КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ СУЛЬФОРАФАН ИЛИ ПРЕДШЕСТВЕННИК СУЛЬФОРАФАНА И ЭКСТРАКТ ИЛИ ПОРОШОК МОЛОЧНОГО ЧЕРТОПОЛОХА
COMPOSITIONS COMPRISING A SULFORAPHANE OR A SULFORAPHANE PRECURSOR AND MILK THISTLE EXTRACT OR POWDER

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании следующих заявок, каждая из которых включена в настоящий документ путем ссылки в полном объеме: предварительная заявка на Патент США №61/668328, поданная 5 июля 2012; предварительная заявка на Патент США №61/668342, поданная 5 июля 2012; предварительная заявка на Патент США №61/668386, поданная 5 июля 2012; предварительная заявка на Патент США №61/668396, поданная 5 июля 2012; предварительная заявка на Патент США №61/668364, поданная 5 июля 2012; предварительная заявка на Патент США №61/668374, поданная 5 июля 2012 и предварительная заявка на Патент США №61/794417, поданная 15 марта 2013.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к комбинации предшественника сульфорафана, фермента, способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, потенциатора фермента и экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также относится к комбинации сульфорафана или его производного и экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также относится к комбинации экстракта или порошка брокколи и экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение предоставляет композиции и способы, относящиеся к этим комбинациям.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Употребление натуральных продуктов приобретает возрастающую популярность у людей и домашних животных. Некоторые из этих натуральных продуктов включают в состав биологически активных добавок к пище и продуктов лечебного питания. В данной области имеется потребность в добавках, полезных в качестве агентов - хемопротекторов и/или антиоксидантов. Кроме того, имеется потребность в данной области в фармацевтических композициях и биологически активных добавках, полезных при состояниях и нарушениях, связанных с глутатионом. Хемопротекция путем употребления натуральных продуктов развивается в качестве эффективного, недорогого, доступного и практичного средства для профилактики или уменьшения частоты многих состояний, влияющих на человека и домашних животных. Известно, что канцерогены, способные повреждать клетки на молекулярном уровне часто поглощаются и вдыхаются в виде нетоксичных предшественников. Эти нетоксичные предшественники могут впоследствии превращаться в организме в канцерогенные вещества. Хемопротективные агенты, такие как натуральные вещества, способные активировать детоксифицирующие ферменты или их кофакторы, могут нейтрализовать и обеспечивать удаление канцерогенов. Эти натуральные вещества могут усиливать другие существующие в природе защитные механизмы, такие как иммунная система.
Некоторые натуральные продукты обладают антиоксидантной активностью. Окислительный стресс играет основную роль в старении, развитии нейродегенеративных заболеваний, равно как, при физиологической травме, такой как ишемия. Агенты антиоксиданты могут уменьшать или ингибировать окисление необходимых биомолекул и могут играть роль в лечении, профилактике или уменьшении частоты состояний, вызываемых окислительным стрессом.
Некоторые натуральные продукты являются полезными для здоровья печени. Неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) представляет собой наиболее распространенное заболевание печени в США, которым страдают около 30% населения. NAFLD известна также под названием липидоз печени. У 10% субъектов с NAFLD заболевание будет прогрессировать в неалкогольный стеатогепатит (NASH), из них у 25% разовьется цирроз. Потенциально у 10-25% из этих пациентов с циррозом разовьется гепатоцеллюлярная карцинома. При текущей частоте возникновения и при отсутствии эффективных способов лечения предполагается, что к 2030 году гепатоцеллюларная карцинома станет наиболее часто диагностируемым раком в Соединенных Штатах. NAFLD возникает при накоплении жира в печени (стеатоз), но не под действием чрезмерного употребления алкоголя.
NAFLD ассоциируют с хроническим воспалением, резистентностью к инсулину, диабетом и ожирением. При NAFLD симптомы отсутствуют или выражены слабо, его наиболее часто диагностируют при отклонении от нормы результатов, полученных при рутинных анализах крови (то есть, при повышенном содержании ALT (аланинаминотрансфераза) и AST (аспартатаминотрансфераза) в сыворотке) и подтверждают ультразвуковым исследованием или биопсией. В настоящее время отсутствуют хирургические или фармакологические способы лечения NAFLD. Рекомендации по контролю NAFLD включают изменения образа жизни, такие как употребление здоровой пищи, упражнения, снижение массы тела, снижение уровня холестерина и контроль диабета.
NAFLD часто связывают со снижением содержания глутатиона. Глутатион представляет собой трипептид с гамма пептидной связью между аминогруппой цистеина и карбоксильной группой боковой цепи глутамата. Глутатион в организме играет важную роль в качестве антиоксиданта, детоксиканта и агента, увеличивающего иммунитет. Глутатион может соединяться с метаболитами и токсинами, такими как проканцерогены, для их выведения из организма. У пациентов содержание глутатиона может понижаться по ряду причин, включая неправильное питание, загрязнение, воздействие токсинов и/или некоторых лекарственных средств, стресс, травму, старение, инфекции и радиацию. Низкое содержание глутатиона может вызвать у пациента восприимчивость к оксислительному стрессу, повысить заболеваемость и предрасположенность к раку. Например, пониженное содержание глутатиона ассоциируют с состояниями, связанными с печенью, простатой, головным мозгом, легкими, почками, толстой кишкой, молочной железой, пищеводом, поджелудочной железой, яичниками и так далее. Примеры расстройств, ассоциируемых с пониженным содержанием и дефицитом глутатиона, включают, не ограничиваясь перечисленными: NAFLD, рак (легкого, простаты, толстой кишки, молочной железы, головного мозга, печени, яичников, пищевода, поджелудочной железы, носа и глотки, остеосаркому), лейкоз, муковисцидоз, ВИЧ, дефицит глутатионсинтетазы, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, Болезнь Гантингтона, болезнь Шарко, наследственную атаксию Фридрейха, рассеянный склероз, фибромиалгию, хроническую усталость, аутизм и диабет.
Примером натурального продукта, который как полагают, обладает хемопротекторными и антиоксидантными свойствами, является сульфорафан. Сульфорафан представляет собой органическое сераорганическое соединение, также известное как 1-изотиоционат-4-метилсульфинилбутан. Предшественник сульфорафана, глюкорафанин, может быть получен из овощей семейства Brassicaceae, таких как брокколи, брюссельская капуста и кочанная капуста. Однако, для того чтобы получить из овощей количества достаточные для хемопротекции необходимо потратить их в больших объемах. Глюкорафанин превращается в сульфорафан при помощи тиоглюкозидазного фермента, называемого мирозиназа, доступного из разнообразных экзогенных ресурсов, таких как овощи Brassicaceae и эндогенно из микрофлоры кишечника. Однако, после поглощения глюкорафанина, не все животные способны осуществлять его превращение в сульфорафан, скорее всего из-за вариаций популяций микрофлоры и общего состояния здоровья. Кроме того, в кислой среде, такой как в желудке, глюкорафанин может превращаться в инертные метаболиты. Активный метаболит, сульфорафан, возбуждает ядерный эритроид-2-связанный фактор (Nrf2), в свою очередь увеличивающий образование детоксифицирующих ферментов фазы II и цитопротекторных ферментов, таких как, глутатион-S-трансфераза, NAD(Р)Н: хинон оксидоредуктаза (NQ01) и гем-оксигеназа-1 (НО-1). Полагают, что сульфорафан стимулирует выработку этих ферментов, не влияя при этом значительно на синтез р-450 цитохромных ферментов. Увеличение выработки ферментов фазы II, как полагают, играет роль во множестве биологических процессов, включая защиту головного мозга от цитотоксичности, защиту печени от токсического эффекта накопления жира и детоксификацию многих других тканей.
Сульфорафан и его предшественник глюкорафанин интенсивно изучались. Shapiro et al. (Nutrition and Cancer, (2006), Vol. 55(1), pp. 53-62) обсуждают клиническое исследование фазы I, определяющее безопасность, переносимость и метаболизм глюкозинолатов и изотиоцианатов ростков брокколи. Shapiro et al. обсуждают рандомизированное, двойное слепое, клиническое исследование с плацебо-контролем экстрактов ростков, содержащих, либо глюкозинолаты, такие как глюкорафанин, либо изоцианаты, такие как сульфорафан у здоровых испытуемых. Исследование показало, что введение этих веществ не привело к систематическим, клинически значимым побочным эффектам.
