МАТРИЦА ДЛЯ КЛЕТОЧНОЙ ТРАНСПЛАНТОЛОГИИ
MATRIX FOR CELL TRANSPLANTOLOGY

Изобретение относится к материалам, используемым в клеточной трансплантологии и тканевой инженерии для восстановления утраченной структуры или функции органов и тканей. В частности, настоящее изобретение способно быть имплантатом, который может быть использован при замене внутренних тканей любой части мягких органов, для заживления раны, для регенерации ткани и для восстановления органа вообще, особенно в развивающейся и взрослой нервной системе или в других подобных областях терапии.
Известно много различных видов матриц, которые пытаются использовать в клеточной трансплантологии. Среди них можно выделить две группы: (1) с использованием фрагментов биологических тканей и (2) синтетические материалы.
К группе (1) можно отнести материалы по патентам RU 2265446 «ИМПЛАНТАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА», RU 2216281 «СПОСОБ ПЛАСТИКИ ДЕФЕКТА СПИННОГО МОЗГА СОСУДИСТЫМ ТРАНСПЛАНТАТОМ С БИОЛОГИЧЕСКИМИ ТКАНЯМИ», RU 2290939 «СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ СПИННОГО И ГОЛОВНОГО МОЗГА». Главным недостатком всех матриц с использованием фрагментов биологических тканей является то, что они вызывают нежелательную неспецифическую защитную реакцию макрофагов, также алло- и ксенотрансплантаты обладают иммунологическим и инфекционным риском. Общий недостаток всех типов натуральных матриц - непредсказуемая (неуправляемая) резорбция, что существенно замедляет образование новой ткани.
К группе (2) можно отнести материалы по патентам RU 2375080 «СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ НЕРВНЫХ ТКАНЕЙ НА ОСНОВЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОСОВМЕСТИМЫХ СУСПЕНЗИЙ ИЛИ ВЗВЕСЕЙ КРЕМНИЕВЫХ НАНОКЛАСТЕРОВ», RU 2394593 «ИМПЛАНТИРУЕМАЯ НЕЙРОЭНДОПРОТЕЗНАЯ СИСТЕМА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ РЕКОНСТРУКТИВНОЙ НЕЙРОХИРУРГИЧЕСКОЙ ОПЕРАЦИИ», RU 2198686 «ПОЛИМЕРНЫЙ ГИДРОГЕЛЬ АКРИЛАМИДНОГО СОПОЛИМЕРА ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ». Главным недостатком использования суспензий из кремниевых нанокластеров является то, что они не способствуют функциональной регенерации проводящих нервных путей. При этом сами кремниевые нанокластеры действуют в ткани центральной нервной системы посредством искусственно создаваемых электрических синапсов. Электрические синапсы гораздо менее характерны для нервной системы взрослых млекопитающих, чем химические. Проведение возбуждения в электрическом синапсе может происходить в обоих направлениях, в противоположность химическим синапсам, и имеет очень низкую степень регулируемости. Соединенные электрическими синапсами пре- и постсинаптические клетки не обладают свойством пластичности, что значительно снижает эффективность работы мозга, вследствие невозможности обучения и формирования долговременной памяти. Кроме того, образующиеся структуры из нанокластеров не окружены электроизолирующим слоем, в отличие от отдельных нервных волокон, что может привести к процессу неспецифического переноса возбуждения и одновременной активации нейронов, противоположных по функциям. Образование кремниевых нанокластеров является неспецифическим процессом, то есть возможно перекрестное соединение, не соответствующее физиологическим путям проведения нервного импульса.
Недостатком использования полимерных гидрогелей является их плохая биосовместимость. Полимерные гидрогели не являются питательной средой для помещенных в них клеток и не обладают биосовместимостью, данные вещества превращаются в рубцовый элемент, препятствующий росту аксонов и приживлению трансплантата. Недостатком применения нейроэндопротезной системы является то, что использование искусственного протеза артерии для формирования кондуита ограничивает проникновение питательных веществ к клеткам, помещенным в эндопротез.
Изобретение, взятое за прототип (патент RU 2198686), относится к полимерному гидрогелю для терапевтических областей применения, действует как заполняющий пространство материал и как каркас, что стимулирует регенерацию ткани, морфогенезис и ремоделирование в интегрированной структуре органа. Полученная неразлагающаяся синтетическая матрица из полимерного гидрогеля с анизотропной пористой структурой, с активной площадью, хорошей адгезионной способностью и совместимостью с тканью предназначена для имплантации в структуру мягкой ткани, особенно в нервную систему, которая постепенно становится частью органа.
