ПРОБИОТИЧЕСКИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ, ОБОГАЩЕННЫЕ ОРГАНИЧЕСКИМ СЕЛЕНОМ НА БАЗЕ СОЕДИНЕНИЙ ГИДРОКСИКИСЛОТ СЕЛЕНА, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ПИТАНИИ, КОСМЕТИКЕ И ФАРМАЦИИ
PROBIOTIC MICROORGANISMS, ENRICHED WITH ORGANIC SELENIUM BASED ON COMPOUNDS OF SELENIUM HYDROXYACIDS, AND THEIR APPLICATION IN NUTRITION, COSMETICS AND PHARMACY

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к обогащению нефотосинтезирующих микроорганизмов органическим селеном, более конкретно с помощью соединений типа гидроксикислот селена, и в частности 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты в форме (D, L), или энантиомера, соли, эфирного или амидного производного этого соединения, а также применения обогащенных таким образом микроорганизмов в питании человека или животных, в косметике или фармации.
Уровень техники
Селен является одним из основных элементов питания, в частности, для человека и млекопитающих (Wendel, A.; Phosphorus, Sulfur Silicon Relat Elem.; 1992; 67, 1-4, 405-415). Более конкретно, он участвует в форме L(+)-селеноцистеина или L(+)-селенометионина {Muller, S. et al.; Arch. Microbiol, 1997; 168; 421) в биосинтезе селенопротеинов, таких как глутатион пероксидаза, тиоредоксин редуктаза и селенопротеин Р.
Имеются сообщения о состояниях дефицита селена у человека, более конкретно у пациентов, которые в течение длительного времени получали парентеральное питание (Von Stockhausen, H.B.; Biol. Trace Elem. Res.; 1988; 15; 147-155). Ежедневная добавка селена в количестве 200 мкг считается надежной и адекватной для взрослого человека среднего веса (Schrauzer, G.N., J. Am. Col. Nutr.; 2001; 20; 1-14).
Селен находится в природе в двух формах: в органической и неорганической.
Неорганические соединения чаще всего являются солями, такими как селенит или селенат натрия. Эти соединения очень токсичны для человека и для большинства животных.
Органические соединения (селеноорганические соединения) представлены, более конкретно, в живых организмах аминокислотами L(+)-селенометионином, L(+)-метилселеноцистеином и L(+)-селеноцистеином.
L(+)-селенометионин является основным источником органического селена у человека и животных. Однако человек и животные являются ауксотрофными в отношении этой аминокислоты, которая может быть получена только с продуктами питания.
Таким образом, в идеале именно в этой органической форме селен должен входить в состав пищевых добавок с целью лечения или предупреждения недостатка селена.
Так, было показано, что пищевая добавка в виде L(+)-селенометионина была гораздо менее токсичной и обладала более высокой биодоступностью по сравнению с введением в форме селенита натрия (Mony, MC et al.; J. of Trace Elem. Exp. Med.; 2000; 13; 367-380).
В настоящее время неизвестны иные метаболические пути усвоения селена живыми организмами, отличные от тех, в которых в качестве субстрата используется неорганический селен, главным образом, в форме селенита натрия и селенометионина.
Можно обнаружить приемлемое поступление селена в форме органического селена у высших растений (более конкретно, у пшеницы, кукурузы, сои), у которых более 80% селена представлено L(+)-селенометионином (Schrauzer, G.N.; J.Am.Coll. Nutrit.; 2001; 20; 1; 1-4). Между тем концентрация селена в этих растениях недостаточна для легкого приготовления пищевых добавок при наименьших затратах.
Один из изученных способов получения богатых селеном композиций заключается в обогащении некоторых микроорганизмов органическим селеном на базе неорганического селена. После обогащения эти микроорганизмы могут служить сырьем для приготовления пищевых или косметических продуктов.
В многочисленных публикациях описывается приготовление дрожжей, обогащенных селеном и, более конкретно, дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Oh Tae-Kwang et al., патентный документ KR 950006950 от 26.06.1995) для их применения как таковых или их включения в состав пищевых композиций (Moesgaard S. et al., патентный документ DK 200200408 от 16.09.2003); или для получения обогащенных селеном производных продуктов, таких как хлеб (Wang Boaquan, патент CN 1817143 от 16.08.2006), молоко (Jeng Chang-Yi, патент TW 565432 от 11.12.2003), яйца (Cui Li et al., патент CN 1302723C от 07.03.2007), шоколад (In Gyeong Suk et al., патентный документ KR 20040101145 от 08.11.2004) или пиво (Jakovleva L.G. et al., патент RU 2209237 от 27.07.2003), обогащенных селеном. Применительно к диетическим пищевым продуктам препараты, содержащие обогащенные селеном дрожжи, также предлагались для беременных женщин (Wang Weiyi, патент CN 1778199 от 31.05.2006) или для улучшения микробной среды кишечника пациентов, страдающих гипогликемией (Li Tao Zhao, патент CN 1810161 от 02.08.2006). В области дермокосметики композиции, содержащие обогащенные селеном дрожжи, были разработаны для уменьшения капиллярных кровопотерь (Kasik Heinz, патент DE 19858670 от 21.06.2000) или для предупреждения фотостарения (Kawai Norihisa et al., патент JP 07300409 от 14.11.1995). Фармацевтические препараты, содержащие обогащенные селеном дрожжи, применяли при профилактике и лечении воспалительных патологий, таких как связанная с диабетом ретинопатия (Crary Ely J., патент US 5639482 от 17.06.1997), или сердечно-сосудистых патологий (Nagy P.L. et al.; патент HUT 060436 от 28.09.1992).
