УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОЧИПА

Полезная модель относится к области медицины, но также может быть использована в области ветеринарии и биологии.
Известно устройство для инкубации и отмывки биочипа, предназначенного для определения поверхностных антигенов клеток, используемое для инкубации биочипа с клеточной суспензией, выполнения его отмывки, а также для обработки биочипа различными жидкостями при проведении дополнительных исследований связавшихся с ним клеток, взятое в качестве прототипа и представляющее собой емкость (например, чашку Петри), на дне которой закреплен биочип.(См., например, А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток». Биологические мембраны, 2008, том 25, №4, с 277-284).
Недостатком прототипа является большой расход растворов реагентов, которые используются при проведении анализа. Это обусловлено тем, что используемый раствор должен покрывать всю поверхность находящегося в емкости биочипа, поверхность которого имеет не только тестовые участки, имеющие значение для проведения анализа, но и разделяющие их фоновые участки.
Особенно большое значение данное обстоятельство будет приобретать, в тех случаях, когда возникает необходимость использования растворов дорогостоящих реагентов, например флуоресцентно-меченных антител, применяемых при определении коэкспрессии антигенов на связанных с биочипом клетках.
Ситуацию еще более усугубляет несоответствие формы и размеров емкости, в которой находится биочип, форме и размерам биочипа. Это заставляет приводить в контакт с жидкостью всю поверхность дна, а не только поверхность биочипа. Данное обстоятельство также обусловливает большой расходу исследуемой клеточной суспензии, отмывочных растворов и других жидкостей на этапах, предшествующих проведению дополнительных исследований связавшихся с биочипом клеток.
Кроме того, недостатком прототипа является невозможность одновременного приведения в контакт разных участков поверхности биочипа с растворами разных реагентов без их смешивания друг с другом. Это не позволяет параллельно проводить несколько разных групп однотипных исследований на одном биочипе.
Недостатком прототипа также является необходимость выполнения точных манипуляций при закреплении биочипа в емкости и его извлечении, повышающих риск повреждения поверхности биочипа.
Задачей заявленной полезной модели является сокращение расхода растворов дорогостоящих реагентов при проведении анализа, а также возможность одновременного приведения в контакт разных участков поверхности биочипа с растворами разных реагентов без их смешивания друг с другом.
Поставленная задача решается за счет того, что согласно полезной модели, устройство для проведения анализа с использованием биочипа, содержащее емкость, на дне которой размещается биочип, снабжено приспособлением, герметично устанавливаемым на поверхность биочипа и разделяющим данную емкость на несколько емкостей меньшего объема, дно каждой из которых образовано участком поверхности биочипа.
Приспособление, разделяющее емкость для размещения биочипа на несколько емкостей меньшего объема, выполнено в виде пластины со сквозными отверстиями.
Сквозные отверстия имеют вытянутую форму.
Приспособление, разделяющее емкость для размещения биочипа на несколько емкостей меньшего объема, выполнено в виде пластины с канавками.
Приспособление, разделяющее емкость для размещения биочипа на несколько емкостей меньшего объема, снабжено дополнительными отверстиями для введения жидкости в эти емкости.
Устройство, снабжено съемной крышкой.
Дно емкости является съемным.
Дно емкости снабжено клейким покрытием для крепления биочипа.
Устройство снабжено приспособлением, прижимающим к поверхности биочипа приспособление, разделяющее емкость на несколько емкостей меньшего объема.
Устройство снабжено приспособлением, фиксирующим съемное дно емкости.
Форма и размеры горизонтального сечения емкости, на дне которой размещается биочип, соответствуют форме и размерам биочипа.
Использование заявленной полезной модели позволяет сократить расход растворов дорогостоящих реагентов при проведении анализа, давая при этом возможность одновременного приведения в контакт разных участков поверхности биочипа с растворами разных реагентов без их смешивания друг с другом. Это достигается благодаря наличию съемного приспособления, герметично устанавливаемого на поверхность биочипа и разделяющего емкость в которой размещается биочип на несколько емкостей меньшего объема, дно каждой из которых образовано участками поверхности биочипа.
