Чувствительность к антибиотикам и идентификция клинических штаммов Pseudomonas fulva

Чувствительность к антибиотикам и идентификция клинических штаммов Pseudomonas fulva

Е. П. СИВОЛОДСКИЙ', Г. В. ГОРЕЛОВА', С. П. БОГОСЛОВСКАЯ', Е. В. ЗУЕВА2

1 Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург

2 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, Санкт-Петербург

Antibiotic Susceptibility and Identification of Clinical Pseudomonas fulva Isolates

E. P. SIVOLODSKY, G. V. GORELOVA, S. P. BOGOSLOVSKAYA, E. V. ZUEVA S. M. Kirov Military Medical Academy, St.Petersburg

L. Pasteur Research Institute of Epidemiology and Microbiology, St.Petersburg

В коллекции культур псевдомонад, выделенных в г. Санкт-Петербурге в 1995—2005 гг., выявлены 8 наиболее ранних клинических штаммов P.fulva, что подтверждает медицинскую значимость этого вида. Установлен высокий уровень видовой идентификации всех штаммов P.fulva методом MALDI-TOF масс-спектрометрии с использованием прибора Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Inc.). Апробированы и предложены тесты традиционных исследований, позволяющие достоверно идентифицировать P.fulva без использования генетических методов. Установлен профиль чувствительности к антибиотикам клинических штаммов P.fulva. У двух штаммов P.fulva выявлена приобретённая резистентность к цефалоспоринам III поколения и хлорамфениколу.

Ключевые слова: Pseudomonas fulva, идентификация, MALDI-TOF масс-спектрометрия, пигменты псевдомонад, чувствительность к антибиотикам, медицинское значение.

The earliest eight clinical strains of Pseudomonas fulva were identified in the culture collection of pseudomonads isolated in St. Petersburg in 1995—2005, that confirmed the medical importance of the species. A high level of the species identification of all the strains of P.fulva by MALDI-TOF mass-spectrometry with the use of Microflex device with database MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Inc.) was shown. Tests for routine studies providing identification of P.fulva without the use of genetic methods were approved. The profile of the antibiotic susceptibility of the clinical strains of P.fulva was described. Acquired resistance of two P.fulva isolates to the 3rd generation cephalosporins and chloramphenicol was detected.

Key words: Pseudomonas fulva, identification, MALDI-TOF mass-spectrometry, pigments ofpseudomonads, antibiotic susceptibility, medical value.

Введение

Бактерии Pseudomonas fulva ( от греч. fulva — жёлто-коричневый ) были выделены в Японии с рисовых полей и описаны в 1963 году [1]. Первое сообщение о медицинской значимости P.fulva было опубликовано в 2010 году [2]. Клинический штамм был выделен в Аргентине из ликвора девочки с опухолью мозга, осложнённой инфекцией. Первоначально штамм был определен автоматическим микробиологическим анализатором Vitek 2 как P.putida, однако методами секвениро-вания ПЦР-продукта гена 16S рРНК и ДНК-ДНК гибридизации окончательно идентифицирован как P.fulva. У штамма была выявлена металло-бета-лактамаза типа VIM-2 с локализацией гена blavim_2 в интегроне. В том же году был

© В. М. Подборонов, И. П. Смирнова, 2014

Адрес для корреспонденции: 194044 Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева 6, ВМедА им. С. М. Кирова

опубликован случай выделения Р.^^а из крови больного в Республике Корея [3]. Идентификация Р.^Ьа была проведена по результатам секве-нирования гена 168 рРНК и генов уВ и гроБ. Штамм был чувствителен ко всем антисинегной-ным антибиотикам.

В 2011 году появилось сообщение об идентификации методом МЛЬБ1-ТОР масс-спектроме-трии штамма Р.^Ьа непосредственно в культу-ральной среде с посевом крови [4]. В 2010—2012 гг. в госпитале Чао-Янг (Пекин) были выделены штаммы Р.^Ьа у 15 кардиологических больных с бактериемией [5]. Анализатором УНек 2 бактерии были идентифицированы как P.putida, но секве-нирование генов 168 рРНК, %угВ, гроВ, гроБ установило их принадлежность к Р.^Ьа. Лекарственная чувствительность штаммов не была приведена.

