращивают из меродиплоидной совокупности на этапе (в) путем посева на питательную среду от 10 до 10, например, приблизительно 10 КОЕ из указанной меродиплоидной совокупности.
21. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17 или 19, отличающийся тем, что на этапе (в) получают по меньшей мере две культуры для тестирования, и одну из них выращивают в отсутствии антибиотика, а другую - в присутствии антибиотика (например, при концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 4 × MIC (минимальную ингибирующую концентрацию)).
22. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17 или 19, отличающийся тем, что указанное распределение вставок транспозонов между культурами для тестирования сравнивают путем секвенирования ДНК, примыкающей или расположенной поблизости от указанного сайта встраивания транспозона.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что секвенирование ДНК, примыкающей или расположенной поблизости от указанного сайта встраивания включает селективную амплификацию участков соединения транспозон-бактериальная ДНК.
24. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанное секвенирование включает биохимический способ секвенирования путем синтеза (SBS).
25. Способ по п. 22, отличающийся тем, что секвенируют приблизительно 25, 50, 75, 100 или более 100 пар оснований ДНК, соседствующих или расположенных поблизости от указанного сайта встраивания.
26. Способ по п. 22, отличающийся тем, что секвенированная ДНК расположена с 5′ и/или 3′-стороны от указанного сайта встраивания.
27. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19 или 23-26, дополнительно включающий этап приписывания определенной жизненно важной функции указанному предполагаемому жизненно важному гену путем сравнения последовательностей с одним или более жизненно важными генами указанной бактерии.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что указанный жизненно важной ген (гены) идентифицируют путем транспозон-направленного секвенирования сайтов встраивания.
29. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26 или 28, дополнительно включающий этап приписывания определенной жизненно важной функции указанному предполагаемому жизненно важному гену путем определения того, что он не является геном устойчивости к антибиотику.
30. Способ по п. 29, отличающийся тем, что указанный этап определения включает идентификацию гена устойчивости к антибиотику путем транспозон-направленного секвенирования сайтов встраивания с применением транспозона, который при встраивании оказывает инактивирующее действие.
31. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28 или 30, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов в соответствии с этапом (б) представлены в составе вектора экспрессии.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов в соответствии с этапом (б) представлены в составе интегрирующегося вектора экспрессии, который встраивается в бактериальную хромосому после трансформации.
33. Способ по п. 31, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов в соответствии с этапом (б) представлены в составе одиночного вектора экспрессии или вектора экспрессии с малым числом копий, отличающегося тем, что он стабильно сохраняется во внехромосомных элементах после трансформации.
34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанный вектор экспрессии представляет собой комбинацию плазмид, содержащих фрагменты нативной хромосомы указанной бактерии.
35. Способ по п. 33, отличающийся тем, что указанный вектор экспрессии представляет собой искусственную бактериальную хромосому (ВАС).
36. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28 или 30, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов на этапе (б) представлены в составе линейной ДНК (например, фрагментов геномной ДНК указанной бактерии).
37. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28, 30 или 32-35, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов на этапе (б) включают все или одну определенную подгруппу жизненно важных генов указанной бактерии.
38. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28, 30 или 32-35, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов на этапе (б) включают по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50, по меньшей мере 100, по меньшей мере 150, по меньшей мере 200, по меньшей мере 250 или по меньшей мере 300 жизненно важных генов указанной бактерии.
39. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28, 30 или 32-35, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов на этапе (б) получают при помощи способа, включающего идентификацию одного или более жизненно важных генов указанной бактерии путем транспозон-направленного секвенирования сайтов встраивания.
40. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28, 30 или 32-35, отличающийся тем, что один или более жизненно важных генов на этапе (б) выбирают из генов, участвующих в:
(а) делении клеток; и/или
(б) репликации ДНК (включая полимеризацию и суперспирализацию); и/или
(в) транскрипции (включая праймирование, элонгацию и терминацию); и/или
(г) трансляции (включая гены, кодирующие рибосомальные компоненты, гены, участвующие в инициации, элонгации и высвобождении); и/или
(д) путях биосинтеза (например, обмен пептидогликанов и/или жирных кислот).
(е) «привыкании» к плазимдам (например, сохранение последовательностей плазмид в клетке бактерии).
R
41. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28, 30 или 32-35, отличающийся тем, что на этапе (б) мутант Ab трансформируют одновременно одним или более жизненно важными генами указанной бактерии и транспозоном.
R
42. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28, 30 или 32-35, отличающийся тем, что на этапе (б) мутант Ab трансформируют сначала транспозоном, а затем одним или более жизненно важными генами указанной бактерии.
R
43. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28, 30 или 32-35, отличающийся тем, что на этапе (б) мутант Ab трансформируют сначала одним или более жизненно важными генами указанной бактерии, а затем транспозоном.
R
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что что на этапе (б) мутант Ab трансформируют сначала внехромосомным элементом (например, плазмидой или ВАС), содержащим: (i) один или более жизненно важных генов указанной бактерии; и (ii) одну или более последовательность транспозонных повторов; и затем трансформируют (например, путем конъюгации с бактерией-донором) плазмидой для доставки транспозона, содержащей (i) ген, кодирующий транспозазу; и (ii) сайты распознавания транспозазы обратных повторов; где одна или более последовательностей траснпозонных повторов указанного внехромосомного элемента придают иммунитет к транспозиции в отношении транспозона, доставляемого плазмидой для доставки транспозона.
45. Способ по любому из пп. 1-11, 15, 17, 19, 23-26, 28, 30, 32-35 или 44, дополнительно включающий этапы:
A
A
(а) создания совокупности бактерий-мутантов посредством транспозонного мутагенеза с применением активирующего транспозона (Tn), отличающегося тем, что указанный Tn содержит промотор, такой что встраивание транспозона в бактериальную ДНК усиливает транскрипцию гена в сайте встраивания или поблизости от него;
(б) выращивания бактерий из совокупности мутантов в присутствии разных количеств указанного антибиотика с получением двух или более культур для тестирования; и
A
(в) сравнения распределения вставок Tn между культурами для тестирования с целью идентификации предполагаемого жизненно важного гена, служащего мишенью для действия указанного антибиотика в указанной бактерии.
46. Плазмида для доставки транспозона, содержащая: (i) ген, кодирующий транспозазу; и (ii) сайты распознавания транспозазы обратных повторов, для применения при реализации способа по п. 44.
47. Набор, включающий плазмиду для доставки транспозона по п. 46, необязательно включающий дополнительно плазмиду или ВАС, содержащие: (i) один или более жизненно важных генов бактерии; и (ii) одну или более последовательность транспозонных повторов, причем указанные последовательности повторов придают иммунитет к транспозиции в отношении транспозона, доставляемого плазмидой для доставки транспозона.
48. Способ идентификации антибиотика, включающий идентификацию жизненно важного гена, который служит мишенью для действия указанного антибиотика согласно способу, описанному в любом из пп. 1-45.
49. Способ получения антибиотика, включающий способ, описанный в п. 45.
50. Способ по п. 49, дополнительно включающий синтез указанного антибиотика.
51. Способ по п. 50, дополнительно включающий смешивание синтезированного антибиотика с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом с получением фармацевтической композиции.