НОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ БЕНЗОЛПОЛИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ
NEW COMPOUNDS OF BENZENE POLYCARBOXYLIC ACIDS

Область техники
Настоящее изобретение относится к новым соединениям бензолполикарбоновых кислот, получаемым путем окисления гидролизованного лигнина в щелочной среде. Настоящее изобретение также относится к применению новых соединений бензолполикарбоновых кислот в составе сложного вещества, которое получают путем формирования комплекса новых соединений бензолполикарбоновых кислот с катионом металла или путем их инкапсуляции в катион металла. Настоящее изобретение также относится к способу получения нового соединения бензолполикарбоновых кислот и к его применению в косметических, нутрицевтических и фармацевтических композициях.
Уровень техники
Одним из наиболее изученных лекарств для лечения рака является цисплатин. Цисплатин - это лекарство с широким спектром действия, эффективное при лечении сарком, карцином и лимфом лишь в качестве нескольких примеров. В то же время, у этого лекарства имеется ряд значительных недостатков. Так, вследствие быстрого метаболизма и образования неактивных соединений, связанных с белком плазмы, оно разрушает как раковые, так и нормальные клетки, что делает его высокотоксичным, в особенности, нефротоксичным.
С целью преодоления этих недостатков прилагаются существенные усилия по созданию способов снижения токсичности цисплатина путем разработки новых металлоорганических комплексов на основе низкомолекулярных органических лигандов (US 4169846, US 4657927). В связи с этим, возможным эффективным решением этой задачи представляется применение полимерных соединений в качестве хелатообразующих или инкапсулирующих агентов.
В патентной заявке US 2010/0278925 описано соединение органоплатины нового типа, в состав которого входит по меньшей мере одно соединение органоплатины и по меньшей мере один ассоциативный водорастворимый полимер, который получают путем полимеризации мономеров (мет)акриловой кислоты, мономерных уретанов и мономерных гемималеатов, а соединение органоплатины выбрано из группы, включающей цисплатин, карбоплатин и оксалиплатин. В частности, это изобретение позволяет получать пероральную композицию лекарства в виде сиропа или гранулята.
Настоящее изобретение отличается от упомянутых выше изобретений тем, что в нем в качестве водорастворимого полимера используется полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот с целью получения металлоорганического соединения предпочтительно для парентерального, энтерального и местного применения.
В другом патенте BY 6420 описана полимерная лекарственная композиция цис-дихлородиамминплатины (II), обладающая противоопухолевым действием. Задачей этого изобретения является иммобилизация (инкапсуляция) соединения платины на поверхности 6-карбоксицеллюлозы. Полученную лекарственную композицию используют при нейрохирургическом вмешательстве с целью имплантации в головной мозг для предотвращения рецидивов злокачественных новообразований. Эта биоразлагаемая полимерная лекарственная композиция цисплатина обладает умеренной нейротоксичностью и улучшенным цитостатическим действием.
Настоящее изобретение отличается от изобретения по патенту BY 6420 тем, что водорастворимый полимер бензолполикарбоновых кислот обладает собственным биологическим действием, и полимерная лекарственная композиция на его основе может использоваться для парентерального, энтерального и местного применения.
2
В патенте RU 2182482 описан способ получения противоракового средства на основе тетрахлороплатината калия. В этом патенте описан способ, в котором тетрахлороплатинат калия вводят в реакцию с гуминовыми веществами. В этом способе обрабатывают водный раствор гуминовых веществ раствором тетрахлороплатината калия. Осуществляют обработку под действием ультразвука с мощностью излучения 40 Вт/см и частотой 22 кГц в течение 4-8 минут. Продукт согласно настоящему изобретению отличается от продукта по патенту RU 2182482 тем, что в качестве соединения платины выбрано соединение платины (II) с квадратно-плоскостной координацией. Кроме того, продукт согласно настоящему изобретению получают другим способом, отличающимся тем, что используются другие условия излучения, мощность которого устанавливают в зависимости от объема облучаемого продукта, и осуществляют облучение до тех пор, пока доля платины, не вступившей в реакцию с полимером, не достигнет 25% или менее исходного количества, и дополнительно осуществляют термостатирование до тех пор, пока доля гидролизуемой платины не достигнет 10% или менее. За счет этого получают отличающийся продукт. Полученный комплекс согласно настоящему изобретению отличается высокой стабильностью связей и существенно сниженной токсичностью.
3
В патентах EP 1864673 и RU 2368379 описано другое противораковое средство, которое также получают путем введения координационного соединения платины (II) в реакцию с гуминовым веществом, предварительно подвергнутым акустической кавитации под действием ультразвука с плотностью мощности 0,5-5 Вт/см и частотой 18-66 кГц. Полученное таким способом противораковое средство отличается тем, что имеет содержание высокомолекулярной фракции гуминового вещества 5% или менее. Продукт согласно настоящему изобретению отличается от продукта по патентам EP 1864673 и RU 2368379 тем, что осуществляют облучение до тех пор, пока доля платины, не вступившей в реакцию с полимером, не достигнет 25% или менее исходного количества, и дополнительно осуществляют термостатирование до тех пор, пока доля гидролизуемой платины не достигнет 10% или менее. За счет этого получают отличающийся продукт. Полученный комплекс согласно настоящему изобретению отличается высокой стабильностью связей и существенно сниженной токсичностью.
2
В патенте RU 2183124 описан способ получения средства защиты организма от ионизирующего излучения, а именно, вещества с радиопротекторными свойствами, из веществ природного происхождения. Согласно этому способу получают гуминовые вещества из природного сырья, обрабатывают водный раствор таких гуминовых веществ молибдатом аммония. Обработку молибдатом аммония проводят при температуре 40±5°C под действием ультразвука с мощностью излучения 40 Вт/см и частотой 22 кГц в течение 4-8 минут. В способе используются гуминовые вещества, полученные из окисленного древесного лигнина. Продукт согласно настоящему изобретению отличается от продукта по патенту RU 2183124 тем, что молибденовая соль выбирается из широкого круга соединений. Кроме того, продукт согласно настоящему изобретению получают другим способом, отличающимся тем, что используются другие условия излучения, мощность которого устанавливают в зависимости от объема облучаемого продукта, и осуществляют облучение до тех пор, пока доля молибдена, не вступившего в реакцию с полимером, не достигнет 25% или менее исходного количества, и дополнительно осуществляют термостатирование до тех пор, пока доля гидролизуемого молибдена не достигнет 10% или менее. За счет этого получают отличающийся продукт. Полученный комплекс согласно настоящему изобретению отличается высокой стабильностью связей и существенно сниженной токсичностью.
В патентах EP 1864674 и RU 2350353 описан другой способ получения средства защиты организма от ионизирующего излучения. Это средство получают путем обработки водного раствора, содержащего гуминовые вещества и молибдат аммония, волновым излучением. Используют молибдат аммония в количестве до 0,4 весовых частей на 1 весовую часть гуминовых веществ, и осуществляют обработку до величины содержания высокомолекулярной фракции гуминовых веществ 5% или менее. Продукт согласно настоящему изобретению отличается от продукта по патентам EP 1864674 и RU 2350353 тем, что молибденовая соль выбирается из широкого круга соединений. Кроме того, продукт согласно настоящему изобретению получают другим способом, отличающимся тем, что используются другие условия излучения, мощность которого устанавливают в зависимости от объема облучаемого продукта, и осуществляют облучение до тех пор, пока доля молибдена, не вступившего в реакцию с полимером, не достигнет 25% или менее исходного количества, и дополнительно осуществляют термостатирование до тех пор, пока доля гидролизуемого молибдена не достигнет 10% или менее. За счет этого получают отличающийся продукт. Полученный комплекс согласно настоящему изобретению отличается высокой стабильностью связей и существенно сниженной токсичностью.
Помимо преимуществ у композиций, описанных в патентах RU 2182482, EP 1864673, RU 2368379, RU 2183124, EP 1864674 и RU 2350353, имеется ряд недостатков, связанных с тем, что для органических лигандов, которые они содержат, характерна изменчивость состава, безопасности и биологической активности и, как следствие, они не могут применяться для разработки стабильных комплексов или сложных веществ, применимых для получения фармацевтических, нутрицевтических или косметических композиций.
Авторами настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что для разработки стабильных, безопасных и сильнодействующих металлоорганических комплексов может использоваться новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот, отличающееся низким содержанием минеральных и низкомолекулярных примесей и собственной биологической активностью.
В таких комплексах достигается повышенная стабильность связей между полимером и катионом металла за счет операций полимеризации, очистки и термостатирования и применения новых условий обработки ультразвуком, когда мощность излучения устанавливается в зависимости от объема, и проводится обработка до образования комплекса с содержанием металлического соединения более 75%. За счет этого получают отличающийся продукт.
