БИОМАРКЕРЫ ТРАВМАТИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА
BIOMARKERS OF TRAUMATIC BRAIN INJURY

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композициям, наборам, системам и способам диагностики и/или мониторинга травматического повреждения головного мозга (TBI). Более конкретно, настоящее изобретение относится к диагностике и мониторингу TBI с использованием мкРНК-биомаркеров.
Уровень техники, предшествующий изобретению
Травматическое повреждение головного мозга (TBI) является основной причиной смертности и инвалидности в возрасте до 45 лет в западных странах. Ожидают, что расходы системы здравоохранения и социальные затраты будут расти и к 2020 Всемирная организация здравоохранения прогнозирует, что TBI станет третьей основной причиной инвалидности в мире.
Несмотря на многие исследования не было обнаружено надежных биомаркеров для оценки степени тяжести TBI и прогнозировать выздоровление. Это особенно справедливо для легкого TBI (mTBI), оценка которого в настоящее время вызывает затруднения в клинической практике. Несмотря на то, что первоначально у пациентов с TBI оценки проводят по шкале комы Глазго (GCS) и способами нейровизуализации, для которых требуется дорогостоящее оборудование, в существующих диагностических средствах отсутствует возможность точно определять и количественно оценивать фактическую степень тяжести повреждения головного мозга, что, таким образом, приводит к легкой детекции тяжелого TBI, но не mTBI, которое составляет большую часть случаев (75-90%).
Точная диагностика mTBI является особенно важной у таких пациентов, как спортсмены, солдаты и дети, которые подвергаются большему риску повторного mTBI и катастрофической формы повреждения головного мозга, известного как синдром повторного сотрясения (SIS), при котором синергическое действие повторного TBI приводит к глубокому поражению и даже гибели. Таким образом, ранняя диагностика и оценка тяжести TBI приобретают решающее значение для благополучия пациентов и в конечном итоге спасают их жизнь.
Частые упоминания сотрясения мозга при занятиях спортом в средствах массовой информации привели к значительному интересу поиска биомаркеров TBI. В последние годы многие исследования были сконцентрированы на биомаркерах, которые могут поддерживать принятия клинических решений на поле или в лечебном центре, связанным со спортом. Однако белковые биомаркеры, описанные в литературе, не обладают специфичностью или чувствительностью или не детектируются в течение некоторого времени после повреждения. Это может быть обусловлено тем, что последующее сотрясение мозга, которое является формой TBI, образующееся в головном мозге соединения высвобождаются лишь в очень незначительных количествах, и гематоэнцефалический барьер остается преимущественно закрытым.
МикроРНК (мкРНК) являются многочисленным классом высоко консервативных некодирующих молекул РНК длиной приблизительно 22 нуклеотида, которые индуцируют разрушение иРНК, подавление трансляции или и то и другое через спаривание с частично комплементарными участками в 3'UTR генов-мишеней. Геном человека кодирует более 2000 мкРНК, которые могут направленно воздействовать приблизительно на 60% всех генов. Однако, несмотря на распространенность мкРНК, их бимолекулярные функции и вовлеченность в патологию остаются полностью неясными. Они играют центральную роль во многих биологических процессах, включая клеточный цикл, клеточный метаболизм, апоптоз и иммунные ответы, и привлекают все больший интерес в клиническом исследовании как возможные биомаркеры для детекции, идентификации и классификации злокачественных опухолей и других состояний болезни, включая нейродегенеративные заболевания.
Настоящее изобретение было разработано с учетом этих проблем.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к способу диагностики или мониторинга травматического повреждения головного мозга (TBI) у индивидуума.
По первому аспекту изобретения предоставлен способ диагностики и/или мониторинга травматического повреждения головного мозга (TBI) у индивидуума, где способ включает детекцию присутствия и/или определение уровня по меньшей мере одной мкРНК в образце от индивидуума.
По меньшей мере одну мкРНК (также обозначаемая в настоящем описании как "miR") можно выбирать из группы, состоящей из miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-5p miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p,В miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-424-5p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p; miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p и miR-629. Эти мкРНК могут быть обозначены в настоящем описании как представляющие интерес мкРНК или целевые мкРНК.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна мкРНК выбрана из группы, состоящей из miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* и miR-671-3p. Обнаружено, что эти микроРНК являются биомаркерами, экспрессируемыми у всех пациентов с TBI (легким или тяжелым).
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна мкРНК выбрана из группы, состоящей из miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g и miR-335.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна мкРНК выбрана из группы, состоящей из let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p,В miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p и miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p.
В определенных вариантах осуществления по меньшей мере одна мкРНК выбрана из группы, состоящей из miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p и miR-629.
Во избежание неопределенности, следует понимать, что "по меньшей мере одна мкРНК выбрана из группы мкРНК", как используют в настоящем описании, означает, что рассматриваемый способ, независимо от того, проводится ли он с диагностической, прогностической или терапевтической целью, можно проводить с любой одной из перечисленных мкРНК или любой совокупностью перечисленных мкРНК (например, двумя, тремя, четырьмя или более из перечисленных мкРНК). Из этого следует, что любая одна или более из перечисленных мкРНК может явным образом быть исключена. Например, когда по меньшей мере одна мкРНК выбрана из группы, состоящей из miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g и miR-335, способ может включать детекцию и/или оценку уровня любой комбинации miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21 и miR-let-7g за исключением miR-335.
По одному из аспектов изобретения предоставлен способ диагностики и/или мониторинга травматического повреждения головного мозга (TBI) у индивидуума, где способ включает определение уровня по меньшей мере одной мкРНК в образце от индивидуума, где мкРНК выбрана из группы, состоящей из: miR-425-5p, miR-502, miR-21 и miR-335.
Травматическое повреждение головного мозга происходит, когда внешняя сила вызывает травматическое повреждение головного мозга. Существуют различные системы классификации TBI, основанные, например, на тяжести, типе повреждения и прогнозе. Наиболее широко используемой системой классификации TBI является шкала комы Глазго (GCS), по которой оценивают уровень сотрясения мозга у индивидуума по шкале 3-15 на основании вербальной, двигательной реакции и реакции открытия глаз на стимулы. В основном TBI с баллом GCS 13 или выше определяют как легкое, 9-12 как среднее и 8 или выше как тяжелое. Другая система, система классификации Мейо, включает три основные классификации, включая определенное среднее-тяжелое TBI, вероятное легкое TBI и возможное TBI. При каждой диагностике используют множественные критерии, включая потерю сознания, посттравматическую амнезию, перелом черепа и доказательство нейрорентгенологических нарушений, включая субдуральную гематому, ушиб головного мозга и геморрагический ушиб головного мозга. Специалистам в данной области известна классификация TBI с использованием систем GCS или Мейо.
Как используют в настоящем описании, ссылку на "легкое", "среднее" и "тяжелое" TBI приводят в соответствии с GCS. Ссылки в настоящем описании на "легкое к тяжелому" TBI включают как легкое, так и тяжелое TBI в соответствии с GCS.
Ожидают, что диагностика и/или мониторинг TBI с использованием биомаркеров по настоящему изобретению поможет в принятии клинического решения и схем лечения в различных ситуациях, включая следующие ситуации: в качестве первичной оценки врачами скорой помощи для определения, следует ли транспортировать пациентов в центр с нейрохирургическим отделением, главный травматологический центр или в местное травматологическое учреждение; в отделении неотложной помощи больниц для определения подходящего лечения, включая необходимость КТ-сканирования головного мозга; "у поля" для помощи в принятии решения об удалении игрока из игры и оценки необходимости отправления игрока в больницу; в лечебных центрах по спортивной медицине для подтверждения сотрясения и обеспечения возможности принятия решения о возвращении в игру; в боевых ситуациях для определения необходимости отправления спасательной команды и эвакуации жертв. Таким образом, индивидуумы, которым настоящее изобретение обеспечивает конкретный положительный эффект, включают жертв несчастных случаев, спортивных игроков и военнослужащих.
В любом случае, но, вероятно, особенно когда индивидуум подвергается повышенному риску TBI (например, когда индивидуум является профессиональным спортсменом или состоит на военной службе), образец можно получать от индивидуума за один раз до любой известной или недавней травмы (например, в начале спортивной карьеры или до начала военной службы) и можно оценивать любую представляющую интерес мкРНК в этот момент времени или позже, когда индивидуум пострадал от возможного TBI. Таким образом, такие образцы могут представлять собой внутренний стандарт сравнения.
В определенных вариантах осуществления индивидуум является человеком.
TBI может представлять собой легкое TBI (mTBI), среднее TBI или тяжелое TBI (sTBI). В определенных вариантах осуществления TBI представляет собой среднее-тяжелое TBI (m-sTBI).
Уровень мкРНК или каждой мкРНК в образце можно количественно или полуколичественно определять. Под "количественно" следует понимать, что в образце определяют абсолютное количество или концентрацию мкРНК или каждой мкРНК. Затем абсолютное количество мкРНК или каждой мкРНК в образце можно сравнивать с предопределенным пороговым значением (например, с опубликованным в литературе значением ожидаемых уровней в норме), известным уровнем той же или эталонной мкРНК в контрольном образце, получаемом от здорового индивидуума, или количеством эталонной мкРНК в образце, получаемом от индивидуума. В определенных вариантах осуществления у индивидуума диагностируют TBI, когда уровень мкРНК является ниже предопределенного порогового уровня, или является пониженным относительно эталонного или контрольного образца. В других вариантах осуществления у индивидуума диагностируют TBI, когда уровень мкРНК является повышенным по сравнению с предопределенным пороговым уровнем.
Под "полуколичественно" следует понимать, что уровень мкРНК или каждой представляющей интерес мкРНК измеряют относительно эталона.
Эталон может представлять собой инвариантную мкРНК, т.е. мкРНК с уровнем экспрессии, который сохраняется по существу без изменений при сравнении у здоровых индивидуумов и индивидуумов с TBI. У индивидуума можно диагностировать, что он перенес TBI, если уровень мкРНК или каждой представляющей интерес мкРНК является повышенным или пониженным относительно уровня инвариантной мкРНК. Подходящие инвариантные мкРНК включают miR-331, miR-223*, miR-23a-3p и miR148b-3p. MiR-23a-3p и miR148b-3p являются инвариантными только в слюне.
В определенных вариантах осуществления уровень мкРНК или каждой мкРНК в образце, получаемом от индивидуума, может являться приблизительно 0,01-100 раз, приблизительно 0,05-50 раз, приблизительно в 0,1-10 раз, приблизительно 0,5-5 раз, приблизительно в 1,0-3 раз или приблизительно в 1,5-2,0 раз ниже или выше по сравнению с уровнем в контрольном образце, эталонным уровнем или опубликованным уровнем.
