СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРИРОДНОЙ СМЕСИ КОНЪЮГИРОВАННЫХ ЛОШАДИНЫХ ЭСТРОГЕНОВ
METHOD OF SEPARATING NATURAL MIXTURE OF CONJUGATED HORSE ESTROGENES

Настоящее изобретение относится к способу выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов, обедненной фенольными компонентами мочи и неконъюгированными липофильными соединениями из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимыми с ними неконъюгированными соединениями.
Эстрогены используются в медицине для заместительной гормонотерапии. Смеси эстрогенов применяют прежде всего в лечебных и профилактических целях при недомоганиях, возникающих у женщин в климактерический период после естественной или искусственно вызванной менопаузы. Для применения в подобных целях как особо эффективные и хорошо переносимые пациентами зарекомендовали себя природные смеси конъюгированных эстрогенов, содержащиеся в моче жеребых кобыл и ниже называемые природными смесями конъюгированных лошадиных эстрогенов.
Содержание твердого вещества, растворенного в моче жеребых кобыл (в последующем описании сокращенно обозначаемой как МЖК), может, как очевидно, колебаться в достаточно широких пределах и обычно составляет от 40 до 90 г сухого вещества на литр. Наряду с мочевиной и прочими обычными компонентами мочи в твердом веществе, содержащемся в МЖК, присутствуют также фенольные компоненты в количествах, составляющих от примерно 2 до 5 мас.% в пересчете на массу сухого вещества. К числу таких фенольных компонентов относятся крезолы и дигидро-3,4-бис-[(3-гидроксифенил)метил]-2(3Н)-фуранон, сокращенно обозначаемый как ГФМФ. Эти вещества могут быть представлены в свободной или конъюгированной форме. В МЖК содержится далее природная смесь эстрогенов, которая преимущественно представлена в конъюгированной форме, например, в виде натриевой соли полуэфира серной кислоты (ниже кратко называемой как "сульфат"). Содержание конъюгированных эстрогенов (рассчитываемое в виде сульфата эстрогенов) может составлять от 0,1 до 1 мас.% в пересчете на массу сухого вещества. В твердом веществе, содержащемся в МЖК, дополнительно могут присутствовать и иные липофильные соединения, количества которых могут варьироваться в широких пределах и не поддаются прогнозированию. К таким липофильным соединениям, источником которых служат преимущественно потребляемые жеребыми кобылами в пищу растения, относятся главным образом различные флавоноидные, изофлавоноидные и норизопреноидные производные, а также сопоставимые с ними соединения, такие, например, как формононетин, генистеин, даидзеин, биоханин А, эквол и куместрол. Эти липофильные соединения изначально растительного происхождения могут присутствовать в моче в конъюгированной или в свободной (неконъюгированной) форме. К другим липофильным компонентам твердого вещества, содержащегося в МЖК, относятся также неконъюгированные стероидные производные, среди которых особо следует отметить андростановые и прегнановые стероиды, но также можно назвать неконъюгированные эстрогеновые производные.
Экстракты, содержащие природные смеси конъюгированных эстрогенов, обычно получают либо методом твердофазной экстракции, либо методом, основанным на различных процессах жидкостно-жидкостной экстракции не смешивающимися или лишь плохо смешивающимися с водой органическими растворителями. В целом же выделенная из МЖК природная смесь конъюгированных эстрогенов для возможности ее использования в качестве действующего вещества в фармацевтических препаратах должна удовлетворять определенным фармацевтическим спецификациям, например, должна соответствовать спецификациям, изложенным в фармакопее США или в европейской фармакопее. Так, в частности, содержание конъюгированных эстрогенов в такой смеси в пересчете на массу сухого вещества должно быть не ниже определенных предельных значений.
В патентах US 2551205 и US 2429398 описан способ получения водорастворимого препарата эстрогенов из МЖК, в соответствии с которым сначала путем адсорбции на активированном угле или иных пригодных адсорбентах, элюирования смешивающимся с водой органическим растворителем, например пиридином, и последующего удаления растворителя получают водный концентрат, который содержит преобладающую часть водорастворимых эстрогеновых компонентов исходной МЖК. Если согласно патенту US 2429398 концентрат путем его экстракционной обработки бензолом и/или диэтиловым эфиром подвергают дальнейшей очистке, то согласно патенту US 2551205 концентрат подкисляют до значения рН в интервале от 2 до 6, предпочтительно от 4 до 5, и затем быстро подвергают экстракционной обработке практически не смешивающимся с водой органическим растворителем из группы алифатических, ароматических или алициклических углеводородов (например, гексаном, бензолом, толуолом, циклогексаном) или хлорированных углеводородов (например, хлороформом, этилендихлоридом, трихлорэтиленом, четыреххлористым углеродом, хлорбензолом) с целью отделения нежелательных веществ, таких как жиры, масла, свободные фенольные компоненты и неконъюгированные стероиды, за счет их перевода в органическую фазу. В завершение водную фазу стабилизируют путем ее нейтрализации. В патенте US 2551205 полученный экстракт рекомендуется подвергать дальнейшей очистке путем последующих стадий экстракции и осаждения. В целом же по завершении описанного в US 2551205 способа выход эстрогеновых компонентов используемого концентрата составляет лишь примерно 80% от всего их содержания в нем.
В патенте US 2565115 описана экстракция конъюгированных эстрогенов из МЖК ацетоном. О чистоте полученной таким путем эстрогеновой фракции в этом патенте, однако, не приводится никаких данных.
В патенте US 2696265 описан способ, в соответствии с которым сначала эстрогены экстрагируют алифатическим спиртом или кетоном, например гексанолом, циклогексанолом или циклогексаноном. Эстрогены переходят при этом в органическую фазу, после чего их подвергают дальнейшей очистке и, в частности, содержащую эстрогены водную фазу подкисляют соляной кислотой до значения рН, равного 4, и подвергают экстракционной обработке этилендихлоридом.
В патенте US 2834712 описан способ получения смесей эстрогенов с высокой степенью чистоты и малой токсичностью, основанный на выполнении множества отдельных стадий экстракции различными растворителями при различных значениях рН. При этом используются большие объемы растворителей, например гексана и бензола. Так, например, на одной из стадий в целях отделения фенольных компонентов уже очищенный концентрат растворяют в воде, полученный раствор подкисляют соляной кислотой до значения рН, равного примерно 5,0, и после этого подвергают экстракционной обработке бензолом, а затем диэтиловым эфиром.
В публикации WO 01/27134 описан сравнительно простой в осуществлении способ экстракции конъюгированных эстрогенов из МЖК. В соответствии с этим способом МЖК после добавления к ней соли, например хлорида натрия, подвергают экстракционной обработке взятым по меньшей мере в таком же объеме органическим растворителем, например этилацетатом, что сопровождается переходом конъюгированных эстрогенов в органическую фазу. Эту органическую фазу затем отделяют и сушат, получая собственно экстракт. Однако в публикации WO 01/27134 не приведено никакой информации о чистоте полученного экстракта конъюгированных эстрогенов.
Однако при осуществлении описанных выше известных методов жидкостно-жидкостной экстракции приходится сталкиваться со множеством проблем, таких как интенсивное пенообразование, образование осадка, образование эмульсии и плохое разделение фаз. Обычно экстракцию требуется проводить в несколько стадий, что приводит к потере эстрогеновых компонентов и лишь неполному их выделению из мочи. Помимо этого для проведения этих методов экстракции требуются большие объемы отчасти вредных для здоровья растворителей. Кроме того, в указанных выше патентных публикациях не содержится никакой информации ни о содержании в получаемых продуктах неконъюгированных липофильных компонентов, таких, например, как неконъюгированные флавоноидные, изофлавоноидные и норизопреноидные производные и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения или же неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, ни об отделении этих компонентов. Эти известные способы не позволяют получить удовлетворительные результаты касательно выхода или касательно чистоты получаемого экстракта, о чем свидетельствуют данные измерений на полученном общем количестве гормонов в пересчете на массу сухого вещества, или же основаны на проведении множества различных стадий и применении больших объемов органических и отчасти даже нежелательных с токсикологической точки зрения растворителей.
Из уровня техники известны далее различные методы твердофазной экстракции, предназначенные для получения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов, значительно обедненной фенольными компонентами мочи.
Так, в частности, в публикации WO 98/08526 описан способ, который позволяет путем твердофазной экстракции на семиполярной, прежде всего на неионогенной семиполярной, полимерной адсорбирующей смоле получать содержащую практически все количество присутствующих в МЖК природных эстрогенов смесь, обедненную фенольными компонентами мочи и практически не содержащую крезола и ГФМФ. В публикации WO 98/08525 описан аналогичный способ, предусматривающий использование при твердофазной экстракции силикагеля в качестве адсорбента. Аналогичный способ описан и в заявке CN 1308083 и основан на применении полярных адсорбирующих смол, содержащих цианогруппы. В заявке US 2002/0156303 описан далее способ, при осуществлении которого МЖК перед ее очисткой пропусканием через полистирольную адсорбирующую смолу сначала обрабатывают щелочным растворителем и предварительно очищают фильтрацией. Получаемые этими способами экстракты могут использоваться в качестве исходного материала для получения фармацевтических препаратов, которые в качестве действующего вещества содержат природную смесь конъюгированных эстрогенов из МЖК.
