ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КОРОВ С СУБКЛИНИЧЕСКИМ МАСТИТОМ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
PREPARATION FOR TREATING COWS WITH SUBCLINICAL MASTITIS AND METHOD FOR USING IT

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности может быть использовано при лечении субклинического воспаления молочной железы у лактирующих коров.
Известны препараты и способ их применения при лечении коров с субклиническим маститом: мастицид, мастисан A, B, E (Ивашура А.И. Система мероприятий по борьбе с маститами коров / А.И. Ивашура. - М., 1991. - С.196-201. Юрков В.М. Антибиотики для лечения коров, больных маститом / В.М. Юрков, Л.Д. Демидова // Ветеринария. - №10. - 1997. - С.30-32). В качестве действующих веществ в данных препаратах выступают комбинации антибиотиков и сульфаниламидов, стабилизированных в масляной основе (растительное масло). Одна лечебная доза препарата составляет 5 мл и содержит калиевой соли бензилпенициллина - 100000 ЕД; сульфата стрептомицина - 100000 ЕД; норсульфазола растворимого - 0,35 г; растительного масла - 4,5 г и эмульгатора - 0,05 г.
Сущность способа применения заключается во введении препаратов коровам интрацистернально в больную четверть вымени. В зависимости от тяжести заболевания вводят 1-4 дозы (5-20 мл) препарата, при необходимости повторяют через каждые 24 часа до полного исчезновения признаков заболевания.
Однако при всей целесообразности и высокой эффективности применения данных препаратов имеется ряд недостатков: антибиотики, сульфаниламиды, входящие в их состав, способствуют развитию полирезистентности у штаммов микроорганизмов, также возникает необходимость браковки молока в период и после лечения в течение 24-96 часов по причине выделения антибиотиков с молоком (Шакиров О.Ф. Контроль за состоянием вымени коров во время лактации /О. Ф. Шакиров // Животноводство. - №2. - 2006. - С.61-63); масляная основа препарата препятствует полному высвобождению и проникновению антибиотиков в ткани вымени; растительные масла, входящие в состав препаратов, при длительном хранении окисляются.
Наиболее близким решением к заявляемому, принятым за прототип, является водорастворимая бактерицидная композиция, содержащая высокодисперсное металлическое серебро, способ получения этой композиции (см. заявка на патент РФ: 94042748/14 от 25.11.1994, МПК A61K 31/79, A61K 33/38). Способ получения такой композиции по изобретению реализуется взаимодействием нитрата серебра с водно-спиртовым раствором поли-N-винилпирролидона-2 при следующих концентрациях ингредиентов, масс.%:
поли-N-винилпирролидон-2
0,065-11,0
нитрат серебра
0,025-29,73
этиловый спирт
5,0-3836
вода
остальное до 100,0
Недостатками препарата и способа по прототипу являются: способ получения композиции недостаточно технологичен и в значительной степени трудоемок, так как процесс приготовления ведется в темноте при определенной температуре (65-75°C), в атмосфере инертного газа. Также не было найдено данных по применению данной композиции в ветеринарии, в частности для терапии субклинического мастита коров. Действующее вещество - нитрат серебра - может являться аллергеном; в способе по прототипу в качестве одного из компонентов выступает спирт, который также может обладать раздражающим действием на слизистую вымени при интрацистернальном введении.
Задача изобретения - расширение арсенала антибактериальных препаратов и способов лечения коров с субклиническим маститом.
2
Поставленная задача решается тем, что в препарате для лечения коров с субклиническим маститом, включающем антибактериальное вещество и наполнитель, согласно изобретению в качестве антибактериального вещества используют наночастицы серебра, стабилизированные субмикронными частицами диоксида титана (далее - Ag-TiO), а в качестве наполнителя используют полимер синтетического происхождения поли-N-винилпирролидон-2 при следующем соотношении компонентов, масс.%:
наночастицы серебра с размерами 200-300 нм
2,0×10<sup>-3</sup>
частицы диоксида титана с размерами 2-4 мкм
60,0×10<sup>-3</sup>
поли-N-винилпирролидон-2
10,0
вода
остальное до 100,0
Поставленная задача решается тем, что в способе применения антибактериального препарата для лечения коров с субклиническим маститом, включающем интрацистернальное введение лекарственного препарата, согласно изобретению больным животным вводят интрацистернально указанный препарат в дозе 10,0 мл два раза в день в течение 2-4 дней.
