Ассоциация мутации митохондриального генома G12315A с суммарными гомогенатами атеросклеротического поражения интимы аорты человека

Все работы по выделению клеток и их культивированию проводились в соответствии с общими принципами культуральных исследований. Забор клеток костного мозга проводили у мышей-доноров, содержащих ген GFP (Касинская и др., 2010).

Полученная смешанная культура из гемопоэтических и стромальных клеток КМ (костного мозга) от мышей-доноров вводилась рыбам внутривенно, речным ракам в вентральный синус (Ревякин и др., 2013). Доза введения составила 8-10млн. культивированных клеток КМ.

Гибели экспериментальных гидробионтов не отмечалось. Вскрытие опытных объектов производилось на 7, 14 и 21 день после введения КМ.

Эксперимент показал успешную трансплантацию стволовых клеток мышей у всех экспериментальных объектов (рыб и речных раков). Отмечалось зеленое свечение КМ с геном GFP при микроскопии внутренних органов (рис. 1).

А

Б

Рисунок 1. Клетки донора на 14 сутки после введения КМ:

А - в печени карпа;

Б - в гепатопанкреасе длиннопалого речного рака

Результаты были подтверждены ПЦР (полимеразной цепной реакцией): во всех опытных образцах был идентифицирован ген GFP.

Таким образом, впервые показано, что КМ мышей успешно приживаются в организме рыб и речных раков.

Литература

1. Касинская Н.В., Степанова О.И., Каркищенко Н.Н., Каркищенко В.Н., Семенов Х.Х., Бескова Т.Б., Капанадзе Г.Д., Ревякин А.О., Деньгина С.Е. Ген зеленого белка как маркер при трансплантации стволовых и прогениторных клеток костного мозга // Биомедицина, 2011. - №2. - С. 30-34.

2. Касинская Н.В., Степанова О.И., Каркищенко Н.Н., Каркищенко В.Н., Семенов Х.Х., Бескова Т.Б., Капанадзе Г.Д., Ревякин А.О., Деньгина С.Е. Ген зеленого белка как маркер при трансплантации стволовых и прогениторных клеток костного мозга // Биомедицина, 2011. - №2. - С. 30-34.

3. Корягина Н.Ю., Пронина Г.И., Ревякин А.О., Степанова О.И., Баранова О.В., Капанадзе Г.Д., Меньшиков И.Ю. Искусственно вызванная патология гепатопанкреаса речных раков // Биомедицина, 2013. - №2. - С. 52-54.

4. Пронина Г.И., Корягина Н.Ю., Ревякин А.О., Капанадзе Г.Д., Степанова О.И., Баранова О.В., Львов Ю.Б. Моделирование патологии поджелудочной железы у рыб // Биомедицина, 2013. - №2. - С. 74-75.

5. Ревякин А.О., Пронина Г.И., Корягина Н.Ю., Капанадзе Г.Д., Степанова О.И., Баранова О.В., Касинская Н.В. Приживаемость клеток костного мозга у рыб и речных раков // Биомедицина, 2013. - №3. - С. 63-66.

6. Шахов В.П., Попов С.В. Стволовые клетки и кардиомиогенез в норме и патологии. - Томск: STT, 2004. - 170с.

7. Bianco P. Cossu G. Uno nesstmo e centomila: searching for the identity of mesodermal progenitors // Exp. Cell Res. - 1999. - № 251 - P. 257-263.

Сазонова М.А. \ Синёв В.В.2, Никитина Н.А.3, Бобрышев Ю.В. 4, Постнов А.Ю. 5, Орехов А.Н.6 , Собенин И.А.7

'Кандидат биологических наук, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН, Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс Минздрава РФ;

2аспирант, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ;

3 кандидат биологических наук, НИИ атеросклероза, инновационный центр Сколково; НИИ физико-химической медицины

ФМБА;

4доктор биологических наук, профессор, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН;

5доктор медицинских наук, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ; 6доктор биологических наук, профессор, НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН; НИИ атеросклероза,

инновационный центр Сколково;

7доктор медицинских наук, Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ, НИИ общей

патологии и патофизиологии РАМН.