Бактерии и, более конкретно, пробиотические бактерии также были объектом для обогащения селеном (Calomnie M. et al., Biol. Trace Elem. Res.; 1995; 47; 379-383). Было описано применение в качестве обогащенных селеном пищевых добавок Lactobacillus acidophilus, а также Lactobacillus reuteri, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus buchnerilparabuchneri (Andreoni V. et al., патент US0258964). При этом исследование, проведенное на Lactobacillus casei ssp casei, показало, что селен был включен в состав в основном в форме селеноцистеина (Calomme M. et al., Biological Trace Element Research 1995, 47, 379-383). Были приготовлены пробиотические смеси, состоящие из дрожжей и лактобактерий, для укрепления иммунной системы и устойчивости к болезням (Huang Kehe Qin, патент CN 1283171C от 08.11.2006).
При этом во всех этих препаратах обогащенные селеном микроорганизмы были приготовлены только на базе неорганического селена. Так, наиболее часто используемый источник селена представляет собой селенит или селенат натрия, растворенный в культуральных средах для микроорганизмов. Зачастую обогащенные таким образом микроорганизмы, несмотря на то, что они синтезировали достаточное количество органического селена, усвояемого организмом человека, содержат повышенное количество остаточного неорганического селена, который не претерпел превращения, что может оказаться опасным для потребителя. Более того, бактерии, такие как бактерии рода Lactobacillus, преобразуют этот неорганический селен главным образом в селеноцистеин, а не в селенометионин.
В предыдущей заявке, опубликованной под номером WO 2006/008190, заявитель описал новые органические соединения типа гидроксикислоты селена, которые могут являться предшественниками синтеза L(+)-селенометионина у человека и у животных.
Раскрытие изобретения
Неожиданно заявитель констатировал, что органические соединения типа гидроксикислоты селена, описанные в заявке WO 2006/008190, при включении в состав культуральной среды могут использоваться различными микроорганизмами, такими как бактерии и дрожжи, с целью их обогащения органическим селеном. Полученные результаты показали, что эти соединения позволяют очень эффективно обогащать нефотосинтезирующие микроорганизмы органическим селеном и, более конкретно, селенометионином с такой же или даже большей эффективностью по сравнению с эффективностью, достигнутой с помощью обычно применяемых неорганических соединений, таких как селенит натрия.
Таким образом, стало очевидным, что обогащение микроорганизмов селенометионином на базе органических соединений типа гидроксикислоты селена позволяет получить микроорганизмы, содержащие в основном источник селена, характеризующийся максимальной биодоступностью для человека и для животных и практически свободный от неорганического селена. Следовательно, изобретение позволяет решить проблемы токсичности, связанные со способами из предшествующего уровня техники, ограничив содержание неорганического азота, и получить в распоряжение новые микроорганизмы, обогащенные селенометионином.
Обогащенные таким способом нефотосинтезирующие микроорганизмы можно напрямую применять в питании в рамках профилактики или лечения состояний дефицита селена, более конкретно, для производства фармацевтических, пищевых или косметических продуктов и композиций.
Краткое описание фигур
На фигурах 1-6 ниже представлены графики, показывающие динамику роста микроорганизмов во времени в среде YPG (Saccharomyces cerevisiae) или MRS (Lactobacillus casei) при добавлении различных неорганических (селенит натрия) и органических (селенометионин или 2-гидрокси-4-метилселенобутановая кислота (THD-177)) соединений селена. Ось абсцисс соответствует числу часов культуры, ось ординат - плотности клеток (коэффициент поглощения измеряли при 550 нм).
Фигура 1: Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивировали в среде YPG с добавлением селенита натрия (неорганическое соединение)
Фигура 2: Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивировали в среде YPG с добавлением селенометионина (органическое соединение)
Фигура 3: Дрожжи Saccharomyces cerevisiae культивировали в среде YPG с добавлением 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты (органическое соединение по изобретению)
Фигура 4: Бактерии Lactobacillus casei культивировали в среде MRS с добавлением селенита натрия (неорганическое соединение)
Фигура 5: Бактерии Lactobacillus casei культивировали в среде MRS с добавлением селенометионина (органическое соединение)
Фигура 6: Бактерии Lactobacillus casei культивировали в среде MRS с добавлением 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты (органическое соединение по изобретению)
Осуществление изобретения
Настоящая заявка касается получения нефотосинтезирующих микроорганизмов, то есть микроорганизмов, рост которых не зависит напрямую от источника света.
Результаты экспериментов, полученные в рамках настоящего изобретения, в частности, касаются нефотосинтезирующих бактерий и дрожжей, метаболизм которых сильно отличается от метаболизма фотосинтезирующих микроорганизмов.
Под микроорганизмом понимают любой живой одноклеточный организм, относящийся к одному из следующих царств: монеры, протисты, грибы или простейшие, имеющий клеточную структуру эукариот или прокариот, микроскопический или ультрамикроскопический размер, обладающий метаболическим и репродуктивным потенциалом. Упомянутые одноклеточные организмы могут участвовать в формировании нитей или биопленок.
Под органическим селеном понимают совокупность органических молекул, включающую по меньшей мере одно соединение, содержащее по меньшей мере один атом селена в своей химической структуре, которое может быть произведено живым организмом, таких как, например, аминокислоты селенометионин, метилселеноцистеин, селеноцистин и селеноцистеин, содержащие их пептиды или белки.
Предпочтительно нефотосинтезирующими микроорганизмами по изобретению являются дрожжи или бактерии, более предпочтительно дрожжи рода Saccharomyces или бактерии рода Lactobacillus.
Микроорганизмы, обогащенные таким способом органическим селеном, можно применять как таковые или в качестве пищевой добавки. Их можно, например, обезвоживать для получения стабильного порошка, который можно включать в состав композиций, являющихся основой при приготовлении продуктов переработки, но также можно применять в живом виде в качестве пробиотиков в способах переработки продуктов питания.
Таким образом, целью настоящего изобретения является новый способ обогащения нефотосинтезирующих микроорганизмов органическим селеном, характеризующийся тем, что упомянутые нефотосинтезирующие микроорганизмы культивируют в культуральной среде, содержащей соединение типа гидроксикислоты селена.
