Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
COMPOSITION FOR CORRECTION OF DYSLIPIDEMIA AND MAINTENANCE OF FUNCTIONAL STATE OF HUMAN BODY IN METABOLIC SYNDROME

Изобретение относится к медицине, касается композиции для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме (МС) для улучшения качества и продолжительности жизни.
Метаболический синдром объединяет группу заболеваний, состояний или расстройств, проявляющихся определенными метаболическими, гормональными и клиническими нарушениями: увеличение массы тела за счет висцерального жира при абдоминальном ожирении, снижение чувствительности периферических тканей к инсулину, гиперинсулинемия, нарушения углеводного, липидного, пуринового обменов, повышенное артериальное давление (АД), повышенный уровень глюкозы в крови натощак, высокое содержание в крови триглицеридов (ТГ) и низкое содержание холестерина (ХС) липопротеидов высокой плотности (ЛПВП). Нарушения липидного обмена заключаются в повышении уровня ТГ (более 1,7 ммоль/л), снижении уровня ХС ЛПВП (менее 1,0 ммоль/л у мужчин и менее 1,2 ммоль/л у женщин), повышении уровня ХС липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) выше 3,0 ммоль/л. При этом появление одного из названных факторов свидетельствует о повышенном риске развития всех остальных. Больные с МС имеют повышенный риск развития дислипидемии, гипертензии, инсулинорезистентности, сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в виде ишемической болезни сердца (ИБС) и сердечной недостаточности, сахарного диабета (СД) 2 типа [1, 2], что делает крайне необходимым не только выявление, но и своевременную коррекцию этих состояний.
Мета-анализ широкомасштабных исследований показал, что в популяции взрослого населения МС выявляется у 10-30% населения в зависимости от особенностей МС и используемых критериев при его диагностике. В России распространенность МС варьирует от 20% до 35%, причем у женщин он встречается в 2,5 раза чаще. С возрастом опасность проявления МС увеличивается [3].
Своевременная диагностика и коррекция отдельных проявлений МС позволит предотвратить развитие и прогрессирование тяжелых кардиоваскулярных заболеваний и их осложнений. Так, снижение массы тела у больных с МС способствует снижению АД, а иногда даже его нормализации. Нормализация нарушений углеводного обмена может приводить к улучшению показателей липидного спектра и также к снижению АД. Гиполипидемическая терапия, в свою очередь, может способствовать повышению чувствительности тканей к инсулину и улучшению показателей углеводного обмена. Грамотно подобранная антигипертензивная терапия может сопровождаться улучшением показателей углеводного, липидного обменов и повышать чувствительность тканей к инсулину.
Существующие способы коррекции дислипидемий заключаются в использовании немедикаментозных и медикаментозных методов. Немедикаментозные методы заключаются в коррекции образа жизни, коррекции пищевого поведения путем снижения потребления насыщенных жиров, холестерина и общего калоража пищи, уменьшении потребления алкоголя и увеличении физической активности. Медикаментозное лечение проводится с использованием четырех основных групп гиполипидемических препаратов: ингибиторов ГМК-КоА-редуктазы (статины), секвестрантов желчных кислот, никотиновой кислоты (НК) (ниацин) и ее производных, фибратов (дериватов фиброевой кислоты).
Наиболее эффективной группой холестеринпонижающих препаратов, которые радикально изменили подход к профилактике проявлений МС и его осложнений, является группа статинов. Однако при использовании препаратов из группы статинов не обеспечивается высокий профиль их безопасности [4], что свидетельствует об ограниченных возможностях их использования. Для статинов характерны такие побочные эффекты, как диспепсические расстройства (тошнота, рвота, метеоризм, нарушения стула), осложнения со стороны костно-мышечного аппарата, проявляющиеся в виде признаков слабости и болезненности мышц (миопатия), которые могут трансформироваться в рабдомиолиз (разрушение клеток мышечной ткани), если не отменить препарат. Бесконтрольный прием статинов отрицательно сказывается на состоянии печени, что проявляется повышением уровня печеночных ферментов - аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT) и др. Негативное влияние статинов на почки было обнаружено сравнительно недавно. Даже при здоровой мочеполовой системе назначение препаратов группы статинов и особенно длительными курсами может привести к тяжелым повреждениям почек (тубулопатия, почечная недостаточность).
Также для препаратов группы статинов характерно снижение эффективности лечения при длительном их применении (феномен уклонения рецепторов). У части больных могут наблюдаться когнитивные расстройства в виде снижения уровня мышления, ухудшения памяти, напоминающих старческое слабоумие. Что особенно важно для лиц с МС, препараты из группы статинов могут провоцировать развитие гипергликемии, характеризующейся повышением уровня глюкозы в крови и развитием нечувствительности к инсулину тканей организма. Как видно, корригируя одно из проявлений МС, препараты из группы статинов провоцируют или усугубляют другие патологические процессы, лежащие в его основе.
К настоящему времени сложились предпосылки для поиска альтернативных методов коррекции отмеченных нарушений. Разработан новый подход к лечению состояний, ассоциированных с МС и дисбиозом кишечника, заключающийся в применении в составе комплексной терапии таких средств, которые бы позволили наряду с улучшением клинического течения и состояния кишечного микробиоценоза добиться позитивного изменения спектра липопротеидов крови и восстановления системы антиоксидантной защиты.
Как известно, в регуляции липидного обмена существенное значение имеет поддержание качественного и количественного состава микрофлоры кишечника [5, 6]. Нарушение кишечной микрофлоры встречается у 90% больных с сердечно-сосудистыми (ИБС) и обменными (ожирение, дислипопротеидемия) заболеваниями [7]. При этом дисбиотические изменения кишечника по мере своего прогрессирования ухудшают клиническое течение основного заболевания, способствуя увеличению атерогенного потенциала сыворотки крови. В этих условиях нарастает выраженность клинических симптомов, удлиняются сроки их клинической манифестации, ухудшаются показатели результатов лечения и качество жизни пациентов.
Указанные обстоятельства предопределяют необходимость усовершенствования подходов к коррекции нарушений липидного обмена у лиц с МС. Одним из них в настоящее время считается применение средств, способствующих восстановлению нормальной микрофлоры кишечника. Перспективность использования средств коррекции микробиоценоза кишечника и, прежде всего, для восстановления его нормальной микрофлоры теоретически обоснована, экспериментально подтверждена и имеет клинический опыт в терапии, например, ишемической болезни сердца [8].
Спектр иммунобиологических препаратов, используемых для формирования, сохранения и коррекции микробиоты человека, достаточно широк и включает [9]:
- пробиотики, включая аутопробиотики;
- пребиотики;
- синбиотики и метабиотики;
- метаболиты симбиотических микроорганизмов;
- структурные компоненты клеток симбиотических бактерий;
- микроэкологическая инженерия.
В клинической практике большой интерес представляют препараты из группы пробиотиков, включающие определенные виды непатогенных для человека микроорганизмов и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном способе введения благоприятные эффекты на физиологические функции, биохимические и поведенческие реакции организма через оптимизацию и стабилизацию его микроэкологического статуса [10]. К их числу относятся, прежде всего, бифидо- и лактосодержащие средства для регулирования равновесия кишечной микрофлоры, так как бифидо- и лактобактерии играют важнейшую роль в обеспечении нормального функционирования кишечника. При возникновении дисбиотических состояний качественный и количественный состав анаэробных бифидо- и лактобактерий претерпевает нарушения в первую очередь. Поэтому препараты на их основе получили широкое распространение в практике врачей различных специальностей.
Одним из перспективных направлений профилактики нарушений микробиоты кишечника является использование препаратов, действующим началом которых являются не живые микроорганизмы (например, Бифидобактерин, Лактобактерин, Споробактерин, Ламинолакт, Линекс, Бифиформ и др.), а метаболиты пробиотических штаммов микроорганизмов [11, 12].
В настоящее время на фармацевтическом рынке из числа подобных средств достаточно известен и находит применение в клинической практике для поддержания оптимальных микроэкологических параметров в кишечнике пробиотический комплекс Бактистатин [13], в состав которого включены (мас. %): стерилизованная культуральная жидкость (СКЖ), полученная при культивировании бактерий вида Bacillus subtilis и содержащая метаболиты бацилл (1,0), гидролизат соевой муки (ГСМ) (20,0), природный минерал цеолит (78,0), стеарат кальция (СК) или аэросил (1,0). Указанный пробиотический комплекс по составу, механизму воздействия на организм и достигаемому благоприятному эффекту, выражающемуся в коррекции нарушений микробиоты кишечника, наиболее близок к заявляемой композиции и принят в качестве композиции-прототипа.
Основу композиции-прототипа составляют иммобилизованные на цеолите биологически активные вещества (БАВ), синтезируемые бактериями Bacillus subtilis при глубинном выращивании, которые и обусловливают ее благоприятный эффект. Перечень их достаточно обширен и включает разнородные по химическому составу и биологическим свойствам вещества: протеолитические и амилолитические ферменты и коферменты, аминокислоты, полипептиды, пребиотические компоненты, полисахариды (гексозамин, глюкозамин), витамины группы В (пиридоксина гидрохлорид, рибофлавин), азотистые основания и их производные (аденин, гуанин, тимин, урацил, цитозин) [14-16].
