СИНТЕТИЧЕСКИЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА БЛЮТАНГА НУКЛЕОТИПА С (6, 14 И 21 СЕРОТИПЫ) МЕТОДОМ ОТ-ПЦР
SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS FOR IDENTIFICATION OF BLUETONGUE VIRUS OF NUCLEOTYPE C (SEROTYPES 6, 14 AND 21) BY RT-PCR METHOD

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления РНК вируса блютанга генетической группы (нуклеотипа С), объединяющей 6, 14 и 21 серотипы.
Известно, что геном вируса состоит из 10 сегментов дцРНК, упакованных в икосаэдрический нуклеокапсид, состоящий из семи структурных белков [1-3]. Внешний слой капсида представлен двумя белками VP2 и VP5, которые имеют высокую степень гетерогенности аминокислотной последовательности, одинаково как между, так и внутри каждого серотипа [4]. Серотип вируса детерминирован VP2 белком, который имеет нейтрализующие эпитопы вируса [5].
VP2 белок кодирует 2 сегмент генома вируса. C помощью филогенетического анализа более 300 изолятов вируса блютанга по сегменту 2 генома установили их разделение на 26 групп или кладов, точно отражающих серотип вируса, с менее 33% нуклеотидных изменений впоследовательности относительно каждого серотипа, и от 29% до 59% замен между серотипами [4]. Однако некоторые серотипы вируса генетически наиболее близко связанны, чем другие, что позволяет сгруппировать их в 12 различных нуклеотипов, стандартно они обозначаются буквами A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L и имеют от 29% до 33% нуклеотидных различий между вирусами, принадлежащими к разным серотипам, но одному и тому же нуклеотипу по 2 сегменту. Серотипы вируса, представляющие один нуклеотип, по 2 сегменту также могут иметь близкое антигенное родство [4].
Сейчас известно о наличии 26 генетических вариантов вируса, 25 из которых в антигенном отношении представляют различные серотипы вируса.
Данные молекулярной эпидемиологии говорят о высокой генетической гетерогенности его популяции, которая позволяет разделить вирусы на типы, топотипы, квазитипы. Уже известно более 300 вариантов вируса, генетически отличающихся друг от друга.
В настоящее время широко применяются тесты, основанные на ОТ-ПЦР, в режиме реального времени для идентификации отдельных серотипов, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае дифференцировать серотип вируса [8; 9]. Однако при появлении вспышек заболевания, вызванных новым серотипом, т.е. тем, который ранее не регистрировали на территории, возникает ряд сложностей. В связи с тем, что серотипов вируса 25, необходимо проводить соответственно 25 серотипспецифических реакций.
Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей 2 сегмента генома вируса блютанга показал, что существует возможность разработать нуклеотипспецифические олигонуклеотидные праймеры для классического варианта ПЦР (с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза) с целью обнаружения одной из генетических групп вируса, что существенно ускоряет и упрощает процесс типирования каждого нового изолята вируса. Аналоги не опубликованы и не представлены на коммерческом рынке ни за рубежом, ни в нашей стране.
Целью изобретения являлась разработка пары олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга нуклеотипа С методом ОТ-ПЦР.
Изобретение - олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа C, а именно участка нуклеотидной последовательности 2 сегмента генома вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов методом ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Процедура анализа включает следующие этапы:
1. Денатурация дцРНК вируса блютанга.
2. Обратная транскрипция - синтез кДНК.
3. ПЦР.
4. Электрофоретическая детекция продуктов амплификации.