Если для получения уровня применяют устройство или способ, авторы могут уточнять это значение термином "приблизительно", чтобы отражать указанное значение и любое изменение этого значения, которое является характерным для применяемого устройства или способа. Если конкретно описывают значения или диапазоны значений, "приблизительно" может означать плюс или минус 10% от указанного значения или диапазона. Например, приблизительно 10 минут может означать 9-11 минут.
Уровень мкРНК или каждой представляющей интерес мкРНК можно определять известными специалистам в данной области способами. В определенных вариантах осуществления определение уровня мкРНК или каждой представляющей интерес мкРНК включает амплификацию мкРНК. В определенных вариантах осуществления общую мкРНК можно сначала выделять из образца стандартными способами, например, с использованием набора miRNeasy mini (Qiagen). Затем можно определять количество представляющей интерес мкРНК. В определенных вариантах осуществления уровень мкРНК или каждой представляющей интерес мкРНК в образце определяют с использованием ПЦР (полимеразной цепной реакции). Например, можно использовать количественную ПЦР для количественного определения уровня мкРНК или каждой представляющей интерес мкРНК. ПЦР также можно использовать для полуколичественного определения путем сравнения уровня мкРНК или каждой представляющей интерес мкРНК в образце с уровнем эталона (например, инвариантной мкРНК).
Подходящие техники определения и/или количественного определения мкРНК, которые будут известны специалистам в данной области, включают анализы кПЦР, мкРНК, секвенирование нового поколения (NGS) и мультиплексные анализы профилирования мкРНК.
В определенных вариантах осуществления уровень мкРНК или каждой представляющей интерес мкРНК определяют с использованием гибридизации in situ, например, с использованием зонда (например, меченого зонда), специфичного к мкРНК.
Уровень мкРНК можно определять в образце, который получали от индивидуума непосредственно после повреждения (т.е. менее чем через 1 час после повреждения) и/или в образце, получаемом в один или более моментов времени через несколько часов или суток после повреждения. Таким образом, изменения уровня мкРНК можно детектировать в течение продолжительного периода времени для обеспечения возможности мониторинга мониторинг TBI. В случае изменения уровней мкРНК в течение продолжительного периода времени описываем в настоящем описании способы мониторинга TBI можно расширять, включая сохранение или изменение схемы лечения индивидуума, соответственно.
В зависимости от конкретной мкРНК и типа TBI уровень мкРНК у индивидуума может значительно изменяться в течение продолжительного периода времени. Таким образом, в определенных вариантах осуществления для обеспечения точного диагноза предпочтительным может являться измерение мкРНК непосредственно сразу после повреждения. В определенных вариантах осуществления уровень мкРНК определяют в образце, получаемом от индивидуума, не более чем 72 часов, не более чем 48 часов, не более чем 36 часов, не более чем 24 часа, не более чем 12 часов, не более чем 6 часов, не более чем 4 часов, не более чем 2 часов или не более чем 1 час после повреждения.
Уровень определенных мкРНК является по существу стабильным в течение продолжительного периода времени, что, таким образом, обеспечивает возможность постановки диагноза через несколько часов, суток или даже недель после повреждения. В определенных вариантах осуществления уровень мкРНК определяют в образце, получаемом от индивидуума, после периода времени продолжительностью до 20, 18, 15, 12, 10, 8, 5 или 2 суток после повреждения.
В определенных вариантах осуществления уровень мкРНК определяют в образце, получаемом от индивидуума, непосредственно после повреждения (например, через T=0 час), через 4-12 часов после повреждения, через 48-72 часов после повреждения или через 15 суток после повреждения.
В определенных вариантах осуществления TBI представляет собой легкое TBI (mTBI) или среднее-тяжелое TBI (m-sTBI), и по меньшей мере одна мкРНК выбрана из группы, состоящей из miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* и miR-671-3p.
В определенных вариантах осуществления TBI представляет собой легкое TBI (mTBI), и мкРНК выбрана из группы, состоящей из miR-425-5p и miR-502. У индивидуума можно диагностировать mTBI, если определяют, что уровень miR-425-5p и/или miR-502 является ниже предопределенного порогового уровня или является пониженным относительно эталона.
В определенных вариантах осуществления уровень miR-425-5p и/или miR-502, который является ниже предопределенного порогового уровня или является пониженным относительно эталона, является диагностическим для mTBI, когда уровень определяют в образце, получаемом менее чем 48 часов после повреждения.
В определенных вариантах осуществления TBI представляет собой среднее-тяжелое TBI (m-sTBI), и мкРНК выбрана из группы, состоящей из miR-21 и miR-335. У индивидуума можно диагностировать среднее-тяжелое TBI, если определяют, что уровень miR-21 и/или miR-335 является выше предопределенного порогового уровня или является повышенным относительно эталона.
В определенных вариантах осуществления уровень miR-21 и/или miR-335, который является выше предопределенного порогового уровня или является повышенным относительно эталона, является диагностическим для среднего-тяжелого TBI, когда уровень определяют в образце, получаемом в течение периода продолжительностью до 15 суток после повреждения.
В определенных вариантах осуществления TBI представляет собой среднее-тяжелое TBI (m-sTBI), и по меньшей мере одна мкРНК выбрана из группы, состоящей из miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p и miR-629.
У индивидуума можно диагностировать m-sTBI, если определяют, что уровень miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642 и/или miR-99a является выше предопределенного порогового уровня или является повышенным относительно эталона.
У индивидуума можно диагностировать m-sTBI, если определяют, что уровень miR-192, miR-429, miR-520D-3p и/или miR-629 является ниже предопределенного порогового уровня или является пониженным относительно эталона.
МкРНК можно использовать отдельно для диагностики TBI. Например, при сотрясении главного мозга при занятии спортом, модно использовать miR-502 или miR-425-5p для подтверждения того, что произошло травматическое повреждение головного мозга.
Таким образом, дополнительный аспект настоящего изобретения представляет собой способ определения тяжести TBI, и этапы этого способа можно повторять для проведения мониторинга индивидуума в течение продолжительного периода времени. Следует понимать, что положительный результат на одну мкРНК (например, определяют, что уровень одной мкРНК является выше/ниже предопределенного порогового уровня или повышается/является пониженным относительно эталона) является достаточным для определения тяжести TBI. Например, если уровень miR-425-5p является ниже предопределенного порогового уровня или является пониженным относительно эталона, определяют, что степень тяжести TBI является средней (mTBI). Однако подходящим может являться объединение различных мкРНК (например, в тестовой панели) для облегчения оценки степени тяжести TBI.
В определенных вариантах осуществления способ включает определение уровня совокупности (например, двух или более) мкРНК в образце. В определенных вариантах осуществления две или более мкРНК выбраны из группы, состоящей из: miR-425-5p, miR-502, miR-21 и miR-335.
В определенных вариантах осуществления способ включает определение уровня:
(i) первой мкРНК, выбранной из miR-425-5p и miR-502; и
(ii) второй мкРНК, выбранной из miR-21 и miR-335.
У индивидуума можно диагностировать TBI, если определяют, что уровень miR-425-5p или miR-502 является ниже предопределенного порогового уровня или является пониженным относительно эталона, или уровень miR-21 или miR-335 является выше предопределенного порогового уровня или является повышенным относительно эталона.
В определенных вариантах осуществления TBI представляет собой легкое TBI (mTBI), и по меньшей мере одна мкРНК выбрана из группы, состоящей из let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p, miRmmiR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-424-5p, miR-30a-5p, miR-107, miR-135b-5p, miR-199b-5p, miR-324-5p и miR-652-3p или их сочетания. У индивидуума можно диагностировать mTBI, если наблюдают изменение по меньшей мере в 0,5, по меньшей мере в 1,0, по меньшей мере в 1,5, по меньшей мере в 2,0, по меньшей мере в 2,5, по меньшей мере в 3,0, по меньшей мере в 3,5 или по меньшей мере в 4,0 раза уровня микроРНК по сравнению с эталоном. В определенных вариантах осуществления у индивидуума диагностируют mTBI, если уровень(и) микроРНК повышается(ются) по сравнению с эталоном.