АССОЦИАЦИЯ МУТАЦИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНОМА G12315A С СУММАРНЫМИ ГОМОГЕНАТАМИ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ИНТИМЫ АОРТЫ ЧЕЛОВЕКА

Аннотация

В настоящей работе была проведена оценка уровня гетероплазмии мутантного аллеля G12315A в образцах ДНК, полученных из суммарных гомогенатов нормальной и пораженной атеросклерозом интимы 10 аорт.

Материалом исследования служили суммарные гомогенаты пораженных и нормальных участков интимы аорты. ПЦР-фрагменты данных образцов, содержащие область мутации G12315A, были пиросеквенированы с целью выявления мутаций, ассоциированных с атеросклерозом. Подсчёт процента гетероплазмии был проведён с помощью оригинального метода количественной оценки мутантного аллеля, разработанного сотрудниками лаборатории.

Обнаружено, что уровень гетероплазмии по мутации G12315A в суммарных гомогенатах атеросклеротического поражения достоверно выше по сравнению с гомогенатами из нормальной сосудистой ткани.

Результаты исследования позволяют предположить, что однонуклеотидная замена гуанина на аденин в позиции 12315 митохондриального генома приводит к дефекту транспортной РНК-Лейцин (кодон узнавания CUN) и неспособности выполнять свою функцию мутантными тРНК. Следствием критического уровня гетероплазмии по данной мутации, по всей

18

видимости, является снижение количества ферментов дыхательной цепи в митоходриях, ведущее к падению уровня выработки энергии в клетке.

Полученные данные могут быть использованы практическими врачами и специалистами по медицинской генетике для ранней досимптоматической диагностики атеросклероза и оценки предрасположенности к данному заболеванию.

Ключевые слова: Мутация, митохондриальный геном, суммарный гомогенат, интима, атеросклероз.

Sazonova M.A л, Sinyov V.V.2, Никитина Н.А.3, Bobryshev Yu.V. 4, Postnov A.Yu. 5, Orekhov A.N 6 , Sobenin LA. 7 'PhD in Biology, Institute of General Pathology and Pathophysiology, Russian Academy of Medical Sciences; Russian Cardiology

Research and Production Complex, Russian Ministry of Health;

^Postgraduate student, Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health;

3 PhD in Biology, Institute for Atherosclerosis Research, Skolkovo Innovative Centre; Scientific Research Institute of Physical-

Chemical Medicine;

4PhD in Biology, Institute of General Pathology and Pathophysiology, Russian Academy of Medical Sciences;

5Doctor of science in Medicine, Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health;

6Doctor of science in Biology, professor, Institute of General Pathology and Pathophysiology, Russian Academy of Medical Sciences; Institute for Atherosclerosis Research, Skolkovo Innovative Centre;

7Doctor of science in Medicine, Russian Cardiology Research and Production Complex, Russian Ministry of Health; Institute of General Pathology and Pathophysiology, Russian Academy of Medical Sciences.

THE ASSOCIATION OF MITOCHONDRIAL GENOME MUTATION G12315A WITH TOTAL HOMOGENATES OF ATHEROSCLEROTIC LESIONS IN HUMAN AORTIC INTIMA

Abstract

In the present article an assessment of heteroplasmy level in the mutant allele G12315A in DNA samples extracted from total homogenates of normal and atherosclerotic intima of 10 aortas.

The materials of the study were total homogenates from atherosclerotic lesions and normal sections of aortic intima. PCR-fragments of the given samples, containing the mutation G12315A area, were pyrosequenced with the aim of detecting mutations associated with atherosclerosis. An estimation of heteroplasmy percentage was conducted by means of a new original method of quantitative assessment of mutant allele, developed by members of our laboratory.

It was found that the heteroplasmy level of mutation G12315A in total homogenates of atherosclerotic lesions is significantly higher compared to homogenates from normal vascular tissue.

