СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ (2R, 3S)-ИЗОЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ИЗ ПОДСОЛНЕЧНОГО МАСЛА С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕЙ YARROWIA LIPOLYTICA
METHOD FOR SYNTHESIS OF (2R, 3S)-ISOCITRIC ACID FROM SUNFLOWER SEED OIL USING YARROWIA LIPOLYTICA YEAST

Область техники
S
Изобретение относится к области микробиологического получения органических кислот, в частности, (2R,3S)-изолимонной кислоты (традиционное название: Tpeo-D-изолимонная кислота), обладающей гепатопротекторным, актопротекторным и антигипоксическим действием, которая может быть использована для спортивного питания и в качестве биологически активной добавки к пище.
Уровень техники
Известны способы получения (2R,3S)-изолимонной кислоты с помощью различных штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica. Кислоту получают путем культивирования указанных выше дрожжей в жидких минеральных средах, содержащих источники азота, фосфора и минеральные соли.
Описан способ получения (2R,3S)-изолимонной кислоты в среде с н-алканами с Candida lipolytica ИБФМ Y-160 с выходом продукта - 68,3 г/л (109,8% от использованного субстрата) (А.с. №849780, 1983). Однако канцерогенность парафинов (Otto et al., 2011), и, следовательно, неприемлемость применения продукта в пищевой промышленности и медицине ограничивают применение этого метода.
Известны способы получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из этилового спирта с помощью природного штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 с выходом продукта 90,5 г/л (77% от субстрата) в условиях периодического режима (Kamzolova et al., 2018) и с выходом 109,6 г/л (80% от субстрата) в условиях отъемно-доливного культивирования (Morgunov et al., 2019). Недостаток вышеприведенных способов получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из этилового спирта - низкий выход продукта и сложность проведения ферментации из-за токсичности высоких концентраций этанола для клетки.
Известен способ получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из глицерин-содержащих отходов производства биодизеля. Генно-модицифированный трансформант Yarrowia lipolytica AJD pADUTGut1/2 с суперэкспрессией генов Gut1 и Gut2 характеризовался быстрым ростом на глицерин-содержащих отходах и продуцировал наряду с лимонной кислотой значительное количество (2R,3S)-изолимонной кислоты (42,5 г/л) (Rzechonek et al., 2019). Недостаток способа заключается в том, что он не обеспечивает достаточно высокого выхода (2R,3S)-изолимонной кислоты.
Известны способы получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из рапсового масла: с помощью природного штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 достигнут выход продукта - 70,6 г/л (82% от субстрата) (Kamzolova et al., 2013), а с использованием мутантных штаммов Yarrowia lipolytica 704-UV4-A-NG50 (Kamzolova et al., 2013) и Yarrowia lipolytica УФ/НГ (Камзолова и др., 2015) достигнуты выходы 86 г/л (95% от субстрата) и 88,7 г/л (90% от субстрата), соответственно. Однако наличие в составе рапсового масла эруковой кислоты (токсичной для человека) ограничивают применение этого субстрата в микробном синтезе продуктов для пищевой промышленности и медицины.
Наиболее близким к предполагаемому по достигаемому эффекту и совокупности существенных признаков является способ получения (2R,3S)-изолимонной кислоты из подсолнечного масла с помощью природного штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 (Kamzolova et al., 2008). Согласно этому способу дрожжи выращивают на среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии подсолнечное масло, а также источники азота, фосфора, минеральные соли и тиамин. Подсолнечное масло вносят дискретно - по 20 г/л в начале и далее по мере снижения концентрации масла ниже 5 г/л. Культивирование проводят при 28°С, концентрация растворенного кислорода 55-60% от насыщения, рН 6 (поддерживают добавлением 10-20% NaOH). В процессе ферментации накапливается 70 г/л (2R,3S)-изолимонной кислоты, что составляет - 75% от использованного субстрата. Также хорошие результаты по накоплению (2R,3S)-изолимонной кислоты в среде с подсолнечным маслом получаются при использовании штамма Yarrowia lipolytica EH 59 (Aurich et al., 2012, p.406): в процессе ферментации накапливается 93 г/л (2R,3S)-изолимонной кислоты, что составляет - 65% от использованного субстрата. Недостаток этих способов заключается в том, что они не обеспечивают достаточно высокого выхода (2R,3S)-изолимонной кислоты.
Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, заключается в получении нового высокоактивного штамма-продуцента (2R,3S)-изолимонной кислоты. Другой задачей является повышение выхода (2R,3S)-изолимонной кислоты при росте дрожжей Yarrowia lipolytica на среде с подсолнечным маслом.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении высокого уровня активности нового штамма Yarrowia lipolytica, адаптированного к высокому уровню изолимонной кислоты при ее производстве в промышленных условиях для фармацевтического и пищевого применения.
Сущность изобретения
Один из аспектов изобретения относится к штамму Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D-продуценту (2R,3S) - изолимонной кислоты.
Другой аспект изобретения относится к способу получения (2R,3S)-изолимонной кислоты путем аэробного культивирования с использованием штамма дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии подсолнечное масло. С целью увеличения выхода целевого продукта за счет повышения степени утилизации субстрата, в период с 20-24 часов культивирования в среду для ферментации вносят итаконовую кислоту в виде натриевой соли в количестве от 3,0 до 4,5 г/л, предпочтительно 3,9 г/л.
Описание изобретения
При совершенствовании промышленной технологии получения изолимонной кислоты технические задачи решались в области повышения эффективности способа непрерывного культивирования нового штамма-продуцента.
Штамм Yarrowia lipolytica LAMM 704-9 был получен путем многоступенчатой адаптации природного штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 к высокой концентрации (2R,3S)-изолимонной кислоты. Для проведения адаптации был выбран ступенчатый режим увеличения концентрации изолимонной кислоты в диапазоне от 0 до 1,4 г изолимонной кислоты на 1 г клеток в ростовых средах с подсолнечным маслом с концентрацией 30 г/л. Штамм Yarrowia lipolytica LAMM 704-9 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ Y-3044D.
Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или в пробирках на скошенной агаризованной среде Ридер с парафином или на сусло-агаре при +4°C с обязательным пересевом не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D имеет следующие характеристики:
Культурально-морфологические признаки
3-суточная культура в жидком сусле и на агаризованном сусле представлена овальными, удлиненно-овальными и округлыми клетками размером 4,0-6,5×4,5-13 мкм. Встречаются мелкие клетки 2,0-2,5×3,0-3,5 мкм. Часть крупных клеток имеет неправильную форму. Почкование полярное или латеральное. Клетки одиночные или соединены в цепочки из 2-3 клеток. Штрих на сусло-агаре (возраст 10 суток) сплошной, плоский, кремового цвета, гладкий, пастообразный, края ровные. Колонии на сусло-агаре округлые, диаметр большинства колоний 6 мм, встречаются мелкие колонии диаметром 3 мм (5-6% популяции). Колонии беловато-кремового цвета, пастообразные, края ровные, центр колоний приподнят. У 90% колоний поверхность гладкая, у 10% колоний - морщинистая. Колонии, выращенные на сусло-агаре за 4 недели, кремового цвета, края бахромчатые, поверхность колонии шероховатая, пастообразная, центр колонии приподнят. На стекле, в картофельном агаре за 5 сут культура образует псевдомицелий типа Candida и Mycocandida. Спор не образует. Строгий аэроб.
Физиологические и биохимические характеристики
Ассимилирует: рапсовое масло, подсолнечное масло, глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, глицерин-содержащие отходы производства биодизельного топлива, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит, молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты. Не ассимилирует: сахарозу, мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты. Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин, не требует биотин. Растет в среде с 10-14% изолимонной кислоты. Оптимальное значение рН для роста составляет 4,0-6,0, для синтеза изолимонной кислоты 5,5-6,0. Оптимальная температура 29°С. Максимальная температура роста 35°С. Штамм не растет при 37°С.