Последовательности и номера доступа для мкРНК, описанных в настоящем описании, приведены в таблице 1:
Таблица 1
мкРНК
последовательность
№ доступа miRBase
hsa-miR-21
uagcuuaucagacugauguuga (SEQ ID No.1)
MIMAT0000076
hsa-miR-425-5p
aaugacacgaucacucccguuga (SEQ ID No.2)
MIMAT0003393
hsa-miR-502-5p (также известная как hsa-miR-502)
auccuugcuaucugggugcua (SEQ ID No.3)
MIMAT0002873
hsa-miR-335-5p (также известная как hsa-miR-335)
ucaagagcaauaacgaaaaaugu (SEQ ID No.4)
MIMAT0000765
hsa-miR-301b-3p (также известная как hsa-miR-301b)
cagugcaaugauauugucaaagc (SEQ ID No.5)
MIMAT0004958
hsa-miR-184
uggacggagaacugauaagggu (SEQ ID No.6)
MIMAT0000454
hsa-miR-505-3p (также известная как hsa-miR-505)
cgucaacacuugcugguuuccu (SEQ ID No.7)
MIMAT0002876
hsa-miR-203a-3p (также известная как hsa-miR-203a, hsa-miR-203)
gugaaauguuuaggaccacuag (SEQ ID No.8)
MIMAT0000264
hsa-miR-654-3p
uaugucugcugaccaucaccuu (SEQ ID No.9)
MIMAT0004814
hsa-miR-655-3p (также известная как hsa-miR-655)
auaauacaugguuaaccucuuu (SEQ ID No.10)
MIMAT0003331
hsa-miR-331-3p (также известная как hsa-miR-331)
gccccugggccuauccuagaa (SEQ ID No.11)
MIMAT0000760
hsa-miR-223-5p (также известная как hsa-miR-223*)
cguguauuugacaagcugaguu (SEQ ID No.12)
MIMAT0004570
hsa-miR-let-7g
ugagguaguaguuuguacaguu (SEQ ID No.13)
MIMAT0000414
hsa-miR-126* (также известная как В hsa-miR-126-5p)
cauuauuacuuuugguacgcg (SEQ ID No.14)
MIMAT0000444
hsa-miR-193a-5p
ugggucuuugcgggcgagauga (SEQ ID No.15)
MIMAT0004614
hsa-miR-144*(также известная какВ hsa-miR-144-5p)
ggauaucaucauauacuguaag (SEQ ID No.16)
MIMAT0004600
hsa-miR-190 (также известная как hsa-miR-190a или hsa-miR-190a-3p)
cuauauaucaaacauauuccu (SEQ ID No.17)
MIMAT0026482
hsa-miR-194 (также известная как hsa-miR-194-5p)
uguaacagcaacuccaugugga (SEQ ID No.18)
MIMAT0000460
hsa-miR-365 (также известная как hsa-miR-365a-3p)
uaaugccccuaaaaauccuuau (SEQ ID No.19)
MIMAT0000710
hsa-miR-590-3p(также известная как hsa-miR-590)
uaauuuuauguauaagcuagu (SEQ ID No.20)
MIMAT0004801
hsa-miR-624
uaguaccaguaccuuguguuca (SEQ ID No.21)
MI0003638
hsa-miR-625*(также известная как hsa-miR-625-3p)
gacuauagaacuuucccccuca (SEQ ID No.22)
MIMAT0004808
hsa-miR-671-3p
uccgguucucagggcuccacc (SEQ ID No.23)
MIMAT0004819
hsa-let-7c-5p
ugagguaguagguuguaugguu (SEQ ID No.24)
MIMAT0000064
hsa-let-7i-5p (также известная как hsa-let-7i)
ugagguaguaguuugugcuguu (SEQ ID No.25)
MIMAT0000415
hsa-miR-142-3p
uguaguguuuccuacuuuaugga (SEQ ID No.26)
MIMAT0000434
hsa-miR-148a-3p (также известная как hsa-miR-148a)
ucagugcacuacagaacuuugu (SEQ ID No.27)
MIMAT0000243
hsa-miR-15b-5p (также известная как hsa-miR-15b)
uagcagcacaucaugguuuaca (SEQ ID No.28)
MIMAT0000417
hsa-miR-16-5p (также известная как hsa-miR-16)
uagcagcacguaaauauuggcg (SEQ ID No.29)
MIMAT0000069
hsa-miR-181a-5p (также известная как hsa-miR-181a)
aacauucaacgcugucggugagu (SEQ ID No.30)
MIMAT0000256
hsa-miR-20a-5p (также известная как hsa-miR-20;hsa-miR-20a)
uaaagugcuuauagugcagguag (SEQ ID No.31)
MIMAT0000075
hsa-miR-20b-5p (также известная как hsa-miR-20b)
caaagugcucauagugcagguag (SEQ ID No.32)
MIMAT0001413
hsa-miR-221-3p (также известная как hsa-miR-221)
agcuacauugucugcuggguuuc (SEQ ID No.33)
MIMAT0000278
hsa-miR-24-3p (также известная как hsa-miR-24)
uggcucaguucagcaggaacag (SEQ ID No.34)
MIMAT0000080
hsa-miR-27b-3p (также известная как hsa-miR-27b)
uucacaguggcuaaguucugc (SEQ ID No.35)
MIMAT0000419
hsa-miR-29a-3p (также известная как hsa-miR-29a)
uagcaccaucugaaaucgguua (SEQ ID No.36)
MIMAT0000086
hsa-miR-29c-3p (также известная как hsa-miR-29c)
uagcaccauuugaaaucgguua (SEQ ID No.37)
MIMAT0000681
hsa-miR-30a-5p (также известная как hsa-miR-30a)
uguaaacauccucgacuggaag (SEQ ID No.38)
MIMAT0000087
hsa-miR-107 (также известная как hsa-miR-107-10)
agcagcauuguacagggcuauca (SEQ ID No.39)
MI0000114
hsa-miR-135b-5p (также известная как hsa-miR-135b)
uauggcuuuucauuccuauguga (SEQ ID No.40)
MIMAT0000758
hsa-miR-199b-5p(также известная как hsa-miR-199b)
cccaguguuuagacuaucuguuc (SEQ ID No.41)
MIMAT0000263
hsa-miR-324-5p
cgcauccccuagggcauuggugu (SEQ ID No.42)
MIMAT0000761
hsa-miR-652-3p (также известная как hsa-miR-652)
aauggcgccacuaggguugug (SEQ ID No.43)
MIMAT0003322
hsa-miR-424-5p(также известная как hsa-miR-424)
cagcagcaauucauguuuugaa (SEQ ID No.44)
MIMAT0001341
hsa-miR-10a (также известная как hsa-miR-10-5p)
uacccuguagauccgaauuugug (SEQ ID No.45)
MIMAT0000253
hsa-miR-132 (также известная как hsa-miR-132-3p)
uaacagucuacagccauggucg (SEQ ID No.46)
MIMAT0000426
hsa-miR-223 (также известная как hsa-miR-223-3p)
ugucaguuugucaaauacccca (SEQ ID No.47)
MIMAT0000280
hsa-miR-143 (также известная как hsa-miR-143-3p)
ugagaugaagcacuguagcuc (SEQ ID No.48)
MIMAT0000435
hsa-miR-148b (также известная как hsa-miR-148b-3p)
ucagugcaucacagaacuuugu (SEQ ID No.49)
MIMAT0000759
hsa-miR-18a (также известная как hsa-miR-18;hsa-miR-18a-5p)
uaaggugcaucuagugcagauag (SEQ ID No.50)
MIMAT0000072
hsa-miR-192 (также известная как hsa-miR-192-5p)
cugaccuaugaauugacagcc (SEQ ID No.51)
MIMAT0000222
hsa-miR-429
uaauacugucugguaaaaccgu (SEQ ID No.52)
MIMAT0001536
hsa-miR-618
aaacucuacuuguccuucugagu (SEQ ID No.53)
MIMAT0003287
hsa-miR-95 (также известная как hsa-miR-95-5p)
ucaauaaaugucuguugaauu (SEQ ID No.54)
MIMAT0026473
hsa-miR-130a (также известная как hsa-miR-130a-3p)
cagugcaauguuaaaagggcau (SEQ ID No.55)
MIMAT0000425
hsa-miR-152 (также известная как hsa-miR-152-5p)
agguucugugauacacuccgacu (SEQ ID No.56)
MIMAT0026479
hsa-miR-27b (также известная как hsa-miR-27b-3p)
uucacaguggcuaaguucugc (SEQ ID No.57)
MIMAT0000419
hsa-miR-301 (также известная как hsa-miR-301a-3p или hsa-miR-301a )
cagugcaauaguauugucaaagc (SEQ ID No.58)
MIMAT0000688
hsa-miR-326
ccucugggcccuuccuccag (SEQ ID No.59)
MIMAT0000756
hsa-miR-345 (также известная как hsa-miR-345-5p)
gcugacuccuaguccagggcuc (SEQ ID No.60)
MIMAT0000772
hsa-miR-361 (также известная как hsa-miR-361-5p)
uuaucagaaucuccagggguac (SEQ ID No.61)
MIMAT0000703
hsa-miR-422a
acuggacuuagggucagaaggc (SEQ ID No.62)
MIMAT0001339
hsa-miR-579 (также известная как hsa-miR-579-3p)
uucauuugguauaaaccgcgauu (SEQ ID No.63)
MIMAT0003244
hsa-miR-642 (также известная как hsa-miR-642a-5p; hsa-miR-642)
gucccucuccaaaugugucuug (SEQ ID No.64)
MIMAT0003312
hsa-miR-99a (также известная как hsa-miR-99a-5p)
aacccguagauccgaucuugug (SEQ ID No.65)
MIMAT0000097
hsa-miR-520D-3p (также известная как hsa-miR-520D)
aaagugcuucucuuuggugggu (SEQ ID No.66)
MIMAT0002856
hsa-miR-629 (также известная как hsa-miR-629-5p)
uggguuuacguugggagaacu (SEQ ID No.67)
MIMAT0004810
hsa-miR-23a-3p (также известная как hsa-miR-23a)
aucacauugccagggauuucc (SEQ ID No.68)
MIMAT0000078
hsa-miR-148b-3p (также известная как hsa-miR-148b)
ucagugcaucacagaacuuugu (SEQ ID No.69)
MIMAT0000759
В целях удобства образец может представлять собой любую подходящую жидкость или образец ткани, получаемый от индивидуума. Например, биологический образец может содержать по меньшей мере один из группы, состоящей из: мочи, слюны, цельной крови, плазмы, сыворотки, мокроты, семенной жидкости, кала, мазка из носа, слез, влагалищного мазка, ректального мазка, мазка из шейки матки, биопсии ткани и мазка из уретры. В определенных вариантах осуществления образец представляет собой жидкий образец. Соответственно, образец представляет собой образец, который можно легко получать от индивидуума, такой как моча, слюна, кровь и мокрота. В определенных вариантах осуществления образец содержит слюну, кровь, плазму или сыворотку. Следует понимать, что в определенных вариантах осуществления процесс получения образца не является частью изобретения, описываемого в настоящем описании.
В определенных вариантах осуществления образец содержит или состоит из сыворотки. Наряду с тем, что сыворотка имеет практические преимущества, она также не содержит антикоагулянты, такие как гепарин, возможный ингибитор реакций ПЦР. Сыворотка также может быть в меньшей степени подвержена гемолизу по сравнению с плазмой.
В определенных вариантах осуществления образец представляет собой слюну. Слюну модно легко получать от пациента (например, около поля или на поле) без специальной подготовки или специального медицинского оборудования.
МкРНК, которые, как было найдено, являются характерными для mTBI, в слюне включают: hsa-let-7ca-5p, hsa-let-7i-5p, hsa-miR-1421-3p, hsa-miR-148a-3p, hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-221-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p, hsa-miR-29c-3p, hsa-miR-340-5p, hsa-miR-424-5p, miR-30a-5p, miR-107, miR-135b-5p; miR-199b выбрана из группы, состоящей из -5p; miR-324-5p; и miR-652-3p.
Уровни мкРНК можно использовать для отслеживания восстановления индивидуума после повреждения. Таким образом, настоящее изобретение относится к мониторингу восстановления индивидуума после TBI в качестве альтернативы или в дополнение к первоначальной диагностике.
В определенных вариантах осуществления способ включает мониторинг TBI, и уровень по меньшей мере одной мкРНК определяют в образце, получаемом от индивидуума, по меньшей мере через 2, по меньшей мере через 3, по меньшей мере через 5, по меньшей мере через 7, по меньшей мере через 10 или по меньшей мере через 14 суток после повреждения. В определенных вариантах осуществления уровень по меньшей мере одной мкРНК определяют в образце, получаемом от индивидуума, через 15 суток после повреждения. В определенных вариантах осуществления уровень по меньшей мере одной мкРНК определяют по меньшей мере в двух образцах, получаемых в различные интервалы времени после повреждения, таким образом, обеспечивая возможность мониторинга восстановления. Например, уровни мкРНК можно определять через 7 и 14 суток после повреждения или через 5, 10 и 15 суток после повреждения. Возвращение уровней мкРНК к нормальным значениям могут указывать на восстановление индивидуума после TBI.
В определенных вариантах осуществления определяют, что индивидуум восстановился после mTBI, если уровень miR-425-5p и/или miR-502 не является больше ниже предопределенного порогового уровня или не снижается больше относительно эталона.