Эти данные свидетельствуют о медицинской значимости Р.^Ьа, недостаточности информации о чувствительности штаммов к антибиотикам,

сложности идентификации ввиду фенотипичес-кого сходства с P.putida и необходимости использовать генетические методы. Представляет интерес изучение пригодности для идентификации P.fulva метода MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Цель данного исследования — характеристика лекарственной чувствительности клинических штаммов P.fulva, оценка их идентификации методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и выявление наиболее значимых тестов идентификации традиционными методами исследований.

Материал и методы

Объектами исследования были 8 штаммов P.fulva из рабочей коллекции культур Е. П. Сиволодского ( № 22—27, 30 и 31) и типовые штаммы P.putida CIP 52191T(ATCC 12633), P.luteola CIP 102995T(JCM 3352), P.oryzihabitans CIP 102996T(JCM 2952), полученные из коллекции бактерий Института Пастера (Париж). Штаммы P.fulva были выделены в 1995—2005 гг. из мочи беременных и урологических больных в лечебных учреждениях г. Санкт-Петербурга. Они хранились в коллекции как псевдомонады неустановленной видовой принадлежности. Принадлежность их к виду P.fulva была установлена в ходе данного исследования методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и традиционными тестами. Для выращивания исследуемых бактерий применяли «питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой (ГРМ-агар)» производства ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (г. Оболенск).

Для идентификации видов бактерий методом MALDI-TOF масс-спектрометрии использовали настольный MALDI-TOF масс-спектрометр Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Inc., Германия). Подготовку к исследованию чистых культур штаммов бактерий и проведение исследований осуществляли в соответствии с инструкцией к прибору. Уровень идентификации бактерий трактовали по критериям, указанным в инструкции : >2.300—3.000 высокая вероятность идентификации вида; 2.000-2.299 надёжная идентификация рода, вероятная идентификация вида; 1.700—1.999 вероятная идентификация рода; 0.000—1.699 ненадёжная идентификация.

Чувствительность грамотрицательных бактерий к ионам бария как маркёра их принадлежности к роду Pseudomonas определяли по методу, описанному в [6]. Оксидазу определяли у культур бактерий, выросших на агаре Мюллера-Хинтон при 26°С в течение 24 ч. Культуру изучали по Ковачу параллельно с реактивом тетраметил-пара-фенилендиамин на полоске OXItest (Erba Lachema) и в 1% водном растворе диметил-пара-фенилендиамина в капле на стекле чашки Петри [7]. Продукцию флуоресцеина выявляли путём посева бактерий на питательную среду King B (bio Merieux) и синтетическую среду King BS, состав которой был разработан нами [8]. Посевы выращивали при 26°С и 35°С в течение 24 и 48 ч. Результат учитывали при ультрафиолетовом освещении. Для обнаружения продуцирования бактериями желтого водонерастворимого пигмента колоний засевали суточные культуры секторами на ГРМ-агар и инкубировали при 26°С в течение 48 ч. Продукцию коричневого водорастворимого пигмента выявляли посевом тех же суточных культур секторами на ГРМ-агар, но инкубацию проводили при 35°С в течение 48 ч. При учёте результатов обращали внимание на появление тёмно-коричневой окраски питательной среды вокруг газонов бактерий. Для усиления продукции коричневого пигмента целесообразно допольнительно вносить в ГРМ-агар перед его стерилизацией 0,05% раствор L-тирозина. Окисление и ферментацию глюкозы изучали О/Ф тестом на среде Хью-Лейфсона [7]. Утилизацию бактериями аминокислот L-лизина и L-лейцина в качестве единственного источника азота и углерода исследовали

по разработанному нами методу [9]. Утилизацию бактериями гиппурата натрия изучали на синтетической питательной среде [9]. Наличие у бактерий нитратредуктазы, аргининдигид-ролазы и гидролиза эскулина определяли микрообъёмным методом с использованием тест-системы «Рапид-Энтеро» производства НИИЭМ имени Пастера (Санкт-Петербург).