Денатурацию дцРНК осуществляют при температуре 95°C в течение 5 минут в реакционной смеси с нуклеотипспецифической парой олигонуклеотидных праймеров, фиксируют денатурированную РНК путем замораживания. Синтез кДНК осуществляют при температуре 42°C в течение 30 минут в реакционной смеси для обратной транскрипции, включающей дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (ДНТФ), буфер для обратной транскрипции и фермент ревертазу (обратную транскриптазу). 3атем реакцию терминируют при 88°C в течение 5-ти минут. кДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции. Готовят стандартную смесь для ПЦР, включающую буфер для ПЦР, ДНТФ, пару олигонуклеотидных нуклеотипспецифических праймеров, и фермент ДНК-полимеразу. Профиль реакции следующий: удержание температуры - 95°C - 3 мин; циклирование: 95°C - 15 с, 58°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторяют 45 раз. Анализ результатов ПЦР проводят методом электрофореза в агарозном геле. Готовят 2% TAE-гель с добавлением бромистого этидия 0,5 мкг/мл. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 20 мин. Результаты электрофореза учитывают с помощью трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся полос на уровне 210 п.о. относительно маркера молекулярного веса. Для сохранения результатов реакции используются гель-документирующие системы.
Выбор и анализ нуклеотипспецифических праймеров (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «BioEdit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank.
Таблица 1
Нуклеотипспецифические олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6,14 и 21 серотипы)
ПЦР-мишень
наименование праймера
нуклеотидная последовательность (н.п.), 5'-3'
локализация на н.п.2 сегмента
RSArrrr/6, (AJ585127)
RSArrrr/14, (AJ585135)
RSArrrr/21, (AJ585142)
2 сегмент
прямой
gRAYATgRTggATATWCCg
149-167
149-167
149-167
обратный
GGcTGcAcRTccAYYGARTc
339-358
339-358
339-358
Техническим результатом изобретения является возможность определения генетической группы - нуклеотипа C вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.
Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных нуклеотипспецифических олигонуклеотидных праймеров проводят ОТ-ПЦР, позволяющую выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы).
Пример конкретного выполнения
Выявление РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы) в образцах биологического материала: культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, образцы интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов.
Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации дцРНК. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препарат кДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР (результаты представлены в таблице 2).
Проведение реакции обратной транскрипции
В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации дцРНК, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата выделенных нуклеиновых кислот. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°C в течение 5 минут. Далее необходимо поместить пробирки в условия с отрицательной температурой, для этого используют штатив с хладагентом.
Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,8 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки с денатурированной РНК вносят по 10 мкл смеси для обратной транскрипции с ферментом. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°C в течение 30 минут. После окончания реакции кДНК используют для постановки ПЦР.
Проведение ПЦР
3
В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 13 мкл смеси для ПЦР, 2 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки, объемом 0,6 или 0,2 см, на поверхность смеси вносят воск в объеме 25 мкл. В подготовленные для ПНР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК. Профиль реакции:
1. Удержание температуры - 94°C - 3 мин.
2. Циклирование: 94°C - 15 с, 58°C - 15 с, 72°C - 15 с.
Цикл повторить 40 раз.
3. Хранение - 4°C.
Анализ продуктов амплификации ПЦР методом электрофореза
Приготовление геля агарозы: взвешивают 2,0 г агарозы, помещают в стеклянную посуду, заливают 100 мл рабочего 1ХТАЕ - буфера и доводят до кипения в микроволновой печи для полного растворения агарозы. Охлаждают раствор агарозы до температуры примерно 60-65°C и заливают в специальную форму с гребенкой, дают гелю затвердеть. После этого гребенку осторожно вынимают и форму с агарозным гелем переносят в камеру для горизонтального электрофореза. Заливают в камеру рабочий 1XTAE-буфер так, чтобы он покрывал гель на 5-10 мм.
Проведение электрофореза: из пробирок с исследуемыми образцами после завершения ПЦР отбирают из-под масла по 12 мкл реакционной смеси и вносят в лунки агарозного геля, в последнюю лунку вносят 5 мкл маркера молекулярной массы. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 20 мин. Направление движения образцов в геле от "-" к "+". Длину амплифицированного фрагмента определяют в соответствии с маркером молекулярной массы (100-1000 пар оснований) и положительным контролем.
Результаты электрофореза учитывают на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся полос. Для сохранения результатов реакции используются гель-документирующие системы.
