Способ морфологической диагностики функционирующего артериального протока у глубоконедоношенных новорожденных с массой тела при рождении менее 1500 г
METHOD FOR MORPHOLOGICAL DIAGNOSIS OF A FUNCTIONING DUCTUS ARTERIOSUS IN PREMATURE NEWBORNS WITH BIRTH WEIGHT BELOW 1500 g

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и может быть использовано для постмортальной диагностики функционирующего артериального протока (ФАП) у глубоконедоношенных новорожденных с гестационным возрастом 22 - 32 недели и массой тела при рождении менее 1500 г.
Частота встречаемости функционирующего артериального протока (код по Международной статистической классификации болезней и проблем, связанных со здоровьем, десятого пересмотра (МКБ-10) Р 29.3) находится в обратной зависимости от гестационного возраста. У глубоконедоношенных детей данная патология наблюдается в 25 - 70% [Современный взгляд на функционирующий артериальный проток у недоношенных новорожденных / Ж.А. Звягина, Е.Г. Цой, Л.Н. Игишева, Д.А. Тронина // Мать и дитя в Кузбассе. – 2018. – Т. 75, № 4. – С. 4-12].
У новорожденных с массой тела при рождении менее 1500 г часто наблюдается нарушение механизмов закрытия артериального протока. Даже в случае, если после рождения происходит функциональное закрытие протока, то у этой категории детей есть все предпосылки для его повторного открытия [Современные представления об открытом артериальном протоке у новорожденных / Д.С. Крючко, А.Г. Антонов, А.А. Ленюшкина и др. // Педиатрия. Журнал им. Г.Н. Сперанского. – 2011. – Т. 90, № 1. – С. 130-136]. Состояниями, способствующими повторному открытию протока, могут выступать гипервентиляция легких, анемия, сепсис, пневмоторакс и другие.
У недоношенных детей ФАП может ассоциироваться с критическим клиническим состоянием и играть решающую роль в их танатогенезе. Гемодинамические нарушения при функционирующем артериальном протоке приводят к изменению церебрального кровотока и развитию ранних внутрижелудочковых кровоизлияний, которые являются одной из главных причин смертности новорожденных в перинатальном периоде [Современный взгляд на функционирующий артериальный проток у недоношенных новорожденных / Ж.А. Звягина, Е.Г. Цой, Л.Н. Игишева, Д.А. Тронина // Мать и дитя в Кузбассе. – 2018. – Т. 75, № 4. – С. 4-12].
Таким образом, разработка способа морфологической диагностики функционирующего артериального протока у глубоконедоношенных новорожденных позволит повысить качество гистологического заключения при морфологическом исследовании артериального протока и объективно и достоверно на молекулярном уровне оценить не только его наличие, но и его функционирование.
Известен способ диагностики открытого артериального протока у недоношенных новорожденных 25 - 34 недель гестации по уровню BNUP в крови [Yoo K.H., Hong Y.S., Son C.S., Lee J.W.  Utility of rapid B-type natriuretic peptide assay for diagnosis of symptomatic patent ductus arteriosus in preterm infants / B.M. Choi, К.Н. Lee, B.L. Eun et al. // Pediatrics. – 2005. – Vol. 115, № 3. – P. 255-261]. При концентрации BNUP 1110 пг/мл и более диагностируют функционирующий артериальный проток.
Однако данный способ имеет следующие недостатки:
1. Способ предназначен для прижизненной диагностики и не может быть использован для постмортальной диагностики.
2. Способ не позволяет на морфологическом уровне диагностировать функционирующий артериальный проток.
Известен способ диагностики ФАП по уровню BNUP в крови у недоношенных детей менее 37 недель гестации [Kim J.S., Shim  E.J. B-Type Natriuretic Peptide Assay for the Diagnosis and Prognosis of Patent Ductus Arteriosus in Preterm Infants  // Korean Circ J. – 2012. – Vol. 42. – P. 192-196]. При уровне концентрации BNUP в крови 412 пг/мл и более диагностируют функционирующий артериальный проток.
Однако данный способ имеет следующие недостатки:
1. Способ предназначен для прижизненной диагностики и не может быть использован для постмортальной диагностики.
2. Способ не позволяет на морфологическом уровне диагностировать функционирующий артериальный проток.
