ЛЕЧЕНИЕ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ МЕЖПОЗВОНОЧНЫХ ДИСКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ТКАНИ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА
TREATMENT OF DEGENERATIVE CHANGES IN INTERVERTEBRAL DISCS USING CELLS OBTAINED FROM HUMAN UMBILICAL TISSUE

Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится по существу к области клеточной терапии. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к использованию клеток, полученных из ткани пуповины, для лечения заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями межпозвоночных дисков.
Предпосылки создания изобретения
В настоящем описании цитируются различные публикации, включая патенты, опубликованные заявки на патенты, технические статьи и научные статьи. Каждая из таких цитированных публикаций считается полностью и для любых целей включенной в настоящий документ путем ссылки.
Боли в пояснице являются одним из наиболее широко распространенных нарушений здоровья и приводят к значительному физическому и эмоциональному дискомфорту у страдающих ими пациентов. Одной из основных причин болей в пояснице является нарушение структуры межпозвоночного диска (МПД). МПД состоит из волокнистого внешнего фиброзного кольца, окружающего более мягкое, гелеобразное, студенистое ядро. Волокна фиброзного кольца прикрепляются к концевым пластинкам тел позвонков спинного мозга и окружают студенистое ядро, создавая изобарическое окружение. Под аксиальной нагрузкой студенистое ядро сжимается и радиально передает нагрузку на фиброзное кольцо. Многослойная структура фиброзного кольца придает ему высокую прочность на разрыв и таким образом позволяет ему расширяться в радиальном направлении в ответ на передаваемую нагрузку.
В здоровом МПД клетки внутри студенистого ядра составляют по объему лишь приблизительно один процент ткани диска. Эти клетки вырабатывают внеклеточный матрикс (ВКМ), содержащий высокую долю протеогликанов. Протеогликаны содержат сульфатированные функциональные группы, которые удерживают воду, тем самым придавая студенистому ядру амортизирующие свойства. Клетки студенистого ядра также могут секретировать небольшие количества цитокинов и матричных металлопротеиназ (ММП), которые помогают регулировать метаболизм клеток студенистого ядра.
При некоторых заболеваниях МПД постепенные дегенеративные изменения МПД вызываются нарушениями механической устойчивости в других частях позвоночника. В таких ситуациях повышенная нагрузка и давление на студенистое ядро заставляет клетки внутри дисков (или проникшие внутрь макрофаги) выбрасывать повышенные по сравнению с нормальными условиями количества вышеупомянутых цитокинов. При других заболеваниях МПД генетические факторы или апоптоз могут привести к снижению количества клеток в дисках и/или высвобождению токсичных количеств цитокинов и ММП. В некоторых ситуациях может быть нарушена насосная функция диска (например, из-за снижения концентрации протеогликанов внутри студенистого ядра), что приводит к ослаблению потока питательных веществ в диск и потока отходов жизнедеятельности из диска. Такое снижение способности к подаче питательных веществ к клеткам и отводу отходов их жизнедеятельности может привести к снижению жизнеспособности клеток и угнетению их метаболизма, тем самым вызывая еще большую деградацию ВКМ, сопровождаемую также накоплением высоких уровней токсинов, которые могут вызывать раздражение нервов и боль.
По мере развития дегенеративных изменений МПД накапливающиеся в студенистом ядре в токсических количествах цитокины и ММП начинают разрушать ВКМ. В частности, ММП (опосредуемые цитокинами) начинают расщеплять удерживающие воду части протеогликанов, тем самым понижая их способность к удержанию воды. Такое разрушение может привести к понижению гибкости студенистого ядра, что изменяет распределение нагрузки внутри диска и, в свою очередь, может привести к расслаиванию фиброзного кольца. Такие изменения вызывают повышение механической неустойчивости, что заставляет клетки выбрасывать еще большие количества цитокинов и приводит к повышению активности ММП. По мере развития описанного разрушительного каскада и прогрессирования дегенеративных изменений МПД диск начинает выпячиваться (ʺгрыжа межпозвоночного дискаʺ) и в конце концов разрывается, что приводит к контакту между студенистым ядром и спинным мозгом и вызывает боль.
На сегодня основными способами терапии дегенеративных изменений МПД являются хирургические вмешательства, при которых поврежденные диски вырезают или сращивают с соседними дисками. Хирургические способы терапии направлены на ослабление боли и других симптомов дегенеративных изменений МПД, но никак не способствуют восстановлению или регенерации пораженных МПД. Одним из подходов к восстановлению клеток и тканей МПД с дегенеративными изменениями является использование клеточной терапии, в которой вводят живые клетки для восстановления, замены и/или реконструкции пораженных тканей. В ряде недавних исследований изучали применение клеточной терапии для лечения состояний с дегенеративными изменениями МПД. Например, в патентах США № 6352557 (Ferree) и 6340369 (Ferree II) описан забор живых клеток МПД у пациента, культивирование клеток и их трансплантация в пораженные МПД. Аналогичным образом, в работе Alini, Eur. Spine J., 2002 г.: 11(Supp.2): S215-220 описано выделение и культивирование клеток из студенистого ядра, их встраивание в биоматрицу и последующая инъекция таких встроенных клеток пациентам для восстановления функционирования пораженных МПД. Такие подходы, несмотря на их перспективность, пока показали лишь ограниченную эффективность в восстановлении МПД с дегенеративными изменениями, и страдают от осложнений, вызванных иммунологической несовместимостью между донорами клеток и реципиентами.
Альтернативный подход на основе клеточной терапии заключается в использовании стволовых клеток, обладающих способностью к делению и дифференцированию в клетки, составляющие пораженные ткани. Трансплантацию стволовых клеток можно использовать в качестве клинического инструмента для восстановления целевой ткани, тем самым восстанавливая ее физиологическую и анатомическую функциональность. Область применения технологии стволовых клеток очень широка и охватывает технологии культивирования тканей, доставку агентов генной терапии и клеточных терапевтических агентов, т.е. доставку биотерапевтических агентов в целевую область с использованием экзогенно вводимых живых клеток или клеточных компонентов, которые содержат или вырабатывают такие агенты (обзор приведен в работе Tresco, P. A. et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 2000 г.; 42:2-37). Обнаружение стволовых клеток стимулировало исследования, направленные на селективное получение конкретных типов клеток для восстановительной медицины. Одним из препятствий к реализации терапевтического потенциала технологии стволовых клеток является трудность получения достаточного количества стволовых клеток. Одним из источников стволовых клеток являются эмбриональные ткани, или ткани плода. Эмбриональные стволовые клетки и клетки-предшественники выделены из ряда видов млекопитающих, включая человека, и для нескольких типов таких клеток продемонстрирована способность к самообновлению и размножению, а также дифференцированию по нескольким различным клеточным линиям дифференцирования. Однако получение стволовых клеток из эмбриональных тканей и тканей плода создает множество этических и моральных вопросов, что препятствовало дальнейшему развитию терапевтических агентов на основе эмбриональных стволовых клеток.
Поэтому в данной области существует потребность в разработке терапевтических агентов на основе стволовых клеток, позволяющих обойти трудности, связанные с использованием стволовых клеток из эмбриональных тканей и тканей плода. Ткани из послеродового материала, такого как пуповина и плацента, привлекли к себе интерес в качестве альтернативного источника мультипотентных или плюрипотентных стволовых клеток. Например, описаны способы извлечения стволовых клеток путем перфузии плаценты или сбора из крови или ткани пуповины. Ограничения таких способов получения стволовых клеток заключались в неадекватном объеме собираемой крови пуповины или количества получаемых клеток, а также неоднородности или отсутствии характеризации популяций клеток, получаемых из таких источников.
Соответственно, наличие надежного, хорошо охарактеризованного и достаточно обильного источника по существу однородных популяций стволовых клеток, обладающих способностью к дифференцированию в клетки, фенотипически сходные с эндогенными клетками МПД, будет очень полезным во множестве диагностических и терапевтических приложений для восстановления, регенерации и/или замены клеток МПД, а также для воссоздания и/или реконструкции тканей МПД.
Изложение сущности изобретения
В одном аспекте в настоящем документе описаны способы лечения заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями МПД. Способы содержат введение клеток, полученных из ткани пуповины, в количестве, эффективном для лечения такого заболевания или состояния. Ткань пуповины, из которой получают клетки, предпочтительно по существу не содержит крови. Клетки, полученные из ткани пуповины, предпочтительно способны к самообновлению и размножению в культуре и имеют потенциал к дифференцированию, например, в клетки фенотипа МПД; требуют L-валин для роста; могут расти в атмосфере с содержанием кислорода по меньшей мере приблизительно 5%; не вырабатывают CD117 или HLA-DR или теломеразу; экспрессируют альфа-актин гладких мышц; и экспрессируют, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина 8 и ретикулона 1.
В другом аспекте в настоящем документе описаны фармацевтические композиции для лечения заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями МПД, где композиции содержат фармацевтически приемлемый носитель и клетки, полученные из ткани пуповины, в количестве, эффективном для лечения такого заболевания или состояния, причем ткань пуповины, из которой получают клетки, предпочтительно по существу не содержит крови, и где клетки способны к самообновлению и размножению в культуре и имеют потенциал к дифференцированию, например, в клетки фенотипа МПД; требуют L-валин для роста; могут расти в атмосфере с содержанием кислорода по меньшей мере приблизительно 5%; не вырабатывают CD117 или HLA-DR или теломеразу; экспрессируют альфа-актин гладких мышц; и экспрессируют, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина 8 и ретикулона 1.
В соответствии с другим аспектом, в настоящем документе описаны наборы для лечения пациента, имеющего заболевание или состояние, связанное с дегенеративными изменениями МПД, где наборы содержат инструкции для использования набора в способе терапии заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями МПД, фармацевтически приемлемый носитель и клетки, полученные из ткани пуповины, в количестве, эффективном для лечения такого заболевания или состояния, причем ткань пуповины, из которой получают клетки, предпочтительно по существу не содержит крови, и где клетки способны к самообновлению и размножению в культуре и имеют потенциал к дифференцированию, например, в клетки фенотипа МПД; требуют L-валин для роста; могут расти в атмосфере с содержанием кислорода по меньшей мере приблизительно 5%; не вырабатывают CD117 или HLA-DR или теломеразу; экспрессируют альфа-актин гладких мышц; и экспрессируют, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина 8 и ретикулона 1. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе наборы дополнительно содержат по меньшей мере один реагент и/или инструкции для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе наборы содержат инструкции для индуцирования клеток к по меньшей мере частичному дифференцированию in vitro, например, в клетки, имеющие фенотип клеток студенистого ядра и/или фенотип клеток фиброзного кольца.
В различных вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, используемые в способах, композициях и/или наборах, описанных в настоящем документе, экспрессируют рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок 2. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе клетки, полученные из ткани пуповины, экспрессируют CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе клетки, полученные из ткани пуповины, обладают способностью к дифференцированию в клетки фиброзного кольца и/или клетки студенистого ядра.
В различных вариантах осуществления заболевание или состояние, связанное с дегенеративными изменениями МПД, может быть связано с возрастом, травмой, аутоиммунной или воспалительной реакцией, генетическим дефектом, отложением иммунного комплекса и/или их комбинациями. Планируемый для лечения МПД может быть интактным или находиться на любой стадии поражения или дегенеративных изменений. Например, планируемый для лечения МПД может иметь грыжу, разрыв, отслоение и/или иные повреждения или факторы дегенеративных изменений.
В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе способы содержат введение недифференцированных клеток, полученных из ткани пуповины, или клеточных производных. Клетки, полученные из ткани пуповины человека, вырабатывают полезные трофические факторы, включая без ограничений цитокины, факторы роста, ингибиторы протеаз, белки внеклеточного матрикса, которые стимулируют выживание, рост и дифференцирование эндогенных клеток-предшественников клеток МПД. Описанные трофические факторы могут секретироваться непосредственно трансплантированными клетками, полученными из ткани пуповины человека, в несущем их организме. Трофические факторы или другие клеточные производные можно собрать из клеток, полученных из ткани пуповины человека, ex vivo и затем ввести их пациенту.
В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе клетки, полученные из ткани пуповины, индуцируют in vitro для дифференцирования в клетки линии дифференцирования хондроцитов и/или в клетки, имеющие фенотип клеток фиброзного кольца, клеток студенистого ядра и/или других клеток, аналогичных клеткам МПД, до, после или одновременно с введением клеток. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе способы дополнительно содержат стадию индуцирования клеток, полученных из ткани пуповины, для по меньшей мере частичного дифференцирования in vitro.
В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, могут быть модифицированы способами генной инженерии для экспрессирования продукта гена, такого как, без ограничений, продукта гена, стимулирующего восстановление и/или регенерацию тканей МПД. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, модифицируют способами генной инженерии для экспрессирования трофического фактора или другого продукта гена. В некоторых вариантах осуществления продукт гена оказывает трофический эффект или иным способом модулирует клетки, полученные из ткани пуповины, дополнительные типы клеток, введенные вместе с клетками, полученными из ткани пуповины, эндогенные клетки МПД и/или другие эндогенные клетки. В некоторых вариантах осуществления продукт гена представляет собой компонент внеклеточного матрикса или агент, который модулирует внеклеточный матрикс. В некоторых вариантах осуществления продукт гена стимулирует экспрессию одного или более белка внеклеточного матрикса.
В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, вводят вместе с клетками по меньшей мере одного другого типа, такими как, без ограничений, клетками фиброзного кольца, клетками студенистого ядра, фибробластами, хондроцитами, мезенхимальными стволовыми клетками, клетками, полученными из жировой ткани или другими мультипотентными или плюрипотентными стволовыми клетками. Указанные клетки по меньшей мере одного другого типа можно вводить одновременно с, до или после введения клеток, полученных из ткани пуповины.
В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, вводят вместе с по меньшей мере одним агентом. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, вводят вместе с трофическим фактором, таким как, без ограничений, TGF-бета, GDF-5, TIMP-1 и PDGF-BB. В различных вариантах осуществления указанный по меньшей мере один агент оказывает трофический эффект или иным способом модулирует клетки, полученные из ткани пуповины, один или более дополнительных типов клеток, введенных вместе с клетками, полученными из ткани пуповины, эндогенные клетки МПД и/или другие эндогенные клетки. В некоторых вариантах осуществления указанный по меньшей мере один агент стимулирует экспрессию одного или более белка внеклеточного матрикса. Другие агенты включают в себя без ограничений противовоспалительные агенты, агенты, повышающие выживаемость клеток, болеутоляющие агенты и иммуномодулирующие агенты. Агент можно вводить одновременно с, до или после введения клеток, полученных из ткани пуповины.
В различных аспектах клетки можно вводить, направлять для введения или формулировать для введения путем инъекции в МПД, включая, например, студенистое ядро и/или фиброзное кольцо МПД с дегенеративными изменениями. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят, направляют для введения или формулируют для введения таким образом, что клетки инкапсулируют внутри имплантируемого устройства или имплантируют в устройстве или матрице, содержащей клетки.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ лечения заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями межпозвоночных дисков, содержащий введение фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере (1) гидрогель и (2) выделенную однородную популяцию клеток, полученных из ткани пуповины человека, в межпозвоночный диск в количестве, эффективном для лечения такого заболевания или состояния, где ткань пуповины по существу не содержит крови, и где выделенная однородная популяция клеток способна к самообновлению, размножению в культуре и имеет потенциал для дифференцирования и не экспрессирует CD117 и/или теломеразу. Выделенная однородная популяция клеток может дополнительно иметь одну из следующих характеристик: (а) экспрессировать ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и гранулоцитарный хемотаксический белок; (b) не вырабатывать CD31, CD34 и HLA-DR; (c) экспрессировать, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина 8 и ретикулона 1; и (d) экспрессировать CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90. В другом варианте осуществления настоящего изобретения выделенная однородная популяция клеток экспрессирует рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и/или гранулоцитарный хемотаксический белок. Композицию можно вводить путем инъекции. В одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит: (а) клетки по меньшей мере одного другого типа, которые могут быть модифицированы способами генной инженерии для экспрессирования по меньшей мере одного экзогенного продукта гена (такого как, например, трофический фактор); и/или (b) по меньшей мере один агент, такой как, например, трофический фактор (например, TGF-бета, GDF-5, PDGF-BB и TIMP1). В другом варианте осуществления композицию вводят в межпозвоночный диск с дегенеративными изменениями, например, в студенистое ядро или фиброзное кольцо межпозвоночного диска. Выделенную популяцию клеток можно по меньшей мере частично индуцировать для дифференцирования in vitro перед введением. В одном варианте осуществления настоящего изобретения выделенную однородную популяцию клеток индуцируют для дифференцирования в клетки, имеющие фенотип клеток фиброзного кольца, или в клетки, имеющие фенотип клеток студенистого ядра.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ лечения заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями межпозвоночных дисков, содержащий введение гидрогеля и выделенной однородной популяции клеток, полученных из ткани пуповины человека, в межпозвоночный диск в количестве, эффективном для лечения такого заболевания или состояния, где ткань пуповины по существу не содержит крови и где выделенная однородная популяция клеток способна к самообновлению, размножению в культуре, и имеет потенциал для дифференцирования и не экспрессирует CD117 и/или теломеразу. Выделенная однородная популяция клеток может дополнительно иметь одну из следующих характеристик: (а) экспрессировать ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и гранулоцитарный хемотаксический белок; (b) не вырабатывать CD31, CD34 и HLA-DR; (с) экспрессировать, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина 8 и ретикулона 1; и (d) экспрессировать CD10, CD13, CD44, CD73 и CD90. В другом варианте осуществления выделенная однородная популяция клеток экспрессирует рецептор окисленных липопротеинов низкой плотности 1, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 и гранулоцитарный хемотаксический белок. Гидрогель и выделенную однородную популяцию клеток можно вводить путем инъекции. Гидрогель вводят одновременно с, до или после введения выделенной однородной популяции клеток, полученных из ткани пуповины человека. В одном варианте осуществления выделенную однородную популяцию клеток вводят внутри имплантируемого устройства. В другом варианте осуществления способ дополнительно содержит введение клеток по меньшей мере одного другого типа одновременно с, до или после введения выделенной однородной популяции клеток, полученных из ткани пуповины человека. Указанные клетки по меньшей мере одного другого типа могут быть модифицированы способами генной инженерии для экспрессирования по меньшей мере одного экзогенного продукта гена (такого как трофический фактор или экзогенный продукт гена, модулирующий экспрессию одного или более белков внеклеточного матрикса).
Способ может дополнительно содержать введение по меньшей мере одного агента, такого как, например, трофический фактор (например, TGF-бета, GDF-5, PDGF-BB и TIMP1), который может оказывать трофический эффект на выделенную однородную популяцию клеток, полученных из ткани пуповины человека. В некоторых вариантах осуществления выделенную однородную популяцию клеток и гидрогель вводят в межпозвоночный диск с дегенеративными изменениями, например, в студенистое ядро межпозвоночного диска или фиброзное кольцо межпозвоночного диска. В других вариантах осуществления выделенную однородную популяцию клеток, полученных из ткани пуповины человека, индуцируют для по меньшей мере частичного дифференцирования in vitro. Выделенную однородную популяцию клеток можно индуцировать для дифференцирования в клетки, имеющие фенотип клеток фиброзного кольца, или в клетки, имеющие фенотип клеток студенистого ядра.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ лечения заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями межпозвоночных дисков, содержащий введение гидрогеля в количестве, эффективном для лечения такого заболевания или состояния. Для такого способа можно использовать любой известный специалистам в данной области гидрогель (такой как раскрытые в настоящем документе). В одном варианте осуществления гидрогель содержит фибриноген и тромбин. В другом варианте осуществления гидрогель содержит фибриновый клей, такой как, например, фибриновый клей EVICEL (EVICEL Fibrin sealant (Human), Omrix Pharmaceuticals, Ltd.).
Вышеизложенные и прочие характеристики и преимущества настоящего изобретения станут очевидными после следующего более подробного описания предпочтительных вариантов осуществления изобретения, проиллюстрированных с помощью прилагаемых чертежей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Приведенное выше краткое описание, а также приведенное ниже подробное описание настоящего изобретения будут более понятны при изучении вместе с приложенными чертежами. Для целей иллюстрирования настоящего изобретения на фигурах представлены варианты осуществления настоящего изобретения. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается только приведенными точными конструкциями, примерами и устройствами.
На фиг. 1 и 2 представлены МРТ-томограммы поясничного отдела позвоночника (см. пример 12). На взвешенных по T2 МРТ-томограммах срединной сагиттальной плоскости в контрольной группе видны выглядящие здоровыми диски. Диски в группе с проколом имеют признаки дегенеративных изменений (потемнение и потеря высоты). Диски в обработанных группах имеют менее выраженные признаки дегенеративных изменений по сравнению с дисками из группы с проколом. В частности, на фиг. 1 и 2 представлены образцы взвешенных по T2 МРТ-томограмм поясничного отдела позвоночника для дисков с L1-2 по L5-6 во временных точках 0 (до кольцевого прокола), 3 недели (до инъекционной хирургии), 6 недель и 12 недель (перед умерщвлением). Проколотые диски (L2-3, L3-4 и L4-5) указаны рамками (L2-3, L3-4 и L4-5 сверху вниз). Непроколотые контрольные диски (L1-2 и L5-6) не имеют никаких признаков дегенеративных изменений. Диски контрольных образцов, как и ожидалось, не имели дегенеративных изменений (фиг. 1A). Проколотые диски (фиг. 1B) с течением времени уменьшались в размерах и темнели, что указывает на дегенеративные изменения. Диски, проколотые и обработанные носителем (фиг. 1C), клетками + буфер (фиг. 2A) и клетками + носитель (фиг. 2B), со временем демонстрировали менее выраженные признаки дегенеративных изменений по сравнению с проколотыми дисками (фиг. 1B).
На фиг. 3 представлены взвешенные по T2 МРТ-томограммы (площадь диска и индекс МРТ) (см. пример 12). В частности, средняя площадь по МРТ студенистого ядра (фиг. 3A) и индекс МРТ (фиг. 3B) при объединении данных по дискам L2-3, L3-4 и L4-5 (диски, которые прошли лечение) для каждой группы кроликов, выраженные в виде процентной доли от значения в момент времени 0, показывают, что группа с проколом испытывает наибольшее снижение площади и индекса с течением времени, тогда как группы с дисками, проколотыми и затем обработанными носителем, клетками в буфере (B+C) или клетками в носителе (C+C), испытывают меньшее снижение площади и индекса. На фиг. 3 маркер ‡ указывает значимость по сравнению с контрольной группой и маркер * указывает значимость по сравнению с проколотой группой. Кроме того, индекс МРТ на фиг. 3 определяли следующим образом:
Индекс МРТ = Площадь студенистого ядра × Интенсивность сигнала
На фиг. 4 представлены средние кривые нормированного полного смещения (фаза нагружения + течение) для залитого в компаунд позвоночно-двигательного сегмента диска L3-4 через 12 недель (см. пример 12). Зависимость смещения от времени при постоянном нагружении имеет характерный вид кривых ползучести. Диски, обработанные клетками в буфере, ведут себя более похоже на проколотые диски, диски, обработанные клетками в носителе, ведут себя более похоже на контрольные диски, поведение дисков, обработанных только носителем, среднее между ними. Средние кривые ползучести получали для каждого условия. Аксиальное тестирование дает характерный вид кривых ползучести на ранних стадиях тестирования (время от 0 до 200 секунд). Пунктирными границами указана стандартная ошибка измерения. Кривые, полученные для проколотых дисков и дисков, обработанных клетками в буфере, выглядят аналогично, так же как кривые для контрольных дисков и дисков, обработанных клетками в носителе. Кривые для каждой из этих групп явно отделяются от кривой для дисков, обработанных только носителем.