В настоящем изобретении также предложены сложные вещества на основе нового водорастворимого полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот, в которых полимерное соединение действует как комплексообразующий и/или инкапсулирующий агент, образующий малотоксичные высокоэффективные комплексы с высокостабильными связями. Эти новые сложные вещества обладают высокой эффективностью даже в низких концентрациях. Такие сложные вещества, содержащие, например, комплексы платины и молибдена, обладают многообещающими свойствами. Комплексы платины являются эффективными противораковыми средствами, и по данным экспериментов обладают улучшенной способностью уничтожать раковые клетки по сравнению с прототипами и такими известными противораковыми средствами, как цисплатин и карбоплатин. Комплексы молибдена являются эффективными средствами профилактики и лечения болезней, вызываемых нарушением клеточного цикла, причиной которых является, например, радиоактивное облучение, старение клеток или иммунные нарушения. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению также могут применяться для снижения/сведения к минимуму побочных эффектов традиционной радиотерапии или химиотерапии.
Химические свойства нового водорастворимого полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот позволяют получать широкий круг высокостабильных комплексов, а также косметические, нутрицевтические и фармацевтические композиции для парентерального, энтерального и местного введения людям и животным.
Сущность изобретения
Согласно первому аспекту, настоящее изобретение относится к новому водорастворимому полимерному соединению бензолполикарбоновых кислот, отличающемуся тем, что имеет следующий элементный состав: 62-67% С, 3,8-4,2% Н, 29-34% О и менее 0,2% N по весу в сухом состоянии, при этом суммарное содержание других элементов составляет не более чем 1% по весу в сухом состоянии.
Согласно второму аспекту, настоящее изобретение относится к способу получения нового водорастворимого полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот, в котором содержащее лигнин исходное сырье подвергают щелочной обработке с последующей кислотной обработкой в градиенте плотности, чтобы получить неочищенное водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот, которое затем подвергают очистке.
Согласно третьему аспекту, настоящее изобретение относится к новому водорастворимому полимерному соединению для применения с целью профилактики, лечения и модифицирования болезней у людей и животных, а также относится к фармацевтической композиции, содержащей новое водорастворимое полимерное соединение для применения с целью профилактики, лечения и модифицирования болезней у людей и животных.
Согласно четвертому аспекту, настоящее изобретение относится к косметической композиций или нутрицевтической композиции, содержащей новое водорастворимое полимерное соединение.
Согласно пятому аспекту, настоящее изобретение относится к сложному веществу, содержащему новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот, катион металла и необязательно противораковое средство, а также относится к его применению в фармацевтической композиции для профилактики, лечении или модифицирования болезней у людей или животных.
Согласно шестому аспекту, настоящее изобретение относится к способу получения сложного вещества, содержащего новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение платины (II) с квадратно-плоскостной координацией.
Согласно седьмому аспекту, настоящее изобретение относится к сложному веществу, содержащему новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение платины (II) с квадратно-плоскостной координацией для применения в качестве лекарства или для применения при получении фармацевтической композиции.
Согласно восьмому аспекту, настоящее изобретение относится к применению лекарства или фармацевтической композиции, содержащей сложное вещество, содержащее новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение платины (II) с квадратно-плоскостной координацией, для профилактики, лечения или паллиативного ухода или с целью модифицирования болезни, такого как, например, рак у млекопитающего.
Согласно девятому аспекту, настоящее изобретение относится к сложному веществу, содержащему новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена, при этом полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот инкапсулирует соединение молибдена или образует комплекс с ним.
Согласно десятому аспекту, настоящее изобретение относится к способу получения сложного вещества, содержащего новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена.
Согласно одиннадцатому аспекту, настоящее изобретение относится к сложному веществу, содержащему новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена для применения в качестве лекарства или для применения при получении фармацевтической композиции.
Согласно двенадцатому аспекту, настоящее изобретение относится к применению лекарства или фармацевтической композиции, содержащей сложное вещество, содержащее новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена, для профилактики, лечения или паллиативного ухода за млекопитающим, страдающим какой-либо болезнью, например, нарушением клеточного цикла, или для модифицирования упомянутой болезни.
Согласно тринадцатому аспекту, настоящее изобретение относится к фармацевтические композиции для применения с целью снижения/сведения к минимуму побочных эффектов традиционной радиотерапии или химиотерапии.
Краткое описание чертежей
13
На фиг. 1 показан спектр С ЯМР гуминовых кислот согласно прототипу RU 2182482,
на фиг. 2. показан ИК-спектр полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению,
13
на фиг. 3 показан спектр С ЯМР полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению,
на фиг. 4А, 4В и 4С показаны двумерные гомо- и гетероядерные спектры полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению,
на фиг. 5 показана масс-спектрометрия методом FTICR полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению,
на фиг. 6 показана результаты рентгеновской спектроскопии тонкой структуры протяженного поглощения сложного вещества, содержащего полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению и цис-дихлородиамминплатину (II), неорганическую цис-дихлородиамминплатину (II) ("цисплатин") и цис-диаммин(циклобутан-1,1-дикарбоксилат-O,O')платину (II) ("карбоплатин"),
на фиг. 7 показаны изображения клеток PBMC через 15 инкубации в среде без добавления полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот ("а - контроль") и в среде, содержащей полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению в концентрации 215 мкг/л среды ("b - полимерное соединение, 215 мкг/л"),
на фиг. 8 показаны данные жизнеспособности клеток линии MCF-7 рака молочной железы человека после лечения соединениями согласно настоящему изобретению,
на фиг. 9 показаны данные жизнеспособности клеток линии T47-D рака молочной железы человека после лечения соединениями согласно настоящему изобретению,
на фиг. 10 показаны данные жизнеспособности клеток линии PI45 рака поджелудочной железы человека после лечения соединениями согласно настоящему изобретению,
на фиг. 11 показаны данные жизнеспособности клеток линии Т24Р рака мочевого пузыря человека и клеток линии SKOV-3 рака яичника человека после лечения соединениями согласно настоящему изобретению,
на фиг. 12 показана LDH-активность клеток линии MCF-7 рака молочной железы человека после лечения соединениями согласно настоящему изобретению,
на фиг. 13 показана LDH-активность клеток линии T47-D рака молочной железы человека после лечения соединениями согласно настоящему изобретению.
Подробное описание
В настоящем изобретении предложено новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот, отличающееся тем, что имеет следующий элементный состав: 62-67% С, 3,8-4,2% Н, 29-34% О и менее 0,2% N по весу в сухом состоянии, при этом суммарное содержание других элементов (неорганических примесей) составляет не более чем 1% по весу в сухом состоянии. Это новое соединение обладает собственной фармакологической активностью, повышенной степенью чистоты, а также улучшенной способностью формировать стабильные комплексы или инкапсулировать различные вещества.
Используемый термин "водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот" означает полимер, содержащий в основном водорастворимые многоосновные ароматические карбоновые кислоты.
13
Новый водорастворимый полимер может быть дополнительно охарактеризован путем С ЯМР-спектроскопии, ИК-спектроскопии и масс-спектрометрии методом ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (FTICR, от английского - Fourier transfrom ion cyclotron resonance).
13
n
AR
По данным C ЯМР-спектроскопии количество углерода в алифатических группах СН, обнаруженное в интервале 0-48 м.д., составляет 15-22%; количество ароматического углерода ароматического углерода C, обнаруженное в интервале 108-145 м.д., составляет 30-42%; количество углерода в карбоксильных и сложноэфирных группах, обнаруженное в интервале 165-187 м.д., составляет 5-13%, и количество углерода в кетоновых группах С=O, обнаруженное в интервале 187-220 м.д., составляет 2-8%. Общее обнаруженное содержание низкомолекулярных примесей низкомолекулярных примесей составляет 168,5 м.д. (анионов карбонатов), 171 часть на миллион (анионов формиатов), 173 м.д. (анионов оксалатов) и 181-182 м.д. (анионов ацетатов) или менее 1%.
Используемый термин "низкомолекулярная примесь" означает неполимеризованное соединение с молекулярной массой менее 300 Да.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
3
2
На ИК-спектрах полимера видны заметные специфические валентные колебания ионизированных асимметричных групп COO с пиками на волне 1410 см. В интервале волн 1500-1700 см видна широкая комплексная полоса поглощения, соответствующая смеси алифатических и ароматических карбоновых кислот. Наряду с карбоновыми кислотами в полимере также содержится значительное количество фенольных соединений, связанных друг с другом водородными связями. Это продемонстрировано присутствием полос поглощения в следующих областях: 3400-3600 см (OH), 1050 см (С-О), 1250-1300 см (OH). В области 2800-3000 см находится полоса поглощения с пиками на волнах 2928 см и 2853 см, соответствующих валентным колебаниям групп CH в CH и СН. Более и менее выраженные пики поглощения, выявленные на волне 1750 см, соответствуют валентным колебаниям групп С=O.
Фрагмент нового полимерного соединения согласно настоящему изобретению с молекулярной массой 1500 Да может быть представлен следующей суммарной формулой:
3
2
х1
2
2
х2
2
х3
(CHO)(CHO)(CH),
1
2
3
в которой x≤12, х≤9, x≤33.
