Особенности метаболических процессов в иммунокомпетентных клетках крови при различных формах тяжести кишечных инфекций у детей

© БОГВИЛЕНЕ Я.А., МАРТЫНОВА Г.П., САВЧЕНКО А.А.

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТКАХ КРОВИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ТЯЖЕСТИ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ДЕТЕЙ

Я.А. Богвилене, Г.П.Мартынова, А.А.Савченко Красноярская государственная медицинская академия, ректор - д.м.н., проф. И. П. Артюхов; кафедра детских инфекционных болезней с курсом ПО, зав. - д.м.н., проф. Г.П. Мартынова; Институт медицинских проблем Севера СО РАМН, директор - член - корр. РАМН, проф. В.Т. Манчук.

Резюме. У детей 1 - 3 и 4 - 7 лет в зависимости от степени тяжести острых кишечных инфекций (ОКИ) исследованы особенности уровней активности метаболических ферментов в лимфоцитах крови. При исследовании уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови обнаружены выраженные особенности интенсивности различных метаболических процессов, причем уровни терминальных стадий гликолиза у детей исследуемых возрастных групп с легкой степенью ОКИ снижаются, тогда как у больных со среднетяжелой и тяжелой степенью тяжести - повышаются. Предполагается, что установленные особенности метаболизма лимфоцитов у детей с ОКИ разного возраста определяются регуляторными и обменными процессами всего организма, которые специфичны для каждого возрастного периода.

Ключевые слова: острая кишечная инфекция, степень тяжести, лимфоциты, метаболизм, ферменты.

Острые кишечные инфекции (ОКИ) остаются наиболее распространенными заболеваниями детского возраста. Более того, в последние годы отмечается отчетливая тенденция к росту заболеваемости ОКИ, утяжелению их клинической

картины, длительному негладкому течению [2,7]. Не следует упускать из вида тот факт, что развитие критических состояний у детей с ОКИ обусловлены иногда быстрым и непредсказуемым развитием болезни. При этом существующие традиционные методы лабораторной диагностики не позволяют своевременно на ранних этапах заболевания оценить ответную реакцию организма на патогенное действие инфекционно-токсических факторов. В связи с этим весьма актуальной остается проблема прогнозирования степени тяжести ОКИ.

Энтеропатогенные бактерии, поражая желудочно-кишечный тракт, стимулируют активность сложнейших взаиморегулируемых процессов иммунной защиты, направленных на поддержание и сохранение гомеостаза организма. Между тем доказано, что уровень иммунореактивности определяется не только морфологическим составом иммунокомпетентных клеток и концентрацией иммуноглобулинов в сыворотке крови, но и уровнем метаболических процессов в им-мунокомпетентных клетках, которые в значительной степени определяют функциональную активность иммуноцитов [3,6,11].

Целью исследования явилась оценка особенностей уровней активности метаболических ферментов в лимфоцитах крови в зависимости от степени тяжести ОКИ у детей 1 - 3 и 4 - 7 лет.

Материалы и методы

Обследовано 243 детей с ОКИ в возрасте 1 - 3 лет (139 детей) и 4 - 7 лет (104 ребенка) лет. Во всех случаях имела место этиологическая расшифровка заболевания. В обеих возрастных группах преобладали шигеллез (45,1% у детей 1 -3 и 65,4% - 4 - 7 лет) и сальмонеллез (16,7% и 13,6%, соответственно по возрастным группам). Условнопатогенная флора чаще являлась причиной заболеваний у детей более раннего возраста (27,1%) по сравнению с детьми 4 - 7 (13,6%) лет. У небольшого количества больных диагностирована сочетанная этиология заболевания (соответственно по возрастным группам 11,1% и 7,4%). Легкая форма заболевания была зарегистрирована в 2,9% случаев - 1 - 3 лет и 20,2% детей с ОКИ в возрасте 4 - 7 лет. Среднетяжелая форма заболевания выявлялась в 41,7% у детей 1 -3 лет с ОКИ и 52,9% - 4 -7, тяжелая - в 55,4% и

26,9% соответственно. Всем детям при поступлении в стационар (1-3 день болезни) и в динамике заболевания проводили комплексное клиниколабораторное обследование, у части - исследование микробиоценоза кишечника. В качестве контроля обследовано 26 здоровых ребенка в возрасте 1 - 3 и 49

- 4 - 7 лет.