The results of the study suggest that single nucleotide substitution of guanine for adenine in position 12315 of mitochondrial genome leads to a transport-RNA-Leucine (codon recognized CUN) defect and disability of mutant tRNA to fulfill its function. It seems that the consequence of the critical heteroplasmy level of this mutation is a decrease in number of respiratory chain enzymes in

mitochondria, leading to reduction of energy generation level in cells.

The obtained data can be used by medical practitioners and medical genetics specialists for early presymptomatic diagnostics of atherosclerosis and estimation of liability to this disease.

Keywords: Mutation, mitochondrial genome, total homogenate, intima, atherosclerosis.

Введение

В настоящее время сердечно-сосудистые-заболевания являются основной причиной смертности в развитых странах. В основе развития многих сердечно-сосудистых заболеваний лежит атеросклероз. Вследствие этого, большое значение имеет ранняя диагностика атеросклероза. Соматические мутации митохондриального генома человека могут быть причинами развития атеросклероза [1-17]. Митохондриальная ДНК человека - кольцевая двухцепочечная молекула, состоящая приблизительно из 16500 пар нуклеотидов, которая содержит 37 генов: 22 гена транспортных РНК, 2 гена рибосомальных РНК и 13 субъединиц комплексов дыхательной цепи: цитохрома B, АТФазы, цитохром-С-оксидазы, NADH-дегидрогеназы [18].

В настоящей работе была проведена оценка уровня гетероплазмии мутантного аллеля G12315A в образцах ДНК, полученных из гомогенатов нормальной и пораженной атеросклерозом интимы 10 аорт.

Из литературных источников известно, что мутация G12315A локализована в стебельке Т-петли тРНК-Лейцин (кодон узнавания CUN) [19].

Материалы и методы

Материалом для исследования послужили общие гомогенаты ткани интимы 10 аорт. Эпителий сосудистой ткани был взят у лиц, погибших в результате несчастного случая или внезапной смерти. Затем проводили гомогенизирование пораженных участков интимы аорты. Масса забираемого участка аорты составляла около 10 мкг. Образцы с нормальными участками интимы аорт также подвергались гомогенизированию.

Выделение тотальной ДНК из исследуемых образцов ткани проводили с помощью метода фенол-хлороформной экстракции. Затем образцы амплифицировали на MJ Research, PTC-200, USA. После проведения ПЦР амплификаты были пиросеквенированы с целью выявления процента гетероплазмии по мутации G12315A.

ПЦР фрагментов, содержащую область мутации, проводили со следующем праймерами: прямой bio-

CTCATGCCCCCATGTCTAA (12230-12249), обратный bio-AAGTCCTAGGAAAGTGACAGCGAGG (13825-13806). Праймеры для ПЦР и пиросеквенирования были подобранны с помощью онлайн программы Primer3.

Подсчет процента гетероплазмии проводился согласно оригинальному методу, разработанному в нашей лаборатории на основе технологии пиросеквенирования. Расчет величины гетероплазмии проводился на основе полученных пиков пирограммы [20-22].

Статистическая обработка данных проводилась методом бутстрэп-анализа.

Результаты и обсуждение

В настоящей работе был проанализирован процент гетероплазмии мутации в G12315A в общих гомогенатах нормальной и пораженной атеросклерозом интимы аорт человека. Полученные данные показали, что уровень гетероплазмии по данной мутации в общих гомогенатах атеросклеротического поражения выше, чем в гомогенатах нормальной сосудистой ткани на уровне значимости p<0,004 (рис.1).

Следует отметить, что при мутации G12315A изменяется нуклеотид 52 транспортной РНК-Лейцин (кодон узнавания CUN), входящий в состав стебелька Т-петли. Общие принципы складывания цепей тРНК в компактную третичную структуру (L-форму) универсальны. При этом D- и T-петли оказываются сближенными и скрепляются между собой путем образования дополнительных связей между основаниями (трёхнуклеотидная структура). В образовании этих связей, как правило, принимают участие консервативные или полуконсервативные остатки. Одним из них для тРНК-Лейцин и является нуклеотид 52 (гуанин, функциональная группа, присоединённая к пуриновому кольцу =О). При замене гуанина на аденин (функциональная группа, присоединённая в том же месте к пуриновому кольцу - NH2) третичная структура тРНК нарушается, что ведёт к её нефункциональности. Итогом такого развития событий является меньшая интенсивность формирования комплексов тРНК-Лейцин и, как следствие, понижение вероятности корректного включения данной аминокислоты в полипептидные цепи.