Бензолполикарбоновые кислоты (ароматические компоненты, преимущественно определяемые как метиловые эфиры бензолполикарбоновых кислот) являются основными мономерами полимера. Кроме того, полимер бензолполикарбоновых кислот содержит мономеры, такие как насыщенные алифатические карбоновые кислоты, насыщенные алифатические гидроксикарбоновые кислоты, мононенасыщенные алифатические карбоновые кислоты, мононенасыщенные алифатические гидроксикарбоновые кислоты и полиненасыщенные алифатические карбоновые кислоты.
n
2n
2
n
2n
2
n
2n-2
2
n
2n-2
3
n
2n-2
4
n
2n-2
5
Насыщенные алифатические карбоновые кислоты имеют общую формулу CHO, в которой n равно от 12 до 26. Насыщенные алифатические гидроксикарбоновые кислоты имеют общую формулу CHO, в которой n равно от 16 до 26. Мононенасыщенные алифатические карбоновые и гидроксикарбоновые кислоты имеют общие формулы CHО, CHO, CHС, CHО, в которых n равно от 14 до 28. Описанные соединения отвечают за поверхностно-активные свойства полимера. В число полиненасыщенных алифатических карбоновых кислот входит 13-цис-ретиноевая кислота, 6Z,9Z,12Z,1SZ-октадекатетраеновая кислота, цис,цис,цис-6,9,12-октадекатриеновая кислота, (9R,13R)-2-оксо-5-пентил-3-циклопентен-1-октановая кислота, 9S-гидроперокси-10Е,12Z,1SZ-октадекатриеновая кислота, С13(8)-гидроксиоктадека-9Z,11Е-диеновая кислота, 10S,11S-эпокси-9S-гидрокси-12Z-октадеценовая кислота, 9S,12S,13S-тригидрокси-10Е,15Z-октадекадиеновая кислота, 5,6-дегидроарахидоновая кислота и 15(S)-гидрокси-(5Z,8Z,11Z,13E,17Z)-эйкозапентаеновая кислота. У полимера согласно настоящему изобретению также сохраняется противоопухолевое и противоокислительное действие многих соединений, относящихся к этому перечню (например, 13-цис-ретиноевой кислоты (изотретиноина), С13(S)-гидроксиоктадека-9Z,11Е-диеновой кислоты, 5,6-дегидроарахидоновой кислоты).
В основную группу мономеров (ароматических компонентов) входят следующие мономеры: метиловый эфир 3-бензилокси-4,5-дигидроксибензойной кислоты, метиловый эфир 5-(фуран-2-карбонилокси)-2-метилбензофуран-3-карбоновой кислоты, диметиловый эфир 2,6-диметилбензо(1,2-b,4,5-b')дифуран-3,7-дикарбоновой кислоты, этиловый эфир 5-(фуран-2-карбонилокси)-2-метилбензофуран-3-карбоновой кислоты, рамнетин, метил((4-метил-6-оксо-6h-бензо(с)хромен-3-ил)окси)гидроацетат, бис(2-(метоксикарбонил)фенил)карбонат, сулохрин, 2,6-диацетил-7,9-дигидрокси-8,9b-диметилдибензофуран-1,3(2Н,9bH)-дион, О-ацетилсалициловый ангидрид, 4-гидрокси-3-((6-гидрокси-бензо(1,3)диоксол-5-ил)-(3-метокси-фенил)-метил)-5h-фуран-2-он, 2,3-бис-бензоилоксиянтарная кислота, метил 5-гидрокси-7,8-диметокси-1,3-диоксо-1,3,10,11-тетрагидробензо[5,6]циклоокта[1,2-с]фуран-4-карбоксилат, метиловый эфир (1-метоксикарбонилметокси-6-оксо-6h-бензо(с)хромен-3-илокси)-уксусной кислоты, атранорин и фенилпропаноид-замещенные эпикатехины. Многие соединения, относящиеся к этой группе, обладают антибиотическим и противоопухолевым действием.
В настоящем изобретении также предложен способ получения водорастворимого полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот. Новое полимерное соединение согласно настоящему изобретению может быть получено описанным далее способом.
На первой стадии способа предоставляют содержащий лигнин материал в качестве исходного сырья. Примеры таких содержащих лигнин материалов включают окисленный лигнин, древесину, торф, остатки растений, отходы целлюлозно-бумажного производства. Наиболее предпочтительное содержащее лигнин исходное сырье получают из хвойных деревьев, при этом оно имеет рН от 5,5 до 7, содержание влаги 50-70% и содержит не более 32% полисахаридов, не менее 66% лигнина и не более 2% водорастворимых соединений.
На второй стадии способа подвергают водную суспензию содержащего лигнин сырья обработке щелочью при рН 13±0,5 и давлении 2,2±0,3 МПа. Примеры щелочей, которые могут использоваться, включают гидроокиси щелочных и/или щелочноземельных металлов и/или аммиак. Тем не менее, предпочтительной щелочью является гидроксид натрия. Путем этой щелочной обработки в результате гидролиза и окисления получают раствор натриевых солей бензолполикарбоновых кислот.
На третьей стадии способа подвергают раствор натриевых солей бензолполикарбоновых кислот кислотной обработке в градиенте плотности. На этой стадии обрабатывают раствор натриевых солей бензолполикарбоновых кислот минеральной кислотой и подвергают центрифугированию. В результате создается градиент плотности, и происходит конденсация и полимеризация бензолполикарбоновых кислот. Примеры минеральных кислот, которые могут использоваться, включают растворимые стабильные кислоты, такие как серная, ортофосфорная, азотная и соляная кислота. Тем не менее, предпочтительной минеральной кислотой является соляная кислота.
13
Четвертой стадией является стадия очистки, которую осуществляют одним или несколькими способами, такими как экстрагирование, флотация, дистилляция, фильтрация, осаждение, центрифугирование, декантация и/или диализ, чтобы удалить низкомолекулярные примеси. Очистка продолжают до тех пор, пока количество низкомолекулярных примесей, обнаруженных путем С ЯМР-спектроскопии или другим наглядным способом (например, газовой хроматографией) не станет менее 1% по весу полимера в сухом состоянии.
Лучший вариант осуществления способа описан в Примере 1. В нем также приведены результаты сравнения полимера согласно настоящему изобретению и гуминовых кислот гуминовых кислот, получаемых согласно патенту RU 2182482.
В настоящем изобретении также предложены сложные вещества, которые содержат новое водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот, катион металла и необязательно противораковое средство. В предпочтительных сложных веществах водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот действует как комплексообразующий и/или инкапсулирующий агент.
Используемый термин "водорастворимый полимер" означает полимер, растворимый в воде при нейтральном или щелочном pH в концентрации 5% по весу.
Используемый термин "комплексообразующий агент" означает электронно-донорное соединение, которое способно образовывать с ионами металлов растворимые комплексы, которые могут являться координационными и/или хелатными комплексами. В этих комплексах фрагменты полимера согласно настоящему изобретению являются лигандами занимающего центральное положение иона металла. Металлом может являться металл 2s-5s или 3d-5d. Примерами таких металлов 2s-5s или 3d-5d являются платина, молибден, литий, кальций, калий, магний, марганец, железо, цинк, серебро, палладий и медь.
Используемый термин "инкапсулирующий агент" означает большую молекулу, которая способна удерживать малые молекулы и защищать их от воздействия окружающей среды. В отличие от комплексообразующего агента, инкапсулирующий агент не образует стабильных химических связей с малыми молекулами, которые он удерживает. Соответственно, используемый термин "инкапсулировать" означает процессе удерживания малых молекул внутри большой молекулы.
Кроме того, авторы настоящего изобретения взялись за решение задачи создания косметических, нутрицевтических и фармацевтических композиций, содержащих такой новый водорастворимый полимер и необязательно одно или несколько дополнительных вспомогательных веществ.
Косметические композиции состоят из нового водорастворимого полимерного соединения и других ингредиентов, которые обычно содержатся в таких косметических композициях. Косметические композиции могут дополнительно содержать другие соединения, обладающие, например, бактерицидными, ранозаживляющими, противоокислительными свойствами. Соответственно, чтобы получить бактерицидную композицию, используют катион серебра в качестве металла, обладающего бактерицидной активностью. Чтобы получить ранозаживляющую композицию, используют медь в качестве металла, обладающего ранозаживляющей активностью. Чтобы получить противоокислительную композицию, используют литий в качестве металла, органоминеральные комплексы которого обладают противоокислительной активностью. Косметические композиции могут использоваться для коррекции недостатков кожи или ее лечения.