В определенных вариантах осуществления определяют, что индивидуум восстановился после среднего-тяжелого TBI, если уровень miR-21 и/или miR-335 не является больше выше предопределенного порогового уровня или больше не является повышенным относительно эталона.
Диагностика у индивидуума наличия TBI, и конкретно диагностика легкого TBI или среднего-тяжелого TBI, может облегчать определение подходящего лечения. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет тест, который обеспечивает возможность работникам сферы здравоохранения, таким как врачи, клиницисты, врачи скорой помощи и даже не медицинскому персоналу (например, учителям, спортивным тренерам, военнослужащим) совершать подходящее действие в отношении индивидуума, у которого подозревают TBI. Индивидуум, который, как определяют, страдает TBI, может, таким образом, получать наиболее подходящее лечение в результате постановки диагноза. Таким образом, способ по изобретению может дополнительно включать направление подходящей терапии у индивидуума, у которого диагностировали TBI.
У индивидуума, у которого диагностировали TBI, можно дополнительно проводить оценки, например, посредством КТ-сканирования. В определенных вариантах осуществления индивидуума госпитализируют. В определенных вариантах осуществления, если можно исключить среднее-тяжелое TBI, индивидуум может не нуждаться в госпитализации для оценки. Индивидуума, у которого диагностировали среднее-тяжелое TBI, могут госпитализировать в больницу или специализированный центр с нейротравматологическим отделением.
Индивидуум, у которого диагностировали TBI (в частности mTBI) вне условий стационара, например, во время спортивного события, во время боя или во время игры, может быть немедленно удален из игры или боя. Затем можно начинать процедуру окончательного возврата в игру или бой индивидуума.
В дополнительном аспекте предоставлен способ определения, является ли подходящим проведение терапии индивидууму для облегчения TBI, где способ включает:
определение уровня по меньшей мере одной мкРНК в образце от индивидуума; и
определение является ли подходящим или не является проведение терапии для облегчения TBI, на основании уровень по меньшей мере одной мкРНК.
Следует понимать, что этап введения терапии индивидуум не является частью заявляемого способа, если конкретно не указано.
В определенных вариантах осуществления способ может дополнительно включать проведение у индивидуума подходящего лечения. В определенных вариантах осуществления лечение может включать терапию для облегчения состояния TBI. Таким образом, изобретение относится к способам диагностики и лечения TBI у индивидуума, где способ включает этапы (a) получения образца (например, образца крови, плазмы, мочи или слюны) от индивидуума; (b) детекции одной или более мкРНК (выбранных из мкРНК, описываемых в настоящем описании); диагностики у пациента TBI, когда уровень(и) мкРНК(s) отличаются от эталонного стандарта (как описано в настоящем описании); и проведения лечения TBI.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу определения подходящего лечения индивидуума, у которого подозревают TBI, где способ включает идентификацию страдает или не страдает индивидуум TBI путем определения уровня по меньшей мере одной мкРНК в образце от индивидуума.
Если у индивидуума идентифицируют TBI, подходящее лечение может включать одно или более из следующих ниже: дополнительную оценку индивидуума, например, посредством дополнительных тестов (например, вербальных, когнитивных, двигательных и/или зрительных тестов), КТ-сканирование и/или сканирование МРТ; прекращение деятельности индивидуумом (например, деятельности, во время которой произошло TBI); поступление индивидуума в больницу или специализированную клинику; хирургическую операцию и проведение терапии для облегчения состояния TBI индивидуума.
Терапия для облегчения состояния TBI может включать нейропротективные лекарственные средства, например, лекарственные средства для лечения отек головного мозга, такие как маннит и гипертонический солевой раствор, и/или другие нейропротективные средства, такие как избегание гипотензивной реанимации и использование успокоительного.
Затем в определенных вариантах осуществления можно проводить мониторинг у индивидуума для отслеживания его восстановления, например, в условиях больницы или клиники.
По дополнительному аспекту изобретения предоставлен способ детекции и/или определения уровня мкРНК-мишени у индивидуума, где способ включает этапы (a) получения образца от индивидуума; и (b) определения и/или определения уровня мкРНК-мишени в образце посредством приведения образца в контакт с зондом, который является специфическим для мкРНК-мишени.
Образец может представлять собой любой подходящий образец жидкости или ткани, получаемый от индивидуума, как определено выше. В определенных вариантах осуществления образец представляет собой кровь, сыворотку, плазму, мочу или слюну.
В определенных вариантах осуществления способ может включать определение уровня двух или более мкРНК-мишеней в образце.
По дополнительному аспекту изобретения предоставлена терапия для облегчения состояния TBI для применения в способе лечения нуждающегося в этом индивидуума, где указанного индивидуума идентифицируют как страдающего TBI путем определения уровня по меньшей мере одной мкРНК в образце от индивидуума.
Этап определения уровня мкРНК-мишени может включать приведение образца в контакт с субстратом, функционализированным зондом, например, чипом, содержащим зонд. Субстрат или чип могут в целях удобства содержать несколько зондов, которые являются специфическими к различным мкРНК-мишеням.
Индивидуум мог страдать от повреждения, в частности повреждения головы. У индивидуума могут подозревать TBI. В определенных вариантах осуществления образец получают не более чем через 72 часов, не более чем через 48 часов, не более чем через 36 часов, не более чем через 24 часа, не более чем через 12 часов, не более чем через 6 часов, не более чем через 4 часа, не более чем через 2 часа или не более чем через 1 час после повреждения.
В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает лечение индивидуума. Лечение может включать одно или более из следующих ниже: дополнительную оценку индивидуума, например, посредством дополнительных тестов (например, вербальных, когнитивных, двигательных и/или зрительных тестов), КТ-сканирование и/или сканирование МРТ; прекращение деятельности индивидуумом (например, деятельности, во время которой произошло TBI); поступление индивидуума в больницу или специализированную клинику; и введение терапии для облегчения состояния TBI индивидууму. В определенных вариантах осуществления лечение включает введение эффективного количества нейропротективного лекарственного средства.
Таким образом, в еще одном дополнительном аспекте изобретение относится к способу лечения TBI, где способ включает:
определение уровня по меньшей мере одной мкРНК в образце от индивидуума; и
если уровень по меньшей мере одной мкРНК является показателем mTBI, проведение лечения, соответствующего mTBI; или
если уровень по меньшей мере одной мкРНК является показателем m-sTBI, проведение лечения, соответствующего m-sTBI.
Специалистам в данной области понятно, что можно использовать различные способы лечения mTBI и m-sTBI.
in situ
Подходящее лечение mTBI может включать: прекращение деятельности индивидуумом; лечение  или во внебольничных условиях; дополнительная оценка индивидуума в больнице без пребывания в течение ночи (как правило, пациентов с mTBI быстро выписывают с советами, касающимися повреждения головы); или пребывание в больнице в течение периода наблюдения (как правило, 1-2 суток). У индивидуума можно дополнительно проводить оценки с использованием тестов (например, вербальных, когнитивных, двигательных и/или зрительных тестов). Как правило, КТ-сканирование требуется, если существуют определенные показания, включая подозрение на перелом черепа, постпосттравматические судороги, очаговый неврологический дефицит, повторную рвоту, балл по шкале GCS менее 13 при первичной оценке (менее 14 для детей или менее чем 15 для грудного ребенка младше 1 года) в соответствии с руководствами NICE.
Подходящее лечение m-sTBI может включать: сканирование МРТ или КТ-сканирование (в частности, в течение 1 часа после повреждения); поступление в больницу (что может включать поступление в реанимацию и/или перевод в специализированную клинику или главный травматологический центр с нейрохирургическим отделением); нейромониторинг; хирургическую операцию; проведение терапии для облегчения состояния TBI, такой как введение нейропротективных лекарственных средств, например, лекарственных средств для лечения отек головного мозга, таких как маннит и гипертонический солевой раствор, и/или других нейропротективных средств, таких как избегание гипотензивной реанимации и использование успокоительного.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает возможность быстрой стратификации индивидуумов с TBI на mTBI или m-sTBI, таким образом, что они могут получать наиболее подходящее лечение.
По дополнительному аспекту изобретения предоставлена система детекции для диагностики и/или мониторинга TBI, где система детекции содержит сенсорный элемент, содержащий субстрат, функционализированный зондом, специфическим к мкРНК-мишени. Система детекции может дополнительно содержать устройство детекции, которое способно детектировать связывание мкРНК-мишени с зондом.
В соответствии с еще одним дополнительном аспекте изобретения предоставлен сенсорный элемент для применения в системе детекции для диагностики и/или мониторинга TBI, где сенсорный элемент содержит субстрат, функционализированный зондом, специфическим к мкРНК-мишени.
Сенсорный элемент может дополнительно содержать зону добавления образца для получаемого образца (например, жидкого образца).
Зонд может селективно связываться с представляющей интерес мкРНК. Субстрат можно функционализировать совокупностью зондов. Зонды могут все являться одинаковыми, или может быть предоставлено два или более различных зонда. Например, в определенных вариантах осуществления субстрат можно функционализировать первым зондом, специфическим к первой мкРНК, и вторым зондом, специфическим ко второй мкРНК. Первый и второй зонды можно группировать друг с другом, например, на разных участках сенсорного элемента.
В дополнительном аспекте изобретения предоставлена композиция для применения в способе диагностики и/или мониторинга травматического повреждения головного мозга (TBI) у индивидуума, где композиция содержит зонд, специфический к мкРНК-мишени. Композиция может содержать любую из перечисленных мкРНК или любую совокупность из перечисленных мкРНК (например, две, три, четыре или более перечисленных мкРНК).
В определенных вариантах осуществления мкРНК-мишень выбрана из группы, состоящей из miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625*, miR-671-3p, hsa-let-7c-5p, hsa-let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p,В miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p, miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p, miR-424-5p, miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p и miR-629.
В определенных вариантах осуществления мкРНК-мишень выбрана из группы, состоящей из miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g, miR-335, hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* и miR-671-3p. Было обнаружено, что эти микроРНК являются биомаркерами, экспрессируемыми у всех пациентов с TBI (средним или тяжелым).
В определенных вариантах осуществления мкРНК-мишень выбрана из группы, состоящей из miR-505, miR-203, miR-654-3p, miR-655, miR-184, miR-301b, miR-425-5p, miR-502, miR-21, miR-let-7g и miR-335.
В определенных вариантах осуществления мкРНК-мишень выбрана из группы, состоящей из let-7c-5p, let-7i-5p, miR-142-3p, miR-148a-3p, miR-15b-5p, miR-16-5p, miR-181a-5p, miR-20a-5p, miR-20b-5p, miR-221-3p,В miR-24-3p, miR-27b-3p, miR-29a-3p, miR-29c-3p,В и miR-424-5p; miR-30a-5p; miR-107; miR-135b-5p; miR-199b-5p; miR-324-5p; miR-652-3p.