Известен способ диагностики ФАП методом эхокардиографического исследования, согласно которому к основным критериям гемодинамической значимости открытого артериального протока относят диаметр протока >1,5 мм (при массе тела <1500 г) или >1,4 мм (при массе тела >1500 г), а также шунтирование крови слева направо. К дополнительным критериям относят признаки переполнения малого круга кровообращения: отношение размеров левого предсердия к корню аорты (LA/Ao) ≥1,5, диастолическая скорость кровотока в легочной артерии (ЛА) ≥0,42 м/с, отношение сердечного выброса левого желудочка (СВЛЖ) к кровотоку в верхней полой вене (LVO/SVC) >4,0, СВЛЖ ≥300 мл/кг/мин, отношение конечного диастолического размера левого желудочка (ЛЖ) к размеру корня аорты (LVd/Ao)>2,1 и критерии обеднения большого круга кровообращения (индекс сосудистой резистентности (Ri) передней мозговой артерии >0,8, ретроградный кровоток в почечной и/или мезентериальной артериях (маятникообразный кровоток), ретроградный кровоток в постдуктальной аорте >50% антеградного кровотока [Открытый артериальный проток у недоношенных детей / А.А. Буров, Д.Н. Дегтярев, О.В. Ионов и др. // Неонатология: новости, мнения, обучение. – 2016. – Т. 14, № 4. – С. 120-128].
Однако способ имеет ряд недостатков:
1. У глубоконедоношенных новорожденных уровень гипоксии стенки артериального протока не достигает той степени, при которой происходит ее ремоделирование, в результате может происходить повторное открытие или реканализация сосуда [Открытый артериальный проток у недоношенных новорожденных / Д.С. Крючко, Е.Н. Байбарина, А.Г. Антонов, А.А. Рудакова // Вопросы практической педиатрии. – 2010. –     Т. 5, № 2. – С. 57-65]. Поэтому данные эхокардиографии у данной категории детей в неонатальном периоде, имеют диагностическую ценность только на момент проведения исследования.
2. Способ предназначен для прижизненной диагностики и не может быть использован для постмортальной диагностики.
3. Не позволяет на морфологическом уровне диагностировать функционирующий артериальный проток.
Наиболее близким по техническому решению является способ определение проходимости артериального протока с помощью зонда при проведении патологоанатомического вскрытия [Автандилов Г.Г. Основы патологоанатомической практики: руководство. - М.: РМАПО, 1994. – 512 с.]. Для этого, положив сердце на столик основанием к врачу, производят вскрытие легочной артерии по передней стенке от клапанного отверстия и осматривают место отхождения артериального протока. Далее для определения проходимости сосуда в проток заводят пуговчатый или желобоватый зонд. Если проток проходим, то зонд проникает в просвет дуги аорты.
Способ имеет ряд недостатков:
1. По данным наших исследований медиана диаметра функционирующего артериального протока у умерших в неонатальном периоде глубоконедоношенных новорожденных с массой тела при рождении менее 1500 г составляет 1,2 [0,35; 1,8] мм, при этом стандартные секционные инструменты, используемые для диагностики проходимости антериального протока, имеют диаметр гораздо больший этого значения (диаметр пуговчатого зонда составляет 2 мм, желобоватого зонда - 4 мм). В связи с несоответствием диаметров эти зонды не могут пройти открытый артериальный проток, из-за чего складывается ложное мнение о нефункционировании данного сосуда на момент смерти. Происходит недооценка роли функционирующего артериального протока в танатогенезе, что может исказить и снизить качество патологоанатомического заключения.
2. В связи с малыми размерами макропрепарата сердца глубоконедоношенных новорожденных и узостью артериального протока существует риск его перфорации при прохождении стандартными секционными зондами, при этом складывается ложное мнение о функционировании артериального протока на момент смерти, переоценке роли функционирующего артериального протока в танатогенезе, что может исказить и снизить качество патологоанатомического заключения.
Техническим решениемзаявляемого способа является постмортальная морфологическая диагностика функционирующего артериального протока у глубоконедоношенных новорожденных с гестационным возрастом 22 - 32 недели и с массой тела при рождении менее 1500 г.
Технический результат достигается путем определения индекса экспрессии рецептора простагландина E2 в стенке артериального протока у умерших глубоконедоношенных новорожденных с гестационным возрастом 22 - 32 недели и массой тела при рождении менее 1500 г, при значении которого равном или более 1,5 условных единиц диагностируют функционирующий артериальный проток, а при значении менее 1,5 условных единиц – нефункционирующий артериальный проток.