Перечисленные БАВ, синтезируемые бактериями Bacillus subtilis, оказывают положительное влияние на макроорганизм в целом, способствуя улучшению микроэкологических условий в кишечнике, влияя на обменные процессы и оказывая иммуномодулирующее действие. Среди них особую значимость имеют природные антибактериальные субстанции (бактериоцины, лизоцим и др.), которые селективно подавляют рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике, не влияя при этом на симбионтную микрофлору.
Цеолит, входящий в состав композиции-прототипа, выполняет функции адсорбента метаболитов бацилл Bacillus subtilis и их носителя. Основное его предназначение заключается в иммобилизации метаболитов, синтезируемых бациллами при культивировании и сконцентрированных в культуральной жидкости, и доставке их в качестве носителя в кишечник. В связи с этим, цеолит в композиции-прототипе содержится в оптимальном количестве, достаточном для обеспечения сорбции всех метаболитов. Существенное понижение количества цеолита приведет к потере части метаболитов и снижению эффективности композиции-прототипа. Повышение количества цеолита (свыше 85%) также недопустимо, так как приведет к снижению эффективности композиции-прототипа из-за разбавления ее малоактивным ингредиентом.
Важная составная часть композиции-прототипа - ГСМ, которая является частью защитной среды метаболитов и обеспечивает прочность их сорбции на поверхности цеолита, а также источником аминокислот и обеспечивает питательные потребности нормальной микрофлоры кишечника и клеток макроорганизма.
СК или аэросил включены в состав композиции-прототипа в качестве вспомогательных технологических добавок.
Основным предназначением композиции-прототипа является восстановление и поддержание оптимальных микроэкологических параметров в кишечнике, лечение заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) путем введения в организм веществ, тормозящих развитие патогенной микрофлоры. Ее действие базируется на том, что при транзитном прохождении по ЖКТ в заданной зоне происходит разрушение защитной капсулы и выделение в полость кишечника иммобилизованных на частицах цеолита БАВ. При этом вокруг частиц цеолита формируются образования мицеллярной структуры, которые в процессе движения по ЖКТ постепенно высвобождаются с пористой поверхности цеолита. С одной стороны, это позволяет поддерживать в ЖКТ активность биологически активных компонентов пробиотика в течение суток, что достаточно для восстановления и стимуляции функциональной активности нормальной микрофлоры кишечника. С другой стороны, эффект постепенного высвобождения с поверхности цеолита иммобилизованных на нем БАВ приводит к появлению открытых поверхностей его пористой структуры, что обеспечивает включение механизмов ионного обмена и избирательной сорбции токсичных соединений и очищению ЖКТ от токсинов и продуктов разложения. Это особенно важно для общей детоксикации организма.
Таким образом, благодаря комплексному составу, композиция-прототип способствует общей нормализации микроэкологических условий в кишечнике через различные механизмы, такие как подавление условно-патогенной флоры, сорбция и выведение токсинов, улучшение процессов пищеварения, улучшение трофической базы для нормальной микрофлоры и эпителия ЖКТ.
Установлена также целесообразность назначения композиции-прототипа при реализации принципиально новых схем терапии ИБС - заболевания, имеющего в настоящее время крайне высокую клиническую и социальную значимость вследствие высокой частоты заболеваемости среди людей трудоспособного возраста, а также тяжести возникающих осложнений [17]. Наряду с основными причинами развития данной патологии, выделяют ряд дополнительных факторов, опосредованно способствующих ее возникновению и развитию. В первую очередь к ним относят дисбактериоз кишечника, так как сформировалось мнение о связи ИБС с количественными и качественными нарушениями состава микробиоты, а также ключевой роли микробиоты кишечника с участием механизмов энтерогепатической циркуляции в регуляции липидного обмена. В данном случае положительное воздействие композиции-прототипа связывают с коррекцией микробиоценоза кишечника.
Вместе с тем, наряду с указанными благоприятными эффектами для композиции-прототипа характерен ряд недостатков:
- ограниченная биологическая активность в отношении влияния на липидный метаболизм, что связано с преимущественным действием препарата на уровне ЖКТ;
- невозможность концентрирования культуральной жидкости, полученной на соевой среде с использованием ГСМ, ввиду ее высокой вязкости;
- использование в технологическом процессе получения композиции-прототипа в качестве питательной среды нативной соевой муки не позволяет в полной мере использовать питательные свойства исходного сырья. Требуется дополнительное проведение химического или ферментативного гидролиза соевой муки, что существенно усложняет технологию получения композиции-прототипа;
- использование для обеспечения питательных потребностей нормальной микрофлоры кишечника и клеток макроорганизма труднодоступного и при этом неполноценного по аминокислотному составу дорогостоящего пищевого продукта - ГСМ, содержащего в своем составе только две незаменимые аминокислоты (лизин и метионин), причем в весьма незначительных количествах (0,2% и 0,096%, соответственно).
Отмеченные недостатки существенно ограничивают возможности широкого использования композиции-прототипа для эффективной коррекции дислипедимии и поддержания функционального состояния организма человека при МС.
Вместе с тем, МС представляет многофакторное патологическое состояние организма и для коррекции его проявлений, в частности, дислипидемии, требуются разработка и практическое использование многокомпонентных рецептур, которые бы наряду с метаболитами пробиотического штамма микроорганизмов включали безопасные активные соединения, позволяющие оказывать комплексное воздействие и на другие не менее важные аспекты МС.
К сожалению, официальная медицина, судя по материалам последней конференции по МС (ноябрь 2014 г.), использует крайне ограниченную номенклатуру природных компонентов для борьбы с этим многофакторным патологическим состоянием организма. Свидетельств эффективности средств для коррекции дислипидемии, соответствующих данным доказательной медицины, крайне недостаточно. Поэтому изыскание рецептур, включающих активные природные соединения, их всестороннее изучение и разработка рекомендаций для использования в клинической практике являются весьма актуальными.
В связи с этим, целью изобретения явилось расширение ассортимента средств для коррекции проявлений МС за счет создания сбалансированного комплекса, обеспечивающего эффективное комплексное воздействие на организм, заключающееся в коррекции состояния кишечного микробиоценоза, липидного обмена организма, регуляции процессов свободнорадикального окисления и поддержании функционального состояния организма, показатели которого снижены при развитии МС, не содержащего опасные для здоровья вещества, нетоксичного, не обладающего способностью к кумуляции, сенсибилизирующим действием и отдаленными негативными последствиями, стабильного при хранении и хорошо переносимого.
Достижение поставленной цели возможно за счет создания сбалансированного поликомпонентного комплекса, состав которого представлен метаболитами пробиотического штамма бактерий, безопасными активными природными соединениями, митохондриальным метаболитом, и соответствует основным патогенетическим механизмам формирования МС и его осложнений, что позволяет улучшить функциональное состояние ЖКТ, осуществлять контроль за уровнем липидов в крови и их нормализацию за счет комплексного воздействия на механизмы развития нарушений липидного обмена, улучшить состояние системы антиоксидантной защиты и поддерживать функциональное состояние организма.
При формировании качественного и количественного состава заявляемой композиции, предназначенной для комплексного воздействия на механизмы коррекции такого проявления МС как дислипидемия, исходили из того, что основные ее компоненты должны:
- оказывать эффективное благоприятное влияние на нормальную микрофлору кишечника, в частности, на лактобактерии, способствуя их росту и размножению, и за счет этого улучшать функциональное состояние ЖКТ;
- нормализовать показатели липидного обмена (достоверно повышать уровень антиатерогенных ЛПВП);
- улучшить состояние системы антиоксидантной защиты;
- поддерживать функциональное состояние организма.
Для реализации указанного комплексного воздействия в поликомпонентный состав заявляемой композиции включены:
- метаболиты пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335, содержащиеся в стерилизованной лиофилизированной культуральной жидкости;
- лактоза;
- цеолит;
- транс-ресвератрол;
- α-токоферола ацетат;
10
- коэнзим Q;
- комплекс ферментов (альфа-амилаза, нейтральные и щелочные протеиназы, бета-глюканаза, целлюлаза, ксиланаза);
-вспомогательная технологическая добавка (кальция стеарат и/или диоксид кремния).
В заявляемой композиции, как и в композиции-прототипе, в обеспечении комплексного воздействия на состояние кишечного микробиоценоза как за счет благоприятного воздействия на индигенную составляющую микрофлоры биотопа, так и обеспечения специфического антагонистического эффекта по отношению к широкому спектру патогенов участвуют метаболиты пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335.
В состав заявляемой композиции метаболиты пробиотического штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 введены в лиофилизированной СКЖ. Именно в СКЖ сконцентрирован уникальный набор метаболитов, синтезируемых бациллами в процессе их выращивания. Из числа метаболитов ценность представляют природные антибактериальные субстанции (бактериоцины, лизоцим и др.), которые не только селективно подавляют рост и размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике, не влияя при этом на симбионтную микрофлору, но и вносят весомый вклад в способность заявляемой композиции оказывать влияние на факторы неспецифической резистентности организма и стимулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток.
Особо значимо, что в составе заявляемой композиции метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 представляют лактогенный фактор и проявляют лактогенный эффект, что выражается в стимулировании роста и размножения лактобацилл индигенной микрофлоры кишечника, вследствие чего происходит нормализация его микрофлоры.