В определенных вариантах осуществления мкРНК-мишень выбрана из группы, состоящей из miR-10a, miR-132, miR-223, miR-143, miR-148b, miR-18a, miR-192, miR-429, miR-618, miR-95, miR-130a, miR-152, miR-194, miR-27b, miR-301, miR-326, miR-345, miR-361, miR-422a, miR-579, miR-642, miR-99a, miR-520D-3p и miR-629.
В определенных вариантах осуществления мкРНК-мишень выбрана из группы, состоящей из miR-425-5p, miR-502, miR-21 и miR-335.
Зонд может содержать биологическую молекулу, такую как белок (например, антитело) или нуклеиновая кислота. В определенных вариантах осуществления зонд содержит нуклеиновую кислоту. Нуклеиновая кислота может содержать последовательность, которая является по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, которая является комплементом полноразмерной последовательности мкРНК-мишени. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность, которая является на 100% идентичной последовательности, которая является комплементом последовательности мкРНК-мишени (т.е. рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая является точным комплементом последовательности мкРНК-мишени).
Зонды можно связывать с поверхностью субстрата любыми подходящими способами, такими как посредством связывающей химии, известной специалистам в данной области. В определенных вариантах осуществления каждый зонд вязан с поверхностью субстрата через линкер. В определенных вариантах осуществления зонд содержит функциональную группу для иммобилизации зонда на субстрате или для связывания зонда с линкером, иммобилизованным на субстрате.
Альтернативно или кроме того, зонд может содержать детектируемую метку. Детектируемая метка может являться, например, радиоактивной, флуоресцентной, люминесцентной или меткой на основе антитела (например, она может представлять собой общепринятое тетрамерное антитело или его детектируемый фрагмент).
Субстрат сенсорного элемента может состоять из любого подходящего вещества. В определенных вариантах осуществления субстрат содержит или состоит из металла, пластика, стекла, диоксида кремния, кремния, графита, графена или любого их сочетания. В определенных вариантах осуществления субстрат содержит много слоев. Например, субстрат можно получать путем формирования поверхности или слоя графена на слое карбида кремния или диоксид кремния. Поверхность графена можно химически модифицировать, например, до оксида графена (GO) или амина графена (GA). Специалистам в данной области известны способы формирования графеновых слоев, такие как эпитаксиальное выращивание и выращивание сублимацией.
В целях удобства, зонды, содержащие или состоящие из нуклеиновой кислоты, можно связывать с поверхностью GO посредством линкера с использованием амидного связывающего реагента (например, (O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N,N'-тетраметилуронийгексафторфосфат (HATU)). Затем сенсорный элемент, содержащий поверхность, функционализированную зондом на основе нуклеиновой кислоты можно использовать для селективной детекции его комплементарной мкРНК.
Подходящие линкеры могут содержать фрагмент анилина (или его производного), фрагмент бензойной кислоты (или ее производного) или фрагмент этандиамина (или его производного). Линкер на основе анилина можно получать путем присоединения молекулы нитробензола (или производного) к поверхности графена (например, с использованием соли диазония) и восстановления нитробензола до анилина. Затем можно использовать аминогруппу анилину для связывания с зондом. Подобным образом, соль диазония (например, тетрафторборат диазония 4-бензойной кислоты) можно использовать для связывания бензойной кислоты или производного бензойной кислоты с поверхностью графена. Фрагмент этандиамина можно связывать с карбоксилированным графеном или оксидом графена.
Сенсорный элемент можно заключать в тест-полоску. Тест-полоска может являться одноразовой.
Устройство детекции можно конфигурировать с возможностью детекции связывания мкРНК-мишени с рецептором любыми подходящими средствами, известными специалистам в данной области, например, посредством детекции изменений электрического сопротивления, концентрации ионов водорода или конформационных изменений, возникающих в результате гибридизации.
Устройство детекции может дополнительно содержать интерфейс пользователя для вывода данных пользователю.
В определенных вариантах осуществления устройство детекции содержит базу данных с информацией о лечении. Устройство может идентифицировать подходящие варианты лечения из базы данных в зависимости от уровней мкРНК или каждой представляющей интерес мкРНК. Информацию о лечении можно предоставлять пользователю через интерфейс пользователя.
В целях удобства устройство детекции может являться переносным, например, ручным. Устройство детекции может содержать блок хранения данных для хранения информации об уровнях мкРНК и другой информации, связанной с индивидуумом. В определенных вариантах осуществления устройство содержит средства передачи данных на другие устройства. Например, устройство может передавать данные по беспроводной связи через WiFi, 3G, 4G, Bluetooth или через приложение для мобильного телефона. Это может обеспечивать возможность легкого доступа к данным медицинских работников при необходимости.
Таким образом, предусматривают, что устройство детекции по изобретению обеспечивает доступное, переносное средство оказания медицинской помощи для диагностики и мониторинга TBI неинвазивным способом. Устройство могут использовать бригады скорой помощи, военные, в школах, в спортивных клубах и работники здравоохранения, что обеспечивает правильную оценку и установку очередности пациентов с подозрением на TBI.
В дополнительном аспекте предоставлен набор для применения в настоящих способах. Набор может содержать по меньшей мере зонд (например, белок, так как антитело, или нуклеиновую кислоту), которые способен селективно связываться с представляющей интерес мкРНК. В определенных вариантах осуществления набор содержит блок, содержащий совокупность зондов. В определенных вариантах осуществления по меньшей мере один зонд представляет собой праймер для проведения ПЦР. Набор может дополнительно содержать инструкции по использованию, например, инструкции для применения в диагностике и/или мониторинге TBI. Набор может дополнительно содержать подходящие буферы и реагенты, такие как праймеры и ферменты для амплификации (например, ДНК-полимеразу, обратную транскриптазу для преобразования мкРНК в кДНК).
Следует понимать, что утверждения, приводимые в настоящем описании в отношении любого аспекта изобретения, можно равноценно применять к любому другому аспекту изобретения, при необходимости.
Подробное описание изобретения
Ниже описаны варианты осуществления изобретения в качестве примера и со ссылкой на прилагаемые фигуры:
Фигура 1: экспрессия miR-425-5p и miR-502 при 3 различных категориях травмы и HV
Экспрессия miR-425-5p и miR-502 у 10 HV, 10 mTBI+EC (1 сутки), 10 mTBI+EC (15 суток), 10 EC (1 сутки), 10В EC (15 суток), 10 sTBI+EC (1 сутки) и 10 sTBI+EC (15 суток) у пациентов, детектируемая анализом кПЦР-РВ. Выявлено, что экспрессия miR-425-5p заметно снижается при mTBI+EC (1 сутки) по сравнению с HV (p<0,01), mTBI+EC (15 суток) (p<0,001) и sTBI+EC (1 сутки) (p<0,01) (фигура 1A). Было выявлено, что экспрессия miR-502 заметно снижается при mTBI+EC (1 сутки) по сравнению с HV (p<0,05), mTBI+EC (15 суток) (p<0,01) и sTBI+EC (1 сутки) (p<0,05) (фигура 1B).
Фигура 2: экспрессия miR-21 и miR-335 при 3 разных категориях травмы и HV
Экспрессия miR-21 и miR-335 у 10 HV, 10 mTBI+EC (1 сутки), 10 mTBI+EC (15 суток), 10 EC (1 сутки), 10В EC (15 суток), 10 sTBI+EC (1 сутки) и 10 sTBI+EC (15 суток) у пациентов, детектируемая анализом кПЦР-РВ. Выявлено, что экспрессия miR-21 значительно повышается при sTBI+EC (1 сутки и 15 суток) по сравнению с HV (p<0,01) (фигура 2A). Было выявлено, что экспрессия miR-335 заметно повышается при sTBI+EC (1 сутки) по сравнению с HV (p<0,001), EC (15 суток) (p<0,001) и mTBI+EC (1 сутки) (p<0,05) (фигура 2B).
Фигура 3: Период действия экспрессии miR-425-5p (фигура 3A) и miR-502 (фигура 3B) при 3 различных категориях травмы и HV
Экспрессия miR-425-5p и miR-502 у 30 HV, 30 пациентов с mTBI+EC, 30 пациентов с EC, 30 пациентов с sTBI+EC в различные моменты времени после повреждения (T0, T4-12 часов, T48-72 часа, 15 суток), детектируемая анализом кПЦР-РВ. Было выявлено, что экспрессия miR-425-5p заметно снижается при mTBI+EC через T0 и T4-12 часов по сравнению с HV, sTBI+EC и EC (p<0,05). Было выявлено, что экспрессия miR-502 заметно снижается при mTBI+EC через T0 и T4-12 часов по сравнению с HV, sTBI+EC и EC (p<0,05). Значения P определяли с помощью апостериорного критерия Тьюки.
* значимое отличие от HV
Фигура 4: Период действия экспрессии miR-21 (фигура 4A) и miR-335 (фигура 4B) при 3 различных категориях травмы и HV
Экспрессия miR-21 и miR-335 у 30 HV, 30 пациентов с mTBI+EC, 30 пациентов с EC и 30 пациентов с sTBI+EC в различные моменты времени после повреждения (T0, T4-12 часов, T48-72 часа, 15 суток), детектируемая анализом кПЦР-РВ. Было выявлено, что экспрессия miR-21 достоверно повышается при sTBI+EC через T4-12 часов, T48-72 часа и 15 суток по сравнению с HV (p<0,01). Было выявлено, что экспрессия miR-335 заметно повышается при sTBI+EC через T0, T4-12 часов, T48-72 часа и 15 суток по сравнению с HV и mTBI+EC (p<0,001), но только не EC. Значения P определяли с помощью апостериорного критерия Тьюки.
* значимое отличие от HV
Примеры
Поскольку мкРНК становятся перспективными биомаркерами при ряде различных патологий, авторы настоящего изобретения пытались изучить их роль при TBI.
Пример 1
Материалы и способы
Подбор пациентов и сбор образцов
Участников исследования набирали из Исследовательского центра хирургической реконструкции и микробиологии (Surgical Reconstruction and Microbiology Research Centre) (SRMRC) при госпитале имени королевы Елизаветы (Queen Elizabeth Hospital) Бирмингем (UK) как часть исследования биомаркеров головного мозга после травмы (The Golden Hour Study) (ссылка на этическую комиссию 13/WA/0399).