Материал представляет собой сополимер (а) N-замещенного метакриламида или акриламида, (b) сшивающего агента и (с) материала со способностью полимеризоваться, выбранного из группы, включающей в себя сахар, производные сахара, пептид, соединяющего ткань, тканевые протеины с дифференцированными молекулами, такие как костно-морфогенетические протеины, и сопряженный полимер с антителами против производных липида, который обладает эластической деформационной способностью и имеет равновесное содержание воды, равное приблизительно 80%.
Гидрогель представляет собой сшитый ковалентными связями, непрозрачный, гетерогенный материал, который предпочтительно обладает светлофазной разделенной структурой, образованной частицами полимера размером примерно от 1 до 10 мкм, предпочтительно от 3 до 5 мкм, так, чтобы обеспечить образование области с относительно крупной пористостью (макропоры), где гидрогель стремится вступить в контакт с тканью хозяина, и с относительно мелкой пористостью (мезопоры), где он стремится вступить в контакт с врастающей тканью. Также клетки или генетически модифицированные клетки могут быть введены в сетку полимера. Это происходит методом гелевого улавливания при температуре ниже нуля, то есть методом криогенной полимеризации, в процессе которой получают пористую матрицу, с помощью которой иммобилизуются клетки и с помощью которой клетки могут быть реорганизованы, могут расти и/или дифференцироваться для последующей трансплантации. Полимерную смесь можно смешивать с живыми клетками, комбинируя при этом физические свойства полимерной матрицы с учетом поведения типового гидрогеля (пористость, стабильность, направляющие поверхности, проницаемость) и с учетом биологических факторов клеток (например, фактор роста). Также возможно использование трехмерной системы культуры, которая может быть использована при получении культуры различных клеток in vitro на продолжительный период времени.
Недостатками данного полимера является то, что способ его производства приводит к образованию свободных радикалов, что провоцирует появление нежелательных токсических свойств. Также из-за отсутствия поддержания формы материала его транспортировка невозможна без нарушения образовавшихся межклеточных связей.
Кроме того, процесс гелевого улавливания нервных клеток, включающий в себя криозаморозку, может привести к нарушению процессов функциональной регенерации. Культуры клеток, получаемые из эмбрионального и постнатального мозга млекопитающих, не устойчивы к криовоздействию. В процессе криоконсервирования большая часть нейронов гибнет, а после выведения из криоконсервации их место занимают активно делящиеся элементы - глиальные клетки. Применение криозащитных агентов, таких как ДМСО (диметилсульфоксид), приводит к частичному разрушению мембран клеток, а поскольку метаболизм нейронов отличается от метаболизма постоянно делящихся клеток, восстановление мембраны не происходит, что еще больше увеличивает количество погибших в процессе криоконсервации нейронов.
Целью изобретения является создание матрицы для клеточной трансплантологии, которая представляет собой синтетический комплекс со свойствами биологически совместимой матрицы для создания тканеинженерной конструкции, а именно: отсутствие цитотоксичности, поддержание адгезии, фиксации, пролиферации и дифференцировки помещенных на ее поверхность клеток, отсутствие эффекта поддержания воспаления, в том числе иммунного, достаточная механическая прочность в соответствии с назначением и возможная биорезорбируемость обычными биологическими путями, например ферментативным или гидролизом.
Технический результат достигается созданием матрицы для клеточной трансплантологии, у которой основным элементом является плоская перфорированная пластина, выполненная из пространственно-сшитого гидрофобного полимера, содержащего гидрофильные группы и образующего на поверхности пластины слой из предельных углеводородов с длиной цепочки от 8 до 18 атомов углерода, ориентированных преимущественно вдоль нормали к поверхности пластины. Данный пространственно-сшитый полимер формируют на подложках с гидрофобной поверхностью путем экспонирования светом с длиной волны 320-380 нм фотополимеризующейся композиции, содержащей ингредиенты:
Олигоуретанметакрилат следующего строения:
где n порядка 35.
Один из мономеров метакрилового ряда с длиной цепочки от 8 до 18 атомов углерода следующего строения:
3
2
k
3
2
СН-(СН)-О-С(O)-С(СН)=СН, где k от 7 до 17.