Нутрицевтические композиции состоят из нового водорастворимого полимерного соединения и других ингредиентов, которые обычно содержатся в таких нутрицевтических композициях. Нутрицевтические композиции могут дополнительно содержать питательные вещества. В качестве питательных веществ (пищевых минералов, жизненно необходимых живому организму) могут использоваться такие макроэлементы, как, например, железо, калий, кальций, магний и др. и/или такие микроэлементы, как, например, литий, серебро, цинк, медь, марганец, палладий и др. Нутрицевтические композиции могут использоваться для восстановления баланса питательных веществ.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат новое водорастворимое полимерное соединение, а в других вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат сложное вещество, содержащее новое водорастворимое полимерное соединение и катион металла. Фармацевтические композиции могут дополнительно содержать противораковое средство, которое может быть выбрано из средств категории L Анатомо-терапевтическо-химической Классификации Всемирной Организации Здравоохранения. Наглядными примерами таких противораковых средств являются циклофосфамид, цисплатин, метотрексат, фторурацил, доксорубицин, гозерелин, тамоксифен, филграстим, интерферон альфа, интерлейкин. Фармацевтическая композиция может применяться для лечения, профилактики или модифицирования болезней. Примеры вспомогательных веществ, которые могут использоваться в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, включают соединения, выбранные из группы, включающей антиадгезивы, связующие вещества, покрывающие вещества, вызывающие дезинтеграцию вещества, наполнители, растворители/сорастворители, корригенты, красители, смазывающие вещества, улучшители скольжения, консерванты, сорбенты, подсластители, носители, полимеры для модификации высвобождения API, полимеры для защиты API, буферные вещества, противоокислители, смачивающие вещества, противовспенивающие вещества, загустители, увлажнители или их смеси.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предпочтительно рассчитаны на пероральное, чресслизистое или подъязычное применение. Соответственно, фармацевтические композиции согласно изобретению предпочтительно применяются в форме таблеток, пастилок, жевательных резинок, жидких вязких паст, твердых леденцов или карамели или в форме требующих длительного жевания конфет или загущенных капель.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено сложное вещество, которое содержит новое водорастворимое полимерное соединение и катион металла. Из упомянутых выше типов сложных веществ наибольший интерес вызывают сложные вещества, содержащие полимер и соединение платины или полимер и соединение молибдена.
Известно, что наиболее сильнодействующими противоопухолевыми соединениями являются комплексы двухвалентной платины, отличающиеся тем, что имеют квадратно-плоскостную структуру, то есть такую структуру, в которой ион платины занимает центральное положение, а лиганды расположены по бокам квадрата, лежащего в той же плоскости. В таких композициях валентный угол координационного иона платины точно соответствует расстоянию между соседними гуаниновыми молекулами ДНК, что позволяет ингибировать ее синтез посредством формирования внутринитевых аддуктов. В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве комплексов двухвалентной платины для синтеза сложного вещества используется цис-дихлородиамминплатин (II), тетрахлороплатинат калия или их смеси.
3
В настоящем изобретении также предложен способ получения сложного вещества согласно настоящему изобретению. В соответствии с изобретением такое сложное вещество, содержащее полимерное соединение согласно настоящему изобретению и соединение платины (II) с квадратно-плоскостной координацией, может быть получено путем воздействия на вещество волновым излучением, более точно, путем обработки ультразвуком с плотностью мощности 0,5-5 Вт/см и частотой 18-66 кГц в течение 1-30 минут до тех пор, пока доля несвязанной платины (т.е. платины, не вступившей во взаимодействие с полимером) не станет менее 25% ее исходного количества.
На следующей стадии подвергают сложное вещество термостатированию (т.е. хранят в специфических температурных условиях) в течение 1-30 суток при температуре от 2°C до 40°C до тех пор, пока доля несвязанной платины не станет менее 10% ее исходного количества, и не образуется комплекс соединения платины (II) с квадратно-плоскостной координацией и полимера.
На последней стадии подвергают сложное вещество очистке, чтобы получить продукт, применимый в фармацевтических целях. Очистка может представлять собой один или несколько процессов, таких как стерилизационная фильтрация, обработка в автоклаве или облучение.
Платина в сложном веществе инкапсулирована в полимер или образует комплекс с полимером бензолполикарбоновых кислот, имеющим одну или несколько из следующих структур:
в которых структуры а, b, с и d соответствуют фрагментам ароматических компонентов, а структура е соответствует фрагменту алифатических компонентов, упомянутых выше.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Присутствие этих структур подтверждается характеристическими полосами поглощения в ИК-диапазоне на волнах 3400-3600 см, 2800-3000 см, 1500-1700 см, 1410 см, 1250-1300 см и 1050 см. В то же время, вследствие образования связей между полимером и платиной интенсивность пиков на волнах 3400-3600 см, 1500-1700 см, 1410 см и 1250-1300 см является меньшей, чем у полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот.
13
3
2
2
2
2
Была определена эмпирическая формула содержащего платину сложного вещества методами С ЯМР-спектроскопии (суммарную формулу) и двумерной ЯМР-спектроскопии, согласно которым она состоит из отдельных повторяющихся фрагментов полимера: (СНО), (СНО), (CH). Поскольку в растворах полимерное соединение существует только в форме коллоидных мицелл, сложно определить его истинную молекулярную массу. Поскольку точная молекулярная формула полимера еще не установлена, в его суммарной формуле невозможно указать более конкретные коэффициенты. Согласно настоящему изобретению композиция содержащего платину сложного вещества представлена следующей общей формулой:
3
2
x1
2
2
x2
2
x3
3
2
x4
(CHO)(CHO)(CH)(Pt(NH)).
4
1
2
3
1
2
3
4
В то же время, соблюдаются следующие стехиометрические отношения x=1, x≤12, x≤9 и x≤33. Это суммарной формулой описывается фрагмент сложного вещества с молекулярной массой 1500-2000 Да. При получении сложного вещества с большей или меньшей молекулярной массой коэффициенты x, х, х и x изменяются пропорционально. При этом они остаются натуральными положительными целыми или дробными числами.
В Примере 2 описан лучший вариант осуществления способа получения сложного вещества, содержащего полимерное соединение и соединение платины.
В настоящем изобретении также предложено лекарство, содержащее полимерное соединение и соединение платины (II).
В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая лекарство, содержащее полимерное соединение и соединение платины (II). Эта фармацевтическая композиция может необязательно содержать одно или несколько вспомогательных веществ. Одно или несколько вспомогательных веществ предпочтительно выбраны из группы, включающей антиадгезивы, связующие вещества, покрывающие вещества, вызывающие дезинтеграцию вещества, наполнители, растворители/сорастворители, корригенты, красители, смазывающие вещества, улучшители скольжения, консерванты, сорбенты, подсластители, носители, полимеры для модификации высвобождения API, полимеры для защиты API, буферные вещества, противоокислители, смачивающие вещества, противовспенивающие вещества, загустители, увлажнители или их смеси.
Лекарство и фармацевтическая композиция, содержащая лекарство, могут применяться для лечения какого-либо болезни, например, для лечения рака различных типов, включая метастазирующий рак молочной железы. Примеры рака, для лечения которого могут применяться фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, включают без ограничения рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак ободочной и прямой кишки и рак головы и шеи. Лекарство и фармацевтическая композиция также могут применяться для профилактики и паллиативного ухода за млекопитающим, страдающим раком, или для модифицирования упомянутого рака. Используемый термин "модифицирование упомянутого рака" относится к ситуации, в которой лекарство не обеспечивает прямого противоракового эффекта, но влияет на течение болезни и/или изменяет качество жизни ракового пациента. Лекарство может вводиться любым обычным путем, но предпочтительными путями введения являются парентеральный, энтеральный или местный, а в случае парентерального применения предпочтительными являются внутримышечные инъекции. В одном из вариантов осуществления млекопитающими, нуждающимися в лечении, являются непродуктивные виды. Непродуктивные виды предпочтительно могут быть выбраны из людей, собак, кошек и лошадей.
По данным доклинических и клинических исследований применения для лечения рака фармацевтические композиции на основе сложного вещества обеспечивают значительное ингибирование роста опухолей у людей (Пример 3).
Авторы настоящего изобретения также получили ряд сложных веществ на основе водорастворимого полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот и соединения молибдена. Соединение молибдена предпочтительно выбрано из таких солей кислот молибдена, как молибдат аммония, тетрагидромолибдат аммония, молибдат калия, молибдат натрия, дигидромолибдат натрия и их смеси.
Молибден в сложном веществе инкапсулирован в полимер или образует комплекс с полимером бензолполикарбоновых кислот, имеющим одну или несколько из следующих структур:
в которых структуры а, b, с и d соответствуют фрагментам ароматических компонентов, а структура е соответствует фрагменту алифатических компонентов, упомянутых выше.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Присутствие этих структур подтверждается характеристическими ИК полосами поглощения в ИК-диапазоне на волнах 3400-3600 см, 2800-3000 см, 1500-1700 см, 1410 см, 1250-1300 см и 1050 см. В то же время, вследствие образования связей между полимером и молибденом интенсивность пиков на волнах 3400-3600 см, 1500-1700 см, 1410 см и 1250-1300 см является меньшей, чем у полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот.
Согласно настоящему изобретению, композиция содержащего молибден сложного вещества может быть представлена следующей общей формулой:
3
2
x1
2
2
x2
2
x3
3
x4
2
x5
4
x6
(CHO)(CHO)(CH)(MoO)(HO)(NH).
4
1
2
3
5
6
1
2
3
4
5
6
В то же время, соблюдаются следующие стехиометрические отношения x=1,5, x≤12, x≤9 и х≤33, х≤2 и x≤2. Это суммарной формулой описывается фрагмент сложного вещества с молекулярной массой 1500-2000 Да. При получении сложного вещества с большей или меньшей молекулярной массой коэффициенты x, х, х, x, х и x изменяются пропорционально. При этом они остаются натуральными положительными целыми или дробными числами.