Способ приготовления препарата осуществляется следующим образом.
2
Комплекс, являющийся действующим веществом препарата, получают путем предварительного смешения порошкообразного серебра с размерами частиц 300-500 мкм и порошкообразного диоксида титана с размерами частиц 300-500 мкм, полученная смесь механически активирована в активаторах планетарного, или вибрационного, или виброцентробежного типов, или роликовых мельницах, обеспечивающих ускорение мелющих тел 200-400 м/с и время пребывания в зоне обработки 5-15 минут (см. European Patent 0854765 B1 от 04.04.2001 Bulletin 2001/14).
После механической активации продукт добавляют в раствор высокомолекулярного полимера синтетического происхождения поли-N-винилпирролидоном-2 при следующем соотношении, масс.%:
наночастицы серебра с размерами 200-300 нм
2,0×10<sup>-3</sup>
частицы диоксида титана с размерами 2-4 мкм
60,0×10<sup>-3</sup>
поли-N-винилпирролидон-2
10,0
вода
остальное до 100,0
Использование наночастиц серебра обеспечивает препарат антибактериальными свойствами. Субмикронные частицы диоксида титана, находясь в комплексе с наночастицами серебра, способствуют пролонгированному действию препарата, обеспечивая постепенное высвобождение ионов серебра к очагу воспаления.
Гель поли-N-винилпирролидона-2 - более приемлемая гидрофильная основа, которая длительно сохраняет активность этиотропного вещества препарата, а также способствующая лучшему распределению его в тканях вымени.
Предпочтительно содержание высокомолекулярного соединения в растворе составляет 10 масс.%.
Обоснование выбора, соотношения компонентов препарата, приведенного в описании, подтверждено примерами, раскрывающими отработку оптимальной концентрации, обладающей бактерицидностью, биосовместимостью и не ведущей к перерасходу компонентов препарата.
Способ получения препарата осуществляется следующим образом.
Изготовление суспензии, содержащей наночастицы серебра, стабилизированные субмикронными частицами диоксида титана.
2
-3
Пример 1. Порошкообразное серебро с размерами частиц 300-500 мкм смешивают с порошкообразным диоксидом титана с размерами частиц 300-500 мкм в соотношении 1:30. Смесь механически активируют в активаторах планетарного, или вибрационного, или виброцентробежного типов, или роликовых мельницах, обеспечивающих ускорение мелющих тел 200 м/с и время пребывания в зоне обработки 5 минут. Полученный продукт добавляют к 10 масс.% раствору поливинилпирролидона до концентрации серебра 0,2×10%.
Конечный продукт содержит наночастицы серебра, субмикронные частицы диоксида титана, поливинилпирролидон при следующем соотношении масс.%:
-3
- наночастицы серебра с размерами 200-300 нм - 0,2×10,
-3
- частицы диоксида титана с размерами 2-4 мкм - 6,0×10,
- поливинилпирролидон - 10,0,
- вода - остальное до 100,0.
2
-3
Пример 2. Порошкообразное серебро с размерами частиц 300-500 мкм смешивают с порошкообразным диоксидом титана с размерами частиц 300-500 мкм в соотношении 1:40. Смесь механически активируют в активаторах планетарного, или вибрационного, или виброцентробежного типов, или роликовых мельницах, обеспечивающих ускорение мелющих тел 400 м/с и время пребывания в зоне обработки 15 минут. Полученный продукт добавляют к 20 масс.% раствору поливинилпирролидона до концентрации серебра 0,5×10%.
Конечный продукт содержит наночастицы серебра, субмикронные частицы диоксида титана, поливинилпирролидон при следующем соотношении масс.%:
-3
- наночастицы серебра с размерами 200-300 нм - 0,5×10,
-3
- частицы диоксида титана с размерами 2-4 мкм - 20,0×10,
- поливинилпирролидон - 20,0,
- вода - остальное до 100,0.
Пример 3. Оценка антимикробной активности суспензии, с разным содержанием наночастиц серебра, стабилизированных субмикронными частицами диоксида титана
2
6
Антибактериальную активность препарата с различной концентрацией комплекса наночастиц серебра, стабилизированных субмикронными частицами диоксида титана (Ag-TiO), в отношении культур Str. agalactiae, St. aureus, St. albus, Esh. coli, Enter, agglomerans осуществляли методом серийных разведений в микропланшетах. Рабочая концентрация культуральной суспензии составляла 1×10 кл./мл (стандарт мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Опыт - композиция + бульонная культура, контроль - бульонная культура. Планшет с культурой и препаратом инкубировали при температуре 37±1°C. Через 24 часа от начала опыта производили замеры оптической плотности (ед.) жидкой среды на приборе «Мультискан» (табл.1).
