ДНК-ВЕКТОРЫ С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ, ПОЛУЧАЕМЫЕ ПУТЕМ БЕСКЛЕТОЧНОГО СИНТЕЗА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ зкДНК-ВЕКТОРОВ

1. Способ получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включающий обеспечение первой одноцепочечной молекулы ITR, содержащей первый ITR; обеспечение второй одноцепочечной молекулы ITR, содержащей второй ITR; обеспечение двухцепочечного полинуклеотида, содержащего последовательность экспрессионной кассеты; и лигирование 5'- и 3'-концов первой молекулы ITR с первым концом двухцепочечной молекулы и лигирование 5'- и 3'-концов второй молекулы ITR со вторым концом двухцепочечной молекулы с образованием ДНК-вектора.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR синтезируют.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную последовательность двухцепочечной экспрессионной кассеты получают путем вырезания из двухцепочечного конструкта ДНК, содержащего указанную последовательность экспрессионной кассеты.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в указанном двухцепочечном ДНК-конструкте последовательность экспрессионной кассеты фланкируют на 5'-конце - первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции, а на 3'-конце - второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции.
5. Способ по п. 3 или 4, отличающийся тем, что указанный двухцепочечный ДНК-конструкт представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо или линейную двухцепочечную молекулу ДНК.
6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанные первая эндонуклеаза рестрикции и вторая эндонуклеаза рестрикции представляют собой одну и ту же эндонуклеазу рестрикции.
7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанные первая эндонуклеаза рестрикции и вторая эндонуклеаза рестрикции являются разными эндонуклеазами рестрикции.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого ITR и второго ITR отжигают перед лигированием с последовательностью экспрессионной кассеты.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого ITR и второго ITR содержит область выступа, комплементарную первому концу последовательности экспрессионной кассеты или второму концу последовательности экспрессионной кассеты, соответственно.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное лигирование выбирают из химического лигирования и лигирования с использованием белков.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанное лигирование осуществляется лигазой Т4 или белком Rep ААВ.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный первый ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.
13. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что указанный второй ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR содержит по меньшей мере один сайт RBE.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого ITR и второго ITR представляет собой ITR ААВ или ITR, полученный из ААВ.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что последовательность указанного первого ITR выбирают из SEQ ID NO: 2, 5-9, 32-48.
17. Способ по п. 15, отличающийся тем, что последовательность указанного второго ITR выбирают из SEQ ID NO: 1, 3, 10-14, 15-31.
18. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная последовательность экспрессионной кассеты содержит по меньшей мере один цис-регуляторный элемент.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из промотора, энхансера, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанный промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CAG, промотора ААТ, промотора LP1 и промотора EF1a.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанная последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена имеет длину по меньшей мере 2000 нуклеотидов.
24. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует белок.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.
26. Способ по п. 22, отличающийся тем, что последовательность трансгена представляет собой функциональную нуклеотидную последовательность.
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанный ДНК-вектор с замкнутыми концами представляет собой зкДНК-вектор.
28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор является очищенным.
29. ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный способом по любому из предшествующих пунктов.
30. Фармацевтическая композиция, содержащая ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 29 и, необязательно, эксципиент.
31. Способ получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включающий: введение в контакт двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего:
экспрессионную кассету;
первый ITR слева от (на 5'-конце) экспрессионной кассеты; второй ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты;
и по меньшей мере два сайта расщепления эндонуклеазой рестрикции, фланкирующие ITR, так чтобы эндонуклеазы рестрикции были расположены дистально по отношению к указанной экспрессионной кассете, с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые могут расщеплять двухцепочечный конструкт ДНК в сайтах расщепления эндонуклеазой рестрикции для вырезания последовательностей между сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции из двухцепочечного ДНК-конструкта; и лигирование 5'- и 3'-концов вырезанной последовательности с образованием ДНК-вектора с замкнутыми концами.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что указанный двухцепочечный конструкт ДНК представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо или линейную двухцепочечную молекулу ДНК.
33. Способ по п. 31 или 32, отличающийся тем, что для осуществления указанного вырезания используют одну эндонуклеазу рестрикции.
34. Способ по п. 31 или 32, отличающийся тем, что для осуществления указанного вырезания используют две разные эндонуклеазы рестрикции.
