СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАСТОЙКИ ИЗ ЛИСТЬЕВ ТОПОЛЯ ЧЕРНОГО, ОБЛАДАЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ШТАММОВ Burkholderia
METHOD FOR PRODUCTION OF BLACK POPLAR LEAF INFUSION HAVING ACTIVITY WITH RESPECT TO BURKHOLDERIA STRAINS

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности, к производству лекарственных средств из лекарственного растительного сырья, и касается получения настойки из листьев тополя черного (Populus nigra L.), активной в отношении штаммов Burkholderia.
Одной из проблем современного общества является терапия муковисцидоза, которая направлена главным образом на облегчение состояния пациента и симптоматическое лечение. Основную сложность в терапии муковисцидоза представляют пациенты, инфицированные штаммами Burkholderia, которые обладают устойчивостью к ряду антибактериальных средств. В связи с этим в настоящее время ведется поиск новых биологически активных соединений с антимикробной и противогрибковой активностью. Перспективными в терапии муковисцидоза являются лекарственные растительные препараты, так как растения обладают более широким спектром биологической активности (например, флавоноиды оказывают антимикробное, противовоспалительное, а также гепатопротекторное, спазмолитическое и антиоксидантное действие), безопасны в применении и обладают минимальным риском развития резистентности у микроорганизмов.
Известен способ получения настойки почек тополя, обладающей антимикробным и ранозаживляющим действием и применяющейся для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей, заключающийся в настаивании исходного сырья 65-96% этиловым спиртом в условиях дробной экстракции, сочетающей в себе настаивание при комнатной температуре в течение 24 ч с последующим извлечением целевых веществ при нагревании не выше 80°С в течение 1 ч и объединением первого и второго извлечений (1, 2).
Недостатком метода является трудоемкость сбора сырья, ограниченное его количество. Кроме того, для препарата, получаемого по данной методике, не описана активность в отношении штаммов Burkholderia.
Наряду с фармакопейным видом лекарственного растительного сырья - почками (3, 4), перспективными являются и листья данного растения, сок которого обладает противовоспалительной и антимикробной активностью (5).
Сок листьев тополя черного получают следующим образом.
Свежесобранное сырье измельчают и полученную кашицу прессуют под высоким давлением на гидравлических прессах. К отжатому соку немедленно добавляют этилового спирта: на 85 частей сока 15 частей 95% этилового спирта. В качестве стабилизатора используют натрия метабисульфит. Очистку сока производят отстаиванием при температуре не выше 8°С и последующим фильтрованием. Далее проводят термическую обработку - полученный сок быстро нагревают до температуры не выше 80°С, выдерживают в этом температурном режиме 30 мин и быстро охлаждают в проточной воде.
Сок из листьев тополя черного взят нами в качестве прототипа. Недостатками данного препарата является низкий выход целевого продукта (10,0%), низкое содержание действующих веществ - флавоноидов (0,37%), низкий выход целевых веществ (1,3%) и отсутствие активности в отношении штаммов Burkholderia.
Таким образом, целью изобретения является получение настойки листьев тополя черного, обладающей активностью в отношении клинических штаммов Burkholderia.
Технический результат достигается тем, что настаивают листья тополя черного 70% этиловым спиртом в соотношении «сырье - экстрагент» 1:8 в условиях дробной экстракции - дважды при комнатной температуре в течение 24 часов с последующим извлечением при нагревании на кипящей водяной бане и объединением трех извлечений; в итоге получают готовый объединенный продукт - настойку листьев тополя черного на 70% этиловом спирте, в которой содержание суммы флавоноидов (целевые вещества), определенное с использованием спектрофотометрического метода, составляет 0,51%, выход целевых веществ в настойке составляет 90,0%.
В таблице 1 (Приложение 1) представлена зависимость выхода целевых веществ и содержания действующих веществ от лекарственной формы и экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимальной лекарственной формы нами выбрана настойка, в качестве экстрагента - 70% этиловый спирт, так как выход целевых веществ (90% от теоретического содержания) и содержание действующих веществ (0,51%) при данном выборе максимально.
Настойку получают следующим образом.
Первый день. В три экстрактора помещают по 1 части измельченных листьев тополя черного. В первый экстрактор заливают 8 объемов по отношению к сырью 70% этилового спирта и оставляют для настаивания в течение 24 часов при комнатной температуре. Во второй экстрактор помещают 3 объема 70% этилового спирта для замачивания сырья в течение 24 часов.
Второй день. Из первого экстрактора сливают полученное извлечение во второй экстрактор и оставляют на 24 ч при комнатной температуре. В первый экстрактор заливают 5 объемов чистого экстрагента и оставляют на 24 часа при комнатной температуре. В третий экстрактор помещают 3 объема 70% этилового спирта для замачивания.
Третий день. Извлечение из второго экстрактора переливают в третий экстрактор, а из первого экстрактора - во второй. В первый экстрактор добавляют 5 объемов чистого экстрагента и оставляют на 24 часа при комнатной температуре для экстракции.
Четвертый день. Осуществляют слив извлечения из третьего экстрактора в сосуд с готовой продукцией (1/3 часть). Извлечение из второго экстрактора переливают в третий экстрактор и оставляют на 24 часа при комнатной температуре. В первом экстракторе осуществляют термическую экстракцию с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Полученное извлечение из первого экстрактора переливают во второй экстрактор и оставляют на 24 часа при комнатной температуре. Сырье из первого экстрактора является отработанным.