На фиг. 5, 6 и 7 представлены гистологические сагиттальные срезы дисков L4-5, полученные после умерщвления на 12 неделе в каждой группе лечения, окраска H&E, увеличение 20x и 100x (см. пример 12). На фиг. 5A представлен гистологический сагиттальный срез диска L4-5 для контрольной группы. На фиг. 5B представлен гистологический сагиттальный срез диска L4-5 для группы с проколом. На фиг. 6A представлен гистологический сагиттальный срез диска L4-5 для группы с дисками, обработанными только носителем. На фиг. 6B представлен гистологический сагиттальный срез диска L4-5 для группы с дисками, обработанными клетками в буфере. На фиг. 7 представлен гистологический сагиттальный срез диска L4-5 для группы с дисками, обработанными клетками в носителе.
Подробное описание примеров осуществления изобретения
В настоящем описании и пунктах формулы изобретения используются различные термины, относящиеся к способам и другим аспектам настоящего изобретения. Такие термины считаются имеющими общепринятое в данной области значение, если иное не оговорено особо. Другие явно определенные термины должны толковаться согласно приведенным в настоящем документе определениям.
В настоящем описании и в прилагаемых пунктах формулы изобретения формы единственного числа включают и множественные обозначения, если только содержание текста не определяет иного. Так, например, отсылка к ʺклеткеʺ включает в себя и комбинацию двух или более клеток и т.п.
Используемый в настоящем документе термин ʺприблизительноʺ при указании измеримой величины, такой как количество, продолжительность во времени и т.п., считается охватывающим отклонения ±20% или ±10%, более предпочтительно ±5%, еще более предпочтительно ±1% и наиболее предпочтительно ±0,1% от указанного значения, поскольку такие отклонения приемлемы для реализации раскрываемых способов.
Термин «полученные из» используется для указания, что клетки получили из их биологического источника и вырастили, размножили в культуре, иммортализовали или иным образом обработали in vitro.
Термин ʺвыделенныйʺ означает измененный ʺрукой человекаʺ от естественного природного состояния. Если молекула или композиция встречается в природе, она считается ʺвыделеннойʺ, если ее изменили и/или удалили из естественной среды.
Термины ʺэкспрессироватьʺ, ʺэкспрессируемыйʺ или ʺэкспрессияʺ для молекулы нуклеиновой кислоты или гена относится к процессу биосинтеза продукта гена, например биосинтезу полипептида.
ʺТрофические факторыʺ представляют собой вещества, которые стимулируют выживание, рост, дифференцирование, пролиферацию и/или созревание клеток, или стимулируют повышенную биологическую активность клеток. Термин ʺклеточные производныеʺ относится к любому материалу, который можно получить из клетки, и включает в себя кондиционированную клетками среду, клеточный лизат, белки внеклеточного матрикса, трофические факторы, клеточные фракции, клеточные мембраны.
Термин ʺдегенеративные измененияʺ относится к любому физическому повреждению, нарушению, дегенеративным изменениям или травме МПД.
Термин ʺпатологияʺ относится к любому структурному или функциональному признаку отклонения от нормального состояния для клетки, ткани, органа или системы по результатам измерения с использованием любого известного специалистам соответствующего способа.
ʺЗаболеваниеʺ представляет собой любое отклонение от или нарушение здоровья, состояния или функционирования клетки, ткани, органа, системы или организма в целом по результатам измерения с использованием любого известного специалистам подходящего способа.
Термины ʺлечитьʺ, ʺтерапияʺ или ʺлечениеʺ относятся к любому успеху или признаку успеха в ослаблении симптомов или облегчении течения заболевания, нарушения или состояния, включая любые объективные или субъективные параметры, такие как ослабление боли, ремиссия, ослабление симптомов или перевод заболевания, нарушения или состояния в более легко переносимую пациентом форму, замедление скорости развития дегенеративных изменений или угасания функции, перевод итоговой точки дегенеративных изменений в менее угнетающую для пациента форму или улучшение общего физического или умственного состояния пациента. Лечение или облегчение симптомов может основываться на объективных или субъективных параметрах; включая результаты врачебного осмотра, неврологического осмотра и/или психиатрической экспертизы.
Термины ʺэффективное количествоʺ и ʺтерапевтически эффективное количествоʺ в настоящем документе используются как взаимозаменяемые и относятся к количеству соединения, материала или композиции, согласно приведенному в настоящем документе описанию, достаточному для достижения требуемого биологического результата, такого как, без ограничений, биологические результаты, раскрытые, описанные или проиллюстрированные в настоящем документе. Такие результаты могут без ограничений включать в себя лечение заболевания или повреждения МПД у субъекта по результатам измерения с использованием любого известного специалистам подходящего способа.
Термин ʺфармацевтически приемлемыйʺ относится к тем свойствам и/или веществам, которые являются приемлемыми для пациента с фармакологической/токсикологической точки зрения, и являются приемлемыми для производителя - специалиста в области химии фармацевтических препаратов с физической/химической точки зрения в отношении состава композиции, возможности ее приготовления, стабильности, комфортности для пациента и биодоступности. Термин ʺфармацевтически приемлемый носительʺ относится к среде, которая не снижает эффективности биологического действия активных компонентов и не является токсичной для организма, в который ее вводят.
Было обнаружено, что заболевания и состояния, связанные с дегенеративными изменениями межпозвоночного диска (МПД), можно лечить путем введения клеток, полученных из ткани пуповины, согласно приведенному в настоящем документе описанию. Преимуществом является то, что описанные в настоящем документе способы, композиции и наборы стимулируют восстановление и регенерацию МПД с дегенеративными изменениями и тем самым ослабляют один или более симптомов, связанных с дегенеративными изменениями МПД. Соответственно, в одном аспекте, в настоящем документе описаны способы лечения заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями МПД, содержащие введение клеток, полученных из ткани пуповины, в МПД в количестве, достаточном для лечения заболевания или состояния.
В различных вариантах осуществления заболевание или состояние, связанное с дегенеративными изменениями МПД, может быть связано с возрастом, травмой, аутоиммунной или воспалительной реакцией, генетическим дефектом, отложением иммунного комплекса (например, формированием рубцовой ткани), и/или их комбинациями. Планируемый для лечения МПД может быть интактным или находиться на любой стадии поражения или развития дегенеративных изменений. Например, планируемый для лечения МПД может иметь грыжу (например, когда на части фиброзного кольца имеется выпячивание или иное раздутие), разрыв (например, когда по меньшей мере часть фиброзного кольца разорвана, что приводит к снижению давления и/или объема студенистого ядра), расслоение (например, когда происходит разделение двух или более слоев фиброзного кольца) и/или иные повреждения или факторы дегенеративных изменений (например, когда фиброзное кольцо имеет трещины, надрывы и т.п. и/или при деградации или изменении свойств внеклеточного матрикса).
В различных вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, вводят в МПД с дегенеративными изменениями, например, путем инъекции, трансплантации, имплантации, инжектирования или введения в виде комплекса клеток с матриксом, либо с использованием любого другого способа, известного в области клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят непосредственно в фиброзное кольцо и/или студенистое ядро МПД. В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в МПД косвенно. Например, клетки могут находиться в водном носителе, могут быть инкапсулированы или высеяны в матриксе, который затем имплантируют в или рядом с МПД с дегенеративными изменениями. Водные носители без ограничений включают в себя физиологические буферные растворы, такие как солевой буфер, фосфатно-солевой буфер, сбалансированный солевой раствор Хенкса, Tris-солевой буфер и Hepes-солевой буфер. В различных вариантах осуществления устройство, матрикс или иное клеточное депо можно имплантировать таким образом, что оно закрепится на внешней стенке фиброзного кольца или окажется снаружи от, но рядом со стенкой фиброзного кольца, или рядом с концевой пластинкой тела позвонка, окружающего МПД.
В некоторых вариантах осуществления клетки вводят в форме устройства, такого как комплекс клеток с матриксом. Материалы для таких устройств без ограничений включают в себя биорассасывающиеся материалы, такие как коллагены, 35/65 поли(эпсилон-капролактон)(PCL)/поли(гликолевая кислота) (PGA), биорассасывающиеся конструкции PANACRYL™, VICRYL™, полиглактин 910, а также самособирающиеся пептиды и нерассасывающиеся материалы, такие как фторполимеры (например, фторполимеры типа TEFLON), пластики и металлы. Матрицы включают в себя биосовместимые каркасы, решетки, самособирающиеся структуры и т.п., биорассасывающиеся или нерассасывающиеся, жидкие, гелеобразные или твердые. Такие матрицы известны в области клеточной терапии, хирургического восстановления, технологии культивирования тканей и заживления ран. Предпочтительно матрицы заранее обрабатывают терапевтическими клетками. Более предпочтительно матрицы заселяют клетками в тесной связи с матриксом или имеющимися в нем полостями. Клетки могут закрепиться на матриксе или могут быть захвачены и удерживаться в полостях матрикса. Наиболее предпочтительными являются комплексы клеток с матриксом, в которых клетки растут в тесной связи с матриксом, и при их последующем терапевтическом использовании стимулируются и поддерживаются рост, восстановление и/или регенерация собственных клеток МПД пациента, а также стимулируется или поддерживается соответствующий ангиогенез. Композиции на основе клеток с матриксом можно вводить в тело пациента любым известным специалистам способом, включая без ограничений имплантацию, инъекцию, хирургическое закрепление, трансплантацию с другими тканями и т.п. В некоторых вариантах осуществления матрицы формируются in vivo, или еще более предпочтительно in situ. Например, полимеризуемые in situ гели можно использовать в соответствии с настоящим изобретением. Примеры таких гелей известны специалистам.
В одном варианте осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, вводят в МПД с дегенеративными изменениями как часть композиции, содержащей гидрогель. В другом варианте осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, вводят в МПД с дегенеративными изменениями одновременно с гидрогелем.
Описанные в настоящем документе клетки также можно высевать на трехмерные матрицы, такие как каркасы, и имплантировать in vivo, где высеянные клетки могут пролиферировать по или в каркас или способствовать нарастанию заменяющей ткани in vivo с помощью или без помощи других клеток. Рост клеток, полученных из ткани пуповины, на трехмерном каркасе предпочтительно приводит к формированию трехмерной ткани, или основы для нее, которую можно использовать in vivo, например, для восстановления и/или регенерации поврежденной или пораженной ткани.
Клетки можно высевать на трехмерный каркас или матрикс, такой как каркас, пену, электростатически спряденный каркас, нетканый каркас, пористые или непористые микрочастицы или гидрогель, и вводить соответствующим образом. Каркасу могут быть приданы различные формы, такие как по существу плоская, по существу цилиндрическая или трубчатая, или он может иметь совершенно свободную форму, что может быть предпочтительно или необходимо для целевой корректирующей структуры. Два или более по существу плоских каркаса можно уложить друг на друга и скрепить друг с другом необходимым образом для получения многослойного каркаса.
На таких трехмерных каркасах клетки можно вводить совместно с клетками других типов или другими предшественниками мягких тканей, включая стволовые клетки. При выращивании в трехмерной системе пролиферирующие клетки могут правильным образом созревать и разделяться для формирования компонентов взрослых тканей, аналогичных их природным прототипам in vivo.
Описанные и проиллюстрированные в настоящем документе матрицы можно сконструировать таким образом, что структура матрикса будет поддерживать клетки, полученные из ткани пуповины, без последующей деградации, будет поддерживать клетки с момента высевания и до перестройки тканевого трансплантата тканью-хозяином, или позволит высеянным клеткам закрепиться, пролиферировать и развиться в тканевую структуру с достаточной механической прочностью для поддерживания себя самой in vitro, и тогда матрикс может рассосаться.
Матрицы, каркасы, такие как нетканые каркасы, электростатически спряденные структуры, микрочастицы и самособирающиеся системы, использование которых предусматривается в настоящем документе, можно имплантировать в комбинации с любым одним или более из клеток, факторов роста, лекарственных средств или других компонентов, таких как биоактивные агенты, которые стимулируют заживление, регенерацию, восстановление или прорастание ткани, или стимулируют ее васкуляризацию или иннервацию или иным образом усиливают или улучшают терапевтический результат при использовании настоящего изобретения, в дополнение к клеткам настоящего изобретения.
6
7
В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе клетки можно свободно выращивать в культуре, извлекать из культуры и инокулировать на трехмерный каркас. Инокулирование трехмерного каркаса некоторой концентрацией клеток, например, приблизительно от 10 до 5×10 клеток на миллилитр, предпочтительно приводит к установлению трехмерного носителя за относительно короткое время. Более того, в некоторых приложениях может оказаться предпочтительным использовать более высокую или более низкую численность клеток в зависимости от желаемого результата.
В некоторых аспектах полезно воссоздать в культуре имеющееся in vivo клеточное микроокружение таким образом, что степень, до которой клетки выращивают до имплантации in vivo или используют in vitro, может варьироваться. Клетки можно инокулировать на каркас до или после формирования требуемой для имплантации формы каркаса, например веревок, трубок, волокон и т.п. После инокуляции клеток на каркас последний предпочтительно инкубируют в соответствующей ростовой среде. Во время инкубационного периода инокулированные клетки вырастают и обволакивают каркас и могут, например, заполнить, или частично заполнить, любые имеющиеся в нем внутренние пустоты. Предпочтительно, но не обязательно, выращивать клетки до соответствующей степени, которая отражает плотность клеток in vivo в ткани, восстановление и регенерацию которой планируется провести. В других вариантах осуществления присутствие клеток, даже при их низкой численности, на каркасе стимулирует прорастание эндогенных здоровых клеток для облегчения заживления, например, поврежденной или пораженной ткани.
TM
Примеры матриц, например каркасов, которые можно использовать в различных аспектах настоящего изобретения, включают в себя маты, пористые или полупористые пены, самособирающиеся пептиды и т.п. Нетканые маты можно, например, сформировать из волокон, образованных из природных или синтетических полимеров. В предпочтительном варианте осуществления для формирования мата используют рассасывающиеся сополимеры гликолевой и молочной кислот (PGA/PLA), поступающие в продажу под торговой маркой VICRYL (Ethicon, Inc., г. Сомервиль, штат Нью-Джерси). Роль каркасов также могут выполнять пены, состоящие из, например, сополимера поли(эпсилон-капролактон)/поли(гликолевая кислота) (PCL/PGA), сформированные с использованием таких процессов, как лиофильная сушка, или лиофилизация, как обсуждается в патенте США № 6355699.
Гели также могут образовывать подходящие матрицы, которые можно использовать в целях настоящего изобретения. Примеры гелей включают в себя готовые к употреблению инъекционные гели, полимеризуемые in situ гели и гидрогели; гели могут состоять из самособирающихся пептидов. Эти материалы часто используют в качестве основы для выращивания ткани. Например, при использовании в форме инъекционного геля, гель может состоять из воды, физиологического или солевого буфера и гелеобразующего материала. Гелеобразующие материалы без ограничений включают в себя белки, такие как коллаген, эластин, тромбин, фибронектин, желатин, фибрин, тропоэластин, полипептиды, ламинин, протеогликаны, фибриновый клей, фибриновый сгусток, сгусток богатой тромбоцитами плазмы (PRP), сгусток бедной тромбоцитами плазмы (PPP), гидрогели из самособирающихся пептидов и ателоколлаген; полисахариды, такие как пектин, целлюлоза, окисленная целлюлоза, хитин, хитозан, агароза, гиалуроновая кислота; полинуклеотиды, такие как рибонуклеиновые кислоты, дезоксирибонуклеиновые кислоты и другие, такие как альгинат, поперечно-сшитый альгинат, поли(N-изопропилакриламид), поли(оксиалкилен), сополимеры поли(этиленоксид)-поли(пропиленоксид), поли(виниловый спирт), полиакрилат, сополимер моностеароилглицерина и сукцината/полиэтиленгликоль (MGSA/PEG) и их комбинации. В одном варианте осуществления гелеобразующий материал (например, гидрогель) содержит фибриноген (фактор I), такой как, например, рекомбинантный фибриноген или фибриноген, выделенный из крови. В другом варианте осуществления гидрогель содержит фибриноген и тромбин. В еще одном варианте осуществления гель представляет собой фибриновый клей EVICEL (EVICEL Fibrin sealant (Human), Omrix Pharmaceuticals, Ltd.) (BAC2 (фибриноген) и тромбин).
По существу гидрогели представляют собой поперечно-сшитые полимерные материалы, которые могут впитывать более 20% от своего веса воды, сохраняя при этом заданную трехмерную структуру. Кроме того, гидрогели имеют высокую проницаемость для кислорода, питательных веществ и других водорастворимых метаболитов. Это определение включает в себя сухие поперечно-сшитые полимеры, которые разбухнут в водной среде, а также разбухшие в воде материалы. Гидрогели можно получить поперечной сшивкой гидрофильных полимеров, при этом полимер может быть биологического происхождения, полусинтетический или полностью синтетический. Гидрогель можно получить из синтетического полимерного материала. Такие синтетические полимеры можно получать с заданными свойствами и предсказуемой воспроизводимостью от партии к партии, и они представляют собой надежный источник материала, для которого по существу не стоит проблема иммуногенности. В одном варианте осуществления настоящего изобретения гидрогели формируют из самособирающихся пептидов, таких как описанные в патентах США № 5670483 и 5955343, публикации патента США № 2002/0160471, заявке № WO 02/062969, раскрытия которых полностью включены в настоящий документ путем ссылки.
Свойства, которые делают гидрогели особенно ценными в качестве матрикса для целей настоящего изобретения, включают в себя равновесную степень разбухания, кинетику сорбции, проницаемость к растворенным веществам, а также их характеристики in vivo. Проницаемость к соединениям зависит частично от степени разбухания или содержания воды и скорости биоразложения. Поскольку механическая прочность геля падает прямо пропорционально его степени разбухания, в рамках настоящего изобретения также предусматривается, что гидрогель можно закрепить на субстрате таким образом, что полученная композитная система будет иметь повышенную механическую прочность. В альтернативных вариантах осуществления гидрогель можно импрегнировать внутрь пористого субстрата, одновременно получив при этом механическую прочность субстрата и полезные свойства гидрогеля как системы доставки.
В целях настоящего изобретения также можно использовать in situ образование разлагаемых сеток (см., например, Anseth, K.S. et al., J. Controlled Release, 2002 г.; 78:199-209; Wang, D. et al., Biomaterials, 2003 г.; 24:3969-3980; публикация патента США № 2002/0022676, автор He et al.). Такие материалы готовят в виде подходящих инъекционных жидкостей, которые затем можно активировать различными способами (например, изменением температуры, pH, освещением) для образования разлагаемых гидрогелевых сеток in situ или in vivo.
В некоторых вариантах осуществления каркас может представлять собой войлок, который может состоять из мультифиламентной пряжи, изготовленной из биорассасывающегося материала, например сополимеров или смесей PGA, PLA, PCL или гиалуроновой кислоты. Пряжу сваливают в войлок с использованием стандартных способов обработки текстильных материалов, состоящих из обжатия, нарезки, чесания и простегивания. Клетки, соответствующие настоящему изобретению, можно высеять на вспененные каркасы, которые могут представлять собой композитные структуры. Кроме того, трехмерный каркас можно отлить в полезную для применения форму, такую как форма конкретной структуры внутри или вокруг МПД, которую требуется восстановить, заменить или увеличить.
Каркас можно обработать клетками настоящего изобретения для улучшения клеточной адгезии. Например, перед инокуляцией клетками настоящего изобретения нейлоновые матрицы можно обработать 0,1 М раствором уксусной кислоты и инкубировать в полилизине, ФСБ и/или коллагене для покрытия нейлона. Полистирол можно аналогичным образом обработать серной кислотой.
Кроме того, можно модифицировать внешние поверхности трехмерного каркаса для улучшения клеточной адгезии или роста и дифференцирования ткани, используя, например, плазменное покрытие каркаса или добавление одного или более белков (например, коллагенов, эластичных волокон, ретикулярных волокон), гликопротеинов, гликозаминогликанов (например, гепаринсульфата, хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, дерматансульфата, кератинсульфата), клеточного матрикса и/или других материалов, включая без ограничений желатин, альгинаты, агар, агарозу и растительные камеди и т.п.
Каркас может быть изготовлен из или обработан материалами, которые делают его нетромбогенным. Такие обработки и материалы также могут стимулировать и поддерживать рост эндотелия, миграцию и отложение внеклеточного матрикса. Примеры таких материалов и обработок без ограничений включают в себя природные материалы, такие как белки базальных мембран, такие как ламинин коллаген типа IV, синтетические материалы, такие как ePTFE, и сегментированные полиуретанмочевинные силиконы, такие как PURSPAN (The Polymer Technology Group, Inc., г. Беркли, штат Калифорния). Такие материалы можно дополнительно обработать, чтобы сделать каркас нетромбогенным. Такие обработки включают в себя обработку антитромботическими агентами, такими как гепарин, и обработки, которые изменяют поверхностный заряд материала, такие как плазменное покрытие.
Разные пропорции различных типов, например, коллагена, осажденного на каркас, могут влиять на рост тканеспецифичных или иных клеток, которыми можно затем инокулировать каркас или которые могут расти на такой структуре in vivo. В альтернативном варианте осуществления каркас можно инокулировать смесью клеток, которые синтезируют соответствующие необходимые типы коллагенов. Соответствующий тип коллагена для инокуляции на каркас или выработки высеянными на него клетками можно выбрать в зависимости от культивируемой ткани. Например, относительные количества коллагеновых и эластичных волокон, присутствующих в каркасе, можно модулировать, регулируя соотношение коллаген-продуцирующих и эластин-продуцирующих клеток в исходном посевном материале.
Засеянный или инокулированный трехмерный каркас по настоящему изобретению можно использовать для трансплантации или имплантации in vivo либо культивированных клеток, полученных из матрикса, либо самого культивированного матрикса. Трехмерные каркасы можно, в соответствии с настоящим изобретением, использовать для замены или увеличения существующей ткани, для введения новой или измененной ткани, для модификации искусственных протезов или для соединения биологических тканей или структур.
В некоторых вариантах осуществления клетки можно вводить (например, путем инъекции) в МПД через иглу, такую как иглу малого диаметра. В некоторых вариантах осуществления используемая игла имеет диаметр приблизительно 22 размера или менее, чтобы снизить вероятность образования грыжи на МПД. При инъекции жидкости в студенистое ядро желательно, чтобы объем вводимого лекарственного средства не превышал приблизительно 3 мл, предпочтительно не превышал приблизительно 1 мл, более предпочтительно находился в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мл. При введении таких небольших объемов можно ожидать, что дополнительный объем жидкости не приведет к значительному повышению давления в студенистом ядре. Если объем вводимой путем прямой инъекции композиции достаточно велик, чтобы создать риск получения слишком большого давления в студенистом ядре, то предпочтительно перед прямой инъекцией удалить по меньшей мере часть студенистого ядра. В некоторых вариантах осуществления объем удаляемой части студенистого ядра по существу равен объему вводимой композиции. Например, объем удаляемой части студенистого ядра может составлять приблизительно 80-120% объема вводимой композиции. В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, перед введением концентрируют.
Клетки, которые можно использовать в способах, композициях и наборах, описанных в настоящем документе, можно получить из пуповин млекопитающих, собранных во время или сразу после разрешения полностью выношенной или недоношенной беременности, например после отделения при рождении или хирургического удаления при кесаревом сечении. Перед выделением клеток из ткани пуповины удаляют кровь и продукты распада клеток, например, путем промывки любой подходящей средой или буфером.
Клетки можно выделить из ткани пуповины механически или ферментативным расщеплением. Предпочтительными ферментами являются металлопротеазы, нейтральные протеазы и муколитические протеазы. Например, для отделения клеток от ткани пуповины можно использовать различные комбинации коллагеназы, диспазы и гиалуронидазы. Специалист в данной области определит, что известно множество способов таких ферментативных обработок для выделения клеток из различных тканей-источников. Например, для способов настоящего изобретения можно использовать комбинации ферментов серии LIBERASE Blendzyme (Roche). Известны и другие источники ферментов, и специалист в данной области также может выделить такие ферменты непосредственно из их природных источников. Специалист в данной области также может оценивать возможности новых или дополнительных ферментов или комбинаций ферментов для выделения клеток, составляющих предмет настоящего изобретения. Предпочтительная продолжительность ферментативной обработки составляет 0,5, 1, 1,5 или 2 часа или более.