Для обеспечения питательной потребности представителей индигенной микрофлоры кишечника, а также клеток макроорганизма, в состав заявляемой композиции в качестве питательной среды введена лактоза.
Цеолит, входящий в состав заявляемой композиции, как и в композиции-прототипе, предназначен, прежде всего, для иммобилизации метаболитов, продуцируемых Bacillus subtilis в процессе их культивирования и сконцентрированных в СКЖ. Целесообразность использования цеолита в качестве компонента заявляемой композиции определена уникальным химическим строением его молекул, в результате чего цеолит обладает высокой сорбирующей активностью по отношению к метаболитам бактерий Bacillus subtilis. Возникают оптимальные условия для выполнения цеолитом его основных функций - адсорбента и носителя метаболитов Bacillus subtilis. Не всасываясь в ЖКТ и проходя транзитом, цеолит выполняет транспортировку иммобилизованных на нем метаболитов бактерий Bacillus subtilis по всему протяжению кишечника. Высвобождение метаболитов происходит постепенно и позволяет в течение достаточно длительного промежутка времени (до 1 суток) поддерживать необходимый уровень эффективности заявляемой композиции.
Благодаря уникальному химическому строению молекул цеолит обладает выраженным сорбционным действием по отношению к соединениям с низкой молекулярной массой, таким как метан, сероводород, аммиак и другие токсические вещества, не вступая в прямое взаимодействие с витаминами, аминокислотами, белками, благодаря чему данные вещества остаются в ЖКТ.
Кроме того, цеолит обладает ионообменными свойствами, так как основной скелет его кристаллической решетки состоит, прежде всего, из тетраэдр и имеет полости, в которых находятся ионы (натрия, калия, кальция), легко обменивающиеся между собой и с окружающим субстратом. Цеолит, проходя транзитом по всему протяжению ЖКТ, участвует в селективном ионообмене и служит дополнительным источником ряда необходимых организму микроэлементов [18]. Частицы используемого цеолита имеют размеры не более 500 мкм и овальную форму кристалла, что исключает образование микротравм в кишечнике и полностью безопасно [19-21].
В качестве активного компонента в состав заявляемой композиции введен ресве-ратрол - природное биологически активное соединение из группы полифенолов, включающей флавоноиды, флавонолы, катехины и стильбены, естественный компонент черного и красного винограда и других фруктов, какао и орехов, красного вина, корня растения японский горец (Polygonum cuspidatum). Причем используют его активную изомерную форму - транс-ресвератрол (3,5,4'-тригидрокси-транс-стильбена).
Транс-ресвератрол обладает многофакторным механизмом действия на органы и ткани человека. При этом фундаментальными свойствами транс-ресвератрола, определяющими его положительное воздействие на организм человека, являются антиоксидантная активность как полифенола и индукция митохондриогенеза. В силу антиоксидантных свойств транс-ресвератрол оказывает не только защитное действие на различные мембранные структуры, но и регулирующее влияние на пролиферативные, дифференцирующие процессы, апоптоз и др. Специфической функцией транс-ресвератрола является индукция образования новых митохондрий путем активации сиртуинов, включая SIRT1. Важным аспектом его действия является также выраженный противовоспалительный эффект, проявляющийся в подавлении экспрессии маркеров воспаления TNF-α, IL-6, IL-1β, индуцибельной NO-синтазы (i-NOS) циклооксигеназы ЦОГ-2 и повышении уровня противовоспалительного цитокина IL-10, вследствие чего транс-ресвератрол проявляет себя как иммуномодулирующий фактор.
Используют транс-ресвератрол в составе заявляемой композиции, прежде всего, для снижения чувствительности тканей к инсулину, улучшения метаболизма глюкозы, нормализации уровней липидов и сахара в крови в результате обеспечения профилактического метаболического действия, заключающегося в модулирующем (активирующем) воздействии на активируемый аденозин-монофосфатом фермент - клеточную 5'АМФ-активируемую протеин-киназу (АМРK).
Протеин-киназа АМРK определяет баланс энергии в клетке, в связи с чем, играет ключевую роль в метаболических процессах. Она содержится в каждой клетке и служит главным регулятором организма, определяя количество подкожного жира за счет способности блокировать синтез жирных кислот и ускорять их окисление. В результате активирования протеин-киназы АМРK в клетках организма запускаются метаболические процессы и клетки теряют в объемах. По сути, активирование протеин-киназы АМРK имитирует эффекты ограничения калорий в организме (эффекты низкокалорийной диеты без изменения рациона питания). Таким путем транс-ресвератрол противодействует негативным последствиям потребления пищи с высоким содержанием жиров.
Кроме того, антиатерогенное действие транс-ресвератрола реализуется за счет ингибирования окисления ЛПНП, снижения уровня агрегации тромбоцитов, сосудорасширяющих свойств, противовоспалительных эффектов в отношении эндотелия сосудов.
Нижний допустимый уровень потребления транс-ресвератрола для профилактики сердечно-сосудистых заболеваний и улучшения чувствительности к инсулину для здоровых людей составляет 5-10 мг в сутки.
Жирорастворимый витамин Е, основное действие которого заключается в антиоксидантном эффекте, используют в составе заявляемой композиции в виде активного α-токоферола ацетата. Указанное природное соединение угнетает и ограничивает свободнорадикальные реакции. Исключительно важное значение имеет способность α-токоферола ацетата стимулировать синтез гема и гемсодержащих ферментов: гемоглобина, миоглобина, цитохромов (в том числе цитохрома Р-450), каталазы, пероксидазы. Следствием этого является улучшение дыхания тканей, синтетических процессов в них, ликвидация перекисей ненасыщенных жирных кислот и липидов, повреждающих клеточные и субклеточные мембраны. В результате действия α-токоферола ацетата стабилизируются клеточные и субклеточные мембраны (эритроцитов, клеток различных тканей, лизосом), понижается их проницаемость и сохраняется целостность, увеличивается синтез белков различных тканей (коллаген в подкожной клетчатке и костях, сократительные белки в скелетных, гладких мышцах и миокарде, белки слизистых оболочек и пр.), а также образование ряда ферментов (креатинфосфокиназы, вазопрессиназы), гормонов (гонадотропинов) и др.
2
2
2
α-токоферола ацетат выполняет роль универсального протектора клеточных мембран от окислительного повреждения. Он занимает такое положение в мембране, которое препятствует контакту кислорода с ненасыщенными липидами мембран (образование гидрофобных комплексов). Это защищает биомембраны от их перекисной деструкции. Антиоксидантные свойства α-токоферола ацетата обусловлены также способностью подвижного гидроксила хроманового ядра его молекулы непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами кислорода (O, НО, НО), свободными радикалами ненасыщенных жирных кислот (RO, RO) и перекисями жирных кислот. Мембраностабилизирующее действие α-токоферола ацетата проявляется и в его свойстве предохранять от окисления SH-группы мембранных белков.
10
10
α-токоферола ацетат является не только антиоксидантом, но и антигипоксантом, что связано с его способностью стабилизировать митохондриальную мембрану и снижать потребление кислорода клетками. Следует отметить, что из всех клеточных органелл митохондрии наиболее чувствительны к повреждению, так как в них содержится больше всего легко окисляющихся ненасыщенных липидов. Вследствие мембраностабилизируюшего эффекта α-токоферола ацетата в митохондриях увеличивается сопряженность окислительного фосфорилирования, синтез аденозинтрифосфата (АТФ) и коэнзима Q (KoQ) - компонента дыхательной цепи и главного антиоксиданта митохондрий [22].
10
10
10
Для поддержания жизнедеятельности организма человека, в том числе дополнительной активизации энергетического метаболизма на клеточном уровне и сжигания за счет этого жиров и углеводов в клетках, используют один из незаменимых участников важнейших процессов в организме - митохондриальный метаболит коэнзим Q. Указанный активный компонент заявляемой композиции локализуется в митохондриях (структурах клеток, которые отвечают за преобразование энергии в молекулы АТФ) и является непосредственным участником дыхательной цепи переноса электронов. KoQ обеспечивает энергетически выгодный аэробный путь утилизации глюкозы, поскольку биохимическим механизмом образования АТФ на этом пути являются электронотранспортные цепи митохондрий, в функционировании которых и играет важную роль KoQ.
10
10
10
Обладая широкими антиоксидантными свойствами KoQ препятствует отложению ХС на стенках сосудов. Также KoQ обладает способностью снижать отечность конечностей и устранять цианоз, поэтому его используют при застойных формах хронической сердечной недостаточности. Согласно данным многих клинических исследований, KoQ обладает способностью к нормализации уровня сахара в крови и снижению повышенного АД, поэтому его назначают при диабете [23].
10
Сочетанное использование KoQ и транс-ресвератрола, как индуктора митохондриогенеза, позволяет обеспечить взаимное усиление эффектов данных соединений, поскольку они имеют общую мишень воздействия - митохондрии, но реализуют свои эффекты за счет разных механизмов.
Использование в составе заявляемой композиции протеолитических и амилолитических ферментов, которые введены в виде комплекса ферментов (альфа-амилаза, нейтральные и щелочные протеиназы, бета-глюканаза, целлюлаза, ксиланаза), способствует полноценному перевариванию пищи и усвоению нутриентов, а также формированию оптимальной эндоэкологической среды в кишечнике. Последнее имеет важное значение для поддержания в оптимальном состоянии нормальной микрофлоры кишечника.