Соответствие формы и размеров внутреннего горизонтального сечения емкости, на дне которой размещается биочип форме и размерам биочипа, позволяет снизить расход клеточной суспензии и растворов, используемых на тех этапах проведения анализа, когда приспособление, разделяющее емкость для размещения биочипа на несколько емкостей меньшего объема, не установлено.
Наличие съемного дна, а также наличие на нем клейкого покрытия, позволяют уменьшить риск повреждения биочипа при его закреплении в устройстве и извлечении из него. Дно может быть выполнено из клейкой пленки, что позволяет легко проводить его отделение и замену после выполнения анализа. Это делает использование устройства более удобным. Дно емкости может быть выполнено прозрачным, что позволяет также контролировать процесс проведения некоторых этапов анализ анализа (например, отмывки биочипа от не специфически связавшихся клеток), а также осуществлять считывание результата анализа с использованием микроскопии в проходящем свете.
За счет использования съемной крышки исключается разбрызгивание жидкости и уменьшается ее испарение.
Наличие приспособления, фиксирующего съемное дно емкости, делает надежным его крепление и исключает отделение дна в процессе проведения анализа.
Наличие дополнительного приспособления, которое прижимает к биочипу приспособление, разделяющее емкость для размещения биочипа на несколько емкостей меньшего объема, исключает возможность разгерметизации данного соединения.
Наличие дополнительных отверстий в приспособлении, разделяющем емкость для размещения биочипа на несколько емкостей меньшего объема, позволяет вводить в эти емкости необходимые растворы с помощью автоматической микропипетки, шприца Гамильтона или иного подобного устройства.
Устройство может быть снабжено несколькими видами съемных приспособлений, разделяющих емкость (кювету) на несколько емкостей меньшего объема. Это повышает универсальность устройства, поскольку позволяет осуществлять работу с биочипами разных конструкций.
Наличие съемной крышки позволяет уменьшить испарение жидкости из устройства в процессе проведения анализа. При наличии герметично закрываемой крышки, устройство может быть использовано также в качестве контейнера, позволяющего осуществлять длительное хранение биочипа перед использованием. (При этом должно быть снято приспособление, предназначенное для разделения емкости для размещения биочипа на несколько емкостей меньшего объема).
Полезная модель поясняется чертежом, на котором на фиг.1 представлен общий вид устройства (сверху) с установленным приспособлением, разделяющим емкость (кювету) на несколько емкостей меньшего объема, которое выполнено в виде пластины с параллельными сквозными прорезями.
на фиг.2 представлен разрез А-А на фиг.1
на фиг.3 представлен разрез В-В на фиг.1
На фиг.4 представлен общий вид устройства (сверху) с установленными биочипом и съемной прозрачной крышкой и снятым приспособлением, предназначавшимся для разделения емкости (кюветы) на несколько емкостей меньшего объема.
На фиг.5 представлен разрез С-С на фиг.4
На фиг.6 представлен поперечный разрез устройства, в котором установлено приспособление, предназначенное для разделения кюветы на несколько емкостей, выполненное в виде пластины с параллельными канавками.
На фиг.7 представлен вид сверху устройства, в котором установлено приспособление, предназначенное для разделения кюветы на несколько емкостей, выполненное в виде пластины со сквозными отверстиями.
На фиг.8 представлен биочип, тестовые участки которого выполнены в виде параллельных полос.
На фиг.9 представлен биочип, тестовые участки которого выполнены в виде областей круглой формы.
Устройство содержит корпус 1 (фиг.1), представляющий собой пластину, в которой выполнено отверстие 2 (фиг.2). К корпусу 1 крепится съемное дно 3 (фиг.3, 5, 6), выполненное из прозрачного материала. При креплении дна 3 (фиг.5) к корпусу 1 образуется емкость 4. Дно 3 имеет клейкое покрытие (на чертеже не показано). Дно 3 может быть выполнено в виде клейкой пленки, приклеенной к корпусу 1. К дну 3 крепится (за счет приклеивания к клейкому покрытию) биочип 5. Возможны и другие варианты конструкции съемного дна, например, в виде твердой пластины, а также иные способы крепления биочипа 5. Возможно также выполнение устройства с несъемным дном, но в этом случае оно будет значительно менее удобным в эксплуатации.
