ВАРИАНТЫ КИСЛОЙ АЛЬФА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

1. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая функциональный химерный белок GAA, который содержит фрагмент сигнального пептида и фрагмент функциональной GAA, в частности фрагмент GAA, соответствующий усеченной форме родительской GAA, где фрагмент сигнального пептида имеет аминокислотную последовательность, выбранную в группе, состоящей из SEQ ID NO: 2 - 4, предпочтительно SEQ ID NO: 2.
2. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, в которой указанный фрагмент GAA имеет от 1 до 75 последовательных аминокислот, усеченных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA, где указанный фрагмент GAA имеет в частности 6, 7, 8, 9, 10, 40, 41, 42, 43, 44, 45 или 46 последовательных аминокислот, усеченных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA, в частности 8, 42 или 43 последовательных аминокислот, усеченных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA.
3. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 2, в которой указанный фрагмент GAA имеет 8 последовательных аминокислот, усеченных на его N-конце, по сравнению с родительской GAA.
4. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 3, в которой указанная родительская GAA представляет собой полипептид GAA человека, приведенный в SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 36, в частности в SEQ ID NO: 5.
5. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 4, которая представляет собой нуклеотидную последовательность, оптимизированную для того, чтобы усовершенствовать экспрессию и/или усовершенствовать иммунологическую толерантность для химерной GAA in vivo, в частности нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 13 или 14.
6. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 5, которая содержит нуклеотидную последовательность, являющуюся результатом комбинации следующих последовательностей:
Кодирующая фрагмент сигнального пептида последовательность
Кодирующая фрагмент GAA последовательность
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 31
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 13
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 14
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 32
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 33
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 34
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 35
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 44
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 45
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 46
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 47
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 48
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 49
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 50
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 51
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 52
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 53
SEQ ID NO: 26SEQ ID NO: 27SEQ ID NO: 28
SEQ ID NO: 54
7. Конструкция нуклеиновой кислоты, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 6, которая представляет собой экспрессирующую кассету, содержащую указанную молекулу нуклеиновой кислоты, функционально связанную с промотором, таким как специфический промотор печени, предпочтительно выбранный в группе, состоящей из промотора α-1-антитрипсина (hAAT), промотора транстиретина, промотора альбумина и промотора тироксинсвязывающего глобулина (TBG), где указанная конструкция нуклеиновой кислоты необязательно дополнительно содержит интрон, в частности интрон, выбранный в группе, состоящей из интрона β-глобина b2 человека (или HBB2), интрона FIX, интрона β-глобина курицы и интрона SV40, где указанный интрон необязательно представляет собой модифицированный интрон, такой как модифицированный интрон HBB2 из SEQ ID NO: 7, модифицированный интрон FIX из SEQ ID NO: 9 или модифицированный интрон β-глобина курицы из SEQ ID NO: 11.
8. Конструкция нуклеиновой кислоты по п. 7, которая содержит, предпочтительно в этом порядке: энхансер; интрон; промотор, в частности специфический промотор печени; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую химерный полипептид GAA; и сигнал полиаденилирования, конструкция содержит, предпочтительно в этом порядке: управляющую область ApoE; интрон HBB2, в частности, модифицированный интрон HBB2; промотор hAAT; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую химерный полипептид GAA; и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, указанная конструкция нуклеиновой кислоты более конкретно содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 20, 21 или 22 или нуклеотидную последовательность, являющуюся результатом любой одно из комбинаций, представленных в п. 6.
9. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 8, который представляет собой вирусный вектор, предпочтительно ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор, или AAV вектор, такой как одноцепочечный или двухцепочечный самокомплементарный AAV вектор, предпочтительно AAV вектор с происходящим из AAV капсидом, таким как капсид AAV1, AAV2, варианта AAV2, AAV3, варианта AAV3, AAV3B, варианта AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, варианта AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, например, AAVcy10 и AAVrh10, AAVrh74, AAVdj, AAV-Anc80, AAV-LK03, AAV2i8 и AAV свиньи, например, AAVpo4 и AAVpo6, или с химерным капсидом, где AAV вектор более конкретно имеет капсид AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8, в частности капсид AAV8, AAV9 или AAVrh74, более конкретно капсид AAV8.
10. Клетка, трансформированная молекулой нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 6, конструкцией нуклеиновой кислоты по любому одному из пп. 7 - 8 или вектором по п. 9, где клетка, в частности, представляет собой клетку печени или клетку мышцы.
11. Химерный полипептид GAA, который содержит фрагмент сигнального пептида и фрагмент функциональной GAA, где фрагмент сигнального пептида выбирают в группе, состоящей из SEQ ID NO:  2 - 4, где в частности фрагмент GAA представляет собой усеченную форму родительского полипептида GAA, такую как фрагмент GAA, имеющий от 1 до 75 последовательных аминокислот, удаленных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA, в частности 6, 7, 8, 9, 10, 20, 27, 28, 29, 30, 31, 41, 42, 43, 44, 45 или 45, более конкретно 6, 7, 8, 9, 10, 20, 41, 42, 43 или 44 последовательные аминокислоты, удаленные на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA, где фрагмент GAA в частности представляет собой усеченную форму белка GAA человека из SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 36, в частности из SEQ ID NO: 5.
12. Химерный полипептид GAA по п. 11, в котором фрагмент GAA имеет 8, 29, 42 или 43 последовательные аминокислоты, усеченные на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA, более конкретно 8 или 42, в частности 8 последовательных аминокислот, усеченных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA, в частности по сравнению с белком GAA человека из SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 36, в частности из SEQ ID NO: 5.
13. Химерный полипептид GAA по п. 11 или 12, который содержит аминокислотную последовательность, являющуюся результатом комбинации следующих последовательностей:
Фрагмент сигнального пептида
фрагмент GAA
SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 4
hGAA дикого типа, свободная от ее природного сигнального пептида; например, SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 36, в частности SEQ ID NO: 5
SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 4
Усеченная hGAA с делецией 8 последовательных N-концевых аминокислот; например, SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 4
Усеченная hGAA с делецией 29 последовательных N-концевых аминокислот; например, SEQ ID NO: 41
SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 4
Усеченная hGAA с делецией 42 последовательных N-концевых аминокислот; например, SEQ ID NO: 30
SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 4
Усеченная hGAA с делецией 43 последовательных N-концевых аминокислот; например, SEQ ID NO: 42
SEQ ID NO: 2SEQ ID NO: 3SEQ ID NO: 4
Усеченная hGAA с делецией 47 последовательных N-концевых аминокислот; например, SEQ ID NO: 43
14. Фармацевтическая композиция, содержащая в фармацевтически приемлемом носителе последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 6, конструкцию нуклеиновой кислоты по любому из пп. 7 - 8, вектор по п. 9, клетку по п. 10 или химерный полипептид по любому из пп. 11 - 13.
15. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 6, конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп. 7 - 8, вектор по п. 9, клетка по п. 10 или химерный полипептид по любому из пп. 11 - 13 для применения в качестве лекарственного средства.
16. Последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1 - 6, конструкция нуклеиновой кислоты по любому из пп. 7 - 8, вектор по п. 9, клетка по п. 10 или химерный полипептид по любому из пп. 11 - 13 для применения в способе лечения болезни накопления гликогена, такой как GSDI (болезнь Гирке), GSDII (болезнь Помпе), GSDIII (болезнь Кори), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII и летальная врожденная болезнь накопления гликогена в сердце, более конкретно GSDI, GSDII или GSDIII, даже более конкретно GSDII и GSDIII и наиболее конкретно GSDII.