СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАНОМАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЖГУТИКОВ АРХЕИ Halobacterium salinarum
METHOD OF PRODUCING NANOMATERIAL BASED ON RECOMBINANT ARCHAEAL Halobacterium salinarum FLAGELLA

Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии, генной и белковой инженерии, к нанотехнолическим применениям модифицированных жгутиков археи Н. sahnarum для формирования активных поверхностей на гибких и твердых подложках или капсулах в области электроники, диагностики, медицины и очистки окружающей среды.
Уровень техники
Создание эффективных поверхностей для формирования гибких, твердых и капсулированных покрытий, используемых в области электроники, диагностики, медицины и очистки окружающей среды, является актуальной задачей.
К устройствам, содержащим покрытия, можно отнести сенсорные датчики [1], компоненты для создания элементов электроники, аккумуляторов [2], покрытие биологических и медицинских устройств, требующих отсутствия агрессивных химических компонентов [3], компоненты покрытий или композиций в составе фармакологических препаратов [4].
Известны изобретения, в которых в качестве элементов покрытий используют биологические материалы, созданные на основе пептидов [4] или вирусов [2, 5-9]. С целью формирования развитой поверхностной структуры используют вирусы, на поверхности которых иммобилизуют как частицы неорганических веществ, так и ионы металлов [5-10]. В частности наноматериалы, выполненные на основе вируса М13, успешно используются для формирования электродов литий-ионных аккумуляторов. В практике создания поверхностей с развитой поверхностной структурой особое внимание уделяется вариантам, которые включают белковые структуры, содержащие аминокислоты, способные связывать ионы металлов [5-15]. Выбор биологических материалов для создания наноструктур с развитой поверхностью, обеспечивающих работу и сохранение биологически активных зон, является непростой задачей.
Известны некоторые применения материалов, выполненных на основе жгутиков архей. Эти материалы обладают достаточными адгезивными свойствами и могут быть использованы для создания молекулярных клеев. В изобретении [3] рассматриваются вопросы получения клеевых материалов, содержащих, по меньшей мере, один белок, полученный из жгутиков архей. В заявке показано, что белки жгутика (флагеллины) архей хорошо прилипают не только к органическим материалам, например к клеточной стенке, но также и к поверхностям, выполненным из неорганических материалов, таких как металлы, пластмассы и кварц. Следует отметить, что не все флагеллины обладают такой возможностью [16]. Для Н. salinarum в качестве примеров флагеллинов, перечисленных в заявке на изобретение [3], фигурируют только FlaB1 и FlaB2, которые являются не основными белками жгутика, а выполняют связующую роль между клеточным мотором и протяженной спиральной нитью жгутика, состоящей из А-флагеллинов [17]. В уровне техники не найдено примеров получения наноструктурированного материала на основе жгутиков Н. salinarum. В публикации [19], относящейся к изучению общих свойств флагеллинов А1 и А2, входящих в состав жгутика, нет связи между исследуемыми физико-химическими параметрами флагеллинов и характеристиками наноматериалов.
Для многих применений в области электроники, диагностики, медицины и очистки окружающей среды требуются разные типы наноструктурированного материала. Волокнистый наноматериал используют при создании фильтров. Материал, выполненный на основе коротких нанотрубок, обеспечивает возможность получения максимальной площади с контактируемой поверхностью нанотрубок. Такие покрытия особенно актуальны при построении биосенсоров и устройств для преобразования электрической энергии.
Целью настоящего изобретения является расширение типов покрытий с развитой наноструктурной поверхностью для формирования активных поверхностей на гибких и твердых подложках или капсулах с использованием жгутиков архей, на основе которых можно обеспечить нековалентное связывание широкого перечня веществ, таких как ионы металлов, наночастицы металлов, полупроводники и другие лиганды, для формирования поверхностей сенсоров, пластин аккумуляторов, нетканых материалов и других материалов с новыми свойствами.
Следующей целью изобретения является повышение эффективности наноструктурной поверхности за счет формирования либо волокнистой структуры, которая содержит более 50% жгутиков архей длиной более 1000 нм, либо кластерной структуры, выполненной на основе фрагментов жгутиков, содержащей более 50% жгутиков длиной менее 500 нм с повышенной плотностью упаковки наноструктур, либо комбинации из волокнистой структуры и кластерной структуры наноматериалов.
Сущность изобретения
Одним из объектов изобретения является способ получения наноструктурного материала на основе модифицированных жгутиков археи Н. salinarum, имеющих сайты для связывания ионов металлов или наночастиц. Способ включает трансформацию клеток архей рекомбинантной плазмидой, выращивание клеток, выделение жгутиков и модификацию поверхности жгутиков. Конструкция плазмиды содержит рекомбинантные гены флагеллинов А1 и А2, формирующих жгутик, при этом аминокислотная последовательность флагеллина А1 или флагеллина А2 или последовательности флагеллина А1 и флагеллина А2 содержат по меньшей мере одну пептидную вставку для избирательного связывания ионов металлов или наночастиц, где место пептидной вставки в флагеллине А1 определяют в области между первым и вторым сайтами N-гликозилирования, расположенной между поз.86 и поз.96 SEQ ID NO:2, а место пептидной вставки в флагеллине А2 определяют в области между первым и вторым сайтами N-гликозилирования, расположенной между поз.82 и поз.92 SEQ ID NO:3.
Длина пептидной вставки составляет от 5 до 60 аминокислот. Вставка может быть выполнена за счет комбинирования нескольких коротких последовательностей с общей длиной до 60 аминокислот. Последовательность пептидной вставки выбирают таким образом, чтобы она нековалентно связывала ионы металлов, выбираемых из группы, в которую входят: кобальт, ванадий, никель, марганец, железо, кадмий, вольфрам, хром, цирконий, титан, скандий, иттрий, медь, кальций, алюминий, барий, бериллий, магний, и стронций и/или наночастицы металлов, выбираемых из группы, состоящей из золота, платины, серебра, палладия или наночастицы, обладающие полупроводниковыми свойствами, например ZnS, CdS, а также наночастицы, обладающие магнитными свойствами, например FePt, CoPt.
После выделения жгутиков осуществляют модификацию поверхности жгутиков для формирования волокнистого наноматериала. В другом варианте способа проводят фрагментацию жгутиков с последующим проведением модификации поверхности фрагментов жгутиков и одновременным формированием кластерной структуры наноматериала. Модификацию осуществляют металлическими, полупроводниковыми, магнитными наночастицами или ионами металлов с последующей минерализацией.
Другим объектом изобретения является многофункциональный наноматериал, содержащий волокнистую структуру, выполненную на основе модифицированных жгутиков археи Н. salinarum для формирования активных поверхностей.
Многофункциональный наноматериал содержит жгутики из флагеллина А1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 и флагеллина А2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, при этом дополнительно в последовательность флагеллина А1 или флагеллина А2 или в последовательности флагеллина А1 и флагеллина А2 включена пептидная вставка длиной от 5 до 60 аминокислот для связывания с ионами металлов или наночастицами. Наноматериал выполнен в виде волокнистой структуры, которая содержит более 50% жгутиков архей длиной более 1000 нм, поверхность которых имеет сайты, в которых связаны ионы металлов или металлические, полупроводниковые, магнитные наночастицы, при этом жгутики дополнительно связаны друг с другом и с подложкой за счет адгезивных свойств жгутиков.
Другим объектом изобретения является многофункциональный наноматериал, содержащий кластерную структуру на основе модифицированных жгутиков археи Н. salinarum для формирования активных поверхностей.
Многофункциональный наноматериал содержит связанные друг с другом фрагменты жгутиков, состоящие из флагеллина А1 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и флагеллина А2 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3. При этом дополнительно в последовательность флагеллина А1 или флагеллина А2 или в последовательности флагеллина А1 и флагеллина А2 включена пептидная вставка длиной от 5 до 60 аминокислот для связывания с ионами металлов или наночастицами.
Наноматериал выполнен в виде кластерной структуры, содержащей более 50% фрагментов жгутиков длиной менее 500 нм и имеющих сайты, в которых связаны ионы металлов или металлические, полупроводниковые, магнитные наночастицы. При этом кластерная структура наноматериала осуществляет возможность связывания отдельных кластеров диаметром от 500 нм с подложкой и друг с другом за счет адгезивных свойств жгутиков.