У всех обследуемых детей утром натощак забиралось 5 мл венозной крови. Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах выполняли биолюминесцентным методом [5]. Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), прямой и обратной реакции лак-татдегидрогеназы (ЛДГ и Обр.ЛДГ), прямой и обратной реакции малатдегидро-геназы (МДГ и Обр.МДГ), НАДФ- и НАД-зависимых глутаматдегидрогеназ (НАДФГДГ и НАДГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ) и глутатионредуктазы (ГР). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах (1 Е=1 мкмоль/мин [1]) на 10000 клеток.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием критерия Манна-Уитни с помощью пакета прикладных программ ЗРББ 8.0.

Результаты и обсуждение

При исследовании уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у детей 1 - 3 лет с ОКИ в зависимости от степени тяжести патологического процесса обнаружено повышение активности Г3ФДГ и снижение уровня НАДГДГ (рис. 1А и рис. 1Б). Снижение активности НАДФМДГ в лимфоцитах крови становится статистически достоверным у детей с тяжелой степенью ОКИ (рис. 1В). Статистически достоверное снижение активности Обр.ЛДГ в лимфоцитах крови у детей с легкой и среднетяжелой степенью ОКИ по сравнению с контрольным диапазоном нивелируется у больных с тяжелой степенью патологического процесса за счет повышения активности (рис. 1Г). Уже у детей с легкой степенью ОКИ отличается увеличение активности ГР в лимфоцитах крови. Причем уровень данного фермента повыша-

ется у больных со среднетяжелой и тяжелой степенью тяжести инфекционного процесса, что выражается в увеличении статистической достоверности различий по сравнению с контрольными показателями (рис. 1Д). Практически не зависит от степени тяжести повышение активности Обр.НАДФГДГ в лимфоцитах крови больных детей 1 - 3 лет (рис. 1Е). При всех степенях тяжести ОКИ у детей в лимфоцитах крови повышена активность НАДФИЦДГ по сравнению с контрольным значением. Только у детей со среднетяжелой степенью ОКИ в лимфоцитах крови статистически достоверно понижается активность Г6ФДГ (1,20±0,24 мкЕ, Р<0,05; в контроле - 2,21±0,40 мкЕ) и повышается уровень НАДИЦДГ (2,16±0,46 мкЕ, Р<0,05; в контроле - 0,92±0,25 мкЕ). У больных с легкой, среднетяжелой и тяжелой степенью ОКИ в иммунокомпетентных клетках понижена активность Обр.МДГ (41,70±6,09 мкЕ, Р<0,05; 66,85±9,27 мкЕ, Р<0,05 и 67,88±7,03 мкЕ, Р<0,05, соответственно; в контроле - 132,78±47,21 мкЕ). Только у детей с тяжелой степенью ОКИ в лимфоцитах крови обнаружено выраженное снижение активности МДГ (8,31±1,40 мкЕ, Р<0,05; в контроле -18,58±2,91 мкЕ).

Исследуемые ферменты находятся на разных метаболических путях иммуно-компетентных клеток, где занимают ключевые позиции. Так Г3ФДГ является ферментом, определяющим перенос продуктов липидного катаболизма на окислительно-восстановительные реакции гликолиза [1,12]. Увеличение активности данного фермента у больных возрастной группы 1 - 3 лет, сочетающееся с ростом степени тяжести инфекционного процесса (рис. 1А), характеризует повышенное использование липидного пула в анаэробных процессах. Причем связанное со степенью тяжести ОКИ повышение активности Г3ФДГ совпадает с увеличением интенсивности анаэробной реакции ЛДГ (рис. 1Г), уровень которой определяется наработанным в гликолизе пируватом и НАДН. При этом необходимо отметить, что если у детей с легкой степенью ОКИ уровень анаэробной реакции ЛДГ значительно снижен, то с тяжелой степенью активность данной ферментативной реакции соответствует контрольному диапазону. Между тем именно у детей 1 - 3 лет с тяжелой степенью ОКИ выявлено выраженное

снижение активности малик-фермента, который определяет интенсивность внутриклеточного анаболизма липидов [12].