Сначала авторы провели сканирование 754 мкРНК в 5 случаях mTBI у пациентов с экстракраниальной травмой (EC), у 5 пациентов с sTBI+EC травмой и здоровых добровольцах (HV) на 1 сутки и через 15 суток после повреждения с целью отбора специфических биомаркеров-кандидатов, с помощью которых можно отличать легкое от тяжелого TBI и прогнозировать восстановление после mTBI через 15 суток. Затем на основании этой информации (таблица 2) удалось подтвердить результаты исследования в расширенной когорте пациентов, состоящей из 40 индивидуумов, разделенных на 4 различные категории: HV (n=10), EC (n=10), mTBI+EC (n=10), sTBI+EC (n=10). Здоровые добровольцы давали согласие, и их включали в исследование RECOS. Пациенты с EC травмой страдали подтвержденными рентгенографией переломами, не страдали травмой головы, не страдали инфекцией, не имели в анамнезе неврологические или психиатрические нарушения и не страдали зависимостью от алкоголя или лекарственных средств. Легкое TBI с EC включало TBI с непроникающей травмой головы и баллом по шкале комы Глазго (GCS) >13. Тяжелое TBI с EC включало пациентов с балом GCS 8 или ниже. Все пациенты имели пол и возраст, сопоставимый с HV.
Обработка образцов
Образцы периферической крови получали на 1 сутки и через 15 суток после повреждения у каждого пациента. Образцы крови обрабатывали для выделения сыворотки в течение 2 часов после отбора крови. Перед центрифугированием при 3000 об./мин. в течение 10 мин при 4°C цельную кровь оставляли отстаиваться приблизительно в течение 30 мин при комнатной температуре. Сыворотку разделяли на аликвоты и хранили при -80°C до проведения анализа.
Выделение РНК, обратная транскрипция и профилирование мкРНК с помощью TaqMan Low Density Array (TLDA)
Первоначальный скрининг (начальный набор) проводили у 5 пациентов с mTBI+EC и 5 пациентов с sTBI+EC, которых сравнивали с HV в два различных момента времени (через 1 сутки и 15 суток после повреждения). Сыворотку этих пациентов использовали для профилирования транскиптома 754 мкРНК. Образцы сыворотки центрифугировали при 2000 об./мин. в течение 10 минут да осадка и удаляли любые циркулирующие клетки или дебрис. МиРНК экстрагировали из 400 мкл образцов сыворотки с использованием набора Qiagen miRNeasy mini (Qiagen, GmbH, Hilden, Germany) по дополнительному протоколу Qiagen для очистки малых РНК из сыворотки и плазмы и в конце элюировали в объеме, равном 30 мкл, не содержащей РНКазу воды. Концентрацию и чистоту получаемой РНК определяли с использованием спектрофотометра ND-1000 UV-Vis(NanoDrop). 20 нг РНК из сыворотки подвергали обратной транскрипции и предварительно амплифицировали по инструкциям производителя. Продукты предварительной амплификации нагружали в TLDA, TaqMan Human MicroRNA Array v3.0 A и B (Applied Biosystems LifeTechnologies™). ПЦР на TLDA проводили на системе 7900HT Fast RealTime PCR (Applied Biosystem, LifeTechnologies™).
Анализ данных
Для получения точного профиля мкРНК, авторы использовали глобальной медианной нормализации. Аналогично анализу на микропанеле значения Ct от каждого образца нормализовали на медианную Ct панели. Кроме того, путем вычисления корреляции Пирсона медиан и средних Ct каждой панели и Ct каждой мкРНК, авторы идентифицировали две мкРНК, для которых демонстрировали профиль экспрессии, близкий к медиане и среднему TLDA, т.е. miR-331 и miR-223*. Также подтверждали, что эти мкРНК находятся среди наиболее стабильных в TLDA в результате применения двух различных способов [DataAssistv.3software (AppliedBiosystem Life Technologies™)] и алгоритм geNorm. Таким образом, miR-331 и miR-223* использовали в качестве референсных генов для валидации отдельных анализов TaqMan. Кратность изменения экспрессии рассчитывали способом 2-ΔΔCT. Дифференциально экспрессируемые мкРНК (DE мкРНК) идентифицировали по значению анализа микропанелей (SAM), вычисленному посредством программы Multi experiment viewer v4.8.1 с применением двухпарный непарный тест для ΔCt и использованием значения p на основании 100 перестановок; модуль подстановки: K-ближайшие соседи (10 соседей); уровень ложноположительных результатов<0,15 использовали в качестве поправки на множественные сравнения. Авторы принимали в качестве надежных только DE мкРНК, согласующиеся с использованием всех эндогенных контролей.
Отдельные анализы TaqMan
Из панели выбирали десять дифференциально экспрессируемых мкРНК как возможных биомаркеров-кандидатов для возможности различать легкое TBI от тяжелого TBI и проводить мониторинг восстановления после легкого TBI. Эти кандидаты использовали для подтверждения данных в расширенной когорте из 30 пациентов (набор подтверждения), разделенных на 3 различные категории (mTBI+EC, sTBI+EC и только EC) и 10 контролей (HV) в два различных момента времени (через 1 и 15 суток после повреждения) отдельными анализами TaqMan (AppliedBiosystems, Life Technologies™). Образцы экстрагировали и подвергали обратной транскрипции, как описано выше и проводили анализ кПЦР в режиме реального времени в системе детекции Bio-Rad iQ5 Real-time PCR (Bio-Rad, CA, USA). Кратные изменения экспрессии рассчитывали способом 2-ΔΔCT.
Статистический анализ
Данные проверяли на нормальное распределение и преобразовывали для применения параметрических критериев. Сравнения в группах в каждый момент времени и в группах в течение продолжительного периода времени проводили посредством однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного критерия Тьюки на преобразованных данных. Анализ операционных характеристик приемника использовали для вычисления чувствительности и специфичности каждого биомаркера в диагностике mTBI или sTBI, выражаемого как площадь под кривой (AUC). Все анализы проводили на SPSS v.20 (IBM). Различия считали статистически значимыми при значении p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Профили экспрессии в результате TaqMan Low Density Arrays (TLDA)
Из 754 подвергаемых скринингу мкРНК TLDA авторы идентифицировали десять дифференциально экспрессируемых циркулирующих мкРНК через 1 сутки и 13-15 сутки у mTBI+EC, через 19-1 сутки и через 22-15 суток в группе sTBI+EC (таблица 2). Их этого списка исключали hsa-miR-126*, miR-193a-5p, miR-144*, miR-190, miR-194, miR-365, miR-590-3p, miR-624, miR-625* и miR-671-3p для дополнительного анализа, т.к. они экспрессировались у большинства пациентов, таким образом, не являлись подходящими биомаркерами-кандидатами только легкой или тяжелой травмы. Однако указанные выше микроРНК могут идентифицировать TBI любой тяжести и являются, таким образом, пригодными биомаркерами TBI. С другой стороны, в качестве ранних биомаркеров-кандидатов mTBI выбирали miR-184, miR-301b, miR-502 и miR-505, исключительно и дифференциально экспрессируемые при mTBI+EC на 1 сутки. Кроме того, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p и miR-655, дифференциально экспрессируемые через 15 суток после mTBI+EC, выбирали в качестве биомаркеров-кандидатов, способных отслеживать восстановление mTBI.
В заключение, для дальнейшего исследования выбирали две мкРНК, miR-21 и miR-335, постоянно экспрессируемые в оба момента времени при TBI+EC.
Таблица 2
: Кратное изменение микроРНК, дифференциально экспрессируемых у 5 пациентов с mTBI+EC (1 и 15 суток) и 5 пациентов с sTBI+EC (1 и 15 суток), по сравнению с 5 HV и детектируемых TLDA.
mTBI+EC 1 сутки в сравнении с HV
mTBI+EC 15 суток в сравнении с HV
sTBI+EC 1 сутки в сравнении с HV
sTBI+EC 15 суток в сравнении с HV
hsa-miR-184
0,1383
hsa-miR-193a-5p
24,901
hsa-let-7g
0,3250
hsa-miR-130a
14,979
hsa-miR-190
0,1278
hsa-miR-194
20,946
hsa-miR-10a
11,953
hsa-miR-152
9,8921
hsa-miR-425-5p
0,0798
hsa-miR-203
4,1763
hsa-miR-132
8,1875
hsa-miR-190
0,0277
hsa-miR-502
0,0538
hsa-miR-365
3,7087
hsa-miR-143
26,193
hsa-miR-193a-5p
13,655
hsa-miR-505
7,7696
hsa-miR-425-5p
3,0166
hsa-miR-148b
20,095
hsa-miR-194
12,301
hsa-miR-126*
0,1570
hsa-miR-654-3p
0,0878
hsa-miR-18a
26,806
hsa-miR-21
12,662
hsa-miR-144*
0,2758
hsa-miR-655
0,0756
hsa-miR-190
0,0634
hsa-miR-27b
18,977
hsa-miR-590-3p
0,3842
hsa-miR-671-3p
4,0584
hsa-miR-192
0,2245
hsa-miR-301
21,954
hsa-miR-624
0,0836
hsa-miR-126*
0,2978
hsa-miR-193a-5p
29,785
hsa-miR-326
93,099
hsa-miR-301b
0,0435
hsa-miR-144*
0,2645
hsa-miR-21
7,1654
hsa-miR-335
45,050
hsa-miR-590-3p
0,3035
hsa-miR-223
4,6799
hsa-miR-345
37,699
hsa-miR-624
0,1643
hsa-miR-335
37,192
hsa-miR-361
37,295
hsa-miR-625*
0,1521
hsa-miR-365
5,5771
hsa-miR-422a
77,373
hsa-miR-429
0,1294
hsa-miR-579
4,7203
hsa-miR-618
29,527
hsa-miR-642
41,515
hsa-miR-95
20,788
hsa-miR-671-3p
8,4425
hsa-miR-144*
0,2759
hsa-miR-99a
12,218
hsa-miR-624
0,0304
hsa-miR-144*
0,2905
hsa-miR-625*
0,0981
hsa-miR-520D-3p
0,2579
hsa-miR-590-3p
0,4188
hsa-miR-625*
0,1575
hsa-miR-629
0,2793
Отдельный анализ TaqMan для биомаркеров-кандидатов mTBI
Затем для подтверждения этих полученных данных авторы тестировали экспрессию выбранных мкРНК в три повторениях и в независимых группах (10 mTBI+EC, 10 sTBI+EC, 10 EC) в два выбранных момента времени (через 1 и 15 суток после повреждения) с использованием отдельных анализов TaqMan. Результаты сравнивали с 10 HV. Кратные изменение рассчитывали способом 2-ΔΔCT, с использованием miR-331 и miR-223* в качестве референсных генов.
