Определение динамики клеточных рецепторов к цитокинам в процессе формирования иммунного ответа на примере вакцинного штамма В. Abortus 19 Ba

2014, Т. 4, № 1

Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»

Показано, что наиболее выраженным цитотокси-ческим действием обладает штамм B. pseudomallei 110, вызывающий полное инцистирование клеток тетра-химен через 72 ч. Динамика образования цист в со-культурах с другими штаммами соотносилась с их вирулентностью (в наименьшей степени она была выражена при взаимодействии с B. pseudomallei 107, авирулентным для экспериментальных животных).

Штамм B. pseudomallei 110 далее был трехкратно пассирован на золотистых хомячках. Культуры пассированного штамма вызывали гибель экспериментальных животных при введении единичных клеток. При этом уже после однократного пассажа их цито-токсичность для тетрахимен также значительно возрастала по сравнению с исходной, приводя к 100% инцистировнию клеток в течение 24—48 ч совместного инкубирования.

Таким образом, T pyriformis может рассматриваться в качестве эукариотической модели для оценки вирулентности штаммов возбудителя мелиоидоза по степени их цитотоксического действия на клетки простейших.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИТОПНОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В ИММУНОБЛОТТИНГЕ

И.И. Корсакова1,2, Н.П. Храпова12, Т.В. Замарина12, Е.В. Пименова1, Н.С. Макаров2

1ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора 2ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет МЗ РФ

Эпитопная направленность — важная характеристика моноклональных антител (МКА), отражающая их индивидуальные свойства. Ее изучение важно для последующего использования МКА как основы диагностических тестов и для выбора метода очистки антигенов. Эпитоп является очень небольшим участком, встречающимся в составе антигенного комплекса с различной частотой. После электрофореза в денатурирующих условиях эти участки можно выявить в составе отдельных антигенных фракций.

Цель работы: определить эпитопную направленность ряда МКА к гликопротеину 200 kDa B. pseudo-mallei в иммуноблоттинге.

Электрофорез антигенов (водно-солевых (ВСЭ) и формамидных (ФЭ) экстрактов B. pseudomallei) в ПААГ-ДСН и последующий перенос осуществляли по методике H. Towbin Клетки 12 гибридом-проду-центов МКА к гликопротеину 200 kDa B. pseudomallei 100 тиражировали для получения препаративных количеств МКА. Из мышиной асцитической жидкости выделяли моноклональные иммуноглобулины, на их основе готовили иммунопероксидазные конъюгаты (ИПК) по методу P.K. Nakane, A. Kawaio, которые после проверки на специфичность использовали для визуализации полос на нитроцеллюлоз-ных мембранах. Рабочее разведение ИПК составило 1:20. Полученные блоттограммы анализировали с помощью компьютерной программы «TotalLab TL120».

Анализ окрашенных различными способами электрофореграмм позволил обнаружить 16—35 и 4—13 антигенных фракций в составе ВСЭ и ФЭ соответственно, а также установить гликопротеиновую природу изучаемых антигенов.

Число обнаруженных иммуноблоттингом эпи-топов, гомологичных МКА 5С2, было наибольшим. Эпитопы выявлены в составе 17 фракций антигенов с молекулярной массой (м.м.) от 37 до 18,4 kDa.

У остальных ИПК картина эпитопного профиля была разнообразной и зависела от вида антигена и штамма, из которого его получали.

Ни одно из изученных МКА не реагировало с ФЭ серии 5 B. pseudomallei 100, имеющим низкое содержание гликопротеинов.

Таким образом, иммуноблоттинг с применением препаратов ВСЭ и ФЭ штаммов B. pseudomallei позволил установить картину специфического взаимодействия экспериментальных ИПК с биополимерами различной м.м., входящими в их антигенный спектр, а также получить представление об эпитопной направленности использованных в работе МКА.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИНАМИКИ КЛЕТОЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ К ЦИТОКИНАМ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ПРИМЕРЕ ВАКЦИННОГО ШТАММА В. ABORTUS 19 BA

М.В. Костюченко, Н.С. Саркисян, Т.В. Бердникова

ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора

Цитокины воздействуют на клетку, связываясь со специфическими рецепторами на цитоплазма-тической мембране, которые запускают каскадную реакцию межклеточных взаимодействий, ведущую к регуляции иммунного ответа.