Молочный чертополох {Silybum marianum) представляет собой растение семейства Asteraceae. Молочный чертополох содержит силимарин, который состоит из ряда компонентов, включая, но не ограничиваясь перечисленными, флавонолигнаны, такие как силибинин (также известный как силибин), изосилибинин, силикристин, силидианин, кверцетин, дегидросилибин, дезоксисилицистин, дезоксисилидианин, силандрин, силибином, силигермин и неосилигермин. Компоненты силимарина возможно обладают рядом биологических эффектов, включая ингибирование образования свободных радикалов, связывание свободнорадикальных частиц, предотвращение перекисного окисления липидных мембран, увеличение содержания глутатиона и хелатирование железа. Силибинин является наиболее активным компонентом силимарина и, как полагают, обладает гепатопротекторными свойствами. Силимарин обсуждают в Патенте США №7563779, который включен в настоящий документ в полном объеме путем ссылки.
Zhang et al. {Proc. Natl. Acad. Sci., (1994), Vol. 91, pp. 3147-3150) описывают исследование на крысах Sprague-Dawley для определения антиканцерогенной активности сульфорафана и его структурных аналогов, синтетических норборнил изотиоцианатов. Исследование показало, что введение сульфорафана было эффективно в блокировании образования опухоли молочной железы.
Cornblatt et al. (Carcinogenesis, (2007), Vol. 38(7): pp. 1485-1490) описывают исследование на крысах Sprague-Dawley для определения эффекта сульфорафана в хемопротекции молочной железы. Исследование показало, что пероральное введение любого сульфорафана приводило к трехкратному увеличению ферментативной активности NAD(Р)Н: хинон оксидоредуктазы (NQ01) и четырехкратному увеличению имунного окрашивания фермента гем-оксигеназы-1 (НО-1) в эпителии молочной железы.
Munday et al. (Cancer Res, (2008), Vol. 68(5): pp. 1593-1600) описывают исследование, касающееся влияния лиофилизированного водного экстракта ростков брокколи на развитие рака мочевого пузыря у крыс. Исследование показало, что введение экстракта ростков брокколи приводило к значительной индукции глутатион-3-трансферазы и NAD(Р)Н: хинон оксидоредуктазы 1 в мочевом пузыре, ферментов, обладающих защитной активностью против оксидантов и канцерогенов.
Aghazadeh S et al. (Exp Toxicol Pathol. (2011) Sep; 63(6):569-74) описывают антиапоптотические и противовоспалительные эффекты Silybum marianum при лечении экспериментального стеатогепатита. Исследование показало, что введение экстракта Silybum maranium крысам, получавшим, с целью индуцировать неалкогольный стеатогепатит, обедненную метионином и холином (MCD) диету, обусловило повышение активности AST и ALT наряду с возрастанием содержания глутатиона по сравнению с крысами в контроле, получавшим только диету MCD.
Заявка на Европейский патент №2213280 раскрывает композиции, содержащие глюкозинолаты, такие как глюкорафанин и мирозиназа, причем композиция заключена в оболочку или покрыта оболочкой.
Все приведенные в настоящем документе источники включены в настоящий документ в полном объеме путем ссылки.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает композицию, содержащую: (i) предшественник сульфорафана, предпочтительно глюкорафанин; (ii) фермент, способный превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, предпочтительно фермент глюкозидазу, более предпочтительно фермент тиоглюкозидазу и наиболее предпочтительно мирозиназу; (iii) потенциатор фермента, предпочтительно аскорбиновую кислоту и (iv) экстракт или порошок молочного чертополоха. Настоящее изобретение также предлагает способ лечения, профилактики, уменьшения частоты, уменьшения симптомов, и/или уменьшения повторных рецидивов заболевания или состояния, связанного с печенью, простатой, головным мозгом, легкими, почками, толстой кишкой, молочной железой, пищеводом, поджелудочной железой, или яичниками у субъекта, содержащий введение субъекту: (i) предшественника сульфорафана, (ii) фермента, способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, (iii) потенциатора фермента и (iv) экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также предлагает способ увеличения содержания глутатиона у субъекта, нуждающегося в этом, содержащий введение субъекту: (i) предшественника сульфорафана, (ii) фермента, способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, (iii) потенциатора фермента и (iv) экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также предлагает способ лечения, профилактики, уменьшения частоты, уменьшения симптомов и/или уменьшения повторных рецидивов заболевания, неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) и/или любого другого расстройства печени, содержащий введение субъекту: (i) предшественника сульфорафана, (ii) фермента, способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, (iii) потенциатора фермента и (iv) экстракта или порошка молочного чертополоха.
Настоящее изобретение предлагает композицию содержащую: (i) сульфорафан или его производное и (ii) экстракт или порошок молочного чертополоха. Настоящее изобретение также предлагает способ лечения, профилактики, уменьшения частоты, уменьшения симптомов, и/или уменьшения повторных рецидивов заболевания или состояния, связанного с печенью, простатой, головным мозгом, легкими, почками, толстой кишкой, молочной железой, пищеводом, поджелудочной железой или яичниками у субъекта, содержащий введение субъекту: (i) сульфорафана или его производного и (ii) экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также предлагает способ увеличения содержания глутатиона у субъекта, нуждающегося в этом, содержащий введение субъекту: (i) сульфорафана или его производного и (ii) экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также предлагает способ лечения, профилактики, уменьшения частоты, уменьшения симптомов, и/или уменьшения повторных рецидивов неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), и/или любого другого расстройства печени, содержащий введение субъекту: (i) сульфорафана или его производного и (ii) экстракта или порошка молочного чертополоха.
Настоящее изобретение предлагает композицию содержащую: (i) экстракт или порошок брокколи и (ii) экстракт или порошок молочного чертополоха. Настоящее изобретение также предлагает способ лечения, профилактики, уменьшения частоты, уменьшения симптомов, и/или уменьшения повторных рецидивов заболевания или состояния, связанного с печенью, простатой, головным мозгом, легкими, почками, толстой кишкой, молочной железой, пищеводом, поджелудочной железой или яичниками у субъекта, содержащий введение субъекту: (i) экстракта или порошка брокколи и (ii) экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также предлагает способ увеличения содержания глутатиона у субъекта нуждающемуся в этом, содержащий введение субъекту: (i) экстракта или порошка брокколи и (ii) экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также предлагает способ лечения, профилактики, уменьшения частоты, уменьшения ассоциируемых симптомов, и/или уменьшения повторных рецидивов неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) и/или любого другого расстройства печени, содержащий введение субъекту: (i) экстракта или порошка брокколи и (ii) экстракта или порошка молочного чертополоха.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
ФИГ. 1 представляет собой схему, описывающую превращение глюкорафанина при 38°C без аскорбиновой кислоты, как описано в Примере 4.
ФИГ. 2 представляет собой схему, описывающую превращение в течение около 10 минут при 38°C в зависимости от концентрации аскорбиновой кислоты, как описано в Примере 4.
ФИГ. 3 представляет собой график, описывающий превращение до сульфорафана в течение 30 минут при 38°C и 1 мМ аскорбиновой кислоты, как описано в Примере 4.
ФИГ. 4 представляет собой схему, описывающую превращение глюкорафанина в жидкости, имитирующей кишечный сок, как описано в Примере 5.
ФИГ. 5 представляет собой схему, описывающую результаты эксперимента, описанные в Примере 6.
ФИГ. 6 представляет собой схему, описывающую результаты эксперимента, описанные в Примере 6.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к комбинации предшественника сульфорафана, фермента, способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, потенциатора фермента и экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также относится к комбинации сульфорафана или его производного и экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также относится к комбинации экстракта или порошка брокколи и экстракта или порошка молочного чертополоха. Настоящее изобретение также относится к применению экстракта или порошка молочного чертополоха в смеси с одним или более из следующего: предшественник сульфорафана, сульфорафан или его производное и экстракт брокколи. Настоящее изобретение предлагает композиции, относящиеся к этим комбинациям.