Выделенные клетки можно использовать для инициирования клеточных культур. Выделенные клетки переносят в стерильные сосуды для культивирования ткани без покрытия или с покрытием внеклеточным матриксом или лигандами, такими как ламинин, коллаген (нативный, денатурированный, ателло или сшитый), желатин, фибронектин и другие белки внеклеточного матрикса. Клетки, полученные из ткани пуповины, культивируют в любой культуральной среде, способной поддерживать рост клеток, такой как, без ограничений, DMEM (с высоким или низким содержанием глюкозы), улучшенная DMEM, DMEM/MCDB 201, основная среда Игла, среда F10 Хэма (F10), среда F-12 Хэма (F12), среда Хейфлика, модифицированная по способу Искова среда Дульбекко, ростовая среда для мезенхимальных стволовых клеток (MSCGM), DMEM/F12, среда RPMI 1640 и CELL-GRO-FREE. В культуральную среду можно дополнительно ввести один или более компонентов, включая, например, фетальную бычью сыворотку, предпочтительно приблизительно 2-15% (об./об.); лошадиную сыворотку; человеческую сыворотку; фетальную телячью сыворотку; бета-меркаптоэтанол, предпочтительно приблизительно 0,001% (об./об.); один или более факторов роста, например фактор роста тромбоцитов (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), фактор ингибирования лейкоцитов (LIF) и эритропоэтин; аминокислоты, включая L-валин; и один или более антибиотиков и/или антимикотических агентов для контроля за микробным заражением, таких как, например, пенициллин G, стрептомицина сульфат, амфотерицин B, гентамицин и нистатин, по отдельности или в комбинации.
2
2
2
Клетки высевают в сосуды для культивирования с плотностью, позволяющей клеткам расти. В одном варианте осуществления клетки культивируют в атмосфере с содержанием CO от приблизительно 0 до приблизительно 5 об.%. В некоторых вариантах осуществления клетки культивируют в атмосфере с содержанием O от приблизительно 2 до приблизительно 25%, предпочтительно в атмосфере с содержанием O от приблизительно 5 до приблизительно 20%. Клетки предпочтительно культивируют при температуре от приблизительно 25 до приблизительно 40°C и более предпочтительно культивируют при температуре 37°C. Среда в сосуде для культивирования может быть неподвижной или перемешиваемой, например, с использованием биореактора. Клетки, полученные из ткани пуповины, предпочтительно выращивают в условиях низкого окислительного стресса (например, с добавлением глутатиона, витамина C, каталазы, витамина E, N-ацетилцистеина), что означает отсутствие или минимальный уровень свободнорадикальных повреждений культивируемых клеток.
Клетки, полученные из ткани пуповины, пассируют или переносят в отдельный сосуд для культивирования, содержащий свежую среду того же типа или другого типа по сравнению с первоначально использованной, в которой популяцию клеток можно митотически размножить. Клетки настоящего изобретения можно применять на любой стадии от пассажа 0 до старения. Клетки предпочтительно пассируют от приблизительно 3 до приблизительно 25 раз, более предпочтительно пассируют от приблизительно 4 до приблизительно 12 раз и предпочтительно пассируют 10 или 11 раз. Для подтверждения выделения клональной популяции клеток можно провести клонирование и/или субклонирование.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения клетки можно выращивать (размножать) на микроносителе. Микроносители представляют собой частицы, сферы или гранулы, которые можно использовать для закрепления и выращивания в культуре опорнозависимых клеток. Микроносители могут быть сплошными, пористыми или представлять собой сплошное ядро с пористым покрытием. Примеры подходящих микроносителей без ограничений включают в себя Cytodex 1, Cytodex 2, Cytodex 3 (GE Healthcare Life Sciences, г. Пискатауэй, штат Нью-Джерси) или HILLEX (SoloHill Engineering, Inc., г. Энн-Арбор, штат Мичиган). Примеры подходящих микроносителей и компонентов микроносителей раскрыты в публикации патента США № 2008/0166328, описание которого полностью включено в настоящий документ путем ссылки.
Различные типы клеток, присутствующих в ткани пуповины, можно разделить на субпопуляции. Для этого можно использовать стандартные способы разделения клеток, включая без ограничений ферментативную обработку; клонирование и выбор конкретных типов клеток, например, без ограничений, выбор на основе морфологических и/или биохимических маркеров; выборочное выращивание требуемых клеток (положительный отбор), выборочное разрушение ненужных клеток (отрицательный отбор); разделение на основе различной способности к агглютинации клеток в смешанной популяции, например, с использованием соевого агглютинина; процедуры замораживания-оттаивания; различные адгезионные свойства клеток в смешанной популяции; фиотрацию; стандартное и зональное центрифугирование; элютриационное центрифугирование (центрифугирование в противотоке); разделение в поле тяжести; противоточное распределение; электрофорез; сортировку флуоресцентно-активированных клеток (FACS); и т.п.
Примеры клеток, выделенных из ткани пуповины, депонированы в коллекции American Type Culture Collection 10 июня 2004 г. под следующими номерами доступа ATCC: (1) штамм UMB 022803 (P7) депонирован под номером доступа PTA-6067; и (2) штамм UMB 022803 (P17) депонирован под номером доступа PTA-6068.
Клетки, полученные из ткани пуповины, можно характеризовать, например, по характеристикам роста (например, способность к удвоению популяции, время удвоения, число пассажей до старения), анализу кариотипа (например, нормальный кариотип; материнская или неонатальная линия), проточной цитометрией (например, анализ FACS), иммуногистохимически и/или иммуноцитохимически (например, на обнаружение эпитоп), по профилю экспрессии генов (например, с использованием генных чипов; полимеразной цепной реакцией (например, ПЦР с обратной транскриптазой, ПЦР в реальном времени и стандартный ПЦР)), белковым чипом, по секреции белков (например, по анализу коагулирующей активности плазмы или анализу PDC-кондиционированной среды, например, с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА)), реакции смешанной культуры лимфоцитов (например, как меры стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови) и/или другими известными специалистам способами.
В различных вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, обладают одной или более из следующих характеристик роста: клеткам для роста в культуре необходим L-валин; клетки могут расти в атмосфере с содержанием кислорода от приблизительно 5% до по меньшей мере приблизительно 20%; клетки имеют потенциал к по меньшей мере приблизительно 40 удвоениям в культуре до достижения старения; и/или клетки закрепляются и размножаются на поверхности сосуда для культивирования ткани с покрытием или без покрытия, причем поверхность сосуда для культивирования ткани с покрытием содержит покрытие из желатина, ламинина, коллагена, полиорнитина, витронектина или фибронектина.
В некоторых вариантах осуществления клетки имеют нормальный кариотип, который сохраняется в процессе пассирования клеток при культивировании. Кариотипирование особенно полезно для идентификации и отличения неонатальных клеток от материнских клеток, полученных из плаценты. Способы кариотипирования хорошо разработаны и известны специалистам в данной области.
В некоторых вариантах осуществления клетки можно характеризовать по выработке определенных белков, включая выработку по меньшей мере одного из тканевого фактора, виментина и альфа-актина гладких мышц; выработку по меньшей мере одного из белков CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа, PD-L2 и маркеров клеточной поверхности HLA-A,B,C по результатам анализа с использованием, например, проточной цитометрии. В других вариантах осуществления клетки можно характеризовать по отсутствию выработки по меньшей мере одного из белков CD31, CD34, CD45, CD80, CD86, CD117, CD141, CD178, B7-H2, HLA-G и маркеров клеточной поверхности HLA-DR, HLA-DP и/или HLA-DQ по результатам анализа с использованием любых подходящих способов, таких как проточная цитометрия. В некоторых вариантах осуществления предпочтительными являются клетки, которые вырабатывают по меньшей мере два из тканевого фактора, виментина и альфа-актина гладких мышц. В некоторых вариантах осуществления предпочтительными являются клетки, вырабатывающие все три из тканевого фактора, виментина и альфа-актина гладких мышц.
В некоторых вариантах осуществления клетки имеют, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, повышенный уровень экспрессии для гена, кодирующего по меньшей мере один из: интерлейкина 8; ретикулона 1; CXCL1 (хемокинового (мотив C-X-C) лиганда 1)/стимулятора активности роста меланомы, альфа; CXCL6 хемокинового (мотив C-X-C) лиганда 6/гранулоцитарного хемотаксического белка 2; CXCL6 (хемокинового (мотив C-X-C) лиганда 3); TNFAIP3 (индуцируемый фактором некроза ткани альфа белок 3).
В других вариантах осуществления клетки имеют, по сравнению с клеткой человека, представляющей собой фибробласт, мезенхимальную стволовую клетку или клетку костного мозга гребня подвздошной кости, пониженный уровень экспрессии для гена, кодирующего по меньшей мере один из: SHOX2 (содержащий гомеобокс ген short stature 2); HSPB2 (27 кДа белок теплового шока 2); CXCL12 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 12/стромальный фактор 1); эластин (надклапанный аортальный стеноз, синдром Уильямса-Бойрена); мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp586M2022 (из клона DKFZp586M2022); Meox2 (содержащий мезенхимальный гомеобокс ген 2, содержащий гомеобокс блокировки роста ген); SIX1 (гомолог гомеобокс-содержащего гена sine oculis 1) (Drosophila); кристаллин, альфа B; DAAM2 (ассоциированный с белком Disheveled активатор морфогенеза 2); белок DKFZP586B2420; аналог нейтралина 1; тетранектин (связывающийся с плазминогеном белок); STAC (ген, содержащий домен src-гомологии 3 (SH3) и богатый цистеином домен); холестерин 25-гидроксилаза; RUNX3 (связанный с карликовостью фактор транскрипции 3); рецептор интерлейкина 11, альфа; PCOLCE (усилитель проколлаген-C-эндопептитазы); FZD7 (гомолог frizzled 7) (Drosophila); гипотетический ген BC008967; коллаген, тип VIII, альфа 1; тенацин C, TNC (гексабрахион); IRX5 (содержащий гомеобокс IRX белок 5); гефестин; интегрин, бета 8; SV2A (гликопротеин синаптического пузырька 2); NBL1 (нейробластома, ген подавления онкогенности 1); IGFBP2 (связывающийся с инсулинподобным фактором роста белок 2, 36 кДа); кДНК Homo sapiens FLJ12280 fis, клон MAMMA1001744; CRLF1 (подобный цитокиновому рецептору фактор 1); KCNN4 (активируемый кальцием канал средней/низкой проводимости, подсемейство N, член 4); интегрин, бета 7; транскрипционный коактиватор с мотивом связывания с PDZ (TAZ); SIX2 (гомолог гомеобокс-содержащего гена sine oculis 2) (Drosophila); белок KIAA1034; VAMP5 (везикуло-ассоциированный мембранный белок 5/миобревин); EFEMP1 (содержащий EGF фибулин-подобный белок внеклеточного матрикса 1); EGR3 (белок раннего ростового ответа 3); DLX5 (содержащий гомеобокс distal-less ген 5); гипотетический белок FLJ20373; AKR1C3 (альдокеторедуктазы, семейство 1, член C3/3-альфагидроксистероид-дегидрогеназа, тип II); бигликан; транскрипционный коактиватор с мотивом связывания с PDZ (TAZ); фибронектин 1; проэнкефалин; интегрин, бета-подобный 1 (с EGF-подобными повторами); мРНК Homo sapiens, полноразмерная вставка, кДНК, клон EUROIMAGE 1968422; EphA3; белок KIAA0367; NPR3 (рецептор натрийуретического пептида C/гуанилатциклаза C/рецептор атрионатрийуретического пептида C); гипотетический белок FLJ14054; мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp564B222 (из клона DKFZp564B222); BNIP3L (ген белка, подобного белку 3, взаимодействующему с BCL2/19 кДа белком аденовируса); AE-связывающий белок 1; и COX7A1 (полипептид 1 субъединицы VIIa цитохром c оксидазы) (мышечный).
В некоторых вариантах осуществления клетки можно характеризовать по секреции по меньшей мере одного из белков MCP-1, IL-6, IL-8, GCP-2, HGF, KGF, FGF, HB-EGF, BDNF, TPO, MIP1b, RANTES и TIMP1. В некоторых вариантах осуществления клетки можно характеризовать по отсутствию секреции по меньшей мере одного из белков TGF-бета2, ANG2, PDGFbb, MIP1a и VEGF по результатам ИФА.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка обладает двумя или более из перечисленных выше характеристик роста, выработки белков/маркеров клеточной поверхности, экспрессии генов или секреции. В некоторых вариантах осуществления предпочтительными являются клетки, обладающие тремя, четырьмя или пятью или более из указанных характеристик. В некоторых вариантах осуществления предпочтительными являются клетки, обладающие шестью, семью или восемью или более из указанных характеристик. В некоторых вариантах осуществления предпочтительными являются клетки, обладающие всеми из указанных выше характеристик. В других вариантах осуществления полученные из ткани пуповины клетки обладают любыми из характеристик, раскрытых в патентах США № 7510873 и 7524489, описание которых полностью включено в настоящий документ путем ссылки.
Среди клеток, которые являются предпочтительными для использования в различных аспектах настоящего изобретения, имеются клетки, обладающие описанными выше характеристиками, и, в частности, те из них, которые имеют нормальные кариотипы и поддерживают нормальные кариотипы при пассировании, и дополнительно те из них, которые экспрессируют каждый из маркеров CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа и HLA-A,B,C, причем клетки вырабатывают иммунологически обнаруживаемые белки, соответствующие перечисленным маркерам. Также являются предпочтительными те клетки, которые, в дополнение к вышесказанному, не вырабатывают белки, соответствующие любому из маркеров CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 или HLA-DR,DP,DQ, по результатам анализа с использованием любых подходящих способов, таких как проточная цитометрия. Крайне предпочтительными являются клетки, которые не экспрессируют CD117 или HLA-DR или теломеразу.
В некоторых предпочтительных аспектах способы настоящего изобретения содержат введение в МПД с дегенеративными изменениями клеток, полученных или выделенных из ткани пуповины человека, где клетки способны к самообновлению и размножению в культуре, требуют L-валин для роста, могут расти в атмосфере с содержанием кислорода по меньшей мере приблизительно 5%, не вырабатывают CD117 или HLA-DR или теломеразу, экспрессируют альфа-актин гладких мышц и экспрессируют, по отношению к фибробластам, мезенхимальным стволовым клеткам или клеткам костного мозга гребня подвздошной кости человека, повышенные уровни интерлейкина 8 и ретикулона 1. Клетки, выделенные из ткани пуповины человека, перед введением можно размножить в культуре. В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины человека, имеют потенциал к дифференцированию в клетки фенотипа клеток МПД, такого как, без ограничений, фенотип клеток фиброзного кольца или фенотип клеток студенистого ядра. Клетки, полученные из ткани пуповины, могут интегрироваться в МПД пациента, или, в альтернативном варианте осуществления, могут обеспечивать поддержку для роста или стимулирование для дифференцирования для естественно присутствующих в МПД стволовых клеток. Выживаемость введенных клеток не является определяющим фактором для получения успешного результата при их применении, когда наблюдается улучшение состояния или течения болезни, связанной с дегенеративными изменениями МПД или общим состоянием здоровья пациента. В некоторых вариантах осуществления клетки предпочтительно по меньшей мере частично интегрируются в, размножаются или выживают в организме пациента. В некоторых вариантах осуществления пациент получает положительный эффект от лечения, например, благодаря способности введенных клеток поддерживать рост других клеток, включая стволовые клетки или клетки-предшественники, присутствующие в МПД и/или окружающих тканях, благодаря прорастанию ткани или васкуляризации ткани и/или благодаря присутствию полезных клеточных факторов, хемокинов, цитокинов и т.п., но при этом клетки не интегрируются в или размножаются в организме пациента. В некоторых аспектах пациент получает положительный эффект от клеточной терапии, но сами клетки не выживают в течение длительного времени в организме пациента. Например, в некоторых вариантах осуществления происходит постепенное понижение численности, жизнеспособности или биохимической активности клеток. В некоторых вариантах осуществления такому понижению может предшествовать период активности, например роста, деления или биохимической активности. В некоторых вариантах осуществления состарившиеся, нежизнеспособные или даже мертвые клетки способны также оказывать терапевтический эффект.
Некоторые клетки, обладающие потенциалом к дифференцированию по линиям, ведущим к различным фенотипам, неустойчивы и, таким образом, могут спонтанно дифференцироваться. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предпочтительными являются клетки, которые спонтанно не дифференцируются. Например, некоторые предпочтительные клетки, при выращивании в ростовой среде, являются по существу устойчивыми по отношению к клеточным маркерам, вырабатываемым на их поверхности, и по отношению к картинам экспрессии различных генов, например, по результатам анализа с использованием определения профиля экспрессии генов, например, с использованием чипов на нуклеиновые кислоты или полипептиды. Такие клетки остаются по существу постоянными, например, в отношении характеристик маркеров поверхности при пассировании, на протяжении множества удвоений популяции.
В некоторых вариантах осуществления в описанных в настоящем документе способах клетки, полученные из ткани пуповины, индуцируют для дифференцирования по линии клеток МПД в направлении фенотипов клеток МПД или их клеток-предшественников или более примитивных родственников. Клетки, полученные из ткани пуповины, могут интегрироваться в МПД пациента, или, в альтернативном варианте осуществления, могут обеспечивать поддержку для роста или стимулирование для дифференцирования для естественно присутствующих в МПД стволовых клеток. Выживаемость введенных клеток не является определяющим фактором для получения успешного результата при их применении, когда наблюдается улучшение состояния или течения болезни, связанной с дегенеративными изменениями МПД или общим состоянием здоровья пациента. В некоторых вариантах осуществления клетки предпочтительно по меньшей мере частично интегрируются в, размножаются или выживают в организме пациента. В некоторых вариантах осуществления пациент получает положительный эффект от лечения, например, благодаря способности введенных клеток поддерживать рост других клеток, включая стволовые клетки или клетки-предшественники, присутствующие в МПД и/или окружающих тканях, благодаря прорастанию ткани или васкуляризации ткани и/или благодаря присутствию полезных клеточных факторов, хемокинов, цитокинов и т.п., но при этом клетки не интегрируются в или размножаются в организме пациента. В некоторых аспектах пациент получает положительный эффект от клеточной терапии, но сами клетки не выживают в течение длительного времени в организме пациента. Например, в некоторых вариантах осуществления происходит постепенное понижение численности, жизнеспособности или биохимической активности клеток. В некоторых вариантах осуществления такому понижению может предшествовать период активности, например роста, деления или биохимической активности. В некоторых вариантах осуществления состарившиеся, нежизнеспособные или даже мертвые клетки способны также оказывать терапевтический эффект.
В некоторых аспектах способы настоящего изобретения могут дополнительно содержать оценку пациентов на предмет улучшения структуры и/или функций МПД и/или улучшений в общем состоянии здоровья. Такие оценки можно проводить в соответствии с любыми известными специалистам способами, включая описанные и проиллюстрированные в настоящем документе.
В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, вводят в комбинации с клетками одного или более других типов, включая без ограничений другие мультипотентные или плюрипотентные клетки или хондроциты, хондробласты, остеоциты, остеобласты, остеокласты, выстилающие клетки кости или клетки костного мозга. Клетки других типов можно смешивать с клетками, полученными из ткани пуповины, непосредственно во время или незадолго перед введением, либо клетки можно совместно культивировать в течение некоторого времени перед введением. В некоторых вариантах осуществления популяция клеток, полученных из ткани пуповины, поддерживает выживание, пролиферацию, рост, поддержание, созревание, дифференцирование и/или повышенную активность клеток одного или более других типов, введенных вместе с клетками, полученными из ткани пуповины, и/или наоборот.
В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, обеспечивают трофическую поддержку для клеток других типов, вместе с которыми их вводят, и/или наоборот. В некоторых вариантах осуществления желательно, чтобы клетки, полученные из ткани пуповины, и совместно культивируемые с ними клетки находились в контакте. Этого можно достичь, например, высевая клетки в культуральной среде или на подходящий культуральный субстрат в виде неоднородной популяции клеток. В альтернативном варианте осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, можно сначала вырастить до конфлюентности и затем использовать их в качестве субстрата для совместно культивируемых с ними клеток. В других вариантах осуществления совместно культивируемые клетки можно культивировать в контакте с кондиционированной средой, внеклеточным матриксом и/или клеточным лизатом клеток, полученных из ткани пуповины.
В различных вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, можно вводить в комбинации с биологически активным агентом, таким как агент, модулирующий пролиферацию, дифференцирование и/или иную клеточную активность. Такой агент можно вводить до, после или одновременно с клетками, полученными из ткани пуповины. Выбор конкретного используемого агента оставляется на усмотрение медицинского работника, ведущего лечение пациента, и может варьироваться в зависимости от конкретных потребностей или состояния пациента. Выбранный агент можно использовать в различных целях, таких как, без ограничений, облегчение введения клеток, улучшение восстановления и/или регенерации МПД, улучшение общего состояния здоровья пациента, снижение боли, снижение или исключение отторжения трансплантированных клеток и т.п.
Примеры агентов, которые можно вводить вместе с клетками, полученными из ткани пуповины, без ограничений включают в себя витамины и другие питательные добавки; антитромбогенные агенты; антиапоптозные агенты; противовоспалительные агенты; иммуносупрессанты (например, циклоспорин, рапамицин); антиоксиданты; гормоны; гликопротеины; фибронектин; пептиды и белки; углеводы (простые и/или сложные); протеогликаны; олигонуклеотиды (смысловые и/или антисмысловые ДНК и/или РНК); костные морфогенетические белки (BMP); факторы дифференцирования; антитела (например, антитела к инфекционным агентам, опухолям, лекарственным препаратам или гормонам); и реагенты генной терапии. В некоторых вариантах осуществления агент представляет собой вещество, такое как анальгетик, противовоспалительный препарат, наркотический препарат, расслабляющий мышцы препарат или их комбинацию, которая облегчает один или более симптомов заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями МПД.
В некоторых вариантах осуществления дополнительный агент представляет собой трофический фактор или иной агент, который оказывает трофический эффект для клеток, полученных из ткани пуповины, для дополнительных клеток, вводимых вместе с клетками, полученными из ткани пуповины, для эндогенных клеток МПД (например, клеток фиброзного кольца, клеток студенистого ядра) и/или для других эндогенных клеток (например, клеток-предшественников клеток соединительной ткани). В некоторых вариантах осуществления трофический фактор представляет собой фактор, секретируемый клетками, полученными из ткани пуповины, и в этом случае его можно получить из препарата таких клеток, полученных из ткани пуповины, или из другого источника. Примеры таких факторов или агентов без ограничений включают в себя членов семейства факторов роста фибробластов, включая кислотный и щелочной факторы роста фибробластов (FGF-1 и FGF-2) и FGF-4; членов семейства факторов роста тромбоцитов (PDGF), включая PDGF-AB, PDGF-BB и PDGF-AA; факторы EGF, членов семейства инсулиноподобных факторов роста (IGF), включая IGF-I и -II; суперсемейство TGF-бета, включая TGF-бета1, 2 и 3 (включая MP-52), остеоид-индуцирующий фактор (OIF), ангиогенины, эндотелины, фактор роста гепатоцитов и фактор роста кератиноцитов; членов семейства костных морфогенетических белков (BMP), таких как BMP-1, BMP-3, BMP-2, OP-1, BMP-2A, BMP-2B, BMP-4, BMP-7 и BMP-14; HBGF-1 и HBGF-2; факторы роста и дифференцирования (GDF); членов семейства белков hedgehog, включая indian hedgehog, sonic hedgehog и desert hedgehog; ADMP-1; GDF-5; TIMP-1 членов семейства колониестимулирующих факторов (CSF), включая CSF-1, G-CSF и GM-CSF; а также их аналоги и изоформы.