В составе заявляемой композиции используют комплекс ферментов, полученных биотехнологическим путем. В отличие от наиболее широко применяемых ферментов животного происхождения, действие используемого комплекса нацелено не на замещение функции собственных пищеварительных ферментов человека, а на расширение спектра их активности. Это достигается за счет расщепления с помощью указанных ферментов химических связей в субстратах, поступающих в ЖКТ и не доступных для собственных пищеварительных ферментов.
Для улучшения технологичности процесса получения заявляемой композиции в твердой форме (гранул, капсул или саше) в ее состав введена скользящая вспомогательная технологическая добавка, в качестве которой используют кальция стеарат и/или диоксид кремния в количестве, определяемом фармацевтической и терапевтической целесообразностью. Применение скользящей вспомогательной технологической добавки обеспечивает создание на поверхности гранул, полученных при производстве заявляемой композиции, тонкой пленки, которая придает им скользящий эффект, что увеличивает сыпучесть капсулируемой массы и облегчает ее капсулирование или заполнение саше.
Действие заявляемой композиции, выполненной в капсулированной форме, начинается уже в желудке, где происходит растворение защитной капсулы под воздействием желудочного сока. Входящие в состав заявляемой композиции метаболиты пробиотического штамма бактерий, деградация которых в ходе транзита по ЖКТ практически исключена, а также активные природные соединения попадают в кишечник, где и проявляется их благоприятное воздействие.
Таким образом, заявляемая композиция представляет собой сбалансированный комплекс, имеет сложный поликомпонентный состав, полученный путем качественного и количественного подбора ингредиентов при следующем их соотношении, мас. %:
стерилизованная лиофилизированная культуральная жидкость,
содержащая метаболиты пробиотического штамма бактерий Bacillus
subtilis ВКПМ №В-2335
- 1,4-1,9;
транс-ресвератрол
- 3,5-4,8;
коэнзим Q<sub>10</sub>
- 7,1-9,6;
α-токоферола ацетат
- 0,4-0,5;
лактоза
- 13,0-17,5;
комплекс ферментов (альфа-амилаза, нейтральные и щелочные
протеиназы, бета-глюканаза, целлюлаза, ксиланаза)
- 0,2-0,3;
цеолит
- 64,2-73,5;
кальция стеарат и/или диоксид кремния
- 0,9-1,2.
Возможность достижения цели изобретения подтверждается результатами проведенных исследований, представленными в следующих примерах.
Пример 1. Получение заявляемой композиции в твердой форме для перорального введения.
Заявляемая композиция может быть выполнена в твердой форме (гранулы, капсулы, саше), что существенно упрощает ее использование при пероральном приеме, удобно в применении, хранении и транспортировке.
10
Получают заявляемую композицию вначале в виде гранул, для чего выполняют следующий алгоритм действий. Выращивают микроорганизмы Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 методом глубинного культивирования в биологическом реакторе (ферментере). По окончании процесса культивирования КЖ с микроорганизмами подвергают центрифугированию для отделения и последующего удаления живых клеток микроорганизмов, а затем стерилизуют. Перед стерилизацией КЖ смешивают с цеолитом, предварительно измельченным до частиц размером не более 500 мкм. Полученную смесь подвергают лиофилизации, при которой происходит иммобилизация биологически активных метаболитов продуцента на частицах цеолита. Далее в массу добавляют последовательно в необходимых количествах лактозу, коэнзим Q, транс-ресвератрол, α-токоферола ацетат, комплекс ферментов и вспомогательную технологическую добавку, помещают в резервуар установки для гранулирования с целью смешивания и досушивания. После выгрузки массу просеивают на вибросите и передают на стадию капсулирования или заполнения саше.
В качестве сорбента-носителя используют цеолит природный - натуральный микропористый силикатный минерал Холинского месторождения (Бурятия) (ООО «КРАФТ», Санкт-Петербург) [24, 25].
Как видно, процесс получения заявляемой композиции в твердой форме для перорального введения (гранул, капсул, саше) достаточно прост, а используемые при этом ингредиенты выпускаются в промышленных условиях, доступны и недороги.
Пример 2. Оценка безопасности заявляемой композиции.
Безопасность заявляемой композиции оценивали путем санитарно-химического анализа, микробиологических исследований, а также определения токсикологических
характеристик, в том числе острой токсичности при внутрижелудочном введении, хронической токсичности и способности к кумуляции, раздражающего и сенсибилизирующего действия, возможных отдаленных последствий. Санитарно-химический анализ.
Подготовку проб проводили по ГОСТ 26929-94 «Сырье и продукты пищевые. Подготовка проб. Минерализация для определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт». Свинец и кадмий определяли по ГОСТ 30178-96 «Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. Межгосударственный стандарт». Мышьяк определяли согласно ГОСТ 26930-86 «Сырье и продукты пищевые. Метод определения мышьяка». Ртуть определяли согласно «Методическим указаниям по обнаружению и определению содержания общей ртути в пищевых продуктах методом беспламенной атомной абсорбции» (№5178-90).
Содержание хлорорганических пестицидов (токсикантов) определяли согласно «Методическим указаниям по определению остаточных количеств хлорорганических пестицидов» (№1766-77) и официальным методам анализа АОAC («Official methods of analysis of the АОАС», 1984, 14th ed., Chapter 29, P. 537-538).
Исследования проводили с использованием весов лабораторных ВЛР-500, газожидкостного хроматографа «Карло Эрба» (модель HRGC 5700), обменных клеток итальянской фирмы «Texnoplast».
Результаты измерений представлены в таблице 1 и свидетельствуют, что в заявляемой композиции содержание токсикантов (хлорорганические пестициды ГХЦТ и ДЦТ) и опасных для здоровья веществ (свинец, кадмий, ртуть, мышьяк) не превышает допустимые уровни, установленные Техническим регламентом Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложение 3, раздел 10) [26]. Такие же пестициды как алдрин и гептахлор в заявляемой композиции не обнаружены.
Микробиологические исследования.
Микробиологические исследования проводили в соответствии с требованиями методических указаний МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов» и МУК 2.3.2.721-98 «Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище», ГОСТ Р 52814-2007 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella)), ГОСТ Р 52816-2007 «Продукты пищевые. Метод выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)», ГОСТ 10444.12-88 «Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов», ГОСТ 30726-2001 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli».
Экспериментально установлено, что по микробиологическим показателям безопасности заявляемая композиция соответствует требованиям, установленным Техническим регламентом Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложения 1 и 2, раздел 1.9) (таблица 2)].
Исследование острой токсичности.
Для определения показателей острой токсичности заявляемую композицию вводили здоровым беспородным белым крысам обоих полов массой тела 130-150 г и 180-200 г внутрижелудочно в виде водно-крахмальных взвесей. Введение осуществляли через металлический атравматичный зонд в возрастающих дозах с использованием пробитанализа по Литчфилду-Уилкоксону в модификации 3. Рота [27].
В ходе эксперимента для исследования действия заявляемой композиции были сформированы опытные группы по 6 животных одного пола в каждой. Кроме того, имелись аналогичные по численности группы контрольных животных каждого пола, которым по тому же пути вводили эквивалентные объемы растворителя - 1% крахмальной взвеси. Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по массе тела (±10%).
Наблюдение за подопытными животными осуществляли в течение 14 сут с регистрацией показателей: летальность, время гибели животных, симптоматика отравления, результаты ежедневного наблюдения общего состояния и поведения, взвешивания, результаты контроля потребления корма и воды, результаты вскрытия и макроскопического описания погибших и выживших животных в конце исследования (эвтаназия осуществлялась передозировкой эфира), результаты определения массовых коэффициентов (МК) внутренних органов.
Введение заявляемой композиции в максимально переносимых дозах (20 г/кг для крыс и 25 г/кг для мышей) не вызывало гибели подопытных животных. Не отмечали и какие-либо другие признаки негативного действия заявляемой композиции. В первые сутки отмечали заторможенность, вялость, снижение потребления корма и воды, диарею. В остальные дни общее состояние и поведение животных опытных групп не отличались от животных контрольной группы. В частности, не отмечали какие-либо диспепсические явления. На вскрытии - без особенностей. Половых различий в течение интоксикации не отмечалось.
При вскрытии через день после острого введения выявлено: листки плевры и органы грудной клетки не изменены. Легкие бледно-розовые, воздушные, без уплотнений на ощупь. Размеры сердца в пределах нормы. В полостях сердца содержится небольшое количество жидкой крови. Мышца сердца плотная, коричневой окраски. Желудок заполнен небольшим количеством плотной пищи. Слизистая оболочка блестящая, складчатая, слегка розоватой окраски.
Слизистая тонкого кишечника блестящая, гладкая, розоватой окраски. Размеры и форма печени не отличаются от контроля. Поверхность печени гладкая. Капсула тонкая, прозрачная. Рисунок печени на разрезе не изменен. Ткань печени умеренно полнокровна. Почки обычной величины и формы, коричневатого цвета, плотные, с отчетливыми корковым и мозговым веществом на разрезе. Щитовидная железа, надпочечники и поджелудочная железа по внешнему виду не отличаются от контроля.