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное лигирование выбирают из химического лигирования и лигирования с использованием белков.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанное лигирование осуществляют с помощью лигазы Т4 или белка Rep ААВ.
37. Способ по любому из пп. 31-36, отличающийся тем, что указанный первый ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.
38. Способ по любому из пп. 31-37, отличающийся тем, что указанный второй ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.
39. Способ по любому из пп. 31-38, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR содержит по меньшей мере один сайт RBE.
40. Способ по любому из пп. 31-39, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанного первого ITR и указанного второго ITR представляет собой ITR ААВ или ITR, полученный из ААВ.
41. Способ по любому из пп. 31-40, отличающийся тем, что указанную последовательность первого ITR выбирают из SEQ ID NO: 2, 5-9, 32-48.
42. Способ по любому из пп. 31-41, отличающийся тем, что указанную последовательность второго ITR выбирают из SEQ ID NO: 1, 3, 10-14, 15-31.
43. Способ по любому из пп. 31-42, отличающийся тем, что указанная последовательность экспрессионной кассеты содержит по меньшей мере один цис-регуляторный элемент.
44. Способ по любому из пп. 31-43, отличающийся тем, что указанный цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из промотора, энхансера, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования.
45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).
46. Способ по п. 44, отличающийся тем, что указанный промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CAG, промотора ААТ, промотора LP1 и промотора EF1a.
47. Способ по любому из пп. 31-46, отличающийся тем, что указанная последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.
48. Способ по п. 47, отличающийся тем, что длина указанной трансгенной последовательности составляет по меньшей мере 2000 нуклеотидов.
49. Способ по п. 47, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует белок.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.
51. Способ по п. 47, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена представляет собой функциональную нуклеотидную последовательность.
52. Способ по любому из пп. 31-51, отличающийся тем, что указанный ДНК-вектор с замкнутыми концами представляет собой зкДНК-вектор.
53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор является очищенным.
54. ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный способом по любому из пп. 31-54.
55. Фармацевтическая композиция, содержащая ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 54 и, необязательно, эксципиент.
56. Способ получения ДНК-вектора, включающий:
синтез одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':
первый смысловой ITR;
смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смысловой ITR; второй антисмысловой ITR;
антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и
первый антисмысловой ITR; образование содержащего шпильку полинуклеотида из одноцепочечной молекулы; и лигирование 5'- и 3'-концов с образованием ДНК-вектора с замкнутыми концами.
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что по меньшей мере что-то одно из первого смыслового ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго смыслового ITR, второго антисмыслового ITR, антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты и первого антисмыслового ITR является синтезированным.
58. Способ по п. 56 или 57, отличающийся тем, что указанную одноцепочечную молекулу ДНК конструируют путем синтеза чего-то одного или нескольких из первого смыслового ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго смыслового ITR, второго антисмыслового ITR, антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты, и первого антисмыслового ITR в качестве олигонуклеотидов, и лигирования таких олигонуклеотидов с образованием указанной одноцепочечной молекулы ДНК.
59. Способ по п. 56 или 57, отличающийся тем, что указанную одноцепочечную молекулу ДНК получают путем вырезания указанной молекулы из двухцепочечного полинуклеотида ДНК с последующей денатурацией вырезанного двухцепочечного фрагмента с получением одноцепочечной молекулы ДНК.
60. Способ по любому из пп. 56-59, отличающийся тем, что указанную стадию образования содержащего шпильку полинуклеотида из одноцепочечной молекулы осуществляют путем отжига одноцепочечной молекулы в условиях, при которых один или несколько ITR образуют петлю шпильки.
61. Способ по любому из пп. 56-60, отличающийся тем, что указанное лигирование выбирают из химического лигирования и лигирования с использованием белков.
62. Способ по п. 61, отличающийся тем, что указанное лигирование осуществляют с использованием лигазы Т4 или белка Rep ААВ.
63. Способ по любому из пп. 56-62, отличающийся тем, что первый смысловой ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.
64. Способ по любому из пп. 56-63, отличающийся тем, что второй смысловой ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.
65. Способ по любому из пп. 56-64, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого смыслового ITR, первого антисмыслового ITR, первого смыслового ITR и второго смыслового ITR содержит по меньшей мере один сайт RBE.
66. Способ по любому из пп. 56-65, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого смыслового ITR и второго смыслового ITR представляет собой ITR ААВ или ITR, полученный из ААВ.