В некоторых вариантах осуществления фактор роста выбирают из группы, состоящей из TGF-бета, TGF-бета1, FGF, bFGF и IGF-1. Считается, что эти факторы роста стимулируют регенерацию студенистого ядра, стимулируют пролиферацию и/или дифференцирование хондроцитов и стимулируют секретирование внеклеточного матрикса. В некоторых вариантах осуществления фактор роста представляет собой TGF-бета. Более предпочтительно, TGF-бета вводят в количестве от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 5000 нг/мл, например от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 500 нг/мл, например от приблизительно 100 нг/мл до приблизительно 300 нг/мл.
В некоторых вариантах осуществления в качестве дополнительного терапевтического агента используют концентрат тромбоцитов. В некоторых вариантах осуществления концентрат тромбоцитов является аутогенным. В некоторых вариантах осуществления концентрат тромбоцитов представляет собой богатую тромбоцитами плазму (PRP). Использование PRP является преимуществом, поскольку она содержит факторы роста, которые могут стимулировать возобновление роста ВКМ, и поскольку ее фибриновый матрикс создает подходящий каркас для роста новой ткани. В некоторых вариантах осуществления дополнительный агент представляет собой клеточный лизат, растворимую клеточную фракцию, обогащенную мембранами клеточную фракцию, клеточные культуральные среды (например, кондиционированные среды) или внеклеточный матрикс, полученные из клеток, полученных из ткани пуповины, или других клеток.
В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, вводят в сочетании с ингибитором HMG-CoA редуктазы, включая без ограничений симвастатин, правастатин, ловастатин, флувастатин, церивастатин и аторвастатин.
В некоторых вариантах осуществления клетки, полученные из ткани пуповины, модифицируют способами генной инженерии для экспрессирования одного или более агентов, таких как, без ограничений, один или более дополнительных терапевтических агентов, описанных в настоящем документе. Клетки настоящего изобретения можно модифицировать способами генной инженерии с использованием различных векторов, включая без ограничений интегрирующие вирусные векторы, например ретровирусный вектор или векторы, связанные с аденовирусами; неинтегрирующие реплицирующиеся векторы, например векторы вируса папилломы, векторы SV40, аденовирусные векторы; или вирусные векторы с нарушенной репликацией. Другие способы введения ДНК в клетки включают в себя применение липосом, электропорации, генной пушки или прямую инъекцию ДНК.
Клетки-хозяева предпочтительно трансформируют или трансфицируют ДНК под контролем или в функциональной связи с одним или более соответствующими элементами управления экспрессией, такими как промоторные или усилительные последовательности, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования и т.п., и селектируемым маркером.
После введения экзогенной ДНК генно-модифицированным клеткам можно позволить вырасти в обогащенной среде и затем перевести их в селективную среду. Селектируемый маркер в экзогенной ДНК придает устойчивость к селекции и позволяет клетке стабильно интегрировать экзогенную ДНК, например, вводимую на плазмиде, в свои хромосомы и вырасти с образованием фокусов, которые затем можно клонировать и размножить в клеточные линии. Данный способ можно эффективно использовать для конструирования клеточных линий, которые экспрессируют продукт гена.
Для индуцирования экспрессии вставленного гена можно использовать любой промотор. Например, вирусные промоторы без ограничений включают в себя промотор/усилитель CMV, SV40, папилломавирус, вирус Эпштейна-Барра или промотор гена эластина. Предпочтительно управляющие элементы, используемые для контроля над экспрессией рассматриваемого гена, должны позволять осуществление регулируемой экспрессии гена таким образом, чтобы в условиях in vivo продукт синтезировался только в случае необходимости. При необходимости временной экспрессии предпочтительно используют конститутивные промоторы в неинтегрирующем векторе и/или векторе с нарушенной репликацией. В альтернативном варианте осуществления при необходимости для активации экспрессии вставленного гена можно использовать индуцируемые промоторы. Индуцируемые промоторы без ограничений включают в себя промоторы, связанные с металлотионеином и белками теплового шока.
Клетки настоящего изобретения можно модифицировать способами генной инженерии для «выключения» или «выбивания» экспрессии факторов, стимулирующих воспаление или отторжение имплантата в месте введения. Ниже описаны способы отрицательной модуляции для снижения уровней экспрессии целевого гена или активности продукта целевого гена. В настоящем документе термин ʺотрицательная модуляцияʺ означает снижение уровня и/или активности продукта целевого гена по отношению к уровню и/или активности продукта целевого гена в отсутствии модулирующей обработки. Экспрессию гена можно уменьшить или выключить с помощью ряда способов, включая, например, ингибирование экспрессии путем полной инактивации гена (которую общепринято называют ʺнокаутомʺ) с помощью способа гомологичной рекомбинации. Как правило, экзон, кодирующий важный участок белка (или экзон в положении 5’ к данному участку), прерывают положительно селектируемым маркером, например, neo, тем самым блокируя получение нормальной мРНК с целевого гена, что приводит к инактивации гена. Ген также можно инактивировать путем создания делеции в части гена или путем удаления всего гена. Использование конструкции с двумя участками гомологии к целевому гену, находящимися в геноме далеко от друга, позволяет вырезать соединяющие эти два участка последовательности (Mombaerts et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1991 г.; 88:3084-3087).
Для снижения уровня активности целевого гена в соответствии с настоящим изобретением также можно использовать антисмысловые, малые интерферирующие РНК, ДНК-ферменты, РНК-ферменты и молекулы рибозима, которые ингибируют экспрессию целевого гена. Например, показано, что молекулы антисмысловой РНК, ингибирующие экспрессию главных комплексов генов гистосовместимости (HLA), являются наиболее универсальными в отношении иммунных ответов. Кроме того, для снижения уровня активности целевого гена можно дополнительно использовать трехцепочечные молекулы.
Этот и другие способы подробно описаны в руководстве L. G. Davis et al. (eds), Basic Methods In Molecular Biology, 2-е издание, Appleton & Lange, Norwalk, Conn. (1994 г.), включенном в настоящий документ путем ссылки.
IL-1 является мощным стимулятором рассасывания хрящевой ткани и выработки медиаторов воспаления хондроцитами (Campbell et al., J. Immun., 1991 г.; 147(4):1238-1246). Используя любой из описанных выше способов, можно выключить экспрессию IL-1 в клетках настоящего изобретения для снижения опасности рассасывания имплантированной хрящевой ткани или выработки медиаторов воспаления клетками настоящего изобретения. Аналогичным образом, можно выключить экспрессию молекул MHC класса II для снижения опасности отторжения имплантированной ткани.
После модификации клеток настоящего изобретения способами генной инженерии их можно непосредственно имплантировать в организм пациента для терапии заболевания или состояния, связанного с дегенеративными изменениями МПД, например, путем выработки продукта, обладающего терапевтическим эффектом в отношении одного или более симптомов заболевания или состояния, такого как продукт противовоспалительного гена. В альтернативном варианте осуществления клетки, модифицированные способами генной инженерии, можно использовать для получения новой ткани in vitro, которую затем имплантируют субъекту согласно приведенному в настоящем документе описанию.
В некоторых аспектах в настоящем документе описаны фармацевтические композиции, которые содержат клетки, полученные из ткани пуповины, согласно приведенному в настоящем документе описанию, и фармацевтически приемлемый носитель. Описанные в настоящем документе фармацевтические композиции могут индуцировать клетки, полученные из ткани пуповины, для дифференцирования по линии клеток МПД, например, для получения фенотипа клеток студенистого ядра и/или фенотипа клеток фиброзного кольца. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе фармацевтические композиции модулируют клеточные процессы эндогенных клеток МПД и/или клеток окружающих тканей, включая без ограничений деление клеток, их дифференцирование и экспрессию генов. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем документе фармацевтические композиции стимулируют восстановление и регенерацию МПД с дегенеративными изменениями.
Также в объем настоящего изобретения входят наборы для реализации на практике способов, обладающих признаками изобретения. В одном аспекте в настоящем документе описаны наборы для терапии пациента, имеющего заболевание или повреждение по меньшей мере одного МПД. Такие наборы содержат фармацевтически приемлемый носитель, клетки, полученные из ткани пуповины человека, в количестве, эффективном для терапии такого заболевания или состояния, такие как клетки, описанные и проиллюстрированные в настоящем документе, и инструкции по использованию набора способом терапии пациента, имеющего заболевание или состояние, связанное с дегенеративными изменениями МПД. Наборы могут дополнительно содержать по меньшей мере один реагент и инструкции для культивирования клеток. Наборы могут дополнительно содержать популяцию клеток по меньшей мере одного другого типа и/или по меньшей мере один агент.
В некоторых аспектах наборы содержат фармацевтически приемлемый носитель, лизат, внеклеточный матрикс или кондиционированную среду, приготовленные из клеток, полученных из ткани пуповины человека, причем клетки имеют характеристики, описанные и проиллюстрированные в настоящем документе. Наборы можно использовать для облегчения восстановления и/или регенерации поврежденного или пораженного МПД.
Следующие примеры предназначены для более подробного описания настоящего изобретения. Они призваны проиллюстрировать, но ни в коей мере не ограничить настоящее изобретение. Дополнительно, при использовании в приведенных ниже примерах и в других местах настоящего описания, клетки, полученные из ткани пуповины, которые можно использовать в способах настоящего изобретения, можно выделить и охарактеризовать в соответствии с раскрытием патентов США № 7510873 и 7524489, содержание которых полностью включено путем ссылки в тех частях, где они относятся к описанию, выделению и характеризации клеток, полученных из ткани пуповины.
ПРИМЕР 1
Выделение клеток, полученных из ткани пуповины
2
Пуповины получили в Национальном центре по обмену материалами для исследования заболеваний (National Disease Research Interchange/NDRI, г. Филадельфия, штат Пенсильвания). Ткани были получены после нормально прошедших родов. Протокол выделения клеток проводили в асептических условиях в ламинарном боксе. Для удаления крови и продуктов распада клеток пуповину промывали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ; Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния) в присутствии антимикотика и антибиотика (100 единиц/миллилитр пенициллина, 100 микрограмм/миллилитр стрептомицина, 0,25 микрограмма/миллилитр амфотерицина B). Затем ткани механически диссоциировали в планшетах для культивирования тканей площадью 150 см в присутствии 50 миллилитров среды (среды DMEM с низким содержанием глюкозы или среды DMEM с высоким содержанием глюкозы; Invitrogen) до измельчения ткани в мелкую пульпу. Размельченные ткани перенесли в конические пробирки объемом 50 миллилитров (приблизительно по 5 грамм ткани в пробирку). Затем ткани расщепляли либо в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы, либо в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с высоким содержанием глюкозы, в каждом случае с добавлением антимикотика и антибиотика, как описано выше. В некоторых экспериментах использовали ферментативную смесь коллагеназы и диспазы (C:D; коллагеназа (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури), 500 единиц/миллилитр; и диспаза (Invitrogen), 50 единиц/миллилитр в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы). В других экспериментах использовали смесь коллагеназы, диспазы и гиалуронидазы (C:D:H; коллагеназа, 500 единиц/миллилитр; диспаза, 50 единиц/миллилитр; и гиалуронидаза (Sigma), 5 единиц/миллилитр, в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы). Конические пробирки, содержащие ткань, среду и расщепляющие ферменты, инкубировали при температуре 37°C на орбитальном шейкере (Environ, Бруклин, г. Нью-Йорк) при скорости 225 об/мин в течение 2 ч.
После расщепления ткани центрифугировали при 150×g в течение 5 минут и отсасывали супернатант. Клеточный осадок повторно суспендировали в 20 миллилитрах ростовой среды (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла с низким содержанием глюкозы (Invitrogen), 15 процентов (об./об.) фетальной бычьей сыворотки (FBS; бычья сыворотка с определенным составом; партия AND18475; Hyclone, г. Логан, штат Юта), 0,001% (об./об.) 2-меркаптоэтанола (Sigma), 1 миллилитр на 100 миллилитров антибиотика/антимикотика, как описано выше. Клеточную суспензию фильтровали через нейлоновый клеточный фильтр с размером пор 70 микрометров (BD Biosciences). Фильтр дополнительно промыли 5 миллилитрами ростовой среды. Затем клеточную суспензию пропустили через нейлоновый клеточный фильтр с размером пор 40 микрометров (BD Biosciences) и фильтр дополнительно промыли 5 миллилитрами ростовой среды.
Фильтрат повторно суспендировали в ростовой среде (до общего объема 50 миллилитров) и центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Супернатант отсасывали и клетки повторно суспендировали в 50 миллилитрах свежей ростовой среды. Описанную процедуру повторили еще дважды.
После последнего центрифугирования супернатант отсосали и клеточный осадок повторно суспендировали в 5 миллилитрах свежей ростовой среды. Количество жизнеспособных клеток определили окрашиванием трипановым синим. Затем клетки культивировали в стандартных условиях.
2
2
2
Клетки, выделенные из пуповин, высевали с плотностью 5000 клеток/см на покрытые желатином колбы T-75 см (Corning Inc., г. Корнинг, штат Нью-Йорк) в ростовой среде с добавлением антибиотиков/антимикотиков, как описано выше. Через 2 суток (в разных экспериментах клетки инкубировали в течение 2-4 суток) истощенную среду отсасывали из колб. Клетки трижды промывали ФСБ для удаления продуктов распада клеток и клеток крови. Затем клетки снова заливали ростовой средой и позволяли культуре расти до конфлюентности (приблизительно 10 суток от пассажа 0) до пассажа 1. При последующих пассированиях (от пассажа 1 до пассажа 2 и т.п.) клетки достигали субконфлюентности (75-85 процентов конфлюентности) за 4-5 суток. Для данных последующих пассирований клетки высевали с плотностью 5000 клеток/см. Клетки растили в увлажняемом инкубаторе в атмосфере с 5 процентами диоксида углерода и атмосферным содержанием кислорода при температуре 37°C.
ПРИМЕР 2
Оценка маркеров поверхности клеток, полученных из послеродового материала человека, с использованием проточной цитометрии
Ткани пуповины охарактеризовали с использованием проточной цитометрии, получив профиль экспрессии для установления отличительных признаков полученных из них клеток.
Клетки культивировали в ростовой среде (Gibco г. Карлсбад, штат Калифорния) с добавлением пенициллина/стрептомицина. Клетки культивировали в обработанных плазмой колбах для культивирования тканей T75, T150 и T225 (Corning, г. Корнинг, штат Нью-Йорк) до конфлюентности. Ростовые поверхности колб покрывали желатином инкубацией с 2% (в/об) раствором желатина (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) в течение 20 минут при комнатной температуре.
7
Закрепившиеся клетки в колбах промывали ФСБ и отделяли с помощью трипсина/ЭДТА. Клетки собирали, центрифугировали и повторно суспендировали в 3% (об./об.) FBS в ФСБ при концентрации 1×10 клеток на миллилитр. В соответствии с инструкциями производителя добавляли антитело на рассматриваемый маркер клеточной поверхности (см. ниже) к ста микролитрам клеточной суспензии и инкубировали смесь в темноте в течение 30 минут при температуре 4°C. После инкубации клетки промывали ФСБ и центрифугировали для удаления несвязавшихся антител. Клетки повторно суспендировали в 500 микролитрах ФСБ и анализировали с использованием проточной цитометрии. Анализ с использованием проточной цитометрии проводили на анализаторе FACScalibur (Becton Dickinson, г. Сан-Хосе, штат Калифорния).
Применяли следующие антитела на маркеры клеточной поверхности:
Антитело
Производитель
Номер по каталогу
CD10
BD Pharmingen (г. Сан-Диего, штат Калифорния)
555375
CD13
BD Pharmingen
555394
CD31
BD Pharmingen
555446
CD34
BD Pharmingen
555821
CD44
BD Pharmingen
555478
CD45RA
BD Pharmingen
555489
CD73
BD Pharmingen
550257
CD90
BD Pharmingen
555596
CD117
BD Pharmingen
340529
CD141
BD Pharmingen
559781
PDGFr-альфа
BD Pharmingen
556002
HLA-A, B, C
BD Pharmingen
555553
HLA-DR, DP, DQ
BD Pharmingen
555558
IgG-FITC
Sigma (г. Сент-Луис, штат Миссури)
F-6522
IgG-PE
SiGMA
P-4685
Клетки анализировали на пассажах 8, 15 и 20 и сравнивали друг с другом клетки, полученные из ткани пуповины от разных доноров. Кроме того, клетки, культивировавшиеся на покрытых желатином сосудах, сравнивали с клетками, культивировавшимися на сосудах без покрытия.
Проанализированные клетки, полученные из пуповины, показали положительную экспрессию CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, на что указывают повышенные значения интенсивности флуоресценции по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении определяемой экспрессии CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения интенсивности флуоресценции, сравнимые с величинами для используемого в качестве контроля IgG. Во внимание были приняты вариации значений флуоресценции положительных кривых. Средние значения (т.е. CD13) и диапазон значений (т.е. CD90) положительных кривых имели некоторые вариации, но сами кривые имели нормальный вид, что подтверждает однородность популяции. Обе кривые по отдельности показали значения, превышающие значения для используемого в качестве контроля IgG.
Клетки на пассажах 8, 15 и 20 экспрессировали CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, на что указывают повышенные значения интенсивности флуоресценции по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения интенсивности флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG.
Изоляты от разных доноров показали положительную экспрессию CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, на что указывают повышенные значения интенсивности флуоресценции по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении экспрессии CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения интенсивности флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG.
Клетки, размножаемые на покрытых желатином и на непокрытых колбах, были положительными в отношении экспрессии CD10, CD13, CD44, CD73, CD 90, PDGFr-альфа и HLA-A, B, C, при этом значения интенсивности флуоресценции были повышены по сравнению с используемым в качестве контроля IgG. Данные клетки были отрицательными в отношении экспрессии CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ, на что указывают значения интенсивности флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG.
Таким образом, клетки, полученные из ткани пуповины, положительны в отношении экспрессии CD10, CD13, CD44, CD73, CD90, PDGFr-альфа, HLA-A,B,C и отрицательны в отношении экспрессии CD31, CD34, CD45, CD117, CD141 и HLA-DR, DP, DQ. Данные отличительные признаки были стабильны при варьировании различных переменных, включая донора, номер пассажа и покрытие поверхности сосуда для культивирования. Наблюдаются некоторые вариации в средних значениях и диапазонах изменения кривых гистограмм значений флуоресценции, но все положительные кривые при всех тестируемых условиях имели нормальный вид и значения интенсивности флуоресценции, превышающие значения для используемого в качестве контроля IgG, тем самым подтверждая, что клетки представляют собой однородную популяцию с положительной экспрессией маркеров.
ПРИМЕР 3
Иммуногистохимическая характеризация клеточных фенотипов
Ткани пуповины человека собирали и фиксировали погружением в 4% (в/об) раствор параформальдегида в течение ночи при температуре 4°C. Иммуногистохимический анализ проводили с использованием антител, направленных на следующие эпитопы: виментин (1:500; Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури), дезмин (1:150, выработанные на кролика; Sigma; или 1:300, выработанные на мышь; Chemicon, г. Темекула, штат Калифорния), альфа-актин гладких мышц (SMA; 1:400; Sigma), цитокератин 18 (CK18; 1:400; Sigma), фактор фон Виллебранда (vWF; 1:200; Sigma) и CD34 (CD34 человека, класс III; 1:100; DAKOCytomation, г. Карпинтерия, штат Калифорния). Кроме того, проверили следующие маркеры: античеловеческий GRO альфа - PE (1:100; Becton Dickinson, г. Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси), античеловеческий GCP-2 (1:100; Santa Cruz Biotech, г. Санта-Круз, штат Калифорния), антирецептор 1 окисленных ЛПНП человека (ox-LDL R1; 1:100; Santa Cruz Biotech) и античеловеческий NOGO-A (1:100; Santa Cruz Biotech). Зафиксированные образцы обрезали скальпелем и поместили в заливочный состав OCT (Tissue-Tek OCT; Sakura, г. Торранс, штат Калифорния) на баню из сухого льда с этанолом. Затем замороженные блоки нарезали на срезы толщиной 10 мкм с использованием стандартного криостата (Leica Microsystems) и установили на предметные стекла для окрашивания.
Иммуногистохимический анализ провели аналогично предыдущим исследованиям (Messina et al., Exper. Neurol., 2003 г.; 184:816-29). Вкратце, срезы тканей промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и обрабатывали белковым блокирующим раствором, содержащим ФСБ, 4% (об./об.) козьей сыворотки (Chemicon, г. Темекула, штат Калифорния) и 0,3% (об./об.) Тритона (Triton X-100; Sigma) в течение 1 часа для доступа к внутриклеточным антигенам. Когда рассматриваемый эпитоп находился на клеточной поверхности (CD34, ox-LDL R1), Тритон исключали на всех стадиях процедуры, чтобы не допустить потери эпитопа. Кроме того, когда первичное антитело было выработано на козу (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), в течение всей процедуры вместо козьей сыворотки использовали 3% (об./об.) ослиную сыворотку. Затем срезы обрабатывали в течение 4 часов при комнатной температуре первичными антителами, разбавленными в блокирующем растворе. Растворы первичных антител удаляли и промывали культуры ФСБ перед добавлением растворов вторичных антител (1 час при комнатной температуре), содержащих блокирующий раствор вместе с конъюгатом козьего антимышиного IgG - Texas Red (1:250; Molecular Probes, г. Евген, штат Орегон) и/или конъюгатом козьего антикроличьего IgG - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes) или конъюгатом ослиного антикозьего IgG - FITC (1:150; Santa Cruz Biotech). Культуры промывали и обрабатывали 10-микромолярным раствором DAPI (Molecular Probes) в течение 10 минут для визуализации клеточных ядер.
Получали флуоресцентные изображения с использованием соответствующего фильтра для флуоресценции на инвертированном эпи-флуоресцентном микроскопе (Olympus, г. Мелвилл, штат Нью-Йорк). Положительное окрашивание представляло собой флуоресцентный сигнал выше сигнала окрашивания контроля. Представительные изображения получали с использованием цветной цифровой видеокамеры и программного пакета IMAGE-PRO (Media Cybernetics, г. Карлсбад, штат Калифорния). Для образцов с тройным окрашиванием каждое изображение получали с использованием только одного фильтра на эмиссию.
Маркеры виментин, дезмин, SMA, CK18, vWF и CD34 экспрессировались подмножеством клеток, присутствующих в пуповине. В частности, экспрессия vWF и CD34 ограничивалась кровеносными сосудами, находящимися внутри пуповины. КлеткиCD34+ находились на самом внутреннем слое (со стороны просвета). Экспрессию виментина обнаружили по всему матриксу и кровеносным сосудам пуповины. Экспрессия SMA ограничивалась матриксом и внешними стенками артерии и вены, но не проходила внутри самих сосудов. CK18 и дезмин наблюдали только внутри сосудов, причем экспрессия дезмина ограничивалась только средним и внешними слоями. Экспрессию GRO альфа, GCP-2, ox-LDL R1 и NOGO-A в ткани пуповины не наблюдали.
ПРИМЕР 4
Анализ на олигонуклеотидных чипах
Для сравнения профилей экспрессии генов клеток, полученных из ткани пуповины, с профилями экспрессии для фибробластов, мезенхимальных стволовых клеток человека и другой клеточной линии, полученной из костного мозга человека, использовали чипы Affymetrix GeneChip. Данный анализ позволил охарактеризовать полученные из послеродового материала клетки и идентифицировать уникальные молекулярные маркеры данных клеток.
2
Пуповины человека получили в Национальном центре по обмену материалами для исследования заболеваний (NDRI, г. Филадельфия, штат Пенсильвания) после нормально прошедших родов при доношенной беременности с согласия пациента. Ткани получили и выделили из них клетки, как описано выше. Клетки культивировали в ростовой среде (используя среду DMEM-LG) на покрытых желатином пластиковых колбах для культивирования тканей. Культуры инкубировали при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO.
Фибробласты дермы человека приобрели в компании Cambrex Incorporated (г. Уолкерсвилл, штат Мэриленд; партия № 9F0844) и ATCC CRL-1501 (CCD39SK). Обе линии культивировали в среде DMEM/F12 (Invitrogen, г. Карлсбад, штат Калифорния) с добавлением 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки (Hyclone) и пенициллина/стрептомицина (Invitrogen). Клетки растили на стандартном обработанном тканью пластике.