19

Следствием критического уровня гетероплазмии по мутации G12315A, по всей видимости, является снижение количества ферментов дыхательной цепи в митоходриях, ведущее к падению уровня выработки энергии в клетке.

Заключение.

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что мутации, происходящие в транспортных РНК митохондрий человека, например, G12315A в гене РНК-Лейцин (кодон узнавания CUN), также могут быть вовлечены в процесс атерогенеза. Однако точные механизмы данного явления еще предстоит выяснить в дальнейших исследованиях.

Данная статья может быть полезна медицинским генетикам и практикующим врачам, специализирующимся в области атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.

Рис. 1. Сравнительный анализ уровня гетероплазмии общих гомогенатов нормальной и пораженной атеросклерозом интимы

аорт по мутации G12315A.

Примечание: * - высокодостоверная корреляция G12315A с гомогенатами атеросклеротического поражения (p<0,004).

Литература

1. Иванова М.М., Сазонова М.А., Желанкин А.В., Митрофанов К.Ю., Хасанова З.Б., Собенин И.А., Мясоедова В.А., Постнов А.Ю., Орехов А.Н. Мутации митохондриального генома в патологии человека.// Фундаментальные науки и практика. -2010.-Т. 1-№4.-С.164-167.

2. Желанкин А.В., Сазонова М.А. Роль мутаций митохондриального генома человека в развитии сахарного диабета 2 типа, артериальной гипертонии и различных видов кардиомиопатии.// Проблемы и перспективы современной науки. -2011.-Т.3-№»1-С.85-87.

3. Митрофанов К.Ю., Сазонова М.А. Связь мутаций митохондриального генома человека с клиническими проявлениями ишемической болезни сердца.// Проблемы и перспективы современной науки. -2011.-Т.3-№1-С.92-96.

4. Сазонова М.А., Желанкин А.В., Иванова М.М., Орехов А.Н., Постнов А.Ю. Анализ митохондриальной мутации A1555G в тотальных гомогенатах атеросклеротических поражений.// Вестник уральской медицинской академической науки.- 2012.-Т. 2-№39-С.72-73.

5. Сазонова М.А., Желанкин А.В., Иванова М.М. Уровень гетероплазмии митохондриальной мутации C5178A в тотальных гомогенатах пораженной атеросклерозом интимы аорты.// Вестник уральской медицинской академической науки.-2012.-Т.2-№39-С.73-74.

6. Sobenin I.A., Sazonova M.A., Ivanova M.M., Zhelankin A.V., Myasoedova V.A., Postnov A.Y., Nurbaev S.D., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N. Mutation C3256T of Mitochondrial Genome in White Blood Cells: Novel Genetic Marker of Atherosclerosis and Coronary Heart Disease.// PLoS One.- 2012.Vol.7,№10:e46573. doi: 10.1371/journal.pone.0046573. Epub 2012 Oct 2.

7. M.A.Сазонова, С.Д.Нурбаев, М.М Чичёва, К.Ю. Митрофанов, А.Н.Орехов, А.Ю.Постнов, И.А.Собенин. Детекция митохондриальных мутаций генов цитохромов B и C в липофиброзных бляшках интимы аорты человека.// Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- 2012.-№ 4-С.62-66.

20

8. Igor A. Sobenin, Margarita A. Sazonova, Anton Y. Postnov, Yuri V. Bobryshev, and Alexander N. Orekhov, Mitochondrial Mutations are Associated with Atherosclerotic Lesions in the Human Aorta.// Clin. Dev. Immunol.- 2012.2012:832464. Epub 2012 Sep 11.

