Люминесцентный сенсор для мультиплексного (спектрально-временного) детектирования аналитов в водных средах и способ его получения
LUMINESCENT SENSOR FOR MULTIPLEX (SPECTRAL-TIME) DETECTION OF ANALYTES IN AQUEOUS MEDIA AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Изобретение относится к системе мультиплексного анализа для детектирования, количественного и качественного определения растворимых аналитов (биомолекул) в пробах воды и гидрофильных жидкостях и может быть использовано в медицине, биологии и экологии.
В клинико-диагностических исследованиях, которые используются в современных биологических и медицинских приложениях, необходимо обеспечить возможность определять различные биомолекулы путем разработки соответствующих селективных сенсорных платформ.
Потенциальное преимущество использования мультиплексного анализа для селективного детектирования большого числа аналитов в одном образце дает мощный импульс для повседневного использования как в исследовательских, так и в клинических лабораториях. Основным методом мультиплексного анализа является оптическая идентификация, позволяющая идентифицировать биомолекулы с помощью фотолюминесцентных зондов, используемых в составе сенсорной платформы для люминесцентного детектирования биомаркеров. Основными фотолюминесцентными характеристиками сенсорной платформы являются положение полосы излучения и времена затухания фотолюминесценции зондов.
В качестве зондов могут выступать неорганические флуорофоры, флуоресцентные органические красители, флуоресцентные белки или ферменты. Возможность использования данных материалов в качестве маркеров для мультиплексного анализа представлены в работе «Наночастицы для мультиплексной диагностики и визуализации» (Wang L., O’Donoghue М. В., Tan W. Nanoparticles for multiplex diagnostics and imaging // Nanomedicine. 2006. T. 1. №4. C. 413-426.), оптические свойства которых позволяют напрямую регистрировать фотолюминесценцию, кинетику фотолюминесценции или параметры Ферстеровского переноса энергии.
Перспективными материалами для решения задач по созданию фотолюминесцентных сенсоров могут выступать полупроводниковые квантовые точки. Использование в качестве люминесцирующих материалов полупроводниковых нанокристаллов в иммуноанализах «Люминесцентные квантовые точки в иммуноанализах» (Goldman Е.R., Medintz I.L., Mattoussi Н. Luminescent quantum dots in immunoassays // Analytical and bioanalytical chemistry. - 2006. - T. 384. - №. 3. - C. 560-563), позволяет регистрировать прямой сигнал флуоресценции с последующим обнаружением биомолекул.
Использование фотолюминесценции с временным разрешением в качестве дополнительного параметра позволит повысить эффективность методов мультиплексирования. Проблема использования фотолюминесценции с временным разрешением с резонансным переносом энергии Ферстера для определения нуклеотидной последовательности полинуклеотида частично решена в работе «Анализ нуклеиновых кислот на основе нанопор со смешанным обнаружением FRET» (Патент США № US 9862997 B2, МПК C12Q 1/6869, заявка US 14/786,518, дата публикации 09.01.2018, дата приоритета 24.05.2013).
Известны «Полупроводниковые нанокристаллические зонды для биологических применений и способы изготовления и использования таких зондов» (Заявка США № US 20170323998 А1, МПК H01L 33/0062, заявка US 15/385377, дата публикации 09.11.2017, дата приоритета 20.12.2016). Предлагаемые зонды предназначены для обнаружения биологических соединений, путем связывания с молекулой и последующим детектированием. Однако выбранные люминесцентные полупроводниковые нанокристаллы (нанокристаллы полупроводников групп II-VI, таких как MgS, MgSe, MgTe, CaS, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnS, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe и HgTe, а также их смешанные композиции) обладают токсичностью, и биосовместимость этих соединений на сегодняшний день изучена недостаточно. Недостатком зондов является использование токсичных соединений в качестве детектирующего материала, что повышает негативное влияние на биосферу земли.