Настоящее изобретение предлагает способы, содержащие введение этих комбинаций. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация может вводиться субъекту для лечения, профилактики, уменьшения частоты, уменьшения симптомов, и/или уменьшения повторных рецидивов заболевания или состояния, связанного с печенью, простатой, головным мозгом, легкими, почками, толстой кишкой, молочной железой, пищеводом, поджелудочной железой или яичниками. В некоторых вариантах выполнения изобретения субъекту, нуждающемуся в лечении, можно применять комбинацию для увеличения содержания глутатиона у субъекта. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинацию можно применять для лечения, профилактики, уменьшения частоты, уменьшения симптомов, и/или уменьшения повторных рецидивов неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD)и/или любого другого расстройства печени у субъекта.
Сульфорафан также известен как 1-изотиоцианат-4-метилсульфинилбутан. Производные сульфорафана включают, не ограничиваясь, сульфокситиокарбаматные аналоги сульфорафана, 6-метилсульфинилгексилизотиоцианат (6-HITC) и соединения, содержащие сульфорафановую структуру с различными боковыми цепями и/или различными длинами спейсеров между изотиоцианатной и сульфоксидной группами. Примеры производных сульфорафана включают производные, описанные в следующих источниках, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки: Hu et al., Eur J Med Chem, 2013, 64:529-539; Ann et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107 (21): 9590-9595 и Morimistu et al., J. Biol. Chem. 2002, 277:3456-3463 и Baird et al., Arch Toxicol, 201 1, 85 (4):241-272.
В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция содержит сульфорафан или его производное, предпочтительно сульфорафан, в количестве от 1 мкг до около 10 г, предпочтительно около 3 мкг до около 5 г, предпочтительно около 5 мкг до около 1000 мг, предпочтительно около 7 мкг до около 750 мг, более предпочтительно около 10 мкг до около 500 мг и наиболее предпочтительно около 100 мкг до около 100 мг. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции, пригодные для применения у человека, содержат около 1 мг до около 20 мг.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способы по настоящему изобретению содержат введение субъекту сульфорафана или его производного, предпочтительно сульфорафана, в количестве от 1 мкг до около 10 г, предпочтительно около 3 мкг до около 5 г, предпочтительно около 5 мкг до около 1000 мг, предпочтительно около 7 мкг до около 750 мг, более предпочтительно около 10 мкг до около 500 мг и наиболее предпочтительно около 100 мкг до около 100 мг. В некоторых вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ содержит введение от около 1 мг до около 20 мг. В некоторых вариантах выполнения изобретения способы по настоящему изобретению содержат введение субъекту сульфорафана или его производного, предпочтительно сульфорафана, в количестве от около 0,01 мкг/кг до около 0,2 г/кг, предпочтительно около 0,05 мкг/кг до около 0,07 г/кг, более предпочтительно около 0,07 мкг/кг до около 15 мг/кг, более предпочтительно около 0,1 мкг/кг до около 11 мг/кг и наиболее предпочтительно около 0,2 мкг/кг до около 7 мг/кг. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ содержит введение около 2 мкг/кг до около 2 мг/кг и более предпочтительно около 0,01 мг/кг до около 0,3 мг/кг. Вышеприведенные количества могут относиться к единичной дозе или общей суточной дозировке. Под общей суточной дозировкой подразумевают общее количество соединения или ингредиента, которое вводят субъекту за двадцать четыре часа.
В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции содержат более чем один сульфорафан или его производное. Например, способы или композиция могут содержать как сульфорафан, так и одно или более его производных или два или более его производных. В некоторых вариантах выполнения изобретения, в которых способ или композиция содержат более чем один сульфорафан или его производное, вышеописанные количества могут относиться к количеству сульфорафана или его производного или общему количеству более чем одного сульфорафана или его производного.
Термин "предшественник сульфорафана" относится к любому соединению, веществу или материалу, которое можно использовать для получения сульфорафана. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения предшественник сульфорафана содержит соединение, которое можно превратить или предпочтительно ферментативно метаболизировать в сульфорафан. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения предшественник сульфорафана содержит глюкорафанин. Глюкорафанин представляет собой глюкозинолат, также известный как 4-метилсульфинилбутилглюкозинолат и 1-S-[(1Е)-5-(метилсульфинил)-N-(сульфонатоокси)пентанимидоил]-1-тио-β-D-глюкопираноза.
В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция содержит около 1 мкг до около 10 г, предпочтительно около 250 мкг до около 5 г, более предпочтительно около 500 мкг до около 2000 мг, еще более предпочтительно около 1 мг до около 750 мг, еще более предпочтительно около 1,5 мг до около 250 мг, еще более предпочтительно около 2 мг до около 100 мг и наиболее предпочтительно около 3 мг до около 75 мг предшественника сульфорафана, предпочтительно глюкорафанина. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции, пригодные для применения у человека, содержат около 3,5 мг до около 50 мг предшественника сульфорафана, предпочтительно глюкорафанина.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение предшественника сульфорафана, предпочтительно глюкорафанина субъекту, в количестве от около 1 мкг до около 10 г, предпочтительно около 250 мкг до около 5 г, более предпочтительно около 500 мкг до около 2000 мг, еще более предпочтительно около 1 мг до около 750 мг, еще более предпочтительно около 1,5 мг до около 250 мг, еще более предпочтительно около 2 мг до около 100 мг и наиболее предпочтительно около 3 мг до около 75 мг. В некоторых вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ содержит введение около 3,5 мг до около 50 мг. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение субъекту предшественника сульфорафана в количестве от около 1 мкг/кг до около 1000 мг/кг, предпочтительно около 5 мкг/кг до около 500 мг/кг, более предпочтительно около 7,5 мкг/кг до около 100 мг/кг, еще более предпочтительно около 10 мкг/кг до около 25 мг/кг и наиболее предпочтительно около 25 мкг/кг до около 10 мг/кг. В некоторых вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ содержит введение около 50 мкг/кг до около 800 мкг/кг. Вышеприведенные количества могут относиться к единичной дозе или общей суточной дозировке.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение более чем одного предшественника сульфорафана. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция содержит более чем один предшественник сульфорафана. В некоторых вариантах выполнения изобретения, в которых способ или композиция содержат более чем один предшественник сульфорафана, вышеуказанные количества могут относиться к количеству каждого предшественника сульфорафана или общему количеству предшественников сульфорафана.
Предшественник сульфорафана может превращаться или метаболизироваться до сульфорафана. В некоторых вариантах выполнения изобретения предшественник сульфорафана превращают в сульфорафан ферментативно. В некоторых вариантах выполнения изобретения фермент, способный превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, содержит глюкозидазный фермент, предпочтительно тиоглюкозидазный фермент и более предпочтительно мирозиназу. Мирозиназа также известна как тиоглюкозид глюкогидролаза.
В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция содержит фермент в количестве от около 1 пг до около 1 мкг, предпочтительно около 50 пг до около 500 нг и наиболее предпочтительно около 1 нг до около 150 нг. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции пригодные для применения у человека содержат около 5 нг до около 75 нг фермента.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение фермента, предпочтительно мирозиназы, в количестве от около 1 пг около 1 мкг, предпочтительно около 50 пг до около 500 нг и наиболее предпочтительно около 1 нг до около 150 нг. В некоторых вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ содержит введение около 5 нг до около 7 5 нг фермента. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение фермента субъекту в количестве от около 0,02 пг/кг до около 0,02 мкг/кг, предпочтительно около 0,7 пг/кг до около 7 нг/кг и наиболее предпочтительно около 0,02 нг/кг до около 2 нг/кг. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ содержит введение около 0,1 нг/кг до около 1 нг/кг. Вышеприведенные количества могут относиться к единичной дозе или общей суточной дозировке.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение более чем одного фермента, способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан.
В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция содержит более чем один фермент, способный превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан. В некоторых вариантах выполнения изобретения, в которых способы или композиции содержат более чем один фермент, вышеуказанные количества могут относиться к количеству каждого фермента или общему количеству ферментов.