Цель работы — изучить экспрессию рецепторов к цитокинам на субпопуляциях лейкоцитов в процессе формирования иммунного ответа при вакцинации белых мышей В. abortus 19 BA.

Исследовали кровь 60 белых мышей иммунизированных подкожно вакцинным штаммом B. abortus 19 BA в дозе 0,1 мл, содержащей 105 микробных клеток. Контролем служили 30 интактных животных, которым вводили стерильный физиологический раствор в том же объеме. Забор крови осуществляли на 3, 5, 7, 14 и 21 сутки после иммунизации, по 6 животных опытной и контрольной группы в каждый период исследования. Методом проточной цитометрии на аппарате «FACSCalibur» с помощью моноклональных антител фирмы Invitrogen определяли рецепторы к интерлейкинам 2, 4 (IL-2, IL-4) и фактору некроза опухоли (TNF) на поверхности лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов. Так в процессе формирования иммунного ответа отмечалось повышение содержания моноцитов, экс-прессирующих рецепторы к IL-2, на 5 сутки 18,67± 2,25%, по сравнению с контролем 3,13+0,37%, ней-трофилов — на 5 и 14 сутки 15,81+1,19 и 12,20+0,63%, контроль — 4,01+0,22%, Количество моноцитов и нейтрофилов, экспрессирующих рецепторы к IL-4 значительно повышалось на 5 сутки и достигало значений 25,88+3,63 и 26,59+1,94% по сравнению с контролем 4,18+0,39 и 2,60+0,35%. Значение этих показателей оставалось высоким в течение всех сроков наблюдения. Повышение уровня моноцитов и нейтрофилов экспрессирующих рецепторы к TNF отмечалось на 3 сутки. Максимальных значений достигало на 7 сутки 22,39+1,87 и 17,55+1,87% по сравнению с этими показателями у интактных животных 5,03+0,45 и 2,25+0,62%. К 21 суткам ис-

Материалы научно-практической конференции «От эпидемиологии к диагностике актуальных инфекций...»

Инфекция и иммунитет

следуемые значения снижались. Определение рецепторов к IL-2 и IL-4 и TNF на мембране лимфоцитов во все сроки исследования были в пределах контрольных значений.

Таким образом, наибольшее повышение уровня моноцитов и нейтрофилов экспрессирующих рецепторы к IL-2, IL-4 и TNF наблюдалось на 5—14 сутки в процессе формирования иммунного ответа у белых мышей при вакцинации В. abortus 19 BA.

КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛПС В САНКТ-ПЕТЕРБУРГЕ ПО ДАННЫМ СПб КИБ им. С.П. БОТКИНА ЗА 2011-2013 гг.

М.Е. Котов1, Е.В. Куликова1, А.Г. Шевалдин1, Л.Р. Городничева2

1ГБОУ ВПО Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова МЗ РФ 2ГБУЗ Клиническая инфекционная больница им. С.П. Боткина, Санкт-Петербург

Проанализированы 50 историй болезни пациентов с геморрагической лихорадкой с почечным синдромом (ГЛПС), находившихся на стационарном лечении в КИБ им. С.П. Боткина в 2011—2013 гг. Возраст больных составил от 24—77 лет (47,5±2,2 года). Преобладали мужчины (70%) трудоспособного возраста 24—59 лет (76%). У всех больных диагноз был подтвержден с помощью МФА или ИФА. У 88% установлен диагноз среднетяжелой формы, у 8% — тяжелой формы ГЛПС. В пригородную зону выезжали 68% больных, из них 28% не исключали контакта с грызунами. Преимущественно ГЛПС регистрировали в осенний период (36% в октябре).