Смеси конъюгированных эстрогенов, выделенные из МЖК описанным в WO 98/08526 или WO 98/08525 способом, обычно удовлетворяют установленным требованиям фармацевтических спецификаций, например, касательно соблюдения предельных значений содержания конъюгированных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Описанные в этих публикациях способы позволяют прежде всего получать обедненный фенольными компонентами мочи, практически не содержащий крезола и ГФМФ продукт. При этом, однако, было установлено, что в полученном сухом веществе наряду с требуемыми конъюгированными эстрогенами могут содержаться также неконъюгированные липофильные соединения. К таким неконъюгированным липофильным соединениям относятся, например, различные неконъюгированные флавоноидные, изофлавоноидные и норизопреноидные производные и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения, такие, например, как формононетин, генистеин, даидзеин, биоханин А, эквол и куместрол, но также неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и неконъюгированные эстрогены, при этом такой перечень неконъюгированных липофильных соединений не ограничен указанными выше. Присутствие подобных неконъюгированных липофильных соединений в выделенной из МЖК смеси конъюгированных эстрогенов не представляется возможным стандартизировать, поскольку содержание и состав свободных и конъюгированных липофильных соединений варьируется, например, в зависимости от потребляемого жеребыми кобылами корма.
Хотя состав природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов и не изменяется из-за дополнительного присутствия в ней неконъюгированных липофильных соединений, тем не менее их наличие может снижать содержание конъюгированных лошадиных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Концентрацию действующих веществ, т.е. конъюгированных лошадиных эстрогенов, в полученном экстракте в принципе можно повысить путем целенаправленного отделения неконъюгированных липофильных компонентов. Отделение неконъюгированных липофильных соединений позволяет также добиться однородного состава отдельных партий экстракта, поскольку в этом случае благодаря удалению неконъюгированных липофильных компонентов, содержание и состав которых в МЖК может варьироваться в зависимости от сезонного изменения типа потребляемого жеребыми кобылами корма, все полученные экстракты имеют сравнимое содержание в них конъюгированных лошадиных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Помимо этого отделение неконъюгированных липофильных соединений может оказаться предпочтительным для достижения однородного спектра физиологического действия. Так, например, может оказаться целесообразным отделять от природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов присутствующие в ней при определенных условиях неконъюгированные липофильные соединения, которые возможно сами могут обладать собственным физиологическим действием.
Одна из возможностей отделения нежелательных неконъюгированных липофильных соединений состоит, например, в отдельной жидкостно-жидкостной экстракционной обработке выделенной известными, рассмотренными выше методами твердофазной экстракции природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов пригодным для этой цели органическим растворителем, который целенаправленно экстрагирует нежелательные неконъюгированные липофильные соединения без потери конъюгированных лошадиных эстрогенов. Подобный способ в целом описан в заявке РСТ/ЕР2003/050703.
В основу настоящего изобретения была положена задача разработать технически и экономически оптимальный способ выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов со значительно сниженным содержанием в ней фенольных компонентов мочи, а также неконъюгированных липофильных соединений, прежде всего неконъюгированных флавоноидных, изофлавоноидных и норизопреноидных производных. Задача настоящего изобретения состояла прежде всего в разработке такого способа, который не требовал бы по сравнению с уже известными способами выделения природных смесей конъюгированных лошадиных эстрогенов проведения дополнительных стадий. Еще одна задача настоящего изобретения состояла в разработке способа, который обеспечивал бы снижение содержания фенольных компонентов мочи и неконъюгированных липофильных соединений в процессе твердофазной экстракции. Помимо этого задача настоящего изобретения состояла в разработке способа, который был бы основан на проведении лишь небольшого количества стадий и позволял бы при этом получать экстракт конъюгированных лошадиных эстрогенов со сравнительно высоким их содержанием в нем в пересчете на массу сухого вещества. Кроме того, подобный способ должен простым путем обеспечивать возможность выделения природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл даже при содержании в ней неконъюгированных липофильных соединений в варьирующихся и при определенных условиях повышенных количествах. Задача настоящего изобретения состояла далее в разработке оптимального способа твердофазной экстракции, получаемая которым природная смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов имела бы высокое содержание в ней действующих веществ и удовлетворяла бы установленным фармацевтическим спецификациям, прежде всего касательно соблюдения предельных значений содержания в ней конъюгированных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества.
Для решения указанных задач согласно изобретению был разработан способ, который неожиданно простым путем позволяет выделять из МЖК даже при содержании в ней неконъюгированных липофильных соединений в варьирующихся и при определенных условиях повышенных количествах практически не содержащую крезол и ГФМФ смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов, которая одновременно с этим в значительной степени обеднена также неконъюгированными липофильными соединениями, прежде всего неконъюгированными флавоноидными, изофлавоноидными и норизопреноидными производными.
Предлагаемый в изобретении способ касательно его наиболее важных стадий основан на описанном в WO 98/08526 способе, который предназначен для выделения из МЖК обедненной ее фенольными компонентами природной смеси конъюгированных эстрогенов. Помимо этого предлагаемый в изобретении способ основан на описанном в WO 03/048183 способе, который позволяет выделять даже из состарившейся МЖК, которая характеризуется при определенных условиях повышенным относительным содержанием в ней свободных эстрогенов, природную смесь конъюгированных эстрогенов, которая удовлетворяет необходимым фармацевтическим спецификациям.
В соответствии с этим в изобретении предлагается способ выделения природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл, при осуществлении которого
а) мочу, которая представляет собой мочу, из которой необязательно удалены слизь и твердые вещества, сгущенный концентрат этой мочи или полученный путем мембранной фильтрации этой мочи ее сгущенный ретентат (вещество, не прошедшее через мембранный фильтр), вводят в контакт с полимерной адсорбирующей смолой в достаточном для адсорбции содержащейся в моче смеси конъюгированных эстрогенов количестве и насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу отделяют от остальной мочи,
б) насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу промывают промывочной жидкостью со значением рН, установленным по меньшей мере на 12,0, прежде всего на 12,5-14,0,
в) необязательно проводят промежуточную промывку, при которой насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу промывают водой,
г) промытую адсорбирующую смолу вводят в контакт с элюентом в достаточном для десорбции адсорбированной смолой смеси конъюгированных эстрогенов количестве и
д) содержащий природную смесь конъюгированных эстрогенов элюат отделяют от адсорбирующей смолы и необязательно сгущают
и который отличается от известного из уровня техники способа тем, что полученная природная смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов обеднена фенольными компонентами мочи и неконъюгированными липофильными соединениями из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимыми с ними неконъюгированными соединениями, а также тем, что в качестве элюента на стадии г) используют одно- или двухфазную смесь, содержащую
(I) воду с необязательно установленным на щелочное значением рН,
(II) по меньшей мере один пригодный для элюирования неконъюгированных липофильных соединений из указанной выше группы не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель и необязательно
(III) по меньшей мере один смешивающийся с водой органический растворитель, выбранный из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, а также смеси указанных растворителей, и
в том случае, если полученный на стадии д), необязательно сгущенный элюат представляет собой двухфазную смесь, от полученного, состоящего из двух фаз элюата на стадии е) отделяют водную фазу с получением содержащей природную смесь конъюгированных эстрогенов водной фазы, которую необязательно концентрируют.
Подготовительная переработка партий исходного материала на известных как таковых стадиях а), б), г) и д), а также применение полученного на стадии д) элюата, содержащего природную смесь конъюгированных эстрогенов, в целом уже описаны в WO 98/08526 в качестве стадий а), b) и с) и тем самым известны специалистам в данной области из этой публикации. Известная как таковая стадия в) предлагаемого в изобретении способа в целом описана в WO 03/048183 в качестве стадии "промежуточной промывки" и тем самым известна специалистам в данной области из этой публикации. В соответствии с этим содержание указанных публикаций WO 98/08526 и WO 03/048183 в полном объеме включено в настоящее описание в качестве ссылки. Дополнительные детали касательно общей методики проведения процесса и используемых при этом материалов в обобщенном виде представлены в настоящем описании в разделе, в котором рассматриваются примеры осуществления изобретения.