Таблица 1
Пример
Ag-TiO<sub>2</sub>, масс.%
Культура микроорганизмов
Оптическая плотность среды, ед.
опыт
контроль
пример 1
0,2×10<sup>-3</sup>
Str. agalactiae
121,06
125,6
St. aureus
98,6
113,6
St. albus
102,4
152
Esh. coli
156,3
268,1
Enter. agglomerans
219,6
290,3
пример 2
1,0×10<sup>-3</sup>
Str. agalactiae
76,9
125,6
St. aureus
35,2
113,6
St. albus
76,4
152
Esh. coli
98,7
268,1
Enter. agglomerans
165,1
290,3
пример 3
2,0×10<sup>-3</sup>
Str. agalactiae
5,3
125,6
St. aureus
6,2
113,6
St. albus
9,7
152
Esh. coli
5,6
268,1
Enter. agglomerans
15,2
290,3
пример 4
4,0×10<sup>-3</sup>
Str. agalactiae
4,48
125,6
St. aureus
1,3
113,6
St. albus
5,6
152
Esh. coli
5,2
268,1
Enter. agglomerans
2,3
290,3
2
-3
-3
Исходя из представленных в таблице 1 данных, отражающих изменение оптической плотности среды, следует, что максимальный бактерицидный эффект наблюдается у суспензии с концентрацией комплекса Ag-TiO (масс.%) 2,0×10 и 4,0×10.
Пример 4. Определение антибактериальной активности препарата, включающего наночастицы серебра, стабилизированные субмикронными частицами диоксида титана, в лабораторных условиях
Для проверки антимикробной активности заявляемого препарата в динамике проведен опыт. Определение сроков антимикробной активности заявляемого препарата проводили методом серийных разведений (Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных / Д.И. Скородумов, В.В. Субботин, М.А. Сидоров, Т.С. Костенко - М.: ИзографЪ, 2005. - 656 с.).
Результаты представлены в виде фигур 1-4.
Из представленных данных видно, что антибактериальный препарат, содержащий наночастицы серебра, стабилизированные субмикронными частицами диоксида титана, во всех представленных концентрациях обладает антибактериальной активностью in vitro в отношении микроорганизмов, являющихся этиологическим фактором возникновения мастита (кривые роста микроорганизмов опытных групп, содержащих препарат в различных концентрациях, расположены ниже относительно кривой роста микроорганизмов в контроле, не содержащем препарат). При этом во временной период с двенадцати часов от начала постановки опыта наблюдается фаза роста микробной культуры. Из чего можно сделать вывод, что антибактериальная активность заявляемого препарата длится 12 часов. Таким образом, оптимальная кратность применения антибактериального препарата животным - два раза в сутки.
Пример 5. Проверка раздражающего действия препарата, включающего наночастицы серебра на основе субмикронных частиц диоксида титана, стабилизированных полимером синтетического происхождения поли-N-винилпирролидоном-2, на молочную железу коров
Было сформировано по две группы по 10 голов клинически здоровых лактирующих коров в условиях примера 1 и примера 2. Препарат с различным соотношением компонентов (комплекс наночастиц серебра и диоксида титана) в количестве 10,0 мл вводили интрацистернально в левую переднюю долю вымени (опыт) после предварительного сдаивания секрета. В правую переднюю долю (контроль) препарат не вводили, она служила контролем. О действии препарата на ткани молочной железы судили по изменению содержания соматических клеток в секрете, которое определяли по методу Прескотта-Брида в следующие сроки: перед введением и через 12, 24, 48 и 72 часа после введения препарата. Контролем служили симметричные здоровые доли вымени, в которые препарат не вводили. Результаты опыта представлены в таблице 2.