2
Мезенхимальные стволовые клетки человека (hMSC) приобрели в компании Cambrex Incorporated (г. Уолкерсвилл, штат Мэриленд; партии № 2F1655, 2F1656 и 2F1657) и культивировали в соответствии с рекомендациями производителя в среде MSCGM (Cambrex). Клетки растили на стандартном культивированном тканью пластике при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO.
4
3
2
2
2
4
2
Костный мозг гребня подвздошной кости человека получили из NDRI с согласия пациента. Костный мозг обработали в соответствии со способом, описанном Ho et al. (WO 2003/025149). Костный мозг смешивали с лизирующим буфером (155 мМ NHCl, 10 мМ KHCO и 0,1 мМ ЭДТА, pH 7,2) в соотношении 1 часть костного мозга к 20 частям лизирующего буфера. Суспензию клеток перемешали на вортексе, инкубировали в течение 2 минут при температуре окружающей среды и центрифугировали в течение 10 минут при 500×g. Супернатант удалили и клеточный осадок повторно суспендировали в минимальной поддерживающей среде-альфа (Invitrogen) с добавлением 10% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки и 4 мМ глутамина. Клетки еще раз центрифугировали и клеточный осадок повторно суспендировали в свежей среде. Количество жизнеспособных мононуклеарных клеток определили тестом на вытеснение трипанового синего (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури). Мононуклеарные клетки высевали в культивированные тканью пластиковые колбы с плотностью 5×10 клетки/см. Клетки инкубировали при температуре 37°C в атмосфере с 5% CO в условиях либо стандартного атмосферного содержания O, либо 5% O. Клетки культивировали в течение 5 суток без замены среды. После 5 суток культивирования среду и незакрепившиеся клетки удалили. Закрепившиеся клетки поддерживали в культуре.
Активно растущие культуры клеток извлекали из колб с помощью скребка и переносили в холодный ФСБ. Клетки центрифугировали в течение 5 минут при 300×g. Супернатант удаляли, клетки повторно суспендировали в свежем ФСБ и центрифугировали еще раз. Супернатант удаляли, клеточный осадок немедленно замораживали и хранили при температуре -80°C. Клеточную мРНК экстрагировали и выполняли транскрипцию на кДНК, которую затем транскрибировали на кРНК и метили биотином. Меченную биотином кРНК гибридизовали с олигонуклеотидным чипом GeneChip HG-U133A (Affymetrix, г. Санта-Клара, штат Калифорния). Гибридизацию и сбор данных проводили в соответствии с рекомендациями производителя. Анализы проводили с использованием программного обеспечения Significance Analysis of Microarrays (SAM) версии 1.21 (Стенфордский университет; Tusher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002 г.; 98:5116-21).
Проанализировали четырнадцать различных популяций клеток. Типы клеток, а также информация о пассажах, культуральном субстрате и культуральной среде указаны в таблице 1.
Таблица 1Клетки, проанализированные на микрочипах. Клеточные линии указаны по коду идентификации с указанием номера пассажа на момент проведения анализа, субстрата, на котором выращивали клетки, и ростовой среды
Клеточная популяция
Пассаж
Субстрат
Среда
Клетки пуповины (022803)
2
Желатин
DMEM, 15% FBS, 2-ME
Клетки пуповины (042103)
3
Желатин
DMEM, 15% FBS, 2-ME
Клетки пуповины (071003)
4
Желатин
DMEM, 15% FBS, 2-ME
Клетки ICBM (070203)(5% O<sub>2</sub>)
3
Пластик
MEM, 10% FBS
Клетки ICBM (062703) (станд. O<sub>2</sub>)
5
Пластик
MEM, 10% FBS
Клетки ICBM (062703)(5% O<sub>2</sub>)
5
Пластик
MEM, 10% FBS
Клетки hMSC(партия 2F1655)
3
Пластик
MSCGM
Клетки hMSC(партия 2F1656)
3
Пластик
MSCGM
Клетки hMSC(партия 2F1657)
3
Пластик
MSCGM
Фибробластычеловека (9F0844)
9
Пластик
DMEM-F12, 10% FBS
Фибробласты человека (CCD39SK)
4
Пластик
DMEM-F12, 10% FBS
Данные оценивали с использованием анализа главных компонентов, анализируя те 290 генов, которые дифференциально экспрессировались в клетках. Данный анализ позволяет провести относительное сравнение для поиска сходств между популяциями. В таблице 2 представлены евклидовы расстояния, рассчитанные для сравнения клеточных пар. Евклидовы расстояния были основаны на сравнении клеток на основе 290 генов, которые дифференциально экспрессировались в клетках разных типов. Евклидово расстояние обратно пропорционально степени сходства между экспрессией 290 генов (т.е. чем больше расстояние, тем меньше сходства).
Таблица 2Евклидовы расстояния для клеточных пар
Клеточная пара
Евклидово расстояние
ICBM-hMSC
24,71
Плацента-пуповина
25,52
ICBM-фибробласт
36,44
ICBM-плацента
37,09
Фибробласт-MSC
39,63
ICBM-пуповина
40,15
Фибробласт-пуповина
41,59
MSC-плацента
42,84
MSC-пуповина
46,86
ICBM-плацента
48,41
В приведенных ниже таблицах 3 и 4 показана экспрессия генов, повышенная в клетках, полученных из ткани пуповины (таблица 3), и пониженная в клетках, полученных из ткани пуповины (таблица 4). Столбец под названием ʺИдентификатор набора зондовʺ относится к идентификационному коду, присвоенному производителем наборам нескольких олигонуклеотидных зондов, расположенных в определенном месте чипа, которые гибридизуются с указанным геном (столбец ʺНазвание генаʺ), содержащим последовательность, которую можно найти в базе данных NCBI (GenBank) под указанным номером доступа (столбец ʺНомер доступа NCBIʺ).
Таблица 3Гены, для которых обнаружена специфически повышенная экспрессия в клетках, полученных из ткани пуповины, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями
Гены с повышенной экспрессией в клетках, полученных из ткани пуповины
Идентификатор набора зондов
Название гена
Номер доступа NCBI
202859_x_at
интерлейкин 8
NM_000584
211506_s_at
интерлейкин 8
AF043337
210222_s_at
ретикулон 1
BC000314
204470_at
CXCL1 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 1/стимулятор активности роста меланомы)
NM_001511
206336_at
CXCL6 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 6/гранулоцитарный хемотаксический белок 2)
NM_002993
207850_at
CXCL3 (хемокиновый(мотив C-X-C) лиганд 3)
NM_002090
203485_at
ретикулон 1
NM_021136
202644_s_at
TNFAIP3 (индуцируемый фактором некроза опухоли альфа белок 3)
NM_006290
Таблица 4Гены, для которых обнаружена пониженная экспрессия в клетках, полученных из ткани пуповины, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями
Гены с пониженной экспрессией в клетках, полученных из ткани пуповины
Идентификатор набора зондов
Название гена
Номер доступа NCBI
210135_s_at
SHOX2 (содержащий гомеобокс ген short stature 2)
AF022654.1
205824_at
HSPB2 (27 кДа белок теплового шока 2)
NM_001541.1
209687_at
CXCL12 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 12/стромальный фактор 1)
U19495.1
203666_at
CXCL12 (хемокиновый (мотив C-X-C) лиганд 12/стромальный фактор 1)
NM_000609.1
212670_at
эластин (надклапанный аортальный стеноз, синдром Вильямса-Бойрена)
AA479278
213381_at
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp586M2022 (из клона DKFZp586M2022)
N91149
206201_s_at
MEOX2 (содержащий мезенхимальный гомеобокс ген 2, содержащий гомеобокс блокировки роста ген)
NM_005924.1
205817_at
SIX1 (гомолог содержащего гомеобокс гена sine oculis 1) (Drosophila)
NM_005982.1
209283_at
кристаллин, альфа B
AF007162.1
212793_at
DAAM2 (ассоциированный с белком Disheveled активаторморфогенеза 2)
BF513244
213488_at
белок DKFZP586B2420
AL050143.1
209763_at
аналог нейтралина 1
AL049176
205200_at
тетранектин (связывающийся с плазминогеном белок)
NM_003278.1
205743_at
STAC (ген, содержащий домен src-гомологии 3 (SH3) и богатый цистеином домен)
NM_003149.1
200921_s_at
BTG1 (ген транслокации B-клеток 1, антипролиферативный)
NM_001731.1
206932_at
холестерин 25-гидроксилаза
NM_003956.1
204198_s_at
RUNX3 (связанный с карликовостью фактор транскрипции 3)
AA541630
219747_at
гипотетический белок FLJ23191
NM_024574.1
204773_at
рецептор интерлейкина 11, альфа
NM_004512.1
202465_at
PCOLCE (усилитель проколлаген C-эндопептидазы)
NM_002593.2
203706_s_at
FZD7 (гомолог frizzled 7) (Drosophila)
NM_003507.1
212736_at
гипотетический ген BC008967
BE299456
214587_at
коллаген, тип VIII, альфа-1
BE877796
201645_at
TNC (тенасцин C, гексабрахион)
NM_002160.1
210239_at
IRX5 (содержащий гомеобокс IRX белок 5)
U90304.1
203903_s_at
гефестин
NM_014799.1
205816_at
интегрин, бета 8
NM_002214.1
203069_at
SV2A (гликопротеин синаптического пузырька 2)
NM_014849.1
213909_at
кДНК Homo sapiens FLJ12280 fis, клон MAMMA1001744
AU147799
206315_at
CRLF1 (подобный цитокиновому рецептору фактор 1)
NM_004750.1
204401_at
KCNN4 (активируемый кальцием канал средней/низкой проводимости, подсемейство N, член 4)
NM_002250.1
216331_at
интегрин, альфа 7
AK022548.1
209663_s_at
интегрин, альфа 7
AF072132.1
213125_at
белок DKFZP586L151
AW007573
202133_at
транскрипционный коактиватор с мотивом связывания с PDZ (TAZ)
AA081084
206511_s_at
SIX2 (гомолог содержащего гомеобокс гена sine oculis 2) (Drosophila)
NM_016932.1
213435_at
белок KIAA1034
AB028957.1
206115_at
EGR3 (белок раннего ростового ответа 3)
NM_004430.1
213707_s_at
DLX5 (содержащий гомеобокс distal-less ген 5)
NM_005221.3
218181_s_at
гипотетический белок FLJ20373
NM_017792.1
209160_at
AKR1C3 (альдокеторедуктаза, семейство 1, член C3/3-альфа-гидроксистероиддегидрогеназа, тип II)
AB018580.1
213905_x_at
бигликан
AA845258
201261_x_at
бигликан
BC002416.1
202132_at
транскрипционный коактиватор с мотивом связывания с PDZ (TAZ)
AA081084
214701_s_at
фибронектин 1
AJ276395.1
213791_at
проэнкефалин
NM_006211.1
205422_s_at
интегрин, бета-подобный 1 (с доменами EGF-подобных повторов)
NM_004791.1
214927_at
мРНК Homo sapiens, полноразмерная вставка кДНК, клон EUROIMAGE 1968422
AL359052.1
206070_s_at
EphA3
AF213459.1
212805_at
белок KIAA0367
AB002365.1
219789_at
NPR3 (рецептор натрийуретического пептида C/гуанилатциклаза C/рецептор атрионатрийуретического пептида C)
AI628360
219054_at
гипотетический белок FLJ14054
NM_024563.1
213429_at
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp564B222 (из клона DKFZp564B222)
AW025579
204929_s_at
VAMP5 (везикуло-ассоциированный мембранный белок 5/миобревин)
NM_006634.1
201843_s_at
EFEMP1 (содержащий EGF фибулинподобный белок внеклеточного матрикса 1)
NM_004105.2
221478_at
BNIP3L (ген белка, подобного белку 3, взаимодействующему с BCL2/белком аденовируса E1B 19 кДа)
AL132665.1
201792_at
AE-связывающий белок 1
NM_001129.2
204570_at
COX7A1 (полипептид 1 субъединицы VIIa цитохром c оксидазы) (мышечный)
NM_001864.1
201621_at
NBL1 (нейробластома, ген подавления онкогенности 1)
NM_005380.1
202718_at
IGFBP2 (связывающийся с инсулиноподобным фактором роста белок 2, 36 кДа)
NM_000597.1
В таблицах 5, 6 и 7 показана экспрессия генов, повышенная в фибробластах человека (таблица 5), клетках ICBM (таблица 6) и клетках MSC (таблица 7).
Таблица 5Гены, для которых обнаружена повышенная экспрессия в фибробластах по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями
DUSP2 (фосфатаза двойной специфичности 2)
белок KIAA0527
кДНК Homo sapiens: FLJ23224 fis, клон ADSU02206
динеин, цитоплазматический, промежуточный полипептид 1
ANK3 (анкирин 3, перехват Ранвье (анкирин G))
INHBA (ингибин, бета A (активин A, активин AB-альфа-полипептид))
ENPP4 (эндонуклеотид-пирофосфатаза/фосфодиэстераза 4 (предполагаемая функция))
белок KIAA1053
MAP1A (белок, ассоциированный с микротрубочками 1A)
ZNF41 (цинк-пальцевый белок 41)
белок HSPC019
кДНК Homo sapiens: FLJ23564 fis, клон LNG10773
мРНК Homo sapiens; кДНК DKFZp564A072 (из клона DKFZp564A072)
LIM-белок (аналогичный связывающемуся с протеинкиназой C крысы, класс enigma)
IKBKAP (ингибитор усилителя гена легкого полипептида каппа в B-клетках, ассоциированный с киназным комплексом белок)
гипотетический белок FLJ22004
человеческая (клон CTG-A4) последовательность мРНК
ESTs, умеренно сходный с CRLF2 (подобный цитокиновому рецептору фактор 2); предшественник цитокинового рецептора CRL2 [Homo sapiens]
TGF-бета2 (трансформирующий фактор роста бета-2)
гипотетический белок MGC29643
антиген, идентифицируемый моноклональным антителом MRC OX-2
предполагаемый белок, связанный с X-хромосомной ретинопатией
Таблица 6Гены, для которых обнаружена повышенная экспрессия в клетках, полученных из ICBM, по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями
- CARP (белок повтора сердечного анкирина)
- MHC, класс I, участок ORF
- интегрин, альфа-10
- гипотетический белок FLJ22362
- UDP-N-ацетил-альфа-D-галактозамин:полипептид N-ацетилгалактозаминилтрансфераза 3 (GalNAc-T3)
- индуцируемый интерфероном белок 44
- SRY (определяющий пол участок Y)-бокс 9 (кампомелическая дисплазия, аутосомная реверсия пола)
- ассоциированный с кератином белок 1-1
- подобный гиппокальцину 1
- JAG1 (jagged 1 (синдром Алажиля))
- протеогликан 1, секреторная гранула
Таблица 7Гены, для которых обнаружена повышенная экспрессия в клетках MSC по сравнению с другими проанализированными клеточными линиями
- интерлейкин 26
- мальтаза-глюкоамилаза (альфа-глюкозидаза)
- NR4A2 (ядерные рецепторы, подсемейство 4, группа A, член 2)
- v-fos FBJ гомолог вирусного онкогена мышиной остеосаркомы
- гипотетический белок DC42
- NR4A2 (ядерные рецепторы, подсемейство 4, группа A, член 2)
- FBJ гомолог вирусного онкогена мышиной остеосаркомы B
- WISP1 (индуцируемый WNT1 белок сигнального пути 1)
- MCF.2 полученная из клеточной линии трансформирующая последовательность
- KCNK15 (калиевый канал, подсемейство K, член 15)
- CART1 (хрящевой гомеобелок 1)
- Homo sapiens кДНК FLJ12232 fis, клон MAMMA1001206
- Homo sapiens кДНК FLJ34668 fis, клон LIVER2000775
- JUNB (прото-онкоген jun B)
- BCL6 (B-клеточный CLL/лимфома 6 (цинк-пальцевый белок 51))
- ZFP36 (цинк-пальцевый белок 36, тип C3H, гомолог (мышиный))
Описанный выше анализ включал клетки, полученные из трех различных пуповин и двух различных линий фибробластов дермы, трех линий мезенхимальных стволовых клеток и трех линий клеток костного мозга гребня подвздошной кости. Экспрессируемые данными клетками мРНК анализировали с использованием олигонуклеотидного чипа, содержащего зонды на 22 000 генов. Полученные результаты показали, что в клетках этих пяти разных типов наблюдается дифференциальная экспрессия 290 генов. Данные гены включают в себя семь генов, экспрессия которых специфически возрастает в клетках, полученных из ткани пуповины. Для пятидесяти четырех генов обнаружена специфически пониженная экспрессия в клетках, полученных из ткани пуповины, по сравнению с клетками других типов. Экспрессию выбранных генов подтвердили с использованием ПЦР. Данные результаты показывают, что клетки, полученные из ткани пуповины, имеют вполне определенный профиль экспрессии генов, например, по сравнению с клетками костного мозга и фибробластами.
ПРИМЕР 5
Клеточные маркеры в клетках, полученных из ткани пуповины
Как показано выше, для клеток, полученных из послеродового материала, были идентифицированы «характерные» гены: рецептор 1 окисленных ЛПНП, интерлейкин-8, ренин, ретикулон, лиганд хемокинового рецептора 3 (CXC лиганд 3) и гранулоцитарный хемотаксический белок 2 (GCP-2). Эти «характерные» гены экспрессировались в клетках, полученных из послеродового материала, на относительно высоком уровне.
Описанные в данном примере процедуры провели для верификации данных анализа на микрочипах и выявления согласий/разногласий между экспрессией генов и белков, а также для создания серии надежных анализов для выявления уникальных идентификаторов клеток, полученных из ткани пуповины.
Клетки, полученные из ткани пуповины (четыре изолята), и нормальные фибробласты кожи человека (NHDF; неонатальные и взрослые) выращивали в ростовой среде с добавлением пенициллина/стрептомицина в покрытой желатином колбе T75. Мезенхимальные стволовые клетки (MSC) выращивали в среде для выращивания мезенхимальных стволовых клеток Bulletkit (MSCGM; Cambrex, г. Уокерсвил, штат Мэриленд).
2
Для выполнения протокола IL-8 клетки размораживали из жидкого азота и высевали в покрытые желатином колбы с плотностью 5000 клеток/см, растили в течение 48 часов в ростовой среде и затем растили в течение еще 8 часов в 10 миллилитрах бессывороточной среды (среда DMEM с низким содержанием глюкозы (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния), пенициллина/стрептомицина (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния) и 0,1% (в/об) бычьего сывороточного альбумина (BSA; Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури). После данной обработки экстрагировали РНК и супернатанты центрифугировали при 150×g в течение 5 минут для удаления продуктов распада клеток. Затем супернатанты замораживали при температуре -80°C для проведения анализа ИФА.
2
Клетки послеродового материала, полученные из пуповины, а также фибробласты человека, полученные из неонатальной крайней плоти человека, культивировали в ростовой среде в покрытых желатином колбах T75. На пассаже 11 клетки замораживали в жидком азоте. Клетки размораживали и переносили в пробирки для центрифугирования объемом 15 миллилитров. После центрифугирования при 150×g в течение 5 минут супернатант удалили. Клетки повторно суспендировали в 4 миллилитрах культуральной среды и подсчитывали. Клетки выращивали в течение 24 часов в колбе с площадью поверхности 75 см, содержащей 15 миллилитров ростовой среды, при посеве 375 000 клеток/колбу. Среду на 8 часов заменили на бессывороточную среду. В конце инкубации бессывороточную среду собрали, центрифугировали при 14000×g в течение 5 минут и хранили при температуре -20°C.
Для оценки количества клеток в каждую колбу добавляли по 2 миллилитра трипсина/ЭДТА (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния) на колбу. После открепления клеток от стенок колбы активность трипсина нейтрализовали добавлением 8 миллилитров ростовой среды. Клетки перенесли в пробирку для центрифугирования объемом 15 миллилитров и центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Супернатант удалили и в каждую пробирку добавили по 1 миллилитру ростовой среды для повторного суспендирования клеток. Количество клеток оценивали с помощью гемоцитометра.
Количество IL-8, секретированного клетками в бессывороточную среду, анализировали с использованием наборов для анализа ИФА (R&D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота). Все анализы проводили в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем.
РНК экстрагировали из конфлюентных культур клеток, полученных из ткани пуповины, и фибробластов или, для оценки экспрессии IL-8, из клеток, обработанных, как описано выше. Клетки лизировали 350 микролитрами буферного раствора RLT, содержащего бета-меркаптоэтанол (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури), в соответствии с инструкциями производителя (набор RNeasy Mini Kit Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния, США). РНК экстрагировали в соответствии с инструкциями производителя (набор RNeasy Mini Kit; Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния, США) и обрабатывали ДНКазой (2,7 Ед/образец) (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури). РНК элюировали 50 микролитрами обработанной DEPC воды и хранили при температуре -80°C.
РНК также экстрагировали из ткани пуповины человека. Ткань (30 миллиграмм) суспендировали в 700 микролитрах буферного раствора RLT, содержащего 2-меркаптоэтанол. Образцы механически гомогенизировали и проводили экстракцию РНК в соответствии с рекомендациями производителя. РНК экстрагировали 50 микролитрами обработанной DEPC воды и хранили при температуре -80°C. Обратную транскрипцию РНК проводили с использованием случайных гексамеров, применяя реагенты для обратной транскрипции TaqMan (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния) при температуре 25°C в течение 10 минут, температуре 37°C в течение 60 минут и температуре 95°C в течение 10 минут. Образцы хранили при температуре -20°C.
Гены, идентифицированные кДНК-микрочипом как уникально регулируемые в клетках из послеродового материала (характерные гены - включая рецептор окисленных ЛПНП, интерлейкин-8, ренин и ретикулон), дополнительно исследовали с использованием ПЦР в реальном времени и стандартного ПЦР.
ПЦР проводили на образцах кДНК с использованием продуктов для экспрессии генов Assays-on-Demand™: рецептор окисленных ЛПНП (Hs00234028); ренин (Hs00166915); ретикулон (Hs00382515); CXCL3 (хемокиновый лиганд 3) (Hs00171061); GCP-2 (Hs00605742); IL-8 (Hs00174103) и GAPDH (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния) смешивали с кДНК и универсальным мастер-миксом для TaqMan ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния), использовали секвенатор 7000 с программным обеспечением ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния). Использовали следующие условия термоциклирования: сначала 50°C в течение 2 мин и 95°C в течение 10 мин, затем 40 циклов по 95°C в течение 15 с и 60°C в течение 1 мин. Данные ПЦР анализировали в соответствии с рекомендациями производителя (Бюллетень пользователя № 2 компании Applied Biosystems для секвенатора ABI Prism 7700 Sequence Detection System).
Стандартный ПЦР проводили на секвенаторе ABI PRISM 7700 (Perkin Elmer Applied Biosystems, г. Бостон, штат Массачусетс) для подтверждения результатов ПЦР в реальном времени. ПЦР проводили с использованием 2 микролитров раствора кДНК, реакционного буферного раствора 1× AmpliTaq Gold universal mix PCR reaction buffer (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния) и первичного денатурирования при температуре 94°C в течение 5 минут. Амплификацию оптимизировали для каждого набора праймеров. Использовали следующие протоколы амплификации: для IL-8, CXCL3 (хемокинового лиганда 3) и ретикулона - 94°C в течение 15 секунд, затем 30 циклов по 55°C в течение 15 секунд и 72°C в течение 30 секунд); для ренина - 94°C в течение 15 секунд, затем 38 циклов по 53°C в течение 15 секунд и 72°C в течение 30 секунд); для рецептора окисленных ЛПНП и GAPDH - 94°C в течение 15 секунд, затем 33 цикла по 55°C в течение 15 секунд и 72°C в течение 30 секунд. Использованные для амплификации праймеры перечислены в таблице 8. Концентрация праймеров в конечной реакционной смеси ПЦР составляла 1 мкМ, за исключением GAPDH, для которого она составляла 0,5 мкМ. Для GAPDH использовали те же праймеры, что и для ПЦР в реальном времени, за исключением того, что в конечную реакционную смесь ПЦР не добавляли прилагаемый производителем зонд TaqMan. Образцы вводили в 2% (в/об) агарозный гель и окрашивали бромидом этидия (Sigma, г. Сент-Луис, штат Монтана). Изображения получали с использованием пленки 667 Universal Twinpack (VWR International, г. Саут-Плэйнфилд, штат Нью-Джерси) и фокусной камеры Polaroid (VWR International, г. Саут-Плэйнфилд, штат Нью-Джерси).