Так, например, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа могут использоваться указанные в WO 98/08526 семиполярные, прежде всего неионогенные семиполярные, адсорбирующие смолы. Помимо этого при осуществлении предлагаемого в изобретении способа можно, что является неожиданным фактом, использовать и иные адсорбирующие смолы без ухудшения качества получаемого продукта, соответственно без ущерба для его обязательного соответствия фармацевтическим спецификациям. Так, в частности, при осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве адсорбентов можно использовать полимерные адсорбирующие смолы. Подобные полимерные адсорбирующие смолы, которые могут использоваться при осуществлении предлагаемого в изобретении способа, более подробно рассмотрены в последующем описании в разделе, в котором рассматриваются примеры осуществления изобретения.
Согласно изобретению предлагаемым в нем способом получают природную смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов, которая обеднена не только фенольными компонентами мочи, такими как крезолы и ГФМФ, но и неконъюгированными липофильными соединениями из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимыми с ними неконъюгированными соединениями.
Для этого после проведения известных как таковых стадий а)-в) промытую на стадии г), насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов адсорбирующую смолу обрабатывают элюентом в достаточном для элюирования смеси конъюгированных эстрогенов количестве. Согласно изобретению с этой целью в качестве элюента на стадии г) используют одно- или двухфазную смесь, которая содержит
(I) воду с необязательно установленным на щелочное значением рН,
(II) по меньшей мере один пригодный для элюирования неконъюгированных липофильных соединений из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимых с ними неконъюгированных соединений не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель и необязательно
(III) по меньшей мере один смешивающийся с водой органический растворитель, выбранный из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, а также смеси указанных растворителей.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве элюента на стадии г) используют одно- или двухфазную смесь, которая содержит
(I) воду с необязательно установленным на щелочное значением рН,
(II) по меньшей мере один пригодный для элюирования неконъюгированных липофильных соединений из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель и
(III) по меньшей мере один смешивающийся с водой органический растворитель, выбранный из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, а также смеси указанных растворителей.
Используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь содержит воду (I) с необязательно установленным на щелочное значением рН.
При использовании на стадии г) в качестве элюента однофазной смеси значение рН подобных содержащих воду элюентов лежит в нейтральном или щелочном диапазоне, достигая 13, и в предпочтительном варианте может составлять от 7 до 10. В качестве растворителей в составе содержащего воду элюента следует применять стабильные в используемом диапазоне значений рН растворители. Значение рН содержащего воду однофазного элюента устанавливают на требуемое добавлением соответствующего количества растворимого в воде инертного основного вещества, предпочтительно неорганического основания, например гидроксида щелочного или щелочноземельного металла, прежде всего гидроксида натрия.
При использовании же на стадии г) в качестве элюента двухфазной смеси значение рН водной фазы подобных элюентов лежит после тщательного перемешивания обеих фаз в нейтральном или щелочном диапазоне, достигая 13, и в предпочтительном варианте может составлять от 7 до 10. Если водная фаза подобных двухфазных элюентов содержит органический растворитель, то в качестве него следует применять стабильные в используемом диапазоне значений рН растворители. Значение рН водной фазы двухфазных элюентов устанавливают на требуемое добавлением соответствующего количества растворимого в воде инертного основного вещества, предпочтительно неорганического основания, например гидроксида щелочного или щелочноземельного металла, прежде всего гидроксида натрия.
4
10
2
10
3
10
4
10
3
10
2
10
3
6
1
3
1
4
1
4
Используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь наряду с необязательно подщелаченной водой (I) содержит также по меньшей мере один пригодный для элюирования неконъюгированных липофильных соединений из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимых с ними неконъюгированных соединений органический растворитель (II). Такой органический растворитель (II), кроме того, должен быть не смешивающимся или практически не смешивающимся с водой, при этом выражение "практически не смешивающийся" означает, что в водной фазе допускается наличие максимум 6 об.% растворенного в ней органического растворителя. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве пригодных для элюирования неконъюгированных липофильных соединений органических растворителей (II) могут использоваться, например, следующие органические растворители с 1-10 атомами углерода, которые могут быть расположены в виде прямой или разветвленной цепи либо в виде цикла: спирты с С-С (как, например, бутанол, гексанол, циклогексанол и пентанол), эфиры кислот с С-С (как, например, этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), метилацетат, пропилацетат, изопропилацетат (изопропиловый эфир уксусной кислоты), бутилацетат, амилацетат, этилметилмалонат, диметилфосфонат), альдегиды с С-С и кетоны с С-С (как, например, бутанон, пентанон, гексан-2,4-дион, гександиал, циклогексанкарбальдегид, бутан-1,2,4-трикарбальдегид, метилфенилкетон и аналогичные соединения), соответственно в целом С-Салкоксисоединения, простые эфиры с С-С (диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир), нитрилы с С-С и галоалканы с С-С (метиленхлорид), а также смеси вышеуказанных растворителей. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве пригодных для элюирования неконъюгированных липофильных соединений не смешивающихся или практически не смешивающихся с водой органических растворителей (II) прежде всего могут использоваться С-Салкиловые эфиры уксусной кислоты, бутанол, циклогексанол, гексанол, диэтиловый эфир, метиленхлорид, метил-трет-бутиловый эфир и смеси указанных растворителей. Среди этих растворителей предпочтительными для применения при осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве пригодных для элюирования неконъюгированных липофильных соединений не смешивающихся или практически не смешивающихся с водой органических растворителей (II) являются С-Салкиловые эфиры уксусной кислоты и прежде всего этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) и/или изопропиловый эфир уксусной кислоты (изопропилацетат).
Используемая согласно изобретению в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь необязательно может содержать также по меньшей мере один смешивающийся с водой органический растворитель (III), выбранный из группы, включающей смешивающиеся с водой простые эфиры, низшие алканолы и низшие алифатические кетоны, а также смеси указанных растворителей. К простым эфирам, которые могут использоваться в составе элюента, относятся смешивающиеся с водой циклические простые эфиры, такие как тетрагидрофуран или диоксан, а также смешивающиеся с водой простые эфиры с открытой цепью, такие, например, как диметиловый эфир этиленгликоля (моноглим), диметиловый эфир диэтиленгликоля (диглим) или этилоксиэтилоксиэтанол (карбитол). В качестве низших алканолов можно использовать смешивающиеся с водой алкиловые спирты с 1-4, предпочтительно 1-3, атомами углерода, прежде всего этанол или изопропанол. В качестве низших алифатических кетонов можно использовать смешивающиеся с водой кетоны с 3-5 атомами углерода, прежде всего ацетон. В качестве наиболее эффективных зарекомендовали себя далее элюенты, в которых смешивающимся с водой органическим растворителем (III) является ацетон, этанол или смесь ацетона с этанолом.
1
4
В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь наряду с необязательно подщелаченной водой (I) содержит в качестве пригодного для элюирования неконъюгированных липофильных соединений не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя (II) С-Салкиловый эфир уксусной кислоты, предпочтительно этиловый эфир уксусной кислоты и/или изопропиловый эфир уксусной кислоты, а в качестве смешивающегося с водой органического растворителя (III) содержит ацетон и/или этанол.
В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь наряду с необязательно подщелаченной водой (I) содержит в качестве пригодного для элюирования неконъюгированных липофильных соединений не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя (II) этиловый эфир уксусной кислоты, а в качестве смешивающегося с водой органического растворителя (III) содержит ацетон.
В используемой в качестве элюента на стадии г) предлагаемого в изобретении способа одно- или двухфазной смеси объемное соотношение между водой (I) и не смешивающимся или практически не смешивающимся с водой органическим растворителем (II) может составлять от 5:1 до 1:5, однако наиболее целесообразно применять их в объемном соотношении от 2:1 до 1:2.
Помимо этого в используемой в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазной смеси объемное соотношение между водой (I) и смешивающимся с водой органическим растворителем (III) может составлять от 4:1 до 1:5; однако предпочтительно применять их в объемном соотношении от 2:1 до 1:3.
В используемой в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазной смеси объемное соотношение между суммарным объемом, складывающимся из объема воды (I) и объема не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя (II), и объемом смешивающегося с водой органического растворителя (III) может составлять от 5:1 до 1:5, предпочтительно от 2:1 до 1:2.
1
4
В наиболее предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используемая в качестве элюента на стадии г) одно- или двухфазная смесь состоит из (I) воды, из (II) С-Салкилового эфира уксусной кислоты, предпочтительно этилового эфира уксусной кислоты и/или изопропилового эфира уксусной кислоты, в качестве не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя и из (III) ацетона и/или этанола в качестве смешивающегося с водой органического растворителя при объемном соотношении между ними в интервале от 1:1:1 до 1:1:2. На стадии г) в качестве элюента прежде всего предлагается использовать однофазную смесь, которая состоит из (I) воды, из (II) этилового эфира уксусной кислоты в качестве не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя и из (III) ацетона в качестве смешивающегося с водой органического растворителя при объемном соотношении между ними 1:1:1,4.
При использовании в качестве элюента на стадии г) двухфазной смеси обе фазы рекомендуется тщательно перемешивать между собой непосредственно перед внесением в колонку.