Пятый день. Осуществляют слив извлечения из третьего экстрактора в сосуд с готовой продукцией (1/3 часть). Во втором экстракторе осуществляют термическую экстракцию с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Полученное извлечение из второго экстрактора переливают в третий экстрактор и оставляют на 24 часа при комнатной температуре. Сырье из второго экстрактора является отработанным.
Шестой день. В третьем экстракторе осуществляют термическую экстракцию с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Полученное извлечение из третьего экстрактора в сосуд с готовой продукцией (1/3 часть). Сырье из третьего экстрактора является отработанным. Полученные три извлечения объединяют в готовый продукт.
Полученный готовый продукт составляет 150 мл. Его выдерживают при температуре 8°С в течение 2-3 дней и фильтруют. Выпавший осадок отфильтровывают, полученное извлечение фасуют в емкости темного стекла.
Предлагаемый способ поясняется следующим примером.
Пример 1.
Использование 70% этилового спирта на стадии экстракции приводит к увеличению выхода целевых веществ и составляет 90, 0% от теоретического содержания (содержание суммы флавоноидов в листьях тополя черного составляет 2,87%) и к увеличению содержания флавоноидов (целевые вещества) в настойке листьев тополя черного, что составляет 0,51%.
Исследование запредельных параметров технологического процесса дает следующие результаты. Использование концентрации спирта ниже 70%, в частности, 60% этилового спирта, на стадии экстракции приводит к существенному снижению выхода целевых веществ (71,0% от теоретического содержания суммы флавоноидов в сырье) и, следовательно, к снижению содержания флавоноидов в настойке листьев тополя черного (0,41%).
Использование концентрации 80% этилового спирта также приводит еще к большему снижению выхода целевых веществ (60,3% от теоретического содержания суммы флавоноидов в сырье) и, соответственно, к снижению содержания флавоноидов в настойке листьев тополя черного (0,34%).
Полученную настойку разработанным способом исследовали на наличие активности в отношении клинических штаммов Burkholderia.
Наличие активности определяли на клинических штаммах Burkholderia cenocepacia ST 208 и Burkholderia multivorans, полученных от пациентов с муковисцидозом. Определение минимальной ингибирующей концентрации проводили методом двойных серийных разведений в бульоне в соответствии с МУ 4.2.1890-04 (6). Учет результатов микробиологического анализа осуществляли через 48-72 часа после инкубации при температуре 37°С. При этом проводили визуальную оценку задержки роста. Затем из нескольких последних лунок с видимой задержкой роста осуществляли повторный посев на питательные среды (5% кровяной агар-агар), через 24 часа отсутствие роста оценивали как бактерицидный эффект, а появление видимого роста - как бактериостатический.
Результаты исследования показали наличие активности настойки листьев тополя черного в отношении клинических штаммов Burkholderia. Вплоть до разведения 1:32 включительно наблюдали бактерицидное действие в отношении штаммов Burkholderia cenocepacia ST 208 и Burkholderia multivorans и бактериостатическое действие до разведения 1:64 в отношении Burkholderia multivorans, при дальнейшем разведении рост культуры возобновлялся.
Таким образом, использование заявляемого средства дает следующие преимущества:
1. Настойка листьев тополя черного, полученная на 70% этиловом спирте в соотношении «сырье-экстрагент» 1:8, позволяет повысить выход действующих веществ (флавоноидов) из листьев тополя черного. Выход целевых веществ в настойке составляет 90,0%, а в соке - 1,3% от теоретического содержания (содержание суммы флавоноидов в листьях тополя черного составляет 2,87%). Содержание суммы флавоноидов в настойке составляет 0,51%, а в соке - 0,37%.
2. Полученная настойка листьев тополя черного обладает активностью в отношении штаммов Burkholderia, в отличие от настойки на основе почек тополя черного, что расширяет спектр фармакологической активности целевого продукта, создает условия для замены дорогостоящих зарубежных аналогов.
3. Заявляемое средство позволяет эффективно решить проблему комплексного использования растения, так как листья тополя черного составляют значительную часть фитомассы растения, причем данный вид сырья более прост в заготовке. Полученная настойка может применяться в химико-фармацевтической промышленности для производства лекарственных препаратов активных в отношении штаммов Burkholderia.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
1. Куркин, В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармац. вузов - Изд. 3-е, перераб. и доп. / В.А. Куркин. - Самара: ООО «Офорт», ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2016. - С. 371-375.
2. Патент РФ №2135201, на изобретение «Способ получения настойки тополя для лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей» / Куркин В.А., Браславский В.Б., Запесочная Г.Г., Правдивцева О.Е., Жданов И.П., Косякин В.А., Ткаченко А.А. - А61К 35/78. Бюл. №3 от 27.08.1998 г. - 6 с.
3. Браславский, В.Б. Комплексное фармакогностическое и физико-химическое исследование флавоноидов и фенилпропаноидов представителей семейства ивовых (Salicaceae): дис. … докт. фармац. наук: 14.04.02 / Браславский Валерий Борисович. - Самара, 2012. - 319 с.
4. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIV издание / МЗ РФ. - Москва, 2018. - Т. 4. - С. 6494-6500.
5. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Paeoniaceae - Thymelaeaceae. - Л.: Наука, 1986. - С. 110-112.
6. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания. МУК 4.2.1890-04 // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2004. - Т. 6, №4. - С. 306-359.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАСТОЙКИ ИЗ ЛИСТЬЕВ ТОПОЛЯ ЧЕРНОГО, ОБЛАДАЮЩЕЙ