2
2
2
При этом до сих пор не защищены прецеденты использования систем на основе полупроводниковых люминесцирующих нанокристаллов тройного состава для системы мультиплексного анализа. Упоминание подобных нанокристаллов имеется в статье «Высокочувствительное флуоресцентное обнаружение гликопротеина на основе передачи энергии между квантовыми точками CuInS и родамином В» (Gao X. et al. Highly sensitive fluorescence detection of glycoprotein based on energy transfer between CuInS QDs and rhodamine В // Luminescence. - 2015. - T. 30. - №. 8. - C. 1389-1394.), где рассматривается метод обнаружения гликопротеинов, основанный на резонансном переносе энергии флуоресценции между квантовыми точками CuInS и родамином В.
2
2
2
Полупроводниковые нанокристаллы хорошо совместимы с полимерами и внедрение квантовых точек в полимерные пленки позволяет получать материалы с люминесцентными свойствами, которые возможно использовать в более сложных устройствах. В работе «Композитная пластина с квантовыми точками и полимером для светоизлучающего диода и метод ее изготовления» (Патент Южной Кореи № KR 20130115771, МПК C09K 11/02, заявка 00/383,92, дата публикации 22.10.2013, дата приоритета 13.04.2012) описываются методы формирования полимерной пленки из поливинилпирролидона или поливинилового спирта с квантовыми точками тройного состава CuInS-ZnS и создание композиционной пластины из такой пленки и неорганического слоя на поверхности, предназначенного для защиты тройных квантовых точек от окисления и деградации. В патенте «Композитный люминесцентный материал на основе квантовых точек AgInS/полиметилметакрилата и его применение» (Патент КНР № CN 104263361, МПК C09K 11/62, заявка 10/404,473, дата публикации 07.01.2015, дата приоритета 15.08.2014) описывается люминесцентный материал на основе твердотельной пленки из полиметилметакрилата и квантовых точек AgInS с различной длиной волны излучения для изготовления светодиода. Композитные материалы на основе квантовых точек, внедренных в полимеры, описанные в данных патентах, представляют собой макроскопические объекты, которые предназначены для оптоэлектроники и не могут быть применены в биологических или медицинских приложениях.
8
Наиболее близким по своим параметрам и характеристикам к предлагаемому изобретению является сенсор на основе квантовых точек CdSe-ZnS (см. «Спектрально-временное мультиплексирование в проточной цитометрии с определением времен затухания кодирующих квантовых точек в полимерных сферах» (Kage D. и др. Tempo-spectral multiplexing in flow cytometry with lifetime detection using QD-encoded polymer beads // Sci. Rep. 2020. T. 10. №1. C. 653.), для получения которого используются гранулы карбоксилированного меламиноформальдегида, растворы полимеров полиаллиламин гидрохлорида (ПААГ) и поли(4-стиролсульфоната натрия) (ПСС) и нанокристаллы состава CdSe-ZnS с максимумами фотолюминесценции при 500 и 645 нм. Методом послойного осаждения на поверхности гранул формируется полимерная оболочка, кодированнная квантовыми точками CdSe-ZnS по схеме: меламиноформальдегидная гранула / ПААГ / ПСС / ПААГ / ПСС / ПААГ / CdSe-ZnS / ПААГ / ПСС / ПААГ / ПСС / ПААГ / ПСС.0,5 мл водного раствора ПААГ с концентрацией 2 мг/мл, растворенного в водном растворе 0,5 моль/л NaCl, добавляется к 0,5 мл суспензии, содержащей ≈3,5×10 микрочастиц карбоксилированного меламиноформальдегида. Суспензия обрабатывается в ультразвуковой ванне в течение 2 минут и встряхивается в течение 20 минут. Избыток полимера удаляется с помощью трех циклов промывки и центрифугирования с использованием дистиллированной воды. Полученный осадок микрогранул, покрытых ПААГ, перерастворяется в 0,5 мл дистиллированной воды. Затем слой ПСС наносится с использованием 0,5 мл раствора ПСС с концентрацией 2 мг/мл, растворенного в водном растворе 0,5 моль/л NaCl при тех же условиях, как и ПААГ. Эта процедуру повторяется для последовательного нанесения следующих слоев ПААГ, ПСС и ПААГ с нанесением каждого слоя с последующими тремя циклами промывки-центрифугирования. Загрузка квантовых точек была достигнута путем инкубирования положительно заряженных гранул с отрицательно заряженными квантовыми точками в течение 80 мин при постоянном встряхивании. После повторятся процедура нанесения слоев ПААГ, ПСС, ПААГ, ПСС, ПААГ и ПСС.