Элюент можно использовать в количестве, которое составляет примерно от 3 до 10, прежде всего примерно от 4 до 6, объемов слоя на один объем слоя полимерной адсорбирующей смолы. Элюент целесообразно пропускать через содержащий насыщенную смесью эстрогенов адсорбирующую смолу реактор с такой скоростью или с таким расходом, чтобы адсорбирующая смола оставалась в контакте с элюентом в течение достаточного для полного элюирования смеси конъюгированных эстрогенов промежутка времени. При использовании в качестве элюента однофазной смеси из воды, этилового эфира уксусной кислоты и ацетона в объемном соотношении между ними, равном 10:10:14, элюент можно пропускать через реактор, например, с расходом, составляющим от 3 до 10 об. частей, предпочтительно от 5 до 7, об. частей, на 1 об. часть адсорбирующей смолы в час. Процесс элюирования целесообразно проводить при температуре в интервале от примерно 20 до примерно 60°С, предпочтительно от примерно 30 до 50°С. При необходимости расход элюента через реактор можно регулировать проведением процесса при слегка повышенном давлении, например при давлении, превышающем окружающее давление на величину, достигающую 0,2 бара, и собирать элюат несколькими фракциями.
Содержание конъюгированных эстрогенов, фенольных компонентов мочи, таких как крезолы и ГФМФ, и неконъюгированных липофильных соединений в отдельных фракциях элюата можно определять известным методом с помощью жидкостной хроматографии высокого разрешения (сокращенно ЖХВР) или же с помощью газовой хроматографии (сокращенно ГХ).
В процессе элюирования сначала на стадии д) получают практически не содержащую эстрогенов первую фракцию, которая имеет слабо выраженную окраску, соответственно вовсе не имеет цвета и количество которой в целом соответствует примерно одному объему слоя. Основное же количество конъюгированных эстрогенов, составляющее, например, от 80 до 99% от всего количества конъюгированных эстрогенов, присутствующих в исходной МЖК, находится в последующих основных фракциях элюата, окраска которых меняется от темно-желтой до коричневой и количество которых в целом соответствует 2-4 объемам слоя. В получаемых в последующем последних фракциях конъюгированные эстрогены содержатся в целом лишь в следовых количествах. При получении последних фракций, содержание в которых конъюгированных эстрогенов все еще превышает 10 мас.% в пересчете на массу сухого вещества, а содержание крезолов и ГФМФ составляет менее 0,6 мас.% в пересчете на массу сухого вещества, эти фракции можно объединять для последующей переработки с основным элюатом с высоким содержанием в нем эстрогенов.
Получаемый на стадии д) элюат может представлять собой одно- или двухфазную смесь. При использовании в качестве элюента однофазной смеси элюат в результате вытеснения имеющейся перед элюированием на колонке с адсорбирующей смолой воды из колонки и обусловленного этим смещения объемного соотношения между водной и органической фазами также может состоять их двух фаз. Получаемый на стадии д) одно- или двухфазный элюат можно при необходимости подвергать известным методом дополнительному сгущению. Такому сгущению прежде всего подвергают получаемый на стадии д) однофазный элюат, предпочтительно отделяя при этом смешивающийся с водой органический растворитель (III) до тех пор, пока сгущенный элюат не станет двухфазной смесью.
Согласно изобретению в том случае, если полученный на стадии д), необязательно сгущенный элюат представляет собой двухфазную смесь, от полученного состоящего из двух фаз элюата на стадии е) отделяют водную фазу с получением содержащей природную смесь конъюгированных эстрогенов водной фазы. С этой целью полученный двухфазный элюат оставляют стоять для разделения фаз. Процесс разделения фаз может в зависимости от получаемых объемов двухфазного элюата занимать от 10 мин до 24 ч, предпочтительно, однако, оставлять фазы стоять на 5-10 ч. После разделения водной и органической фаз водную фазу отделяют и направляют на хранение для последующего применения или переработки, а органическую фазу направляют в отход.
2
3
После отделения органической фазы от водной фазы на стадии е) получают содержащую природную смесь конъюгированных эстрогенов водную фазу. Эта водная фаза содержит входящую в состав МЖК природную смесь конъюгированных эстрогенов наряду лишь с малым количеством исходно содержащихся в МЖК ее фенольных компонентов, таких как крезолы и ГФМФ, а также наряду лишь с исключительно малым количеством исходно содержащихся в МЖК неконъюгированных липофильных компонентов. Эту водную фазу можно при необходимости подвергать известным методом дальнейшему сгущению для получения концентрата, из которого практически полностью удален органический растворитель и который пригоден для последующей переработки. Так, например, из полученной водной фазы можно отгонкой удалять все еще присутствующие в ней остатки органического растворителя. Перегонка позволяет также довести содержание сухого вещества в водном экстракте до некоторого конкретного значения, предпочтительно до 5-15%, прежде всего до 9%. В завершение для стабилизации полученной природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов значение рН водного экстракта (раствора) можно установить на щелочное, предпочтительно на величину в интервале от 8 до 13, более предпочтительно от 9 до 12. Для подобного регулирования значения рН пригодны обычно применяемые в этих целях основания, например 1 н. NaOH или NaCO.
Водную фазу, полученную на стадии е) предлагаемого в изобретении способа и при необходимости дополнительно подвергнутую дальнейшей переработке или концентрированию, можно использовать в качестве исходного материала для получения лекарственных средств, содержащих природную смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов. При необходимости соответствующим методом сушки, например распылительной сушкой или сушкой в псевдоожиженном слое, можно получать не содержащую элюент смесь твердых веществ. Если природная смесь конъюгированных эстрогенов должна использоваться для получения твердой лекарственной формы, может оказаться целесообразным примешивать к содержащей конъюгированные эстрогены водной фазе твердый носитель еще до ее концентрирования или сушки для получения таким путем содержащей конъюгированные эстрогены и носители смеси твердых веществ. Так, например, содержащую конъюгированные эстрогены водную фазу можно наносить ее распылением в псевдоожиженном слое на твердый носитель, такой, например, как целлюлоза. Содержащую смесь эстрогенов водную фазу, равно как и полученный из нее концентрат или высушенный твердый продукт можно по известной технологии перерабатывать в твердые или жидкие галеновы препараты, такие, например, как таблетки, драже, капсулы или эмульсии. Такие галеновы препараты можно изготавливать известными методами с применением обычных твердых или жидких носителей, таких, например, как крахмал, целлюлоза, лактоза или тальк либо жидкие парафины, и/или с применением обычных фармацевтических вспомогательных веществ, например разрыхлителей для таблеток, гидротропных солюбилизаторов или консервантов. Так, в частности, содержащий конъюгированные эстрогены продукт можно известным методом смешивать с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами и переводить полученную смесь в требуемую лекарственную форму.
При твердофазной экстракции предлагаемым в изобретении и описанным выше способом из мочи, которая представляет собой либо мочу, из которой необязательно удалены слизь и твердые вещества, либо сгущенный концентрат этой мочи, либо полученный путем мембранной фильтрации этой мочи сгущенный ретентат, получают природную смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов, из которой простым путем практически полностью удаляются фенольные компоненты мочи, такие как прежде всего крезолы и ГФМФ, а также большинство неконъюгированных липофильных соединений. К таким отделенным неконъюгированным липофильным соединениям относятся главным образом неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды и неконъюгированные стероиды, а среди них - главным образом неконъюгированные андростановые и неконъюгированные прегнановые производные.
По сравнению с известными методами твердофазной экстракции предлагаемый в изобретении способ твердофазной экстракции позволяет получать природную смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов, из которой практически полностью удалены фенольные компоненты мочи, а также неконъюгированные липофильные соединения, без необходимости проведения дополнительных стадий, поскольку удаление неконъюгированных липофильных соединений также происходит уже в процессе твердофазной экстракции.
При получении природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов известным из WO 98/08526 способом часть неконъюгированных липофильных соединений, например изофлавон эквол, вымывают на стадии б) этого способа, тогда как другие неконъюгированные липофильные соединения, например формононетин, попадают в элюат, и поэтому их при определенных условиях требуется отделять путем последующей жидкостно-жидкостной экстракции. Сказанное аналогичным образом относится и к неконъюгированным, т.е. свободным, стероидным гормонам, определенные количества которых также можно обнаружить в элюате. Поэтому как особенно неожиданный следует отметить тот факт, что для количественного элюирования адсорбированных на полимерной адсорбирующей смоле конъюгированных эстрогенов можно использовать одно- или даже двухфазную смесь из воды, не смешивающегося или практически не смешивающегося с водой органического растворителя, а также необязательно смешивающегося с водой органического растворителя, такого как низшие простые эфиры, алканолы или кетоны, а полученный, необязательно сгущенный элюат допускает возможность его разделения на две фазы, при этом количественно элюированные конъюгированные эстрогены почти полностью присутствуют в водной фазе, тогда как нежелательные неконъюгированные липофильные соединения содержатся в органической фазе, и поэтому их легко можно отделить от смеси конъюгированных эстрогенов.