Чувствительность к антибиотикам бактерий P.fulva изучали в отношении 30 антимикробных препаратов с использованием автоматического микробиологического анализатора Vitek 2 (bio Merieux). К некоторым антибиотикам определяли чувствительность диско-диффузионым методом, используя диски производства НИИЭМ имени Пастера. Результаты определения чувствительности оценивали в соответствии с МУК 4.12.1890-04 [10].

Результаты и обсуждение

Изучение методом MALDI-TOF масс-спектро-скопии с использованием прибора Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Inc.) 8 штаммов нашей коллекции, продуцирующих жёлтый и коричневый пигменты, установило принадлежность всех штаммов к виду P.fulva. При этом были получены максимальные показатели уровня идентификации — у всех штаммов в диапазоне от 2.302 до 2.455, что соответствует высокой вероятности идентификации вида бактерий. Высокий уровень идентификации P.fulva был обеспечен обширной базой данных этого прибора, содержащей информацию о большинстве известных видов псевдомонад, включая P.fulva.

Информация о P.fulva отсутствует в базе данных автоматизированных микробиологических анализаторов Vitek 2 и Phoenix, которые не идентифицируют эти бактерии или ошибочно определяют их как P.putida [2, 5]. Сведения о фенотипи-ческих признаках P.fulva противоречивы, получены на малом количестве штаммов [2, 3, 11], что нуждается в их уточнении.

Наиболее характерными признаками P.fulva, определившими название вида, являются продукция жёлтого водонерастворимого пигмента колоний и коричневого водорастворимого пигмента, окрашивающего питательную среду вокруг колоний. Однако бактерии, выращенные при одной температуре, редко имеют оба пигмента. Нами было установлено, что температурный оптимум для синтеза жёлтого и коричневого пигментов различен. Жёлтый пигмент продуцируют все штаммы P.fulva на ГРМ-агаре при 26°С в течение 48 ч.

При этом большинство штаммов коричневый пигмент не образуют. Коричневый пигмент продуцируют все штаммы P.fulva на ГРМ-агаре при 35°С в течение 48 ч, при этом большинство штаммов жёлтый пигмент не образуют (табл. 1). Такой же коричневый пигмент образуют большинство штаммов P.putida, однако они не продуцируют жёлтый пигмент. Поэтому продукцию указанных пигментов следует определять на ГРМ-агаре на отдельных чашках при 26°С (жёлтый пигмент) и 35°С (коричневый пигмент) в течение 48 ч.

Таблица 1. Фенотипическая характеристика P.fulva и других псевдомонад, продуцирующих жёлтый и коричневый пигменты

Таксономические признаки _Исследуемые ш таммы_

1*

Чувствительность к ионам бария + + + + + + +

Оксидаза + + — — + — —

Продукция флуоресцеина:

среда King B при 26°С и 35°С — — — — — — —

среда King BS при 26°С + 0 0 0 + — —

при 35°С — 0 0 0 — — —

Продукция жёлтого пигмента колоний в течение 48 ч:

при 26°С + 0 0 0 — + +

при 35°С -/+ + + + — + +

Продукция коричневого пигмента вокруг колоний за 48 ч:

при 26°С -/+ 0 0 0 — — —

при 35°С + 0 0 0 + — —

О/Ф тест с глюкозой ± ± ± ± ± ± ±

Утилизация гиппурата натрия — — 0 0 + — —

Утилизация источника N и С:

L-лизина — 0 0 0 + — —

L-лейцина — 0 0 0 + — —

Аргининдигидролаза + + + + + + —

Нитратредуктаза — — — — — + —

Гидролиз эскулина — — — — — + —

Рост при 41°С — — — — — + —

Примечание. * 1 - P.fulva, наши данные; 2 - P.fulva [9]; 3 - P.fulva [3]; 4 - P.fulva [2]; 5 - P.putida (типовой); 6 -P.luteola (типовой) ; 7 - P.oryzihabitans (типовой); 0 - не изучался; -/+ - отрицательный результат у большинства штаммов; ± - положительный результат у большинства штаммов.