Среди биомаркеров-кандидатов mTBI в оба момента времени (miR-184, miR-301b, miR-502, miR-505, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p и miR-655), где для двух миРНК демонстрировали интересные результаты, и они являлись достоверно и дифференциально экспрессируемыми в трех различных категориях по сравнению с HV. В частности, для miR-425-5p и miR-502 демонстрировали аналогичную тенденцию (Fig 1). Они обе значительно подавлялись при mTBI+EC (среднее значение 0,387±0,201 и 0,314±0,146) соответственно через 1 сутки после повреждения по сравнению с HV (p<0,001), EC (p<0,001) и sTBI+EC (p<0,001). Через 15 суток после легкого повреждения miR425-5p и miR-502 возвращались к нормальным уровням (0,886±0,310 и 1,157±0,258). Экспрессию miR-425-5p и miR-502 в образцах EC через 1 сутки и 15 суток после повреждения также находили аналогичной экспрессии у HV, таким образом, предположительно эти два биомаркера дифференциально экспрессируются только у пациентов с повреждением головного мозга. Кроме того, ни для одного из них не демонстрировали какого-либо значимого отличия in sTBI+EC по сравнению с HV в оба момента времени. Таким образом, miR-425-5p и miR-502 можно рассматривать как наиболее перспективные биомаркеры-кандидаты для ранней диагностики и мониторинга mTBI через 15 суток после травмы. AUC этих биомаркеров приведены в таблице 3.
Отдельный анализ TaqMan на биомаркеры-кандидаты sTBI
MiR-21 и miR-335 анализировали как возможные биомаркеры sTBI, т.к. они обе оказываются повышено экспрессируемыми в оба момента времени sTBI+EC при первичном скрининге. Было продемонстрировано, что они также являются сильными кандидатами во втором наборе данных от пациентов (Фиг. 2). Mir-21 также значительно повышалась в оба момента времени в sTBI с EC (7,106±4,192 и 4,012±1,577) в отношении HV (p,0,001), EC (p<0,001) и mTBI (p<0,001). Не наблюдали значимых отличий в оставшихся категориям по сравнению с HV. Для miR-335 демонстрировали повышение экспрессии при sTBI+EC и в оба момента времени (16,824±14,195 и 12,324±8,931, соответственно). На сутки 1 эта группа значительно отличалась от контролей (p=0,001) и mTBI+EC (p=0,031), но не от EC. Следует отметить, что значительное повышение экспрессии у пациентов с EC обнаруживали на 1 сутки (7,951±4,870), но не через 15 суток после повреждения (1,260±0,531). По этой причине, на сутки 15 miR335 являлась значительно выше в группе sTBI+EC по сравнению с HV (p=0,002), EC (p=0,007) и mTBI+EC (p=0,001). Для miR-335 не демонстрировали какие-либо значимые отличия при mTBI+EC в оба момента времени по сравнению с HV. AUC для этих биомаркеров также приведены в таблице 3.
Таблица 3: Площадь под кривой
Переменная(ые)
Площадь
Асимптотический 95% доверительный интервал
Нижняя граница
Верхняя граница
miR-502В 1 сутки
0,993
0,972
1,000
miR-502В 15 суток
Незначительное
-
-
miR-425-5p 1 сутки
0,994
0,977
1,000
miR-425-5pВ 15 суток
Незначительное
-
-
miR-21В 1 сутки
0,979
0,934
1,000
miR-21В 15 суток
0,975
0,929
1,000
miR-335В 1 сутки
0,758
0,592
0,921
miR-335В 15 суток
0,957
0,884
1,000
Обсуждение
В настоящем исследовании изучали, можно ли изменения уровней мкРНК принимать для диагностики TBI и оценки его тяжести. Идентифицировали, то четыре мкРНК дифференциально экспрессируются при TBI; miR-425-5p, miR 502, miR-21 и miR-335.
Для miR-425-5p демонстрировали значимые результаты через сутки 1 при mTBI+EC по сравнению с HV и аналогичные результаты получали во всех других категориях. Их снижение экспрессии в течение первых 24 часов после легкого повреждения и их возвращение к нормальным уровням через 15 суток делает miR-425-5p подходящими биомаркерами-кандидатами легкой травмы.
Также было выявлено, что miR-502 дифференциально экспрессируется при mTBI+EC. Тенденция этой мкРНК являлась очень схожей с miR-425-5p. Продемонстрирована ее специфичность для пациентов с повреждением головного мозга и ее также можно использовать для отслеживания восстановления, т.к. она возвращается к нормальному значению через 15 суток после среднего повреждения.
Отмечали, что после sTBI 2 мкРНК (miR-21, miR-335) экспрессировались как через 1 сутки, так и чрез 15 суток, и, таким образом, их выбирали в качестве возможных биомаркеров sTBI. Экспрессия miR-21 и miR-335 значительно повышалась в оба момента времени по сравнению с контролями при sTBI+EC. Таким образом, повышенная экспрессия подтверждала результаты панели и демонстрировала эффективность этих молекул в качестве биомаркеров sTBI.
С выбранной панелью мкРНК можно точно диагностировать TBI и обеспечивать стратификацию пациентов в зависимости от степени тяжести, что, в свою очередь, позволяет обеспечить наиболее подходящее лечение.
Пример 2
Подбор пациентов и сбор образцов
Участников исследования набирали из Исследовательского центра хирургической реконструкции и микробиологии (Surgical Reconstruction and Microbiology Research Centre) (SRMRC) при госпитале имени королевы Елизаветы (Queen Elizabeth Hospital) Бирмингем (UK) как часть исследования SIR (Стероиды и иммунитет от повреждения до реабилитации) (ссылка на этическую комиссию 11/SW/0177), исследования ReCoS (Повторное сотрясение головного мозга в спорте) (ссылка на этическую комиссию 11-0429AP28) и исследования Golden Hour (ссылка на этическую комиссию 13/WA/0399). Перед включением в исследование получали письменное информированное согласие от участников или действующего доверенного лица (члена семьи или специалиста, не участвующего непосредственно в исследовании).
Во втором наборе данных образцов использовали образцы сыворотки в целом от 120 индивидуумов, разделенных на 4 различные категории: HV (n=30), EC (n=30), mTBI+EC (n=30), sTBI+EC (n=30), и отбирали кровь в различные моменты времени (T0-1 час, T4-12 часов, T48-72 часа, 15 суток) от каждого пациента. Здоровые добровольцы давали согласие, и их включали в исследование. Пациенты с EC травмой страдали подтвержденными рентгенографией переломами, не страдали травмой головы, не страдали инфекцией, не имели в анамнезе неврологические или психиатрические нарушения и не страдали зависимостью от алкоголя или лекарственных средств. Легкое TBI с EC включало TBI с непроникающей травмой головы и баллом по шкале комы Глазго (GCS) ≥13. Тяжелое TBI с EC включало пациентов с балом GCS≤8.
Обработка образцов
Образцы крови обрабатывали для выделения сыворотки в течение 2 часов после отбора. Перед центрифугированием при 3000 об./мин. в течение 10 мин при 4°C цельную кровь оставляли отстаиваться приблизительно в течение 30 мин при комнатной температуре. Сыворотку разделяли на аликвоты и хранили при -80°C до проведения анализа.
Выделение РНК, анализ данных, анализы и статистический анализ проводили, как описано в примере 1.
Результаты
Отдельный анализ TaqMan биомаркеров-кандидатов mTBI
Для подтверждения полученных данных из примера 1 в различные моменты времени (T0, T4-12 час, T48-72 час и 15 суток после повреждения) измеряли экспрессию отобранных мкРНК в 3 отдельных и независимых группах (30 mTBI+EC, 30 sTBI+EC, 30 EC) в различные моменты времени (T0, T4-12 час, T48-72 час и 15 суток после повреждения) с использованием отдельных анализов TaqMan. Результаты сравнивали с 10 HV. Кратные изменение рассчитывали способом 2-ΔΔCT, с использованием miR-331 и miR-223* в качестве эталона.
Среди биомаркеров-кандидатов mTBI в оба момента времени (miR-184, miR-502, miR-505, miR-301b, miR-203, miR-425-5p, miR-654-3p и miR-655) только для двух демонстрировали интересные результаты, и они достоверно и дифференциально экспрессировались в 3 различных категориях по сравнению с HV. Конкретно, для miR-425-5p и miR-502 демонстрировали аналогичную тенденцию (фигура 3). Они обе в значительной степени подавлялась при mTBI+EC, miR-425-5p в моменты времени T0-1 час (p=0,01845) и T4-12 часов (p=0,01962) соответственно по сравнению с HV или EC и sTBI+EC (p<0,05), и miR-502 в моменты времени T0-1 час и T4-12 часов по сравнению с HV (p=0,02538 и p=0,03718 соответственно), или EC и sTBI+EC (p<0,01). Через 48 час после легкого повреждения miR425-5p и miR-502 возвращались обратно к нормальным уровням. Экспрессию miR-425-5p и miR-502 также выявляли в группе EC на сравнимом уровне с HV, таким образом, подтверждая, что только эти два биомаркера подавляются при повреждении головного мозга. Кроме того, ни для одного из них не демонстрировали какого-либо значительного снижения экспрессии при sTBI+EC по сравнению с HV во все моменты времени. Таким образом, miR-425-5p и miR-502 можно рассматривать как наиболее перспективные биомаркеры-кандидаты для ранней диагностики и мониторинга mTBI. AUC для этих биомаркеров в наиболее релевантные моменты времени приведены в таблице 4.
Отдельный анализ TaqMan на биомаркеры-кандидаты sTBI
MiR-21 и miR-335 анализировали как возможные биомаркеры sTBI, т.к. они обе, по-видимому, экспрессируются на повышенном уровне в оба момента времени sTBI+EC в первичном скрининге. Было продемонстрировано, что они являются сильными кандидатами также во втором наборе данных пациентов (фигура 4). Экспрессия mir-21 значительно повышалась при sTBI с EC во все моменты времени через 4 часа после повреждения по сравнению с HV, EC и mTBI+EC (p=0,00306 в момент времени T4-12 часов, p=0,00844 в момент времени T48-72 часа и p=0,00077 через 15 суток). Не наблюдали значимых отличий в оставшихся категориях по сравнению с HV. Для miR-335 демонстрировали повышение экспрессии при sTBI+EC и во все моменты времени по сравнению с HV (p=0,00109 в момент времени T0-1 час, p=0,00284 в момент времени T4-12 часов, p=0,00012 T48-72 час и p=0,01284 через 15 суток) и mTBI+EC, но не выявляли повышение экспрессии по сравнению с EC. AUC для этих биомаркеров также приведены в таблице 4.
Таблица 4
: Площадь под кривой четырех биомаркеров-кандидатов TBI в различные моменты времени.
Приведены только наиболее релевантные моменты времени.