Следующим объектом изобретения является покровный материал, для формирования наноструктурированного покрытия пластин, пленок, капсул, текстильного материала, содержащий композицию наноматериалов из волокнистой структуры и кластерной структуры, включающий, по меньшей мере, один тип модифицированного жгутика археи Н. salinarum.
Перечень чертежей
На фиг.1 представлена аминокислотная последовательность флагеллина А1. Последовательности сайтов N-гликозилирования выделены цветом.
На фиг.2 представлена аминокислотная последовательность флагеллина А2. Последовательности сайтов N-гликозилирования выделены цветом.
На фиг.3 представлены нуклеотидная и аминокислотная последовательности гена флагеллина А1 и кодируемого им белка в области вставок, а также последовательности самих вставок. Последовательности сайтов N-гликозилирования подчеркнуты, где приведено: 101 - участок последовательности гена флагеллина А1, кодирующий 1 и 2 сайты гликозилирования и участок между ними; 102 - место, по которому эндонуклеаза рестрикции BstXI разрезает ген А1-флагеллина; 103 - схематическое изображение олигонуклеотидной вставки, предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина А1 по сайту BstXI; 104 - изображение олигонуклеотидной вставки, кодирующей FLAG-пептид и предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина А1 по сайту BstXI.
На фиг.4 представлены нуклеотидная и приведенная в соответствие к ней аминокислотная последовательность флагеллина А2 в области вставок после введения сайта эндонуклеазы рестрикции AsuNHI, а также последовательности самих вставок. Последовательности сайтов N-гликозилирования подчеркнуты, где приведено: 201 - участок последовательности гена флагеллина А2 с введенным сайтом для AsuNHI, кодирующий 1 и 2 сайты гликозилирования и участок между ними; 202 - место, по которому эндонуклеаза рестрикции AsuNHI разрезает ген флагеллина А2; 203 - схематическое изображение олигонуклеотидной вставки, предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина А2 по сайту AsuNHI; 204 - изображение олигонуклеотидной вставки, кодирующей FLAG-пептид и предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина А2 по сайту AsuNHI; 205 - изображение олигонуклеотидной вставки, кодирующей золотосвязывающий пептид и предназначенной для встраивания в последовательность гена флагеллина А2 по сайту AsuNHI.
На фиг.5 представлено электронно-микроскопическое изображение жгутиков Н. salinarum: (А) дикий тип, (Б) модифицированные жгутики со вставкой в А1-флагеллин FLAG-пептида, (В) модифицированные жгутики со вставкой в А2-флагеллин FLAG-пептида. Препараты были мечены специфичными антителами и конъюгатами белка А с частицами коллоидного золота (10 нм). Негативное контрастирование проведено уранил ацетатом. Масштабная линейка - 300 нм.
2+
2+
На фиг.6 представлена схема минерализации жгутиков Н. salinarum, модифицированных вставкой в А1- или А2-, или А1- и А2-флагеллины, способной связывать ионы металлов, где приведено: 301 - жгутик; 302 - ион металла (Со, Cu и т.п.;, 303 - жгутик, связавший на своей поверхности ионы металла; 304 - частица оксида металла; 305 - наноструктурный материал, представляющий собой жгутик, покрытый частицами оксидов металлов.
На фиг.7 представлено электронно-микроскопическое изображение жгутиков Н. salinarum: (А) дикого типа, которые были минерализованы оксидом кобальта. Представлены в качестве отрицательного контроля: (Б) модифицированные жгутики со вставкой в A1-флагеллин FLAG-пептида, которые были минерализованы оксидом кобальта; (В) модифицированные жгутики со вставкой в A1-флагеллин FLAG-пептида, которые были минерализованы оксидом меди. Негативное контрастирование проведено уранил ацетатом. Масштабная линейка - 300 нм.
На фиг.8 представлено электронно-микроскопическое изображение жгутиков со вставкой в A1-флагеллин FLAG-пептида, обработанных ультразвуком частотой 44 кГц в течение 20 мин. Негативное контрастирование проведено уранил ацетатом. Масштабная линейка - 100 нм.
2+
2+
На фиг.9 представлена схема минерализации жгутиков Н. salinarum, модифицированных вставкой в А1- или А2-, или А1- и А2-флагеллины, способной связывать ионы металлов, и обработанных ультразвуком. Схема показывает принцип образования кластеров, представленных центральной частью из плотно упакованных частиц оксида металла с модифицированными частями фрагментов жгутиков и наружной частью из немодифицированных окончаний фрагментов жгутиков. Обозначены: 302 - ион металла (Со, Cu и т.п.); 304 - частица оксида металла; 306 - обработанные ультразвуком жгутики; 307 - обработанные ультразвуком жгутики, связавшие ионы металлов; 308 - кластер, центральная часть которого состоит из плотно упакованных частиц оксида металла с модифицированными частями фрагментов жгутиков, а наружная часть из немодифицированных окончаний фрагментов жгутиков; 309 - немодифицированные окончания фрагментов жгутиков в кластерах, с помощью которых кластеры могут прилипать друг к другу или к подложке; 310 - подложка.
На фиг.10 представлено электронно-микроскопическое изображение наноструктурного материала, полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком в течение 20 мин при 44 кГц жгутиков со вставкой в A1-флагеллин FLAG-пептида и минерализованных оксидом кобальта. Негативное контрастирование проведено уранил ацетатом. Масштабная линейка - 300 нм
6
3
4
На фиг.11 представлено изменение разрядной емкости электродов на основе: 1) оксида кобальта, нанесенного на электрод без добавления жгутиков; 2) наноструктурного материала на основе жгутиков со вставкой в A1-флагеллин FLAG-пептида и минерализованных оксидом кобальта; 3) наноструктурного материала полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком (частотой 44 кГц в течение 20 мин) жгутиков со вставкой в A1-флагеллин FLAG-пептида и минерализованных оксидом кобальта. Циклирование проводилось в 1М LiPF в смеси этиленкарбонат-диэтилкарбонат-диметилкарбонат (1:1:1, далее ЭК-ДЭК-ДМК) током 20 мА/г CoO.
Описание изобретения
Исследование свойств натуральных волокнистых (протяженных) жгутиков Н. salinarum (диаметром 12 нм и длиной несколько микрометров), собранных из флагеллинов А1 и А2 «дикого типа» (без генноинженерных вставок), показало, что жгутики из таких флагеллинов обладают адгезивными свойствами к поверхности металлов, пластмасс и других материалов. Однако такие жгутики обладают низкой эффективностью связывания на своей поверхности ионов металлов, что не позволяет использовать жгутики из флагеллинов дикого типа для создания наноматериалов с заданными свойствами. Для получения наноструктурированного материала с заданными свойствами полимерной структуре жгутика, состоящего из А1- и А2-флагеллинов, необходимо придать свойство специфично связывать металлические, полупроводниковые, магнитные наночастицы или ионы связывать металлы для последующей минерализации поверхности.
Известно, что возможность полимеризации белков А1 и А2 в жгутик определяется характером межатомных связей, который зависит от состава первичной аминокислотной последовательности и типа укладки в 3-мерную (третичную) структуру. Однако разрешенной третичной структуры для жгутиков архей на сегодняшний момент нет, и, как следствие, нет и информации об участках полипептидной цепи флагеллина, которые бы в собранном жгутике формировали его поверхность. Поэтому для получения жгутиков с измененной поверхностью необходимо было решить неочевидную задачу и выбрать в последовательностях флагеллинов участки, пригодные для включения в них пептидных вставок, с возможностью их последующей модификации ионами металлов или с возможностью последующего связывания наночастиц. При этом должны быть сохранены структурные механизмы, обеспечивающие полимеризацию флагеллинов А1 и А2 в жгутик, а для проведения эффективной модификации вставок необходимо обеспечить выведение пептидных вставок на внешнюю поверхность сформированного жгутика. В результате получают комбинированный наноструктурированный материал волокнистой структуры, содержащий нити модифицированных жгутиков.
Известно, что флагеллины А1 и А2, формирующие жгутики Н. salinarum, N-гликозилированы, при этом каждый флагеллин содержит до 3-х сайтов гликозилирования (последовательности NXT, NXS) [17, 18].