67. Способ по п. 66, отличающийся тем, что указанную последовательность первого смыслового ITR выбирают из SEQ ID NO: 2, 5-9, 32-48.
68. Способ по п. 66, отличающийся тем, что указанную последовательность второго ITR выбирают из SEQ ID NO: 1, 3, 10-14, 15-31.
69. Способ по любому из пп. 56-68, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит по меньшей мере один цис-регуляторный элемент.
70. Способ по п. 69, отличающийся тем, что указанный цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из промотора, энхансера, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования.
71. Способ по п. 70, отличающийся тем, что указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).
72. Способ по п. 70, отличающийся тем, что указанный промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CAG, промотора ААТ, промотора LP1 и промотора EF1a.
73. Способ по любому из пп. 56-72, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.
74. Способ по п. 73, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена имеет длину по меньшей мере 2000 нуклеотидов.
75. Способ по п. 73, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует белок.
76. Способ по п. 75, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.
77. Способ по п. 73, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена представляет собой функциональную нуклеотидную последовательность.
78. Способ по любому из пп. 56-77, отличающийся тем, что указанный ДНК-вектор с замкнутыми концами представляет собой зкДНК-вектор.
79. Способ по п. 78, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор является очищенным.
80. ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный способом по любому из пп. 56-79.
81. Фармацевтическая композиция, содержащая ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 85 и, необязательно, эксципиент.
82. Способ получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включающий:
синтез одноцепочечной молекулы ДНК, содержащей, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':
первый смысловой ITR;
смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смыслоыой ITR; и
антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и отжиг указанной молекулы.
83. Способ по п. 82, отличающийся тем, что по меньшей мере что-то одно из первого смыслового ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго смыслового ITR и антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты синтезируют.
84. Способ по п. 82 или 83, отличающийся тем, что указанную одноцепочечную молекулу ДНК конструируют путем синтеза одного или нескольких из первого смыслового ITR, смысловой последовательности экспрессионной кассеты, второго смыслового ITR и антисмысловой последовательности экспрессионной кассеты, и лигирования таких олигонуклеотидов с образованием одноцепочечной молекулы ДНК.
85. Способ по п. 82 или 83, отличающийся тем, что указанную одноцепочечную молекулу ДНК получают путем вырезания молекулы из двухцепочечного полинуклеотида ДНК с последующей денатурацией вырезанного двухцепочечного фрагмента с получением одноцепочечной молекулы ДНК.
86. Способ по любому из пп. 82-85, отличающийся тем, что указанная стадия отжига приводит к тому, что один или оба из первого смыслового ITR и второго смыслового ITR образуют петлю шпильки.
87. Способ по любому из пп. 82-86, отличающийся тем, что указанный первый смысловой ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.
88. Способ по любому из пп. 82-87, отличающийся тем, что указанный второй смысловой ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированной ITR.
89. Способ по любому из пп. 82-88, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого смыслового ITR и второго смыслового ITR содержит по меньшей мере один сайт RBE.
90. Способ по любому из пп. 82-89, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого смыслового ITR и второго смыслового ITR представляет собой ITR ААВ или ITR, полученный из ААВ.
91. Способ по п. 90, отличающийся тем, что указанную последовательность первого смыслового ITR выбирают из SEQ ID NO: 2, 5-9, 32-48.
92. Способ по п. 90, отличающийся тем, что указанную последовательность второго ITR выбирают из SEQ ID NO: 1, 3, 10-14, 15-31.
93. Способ по любому из пп. 82-92, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит по меньшей мере один цис-регуляторный элемент.
94. Способ по п. 93, отличающийся тем, что указанный цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из промотора, энхансера, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования.
95. Способ по п. 94, отличающийся тем, что указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).
96. Способ по п. 94, отличающийся тем, что указанный промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CAG, промотора ААТ, промотора LP1 и промотора EFla.
97. Способ по любому из пп. 82-96, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.
98. Способ по п. 97, отличающийся тем, что длина указанной последовательности трансгена составляет по меньшей мере 2000 нуклеотидов.
99. Способ по п. 97, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует белок.
100. Способ по п. 99, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.
101. Способ по п. 97, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена представляет собой функциональную нуклеотидную последовательность.
102. Способ по любому из пп. 82-101, отличающийся тем, что указанный ДНК-вектор с замкнутыми концами представляет собой зкДНК-вектор.