Предпочтительно, соединение типа гидроксикислоты селена является соединением общей формулы (I), ее солью или эфирным или амидным производным,
формула, в которой:
n=0, 1 или 2;
1
3
3
2
3
4
5
6
R=ОН, OCOR, OPOH, OPORR или OR;
2
3
7
R=OH, R, NHR, S-цистеинил или S-глутатионил;
2
1
при условии, что если N=1 и R=OH, то R не может быть OH;
3
R=алкоксил, церамид 1, церамид 2, церамид 3, церамид 4, церамид 5, церамид 6a и 6b, S-цистеинил, S-глутатионил или группа, выбранная из числа следующих групп:
, ,
, , ,
, ,
, ,
,
или ,
4
1
26
OR=алкоксил (C-C), церамид 1, церамид 2, церамид 3, церамид 4, церамид 5, церамид 6а и 6b, или группа, выбранная из числа следующих групп:
, ,
, , ,
, ,
, ,
,
или ,
5
1
26
OR=алкоксил (C-C), церамид 1, церамид 2, церамид 3, церамид 4, церамид 5, церамид 6а и 6b или группа, выбранная из числа следующих групп:
, ,
, , ,
, ,
, ,
,
или
6
OR=пируват, лактат, цитрат, фумарат, малеат, миристат, пальмитат, стеарат, пальмитолеат, олеат, линолеат, остаток природной жирной кислоты или 13-цис ретиноат;
7
2
1
26
NHR=NH, NH-алкил (C-C), остаток природной аминокислоты или остаток природного амина.
В формуле (I) выше:
- под алкилом понимают группу, включающую от 1 до 26, предпочтительно от 1 до 10 и более предпочтительно от 1 до 6 атомов углерода, линейную или циклическую, в ряде случаев разветвленную, в ряде случаев фторированную или полифторированную, и содержащую в ряде случаев одну или несколько двойных связей углерод-углерод, такую как, например, метиловую, этиловую, изопропиловую, трифторметиловую, жирные цепи жирных кислот (то есть без кислотной функции), такие как жирная цепь линолеила, жирная цепь линоленила, жирная цепь пальмитоила;
- под алкоксилом понимают группу, производную первичного, вторичного или третичного спирта и связанную с остальной частью молекулы через атом кислорода спиртовой функции, включающую от 1 до 26, предпочтительно от 1 до 10 и более предпочтительно от 1 до 6 атомов углерода, линейную или циклическую, в ряде случаев разветвленную, в ряде случаев фторированную или полифторированную, и содержащую в ряде случаев одну или несколько двойных связей углерод-углерод, такую как, например, метоксиловую, этоксиловую, изопропоксиловую, трифторметоксиловую;
- структуры радикалов типа церамида описаны более конкретно в «Cosmetic Lipids and the Skin Barrier» («Косметические липиды и кожный барьер»), Thomas Forster Ed. 2002, Marcel Dekker, Inc., с 2, фигура 2;
- под природным понимают любое соответствующее соединение, обнаруживаемое в метаболизме организмов растительного и животного мира, а также в метаболизме человека (Steglich W., Rompp Encyclopedia Natural Products, G. Thieme ed.);
- под жирной кислотой понимают алифатическую карбоновую кислоту, включающую от 4 до 28 атомов углерода (включая атом углерода карбоксильной функции), причем углеводородная цепь является линейной, насыщенной или ненасыщенной;
- под остатком жирной кислоты понимают, что жирная кислота связана с остальной частью молекулы через свою карбоксильную функциональную группу (COOH);
- под жирным спиртом понимают жирную кислоту в соответствии с определением выше, в которой карбоксильная функциональная группа (COOH) заменена спиртовой функциональной группой (OH);
- под природной аминокислотой понимают более конкретно следующие аминокислоты: аланин (Ala), аргинин (Arg), аспарагин (Asn), аспарагиновую кислоту (Asp), цистеин (Cys), глутамин (Gin), глутаминовую кислоту (Glu), глицин (Gly), гистидин (His), изолейцин (lle), лейцин (Leu), лизин (Lys), метионин (Met), фенилаланин (Phe), пролин (Pro), серин (Ser), треонин (Thr), триптофан (Trp), тирозин (Tyr) и валин (Val);
2
- под природным амином понимают первичный природный амин, имеющий функциональную группу NH, такой как путресцин, кадаверин, спермин, спермидин;
2
- под остатком аминокислоты или амина понимают, что аминокислота или амин связаны с остальной частью молекулы через свою первичную аминную функциональную группу (NH);
- под олигомером понимают любое соединение, состоящее из цепочки из 2-15 мономеров, связанных между собой связью типа эфирной;
- под полимером понимают любое соединение, состоящее из цепочки более чем из 15 мономеров, связанных между собой связью типа эфирной.
По изобретению упомянутые соединения формулы (I) предпочтительно используют в форме солей кальция, магния или цинка, что обеспечивает лучшую растворимость в культуральных средах, а также лучшее усвоение микроорганизмами.
Изобретение также включает стереоизомеры соединений формулы (I), а также смеси стереоизомеров в любых соотношениях и, более конкретно, рацемические смеси.
Под «стереоизомерами» понимают в смысле настоящего изобретения диастереоизомеры и энантиомеры. Таким образом, речь идет об оптических изомерах. Стереоизомеры, которые не являются зеркальными изображениями друг друга, называют «диастереоизомерами», а стереоизомеры, которые являются зеркальными, но не накладываемыми изображениями, называют «энантиомерами».
Смесь, содержащую равные количества двух отдельных энантиомерных форм противоположной хиральности, называют «рацемической смесью».
Предпочтительно, n является 0 в общей формуле (I).
1
3
6
3
1
R может быть представлен группой OH, OCOR или OR, причем предпочтительно R представлен алкоксильной группой. Более конкретно, R может быть представлен группой OH.