В процессе изучения свойств жгутиков был обнаружен неочевидный факт того, что введение коротких пептидных вставок длиной от 5 до 60 аминокислот в участки, расположенные между сайтами гликозилирования флагеллинов А1 и/или А2, не влияет на формирование структуры жгутиков, а сами пептидные вставки при синтезе жгутиков остаются экспонированными на внешней поверхности жгутиков, что дает возможность для эффективного нековалентного связывания аминокислот, входящих в состав вставок с ионами и наночастицами металлов.
В общем случае способ получения наноструктурированного материала на основе рекомбинантных жгутиков архей Н. salinarum, имеющих множество сайтов для связывания ионов металлов или наночастиц, состоит из следующих стадий:
A) Выделяют фрагмент ДНК, кодирующий флагеллины А1 и А2, последовательность которого определена SEQ ID NO:1.
Б) Выбирают участки для введения по меньшей мере одной пептидной вставки в аминокислотные последовательности флагеллина А1 и/или А2. При этом участок пептидной вставки в флагеллине А1 соответствует области между первым и вторым сайтом гликозилирования, расположенной между поз.86 и поз.96 SEQ ID NO:2, а участок пептидной вставки в флагеллине А2 соответствует области между первым и вторым сайтом гликозилирования, расположенной между поз.82 и поз.92 SEQ ID NO:3.
B) Выбирают по меньшей мере один тип эндонуклеазы рестрикции для разрезания последовательности генов в выбранном месте участка для введения пептидной вставки.
Г) Выбирают длину и последовательность по меньшей мере одной пептидной вставки, где длина вставки составляет от 5 до 60 аминокислот, предпочтительно 8-40, более предпочтительно от 8 до 20.
Д) Выбирают тип плазмиды и формируют генетическую конструкцию плазмиды на основании пп. А-Г;
Е) Создают штамм путем трансформации выбранных клеток плазмидой по п.Д), выращивают клетки и осуществляют последующее выделение жгутиков из культуральной среды.
Ж) Осуществляют выбор типа наноструктурированного материала, который выбирают из группы, состоящей из волокнистого материала, где длина более 50% жгутиков волокнистого материала составляет более 1000 нм, наноструктурированного кластерного материала, где длина более 50% жгутиков, входящих в кластерные структуры, составляет менее 500 нм, или их комбинации.
З) Осуществляют модификацию жгутиков для формирования волокнистого наноматериала или фрагментирование жгутиков с последующей модификацией поверхности фрагментов и одновременным формированием кластерной структуры получаемого наноматериала.
И) Проводят выделение, сушку и хранение модифицированных жгутиков, предназначенных для формирования многофункционального наноматериала.
Выделение ДНК, кодирующей флагелин
Для выделения тотальной ДНК из Н. salinarum, а также выделения плазмидной ДНК из Е. coli используют стандартные методы, описанные в [24], либо коммерческие наборы для осуществления подобных процедур. Тотальную ДНК Н. salinarum используют в качестве матрицы для наработки ПЦР-фрагментов А-флагеллинового оперона с фланкирующими участками.
Выбор типа плазмиды и ее генетической конструкции
Рекомбинантная плазмидная ДНК pNXA имеет размер молекулы около 11000 п.о. и содержит клонированный А-флагеллиновый оперон Н. salinarum, содержащий области А1- и А2-генов флагеллина по сайтам клонирования XbaI и HmindIII. Данная плазмида получена на основе плазмиды pNX [19] путем клонирования ПЦР фрагмента А-флагеллинового оперона Н. salinarum, при этом длина клонированного фрагмента составляет около 2400 пар нуклеотидов (SEQ ID NO:1). Плазмида содержит ген устойчивости к ампициллину (AmpR) и ген устойчивости к новобиоцину (NovR). В плазмиде также содержится ген галофильной β-галактозидазы (bgaH). Ген AmpR и бактериальный сайт инициации репликации позволяют наращивать данную плазмиду и ее модификации в клетках Е. coli. Ген NovR обеспечивает устойчивость трансформированных клеток архей к новобиоцину, продукт гена bgaH позволяет трансформированным клеткам приобретать синюю окраску продуктами разложения коммерческого субстрата X-Gal, что служит дополнительным маркером для подтверждения трансформации. В плазмиде отсутствует галоархейный сайт инициации репликации. Это приводит к тому, что при трансформации плазмидой устойчивость к новобиоцину клетки архей приобретают только в случае встраивания плазмиды в хромосому по механизму гомологичной рекомбинации. В конструкции плазмиды около 1200 п.о. в сумме составляют А1-ген флагеллина, представленный на Фиг.2 (SEQ ID NO:2), и А2-ген флагеллина, представленный на Фиг.3 (SEQ ID NO:3), а также левый (около 600 п.о.) и правый (400 п.о.) фланкирующие участки А-флагеллинового оперона [26]. Кроме того, гены А1 и А2 разделяет межгенный промежуток длиной 11 пар нуклеотидов. Фрагмент ДНК А-флагеллинового оперона наработан праймерами:
5'-GTCGGTGCTCTAGACGTCGGGGATCGG-3' (SEQ ID NO:4)
5'-TCACGATGCAAAGCTTCCATCAGTACGG-3' (SEQ ID NO:5)
с помощью ПЦР. Фрагмент клонирован в плазмиду по сайтам рестрикции HindIII и XbaI. В зависимости от вариантов генетической конструкции плазмиды в область А1-гена, либо А2-гена, либо одновременно в области А1- и А2-гена вводят последовательность, кодирующую пептидную вставку.
Выбор области в аминокислотной последовательности флагеллина для введения пептидной вставки
Введение пептидных вставок осуществляют в области А1- и А2-флагеллинов, располагающейся между их первыми двумя сайтами N-гликозилирования от NLT до NLS. Для А1-флагеллина последовательность области выглядит как VRQAAGADNI (SEQ ID NO:6), а для А2-флагеллина данная последовательность выглядит как VRQAAGADNI (SEQ ID NO:7). Допустимо введение вставки в любое место между данными сайтами гликозилирования от поз.86 до поз.96 в области флагеллина А1 (Фиг.2) и между поз.82 до поз.92 в области флагеллина А2 (Фиг.3). Предпочтительно вводить вставку в середину области между поз.89 до поз.92 для флагеллина А1. Так, на фиг.2 представлена аминокислотная последовательность А1-флагеллина, а последовательности сайтов гликозилирования выделены цветом. Для флагеллина А2 предпочтительно вводить вставку в область между поз.85 до поз.88. На Фиг.3 представлена аминокислотная последовательность А2-флагеллина, а последовательности сайтов гликозилирования также выделены цветом. При этом введенная аминокислотная последовательность экспонируется на поверхность сформированного жгутика, что позволяет осуществить его последующую обработку веществами, обладающими сродством к использованной вставке.
Клонирование последовательностей, кодирующих пептидные вставки
Клонирование последовательностей, кодирующих выбранный пептид, в области А1- и/или А2-гена осуществляется с использованием стандартных методик, включающих в себя: 1) выбор сайта рестрикции в области генов, соответствующих аминокислотным последовательностям фрагментов белков (SEQ ID NO:6) и (SEQ ID NO:7); 2) синтез парных олигонуклеотидов, один из которых кодирует пептидную вставку, а другой комплементарен ему для формирования дуплекса. Данные олигонуклеотиды должны также содержать липкие концы, соответствующие выбранному сайту рестрикции; 3) клонирование дуплекса по выбранному сайту.
Последовательность пептидной вставки содержит одиночную последовательность длиной от 6 до 60 аминокислот или содержит короткие соединенные друг с другом последовательности с общей длиной вставки до 60 аминокислот, при этом количество коротких последовательностей лежит в пределах от 2 до 10.
Ниже приведен пример клонирования последовательностей, кодирующих выбранный пептид. Так, например, для A1-гена подобное клонирование состояло из этапов: 1) выбор эндонуклеазы рестрикции BstXI, которая разрезает А1-ген флагеллина в месте, соответствующем 90-91 аминокислоте белка; 2) синтезолигонуклеотидной последовательности SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22; 3) клонирование дуплекса олигонуклеотидов в плазмиду pNXA (Фиг.3). При этом все олигонуклеотидные последовательности, кодирующие выбранный пептид, можно схематически изобразить следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и содержит также липкий 3'-конец для клонирования по сайту рестрикции BstXI: 5'-NN(NNN)xGCCG-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту BstXI: 5'-(NNN)x NNCGGC-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в А1-ген приведена на Фиг.3. Число х определяет число кодонов, кодирующих аминокислоту, и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки.