Результаты изучения динамики изменения массы тела, потребления воды и корма подопытных животных, а также динамики изменения массы тела выживших белых мышей, получавших заявляемую композицию в течение 14 сут наблюдения за ними практически не различались (таблицы 3-6).
Анализ величин МК органов выживших белых крыс и мышей позволил установить, что острое введение им заявляемой композиции в максимально переносимой дозе не вызывало какие-либо достоверные отличия по сравнению с контрольной группой животных, получавших 1% крахмальную взвесь (таблицы 7 и 8).
Состояние переживших острую интоксикацию животных свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности заявляемой композиции при введении ее в максимально переносимых дозах.
Таким образом, результаты токсикометрии, данные некропсии и результаты наблюдений за подопытными животными на протяжении 14 сут после острого введения позволяют отнести заявляемую композицию к нетоксичным (относительно безвредным по С.Д. Заугольникову) и малоопасным (IV класс опасности по ГОСТ 12.1.007) веществам.
Исследование способности к кумуляции.
Исследования способности к кумуляции проводили на белых нелинейных крысах-самцах массой 180-200 г при введении заявляемой композиции внутрижелудочно через атравматичный металлический зонд в течение 30 дней при суточной дозе 1,5 г/кг. Животные контрольной группы получали 1% крахмальную взвесь в аналогичном объеме.
Контроль основных физиологических показателей осуществляли через 30 дней хронического ежедневного введения заявляемой композиции.
В течение всего периода наблюдения летальных эффектов не наблюдали. Общее состояние и поведение подопытных животных оставалось нормальным и не отличалось от показателей контрольной группы в течение всего эксперимента.
Вскрытие крыс, умерщвленных на следующий день после последнего введения заявляемой композиции, показало, что размеры, форма и окраска их внутренних органов не имели макроскопических изменений по сравнению с контрольной группой. Слизистая оболочка желудка и тонкого кишечника были блестящими, бледно-розовыми, без признаков раздражения или воспаления.
При гистологическом исследовании препаратов легких, миокарда, печени, почек и слизистой желудка подопытных животных, получавших заявляемую композицию, дистрофические, воспалительные или некробиотические изменения органов не выявлены.
Следовательно, хроническое внутрижелудочное введение в организм подопытных животных заявляемой композиции не вызывало дистрофических или деструктивных изменений паренхиматозных органов и не сопровождалось раздражением слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). Таким образом, по интегральному показателю кумуляции заявляемая композиция не обладает способностью к кумуляции.
Исследование сенсибилизирующего действия.
2
Изучение сенсибилизирующего действия заявляемой композиции проводили на морских свинках. Для этого в кожу наружной поверхности уха животных туберкулиновым шприцем вводили однократно 0,02 мл водного разведения заявляемой композиции в дозе 10 мг/кг, а через 10 дней на предварительно выстриженные участки кожи боковой поверхности спины размером 2×2 см наносили и фиксировали заявляемую композицию в виде порошка из расчета 20 мг/см. Забор крови у подопытных животных осуществляли через 3 ч после постановки кожных проб.
Результаты оценки влияния заявляемой композиции на показатели сенсибилизирующего действия представлены в таблице 9 и свидетельствуют об отсутствии признаков сенсибилизации в периферической крови - эозинофилии или увеличения уровня лизиса в реакции специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ) по сравнению с контролем. При осмотре кожи спины подопытных животных признаков раздражения не отмечалось. Следовательно, заявляемая композиция при эпикутанном контакте не обладает сенсибилизирующим действием, то есть не провоцирует развитие аллергии.
Исследование развития возможных отдаленных последствий.
Изучение возможного гонадотоксического эффекта проводили в соответствии с методическими рекомендациями по показателям, обязательным при первичной оценке химических веществ [28, 29]. Изучение мутагенной активности проводили по частоте образования микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга (из бедренной кости) белых мышей в соответствии с методическими рекомендациями [30, 31].
Результаты изучения возможных гонадотоксического и мутагенного эффектов заявляемой композиции при введении ее в течение 10 дней в дозе 1 г/кг, проведенного через 15 дней после окончания ее введения, свидетельствуют об отсутствии достоверно значимых сдвигов показателей гонадотоксичности и мутагенности (таблица 10). Угнетения сперматогенеза или увеличения частоты мутаций также не наблюдалось.
Следовательно, заявляемая композиция не обладает токсическим влиянием на репродуктивную функцию и не оказывает мутагенного эффекта. Это свидетельствует о ее безопасности в плане развития отдаленных негативных последствий у человека.
Пример 3. Оценка стабильности заявляемой композиции в процессе хранения.
Исследовали возможность сохранения активности и безопасности заявляемой композиции, выполненной в твердой форме в виде гранул, и устанавливали гарантированный срок годности в случае хранения при различных температурах и без использования специального оборудования.
10
В ходе эксперимента гранулы закладывали в 120 потребительских упаковок в виде двойных полиэтиленовых пакетов и хранили их в течение 3,0 лет при температурах 5±2°С, 10±3°С, 25±5°С, 35±6°С (по 25 упаковок на каждый температурный режим хранения). Через каждые 6 мес хранения отбирали по 5 упаковок от соответствующего температурного режима и определяли характеристики гранул: органолептические показатели (внешний вид, цвет, запах), физико-химические показатели (содержание коэнзима Q и транс-ресвератрола, амилолитическая и протеолитическая активность, массовая доля влаги, распадаемость, средняя масса гранул в капсуле), микробиологическую чистоту. Для оценки возможных изменений указанных характеристик при хранении предварительно определяли их значения в начале исследований.
Данные, представленные в таблице 11, свидетельствуют о том, что при обычной температуре хранения (25±5°С) органолептические и физико-химические показатели, а также микробиологическая чистота заявляемой композиции, выполненной в твердой форме в виде гранул, практически не изменяются в течение 3,0 лет.
Таким образом, гарантированный срок хранения заявляемой композиции составляет не менее 3,0 лет при условии соблюдения сохранности упаковки. Особые температурные условия хранения или использование специального оборудования при этом не требуются.
Пример 4. Оценка биологической активности заявляемой композиции.
Биологическую активность заявляемой композиции оценивали на основании изучения ее способности нормализовать жировой обмен и вызывать за счет этого коррекцию массы тела подопытных животных, а также поддерживать функциональное состояние организма и, прежде всего, адаптационные возможности, сниженные, как правило, при наличии избыточной массы тела и ожирении.
Опыты по оценке указанных характеристик выполнены на белых нелинейных крысах-самцах стандартной массой 150-160 г, поступивших из питомника РАМН «Рапполово» Ленинградской области, у которых было смоделировано экспериментальное ожирение.
При моделировании экспериментального ожирения у крыс в качестве модели индуцирования гиперлипидемии и ожирения использовали диету, перенасыщенную жирами [32]. Для этого экспериментальные животные потребляли гомогенный корм, содержащий (%):
-казеин
- 5;
- подсолнечное масло в смеси со свиным жиром
- 40;
- глюкозу
- 43;
- агар
- 2;
- соли, витамины
- 4;
- холиевую кислоту
- 1;
- тиоурацил
- 1;
- холестерин
- 4.
Кроме этого, крысам дополнительно внутрижелудочно вводили 10% масляную эмульсию свиного жира в дозе 100 мг/кг.
Заявляемую композицию вводили в дозе 150 мг/кг (приблизительная «терапевтическая-профилактическая» доза для крыс с учетом коэффициента межвидового переноса доз, равного 5,9 для человека средней массой 70 кг, исходя из 4-х капсул в сутки).
Вводили заявляемую композицию внутрижелудочно через атравматичный зонд за час до введения свиного жира на протяжении 1,5 мес на фоне указанной выше диеты.
Интактная группа крыс получала обычную виварную диету.
Все животные получали воду ad libitum.
Все тесты и последующий забор крови осуществляли в конце исследования через 18 ч после последнего введения заявляемой композиции. В этот период подопытные животные были лишены пищи.
Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по Стьюденту-Фишеру.
Изучение способности коррекции массы тела подопытных животных за счет нормализации жирового обмена.
В ходе эксперимента изучали влияние заявляемой композиции на показатели жирового обмена и массу тела. Все лабораторные тесты проводили по стандартным методикам [33, 34]. β-липопротеиды (β-ЛП) сыворотки крови определяли турбодиметрическим методом, свободные (неэтерифицированные) жирные кислоты (НЭЖК) - титрометрически, общий билирубин (ОБ) - спектрофотометрически, фосфолипиды (ФЛ) - по содержанию общего фосфора.
Динамику изменения массы тела крыс изучали с использованием весов ВЛР-500.
Также в конце эксперимента подопытных животных индивидуально высаживали в обменные клетки итальянской фирмы «Tecniplast Gazzada» на 24 ч для сбора экскрементов (кала). Затем в кале общепринятыми методами определяли количество нейтрального жира, наличие жирных кислот и мыла [35].
Результаты экспериментов, представленные в таблицах 12 и 13, подтвердили адекватность использованной модели ожирения: в контрольной группе (без профилактики) значительно возросло содержание в крови общих липидов, липопротеидов низкой плотности, триглицеридов, холестерина, а содержание фосфолипидов в сыворотке, наоборот, снизилось, увеличился коэффициент атерогенности. Масса тела подопытных животных при этом значительно возросла.