Прототип имеет следующие недостатки:
1. В качестве фотолюминофоров используются квантовые точки, содержащие токсичный материал Cd, применение которого оказывает негативное воздействие на состояние окружающей среды и опасно для использования в биологических и медицинских приложениях.
2. Сенсор представляет смесь двух отдельных систем, в которых используются нанокристаллы CdSe-ZnS с различными оптическими свойствами, что усложняет изготовление и дальнейшее использование сенсорной платформы.
3. Времена затухания люминесценции представленного сенсора (не более 25 нс), близки к временам затухания автолюминесценции типичных биологических сред, маскирующей сигнал фотолюминесценции биомаркера.
2
Технической задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является упрощение технологии изготовления сенсорной платформы, исключающие использование токсичных веществ. Поставленная задача решается тем, что люминесцентный сенсор для мультиплексного детектирования аналитов в водной среде методом проточной цитометрии с определением времен затухания квантовых точек, представляющих нанокристаллы тройного состава AgInS-ZnS, внедренные в чередующиеся полимерные слои полиэлектролитов ПААГ и ПСС, находящиеся на поверхности полистирольных микросфер.
2
Способ изготовления люминесцентного сенсора состоит из поочередного осаждения слоев полиэлектролитов ПААГ и ПСС на поверхности полистирольных микросфер, формируя чередующиеся разноименно заряженные слои полиэлектролитов с внедренным слоем квантовых точек тройного состава AgInS-ZnS.
2
В предлагаемом сенсоре в качестве экологичной альтернативы используются бескадмиевые квантовые точки тройного состава AgInS, покрытые оболочкой ZnS, которые сочетают в себе низкую токсичность, интенсивную фотолюминесценцию, широкую полосу излучения и времена затухания люминесценции сотни наносекунд, что улучшает точность измеряемого сигнала. Полученная сенсорная платформа с внедренными тройными квантовыми точками будет использована в схемах обнаружения репрезентативных биомаркеров клеточных лизатов, патогенов и репрезентативных антигенов различных вирусов, включая COVID-19 с использованием проточного цитометра с системой детектирования спектрального положения, интенсивности и времени затухания люминесценции сенсора, с селекцией по резонансному переносу энергии с временным разрешением.
2
2
2
Сущность предполагаемого изобретения состоит в том, что в качестве чувствительного элемента для мультиплексного анализа, образующего донорно-акцепторную пару с кодированным биомаркером, используются тройные полупроводниковые нанокристаллы состава AgInS-ZnS, внедренные в комплекс на основе полистирольных микросфер, покрытые полиэлектролитной оболочкой, состоящей из чередующихся слоев полиаллиламин гидрохлорида (ПААГ) и поли(4-стиролсульфоната натрия) (ПСС). Квантовые точки AgInS-ZnS располагаются между слоями полиэлектролитров. Полученный сенсор предназначен для использования в технологиях мультиплексного анализа с помощью метода проточной цитометрии для одновременного количественного определения нескольких кодированных биоаналитов в образце. Квантовые точки AgInS-ZnS в составе сенсора используются в качестве донора энергии для мультиплексного зондирования с временным разрешением на основе метода резонансной передачи энергии для детектирования лизатов клеток и патогенов. Предполагаемый сенсор оптимально функционирует в водной среде, использованные квантовые точки обладают исходным квантовым выходом 40%, широкой полосой фотолюминесценции с шириной на полувысоте 110 нм и с временами затухания люминесценции 300 нс.