Жесткость фиксации съемного дна 3 (фиг.5) к корпусу 1 обеспечивает прижимающая рама 6. Прижимающая рама 6 имеет отверстие закрытое прозрачной вставкой 7, которое при сборке устройства оказывается расположенным под дном 3 емкости 4.
Форма и размеры горизонтального сечения емкости 4 (фиг 1), соответствуют форме и размерам биочипа 5 (фиг.8, 9). Устройство снабжено съемным приспособлением 8 (фиг.1, 3, 6, 7), устанавливаемым на поверхность биочипа 5 (фиг.3, 6) (находящегося в емкости 4) и разделяющее емкость 4 на несколько емкостей 9 имеющих меньшие размеры.
Приспособление 8 выполнено в виде пластины 10, имеющей покрытие 11, герметизирующее соединение с биочипом 5. Для возможности работы с биочипами 5 различных типов (фиг 8, 9), устройство укомплектовано разными типами съемных приспособлений 8 (фиг.1, 3, 6, 7), отличающимися по конструкции. В приспособлении 8 (фиг.1, 3) 1-го типа, в пластине 10 выполнены сквозные отверстия (прорези) 12 вытянутой формы, расположенные параллельно. При установке приспособления 8 на поверхность биочипа 5 образуются параллельные друг другу емкости 9 (фиг.3). В пластине 10 (фиг.1) приспособления 8 выполнены сквозные отверстия 13, каждое из которых соединяется с одним из отверстий (прорезей) 12. Отверстия 13 предназначены для заполнения емкостей 9 жидкостью с помощью автоматической микропипетки, шприца Гамильтона или иного подобного устройства. (При введении жидкости наконечник микропипетки или игла шприца Гамильтона вставляется в отверстие 13).
В приспособлении 8 (фиг.6) 2-го типа, вместо сквозных прорезей выполнены канавки 14 вытянутой формы, которые также располагаются параллельно. Приспособление 8 данного типа также имеет отверстия (аналогичные отверстиям 13, показанным на фиг.1), которые сообщаются с канавками 14. При установке на поверхность биочипа приспособления 8 2-го типа (фиг.6), также образуется несколько емкостей 9, которые в данном случае имеют вид капилляров.
Приспособления 8 1-го и 2-го типа позволяют осуществлять работу с биочипами (фиг.8), в которых тестовые участки 24, содержащие иммобилизованные вещества, выполнены в виде параллельных полос. При этом возможна установка данного приспособления таким образом, чтобы прорези 12 (или канавки 14) располагались перпендикулярно тестовым участкам биочипа и при этом каждая канавка 14 (прорезь 12) при установке приспособления 8 на поверхность биочипа 5 образовывала емкость 9, на дне которой располагалось несколько фрагментов разных тестовых участков 24. Кроме того возможна установка приспособления 8 таким образом, чтобы канавки 14 (прорези 12) располагались вдоль тестовых участков 24 биочипа 5. В этом случае, при установке приспособления 8 на поверхность биочипа 5 образуются емкости 9, дно каждой из которых образовано только одним из тестовых участков 24. Это позволяет приводить в контакт с раствором каждого используемого реагента, вносимого в емкость 9, либо только один тестовый участок 24 биочипа 5, либо несколько фрагментов разных тестовых участков 24. При установке приспособления 8, относящегося к 1-му или 2-му типу, на поверхность биочипа, показанного на фиг.9, на дне каждой из емкостей 9 оказывается группа из нескольких тестовых участков 24.