Таблица 8Использованные праймеры
Название праймера
Праймеры
Рецептор окисленных ЛПНП
S: 5′-GAGAAATCCAAAGAGCAAATGG-3’(SEQ ID NO:1)A: 5′-AGAATGGAAAACTGGAATAGG-3′(SEQ ID NO:2)
Ренин
S: 5′-TCTTCGATGCTTCGGATTCC-3′(SEQ ID NO:3)A: 5′-GAATTCTCGGAATCTCTGTTG-3′(SEQ ID NO:4
Ретикулон
S: 5′-TTACAAGCAGTGCAGAAAACC-3′(SEQ ID NO:5)A: 5′-AGTAAACATTGAAACCACAGCC-3′(SEQ ID NO:6
Интерлейкин-8
S: 5′-TCTGCAGCTCTGTGTGAAGG-3′(SEQ ID NO:7)A: 5′-CTTCAAAAACTTCTCCACAACC-3′(SEQ ID NO:8)
CXCL3 (хемокиновый лиганд 3)
S: 5’-CCCACGCCACGCTCTCC-3’(SEQ ID NO:9)A: 5’-TCCTGTCAGTTGGTGCTCC-3’(SEQ ID NO:10)
Клетки фиксировали в холодном 4% (в/об) параформальдегиде (Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури) на 10 минут при комнатной температуре. Использовали один изолят клеток пассажа 0 (P0) (непосредственно после выделения), два изолята клеток пассажа 11 (P11) и фибробласты (P11). Иммуноцитохимическое окрашивание проводили с использованием антител к следующим эпитопам: виментин (1:500, Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури), дезмин (1:150; Sigma - выработанные на кролика; или 1:300; Chemicon, г. Темекула, штат Калифорния - выработанные на мышь), альфа-актин гладких мышц (SMA; 1:400; Sigma), цитокератин 18 (CK18; 1:400; Sigma), фактор фон Виллебранда (vWF; 1:200; Sigma) и CD34 (CD34 человека, класс III; 1:100; DAKOCytomation, г. Карпинтерия, штат Калифорния). Кроме того, для клеток из послеродового материала 11 пассажа проверили следующие маркеры: античеловеческий GRO альфа - PE (1:100; Becton Dickinson, г. Франклин Лейкс, штат Нью-Джерси), античеловеческий GCP-2 (1:100; Santa Cruz Biotech, г. Санта-Круз, штат Калифорния), антирецептор 1 окисленных ЛПНП человека (ox-LDL R1; 1:100; Santa Cruz Biotech) и античеловеческий NOGA-A (1:100; Santa Cruz, Biotech).
Культуры промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) и обрабатывали белковым блокирующим раствором, содержащим ФСБ, 4% (об./об.) козьей сыворотки (Chemicon, г. Темекула, штат Калифорния) и 0,3% (об./об.) Тритона (Triton X-100; Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) в течение 30 минут для доступа к внутриклеточным антигенам. Когда рассматриваемый эпитоп размещался на клеточной поверхности (CD34, ox-LDL R1), Тритон X-100 исключали на всех стадиях процедуры, чтобы не допустить потери эпитопа. Кроме того, когда первичное антитело было выработано на козу (GCP-2, ox-LDL R1, NOGO-A), в течение всей процедуры вместо козьей сыворотки использовали 3% (об./об.) ослиную сыворотку. Затем культуры в течение 1 часа обрабатывали при комнатной температуре разбавленными в блокирующем растворе первичными антителами. Растворы первичных антител удаляли и промывали культуры ФСБ перед добавлением растворов вторичных антител (1 час при комнатной температуре), содержащих блокирующий раствор вместе с конъюгатом козьего антимышиного IgG - Texas Red (1:250; Molecular Probes, г. Евген, штат Орегон) и/или конъюгатом козьего антикроличьего IgG - Alexa 488 (1:250; Molecular Probes) или конъюгатом ослиного антикозьего IgG - FITC (1:150, Santa Cruz Biotech). Затем культуры промывали и обрабатывали 10-микромолярным раствором DAPI (Molecular Probes) в течение 10 минут для визуализации клеточных ядер.
После иммунного окрашивания получали флуоресцентные изображения с использованием соответствующего фильтра для флуоресценции на инвертированном эпи-флуоресцентном микроскопе (Olympus, г. Мелвилл, штат Нью-Йорк). Во всех случаях положительное окрашивание соответствовало сигналу флуоресценции выше сигнала для контрольного окрашивания, при котором выполняли всю описанную выше процедуру за исключением обработки раствором первичных антител. Представительные изображения получали с использованием цветной цифровой видеокамеры и программного пакета IMAGE-PRO (Media Cybernetics, г. Карлсбад, штат Калифорния). Для образцов с тройным окрашиванием каждое изображение получали с использованием только одного фильтра на эмиссию. Затем получили послойные монтажи с использованием программного обеспечения Adobe Photoshop (Adobe, г. Сан-Хосе, штат Калифорния).
7
Закрепившиеся клетки в колбах промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния) и отделяли с помощью трипсина/EDTA (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния). Клетки собирали, центрифугировали и повторно суспендировали в 3% (об./об.) растворе FBS в ФСБ при концентрации клеток 1×10 на миллилитр. Отбирали аликвоты по сто микролитров в конические пробирки. Клетки, окрашиваемые на внутриклеточные антигены, пермеабилизировали буферным раствором Perm/Wash (BD Pharmingen, г. Сан-Диего, штат Калифорния). Антитела добавляли к аликвотам согласно рекомендациям производителя и инкубировали клетки в темноте в течение 30 минут при температуре 4ºC. После инкубации клетки промывали ФСБ и центрифугировали для удаления избытка антител. Клетки, требующие вторичных антител, повторно суспендировали в 100 микролитрах 3% раствора FBS. Вторичные антитела добавляли к аликвотам согласно рекомендациям производителя и инкубировали клетки в темноте в течение 30 минут при температуре 4°C. После инкубации клетки промывали ФСБ и центрифугировали для удаления избытка вторичных антител. Промытые клетки повторно суспендировали в 0,5 миллилитра ФСБ и анализировали с использованием проточной цитометрии. Использовали следующие антитела: рецептор 1 окисленных ЛПНП (sc-5813; Santa Cruz, Biotech), GROa (555042; BD Pharmingen, Bedford, MA), мышиный IgG1 каппа, (P-4685 и M-5284; Sigma), ослиный антикозий IgG (sc-3743; Santa Cruz, Biotech.). Проточную цитометрию проводили на анализаторе FACScalibur (Becton Dickinson, г. Сан-Хосе, штат Калифорния).
Данные, полученные в результате ПЦР в реальном времени, проанализировали методом ΔΔCT и выразили в логарифмической шкале. Уровни экспрессии ретикулона и рецептора окисленных ЛПНП в клетках, полученных из ткани пуповины, оказались выше по сравнению с другими клетками. Никаких существенных отличий в уровнях экспрессии CXCL3 (хемокинового лиганда 3) и GCP-2 между клетками, полученными из послеродового материала, и контролями не обнаружено. Результаты ПЦР в реальном времени подтвердили стандартным ПЦР. Данные результаты дополнительно подтвердили секвенированием продуктов ПЦР. Никаких существенных отличий в уровнях экспрессии CXCL3 (хемокинового лиганда 3) между клетками, полученными из послеродового материала, и контролями при использовании перечисленных выше праймеров на CXCL3 стандартной ПЦР не обнаружено.
Уровень продукции цитокина IL-8 в клетках, полученных из послеродового материала, был повышен как в клетках, культивированных в ростовой среде, так и в клетках, культивированных в бессывороточной среде. Все данные ПЦР в реальном времени подтвердили стандартным ПЦР и секвенированием продуктов ПЦР.
При исследовании супернатантов от клеток, выращенных в бессывороточной среде, на наличие IL-8 самые высокие уровни обнаружили в средах, полученных от клеток пуповины и некоторых изолятов клеток плаценты (таблица 9). В среде, полученной от фибробластов кожи человека, IL-8 не обнаружено.
Таблица 9Количество белка IL-8, измеренное с использованием ИФА
Клеточный тип
IL-8
Фибробласты человека
не определяется
Изолят пуповины 1
2058,42±144,67
Изолят пуповины 2
2368,86±22,73
Результаты представлены в единицах пикограмм/миллион клеток, n=2, СПС; не определяется = при анализе не обнаружено
Клетки пассажа 0, полученные из ткани пуповины человека, проверили на выработку выбранных белков с использованием иммуноцитохимического анализа. Непосредственно после выделения (пассаж 0) клетки зафиксировали 4% раствором параформальдегида и обработали антителами на шесть белков: фактор фон Виллебранда, CD34, цитокератин 18, дезмин, альфа-актин гладких мышц и виментин. Клетки, полученные из ткани пуповины, оказались положительными на альфа-актин гладких мышц и виментин, причем данная тенденция окрашивания сохранялась вплоть до пассажа 11.
Согласованность между уровнями экспрессии генов, измеренными с использованием микрочипа и ПЦР (как в реальном времени, так и стандартного), установлена для четырех генов: рецептор 1 окисленных ЛПНП, ренин, ретикулон и IL-8. Экспрессия данных генов дифференциально регулировалась на уровне мРНК в PPDC, при этом IL-8 также дифференциально регулировался на уровне белка. Клетки пассажа 0, полученные из ткани пуповины человека, проверили на экспрессию альфа-актина гладких мышц и виментина, и они оказались положительными на оба белка. Данная тенденция по окраске сохранялось вплоть до пассажа 11.
ПРИМЕР 6
In Vitro иммунологическая оценка клеток, полученных из послеродового материала
+
Провели оценку клеток, полученных из послеродового материала (PPDC), in vitro на иммунологические характеристики в попытке прогнозировать возможный иммунологический ответ на данные клетки при их трансплантации in vivo. Клетки PPDC оценивали с использованием проточной цитометрии на присутствие в них белков HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86 и B7-H2. Эти белки экспрессируются антигенпредставляющими клетками (APC) и необходимы для прямой стимуляции непримированных CD4 T-клеток (Abbas & Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, 5-е издание (Saunders, Philadelphia, 2003 г.; стр. 171)). Клеточные линии также анализировали с использованием проточной цитометрии на экспрессию HLA-G (Abbas & Lichtman, 2003 г., см. выше), CD 178 (Coumans, et al., Journal of Immunological Methods, 1999; 224:185-196) и PD-L2 (Abbas & Lichtman, 2003 г., см. выше; Brown, et. al., The Journal of Immunology, 2003 г.; 170:1257-1266). Считается, что экспрессия данных белков клетками, находящимися в плацентарных тканях, опосредует иммуно-привилегированный статус плацентарных тканей in utero. Для прогнозирования степени, в которой линии клеток, полученных из ткани пуповины, вызывают иммунный ответ in vivo, клеточные линии тестировали в однонаправленной реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ-реакции).
Клетки культивировали до конфлюентности в ростовой среде с добавкой пенициллина/стрептомицина в колбах T75 (Corning, г. Корнинг, штат Нью-Йорк), покрытых 2% раствором желатина (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури).
7
Клетки промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния) и отделяли с помощью трипсина/EDTA (Gibco, г. Карлсбад, штат Калифорния). Клетки собирали, центрифугировали и повторно суспендировали в 3% (об./об.) растворе FBS в ФСБ при концентрации клеток 1×10 на миллилитр. Антитело (таблица 10) добавляли к ста микролитрам клеточной суспензии в соответствии с инструкциями производителя и инкубировали в темноте в течение 30 минут при температуре 4°C. После инкубации клетки промывали ФСБ и центрифугировали для удаления несвязавшихся антител. Клетки повторно суспендировали в пятистах микролитрах ФСБ и анализировали с использованием проточной цитометрии на анализаторе FACSCalibur (Becton Dickinson, г. Сан-Хосе, штат Калифорния).
Таблица 10Антитела
Антитело
Производитель
Номер по каталогу
HLA-DRDPDQ
BD Pharmingen (г. Сан-Диего, штат Калифорния)
555558
CD80
BD Pharmingen (г. Сан-Диего, штат Калифорния)
557227
CD86
BD Pharmingen (г. Сан-Диего, штат Калифорния)
555665
B7-H2
BD Pharmingen (г. Сан-Диего, штат Калифорния)
552502
HLA-G
Abcam (Кембриджшир, Великобритания)
ab 7904-100
CD 178
Santa Cruz (г. Санта-Крус, штат Калифорния)
sc-19681
PD-L2
BD Pharmingen (г. Сан-Диего, штат Калифорния)
557846
Мышиный IgG2A
Sigma (г. Сент-Луис, штат Миссури)
F-6522
Мышиный IgG1 каппа
Sigma (г. Сент-Луис, штат Миссури)
P-4685
3
3
Криоконсервированные флаконы с клетками, полученными из ткани пуповины, пассажа 10, помеченными как клеточная линия A, отправили на сухом льду в лабораторию CTBR (г. Сенвиль, провинция Квебек) для проведения реакции смешанной культуры лимфоцитов согласно стандартному протоколу CTBR SOP № CAC-031. Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) собрали у множества добровольных доноров мужского и женского пола. Аллогенные МКПК стимулятора (донора), аутогенные МКПК и клетки полученных из послеродового материала клеточных линий обработали митомицином C. Аутогенные и обработанные митомицином C стимуляторные клетки добавили к МКПК респондера (получателя) и культивировали в течение 4 дней. После инкубации в каждый образец добавили [H]-тимидин и культивировали смесь в течение 18 часов. Затем клетки собрали, экстрагировали радиоактивно меченную ДНК и измерили потребление [H]-тимидина с использованием сцинтилляционного счетчика.
Коэффициент стимулирования для клеток аллогенного донора (SIAD) рассчитали как сумму средней пролиферации клеток получателя и обработанных митомицином C клеток аллогенного донора, деленную на базовую пролиферацию клеток получателя. Коэффициент стимулирования для клеток PPDC рассчитали как сумму средней пролиферации клеток получателя и обработанной митомицином C клеточной линии из послеродового материала, деленную на базовую пролиферацию клеток получателя.
Проанализировали шесть человек, добровольных доноров крови, для выявления одного аллогенного донора, который бы показал устойчивый пролиферативный ответ в реакции смешанной культуры лимфоцитов с остальными пятью донорами крови. Данного донора выбрали в качестве аллогенного донора - положительного контроля. Остальных пять доноров выбрали как получателей. Клетки аллогенного донора - положительного контроля и клетки полученных из пуповины клеточных линий обработали митомицином C и культивировали в реакции смешанной культуры лимфоцитов с индивидуальными клетками каждого из пяти аллогенных получателей. Реакции повторяли три раза, используя два планшета для культивирования клеток с тремя получателями на планшет (таблица 11). Средний коэффициент стимулирования для тестируемых клеток находился в диапазоне от 6,5 (планшет 1) до 9 (планшет 2), а для клеток аллогенного донора - положительного контроля - в диапазоне от 42,75 (планшет 1) до 70 (планшет 2) (таблица 12).
Таблица 11Реакция смешанной культуры лимфоцитов - клеточная линия A (клетки пуповины)
Расп/мин для анализа на пролиферацию ID планшета: планшет 1
Аналитический номер
Культуральная система
Репликаты
Среднее значение
SD
CV
1
2
3
IM04-2478
Базовая пролиферация получателя
1074
406
391
623,7
390,07
62,5
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
672
510
1402
861,3
475,19
55,2
СКЛ-реакция, аллогенный донор IM04-2477 (обработанный митомицином C)
43777
48391
38231
43466,3
5087,12
11,7
СКЛ-реакция с клеточной линией (обработанные митомицином C клетки типа A)
2914
5622
6109
4881,7
1721,36
35,3
SI (Донор)
70
SI (Клеточная линия)
8
IM04-2479
Базовая пролиферация получателя
530
508
527
521,7
11,93
2,3
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
701
567
1111
793,0
283,43
35,7
СКЛ-реакция, аллогенный донор IM04-2477 (обработанный митомицином C)СКЛ-реакция с клеточной линией
25593
24732
22707
24344,0
1481,61
6,1
(обработанные митомицином C клетки типа A)
5086
3932
1497
3505,0
1832,21
52,3
SI (Донор)
47
SI (Клеточная линия)
7
IM04-2480
Базовая пролиферация получателя
1192
854
1330
1125,3
244,90
21,8
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
2963
993
2197
2051,0
993,08
48,4
СКЛ-реакция, аллогенный донор IM04-2477 (обработанный митомицином C)
25416
29721
23757
26298,0
3078,27
11,7
СКЛ-реакция с клеточной линией (обработанные митомицином C клетки типа A)
2596
5076
3426
3699,3
1262,39
34,1
SI (Донор)
23
SI (Клеточная линия)
3
IM04-2481
Базовая пролиферация получателя
695
451
555
567,0
122,44
21,6
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
738
1252
464
818,0
400,04
48,9
СКЛ-реакция, аллогенный донор IM04-2477 (обработанный митомицином C)
13 177
24 885
15 444
17 835,3
6209,52
34,8
СКЛ-реакция с клеточной линией (обработанные митомицином C клетки типа A)
4495
3671
4674
4280,0
534,95
12,5
SI (Донор)
31
SI (Клеточная линия)
8
ID планшета: планшет 2
Аналитический номер
Культуральная система
Репликаты
Среднее значение
SD
CV
1
2
3
IM04-2482
Базовая пролиферация получателя
432
533
274
413,0
130,54
31,6
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
1459
633
598
896,7
487,31
54,3
СКЛ-реакция, аллогенный донор IM04-2477 (обработанный митомицином C)
24286
30823
31346
28818,3
3933,82
13,7
СКЛ-реакция с клеточной линией (обработанные митомицином C клетки типа A)
2762
1502
6723
3662,3
2724,46
74,4
SI (Донор)
70
SI (Клеточная линия)
9
IM04-2477 (Аллогенный донор)
Базовая пролиферация получателя
312
419
349
360,0
54,34
15,1
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
567
604
374
515,0
123,50
24,0
Клеточная линия тип A
Базовая пролиферация получателя
5101
3735
2973
3936,3
1078,19
27,4
Контроль автостимулирования (обработанные митомицином C аутогенные клетки)
1924
4570
2153
2882,3
1466,04
50,9
Таблица 12Средний индекс стимулирования для клеток, полученных из ткани пуповины, и аллогенного донора в реакции смешанной культуры лимфоцитов с пятью индивидуальными аллогенными получателями
Средний коэффициент стимулирования
Реципиент
Пуповина
Планшет 1 (Получатели 1-4)
42,75
6,5
Планшет 2 (Получатель 5)
70
9
+
Гистограммы проанализированных с использованием проточной цитометрии клеток, полученных из ткани пуповины, показали отрицательную экспрессию HLA-DR, DP, DQ, CD80, CD86 и B7-H2, на что указывают значения интенсивности флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG, что указывает на отсутствие у клеток пуповинных линий на клеточной поверхности молекул, требуемых для прямой стимуляции CD4 T-клеток. Гистограммы проанализированных с использованием проточной цитометрии клеток, полученных из пуповины, показали положительную экспрессию PD-L2, на что указывает повышение значения интенсивности флуоресценции по сравнению с используемым в качестве контроля IgG, и отрицательную экспрессию CD178 и HLA-G, на что указывают значения интенсивности флуоресценции, согласующиеся с величинами для используемого в качестве контроля IgG.
+
+
В реакции смешанной культуры лимфоцитов, проведенной с клетками полученных из ткани пуповины клеточных линий, средний индекс стимулирования для тестируемых клеток находился в диапазоне от 6,5 до 9, а для аллогенного донора - положительного контроля - в диапазоне от 42,75 до 70. По результатам измерения с использованием проточной цитометрии клетки полученных из ткани пуповины клеточных линий оказались отрицательными в отношении экспрессии стимуляторных белков HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ, CD80, CD86 и B7-H2. По результатам измерения с использованием проточной цитометрии клетки полученных из ткани пуповины клеточных линий оказались отрицательными в отношении экспрессии иммуномодуляторных белков HLA-G и CD178 и положительными в отношении экспрессии PD-L2. МКПК аллогенного донора содержат антигенпредставляющие клетки с экспрессией HLA-DR, DQ, CD8, CD86 и B7-H2, позволяя тем самым стимулировать непримированные CD4 T-клетки. Отсутствие на клеточной поверхности полученных из ткани пуповины клеточных линий антигенпредставляющих молекул, требуемых для прямой стимуляции непримированных CD4 T клеток, и присутствие иммуномодулирующего белка PD-L2 может объяснить низкий коэффициент стимулирования, показанный данными клетками в СКЛ-реакции по сравнению с аллогенными контролями.
ПРИМЕР 7
Секретирование трофических факторов клетками, полученными из ткани пуповины
Измерили секретирование выбранных трофических факторов клетками, полученными из ткани пуповины. Выбранные для обнаружения факторы включали в себя: (1) факторы с известной ангиогенной активностью, такие как фактор роста гепатоцитов (HGF) (Rosen et al., Ciba Found. Symp., 1997 г.; 212:215-26), моноцитарный хемотаксический фактор 1 (MCP-1) (Salcedo et al., Blood, (2000 г.; 96:34-40), интерлейкин-8 (IL-8) (Li et al., J. Immunol., 2003 г.; 170:3369-76), фактор роста кератиноцитов (KGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (Hughes et al., Ann. Thorac. Surg., 2004 г.; 77:812-8), матриксную металлопротеиназу 1 (TIMP1), ангиопоэтин 2 (ANG2), фактор роста тромбоцитов (PDGF-bb), тромбопоэтин (TPO), связывающийся с гепарином эпидермальный фактор роста (HB-EGF), стромальный фактор роста 1 альфа (SDF-1альфа); (2) факторы с известной нейротрофической/нейропротекторной активностью, такие как нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) (Cheng et al., Dev. Biol., 2003 г.; 258:319-33), интерлейкин-6 (IL-6), гранулоцитарный хемотаксический белок 2 (GCP-2), трансформирующий фактор роста бета 2(TGFbeta2); и (3) факторы с известной хемокиновой активностью, такие как макрофагальный белок воспаления 1 альфа (MIP1a), макрофагальный белок воспаления 1 бета (MIP1b), моноцитарный хемоатрактантный белок-1 (MCP-1), Rantes (хемокин, экспрессируемый и выделяемый нормальными T-клетками при активации), I309, выделяемый при активации хемокин тимуса (TARC), эотаксин, хемокин макрофагов (MDC), IL-8.
2
Клетки, полученные из ткани пуповины, а также фибробласты человека, полученные из неонатальной крайней плоти человека, культивировали в ростовой среде с добавлением пенициллина/стрептомицина в покрытых желатином колбах T75. На пассаже 11 клетки криоконсервировали и замораживали в жидком азоте. После размораживания в клетки добавляли ростовую среду, переносили их в пробирку для центрифугирования объемом 15 миллилитров и центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Супернатант удаляли. Клеточный осадок повторно суспендировали в 4 миллилитрах ростовой среды и подсчитывали клетки. Клетки высевали в количестве 375 000 клеток на колбу с площадью поверхности 75 см, содержащую 15 миллилитров ростовой среды, и культивировали в течение 24 часов. Среду заменили на бессывороточную среду (среда DMEM с низким содержанием глюкозы (Gibco), 0,1% (в/об.) бычьего сывороточного альбумина (Sigma), пенициллина/стрептомицина (Gibco)) на 8 часов. В конце инкубации кондиционированную бессывороточную среду собрали центрифугированием при 14 000×g в течение 5 минут и хранили при температуре -20°C. Для оценки количества клеток в каждой колбе клетки промыли ФСБ и отделили с использованием 2 миллилитров трипсина/EDTA. Активность трипсина ингибировали добавлением 8 миллилитров ростовой среды. Клетки центрифугировали при 150×g в течение 5 минут. Супернатант удалили и клетки повторно суспендировали в 1 миллилитре ростовой среды. Количество клеток оценивали с помощью гемоцитометра.