Таблица 2
Пример
Ag-TiO<sub>2</sub>, масс.%
Сроки исследования, часы
Доли вымени, количество соматических клеток
опыт, тыс./мл
контроль, тыс./мл
пример 1
2,0×10<sup>-3</sup>
до введения
468,8±3,3
501,8±3,8
12
241,05±2,5
419,8±2,2
24
265,8±0,3
474,5±6,8
48
295,2±8,2
327,1±7,1
72
455,2±3,8
458,3±2,0
пример 2
4,0×10<sup>-3</sup>
до введения
328,8±2,3
346,8±1,8
12
168,5±0,5
329,8±2,4
24
206,8±1,3
404,5±3,8
48
298,2±4,2
427,1±1,1
72
365,2±5,8
409,3±2,1
Установлено, что через 12 часов после введения препарата «Арго-маст», общее состояние исследуемых животных было в пределах физиологических границ. Местная температура опытных и контрольных четвертей молочной железы не была повышена; кожа вымени эластичная, безболезненная. К 72 часам наблюдали постепенное увеличение количества соматических клеток до уровня, не превышающего нормативные показатели (ГОСТ 52054-2003 «Молоко натуральное коровье - сырье»).
Пример 6. Отработка оптимальной концентрации действующего вещества антибактериального препарата
2
-3
-3
Исходя из ранее проведенных исследований установлено, максимальный бактерицидный эффект наблюдается у суспензии с концентрацией комплекса Ag-TiO (масс.%) 2,0×10 и 4,0×10.
2
-3
-3
Были сформированы две опытные группы коров черно-пестрой породы второй-четвертой лактации. Диагноз, субклинический мастит, ставили по результатам калифорнийского мастит-теста и лабораторного подсчета соматических клеток в камере Горяева. Коровам 1-4-й опытных групп дважды в сутки интрацестернально вводили антибактериальный препарат с различной концентрацией действующего вещества Ag-TiO (масс.%) 2,0×10 и 4,0×10. Препарат вводили сразу после постановки диагноза два раза в день до излечения. Содержимое флакона перед употреблением тщательно взбалтывали до получения равномерной суспензии, из флакона набирали в стерильный шприц 10,0 мл. Препарат вводили посредством молочного катетера через наружное отверстие соскового канала нажатием на поршень шприца в сосковую цистерну вымени.
За животными проводили наблюдение. Терапевтическая эффективность препарата определялась по отрицательной пробе калифорнийского мастит-теста (отрицательная реакция - смесь в лунке молочно-контрольной пластины жидкая, однородная, светло-сиреневого цвета; положительная реакция - смесь желеобразной консистенции разной степени, цвет от темно-сиреневого до фиолетового), а также путем подсчета количества соматических клеток в камере Горяева и контрольному бактериологическому исследованию проб молока на наличие патогенной микрофлоры.
Таблица 3
Группы (концентрация действующего вещества, мг/кг)
Всего в опыте
Выздоровело
Сроки выздоровления, сутки
коров
пораженных долей
коров
%
долей
%
1-я опытная (20,0)
16
17
16
100
17
100
4,18±0,82
2-я опытная (40,0)
15
15
15
100
15
100
4,06±0,69
Из таблицы 3 следует, что терапевтический эффект при лечении мастита коров был достигнут в обеих группах. Выздоровление наступало на 4-е сутки.
Таблица 4
Группы
Начало лечения, тыс./мл
Окончание лечения, тыс./мл
Разность, тыс./мл
1-я опытная (20,0)
787,5±32,2
336,8±24,6*
-450,7±7,6
2-я опытная (40,0)
800,3±37,8
313,4±21,2*
-486,9±16,6
Примечание: * P<0,05
Как представлено в таблице 4, уровень соматических клеток в молоке коров 1-й опытной группы снизился с 787,5±32,2 до 336,8±24,6 тыс./мл - на 57,2%; 2-й опытной снизился с 800,3±37,8 до 313,4±21,2 тыс./мл - на 60,8% соответственно.
Таблица 5
Микрофлора
Окончание лечения
Окончание лечения
группа
группа
O1
O2
O1
O2
Str. agalactiae
+
+
-
-
St. aureus
+
+
-
-
St. albus
+
+
-
-
Esh. coli
+
-
-
-
Prot. vulgaris
-
-
-
-
Enter. agglomerans
+
-
-
-
Примечание: O1…O2 - 1-я опытная…2-я опытная
При контрольном посеве в молоке животных 1-й и 2-й опытных групп исходной микрофлоры не обнаружено (табл.5).
2
2
-3
-3
В результате исследования выявлено, что применение препарата с концентрацией действующего вещества Ag-TiO (масс.%) 4,0×10 животным во 2-й опытной группе не выявило значительного повышения терапевтической эффективности и приводило к перерасходу действующих веществ препарата. Следовательно, в дальнейшем проводили исследование терапевтической эффективности антибактериального препарата с концентрацией действующего вещества Ag-TiO (масс.%) 2,0×10.