Помимо этого предлагаемый в изобретении способ позволяет получать экстракт конъюгированных лошадиных эстрогенов со сравнительно высоким их содержанием в нем в пересчете на массу сухого вещества. Так, в частности, предлагаемый в изобретении способ позволяет простым путем выделять природную смесь конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл даже при варьирующихся или при определенных условиях повышенных количествах в ней неконъюгированных липофильных соединений без необходимости проведения после твердофазной экстракции дополнительных стадий очистки смеси конъюгированных эстрогенов.
Получаемая предлагаемым в изобретении способом в качестве экстрагированного действующего вещества обедненная неконъюгированными липофильными компонентами и фенольными компонентами мочи природная смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов обладает, как было установлено при создании изобретения, оптимизированным по сравнению с получаемыми известным методом твердофазной экстракции экстрагированными действующими веществами набором свойств, в гораздо большей степени отвечающих требованиям фармацевтических спецификаций.
Как особенно неожиданный следует отметить тот установленный согласно изобретению факт, что предлагаемая в изобретении модификация уже известного способа твердофазной экстракции природной смеси конъюгированных эстрогенов даже из содержащей неконъюгированные липофильные компоненты в различных и переменных количествах мочи жеребых кобыл способствует повышению качества получаемого экстрагированного действующего вещества. Наиболее неожиданным является прежде всего тот факт, что предлагаемый в изобретении способ позволяет эффективно снижать долю неконъюгированных липофильных соединений, содержание и состав которых могут колебаться в широких пределах в зависимости от используемой для переработки МЖК, и получать в результате на стадии е) в качестве водной фазы смесь природных конъюгированных лошадиных эстрогенов, которая отвечает высоким требованиям фармацевтических спецификаций, например требованиям фармакопеи США или европейской фармакопеи.
Предлагаемый в изобретении способ обладает, как уже подробно описывалось выше, целым рядом преимуществ перед известными из уровня техники способами. Так, в частности, предлагаемым в изобретении способом можно перерабатывать также содержащую неконъюгированные липофильные компоненты в варьирующихся количествах МЖК, в которой допустимо, например, повышенное относительное содержание свободных флавоноидов, свободных изофлавоноидов, свободных норизопреноидов или свободных стероидных производных, в данном случае прежде всего свободных андростановых или прегнановых стероидов, без ущерба для обязательного соответствия получаемого продукта фармацевтическим спецификациям. При этом предлагаемый в изобретении способ основан на известных методах твердофазной экстракции, однако неожиданно позволяет получать природную смесь конъюгированных эстрогенов без необходимости проведения дополнительных стадий экстракции. Так, в частности, предлагаемый в изобретении способ обеспечивает сбалансированность состава отдельных партий экстракта благодаря неизменному удалению неконъюгированных липофильных компонентов, содержание и состав которых в МЖК может варьироваться в зависимости от типа потребляемого жеребыми кобылами корма, и получение экстрактов со сопоставимым во всех них содержанием конъюгированных лошадиных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Помимо этого обеспечиваемое предлагаемым в изобретении способом целенаправленное отделение не только фенольных компонентов мочи, но и прежде всего ее неконъюгированных липофильных компонентов позволяет в ходе лишь одного технологического процесса получать экстракт с повышенной концентрацией в нем действующих веществ, т.е. конъюгированных лошадиных эстрогенов. Предлагаемый в изобретении способ дополнительно обладает и целым рядом экономических преимуществ, достигаемых благодаря значительному снижению опасности потери ценных действующих веществ из-за несоответствия получаемого продукта фармацевтическим спецификациям, например, из-за недостаточного содержания в нем конъюгированных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Предлагаемый в изобретении способ позволяет, кроме того, существенно повысить точность и воспроизводимость регулирования концентрации действующего вещества в получаемом экстракте. Такое действующее вещество наиболее пригодно для получения на его основе фармацевтических препаратов, содержащих в качестве такового смесь природных конъюгированных лошадиных эстрогенов.
Ниже изобретение более подробно рассмотрено на примерах, которые, однако, не ограничивают его объем.
Примеры
В последующих примерах рассмотрена общая методика получения из МЖК экстрактов, которые содержат в качестве действующего вещества природную смесь содержащихся в МЖК конъюгированных эстрогенов и которые в значительной степени обеднены фенольными компонентами мочи, такими, например, как крезолы или ГФМФ, а также неконъюгированными липофильными соединениями, такими, например, как неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимыми с ними неконъюгированными соединениями. В этих примерах описывается, каким образом согласно изобретению даже из МЖК с возможно варьирующимся, соответственно повышенным относительным содержанием в ней неконъюгированных липофильных соединений можно получить качественный экстракт с высоким содержанием в нем действующего вещества.
Моча
Предлагаемым в настоящем изобретении способом аналогично описанному в WO 98/08526 способу можно перерабатывать МЖК как таковую, полученный из нее путем сгущения концентрат либо полученный из нее концентрат, который уже подвергнут предварительной очистке путем фильтрации или иными предназначенными для этого методами. Собранную мочу (МЖК) сначала известным методом очищают от слизи и твердых примесей или веществ. В предпочтительном варианте таким твердым веществам и слизи сначала дают осесть, а затем отделяют от них остальную мочу известными методами разделения, например декантацией, сепарацией и/или фильтрацией. Так, например, МЖК можно пропускать через известное как таковое разделительное устройство, в частности сепаратор, фильтровальную установку или отстойник. Разделяющей средой может служить, например, песок или же для разделения могут использоваться имеющиеся в продаже сепараторы, например сопловые сепараторы либо сепараторы камерного типа. При необходимости можно также использовать установку для микрофильтрации или установку для ультрафильтрации, применение которых одновременно обеспечивает также практически полное отсутствие микробов и вирусов в профильтрованной МЖК.
При необходимости к моче, соответственно ее концентрату можно добавлять консерванты, гермициды, бактерициды и/или гельминтоциды.
В качестве предварительно очищенного концентрата мочи можно также использовать ее концентрированный ретентат, который можно получать из МЖК путем ее известной мембранной фильтрации. Содержание твердого вещества в ретентате и его состав могут варьироваться в зависимости от перерабатываемой МЖК и используемой для фильтрации мембраны, например, от размера ее пор, а также в зависимости от условий фильтрации. Так, в частности, использование мембранного фильтра с размером пор, лежащим в нанометровом диапазоне, обеспечивает практически без потерь концентрирование содержащихся в МЖК эстрогенов в ретентате при одновременном удалении до 50 мас.% низкомолекулярных компонентов МЖК. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа можно использовать ретентаты МЖК, степень или коэффициент концентрации которых может достигать порядка 1:10, например может составлять порядка 1:7, и объем которых тем самым может быть уменьшен до порядка 1/10, например может составлять порядка 1/7, от первоначального объема МЖК.
Адсорбирующие смолы
2
2
Используемые на стадии а) полимерные адсорбирующие смолы представляют собой согласно WO 98/08526 семиполярные, прежде всего неионогенные семиполярные, полимерные адсорбирующие смолы. Используемые при осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве адсорбента полимерные адсорбирующие смолы предпочтительно представляют собой пористые органические неионогенные полимеры, которые в отличие от неполярных гидрофобных полимерных адсорбирующих смол обладают промежуточной полярностью (соответствующей, например, дипольному моменту активной поверхности смолы от 1,0 до 3,0 Д, прежде всего от 1,5 до 2,0 Д) и имеют несколько более гидрофильную структуру и в качестве примера которых можно назвать поликарбоксилатные смолы. Целесообразно использовать макропористые семиполярные смолы с предпочтительно макросетчатой структурой и со средним диаметром пор от 50 до 150 Å, предпочтительно от 70 до 100 Å, а также с удельной поверхностью от 300 до 900 м/г, предпочтительно от 400 до 500 м/г. В качестве наиболее пригодных для применения при осуществлении предлагаемого в изобретении способа зарекомендовали себя макропористые поперечно-сшитые алифатические поликарбоксилатные смолы, прежде всего поперечно-сшитые полиакрилатные смолы, такие, например, как смола амберлит XAD-7 (тип HP) фирмы Rohm and Haas, которые являются неионогенными семиполярными адсорбирующими смолами.