3
В настоящем изобретении также предложен способ получения сложного вещества согласно настоящему изобретению. В соответствии с изобретением такое сложное вещество, содержащее полимерное соединение согласно настоящему изобретению и соединение молибдена, может быть получено путем воздействия на вещество волновым излучением, более точно, путем обработки ультразвуком с плотностью мощности 0,5-5 Вт/см и частотой 18-66 кГц в течение 1-30 минут до тех пор, пока доля несвязанного молибдена (т.е. молибдена, не вступившего во взаимодействие с полимером) не станет менее 25% его исходного количества.
На следующей стадии подвергают сложное вещество термостатированию (т.е. хранят в специфических температурных условиях) в течение 1-30 суток при температуре от 2°C до 40°C до тех пор, пока доля несвязанного молибдена не станет менее 10% его исходного количества, и не образуется комплекс соединения молибдена и полимера.
На последней стадии подвергают сложное вещество очистке, чтобы получить продукт, применимый в фармацевтических целях. Очистка может представлять собой один или несколько процессов, таких как стерилизационная фильтрация, обработка в автоклаве или облучение.
В Примере 4 описан лучший вариант осуществления способа получения сложного вещества, содержащего полимерное соединение и соединение молибдена.
В настоящем изобретении также предложено лекарство, содержащее полимерное соединение и соединение молибдена.
В настоящем изобретении также предложена фармацевтическая композиция, содержащая лекарство, содержащее полимерное соединение и соединение молибдена. Эта фармацевтическая композиция может необязательно содержать одно или несколько вспомогательных веществ. Одно или несколько вспомогательных веществ предпочтительно выбраны из группы, включающей антиадгезивы, связующие вещества, покрывающие вещества, вызывающие дезинтеграцию вещества, наполнители, растворители/сорастворители, корригенты, красители, смазывающие вещества, улучшители скольжения, консерванты, сорбенты, подсластители, носители, полимеры для модификации высвобождения API, полимеры для защиты API, буферные вещества, противоокислители, смачивающие вещества, противовспенивающие вещества, загустители и увлажнители.
Лекарство и фармацевтическая композиция, содержащая лекарство, могут применяться для лечения млекопитающего, страдающего нарушением клеточного цикла, таким как, например, канцерогенез, вызванный облучением или естественным старением клеток.
Лекарство и фармацевтическая композиция, содержащая лекарство, могут применяться для паллиативного ухода за млекопитающим, страдающим нарушением клеточного цикла, таким как, например, канцерогенез, вызванный облучением или естественным старением клеток, или для модифицирования упомянутой болезни. Используемый термин "модифицирование упомянутой болезни" относится к ситуации, в которой лекарство не обеспечивает прямого лечения, но влияет на течение болезни и/или изменяет качество жизни пациента. Лекарство может вводиться пероральным путем. В одном из вариантов осуществления млекопитающими, нуждающимися в лечении, являются непродуктивные виды. Непродуктивные виды предпочтительно могут быть выбраны из людей, собак, кошек и лошадей.
В Примере 5 приведены результаты исследований фармацевтической композиции, содержащей полимерное соединение и соединение молибдена и используемой с целью вызвать клеточный ответ.
Примеры
Изобретение дополнительно проиллюстрировано на следующих примерах, которые не имеют целью ограничить объем настоящего изобретения.
Сравнительный пример 1А
Способ получения гуминовых кислот по патенту RU 2182482 и определение их характеристик
В целях сравнения были получены известные гуминовые кислоты по Примеру 1 из патента RU 2182482 и определены их характеристики, как описано далее.
Получение
В качестве исходного материала использовали гидролизованный лигнин, являющийся неспецифическим энтеральным сорбентом (предлагаемым под торговым наименованием "Polyphepanum" компанией Scientek Ltd).
В течение 1 часа подвергли раствор 1 кг исходного материала, 100 г гидроокиси натрия и 8,1 кг воды обработке в окислительном реакторе, оснащенном механической мешалкой, при температуре 160°C, давлении 2,5 МПа и скорости подачи кислорода 5 л/мин. Затем охладили реакционную смесь до комнатной температуры, и путем фильтрации удалили сухой остаток. С помощью серной кислоты довели до 2-3 величину pH фильтрата, представлявшего собой щелочной раствор, содержащий гуминовые вещества. Путем фильтрации отделили остатки гуминовых кислот, последовательно промыли дистиллированной водой и водно-спиртовой смесью до достижения pH 6,0-6,5. Затем высушили полученный продукт при температуре 105°C до получения однородной массы.
Определение характеристик
Гуминовые кислоты, полученные описанным выше способом, имели следующие характеристики.
Содержание золы (минеральных примесей): 13,5%
Элементный состав: С 67,0%, Н 4,0%, N 1,0%, О 0,28%
13
Низкомолекулярные примеси: обнаружены по следующим пикам С ЯМР-спектроскопии: 168,5 м.д. (анионов карбонатов), 171 часть на миллион (анионов формиатов), 173 м.д. (анионов оксалатов), 181-182 м.д. (анионов ацетатов). Общее содержание обнаруженных примесей составило 4,1% по весу в сухом состоянии.
13
Проанализировали структуру гуминовых кислот методом С ЯМР-спектроскопии. Результаты представлены далее в Таблице 1 и на фиг. 1.
Пример 1Б
Способ получения водорастворимого полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению и определение его характеристик
Получение
В качестве исходного материала использовали гидролизованный лигнин, являющийся неспецифическим энтеральным сорбентом (предлагаемым под торговым наименованием "Polyphepanum" компанией Scientek Ltd).
Этот исходный материал имеет следующие физико-химические характеристики: pH 6,5, содержание влаги 66,63%, содержание полисахаридов 25%, содержание лигнина 72,5%, содержание водорастворимых соединений 1,5% по весу в сухом состоянии.
Стадия а)
Поместили 0,998 кг Polyphephanum в 15-литровый сосуд, и добавили 6 кг дистиллированной воды. Тщательно перемешали смесь.
Стадия б)
3
С перерывами добавили приблизительно 2 литра раствора 50% гидроокиси натрия в полученную на стадии а) смесь, чтобы довести ее pH до 13. Затем подвергли ее щелочной обработке в 10-литровом реакторе окислительно-гидролитической деструкции. По достижение температуры и давления 160°C и 2,2 МПа, соответственно, уменьшили подачу воздуха до 5 дм/мин, и продолжали обработку еще в течение двух часов, чтобы обеспечить полный гидролиз и окисление нерастворимого лигнина. Затем с помощью пресс-фильтра отделили полученный продукт, т.е. раствор натриевых солей бензолполикарбоновых кислот от сухого остатка.
Стадия в)
Затем обработали раствор натриевых солей бензолполикарбоновых кислот, полученный на стадии б, соляной кислотой до достижения pH 1-2, и подвергли центрифугированию в течение 15 минут со скоростью 2500 об/мин, чтобы вызвать полимеризацию бензолполикарбоновых кислот посредством градиента плотности.
В результате получили уплотненный неочищенный полимер бензолполикарбоновых кислот.
Стадия г)
13
Затем поместили неочищенный полимер бензолполикарбоновых кислот в диализаторы, рассчитанные на молекулярную массу 3,5 кДа, и осуществили диализ в дистиллированной воде до тех пор, пока доля низкомолекулярных примесей, обнаруженных методом С ЯМР-спектроскопии или другим наглядным методом (например, газовой хроматографии) не достигла 1% по весу сухого вещества полимера. Получили готовое очищенное полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот.
Затем высушили готовое очищенное полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот с целью дальнейшего определения характеристик.
Определение характеристик
Полимер, полученный на стадии г), имел следующие характеристики.
Описание: черные кристаллы.
-1
-1
-1
-1
-1
-1
3
2
Идентичность: полосы поглощения в ИК-диапазоне на волнах 3400-3600 см (OH), 1050 см (С-О), 1250-1300 см (OH). В области 2800-3000 см находится полоса поглощения с пиками на волнах 2928 и 2853 см, которые соответствуют валентным колебаниям групп CH в CH и CH. Более и менее выраженный пик поглощения был выявлен на волне 1750 см, что соответствует валентным колебаниям групп С=O. ИК-спектр полимера представлен на фиг. 2.
Сухой остаток: 93,25%
Содержание золы (минеральных примесей): 0,67%
Хлориды: менее 0,03%
Тяжелые металлы: менее 0,001%
Элементный состав: С 62,5%, Н 3,8%, N 0,18%, О 33,7%
13
Низкомолекулярные примеси: обнаружены по следующим пикам С ЯМР-спектроскопии: 168,5 м.д. (анионов карбонатов), 171 часть на миллион (анионов формиатов), 173 м.д. (анионов оксалатов), 181-182 м.д. (анионов ацетатов). Общее содержание обнаруженных примесей составило 0,8% по весу в сухом состоянии.