Если возникает необходимость введения вставки от поз.86 до поз.96 в области флагеллина А1 и между поз.82 до поз.92 в области флаггелина А2, но нельзя подобрать подходящий сайт для эндонуклеазы рестрикции, то возможно в данной области изменение нуклеотидной и, соответственно, аминокислотной последовательности. Подобная замена не приводит к утрате функциональности флагеллина и может при необходимости осуществляться на генах как А1-, так и А2- флагеллинов, если содержит дополнительные замены аминокислот с сохранением, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности, при этом любая замена аминокислоты является предпочтительно консервативной.
Для А2-гена подобное клонирование состояло из этапов: 1) проведение замены в нуклеотидной последовательности гена флагеллина А2 в составе плазмиды pNXA синтетическими праймерами SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24 с использованием QuikChange site-directed mutagenesis kit фирмы Stratagen. Эта замена привела к появлению сайта рестрикции AsuNHI в гене А2, а в соответствующей аминокислотной последовательности произошла замена в поз.86 аланина на лейцин SEQ ID NO:8; 2) синтез олигонуклеотидной последовательности, например, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26; 3) клонирование дуплекса олигонуклеотидов в плазмиду pNXA (Фиг.4). При этом все олигонуклеотидные последовательности, кодирующие выбранный пептид, можно схематически изобразить следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и содержит также липкий 5'-конец для клонирования по сайту рестрикции AsuNHI: 5'-CTAGNN(NNN)x-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту AsuNHI: 5'-CTAG(NNN)xNN-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина А2 приведена на Фиг.4. Число х определяет число кодонов, кодирующих аминокислоту, и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки.
Получение плазмид с тандемно клонированными вставками перечисленных последовательностей и получение штаммов продуцентов на их основе возможно приведет к усилению или улучшению отдельных характеристик получаемого наноматериала.
Если вставка тандемно повторяется, то величина х должна уменьшиться кратно числу повторяющихся вставок.
Выбор последовательности, кодирующей пептидную вставку
Известны пептидные последовательности, которые обладают способностью связывать определенные лиганды [5-13, 15, 16]. В качестве одного из примеров, подтверждающего воспроизводимость и работоспособность способа получения наноструктурированного материала на основе жгутиков архей, создан штамм галофильного археона Н. salinarum, синтезирующий жгутики, модифицированные FLAG-пептидом DYKDDDDK (SEQ ID NO:9) как по А1-, так и по А2-флагеллину. Данный пример (см. пример 1) включает, но не ограничивает других вариантов жгутиков, модифицированных пептидными последовательностями, имеющими высокое сродство к различным лигандам.
Подобным образом могут быть получены модифицированные и другими экспонированными на поверхности вставками флагеллины архей с сохранением протяженной надмолекулярной структуры жгутиков. В свете имеющихся данных целесообразным кажется получение жгутиков Н. salinarum с модифицированным А1- и/или А2-флагеллином с вариантами пептидных последовательностей, которые связывают заряженные ионы, оксиды и наночастицы металлов, фосфат железа, лиганды с полупроводниковыми и магнитными свойствами.
Последовательность тетраглутамина ЕЕЕЕ (SEQ ID NO:10) связывает положительно заряженные ионы металлов. Жгутики, модифицированные данной последовательностью, могут быть использованы для получения материала для электродов литий-ионных аккумуляторов [5-6]. Кроме того, показано, что данный тетрапептид способен связывать и фосфат железа, являющийся перспективным материалом для катодов литий-ионных аккумуляторов [20].
Для некоторых вариантов покрытий, использующих наноструктурные материалы, могут быть использованы жгутики архей с пептидными вставками, связывающими коллоидные наночастицы благородных металлов, или жгутики архей, содержащие два типа вставок: одна из них связывает ионы металла, другая - наночастицы благородных металлов. В качестве примера вставки, связывающей наночастицы золота с поверхностью жгутика, служит, так называемый, золотосвязывающий пептидный мотив LKAHLPPSRLPS (SEQ ID NO:10) [5-6], который включает, но не ограничивает типы пептидных вставок для связывания наночастиц на поверхности жгутика архей.
Возможно совместное применение двух разных типов пептидных вставок (SEQ ID NO:11) и (SEQ ID NO:10), которые, например, совместно экспрессировались для связывания частиц с разными свойствами модифицированным вирусом М13 [5-6].
В качестве пептидной вставки могут быть использованы пептидные последовательности, которые могут связывать лиганды, обеспечивающие полупроводниковые и магнитные свойства. Так, пептид с последовательностью CNNPMHQNC (SEQ ID NO:12) связывает ZnS, пептид с последовательностью SLTPLTTSHLRS (SEQ ID NO:13) связывает CdS, пептид с последовательностью HNKHLPSTQPLA (SEQ ID NO:14) связывает FePt, пептид с последовательностью CNAGDHANC (SEQ ID NO:15) связывает CoPt [10].
2
Известно, что тетрапептиды RRRR(SEQ ID NO:16) и RKRK (SEQ ID NO:17) связывают ионы и оксиды металлов. Пары обладают избирательным сродством к CuO и ZnO, соответственно [21].
Некоторые пептидные структуры, образующие петли на поверхности белка, обладают свойствами связывать ионы металлов, и, в зависимости от состава, имеют анионные или катионные свойства. К таким петлям относятся гистидиновые петли "His-loop" (GHHHHHH) (SEQ ID NO:18), глутамин-аспарагиновые петли "Glu-Asp loop" (DQDQDQG) (SEQ ID NO:19), аргнинин-лизиновые петли "Arg-Lys loop" (RKRKRKR) (SEQ ID NO:20) [11].
Варианты плазмид
Для проверки эффективности изобретения на основе плазмиды pNXA были получены следующие варианты плазмид: 1) рекомбинантная плазмидная ДНК pNXA I FLAG обеспечивающая синтез модифицированного FLAG-пептидом А1-флагеллина при сохранении нативности А2-флагеллина; 2) рекомбинантная плазмидная ДНК pNXA1A2FLAG, обеспечивающая синтез модифицированных FLAG-пептидом А1- и А2-флагеллинов; 3) рекомбинантная плазмидная ДНК pNXA1FLAGA2GBP, обеспечивающая синтез модифицированного FLAG-пептидом A1-флагеллина и модифицированного золотосвязывающим пептидом А2-флагеллина в клетках Н. salinarum R1 при трансформации и встраивании данной плазмиды в хромосому организма. Варианты плазмид и способы их получения приведены в примере 2.
Выбор клеток и трансформация клеток полученной плазмидой
Полученными плазмидами трансформируют клетки Н. salinarum и выращивают их на поверхности агаризованной среды с антибиотиком. Выросшие колонии клеток пересевают в жидкую среду, и после роста из клеток либо выделяют жгутики, либо отбирают небольшие количества клеток.
2
4
2
Для получения штаммов-продуцентов модифицированных флагеллинов трансформируют клетки Н. Salinarum по приводимой методике [22]. Н. salinarum - это экстремальный галофильный грамнегативный археон с облигатной аэробностью. Естественной средой обитания данного организма является вода Мертвого моря, а оптимальной для роста является экстремально высокая соленость (до 5.5М NaCl). В лабораторных условиях выращивается на среде следующего состава: 25% NaCl, 0.2% KCl, 2% MgSO 7xHO, 0.3% Na-цитрат, 0.5% триптон, 0.2% дрожжевой экстракт, рН 7.5 при 37°C [23].
Н. salinarum представляет собой одиночные клетки палочковидной формы, не образующие спор, имеющие лофотрихиальное расположение жгутиков, на стационарной фазе у клеток Н. Salinarum возможна амфитрихиальная локализация.
Во всех случаях нити жгутиков образуют пучок, вращение которого создает гидродинамическое усилие, приводящее клетку в движение. В пучок входят 5-10 нитей, представляющих собой полужесткую спираль. При росте Н. salinarum в культуральной среде обнаруживается значительное количество свободных жгутиков.
Взвеси клеток в жидких питальных средах либо колонии, выросшие на поверхности агаризованной среды, обладают красным цветом за счет присутствия в клеточной стенке бактородопсина.
В России доступен штамм Н. salinarum R1, предоставляемый Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (г. Москва).