Наряду с указанными выше предпочтительными адсорбентами могут использоваться и иные адсорбирующие смолы. В качестве таких адсорбирующих смол при этом могут использоваться неполярные, семиполярные, а также полярные адсорбирующие смолы. Количество мочи, которое можно прокачивать через адсорбент, следует при этом определять заранее исходя из адсорбционной емкости конкретного адсорбента. В качестве примера пригодных для применения адсорбирующих смол можно назвать имеющиеся в продаже типы адсорбирующих смол, такие как полимерные адсорбенты типа амберлитов со стиролдивинилбензольными каркасами (например, типа XAD-1180, XAD-2, XAD-16), с акрилатными каркасами (например, XAD-7) или же с высокополярными каркасами, содержащими азот и кислород (например, XAD-12). К числу других приемлемых адсорбирующих смол относятся смолы типа доуэкс (сополимеры стирола и дивинилбензола), например, доуэкс 112, доуэкс оптипор, доуэкс оптипор V 493, смолы типа леватитов (сшитые полистиролы), например леватит ОС 1064, леватит ОС 1066 или леватит ОС 1163, и полиаминовые анионообменные смолы, например смолы типа доуэкс. Предпочтительными адсорбирующими смолами являются прежде всего XAD-7 (тип HP), XAD-16 (тип HP), XAD 118 и доуэкс оптипор, предпочтительно в виде доуэкс оптипор V 493, а также леватиты ОС 1064, ОС 1066 и ОС 1163.
Стадия а)
Для адсорбции конъюгированных эстрогенов полимерной адсорбирующей смолой необязательно подвергнутую предварительной очистке МЖК или ее ретентат можно в соответствии с описанным в WO 98/08526 способом, равно как и в соответствии с предлагаемым в настоящем изобретении способом, вводить в контакт с адсорбирующей смолой, для чего мочу загружают в содержащий адсорбирующую смолу реактор и выдерживают в нем в контакте с адсорбирующей смолой в течение достаточного для адсорбции содержащихся в моче эстрогенов промежутка времени. По завершении адсорбции конъюгированных эстрогенов полимерной адсорбирующей смолой насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов адсорбирующую смолу можно известным путем отделить от остальной мочи. Мочу целесообразно пропускать через содержащую адсорбирующую смолу колонку с такой скоростью или с таким расходом, чтобы моча оставалась в контакте с адсорбирующей смолой в течение достаточного для адсорбции содержащихся в моче эстрогенов промежутка времени. Мочу можно пропускать через содержащую адсорбирующую смолу колонку, например, со скоростью или с расходом из расчета 3-10, предпочтительно 5-7, об. частей МЖК на 1 об. часть адсорбирующей смолы в час. Регулировать скорость прохождения мочи через реактор в предпочтительном варианте можно ведением процесса при слегка повышенном или пониженном давлении. Количество используемой полимерной адсорбирующей смолы может варьироваться в зависимости от типа применяемой адсорбирующей смолы и количества содержащегося в моче твердого вещества. Так, в частности, при переработке МЖК как таковой степень насыщения одной объемной части адсорбирующей смолы, например поперечно-сшитой алифатической поликарбоксилатной адсорбирующей смолы, может достигать 80, предпочтительно 30-50, объемных частей предварительно обработанной МЖК, и при такой степени насыщения адсорбирующей смолы в отводимом потоке мочи уже не обнаруживается заметных количеств эстрогенов. При переработке же концентрата МЖК или ее ретентата сорбционная емкость адсорбирующей смолы, как очевидно, уменьшается в степени, пропорциональной степени их концентрирования. Так, например, 1 об. часть поперечно-сшитой алифатической поликарбоксилатной адсорбирующей смолы способна в этом случае адсорбировать мочу в количестве, соответствующем 20-80, предпочтительно 30-50, объемным частям МЖК.
Стадия б)
На стадии б) насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу промывают промывочной жидкостью со значением рН, установленным по меньшей мере на 12,0, прежде всего на 12,5-14, предпочтительно примерно на 12,5-13,5. В качестве промывочной жидкости можно использовать водные растворы растворимых в моче инертных оснòвных веществ достаточной для повышения значения рН промывочной жидкости до по меньшей мере 12,5 концентрации или крепости. В качестве инертных по отношению к полимерной адсорбирующей смоле растворимых в воде оснòвных веществ предпочтительно использовать растворимые в воде неорганические основания, такие как гидроксиды щелочных или щелочноземельных металлов, прежде всего гидроксид натрия. В предпочтительном варианте промывочная жидкость должна содержать оснòвные вещества лишь в таких количествах, которые необходимы для достижения требуемого значения рН, равного предпочтительно примерно 13. Количество промывочной жидкости выбирается с таким расчетом, чтобы его было достаточно только для практически полного удаления из мочи ее фенольных компонентов во избежание совместного вымывания с ними существенных количеств конъюгированных эстрогенов. Так, например, целесообразно использовать от 2 до 10, предпочтительно от 4 до 6, объемов слоя промывочной жидкости на объем слоя адсорбирующей смолы. При этом промывочную жидкость целесообразно пропускать через содержащий адсорбирующую смолу реактор с расходом от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 7, об. частей на 1 об. часть адсорбирующей смолы в час.
Стадия в): промежуточная промывка
Насыщенную на стадии а) смесью конъюгированных эстрогенов полимерную адсорбирующую смолу подвергают после выполнения стадии б) промежуточной промывке водой. Количество промывочной воды выбирается при этом с таким расчетом, чтобы смесь конъюгированных эстрогенов в получаемом на последующей стадии д) элюате отвечала бы необходимым требованиям касательно максимально допустимого содержания в ней свободных эстрогенов и тем самым могла бы использоваться в качестве действующего вещества в фармацевтических препаратах. Так, например, целесообразно использовать от 1 до 8, предпочтительно от 1 до 4, объемов слоя промывочной воды на один объем слоя адсорбирующей смолы. При этом промывочную воду целесообразно пропускать через содержащий адсорбирующую смолу реактор с расходом от 3 до 10, предпочтительно от 5 до 7, об. частей на 1 об. часть адсорбирующей смолы в час.
В одном из предпочтительных вариантов осуществления предлагаемого в изобретении способа промежуточную промывку проводят при температуре ниже комнатной, прежде всего при температуре от 0 до 10°С, поскольку, как было установлено, проведение дополнительной стадии промежуточной промывки именно в этом интервале температур позволяет значительно уменьшить обусловленную ею при определенных условиях потерю гормонов, соответственно действующих веществ. За комнатную обычно принимается температура окружающей среды, например температура в интервале от 20 до 30°С. Предлагаемый в изобретении способ наиболее целесообразно осуществлять при температуре, фактически равной 0°С, соответственно при температурах, близких к 0°С. Поэтому на практике рекомендуется работать при температурах несколько выше 0°С и за счет принятия соответствующих мер обеспечивать их поддержание в указанном диапазоне. С этой целью могут приниматься обычные меры, направленные на снижение температуры, например, применение охлаждаемых реакторов, охлажденных материалов и/или охлажденных исходных веществ, в частности МЖК. За температуру, равную 0°С, соответственно за температуры, близкие к 0°С, с практической точки зрения можно принимать интервал температур от 0 до примерно 5°С, прежде всего от 0 до примерно 3°С.
Для удержания возможной потери гормонов в процессе промежуточной промывки на минимально возможном уровне согласно этому варианту осуществления изобретения используемую на стадии промежуточной промывки промывочную воду и/или также на стадии б) подщелаченную промывочную жидкость предварительно охлаждают до температуры ниже комнатной, прежде всего до температуры в интервале от 0 до 10°С. Другими целесообразными, соответственно предпочтительными интервалами температур, до которых можно предварительно охлаждать промывочную воду, соответственно жидкость, являются указанные выше интервалы температур от 0 до примерно 5°С, прежде всего от 0 до примерно 3°С. Предпочтительно работать при температуре, равной 0°С, соответственно при температурах, близких к 0°С, т.е. используемую на стадии промежуточной промывки промывочную воду и/или также на стадии б) подщелаченную промывочную жидкость предпочтительно предварительно охлаждать до температуры несколько выше 0°С. Использование охлажденной подщелаченной промывочной жидкости на стадии б) обеспечивает своего рода предварительное охлаждение адсорбирующей смолы или поддержание в охлажденном состоянии уже охлажденной адсорбирующей смолы, например, во избежание при применении охлажденной промывочной воды для промежуточной промывки нежелательного ее повторного нагрева. Предпочтительно поэтому проводить обе стадии, т.е. стадию промежуточной промывки и предшествующую ей стадию б), в одном и том же интервале температур, например при температуре ниже комнатной, прежде всего при температуре от 0 до 10°С, или предпочтительно в указанных выше интервалах температур.
В вышеописанном варианте осуществления изобретения, предусматривающем проведение предлагаемого в нем способа при температуре ниже комнатной, может оказаться целесообразным предварительно охлаждать все используемые устройства и аппараты, такие как реакторы, в которые загружается полимерная адсорбирующая смола, или уже содержащие ее реакторы, и/или используемую МЖК соответственно до температуры ниже комнатной, прежде всего до температуры в интервале от 0 до 10°С, или до температуры, лежащей в указанных выше предпочтительных интервалах.