Штамм Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D культивируют в аэробных условиях на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии - подсолнечное масло, источник азота, фосфора, минеральные соли и тиамин. Культивирование осуществляется в ферментерах. Подсолнечное масло вносят дискретно в процессе культивирования по мере потребления его из среды. Для повышения эффективности в среду культивирования дополнительно вводят ионы железа - 1,2 мг/л (активатор аконитатат-гидратазы) и итаконовую кислоту (ингибитор изоцитрат-лиазы). При выращивании дрожжей без итаконовой кислоты при температуре 29°С и рН 6,0, выход (2R,3S)-изолимонной кислоты составляет 95,7 г/л, т.е. 85,8% от субстрата, а с итаконовой кислотой - 109,2 г/л, т.е. 99,8% от субстрата (см. таблицу 1).
Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.
Пример 1. Хранение штамма
4
2
4
4
2
3
2
2
4
2
4
3+
2+
2+
2+
2+
2+
Штамм хранят на агаризованной минеральной среде Ридер следующего состава (г/л): парафин - 20; (NH)SO - 3,0; MgSO⋅7HO - 0,7; Ca(NO) - 0,4; NaCl - 0,5; KHPO - 1,0; KHPO - 0,1; агар-агар -25,0; дрожжевой автолизат - 2 мл; смесь Буркгольдера - состав смеси микроэлементов по прописи Буркгольдера, мг/мл: KJ - 0,1; В - 0,01; Mn - 0,01; Zn - 0,01; Cu - 0,01; Мо - 0,01; Fe - 0,05; вода дистиллированная - до 1 л.
Пример 2. Подготовка и инкубирование посевного материала Дрожжи выращивают на косяках агаризованной среды в течение трех суток при 28-30°С.
4
2
4
4
2
3
2
2
4
2
4
Клетки с двух косяков суспендируют в 5 мл стерильной дистиллированной среды и переносят в колбу объемом 750 мл, содержащую 100 мл среды следующего состава (г/л): подсолнечное масло - 20,0; (NH)SO - 3,0; MgSO⋅7HO - 0.7; Ca(NO) - 0,4; NaCl - 0,5; KHPO - 1,0; KHPO - 0,1; микроэлементы (удвоенная смесь Буркгольдера); тиамин - 500 мкг, вода дистиллированная.
Инкубирование посевного материала проводят на качалке (220 об/мин) в течение 20-24 ч при 28-30°С. Выросшие клетки (из расчета 100 мг/л по сухому весу) переносят в другую партию колб со средой того же состава, что и для посевного материала и инкубируют в течение 48 ч при 28-30°С. На 24 ч и 48 от начала культивирования измеряют рН культуральной среды и проводят подтитровку среды стерильным раствором 10%-ной KOH до рН среды 4,5-6,0. В конце культивирования выросшую культуру (5-6 колб) сливают в колбу с отростком и используют для засева; сухой вес посевного материала - 3-4 г/л (для ферментера с рабочим объемом 6 л).
Пример 3. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D с подсолнечным маслом.
4
2
4
4
2
3
2
2
4
2
4
2+
Среда для ферментации имеет следующий состав (г/л): (NH)SO - 3,0; MgSO⋅7HO - 1,4; Ca(NO) - 0,8; NaCl - 0,5; KHPO - 2,0; KHPO - 0,2; дрожжевой автолизат - 6 мл; удвоенная смесь Буркгольдера; Fe - 1, 2 мг/л; вода дистиллированная.
До засева в ферментер вносят тиамин - 0,5 мг/л. Подсолнечное масло вносят дискретно - по 20 г/л в начале и далее в момент повышения концентрации растворенного кислорода на 10% в сравнении со стабильным уровнем насыщения кислорода. Такое повышение концентрации растворенного кислорода указывает на полное потребление дрожжами ранее присутствующего субстрата.