Приспособление 8 3-го типа (Фиг.7), представляет собой пластину, в которой выполнены отверстия 15. Отверстия 15 расположены таким образом, что при установке приспособления 8 данного типа на поверхность биочипа, показанного на фиг.9, образуются емкости, на дне каждой из которых располагается по одному тестовому участку, а при установке приспособления 8 на поверхность биочипа, показанного на фиг.8, образуется несколько отдельных емкостей для каждого из тестовых участков. Необходимо отметить, что диаметр отверстий 15 должен быть достаточно большим (оптимально 1-3 мм) для того, чтобы не возникало сложностей при заполнении жидкостью емкостей 9. Поэтому приспособление 8 3-го типа может быть использовано для работы с биочипами 5, (показанными на фиг.9), тестовые участки 24 которых расположены на достаточно большом расстоянии друг от друга и имеют размеры близкие к диаметру отверстий 15. Использование биочипов с такими характеристиками целесообразно для решения достаточно ограниченного числа задач.
Стенки прорезей 12 (фиг.3), канавок 14 (фиг.6), отверстий 15 (фиг.7) приспособлений 8, могут иметь покрытие (на чертеже не показано), обеспечивающие повышение или напротив уменьшение их гидрофильности (гидрофобности). С этой же целью вместо нанесения покрытия может быть использовано химическое или физико-химическое модифицирование поверхности данных участков.
Приспособление 8 (фиг.3, 6) прижимается к поверхности биочипа 5 с помощью пластины 16, которая подвижно крепится в пазах 17, выполненных в раме 6. Прижимающая пластина 16 имеет отверстие 18 (фиг.5), располагающееся при ее установке над емкостью 4.
При снятом приспособлении 8 емкость 4 может быть герметично закрыта крышкой 19 (фиг.5), которая фиксируется на корпусе 1 с помощью прижимающей пластины 16. В таком виде устройство может использоваться в качестве контейнера для хранения биочипа. Кроме того, крышка 19 может устанавливаться в процессе проведения анализа на тех его этапах, когда приспособление 8 не используется. В последнем случае наличие крышки 19 предотвращает разбрызгивание и уменьшает испарение жидкости из емкости 4.
При установленном приспособлении 8 1-го или 3-го типа в процессе проведения анализа может использоваться съемная крышка 20 (фиг.3), предназначенная для уменьшения испарения жидкости из емкостей 9. Это особенно важно, поскольку используются малые объемы растворов, а испарение жидкости может привести к быстрому высыханию поверхности биочипа и искажению результатов анализа.
Биочип 5 (фиг.8, 9) представляет собой твердую плоскую подложку 21, на которой имеется рабочая область 22 и края 23. В рабочей области 22 на поверхности биочипа расположены тестовые участки 24, в каждом из которых иммобилизованы молекулы веществ, способных специфически связываться со строго определенными молекулами, присутствующими в исследуемом образце. Например, в тестовых участках 24 могут быть иммобилизованы молекулы антител, специфичных к поверхностным антигенам клеток. При этом тестовые участки отличаются друг от друга типом иммобилизованных в них молекул, например, содержат иммобилизованные антитела, имеющие разную специфичность. Тестовые участки 24 отделены друг от друга фоновыми участками 25, не содержащими молекул данных веществ. Подложка 21 может быть выполнена из прозрачного материала. В этом случае в процессе выполнения анализа возможно проведение микроскопического исследования биочипа в проходящем свете.
Тестовые участки могут быть выполнены в виде параллельных полос (фиг.8) или в виде областей («пятен») круглой (фиг.9) или иной формы.
Устройство используют следующим образом.
К корпусу 1 прикрепляют съемное дно 3 и фиксируют данное соединение с помощью съемной рамы 6. В емкости 4 закрепляют биочип 5. При использовании биочипа 5, предназначенного для определения поверхностных антигенов клеток и содержащего иммобилизованные антитела, специфичные к их поверхностным антигенам, в процессе проведения анализа выполняют следующие манипуляции. Если это необходимо, выполняют блокирование сайтов неспецифического связывания подложки 21, например, путем инкубации биочипа 5 с раствором бычьего сывороточного альбумина или иного белка. Затем проводят отмывку биочипа раствором детергента, после чего осуществляют инкубацию биочипа 5 с суспензией исследуемых клеток. Соответствующие жидкости вносят в емкость 4 с помощью автоматической пипетки или иного подобного приспособления. В процессе проведения длительных инкубации биочипа, например, с блокирующим раствором или суспензией клеток, для предотвращения разбрызгивания и уменьшения испарения жидкости емкость 4 может быть закрыта съемной крышкой 19, которую фиксируют прижимающей планкой 16, вставляемой в пазы 17 съемной рамы 6. При смене жидкостей крышку 19 снимают.