Все полученные штаммы-продуценты на основе Н. salinarum R1 характеризуются следующими признаками:
- морфологические признаки: клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные,
- культуральные признаки: при росте на агаризованной среде для Н. Salinarum колонии круглые, гладкие, блестящие, край ровный, окрашены в красный цвет. При росте на жидких средах образуют интенсивную ровную муть,
- физико-биологические признаки: клетки растут при температуре от 20°С до 45°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы,
- устойчивость к антибиотикам: клетки проявляют устойчивость к новобиоцину (до 0.6 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде pNXA гена NovR,
- штаммы-продуценты отличаются от штамма-реципиента Н. salinarum R1 только наличием различных вариантов рекомбинантной плазмидной ДНК pNXA, которая придает ему устойчивость к новобиоцину,
- отсутствие галоархейного сайта инициации репликации приводит к тому, что при трансформации плазмидой устойчивость к новобиоцину клетки архей приобретают только в случае встраивания плазмиды в хромосому по механизму гомологичной рекомбинации,
- штаммы-продуценты помимо встроенного с плазмидой модифицированного А-флагеллинового оперона также содержат в себе нативный А-оперон. Следовательно, в составе жгутиков помимо модифицированных флагеллинов (его наличие показано экспериментально иммуноэлектронной микроскопией) могут содержаться и немодифицированные флагеллины.
В примерах 4-6 приведены этапы получения рекомбинантных жгутиков: а) выращивание клеток на поверхности агаризированной среды и последующий рост клеток в жидкой среде, б) выделение жгутиков из культуральной среды для модификации и последующей минерализации поверхности жгутиков, г) модификация поверхности жгутиков наночастицами металла, полупроводника и магнитными наночастицами или модификация выбранным ионом металла и затем последующая минерализация поверхности жгутиков выбранным веществом, д) выделение, сушка и хранение минерализированных жгутиков, предназначенных для формирования материала.
Модифицированные жгутики со вставкой FLAG-пептида с последовательностью SEQ ID NO:9 позволяют детектировать его присутствие на поверхности с помощью специфичных моноклональных антител. С помощью иммуноэлектронной микроскопии препарата жгутиков FLAGA1- и FLAGA2-штамма Н. salinarum было показано, что данный пептид присутствует в составе флагеллина, а жгутики специфично метятся антителами. Видно, что модифицированные жгутики сохраняют нативную спиральную структуру и морфологически не отличаются от жгутиков дикого типа, при этом FLAG-пептид доступен для связывания с антителами, то есть находится в составе поверхностного участка полипетидной цепи А1- и А2-флагеллина (Фиг.5). Известно, что выведенные на поверхность белков тетраглутаминовые или тетрааспарагиновые последовательности способны эффективно связывать ионы металлов (например, Со2+, Cu2+) [5-13]. Так как в составе FLAG-пептида также имеются 4 последовательных отрицательно заряженных аминокислотных остатка - аспартата, жгутики были проверены на связывание металлических ионов. Петля, образованная восемью остатками, оказалась достаточной для выведения кластера заряженных аминокислот на поверхность жгутика и способной связывать ионы металлов. Затем ионы в присутствии боргидрида натрия переводились в нерастворимые частицы оксидов, прикрепленные к жгутику (Фиг.7).
Выбор типа наноматериала
Для различных типов покрытий могут использоваться жгутики с волокнистой структурой, фрагменты жгутиков, сгруппированные в кластеры, и композиции жгутиков с волокнистой структурой и фрагментами жгутиков в кластерах. Наноматериал выполнений в виде волокнистой структуры содержит более 50% жгутиков архей длиной более 1000 нм, поверхность которых имеет сайты, в которых связаны ионы металлов или металлические, полупроводниковые, магнитные наночастицы, при этом жгутики дополнительно связаны друг с другом и с подложкой за счет адгезивных свойств жгутиков.
Для формирования кластерных структур длинные волокнистые жгутики фрагментируют. Наиболее подходящим способом фрагментации является воздействие на надмолекулярную структуру жгутиков ультразвуком. Образцы жгутиков после обработки ультразвуком анализировались на электронном микроскопе. Результат обработки ультразвуком жгутиков штамма Н. salinarum со вставкой в A1-флагеллин FLAG-пептида (SEQ ID NO:2) перед минерализацией оксидом кобальта для создания наноматериала для электрода литий-ионного аккумулятора приведен на Фиг.8. Если в обычных условиях длина жгутика составляет несколько микрометров, то в зависимости от времени, интенсивности и частоты обработки ультразвуком основная часть длины получающихся фрагментов жгутиков будет составлять 50-300 нм (см. Таблицу). В общем случае кластерные структуры содержат более 50% фрагментов жгутиков длиной менее 500 нм.
Фрагменты жгутиков за счет меньшей длины, чем у нативных жгутиков, иначе ведут себя при минерализации. Из-за меньших диффузионных препятствий и меньшей протяженности фрагментам жгутиков при минерализации с частицами оксида удается формировать более плотный материал. Анализ полученных изображений фрагментированных жгутиков показывает, что из-за неоднородного состава (модифицированные и немодифицированные участки на фрагментах жгутиков) фрагментов они ориентируются друг с другом таким образом, что при минерализации модифицированные части фрагментов связываются частицами оксида кобальта, а немодифицированные части фрагментов выступают с внешней стороны кластера (Фиг.9, 10). Все это приводит к положительному в изменению электрохимических свойств наноматериала, выполненного в виде кластеров, по отношению к применению волокнистых наноматериалов при использовании в качестве покрытия пластин литийионных аккумуляторов. Данные изменения были обнаружены в последующих электрохимических испытаниях (см. Пример 12).
Ниже приведены примеры, которые включают, но не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Получение генетических конструкций
Генетические конструкции получают на основе плазмиды pNX [19], содержащей ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к новобиоцину. Для выделения тотальной ДНК из Н. salinarum, а также выделения плазмидной ДНК из Е. coli использовали колонки со стеклянным наполнителем фирмы Qiagen (США). ДНК выделяют согласно инструкции фирмы-производителя. Тотальную ДНК Н. salinarum используют в качестве матрицы для наработки ПЦР-фрагментов А-флагеллиного оперона с фланкирующими участками.
2
4
2
С использованием олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 проводят ПЦР в 50 мкл смеси, состоящей из ПЦР буфера (для Taq ДНК-полимеразы: 57 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 16.6 мМ (NH)SO, 0.1% Tween-20) с концентрацией MgCl от 1.5 до 2.5 мМ, смеси дезоксирибонуклеотидов (в концентрации 0.2 мМ каждого), олигонуклеотидов-праймеров по 20-100 пМ каждого, 2-20 нг плазмидной или 100-200 нг хромосомной ДНК и смеси из 1-2 ед. Taq ДНК-полимеразы и 0.1-0.2 ед. Pfu ДНК-полимеразы. Длительность стадий плавления, отжига и элонгации составляет 10 с, 30 с и 3 мин, соответственно. Температуру отжига праймеров определяют по максимальному выходу продуктов, стадию плавления проводят при 95°С, а элонгацию при 72°С, количество циклов - 25.
ПЦР-продукты, а также плазмидную ДНК анализируют методом ДНК-электрофореза в агарозном геле в ТАЕ-буфере согласно [24]. Обработку ДНК эндонуклезами рестрикции (все фирмы Fermentas, Литва) и постановку лигазной реакции с использованием Т4 ДНК-лигазы (Fermentas, Литва) проводят согласно инструкции производителя.
Пример 2. Конструкции плазмид с разными типами пептидных вставок
В качестве клонируемой последовательности использованы различные дуплексы синтетических олигонуклеотидов: (SEQ ID NO:21), (SEQ ID NO:22); (SEQ ID NO:25), (SEQ ID NO:26); (SEQ ID NO:27), (SEQ ID NO:28). Все последовательности в соответствии с комплементарностью попарно отжигают друг на друга.
А) Конструкция плазмиды pNXA1FLAG
В качестве примера, который включает, но не ограничивает других вариантов, в данном примере рассмотрен способ введения вставки, которая кодирует последовательность FLAG-пептида. С этой целью используют праймер с последовательностью SEQ ID NO:21 и праймер с комплементарной последовательностью SEQ ID NO:22.