На догоспитальном этапе предварительный диагноз ГЛПС был установлен лишь в 4 случаях. Частым диагнозом при направлении в стационар были ОРВИ (54%), у 5 пациентов подозревали пневмонию, у двух — псевдотуберкулез. У 94% больных наблюдалась фебрильная лихорадка, интоксикационный синдром проявлялся общей слабостью (90%), головной болью (56%), миалгиями (54%). Частые жалобы на кашель (30%) и гиперемия зева (52%) по-видимому определяли ошибочный диагноз ОРВИ. Вместе с тем, дискомфорт в пояснице и снижение остроты зрения, типичные для ГЛПС, отмечали соответственно 44 и 24% пациентов. Болезненность при поколачивании по пояснице выявили у 44% больных, снижение суточного диуреза — у 32%. У 6 больных обнаружена негеморрагическая сыпь и только у одного выявили петехии на переходной складке нижнего века. По данным УЗИ диффузные изменения интерстиция паренхимы почек обнаружены у 68%, увеличение печени — у 62% пациентов. Креатинин был повышен у 60% больных. Средний уровень креатинина сыворотки при поступлении составил 0,191+0,027 ммоль/л. Число тромбоцитов в среднем составило 172,4+19,8 х 109/л. При тяжелой форме ГЛПС отмечено более значимое снижение тромбоцитов (143,2+52,2 х 109/л), наиболее выраженная протеинурия и гематурия.

Таким образом, диагностика ГЛПС в неэндемичном регионе с преобладанием среднетяжелых форм (отсутствие клинических проявлений геморрагического синдрома) представляет сложную задачу. Вместе с тем, очевидна недооценка данных эпидемиологического анамнеза, типичных признаков поражения почек и снижения остроты зрения при ГЛПС.

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ВИДОВ DIROFILARIA REPENS И DIROFILARIA IMMITIS МЕТОДОМ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Е.Ю. Криворотова, С.А. Нагорный, А.В. Алешукина, С.О. Коршунов

ФБУН Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону

Идентификация видовой принадлежности паразитов предопределяет успешную работу специалистов в диагностике и лечении пациентов. Определение микроорганизмов до вида с помощью масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) хорошо изучено и широко используется в практике. В меньшей степени протеомный анализ применяется как таксономический инструмент для идентификации многоклеточных организмов. Определение вида членистоногих с использованием MALDI-TOF MS исследовано для дрозофил, мокрецов, мухи цеце и других насекомых.

Цель исследования: проверка возможности дифференциации видов Dirofilaria repens и D. immitis методом масс-спектрометрии.

Гельминтов D. repens и D. immitis многократно отмывали в физрастворе, гомогенизировали механически и ультразвуком. Для улучшения качества спектра проводили экстракцию в 20 мкл 70% муравьиной кислоты. Затем в пробирку добавляли аналогичное количество (20 мкл) 50% ацетонитрила. Гомогенаты центрифугировали при 13 000 оборотах в минуту в течение 2 мин 1 мкл супернатанта наносили на стальную пластину (Bruker Daltonics) в 2-х последовательностях. Мишень сушили в течение нескольких минут при комнатной температуре. Затем на каждый образец наносили 1 мкл матрицы (CHCA), просушивали и помещали в прибор MALDI-TOF MS для анализа. В общей сложности 16 образцов были подвергнуты MALDI-TOF MS анализу.

Профили масс белков получены с использованием Microflex LT MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) с программным обеспечением FlexControl (Bruker Daltonics). Профили полученного спектра визуализированы с помощью программного обеспечения Flex analysis 3.3 (Bruker Daltonics).

Качество спектров и интенсивность спектральных пиков согласуется у всех образцов одного вида. Профили спектров, полученные из белков дирофиля-рий, отличаются, что делает возможным дифференцировать по белковому профилю D. repens и D. immitis.

MALDI-TOF MS обладает рядом преимуществ по сравнению с другими методами определения видов: подготовка образца сравнительно проста; не требуются дорогостоящие расходные материалы и генетическая информация об организмах, рабочий процесс автоматизирован.

ИММУНОГЕННОСТЬ И КРОСС-РЕАКТИВНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА С РАЗЛИЧНОЙ РЕЦЕПТОРНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ НА МОДЕЛИ МЫШЕЙ

В.А. Кузнецова, С.А. Кузнецова, И.Н. Исакова-Сивак

ФГБУ НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Известно, что вирусы гриппа птиц и человека имеют сродство к сиаловым рецепторам типа а2-3 и а2-6 соответственно. Возможность размножаться в клетках млекопитающих птичьи вирусы получа-