2
-3
Пример 7. Определение терапевтической эффективности антибактериального препарата с концентрацией действующего вещества Ag-TiO (масс.%) 2,0×10, при лечении субклинического мастита у коров.
2
-3
С целью определения терапевтической эффективности при применении антибактериального препарата было подобрано 40 коров больных субклиническим маститом. Животные были разделены на две группы. Опытной группе интрацистернально вводили антибактериальный препарат, содержащий наночастицы серебра, стабилизированные субмикронными частицами диоксида титана (Ag-TiO (масс.%) 2,0×10) в дозе 10,0 мл дважды в сутки до выздоровления. Аналогично контрольной группе интрацистернально вводили антибактериальный препарат - неотил, содержащий Tybocinum basicum 0,25 г 250000 IU, Neomycinum sulfatum 0,1 г 100000 IU.
Оценку эффективности способа лечения проводили путем учета результатов исследования проб молока калифорнийским мастит-тестом (отрицательная реакция - смесь в лунке молочно-контрольной пластины жидкая, однородная, светло-сиреневого цвета; положительная реакция - смесь желеобразной консистенции разной степени от темно-сиреневого до фиолетового цвета), подсчетом соматических клеток в камере Горяева и контрольным бактериологическим исследованием проб молока, учетом сроков выздоровления.
Как видно из таблицы 6, излечение опытных животных наступало в 95% случаев (96% долей) на 4,45±0,27 сутки лечения препаратом, содержащим наночастицы серебра стабилизированные субмикронными частицами диоксида титана. В контроле вылечено 80% животных (81,8% долей) в течение 8,95±0,53 суток.
Таблица 6
Группа
Всего в опыте
Выздоровело
Срок выздоровления, сутки
коров
больных долей
коров
%
долей
%
опытная (изучаемый препарат)
20
25
19
95
24
96
4,45±0,27
контрольная (неотил)
20
22
16
80
18
81,8
8,95±0,53
Из представленных в таблице 7 данных следует, что после лечения в молоке животных опытной группы содержание СК снизилось с 873,6±21,1 до 420,9±36,0 тыс./мл (на 51,8% относительно начала лечения), в контрольной - с 869,9±22,3 до 576,2±32,2 тыс./мл (на 33,8%).
Таблица 7
Группа
Количество соматических клеток, тыс./мл
До лечения
После лечения
Разность
опытная (изучаемый препарат)
873,6±21,1
420,9±36,0*
452,7±14,9
контрольная (неотил)
869,9±22,3
576,2±32,2*
293,7±9,9
Примечание: * P<0,05
Результаты исследований свидетельствуют о том, что антибактериальный препарат, включающий наночастицы серебра, стабилизированные субмикронными частицами диоксида титана, обусловил ускорение процесса обезвреживания микрофлоры в больных маститом долях молочной железы, что выражалось уменьшением количества соматических клеток в молоке и снижением сроков выздоровления животных.
Для изучения влияния лекарственных препаратов на микрофлору вымени проводили бактериологическое исследование секрета молочной железы коров обеих групп. Пробы секрета отбирали из пораженных долей с соблюдением правил асептики и антисептики до введения препаратов и по окончанию лечения.
3
3
До введения препаратов у всех коров обнаружили микрофлору в количестве 6-96,2×10 кл./мл. Выделенная микрофлора была представлена микроорганизмами родов Streptococcus (Str. agalactiae, Str. dysagalactiae, Str. spp.), Staphylococcus (St. albus, St. aureus), Escherichia (Esh. coli), Klebsiella (Kleb. pneumoniae), Enterobacter (Enter. agglomerans). После окончания терапии в секрете молочной железы у всех коров опытной группы (100,0%) ранее выделяемая микрофлора отсутствовала, у коров контрольной группы 4-65,9×10 (68,6%) присутствовали стрептококки, стафилококки, кишечной палочки и микроорганизмы рода Enterobacter.
2
-3
Таким образом, предлагаемый способ лечения субклинического мастита у коров с использованием антибактериального препарата, содержащего наночастицы серебра, стабилизированные субмикронными частицами диоксида титана, с концентрацией действующего вещества Ag-TiO (масс.%) 2,0×10 в дозе 10,0 мл дважды в сутки при интрацистернальном методе введении является более эффективным в сравнении со способом лечения препаратом неотил, что выражалось в уменьшении сроков лечения, снижением соматических клеток и санацией вымени.