Проведено морфологическое исследование 42 артериальных протоков, полученных при аутопсии умерших в неонатальном периоде новорожденных, родившихся с массой тела менее 1500 г в сроке гестации 22 - 32 недели. Физическое развитие новорожденных соответствовало сроку гестации. В качестве основной причины смерти у них диагностированы двусторонние нетравматические внутрижелудочковые кровоизлияния II-III степени и врожденная интерстициальная пневмония. Из обследования исключались дети с миокардитом, врожденными пороками сердца и сосудов. При проведении патологоанатомического вскрытия всем детям проводилось выделение артериального протока и определение его проходимости. Для этих целей использовались полиуретановые центральные венозные и пупочные катетеры размерами от 1 до 5 Fr диаметром 0,35 - 1,8 мм (1 Fr – диаметр 0,35 мм; 2,5 Fr – 0,8 мм; 3,5 Fr – 1,2 мм; 4 Fr –1,5 мм; 5 Fr – 1,8 мм, фирма Vygon, Германия). У 28 детей артериальный проток был проходим для катетера (из них у 2 детей – для катетера размером 1 Fr, у 7 детей – 2 Fr, у 5 – 3 Fr, у 9 – 4 Fr и у 5 – 5 Fr), а при проведении иммуногистохимического исследования с антителами к рецепторам простагландина Е2 значения индекса экспрессии составили 1,5 и более условных единиц. У 14 детей при зондировании артериальный проток был непроходим для полиуретановых центральных венозных либо пупочных катетеров размерами от 1 до 5 Fr, а значения индекса экспрессии при иммуногистохимическом исследовании с антителами к рецепторам простагландина Е2 составили менее 1,5 условных единиц.
Способ осуществляется следующим образом: у умерших глубоконедоношенных детей с массой тела при рождении менее 1500 г и гестационным возрастом 22 – 32 недели во время аутопсии выделяют артериальный проток. Материал фиксируют в 10% забуференном формалине в течение 12 - 24 часов и выполняют стандартную гистологическую проводку. Иммуногистохимическое исследование проводят на парафиновых срезах, толщиной 4 - 5 микрон. После депарафинации микропрепаратов осуществляют демаскировку антигена путем кипячения в цитратном буфере в течение 15 минут в микроволновой печи при мощности 650 Вт. Эндогенную пероксидазу блокируют 1% раствором перекиси водорода с последовательной инкубацией во влажной камере с первичными антителами. В качестве первичных антител использовались кроличьи поликлональные антитела к рецепторам простагландина Е2 класса IgG («ThermoFisher Scientific», USA, рабочее разведение 1:200). В промежутках между инкубацией срезы промывают в трех сменах фосфатного буфера. Визуализацию комплексов антиген-антитело осуществляли с помощью системы детекции UltraVision Quanto Detection System HRP («ThermoFisher Scientific», USA). С целью исключения вероятности получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов каждое иммуногистохимическое исследование проводят с постановкой положительного и отрицательного контроля. Отрицательный контроль исключал специфическое окрашивание препаратов. Положительный контроль подтверждал специфичность поставленной иммуногистохимической реакции с данными антителами.
Результаты иммуногистохимической реакции оценивают в 10 полях зрения микроскопа в 100 клетках при увеличении х 400. Для количественной оценки определялся индекс экспрессии рецептора простагландина E2 в стенке артериального протока  по формуле:
Индекс экспрессии = ∑P(i) ⋅ i/100 условные единицы,
где i – интенсивность окрашивания иммуногистохимической реакции срезов артериального протока, оцененной в 10 полях зрения микроскопа в 100 клетках препарата при увеличении х 400, выражена в баллах от 0 до 3;
Р(i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.
[Pathology of the Breast / F.A. Tavassoli et al. - Stamford: Appleton-Lange, 1999].
При значении индекса экспрессии рецептора простагландина E2 равном или более 1,5 условных единиц диагностируют функционирующий артериальный проток, а при значении менее 1,5 условных единиц – нефункционирующий артериальный проток.
Новизна изобретения заключается в том, чтовпервые предлагается морфологическая диагностика функционировавшего артериального протока у глубоконедоношенных новорожденных по определению экспрессии рецептора простагландина E2 в стенке артериального протока.
Функциональное закрытие протока достигается путем сокращения гладкой мускулатуры за счет регуляторных факторов вазореактивности, к которым относится и простагландин Е2 (PGE2) [Hung Y.C., Yeh J.L., Hsu J.H. Molecular Mechanisms for Regulating Postnatal Ductus Arteriosus Closure // Int J Mol Sci – 2018. – Vol.19, №7. – P.1861]. Последний через внутриклеточную цАМФ снижает чувствительность миоцитов стенки сосуда к воздействию ионов кальция [Yokoyama U. Prostaglandin E-mediated molecular mechanisms driving remodeling of the ductus arteriosus // Pediatr Int. – 2015. – Vol. 57, № 5. – P. 820-827].