Стадии г), д) и е) предлагаемого в настоящем изобретении способа
После проведения описанных выше стадий затем на стадии г) предлагаемого в изобретении способа промытую, насыщенную смесью конъюгированных эстрогенов адсорбирующую смолу обрабатывают элюентом в достаточном для элюирования смеси конъюгированных эстрогенов количестве, после чего на стадии д) получают содержащий природную смесь конъюгированных эстрогенов МЖК элюат, который необязательно сгущают. В том случае, если полученный, необязательно сгущенный элюат представляет собой двухфазную смесь, то на следующей стадии е) отделяют водную фазу такого элюата, получая содержащую природную смесь конъюгированных эстрогенов МЖК водную фазу, которую затем необязательно можно концентрировать.
Регенерация колонки с адсорбирующей смолой
Для регенерации колонку сначала промывают смесью этанол/вода с 50%-ным содержанием этанола и значением рН, установленным на 13, используя по 1-4, прежде всего по 2-3, объема слоя этой смеси на один объем слоя адсорбирующей смолы, затем промывают соответствующим объемом 10%-ного водного раствора цитрата натрия и в завершение промывают соответствующим объемом дистиллированной воды. Весь процесс регенерации колонки проводят при температуре в пределах от 40 до 45°С. Содержащуюся в колонке адсорбирующую смолу можно насыщать и вновь регенерировать многократно, например до 40 раз.
Пример 1
Этот пример является сравнительным и соответствует способам, описанным в WO 98/08526 и WO 03/048183.
Примеры 2а, 2б и 3 (предлагаемый в изобретении способ)
В примере 2а элюирование проводят при комнатной температуре (КТ) с использованием 50%-ного по объему этилацетата.
В примере 2б элюирование проводят при 45°С с использованием 50%-ного по объему этилацетата.
В примере 3 элюирование проводят при 40°С с использованием однофазной элюирующей смеси, содержащей этилацетат.
Стадия а): адсорбция содержащихся в МЖК эстрогенов на семиполярной полиакрилатной адсорбирующей смоле (все примеры)
2
Колонку высотой 330 мм и диаметром 40 мм заполняют 200 мл набухшей в воде семиполярной полиакрилатной адсорбирующей смолы (в качестве которой используют смолу амберлит XAD-7 (тип HP) фирмы Rohm and Haas, крупность зерен от 0,3 до 1,2 мм, дипольный момент 1,8 Д, средний диаметр пор 80 Å, удельная поверхность около 450 м/г в сухом состоянии). После этого через колонку при комнатной температуре пропускают 7 л (что соответствует 35 объемам слоя, ниже сокращенно обозначаемым как ОС) профильтрованной в установке для ультрафильтрации МЖК, содержание в которой конъюгированных эстрогенов, рассчитанное в виде суммарного содержания сульфата эстрона, сульфата эквилина и 17α-DH-эквилина, а также содержание крезола определяли с помощью ЖХВР (полученные значения см. в таблице I), с расходом, составляющим в среднем 16,7 мл/мин (что соответствует 5 ОС/ч) в примере 1, 40 мл/мин (что соответствует 12 ОС/ч) в примере 2а и 24,4 мл/мин (что соответствует 7,3 ОС/ч) в примерах 2б и 3. Содержащиеся в МЖК эстрогены полностью адсорбируются на колонке с подобной набивкой из семиполярной адсорбирующей смолы. Выходящий из колонки поток мочи, который анализируют с помощью ЖХВР на содержание в нем конъюгированных эстрогенов, практически не содержит эстрогенов. Эту вытекающую из аппарата мочу направляют в отход.
Стадия б): промывка колонки с насыщенной адсорбирующей смолой (все примеры)
Колонку с насыщенной адсорбирующей смолой промывают 1,0 л (что соответствует 5 ОС) водного раствора гидроксида натрия со значением рН, равным 13. С этой целью щелочную промывочную жидкость пропускают через колонку с расходом, составляющим в среднем 16,7 мл/мин (что соответствует 5 ОС/ч). Вытекающую из колонки промывочную жидкость анализируют с помощью ЖХВР на содержание в ней конъюгированных эстрогенов и крезола. По данным этого анализа в процессе промывки вымывается менее 5% от всего количества поступивших с мочой в колонку эстрогенов.
Стадия в): промежуточная промывка (все примеры)
Колонку с насыщенной адсорбирующей смолой промывают 600 мл (что соответствует 3 ОС) воды. С этой целью нейтральную промывочную воду пропускают через колонку с расходом, составляющим в среднем 16,7 мл/мин (что соответствует 5 ОС/ч). Вытекающую из колонки промывочную жидкость анализируют с помощью ЖХВР на содержание в ней конъюгированных эстрогенов и крезола. По данным этого анализа в процессе такой промежуточной промывки вымывается лишь незначительная часть (максимум лишь порядка нескольких процентов) от всего количества поступивших с мочой в колонку эстрогенов.
Стадии г) и д): десорбция конъюгированных эстрогенов из промытой колонки с адсорбирующей смолой
Пример 1: сравнительный пример
Через колонку, предварительно нагретую до температуры 45°С, пропускают 1,1 л (что соответствует 5,5 ОС) элюента (этанол/вода в соотношении 30:70) с расходом, составляющим в среднем 8,2 мл/мин (что соответствует 2,4 ОС/ч). Вытекающий из колонки элюат собирают 6-ю фракциями Э1-Э5 и Э6. Эти фракции объемом по 200 мл (что соответствует 1 ОС), соответственно 100 мл (что соответствует 0,5 ОС для Э6) анализируют с помощью ЖХВР на содержание в них конъюгированных эстрогенов и крезола (полученные значения см. в таблице I).
Первые четыре фракции содержат около 80-98% от всего адсорбированного на колонке количества конъюгированных эстрогенов. Последние фракции содержит лишь небольшое количество конъюгированных эстрогенов. Фракции, содержащие основное количество конъюгированных эстрогенов, представляют собой пригодные для дальнейшей переработки в галеновы препараты экстракты.
Пример 2
Пример 2а: элюирование 50%-ным по объему этилацетатом при комнатной температуре
Пример 2б: элюирование 50%-ным по объему этилацетатом при 45°С
Через колонку, предварительно нагретую до указанной температуры элюирования, пропускают 900 мл (что соответствует 4,5 ОС) двухфазного элюента (представляющего собой смесь этилацетата с водой в соотношении 50:50) с расходом, составляющим в среднем 16,7 мл/мин (что соответствует 5,0 ОС/ч). Вытекающий из колонки элюат собирают 9-ю фракциями Э1-Э9. Объем каждой фракции составляет по 100 мл (что соответствует 0,5 ОС). Начиная с четвертой фракции в качестве элюата получают двухфазную смесь, которую в целях анализа по отдельности каждого элюата разделяют на водную и органическую фазы (Э4-Э9, сокращение Р обозначает "растворитель", а сокращение В обозначает "водная фаза"). Все фракции анализируют с помощью ЖХВР на содержание в них конъюгированных эстрогенов и крезола (полученные значения см. в таблице I). Некоторые фракции анализируют также с помощью ГХ на содержание в них неконъюгированных липофильных соединений на примере формононетина (полученные значения см. в таблице II).
Первые три фракции содержат эстрогены только в следовых количествах. В последующих водных фазах фракций 4-8 содержится уже около 80-98% от всего адсорбированного на колонке количества конъюгированных эстрогенов. Последние фракции содержит лишь небольшое количество эстрогенов. Фракции, содержащие основное количество конъюгированных эстрогенов, представляют собой пригодные для дальнейшей переработки в галеновы препараты экстракты.
Для контроля полноты элюирования смесью этилацетата с водой после экстракции предлагаемым в изобретении способом проводили экстракцию уже известным способом с использованием однофазной смеси этанола с водой (в соотношении 30:70).
При последующем элюировании этанолом в примере 2а все еще элюируется значительное количество конъюгированных эстрогенов, составляющее около 6,8% от всего их поступившего с мочой в колонку количества. Повышение температуры элюирования до 45°С позволяет уменьшить до менее 1% количество все еще остающихся в колонке конъюгированных эстрогенов, которые вымываются лишь при последующем элюировании этанолом.
Пример 3: элюирование однофазной, содержащей этилацетат смесью при температуре 40°С
Через колонку, предварительно нагретую до температуры 40°С, пропускают 1,0 л (что соответствует 5 ОС) однофазного элюента (представляющего собой смесь этилацетата с водой и ацетоном в объемном соотношении 1:1:1,4) с расходом, составляющим в среднем 16,7 мл/мин (что соответствует 5,0 объемам слоя в час). Вытекающий из колонки элюат собирают 13-ю фракциями различного объема. Объем первой фракции составляет 100 мл (что соответствует 0,5 ОС), объем каждой из последующих 10-и фракций составляет по 50 мл (что соответствует 0,25 ОС), а объем каждой из обеих последних фракций составляет по 200 мл. После вытеснения из колонки промывочной жидкости в элюате (начиная с 4-й фракции) неожиданно появляются две фазы. Все фракции анализируют с помощью ЖХВР на содержание в них конъюгированных эстрогенов и крезола (полученные значения см. в таблице I).