Переменная(ые)
Площадь
Значимость
Asymptotic 95% Доверительный интервал
Нижняя граница
Верхняя граница
miR-425-5pВ T0
mTBI в сравнении с HV
1
0,002
1
1
mTBI сравнении с sTBI
0,911
0,020
0,778
1,000
mTBI сравнении с EC
0,950
0,01
0,860
1,000
miR-502 T0
mTBI в сравнении с HV
1
0,001
1,000
1,000
mTBI сравнении с sTBI
0,990
0,001
0,960
1,000
mTBI сравнении с EC
0,990
0,001
0,940
1,000
miR-21 T4-12 час
sTBI в сравнении с HV
0,961
0,003
0,880
1,000
sTBI сравнении с mTBI
0,960
0,001
0,870
1,000
sTBI сравнении с EC
0,900
0,004
0,740
1,000
miR-335 T0
sTBI в сравнении с HV
0,990
0,000
0,960
1,000
sTBI в сравнении с mTBI
0,780
0,023
0,590
0,960
sTBI в сравнении с EC
0,500
1
0,240
0,780
Обсуждение
Это исследование подтверждало полученные ранее данные о том, что изменения уровней мкРНК можно применять для диагностики TBI и оценки его тяжести. В исследовании подтверждали, что следующие ниже четыре мкРНК дифференциально экспрессируются при TBI: miR-425-5p, miR 502, miR-21 и miR-335.
Демонстрировали достоверные результаты для miR-425-5p через T0 и T4-12 часов при mTBI+EC по сравнению с HV и аналогичные результаты получали во всех других категориях. Их снижение экспрессии возвращаете к нормальным уровням через T48-72 часа, что подтверждает, что miR-425-5p является подходящим биомаркером-кандидатом легкой травмы.
Также подтверждали, что miR-502 дифференциально экспрессируется при mTBI+EC. Тенденция этой мкРНК являлся очень схожей с miR-425-5p. Показана ее специфичность у пациентов с травмой головного мозга и ее также можно использовать для отслеживания восстановления, т.к. она возвращается к нормальному значению через T48-72 часа после легкого повреждения.
Отмечали, что после sTBI 2 мкРНК (miR-21, miR-335) экспрессируются во все анализируемые моменты времени, и, таким образом, их подтверждали в качестве возможных биомаркеров для sTBI. Экспрессия miR-21 и miR-335 достоверно повышалась по сравнению с контролями при sTBI+EC. Таким образом, повышенная экспрессия подтверждала эффективность этих молекул в качестве биомаркеров sTBI.
Пример 3
Образцы слюны собирали у профессиональных спортсменов с сотрясением головного мозга через 2-3 суток после повреждения и анализировали микроРНК, содержащиеся в слюне. У спортсменов клинически диагностировали mTBI.
Материалы и способы
МикроРНК анализировали с использованием технологии nCounter (nanoString Technologies), в которой используют молекулярные "штрихкоды" и визуализацию на микроскопе для детекции и подсчета до нескольких сотен уникальных транскриптомов в одной реакции гибридизации. Каждый кодируемый цветом штрихкод присоединяли к одному специфическому к мишени зонду, соответствующему представляющей интерес микроРНК.
Анализы проводили по протоколу производителя, который включал следующие этапы:
Гибридизация
: В способе применяют два зонда ~20 оснований на микроРНК, которая гибридизуется в растворе. Репортерный зонд несет сигнал, тогда как захватывающий зонд обеспечивает иммобилизацию комплекса для собора данных.
Очистка и иммобилизация
: После гибридизации удаляют избыток зондов и комплексы зонд/мишень выравнивают и иммобилизуют в картридже nCounter.
Сбор данных
: Картриджи с образцом помещают в прибор цифровой анализатор для сбора данных. Цветовые коды на поверхности картриджа подсчитывают и вносят в таблицу для каждой молекулы-мишени.
Результаты
Таблица 5 ниже представляет собой список микроРНК, которые, как было обнаружено, достоверно и дифференциально экспрессируются у спортсменов в сотрясением головного мозга по сравнению со здоровыми добровольцами. В таблице показано кратное изменение экспрессии микроРНК у пациентов по сравнению с контрольной группой. Кратные изменения рассчитывали с использованием miR-23a-3p и miR-148b-3p в качестве референсных генов.
Таблица 5
микроРНК
Кратное изменение
hsa-let-7c-5p
2,80
hsa-let-7i-5p
1,82
hsa-miR-142-3p
1,41
hsa-miR-148a-3p
1,72
hsa-miR-15b-5p
2,30
hsa-miR-16-5p
2,32
hsa-miR-181a-5p
1,54
hsa-miR-20a-5p+hsa-miR-20b-5p<sup></sup>
2,16
hsa-miR-221-3p
2,90
hsa-miR-24-3p
1,94
hsa-miR-27b-3p
3,45
hsa-miR-29a-3p
4,03
hsa-miR-29c-3p
1,44
hsa-miR-424-5p
2,88
hsa-miR-30a-5p
2,16
hsa-miR-107
1,72
hsa-miR-135b-5p
1,97
hsa-miR-199b-5p
1,88
hsa-miR-324-5p
5,61
hsa-miR-652-3p
3,43
значения для miR-20a-5p и miR-20b-5p объединяли, т.к. с помощью технологии nCounter невозможно провести различие между ними.
Обсуждение
Это исследование демонстрирует, что микроРНК, содержащиеся в слюне, являются показателями сотрясения головного мозга/mTBI. Это является важным, поскольку слюну легче получать, чем кровь, и, таким образом, детекция микроРНК в слюне обеспечивает быстрый и удобный способ диагностики TBI, в частности "на поле".
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  The University of Birmingham
<120>  БИОМАРКЕРЫ ТРАВМАТИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА
<130>  PB150144WO
<150>  GB1603967.9
<151>  2016-03-08
<160>  69
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
uagcuuauca gacugauguu ga                                                22
<210>  2
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
aaugacacga ucacucccgu uga                                               23
<210>  3
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
auccuugcua ucugggugcu a                                                 21
<210>  4
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu                                               23
<210>  5
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  5
cagugcaaug auauugucaa agc                                               23
<210>  6
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  6
uggacggaga acugauaagg gu                                                22
<210>  7
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  7
cgucaacacu ugcugguuuc cu                                                22
<210>  8
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  8
gugaaauguu uaggaccacu ag                                                22
<210>  9
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  9
uaugucugcu gaccaucacc uu                                                22
<210>  10
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  10
auaauacaug guuaaccucu uu                                                22
<210>  11
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  11
gccccugggc cuauccuaga a                                                 21
<210>  12
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  12
cguguauuug acaagcugag uu                                                22
<210>  13
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  13
ugagguagua guuuguacag uu                                                22
<210>  14
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  14
cauuauuacu uuugguacgc g                                                 21
<210>  15
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  15
ugggucuuug cgggcgagau ga                                                22
<210>  16
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  16
ggauaucauc auauacugua ag                                                22
<210>  17
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  17
cuauauauca aacauauucc u                                                 21
<210>  18
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  18
uguaacagca acuccaugug ga                                                22
<210>  19
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  19
uaaugccccu aaaaauccuu au                                                22
<210>  20
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  20
uaauuuuaug uauaagcuag u                                                 21
<210>  21
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  21
uaguaccagu accuuguguu ca                                                22
<210>  22
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  22
gacuauagaa cuuucccccu ca                                                22
<210>  23
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  23
uccgguucuc agggcuccac c                                                 21
<210>  24
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  24
ugagguagua gguuguaugg uu                                                22
<210>  25
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  25
ugagguagua guuugugcug uu                                                22
<210>  26
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  26
uguaguguuu ccuacuuuau gga                                               23
<210>  27
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  27
ucagugcacu acagaacuuu gu                                                22
<210>  28
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  28
uagcagcaca ucaugguuua ca                                                22
<210>  29
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  29
uagcagcacg uaaauauugg cg                                                22
<210>  30
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  30
aacauucaac gcugucggug agu                                               23
<210>  31
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  31
uaaagugcuu auagugcagg uag                                               23
<210>  32
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  32
caaagugcuc auagugcagg uag                                               23
<210>  33
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  33
agcuacauug ucugcugggu uuc                                               23
<210>  34
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  34
uggcucaguu cagcaggaac ag                                                22
<210>  35
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  35
uucacagugg cuaaguucug c                                                 21
<210>  36
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  36
uagcaccauc ugaaaucggu ua                                                22
<210>  37
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  37
uagcaccauu ugaaaucggu ua                                                22
<210>  38
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  38
uguaaacauc cucgacugga ag                                                22
<210>  39
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  39
agcagcauug uacagggcua uca                                               23
<210>  40
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  40
uauggcuuuu cauuccuaug uga                                               23
<210>  41
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  41
cccaguguuu agacuaucug uuc                                               23
<210>  42
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  42
cgcauccccu agggcauugg ugu                                               23
<210>  43
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  43
aauggcgcca cuaggguugu g                                                 21
<210>  44
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  44
cagcagcaau ucauguuuug aa                                                22
<210>  45
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  45
uacccuguag auccgaauuu gug                                               23
<210>  46
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  46
uaacagucua cagccauggu cg                                                22
<210>  47
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  47
ugucaguuug ucaaauaccc ca                                                22
<210>  48
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  48
ugagaugaag cacuguagcu c                                                 21
<210>  49
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  49
ucagugcauc acagaacuuu gu                                                22
<210>  50
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  50
uaaggugcau cuagugcaga uag                                               23
<210>  51
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  51
cugaccuaug aauugacagc c                                                 21
<210>  52
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  52
uaauacuguc ugguaaaacc gu                                                22
<210>  53
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  53
aaacucuacu uguccuucug agu                                               23
<210>  54
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  54
ucaauaaaug ucuguugaau u                                                 21
<210>  55
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  55
cagugcaaug uuaaaagggc au                                                22
<210>  56
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  56
agguucugug auacacuccg acu                                               23
<210>  57
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  57
uucacagugg cuaaguucug c                                                 21
<210>  58
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  58
cagugcaaua guauugucaa agc                                               23
<210>  59
<211>  20
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  59
ccucugggcc cuuccuccag                                                   20
<210>  60
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  60
gcugacuccu aguccagggc uc                                                22
<210>  61
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  61
uuaucagaau cuccaggggu ac                                                22
<210>  62
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  62
acuggacuua gggucagaag gc                                                22
<210>  63
<211>  23
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  63
uucauuuggu auaaaccgcg auu                                               23
<210>  64
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  64
gucccucucc aaaugugucu ug                                                22
<210>  65
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  65
aacccguaga uccgaucuug ug                                                22
<210>  66
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  66
aaagugcuuc ucuuuggugg gu                                                22
<210>  67
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  67
uggguuuacg uugggagaac u                                                 21
<210>  68
<211>  21
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  68
aucacauugc cagggauuuc c                                                 21
<210>  69
<211>  22
<212>  РНК
<213>  Homo sapiens
<400>  69
ucagugcauc acagaacuuu gu                                                22
<---