Клетки выращивали при температуре 37°C в присутствии 5% диоксида углерода и атмосферной концентрации кислорода. Клетки, полученные из плаценты (партия 101503), также выращивали в атмосфере с содержанием кислорода 5% или в среде с добавлением бета-меркаптоэтанола (BME). Количество MCP-1, IL-6, VEGF, SDF-1альфа, GCP-2, IL-8 и TGF-бета2, вырабатываемое каждым образцом клеток, измеряли с использованием анализа ИФА (R&D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота). Все тесты проводили в соответствии с инструкциями производителя.
Хемокины (MIP1a, MIP1b, MCP-1, Rantes, I309, TARC, эотаксин, MDC, IL8), BDNF и ангиогенные факторы (HGF, KGF, bFGF, VEGF, TIMP1, ANG2, PDGF-bb, TPO, HBF-EGF) измеряли с использованием протеомных массивов SearchLight Proteome Arrays (Pierce Biotechnology Inc.). Протеомные массивы представляют собой мультиплексные иммуноферментные сэндвич-системы для количественного измерения от 2 до 16 белков на лунку. Массивы получают, нанося матрицу 2×2, 3×3 или 4×4 от 4 до 16 разных антител захвата в каждую лунку 96-луночного планшета. После проведения процедуры сэндвич-ИФА снимают изображение всего планшета для получения сигнала хемилюминесценции, генерируемого в каждой точке матрицы в каждой лунке планшета. Количество сигнала, генерируемого в каждой точке матрицы, пропорционально количеству целевого белка в исходном стандартном или анализируемом образце.
2
MCP-1 и IL-6 секретировались клетками, полученными из ткани пуповины, и фибробластами кожи (таблица 13). SDF-1альфа секретировался фибробластами. GCP-2 и IL-8 секретировались полученными из ткани пуповины клетками, культивированными в присутствии BME или в атмосфере с 5% O. GCP-2 также секретировался фибробластами человека. TGF-бета2 не был определен с использованием анализа ИФА.
Таблица 13Результаты анализа ИФА
MCP-1
IL-6
VEGF
SDF-1α
GCP-2
IL-8
TGF-бета2
Фибробласты
17±1
61±3
29±2
19±1
21±1
не определяется
не определяется
Клетки пуповины (022803)
1150±74
4234±289
не определяется
не определяется
160±11
2058±145
не определяется
Клетки пуповины (071003)
2794±84
1356±43
не определяется
не определяется
2184±98
2369±23
не определяется
Результаты представлены в единицах пикограмм/миллилитр/миллион клеток, n=2, СПС; не определяется = при анализе не обнаружено
TIMP1, TPO, KGF, HGF, FGF, HBEGF, BDNF, MIP1b, MCP1, RANTES, I309, TARC, MDC и IL-8 секретировались клетками, полученными из ткани пуповины (таблицы 14 и 15). Ang2, VEGF и PDGF-bb не были обнаружены.
Таблица 14Результаты мультиплексного анализа ИФА SearchLight
TIMP1
ANG2
PDGFbb
TPO
KGF
HGF
FGF
VEGF
HBEGF
BDNF
Hfb
19306,3
не определяется
не определяется
230,5
5,0
не определяется
не определяется
27,9
1,3
не определяется
U1
57718,4
не определяется
не определяется
1240,0
5,8
559,3
148,7
не определяется
9,3
165,7
U3
21850,0
не определяется
не определяется
1134,5
9,0
195,6
30,8
не определяется
5,4
388,6
hFB = фибробласты человека, U1 = клетки, полученные из ткани пуповины, (022803), U3 = клетки, полученные из ткани пуповины, (071003), не определяется = при анализе не обнаружено
Таблица 15Результаты мультиплексного анализа ИФА SearchLight
MIP1a
MIP1b
MCP1
RANTES
I309
TARC
Эотаксин
MDC
IL8
hFB
не определяется
не определяется
39,6
не определяется
не определяется
0,1
не определяется
не определяется
204,9
P1
79,5
не определяется
228,4
4,1
не определяется
3,8
12,2
не определяется
413,5
U1
не определяется
8,0
1694,2
не определяется
22,4
37,6
не определяется
18,9
51930,1
P3
не определяется
не определяется
102,7
не определяется
не определяется
0,4
не определяется
не определяется
63,8
U3
не определяется
5,2
2018,7
41,5
11,6
21,4
не определяется
4,8
10 515,9
hFB = фибробласты человека, U1 = клетки, полученные из ткани пуповины, (022803), U3 = клетки, полученные из ткани пуповины, (071003), не определяется = при анализе не обнаружено.
Клетки, полученные из ткани пуповины, секретировали ряд очень полезных трофических факторов. Некоторые из этих трофических факторов, такие как TIMP1, ингибитор катаболизма, играют ключевую роль в предотвращении деградации внеклеточного матрикса матриксными металлопротеазами. HGF, bFGF, MCP-1 и IL-8 играют важные роли в функциях обеспечения выживаемости и дифференцирования клеток. Другие трофические факторы, такие как BDNF и IL-6, играют важную роль в регенерации нервной ткани.
ПРИМЕР 8
Ингибирование индуцированной IFN-гамма экспрессии HLA-DR, DP, DQ на размноженных клетках, полученных из ткани пуповины человека, ингибиторами HMG-CoA редуктазы
Размноженные в культуре клетки, полученные из ткани пуповины человека (022803 P4), высевали на 6-луночные планшеты для культивирования тканей и культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) с низким содержанием глюкозы с добавлением 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллина/стрептомицина (P/S), бета-меркаптоэтанола (BME) до конфлюентности приблизительно 70%. Затем клетки обработали средой, содержащей 10 мкМ соответствующего ингибитора HMG-CoA редуктазы (симвастатиновая кислота (Alexis Biochemicals, г. Лаузен, Швейцария), приготовленной в форме 10 мМ раствора в DMSO), или несущей средой DMSO-0,1% (Sigma, г. Сент-Луис, штат Миссури) и инкубировали в течение ночи. Среду удалили остасыванием и заменили на среду, содержащую 500 единиц/мл rhIFN-гамма (BD Pharmingen, г. Франклин Лэйкс, штат Нью-Джерси) и 10 мкМ соответствующего ингибитора HMG-CoA редуктазы и инкубировали в течение 3 дней. На третий день клетки собрали трипсином.
Собранные клетки однократно промыли ФСБ и повторно суспендировали в 100 мкл 3% FBS в ФСБ с добавкой 20 мкл меченого FITC HLA-DR,DP,DQ (BD Biosciences, г. Франклин Лэйкс, штат Нью-Джерси) или меченого FITC антитела на IgG (BD Biosciences, г. Франклин Лэйкс, штат Нью-Джерси) и инкубировали в течение одного часа. Клетки однократно промыли ФСБ и повторно суспендировали в 500 мкл ФСБ и проанализировали на проточном цитометре FACSCalibur (BS Biosciences, г. Франклин Лэйкс, штат Нью-Джерси).
Таблица 16Экспрессия HLA-DR,DP,DQ клетками hUTC по результатам измерения величин интенсивности флюоресценции FITC для клеток, предварительно обработанных ингибитором HMG-CoA редуктазы и дополнительно обработанных воспалительным цитокином IFN-гамма
Обработка ингибитором HMG-CoA редуктазы
Контроль IgG
Обработка IFN-гамма
Без обработки цитокином
Среднее значение
Станд. откл.
Среднее значение
Станд. откл.
Среднее значение
Станд. откл.
Без обработки
4,88
5,12
274,23
219,04
5,56
8,97
Несущая среда DMSO (контроль) 0,1%
4,09
5,67
294,08
257,08
5,54
5,46
Симвастатин
4,4
2,38
5,57
3,98
5,66
3,25
Как показано в таблице 16, необработанные и обработанные несущей средой DMSO (контроль) 0,1% клетки, полученные из ткани пуповины человека, инкубированные с воспалительным цитокином IFN-гамма, показали рост экспрессии HLA-DR, DP, DQ, на что указывают повышенные значения интенсивности флуоресценции по результатам анализа с использованием проточной цитометрии. Клетки, полученные из ткани пуповины человека, предварительно обработанные ингибитором HMG-CoA редуктазы и затем инкубированные с IFN-гамма, показали экспрессию HLA-DR, DP, DQ, аналогичную экспрессии для необработанных и обработанных несущей средой клеток.
Эти данные указывают, что HMG-CoA редуктаза ингибирует опосредованную воспалительными цитокинами экспрессию HLA-DR, DP, DQ в клетках, полученных из ткани пуповины человека.
Пример 9
Эффективность клеток, полученных из ткани пуповины человека (hUTC), в кроличьей модели дегенеративных изменений межпозвоночного диска
Провели исследование для определения того, насколько клетки, полученные из ткани пуповины человека (hUTC) эффективны в кроличьей модели дегенеративных изменений межпозвоночного диска (МПД). Клетки вводили путем инъекции в месте повреждения и оценивали размеры диска с использованием рентгенографии. Анализ тканей проводили при вскрытии.
Для оценки влияния клеток, полученных из ткани пуповины человека (hUTC), на дегенеративные изменения межпозвоночного диска (МПД), клетки hUTC вводили путем инъекции в проколотый МПД. Раз в две недели снимали рентгенограмму и анализировали изменение высоты диска по сравнению с контролем, получившим повреждение и обработанным только несущей средой. Обработка клетками hUTC приводила к увеличению высоты дисков, а также увеличению скорости восстановления по сравнению с обработанными несущей средой контролями.
Создание модели дегенеративных изменений диска: случайным образом отобрали самок белых новозеландских кроликов в возрасте 6 месяцев. Животных пометили и взвесили перед началом исследования и непосредственно перед вскрытием. Перед наркозом кроликам дали гликопиролат (от 0,01 до 0,02 мг/кг подкожно) для снижения оротрахеальной секреции и уменьшения замедления сердечного ритма, связанных с анестезией. Перед проведением операции животным давали бупренорфин (бупренорфин HCI 0,03 мг/кг) в качестве предупредительного анальгетика. Кроликов анестезировали введением гидрохлорида кетамина (25 мг/кг) и малеата ацепромазина (1 мг/кг, 10 мг/мл) для облегчения эндотрахеальной интубации. Перед проведением операции сняли рентгенограмму для использования в качестве базового контроля. После завершения предоперационной рентгенографии животным подкожно или внутримышечно ввели ксилазин в дозировке 5 мг/кг. Животных поддерживали ингаляцией изофлурана (начальная 2-3%, поддерживающая 0,5-2%).
Кроликов (весом 3,5 кг) помещали в боковое лежачее положение. После подготовки и наложения хирургической простыни открывали доступ к МПД поясничного отдела через заднебоковой ретроперитонеальный доступ путем тупого отслаивания поясничной мышцы. Открывали переднюю поверхность трех последовательных МПД поясничного отдела (L2/3, L3/4 и L4/5). Используя иглу 18 калибра с ограничителем, позволявшим ввести иглу на глубину 5 мм, прокалывали фиброзное кольцо в вентральном аспекте с входом в студенистое ядро на уровнях L2/3 и L4/5. В качестве маркера на поясничную мышцу на уровне L3/4 A накладывали сосудистую скобу и нить. Созданную хирургическую рану восстанавливали послойно. Кожу закрывали с использованием скоб.
После операции снимали послеоперационную рентгенограмму для подтверждения уровня прокола. Перорально вводили 1,5 мг мелоксикама (за день до операции и 2-3 дня после операции). Анальгетик (бупренорфин HCl 0,01-0,03 мг/кг) давали до двух раз в день в течение 2-3 дней, по необходимости, при консультировании с ветеринарным персоналом. После отхождения анестезии кроликов возвращали в свои клетки и позволяли им двигаться без ограничений. Чтобы не дать кроликам достать и повредить/вскрыть место хирургического разреза и вырвать скобы, использовали специальные жилеты.
Оценка результатов терапевтической обработки. Через четыре недели после первичной операции (кольцевого прокола), аналогичную хирургическую процедуру проводили с другой стороны, чтобы избежать кровотечения из шрама, образовавшегося после первой операции. После подтверждения хирургического повреждения дисков путем рентгенографии и визуального осмотра каждому кролику в студенистое ядро диска вводили ФСБ, 1 000 000 или 100 000 клеток, используя микрошприц и иглу 28 калибра на уровнях L2/3 и L4/5. Диск L3/4 оставляли в качестве непроколотого и необработанного контроля. После закрытия хирургической раны кроликов возвращали в свои клетки и внимательно наблюдали за ними. Как описано ранее, животным в течение трех дней вводили антибиотик и анальгетик. Каждый кролик получал перорально 1,5 мг мелоксикама (за день до операции и 2-3 дня после операции). Внимательно наблюдали за поведением, аппетитом и изменением веса тела животных, и ветеринарный персонал и исследователи наблюдали за послеоперационным стрессом.
Все инъекционные материалы готовили в стерильных условиях. Для исследования использовали клетки hUTC категории Research grade (партия Q030306), проверенные на стерильность, микоплазму, кариотип и патогены. Хранившиеся в криогенных условиях клетки быстро размораживали и разбавляли ФСБ. Клетки центрифугировали и супернатант удаляли. Клетки повторно суспендировали в ФСБ и подсчитывали для получения конечной концентрации клеток 100 000 или 10 000 клеток на микролитр. Для оценки жизнеспособности клеток использовали трипановый синий. Десять микролитров клеток помещали в предварительно стерилизованные микрошприцы и вкалывали их в МПД, как описано выше.
Через 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 и 16 недель после прокола и после умерщвления на 16 неделе после прокола снимали рентгенограмму для измерения высоты МПД, введя гидрохлорид кетамина (25 мг/кг) и малеат ацепромазина (1 мг/кг).
Через 16 недель после первичного кольцевого прокола (что соответствует 12 неделям после введения (клеток)), по восемь кроликов из каждой группы анестезировали гидрохлоридом кетамина (25 мг/кг) и малеатом ацепромазина (1 мг/кг) и умерщвляли избыточной дозой фенобарбитала (90 мг/кг, раствор Euthanasia B solution: Henry Schein Inc., г. Мелвилл, штат Нью-Йорк).
Пленки с рентгенограммами, полученными перед проколом, в каждой временной точке после прокола и после умерщвления оцифровали и измерили высоту тела позвонка и высоту диска. Высоту МПД выразили в форме индекса высоты диска (DHI), следуя опубликованным способам (Chujo et al., Spine, 2006 г.; 31:2909-17; Masuda et al., Spine, 2006 г.; 31:742-54). Исследователь-ортопед, не знающий об отнесении животных к группам лечения, независимо интерпретировал все рентгенограммы. Оцифрованные рентгенограммы, результаты измерений, включая высоту тела позвонка и высоту МПД, анализировали с помощью специально написанной программы в среде MATLAB (г. Нэтик, штат Массачусетс). Данные экспортировали в пакет Excel и выразили высоту МПД в виде индекса высоты диска (DHI = высота МПД/высота соседнего к МПД тела позвонка), следуя способу Lu et al., Spine, 22:1828-34 (1997 г.) с небольшими модификациями. Среднюю высоту МПД (DHI) рассчитали усреднением результатов измерения передней, средней и задней частей МПД и делением такого среднего на среднюю высоту соседних тел позвонков. %DHI выражали как (послеоперационный DHI/дооперационный DHI)×100. Кроме того, %DHI нормировали, используя в качестве контрольного уровня уровень L3/4. Нормированный %DHI = (%DHI для экспериментального уровня/%DHI для уровня L3/4)×100. Также рассчитали скорость восстановления следующим образом: (%DHI (временная точка) - %DHI (4 нед [прокола]))/(100-%DHI (4 нед [прокола])).
Значимость различий между средними величинами для результатов измерения по рентгенограммам анализировали в модели повторных измерений ANOVA или в модели однократных измерений ANOVA с последующим апостериорным анализом по критерию наименьшей значимой разности Фишера. Все данные выражали в виде среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводили в программном пакете Statview (Версия 5.0, SPSS, г. Чикаго, штат Иллинойс) при уровне значимости p<0,05.
Индекс высоты диска оценивали раз в две недели, как описано выше. Диски с дефицитом менее 10% из исследования исключали. Результаты (представленные в таблице 17) показывают, что высота дисков увеличивалась при дозировке клеток hUTC 100 000 и уменьшалась при дозировке клеток 1 000 000 по сравнению с контролем на промежутке 2-12 недель после трансплантации (6-16 недель после прокола) (p<0,05 hUTC (1 000 000) по сравнению с hUTC (100 000) 2, 4, 6 и 14 недель после трансплантации; p<0,01 8 недель после трансплантации).
Таблица 17Влияние клеток hUTC на высоту диска
Высота диска (%)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
До операц.
2 нед.-прокол
4 нед.-прокол
2 нед.
4 нед.
6 нед.
8 нед.
10 нед.
12 нед.
Контроль
100,0
79,4
79,3
78,9
79,5
78,5
77,1
74,8
78,5
Контроль - SE
0,0
3,2
2,8
2,1
2,6
3,4
4,6
3,6
2,0
1,00E+06
100,0
76,6
76,6
74,8
74,6
72,7
70,8
74,4
72,9
SE
0,0
2,2
1,5
2,1
1,8
2,1
1,4
1,8
2,8
1,00E+05
100,0
84,8
76,6
83,7
83,8
81,3
86,0
82,4
82,2
SE
0,0
1,7
2,6
2,7
3,3
1,9
3,1
4,2
3,8
Скорость восстановления измерили, как описано выше. Диски с дефицитом менее 10% из исследования исключали. Результаты (представленные в таблице 18) показывают, что скорость восстановления увеличивалась при дозировке клеток hUTC 100000 и уменьшалась при дозировке клеток 1000000 по сравнению с контролем на промежутке 2-12 недель после трансплантации (6-16 недель после прокола) (p<0,05 контроль по сравнению с клетками hUTC (100000 клеток) 2 и 14 недель после трансплантации; p<0,01 12 недель после трансплантации).
Таким образом, оценили влияние клеток hUTC на дегенеративные изменения МПД в кроличьей модели дегенеративных изменений МПД путем инъекции клеток hUTC в проколотый МПД в количестве 1000000 и 100000 клеток/инъекцию. Каждые две недели снимали рентгенограммы и анализировали изменение высоты диска по сравнению с необработанным проколотым контролем. Полученные данные показывают, что обработка клетками hUTC в концентрации 100000 приводит к увеличению высоты диска, а обработка в концентрации 1000000 снижает высоту диска по сравнению с обработанными ФСБ контролями (таблица 17). Дополнительный анализ данных показал, что скорость восстановления (величина восстановления/полное снижение нормированного %DHI) дисков, обработанных клетками hUTC (100000), оказалась выше, чем для контроля (таблица 18).
Таблица 18Эффект клеток hUTC на скорость восстановления (%)
Скоростьвосстановления
0
2
4
6
8
10
12
14
16
До операц.
2 нед.-прокол
4 нед.-прокол
2нед.
4нед.
6нед.
8нед.
10нед.
12нед.
Контроль-
0,0
0,0
0,0
-0,1
-0,1
-0,1
-0,1
-0,3
-0,2
Контроль - SE
0,0
0,0
0,0
0,1
0,2
0,2
0,3
0,2
0,2
1,00E+06%
0,0
0,0
0,0
-0,1
-0,1
-0,2
-0,3
-0,1
-0,2
SE
0,0
0,0
0,0
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
1,00E+05%
0,0
0,0
0,0
0,3
0,2
0,1
0,4
0,3
0,3
SE
0,0
0,0
0,0
0,1
0,2
0,1
0,2
0,1
0,1
Пример 10
Экспрессия белков внеклеточного матрикса клетками, полученными из ткани пуповины человека, in vitro
Провели исследование для определения степени экспрессии трех белков внеклеточного матрикса, аггрекана, коллагена I и коллагена II, клетками hUTC in vitro. Клетки тестировали сами по себе и после стимуляции трофическими факторами, TGF-бета, GDF-5 и PDGF-BB.
Культуры клеток, полученных из ткани пуповины человека (hUTC; партия 120304), поддерживали в культуре в стандартных условиях. Вкратце, клетки высевали с плотностью 5000 клеток на квадратный см в T-колбах с пассированием и пересевам каждые 3-4 дня. Клетки для эксперимента со стимуляцией трофическим фактором инкапсулировали в гранулы из альгината и обрабатывали факторами в стандартной ростовой среде. В культуры добавляли аскорбиновую кислоту в количестве 100 мкг/мл. Тестировали следующие факторы: PDGF-BB в концентрации 10 нг/мл, TGF бета-1 в концентрации 5 нг/мл и GDF-5 в концентрации 200 нг/мл. Создали пять групп лечения, используя только клетки hUTC, клетки hUTC с GDF-5, клетки hUTC с TGF-бета1, клетки hUTC с PDGF-BB и клетки hUTC с TGF-бета1 и GDF-5.
После культивирования в течение 2 недель клетки извлекли из альгината, промыли, осадили и заморозили. Выделили РНК и провели обратную транскрипцию для получения кДНК. Образцы анализировали с использованием ПЦР в реальном времени на экспрессию аггрекана, коллагена типа I и типа II.
Результаты анализа с использованием ПЦР в реальном времени показывают экспрессию белков в пяти разных условиях культивирования. Полученные результаты приведены в таблице 19 и выражены в виде относительного уровня экспрессии по сравнению с клетками hUTC без обработки факторами роста. Культуры, обработанные PDGF-BB и GDF-5 с TGF-бета1, показали сравнимые уровни экспрессии аггрекана, коллагена I и коллагена II. Клетки, обработанные TGF-бета1, показали некоторую индукцию коллагена I и коллагена II и аггрекана на уровне приблизительно 10-20 раз. Наибольшую индукцию наблюдали при обработке GDF-5. Клетки показали приблизительно 50-кратное увеличение экспрессии аггрекана и коллагена типа I и более чем 300-кратное увеличение экспрессии коллагена типа II.
Таблица 19Экспрессия белков внеклеточного матрикса клетками hUTC in vitro
Отн. мРНК
Аггрекан
Коллаген I
Коллаген II
Клетки hUTC
1
1
1
hUTC+GDF-5
56
45
387
hUTC+GDF-5/TGF бета
1
1
113
hUTC+PDGF
1
<1
<1
hUTC+TGF бета
23
7
13
ПРИМЕР 11
Экспрессия теломеразы в клетках, полученных из пуповины
Функция теломеразы состоит в синтезе теломерных повторов, которые защищают целостность хромосом и продлевают репликативно-активную жизнь клеток (Liu, K, et al., PNAS, 1999 г.; 96:5147-5152). Теломераза состоит из двух компонентов - теломеразного РНК-шаблона (TERC) и теломеразной обратной транскриптазы (hTERT). Регулирование теломеразы определяется транскрипцией hTERT, но не TERC. Таким образом, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени для мРНК hTERT является общепринятым способом определения теломеразной активности клеток.
Выделение клеток. Для определения продукции теломеразы в клетках, полученных из ткани пуповины человека, проводили эксперименты с ПЦР в реальном времени. Клетки, полученные из ткани пуповины человека, подготовили в соответствии с описанными выше примерами. По существу пуповины, полученные в Национальном центре по обмену материалами для исследования заболеваний (NDRI, г. Филадельфия, штат Пенсильвания) после нормально прошедших родов, промывали для удаления крови и продуктов распада клеток и механически диссоциировали. Затем ткань инкубировали с расщепляющими ферментами, включая коллагеназу, диспазу и гиалуронидазу, в культуральной среде при температуре 37°C. Клетки, полученные из ткани пуповины человека, культивировали в соответствии со способами, описанными в приведенных выше примерах. Мезенхимальные стволовые клетки и нормальные фибробласты дермы кожи (cc-2509 партия № 9F0844) получили от компании Cambrex, г. Уолкерсвилл, штат Мэриленд. Плюрипотентные клетки nTera-2 клеточной линии тестикулярной эмбриональной карциномы (тератомы) nTera-2 (NTERA-2 cl.Dl) (см., Plaia et al., Stem Cells, 2006 г.; 24(3):531-546) приобрели в культуральной коллекции ATCC (г. Манассас, штат Вирджиния) и культивировали в соответствии с описанными выше способами.