Принцип действия сенсора состоит в том, что исследуемые биоконъюгированные флуоресцентными красителями аналиты (биомаркеры), находящиеся в пробе, связываются с конъюгированным антителами или бактериальными клетками сенсором для реализации селективного анализа. Полученные комплексы образуют донорно-акцепторную пару между люминесцентной квантовой точкой в структуре сенсора и флуоресцентным красителем в структуре биомаркера, причем полимерная оболочка позволяет создать оптимальное расстояние для эффективной резонансной передачи энергии между донором и акцептором. Перенос энергии от квантовой точки индуцирует фотолюминесценцию красителя биомаркера, что позволяет измерять изменение оптических свойств детектируемых аналитов.
2
Предлагаемая сенсорная платформа с внедренными тройными квантовыми точками AgInS-ZnS для мультиплексного детектирования имеет следующие преимущества:
2
1. Предлагаемый сенсор адаптирован к условиям проточной цитометрии (приблизительно 20-100 фотонов, детектируемых за цикл измерений), позволяющий детектировать резонансный перенос энергии между биоконъюгированными аналитами и квантовыми точками AgInS-ZnS.
2. Предлагаемый сенсор содержит в себе биосовместимые функциональные наноматериалы, позволяющие осуществлять оптическое обнаружение и идентификацию патогенных бактерий и вирусов в пробах, взятых из организма, образцах окружающей среды или пищевых продуктах.
3. Предлагаемая сенсорная платформа позволяет совместить приготовление и обработку образцов, уменьшить объем образцов аналита до диапазона пико- и нанолитров.
Синтез квантовых точек:
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
В предлагаемом сенсоре используются квантовые точки состава AgInS-ZnS, полученные по протоколу, описанному в работе «Исследование квантовых точек AgInS/ZnS методом спектроскопии магнитного кругового дихроизма» (Gromova Y. et al. Investigation of AgInS/ZnS quantum dots by magnetic circular dichroism spectroscopy // Materials. - 2019. - T. 12. - №. 21. - C. 3616.). Гидрофильный синтез квантовых точек AgInS-ZnS основан на контролируемой реакции между сульфидом натрия, меркаптоацетатными комплексами серебра (I) и индия (III). В трехгорлую колбу, наполненную 96 мл дистиллированной водой, добавляется 1,0 мл водного 0,1 М раствора AgNO, 2 мл водного 1,0 М раствора меркаптоуксусной кислоты и 0,2 мл водного 5,0 М раствора аммиака при непрерывном магнитном перемешивании и без дополнительной инертной атмосферы. После к полученной желтой суспензии поочередно добавляются 0,45 мл водного 5,0 М раствора аммиака и 0,7 мл водного 1,0 М раствора хлорида индия в водном 0,2 М растворе азотной кислоты, что приводит к обесцвечиванию смеси из-за образования меркаптоацетатных комплексов. Затем добавляется 1,0 мл водного 1,0 М раствора NaS, и цвет раствора меняется на оранжевый. Полученный раствор нагревается на водяной бане до 95°С в течение 30 минут. После первой стадии синтеза для роста оболочки ZnS на поверхности ядер квантовых точек AgInS при интенсивном перемешивании добавляется 1,0 мл водного 1,0 М раствора меркаптоуксусной кислоты и 1,0 мл водного раствора 1,0 М Zn(CHCOO) в водном 0,01 М растворе азотной кислоты. Полученную смесь еще раз нагревают до 95°С в течение 30 минут. В конце реакции колба охлаждается до комнатной температуры, полученный раствор квантовых точек тройного состава AgInS-ZnS выпаривается с помощью вакуумно-ротационного испарителя. К полученному раствору добавляется избыточное количество изопропилового спирта и раствор центрифугируется, полученный осадок квантовых точек растворяется в дистиллированной воде.