13
Проанализировали структуру полимерного соединения методом С ЯМР-спектроскопии. Результаты представлены далее в Таблице 2 и на фиг. 3.
Были дополнительно получены двумерные гомо- и гетероядерные спектры полимера согласно настоящему изобретению (фиг. 4А, 4В и 4С). Далее в Таблице 3 представлены результаты распределения пиков.
3
2
2
2
2
Согласно данным ЯМР-спектроскопии полимер согласно настоящему изобретению может быть охарактеризован как ароматическое ядро, замещенное алкильными, метоксильными, спиртовыми и гидроксиксильными группами, а также карбоксильными группами практически во всех положениях. Как видно из Таблицы 3, от 4,5 до 6 атомов алифатического углерода соответствуют 6 атомам ароматического углерода. При этом повторяются следующие структурные фрагменты: (CHO), (CHO), (CH).
Молекулярная масса заявленного полимера была проанализирована методом гель-фильтрации. Определенная таким способом молекулярная масса фрагмента заявленного полимера составляла 1,5 кДа. На основании молекулярной массы, данных элементного состава и ЯМР-спектроскопии была рассчитана следующая структурная формула:
3
2
х1
2
2
х2
2
х3
(CHO)(CHO)(CH),
в которой х1≤12, х2≤9, х3≤33.
Мономеры полимера согласно настоящему изобретению были также исследованы методом масс-спектрометрии методом ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (FTICR-MS) (фиг. 5) (Таблица 4).
30
Экспериментальные данные
Дополнительно разбавили полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению дистиллированной водой, чтобы получить другие концентрации, и испытали на одноядерных клетках периферической крови (PBMC), состоящих из лимфоцитов (70-80%) и моноцитов (20-30%), выделенных из крови здоровых доноров путем центрифугирования по протоколу Lymphoprep.
Было установлено, что через 15 суток инкубации клеточной культуры, содержащей 215 мкг/л полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению, оно оказало воздействие на PBMC, выразившееся в увеличении подвижности лимфоцитов, а также повышении стойкости моноцитов, как показано на фиг. 7.
Пример 2А
Способ получения противоракового средства по патенту RU 2182482 и определение его характеристик
Получение
2
Обработали гуминовые кислоты, полученные в Примере 1 способом по патенту RU 2182482, 5% раствором аммиака в количестве 80 мл на 1 грамм гуминовых кислот, нагрели на водяной бане, чтобы удалить избыток аммиака, профильтровали и смешали с 30% по объему дистиллированной воды. Затем обработали полученный раствор в виде солей гуминовых кислот тетрахлороплатинатом калия в количестве 0,27% по весу на 1 грамм солей гуминовых кислот, и подвергли акустической кавитации под действием ультразвука с мощностью 40 Вт/см и частотой 22 кГц в течение 4 минут. Использовали воду, чтобы довести объем раствора до 100 мл.
Эксперимент 2А-1
7
Подкожно ввели полученное таким способом противораковое средство мышам с привитой опухолью Эрлиха в количестве 62,5 мг/кг массы тела. Опухоль была привита подкожно в количестве 10 клеток. Лечение было начато через 48 часов после инокуляции опухоли. Мышам вводили инъекции по 0,3 мл три раза в неделю в течение 3 недель (всего по 9 инъекций). Контрольная группа получала изотонический раствор хлорида натрия согласно такой же схеме. Выживаемость составила 60% (6 из 10 животных), и было зарегистрировано 50% ингибирование роста опухоли по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения.
Причиной смертности являлась токсичность соединения платины, не связанного с гуминовыми кислотами.
Пример 2Б
Способ получения содержащего платину (II) сложного вещества согласно настоящему изобретению и определение его характеристик
Получение
Стадия а)
3
Разбавили 4,529 г сухого полимера, полученного способом согласно Примеру 1Б, в 1 литре дистиллированной воды, и с помощью 10% раствора аммиака довели pH до 9,2. Добавили в раствор 0,8373 г цис-дихлородиамминплатины (II). Подвергли полученный раствор обработке ультразвуком с плотностью мощности 3,5 Вт/см и частотой 22 кГц до тех пор, пока содержание несвязанной платины не стало менее 25% исходного количества.
Способ обнаружения несвязанной платины
Для контроля полноты образования комплекса платины использовали целлюлозные диализные мембраны со стандартными порами, рассчитанными на молекулярную массу 500-1000 Да. Поры этого размера позволяют соединению платины проникать через мембрану, но задерживают заявленный полимер с молекулярной массой 1500 Да и, следовательно, его комплекс с платиной.
Для проведения испытания поместили в диализаторы 8 мл образцов сложного вещества, собранного во время обработки ультразвуком, и на 4 часа погрузили в сосуды с дистиллированной водой, чтобы осуществить диализ.
Разбавили 0,8373 г цис-дихлородиамминплатины (II) в 1 литре дистиллированной воды, чтобы получить модельный раствор (контрольный раствор). Приняли количество платины, перешедшей из модельного раствора в диализат, за 100%.
Концентрация свободной платины в диализате модельного раствора составляла 76 мг/л (100%), а ее концентрация в диализате сложного вещества согласно настоящему изобретению составляла 18 мг/л (24%).
Стадия б)
Затем подвергли реакционную смесь, содержащую полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и цис-дихлородиамминплатину (II), термостатированию при 40°C в течение 24 часов, чтобы завершить образование желаемого комплекса. Продолжали термостатирование до тех пор, пока концентрация несвязанной платины (определенная описанным выше способом) не стала менее 10% количества, добавленного на стадии а.
Стадия в)
Затем очистили неочищенное сложное вещество, полученное на стадии б), от механических включений с помощью 10,0-мкм полипропиленового фильтра и использовали для получения фармацевтической композиции, как описано в Примере 3.
Эксперимент 2Б-1
7
Подкожно ввели полученное таким способом сложное вещество животным с привитой опухолью Эрлиха в количестве 62,5 мг/кг массы тела. Опухоль была привита подкожно в количестве 10 клеток. Лечение было начато через 48 часов после инокуляции опухоли. Мышам вводили инъекции по 0,3 мл три раза в неделю в течение 3 недель (всего по 9 инъекций). Контрольная группа получала изотонический раствор хлорида натрия согласно такой же схеме. Выживаемость составила 100% (10 из 10 животных), и было зарегистрировано 65% ингибирование роста опухоли по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения.
Более высокая безопасность и эффективность сложного вещества по сравнению с противораковым средством по патенту RU 2182482 стала результатом более эффективного образования комплекса соединения платины с заявленным сложным веществом.
Определение характеристик
Дополнительно проанализировали образование нового комплекса полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот с цис-дихлородиамминплатиной (II) методом рентгеновской спектроскопии тонкой структуры протяженного поглощения (EXAFS) (смотри фиг. 6). На спектре EXAFS заметны значительные различия между заявленным сложным веществом, содержащим полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот согласно настоящему изобретению и цис-дихлородиамминплатину (II), неорганической цис-дихлородиамминплатиной (II) ("цисплатин") и цис-диаммин(циклобутан-1,1-дикарбоксилат-O,O')платиной (II) ("карбоплатин").
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Сложное вещество согласно настоящему изобретению имеет следующие характеристические полосы поглощения ИК-спектра: 3400-3600 см, 2800-3000 см, 1500-1700 см, 1410 см, 1250-1300 см и 1050 см, при этом интенсивность пиков у сложного вещества в полосах 3400-3600 см, 1500-1700 см, 1410 см и 1250-1300 см является меньшей, чем у полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот.
13
На основании данных С ЯМР-спектроскопии и EXAFS была рассчитана следующая суммарная формула сложного вещества:
3
2
x1
2
2
x2
2
x3
3
2
x4
(CHO)(CHO)(CH)(Pt(NH)),
1
2
3
4
в которой x, х, х и x означают коэффициенты, являющиеся любым натуральным положительным целым или дробным числом.
Пример 3
Описание неклинических и клинических данных, которые подтверждают применение фармацевтической композиции на основе сложного вещества, содержащего водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение платины, и определение его характеристик
Получение
Использовали сложное вещество в концентрации 0,5%, полученное согласно Примеру 2Б, в качестве основы для получения фармацевтической композиции, дополнительно содержащей такие вспомогательные вещества, как растворитель в виде изотонического раствора хлорида натрия для доведения концентрации фармацевтической композиции до 0,05% и буферное вещество в виде соляной кислоты для доведения pH до 7-8. Получили фармацевтическую композицию путем механического перемешивания сложного вещества и вспомогательных веществ с постоянным контролем pH. Дополнительно очистили фармацевтическую композицию путем стерилизационной фильтрации.
Полученная таким способом фармацевтическая композиция может применяться для парентерального (подкожного или внутримышечного) введения.
Определение характеристик
Определили характеристики фармацевтической композиции следующими методами, описанными в 6-м издании Европейской Фармакопеи:
Описание: прозрачная темно-коричневая жидкость
pH: 7,27
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Идентичность: характеристические полосы поглощения в ИК-диапазоне на волнах 3400-3600 см, 2800-3000 см, 1500-1700 см, 1410 см, 1250-1300 см и 1050 см с меньшей интенсивностью пиков на волнах 3400-3600 см, 1500-1700 см, 1410 см и 1250-1300 см, чем у полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот.