В опытной группе, получавшей заявляемую композицию, наблюдалась нормализация показателей липидного обмена. Животные в опытной группе были более активными, без признаков ожирения.
Таким образом, экспериментально установлено, что заявляемая композиция проявляет гиполипидемическое действие и эффективно снижает массу тела подопытных животных.
Об этом свидетельствует также нормализация копрограммы при профилактическом применении заявляемой композиции.
Влияние на устойчивость крыс к воздействию высоких температур.
Адаптогенные свойства заявляемой композиции оценивали по воздействию на подопытных животных температурного фактора, что позволяет провести комплексную оценку влияния заявляемой композиции на метаболические системы, устойчивость функционирования которых в условиях гипертермии определяет выживаемость особей.
Для оценки устойчивости крыс в условиях гипертермии подопытную и контрольную группы по 6 животных в клетке помещали в вентилируемый термостат и выдерживали при температуре 60°С. Устройство термокамеры позволяло обеспечить адекватный газообмен, достаточный для предупреждения кислородной недостаточности, и позволяло наблюдать за животными через смотровое застекленное отверстие. В ходе наблюдения регистрировали развитие симптоматики поражения и отмечали время манифестации судорожного синдрома и гибели особей.
Экспериментальные данные свидетельствуют, что четырехнедельное введение заявляемой композиции способствует положительному влиянию на устойчивость крыс к гипертермии (таблица 14). Скорость развития судорожного синдрома у крыс, получавших заявляемую композицию, имеет отчетливую тенденцию к снижению, а продолжительность их жизни в условиях гипертермии достоверно выше. Таким образом, заявляемая композиция обладает адаптогенным действием и при курсовом применении способна увеличить устойчивость к воздействию экстремальных факторов.
Влияние на когнитивные функции.
Эксперименты на животных выполняли в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению лекарственных средств с ноотропным типом действия» [36].
Базисной моделью для оценки влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа в норме и в условиях его экспериментального нарушения является методика условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [37]. Основными преимуществами этого метода являются быстрота выработки рефлекса (обучение с одной пробы) и возможность дифференцированного воздействия на различные фазы памяти. Метод основан на торможении врожденной деятельности или приобретенных навыков, приводящим к отрицательным последствиям для организма. В условиях пассивного избегания животное обучается избегать вредные факторы путем подавления определенных форм поведения, в данном исследовании - избегать предпочитаемого темного пространства. Существует несколько вариантов методики УРПИ, вырабатываемых в одном сочетании. В данном исследовании использовали наиболее часто используемую форму УРПИ.

Подопытные животные были разделены на 3 группы: контрольную и две опытные по 10 особей в каждой. Перед выработкой УРПИ подопытным животным первой опытной группы на протяжении 10 дней внутрижелудочно вводили заявляемую композицию в дозе 100 мг/кг. Животным второй опытной группы также на протяжении 10 дней вводили внутрижелудочно препарат сравнения «Ноопепт таблетки 10 мг» (ЗАО «Мастер-клон», Москва) в виде водной взвеси в дозе 5 мг/кг (адаптированная для грызунов максимальная терапевтическая доза для человека в расчете на активный компонент). Животным контрольной группы вводили 1% крахмальную взвесь в объеме 0,2 мл.
Установка для выработки рефлекса пассивного избегания представляет собой фанерный ящик - отсек, который состоит из освещенной части с вмонтированной лампой накаливания мощностью 40 Вт и затемненной с медными стержнями диаметром 2 мм на полу. К стержням через латер и замыкающий ключ подают ток от сети. Между собой части разделены перегородкой с отверстием, которое перекрывает заслонка.
На 11 день исследования проводили выработку УРПИ у крыс в установке, запускающим стимулом которой было нахождение животного в ярко освещенном пространстве. Крысу помещали в светлую часть отсека. После перехода крысы в темную часть сразу же наносили неустранимое болевое воздействие 5 последовательными стимулами переменного тока (1 мА, длительностью 1 с каждый с интервалом 2 с).
При тестировании (повторном помещении в освещенную часть отсека через 24 ч с целью определения сохранения УРПИ) за каждым животным наблюдали в течение 180 с. При этом регистрировали время латентного периода перехода крысы в темную часть отсека, время пребывания в светлой и темной частях отсека и число животных, не зашедших в темную часть отсека (число обученных животных).

Результаты, представленные в таблице 15, свидетельствуют, что заявляемая композиция и препарат сравнения «Ноопепт таблетки 10 мг» в случае их применения с профилактической целью улучшают мнестические функции ЦНС подопытных животных: увеличивалось время пребывания в светлой камере, удлинялся латентный период, сокращалось время пребывания в темной камере, где животные испытывали болевые ощущения. Следовательно, у подопытных животных улучшались память и способность к обучению. При этом экспериментально установлено, что по эффективности заявляемая композиция не уступает известному и широко применяемому ноотропному препарату «Ноопепт таблетки 10 мг». Влияние на устойчивость крыс к воздействию гипоксии.
При оценке адаптогенного и цитопротективного эффектов заявляемой композиции выполняли моделирование гипоксии в замкнутом объеме («баночная гипоксия») [38].
Дыхание из замкнутого пространства - ререспирация - является достаточно адекватной и простой моделью острой гипоксии [39]. Животное, поглощая кислород из замкнутого пространства вследствие дыхания, вызывает развитие его дефицита - гипоксическую гипоксию, что позволяет оценивать исследуемый препарат по интегральным показателям летальности за определенное время наблюдения и устойчивости к дефициту кислорода (максимальной продолжительности жизни).
Животных помещали в банку объемом 2 л, плотно закрытую стеклянной крышкой, смазанной герметиком. Фиксировали с помощью секундомера максимальную продолжительность жизни и симптомы танатогенеза. Банки с животными во время исследования находились в кондиционере, обеспечивающем постоянство условий эксперимента (температура +20°С, влажность - 65-70%, атмосферное давление).
Перед экспериментом животным опытной группы на протяжении четырех недель внутрижелудочно вводили заявляемую композицию в дозе 150 мг/кг. Животным контрольной группы вводили 1% крахмальную взвесь в объеме 0,2 мл.
Экспериментально установлено, что заявляемая композиция способствует значимому повышению устойчивости животных к воздействию неблагоприятных факторов, моделирующих условия закрытых помещений, задымленной среды и подземного транспорта, то есть проявляет цитопротективное действие (таблица 16). Таким образом, заявляемая композиция достоверно увеличивает время жизни крыс.
Влияние на двигательную и исследовательскую активность.
Избыточная масса тела способствует снижению двигательной активности и эмоциональности. В связи с этим, было изучено влияние на указанные показатели заявляемой композиции в случае ее профилактического применения.
Двигательную активность изучали с помощью автоматической системы регистрации движений «Клетка активности» (Ugo Basile, Италия). Подопытные животные были разделены на две группы: контрольная и опытная по 10 особей в каждой.
В ходе эксперимента для оценки спонтанной двигательной активности (СДА) крысу помещали на 3 мин в камеру.
Результаты оценки влияния заявляемой композиции на СДА крыс представлены в таблице 17 и свидетельствуют, что профилактическое применение заявляемой композиции способствует повышению общей двигательной активности крыс.
Исследовательскую активность изучали с помощью круглой пластиковой арены диаметром 100 см с бортами по периметру. Пол арены приподнят и разделен на 9 квадратов с отверстиями для регистрации исследовательской активности. Над камерой размещен источник света. Характер и количество движений отмечает регистратор. Регистрировали шесть компонентов поведения подопытных животных в течение 5 мин наблюдения за ними: латентный период выхода, вертикальную и горизонтальную активность, количество заглядываний в норки, груминг и болюсы. Для определения выраженности эффекта использовали отношение количества движений в опыте и контроле.
Из данных, представленных в таблице 18, видно снижение активности подопытных животных контрольной группы. У крыс с ожирением отмечали снижение исследовательской активности (общее количество вертикальных стоек, заглядываний в норку), а также повышение уровня тревожности (число дефекаций и груминга).
Профилактическое применение заявляемой композиции способствовало повышению исследовательской активности подопытных животных.
Влияние на физическую работоспособность и мышечную силу.
Физическая работоспособность и мышечная сила являются важными показателями, свидетельствующими об активности животных. Оценивали биологическую активность заявляемой композиции по длительности плавания и мышечной силе подопытных животных.
Влияние на длительность плавания мышей.
Плавание является тяжелой физической динамической нагрузкой и позволяет оценить эффективность адаптогенов и активность окислительно-восстановительных процессов в мышцах мышей. В ходе эксперимента плавание осуществлялось при температуре воды 37°С и выполнялось с грузом, представляющим собой свинцовую трубку на резиновом кольце, прикрепленную к корню хвоста мыши и составляющую 10% от массы тела. Одновременно в большой ванне плавали по 5 животных из контрольной и опытной групп. Животным опытной группы ежедневно внутрижелудочно вводили заявляемую композицию в дозе 150 мг/кг каждой. Мыши контрольной группы получали ежедневно внутрижелудочно 1% крахмальную взвесь в объеме 0,2 мл.