Положительными считаются пробы, полосы в которых располагаются в геле на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля. Размер фрагмента, синтезируемого в ПЦР, составляет 210 пар оснований. Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют размеру фрагмента в контрольной пробе (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта). Результаты ОТ-ПЦР с использованием разработанной нуклеотипспецифической системы олигонуклеотидов представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы) методом ОТ-ПЦР с использованием разработанной пары олигонуклеотидов
№№ проб
Характеристика биоматериала
Результат ОТ-ПЦР
1
культуральный вирус блютанга 1 серотип, RSArrrr/01 (AJ585122) референтный штамм
-
2
культуральный вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм
-
3
культуральный вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм
-
4
культуральный вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04 (AJ585125) референтный штамм
-
5
культуральный вирус блютанга 5 серотип, RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм
-
6
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127)референтный штамм
+
7
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 7 серотип, RSArrr/07 (AJ585128)референтный штамм
-
8
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129)референтный штамм
-
9
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130)референтный штамм
-
10
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131) референтный штамм
-
11
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм
-
12
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12 (AJ585133) референтный штамм
-
13
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13 (AJ585134) референтный штамм
-
14
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм
+
15
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ585136)референтный штамм
-
16
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ585137)референтный штамм
-
17
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ585138)референтный штамм
-
18
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ585139)референтный штамм
-
19
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140)референтный штамм
-
20
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (AJ585141)референтный штамм
-
21
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142)референтный штамм
+
22
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (AJ585143)референтный штамм
-
23
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 23 серотип, RSAnrr/23 (AJ585144)референтный штамм
-
24
лиофилизированный культуральный вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24 (AJ585145)референтный штамм
-
25
культуральный вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02 (HM590642)
-
26
интактная культура клеток Vero
-
27
интактная культура клеток ВНК-21
-
28
кровь от интактного животного (корова)
-
29
кровь от интактного животного (овца)
-
30
культуральный вирус ЭГБО, штамм «Нью-Джерси»
-
Таким образом разработана нуклеотипспецифическая пара олигонуклеотидных праймеров, позволяющая с помощью классической ОТ-ПЦР выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы).
Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:
- специфичность и чувствительность способа выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы) с помощью ОТ-ПЦР, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 2-го сегмента генома вируса блютанга группы серотипов;
- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;
- относительная дешевизна метода, благодаря использованию ОТ-ПЦР для идентификации нуклеотипа.
Источники информации
1. Clinical aspects linked with the emergence of bluetongue in cattle in northern Europe: results of a two month longitudinal study/ C. Saegerman, A. Mauroy, H. Guyot// Rene. Rech. Ruminants. - 2007. - Vol.14. - P.215.
2. The dsRNA viruses/ P.P.C. Mertens// Virus Res. - 2004. -Vol.101. - P.3-13.
3. Bluetongue virus assembly and morphogenesis/ P. Roy, R. Noad// Curr Top Microbiollmmunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.
4. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes / S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui, P.P.C. Mertens// J Gen Virol. - 2007. - Vol.88. - P. 621-630.
5. Assignment of the genome segments of Bluetongue Virus Type-1 to the proteins which they encode/ P.P.C. Mertens, F. Brown, D.V. Sangar// Virology. - 1984. - Vol.135. - P.207-217.
6. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two differ-ent genomic segments/ J. F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq// J. Virol. Methods. - 2007. - Vol.140. - P.115-123.
7. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment 1/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens// Journal of Virological Methods. - 2007. - Vol.145. - P.115-126.
8. Emergence of Bluetongue Serotypes in Europe, Part 1: Description and Validation of Four Real-Time RT-PCR Assays for the Serotyping of Bluetongue Viruses BTV-1, BTV-6, BTV-8 and BTV-11/ F. Vandenbussche, I. De Leeuw, E. Vandemeulebroucke and K. De Clercq// TransboundEmerg Dis. - 2009. - Vol.56 (9-10). - P.346-54.
9. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Specifically Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8/ B. Hoffmann, M. Eschbaumer, and M. Beer// Journal of Clinical Microbiology. - 2009. - Vol.47. - P.2992-2994.