Содержание платины: 0,0049%
Стерильность: стерильная
Токсичность: нетоксичная в дозировке 0,1 мг/мышь
Пирогенность: непирогенная в дозировке 1,3 мг/кг массы тела внутримышечно (при испытании на кроликах)
Неклинические данные
Была оценена противоопухолевая эффективность заявленной фармацевтической композиции в отношении аутохтонных спонтанных опухолей молочной железы у самок мышей линии HER-2/neu с повышенными уровнями экспрессии онкогена HER-2/neu, фактора роста эпидермиса и высокой вероятностью спонтанного развития множества новообразований в молочной железе.
Согласно выбранной схеме эксперимента по достижении диаметра опухолей молочной железы по меньшей мере 5 мм животных произвольным образом относили к контрольной и экспериментальной группам. Подкожно вводили заявленную фармацевтическую композиция в виде двух доз (62,5 мг/кг массы тела и 3,0 мг/кг массы тела) 3 раза в неделю до умерщвления животных.
Через 7-14 дней доля животных с ремиссией из получавших 62,5 мг/кг массы тела или 3 мг/кг массы тела заявленной фармацевтической композиции составляла 13% и 12%, соответственно, (результаты являются статистически значимыми) по сравнению с 0% в контрольной группе.
Эти результаты является хорошим показателем эффективности заявленной фармацевтической композиции при лечении опухолей молочной железы, который может быть экстраполирован на людей и непродуктивных животных.
Клинические данные
Была проведена фаза Ib клинического исследования заявленного лекарства на 8 пациентах с метастазирующим раком молочной железы. Пациенты получали 1 инъекцию лекарства в сутки в течение 32 дней. Оценочный интервал суммарной дозы составлял от 0,96 мг/кг массы тела до 1,12 мг/кг массы тела.
Были получены следующие результаты с использованием заявленной фармацевтической композиции: один случай полной восприимчивости (с исчезновением всех метастазов), один случай частичной восприимчивости (с уменьшением размеров метастазов более, чем на 25%), три случая стабильного течения болезни (с изменением размера метастазов в пределах от -25% до 25%) и три случая прогрессирующей болезни (с увеличением размера метастазов более, чем на 25%).
Эти результаты является хорошим показателем эффективности заявленной фармацевтической композиции при лечении опухолей молочной железы.
В общей сложности в ходе исследования зарегистрировано 78 неблагоприятных событий. Ни одно из зарегистрированных неблагоприятных событий не являлось серьезным. Неблагоприятные события являлись в основном легкими или умеренными, и лишь 2% из 78 неблагоприятных событий были связаны с заявленной фармацевтической композицией.
Кроме того, при увеличении дозы заявленной фармацевтической композиции наблюдалось снижение числа побочных эффектов. Эти данные являются хорошим показателем высокой безопасности заявленной фармацевтической композиции и ее потенциала при паллиативной терапии, в частности, пациентов с заболеваниями в терминальной стадии.
Было дополнительно установлено, что заявленная фармацевтическая композиция способствует нормализации параметров крови. Так, к концу периода последующего наблюдения нормализовались следующие параметры крови: содержание гемоглобина у 2 из 4 пациентов, содержание эритроцитов у 2 из 3 пациентов, содержание тромбоцитов у 1 из 3 пациентов, содержание лейкоцитов у 3 из 5 пациентов, содержание нейтрофилов у 3 из 3 пациентов и содержание лимфоцитов у 1 пациента по сравнению с уровнями, зарегистрированными при скрининге.
Эти данные является хорошим показателем того, что заявленная фармацевтическая композиция может эффективно применяться для модифицирования основной болезни, такой как, например, рак.
Пример 4
Способ получения сложного вещества, содержащего водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена, и определение его характеристик
Стадия а)
3
Разбавили 15 г сухого полимера, полученного способом согласно Примеру 1Б, в 1 литре дистиллированной воды, и довели pH до 9,2 с использованием приблизительно 15 мл 10% раствора аммиака. Затем нагрели раствор до 60°C и перемешивали в течение 1,5 часов, чтобы удалить избыток аммиака. Добавили 5 г тетрагидромолибдата аммония и подвергли полученный раствор обработке ультразвуком с плотностью мощности 3,5 Вт/см и частотой 22 кГц до тех пор, пока содержание несвязанного молибдена не стало менее 25% исходного количества.
Способ обнаружения несвязанного молибдена
Для контроля полноты образования комплекса молибдена использовали целлюлозные диализные мембраны со стандартными порами, рассчитанными на молекулярную массу 500-1000 Да. Поры этого размера позволяют соединению молибдена проникать через мембрану, но задерживают заявленный полимер с молекулярной массой 1500 Да и, следовательно, его комплекс с молибденом.
Для проведения испытания поместили в диализаторы 8 мл образцов сложного вещества, собранного во время обработки ультразвуком, и на 4 часа погрузили в сосуды с дистиллированной водой, чтобы осуществить диализ.
Разбавили 5 г тетрагидромолибдата аммония в 1 литре дистиллированной воды, чтобы получить модельный раствор (контрольный раствор). Приняли количество молибдена, перешедшего из модельного раствора в диализат, за 100%.
Концентрация свободного/несвязанного молибдена в диализате модельного раствора составляла 52 мг/л (100%), а его концентрация в диализате сложного вещества согласно настоящему изобретению составляла 11 мг/л (21%).
Стадия б)
Затем подвергли полученное на стадии а) сложное вещество, содержащее полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и тетрагидромолибдат аммония, термостатированию при 40°C в течение 24 часов, чтобы завершить образование желаемого комплекса. Продолжали термостатирование до тех пор, пока концентрация несвязанного молибдена (определенная описанным выше способом) не стала менее 10% количества, добавленного на стадии а).
Стадия в)
Очистили неочищенное сложное вещество, полученное на стадии б), от механических включений с помощью 10,0-мкм полипропиленового фильтра и использовали для получения фармацевтической композиции, как описано в Примере 5.
Определение характеристик
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Сложное вещество имеет следующие характеристические полосы поглощения ИК-спектра: 3400-3600 см, 2800-3000 см, 1500-1700 см, 1410 см, 1250-1300 см и 1050 см, при этом интенсивность пиков у сложного вещества в полосах 3400-3600 см, 1500-1700 см, 1410 см и 1250-1300 см является меньшей, чем у полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот.
13
На основании данных С ЯМР-спектроскопии была рассчитана следующая суммарная формула сложного вещества:
3
2
x1
2
2
x2
2
x3
3
x4
2
x5
4
x6
(CHO)(CHO)(CH)(MoO)(HO)(NH),
1
2
3
4
5
6
в которой x, х, х, x, x и x означают коэффициенты, являющиеся любым натуральным положительным целым или дробным числом.
Пример 5
Описание экспериментальных данных, которые подтверждают применение фармацевтической композиции на основе сложного вещества, содержащего водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена, и определение его характеристик
Получение
Использовали сложное вещество, полученное согласно Примеру 4, в качестве основы получения фармацевтической композиции, дополнительно содержащей дистиллированную воду в качестве растворителя. С этой целью смешали сложное вещество в концентрации 0,55% и дистиллированную воду в соотношении 1:40 и подвергли механическому перемешиванию. Полученная таким способом фармацевтическая композиция может применяться для перорального введения.
Определение характеристик
Определили характеристики фармацевтической композиции следующими методами, описанными в 6-м издании Европейской Фармакопеи:
Описание: непрозрачная, темно-коричневая жидкость
pH: 8,27
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
Идентичность: полосы поглощения в ИК-диапазоне на волнах 3400-3600 см, 2800-3000 см, 1500-1700 см, 1410 см, 1250-1300 см и 1050 см с меньшей интенсивностью пиков на волнах 3400-3600 см, 1500-1700 см, 1410 см и 1250-1300 см, чем у полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот.
Общее количество микробов: менее 100 КОЕ/г
Токсичность: нетоксичная в дозировке 0,1 мг/мышь
Пирогенность: непирогенная в дозировке 1,3 мг/кг массы тела внутримышечно (при испытании на кроликах)
Экспериментальные данные
Дополнительно разбавили фармацевтическую композицию на основе сложного вещества, содержащего водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена, дистиллированной водой, чтобы получить другие концентрации, и испытали на одноядерных клетках периферической крови (PBMC), состоящих из лимфоцитов (70-80%) и моноцитов (20-30%), выделенных из крови здоровых доноров путем центрифугирования по протоколу Lymphoprep.
Было установлено, что через 11 суток инкубации клеточной культуры, содержащей 35 мкг/л и 215 мкг/л фармацевтической композиции, она оказала воздействие на PBMC, выразившееся в увеличении подвижности лимфоцитов, а также повышении стойкости моноцитов.