Первая фракция содержит эстрогены только в следовых количествах. В последующих фракциях 2-7 содержится уже около 80-98% от всего адсорбированного на колонке количества конъюгированных эстрогенов. Последние фракции содержит лишь небольшое количество эстрогенов. Фракции, содержащие основное количество конъюгированных эстрогенов, представляют собой пригодные для дальнейшей переработки в галеновы препараты экстракты.
Элюаты Э7-Э13 разделяются на две фазы лишь по истечении примерно 24 ч. Элюаты Э1-Э7 объединяют и перерабатывают следующим путем. Элюаты Э1-Э7 объединяют в 500-миллилитровой капельной воронке, получая около 350 мл раствора. При этом не происходит немедленного разделения фаз, однако после стояния раствора в течение выходных сверху в капельной воронке видна небольшая органическая фаза объемом около 10 мл. Фазы анализируют с помощью ЖХВР на содержание в них конъюгированных эстрогенов и крезола. После разделения фаз водную фазу концентрируют на роторном испарителе при 70°С до доведения содержания в ней сухого вещества (СВ) до 8-10% (в данном случае до 8,16% СВ, полученные значения см. в таблице I).
Регенерация колонки с адсорбирующей смолой (все примеры)
Для регенерации колонку сначала промывают 400 мл смеси этанола с водой с 50%-ным содержанием этанола и значением рН, установленным на 13, затем промывают 400 мл 10%-ного водного раствора цитрата натрия и в завершение промывают 400 мл дистиллированной воды. Весь процесс регенерации проводят при температуре в интервале от 40 до 45°С. Содержащуюся в колонке адсорбирующую смолу можно насыщать и вновь регенерировать многократно, например до 40 раз.
В приведенной ниже таблице II для каждой из полученных при элюировании и содержащих основное количество конъюгированных эстрогенов фракций указано содержание сухого вещества (СВ) в мас.% и определенное с помощью ЖХВР содержание конъюгированных эстрогенов (КЭ, рассчитанное как суммарное содержание натрийсульфата эстрона, натрийсульфата эквилина и 17α-DH-эквилина), а также содержание крезола. Помимо этого в таблице I приведены также значения выхода экстракции.
Таблица I
Сравнение между собой отдельных способов на основании состава содержащих основное количество конъюгированных эстрогенов фракций
Объем [л]
СВ [мас.%]
Крезол [мг/л]
17α-DH-эквилин [мг/л]
Эквилин [мг/л]
Эстрон [мг/л]
КЭ
[мг/л]
[мг]
мас.% СВ
выход
Пример 1: сравнительный способ
МЖК
7,0
не опр.
329
25,3
57,9
64,9
148,1
1037
не опр.
Э1
0,2
0,22
0,0
21,2
65,8
76,0
163,0
33
7,46
Э2
0,2
1,08
0,0
345,9
1093,8
1237,0
2676,7
535
24,77
Э3
0,2
0,44
0,0
183,4
524,7
607,8
1315,9
263
30,24
Э4
0,2
0,10
0,0
30,2
58,2
84,6
173,0
35
16,99
Э5
0,2
0,06
1,6
8,9
7,5
21,1
37,5
8
6,49
Э2-4*
0,6
0,54
0,0
186,5
558,9
643,1
1388,5
833
25,71
80%
Пример 2а: элюирование смесью вода/этилацетат в соотношении 50:50 при КТ
МЖК
7,0
не опр.
163,0
15,7
41,1
71,1
127,9
895
не опр.
Э3
0,1
0,29
0,0
90,1
254,8
379,8
724,7
72
24,99
Э4 В
0,064
2,70
266,0
735,5
1877,7
2858,2
5471,5
350
20,24
Э5 В
0,053
1,00
188,8
466,9
1233,9
1877,4
3578,2
190
35,84
Э6 В
0,051
0,50
98,9
245,6
666,9
1015,1
1927,6
98
38,68
Э7 В
0,051
0,31
57,8
136,2
363,8
551,7
1051,7
54
33,82
Э8 В
0,051
0,23
33,8
79,6
208,0
314,4
602,0
31
26,27
Э4-8*
0,27
1,02
136,1
353,1
921,3
1401,4
2675,8
722
25,91
81%
Пример 2б: элюирование смесью вода/этилацетат в соотношении 50:50 при 45°С
МЖК
7,0
не опр.
549,1
13,5
61,3
56,3
131,0
917
не опр.
Э3
0,1
не опр.
31,8
26,6
124,4
122,7
273,7
27
не опр.
Э4 В
0,086
2,67
0,0
401,9
1719,9
1684,2
3806.0
327
14,25
Э5 В
0,058
1,49
0,0
519,8
2527,0
2268,4
5315,1
308
35,67
Э6 В
0,058
0,60
0,0
227,1
878,3
884,1
1989,6
115
33,16
Э7 В
0,056
0,25
0,0
84,9
350,7
357,9
793,6
44
31,74
Э8 В
0,053
0,19
0,0
50,4
208,1
204,2
462,8
25
24,36
Э4-8*
0,311
1.21
0,0
274,3
1209,3
1152,9
2636,5
820
21,87
89%
Пример 3: элюирование смесью вода/этилацетат/ацетон в соотношении 10:10:14 при 40°С
МЖК
7,0
не опр.
266,4
31,9
71,7
91,5
195,0
1365
не опр.
Э1
0,1
0,30
0,0
58,4
126,2
180,8
365,3
37
12,18
Э2
0,05
0,28
0,0
75,9
194,2
272,8
542,8
27
19,39
Э3
0,05
1,40
0,0
794,0
1834,5
2304,5
4933,0
247
35,24
Э4 В
0,046
4,24
0,0
2300,5
5446,5
6947,8
14694,8
676
34,66
Э5 В
0,035
1,68
0,0
745,8
1722,8
2165,0
4633,5
162
27,58
Э6 В
0,035
0,57
0,0
212,5
454,0
548.5
1215.0
43
21,32
Э7
0,05
0,03
0,0
81,0
166,5
212,0
459,5
23
-
Э8
0,05
0
0,0
9,6
20,1
25,0
54,7
3
-
Э1-7*
0,366
1,06
0,0
526,6
1227,0
1563,1
3316,8
1214
31,29
89%
Э1-7 В
0,34
1,06
0,0
508,0
1146,6
1516,8
3171,4
1078
29,91
79%
Э1-7Р
0,01
не опр.
0,0
97,0
235,0
340,0
672,0
7
-
Э1-7 В, конц.
0,044
8,16
0,0
3878
8798
11780
24456
1076
29,97
79%
*Содержание определяли путем расчетов.
При проведении опыта аналогично примеру 1, т.е. при элюировании этанолом, одна часть изофлавонов, например эквол, вымывается из колонки при ее щелочной промывке, тогда как другая часть изофлавонов, например формононетин, попадает в элюат, от которого их можно отделить лишь путем последующей экстракции. Сказанное аналогичным образом относится и к другим неконъюгированным липофильным соединениям, таким, например, как свободные стероидные гормоны. В отличие от этого при элюировании предлагаемым в изобретении способом еще остающиеся в колонке изофлавоны и свободные стероиды большей частью попадают в содержащую не смешивающийся с водой растворитель фазу необязательно сгущенного элюата, тогда как около 98% конъюгированных эстрогенов находятся в подвергаемой дальнейшей переработке водной фазе этого элюата. Эта водная фаза не содержит конъюгированные стероидные гормоны и в значительной степени обеднена изофлавонами и сопоставимыми с ними неконъюгированными липофильными соединениями. О подобном распределении указанных веществ между водной и органической фазами 4-го элюата из примера 2а свидетельствуют результаты ГХ-анализа этих фаз, представленные в приведенной ниже таблице II.
Таблица II
Распределение конъюгированных эстрогенов, свободных стероидных гормонов и формононетина (в качестве примера изофлавонов) между водной фазой и содержащей органический растворитель фазой 4-го элюата из примера 2а по данным ГХ-анализа (водную фазу перед анализом концентрировали с уменьшением ее объема примерно в 1,8 раза)
Фаза
Элюат 4
Масса [г]
КЭ (всего)
Свободные гормоны
Формононетин
[мг/г]
[мг]
Содержание [%]
[мг/г]
[мг]
Содержание [%]
[мг/мл]
[мг]
Содержание [%]
Вода
34,1
9,16
312
97,9
0
0
0
0,027
0,9
45,2
Этилацетат
30,5
0,23
7
2,1
0,072
2,1
100
0,037
1,1
54,8