Настоящее изобретение также предлагает применение экстракта и/или порошка брокколи, включая, но, не ограничиваясь, экстракты и порошки семян и ростков брокколи. Настоящее изобретение предлагает способы введения экстракта и/или порошка брокколи и композиции, содержащие экстракт и/или порошок брокколи. В некоторых вариантах выполнения изобретения экстракт или порошок брокколи стандартизован до содержания от около 1 вес. % до около 75 вес. %, более предпочтительно около 2,5 вес. % до около 50 вес. %, еще более предпочтительно около 5 вес. % до около 25 вес. % и наиболее предпочтительно около 10 вес. % до около 20 вес. % предшественника сульфорафана, предпочтительно глюкорафанина. Примеры экстрактов и порошков брокколи включают в себя, не ограничиваясь, примеры, описанные в Патентах США №№5,411,986; 5,725,895; 5,968,505; 5,968,567; 6,177,122; 6,242,018; 6,521,818; 7,303,770 и 8,124,135, каждый из которых включен в настоящий документ в полном объеме путем ссылки. Порошки брокколи можно получать, например, посредством воздушной сушки, лиофильной сушки, сушки в сушильном барабане, сушки распылением, термической сушки и/или сушки в низком вакууме брокколи, предпочтительно ростков брокколи. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции и способы содержат применение около 1 мкг до около 10 г, более предпочтительно около 250 мкг до около 5 г, еще более предпочтительно около 500 мкг до около 1 г, предпочтительно около 600 мкг до около 500 мг, более предпочтительно около 750 мкг до около 400 мг и наиболее предпочтительно около 1 мг до около 300 мг экстракта брокколи. В некоторых вариантах выполнения изобретения экстракт или порошок брокколи присутствует в композиции или вводится субъекту в количествах достаточных, чтобы обеспечить субъекта предшественником сульфорафана или сульфорафаном в вышеописанных количествах. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция может дополнительно содержать потенциатор фермента, предпочтительно аскорбиновую кислоту. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ может дополнительно содержать введение потенциатора фермента, предпочтительно аскорбиновой кислоты.
Сульфорафан или его производное, предшественник сульфорафана и/или фермент, способный превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан можно получить из любого источника, включая, но не ограничиваясь перечисленными, одно или более из растений семейства Brassicaceae (также известного как Cruciferae). Примеры растений семейства Brassicaceae включают, но, не ограничиваясь перечисленными, следующие: брокколи, брюссельскую капусту, спарассис кудрявый (Sparassis crispa), кочанную капусту, хрен обыкновенный, пастернак, редис, японский хрен, горчицу полевую и белую горчицу. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения предшественник сульфорафана, предпочтительно глюкорафанин и фермент, предпочтительно мирозиназу, получают из брокколи, ростков брокколи или семян брокколи. Предшественник сульфорафана и фермент может быть получен из одного источника или из различных источников. В некоторых вариантах выполнения изобретения предшественник сульфорафана и фермент могут быть получены из экстракта или порошка этих растений, предпочтительно экстракта или порошка семян или ростков брокколи.
Настоящее изобретение предлагает применение потенциатор фермента. Потенциаторы фермента могут применяться для увеличения активности фермента, что способствует превращению предшественника сульфорафана в сульфорафан. В некоторых вариантах выполнения изобретения потенциатор фермента содержит кофактор фермента, предпочтительно аскорбиновую кислоту. Аскорбиновая кислота, также известная как аскорбат или витамин С, может потенцировать активность мирозиназы. В некоторых вариантах выполнения изобретения без потенциатора фермента, такого как аскорбиновая кислота, реакция превращения в сульфорафан может протекать слишком медленно, для локализации, необходимой для максимальной абсорбции. Потенциатор фермента может быть получен из натурального источника или его можно получить синтетически.
В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции могут содержать около 1 мг до около 500 мг, предпочтительно около 1 мг до около 250 мг и наиболее предпочтительно около 1 мг до около 125 мг потенциатора фермента. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения композиции, пригодные для применения у человека, содержат около 1 мг до около 50 мг потенциатора фермента.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ по настоящему изобретению содержит введение потенциатора фермента, предпочтительно аскорбиновой кислоты, в количестве от около 1 мг до около 500 мг, предпочтительно около 1 мг до около 250 мг и наиболее предпочтительно около 1 мг до около 125 мг. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ содержит введение около 1 мг до около 50 мг. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ по настоящему изобретению содержит введение потенциатора фермента, предпочтительно аскорбиновой кислоты, в количестве около 0,01 мг/кг до около 3 мг/кг, и лучше всего около 0,02 мг/кг до около 2 мг/кг. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ содержит введение около 0,02 мг/кг до 0,7 мг/кг потенциатора фермента. Вышеприведенные количества могут относиться к единичной дозе или общей суточной дозировке.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение более чем одного потенциатора фермента. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция содержит более чем один потенциатор фермента. В некоторых вариантах выполнения изобретения, в которых способ или композиция содержат более чем один потенциатор фермента, вышеприведенные количества могут относиться к количеству любого потенциатора фермента или общему количеству потенциаторов ферментов.
Настоящее изобретение также содержит применение экстракта или порошка молочного чертополоха. Молочный чертополох принадлежит к виду Silybum marianum. Молочный чертополох содержит ряд компонентов или фракций, обладающих биологической активностью. Активная фракция молочного чертополоха представляет собой силимарин, содержащий ряд компонентов.
Примеры компонентов силимарина включают, не ограничиваясь перечисленными: силибинин (также известный как силибин), изосилибинин, силикристин, силидианин и кверцетин, дегидросилибин, дезоксисилицицистин, дезоксисилидианин, силандрин, силибином, силигермин и неосилигермин. Изомеры силибинина включают Силибинин А и Силибинин В. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения экстракт или порошок молочного чертополоха содержит силимарин.
В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции и способы по настоящему изобретению могут содержать применение одного или более производных силимарина, вместо или дополнительно к экстракту или порошку молочного чертополоха. Производные силимарина включают любые модифицированные формы вышеприведенных соединений, включая, но не ограничиваясь перечисленными, 7-O- и 23-О-ацильные производные и аналоги. Примеры производных компонентов силимарина включают, но не ограничиваясь перечисленными, 2,3-дегидросилибин (DHS); 7-0-метилсилибин; 7-O-галлоилсилибин; 7,23-силибиндисульфат (DSS); 7-О-пальмитоилсилибин и 23-O-пальмитоилсилибин. Примеры производных включают примеры, описанные в следующих источниках, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки: Agarwal et al. PLOS ONE, 2013, 8(3):e60074; GB 2167414 и CA1337124. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции и способы по настоящему изобретению могут содержать применение силимарина или силибинина в очищенной форме или силимарина или силибинина, приготовленных синтетически, вместо или дополнительно к экстракту или порошку молочного чертополоха.
В некоторых вариантах выполнения изобретения можно применять экстракт или порошок молочного чертополоха. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения экстракт молочного чертополоха содержит силимарин. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения экстракт молочного чертополоха содержит силибинин. В некоторых вариантах выполнения изобретения экстракт или порошок молочного чертополоха стандартизован до содержания от около 25% до около 95%, предпочтительно около 50% до около 90% и более предпочтительно около 55% до около 85% силимарина. В некоторых вариантах выполнения изобретения экстракт или порошок молочного чертополоха стандартизован до содержания около 5% до около 75%, предпочтительно около 10% до около 60%, более предпочтительно около 15% до около 50% и наиболее предпочтительно около 20% до около 35% силибинина. Примеры экстракта молочного чертополоха включают, но не ограничиваясь описанными в Патенте США №6,555,141; Патенте США №6,863,906; Патенте США №7563779; заявке WO 200908006; заявке ЕР 2020238; заявке WO 2009043671; патенте ЕР 1584240 и заявке WO 2011076154, каждый из которых включен в настоящий документ в полном объеме путем ссылки. Порошки молочного чертополоха можно получить, например, посредством воздушной сушки, лиофильной сушки, сушки в сушильном барабане, сушки распылением, термической сушки и/или сушки в низком вакууме молочного чертополоха.