Лимфоциты являются клетками, в которых энергетические процессы определяются не только интенсивностью анаэробного окисления глюкозы, но и активностью аэробных реакций [3,6]. Обнаружено, что только в иммунокомпетент-ных клетках крови у детей 1 - 3 лет с тяжелой степенью ОКИ значительно снижается активность МДГ (одного из регуляторных ферментов цикла Кребса). При этом активность другого фермента лимонного цикла - НАДИЦДГ - в лимфоцитах у детей со среднетяжелой степенью ОКИ возрастает. По-видимому, одним из механизмов поддержки высокого уровня интенсивности субстратного потока по циклу трикарбоновых кислот при пониженном уровне образовании пирувата в гликолизе является повышение активности НАДФИЦДГ - вспомогательной дегидрогеназы цикла Кребса, позволяющей поддерживать ферментативные реакции за счет НАДФ-зависимого окисления [1,10]. Однако активность дыхательной цепи митохондрий зависит также и от водородного градиента, который в значительной степени определяется малат-аспартатным шунтом. Установлено, что активность ключевой реакции малат-аспартатного шунта митохондрий - Обр.МДГ [1] - в лимфоцитах крови у детей с легкой, среднетяжелой и тяжелой степенью ОКИ снижена.

Между тем при исследовании ферментов, отражающих наработку интермедиатов для пластических процессов, обнаружена активация обратной реакции НАДФГДГ, которая характеризует уровень переноса субстратов на реакции аминокислотного обмена [1]. При этом внутриклеточная активность НАДГДГ у детей со среднетяжелой и тяжелой степенью ОКИ снижена (рис. 1Б), что позволяет предположить пониженный уровень переноса интермедиатов с реакций аминокислотного обмена на окислительно-восстановительные реакции цикла Кребса.

Необходимо также отметить выраженное повышение активности ГР в лимфоцитах крови больных ОКИ, что указывает на увеличение интенсивности

внутриклеточных перекисных процессов [1,8], так как ГР - фермент антиокси-дантной системы.

При исследовании активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у детей 4 - 7 лет установлены значительные особенности как относительно контрольного диапазона, так и выявленных среднестатистических значений у больных 1 - 3 лет. Так активность Г3ФДГ в лимфоцитах крови в группе детей 4 - 7 лет значительно повышена только при среднетяжелой степени ОКИ, тогда как в иммунокомпетентных клетках с тяжелой степенью инфекции уровень данного фермента достоверно снижен (рис. 2 А). Значительно снижена активность аэробной реакции ЛДГ в лимфоцитах крови больных 4 - 7 лет с легкой степенью ОКИ, затем при среднетяжелой и тяжелой степени уровень данной ферментативной реакции повышается (рис. 2Б). В отличие от особенностей активности анаэробной реакции ЛДГ в лимфоцитах крови больных 1 - 3 лет (рис. 1Г), у детей 4 - 7 лет уровень данной реакции значительно повышен при легкой степени тяжести инфекционного процесса, при среднетяжелой и тяжелой степени ОКИ снижается до контрольного диапазона (рис. 2В). Подобным образом в зависимости от степени тяжести ОКИ изменяется активность Обр.МДГ в лимфоцитах крови больных 4 - 7 лет при легкой и среднетяжелой степенях - повышение, а при тяжелой степени ОКИ - относительное понижение активности до контрольного диапазона (рис. 2Г). В зависимости от степени тяжести заболевания аналогичным образом изменяется активность ГР (рис. 2Д) и Обр.НАДФГДГ (рис. 2Е) в лимфоцитах больных 4 - 7 лет. Кроме того обнаружено, что у детей 4 - 7 лет с легкой и тяжелой степенью ОКИ в лимфоцитах значительно снижена активность Г6ФДГ и НАДГДГ.

Анализ уровней активности исследуемых НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ лимфоцитов крови у детей 4 - 7 лет с различной степенью тяжести ОКИ позволяет установить значительные особенности метаболизма иммуно-компетентных клеток крови как относительно контрольных показателей, так и относительно детей 1 - 3 и 4 - 7 лет с легкой и тяжелой степенью ОКИ в лимфоцитах крови снижена активность ключевой и инициализирующей реакции

пентозофосфатного цикла - Г6ФДГ. Так же как и у больных 1 - 3 лет, у детей 4

- 7 лет в лимфоцитах крови независимо от тяжести ОКИ повышена активность ГР. Кроме того у больных 4 - 7 лет с легкой степенью ОКИ в лимфоцитах крови значительно повышена активность анаэробной реакции ЛДГ, что позволяет предположить высокую интенсивность анаэробного дыхания иммунокомпе-тентных клеток. Однако при среднетяжелой и тяжелой степени ОКИ активность данной реакции снижается до контрольного диапазона. Между тем активность Г3ФДГ повышена только в лимфоцитах крови у больных 4 - 7 лет со среднетяжелой степенью, тогда как у детей с тяжелой степенью инфекционного процесса уровень фермента снижен практически до нуля. В то же время при тяжелой степени ОКИ уровень переноса продуктов липидного катаболизма на окислительно-восстановительные реакции гликолиза через Г3ФДГ значительно снижен.