Праймеры отжигают друг на друга с охлаждением их смеси с 80°С до комнатной температуры, после чего проводят их фосфорилирование по 3'-концам полинуклеотидкиназой (Fermentas, Литва) согласно инструкции. Далее проводят клонирование данной синтетической двухцепочечной олигонуклеотидной последовательности, кодирующей FLAG-пептид, путем вставки в А1-ген флагеллина в месте, соответствующем 90-91 аминокислоте белка по сайту рестрикции BstXI за счет липких концов для данного сайта (Фиг.4), образующегося при отжиге синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов (SEQ ID NO:21) и (SEQ ID NO:22). Полученной лигазной смесью трансформируют клетки Е. coli согласно [25] и высевают на чашки с агаризованной (1.5%) средой LB с 100 мкг/мл ампициллина. Для наработки плазмидной ДНК выращенную колонию с чашки пересевают в жидкую среду с антибиотиком и после подроста клеток выделяют плазмиду. Полученные плазмиды секвенируют на ДНК-секвенаторе ABI PRIZM 310 (Applied Biosystems, США).
Таким образом, в приведенном примере, для клонирования в ген флагеллина А1 по сайту рестрикции BstXI олигонуклеотидов, кодирующих другие вставки, они должны выглядеть следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 3'-конец: 5'-NN(NNN)xGCCG-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту BstXI: 5'-(NNN)x NNCGGC-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина А1 приведена на Фиг.4. Число х определяет число кодонов, кодирующих аминокислоту, и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки.
Б) Конструкция плазмиды pNXA1A2FLAG
Плазмида pNXA1A2FLAG была получена в два этапа: во-первых, созданы условия для вставки в область А2-флагеллинового гена различных последовательностей. Так как сайта рестрикции для BstXI в А2-гене не имеется, а также не удалось подобрать других уникальных сайтов в выбранной области между сайтами гликозилирования, было решено ввести искусственный сайт путем замены нескольких нуклеотидов. Такая замена была осуществлена в плазмиде pNXA с использованием синтетических олигунуклеотидов:
5'-CACCGTGCGCCAGCTAGCCGGAGCC-3' (SEQ ID NO:23) и
5'-GGCTCCGGCTAGCTGGCGCACGGTG-3' (SEQ ID NO:24)
и набора реактивов QuikChange site-directed mutagenesis kit (фирмы Stratagene). Таким образом, был введен сайт для эндонуклеазы рестрикции AluNHI, приводящей к замене в продукте А2-гена 86 аминокислоты аланина на лейцин. В результате фрагмент флагеллина А2, ограниченный первыми двумя сайтами гликозилирования, после замены выглядит как VRQLAGADNI (SEQ ID NO:8). Подобная замена не приводит к утрате функциональности флагеллина и может при необходимости осуществляться как на гене флагеллина А1, так и на на гене флагеллина А2. Количество замен в области из 10 аминокислот между первыми двумя сайтами гликозилирования как в А1, так и А2 флагеллинах может достигать 20% процентов с сохранением, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности, при этом любая замена аминокислоты является предпочтительно консервативной заменой.
Далее, ген флагеллина А1 в месте, соответствующем 90-91 аминокислоте, и ген флагеллина А2 в месте, соответствующем 86-87 аминокислоте каждого белка, вставили по синтетической двухцепочечной олигонуклеотидной последовательности, кодирующей FLAG-пептид. Данная последовательность встроена в ген флагеллина А1 по сайту рестрикции BstXI за счет липких концов для данного сайта, образующегося при отжиге синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов (SEQ ID NO:21) и (SEQ ID NO:22), а в ген флагеллина А2 по сайту рестрикции AluNHI также за счет липких концов для данного сайта, образующегося при отжиге синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов (Фиг.4-5):
5'-CTAGGTGACTACAAGGACGATGACGATAAGGGT-3' (SEQ ID NO:25)
5'-CTAGACCCTTATCGTCATCGTCCTTGTAGTCAC-3' (SEQ ID NO:26)
Таким образом, в приведенном примере, для клонирования по сайту рестрикции BstXI в ген A1-флагеллина олигонуклеотидов, кодирующих другие вставки, они должны выглядеть следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 3'-конец: 5'-NN(NNN)xGCCG-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту BstXI: 5'-(NNN)x NNCGGC-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина А1 приведена на Фиг.4. Для вставки в ген флагеллина А2: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 5'-конец для клонирования по сайту рестрикции AsuNHI: 5'-CTAGNN(NNN)x-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту AsuNHI: 5'-CTAG(NNN)xNN-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина А2 приведена на Фиг.5. Число х определяет число кодонов, кодирующих аминокислоту и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки.
В) Конструкция плазмиды pNXA1FLAGA2GBP
Плазмида pNXA1FLAGA2GBP также была получена в два этапа: во-первых, аналогично получению плазмиды pNXA1A2FLAG в область А2-флагеллинового гена был введен сайт для эндонуклеазы рестрикции AluNHI, приводящей к замене в продукте гена флагеллина А2 86 аминокислоты аланина на лейцин. Далее, в ген флагеллина А1 в месте, соответствующем 90-91 аминокислоте белка, вставили синтетическую двухцепочечную олигонуклеотидную последовательность, кодирующую FLAG-пептид, а в ген флагеллина А2 в месте, соответствующем 86-87 аминокислоте белка, - синтетическую двухцепочечную олигонуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:11), кодирующую пептид, связывающую наночастицы коллоидного золота (Golden Binding Peptide). Последовательность золотосвязывающего пептидного мотива (SEQ ID NO:11) определена методом фагового дисплея. Последовательность, кодирующая FLAG-пептид, встроена в ген флагеллина А1 по сайту рестрикции BstXI за счет липких концов для данного сайта, образующегося при отжиге двух синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов (SEQ ID NO:21) и (SEQ ID NO:22). Последовательность (SEQ ID NO:11), кодирующую пептид, вставили в ген флагеллина А2 по сайту рестрикции AluNHI также за счет липких концов для данного сайта, образующегося при отжиге синтетических одноцепочечных олигонуклеотидов (Фиг.4-5):
5'-CTAGGTCTAAAGGCCCATCTACCTCCTAGTAGGCTACCTAGTGGT-3'
(SEQ ID NO:27)
5'-CAGATTTCCGGGTAGATGGAGGATCATCCGATGGATCACCAGATC-3'
(SEQ ID NO:28)
Таким образом, в приведенном примере, для клонирования по сайту рестрикции BstXI в ген флагеллина А1 олигонуклеотидов, кодирующих другие вставки, они должны выглядеть следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 3'-конец: 5'-NN(NNN)xGCCG-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту BstXI: 5'-(NNN)x NNCGGC-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина А1 приведена на Фиг.4. Для вставки в ген флагеллина А2: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 5'-конец для клонирования по сайту рестрикции AsuNHI: 5'-CTAGNN(NNN)x-3 (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и, кроме того, содержит липкий конец для клонирования по сайту AsuNHI: 5'-CTAG(NNN)xNN-3' (где N - стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в ген флагеллина А2 приведена на Фиг.5. Число х определяет число кодонов, кодирующих аминокислоту, и может достигать величины от 6 до 60 кодонов для одиночной вставки.
Пример 3. Получение штаммов продуцентов модифицированных жгутиков Н. salinarum R1
2
4
2
Использован штамм Н. salinarum R1, предоставленный Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (г.Москва). Клетки Н. salinarum выращивают на среде следующего состава: 25% NaCl, 0,2% KCl, 2% MgSO 7xHO, 0.3% Na-цитрат, 0.5% триптон, 0.2% дрожжевой экстракт, рН 7.5 при 37°С [23].
Штамм получают путем трансформации клеток Н. salinarum с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) по описанной ранее методике [22] со следующими модификациями. Сферопласты получают отдельно для каждой аликвоты (1.5 мл) клеточной культуры. Клетки осаждают в 1.5 мл пробирках центрифугированием при 4000 g в течение 10 мин и затем ресуспендируют в 150 мкл сферопластирующего раствора. Для получения сферопластов к клеточной суспензии добавляют 15 мкл 0.5 М ЭДТА и выдерживают смесь 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 10 мкл раствора, содержащего около 5 мкг плазмидной ДНК, и инкубируют смесь в течение 5 мин, после чего добавляют равный объем раствора, содержащего 60% ПЭГ-600 и 40% сферопластирующего раствора (вес/объем). Клетки инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре. Для восстановления клеток к суспензии добавляют 15 мл культуральной среды, содержащей 15% сахарозы, и инкубируют в течение 12-24 часов при 37°C с покачиванием. Селекцию трансформантов осуществляют на агаризованной среде, содержащей 15% сахарозы и 0.1-0.2 мкг/мл антибиотика новобиоцина (Sigma, США). Инкубацию осуществляют при 37°С в течение 10-14 сут. Культуры клеток Н. salinarum хранят на чашках Петри на соответствующих средах с 1.5% агаром при комнатной температуре.