2
Процесс получения сенсора, кодированного квантовыми точками AgInS-ZnS, состоит в следующем: к микросферам полистирола добавляется 1 мл 0,5 М раствора NaCl с концентрацией полиэлектролита ПААГ 5 мг/мл. Полученная дисперсия встряхивается в течение 10 минут. Избыток полиэлектролита удаляется с помощью двух стадий отмывки: центрифугирование 30 секунд на скорости 4000 об/мин, удаление надосадочной жидкости, добавление 1 мл дистиллированной воды и последующего центрифугирования в течение 30 секунд на скорости 4000 об/мин. Затем к промытому осадку сфер добавляется 1 мл 0,5 М раствор NaCl с концентрацией полиэлектролита ПСС 5 мг/мл. Полученная дисперсия встряхивается в течение 10 минут. Избыток полиэлектролита удаляется с помощью двух стадий отмывки: центрифугирование 30 секунд на скорости 4000 об/мин, удаление надосадочной жидкости, добавление 1 мл дистиллированной воды и последующего центрифугирования в течение 30 секунд на скорости 4000 об/мин.
2
После пятикратного покрытия бинарным слоем полиэлектролитов ПААГ/ПСС формируется внешний положительный слой из полиэлектролита ПААГ аналогичным методом, описанным для предыдущих слоев. Далее к сенсору добавляется 200 мкл водного концентрированного раствора квантовых точек тройного состава AgInS-ZnS. Раствор встряхивается в течение 10 минут и далее центрифугируется 30 секунд на скорости 4000 об/мин с целью удаления непрореагировавших квантовых точек вместе с надосадочной жидкостью и последующим промыванием дистиллированной водой. Далее к полученному сенсору добавляется 1 мл 0,5 М раствор NaCl с концентрацией полиэлектролита ПААГ 5 мг/мл. Полученная дисперсия встряхивается в течение 10 минут. Избыток полиэлектролита удаляется с помощью двух стадий отмывки: центрифугирование 30 секунд на скорости 4000 об/мин, удаление надосадочной жидкости, добавление 1 мл дистиллированной воды и последующего центрифугирования в течение 30 секунд на скорости 4000 об/мин. Затем к сферам добавляется 1 мл 0,5 М раствора NaCl с концентрацией полиэлектролита ПСС 5 мг/мл. Полученная дисперсия встряхивается в течение 10 минут. Избыток полиэлектролита удаляется с помощью двух стадий отмывки: центрифугирование 30 секунд на скорости 4000 об/мин, удаление надосадочной жидкости, добавление 1 мл дистиллированной воды и последующего центрифугирования в течение 30 секунд на скорости 4000 об/мин. Полученный и отчищенный сенсор диспергируется в дистиллированной воде.
2
2
Работа сенсора проверяется следующим образом: к сенсору добавляется водный раствор циановых красителей (3,3'-диэтилтиакарбоцианин иодид (Су3) и 3,3-диэтилтиадикарбоцианин иодид (Су5)), что приводит к образованию комплексов сенсор/краситель за счет кулоновского электростатического взаимодействия между внешним отрицательным слоем на поверхности сенсора (слой полиэлектролита ППС) и положительно заряженной молекулой цианина Су3 или Су5. При облучении образовавшегося комплекса сенсор/краситель на длине волны 405 нм, происходит возбуждение фотолюминесценции квантовых точек AgInS-ZnS в составе сенсора и безызлучательный перенос энергии от донора (квантовая точка AgInS-ZnS) к акцептору (циановый краситель) сопровождающийся уменьшением интенсивности люминесценции квантовых точек и появлением фотолюминесценция красителей. Выбор длины волны возбуждения на 405 нм обусловлен наличием локального минимума поглощения обоих цианинов. Наблюдаемая фотолюминесценция и увеличение времен релаксации люминесценции красителей в комплексах указывает на Ферстеровский перенос энергии между квантовыми точками и молекулами цианина Су3 и Су5.
2
Данный подход позволяет легко контролировать изменения интенсивности и времени жизни фотолюминесценции как для квантовых точек AgInS-ZnS, так и для красителей (Су3 или Су5), а также оценивать эффективность передачи энергии в комплексах сенсор/краситель.