9. М.А. Сазонова, В.В Синёв., М.М.Чичёва, А.В. Желанкин, К.Ю.Митрофанов, А.Н. Орехов, И.А. Собенин. Анализ гетероплазмии некоторых генов субъединиц NADH дегидрогеназы в гомогенатах атеросклеротического поражения интимы аорты.//Патологическая физиология и экспериментальная терапия.- 2012.-№4-С.71-74.

10. Sobenin I.A., Sazonova M.A., Postnov A.Y., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N. Changes of mitochondria in atherosclerosis: Possible determinant in the pathogenesis of the disease.//Atherosclerosis. -2013. Jan 25. doi: pii: S0021-9150(13)00041-5. 10.1016/j.atherosclerosis.2013.01.006. [Epub ahead of print].

11. Косогорова С.А., Сазонова М.А., Чичёва М.М., Митрофанов К.Ю., Желанкин А.В., Коробов Г.А., Собенин И.А. Анализ гетероплазмии митохондриальной мутации C5178A гена субъединицы 2 NADH дегидрогеназы в гомогенатах пораженной интимы аорты.//Биомедицинский журнал Medline.ru.- 2012.- Т. 13- Ст.75- С. 895-899.

12. Sobenin I.A., Chistiakov D.A., Sazonova M.A., Ivanova M.M., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N., Postnov A.Y. Association of the level of heteroplasmy of the 15059G>A mutation in the MT-CYB mitochondrial gene with essential hypertension.// World J. Cardiol. -2013. May 26,Vol.5, №5- P.132-140. doi: 10.4330/wjc.v5.i5.132.

13. Сазонова М. А., Баринова В. А., Синёв В. В., Чичёва М. М., Митрофанов К. Ю., Желанкин А. В., Хасанова З. Б., Егорова Л. А., Собенин И. А., Постнов А. Ю. Детекция уровня гетероплазмии мутации митохондриального генома G14459A в гомогенатах имтимы аорты человека.// Атеросклероз и дислипидемии.- 2013.-№1-С.40 - 44.

14. М.А.Сазонова, С.Д.Нурбаев, А.В.Желанкин, М.М.Иванова, К.Ю.Митрофанов, И.А.Собенин, А.Ю.Постнов. Ассоциация мутаций митохондриальных генов субъединиц 1, 2, 5 и 6 NADH-дегидрогеназы с липофиброзными бляшками аорты человека. //Кардиологический вестник.- 2013.-Т.8 (20)-№1-С.32-35.

15. Sobenin I.A., Sazonova M.A., Postnov A.Y., Salonen J.T., Bobryshev Y.V., Orekhov A.N. Association of mitochondrial genetic variation with carotid atherosclerosis.// PLoS One. - 2013. Jul 9,Vol.8, N°7:e68070. doi: 10.1371/journal.pone.0068070. Print 2013.

16. Синёв В.В., Сазонова М.А., Чичёва М.М., Митрофанов К.Ю., Желанкин А.В., Собенин И.А., Постнов А.Ю. Изучение гетероплазмии мутации митохондриального генома A1555G в гомогенатах пораженной атеросклерозом интимы аорты.// Атеросклероз и дислипидемии. -2013- №3-С.45-48.

17. Митрофанов К.Ю., Желанкин А.В., Сазонова М.А., Собенин И.А., Постнов А.Ю. Ассоциация мутаций ядерного генома с развитием инфаркта миокарда.// Атеросклероз и дислипидемии. -2013.-№ 2-С. 56-60.

18. Anderson S., Bankier A.T., Barrell B.G., de Bruijn M.H., Coulson A.R., Drouin J., Eperon I.C., Nierlich D.P., Roe B.A., Sanger F., Schreier P.H., Smith A.J., Staden R., Young I.G. Sequence and organization of the human mitochondrial genome. April 1981.// Nature 290. (5806) -P. 457-465.

19. Yamagata K., Muro K., Usui J., Hagiwara M., Kai H., Arakawa Y., Shimizu Y,. Tomida C., Hirayama K., Kobayashi M., Koyama A.. Mitochondrial DNA mutations in focal segmental glomerulosclerosis lesions.// J. Am. So.c Nephrol.- 2002.-Vol. 13, №7,P.1816-1823.