При исследовании в лимфоцитах крови у детей 4 - 7 лет с ОКИ уровней активности ферментов митохондриального компартмента установлено выраженное снижение активности МДГ при легкой и тяжелой степени. Активность другого фермента цикла трикарбоновых кислот - НАДИЦДГ - снижена при всех степенях тяжести инфекционного процесса, что, по-видимому, отражает пониженную интенсивность субстратного потока по циклу Кребса. Необходимо также отметить, что в иммунокомпетентных клетках крови у детей 4 - 7 лет с легкой и тяжелой степенью ОКИ снижена активность НАДГДГ, которая осуществляет перенос продуктов аминокислотного обмена на реакции цикла Кребса [1].

Своеобразно изменяется активность обратных реакций НАД- и НАДФ-зависимых глутаматдегидрогеназ в иммунокомпетентных клетках крови у больных 4 - 7 лет: активность Обр.НАДГДГ значительно снижена при всех степенях тяжести ОКИ, тогда как уровень Обр.НАДФГДГ повышен в лимфоцитах крови при легкой и средней степени тяжести. Подобное состояние активности данных ферментов, осуществляющих соответственно НАДН- и НАДФН-зависимый перенос интермедиатов с реакций лимонного цикла на реакции ами-

нокислотного обмена, отражает недостаточность в митохондриальном компар-тменте НАДН - и высокий уровень содержания НАДФН - при легкой и среднетяжелой степени острого инфекционного процесса.

Таким образом, установлены выраженные зависимые от возраста различия в метаболическом статусе иммунокомпетентных клеток у детей с различной степенью тяжести ОКИ. Так анализ исследуемых уровней активности ферментов лимфоцитов крови у детей 1 - 3 лет позволяет предположить снижение интенсивности анаэробного окисления глюкозы уже при легкой степени ОКИ, причем при тяжелой степени он достигает диапазона нормы, тогда как у детей 4 - 7 лет обнаружены совершенно обратные изменения. Кроме того, если у детей 1 -3 не изменяются уровни активности исследуемых оксидоредуктаз цикла три-карбоновых кислот, то у детей 4 - 7 - обнаружено снижение активности ферментов, характеризующих интенсивность аэробных реакций. Независимо от возраста в иммунокомпетентных клетках больных ОКИ повышена активность ГР. Вероятно, установленные особенности метаболизма лимфоцитов у детей с ОКИ разного возраста определяются регуляторными и обменными процессами всего организма, специфичными для каждого возрастного периода. Следовательно, при разработке иммунореабилитационных методов необходимо учитывать и степень нарушения метаболических процессов иммунокомпетентных клеток.

THE PECULIARITY OF METABOLIC PROCESSES IN BLOOD IMMUNOCOMPLETENT CELLS BY DIFFERENT FORMES OF INTESTINAL INFECTION GRAVITY BY CHILDREN

Y.A. Bogvilene, G.P.Martynova, A.A.Savchenko

Krasnoyarsk state medical academy named in honour of V.F. Vojno-Yasenetskij

We studied the peculiarities of the activity of metabolic enzymes in blood lymphocytes in children in ages from 1 to 3 and from 4 to 7 according to the stage of acute intestine infection (AII). We revealed that the activity of NAD- and NADP-

dependent dehydrogenases in blood lymphocytes described of peculiarities in the intensity of different metabolic processes. While the levels of terminal stages of glycolysis according to AII stage in junior and senior children are changing in diametrically different way. We assume that the revealed peculiarities of lymphocyte metabolism in children (AII patients) in different ages are determined by regulatory and metabolism processes in the whole body, which are specific in every age period.

Литература

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.:Медицина, 1998. - 395 с.

2. Воротынцева Н.В., Мазанкова Л.Н. Острые кишечные инфекции у детей. -М.: Медицина, 2001. - 480 с.

3. Куртасова Л.М., Савченко А.А., Манчук В.Т. Метаболические аспекты иммунных нарушений у детей с заболеваниями органов дыхания. -Новосибирск: СО РАМН, 2001. - 107 с.

4. Куприна Н.П. Клинико-лабораторная характеристика острого периода диарей у детей // Дет. инфекции. - 2004. - №3 (8). - С. 31-33.

5. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом // Лаб. дело. - 1989. - № 11. - С. 23-25.

6. Труфакин В.А., Шурлыгина А.В., Дергачева Т.И., Литвиненко Г.И. Циркадные вариации метаболической реакции лимфоцитов крови людей на гормональные стимулы в норме и при развитии иммунодефици-та//Бюлл.эксперим.биол. и мед. - 1995. - Т.119, № 2. - С.181-183.