2,2-Диметокси-2-фенилацетофенон следующего строения:
2,4-Дитретбутилортохинон следующего строения:
при этом вышеуказанные компоненты взяты в следующем соотношении, мас.%:
Олигоуретанметакрилат - 15-60,
Мономер метакрилового ряда с длиной цепочки от 8 до 18 атомов углерода - 39-84,
2,2-Диметокси-2-фенилацетофенон - 0,4-3,0,
2,4-Дитретбутилортохинон - 0,01-0,06.
Отличительной особенностью такого способа получения матрицы для клеточной трансплантологии является то, что процесс формирования происходит по одностадийной схеме, исключающей какие-либо механические воздействия. Любое механическое воздействие на полимер, как известно, провоцирует образование свободных радикалов, которые впоследствии приводят к деструкции полимера и нежелательным токсическим реакциям. Указанный материал обладает повышенной устойчивостью в биологически активных средах, повышенной устойчивостью к окислительным процессам и процессам адсорбции белков на поверхности, предотвращающий образование грубой соединительнотканной капсулы. Данная матрица предназначена для выращивания клеток тканей, в том числе нейрональных клеток. Сначала изготавливается матрица, а потом на ней культивируют заданные группы клеток. Процесс выращивания клеточных культур заключается в том, что на данную матрицу сажают диссоциированные клетки с необходимым количеством питательной среды. Отличительной особенностью предлагаемого изобретения является то, что на поверхности матрицы сформирован слой из предельных углеводородов с длиной цепочки от 8 до 18 атомов углерода, ориентированных преимущественно вдоль нормали к поверхности пластины. Гидрофобные концы обращены к питательной среде и абсорбируют на себя липиды, содержащиеся в питательной среде, таким образом, что гидрофобные концы липидов обращены к гидрофобным концам матрицы, а гидрофильные - «наружу». Гидрофильные концы липидов в свою очередь абсорбируют на себя белки, содержащиеся в питательной среде. Таким образом, воспроизводится поверхность, подобная поверхности клеточной мембраны. Именно такое решение позволяет обеспечить высокую адгезию культивируемых клеток к матрице, что обеспечивает высокую плотность прикрепления клеток к данной подложке. Перфорированная структура основного элемента матрицы - пластины - позволяет образовывать связи между группами клеток с двух сторон пластины и способствует их взаимодействию. Также матрица для клеточной трансплантологии может быть в виде объемного элемента, состоящего из многослойного комплекса перфорированных пластин. Дальнейшая трансплантация данных конструкций может использоваться для замещения поврежденной ткани, пластики дефекта, а также стимуляции пролиферации и дифференцировки собственных тканей, что, возможно, приведет к восстановительному лечению различных дефектов нервной ткани после травмы либо оперативных вмешательств.
На заявленной матрице были культивированы клетки коры больших полушарий эмбрионов мыши. В ходе работы культивировались диссоциированные нейрональные клетки коры больших полушарий (КБП) 18 - дневных эмбрионов мыши в следующие этапы:
1 этап. Производилось извлечение культуры КБП эмбриона.
2 этап. Культура коры механически измельчалась скальпелем, и ткань помещалась в 0,025% раствор трипсина.
3 этап. Ткань два раза промывалась раствором PBS, питательной средой NBM.
4 этап. Ткань центрифугировалась и ресуспендировалась в необходимом количестве питательной среды.
5 этап. Суспензия раскапывалась по 50 мкл на все виды полимеров, выдерживалась в таком виде 2 часа, после чего заливалась питательной средой NBM1 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки.
2
2
6 этап. Жизнедеятельность культуры поддерживалась в условиях СО инкубатора при температуре 35,5°С и газовой смеси, содержащей 5% СO.
7 этап. Смена среды производилась на первые сутки культивирования, в дальнейшем 1 раз в 3 дня.