В доступной литературе отсутствуют данные об использовании иммуногистохимического индекса экспрессии рецепторов простагландина E2 в качестве маркера функционирующего артериального протока у глубоконедоношенных новорожденных с массой тела при рождении менее 1500 г.
Отличительные признаки способа:
определяют индекс экспрессии рецептора простагландина E2 в стенке артериального протока по формуле:
Индекс экспрессии = ∑P(i) ⋅ i/100 условные единицы,
где i – интенсивность окрашивания иммуногистохимической реакции срезов артериального протока, оцененной в 10 полях зрения микроскопа в 100 клетках препарата при увеличении х 400, выражена в баллах от 0 до 3;
Р(i) – процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью,
и при значении индекса экспрессии рецептора простагландина E2 равном или более 1,5 условных единиц диагностируют функционирующий артериальный проток, а при значении менее 1,5 условных единиц – нефункционирующий артериальный проток
Сущность заявляемого способа поясняется следующими примерами.
Пример 1
. Ребенок М. родилась от 1 беременности 1 преждевременных оперативных родов в 25 недель гестации. Беременность осложнилась тяжелой преэклампсией, плацентарной недостаточностью, хронической внутриутробной гипоксией плода. Вес при рождении 650 г, рост 30 см. Оценка по шкале Апгар 5/6 баллов. На 2 сутки выполнено эхокардиографическое исследование и диагностирован функционирующий артериальный проток диаметром 2 мм. Ребенок умер на 3 сутки жизни от двустороннего нетравматического внутрижелудочкового кровоизлияния III степени. На вскрытии артериальный проток проходим для пуговчатого зонда, диаметр протока 2 мм.
Согласно предложенному способу определялся индекс экспрессии рецептора простагландина Е2 в стенке артериального протока, который составил 1,7 условных единиц, что соответствует функционирующему артериальному протоку.
Заключение: функционирующий артериальный проток.
Пример 2
. Новорожденная девочка Н., от 3 беременности 2 преждевременных оперативных родов в сроке 30 недель. Течение беременности осложнилось умеренной преэклампсией, анемией I ст., плацентарной недостаточностью, хронической внутриутробной гипоксией плода. Вес при рождении 1100 г, рост 39 см. На 2 сутки выполнено эхокардиографическое исследование, ФАП не визуализировался. Ребенок умер на 5 сутки жизни от двусторонней интерстициальной пневмонии неуточненной этиологии. На вскрытии артериальный проток был не проходим для пуговчатого зонда и проходим для полиуретанового центрального венозного катетера диаметром 0,8 мм.
Согласно предложенному способу определялся индекс экспрессии рецептора простагландина Е2 в стенке артериального протока, который составил 1,5 условных единиц, что соответствует функционирующему артериальному протоку.
Заключение: функционирующий артериальный проток.
Пример 3
. Ребенок С. родилась от 3 беременности 2 преждевременных оперативных родов в 31 неделю гестации. Беременность осложнилась истмико-цервикальной недостаточностью, плацентарной недостаточностью, хронической внутриутробной гипоксией плода. Вес при рождении 1450 г, рост 42 см. На 2 сутки выполнено эхокардиографическое исследование, диагностирован функционирующий артериальный проток диаметром 1,5 мм. Ребенок умер на 9 сутки жизни от двусторонней интерстициальной пневмонии. На вскрытии артериальный проток для пуговчатого зонда и полиуретановых центральных венозных и пупочных катетеров не проходим.
Согласно предложенному способу определялся индекс экспрессии рецептора простагландина Е2 в стенке артериального протока, который составил 0,9 условных единиц, что соответствует нефункционирующему артериальному протоку.
Заключение: нефункционирующий артериальный проток.
Преимущества предлагаемого способа.
1. Является объективным, высокоинформативным и достоверным методом морфологической диагностики, позволяющим на молекулярном уровне оценить функционирование артериального протока у глубоконедоношенных новорожденных.
2. Способ повышает точность диагностики, качество гистологического заключения и полноту клинико-морфологического сопоставления результатов исследования сердечнососудистой системы у глубоконедоношенных новорожденных.
3. Способ прост в оценке результатов, для его осуществления не требуется дорогостоящего оборудования.