В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции и способы содержат применение от около 1,25 мг до около 15 граммов, предпочтительно около 5 мг до около 10 граммов и наиболее предпочтительно около 10 мг до около 7,5 граммов экстракта молочного чертополоха. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых композиция пригодна для применения у человека, композиция содержит около 25 мг до около 5 граммов молочного чертополоха. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция содержит около 0,75 мг до около 15 граммов, предпочтительно около 3 мг до около 7 граммов, более предпочтительно около 7 мг до около 5 граммов и наиболее предпочтительно около 15 мг до около 3,5 граммов силимарина. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых композиция пригодна для применения у человека, композиция содержит около 50 мг до около 200 мг силимарина. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция содержит около 0,3 мг до около 5 граммов, предпочтительно около 1,5 мг до около 3 граммов, более предпочтительно около 3 мг до около 2 граммов и наиболее предпочтительно около 7 мг до около 1,5 граммов силибинина. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых композиция пригодна для применения у человека, композиция содержит около 30 мг до около 90 мг силибинина.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение силимарина в количестве от около 1 мкг/кг до около 75 мг/кг, предпочтительно около 2,5 мкг/кг до около 50 мг/кг, более предпочтительно около 5 мкг/кг до около 25 мг/кг, более предпочтительно около 10 мкг/кг до около 15 мг/кг, и наиболее предпочтительно около 15 мкг/кг до около 10 мг/кг. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ содержит введение около 1 мг/кг до около 3 мг/кг силимарина. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение силибинина в количестве от около 0,5 мкг/кг до около 50 мг/кг, предпочтительно около 1 мкг/кг до около 35 мг/кг, более предпочтительно около 2,5 мкг/кг до около 25 мг/кг, более предпочтительно около 5 мкг/кг до около 10 мг/кг и наиболее предпочтительно около 7,5 мкг/кг до около 5 мг/кг. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых субъектом является человек, способ дополнительно содержит введение около 3 00 мкг/кг до около 2 мг/кг силибинина. В вариантах выполнения изобретения, в которых применяют производное силимаринового компонента, способы и композиции могут содержать производное в количестве от около 0,75 мг до около 15 граммов, предпочтительно около 3 мг до около 7 граммов, более предпочтительно около 7 мг до около 5 граммов и наиболее предпочтительно около 15 мг до около 3,5 граммов. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения, в которых композиция пригодна для применения у человека, композиции содержат около 50 мг до около 200 мг производного силимаринового компонента. Вышеприведенные количества могут относиться к единичной дозе или общей суточной дозировке.
В некоторых вариантах выполнения изобретения вместо или дополнительно к экстракту молочного чертополоха, силимарину и/или силибинину можно применять S-аденозилметионин.
Способы по настоящему изобретению могут также содержать введение одного или более дополнительных компонентов. Композиции по настоящему изобретению могут также содержать один или более дополнительных компонентов. Дополнительные компоненты могут включать активные фармацевтические ингредиенты, пищевые добавки и пищевые экстракты. Примеры дополнительных компонентов включают, не ограничиваясь перечисленными, кверцетин или его производное, аминоуглевод, такой как глюкозамин, гликозоаминогликан, такой как хондроитин, неомыляемые вещества на основе авокадо и соевых бобов, витамины, такие как витамин К2, плоды кофейного дерева, магний, урсоловую кислоту проантоцианидины, альфа- и бета-глюканы, куркумин, фитостеролы, фитостанолы и S-аденозилметионин (SAMe). Эти дополнительные компоненты могут встречаться в экстракте клюквы (Vaccinium macrocarpon) (проантоцианидины, кверцетин и урсоловая кислота), куркуме (Curcuma longa), экстракте лекарственных грибов, таких как экстракты грибов шиитаке (Lentinus edodes), грифолы курчавой (Grifola frondosa) и трутовика лакированного (Ganoderma lucidum).
В некоторых вариантах выполнения изобретения соотношение силимарина к сульфорафану или его производному составляет около 1:1 до около 75:1, более предпочтительно около 2:1 до около 50:1, более предпочтительно около 2,5:1 до около 25:1, еще более предпочтительно около 5:1 до около 15:1 и наиболее предпочтительно около 6:1 до около 9:1. В некоторых вариантах выполнения изобретения отношение силибинина к сульфорафану или его производному составляет около 1:2 до около 35:1, более предпочтительно около 1:1 до около 25:1, более предпочтительно около 1:1 до около 15:1, еще более предпочтительно около 2:1 до около 10:1, и наиболее предпочтительно около 2:1 до около 5:1. В некоторых вариантах выполнения изобретения отношение силимарина к предшественнику сульфорафана составляет около 1:5 до около 50:1, предпочтительно около 1:2 до около 25:1, более предпочтительно около 1:1 до около 10:1, более предпочтительно около 1,5:1 до около 5:1 и наиболее предпочтительно около 1:1 до около 4:1. В некоторых вариантах выполнения изобретения отношение силибинина к предшественнику сульфорафана составляет около 1:5 до около 50:1, предпочтительно около 1:2 до около 25:1, предпочтительно 1:1 до около 20:1 и наиболее предпочтительно около 1:1 до около 13:1.
В некоторых вариантах выполнения изобретения композиция содержит единичную лекарственную форму, включая, но не ограничиваясь перечисленными, фармацевтические лекарственные формы пригодные для перорального, ректального внутривенного, подкожного, внутримышечного, чрескожного, чресслизистогои местного введения. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения композиция содержит лекарственную форму для перорального введения или лекарственную форму для ректального введения. Примеры лекарственных форм для орального введения включают, но не ограничиваясь перечисленными, таблетку, капсулу, порошок, который может быть диспергирован в напитке, жидкость, такую как раствор, суспензию или эмульсию, мягкую жевательную капсулу с гелем, жевательную пастилку или другую удобную лекарственную форму, известную в данной области техники. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения композиция содержит таблетку, капсулу или мягкое жевательное угощение. Лекарственные формы для перорального введения могут быть приготовлены для немедленного высвобождения, отсроченного высвобождения или замедленного высвобождения
В некоторых вариантах выполнения изобретения, по меньшей мере, предшественник сульфорафана, фермент и потенциатор фермента предлагают в лекарственной форме, позволяющей высвобождение в области желудочно-кишечного тракта, имеющей рН по меньшей мере, 4 и предпочтительно по меньшей мере 5, такой как тонкий кишечник, предпочтительно в двенадцатиперстной кишке. В некоторых вариантах выполнения изобретения, по меньшей мере, сульфорафан или его производное и/или экстракт или порошок брокколи предлагают в лекарственной форме, позволяющей высвобождение в области желудочно-кишечного тракта, имеющей рН по меньшей мере, 4 и предпочтительно по меньшей мере 5, такой как тонкий кишечник, предпочтительно в двенадцатиперстной кишке. В некоторых вариантах выполнения изобретения экстракт или порошок молочного чертополоха и/или любые факультативные дополнительные компоненты, также высвобождаются в области желудочно-кишечного тракта при рН, по меньшей мере, 4 и предпочтительно, по меньшей мере 5, такой как тонкий кишечник, предпочтительно в двенадцатиперстной кишке. Тонкий кишечник включает в себя двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку.
В некоторых вариантах выполнения изобретения каждый из этих компонентов (то есть, предшественник сульфорафана, фермент, потенциатор фермента, сульфорафан или его производное, экстракт или порошок брокколи, экстракт или порошок молочного чертополоха и/или дополнительные компоненты) высвобождаются одновременно или сопутствуя один другому (то есть, в течение короткого периода времени один за другим). Это предоставляет преимущества по сравнению с глюкорафанин-содержащими композициями, рецептура которых составлена так, чтобы они высвобождали глюкорафанин в области желудочно-кишечного тракта при рН ниже 4, такой как желудок. В средах с низким значением рН, таких, как только что упомянутая, кислая среда может способствовать превращению предшественника сульфорафана в другие, физиологических неактивные конечные продукты, такие как сульфорафан нитрил и эпитионитрил.