В ходе той же серии экспериментов оценили воздействие фармацевтической композиции на панель цитокинов, вырабатываемых одноядерными клетками периферической крови (PBMC). Было установлено, что через 11 суток инкубации клеточной культуры выработка интерферона гамма увеличилась с 0-75 пикограмм/мл в контрольной группе до 2000-3000 пикограмм/мл в группах, получавших фармацевтическую композицию; выработка ФНО-альфа увеличилась с 0 пикограмм/мл в контрольной группе до 400-650 пикограмм/мл в группах, получавших фармацевтическую композицию.
Эти данные является хорошим показателем того, что фармацевтическая композиция может эффективно применяться для профилактики и лечения болезней, связанных с нарушением клеточного цикла (например, канцерогенеза, вызванного облучением или естественным старением клеток).
Пример 6
Описание экспериментальных данных, которые подтверждают клиническое применение фармацевтической композиции на основе сложного вещества, содержащего водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена, с целью снижения/сведения к минимуму побочных эффектов, сопутствующих традиционной радиотерапии или химиотерапии
Характеристики пациента
В качестве пациента в этом исследовании участвовала женщина 64 лет, долгое время страдавшая заболеваниями желудочно-кишечного тракта. В мае 2012 года у нее был диагностирован рак ободочной и прямой кишки с местными метастазами в лимфоузлах, и было рекомендовано хирургическое вмешательство, которое было проведено в июне того же года. По ряду причин операцию пришлось проводить дважды. По данным первой оценки к концу августа пациенту было предложено начать курс химиотерапии.
Результаты и процедура
Путем лабораторных исследований данных первой оценки, было обнаружено довольно низкое содержание сывороточного альбумина в сочетании с низким содержанием гемоглобина, лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и лимфоцитов. Кроме того, было обнаружено пониженное содержание эозинофилов, АлАТ, АсАт и щелочных фосфатаз (Таблица 5). Лечащий онколог отменил начало курса химиотерапии, чтобы дать новую оценку через две недели. В течение этого времени пациент ежедневно получал 20 мл фармацевтической композиции, содержащей новый комплекс бензолполикарбоновых кислот с молибденом. Композиция вводилась перорально. В результате лабораторных исследований данных второй оценки обнаружена нормализация содержания альбумина, значительное повышение уровня содержания гемоглобина, лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов, лимфоцитов и эозинофилов. Кроме того, повысились уровни содержания АлАТ и АсАт. Был немедленно начат курс химиотерапии.
Курс химиотерапии
Было проведен курс из 12 двухдневных периодов инъекций с двухнедельным периодом отдыха после каждого курса. После каждого периода инъекций брались образцы крови для лабораторного анализа. Кроме того, в течение одного из периодов отдыха пациент заполнил форму С-30 опросника оценки качества жизни (КЖ).
Пациент получил 20 мл перорально композиции согласно настоящему изобретению (т.е. сложного вещества, содержащего водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена) за две недели до и через одну неделю после первого двухдневного периода инъекций.
За одну неделю до и через одну неделю после второго периода инъекций композиция согласно настоящему изобретению не вводилась. Лечение композицией согласно настоящему изобретению возобновили через одну неделю после второго периода инъекций, и вводили ее ежедневно до и после следующих трех периодов инъекций. За одну неделю до шестого периода инъекций снова прекратили применение композиции согласно настоящему изобретению. Это дополнительное лечение снова возобновили непосредственно перед седьмым периодом инъекций и не применяли в течение оставшейся части из 12 периодов курса химиотерапия.
После первого и второго периодов инъекций пациент заполнил форму С-30 опросника, а также дополнительно после пятого, шестого и седьмого периодов.
Результаты
Лабораторные показатели
Было установлено, что содержание сывороточного альбумина было слишком низким для начала химиотерапии. Изначально оно составляло всего 28 (Таблица 5), но затем выросло до 39 через 10 дней лечения композицией согласно настоящему изобретению. Этот уровень также сохранялся во время первого периода курса химиотерапии с дополнительным лечением композицией согласно настоящему изобретению. Содержание альбумина немного снизилось в течение второго и шестого периодов курса химиотерапии без дополнительного лечения композицией согласно настоящему изобретению по сравнению с лечением до и после, когда пациент также получал композицию согласно настоящему изобретению.
Была также получена аналогичная картина содержания гемоглобина, лейкоцитов, гранулоцитов, лимфоцитов и эозинофилов. Все эти показатели являлись низкими до начала курса химиотерапии, но значительно выросли за 10 дней дополнительного перорального приема композиции согласно настоящему изобретению. Полученные показатели почти не изменялись во время первого периода курса химиотерапии с дополнительным лечением композицией согласно настоящему изобретению.
Второй период курса химиотерапии проводился без применения композиции согласно настоящему изобретению, и было обнаружено, что все приведенные выше показатели снова снизились. Следующие три курса химиотерапии проводились с дополнительным применением композиции согласно настоящему изобретению, и содержание гемоглобина, лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов снова повысилось до предыдущих уровней. Почти аналогичная картина была также получена для эозинофилов за исключение третьего периода. Шестой период, как и второй период, также проводился без дополнительного применения композиции согласно настоящему изобретению, и произошло почти то же самое.
Содержание АлАТ и АсАт определялось только до начала курса химиотерапии и в течение первых двух периодов курса химиотерапии. Тем не менее, была получена такая же картина, которая была описана выше применительно к гематологическим показателям.
Форма С-30 опросника оценки качества жизни
Суммарная оценка по форме С-30 снизилась на 53% за время от периода отдыха после первого периода курса химиотерапии с дополнительным применением композиции согласно настоящему изобретению до периода отдыха после второго периода курса химиотерапии без дополнительного применения композиции согласно настоящему изобретению. Аналогичная картина была также получена для периодов отдыха после пятого, шестого и седьмого периодов курса химиотерапии. Оценка по форме С-30 снизилась на 48% за время от пятого периода с дополнительным применением композиции согласно настоящему изобретению до седьмого периода без ее применения, и выросла на 58% за время от шестого периода до седьмого периода с дополнительным применением композиции согласно настоящему изобретению.
Вывод
Несмотря на то, что это исследование представляет собой лишь неструктурированное описание клинических случаев, оно ясно демонстрирует благоприятный эффект композиций согласно настоящему изобретению в качестве возможной терапии, дополняющей химиотерапию.
Пример 7
Исследование жизнеспособности раковых клеток при воздействии соединениями согласно настоящему изобретению
В этом исследовании изучены следующие клетки:
клетки рака молочной железы человека линии MCF-7 (с выраженной дифференциацией),
клетки рака молочной железы человека линии T47-D (со слабой дифференциацией),
клетки рака поджелудочной железы человека линии PI45 (со слабой дифференциацией),
клетки рака мочевого пузыря человека линии Т24Р (со слабой дифференциацией),
клетки рака яичника человека линии SKOV (со слабой дифференциацией),
клетки рака ободочной и прямой кишки человека линии HCT116,
клетки рака головы и шеи линии Fadu.
В течение 72 часов воздействовали на клетки различными количествами (10-200 мкг на лунку):
водорастворимого полимерного соединения бензолполикарбоновых кислот ("Соединение 2" на фиг. 8-13),
сложного вещества, содержащего водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение платины ("Соединение 1" на фиг. 8-13) и
сложного вещества, содержащего водорастворимое полимерное соединение бензолполикарбоновых кислот и соединение молибдена ("Соединение 3" на фиг. 8-13).
Жизнеспособность клеток
4
Высеяли клетки на 96-луночные планшеты (5×10 клеток/мл), и на второй день заменили среду средой, содержащей соединения/сложные вещества в различных концентрациях. Определили жизнеспособность клеток через 72 часа и 96 часов методом ХТТ согласно протоколу, прилагаемому к набору для анализа.
Результаты приведены на фиг. 8-11.
Как показывают результаты, соединение/сложные вещества во всех трех случаях влияют на жизнеспособность клеток всех линий. Снижение жизнеспособности составляло от 40% до 90% в зависимости от исследуемой линии клеток. Наиболее выраженный эффект уничтожения клеток наблюдался в случае линий клеток рака человека и рака головы и шеи, а наименьший - в случае линий клеток рака яичника и рака печени. Смотри Таблицу 6 далее.
Цитотоксическое действие, определенное путем измерения активности лактатдегидрогеназы (LDH)
Определили целостность плазматических мембран путем измерения активности LDH, высвобождаемой в среду для культивирования. Отслеживали активность LDH после окисления NADH на основании снижения спектральной поглощательной способности на волне 334 нм. Определили процент высвобожденной LDH как соотношение активности LDH в супернатанте и суммарного количества высвобожденной LDH плюс активность, измеренная в клеточном лизате.
Результаты приведены на фиг. 12-13.
Результаты показывают отсутствие признаков повреждения клеток. Высвобождение LDH из контрольных клеток не отличалось от высвобождения из клеток, на которые воздействовали испытуемыми веществами, т.е. вещества являются нетоксичными. Повреждение клеток, такое как некроз, вызывает повышение концентрации LDH в среде. Целостность плазматических мембран после воздействия определяли путем измерения активности LDH, высвобождаемой в среду для культивирования. Для измерения ферментативной активности использовали метод спектрофотометрии (Moran и Schnellmann 1996).