2
3
1
26
R представлен, в частности, группой OH или R, и, более конкретно, группой OH или алкоксилом (C-C).
Более конкретно, соединения гидроксикислоты селена, используемые в рамках настоящего изобретения, могут соответствовать следующей формуле (Ia):
или ее соли, стереоизомеру или смеси стереоизомеров в любых соотношениях, эфиру или амиду, причем n является таким, как определено выше, предпочтительно является 0.
Под «эфиром» понимают, что эфирная функциональная группа (-C(O)O-) образована на базе группы ОН спирта или карбоксильной группы, которую несут соединения типа гидроксикислоты селена по настоящему изобретению. Таким образом, эти эфиры получают:
- реакцией спиртовой группы с карбоновой кислотой, например, формулы R-COOH, где R = алкил в соответствии с определением выше; природной жирной кислотой; природной аминокислотой; глутатионом; пировиноградной, молочной, лимонной, фумаровой, яблочной или 13-цис-ретиноевой кислотой; более конкретно, с кислотой RCOOH, в которой R представляет собой линейную или разветвленную насыщенную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода,
- реакцией карбоксильной группы со спиртом, таким как первичный, вторичный или третичный спирт формулы R'H, где R' = алкоксил в соответствии с определением выше; жирным спиртом; или церамидом; более конкретно со спиртом R'H, в котором R представляет собой линейную или разветвленную насыщенную углеводородную цепь, содержащую от 1 до 6 атомов углерода.
Под «амидом» понимают, что амидная функциональная группа (-C(O)NH-) образована на базе группы OH спирта или карбоксильной группы, которую несут соединения типа гидроксикислоты селена по настоящему изобретению. Таким образом, эти амиды получают:
- реакцией спиртовой группы с амидом, производным такой карбоновой кислоты, какая описана в определении термина «эфир»,
- реакцией карбоксильной группы с амином, производным такого спирта, какой описан в определении термина «эфир», или соответствующим природной аминокислоте или природному амину.
Более конкретно изобретение имеет целью применение соединения формулы (I), выбранного из числа:
- L-2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты,
- D-2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты,
- D,L-2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты
или соли этих соединений.
Эти соединения описаны в заявке WO 2006/008190.
-6
-6
-6
Целью изобретения также являются микроорганизмы, более конкретно нефотосинтезирующие бактерии, обогащенные органическим селеном, которые можно получить способом по изобретению. Содержание органического селена в таких микроорганизмах обычно составляет выше 1000·10, предпочтительно выше 1200·10, более предпочтительно выше 1400·10 в селеновом эквиваленте, и содержание неорганического селена составляет ниже 0,5%, предпочтительно ниже 0,2% и более предпочтительно ниже 0,1% сухого веса упомянутых микроорганизмов.
Целью изобретения также являются более конкретно дрожжи рода Saccharomyces, обогащенные селеном, характеризующиеся тем, что содержание в них селенометионина составляет выше 130 микрограммов в селеновом эквиваленте на грамм (мкгSe/г), предпочтительно выше 150 мкгSe/г и более предпочтительно выше 170 мкгSe/г сухого веса упомянутых дрожжей.
Общее содержание селена и содержание селенометионина в микроорганизмах можно определить, соответственно, минерализацией и ферментативным перевариванием после центрифугирования и лиофилизации микроорганизмов, например, способом, предложенным Лобински и коллегами (Lobinsky et al.), описанным в Mester, Z. et al. (2006) Annal. Bioanal. Chem. 385: 168-180. Содержание селенометионина соответствует содержанию селенометионина в качестве свободной аминокислоты и селенометионина, связанного с другими аминокислотами, то есть присутствующего в протеинах и пептидах.
Дрожжи по изобретению могут оказаться полезными, например, при изготовлении обогащенных селеном хлебобулочных изделий, а также при получении молока животного происхождения, обогащенного органическим селеном, или яиц, обогащенных органическим селеном.
Более конкретно, целью изобретения являются нефотосинтезирующие пробиотические бактерии, в частности молочнокислые бактерии, более конкретно бактерии рода Lactobacillus, характеризующиеся тем, что содержание в них селенометионина составляет выше 50 мкгSe/г, предпочтительно выше 100 мкгSe/г и наиболее предпочтительно выше 500 мкгSe/г сухого веса упомянутых нефотосинтезирующих пробиотических бактерий.
Более конкретно, селенометионин будет составлять более 50%, предпочтительно более 60% общего содержания селена в бактериях.
Такие бактерии могут оказаться полезными, например, при изготовлении кисломолочных продуктов, таких как сыры или йогурты, обогащенных органическим селеном.
Под «пробиотиками» понимают микроорганизмы, которые может поглощать животное или человек, в живой или неживой форме, которые оказывают благоприятное воздействие на животное или на человека в аспекте питания, фармацевтики или косметики. Применительно к бактериям речь может идти о молочнокислых бактериях, более конкретно о бактериях из рода Lactobacillus. Бактерии Cupriavidus metallidurans и Ralstonia metallidurans, применяемые для детоксикации почв, не соответствуют этому определению.
Так, нефотосинтезирующие пробиотические бактерии по настоящему изобретению могут быть полезными в качестве пробиотиков, более конкретно, в косметическом, фармацевтическом или пищевом продукте.
Нефотосинтезирующие микроорганизмы по изобретению могут также быть полезными при питании человека и при кормлении животных, в частности, с целью получения вторичных производных, обогащенных органическим селеном, например молока или яиц.
Цель изобретения также заключается в изготовлении пробиотических продуктов для применения в питании, косметике и фармацевтике непосредственно из микроорганизмов, обогащенных органическим селеном способом по настоящему изобретению. Это изготовление относится к методикам, известным специалистам в этой области.