Сведения о наличии оксидазы у P.fulva противоречивы: отмечается наличие оксидазы [11] или её отсутствие [2, 3]. По нашим данным, все 8 изученных штаммов продуцируют оксидазу слабой активности, которая выявляется любым реактивом. Большинство авторов отмечают отсутствие образования флуоресцеина бактериями P.fulva на среде King B [2, 3, 11]. Наши результаты подтверждают отсутствие продукции флуоресцеина всеми штаммами P.fulva на среде King B (bioMerieux) при 26°С и 35°С в течение 48 ч. Однако на синтетической среде King BS, разработанной нами [8], все штаммы P.fulva продуцировали флуоресцеин при 26°С, но не продуцировали при 35°С в течение 48 ч, что подтверждает правильность принадлежности P.fulva к группе флуоресцирующих псевдомонад, как было указано при описании этого вида [1].

Бактерии P.fulva можно отличить от P.putida по отсутствию утилизации гиппурата натрия, а также отсутствию утилизации L-лизина и L-лей-цина в качестве единственного источника азота и углерода [9]. Тесты на аргининдигидролазу, нит-ратредуктазу, гидролиз эскулина, рост при 41°С позволяют отличить P.fulva от других видов псевдомонад, продуцирующих жёлтый пигмент — P.luteola, P.oryzihabitans (см. табл. 1).

Все 8 штаммов P.fulva нашей коллекции были выделены из клинического материала: 4 штамма из мочи беременных женщин в родильном доме, остальные — из мочи женщин и мужчин, являвшихся пациентами лечебных учреж-

дений г. Санкт-Петербурга. Концентрация Pfulva в моче составляла 104—107 КОЕ/мл, что указывает на их этиологическую значимость. С 2010 г. известны только 4 сообщения о выделении P.fulva из клинического материала: 3 публикации по 1 штамму [2—4] и одно сообщение о выделении 15 штаммов [5]. Наши сведения свидетельствуют о более ранней циркуляции клинических штаммов Pfulva в период 1995—2005 гг. в России и подтверждают медицинскую значимость P.fulva.

Изучение чувствительности к антибиотикам показало (табл. 2), что все 8 клинических штаммов P.fulva имеют природную устойчивость к ампициллину, ингибиторозащищённым пеницилли-нам (ампициллин/сульбактам, ампициллин/кла-вуланат) и цефалоспоринам I и II поколений (цефазолин, цефуроксим). Два штамма (№ 27, 31) имеют приобретённую устойчивость к цефалоспо-ринам III поколения ( цефотаксиму, цефтриаксо-ну, цефаперазону/сульбактаму), однако чувствительны к цефтазидиму.Все штаммы сохранили чувствительность к цефепиму, карбапенемам (имипенему, меропенему), а также к азлоциллину, азтреонаму (кроме № 27), пиперациллину/тазо-бактаму, колистину, аминогликозидам (амикаци-ну, гентамицину, тобрамицину, нетилмицину), ципрофлоксацину, левофлоксацину, тетрациклину, тигециклину. Три штамма (№ 23, 27, 31) приобрели устойчивость к хлорамфениколу. Все штаммы резистентны к фосфомицину, рифампи-цину, эритромицину, нитрофурантоину, тримето-приму/сульфаметоксазолу.

