БАКТЕРИАЛЬНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

1. Способ получения мутантной бактерии, демонстрирующей улучшенную выживаемость и/или рост в выбранных условиях роста, причем указанный способ включает этапы:
A
A
(a) создания пула мутантных бактерий путем транспозонного мутагенеза с использованием активирующего транспозона (Tn), причем Tn включает промотор, способный усиливать транскрипцию гена, находящегося в сайте его инсерции или вблизи него;
(b) выращивания бактерий из мутантного пула в выбранных условиях роста и в одном или большем числе референсных условий с получением двух или большего числа тестовых культур;
A
(c) сравнения распределения инсерций Tn между тестовыми культурами для идентификации первого класса генов, которые являются невыгодными для роста и/или выживания в выбранных условиях роста, и второго класса генов, которые являются выгодными для роста и выживания в выбранных условиях роста; и
(d) получения модифицированной мутантной бактерии, у которой удален или нарушен по меньшей мере один из указанных невыгодных генов и/или сверхэкспрессируется по меньшей мере один из указанных выгодных генов, в результате чего мутантная бактерия демонстрирует улучшенную выживаемость и/или рост в выбранных условиях роста.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что несколько указанных невыгодных генов удалены или нарушены.
3. Способ по п. 1 отличающийся тем, что несколько указанных выгодных генов сверхэкспрессируются.
4. Способ по п. 1, дополнительно включающий культивирование модифицированной мутантной бактерии и применение этапов (а)-(с) по п. 1 к указанной модифицированной мутантной бактерии для идентификации дополнительных генов первого класса, которые являются невыгодными для роста и/или выживания в выбранных условиях роста, и дополнительных генов второго класса, которые являются выгодными для роста и выживания в выбранных условиях роста.
5. Способ по п. 4, дополнительно включающий этап получения модифицированной мутантной бактерии второго цикла, у которой удален или нарушен по меньшей мере один из указанных дополнительных невыгодных генов, и/или сверхэкспрессируется по меньшей мере один из указанных дополнительных выгодных генов, в результате чего мутантная бактерия демонстрирует улучшенную выживаемость и/или рост в выбранных условиях роста по сравнению с модифицированной мутантной бактерией по п. 2.
6. Способ по п. 5, включающий один или более дополнительных циклов мутагенеза и итеративное применение этапов (а)-(с) по п. 1 для получения мутантной бактерии третьего или цикла большего порядка, которая демонстрирует улучшенное выживание и/или рост в присутствии указанных сложных условий среды по сравнению с модифицированной мутантной бактерией предыдущего цикла.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что удаление и/или нарушение указанных невыгодных генов включает минимизацию генома.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанная минимизация генома включает встраивание плазмидной ДНК в бактериальную хромосому и последующее выделение совместно встроенной области.
9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанная минимизация генома включает гомологичную рекомбинацию, опосредуемую короткими гомологичными отрезками на концах линейной ДНК.
10. Способ по п. 1, дополнительно включающий этап встраивания по меньшей мере одного гетерологичного гена в бактерию.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанный гетерологичный ген является выгодным для роста и/или выживания в выбранных условиях роста.
12. Способ по п. 10, включающий этап встраивания кластера гетерологичных генов в бактерию.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что кластер гетерологичных генов кодирует путь биосинтеза.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что путь биосинтеза дает вторичный метаболит.
15. Способ по п. 12, отличающийся тем, что кластер гетерологичных генов кодирует путь биодеградации.
16. Способ по п. 10, отличающийся тем, что указанный гетерологичный ген кодирует терапевтический белок.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что указанный терапевтический белок выбран из:
(a) фермента;
(b) антитела;
(c) антигена;
(d) токсина;
(e) лиганд-связывающего белка;
(f) антибиотика;
(g) пептида; и
(h) цитокина.