Полученные штаммы культивируются аналогично нетрансформированным клеткам Н. Salinarum R1 за исключением добавки 0.1-0.2 мкг/мл антибиотика новобиоцина.
Пример 4. Выделение и очистка жгутиков
3
4
Для выделения жгутиков культуру Н. salinarum выращивают в литровых колбах с 200 мл среды до поздней стационарной фазы. Полученную биомассу осаждают центрифугированием при 8000 g в течение 30 мин. К супернатанту, полученному после осаждения клеток, добавляют 4% ПЭГ-6000 и затем осаждают жгутики центрифугированием при 15000 g в течение 45 мин. Далее, для очистки жгутиков используют центрифугирование в градиенте плотности CsCl (12 часов при 55000 об/мин, ротор VTI-80, Beckman, США). Хлористый цезий растворяют в солевой среде до получения плотности 1.36 г/см. Фракция, содержащая жгутики, образовывала видимую зону в средней части пробирки. Содержимое фракции разводят (в 10 раз) солевой средой, содержащей 25% NaCl, 20 мМ MgSO, далее жгутики переосаждают центрифугированием при 80000 g в течение 1 часа.
Пример 5. Связывание ионов металлов и минерализация волокнистых жгутиков
4
Связывание ионов металлов проводят аналогично методу, описанному Белчер [5-6] с модификациями. Жгутики при концентрации 0.1 мг/мл выдерживают в течение 1 часа в водном растворе 0.15-2.5М NaCl, содержащем 5 мМ хлорида Со или Cu. Затем к трем объемам раствора жгутиков добавляли один объем раствора, содержащего 1.5М NaCl и 100 мМ NaBH, и инкубировали в течение 1 часа до прекращения реакции. При этом методе концентрация жгутиков и солей металлов выбирается исходя из характеристик материала, который необходимо получить. Концентрация хлорида натрия не должна быть меньше 0.15М, так как при меньшей концентрации наступает необратимое разрушение жгутиков. Величина рН выбирается исходя из свойств веденной пептидной группы. Так, для FLAG-пептида необходима депротонизация кислотных групп 4-х аспарагинов с тем, чтобы они могли связать ион металла. Отсюда следует, что рН реакции для минерализации жгутиков с введенным FLAG-пептидом должен быть в пределах 4-13, желательно 6-12 и еще более желательно 7-11. Для остальных групп оптимальный для реакции рН может быть другим, но не выходить за пределы 4-13. Температура должна находиться в пределах 0°С - 50°С, желательно 10°С - 40°С, еще более желательно 15°С - 30°С.
Пример 6. Получение наноструктурированного материала на основе минерализованных жгутиков с модификациями
После минерализации модифицированных жгутиков (пример. 4) они переходят в легко осаждаемый (4000 g, 10 минут) осадок черного цвета (цвет оксидов Со и Cu). Данный осадок отделяется от супернатанта, затем суспендируется в воде и заново осаждается для отмывки от соли. Отделение осадка проводят при температуре от 20 до 25°С.
Полученный осадок переносится на инертную подложку, сушится под ваккумом при комнатной температуре в течение суток. Полученный сухой порошок черного цвета хранится при комнатной температуре длительное время.
Пример 7. Получение электронных микрофотографий и исследование жгутиков с помощью иммуноэлектронной микроскопии
Для получения электронных микрофотографий использовали микроскоп JEM-100 с «JEOL» (Япония). Все манипуляции проводятся при комнатной температуре. Для приготовления электронномикроскопических образцов препараты наносят на электронномикроскопические медные сетки с формваровой пленкой-подложкой, выдерживают 1 мин и отбирают раствор фильтровальной бумагой, после чего помещают сетку на раствор 2% уранил ацетата, выдерживают 30 с, отбирают раствор фильтровальной бумагой и далее высушивают.
Образцы жгутиков наносят на электронномикроскопические медные сетки с формваровой пленкой-подложкой и выдерживают 5 мин. Сетки с образцами жгутиков помещают на блокирующий буфер для ИЭМ (10 мМ Трис-HCl, рН 8, 150 мМ NaCl, 1% БСА) на 30 мин, а затем переносят на тот же буфер с препаратом моноклональных ANTI FLAG М2-антител (Sigma, США) и выдерживают 30 мин. Антитела разводят в 500, 200 и 100 раз. Затем сетки отмывают от антител в блокирующем буфере для ИЭМ 3-4 раза по 1 мин и переносят на тот же буфер с добавлением конъюгатов белка А с частицами коллоидного золота (размер частиц 10 нм, Jannsen Biotech, Бельгия) на 45-60 мин. Конъюгаты разводят в 50, 20 и 10 раз. Далее сетки отмывают блокирующим буфером для ИЭМ без БСА 2-3 раза по 5-10 мин, отбирают раствор фильтровальной бумагой и помещают на раствор 2% уранил ацетата для негативного контрастирования. Через 30 с раствор 2% уранил ацетата отбирают фильтровальной бумагой, сетки высушивают и исследуют образцы на микроскопе. Наилучшее мечение препаратов жгутиков было достигнуто при разведении антител в 200-100, а конъюгатов в 20-10 раз.
Пример 8. Ультразвуковая обработка рекомбинантных жгутиков
Выделенные и очищенные жгутики (пример 4) обрабатывают на частоте 22 и 44 кГц ультразвуковым диспергатором (модель УЗДН-2Т) на номинальной выходной мощности генератора прибора в рабочем диапазоне частот на активной нагрузке, составляющей 400 Вт. Обрабатываемый образец помещают в 1.5 мл центрифужную пробирку (Eppendorf), которую, в свою очередь, устанавливают в специальную насадку для обработки образцов в пробирках [27]. Пробирка с образцом и насадка находились в охлаждающем стакане, наполненном водой со льдом. Ультразвук подают периодами по 1 мин с паузами по 1 мин для охлаждения обрабатываемого образца. Образцы жгутиков после обработки ультразвуком анализируют на электронном микроскопе.
Данные фрагментации приведены в Таблице.
Длина фрагментированных жгутиков в зависимости от частоты и длительности воздействия ультразвуком
Частота обработки, кГц
Суммарное время обработки, мин
Наиболее часто встречающиеся визуально оцененные размеры фрагментированных жгутиков, нм
22
10
Более 3000
22
20
1500-3000
22
40
1000-2000
44
10
200-1200
44
20
100-600
44
40
50-300
Окончательным способом фрагментации жгутиков для последующей минерализации была выбрана обработка на частоте ультразвука 44 кГц интервалами по 1 мин и охлаждением в течение 1 мин общей продолжительностью 40 мин. На фиг.10 представлено электронномикроскопическое изображение наноструктурного материала, полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком в течение 20 мин при 44 кГц жгутиков со вставкой в A1-флагеллин FLAG-пептида и минерализованных оксидом кобальта. Негативное контрастирование уранил ацетатом. Масштабная линейка - 300 нм.
Пример 9. Связывание ионов металлов и минерализация предварительно обработанных ультразвуком жгутиков
4
Связывание ионов металлов проводят аналогично (пример 5) методу, описанному Белчер [5-6] с модификациями жгутики. Обработанные ультразвуком жгутики при концентрации 0.1 мг/мл выдерживают в течение 1 часа в водном растворе 0.15-2.5 М NaCl, содержащем 5 мМ хлорида Со или Сu. Затем к трем объемам раствора жгутиков добавляли один объем раствора, содержащего 1.5 М NaCl и 100 мМ NaBH, и инкубировали в течение 1 часа до прекращения реакции. При этом методе концентрация жгутиков и солей металлов выбирается исходя из характеристик материала, который необходимо получить. Концентрация хлорида натрия не должна быть меньше 0.15 М, так как при меньшей концентрации наступает необратимое разрушение жгутиков. Величина рН выбирается исходя из свойств веденной пептидной группы. Так, для FLAG-пептида необходима депротонизация кислотных групп 4-х аспарагинов с тем, чтобы они могли связать ион металла. Отсюда следует, что рН реакции для минерализации жгутиков с введенным FLAG-пептидом должен быть в пределах 4-13, желательно 6-12 и еще более желательно 7-11. Для остальных групп оптимальный для реакции рН может быть другим, но не выходить за пределы 4-13. Температура должна находиться в пределах 0°С - 50°С, желательно 10°С - 40°С, еще более желательно 15°С - 30°С.