Выделение общей РНК. РНК экстрагировали из клеток с использованием набора RNeasy (Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния). РНК элюировали 50 микролитрами обработанной DEPC воды и хранили при температуре -80°C. Обратную транскрипцию РНК проводили с использованием случайных гексамеров, применяя реагенты для обратной транскрипции TaqMan (Applied Biosystems, г. Фостер Сити, штат Калифорния) при температуре 25°C в течение 10 минут, температуре 37°C в течение 60 минут и температуре 95°C в течение 10 минут. Образцы хранили при температуре -20°C.
ПЦР в реальном времени. ПЦР проводили на образцах кДНК с использованием продуктов для экспрессии генов Assays-on-Demand™ компании Applied Biosystems (также известные как наборы для определения экспрессии генов TaqMan Gene Expression Assays) в соответствии с инструкциями производителя (Applied Biosystems). Этот коммерчески доступный набор широко используют для проверки клеток человека на теломеразу. Вкратце, hTERT (ген теломеразы человека) (HsOO162669) и GAPDH человека (внутренний контроль) смешивали с кДНК и универсальным мастер-миксом для ПЦР TaqMan, использовали секвенатор 7000 с программным обеспечением ABI Prism 7000 SDS (Applied Biosystems). Использовали следующие условия термоциклирования: сначала 50°C в течение 2 минут и 95°C в течение 10 минут, затем 40 циклов по 95°C в течение 15 секунд и 60°C в течение 1 минуты. Данные ПЦР анализировали в соответствии с рекомендациями производителя.
Клетки, полученные из ткани пуповины человека (номер доступа ATCC PTA-6067), фибробласты и мезенхимальные стволовые клетки человека анализировали на hTERT и 18S РНК. Как показано в таблице 20, hTERT и, следовательно, теломеразу не обнаружили в клетках, полученных из ткани пуповины человека.
Таблица 20
hTERT
18S РНК
Клетки пуповины (022803)
не определяется
+
Фибробласты
не определяется
+
не определяется = при анализе не обнаружено; + сигнал обнаружен
Проанализировали клетки, полученные из ткани пуповины человека (изолят 022803, номер доступа ATCC PTA-6067), и клетки nTera-2, полученные результаты показали отсутствие экспрессии теломеразы в двух партиях клеток, полученных из ткани пуповины человека, тогда как клеточная линия тератомы экспрессировала теломеразу на высоком уровне (таблица 21).
Таблица 21
Клеточный тип
hTERT
GAPDH
hTERT норм.
Эксп. 1
Эксп. 2
Эксп. 1
Эксп. 2
nTera2
22,85
27,31
16,41
16,31
0,61
022803
-
-
22,97
22,79
-
Следовательно, можно сделать вывод, что клетки, полученные из ткани пуповины человека, которые составляют предмет настоящего изобретения, не экспрессируют теломеразу.
ПРИМЕР 12
Инъекция клеток, полученных из ткани пуповины человека, в студенистое ядро изменяет течение дегенеративных изменений межпозвоночного диска in vivo
В этом примере изучали полезность инъекции клеток, полученных из ткани пуповины человека (hUTC), непосредственно в студенистое ядро в хирургической in vivo модели дегенеративных изменений МПД. Клетки hUTC вводили вместе с и без гидрогелевого носителя. Это одно из первых исследований по изучению МРТ и биохимического отклика на обработку в такой модели дегенеративных изменений.
Способы
Как более подробно описано ниже, использовали тридцать новозеландских белых кроликов со зрелым скелетом (контрольная группа n=6, группа с проколом n=6, группа с гидрогелевым носителем n=6, группа с клетками + ФСБ буфер n=6, группа с клетками + гидрогелевый носитель n=6) в верифицированной ранее кроличьей аннулотомической модели дегенеративных изменений межпозвоночных дисков (см. Sobajima et al. Spine. 2005 г.; 30(1):15-24). Диски L2-3, L3-4 и L4-5 прокалывали иглой 16 калибра для индуцирования дегенеративных изменений и затем обрабатывали клетками, полученными из ткани пуповины человека, с использованием или без использованием гидрогелевого носителя. Анализировали последовательно полученные МРТ-томограммы позвоночника, снятые на 0, 3, 6 и 12 неделях с использованием катушек для колена на 3 Тл, на наличие признаков дегенеративных изменений в соответствии с верифицированной ранее методологией. На 12 неделе кроликов умерщвляли и проводили гистологический анализ дисков L4-5. Вязкоупргугие свойства дисков L3-4 анализировали в тесте на нормированное на нагрузку смещение при одноосном нагружении. Кривые ползучести моделировали математически в соответствии с ранее верифицированной двухфазной экспоненциальной моделью.
Кролики
В данном исследовании использовали тридцать новозеландских белых кроликов со зрелым скелетом (самки, возраст 1 год, вес 5 кг). Животных раздели на контрольную группу без прокола (n=6), группу с проколом (n=6), группу с проколом и последующим введением только носителя (n=6), группу с проколом и последующим введением клеток в ФСБ буфере (n=6) и группу с проколом и последующим введением клеток в носителе (n=6).
Приготовление образцов
2
Ткани пуповины человека получали у давшего на это согласие донора после естественных или кесаревых родов. Клетки, полученные из ткани пуповины человека (hUTC), выделяли и размножали из пуповины одного донора. Вкратце, пуповину вручную измельчали и расщепляли смесью 0,5 единиц/мл коллагеназы (Nordmark), 5,0 единиц/мл диспазы (Roche Diagnostics) и 2 единиц/мл гиалуронидазы (ISTA Pharmaceuticals) до практически полного расщепления. Клеточную суспензию пропустили через сито для удаления нерасщепленной ткани, и клетки центрифугировали и высевали с плотностью 5 000 клеток на см на покрытые свиным желатином колбы в ростовой среде 1 (среда DMEM с низким содержанием глюкозы (Cambrex/SAFC Biosciences), 15% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки определенного состава (FBS; HyClone, г. Логан, штат Юта), 0,001% бета-меркаптоэтанола (Sigma), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Lonza)). Клетки размножали в T-колбах без встряхивания в стандартных условиях культивирования в среде с атмосферным содержанием кислорода и 5% диоксида углерода при температуре 37° до достижения пяти удвоений популяции и затем собирали. Затем клетки размножали в T-колбах без встряхивания до достижения приблизительно 12 общих удвоений популяции в ростовой среде 2 (среда DMEM с низким содержанием глюкозы, 15% (об./об.) фетальной бычьей сыворотки определенного состава (FBS; HyClone), 100 единиц/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Invitrogen)) и собирали. Затем клетки дополнительно размножали на микроносителях HILLEX II (SoloHill Engineering) в колбах с перемешиванием (Corning, NY) в ростовой среде 2. Содержащие клетки колбы с перемешиванием устанавливали на столы для перемешивания со скоростью перемешивания 60 об/мин и культивировали клетки в стандартных условиях культивирования в среде с атмосферным содержанием кислорода и 5% диоксида углерода при температуре 37° до достижения приблизительно 25-30 общих удвоений популяции. Клетки собирали с микроносителей с использованием фермента TrypLE™ (Invitrogen), криоконсервировали и хранили при криогенных температурах. Аликвоты клеточного банка размораживали для тестирования характеристик клеток, которые включали в себя жизнеспособность, восстановление, стерильность, эндотоксины, микоплазму, кариологию и иммунофенотипирование маркеров клеточной поверхности, для обеспечения безопасности и идентичности клеток. Клетки тестировали на раннем пассаже на вирусные патогены с использованием анализа ПЦР для выявления последовательностей нуклеиновых кислот, специфичных для вирусов HIV-1, HIV-2, CMV, HBV, HCV, HTLV и EBV. Клетки хранили при криогенных температурах до использования и готовили к инъекции непосредственно перед введением. Непосредственно перед введением клеток животным флаконы с клетками размораживали на водяной бане с температурой 37°C и затем промывали клетки ФСБ. Отбирали аликвоты суспензии клеток, смешивали их с трипановым синим и подсчитывали клетки на гемоцитометре. Концентрацию клеток корректировали до соответствующей плотности для введения. В качестве раствора-носителя использовали либо ФСБ, либо образующийся in situ гидрогелевый носитель, получаемый из компонентов фибринового клея EVICEL (EVICEL Fibrin sealant (Human), Omrix Pharmaceuticals, Ltd.). Для загрузки клеток в гидрогель клетки смешивали с фибриногеном человека (6,8-10,6 мг/мл) в ФСБ. Полученный реагент смешивали с тромбином человека (0,4-0,6 единиц/мл) в ФСБ. Практически сразу после смешивания образовывался гель.
Операция по проколу диска
В ветеринарной операционной, в стерильных хирургических условиях и под общим наркозом, открывали доступ к поясничным отделам позвоночника кроликов через левый переднебоковой подход. Межпозвоночный диск L4-5 идентифицировали по его положению относительно гребня подвздошной кости и прокалывали иглой 16 калибра на глубину 5 мм таким образом, чтобы острие иглы оказывалось в центре диска. Игла входила в диск параллельно концевым пластинам со скосом, обращенным к голове. Затем прямым осмотром и пальпацией идентифицировали диски L3-4 и L2-3 и прокалывали их, как описано выше. После операции кроликов держали в больших персональных клетках, обеспечивающих неограниченную подвижность животного. Проводимая таким образом аннулотомия МПД кролика индуцирует медленный, надежный, воспроизводимый каскад дегенеративных изменений, который можно подтвердить последовательно снимаемыми взвешенными по T2 МРТ-томограммами (см. Masuda et al. Spine. 2005 г.; 30(1):5-14).
Операция по инъекции
5
5
Кроликов из групп лечения через 3 недели после первоначальной операции по проколу снова вернули в операционную. Доступ к позвоночнику открывали через правый переднебоковой подход (с противоположной стороны от места проведения операции по проколу). Используя микрошприц Hamilton объемом 100 микролитров (1710TPLT; продукт № 81041), иглу Hamilton 30 калибра с острым концом и пластиковой втулкой (KF 730 NDL 6/pack, 30G/2"; продукт № 90130), выполнили терапевтическую инъекцию в центр студенистого ядра. Для группы с введением только носителя для каждого диска в шприц набирали по 15 микролитров гидрогеля и затем медленно вводили его в диск (менее чем за 4,5 минуты для облегчения введения жидкости до гелеобразования). Для группы с введением клеток + буфер (фосфатно-солевой буфер) в каждый диск вводили 10 клеток в 15 микролитрах стерильного ФСБ. Для группы с введением клеток в носителе вводили 10 клеток в 15 микролитрах гидрогелевого носителя. Инъекции проводили под рентгеновским устройством с рамой C-типа, чтобы обеспечить введение иглы в центр диска. Все инъекции проводили с целенаправленно малой и постоянной скоростью на протяжении одной минуты, чтобы избежать быстрого подъема давления в диске и последующего выталкивания материалов. После этого на кроликах закрывали разрез, выводили их из-под наркоза и ухаживали за ними, как описано для операции по проколу.
Магниторезонансная томография
Снимали сагиттальные МРТ-томограммы в момент времени 0 (перед кольцевым проколом), 3 недели (перед операцией по инъекции), 6 недель и 12 недель (перед умерщвлением). Используя магнит фирмы Siemens на 3 Тесла и стандартную катушку для колена человека, получали взвешенные по T1 изображения (TR=650 мс, TE=14 мс, толщина слоя = 0,6 мм) и взвешенные по T2 изображения (TR=3800 мс, TE=114 мс, толщина слоя = 0,6 мм). Кроликам давали наркоз и помещали их в катушку для колена в положении на спине. Взвешенные по T1 изображения использовали для качественной проверки на наличие аномалий костей позвоночника. Взвешенные по T2 изображения использовали для количественного определения объема дегенеративных изменений дисков. Подготовленный специалист идентифицировал слой срединной сагиттальной плоскости для взвешенных по T2 последовательностей на основе ширины тела позвонка, спинного мозга и остистых отростков. Для идентификации студенистого ядра как области исследования использовали верифицированный ранее способ автоматической сегментации (см. Bechara et al. Am J Neuroradiology. 2010 г.; 31(9):1640-1644). Рассчитывали индекс МРТ как сумму произведений площадей пикселов на интенсивность пикселов для каждого пиксела в области исследования. Усреднили относительную по сравнению с контрольными величинами для недели 0 процентную площадь студенистого ядра и индекс МРТ по трем исследуемым дискам и отложили их как функцию времени. Статистическую значимость рассчитывали с использованием T-критерия Стьюдента (p<0,05).
Умерщвление и обработка образцов
Всех кроликов умерщвляли через 12 недель после первоначальной операции по проколу (после снятия последней МРТ-томограммы). Немедленно после смерти вырезали позвоночники блоками. Диск L4-5 готовили для гистологического анализа. Диски фиксировали и декальцифицировали с использованием раствора DECALCIFIER I (Surgipath Medical Indus., Inc.) в течение двух недель, затем дегидратировали в гистологическом процессоре ткани и заливали в парафин. Затем диски нарезали на срезы толщиной 5 мкм в сагиттальной плоскости. Срезы окрашивали смесью гематоксилина и эозина (H&E) (Sigma) с использованием стандартного гистологического протокола и фотографировали на микроскопе Nikon E800.
Биомеханический анализ
После умерщвления диск L3-4 вырезали в виде позвоночно-двигательного сегмента (FSU, кость-диск-кость) для проведения биомеханического анализа. Образцы очищали от постериальных элементов, заливали в эпоксидный компаунд и устанавливали с использованием специальных креплений на устройство для аксиального тестирования, управляемое программой на основе нечеткой логики, написанной в среде Matlab (Matlab R2008a, The Mathworks, Inc., г. Нэтик, штат Массачусетс). Все диски заворачивали в пропитанную солевым раствором ткань для сведения к минимуму дегидратации, тестирование проводили непосредственно в день умерщвления. Образцы предварительно обрабатывали 20 циклами компрессионного нагружения (от 0 до 1,0 МПа, 0,1 мм/с) и затем устанавливали под постоянную сжимающую нагрузку (1,0 МПа) на 1100 секунд. Такую величину нагрузки выбрали, поскольку она сравнима с давлениями, испытываемыми МПД человека в повседневной жизни (с коррекцией на меньший размер дисков кролика) (Wilke et al. Spine. 1999 г.; 24(8):755-762). Фазу начального нагружения определяли как первые 200 микросекунд теста, а фазу течения определяли как остальную продолжительность теста. После теста кривые ползучести аппроксимировали двухфазной экспоненциальной моделью,
,
0
1
2
1
2
где d(t) представляет собой зависимость аксиального смещения от времени, L представляет собой приложенную нагрузку, Sи S представляют собой коэффициенты упругого демпфирования (Н/мм) и ηи η представляют собой коэффициенты вязкого демпфирования (Нс/мм). Для каждых условий обработки получали средние кривые и аппроксимировали их в экспоненциальной модели.
Результаты
Кролики
Ни в одной группе не обнаружено вызванных обработкой отрицательных эффектов.
МРТ-томограммы
На взвешенных по T1 МРТ-томограммах срединной сагиттальной плоскости дисков L2-3, L3-4 и L4-5 не обнаружено значительных изменений формирования остеофитов. На взвешенных по T2 МРТ-томограммах срединной сагиттальной плоскости дисков в группе с проколом обнаружены признаки дегенеративных изменений (область исследования потемнела и сжалась с 0 по 12 неделю) по сравнению с контрольной группой без прокола. Для всех трех групп лечения качественно получено меньше дегенеративных изменений по сравнению с группой с проколом, как показано на фиг. 1 и 2. Для проколотых (и необработанных) дисков наблюдались самые выраженные дегенеративные изменения с уменьшением площади студенистого ядра на 59% и уменьшением индекса МРТ на 64% с течением времени. Для всех трех групп лечения получены меньшие дегенеративные изменения по сравнению с группой с проколом по результатам измерения как площади студенистого ядра, так и индекса МРТ. В группе, обработанной клетками с носителем, наблюдалось самое малое уменьшение площади студенистого ядра и индекса МРТ из всех обработанных групп, она больше всего походила на контрольную группу (фиг. 3). На 0 и 3 неделях не наблюдалось никаких статистически значимых различий в индексе МРТ или площади студенистого ядра между контрольной группой и всеми тремя группами лечения или между группой прокола и группами лечения. На 6 и 12 неделях различия как в индексе МРТ, так и в площади студенистого ядра между контрольной группой и группой с проколом были статистически значимыми, как и следовало ожидать для работающей модели дегенеративных изменений. Для контрольной группы и группы, получавшей носитель, наблюдались статистически значимые различия в индексе МРТ на 6 и 12 неделях и в площади студенистого ядра на 12 неделе. Контрольная группа и группа, получавшая буфер + клетки, статистически значимо различались по индексу МРТ на 12 неделе. Контрольная группа и группа, получавшая носитель + клетки, статистически значимо различались и по индексу МРТ, и по площади студенистого ядра как на 6, так и на 12 неделе. Для группы с проколом и группы, получавшей носитель, не наблюдалось статистически значимых различий в индексе МРТ во всех точках по времени. Группа с проколом и группа, получавшая буфер + клетки, статистически значимо различались и по индексу МРТ, и по площади студенистого ядра как на 6, так и на 12 неделе. Группа с проколом и группа, получавшая носитель + клетки, статистически значимо различались по индексу МРТ и по площади студенистого ядра на 12 неделе.
Биомеханический анализ
На фиг. 4 представлены полные кривые смещения при нормированной нагрузке (фаза первичного нагружения и фаза последующего течения). Имеется тенденция к различию между группами. Более конкретно, кривая для контрольной группы похожа на кривую для группы, получавшей носитель + клетки, кривая для группы с проколом похожа на кривую для группы, получавшей буфер + клетки, а кривая для группы, получавшей носитель, лежит между этими группами. Основные различия между группами наблюдались на фазе первичного нагружения. Несмотря на отмеченные тенденции, при аппроксимации фазы течения кривой в двухэкспоненциальной модели статистически значимых различий между коэффициентами раннего и позднего вязкого и упругого демпфирования не наблюдалось (данные не приведены).
Гистологический анализ
Представительные сагиттальные срезы диска L4-5 окрашивали смесью гематоксилина и эозина (H&E) и анализировали при увеличении 20x и 100x (фиг. 5, 6 и 7). Контрольные диски сохранили свою архитектуру. Как и ожидалось, для проколотых дисков наблюдалось понижение насыщенности клетками и фиброз в студенистом ядре, что указывает на дегенеративные изменения. Для проколотых дисков, обработанных гидрогелевым носителем, наблюдалось некоторое понижение насыщенности клетками, но сохранение здорового внеклеточного матрикса. Обработка клетками + буфер привела к относительному сохранению площади студенистого ядра, хотя наблюдался значительный фиброз. Обработка клетками + носитель привела к улучшению насыщенности клетками и архитектуры по сравнению с проколотыми дисками.
Обсуждение
В данном примере содержится широкий и разнообразный спектр показателей, включая новые показатели на основе технологии МРТ и биомеханических измерений, не только для количественно выражения степени дегенеративных изменений межпозвоночного диска, но также для демонстрации отклика на целевую обработку для лечения дегенеративных изменений диска. Как подробно обсуждается в данном примере, для групп лечения наблюдаются вязкоупругие свойства, отличные от таких свойств для контрольной группы и группы прокола.
На основе результатов МРТ, гистологического и биохимического анализа можно сделать вывод, что введение клеток hUTC в носителе в межпозвоночные диски (МПД) поясничного отдела кролика, пораженные ДМД, обеспечивает более благоприятный эффект по сравнению с введением только носителя или только клеток в буфере. Все три типа обработки оказались благоприятными по сравнению с необработанными дисками с проколом. По результатам МРТ площадь студенистого ядра и индекс МРТ для всех трех групп лечения оказался промежуточным между соответствующими величинами для контрольной группы (без дегенеративных изменений) и группы с проколом (наиболее выраженные дегенеративные изменения), указывая на то, что обработка помогла частично замедлить изменение высоты диска и интенсивности сигнала МРТ. Аксиальное нагружение дало характерные кривые смещения для каждых условий обработки. Гистологический анализ продемонстрировал варьируемую степень восстановления архитектуры диска и его насыщенности клетками при обработке.
Для группы, получавшей клетки + ФСБ, получены данные МРТ, попадающие между результатами для контрольной группы и группы с проколом, и очень похожие на данные МРТ для группы, получавшей носитель. Однако кривая смещения для этой группы была наиболее близка к кривой для проколотого состояния, указывая, что, хотя такая обработка и помогла частично восстановить площадь студенистого ядра и интенсивность сигнала МРТ, она оказалась не слишком эффективной для восстановления исходных механических характеристик диска.
Для группы, получавшей только носитель, получены данные МРТ, попадающие между результатами для группы с проколом и группы без прокола. В этом примере кривая смещения для группы, получавшей гидрогель, также попадает между кривыми для группы с проколом и группы без прокола, указывая, что гидрогелевый носитель оказался способным восстановить некоторые механические характеристики диска независимо от синтеза внеклеточного матрикса нативными или трансплантированными клетками. Результаты гистологического анализа для группы, получавшей носитель, показывают большую насыщенность клетками, чем можно было бы ожидать для обработки без использования клеток, возможно указывая на то, что гидрогель оказался способным обеспечить безопасную среду для развития нативных клеток.
В группе, получавшей клетки в носителе, объединены и клеточный трансплантат, и гидрогелевый носитель, которые вводили путем инъекции в двух других группах. Для этой группы наблюдается устойчивая, но не значимая тенденция к измеряемым по МРТ характеристикам дегенеративных изменений, лучшим по сравнению с группами лечения (наиболее близкие к контрольной группе, хотя все еще значимо отличающиеся от величин для контрольной группы). Для этой группы также наблюдалась кривая смещения, наиболее близкая к кривой для контрольной группы, что указывает на наилучший механический отклик. Результаты гистологического анализа для этой группы показывают заметный рост насыщенности клетками по сравнению с группой с проколом и относительно сохранения архитектуры, однако имеются и признаки фиброза.
Гистологических признаков иммунного ответа, генерируемого трансплантацией клеток человека в диски кролика, не обнаружено. Ни один из обработанных кроликов не показывал признаков болезни, гистологических признаков воспалительного ответа не обнаружено.
Ткань пуповины из послеродового материала человека представляет собой привлекательный источник клеток для клеточной терапии, поскольку донорная ткань легко доступна и клетки можно легко собрать без этических конфликтов, связанных с использованием эмбриональных стволовых клеток или клеток плода.
Подводя итоги, для группы с проколом наблюдаются МРТ и гистологические признаки дегенеративных изменений дисков по сравнению с контрольной группой без прокола, как и следовало ожидать. Для групп лечения наблюдаются менее выраженные МРТ и гистологические признаки дегенеративных изменений дисков по сравнению с группой с проколом. Для групп лечения наблюдаются вязкоупругие свойства, отличимые от свойств для контрольной группы и группы с проколом. Настоящее исследование также показывает, что введение (a) клеток hUTC и (b) носителя в межпозвоночные диски (МПД) поясничного отдела кролика с дегенеративными изменениями замедляет развитие дегенеративных изменений МПД. Введение клеток в гидрогеле замедляет развитие дегенеративных изменений больше, чем введение только (a) клеток hUTC или (b) только гидрогеля. Таким образом, в настоящем исследовании показано, что обработка проколотых межпозвоночных дисков кролика клетками, полученными из ткани пуповины человека (hUTC), с использованием или без использования гидрогелевого раствора-носителя, помогает восстановить МРТ, гистологические и биомеханические характеристики до величин, близких к величинам для контрольной группы без прокола.