103. Способ по п. 102, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор является очищенным.
104. ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный способом по любому из пп. 82-103.
105. Фармацевтическая композиция, содержащая ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 104 и, необязательно, эксципиент.
106. Способ получения ДНК-вектора с замкнутыми концами, включающий: обеспечение двухцепочечного ДНК-конструкта, содержащего, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':
первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции; первый смысловой ITR;
смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смысловой ITR;
антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и
второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции; контактирование указанного двухцепочечного ДНК-конструкта с одной или несколькими эндонуклеазами рестрикции, которые могут расщеплять двухцепочечный ДНК-конструкт в первом сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции и втором сайте расщепления эндонуклеазой рестрикции для вырезания двухцепочечной последовательности между указанными сайтами расщепления эндонуклеазой рестрикции в двухцепочечной полинуклеотиде;
разделение вырезанной двухцепочечной последовательности на смысловую цепь и антисмысловую цепь; и
проведение стадии отжига, на которой каждая из смысловой цепи и антисмысловой цепи образует ДНК-вектор с замкнутыми концами.
107. Способ по п. 106, отличающийся тем, что указанный двухцепочечный ДНК-конструкт представляет собой бакмиду, плазмиду, мини-кольцо или линейную двухцепочечную молекулу ДНК.
108. Способ по п. 106 или 107, отличающийся тем, что для осуществления указанного вырезания используют одну эндонуклеазу рестрикции.
109. Способ по п. 106 или 107, отличающийся тем, что для осуществления указанного вырезания используют две разные эндонуклеазы рестрикции.
110. Способ по любому из пп. 106-109, отличающийся тем, что указанная стадия отжига приводит к тому, что один или оба из первого смыслового ITR и второго смыслового ITR образуют петлю шпильки.
111. Способ по любому из пп. 106-110, отличающийся тем, что указанный первый смысловой ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.
112. Способ по любому из пп. 106-111, отличающийся тем, что указанный второй смысловой ITR выбирают из ITR дикого типа и модифицированного ITR.
113. Способ по любому из пп. 106-112, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого смыслового ITR и второго смыслового ITR содержит по меньшей мере один сайт RBE.
114. Способ по любому из пп. 106-113, отличающийся тем, что по меньшей мере один из указанных первого смыслового ITR и второго смыслового ITR представляет собой ITR ААВ или ITR, полученный из ААВ.
115. Способ по п. 114, отличающийся тем, что указанную последовательность первого смыслового ITR выбирают из SEQ ID NO: 2, 5-9, 32-48.
116. Способ по п. 114, отличающийся тем, что указанную последовательность второго ITR выбирают из SEQ ГО NO: 1, 3, 10-14, 15-31.
117. Способ по любому из пп. 106-116, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит по меньшей мере один цис-регуляторный элемент.
118. Способ по п. 117, отличающийся тем, что указанный цис-регуляторный элемент выбирают из группы, состоящей из промотора, энхансера, посттранскрипционного регуляторного элемента и сигнала полиаденилирования.
119. Способ по п. 118, отличающийся тем, что указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита североамериканского лесного сурка (WPRE).
120. Способ по п. 118, отличающийся тем, что указанный промотор выбирают из группы, состоящей из промотора CAG, промотора ААТ, промотора LP1 и промотора EF1a.
121. Способ по любому из пп. 106-120, отличающийся тем, что указанная смысловая последовательность экспрессионной кассеты содержит последовательность трансгена.
122. Способ по п. 121, отличающийся тем, что длина указанной последовательности трансгена составляет по меньшей мере 2000 нуклеотидов.
123. Способ по п. 121, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует белок.
124. Способ по п. 123, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена кодирует репортерный белок, терапевтический белок, антиген, ген-редактирующий белок или цитотоксический белок.
125. Способ по п. 121, отличающийся тем, что указанная последовательность трансгена представляет собой функциональную нуклеотидную последовательность.
126. Способ по любому из пп. 106-125, отличающийся тем, что указанный ДНК-вектор с замкнутыми концами представляет собой зкДНК-вектор.
127. Способ по п. 126, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор является очищенным.
128. ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный способом по любому из пп. 106-127.
129. Фармацевтическая композиция, содержащая ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 128 и, необязательно, эксципиент.
130. Выделенный ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный или получаемый способом по любому из пп. 1-28, 31-53, 56-79, 82-103 и 106-127.