Критерием утомления и прекращения плавания считали первое «ныряние» мыши с погружением носовых ходов в воду. Регистрировали продолжительность плавания мышей от момента помещения их в ванну до момента первого «ныряния». Результаты тестирования, проведенного через 14 дней после ежедневного введения заявляемой композиции, свидетельствуют, что ежедневное профилактическое введение крысам заявляемой композиции оказывает протективное действие и снижает утомляемость (таблица 19), повышает их выносливость в тесте плавания приблизительно на 93%, то есть значительно повышает адаптационные способности организма.
Влияние на мышечную силу крыс.
Оценка мышечной силы проводилась на белых крысах с использованием динамометра для крыс. Результаты, представленные в таблице 20, свидетельствуют, что по результатам теста на мышечную силу в случае ежедневного профилактического применения заявляемой композиции отмечается увеличение данного показателя на 52% по сравнению с контролем.
Пример 5. Исследование влияния метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 на рост и размножение пробиотических лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3.
В ходе эксперимента исследовали in vitro влияние метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 на рост лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3, близких нормальной составляющей индигенной микрофлоры кишечника человека.
Исследования проводили с использованием:
- метода прямого антагонизма путем прямого нанесения стерильных метаболитов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 или живых лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 в лунки или на поверхность твердой питательной среды (агар МРС-4) сразу же после посева в нее лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 или индикаторных тест-культур с последующей инкубацией в течение 24 ч при температуре 37°С;
-метода двухслойного агара [40], при котором в нижний слой твердой питательной среды (агар МРС-4) вносили суспензию метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 или живые лактобациллы Lactobacillus plantarum 8R-A3, а в верхний слой засевали лактобациллы Lactobacillus plantarum 8R-A3 или индикаторные тест-культуры.
Метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 вводили в концентрациях 1 г или 0,1 г в 10 мл агара.
Лактобациллы засевали в различных количествах, составляющих 7 lg КОЕ/мл-2 lg КОЕ/мл.
После нанесения стерильных метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 в лунки или на поверхность агара, засеянного лактобациллами Lactobacillus plantarum 8R-A3, экспериментально, с использованием метода прямого антагонизма установлено, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 не проявляют антагонистическую активность в отношении указанного штамма лактобацилл, зоны подавления роста лактобацилл отсутствуют.
Использование метода двухслойного агара подтвердило, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 при введении в указанной концентрации не оказывают ингибирующий эффект на рост лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3. При этом экспериментально установлено, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 стимулируют рост пробиотических лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 (таблица 21). В присутствии указанных метаболитов в принятых концентрациях вырастало большее количество лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3 (в четыре и более раз).
Таким образом, экспериментально установлен лактогенный эффект метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335, выражающийся в стимулировании роста и размножения пробиотических лактобацилл Lactobacillus plantarum 8R-A3. Данное свидетельствует о том, что метаболиты Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335 в составе заявляемой композиции представляют лактогенный фактор, чем и обусловлен их положительный эффект при восстановлении нормофлоры кишечника.
Пример 6. Оценка эффективности заявляемой композиции, переносимости и безопасности применения.
Эффективность заявляемой композиции оценивали по динамике следующих показателей: клинических признаков (времени исчезновения субъективных клинических симптомов), состояния микробиоценоза кишечника и биохимических показателей крови (липидограммы, показателей перекисного окисления липидов, маркеров антирадикальной защиты).
Под наблюдением находились 40 пациентов с метаболическим синдромом, дисли-пидемией, нарушением углеводного обмена (повышением глюкозы натощак и нарушением толерантности к углеводам). Средний возраст составил 55,7±9 лет.
Пациенты были рандомизированы на 2 группы по 20 человек. Всем пациентам проводилась стандартная схема терапии ИБС, включающая назначение нитратов, антиагрегантов, β-адреноблокаторов или блокаторов кальциевых каналов, ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (АПФ), мочегонных средств. Пациенты основной группы дополнительно получали заявляемую композицию в дозе 360 мг 1 раз в день во время еды. Пациенты группы сравнения в дополнение к базисной терапии в течение 1 мес. получали препарат из группы статинов (симвастатин) в дозе 20 мг в сут.
Влияние на клиническую картину.
При стандартизированном расспросе отмечалось, что до лечения в 100% случаев пациенты предъявляли жалобы на боли за грудиной или в области сердца, сжимающего и давящего, ноющего характера, средней интенсивности, возникающие при ходьбе более 500 м, одышку инспираторного характера при подъеме на 2 этаж, сердцебиения и перебои в работе сердца.
На фоне терапии к 30-м сут отмечалась положительная клиническая динамика в отношении регресса клинических проявлений ИБС в обеих группах пациентов. Отмечалось значительное урежение эпизодов болевого синдрома, уменьшение одышки и ощущения сердцебиений во всех группах (таблица 22).
На фоне лечения в основной группе отмечалась положительная клиническая динамика: уменьшение выраженности вплоть до полного купирования болевого абдоминального синдрома и явлений диспепсии, значительное снижение ощущений привкусов во рту. В группе сравнения динамики жалоб со стороны ЖКТ не наблюдалось. Кроме того, у обследуемых пациентов, получающих стандартную терапию ИБС с дополнительным назначением заявляемой композиции, отмечена нормализация капрограммы (таблица 23).
Влияние на кишечный микробиоценоз
При проведении динамической оценки состояния микробиоценоза кишечника у лиц, получающих заявляемую композицию, было установлено снижение степени тяжести дисбиоза, увеличение представительства облигатной кишечной флоры, уменьшение уровня условно-патогенных микроорганизмов и стафилококков. В то же время в группе сравнения имела место тенденция к увеличению выраженности дисбиотических изменений микрофлоры толстой кишки с достоверным уменьшением количества бифидо- и лактобацилл и сохранением прежней популяции стафилококков (таблица 24).
Влияние на липидный обмен.
В показателях биохимического анализа крови на фоне назначения при лечении заявляемой композиции наблюдалась положительная динамика липидограмм, сопоставимая по показателям в основной группе и группе сравнения: у всех пациентов отмечалась тенденция к снижению общего ХС, ТГ, ХС ЛПНП. Однако достоверное и значимое повышение уровня ХС ЛПВП было зарегистрировано лишь у тех пациентов, которым в ходе лечения назначали заявляемую композицию. Данные динамики значений показателей липидограмм у пациентов основной группы и группы сравнения представлены, соответственно, на фиг. 1 и фиг. 2. Таким образом, применение заявляемой композиции в составе комплексной терапии оказывает выраженное гиполипидемическое действие, сопоставимое с действием симвастатина, но при этом также способствует повышению уровня антиатерогенных липопротеидов высокой плотности.
Влияние на систему антиоксидантной защиты.
Механизмы изменения соотношения липопротеидов в условиях дифференцированного лечения в значительной мере проясняют полученные данные, связанные с оценкой у пациентов показателей антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов (ПОЛ). Динамика процессов ПОЛ и состояния антиоксидантной системы представлена в таблице 25. Из представленных данных видно, что функциональная активность антирадикальных ферментов - супероксиддисмутазы и каталазы - возрастала только в основной группе, получавшей заявляемую композицию. Активация субстратного и ферментативного звеньев антиоксидантной защиты способствовала достоверному уменьшению уровня реакций ПОЛ у пациентов основной группы, в отличие от группы сравнения, где данный показатель, напротив, возрос.
Оценка переносимости и безопасности применения заявляемой композиции.
За период наблюдения в течение месяца ни один из пациентов не прекратил прием заявляемой композиции. Высокую приверженность к приему заявляемой композиции продемонстрировали 100% пациентов.
При оценке безопасности курсового приема заявляемой композиции не было отмечено значимых изменений показателей жизненно-важных функций и появления значимых клинических симптомов, не отмечено клинически значимых изменений клинических и биохимических показателей крови, изменений в общем анализе мочи, которые могли бы указывать на негативное влияние заявляемой композиции на функцию соответствующих органов и систем. Как положительный эффект можно отметить тенденцию к снижению уровня глюкозы в основной группе, тогда как в группе сравнения тенденция была противоположной.
Динамика основных лабораторных показателей у пациентов, входящих в группу оценки безопасности, представлена в таблице 26. Экспериментально установлено, что заявляемая композиция оказывает положительное влияние на углеводный обмен, что проявляется достоверным снижением уровня глюкозы в крови.
Таким образом, проведенные исследования показали, что воздействие заявляемой композиции, представляющей собой сбалансированный поликомпонентный комплекс, заключается в:
- коррекции состояния кишечного микробиоценоза, а именно: снижении степени тяжести дисбиоза, увеличении представительства облигатной кишечной флоры за счет лактогенного эффекта метаболитов Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335, уменьшении уровня условно-патогенных микроорганизмов и стафилококков;
- коррекции липидного обмена, заключающемся в нормализации показателей липидного обмена, а именно: снижении уровней общего холестерина, триглицеридов, холестерина липопротеидов низкой плотности, достоверном повышении уровня холестерина антиатерогенных липопротеидов высокой плотности;
- положительном влиянии на углеводный обмен, что проявляется достоверным снижением уровня глюкозы в крови;
- регуляции процессов свободнорадикального окисления за счет активации субстратного и ферментативного (супероксиддисмутаза и каталаза) звеньев антиоксидантной защиты.