Таблица 2. Чувствительность к антибиотикам клинических штаммов P.fulva

Антибиотики МПК, мг/л

22* 23* 24* 25* 26* 27* 30* 31* 1** 1***

Ампициллин 32R 32R 32R 32R 32R 32R 32R 32R

Ампициллин/сульбактам 32R 32R 16R 32R 32R 32R 32R 32R

Ампициллин/клавуланат 16I 32R 8S 32R 32R 32R 32R 32R

Цефазолин 64R 64R 64R 64R 64R 64R 64R 64R

Цефуроксим 64R 64R 8R 64R 64R 64R 64R 64R

Цефотаксим 8S 8S 1S 8S 16I 64R 1S 64R S

Цефтазидим 4S 2S 1S 2S 2S 4S 1S 4S 32R S

Цефтриаксон 16I 16I 2S 16I 16I 64R 16I 64R

Цефоперазон/сульбактам 16S 8S 8S 16S 16S 64R 16S 64R

Цефепим 1S 1S 1S 1S 2S 2S 1S 2S 8S S

Имипенем 1S 1S 2S 1S 2S 2S 1S 2S 32R S

Меропенем 1S 2S 0,2S 1S 2S 4S 1S 4S 32R S

Амикацин 2S 2S 2S 2S 2S 2S 2S 2S 16S S

Гентамицин 1S 1S 1S 1S 1S 1S 1S 1S 128R S

Тобрамицин 1S 1S 1S 1S 1S 1S 1S 1S S

Нетилмицин 1S 1S 1S 1S 1S 1S 1S 1S

Ципрофлоксацин 0,2S 0,2S 0,2S 0,2S 0,2S 0,5S 0,2S 0,5S 0,5S

Тетрациклин 1S 1S 1S 1S 1S 4S 2S 4S

Тигециклин 0,5S 2S 1S 0,5S 0,5S 4I 2S 4I

Хлорамфеникол 16I 32R 8S 16I 16I 64R 16I 64R R

Колистин 0,5S 0,5S 0,5S 0,5S 0,5S 0,5S 0,5S 0,5S 1S

Фосфомицин 256R 256R 256R 256R 256R 256R 256R 256R

Нитрофурантоин 512R 64I 64I 512R 64I 128R 128R 256R

Пиперациллин/тазобактам S S S S S S S S 128R S

Азлоциллин S S S S S S S S

Азтреонам S I S S I R I S 16I S

Левофлоксацин S S S S S S S S S

Рифампицин R R R I I R R R

Эритромицин R I R I R R R I

Триметоприм/сульфаметоксазол 160R 80R 20S 320R 160R 320R 80R 320R R

Примечание. * — номера штаммов P.fulva (наши данные); ** - штамм по [2]; *** - штамм по [3]; группы SIR: S чувствительность, I — умеренно резистентный, R — резистентный.

Эти результаты свидетельствуют, что в течение 1995—2005 годов некоторые штаммы P.fulva приобрели устойчивость к цефалоспоринам III поколения и хлорамфениколу. Профиль чувствительности к антибиотикам штамма № 27 (устойчивость к цефотаксиму, цефтриаксону, цефапера-зону/сульбактаму, азтреонаму; чувствительность к цефтазидиму и пиперациллину/тазобактаму) характерен для бета-лактамазы расширенного спектра действия типа СТХ-М.

Данные о чувствительности к антибиотикам штамма P.fulva, выделенного в Республике Корея [3], совпадают с данными по чувствительности большинства наших штаммов (табл. 2). Вызывает интерес сообщение [2] о выделении в Аргентине штамма P.fulva, резистентного к карбапенемам, что обусловлено продукцией металло-бета-лакта-мазы типа VIM-2 с локализацией гена Ыажш_2 в интегроне (см. табл. 2). Там же в 2005 году были выделены два клинических штамма P.putida с ме-талло-бета-лактамазой типа VIM-2 [12]. Имеется сообщение [13] о высокой частоте циркуляции в Республике Корея штаммов P.putida, устойчивым к карбапенемам (22%). Учитывая, что P.fulva часто ошибочно идентифицировали как P.putida, следует признать оба вида псевдомонад возможным резервуаром генов карбапенемаз в резистоме [14].