В процессе инкубации биочипа 5 с клеточной суспензией клетки оседают на его поверхность. При наличии определяемых поверхностных антигенов клетки связываются в области тех тестовых участков 24 биочипа 5, где иммобилизованы специфичные к ним антитела. Не связавшиеся клетки устраняют путем ополаскивания биочипа 5 промывочным раствором, который также наливают в емкость 4. Качество отмывки биочипа оценивают, например, с помощью микроскопического исследования. При этом устройство размещают на предметном столике микроскопа. Критерием качества отмывки биочипа 5 является отсутствие клеток в области фоновых участков 25. При необходимости осуществляют инкубацию биочипа с раствором, повышающим прочность связывания с подложкой оставшихся клеток. Осуществляют считывание промежуточного результата, например, путем микрофотографирования тестовых участков 24 с помощью фотокамеры, установленной на инвертированном микроскопе. Из емкости 4 сливают жидкость и осторожно убирают ее избыток. После этого в емкости 4 устанавливают приспособление 8, которое прижимают к поверхности биочипа 5 с помощью прижимающей планки 16. Герметизацию соединения приспособления 8 с поверхностью биочипа 5 обеспечивает покрытие 11. При установке приспособления 8 образуется несколько емкостей 9 малого объема, дно которых образовано участками поверхности биочипа 5. В зависимости от конструкции биочипа 5 (фиг.8 или фиг.9), а также в зависимости от типа приспособления 8 и положения, в котором оно устанавливается, на дне каждой из емкостей 9 может располагаться либо один тестовый участок 24, либо несколько тестовых участков 24 или их фрагментов. При этом в тестовых участках 24 с иммобилизованными антителами находятся связавшиеся клетки. Заполняют емкости 9 растворами реагентов, используемых для дополнительного исследования связанных клеток, например, растворами флуоресцентно-меченных антител при определении на клетках коэкспрессии антигенов. Данную манипуляцию осуществляют с помощью шприца Гамильтона, автоматической микропипетки или иного подобного устройства. При использовании приспособления 8 3-го типа данные растворы вносят непосредственно в емкости 9, а при использовании приспособления 8 1-го или 2-го типов - в отверстия 13. При использовании приспособления 8 2-го типа обеспечивается наибольшая экономия растворов реагентов, вводимых в емкости 9. Осуществляют инкубацию биочипа с данными растворами. При этом для уменьшения испарения жидкости из емкостей 9 при использовании приспособления 8 1-го или 2-го типа, на устройство устанавливают съемную крышку 20. После выполнения инкубации в емкости 9 может быть введена жидкость, инактивирующая находящийся в них реагент. Затем выполняют отмывку биочипа. При этом приспособление 8 снимают. Осуществляют считывание результата дополнительного исследования связанных клеток, например, в рассматриваемом случае, микрофотографирование тестовых участков 24 с помощью фотокамеры, установленной на люминесцентном микроскопе. Разбирают устройство, отделяют биочип от съемного дна 3. После промывания и обработки дезинфицирующим раствором устройство может быть использовано повторно.
С помощью данного устройства могут быть выполнены и многие другие дополнительные исследования связавшихся с биочипом клеток с использованием питательных сред, растворов красителей, растворов антител, конъюгированных с ферментами, а также растворами других веществ, которые в процессе анализа вводят в емкости 9. При этом характер и последовательность выполняемых манипуляций будут иными.
Кроме того, устройство также может быть использовано для работы с биочипами других типов, предназначенных для проведения исследований других объектов. Характер и последовательность выполняемых манипуляций при этом также будут отличаться.