По конкретному способу реализации изобретения микроорганизмы, предварительно обогащенные органическим селеном способом по настоящему изобретению, вводят живыми или неживыми в качестве добавки в данную пробиотическую композицию. В этом случае микроорганизмы не обязательно участвуют в биологической трансформации ингредиентов, присутствующих в композиции.
По другому способу реализации изобретения живые микроорганизмы не обогащают селеном предварительно, а обогащают постепенно в ходе способа изготовления композиции на базе одного или нескольких компонентов формулы (I) в соответствии с определением выше способом по изобретению. Так, упомянутые компоненты формулы (I) вводят в упомянутую композицию с другими ингредиентами и нефотосинтезирующими микроорганизмами. В этом случае нефотосинтезирующие микроорганизмы могут проводить биоконверсию соединений органического селена в рамках самой композиции для получения, например, теста для выпечки хлеба, дрожжи в котором обогащены органическим селеном, или кисломолочный продукт, в котором молочнокислые бактерии обогащены органическим селеном.
Более конкретно, в этих композициях будут применять пробиотические бактерии в соответствии с определением выше, например молочнокислые бактерии, в частности бактерии рода Lactobacillus.
Полученные таким образом органический селен и производные продукты полезны в различных областях применения, в том числе в тех, которые были упомянуты во вводной части, более конкретно в качестве косметического, фармацевтического средства или питательного вещества.
Цель изобретения также заключается в пробиотических композициях (косметического, фармацевтического или пищевого назначения), включающих один или несколько микроорганизмов, обогащенных органическим селеном по изобретению, и, более конкретно, пробиотические бактерии в соответствии с определением выше, например молочнокислые бактерии, в частности бактерии рода Lactobacillus.
Под композицией или пробиотическим продуктом понимают композицию или продукт, содержащий микроорганизмы, живые или неживые, применяемый в качестве пробиотика в соответствии с определением выше.
Цель изобретения также заключается в обеспечении культуральной среды для нефотосинтезирующих микроорганизмов, характеризующейся тем, что она содержит одно или несколько соединений формулы (I), определение которых дано выше. Такая культуральная среда полезна для реализации способа обогащения микроорганизмов органическим селеном по изобретению. Более конкретно, цель изобретения заключается в предоставлении культуральной среды, содержащей по меньшей мере одно соединение формулы (I) в соответствии с определением выше, предпочтительно 2-гидрокси-4-метилселенобутановую кислоту или одну из ее солей, или один из ее эфиров или амидов или ее стереоизомеров или смесей стереоизомеров в концентрации от 0,5 до 2000 мг/л предпочтительно от 1 до 1000 мг/л, более предпочтительно от 2 до 500 мг/л, то есть соответственно примерно от 0,2 до 800 мг/л упомянутого соединения в селеновом эквиваленте, предпочтительно от 0,4 до 400 мг/л упомянутого соединения в селеновом эквиваленте, более предпочтительно от 0,8 до 200 мг/л упомянутого соединения в селеновом эквиваленте.
Способ приготовления нефотосинтезирующих микроорганизмов по изобретению может, более конкретно, включать один или несколько следующих этапов:
- приготовление культуральной среды, предпочтительно минимальной среды, содержащей химические элементы, необходимые для роста упомянутых нефотосинтезирующих микроорганизмов;
- введение в культуральную среду соединения формулы (I), предпочтительно 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты или одной из ее солей в качестве органического источника селена;
- доведение рН смеси до уровня от 3 до 8;
- культивирование инокулята прекультуры упомянутых нефотосинтезирующих микроорганизмов в составленной таким образом смеси при температуре от 25 до 80°С при круговом перемешивании со скоростью от 100 до 500 об/мин, и в атмосфере, в которой может содержаться от 0 до 20% кислорода и от 0,5 до 99% углекислого газа, предпочтительно в течение от 24 до 96 часов;
- центрифугирование смеси при скорости от 4000 до 10000 об/мин, в течение нескольких минут;
- перемещение клеточного сгустка в физиологический раствор;
- повторное центрифугирование со скоростью от 4000 до 10000 об/мин, в течение нескольких минут;
- стерилизация влажного клеточного сгустка, в котором находятся нефотосинтезирующие микроорганизмы, обогащенные селеном;
Влажный клеточный сгусток можно лиофилизировать или высушить на воздухе.
Более конкретно, культуральная среда может быть синтетической или полусинтетической, обогащенной средой или селективной средой.
После центрифугирования и лиофилизации микроорганизмов общее содержание селена и содержание селенометионина можно определить, например, соответственно, после минерализации и ферментативного переваривания способом, предложенном Лобински и коллегами (Lobinsky et al.), описанном в Mester, Z. et al. (2006) Annal. Bioanal. Chem. 385: 168-180.
Другие особенности и преимущества изобретения приведены в следующих примерах. Приведенные ниже примеры представлены исключительно для иллюстрации и не должны ни в коем случае ограничивать объем изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Производство дрожжей Saccharomyces cerevisiae в среде YPG, содержащей 2-гидрокси-4-метилселенобутановую кислоту, и в среде YPG, содержащей селенит натрия:
- Выделение штамма Saccharomyces cerevisiae 3053-E000
Штамм был выделен из кубика хлебопекарных дрожжей 42 г марки FALA BACKHEFE из партии под номером DLC 22/07/2007. Эти дрожжи до применения хранили в холодильнике при +4°С, затем их помещали в жидкую среду YPG (Yeast Peptone Glucose). Штамм Saccharomyces cerevisiae: 3053-E000 был получен разделением на среде YPG отдельных колоний и сбором при -80°С с добавлением 10% глицерина - объем/объем в качестве криопротектора.
Композиция среды YPG:
Экстракт дрожжей
10 г
Пептон
20 г
Глюкоза
20 г
рН
7,0
Осмотическая вода, до
1 л
В описанных экспериментах измерение особенностей роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae 3053-E000 выполняли в присутствии различных концентраций селена в форме селенита натрия, селенометионина или 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты и сравнивали с особенностями роста в отсутствии добавок (контроль).