Заключение

Таким образом, в рабочей коллекции культур псевдомонад, выделенных в Санкт-Петербурге в 1995—2005 гг., выявлены наиболее ранние изо-ляты клинических штаммов P.fulva, что подтверждает медицинскую значимость этого вида псевдомонад. Установлен высокий уровень идентификации всех штаммов P.fulva методом MALDI-TOF масс-спектрометрии с использованием прибора Microflex с базой данных MALDI Biotyper (Bruker Daltonics Inc.). Апробированы и предложены тесты традиционных исследований, позволяющие достоверно идентифицировать P.fulva без использования генетических методов, среди них: чувствительность к ионам бария ; продукция водонерастворимого жёлтого пигмента колоний при 26°С и водорастворимого коричневого пигмента при 35°С; наличие окси-дазы слабой активности; продукция флуоресце-ина на синтетической среде King BS при 26°С; отсутствие утилизации гиппурата натрия, L-ли-зина, L-лейцина и др. Установлен профиль чувствительности к антибиотикам клинических штаммов P.fulva. У двух штаммов P.fulva выявлена приобретённая резистентность к цефалоспо-ринам III поколения и хлорамфениколу.

ЛИТЕРАТУРА

1. Iizuka H, Komagata K. New species of Pseudomonas belonged to fluorescent group (studies on the microorganisms of cereal grains. Part V). J Agricul Che Soc Japan 1963; 37: 137—141.

2. Almuzara M.N., Vazquez M, Tanaka N, Turko M, Ramires M.S., Lopez E.L. et al. First case of human infection due to Pseudomonas fulva, an environmental bacterium isolated from cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 2010; 48: 2: 660—664.

3. Seok Y, Shin H, Lee Y, Cho I, Na S, Yong D. et al. First report of blood stream infection caused by Pseudomonas fulva. J Clin Microbiol 2010; 48: 7: 2656—2657.

4. Kok J., Thomas L.C., Olma T, Chen S.C.A., Iredell J R. Identification of bacteria in blood culture broths using Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionization sepsityper and Time of Flight Mass Spectrometry. PLOS One 2011; 6: 8: е23285.

5. Liu Yingmei, Liu Kun, Yu Xiaomin, Li Binbin, Cao Bin. Identification and control of Pseudomonas spp. (P.fulva and P.putida) bloodstream infection outbreak in a teaching hospital in Beijing, China. Int J Infect Dis 2014; 23: 105—108.

6. Sivolodskii E.P. Determination of the sensitivity of bacteria to barium ions, a taxonomic marker of the genus Pseudomonas. Microbiology 2012; 81 (1): 112—117].

7. Герхардт Ф., ред. Методы общей бактериологии. т. 3. М.: Мир; 1983.

8. Сиволодский Е.П. Синтетическая питательная среда King BS для определения синтеза флуоресцеина бактериями рода Pseudomonas. Клин лабор диагн 2012; 10: 60—62.

9. Sivolodskii E.P. Application of the profiles of amino acid utilization as the sole carbon and nitrogen sources for pseudomonad taxonomy. Microbiology 2009; 78: 6: 711—716.

10. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4.12.1890-04. М.: 2004.

11. Uchino M, Shida O, Uchimura T, Komagata K. Recharacterization of Pseudomonas fulva Iizuka and Komagata 1963, and proposals of Pseudomonas parafulva sp. nov. and Pseudomonas cremoricolorata sp. nov. J Gen Appl Microbiol 2001; 47: 5: 247—261.

12. Almuzara M, Radice M, de Garate N, Kossman A., Cuirolo A, Santella G. et al. VIM-2 — producing Pseudomonasputida, Buenos Aires. Emer Infect Dis 2007; 13: 4: 668-669.

13. Seong Eun Kim, Seong -Hwan Park, Kyung-Hwa Park, Su-Hyun Kim, Sock-In Jung, Jong-Hee Shin et al. Nosocomial Pseudomonas putida bacteremia: high rates of carbapenem resistance and mortality. Chonnam Med J 2012; 48: 2: 91—95.

14. Виноградова K.A., Булгакова В.Г., Полин A.H., Кожевин П.А. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам: резистома, её объем, разнообразие и развитие. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 5—6: 38—48.