ТМ
2+
2
2
Диссоциирование клеток достигалось путем обработки ткани КБП 0,25% трипсином (Invitrogen 25200-056). Клетки ресуспендировали в нейробазальной среде Neurobasal (Invitrogen 21103-049) в комплексе с биоактивной добавкой В27 (Invitrogen 17504-044), глутамином (Invitrogen 25030-024), эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко К055). Поддержание жизнеспособности культуры осуществлялось в условиях CO инкубатора при температуре 35,5°С и газовой смеси с 5% СО в инкубаторе МСО-18А1С (Sanyo). Структуру и динамику развития культур оценивали с помощью инвертированного микроскопа DM 1000 (Leica). Состав нейроглиальных сетей в культурах и динамику спонтанных кальциевых осцилляций, отражающих состояние кальциевого гомеостаза клеток, формирующих in vitro нейроглиальную сеть, исследовали с применением конфокального лазерного микроскопа Zeiss LSM510 NLO Duoscan. В качестве флуоресцентных зондов использовали специфический кальциевый краситель Oregon Green 488 ВАРТА-1 и Са-нечувствительный краситель Sulforhodamine 101, селективно маркирующий глиальные клетки. Для маркирования клеток в диссоциированных культурах использовались специфические антитела к поверхностным и внутриклеточным белкам. Характерным маркером глиальных клеток являлся глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), а одним из наиболее активно используемых маркеров нейронов - маркер ядер зрелых нейронов (NeuN). Для визуализации полученных результатов необходимо добавление вторичных антител с флуоресцентной меткой. В качестве вторичных антител нами были использованы: антимышиные антитела, меченные флуоресцентным красителем Alexa-fluo 430 - для визуализации белка NeuN (Alexa-fluo 430 anti mouse Invitrogen A 11063), и антикуриные антитела, меченные флуоресцентным красителем Су-5 - для визуализации белка GFAP (Cy-5 anti cnk Millipor AP194S).
В ходе анализа динамики роста и развития культуры клеток с помощью инвертированного микроскопа было выявлено, что в конце первых суток культивирования жизнеспособные клетки прикрепляются в большом количестве на заявленную матрицу. На второй день культивирования часть клеток отделяется от полимера, оставшиеся прогениторные клетки образуют нейросфероподобные структуры с отходящими из центра отростками. В процессе деления прогениторных клеток и развития тяжей глиальных клеток, вдоль которых располагаются нейроны, происходит формирование новых нейросфероподобных структур. К девятому дню культивирования наблюдается развитие глиальной сети вокруг нейросфер. Наблюдается дальнейшее образование на поверхности субстрата сложных сплетений растущих отростков нервных и глиальных клеток, идут интенсивные процессы роста, дифференцировки и пролиферации диссоциированных клеток нервной системы, соединение нейросфероподобных структур между собой многочисленными отростками. Если говорить о длительности культивирования, то со времени первой посадки прошло более 80 дней и культуры сохраняют жизнеспособность, что говорит об отсутствии токсических свойств данного полимера на субстрат. Методом функционального нейроимиджинга, характеризующего метаболические изменения в клетках, выявлены спонтанные кальциевые осцилляции, проявляющиеся в изменении интенсивности флуоресценции Oregon Green 488 ВАРТА-1, которые свидетельствуют об активном функциональном состоянии нейроглиальной сети культивируемых клеток. Иммуногистохимическим методом с применением специфических антител доказано наличие дифференцированной нейрональной сети, культивируемой на данном полимере. Показано, что нейросфероподобная структура представляет собой скопление нейронов и глиальных клеток, возвышающихся над поверхностью полимера в среднем на 200 мкм с многочисленными тяжами и развитой глиальной сетью в основании ее.
Динамики роста и развития культуры клеток поясняется следующими фигурами:
Фиг.1. Первый день культивирования - жизнеспособные клетки (1) прикрепляются к матрице изолированно или небольшими группами.
Фиг.2. Перфорированная структура матрицы для клеточной траспланталогии.
Фиг.3. Второй день культивирования - оставшиеся прогениторные клетки образуют нейросфероподобные структуры (2) с отходящими из центра отростками (3).
Фиг.4. Формирование новых нейросфероподобных структур (А, Б).
Фиг.5. К десятому дню культивирования наблюдается развитие глиальной сети вокруг нейросфероподобных структур:
С - нейросфероподобная структура,
D - глиальная сеть.
Фиг.6. Соединение нейросфероподобных структур между собой многочисленными отростками растущих нейронов и глиальных клеток (двадцать седьмой день культивирования). На рисунке видно, что матрица для клеточной траспланталогии имеет перфорированную структуру.
Фиг.7. - Двадцать пятый день культивирования.
Фиг.8 - Пятьдесят девятый день культивирования. На матрице для клеточной траспланталогии происходит формирование более плотной и развитой монослойной нейрональной и глиальной сетей.
Было доказано, что заявленная матрица обладает хорошей адгезивной способностью, сохраняет прогениторные клетки, способствует их дифференцировке, стимулирует рост, что служит основанием для дальнейшего внедрения данного материала в клиническую практику.