131. Генетическое лекарственное средство, содержащее выделенный ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный способом по любому из пп. 1-28, 31-53, 56-79, 82-103 и 106-127.
132. Клетка, содержащая ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 130.
133. Трансгенное животное, содержащее ДНК-вектор с замкнутыми концами по п. 130.
134. Способ лечения субъекта путем введения ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 1-28, 31-53, 56-79, 82-103 и 106-127.
135. Способ доставки терапевтического белка субъекту, включающий введение субъекту композиции, содержащей ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный или получаемый способом по любому из пп. 1-28, 31-53, 56-79, 82-103 и 106-127, причем по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует терапевтический белок.
136. Способ по п. 135, отличающийся тем, что указанный терапевтический белок представляет собой терапевтическое антитело.
137. Набор, содержащий ДНК-вектор с замкнутыми концами, полученный или получаемый способом по любому из пп. 1-28, 31-53, 56-79, 82-103 и 106-127, и наноноситель, упакованный в контейнер с упаковочным вкладышем.
138. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 1-28, 31-53, 56-79, 82-103 и 106-127.
139. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 1-28, содержащий первую одноцепочечную молекулу ITR, содержащую первый ITR, вторую одноцепочечную молекулу ITR, содержащую второй ITR. и по меньшей мере один реагент для лигирования указанных первой одноцепочечной молекулы ITR и второй одноцепочечной молекулы ITR с двухцепочечной полинуклеотидной молекулой.
140. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 31-53, содержащий:
a. двухцепочечный ДНК-конструкт, содержащая экспрессионную кассету; первый ITR слева от (на 5'-конце) экспрессионной кассеты; второй ITR справа от (на 3'-конце) экспрессионной кассеты; и по меньшей мере два сайта расщепления эндонуклеазой рестрикции, фланкирующие ITR, так чтобы эндонуклеазы рестрикции были расположены дистально по отношению к экспрессионной кассете, причем указанная экспрессионная кассета имеет сайт эндонуклеазы рестрикции для вставки трансгена, и
b. по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования.
141. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 56-79, содержащий:
a. молекулу одноцепочечной ДНК, содержащую, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':
первый смысловой ITR;
смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смысловой ITR; второй антисмысловой ITR;
антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и первый антисмысловой ITR;
причем указанные смысловая последовательность экспрессионной кассеты и антисмысловая последовательность экспрессионной кассеты имеют сайт эндонуклеазы рестрикции для вставки трансгена, и
b. по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования.
142. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 83-103, содержащий:
a. молекулу одноцепочечной ДНК, содержащую, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':
первый смысловой ITR;
смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смысловой ITR; и
антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты;
причем указанные смысловая последовательность экспрессионной кассеты и антисмысловая последовательность экспрессионной кассеты имеют сайт эндонуклеазы рестрикции для вставки трансгена, и
b. по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования.
143. Набор для продуцирования ДНК-вектора с замкнутыми концами, полученного или получаемого способом по любому из пп. 106-127, содержащий:
а. двухцепочечный ДНК-конструкт, содержащий, в порядке расположения в направлении от 5' к 3':
первый сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции; первый смысловой ITR;
смысловую последовательность экспрессионной кассеты; второй смысловой ITR;
антисмысловую последовательность экспрессионной кассеты; и
второй сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции;
причем указанные смысловая последовательность экспрессионной кассеты и антисмысловая последовательность экспрессионной кассеты имеют сайт эндонуклеазы рестрикции для вставки трансгена, и b. по меньшей мере один лигирующий реагент для лигирования.
144. Набор по любому из пп. 138-143, отличающийся тем, что по меньшей мере один реагент для лигирования представляет собой реагент для химического лигирования.
145. Набор по п. 144, отличающийся тем, что по меньшей мере один реагент для лигирования представляет собой реагент для лигирования с использованием белка.
146. Набор по п. 145, отличающийся тем, что указанное лигирование осуществляют посредством лигирования Т4 или белка Rep ААВ.
147. Набор по любому из пп. 138-146, отличающийся тем, что указанные первая одноцепочечная молекула ITR и вторая одноцепочечная молекула ITR содержат на своих концах сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции.
148. Набор по любому из пп. 138-147, отличающийся тем, что указанный набор дополнительно содержит по меньшей мере один фермент эндонуклеазы рестрикции.