18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что выбранное условие роста включает присутствие:
(a) загрязнителя окружающей среды;
(b) компонента промышленных отходов;
(c) компонента медицинских отходов;
(d) лекарственного вещества или лекарственного вещества-кандидата;
(е) выбранного источника углерода, например, углеводорода;
(f) одного или большего числа других организмов, например, микроорганизмов и вирусов.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанный один или большее число других организмов выбраны из:
(a) возбудителей заболеваний человека;
(b) возбудителей заболеваний животных; и
(c) возбудителей заболеваний растений.
5
5
20. Способ по п. 1, отличающийся тем, что пул мутантных бактерий содержит по меньшей мере 0,5×10 мутантов, например по меньшей мере 1×10 мутантов.
5
21. Способ по п. 20, отличающийся тем, что пул мутантных бактерий содержит по меньшей мере 5×10 мутантов.
6
22. Способ по п. 20, отличающийся тем, что пул мутантных бактерий содержит по меньшей мере 1×10 мутантов.
6
6
23. Способ по п. 20, отличающийся тем, что пул мутантных бактерий содержит по меньшей мере 0,5×10-2×10 мутантов.
6
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что пул мутантных бактерий содержит приблизительно 1×10 мутантов.
25. Способ по п. 1, в котором этап транспозонного мутагенеза (а) обеспечивает частоту инсерции по меньшей мере один транспозон на 50 пар оснований бактериальной ДНК.
26. Способ по п. 1, в котором этап транспозонного мутагенеза (а) обеспечивает частоту инсерции по меньшей мере один транспозон на 30 пар оснований бактериальной ДНК.
27. Способ по п. 1, в котором этап транспозонного мутагенеза (а) обеспечивает частоту инсерции по меньшей мере один транспозон на 25 пар оснований бактериальной ДНК.
28. Способ по п. 1, в котором этап транспозонного мутагенеза (а) обеспечивает частоту инсерции по меньшей мере один транспозон на 15 пар оснований бактериальной ДНК.
29. Способ по п. 1, в котором этап транспозонного мутагенеза (а) обеспечивает частоту инсерции по меньшей мере один транспозон на 10 пар оснований бактериальной ДНК.
30. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактериальная ДНК на этапе (а) является хромосомной (геномной) ДНК.
31. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактериальная ДНК на этапе (а) является плазмидной ДНК или смесью хромосомной (геномной) и плазмидной ДНК.
32. Способ по п. 1, отличающийся тем, что транспозонный мутагенез на этапе (а) осуществляют in vivo.
33. Способ по п. 1, отличающийся тем, что транспозонный мутагенез на этапе (а) осуществляют in vitro.
34. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактерия является грамположительной или грамотрицательной бактерией, например Rhodopseudomonas palustris.
35. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактерия является пробиотиком.
7
9
8
36. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бактерии выращивают из мутантного пула на этапе (b) путем засева ростовой среды 10-10, например, приблизительно 10 КОЕ из мутантного пула.
A
A
37. Способ по п. 1, отличающийся тем, что распределение инсерций Tn между тестовыми культурами сравнивают посредством секвенирования ДНК, прилегающей или находящейся вблизи от сайта инсерции Tn.
A
38. Способ по п. 38, отличающийся тем, что секвенирование ДНК, прилегающей или находящейся вблизи от сайта инсерции Tn, включает селективную амплификацию переходов транспозон-бактериальная ДНК.
39. Способ по п. 37, отличающийся тем, что секвенирование включает биохимический аппарат секвенирования посредством синтеза (SBS).
A
40. Способ по п. 37, отличающийся тем, что секвенируют приблизительно 25, 50, 75, 100 или более 100 пар оснований ДНК, прилегающих или находящихся вблизи от сайта инсерции Tn.
A
41. Способ по любому из пп. 37-40, отличающийся тем, что секвенируемая ДНК находится в 5′- и/или 3′-направлении от сайта инсерции Tn.
42. Мутантная бактерия, которую можно получить или получают посредством способа, описанного в любом из предшествующих пунктов.