Культивирование проводят при 29°С, концентрация растворенного кислорода 55-60% от насыщения, рН 6 (поддерживают добавлением 20%-ного раствора KOH). В процессе ферментации на 144 ч накапливается 95,7 г/л (2R,3S)-изолимонной кислоты, что составляет 85,8% от использованного субстрата.
Пример 4. Культивирование штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D с внесением итаконовой кислоты.
Выращивание дрожжей на агаризованной среде, подготовку посевного материала, подготовку среды для ферментации, период подачи подсолнечного масла, а также установку параметров температуры, концентрации растворенного кислорода и рН среды, проводят как в примерах 2-3. В период 20-24 ч культивирования штамма Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D в среду ферментации вносят итаконовую кислоту в виде натриевой соли в количестве от 3,0 до 4,5 г/л, предпочтительно 3,9 г/л. Итаконовая кислота является ингибитором изоцитрат-лиазы, ключевого фермента метаболизма изолимонной кислоты.
В процессе ферментации на 144 ч накапливается 109,2 г/л (2R,3S)-изолимонной кислоты, что составляет 99,8% от использованного субстрата.
Результаты испытания способов представлены в таблице 1.
Промышленная применимость
В настоящем изобретении описан новый способ получения (2R,3S)-изолимонной кислоты, в котором с целью увеличения выхода целевого продукта из подсолнечного масла за счет повышения степени утилизации субстрата, в качестве продуцирующих дрожжей используют новый штамм Yarrowia lipolytica ВКМ Y-3044D. При этом в процессе культивации в период с 20-24 часов в среду ферментации вносят итаконовую кислоту. Применение нового штамма Yarrowia lipolytica в усовершенствованном способе культивации позволяет добиться синергетического эффекта от применения нового штамма и усовершенствованного способа культивирования высокоактивной и нетоксичной (2R,3S)-изолимонной кислоты для пищевой промышленности и медицины. Это создает возможность использовать ее в качестве компонента гепатопротекторного, актопротекторного и антигипоксического средств, применяемых в спортивном питании и в биологически активных добавках к пище. Предлагаемый способ позволяет получить выход (2R,3S)-изолимонной кислоты при культивировании на среде с подсолнечным маслом в 1,22-1,42 раза выше, чем ранее известный способ-прототип на подсолнечном масле.
Источники информации
1. Илларионова В.И. и др. Способ получения изолимонной кислоты. Авторское свидетельство № SU 849780 (1983).
2. Otto Ch. et al. Overproduction and secretion of α-ketoglutaric acid by microorganisms // Appl Microbiol Biotechnol 92, pp. 689-695 (2011).
3. Kamzolova S.V. et al. Fermentation conditions and media optimization for isocitric acid production from ethanol by Yarrowia lipolytica // Biomed Research International, Feb 7; 2018:2543210(2018).
4. Morgunov I.G. et al. Biosynthesis of isocitric acid in repeated-batch culture and testing of its stress-protective activity // Appl Microbiol Biotechnol 103(8), pp. 3549-3558 (2019).
5. Rzechonek D.A. et al. Aseptic production of citric and isocitric acid from crude glycerol by genetically modified Yarrowia lipolytica // Bioresour Technol 271: pp. 340-344 (2019).
6. Kamzolova S.V. et al. Isocitric acid production from rapeseed oil by Yarrowia lipolytica yeast // Appl Microbiol Biotechnol, V. 97, pp. 9133-9144 (2013).
7. Камзолова С.В. и др. Биосинтез изолимонной кислоты дрожжами Yarrowia lipolytica и его регуляция // Прикладная биохимия и микробиология, т. 51, №2, с. 251-257 (2015).
8. Kamzolova S.V. et al. Microbiological production of citric and isocitric acid from sunflower oil // Food Technol. Biotechnol. V. 46, №1, pp. 51-59 (2008).
9. Aurich A. et al. Microbiologically produced carboxylic acids used as building blocks in organic synthesis. In: Wang X., Chen J., Quinn P. (eds) Reprogramming Microbial Metabolic Pathways // Subcellular Biochemistry, vol 64. Springer, Dordrecht, pp. 391-423 (2012).