™

В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции могут включать в себя композиции для перорального введения, содержащие гастропротекторные рецептуры, включая лекарственные формы с энтеросолюбильным покрытием или любые лекарственные формы, устойчивые к распаду в области желудочно-кишечного тракта, обладающей значениями рН ниже 4, такой как желудок. Например, композиция для перорального введения может содержать таблетку или капсулу, содержащую энтеросолюбильное покрытие. Энтеросолюбильное покрытие может содержать материалы, включая, но не ограничиваясь перечисленными, ацетатфталат целлюлозы, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, поливинилацетатфталат, сополимер метакриловой кислоты, сополимер метакриловой кислоты и акрилового эфира, ацетатсукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы, тримеллитат гидроксиметилпропилметилцеллюлозы, шеллак, ацетаттримеллитат целлюлозы, карбоксиметилэтилцеллюлозу и их смеси. Энтеросолюбильное покрытие может содержать любые подходящие энтеросолюбильные полимеры, известные в данной области техники. В некоторых вариантах выполнения изобретения один или более компонентов композиции может быть внедрен в матрицу энтеросолюбильных полимеров. В некоторых вариантах выполнения изобретения композиции для перорального введения содержат капсулу, медленно растворяющуюся в кислоте желудочного сока и поступающую в тонкий кишечник, такие как кислотостойкие капсулы DRCAPS, продаваемые под наименованием CAPSUGEl или любые другие кислотостойкие капсулы. В наиболее предпочтительной форме композиция для перорального введения окружена покрытием, нерастворимым до тех пор, пока значение рН окружающей среды не превысит, по меньшей мере, 4 и более предпочтительно, по меньшей мере, 5. Иначе говоря, можно применять покрытие с контролируемым высвобождением, как противодействие рН, со скоростью, отрегулированной таким образом, чтобы компоненты не высвобождались до тех пор, пока значение рН желудочно-кишечного тракта не возрастет до, по меньшей мере, 4 и более предпочтительно, по меньшей мере, 5. Таким образом, с целью защиты предшественника сульфорафана, фермента способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан и потенциатора фермента или сульфорафана в желудочной среде, может применяться лекарственная форма с замедленным высвобождением. Слой (слои) покрытия можно наносить на композицию для перорального введения, применяя стандартные технологии нанесения. Материалы для энтеросолюбильного покрытия можно растворять или диспергировать в органических или водных растворителях. Значение рН, при котором энтеросолюбильное покрытие растворяется, можно контролировать посредством выбора полимера или комбинаций полимеров и/или соотношением боковых групп. Например, параметры растворимости полимерной пленки могут быть изменены соотношением свободных карбоксильных групп к сложноэфирным группам. Слои энтеросолюбильного покрытия также содержат фармацевтически приемлемые пластификаторы, такие как триэтилцитрат, дибутилфталат, триацетин, полиэтиленгликоли, полисорбаты или другие пластификаторы. Могут также включаться вспомогательные вещества, такие как диспергаторы, красители, антиадгезионные и антивспенивающие агенты.
Композиции могут содержать один или более из неактивных фармацевтических ингредиентов (также, как правило, известных как «вспомогательные вещества»). Неактивные ингредиенты, например, служат для солюбилизации, суспендирования, сгущения, разбавления, эмульгирования, стабилизации, консервирования, защиты, окрашивания, ароматизациии, то есть превращают активные ингредиенты в пригодный для применения и эффективный препарат, безопасное, удобное для применения, иначе говоря, приемлемое для применения средство. Вспомогательные вещества предпочтительно являются фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами. Примеры классов фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ включают смазывающие вещества, буферные агенты, стабилизаторы, вспенивающие агенты, пигменты, красители, ароматизаторы, присадки, наполнители, ароматизаторы, модификаторы высвобождения, адъютанты, пластификаторы, ускорители потока, смазывающие агенты, полиолы, гранулирующие агенты, разбавители, связующие вещества, буферы, абсорбенты, скользящие вещества, адгезивы, агенты, препятствующие слипанию, подкислители, умягчители, смолы, успокоительные, растворители, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы, эластомеры и их смеси.
В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация (i) предшественника сульфорафана, предпочтительно глюкорафанина, (ii) фермента, способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, предпочтительно фермента глюкозидазы, более предпочтительно фермента тиоглюкозидазы и наиболее предпочтительно мирозиназы, (iii) потенциатора фермента, предпочтительно кофактора фермента, более предпочтительно аскорбиновой кислоты и (iv) экстракта или порошка молочного чертополоха демонстрирует синергический эффект. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация сульфорафана (или его производного) и экстракта или порошка молочного чертополоха демонстрирует синергический эффект. Синергия означает эффект, в котором комбинация двух или более компонентов обеспечивает результат, превосходящий сумму эффектов, обусловленных агентами взятыми отдельно. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения, синергический эффект превосходит аддитивный эффект. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация предшественника сульфорафана, фермента, способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, потенциатора фермента и экстракта или порошка молочного чертополоха имеет статистически значимый эффект, превосходящий эффекты сравнительно с: (i) каждым компонентом, взятым отдельно, (ii) комбинацией предшественника сульфорафана и фермента, взятых отдельно; и/или (iii) комбинацией предшественника сульфорафана, фермента и потенциатора фермента, взятых отдельно.
В предпочтительных вариантах выполнения изобретения комбинация предшественника сульфорафана, фермента, потенциатора фермента и экстракта или порошка молочного чертополоха демонстрирует синергию, обладая статистически значимым и/или превосходящим аддитивный, эффектом по сравнению с предшественником сульфорафана, взятым отдельно и экстрактом или порошком молочного чертополоха взятыми отдельно. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация глюкорафанина, мирозиназы, аскорбиновой кислоты и силимарина обладает синергическим эффектом по сравнению с комбинацией глюкорафанина, мирозиназы, аскорбиновой кислоты взятых отдельно и по сравнению с силимарином, взятым отдельно. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация глюкорафанина, мирозиназы, аскорбиновой кислоты и силибинина обладает синергическим эффектом по сравнению с комбинацией глюкорафанина, мирозиназы, аскорбиновой кислоты, взятых отдельно и по сравнению с силибинином, взятым отдельно.
В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация сульфорафана (или его производного) и экстракта или порошка молочного чертополоха обладает статистически значимым и/или эффектом, превышающим аддитивный по сравнению с: (i) сульфорафаном (или его производным) взятым отдельно и/или (ii) экстрактом или порошком молочного чертополоха взятыми отдельно. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация сульфорафана и силимарина обладает синергическим эффектом по сравнению с сульфорафаном, взятым отдельно и силимарином, взятым отдельно. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация сульфорафана и силибинина обладает синергическим эффектом по сравнению с сульфорафаном, взятым отдельно и силибинином, взятым отдельно.
В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация экстракта или порошка брокколи и экстракта или порошка молочного чертополоха обладает статистически значимым и/или превосходящим аддитивный эффектом по сравнению с: (i) эктрактом или порошком брокколи взятыми отдельно, и/или (ii) расторопшей пятнистой взятой отдельно. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация экстракта или порошка брокколи и силимарина обладает синергическим эффектом по сравнению с экстрактом или порошком брокколи, взятыми отдельно и силимарином взятым отдельно. В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинация экстракта или порошка брокколи и силибинина обладает синергическим эффектом по сравнению с экстрактом или порошком брокколи взятыми отдельно и силибинином взятым отдельно.
Настоящее изобретение предлагает способы применения, включая способы введения субъекту, нуждающемуся в этом. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение комбинации предшественника сульфорафана, фермента, способного превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, потенциатора фермента и экстракта или порошка молочного чертополоха. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение комбинации сульфорафана или его производного и экстракта или порошка молочного чертополоха. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение комбинации экстракта или порошка брокколи и экстракта или порошка молочного чертополоха.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ относится к лечению, профилактике, уменьшению частоты, уменьшению симптомов, и/или уменьшению повторных рецидивов заболевания или состояния, связанного с печенью, мочеполовой системой (включая простату, молочную железу и яичники), головным мозгом, легкими, почками, толстой кишкой, пищеводом, поджелудочной железой или гематопоэтической системой у субъекта, включающий введение субъекту. Способы могут быть полезными в уменьшении повреждения или замедлении повреждения тканей и органов, таких как печень, мочеполовая система (включая простату, молочную железу и яичники), головной мозг, легкие, почки, толстая кишка, пищевод, и поджелудочная железа. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ относится к увеличению содержания глутатиона у субъекта, нуждающегося в этом. Способ может также быть полезным в лечении, профилактике, уменьшении симптомов, и/или уменьшении повторных рецидивов заболеваний или состояний, связанных с низким содержанием глутатиона.