7. Учайкин В.Ф., Новокшонов А. А., Мазанкова Л.Н., Соколова Н.В. Острые кишечные инфекции у детей: диагностика, классификация, лечение / Пособие для врачей. - М., 2003. - 48 с.

8. Abiaka C., Al-Awadi F., Olusi S. Effect of prolonged storage on the activities of superoxide dismutase, glutathione reductase, and glutathione peroxidase // Clin. Chem. - 2000. -Vol.46, № 4. - P.566-567.

9. Bansal M.P., Sood S. In vivo and in vitro influence of selenium on DNA/RNA synthesis in spleen and lymphocytes in culture - possible mediation of changes in GSH/GSSG ratio//Indian J. Exp. Biol. - 2001. - Vol.39, № 1. - P.25-28.

10. Barroso J.B., Peragon J., Garcia-Salguero L. et al. Carbohydrate deprivation reduces NADPH-production in fish liver but not in adipose tissue//Int. J. Bio-chem. Cell Biol. -2001. - Vol. 33, № 8. - P.785-796.

11. De Azevedo R.B., Rosa L.F., Lacava Z.G., Curi R. Gonadectomy impairs lymphocyte proliferation and macrophage function in male and female rats. Correlation with key enzyme activities of glucose and glutamine metabolism//Cell Biochem.Funct. - 1997. -Vol.15, № 4. - P.293-298.

12. MacDonald M.J., Marshall L.K. Survey of normal appearing mouse strain which lacks malic enzyme and NAD+-linked glycerol phosphate dehydrogenase: normal pancreatic beta cell function, but abnormal metabolite pattern in skeletal muscle//Mol. Cell. Biochem. - 2001. - Vol.220, № 1-2. - P.117-125.

13. Tuttle S., Stamato T., Perez M.L., Biaglow J. Glucose-6-phosphate dehydrogenase and the oxidative pentose phosphate cycle protect cells against apop-tosis induced by low doses of ionizing radiation//Radiat.Res. - 2000. -Vol.153, №

2. - P.781-787.

і

і

Сі

о

^3

то

Си

s

то

^0

С

Sit

TO

^0

С

SS(

TO

TO

s

TO

s

04

5

Si

с

«с

s

с

то

I

TO

«С

Si

s

к

TO

Co

Cu

с

05

О4

*~«4

TO

к

iso

0\

§

a4

К

a4

*~«4

TO

TO

TO

t\j

С

SS(

TO

TO

s

TO

s

a4

5

kS

^3

с

05

К

Ч;

Cu-

TO

ТО

SS(

Оо

ТО

К

ТО

ьЬ,

К

05

К

С

то

a4

Активность ГР,

h- h-t Ы Ы М М 4-

ТО £

^3 ^

р

Со

К

с

SS(

то

то

S

то

К

04

5

fcH

то

то

с

то

^3

с

SS(

к

то

л

К

с

»

К

то

Си

с

то

I

Со

05

к

то

I

04

*~«4

Си-

то

с\>

к

^3

с

с\>

то

К

8

05

I

>0-

с

4S

к

1

к»

Ui

Активность Обр.НАДФГДГ, (мкЕ

И

Pi<0,01 Pi<0,001 ^ 160,0

Ы 4- С\ 00

Ы 4- С\ 00

К»

и

О Ы Os X n* Ы

>

Активность Обр.ЛДГ,

р р р р р р р р р р р

о о о о о о о о о о о

Активность НАДГДГ,

о о о о h-

ы On 00 о ы

I---------------------------------------1

I

ТО

Л

К

к

то

то

^3

к

то

то

л

а;

с

SS(

к

а;

>0-

то

4К

к

к

I

4К

к

I

с

05

К

Ч;

Си-

ТО

ТО

SS(

tv

ТО

ТО

^3

8

К

с

»

ТО

то

S

то

К

04

5

то

то

к

с

то

^3

с

к

к

то

N>

hb,

к

05

К

с

то

О4

I

VI ъ

к

fcH

I

Со

Si

05

к

то

I

04

*~«4

Си-

то

с\>

к

^3

с

с\>

то

К

8

05

I

>0-

с

к»

1Д-.

л

ІР

о

Активность Обр.НАДФГДГ,

И

Активность Обр.МДГ,

О О О О О J—

О Ы 0\ 00 о ы

>

Активность ЛДГ,

_ _ ы ы

О О О

О О О О О О

30,0