Прекультура штамма Saccharomyces cerevisiae 3053-E000 была реализована в жидкой среде YPG при 37°С при круговом перемешивании (250 об/мин) в течение 24 часов.
- Условия культивирования штамма Saccharomyces cerevisiae 3053-E000
6
Культура реализована на базе инокулята (1·10 КОЕ/мл) описанной выше прекультуры в 100 мл среды YPG при рН=4, при температуре 37°С при перемешивании (250 об/мин) в следующих условиях:
Культуры Saccharomyces cerevisiae 3053-E000 обследовали измерением поглощения при 550 нм и подсчетом КОЕ в чашках с агар-агаром YPG.
- Добавление селена в форме селенита натрия
Концентрации, исследованные при добавлении селенита селена, составляют 0,5 мг/л, 10 мг/л и 20 мг/л в селеновом эквиваленте, то есть соответственно: 1,1 мг/л, 22,22 мг/л и 44,44 мг/л селенита натрия.
График на фигуре 1 позволяет визуализировать рост штамма Saccharomyces cerevisiae 3053-E000 в присутствии различных концентраций селенита натрия. Как можно наблюдать, селенит натрия начинает проявлять токсическое действие с 10 мг/л (в селеновом эквиваленте), отрицательно влияя на скорость роста и продуктивность по биомассе (- 50% за 48 ч). При концентрации 20 мг/л (в селеновом эквиваленте) селенит натрия проявляет выраженное токсическое действие на Saccharomyces cerevisiae.
- Добавление селена в форме селенометионина
Концентрации, исследованные при добавлении селенометионина, составляют 0,5 мг/л, 2 мг/л, 10 мг/л и 20 мг/л в селеновом эквиваленте, то есть соответственно 1,25 мг/л, 5 мг/л, 25 мг/л и 50 мг/л селенометионина.
График на фигуре 2 позволяет визуализировать рост штамма Saccharomyces cerevisiae 3053-E000 в присутствии различных концентраций селенометионина. Как можно наблюдать, селенометионин начинает проявлять действие с 2 мг/л (в селеновом эквиваленте), отрицательно влияя на продуктивность по биомассе (- 29% за 48 ч). Повышение дозы до 10 мг/л (в селеновом эквиваленте) оказывает более выраженное ингибирующее действие на скорость роста и продуктивность по биомассе (- 50%), при этом не оказывая негативного влияния на жизнеспособность (- 30%). При концентрации 20 мг/л селенометионина (в селеновом эквиваленте) эффект аналогичен эффекту, полученному при 10 мг/л применительно к скорости и окончательной продуктивности по биомассе, при этом токсическое действие на жизнеспособность проявлялось сильнее (-50%).
- Добавление селена в форме 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты
Концентрации, исследованные при добавлении 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты, составляют 0,5 мг/л, 2 мг/л, 10 мг/л и 20 мг/л в селеновом эквиваленте, то есть соответственно 1,25 мг/л, 5 мг/л, 25 мг/л и 50 мг/л 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты (THD-177, Tetrahedron, Франция, CAS: 873 660-49-2).
График на фигуре 3 позволяет визуализировать рост штамма Saccharomyces cerevisiae 3053-E000 в присутствии различных концентраций 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты. Как можно наблюдать, 2-гидрокси-4-метилселенобутановая кислота начинает проявлять действие с 10 мг/л (в селеновом эквиваленте), отрицательно влияя на окончательную продуктивность по биомассе (-15%) и снижая жизнеспособность на 36%. При концентрации 20 мг/л 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты (в селеновом эквиваленте) продуктивность по биомассе снижается на 36% и жизнеспособность снижается на 50%.
- Обогащение Saccharomyces cerevisiae селеном
В свете результатов, полученных ранее применительно к производству биомассы штамма Saccharomyces cerevisiae 3053-E000, был проведен опыт по выбору между уровнем включения 20 мг/л 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты (в селеновом эквиваленте) и уровнем включения 10 мг/л селенита натрия (в селеновом эквиваленте) в описанных ниже культурах:
Прекультуры: на базе насыщенной культуры в YPG было реализовано два этапа прекультуры.
Прекультура 1: 10 мл культуры (засев 10% по объему на базе насыщенной культуры, инкубация в течение 24 ч при 37°С)
Прекультура 2: 100 мл культуры (засев 10% по объему на базе прекультуры 1, инкубация в течение 24 ч при 37°С)
Культура: на базе прекультуры 2,1 л среды YPG засевали из расчета 10% по объему. Культуру инкубировали при фиксированной и отрегулированной температуре 37°С. рН откорректировали до 4, и культуру перемешивали круговыми движениями (150 об/мин).
Приготовление образцов для анализов:
После 48 часов культуры среду центрифугировали при 6500 об/мин, в течение 5 мин, клеточный сгусток переносили в физиологический раствор, затем снова центрифугировали при 6500 об/мин, в течение 5 минут.
Влажный клеточный сгусток лиофилизировали для анализа селеновых компонентов (общий селен, селенометионин и селенит натрия).
- Анализ селеновых компонентов дрожжей Saccharomyces cerevisiae, произведенных в среде, содержащей 2-гидрокси-4-метилселенобутановую кислоту или селенит натрия
Общее количество селена определяли методом индуктивно связанной плазмы в сочетании с масс-детектированием после минерализации образца. Определение вида селена выполнялось способом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-детектированием после ферментативного переваривания образца (Mester, Z. et al. (2006) Annal. Bioanal. Chem. 385: 168-180).