Данное изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1
Основной элемент матрицы для клеточной трансплантологии - пластину - изготавливают следующим образом. В реакционную колбу, снабженную мешалкой, последовательно вводят компоненты в следующем соотношении, % мас.:
Олигоуретанметакрилат - 49,55,
Октилметакрилат (k=7) - 49,55,
2,2-Диметокси-2-фенилацетофенон - 0,89,
2,4-Дитретбутилортохинон - 0,01.
Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 40 мин до полного растворения. После перемешивания композицию отфильтровывают и откачивают с помощью вакуумного насоса при давлении 0,5-1 мм рт.ст. до полного прекращения газовыделения. На гидрофобную подложку, с установленной по краю прокладкой, формирующей толщину пластины, наливают композицию. Затем накрывают фотошаблоном, содержащим прозрачный рисунок на непрозрачном для УФ-света фоне (отверстия перфораций соответствуют непрозрачному фону, остальное - прозрачному), и плотно сжимают. Полученную конструкцию облучают УФ-светом с длиной волны 320-380 нм со стороны фотошаблона в течение времени, оптимального для воспроизведения заданной геометрии. После облучения фотошаблон и подложку разъединяют. Полученную полимерную пластину промывают в подходящем растворителе от остатков неотвержденной композиции и сушат до полного удаления растворителя. Благодаря используемой фотохимической технологии по данным ЭПР, свободные радикалы отсутствуют, материал устойчив в биологически активных средах.
Пример 2
Композицию готовят, как в примере 1, при следующем соотношении компонентов:
Олигоуретанметакрилат - 32,27,
Децилметакрилат (k=9) - 66,0,
2,2-Диметокси-2-фенилацетофенон - 1,7,
2,4-Дитретбутилортохинон - 0,03.
Изготавливают матрицу для клеточной трансплантологии, как в примере 1.
Характеристики приведены в табл.1.
Пример 3
Композицию готовят, как в примере 1, при следующем соотношении компонентов:
Олигоуретанметакрилат - 58,0,
Октадецилметакрилат (k=17) - 40,5,
2,2-Диметокси-2-фенилацетофенон -1,48,
2,4-Дитретбутилортохинон - 0,02.
Изготавливают матрицу для клеточной трансплантологии, как в примере 1.
Характеристики приведены в табл.1.
Пример 4
Композицию готовят, как в примере 1, при следующем соотношении компонентов:
Олигоуретанметакрилат - 9,4,
Гексадецилметакрилат (k=15) - 90,576,
2,2-Диметокси-2-фенилацетофенон - 0,02,
2,4-Дитретбутилортохинон - 0,0004.
Изготавливают матрицу для клеточной трансплантологии, как в примере 1.
Характеристики приведены в табл.1.
Пример 5
Композицию готовят, как в примере 1, при следующем соотношении компонентов:
Додецилметакрилат (k=11) - 99,522,
2,2-Диметокси-2-фенилацетофенон - 0,41,
2,4-Дитретбутилортохинон - 0,068.
Изготавливают матрицу для клеточной трансплантологии, как в примере 1.
Характеристики приведены в табл.1.
Таблица 1
Качественные оценки характера взаимодействия матрица-клетки
Характеристики
Пример 1
Пример 2
Пример 3
Пример 4
Пример 5
Первичное прикрепление
в большом количестве
в большом количестве
в большом количестве
в небольшом количестве
в небольшом количестве
Расположение на полимере
равномерно
равномерно
равномерно
равномерно
равномерно
Способность к длительному прикреплению
есть
есть
есть
нет
нет
Характер роста, пролиферации
Интенсивный
Интенсивный
Интенсивный
Медленный
Медленный
Количество связей между нейросфероподоб-ными структурами
Много
Много
Много
Нет
Нет
Образование монослоя
К 9-му дню
К 9-му дню
К 9-му дню
Не наблюдается
Не наблюдается
Из таблицы 1 следует, что в примерах 1, 2, 3, в которых ингредиенты взяты в количестве, соответствующем формуле изобретения, матрица для клеточной трансплантологии обладает высокой способностью крепления посаженных клеток, интенсивным ростом и пролиферацией клеток, большим количеством образования клеточных структур, образованием плотной монослойной клеточной сети. Отклонения от способа, соответствующего формуле изобретения (примеры 4, 5), приводят к получению матрицы с низкими указанными характеристиками.
Последнее время все шире используются новые методы, основанные на применении клеточной трансплантологии и тканевой инженерии для восстановления утраченной структуры или функции органов и тканей. Внедрение заявленной матрицы для клеточной трансплантологии представляет большой интерес для медицины.