Прием заявляемой композиции обеспечивает также дополнительные положительные эффекты, что особенно важно для лиц с МС, стремящихся поддержать функциональное состояние своего организма. Она значительно повышает адаптационные способности организма: физическую работоспособность и выносливость, устойчивость к воздействию экстремальных факторов (в том числе в условиях гипоксии), умственную работоспособность за счет улучшения мнестических функций ЦНС (памяти и способности к обучению).
Кроме того, заявляемая композиция хорошо переносится пациентами с МС, является безопасной для данной категории пациентов, так как не содержит токсичные и опасные для здоровья компоненты в количествах, превышающих допустимые уровни, нетоксична, не обладает способностью к кумуляции, не имеет нежелательные побочные эффекты, в том числе токсическое влияние на репродуктивную функцию, мутагенный эффект и отдаленные негативные последствия.
Следует также отметить, что при приеме заявляемой композиции не требуется изменения обычного образа жизни. Заявляемую композицию можно принимать дополнительно к пище, не изменяя диету и/или физическую активность в течение дня, что немаловажно для людей с МС.
Заявляемая композиция имеет сложный поликомпонентный состав, а ее эффективность в отношении коррекции нарушений липидного обмена у лиц с МС превосходит эффективность входящих в ее состав компонентов, что обеспечивается за счет эффективного комплексного восстановления обменных процессов в организме, нарушенных, как правило, при МС.
Заявляемое изобретение удовлетворяет критерию «новизна», так как впервые для коррекции проявлений метаболического синдрома предлагается использовать композицию, представляющую собой сбалансированный комплекс, поликомпонентный состав которой подобран таким образом, что обеспечивается коррекция состояния кишечного микробиоценоза, липидного и углеводного обмена, активация субстратного и ферментативного звеньев антиоксидантной защиты, а также поддержание функционального состояния организма, выполненную в твердой форме для перорального введения.
10
Заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень», так как из доступной информации не представлялась очевидной целесообразность сочетания в составе заявляемой композиции метаболитов пробиотического штамма микроорганизмов, активного природного соединения транс-ресвератрол и митохондриального метаболита коэнзим Q для обеспечения их эффективного комплексного воздействия, а также возможность поддержания при этом функционального состояния организма.
Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для промышленного применения» подтверждается многочисленными данными, показавшими несложную технологию производства заявляемой композиции в твердой дозированной форме для перорального введения, ингредиенты которой выпускаются в промышленных условиях и доступны, а заявляемая композиция обладает высокой стойкостью при хранении, безопасна, обладает высоким уровнем биологической активности и обеспечивает эффективную коррекцию состояния кишечного микробиоценоза, липидного и углеводного обмена, активацию звеньев антиоксидантной защиты и при этом позволяет поддерживать функциональное состояние организма.
Список литературы
1. Zimmet P.Z. et al. The Metabolic Syndrome: Perhaps an Etiologic Mystery but Far From a Myth - Where Does the International Diabetes Federation Stand?, Diabetes & Endocrinology, 7 (2), (2005).
2. Alberti K.G. et al. The Metabolic Syndrome - A New Worldwide Definition, Lancet, 366, 1059-62 (2005).
3. Рекомендации по ведению больных с метаболическим синдромом. Клинические рекомендации. 2013 г.
4. Лазебник Л.Б., Дроздов В.Н. Заболевания органов пищеварения у пожилых. М.: Анахарсис, 2003.
5. Шендеров Б.А. Микрофлора человека и животных и ее функции. - М.: Грантъ, 1998. - С. 416.
6. Acheson D.W. Microbial gut interaction in health and disease. Mucosal immune responses / D. W. Acheson, S. Luccioli // Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2004. - Vol. 18 (2). - P. 387-404.
7. Гриневич В.Б. Современные представления о значении кишечного микробиоценоза человека и способы коррекции его нарушений / В.Б. Гриневич, М.М. Захарченко // Новые Санкт-Петербургские врачебные ведомости. - 2003. - №3. - С. 13-20.
8. Ткаченко Е.И. и др. Клинические возможности пробиотической терапии в коррекции нарушений липидного обмена у больных ишемической болезнью сердца // Клиническое питание. - 2006. - №1-2. - С. 25-30.
9. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома. - М.: ДеЛи принт, 2008. - 319 с.
10. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Микрофлора человека и животных и ее функция. - М.: Грантъ, 1998. - 288 с.
11. Воробейников Е.В., Василенко А.Ж., Синица А.В и др. Методологические аспекты применения пробиотиков и антибиотиков для экстренной профилактики инфекционных заболеваний // Сб. научн. тр. III съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - М: МаксПресс, 2005. - С. 35-36.
12. Ткаченко Е.И., Авалуева Е.Б., Успенский Ю.П. и др. Эрадикационная терапия, включающая пробиотики: консенсус эффективности и безопасности // Клиническое питание, 2005. - №1. - С. 14-20.
13. RU 2287335 С1, 20.11.2006.
14. Волков М.Ю. Новый пробиотик Бактистатин - продукт современных биотехнологий // Сб. науч. тр. II Междунар. научно-практ. конф. МЕДБИОТЕК «Перспективы развития биотехнологии в России». - Пущино: МаксПресс, 2005. - С. 21-22.
15. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. - М: Медицина, 1985.
16. Волков М.Ю., Тухбатов И.А. Влияние нового пробиотика на обменные процессы и показатели иммунитета // Нива Урала, 2006. - №7. - С. 14-15.
17. Успенский Ю.П., Авалуева Е.Б., Баскович Г.А., Захарченко М.М., Льнявина В.М., Петренко В.В. Терапия ишемической болезни сердца, ассоциированной с метаболическим синдромом и дисбиозом кишечника (усовершенствованная медицинская технология). - СПб, 2008. - 8 с.
18 Маннапов А.Н., Панин А.Г., Ахмадиев P.P. Естественный микробиоценоз кишечника хомячков в онтогенезе и при коррекции пробиотиком, препаратами «Микровитам», «Ферран» и цеолитом // Матер, междунар. конф. «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания». - М., 2004. - С. 146.
19 Авраменко В.А., Василевский В.А. Новые сорбенты на основе модифицированных цеолитов и их применение в экологии, сельском хозяйстве и медицине // Цеолиты Приморья. Тезисы докладов научно-практической конференции. Владивосток, 1994, - С. 16-19.
20 Паничев A.M., Гульков А.Н. Природные минералы и причинная медицина будущего. Владивосток: Издательство ДВГТУ, 2001, - 216 с.
21 Пылев Л.Н., Васильева Л.А., Валамина И.Е. Анализ биологической агрессивности цеолитов различных месторождений Российской Федерации // Природные минералы на службе человека. Материалы научно-практической конференции. Новосибирск, 1999, - С. 68-70.
22. Морозкина Т.С., Мойсеенок А.Г. Витамины. Краткое руководств. Минск: Асар, 2002. - 112 с.
23. http://fb.ru/article/224815/koenzim-q-polza-i-vred-kak-primenyat-koenzim-q.
24. ТУ 9197-033-16925875-03 «Цеолит природный - сырье для производства биологически активных добавок к пище».
25. Пылев Л.Н., Заключение Комиссии по канцерогенным факторам при МЗ РФ, 1998.
26. Технический регламент Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложения 1 и 2, раздел 1.9, приложение 3, раздел 10). - 242 с.
27. Гланц Э. Медико-биологическая статистика. - М.. 1999.
28. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию. Методические рекомендации. - М., 1969. - 25 с.
29. Методы экспериментальных исследований по установлению порогов действия промышленных ядов на генеративную функцию с целью гигиенического нормирования. Методические рекомендации 1744-77. - М., 1978. - 35 с.
30. Оценка мутагенной активности химических веществ микроядерным методом. Методические рекомендации 28/10. - М., 1984. - 21 с.
31. Критерии оценки и методы прогнозирования отдаленных последствий действия на организм вредных веществ в воздухе рабочей зоны. Информационное письмо. НИИ гиг. тр. и проф. забол. - М., 1985. - 15 с.
32. Воспроизведение заболеваний у животных для экспериментально-терапевтических исследований. Под. ред. Н.В. Лазарева. МедГИЗ, 1954. - С. 54-55, 221-225.
33. Меньшиков В.В., Дилекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. Лабораторные методы исследований в клинике. Справочник. - М.: «Медицина», 1987. - 368 с.
34. Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск: «Беларусь», 1976, - С. 150-171.
35. Руководство к практическим занятиям по патологической физиологи. Под ред. О.М. Павленко. М.: «Медицина», 1974, - С. 174-175.
36. «Методические рекомендации по доклиническому изучению лекарственных средств с ноотропным типом действия» (в книге «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств». Под ред. А.Н. Миронова. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 276-297).
37. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения. М.: Высшая школа, 1991. - 399 с.
38. Руководство по физиологии. Экологическая физиология человека. Адаптация человека к экстремальным условиям среды. Под ред. О.Г. Газенко. М.: «Наука», 1979, - С. 333-336.
39. Руководство к практическим занятиям по патологической физиологии. Под ред. О.М. Павленко. М.: «Медицина», 1974, - С. 174-175.
40. Ермоленко Е.И., Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная оценка антагонистической активности лактобацилл. // Журн. микробиол., эпидем., иммунобиол. - 2004. - №5. - С. 94-98.
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме
Композиция для коррекции дислипидемии и поддержания функционального состояния организма человека при метаболическом синдроме