Примеры таких заболеваний и состояний включают, но не ограничиваясь перечисленными, неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD), рак (такой как рак печени, легких, простаты, толстой кишки, молочной железы, головного мозга, яичников, пищевода, поджелудочной железы, носоглотки, остеосаркома), лейкоз, муковисцидоз, ВИЧ, дефицит глутатионсинтетазы, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, Болезнь Гантингтона, болезнь Шарко, наследственную атаксию Фридрейха, рассеянный склероз, фибромиалгию, хроническую усталость, аутизм и диабет, гепатотоксичность и токсичность, обусловленная экологическими факторами.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ относится к лечению, профилактике, уменьшению частоты, уменьшению симптомов, и/или уменьшению повторных рецидивов неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD) и/или любого другого расстройства печени у субъекта. В некоторых вариантах выполнения изобретения способы относятся к улучшению или уменьшению вредных эффектов NAFLD.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способы относятся к обеспечению положительного эффекта на биомаркеры и лечения, профилактики, уменьшения частоты, уменьшения симптомов, связанных с аномальным содержанием этих биомаркеров. Примеры таких биомаркеров включают, но не ограничиваясь перечисленными, NADPH-зависимые ферменты, тиоредоксин (TXN), тиоредоксин редуктазу-1 (Txnrd-1), субъединицу глутамат-цистеин лигазы (GCLC), сульфотрансферазу 1А1 (SULT1A1), гемоксигеназу-1 (HMOX1), глутатионпероксидазу-3 (GPx-3), глутатион-S-трансфразу тэта 2 (GSTT2), микросомальную глутатион-Б-трансферазу 1 (MGST1), альдегидоксидазу (AOX1), альдокеторедуктазу 1 В8 (Akr1 b8), флавинсодержащую монооксигеназу 2 (FM.02), рецептор III Fc рецепторного региона (Fcgr3), триптазу бета 1 (TPSB1), тучноклеточную протеазу-6 (Mcpt6), нейрексин-1-альфа (NRXN-1), транскрипционный фактор, ассоциируемый с микрофтальмией (MITF), иодтирониндеиодиназу II (DIO2), ангиопоэтин-14 (Angpt14), кластер дифференцировки (CD36), и Ntel. Заболевания или состояния, связанные с повышенным или аномальным содержанием этих биомаркеров включают, но не ограничиваясь перечисленными, рак, туберкулез легких и центральной нервной системы, рассеянный склероз, болезнь Крона, атеросклероз, остеоартрит, астму, инсульт, эмфизему, диабетической нефропатии, хронический гистиоцитарный интервиллозит плаценты, гипертензию, анервизму брюшной аорты, воспалительное заболевание кишечника, хронический риносинусит, заболевание коронарных артерий и заболевание почек.
В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение субъекту, нуждающему в этом, комбинации сульфорафана и экстракта или порошка молочного чертополоха. В некоторых вариантах выполнения изобретения способ содержит введение субъекту, нуждающемуся в этом, комбинации экстракта или порошка брокколи и экстракта или порошка молочного чертополоха. В некоторых предпочтительных вариантах выполнения изобретения способ содержит введение субъекту комбинации глюкорафанина, мирозиназы, аскорбиновой кислоты и экстракта или порошка молочного чертополоха. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения комбинации в способах по настоящему изобретению демонстрируют синергический эффект.
В предпочтительных вариантах выполнения изобретения один или более компонент комбинаций (например, предшественник сульфорафан, фермент, способный превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан, потенциатор фермента, экстракт или порошок молочного чертополоха или сульфорафан или его производное и экстракт или порошок молочного чертополоха или экстракт или порошок брокколи и экстракт или порошок молочного чертополоха) вводят совместно в одной композиции или лекарственной форме, или раздельно, предпочтительно в течение времени перекрывания их терапевтических свойств. В некоторых вариантах выполнения изобретения компоненты комбинаций можно применять в двух или более композициях или лекарственных формах, вводимых перорально. Например, в некоторых вариантах выполнения изобретения предшественник сульфорафана, фермент, способный превращать предшественник сульфорафана в сульфорафан и потенциатор фермента вводят в лекарственной форме, вводимой перорально, в то время как экстракт или порошок молочного чертополоха вводят в одной или более отдельной(ых) или дополнительной(ых) лекарственной(ых) форме(ах). В предпочтительных вариантах выполнения изобретения компоненты комбинации вводят в одной лекарственной форме.
В некоторых вариантах выполнения изобретения комбинацию можно применять с частотой от 1 до 10 раз в день, предпочтительно 1 до 5 раз в день, более предпочтительно 1 до 3 раз в день и наиболее предпочтительно 1 раз в день.
Дозировки, раскрываемые в этой заявке, относятся, как правило, к дозировкам, применимым для человека. Расчеты дозировок могут определяться специалистами в данной области техники с учетом массы тела, площади поверхности, скорости метаболизма и видовых различий.
Термин "субъект" относится к любому животному, включая млекопитающих и птиц. Млекопитающие включают, но не ограничиваясь перечисленными, людей, собак, кошек, лошадей, коров, верблюдов, слонов, львов, тигров, медведей, тюленей и кроликов. В предпочтительных вариантах выполнения изобретения субъектами являются млекопитающие, которых не употребляют в пищу, такие как люди, кошки и собаки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Нижеследующее представляет собой примерную рецептуру:
Экстракт брокколи, содержащий глюкорафанин (около 12 вес. %), 50 мг до 5 г
Лиофилизированный порошок ростков брокколи, содержащих мирозиназу, 25 мг до 500 мг
Аскорбиновая кислота, 5 мг до 500 мг
Экстракт молочного чертополоха (около 20 вес. % до 35 вес. % силибинина), 25 мг до 5 г
Пример 2
Разработан метод хроматографии гидрофобных взаимодействий (HILIC), отвечающий нижеследующим условиям:
Колонка: Waters ВЕН Amide, размер частиц 1,7 мкм; 2,1 мм ×100 мм
Подвижная фаза: 20% 10 мМ ацетата аммония, рН 5,0; 8 0% ацетонитрила;
Способ разделения: изократический
Температура колонки: 70°C
Скорость потока: 0,7 мл/мин
Вышеуказанные условия обеспечиват разделение пяти типичных глюкозинолатов Brassicaceae, включая предшественник сульфорафана, глюкорафанин.
Пример 3.
Расходование глюкорафанина как функция концентрации аскорбиновой кислоты.
Около 250 мг экстракта семян брокколи, содержащего около 12 вес. % глюкорафанина подвергнуты гидролизу при фиксированной концентрации мирозиназы из ростков брокколи в присутствии аскорбиновой кислоты, имеющей концентрацию, варьирующуюся в диапазоне от 0 до 600 мкмоль/л. Реакционные смеси термостатировали при 38°C; аликвоты отбирали каждые 15 минут в течение 60 минут и хроматографически определяли концентрацию глюкорафанина. Скорость расходования глюкорафанина интерпретировали как скорость его превращения в сульфорафан. Графическое изображение уменьшения содержания глюкорафанина в зависимости от увеличения концентрации аскорбиновой кислоты представлено в виде серии линейных кривых; тангенсы угла наклона линий линейной регрессии отражают скорость расходования глюкорафанина в мкмоль/минуту. Видно, что в присутствии аскорбиновой кислоты с концентрацией 600 мкмоль/литр, скорость реакции увеличивается в 13 раз, по сравнению с тем, как если она бы протекала без модулирующих эффектов аскорбиновой кислоты.
Пример 4
Эквимолярное превращение глюкорафанина в сульфорафан.