20. Sazonova M., Budnikov E., Khasanova Z., Sobenin I., Postnov A., Orekhov A. Studies of the human aortic intima by a direct quantitative assay of mutant alleles in the mitochondrial genome.// Atherosclerosis.- 2009-Vol. 204, №1, -P.184-190.

21. Sazonova M.A., Budnikov Y.Y., Khazanova Z.B., Postnov A.Y., Sobenin I.A., Orekhov A.N. Direct quantitative assessment of mutant allele in mitochondrial genome in atherosclerotic lesion of human aorta. //Atherosclerosis Suppl.- 2007.- Vol.8, №1-P.45-46.

22. М.А. Сазонова, А.Ю. Постнов, А.Н. Орехов, И.А. Собенин. Новый метод количественной оценки мутантного аллеля митохондриального генома.// Пат. физиол. и эксп. тер.,- 2011.-№4-С.81-84.

Горбанева Е.П.1, Лагутина М.В. 2, Ступина А.Ю3.

'Доктор медицинских наук, доцент; 2аспирант, 3студент, Волгоградская государственная академия физической культуры

КАЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ПОДГОТОВЛЕННОСТИ, ОБУСЛОВЛИВАЮЩИЕ СПЕЦИАЛЬНУЮ ФИЗИЧЕСКУЮ РАБОТОСПОСОБНОСТЬ СПОРТСМЕНОК ФИТНЕСАЭРОБИКИ РАЗЛИЧНОЙ КВАЛИФИКАЦИИ

Аннотация

Проведено исследование спортсменок специализации фитнес-аэробика различного возраста и квалификации, с целью выяснения ведущих физиологических факторов, определяющих специальную физическую работоспособность. Определена структура вклада изучаемых физиологических свойств (мощность, мобилизация, экономизация и устойчивость) в достижение необходимого уровня адаптированности к специфическим мышечным нагрузкам в фитнес-аэробике.

Ключевые слова: специальная физическая работоспособность, фитнес-аэробика, многолетняя адаптация.

Gorbaneva E.P.1, Lagutina M V.2, StupiM A.Y.3

*MD in medicals, associate professor; ^Postgraduate stuent, 3student, Volgograd state academy of physical culture

QUALITY DATA FUNCTIONAL TRAINING, DRIVEN BY THE SPECIFIC PHYSICAL PERFORMANCE SPORTSWOMEN FITNESS- AEROBICS VARIOUS SKILLS

Abstract

A study of athletes specialization aerobic fitness of various ages and skills in order to clarify the leading physiological factors determining the special physical performance. The structure of the deposit studied physiological properties (power, mobilization, economization and stability) to achieve the necessary level of adaptation to specific muscular exercise in fitness aerobics.

Keywords: special physical performance, fitness-aerobics, long-term adaptation.

Физическая работоспособность является интегративным показателем функционального состояния и функциональной подготовленности организма спортсменов, а также важнейшим условием для развития физических качеств, основой способности организма к перенесению высоких специфических нагрузок и во многом определяет достижения спортсменов различных видов спорта практически на всех этапах многолетней тренировки [1].

Считается, что общая физическая работоспособность это уровень развития физических качеств и способностей, не свойственных данному виду спорта, но прямо или косвенно влияющих на достижения в избранном виде спорта [2]. В тоже время специальная физическая работоспособность - это уровень развития физических способностей, соответствующих специальным требованиям избранной спортивной специализации [2]. В связи с этим, знание структуры специальной физической работоспособности необходимо для проведения адекватного контроля функционального состояния организма спортсменов различных специализаций, а также оптимального управления тренировочным процессом на этапах многолетней адаптации организма к мышечной деятельности. В виду этого, целью исследования явилось выяснение роли функциональных свойств физиологических систем организма (мощности, мобилизации, экономизации, устойчивости) в обеспечении специальной физической работоспособности спортсменок фитнес-аэробики на различных этапах многолетней адаптации к мышечной деятельности.

21