- Результаты
Концентрации общего селена, селенометионина и селенита натрия приведены в следующей таблице:
Таблица 1
Анализ селеновых компонентов дрожжей Saccharomyces cerevisiae 3053- Е000, произведенных в среде YPG с добавками
Общий селен<sup>a</sup>
Общий селенометионин<sup>a</sup>
Селенометионин/общий селен
Селенит<sup>a</sup>
Контроль
0,17±0,02
0,053±0,006
-
<0,02
+ селенит (10 MrSe/л)
849±12
122±1
14%
14±1
+ THD 177 (20 мгSe/л)
601±15
185±21
31%
3,3±0,1
<sup>a</sup>: мкг (эквивалент Se)/r
Полученные результаты, представленные в таблице 1, показывают, что включение в культуральную среду 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты позволяет увеличить примерно в 3500 раз общее содержание селена в Saccharomyces cerevisiae, при этом селенометионин составляет 31% этого общего селена. Селенит натрия позволяет обеспечить большую степень увеличения содержания селена, порядка 5000 раз, но при этом содержание селенометионина будет составлять только 14% общего содержания селена.
Кроме того, остаточное содержание селенита в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, связанное с применением 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты как источника селена, более чем в 4 раза ниже такового, соответствующего применению селенита натрия в качестве источника селена.
Так, 2-гидрокси-4-метилселенобутановая кислота является лучшим источником селена, чем селенит натрия, для обогащения селенометионином эукариотного микроорганизма, такого как Saccharomyces cerevisiae, снижая на 400% риск токсичности, связанной с остаточным содержанием селенита в микроорганизмах.
Пример 2: Производство бактерий Lactobacillus paracasei в среде MRS, содержащей 2-гидрокси-4-метилселенобутановую кислоту, ив среде MRS, содержащей селенит натрия
- Выделение штамма Lactobacillus paracasei 3052-Е000
Штамм был выделен из пробирки с ACTIMEL, выпускаемым в продажу компанией Данон.
Эту пробирку перед применением хранили в холодильнике при +4°С, затем ее содержимое растворяли в 50 мл жидкой среды MRS.
Штамм Lactobacillus paracasei 3052-E000 был получен разделением отдельных колоний на среде MRS. Он был охарактеризован на Galerie API 50 CHL и собран при -80°С с добавлением 10% глицерина - объем/объем в качестве криопротектора.
Композиция и приготовление 1 л среды MRS:
Полипептон
10 г
Экстракт дрожжей
5 г
Мясной экстракт
10 г
Глюкоза
20 г
Дикалий фосфат
2 г
Ацетат натрия
5 г
Цитрат аммония
2 г
Сульфат магния
0,20 г
Сульфат марганца
0,05 г
Tween 80
1 мл
рН
6,4
В этом эксперименте показатели роста бактерий Lactobacillus paracasei измеряли в присутствии различных концентраций селена в форме селенита натрия, селенометионина, 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты и сравнивали с параметрами роста в отсутствии добавок.
- Прекультура штамма Lactobacillus paracasei 3052-Е000
Прекультура штамма Lactobacillus paracasei 3052-E000 была реализована в жидкой среде MRS при 42°С без перемешивания в течение 24 ч.
7
Культура штамма Lactobacillus paracasei 3052-E000 была реализована на базе инокулята (1·10 КОЕ/мл) упомянутой выше прекультуры в 100 мл среды MRS при рН=6,4 и при температуре 42°С (без перемешивания).
Культуры обследовали измерением поглощения при 550 нм и подсчетом КОЕ в чашках с MRS.
- Добавление селена в форме селенита натрия
Концентрации, исследованные при добавлении селенита селена, составляют 0,5 мг/л, 2 мг/л, 10 мг/л и 20 мг/л в селеновом эквиваленте, то есть соответственно: 1,11 мг/л, 4,44 мг/л, 22,22 мг/л и 44,44 мг/л селенита натрия. График на фигуре 4 позволяет визуализировать рост штамма Lactobacillus paracasei 3052-E000 в присутствии селенита натрия.
Как можно наблюдать, селенит натрия начинает проявлять ингибирующее действие на рост Lactobacillus paracasei с добавления 0,5 мг/л селенита натрия (в селеновом эквиваленте), а также отмечается снижение продуктивности по биомассе на 25% за 48 ч. Это действие усиливается при добавлении 2 мг/л селенита натрия (в селеновом эквиваленте), при этом снижение продуктивности достигает 90% за 48 ч для концентраций 10 и 20 мг/л селенита селена (в селеновом эквиваленте). При этом уровне селенит натрия проявляет токсическое действие на Lactobacillus paracasei.
- Добавление селена в форме селенометионина
Концентрации, исследованные при добавлении селенометионина, составляют 0,5 мг/л, 2 мг/л, 10 мг/л и 20 мг/л в селеновом эквиваленте, то есть соответственно 1,25 мг/л, 5 мг/л, 25 мг/л и 50 мг/л селенометионина.
График на фигуре 5 позволяет визуализировать рост штамма Lactobacillus paracasei 3052-Е000 в присутствии различных концентраций селенометионина. Как можно наблюдать, селенометионин начинает проявлять действие с 2 мг/л (в селеновом эквиваленте), отрицательно влияя на продуктивность по биомассе (- 29% за 48 ч).
Добавление селена в форме селенометионина не оказывает на Lactobacillus paracasei ни ингибирующего действия на рост, ни заметного действия, снижающего продуктивность по биомассе, до концентрации 20 мг/л (в селеновом эквиваленте).
- Добавление селена в форме 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты
Концентрации, исследованные при добавлении 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты составляют 0,5 мг/л, 2 мг/л, 10 мг/л и 20 мг/л в селеновом эквиваленте, то есть соответственно 1,25 мг/л, 5 мг/л, 25 мг/л и 50 мг/л 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты (THD-177, Tetrahedron, Франция, CAS: 873660-49-2).