Для дополнительного выяснения роли аскорбиновой кислоты в модулировании активности мирозиназы проводили эксперимент, состоящий из двух частей. Все растворы готовили в 20 мМ физиологическом растворе, забуференном Трис (трис-гидроксиметиламинометан) при значении рН 7,5, что как было показано ранее, является оптимальным для активности мирозиназы; в каждую тестовую побирку помещали в качестве источника мирозиназы точную навеску 100 мг лиофилизированного порошка брокколи. Эксперимент проводили при 38°C в течение 2 часов, с 30-минутными интервалами отбирали аликвоты образца и с помощью HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) определяли содержание как глюкорафанина, так и сульфорафана. С целью мгновенного ингибирования дальнейшей активности мирозиназы в отобранных аликвотах применяли сильнокислый «стоп» раствор. Контрольный образец не содержал аскорбиновую кислоту, и ферментативное превращение протекало без участия кофактора.
ЧАСТЬ 1. В присутствии аскорбиновой кислоты постоянной концентрации, 1 ммоль/литр, добавляли экстракт семян брокколи (около 12 вес. % глюкорафанина), увеличивая его количество от 250 мг до 500 мг.
ЧАСТЬ 2. При фиксированном количестве экстракта семян брокколи равном 250 мг варьировали концентрацию аскорбиновой кислоты от 0,4 ммоль/литр до 3,8 ммоль/литр.
В таблице ниже приведены концентрации глюкорафанина и сульфорафана, выраженные в микромолях. Видно, что в течение первых 3 0 минут почти во всех реакционных смесях глюкорафанин полностью превратился в сульфорафан. Однако, тщательное изучение ферментативного превращения в контрольном образце, без стимулирующих эффектов аскорбиновой кислоты, выявляет эквимолярное превращение глюкорафанина в сульфорафан, то есть, количество израсходованного глюкорафанина эквивалентно количеству получаемого сульфорафана.
В части 2 эксперимента изучали модулирующий эффект увеличения концентрации аскорбиновой кислоты на активность мирозиназы. Первоначальный, по-видимому, линейный, рост конверсии глюкофаранина в сульфорафан, стимулируемой мирозиназой, наблюдался до достижения концентрации аскорбиновой кислоты равной 2 ммоль/л, и впоследствии сменялся значительным выравниванием.
В заключение, изучение выхода сульфорафана после 30 минут эксперимента в рамках Части 1 выявило, что в присутствии 1 ммоль/литр аскорбиновой кислоты, фиксированное количество мирозиназы, содержащееся в 100 мг лиофилизированного порошка ростков брокколи, согласно предсказуемому линейному закону, способно сгенерировать по меньшей мере 200 мкмоль сульфорафана. ФИГ. 1, 2, 3 и 4 иллюстрируют результаты этого исследования.
Пример 5.
Превращение глюкофаранина в сульфорафан в присутствии жидкости, имитирующей кишечный сок.
Применяли порошок жидкости, имитирующей кишечный сок (SIF), коммерчески доступный концентрат, близкий по составу, рН и ионной силе раствора к содержимому кишечника человека. В эксперименте применяли USP аппарат 2 для растворения (лопастной), куда в шесть сосудов для растворения помещали 500 мл жидкости, имитирующей кишечный сок, совместно с 150 мг лиофилизированного порошка ростков брокколи в качестве источника мирозиназы. В сосудах 1-4 концентрация аскорбиновой кислоты варьировалась от 0,25 до 1,00 ммоль/л; в сосуд 5, дополнительно к 1 ммоль/л аскорбиновой кислоты суспендировали 3,125 г панкреатина (8×USP); в сосуд 6 дополнительно к 1 ммоль/л аскорбиновой кислоты и 3,125 г панкреатина (8×USP), добавляли удвоенное количество лиофилизированного порошка ростков брокколи (300 мг). После доведения температуры сосудов до 38°C в каждый сосуд добавляли 250 мг экстракта семян брокколи, богатых глюкорафанином (12 вес. %), и полученные суспензии перемешивали при 75 оборотах в минуту в течение 2 часов. Каждые 15 минут отбирали аликвоты и анализировали на сульфорафан. ФИГ. 4 показывает прямую зависимость между увеличением выхода сульфорафана и повышением концентраций аскорбиновой кислоты, особенно на ранних этапах эксперимента.
Пример 6
Следующее исследование проводили для определения влияния комбинации сульфорафана и силибинина на содержание глутатиона. Глутатион играет в организме важную роль, так как он может служить как антиоксидант, детоксикант и агент, увеличивающий иммунитет. Пониженное содержание глутатиона может вызывать у пациента восприимчивость к окислительному стрессу, заболеваниям, и раку. Поэтому увеличение содержания глутатиона производит положительный эффект.
В исследовании клеточную линию HepG2 рака печени человека обрабатывали ДМСО (контроль растворителем), сульфорафаном (SFN), силибинином (Silib) или комбинацией сульфорафана и силибинина в течение 24 часов. Собирали лизаты клеток и измеряли содержание глутатиона, применяя о-фталальдегид (ОРТ) в качестве флуоресцентного реагента. ФИГ. 5 и ФИГ. 6 показывают результаты исследования.
В части 1 исследования эффект влияния 0,5 мкм SFN сравнивали с эффектом влияния различных концентраций силибинина и с комбинацией 0,5 мкм SFN и различных концентраций силибинина. Конкретно, клетки обрабатывали одним из следующего: (i) ДМСО (контроль растворителем), (ii) 0,5 мкм SFN, (iii) 100 мкм Silib, (iv) 200 мкм Silib, (v) 300 мкм Silib, (vi) 0,5 мкм SFN и 100 мкм Silib, (vii) 0,5 мкм SFN и 200 мкм Silib и (viii) 0,5 мкм SFN и 300 мкм Silib. Результаты показывают, что комбинация сульфорафана и силибинина в каждой из тестированных доз обладает синергическим эффектом по сравнению с каждым из компонентов взятым отдельно. Например, когда клетки обрабатывали индивидуальными компонентами содержание глутатиона оставалось тем жепри обработке сульфорафаном взятым отдельно и слегка уменьшалось при обработке силибинином, по сравнению с контролем ДМСО (контроль растворителем). Однако, если клетки обрабатывали комбинацией сульфорафана и силибинина, в каждой из тестированных доз содержание глутатиона синергично увеличивалось по сравнению с контролем. Возрастание содержания глутатиона производит положительный эффект. Результаты показаны на ФИГ. 5.
В части 2 исследования эффект влияния 2 мкм SFN сравнивали с эффектом влияния различных концентраций силибинина и комбинацией 2 мкм SFN и различных концентраций силибинина. Конкретно, клетки обрабатывали одним из следующего: (i) ДМСО (контроль растворитем), (ii) 2 мкм SFN, (iii) 100 мкм Silib, (iv) 300 мкм Silib, (v) 2 мкм SFN и 100 мкм Silib и (vi) 0,5 мкм SFN и 300 мкм Silib. Результаты показывают, что комбинация сульфорафана и силибинина в каждой из тестированных доз обладает синергическим эффектом по сравнению с каждым компонентом взятым отдельно. Например, когда клетки обрабатывали индивидуальными компонентами, содержание глутатиона оставалось тем же при обработке сульфорафаном взятым отдельно или слегка уменьшалось при обработке силибинином по сравнению с контролем. Однако если клетки обрабатывали комбинацией сульфорафана и силибинина, в каждой из тестируемых доз, содержание глутатиона синергично увеличивалось по сравнению с контролем. Увеличение содержания глутатиона производит положительный эффект посредством детоксикации клеток. Результаты показаны на ФИГ. 6.
Пример 7
У субъекта диагностирована неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) и субъект имеет симптомы, включающие в себя недомогание, усталость и дискомфорт в области брюшной полости. Она пронимала таблетку, содержащую глюкорафанин, мирозиназу, аскорбиновую кислоту и экстракт молочного чертополоха. Таблетка представляет собой энтеросолюбильную лекарственную форму, которая обеспечивает высвобождение содержимого в тонком кишечнике. После одного месяца ежедневного приема таблетки субъект испытал модуляцию суррогатных биомаркеров, включая глутатион, что коррелирует с улучшением симптомов.