Пример 10. Получение наноструктурированного материала на основе минерализованных жгутиков с модификациями и предварительной обработкой ультразвуком
Модификация проводится аналогично примеру 6. После минерализации модифицированных жгутиков (пример 4) они переходят в легко осаждаемый (4000 g, 10 мин) осадок черного цвета (цвет оксидов Со и Cu). Данный осадок отделяется от супернатанта, затем суспендируется в воде и заново осаждается для отмывки от соли. Отделение осадка проводят при температуре от 20 до 25°С. Полученный осадок переносится на инертную подложку, сушится под вакуумом при комнатной температуре в течение суток. Полученный сухой порошок черного цвета хранится при комнатной температуре длительное время.
Пример 11. Сборка электрохимической ячейки литий-ионного аккумулятора с анодом на основе наноструктурного материала оксид кобальта - рекомбинантные модифицированные жгутики
Электроды были изготовлены по стандартной намазной технологии, которая включала приготовление активной массы, нанесение ее на токопроводящую основу, первоначальную сушку в сушильном шкафу, прессование, окончательную сушку в вакууме форвакуумного насоса [28]. Рабочая масса являлась механической смесью из активного вещества модифицированных оксидом кобальта жгутиков (75 мас.%) и ацетиленовой сажи (15 мас.%) с добавлением связующего вещества (поливинилиденфторид, 10 мас.%).
Пример 12. Измерение электрохимической емкости аккумулятора с отрицательно заряженным электродом из наноструктурированного материала на основе модифицированных жгутиков с предварительной обработкой ультразвуком или без предварительной обработки ультразвуком
3
4
3
4
Гальваностатическое циклирование исследуемых электродов проводили током 20 мА/г активного вещества (CoO). Пределы циклирования составляли 3.0-0.01 В. Результат циклирования различных наноструктурированных материалов представлен на фиг.11. На фиг.11 представлено изменение разрядной емкости электродов на основе: 1) оксида кобальта, нанесенного на электрод без добавления жгутиков; 2) наноструктурного материала на основе жгутиков со вставкой в А1-флагеллин FLAG-пептида и минерализованных оксидом кобальта; 3) наноструктурного материала, полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком (частотой 44 кГц в течение 20 мин) жгутиков со вставкой в A1-флагеллин FLAG-пептида и минерализованных оксидом кобальта. Циклирование проводилось в 1М L1PF6 в смеси этиленкарбонат-диэтилкарбонат-диметилкарбонат (1:1:1, далее ЭК-ДЭК-ДМК) током 20 мА/г CoO.
Результаты испытаний показали наибольшую эффективность наноструктурного материала, полученного на основе предварительно обработанных ультразвуком жгутиков флагеллина.
Несмотря на то, что настоящее изобретение описывает конкретные и предпочтительные варианты его реализации, следует иметь в виду, что указанные варианты не ограничивают возможные модификации и варианты настоящего изобретения.
Литература
1. Bock L. et al. Nano-Chem-Fet Based Biosensors. US Pat. Applic. №20080044911 (February 21, 2008).
2. Tran B.Q. NANO-electronics. US Pat. Applic. №20070285843 (December 13, 2007).
3. Wirth R. et al. Molecular Glue. US Pat. Applic. №20080305524 (December 11, 2008).
4. Gazit E. et al. Peptide nano structures encapsulating a foreign material and method of manufacturing same. US Pat. Applic. №20060079455 (April 13, 2006).
5. Nam K.T. et al. Virus-Enabled Synthesis and Assembly of Nanowires for Lithium Ion Battery Electrodes. Science, V.312, P.885-888 (2006).
6. Belcher A.M. et al. Nanoscaling ordering of hybrid materials using genetically engineered mesoscale virus. US Pat. Applic. №20030073104 (April 17, 2003).
7. Belcher A.M. et al. Multifunctional biomaterials as scaffolds for electronic, optical, magnetic, semiconducting, and biotechnological applications. US Pat. Applic. №20050170336 (August 4, 2005).
8. Belcher A.M. et al. Biological control of nanoparticle nucleation, shape and crystal phase US Pat. Applic. №20060275791 (December 7, 2006).
9. Nam K. Т. et al. Virus scaffold for self-assembled, flexible and light lithium battery. US Pat. Applic. №20060121346 (June 8, 2006).
10. Мао С. et al., Virus-Based Toolkit for the Directed Synthesis of Magnetic and Semiconducting Nanowires. Science, 2004, V.303, P.213-217.
11. Kumara M.T. et al., Self-assembly of metal nanoparticles and nanotubes on bioengineered flagella scaffolds. Chem. Mater., 2007, V.19, P.2056-2064.
12. Yu В. et al., A Novel Biometallic Interface: High Affinity Tip-Associated Binding by Pilin-Derived Protein Nanotubes. J. Bionanosci., 2007, V.1, 73-83.
13. Audette G.F., Hazes B. Development of protein nanotubes from a multipurpose biological structure. J. Nanosci. Nanotechnol., 2007, V.7, P.2222-2229.
14. Mudalige Thilak Kumara et al., Bioengineered Flagella Protein Nanotubes with Cysteine Loops: Self-Assembly and Manipulation in an Optical Trap Nano Lett., Vol. 6, No. 9, 2006.
15. Benita Westerlund-Wikstro et al., Functional expression of adhesive peptides as fusions to Escherichia coli flagellin. Protein Engineering vol.10 no.11 pp.1319-1326, 1997.
16. Trpepi M., Polschroder M., Haloferax volcanii flagella are required for motility but are not involved in PibD-dependent surface adhesion. 2010, J. Bacteriol., doi:10.1128/JB.00133-10.
17. Thomas A.N. et al., The archaeal flagellum: a different kind of prokaryotic motility structure. FEMS Microbiol. Reviews, 2001, V.25, P.147-174.
18. Logan S.M. Flagellar glycosylation - a new component of the motility repertoire? Microbiol., 2006, V.152, P.1249-1262.
19. Tarasov V.Y., Pyatibratov M.G., Tang S., Dyall-Smith M., Fedorov O.V. // Role offlagellins from A and В loci in flagella formation of Halobacterium salinarum. Mol. Microbiol., 2000, V.35, P.69-78.
20. Fabricating Genetically Engineered High-Power Lithium Ion Batteries Using Multiple Virus Genes. Yun Jung Lee, Hyunjung Yi, Woo-Jae Kim, Kisuk Kang, Dong Soo Yun, Michael S. Strano, Gerbrand Ceder, Angela M. Belcher. 2 April 2009/ 10.1126/science.
2
21. Corrine K. Thai et al., Identification and Characterization of CuO- and ZnO-Binding Polypeptides by Escherichia coli Cell Surface Display: Toward an Understanding of Metal Oxide Binding. BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, VOL. 87, NO. 2, JULY 20, 2004.
22. Cline S.W. et al., Transformation methods for halophilic archaebacteria. Can. J. Microbiol., 1989, V.35, P.148-152.
23. Dyall-Smith M. The halohandbook: protocols for halobacterial genetics. 2008 (http://www.haloarchaea.com/resources/halohandbook)
24. Sambrook J., Russell D.W. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
25. Inoue H. et al., High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 1990, V.96, P.23-28.
26. Oesterhelt The system was conceived and implemented within the Dept. of Membrane Biochemistry of the Max-Planck-Institute of Biochemistry, Martinsried, Germany (http://www.halolex.mpg.de/public)
27. Эльпинер И.Е. Биофизика ультразвука. М., Наука, 1973, 384 с., ил.
28. Под редакцией Н.В.Коровина и А.М.Скундина. «Химические источники тока: Справочник» // M.: Издательство МЭИ, 2003, 740 с., ил.