График на фигуре 6 позволяет визуализировать рост штамма Lactobacillus paracasei 3052-Е000 в присутствии различных концентраций 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты. Аналогично добавлению селенометионина добавление селена в форме 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты не оказывает ни ингибирующего действия на рост, ни заметного действия, снижающего продуктивность по биомассе, до концентрации 20 мг/л 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты (в селеновом эквиваленте).
Для дополнения исследования влияния добавления 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты в более высокой концентрации было проведено тестирование концентраций 40 и 60 мг/л в тех же условиях, что и описанные выше.
Равно как и при добавлении 20 мг/л селена в форме 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты не было отмечено никакого ингибирующего действия на рост и продуктивность по биомассе штамма.
- Обогащение Lactobacillus paracasei селеном
В свете полученных ранее результатов был проведен опыт по выбору между уровнем включения 60 мг/л 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты (в селеновом эквиваленте) и уровнем включения 1 мг/л селенита селена (в селеновом эквиваленте) применительно к производству биомассы штамма Lactobacillus paracasei 3052-E000.
Приготовление образцов для анализов.
После 48 часов культуры среду центрифугировали при 6500 об/мин, в течение 5 мин, клеточный сгусток переносили в физиологический раствор, затем снова центрифугировали при 6500 об/мин, в течение 5 минут.
- Анализ селеновых компонентов бактерий Lactobacillus paracasei, произведенных в среде, содержащей 2-гидрокси-4-метилселенобутановую кислоту или селенит натрия
Общее количество селена определяли методом индуктивно связанной плазмы в сочетании с масс-детектированием после минерализации образца. Определение вида селена выполнялось способом высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-детектированием после ферментативного переваривания образца.
- Результаты
Концентрации общего селена, селенометионина и селенита натрия приведены в следующей таблице:
Таблица 2
Анализ селеновых компонентов бактерий Lactobacillus paracasei 3052-Е000, произведенных в среде MRS с добавками
Общий селен<sup>a</sup>
Общий селенометионин<sup>a</sup>
Селенометионин/общий селен
Селенит<sup>a</sup>
Контроль
0,18±0,02
0,108±0,006
-
<0,02
+ селенит (1 мгSe/л)
120±2
17±2
14%
<0,5
+ ТНD 177 (60 мгSe/л)
1019±19
671±117
66%
<0,5
<sup>a</sup>: мкг (эквивалент Se)/r
Полученные результаты, представленные в таблице 2, показывают, что включение в культуральную среду 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты позволяет увеличить примерно в 5700 раз общее содержание селена в Lactobacillus paracasei, при этом селенометионин составляет 66% этого общего селена. Коэффициент увеличения общего содержания селения в результате включения селенита натрия в культуральную среду является значительно более низким и составляет только 700, и при этом содержание селенометионина составляет только 14% общего содержания селена.
Так, 2-гидрокси-4-метилселенобутановая кислота является лучшим источником селена, чем селенит натрия, для обогащения селенометионином эукариотного микроорганизма, такого как Lactobacillus paracasei.
Пример 3: Производство бактерий Lactobacillus plantarum 3120-E000 в среде MRS. содержащей 2-гидрокси-4-метилселенобутановую кислоту, после 47 часов культуры
В этом примере условия культуры идентичны условиям в примере 2. Результаты, соответствующие этим работам, представлены в следующей таблице:
Таблица 3
Анализ селеновых компонентов бактерий Lactobacillus plantarum 3120-Е000, произведенных в среде MRS с добавками
Общий ceлeн<sup>a</sup>
Общий селенометионин<sup>a</sup>
Селенит<sup>a</sup>
Контроль
0,289±0,014
0,26±0,03
0,2
+ THD 177 (10 мгSe/n)
582±14
512±35
0,27±,03
+ THD 177 (60 мгSe/n)
2015±78
1813±152
1,4±0,4
<sup>a</sup>: мкг (эквивалент Se)/r
Полученные результаты, представленные в таблице 3, показывают, что включение в культуральную среду 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты в концентрации 10 мг/л или 60 мг/л в течение 47 ч позволяет увеличить общее содержание селена примерно в 2000 или в 7000 раз соответственно. Кроме того, эти результаты показывают, что содержание селенометионина составляет более 88% общего содержания селена.
Пример 4: Производство бактерий Escherichia coli WT 3121-Е000 в минимальной среде (М63 + глюкоза + метионин). содержащей 2-гидрокси-4-метилселенобутановую кислоту, после 48 часов культуры
Происхождение штамма Escherichia coli WT 3121-Е000 - следующее: Escherichia coli К12 (штамм 58), регистрационный номер Центра генетического кода Coli (CGSC) - 5587
Композиция и приготовление 1 л культуральной среды:
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
13,6 г
KOH
4,2 г
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
2,0 г
FeSO<sub>4</sub>, 7H<sub>2</sub>O
1,08 мг
Тиамин
1 мг
MgSO<sub>4</sub>, 7H<sub>2</sub>O
246 мг
Глюкоза
4,0 г
Метионин
50,0 мг
рН
7,0
Осмотическая вода, до
1 л
Результаты, соответствующие этим работам, описаны в следующей таблице:
Таблица 4
Анализ селеновых компонентов бактерий Escherichia coli WT 3121-E000, произведенных в минимальной среде (М63 + глюкоза + метионин) с добавками
Общий селен<sup>a</sup>
Общий селенометионин<sup>a</sup>
Селенит<sup>a</sup>
Контроль
0,164±0,140
0,140±0,018
0,1
+ ТНD 177 (60 мгSe/л)
6310±78
6223±432
2,1±0,4
<sup>a</sup>: мкг (эквивалент Se)/r
Полученные результаты, представленные в таблице 4, показывают, что включение в культуральную среду 2-гидрокси-4-метилселенобутановой кислоты в концентрации 60 мг/л в течение 48 ч позволяет увеличить общее содержание селена более чем в 38000 раз. Кроме того, эти результаты показывают, что содержание селенометионина составляет более 98% общего содержания селена.